(57)【要約】  ＡＡＶ媒介性送達の細胞性免疫応答および／若しくは毒性の低下方法が記述される。該方法は、Ｔ細胞を誘導し、かつ、選択されたＡＡＶキャプシド上に位置するＲｘｘＲモチーフを遮蔽若しくは除去することを提供する。該方法はＡＡＶへのヘパリン結合を低下若しくは排除することをさらに提供する。改変ＡＡＶキャプシドを含有する組成物およびそれらの使用方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変されたキャプシドを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であって、ＡＡＶキャプシドタンパク質中のヘパリン結合部位を除去するように改変されたＡＡＶキャプシドタンパク質を含む前記ＡＡＶ；
および生理学的に適合性のキャリヤー
を含んでなる、低下されたＡＡＶ免疫原性をもつ分子のＡＡＶ媒介性送達のための組成物。
【請求項２】
ＡＡＶが、ＡＡＶ３、ＡＡＶ６、ｈｕ．５１、ｈｕ．３４、ｈｕ．３５、ｈｕ．４５およびｈｕ．４７から選択されるキャプシドタンパク質を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ヘパリン結合部位が、ヘパリン結合部位をコードする配列の部位特異的突然変異誘発により永続的に除去される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ヘパリン結合部位が、ヘパリン結合部位に別の特異的若しくは無特異的（ａｓｐｅｃｉｆｉｃ）分子を結合することにより除去される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
ヘパリン結合部位がヘパリン結合部位を遮蔽することにより遮断される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ＡＡＶキャプシドタンパク質中のＲｘｘＲ（配列番号２）部位を除去するように改変されたキャプシドタンパク質を有する改変ＡＡＶ、および生理学的に適合性のキャリヤー
を含んでなる、低下されたＡＡＶ免疫原性をもつ分子のＡＡＶ媒介性送達のための組成物。
【請求項７】
ＡＡＶが、クレードＢのＡＡＶから選択されるＡＡＶ  ｖｐタンパク質を含んでなるＡＡＶキャプシドを有する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ヘパリン結合部位が、アミノ酸配列ＲｘｘＲ、配列番号２を特徴とするモチーフを有する、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
ＡＡＶが、それがアルギニンと非保存的であるアミノ酸をコードするようにＲｘｘＲヘパリン結合配列（配列番号２）中の第一の若しくは最後のアルギニンを変えることにより改変されている、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
ヘパリン結合部位がＲｘｘＲ配列（配列番号２の第一のアミノ酸で改変される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ヘパリン結合部位の第一のアミノ酸がＡｒｇからＳｅｒ若しくはＧｌｕに変更される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ヘパリン結合部位がＲｘｘＲ配列の最後のアミノ酸で改変される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
改変されたヘパリン結合部位の最後のアミノ酸がＡｒｇからＴｈｒに変更される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＡＡＶが、細胞中でのその発現を指図する配列の制御下に治療的分子をコードする
核酸配列を含んでなる、請求項１ないし１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＡＡＶが、細胞中でのその発現を指図する配列の制御下に免疫原分子をコードする核酸配列を含んでなる、請求項２０に記載の組成物。
【請求項１６】
ヘパリン結合部位をもつキャプシドタンパク質を有するＡＡＶを、ヘパリン結合を除去するように改変する段階
を含んでなる、ヘパリン結合部位をもつキャプシドを有するＡＡＶの免疫原性および／若しくは毒性の低下方法。
【請求項１７】
被験体に改変ＡＡＶを送達して、それにより、該改変ＡＡＶの免疫応答および／若しくは毒性が、ヘパリン結合を除去するようにＡＡＶを改変することの前の該ＡＡＶの免疫応答および／若しくは毒性より実質的により低くなる段階をさらに含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ヘパリン結合部位が、ヘパリン結合部位に別の特異的若しくは特異的分子を結合することにより除去される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ヘパリン結合部位がヘパリン結合部位を遮蔽することにより遮断される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ヘパリン結合部位が、ヘパリン結合部位をコードする核酸配列の部位特異的突然変異誘発により永続的に除去されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
アルギニンと非保存的であるアミノ酸でこのモチーフの第一のアルギニンおよび／若しくは最後のアルギニンを置き換えるように、ＲｘｘＲモチーフをもつキャプシドタンパク質を有するＡＡＶを改変する段階
を含んでなる、ＲｘｘＲモチーフをもつキャプシドを有するＡＡＶの免疫原性および／若しくは毒性の低下方法。
【請求項２２】
モチーフがＲｘｘＲ配列（配列番号２）の第一のアミノ酸で改変される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該モチーフの第一のアミノ酸がＡｒｇからＳｅｒ若しくはＧｌｕに変更される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
モチーフ部位がＲｘｘＲ配列（配列番号２）の最後のアミノ酸で改変される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ＲｘｘＲ配列の最後のアミノ酸がＡｒｇからＴｈｒに変更される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２１ないし２５のいずれかに記載の方法により製造される改変ＡＡＶ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦に支援される研究若しくは開発に関する声明
本出願は、米国国立保健研究所からの助成金ＮＨＬＢＩ助成金番号第Ｐ０１−ＨＬ−０５９４０７号により少なくとも部分的に支援された研究を記述する。米国政府は本発明にある種の権利を有しうる。
【０００２】
本発明はＡＡＶの免疫原性の変更方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
パルボウイルス科の１メンバー、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、４．７キロベース（ｋｂ）ないし６ｋｂの一本鎖直鎖状ＤＮＡゲノムをもつ、小型のエンベロープを持たない（ｎｏｎｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）正二十面体ウイルスである。ＡＡＶは精製されたアデノウイルスストック中の汚染物質として発見されたため、該ウイルスはデペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）に帰属されている。ＡＡＶの生活環は、ＡＡＶゲノムが感染後に宿主ゲノムに組込まれている潜伏期、およびアデノウイルス若しくは単純疱疹ウイルスいずれかの感染後に該組込まれたＡＡＶゲノムがその後レスキューされ、複製されそして感染性ウイルスにパッケージングされる感染期を包含する。非病原性の特性、非分裂細胞を包含する広範な宿主感染性の範囲、および組込みは、ＡＡＶを魅力的な送達ベヒクルにする。
【０００４】
多様な異なるＡＡＶ配列およびそれの組織からの単離方法は記述されている。サル若しくはヒト組織供給源から得られる他のＡＡＶ配列のなかでもＡＡＶ１−６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９およびＡＡＶ９が記述されている。例えば特許文献１、特許文献２（ＡＡＶ８）および特許文献３を参照されたい。これを用いて、厳密に血清学的交差反応性（血清型）によりＡＡＶを定義することから離れる動きが起こった。最近の文献は、「クレード」と命名される群を提案する、系統的関係性に関するこれらＡＡＶ間の関係を定義する。例えば非特許文献１；特許文献３を参照されたい。
【０００５】
ＡＡＶは現在、診察室で遺伝子治療の送達ベクターとして考慮されている。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２ベクターのキャプシドに対するＴ細胞の活性化は、血友病Ｂの最近のヒト遺伝子治療試験で肝毒性と関連していた［非特許文献２］。
【０００６】
ＡＡＶ２は細胞表面上でヘパリンおよびへパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）を結合することが既知である。該ビリオンのキャプシド上の５８５ＲＧＮＲ５８８モチーフがこの相互作用の原因であるドメインとしてマッピングされている。非特許文献３；非特許文献４。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏでＨＳＰＧに結合しないＡＡＶ２を送達することによるＡＡＶの向性を変えることを改良するための試みが記述されている。
【０００７】
必要とされるものは、変えられた免疫効果を有するＡＡＶ組成物である。
【０００８】
【特許文献１】国際特許公開第ＷＯ  ０２／３３２６９号
【特許文献２】国際特許公開第ＷＯ  ０２／３８６１２２号
【特許文献３】国際特許公開第ＷＯ  ２００５／０３３３２１号
【非特許文献１】Ｇａｏら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７８（１２）：６３８１−６３８８（２００４年６月）
【非特許文献２】Ｍａｎｎｏ，Ｃ．Ｓ．ら  Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  ｂｙ  ＡＡＶ−Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ｉｍｐｏｓｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ（２００６）
【非特許文献３】Ａ．Ｋｅｒｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：１１０７２−８１（２００３）
【非特許文献４】Ｓ．Ｒ．Ｏｐｉｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：６９９５−７００６（２００３）
【発明の開示】
【０００９】
［発明の要約］
一アスペクトにおいて、本発明は、免疫原性、およびとりわけＡＡＶに向けられたＴ細胞応答を低下させるためにヘパリン結合ドメインの機能性がＡＡＶ中で変えられている組成物を提供する。一態様において、本発明は、選択されたＡＡＶのヘパリン結合ドメインが、遺伝子送達の安全性および成功を増大させるために遮蔽若しくは除去されている組成物を提供する。
【００１０】
別のアスペクトにおいて、本発明は、本発明の改変ＡＡＶおよび生理学的に適合性のキャリヤーを含有する製薬学的およびワクチン組成物が提供される。
【００１１】
なお別のアスペクトにおいて、本発明の製薬学的およびワクチン組成物の送達方法が記述される。
【００１２】
本発明のなお他の利点は本発明の詳細な記述から明らかとなろう。
【００１３】
［発明の詳細な記述］
一アスペクトにおいて、本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）送達ベヒクルに対する細胞性免疫応答の低下方法を提供する。別のアスペクトにおいて、本発明はＡＡＶ送達ベヒクルの毒性の低下方法を提供する。なお別のアスペクトにおいて、本発明は改変ＡＡＶを含んでなる組成物を提供する。
【００１４】
一態様において、本発明はヘパリン結合部位を有するＡＡＶキャプシドへのヘパリンの結合を予防することにより改変されるＡＡＶを提供する。別の態様において、本発明は、ヘパリン結合ドメインおよび／若しくはヘパリン結合ドメインのＴ細胞活性化機能性を破壊するように改変されたキャプシドを有するＡＡＶを提供する。
【００１５】
一アスペクトにおいて、本発明は、低下されたＴ細胞免疫原性をもつ分子のＡＡＶ媒介性送達のための組成物を提供する。一態様において、こうした組成物は改変されたキャプシドを有するＡＡＶ（前記ＡＡＶキャプシドはＡＡＶキャプシドタンパク質中のヘパリン結合部位を除去するように改変されたＡＡＶキャプシドを含んでなる）、および生理学的に適合性のキャリヤーを含有する。一態様において、改変ＡＡＶはＡＡＶ２由来でない。
【００１６】
一態様において、ＡＡＶ配列がヘパリン結合部位を除去するよう改変される。ヘパリン結合部位を除去することにより、該部位がもはやＴ細胞を活性化せずかつ／若しくはヘパリンに結合する能力を欠くことを意味している。
【００１７】
理論により束縛されることを願うことなく、発明者は、彼らがＡＡＶキャプシド中のヘパリン結合ドメインとＴ細胞の活性化の間の直接の関連を見出したと考える。予備データは、そのように活性化されるＴ細胞が、ペプチドでの刺激に応答してＡＡＶキャプシドからＩＦＮγを産生するものを包含することを示す。それらのＴ細胞集団のさらなるフェノタイピング（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）はＣＤ８＋キャプシド特異的Ｔ細胞を検出した。
従って、発明者は、ＡＡＶ中のヘパリン結合を機能的に除去することによりＴ細胞活性化が低下若しくは排除されることを見出した。
【００１８】
Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ、配列番号２（ＲｘｘＲモチーフ）を有するヘパリン結合ドメインはＡＡＶ２で記述された（すなわち、Ｋｅｒｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：１１０７２−８１；Ｏｐｉｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：６９９５−７００６、第ＷＯ  ０２／３３２６９号の中に具体的に説明される番号付け体系に基づき、ＡＡＶ２ＶＰ１、配列番号３の座標５８５−５８８）。他の現在記述されるＡＡＶはＲｘｘＲ結合部位を欠くがしかしヘパリンを結合する（例えばＡＡＶ３）。従って、これらの他のＡＡＶはヘパリン親和性の原因である異なるモチーフを有する。
【００１９】
選択されたＡＡＶキャプシド中のヘパリン結合の存在は、多様なアッセイ形式（例えばヘパリン結合カラム）を使用して容易に同定し得、その多くはヘパリン若しくはその部分を使用する。選択されたＡＡＶキャプシド中で一旦結合が同定されれば、該ヘパリン結合ドメインを当業者に既知の技術を使用してマッピングし得る。例えば、ＡＡＶ６配列は、位置５３１のリシン残基の非保存的アミノ酸変化により除去されるヘパリン結合ドメインを有することが見出された。［ＡＡＶ６．１の配列は国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／１３３７５号に提供され、そして残基番号はその国際特許出願に提供される番号付けスキームに基づく（例えば表を参照されたい）］。ＡＡＶ２について真実であるとおり、ＡＡＶ粒子の結合部位が一旦マッピングされれば、こうした部位の非存在若しくは存在はアライメントソフトウェアを利用することにより容易に決定し得る。結合ドメインの相同性は機能的ヘパリン結合を予測し、また、相同性の非存在はその欠如を予測する。機能的活性、すなわち結合部位を含有するウイルスベクターのヘパリン親和性は、例えばヘパリン結合アッセイ［Ｏｐｉｅ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７、６９９５−７００６（２００３）］の使用を包含する既知の方法を使用して容易に決定し得る。
【００２０】
他のＡＡＶの類似の領域は、入手可能なコンピュータプログラムおよび公知の技術を使用して、選択されたＡＡＶおよびＡＡＶ２のアライメントを実施することにより、容易に決定し得る。「整列された」配列若しくは「アライメント」は、参照配列に比較して欠けている若しくは付加的な塩基若しくはアミノ酸についての補正をしばしば含有する、複数の核酸配列若しくはタンパク質（アミノ酸）配列を指す。参照配列はＡＡＶ２若しくは別の選択された配列でありうる。例えば、ＡＡＶ  １（米国特許第６，７５９，２３７号）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ３２．３３、ｒｈ．１０、ｈｕ．１１、ヒトおよびヒト以外の供給源からの他のＡＡＶ（例えば、国際特許公開第ＷＯ  ０２／３３２６９号、同第ＷＯ  ０２／３８６１２２号（ＡＡＶ８）およびＧｅｎＢａｎｋを参照されたい）、ならびにシングルトンエラーを是正するように変えられたような配列、例えばＡＡＶ６．２［ＡＡＶ６、配列番号４、Ｆ１２９Ｌを伴う］、ＡＡＶ６．１［ＡＡＶ６、配列番号４、Ｋ５３１Ｅ変化を伴う］、ＡＡＶ６．１．２［ＡＡＶ６、配列番号４、Ｋ５３１Ｅ、Ｆ１２９Ｌを伴う］、ｒｈ．３２．３３、ｒｈ．１０ならびにｒｈ６４Ｒ１［配列番号５、Ｒ６９７Ｗを伴う］ならびにｒｈ８Ｒ［配列番号６、Ｄ５３１Ｅを伴う］［例えば２００６年１０月１９日公開の第ＷＯ  ２００６／１１０６８９号を参照されたい］を参照されたい。あるいは、既知技術［例えば国際特許公開第ＷＯ  ２００５／０３３３２１号およびＧｅｎＢａｎｋを参照されたい］を使用して若しくは他の手段により当業者により同定されるものを包含する他のＡＡＶ配列を、本明細書に記述されるとおり改変しうる。
【００２１】
