(57)【要約】  本発明は、目的タンパク質を細胞培養液で分泌生産する方法に係り、より具体的には、大腸菌由来の細胞外膜にタンパク質Ｆ(ＯｍｐＦ)遺伝子を含む組換え発現ベクターと細胞培養液で分泌しようとする目的タンパク質を含む組換え発現ベクターによって同時に形質転換された微生物及び前記微生物を培養して目的タンパク質を細胞培養液で分泌生産する方法に関するものである。本発明によれば、目的タンパク質を他のタンパク質と融合せず純粋な状態で細胞培養液で分泌させることができ、目的タンパク質の収率的な分離精製が可能である。
2009501021.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＯｍｐＦをコードする遺伝子を含む組換えベクターと目的タンパク質をコードする遺伝子を含み、前記目的タンパク質を微生物の周辺細胞質に発現及び分泌させることができる組換えベクターとで、同時に形質転換され、ＯｍｐＦをコードする遺伝子と目的タンパク質をコードする遺伝子とが同時に発現され、目的タンパク質を細胞外(培養液)に分泌生産できる特性を有する組換え微生物。
【請求項２】
ＯｍｐＦをコードする遺伝子を発現させることができるようにＯｍｐＦをコードする遺伝子とそのプローモーターとを染色体に導入した組換え微生物に、目的タンパク質をコードする遺伝子を含み、前記目的タンパク質を微生物の周辺細胞質に発現及び分泌させることができる組換えベクターを導入して得られ、ＯｍｐＦをコードする遺伝子と目的タンパク質をコードする遺伝子とが同時発現され、目的タンパク質を細胞外(培養液)に分泌生産できる特性を有する組換え微生物。
【請求項３】
ＯｍｐＦをコードする遺伝子を含む組換えベクターと目的タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターとが、実質的に同じ条件で発現されるオリジンを有することを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項４】
ＯｍｐＦをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターが、各々ｐ１５Ａ及びＣｏｌＥ１オリジンを有することを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項５】
ＯｍｐＦをコードする遺伝子を含む組換えベクターが、ＯｍｐＦ自体のプローモーターを有することを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項６】
ＯｍｐＦをコードする遺伝子を含む組換えベクターはｐＡＣＹＣ-ＯｍｐＦであることを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項７】
ＯｍｐＦをコードする遺伝子が、大腸菌由来であることを特徴とする請求項１または２に記載の組換え微生物。
【請求項８】
大腸菌であることを特徴とする請求項１または２に記載の組換え微生物。
【請求項９】
次の段階を含む目的タンパク質の細胞外分泌生産方法：
(ａ)請求項１〜６の何れか一項に記載の組換え微生物を培養して目的タンパク質を細胞外(培養液)に分泌させる段階；及び
(ｂ)前記培養液から目的タンパク質を回収する段階。
【請求項１０】
前記(ａ)段階で目的タンパク質の細胞外分泌が、微生物の溶解を実質的に伴わないことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
目的タンパク質をコードする遺伝子を含み、前記目的タンパク質を微生物の周辺細胞質に発現及び分泌させることができるベクターにＯｍｐＦをコードする遺伝子を導入して作製し、発現する時、ＯｍｐＦをコードする遺伝子と目的タンパク質をコードする遺伝子とが同時に発現され、目的タンパク質を細胞外(培養液)に分泌できる特性を有する組換えベクター。
【請求項１２】
ＯｍｐＦをコードする遺伝子が、大腸菌由来であることを特徴とする請求項１１に記載の組換えベクター。
【請求項１３】
請求項１１の組換えベクターで形質転換された微生物。
【請求項１４】
大腸菌であることを特徴とする請求項１３に記載の微生物。
【請求項１５】
次の段階を含む目的タンパク質の細胞外分泌生産方法：
(ａ)請求項１３または１４の微生物を培養して目的タンパク質を細胞外(培養液)に分泌させる段階；及び
(ｂ)前記培養液から目的タンパク質を回収する段階。
【請求項１６】
前記(ａ)段階で目的タンパク質の細胞外分泌が、微生物の溶解を実質的に伴わないことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的タンパク質を細胞培養液に分泌生産する方法に係り、より具体的には、大腸菌由来の細胞外膜タンパク質Ｆ(ＯｍｐＦ)遺伝子を含む組換え発現ベクターと細胞培養液から分泌しようとする目的タンパク質とを含む組換え発現ベクターで同時に形質転換された微生物及び前記微生物を培養して細胞培養液から目的タンパク質を分泌生産する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子操作技術が発展しつつ、バクテリア及び多くの動植物を利用して有用タンパク質を大量生産する研究も活発に行われている。現在まで大腸菌は多くの有用タンパク質を大量に生産するために汎用されている宿主細胞であり、これに関する研究も活発に行われている(Hodgson, Bio/Technology, １１:８８７, １９９３; Lee, Trends Biotechnol., １４:９８, １９９６)。しかし、生産しようとする有用タンパク質が大腸菌の細胞質内で生産される場合、多くの問題点が出されている。第一に、細胞質内で生産されたタンパク質を純粋分離及び精製するためには、相当に複雑で費用のかかる分離及び精製過程を経る必要がある。そして、細胞質内に存在する多くのプロテアーゼ(protease)に露出されやすいので、収率が低下する原因となる。また、多くの場合、細胞質内で過剰発現されたタンパク質は、完全にフォールディング(folding)することができず、活性を失った状態の不溶性封入体(inclusion body)を形成する。この不溶性タンパク質は、タンパク質としての活性を持たないので、これによって生物学的活性を持つ水溶性タンパク質を得るためには複雑で費用のかかる変性(denaturation)とリフォールディング(refolding)の過程が必要である(Kane and Hartley, Trends Biotechnol.,６:９５,１９８８)。
