(57)【要約】本発明は、超臨界ＣＯ２抽出法によって調製されたニワトコ種植物材料の抽出物、被験体においてウイルスを処置する方法、およびそれらの細胞中でのウイルス感染を阻害する方法に関する。本発明は、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス中で測定した場合に１５０μｇ／ｍＬ〜１５００μｇ／ｍＬのＩＣ５０を有する画分を含む、ニワトコ種抽出物に関する。本発明は、本発明のニワトコ種抽出物に関するが、前記画分は、アントシアニン；フラボノイド；Ｃ１６もしくはＣ１８の飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸、アルコール、もしくはエステル；および／または多糖類を含んでいる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図３６〜図７０のいずれかのリアルタイム直接分析（ＤＡＲＴ）質量分析クロマトグラムを有する画分を含む、ニワトコ種抽出物。
【請求項２】
前記画分は、図４６〜図５０のいずれかのＤＡＲＴ質量分析クロマトグラムを有する、請求項１に記載のニワトコ種抽出物。
【請求項３】
前記画分は、図４８のＤＡＲＴ質量分析クロマトグラムを有する、請求項１に記載のニワトコ種抽出物。
【請求項４】
Ｈ１Ｎ１インフルエンザ阻害アッセイにおいて測定された１５０μｇ／ｍＬ〜１５００μｇ／ｍＬのＩＣ５０を有する画分を含む、ニワトコ種抽出物。
【請求項５】
前記画分は、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ阻害アッセイにおいて測定された１５０μｇ／ｍＬ〜７５０μｇ／ｍＬのＩＣ５０を有する画分を有する、請求項４に記載のニワトコ種抽出物。
【請求項６】
前記画分は、１５０μｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬのＩＣ５０を有する、請求項４に記載のニワトコ種抽出物。
【請求項７】
前記画分は、少なくとも約１９５μｇ／ｍＬのＩＣ５０を有する、請求項４に記載のニワトコ種抽出物。
【請求項８】
前記画分は、アントシアニン；フラボノイド；Ｃ１６もしくはＣ１８の飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸、アルコール、もしくはエステル；および／または多糖類を含む、請求項１または４に記載のニワトコ種抽出物。
【請求項９】
前記アントシアニンは、シアニジン−３−グルコシドおよびシアニジン−３−サンブビオシドからなる群から選択される、請求項８に記載のニワトコ種抽出物。
【請求項１０】
前記アントシアニンの量は、１０重量％より多い、請求項８に記載のニワトコ種抽出物。
【請求項１１】
前記フラボノイドは、ルチンである、請求項８に記載のニワトコ種抽出物。
【請求項１２】
前記Ｃ１６もしくはＣ１８の飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸、アルコール、もしくはエステルは、ヘキサデカノール、ヘキサデカン酸、ヘキサデカン酸メチルエステル、ヘキサデカン酸エチルエステル、ヘキサデカン酸ブチルエステル、オクタデカン酸、オクタデカン酸エチルエステル、オクタデカン酸ブチルエステル、９−オクタデセン−１−オール、９，１２−オクタデカン酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載のニワトコ種抽出物。
【請求項１３】
前記Ｃ１６もしくはＣ１８の飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸、アルコール、もしくはエステルの量は、少なくとも約２重量％である、請求項８に記載のニワトコ種抽出物。
【請求項１４】
前記多糖類は、デキストラン、グルコース、アラビノース、ガラクトース、ラムノース、キシロース、ウロン酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載のニワトコ種抽出物。
【請求項１５】
前記多糖類の量は、少なくとも約１０重量％である、請求項８に記載のニワトコ種抽出物。
【請求項１６】
アントシアニン；Ｃ１６もしくはＣ１８の飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸、アルコール、もしくはエステル；および多糖類を含む、請求項８に記載のニワトコ種抽出物。
【請求項１７】
前記アントシアニンは、シアニジン−３−グルコシドおよびシアニジン−３−サンブビオシドからなる群から選択される、請求項１６に記載のニワトコ種抽出物。
【請求項１８】
前記アントシアニンの量は、１０重量％より多い、請求項１６に記載のニワトコ種抽出物。
【請求項１９】
前記Ｃ１６もしくはＣ１８の飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸、アルコール、もしくはエステルは、ヘキサデカノール、ヘキサデカン酸、ヘキサデカン酸メチルエステル、ヘキサデカン酸エチルエステル、ヘキサデカン酸ブチルエステル、オクタデカン酸、オクタデカン酸エチルエステル、オクタデカン酸ブチルエステル、９−オクタデセン−１−オール、９，１２−オクタデカン酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１６に記載のニワトコ種抽出物。
【請求項２０】
前記Ｃ１６もしくはＣ１８の飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸、アルコール、もしくはエステルの量は、少なくとも約２重量％である、請求項１６に記載のニワトコ種抽出物。
【請求項２１】
前記多糖類は、デキストラン、グルコース、アラビノース、ガラクトース、ラムノース、キシロース、ウロン酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１６に記載のニワトコ種抽出物。
【請求項２２】
前記多糖類の量は、少なくとも約１０重量％である、請求項１６に記載のニワトコ種抽出物。
【請求項２３】
請求項１または４に記載のニワトコ種抽出物を含む、食品もしくは医薬。
【請求項２４】
ウイルスに感染した被験体を処置する方法であって、それを必要とする被験体に有効量の請求項１または４に記載のニワトコ種抽出物を投与する工程を含む、方法。
【請求項２５】
前記ウイルスは、エンベロープウイルスである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記エンベロープウイルスは、フラビウイルスである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ウイルスは、非エンベロープウイルスである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルス、Ａ型ヒトインフルエンザウイルスおよびＢ型ヒトインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ＳＡＲＳ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、フラビウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、西ナイル熱ウイルス、および脳炎ウイルスからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記ウイルスは、ノーウォークウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、アンドウイルスおよびライノウイルスからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記被験体は、霊長類、鳥類、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、齧歯類、ネコ、もしくはイヌである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記被験体は、ヒトである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
細胞のウイルス感染を阻害する方法であって、該細胞を請求項１または４に記載のニワトコ種抽出物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項３３】
前記ウイルスは、エンベロープウイルスである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記エンベロープウイルスは、フラビウイルスである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ウイルスは、非エンベロープウイルスである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルス、Ａ型ヒトインフルエンザウイルスおよびＢ型ヒトインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ＳＡＲＳ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、フラビウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、西ナイル熱ウイルス、および脳炎ウイルスからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記ウイルスは、ノーウォークウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、アンドウイルスおよびライノウイルスからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも１つの所定の特性を有するニワトコ種抽出物を調製する方法であって：
ａ）超臨界二酸化炭素抽出によってニワトコ種植物材料を抽出して精油画分および第１残留物を生成する工程；と
ｂ）約４０℃〜約７０℃の水または含水アルコール抽出によってニワトコ種植物材料または工程ａ）からの第１残留物を抽出してポリフェノール画分および第２残留物を生成する工程；と
ｃ）約７０℃〜約９０℃の水抽出によって工程ｂ）からの第２残留物を抽出して多糖類画分を生成する工程；と
によって、精油画分、ポリフェノール画分および多糖類画分を生成するためにニワトコ種植物材料を連続的に抽出する工程を含む、方法。
【請求項３９】
工程ａ）は：
１）抽出容器に微粉化したニワトコ種植物材料を装填する工程；と
２）超臨界条件下で二酸化炭素を加える工程；と
３）該ニワトコ種植物材料および該二酸化炭素をある時間接触させる工程；と
４）収集容器に精油画分を収集する工程;と
を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
超臨界二酸化炭素分別分離システムを用いて前記精油抽出物を分留することによって該精油化学成分の複合比を変化させる工程をさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
工程ｂ）は：
１）微粉化したニワトコ種植物材料または工程ａ）からの前記残留物と約４０℃〜約７０℃の水または含水アルコール溶液とを、ポリフェノール酸化学成分を抽出するために十分な時間にわたり接触させる工程；と
２）前記工程ａ）からの抽出したポリフェノール酸化学成分の水溶液もしくは含水アルコール溶液を親和性吸着剤樹脂カラムに通過させる工程であって、アントシアニジンを含む該ポリフェノール酸が吸着される工程；と
３）該親和性吸着剤樹脂から精製した該ポリフェノール酸化学成分画分を溶出させる工程；と
を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
多糖類画分を抽出するための前記方法は：
１）工程ｂ）からの前記第２残留物を約７０℃〜約９０℃の水と、多糖類を抽出するために十分な時間にわたり接触させる工程；と
２）該多糖類をエタノール沈降法によって水溶液から沈降させる工程；と
を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
請求項３８〜４２のいずれかに記載の方法によって調製された、ニワトコ種抽出物。
【請求項４４】
ピロガロール、該ピロガロールの１５重量％〜２５重量％のメチル桂皮酸、該ピロガロールの１重量％〜４重量％のシンナミド、該ピロガロールの５重量％〜１０重量％の２−メトキシフェノール、該ピロガロールの１重量％〜２重量％のベンズアルデヒド、該ピロガロールの５重量％〜１０重量％の桂皮アルデヒド、および該ピロガロールの５重量％〜１５重量％の酢酸シンナミルを含む、ニワトコ種抽出物。
【請求項４５】
ルチン、該ルチンの２０重量％〜３０重量％のフェルラ酸、該ルチンの２５重量％〜３５重量％の桂皮酸、該ルチンの１５重量％〜２５重量％のシキミ酸、および該ルチンの５５重量％〜６５重量％のフェニル乳酸を含む、ニワトコ種抽出物。
【請求項４６】
ルチン、該ルチンの１重量％〜１０重量％のタキシフォリン、該ルチンの１重量％〜５重量％のフェルラ酸、該ルチンの１重量％〜５重量％の桂皮酸、該ルチンの０．５重量％〜５重量％のシキミ酸、該ルチンの１重量％〜５重量％のフェニル乳酸、該ルチンの５重量％〜１５重量％のシアニジン、および該ルチンの１５重量％〜２５重量％のペツニジンを含む、ニワトコ種抽出物。
【請求項４７】
ルチン、該ルチンの３０重量％〜４０重量％のシアニジン、該ルチンの７５重量％〜８５重量％のペツニジン、該ルチンの５重量％〜１０重量％のバニリン酸、該ルチンの１重量％〜５重量％のフェルラ酸、および該ルチンの１重量％〜１０重量％の桂皮酸を含む、ニワトコ種抽出物。
【請求項４８】
ｐ−クマル酸／フェニルピルビン酸、ｐ−クマル酸／フェニルピルビン酸の６５重量％〜７５重量％のルチン、ｐ−クマル酸／フェニルピルビン酸の６５重量％〜７５重量％のバニリン酸、ｐ−クマル酸／フェニルピルビン酸の３５重量％〜４５重量％のフェルラ酸、ｐ−クマル酸／フェニルピルビン酸の６５重量％〜７５重量％の桂皮酸、およびｐ−クマル酸／フェニルピルビン酸の４５重量％〜５５重量％のシキミ酸を含む、ニワトコ種抽出物。
【請求項４９】
ルチン、該ルチンの２０重量％〜３０重量％のヘスペリジン、該ルチンの７０重量％〜８０重量％のバニリン酸、および該ルチンの４０重量％〜５０重量％の桂皮酸を含む、ニワトコ種抽出物。
【請求項５０】
ペツニジン、該ペツニジンの８５重量％〜９５重量％のルチン、該ペツニジンの５５重量％〜６５重量％のバニリン酸、および該ペツニジンの３０重量％〜４０重量％の桂皮酸を含む、ニワトコ種抽出物。
【請求項５１】
ルチン、該ルチンの５重量％〜１５重量％のシアニジン、該ルチンの１重量％〜１０重量％のタキシフォリン、該ルチンの５重量％〜１５重量％のコーヒー酸、該ルチンの１重量％〜１０重量％のフェルラ酸、該ルチンの１重量％〜１０重量％のシキミ酸、該ルチンの２５重量％〜３５重量％のペツニジン、および該ルチンの１重量％〜５重量％のエリオジクチオールもしくはフスチンを含む、ニワトコ種抽出物。
【請求項５２】
ルチン、該ルチンの１０重量％〜２０重量％のシアニジン、該ルチンの１重量％〜５重量％のエリオジクチオールもしくはフスチン、該ルチンの１０重量％〜２０重量％のナリンゲニン、および該ルチンの１重量％〜１０重量％のタキシフォリンを含む、ニワトコ種抽出物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、米国仮特許出願第６０／７８３，４５３号（２００６年３月１７日出願）、米国仮特許出願第６０／８４６，４１２号（２００６年９月２２日出願）、および米国仮特許出願第６０／８７３，４７３号（２００６年１２月７日出願）（これらは、それらの全体が本明細書に参考として援用される）に基づく優先権の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、比類なく上昇した精油化学成分、フェノール酸化学成分、アントシアニジンもしくはプロアントシアニジン化学成分、もしくはレクチン−多糖類化学成分を有するニワトコのサンブカ（Ｓａｍｂｕｃａ）種に由来する抽出物および抽出方法、そのような方法によって抽出された抽出物ならびにそのような抽出物の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ヨーロッパ、北アフリカおよび西アジアを原産とするニワトコ、Ｓａｍｂｕｃａ  ｎｉｇｒａ  Ｌ．は、野生灌木である。ニワトコは、詳細には２０種を超えるサンブカ種から構成されるが、それらの多くは類似の化学成分を有する。Ｓａｍｂｕｃａ  ｎｉｇｒａ  Ｌ．は、科学的研究のほとんどが実施されている種である。Ｓａｍｂｕｃａ  ｎｉｇｒａ  Ｌ．は、クリーム色の花を咲かせ、濃い藍色の果実（エルダーベリー）がなる、高さ１０ｍまで成長する落葉樹である。花、葉、および果実はすべてが、精油化合物、詳細にはフラボノイドおよびアントシアニジンであるフェノール酸、レクチンタンパク質化合物、および多糖類化合物を含む、医学的に重要な化学成分を含有している。
【０００４】
薬剤としてのサンブカ種の使用は、Ｈｉｐｐｏｃｒａｔｅｓ、Ｄｉｏｓｃｏｒｉｄｅｓ、およびＰｌｉｎｙの書物にも含まれおり、紀元前５世紀までさかのぼる。ニワトコには、アメリカ先住民およびヨーロッパの植物学者の間で伝統的に使用されてきたという長い歴史がある。伝統的な医学的使用および現代の研究活動の焦点は、花の抽出物に当てられてきた。
【０００５】
花は春に収穫され、芳香の消失を最小限に抑えるために４０℃未満で日光を避けて乾燥させられる。果実は、十分に熟してから秋に収穫される。商業的目的での花および果実のほとんどは、ロシア連邦、ポーランド、ハンガリー、ブルガリア、およびポルトガルから輸入されている。果実は、ワイン、ウィンターコーディアル（ｗｉｎｔｅｒ  ｃｏｒｄｉａｌ）、保存料、食品、および香辛料のために、風味および色を加えるためにも使用される。花および果実はどちらも、薬剤としての長い歴史を有している。
【０００６】
Ｓａｍｂｕｃａ  ｎｉｇｒａ  Ｌ．の花および果実の化学成分には、生物活性フェノール酸（フラボノイドおよびアントシアニジン）、タンパク質、多糖類、およびビタミン類（Ｃ、Ｐ、Ｂ１、Ｂ２、およびＢ６）が含まれる。サンブカ種の花および果実の化学成分に関する情報は不完全であるが、知られている化学成分は表１に列挙した。商業的および生物学的観点から、フラボノイドおよびアントシアニジンは、他の成分より重要性が高いと以前から考えられている。
【０００７】
（表１．Ｓａｍｂｕｃａ  ｎｉｇｒａ  Ｌ．（Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ  Ｌ．）の花部および果実の化学成分）
【０００８】
【表１】
2009531316.tif 000002
ニワトコ種の薬効特性は、薬理学的に活性なその化学成分の存在下で生じる。化学的含有物についての一般的法則として、強度に有色の果実は、顔料としての高レベルのアントシアニジン、ならびにフラボノールグリコシドおよびアグリコンを含有している（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００９】
アントシアニジンは、２−フェニルベンゾピリリウム塩のグリコシル化−ポリヒドロキシ誘導体およびグリコシル化−ポリメトキシ誘導体である（非特許文献３）。エルダーベリーは、これらの顔料が最も豊富な起源の１つであり、０．２〜１％の含有量を有するが、これはブドウ類で見いだされる含有量よりはるかに高い（非特許文献４）。エルダーベリーは、数種の相違するアントシアニンを含有しており、その中ではシアニジン−３−サンブビオシド（ｓａｍｂｕｂｉｏｓｉｄｅ）（化合物１）およびシアニジン−３−グルコシド（化合物２）は、量的に最も重要であり、アントシアニジン含量の８５％以上を占めているが、他方シアニジン−３−サンブビオシド−５−グルコシド（化合物３）およびシアニジン−３，５−ジグルコシド（化合物４）は、ほんの微量しか存在しない（非特許文献５；非特許文献６）。アントシアニジンは、一連の生物学的活性を示す。最もよく知られている特性の１つは、詳細にはシアニジン誘導体の抗酸化活性である（非特許文献６；非特許文献７）。
【００１０】
【化１】
2009531316.tif 000003
様々なクラスのビルベリー由来フェノール酸化合物がインビトロで大腸癌細胞増殖を阻害する能力について試験すると、アントシアニジンは、強力なフェノール系誘導体であることが見いだされた（非特許文献８）。シアニジンは、詳細には強力な抗発癌性ゲニステインのために必要とされる濃度の１／１０に過ぎない２μｇ／ｍＬという低濃度で細胞増殖を阻害することに極めて有効であった。抗癌活性は、ブルーベリー由来のアントシアニンについても言及されている（非特許文献９）。
【００１１】
ルチンおよびイソクエルシトリンは、ニワトコ種植物材料中で主要なフラボノールグリコシドである（非特許文献１０）。これらの化合物は、強力なラジカルスカベンジャーとして作用する（非特許文献１１；非特許文献１２）、様々な酵素を阻害する（非特許文献１３）能力を有しており、さらに血管を収縮させることによる抗出血活性（非特許文献１４）を有している。Ｓａｍｂｕｃａ  ｎｉｇｒａ  Ｌ．の花、果実および葉の加速溶媒抽出法を用いた試験では、ルチンは主要フラボノイドであることが見いだされた。花は、各々２〜３％および０．１％の濃度で最高量のルチンおよびイソクエルシトリンを有していた。エルダーベリーおよび葉は、約０．２％の濃度で類似量のルチンを有している。結果は、表２に示した。
【００１２】
【化２】
2009531316.tif 000004
（表２．８０％メタノールによる、Ｓａｍｂｕｃａ  ｎｉｇｒａ  Ｌ．の様々な部分由来のルチンおよびイソクエルシトリンの抽出収率）
【００１３】
【表２】
2009531316.tif 000005
ニワトコ種植物材料は、その揮発性成分に起因して心地よい強い芳香を有している。ニワトコの葉内では、数種のアルカンが同定されており、ヘプタコサン、ノナコサンおよびヘントリアコンタンが量的に最も重要なアルカンである。ニワトコの花由来の精油中では、脂肪酸（６６％）およびｎ−アルカン（７．２％）が高濃度である。ニワトコの花由来の精油の蒸気蒸留からは７９種の化合物が同定されている（非特許文献１５）。精油の主要成分は、トランス−３，７−ジメチル−１，３，７−オクタトリエン−３−オール（１３％）、パルミチン酸（１１．３％）、リナロール（３．７％）、シス−ヘキセノール（２．５％）ならびにシス−およびトランス−ローズ酸化物（各々、３．４％および１．７％）であった。
【００１４】
市販の主要なエルダーベリー抽出物は、０．５％の濃度のアントシアニジンを含有している（非特許文献１６）。優勢なアントシアニジンは、シアニジン−３−モノグリコシド（９７％）およびシアニジン−３，５−ジグリコシド（３％）であった。濃縮物は、コーヒー酸誘導体（０．０１１％）およびルチン（０．０５５）の存在によっても特徴付けられた。
【００１５】
