(57)【要約】  本発明は、結核感染患者および結核とHIV の両方に感染した患者における結核関連免疫再構築症候群 (TB-IRS) の診断のための方法およびキットに関し、この方法は、ツベルクリン、即ちPPD (Purified Protein Derivative) と称されるマイコバクテリア抽出物、および16kDa 蛋白質〔結核菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、Mycobacterium tuberculosis) 由来の２つの抗原であるESAT-6またはCFP-10ではない〕に対して暴露後の、Th１応答における急性の増加を検出することを含む。
2009515143.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程からなる、結核菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、Mycobacterium tuberculosis)(TB) に共感染した患者、およびTBのみに感染した患者における免疫再構築症候群 (IRS)のin vitro診断方法：
a)前記患者の末梢血単核細胞 (PBMC) または全血を、PPD(精製蛋白誘導体) と称されるマイコバクテリア抽出物及び／又は16kDa 蛋白質 (SEQ ID No.1)から選択されるマイコバクテリア抗原を有する培地でインキュベートすること、
b)前記患者の末梢血単核細胞 (PBMC) または全血を、陰性対照としてESAT-6 (SEQ ID No.2)、CFP-10 (SEQ ID No.3)および85Ｂ (SEQ ID No.4)から選択される結核菌 (マイコバクテリウム・ツベルクローシス、Mycobacterium tuberculosis) 由来の少なくとも１種の抗原を有する培地でインキュベートすること、および
c)b)における前記マイコバクテリア抗原と比べた、a)に記載の前記マイコバクテリア抗原に対するTh１応答のレベルを検出すること；
ここで、b)に記載した抗原と比べた、または非刺激細胞もしくは非マイコバクテリア抗原で刺激された対照細胞と比べた、a)に記載の抗原の１つに対する１時点で測定したTh１応答の250 ％超の増加、またはTh１応答における強い反応性が、IRS の指標となる。
【請求項２】
工程b)が、ELISPOT 解析、またはフローサイトメトリーと組み合わせた細胞内サイトカイン染色または蛍光顕微鏡検査と定量により、抗原特異的Ｔ細胞の定量を行うことを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
IFN-γを産生するマイコバクテリア特異的Th１細胞の定量を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
細胞単独で得られる平均バックグラウンドを差し引いた後に、500 超の SFC (スポット形成細胞) ／106 PBMC、例えば500 超、1000超または2000超のSFC の結果がIRS の指標となり、同時に、ESAT-6、85B 、CFP-10に対して、典型的には500 ／106 PBMCより低いSFC または400 もしくは300 より低いSFC など、SFC が検出されないか最小である、請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
工程b)が、培養上清を集めることおよび、IL-2, IL-2R, IL-12p40, IL-15, IL-17, IFN- γ, TNF-α, GMCSF, MIP-1α, MIP-β, MCP-1, MIG, RANTES, IP-10 を含む、少なくとも１種のTh１特異的サイトカインまたはケモカインを定量することを含む、請求項１〜４のいずれかの項記載の方法。
【請求項６】
多重サンドイッチ免疫検定法または個別のサイトカイン特異的サンドイッチ免疫検定法を用いて行う、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ELISによりIFN-γ産生を定量する、請求項５記載の方法。
【請求項８】
工程a)の末梢血単核細胞を約６〜72時間インキュベートする、請求項１〜７のいずれかの項記載の方法。
【請求項９】
工程a)の末梢血単核細胞を、約１μｇ／mlのPPD 及び／又は16kDa 蛋白質と共に、および別途、約１μｇ／mlのESAT-6組換え蛋白質と共にインキュベートする、請求項１〜８のいずれかの項記載の方法。
【請求項１０】
工程a)の末梢血単核細胞を、約１μｇ／mlのPPD 及び／又は16kDa 蛋白質と共に、および別途、CFP-10及び／又は85B と共にインキュベートする、請求項１〜９のいずれかの項記載の方法。
【請求項１１】
対照細胞が、CMV 抽出物、HIV-1 p24 、フィトヘマグルチニンと共に、および培地のみでインキュベートした細胞から選択される、請求項１〜１０のいずれかの項記載の方法。
【請求項１２】
結核に共感染したHIV 陽性患者における強力な抗レトロウイルス療法 (HAART)の過程で行われる、請求項１〜１１のいずれかの項記載の方法。
【請求項１３】
同時または連続のHAART および結核治療を受けている患者において行われる、請求項１〜１２のいずれかの項記載の方法。
【請求項１４】
TBのみに罹患した患者において行われる、請求項１〜１１のいずれかの項記載の方法。