アライメントは、多様な公的に若しくは商業的に入手可能な複数の配列アライメントプログラムのいずれかを使用して実施する。こうしたプログラムの例は、「Ｃｌｕｓｔａｌ
Ｗ」、「ＣＡＰ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＭＡＰ」および「ＭＥＭＥ」を包含し、これらはインターネット上のウェブサーバーを通じてアクセス可能である
。こうしたプログラムの他の供給源は当業者に既知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩユーティリティーもまた使用される。上述されたプログラムに含有されるものを包含する、ヌクレオチド配列の同一性を測定するのに使用し得る当該技術分野で既知の多数のアルゴリズムもまた存在する。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１中のプログラムＦａｓｔａＴＭを使用して比較し得る。ＦａｓｔａＴＭはクエリ配列と参照配列の間の最良のオーバーラップ領域のアライメントおよび配列の同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間の配列の同一性パーセントは、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１（引用することにより本明細書に組み込まれる）に提供されるところのそのデフォルトのパラメータ（６のワードサイズ（ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ）およびスコアリングマトリックスについてのＮＯＰＡＭ係数）を用いてＦａｓｔａＴＭを使用して決定し得る。複数の配列アライメントプログラム、例えば「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」および「Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ」プログラムがアミノ酸配列にもまた利用可能である。一般に、これらのプログラムのいずれもデフォルトの設定で使用されるとは言え、当業者はこれらの設定を必要とされるように変更し得る。あるいは、当業者は、少なくとも言及されるアルゴリズムおよびプログラムにより提供されるもののような同一性若しくはアライメントのレベルを提供する別のアルゴリズム若しくはコンピュータプログラムを利用し得る。例えばＪ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、”Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ“、２７（１３）：２６８２−２６９０（１９９９）を参照されたい。
【００２２】
ある種のＡＡＶ配列はこうしたヘパリン結合部位を天然に欠く。ヘパリン結合部位を欠くＡＡＶ、例えばＡＡＶ８について、ＡＡＶ配列、細胞若しくは培地の改変は必要とされない。ヘパリンを結合するＡＡＶキャプシドの能力は、多様なアッセイ形式、およびＡＡＶを結合するためのヘパリン若しくはその部分を使用して容易に同定し得る。さらに、ＡＡＶの感染／形質導入能力を遮断するヘパリンの能力は当業者により容易に測定し得る。ＡＡＶのいかなる感染／形質導入も遮断するヘパリンの能力を測定するための適するアッセイが、例えばＣ．Ｈａｌｂｅｒｔら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７５（１４）：６６１５−６６２４（２００１年７月）およびＣ．Ｅ．ＷａｌｓｈとＨ．Ｃｈａｏ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ、８（Ｓｕｐｐｌ．２）、ｐ．６０−６７（２００２）に記述されている。
【００２３】
他のＡＡＶ配列、例えばＡＡＶ６はヘパリン結合部位を有するが、しかし感染させるＡＡＶ６の能力はヘパリンの存在により部分的に阻害される（遮断されない）。別の例において、ＡＡＶ６のｖｐ１キャプシドの配列は、ヘパリン結合を媒介する単一のアミノ酸残基すなわち位置５３１［配列番号４］の天然のリシン残基を有するとして記述されている。［ＡＡＶ６の配列は国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／１３３７５号に提供され、そして残基番号はその国際特許出願に提供される番号付けスキームに基づく。
【００２４】
一態様において、発明者は、ヘパリン結合ドメインを有しかつヘパリンにより遮断されるいずれかの検出可能な量の感染／形質導入能力を有することを特徴とするＡＡＶが分泌しないことを見出した。こうしたＡＡＶの例は、産生の間に大部分が細胞に会合しているＡＡＶ２、およびＡＡＶ３である。一態様において、ヘパリン結合ドメインは、ＡＡＶ２で記述されたところのＡｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ（ＲｘｘＲ）［配列番号２］モチーフである（すなわちＡＡＶ２  ｖｐ１キャプシドタンパク質、配列番号３のほぼアミノ酸５８５ないし５８８、Ｋｅｒｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：１１０７２−８１；Ｏｐｉｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：６９９５−７００６（第ＷＯ  ０２／３３２６９号に具体的に説明される番号付けに基づく））。Ｘａａはいずれかのアミノ酸を表す。発明者はＲｘｘＲモチーフを有する他のＡＡＶキャプシドを記述することが最初の者であり、それらのいくつかはクレードＢのＡＡＶである。ＲｘｘＲモチーフを有するこうしたＡＡＶキャプシドの例は、ｈｕ．５１［配列番号７］、ｈｕ．３４［配列番号８］、ｈｕ．３５［配
列番号９］、ｈｕ．４５［配列番号１０］およびｈｕ．４７［配列番号１１］を包含する。ＲｘｘＲドメインを有する他のＡＡＶは、記述されたＡＡＶ配列のなかから当業者により容易に同定され得る。加えて、他のヘパリン結合部位は、当業者に既知の技術を使用してＡＡＶ中で容易に同定し得る。別の例において、ＡＡＶ３はヘパリンを結合するが；しかしながらそれはＲｘｘＲドメインを含有しない。
【００２５】
発明者は、非保存的アミノ酸変化を含有するようにヘパリン結合ドメイン（モチーフ）の決定的な一部分を形成するアミノ酸残基（１個若しくは複数）を変えることを変化させることにより、ヘパリン結合が除去されるのみならず、しかしまたＴ細胞活性化が有意に低下されることを見出した。一態様において、ヘパリン結合を媒介するアミノ酸残基の単一の非保存的アミノ酸変化が、このモチーフの機能を除去するのに十分である。本明細書に具体的に説明されるとおり、ＡＡＶ６のＫ５３１の非保存的変化はヘパリン結合およびＴ細胞活性化を除去する。加えて、ＲｘｘＲヘパリン結合ドメインの第一のアルギニン若しくは最後のアルギニンいずれかでの単一の非保存的変化は、ヘパリン結合を除去することができる。本明細書に具体的に説明されるとおり、一態様において、改変されたヘパリン硫酸糖タンパク質結合部位の第一のアミノ酸は、Ａｒｇから例えばＳｅｒ若しくはＧｌｕに変化し得る。別の態様において、改変されたヘパリン硫酸糖タンパク質結合部位の最後のアミノ酸をＡｒｇからＴｈｒに変化させる。他の適する非保存的アミノ酸変化は当業者に明らかであろう。
【００２６】
一態様において、ＡＡＶキャプシドのヘパリン結合部位をコードする核酸配列は、部位特異的突然変異誘発技術を使用して改変され、該モチーフの最初のアルギニンおよび／若しくは最後のアルギニンのコドンは、該アミノ酸の一方（若しくは双方）で非保存的変化をなすように変えられている。非保存的アミノ酸変化の例は、タンパク質の機能に影響を及ぼすもの、例えば異なる化学構造（特性）の別のアミノ酸での一アミノ酸の置換を包含する。以下の表は最も一般的なアミノ酸およびそれらの特性を具体的に説明する。
【００２７】
【表１】
2009535339.tif 000002
【００２８】
アミノ酸のコーディング配列の他の適する変更技術を利用しうる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）を参照されたい。なお別の態様において、ヘパリン結合ドメインは、ＲｘｘＲモチーフに１個若しくはそれ以上の外因性アミノ酸配列を挿入してそれにより該モチーフを破壊することにより除去しうる。
【００２９】
別の態様において、ヘパリン結合部位を含有するＡＡＶへのヘパリンの結合を、ヘパリン結合部位の配列を変えること以外の方法により除去する。例えば、産生体細胞中でヘパリン結合部位を効果的に遮蔽する分子をもつＡＡＶキャプシドを提供しうる。例えば、ウイルス粒子へのポリエチレングリコール分子の提供方法が記述されている。
【００３０】
なお別の態様において、細胞へのヘパリン結合、例えば細胞表面上で細胞にヘパリン分子（へパラン硫酸プロテオグリカン）を提供することを、一過性に若しくは永続的にのいずれかで排除若しくは実質的に低下させるように標的細胞の改変しうる。例えば、適する一技術は例えばヘパリナーゼのような酵素によるヘパリンの酵素消化を必要としうる。別の態様において、可溶性ヘパリンをＡＡＶとともに送達し得る。
【００３１】
別の態様において、本発明はヘパリン結合モチーフを除去するように改変されたＡＡＶキャプシドを提供する。一態様において、ＡＡＶキャプシドの供給源はＡＡＶ２以外のＡＡＶである。別の態様において、ＡＡＶは、改変がＡＡＶ２のＲ５８５ＳおよびＲ５８８Ｔ以外であることを除き、最低１種の改変ＡＡＶ２キャプシドタンパク質［配列番号３］を含んでなる。
【００３２】
新規ＡＡＶキャプシドをもつｒＡＡＶの製造
本発明は、ＤＮＡおよび／若しくはこれらのウイルスが天然に会合している細胞物質を含まない、新規の改変ＡＡＶキャプシドおよびそれらをコードする配列を包含する。別のアスペクトにおいて、本発明は、標的細胞への異種遺伝子若しくは他の核酸配列の送達で有用な分子の製造のための、そのフラグメントを包含する本発明の新規ＡＡＶ核酸およびタンパク質配列を利用する分子を提供する。ＡＡＶ配列を含有する本発明の分子は、それに保有される配列を移入する、宿主細胞に送達されうるいかなる遺伝因子（ベクター）、例えば、裸のＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、ウイルス以外の送達ベヒクル（例えば脂質に基づくキャリヤー）中のタンパク質、ウイルスなども包含する。選択されるベクターは、トランスフェクション、電気穿孔法、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を包含するいずれかの適する方法により送達しうる。本発明のいずれかの態様を構築するのに使用される方法は核酸操作の当業者に既知であり、そして遺伝子工学、組換え工学および合成技術を包含する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照されたい。
【００３３】
適しては、本発明の改変ＡＡＶキャプシドは、標的細胞への送達のための発現カセットが該改変ＡＡＶキャプシドにパッケージングされる、感染性ＡＡＶ粒子の製造で利用される。
【００３４】
発現カセット、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、およびＡＡＶを製造するのに必要とされるヘルパー機能は、それに保有される配列を移入するいずれかの遺伝因子の形態でパッケージング宿主細胞に送達しうる。選択される遺伝因子は、本明細書に記述されるものを包含するいずれかの適する方法により送達しうる。本発明のいずれかの態様を構築するのに使用される方法は核酸操作の当業者に既知であり、そして遺伝子工学、組換え工学および合成技術を包含する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンの生成方法は公知であり、そして適する方法の選択は本発明に対する制限でない。例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：５２０−５３２（１９９３）および米国特許第５，４７８，７４５号を参照されたい。
【００３５】
別の方法で明記されない限り、ＡＡＶ  ＩＴＲ、および本明細書に記述される他の選択されるＡＡＶ成分は、とりわけ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９を制限なしに包含するいかなるＡＡＶのなかからも容易に選択しうる。これらのＩＴＲ若しくは他のＡＡＶ成分は、当業者に利用可能な技術を使用してＡＡＶ配列から容易に単離しうる。こうしたＡＡＶは学術的、商業的若しくは公的供給源（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｙｐｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、バージニア州マナサス）から単離する若しくは得ることができる。あるいは、ＡＡＶ配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（Ｒ）、ＰｕｂＭｅｄ（Ｒ）などのような文献若しくはデータベースで入手可能であるような公表された配列への参照により、合成若しくは他の適する手段により得ることができる。
【００３６】
Ａ．発現カセット
発現カセットは、少なくとも、５’ＡＡＶ末端逆位配列、その転写、翻訳および／若しくは発現を指図する制御配列に作動可能に連結された、所望の産物を場合によってはコードするか若しくはそれ自身である核酸配列を含んでなる核酸分子、ならびに３’ＡＡＶ  ＩＴＲより構成される。望ましい一態様においてＡＡＶ血清型２のＩＴＲを使用する。しかしながら他の適する供給源からのＩＴＲを選択してもよい。キャプシドタンパク質にパッケージングされかつ選択された宿主細胞に送達されるのは、このミニ遺伝子である。
【００３７】
１．核酸配列
一態様において、核酸配列はＡＡＶ  ＩＴＲに対し異種でありかつ治療上有用である。適する配列の一例は例えばＲＮＡである。望ましいＲＮＡ分子は、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを包含する。有用なＲＮＡ配列の一例は、処置される動物における標的とされる核酸配列の発現を阻害する若しくは消滅させる配列である。典型的には、適する標的配列は腫瘍学的標的およびウイルス性疾患を包含する。こうした標的の例について、免疫原に関する節で下に同定される腫瘍学的標的およびウイルスを参照されたい。
【００３８】
別の態様において、目的のポリペプチド、タンパク質若しくは他の産物をコードする核酸配列は、ＡＡＶ  ＩＴＲに対し異種である。該核酸コーディング配列は、宿主細胞中での導入遺伝子の転写、翻訳および／若しくは発現を可能にする様式で調節成分に効果的に連結される。
【００３９】
核酸配列の組成は、生じるベクターがもたらされることができる使用に依存することができる。例えば、１つの型の配列は、発現に際して検出可能なシグナルを生じるレポーター配列を包含する。しかしながら、望ましくは、該配列は、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素、ドミナントネガティブな変異体若しくは触媒ＲＮＡのような、生物学および医学で有用である産物をコードする非マーカー配列である。
【００４０】
該核酸配列は単一産物をコードしうる。本発明は複数の遺伝子を使用することをさらに包含する。ある状況では、１タンパク質の各サブユニットをコードするため、または異なるペプチド若しくはタンパク質をコードするために異なる遺伝子を使用しうる。これは、タンパク質サブユニットをコードするＤＮＡの大きさが大きい場合、例えば免疫グロブリン、血小板由来増殖因子若しくはジストロフィンタンパク質に望ましい。細胞が多サブユニットタンパク質を産生するためには、異なるサブユニットのそれぞれを含有する組換えウイルスに細胞を感染させる。あるいは、タンパク質の異なるサブユニットを同一の導入遺伝子によりコードしうる。この場合、単一遺伝子がサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡを包含し、各サブユニットのＤＮＡは配列内リボザイム進入部（ＩＲＥＳ）により分離される。これは、サブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡの大きさが小さい、例えばサブユニットおよびＩＲＥＳをコードするＤＮＡの大きさの合計が５キロベース未満である場合に望ましい。ＩＲＥＳに対する一代替として、ＤＮＡは、翻訳後事象で自己切断する２Ａペプチドをコードする配列により分離しうる。例えば、Ｍ．Ｌ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７８（Ｐｔ  １）：１３−２１（１９９７年１月）；Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、８（１１）：８６４−８７３（２００１年６月）；Ｋｌｕｍｐ  Ｈ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、８（１０）：８１１−８１７（２００１年５月）を参照されたい。この２ＡペプチドはＩＲＥＳより有意により小さく、空間が制限要因である使用にそれを良好に適するようにする。よりしばしば、遺伝子が大きいか、多サブユニットよりなるか、若しくは２種の遺伝子を共送達する場合、所望の遺伝子（１種若しくは複数）またはサブユニットを保有するｒＡＡＶを共投与して、それらをｉｎ  ｖｉｖｏで鎖状体化させて単一のベクターゲノムを形成させる。こうした一
態様において、第一のＡＡＶは単一遺伝子を発現する発現カセットを保有することができ、また、第二のＡＡＶは、宿主細胞中での共発現のための異なる遺伝子を発現する発現カセットを保有しうる。しかしながら、選択された遺伝子は、いかなる生物学的活性産物若しくは他の産物、例えば研究に所望の産物もコードしうる。
【００４１】
適する遺伝子は当業者により容易に選択されうる。遺伝子の選択は本発明の制限であると考えられない。
【００４２】
２．調節エレメント
発現カセットについて上で同定された主要エレメントに加え、ベクターは、該プラスミドベクターでトランスフェクトしたか若しくは本発明により製造したウイルスに感染させた細胞中でのその転写、翻訳および／若しくは発現を可能にする様式で核酸コーディング配列に作動可能に連結されている慣習的調節領域もまた包含する。本明細書で使用されるところの「作動可能に連結されている」配列は、目的の遺伝子と連続する発現制御配列およびトランスで若しくは離れて作用して目的の遺伝子を制御する発現制御配列の双方を包含する。