トリテルペンおよびフラボノイドは、サンブカ種の生物活性の原因となる主要化学成分であると長年考えられてきた（非特許文献１７）。しかし、４種の主要アントシアニジンは、サンブカ種の抗インフルエンザ活性において重要な役割を果たすと思われる。これらのアントシアニジンは、サンブカ抽出物への４時間にわたる曝露後には内皮細胞の血漿膜および細胞質ゾル中に組み込まれる（非特許文献１８）。サンブカ種のアントシアニジンが豊富なヒトおよび動物内皮細胞は、酸化ストレッサーに対する保護作用を付与すると思われる。さらに、サンブカ種の果実の抽出物は、酸素ラジカル吸収能力を有することが証明されている（非特許文献１９）。サンブカ種のレクチンおよびリボソーム不活性化タンパク質は、さらに抗ウイルス活性を示す（非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２）。Ｓａｍｂｕｃａ  ｎｉｇｒａ  Ｌ．の果実の標準化抽出物（Ｓａｍｂｕｃｏｌ（登録商標）、Ｒａｚｅｉ  Ｂａｒ社、エルサレム）（成人用量：４ｇ）は、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｃａ（根茎）抽出物、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ  ｐｕｒｐｕｒａ（幹、葉、および花）抽出物、ビタミンＣ（１００ｍｇ）および亜鉛（１０ｍｇ）と結合されたアントシアニジンとともに３８％のブラックエルダーベリー抽出物を含有しており、以下の特性を示す：ヒトにおけるインフルエンザウイルスによって生成される赤血球凝集の阻害（非特許文献２３）；ヒトおよびインビトロにおけるウイルス複製の阻害（非特許文献２３）；ヒトにおける炎症性および抗炎症性サイトカインの産生増加（非特許文献２４）；赤血球凝集の減少ならびにＡ型ヒトインフルエンザウイルスおよびＢ型ヒトインフルエンザウイルスのインビトロでの複製の阻害（非特許文献２３）；インビトロでのＨＩＶの感染性の減少（非特許文献２５）；インビトロでのＨＳＶ−Ｉ菌株複製の阻害（非特許文献２５）；ラットモデルにおける結腸炎の減少（非特許文献２６）；チンパンジーにおけるインフルエンザの症状の減少（非特許文献２７）；そして、あるランダム化臨床試験はヒトにおけるＡ型インフルエンザおよびＢ型の症状の減少を証明した（非特許文献２５）。Ｓａｍｂｕｃａ  ｎｉｇｒａ  Ｌ．に由来する他の抽出組成物を用いた追加の所見には：リソソーム酵素の増強、リポキシゲナーゼ添加生成物の生成の減少、およびインビトロでのミエロペルオキシダーゼ活性の減少（非特許文献２５）；インビトロでの酸化ストレスに対する保護（非特許文献２８）；インビトロでの酸素ラジカル吸収能力の増加（非特許文献２９）ならびにインビボでのインスリン様作用およびインスリン遊離作用（非特許文献３０）が含まれる。
【００１６】
Ｓａｍｂｕｃａ  ｎｉｇｒａ  Ｌ．の化学成分の治療的価値を手短に要約すると、科学的研究および臨床試験は、抗ウイルス、抗感冒、抗インフルエンザ、抗ＨＩＶ、抗ＨＳＶ（トリテルペン、アントシアニジン、レクチンタンパク質、多糖類、粗抽出物）；酸化防止剤および酸素フリーラジカル捕捉（フラボノイド、アントシアニジン、粗抽出物）；抗炎症活性（粗抽出物）；抗糖尿病活性（多糖類、水溶性抽出物）；腸活性の調節および下痢の緩和（抽出物）；ならびに興奮および情動不安の減少（抽出物）を含む、サンブカ種の様々な化合物、化学基、もしくは抽出組成物の治療作用を実証している。さらに、Ｓａｍｂｕｃａ  ｎｉｇｒａ  Ｌ．の花もしくは果実（エルダーフラワーもしくはエルダーベリー）の抽出組成物には、一般に知られている禁忌はなく、安全であると考えられている。
【非特許文献１】Ｅｓｐｉｎ  ＪＣら、Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，２０００年，第４８号，ｐ．１５８８−１５９２
【非特許文献２】Ｋａｈｋｏｎｅｎ  ＭＰら、Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，２００１年，第４９号，ｐ．４０７６−４０８２
【非特許文献３】Ｂｒｏｕｉｌｌａｒｄ  ＫａＨＳＨ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２年
【非特許文献４】Ｂｒｏｎｎｕｍ−Ｈａｎｓｅｎ  Ｋら、Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８５年，第２０号，ｐ．７０３−７１１
【非特許文献５】Ｂｒｏｎｎｕｍ−Ｈａｎｓｅｎ  Ｋら、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１９８３年，第２６２号，ｐ．３９３−３９６
【非特許文献６】Ｄｒｄａｋ  ＭおよびＤａｕｃｉｋ  Ｐ．Ａｃｔａ  Ａｌｉｍｅｎｔ，年，第１９号，ｐ．３−７
【非特許文献７】Ｔｓｕｄａ  Ｔら、Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，１９９４４２年，ｐ．２４０７−２４１０
【非特許文献８】Ｋａｍｅｉ  Ｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ，１９９５年，第１３号，ｐ．５９０−５９４
【非特許文献９】Ｓｍｉｔｈ  ＭＡＬら、Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ，２０００年，第６５号，ｐ．３５２−３５６
【非特許文献１０】Ｐｉｅｔｔａ  ＰおよびＢｒｕｎｏ  Ａ．Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１９９２年，第５９３号，ｐ．１６５−１７０
【非特許文献１１】Ｓｈａｈｉｄｉ  ＦおよびＷａｎｎａｓｕｎｄｒａ  ＰＫ．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ  Ｎｕｔｒ，１９９２年，第３２号，ｐ．６７−１０３
【非特許文献１２】Ｒｉｃｅ−Ｅｖａｎｓ  ＣＡら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌ  ＆  Ｍｅｄ，１９９６年，第２０号，ｐ．９３３−９５６
【非特許文献１３】Ｆｏｒｍｉｃａ  ＪＶおよびＲｅｇｅｌｓｏｎ  Ｗ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｏｘｉｃ，１９９５年，第３３号，ｐ．１０６１−１０８０
【非特許文献１４】Ｄａｗｉｄｏｗｉｃｚ  ＡＪら、Ｊ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＣｈｒｏｍｏｔｏｇおよびＲｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２００３年，第２６号，ｐ．２３８１−２３９７
【非特許文献１５】Ｔｏｕｌｅｍｏｎｄｅ  Ｂら、Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，１９８３年，第３１号，ｐ．３６５−３７０
【非特許文献１６】Ｅｓｐｉｎ  ＪＣら、Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，２０００年，第４８号，ｐ．１５８８−１５９２
【非特許文献１７】Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ  Ｍら、Ｈｅｒｂａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ，２０００年，ｐｐ．１０３−１０５
【非特許文献１８】Ｙｏｕｄｉｎ  ＫＡら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ，２０００年，第２９号，ｐ．５１−６０
【非特許文献１９】Ｒｏｙ  Ｓら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｒｅｓ，２００２年，第３６号，ｐ．１０２３−１０３１
【非特許文献２０】Ｖａｎｄｅｒｂｕｓｓｃｈｅ  Ｆら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００４年，第２７号，ｐ．１５０８−１５１５
【非特許文献２１】ｄｅ  Ｂｅｎｉｔｏ  ＦＭら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，１９９８年，第４２８号，ｐ．７５−７９
【非特許文献２２】Ｆｕｊｉｍｕｒａ  Ｙら、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ，２００３年，第４４４号，ｐ．３６−４２
【非特許文献２３】Ｚａｋａｙ−Ｒｏｎｅｓ  Ｚら、Ｊ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ＆  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９５年，第１号，ｐ．３６１−３６９
【非特許文献２４】Ｂａｒａｋ  Ｖら、Ｉｓｒ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ  Ｊ  ，２００２，第４号（補遺１１），ｐ．９１９−９２２
【非特許文献２５】Ｚａｋａｙ−Ｒｏｎｅｓ  Ｚら、Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ，２００４年，第３２号，ｐ．１３２−１４０
【非特許文献２６】Ｂｏｂｅｋ  Ｐら、Ｂｉｏｌｏｇｉａ  Ｂｒａｔｉｓｌａｖｉａ，２００２年，第５６号，ｐ．６４３−６４８
【非特許文献２７】Ｇｒａｙ  ＡＭら、Ｊ  Ｎｕｔｒ，２０００年，第３０号，ｐ．１５−２０
【非特許文献２８】Ｂｒｏｕｉｌｌａｒｄ  ＫａＨＳＨ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２年
【非特許文献２９】Ｂｒｏｎｎｕｍ−Ｈａｎｓｅｎ  Ｋら、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１９８３年，第２６２号，ｐ．３９３−３９６
【非特許文献３０】Ｇｒａｙ  ＡＭら、Ｊ  Ｎｕｔｒ，２０００年，第３０号，ｐ．１５−２０
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（発明の要旨）
１つの態様では、本発明は、図３６〜７０のいずれかのリアルタイム直接分析（Ｄｉｒｅｃｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（ＤＡＲＴ）質量分析クロマトグラムを有する画分を含む、ニワトコ種抽出物に関する。また別の実施形態では、前記画分は、図４６〜５０のいずれかのＤＡＲＴ質量分析クロマトグラムを有する。また別の実施形態では、前記画分は、図４８のＤＡＲＴ質量分析クロマトグラムを有する。
【００１８】
１つの態様では、本発明は、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス中で測定した場合に１５０μｇ／ｍＬ〜１５００μｇ／ｍＬのＩＣ５０を有する画分を含む、ニワトコ種抽出物に関する。また別の実施形態では、前記画分は、１５０μｇ／ｍＬ〜７５０μｇ／ｍＬのＩＣ５０を有する。また別の実施形態では、前記画分は、１５０μｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬのＩＣ５０を有する。また別の実施形態では、前記画分は、少なくとも１９５μｇ／ｍＬのＩＣ５０を有する。
【００１９】
また別の実施形態では、本発明は、本発明のニワトコ種抽出物に関するが、前記画分は、アントシアニン；フラボノイド；Ｃ１６もしくはＣ１８の飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸、アルコール、もしくはエステル；および／または多糖類を含んでいる。また別の実施形態では、アントシアニンは、シアニジン−３−グルコシドおよびシアニジン−３−サンブビオシドからなる群から選択される。また別の実施形態では、アントシアニンの量は、１０、２０、３０、４０もしくは５０重量％より多い。また別の実施形態では、フラボノイドは、ルチンである。また別の実施形態では、Ｃ１６もしくはＣ１８の飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸、アルコール、もしくはエステルは、ヘキサデカノール、ヘキサデカン酸、ヘキサデカン酸メチルエステル、ヘキサデカン酸エチルエステル、ヘキサデカン酸ブチルエステル、オクタデカン酸、オクタデカン酸エチルエステル、オクタデカン酸ブチルエステル、９−オクタデセン−１−オール、９，１２−オクタデカン酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。また別の実施形態では、Ｃ１６もしくはＣ１８の飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸、アルコール、もしくはエステルの量は、２、４、６、８、もしくは１０重量％である。また別の実施形態では、多糖類は、デキストラン、グルコース、アラビノース、ガラクトース、ラムノース、キシロース、ウロン酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。また別の実施形態では、多糖類の量は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、もしくは４０重量％である。
【００２０】
また別の実施形態では、本発明は、本発明のニワトコ抽出物に関するが、前記画分は、アントシアニン；Ｃ１６もしくはＣ１８の飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸、アルコール、もしくはエステル；および多糖類を含んでいる。また別の実施形態では、アントシアニンは、シアニジン−３−グルコシドおよびシアニジン−３−サンブビオシドからなる群から選択される。また別の実施形態では、アントシアニンの量は、１０、２０、３０、４０もしくは５０重量％より多い。また別の実施形態では、Ｃ１６もしくはＣ１８の飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸、アルコール、もしくはエステルは、ヘキサデカノール、ヘキサデカン酸、ヘキサデカン酸メチルエステル、ヘキサデカン酸エチルエステル、ヘキサデカン酸ブチルエステル、オクタデカン酸、オクタデカン酸エチルエステル、オクタデカン酸ブチルエステル、９−オクタデセン−１−オール、９，１２−オクタデカン酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。また別の実施形態では、Ｃ１６もしくはＣ１８の飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸、アルコール、もしくはエステルの量は、２、４、６、８、もしくは１０重量％である。また別の実施形態では、多糖類は、デキストラン、グルコース、アラビノース、ガラクトース、ラムノース、キシロース、ウロン酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。また別の実施形態では、多糖類の量は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、もしくは４０重量％である。
【００２１】
また別の態様では、本発明は、本発明のニワトコ種抽出物を含む食品もしくは医薬に関する。
【００２２】
また別の態様では、本発明は、ウイルス感染症に対して被験体を処置するための方法であって、それを必要とする前記被験体に有効量の本発明のニワトコ種抽出物を投与する工程を含む方法に関する。また別の実施形態では、ウイルス感染は、エンベロープウイルスによって惹起される。また別の実施形態では、エンベロープウイルスは、フラビウイルスである。また別の実施形態では、ウイルス感染は、非エンベロープウイルスによって惹起される。また別の実施形態では、ウイルス感染は、は、インフルエンザウイルス、Ａ型ヒトインフルエンザウイルスおよびＢ型ヒトインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ＳＡＲＳ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、フラビウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、西ナイル熱ウイルス、および脳炎ウイルスによって惹起される。また別の実施形態では、ウイルス感染は、ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、アンドウイルス（ａｎｄｏｖｉｒｕｓ）もしくはライノウイルスによって惹起される。また別の実施形態では、被験体は、霊長類、ウシ、鳥類、ヒツジ、ウマ、ブタ、齧歯類、ネコ、もしくはイヌである。また別の実施形態では、被験体は、ヒトである。
【００２３】
また別の実施形態では、本発明は、細胞のウイルス感染を阻害する方法であって、細胞を本発明のニワトコ種抽出物と接触させる工程を含む方法に関する。また別の実施形態では、ウイルス感染は、エンベロープウイルス感染である。また別の実施形態では、エンベロープウイルス感染は、フラビウイルス感染である。また別の実施形態では、ウイルス感染は、非エンベロープウイルス感染である。また別の実施形態では、ウイルス感染は、インフルエンザウイルス、Ａ型ヒトインフルエンザウイルスおよびＢ型ヒトインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ＳＡＲＳ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、フラビウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、西ナイル熱ウイルス、および脳炎ウイルス感染である。また別の実施形態では、ウイルス感染は、ノーウォークウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、アンドウイルスもしくはライノウイルスである。
【００２４】
また別の態様では、本発明は、少なくとも１つの規定特性を有するニワトコ種抽出物を調製する方法であって：ａ）超臨界二酸化炭素抽出によってニワトコ種植物材料を抽出して精油画分および第１残留物を生成する工程；とｂ）約４０℃〜約７０℃の水または含水アルコール抽出によってニワトコ種植物材料または工程ａ）からの第１残留物を抽出してポリフェノール画分および第２残留物を生成する工程；とｃ）約７０℃〜約９０℃の水抽出によって工程ｂ）からの第２残留物を抽出して多糖類画分を生成する工程によって、精油画分、ポリフェノール画分および多糖類画分を生成するためにニワトコ種植物材料を連続的に抽出する工程を含む方法に関する。また別の実施形態では、抽出プロセスは、例えば、クロフサスグリの果実、アカフサスグリの果実、グーズベリー、ビルベリー、ブラックベリー、ブルーベリー、チェリー、クランベリー、サンザシの果実、ローガンベリー、ラズベリー、チョークベリー、リンゴ、ザクロ、マルメロ、およびプラムなどの、アントシアニジンおよび／またはプロアントシアニジンが豊富な任意の種を用いて実施できる。
【００２５】
また別の実施形態では、精油画分を入手する工程は：１）抽出容器内に微粉化したニワトコ種植物材料を装填する工程；と２）超臨界条件下で二酸化炭素を加える工程；と３）ニワトコ種植物材料および二酸化炭素をある時間接触させる工程；と４）収集容器内に精油画分を収集する工程とを含んでいる。
【００２６】
また別の実施形態では、本発明の方法は、超臨界二酸化炭素分別分離システムを用いて精油抽出物を分留することによって、精油化学成分の複合比を変化させる工程をさらに含んでいる。
【００２７】
また別の実施形態では、ポリフェノール画分は、１）微粉化したニワトコ種植物材料または工程ａ）からの残留物と約４０℃〜約７０℃の水または含水アルコール溶液とを、ポリフェノール酸化学成分を抽出するために十分な時間にわたり接触させる工程；と２）工程ａ）からの抽出したポリフェノール酸化学成分の含水アルコール溶液を親和性吸着剤樹脂カラムに通過させる工程であって、アントシアニジンを含む前記ポリフェノール酸が吸着される工程；と３）親和性吸着剤樹脂から精製したポリフェノール酸化学成分画分を溶出させる工程とによって入手される。
【００２８】
また別の実施形態では、多糖類画分を入手する方法は：１）工程ｂ）からの第２残留物と約７０℃〜約９０℃の水とを、多糖類を抽出するために十分な時間にわたり接触させる工程；と２）エタノール沈降法により水溶液から多糖類を沈降させる工程とを含んでいる。
【００２９】
また別の態様では、本発明は、本発明の方法のいずれかによって調製されたニワトコ種抽出物に関する。
【００３０】
また別の態様では、本発明は、ピロガロール、ピロガロールの１５重量％〜２５重量％のメチル桂皮酸、ピロガロールの１重量％〜４重量％のシンナミド、ピロガロールの５重量％〜１０重量％の２−メトキシフェノール、ピロガロールの１重量％〜２重量％のベンズアルデヒド、ピロガロールの５重量％〜１０重量％の桂皮アルデヒド、およびピロガロールの５重量％〜１５重量％の酢酸シンナミルを含むニワトコ種抽出物に関する。
【００３１】
また別の態様では、本発明は、ルチン、ルチンの２０重量％〜３０重量％のフェルラ酸、ルチンの２５重量％〜３５重量％の桂皮酸、ルチンの１５重量％〜２５重量％のシキミ酸、およびルチンの５５重量％〜６５重量％のフェニル乳酸を含むニワトコ種抽出物に関する。
【００３２】
また別の態様では、本発明は、ルチン、ルチンの１重量％〜１０重量％のタキシフォリン、ルチンの１重量％〜５重量％のフェルラ酸、ルチンの１重量％〜５重量％の桂皮酸、ルチンの０．５重量％〜５重量％のシキミ酸、ルチンの１重量％〜５重量％のフェニル乳酸、ルチンの５重量％〜１５重量％のシアニジン、およびルチンの１５重量％〜２５重量％のペツニジンを含むニワトコ種抽出物に関する。
【００３３】
また別の態様では、本発明は、ルチン、ルチンの３０重量％〜４０重量％のシアニジン、ルチンの７５重量％〜８５重量％のペツニジン、ルチンの５重量％〜１０重量％のバニリン酸、ルチンの１重量％〜５重量％のフェルラ酸、およびルチンの１重量％〜１０重量％の桂皮酸を含むニワトコ種抽出物に関する。
【００３４】
また別の態様では、本発明は、ｐ−クマル酸／フェニルピルビン酸、ｐ−クマル酸／フェニルピルビン酸の６５重量％〜７５重量％のルチン、ｐ−クマル酸／フェニルピルビン酸の６５重量％〜７５重量％のバニリン酸、ｐ−クマル酸／フェニルピルビン酸の３５重量％〜４５重量％のフェルラ酸、ｐ−クマル酸／フェニルピルビン酸の６５重量％〜７５重量％の桂皮酸、およびｐ−クマル酸／フェニルピルビン酸の４５重量％〜５５重量％のシキミ酸を含むニワトコ種抽出物に関する。
【００３５】
また別の態様では、本発明は、ルチン、ルチンの２０重量％〜３０重量％のヘスペリジン、ルチンの７０重量％〜８０重量％のバニリン酸、およびルチンの４０重量％〜５０重量％の桂皮酸を含むニワトコ種抽出物に関する。
【００３６】
また別の態様では、本発明は、ペツニジン、ペツニジンの８５重量％〜９５重量％のルチン、ペツニジンの５５重量％〜６５重量％のバニリン酸、およびペツニジンの３０重量％〜４０重量％の桂皮酸を含むニワトコ種抽出物に関する。
【００３７】
また別の態様では、本発明は、ルチン、ルチンの５重量％〜１５重量％のシアニジン、ルチンの１重量％〜１０重量％のタキシフォリン、ルチンの５重量％〜１５重量％のコーヒー酸、ルチンの１重量％〜１０重量％のフェルラ酸、ルチンの１重量％〜１０重量％のシキミ酸、ルチンの２５重量％〜３５重量％のペツニジン、およびルチンの１重量％〜５重量％のエリオジクチオールもしくはフスチンを含むニワトコ種抽出物に関する。
【００３８】
また別の態様では、本発明は、ルチン、ルチンの１０重量％〜２０重量％のシアニジン、ルチンの１重量％〜５重量％のエリオジクチオールもしくはフスチン、ルチンの１０重量％〜２０重量％のナリンゲニン、およびルチンの１重量％〜１０重量％のタキシフォリンを含むニワトコ種抽出物に関する。
【００３９】
本発明のこれらの実施形態、その他の実施形態、ならびにそれらの機能および特徴は、以下に記載する本明細書、図面および特許請求項から明白になるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書で使用する冠詞「１つの」は、前記冠詞の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）の文法的対象を意味する。例えば、「１つの要素」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００４１】
用語「アントシアニジン」は、当技術分野において認識されており、フラビリウムのカチオン誘導体を含む化合物を意味する。
【００４２】
用語「アントシアニン」は、当技術分野において認識されており、糖基を備えるアントシアニジンを意味する。アントシアニンは、主として、アントシアニジンの３−グルコシドである。アントシアニンは、無糖アントシアニジンアグリコンおよびアントシアニングリコシドに細分される。
【００４３】
用語「カプシド」は、当技術分野において認識されており、ウイルスの核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を取り囲んで保護するタンパク膜を意味する。
【００４４】
用語「含む」および「含んでいる」は、追加の要素を含むことのできる包括的な、開放的感覚の意味で使用される。
【００４５】