【０００３】
このような問題点を解決するための方法の中での一つとして、細胞質内で生産されたタンパク質を周辺細胞質(periplasm)又は培養液で分泌(secretion)させる方法がある。大腸菌から目的タンパク質の細胞外分泌生産は多くの長所を持っている。第一に、大腸菌細胞内で生産される場合生じる細胞内のプロテアーゼによる分解(proteolysis)を根本的に防止することができるので、所望のタンパク質の安定的な生産を期待することができる。第二に、分泌過程を経てタンパク質の正しいフォールディング(folding)が可能になり、活性を持つタンパク質を生産することができるし、不適切なフォールディングによる不溶性封入体(inclusion body)の形成を防止することができる。第三に、分泌過程を経てＮ−末端の分泌信号配列が除去されるので、細胞内での生産時、不可避に連結されるＮ−末端のメチオニン(methionine、Ｍｅｔ)残基を有していない自然状態に存在するものと同一なアミノ酸配列を維持することができる。最後には精製過程が容易である。これは、自然状態では大腸菌によって培養液で分泌されるタンパク質は、ほとんどないので所望のタンパク質を細胞培養液で分泌生産された場合、高い純度(purity)を維持することができるし、これによって、所望のタンパク質の純粋分離も非常に容易であるからである。細胞外分泌生産方法は、大腸菌の周辺細胞質に分泌する一般的な分泌生産と類似の長所を有しているが、産業的な生産側面を考慮して見ると、細胞外分泌生産方法は上述した各長所をより有効にすると考えられる。これは、限定されている周辺細胞質内で生産されるのではなく、細胞の外に完全に分泌させる方法であるので、タンパク質過剰生産で細胞に与える負担が減り、高濃度培養及び連続培養によるタンパク質の大量生産が可能になる。精製過程においても、二つの方法いずれも高い純粋度を維持する状態で生産することが可能であるが、周辺細胞質への分泌生産は細胞外分泌生産よりもっと複雑な精製過程を経る必要があるので、これは産業的に活用されることは難しい。このように細胞外分泌生産が有する長所は、非常にすぐれていて多様であり、この理由で大腸菌から目的タンパク質の周辺細胞質又は細胞外分泌生産に関して多様な研究が進行されて来た。
【０００４】
大腸菌から合成された有用タンパク質を周辺細胞質や培養液で分泌させる方法は、大腸菌を利用した組換えタンパク質の生産側面で、多くの長所がある。まず、周辺細胞質や培地内には、細胞質内に対して非常に少ないタンパク質が存在するので所望の有用タンパク質の高純度分離及び精製が容易になる。そして、大部分のプロテアーゼが存在する細胞質から分離されるので、細胞内のプロテアーゼによる分解を事前に防止することができ、収率面から良い結果を得ることができる。また、周辺細胞質は細胞質内よりさらに酸化された環境であるので、ジスルフィド(disulfide)結合がより容易に行え、結局、生成されたタンパク質の正しいフォールディング(folding)が形成され不溶性封入体の形成が著しく減少する(Choi and Lee, Appl. Microbiol. Biotechnol., ６４:６２５, ２００４)。
【０００５】
大腸菌で分泌されない外来タンパク質を分泌させるために既に知られている分泌信号配列を(ＯmpＡ、ＯｍｐＦ、ＰｈｏＡ、ＳｐＡなど)外来タンパク質のＮ−末端に連結するか又はこれら信号配列を少し変形させて連結し分泌させた(Abrahmsen et al.,  EMBO J., ４：３９０１, １９８５； Choi and Lee, Appl.  Microbiol. Biotechnol.. ６４：６２５, ２００４；Jobling et al., Plasmid, ３８：１５８, １９９７； Klein et al., Protein Eng., ５：５１１, １９９２；Utsumi et al., Gene, ７１：３４９, １９８８)。
【０００６】
しかし、このような信号配列とタンパク質の選択に伴って、分泌効率面では多くの差があり、また分泌が全然行われない場合も多い。これは、いまだに、信号配列と対象タンパク質との相互関係に関しては正確に解明されていないからである。よって、対象タンパク質をさらに効率的に分泌させる新たな信号配列に対する探索に関する研究が今も全世界的に進行されている。また、周辺細胞質からの分離精製する方法は、細胞質からの分離及び精製方法より、簡便であるが、これを細胞外で分泌する場合の分離及び精製方法がさらに簡便になる。
【０００７】
