(57)【要約】  本発明は、ペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質およびそれらを核酸、膜構造、炭水化物構造などの他の物質と組み合わせて含む複合化合物などのタンパク質性物質に、該タンパク質性物質の免疫原性を増強するクロスβ構造を付与するための新規な方法および手段に関する。得られたペプチド、タンパク質、糖タンパク質などは好ましくはワクチンで用いられる。本発明は、少なくとも１つのペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質および／またはリポタンパク質を含む免疫原組成物を製造する方法であって、該組成物に少なくとも１つのクロスβ構造を付与することを含む方法を提供する。本発明はまた、感染性疾患の予防のためのワクチンの製造におけるクロスβ構造の使用も開示する。本発明はさらに、少なくとも１つのペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質および／またはリポタンパク質を含む組成物の免疫原性を高める方法であって、該ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質および／またはリポタンパク質の少なくとも１つをクロスβ誘導剤と接触させ、それにより該組成物に付加的クロスβ構造を付与することを含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種類のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質および／またはリポタンパク質を含んでなるむ免疫原組成物を産生する方法であって、
該組成物に少なくとも１つのクロスβ構造を付与することを含む、方法。
【請求項２】
前記クロスβ構造が少なくとも１つのペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質および／またはリポタンパク質の少なくとも一部において誘導される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
感染性疾患の予防用ワクチンの作製におけるクロスβ構造の使用。
【請求項４】
感染性病原体に対する免疫応答を誘導するワクチンの作製における、前記感染性病原体のタンパク質成分において誘導されるクロスβ構造の使用。
【請求項５】
前記タンパク質成分がウイルスタンパク質であり、前記感染性病原体がウイルスである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記タンパク質成分がウイルスまたは細菌タンパク質であり、前記感染性病原体がウイルスまたは細菌である、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
前記ウイルスタンパク質の少なくとも４〜５０％、好ましくは１０〜３０％がクロスβ構造を含むコンフォメーションにある、少なくとも１つのウイルスタンパク質を含むサブユニットワクチン。
【請求項８】
前記細菌タンパク質の少なくとも４〜５０％、好ましくは１０〜３０％がクロスβ構造を含むコンフォメーションにある、少なくとも１つの細菌タンパク質を含むサブユニットワクチン。
【請求項９】
前記ウイルスタンパク質の少なくとも４〜５０％、好ましくは１０〜３０％がクロスβ構造を含むコンフォメーションにある、少なくとも２つのウイルスタンパク質を含むサブユニットワクチン。
【請求項１０】
前記細菌タンパク質の少なくとも４〜５０％、好ましくは１０〜３０％がクロスβ構造を含むコンフォメーションにある、少なくとも２つの細菌タンパク質を含むサブユニットワクチン。
【請求項１１】
少なくとも１つのペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質および／またはリポタンパク質を含んでなる組成物の免疫原性を向上させる方法であって、
該ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質および／またはリポタンパク質の少なくとも１つをクロスβ構造誘導剤と接触させ、それにより該組成物に付加的なクロスβ構造を付与することを含む、方法。
【請求項１２】
少なくとも１つのペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質および／またはリポタンパク質を含んでなるワクチン組成物の免疫原性を増強する方法であって、
少なくとも１つのペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質および／またはリポタンパク質をクロスβ構造誘導剤と接触させ、それにより該ワクチン組成物に付加的なクロスβ構造を付与することを含む、方法。
【請求項１３】
ワクチン組成物におけるクロスβ構造の量を測定する方法であって、
該ワクチン組成物を少なくとも１種類のクロスβ構造結合化合物と接触させ、結合したクロスβ構造の量をそのワクチン組成物に存在するクロスβ構造の量と連関させることを含む、方法
【請求項１４】
癌の予防および／または治療用の免疫原組成物の作製におけるクロスβ構造の使用。
【請求項１５】
免疫弱化および／または
アテローム性動脈硬化症、類澱粉症、自己免疫疾患、移植片対宿主病および／または移植拒絶の予防および／または治療のための免疫原組成物の作製におけるクロスβ構造の使用。
【請求項１６】
細菌または寄生虫またはウイルス抗原を含み、前記抗原が前記抗原の少なくとも４〜５０％、好ましくは１０〜３０％の間をクロスβ構造コンフォメーションで含む、免疫原組成物。
【請求項１７】
前記抗原がＨＰＶ  Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質、インフルエンザヘマグルチニンＨ５、インフルエンザヘマグルチニンＨ７、ペスチウイルスＥ２タンパク質、肝蛭(Fasciola hepatica)ＣＬ３タンパク質および／またはナイセリアＰｏｒＡタンパク質を含む、請求項１６に記載の免疫原組成物。
【請求項１８】
ワクチンである、請求項１６または１７に記載の免疫原組成物。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質および／またはリポタンパク質がＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、肝蛭ＣＬ３、インフルエンザＨ５、インフルエンザＨ７、ペスチウイルスＥ２タンパク質および／またはナイセリアＰｏｒＡタンパク質を含む、請求項１〜２または１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
β２糖タンパク質Ｉまたはその抗原ペプチドを含み、前記タンパク質またはペプチドの少なくとも４〜６７％、好ましくは１０〜３３％の間をクロスβ構造コンフォメーションで含む、免疫原組成物。
【請求項２１】
β２糖タンパク質Ｉまたはその抗原ペプチドを含み、前記β２糖タンパク質Ｉまたはその抗原ペプチドが、別のタンパク質またはそのペプチドと共役または混合され、前記別のタンパク質またはペプチドの少なくとも４〜６７％、好ましくは１０〜３３％の間をクロスβ構造コンフォメーションで含む、免疫原組成物。
【請求項２２】
自己免疫疾患の予防または治療のための、請求項２０または２１に記載の免疫原組成物の使用。
【請求項２３】
細菌もしくは寄生虫もしくはウイルスタンパク質またはその抗原ペプチドを含み、前記タンパク質が前記タンパク質またはペプチドの少なくとも４〜６７％、好ましくは１０〜３３％の間をクロスβ構造コンフォメーションで含む、免疫原組成物。
【請求項２４】
細菌もしくは寄生虫もしくはウイルスタンパク質またはその抗原ペプチドを含み、そのタンパク質または抗原ペプチドがクロスβ構造コンフォメーションにある少なくとも４〜６７％、好ましくは１０〜３３％の間の前記他のタンパク質またはペプチドを含む別のタンパク質またはペプチドと共役または混合されている、免疫原組成物。
【請求項２５】
前記別のタンパク質が好ましくはＯＶＡもしくはＫＬＨまたは双方の組合せを含む、請求項２１または２４に記載の免疫原組成物。
【請求項２６】
アジュバントをさらに含む、請求項７〜１０、１６〜１８、２０〜２１または２３〜２５のいずれか一項に記載の免疫原組成物またはワクチン。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、ペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質およびそれらを核酸、膜構造、炭水化物構造などの他の物質と組み合わせて含む複合体化合物などのタンパク質性物質に、該タンパク質性物質免疫原性を高めるクロスβ構造を付与するための新規な方法および手段に関する。得られたペプチド、タンパク質、糖タンパク質などはワクチンとして使用される。
【０００２】
ワクチンは２つの基本的な群、すなわち、予防ワクチンと治療ワクチンに分けることができる。予防ワクチンは、ヒト、ペットおよび／または家畜のおいて何らかの病因を持つ実質的に全ての既知感染性病原体（ウイルス、細菌、酵母、真菌、寄生虫、マイコプラズマなど）に対して作製および／または提案されている。治療ワクチンも感染性病原体だけでなく、癌および他の異常の治療、ならびに例えば雄性免疫弱化のためのＬＨＲＨ、または移植片対宿主病（ＧｖＨ）および／または移植拒絶の予防といった幅広い範囲の、他の自己抗原に対する免疫応答を誘導するために作製および／または提案されている。
【０００３】
ワクチンには一般に２つの重大な問題がある。ワクチンは有効でなければならず、かつ、安全でなければならない。ワクチンの開発を試みる場合、しばしばこの２つの要件は互いに背反すると思える。最も有効なワクチンはこれまでは生きた感染性病原体を改変したものであった。これらは許容レベルにまで毒性を減弱（弱毒）するように改変される。感染性病原体のワクチン株は一般に宿主内で複製するが、そのレベルは低く、宿主は十分な免疫応答を惹起することができ、宿主にその感染性病原体に対する長期免疫を付与することもできる。弱毒ワクチンのマイナス面は、感染性病原体がより毒性の高い形態（ひいては、病原型）へ復帰し得ることである。
【０００４】
これはどの感染性病原体にも起こり得るが、変異の早いウイルス（特にＲＮＡウイルスなど）では極めて重大な問題である。改変型生ワクチンに伴うもう１つの問題は、感染性病原体が多くの異なる血清型を有する場合が多いことである。異なる血清型の感染性病原体から防御する免疫応答を宿主に惹起するワクチンを得ることが多くの場合、困難であることが分かっている。
【０００５】
感染性病原体が死滅しているワクチンは安全であるが、それらの有効性は、ワクチンがアジュバントを含んでいたとしても、せいぜい中程度である場合が多い。
【０００６】
最新の生物学の出現以来、多大な注目を受けているワクチン種はサブユニットワクチンである。これらのワクチンでは、免疫応答の惹起に感染性病原体の数種の要素だけが用いられる。一般に、サブユニットワクチンは、組換え手段および／または合成手段により産生された、感染性病原体（１以上の血清型に由来）の２種類または３種類のタンパク質（糖タンパク質）および／またはタンパク質中に存在するペプチドを含む。これらのワクチンは理論上最も有望な安全かつ有効なワクチンであるが、実際には有効性が主要な障害であることが分かっている。分子生物学により、理論的に、異なる血清型の感染性病原体に対する交差防護ももたらすはずである安全かつ有効なワクチンに到達するためのもう１つの方法がもたらされている。感染性病原体由来の炭水化物構造が、ワクチンの特定の免疫応答惹起成分として提案されており、それとともにリポ多糖構造、核酸複合体でさえも提案されている。これらの成分ワクチンは一般に安全であるが、それらの有効性および異なる血清型に対する交差防護を通常欠いている。異なる種の組合せ（炭水化物とペプチド／タンパク質、およびリポ多糖（ＬＰＳ）とペプチド／タンパク質、場合により担体を含む）が提案されているが、これまでのところ安全性と有効性の問題がなお存在する。
【０００７】
交差防護を提供する別のアプローチとして、感染性病原体の２以上の血清型に由来する抗原成分を含むハイブリッド感染性病原体を作製するというものがある。これらは最新の分子生物学技術により作出可能であり、作出されてもいる。それらは改変型生ワクチンとして、または病原体が不活性化または死滅されたワクチンとして作出するもできるし、サブユニットワクチンとして作出することもできる。また、全く異なる感染性病原体に由来する抗原を含む混合ワクチンも周知である。多くの国で、子供に慣例的に、例えば、ジフテリア、百日咳、破傷風およびポリオなどに対する混合ワクチンによる予防接種が行われている。また、異なる感染性病原体に由来する抗原要素を含む組換えワクチンも提案されている。例えば、家禽類では、ニワトリ貧血ウイルスに基づくワクチンがマレック病ウイルス（ＭＤＶ）の抗原要素で補われることが示唆されているが、多くのさらなる組合せが提案され、作出されている。
【０００８】
最新の組換えワクチンのもう１つの重要な利点は、マーカーワクチンを作出する機会をもたらしたことである。マーカーワクチンは野生型感染性病原体には存在しない余分な要素とともに提供されているか、あるいはマーカーワクチンは野生型感染性病原体に存在する要素を欠いている。両種のマーカーワクチンに対する宿主の応答は、野生型の感染に対する応答と区別することができる（一般に、血清学的診断による）。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、免疫応答の惹起を意図した組成物の免疫原性を向上させる方法および手段を提供する。
【００１０】
特に本発明は、予防用または治療用のワクチンとして用いるための、免疫原性の増強された組成物を提供する。本発明はまた、免疫原性と安全性が向上したワクチンを提供する。
【発明の具体的説明】
【００１１】
一つの実施形態では、本発明は、少なくとも１種類のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質および／またはリポタンパク質を含む免疫原組成物を産生する方法であって、該組成物に少なくとも１つのクロスβ構造を付与することを含む方法を提供する。クロスβ構造はタンパク質もしくはペプチドの一部、またはペプチドおよび／もしくはタンパク質の構築物の一部と定義され、規則的に並んだβ鎖群、一般にはβシート状に配置されたβ鎖群、特に積層され、層状となったβシート群を含む。積層されたβシートの一般形態は原繊維様の構造であり、βシートは原繊維の軸の方向または原繊維の軸の方向と垂直に積層されている。構造という用語はコンフォメーションという用語と互換的に使用できる。もちろん、ペプチドという用語はオリゴペプチドならびにポリペプチドを含むものとし、タンパク質という用語はグリコシル化などの翻訳後修飾を受けているタンパク質も受けていないタンパク質も含む。これにはリポタンパク質、ならびにタンパク質−核酸複合体（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）、膜−タンパク質複合体など、タンパク質を含む複合体も含まれる。
【００１２】
免疫原組成物、特に、特定の抗原（群）に対して特異的な免疫応答を惹起することを意図した免疫原組成物にクロスβ構造を付与するためには、単に、クロスβ構造を含む上記で定義されたタンパク質またはペプチドを該組成物に加えればよい。好ましくは、該クロスβ構造を含むタンパク質またはペプチドはそれ以外の点では不活性なペプチドまたはタンパク質である。不活性とは、宿主において望まない免疫応答または他の望まない生化学反応を、少なくとも許容されない程度には惹起しない、好ましくは、無視できる程度にしか惹起しないものと定義される。もちろん、クロスβ構造による望ましい機能は存在しなければならない。クロスβ構造を含むタンパク質またはペプチドは治療用であれ予防用であれ、感染性病原体そのものを弱毒化または死滅させたものであれ、サブユニットワクチンであれ、炭水化物またはＬＰＳワクチンであれ、その組合せであれ、どのワクチン種にも付加可能である。クロスβ構造は単一のタンパク質性化合物に存在してもよいし、あるいは数種のタンパク質性化合物により共有されている構造であってもよい。クロスβ構造は多くの異なる機構を介して誘導され得る。タンパク質および／またはポリペプチドに対する多種の変性過程がクロスβ構造の形成をもたらす。従って、このような変性過程は、多種のポリペプチドおよび／またはタンパク質におけるクロスβ構造の誘導に応用することができる。例としては、加熱、例えば塩、酸またはアルカリ性物質などの化学処理、圧力および他の物理的処理などがある。クロスβ構造の付加により、組成物に宿主における免疫原性を与えることができ、それはまた組成物中にすでに存在する免疫原性も増強し得る。クロスβ構造が付与されたタンパク質／ポリペプチド／ペプチドは、それ自体組成物に付加することができるが、クロスβ構造が付与されたタンパク質性物質を、感染性病原体および／または抗原の要素が結合される担体として用いるのも有用である。この結合は化学結合（直接的または間接的）を介して提供することもできるし、あるいは関連の抗原とクロスβ構造が付与されたタンパク質性物質を融合タンパク質として発現させることによって提供することもできる。両場合とも、この二者間にリンカーが存在し得る。両場合とも、抗原（または関連抗原の１以上のエピトープ）の二量体、三量体および／または多量体を、クロスβ構造が付与されたタンパク質性化合物と共役させればよい。しかしながら、それらと共役された関連のエピトープまたは抗原を含む通常の担体も使用可能である。クロスβ構造を含むタンパク質性物質を単に付加するだけで、このような複合体の免疫原性が増強される。このことは一般に多かれ少なかれ事実である。本発明の免疫原組成物は一般に、免疫原組成物（特にワクチン）の通常の構成要素のいくつかまたは全てを含み、クロスβ構造（コンフォメーション）を含むタンパク質性化合物が添加されている。
【００１３】
好ましい実施形態では、このクロスβ構造が付与されたポリペプチド／タンパク質はそれ自体ワクチン成分である（すなわち、免疫応答が望まれる感染性病原体または抗原に由来している）。
【００１４】
よって、さらなる実施形態では、本発明は、少なくとも１つのペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質および／またはリポタンパク質の少なくとも一部にクロスβ構造が誘導される、本発明の方法を提供する。
【００１５】
この実施形態では、所望の抗原および／もしくは抗原、またはその抗原に由来する１以上のエピトープの一部が、クロスβ構造が付与された化合物として使用される。前述のように、クロスβ構造は多くの方法で導入することができる。抗原にクロスβ構造を導入する好ましい方法は、加熱、冷凍、酸化、糖化、ペグ化、スルファテーション(sulphatation)、カオトロピック剤曝露（好ましくは、このカオトロピック剤は尿素または塩酸グアニジンである）、リン酸化、部分タンパク質分解、化学溶解（好ましくは、ＨＣｌまたは臭化シアノゲンによる）、音波処理、有機溶液、好ましくは、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールおよびトリフルオロ酢酸への溶解の１以上の処理、またはそれらの組合せによるものがある。
【００１６】
エピトープはそれ自体、小さすぎてクロスβ構造を含むことができない。前述のように、いくつかのエピトープが一緒になってクロスβ構造を形成してもよく、かつ／またはエピトープを、クロスβ構造を含む環境に置くこともできる（合成的、化学的または組換え的に）。このように、例えば感染性病原体に由来する２つのタンパク質性抗原を含むサブユニットワクチンでは、抗原の一方または他方または双方の一部にクロスβ構造を付与し、その抗原物質の残りの部分と一緒に回収し、これらの抗原を含む組成物の免疫原性を得る、または少なくとも向上させることができる。ここでもまた、担体、アジュバント、他の賦形剤などの免疫原組成物（特にワクチン）の通常の構成要素を付加することができる。担体がタンパク質性である場合には、この担体の少なくとも一部にもクロスβ構造を誘導するのが有利であり得る。このサブユニットワクチンの１以上の抗原成分を該担体と共役させてよい。ここでも、抗原成分は、単量体、二量体、head to tail型配置（間にスペーサーを含む、または含まない）、または他の多量体配置（「ツリー」型または「星」型などとして知られる）の多量体として存在し得る。本発明の方法により作出される免疫原組成物もまた本発明の一部である。本発明の抗原組成物は一般に、所望の既知抗原に対する既知のワクチンであり、これに少なくとも１種類のタンパク質性化合物が、そのワクチン中に存在する抗原材料の３０重量％までの量で付加される。好ましい実施形態では、このクロスβ構造が付加された化合物は、抗原材料に対して１０〜３０重量％で存在する。ワクチンで通常の担体に代えて本発明のクロスβ構造を含む材料を用いる場合には、元の担体とほぼ同じ重量比で用いればよい。クロスβ構造化合物を得るために関連抗原の一部を用いる場合には、抗原材料の総量を好ましくは、該クロスβ構造を持たないワクチンと少なくとも同じにすべきである。一般に、これは、抗原の総量（通常のもの＋クロスβ構造を含むもの）が、クロスβ構造を持たないワクチンより１０〜５０％、好ましくは５〜３０％多いということを意味する。クロスβ構造が付与された化合物として用いられる抗原のうち一般に少なくとも５０％が変性しており、より好ましくは、９０％を超えるものが変性している。各ワクチンの変性抗原と通常抗原の最適な組合せは簡単な用量漸増試験によって決定される。付加されたクロスβ構造を含む抗原の適正量を決定するには、５、１０、２０、３０、４０、５０重量％の変性抗原材料を含む範囲の抗原組成物を作出する。範囲を決定する際には、最良な用量間の範囲を求めることで微調整する。クロスβ構造の付与に不活性なタンパク質性材料を用いる場合にも同じことを行う。
【００１７】
本発明の抗原組成物の意図する使用は治療用または予防用のワクチンである。好ましい使用は、感染性病原体に対する予防である。ワクチン分野は古い技術分野である。当技術分野ならば既知のワクチンに本発明を十分適合させることができる。さらに、十分な有効性（保護）がないワクチン（例えば、サブユニットワクチン）も、本発明の方法および手段により増強することができる。
【００１８】
よって、さらなる実施形態では、本発明は、感染性疾患の予防用ワクチンの作製におけるクロスβ構造の使用、またはより好ましくは、感染性病原体に対する免疫応答を誘導するワクチンの作製における、該感染性病原体のタンパク質成分において誘導されるクロスβ構造の使用、特に、該タンパク質成分がウイルスまたは細菌タンパク質であり、該感染性病原体がウイルスまたは細菌である上記の使用を提供する。
【００１９】
もう１つの実施形態では、本発明は、少なくとも１種類のウイルスタンパク質を含み、該ウイルスタンパク質の少なくとも４〜５０％、好ましくは１０〜３０％がクロスβ構造を含むコンフォメーションである、サブユニットワクチンを提供する。
【００２０】
さらに別の実施形態では、本発明は、少なくとも１種類の細菌タンパク質を含み、該細菌タンパク質の少なくとも４〜５０％、好ましくは１０〜３０％がクロスβ構造を含むコンフォメーションである、サブユニットワクチンを提供する。
【００２１】
さらに別の実施形態では、本発明は、少なくとも２種類のウイルスタンパク質を含み、該ウイルスタンパク質の少なくとも１種類の４〜５０％、好ましくは１０〜３０％がクロスβ構造を含むコンフォメーションである、サブユニットワクチンを提供する。
【００２２】
さらに別の実施形態では、本発明は、少なくとも２種類の細菌タンパク質を含み、該細菌タンパク質の少なくとも１種類の４〜５０％、好ましくは１０〜３０％がクロスβ構造を含むコンフォメーションである、サブユニットワクチンを提供する。
【００２３】
さらなる実施形態では、本発明は、癌の予防および／または治療用の免疫原組成物の作製におけるクロスβ構造の使用を提供する。該免疫原組成物は好ましくは、腫瘍または転移の予防および／または治療用のワクチンである。ワクチンのタンパク質成分に誘導されるクロスβ構造は好ましくは、腫瘍または転移に対する免疫応答を誘導するために使用される。該タンパク質成分は好ましくは腫瘍抗原を含む。ゆえに、腫瘍抗原におけるクロスβ構造の誘導は、該腫瘍に対する免疫応答を惹起し得る免疫原組成物の作製に特に好適である。その代わりに、またはそれに加えて、該タンパク質成分はクロスβ構造を含む別の化合物と組み合わせる。該他の化合物は好ましくはアジュバントを含む。好ましくは、クロスβ構造の形成が誘導および／または増強されているオボアルブミンの作製に用いる。
【００２４】
１つの好ましい実施形態では、本発明の方法は、例えばウイルスなどの感染性病原体によって誘導される腫瘍に対する免疫原組成物の作製のために用いられる。最も好ましくは、クロスβ構造は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連腫瘍に対する免疫原組成物の作製に用いられる。好ましくは、クロスβ構造はＨＰＶ  Ｅ６タンパク質および／またはＨＰＶ  Ｅ７タンパク質において誘導および／または増強される。クロスβ構造の形成が誘導および／または増強されている、このようなＨＰＶ  Ｅ６タンパク質および／またはＨＰＶ  Ｅ７タンパク質は、ＨＰＶ関連腫瘍に対する免疫応答を惹起するのに特に好適である。その代わりに、またはそれに加えて、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質および／またはＨＰＶ  Ｅ７タンパク質を、クロスβ構造を含む別の化合物と組み合わせる。該他の化合物は好ましくはアジュバントを含む。好ましくは、クロスβ構造の形成が誘導および／または増強されているオボアルブミンの作製に用いる。
【００２５】
さらに別の実施形態では、本発明は、免疫弱化のための免疫原組成物の作製におけるクロスβ構造の使用を提供する。この実施形態では、クロスβ構造の形成は好ましくはＬＨＲＨにおいて誘導および／または増強される。その代わりに、またはそれに加えて、ＬＨＲＨを、クロスβ構造を含む別の化合物と組み合わせる。該他の化合物は好ましくはアジュバントを含む。
【００２６】
これとともに、アテローム性動脈硬化症、類澱粉症、自己免疫疾患、移植片対宿主病および／または移植拒絶の予防および／または治療用の免疫原組成物の作製におけるクロスβ構造の使用も提供される。該免疫原組成物は好ましくはワクチンを含む。クロスβ構造は好ましくは、前記疾病、好ましくは、アテローム性動脈硬化症、類澱粉症および／または自己免疫疾患の少なくとも１つに関与するタンパク質成分に対する免疫応答を誘導し得るワクチンのタンパク質成分において誘導され、ここで、該タンパク質成分は抗原であり、該疾病は該タンパク質成分の蓄積に関連するものである。さらに別の実施形態では、本発明は、他の異常の予防または治療において免疫応答を誘導するため、ならびに他のいずれかの部分または自己抗原、好ましくは限定されるものではないが、ニコチン、ハプテンおよび／またはＬＨＲＨに対する免疫応答を誘導するための、免疫原組成物、好ましくはワクチンの作製におけるクロスβ構造の使用を提供する。一つの実施形態では、クロスβ構造は、移植片対宿主病（ＧｖＨ）または移植拒絶に関与する成分に対する免疫応答を誘導し得るワクチンのタンパク質成分において誘導される。
【００２７】
さらに別の実施形態では、本発明は、細菌または寄生虫またはウイルス抗原を含み、該抗原が該抗原の少なくとも４〜５０％、好ましくは１０〜３０％の間をクロスβ構造コンフォメーションで含む、免疫原組成物を提供する。該抗原は好ましくは、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質、インフルエンザヘマグルチニンＨ５、インフルエンザヘマグルチニンＨ７、ペスチウイルスＥ２タンパク質、肝蛭(Fasciola hepatica)ＣＬ３タンパク質および／またはナイセリアＰｏｒＡタンパク質を含む。該免疫原組成物は好ましくはワクチンである。
【００２８】
これとともに、少なくとも１つのペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質および／またはリポタンパク質（該少なくとも１つのペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質および／またはリポタンパク質はＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、肝蛭ＣＬ３、インフルエンザＨ５、インフルエンザＨ７、ペスチウイルスＥ２タンパク質および／またはナイセリアＰｏｒＡタンパク質を含む）を含む免疫原組成物を作製するため、および／または該組成物の免疫原性を向上させるための、本発明の方法も提供される。
【００２９】
本発明によれば、タンパク質またはペプチドの免疫原性は、該タンパク質におけるクロスβ構造の形成の誘導および／または増強後に高まる。例えば該タンパク質は、自己タンパク質であるβ２糖タンパク質Ｉを含む。自己タンパク質の免疫原性の増大は、通常免疫系により抗原として容易に認識されない、このようなタンパク質に対する免疫応答の誘導に非常に有用である。このようなタンパク質の例としては、例えば、ＬＨＲＨ、Ｂ２糖タンパク質Ｉおよび腫瘍抗原がある。このようなタンパク質またはその抗原ペプチドにおけるクロスβ構造コンフォメーションの誘導および／または増強は、該タンパク質または抗原ペプチドを動物またはヒトに投与した際に（高い）免疫応答をもたらす。
【００３０】
一つの態様では、本発明は、β２糖タンパク質Ｉまたはその抗原ペプチドを含み、該タンパク質またはペプチドの少なくとも４〜６７％、好ましくは１０〜３３％の間をクロスβ構造コンフォメーションで含む、免疫原組成物を提供する。別の実施形態は、β２糖タンパク質Ｉまたはその抗原ペプチドを含み、該β２糖タンパク質Ｉまたはその抗原ペプチドが、別のタンパク質またはそのペプチドと共役または混合され、該別のタンパク質またはペプチドの少なくとも４〜６７％、好ましくは１０〜３３％の間をクロスβ構造コンフォメーションで含む、免疫原組成物を提供する。一つの実施形態では、β２糖タンパク質Ｉまたはその抗原ペプチドを含み、該β２糖タンパク質Ｉタンパク質またはペプチドの少なくとも４〜６７％、好ましくは１０〜３３％の間をクロスβ構造コンフォメーションで含み、該β２糖タンパク質Ｉまたは抗原ペプチドが、別のタンパク質またはペプチドと共役または混合され、該別のタンパク質またはペプチドの少なくとも４〜６７％、好ましくは１０〜３３％の間をクロスβ構造コンフォメーションで含む、免疫原組成物が提供される。このような免疫原組成物は好ましくはワクチンとして用いられる。１つの好ましい実施形態では、該免疫原組成物は自己免疫疾患の予防または治療に用いられる。
【００３１】
さらに別の実施形態では、本発明は、細菌もしくは寄生虫もしくはウイルスタンパク質またはその抗原ペプチドを含み、該タンパク質が該タンパク質またはペプチドの少なくとも４〜６７％、好ましくは１０〜３３％の間をクロスβ構造コンフォメーションで含む、免疫原組成物を提供する。これとともに、細菌もしくは寄生虫もしくはウイルスタンパク質またはその抗原ペプチドを含み、該タンパク質または抗原ペプチドは別のタンパク質またはそのペプチドと共役または混合され、該他のタンパク質またはペプチドの少なくとも４〜６７％、好ましくは１０〜３３％の間をクロスβ構造コンフォメーションで含む、免疫原組成物も提供される。１つの好ましい実施形態は、細菌もしくは寄生虫もしくはウイルスタンパク質またはその抗原ペプチドを含み、該タンパク質が該タンパク質またはペプチドの少なくとも４〜６７％、好ましくは１０〜３３％の間をクロスβ構造コンフォメーションで含み、該タンパク質または抗原ペプチドが別のタンパク質またはペプチドと共役または混合され、該他のタンパク質またはペプチドの少なくとも４〜６７％、好ましくは１０〜３３％の間をクロスβ構造コンフォメーションで含む、免疫原組成物を提供する。前記免疫原組成物は好ましくはワクチンを含む。該別のタンパク質は好ましくはＯＶＡもしくはＫＬＨまたは双方の組合せを含むが、これはこれらの化合物が特によく免疫原性を増強し得るからである。よって、本発明はさらに、該別のタンパク質がＯＶＡもしくはＫＬＨまたは双方の組合せを含む、本発明の免疫原組成物および／またはワクチンを提供する。
【００３２】
これとともに、アジュバントをさらに含む本発明の免疫原組成物またはワクチンも提供される。アジュバントはさらに免疫原性を増強する。
【００３３】
本発明のワクチンは、１以上の感染性病原体に由来するタンパク質を含むものであれ、１以上の病原体に由来するエピトープ（または１以上の病原体に由来するエピトープとタンパク質の組合せ）を含むものであれ、所望により他の抗原化合物（多糖類、脂質、ＬＰＳ、ＤＮＡ、オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＯＤＮ−ＣｐＧ）または１以上の病原体に由来するタンパク質を含む複合体を含むものであれ、既知のあらゆる種のサブユニットワクチンを含むのは明らかである。本発明のワクチンは、限定されるものではないが、ウイルス、細菌、真菌、酵母または寄生虫により引き起こされる感染の予防のためのワクチンを含むあらゆる種のワクチンを含むのは明らかである。
【００３４】
本発明は、一つの実施形態において、所望の免疫原性を有し、本質的に非免疫原性である組成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、免疫原性が向上または増強された既知の免疫原組成物を提供する。
【００３５】
よって、さらなる実施形態では、本発明は、少なくとも１つのペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質および／またはリポタンパク質を含む組成物の免疫原性を向上させる方法であって、該ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質および／またはリポタンパク質の少なくとも１つをクロスβ構造誘導剤と接触させ、それにより該組成物に付加的なクロスβ構造を付与することを含む方法を提供する。
【００３６】