用語「〜からなる」は、通常はそれに結び付いている不純物を別にして、要素を規定された要素に限定するために使用される。
【００４６】
用語「本質的に〜からなる」は、要素を本明細書に規定した要素および材料もしくは工程の基本的かつ新規の特性へ物質的に影響を及ぼさない要素に限定するために使用される。
【００４７】
用語「シアニジン」もしくは「フラボン−３−オール」は、当技術分野において認識されており、フラボノイドおよびアントシアニンとして分類される天然有機化合物を意味する。これはビルベリー、ブラックベル−、ブルーベリー、チェリー、クランベリー、エルダーベリー、サンザシ、ローガンベリー、アサイベリーおよびラズベリーを含むがそれらに限定されない、多数のレッドベリー類において見いだされる色素である。リンゴおよびプラムなどの他の果物においてもまた見いだすことができる。
【００４８】
本明細書で使用する用語「有効量」は、所望の生物学的応答を引き出すために必要とされる量を意味する。当業者には理解されるように、複合剤もしくは生物活性剤の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、送達対象の生物活性剤、封入基質の組成、標的組織などの要素に依存して変動する可能性がある。
【００４９】
本明細書で使用する用語「ニワトコ」は、サンブカ種植物に由来するサンブカ植物材料を意味する。用語「ニワトコ」はさらに、ニワトコ種、サンブカ種、およびエルダーベリーと互換的に使用され、これらの植物、クローン、変異株、および変種などを意味する。
【００５０】
本明細書で使用する用語「ニワトコ成分」は、ニワトコ種において見いだされる化合物を意味しており、上記に同定されたそのような化合物ならびに精油化学成分、ポリフェノール酸、および多糖類を含むがそれらに限定されないニワトコ種において見いだされる他の化合物を含むものである。
【００５１】
本明細書で使用する用語「エンベロープウイルス」は、宿主細胞膜に由来するウイルス糖タンパク質を含有する脂質二重層を含むウイルスを意味する。エンベロープウイルスでは、宿主細胞内への結合および侵入を媒介するウイルスタンパク質は、エンベロープ内で見いだされる。エンベロープウイルスの例には、ヒトおよびトリ両方のインフルエンザ、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ、ＨＰＶ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、デング熱ウイルス、ならびに黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、および脳炎ウイルスなどのフラビウイルスが含まれる。
【００５２】
本明細書で使用する用語「精油画分」は、リノエライジン酸と分類される化合物を含むがそれには限定されないニワトコおよび関連種から入手される、またはそれらに由来する脂溶性、水不溶性化合物を含んでいる。
【００５３】
本明細書で使用する用語「精油サブ画分」は、ニワトコ種の精油中で見いだされる特定化合物の濃度を増強もしくは低下させた、リノエライジン酸として分類される化合物を含むがそれには限定されない、ニワトコおよび関連種から入手される、またはそれらに由来する脂溶性、水不溶性化合物を含んでいる。
【００５４】
本明細書で使用する用語「供給原料」は、一般に、全植物体を単独で、または葉、例えば主根、尾根、および繊維根を含む根、幹、樹皮、葉、果実、種子、ならびに花を含むがそれらに限定されない植物の１つ以上の構成部分と組み合わせて含む植物原料を意味するが、植物もしくは構成部分は、生である、乾燥、蒸し加熱、加熱さもなければ加工処理を促進するための物理的加工処理を受けさせられ、これはさらに無傷、刻み、ダイスカット、製粉、微粉化、さもなければ植物材料のサイズおよび物理的完全性に影響を及ぼすように加工処理される材料をさらに含むことができる。時には、用語「供給原料」は、追加の抽出プロセスのための供給源として使用すべき抽出生成物を特徴付けるために使用される場合がある。
【００５５】
「フラビウイルス」は、エンベロープウイルスのサブセットである。それらは、一般には脂質二重層エンベロープを獲得することによってヒトを感染させる動物において見出されるウイルスである。フラビウイルスの例には、黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、および脳炎ウイルスが含まれる。
【００５６】
本明細書で使用する用語「画分」は、所定の物理的特性、化学的特性または物理的もしくは化学的特性によって特性付けられた化合物の特定群を含む抽出組成物を意味する。
【００５７】
用語「〜を含む」は、「〜を含むがそれらに限定されない」ことを意味するために本明細書で使用される。「〜を含む」および「〜を含むがそれらに限定されない」は、互換的に使用される。
【００５８】
本明細書で使用する用語「非エンベロープウイルス」は、脂質二重層が欠如するウイルスを意味する。非エンベロープウイルスでは、カプシドは宿主細胞内への結合および侵入を媒介する。非エンベロープウイルスの例には、ノーウォークウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、およびライノウイルスが含まれる。
【００５９】
本明細書で使用する用語「１つ以上の化合物」は、例えばリノエライジン酸（ニワトコ種の脂溶性精油化学成分）、もしくはシアニジン−３−グルコシド（ニワトコ種の水溶性ポリフェノール酸化学成分）またはニワトコ種の多糖類分子などであるがそれらに限定されない少なくとも１つの化合物が企図されている、または２つ以上の化合物、例えば、リノエライジン酸およびシアニジン−３−グルコシドが企図されることを意味している。当技術分野において知られているように、用語「化合物」は、単一分子ではなく、多数もしくは複数モルの１つ以上の化合物を意味している。当技術分野において知られているように、用語「複合物」は、明確な化学的および物理的特性を有する特定化学成分を意味するが、他方「化合物」は、１つ以上の化学成分を意味する。
【００６０】
本方法によって処置すべき「患者」、「被験体」もしくは「宿主」は、霊長類（例、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、齧歯類、ネコ、もしくはイヌであってよい。
【００６１】
用語「医薬上許容される塩」は、当技術分野において認識されており、例えば、本発明の組成物中に含有されているものを含む、化合物の相当に非毒性の無機および有機酸付加塩を意味する。
【００６２】
本明細書で使用する用語「ポリフェノール画分」は、ルチン、およびシアニジン−３−グルコシドなどであるがそれらに限定されない化合物をさらに含む、ニワトコおよび関連種から入手される、またはそれらに由来する水溶性およびエタノール可溶性ポリフェノール酸化合物を含んでいる。
【００６３】
本明細書で使用する用語「多糖類画分」は、ニワトコおよび関連種から入手される、またはそれらに由来する水溶性−エタノール不溶性レクチンタンパク質および多糖類化合物を含んでいる。
【００６４】
ニワトコの他の化学成分もまたこれらの抽出物画分中に存在することもある。
【００６５】
本明細書で使用する用語「プロアントシアニン」は、アントシアニンの二量体、三量体、およびｑｕａｄｉｆｅｒを意味する。
【００６６】
本明細書で使用する用語「プロフィール」は、抽出物画分もしくはサブ画分内の化合物の質量（重量）％による比率、または最終ニワトコ抽出組成物中の３種のニワトコ画分化学成分各々の質量（重量）％による比率を意味する。
【００６７】
本明細書で使用する用語「精製」画分もしくは抽出物は、画分または抽出物の化学成分の質量（重量）％で１０％超へ濃縮されている所定の物理化学的特性または物理的もしくは化学的特性によって特性付けられた化合物の特定群を含む画分もしくは抽出物を意味する。言い換えると、精製画分もしくは抽出物は、画分もしくは抽出物を規定する、所定の所望の物理化学的特性または物理的もしくは化学的特性によって特性付けられていない８０％以下の化学成分化合物を含んでいる。
【００６８】
用語「相乗的」は、当技術分野において認識されており、全効果が化合物の作用の合計より大きくなるように、２つ以上の成分が一緒に作用することを意味する。
【００６９】
用語「処置する」は、当技術分野において認識されており、任意の状態もしくは障害を治癒させる、ならびにそれらの少なくとも１つの症状を緩和することを意味する。
【００７０】
用語「ウイルス」は、当技術分野において認識されており、それらの固有の代謝機構は欠如するが、宿主細胞の代謝機構を使用することによって繁殖する非細胞性生物学的実体を意味する。ウイルスは、核酸の分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含んでおり、エンベロープウイルスまたは非エンベロープウイルスであってよい。
【００７１】
（組成物）
本発明は、１つ以上のニワトコ種由来の精油（もしくは精油サブ画分）、ポリフェノール酸、および多糖類の単離かつ精製された画分の組成物を含んでいる。これらの個々の画分組成物を特定比率（プロフィール）で結合すると有益な組み合わせ組成物を提供することができ、そして現在知られている抽出生成物中では見いだされない、信頼できる、または再現性の抽出生成物を提供できる。例えば、１つの種由来の精油画分もしくはサブ画分は、同一もしくは相違する種由来の精油画分もしくはサブ画分と、または同一もしくは相違する種由来のポリフェノール酸画分と組み合わせることができ、その組み合わせは、ニワトコの同一もしくは相違する種由来の多糖類画分と組み合わせてもよい、または組み合わせなくともよい。
【００７２】
抽出されたニワトコ種組成物は、所定の生成物のために所望である有益な生物学的作用に依存して、任意の１つ、２つ、もしくは全３つの濃縮抽出物画分を含んでいる可能性がある。典型的には、全３つのニワトコ種抽出物画分を含有する組成物は、そのような新規な組成物が、天然植物材料中で見いだされる全３つの主要な生物学的に有益な化学成分を含有する第１の高度に精製されたニワトコ種抽出生成物を示すので一般に望ましい。本発明の実施形態は、所定の特性が、別個の抽出物画分中に規定の選択的に増加した濃度のニワトコ種の精油化学成分、ポリフェノール性アントシアニジン、および多糖類を含む方法を含んでいる。
【００７３】
詳細には、本発明の組成物は、自然に見いだされるものを含む、知られている組成物に比較して増加した量のアントシアニンを有する。アントシアニンは、心疾患および癌に対する保護を含む、様々な健康上の利益とますます関連してきた高度に活性の化学物質である強力な酸化防止剤である。それらの酸化防止特性に加えて、アントシアニンは５０％までインスリン産生を増加させるため、糖尿病を処置する目的にも使用できることが報告されている。本発明の組成物は、唯一の有効成分として増加した量のアントシアニンを含むことがある、または本組成物は、ニワトコと関連する他の活性成分を含有することがある。他の有効成分の例には、精油画分中で見いだされるＣ１６もしくはＣ１８の脂肪酸、アルコール、もしくはエステル、または多糖類画分で見いだされる多糖類が含まれる。
【００７４】
アントシアニンおよびフラボノイドは、濃縮し、ポリマー吸着剤（ＰＡ）技術によってプロファイリングすることができる。このような用途において、例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ４、ＸＡＤ  ７ＨＰ（Ｒｏｈｍ−Ｈａｓｓ社）、Ｄｉａｌｏｎ  ＨＰ２０、ＨＰ２１、ＳＰ８２５（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ社）、ＡＤＳ５、ＡＤＳ１７（Ｎａｉｋａｉ大学）などの広範囲のポリマー吸着剤を使用できる。ＰＡ加工処理の作用原理は、「同類は引き付け合う」（吸着質が吸着剤に付着したままになるか、または相対強度に依存して溶離剤中に溶解するかどうか）に基づいている。ＸＡＤ  ７ＨＰおよびＡＤＳ５を用いる実施例は、本明細書に提示されている。結果は、以下の表に示した。
【００７５】
（表３．抽出後のアントシアニン成分の重量％）
【００７６】
【表３】
2009531316.tif 000006
（表４．アントシアニンのプロフィール）
【００７７】
【表４】
2009531316.tif 000007
（表５．ルチン対全アントシアニンの比率）
【００７８】
【表５】
2009531316.tif 000008
（表６．プロフィール（％））
【００７９】
【表６】
2009531316.tif 000009
化合物の重量％は、加工処理中にどのくらいの量の化合物が精製（濃縮）されたのかを示す：シアニジン−３，５−グルコシドは、供給原料（Ｆ２、ＸＡＤ  ７ＨＰポリマー吸着剤）中の５６．２倍まで精製されている；シアニジン−３−サンブビオシドは、供給原料（Ｆ３、ＸＡＤ  ７ＨＰポリマー吸着剤）中の７４倍まで精製されている；シアニジン−３−グルコシドは、供給原料（Ｆ４、ＸＡＤ  ７ＨＰポリマー吸着剤）中の５０倍まで精製されている；全アントシアニンは、供給原料（Ｆ２およびＦ３、ＸＡＤ  ７ＨＰポリマー吸着剤）中の４６〜４７倍まで精製されている；ルチンは、供給原料（Ｆ３、ＡＤＳ５ポリマー吸着剤）中の１０７倍まで精製されている、そして全フェノール酸は、供給原料中の１３〜１７倍まで精製されている。
【００８０】
アントシアニンのプロフィールデータは、アントシアニンのプロフィールを加工処理中に調整できることを証明している：シアニジン−３−グルコシドは、４２％〜１００％の間でプロファイリングできる；シアニジン−３−サンブビオシドは、９％〜１７％の間でプロファイリングできる；およびシアニジン−３，５−グルコシドは、４．８％〜４３％の間でプロファイリングできる。
【００８１】
ルチンおよびアントシアニンは、ニワトコ種中での重要な医薬化合物である。ルチン対全アントシアニンの比率は、加工処理中に０．１０〜３，２６７の間でプロファイリングできる。
【００８２】
全フェノール酸中のアントシアニンおよびルチンの濃度もまた加工処理中にプロファイリングすることができる：シアニジン−３−グルコシドは、０．０２〜５．４％の間でプロファイリングできる；シアニジン−３−サンブビオシドは、０〜１．５％の間でプロファイリングできる；シアニジン−３，５−グルコシドは、０〜３．８％の間でプロファイリングできる；全アントシアニンは、０．０２〜９．６％の間でプロファイリングできる；およびルチンは、０．８〜８４．９％の間でプロファイリングできる。
【００８３】
１つの実施形態では、本発明の組成物は、増加した量のアントシアニンおよび以下で考察する医薬担体を含有している。また別の実施形態では、本発明の組成物は、精油画分由来の、例えばＣ１６およびＣ１８の飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸、アルコールおよびエステルなどの別のニワトコ種を含んでいる。
【００８４】
乾燥エルダーフラワーの揮発性成分についての文献データ（Ｔｏｕｌｅｍｏｎｄｅ  １９８３）と最近の研究との比較を以下の表に示した：
（表７．文献データと実験データの比較）
【００８５】
【表７】
2009531316.tif 000010
本発明の組成物は、増加した量のアントシアニンおよび多糖類を含む可能性がある。水粗抽出物中では、タンパク質収率は、ニワトコの花中では０．０９％およびエルダーベリー中では０．５９％であった。粗抽出物中のタンパク質の９５％は、８０％エタノールによって沈降させることができる。このため、８０％の沈降物は、多糖類−タンパク質複合体である。これらの複合体の平均分子量は、約２，０００ｋＤａであった。１つの実施形態では、本組成物は、比色分析法に基づくと１００〜１７０ｍｇ／ｇ（デキストラン当量）の純度を有するレクチン−多糖類画分組成物および本発明によって教示されるようなＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイに基づいて４〜５０％を超える質量（重量）％の純度のレクチンタンパク質を含んでいる。
【００８６】
本発明の組成物は、増加した量のアントシアニン、Ｃ１６もしくはＣ１８の飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸、アルコール、および多糖類を含む可能性がある。
天然ニワトコ種に比較した抽出
本発明の組成物は、天然ニワトコ種において見出されるものに比較して濃度に関して規定することもできる。例えば、精油の濃度は、天然ニワトコ種の濃度の０．００１〜１０，０００倍である、および／または所望のポリフェノール酸の濃度が天然ニワトコ種の濃度の０．００１〜４０倍である組成物、および／または水溶性−エタノール不溶性多糖類の濃度が天然ニワトコ種の濃度の０．００１〜４０倍である組成物、および／またはレクチンタンパク質の濃度が天然ニワトコ種植物材料の濃度の０．００１〜１００倍である組成物。本発明の組成物は、精油の濃度が、天然ニワトコ種の濃度の０．０１〜１０，０００倍である組成物、および／または所望のポリフェノール酸の濃度が天然ニワトコ種の濃度の０．０１〜４０倍である組成物、および／または多糖類の濃度が天然ニワトコ種の濃度の０．０１〜４０倍である組成物、および／またはレクチンタンパク質の濃度が天然ニワトコ種植物材料の濃度の０．０１〜１００倍である組成物を含んでいる。さらに、本発明の組成物は、天然ニワトコ種植物材料精油化学成分中で見いだされる量より多い、または少ない量である天然植物材料精油中に存在する少なくとも１つ以上の化合物を有する精油化学成分のサブ画分を含んでいる。例えば、化合物であるリノエライジン酸は、天然ニワトコ種植物材料中の全精油化学成分の質量（重量）％でその２％の濃度からサブ画分の質量（重量）％で２２％へ増加した精油サブ画分中の濃度を有していることがあり、これは濃度の１０倍の増加である。これとは対照的に、リノエライジン酸は、天然植物材料中の全精油化学成分の質量（重量）％で約２％の濃度から、サブ画分の質量（重量）％で０．０１％未満へ減少した精油サブ画分中の濃度を有していることがあり、これは濃度の１００分の１への減少である。本発明の組成物は、そのような新規の精油サブ画分中の特定化合物の濃度が、天然ニワトコ種精油化学成分中で見いだされる濃度の約１．１〜約１０倍へ増加する、または約０．１〜約１００分の１へ減少する、のいずれかである組成物を含んでいる。
【００８７】
（抽出物の純度）
以前に記載された抽出方法を実行した際に、ニワトコ種のオリジナルの乾燥させた果実（エルダーベリー）もしくは花（エルダーフラワー）供給原料中で９５％を超える純度を有する精油化学成分の質量（重量）％で８０％を超える収率を精油画分中でＳＣＣＯ２（超臨界二酸化炭素）抽出によって抽出できることが見いだされた（工程１Ａ）。工程１Ａおよび１Ｂにおいて教示される方法を用いると、精油の収率は、新規化学成分プロフィールを有する高度に精製された精油サブ画分への精油化学成分の細分別に起因して減少することがある。さらに、本発明によって教示されるようなＳＣＣＯ２抽出および分別プロセスは、固有の精油サブ画分プロフィールを特定の医薬上の目的のために作製できるように精油化学成分画分を含む個別化学成分の比率（プロフィール）を変化させることを許容する。例えば、アルコール精油化学成分の濃度は、脂肪酸化合物の濃度を減少させながら同時に増加させることができるが、その逆もまた可能である。
【００８８】
本発明の工程２において教示される方法を使用すると、含水アルコール浸出画分は、天然エルダーベリー供給原料中で見いだされるフェノール酸化学成分の約６０質量（重量）％の収率である、オリジナルのニワトコ種供給原料から全フェノール酸の４．３％の濃度を有する３５．６質量（重量）％の収率で達成される。さらに、この含水アルコール溶媒抽出物もまた、貴重なアントシアニジン化学成分を含有する。
【００８９】
本発明の工程３において教示される方法（親和性吸着剤抽出プロセスもしくはプロセスクロマトグラフィ−）を用いると、２．５質量（重量）％を超えるアントシアニジンを含む抽出物画分の乾燥質量％で４０％を超える純度を備えるポリフェノール酸画分を入手できる。含水アルコール浸出抽出物供給原料から約６０％のポリフェノール酸を抽出することが可能である。これは、天然ニワトコ種植物材料中で見いだされるポリフェノール酸化学成分の収率４０％に一致する。相当に高濃度のアントシアニジン（＞２．９質量（重量）％）または低濃度のアントシアニジン（＜０．０５質量（重量）％）のいずれかを備える高濃度のフェノール酸（＞３０質量（重量）％）を含有する精製フェノール酸サブ画分を生成することもまた可能である。
【００９０】
本発明の工程４において教示される方法（水浸出法およびエタノール沈降法）を用いると、オリジナルの乾燥ニワトコ種供給原料から９０質量（重量）％を超える収率の水溶性−エタノール不溶性レクチンタンパク質および多糖類化学成分をレクチン−多糖類画分中で抽出かつ精製できると思われる。８０％エタノールを用いてレクチンおよび多糖類を沈降させると、水浸出抽出物から精製レクチン−多糖類画分を収集することができる。レクチン−多糖類画分の収率は、天然ニワトコ種植物材料供給原料に基づくと約３．４５質量（重量）％である。参照標準物質としてデキストランを使用する比色分析方法に基づくと、１００〜１７０ｍｇ／ｇ（デキストラン当量）の純度の多糖類を入手できる。Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイに基づくと、画分の１６質量（重量）％の純度のレクチンを入手できる。現在入手できる証拠は、画分中に残留している化合物が多糖類（約８３質量（重量）％）であることを示すであろう。レクチンタンパク質の純度は、６０％エタノール沈降法を用いると約５％へ減少させることができる、または６０％エタノール沈降法および多糖類の抽出後に残留物溶液の段階的８０％エタノール沈降法を用いると、サブ画分の約５０質量（重量）％へさらに増加させることができる。
【００９１】
最後に、本発明によって教示される方法は、ニワトコ種精油化学成分画分、新規なポリフェノール画分もしくはサブ画分、および新規なレクチン−多糖類画分の、精油画分中で所望の化学成分の９９質量（重量）％という高さ、フェノール画分中でフェノール酸の４１質量（重量）％という高さ、ポリフェノール画分中でアントシアニジンの３％という高さ、レクチン−多糖類画分中でレクチンの５０質量（重量）％という高さ、およびレクチン−多糖類画分中で多糖類の９０質量（重量）％という高さへの精製（濃縮）を許容する。特定の抽出環境、抽出率、溶媒、および使用される抽出技術は、起源材料の出発化学成分プロフィールおよび最終抽出生成物中での所望の精製レベルに依存する。本発明によって教示されるような特定の方法は、特定の属性を有するアウトプット材料へ加工処理される出発材料の属性におけるサンプル変化を説明するためにプロセスを調整するために典型的なルーチンの実験だけを使用すれば、当業者であれば容易に決定できる。例えば、特定ロットのニワトコ種植物材料では、精油化学成分、ポリフェノール酸、アントシアニジン、レクチン、および多糖類の初期濃度は、本発明によって教示されるような当業者に知られている方法を用いて決定される。当業者であれば、最終ニワトコ種組成物製品中の所望の濃度および／または化学的プロフィールに達するために、本明細書に開示した抽出方法を用いて、精油化学成分の初期濃度から、最終抽出生成物についての、例えば、規定量もしくは分布（プロフィール）の精油化学成分への変化量を決定できる。
【００９２】
（サブ画分）
本発明のまた別の実施形態は、精油化学成分の新規なサブ画分を含む組成物であって、例えば、アルコール、アルデヒド、エステルもしくは脂肪酸などであるがそれらに限定されない特定化学基の濃度が新規な抽出組成物中で増加もしくは減少した各濃度を有する組成物である。
【００９３】
本発明のまた別の実施形態は、精製ポリフェノール酸化学成分の新規なサブ画分を含む組成物であって、例えば、アントシアニジンなどであるがそれには限定されない特定化学基の濃度が新規な抽出組成物中で増加もしくは減少した各濃度を有する組成物である。
【００９４】
本発明の追加の実施形態は、精製レクチン−多糖類化学成分の新規なサブ画分を含む組成物であって、例えば、レクチンなどであるがそれには限定されない特定化学基の濃度が新規な抽出組成物中で増加もしくは減少した各濃度を有する組成物である。
【００９５】
（抽出方法）