今まで進行されて来た大腸菌から目的タンパク質の細胞外分泌生産方法は、下記のように大きく４つに分けられる。(１)分泌信号配列(signal peptide)との融合方法として、主に大腸菌から周辺細胞質への分泌生産に利用される分泌信号ペプチドがよく利用される。Ｔｏｋｓｏｙらは、マルトース結合タンパク質(maltose binding protein,ＭＢＰ)との融合方法として、ＴaqＩタンパク質を細胞外に分泌生産した事がある(Toksoy et al., Biotechnol Techniq., ３:８０３, ９９９)。大腸菌ＸＬ１菌株を利用し、１mＭのＩＰＴＧを用いて誘導発現した後、培養液１Ｌ当たり約２７０×１０３ＵnitのＴaqＩタンパク質を細胞培養液で生産した。Ｌｏらは枯草菌(Bacillus subtilis)由来のβ-１,４−エンドグルカナーゼ(β-１,４-endoglucanase)を大腸菌に発現させた結果、細胞外分泌生産が確認された(Lo et al., Appl. Environ. Microbiol., ５４:２２８７, １９８８)。ＮagahariらはＯｍｐＦタンパク質の分泌信号配列及びＮ−末端の８個のアミノ酸との融合方法を利用してβ-エンドルフィンを細胞外分泌生産した(Nagahari et al., EMBO J., ４：３５８９, １９８５)。大腸菌Ｎ９９，ＲＲＩ，ＭＣ４１００及び変異体であるＭＨ１４６１(envＺ)，ＭＨ１１６０(ompＲ)を宿主細胞として使用し、この中でＲＲ１菌株からの分泌効率が一番高かったが、分泌生産後、細胞外プロテアーゼの作用によって急激にβ−エンドルフィンの分解が起きた。一番安定的な分泌効率はＮ９９菌株から現れた。一方、Ｙａｍａｍｏｔｏらは前記のようにＯｍｐＦ分泌信号配列との融合方法を利用してハービーマウス肉腫ウイルス（Ｈarvey murine sarcoma virus）由来のp２１タンパク質の分泌生産を試みたが、分泌生産されず細胞質内(cytoplasm)に不溶性封入体(insoluble inclusion body)の形態で蓄積されていたと報告した(Yamamoto et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., ３５:６１５, １９９１)。
【０００８】
(２)大腸菌で目的タンパク質分泌に関与するタンパク質及び目的タンパク質の同時生産方法を利用する。ＢａｎｅｙｘらはＯmpＡ-ＴＥＭ-β-lactamase融合タンパク質の分泌生産に大腸菌の膜貫通（transmembrane）タンパク質であるＴｏｌＡＩＩＩタンパク質の同時生産方法を利用した(Baneyx and Eugene, Protein Expr. Purif., １４:１３, １９９８)。ＯｍｐＡ-ＴＥＭ-β-lactamase融合タンパク質の分泌生産にはＩＰＴＧ誘導体を必要とするlpp-lacプローモーターを使用し、ＴｏｌＡＩＩＩの発現にもＩＰＴＧ誘導体を必要とするＴ７lacプローモーターを使用した。大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)を使用して１mＭのＩＰＴＧで誘導発現した結果、ＴｏｌＡＩＩＩが同時発現されなかった場合と比べると、同時発現した場合、細胞培養液からβラクタマーゼ（β-lactamase）活性が３.５倍程度増加したことが確認された。Ｒｏｂｂｅｎｓらはインターロイキンー２（interleukin-２：ＩＬ-２)の生産において、ｋｉｌ遺伝子の同時発現方法を使用した(Robbens et al., Protein Eｘpr. Purif., ６:４８１, １９９５)。ＩＬ-２遺伝子をＯmpＡ分泌信号配列と融合した後、ＩＰＴＧ誘導体を必要とするtacプローモーターを利用して誘導発現し、ｋｉｌ遺伝子の場合４２℃の熱衝撃（heat shock）を必要とするＰＬプローモーターを同時発現に用いた。熱衝撃によるkil遺伝子を誘導発現する前に大腸菌の周辺細胞質に生成されたＩＬ-２タンパク質の大部分が、kil遺伝子の誘導発現の後、細胞外膜を通過して細胞培養液に分泌されていることを確認した。van der Ｗalらはβ-ラクタマーゼ(β-lactamase)の細胞外分泌生産に大腸菌のリポプロテイン（lipoprotein）であるバクテリオシン放出タンパク質（bacteriocin release protein：ＢＲＰ)を利用した(van der Wal et al., Appl. Environ. Microbiol., ６４:３９２, １９９８)。van der Walらは既存のＢＲＰ遺伝子に無作為突然変異(randome mutagenesis：ランダム変異導入法)方法を用いて変形されたＢＲＰ遺伝子を得て、これらから既存のＢＲＰより安定的に細胞外分泌生産が可能なシステムを開発した。ＡristidouらはＢＲＰを利用した細胞外分泌生産で培地内にグリシン(glycine)を添加することが分泌効率を高めるのに効果があると報告した(Aristidou et al., Biotechnol. Lett., １５:３３１, １９９３)。対象タンパク質としてはα-アミラーゼ(α-amylase)とβ-ラクタマーゼ(β-lactamase)を使用したが、ＢＲＰの発現は、lpp/lacプローモーターによって行われた。α-アミラーゼの場合、培地内にグリシンを１％添加して、０.１％添加した場合と比べると、細胞培養液で約１０倍程度の高い活性を持ち、β-ラクタマーゼの場合は、約２.５倍の活性増加を示した。
【０００９】
(３)細胞外膜がない大腸菌を利用する方法である。いわゆるＬ-formと呼ばれるその突然変異体は大腸菌の細胞外膜を除去することによって、周辺細胞質なしに細胞内膜のみで細胞が形成されている状態である。すなわち、公知の汎用されて来た周辺細胞質へのタンパク質分泌生産方法を用いた時、細胞内膜のみを通過すると周辺細胞質なしにすぐ細胞培養液に露出されるので、細胞外分泌生産が可能である。ＫｕｊａｕらはＬ-form大腸菌であるＲＶ３０８菌株を使用してミニ抗体（miniantibody：miniＡｂ)を細胞外に分泌生産した(Kujau et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., ４９:５１, １９９８)。ＭiniＡｂ遺伝子はＯｍｐＡ分泌信号配列と融合してlacプローモーターによって誘導発現された。２６℃の低温で培養した時が、３７℃で培養した時よりもっと高い細胞濃度及びタンパク質の生成程度を示した。