【００４３】
発現制御配列は、適切な転写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配列；イントロン、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルのような効率的ＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわちコザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；ならびに、所望の場合はコードされる産物の分泌を高める配列を包含する。天然の、構成的、調節可能および／若しくは組織特異的であるプロモーターを包含する多数の発現制御配列が、当該技術分野で既知でありかつ利用しうる。
【００４４】
構成的プロモーターの例は、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によってはＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によってはＣＭＶエンハンサーを伴う）［例えばＢｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ、４１：５２１−５３０（１９８５）を参照されたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１プロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］を制限なしに包含する。調節可能なプロモーターは、外因性に供給される化合物、温度のような環境因子、または特定の生理学的状態の存在（例えば急性期、細胞の特定の分化状態）により、若しくは複製する細胞のみで遺伝子発現の調節を可能にしかつ調節され得る。調節可能なプロモーターおよび調節可能な系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄを制限なしに包含する多様な商業的供給源から入手可能である。多くの他の系が記述されており、そして当業者により容易に選択され得る。外因性に供給される化合物により調節される調節可能なプロモーターの例は、亜鉛で誘導可能なヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメサゾン（Ｄｅｘ）で誘導可能なマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系［国際特許公開第ＷＯ  ９８／１００８８号］；エクダイソン昆虫プロモーター［Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６−３３５１（１９９６）］、テトラサイクリンで抑制可能な系［Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７−５５５１（１９９２）］、テトラサイクリンで誘導可能な系［Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６−１７６９（１９９５）、Ｈａｒｖｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２：５１２−５１８（１９９８）もまた参照されたい］、ＲＵ４８６で誘導可能な系［Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５：２３９−２４３（１９９７）およびＷａｎｇら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、４：４３２−４４１（１９９７）］ならびにラパマイシンで誘導可能な系［Ｍａｇａｒｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００：２８６５−２８７２（１９９７）］を包含す
る。本情況で有用でありうる他の型の調節可能なプロモーターは、特定の生理学的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態により、若しくは複製する細胞のみで調節されるものである。
【００４５】
別の態様において、導入遺伝子の天然のプロモーターを使用することができる。天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現が天然の発現を模倣すべきであることが望ましい場合に好ましいことができる。天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現を一時的に若しくは発達的に、または組織特異的様式で、あるいは特定の転写刺激に応答して調節しなければならない場合に使用しうる。さらなる一態様において、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位若しくはコザックコンセンサス配列のような他の天然の発現調節領域もまた、天然の発現を模倣するのに使用しうる。
【００４６】
核酸コーディング配列の別の態様は、組織特異的プロモーターに作動可能に連結された遺伝子を包含する。例えば、骨格筋中での発現が望ましい場合は、筋中で活性のプロモーターを使用すべきである。これらは、骨格βアクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼをコードする遺伝子からのプロモーター、ならびに天然に存在するプロモーターより高い活性をもつ合成の筋プロモーターを包含する（Ｌｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：２４１−２４５（１９９９）を参照されたい）。組織特異的であるプロモーターの例は、とりわけ、肝（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：５１２４−３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、３：１００２−９（１９９６）；α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、７：１５０３−１４（１９９６））、骨オステオカルシン（Ｓｔｅｉｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、２４：１８５−９６（１９９７））；骨シアロタンパク質（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１１：６５４−６４（１９９６））、リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１：１０６３−８（１９９８）；免疫グロブリンＨ鎖；Ｔ細胞受容体α鎖）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１３：５０３−１５（１９９３））、神経細線維軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：５６１１−５（１９９１））およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｎｅｕｒｏｎ、１５：３７３−８４（１９９５））のような神経型について既知である。
【００４７】
場合によっては、治療上有用な導入遺伝子を保有するプラスミドは選択可能なマーカーもまた包含しうるか、または、レポーター遺伝子はとりわけ、ジェネチシン、ハイグロマイシン若しくはピューリマイシン（ｐｕｒｉｍｙｃｉｎ）耐性をコードする配列を包含しうる。こうした選択可能なレポーター若しくはマーカー遺伝子（好ましくは本発明の方法によりレスキューされるべきウイルスゲノムの外側に配置される）を使用して、アンピシリン耐性のような細菌細胞中のプラスミドの存在を知らせることができる。プラスミドの他成分は複製起点を包含しうる。これらおよび他のプロモーターおよびベクター要素の選択は慣習的であり、そして多くのこうした配列が入手可能である［例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、およびその中に引用される参考文献を参照されたい］。
【００４８】
本発明の教示を提供されれば、こうした発現カセットの設計は慣習的技術に頼ることによりなし得る。
【００４９】
３．パッケージング宿主細胞への発現カセットの送達
発現カセットは、宿主細胞に送達されるいずれかの適するベクター、例えばプラスミド上に保有され得る。それらが複製および場合によっては原核生物細胞、哺乳動物細胞、若しくは双方への組込みに適するような、本発明で有用なプラスミドを工作しうる。これら
のプラスミド（若しくは５’ＡＡＶ  ＩＴＲ−異種分子−３’ＡＡＶ  ＩＴＲを保有する他のベクター）は、真核生物および／若しくは原核生物中での発現カセットならびにこれらの系の選択マーカーの複製を可能にする配列を含有する。選択可能なマーカー若しくはレポーター遺伝子は、とりわけ、ジェネチシン、ハイグロマイシン若しくはピューリマイシン耐性をコードする配列を包含しうる。該プラスミドは、アンピシリン耐性のような、細菌細胞中のベクターの存在を知らせるのに使用し得るある種の選択可能なレポーター若しくはマーカー遺伝子もまた含有しうる。プラスミドの他成分は複製起点、およびエプスタイン−バーウイルスの核抗原を使用するアンプリコン系のようなアンプリコンを包含しうる。このアンプリコン系若しくは他の類似のアンプリコン成分は、細胞中での高コピーのエピソーム複製を可能にする。好ましくは、発現カセットを保有する分子を細胞にトランスフェクトし、それはそこで一過性に存在しうる。あるいは、発現カセット（５’ＡＡＶ  ＩＴＲ−異種分子−３’ＡＡＶ  ＩＴＲを保有する）は、染色体に若しくはエピソームとしてのいずれかで宿主細胞のゲノムに安定に組込まれうる。ある態様において、発現カセットは、場合によっては頭から頭、頭から尾若しくは尾から尾の鎖状体で複数コピーで存在する。適するトランスフェクション技術は既知であり、そして宿主細胞にミニ遺伝子を送達させるのに容易に利用しうる。
【００５０】
一般に、発現を含んでなるベクターをトランスフェクションにより送達する場合、該ベクターは、約５μｇから約１００μｇまでのＤＮＡ、約１０μｇないし約５０μｇのＤＮＡの量で、約１×１０４細胞ないし約１×１０１３細胞、若しくは約１×１０５細胞に送達する。しかしながら、宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対量は、選択されたベクター、送達方法および選択された宿主細胞のような因子を考慮に入れて調節しうる。
【００５１】
Ｂ．ｒｅｐおよびｃａｐ配列
ミニ遺伝子に加え、宿主細胞は、宿主細胞中での本発明の新規ＡＡＶキャプシドタンパク質（若しくはそのフラグメントを含んでなるキャプシドタンパク質）の発現を駆動する配列、およびミニ遺伝子中で見出されるＡＡＶ  ＩＴＲの供給源と同一の供給源若しくは交差相補する供給源のｒｅｐ配列を含有する。ＡＡＶのｃａｐおよびｒｅｐ配列は、上述されたところのＡＡＶ供給源から独立に得ることができ、そして、上述されたところの当業者に既知のいずれかの様式で宿主細胞に導入しうる。加えて、改変ＡＡＶ中でＡＡＶベクターをシュードタイピングする場合、必須のｒｅｐタンパク質のそれぞれをコードする配列を、異なるＡＡＶ供給源（例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９）により供給しうる。例えば、ｒｅｐ７８／６８配列はＡＡＶ２からであってよい一方、ｒｅｐ５２／４０配列はＡＡＶ８からであってよい。
【００５２】
一態様において、宿主細胞は、上述されたもののような適するプロモーターの制御下にキャプシドタンパク質を安定に含有する。最も望ましくは、本態様において、キャプシドタンパク質は調節可能なプロモーターの制御下に発現される。別の態様において、キャプシドタンパク質はトランスで宿主細胞に供給される。宿主細胞にトランスで送達される場合、キャプシドタンパク質は、選択されたキャプシドタンパク質の宿主細胞中での発現を指図するのに必要な配列を含有するプラスミドを介して送達しうる。最も望ましくは、宿主細胞にトランスで送達される場合、キャプシドタンパク質を保有するプラスミドは、ｒＡＡＶをパッケージングするのに必要とされる他の配列、例えばｒｅｐ配列もまた保有する。
【００５３】
別の態様において、宿主細胞は、上述されたもののような適するプロモーターの制御下にｒｅｐ配列を安定に含有する。最も望ましくは、本態様において、必須のｒｅｐタンパク質が調節可能なプロモーターの制御下に発現される。別の態様において、ｒｅｐタンパク質はトランスで宿主細胞に供給される。宿主細胞にトランスで送達される場合、ｒｅｐ
タンパク質は、選択されたｒｅｐタンパク質の宿主細胞中での発現を指図するのに必要な配列を含有するプラスミドを介して送達しうる。最も望ましくは、宿主細胞にトランスで送達される場合、キャプシドタンパク質を保有するプラスミドはｒＡＡＶをパッケージングするのに必要とされる他の配列、例えばｒｅｐおよびｃａｐ配列もまた保有する。
【００５４】
従って、一態様において、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は、単一の核酸分子上で宿主細胞にトランスフェクトされることができ、そして該細胞中で１個のエピソームとして安定に存在しうる。別の態様において、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は細胞の染色体中に安定に組込まれる。別の態様は、宿主細胞中で一過性に発現されるｒｅｐおよびｃａｐ配列を有する。例えば、こうしたトランスフェクションのための有用な核酸分子は、５’から３’へ、プロモーター、プロモーターとｒｅｐ遺伝子配列の開始部位との間に挿入された任意のスペーサー、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子配列、およびＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子配列を含んでなる。
【００５５】
場合によっては、ｒｅｐおよび／若しくはｃａｐ配列は、宿主細胞に導入されるべきである他のＤＮＡ配列を含有する１ベクター上で供給しうる。例えば、ベクターはミニ遺伝子を含んでなるｒＡＡＶ構築物を含有しうる。ベクターは、ヘルパー機能をコードする遺伝子、例えばアデノウイルスタンパク質Ｅ１、Ｅ２ａおよびＥ４  ＯＲＦ６、ならびにＶＡＩ  ＲＮＡの遺伝子の１種若しくはそれ以上を含みうる。
【００５６】
好ましくは、本構築物で使用されるプロモーターは、当業者に既知の若しくは上で論考されたところの構成的、調節可能な若しくは天然のプロモーターのいずれでもありうる。一態様においてＡＡＶ  Ｐ５プロモーター配列を使用する。これらの配列のいずれかを提供するためのＡＡＶの選択は本発明を制限しない。
【００５７】
別の好ましい態様において、ｒｅｐのプロモーターは、導入遺伝子の調節エレメントに関して上で論考されたような調節可能なプロモーターである。ｒｅｐ発現のための好ましい一プロモーターはＴ７プロモーターである。Ｔ７プロモーターにより調節されるｒｅｐ遺伝子、およびｃａｐ遺伝子を含んでなるベクターを、Ｔ７ポリメラーゼを構成的に若しくは誘導可能にのいずれかで発現する細胞にトランスフェクト若しくは形質転換する。１９９８年３月１２日公開の国際特許公開第ＷＯ  ９８／１００８８号を参照されたい。
【００５８】
スペーサーはベクターの設計における任意の一要素である。スペーサーは、プロモーターとｒｅｐ遺伝子のＡＴＧ開始部位との間に挿入されるＤＮＡ配列である。スペーサーはいかなる所望の設計を有してもよい。すなわち、それはヌクレオチドの無作為の配列でありうるか、若しくは、あるいは、それはマーカー遺伝子のような遺伝子産物をコードしうる。スペーサーは開始／終止およびポリＡ部位を典型的に組み込む遺伝子を含有しうる。スペーサーは、原核生物若しくは真核生物からの非コーディングＤＮＡ配列、反復非コーディング配列、転写制御を伴わないコーティング配列、または転写制御を伴うコーディング配列でありうる。スペーサー配列の例示的２供給源はファージラダー配列若しくは酵母ラダー配列であり、それらは例えばとりわけＧｉｂｃｏ若しくはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから商業的に入手可能である。スペーサーは、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０およびｃａｐ遺伝子産物を正常レベルで発現されるままにしてｒｅｐ７８およびｒｅｐ６８遺伝子産物の発現を低下させるのに十分ないかなる大きさのものであってもよい。スペーサーの長さは、従って約１０ｂｐから約１０．０ｋｂｐまで、好ましくは約１００ｂｐないし約８．０ｋｂｐの範囲の範囲にわたりうる。組換えの可能性を低下させるため、スペーサーは、好ましくは長さ２ｋｂｐ未満であるが；しかしながら、本発明はそのように制限されない。
【００５９】
ｒｅｐおよびｃａｐを提供する分子（１種若しくは複数）が宿主細胞中に一過性に存在しうる（すなわちトランスフェクションにより）とは言え、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質の一方若しくは双方およびそれらの発現を制御するプロモーター（１種若しくは複数）
が、例えばエピソームとして若しくは宿主細胞の染色体中への組込みにより宿主細胞中で安定に発現されることが好ましい。本発明の態様を構築するために使用される方法は、上の参考文献に記述されるもののような慣習的な遺伝子工学若しくは組換え工学技術である。本明細は本明細書に提供される情報を使用して特定の構築物の具体的に説明する例を提供する一方、当業者は、スペーサー、Ｐ５プロモーター（ＡＡＶと同一供給源、若しくは周囲の配列と異なる供給源からでありうるか、または発現を制御するためにｒｅｐ発現カセットの下流に再配置されうる）、イントロン、ならびに最低１個の翻訳開始および終止シグナルを包含する他のエレメントの選択、ならびにポリアデニル化部位の任意の付加を使用して、他の適する構築物を選択かつ設計しうる。