【請求項１５】
結核（TB）患者または結核 (TB) とHIV に共感染した患者における免疫再構築症候群 (IRS)の診断キットであり、PPD(精製蛋白質誘導体) と称されるマイコバクテリア抽出物、及び16kDa 蛋白質 (配列番号１) から選ばれるマイコバクテリア抗原、並びにESAT-6 (配列番号２) 、CFP-10 (配列番号２) および85B ( 配列番号３) から選ばれる結核菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、Mycobacterium tuberculosis) からの少なくとも１種の抗原を含む、前記診断キット。
【請求項１６】
抗IFN-γ抗体などの、固体担体に結合したTh１免疫応答特異的な抗サイトカイン／ケモカイン抗体の少なくとも１種をさらに含む、請求項１５記載の診断キット。
【請求項１７】
固体担体がELISPOT プレートである請求項１６記載の診断キット。
【請求項１８】
固体担体がELISA プレートである請求項１６記載の診断キット。
【請求項１９】
HAART および結核治療の過程での、結核（TB）患者または結核 (TB) とHIV に共感染した患者における結核関連免疫再構築症候群 (TB-IRS) を検出するための、請求項１５〜１８のいずれかの項記載のキットの使用。
【請求項２０】
TBのみに罹患した患者における免疫再構築症候群 (TB-IRS) を検出するための、請求項１５〜１８のいずれかの項記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核 (TB) 感染患者およびHIV に共感染した患者における、結核関連免疫再構築症候群 (immune restoration syndorome associated with tuberculosis, TB-IRS)の診断のための方法およびキットに関し、これは、ツベルクリン、即ちPPD (purified protein derivative, 精製蛋白誘導体) と称されるマイコバクテリアの抽出物、及び／又は16kDa 蛋白質〔結核菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、Mycobacterium tuberculosis) からのESAT-6またはCFP-10抗原に対してではない〕に曝した後の急性Th１反応を検出することを含む。
【背景技術】
【０００２】
ジドブジンの単独治療を受けているマイコバクテリウム・アビウム・コンプレックス (Mycobacterium avium complex)に感染したHIV 感染患者において最初に報告された (1)、結核に罹患した患者における免疫再構築症候群 (IRS)は、強力な抗レトロウイルス治療 (HAART)の時期に対応して極めて高い頻度 (29〜36％) で生じるようになった (2)。IRS はまた、より低い頻度ではあるが、HIV 陰性患者におけるTB治療の開始後にも生じうる。
【０００３】
典型的には、IRS は、結核 (TB) およびHIV に共感染し、HAART を受けたことがなく、HIV 疾患が進行した患者において、両方の治療が同時にまたは短い間隔で開始された場合に生じる。通常、臨床症状としては熱、リンパ節障害、呼吸およびその他の初期のTB症状の悪化がある (2)。IRS の主要な基準の定義が提案され、別の説明 (薬剤耐性、その他の日和見感染 (OI))ができず副次的特徴として免疫回復の証拠を有すれば、HAART に応答している患者における日和見感染 (opportunistic infection, OI)または腫瘍の典型的でない呈示 (１log10 コピー／mlより大きい血漿 HIV RNAレベルにおける低下) を含む根本的な日和見性の事象が何であってもよい (3)。
【０００４】
しかし、IRS は３つの臨床的に関連する問題を生じる：第１に、IRS は治療の失敗や耐性、またはその他の日和見性の疾患と区別されるべきであるので診断が難しい；第２に、いくつかの生命を脅かす症例におけるIRS 治療は、依然として経験的にステロイドによっており、これはかかる免疫無防備状態の患者において導入することは心配である；第３に、IRS リスク因子の決定により臨床医がその治療方針、即ちHAART 導入を遅らせるか否かを決定するのを助けることができる（４）。
【０００５】
従って、現在、依然としてIRS の診断のための信頼できる試験法の強い要望がある。IRS の病態生理学は全体としてはまだ解明されていない。急性の前炎症性サイトカイン（IL-6) 産生がIRS の間に生じることが実証された (５、６）が、その起源は不明である。加えて、強い有力な仮説は、IRS は、HAART が血漿のウイルス量 (VL) を減少させた後に、記憶Ｔ細胞の再循環または増殖のいずれかによる、マイコバクテリア特異的Ｔリンパ球応答の急性回復と関連するであろうというものである（７、８）。この仮説は示唆されているだけで、PPD に対するDTH 皮膚試験の回復以外はまだ実証されていない（９）。HIV-陰性TB感染患者においても同様に、IRS はTB特異的Th１免疫の増加を反映しているという仮説がたてられている。
【０００６】
