(57)【要約】  本発明は、DNAポリメラーゼを含む反応混合物中にDNAリガーゼのタンパク質を含めることにより、DNAポリメラーゼ反応を増強する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
DNAポリメラーゼを含む反応混合物中にDNAリガーゼのタンパク質を含めることにより、DNAポリメラーゼ反応を増強する方法。
【請求項２】
前記DNAリガーゼタンパク質が、野生型配列または合成変異体のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記DNAリガーゼタンパク質が、NAD依存性DNAリガーゼのタンパク質である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記DNAリガーゼタンパク質が、大腸菌由来のDNAリガーゼ（大腸菌DNAリガーゼ）のタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記DNAリガーゼタンパク質が、サーマス・アクアチクス由来のDNAリガーゼ（Taq DNAリガーゼ）のタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記DNAリガーゼタンパク質が、サーマス・サーモフィラス由来のDNAリガーゼ（Tth DNAリガーゼ）のタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記DNAリガーゼタンパク質が、サーマス・フラバス由来のDNAリガーゼ（Tfl DNAリガーゼ）のタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記DNAリガーゼタンパク質が、サーマス・ルバー由来のDNAリガーゼのタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記DNAリガーゼタンパク質が、サーマス・フィルホルミス由来のDNAリガーゼのタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記DNAリガーゼタンパク質が、サーマス・ブロッキアナス由来のDNAリガーゼのタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記DNAリガーゼタンパク質が、サーマス・スコトダクタス由来のDNAリガーゼのタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記DNAポリメラーゼが、大腸菌DNAポリメラーゼIのようなDNAポリメラーゼのファミリー由来のDNAポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記DNAポリメラーゼが大腸菌DNAポリメラーゼIである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記DNAポリメラーゼが大腸菌DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記DNAポリメラーゼが、サーマス・アクアチクス由来のDNAポリメラーゼI（Taq DNAポリメラーゼ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記DNAポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼのStoffelフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記DNAポリメラーゼが、Klentaq DNAポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記DNAポリメラーゼが、サーマス・サーモフィラス由来のDNAポリメラーゼI（Tth DNAポリメラーゼ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記DNAポリメラーゼが、サーマス・フラバス由来のDNAポリメラーゼI（Tfl DNAポリメラーゼ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記DNAポリメラーゼが、サーマス・ルバー由来のDNAポリメラーゼIである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記DNAポリメラーゼが、サーマス・フィルホルミス由来のDNAポリメラーゼIである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記DNAポリメラーゼが、サーマス・ブロッキアナス由来のDNAポリメラーゼIである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記DNAポリメラーゼが、サーマス・スコトダクタス由来のDNAポリメラーゼIである、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記反応混合物が、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠く少なくとも1つのDNAポリメラーゼ及び3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を示す少なくとも1つのDNAポリメラーゼを含む、請求項１に記載の、反応混合物中にDNAリガーゼのタンパク質を含めることにより、DNAポリメラーゼ反応を増強する方法。
【請求項２５】
前記DNAリガーゼタンパク質が、請求項２から１１のいずれか一項に規定されるものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記DNAポリメラーゼが、大腸菌DNAポリメラーゼIのようなDNAポリメラーゼのファミリー由来の、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠くDNAポリメラーゼである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠くDNAポリメラーゼが、請求項１５から２３のいずれか一項に規定されるものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を示すDNAポリメラーゼが、大腸菌DNAポリメラーゼI、大腸菌DNAポリメラーゼIのKlenow（exo+）フラグメント、T4 DNAポリメラーゼ、ピロコッカス・フリオサス（Pfu）DNAポリメラーゼ、サーモトガ・マリチマ（Tma）DNAポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Tli）DNAポリメラーゼ（VentR（登録商標）ともいう）、ピロコッカスGB-D DNAポリメラーゼ、ピロコッカス・コダカラエンシス（KOD）DNAポリメラーゼ、Pfx、Pwo及びDeepVentR（登録商標）ポリメラーゼからなる群から選択され得る、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記DNAポリメラーゼ反応がDNA配列決定に使用される、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記DNAポリメラーゼ反応がニックトランスレーションの反応である、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記DNAポリメラーゼ反応がプライマー伸長反応である、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記DNAポリメラーゼ反応が逆転写（RT）の反応である、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記DNAポリメラーゼ反応がPCRである、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記DNAポリメラーゼ反応がRT-PCRである、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法によってDNAポリメラーゼ反応を実施するための、酵素及びタンパク質の組成物であって、少なくとも1つのDNAリガーゼタンパク質及び少なくとも1つの細菌性DNAポリメラーゼを含み、1つまたは複数の追加の成分を含み得る、組成物。