本発明の方法は、ヒトの障害を処置および予防するための新規なニワトコ種組成物を提供する。例えば、インフルエンザを処置するための新規なニワトコ種組成物は、天然ニワトコ種植物材料または従来型の知られている抽出生成物中で見いだされる濃度に比較して、重量％で、増加したポリフェノール画分組成物濃度、増加した多糖類組成物濃度、および減少した精油画分組成物濃度を有する可能性がある。抗酸化、抗血管傷害、虚血性脳血管疾患のための新規なニワトコ種組成物は、天然ニワトコ種植物材料中もしくは従来型の知られている抽出生成物中で見いだされる濃度より、重量％で、増加した精油およびポリフェノール酸画分組成物および減少した多糖類画分組成物を有している可能性がある。糖尿病性障害を処置するための新規なニワトコ種組成物のまた別の例は、天然ニワトコ種植物材料もしくは知られている従来型抽出生成物中で見いだされる濃度よりも増加したポリフェノール画分組成物濃度、減少した多糖類組成物、および減少した精油画分組成物を有する組成物を含んでいる。
【００９６】
追加の実施形態は、天然植物材料もしくは現在入手できるニワトコ種抽出生成物中で見いだされるものに比較して、変化したプロフィール（分布比）のニワトコ種の化学成分を含む組成物を含んでいる。例えば、精油画分は、ポリフェノール酸濃度および／または多糖類濃度に比較して増加もしくは減少してよい。同様に、ポリフェノール酸もしくは多糖類は、特定の生物学的作用のために新規な構成の化学プロフィール組成物を許容するために他の抽出成分画分と比較して増加もしくは減少してよい。１つ以上の精油、ポリフェノール類および／または多糖類の単離かつ精製した画分を結合することによって、新規な組成物を作製できる。
【００９７】
以下に教示する方法は、個別に、または本明細書に開示した方法もしくは当業者に知られている方法と組み合わせて使用できる。
【００９８】
抽出するための出発材料は、１つ以上のニワトコ種からの植物材料である。植物材料は、植物の任意の部分であってよいが、果実および花が最も好ましい出発材料である。
【００９９】
ニワトコ種植物材料は、材料を任意の特定形態に、そして本発明によって企図されている抽出のために有用な任意の形態にさせる前抽出工程を受けさせることができる。そのような前抽出工程には、材料を刻む、ミンチ切りする、細かく刻む、すりつぶす、粉末化する、切断する、もしくは裂く工程が含まれるがそれらに限定されない。出発材料は、前抽出工程の前には、乾燥した、もしくは新鮮な植物材料である。好ましい前抽出工程は、ニワトコ種植物材料を微細粉末にすりつぶす、および／または粉末化する工程を含んでいる。出発材料または前抽出工程後の材料は、乾燥させることができる、またはそれに加えられた水分を有していてよい。ニワトコ種植物材料が抽出のための形状になると、抽出方法は、本発明によって企図されている。
【０１００】
（ニワトコの超臨界流体抽出）
本発明の抽出方法は、本明細書に開示したプロセスを含んでいる。一般に、本発明の方法は、一部には、ニワトコ種植物材料が溶媒として二酸化炭素（ＳＣＣＯ２）を用いる超臨界流体抽出法（ＳＦＥ）を使用し、その後に例えば水、含水アルコール、および親和性ポリマー吸着剤抽出プロセスなどであるがそれらに限定されない１つ以上の溶媒抽出工程を使用して抽出される方法を含んでいる。本発明のために企図されている他の追加の方法は、他の有機溶媒、冷却用薬品、圧縮性ガス、超音波処理、加圧液体抽出、高速逆流クロマトグラフィー、分子捺印ポリマー、およびその他の知られている抽出法を用いたニワトコ種植物材料の抽出を含んでいる。そのような技術は、当業者には知られている。１つの態様では、本発明の組成物は、図１〜４に略図で示した工程を含む方法によって調製できる。
【０１０１】
本発明は、ＳＣＣＯ２技術を使用してニワトコ植物材料から精油およびその他の脂溶性化合物を濃縮（精製）およびプロファイリングするためのプロセスを含んでいる。本発明は、ニワトコの脂溶性化学成分を、例えば、高純度の精油画分（高精油化学成分濃度）に分別する工程を含んでいる。さらに、本発明は、抽出物画分内の個別化学成分がそれらの化学成分比もしくはプロフィールを変化させる可能性があるＳＣＣＯ２プロセスを含んでいる。例えば、精油画分内の化学成分のＳＣＣＯ２による分別分離は、他の化合物より所定の化合物の濃度が高い精油抽出物のサブ画分を精製できるように、他の精油化合物に比較して所定の精油化合物の優先的抽出を許容する。本発明によって教示されるようなＳＣＣＯ２を用いたニワトコ種の精油化学成分の抽出は、毒性有機溶媒の使用を排除し、抽出物の同時分別を提供する。二酸化炭素は、天然の安全な生物学的生成物であり、多くの食品および飲料に含まれる成分である。
【０１０２】
ニワトコの生物活性化学成分の抽出方法の略図は、図１〜４に示した。抽出プロセスは、典型的には５工程であるが、それには限定されない。本抽出プロセスで使用した分析方法は、実験のセクションに提示されている。
【０１０３】
（工程１：ニワトコ精油の超臨界流体（二酸化炭素）抽出）
この抽出プロセスには、精油の疎水性の性質に起因して、ＳＣＣＯ２、ヘキサン、石油エーテル、および酢酸エチルを含むがそれらに限定されない非極性溶媒を使用できる。精油の成分の一部は揮発性であるため、抽出プロセスとして蒸気蒸留法もまた使用できる。
【０１０４】
ＳＣＣＯ２を用いるニワトコ種の根茎からの精油化学成分の抽出についての一般的説明は、図１に図示されている。供給原料１０は、乾燥させて微粉化（約１４０メッシュ）したエルダーベリーもしくはエルダーフラワーである。抽出溶媒２１０は、純粋二酸化炭素である。補助溶媒としてエタノールを使用できる。供給原料は、ＳＦＥ抽出容器２０内に装填される。パージおよび漏れ試験の後、本プロセスは、貯蔵容器から冷却器を経由してＣＯ２ポンプまで液化ＣＯ２を流動させる工程を含んでいる。ＣＯ２は所望の圧力まで圧縮され、圧力および温度が所望のレベルで維持されている抽出容器内の供給原料を通過するように流される。抽出のための圧力は約６０ｂａｒ〜８００ｂａｒの範囲内であり、温度は約３５℃〜約９０℃の範囲内である。本明細書で教示されるＳＣＣＯ２抽出は、好ましくは少なくとも１００ｂａｒの圧力および少なくとも３５℃の温度、ならびにより好ましくは約６０ｂａｒ〜５００ｂａｒの圧力および約４０℃〜約８０℃の温度で実施される。単一工程抽出を行うための抽出時間は、約３０分間〜約２．５時間、〜約１時間である。溶媒対供給原料比は、典型的には各ＳＣＣＯ２抽出に対して約６０：１である。ＣＯ２は、再利用される。抽出され、精製され、そしてプロファイリングされた精油化学成分３０は、次にコレクターもしくはセパレーターに収集され、遮光性ガラス瓶に貯蔵され、照明を落とした４℃の冷蔵庫内に保管される。ニワトコ供給原料１０は、結果として生じた抽出および精製されたニワトコ精油画分３０が１つのコレクターＳＦＥもしくはＳＣＣＯ２システム２０内に収集される１工程プロセス（図１）、または抽出されて精製およびプロファイリングされたニワトコ精油サブ画分５０、６０、７０、８０が個別および連続的に１つのコレクターＳＦＥシステム２０内に収集される多段階（図１、工程１Ｂ）で抽出できる。または、分別ＳＦＥシステムにおけるように、ＳＣＣＯ２抽出されたニワトコ供給原料は、各コレクター内にはその各々に精製精油サブ画分が収集されている相違する相対比率の精油化学成分組成（プロフィール）が存在するように、コレクター容器（セパレーター）内に分離することができる。残留物（残余）４０が収集され、保存され、ニワトコ種フェノール酸および多糖類の精製画分を入手するためのさらなる加工処理のために使用される。本発明の１つの実施形態は、６０ｂａｒ〜５００ｂａｒの圧力および３５℃〜９０度の温度で多段階式ＳＣＣＯ２抽出法を用いてニワトコ種供給原料を抽出する工程と、各段階の後に抽出したニワトコ材料を収集する工程とを含んでいる。本発明の第２実施形態は、６０ｂａｒ〜５００ｂａｒの圧力および３５℃〜９０℃の温度で分別ＳＣＣＯ２抽出法を使用してニワトコ種供給原料を抽出する工程と、既定条件（圧力、温度、および密度）ならびに規定間隔（時間）で相違するコレクター容器内に抽出したニワトコ種材料を収集する工程とを含んでいる。多段階抽出機の各々、または相違するコレクター容器（分別システム）内の生じた抽出されたエルダーの精製精油サブ画分組成物は、回収して個別に使用できる、または天然植物材料中もしくは従来型のニワトコ抽出生成物中において見出される濃度より高い、もしくは低い規定の精油化学成分濃度を含む１つ以上のニワトコ種精油組成物を形成するために結合できる。典型的には、単一工程最高ＳＣＣＯ２抽出法を用いたエルダー種ベリーからの精油画分の全収率は、抽出物の９５質量（重量）％を超える純度の精油化学成分を有して、約９重量％（精油化学成分の＞９５％）である。これとは対照的に、単一工程最高ＳＣＣＯ２抽出法を用いたエルダーフラワーからの精油画分の全収率は、抽出物の９５質量（重量）％を超える純度の精油化学成分を有して、約１．５質量（重量）％（精油化学成分の＞９５％）である。これらのデータは、エルダーベリーがエルダーフラワーに比較して約６倍の濃度の精油化合物を含有することを証明している。本発明の実施例のためには、天然ニワトコ種供給原料としてエルダーベリーを使用した。この抽出プロセスの例は、実施例１に見いだすことができる。
【０１０５】
供給原料としてエルダーベリーを使用するこの実験実施例では、抽出条件は温度範囲が４０〜８０℃であり、圧力範囲が８０〜５００ｂａｒであるように設定した。ＣＯ２流量は、１０ｇ／分であった。結果は、表８および９に示した。
【０１０６】
（表８．供給原料としてエルダーベリーを使用した場合の、温度、圧力、および時間がＳＣＣＯ２による精油抽出収率に及ぼす作用）
【０１０７】
【表８】
2009531316.tif 000011
（表９．ＧＣ−ＭＳによる、様々なＳＦＥ条件で抽出したエルダーベリーのＳＣＣＯ２による精油抽出物画分の化学組成（温度：Ｔおよび圧力：ｂａｒ））
【０１０８】
【表９−１】
2009531316.tif 000012
【０１０９】
【表９−２】
2009531316.tif 000013
【０１１０】
【表９−３】
2009531316.tif 000014
【０１１１】
【表９−４】
2009531316.tif 000015
（表１０．ＧＣ−ＭＳによって同定されたエルダーベリーの精油化合物）
【０１１２】
【表１０−１】
2009531316.tif 000016
【０１１３】
【表１０−２】
2009531316.tif 000017
【０１１４】
【表１０−３】
2009531316.tif 000018
【０１１５】
【表１０−４】
2009531316.tif 000019
これらの結果は、圧力が抽出の動態に及ぼす作用を示している。
【０１１６】
抽出圧力が高いほど、少量のＣＯ２消費量を伴ってより短時間で平衡に達するシステムを生じさせる。全抽出収率は、圧力上昇に関連する密度増加に起因して、抽出圧力の上昇に伴って増加する。興味深いことに、１００〜３００ｂａｒなどの低圧、低温度、高収率は同様に高密度に関連していた。３００〜５００ｂａｒなどの高圧力では、温度は抽出収率にはるかに小さな作用しか及ぼさない。高収率および高抽出効率は３００ｂａｒより大きな圧力を用いると達成できるが、精油化学成分の９５％純度は、３００ｂａｒ未満の圧力および約４０〜６０℃の温度を用いて達成できる。
【０１１７】
調査した実験範囲では、温度と密度との間に競合作用が存在することを明確に述べることができる。温度が一定の場合には圧力の増加は超臨界および近臨界流体の溶解能力における増強に起因して収率の増加を導くというこの態様は、明確に規定されており、文献において立証されている。温度の上昇は、抽出に好ましい化合物の蒸気圧の強化を促進する。さらに、拡散係数の増加および溶媒粘度の減少もまた、温度がより高い数値に増加するにつれて草本性多孔質基質からの化合物の抽出に役立つ。他方では、システム圧が一定の場合の温度の上昇は、溶媒密度の減少をもたらす。
【０１１８】
ＧＣ−ＭＳ分析を用いると、各化合物の質量スペクトルによってエルダーベリー精油中で６７種の化合物が分離されて同定された（表９および１０）。化合物は、７〜５０分間の保持時間を有し、主要アルデヒドは不飽和Ｃ７およびＣ１０アルデヒドである９種のアルデヒド（Ｃ７〜Ｃ１５）（表５に記載の化合物番号１、２、６、および８）；１１種のアルコール（Ｃ１３〜Ｃ２０）；１２種のエステル（Ｃ１３〜Ｃ２２）；７種の脂肪酸（Ｃ１４〜Ｃ２２）；および他の芳香族および脂肪族化合物を含む７炭素化合物（Ｃ７）〜２３炭素化合物（Ｃ２３）まで様々であった。知られている生物活性に基づくと、最も重要な化合物はＣ１６およびＣ１８の飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸、アルコール、およびそのエステルであると思われる。例えば、ヘキサデカノール（＃３０）、ヘキサデカン酸（＃３４）、ヘキサデカン酸メチルエステル（＃３２）、ヘキサデカン酸エチルエステル（＃３５）、およびヘキサデカン酸ブチルエステル（＃５２）は、全部がＣ１６化合物に属する。飽和オクタデカジエン酸ならびにそのエステルであるオクタデカン酸エチルエステル（＃５３）およびオクタデカン酸ブチルエステル、一価不飽和脂肪酸である９−オクタデセン−１−オール異性体（＃３８、３９）、多価不飽和脂肪酸である９，１２−オクタデカン酸異性体（＃４６、４８）は、Ｃ１８化合物に属する。Ｃ１６およびＣ１８脂肪酸の一般名は、パルミチン酸およびステアリン酸と呼ばれている。
【０１１９】
表９では、強調表示した化合物は、精油画分内で見いだされる高濃度の化合物である。化合物の比率は、様々なＳＣＣＯ２抽出条件に伴って変動することに留意されたい。例えば、１００ｂａｒなどの低圧では、Ｃ１６およびＣ１８脂肪酸は低い全抽出収率を伴ってより高濃度で得られる。これとは対照的に、Ｃ１６およびＣ１８脂肪酸エステルは、高抽出温度で高濃度で見いだされる。
【０１２０】
興味深いことに、スクアレンは４０℃および３００ｂａｒにおいて約２３％の高濃度で抽出され、精油画分は４０℃および５００ｂａｒの画分内で約８％の低濃度で抽出される。スクアレンは、一部のヒト癌のための補助療法として調査されてきた。動物モデルでは、肺癌を阻害することに有効であることが証明されている。さらにまた、動物モデルにおける結腸癌に対する化学的予防作用を有することもまた証明されている。動物モデルにおけるスクアレンの補給は、免疫機能を増強し、コレステロールレベルを減少させることが証明されている。
【０１２１】
結論として、所定のニワトコ種精油化学成分の濃度は、様々なＳＦＥ条件を用いて変化させることができる。そのような示差的ＳＦＥ抽出特性を使用すると、図１の工程１Ｂに例示した連続的多段階式ＳＣＣＯ２分別システム、または複数コレクター分別システムを用いることによって、精製精油サブ画分中の所定化合物の濃度をさらに強化もしくは減少させることができる。
【０１２２】
（工程２：粗フェノール酸画分を抽出するための含水アルコール浸出プロセス）
１つの態様では、本発明は、分離抽出および精製のために残留物中にレクチンおよび多糖類を維持しながら、生物活性フェノール酸化学成分の抽出および濃縮を含んでいる（工程４）。この工程の一般的説明は、図２に図示されている。この工程２の抽出プロセスは、溶媒浸出プロセスである。この抽出のための供給原料は、ニワトコ種の微粉化した乾燥植物材料１０もしくは工程１での精油化学成分のＳＣＣＯ２による抽出からの残留物４０のいずれかである。抽出溶媒２２０は、水性エタノールである。抽出溶媒は、１０〜９５％水性アルコールであってよいが、８０％水性エタノールが好ましい。本方法では、ニワトコ供給原料および抽出溶媒が、加熱および攪拌される抽出容器１００、１５０中に装填される。これは１００℃、約９０℃、約８０℃、約７０℃、または約６０〜９０℃へ加熱することができる。抽出は、約１〜１０時間、約１〜５時間、約２時間にわたり実施される。生じた流体−抽出物は、濾過され（１１０）、遠心される（１２０）。濾液（上清）３１０、３２０、３３０は、生成物として収集され、容積および固体含量、溶媒を蒸発させた後の乾燥質量が測定される。抽出残留物材料１６０は、保持されて、その後の加工処理のために貯蔵される（工程４を参照）。抽出は、必要もしくは所望に応じて、複数回繰り返すことができる。これは、１回以上、２回以上、３回以上など繰り返すことができる。例えば、図２は、第２段階および第３段階が同一方法および条件を使用する、３段階式プロセスを示している。この抽出工程の例は、実施例２に見出される。結果は、表１１に示した。
【０１２３】
（表１１．エルダーベリーの浸出抽出による粗フェノール酸の収率および純度）
【０１２４】
【表１１】
2009531316.tif 000020
全粗フェノール酸抽出収率は、オリジナルの天然エルダーベリー供給原料の約３５質量（重量）％であり、全フェノール酸抽出収率は１．６％およびフェノール酸の純度は画分の４．３質量（重量）％であった。粗フェノール酸画分中のアントシアニジン抽出収率は、オリジナルのエルダーベリー供給原料の０．０６質量（重量）％であり、純度（濃度）は画分の０．１８質量（重量）％であった。主要フェノール酸はルチンであり、主要アントシアニジンはシアニジン−３−グルコシドであった。これらのデータは、すべてが文献と一致している。この粗フェノール酸組成物は、最終生成物として、または所望のフェノール酸化学成分を精製するためのさらなる加工処理（工程３）のための供給原料としてのいずれかで使用できる。
【０１２５】
（工程３：親和性吸着剤抽出プロセス）
本明細書で教示するように、ニワトコおよび関連種由来の精製フェノール酸画分抽出物は、親和性吸着剤上に含水アルコール抽出物中に含有される活性フェノール酸を吸着できるように、ニワトコ供給原料の含水アルコール抽出物を固体親和性ポリマー吸着剤樹脂と接触させる工程によって入手できる。結合した化学成分は、引き続いて本明細書に教示した方法によって溶出される。フェノール酸画分化学成分を溶出する前に、その上に吸着させられた所望の化学成分を備える親和性吸着剤は、好ましくは、吸着剤と接触させる工程である任意の便宜的方法によって抽出物の残余から分離でき、分離は水性抽出物に抽出カラムもしくは吸着剤材料床を通過させる工程によって実行される。
【０１２６】
「Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−２」（Ｒｏｈｍ  ＆  Ｈａｓｓ社）、「Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ｓ−３０」（Ｄｉａｍｏｎｄ  Ａｌｋａｉ社）、「ＳＰ２０７」（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）、ＡＤＳ−５（Ｎａｎｋａｉ大学、中国天津）、ＡＤＳ−１７（Ｎａｎｋａｉ大学、中国天津）、Ｄｉａｌｏｎ  ＨＰ２０（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ社、日本国）およびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ  ７ＨＰ（Ｒｏｈｍ  ＆  Ｈａｓｓ社）などであるがそれらに限定されない様々な親和性吸着剤を利用すると、ニワトコ種のフェノール酸化学成分を精製することができる。Ａｍａｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ７  ＨＰは、好ましくは、ニワトコおよび関連種のフェノール酸化学成分に対する高親和性に起因して使用される。
【０１２７】
吸着剤からフェノール酸化学成分を回収するためには様々な溶離剤を使用するとことができるが、本発明の１つの態様では、溶離剤は、メタノール、エタノール、もしくはプロパノールを含むがそれらに限定されない低分子量アルコールを含んでいる。第２の態様では、溶離剤は、水との混合液中の低分子量アルコールを含んでいる。また別の態様では、溶離剤は、低分子量アルコール、第２有機溶媒、および水を含んでいる。
【０１２８】
好ましくは、ニワトコ種供給原料は、抽出物を含有する水性フェノール酸化学成分を親和性吸着剤材料と接触させる工程の前に、工程１および２に記載したプロセスなどであるがそれらに限定されない１つ以上の予備精製プロセスを受けている。
【０１２９】
本発明によって教示されるように親和性吸着剤を使用すると、顕著にも、通常は天然植物材料中に、または入手可能な市販の抽出生成物中に存在する他の化学成分を含んでいない、ニワトコ種の高度に精製されたフェノール酸化学成分を生じさせる。例えば、本発明において教示されるプロセスは、乾燥質量（重量）％で４０％過剰の全フェノール酸化学成分および２％過剰の全アントシアニジンを含有する、精製フェノール酸抽出物を生じさせることができる。
【０１３０】
ポリマー親和性吸着剤樹脂ビーズを用いるニワトコ種の葉からのフェノール酸の抽出および精製についての一般的説明は、図３に図示されている。この抽出プロセスのための供給原料は、工程２の水浸出抽出３１０＋／−３２０＋／−３３０からのフェノール酸を含有するエタノール水溶液であってよい。吸着剤樹脂ビーズの適切な重量（吸着剤樹脂１ｇ当たり５ｍｇのフェノール酸）は４〜５ＢＶ（床容積）エタノール２３０および４〜５ＢＶ蒸留水２４０を用いて、カラム４１０、４２０内へ装填する前後に洗浄した。水溶液３１０＋３２０を含有するフェノール酸は、次に３〜５ＢＶ／時の流量でカラム４３０へ装填される。カラムが完全に装填されると、カラムは２〜３ＢＶ／時の流量で蒸留水２５０を用いて洗浄され（４５０）、吸着されたフェノール酸からすべての不純物が除去される。排出残留物４４０および洗浄残留物４６０が収集され、質量含量でフェノール酸含量について測定され、そして廃棄される。吸着されたフェノール酸４７０の溶出は、溶離液２６０としての３〜４ＢＶ／時の流量で４０もしくは８０％のエタノール／水を用いる均一濃度法で遂行され、溶離抽出物（抽出物）４８０についての溶出曲線が記録された。溶出容積４８０は、約２５分毎に収集することができ、これらのサンプルはＨＰＬＣを用いて分析し、固体含量および純度について試験される。この抽出プロセスの例は、実施例３に見出される。結果は、表１２および１３に示した。
【０１３１】
（表１２．ＸＡＤ  ７ＨＰカラムから溶出させた様々な画分についての質量平衡およびＨＰＬＣ分析の結果）
【０１３２】
【表１２】
2009531316.tif 000021
（表１３．ＡＤＳ５カラムから溶出させた様々な画分についての質量平衡およびＨＰＬＣ分析の結果）
【０１３３】
【表１３】
2009531316.tif 000022
本明細書で教示するように、親和性吸着剤であるＸＡＤ７ＨＰおよびＡＤＳ５は、ニワトコ種植物材料のフラボノイドおよびアントシアニジンフェノール酸をさらに精製（濃縮）することができる。各溶出液サブ画分の質量（重量）％で４０％を超える全フェノール酸、２．８％を超える全アントシアニジン、および２９％を超えるルチンの純度。これらは、天然ニワトコ種植物材料中または知られている材料中で見いだされる濃度に比して１０倍を超える、そして入手できるニワトコ種抽出生成物中において見出される濃度に比して５倍を超える増加を表している。装填溶液のフェノール酸化学成分の６０質量（重量）％を超える収率が溶離剤中で回収される。オリジナルのニワトコ種供給原料に基づくと、全フェノール酸収率は、オリジナルの供給原料の約４．２質量（重量）％である。実際に、排出液もしくは洗浄液中では、ルチンもしくはアントシアニジンはほとんど全く検出できなかった。興味深いことに、ＡＤＳ５は、様々な濃度のエタノール溶液を使用することによって様々なサブ画分中のルチンからアントシアニジンを分離することが可能であるという点で相当に固有の長所を有している。例えば、ＡＤＳ５の４０％エタノール溶出画分（Ｆ２）は、アントシアニジンを１０倍を超えて濃縮させるが、他方結合サブ画分（Ｆ３＋Ｆ４）は、ほとんどもしくは全くアントシアニジンの濃縮を伴わずにルチンを２５倍を超えて濃縮させる。このため、工程３の親和性吸着剤プロセスは、新規な化学成分プロフィールを備える新規な精製フェノール酸サブ画分を産生できる。
【０１３４】
（工程４：レクチン−多糖類画分抽出プロセス）