特に、本発明は、既知のワクチンの免疫原性を向上させることをねらいとする。よって、さらなる実施形態では、本発明は、少なくとも１つのペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質および／またはリポタンパク質を含むワクチン組成物の免疫原性を増強する方法であって、少なくとも１つのペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質および／またはリポタンパク質をクロスβ構造誘導剤と接触させ、それにより該ワクチン組成物に付加的なクロスβ構造を付与することを含む方法を提供する。ワクチン組成物が、該組成物に付加的なクロスβ構造を付与することにより免疫原性が向上され得るかどうかを判定するには、すでにそこに存在しているクロスβ構造の量を本明細書に開示されるような手段、特に、コンゴレッドまたはチオフラビンＴ染色などのクロスβ構造結合化合物と結合させることにより測定する。好ましい方法では、このクロスβ構造の量は、表１〜３に挙げられているようなクロスβ構造結合化合物、好ましくは、ｔＰＡまたは因子ＸＩＩを結合させ、それ自体公知の方法で結合したクロスβ構造の量を検出し、さらなるクロスβ構造の付加が免疫応答を向上させるかどうかを判定することにより測定される。
【００３７】
よって、本発明はさらに、ワクチン組成物におけるクロスβ構造の量を測定する方法であって、該ワクチン組成物を少なくとも１種類のクロスβ構造結合化合物と接触させ、結合したクロスβ構造の量をそのワクチン組成物に存在するクロスβ構造の量と連関させることを含む方法を提供する。
【００３８】
以下、本発明を次の実験の節でさらに詳しく説明する。
【実施例】
【００３９】
実施例１〜５
実験手順
プラスミノーゲン活性化アッセイ、因子ＸＩＩ活性化アッセイおよび因子ＸＩＩ／プレカリクレイン活性化アッセイ
プラスミン（ＰＩｍ）活性は記載１のようにアッセイした。刺激能を調べたペプチドおよびタンパク質は、特に断りのない限り、１００μｇ  ｍｌ−１で用いた。組織型プラスミノーゲンアクチベーター(tPA, Actilyse, Boehringer-Ingelheim)およびプラスミノーゲン（Ｐｌｇ，リシンアフィニティークロマトグラフィーによりヒト血漿から精製(purified form human plasma by lysine-affinity chromatography)）をそれぞれ４００ｐＭおよび１．１または０．２２μＭの濃度で用いた。発色基質Ｓ−２２５１(Chromogenix, Instrumentation Laboratory SpA,ミラノ,イタリア)を用いてＰｌｓ活性を測定した。アジュバントのｔＰＡ活性化特性を測定するため、１６００ｐＭ  ｔＰＡおよび０．２２μＭ  Ｐｌｇを次のアジュバント：５μｇ／ｍｌデキストラン硫酸ＭＷ＝５００ｋＤａ（ＤＸＳ５００ｋ， Pharmacia,スウェーデン）、２０倍希釈したフロイントの完全アジュバント(CFA, DIFCO, Brunswig, #0368-60)、２．１μｇ／ｍｌ  ＣｐＧ（Coley Pharmaceutical Group, MA, USA)、１％ｖ／ｖミョウバン懸濁液(Imject, Pierce, Rockford, IL, USA)を、０．５％ｖ／ｖのプールしたクエン酸化ヒト血漿、または１００μｇ／ｍｌジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDA, Sigma, D2779)懸濁液とともに混合した。濃度はアッセイに用いた最終のアジュバント濃度である。
【００４０】
チモーゲン因子ＸＩＩ(#233490, Calbiochem, EMD Biosciences, Inc.,サンディエゴ，カナダ)の、タンパク質分解上活性な因子ＸＩＩ（因子ＸＩＩａ）への変換を、プレカリクレインの因子ＸＩＩａ切断によって形成されたカリクレインによる発色基質Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ−ＰＫ(Roche Diagnostics,アルメア,オランダ)の変換を測定することによって間接的にアッセイした。Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ−ＰＫは０．３ｍＭの濃度で用いた。因子ＸＩＩ、ヒト血漿由来プレカリクレイン(#529583, Calbiochem)および反応の補因子であるヒト血漿由来高分子量キニノゲン(#422686, Calbiochem)を１μｇ  ｍｌ−１の濃度で用いた。アッセイバッファーはＨＢＳ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ  ＫＣｌ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２、５μＭ  ＺｎＣｌ２、０．１％ｍ／ｖ  ＢＳＡ(A7906, Sigma,セントルイス, MO, USA)）を含んだ。アッセイはマイクロタイタープレート(#2595, Costar, Cambridge, MA, USAまたはExiqon peptide/protein Immobilizer, Vadbaek, Denmark)を用いて行った。ペプチドおよびタンパク質の、因子ＸＩＩを活性化する能力を調べた。因子ＸＩＩの確立されたアクチベーターであるカオリン１５０μｇ  ｍｌ−１を陽性対照として用い、溶媒（Ｈ２Ｏ）を陰性対照として用いた。Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ−ＰＫの変換動態を３７℃で記録した。対照ウェルでは、アッセイ溶液から因子ＸＩＩを除いた。
【００４１】
あるいは、因子ＸＩＩの活性化を、発色基質Ｓ−２２２２(Chromogenix)を用いて直接測定した。血漿中の因子の活性化は、潜在的補因子を含む、または含まない、基質とＨ２Ｏで希釈した６０％ｖ／ｖ血漿を用いて測定した。精製因子ＸＩＩの自己活性化は、５３μｇ  ｍｌ−１の精製因子ＸＩＩを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーｐＨ７．５中、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．００１％ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００とともに、またはＳ−２２２２およびＨ２Ｏとともに、または潜在的補因子を含む、または含まずにインキュベートすることにより測定した。
【００４２】
ｔＰＡとクロスβ構造コンフォメーションを含むタンパク質凝集物との結合
ｔＰＡとアミロイド様凝集物との結合は、ＥＬＩＳＡで測定した。クロスβ構造コンフォメーションとの凝集物をExiqon (Vadbaek,デンマーク)、Nunc (amino strips,カタログ番号#076901)、Immobilizer plateまたはGreiner microlon high-binding plate (Greiner Bio-One,オランダ)に固定した。ｔＰＡの結合は、モノクローナル抗体３７４ｂ(American Diagnostica, Tebu-Bio,オランダ)で検出した。Ｎ末端Ｆ−ＥＧＦ様ドメイン−ｋｒｉｎｇｌｅ  １ドメインを欠いたｔＰＡ類似体、Ｋ２Ｐ−ｔＰＡ（Reteplase, Boehringer-Ingelheim,ドイツ)を対照として用いた。ｔＰＡおよびＫ２Ｐ−ｔＰＡの結合を、ｔＰＡ  ｋｒｉｎｇｌｅ２ドメインと溶媒に曝されているリシン残基との結合を無効にするリシン類似体、ε−アミノカプロン酸（εＡＣＡ）１０ｍＭの存在下で試験した。
【００４３】
アミロイド様凝集物および対照ペプチド溶液の調製
ヒトγ−グロブリンの調製物は次のように作製した。凍結乾燥γ−グロブリン（Ｇ４３８６, Sigma- Aldrich）を、１（：）１容量比の１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールおよびトリフルオロ酢酸に溶かした後、通気下で乾燥させる。乾燥γ−グロブリンをＨ２Ｏに溶かし終濃度１ｍｇ  ｍｌ−１とし、少なくとも３日間室温で維持した。アリコートを−２０℃で保存した。
【００４４】
アミロイド様の特性を有する他のペプチドバッチは次のように調製した。使用ペプチドはヒトＡβ（１−４０）オランダ型（ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＱＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ）、トランスチレチンのアミロイド断片（ＴＴＲ１１，ＹＴＩＡＡＬＬＳＰＹＳ）、ラミニンα１鎖（２０９７−２１０８）アミロイドコアペプチド（ＬＡＭ１２，ＡＡＳＩＫＶＡＶＳＡＤＲ）、マウス非アミロイド形成ＩＡＰＰ（２０−２９）コア（ｍＩＡＰＰ，ＳＮＮＬＧＰＶＬＰＰ）、ヒトフィブリンα鎖の非アミロイド断片ＦＰ１０（１４８−１５７）（ＫＲＬＥＶＤＩＤＩＫ）１およびＬｙｓｌ５７Ａｌａ突然変異を有するヒトフィブリンα鎖（１４８−１６０）アミロイド断片（ＦＰ１３，ＫＲＬＥＶＤＩＤＩＡＩＲＳ）（ＢＢ，非公開およびＬ２）であった。Ａβ、ＩＡＰＰ、ＦＰ１３およびＬＡＭ１２を１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−イソプロピルアルコールとトリフルオロ酢酸の１：１（ｖ／ｖ）混合物中で解離させ、風乾し、Ｈ２Ｏに溶かした（Ａβ、ＬＡＰＰ、ＬＡＭ１２：１０ｍｇ  ｍｌ−１、ＦＰ１３：１ｍｇ  ｍｌ−１）。３７℃で３日後、ペプチドを室温で２週間維持し、その後、４℃で保存した。ＥＬＩＳＡプレートに固定する前に、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−イソプロピルアルコールおよびトリフルオロ酢酸に新しく溶かしたＡβ（１０ｍｇ  ｍｌ−１）をＨ２Ｏで希釈した。ＴＴＲ１１（１５ｍｇ  ｍｌ−１）を水中１０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルｐＨ２（ＨＣｌ）に溶かし、３日間３７℃で維持した後、室温で２週間維持した。ｍＩＡＰＰおよびＦＰ１０をＨ２Ｏに１ｍｇ  ｍｌ−１の濃度で溶かし、４℃で保存した。ペプチド溶液のアミロイドコンフォメーションの存在を、チオフラビンＴ−(ThT, #T3516, Sigma-Aldrich,セントルイス, MO, USA)またはコンゴレッド蛍光により記載３−５のようにして調べた。コンゴレッドはAldrich Chemical Company(#86,095-6,ミルウォーキー, WI, USA)から入手した。
【００４５】
チオフラビンＴの蛍光
ＴｈＴ、すなわち、アミロイド様タンパク質／ペプチド付加物の蛍光を次のように測定した。２５μｇ  ｍｌ−１のタンパク質またはペプチド調製物の溶液を、２５μＭ  ＴｈＴを含む５０ｍＭグリシンバッファーｐＨ９．０で作製した。蛍光は４３５ｎｍで励起させ、４８５ｎｍで測定した。バッファー、ＴｈＴを含むバッファーおよびＴｈＴを含まないタンパク質／ペプチド溶液からのバックグラウンドシグナルを、ＴｈＴとともにインキュベートしたタンパク質溶液を用いた、対応する測定値から差し引いた。一様に、Ａβの蛍光を陽性対照として用い、非アミロイドフィブリン断片１、ＦＰ１０とバッファーの蛍光を陰性対照として用いた。蛍光は、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｆ−４５００蛍光分光光度計（日立株式会社，東京，日本）で３回測定した。
【００４６】
アジュバントのＴｈＴ蛍光誘導能を測定するため、８０倍または２０倍希釈のヒト血漿をアジュバントとともにインキュベートした後、４０倍希釈し、その後、ＴｈＴ蛍光を測定した。希釈した血漿およびアジュバントを室温で３０分間インキュベートした後、ＴｈＴアッセイバッファーで希釈した。ＤＥＡＥ−デキストラン(Pharmacia, 17-0350-01)を５μｇ  ｍｌ−１で用い、ＤＸＳ５００ｋを５μｇ  ｍｌ−１で用い、ＤＤＡを１μｇ  ｍｌ−１で用いた。スペコール(7925000, ID-DLO,オランダ)を４０倍または１０倍希釈した血漿にて５：４比で希釈した。ＣＦＡ、フロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）およびミョウバン懸濁液は、４０倍または１０倍希釈の血漿とともに１：１比で用いた。ＣｐＧは１１μｇ  ｍｌ−１の濃度で用いた。８０倍希釈の血漿を用いた実験には、希釈血漿をミョウバン以外の総てのアジュバントと混合する際にボルテックス工程を含めた。ミョウバンは３０分間ローラーバンク上で回転させることにより血漿と混合した。２０倍希釈血漿を用いる場合は、希釈血漿をＤＸＳ５００ｋ、ＤＥＡＥ−デキストラン、ＤＤＡおよびＣｐＧとともに旋回させることにより混合するが、ＣＦＡ、ＩＦＡ、スペコールまたはミョウバンを用いる場合は、血漿とジュバントを２０秒間ボルテックスにかけることにより混合した。次に、１０．７、２１．４および４２．８μｇ  ｍｌ−１濃度のＣｐＧをローラーバンクにて室温で３０分間または４℃でｏ／ｎ、１ｍｇ  ｍｌ−１リゾチームまたはエンドスタチンとともにインキュベートした。ＴｈＴ蛍光の増強は上記と同様に測定した。
【００４７】
あるいは、２１．４μｇ  ｍｌ−１のＣｐＧを１ｍｇ  ｍｌ−１のニワトリ卵白リゾチーム(Fluka, #62971)、ウシ血清アルブミン(ICN, #160069,フラクションＶ)、組換えヒトコラーゲンＸＶＴＩＩＩ断片エンドスタチン(Entremed, Inc, Rockville, MD)、ヒトγ−グロブリン、血漿ヒトβ２−糖タンパク質Ｉ（下記参照）および組換えヒトβ２−糖タンパク質Ｉ（下記参照）と混合し、ローラーにて４℃ｏ／ｎでインキュベートした後、ＴｈＴ蛍光を測定した。この目的で、使用前に２ｍｇ  ｍｌ−１のタンパク質溶液を１００，０００＊ｇで１時間超遠心した後、４２．９μｇ  ｍｌ−１  ＣｐＧを含むバッファーで１：１希釈した。ＣｐＧ、ＣｐＧとリゾチーム、リゾチームのサンプルの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像も採取した。さらに、リゾチームを２５０μｇ  ｍｌ−１  ＤＸＳ５００ｋとともにインキュベートし、リゾチームとＤＸＳ５００ｋ、およびＤＸＳ５００ｋ単独でＴＥＭ画像を記録した。
【００４８】
β２−糖タンパク質ＩによるｔＰＡの活性化、因子ＸＩＩおよびｔＰＡとβ２−糖タンパク質ＩおよびＴｈＴとの結合、ならびにβ２−糖タンパク質ＩのＴＥＭ分析
β２−糖タンパク質Ｉ（β２ＧＰＩ）の精製は確立された方法６−７に従って行った。組換えヒトβ２ＧＰＩ記載６のように昆虫細胞を用いて作製し、精製した。因子ＸＩＩ  ＥＬＩＳＡ、Ｐｌｇ活性化アッセイおよび抗リン脂質症候群抗体ＥＬＩＳＡ（下記参照）に用いる血漿由来β２ＧＰＩは、記載７のように新鮮なヒト血漿から精製した。あるいは、β２ＧＰＩは、新鮮なヒト血漿または冷凍血漿のいずれかから抗β２ＧＰＩ抗体アフィニティーカラム８を用いて精製した。
【００４９】
β２ＧＰＩ調製物によるｔＰＡ(Actilyse, Boehringer-Ingelheim)の活性化は、Ｐｌｇ活性化アッセイ（上記参照）で試験した。このＰｌｇ活性化アッセイでは、１００μｇ  ｍｌ−１の血漿β２ＧＰＩまたは組換えβ２ＧＰＩの刺激活性を調べ、ペプチドＦＰ１３１刺激活性と比較した。
【００５０】
血漿由来のヒト因子ＸＩＩ(Calbiochem)または組換えヒトｔＰＡとヒト血漿から精製されたβ２ＧＰＩまたは組換えヒトβ２ＧＰＩとの結合をＥＬＩＳＡで試験した。ＰＢＳ中、１０μｇの因子ＸＩＩまたはｔＰＡをＣｏｓｔａｒ  ２５９５  ＥＬＩＳＡプレートのウェルにコーティングし、一連の濃度のβ２ＧＰＩを重層した。β２ＧＰＩの結合は、モノクローナル抗体２Ｂ２８を用いて評価した。因子ＸＩＩとβ２ＧＰＩとの結合はまた、免疫ブロット法を用いて調べた。新鮮な血漿または冷凍血漿のいずれかから精製したβ２ＧＰＩ（３３μｇ）を７．５％ポリアクリルアミドゲル上にのせた。ニトロセルロース膜(Schleicher & Schuell)にブロットした後、そのブロットを１０００倍希釈したウサギポリクローナル抗ヒト因子ＸＩＩ抗体(#233504, Calbiochem)とともにインキュベートし、その後、３０００倍希釈したペルオキシダーゼ結合ブタ抗ウサギ免疫グロブリン(SWARPO, #P0217, DAKO,デンマーク)で洗浄した。β２ＧＰＩのＴｈＴ蛍光は次のように測定した。ヒト血漿から精製したβ２ＧＰＩ（終濃度４００μｇ  ｍｌ−１）を、２５ｍＭ  
【００５１】
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３中、１００μＭカルジオリピン小胞または２５０μｇ  ｍｌ−１のアジュバントＤＸＳ５００ｋとともに、または伴わずにインキュベートした。このＴｈＴ蛍光アッセイでは、バッファー中β２ＧＰＩの蛍光、バッファー中カルジオリピンまたはＤＸＳ５００ｋの蛍光、バッファーおよびＴｈＴ単独の蛍光、ならびにβ２ＧＰＩ−カルジオリピン付加物およびβ２ＧＰＩ−ＤＸＳ５００ｋ付加物の蛍光を上記（ＴｈＴの蛍光の節）のように記録した。さらに、カルジオリピン、ヒト血漿由来のβ２ＧＰＩを含む場合、カルジオリピンを含む場合または含まない場合、組換えβ２ＧＰＩを含む場合の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を記載３のように記録した。
【００５２】
抗リン脂質抗体症候群自己免疫患者由来の抗β２ＧＰＩ自己抗体と固定化β２ＧＰＩとの結合の、組換えβ２ＧＰＩにより干渉され、血漿由来β２ＧＰＩによっては干渉されない
血漿由来β２ＧＰＩを親水性ＥＬＩＳＡプレートにコーティングすると、抗リン脂質抗体症候群自己免疫患者の血漿から単離された抗β２ＧＰＩ自己抗体が結合できる９。コーティングされたβ２ＧＰＩの、血漿β２ＧＰＩまたは組換えβ２ＧＰＩｓを伴った抗体との同時インキュベーションの影響を調べるため、患者の抗体に一連の濃度のβ２ＧＰＩを加えた。次に、これらの抗体とコーティングすされたβ２ＧＰＩとの結合を調べた。
【００５３】
アジュバント曝露後のタンパク質構造の分析
凍結乾燥タンパク質をＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４  ｍＭ  ＫＣｌ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に溶かし、終濃度２ｍｇ  ｍｌー１とした。タンパク質を室温で１０分間、３７℃で１０分間、再び室温で１０分間、ローラーにて穏やかに溶解させた。カオリン(6564, Genfarma,Zaandam,オランダ)懸濁液および５００μｇｍｌ−１のＤＸＳ５００ｋ保存溶液をＨＢＳで調製した。アルブミン(ICN, 160069)、リゾチーム(ICN, 100831)、γ−グロブリン(G4386, Sigma-Aldrich, Zwijndrecht,オランダ)、エンドスタチン(EntreMed, Inc., Rockville, MD)および因子ＸＩＩ(Calbiochem, 233490)をＨＢＳ単独またはカオリンもしくはＤＸＳ５００ｋを含むＨＢＳで１：１希釈した。
【００５４】
使用前に、プールしたヒトクエン酸化血漿をＨＢＳで４０倍希釈し、推定総タンパク質濃度２ｍｇ  ｍｌ−１とし、その後、バッファーまたはアジュバント溶液／懸濁液で１：１希釈した。対照タンパク質サンプルおよびタンパク質−アジュバントサンプルをローラー上、４℃にて一晩インキュベートした。インキュベーション後、２５μｌのサンプルをＴｈＴ結合に関して分析した（上記参照）。バックグラウンドを差し引くためにバッファーまたはアジュバントの蛍光を記録した。アミロイド−β（１−４０）Ｅ２２Ｑを陽性対照として用いた。あるいは、対照タンパク質および可溶性アジュバントＤＸＳ５００ｋとインキュベートしたタンパク質をGreiner microlon high-binding ELISAプレートに固定した。ウェルをブロッキング試薬(Roche)でブロックした。糖化ヘモグロビン（Ｈｂ−ＡＧＥ）を、アミロイド様特性を有するタンパク質凝集物へのｔＰＡ結合に関する陽性対照として固定した。Ｈｂ−ＡＧＥは、ｉ）透過型電子顕微鏡下で繊維構造として見られ（示されていない）、ｉｉ）円偏光二色性分光偏光解析で判定されるように、β−シート二次構造の増加を示し（示されていない）、かつ、ｉｉｉ）コンゴレッド蛍光を増強する（示されていない）。１０ｍＭ  εＡＣＡの存在下、一連の濃度の全長ｔＰＡまたはＫ２Ｐ−ｔＰＡをサンプルに重層した。
【００５５】
リポ多糖曝露後のリゾチーム構造のＴｈＴ蛍光分析
リポ多糖（ＬＰＳ）はリゾチームと結合し１０、ＬＰＳの生物活性を妨げることができ、ＬＰＳは因子ＸＩＩを活性化する１２。本発明者らは、アミロイド様構造の導入に伴うタンパク質のコンフォメーション変化によってリゾチームの結合が達成されるかどうかを調べた。この目的で、０、１０、２５、１００、２００、６００および１２００μｇ  ｍｌ−１のＬＰＳ（大腸菌(Escherichia coli)血清型０１１：Ｂ４，#L2630,ロット104K4109, Sigma-Aldrich）を、ＨＢＳ中、１ｍｇ  ｍｌ−１のリゾチーム（ＩＣＮ，１００８３１）とともに、ローラー上、４℃にて一晩または室温で３０分間インキュベートした。次に、ＴｈＴ蛍光増強能を、上記のように、４０倍希釈溶液を用いて測定した。
【００５６】
あるいは、ＣｐＧに関して上記したものと同様に、６００μｇ  ｍｌ−１のＬＰＳを１ｍｇ  ｍｌ−１のリゾチーム、アルブミン、エンドスタチン、γ−グロブリン、血漿β２−糖タンパク質Ｉ（β２ＧＰＩ）および組換えβ２−ＧＰＩと混合し、４℃でローラー上、ｏ／ｎにてインキュベートした後、ＴｈＴ蛍光を測定した。使用前に再び、２ｍｇ  ｍｌ−１のタンパク質溶液を１００，０００＊ｇで１時間超遠心分離した後、１２００μｇ  ｍｌー１のＬＰＳを含むバッファーで１：１希釈した。
【００５７】
ＬＰＳおよびクロスβ構造コンフォメーションを含むポリペプチドによるＵ９３７単球細胞の活性化
Ｕ９３７単球を６ウェルプレートで培養した。細胞をバッファー（陰性対照）、１μｇ  ｍｒー１  ＬＰＳ（陽性対照）、１００μｇ  ｍｌ−１アミロイドエンドスタチン１，３、２６０μｇ  ｍｌー１糖化ヘモグロビンおよび２６０μｇ  ｍｌー１対照ヘモグロビンで刺激した。刺激１時間後、細胞を氷上に置いた。洗浄後、ＲＮＡを単離し、分光光度測定により定量した。ノーマライズしたＲＮＡ量を、ヒトＴＮＦαプライマーを用いる２６サイクルのＲＴ−ＰＣＲおよびノーマライゼーション目的ではリボゾーム１８Ｓプライマーを用いる１８サイクルのＲＴ−ＰＣＲに用いた。ＤＮＡを２％アガロースゲル上で分析した。
【００５８】
アミロイド様オボアルブミン、ヒトグルカゴン、エタネルセプト(エタネルセプト)およびネズミ血清アルブミンの調製
アミロイドクロスβ構造コンフォメーションにより構造上変化したオボアルブミン（ＯＶＡ）を調製するため、精製ＯＶＡ(Sigma, A-7641,ロット071k7094)を８５℃に加熱した。６７ｍＭ  ＮａＰｉバッファーｐＨ７．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ中、１ｍｇ  ｍｌー１のＯＶＡをＰＴＣ−２００サーマルサイクラー(MJ Research, Inc., Waltham, MA, USA)にて、ＰＣＲカップ内で２サイクルの間加熱した。各サイクルでは、ＯＶＡを３０〜８５℃、５℃／分の速度で加熱した。天然型ＯＶＡ（ｎＯＶＡ）および熱変性型ＯＶＡ（ｄＯＶＡ）をＴｈＴ蛍光アッセイおよびＰｌｇ活性化アッセイで試験した。蛍光アッセイおよびＰｌｇ活性化アッセイでは、それぞれ２５および１００μｇ  ｍｌ−１のｎＯＶＡおよびｄＯＶＡを試験した。ｎＯＶＡおよびｄＯＶＡのＴＥＭ画像を採取し、大きな凝集物の有無を確認した。改変型ネズミ血清アルブミン（ＭＳＡ）は、還元およびアルキル化により得た。ＭＳＡ(#126674, Calbiochem)を８Ｍ尿素、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．２に終濃度１０ｍｇ  ｍｌ−１で溶解させた。ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を終濃度１０ｍＭまで加えた。空気をＮ２に置き換え、この溶液を室温で２時間インキュベートした。次に、この溶液を氷に移し、ヨードアセトアミドを１Ｍ保存液から終濃度２０ｍＭまで加えた。１５分氷上でインキュベートした後、還元されたアルキル化ＭＳＡ（アルキル−ＭＳＡ）を、Ｈ２Ｏを加えて１ｍｇ  ｍｌー１まで希釈した。アルキル−ＭＳＡは使用前にＨ２Ｏに対して透析した。天然型ＭＳＡ（ｎＭＳＡ）およびアルキル−ＭＳＡをＴｈＴ蛍光アッセイおよびＰｌｇ活性化アッセイで試験した。ＴｈＴ−蛍光アッセイでは、２５μｇ  ｍｌー１のｎＭＳＡおよびアルキル−ＭＳＡを試験し、Ｐｌｇ活性化アッセイでは、１００μｇ  ｍｌー１を試験した。凝集物または原繊維の有無はＴＥＭで分析した。
【００５９】
ヒトグルカゴン(Glucagen, #PW60126, Novo Nordisk,コペンハーゲン，デンマーク)のアミロイド様特性は次のように導入した。凍結乾燥した無菌グルカゴンを、１０ｍＭ  ＨＣｌを用い、Ｈ２Ｏ中、１ｍｇ  ｍｌー１で溶解させた。次に、この溶液を３７℃で２４時間、４℃で１４日間、さらに再び３７℃で９日間維持した。ＴｈＴ蛍光は上記のように測定し、新たに溶かしたグルカゴンと比較した。熱変性グルカゴンと新たに溶かしたグルカゴンの双方のｔＰＡ活性化特性を５０μｇ  ｍｌー１で試験した。大きな多量体構造の有無を評価するため、ＴＥＭ分析を行った。
【００６０】
オボアルブミンおよびアミロイド様オボアルブミンによるＢａｌｂ／ｃマウスの免疫化
８〜１０週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを２種類の免疫化法に従い、ＯＶＡで免疫化した(Central Animal Laboratories, UtrechtUniversity,オランダ)。免疫化前に免疫前血清を採取した。一方の方法では、５個体２群のマウスに連続３週間、１週間につき連続５日間、皮下注射を行った。用量は各注射につき１０μｇの天然型ＯＶＡまたは熱変性ＯＶＡからなった。あるいは、もう１つのプロトコールに従い、５個体３群のマウスにフロイントの完全アジュバントと１：１で混合した５μｇ  ｎＯＶＡ、５μｇ  ＯＶＡまたは５μｇ天然型ＯＶＡを含む用量で腹腔内注射を一度行った。毎週、採血を行った。３週間後、２回目の投与を行った。フロイントの完全アジュバントの代わりにフロイントの不完全アジュバントを用いた。免疫化開始から１週間後に採血した。血清の抗体力価を測定し、血清のクロスβ構造コンフォメーション特異的抗体の有無を分析した。この目的で、ｎＯＶＡを９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルにコーティングし、血清の希釈系とともにインキュベートした。分析前に、マウス５個体の群の血清をプールした。プレートを洗浄した後、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウス免疫グロブリン(RAMPO, P0260, DAKOCytomation, Glostrup,デンマーク)とともにインキュベートした。その後、プレートをテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質で現像した。反応はＨ２ＳＯ４で終わらせた。
【００６１】
結果例１〜５
結果例１
因子ＸＩＩは負電荷表面およびクロスβ構造コンフォメーションを有するペプチドにより活性化される
アミロイド様クロスβ構造コンフォメーションを有するタンパク質凝集物による因子ＸＩＩの活性化
因子ＸＩＩをカオリンおよびＤＸＳなどの人工的な負電荷表面と接触させるとその活性化が起こることが知られている。ここで、本発明者らは、プレカリクレインから、発色基質Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ−ＰＫを変換することができるカリクレインへの変化により測定されるように、クロスβ構造コンフォメーションを有するペプチド凝集物も因子ＸＩＩの活性化を刺激することを証明する（図１Ａ、Ｂ）。本発明者らはまた、クロスβ構造コンフォメーションを有するタンパク質凝集物の、因子ＸＩＩの自己活性化を誘導する能力も示す（図１Ｃ）。この目的で、精製因子ＸＩＩを基質Ｓ−２２２２およびバッファーまたは１μｇ  ｍｌー１  ＤＸＳ５００ｋ、１００μｇ  ｍｌ−１  ＦＰ１３  Ｋ１５７Ｇ、１０μｇ  ｍｌ−１  Ａβ（１−４０）Ｅ２２Ｑおよび１０μｇ  ｍｌー１  Ｈｂ−ＡＧＥのいずれかとともにインキュベートした。３種類のアミロイド様凝集物総てが因子ＸＩＩの自己活性化を誘導することができる。ＦＰ１３  Ｋ１５７ＧおよびＨｂ−ＡＧＥは、確立されている表面アクチベーターＤＸＳ５００ｋと同等の自己活性化誘導効力を持つが、Ａβ（１−４０）Ｅ２２Ｑの効力はいく分低い。
【００６２】
結果例２
アジュバントはタンパク質にアミロイド様特性を導入する
アジュバントは変性剤として働き、タンパク質にクロスβ構造コンフォメーションを誘導する
因子ＸＩＩおよびｔＰＡはアミロイド様クロスβ構造コンフォメーションを有するタンパク質またはペプチド凝集物と結合する１，３，１３および非公開結果Ｂ  Ｂｏｕｍａ／ＭＦＢＧ  Ｇｅｂｂｉｎｋ。さらに、クロスβ構造を含む凝集物との結合により、両セリンプロテアーゼの活性化が起こる（実施例１および１参照）。さらに、ＴｈＴとアミロイド様タンパク質コンフォメーションとの結合により、特異的な蛍光シグナルが生じる。また、クロスβ構造コンフォメーションを有するペプチドおよびタンパク質の凝集の最終的な結果として、原繊維質または非晶質の沈殿が形成し、これは透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で可視化することができる。よって、これらの方法を用い、タンパク質またはペプチドが予防接種法に用いられる種々のアジュバントに曝されるとアミロイド様特性が導入されるかどうかを判定した。
【００６３】
本発明者らは、アジュバントの機能および活性の少なくとも一部が、抗原か、またはアジュバントと接触する他のいずれかのタンパク質もしくはペプチドかのいずれかにおけるクロスβ構造コンフォメーションまたは他のいずれかのアミロイド様コンフォメーションを導入する能力にあるものとの仮説を持っている。あるいは、ペプチドまたはタンパク質に基づくアジュバントがそれ自体アミロイド様特性を有していてもよい。従って、このアミロイド様タンパク質コンフォメーションは免疫応答を誘導する免疫原因子である。
【００６４】
この仮説を検証するため、精製アルブミン、γ−グロブリン、リゾチーム、因子ＸＩＩ、エンドスタチンおよび希釈血漿をカオリンまたはＤＸＳ５００ｋ（この２種の化合物はＦＸＩＩを活性化する能力が既知であるが、アジュバントとしても用いられる）に曝した。次に、ＴｈＴ蛍光を測定した。因子ＸＩＩはＤＸ５００ｋのみに曝した。バックグラウンドシグナルを差し引いた後に、カオリンは１．６〜６．６倍のＴｈＴ蛍光シグナルの増強を誘導する。ＤＸＳ５００ｋはＴｈＴ蛍光を２．６倍（因子ＸＩＩ）〜１７．８倍（アルブミン）を増強する（図２Ａ）。ＥＬＩＳＡで、固定化対照タンパク質およびタンパク質とＤＸＳ５００ｋとの混合物に対するｔＰＡおよびＫ２Ｐ−ｔＰＡの結合を評価した（図２Ａ）。Ｋ２Ｐ−ｔＰＡはこれらのタンパク質またはＤＸＳ５００ｋ−タンパク質混合物のいずれとも結合しない（示されていない）。タンパク質または希釈血漿のＤＸＳ５００ｋ曝露は、ｔＰＡ結合を、バッファー単独でインキュベートした場合のｔＰＡとタンパク質との結合に比べ、１．３倍（アルブミン）〜１０．５倍（エンドスタチン）まで増強した。このＴｈＴ蛍光データおよびｔＰＡ結合データは、タンパク質の、アジュバントであるカオリンおよびＤＸＳ５００ｋに対する曝露がタンパク質におけるアミロイド様特性を誘導することを示す。
【００６５】
次に、因子ＸＩＩの活性化に対するアミロイド様クロスβ構造コンフォメーションの役割を評価した。この目的で、因子ＸＩＩの有効なアクチベーターであるアミロイドフィブリンペプチドＦＰ１３  Ｋ１５７Ｇ（図１Ｃ）を精製因子ＸＩＩとともに、活性化した因子ＸＩＩ基質Ｓ２２２２の存在下、ＴｈＴとともに、または伴わずにインキュベートした（図２Ｂ）。結果は、アミロイド様凝集物に確立された親和性を有する色素であるＴｈＴが、ＦＰ１３  Ｋ１５７Ｇの刺激活性を効果的に阻害することを示す（図２Ｂ）。これは因子ＸＩＩの活性化におけるクロスβ構造コンフォメーションの役割の直接的証拠となる。ずっと以前から、ガラス、カオリン、ＤＸＳ５００ｋ、外科用スチール、白金およびエラグ酸などの化合物の因子ＸＩＩ活性誘導能が知られている。現在では、因子ＸＩＩは負電荷を有するタンパク質の特異的相互作用により活性化されると見られている。種々のアミロイド様凝集物も因子ＸＩＩを活性化することができるという本発明者らの知見に基づき、本発明者らは、負電荷化合物が、負電荷表面に露出したタンパク質において形成されるクロスβ構造コンフォメーションを介して間接的に因子ＸＩＩを活性化するという仮説を立てた。よって、アジュバントをはじめとする因子ＸＩＩ活性化化合物は、アミロイド様特性の形成を伴ったタンパク質／ペプチド凝集を誘導する変性剤として働く。このこの仮説を検証するため、本発明者らは因子ＸＩＩがＤＸＳ５００ｋにより活性化されない、またはされにくいアッセイ条件を用いた（図２Ｃ）。これらの条件下で、因子ＸＩＩは８０倍希釈の血漿を加えることにより活性可能である。活性化はＴｈＴを導入することにより完全に阻害される。これらの知見は、その負電荷よりもむしろクロスβ構造コンフォメーションを含む変性（血漿）タンパク質が因子ＸＩＩの真のアクチベーターであることを示す。図２Ｄでは、本発明者らは、さらに別のアジュバントであるＣａ３（ＰＯ４）２が因子のアクチベーターであることを示す。アッセイで十分量の因子ＸＩＩを用いると、活性化にさならなるタンパク質を必要としない。本発明者らはまた、因子ＸＩＩはそれ自体、アジュバントに曝された際にアミロイド様コンフォメーションを獲得できることを確認した（図２Ａ）。よって、ここで、因子ＸＩＩの活性化は、負電荷面の表面において、変性したクロスβ構造を含み、おそらくは凝集した因子ＸＩＩが他の因子ＸＩＩ分子に対する活性化物質として働き得るという事実により説明することができる。本発明者らは、希釈血漿または高レベルの因子ＸＩＩの他、アルブミンおよびエンドスタチンが使用可能であることを見出した（図２Ｅ、Ｆ）。アルブミンまたはエンドスタチン単独でも、カオリンまたはＤＸＳ５００ｋ単独でも因子ＸＩＩの有効なアクチベーターとはならないが、アジュバントとタンパク質補因子の組合せは因子ＸＩＩ、次にプレカリクレイン活性を生じる。これらのことを考え合わせると、因子ＸＩＩの活性化は、（１）変性表面と、（２）提供された表面上で変性し得る十分量のタンパク質を必要とする。