【００１０】
(４)細胞外膜タンパク質Ｆ(ＯｍｐＦ)と目的タンパク質を融合して細胞外で分泌させる方法である。この方法は、細胞外膜タンパク質ＦのＣ-末端に目的タンパク質であるβエンドルフィン（β-endorphin）を融合させ高濃度培養をして細胞外で分泌させた(韓国特許１０-０４４７５３０；Jeong and Lee, Appl. Environ. Microbiol., ６８:４９７９, ２００２)。しかし、この方法の場合、細胞外で分泌させ生産するためには必ず高濃度培養が必要であり、生産された目的タンパク質はＯｍｐＦタンパク質と融合されているので、多種類のプロテアーゼを用いて切断し目的タンパク質を分離精製する段階を必要とする短所がある。
【００１１】
このように大腸菌から目的タンパク質の細胞外分泌生産のため、多様な方法が開発されて来たが、まだいろいろな問題点が残っている。前述の方法によって所望のタンパク質の分泌生産が可能であるが、ほとんどの方法で部分的な大腸菌の溶解(lysis)を伴うので、細胞培養液でかなりの量の大腸菌細胞内のタンパク質が含まれるようになり、純度が減少し結局、細胞外分泌生産の最大長所である容易な精製過程が難しくなる。また、大腸菌の溶解を伴う方法であるので、高濃度培養が難しいという短所があって所望のタンパク質の大量生産も難しくなるという問題がある。特にＬ-form大腸菌の場合、大腸菌の構造的な問題点があるので低濃度培養のみが可能である。
【発明の詳細な説明】
【００１２】
《技術的課題》
ここで本発明者は、大腸菌から目的タンパク質を細胞の外(培養液)で効率的に分泌生産する方法を開発しようと鋭意努力した結果、大腸菌の細胞外膜タンパク質Ｆ(ＯｍｐＦ)と目的タンパク質とを同時発現させた時、目的タンパク質が大腸菌から細胞培養液で効率的に分泌生産され、細胞培養液に純粋な形態の目的タンパク質のみが存在するので、所望の目的タンパク質を非常に簡単な方法で分離及び精製できることが確認され、本発明を完成するに至った。
【００１３】
結局、本発明の主な目的はＯｍｐＦと目的タンパク質とを同時発現させ、目的タンパク質を細胞の外で分泌生産できる特性を持つ微生物を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記微生物を培養することを特徴とする目的タンパク質の細胞外分泌生産方法を提供することにある。
【００１５】
上記目的を達成するために本発明は、ＯｍｐＦをコードする遺伝子を含む組換えベクターと目的タンパク質をコードする遺伝子を含み、前記目的タンパク質を微生物の周辺細胞質に発現及び分泌させることができる組換えベクターとで、同時に形質転換され、ＯｍｐＦをコードする遺伝子と目的タンパク質をコードする遺伝子とが同時に発現され、目的タンパク質を細胞外(培養液)に分泌生産できる特性を有する組換え微生物を提供する。
【００１６】
また、本発明は、ＯｍｐＦをコードする遺伝子を発現させることができるようにＯｍｐＦをコードする遺伝子とそのプローモーターとを染色体（chromosome）に導入した組換え微生物に、目的タンパク質をコードする遺伝子を含み、前記目的タンパク質を微生物の周辺細胞質に発現及び分泌させることができる組換えベクターを導入して得られ、ＯｍｐＦをコードする遺伝子と目的タンパク質をコードする遺伝子とが同時発現され、目的タンパク質を細胞外(培養液)に分泌生産できる特性を有する組換え微生物を提供する。
【００１７】
本発明において、ＯｍｐＦをコードする遺伝子を含む組換えベクターと目的タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターは、実質的に同じ条件で発現されるオリジンを有することを特徴とする。例えば、ＯｍｐＦをコードする遺伝子を含む組換えベクターのオリジンはｐ１５Ａであり、目的タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターのオリジンはＣｏｌＥ１である。
【００１８】
前記ＯｍｐＦをコードする遺伝子を含む組換えベクターはＯｍｐＦ自体のプローモーターを有することを特徴とし、好ましくはｐＡＣＹＣ-ＯｍｐＦである。
【００１９】
一方、目的タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターは、目的タンパク質を微生物の周辺細胞質で発現及び分泌させることが好ましいが、このような特性を有する組換えベクターとＯｍｐＦをコードする遺伝子で、同時に微生物を形質転換させた後、培養する場合、目的タンパク質を培養液で分泌させることができる。
【００２０】
従って、本発明は、また(ａ)前記組換え微生物を培養して目的タンパク質を細胞外(培養液)に分泌させる段階；及び(ｂ)前記培養液から目的タンパク質を回収する段階とを含む目的タンパク質の細胞外分泌生産方法を提供する。
【００２１】
また、本発明は、目的タンパク質をコードする遺伝子を含み、前記目的タンパク質を微生物の周辺細胞質で発現及び分泌させることができるベクターにＯｍｐＦをコードする遺伝子を導入して作製し、発現する時、ＯｍｐＦをコードする遺伝子と目的タンパク質をコードする遺伝子とが同時に発現され目的タンパク質を細胞外(培養液)に分泌できる特性を有する組換えベクターを提供する。
【００２２】
さらに本発明は、前記組換えベクターで形質転換された微生物及び前記形質転換微生物を培養して目的タンパク質を細胞の外(培養液)で分泌させることを特徴とする段階を含む目的タンパク質の細胞外分泌生産方法を提供する。
【００２３】