ニワトコ種の化学成分のレクチン−多糖類画分抽出物画分は、科学文献において「水溶性、エタノール不溶性抽出物画分」として規定されている。水溶媒浸出およびエタノール沈降プロセスを用いてニワトコ種の抽出物から多糖類画分を抽出する方法についての一般的説明は、図４に図示されている。供給原料１６０は、工程２の含水アルコール浸出抽出プロセスからの固体残留物である。この供給原料は、２段階で浸出抽出される。溶媒は、蒸留水２７０である。本方法では、ニワトコ種残留物１６０および抽出溶媒２７０は、抽出容器５００、５２０中に装填され、加熱および攪拌される。これは、１００℃、約８０℃、または約７０〜９０℃へ加熱されてよい。この抽出は、約１〜５時間、約２〜４時間、または約２時間にわたり実施される。２段階抽出溶液６００＋６１０は結合され、スラリーは濾過され（５４０）、遠心分離され（５５０）、そして蒸発させられて（５６０）、溶液６２０中の化学物質の濃度が約８倍に増加するまで水が除去される。次に無水エタノール２８０を使用して、６０〜８０％の最終エタノール濃度を作製するためにオリジナルの溶液の容積が復元される。大きな沈降物５７０が観察される。この溶液は遠心分離され（５８０）、デカンテーションされ（５９０）、上清残留物７３０が廃棄される。沈降生成物６４０は、多糖類については参照標準物質として５，０００〜４１０，０００の分子量のデキストランを用いる比色法を用いて、そしてタンパク質についてはＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質分析法を用いて分析できる精製レクチン−多糖類画分である。抽出した多糖類画分の純度は、オリジナルの天然ニワトコ種植物材料供給原料の２．４〜３．５質量（重量）％の全収率を生じる約１００〜１７０ｍｇ／ｇのデキストラン標準等価物である。抽出したレクチンタンパク質の純度は、オリジナルの天然ニワトコ種植物材料の０．５６質量（重量）％の全収率を生じるレクチン−多糖類画分の約１６質量（重量）％である。この抽出プロセスの例は、実施例４に見出される。結果は、表１４および１５に示した。さらに、ＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量分析法（実験のセクションを参照）を使用して、精製した多糖類画分を含む化合物の分子量をさらにプロファイリングした。
【０１３５】
（表１４．エルダーベリーのレクチン−多糖類画分の多糖類分析）
【０１３６】
【表１４】
2009531316.tif 000023
（表１５．エルダーベリーのレクチン−多糖類画分のタンパク質分析）
【０１３７】
【表１５】
2009531316.tif 000024
全ニワトコのレクチン−多糖類収率は、オリジナルの天然エルダーベリー供給原料に基づく質量（重量）％で、６０％エタノール沈降法を用いると２．４３％であり、８０％エタノール沈降法を用いると３．４５％であった。ニワトコ種植物材料および他の植物を用いた複数回の実験ならびに科学文献に基づくと、レクチン−多糖類画分の３．５％の収率は、生ニワトコ種植物材料中に存在する水溶性−エタノール不溶性多糖類およびレクチンタンパク質の濃度に極めて近い。
【０１３８】
多糖類の純度は、１００〜１７０ｍｇ／ｇ（デキストラン当量）であった。多糖類画分のデキストラン当量は他の植物由来の精製多糖類画分を用いて見いだされたものよりいくらか低いと思われるが、ニワトコ種植物材料中の多糖類の分子量は知られていない。そこで、多糖類化学成分の純度は、デキストラン当量を用いた比色アッセイを用いて推定されるものよりニワトコ種精製多糖類画分中における方がはるかに高い可能性がある。
【０１３９】
ニワトコのレクチン−多糖類画分中のレクチンタンパク質の純度は、その画分の質量（重量）％で、６０％エタノール沈降法を用いた場合は４．８％、そして８０％エタノール沈降法を用いた場合は１６．２％であった。８０％エタノール沈降法を用いた場合の全レクチンタンパク質収率は、オリジナルの天然ニワトコ種供給原料に基づくと０．５６質量（重量）％であり、粗水浸出抽出物に基づくと約９５質量（重量）％であった。６０％エタノール沈降法を用いた場合の全レクチン収率は、粗水浸出抽出物に基づくと約２０質量（重量）％に過ぎない。６０％エタノール沈降法は、高純度の多糖類化学成分および低純度のレクチンタンパク質を生じさせる。このため、２段階式エタノール沈降法を用いると、６０％エタノール沈降法を用いて高多糖類濃度の低レクチンタンパク質濃度プロフィール（約０／１）のサブ画分を有し、その後に８０％エタノールを用いる第２段階沈降法によって低多糖類／高レクチンタンパク質濃度プロフィール（約２／１）サブ画分を生成することが可能である。
【０１４０】
当技術分野においては、溶液からアルコールを除去するための多数の方法が知られている。再利用するためにアルコールを維持することが望ましい場合は、アルコールは、標準もしくは低い大気圧下での蒸留によって、抽出後に溶液から除去することができる。そのアルコールは、再使用できる。さらに、当技術分野においては、さらに水溶液もしくはそれからアルコールが除去された溶液のいずれかである溶液から水を除去するために知られている多数の方法がある。そのような方法には、水溶液を例えば炭酸マグネシウムもしくはマルトデキストリンなどであるがそれらに限定されない適切な担体上へ噴霧して乾燥させる工程が含まれる、または、液体は凍結乾燥法もしくはリフラクティブ・ウインドウ（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｗｉｎｄｏｗ）乾燥法によって乾燥させることができる。
【０１４１】
（食品および医薬）
本発明の食品の形態として、例えば、顆粒状態、粒状状態、ペースト状態、ゲル状態、固体状態、または液体状態などのあらゆる任意の形態に調製することができる。これらの形態では、例えば、結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、風味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解助剤、保存料、乳化剤、等張剤、安定剤もしくはｐＨ調節剤などの食品に加えることが許可されている、当業者に従来より知られている様々な種類の物質を任意で含有することができる。食品に加えられるエルダーベリー抽出物の量は、特別には限定されないが、それは、例えば、体重が約６０ｋｇの成人が摂取する量として１日当たり約１０ｍｇ〜５ｇ、好ましくは５０ｍｇ〜２ｇであってよい。
【０１４２】
詳細には、それが健康を維持するための食品、機能性食品などとして利用される場合は、本発明の規定の作用が十分に証明されているような量で本発明の有効成分を含有することが好ましい。
【０１４３】
本発明の医薬は、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固体作用物質、または注射剤などの液体作用物質として、従来より知られている方法によって任意に調製できる。これらの医薬には、例えば結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、風味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解助剤、保存料、乳化剤、等張剤、安定剤もしくはｐＨ調節剤などの一般に使用される任意の材料を用いて調製できる。
【０１４４】
医薬中の有効成分（エルダーベリー抽出物）の投与量は、種類、剤形、患者の年齢、体重もしくは症状などに依存して変動する可能性があり、そしてそれが経口投与される場合は、体重が約６０ｋｇの成人に対しては１日当たり１もしくは数回にわたり投与され、さらに１日当たり約１０ｍｇ〜５ｇ、好ましくは約５０ｍｇ〜２ｇの量で投与される。有効成分は、ニワトコ抽出物の１つまたは数種の成分であってよい。
【０１４５】
（送達系）
本発明の組成物を被験体に送達するために有用な投与様式には、例えば、散剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、パッチ剤および吸入剤などの当業者には一般に知られている投与様式が含まれる。
【０１４６】
１つの実施形態では、投与様式は、例えば、リポソーム製剤などの徐放性もしくは制御放出性吸入製剤を含んでいてよい吸入剤である。そのような送達系は、ＳＡＲＳ、鳥インフルエンザなどについて被験体を処置するために有用であろう。本実施形態では、本発明の製剤は、鼻腔内投与のために適する任意の定量投与器具で使用できる。本器具は、一見して最適な計量精度および鼻腔投与製剤との例えば容器、弁およびアクチュエーターなどの構成要素の適合性を保証するように構成されなければならず、そして例えば定量ネブライザー、ドライパウダー吸入器、ソフトミスト吸入器、またはネブライザーのポンプシステムのような機械的ポンプシステムを基礎とすることができよう。大量の投与される用量に起因して、好ましい器具には、ジェットネブライザー（例えば、ＰＡＲＩ  ＬＣ  Ｓｔａｒ、ＡＫＩＴＡ）、ソフトミスト吸入器（例えば、ＰＡＲＩ  ｅ−Ｆｌｏｗ）、およびカプセル使用型ドライパウダー吸入器（例えば、ＰＨ＆Ｔ  Ｔｕｒｂｏｓｐｉｎ）が含まれる。適切な推進剤は、フッ化炭素、炭化水素、窒素および酸化二窒素またはそれらの混合気などの気体から選択できる。
【０１４７】
吸入送達器具は、ネブライザーもしくは計量吸入器（ＭＤＩ）、または当業者には知られている任意の他の適切な吸入送達器具であってよい。器具は、単回用量の製剤を含有しており、それを送達するために使用できる、または器具は複数回用量の本発明の組成物を含有しており、それを送達するために使用できる。
【０１４８】
ネブライザータイプの吸入送達器具は、通常は水性である液剤、または懸濁剤として本発明の組成物を含有することができる。吸入のために本組成物の噴霧スプレーを生成する際に、ネブライザータイプの送達器具は、超音波により、圧縮空気により、他の気体により、電気的もしくは機械的に駆動させることができる。超音波ネブライザー器具は、通常は電気化学的振動面を介して製剤の液体膜へ高速振動波形を付与することによって作動する。所定の振幅では、波形は不安定になり、それにより液体膜を分解し、製剤の小滴を作り出す。空気もしくは他の気体によって駆動されるネブライザー器具は、高圧ガス流が局所的圧力低下を作り出し、それが毛細管作用によって液体製剤をガス流内に引き込むことに基づいて作用する。この微細な液体流は、次に剪断力によって分解される。ネブライザーは、設計においてポータブル型およびハンドヘルド型であってよく、内蔵電気ユニットを装備することができる。ネブライザー器具は、それを通して液体製剤を加速できる規定アパーチャサイズの、２本の同じ場所にある出口チャネルを有するノズルを含んでいてよい。これは、２つの流れの衝突および製剤の噴霧化を生じさせる。ネブライザーは、吸入用の製剤のエアロゾルを生成するために、規定アパーチャサイズの複数孔ノズルを通して液体製剤を推し進めるために機械的アクチュエーターを使用できる。単回用量ネブライザーの設計においては、単回用量の製剤を含有するブリスターパックを使用できる。
【０１４９】
本発明においては、ネブライザーは、例えば、肺膜内に粒子を配置するために粒子のサイズ設定が最適であることを保証するために使用できる。
【０１５０】
定量吸入器（ＭＤＩ）は、本発明の組成物のための吸入送達器具として使用できる。本器具は加圧式（ｐＭＤＩ）で、その基本構造は、計量弁、アクチュエーターおよび容器を含んでいる。器具から製剤を放出するためには推進剤が使用される。本組成物は、加圧推進剤液体中に懸濁させた規定サイズの粒子から構成されてよい、または本組成物は加圧液体推進剤の溶液もしくは懸濁液中にあってよい。使用される推進剤は、例えば１３４ａおよび２２７などの主として大気に優しいヒドロフルオロカーボン（ＨＦＣ）である。ＣＦＣ−１１、１２および１１４のような伝統的クロロフルオロカーボンは、不可欠である場合にのみ使用される。吸入システムの器具は、例えばブリスターパックによって単回用量を送達できる、またはそれは複数回投与の設計であってもよい。吸入システムの加圧計量吸入器は、正確な用量の脂質含有製剤を送達するために呼吸作動させることができる。投与の精度を保証するために、製剤の送達は、吸入サイクルの所定の時点で発生させるためにマイクロプロセッサーによってプログラミングすることができる。ＭＤＩは、ポータブル型およびハンドヘルド型であってよい。
【０１５１】
また別の実施形態では、送達系は、例えば、ヒドロゲル、クリーム剤、ローション剤、軟膏剤、もしくはパッチ剤などの経皮送達系であってよい。パッチは、詳細には、数週間もしくは数カ月間の時限投与が所望の場合に使用できる。
【０１５２】
また別の実施形態では、非経口の投与経路を使用できる。非経口経路は、身体の様々な区画内への注射を含んでいる。非経口経路には、静脈内（ｉｖ）、すなわち、静脈を通して血管系への直接的投与；動脈内（ｉａ）、すなわち、動脈を通して血管系への直接的投与；腹腔内（ｉｐ）、すなわち、腹腔内への投与；皮下（ｓｃ）、すなわち、皮膚下への投与；筋肉内（ｉｍ）、すなわち、筋肉内への投与；および皮内（ｉｄ）、すなわち、皮膚層間への投与が含まれる。非経口経路は、投与される製剤の一部が消化管内で部分的もしくは完全に分解するであろう場合には、時には経口経路よりも好ましい。同様に、救急症例において迅速な反応が必要な場合には、非経口投与は、通常は経口よりも好ましい。
【０１５３】
（インフルエンザの処置方法）
Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１に対するエルダーベリー画分の阻害活性を定量した。画分の連続希釈液を知られている量のウイルスとともにインキュベートし、細胞培養単層へ送達した（図５を参照）。用量反応曲線をプロットし、Ａ型ヒトインフルエンザＨＩＮ１ウイルスに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を各画分について決定した。ＩＣ５０値については、図６〜１１および以下の表１６を参照されたい。さらに、エルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ２がデング熱ウイルスならびにＡ型ヒトインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１を阻害することも決定されている（図１２を参照）。実験プロトコルについては、実施例９を参照されたい。
【０１５４】
（表１６．Ａ型ヒトインフルエンザＨ１Ｎ１ウイルスを用いた阻害分析の結果の要約）
【０１５５】
【表１６】
2009531316.tif 000025
（ＨＩＶの処置方法）
ＨＩＶ−１ウイルスに対するエルダーベリー画分の阻害活性を定量した。知られている希釈率の抽出物を知られている量のキメラＨＩＶ−１  ＳＧ３（ゲノム）Ｃサブタイプ（エンベロープ）ウイルスとともにインキュベートした。図９を参照されたい。用量反応曲線をプロットし、外挿した５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を決定した。図３２〜３４および以下の表１７を参照されたい。実験プロトコルについては、実施例１０を参照されたい。
【０１５６】
（表１７．ＨＩＶ−１ウイルスを用いた阻害分析の結果の要約）
【０１５７】
【表１７】
2009531316.tif 000026
（適例）
（材料）
植物：野生のＳａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ  Ｌ．（Ｓａｍｂｕｃａ  ｎｉｇｒａ  Ｌ．）の果実（エルダーベリー）（製品番号：７２４、ロット番号：Ｌ１０３７９ｗ、ハンガリー）およびＳａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ  Ｌ．（Ｓａｍｂｕｃａ  ｎｉｇｒａ  Ｌ．）の花（エルダーフラワー）（製品番号：７２５、ロット番号：Ｌ０１２５８Ｗ、ポーランド）は、Ｂｌｅｓｓｅｄ  Ｈｅｒｂｓ社（シンシナティ）から購入した。
【０１５８】
有機溶媒：アセトン（６７−６４−１）、≧９９．５％、ＡＣＳ試薬（１７９１２４）；ＨＰＬＣ用のアセトニトリル（７５−０５−８）、勾配グレード≧９９．９％（ＧＣ）（０００６８７）；ヘキサン（１１０−５４−３）、９５＋％、分光法グレード（２４８８７８）；酢酸エチル（１４１−７８−６）、９９．５＋％、ＡＣＳグレード（３１９９０２）；４．８％イソプロパノールを用いて変性させたエタノール（０２８５３）；無水エタノール（６４−１７−５）（０２８８３）；メタノール（６７−５６−１）、９９．９３％、ＡＣＳ  ＨＰＬＣグレード（４３９１９９３）；および水（７７３２−１８−５）、ＨＰＬＣグレード（９５３０４）。全部をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。
【０１５９】
酸および塩基：ギ酸（６４−１８−６）、５０％溶液（０９６７６）；酢酸（６４−１９−７）、９９．７＋％、ＡＣＳ試薬（３２００９９）；塩酸（７６４７−０１−０）、容積標準１．０Ｎ水溶液（３１８９４９）；Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕフェノール試薬（２Ｎ）（４７６４１）；フェノール（１０８−９５−２）（Ｐ３６５３）；硫酸（７６６４−９３−９）、ＡＣＳ試薬、９５〜９７％（４４７１９）；および炭酸ナトリウム（Ｓ２６３−１、ロット番号：０３７４０６）は、Ｆｉｓｈｅｒ社から購入した。
【０１６０】
化学参照標準物質：血清アルブミン（９０４８−４６−８）、試験したウシアルブミン画分Ｖ粉末細胞培養（Ａ９４１８）；ルチン（ＣＡＳ番号：１５３−１８−４）；およびシアニジン３−グルコシド塩化物（ＣＡＳ番号：７０８４−２４−４）は、Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ社から購入した。ＤＩＮにしたがって認定されたデキストラン標準物質［５０００（００２６９）、５０，０００（００８９１）および４１０，０００（００８９５）］は、Ｆｌｕｋａ社から購入した。ＨＰＬＣ化学参照標準物質の構造は、以下に示した。
【０１６１】
【化３】
2009531316.tif 000027
ポリマー親和性吸着剤：５６０〜７１０ｎｍの粒径および３８０ｍ２／ｇの表面積を備える白色透明ビーズとして使用した、マクロ網状脂肪族アクリル架橋結合ポリマーであるＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ  ７ＨＰ（Ｒｏｈｍ  ＆  Ｈａａｓ社、フランス国）。３００〜１２００ｎｍの粒径および５００〜６００ｍ２／ｇの表面積を備える、エステル基改質ポリスチレンであるＡＤＳ−５（Ｎａｎｋａｉ大学、中国）。
【０１６２】
（方法）
（高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法）
クロマトグラフィーシステム：ＳＰＤ−Ｍ  １０ＡＶＰ光ダイオードアレイ検出器を備える、ＬＣ１０ＡＤＶＰポンプを装備した、Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製高速液体クロマトグラフィーＬＣ１０ＡＶＰシステム。
【０１６３】
本発明のエタノール抽出生成物は、逆相Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラム（内径２５０×４．６ｍｍ、５μ、３００Å）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社、部品番号：００Ｇ−４０５３−Ｅ０、製造番号：２２１７５２０−３、バッチ番号：５２４３−１７）上で測定した。注入量は１０μＬであり、移動相の流量は１ｍＬ／分であった。カラム温度は、２５℃であった。移動相は、Ａ（５％ギ酸／酢酸、ｖ／ｖ）およびＢ（メタノール）から構成された。勾配は次のようにプログラミングした：最初の２分間は、Ｂを５％で２〜１０分間維持し、溶媒Ｂを１０〜１５分間かけて５％〜２４％へ線形で増加させ、Ｂを１５〜３０分間にわたり２４％で維持し、Ｂを３０〜３５分間にわたり２４％〜３５％へ線形で増加させ、Ｂを３５〜５０分間にわたり３５％で維持し、Ｂを３５％〜４５％へ線形で増加させ、この組成で５分間、さらに５５〜６５分間にわたり保持し、６５〜６８分間にわたり４５％〜５％へ線形で減少させ、Ｂを５％で維持した。検出波長は、フラボノイドについては３５０ｎｍであり、アントシアニジンについては５２０ｎｍであった。
【０１６４】
２つの参照標準物質のメタノールストック溶液は、計量した量の標準化合物を５ｍｇ／ｍＬでエタノール中に溶解させる工程によって調製した。混合参照標準物質溶液は、次に一連の溶液を各々１．０、０．５、０．２５、０．１、および０．０５ｍｇ／ｍＬの最終濃度で生成するために段階的に希釈した。ストック溶液および作用溶液は全部を７日間以内に使用し、＋４℃で保管し、使用前に室温にさせた。これらの溶液を使用して、エルダーベリーおよびエルダーフラワー両方において化合物を同定および定量した。５２０ｎｍでのシアニジン−３−グルコシド（ＣＹ３ｇｌｕ）および３５０ｎｍでのルチンの保持時間は、各々約１３．２７および２０．２０分間であった。０．０１〜２０μｇの範囲内の線形フィットが見出された。回帰方程式および相関係数は、次のとおりであった：アントシアニジン−３−グルコシド：面積／１００＝２０８８８＊×Ｃ（μｇ）＋５０２．２１、Ｒ２＝０．９９９４（Ｎ＝５）；およびルチン：面積／１００＝１１５７３×Ｃ（μｇ）＋５８４．５７、Ｒ２＝０．９９９６（Ｎ＝５）。ＨＰＬＣの結果は、表１８に示した。各サンプル中の参照標準物質の含量は、ピーク面積に基づいて対応する検量線からの内挿によって計算した。
【０１６５】
（表１８．メタノール中の０．１ｍｇ／ｍＬの濃度でのニワトコ参照標準物質についてのＨＰＬＣ分析の結果）
【０１６６】
【表１８】
2009531316.tif 000028
＊理論段数は：Ｎ＝１６×（ｔＲ／ｗ）２によって計算した。ｔＲは保持時間であり、ｗはピークの幅である、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｎ−ｎｅｔ．ｃｏｍ／ｗｅｂ％５ＣＭＮ−ＷＥＢ  ＨＰＬＣＫａｔａｌｏｇ．ｎｓｆ／ＷｅｂＥ／ＧＲＵＮＤＬＡＧＥＮ
（ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）法）
ＧＣ−ＭＳ分析は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０システムを使用して実施した。このシステムは、高性能ガスクロマトグラフ、直接結合ＧＣ／ＭＳインターフェース、独立温度制御装置を備える電気衝撃（ＥＩ）イオン源、および四重極マスフィルターを含んでいる。このシステムは、データ収集およびラン後分析のためのＧＣＭＳ溶液Ｖｅｒ．２ソフトウエアを用いて制御される。分離は、下記の温度プログラムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｊ＆Ｗ  ＤＢ−５溶融石英キャピラリーカラム（内径３０ｍ×０．２５ｍｍ、厚さ０．２５μｍのフィルム（５％フェニル、９５％ジメチルシロキサン）（カタログ番号：１２２５０３２、製造番号：ＵＳ５２８５７７４Ｈ）上で実施した。初期温度は６０℃で、２分間にわたり維持し、次に４℃／分の速度で１２０℃へ上昇させ、１５分間維持し、次に４℃／分の速度で２００℃へ上昇させ、１５分間にわたり維持し、次に４℃／分の速度で２４０℃へ上昇させ、さらに１５分間にわたり維持した。全ラン時間は、およそ９２分間であった。サンプル注入温度は、２５０℃であった。１μＬのサンプルは、オートインジェクターによってスプリットレスモードで１分間に注入した。キャリヤーガスはヘリウムであり、流量は６０ｋＰａの圧力によって制御した。そのような圧力下で、流量は１．０３ｍＬ／分であり、線形速度は３７．１ｃｍ／分および総流量は３５ｍＬ／分であった。ＭＳイオン源温度は２３０℃であり、ＧＣ／ＭＳインターフェース温度は２５０℃であった。ＭＳ検出器は、７０ｅＶのイオン化電圧を用いて１，０００ＡＭＵ／秒のスキャン速度で５０〜５００のｍ／ｚ間でスキャンした。溶媒カットオフ温度は、３．５分間であった。
【０１６７】
Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ法（Ｍａｒｋａｒ，Ｈ．Ｐ．Ｓ．，ＢｌｕｅｍｍｅｌＭ．，Ｂｏｒｏｗｙ，Ｎ．Ｋ．ａｎｄ  Ｂｅｃｋｅｒ，Ｋ．，１９９３，Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．６１：１６１−１６５）による全フェノール酸濃度
機器：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（ＵＶプローブを備えるＵＶ１７００：Ｓ／Ｎ：Ａ１１０２４２１９８２ＬＰ）。
【０１６８】