【請求項３６】
前記細菌性DNAリガーゼタンパク質が、請求項２から１１のいずれか一項に規定されるものである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記DNAポリメラーゼが、請求項１２から２３のいずれか一項に規定されるものである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
前記DNAリガーゼタンパク質が大腸菌DNAリガーゼであり、前記DNAポリメラーゼが大腸菌DNAポリメラーゼIである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３９】
前記DNAリガーゼタンパク質がTaq DNAリガーゼであり、前記DNAポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ及びTfl DNAポリメラーゼからなる群から選択され得る、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４０】
前記細菌性DNAリガーゼタンパク質がTth DNAリガーゼであり、前記DNAポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ及びTfl DNAポリメラーゼからなる群から選択され得る、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４１】
前記DNAリガーゼタンパク質がTfl DNAリガーゼであり、前記DNAポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ及びTfl DNAポリメラーゼからなる群から選択され得る、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４２】
前記組成物の追加の成分が、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を示すDNAポリメラーゼである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４３】
3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を示す前記DNAポリメラーゼが、大腸菌DNAポリメラーゼI、大腸菌DNAポリメラーゼIのKlenow（exo+）フラグメント、T4 DNAポリメラーゼ、ピロコッカス・フリオサス（Pfu）DNAポリメラーゼ、サーモトガ・マリチマ（Tma）DNAポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Tli）DNAポリメラーゼ（VentR（登録商標）ともいう）、ピロコッカスGB-D DNAポリメラーゼ、ピロコッカス・コダカラエンシス（KOD）DNAポリメラーゼ、Pfx、Pwo及びDeepVentR（登録商標）ポリメラーゼからなる群から選択され得る、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記組成物の追加の成分が、無機ピロホスファターゼである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４５】
前記無機ピロホスファターゼが、大腸菌ピロホスファターゼ、Tthピロホスファターゼ、Tflピロホスファターゼ及びTaqピロホスファターゼからなる群から選択され得る、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法によってDNAポリメラーゼ反応を実施するためのキットであって、
a）DNAポリメラーゼ反応のための成分；及び
b）請求項２から１１のいずれか一項に規定されるDNAリガーゼタンパク質または請求項３５から４５のいずれか一項に記載の組成物を含む容器
を別々の容器中に含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNAの酵素的な合成及び増幅の方法の改善に関する。本発明は、酵素的DNAポリメラーゼ反応を増強するための方法、キット、タンパク質及びタンパク質の組成物を提供する。
【０００２】
本発明の開示する方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を改善するために特に有用であり、長距離PCR及び/または低コピーDNAテンプレートPCR増幅の収量を増強するために特に有用である。本発明は、プライマー伸長、逆転写及びDNA配列決定などの、DNAポリメラーゼを使用した他の実験室手法を改善するためにも有用であり得る。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、酵素の新規な配合により、核酸重合反応の効率を増大させること、より具体的には、長いDNAテンプレート及び低コピーDNAテンプレートのPCRによる増幅を触媒する効率を増大させることを目的とする。
【０００４】
DNAを形成するための、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（dNTP）のテンプレート依存的重合反応が、プライマー伸長技術、DNA配列決定及びDNA増幅などの、種々のin vitroのDNA合成用途において使用される。重合反応によってDNAを操作することは、バイオテクノロジー関連研究の基本的な構成要素である。
【０００５】
DNA重合反応を触媒する酵素であるDNAポリメラーゼは周知であり、広範な実験室手法、特に分子生物学において有用である。熱安定性酵素は比較的高い温度で使用できるので、熱安定性DNAポリメラーゼは多数の技術で有益である。熱安定性DNAポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）において特に有用である。
【０００６】
PCRは、バイオテクノロジー産業の発展並びに基礎的な生物学的研究にとって非常に重要である。今日、PCR反応は、DNAを増幅するために、加熱及び冷却の工程を交互に数回実行するマルチサイクルのプロセスで、耐熱性DNAポリメラーゼ酵素（Taq DNAポリメラーゼなど）を使用して実施される（米国特許第4,683,202号及び米国特許第4,683,195号）。まず、反応混合物を、二本鎖の標的DNAを2つの一本鎖に変性させるのに充分な温度まで加熱する。次いで、反応混合物の温度を低下させて、特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、そのそれぞれの相補的な一本鎖標的DNAにアニールさせる。アニーリング工程の後、温度を使用されるDNAポリメラーゼに最適な温度まで上昇させ、アニールしたオリゴヌクレオチドプライマーの3'末端での相補的ヌクレオチドの取り込みを可能にし、それによって二本鎖標的DNAを再形成する。熱に安定なDNAポリメラーゼを使用することによって、変性、アニーリング及び伸長のサイクルが、各熱変性後にポリメラーゼを添加することなく、所望の産物を生成するのに必要な回数反復され得る。20または30回の複製サイクルにより、標的DNA配列の百万倍までの増幅を得ることができる（「Current Protocols in Molecular Biology」、F. M. Ausubelら（編）、John Wiley and Sons, Inc.、1998）。
【０００７】
「サーマス（Thermus）」属の細菌から得られたDNAポリメラーゼ（例えば、サーマス・アクアチクス（Thermus aquaticus）（Taq DNAポリメラーゼ）［米国特許第4,889,818号及び米国特許第5,079,352号］、サーマス・フラバス（Thermus flavus）（Tfl DNAポリメラーゼ）［Akhmetzjanov, A. A.及びVakhitov, V. A.（1992）Nucleic Acids Research 20：5839、GenBankアクセッション番号X66105］、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）（Tth DNAポリメラーゼ）［米国特許第5,618,711号］など）は、おそらくDNAのPCR増幅及び関連のDNAプライマー伸長技術において最もよく使用されている。これらの酵素は、大腸菌DNAポリメラーゼI［Joyce, C.M.及びSteitz, T.A.（1994）Annu. Rew. Biochem.、63、777-822；Steitz, T.A.（1999）J. Biol. Chem.、274、17395-17398］などのDNAポリメラーゼのファミリーの代表である。