本発明に関し、我々はHIV とTBの両方に感染した患者について、将来予想されるマルチセンターでの検討を行った。我々は、マイコバクテリア特異的 (PPD)Th１IFN-γ産生細胞がIRS の間に急速に増加すること、その一方、対照として試験されたCMV 、HIV p24 特異的応答は増加しなかったことを見出した。さらに、きわめて少数のIRS+患者のみがIRS の間に低レベルであるがESAT-6特異的応答を示し、そしてIRS-患者は急性のPPD 特異的応答を生じなかった。これらの発見はIFN-γ、IL-2、IL-12 、IP10およびMIG などのPPD 特異的Th１サイトカインのピークと関連したが、我々はTh２サイトカインは検出しなかった；TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 、RANTESおよびMCP-1 などのその他の炎症性ケモカインやサイトカインも検出された。我々はまた、16kDa 蛋白質抗原での刺激に応答したTh１特異的サイトカインの急激な放出も同定した。
【０００７】
従って、我々はここに、HIV とTBの両方に感染した患者およびTBのみの患者において、マイコバクテリア抗原に対するTh１応答の急性増加を検出することからなるTB-IRSの新規な診断試験を提供する。
【発明の開示】
【０００８】
第１の態様において、本発明は、以下の工程からなる、結核菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、Mycobacterium tuberculosis)(TB) に共感染した患者、およびTBのみに感染した患者における免疫再構築症候群 (IRS)のin vitro診断の方法に関する：
a)前記患者の末梢血単核細胞 (PBMC) または全血を、PPD(精製蛋白誘導体、精製ツベルクリン) と称されるマイコバクテリア抽出物及び／又は16kDa 蛋白質 (SEQ ID No.1)から選択されるマイコバクテリア抗原を有する培地でインキュベートすること、
b)前記患者の末梢血単核細胞 (PBMC) または全血を、陰性対照としてESAT-6 (SEQ ID No.2)、CFP-10 (SEQ ID No.3)および85Ｂ (SEQ ID No.4)から選択されるマイコバクテリウム・ツベルクローシス (Mycobacterium tuberculosis) 由来の少なくとも１種の抗原を有する培地でインキュベートすること、
c)b)における前記マイコバクテリア抗原と比べた、a)に記載の前記マイコバクテリア抗原に対するTh１応答のレベルを検出すること；
ここで、b)に記載した抗原と比べた、または非刺激細胞もしくは非マイコバクテリア抗原で刺激された対照細胞と比べた、a)に記載の抗原の１つに対する１時点で測定したTh１応答の250 ％超の増加、またはTh１応答における強い反応性が、IRS の指標となる。
【０００９】
好ましい態様において、工程a)およびb)は同時に行う。
本発明方法の別の好ましい態様において、非刺激細胞もしくは非マイコバクテリア抗原で刺激された対照細胞と比べた、b)に記載の抗原の１つに対する１時点で測定したTh１応答の増加または反応性は、ゼロであるかまたは極わずかである。
【００１０】
この試験は、TB-IRSにおいて、PPD および16kDa 蛋白質に対して特異的にTh１応答が急激に増加するが、ESAT-6、CFP-10および85Ｂなどのその他のマイコバクテリア抗原に対してはそうでないという我々の発見に基づいている。ここで急激な増加とは、典型的にはバックグラウンドの 250％超、さらには500 〜5000％超の増加、または対照細胞に比べてTh１応答が少なくとも250 ％超 (例えば、300 ％超、400 ％超、もしくは500 ％超でも) と理解されよう。「反応性なしまたは極わずか」とは、対照細胞に対してTh１応答のほとんど意味のない増加、例えば200 ％以下、典型的には100 ％または50％以下と理解されよう。
【００１１】
％での上記増加は、工程a)に記載された抗原について得られたTh１試験 (例えばIFN-γ放出試験などのようなサイトカイン放出試験) で得られた測定値を、工程b)に記載の抗原、または非刺激細胞もしくは非マイコバクテリア抗原で刺激された対照細胞で得られた測定値で単に割ることにより当業者が算出しうる。
【００１２】
ESAT-6、85ＢおよびCFP-10は結核菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、Mycobacterium tuberculosis）（Mtb)から単離された抗原であり、一方PPD は、Mtb およびBCG (Mtbに対する一般的ワクチンとして使用されるBacile of Calmette et Guerinは当分野においてよく知られ、デンマーク、コペンハーゲンのStatens Serum Institute により販売されているPPD を含む複数の市販原料から得ることができる) の両方からの抽出物からなる。PPD 、即ちツベルクリンは、Mtb およびBCG の混合物から蛋白質を抽出することにより得られ、BCG またはMtb のいずれかに対して生じる細胞性免疫、即ちTh１応答の存在を試験するのに共通して使用される。例えば、large Master Batch, Connaught Tuberculin (CT68) から調製されたConnaught Laboratories LimitedのTubersol (登録商標) から得ることができる。ESAT-6蛋白質は、Harboe et al., 1996 、Sorensen et al., 1995 に記載のようにM.ツベルクローシス (M.tuberculosis) の短期間培養物のろ液から精製された主要な分泌抗原である。ここでは、ESAT-6、CFP-10および85Ｂは細胞溶解物、精製または組換え技術により得ることができる。例えば、ESAT-6はStatens Serum Institute からの組換え蛋白質として入手できる。