本発明に係る目的タンパク質の細胞外分泌生産方法において、前記(ａ)段階で目的タンパク質の細胞外に分泌する時、微生物の溶解(lysis)を実質的に伴わないことを特徴とする。
【００２４】
以下、本発明をより具体的に説明する。
本発明者は、大腸菌ＯｍｐＦを同時発現させるために組換えプラスミドベクターｐＡＣＹＣ-ＯｍｐＦを製造した。本組換えプラスミドは大腸菌ＯｍｐＦ遺伝子及びプローモーターとクロラムフェニコール抵抗遺伝子を含み、ｐ１５Ａオリジンを有しているので、大部分の発現ベクターにおいて使用されるＣｏｌＥ１オリジンと容易に同時発現される。ＯｍｐＦ遺伝子及びプローモーターは大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)染色体からＰＣＲ方法を利用して得た。
【００２５】
次に、目的タンパク質を生産し、細胞外で分泌する形質転換された大腸菌を製造するため、多様な組換えプラスミドを使用する。まず、目的タンパク質としては、大腸菌由来のアルカリ・ホスファターゼ(alkaline phosphatase)を用いた。アルカリ・ホスファターゼは４５０個のアミノ酸からなり、分子量は約５０ｋＤａである。大腸菌から発現され周辺細胞質で分泌され、周辺細胞質に存在する時のみに酵素活性を有することが知られている(Manoil et al., Science, ２３３:１４０３, １９８６)。アルカリ・ホスファターゼを細胞質で分泌生産できる組換えプラスミドｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡと前記ｐＡＣＹＣ-ＯｍｐＦを同時に大腸菌に導入させ培養した後、培養液を分析した結果、大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)とＭＣ４１００から目的タンパク質であるアルカリ・ホスファターゼが培養液に非常に良い効率で分泌生産されることが確認された。前記菌株から細胞外で分泌された純粋アルカリ・ホスファターゼを得た。また、アルカリ・ホスファターゼ以外の他のタンパク質として、５３個のアミノ酸からなる上皮細胞成長因子（epithelial cell growth factor ：EGF）、人体由来のレプチンタンパク質、バチルス(Bacillus sp.)由来のエンドキシラナーゼ（endoxylanase）を目的タンパク質として使用して、培養液としての分泌性能を確認した。上述したすべてのタンパク質が形質転換大腸菌から培養液で効率的に分泌されることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】プラスミドｐＡＣＹＣ−ＯｍｐＦの遺伝子地図である。
【図２】プラスミドｐＡＣＹＣ−ＯｍｐＦとｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡで形質転換された大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)を培養して培養液をＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分析した結果を示す図である。
【図３】プラスミドｐＡＣＹＣ−ＯｍｐＦとｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡで形質転換された大腸菌ＭＣ４１００を培養して培養液をＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分析した結果を示す図である。
【図４】プラスミドｐＡＣＹＣ-ＯｍｐＦとｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡで形質転換された大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)を多様なＮａＣｌ２濃度で培養して培養液をＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分析した結果を示す図である。
【図５】プラスミドｐｓＥＧＦの遺伝子地図である。
【図６】プラスミドｐＡＣＹＣ-ＯｍｐＦとｐｓＥＧＦで形質転換された大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)を培養して培養液をＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分析した結果を示す図である。
【図７】プラスミドｐＡＣＹＣ-ＯｍｐＦとｐｓＥＧＦで形質転換された大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)を培養して培養液をＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上でＣｕＣｌ２で染色して分析した結果を示す図である。
【図８】プラスミドｐＡＣＹＣ-ＯｍｐＦとｐＪＳ１０１ΔＰで形質転換された大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)を培養して培養液をＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分析した結果を示す図である。
【図９】プラスミドｐＡＣＹＣ-ＯｍｐＦとｐＴｒｃＫＯｂＤで形質転換された大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)を培養して培養液をＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分析した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。但し、これらの実施例は単に本発明を一層詳しく説明するためのものであり、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかである。