【００６０】
本発明の別の態様において、ｒｅｐ若しくはｃａｐタンパク質は宿主細胞により安定に提供されうる。
【００６１】
Ｃ．ヘルパー機能
パッケージング宿主細胞は、本発明のｒＡＡＶをパッケージングするためにヘルパー機能もまた必要とする。場合によっては、これらの機能はヘルペスウイルスにより供給されうる。最も望ましくは、必要なヘルパー機能は、上述されたものおよび／若しくはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナサス（米国）を包含する多様な供給元から入手可能であるようなヒト若しくはヒト以外の霊長類のアデノウイルス供給源からそれぞれ提供される。現在好ましい一態様において、宿主細胞は、Ｅ１ａ遺伝子産物、Ｅ１ｂ遺伝子産物、Ｅ２ａ遺伝子産物、および／若しくはＥ４  ＯＲＦ６遺伝子産物を提供されかつ／若しくは含有する。宿主細胞はＶＡＩ  ＲＮＡのような他のアデノウイルス遺伝子を含有しうるが、しかしこれらの遺伝子は必要とされない。好ましい一態様において、他のアデノウイルス遺伝子若しくは遺伝子機能が宿主細胞中に存在しない。
【００６２】
アデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａおよび／若しくはＥ４ＯＲＦ６遺伝子産物、ならびにいずれかの他の所望のヘルパー機能は、細胞中でのそれらの発現を可能にするいずれかの手段を使用して提供され得る。これらの産物をコードする配列のそれぞれは別個のベクター上にありうるか、または１種若しくはそれ以上の遺伝子が同一ベクター上にありうる。ベクターは、プラスミド、コスミドおよびウイルスを包含する、当該技術分野で既知若しくは上で開示されたいずれのベクターでもありうる。ベクターの宿主細胞への導入は、とりわけ、トランスフェクション、感染、電気穿孔法、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を包含する、当該技術分野で既知若しくは上で開示されたところのいずれの手段によっても達成しうる。アデノウイルス遺伝子の１種若しくはそれ以上は、宿主細胞のゲノム中に安定に組込まれても、エピソームとして安定に発現されても、若しくは一過性に発現されてもよい。遺伝子産物は全部、エピソーム上で一過性に発現されうるか、若しくは安定に組込まれうるか、または遺伝子産物のいくつかが安定に発現されうる一方で他者が一過性に発現される。さらに、アデノウイルス遺伝子のそれぞれのプロモーターは、構成的プロモーター、調節可能なプロモーター若しくは天然のプロモーターから独立に選択しうる。プロモーターは、生物体若しくは細胞の特定の生理学的状態により（すなわち分化状態により、または複製若しくは静止期細胞で）、あるいは例えば外因性に添加した因子により調節しうる。
【００６３】
Ｄ．宿主細胞およびパッケージング細胞株
宿主細胞それ自身は、原核生物（例えば細菌）細胞、ならびに昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞を包含する真核生物細胞を包含するいずれの生物学的生物体からも選択しうる。とりわけ望ましい宿主細胞は、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ  １、ＣＯＳ  ７、ＢＳＣ  １、ＢＳＣ  ４０、ＢＭＴ  １０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、２９３細胞（機能的アデノウイルスＥ１を発現する）、Ｓ
ａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、ならびにヒト、サル、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを包含する哺乳動物由来の初代線維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞のような細胞を制限なしに包含するいずれかの哺乳動物種のなかから選択する。細胞を提供する哺乳動物種の選択は本発明の制限でなく；また、哺乳動物細胞の型、すなわち線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞などもそうでない。使用される細胞に対する要件は、それがＥ１、Ｅ２ａおよび／若しくはＥ４  ＯＲＦ６以外のいかなるアデノウイルス遺伝子も保有せず；それがｒＡＡＶの産生の間に汚染するウイルスの相同的組換えをもたらし得るいかなる他のウイルス遺伝子も含有せず；そしてそれがＤＮＡの感染若しくはトランスフェクションおよびトランスフェクトされたＤＮＡの発現が可能であることである。好ましい一態様において、宿主細胞は細胞中でｒｅｐおよびｃａｐが安定にトランスフェクトされているものである。
【００６４】
本発明で有用な一宿主細胞は、ｒｅｐおよびｃａｐをコードする配列で安定に形質転換されかつアデノウイルスＥ１、Ｅ２ａおよびＥ４ＯＲＦ６  ＤＮＡならびに上述されたところのミニ遺伝子を保有する構築物でトランスフェクトされている宿主細胞である。Ｂ−５０（国際特許出願公開第ＷＯ  ９９／１５６８５号）、若しくは米国特許第５，６５８，７８５号明細書に記述されるもののような安定なｒｅｐおよび／若しくはｃａｐを発現する細胞株もまた同様に使用しうる。別の所望の宿主細胞はＥ４  ＯＲＦ６を発現するのに十分である最少のアデノウイルスＤＮＡを含有する。
【００６５】
本発明の宿主細胞の製造は選択されたＤＮＡ配列の集成のような技術を必要とする。この集成は慣習的技術を利用して達成しうる。こうした技術は、公知でありかつ上で引用されたＳａｍｂｒｏｏｋらに記述されるｃＤＮＡおよびゲノムクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応と組合せたアデノウイルスおよびＡＡＶゲノムのオーバーラップオリゴヌクレオチド配列の使用、合成法、ならびに所望のヌクレオチド配列を提供するいずれかの他の適する方法を包含する。
【００６６】
宿主細胞中への（プラスミド若しくはウイルスとしての）分子の導入は、当業者に既知かつ本明細を通じて論考されるところの技術を使用してもまた達成しうる。好ましい態様において、標準的トランスフェクション技術、例えばＣａＰＯ４トランスフェクション若しくは電気穿孔法、および／またはヒト胎児由来腎臓細胞株ＨＥＫ  ２９３（トランスに作用するＥ１タンパク質を提供する機能的アデノウイルスＥ１遺伝子を含有するヒト腎細胞株）のような細胞株へのハイブリッドアデノウイルス／ＡＡＶベクターによる感染を使用する。
【００６７】
ＡＡＶウイルス粒子の適する製造方法は記述されている。
【００６８】
加えて、ＡＡＶの望ましい一製造方法が、共通に所有される米国仮出願、”Ｓｃａｌａｂｌｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ＡＡＶ（ＡＡＶの規模適応性の製造方法）”（本明細書と同時に出願されておりかつ引用することによりここに組込まれる）に記述される。細胞溶解を必要とすることのないＡＡＶの製造方法が記述される。該方法はＡＡＶを上清から収集することを必要とする。一アスペクトにおいて、本発明は分泌しないＡＡＶを改変することを必要とする。例えば、ヘパリンにより遮断されるその形質導入（感染）能力を有することを特徴とするヘパリン結合ドメインを有するＡＡＶは、検出可能な量で分泌しないことが見出されている。こうしたＡＡＶの例はＡＡＶ２およびＡＡＶ３である。従って、一態様において、該方法は、ＡＡＶのヘパリン結合部位と産生体細胞の間の結合を実質的に低下若しくは排除するようにＡＡＶキャプシド、細胞および／若しくは培養条件を改変してそれによりＡＡＶが上清すなわち培地にわたることを可能にすることを必要とする。本方法は、細胞溶解段階を使用する方法を使用して製造されるＡＡＶに比較して、細胞膜および細胞内物質からのより高程度の純度を有するＡＡＶの高
収量を含有する上清を提供する。
【００６９】
組換えウイルスおよびそのための用途
一アスペクトにおいて、本発明の改変ＡＡＶは、治療的、免疫原若しくはワクチン分子の宿主細胞への送達に使用する。一態様において、本発明の改変ＡＡＶは免疫応答を低下させるのに有用であり、かつ／または、該改変ＡＡＶの毒性は、ヘパリン結合を除去するようにＡＡＶを改変することの前の該ＡＡＶの免疫応答および／若しくは毒性より実質的により低い。本発明の改変ＡＡＶは、免疫応答を低下させるのに有用であり、かつ／または、該改変ＡＡＶの毒性は、ＲｘｘＲモチーフを変えるようにＡＡＶを改変することの前の該ＡＡＶの免疫応答および／若しくは毒性より実質的により低い。
【００７０】
Ａ．ウイルスの送達
別のアスペクトにおいて、本発明は、本発明の改変ＡＡＶキャプシドを用いて生成したＡＡＶウイルスベクターで、選択された宿主細胞をトランスフェクト若しくは感染させることを必要とする、宿主への選択された異種核酸分子若しくは配列の送達方法を提供する。送達方法は当業者に公知でありかつ本発明の制限でない。
【００７１】
望ましい一態様において、本発明は宿主への分子のＡＡＶ媒介性送達方法を提供する。本方法は、選択された分子の発現を指図する配列の制御下の選択された分子、および改変ＡＡＶキャプシドタンパク質を含有する組換えウイルスベクターで、選択された宿主細胞をトランスフェクト若しくは感染させることを必要とする。
【００７２】
場合によっては、宿主からのサンプルを、選択されたＡＡＶ供給源（例えば血清型）に対する抗体の存在について最初にアッセイしうる。中和抗体を検出するための多様なアッセイ形式が当業者に公知である。こうしたアッセイの選択は本発明の制限でない。例えば、Ｆｉｓｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、３（３）：３０６−３１２（１９９７年３月）およびＷ．Ｃ．Ｍａｎｎｉｎｇら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、９：４７７−４８５（１９９８年３月１日）を参照されたい。本アッセイの結果を、特定の１供給源のキャプシドタンパク質を含有するどのＡＡＶベクターが送達に好ましいかを、例えばそのキャプシド供給源に特異的な中和抗体の非存在により決定するのに使用しうる。
【００７３】
本方法の一アスペクトにおいて、本発明の改変ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むベクターの送達は、異なるＡＡＶキャプシドタンパク質を含むベクターを介する遺伝子の送達に先行しても若しくは後に続いてもよい。従って、ＡＡＶベクターを介する遺伝子送達を、選択された宿主細胞への反復遺伝子送達に使用しうる。望ましくは、その後投与されるＡＡＶベクターは第一のＡＡＶベクターと同一の導入遺伝子を保有するが、しかし、その後投与されるベクターは、第一のベクターと異なる供給源（および好ましくは異なる血清型）のキャプシドタンパク質を含有する。
【００７４】
場合によっては、複数のＡＡＶベクターを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで鎖状体化して単一のベクターゲノムを形成するＡＡＶベクターの共投与により大型遺伝子若しくは複数の遺伝子を送達し得る。こうした一態様において、第一のＡＡＶは単一遺伝子（若しくはその１サブユニット）を発現する発現カセットを保有することができ、そして第二のＡＡＶは宿主細胞中での共発現のため第二の遺伝子（若しくは異なるサブユニット）を発現する発現カセットを保有しうる。第一のＡＡＶは、多シストロン性構築物の第一の一片（例えばプロモーターおよび導入遺伝子若しくはサブユニット）である発現カセットを保有することができ、そして第二のＡＡＶは、多シストロン性構築物の第二の一片（例えば遺伝子若しくはサブユニットおよびポリＡ配列）である発現カセットを保有しうる。多シストロン性構築物のこれら二片がｉｎ  ｖｉｖｏで鎖状体化して、第一および第二のＡＡＶにより送達される遺伝子を共発現する単一のベクターゲノムを形成する。こうした態様におい
て、第一の発現カセットを保有する改変ＡＡＶベクターおよび第二の発現カセットを保有する改変ＡＡＶベクターを、単一の製薬学的組成物中で送達し得る。他の態様において、２種若しくはそれ以上の改変ＡＡＶベクターは、実質的に同時にまたは相互の直前若しくは後に投与し得る別個の製薬学的組成物として送達される。
【００７５】
上述された組換えベクターは、公表された方法に従って宿主細胞に送達しうる。好ましくは生理学的に適合性のキャリヤーに懸濁した改変ＡＡＶを、ヒト若しくはヒト以外の哺乳動物患者に投与しうる。適するキャリヤーは、移入ウイルスが向けられる適応症を鑑みて当業者により容易に選択されうる。例えば、１種の適するキャリヤーは、多様な緩衝溶液とともに処方されうる生理的食塩水を包含する（例えばリン酸緩衝生理的食塩水）。他の例示的キャリヤーは、滅菌生理的食塩水、乳糖、ショ糖、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、アガー、ペクチン、ラッカセイ油、ゴマ油および水を包含する。キャリヤーの選択は本発明の制限でない。
【００７６】
場合によっては、本発明の組成物は、改変ＡＡＶおよびキャリヤー（１種若しくは複数）に加え、保存剤若しくは化学的安定剤のような他の慣習的製薬学的成分を含有しうる。適する例示的保存剤はクロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化イオウ、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールを包含する。適する化学的安定剤はゼラチンおよびアルブミンを包含する。
【００７７】
該ベクターは、細胞をトランスフェクトし、かつ、医学の技術分野の当業者により決定され得る過度の悪影響を伴わずに若しくは医学的に許容できる生理学的効果を伴い治療的利益を提供するのに十分なレベルの遺伝子移入および発現を提供するのに十分な量で投与する。慣習的なおよび製薬学的に許容できる投与経路は、限定されるものでないが所望の器官（例えば肝（場合によっては肝動脈を介して）若しくは肺）への直接送達、経口、吸入、鼻内、気管内、動脈内、眼内、蝸牛内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、および他の非経口投与経路を挙げることができる。投与経路は所望の場合に組み合わせうる。
【００７８】
ウイルスベクターの投薬量は、主として、治療されている状態、患者の齢、体重および健康状態のような因子に依存することができ、そして従って患者間で異なりうる。例えば、ウイルスベクターの治療上有効なヒト投薬量は、一般に約１×１０９から１×１０１６までのゲノムウイルスベクターの濃度を含有する約０．１ｍＬから約１００ｍＬまでの溶液の範囲にある。大型の器官（例えば肝、筋、心および肺）への送達に好ましいヒト投薬量は、約１ないし１００ｍＬの容量で１ｋｇあたり約５×１０１０ないし５×１０１３ＡＡＶゲノムでありうる。眼若しくは耳（蝸牛）への送達に好ましい投薬量は、約０．１ｍＬないし１ｍＬの容量で約５×１０９ないし５×１０１２ゲノムコピーである。投薬量は、いかなる副作用に対しても治療的利益の均衡を図るように調節することができ、そして、こうした投薬量は組換えベクターを使用する治療的応用に依存して変動しうる。導入遺伝子の発現のレベルをモニターして、ウイルスベクター、好ましくはミニ遺伝子を含有するＡＡＶベクターをもたらす投薬頻度を決定し得る。場合によっては、治療の目的上記述されるものに類似の投与計画を、本発明の組成物を使用する免疫化に利用しうる。
【００７９】
本発明の改変ＡＡＶ含有ベクターによる送達のための治療的産物および免疫原産物の例を下に提供する。これらのベクターは、本明細書に記述されるところの多様な治療若しくはワクチンレジメンに使用しうる。加えて、これらのベクターは所望の治療および／若しくはワクチンレジメンにおいて１種若しくはそれ以上の他のベクター若しくは有効成分と組合せで送達しうる。
【００８０】
Ｂ．治療的産物
発現カセットに保有される核酸分子によりコードされる有用な治療的産物は、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体化ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦα、アクチビン、インヒビンを包含するトランスフォーミング成長因子αスーパーファミリーのいずれか１種、若しくは骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１〜１５のいずれか、成長因子のヘレグルイン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーのいずれか１種、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３およびＮＴ−４／５、絨毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンのファミリーのいずれか１種、ネトリン−１およびネトリン−２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグならびにチロシンヒドロキシラーゼを制限なしに包含するホルモンならびに増殖および分化因子を包含する。
【００８１】
他の有用な導入遺伝子産物は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−１からＩＬ−２５（例えばＩL−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８を包含する）、単球化学遊走物質タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、βおよびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンドのようなサイトカインおよびリンホカインを制限なしに包含する免疫系を調節するタンパク質を包含する。免疫系により産生される遺伝子産物もまた本発明で有用である。これらは、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子、ならびに工作された免疫グロブリンおよびＭＨＣ分子を制限なしに包含する。有用な遺伝子産物は、補体調節タンパク質、膜補助因子タンパク質（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２およびＣＤ５９のような補体調節タンパク質もまた包含する。