【０００８】
増幅またはプライマー伸長工程を有する技術を使用することにより、使用されるポリメラーゼの効率及び感度に関心が払われている。DNAポリメラーゼによって触媒されるDNAポリメラーゼ反応の効率を増強するために、いくつかのアプローチが開発された。
【０００９】
PCR及び配列決定反応を改善するための1つの方法は、添加剤の使用を介するものである。例えば、テトラメチルアンモニウム（TMA）クロライド（Chevet, E.ら、（1995）Nucleic Acids Res.、23、3343-3344；Hung, T.ら、（1990）Nucleic Acids Res.、18、4953；Warner, CK.及びDawson, J.E.（1996）、Persing, D.H.（編）、PCR Protocols for Emerging Infectious Diseases. ASM Press、Washington DC.）、ジメチルスルホキシド（Winship, P.R.（1989）Nucleic Acids Res.、17、1266；Bookstein, R.ら、（1990）Nucleic Acids Res.、18、1666；Sidhu, M. K.ら、（1996）Biotechniques、21、44-47.）、アミド類（Chakrabarti, R.ら、（2001）Nucleic Acids Res.、29、2377-2381）及びベタイン（Weissensteiner, T.ら、（1996）Biotechniques、21、1102-1108；Henke, W.ら、（1997）Nucleic Acids Res.、19、3957；米国特許第6,270,962号）などのいくつかの試薬は、PCRの効率及び特異性を改善することが可能である。これらの試薬はしばしば、PCR用の市販の最適化及びエンハンサーキットの構成要素として使用される。
【００１０】
PCRを改善するための別の方法は、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠く熱安定性DNAポリメラーゼ及び3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を示す熱安定性DNAポリメラーゼを含む、ポリメラーゼの組合せの使用を介したものである［米国特許第5,436,149号及び米国特許第6,410,277号］。例えば、多数のポリメラーゼの組合せが、Barnes（Proc. Nat. Acad. Sci. USA、91：2216-2220（1994））によって試験された。
【００１１】
特定のタンパク質もまた、DNAポリメラーゼ反応を増強するために使用され得る。これらのアクセサリータンパク質は、DNAポリメラーゼと相互作用でき、ポリメラーゼ活性及び/またはポリメラーゼの処理能力を改善でき、また、ポリメラーゼ反応の増強において非常に重要であり得る。例えば、T7 DNAポリメラーゼと組み合わせた細菌性チオレドキシンは、このポリメラーゼの処理能力を増大させる。ウイルス遺伝子5の産物であるT7 DNAポリメラーゼ自体は、低い処理能力を有する。T7 DNAポリメラーゼは、15nt未満を取り込んだ後に、プライマー-テンプレートから解離する（Tabor, S.、Huber, H. E.及びRichardson, C. C.（1987）J. Biol. Chem. 262、16212-16223）。大腸菌（Escherichia coli）の感染に際して、T7は宿主タンパク質チオレドキシンに付属して、その作用因子として機能する（Modrich, P.及びRichardson, C. C.（1975）J. Biol. Chem. 250、5515-5522）。T7 DNAポリメラーゼ及びチオレドキシンは、5nMの見かけの解離定数で、一対一の複合体で結合する（Huber, H. E.、Russel, M.、Model, P.及びRichardson, C. C.（1986）J. Biol. Chem. 261、15006-15012）。チオレドキシンのT7 DNAポリメラーゼへの結合は、このポリメラーゼのプライマー-テンプレートへの特異的な親和性を80倍増大させる（Huber, H. E.、Tabor, S.及びRichardson, C. C.（1987）J. Biol. Chem. 262、16224-16232）。プライマー-テンプレートに対する親和性の増大の結果は、T7 DNAポリメラーゼが、解離することなく数千ヌクレオチド、一本鎖DNA（ssDNA）上のプライマーを伸長させる能力である（Tabor, S.、Huber, H. E.及びRichardson, C. C.（1987）J. Biol. Chem. 262、16212-16223）。
【００１２】
アクセサリータンパク質によりDNAポリメラーゼ反応を増強する別の例は、Pfu DNAポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び処理能力を改善するために、古細菌ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）（Pfu）から単離された細胞抽出物及びタンパク質複合体を使用することである［米国特許第6,444,428号］。
【特許文献１】米国特許第4,683,202号
【特許文献２】米国特許第4,683,195号
【特許文献３】米国特許第4,889,818号
【特許文献４】米国特許第5,079,352号
【特許文献５】米国特許第5,618,711号
【特許文献６】米国特許第6,270,962号
【特許文献７】米国特許第5,436,149号
【特許文献８】米国特許第6,410,277号
【特許文献９】米国特許第6,444,428号
【非特許文献１】「Current Protocols in Molecular Biology」、F. M. Ausubelら（編）、John Wiley and Sons, Inc.、1998
【非特許文献２】Akhmetzjanov, A. A.及びVakhitov, V. A.（1992）Nucleic Acids Research 20：5839
【非特許文献３】Joyce, C.M.及びSteitz, T.A.（1994）Annu. Rew. Biochem.、63、777-822
【非特許文献４】Steitz, T.A.（1999）J. Biol. Chem.、274、17395-17398
【非特許文献５】Chevet, E.ら、（1995）Nucleic Acids Res.、23、3343-3344
【非特許文献６】Hung, T.ら、（1990）Nucleic Acids Res.、18、4953
【非特許文献７】Warner, CK.及びDawson, J.E.（1996）、Persing, D.H.（編）、PCR Protocols for Emerging Infectious Diseases. ASM Press、Washington DC.
【非特許文献８】Winship, P.R.（1989）Nucleic Acids Res.、17、1266
【非特許文献９】Bookstein, R.ら、（1990）Nucleic Acids Res.、18、1666
【非特許文献１０】Sidhu, M. K.ら、（1996）Biotechniques、21、44-47.
【非特許文献１１】Chakrabarti, R.ら、（2001）Nucleic Acids Res.、29、2377-2381
【非特許文献１２】Weissensteiner, T.ら、（1996）Biotechniques、21、1102-1108
【非特許文献１３】Henke, W.ら、（1997）Nucleic Acids Res.、19、3957
【非特許文献１４】Barnes（Proc. Nat. Acad. Sci. USA、91：2216-2220 （1994））
【非特許文献１５】Tabor, S.、Huber, H. E.及びRichardson, C. C.（1987）J. Biol. Chem. 262、16212-16223
【非特許文献１６】Modrich, P.及びRichardson, C. C.（1975）J. Biol. Chem. 250、5515-5522
【非特許文献１７】Huber, H. E.、Russel, M.、Model, P.及びRichardson, C. C.（1986）J. Biol. Chem. 261、15006-15012