【００２８】
特に、下記実施例では、ＯｍｐＦをコードする遺伝子を含む組換えベクターと目的タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターで、同時に形質転換された微生物を培養して目的タンパク質を細胞の外(培養液)で分泌生産することを例示したが、目的タンパク質をコードする遺伝子を含み、前記目的タンパク質を微生物の周辺細胞質で発現及び分泌させることができる組換えベクターにＯｍｐＦをコードする遺伝子を導入して作製された組換えベクターで形質転換された微生物を使用しても目的タンパク質を細胞の外(培養液)で分泌生産することができるということは当業者には自明である。それだけではなく、ＯｍｐＦをコードする遺伝子を含む組換えベクター以外に、ＯｍｐＦをコードする遺伝子を発現させることができるようにＯｍｐＦをコードする遺伝子とそのプローモーターを染色体（chromosome：クロモソーム）に導入した組換え微生物に目的タンパク質をコードする遺伝子を含み、前記目的タンパク質を微生物の周辺細胞質に発現及び分泌させることができる組換えベクターを導入して組換え微生物を作製し、これを用いて目的タンパク質を細胞の外(培養液)で分泌生産することができるということも当業者には自明である。
【００２９】
また、下記実施例では目的タンパク質をコードする遺伝子を含み、前記目的タンパク質を微生物の周辺細胞質で発現及び分泌させることができる組換えベクターで、ｐＪＳ１０１ΔＰ(エンドキシラナーゼを周辺細胞質で分泌発現させることができる組換えベクター)とｐＴｒｃＫＯｂＤ(レプチンタンパク質を大腸菌の周辺細胞質で分泌発現させることができる組換えベクター)を例示したが、目的タンパク質を微生物の周辺細胞質で発現及び分泌させることができる組換えベクターであれば制限なしに使用可能であることは当業者には自明である。同時に、下記実施例では目的タンパク質で、アルカリ・ホスファターゼ、上皮細胞成長因子、エンドキシラナーゼ及びレプチンのみを例示したが、これに限らないということは当業者であれば自明である。
【００３０】
実施例１：ＯｍｐＦ遺伝子発現システムの開発
大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)から染色体を分離した後、ＯｍｐＦ遺伝子及びそのプローモーター領域をクローニングするために、プライマー１(５'-ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＧＧＡＴＴＡＴＡＣＣＧＡＣＧＣＡＧ-３'：配列番号１)とプライマー２(５'-ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＡＡＣＴＧＧＴＡＡＡＣＧＡＴＡＣ-３'：配列番号２)を合成した。プライマー１と２を用いてＰＣＲを行い、２１６０ｂｐのＰＣＲ産物を得た。これをＨidＩＩＩとＢａｍＨＩで切断した後、ｐＡＣＹＣ１８４(New England Biolabsd, 米国)にクローニングした。これを大腸菌ＸＬ１-Ｂlue[supＥ４４ hsdＲ１７ recＡ１ endＡ１ gyrＡ９６ thi relＡ１ lacＦ'(proＡＢ+lacIqlacＺΔＭ１５Ｔｎ(tetr))]で形質転換して組換えプラスミドｐＡＣＹＣ-ＯｍｐＦを得た(図１)。
【００３１】
実施例２:組換えプラスミドｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡの製造
大腸菌Ｗ３１１０(derived from Ｅ. coli Ｋ-１２, λ−, Ｆ−, prototrophic)から染色体を分離した後、アルカリ・ホスファターゼ遺伝子を確保するためにプライマー３(５'-ＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＣＧＧＡＣＡＣＣＡＧＡＡＡＴＧＣＣＴＧＴＴ-３'：配列番号３)とプライマー４(５'-ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＣＡＧＣＣＣＣＡＧＡＧＣＣＧＧ-３'：配列番号４)を合成して、これを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は次のようである。第一変性(denaturation)は、９４℃で５分間一度して、その後第二変性(denaturation)は、９４℃で４５秒間、アニーリング(annealing)は、５２℃で４５秒間、延長(extension)は、７２℃で１分１０秒間ずつ行い、これを３０回繰り返した。以後、７２℃で７分間最後の延長(extension)を一度行なった。前記ＰＣＲによって得られたＤＮＡをアガロース・ゲル電気泳動して、約１３６０ｂｐの大きさのＤＮＡ切片を分離し、これを二つの制限酵素ＰｓｔＩとＢａｍＨＩで切断した。これと同時に組換えプラスミドpＪＳ１０１ΔＰ(Choi, J.H., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., ５３:６４０, ２０００)を二つの制限酵素ＰｓｔＩとＢａｍＨＩで切断してエンドキシラナーゼ遺伝子を除去した後、これを前記から得られたＤＮＡ切片と共に混合した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して連結させ、組換えプラスミドｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡを得た。