【００６６】
本発明者らは次に、負電荷表面およびアジュバントがｔＰＡの活性化も誘導することができるかどうかを調べた。アジュバントＤＸＳ５００ｋ、ＣＦＡ、ＣｐＧ、ミョウバンおよびＤＤＡは総てｔＰＡのアクチベーターであることが分かった（図２Ｇ、Ｈ）。これらの試験条件下、すなわち、１６００ｐＭ  ｔＰＡ、０．２２μＭ  Ｐｌｇ、ミョウバン単独は、そのｔＰＡ活性化特性に付加的なタンパク質補因子（希釈血漿）を必要とする。同様に、他のアジュバントｔＰＡおよび／またはＰｌｇはそれ自体、アジュバント表面で部分的に変性し、それにより、アミロイドクロスβ構造コンフォメーションの形成を誘導し、その後、これがｔＰＡを活性化することができる。
【００６７】
また、ＩＦＡ、スペコールおよびＤＥＡＥ−デキストランを伴うアジュバントを、８０倍または２０倍希釈の血漿とともにインキュベートした際のＴｈＴ蛍光誘導能も分析した（それぞれ図２１および２Ｊ）。８０倍希釈の血漿の場合、ＣＦＡ、スペコール、ＤＸＳ５００ｋおよびＣｐＧが、クロスβ構造コンフォメーションを有するアミロイド様タンパク質凝集物の形成の指標となるＴｈＴ蛍光を誘導し、２０倍希釈血漿の場合では、ＣＦＡ、スペコール、ＤＸＳ５００ｋ、ＣｐＧ、ならびにＩＦＡがＴｈＴ蛍光を誘導する。さらに、１０．７、２１．４および４２．８μｇ  ｍｌー１のＣｐＧを１ｍｇ  ｍｌー１のリゾチームとともに一晩インキュベートすると、ＣｐＧの変性能力のさらなる指標となるＴｈＴ蛍光をそれぞれ１．１倍、１．２倍および１．４倍増強した（示されていない）。さらに、１０．４または２１．７μｇ  ｍｌー１のＣｐＧを１ｍｇ  ｍｌー１のリゾチームまたはエンドスタチンとともに室温で３０分間インキュベートすると、それぞれリゾチームについてはおよそ８〜７倍、エンドスタチンについては３９〜５６倍のＴｈＴ蛍光の増強が見られる（図２Ｋ、Ｌ）。また、１ｍｇ  ｍｌー１のアルブミン、エンドスタチン、血漿Ｂ２ＧＰＩまたはｒｅｃ．Ｂ２ＧＰＩから２１．４μｇ  ｍｌー１のＣｐＧは、ＴｈＴ蛍光をそれぞれ３倍、１０倍、２倍および５倍増強した（図２Ｍ）。これらのアッセイ条件では、リゾチームおよびγ−グロブリンには効果が見られない。ＣｐＧ、リゾチームおよびリゾチームとＣｐＧをＴＥＭで分析したところ（総て一晩インキュベーション後）、ＣｐＧ溶液中に小さな針状構造が存在し（図２Ｎ）、リゾチーム溶液には凝集物がいくつか存在する（図２Ｏ）ことが明らかになった。ＣｐＧとリゾチームを一緒にインキュベートした場合は、高密度の比較的厚い凝集物が見られ、これは球状沈降物のつながりからなるものと思われる（図２Ｐ）。ＤＸＳ５００ｋ針状構造に曝されたリゾチームでは、同様の球状凝集物の、はるかに大きなネットワークが多量に見られる（図２Ｑ、Ｒ）。このＣｐＧおよびＤＸＳ５００ｋ溶液中の針状構造はリゾチームに曝された後には消失した。
【００６８】
円偏光二色性分光偏光解析、フーリエ変換赤外分光法、透過型電子顕微鏡、クロスβ構造コンフォメーション結合化合物、タンパク質およびタンパク質断片との結合研究ならびにＸ線繊維回折研究によりさらに分析を行ったところ、アジュバントに曝されたタンパク質およびペプチドにおいて、クロスβ構造コンフォメーションを有するアミロイド様凝集物の存在についてさらなる情報を得ることができた。基本的に、確立されているアジュバントでも新たに発見されたアジュバントでも、クロスβ構造コンフォメーションを有する凝集物の形成を伴うその変性能に関して、またはアジュバントそれ自体におけるアミロイド様タンパク質コンフォメーションの存在に関してスクリーニングすることができる。野生型種またはトランスジェニック種での免疫試験、あるいは変性アジュバントと組み合わせた抗原を用いた、またはクロスβ構造コンフォメーションを含む変性した抗原を用いた細胞免疫アッセイを行うことで、アジュバントが、クロスβ構造コンフォメーションを伴った凝集物を誘導するそれらの能力により、免疫応答の誘導因子として働く可動が明らかになる。おそらくアジュバントは厳密には必要でなく、すなわち、クロスβ構造コンフォメーションを有する抗原はそれ自体免疫原性であり得る。この見解を検証するため、１）天然型抗原、２）クロスβ構造コンフォメーションを有する抗原、またはクロスβ構造コンフォメーションを誘導するか、もしくは含むアジュバントを伴う抗原、および３）ＣＦＡ、スペコール、ミョウバン、ＬＰＳまたはその誘導体およびＣｐＧなどの通常のアジュバントと組み合わせた天然型抗原との間で免疫の比較を行うことができる。マウスまたはin vitro細胞アッセイによる免疫試験は例えば、１）天然型ＯＶＡ、グルカゴン、アルブミンまたは血漿Ｂ２ＧＰＩ、２）熱変性ＯＶＡ、熱／酸変性グルカゴン、熱変性アルブミン、アルキル化アルブミン、組換え産生Ｂ２ＧＰＩ、ＤＸＳ５００ｋを伴う血漿Ｂ２ＧＰＩまたはカルジオリピン、および３）天然型ＯＶＡ、グルカゴン、アルブミンまたはβ２ＧＰＩを伴うＣＦＡを用いて行うことができる。これらの実験はまた、ＣｐＧ様アジュバント種の作用機序の理解にも寄与する。これらのアジュバントは、あまり理解されていない機構であるＴｏｌｌ様受容体９を介してそれらの免疫原活性を伝達する。ＣｐＧとＴＬＲ９の間の直接的な相互作用はこれまでに証明されていない。本発明者らの結果は、変性したタンパク質が必要であることが示唆する。このタンパク質は好ましくはＣｐＧにより変性される。ＣｐＧによる免疫原性の増強におけるクロスβ構造コンフォメーションの役割は現在、当業者ならば容易に試験することができる。このことが本当であれば、ＣｐＧの免疫増強は、クロスβ構造の形成阻害剤の存在下、またはクロスβ構造コンフォメーションと、免疫シグナルを伝達するその標的分子の１つとの相互作用の阻害剤により消失するはずである。このような阻害剤としては、ＴｈＴ、ｔＰＡまたはその等価物などのクロスβ構造結合化合物、関連のクロスβ構造コンフォメーションに対する抗体、または標的受容体に対する抗体であり得る。標的受容体は、ｔＰＡ、因子ＸＩＩ、フィブロネクチン、肝細胞増殖因子アクチベーター、ＣＤ１４、低密度リポタンパク質受容体様タンパク質、ＣＤ３６、スカベンジャー受容体Ａ、スカベンジャー受容体Ｂ、Ｔｏｌｌ様受容体および糖化の進んだ最終生成物の受容体など、クロスβ構造を含むタンパク質と結合する、または結合する可能性のある多リガンド受容体のいずれであってもよい。
【００６９】
結果例３
抗リン脂質抗体症候群患者において重要な抗原であるβ２−糖タンパク質Ｉの構造と抗原性との関係
抗リン脂質抗体症候群とコンフォメーションが変更されたβ２−糖タンパク質Ｉ
抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）は、抗β２−糖タンパク質Ｉ自己抗体の存在を特徴とする自己免疫疾患である。ＡＰＳの主要な２つの臨床的懸念として、自己抗体の血栓誘導傾向と胎児吸収のリスクがある。この自己免疫疾患の発症についてはほとんど分かっていない。最近の研究では、元々潜伏している自己抗体のエピトープが露出する前に、ＡＰＳの主要抗原であるβ２−糖タンパク質Ｉ（β２ＧＰＩ）のコンフォメーション変化が必要であることが実証された１４。天然型β２ＧＰＩとある種のＥＬＩＳＡプレートとの結合は、ＡＰＳ患者に明らかに存在する潜伏エピトープの露出を模倣する１４。抗β２ＧＰＩ自己抗体は溶液中の球状のβ２ＧＰＩとは結合しないが、β２ＧＰＩがある種のＥＬＩＳＡプレートに固定された場合にのみ結合することが示されている１４。球状（天然型）のタンパク質には免疫原性がなく、カルジオリピン、アポトーシス細胞または酸化による改変が加わる必要がある１５−１６。よって、自己抗体の生成は、β２ＧＰＩのコンフォメーション変化型により誘導され、このβ２ＧＰＩのコンフォメーション変化型に対して惹起されるものと思われる。これまでに、適応免疫応答の誘導には、他の作用の中でも抗原提示と樹状細胞によるサイトカイン放出を刺激する、いわゆる「危険」信号を必要とすることが提案されている１７。次の結果は、カルジオリピンが、危険信号として働くβ２ＧＰＩにおいてクロスβ構造コンフォメーションを誘導することを暗示している。同様に、他の負電荷リン脂質、またはリポソームもしくはアポトーシス細胞などの負電荷脂質を含む構造、またはクロスβ構造コンフォメーション誘導特性を有するＬＰＳ、ＣｐＧをはじめとするクロスβ構造コンフォメーションの他の誘導因子も、クロスβ構造コンフォメーションを誘導するということで少なくとも部分的に免疫原性であり得る。
【００７０】
因子ＸＩＩおよびｔＰＡは組換えβ２ＧＰＩおよび冷凍血漿から精製されたβ２ＧＰＩに結合するが、新鮮な血漿から精製されたβ２ＧＰＩには結合しない
組換えβ２ＧＰＩは、プラスミン特異的発色基質Ｓ−２２５１の変換として測定される、ｔＰＡにより媒介されるＰｌｇからプラスミンへの変換を刺激するが、新鮮な血漿から精製されたβ２ＧＰＩは刺激しない（図３Ａ）。ＥＬＩＳＡを用い、ｔＰＡおよび因子ＸＩＩは組換えβ２ＧＰＩと結合するが、新鮮なヒト血漿から精製されたβ２ＧＰＩとは結合しないことが示されている（図３Ｂ、Ｃ）。組換えβ２ＧＰＩは因子ＸＩＩとｋＤ  ２０ｎＭで結合し（図３Ｃ）、ｔＰＡとｋＤ  ５１ｎＭで結合する（図３Ｂ）。さらに、−２０℃で冷凍され、その後解凍された血漿から精製されたβ２ＧＰＩ、因子ＸＩＩは、そのブロットを抗因子ＸＩＩ抗体とともにインキュベーションした後のウエスタンブロットで示されるように、抗β２ＧＰＩ抗体アフィニティーカラムから同時に溶出する（図３Ｄ）。これは、β２ＧＰＩが、冷凍の際にクロスβ構造を含むコンフォメーションへとリフォールディングされたことを示唆する。図３Ｅでは、ＡＰＳ患者から単離された抗β２ＧＰＩ自己抗体の、固定化β２ＧＰＩへの結合に対する組換えβ２ＧＰＩの阻害効果を示す。溶液中の血漿由来β２ＧＰＩは固定化β２ＧＰＩに対する抗体結合にほとんど作用を持たないものと思われる。図３Ｆは、β２ＧＰＩがカルジオリピンまたはＤＸＳ５００ｋに曝されると、クロスβ構造コンフォメーションの形成を伴うβ２ＧＰＩのコンフォメーション変化の指標であるＴｈＴ蛍光シグナルの増強が誘導されることを示す。ここでも、組換えβ２ＧＰＩは、血漿から精製された天然型β２ＧＰＩよりも高いＴｈＴ蛍光シグナルを最初からすでに示していた。さらに、血漿β２ＧＰＩおよび組換えβ２ＧＰＩをアジュバント／変性剤ＬＰＳまたはＣｐＧに曝してもＴｈＴ蛍光の増強が誘導され、これは両アジュバントとも、血漿β２ＧＰＩの場合よりも組換えβ２ＧＰＩで大きい（図２Ｍおよび図４Ｃ）。これらのデータは、組換えβ２ＧＰＩがすでに血漿β２ＧＰＩよりも多くのクロスβ構造コンフォメーションを含んでいることを示すだけでなく、組換えβ２ＧＰＩが種々のアジュバントおよび表面、すなわち、カルジオリピン、ＤＸＳ５００ｋ、ＬＰＳおよびＣｐＧと接触した際により容易にこのコンフォメーションを適応させていることも示す。図３Ｇでは、β２ＧＰＩが、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに固定されたカルジオリピンに曝されると、β２ＧＰＩにｔＰＡ結合能を持たせることを示す。β２ＧＰＩがＥＬＩＳＡプレートに直接結合すると、ｔＰＡの結合は低下する。これらの知見はまた、カルジオリピンが変性作用を有し、それにより、ｔＰＡの結合に必要な、β２ＧＰＩにおけるアミロイド様コンフォメーションを誘導することを示す。これらの知見を、β２ＧＰＩがカルジオリピン小胞に曝されるとＴｈＴ結合能が誘導されたという知見（図３Ｆ）と考え合わせると、β２ＧＰＩが変性表面に曝されると、アミロイド様クロスβ構造コンフォメーションの形成が誘導されることを示す。
【００７１】
自己抗体のエピトープは、クロスβ構造コンフォメーションを含むβ２ＧＰＩの非天然型コンフォメーションに特異的に曝される
図３は、β２ＧＰＩ調製物はアミロイドクロスβ構造マーカーであるＴｈＴ、ｔＰＡおよび因子ＸＩＩと反応することを示す。さらに、β２ＧＰＩがカルジオリピンに曝されると、ｔＰＡ結合能が誘導される（図３Ｇ）。また、カルジオリピンと接触させた血漿β２ＧＰＩのＴＥＭ画像には大きな原繊維構造が見られる（図３Ｈ、画像２および３）。小さなカルジオリピン小胞が原繊維β２ＧＰＩに付着しているのが見られる。血漿β２ＧＰＩ単独（図３Ｈ、画像１）またはカルジオリピン単独（示されていない）の画像から、目に見える超構造は存在しないことが明らかになった。これに対し、組換えβ２ＧＰＩの画像では、非原繊維性の凝集物や比較的薄く、カールした原繊維が見られる（図３Ｈ、画像４）。これらの知見は、β２ＧＰＩがカルジオリピンに曝され、組換えβ２ＧＰＩが発現および精製されると、Ｘ線結晶学で見られた単量体構造１８に比べ、多量体構造の変化したβ２ＧＰＩが生じることを示す。クロスβ構造コンフォメーションを有するβ２ＧＰＩ調製物は、ＡＰＳ患者血漿から単離された抗β２ＧＰＩ自己抗体により認識されるエピトープを発現する。さらに、β２ＧＰＩがカルジオリピンまたはＤＸＳ５００ｋに曝されると、β２ＧＰＩが負電荷表面と接触した際のクロスβ構造コンフォメーションの形成の指標となるＴｈＴを加えた際に高い蛍光が誘導される。興味深いことに、β２ＧＰＩのカルジオリピン曝露は、免疫マウスの血清における抗β２ＧＰＩ抗体の検出の必須条件であるということがこれまでに観察されている。これらの知見を組み合わせると、新たな免疫部位を露出するのに必要な、天然型β２ＧＰＩのコンフォメーション変化の役割が指摘される。本発明者らの結果は、クロスβ構造要素がこのエピトープの一部であることを示す。本発明者らは、クロスβ構造コンフォメーションが、拡張されたβ２ＧＰＩ分子の５つのドメインのうち１以上により比較的容易に形成できると予想している１８。各ドメインは、クロスβ構造コンフォメーションへと局物的にリフォールディングするためのシードとして働き得る少なくとも１枚のβシートを含む。ここで当業者ならば、クロスβ構造コンフォメーションが抗β２ＧＰＩ抗体を惹起するのに不可欠であるという仮説を検証することができる。天然型β２ＧＰＩおよびクロスβ構造コンフォメーションを含む、または含まないコンフォメーションが変化したβ２ＧＰＩを用いた免疫研究を、クロスβ構造コンフォメーションの活性を阻害する、ＴｈＴ、ｔＰＡ、ＲＡＧＥ、ＣＤ３６、抗クロスβ構造抗体またはその機能的等価物をはじめとする化合物の存在下または不在下で行うことができる。あるいは、樹状細胞（ＤＣ）をはじめとする抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いたin vitro研究を行うことができる。コンフォメーションが変化したβ２ＧＰＩの供給源は組換えβ２ＧＰＩ、または例えば、プラスチックなどの変性面、カルジオリピン、ＤＸＳ５００ｋおよびおそらくは他のアジュバントに曝されたβ２ＧＰＩである。さらに、構造が変化したβ２ＧＰＩは、例えば、加熱、ｐＨ変化、還元−アルキル化などの他のいずれかの化学的または物理的処置で得ることができる。当業者ならば、自己免疫におけるクロスβ構造コンフォメーションの役割のさらなる���拠を得るために、in vitro細胞アッセイおよびin vivoマウスモデルを計画および実施することができる（下記参照）。クロスβ構造要素が免疫応答の惹起または抗体の結合に不可欠なものかどうかを確認するために、抗体結合と競合し得るか、または免疫応答を妨げ得るクロスβ構造結合化合物を用いて阻害研究を行うことができる。本発明者らの知見は、クロスβ構造コンフォメーションが適応免疫応答の誘導に不可欠であることを示す。クロスβ構造コンフォメーションはまた、自己免疫抗体により認識されるエピトープの一部でもあり得る。本発明者らの研究に基づけば、自己抗体が関連する他の疾病および合併症も、クロスβ構造コンフォメーションを含むタンパク質により媒介されているのではないかと予測される。抗リン脂質抗体症候群の他、このような症状としては、限定されるものではないが、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病、赤血球形成不全症および因子ＶＩＩＩで処置された血友病患者における阻害抗体の形成が挙げられる。ここで当業者ならば、抗因子ＶＩＩＩ自己抗体を有する血友病患者を、クロスβ構造コンフォメーションを認識する血漿中の抗体の存在に関してスクリーニングすることができる。さらに詳細に分析すると、推定クロスβ構造結合抗体が抗原のクロスβ構造コンフォメーションと特異的に（部分的に）結合するかどうか、またはこれらの抗体が無関連のタンパク質中に存在するクロスβ構造コンフォメーションと特異的に結合するかどうかが明らかになる。
【００７２】
結果例４
培養Ｕ９３７単球を、クロスβ構造コンフォメーションを含むタンパク質とともにインキュベーションすると、組織壊死因子−α  ｍＲＮＡレベルのアップレギュレーションがもたらされ、ＬＰＳはリゾチームにおいてアミロイド様構造の形成を誘導する
クロスβ構造豊富な化合物は単球においてＴＮＦα  ＲＮＡの発現を誘導する
Ｕ９３７単球をＬＰＳまたはクロスβ構造豊富なアミロイドエンドスタチンまたはＨｂ−ＡＧＥを曝した後、単離されたＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲの後にＴＮＦα  ＤＮＡを得る（図４Ａ）。対照ヘモグロビンはＴＮＦα  ＲＮＡのアップレギュレーションをある程度誘導するが、アミロイドエンドスタチンまたは糖化Ｈｂ刺激の後に得られた値のおよそ３０％を超えることはない。単球ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲの後に得られたＴＮＦα  ＤＮＡの量を、対応するサンプル中に存在するリボゾーム１８Ｓ  ＤＮＡの量に対してノーマライズする。
【００７３】
ＬＰＳは変性剤として働き、クロスβ構造コンフォメーションを誘導する
１ｍｇ  ｍｌー１のリゾチームを溶液中、１０、２５、１００、２００、６００および１２００μｇ  ｍｌー１のＬＰＳに曝した後、クロスβ構造を有するアミロイド様コンフォメーションの形成の指標となるＴｈＴ蛍光は、バッファー単独でインキュベートしたリゾチームに比べて、それぞれ１．１倍、１．３倍、１．６倍、２．３倍、５．７倍および１３．１倍増強される（図４Ｂ）。リゾチームおよびエンドスタチンを２００、４００および６００μｇ  ｍｌ−１のＬＰＳに曝すと、ＴｈＴ蛍光はそれぞれおよそ５倍、１１倍および１８倍、そして８倍、２０倍および２６倍増強される（図２Ｋ、Ｌ）。あるいは、ＣｐＧで観察されたもの（図２Ｍ）と同様に、１ｍｇ  ｍｌー１のリゾチーム、アルブミン、γ−グロブリン、エンドスタチン、血漿β２ＧＰＩまたは組換えβ２ＧＰＩを６００μｇ  ｍｌ−１のＬＰＳに曝すと、ＴｈＴ蛍光はそれぞれおよそ１０倍、３倍、２倍、１０倍、２倍および４倍増強される（図４Ｃ）。さらなるＴＥＭ画像は、ＬＰＳに曝されたタンパク質がアミロイド様原繊維へと、または他の目に見える凝集物へとそれらのコンフォメーションを再配列したかどうかに着目することができる。このＴｈＴ蛍光増強データは、ＬＰＳが最初は球形のタンパク質をアミロイド様ポリペプチドへと変換する変性剤として働くことを示す。これまでに、リゾチームは精製ＬＰＳにも、細菌細胞壁をＬＰＳとともに含み、タンパク質の構造変化を伴ったフロイントの完全アジュバントにも結合できることがすでに実証されている。さらに、ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＣｏｃｈｒａｎｅ１２は、ＬＰＳが因子ＸＩＩを強く活性化できることを示し、これがＬＰＳはタンパク質変性剤として働くという本発明者らの見解に加わり、因子ＸＩＩ活性化特性が導入される（図２Ｅ、Ｆも参照）。ここで本発明者らの結果は、ＬＰＳの結合がクロスβ構造コンフォメーションを誘導すること、および因子ＸＩＩのＬＰＳ活性化がクロスβ構造コンフォメーションを有するタンパク質により媒介されることを開示し、これまでに報告されているこれらの知見の説明が得られる。
【００７４】
考察：ＬＰＳ同様に、クロスβ構造豊富なタンパク質は単球においてＴＮＦαのアップレギュレーションを誘導し、ＬＰＳはリゾチームにおいてアミロイドクロスβ構造コンフォメーションを誘導する
それらの３分の１／４分の１だけクロスβ構造コンフォメーションを含むタンパク質でＵ９３７単球を刺激すると、ＬＰＳによるＴＮＦα  ＲＮＡのアップレギュレーションと同様に、ＴＮＦα  ＲＮＡの発現をもたらす。対照ヘモグロビンが、ある程度しかＴＮＦα  ＲＮＡレベルに影響を及ぼさなかったという知見は、クロスβ構造コンフォメーションの存在が見られたアップレギュレーションにとっての重要な因子であることを示す。本発明者らはここで、ＬＰＳがクロスβ構造コンフォメーション誘導剤として働くことを示すので、免疫系の細胞をはじめとする細胞の、ＬＰＳによる活性化は少なくとも一部には、クロスβ構造コンフォメーションを含むコンフォメーションが変化したタンパク質により誘導されるものであると結論付ける。従って、ＬＰＳがリゾチームにアミロイド様クロスβ構造コンフォメーションを導入するという本発明者らの知見同様に、ＬＰＳは、細胞表面または細胞環境に存在するタンパク質にクロスβ構造コンフォメーションの形成を誘導する変性表面またはアジュバントとして働く。形成されたクロスβ構造コンフォメーションは免疫応答の刺激因子である。本発明者らの結果、仮説および結論は、アルブミンまたはヘモグロビンの存在下でＬＰＳの内毒素活性が増強されるという文献の知見により裏付けられる。さらに、ＬＰＳはアルブミンに、アルブミンの天然型には存在しない構造要素であるβシートの形成を誘導するが、このことはクロスβ構造コンフォメーションが形成されることを示唆する１９。ＬＰＳおよび凝集Ａβに対する小グリア細胞の同様の応答も報告されている２０。本発明者らの知見は、これら、および最近の、ＬＰＳ受容体ＣＤ１４がＡβ食作用に関与している２１−２２というさらなる知見に理論的根拠を与える。本発明者らの結果を鑑みれば、ＣＤ１４はおそらく、リガンドにおける同様の非天然型タンパク質コンフォメーションを介して、ＬＰＳおよびＡβと会合している変性タンパク質と相互作用する。このことは、ＣＤ１４がアミロイド様クロスβ構造結合タンパク質種の可能性のあるメンバーであることを示唆する３。当業者にとっては、これらの知見は、免疫系の活性化に対するクロスβ構造コンフォメーションの役割を裏付ける、さらなるin vitro細胞アッセイを行うための手段を提供する。当業者ならばここで、クロスβ構造コンフォメーションにより誘導される種類の免疫応答における洞察を集めるために適当な細胞アッセイを選択することができる。例えば、宿主の生得的免疫系および／または適応免疫系を活性化する能力ならびに細胞免疫応答および／または体液性免疫応答を誘導する能力を、また、いっそう詳しいレベルでは、応答の種類（すなわち、ＩｇＧ２ａサブクラスの免疫グロブリンの惹起をもたらすＴ細胞ヘルパー１型の反応、または主としてＩｇＧ１の惹起をもたらすＴ細胞ヘルパー２型の反応、またはＴ細胞調節型の応答）を調べることができる。クロスβ構造結合化合物およびタンパク質、例えば、ＴｈＴ、コンゴレッド、チオフラビンＳ（ＴｈＳ）、ｔＰＡおよびその断片、因子ＸＩＩおよびその断片、抗クロスβ構造ハイブリドーマを用いたブロッキング実験では、免疫系の活性化におけるクロスβ構造要素の役割に関するさらなる���拠が得られる。さらに、どういった外観（すなわち、可溶性オリゴマー、原繊維、または他の外観）のクロスβ構造コンフォメーションが免疫原特性を有するか研究するために、細胞アッセイを使用することもできる。また、アジュバントそれ自体の、またはアジュバントにより誘導されるクロスβ構造コンフォメーションにより媒介される免疫応答誘導能に関して確立されたアジュバントおよび新規なアジュバントをスクリーニングするために、細胞免疫アッセイを使用することもできる（図２参照）。ここでも、アジュバント／タンパク質混合物をクロスβ構造の結合を無効にする可能性のある化合物またはタンパク質で予め処理すると免疫応答が妨げられる場合がある。
免疫応答の誘導におけるＬＰＳの変性能の役割に対するさらなる洞察は、内毒素活性型および内毒素不活性型のＬＰＳ変異体をタンパク質におけるそれらのクロスβ構造コンフォメーション誘導能に関して、また、免疫系に対する作用に関して調べる比較研究からもたらされる可能性がある。内毒素不活性型ＬＰＳの例としては、ロドバクター・カプシュラタス(Rhodobacter capsulatus)ＬＰＳおよびテトラまたはペンタアシル化脂質Ａ１９がある。さらに、ＬＰＳの内毒素活性を阻害するポリミキシンＢの、ＬＰＳのクロスβ構造誘導特性に対する作用も試験することができる。あるいは、ポリミキシンＢはクロスβ構造含有タンパク質に直接作用する可能性もある。その場合には、ポリミキシンＢはクロスβ構造結合化合物の一覧に加えられる。
【００７５】
本発明者らの結果は、免疫試験においてアジュバントとして用いる場合のＬＰＳの作用の増強を、投与抗原における、または同時投与された、もしくは内在性のタンパク質または内在タンパク質セットにおける免疫原性クロスβ構造コンフォメーションの導入に少なくとも部分的に帰することができることを示す。ここで、ＬＰＳに曝された際にクロスβ構造コンフォメーションを優先的に形成する内在性タンパク質を投与することで、安全な免疫計画をデザインするための手段が得られるものと予測される。クロスβ構造コンフォメーションが導入されるこれらの内在性タンパク質または変性タンパク質セットがアジュバントとして間接的に使用される場合には、ＬＰＳは減らすか省くことができると思われる。当業者にとっては、限定されるものではないが、ＣｐＧまたはミョウバンをはじめとする他のアジュバントでもこれらの結果および結論が得られる可能性があることが明らかである。
【００７６】
結果例５
アジュバントの不在下での、クロスβ構造コンフォメーションを含むポリペプチドによるマウスの免疫化
クロスβ構造コンフォメーションを有する抗原の作製
実施例２および実施例４のデータは、動物およびヒトワクチン接種計画に用いられる種々のアジュバントがタンパク質においてクロスβ構造コンフォメーションを誘導することを示す。種々のタンパク質治療薬におけるクロスβ構造コンフォメーションの存在は免疫原性を誘導する。これは、免疫原性を、クロスβ構造を含むタンパク質またはポリペプチドに少なくとも部分的に帰すことができることを示唆する。このことは、本発明者らに、アジュバントを添加せずにクロスβ構造コンフォメーション豊富な化合物を用いて免疫試験を設定させた。上記の結果に基づけば、免疫原性のクロスβ構造コンフォメーションの存在が不可欠であり、タンパク質とアジュバントを含まない種々のタンパク質に基づく医薬で見られるような免疫応答の誘導に十分なものであると予測される。実際に本発明者らは、免疫試験にクロスβ構造コンフォメーションを含まないＯＶＡ（ｎＯＶＡ）と比較して、クロスβ構造コンフォメーションを含むニワトリＯＶＡ（ｄＯＶＡ）を用いた場合に高い抗体力価を得た（図５Ｌ）。クロスβ構造コンフォメーションを含まないＯＶＡでも力価が得られた。ＯＶＡにおけるクロスβ構造の形成は容易に起こるので、ｎＯＶＡによる免疫化の後の抗体の生成もまた、クロスβ構造コンフォメーションを含む分子により媒介されると予測される。この場合、クロスβ構造コンフォメーションは皮下注射中または皮下注射後に誘導される。これらの実験により、タンパク質におけるクロスβ構造コンフォメーションの存在が、有害であり得る免疫原性を誘導し得ることが確認される。タンパク質治療薬の場合、その治療薬のクロスβ構造含量を低減するか、排除すれば、より安全な薬剤となる。
【００７７】
アミロイド様ＯＶＡは８５℃での熱変性により得られた（図５Ａ、Ｂ、Ｉ、Ｋ）。クロスβ構造コンフォメーションの存在はＴｈＴ蛍光およびＰｌｇ活性化アッセイで、また、ＴＥＭ画像で確認した。ＴＥＭ画像に見られる少なくとも長さ２μｍまでの原繊維構造は、０．２μｍフィルターによる濾過がＴｈＴ蛍光の増強を低下させないという知見から結論付けられるように、おそらくは存在する唯一のクロスβ構造コンフォメーションを含むＯＶＡ構築物ではない。当業者ならば、ネズミ血清アルブミン、ヒトグルカゴンおよび下記のものなどのクロスβ構造コンフォメーションを含むエタネルセプト保存溶液で同様の実験を行うことができる（図５）。
【００７８】
アミロイド様タンパク質の折りたたみは、アルブミンにおいて８５℃での熱変性、ならびにジスルフィド結合の還元およびアルキル化により誘導された（図５Ａ〜Ｄ）。本発明者らは、天然型アルブミンも同程度にＴｈＴ蛍光を増強したが、これはｔＰＡ活性化の刺激によっては影響を受けなかったことを観察した。熱変性アルブミンおよびアルキル化アルブミンは同程度にＴｈＴ蛍光を増強したが、ｔＰＡ活性化能は異なっている。このことは、ｔＰＡおよびＴｈＴはクロスβ構造コンフォメーションの異なる態様と相互作用することを示唆する。これまでに本発明者らは、別のアミロイド特異的色素であるコンゴレッドがＥＬＩＳＡにおいてｔＰＡ結合をめぐってアミロイド様凝集物と競合し得るが、ＴｈＴはｔＰＡの結合を全く阻害しなかったことを観察した（特許出願ＷＯ２００４／００４６９８）。
【００７９】
アミロイド様クロスβ構造コンフォメーションは、グルカゴンでは、３７℃、ＨＣｌバッファー中、低ｐＨでの熱変性によって誘導された（図５Ｅ、Ｆ、Ｊ）。このようにしてｔＰＡの強力なアクチベーターが得られ、これはＴｈＴ蛍光をより大きな程度で増強した。さらに、ＴＥＭ画像で見られるように、長く、折れ曲がった、分岐のない原繊維が形成される（図５Ｊ）。注目すべきは、高いグルカゴン濃度でも、天然型グルカゴンはｔＰＡ活性化能を有し、これはある量のクロスβ構造コンフォメーション豊富なタンパク質が存在することを示唆する。
【００８０】
アルキル化エタネルセプトはｔＰＡを全く活性化しないが、熱変性エタネルセプトはアミロイドγ−グロブリンと同様のｔＰＡ活性化能を有する（図５Ｇ）。熱変性後のエタネルセプトも、高いＴｈＴ蛍光を効果的に誘導する（図５Ｈ）。天然型エタネルセプトはｔＰＡの活性化を誘導し、ＴｈＴ蛍光のいくらかの増強も示す。
【００８１】
Ｂａｌｂ／ｃマウスの免疫化では、ｎＯＶＡ、ｄＯＶＡおよびｎＯＶＡをフロイントの完全アジュバントとともに用いた。ｎ−ＭＳＡ、熱変性ＭＳＡ、アルキル−ＭＳＡ、天然型グルカゴン、熱変性グルカゴン、天然型エタネルセプト、変性エタネルセプト、天然型β２ＧＰＩ、アルキル−β２ＧＰＩ、変性β２ＧＰＩ、組換えβ２ＧＰＩ、二量体β２ＧＰＩ２３、β２ＧＰＩとＣｐＧ、β２ＧＰＩとカルジオリピンおよびβ２ＧＰＩとＤＸＳ５００ｋでも同様の免疫化および分析を行うことができる。さらに、種々の力価の分析は、用量、注射回数、注射方法、より免疫原性の高いクロスβ構造コンフォメーションを導入するための抗原の前処理に関して改良された免疫化プロトコールを指摘する。
【００８２】
例えば、２５μｇのエタネルセプト、熱変性エタネルセプト、グルカゴンおよび熱／酸変性グルカゴンを、０日目と１８日目にアジュバント無しで皮下投与する。力価の測定のために３日目、１８日目および２５日目に伏在静脈から採血する。天然型β２ＧＰＩ（１５μｇ）、還元／アルキル化β２ＧＰＩ（１５μｇ）および天然型β２ＧＰＩ（１５μｇ）を１．３５μｇのカルジオリピンとともに０日目、４日目、１４日目および１８日目に静脈投与する。β２ＧＰＩとカルジオリピンは予め混合し、終濃度４００μｇ  ｍｌ−１および２５μＭでインキュベートする。３日目、９日目、２５日目に採血した。まず、天然型タンパク質をコーティングしたプレートを用い、ＥＬＩＳＡにより力価を測定する。
【００８３】
本発明者らの分析から、本発明者らは、β２ＧＰＩとカルジオリピン、ｄＯＶＡ、アルキル−ＭＳＡ、熱／酸変性グルカゴンおよび熱変性エタネルセプトはクロスβ構造コンフォメーションを含むと結論付ける。クロスβ構造コンフォメーションの存在はさらに、円偏光二色性分光偏光解析、Ｘ線繊維回折実験、フーリエ変換赤外分光法、コンゴレッド蛍光／複屈折、ｔＰＡの結合、因子ＸＩＩの活性化および結合その他によっても確認することができる。
【００８４】
「全血」アッセイによるクロスβ構造コンフォメーションを含む化合物の免疫原性評価
クロスβ構造コンフォメーションを有するタンパク質が免疫系の活性化細胞であるかどうかを評価する１つの方法として、「全血」アッセイの使用によるものがある。この目的で、１日目に採取したばかりのヒトＥＤＴＡ血を、３７℃に予温したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＨＥＰＥＳ緩衝、Ｌ−グルタミン含有、Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｒｅｄａ，ランダ）に１：１比で加える。次に、クロスβ構造コンフォメーションを含むタンパク質を加えることができる。陽性対照を含めることが好ましく、好ましくはＬＰＳである。ＬＰＳに対して使用可能な阻害剤はポリミキシンＢ、終濃度５μｇ  ｍｌ−１である。供試可能な標準的なクロスβ構造コンフォメーション豊富なポリペプチドはＡβ、アミロイドγ−グロブリン、糖化タンパク質、ＦＰ１３、熱変性ＯＶＡその他である。陰性対照は天然型γ−グロブリン、天然型アルブミン、天然型Ｈｂ、新しく溶解させたＡβまたはＦＰ１３、天然型ＯＶＡである。内毒素の混入のために見られる効果を排除するため、対照として、総てのタンパク質サンプルを５μｇ  ｍｌ−１ポリミキシンＢの不在下または存在下で試験することができる。さらに、天然型タンパク質単独、または例えば、ＬＰＳ、ＤＸＳ５００Ｋ、カオリンおよびＣｐＧまたは新規なアジュバントなどの変性アジュバントに予め曝した天然型タンパク質も免疫原活性を調べることができる。血液と培地は注意深く混合し、ＣＯ２を流入させる蓋を備えたＣＯ２インキュベーター内で一晩インキュベートしなければならない。２日目に培地を回収した後、室温で１０分、１，０００＊ｇで回転させる。この細胞ペレットを冷凍保存する。再び室温で２０分、２，０００＊ｇで培地を回転させる。上清の免疫応答マーカー、例えば、組織壊死因子−αの濃度を、ＥＬＩＳＡを用いて分析する。陽性対照および陰性対照ならびに信頼性のある滴定曲線が確立されれば、免疫原性マーカーの濃度に関して、いずれの溶液のクロスβ構造負荷も調べることができる。さらに、免疫応答の推定阻害剤も調べることができる。例えば、フィンガードメイン、ＴｈＴ、コンゴレッド、ｓＲＡＧＥおよびｔＰＡは、凝集物を含むタンパク質治療薬溶液に添加した際に免疫応答を妨げることができる。