参照標準物質：１ｍｇ／ｍＬの濃度で没食子酸／水のストック水溶液を作製した。適切な量の没食子酸溶液を試験管中に装填し、蒸留水を用いて容量を０．５ｍＬにし、０．２５ｍＬのＦｏｌｉｎ  Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬を加え、そして次に１．２５ｍＬの２０重量％炭酸ナトリウム溶液を加えた。試験管を４０分間にわたり超音波浴中でしっかりと振とうし、７２５ｎｍで吸光度を記録した。参照標準物質のデータは、表１９に示した。
【０１６９】
（表１９．Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ法で没食子酸参照標準物質を使用するための検量線データ）
【０１７０】
【表１９】
2009531316.tif 000029
＊：没食子酸溶液の量は、吸着情報に左右される。
【０１７１】
未知のサンプル：適切なアリコートのタンニン含有抽出物を試験管中に入れ、蒸留水を用いて容量を０．５ｍＬにし、０．２５ｍＬのＦｏｌｉｎ  Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬を加え、そして次に１．２５ｍＬの炭酸ナトリウム溶液を加えた。試験管をボルテックスミキサーにかけ、４０分後に７２５ｎｍで吸光度を記録した。上記の検量線から没食子酸等価物として全フェノールの量を計算した。
【０１７２】
（Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬法によるタンパク質含量の決定）
機器：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（ＵＶプローブを備えるＵＶ１７００：Ｓ／Ｎ：Ａ１１０２４２１９８２ＬＰ）。
【０１７３】
標準検量線：未知サンプルとして同一バッファー中で適切な濃度のタンパク質標準物質を調製した。本発明では、脱イオン水をバッファーと置換することができる。２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡのタンパク質標準物質溶液を連続希釈することによって０．１〜１．４ｍｇ／ｍＬの範囲内のＢＳＡ標準物質を作製した。次に、０．１ｍＬのＢＳＡ標準物質を３ｍＬのＢｒａｄｆｏｒｄ試薬と混合した。混合液をボルテックスミキサーにかけ、サンプルを５〜４５分間にわたり室温でインキュベートした。吸光度を５９５ｎｍで記録した。サンプルの吸光度は、６０分間の制限時間前および相互に１０分間以内に記録しなければならない。結果は、表２０に示した。
【０１７４】
（表２０．Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイについての標準検量データ）
【０１７５】
【表２０】
2009531316.tif 000030
未知サンプルの分析：試験管中にタンパク質含有試験サンプルの適切なアリコートを入れた；蒸留水を用いて容量を０．１ｍＬにした。次に３ｍＬのＢｒａｄｆｏｒｄ試薬を加えた。試験管を振とうし、５〜４５分間以内に５９５ｎｍで吸光度を記録した。上記の検量線からＢＳＡ標準物質等価物としてタンパク質の量を計算した。
比色法（Ｄｕｂｏｉｓ，Ｍ．，Ｇｉｌｌｅｓ，Ｋ．Ａ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ｋ．，Ｒｅｂｅｒｓ，Ｐ．Ａ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｆ．，１９５６，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８（３）：３５０−３５６）を用いた多糖類分析。
【０１７６】
分光光度計システム：本試験では、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ−１７００紫外・可視分光光度計（１９０〜１１００ｎｍ、分解能１ｍｍ）を使用した。
【０１７７】
多糖類分析のためには比色法が使用されてきた。デキストランの０．１ｍｇ／ｍＬのストック溶液（分子量＝５，０００、５０，０００および４１０，０００）を作製した。０．０８、０．１６、０．２４、０．３２、０．４０ｍＬのストック溶液を取り出し、蒸留水を用いて容量を０．４ｍＬにした。次に０．２ｍＬの５％フェノール溶液および１ｍＬの濃硫酸中に加えた。この混合液を１０分間放置し、その後にＵＶスキャニングを実施した。最高吸光度は、４８８ｎｍで見いだされた。次に波長を４８８ｎｍに設定し、各サンプルについて吸光度を測定した。結果は、表２１に示した。標準検量線は、以下のようにデキストラン溶液各々について入手した：デキストラン５，０００、吸光度＝０．０１９１９＋０．０２７７８２Ｃ（μｇ）、Ｒ２＝０．９７（Ｎ＝５）；デキストラン５０，０００、吸光度＝０．００７５７１４＋０．０３２１９６Ｃ（μｇ）、Ｒ２＝０．９６（Ｎ＝５）；およびデキストラン４１０，０００、吸光度＝０．０３４８１＋０．０３６２９３Ｃ（μｇ）、Ｒ２＝０．９８（Ｎ＝５）。
【０１７８】
（表２１．デキストラン参照標準物質の比色分析）
【０１７９】
【表２１】
2009531316.tif 000031
（多糖類分析のためのリアルタイム直接分析（ＤＡＲＴ）質量分析）
全ＤＡＲＴクロマトグラム、および詳細にはＸＡＤ  ７ＨＰ充填剤からの画分Ｆ１〜Ｆ６およびＡＤＳ５充填剤からの画分Ｆ１〜Ｆ４についてのＤＡＲＴクロマトグラムは、以下に記載した機器および方法を用いてランした。
【０１８０】
機器：ＪＯＥＬ  ＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ  ＬＣ飛行時間質量分析計（Ｊｏｅｌ  ＵＳＡ社、米国マサチューセッツ州ピーボディ）。この飛行時間（ＴＯＦ）質量分析計の技術は、サンプル調製を必要とせず、０．００００１質量単位までの精度の質量を生成する。
【０１８１】
方法：多糖類画分を捕捉および分析するために利用したこの機器の設定は、次のとおりであった：カチオンモードについては、ＤＡＲＴ針電圧は３，０００Ｖ、２５０℃での加熱要素、電極１は１００Ｖ、電極２は２５０Ｖ、およびヘリウムガス流量は７．４５リットル／分（Ｌ／分）であった。質量分析計については、オリフィス１は１０Ｖ、リングレンズは５Ｖ、およびオリフィス２は３Ｖであった。ピーク電圧は、およそ６０ｍ／ｚから出発する解像力を得るために６００Ｖに設定したが、それでもより大きな質量範囲で十分な分解能を許容した。マイクロチャネルプレート検出器（ＭＣＰ）電圧は、２，４５０Ｖに設定した。検量は、０．５Ｍカフェイン溶液標準物質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国セントルイス）を用いてサンプル導入前に毎朝実施した。検量公差は、≦５ｍμに維持した。
【０１８２】
サンプルは、サンプルの最大表面積をヘリウムプラズマビームに曝露させることを保証するように、無菌鉗子を用いてＤＡＲＴヘリウムプラズマ内に導入した。サンプルをビーム内に導入するためには、掃引運動を使用した。この運動はサンプルを約０．５秒／スワイプについて前後ストロークで繰り返し曝露させ、サンプルの熱分解を防止することを許容した。この運動は、感知できる全イオン電流（ＴＩＣ）シグナルが検出器で観察されるまで繰り返し、次にベースライン／バックグラウンド標準化を許容するために、サンプルを除去した。
【０１８３】
アニオンモードのためには、ＤＡＲＴおよびＡｃｃｕＴＯＦ  ＭＳを陰イオンモードへ切り替えた。針電圧は３，０００Ｖ、加熱要素は２５０℃、電極１は１００Ｖ、電極２は２５０Ｖ、およびヘリウムガス流量は７．４５Ｌ／分であった。質量分析計については、オリフィス１は−２０Ｖ、リングレンズは−１３Ｖ、およびオリフィス２は−５Ｖであった。ピーク電圧は、２００Ｖであった。ＭＣＰ電圧は２，４５０Ｖに設定した。サンプルは、カチオンモードと正確に同一方法で導入した。全データ分析は、機器と一緒に供給されるＭａｓｓＣｅｎｔｅｒＭａｉｎ  Ｓｕｉｔｅソフトウエアを用いて実施した。
【実施例】
【０１８４】
（実施例１）
（工程１Ａの実施例：エルダーベリーの単一工程ＳＦＥ最高抽出および精製）
全ＳＦＥ抽出は、各々６９０ｂａｒおよび２００℃までの圧力および温度に対して設計されたＳＦＴ  ２５０（Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｆｌｕｉｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国デラウエア州ニューアーク）上で実施した。この装置は、動的もしくは静的モードいずれかで作動するための柔軟性を備えて、超臨界条件での単純かつ効率的抽出を許容する。この装置は、主として３つのモジュールであるオーブン、ポンプおよび制御装置、ならびに収集モジュールから構成される。オーブンは、１つの予熱カラムおよび１つの１００ｍＬ抽出容器を有している。ポンプモジュールには、３００ｍＬ／分の定流量能力を備える圧縮空気駆動式ポンプが装備されている。収集モジュールは、抽出生成物を回収するためのキャップおよび隔膜で密封された４０ｍＬのガラスバイアルである。この装置には、マイクロメーター弁および流量計が用意されている。抽出容器の圧力および温度は、監視され、±３ｂａｒ以内および±１℃以内で制御される。
【０１８５】
典型的な実験実施例では、スクリーン（１４０メッシュ）を用いて測定した１０５μｍを超えるサイズへふるいにかけた、５ｇの微粉化したＳａｍｂｕｃｕｓ  Ｎｉｇｒａ  Ｌ．の果実（エルダーベリー）または花（エルダーフラワー）の粉末を各実験のために１００ｍＬの抽出容器に装填した。固体材料が持ち越される可能性を回避するために、カラムの両端にガラスウールを配置した。オーブンは、充填容器に装填する前に、所望温度へ予熱した。容器をオーブンに接続した後に、ＣＯ２（約８５０ｐｓｉｇ）を用いてシステムを加圧することによって抽出システムを漏出について試験し、パージした。システムを密閉し、空気駆動式液体ポンプを用いて所望の抽出圧へ加圧した。次に、システムを平衡させるために約３分間にわたり放置した。サンプリングバイアル（４０ｍＬ）を計量し、サンプリングポートへ接続した。抽出は、計量弁によって制御される約５ＳＬＰＭ（１０ｇ／分）の速度でＣＯ２を流動させることによって開始した。収率は、全抽出物対原料の供給量の重量比であると規定した。収率は、抽出器内の原料の初期装填量に比較した、抽出された油の重量％とであると規定した。温度を４０〜８０℃および圧力を１００〜５００ｂａｒの間で変動させる全要因抽出設計を採用した。各条件で入手された抽出物は、ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）分析のために、４００ｐｐｍの濃度でジクロロメタン中に溶解させた。
【０１８６】
（実施例２）
（工程２の実施例：含水アルコール浸出抽出）
ニワトコ種のフェノール酸化学成分についての２段階式溶媒抽出の典型的な実施例は、次のとおりである：供給原料は、精油の工程１のＳＣＣＯ２抽出（６０℃、３００ｂａｒ、９０分）からの１７．６ｇの微粉化したエルダーベリーＳＦＥ残留物であった。溶媒は、３００ｍＬの２５％エタノール水溶液であった。この方法では、供給原料および８０％エタノール水溶液を５００ｍＬの抽出容器内へ個別に装填し、４時間にわたり６０℃で加熱水浴中で混合した。抽出溶液は、４〜８μｍの粒子保持サイズを有するＦｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ  Ｐ４濾紙を使用して濾過し、２０分間にわたり２，０００ｒｐｍで遠心分離し、粒子状残留物をその後の抽出のために使用した。濾液（上清）を収集し、収率計算、ＨＰＬＣ分析、ならびにＦ１〜Ｆ４およびＦ１〜Ｆ６画分の生成のために結合した（下記の実施例３を参照されたい）。上記の方法を用いて、第１段階の残留物を２時間にわたり抽出した（第２段階）。
【０１８７】
（実施例３）
（工程３の実施例：フェノール酸画分の親和性吸着剤抽出（Ｆ１〜Ｆ４およびＦ１〜Ｆ６画分の調製））
典型的な実験では、作用溶液は、工程２におけるニワトコ種のエタノール水溶液浸出抽出物の透明含水アルコール溶液であった。親和性吸着剤ポリマー樹脂は、ＸＡＤ７ＨＰまたはＡＤＳ５であった。１５ｇのＡＤＳ５親和性吸着剤または２０ｇのＸＡＤ７ＨＰ親和性吸着剤は、内径２５ｍｍおよび長さ５００ｍｍを備えるカラム内に充填する前後に、９５％エタノール（４〜５ＢＶ）および蒸留水（４〜５ＢＶ）を用いて予備洗浄した。装填溶液は粗８０％エタノール浸出フェノール酸溶液であったが、化学成分は回転真空蒸留およびエタノールの再循環によって濃縮させた。最終装填溶液の濃度は、ＸＡＤ７ＨＰ装填のためには２９．０３ｍｇ／ｍＬおよびＡＤＳ５装填のためには３４．９０ｍｇ／ｍＬであった。０．３ＢＶ／時の流量で、５０ｍＬの装填溶液はＸＡＤ７ＨＰカラム上に装填し、６０ｍＬの装填溶液はＡＤＳ５カラム上に装填した。装填時間は、約５０〜６０分間であった。装填されたカラムは、１３分間の洗浄時間を用いて０．２ＢＶ／時の流量で２ＢＶの蒸留水により洗浄した。４０ｍＬの４０％および８０％水性エタノールを使用して、ＸＡＤ７ＨＰについては２ｍＬ／分およびＡＤＳ５については１．５ｍＬ／分の流量で装填したカラムを連続的に溶出させた。溶出中、６つの溶離剤画分（Ｆ１〜Ｆ６：Ｆ１  約２０ｍＬ、Ｆ２  約２０ｍＬ、Ｆ３  約１８ｍＬ、Ｆ４  約１０ｍＬ、Ｆ５  約１７ｍＬ、およびＦ６  約２７ｍＬ）をＸＡＤ７ＨＰカラムから収集し、４つの溶離剤画分（Ｆ１〜Ｆ４：Ｆ１  約２０ｍＬ、Ｆ２  約２０ｍＬ、Ｆ３  約１７ｍＬ、およびＦ４  約１７ｍＬ）をＡＤＳ５カラムから各々収集した。ＸＡＤ７ＨＰカラムについては、Ｆ１〜Ｆ３は、４０％エタノールを用いて溶出し、そしてＦ４〜Ｆ６は８０％エタノールを用いて収集した。ＡＤＳ５カラムについては、Ｆ１〜Ｆ２は、４０％エタノールを用いて溶出し、そしてＦ３〜Ｆ４は８０％エタノールを用いて溶出させた。次に、４〜５ＢＶの９５％エタノールを使用して、３．６ＢＶ／時の流量でカラム上に残留している化学薬品を一掃し、その後に３．８ＢＶ／時で４〜５ＢＶの蒸留水を用いて洗浄した。全プロセス所要時間は、２時間未満であった。全プロセス中の流量は、ＦＰＵ  ２５２  Ｏｍｅｇａｆｌｅｘ（登録商標）速度可変式（３〜５０ｍＬ／分）蠕動ポンプを用いて制御した。各溶出画分を収集し、ＤＡＲＴ質量平衡およびＨＰＬＣによって分析した。
【０１８８】
（実施例４）
（工程５の実施例：多糖類画分の抽出）
ニワトコ種の水溶性−エタノール不溶性精製レクチン−多糖類画分化学成分の溶媒抽出および沈降の典型的な実験的実施例は、次のとおりである：２段階式含水アルコール浸出抽出（工程２）からの１５ｇの固体残留物は、８０℃で２時間にわたり３００ｍＬの蒸留水を用いて２段階で抽出した。２つの抽出溶液を結合し、スラリーはＦｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ  Ｐ４濾紙（孔径：４〜８μｍ）を用いて濾過し、２０分間にわたり２，０００ｒｐｍで遠心した。溶液中の化合物の濃度は、３．８ｍｇ／ｍＬであった。３００ｍＬのこの溶液、および次に４５６ｍＬもしくは１，２００ｍＬの無水エタノールを加えて６０％もしくは８０％の最終エタノール濃度を作製した。溶液を１時間にわたり放置すると、その間に沈降が発生した。抽出溶液を２０分間にわたり３，０００ｒｐｍで遠心し、上清をデカンテーションし、廃棄した。沈降物を収集し、５０℃のオーブンで１２時間にわたり乾燥させた。乾燥させた多糖類画分を計量し、参照標準物質としてデキストランを用いる比色法による多糖類純度の分析およびＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ法を用いるレクチンタンパク質純度の分析のために水中に溶解させた。ＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量分析法を使用して、精製した多糖類画分を含む化合物の分子量をさらにプロファイリングした。エルダーベリーの結果は、図３６および３７ならびに表２２に示した。エルダーフラワーの結果は、図３８および３９ならびに表２２に示した。
【０１８９】
（表２０．エルダーベリーおよびエルダーフラワー由来の多糖類についてのＤＡＲＴ分析）
【０１９０】
【表２０−Ａ】
2009531316.tif 000032
【０１９１】
【表２０−Ｂ】
2009531316.tif 000033
【０１９２】
【表２０−Ｃ】
2009531316.tif 000034
（実施例５）
以下の成分を調製物のために混合した：
【０１９３】
【化４】
2009531316.tif 000035
ニワトコ種の新規抽出物は、精油画分、フェノール酸−精油画分、および多糖類画分を天然根茎材料中もしくは従来型抽出生成物中で見いだされるより多い質量（重量）％で含んでいる。本調製物は、経口製剤に作製して、１日１回または所望の生理学的および心理学的作用（興奮および情動不安の減少）および医学的作用（一般的な風邪、インフルエンザ、単純ヘルペス、帯状疱疹、およびＨＩＶなどのウイルス疾患、糖尿病、心血管および脳血管疾患の予防および処置、抗アテローム硬化症、酸化防止剤およびフリーラジカル捕捉剤、抗炎症薬、抗関節炎薬、抗リウマチ薬、および消化管障害）のための必要に応じて１日１５回まで投与できる。
【０１９４】
（実施例６）
以下の成分を以下の調製物のために混合した：
【０１９５】
【化５】
2009531316.tif 000036
ニワトコ種のセンキュウ（ｃｈｕａｎｇｘｉｏｎｇ）の新規抽出組成物は、天然植物材料中もしくは従来型抽出生成物中で見いだされるより多い質量（重量）％の精油、フェノール酸−精油、および多糖類化学成分画分を含んでいる。本調製物は、任意の経口製剤形に作製し、所望の生理学的、心理学的および医学的作用のための必要に応じて１日１５回まで安全に投与することができる（上記の実施例５を参照されたい）。
【０１９６】
（実施例７）
（使用すべき細胞数を決定するためのＭＴＴアッセイ）
目的：これは、ＭＴＴ／細胞毒性アッセイにおいて将来使用するための細胞量を決定するためのコントロール実験である。これは、使用される１細胞系につき１回のみ実施しなければならない。
【０１９７】
（抗ウイルス活性についての生物活性剤のＪＤ評価）
（第１日）
１つのコンフルエントな細胞のＴ−７５フラスコから（このプロトコルはＭＤＣＫ（マディンダービーイヌ腎）細胞を用いて書かれている）：
１．培地を吸引して取り除き、２ｍＬのトリプシンをフラスコに加える。３７℃で５分間にわたりインキュベートする。
２．フラスコの側面を強く叩き、側面のトリプシンを５０ｃｃ円錐管内へ落とす。この試験管へ０．５ｍＬの増殖培地（ＤＭＥＭ＋Ｐ／Ｓ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ＋ＦＢＳ）をさらに加える。
３．別の２ｍＬトリプシンをフラスコへ加える。３７℃で３〜５分間にわたりインキュベートする。
４．フラスコの側面を強く叩き、側面のトリプシンを工程２からの５０ｃｃ円錐管へ落とす。１０ｍＬの増殖培地をフラスコへ加え、フラスコの底部を２回すすぎ洗う。この１０ｍＬ培地を同一の５０ｃｃの円錐管へ入れる。顕微鏡を用いて細胞が除去されているかどうかについてフラスコをチェックする。
５．５分間かけて、４℃、１，０００ｒｐｍで遠沈させる。上清を吸引により取り除く。
６．ペレットを取り除き、このペレットを５ｍＬ増殖培地中に再懸濁させる。
７．５分間かけて、４℃、１，０００ｒｐｍで遠沈させる。上清を吸引により取り除く。
８．ペレットを取り除き、細胞を１ｍＬ増殖培地中に再懸濁させる。
９．５００μＬの細胞を微量遠心管中の５００μＬ増殖培地へ加えることによって細胞を１：２に希釈する。極度に細胞密度が高いプレートを用いて開始した場合は、細胞を増殖培地中で１：４に希釈してもよい。
１０．血球計上で１０μＬの希釈細胞についてチェックする。３つの大きなグリッドについて細胞数を記録し、これらの３つの数の平均値を出す。これによって細胞数：平均値×１０４細胞（個）／ｍＬが得られる。約５×１０６細胞（個）／ｍＬを用いて開始してもよい。過剰に多数の細胞を有する場合は、もう一度希釈した後に細胞を再計数する。
１１．２倍希釈液を調製するためには、計１１本の微量遠心管を使用する。これは１つの実施例である：
【０１９８】
【化６】
2009531316.tif 000037
１２．本アッセイは、３組ずつ実施する。各遠心管から１００μＬを９６ウエルプレート内のウエルＡ〜Ｃ内に加えるが、プレート内の各カラム番号はそれらのサンプルを現在含有する遠心管に対応する。
１３．プレートを３７℃で一晩、または細胞を回収して再付着させるために要する時間（通常は１２〜１８時間））にわたりＣＯ２と一緒にインキュベートする。
【０１９９】
（第２日）
１．午前９時頃に、細胞が付着性であること、それらが少なくともカラム１内ではコンフルエントであること、そしてプレートを越えて移動するにつれて１ウエル当たりの細胞数が少なくなることを確認するためにプレート内の細胞を顕微鏡下でチェックする。最初の２〜３本のカラム内の媒質はオレンジ色のはずである；その他はピンク色のはずである。
２．１ウエル当たり１０μＬのＭＴＴ試薬（４℃で保管）を加えるが、各ウエル間でチップを交換し、ＭＴＴ試薬のストック溶液が汚染しないように注意を払う。プレートを３７℃で２時間インキュベートする。
３．顕微鏡下で紫色の点状の細胞内沈降物の出現についてプレートをチェックする。これが見えない場合は、２４時間までインキュベーションを続ける。
４．沈降物が見えたら、１ウエル当たり１００μＬの界面活性剤試薬（室温で保管）を加える。これ以降は絶対にプレートを揺り動かしては行けない。プレートをアルミホイルで被覆し、プレートを室温で一晩放置する。
【０２００】
（第３日）
１．Ｔｅｃａｎプレートリーダーを用いて、６２０ｎｍの参照波長を用いて５６０ｎｍでウエルの吸光度を測定する。ＸＦｌｕｏｒ４における「ＭＴＴ」と呼ばれるプログラムのいずれかを使用すると、これを行える。フィルタースライドＣがＴｅｃａｎ内にあることを確認する必要がある。
２．３回の読み取りから平均値を決定し、媒質単独のブランクについての平均値からの平均値を減じる（カラム１１）。ｙ軸上に吸光度、ｘ軸上に１ｍＬ当たりの細胞数をプロットする。
【０２０１】
今後のアッセイに使用するための、０．７５〜１．２５の吸光度を産生する細胞数を選択する。選択した細胞数は、曲線の線形部分内に含まれるはずである。
【０２０２】
（実施例８）
（ＭＴＴアッセイ）
目的：抽出物が細胞に細胞毒性作用を及ぼすかどうかを決定すること。
抗ウイルス活性についての生物活性剤のＪＤ評価
（第１日）
１．ＷＨ２６５内のウィンドウによる超高感度はかりを用いて、０．０１ｇの抽出物を測定し、１００μＬの無菌ＰＢＳ中に溶解させる。これを注意深くに精密に行うと、極めて精密な数値が入手されるので、抽出管のラベルの詳細と一緒に、ノートに質量を記録する。これは「未希釈抽出物」であり、約０．１ｇ／ｍＬの濃度にある。抽出物が完全に可溶性ではない場合は、微量遠心機内で３０秒間にわたり１３，０００ｒｐｍで沈降物を遠沈させ、当日中に作業するためには上清を無菌微量遠心管へ取り出し、翌日以降に使用するためにはペレットを−２０℃で保管する。
１つのコンフルエントな細胞のＴ−７５フラスコから（このプロトコルはＭＤＣＫ細胞を用いて書かれている）：
１．培地を吸引して取り除き、２ｍＬのトリプシンをフラスコに加える。３７℃で５分間にわたりインキュベートする。
２．フラスコの側面を強く叩き、側面のトリプシンを５０ｃｃ円錐管内へ落とす。この試験管へさらに０．５ｍＬの増殖培地（ＤＭＥＭ＋Ｐ／Ｓ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ＋ＦＢＳ）を加える。
３．別の２ｍＬトリプシンをフラスコへ加える。３７℃で３〜５分間にわたりインキュベートする。
４．フラスコの側面を強く叩き、側面のトリプシンを工程２からの５０ｃｃ円錐管へ落とす。１０ｍＬの増殖培地をフラスコへ加え、フラスコの底部を２回すすぎ洗う。この１０ｍＬ培地を同一の５０ｃｃの円錐管へ入れる。顕微鏡を用いて細胞が除去されているかどうかについてフラスコをチェックする。
５．５分間かけて、４℃、１，０００ｒｐｍで遠沈させる。上清を吸引により取り除く。
６．ペレットを取り除き、このペレットを５ｍＬ増殖培地中に再懸濁させる。
７．５分間かけて、４℃、１，０００ｒｐｍで遠沈させる。上清を吸引により取り除く。
８．ペレットを取り除き、細胞を１ｍＬ増殖培地中に再懸濁させる。
９．５００μＬの細胞を微量遠心管中の５００μＬ増殖培地へ加えることによって細胞を１：２に希釈する。極度に細胞密度が高いプレートを用いて開始した場合は、細胞を増殖培地中で１：４に希釈してもよい。