【００１３】
ツベルクリン、即ちマイコバクテリア抽出物からのPPD (purified protein derivative、精製蛋白誘導体) は、M.ツベルクローシス (M.tuberculosis) のゲノム内のみに位置する遺伝子によりコードされ、そしてBCG には含まれないESAT-6 (early secreted antigenic target 6)、CFP-10 (culture filtrate protein 10)および85Ｂとは異なる、というのはPPD は、BCG 亜株および病原性が低いか非病原性のいくつかの非結核性マイコバクテリアの種に共有されるその他の抗原をも含有するからである。
【００１４】
これらの抗原の配列はこの明細書に含まれる配列表にも示される。
Th１応答の連続測定が可能でない場合、試験は、IRS の間または直後の一時点で採取した１つの血液試料に基づき、そして工程a)に記載の抗原の１つに対するが、工程b)に記載の抗原に対してではない、IFN-γ産生マイコバクテリア特異的Th１細胞の定量などのTh１応答を検出するELISPOT または任意のアッセイにより、抗原特異的Ｔ細胞の定量を行うことを含む。
【００１５】
ここで、強い反応性とは、細胞単独で得られる平均バックグラウンドを差し引いた後に、工程a)に記載の抗原に対する、500 超の SFC (ELISspot-forming-cells、ELISスポット形成細胞) ／106 PBMC、例えば500 超、1000超または2000超またはそれより大きいSFC の結果と規定され、IRS の指標となり、同時に、典型的には500 〜０／106 PBMCのSFC など、ESAT-6、85B 、CFP-10に対するSFC が検出されないか最小である。あるいは工程b)に記載の抗原に比べて工程a)に記載の抗原に対する250 ％以上のより大きいTh１応答がIRS の指標となる。
【００１６】
好ましくは、細胞単独で得られる平均バックグラウンドは100 以下の SFC／106 PBMCである。
その結果、a)抗原のSFC ／抗原なしのSFC のパーセンテージ (％) はTB-IRSを示すいき値、即ち 250％超、特に 500％超を与える。
【００１７】
その結果、a)抗原のSFC ／b)抗原のSFC のパーセンテージ (％) はTB-IRSを示すいき値、即ち 250％超を与える。
ELISPOT法は、Th１応答を検出する任意の方法、即ちELISpot によりその他のTh１サイトカインを産生するＴ細胞を計量すること、またはフローサイトメトリーと組み合わせた細胞内サイトカイン染色または蛍光顕微鏡検査と定量のいずれかによる、Ｔ細胞により放出されるTh１サイトカインの定量に代えてもよい。
【００１８】
別法としてまたは同時に、試験法は、工程a)およびb)で得られた培養上清を集め、非刺激細胞と比較した工程a)およびb)に記載の抗原で刺激された細胞の培養上清中の少なくとも１種のTh１特異的サイトカイン、即ちIL-2, IL-2R, IL-12p40, IL-15, IL-17, IFN- γ, TNF-α, GMCSF, MIP-1α, MIP-β, MCP-1, MIG, RANTES, IP-10 を定量することを含んでもよい。
【００１９】
かかる分析法は多重サンドイッチ免疫検定法または個別のサイトカイン特異的サンドイッチ免疫検定法を用いて行うことができる。
これらの本発明の別法または同時試験法の１つの特定の面において、少なくとも１種のTh１特異的サイトカインの定量は、ELISA またはRIA によりIFN-γ産生を定量することを含む。
【００２０】
好ましくは、工程a)の末梢血単核細胞を約６〜72時間インキュベートする。さらに、有利には、工程a)の末梢血単核細胞を、約１μｇ／mlの前記「工程a)」のPPD 抗原及び／又は16kDa 蛋白質と共に、および別に約１μｇ／mlの前記「工程b)」のESAT-6抗原組換え蛋白質と共にインキュベートする。PBMCはまた、陰性対照としてCFP-10または85B と共にインキュベートしてもよい。
【００２１】
対照細胞は抗原なしでまたは非マイコバクテリア抗原と共にインキュベートした細胞から選択される。例えば、CMV 抽出物、HIV-1 p24 、フィトヘマグルチニンを用いることができる。培地のみでの培養はバックグラウンドを測定するための陰性対照となる。
【００２２】
本発明の方法は、TBの過程で、特に結核に共感染したHIV 陽性患者における強力な抗レトロウイルス療法 (HAART)の過程で行われる。とりわけ、同時または連続のHAART および結核治療を受けている患者において行われる。
【００２３】
HAART は当分野ではよく知られており、ヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤 (NARTI)もしくは (NRTI) 、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤 (NNARTI) およびプロテアーゼ阻害剤  (PI)またはHIV の標的細胞への侵入を阻害もしくはウイルスＤＮＡの組み込みを阻害するその他の分子、またはHIV 複製を有意に阻止しCD4 Ｔ細胞の再構成を可能にしうるその他の任意の新規抗レトロウイルス分子による複合治療の複数のプロトコルを含む。