【００８５】
クロスβ構造を含むタンパク質の免疫原性
本発明は、クロスβ構造コンフォメーションを含むタンパク質が免疫原性であることを開示する。ここで、当業者には、免疫原性におけるクロスβ構造コンフォメーションの提案された役割を裏付けるさらなる証拠が得られることが明らかである。例えば、ＯＶＡ、β２ＧＰＩおよび／または組織壊死因子α、グルカゴンもしくはエタネルセプトなどのタンパク質治療薬をはじめとするタンパク質の免疫原性を調べる。好ましくは、これらのタンパク質の天然状態の免疫原性を、クロスβ構造コンフォメーションが導入された状態と比較する。好ましくは、クロスβ構造コンフォメーションは、加熱、酸化、糖化またはＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、ＬＰＳもしくはカルジオリピンなどのアジュバント処理により誘導される。クロスβ構造コンフォメーションの含量は好ましくはＴｈＴ、コンゴレッド、ＴＥＭ、サイズ排除クロマトグラフィー、ｔＰＡ活性化活性、および／または表１〜３に挙げられている他のいずれかのクロスβ構造結合タンパク質の結合により測定する。該タンパク質の免疫原性は好ましくはin vitroおよびin vivoで調べる。当業者にとっては、該タンパク質の免疫原性を測定するにはいくつかのin vitroアッセイが好ましい。好ましくは、該天然型タンパク質またはクロスβ構造含有タンパク質で処理した後に抗原提示細胞（ＡＰＣ）、好ましくは樹状細胞（ＤＣ）の活性化を調べる。好ましくは、これは確立されたプロトコールに従って行う。抗原提示細胞の活性化は、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）分析により測定することができる。好ましくは、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６などのいわゆる共刺激分子のレベルを、好ましくはＣＤ１１ｃ陽性細胞で測定する。あるいは、ＮＦ−κＢの活性化および／またはサイトカインの発現を、ＡＰＣおよびＤＣなどの免疫原性に関与する細胞の活性化の指標として使用することもできる。
【００８６】
好ましくは、次のサイトカイン：ＴＮＦα、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、またはＩＦＮγその他を定量する。好ましくは、サイトカインレベルはＥＬＩＳＡにより定量する。あるいは、ｍＲＮＡレベルを定量することもできる。当業者には、ＡＰＣおよびＤＣの機能も同様に調べることができることが明らかである。好ましくは、抗原の交差提示を調べることができる。好ましくは、これは、モデルタンパク質としての、ＯＶＡをその天然型コンフォメーションおよびクロスβ構造コンフォメーションを有するコンフォメーションで用い、達成することができる。ＤＣまたはＡＰＣの、ＭＨＣクラスＩ限定またはＭＨＣクラスＩＩ限定Ｔ細胞を活性化する能力を分析すべきである。当業者ならば、これを確立されたプロトコール４３ー４４に従って行うことができる。クロスβ構造コンフォメーションを含むタンパク質の、ＡＰＣの活性化における役割およびそれらの抗原提示における役割は、競合アッセイにおいてクロスβ構造結合化合物を用い、これら前述の実験手順でさらに取り組むことができる。好ましくは、ＤＣの活性化および機能的抗原提示をＴｈＴ、コンゴレッド、ｔＰＡ、または表１〜３に挙げられているものを含む他のいずれかのクロスβ構造結合タンパク質の存在下または不在下で調べる。クロスβ構造コンフォメーションを有するタンパク質の免疫原性は、さらにin vivoでも実証される。例えば、ＯＶＡ、β２ＧＰＩおよび／または組織壊死因子α、グルカゴンもしくはエタネルセプトなどのタンパク質治療薬をはじめとするタンパク質の免疫化の際の、抗体の誘導および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性の誘導を調べる。好ましくは、これらのタンパク質の天然状態の免疫原性を、クロスβ構造コンフォメーションが導入されている状態と比較する。好ましくは、クロスβ構造コンフォメーションは、加熱、酸化、糖化またはＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、ＬＰＳもしくはカルジオリピンなどのアジュバント処理により誘導される。クロスβ構造コンフォメーションの含量は好ましくは、ＴｈＴ、コンゴレッド、ＴＥＭ、サイズ排除クロマトグラフィー、ｔＰＡ活性化活性、および／または表１〜３に挙げられている他のいずれかのクロスβ構造結合タンパク質の結合により測定する。好ましくは免疫化後の抗体力価はＥＬＩＳＡにより測定し、ＣＴＬ活性は５１Ｃｒ放出アッセイを用いて測定する。あるいは、ＩＬ−２をはじめとするサイトカインの放出を測定することもできる。当業者にとっては、ここで、クロスβ構造コンフォメーションを含む各タンパク質についての免疫原性に対する作用それ自体も試験可能であることが明らかである。提案されたこれらの実験は、免疫原性におけるクロスβ構造コンフォメーションの役割をさらに精密にする。
【００８７】
アジュバントの免疫原性
本発明は、アジュバントがクロスβ構造コンフォメーションを誘導することを開示する。当業者にとっては、ここで、アジュバントの免疫原性におけるクロスβ構造コンフォメーションの提案されている役割を裏付けるさらなる証拠が得られることが明らかである。例えば、大腸菌(Escherichia coli)の非耐熱性腸毒素（ＥｔｘＢ）、種々のＣｐＧ関連オリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＬＰＳの変異体、またはモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）などのＬＰＳ関連分子など、さらなる新規なアジュバントを試験することができる。このクロスβ構造誘導能は天然型タンパク質またはタンパク質セット。好ましくはＯＶＡ、リゾチーム、エンドスタチン、γ−グロブリン、アルブミン、血漿または血漿由来タンパク質もしくはタンパク質セットを用いて測定する。クロスβ構造の含量は好ましくはＴｈＴ、コンゴレッド、ＴＥＭ、サイズ排除クロマトグラフィー、ｔＰＡ活性化活性、および／または表１〜３に挙げられている他のいずれかのクロスβ構造結合タンパク質の結合により測定する。好ましくは、これらの化合物のクロスβ構造誘導能を、上記のアッセイを用い、in vitroおよびin vivoでの免疫原性と比較する。当業者ならば、ここで、アジュバントに曝された際にクロスβ構造を有するコンフォメーションへとリフォールディングするタンパク質またはタンパク質セットを同定することができる。例えば、アジュバント、好ましくは、ＣｐＧ、ＬＰＳまたはその機能的等価物を固定した後、アジュバントとして用いる。次に、この固定化アジュバントを採取し、十分洗浄した後、クロスβ構造コンフォメーションを有する結合タンパク質を単離する。必要であれば、これらのタンパク質を標準的な手順、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製することもできる。タンパク質の属性は好ましくは質量分析、すなわち、質量分析に基づくプロテオミクスにより明らかにする。
【００８８】
アジュバントの作用におけるクロスβ構造コンフォメーションの役割は、競合アッセイにおいてクロスβ構造結合化合物を用い、これら前述の実験手順でさらに取り組むことができる。好ましくは、ＤＣの活性化および機能的抗原提示をＴｈＴ、コンゴレッド、ｔＰＡ、または表１〜３に挙げられているものまたはその機能的等価物を含む他のいずれかのクロスβ構造結合タンパク質の存在下または不在下で調べる。
【００８９】
これらの実験は、免疫原性におけるクロスβ構造コンフォメーションの役割をさらに精密にする。さらに、当業者にとっては、クロスβ構造コンフォメーションへとリフォールディングし、アジュバントと結合した際に免疫原性となるタンパク質を選択することは実現可能である。このようなタンパク質はアジュバントそれ自体として使用可能である。最後に、当業者ならば、表１〜３に挙げられているものをはじめとするクロスβ構造結合化合物とこれらのクロスβ構造含有タンパク質との結合に基づき、免疫化および免疫応答の形成に最適なクロスβ構造含有タンパク質を選択することができる。
【００９０】
クロスβ構造コンフォメーションを含むタンパク質による免疫化は病原体の投与に対する防御を促す
本発明は、クロスβ構造コンフォメーションを含むタンパク質が免疫原性であることを開示する。当業者にとっては、ここで、クロスβ構造コンフォメーションを含むタンパク質での免疫化が病原体に対する防御を誘導または増強することが明らかである。例えば、ワクチン開発のよい候補成分となる病原性タンパク質を、クロスβ構造コンフォメーションを含むタンパク質と組み合わせる。このような病原性タンパク質としては、限定されるものではないが、Ｍ様タンパク質および連鎖球菌種のフィブロネクチン結合タンパク質または髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)の混濁（Ｏｐａ）タンパク質のなどの細菌の毒力に関与するタンパク質が挙げられる。あるいは、このようなタンパク質は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）および／またはノイラミダーゼ（ＮＡ）など、ウイルス起源のものである。防御免疫応答を惹起するこのような病原性タンパク質を、クロスβ構造コンフォメーションを含む有効量のタンパク質を含むタンパク質と組み合わせ、動物、好ましくはマウスに注射する。あるいは、防御免疫応答を誘導する病原性タンパク質を、クロスβ構造を含むコンフォメーションへとリフォールディングするように処理する。このような処理は好ましくは、加熱、酸化、および／または音波処理、またはクロスβ構造コンフォメーションを誘導する他のいずれかの処理である。クロスβ構造コンフォメーションの含量は好ましくは、ＴｈＴ、コンゴレッド、ＴＥＭ、サイズ排除クロマトグラフィー、ｔＰＡ活性化活性、および／または表１〜３に挙げられている他のいずれかのクロスβ構造結合タンパク質の結合により測定する。免疫化の後、免疫応答は、当業者ならば、抗体力価の測定およびＣＴＬ応答の誘導に関して確立されているプロトコールを用い、容易に測定することができる。クロスβ構造を含むタンパク質を、防御免疫応答を誘導すると予測される所与の病原性タンパク質または病原性タンパク質セットとともに用いる免疫化の防御効果は、免疫マウスを病原性タンパク質が由来する病原体で刺激することで分析し、免疫されていないマウスと生存または感染の重篤度を比較する。例えば、マウスを、クロスβ構造コンフォメーション誘導するように処理した、またはクロスβ構造コンフォメーションを含むタンパク質と組み合わせたフィブロネクチン結合タンパク質（ＦＮＺおよび／またはＳＦＳ）および／またはＥＡＧ（α２−マクログロブリン、アルブミン、およびＩｇＧ結合タンパク質）で免疫化した後にStreptococcus equiに感染させることができる。別の例として、クロスβ構造コンフォメーション誘導するように処理した、またはクロスβ構造コンフォメーションを含むタンパク質で免疫化した、組換え髄膜炎菌ＯｐａＢおよびＯｐａＪタンパク質またはＰｏｒＡおよびＰｏｒＢタンパク質を含む外膜小胞による免疫化を用いて得られるものがある。確立されているプロトコールを用い、マウスを髄膜炎菌(Neisseria meningitis)で刺激する。この免疫化の効果を抗体反応を測定することにより分析する。さらに別の例では、マウスを、クロスβ構造コンフォメーションを誘導するように処理した、またはクロスβ構造コンフォメーションを含むタンパク質もしくはタンパク質セットと組み合わせて用いる、組換えバキュロウイルスが産生したＮＡおよびＮＡワクチンで免疫化する。次に、このマウスをインフルエンザウイルスで刺激し、例えば確立されているプロトコールに従い、クロスβ構造を含むタンパク質による免疫化の防御効果を測定する。
【００９１】
病原性タンパク質またはタンパク質セットと組み合わせて用いる理想的なタンパク質またはタンパク質セットは好ましくは、ＣｐＧまたはＬＰＳなど、アジュバントの応答に関連するタンパク質の分析から得られるものである。
これらのことを考え合わせると、これらの実験の結果はさらに、クロスβ構造を含むタンパク質がワクチンの有益な成分であることを示す。
【００９２】
実施例６
クロスβ構造の適正な用量を決定するため、各回２用量の市販の不活生化インフルエンザ表面抗原ワクチン（Agrippal（商標））を用いる。
【００９３】
１用量はそのまま用い（Ａ）、もう１用量（Ｂ）は加熱、冷凍、酸化、糖化、ペグ化、スルファテーション(sulphatation)、カオトロピック剤曝露（好ましくは、このカオトロピック剤は尿素または塩酸グアニジンである）、リン酸化、部分タンパク質分解、化学溶解（好ましくは、ＨＣｌまたは臭化シアノゲンによる）、音波処理、有機溶液、好ましくは、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールおよびトリフルオロ酢酸への溶解の１以上の処理、またはそれらの組合せにより変性させる。
【００９４】
次の組合せを作製する。
【００９５】
【表１ａ】
2009501215.tif 000002
【００９６】
マウスを上記のようにＡＢ組合せまたはプラセボで免疫化する。
【００９７】
３週間後、同じ組成物で追加刺激する。
【００９８】
さらに３週間後、マウスを病原体で刺激する。
【００９９】
免疫応答を測定する。
【０１００】
実施例７
クロスβ構造を含むタンパク質は、癌、好ましくは、限定されるものではないが、ウイルス感染に関連する癌の治療および／または予防における医学適用のための成分としても使用される。該癌は好ましくはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染に関連したものである。
【０１０１】
例えば、癌、好ましくは、ＨＰＶ感染に関連する子宮頸癌、肛門癌、陰門癌、膣癌および／または陰茎癌および／または性器疣贅、好ましくは、ＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８および／またはＨＰＶ６および／またはＨＰＶ１１腫瘍関連抗原に関連する癌の発症および／または進行に対抗し、治療し、かつ／または少なくとも部分的に予防するために免疫応答を誘導する。好ましくは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６型および／またはＥ７型タンパク質を対象とする。このような抗原、好ましくはＥ６および／またはＥ７抗原においてクロスβ構造を誘導するか、または該抗原とクロスβ構造を含むタンパク質成分を組み合わせると、抗原特異的免疫応答の惹起に特に好適な化合物および／または組成物が得られる。好ましくは、Ｅ６および／またはＥ７特異的応答が惹起される。好ましくは、該抗原、好ましくはＥ６および／またはＥ７を発現する腫瘍による刺激に対してマウスを防御し得る化合物および／または組成物を産生させる。最も好ましくは、ＨＰＶ感染により引き起こされる癌および／または性器疣贅の進行からヒトを少なくとも部分的に保護し得る化合物および／または組成物を産生させる。治療上有効な量、好ましくは１〜１００μｇの腫瘍抗原を、治療上有効な量、好ましくは１〜１００μｇのクロスβ構造含有タンパク質成分と組み合わせて用いる。該クロスβ構造含有タンパク質成分は好ましくはオボアルブミンである。いっそうより好ましくは、前記クロスβ構造含有タンパク質成分は腫瘍関連抗原である。ゆえに、クロスβ構造は好ましくは腫瘍関連抗原において誘導され、これにより該腫瘍関連抗原を含む組成物はより高い免疫原性となる。ＨＰＶ関連癌の少なくとも部分的な治療および／または予防が望ましい場合、該腫瘍関連抗原は好ましくはＥ６および／またはＥ７である。
【０１０２】
マウスを、好ましくは２〜３週間間隔で、好ましくは筋肉内に２回免疫し、好ましくは腫瘍細胞、好ましくは５×１０４ＴＣ−１腫瘍細胞で刺激し、好ましくは腫瘍増殖を測定し、経時的にモノタリングする。ヒト被験者も好ましくは同様に２回以上免疫し、癌の数、発生および／または増殖および／または疣贅の発達を、免疫者および非免疫者の間で測定することによりモニタリングする。
【０１０３】
実施例８
クロスβ構造を含むタンパク質はまた、他の異常、好ましくは、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化症または類澱粉症、好ましくは、アルツハイマー病の予防および／または治療において免疫応答を誘導するための医学的適用に、ならびに例えば、雄性免疫弱化のため、または移植片対宿主病（ＧｖＨ）および／または移植拒絶の予防に用いるためといった広範囲の他の自己抗原に対する免疫応答の誘導のための成分としても用いられる。
【０１０４】
例えば、アテローム性動脈硬化症を治療するためには、好ましくは酸化ＬＤＬまたは糖化タンパク質またはその特異的エピトープが標的となる。好ましくは、クロスβ構造を含む酸化ＬＤＬおよび／または糖化タンパク質は、ｏｘ−ＬＤＬ−および／または糖化タンパク質特異的免疫応答を誘導するために、このような医学適用の成分として用いられる。治療上有効な量、好ましくは１〜１００μｇのｏｘ−ＬＤＬおよび／または糖化タンパク質を、治療上有効な量、好ましくは１〜１００μｇのクロスβ構造含有タンパク質成分と組み合わせて用い、該タンパク質成分は好ましくはｏｘＬＤＬおよび／または糖化タンパク質である。
【０１０５】
類澱粉症またはいずれかのタンパク質ミスフォールディング疾患、好ましくはアルツハイマー病を治療するためには、好ましくは、特定の類澱粉症と組み合わせられるタンパク質またはタンパク質断片を免疫源として用いて、該タンパク質またはタンパク質断片に対する特異的免疫応答を誘導する。好ましくは、治療上有効な量、好ましくは１〜１００μｇの該タンパク質またはタンパク質断片を、治療上有効な量、好ましくは１〜１００μｇのクロスβ構造含有タンパク質成分と組み合わせて用い、該タンパク質成分は好ましくは前記のタンパク質またはタンパク質成分である。
【０１０６】
例えば雄性免疫弱化のため、または移植片対宿主病（ＧｖＨ）および／または移植拒絶の予防に用いるためといった広範囲の自己抗原に対する免疫応答を惹起するためには、好ましくは自己抗原を免疫原として、好ましくはクロスβ構造含有タンパク質成分とともに用いる。好ましくは、該クロスβ構造含有タンパク質成分は、クロスβ構造が誘導されている前記の自己抗原である。好ましくは、治療上有効な量、好ましくは１〜１００μｇの該自己タンパク質を、治療上有効な量、好ましくは１〜１００μｇのクロスβ構造含有タンパク質成分と組み合わせて用い、該クロスβ構造含有タンパク質成分は好ましくは、クロスβ構造が誘導されている前記の自己タンパク質である。惹起された免疫応答は好ましくは、例えばＥＬＩＳＡによる免疫学的方法またはＣＴＬ反応の測定により測定する。該治療の有効性は例えば、対象とする異常の特定の発症をモニタリングすることにより測定する。
【０１０７】
実施例９
クロスβ構造をアジュバントとする血清型Ｂ外膜タンパク質髄膜炎菌ワクチンの免疫原性髄膜炎菌に対する三価ＰｐｒＡワクチンによるマウスの免疫化
目的
アミロイド様ミスフォールディングタンパク質コンフォメーションを有するＰｏｒＡ抗原が抗体力価を惹起するかどうかを調べること。ミョウバンをアジュバントとするＰｏｒＡ、天然型ＰｏｒＡ、プラセボ（注射用バッファー）、またはアミロイド様特性を有する（クロスβ構造をアジュバントとする）それぞれ２５％または７５％ミスフォールディングＰｏｒＡを含む２種類のＰｏｒＡ調製物を２回接種した後、マウス血清について、総抗体力価および３種類の異なる髄膜炎菌株に由来するＰｏｒＡに対する殺菌性の抗体力価を分析した。
【０１０８】
材料および方法
ワクチンの調製
ＰｏｒＡ抗原溶液は、オランダワクチン協会(NVI,Bilthoven,オランダ)のＧ．  Ｋｅｒｓｔｅｎ博士およびＧ．  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｄｏｂｂｅｌｓｔｅｅｎ博士から入手した。細菌の外膜小胞（ＯＭＶ）のＰｏｒＡは本質的に記載の通りに調製した（１）。ＯＭＶ溶液中のタンパク質濃度は常法を用いて測定した。ＰｏｒＡ含量は、ＰｏｒＡ調製物のゲル電気泳動後にクーマシー染色したポリアクリルアミドゲルの濃度分析を行うことにより測定し、４００μｇ／ｍｌであった。ＰｏｒＡバッファーは１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、３％サッカロース、ｐＨ７．４である。ワクチン調製のため、１０倍ＰｏｒＡバッファー（３０％ｗ／ｗスクロース、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、０．４５μｍ濾過除菌）を調製した。この研究に用いたＯＭＶは、３つのＰｏｒＡ血清亜型、すなわち、Ｐ１．５−２，１０、Ｐ１．１２−１．１３およびＰ１．７−２，４を発現する三価株から得た。アジュバントミョウバン（Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ、Ｂｒｅｎｎｔａｇ、２％ＡｌＰＯ４、０．４４％Ａｌ３＋、バッチ８９８１）はプレーンＰｏｒＡバッファー同様、ＮＶＩから供給されたものであった。これらの無菌保存溶液は４℃で保存した。
【０１０９】
タンパク質におけるアミロイド様ミスフォールディングタンパク質コンフォメーションの導入
アミロイド様ミスフォールディングＰｏｒＡの調製のため、次の３つの方法を用いた。
ミスフォールディング法Ｉ：熱周期による熱変性
８７５μｌ  ＰｏｒＡバッファーおよび１２５μｌ  ＰｏｒＡ保存溶液（［ＰｏｒＡ］＝５０μｇ／ｍｌ；［ＯＶＡ］＝１ｍｇ／ｍｌ）中、１ｍｇの精製ニワトリＯＶＡ（Sigma；カタログ番号Ａ５５０３）を、ＰＴＣ−２００サーマルサイクラー(MJ Research,Inc.,Waltham,MA,USA)のＰＣＲカップ内で５サイクル加熱した。各サイクルで、タンパク質溶液を３０℃から８５℃まで５℃／分の速度で加熱した。熱変性タンパク質溶液は−８０℃で保存した。
【０１１０】
ミスフォールディング法ＩＩ：ＰｏｒＡとオボアルブミンのカップリング
Ｎ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、保存溶液は４００ｍＭ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、保存溶液は１００ｍＭ）を用いるＰｏｒＡとＯＶＡのカップリングでは、化合物とタンパク質をＭＥＳバッファー（０．０２％（ｍ／ｖ）ＮａＮ３、１００ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．７；１０倍ＭＥＳバッファー保存溶液から希釈）を混合した。要するに、２５０μｌのＥＤＣ保存溶液と３５０μｌのＨ２Ｏに２００μｌの１０倍ＭＥＳバッファーを加えた（溶液１）。ＯＶＡ（０．２ｍｇ）を１００μｌ  ＰｏｒＡ保存溶液に溶かした。このＰｏｒＡ／ＯＶＡ溶液に８μｌの溶液１を加えた後、２０μｌのＮＨＳ保存溶液を加えた。この混合物を回転装置上、室温で２時間インキュベートした後、８００μｌのＰＢＳを加え、その後、４℃でＰＢＳに対して徹底的に透析した（［ＰｏｒＡ］＝４０μｇ／ｍｌ；［ＯＶＡ］＝１ｍｇ／ｍｌ）。ＰｏｒＡ−ＯＶＡコンジュゲートを含むこの溶液中には小さな粒子が見られた。次に、このコンジュゲート溶液を上記のような５回の熱周期で加熱した。このコンジュゲートは−８０℃で保存した。
【０１１１】
ミスフォールディング法ＩＩＩ：グルタルアルデヒド／ＮａＢＨ４活性化によるポリペプチド−Ａとポリペプチド−Ｂのカップリング
ＰｏｒＡとＯＶＡのカップリングのため、両タンパク質をグルタルアルデヒドおよび水素化ホウ素ナトリウムで活性化し、混合した。この目的で、１００μｇのＯＶＡを２５０μｌのＰｏｒＡ保存溶液に溶かし、２５０μｌのＰｏｒＡバッファーを加えた。Ｈ２Ｏ中４％の１００倍保存溶液に予め希釈したグルタルアルデヒド（Ｈ２Ｏ中２５％（ｖ／ｖ）溶液、Merck, Hohenbrunn, ドイツ，８．２０６０３．１０００（ＵＮ２９２７、毒性）、ロットＳ４５０３６０３  ５４９）を終濃度０．０４％となるように加えた。ボルテックスにかけ、室温で２分間インキュベートした後、５μｌの１２０ｍＭ  １００倍ＮａＢＨ４保存溶液（およそ９８％，Ｓｉｇｍａ，セントルイス，ＭＯ，ＵＳＡ，Ｓ９１２５、ロット５３Ｈ３４７５）を終濃度１．２ｍＭとなるように加えた。この溶液をボルテックスにかけ、回転装置上、室温で４２時間インキュベートした。このインキュベーション中、小さな浮遊粒子が見られた。その後、この溶液をＰＢＳに対して徹底的に透析した。次に、このコンジュゲート溶液を上記のような５回の熱周期で加熱した。最終的なＰｏｒＡおよびＯＶＡ濃度はＰＢＳ中２００μｇ／ｍｌであった。
【０１１２】
ＰｏｒＡ溶液における、クロスβ構造を有するアミロイド様ミスフォールディングタンパク質の存在に関する分析
チオフラビンＴ蛍光
ＰｏｒＡ調製物によるアミロイド特異的色素チオフラビンＴ（ＴｈＴ）蛍光の増強を確認するため、黒い９６ウェルプレートのウェル内の（二反復）１０μｌサンプルに、５０ｍＭグリシンバッファー（ｐＨ９．０）中、９０μｌの２５μＭ  ＴｈＴ溶液を加えた。陽性対照として、アミロイド−β（Ａβ）を１ｍｇ／ｍｌの保存溶液濃度で用いた。蛍光は、Thermo Fluoroskan Ascent 2.5にて、励起波長４３５ｎｍおよび発光波長４８５ｎｍで２回測定した。１つのアッセイでは、ＰｏｒＡおよびミスフォールディング法Ｉ〜ＩＩＩの後のミスフォールディングＰｏｒＡを４００倍希釈のＰｏｒＡ保存溶液を用いて処理した。もう１つのアッセイでは、５種類のワクチン溶液（ａ〜ｅ）を２０倍希釈液で試験した。
【０１１３】
組織型プラスミノーゲンアクチベーター  プラスミノーゲン活性化アッセイ
組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）はアミロイド様ミスフォールディングタンパク質と結合し、このタンパク質により活性化される。ｔＰＡが活性化されると、その基質であるプラスミノーゲンがプラスミンへ変換し、これを発色性プラスミン基質を用いて経時的に追跡することができる。このアッセイは９６ウェルプレート(Costar 2595 ELISAプレート)で行った。ｔＰＡ(Actilyse,Boehringer-Ingelheim)およびプラスミノーゲン（Ｐｌｇ，ヒト血漿から精製）濃度はそれぞれ４００ｐＭおよび０．２μＭであった。発色基質Ｓ−２２５１（Chromogenix，ミラノ，イタリア）を０．５ｍＭで用いて、ＰＩｍ活性を測定した。アッセイバッファーはＨＢＳ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ  ＫＣｌ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）であった。陰性対照はＨ２Ｏとし、陽性対照はＨ２Ｏに溶解した２０μｇ／ｍｌのアミロイド様ミスフォールディングγ−グロブリンとした。１つのアッセイでは、ＰｏｒＡおよびミスフォールディング法Ｉ〜ＩＩＩの後のミスフォールディングＰｏｒＡを４００倍希釈のＰｏｒＡ保存溶液を用いて試験した。もう１つのアッセイでは、５種類のワクチン溶液（ａ〜ｅ）を２０倍希釈で試験した。サンプルは二反復のウェルで試験し、ｔＰＡを加えなかった陰性対照ウェルでも完了させた。全アッセイ量は５０μｌとした。分光光度計(Spectramax)にて４０５ｎｍで動態測定を行い、３７℃で３時間毎分測定し、各測定の前に振盪を行った。
【０１１４】
免疫化実験の設定
７〜９週齢の雌ＢａｌＢ／ＣＡｎＮＨＳｄ(BalB/C, Harlan)を各群５個体のマウスをフィルタートップケージで飼育した(Animal Facility ‘Gemeenschappelijk Dierenlaboratorium’,Utrecht University,オランダ）。およそ１週間の環境馴化の後、採血して免疫前血清を採取した（−３日目）。０日目と２８日目に各マウスに次の計画に従った３００μｌ量のワクチンを皮下注射した。
ａ群  ミョウバンをアジュバントとするＰｏｒＡワクチン（陽性対照）
ｂ群  無アジュバントＰｏｒＡ（参照サンプル）
ｃ群  ＰｏｒＡバッファー（プラセボ）
ｄ群  ７５％無アジュバントＰｏｒＡ、２５％ミスフォールディングＰｏｒＡ（試験品１）
ｅ群  ２５％無アジュバントＰｏｒＡ、７５％ミスフォールディングＰｏｒＡ（試験品２）
【０１１５】
７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３５日目および４２日目に血清を採取し、−２０℃で保存した。ＰｏｒＡ用量は各動物３ｐｇとした。ワクチン（およそ６用量）を次のようにして作製した。
ａ群：１．  ５０μｌ  ＰｏｒＡ保存溶液、２．  ２００μｌ  １０倍バッファー、３．  ５０μｌミョウバン保存溶液、４．  １．７ｍｌ  Ｈ２Ｏ、５．  室温にて回転装置で３０分
ｂ群：１．  ５０μｌ  ＰｏｒＡ保存溶液、２．  １９５０μｌ  １倍ＰｏｒＡバッファー
ｃ群：１倍ＰｏｒＡバッファー
ｄ群：  １．  ３７．５μｌ  ＰｏｒＡ保存溶液、２．  ＰＢＳ中、５０μｌ熱変性（ＰｏｒＡ＋ＯＶＡ）（ミスフォールディング法Ｉ）、３．  ５０μｌ  ＥＤＣ／ＮＨＳコンジュゲート（ＰｏｒＡ＋ＯＶＡ）、ＰＢＳ中、３０７μｇ／ｍｌ（ミスフォールディング法ＩＩ）、４．ＰＢＳ中、２０μｌ熱変性グルタルアルデヒド／ＮａＢＨ４コンジュゲート（ＰｏｒＡ−ＯＶＡ）（ミスフォールディング法ＩＩＩ）、５．  １８１３μｌ  １倍ＰｏｒＡバッファー
ｅ群：１．  １２．５μｌ  ＰｏｒＡ保存溶液、２．  １５０μｌ熱変性（ＰｏｒＡ＋ＯＶＡ）（ミスフォールディング法Ｉ）、３．  １５０μｌ  ＥＤＣ／ＮＨＳコンジュゲート（ＰｏｒＡ＋ＯＶＡ）、ＰＢＳ中、３０７μｇ／ｍｌ（ミスフォールディング法ＩＩ）、４．  ＰＢＳ中、６０μｌ熱変性グルタルアルデヒド／ＮａＢＨ４コンジュゲート（ＰｏｒＡ−ＯＶＡ）（ミスフォールディング法ＩＩＩ）、５．  １６２８μｌ  １倍ＰｏｒＡバッファー
【０１１６】
抗ＰｏｒＡ抗体ＥＬＩＳＡ
ＰｏｒＡ特異的ＩｇＧ力価は、標準的なＥＬＩＳＡを用い、３種類の異なる各ＰｏｒＡ亜型またはウェルにコーティングした三価ＰｏｒＡ溶液により測定した。要するに、３種類の個々のＰｏｒＡ亜型によるＥＬＩＳＡでは、平底９６ウェルマイクロタイタープレート（Immulon 2,Nunc,Roskilde，デンマーク）を室温で一晩、ナイセリア株の３つ種類のＰｏｒＡ亜型、それぞれＰ１．５−２，１０、Ｐ１．１２−１，１３およびＰ１．７−２，４（３μｇ／ｍｌ）を含む外膜小胞（ＯＭＶ）でコーティングした。陰性対照としては、ＰｏｒＡを含まないＯＭＶをコーティングした。一晩インキュベーション後、これらのプレートを水道水中０．０３％のＴｗｅｅｎ  ８０溶液で３回洗浄した。次に、これらのプレートを３７℃にて８０分間、個々のマウスの血清サンプルの３倍希釈液とともにインキュベートし、−３日目（免疫前）、１４日目、２８日目（２回目のワクチン接種）および４２日目に０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ８０を含有するＰＢＳ中に回収した。最初の希釈率は１００倍であった。インキュベーション後、これらのプレートを水道水中、０．０３％のＴｗｅｅｎ  ８０で３回洗浄した。ＰｏｒＡ特異的ＩｇＧレベルは、ヤギ抗マウスＩｇＧ−セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート(Southern Biotechnology Associated Inc.,Birmingham,ALA,USA.)を用いて測定した。このコンジュゲートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ８０および０．５％スキムミルク粉末(Protifar; Nutricia,Zoetermeer,オランダ)を含有するＰＢＳで１：５０００希釈し、１００μｌをウェルに加えた。次に、これらのプレートを水道水中０．０３％のＴｗｅｅｎ  ８０で３回、さらに水道水単独で１回洗浄した。各ウェルにペルオキシダーゼ基質（１１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）中、１００μｌの３，３’５，５’−テトラメチルベンジジンと０．０１％のＨ２Ｏ２）を各ウェルに加え、これらのプレートを室温で１０分間インキュベートした。各ウェルに１００μｌの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることで反応を停止させた。ＩｇＧ抗体力価を、４５０ｎｍにおける最大光学密度の５０％を与える血清希釈溶液のｌｏｇ１０として表した。最初に１００倍希釈した血清でシグナルが得られない場合は、その力価を任意に５０に設定した。ＥＬＩＳＡはＮＶＩ（G. van den Dobbelsteen博士）で行う。
【０１１７】
抗三価ＰｏｒＡ抗体力価の測定については、５μｇ／ｍｌの三価ＰｏｒＡをMicrolon high-bindingプレート(Greiner)のウェルにコーティングした。ブロッキング試薬(Roche)でブロッキングした後、ウェルを、２１日目に採取した血清、およびマウスａ〜ｅの各群でプールした血清の一連の希釈液で覆った。希釈バッファーはＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０であった。マウス抗体の結合は１：３０００ＲＡＭＰＯおよびＴＭＢ／Ｈ２ＳＯ４染色を用いて検出した。吸光度は４５０ｎｍで測定した。
【０１１８】
血清殺菌アッセイ
三価株（１．  Ｐ１．５−２，１０；２．  Ｐ１．１２−１，１３；３．  Ｐ１．７−２，４）のＰｏｒＡで免疫化した後のマウス血清を用いる血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）は、２回の免疫の後、上記のように２８日目（２回目の接種）と４２日目に採取した血清で行った。要するに、血清を、０．５％ウシ血清アルブミンおよび不活性化補体（５６℃３０分）を含有するグレイのバランス塩溶液で１：１０希釈した。細菌をＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培養液中で、６２０ｎｍにおける光学密度が０．２２０〜０．２４０となるまで増殖させ（３７℃でおよそ８０分）、０．５％ウシ血清アルブミンを含有するＧＢＳＳで希釈し、ウェルに加えた（総濃度１０４ＣＦＵ／ｍｌ）。各調製物を室温で２０分間インキュベートした。子ウサギ補体（８０％）を加え、０時間のサンプルをプレーティングし、それらの９６ウェルプレートを３７℃で６０分間インキュベートした。ＳＢＡ力価は、０時間サンプル中の濃度に基づき、９０％以上の死滅をもたらす血清希釈率の逆数ｌｏｇ２を求めることにより算出した。最初の１０倍希釈血清でシグナルが得られない場合は、その力価を任意に５に設定した。ＳＢＡ力価の測定はＮＶＩ（Ｇ．  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｄｏｂｂｅｌｓｔｅｅｎ博士）で行った。