【非特許文献１８】Huber, H. E.、Tabor, S.及びRichardson, C. C.（1987）J. Biol. Chem. 262、16224-16232
【非特許文献１９】Sambrookら、（1989）「Molecular cloning - A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press
【非特許文献２０】Barany, F.及びGelfand, D.H.［（1991）、Gene、109、1-11］
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、アクセサリータンパク質としての、大腸菌DNAポリメラーゼIなどの細菌性DNAポリメラーゼと相互作用し、DNAポリメラーゼ反応を増強し得るタンパク質の同定及び使用は、種々のin vitro DNA合成適用において有用であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、DNAの酵素的合成及び増幅の改善のための方法を提供する。特に、本発明は、PCRの収量を増強することに主に関する。本発明の方法は、長距離PCR及び低コピーDNAテンプレートのPCR増幅の収量を増強するために特に有用である。本発明はまた、プライマー伸長及びDNA配列決定などの、DNAポリメラーゼを使用する他の実験室手法を改善するためにも有用であり得る。
【００１５】
本発明は、DNAポリメラーゼによって触媒される反応において産物の収量を増大させるための方法、タンパク質及び反応キットを提供する。DNAポリメラーゼ反応の産物の増大は、DNAポリメラーゼを含む反応混合物にDNAリガーゼタンパク質を添加することによって達成される。
【００１６】
DNAポリメラーゼ反応を実施するために使用されるDNAポリメラーゼは、大腸菌DNAポリメラーゼIなどのDNAポリメラーゼのファミリーの代表であり得る［Joyce, CM.及びSteitz, T.A.（1994）Annu. Rew. Biochem.、63、777-822；Steitz, T.A.（1999）J. Biol. Chem.、274、17395-17398］。DNAポリメラーゼ反応を増強するために使用されるDNAリガーゼは、細菌性DNAリガーゼであり得る。
【００１７】
本発明は、DNAリガーゼタンパク質（例えば、サーマス・アクアチクス（Taq DNAリガーゼ）、サーマス・サーモフィラス（Tth DNAリガーゼ）、サーマス・フラバス（Tfl DNAリガーゼ）または大腸菌（大腸菌DNAリガーゼ）由来のNAD依存性DNAリガーゼのタンパク質）の、大腸菌DNAポリメラーゼIなどのDNAポリメラーゼ（例えば、Taq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼまたは大腸菌DNAポリメラーゼI）を含む反応混合物への添加により、DNAポリメラーゼ反応を増強するための方法を提供する。本発明によれば、特に、細菌性DNAリガーゼが、細菌性DNAポリメラーゼ活性を増強するために適用される。
【００１８】
特に、本発明は、Taq DNAポリメラーゼまたはTth DNAポリメラーゼを含む反応混合物中に、サーマス・アクアチクス（Taq DNAリガーゼ）またはサーマス・サーモフィラス（Tth DNAリガーゼ）由来の細菌性DNAリガーゼのタンパク質を含めることによる、DNAポリメラーゼ反応を増強するための方法を提供する。本発明の特定の実施形態において、この混合物は、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠くDNAポリメラーゼ及び3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を示すDNAポリメラーゼを少なくとも含むか、または少なくとも2つのDNAポリメラーゼ活性の任意の他の混合物を含む。
【００１９】
本発明は、プライマー伸長反応、DNA配列決定、ニックトランスレーション、逆転写、PCRなどのDNAポリメラーゼ反応、並びに特に長距離PCR及び低コピーDNAテンプレートのPCR増幅の効率を改善することを可能にする。
【００２０】
本発明の組成物、反応混合物及びキットは、DNAポリメラーゼ反応の効率を改善増強するために使用されるDNAリガーゼタンパク質を含む。さらに、これらの組成物、反応混合物及びキットは、複数の追加の反応成分を含み得る。追加の反応成分には、DNAポリメラーゼなどの酵素が含まれ得る。
【００２１】
本発明の他の特徴、態様及び利点は、以下の図面及び詳細な説明を吟味すれば当業者に明らかであるか、あるいは当業者に明らかとなろう。本記載内に含まれる全てのこのような追加の系、特徴、態様及び利点は、本発明の範囲内であり、添付の特許請求の範囲によって保護されることが意図される。
【００２２】
本発明のこれら及び他の特徴、態様及び利点は、以下の説明、特許請求の範囲及び添付の図面に関し、よりよく理解されるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
明細書及び特許請求の範囲の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義を提供する。
【００２４】
略号：bp=塩基対；kb=キロ塩基（1000塩基対）；dNTP=デオキシリボヌクレオシド三リン酸；NAD=β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド；RT=逆転写；PCR=ポリメラーゼ連鎖反応。
【００２５】
以下の3文字略号は、微生物により詳述される酵素をしばしばいう：Taq=サーマス・アクアチクス（Thermus aquaticus）；Tth=サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）；Tfl=サーマス・フラバス（Thermus flavus）；Tli=サーモコッカス・リテラリス（Thermococcus literalis）；Pfu=ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）；Pwo=ピロコッカス・ウーゼイ（Pyrococcus woesii）。
【００２６】
用語「熱安定性」または「熱的に安定な」は、不可逆的に変性されることなく数分間少なくとも95℃までの温度を耐えることができる酵素を記述するために、本明細書中で相互交換可能に使用される。典型的に、このような酵素は、約45℃、好ましくは50℃〜75℃の至適温度を有する。
【００２７】
用語、酵素の「修飾」とは、本明細書中で使用する場合、酵素の化学的または遺伝的修飾をいう。
【００２８】
用語「核酸配列」または「ポリヌクレオチド配列」とは、デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーをいい、5'端から3'端に読まれる。
【００２９】
用語「オリゴヌクレオチドプライマー」、「オリゴヌクレオチド」または「プライマー」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの一本鎖ポリマーをいう。
【００３０】
用語「相補的」とは、本明細書中で使用する場合、2つの核酸配列間の関係をいう。1つの核酸配列は、第2の核酸と二重鎖を形成することが可能な場合、この第2の核酸配列と相補的であり、このとき二重鎖の各残基は、グアノシン-シチジン（G-C）塩基対もしくはアデノシン-チミジン（A-T）塩基対、または等価な塩基対を形成する。等価な塩基対は、グアノシン、シチジン、アデノシンまたはチミジン以外のヌクレオシドまたはヌクレオチドのアナログを含み得る。
【００３１】
用語「DNAテンプレート」、「RNAテンプレート」または「テンプレート」とは、本明細書中で使用する場合、新たな相補的核酸を合成するためにDNAポリメラーゼによって使用される核酸をいう。
【００３２】
用語「DNAポリメラーゼ」とは、DNAポリメラーゼ活性を示す全てのタンパク質またはペプチドをいい、これには、細菌由来または真核生物由来のいずれかの、天然に存在するDNAポリメラーゼ、組換えDNAポリメラーゼまたは合成DNAポリメラーゼの、アレル変異体、フラグメント、誘導体またはアナログが含まれる。
【００３３】