【００８２】
なお他の有用な遺伝子産物は、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質および免疫系タンパク質の受容体のいずれか１種を包含する。本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体およびスカベンジャー受容体を包含するコレステロール調節および／若しくは脂質調節のための受容体を包含する。本発明はまた、グルココルチコイド受容体およびエストロゲン受容体、ビタミンＤ受容体ならびに他の核受容体を包含するステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーのような遺伝子産物も包含する。加えて、有用な遺伝子産物は、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ−１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤおよびミオゲニン、ＥＴＳボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ−４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡボックス結合タンパク質、例えばＧＡＴＡ−３、ならびに翼状らせんタンパク質のフォークヘッドファミリーのような転写因子を包含する。
【００８３】
他の有用な遺伝子産物は、カルバモイル合成酵素１、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸合成酵素、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸加水分解酵素、フェニルアラニン水酸化酵素、α−１アンチトリプシン、グルコ
ース−６−ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲン脱アミノ酵素、シスタチオンβ−合成酵素、分枝状鎖ケト酸脱炭酸酵素、アルブミン、イソバレリル−ｃｏＡ脱水素酵素、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡ脱水素酵素、インスリン、β−グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシン脱炭酸酵素、Ｈ−プロテイン、Ｔ−プロテイン、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列、およびジストロフィン遺伝子産物［例えばミニ若しくはミクロジストロフィン］を包含する。なお他の有用な遺伝子産物は、酵素の不足した活性から生じる多様な状態で有用である酵素補充療法で有用でありうるような酵素を包含する。例えば、マンノース−６−リン酸を含有する酵素は、リソゾーム蓄積症の治療で利用しうる（例えば、適する遺伝子はβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をコードするものを包含する）。
【００８４】
なお他の有用な遺伝子産物は、血友病Ｂ（第ＩＸ因子を包含する）ならびに血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子、ならびにヘテロ二量体のＬ鎖およびＨ鎖ならびにＢ欠失ドメインのようなそのバリアントを包含する；米国特許第６，２００，５６０号および同第６，２２１，３４９号）を包含する血友病の処置に使用されるものを包含する。第ＶＩＩＩ因子遺伝子は２３５１アミノ酸をコードし、そして該タンパク質は６ドメインを有し、アミノから末端のカルボキシ末端へＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２と呼称される［Ｗｏｏｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３１２：３３０（１９８４）；Ｖｅｈａｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：３３７（１９８４）；およびＴｏｏｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：３３７（１９８４）］。ヒト第ＶＩＩＩ因子は細胞内でプロセシングされて、Ａ１、Ａ２およびＢドメインを含有するＨ鎖ならびにＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを含有するＬ鎖を主として含んでなるヘテロ二量体を生じる。一本鎖ポリペプチドおよびヘテロ二量体の双方が、Ｂドメインを遊離しかつＡ１およびＡ２ドメインよりなるＨ鎖をもたらすＡ２およびＢドメインの間のトロンビン切断により活性化されるまで、不活性前駆体として血漿中を循環する。Ｂドメインは活性化された凝血原の形態のタンパク質中では除去されている。加えて、天然のタンパク質中でＢドメインに隣接する２本のポリペプチド鎖（「ａ」および「ｂ」）は、二価のカルシウム陽イオンに結合している。
【００８５】
いくつかの態様において、ミニ遺伝子は、１０アミノ酸のシグナル配列をコードする第ＶＩＩＩ因子Ｈ鎖の最初の５７塩基対、ならびにヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列を含んでなる。代替の態様において、ミニ遺伝子は、Ａ１およびＡ２ドメイン、ならびにＢドメインのＮ末端からの５アミノ酸および／若しくはＢドメインのＣ末端の８５アミノ酸、ならびにＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインをさらに含んでなる。なお他の態様において、第ＶＩＩＩ因子Ｈ鎖およびＬ鎖をコードする核酸が、Ｂドメインの１４アミノ酸をコードする４２核酸により分離される単一のミニ遺伝子中に提供される［米国特許第６，２００，５６０号］。
【００８６】
本明細書で使用されるところの治療上有効な量は、被験体の血液が凝固するのにそれがかかる時間を短縮するのに十分な量の第ＶＩＩＩ因子を産生するＡＡＶベクターの量である。一般に、正常レベルの１％未満の第ＶＩＩＩ因子を有する重症血友病患者は、非血友病患者についてのおよそ１０分に比較して６０分より長い全血凝固時間を有する。
【００８７】
本発明はいずれかの特定の第ＶＩＩＩ因子配列に制限されない。多くの天然のおよび組換えの形態の第ＶＩＩＩ因子が単離かつ生成されている。天然に存在するおよび組換えの形態の第ＶＩＩ因子の例は、米国特許第５，５６３，０４５号、同第５，４５１，５２１号、同第５，４２２，２６０号、同第５，００４，８０３号、同第４，７５７，００６号、同第５，６６１，００８号、同第５，７８９，２０３号、同第５，６８１，７４６号、同第５，５９５，８８６号、同第５，０４５，４５５号、同第５，６６８，１０８号、同第５，６３３，１５０号、同第５，６９３，４９９号、同第５，５８７，３１０号、同第
５，１７１，８４４号、同第５，１４９，６３７号、同第５，１１２，９５０号、同第４，８８６，８７６号明細書；国際特許公開第ＷＯ  ９４／１１５０３号、同第ＷＯ  ８７／０７１４４号、同第ＷＯ  ９２／１６５５７号、同第ＷＯ  ９１／０９１２２号、同第ＷＯ  ９７／０３１９５号、同第ＷＯ  ９６／２１０３５号および同第ＷＯ  ９１／０７４９０号明細書；欧州特許出願第ＥＰ  ０  ６７２  １３８号、同第ＥＰ  ０  ２７０  ６１８号、同第ＥＰ  ０  １８２  ４４８号、同第ＥＰ  ０  １６２  ０６７号、同第ＥＰ  ０  ７８６  ４７４号、同第ＥＰ  ０  ５３３  ８６２号、同第ＥＰ  ０  ５０６  ７５７号、同第ＥＰ  ０  ８７４  ０５７号、同第ＥＰ  ０  ７９５  ０２１号、同第ＥＰ  ０  ６７０  ３３２号、同第ＥＰ  ０  ５００  ７３４号、同第ＥＰ  ０  ２３２  １１２号および同第ＥＰ  ０  １６０  ４５７号明細書；Ｓａｎｂｅｒｇら、ＸＸｔｈ  Ｉｎｔ．Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｆｅｄ．Ｏｆ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ（１９９２）、ならびにＬｉｎｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２３２：１９（１９９５）を包含する特許および学術論文に見出し得る。
【００８８】
上述された第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸配列は、組換えの方法を使用して、若しくは該配列を包含することが既知のベクターからそれを派生させることにより得ることができる。さらに、所望の配列を、フェノール抽出およびｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡのＰＣＲのような標準的技術を使用して、それを含有する細胞および組織から直接単離し得る［例えばＳａｍｂｒｏｏｋらを参照されたい］。ヌクレオチド配列はまた、クローン化されるよりはむしろ合成で製造し得る。完全な配列は、標準的方法により製造したオーバーラップオリゴヌクレオチドから集成し得、そして完全なコーディング配列に集成し得る［例えば、Ｅｄｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７５７（１９８１）；Ｎａｍｂａｒｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２３：１２９９（１９８４）；およびＪａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１（１９８４）を参照されたい。
【００８９】
さらに、本発明はヒト第ＶＩＩＩ因子に制限されない。事実、本発明は、限定されるものでないがコンパニオンアニマル（例えばイヌ、ネコおよびウマ）、家畜（例えばウシ、ヤギおよびヒツジ）、実験動物、海棲哺乳類、大型のネコなどを挙げることができるヒト以外の動物からの第ＶＩＩＩ因子を包含することを意図している。
【００９０】
ＡＡＶベクターは、それ自身生物学的に活性でないがそれでもなお被験体に投与される場合に血液凝固時間を改良若しくは復帰させる第ＶＩＩＩ因子のフラグメントをコードする核酸を含有しうる。例えば、上で論考されたとおり、第ＶＩＩＩ因子タンパク質は２個のポリペプチド鎖、すなわちプロセシングの間に切断されるＢドメインにより分離されたＨ鎖およびＬ鎖を含んでなる。本発明により示されるとおり、第ＶＩＩＩ因子のＨおよびＬ鎖でレシピエント細胞を共形質導入することは、生物学的に活性の第ＶＩＩＩ因子の発現に至る。大部分の血友病患者は該鎖の一方（例えばＨ若しくはＬ鎖）のみに突然変異若しくは欠失を含有するため、患者で欠損の鎖のみを投与して他方の鎖を供給することが可能でありうる。
【００９１】
他の有用な遺伝子産物は、挿入、欠失若しくはアミノ酸置換を含有する天然に存在しないアミノ酸配列を有するキメラ若しくはハイブリッドポリペプチドのような天然に存在しないポリペプチドを包含する。例えば、一本鎖の工作された免疫グロブリンはある種の免疫無防備状態の患者で有用であり得る。他の型の天然に存在しない遺伝子配列は、アンチセンス分子、および標的の過剰発現を低下させるのに使用し得るリボザイムのような触媒核酸を包含する。
【００９２】
遺伝子の発現の低下および／若しくは調節は、癌および乾癬がそうであるように、過剰増殖する細胞を特徴とする過剰増殖状態の処置にとりわけ望ましい。標的ポリペプチドは、正常細胞に比較して過剰増殖細胞中で独占的に若しくはより高レベルで産生されるポリペプチドを包含する。標的抗原は、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎのような癌遺伝子、ならびに転位遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋおよびＥＧＲＦによりコードされるポリペプチドを包含する。標的抗原としての癌遺伝子産物に加え、抗癌処置および保護的レジメンの標的ポリペプチドは、Ｂ細胞リンパ腫により作成される抗体の可変領域およびＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変領域を包含し、それらは、いくつかの態様において自己免疫疾患の標的抗原としてもまた使用される。モノクローナル抗体１７−１Ａにより認識されるポリペプチドおよび葉酸結合ポリペプチドを包含する、腫瘍細胞中でより高レベルで見出されるポリペプチドのような、他の腫瘍関連ポリペプチドを標的ポリペプチドとして使用し得る。
【００９３】
他の適する治療的ポリペプチドおよびタンパク質は、細胞受容体および「自己」に向けられた抗体を産生する細胞を包含する自己免疫と関連する標的に対する広範囲にわたる保護免疫応答を与えることにより、自己免疫疾患および障害に苦しめられている個体を処置するのに有用でありうるものを包含する。Ｔ細胞媒介性の自己免疫疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、クローン病および潰瘍性大腸炎を包含する。これらの疾患のそれぞれは、内因性抗原に結合しかつ自己免疫疾患に関連する炎症カスケードを開始するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を特徴とする。
【００９４】
Ｃ．免疫原性導入遺伝子
適しては、本発明のＡＡＶベクターは、ＡＡＶキャプシド配列に対する免疫応答の生成を回避する。しかしながら、これらのベクターは、それにもかかわらず、該ベクターにより保有される導入遺伝子の発現が選択された抗原に対する免疫応答を誘導することを可能にする様式で処方しうる。例えば、免疫応答を促進するために、遺伝子産物を構成的プロモーターから発現させることができ、該ベクターを本明細書に記述されるとおり補助し（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）得、かつ／若しくは該ベクターを変性組織に置くことができる。
【００９５】
本発明の改変ＡＡＶ含有ベクターによる送達のための適する抗原および免疫原産物の例を下に提供する。これらのベクターは、本明細書に記述されるところの多様な免疫原若しくはワクチンレジメンに使用しうる。加えて、これらのベクターは、所望の免疫調節および／若しくはワクチンレジメンで１種若しくはそれ以上の他のベクター若しくは有効成分とともに送達しうる。例えば、プライム−ブースト（ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ）レジメンは、２００５年４月２７日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１４５５６号明細書に記述されるＡＡＶベクターを利用したを参照されたい。
【００９６】
適しては、本発明のＡＡＶベクターは、該ベクター内に含有されるＡＡＶに対する細胞性（すなわちＴ細胞）免疫応答を高める。しかしながら、これらのベクターは、それにもかかわらず、該ベクターにより保有される導入遺伝子の発現が選択された抗原に対する免疫応答を誘導することを可能にする様式で処方されうる。例えば、免疫応答を促進するために、導入遺伝子を構成的プロモーターから発現させることができ、該ベクターを本明細書に記述されるとおり補助し得、かつ／若しくは該ベクターを変性組織に置くことができる。
【００９７】