【０１１９】
統計学
ＩｇＧ力価は、各マウス群に対して得られた幾何平均力価（ＧＭＴ）のｌｏｇ１０値とその平均値の標準誤差で表す。ＳＢＡ力価は、各マウス群に対して得られたｌｏｇ２平均値として表す。実験は３回行った、力価間の差は、スチューデントのｔ検定により判定したところ、Ｐ値≦０．０５で有意であるとみなされた。
【０１２０】
結果
クロスβ構造を含むアミロイド様ミスフォールディングタンパク質コンフォメーションを有するｏｆミスフォールディングＰｏｒＡの存在の分析
ＮＶＩから入手した三価ＰｏｒＡを、ＯＶＡの存在下での周期的熱変性（方法Ｉ）、ＥＤＣ／ＮＨＳカップリングを用いてＯＶＡに結合させたＰｏｒＡの周期的熱変性（方法ＩＩ）およびグルタルアルデヒド／ＮａＢＨ４カップリングを用いてＯＶＡに結合させたＰｏｒＡの周期的熱変性（方法ＩＩＩ）の３つの方法に従って変性させた。アミロイド様ミスフォールディングタンパク質コンフォメーションの存在を２つの異なるアッセイを用いて判定した。アミロイド特異的色素ＴｈＴの蛍光増強を評価し（図６Ａ、Ｃ）、アミロイド様ミスフォールディングタンパク質コンフォメーションを含むタンパク質と結合し、そのタンパク質により活性化されるセリンプロテアーゼであるｔＰＡの活性の増強を調べた（図６Ｂ、Ｄ）。図６ＡおよびＢでは、４００倍希釈のＰｏｒＡ保存溶液は総てクロスβ構造を含んでいることが分かる。ワクチンａ〜ｅの形成後、ミョウバンをアジュバントとする対照ワクチンおよび７５％のクロスβをアジュバントとするＰｏｒＡワクチンが、ｔＰＡ活性化アッセイにおいてアミロイド様ミスフォールディングタンパク質の存在が陽性と判定される（図６Ｄ）。しかしながら、ＴｈＴ蛍光分析（図６Ｃ）に基づけば、ミョウバンをアジュバントとするＰｏｒＡは陰性と判定され、本発明者らは、ミョウバンをアジュバントとするＰｏｒＡで見られたｔＰＡ活性化の増強は、ミョウバン沈殿の表面におけるｔＰＡ／プラスミノーゲンのアッセイ内ミスフォールディングによるものであり、その結果続いてｔＰＡの結合と活性化が生じたものと結論付ける。結論として、ＰｏｒＡ出発材料およびミスフォールディングＰｏｒＡはアミロイド様クロスβ構造を含む。
【０１２１】
抗ＰｏｒＡ抗体ＥＬＩＳＡおよびＳＢＡ
三価ＰｏｒＡ抗原、または３種類の個々のＰｏｒＡ亜型のいずれかを抗原として用いた抗ＰｏｒＡ抗体力価測定の結果を表４〜１８および図７ＡおよびＢに示す。２１日目に採取した血清をプールしたものにおける総抗三価ＰｏｒＡ抗体力価を図７Ａに示す。総てＰｏｒＡ抗原の接種を受けたマウス群ａ、ｂ、ｄ、ｅの血清をプールしたものは、抗ＰｏｒＡ抗体の存在が陰性と判定されるｃ群（バッファー／プラセボ）および免疫前血清と同等の総抗ＰｏｒＡ抗体力価を有することが明らかである。３種類の各ＰｏｒＡ亜型に対する力価を評価する場合、力価の値に関しては群内のマウス間の差が見られる。プラセボ群ｃは、免疫前血清と同様に、総てのマウスで陰性と判定された。ＰｏｒＡ接種を受けた各群内では、１個体以上のマウスが力価を全く示さなかった。ａ、ｂ、ｄおよびｅ群の間に差は見られなかった。
【０１２２】
図７Ｃおよび表１９〜２３では、３種類の各ＰｏｒＡ亜型でのＳＢＡ力価測定の結果を示す。抗原のＥＬＩＳＡを用いた場合と同様に、３種類の各ＰｏｒＡ亜型に対するＳＢＡ力価を評価する場合にも、力価の値に関して、群内のマウス間の差が見られた。プラセボ群ｃは総てのマウスで陰性と判定された。ＰｏｒＡ接種を受けた各群内では、１個体以上のマウスが力価を全く示さなかった。ａ、ｂ、ｄおよびｅ群の間に差は見られなかった。
【０１２３】
表２４では、抗ＰｏｒＡ亜型抗体力価および亜型特異的ＳＢＡ力価を各マウスで比較する。マウス３／ａ群／亜型Ｐ１．７−２，４、マウス１／ｂ／Ｐ１．１２−１，１３、マウス４／ｂ／Ｐ１．７−２，４およびマウス３／ｄ／Ｐ１．５−２，１０に対してＳＢＡで力価が見られた場合でも、抗原ＥＬＩＳＡで判定した場合には力価が存在しない場合があることは明らかである。抗原ＥＬＩＳＡで力価が見られた場合でもＳＢＡでは力価が存在しないという逆の場合も、マウス４／ａ／Ｐ１．７−２，１０、２／ｂ／Ｐ１．７−２，１０、２／ｄ／Ｐ１．５−２，１０、１／ｅ／Ｐ１．５−２，１０および４／ｅ／Ｐ１．７−２，４で見られる。このことは明らかに、髄膜炎菌サブユニットワクチンを開発する際に出くわす難点の１つを示す。あるアッセイでの陽性結果が、別のアッセイで予測される結果に関して一貫した推定値を持つとは限らない。惹起された抗体のエピトープおよび／または惹起された抗体の親和性／アビジティーの違いはこの食い違いに基づくものである。さらに、マウスが３種類総てＰｏｒＡ亜型に対して関連抗体力価を惹起するわけではないことも明らかに分かる。ほとんどの場合で、１または２つのＰｏｒＡ亜型に対する力価が現れた。これら３種類のＰｏｒＡ亜型の相対的免疫原性（Ｐ１．５−２、１０＞＞Ｐ１．１２−２、４〜Ｐ１．７−２，４）は、最も免疫原性の高い亜型Ｐ１．５−２、１０と比べた場合に免疫原性の低い２つの亜型に対して力価を生じたマウスの個体数に反映される。無アジュバントＰｏｒＡおよび従来のミョウバンをアジュバントとするＰｏｒＡとクロスβ−ＰｏｒＡをアジュバントとするワクチンを比較すると、抗体の生成が見られたマウスの個体数には差がなく、力価が生じた亜型に関しても差は見られず、ＳＢＡ力価の随伴を考慮する場合には、抗原ＥＬＩＳＡの推定力に関しても差は見られない。従って、結局のところ、ＰｏｒＡに対して殺菌性抗体を惹起するかどうかを調べるこの第一の試験では、クロスβ構造によるアジュバンド形成(法)技術(Adjuvation-through-crossbeta structure technology)により、従来用いられているミョウバンをアジュバントとするＰｏｒＡと同じ効力のワクチンが得られることが分かった。このクロスβ構造によるアジュバンド形成技術により、現在利用可能な髄膜炎菌多価ＰｏｒＡ亜型ワクチンの改良のためのいくつかの手段が得られる。例えば、防御力価を惹起するために用いる材料が少ない。もっと重要なことでは、免疫原性の低い亜型を考える場合には、問題のある亜型に対して特異的にクロスβ構造によるアジュバンド形成技術を用いることで、効果的な防御免疫原性の改良が達成される。クロスβ構造によるアジュバンド形成技術を提供した後、防御抗体惹起能に関して最適なクロスβ構造を有する亜型を、例えば多価サブユニットワクチンと同時投与する。あるいは、この技術を完全多価サブユニットワクチンに適用する。免疫強度の低いＰｏｒＡ亜型を強力な免疫原性クロスβ構造を含む別のタンパク質に結合させると、望ましい抗体の開発に近づく。さらに、多価ワクチンにおいてＰｏｒＡの他に免疫強度の高いクロスβ構造を有するタンパク質を適用する場合、無関連のタンパク質に対する抗原力価が、殺菌性抗体の存在に関する推定手段となる。
【０１２４】
最後に、現在、ミョウバンは、ＰｏｒＡワクチンの処方に選択アジュバントとして用いられている。クロスβ構造によるアジュバンド形成技術をワクチン開発、例えばＰｏｒＡワクチンの開発に適用すれば、最終処方物において、ＰｏｒＡワクチンの処方のため、クロスβ構造を含むタンパク質性分子以外のアジュバント（例えばミョウバン）を付与する必要はもはやなくなる。もちろん、他の場合では、現在用いられているアジュバントの量が、完全には除かれないまでも低減され、これはとりわけ安全問題、コストの低減、使用のしやすさ、および安定性に関して有益である。
【０１２５】
実施例１０
クロスβ構造を含むヒト抗原でマウスを免疫化すると、非処理ヒト抗原に対して抗体力価が生じ、マウスの耐性が打破される
クロスβ構造を有する、自己免疫疾患抗リン脂質抗体症候群における自己抗原ヒトβ２−糖タンパク質Ｉは、マウスにおいて自己β２−糖タンパク質Ｉに対する力価を誘導する
材料および方法
ミスフォールディングβ２−糖タンパク質Ｉの免疫化
保存溶液
ヒトβ２−糖タンパク質Ｉの保存溶液；１倍Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２（１倍ＴＢＳ）中８００μｇ／ｍｌ。カルジオリピン小胞は、Ｓｕｂａｎｇらによるプロトコール（２）に従ってカルジオリピン(Sigma;C-1649)の層状溶液から調製した。２００μｌのカルジオリピンをガラス試験管に入れ、一定のＮ２流によりエタノールを蒸発させた。乾燥カルジオリピンを１０４μｌの１倍ＴＢＳで再構成し、十分ボルテックスにかけた。得られた溶液は１０ｍｇ／ｍＬ（７．１４ｍＭ）のカルジオリピン小胞を含んだ。この溶液を４℃で最長１４日間保存することができた。希釈は総てＴＢＳで行い、保存後、使用前に溶液をボルテックスにかけた。
【０１２６】
改変法：アルキル−β２ｇｐｉの調製
β２−ＧＰＩを次のように還元およびアルキル化した。６４０μｌのβ２−ＧＰＩ保存溶液を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．２中、６４０μｌの８Ｍ尿素（冷却溶液）と混合した。この溶液をＮ２ガスでおよそ６分間脱気した。１Ｍ  ＤＴＴ保存溶液から１２．８μｌをこの溶液に加え、混合し、室温で３時間インキュベートした。１Ｍヨードアセトアミド(Sigma;I-6125)を調製し、その２５．６μｌをβ２−ＧＰＩ反応混合物に加えた。次に、この溶液をＰＢＳに対して透析した。得られたアルキル−β２ｇｐｉのミスフォールディングを、ＴｈＴ蛍光の増強を測定することにより、また、発色アッセイでプラスミンを生じるｔＰＡ／プラスミノーゲンを活性化する能力の増強により判定した。この発色アッセイは４００ｐＭ  ｔＰＡ、２０μｇ／ｍｌプラスミノーゲンを用いて行った。アルキル−β２ｇｐｉで得られたシグナルを天然型β２ｇｐｉ出発材料で得られたものと比較した。
【０１２７】
天然型β２ｇｐｉ、アルキル−β２ｇｐｉおよびカルジオリピン−β２ｇｐｉによるマウスの免疫化
７〜９週齢の雌Ｂａｌｂ／Ｃ  ＡｎＮＨＳｄ(BalB/C, Harlan)を各群マウス５個体としてフィルタートップケージで飼育した。およそ１週間の環境馴化後、免疫前血清を採取した。第１週目のはじめにマウスに１００μｌの血漿（１５０μｇ／ｍｌ）β２−糖タンパク質Ｉ、１００μｌのアルキル−β２−糖タンパク質Ｉ（１５０μｇ／ｍｌ）または１５０μｇ／ｍｌのβ２−糖タンパク質Ｉと９．３３μＭのカルジオリピン（ＣＬ−β２ｇｐｉ）の混合物１００μｌを与えた。後者のサンプルは、４００μｇ／ｍｌのβ２−ＧＰＩを２５μＭのカルジオリピン小胞とともに、ピペット操作でサンプルを混合した後に室温で少なくとも１０分間プレインキュベーションし、その後、サンプルを１５０μｇ／ｍｌに希釈した。ＣＬ−β２ｇｐｉ調製物中のミスフォールディングβ２ｇｐｉの存在を、ＴｈＴ蛍光の増強およびｔＰＡ／プラスミノーゲン活性化刺激能の増強を測定することにより判定した。希釈液は総てＴＢＳで新しく作製し、氷上で維持した。注射はマウスの尾の静脈から、第１週と第３週の月曜と金曜に行った。試験開始の３日前と、第２週と第４週の素要に、伏在静脈穿刺により採血した。血液は、Ｚ血清血餅アクチベーターを含むEasycollectチューブに採取した。血清は、ローター径７ｃｍの卓上遠心機にて、３８００ｒｐｍ、１０分の遠心分離（スロースタート・スローストップ）により調製し、さらなる分析まで−２０℃で保存した。
【０１２８】
力価の測定
血清の、非改変天然型（コーティング）β２−ＧＰＩに対する抗体を分析した。Microlon high-binding９６ウェルプレート(Greiner,Alphen aan den Rijn,オランダ)をウェル当たり５０μｌの天然型β２−ＧＰＩ（１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６、０．０５％ＮａＮ３中、５μｇ／ｍＬ）で１時間コーティングした。次に、これらのウェルを排出し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含有する３００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。洗浄後、ＰＢＳ中、２００μＬのブロッキング試薬(Roche,Almere,オランダ)とともに１時間インキュベートすることによりウェルをブロッキングした。ウェルを排出し、３００μｌのＰＢＳＴで２回洗浄した。抗体力価は、天然型ヒトβ２ｇｐｉでコーティングしたプレートに各実験群（ｎ＝５）のプール血清を３倍連続希釈（１：３０からはじまる、５０μｌ／ウェル）で加えることにより求めた。これらのプレートを３００μｌのＰＢＳＴで４回洗浄した。ＰＢＳＴで１：３０００希釈したペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウス抗体（ＲＡＭＰＯ）をウェルに加え、１時間インキュベートした。プレートを排出し、３００μｌのＰＢＳＴで４回、さらに３００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。これらのプレートを、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質(Biosource Europe,Nivelles,ベルギー)を用いておよそ５分間染色し、２ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止させ、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ３４０マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにて読み取った。吸光度の値をｌｏｇ希釈率に対してプロットした。曲線をシグモイド曲線に当てはめた(GraphPad Prismバージョン4.02 Windows用, Graphpad Software,CA,USA)。比較のため、バックグラウンドを差し引いた残りの吸光度が０．１となる希釈率を任意に種々の血清の力価とした。
【０１２９】
同様のＥＬＩＳＡ法では、天然型ヒトβ２ｇｐｉ、アルキル−β２ｇｐｉ、ＣＬ−β２ｇｐｉで免疫した後の１００倍希釈血清および免疫前血清と固定化ネズミβ２ｇｐｉとの結合を評価した。このようにして、ヒトβ２ｇｐｉによるマウスの免疫化がネズミβ２ｇｐｉに対して体液性の自己免疫応答を惹起するかどうかが判定される。
【０１３０】
結果
従来のアジュバントを用いずに、クロスβをアジュバントとするミスフォールディングβ２ｇｐｉによるマウスの免疫化
ヒト天然型β２ｇｐｉのカルジオリピン曝露またはβ２ｇｐｉにおけるシステイン残基のアルキル化はアミロイド様タンパク質コンフォメーションを誘導する（図８Ａ、Ｂ）。１５μｇ抗原／動物の注射を４回受けたマウスの免疫化により、アルキル−β２ｇｐｉおよびＣＬ−β２ｇｐｉは天然型β２ｇｐｉよりもはるかに高い体液性免疫応答を惹起したことが明らかになった（図８Ｃ、Ｄ）。このことは、アミロイド様特徴の外観を伴うβ２ｇｐｉのミスフォールディングのみによるクロスβアジュバンド形成法がそれに高い免疫力を与えることを示す。天然型ヒトβ２ｇｐｉ、アルキル−β２ｇｐｉおよびＣＬ−β２ｇｐｉによる免疫化の後にマウス自己β２ｇｐｉに対する抗体力価を評価した場合、ヒト天然型β２ｇｐｉと結合する抗体の力価の増強の他、ヒトβ２ｇｐｉ中にアミロイド様構造が存在する場合に、ネズミβ２ｇｐｉに対する自己免疫抗体力価が上昇したことが明らかに分かった（図８Ｅ）。このことにより、タンパク質のアミロイド様特性が免疫原性の誘因となり、クリアランスをもたらすという洞察のさらなる証拠が得られる。クロスβ構造は、退化したタンパク質のクリアランスのためのクロスβ経路内の防御機構の一部である。さらに、耐性は体液性免疫応答が生じるかどうかの決め手となる側面ではないことを示す。その部分がその個体にとって危険とみなされるかどうか、従ってまた、個体がアミロイド様部分に曝されることが十分に抑えるべきことかどうかを決めるのは、抗原のアミロイド様特性である。本発明者らのデータは、基礎にあるアミノ酸配列が自己起源のものか、あるいは非自己起源のものかは主要な決定パラメーターでないことを示す。新たなワクチン接種アプローチは、感染以外の疾病において役割を果たす、例えば、雄性免疫弱化のためのＬＨＲＨに対する抗体を誘導するため、または移植片対宿主病（ＧｖＨ）および／または移植拒絶において用いるための、自己抗原に対するワクチンの開発に関しても可能となった。
【０１３１】
実施例１１〜１４
Ｅ２、ＣＬ３、Ｈ５、Ｈ７を用いた免疫試験のための材料および方法
抗原鳥インフルエンザヘマグルチニン−５のクローニング、発現および精製
ウイルス株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４のヘマグルチニン−５（Ｈ５またはＨＡ５）ｃＤＮＡはL. Cornelissen博士（ID-Lelystad，オランダ）の厚意による譲渡品であった。プライマーＣＡＩ  １２７と１２９を用いてＤＮＡを増幅し、ABC-expression facility(R. Romijn and W. Hemrika,ユトレヒト大学，オランダ_にて、プライマー5'ggatccgatcagatttgcattggttacc 3'と5'gcggccgccagtatttggtaagttcccat 3'を用い、Ｈ５  ｃＤＮＡをさらに増幅した。このＰＣＲ断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターに連結した。配列解析はBaseclear（Leiden，オランダ）で行った。クローン７０９−５のＨ５配列は、２つのサイレント突然変異（配列番号１参照；太字／下線、ａ→ｇおよびｔ→ａ）を含んでいた。このＨ５  ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、精製し、ｐＡＢＣ−ＣＭＶ−ｄＥ−ｄＨ−ｓｕｂ−optimal_sp−Ｆｌａｇ３Ｃ−ｈｉｓＣ_（ｐＵＣ）（配列番号２参照；サブオプティマルシグナル配列は下線／斜体、ＦＬＡＧタグ  Ｈｉｓタグは太字／下線）およびｐＡＢＣ−ＣＭＶ−ｄＥ−ｄＨ−Cystatine_sp−Ｆｌａｇ３Ｃ−ｈｉｓＣ_（ｐＵＣ）発現ベクター（ABC-expression facility）に連結した。このようにして、カルボキシ末端ＦＬＡＧタグ  Ｈｉｓタグを有するＨ５が発現される。
【０１３２】
Ｈ５の発現および精製
Ｈ５−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓタンパク質の発現のため、ＨＥＫ２９３Ｅ（ヒト胎児腎臓）懸濁細胞の２リットル培養物を、ポリエチレンイミンを用い、発現ベクターで一時的にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を５〜６日間増殖させた。細胞培養培地中に分泌されたＨ５の精製のため、細胞をペレットとし、１０ｋＤａカットオフのフィルター(GE Healthcare)を用い、Ｑｕｉｘｓｔａｎｄ濃縮装置(AJG Technology Corp.)を用いて上清を濃縮した。同じ濃縮装置で透析工程も行い、タンパク質をＰＢＳ／１Ｍ  ＮａＣｌに対して透析した。濃縮および透析した培地を濾過し（０．４５μｍ、Millipore）、７．５ｍＭイミダゾールの存在下、室温で３時間、一定攪拌下で、Ｎｉ−セファロース・ファースト・フロー・ビーズ(GE-Healthcare 17-5318-02)とともにインキュベートした。カラムをこのビーズで満たし、イミダゾール濃度を上昇させてタンパク質を抽出した。精製はAKTA Explorer(Pharmacia)で行った。Ｈ５を含む画分をプールし、さらに精製するために再びＮｉ−セファロースビーズに付加した。Ｈ５を含む画分をプールし、ＰＢＳに対して透析した後、標準的なＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット(Pierce No. 23225)を用いてＨ５濃度を測定した。Ｈ５の分子量はおよそ７５ｋＤａであった。プールしたＨ５溶液（２３６μｇ／ｍｌ）をアリコートに分け、−８０℃で保存した（ロット１  ＣＳ２１０４０６）。Ｈ５タンパク質の第二バッチ（ロット２画分Ｘ２５０５０６ＣＳ）の濃度はＰＢＳ中、１４０μｇ／ｍｌであった。
【０１３３】
鳥インフルエンザＨ７
ウイルス株Ａ／ニワトリ／オランダ／６２１５５７／０３のＨ７  ｃＤＮＡは、L. Cornelissen（ID-Lelystad，オランダ、ＢｇｌＩＩ−ＮｏｔＩ、プライマーＲＤＳＨ７’５とＲＤＳ７’３’を用いて増幅）の厚意による譲渡品であり、ＰＣＲ断片として提供された。ABC-expression facility(R. Romijn and W. Hemrika, ユトレヒト大学，オランダ)にて、このＨ７  ＰＣＲ断片を、プライマー5' agatctgacaaA(g)atctgccttgggcatcat 3'と5'gcggccgcaagtatcacatctttgtagcc 3'を用いて増幅した。このＰＣＲ断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターに連結した。配列解析はＢａｃｅｃｌｅａｒで行った。クローン７１０−１５のＨ７配列は４つの突然変異を含んでおり、そのうち２つはアミノ酸突然変異をもたらすものである（配列番号３および４参照；ａ→ｇ、ｇ→ａ、ｇ→ａ（Ａｒｇ→Ｌｙｓ）、ａ→ｇ（Ｍｅｔ→Ｖａｌ））。Ｈ７  ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ消化にて単離し、ｐＡＢＣ−ＣＭＶ−ｄＥ−ｄＨ−ｓｕｂ−optimal_sp−Ｆｌａｇ３Ｃ−ｈｉｓＣ_（ｐＵＣ）（配列番号４参照；サブオプティマルシグナル配列は下線／斜体、ＦＬＡＧタグ−Ｈｉｓタグは太字／下線）およびｐＡＢＣ−ＣＭＶ−ｄＥ−ｄＨ−シスタチン＿ｓｐ−Ｆｌａｇ３Ｃ−ｈｉｓＣ_（ｐＵＣ）発現ベクター(ABC-expression facility)に連結した。このようにして、カルボキシ末端ＦＬＡＧタグ−Ｈｉｓタグを有するＨ７が発現する。
【０１３４】
Ｈ７の発現および精製
２リットルの細胞懸濁液からの細胞を遠心分離によりペレットとし、細胞ペレットを単離し、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．２に５０ｍｌ量になるよう再懸濁させた。これらの細胞を１回凍結−解凍し、この細胞懸濁液に５個のプロテアーゼ阻害剤混合錠剤（Rocheカタログ番号11 836 170 001）を加えた。この細胞懸濁液を氷上で音波処理し、４℃、２１，０００＊ｇで１時間遠心分離した。上清を濾過し（０．４５μｍ）、４℃、一定攪拌下で１６時間、２０ｍＭイミダゾールの存在下、Ｎｉ−セファロース・ファースト・フロー・ビーズとともにインキュベートした。カラムを充填した後、イミダゾール濃度を上昇させてＨ７を溶出した。Ｈ７の発現は、クーマシーを用いるポリアクリルアミドゲルにて、また、１：３０００抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ(Sigma A-8592)を用いるウエスタンブロットにて分析した。Ｈ７を含む画分をプールし、４℃にてＰＢＳ  ｐＨ７．４に対して透析し、アリコートに分け、−８０℃で保存した。プールしたＨ７溶液の濃度は、標準曲線のため精製Ｅ２−Ｆｌａｇを既知濃度で用いるウエスタンブロットでの濃度分析により測定したところ、１０．５μｇ／ｍｌであった（Ｈ７の分子量はおよそ７５ｋＤａでる（ロット２ 05-2006CS）。
【０１３５】
ＨＥＫ２９３Ｅ細胞による発現およびその後のＥ２の精製
豚コレラウイルス(Classical Swine Fever virus, CSFV)の糖タンパク質Ｅ２のＤＮＡは、Geneart（レーゲンスブルク，ドイツ，配列番号５および６）から入手した。この構築物をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩＩで消化し、ベクターｐＡＢＣ６７４(ABC-expression facility)に連結し、これによりカルボキシ末端ＦＬＡＧタグ−Ｈｉｓタグを有する組換えＥ２を拡張する。ＨＥＫ２９３Ｅ細胞を一時的にトランスフェクトし、５〜６日間増殖させた(C. Seinen,University Medical Center Utrecht,オランダ)。精製はＨ５およびＨ７に関して記載した方法と本質的に同様とした。Ｎｉ２＋−カラム用の結合バッファーは、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．２であった。Ｅ２を含む画分をプールしたものを透析した後、純度はゲルから、ImageQuantソフトウエア(Molecular Dynamics)を用いて判定した。Ｅ２の純度はおよそ９０％であった。タンパク質濃度はＢＣＡ法で測定し、ＰＢＳ中、６５５μｇ／ｍｌであった。アリコートに分けた保存溶液中のＥ２濃度は５６１μｇ／ｍｌであり、これを−８０℃で保存した（ロット１  ２１０４０６ＣＳ）。
【０１３６】
Ｓｆ２１細胞による発現およびその後のＥ２の精製
ＣＳＦＶに対する新たなクロスβをアジュバントとするＥ２ワクチンを試験するため、ＣＳＦＶの組換え糖タンパク質Ｅ２も発現させ、精製した。このＥ２の生産は、Animal Sciences Group(ASG,ID-Lelystad,オランダ)にてR.D. Strangi(TU Eindhoven,オランダ)により行われた。液体窒素からのヨトウガ(Spodoptera frugiperda)（Ｓｆ２１）細胞系統(P.A. van Rijn,ID-Lelystad４)アリコートを水浴中で３７℃まで急速解凍した。その後、１．５ｍｌの細胞培養物を、１％ｖ／ｖ抗生物質−抗真菌薬(Gibco,15240-062)を添加した２７ｍｌの予温増殖培地（Ｌ−グルタミンを含むＳＦ９００−ＩＩ血清フリー培地，Ｇｉｂｃｏ）を含む１５０ｃｍ２フラスコに移し、２８℃で増殖させた。次に、Ｓｆ２１培養物を、実施量３０ｍｌの細胞懸濁液が得られるまで、別の１５０ｃｍ２フラスコで拡張した。
【０１３７】
ＳＦ９００−ＩＩ培地中で増殖させたＳｆ２１細胞を、Ｈｕｌｓｔら（５）が記載しているように、Ｅ２発現バキュロウイルスに感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ．）０．０１で感染させ、２８℃で２８０時間インキュベートした。いくつかの時点で、培地中のＥ２発現レベルを下記のように表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定した。６００ｘｇで１０分間の遠心分離により、培地から細胞残渣を取り除き、ＮａＮ３を終濃度が０．０２％となるように加えた後、４℃で保存した。
【０１３８】
抗Ｅ２抗体による表面プラズモン共鳴
抗Ｅ２抗体および組換えＥ２を含む細胞培養培地を用いた結合実験は、ＣＭ５研究級チップを用い、Biacore 3000 instrument(Biacore AB,Uppsala,スウェーデン)にてＳＰＲを用いて行った。標準化されたアミンカップリング法を用いてセンサー表面にタンパク質を共有結合させ、これは、１００ｍＭ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と４００ｍＭ  Ｎ−エチル−Ｎ’−（ジメチル−アミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）の１：１混合物を流速５μｌ／分で７分間注入することでこのＣＭ５センサー表面のデキストラン表面をまず活性化することを含む。抗Ｅ２抗体α−Ｖ３(ID-Lelystad)を酢酸バッファーｐＨ５．５で１：４０希釈し、流速する１０μｌ／分で７分間の注入により活性化されたデキストランに共有結合させた。各フローセルに残った活性化基は、３５μｌの１Ｍ塩酸エタノールアミンｐＨ８．５を注入することによりブロッキングした。解離は、注入されたサンプルがランニングバッファーにより置き換えられる際に開始した。２分間の解離の後、残留応答単位（ＲＵ）を測定した。濾過および脱気したＨＢＳ−ＥＰバッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）をランニングバッファー（Ｂｉａｃｏｒｅ）として用いた。培養培地をランニングバッファーで１：１０希釈し、Ｅ２と固定化α−Ｖ３との結合を測定した（示されていない）。
【０１３９】
α−Ｖ３抗Ｅ２抗体アフィニティーカラム
モノクローナル抗Ｅ２抗体α−Ｖ３（９ｍｇ／ｍｌ、ASG,ID-Lelystadで生産および精製）を、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．３に対して透析した。透析膜(Medicell International Ltd,カットオフ分子量１２〜１４，０００Ｄａ）を、２％（ｗ／ｖ）重炭酸ナトリウムおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０を含む水中で３０分間加熱した。次に、これを１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０中で１０分間煮沸した。抗体α−Ｖ３を、４℃にて、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．３  ４リットルに対して、全部で４回更新して透析した。透析したモノクローナル抗体α−Ｖ３を、製造業者の使用説明書に従い、ＣＮＢｒ活性化ファロース−４Ｂ(Amersham Biosciences AB,Uppsala Sweden)と共有結合させた(as coupled to)。１．５ｇのＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂを３００ｍｌの１ｍＭ  ＨＣｌ中で１５分間膨潤させた。その後、これらのセファロースビーズを、短時間回転沈降させ、上清を新しい１ｍＭ  ＨＣｌに置き換えることにより、４回洗浄した。０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．３中、α−Ｖ３抗体を加え、回転装置上、室温で２間インキュベートした。結合していないα−Ｖ３を０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．３  ５０ｍｌで洗い流した。次に、マトリックスに残留する活性基を、２０ｍｌのグリシンｐＨ８．０とともに１時間インキュベートすることによりブロッキングした。その後、交互ｐＨ（０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．３、次いで０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．０）で３回の洗浄を行った。最後に、１０ｍｌの０．１ＭグリシンｐＨ２．５による洗浄を行った後、ＰＢＳで洗浄した。その後、０．０２％ｗ／ｗ  ＮａＮ３を添加したＰＢＳ中、４℃でこのカラムを保存した。
【０１４０】
Ｅ２の精製
拡張したＳｆ２１細胞のウイルス感染の開始から２８０時間後、培養培地を５０ｍｌ試験管に採取し、６００ｘｇで１０分の遠心分離により細胞および細胞残渣を取り除き、４℃で保存した。細胞ペレットから上清を分離し、０．０２％ｗ／ｗアジドを加えた。その後、下記のような３工程で細胞培養上清からＥ２を精製した：工程１（ロット１  ２００４０６ＲＳ）：Ｅ２培養培地を、室温で２．５時間、流速６０ｍｌ／時でα−Ｖ３アフィニティーカラムに循環させた後、ＰＢＳで一晩洗浄した。Ｅ２は０．１ＭグリシンｐＨ２．５で溶出させた。溶出液を３ｍｌ画分で回収し、４５μｌの３Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基を加えることでｐＨ７〜８に直接調整した。次に、精製Ｅ２タンパク質を含有する画分をＰＢＳに対して透析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。BCA Protein Assay(Pierce)を用いてタンパク質を定量した後、９５％を超える純度のＥ２を含む画分をプールし、−８０℃で保存した。プールした画分中のＥ２濃度はロット１  ２００４０６ＲＳで２８５μｇ／ｍｌであった。同じ細胞培養上清から、α−Ｖ３アフィニティーマトリックス（工程２、ロット２  ０３０５０６ＲＳ）に再循環させることにより、さらなる量のＥ２が抽出された。工程３（ロット３  １００５０６ＲＳ）：発現したＥ２を含む細胞培養培地の第二バッチをまず−８０℃で保存し、その後、上記のようなＥ２精製に用いた。まず、１５ｍｌ  Ｍａｃｒｏｓｅｐ  １０Ｋ濃縮装置（Ｐａｌｌ）を用いて培地を濃縮した。３．３倍濃縮されたＥ２培地を室温で５時間、流速６０ｍＬ／時でアフィニティーカラムに循環させた後、ＰＢＳで５時間洗浄した。最初の精製工程の後、次の精製のため、濃縮された培地をカラムに再ロードした。Ｅ２はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法で分析した。サンプルを４〜１５％のポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE,NUPAGE,Invitrogen)に適用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に、サンプルを２０ｍＭ  ＤＴＴの存在下、９５℃で５分間加熱した。分離したタンパク質をニトロセルロースブロット膜に移し、Ｅ２タンパク質を、まずα−Ｖ３とともに、次にＲＡＭＰＯとともにインキュベートした後、ケモルミネッセンス(Western Lightning,Perkin-Elmer)で染色することにより可視化した。
【０１４１】
肝蛭(Fasciola hepatica)カテプシンＬ３タンパク質の発現および精製