用語「DNAリガーゼ」とは、合成、組換えまたは天然由来のいずれかの、DNAリガーゼ活性を示す全てのタンパク質またはペプチドをいう。さらに、この用語は、大腸菌のDNAリガーゼまたは好熱性細菌由来のDNAリガーゼの群由来のDNAリガーゼの1つに対して、少なくとも70%、好ましくは80%、最も好ましくは少なくとも90%、95%または98%の同一性を有する、アレル変異体、フラグメント、誘導体またはアナログを含む。例えば、サーマス属由来のもの（T.アクアチクス、T.サーモフィラス、T.ルバー（rubber）、T.フィルホルミス（filiformis）、T. ブロッキアナス（brockianus）、T.フラバス及びT.スコトダクタス（scotoductus）由来のリガーゼ）またはそのフラグメントなど。
【００３４】
用語「DNAポリメラーゼ反応」とは、DNAポリメラーゼ活性を含む全ての反応をいう。
【００３５】
本発明は、PCR、プライマー伸長及びDNA配列決定などのDNAポリメラーゼ反応の効率を改善させる、方法、タンパク質及び反応キットを提供する。本発明は主に、PCRの改善、並びに特に長距離PCR及び低コピーDNAテンプレートのPCR増幅の収量の増強に関する。
【００３６】
本発明は、酵素的DNAポリメラーゼ反応を増強するための方法を提供する。この方法は、細菌性DNAリガーゼが、細菌性DNAポリメラーゼと（おそらくアクセサリータンパク質として）相互作用し、DNAポリメラーゼ反応の効率を増強させ得るという、本発明において開示された事実に基づく。
【００３７】
DNAポリメラーゼ反応の増強及びこの反応の産物の増大は、細菌性DNAポリメラーゼを含む反応混合物への細菌性DNAリガーゼタンパク質の添加によって達成され得る。DNAポリメラーゼ反応の効率の増強は、細菌性DNAリガーゼ及びポリメラーゼの混合物を含む組成物を使用することによっても達成され得る。
【００３８】
DNAポリメラーゼ反応の効率及び特異性を改善することが可能なDNAリガーゼは、大腸菌DNAリガーゼなどのNAD依存性細菌性DNAリガーゼであり得る。
【００３９】
DNAポリメラーゼ反応を実施するために使用されるDNAポリメラーゼは、例えば、大腸菌DNAポリメラーゼIなどのDNAポリメラーゼのファミリーの細菌性ポリメラーゼであり得る［Joyce, CM.及びSteitz, T.A.（1994）Annu. Rew. Biochem.、63、777-822；Steitz, T.A.（1999）J. Biol. Chem.、274、17395-17398］。
【００４０】
本発明の方法によって改善され得る酵素的DNAポリメラーゼ反応は、DNAポリメラーゼによって触媒され得る、プライマー伸長反応、逆転写反応、DNA配列決定、ニックトランスレーション、PCR及び他の反応であり得る。
【００４１】
本発明の一実施形態において、このDNAポリメラーゼは、大腸菌DNAポリメラーゼI、Taq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼなどの、大腸菌DNAポリメラーゼIなどのDNAポリメラーゼのファミリーから選択され得る。このポリメラーゼは、野生型配列または合成変異体及びフラグメントであり得る。
【００４２】
本発明において使用するためのDNAポリメラーゼは、例えば、DNAポリメラーゼのN末端欠失、例えば、大腸菌DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメント、TaqポリメラーゼのN末端欠失（Taq DNAポリメラーゼのStoffelフラグメント、Klentaq-235及びKlentaq-278を含む）などの、大腸菌DNAポリメラーゼIなどのDNAポリメラーゼのファミリーの修飾されたDNAポリメラーゼから選択され得る。
【００４３】
本発明において使用するために好ましいDNAポリメラーゼには、熱安定性DNAポリメラーゼが含まれるが、これに限定されない。
【００４４】
熱安定性ポリメラーゼは、好熱性細菌供給源（例えば、好熱性サーマス属）から単離され得るか、あるいは組換え手段によって単離及び調製され得る。サーマス属の代表的な種には、T.アクアチクス、T.サーモフィラス、T.ルバー、T.フィルホルミス、T.ブロッキアナス、T.フラバス及びT.スコトダクタスが含まれる。
【００４５】
本発明において使用するための熱安定性DNAポリメラーゼの例には、Tth DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、TaqポリメラーゼのN末端欠失（例えば、DNAポリメラーゼのStoffelフラグメント、Klentaq-235及びKlentaq-278）が含まれるが、これらに限定されない。他のDNAポリメラーゼには、KlenTaq1、Taquenase（商標）（Amersham）、Ad-vanTaq（商標）（Clontech）、GoTaq及びGoTaq Flexi（Promega）が含まれる。
【００４６】
本発明の別の実施形態において、このDNAポリメラーゼは、DNAポリメラーゼ反応を実施するための酵素の混合物中に含まれ得る。好ましい実施形態において、この混合物は、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠く、大腸菌DNAポリメラーゼIなどのDNAポリメラーゼのファミリー由来の少なくとも1つのDNAポリメラーゼ、及び3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を示す少なくとも1つのDNAポリメラーゼを含む。
【００４７】
3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠くDNAポリメラーゼの例には、Taq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼIのKlenow（exo-）フラグメント、TaqポリメラーゼのN末端欠失（DNAポリメラーゼのStoffelフラグメント、Klentaq-235及びKlentaq-278を含む）などが含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を示すDNAポリメラーゼの例には、大腸菌DNAポリメラーゼI、大腸菌DNAポリメラーゼIのKlenow（exo+）フラグメント、T4 DNAポリメラーゼ、ピロコッカス・フリオサス（Pfu）DNAポリメラーゼ、サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）（Tma）DNAポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）（Tli）DNAポリメラーゼ（VentR（登録商標）ともいう）、ピロコッカスGB-D DNAポリメラーゼ、ピロコッカス・コダカラエンシス（Pyrococus kodakaraensis）（KOD）DNAポリメラーゼ、Pfx、Pwo及びDeepVentR（登録商標）ポリメラーゼなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
本発明において使用するためのDNAポリメラーゼ混合物の例には、例えば、米国特許第5,436,149号及び米国特許第6,410,277号に開示された混合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
本発明において使用するためのDNAポリメラーゼの好ましい混合物は、熱安定性DNAポリメラーゼを含む。
【００５１】
本発明において使用するための市販のDNAポリメラーゼ混合物には、TaqLA、TthLAまたはExpand High FidelityPlus Enzyme Blend（Roche）；TthXL KlenTaqLA（Perkin-Elmer）；ExTaq（登録商標）（Takara Shuzo）；Elongase（登録商標）（Life Technologies）；Advantage（商標）KlenTaq、Advantage（商標）Tth及びAdvantage2（商標）（Clontech）；TaqExtender（商標）（Stratagene）；Expand（商標）Long Template及びExpand（商標）High Fidelity（Boehringer Mannheim）；並びにTripleMaster（商標）Enzyme Mix（Eppendorf）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