【００３２】
実施例３：アルカリ・ホスファターゼの細胞外分泌生産
大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)を組換えプラスミドｐＡＣＹＣ-ＯｍｐＦとｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡで同時に形質転換した。形質転換方法としてはエレクトロポレーション（electroporation）方法を用いて、形質転換菌株は抗生剤アンピシリン(５０μg/Ｌ)とクロラムフェニコール(３４μg/Ｌ)が添加されたＬＢ平板培地で選択した。このように形質転換された菌株をＬＢ液体培地(トリプトン１０g/Ｌ, yeast extract ５g/Ｌ, ＮaＣl ５g/Ｌ)に接種して３０℃で培養した後、アルカリ・ホスファターゼの細胞外分泌の程度を検査した。液体培地に接種した後、分光光度計により６００nm波長において測定された光学密度(Ｏ.Ｄ.)が０．７となる時点で、０.１及び１.０mＭのＩＰＴＧを添加して遺伝子発現を誘導した。誘導発現１２時間後に培養液１mＬずつを取り、アルカリ・ホスファターゼ活性を測定して同時に培養液１mＬをＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分析した(図２)。図２において、Ｍはタンパク質の標準分子量であり、１は０.１mＭのＩＰＴＧによって誘導発現１２時間後にｐＡＣＹＣ-ＯｍｐＦとｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡで形質転換された大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)培養液をＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分析した結果である。図２に示したように、約５０kＤaにあたるアルカリ・ホスファターゼを確認することができ、これは本システムが目的タンパク質を非常に効率的に培養液で分泌させることができるということを示したものである。すなわち、大腸菌からアルカリ・ホスファターゼの分泌があったことが分かり、その量をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）方法で定量した結果、培養液からアルカリ・ホスファターゼが約０.１g/Ｌで水溶性形態に生産されることが確認された。
【００３３】
前述のように大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)からアルカリ・ホスファターゼが効率的に培養液に分泌されることが確認されたが、大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)のみならず、他の大腸菌からも培養液で分泌されることが確認された。前述の組換えプラスミドｐＡＣＹＣ-ＯｍｐＦとｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡを同時に大腸菌ＭＣ４１００[F−araD139 (argF−lac)U169 rpsL150(strr) relA1 flbB5301 deoC1 ptsF25 rbsR]に導入した。形質転換方法としてはエレクトロポレーション方法を用いて、形質転換菌株は、抗生剤アンピシリン(５０μｇ/Ｌ)とクロラムフェニコール(３４μｇ/Ｌ)が添加されたＬＢ平板培地で選択した。このように形質転換された菌株をＬＢ液体培地(トリプトン１０g/Ｌ, yeast extract ５g/Ｌ, NaCl５g/Ｌ)に接種して３０℃で培養した後、アルカリ・ホスファターゼの細胞外分泌の程度を検査した。液体培地に接種した後、分光光度計により６００nm波長において測定された光学密度(Ｏ.Ｄ.)が０．７となる時点で、０.１及び１.０mＭのＩＰＴＧを添加して遺伝子発現を誘導した。誘導発現１２時間後に培養液１mＬずつを取り、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分析した(図３)。図３において、Ｍはタンパク質の標準分子量であり、１は１mＭのＩＰＴＧによって誘導発現１２時間後にｐＡＣＹＣ-ＯｍｐＦとｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡで形質転換された大腸菌ＭＣ４１００培養液をＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分析した結果であり、２は０.１mＭのＩＰＴＧによって誘導発現１２時間後にｐＡＣＹＣ-ＯｍｐＦとｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡで形質転換された大腸菌ＭＣ４１００培養液をＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分析した結果である。図３に示したように、約５０ｋＤａにあたるアルカリ・ホスファターゼを確認することができ、これは本システムが目的タンパク質を非常に効率的に培養液で分泌させることができるということを示したものである。しかし、大腸菌ＭＣ４１００からのアルカリ・ホスファターゼの分泌効率は大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)より少なかった。
【００３４】
実施例４：組換え大腸菌から分泌されたアルカリ・ホスファターゼの活性測定