１０．血球計上で１０μＬの希釈細胞についてチェックする。３つの大きなグリッドについて細胞数を記録し、これらの３つの数の平均値を出す。これによって細胞数：平均値×１０４細胞（個）／ｍＬが得られる。開始するためには、約１〜１．６×１０５細胞（個）／ｍＬのＭＤＣＫ細胞もしくは１．３〜２．１〜１０５細胞（個）／ｍＬの２９３Ｔ細胞がなければならない；これは、以下によって達成できる：
ＭＤＣＫ細胞について：
ａ．１：４に希釈する。
【０２０３】
ｂ．細胞を計数する。通常は、大きなグリッド１つ当たり約３６０個の細胞が得られる。
【０２０４】
ｃ．１：４  １：３に希釈する。次に、それを１：１０（３．６ｍＬの媒質中に４００μＬの細胞）に希釈する。
【０２０５】
ｄ．細胞を計数する。大きなグリッド１つ当たり１０〜１６個の細胞を必要とする。
２９３Ｔ細胞について：
ａ．１：８に希釈する。
【０２０６】
ｂ．細胞を計数する。通常は、大きなグリッド１つ当たり約３００個の細胞が得られる。
【０２０７】
ｃ．１：８  １：２に希釈する。次に、それを１：１０（３．６ｍＬの媒質中に４００μＬの細胞）に希釈する。
【０２０８】
ｄ．細胞を計数する。大きなグリッド１つ当たり１３〜２１個の細胞を必要とする。
１１．抽出物の２倍希釈液を調製するためには、以下のとおりに計９本の微量遠心管を使用する。
【０２０９】
【化７】
2009531316.tif 000038
９６ウエルプレート、カラム
１１＝ＰＢＳ／溶媒単独コントロール（細胞は有するが抽出物は含有しない）
１２＝媒質単独コントロール（ブランク−細胞なし、抽出物なし）
１２．本アッセイは３組ずつ実施する。そこで新しくボルテックスミキサーにかけ、適正に希釈した１００μＬの細胞を無菌９６ウエルプレート内のカラム１〜１１の列Ａ〜Ｃ内に加え、３本のカラムを充填した後に遠心管中の細胞をボルテックスミキサーにかける。
１３．１００μＬの媒質をカラム１２の列Ａ〜Ｃに加える。
１４．次に６μＬの抽出物希釈液をプレート内のカラム１〜１０の列Ａ〜Ｃに加える。（備考：プレート内の各カラム番号は、上記からの微量遠心管番号に対応しているはずである）
１５．６μＬの溶媒をカラム１１の列Ａ〜Ｃに加える。
１６．プレートを見て、抽出物がウエルの側壁上ではなく各ウエル内の液体中に確実に存在するように穏やかに軽く叩く。
１７．プレートを３７℃で一晩、ＣＯ２と一緒に２４時間インキュベートする。
１８．細胞のオリジナルの微量遠心管から５００μＬ（新しくボルテックスミキサーにかける）を１：２に分割させるためにＴ−７５フラスコ内の１０ｍＬの増殖培地中へ入れ、再び分割する準備が整うまで３７℃で放置する。
１９．この時間を利用して、どの位を量り分けたか、そしてどの位の量を各カラムに加えたかに基づいて、各カラム内の抽出物の正確なμｇ／ｍＬを計算する。
【０２１０】
（第２日）
１．各ウエル内の液体を吸引して取り除く。多チャネルピペッターを使用して、２００μＬの無菌ＰＢＳを用いて各ウエルを１回洗浄する。１００μＬの無菌媒質を各ウエルに加える。
２．顕微鏡下で細胞について、まだそこに存在すること、そしてそれらが内在抽出物から紫色ではないことを確認するためにチェックする。
３．ガラス瓶から微量遠心管内へ４００μＬのＭＴＴ試薬（ＢＳＬ３ルーム内で４℃のドア内に保管されている）を取り出す。レギュラーピペッターを用いて１ウエル当たり１０μＬのＭＴＴ試薬を加えるが、各ウエル間でチップを交換し、ＭＴＴ試薬のストック溶液が汚染しないように注意を払う。プレートを３７℃で２時間インキュベートする。
４．多チャネルピペッターを使用して、１ウエル当たり１００μＬの界面活性剤試薬（室温で保管）を加える。これ以降は絶対にプレートを揺り動かしてはいけない。プレートをアルミホイルで被覆し、プレートを午後３時まで３７℃で放置するが、その時点にはＴｅｃａｎ上でプレートを読み取れるはずである。
プレートを読み取る：
１．Ｔｅｃａｎプレートリーダーを使用して、ウエルの吸光度を５６０ｎｍで測定する。ＸＦｌｕｏｒ４内の「ＭＴＴ」と呼ばれるプログラムを使用する。フィルタースライドＣがＴｅｃａｎ内にあることを確認する。
【０２１１】
３回の読み取りから平均値を決定し、媒質単独のブランクについての平均値からのこれらの平均値を減じる（カラム１２）。ｙ軸上に吸光度、ｘ軸上にμｇ／ｍＬ（抽出物）をプロットする。
【０２１２】
（実施例９）
（エルダーベリーの抽出によるＡ型インフルエンザ感染の阻害についてのアッセイ）
（第１日）
１．ＷＨ２６５内のウィンドウにより高感度はかり上で抽出物を量り分ける。少なくとも４０ｍｇ／ｍＬを用いて開始する。これは１２５μＬの無菌ＰＢＳにつき５ｍｇ（もしくは０．００５ｇ）であろう。
２．溶解させるためにボルテックスミキサーにかける。溶液中に入らない場合は、同量のＰＢＳを加える。必要であれば繰り返す。この３回の試行後にそれが完全に溶液中に入らない場合は、微量遠心管内へ３０秒間にわたり１０〜１３，０００ｒｐｍで遠沈させる。上清を取り除き、代りに使用する。しかし、不溶性画分を表示して−２０℃で保存する。
３．工程１および２を繰り返し、測定した可溶化抽出物を結合し、２５０μＬの抽出物溶液を調製する。
４．２本の無菌微量遠心管に「Ａｂ  １：１０００」および「Ａｂ  １：５００」と表示する。９９９μＬの無菌ＰＢＳおよび１μＬの抗インフルエンザ一次Ａ抗体を「Ａｂ  １：１０００」微量遠心管へ加える。ボルテックスミキサーにかける。９９８μＬのＰＢＳおよび２μＬの抗インフルエンザ一次Ａ抗体を「Ａｂ  １：５００」遠心管へ加える。ボルテックスミキサーにかける。
５．ウイルスを希釈する：
ａ．４本の遠心管に「ＵＶ」、「−１」、「−２」、および「−３」と表示する。９９０μＬのＰＢＳを「ＵＶ」遠心管へ、そして９００μＬのＰＢＳを他の遠心管へ加える。
【０２１３】
ｂ．氷上の１０μＬのウイルスを「ＵＶ」遠心管へ加える。ボルテックスミキサーにかける。チップを交換する。１００μＬのウイルスを取り出し、「−１」遠心管へ加える。ボルテックスミキサーにかける。続けて、各遠心管から次の微量遠心管へ１００μＬを加え、ボルテックスミキサーにかけ、各希釈間にはチップを交換する。
６．抽出物を希釈する：
ａ．５本の微量遠心管を「１：２」、「１：４」、「１：８」、「１：１６」、および「１：３２」と表示する。各々に１２５μＬのＰＢＳを加える。
【０２１４】
ｂ．抽出物溶液をボルテックスミキサーにかける。１２５μＬの抽出物溶液を「１：２」遠心管に加える。ボルテックスミキサーにかけ、チップを交換する。１２５μＬの「１：２」を「１：４」へ加える。ボルテックスミキサーにかけ、チップを交換する。１２５μＬの「１：４」を「１：８」へ加える。残りの遠心管についても繰り返し、ボルテックスミキサーにかけ、希釈間でチップを交換する。
７．アッセイを実施する：
ａ．７本の微量遠心管を「未希釈」、「１：２」、「１：４」、「１：８」、「１：１６」、「１：３２」、および「ＰＢＳ」と表示する。
【０２１５】
ｂ．６００μＬのＰＢＳを、１，０００μＬのＰＢＳを含有する「ＰＢＳ」微量遠心管以外の全部の微量遠心管へ加える。
【０２１６】
ｃ．１００μＬの「−３」ウイルス希釈液（新しくボルテックスミキサーにかけた！）を全６本の遠心管に加えるが、「ＰＢＳ」遠心管には加えない。
【０２１７】
ｄ．「１：２」抽出物溶液をボルテックスミキサーにかける。１００μＬの「１：２」抽出物溶液を新規の「１：２」遠心管に加える。ボルテックスミキサーにかける。
【０２１８】
ｅ．工程ｄを「１：４」から「１：１０」の遠心管について繰り返し、抽出物溶液を、ＰＢＳおよびウイルスを含有する各々表示された新規な遠心管に加える。
【０２１９】
ｆ．１００μＬの未希釈抽出物溶液（新しくボルテックスミキサーにかけた！）は、ＰＢＳおよびウイルスを含有する「未希釈」遠心管に加える。ボルテックスミキサーにかける。
【０２２０】
ｇ．１００μＬの−３ウイルスおよび７００μＬのＰＢＳを含むまた別の微量遠心管を準備し、それに「−４ウイルス」と表示する。ボルテックスミキサーにかける。
【０２２１】
ｈ．直ちに「Ａｂ  １：１０００」および「Ａｂ  １：５００」微量遠心管から３００μＬを廃棄し、１００μＬの「−３」ウイルス希釈液（新しくボルテックスミキサーにかけた！）を「ＡＢ  １：１０００」および「Ａｂ  １：５００」遠心管に加える。ボルテックスミキサーにかける。
【０２２２】
ｉ．タイマーを１時間に設定する。
【０２２３】
ｊ．このプレインキュベーション段階中にはフード内の照明のスイッチを切る。
【０２２４】
ｋ．プレートには抗体コントロールについての「未希釈抽出物」、「１：２」、「１：４」、「１：８」、「１：１６」、「１：３２」、「１：１０００」および「１：５００」と表示した各３ずつのカラム、「−４ウイルス＋ＰＢＳ単独」および「ＰＢＳ単独」と表示する。
【０２２５】
ｌ．約５０分間にわたりプレインキュベーションし、細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、次の工程のためにウエルを空にする。
【０２２６】
ｍ．プレインキュベーションの時間が終了した後、各遠心管をボルテックスミキサーにかけ、その直後にそれから２００μＬを各々表示したウエルへ加える。
【０２２７】
ｎ．室温のＢｅｌｌｙ  Ｄａｎｃｅｒ上で３０分間インキュベートし、１５分後に９０°で回転させ、この時点でさらに寒天オーバーレイを作製する。
８．感染において約１５分間残っている場合は、寒天オーバーレイを構成する：
ａ．ＤＭＥＭ瓶を加温するために水浴に加える。
【０２２８】
ｂ．１．５〜２分間にわたり５％のＳｅａＰｌａｑｕｅストック溶液を電子レンジにかける。
【０２２９】
ｃ．少なくとも１００ｍＬを保持する無菌ガラス瓶中で以下を混合する：
【０２３０】
【化８】
2009531316.tif 000039
ｄ．接種菌を取り除き、１ウエル当たり２ｍＬの寒天オーバーレイと取り替える。プレートは表を上にして約２０分間にわたり４℃で放置する。
【０２３１】
ｅ．冷蔵庫からプレートを取り出し、表を上にして感染後（工程ｍにおいて細胞にウイルスを加えた後）２７時間にわたり３７℃のインキュベーターで放置する。
【０２３２】
（第２日）
感染後２７時間にわたり、０．５〜１ｍＬのＦｏｒｍａｆｒｅｓｈを各ウエルに加える。プレートは４℃で一晩放置する。
【０２３３】
（第３日）
１．Ｆｏｒｍａｆｒｅｓｈを吸引により取り除く。
２．スパチュラを用いて寒天プラグを取り除く。
３．０．５ｍＬの７０％のＥｔＯＨを加え、少なくとも２０分間にわたり室温でインキュベートする。その間に、上段で５０ｃｃ円錐管中のＢｌｏｔｔｏ内において１：１０００で一次抗体を作製し、以下の成分を混合するためにボルテックスミキサーにかける：
１５．５ｍＬのＰＢＳ
０．７７５ｇの粉乳
１５．５μＬのＴｗｅｅｎ  ２０
１５．５μＬの抗Ａ型インフルエンザ抗体（４℃で保管）
４．ＥｔＯＨを吸引により取り除く。ＰＢＳを用いて１回すすぎ洗う。
５．Ｂｌｏｔｔｏ中の新しくボルテックスミキサーにかけた５００μＬの一次抗体を各ウエルに加える。Ｂｅｌｌｙ  Ｄａｎｃｅｒ上で４℃で上段を一晩揺動させる。
第４日
１．上段で、Ｂｌｏｔｔｏ中の二次抗体１：５００を混合する。（そこで、上述のようにＢｌｏｔｔｏを作製し、一次抗体の代りに６２μＬの二次抗体（グリセロール中で冷凍され、分取され、−２０℃で保管された）だけを加える）
２．プレートを下段に置き、一次抗体を吸引して取り除く。
３．ＰＢＳ中で１回洗浄する。
４．１ウエル当たり５００μＬのＢｌｏｔｔｏ中の二次抗体を加え、室温のＢｅｌｌｙ  Ｄａｎｃｅｒ上で５時間にわたりインキュベートする。
５．二次抗体を吸引して取り除く。ＰＢＳを用いて１回すすぎ洗う。
６．１ウエル当たり６滴のＤａｋｋｏ基質（Ｐ３内の４℃の庫内の下段に保管する）を加える。
７．直ちにＢｅｌｌｙ  Ｄａｎｃｅｒ上に置き、室温で１０〜１５分間にわたり、または細胞増殖巣が見えるまでインキュベートする。
８．基質を吸引して取り除き、ＰＢＳを用いて１回洗浄する。ＰＢＳ中に保管する。
９．ライトボックス内で写真を撮影し、細胞増殖巣を計数する。
【０２３４】
（実施例１０）
（エルダーベリー抽出物の活性をアッセイするためのＨＩＶ阻害試験プロトコル
偽型ＨＩＶ−１産生）
偽型ＨＩＶ−１ビリオンは、Ｔ７５細胞培養フラスコ内の２９３Ｔ細胞を６μｇのｐＳＧ３Ｅｅｎｖ、ＨＩＶ−１菌株ＳＧ３のゲノムのエンベロープ欠損コピーを含有するプラスミド、およびザンビアからのＣサブタイプのＨＩＶ−１菌株のエンベロープをコードする２μｇのエンベロープクローンＺＭ５３Ｍ．ＰＢ１２と一緒に共形質移入することによって生成した。細胞を形質移入するためにはＥｆｆｅｃｔｅｎｅ形質移入試薬（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア）を使用した。１８時間後に、培養および培地をＥｆｆｅｃｔｅｎｅ形質移入試薬と交換した。上清を形質移入４８時間後に収集し、低速遠心分離によって浄化し、分取し、そして−１８℃で冷凍した。バイアルストック液の力価は、９６ウエルプレート上に３７℃で２時間にわたり段階的に１０倍の希釈率で播種したＧＨＯＳＴ細胞を感染させることによって決定した。２時間のインキュベーション後、ウイルスを含む培地は、１０％ウシ胎児血清を含有する新鮮Ｄｕｌｂｅｃｃｏ修飾Ｅａｇｌｅ培地と交換し、３７℃で４８時間にわたりインキュベートした。プレートは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウエアを備えるＴｙｐｈｏｏｎホスホイメージャー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いてスキャンして細胞増殖巣を計数した。
【０２３５】
（エルダーベリー抽出物の調製（Ｆ４画分）および感染阻害アッセイ）
エルダーベリー抽出物（Ｆ４）は、１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に４０ｍｇの凍結乾燥エルダーベリー抽出物を再懸濁させ、４０μＬのＮａＯＨ（０．６２５Ｍ）を用いてそのｐＨを７．０へ調整することによって完全に溶液中に入れた。ＨＩＶ−１に対するＦ４抗ウイルス活性をアッセイするために、５×１０４個のＧＨＯＳＴ細胞を９６ウエル組織培養プレートの各ウエル内でプレーティングした。翌日、約１，０００ｐｆｕの偽型ウイルスを６．５５、３．２８、１．６４、０．８２、０．４１、および０．２０μｇのＦ４／ｍＬの存在下もしくは不在下で各ウエルに加えた。３７℃で２時間のインキュベーション後、ウイルスを含有する培地を取り除き、１ウエル当たり１０％ウシ胎児血清を含有する２００μＬのＤｕｌｂｅｃｃｏ修飾Ｅａｇｌｅ培地を加え、３７℃で４８時間にわたりインキュベーションを継続した。引き続いて、プレートは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウエアを備えるＴｙｐｈｏｏｎホスホイメージャー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてスキャンして細胞増殖巣を計数した。
【０２３６】
（ＨＩＶ−１  Ｃサブタイプの阻害アッセイ）
キメラＨＩＶ−１  ＳＧ３（ゲノム）のＣサブタイプ（エンベロープ）に対する阻害アッセイ。この特異的エンベロープタンパク質は、Ｅ．ＨｕｎｔｅｒおよびＣ．Ｄｅｒｄｅｙｎ両博士によって提供された、女性から男性への伝達様式を備える、ザンビアを起源とするエンベロープクローンＺＭ１３５Ｍ．ＰＢ１２（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ４２３９８４）に由来する。明るい白色斑点（図９を参照されたい）は、わずかに乳白色のバックグラウンド上の細胞増殖巣である。バックグラウンドは、宿主細胞のわずかな蛍光によって惹起され、それ以上減少することはあり得ない。＋、陽性感染コントロールで；Ｆ４、エルダーベリーの抽出物画分Ｆ４；Ｔ、アッセイにおいて使用されるウイルスの滴定値。
【０２３７】
（参考文献の組み込み
本明細書で言及したすべての米国特許および米国特許出願公報は、これにより参照して本明細書に組み込まれる。
【０２３８】
（等価物）
当業者であれば、本明細書に記載した発明の特定実施形態にとっての多数の等価物を認識するであろう、または日常的実験を用いて確認することができよう。そのような等価物は、以下の特許請求項に含まれることが企図されている。
【図面の簡単な説明】
【０２３９】
【図１】図１は、本発明によるニワトコ種抽出プロセスの代表的な略図である。
【図２】図２は、本発明によるニワトコ種抽出プロセスの代表的な略図である。
【図３】図３は、本発明によるニワトコ種抽出プロセスの代表的な略図である。
【図４】図４は、本発明によるニワトコ種抽出プロセスの代表的な略図である。
【図５】図５は、Ａ型ヒトインフルエンザウイルスＨＩＮ１を使用したウイルス侵入アッセイ系を示した図である。ＭＤＣＫ細胞は、ウイルス単独（左上；１０〜４  Ａ型インフルエンザウイルス）、ウイルス非含有（左下；ＰＢＳ）、１：１，０００の濃度（右上；１：１０００の抗体）および１：５００の濃度（右下；１：５００の抗体）で抗インフルエンザウイルス抗体と混合したウイルス、とともにインキュベートした。各実験は、３組ずつ実施した。茶褐色の各スポットは、１つのウイルス感染事象を示している。抗体コントロール中では、ウイルス阻害もしくは有色スポット数の減少が検出される。
【図６】図６は、エルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ４およびＡ型ヒトインフルエンザＨ１Ｎ１ウイルスを用いた阻害アッセイの例を示した図である。エルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ４画分の連続希釈液（未希釈〜１：３２の希釈率）は、ＭＤＣＫ細胞とインキュベートする前にウイルスとプレインキュベートした。各実験は、３組ずつ実施した。スポットは、１つのウイルス感染事象に対応する。ウイルス阻害は、スポット数の減少によって示される。
【図７】図７は、エルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ４およびＡ型ヒトインフルエンザＨ１Ｎ１ウイルスを用いた阻害アッセイを示した図である。エルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ４画分の連続希釈液（未希釈〜１：３２の希釈率）は、ＭＤＣＫ細胞とインキュベートする前にウイルスとプレインキュベートした。各実験は、３組ずつ実施した。茶褐色のスポットは、１つのウイルス感染事象に対応する。ウイルス阻害は、有色スポット数の減少によって示される。
【図８】図８は、エルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ４およびＡ型ヒトインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスを用いた阻害アッセイを示した図である。エルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ４画分の連続希釈液（未希釈〜１：３２の希釈率）は、ＭＤＣＫ細胞とインキュベートする前にウイルスとプレインキュベートした。各実験は、３組ずつ実施した。茶褐色のスポットは、１つのウイルス感染事象に対応する。ウイルス阻害は、有色スポット数の減少によって示される。
【図９】図９は、キメラＨＩＶ−１  ＳＧ３（ゲノム）のＣサブタイプ（エンベロープ）に対する阻害アッセイを示した図である。＋は、陽性感染コントロールである；Ｆ４は、エルダーベリーの抽出物画分Ｆ４である；およびＴは、アッセイにおいて使用されるウイルスの滴定値である。
【図１０】図１０は、２９３Ｔ細胞におけるエルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ２画分についてのＭＴＴ生育性アッセイを示した図である。
【図１１】図１１は、ＭＤＣＫ細胞におけるエルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ２画分についてのＭＴＴ生育性アッセイを示した図である。
【図１２】図１２は、２４時間後の、２９３Ｔ細胞におけるエルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ４画分についてのＭＴＴ生育性アッセイを示した図である。
【図１３】図１３は、４４時間後の、２９３Ｔ細胞におけるエルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ４画分についてのＭＴＴ生育性アッセイを示した図である。
【図１４】図１４は、エルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ２画分についての感染阻害用量反応曲線および５０％阻害濃度を示した図である。
【図１５】図１５は、エルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ３画分についての感染阻害用量反応曲線および５０％阻害濃度を示した図である。
【図１６】図１６は、エルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ４画分についての感染阻害用量反応曲線および５０％阻害濃度を示した図である。
【図１７】図１７は、エルダーフラワーＸＡＤ  ７ＨＰ脱着Ｆ２画分についての感染阻害用量反応曲線および５０％阻害濃度を示した図である。
【図１８】図１８は、エルダーフラワーＸＡＤ  ７ＨＰ脱着Ｆ３画分についての感染阻害用量反応曲線および５０％阻害濃度を示した図である。
【図１９】図１９は、Ｈ１Ｎ１ウイルスを用いた、非緩衝化エルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ３画分についての感染阻害用量反応曲線および５０％阻害濃度を示した図である。
【図２０】図２０は、Ｈ１Ｎ１ウイルスを用いた、非緩衝化エルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ３画分についての感染阻害用量反応曲線および５０％阻害濃度を示した図である。
【図２１】図２１は、Ｈ１Ｎ１ウイルスを用いた、非緩衝化エルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ２画分についての感染阻害用量反応曲線および５０％阻害濃度を示した図である。
【図２２】図２２は、Ｈ１Ｎ１ウイルスを用いた、非緩衝化エルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ４画分についての感染阻害用量反応曲線および５０％阻害濃度を示した図である。
【図２３】図２３は、Ｈ１Ｎ１ウイルスを用いた、緩衝化エルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ４画分についての感染阻害用量反応曲線および５０％阻害濃度を示した図である。
【図２４】図２４は、Ｈ１Ｎ１ウイルスを用いた、非緩衝化エルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ４画分についての感染阻害用量反応曲線および５０％阻害濃度を示した図である。
【図２５】図２５は、Ｈ５Ｎ１ウイルスを用いた、緩衝化エルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ４画分についての感染阻害用量反応曲線および５０％阻害濃度を示した図である。
【図２６】図２６は、Ｈ５Ｎ１ウイルスを用いた、緩衝化エルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ４画分についての感染阻害用量反応曲線および５０％阻害濃度を示した図である。
【図２７】図２７は、試験した抽出物についての結合感染阻害用量反応曲線を示した図である。
【図２８】図２８は、Ｈ１Ｎ１ウイルスを用いた、緩衝化エルダーフラワーＡＤＳ５脱着Ｆ２画分についての感染阻害用量反応曲線および５０％阻害濃度を示した図である。
【図２９】図２９は、エルダーフラワーＦ２画分についてのＨ１Ｎ１ウイルスに対する計算ＩＣ５０値を示した図である。
【図３０】図３０は、エルダーベリーＦ４画分およびエルダーフラワーＦ２画分についてのＨ１Ｎ１ウイルスに対するＩＣ５０値の比較を示した図である。
【図３１】図３１は、エルダーベリーＦ４画分およびエルダーフラワーＦ２画分についてのＨ１Ｎ１ウイルスに対するＩＣ９０値の比較を示した図である。