本発明の一実施形態において、DNAポリメラーゼ反応を増強するために使用されるタンパク質は、細菌性DNAリガーゼタンパク質である。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態において、この細菌性DNAリガーゼは、大腸菌DNAリガーゼなどのNAD依存性DNAリガーゼであり得る。特に、本発明において使用するための好ましいDNAリガーゼタンパク質には、大腸菌DNAリガーゼ及び好熱性細菌供給源（例えば、好熱性サーマス属）由来の熱安定性DNAリガーゼ（例えば、T.アクアチクス、T.サーモフィラス、T.ルバー、T.フィルホルミス、T.ブロッキアナス、T.フラバス及びT.スコトダクタス由来のリガーゼ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
本発明において使用するためのDNAリガーゼタンパク質は、野生型配列または合成変異体及びフラグメントであり得る。これらのタンパク質は、細菌または真核生物の供給源から単離され得るか、あるいは組換え手段によって単離及び調製され得る。
【００５５】
本発明において使用するためのDNAリガーゼタンパク質またはその合成変異体及びフラグメントは、DNAリガーゼ活性を示しても示さなくてもよい。例えば、NAD依存性DNAリガーゼ（例えば、Taq DNAリガーゼまたはTth DNAリガーゼ）は、DNAリガーゼ活性を示すためにNADを必要とするが、実施例に示されるように、Taq DNAリガーゼ及びTth DNAリガーゼは、NADなしにDNAポリメラーゼ反応を増強することができ、NADの存在は必須ではない。このように、DNAリガーゼ活性を示すことは、DNAリガーゼタンパク質によってDNAポリメラーゼ反応を増強するために必須ではない。
【００５６】
本発明の一実施形態において、DNAポリメラーゼ反応を増強すること及びこの反応の産物の増大は、このDNAリガーゼタンパク質（1種または複数）の、大腸菌DNAポリメラーゼIなどの少なくとも1つのDNAポリメラーゼを含む反応混合物への添加によって、達成され得る。本発明の別の実施形態において、DNAポリメラーゼ反応を増強することは、このDNAリガーゼ及びポリメラーゼの混合物を含む組成物を使用することによっても、達成され得る。
【００５７】
本発明において使用するための、DNAリガーゼとDNAポリメラーゼとの適切な組合せには、大腸菌DNAリガーゼと大腸菌DNAポリメラーゼIとの組合せ；及び熱安定性DNAリガーゼとサーマス属由来のポリメラーゼとの組合せが含まれるが、これらに限定されない。DNAリガーゼとDNAポリメラーゼとの好ましい組合せには、Taq DNAリガーゼとTaq DNAポリメラーゼ、またはTth DNAポリメラーゼ、またはTfl DNAポリメラーゼ；Tth DNAリガーゼとTaq DNAポリメラーゼ、またはTth DNAポリメラーゼ、またはTfl DNAポリメラーゼ；Tfl DNAリガーゼとTaq DNAポリメラーゼ、またはTth DNAポリメラーゼ、またはTfl DNAポリメラーゼが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００５８】
本発明において使用され得るDNAリガーゼ及びDNAポリメラーゼは、組成物の成分として、反応混合物に別々にまたは一緒に添加され得る。
【００５９】
本発明の組成物、反応混合物及びキットは、このDNAリガーゼ（1種または複数）またはDNAリガーゼとDNAポリメラーゼとの組合せ（1種または複数）を含み得る。さらに、これらの組成物、反応混合物及びキットは、複数の追加の反応成分を含み得る。この追加の反応成分は、酵素、タンパク質及び化学物質（例えば、テンプレート核酸、オリゴヌクレオチドプライマー、dNTPなど）であり得る。好ましい追加の酵素は、無機ピロホスファターゼ（PPase）及び3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を示すDNAポリメラーゼ、特に、熱安定性酵素（例えば、Tth PPaseまたはTaq PPase及びDNAポリメラーゼ：Pfu、Tma、Tli、Pfx、Pwo、KOD、VentR（登録商標）及びDeepVentR（登録商標））であり得る。
【００６０】
一態様において、本発明は、DNAポリメラーゼ反応の効率を増大させるための反応キットを提供する。このキットは、1つのDNAリガーゼ（または複数のDNAリガーゼ）またはこのタンパク質を含む組成物を含み得る。このキットはさらに、酵素的プロセスを促進するために、1つまたは複数の追加の反応成分を含み得る。このキットはさらに、酵素的プロセスを実施するための1つまたは複数のDNAポリメラーゼを含み得る。
【００６１】
一般に、キットは、DNAリガーゼまたはこのタンパク質を含む組成物を含む第1の容器、及びDNAポリメラーゼ反応を実施するのに適切な1つまたは複数の成分を含む第2の容器を少なくとも含み得る。この第2の容器は、（a）dNTP；（b）ddNTP；（c）DNAポリメラーゼ；（d）反応緩衝液、及び（e）プライマーのうち、1つまたは複数を含み得る。このキットは、別々に包装されたこれらまたは他の成分を含む2つまたは複数、例えば、3つ、4つもしくは5つの別々の容器、またはそれらの組合せを含み得る。キットは、これらの試薬を使用するための指示書も含み得る。
【００６２】
本発明は、大腸菌DNAポリメラーゼIなどのDNAポリメラーゼによって触媒され得る、プライマー伸長反応、DNA配列決定、ニックトランスレーション、逆転写（RT）、PCR、RT-PCR及び他の反応などのDNAポリメラーゼ反応の効率を改善させる。
【００６３】
好ましい実施形態において、本発明は、PCR及びRT-PCRの効率を増大させるためのタンパク質及び方法を含む。具体的には、本発明は、長距離PCR及び低コピーDNAテンプレートのPCR増幅を実施するためのプロセス及びキットを提供する。このプロセス及びキットは、PCRの反応混合物への、PCRの効率を改善することが可能な、本明細書中に記載されるDNAリガーゼタンパク質を添加する工程を利用する。
【００６４】
PCR用途において使用するのに好ましいDNAポリメラーゼには、熱安定性DNAポリメラーゼ及び/またはそれらの組合せが含まれる。熱安定性DNAポリメラーゼには、本明細書中で上記したものが含まれ得るが、それらに限定されない。
【００６５】
PCR用途においてDNAポリメラーゼ反応を増強するために好ましいDNAリガーゼには、熱安定性DNAリガーゼ及び/またはそれらの組合せが含まれる。熱安定性DNAリガーゼには、本明細書中で上記したものが含まれ得るが、それらに限定されない。
【００６６】
PCR用途において使用するための本発明の好ましい組成物、反応混合物及びキットには、熱安定性DNAリガーゼと熱安定性DNAポリメラーゼとの組合せが含まれる。熱安定性DNAリガーゼと熱安定性DNAポリメラーゼとの組合せには、本明細書中で上記したものが含まれ得るが、それらに限定されない。
【００６７】
本明細書中に記載されるリガーゼタンパク質の添加は、PCRの増強を促進する。TaqポリメラーゼまたはTthポリメラーゼを使用して実施されるPCRの効率に対する、Taq DNAリガーゼ及びTth DNAリガーゼの有効性の実証については、本明細書中の実施例を参照のこと。本発明の他のDNAリガーゼタンパク質は、PCRまたは他のDNAポリメラーゼ反応の効率を改善するために、同様の様式で、DNAポリメラーゼとの組合せ（本明細書中で上記したもの）で使用され得る。
【００６８】
以下の実施例は、本発明の態様を例示する。これらの実施例は、本発明の例示であり、本発明を拘束するものではない。具体的に規定されていない任意の方法、調製、溶液などは、Sambrookら［Sambrookら、（1989）「Molecular cloning - A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press］中に見出され得る。他に特定しない限り、全ての溶液は水溶液であり、滅菌の脱イオン水中で調製される。Taq DNAポリメラーゼ及びTth DNAポリメラーゼは、Roche Molecular Systems, Inc.から得た。Taq DNAポリメラーゼと3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を示すプルーフリーディングDNAポリメラーゼとの混合物を含む、PCR用のTripleMaster（登録商標）Enzyme Mixは、Eppendorfから得た。Taq DNAリガーゼは、New England Biolabs, Inc.から得た。Tth DNAリガーゼはBarany, F.及びGelfand, D.H.［（1991）、Gene、109、1-11］に記載された方法によって得た。他の試薬はGeneCraft（ドイツ）から得た。