【００２４】
第２の態様では、本発明は上記の方法を行うためのキットに関する。
このように、本発明は、TB患者または結核 (TB) とHIV に共感染した患者における免疫再構築症候群 (IRS)の診断キットに関し、これはPPD(精製蛋白質誘導体) と称されるマイコバクテリア抽出物、及び／又は16kDa 蛋白質 (配列番号１) から選ばれるマイコバクテリア抗原、並びにESAT-6 (配列番号２) 、CFP-10 (配列番号２) および85B(配列番号３) から選ばれるMtb 毒性関連結核菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、Mycobacterium tuberculosis) からの少なくとも１つの抗原を含む。別の例では、本キットは16kDa 蛋白質およびESAT-6、CFP-10および85B のうちの少なくとも１つを含む。
【００２５】
さらに、本キットは抗IFN-γ抗体などの、固体担体に結合したTh１免疫応答特異的な抗サイトカイン／ケモカイン抗体の少なくとも１種を含んでもよい。キットの固体担体はELISPOT プレート及び／又はELISA プレートであってもよい。
【００２６】
第３の態様において、本発明は、HAART および結核治療の過程でのTB患者または結核 (TB) とHIV に共感染した患者におけるTB関連免疫再構築症候群 (TB-IRS) を検出するための上記方法およびキットの使用に関する。
【実施例１】
【００２７】
IRS はHIV と結核に共感染した患者におけるマイコバクテリア特異的Th１細胞により誘導される
1-患者および方法
1.1.1 患者
29人の続発的にTB- HIV に共に感染した未治療の患者を、抗TB治療開始時に見込みをもって対象に入れた。この包含の基準は：HIV-1 感染、以前にHAART を行っていない、CD4 のカウントが200 細胞／mm3 以下、包含およびさらなるHAART 開始の指示の長くとも１週間以内に抗TB療法を開始。次に、結核菌 (M.tuberculosis) 感染が証明された (陽性培養または組織学的所見) 場合に確実に対象に包含した。抗マイコバクテリア療法(TBK) の開始時およびHAART の開始時 (M0) およびHAART 開始後１、３、６、および12ヶ月 (M1,3,6,12)に患者を評価した。さらに、IRS 患者(IRS+)をIRS 期間(TIRS ) および20日後に評価した。IRS は以下のように定義される (3)：炎症性反応の回帰（熱、CRP 上昇) 、もとから存在した障害の拡大、またはマイコバクテリウム抵抗性がなく、陽性の培養試料がなく、その他の診断がなく、かつHAART に対する応答を有する (HIV-RNA 減少＞１log コピー／ml) 新たな障害 (リンパ節、胸膜炎) の発生。HAART 開始後３ヶ月以内にIRS を経験しなかった患者はIRS-と判定された。
【００２８】
この研究はSaint-Louis Hospital Institutional-Ethical-Committeeにより受け入れられ、患者全員がインフォームドコンセントに署名した。
1.1.2 方法
マイコバクテリア特異的Th１細胞の定量のためのELISPOT アッセイ
IFN-γを産生する抗原特異的Th１細胞を、マイコバクテリア抽出物 (PPD,１μｇ/ml ；Statens Serum Institute 、コペンハーゲン、デンマーク) およびESAT-6組換え蛋白質 (１μｇ/ml 、Statens Serum Institute 、コペンハーゲン、デンマークより供与) で40時間刺激後、(10)に記載のようにしてELISpot により新鮮末梢血単核細胞 (PBMC) において予測定量した。対照は、CMV 抽出物 (Behring)、HIV-1 p24 (Protein-Sciences)、フィトヘマグルチニン (Murex)、および培地単独を含む。スポットをELISpot 読み取り装置  (Zeiss) を用いて計測し、データはスポット形成細胞 (SFC)/106 PBMC として表した。細胞単独で得られた平均バックグラウンドを差し引いた後SFC/106 PBMCが50より大きい場合、結果は陽性と判断された。
サイトカイン／ケモカイン産生の定量
新鮮PBMCを、上記と同様の抗原でサイトカイン／ケモカイン産生を刺激した。培養上清をインキュベーション２日目に集め、低温保存した。25種類の炎症性および免疫調節性サイトカイン／ケモカイン (IL-1β, IL-1RA, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12p40, IL-13, IL-15, IL-17,IFN-γ, IFN-γ, TNF-α, GMCSF, MIP-1α, MIP-1 β, MCP-1, MIG, RANTES, IP-10, Eotaxin) の定量を(11)に記載のflowmetric Luminex (登録商標) 法 (Luminex 100 TM, Clinisciences)に基づいて多重サンドイット免疫検定 (Human 25-plex(登録商標), Biosource) を用いて４人の患者 (IRS+３人とIRS-１人)   について行った。IFN-γ産生はBiocource ELIZA キットにより同じ上清で定量した。