適する免疫原かつ抗原産物の例は多様なウイルス科由来のものを包含する。免疫応答が望ましいとみられる所望のウイルス科の例は、一般的な風邪の症例の約５０％の原因であるライノウイルス属を包含するピコルナウイルス科；ポリオウイルス、コックサッキーウイルス、エコーウイルス、およびＡ型肝炎ウイルスのようなヒトエンテロウイルスを包含するエンテロウイルス属；ならびに主としてヒト以外の動物での口蹄疫の原因であるアプトウイルス属を包含する。ウイルスのピコルナウイルス科内で、標的抗原はＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４およびＶＰＧを包含する。他のウイルス科はアストロウイルスおよびカルシウイルス（ｃａｌｃｉｖｉｒｕｓ）科を包含する。カルシウイルス科は、流行性胃腸炎の重要な原因病原体であるノーウォーク群のウイルスを包含する。ヒトおよびヒト以外の動物で免疫応答を誘導するための抗原の標的設定における使用に望ましいなお別のウイルス科は、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルス、ならびにベネズエラ、東部および西部ウマ脳炎ウイルスを包含するアルファウイルス属、ならびに風疹ウイルスを包含するルビウイルス属を包含するトガウイルス科である。フラビウイルス科は、デング熱、黄熱病、日本脳炎、セントルイス脳炎およびダニ媒介脳炎ウイルスを包含する。他の標的抗原は、Ｃ型肝炎ウイルス、または感染性気管支炎ウイルス（家禽）、ブタ伝染性胃腸ウイルス（ブタ）、ブタヘマグルチナチン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎ）脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）のような多数のヒト以外のウイルス、ならびに、一般的な風邪および／または非Ａ、Ｂ若しくはＣ型肝炎を引き起こすことがありかつ重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の推定の原因を包含するヒト呼吸器コロナウイルスを包含するコロナウイルス科から生成しうる。コロナウイルス科内で、標的抗原は、Ｅ１（Ｍすなわちマトリックスタンパク質ともまた呼ばれる）、Ｅ２（Ｓすなわちスパイクタンパク質ともまた呼ばれる）、Ｅ３（ＨＥすなわちヘマグルチン−エルテロース（ｅｌｔｅｒｏｓｅ）ともまた呼ばれる）糖タンパク質（全部のコロナウイルスに存在するわけではない）若しくはＮ（ヌクレオキャプシド）を包含する。なお他の抗原はアルテリウイルス科およびラブドウイルス科を標的としうる。ラブドウイルス科は、ベシクロウイルス（例えば水疱性口内炎ウイルス）および一般的なリッサウイルス（例えば狂犬病）属を包含する。ラブドウイルス科内で、適する抗原はＧタンパク質若しくはＮタンパク質に由来しうる。マルブルクおよびエボラウイルスのような出血性熱ウイルスを包含するフィロウイルス科が抗原の適する供給源となりうる。パラミクソウイルス科は、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス３型、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ルブラウイルス（流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス４型、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫、麻疹およびイヌジステンパーを包含するモルビリウイルス、ならびにＲＳウイルスを包含するニューモウイルスを包含する。インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルス科内で分類され、そして抗原の適する供給源である（例えばＨＡタンパク質、Ｎ１タンパク質）。ブニヤウイルス科は、ブニヤウイルス（カリフォルニア脳炎、ラクロス）、フレボウイルス（リフトバレー熱）、ハンタウイルス（プーマラ（ｐｕｒｅｍａｌａ）はヘマハギン（ｈｅｍａｈａｇｉｎ）熱ウイルスである）、ナイロウイルス（ナイロビ羊病）、および多様な割り当てられていないブンガウイルス（ｂｕｎｇａｖｉｒｕｓ）属を包含する。アレナウイルス科はＬＣＭおよびラッサ熱ウイルスに対する抗原の供給源を提供する。抗原の別の供給源はボルナウイルス科である。レオウイルス科は、レオウイルス、ロタウイルス（小児で急性胃腸炎を引き起こす）、オルビウイルスおよびカルチウイルス（ｃｕｌｔｉｖｉｒｕｓ）（コロラドダニ熱、レボンボ（ヒト）、ウマ脳症、ブルータング）属を包含する。レトロウイルス科は、ネコ白血病ウイルス、ＨＴＬＶＩおよびＨＴＬＶＩＩ、レンチウイルス亜科の（ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｌ）（ＨＩＶ、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルスおよびスプマウイルス亜科の（ｓｐｕｍａｖｉｒｉｎａｌ）を包含する）のようなヒトおよび家畜の疾患を包含するオンコリウイルス（ｏｎｃｏｒｉｖｉｒｉｎａｌ）亜科を包含する。パボーバウイルス科は、ポリオーマウイルス亜科（ＢＫＵおよびＪＣＵウイルス）ならびにパピローマウイルス亜科（癌若しくは乳頭腫の悪性進行と関連する）を包含する。アデノウイルス科は呼吸器疾患および／若しくは腸炎を引き起こすウイルス（ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）を包含する。パルボウイルス科はネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌパルボウイルスおよびブタパルボウイルスを包含する。ヘルペスウイルス科は、シンプレックスウイルス（ＨＳＶＩ、ＨＳＶＩＩ）、ワリセロウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）（偽性狂犬病、帯状疱疹）属を包含するアルファヘルペスウイルス亜科、およびサイトメガロウイルス属（ＨＣＭＶ、ムロメガロウイルス）を包含するベータヘルペスウイルス亜科、ならびに、リンホクリプトウイルス属、ＥＢＶ（バーキットリンパ腫）、６Ａ、６Ｂおよび７型ヒトヘルペスウイルス、カポシ肉腫関連ヘルペスウイルスならびにオナガザルヘルペスウイルス（Ｂウイルス）、感染性鼻気管炎、マレック病ウイルスならびにラジノウイルス属を包含するガンマヘルペスウイルス亜科を包含する。ポックスウイルス科は、オルトポックスウイルス（大疱瘡（天然痘）およびワクシニア（牛痘））、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス属を包含するチョルドポックスウイルス亜科、ならびにエントモポックスウイルス亜科を包含する。ヘパドナウイルス科はＢ型肝炎ウイルスを包含する。抗原の適する供給源となりうる１種の分類されないウイルスは、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルスおよびプリオンである。抗原の供給源となる別のウイルスはニパンウイルスである。なお他のウイルス供給源は、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスおよびブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルスを包含しうる。アルファウイルス科はウマ動脈炎ウイルスおよび多様な脳炎ウイルスを包含する。
【００９８】
他の免疫原は、ヒトおよびヒト以外の脊椎動物を感染させる細菌、真菌、寄生性微生物若しくは多細胞寄生生物を包含する他の病原体に対しヒト若しくはヒト以外の動物を免疫するのに有用であるか、または癌細胞若しくは腫瘍細胞からであるものを包含する。細菌性病原体の例は肺炎球菌；ブドウ球菌（およびそれにより産生される毒素、例えばエンテロトキシンＢ）；ならびに連鎖球菌をはじめとする病原性グラム陽性球菌を包含する。病原性グラム陰性球菌は髄膜炎菌；淋菌を包含する。病原性の腸グラム陰性桿菌は、腸内細菌科；シュードモナス菌、アシネトバクテリア（ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびエイケネラ（ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）；類鼻疽；サルモネラ（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）；シゲラ（ｓｈｉｇｅｌｌａ）；ヘモフィルス（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）；モラクセラ（ｍｏｒａｘｅｌｌａ）；軟性下疳菌（Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ）（軟性下疳を引き起こす）；ブルセラ（ｂｒｕｃｅｌｌａ）スピーシーズ（ブルセラ症）；野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病を引き起こす）；ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）（ペスト）および他のエルジニア（ｙｅｒｓｉｎｉａ）（パスツレラ菌）；ストレプトバチルス  モニリフォルミス（ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）およびらせん菌を包含し；グラム陽性桿菌はリステリア菌（ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；豚丹毒菌（ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）（ジフテリア）；コレラ；炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）；ドノヴァン症（鼠径部肉芽腫）；およびバルトネラ症を包含する。病原性嫌気性細菌により引き起こされる疾患は、破傷風；ボツリヌス中毒（クロストリズム  ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）およびその毒素）；ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびそのε毒素；他のクロストリジウム；結核；らい；ならびに他のミコバクテリアを包含する。病原性のスピロヘータ疾患は梅毒；トレポネーマ症；イチゴ腫、ピンタおよび風土病性梅毒；ならびにレプトスピラ症を包含する。より高病原性の細菌および病原性真菌により引き起こされる他の感染症は、鼻疽（バークホルデリア  マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ））；アクチノミセス症；ノカルジア症；クリプトコックス症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症およびコクシジオイデス真菌症；カンジダ症、アスペルギルス症およびムコール症；スポロトリクス症；パラコクシジオイドミコーシス、ペトリエリジオシス（ｐｅｔｒｉｅｌｌｉｄｉｏｓｉｓ）、トルロプシス症、菌腫およびクロモミコーシス；ならびに皮膚糸状菌症を包含する。リケッチア感染症は、発疹チフス、ロッキー山熱、Ｑ熱（コクシエラ
ブルネティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｔｉ））およびリケッチア痘を包含する。マイコプラスマおよびクラミジア感染症の例は：マイコプラスマ肺炎；性病性リンパ肉芽腫；オウム病；および周産期クラミジア感染症を包含する。病原性真核生物は病原性原生動物および蠕虫を包含し、また、それらにより生じられる感染症は：アメーバ症；マラ
リア；リーシュマニア症；トリパノソーマ症；トキソプラスマ症；ニューモシスチス  カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）；トリカンス（Ｔｒｉｃｈａｎｓ）；トキソプラスマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）；バベシア症；ジアルジア症；旋毛虫症；フィラリア症；住血吸虫症；線虫；吸虫（ｔｒｅｍａｔｏｄｅｓ）すなわち吸虫（ｆｌｕｋｅｓ）；および条虫（ｃｅｓｔｏｄｅ）（条虫（ｔａｐｅｗｏｒｍ））感染症を包含する。
【００９９】
これらの生物体および／若しくはそれらにより産生される毒素の多くは、生物学的攻撃での使用に関する潜在性を有する剤として疾病対策センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）［（ＣＤＣ）、米国保健福祉省の部門］により同定された。例えば、これらの生物学的剤のいくつかは、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）およびその毒素（ボツリヌス中毒）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）（ペスト）、大疱瘡（天然痘）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病）、ならびにウイルス性出血熱［フィロウイルス（例えばエボラ、マルブルク］、ならびにアレナウイルス［例えばラッサ、マチュポ］）（それらの全部は現在カテゴリーＡの病原体に分類されている）；コクシエラ  ブルネティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｔｉ）（Ｑ熱）；ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）スピーシーズ（ブルセラ症）、バークホルデリア  マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）（鼻疽）、バークホルデリア  シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）（類鼻疽）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）およびその毒素（リシン毒素）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびその毒素（ε毒素）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）スピーシーズおよびそれらの毒素（エンテロトキシンＢ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）（オウム病）、水の安全性に対する脅威（例えばコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ
ｃｈｌｅｒａｅ）、クリトスポリジウム  パルブム（Ｃｒｙｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ））、発疹チフス（発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｈｅｔｔｓｉａ  ｐｏｗａｚｅｋｋｉ））、ならびにウイルス性脳炎（アルファウイルス、例えばベネズエラウマ脳炎；東部ウマ脳炎；西部ウマ脳炎）；（それらの全部は現在カテゴリーＢの剤として分類されている）；ならびにニパンウイルスおよびハンタウイルス（現在カテゴリーＣの病原体として分類されている）を包含する。加えて、そのように分類されるか若しくは異なって分類される他の生物体が、将来同定かつ／若しくはこうした目的上使用されうる。本明細書に記述されるウイルスベクターおよび他の構築物が、これらの生物学的剤での感染症若しくはそれらとの他の有害反応を予防かつ／若しくは処置することができるこれらの生物体、ウイルス、それらの毒素若しくは他の副生成物からの抗原を送達するのに有用であることが容易に理解されるであろう。
【０１００】
Ｔ細胞の可変領域に対する免疫原を送達するための本発明のベクターの投与は、それらのＴ細胞を排除するためのＣＴＬを包含する免疫応答を導き出す。関節リウマチ（ＲＡ）において、該疾患に関与するＴＣＲの数個の特異的可変領域が特徴づけられている。これらのＴＣＲはＶ−３、Ｖ−１４、Ｖ−１７およびＶ−１７を包含する。従って、これらのポリペプチドの最低１種をコードする核酸配列の送達は、ＲＡに関与するＴ細胞を標的とすることができる免疫応答を導き出すことができる。多発性硬化症（ＭＳ）において、該疾患に関与するＴＣＲの数個の特異的可変領域が特徴づけられている。これらのＴＣＲはＶ−７およびＶ−１０を包含する。従って、これらのポリペプチドの最低１種をコードする核酸配列の送達は、ＭＳに関与するＴ細胞を標的とすることができる免疫応答を導き出すことができる。強皮症において、該疾患に関与するＴＣＲの数個の特異的可変領域が特徴づけられている。これらのＴＣＲはＶ−６、Ｖ−８、Ｖ−１４およびＶ−１６、Ｖ−３Ｃ、Ｖ−７、Ｖ−１４、Ｖ−１５、Ｖ−１６、Ｖ−２８およびＶ−１２を包含する。従って、これらのポリペプチドの最低１種をコードする核酸分子の送達は、強皮症に関与する
Ｔ細胞を標的とすることができる免疫応答を導き出すことができる。
【０１０１】
従って、本発明の改変ｒＡＡＶウイルスベクターは、生物体が１種若しくはそれ以上のＡＡＶ供給源に対する中和抗体を有する場合であっても、選択された導入遺伝子を選択された宿主細胞にｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｅｘ  ｖｉｖｏで送達し得る効率的な遺伝子移入ベヒクルを提供する。一態様において、ｒＡＡＶおよび細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで混合し；感染した細胞を慣習的方法論を使用して培養し；そして形質導入された細胞を患者に再注入する。
【０１０２】
従って、本発明の改変ＡＡＶは、生物体が１種若しくはそれ以上のＡＡＶ供給源に対する中和抗体を有する場合であっても、選択された導入遺伝子を選択された宿主細胞にｉｎ
ｖｉｖｏ若しくはｅｘ  ｖｉｖｏで送達し得る効率的な遺伝子移入ベヒクルを提供する。一態様において、ＡＡＶおよび細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで混合し；感染した細胞を慣習的方法論を使用して培養し；そして形質導入された細胞を患者に再注入する。
【０１０３】
これらの組成物は、保護免疫を誘導することを包含する治療的目的上および免疫化のための遺伝子送達にとりわけ良好に適する。さらに、本発明の組成物は所望の遺伝子産物のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの製造にもまた使用しうる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ製造のため、所望の産物（例えばタンパク質）は、該所望の産物をコードする分子を含有するＡＡＶでの宿主細胞のトランスフェクション、および発現を可能にする条件下で細胞培養物を培養することの後に、所望の培養物から得ることができる。発現された産物をその後、所望のとおり精製かつ単離しうる。適するトランスフェクション、細胞培養、精製および単離技術は当業者に既知である。
【０１０４】
［実施例］
本明細書に提供される研究は、キャプシドに対するＴ細胞の活性化への決定的な経路が、ＭＨＣクラスＩ拘束の関数でなく、しかしむしろへパラン硫酸糖タンパク質（若しくはヘパリン）へのキャプシドの結合に依存することを示す。本明細において、ヘパリンを結合しないＡＡＶの工作された若しくは天然のバリアントが、該キャプシドに対しＴ細胞を活性化することがよりありそうでないことが、マウスおよびヒト以外の霊長類の双方で示される。クレードＡ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦからのＡＡＶの全部の現在既知のメンバーはＲｘｘＲ［配列番号２］モチーフが欠けている。さらに、それぞれ肝および心への優れた形質導入プロファイルを示すＡＡＶ８およびＡＡＶ９を包含する、今日まで研究されたクレードのメンバーは、ＡＡＶ２のアビディティーでヘパリンを結合しない［Ｈａｌｂｅｒｔ，Ｃ．Ｌ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５、６６１５−２４（２００１）］。事実、ヘパリン結合ドメイン中を除きＡＡＶ２に事実上同一であるｈｕ．１３のようなクレードＢファミリーの数メンバーは、キャプシドＴ細胞の問題を伴わずにＡＡＶ２に類似のｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子移入のレベルを保持する。
【０１０５】