【実施例】
【００６９】
＜実施例１＞
反応混合物にTaq DNAリガーゼを添加することによる、Taq DNAポリメラーゼを用いて実施される長距離PCRの収量の増強
10,000bpのDNAフラグメントを、93℃45秒；58℃45秒；70℃8分の32サイクルで、7.5ngのファージλゲノムDNAから増幅した。反応混合物（50μl）は以下を含んだ：2.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl（25℃でpH9.0）、50mM KCl、0.1% Triton X-100、0.5mMの各dNTP、20pmolのプライマーPr1（5'-ctgatcagttcgtgtccgtacaactggcgtaatc）、20pmolのプライマーPr2（5'-atacgctgtattcagcaacaccgtcaggaacacg）及び2.5UのTaq DNAポリメラーゼ。
【００７０】
PCR反応を、Taq DNAリガーゼの非存在下及びTaq DNAリガーゼの存在下で実施した。Taq DNAリガーゼを、12.5U、25U、37.5U及び50Uに対応する量で反応混合物に添加した（1単位は、50μlの総反応容量中45℃で15分間で、BstE II消化した1μgのλDNAの12塩基対の付着末端の50%のライゲーションを与えるのに必要なDNAリガーゼの量として規定する）。
【００７１】
図１は、得られた増幅産物の電気泳動分析を示す。本発明の方法（Taqポリメラーゼを含む反応混合物へのTaq DNAリガーゼの添加）は、ポリメラーゼ反応の収量の有意な増大を提供した。追加の添加剤を含まない従来のPCR手順（レーン1）と比較して、検出可能な量の所望の産物が、Taq DNAリガーゼを添加することによって得られた（レーン1と比較した、レーン3から5における標的増幅産物の存在に留意のこと）。
【００７２】
＜実施例２＞
反応混合物にTth DNAリガーゼを添加することによる、Taq DNAポリメラーゼを用いて実施される長距離PCRの収量の増強
10,000bpのDNAフラグメントを、93℃45秒；58℃45秒；70℃8分の32サイクルで、7.5ngのファージλゲノムDNAから増幅した。反応混合物（50μl）は以下を含んだ：2.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl（25℃でpH9.0）、50mM KCl、0.1% Triton X-100、0.5mMの各dNTP、20pmolのプライマーPr1（5'-ctgatcagttcgtgtccgtacaactggcgtaatc）、20pmolのプライマーPr2（5'-atacgctgtattcagcaacaccgtcaggaacacg）及び2.5UのTaq DNAポリメラーゼ。
【００７３】
PCR反応を、Tth DNAリガーゼの非存在下及びTth DNAリガーゼの存在下で実施した。Tth DNAリガーゼを、12.5U、25U、37.5U及び50Uに対応する量で反応混合物に添加した（1単位は、50μlの総反応容量中45℃で15分間で、BstE II消化した1μgのλDNAの12塩基対の付着末端の50%のライゲーションを与えるのに必要なDNAリガーゼの量として規定する）。
【００７４】
図２は、得られた増幅産物の電気泳動分析を示す。本発明の方法（Taqポリメラーゼを含む反応混合物へのTth DNAリガーゼの添加）は、ポリメラーゼ反応の収量のかなりの増大を提供した。追加の添加剤を含まない従来のPCR手順（レーン1）と比較して、漸増する量の所望の産物が、Tth DNAリガーゼを添加することによって得られた（レーン1と比較した、レーン2から5における標的増幅産物の量の増大に留意のこと）。
【００７５】
＜実施例３＞
反応混合物にTth DNAリガーゼを添加することによる、Tth DNAポリメラーゼを用いて実施される長距離PCRの収量の増強
15,000bpのDNAフラグメントを、93℃45秒；58℃45秒；70℃8分の32サイクルで、7.5ngのファージλゲノムDNAから増幅した。反応混合物（50μl）は以下を含んだ：2.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl（25℃でpH9.0）、50mM KCl、0.1% Triton X-100、0.5mMの各dNTP、20pmolのプライマーPr1（5'-ctgatcagttcgtgtccgtacaactggcgtaatc）、20pmolのプライマーPr3（5'-ccagccgcaatatctggcggtgcaatatcggtac）及び2.5UのTth DNAポリメラーゼ。
【００７６】
PCR反応を、Tth DNAリガーゼの非存在下及びTth DNAリガーゼの存在下で実施した。Tth DNAリガーゼを、12.5U、25U、37.5U及び50Uに対応する量で反応混合物に添加した（1単位は、50μlの総反応容量中45℃で15分間で、BstE II消化した1μgのλDNAの12塩基対の付着末端の50%のライゲーションを与えるのに必要なDNAリガーゼの量として規定する）。
【００７７】
図３は、得られた増幅産物の電気泳動分析を示す。本発明の方法（Tthポリメラーゼを含む反応混合物へのTth DNAリガーゼの添加）は、ポリメラーゼ反応の15,000bpの標的産物の収量の有意な増大を提供した。追加の添加剤を含まない従来のPCR手順（レーン1）と比較して、検出可能な量の所望の産物が、Tth DNAリガーゼを添加することのみによって得られた（レーン1と比較した、レーン3から5における標的増幅産物の存在に留意のこと）。
【００７８】
＜実施例４＞
反応混合物にTth DNAリガーゼを添加することによる、Taq DNAポリメラーゼ及び3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を示すプルーフリーディングDNAポリメラーゼを含む市販のポリメラーゼ混合物「TripleMaster（登録商標）Enzyme Mix」（Eppendorf）を用いて実施される長距離PCRの収量の増強
20,000bpのDNAフラグメントを、93℃45秒；58℃45秒；70℃10分の32サイクルで、7.5ngのファージλゲノムDNAから増幅した。反応混合物（50μl）は以下を含んだ：2.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl（25℃でpH9.0）、50mM KCl、0.1% Triton X-100、0.5mMの各dNTP、20pmolのプライマーPr1（5'-ctgatcagttcgtgtccgtacaactggcgtaatc）、20pmolのプライマーPr4（5'-gtgcaccatgcaacatgaataacagtgggttatc）及び2.5UのTripleMaster（登録商標）Enzyme Mix。
【００７９】
PCR反応を、Tth DNAリガーゼの非存在下及びTth DNAリガーゼの存在下で実施した。Tth DNAリガーゼを、12.5U、25U、37.5U及び50Uに対応する量で反応混合物に添加した。
【００８０】
図４は、得られた増幅産物の電気泳動分析を示す。本発明の方法（反応混合物へのTth DNAリガーゼの添加）は、20,000bpの標的DNA産物の収量の有意な増大を提供した。Tth DNAリガーゼを含まない従来のPCR手順（レーン1）と比較して、かなりの量の所望の産物が、Tth DNAリガーゼを添加することのみによって得られた（レーン1と比較した、レーン4及び5における標的増幅産物の存在に留意のこと）。
【００８１】
30,000bpのDNAフラグメントを、93℃45秒；58℃45秒；70℃20分の32サイクルで、6ngのファージλゲノムDNAから増幅した。反応混合物（50μl）は以下を含んだ：2.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl（25℃でpH9.0）、50mM KCl、0.1% Triton X-100、0.5mMの各dNTP、20pmolのプライマーPr1（5'-ctgatcagttcgtgtccgtacaactggcgtaatc）、20pmolのプライマーPr5（5'-gaaagttatccctagtcagtggcctgaagagac）及び5UのTripleMaster（登録商標）Enzyme Mix。
【００８２】
PCR反応は、Tth DNAリガーゼの非存在下及び100UのTth DNAリガーゼの存在下で実施した。