肝蛭のカテプシンＬ３タンパク質（ＣＬ３タンパク質）の組換えＤＮＡはＧｅｎｅａｒｔから入手した（配列番号７参照）。この構築物をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し、ベクターｐＡＢＣ６７４(ABC-expression facility)に連結し、これによりカルボキシ末端ＦＬＡＧタグ  Ｈｉｓタグを有する組換えＣＬ３タンパク質を拡張する。５〜６日間発現させた後、２リットルの懸濁培養からペレット化したＨＥＫ２９３Ｅ細胞を２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．２に５０ｍｌ量となるように再懸濁させた。細胞を１回凍結−解凍し、この細胞懸濁液に５個のプロテアーゼ阻害剤混合錠剤（Rocheカタログ番号11 836 170 001)を加えた。この細胞懸濁液を氷上で音波処理し、４℃、２１，０００＊ｇで１時間遠心分離した。上清を濾過し（０．４５μｍ、Millipore）、イミダゾールを終濃度１０ｍＭとなるように加えた。このＣＬ３タンパク質を、ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰ  １ｍｌカラム(GE Healthcare 17-5247-01)に流速０．７５ｍｌ／分、閉鎖系でロード／再ロードした。結合したＣＬ３−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓをカラムにイミダゾール勾配を適用して溶出させた。精製されたタンパク質は、クーマシー染色(Fermentas PageBlue R0571)を伴ったＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動(Invitrogen,NuPage 4-12% BisTris NP0323)により可視化した。さらに、ＣＬ３に対してウエスタンブロット法を行った後、抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ(Sigma A-8592)とＨＲＰ触媒検出のためのルミノールに基づく基質(Western Lightning Chemi-luminescence Reagent Plusカタログ番号NEL 104)を用いて染色した。ＰＢＳに対して透析した、ＣＬ３タンパク質を含む画分をプールしたものの純度は、クーマシー染色ゲル上での濃度分析により評価したところ、およそ７．５％であった。全タンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌタンパク質を含む溶液が吸光度１．０となると仮定して算出するで求めた。全タンパク質濃度は４００μｇ／ｍｌであった。純度を考慮に入れると、このＣＬ３タンパク質濃度はＰＢＳ中、およそ３０μｇ／ｍｌである。ＣＬ３タンパク質の分子量は、Ｎ結合炭水化物１個を含めおよそ３８ｋＤａである。タンパク質溶液をアリコートに分け、−８０℃で保存した（ロット１  ０１０６０６ＣＳ）。
【０１４２】
肝蛭カテプシンＬ３ペプチドとキーホールリンペット・ヘモシアニンとのコンジュゲーション
免疫試験のため、治験肝蛭のカテプシンＬ３ペプチド（ＣＬ３ペプチド，Ansynth Service B.V, Roosendaal, オランダ、ロットＢＢ１；配列はCatepsin L-like cystein proteinase UniProtKB/Swiss-Prot entry www.expasy.org/uniprot/P80528から入手し、アミノ末端システインを延長した：ＣＳＮＤＶＳＷＨＥＷＫＲＭＹＮＫＥＹＮＧ；配列番号８）を用いた。このアミノ末端システインは、Ｉｍｊｅｃｔマレイミドで活性化した海中養殖キーホールリンペット・ヘモシアニン（ｍｃＫＬＨ）担体タンパク質(Pierce)に結合させるために導入した。ＣＬ３ペプチドとマレイミド活性化ｍｃＫＬＨとのコンジュゲーションは逓増業者のマニュアルに従って行った。凍結乾燥されたＣＬ３ペプチドを供給されているコンジュゲーションバッファー（８３ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、０．９Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．２を含有）に、終濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるように溶かした。マレイミド活性化ｍｃＫＬＨは蒸留水で１０ｍｇ／ｍｌに再構成した。この２種の溶液を混合し、回転装置上、室温で２．５時間インキュベートした。コンジュゲーション後、生じた沈殿を、１６，０００ｘｇで１０分の遠心分離により上清から分離した。沈殿を含んだペレットを氷上で保存した。この上清を、８３ｍＭリン酸ナトリウム、０．９Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．２を含むランニングバッファーを用い、Ｄ塩デキストラン脱塩カラム（カットオフ分子量５ｋＤａ、Pierce）に適用することにより、溶液中のコンジュゲートを過剰な有利ＣＬ３ペプチドから精製した。０．５ｍｌ画分を採取し、タンパク質濃度をＢＣＡ法(Pierce)で測定した。コンジュゲートの存在はＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシーで、またＥＬＩＳＡでも評価した。コンジュゲートを含む画分をプールし、次に、このプール画分に単離したペレットを溶かした。その後、ＣＬ３−ＫＬＨコンジュゲートを４リットルのＰＢＳに対して透析した。タンパク質の定量はＢＣＡタンパク質アッセイ(Pierce)を用いて行い、このコンジュゲート懸濁液を４℃で保存した。ＣＬ３−ＫＬＨ濃度は１．３５ｍｇ／ｍｌであった。ＥＬＩＳＡでは、濃一連の濃度の遊離ＣＬ３ペプチド、遊離ＫＬＨおよびＣＬ３−ＫＬＨコンジュゲート、ならびにコートバッファー単独をMicrolon high-binding９６ウェルプレート(Greiner)のウェルにコーティングした。ブロッキング試薬(Roche)でブロッキングした後、ＰＢＳ／０．１％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０中、５００倍希釈のマウス抗ＣＬ３血清（ID-Lelystad、A. Antonisにより供給、コード「ＹＭ３０，ＩＩＩ  Ｃ１１Ｃ７Ｅ８」）でウェルを覆った。抗ＣＬ３抗体の結合はＲＡＭＰＯ(DAKO Cytomation, P0260, ロット00020228)−１，２−フェニレンジアミン／Ｈ２ＳＯ４の吸光度測定（４９０ｎｍ）を用いて可視化した。ＣＬ３−ＫＬＨコンジュゲート中のＣＬ３画分は、抗体結合を、遊離ＣＬ３ペプチド標品をコーティングした場合に得られたものと比較することで評価した。ＣＬ３：ＫＬＨ比はおよそ１：１であった。
【０１４３】
ワクチンの作製：クロスβ構造を含むアミロイド様ミスフォールディングタンパク質コンフォメーションの形成
種々の抗原におけるアミロイド様ミスフォールディングタンパク質コンフォメーションの導入は、異なるミスフォールディング技術を用いて行う。ミスフォールディングの程度は、抗原溶液のＴｈＴ蛍光増強能を分析し、かつ／またはｔＰＡにより媒介されるプラスミノーゲンからプラスミンへの変換を刺激する能力を評価することにより評価した。
【０１４４】
Ｈ５を用いたミスフォールディング法Ｉ：ＯＶＡと混合したＨ５の熱周期によるミスフォールディング
ミスフォールディングに用いるＨ５保存溶液：ＰＢＳ中、２３６μｇ／ｍｌのＨ５ロット１  ＣＳ２１０４０６。ＯＶＡをＨ５溶液に終濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるように溶かした。次に、Ｈ５／ＯＶＡ溶液に対して、ＰｏｒＡに関して上記した手順に従い、熱周期によるミスフォールディングを行った。
【０１４５】
ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に由来するＨ５によるミスフォールディング法ＩＩ：ＥＤＣ−ＮＨＳカップリングを用い、オボアルブミンとコンジュゲートさせたＨ５を用いた熱周期によるミスフォールディング
用いたＨ５保存溶液は、ＰＢＳ中、２３６μｇ／ｍｌの天然型Ｈ５  ロット１  ＣＳ２１０４０６であった。ＰｏｒＡと同様（上記参照）、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞から得られたＨ５をＯＶＡとコンジュゲートした。Ｈ５濃度およびＯＶＡ濃度はそれぞれ１６９μｇ／ｍｌおよび１０００μｇ／ｍｌであった。カップリングの後、溶液をＰＢＳに対して透析した。次に、これらの溶液をＰＣＲカップに移し、周期的熱熱変性でミスフォールディングした。
【０１４６】
Ｈ５に適用したミスフォールディング法ＩＩＩ：グルタルアルデヒド／ＮａＢＨ４活性化によるポリペプチドＡとポリペプチドＢのカップリング
ＰｏｒＡと同様に、Ｈ５とＯＶＡのカップリングでも、両タンパク質をグルタルアルデヒドおよび水素化ホウ素ナトリウムで活性化し、混合した。この目的で、２５０μｇのＯＶＡを１ｍｌのＨ５保存溶液に溶かし、１８０μｌのＰＢＳを加えた。Ｈ２Ｏ中、４％の１００倍保存溶液となるように予め希釈したグルタルアルデヒド（Ｈ２Ｏ中２５％（ｖ／ｖ）溶液， Merck, Hohenbrunn, Germany, 8.20603.1000 (UN2927, 毒性)、ロットＳ４５０３６０３  ５４９）を終濃度が０．０４％となるように加えた。ボルテックスにかけ、室温で２分間インキュベートした後、１２０ｍＭの１００倍保存溶液ＮａＢＨ４（およそ９８％、Sigma, セントルイス, MO, USA, S9125, ロット５３Ｈ３４７５）を終濃度が１．２ｍＭとなるように加えた。この溶液をボルテックスにかけ、回転装置にて室温で４２時間インキュベートした。その後、この溶液をＰＢＳに対して徹底的に透析した。このコンジュゲート溶液を上記のような５回の熱周期で加熱した。
【０１４７】
Ｈ７を用いたミスフォールディング法Ｉ：遊離Ｈ７またはＯＶＡと混合したＨ７の熱周期によるミスフォールディング
ミスフォールディングに用いたＨ７保存溶液：ＰＢＳ中、２１．４μｇ／ｍｌのＨ７ロット１  ＣＳ２１０４０６。Ｈ７溶液に何も添加せずに熱ミスフォールディングを行うか、Ｈ７保存溶液にＯＶＡを終濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるように溶かした後にＨ７を熱的にミスフォールディングした。熱周期によるミスフォールディングはＰｏｒＡに関して上記したように行った。
【０１４８】
Ｈ７を用いたミスフォールディング法ＩＩ：ＥＤＣ−ＮＨＳカップリングを用い、オボアルブミンとコンジュゲートさせたＨ７を用いた熱周期によるミスフォールディング
ミスフォールディングに用いたＨ７保存溶液：ＰＢＳ中、２１．４μｇ／ｍｌのＨ７ロット１  ＣＳ２１０４０６。ＰｏｒＡと同様に（上記参照）、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞により発現されたＨ７をＯＶＡとコンジュゲートした。最終的なＨ７濃度は１０．７μｇ／ｍｌであり、ＯＶＡ濃度は１ｍｇ／ｍｌであった。カップリング後、コンジュゲート溶液をＰＢＳに対して透析した。次に、この溶液をＰＣＲカップに移し、３０℃から８５℃まで５℃／分、そして４℃まれ急速冷却の１サイクルを行い、周期的熱熱変性でミスフォールディングした。
【０１４９】
Ｓｆ１細胞由来のＥ２の熱周期によるミスフォールディング
ＰＢＳ中、Ｓｆ１細胞により発現されたＥ２を精製したものを、ＰＴＣ−２００サーマルサイクラー(MJ Research, Inc, Waltham, MA, USA)にてＰＣＲカップ内で５サイクル加熱した。各サイクルでは、タンパク質を３０℃から８５℃まで５℃／分の速度で加熱し、３０℃まで急速に冷却した後、新たなサイクルを始めた。最後に、熱変性Ｅ２を４℃で維持した。最終的なＥ２濃度は２８０μｇ／ｍｌであった（ロット２  ０３０５０６ＲＳ）。
【０１５０】
ミスフォールディング法ＩＶ：Ｓｆ１細胞由来のＥ２におけるＣｙｓ残基の還元−アルキル化
アルキル化Ｅ２は、ジスルフィド結合を還元した後、生じた遊離Ｃｙｓ残基をアルキル化することにより得られる。まず、３５３μｇ／ｍｌＥ２に尿素を終濃度が８Ｍとなるように加え、穏やかに揺動することによりこれを混合した。次に、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を終濃度が１０ｍＭとなるように加えた。還元システインの酸化を阻害するため、試験管内の空気を窒素ガスに置換した。その後、回転装置上、室温で２時間インキュベートした。次に、この溶液を冷却し（氷上で）、ヨードアセトアミド(Sigma)を終濃度が２０ｍＭとなるように加えた。最後に、アルキル化Ｅ２を１ＬのＰＢＳに対して４時間、その後、５Ｌに対して７時間、さらに５ＬのＰＢＳに対して９時間透析した。透析後のアルキル−Ｅ２の濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイ(Pierce)を用いて測定したところ、１６７μｇ／ｍｌであった。
【０１５１】
Ｅ２およびＯＶＡを用いたミスフォールディング法Ｉ：熱周期によるミスフォールディング
１ｍｇのＯＶＡを、ＰＢＳ中、１ｍｌのＥ２溶液に溶かした（ＯＶＡ濃度は１ｍｇ／ｍｌ、Ｅ２濃度は２８０μｇ／ｍｌ；ロット２  ０３０５０６ＲＳ）。溶液に対し、３０℃から８５℃まで５℃／分で加熱し、次のサイクルを開始する前に３０℃まで冷却することにより（５サイクル）、熱周期によるミスフォールディングを行った。ＴｈＴ蛍光の増強およびｔＰＡ／プラスミノーゲン活性の増強を評価した。
【０１５２】
Ｓｆ１細胞由来のＥ２を用いたミスフォールディング法ＩＩ：ＥＤＣ−ＮＨＳカップリングを用い、オボアルブミンまたはＫＬＨとコンジュゲートしたＥ２を用いた熱周期によるミスフォールディング
ＰｏｒＡと同様に（上記参照）、Ｓｆ１細胞から得られたＥ２をＯＶＡまたはＫＬＨのいずれかをコンジュゲートした。Ｅ２濃度およびＯＶＡ濃度はそれぞれ１９３μｇ／ｍｌおよび１０４７μｇ／ｍｌであった。Ｅ２およびＫＬＨ濃度はそれぞれ１４５および６３１μｇ／ｍｌであった。カップリング後、溶液をＰＢＳに対して透析した。次に、溶液をＰＣＲカップの移し、コンジュゲートを周期的熱変性でミスフォールディングした。
【０１５３】
２９３Ｅ細胞由来のＥ２を用いたミスフォールディング法ＩＩ：遊離Ｅ２を用いた熱周期によるミスフォールディング
ＰｏｒＡに関して記載したように、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞培養上清から精製されたＥ２（ロット１  ２１０４０６ＣＳ、ＰＢＳ中５６１μｇ／ｍｌ）に対して、ＰＣＲ装置を用い、熱的ミスフォールディングを行った。
【０１５４】
２９３Ｅ細胞由来のＥ２を用いたミスフォールディング法ＩＩ：ＥＤＣ−ＮＨＳカップリングを用いたオボアルブミンまたはＫＬＨとコンジュゲートしたＥ２を用いた熱周期によるミスフォールディング
ＰｏｒＡおよびＳｆ１細胞由来のＥ２同様に（上記参照）、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞から得られた組換えＥ２をＯＶＡとコンジュゲートした。Ｅ２濃度およびＯＶＡ濃度はそれぞれ５６１μｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌであった。カップリング後、溶液をＰＢＳに対して透析した。次に、これらの溶液をＰＣＲカップに移し、コンジュゲートを周期的熱変性でミスフォールディングした（ロット１  ２１０４０６ＣＳ、ＰＢＳ中５６１μｇ／ｍｌ）。
【０１５５】
ミスフォールディング法Ｖ：遊離ＣＬ３ペプチドのミスフォールディング：熱的ミスフォールディング
遊離ＣＬ３ペプチドをＨ２Ｏに１ｍｇ／ｍｌで溶かし、そのままワクチンの作製に用いたか、ワクチンに使用するまで６５℃または３７℃で数日間維持した。
【０１５６】
ＣＬ３ペプチドおよびＯＶＡを用いたミスフォールディング法Ｉ：熱周期によるミスフォールディング
１ｍｇのＯＶＡと１ｍｇのＣＬ３ペプチド、または１ｍｇの凍結乾燥ＫＬＨと１ｍｇのＣＬ３ペプチドを２つの個別のカップで混合し、１ｍｌのＰＢＳに溶かした（全タンパク質／ペプチド濃度は１ｍｇ／ｍｌ）。溶液に対し、３０℃から８５℃まで５℃／分で加熱し、次のサイクルを開始する前に３０℃まで冷却することにより（５サイクル）、熱周期によるミスフォールディングを行った。ＴｈＴ蛍光の増強およびｔＰＡ／プラスミノーゲン活性の増強を評価した。
【０１５７】
ＣＬ３ペプチドを用いたミスフォールディング法ＩＩ：ＥＤＣ−ＮＨＳカップリングを用い、オボアルブミンまたはＫＬＨとコンジュゲートしたＣＬ３を用いた熱周期によるミスフォールディング
ＰｏｒＡと同様（上記参照）、ＣＬ３ペプチドをＯＶＡまたはＫＬＨのいずれかとコンジュゲートした。ＣＬ３ペプチド濃度およびＯＶＡまたはＫＬＨ濃度はともに１．２８ｍｇ／ｍｌであった。カップリング後、溶液をＰＢＳに対して透析した。次に、これらの溶液をＰＣＲカップに移し、コンジュゲートを周期的熱変性でミスフォールディングした。
【０１５８】
ＣＬ３タンパク質およびＯＶＡを用いたミスフォールディング法Ｉ：熱周期によるミスフォールディング
１ｍｇのＯＶＡをＰＢＳ中３０μｇ／ｍｌのＣＬ３タンパク質１ｍｌに溶かした。これらの溶液に対し、３０℃から８５℃まで５℃／分で加熱し、次のサイクルを開始する前に３０℃まで冷却することにより（５サイクル）、熱周期によるミスフォールディングを行った。さらに、ＰＢＳ中３０μｇ／ｍｌのＣＬ３タンパク質保存溶液を、タンパク質を加えずに、熱周期でミスフォールディングした。使用したＣＬ３タンパク質保存溶液はロット１  ０１０６０６ＣＳ（上記参照）であった。
【０１５９】
結果
抗原におけるアミロイド様構造の導入
オボアルブミン
凍結乾燥ＯＶＡをできるだけアミロイド様特性がないよう自然状態で正確にフォールディングさせるように注意深く溶かした。このような努力にもかかわらず、ＯＶＡは、アミロイド特異的色素ＴｈＴとの相互作用により、また、ｔＰＡおよびプラスミノーゲンの活性化の増強により示されるように、クロスβ構造を有する分子が少なくとも一部に存在することの証明となる特徴を示す（図９Ａ、Ｂ）。しかしながら、熱周期によるミスフォールディングの後、クロスβ構造に典型的なシグナルが変性ＯＶＡによっていっそう増強される（ＤＯＶＡ、図９Ａ、Ｂ）。示されているデータは通常作製されるアミロイド様ミスフォールディングＤＯＶＡとより天然に近いフォールディングのＯＶＡに代表的な数値である。クロスβ含量の大きな差は、このＯＶＡ／ＤＯＶＡの組合せをワクチン用として興味深いものとする。天然抗原または部分的にアミロイド様のミスフォールディングを有する抗原にＤＯＶＡを加えると、強力なクロスβ構造アジュバントとして役立つ。
【０１６０】
混合ワクチンの作製のためのＨ５
カルボキシ末端ＦＬＡＧタグ  Ｈｉｓタグを有する組換えＨ５を所内で発現させ、精製した。ＴｈＴ蛍光増強特性およびｔＰＡ／プラスミノーゲン活性化特性の測定から、未処理の精製Ｈ５がすでにいくらかのアミロイド様ミスフォールディングタンパク質を含んでいることが明らかになった（図９Ｃ、Ｄ、Ｅ）。Ｈ５ロット１  ２１０４０６ＣＳでは、ｔＰＡ活性化部分がいくらか検出された。Ｈ５ロット２画分Ｘ２５０５０６ＣＳでは、反応混合物からｔＰＡを除いた場合の、Ｈ５溶液におけるプラスミン基質変換活性の存在により、ｔＰＡ／プラスミノーゲン活性化特性の評価が妨げられた。ＯＶＡと混合したＨ５またはＥＤＣ／ＮＨＳを用いてＯＶＡとコンジュゲートしたＨ５の熱周期の際にＴｈＴ蛍光が著しく増強したが、このことは未処理のＨ５に比べ、Ｈ５抗原溶液中のクロスβ構造含量が増えていることを示す（図９Ｅ）。Ｈ５調製物は、Ｅ２、ＣＬ３およびＨ７を含むマウス混合ワクチンの作製のために用いただけでなく、マウスの一価Ｈ５免疫のためにも用いた。
【０１６１】
混合ワクチンの作製に用いたＨ７
Ｅ２、Ｈ５、ＣＬ３、ＯＶＡを含む混合ワクチンの作製の未処理抗原の供給源として、Ａ／オランダ／２１９／０３株(Protein Sciences Corp.)の組換えＨ７を用いた。しかしながら、本発明者らは、未処理のＨ７でもいくらかのＴｈＴ蛍光増強能を検出し、また、反応混合物にＨ７を導入することでｔＰＡ／プラスミノーゲンの活性化が増強された（図９Ｆ、Ｇ）。これらの結果は、クロスβ構造を有するＨ７分子が少なくとも一部に存在することを示す。図９ＨおよびＩでは、所内で生産した組換え天然型Ｈ７、Ｈ７とＯＶＡの熱ミスフォールディング混合物、およびＥＤＣ／ＮＨＳカップリングから得られた熱ミスフォールディングＨ７−ＯＶＡコンジュゲートでＴｈＴ蛍光増強が、ｔＰＡ活性に対する影響とともに示される。このＴｈＴアッセイでは、Ｈ７保存溶液を１０倍希釈した。ｔＰＡ／プラスミノーゲン活性アッセイでは、Ｈ７を１μｇ／ｍｌで用いた。これらのアッセイは、ＯＶＡとの混合またはコンジュゲーションの後に熱周期に曝すとクロスβ構造含量の増加を示す。
【０１６２】
混合ワクチンに用いるためのＨＥＫ２９３Ｅ細胞で発現されたＥ２
ＣＳＦＶの組換えＥ２タンパク質をＨＥＫ２９３Ｅ細胞で所内で発現させ、細胞培養上清から精製し、マウスの免疫試験に用いた。精製したＥ２に対し、遊離Ｅ２を用いて３０℃と８５℃の間の熱周期、またはＥＤＣ／ＮＨＳカップリングを用い、Ｅ２とＯＶＡをコンジュゲートした後の熱周期という２種類のミスフォールディング法を行った。図９Ｊでは、これらのミスフォールディングを用いた場合のＴｈＴ蛍光の増強も明らかに見られる。ｔＰＡ活性に対する影響は、精製Ｅ２溶液に、微量のプラスミン様プロテアーゼが存在することを示す基質変換活性により評価できなかった。未処理Ｅ２とミスフォールディングＥ２の間に見られるＴｈＴ蛍光増強能の違いは、ミスフォールディング法を適用した際にクロスβ構造含量が増えることを明らかに示す。
【０１６３】
混合ワクチンに配合するために用いるＣＬ３ペプチド
１９アミノ酸残基のＣＬ３断片とカップリングのためのアミノ末端Ｃｙｓ延長部に対して種々のタンパク質−タンパク質コンジュゲーション法を行った後、タンパク質ミスフォールディング法を行った。図９ＫおよびＬでは、ＴｈＴ蛍光を増強し、さらにｔＰＡ／プラスミノーゲンを刺激する特性を考慮して、総てのＣＬ３ペプチド調製物がクロスβ構造コンフォメーションをいくらか含むことが示される。遊離ペプチドであってもＨ２Ｏに溶かした後はクロスβ構造を含む。
【０１６４】
ｔＰＡ／プラスミノーゲン活性化アッセイでは、新しく溶かしたＣＬ３ペプチドと６５℃でインキュベートしたペプチドが最も強力なｔＰＡアクチベーターであったが、室温または３７℃でのインキュベーションでは活性化クロスβ構造含量は低い（図１０Ｄ）。このアッセイにおけるペプチド濃度は２００μｇ／ｍｌであった。ペプチドを暗所にて示された温度で数日間インキュベートした。
【０１６５】
Ｈ５Ｎ１ウイルス刺激のためのクロスβ−抗原Ｈ５
ミスフォールディングＨ５の調製のためおよびワクチン製剤における使用のための未処理Ｈ５の保存溶液は、１回目の接種では、ＰＢＳ中、２３６μｇ／ｍｌ組換えＨ５保存溶液（ロット１  ２１０４０６ＣＳ、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４株）であり、２回目の接種では、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．２、５００ｍＭ  ＮａＣｌ中、１４０μｇ／ｍｌ  Ｈ５（ロット２画分Ｘ２４０５０６ＣＳ）溶液であった。アミロイド様ミスフォールディングタンパク質コンフォメーションを有するＨ５は、ミスフォールディング法Ｉ〜ＩＩＩ（上記参照）の適用により得られた両Ｈ５ロットによるものであった。図１０Ａでは、４種類の各保存溶液Ｈ５  ２４μｇ／ｍｌを試験した場合にＴｈＴ蛍光の増強が示される。未処理のＨ５と比べた場合、修飾したものは３種類のミスフォールディングＨ５調製物の総てでクロスβ構造含量に有意な増強をもたらすことが明らかである。
【０１６６】
ＣＳＦＶ刺激のためのクロスβ抗原Ｅ２
ＣＳＦＶに対する１回目のワクチン接種では、未処理Ｅ２、熱周期ミスフォールディングＥ２（方法Ｉ）およびアルキル−Ｅ２（方法ＩＶ）を用いた（ロット１  ２００４０６ＲＳ、ＰＢＳ中２８５μｇ／ｍｌ）。アルキル−Ｅ２（ミスフォールディング法ＩＶ）および熱周期ミスフォールディングＥ２（ミスフォールディング法Ｉ）中のクロスβ構造の存在は、ＴｈＴ蛍光の強い増強およびｔＰＡ／プラスミノーゲン活性化の増強によって示される（図１０Ｂ、Ｃ）。
【０１６７】
２回目の免疫では、ここでもＳｆ１細胞が発現した組換えＥ２（ロット２  ０３０５０６ＲＳから）、ＰＢＳ中、２８０μｇ／ｍｌを用いた。Ｅ２は、遊離Ｅ２の周期的熱変性（方法Ｉ）、ＯＶＡの存在下でのＥ２の周期的熱変性（方法Ｉ）、ＥＤＣ／ＮＨＳカップリングにより得られたＥ２−ＯＶＡコンジュゲートの周期的熱変性（方法ＩＩ）およびこれもＥＤＣ／ＮＨＳカップリングにより得られたＥ２−ＫＬＨコンジュゲートの周期的熱変性（方法ＩＩ）という４種類のミスフォールディング法を用いてミスフォールディングした。これらのミスフォールディングクロスβ−Ｅ２調製物はワクチン処方物に配合する前に１：１：１：１混合した。
【０１６８】
実施例１１
豚コレラ抗原Ｅ２、肝蛭抗原カテプシンＬ３ペプチドおよびタンパク質、鳥インフルエンザ抗原ヘマグルチニン５ならびに鳥インフルエンザ抗原ヘマグルチニン７をオボアルブミンとともに含む混合ワクチンによるマウスの免疫化
用量応答研究およびクロスβ構造をアジュバントとする抗原の免疫原性試験
目的
豚コレラ抗原Ｅ２、肝蛭抗原カテプシンＬ３ペプチドおよびタンパク質、鳥インフルエンザ抗原ヘマグルチニン５ならびに鳥インフルエンザ抗原ヘマグルチニン７が、アミロイド様ミスフォールディングタンパク質コンフォメーションを有するＯＶＡ抗原とともに混合ワクチン中に組み合わされる場合に、さらにアジュバントを用いずに抗体力価を生じるかどうかを調べること。クロスβ構造による、すなわち、本明細書に定義されるアミロイド特性を含むタンパク質を用いたアジュバンド形成法。よって、マウス血清を免疫後２８日目に個々の抗原に対する抗体力価に関して分析した。
【０１６９】
抗原保存溶液
ワクチン接種に用いるタンパク質溶液
Ｉ．ＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍｌのオボアルブミン（鶏卵アルブミン、ＯＶＡ、Sigma；カタログ番号Ａ５５０３）を新たに調製した（ピペット操作により溶解；回転装置にて室温で３０分；３７℃で１時間；回転装置にて室温で１時間；４℃で保存）。
【０１７０】
ＩＩ．１ｍｇ／ｍｌのアミロイド様ミスフォールディングＯＶＡ（ＤＯＶＡ）を上記のような熱変性プロトコールに従って得た。
【０１７１】
ＩＩＩ．ＰＢＳ中、カテプシンＬ３ペプチド(Ansynth Service B.V., Roosendaal, オランダ, ロットＢＢ１；配列ＣＳＮＤＶＳＷＨＥＷＫＲＭＹＮＫＥＹＮＧ（アミノ末端Ｃｙｓ延長部を有するＣＬ３ペプチド））をＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍｌで溶かし、４℃で維持した。
【０１７２】
ＩＶ．アミロイド様ミスフォールディングＣＬ３ペプチド−ＫＬＨコンジュゲートを熱変性で得た（コンジュゲート濃度はＰＢＳ中１．３５ｍｇ／ｍｌ；およそ５０％のＣＬ３ペプチド）ロット１  ０５−２００６ＲＳ（上記参照）
【０１７３】
Ｖ．ＣＬ３タンパク質（ＰＢＳ中３０μｇ／ｍｌ）ロット１  ０１０６０６ＣＳ（上記参照）
【０１７４】
ＶＩ．アミロイド様熱変性ＣＬ３タンパク質（ＰＢＳ中３０μｇ／ｍｌ）ロット１  ０１０６０６ＣＳ
【０１７５】
ＶＩＩ．アミロイド様ミスフォールディングＣＬ３タンパク質−ＯＶＡコンジュゲート、熱変性（ＰＢＳ中３０μｇ／ｍｌ）ロット１  ０１０６０６ＣＳ
【０１７６】
ＶＩＩＩ．Ｅ２（ＰＢＳ中５６１μｇ／ｍｌ）ロット１  ２１０４０６ＣＳ（上記参照）
【０１７７】
ＩＸ．アミロイド様ミスフォールディングＥ２熱変性（ＰＢＳ中５６１μｇ／ｍｌ）ロット１  ２１０４０６ＣＳ
【０１７８】
Ｘ．アミロイド様ミスフォールディングＥ２−ＯＶＡコンジュゲート、熱変性（ＰＢＳ中５６１μｇ／ｍｌ）ロット１  ２１０４０６ＣＳ
【０１７９】
ＸＩ．Ｈ５（ＰＢＳ中２３６μｇ／ｍｌ）ロット１  ２１０４０６ＣＳ
【０１８０】
ＸＩＩ．Ｈ５とＯＶＡのアミロイド様ミスフォールディングタンパク質混合物、熱変性（ＰＢＳ中１４０μｇ／ｍｌ）ロット２画分Ｘ２５０５０６ＣＳ
【０１８１】
ＸＩＩＩ．アミロイド様ミスフォールディングＨ５−ＯＶＡコンジュゲート、熱変性（ＰＢＳ中１４３μｇ／ｍｌ）ロット２画分Ｘ２５０５０６ＣＳ
【０１８２】
ＸＩＶ．Ｈ７保存溶液Ｉ（ＰＢＳ中１０．５μｇ／ｍｌ）ロット２  ０５−２００６ＣＳ  （上記参照）
【０１８３】
ＸＶ．Ｈ７とＯＶＡのアミロイド様ミスフォールディングタンパク質混合物、熱変性（ＰＢＳ中１０．５μｇ／ｍｌ）ロット２  ０５−２００６ＣＳ
【０１８４】
ＸＶＩ．アミロイド様ミスフォールディングＨ７−ＯＶＡコンジュゲート、熱変性（ＰＢＳ中１０．６μｇ／ｍｌ）ロット２  ０５−２００６ＣＳ
【０１８５】
ＸＶＩＩ．Ｈ７、保存溶液ＩＩ、６０３μｇ／ｍｌ（Ａ／オランダ／２１９／０３、Protein Sciences Corp., Meriden, CT, USA；カタログ番号３００６、ロット１１２３０５、バッファー：１０ｍＭ  Ｎａ−ＨＰＯ４、ｐＨ７．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）
【０１８６】
実験設定：ワクチンの作製および接種
混合ワクチンの用量を調製するため、１．無アジュバント抗原各１．２０μｇ／ｍｌ、２．ミスフォールディングＨ７  ２μｇ／ｍｌおよび他のクロスβをアジュバントとする抗原各１９μｇ／ｍｌ、の２つの溶液を作製した。２μｇ／ｍｌ混合抗原保存溶液はこれらの保存溶液の１０倍希釈で作製した（溶液３および４）。１０μｇ／ｍｌの無アジュバント抗原／１０μｇ／ｍｌのクロスβをアジュバントとする抗原と１μｇ／ｍｌの無アジュバント抗原／１μｇ／ｍｌクロスβをアジュバントとする抗原を含むワクチンをそれぞれ溶液１と２、または３と４を１：１混合することにより作製した（溶液５および６）。
【０１８７】
溶液１．
ＰＢＳ中、抗原Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩＩＩ、ＸＩおよびＸＶＩＩ
【０１８８】
溶液２．
ＰＢＳ中、抗原ＩＩ、ＩＶ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶおよびＸＶＩ
【０１８９】
免疫化では、７〜９週齢の雌ＢａｌＢ／ＧＡｎＮＨＳｄマウス(BalB/C、Harlan;5個体6群)(Animal Facility ' Gemeenschappelijk Dierenlaboratorium’ GDL, ユトレヒト大学, オランダ）を用いた。およそ１週間の環境循環の後、−４日目に免疫前血清を採取するため採血した。０日目に各マウスに次のスキームに従い、５００μｌの皮下注射ワクチン接種を行った。
ａ群  １００％の無アジュバント混合抗原、１０μｇ／抗原／マウス（対照）
ｂ群  ５０％の無アジュバント／５０％のクロスβをアジュバントとする混合抗原、１０μｇ／抗原／マウス
ｃ群  １００％のクロスβをアジュバントとする混合抗原、１０μｇ／抗原／マウス群
ｄ群  １００％の無アジュバント混合抗原、１μｇ／抗原／マウス（対照）
ｅ群  ５０％の無アジュバント／５０％のクロスβをアジュバントとする混合抗原、１μｇ／抗原／マウス
ｆ群  １００％のクロスβをアジュバントとする混合抗原、１μｇ／抗原／マウス
【０１９０】
ＥＬＩＳＡを用いた抗抗原抗体力価の測定
接種後２１日目に得られた血清を用い、混合ワクチンの各成分に対して生じた抗体力価を、従来のＥＬＩＳＡ技術を用いて評価した。プロトコールはＣＬ３−ＫＬＨコンジュゲートに関して記載した通りとした。各マウス群ａ〜ｆで、血清をプールし、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で一連の希釈液を作製した。コーティング抗原ついては以下に示す。ＣＬ３ペプチド、Ｅ２、Ｈ５またはＨ７を認識する対照抗体の一連の希釈液をＥＬＩＳＡにおいて陽性対照として用いた。Ｈ５およびＨ７は２．５μｇ／ｍｌでコーティングし、Cedi-DiagnosticsのＥ２保存溶液はコーティング前に１００倍希釈し、ＣＬ３ペプチドは１０μｇ／ｍｌでコーティングした。
【０１９１】
抗体力価ＥＬＩＳＡにおいて抗原として用いるタンパク質溶液
−  凍結乾燥Ｅ２抗原、製造業者の奨励に従って再構築(Ceditest CSFV, Cedi-Diagnostics B.V., Lelystad, オランダ)
【０１９２】
−  Ｈ５、８３μｇ／ｍｌ  Ｈ５（Ａ／ヴェトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Protein Sciences Corp., Meriden, CT, USA）、カタログ番号３００６、ロット４５−０５０３４ＲＡ−２、バッファー：１０ｍＭ  Ｎａ−ＨＰＯ４、ｐＨ７．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ
【０１９３】
−  Ｈ７、６０３μｇ／ｍｌ  Ｈ７（Ａ／オランダ／２１９／０３、Protein Sciences Corp., Meriden, CT, USA）、カタログ番号３００６、ロット１１２３０５、バッファー：１０ｍＭ  Ｎａ−ＨＰＯ４、ｐＨ７．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ
【０１９４】
−  ＣＬ３ペプチド（４℃下のアリコート、ロットＢＢ１, Ansynth Service B.V, Roosendaal, オランダ）ＮＨ２−ＣＳＮＤＶＳＷＨＥＷＫＲＭＹＮＫＥＹＮＧ−ＣＯＯＨ（Ｎ末端Ｃｙｓ延長部を有するＣＬ３ペプチド）
【０１９５】
−  ＯＶＡ、ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌ（保存溶液０６０６１３ＮＨ−４℃；カタログ番号Ａ−５５０３、ロット１４Ｈ７０３５、Sigma）
【０１９６】
−  ＤＯＶＡ、ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌ（保存溶液０６０６１３ＮＨ−４℃）、熱変性
【０１９７】
力価ＥＬＩＳＡに用いた材料
−  Microlon high-binding  ＥＬＩＳＡプレート（Greiner、カタログ番号６５５０９２）