ヘパリン結合がキャプシドに対するＴ細胞の活性化を指図する機構は不明である。ＨＳＰは、樹状細胞に結合しかつそれらの活性化を促進することが他者により示された。ＨＳＰへのキャプシドの結合が、そのプロセシングおよびＭＨＣクラスＩ提示につながる樹状細胞経路にビリオンを往復輸送する（ｓｈｕｔｔｌｅ）ことが発明者により仮定されている。これが起こる経路は、飲食作用若しくは貪食性取り込みで開始し、次いで一連のタンパク質分解段階、そしてＭＨＣクラスＩ複合体にペプチドが最終的に負荷される。これらの経路に沿ってどこでＨＳＰ結合が交差提示の過程を促進するかは不明である。多様なクレードのヘパリン結合欠損ビリオンが優れた形質導入プロファイルを保持するため、これらの経路がベクター形質導入に依存しないことは興味深い。さらに、ヘパリン結合は導入遺伝子へのＴおよびＢ細胞応答に必要でなく；導入遺伝子産物に対しわれわれが観察する最高のＴ細胞応答は、非ヘパリン結合体ＡＡＶ７および８からである。ＡＡＶはそのキャ
プシドの構造により指図されるＭＨＣクラスＩ経路の興味深い相違を呈する。
【０１０６】
以下の実施例は、ＡＡＶ２キャプシド［配列番号３］中のＲｘｘＲ［配列番号２］ドメインへのＴ細胞エピトープのマッピングを示す。除去されたＲｘｘＲドメイン若しくは人工的に挿入されたＲｘｘＲドメインを有する改変ＡＡＶの例示的構築方法が具体的に説明される。哺乳動物を包含する動物へのこうした構築物の送達方法もまた具体的に説明する。
【０１０７】
表１は本明細を通じて言及されるＡＡＶ単離物および変異体の記述を提供する。単離物、ＡＡＶ２［配列番号３］、ｈｕ．５１［配列番号７］、ｈｕ．１３［配列番号１２］、ＡＡＶ８［配列番号１３］およびＡＡＶ７［配列番号１４］、ならびにＡＡＶ８［配列番号１３］のＡＡＶ８ＲＱＮＲ変異体、ｈｕ．２９［配列番号１５］のｈｕ．２９Ｒ変異体、ならびにＡＡＶ２［配列番号３］のＡＡＶ２ＨＳＰＧ−変異体のキャプシド配列は以前に公表されているが、しかし便宜上配列表にもまた提供する。単離物若しくは変異体の名称、その系統分類クレード、ＡＡＶ２に類似のＲｘｘＲ［配列番号２］モチーフのアミノ酸配列、ヘパリンカラム結合親和性（＋、特異的結合；−、結合なし）およびＲｘｘＲドメインの外側のＡＡＶ２からの距離が提供される。該距離は、ＡＡＶ２に比較した場合のＲｘｘＲの外側の残基の差違の数で示す。クレードＢメンバーについて、アミノ酸の差違をそれらの座標とともに提示する。
【０１０８】
【表２】
2009535339.tif 000003
【実施例１】
【０１０９】
ＡＡＶ投与後のマウスにおけるＴ細胞の活性化
本研究において、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６およびＢａｌｂ／Ｃ）にＡＡＶ２、２／７および２／８の１０１１ゲノム含有粒子（ＧＣ）をＩＭ注入し、そして、キャプシドタンパク質に対するＴ細胞の活性化について酵素結合ＩｍｍｕｎｏＳＰＯＴ（ＥＬＩＳＰＯＴ）により評価した（全ベクターは異なるキャプシドで被包化されたＡＡＶ２に基づく同一ゲノムを含有する）。ＶＰ１キャプシド全体にわたる合わせたペプチド、ならびにマッピングされたドミナントペプチドで脾細胞を刺激した。高レベルのキャプシド特異的Ｔ細胞が、ＡＡＶ２、および多数の系統発生的に関係したＡＡＶバリアントに基づくベクターに対し検出された。しかしながら、ＡＡＶ８［Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．ら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９、１１８５４−９（２００２）］のような他のＡＡＶ
クレードからのベクター［Ｇａｏ，Ｇ．ら  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７８、６３８１−８（２００４）］は、キャプシド特異的Ｔ細胞の活性化につながらなかった。
【０１１０】
Ａ．ＡＡＶベクターの構築
使用したパッケージングプラスミドは、記述された［Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．ら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９、１１８５４−９（２００２）］ところの特定のｃａｐ遺伝子とともにシスでクローン化されたＡＡＶ２  ｒｅｐを発現する。全部の天然の単離物は以前に記述された［Ｇａｏ，Ｇ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７８、６３８１−８（２００４）；Ｇ．Ｇａｏら、（２００２）；Ｇａｏ，Ｇ．ら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００、６０８１−６（２００３）］。高力価のベクター調製物を三重トランスフェクションにより製造し、そしてＣｓＣｌ勾配での３回の沈降により精製した。
【０１１１】
Ｂ．マウス免疫化
雄性Ｃ５７Ｂｌ／６およびＢａｌｂ／ＣはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。動物に、後肢の２注入部位での筋肉内注入により１０１１ＧＣを注入した。マウス免疫化研究は、１）ウシ成長ホルモンからのポリアデニル化シグナル配列を伴う増強ニワトリβ−アクチンプロモーターから駆動される核を標的とするＬａｃＺ導入遺伝子およびＡＡＶベクター、ならびに２）増強ニワトリβ−アクチンプロモーターから駆動されるヒトα−１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）遺伝子双方で実施した。遺伝子移入効率実験を、Ａ１ＡＴベクターを用いて実施した。
【０１１２】
ＩＮＦ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、マウスについて以前に記述されたプロトコル［Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｇ．ら  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３１８、２２４−３０（２００４）；Ｚｈｉ，Ｙ．ら  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３３５、３４−４５（２００５）］を使用して実施した。ＡＡＶ２、７若しくは８タンパク質のＶＰ１由来のペプチドライブラリーを、先行するペプチドを伴う１０アミノ酸オーバーラップをもつ１５−ｍｅｒとして合成し（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ）、そしておよそ１００ｍｇ／ｍｌでＤＭＳＯに溶解した。
【０１１３】
Ｂａｌｂ／ｃマウス実験は、以下のＨ２ｄ拘束性エピトープ、すなわちＶＰＱＹＧＹＬＴＬ、配列番号２２（ＡＡＶ２）ならびにＩＰＱＹＧＹＬＴＬ、配列番号１（ＡＡＶ７およびＡＡＶ８）を用いて行った。ペプチドは全実験で２μｇ／ｍｌの濃度で使用し、また、ＤＭＳＯ濃度は全最終アッセイ混合物中で０．１％（ｖ／ｖ）より下に保った。スポットをＥＬＩＳＰＯＴリーダー（ＡＩＤ）で計数した。ペプチド刺激は別にして、ペプチドなし条件、ならびにＳＥＢおよびＰＭＡ／イオノマイシン対照での非特異的刺激を実施した。スポット数は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでの細胞密度のわずかな変動を説明するために、ＰＭＡ／イオノマイシン値で細胞数について正規化した。
【０１１４】
Ｃ．マウス研究におけるＡＡＶ２キャプシド特異的Ｔ細胞の検出
Ｔ細胞応答を図１に提示する。ＡＡＶ２はキャプシドに対する高Ｔ細胞頻度をもたらしたが、しかしながら、同一用量のＡＡＶ２／７および２／８は、ｉｎ  ｖｉｖｏ形質導入がＡＡＶ２と比較してＡＡＶ２／７および２／８ベクターで最低５ないし１０倍より高かったという事実にもかかわらず、キャプシドに対するＴ細胞活性化の証拠をほとんど生じなかった。Ｔ細胞応答における血清型特異的差違は、マウスの系統（図１ＡおよびＢ）ならびにベクター調製物および用量（データは示されない）に依存しなかった。
【実施例２】
【０１１５】
霊長類研究におけるＡＡＶ２キャプシド特異的Ｔ細胞の検出
類似の研究を、ＨＩＶ抗原を発現するＡＡＶベクターを受領したカニクイザルで実施した。カニクイザルはニュージャージー州オックスフォードのＢａｒｔｏｎ’ｓ  Ｗｅｓｔ
Ｅｎｄ  Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ（ＢＷＥＦ）で処置かつ世話した。
【０１１６】
霊長類研究において、以下のベクターを使用した。ＡＡＶ．ＣＭＶ．ＨＩＶｇｐ１４０、ＡＡＶ．ＣＭＶ．ＨＩＶＲＴ３およびＡＡＶ．ＣＭＶ．ＨＩＶＧＮ２。該ベクターを、以前に記述されたとおりＡＡＶ２、７若しくは８血清型でパッケージングした。例えば、を参照されたい、（例えば図２を参照されたい、各血清型について、ｇｐ１４０、ＲＴおよびｇａｇ−ｎｅｆ融合を発現する３種のベクターを合わせた）。動物（群あたり５）にＡＡＶ２、ＡＡＶ２／７若しくはＡＡＶ２／８をＩＭ注入した。ベクターの各混合物は群あたり５動物に１０１２粒子の用量で注入した（ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／７およびＡＡＶ２／８）。各サルに、動物あたり１ｍｌのＰＢＳに再懸濁したベクターの全混合物を、２５ゲージ針を用いて右大腿四頭筋の２部位に筋肉内注入した。
【０１１７】
血液サンプルは伏在静脈の静脈穿刺を介して採取した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を全血から単離し、そして、合わせたＶＰ１ペプチドを使用して、以前に記述されたとおり［Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｙ．Ｍ．ら  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９、４８７７−８５（２００５）］キャプシド特異的Ｔ細胞についてアッセイした。ＩＮＦ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、サルについて以前に記述されたプロトコル［Ｒｅｙｅｓ−Ｓａｎｄｏｖａｌ，Ａ．ら  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７８、７３９２−９（２００４）］を使用して実施した。
【０１１８】
５匹のＡＡＶ２を注入した動物のうち４匹が、キャプシドに対する非常に高いＴ細胞頻度を示し；ＡＡＶ２／７若しくはＡＡＶ２／８を投与した動物の大部分がキャプシド抗原に応答することに失敗した（すなわちバックグラウンドより２．５倍未満より高い）。興味深いことに、これらの動物におけるＨＩＶ−１導入遺伝子に対するＴ細胞応答は、ＡＡＶ２でよりもＡＡＶ２／７およびＡＡＶ２／８でより高くかつより広範であり、導入遺伝子産物に比較しての抗原プロセシングおよびキャプシドについてのＴ細胞活性化の解離（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ）を示す。
【実施例３】
【０１１９】
ＡＡＶ２キャプシド中のＴ細胞エピトープの同定
Ａ．ハイブリッドはＡＡＶ２のＶＰ３タンパク質に対するＡＡＶのＴ細胞エピトープにマッピングする
ＡＡＶ２／ＡＡＶ８ハイブリッドを、Ｔ細胞の活性化を指図するドメインをマッピングするために生成した。
【０１２０】
使用したＡＡＶ２とＡＡＶ８の間のハイブリッドキャプシドを、オーバーラップ伸長［Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ  ７７、６１−８（１９８９）］を使用するスプライシングにより生成した。一対のハイブリッドについて、ＡＡＶ２とＡＡＶ８の間の接合部をＶＰ２開始部位で工作した。ＡＡＶ２からＡＡＶ８へ若しくはその逆への移行がＶＰ３開始コドンの近位の保存された領域に配置されている（ＶＰ１開始を通り越す６６０ｂｐ）別のハイブリッド対を使用した。これらのハイブリッドを使用して、記述されたとおりＡＡＶを生成した。
【０１２１】
ＡＡＶ２とＡＡＶ８の間のハイブリッドの分析は、該キャプシドにＴ細胞を向ける原因であるドメインがＶＰ３オープンリーディングフレーム内にあることを決定した。多数の重要な機能的ドメインが、ＡＡＶ２中の残基５８５ないし５８８にわたるＲＸＸＲモチーフを特徴とする以前にマッピングされたヘパリン結合ドメインを包含するＶＰ３中に位置している［Ｋｅｒｎ、Ａ．ら  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７、１１０７２−８１（２００３）；Ｏｐｉｅ、Ｓ．Ｒ．、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７、６９９５−７００６（２００３）］。
【０１２２】
Ｔ細胞応答をキャプシドに向けることにおけるヘパリン結合の潜在的役割をさらに研究
するため、われわれは、ＲＸＸＲモチーフを保持する１種（すなわちｈｕ．５１）ならびに保持しない２種（すなわちｈｕ．２９Ｒおよびｈｕ．１３）を包含する、ＡＡＶ２が属するクレードＢファミリーの他メンバーからのベクターを研究した（表１）。ｈｕ．２９ＲはＧ３９６Ｅ変化後に良好な産生のため至適化した。無傷の結合モチーフの存在はキャプシドＴ細胞応答と相関し（図１ＡおよびＢ）；ｈｕ．１３はヘパリン結合ドメイン中以外の２残基のみでＡＡＶ２と異なり、このドメインが重要であることを示唆する。ヘパリン結合欠損クレードＢバリアントの導入遺伝子発現は、筋に向けられた遺伝子移入後のレポーター遺伝子α１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）の発現に関してヘパリン結合バリアントで見られたものと識別不可能であった（表１）。
【０１２３】
これらのハイブリッドにより、該ドメインはＶＰ３のＲＸＸＲモチーフにマッピングされた。天然のおよび工作されたＡＡＶバリアントの評価は、ヘパリン結合、ヒト樹状細胞への取り込み、およびキャプシドＴ細胞の活性化の間の直接の相関を示した。キャプシドＴ細胞応答を指図することにおけるＲＸＸＲモチーフの役割の決定的な確認が、２種の工作実験で提供された。
【０１２４】
Ｂ．Ｔ細胞活性化におけるＲＸＸＲモチーフの役割の確認
ＲＧＮＲを、１５種のクレードＢのヘパリンに結合しないＡＡＶ単離物の分析からのコンセンサス配列であるＳＧＮＴに転化することにより、ヘパリン結合部位を除去した（表１）。ＡＡＶ２ＨＳＰＧ−は、Ｒ５８５Ｓ、Ｒ５８８Ｔ突然変異誘発、配列番号３によりＡＡＶ２パッケージングプラスミドバックボーンで生成した（Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ  ＩＩ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。生じるベクターはキャプシドに対しＴ細胞を活性化しなかった（図１ＡおよびＢ）。
【０１２５】
ＡＡＶ２／８中の対応する残基を、ヘパリンへの結合を与えるはずであるモチーフに転化した（すなわちＱＱＮＴからＲＱＮＲへ［表１］）。ＡＶ８ＲＱＮＲはＱ５８８Ｒ、Ｔ５９１Ｒ突然変異誘発後に部位特異的に工作した。再構築されたヘパリン結合部位をもつＡＡＶ２／８バリアントは、高レベルのキャプシド反応性Ｔ細胞を活性化した（図１ＡおよびＢ）。
【０１２６】
ＡＡＶ  Ｔ細胞アッセイのため、各血清型のペプチドライブラリーを、プール２ＡがＡＡＶ２  ＶＰ１の最初の５０ペプチドを含有し、プール２Ｂがペプチド５１〜１００を含有し、そしてプール２Ｃがペプチド１０１〜１４５を含有するような３プールに分割した。ドミナントエピトープに対応するペプチドをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールズバッド）若しくはＭｉｍｏｔｏｐｅｓから得、そしてＤＭＳＯに可溶化した（４ｍｇ／ｍｌ）。ドミナントＨ２ｂ拘束性エピトープＴＳＮＹＮＫＳＶＮ（ＡＡＶ２）、配列番号２３、ＮＳＬＶＮＰＧＶＡ、配列番号２４（ＡＡＶ７）、ＮＳＬＡＮＰＧＩＡ、配列番号２５（ＡＡＶ８）をＣ５７Ｂｌ／６マウスで使用した。
【０１２７】
表２に、最低３種のベクター調製物からの平均収量を標準偏差とともに示す。Ｃ５７Ｂｌ／６（ｎ＝５）マウスでの遺伝子移入効率を、筋肉内注入および門脈内注入（肝）２８日後の、それぞれのキャプシド単離物での遺伝子送達後のＡ１ＡＴ血清濃度の平均および標準偏差により表す。
【０１２８】
【表３】
2009535339.tif 000004
【０１２９】
上述された研究は、ＲｘｘＲヘパリン結合部位の存在とキャプシド特異的Ｔ細胞の活性化の間の直接の相関の証拠を提供する。これらの天然のおよび工作されたバリアントの１サブセットを、ヘパリンへの結合の生化学的および細胞の証拠についてさらに評価した。ベクターの精製した調製物にヘパリン結合カラムを通過させ、そして通過物（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）をベクターゲノムについて分析した。ＲＸＸＲ含有バリアント−ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／ｈｕ．５１およびＡＡＶ２／８ＲＱＮＲ−の事実上完全な結合が観察された一方、かなりの量のベクターが、ＲＸＸＲモチーフを欠くベクター−ＡＡＶ２／ｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶ２／ｈｕ．１３、ＡＡＶ２ＨＳＰＧ−およびＡＡＶ２／８の通過物中で見出された（表２）。
【０１３０】
ベクターは、４℃でのインキュベーション、および洗浄した細胞のベクターゲノムの保持についての分析により、ＨｅＬａおよびＣＨＯ細胞への結合についてもまた評価した。ＨｅｌａおよびＣＨＯ細胞の付着培養物をＡＴＣＣに従って維持し、そして、細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とのインキュベーション後に細胞を非酵素的に遊離した。図３はＡＡＶ２で観察されたものに関する結合を示す。ＡＡＶ２／８、および除去されたヘパリン結合部位を伴うＡＡＶ２バリアント（ＡＡＶ２ＨＳＰＧ−）の結合は、ヘパリンの存在下でのＡＡＶ２の結合がそうであるように、双方の細胞株について実質的に低下される。ＡＡＶ２／８中のＲＸＸＲモチーフの再構築は、ＡＡＶ２で見られるものに対し過剰のレベルまでの細胞結合を与える。
【実施例４】
【０１３１】
樹状細胞によるヘパリン媒介性の取り込みの研究