【００８３】
図５は、得られた増幅産物の電気泳動分析を示す。本発明の方法（反応混合物へのTth DNAリガーゼの添加）は、30,000bpの標的DNA産物の収量の有意な増大を提供した。Tth DNAリガーゼを含まない従来のPCR手順（レーン1）と比較して、かなりの量の所望の産物が、Tth DNAリガーゼを添加することによって得られた（レーン2）。
【００８４】
40,000bpのDNAフラグメントを、93℃45秒；58℃45秒；70℃20分の32サイクルで、15ngのファージλゲノムDNAから増幅した。反応混合物（50μl）は以下を含んだ：2.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl（25℃でpH9.0）、50mM KCl、0.1% Triton X-100、0.5mMの各dNTP、20pmolのプライマーPr1（5'-ctgatcagttcgtgtccgtacaactggcgtaatc）、20pmolのプライマーPr6（5'-taatgcaaactacgcgccctcgtatcacatgg）及び5UのTripleMaster（登録商標）Enzyme Mix。
【００８５】
PCR反応を、Tth DNAリガーゼの非存在下及び100UのTth DNAリガーゼの存在下で実施した。
【００８６】
図６は、得られた増幅産物の電気泳動分析を示す。本発明の方法（反応混合物へのTth DNAリガーゼの添加）は、40,000bpの標的DNA産物の収量の有意な増大を提供した。Tth DNAリガーゼを含まない従来のPCR手順（レーン1）と比較して、検出可能な量の所望の産物が、Tth DNAリガーゼを添加することによって得られた（レーン2）。
【００８７】
＜実施例５＞
反応混合物にTth DNAリガーゼを添加することによる、Taq DNAポリメラーゼを用いて実施される低テンプレートコピー数PCR増幅の収量の増強
CSF3R（コロニー刺激因子3レセプター）遺伝子の795bpのDNAフラグメントを、93℃40秒；58℃40秒；72℃40秒の45サイクルで、6ngのヒトゲノムDNA（1,000コピー）から増幅した。反応混合物（50μl）は以下を含んだ：2mM MgCl2、20mM Tris- HCl（25℃でpH9.0）、50mM KCl、0.1% Triton X-100、0.15mMの各dNTP、10pmolのプライマーPrCSFR1（5'-CCTGGAGCTGAGAACTAC）、10pmolのプライマーPrCSFR2（5'-TCCCGGCTGAGTTATAGG）及び1UのTaq DNAポリメラーゼ。
【００８８】
PCR反応を、Tth DNAリガーゼの非存在下及び20UのTth DNAリガーゼの存在下で実施した。
【００８９】
図７は、得られた増幅産物の電気泳動分析を示す。本発明の方法（反応混合物へのTth DNAリガーゼの添加）は、標的DNA産物の収量の有意な増大を提供した。Tth DNAリガーゼを含まない従来のPCR手順（レーン1）と比較して、所望の産物の量の顕著な増大が、反応混合物にTth DNAリガーゼを添加することによって得られた（レーン2）。
【００９０】
＜実施例６＞
反応混合物にTth DNAリガーゼを添加することによる、Tth DNAポリメラーゼを用いて実施されるRT-PCRの収量の増強
アフリカツメガエル胚の伸長因子1-α mRNAの221bpのcDNAフラグメントを、50ngのアフリカツメガエル胚の全mRNAから、RT-PCRによって増幅した。逆転写（RT）を、58℃で40分間、Tth DNAポリメラーゼを用いて実施した。cDNAのフラグメントを、93℃30秒；58℃30秒；70℃30秒の25サイクルでPCRにより増幅した。RT-PCRのための反応混合物（50μl）は以下を含んだ：1mM MnCl2、50mM Tris-HCl（25℃でpH8.2）、50mM KCl、0.25mMの各dNTP、15pmolのプライマーPr-RT1（5'-CCTGAACCACCCAGGCCAGATTGGTG）、15pmolのプライマーPr-RT2（5'-GAGGGTAGTCAGAGAAGCTCTCCACG）、2UのTth DNAポリメラーゼ及びテンプレートとして50ngのアフリカツメガエル胚の全mRNA。
【００９１】
RT-PCR反応を、Tth DNAリガーゼの非存在下及び40UのTth DNAリガーゼの存在下で実施した。
【００９２】
図８は、得られた増幅産物の電気泳動分析を示す。本発明の方法（反応混合物へのTth DNAリガーゼの添加）は、221bpの標的cDNA産物の収量の有意な増大を提供した。Tth DNAリガーゼを含まない従来のRT-PCR手順（レーン1）と比較して、所望の産物の量の顕著な増大が、反応混合物にTth DNAリガーゼを添加することによって得られた（レーン2）。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】実施例１で得られたPCR産物の電気泳動分析を示す図である。10,000bpのDNAフラグメントを、32サイクルで、7.5ngのファージλゲノムDNAから増幅した。PCRを、2.5UのTaq DNAポリメラーゼを用いて、追加の添加剤なしに（レーン1）、並びに12.5U、25U、37.5U、50UのTaq DNAリガーゼの存在下で（レーン2、3、4、5）実施した。
【図２】実施例２で得られたPCR産物の電気泳動分析を示す図である。10,000bpのDNAフラグメントを、32サイクルで、7.5ngのファージλゲノムDNAから増幅した。PCRを、2.5UのTaq DNAポリメラーゼを用いて、追加の添加剤なしに（レーン1）、並びに12.5U、25U、37.5U、50UのTth DNAリガーゼの存在下で（レーン2、3、4、5）実施した。
【図３】実施例３で得られたPCR産物の電気泳動分析を示す図である。15,000bpのDNAフラグメントを、32サイクルで、7.5ngのファージλゲノムDNAから増幅した。PCRを、2.5UのTth DNAポリメラーゼを用いて、追加の添加剤なしに（レーン1）、並びに12.5U、25U、37.5U、50UのTth DNAリガーゼの存在下で（レーン2、3、4、5）実施した。
【図４】実施例４で得られたPCR産物の電気泳動分析を示す図である。32サイクルで7.5ngのファージλゲノムDNAから増幅した20,000bpのPCR産物の電気泳動分析を示す。PCRを、2.5UのTripleMaster（登録商標）Enzyme Mixを用いて、追加の添加剤なしに（レーン1）、並びに12.5U、25U、37.5U、50UのTth DNAリガーゼの存在下で（レーン2、3、4、5）実施した。
【図５】実施例４で得られたPCR産物の電気泳動分析を示す図である。32サイクルで6ngのファージλゲノムDNAから増幅した30,000bpのPCR産物の電気泳動分析を示す。PCRを、5UのTripleMaster（登録商標）Enzyme Mixを用いて、追加の添加剤なしに（レーン1）、並びに100UのTth DNAリガーゼの存在下で（レーン2）実施した。
【図６】実施例４で得られたPCR産物の電気泳動分析を示す図である。32サイクルで15ngのファージλゲノムDNAから増幅した40,000bpのPCR産物の電気泳動分析を示す。PCRを、5UのTripleMaster（登録商標）Enzyme Mixを用いて、追加の添加剤なしに（レーン1）、並びに100UのTth DNAリガーゼの存在下で（レーン2）実施した。
【図７】実施例５で得られたPCR産物の電気泳動分析を示す図である。CSF3R（コロニー刺激因子3レセプター）遺伝子の795bpのDNAフラグメントを、45サイクルで6ngのヒトゲノムDNAから増幅した。PCRを、追加の添加剤なしに1UのTaq DNAポリメラーゼを用いた従来の条件下で（レーン1）、及び20UのTth DNAリガーゼの存在下で（レーン2）実施した。
【図８】実施例６で得られたRT-PCR産物の電気泳動分析を示す図である。アフリカツメガエル胚の伸長因子1-αmRNAの221bpのcDNAフラグメントを、50ngのアフリカツメガエル胚の全mRNAから、RT-PCRによって増幅した。逆転写（RT）反応及びPCR反応を、2UのTth DNAポリメラーゼを用いて、追加の添加剤なしに（レーン1）、及び40UのTth DNAリガーゼの存在下で（レーン2）実施した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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