−  コートバッファー：５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６
−  ブロッキング試薬（Roche、カタログ番号１１１１２５８９００１）
−  洗浄バッファー：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．３
−  各個体のマウス血清、−４日目と接種後２８日目に採取
−  抗Ｈ５Ｎ１マウス血清（‘ID-Lelystad (Dr L. Cornelissen) Ｈ５Ｎ１、ｇｒ５、４０１０６、２．０２．２４１５０．００、ｎｄ２５７９ｊｅｔ、１８０μｌ’）→対照抗Ｈ５血清
−  抗Ｅ２抗体、ＨＲＰコンジュゲート（Ａｒｔ．７６１０３８４、ロット０６Ｃ０５２、Cedi-Diagnostics B. V., Lelystad, オランダ）
−  抗ＣＬ３血清、マウス(ID-Lelystad (A. Antonis) ＹＭ３０  ＩＩＩ, ｃｌｌｃ７ｅ８)→対照抗ＣＬ３血清
−  マウス腹水抗鶏卵アルブミン（ＯＶＡ）、クローンＯＶＡ−１４、ＩｇＧ１、（Sigma、Ａ６０７５、ロット０７４Ｋ４７６８→対照抗ＯＶＡ腹水
−  マウス抗Ｈ７Ｎ７血清(‘muis-抗H7N7, dpi: 14 groep 6, 040106’, ID-Lelystad, Dr L. Cornelissen)→対照抗Ｈ７血清
−  結合バッファー：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．８ｍＭリン酸二水素カリウム、ｐＨ７．３（ＰＢＳ）と０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
−  ペルオキシダーゼコンジュゲートウサギ抗マウス免疫グロブリン(RAMPO, P0260, DAKOCytomation, Glostrup,デンマーク)
−  ＰＢＳ
−  Ｈ２Ｏ２：３５％ｖ／ｖ(Merck, Darmstadt, ドイツ)
−  ＯＰＤ：１，２−フェニレンジアミン（Merck, カタログ番号１．０７２４３．００５０, ロットＬ９３７５４３−８４）
−  クエン酸／リン酸バッファーｐＨ５．０
−  Ｈ２Ｏ中１０％ｖ／ｖＨ２ＳＯ４
−  Ａ４９０ｎｍ読み取りのためのＳｐｅｃｔｒａｍａｘ分光光度計
【０１９８】
結果
接種後２８日目のマウス血清における抗抗原力価
Ｂａｌｂ／ｃマウスを１または１０μｇ抗原／動物の混合ワクチンで免疫した。この混合物はＥ２、ＣＬ３、Ｈ５、Ｈ７およびＯＶＡ、および／またはアミロイド様ミスフォールディング対応物を含んでいた。６群のマウスのワクチン間のクロスβ構造含量の違いを表１１に示す。ｔＰＡ／プラスミノーゲン活性の増強特性は、それぞれ０％、５０％および１００％のアミロイド様ミスフォールディングタンパク質コンフォメーションを有する各抗原２０μｇ／ｍｌを含む混合抗原で評価した。これらのミスフォールディングタンパク質の相対的含量はｔＰＡ活性化能に反映され、同じ順位を示す。また、１００％未処置混合抗原溶液がある程度ｔＰＡを活性化するということも、少なくとも未処理ＣＬ３ペプチド、Ｈ５およびＯＶＡが、そのような特徴を誘導する処理なしに、少量のクロスβ構造が存在する何らかの特徴を示すということで説明される。ｔＰＡ活性化アッセイで見られたものと同じ順位のシグナルがコンゴレッドおよびＴｈＴ蛍光アッセイにおいて混合物の１０倍希釈液で見られる（図１１Ｂ、Ｃ）。
【０１９９】
接種後２８日目に採取したマウス血清をプールしたものでは、混合ワクチン中に存在する個々の未処理抗原のそれぞれに対する力価を記載のＥＬＩＳＡ設定で測定した。さらに、ＤＯＶＡに対する力価も、アミロイド様ミスフォールディングクロスβ構造をアジュバントとするＯＶＡの有効性を分析できるかどうか試験した。
【０２００】
遊離ＣＬ３ペプチドをコーティングしたものに対する血清または未処理Ｈ５に対する血清では力価は見られなかった。マウスに２回目の抗原投与を行った少なくとも１４日後に力価を再び分析するが、この場合には検出可能な力価を得る必要があると考えられる。
【０２０１】
未処理Ｈ７および未処理Ｈ７とクロスβをアジュバントとするＨ７の１：１混合物、双方とも１および１０μｇ／動物用量に対して同等の力価が生じた（図１２Ａでは１０μｇ／動物用量について示す）。未処理Ｈ７保存溶液中にアミロイド様クロスβ構造コンフォメーションを有するＨ７分子が妥当な量存在することは（図９Ｆ、Ｇ参照）、観察された免疫原性を説明する。
【０２０２】
コーティングされたＥ２抗原に対して生じた力価を１回量のワクチン接種の後に測定すると、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞で発現されたクロスβをアジュバントとするＥ２  ５または１０μｇを受けたマウスは力価を生じた（図１２Ｂ）。あきらかに、１μｇのＥ２／動物のみをマウスに接種した場合では、１回量投与の後に力価は生じない。興味深いことに、マウスを、ＨＥＫ２９３細胞で発現された、カルボキシＦＬＡＧタグ−Ｈｉｓタグ延長部を含む１００％アミロイド様ミスフォールディングＥ２（ｃ群）で免疫した場合でもなお、Ｓｆ１細胞で発現された未処理のＥ２に対する抗体力価が生じる。これらの知見は、「クロスβ構造によるアジュバンド形成法」技術の有益な使用を実証するものである。重要なことには、アジュバントを用いずに、未処理のＥ２を抗原として用いた場合には力価は生じなかった。しかしながら、５０または１００％のクロスβをアジュバントとするＥ２では、アジュバントを用いなくても力価が生じる。これら６種類の混合抗原では、その免疫原性のためにＯＶＡを含む。ａ群およびｄ群は２０μｇおよび２μｇＯＶＡ／ｍｌを含み、ｃ群およびｆ群は２０μｇおよび２μｇ／ｍｌのＤＯＶＡとミスフォールディング抗原−ＯＶＡコンジュゲートの使用のためにさらなる量のＤＯＶＡを含む。図９ＡおよびＢで示される実験から、ＯＶＡは、ＤＯＶＡと比較した場合、比較的少量、しかし、無視できない量のクロスβ構造を含むということがすでに分かっている。これらの免疫試験から、ここで、このような少量では抗ＯＶＡ力価または抗ＤＯＶＡ力価を生じないことが分かる（図１２Ｃ、Ｄ）。これに対し、混合ワクチンｂ、ｃおよびｅのＤＯＶＡは抗ＤＯＶＡ力価と抗ＯＶＡ力価の双方を生じる。ＯＶＡを混合抗原の一部とする場合には、ＯＶＡに対してより強力な力価が得られるのが明らかである（ｃ群に対してｂ群；ｆ群（力価無し）に対してｅ群）。１０μｇまたは２０μｇ／ｍｌのＤＯＶＡを用いる場合には、１μｇまたは２μｇ／ｍｌのＤＯＶＡよりも高い力価に達する。これらの知見は、クロスβ構造含量の高いＤＯＶＡは、クロスβ構造をわずかしか含まないＯＶＡよりも強力な免疫原性刺激剤となることを示す。さらに、ＯＶＡ単独ではＯＶＡまたはＤＯＶＡに対する力価を生じないが、ＤＯＶＡとＯＶＡを組み合わせると、両抗原の出現に対して最高の力価が得られることが明らかである。混合抗原ａとｃで生じた力価を比べると、ＯＶＡにクロスβ構造を含むアミロイド様ミスフォールディングタンパク質コンフォメーションを形成することで、アジュバントを用いずに抗抗原力価を生じるに十分であることが明らかである。このことは、クロスβ構造のアジュバンド形成法特性および「クロスβ構造によるアジュバンド形成法」技術の直接的証拠となる。これはクロスβ構造コンフォメーションの免疫力を実証し、アミノ酸配列または配列の長さにかからず、事実上あらゆるポリペプチドに適合させることができる。より詳しくは、このＯＶＡ／ＤＯＶＡの例は、未処理抗原とクロスβ抗原の組合せが免疫系の強力な刺激剤となることを実証するものである。
【０２０３】
実施例１２
Ｈ５サブユニットワクチンおよびＨ７サブユニットワクチンのクロスβ構造アジュバンド形成法はより高い抗体力価を誘導し、クロスβ−Ｈ５の接種は致死量の鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１（ＡＩＶ）による攻撃からマウスを保護する
Ｈ５サブユニットワクチンによるマウスのワクチン接種研究
目的
アミロイド様ミスフォールディングタンパク質コンフォメーションを有するＡＩＶのＨ５抗原を含むサブユニットワクチン（クロスβ構造をアジュバントとするＨ５）が抗体力価を生じ、ＡＩＶ  Ｈ５Ｎ１による攻撃からマウスを保護するかどうかを調べること。
【０２０４】
緒論
インフルエンザ、特に、インフルエンザ亜型Ａ（Ｈ５Ｎ１）により引き起こされるインフルエンザは重大な汎発流行のおそれを持つ。このため、ＡＩＶ、特にＨ５Ｎ１の拡散および感染の予防または治療するための公衆衛生の維持管理が必要である。このような目標を満たすために重要なことは、安全かつ有効なワクチンの開発である。
【０２０５】
インフルエンザウイルスには、Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルスを含むものと、Ｃ型インフルエンザウイルスを含むものの２属がある。Ｂ型およびＣ型インフルエンザはヒトウイルスであり、Ａ型インフルエンザは広範な鳥類および哺乳類宿主の間を行き来し、循環している。もちろん、Ａ型インフルエンザウイルスは一般に経済上、そしてヒトの健康に最も深刻な問題を引き起こす。Ａ型インフルエンザウイルスは一本鎖ネガティブセンスＲＮＡのゲノムセグメントを有し、これらはウイルスにコードされている核タンパク質に包まれている。このウイルスは２つの重要なウイルス表面抗原、ヘマグルチニン糖タンパク質（ＨＡまたはＨ）とノイラミダーゼ（ＮＡまたはＮ）をコードしている。ＨＡおよびＮＡウイルス表面抗原は血清学的に亜型に分類され、これまでに自然界では１５のＨＡ亜型と９つのＮＡ亜型が確認されている。総ての亜型がアヒルなどの野生の水鳥の間に偏在して循環しており、これらの鳥類宿主が総てのＡ型インフルエンザウイルスの天然の貯蔵庫となっている。これらの種では、感染は一般に腸管に局在し、疾病を引き起こすことばく、高濃度のウイルスが糞に放出される。ＨＡは、ウイルス粒子とシアル酸を含む細胞表面受容体との結合を担い、そしてエンドサイトーシスの後には、ウイルス膜と細胞膜の融合の媒介を担う。それは翻訳後に除去されるシグナル配列と、カルボキシ末端付近の膜固定ドメインと、短い細胞質テールとを含む、Ｉ型膜糖タンパク質である。ＨＡはホモ三量体として非共有結合的に会合したおよそ７５ｋＤａの前駆体として合成される。この前駆体ポリペプチドは翻訳後に、保存されているアルギニン残基の部位で２つのサブユニットへと切断され、これらが１つのジスルフィド結合により連結される。ＨＡは主要なワクチン抗原である。
【０２０６】
これまでのところ、現在認可されているインフルエンザワクチンは総て、孵化鶏卵で生成されている。このような卵をインフルエンザワクチン製造の基質として使用することのよく認知されている不利な点として、卵の供給力が潜在的に弱いこと、卵の生産をスケールアップするのに長い時間がかかること、および新しい変種を卵生産力の高い成長に適応させる必要があり、時間がかかり、いつも上手くいくとは限らないことが挙げられる。さらに、卵の増産の結果、循環株に対する防御に最適とは言えない受容体変種が選択されることもある。また、ヒトにおける最近の研究では、不活性化したサブビリオンＡ型インフルエンザ（Ｈ５Ｎ１）ワクチンを用いたアプローチの結果、中和抗体の形成を含む血清抗体応答が生じること、しかし、その応答は不完全なものであり、実質量の抗原を必要とすることが示されている６，７。抗体応答の頻度は、４５μｇまたは９０μｇを投与した被験者で最も高かった。９０μｇを２回投与した被験者では、中和抗体力価は５４％で１：４０以上に達し、ヘマグルチニン阻害力価は５８％で１：４０以上に達した。４５、１５および７．５μｇを２回投与した被験者のそれぞれ４３％、２２％および９％で、１：４０以上の中和力価が見られた。プラセボ受容者では応答は見られなかった。ゆえに、インフルエンザワクチンは改良する必要がある。
【０２０７】
インフルエンザワクチンを製造するためのもう１つの方法が、組換えＤＮＡ技術による主要ワクチン抗原ＨＡの発現である。最近の研究では、亜型Ａ／パナマ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、およびＢ／香港／３３０／２００１に由来し、組換えバキュロウイルスにより昆虫細胞で生産された、ＨＡ（Ｈ１およびＨ３）を含有するサブユニットワクチンが評価された８。この別法は卵依存を避け、この場合、バキュロウイルス発現系を用いて効率的にタンパク質を発現する。バキュロウイルスによる発現されたＨＡワクチンは安全であり、三価の不活性化インフルエンザワクチンに比べ、各４５μｇまたは１３５μｇ用量のＨＡを投与した場合、Ｈ３成分に対してより良い血清抗体応答を誘導した。しかしながらなお、１３５μｇを投与しても、応答者数は完全でなかった（亜型およびワクチン投与量によって１６〜８８％）。これらの研究では、インフルエンザワクチンと併用するのに良いアジュバントが得られなかったことから、アジュバント無しでワクチンを用いた。
【０２０８】
本研究の目的は、クロスβ構造によるＨＡサブユニットワクチンのアジュバンド形成法が良好な免疫原性をもたらすかどうか、そしてこのようなワクチンがマウスをＡＩＶ  Ｈ５Ｎ１による攻撃からマウスを保護するかどうかを評価することであった。
【０２０９】
材料および方法
免疫化
８８個体の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスを用いた。マウスはオランダのＩＤ−Ｌｅｌｙｓｔａｄ施設で飼育した。実験の開始時に、マウスはおよそ６週齢であった。マウスをワクチン群と対照群に無作為に割り付け、１１群それぞれ８個体からなった。動物には餌（２１８５  ＲＭＨ／Ｂ）と飲み水を自由に摂らせた。
【０２１０】
未処理のＨ５とクロスβ−Ｈ５によるマウスの免疫化では、ワクチン処方物に用いる保存溶液は、１回目の接種には、ＰＢＳ中２３６μｇ／ｍｌ組換えＨ５保存溶液（ロット１  ２１０４０６ＣＳ、Ａ／ヴェトナム／１２０３／２００４株）、２回目の接種には、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．２、５００ｍＭ  ＮａＣｌ中、１４０μｇ／ｍｌ  Ｈ５（ロット２画分Ｘ２４０５０６ＣＳ）溶液とした。ワクチン処方物には、３種類のアミロイド様ミスフォールディングＨ５調製物を１：１：１比で用いた（下記参照）。マウス５群（各群８個体）について、５μｇ  Ｈ５／個体として次の調製物を処方した。
→２群、１００％未処理Ｈ５
→３群、６７％未処理Ｈ５／３３％ミスフォールディングＨ５
→４群、３３％未処理Ｈ５／６７％ミスフォールディングＨ５
→５群、１００％ミスフォールディングＨ５
【０２１１】
鳥インフルエンザサブユニットＨ７ワクチンによるマウスの免疫化では、Ｈ７ロット２（１６０５０６ＣＳ、ＰＢＳ中１０．５μｇ／ｍｌ）を用いてワクチンを処方した。ミスフォールディングアミロイド様Ｈ７を含むワクチン処方物としては、ミスフォールディング法ＩおよびＩＩで得られたクロスβ−Ｈ７を用いた。遊離Ｈ７をミスフォールディングし、ならびにＨ７をＯＶＡと混合し、ＥＤＣ／ＮＨＳカップリングを用いてＨ７とＯＶＡをコンジュゲートした。
０日目と２１日目にマウスの頸部（０日目）および左側部（２１日目）に試験サンプル０．５ｍｌで皮下免疫した。Ｔ０１群（対照、＃１．１〜１．８）には試験サンプル１（水、プラセボ）、Ｔ０２群（＃２．１〜２．８）にはサンプル２（５μｇ未処理Ｈ５）、Ｔ０３群（＃３．１〜３．８）にはサンプル３（未処理Ｈ５と方法Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩにより修飾した３３％クロスβ−Ｈ５の組合せ）、Ｔ０４群（＃４．１〜４．８）にはサンプル４（未処理Ｈ５と方法Ｉ〜ＩＩＩにより修飾した６６％クロスβ−Ｈ５の組合せ）、Ｔ０５群（＃５．１〜５．８）にはサンプル５（方法Ｉ〜ＩＩＩにより修飾したクロスβ−Ｈ５  １００％）、Ｔ０６群（＃６．１〜６．８）にはサンプル６（０．５μｇ未処理Ｈ７）、Ｔ０７群（＃７．１〜７．８）にはサンプル７（未処理Ｈ７と方法Ｉ、ＩＩにより修飾した３３％クロスβ−Ｈ７の組合せ）、Ｔ０８群（＃８．１〜８．８）にはサンプル８（未処理Ｈ７と方法Ｉ、ＩＩにより修飾した３３％クロスβ−Ｈ７の組合せ）、Ｔ０９群（＃９．１〜９．８）にはサンプル９（方法Ｉ、ＩＩにより修飾されたクロスβ−Ｈ７  １００％）、Ｔ１０群（＃１０．１〜１０．８）にはサンプル１０（ワクチン、Ｇａｌｌｉｍｕｎｅ（商標）ＦＬＵ  Ｈ５Ｎ９、ロットＦ３８７８５Ｃ、不活性化鳥インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ９、Ａ／シチメンチョウ／ウィスコンシン／６８株）を含む）、Ｔ１１群（＃１１．１〜１１．８）にはサンプル１１（スペコールをアジュバントとする未処理Ｈ７）を施した。Ｈ５の場合、総ての場合で、全部で（未処理型と修飾型を合わせて）ＰＢＳ中、５μｇのＨ５を投与した。Ｈ７の場合、総ての場合で、全部でＰＢＳ中、０．５μｇのＨ７を投与した。
【０２１２】
抗原投与
２４日目にマウス（Ｔ０１群、Ｔ０３群およびＴ１０群）に、２０  ＬＤ５０（２＊１０５  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）量のＡＩＶ  Ｈ５Ｎ１  Ａ／１５６／９７／ＨＫを含む５０μｌの鼻内接種により抗原投与を行った。
【０２１３】
評価および検討
全研究の過程で動物を毎日１回モニタリングした（臨床スコア０〜４、死亡、（０）は健康であり、（１）は体毛に乱れがあるが、活動的、（２）は皮膚の荒れ、よろよろ歩く、反応性の低下、取扱い中も受動的、（３）体毛の乱れ、よろよろ歩く、呼吸が速い、反応性の低下、取扱い中も受動的、および（４）は体毛の乱れ、よろよろ歩く、呼吸が速い、反応性の低下、取扱い中も受動的、仰向けにしても反転できない、として定義される）。このスコアにそのスコアを有する個体数をかけることで総合スコアを得た。呼吸器系に問題のある個体数は、スコア３として各群の個体数を数えることで算出した。
【０２１４】
０日目、２１日目、３３日目、４２日目（抗原投与）および５６日目に、血清採取のため尾の静脈から血液サンプルを採取した。血液を凝固させた後、遠心分離（３５００ｒｐｍ５分）の後に血清を得た。血清は−２０℃で保存した。
【０２１５】
−１日目、３３日目、同用量の５μｇ  Ｈ５／個体または０．５μｇ  Ｈ７／個体で２回目のワクチン接種を行った２２日後に採取したマウス血清で、抗Ｈ５抗体力価および抗Ｈ７抗体力価を評価した。ワクチン接種に用いたＨ５抗原はＨＥＫ２９３Ｅ細胞で発現されたものであり、カルボキシ末端ＦＬＡＧタグ−Ｈｉｓタグ延長部を含んでいた。力価測定には、Protein Sciences Corp.から購入した同じＨ５Ｎ１株のＨ５抗原を用いた。抗Ｈ７抗体に関する力価測定には、同じ株（Ａ／オランダ／２１９／０３）の組換えＨ７をProtein Sciences Corp.から購入した。
【０２１６】
−１日目と３３日目に採取したマウスの血清では、ＯＶＡに関する力価測定を行った。この目的で、群内の８個体の血清をプールした。−１日目に採取した血清をプールしたものを陰性対照として用いた。
結果
【０２１７】
８８個体のマウス（各群８個体で１１群）を本研究に用いた。各マウスに０日目と２１日目にプラセボ（水、Ｔ０１群）または組換え生産された構造糖タンパク質Ｈ５もしくはＨ７を含むサブユニットワクチン（Ｔ０２群〜Ｔ０９群、Ｔ１１群）または不活性化Ｈ５Ｎ９ウイルスワクチン（Ｔ１０群）を接種した。３群（Ｔ０１群、Ｔ０３群およびＴ１０群）のマウスに、２０  ＬＤ５０（２＊１０５  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）用量のＡＩＶ  Ｈ５Ｎ１  Ａ／１５６／９７／ＨＫを含む５０μｌを鼻内接種することで、４２日目に抗原投与を行った。
【０２１８】
図１３ＡおよびＢでは、３３日目に採取したマウス血清をプールしたものと、供給源の異なる天然型Ｈ５またはＨ７抗原をコーティングしたものでの力価測定値を示す。プラセボワクチン（すなわち、水）を投与したＴ０１群から採取された血清は、抗Ｈ５抗体または抗Ｈ７抗体を含まない。種々のＨ５ワクチンを接種したマウスにおいて、アジュバント無しの未処理Ｈ５（Ｔ０２）または１００％のクロスβをアジュバントとするＨ５を投与した群は、３３％または６７％のクロスβをアジュバントとするＨ５を接種した後に得られた力価に比べて、生じた力価は小さかった。後者２種のワクチンは、生じた力価に関しては、不活性化Ｈ５Ｎ９ワクチンと同等の効力であった（図１３Ａ）。これらの結果は、Ｈ５ワクチンにクロスβをアジュバントとする抗原を含めると、従来アジュバントの不活性化ウイルスワクチンに匹敵する体液性免疫応答が生じることを実証する。１００％のクロスβをアジュバントとするＨ５抗原は、クロスβをアジュバントとする抗原画分を未処理／無アジュバント抗原とともに含むワクチンに比べて免疫原部分が少ない。力価に基づき、Ｔ０１群、Ｔ０３群およびＴ１０群に対してはＨ５Ｎ１ウイルス投与実験を行った。
【０２１９】
Ｈ５Ｎ１ウイルス投与を行ったＴ０１群（プラセボ）、Ｔ０３群（３３％のクロスβをアジュバントとするＨ５）およびＴ１０群（不活性化Ｈ５Ｎ９ウイルスワクチン）のマウスの個々の血清では、Protein Sciences Corp.から購入した天然型Ｈ５に対して力価を測定した（ワクチン接種に用いたＨ５は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞にて所内で生産した）。図１３ＥおよびＦでは、Ｔ０３およびＴ１０の力価が示されている。免疫前血清のプールで得られたものより高い力価は見られなかった（示されていない）。Ｔ０３では、個々のマウスの力価はほぼマウス５＝６＝７＞８＞１＝２＝４＞３＞免疫前プール＝力価無し、という順序で生じた。Ｔ１０では、この順序はマウス６＞２＝４＞３＝８＞１＝５＞７＞免疫前血清プール＝力価無し、である。これらの免疫応答強度の違いは、Ｈ５Ｎ１ウイルス投与に対する防御程度に反映される。
【０２２０】
Ｈ７の研究では、生じた抗Ｈ７抗体力価の強さの順序は、Ｈ７／スペコール＞３３％クロスβ−Ｈ７＞６７％クロスβ−Ｈ７＞未処理／無アジュバント−Ｈ７〜１００％クロスβ−Ｈ７〜プラセボであった。従ってここでも、抗体力価を考慮すれば、クロスβ構造をアジュバントとするＨ７が有効なワクチンであることが明らかである。ここでもＨ５同様、未処理／無アジュバント抗原および天然型抗原を用いない１００％のクロスβをアジュバントとする抗原は、３３％または６７％のクロスβをアジュバントとする抗原を含むワクチンに比べ、免疫原性が低い。
【０２２１】
図１３Ｃでは、プラセボまたはクロスβをアジュバントとするＨ５または未処理／無アジュバントＨ５を接種した後３３日目に得た血清プール中のＯＶＡに対する力価を考える。ＯＶＡでは、生じた抗ＯＶＡ力価の順序は、１００％のクロスβをアジュバントとするＨ５＞６７％のクロスβをアジュバントとするＨ５＞３３％のクロスβをアジュバントとするＨ５≧未処理／無アジュバントＨ５〜免疫前血清である。３３％、６７％および１００％のクロスβをアジュバントとするＨ５を用いて処方したワクチンは、漸増量のアミロイド様ミスフォールディングＯＶＡ（ＤＯＶＡ）を含んでいる。ＯＶＡを考える場合には、天然の折りたたみを有する抗原をワクチン処方物の一部にする必要はない。明らかに、ＤＯＶＡにおいては、合理的な密度の天然様エピトープが露出し、それに対して交差反応力価が生じる。従ってこれらの結果から、ワクチンクロスβ構造を有する抗原が、天然型抗原に対して所望の免疫応答を惹起するために用いるのに好適であることが分かった。
【０２２２】
これらの結果はともに、アジュバントとしてクロスβ構造を用いると、ワクチン処方物に従来のアジュバントを含む必要なく、良好な抗原力価が達成されることを示す（必要ではないが、もちろん、クロスβ構造アジュバントと従来のアジュバントの組合せを、場合により従来の用量より低用量で使用することもできる）。ワクチン接種していないマウスでは、感染３日後に最初の臨床徴候が見られた。これらの徴候は研究の終了時まで見られていた。７日目から、ワクチン接種していない群では、総ての個体が呼吸器症状を示した。８個体中６個体が、研究の終了までに死亡したか、安楽死させなければならなかった。１個体は感染後１日目に疾病徴候を示さずに死亡した。ワクチン接種した個体は総て、抗原投与しても生存した（図１３Ｄ）。Ｇａｌｌｉｍｕｎｅ（商標）ＦＬＵ  Ｈ５Ｎ９のワクチン接種を行った際、Ｔ１０群は、総てが感染徴候を回避したわけではないが、呼吸器系症状が出た個体はなかった。同様に、クロスβをアジュバントとするＨ５でワクチン接種を行った場合も、呼吸器系症状は少なかった。両ワクチン接種計画とも、総ての個体が完全に回復した。市販のワクチンで接種および抗原投与を行った際は、総ての個体に有害な作用が見られた（表２５）。
【０２２３】
表２６は、抗原投与後の臨床スコアを示す。表２７は呼吸器系症状のスコアを示す。表２８はＨ５Ｎ１抗原投与時の死亡率を示す。ヘマグルチニン抗体力価は表２９に示す。
【０２２４】
これらの研究を考え合わせると、ワクチンにクロスβをアジュバントとするＨ５またはＨ７を添加すると抗体力価が高まること、そしてクロスβをアジュバントとするＨ５をマウスに接種すると臨床徴候が軽減され、Ｈ５Ｎ１感染の結果としての死からマウスを保護することが示される。よって、クロスβ構造の添加は防御的免疫原性を可能とする。
【０２２５】
実施例１３
クロスβ構造をアジュバントとするＥ２−サブユニットワクチンは、致死量の豚コレラウイルス投与後、ブタを死から保護する
Ｅ２サブユニットワクチンによるブタのワクチン接種研究
目的
アミロイド様ミスフォールディングタンパク質コンフォメーションを有するＥ２抗原を含むサブユニットワクチンが抗体力価を生じ、致死量の豚コレラウイルスからブタを保護するかどうかを調べること。
【０２２６】
緒論
豚コレラ（ＣＳＦ、synonym hog cholera）は、発熱、出血、運動失調および免疫抑制を特徴とする伝染性で、多くの場合死に至るブタの疾病である。病原体は豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）であり、フラビウイルス科のペスチウイルス属のメンバーである。多くのヨーロッパ諸国で、このウイルスは固有のものでなく、周期的にＣＳＦが大発生し、大きな経済的損失を招くおそれがある。ＣＳＦＶ感染後は、構造糖タンパク質Ｅ２およびＥｒａｓ、ならびに非構造タンパク質ＮＳ３に対して抗体が生じる。Ｅ２は最も免疫原性の高いＣＳＦＶエンベロープタンパク質であり、ブタに中和抗体応答を誘導する。不活性化ＣＳＦＶに基づくワクチンは迅速かつ防御的な免疫応答を誘導する。しかしながら、これらのワクチンの欠点は、ワクチン接種された個体由来の血清が感染個体のものと区別できないことである。ＣＳＦＶに対するサブユニットワクチンは、このエンベロープ糖タンパク質Ｅ２に基づいて開発されたものである９。よって、このサブユニットワクチンは、ワクチン接種ブタと感染ブタの区別がＥｒｎｓおよび／またはＮＳ３に対する抗体の検出に基づき得るので、有力なマーカーワクチンとなる。このサブユニットワクチンは、安全性と有効性が試験されている５，１０昆虫細胞で生産されたＥ２を含む。このＥ２に基づくサブユニットワクチンは、速さは遅いが、防御的な免疫応答を生じる。ゆえに、より迅速な免疫応答を得るための何らかの改良が望まれる。
【０２２７】
材料および方法
ワクチンの作製
ブタ６個体６群を３２μｇの組換えＥ２／個体またはプラセボ（Ｈ２Ｏ、試験群Ｔ０１）で免疫化した。最初の接種では、未処理Ｅ２、熱周期ミスフォールディングＥ２（ミスフォールディング法Ｉ）およびアルキル−Ｅ２（ミスフォールディング法ＩＶ）を次のような比率で用いた（ロット１  ２００４０６ＲＳ、ＰＢＳ中２８５μｇ／ｍｌ）。
１群  プラセボ（Ｈ２Ｏ）
２群  １００％未処理Ｅ２
３群  ５０％ミスフォールディングＥ２（方法Ｉ）／５０％未処理Ｅ２
４群  ５０％ミスフォールディングアルキル−Ｅ２（方法ＩＶ）／５０％未処理Ｅ２
５群  ２５％ミスフォールディングＥ２（方法Ｉ）／２５％ミスフォールディングアルキル−Ｅ２（方法ＩＶ）／５０％未処理Ｅ２
６群  水−油エマルションをアジュバントとするＥ２
【０２２８】
２回目の免疫化としては、２１日目に、ここでもＳｆ１細胞により発現された組換えＥ２を、この場合は、ロット２  ０３０５０６ＲＳ、ＰＢＳ中２８０μｇ／ｍｌを用いた。Ｅ２は４つのミスフォールディング法（上記参照）を用いてミスフォールディングされたものであった。ワクチン処方物には、４種類のミスフォールディングＥ２調製物を１：１：１：１比で含む溶液を用い、Ｅ２終濃度はＰＢＳ中２２５μｇ／ｍｌであった。ブタ試験群１、２および６（Ｔ０１、Ｔ０２、Ｔ０６）に最初の接種と同じワクチンを投与した。２回目のワクチン接種では、ブタ試験群３、４および５（Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５）のワクチンは２５％、５０％および７５％のクロスβをアジュバントとするＥ２を含んだ。用量はここでも３２μｇＥ２／個体とした。
【０２２９】
免疫化
３６個体の雌ブタを用いた。ブタはオランダのＩＤ−Ｌｅｌｙｓｔａｄ施設で飼育した。ワクチン接種時、ブタはおよそ６週齢であり、ＣＳＦＶおよび他のペスチウイルスに対する抗体は含まなかった。ブタを無作為にワクチン群または対照群に割り付け、６群（ｎ＝６）をそれぞれ、高度封じ込め条件下、隔離ユニットで飼育した。動物に餌を与え、飲み水は自由に摂らせた。ブタに、０日目と２１日目に２．０ｍｌ試験サンプルで、耳のおよそ２ｃｍ後ろに右に１回、左に１回、筋肉内免疫を行った。最初の免疫化では、Ｔ０１群（対照、個体＃１１４〜１１９）に試験サンプル１（水）、Ｔ０２群（＃１２０〜１２５）にサンプル２（３２μｇ未処理Ｅ２）、Ｔ０３群（＃１２６〜１３１）にサンプル３（１６μｇ未処理Ｅ２とクロスβ法Ｉでアジュバント化した１６μｇＥ２の組合せ）、Ｔ０４群（＃１３２〜１３７）にサンプル４（１６μｇ未処理Ｅ２とクロスβ法ＩＶでアジュバント化した１６μｇＥ２の組合せ）、Ｔ０５群（＃１３８〜１４３）にサンプル５（１６μｇ未処理Ｅ２とクロスβ法Ｉでアジュバント化した８μｇＥ２およびクロスβ法ＩＶでアジュバント化した８μｇＥ２の組合せ）、Ｔ０６群（＃１４４〜１４９）にサンプル６（記載のようなダブル水中油［ＤＯＥ］１０をアジュバントとする３２μｇ未処理Ｅ２）を投与した。２回目の免疫化では、Ｔ０１群（対照）に試験サンプル１（水）、Ｔ０２群にサンプル２（３２μｇ未処理Ｅ２）、Ｔ０３群にサンプル３（２４μｇ未処理Ｅ２とクロスβ法Ｉ／ＩＩでアジュバント化した８μｇＥ２の組合せ）、Ｔ０４群にサンプル４（１６μｇ未処理Ｅ２とクロスβ法Ｉ／ＩＩでアジュバント化した１６μｇＥ２の組合せ）、Ｔ０５群にサンプル５（８μｇ未処理Ｅ２とクロスβ法Ｉ／ＩＩでアジュバント化した２４μｇＥ２の組合せ）、Ｔ０６群にサンプル６（ダブル水中油［ＤＯＥ］１０をアジュバントとする３２μｇ未処理Ｅ２）を投与した。第６群の１個体には、２ｍｌでなく１．５ｍｌを投与した。
【０２３０】
ＣＳＦＶ  Ｂｒｅｓｃｉａ  ４５６６１０株による抗原投与
４２日目に、１９個体のブタ（１群、３群および６群の全個体と５群の１個体＃１４３）に、２００  ＬＤ５０用量の高病原性ＣＳＦＶ  Ｂｒｅｓｃｉａ  ４５６６１０株を鼻内接種した。
【０２３１】
評価および検討
全研究の過程で動物を毎日１回モニタリングした（臨床スコア０〜７）。臨床徴候は、（１）成長遅滞、痩せ（衰弱）、食欲低下、食欲無し、嘔吐、緩慢／無気力／反応性の低下、補助無しでは立てない、全体的に病的、震えなどの症候を含む不調、（２）咳、くしゃみ、速い呼吸、いびきまたは鼻をすする、目やに（または涙目）、結膜炎または鼻水を含む呼吸器系の障害、および（３）耳の赤い点、直腸からの出血、または蒼白などの症候を含む出血、として定義した。各症候を１としてカウントした。抗原投与の２日前から試験の終了（５６日目）まで肛門温度を測定した。発熱は４０℃を超える温度と定義した。
【０２３２】
血清採取のため０日目、２日目、５日目、９日目、１２日目、１６日目、１９日目、２６日目、３３日目、４２日目（抗原投与）および５６日目に採血を行った。血液を凝固させた後、遠心分離（３５００ｒｐｍ５分）の後に血清を得た。血清は−２０℃で保存した。
【０２３３】
ＰＫ１５細胞と非細胞病原性ウイルスを用い、Ｅ２上の異なるエピトープと反応する２つのモノクローナル抗体（バッチＶ３：０３０５０２、バッチＶ４：１１０７０２）を用い、中和ペルオキシダーゼ結合アッセイ（ＮＰＬＡ）で中和抗体の存在に関して血清を調べた１１。血清の一連の希釈液（二反復）を、３０±３００のＴＣＩＤ５０  ＣＳＦＶ（Ｂｒｅｓｃｉａ株）を含む同量のＥａｇｌｅ  ＢＳＳと混合した。ＣＯ２インキュベーターにて、３７℃で１時間インキュベートした後、ウェル当たりおよそ２５０００個のＰＫ−１５細胞を加えた。４日後にこれまでに記載されているように１０，１２、ＩＰＭＡを行った。抗体力価は、細胞培養物の５０％において単層の感染が阻害された（１００％）最高希釈率の逆数として表した。１０未満の力価は陰性とみなした。
【０２３４】
また、製造業者の説明書に従い、ＥＬＩＳＡ（Ｃｅｄｉｔｅｓｔ（商標）ＣＳＦＶおよびＣｅｄｉｔｅｓｔ（商標）ＣＳＦＶ２．０、Cedi-Diagnostics, Lelystad, オランダ）を用いて、抗体の存在に関して血清を調べた。
【０２３５】
ＥＤＴＡ血液サンプル中の白血球および血小板の数をＭｅｄｏｎｉｃ７  ＣＡ５７０コールターカウンターで測定した。白血球減少症は＜８×１０９細胞ｓ／１Ｌ血液、血小板減少症は＜２００×１０９細胞／１Ｌ血液として定義される。
【０２３６】
結果
３６個体のブタ（各群６個体で６群）を本研究に用いた。各ブタに０日目と２１日目に対照ワクチン（水、Ｔ０１群）または組換え生産された構造糖タンパク質Ｅ２を含むサブユニットワクチン（Ｔ０２〜Ｔ０６群）を接種した後、材料および方法の節に記載されているようにＣＳＦＶ（Ｂｒｅｓｃｉａ  ４５６６１０株）を投与した。
【０２３７】
中和抗体力価を測定した（表２９）。クロスβ構造でアジュバント化したＥ２を接種した個体（Ｔ０３およびＴ０５のブタ＃１４３）の力価は、２６日目、３３日目および４２日目で対照群（Ｔ０１）に比べて有意に高かった。Ｔ０３のブタ＃１２７はＮＰＬＡ力価をほとんど生じていなかった。
【０２３８】