出現しつつある仮説は、樹状細胞によるベクターのＨＳＰ媒介性の取り込みが、キャプシドに対するＴ細胞の活性化における律速段階であることである。これを、ヒト単球由来樹状細胞の初代培養物を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで研究した。
【０１３２】
ヒト初代樹状細胞をＣＦＡＲ、ペンシルバニア大学により提供されたＰＢＭＣから培養した。簡潔には、プラスチック付着性単球をＧＭ−ＣＳＦ（Ｂｅｒｌｅｘ）およびＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ）の存在下で７日間培養した。未熟樹状細胞を、以下のマーカーすなわちＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１４およびＤＣ−ＳＩＧＮ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してフェノタイピングした。ウイルス結合に先立ち、２０単位のヘパリン塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）若しくは等容量のＰＢＳの存在下で１０１０ＧＣを氷上で３０分インキュベーションした。細胞（１０６）をベクタ
ーと混合し、そして揺動プラットフォーム上４℃でインキュベートした。３時間後に細胞を遠心分離により回収し、そして無血清培地で３回洗浄した。細胞ペレットを４００ｍＭ
ＮａＣｌ溶液に懸濁し、３回凍結−融解し、そして上清をＴａｑｍａｎ  ＰＣＲによりＡＡＶゲノムの存在についてアッセイした。
【０１３３】
ＡＡＶ２をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８タンパク質標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合させた。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７微小スケールタンパク質標識キットを使用して、抗へパラン硫酸プロテオグリカンモノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４（生化学、日本）を標識した。細胞をヘパリンの存在若しくは非存在下にウイルスおよび抗体と４℃で１時間インキュベートし、そしてその後ＰＢＳ／２．５％ＦＢＳ／０．１％ＮａＮ３で３回洗浄した。細胞を４％ＰＦＡ／ＰＢＳ溶液中で固定し、そしてスライドにマウントする前に等容量のＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と混合した。落射蛍光のための水銀灯、ｚ軸スライスのためのＡｐｏｔｏｍｅ装置、および青色（ＤＡＰＩ；フィルターセット＃４９）、緑色（４８８；フィルターセット＃１０）若しくは遠赤外（６４７；フィルターセット＃５０）フィルターキューブを正しい位置に装備した倒立型Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍで顕微鏡検査を実施した。ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ（バージョン４．３）ソフトウェアにより駆動される冷却ＣＣＤ  ＡｘｉｏＣａｍ  ＨＲｍカメラで画像を取得した。全顕微鏡部品（顕微鏡、アーク灯、Ａｐｏｔｏｍｅ、フィルターキューブ、カメラ、ソフトウェア）はＣａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇから得た。
【０１３４】
結合研究は該細胞株で観察されたものに同一の結果を示した（図３）。全ＲＸＸＲ含有ベクターが樹状細胞を結合した一方、このドメインを伴わないものは同様に結合しなかった。
【０１３５】
樹状細胞へのＡＡＶの結合を、ＨＳＰに対する抗体での間接的免疫蛍光と一緒に蛍光標識したＡＡＶ２を使用する顕微鏡検査により直接可視化した。
【０１３６】
ＡＡＶ２は、ＨＳＰと共局在化した別個の中心の細胞の表面に結合した。ＡＡＶ２の検出可能な結合は、過剰のヘパリンの存在下で観察されなかった。
【実施例５】
【０１３７】
異なるキャプシドを有する多様なＡＡＶのＴ細胞活性化に対する影響を評価するために免疫化研究を実施した。該研究は、位置５３１のリシン残基にヘパリン結合ドメインを有することが既知の天然のＡＡＶ６キャプシドを、部位特異的改変を導入したキャプシドを有する３種の改変ＡＡＶと比較した。ＡＡＶ２／６．２（Ｋ５３１以外の１位置で改変した）、ＡＡＶ２／６．１（グルタミン酸を含有する（すなわち非保存的アミノ酸変化）ように位置５３１でＡＡＶ６キャプシドを改変させた）、ならびにＡＡＶ６．２およびＡＡＶ６．１キャプシドの改変の双方を伴うＡＡＶ６キャプシドを有するＡＡＶ２／６．１．２と呼称されるこれらのＡＡＶを利用した。これらのベクターの配列および生成は国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／１３３７５号に記述されている。ＡＡＶ１は陰性対照としてはたらき、また、ＡＡＶ２が陽性対照としてはたらいた。
【０１３８】
Ｂａｌｂ／ｃマウス（雄性）を、１×１０１１ＧＣのＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／６．１、ＡＡＶ２／６．２、ＡＡＶ２／６．１．２、ＡＡＶ２／１若しくはＡＡＶ２ベクターで筋肉内に免疫した。１３日後に群あたり３マウスから脾細胞を収集しかつ合わせた。等量の脾細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでＢａｌｂ／ｃ  ＡＡＶエピトープＩＰＱＹＧＹＬＴＬ［配列番号１］でｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激した。図４を参照されたい。
【０１３９】
これらの結果は、未改変のＡＡＶ６キャプシドを含有するウイルスベクターが、ＡＡＶ
２キャプシドにより誘導されるものに匹敵するＴ細胞のレベルを誘導したことを示す。対照的に、除去されたヘパリン結合ドメインを有する改変ＡＡＶ６ベクター（ＡＡＶ２／６．１およびＡＡＶ２／６．１．２）は、陰性対照（ＡＡＶ１）と事実上識別不可能であるＴ細胞応答を有した。
【０１４０】
これは、ＡＡＶキャプシドへのヘパリン結合を媒介する原因であるアミノ酸残基を非保存的アミノ酸残基に変更することが、ヘパリン結合を除去するのみならず、しかしまたＴ細胞活性化も有意に低下させることを示す。
【実施例６】
【０１４１】
ヘパリン媒介性のＡＡＶキャプシド免疫原性に対するＡＡＶ−Ｃａｐメモリー（既存の免疫）の影響
実験では、それぞれ、ナイーブな若しくはＡＡＶ免疫前被験体を模倣する無関係の抗原（ＳＡＲＳのｎスパイク）若しくはＡＡＶ８  ＶＰ１キャプシドタンパク質を発現するアデノウイルスベクターいずれかでマウスを免疫した。免疫するキャプシドベクターは、免疫化により誘導される中和抗体応答を克服するためにＡＡＶ投与されるベクターのものと異なる血清型のものである。抗体の存在下でのＡＡＶ投与は、キャプシドを中和しかつ細胞性免疫応答の読出しを混乱させることができる。Ｂａｌｂ／ｃマウスで、それがＡＡＶ２とＡＡＶ８の間で機能的に交差反応する保存されたＭＨＣＩエピトープを有することが、以前に示されている［Ｓａｂａｔｉｎｏ，Ｄ．Ｅ．ら  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １２、１０２３−３３（２００５）およびわれわれの研究室における観察結果、現在Ｗａｎｇ，Ｌ．ら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ（２００７）として公表されている］。これは、一方の血清型および他方の投与ベクターでのこれらのマウスでの免疫化を可能にする。このアプローチは、メモリーＴ細胞応答が、別個のＡＡＶ血清型で交差反応性でない可能な混乱させる中和抗体の非存在下で研究されることを可能にする。
【０１４２】
免疫化数か月後に、これらのマウスにＡＡＶ２若しくはＡＡＶ２ＨＳＰＧ−（天然のＡＡＶ２ヘパリン硫酸結合ドメインを除去させている）いずれかを多様な投薬量で投与した。ＡＡＶ投与７日後に、ＡＡＶ  Ｃａｐ特異的Ｔ細胞の数を、フローサイトメトリーにより、ドミナントなＡＡＶ  Ｃａｐエピトープに特異的な四量体により測定する。ＡＡＶ２ＨＳＰＧ−変異体に対する最小限のみのＴ細胞応答を除いて、ＡＡＶ２投与後のＡＡＶキャプシドＴ細胞の期待された上昇が観察された。免疫前状態で、ＡＡＶ２投与は、ナイーブな状態で該応答に対し大きさが明確により大きかったキャプシドＴ細胞の用量応答性の上昇を示した。類似のおよびより高用量でＡＡＶ２ＨＳＰＧ−を投与された動物は、キャプシドに向けられたＴ細胞の上昇されたレベルを誘導することに失敗した。
【実施例７】
【０１４３】
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスでの尾静脈注入後のＡＡＶゲノム体内分布に対するヘパリンの影響
ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ＨＳＰＧ−、ＡＡＶ８若しくはＡＡＶ８ＲＱＮＲを１×１０１１ＧＣの用量で静脈内注入した。組織を収集し、そして定量的ＴａｑｍａｎＴＭ  ＰＣＲによりベクターゲノムの存在について分析した。組織分布は全ベクターについて異なり、そして、脾から回収されたベクターゲノムの存在についてを除き、ヘパリンに結合しないベクター（ＡＡＶ２ＨＳＰＧ−およびＡＡＶ８）とヘパリンに結合するもの（ＡＡＶ２およびＡＡＶ８ＲＱＮＲ）の間で明瞭な相関は観察されなかった。
【０１４４】
ヘパリン結合ベクターで送達されたゲノムは、ヘパリンに結合するベクターを受領した全動物について早期の第３日の時間点で１０倍より多い量で回収された（その特定の動物の全組織でのより低いコピー数により、部分的に失敗した注入を受領したことがありそうであるＡＡＶ２を受領した１動物を除き、そのヘパリンに結合しないホモログに比較して）。注入後第３０日の時間点で、ＡＡＶ２ＨＳＰＧ−に対するＡＡＶ２の脾での差違はよ
り少なく明瞭である一方、ＡＡＶ８ＲＱＮＲに対しＡＡＶ８については、全体的な絶対量は減少したが、しかし、ＡＡＶ８ＲＱＮＲのレベルに対しヘパリンに結合しないＡＡＶ８について２対数より多かった。
【０１４５】
脾はＴ細胞の活性化に関連する二次リンパ器官である。ＡＡＶ２でのヘパリン結合がベクターゲノムを脾に向け直すという知見は、そのより高い免疫原性の指標である。従って、ＡＡＶ中のヘパリン結合ドメインの除去はその免疫原性を低下させる。
【実施例８】
【０１４６】
機能性を維持しながらのクレードＡのＡＡＶに基づくベクターの免疫原性に対する改変
ＡＡＶ１の低下された免疫原性は、ＡＡＶ６のヘパリン結合残基（配列番号４のＫ５３１）と相関すると思われたＡＡＶ６と比較して以前に観察された。ＡＡＶ１の免疫原性が低下される場合であっても、それはｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔ細胞活性化アッセイにより検出不可能でない。
【０１４７】
構造機能分析において、ＡＡＶ１およびＡＡＶ６双方に存在する付加的な１残基が、この残余の免疫原性の原因でありそうであることが見出された。この正に荷電したＲ５７６は、ヘパリン結合によりＡＡＶキャプシドの免疫原性に関与するとして以前に同定された全残基（ＡＡＶ６、配列番号４のＫ５３１、ＡＡＶ２、配列番号３の５８５ＲＧＮＲ）と類似のポケット中に厳密に配置される。クレードＡのメンバー（ＡＡＶ１およびＡＡＶ６を含んでなる）のみがこのＲ５７６残基を保有する一方、他の血清型はグルタミン酸若しくはグルタミンいずれかを保有する（正に荷電したからそれぞれ負に若しくは荷電していないへの極性変化）。
【０１４８】
ＡＡＶ６．１２（除去）ベクターを、以下の変化、すなわち配列番号４のＲ５７６Ｑ若しくはＲ５７６Ｅいずれかを伴う部位特異的突然変異誘発により工作した。これらの変化を伴うベクターは、ＡＡＶ６と比較した場合に約５〜１０倍より良好、およびＡＡＶ１若しくはＡＡＶ６．１．２と等しく良好に産生する。マウスでの骨格筋へのｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子移入は、ＡＡＶ６．１．２Ｒ５７６ＱウイルスについてＣＢ．ｈＡ１ＡＴをコードするＡＡＶの筋肉内投与後に血清中のｈＡ１ＡＴにより測定されるとおり、高レベルで維持される。構造のモデル化および外挿は、これらＲ５７６ＱおよびＲ５７６Ｅ変化が、機能性を維持しつつクレードＡのＡＡＶに基づくベクターの免疫原性に影響することを示す。
【０１４９】
本明細に引用される全刊行物は引用することにより本明細書に組込まれる。本発明はとりわけ好ましい態様に関して記述した一方、本発明の技術思想から離れることなく改変をなし得ることが認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１Ａ】Ｃ５７Ｂｌ／６マウスでのＡＡＶの筋肉内注入７日後に収集した脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイでのＩＦＮ−γスポット形成単位（ＳＦＵ）の数を示す棒グラフである。数種のクレードＢの天然に存在するＡＡＶ単離物（ＡＡＶ２、ｈｕ．５１、ｈｕ．２９Ｒ、ｈｕ．１３）および変異体（ＡＡＶ２ＨＳＰＧ−）をＴ細胞応答について評価した。加えて、マウスにＡＡＶ  ２／７（ＡＡＶ７として示される）、ＡＡＶ２／８（ＡＡＶ８として示される）およびＡＡＶ２／８変異体ＲＱＮＲ（ＡＡＶ８ＲＺＮＲとして示される）を注入して、Ｔ細胞活性化をモニターした。全ＡＡＶは図１Ｂのｘ軸に沿って同定される。細胞を、ＡＡＶ２若しくはＡＡＶ８キャプシドに全体に一緒にわたる３種のペプチドプール（Ａ、ＢおよびＣと同定される）、ＡＡＶ２若しくはＡＡＶ８のＣ５７Ｂｌ／６ドミナントエピト―プ（黒棒）またはペプチドなし陰性対照（白棒）で刺激した。
【図１Ｂ】Ｂａｌｂ／ＣマウスでのＡＡＶの筋肉内注入１４日後に収集した脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイでのＩＦＮ−γスポット形成単位（ＳＦＵ）の数を示す棒グラフである。ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／ｈｕ．５１およびＡＡＶ２ＨＳＰＧ−変異体ＩＭ注入群を、ペプチドなし、包括的ＡＡＶ２ペプチドプール（Ａ、Ｂ、Ｃ）およびＡＡＶ２ドミナントエピトープで刺激した。ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ８ＲＱＮＲ注入群からの細胞を、ペプチドの非存在下に、合わせたＡＡＶ２／８ペプチド若しくはそのドミナントエピトープペプチドとインキュベートした。各場合で、スポットの数（ｙ軸）は、細胞を刺激するのに使用した異なるペプチド（ドミナントおよびプール）について、注入されたベクター（ｘ軸）の関数として提示する。刺激ペプチドの符号は図１Ａについてのものと同一である。
【図２Ａ−２Ｃ】個別のサルでの異なる血清型のＡＡＶベクターでの筋肉内ワクチン接種後のカニクイザルにおけるＡＡＶキャプシドに対するＴ細胞応答の時間経過を示す棒グラフである。サルは、ＡＡＶ．ＣＭＶ．ＨＩＶｇｐ１４０、ＡＡＶ．ＣＭＶ．ＨＩＶＧＮ２およびＡＡＶ．ＣＭＶ．ＨＩＶ  ＲＴ３のそれぞれ１０１２ＧＣの混合物のＩＭ注入により免疫した。免疫化後第２、４、８、１４、２４および３２週にＰＢＭＣを単離し、そして特定のＡＡＶ血清型に対応するペプチドプールでｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激しかつＩＮＦ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して分析した。合計１５動物にベクター血清型あたり５動物で投与した（ＡＡＶ２：図２Ａ、ＡＡＶ２／７：図２Ｂ、ＡＡＶ２／８：図２Ｃ）。ＥＬＩＳＰＯＴにより測定されたところのスポットの頻度を、５桁数により同定される個々の動物につき、週（例えば８週）で示される時間の関数として提示する。各アッセイについて、対応するキャプシドの全ＶＰ１領域にわたる３種のペプチドプールを使用する。（ｎ／ａ：アッセイせず）。符号は、グラフの多様に影付きの棒により表される刺激ペプチドを同定する。
【図３】ＡＡＶ結合に対するヘパラン硫酸プロテオグリカンの親和性の影響を示す。ヒト単球由来樹状細胞（ＤＣ、黒棒）、ＨｅＬａ（白棒）およびＣＨＯ（影付き棒）細胞へのＡＡＶの相対結合をＡＡＶ２と比較する。細胞を、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ＨＳＰＧ−、ヘパリンの存在下のＡＡＶ２、ＡＡＶ８およびＡＡＶ８ＲＱＮＲと４℃で３時間インキュベートした。細胞ペレットを収集し、培地で３回洗浄し、そして４００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液に再懸濁した。ＤＮアーゼ抵抗性ゲノムコピーを定量的ＰＣＲにより測定し、そしてＡＡＶ２結合したウイルス条件からの値で正規化した。結合データは増大倍数（ｆｏｌｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ）としてＡＡＶ２に関して各ベクターについて提示し；正の数はＡＡＶ２より大きい結合を表し、そして負の数はＡＡＶ２より小さい結合を表す。
【図４】Ｔ細胞活性化に関する多様なＡＡＶでの免疫化の結果を示す棒グラフである。Ｂａｌｂ／ｃマウスを１×１０１１ＧＣのＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／６．１、ＡＡＶ２／６．２、ＡＡＶ２／６．１．２、ＡＡＶ２／１およびＡＡＶ２ベクターで免疫した。１３日後に脾細胞を群あたり３マウスから収集しかつ合わせた。等量の脾細胞をＥＬＩＳＰＯＴアッセイでＢａｌｂ／ｃ  ＡＡＶエピトープＩＰＱＹＧＹＬＴＬ［配列番号１］でｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激した。
【図１Ａ−１Ｂ】
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【図２Ａ−２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009535339.tif 000010
2009535339.tif 000011