【図３２】図３２は、デング熱ウイルス２型を用いた、エルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ２画分についての感染阻害用量反応曲線および５０％阻害濃度を示した図である。
【図３３】図３３は、ＨＩＶウイルスを用いた、エルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ４画分についての感染阻害用量反応曲線を示した図である。この曲線は、指示した濃度で１００％阻害を示している。
【図３４】図３４は、ＨＩＶウイルスを用いた、エルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ４画分についての感染阻害用量反応曲線を示した図である。この曲線は、指示した濃度で１００％阻害を示している。
【図３５】図３５は、ＨＩＶウイルスを用いた、エルダーベリーＢアントシアニン画分ＡＤＳ５脱着Ｆ４画分についての感染阻害用量反応曲線および５０％阻害濃度を示した図である。
【図３６】図３６は、エルダーベリー多糖類についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陽イオンモード）。
【図３７】図３７は、エルダーベリー多糖類についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陰イオンモード）。
【図３８】図３８は、エルダーフラワー多糖類についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陽イオンモード）。
【図３９】図３９は、エルダーフラワー多糖類についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陰イオンモード）。
【図４０】図４０は、図示した妥当と思われる構造とともに、全エルダーベリー供給原料についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陽イオンモード）。メチル桂皮酸（１６３．０６８８）（存在量＝１９．４７）、シンナミド（１４８．０８２６）（存在量＝２．６３）、２−メトキシフェノール（１２５．０５９９）（存在量＝７．３４）、３−メトキシ−１−チロシン（２１２．０９８５）（存在量＝１７．４２）、ベンズアルデヒド（１０７．０４２２）（存在量＝１．１０）、桂皮アルデヒド（１３３．０５６８）（存在量＝６．５６）、酢酸シンナミル（１７７．０９５６）（存在量＝８．５１）、およびピロガロール（１２７．０３４４）（存在量＝９３．６７）が検出された。未同定化合物もまた、Ｃ６Ｈ８Ｏ４＋Ｈ＋（１４５．０４６９で）およびＣ６Ｈ６Ｏ３＋Ｈ＋（１２７．０３４４で）として検出された。
【図４１】図４１は、図示した妥当と思われる構造とともに、全エルダーベリー供給原料についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陰イオンモード）。桂皮酸（１４７．０３８５）（存在量＝５．５７）、桂皮アルデヒド（１３１．０４）（存在量＝５．５７）、ピロガロール（１２５．０２４）（存在量＝３．５４）、クエルセチン（３０１．０２５３）（存在量＝０．７３）、ウルソール酸（４５５．３５１８）（存在量＝１０．９９）、およびシキミ酸（１７３．０４５４）（存在量＝７．１８）が検出された。
【図４２】図４２は、８０％のＥｔＯＨ溶液を用いた、全エルダーベリー供給原料の抽出物についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陽イオンモード）。未同定化合物は、Ｃ６Ｈ１０Ｏ５＋Ｈ＋（１６３．０６０１）（存在量＝１７．１９）およびＣ１４Ｈ１５ＮＯ＋Ｈ＋（２１４．１２６６）（存在量＝２４．０６）として検出された。
【図４３】図４３は、ＡＤＳ５脱着充填剤を用いた、Ｆ２カラムクロマトグラフィー画分についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陽イオンモード）。ルチンもしくはデルフィニジン（３０３．０５４１）（存在量＝５９．２８）、フェルラ酸（１９５．０７５５）（存在量＝１３．５４）、桂皮酸（１４９．０５７２）（存在量＝１９．５５）、シキミ酸（１７５．０６９９）（存在量＝１１．７２）、およびフェニル乳酸（１６７．０７９３）（存在量＝３６．１７）が検出された。未同定化合物は、Ｃ６Ｈ６Ｏ３＋Ｈ＋（１２７．０３４８）（存在量＝１００）およびＣ７Ｈ６Ｏ４＋Ｈ＋（１５５．０３３５）（存在量＝５９．１８）として検出された。
【図４４】図４４は、ＡＤＳ５脱着充填剤を用いた、Ｆ３カラムクロマトグラフィー画分についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陽イオンモード）。ルチンもしくはデルフィニジン（３０３．０５２１）（存在量＝１００）、タキシフォリン（３０５．０６９３）（存在量＝４．２５）、フェルラ酸（１９５．０７５）（存在量＝１．３４）、桂皮酸（１４９．０５５２）（存在量＝３．３２）、シキミ酸（１７５．０６９６）（存在量＝０．９６）、フェニル乳酸（１６７．０７０１）（存在量＝３．９７）、シアニジン（２８７．０６２２）（存在量＝８．３６）、およびペツニジン（３１７．０７０７）（存在量＝２１．７１）が検出された。未同定化合物は、Ｃ１０Ｈ１２Ｏ３＋Ｈ＋（１８１．０８５４）（存在量＝９．７１）およびＣ１３Ｈ１４Ｎ２Ｏ２＋Ｈ＋（２３１．１１６３）（存在量＝５．８５）として検出された。
【図４５】図４５は、ＡＤＳ５脱着充填剤を用いた、Ｆ４カラムクロマトグラフィー画分についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陽イオンモード）。ルチンもしくはデルフィニジン（３０３．０５３４）（存在量＝１００）、フェルラ酸（１９５．０７４４）（存在量＝３．３２）、桂皮酸（１４９．０５７）（存在量＝６．３６）、シアニジン（２８７．０６０８）（存在量＝３６．４４）、ペツニジン（３１７．０６９１）（存在量＝７８．７５）、およびバニリン酸（１６９．０５２４）（存在量＝７．７５）が検出された。未同定化合物は、Ｃ２９Ｈ１８Ｏ７＋Ｈ＋（４７９．１２１８）（存在量＝２２．６２）およびＣ１２Ｈ１４Ｏ４＋Ｈ＋（２２３．０９９４）（存在量＝２１．５６）として検出された。
【図４６】図４６は、エルダーベリーＢアントシアニンのＡＤＳ５脱着充填剤を用いた、Ｆ２カラムクロマトグラフィー画分についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陽イオンモード）。前記画分は、Ｈ１Ｎ１ウイルスを用いる抗ウイルスアッセイにおいて使用するとＩＣ５０＝３３３μｇ／ｍＬが生じた。ルチンもしくはデルフィニジン（３０３．０５６６）（存在量＝１８．３３）、フェルラ酸（１９５．０７２４）（存在量＝１０．３２）、ｐ−クマル酸／フェニルピルビン酸（１６５．０６３９）（存在量＝２５．５４）、桂皮酸（１４９．０５７３）（存在量＝１７．８６）、シキミ酸（１７５．０６３３）（存在量＝１２．６２）、およびバニリン酸（１６９．０５７５）（存在量＝１８．０１）が検出された。未同定化合物は、Ｃ１３Ｈ１１Ｏ＋Ｈ＋（１８３．０８１８）（存在量＝４３．３３）およびＣ１４Ｈ１７ＮＯ３＋Ｈ＋（２４８．１２７１）（存在量＝６０．２８）として検出された。
【図４７】図４７は、エルダーベリーＢアントシアニンのＡＤＳ５脱着充填剤を用いた、Ｆ３カラムクロマトグラフィー画分についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陽イオンモード）。前記画分は、Ｈ１Ｎ１ウイルスを用いる抗ウイルスアッセイにおいて使用するとＩＣ５０＝２９４μｇ／ｍＬが生じた。ルチンもしくはデルフィニジン（３０３．０５５３）（存在量＝４１．７４）、ヘスペリン（２８７．０９３６）（存在量＝１０．４１）、桂皮酸（１４９．０５８４）（存在量＝１７．８５）、およびバニリン酸（１６９．０５７１）（存在量＝３１．０９）が検出された。未同定化合物は、Ｃ８Ｈ８Ｏ＋Ｈ＋（１２１．０５８６）（存在量＝２９．３６）およびＣ１４Ｈ２０Ｎ２Ｏ３＋Ｈ＋もしくはＣ１５Ｈ２０Ｏ４＋Ｈ＋（２６５．１４６９）（存在量＝２６．２３）として検出された。
【図４８】図４８は、エルダーベリーＢアントシアニンのＡＤＳ５脱着充填剤を用いた、Ｆ４カラムクロマトグラフィー画分についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陽イオンモード）。前記画分は、Ｈ１Ｎ１ウイルスを用いる抗ウイルスアッセイにおいて使用するとＩＣ５０＝１９５μｇ／ｍＬが生じた。ルチンもしくはデルフィニジン（３０３．０５５７）（存在量＝２０．２７）、桂皮酸（１４９．０５９３）（存在量＝７．９４）、ペツニジン（３１７．０７１）（存在量＝２２．０９）、およびバニリン酸（１６９．０５３８）（存在量＝１２．８２）が検出された。未同定化合物は、Ｃ６Ｈ１０Ｏ５＋Ｈ＋（１６３．０７６）（存在量＝６３．２８）およびＣ１７Ｈ１８Ｏ＋Ｈ＋（２３９．１５３１）（存在量＝２６．３２）として検出された。
【図４９】図４９は、エルダーフラワーのＸＡＤ  ７ＨＰ脱着充填剤を用いた、Ｆ２カラムクロマトグラフィー画分についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陽イオンモード）。前記画分は、Ｈ１Ｎ１ウイルスを用いる抗ウイルスアッセイにおいて使用するとＩＣ５０＝１，５９２μｇ／ｍＬが生じた。シアニジン（２８７．０５８８）（存在量＝１０．９２）、ルチンもしくはデルフィニジン（３０３．０５３１）（存在量＝１００）、タキシフォリン（３０５．０６５１）（存在量＝４．６９）、コーヒー酸／４−ヒドロキシフェニル乳酸（１８１．０５８９）（存在量＝９．４５）、フェルラ酸（１９５．０７４１）（存在量＝３．３３）、シキミ酸（１７５．０６４５）（存在量＝３．１１）、ペツニジン（３１７．０６８９）（存在量＝２９．４８）、およびエリオジクチオールもしくはフスチン（２８８．０７０９）（存在量＝２．３６）が検出された。未同定化合物もまた、Ｃ１０Ｈ１３ＮＯ２＋Ｈ＋（１８０．１０２４）（存在量＝１５．９８）およびＣ８Ｈ６Ｎ２Ｏ＋Ｈ＋もしくはＣ９Ｈ６Ｏ２＋Ｈ＋（１４７．０５４５）（存在量＝７３．５０）として検出された。
【図５０】図５０は、エルダーフラワーのＸＡＤ  ７ＨＰ脱着充填剤を用いた、Ｆ３カラムクロマトグラフィー画分についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陽イオンモード）。前記画分は、Ｈ１Ｎ１ウイルスを用いる抗ウイルスアッセイにおいて使用するとＩＣ５０＝５８２μｇ／ｍＬが生じた。シアニジン（２８７．０５７４）（存在量＝１７．１６）、ルチンもしくはデルフィニジン（３０３．０５１８）（存在量＝１００）、タキシフォリン（３０５．０６５８）（存在量＝５．５４）、ナリンゲニン／ブテイン／フロレチン（２７３．０７９７）（存在量＝１６．０６）、およびエリオジクチオールもしくはフスチン（２８９．０７９５）（存在量＝３．１４）が検出された。未同定化合物もまた、Ｃ１０Ｈ１６Ｏ＋Ｈ＋（１５３．１２６８）（存在量＝３０．９６）およびＣ２３Ｈ１４Ｏ４＋Ｈ＋（３５５．１０４８）（存在量＝３０．０３）として検出された。
【図５１】図５１は、＃１８５についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陽イオンモード）。桂皮酸（１４９．０６１６）（存在量＝３．８２）、シキミ酸（１７５．０６１３）（存在量＝１４．７１）、およびフェニル乳酸（１６７．０７４）（存在量＝５．３５）が検出された。未同定化合物もまた、Ｃ３０Ｈ４６Ｏ２＋Ｈ＋（４３９．３６２５）（存在量＝１６．４９）およびＣ３９Ｈ６８Ｏ５＋Ｈ＋（６１７．５１５１）（存在量＝４．０９）として検出された。
【図５２】図５２は、＃３１９についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陽イオンモード）。ｐ−クマル酸／フェニルピルビン酸（１６５．０６０４）（存在量＝３．９６）、桂皮酸（１４９．０５７９）（存在量＝０．４８）、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸（２２５．０８１６）（存在量＝１０．５９）、シキミ酸（１７５．０５６９）（存在量＝５．３７）、およびフェニル乳酸（１６７．０７７３）（存在量＝２．７１）が検出された。未同定化合物もまた、Ｃ６Ｈ８Ｏ４＋Ｈ＋（１４５．０５０７）（存在量＝１００）およびＣ１２Ｈ１２Ｏ６＋Ｈ＋（２５３．０７０８）（存在量＝３５．２７）として検出された。
【図５３】図５３は、＃３２２についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陽イオンモード）。デルフィニジン（３０４．０５７６）（存在量＝８．７５）、ルチン（３０３．０５７）（存在量＝４９．２８）、エリオジクチオール／フスチン（２８９．０７５２）（存在量＝１３．５０）、タキシフォリン（３０５．０６３８）（存在量＝３．４１）、フェルラ酸（１９５．０７４５）（存在量＝７．１５）、ｐ−クマル酸／フェニルピルビン酸（１６５．０６１３）（存在量＝１６．９１）、桂皮酸（１４９．０６９５）（存在量＝３．２０）、シキミ酸（１７５．０６７）（存在量＝８．３４）、およびフェニル乳酸（１６７．０７２２）（存在量＝８．８４）が検出された。未同定化合物は、Ｃ６Ｈ６Ｏ３＋Ｈ＋（１２７．０４１３）（存在量＝１００）およびＣ１１Ｈ１５Ｏ５＋Ｈ＋（２２７．０８７６）（存在量＝２９．２６）として検出された。
【図５４】図５４は、＃３２４についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陽イオンモード）。未同定化合物は、Ｃ３７Ｈ６６Ｏ４＋Ｈ＋（５７５．５１）（存在量＝５．４２）およびＣ５９Ｈ８８Ｏ５＋Ｈ＋（８７７．６７）（存在量＝１５．４６）として検出された。
【図５５】図５５は、＃３２５についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陽イオンモード）。シキミ酸（１７５．０６５８）（存在量＝６．０５）が検出された。未同定化合物もまた、Ｃ１６Ｈ１４Ｏ４＋Ｈ＋（２７１．０９４１）（存在量＝２２．２４）およびＣ１６Ｈ１６Ｏ５＋Ｈ＋（２８９．０９８３）（存在量＝１５．７６）として検出された。
【図５６】図５６は、＃３２６についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陽イオンモード）。桂皮酸（１４９．０６８１）（存在量＝２．６７）が検出された。未同定化合物は、Ｃ２２Ｈ４２Ｏ４＋Ｈ＋（３７１．３１９６）（存在量＝４６．６０）およびＣ１８Ｈ３０Ｏ２＋Ｈ＋（２７９．２３４６）（存在量＝２０．２８）として検出された。
【図５７】図５７は、＃３２７についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陽イオンモード）。未同定化合物は、Ｃ８Ｈ８Ｏ＋Ｈ＋（１２１．０６６３）（存在量＝６６．３４）およびＣ８Ｈ８Ｏ２＋Ｈ＋（１３７．０６５）（存在量＝２０．１６）として検出された。
【図５８】図５８は、＃３２８についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陽イオンモード）。フェルラ酸（１９５．０７３７）（存在量＝４．０４）、ｐ−クマル酸／フェニルピルビン酸（１６５．０６０４）（存在量＝３．６７）、桂皮酸（１４９．０６９１）（存在量＝３．４９）、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸（２２５．０８１７）（存在量＝５．１８）、シキミ酸（１７５．０６１６）（存在量＝４．８８）、およびフェニル乳酸（１６７．０７８６）（存在量＝２．６３）が検出された。未同定化合物は、Ｃ６Ｈ１０Ｏ５＋Ｈ＋（１６３．０６０２）（存在量＝１０．８４）およびＣ１２Ｈ１４Ｏ７＋Ｈ＋（２７１．０８２９）（存在量＝２１．７）として検出された。
【図５９】図５９は、＃３２９についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陽イオンモード）。桂皮酸（１４９．０６２１）（存在量＝１．４３）およびシキミ酸（１７５．０６３３）（存在量＝３．２３）が検出された。未同定化合物もまた、Ｃ２１Ｈ３６Ｏ３＋Ｈ＋（３３７．２７６３）（存在量＝１３．３８）およびＣ３９Ｈ６６Ｏ４＋Ｈ＋（５９９．５０７）（存在量＝５．５３）として検出された。
【図６０】図６０は、＃３３０についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陽イオンモード）。フェルラ酸（１９５．０７４７）（存在量＝２．７６）、ｐ−クマル酸／フェニルピルビン酸（１６５．０６０８）（存在量＝２．４２）、桂皮酸（１４９．０６１６）（存在量＝０．７９）、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸（２２５．０８２４）（存在量＝２．９８）、シキミ酸（１７５．０６０４）（存在量＝２．５５）、およびフェニル乳酸（１６７．０７８）（存在量＝１．９５）が検出された。未同定化合物もまた、Ｃ１４Ｈ１４Ｏ４＋Ｈ＋（２４７．０８９５）（存在量＝４．２８）およびＣ３０Ｈ４６Ｏ２＋Ｈ＋（４３９．３６１９）（存在量＝５．９８）として検出された。
【図６１】図６１は、＃１８５についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陰イオンモード）。ヘスペリジン（２８５．０８４１）（存在量＝０．４４）およびフロリジン（２５５．０７１１）（存在量＝０．７１）が検出された。未同定化合物もまた、Ｃ４Ｈ６Ｏ５−Ｈ＋（１３３．０１３４）（存在量＝１００）およびＣ１０Ｈ８Ｏ４−Ｈ＋（１９１．０３２５）（存在量＝２５．３４）として検出された。
【図６２】図６２は、＃３１９についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陰イオンモード）。桂皮酸（１４７．０３５８）（存在量＝０．６７）が検出された。未同定化合物もまた、Ｃ４Ｈ６Ｏ５−Ｈ＋（１３３．０１３５）（存在量＝８６．１１）およびＣ１０Ｈ８Ｏ４−Ｈ＋（１９１．０１９５）（存在量＝１００）として検出された。
【図６３】図６３は、＃３２２についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陰イオンモード）。シアニジン（２８６．０５０２）（存在量＝５．３０）、デルフィニジン（３０２．０３８８）（存在量＝１８．５１）、ペラルゴニジン（２７０．０５１２）（存在量＝０．３４）、ミリセチン（３１７．０３１５）（存在量＝１３．２７）、ルチン（３０１．０３２４）（存在量＝１００）、シリビン／ゲニステイン（２６９．０３９９）（存在量＝０．４２）、３−ＯＨフラボン（２３７．０５８７）（存在量＝０．８９）、エリオジクチオール／フスチン（２８７．０５９２）（存在量＝７．０９）、カテキン／エピカテキン（２８９．０７８４）（存在量＝５．２９）、タキシフォリン（３０３．０４６８）（存在量＝５．３１）、フロリジン（２５５．０６１４）（存在量＝０．８１）、バニリン酸（１６７．０４１６）（存在量＝４．０７）、ｐ−クマル酸／フェニルピルビン酸（１６３．０３０７）（存在量＝１２．９５）、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸（２２３．０５４）（存在量＝０．８０）、没食子酸（１６９．０１６６）（存在量＝１．７３）、およびシキミ酸（１７３．０４７５）（存在量＝１．１１）が検出された。未同定化合物もまた、Ｃ１０Ｈ８Ｏ４−Ｈ＋（１９１．０５３２）（存在量＝３１．５１）およびＣ２２Ｈ２２Ｏ１３−Ｈ＋（４９３．０９５５）（存在量＝４．４２）として検出された。
【図６４】図６４は、＃３２４についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陰イオンモード）。エリオジクチオール／フスチン（２８７．０６５５）（存在量＝０．９９）、カテキン／エピカテキン（２８９．０７２６）（存在量＝０．９２）、ウルソール酸（４５５．３４６５）（存在量＝０．８７）、バニリン酸（１６７．０３８８）（存在量＝１．８９）、フェルラ酸（１９３．０４７８）（存在量＝７．３５）、ｐ−クマル酸／フェニルピルビン酸（１６３．０４０４）（存在量＝５．６６）、桂皮酸（１４７．０３７３）（存在量＝５．９７）、およびシキミ酸（１７３．０３７３）（存在量＝１０．００）が検出された。未同定化合物もまた、Ｃ１６Ｈ１４Ｏ４−Ｈ＋（２６９．０８７８）（存在量＝２１．９８）およびＣ２３Ｈ１８Ｏ３−Ｈ＋（３４１．１１９３）（存在量＝１２．２７）として検出された。
【図６５】図６５は、＃３２５についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陰イオンモード）。未同定化合物が、Ｃ４Ｈ６Ｏ５−Ｈ＋（１３３．０１１８）（存在量＝１００）およびＣ１０Ｈ８Ｏ４−Ｈ＋（１９１．０１８３）（存在量＝８１．１９）として検出された。
【図６６】図６６は、＃３２６についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陰イオンモード）。ルチン（３０１．０４４１）（存在量＝３１．６２）、３−ＯＨフラボン（２３７．０６２）（存在量＝０．７４）、カテキン／エピカテキン（２８９．０７９）（存在量＝２．７０）、フロリジン（２５５．０６８７）（存在量＝２．２４）、ウルソール酸（４５５．３５５６）（存在量＝７．４３）、コーヒー酸／４−ヒドロキシフェニル乳酸（１７９．０３９８）（存在量＝１２．２６）、フェルラ酸（１９３．０５１）（存在量＝７．６３）、ｐ−クマル酸／フェニルピルビン酸（１６３．０４０５）（存在量＝８．７５）、桂皮酸（１４７．０４１４）（存在量＝３．２４）、およびシキミ酸（１７３．０４５２）（存在量＝２３．５９）が検出された。未同定化合物もまた、Ｃ５Ｈ６Ｏ４−Ｈ＋（１２９．０１７８）（存在量＝１００）およびＣ１６Ｈ１６Ｏ８−Ｈ＋（３３５．０８０７）（存在量＝２５．８２）として検出された。
【図６７】図６７は、＃３２７についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陰イオンモード）。３−ＯＨフラボン（２３７．０５２４）（存在量＝０．２６）、ヘスペリジン（２８５．０８２２）（存在量＝０．６３）、カテキン／エピカテキン（２８９．０７３２）（存在量＝０．１１）、フロリジン（２５５．０７０６）（存在量＝０．８２）、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸（２２３．０５４３）（存在量＝０．０９）、およびコリスミン酸（２２５．０４８９）（存在量＝０．１０）が検出された。未同定化合物もまた、Ｃ４Ｈ６Ｏ５−Ｈ＋（１３３．０１１７）（存在量＝１００）およびＣ２０Ｈ２０Ｏ７−Ｈ＋（３７１．１１７５）（存在量＝２．３９）として検出された。
【図６８】図６８は、＃３２８についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陰イオンモード）。ルチン（３０１．０４４６）（存在量＝０．６２）、フロリジン（２５５．０７４４）（存在量＝０．０５）、およびｐ−クマル酸／フェニルピルビン酸（１６３．０３８６）（存在量＝０．３６）が検出された。未同定化合物もまた、Ｃ５Ｈ８Ｏ５−Ｈ＋（１４７．０２９３）（存在量＝７．５０）およびＣ６Ｈ６Ｏ６−Ｈ＋（１７３．００９９）（存在量＝７．８４）として検出された。
【図６９】図６９は、＃３２９についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陰イオンモード）。未同定化合物は、Ｃ６Ｈ１０Ｏ５−Ｈ＋（１６１．０４）（存在量＝２．９７）およびＣ８Ｈ１２Ｏ７−Ｈ＋（２１９．０５）（存在量＝３．６４）として検出された。
【図７０】図７０は、＃３３０についてのＡｃｃｕＴＯＦ−ＤＡＲＴ質量スペクトルを示した図である（陰イオンモード）。未同定化合物が、Ｃ５Ｈ４Ｏ３−Ｈ＋（１１１．０１）（存在量＝１２．３２）およびＣ６Ｈ１２Ｏ６−Ｈ＋（１７９．０５）（存在量＝１．２０）として検出された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【国際調査報告】
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