Ｔ０１群（プラセボ）、Ｔ０３群（５０％クロスβ−Ｅ２方法Ｉ／２５％クロスβ−Ｅ２方法ＩおよびＩＩ）、Ｔ０５群ブタ＃１４３（５０％クロスβ−Ｅ２方法Ｉ／ＩＶ／７５％クロスβ−Ｅ２方法ＩおよびＩＩ）の個体を抗原投与実験に含めた。プラセボ／水で免疫した個体（対照群Ｔ０１）は総て死亡した（図１４）。クロスβ構造をアジュバントとするものであれＤＯＥをアジュバントとするものであれ、Ｅ２−ワクチンを施した動物は、１つの例外（Ｔ０３、ブタ＃１２７、ＮＰＬＡ力価がほとんど生じない）を除き、総ての個体が生存した（図１４）。ＤＯＥをアジュバントとするＥ２で免疫化した個体は、感染の臨床徴候を示さなかった。クロスβ構造をアジュバントとするＥ２を施した個体は感染の徴候を示したが、それらの徴候はＴ０１個体に比べて重篤度が小さかった（表３０）。クロスβ構造をアジュバントとするＥ２を接種した個体では、Ｔ０１（プラセボ）に比べて呼吸障害が少なく、出血も少なかった。Ｔ０１のブタでは６個体中６個体に出血が見られた。７個体のクロスβ−Ｅ２接種ブタのうち４個体がＣＳＦＶ投与後に出血を示した。出血の平均期間は、クロスβ−Ｅ２接種ブタでは１．８日であったのに対し、Ｔ０１のプラセボ処置ブタでは３．２日間であった。Ｔ０３（クロスβ−Ｅ２ワクチン）では、他のブタの中でも、ＮＰＬＡ力価をほとんど生じなかったブタ＃１２７が出血に見舞われた。
【０２３９】
臨床スコアおよび血液サンプルの分析を以下に示す。表３１は、抗原投与後の段階の臨床スコアを示す。表３２は、抗原投与中の温度の測定値を示す。
【０２４０】
対照群（Ｔ０１）およびクロスβ構造をアジュバントとするＥ２で免疫した群では、見られた白血球減少症（１００％、８７％）および血小板減少症（双方とも１００％）は、ＤＯＥをアジュバントとするＥ２を施した群に比べて（白血球減少症０％、血小板減少症１７％）有意であった（表３４）。Ｔ０３群のブタ＃１２７は、極めて強い白血球減少症および血小板減少症を示し、ＮＰＬＡ力価の不在との関連が最も高いと思われた。
【０２４１】
これらの研究は、クロスβ構造をアジュバントとするＥ２を接種した際に、重篤な抗原投与試験で判定された、致死量のＣＳＦＶに対して部分的保護、すなわち、臨床徴候の軽減を伴った生存が得られることを示す。
【０２４２】
実施例１４
クロスβ構造を含むオボアルブミンでニワトリを免疫すると耐性が打破され、その結果、自己抗体力価が形成される
材料および方法
ＯＶＡのミスフォールディング
ニワトリの免疫化に用いるサンプルは、上記のようなマウスの免疫化（実施例１２）に用いたものと同じであった。
【０２４３】
免疫化
８８個体のおよそ３週齢の雄ＬＳＬ  Ｌｏｈｍａｎ鶏を用いた。０日目と２１日目に０．５ｍｌ試験サンプルを、ニワトリの左腿（０日目）と右腿（２１日目）に筋肉内免疫した。Ｔ０１群（対照、＃４６０１〜４６０８）に試験サンプル１（水、プラセボ）、Ｔ０２群（＃４６０９〜４６１６）にサンプル２（５μｇ未処理Ｈ５）、Ｔ０３群（＃４６１７〜４６２４）にサンプル３（未処理Ｈ５と方法Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩによりミスフォールディングした３３％クロスβ−Ｈ５の組合せ）、Ｔ０４群（＃４６２５〜４６３２）にサンプル４（未処理Ｈ５と方法Ｉ〜ＩＩＩで修飾した６６％クロスβ−Ｈ５の組合せ）、Ｔ０５群（＃４６３３〜４６４０）にサンプル５（方法Ｉ〜ＩＩＩで修飾した１００％クロスβ−Ｈ５）、およびＴ１０群（＃４６７３〜４６８０）にサンプル１０（ワクチン、Ｇａｌｌｉｍｕｎｅ（商標）ＦＬＵ  Ｈ５Ｎ９、ロットＦ３８７８５Ｃ、不活性化鳥インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ９、Ａ／シチメンチョウ／ウィスコンシン／６８株）を含む）を投与した。総ての場合で、全部で（未処理型と修飾型を合わせて）ＰＢＳ中、５μｇのＨ５を投与した。
【０２４４】
血清採取のため、−１日目、２１日目、３３日目に羽の静脈から採血した。血液を凝固させた後、遠心分離（３５００ｒｐｍ５分）の後に血清を得た。血清は−２０℃で保存した。抗ＯＶＡ抗体力価は、０日目と３３日目に採取した血清で、標準的なＥＬＩＳＡを用いて評価した。−１日目と３３日目に採取したニワトリの血清で、ＤＯＶＡに関する力価測定を行ったこの目的で、群内の８個体の血清をプールした。−１日目に採取した血清プールを陰性対照として用いた。
【０２４５】
結果
図１５では、プールしたニワトリ血清での力価測定値を示す。プラセボワクチン（すなわち、水）を施したＴ０１群から採取した血清は検出可能な量の抗ＯＶＡ抗体を含まない。ＯＶＡを含む種々のワクチンを接種したニワトリはより高い抗ＯＶＡ力価を生じた。最も顕著には、３３％のクロスβをアジュバントとするサンプルを含むワクチンで免疫化すると、高い抗ＯＶＡ力価を生じた。同様に、アジュバントを添加すると、抗ＯＶＡ抗体が誘導された。これらの結果は、ワクチンにクロスβをアジュバントとするＯＶＡ−抗原を含めると、体液性の自己免疫応答が生じることを示す。このクロスβ構造の耐性打破能を考えると、自己抗原に対するワクチンが開発される。このようなワクチンは、例えば雄性免疫弱化のためのＬＨＲＨに対する抗体の誘導のため、または移植片対宿主病（ＧｖＨ）および／または移植拒絶に用いるためといった感染以外の疾病または目的に対して用いられる。
【０２４６】
表の説明
表１に挙げられている化合物および表２に挙げられているタンパク質は総て、アミロイド様非天然型の折りたたみを有するポリペプチドと結合する。文献では、この非天然型の折りたたみは、タンパク質凝集物、非晶質凝集物、非晶質堆積物、もつれ、（老人）斑、アミロイド、アミロイド様タンパク質、変性タンパク質、アミロイドオリゴマー、アミロイド形成性堆積物、クロスβ構造、β−プリーツシート、クロスβスパイン、プラーク、変性タンパク質、クロスβシート、β−構造豊富な凝集物、タンパク質の感染性凝集形態、非フォールディングタンパク質、アミロイド様折りたたみ／コンフォメーションとおそらくは選択的に呼ばれている。表１および２に挙げられている１以上の化合物のリガンドである、非天然型のアミロイド様の折りたたみを有する総てのポリペプチドで共通の主題は、クロスβ構造コンフォメーションの存在である。
表１および２に挙げられている化合物は、これまでに非天然型タンパク質コンフォメーションと結合することが知られている総ての化合物のサブセットに過ぎないと考えられる。従って、これらの一覧は非限定的なものである。アミロイド様タンパク質コンフォメーションと結合する化合物は現在、より多くのものが知られている。例えば、特許ＡＵ２００３２１４３７５には、プリオンタンパク質、アミロイド、およびｔａｕの凝集物は、デキストラン硫酸もしくはペントサン（陰イオン性）などの多イオン性結合剤、またはポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）（陽イオン性）などのポリアミン化合物と選択的に結合することが記載されている。この特許また他所に挙げられているタンパク質の非天然型の折りたたみに対して特異性を有する化合物は特に、この特許出願に開示されている方法および装置に対して同程度に好適である。さらに、表１および２に挙げられているものに関連する化合物またはタンパク質はいずれも本特許請求の範囲に含まれる。例えば、点突然変異体、断片、クロスβ構造結合ドメインの組換え生産された組合せ、欠失突然変異体および挿入突然変異体は、それらがクロスβ構造と結合できる限り（すなわち、それらが機能的等価物である限り）、化合物セットの一部である。さらにまた、クロスβ構造折りたたみに親和性を示す、新たに開発された小分子またはタンパク質はいずれも、本明細書で開示されている方法および適用のいずれか１つに基本的に使用可能である。
【０２４７】
表３に挙げられている化合物もまた、「クロスβ構造経路」の一部であると考えられ、この考えは、挙げられている分子と、おそらくはクロスβ構造の折りたたみを含むが、それ自体は開示されていない化合物との相互作用を示す文献データに基づいている。表４〜３４は実施例の結果を示す。
【０２４８】
参考文献リスト（実施例７〜１４を除く）
2009501215.tif 000003
2009501215.tif 000004
2009501215.tif 000005
【０２４９】
参考文献リスト（実施例７〜１４）
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2009501215.tif 000007
【０２５０】
【表１ｂ】
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【０２５１】
【表２】
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【０２５２】
【表３】
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【０２５３】
【表４】
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【０２５４】
【表５】
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【０２５５】
【表６】
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【０２５６】
【表７】
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【０２５７】
【表８】
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【０２５８】
【表９】
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【０２５９】
【表１０】
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【０２６０】
【表１１】
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【０２６１】
【表１２】
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【０２６２】
【表１３】
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【０２６３】
【表１４】
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【０２６４】
【表１５】
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【０２６５】
【表１６】
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【０２６６】
【表１７】
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【０２６７】
【表１８】
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【０２６８】
【表１９】
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【０２６９】
【表２０】
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【０２７０】
【表２１】
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【０２７１】
【表２２】
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【０２７２】
【表２３】
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【０２７３】
【表２４】
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【０２７４】
【表２５】
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【０２７５】
【表２６】
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【０２７６】
【表２７】
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【０２７７】
【表２８】
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【０２７８】
【表２９】
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【０２７９】
【表３０】
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【０２８０】
【表３１】
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【０２８１】
【表３２】
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【０２８２】
【表３３】
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【０２８３】
【表３４】
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【０２８４】
配列
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【図面の簡単な説明】
【０２８５】
【図１】アジュバントカオリンによる、また、クロスβ構造コンフォメーションを有するペプチド凝集物による因子ＸＩＩの活性化  Ａ．カオリン同様、ＦＰ１３およびＡβのアミロイド様ペプチド凝集物は、活性化された因子ＸＩＩによるプレカリクレインからのカリクレインの形成の際の、クロモザイム−ＰＫの変換により検出されるように、因子ＸＩＩの活性化を刺激する。バッファー対照および非アミロイド対照であるフィブリン断片ＦＰ１０および非アミロイドネズミ膵アミロイドポリペプチドｍＩＡＰＰは因子ＸＩＩを活性化しない。Ｂ．ＦＰ１３およびＡβ同様、クロスβ構造コンフォメーション豊富なペプチドラミニン（ＬＡＭ１２）およびトランスチレチン（ＴＴＲ１１）も、カオリンと同程度に因子ＸＩＩの活性化を刺激する。Ｃ．因子ＸＩＩの自己活性化は、精製した因子ＸＩＩをＤＸＳ５００ｋとともに、またはクロスβ構造コンフォメーションを有する種々のアミロイド様タンパク質凝集物とともに、発色基質Ｓ−２２２２の存在下でインキュベートすることにより確認される。
【図２】アジュバントは種々のタンパク質にアミロイド様特性を誘導する  Ａ．ＤＸＳ５００ｋとともに、または伴わずに固定化したタンパク質によるＥＬＩＳＡで測定されるように、アジュバントＤＸＳ５００ｋおよびカオリンはＴｈＴ蛍光を誘導し、アジュバントＤＸＳ５００ｋは、一晩のインキュベーションの後に種々のタンパク質にｔＰＡ結合特性を誘導する。ＤＸＳ５００ｋまたはカオリンとともにインキュベートしたタンパク質を用いた場合のＴｈＴ蛍光またはｔＰＡ結合は、タンパク質のインキュベーション時にＤＸＳ５００ｋおよびカオリンを除いた場合に観察される蛍光またはｔＰＡ結合の倍率として示される（「増強倍率」）。Ｂ．発色性因子ＸＩＩ自己活性化アッセイでは、アミロイドフィブリン由来ペプチドＦＰ１３  Ｋ１５７Ｇは因子ＸＩＩの自己活性化を刺激し、これはアミロイド特異的色素ＴｈＴにより阻害される。Ｃ．アジュバントＤＸＳ５００ｋは、８０倍希釈の血漿が存在する場合、因子ＸＩＩの活性化の唯一の刺激因子である。ＤＸＳ５００ｋおよび血漿タンパク質による因子ＸＩＩの活性化は、ＴｈＴによって阻害される。因子ＸＩＩの活性化は発色アッセイで測定した。Ｄ．６０％ｖ／ｖ血漿の存在下では、発色基質Ｓ２２２２の変換を測定することにより検出されるように、アジュバントＧａ３（ＰＯ４）２沈殿が因子ＸＩＩを活性化する。Ｅ〜Ｆ．従って、因子ＸＩＩは、アジュバントであるカオリンまたはＤＸＳ５００ｋの双方と、エンドスタチン（Ｅ）またはアルブミン（Ｆ）いずれか１ｍｇ  ｍｌー１がアッセイ混合物に含まれる場合のみに効率的に活性化される。プレカリクレインおよび高分子量キニノゲンの存在下での因子ＸＩＩの活性化は、発色性カリクレイン基質クロモザイム−ＰＫの変換を測定することにより求めることができる。Ｇ〜Ｈ．アジュバントＤＸＳ５００ｋ、ＣｐＧ、フロイントの完全アジュバント（Ｇ）、ミョウバンおよびＤＤＡ（Ｈ）は、発色性プラスミン基質Ｓ２２５１の変換を測定することにより求められるように、ｔＰＡおよびＰｌｇの活性化を誘導する。陽性対照は１００μｇｍｌー１のアミロイドγ−グロブリンであり、陰性対照はバッファーであった。Ｉ．８０倍希釈の血漿を示されているアジュバントとともにインキュベートすると、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）、スペコール、ＤＸＳ５００ｋおよびＣｐＧについてはＴｈＴ蛍光が生じるが、ＤＥＡＥ−デキストラン、フロイントの不完全アジュバント、ミョウバンおよびＤＤＡは効果が無い。ＴｈＴの測定のために、サンプルを４０倍希釈した。Ｊ．同様の実験で、２０倍希釈の血漿を示されている一連のアジュバントとともにインキュベートした。１６０倍希釈の後、ＤＸＳ５００ｋ、ＣｐＧ、ＣＦＡ、ＩＦＡおよびスペコールは、ＴｈＴ蛍光を誘導した。Ｋ−Ｌ．１ｍｇ  ｍｌー１のリゾチーム（Ｋ）またはエンドスタチン（Ｌ）を示されている一連の濃度のＬＰＳまたはＣｐＧに曝すと、ＴｈＴ蛍光シグナルの増強が誘導される。１ｍｇ  ｍｌー１のアルブミン、エンドスタチン、血漿β２ＧＰＩまたは組換えβ２ＧＰＩを２１．４μｇ  ｍｌー１のＣｐＧに曝すと、およそ２〜１１倍ＴｈＴ蛍光が増強される。これらのアッセイ条件では、リゾチームおよびγ−グロブリンによる作用は見られない。Ｎ−Ｒ．ＣｐＧ（Ｎ．）、リゾチーム（Ｏ．）、ＣｐＧに曝されたリゾチーム（Ｐ．）ＤＸＳ５００ｋ（Ｑ．）およびＤＸＳ５００ｋに曝されたリゾチーム（Ｒ．）のＴＥＭ画像。スケールバーは２００ｎｍを表す。
【図３】因子ＸＩＩおよびｔＰＡとβ２−糖タンパク質Ｉとの結合および抗β２ＧＰＩ自己抗体と組換えβ２ＧＰＩとの結合  Ａ．ｔＰＡにより媒介されるＰｌｇからプラスミンへの変換に対する組換えＢ２ＧＰＩの刺激活性を示す発色性プラスミンアッセイ。陽性対照はアミロイドフィブリンペプチドＦＰ１３であった。Ｂ．ＥＬＩＳＡにおいて、組換えβ２ＧＰＩは固定化ｔＰＡと結合するが、血漿から精製されたβ２ＧＰＩは結合しない。ｋＤは２．３μｇｍｌー１（５１ｎＭ）である。Ｃ．ＥＬＩＳＡにおいて、精製因子ＸＩＩがＥＬＩＳＡプレートに固定化されている場合、因子ＸＩＩは精製組換えヒトβ２ＧＰＩと結合するが、ヒト血漿から精製されたβ２ＧＰＩとは結合しない。組換えβ２ＧＰＩは、ｋＤ  ０．９μｇ  ｍｌー１（２０ｎＭ）で固定化因子ＸＩＩと結合する。Ｄ．抗ヒト因子ＸＩＩ抗体とともにインキュベートしたウエスタンブロット。β２ＧＰＩを新鮮なヒト血漿または−２０℃で冷凍され、その後、β２ＧＰＩアフィニティーカラムで精製する前に解凍された血漿のいずれかから精製した。溶出した画分をＳＤＳ−ＰＡ電気泳動の後、ウエスタンブロットにて分析した。レーン２〜３を４〜５と比較すると、血漿の冷凍−解凍の結果、因子ＸＩＩがβ２ＧＰＩとともに精製されるようになる。因子ＸＩＩの分子量は８０ｋＤａである。Ｅ．ＥＬＩＳＡにおいて、組換えβ２ＧＰＩは、抗β２ＧＰＩ自己抗体と固定化β２ＧＰＩとの結合を効果的に阻害するが、血漿β２ＧＰＩの抗体結合に対する効果は小さい。抗β２ＧＰＩ自己抗体は、自己免疫疾患抗リン脂質抗体症候群患者の血漿から精製されたものである。Ｆ．２５μｇ  ｍｌー１のβ２ＧＰＩ、組換え生産型（ｒβ２ＧＰＩ）または血漿精製型（ｎβ２ＧＰＩ）を１００μＭのカルジオリピン小胞または２５０μｇ  ｍｌー１のデキストラン硫酸５００，０００Ｄａ（ＤＸＳ）に曝すと、溶液中のクロスβ構造コンフォメーションの量の増加を示唆するＴｈＴ蛍光の増強が誘導される。シグナルは、カルジオリピン、ＤＸＳ、ＴｈＴおよびバッファーのバックグラウンド蛍光に関して補正されている。Ｇ．ｔＰＡおよびＫ２Ｐ−ｔＰＡと、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに固定化されているβ２ＧＰＩとの結合、または固定化カルジオリピンと結合したβ２ＧＰＩとの結合を評価する。カルジオリピンと接しているβ２ＧＰＩは、ＥＬＩＳＡプレートに直接接しているβ２ＧＰＩよりも高い程度でｔＰＡと結合する。Ｋ２Ｐ−ｔＰＡはβ２ＧＰＩと結合しない。ｔＰＡは固定化カルジオリピンとは結合しない。Ｈ．４００μｇ  ｍｌー１の精製血漿β２ＧＰＩ単独（１）または１００μＭのカルジオリピンと接したもの（２、３）および４００μｇ  ｍｌー１の精製組換えβ２ＧＰＩ（４）の透過型電子顕微鏡画像。
【図４】クロスβ構造コンフォメーション豊富な化合物および変性剤として働くＬＰＳによる刺激後の、単球におけるＴＮＦα  ＲＮＡの合成  Ａ．培養Ｕ９３７単球をバッファー、ＬＰＳ、アミロイドエンドスタチン、アミロイドＨｂ−ＡＧＥまたは対照Ｈｂとともに１時間インキュベートした。ＴＮＦα  ＲＮＡのアップレギュレーションを、単球から単離したＲＮＡ(RNA isolated form the monocytes)とＴＮＦαプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行うことで評価した。ＲＴ−ＰＣＲ後のＴＮＦα  ｃＤＮＡの量を、同じＲＮＡサンプルで得られたリボゾーム１８Ｓ  ｃＤＮＡの量に対してノーマライズした。バッファーとともにインキュベートした単球では、ＴＮＦα  ＲＮＡは検出されない。エンドスタチンおよびＨｂ−ＡＧＥは、ＬＰＳに比べておよそ３０％のＴＮＦα  ＲＮＡ発現を誘導するが、対照Ｈｂにより誘導されるＴＮＦα  ＲＮＡの発現はおよそ３分の１の低さであった。Ｂ．１ｍｇ  ｍｌー１のリゾチームを０〜１２００μｇ  ｍｌー１のＬＰＳに曝すと、バッファーのみでインキュベートしたリゾチームに対して１．１倍〜１３．１倍までのＴｈＴ蛍光の増強が起こり、これは結果としてリゾチームにアミロイド様構造を生じるＬＰＳの変性能を示唆する。標準偏差は一般に１０％未満であった（示されていない）。Ｃ．１ｍｇ  ｍｌー１のリゾチーム、アルブミン、エンドスタチン、γ−グロブリン、血漿β２ＧＰＩまたは組換えβ２ＧＰＩを６００μｇ  ｍｌー１のＬＰＳに曝すと、およそ２〜１０倍のＴｈＴ蛍光の増強が起こる。
【図５】アルキル化ネズミ血清アルブミン、ならびに熱変性されたオボアルブミン、ネズミ血清アルブミン、ヒトグルカゴンおよびエタネルセプトにおけるアミロイド様クロスβ構造コンフォメーション  Ａ．発色基質Ｓ−２２５１を用いたプラスミン活性の読み取りによるＰｌｇ活性化アッセイ。還元・アルキル化ネズミ血清アルブミン（アルキル−ＭＳＡ）および熱変性ＯＶＡ（ｄＯＶＡ）の活性化特性を、アミロイドγ−グロブリン（陽性対照）、バッファー（陰性対照）、および天然型アルブミンおよびＯＶＡ（ｎＭＳＡ、ｎＯＶＡ）と比較した。Ｂ．天然型および変性ＭＳＡおよびＯＶＡを用いたチオフラビンＴ蛍光アッセイ。Ｃ．還元・アルキル化ＭＳＡと熱変性ＭＳＡとの比較のためのＰｌｇ活性化アッセイ。Ｄ．還元／アルキル化ＭＳＡと熱変性ＭＳＡを用いたチオフラビンＴ蛍光アッセイ。Ｅ．一連の濃度の熱／酸変性グルカゴンを用いたＰｌｇ活性化アッセイ。Ｆ．天然型および熱／酸変性グルカゴンを用いたチオフラビンＴ蛍光アッセイ。Ｇ．熱変性エタネルセプト、天然型エタネルセプトおよび還元／アルキル化エタネルセプトのｔＰＡ活性化特性の比較。Ｈ．天然型および熱変性エタネルセプトのチオフラビンＴ蛍光。Ｉ．熱変性ＯＶＡのＴＥＭ画像。スケールバーは２００ｎｍを表す。Ｊ．熱／酸変性グルカゴンのＴＥＭ画像。スケールバーは１μＭを表す。Ｋ．変性ＯＶＡを０．２μｍフィルターで濾過しても蛍光増強特性に影響はないことを示すチオフラビンＴ蛍光アッセイ。Ｌ．ｎＯＶＡまたはｄＯＶＡで免疫化したマウスの血清をプールしたものにおける抗ｎＯＶＡ抗体の力価測定。力価は、免疫前血清の１０倍希釈で得られたバックグラウンド値を超えるシグナルをなお示す血清希釈率として定義される。ｎＯＶＡ免疫マウスの力価は６１０＊であり、ｄＯＶＡ免疫マウスの力価は３９９９＊であった。１週間後、両群とも力価は検出されなかった。ｄＯＶＡ免疫マウスで見られた６．６倍高い力価は、クロスβ構造コンフォメーションを有する変性ＯＶＡのより高い免疫活性を示唆する。
【図６】ＰｏｒＡ調製物におけるアミロイド様ミスフォールディングタンパク質の検出  Ａ．３つのタンパク質ミスフォールディング法Ｉ〜ＩＩＩのいずれかを受けたＰｏｒＡおよびＰｏｒＡの保存溶液はＴｈＴ蛍光アッセイに４００倍希釈で適用される。Ｂ．同じＰｏｒＡサンプルを、発色性プラスミンアッセイにおいてｔＰＡ／プラスミノーゲンを活性化する能力に関して調べた。サンプルは４００倍希釈した。Ｃ．１０倍希釈のＰｏｒＡワクチン調製物（１アッセイにおいて１μｇ／ｍｌ  ＰｏｒＡ）を用いたＴｈＴ蛍光アッセイ。Ｄ．２０倍希釈のＰｏｒＡワクチン調製物（１アッセイにおいて０．５μｇ／ｍｌ  ＰｏｒＡ）を用いたｔＰＡ／プラスミノーゲン活性化アッセイ。
【図７】抗ＰｏｒＡ抗体力価の測定および血清殺菌抗体力価の測定  Ａ．ワクチン接種後２１日目、各マウス群の血清プールを、０日目のワクチン接種に用いた三価ＰｏｒＡ抗原を用い、それらの抗三価ＰｏｒＡ抗体力価に関して分析した。Ｂ．０日目のワクチン接種後４２日目と２１日目のワクチン接種後１４日目に採取した個々の血清を用いて測定した抗ＰｏｒＡ抗体力価。用いた抗原は、三価ワクチンを構成している３つのＰｏｒＡ亜型であった。Ｃ．Ｂと同様の血清で測定した血清殺菌抗体（ＳＢＡ）力価。
【図８】ヒトクロスβ−β２−糖タンパク質Ｉでマウスを免疫化すると、自己抗原および非自己抗原に対する抗体力価が生じる  Ａ．ヒトβ２ｇｐｉをカルジオリピンに曝すと、この混合物に、プラスミン基質を用いた発色性ｔＰＡ／プラスミノーゲン活性化アッセイで測定されるようなｔＰＡ／プラスミノーゲン活性特性（クロスβ構造の存在の指標となる）が付与される。Ｂ．ヒトβ２ｇｐｉのシステイン残基のアルキル化により、ＴｈＴ蛍光増強アッセイで測定されるようなクロスβ構造が導入される。Ｃ．カルジオリピンとヒトβ２ｇｐｉの混合物で免疫化されたマウスは、未処理ヒトβ２ｇｐｉ抗原に対する抗体力価を生じる。Ｄ．クロスβ構造を有するカルジオリピン−β２ｇｐｉと同様に、クロスβ構造を有するヒトアルキル−β２ｇｐｉも未処理ヒト抗原に対する抗体力価を生じる。Ｅ．ヒトクロスβ−β２ｇｐｉで免疫化したマウスはマウス未処理β２ｇｐｉに対する力価を生じるが、このことはクロスβ構造を含む抗原で免疫化した場合のマウスの耐性打破を証明する。
【図９】抗原におけるクロスβ構造を含むアミロイド様ミスフォールディングタンパク質コンフォメーションの検出  クロスβ構造は、アミロイド特異的色素と溶液中の抗原を接触させた際のＴｈＴ蛍光の増強を評価することにより、また、発色性プラスミン基質変換アッセイにおいて、クロスβ構造と結合し、かつ、それにより活性化されるセリンプロテアーゼであるｔＰＡの活性化際のプラスミン活性を測定することにより検出される。Ａ．バッファー対照と比較した、１００μｇ／ｍｌのＯＶＡまたはＤＯＶＡ（ミスフォールディング法Ｉ）によるｔＰＡ／プラスミノーゲン活性化。Ｂ．１００μｇ／ｍｌのＯＶＡまたはＤＯＶＡを用いたＴｈＴ蛍光アッセイ。Ｃ．１０倍希釈の未処理Ｈ５保存溶液（ロット１  ２１０４０６ＣＳ、ＰＢＳ中２３６μｇ／ｍｌ）を用いたＴｈＴ蛍光。Ｄ．クロスβ構造コンフォメーションを有するＨ５分子の画分の存在を示す、Ｈ５保存溶液（ロット１  ２１０４０６ＣＳ、ＰＢＳ中２３６μｇ／ｍｌ）によるｔＰＡの活性化。Ｅ．未処理Ｈ５、熱的ミスフォールディング（Ｈ５＋ＯＶＡ）（方法Ｉ）および熱的ミスフォールディングＨ５−ＯＶＡ（グルタルアルデヒド／ＮａＢＨ４とコンジュゲートしたもの；方法ＩＩＩ）、総て１４μｇ／ｍｌ（ロット２画分Ｘ２５０５０６ＣＳ、ＰＢＳ中１４０μｇ／ｍｌ）によるＴｈＴ蛍光。Ｆ．クロスβ構造の存在を示す、Protein Sciences Corp.から購入した１２μｇ／ｍｌ組換えＨ７のｔＰＡ活性化特性。陽性対照：アミロイドγ−グロブリン。Ｇ．Protein Sciences Corp.から購入した組換えＨ７は６０μｇ／ｍｌで、クロスβ構造を有するタンパク質分子の存在を示す、ＴｈＴ蛍光をいくらか増強する。Ｈ．所内生産した組換え天然型Ｈ７、Ｈ７とＯＶＡの熱的ミスフォールディング混合物、およびＥＤＣ／ＮＨＳカップリングから得られた熱的ミスフォールディングＨ７−ＯＶＡコンジュゲートを用いたＴｈＴ蛍光アッセイ。Ｈ７保存溶液は１０倍希釈した。Ｉ．１μｇ／ｍｌミスフォールディングＨ７（ロット２  ０５−２００６ＣＳ）の導入時のｔＰＡ／プラスミノーゲン活性の増強。「（Ｈ７＋ＯＶＡ）」は、熱的ミスフォールディングＨ７にＯＶＡを加えたものを指し、「Η７−ＯＶＡ」は、ＥＤＣ／ＮＨＳを用いてＨ７とＯＶＡをカップリングした後の、Ｈ７の熱的ミスフォールディングを指す。Ｊ．１０倍希釈のＥ２調製物と１００μｇ／ｍｌ濃度のＤＯＶＡと接触させた際のＴｈＴ蛍光。ＨＥＫ２９３Ｅ細胞由来の遊離Ｅ２を、熱周期を用いて直接ミスフォールディングしたか、またはまずＥＤＣ／ＮＨＳを用いてＯＶＡとコンジュゲートした後にミスフォールディングした。Ｋ．ｔＰＡ活性の増強は、１００μｇ／ｍｌの種々のＣＬ３ペプチド調製物を用いて測定する。Ｌ．ＴｈＴ蛍光増強アッセイにおいて、サンプル１、２、５および６の濃度は１３６μｇ／ｍｌであり、サンプル３および４は１００μｇ／ｍｌで試験した。
【図１０】鳥インフルエンザＨ５Ｎ１抗原投与実験およびＣＳＦＶ抗原投与実験に用いた抗原  Ａ．Ｈ５調製物２４μｇ／ｍｌのＴｈＴ蛍光。サンプル２では、Ｈ５をＯＶＡと混合した後に熱周期を用いたミスフォールディングを適用した。Ｈ５−ＯＶＡ−１、ＥＤＣ／ＮＨＳカップリングを用いてＨ５とＯＶＡをコンジュゲートさせたもの；Ｈ５−ＯＶＡ−２、グルタルアルデヒド／ＮａＢＨ４カップリングを用いてＨ５とＯＶＡをコンジュゲートさせたもの。Ｂ．天然型Ｅ２と２種類のミスフォールディングＥ２調製物を用いたｔＰＡ／プラスミノーゲン活性アッセイ。未処理Ｅ２または種々のアミロイド様ミスフォールディング型によるブタの最初のワクチン接種に用いたＥ２調製物。Ｓｆ１細胞で発現させたＰＢＳ中２８５μｇ／ｍｌのＥ２ロット１  ２００４０６ＲＳを免疫化に用いた。このアッセイでは、Ｅ２濃度は２０μｇ／ｍｌであった。Ｃ．ワクチン処方物に用いたＥ２調製物のＴｈＴ蛍光。ミスフォールディングＥ２は３０℃から８５℃、そして３０℃に戻る熱周期により得られたものである。Ｄ．ｔＰＡ／プラスミノーゲン活性化アッセイにおいて、新しく溶かしたＣＬ３ペプチドと６５℃でインキュベートしたペプチドが最も強力なｔＰＡアクチベーターであり、室温または３７℃でのインキュベーションでは活性化クロスβ構造含量が低下する。このアッセイにおけるペプチド濃度は２００μｇ／ｍｌであった。
【図１１】Ｅ２、ＣＬ３、Ｈ５、Ｈ７およびオボアルブミンを含む混合ワクチン中のクロスβ構造含量の測定  Ａ．ｔＰＡ／プラスミノーゲンの活性化を２０倍希釈の混合ワクチン溶液ａ〜ｆで測定したところ、ａ〜ｃ群およびｄ〜ｆ群の全抗原濃度はそれぞれおよそ５μｇ／ｍｌおよび０．５μｇ／ｍｌである。Ｂ．１０倍希釈の抗原溶液ａ〜ｆでのコンゴレッド蛍光アッセイ。陽性対照はアミロイド−βとした。Ｃ．１０倍希釈の抗原溶液ａ〜ｆでのＴｈＴ蛍光アッセイ。陽性対照：Ａβ。
【図１２】クロスβをアジュバントとする混合抗原によるワクチン接種後２８日目のマウス血清の抗抗原抗体力価  Ａ．ａ群のマウスに１個体当たり１０μｇの未処理組換えＨ７(Protein Sciences Corp.)で１回の接種を行うと、抗Ｈ７抗体力価が生じる。Ｂ．Ｃｅｄｉ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＣＳＦＶキットのＥ２抗原に対する力価。１回のワクチン接種後、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞で発現されたクロスβをアジュバントとするＥ２  ５または１０μｇを受けたマウスは力価を生じた。Ｃ．コーティングされたＤＯＶＡでの力価測定。Ｄ．コーティングされた未処理ＯＶＡでの力価測定。
【図１３】プラセボ（水、Ｔ０１）接種、クロスβ構造をアジュバントとするサブユニットワクチンＨ５（Ｔ０３群）接種または不活性化インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ９）（Ｔ１０群）接種、ならびに材料および方法に記載されるような２０  ＬＤ５０を用いた抗原投与後のマウスの生存数  Ａ．プラセボ、未処理Ｈ５、市販のＨ５Ｎ９ワクチンまたはクロスβをアジュバントとするＨ５の接種後３３日目のマウス血清プールにおける抗Ｈ５力価を、ワクチン接種に用いた抗原とは異なる供給源由来の組換えＨ５をＥＬＩＳＡの抗原として用いて評価した。Ｂ．プラセボ、未処理Ｈ７、スペコールをアジュバントとするＨ７またはクロスβをアジュバントとするＨ７の接種後３３日目のマウス血清プールにおける抗Ｈ７力価をＥＬＩＳＡで評価した。Ｃ．免疫前血清およびプラセボ、未処理Ｈ５またはクロスβをアジュバントとするＨ５を接種した後３３日目に得られた血清で、ＤＯＶＡに対する力価を評価した。ＤＯＶＡは３群、４群および５群のワクチン処方の一部である。Ｄ．プラセボ（Ｔ０１）、クロスβ−Ｈ５抗原（Ｔ０３）または不活性化ウイルスＨ５Ｎ９ワクチン（Ｔ１０）を接種し、Ｈ５Ｎ１ウイルスを投与した後のマウスの生存数。Ｅ．クロスβをアジュバントとするＨ５を接種した後３３日目に得られたＴ０３の個々のマウスの血清で測定した力価。Ｆ．不活性化Ｈ５Ｎ９ウイルスを接種した後３３日目に得られたＴ１０の個々のマウス血清で測定した力価。
【図１４】クロスβ構造をアジュバントとするＥ２またはＤＯＥをアジュバントとするＥ２を接種し、２００  ＬＤ５０の豚コレラウイルスＢｒｅｓｃｉａ  ４５６６１０株を投与したブタの１４日目の生存数  ＣＳＦＶを投与した後のブタの生存数。Ｔ０３群、ならびにＴ０５群の＃１４３にはクロスβ−Ｅ２を接種した。Ｔ０６群には水−油エマルションをアジュバントとする（ＤＯＥ）Ｅ２を接種した。
【図１５】クロスβ構造を含むワクチンを接種した際に形成される自己免疫ＯＶＡ抗体  本明細書に記載のワクチンで免疫化したニワトリから採取した血清の抗体をＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＬＩＳＡでは、アミロイド様特性を有するＯＶＡを抗原として用いた。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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