リンパ球表現型決定
CD4 およびCD8 T-リンパ球表現型を、以下の抗体を用いて標準法による４色フローサイトメリー(7) によって新鮮全血で分析した：抗HLA-DR-FITC (Immunotech)、抗-CD25-PE (Becton Dickinson) 、抗-CD4-PerCPCy5 (Becton Dickinson)、または抗-CD8-PerCP (Becton Dickinson) 、抗-CD3-APC (Becton Dickinson) 。染色された細胞を上記FACScalibur (Becton Dickinson)で解析した。
統計的分析
群の間の比較は必要によりχ2 およびスチューデントt 検定を用いて行った。
1.2 結果
抗TB治療開始時に29人の続発的にTB- HIV に共感染した未治療の患者を見込みをもって対象に入れた。次いで10人を以下の理由により除いた：４人は結核が証明されなかった、５人は移動し、１人は急にICU に移された。残りの19人をHAART 開始後少なくとも３ヶ月間追跡した。そのうち７人 (39％) は、M0から中央値で23日 (12-85)以内にIRS を経験した。IRS 臨床症状を表１に挙げる。
【００２９】
【表１】
2009515143.tif 000003
【００３０】
３人の患者は迅速な回復のための経口ステロイド療法を受けた；その中の１人についてはIRS の時点でHAART を一時的に停止した。IRS の患者 (IRS+) およびIRS のない患者 (IRS-) は人種、年齢、性別、結核の広がりまたはＴBKとＭ0 間の期間 (それぞれ27日対45日、NS) に関して違いはなかった。M0におけるCD4 カウントの中央値は、IRS+患者においてそれほど著しくはないがより低く (IRS+で中央値32/mm3に対し、IRS-で60/mm3、p ＝0.053)、M3においてはIRS+で中央値107/mm3 に対し、IRS-で51/mm (NS)と上昇した。検出不可のウイルス量に達する時間には違いはなかった。
【００３１】
IFN-γを産生するPPD 特異的細胞の数は、２つの群において基準日 (M0）では違いがなかったが、IRS の間はその割り合いは急激に増加し、７人のIRS+患者においては2970 SFC/106  BMC の中央値 (範囲616-3744) に達した（図１ＡおよびＢ、左側）。この爆発的反応性はIRS+患者においてこの抗原に限られ、CMV 特異的応答には影響しなかった。IRS-患者では急性のPPD 特異的応答は１人の患者を除いて生じず (中央値430 SFC/106 PBMC) 、この患者は臨床的IRS はなくM3において1500 SFC/106 PBMC を超える急激な増加を示し、この時点でHAART は接着力が乏しいためもはや有効でなかった。さらに、IRS-患者はIRS+患者よりもCMV により応答した (中央値415 SFC/106 PBMC対150 SFC/106 PBMC)  (図１Ａおよび１Ｂ) 。    
【００３２】
２種のマイコバクテリア抗原に対する反応性を比較すると、PPD 反応性と対比して、３人のIRS+患者のみがIRS の間に、58,142および318 SFC/106 PBMCの頻度でESAT-6特異的陽性応答を示した (図１Ｂ) 。さらに、IRS のない２人の患者のみが、両者ともCD4 ＞100/mm3 と、追跡中にESAT-6抗原を認識した (データ示さず) 。
【００３３】
４人の患者 (IRS+３人、IRS-１人) について広範なプロテオミック解析を行い、抗原刺激PBMC上清において化学発光により25種の炎症性および免疫調節性サイトカイン／ケモカインのin vitro産生を評価した。IRS 間に２つの異なるパターンが観察された。第１に、PPD 特異的IFN-γ産生はその他のPPD 特異的Th１関連サイトカイン／ケモカイン (IL-2, IL-12, IP10 およびMIG)と共にピークに達したが (図１Ｃ) 、Th２サイトカイン調節は生じなかった  (IL-4, IL-5, IL-13, IL-15)。第２に、炎症性サイトカイン／ケモカイン (TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-10, RANTES およびMCP-1) (図１Ｄ) はピークに達し、非刺激細胞および抗原刺激細胞の両方により産生された。さらに、PPD 特異的サイトカイン／ケモカイン産生はIRS+患者においてCMV 特異的応答を大きく超えたが、一方、CMV 反応性はIRS-患者において優勢であった (図１Ｄ右) 。
【００３４】
最後に、CD3+、CD4+およびCD8+Ｔ細胞の全血４色フローサイトメトリー解析により、PPD 特異的IFN-γ産生応答と全く同じ動態 (データ示さず) に続き、活性化マーカー (HLA-DR, CD25+)の発現はIRS の間に明確に増加し、一方予想されるように、これらのマーカーはIRS のない患者においてHAART の間に減少することが示された。
1.3 結論
抗TBおよびHAART 療法を開始した、HIV およびTBの両方に感染した患者の予測的連続検討の結果から、IRS は、HAART により生じる免疫再構築の間の前炎症性事象を伴うTB特異的Th１応答の悪化に対応することが最初に証明された。
【００３５】
PPD 特異的応答の回復がHAART による免疫再構築の特徴であることはよく知られている(12-15) 。我々の予測的検討は、IRS として報告された急性の炎症性臨床症状と同時に生じるPPD 特異的応答の極めて急激で強力かつ再生可能な動態をはっきり示すことにより他のものとは異なる。この急な応答はIRS の間にHAART を中止しコルチコステロイドを投与された１人のIRS+患者のみに欠如し、一方、１人のIRS-患者はIRS の臨床診断がないが、HAART および免疫ウイルス学的コントロールが不十分であるにもかかわらず同様のピークを示した。かかる発見は、おそらくこれまでの研究の後ろ向きな特徴のため未だ証明されていなかった。
【００３６】
さらに、我々はマイコバクテリア特異的応答はPPD に含まれるいくつかの持続的抗原に限られることをここに示す。実際、マイコバクテリアの分泌蛋白質ESAT-6に対する弱い応答は、ESAT-6が抗マイコバクテリア療法後には残らないか、IRS に関与するＴ細胞を刺激しないことを示唆する。この発見は診断に重要である。というのは、ESAT-6に基づく新らしい結核診断試験(16)はこの急性の応答を見逃したであろうから。
【００３７】
IFN-γ産生マイコバクテリア特異的Ｔ細胞の急激な増幅は、その他のTh１および前炎症性サイトカイン／ケモカインの急な発生に関連し、IRS+患者において産生された高濃度のseric IL-6を示すStone et al.(6) の結果と一致する。ここで我々は、両方の現象は共通して報告された臨床所見(2) の突然の始まりと関連することを示す：リンパ節膨張および機能性肉芽腫形成(17)。従って、我々はIRS に対して２段階の病態生理学を提案する：第１の事象はTB肉芽腫病変拡大の原因である、Th２とバランスのとれないPPD 特異的Th１応答の過度の回復であり、これは直ちに、全身の炎症性症候群を誘導する、非特異的前炎症性サイトカインおよびケモカインの急速な放出を生じさせる。この後者の発見は、重篤なIRS 患者における全身性抗炎症剤及び／又は免疫抑制剤の使用を裏付ける。
【００３８】
この機序は、おそらく抗TB療法中に同等の逆説的反応を経験する非HIV 患者にも拡張できる。非HIV 患者の中には、IFN-γ分泌が活性なTB感染中に消失し、抗マイコバクテリア治療の間に再出現する場合がある(18)。IFN-γ産生の脱阻害 (desinhibition)は、免疫が大きく抑制された患者における免疫応答の回復と共に特に強いかもしれない。このマイコバクテリア抗原への生理学的応答が何人かの患者において非常に強くなり、時に生命を脅かすようになる理由について説明する因子は明らかでないが、Th１機能を調節する遺伝的要因が、既にP.Price (19)により提案されたようにIRS およびその重篤度に対する素因を決定しているかもしれない。
【００３９】
結論として、いくつかのマイコバクテリア抗原に対するTh１応答の急性の増加が、HIV およびTBの両方に感染した患者においてIRS を引き起こすようである。
【実施例２】
【００４０】
IRS はツベルクリン(PPD) および16kDa 蛋白質に対して特異的な爆発的Th１応答と関連する
(材料および方法) 
被検者および患者
CD４細胞数の中間値が基準日 (TB診断の期間、T TB) で58/mm3であるHIV とTBの両方に感染した14人の患者 (IRS+７人、IRS-７人) を、基準日、およびIRS + 患者についてはIRS の期間 (またはその後の期間) またはIRS-の患者についてはHAART の開始後の１〜６ヶ月において抗マイコバクテリア応答について試験した。
【００４１】
対照として、BCG を接種したTBおよびHIV 陰性の４人、および非接種の１人を試験した。HIV 陰性であるがTB陽性の４人の患者、およびHIV 陽性であるがTB陰性の患者１人もまた対照として試験した。
【００４２】
アッセイ：
IFN-γを産生する抗原特異的Th１細胞を、以下の２系列のアッセイを用いて新鮮および凍結末梢血の単核細胞 (PBMC) において定量した：
・既報 (Martinez V, JID 2005) のように、対照抗原で刺激40間後のELISpot はフィトヘマグルチニン (Murex)および培地のみを含んでいた。スポッをELISpot 読み取り装置 (Zeiss)を用いて計測し、データをスポット形成細胞 (SFC)/106 PBMC で表した。細胞単独で得られた平均バックグラウンドを差し引いた後50より大きいSFC/106 PBMCの場合、結果は陽性と考えられる。
・IFN-γ産生細胞の細胞内サイトカイン染色 (ICS)を、PPD (10 μｇ/mL)、天然16kDa で16時間刺激後、または刺激せずに測定し、分泌はブレフェルダインＡ (blefeldine A) でブロックし、染色はFACSCalibur で分析した。
【００４３】
抗原
マイコバクテリア抽出物 (PPD,１μｇ/ ml； Statens-Serum-Institute、コベンハーゲン、デンマーク) 、ESAT-6組換え蛋白質 (１μｇ/ml 、米国コロラドのコロラド州立大学の研究所より供与) 。天然16kDa 蛋白質はICSUより供与された。ICSU (米国) より供与された以下の抗原も試験した：組換えAcr1 (HSPX) 、天然38kDa 、組換えAra-およびMan-LAM(それぞれ５、20、５、20および20μｇ/ml)。Acr, TB10.4, TB10.3, Apa, 組換えPhosI  (パリ、パスツール研究所、Claude Leclercより供与) を最適化濃度で試験した。RD1, CFP10抗原を市販のT-spot TB(登録商標)test (Oxford Immunotech, Oxford, Chapman A, AIDS 2002) において製造者の推奨に従い試験した。
【００４４】
純度が少なくとも80％でHPLCで確認した均質性を有する、16kDa 蛋白質の配列にまたがる、10個のアミノ酸が重複する合成20-mer隣接ペプチド14種 (Genepep(登録商標))を、個々に試験するか、最適濃度でプールした。
【００４５】
(結果) 
IRS における標的化抗原の同定
IRS において認められたツベルクリン製剤に含まれる抗原が何であるかを正確に規定し、確実な診断アッセイのための基礎を用意するために、このツベルクリン特異的応答の標的化抗原をELISpot IFN-γで探した (結果は表２に示す) 。
表２：スポット形成細胞 (SFC)/106 PBMC で表したELISpot IFN-γ抗原特異的Ｔ細胞定量
ND＝実施せず、N pos ＝陽性結果の数／試験した数、T TB＝抗マイコバクテリア療法開始、1 ：IRS+およびIRS-  データ(SFC/106 PBMC)間の非母数のマン・ホイットニー検定、 *：p ＜0.05, §：p ＝0.07
【００４６】
【表２】
2009515143.tif 000004
【００４７】
まず、我々は、試験したすべての被検者において、HIV 感染患者のような高度な免疫無防備状態の被検者であっても、ELISpot で定量したPPD および16kDA 特異的応答の間に高い相関性を見出した (図２) 。この高い相関性はその他の抗原では見られなかった。
【００４８】
PPD について観察されるように、IRS の時期は16kDa 特異的応答は試験したIRS+患者において急激に上がり (表３) 、IRS-患者においてよりも著しく高い (表２) 。これは試験したその他の抗原、特にRD1 抗原 (ESAT-6およびCFP-10) ではそうではなかった。
IRS におけるツベルクリンおよび16kDa 特異的Ｔ細胞の表現型特性決定
IRS の時期、PPD および16kDa 特異的細胞の14％はCD8+であり、80％はCD4+であり、全CD4 の35％までを発現する。これらのCD4 Ｔ細胞は活性化され (100 ％がHLA-DR+)、TNF-αを共に産生するが、IL-2は産生せず、エフェクター記憶細胞である (84％がCD45RA-CD-27- である) 。
【００４９】
(結論) 
我々の結果は、IRS がPPD および天然16kDa 特異的Th１細胞応答の両方に関連するが、その他のTB抗原に対するＴ細胞応答には関連しないことを実証する。これらの発見により、IRS は、休止状態からのTB抗原に対する、しかし分泌抗原またはその他の活性結核関連抗原に対するものではない、エフェクター記憶CD4 Ｔ細胞の爆発的再活性化によることが示唆される。応答は天然蛋白質および16kDa の免疫優性ペプチドによって誘導されうる。従って、これらの結果はIRS の免疫学的診断のための独自の手段を提供し、TBの再発とIRS とを区別することを可能にする。
（参考文献）
【００５０】
【表３】
2009515143.tif 000005
【００５１】
【表４】
2009515143.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１Ａ〜１ＤはIRS 患者およびIRS ではない患者のPPD 特異的反応性を示す。左欄はIRS + 患者のデータを表し、右欄はIRS-患者のデータを表す。  図１Ａは、PPD(赤色) またはCMV(青緑色) でのPBMC刺激40時間後のIRS+およびIRS-の全患者で行われたELISpot IFN-γアッセイの、スポット形成細胞(SFC) ／106PBMC で表した全結果を示す。  図１Ｂ、１Ｃ、１ＤはIRS+患者１人およびIRS-の患者１人からの代表的結果を示す。  図１Ｂは、PPD 、ESAT6(赤色) と対照抗原 (CMV 、HIV1p24) (青緑色) で刺激後のIFN-γ ELISpotを示す。図１Ｃ、１Ｄは、IRS + およびIRS-の２人の代表的患者においてPPD  (赤色) 、CMV(青緑色) および培地単独でのin vitroPBMC刺激後の発光で測定した産生を示し、図１ＣはIFN-γ (■) 、IL-2 (★) 、IP-10(▲) について、図１ＤはTNF-α (★) 、IL-6( ■) 、IL-1β (▲) について示す。
【図２】PPD および天然16kDa(左) 、ESAT-6 (右) 特異的細胞のELISpot 定量 (SFC/106PBMC)(n＝37) の回帰曲線を示す。
【図３】スポット形成細胞(SFC) ／106PBMC で表した、ELISpot により測定した１人のIRS+患者における抗原特異的細胞の数の動態を示す。ＴTB＝抗マイコバクテリア療法開始、ＴIRS ＝IRS の期間、M3＝HAART 開始後３ヶ月。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009515143.tif 000014
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