アルカリ・ホスファターゼの活性測定は次のような方法で行った(Brickman and Beckwith, J Mol. Biol., ９６:３０７, １９７５)。組換えプラスミドｐＡＣＹＣ-ＯｍｐＦとｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡを有している組換え大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)を５０mＬのＬＢ培地が入っている２５０mＬフラスコに接種して３７℃で培養した。分光光度計により６００nm波長において測定された光学密度(Ｏ.Ｄ.)が０．７となる時点で、１ｍＭのＩＰＴＧを添加して遺伝子発現を誘導し、誘導発現１２時間後に培養液１ｍＬずつを取った後、ここにクロロホルム(chlroform)０.１ｍＬを添加した後、３７℃で５分間反応させた。反応後０.４％ＰＮＰＰ(p-Nitrophenyl phosphate)を０.１mＬ添加した後、また３７℃で５分間反応させた。５分間反応した後１Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４溶液を０.１mＬ添加して反応を停止させた。このように得られた反応液を５０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ溶液で適切に希釈させた後、分光光度計により４２０ｎｍと５５０ｎｍの二つの波長において吸光度を測定した。この時、対照試験としてプラスミドを有していない大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)とｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡで形質転換されたＢＬ２１(ＤＥ３)培養液から同一方法で活性を測定した。活性度は次の式により求め、その結果は表１のようである。
【００３５】
活性度(Ｕ/ｍＬ)=１０００×(Ａbs４２０nm-１.７５×Ａbs５５０nm)／[反応時間(分)×反応体積(ｍＬ)]
【００３６】
【表１】
2009501021.tif 000003
【００３７】
前記、表１に示したように、プラスミドｐＡＣＹＣ-ＯｍｐＦとｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡで形質転換された大腸菌の培養液は、いずれも高いアルカリ・ホスファターゼ活性を示した一方、形質転換されていない大腸菌はほとんど活性を示していない。アルカリ・ホスファターゼは細胞内では活性を有することができないので、必ず分泌過程による周辺細胞質でのジスルフィド（disulfide）結合によって活性化される。よって、前記の実験結果から分かるように、形質転換された組換え大腸菌から生産されたアルカリ・ホスファターゼは培養液として非常に高い効率で分泌が成功的に起きることが分かる。
【００３８】
実施例５：アルカリ・ホスファターゼの細胞外分泌に対するＮaＣl２濃度の影響
大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)に組換えプラスミドｐＡＣＹＣ-ＯｍｐＦとｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡを同時に導入した。形質転換方法はエレクトロポレーション方法を利用し、形質転換菌株は抗生剤アンピシリン(５０μｇ/Ｌ)とクロラムフェニコール(３４μｇ/Ｌ)が添加されているＬＢ平板培地から選択された。このように形質転換された菌株を多様なＮaＣl２濃度を有するＬＢ液体培地(トリプトン１０g/Ｌ, yeast extract５g/Ｌ, NaCl ０, １, ５, １０g/Ｌ)に接種して３０℃で培養した後、アルカリ・ホスファターゼの細胞外分泌の程度を検査した。液体培地で接種した後、分光光度計により６００nm波長において測定された光学密度(Ｏ.Ｄ.)が０．７となる時点で、０.１及び１.０mＭのＩＰＴＧを添加して遺伝子発現を誘導した。誘導発現１２時間後に培養液１mＬずつを取ってＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分析した(図４)。図４において、Ｍはタンパク質の標準分子量であり、１-４は０.１ｍＭのＩＰＴＧによって誘導発現１２時間後にｐＡＣＹＣ-ＯｍｐＦとｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡで形質転換された大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)培養液をＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分析した結果であって、ライン１-４はそれぞれお互いに違うＮaＣl２濃度を有するＬＢ液体培地(トリプトン１０g/Ｌ, yeast extract ５g/Ｌ, NaCl ０, １, ５, １０g/Ｌ)で培養した後、得られたサンプルである。図４に示したように、約５０ｋＤａにあたるアルカリ・ホスファターゼのタンパク質を確認することができ、特にＮaＣl２の濃度が０から１０g/Ｌに増加することによって培養液で分泌されるアルカリ・ホスファターゼが増加されることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
以上、詳細に説明したように本発明は、目的タンパク質を細胞培養液で分泌する大腸菌及びこれを用いた目的タンパク質の細胞外分泌生産方法を提供する効果がある。従来技術によって組換えタンパク質を大腸菌から細胞培養液で分泌生産しようとする場合、所望のタンパク質の分泌生産が可能である一方、大部分の方法が部分的な大腸菌の溶解(lysis)を伴うので、細胞培養液にかなりの量のタンパク質が大腸菌細胞内に含まれ、純度が減少され結局、精製過程が難しくなる。これに対して本発明は、ＯｍｐＦ自体プローモーターを用いる定常的な発現によって細胞が成長しながら目的タンパク質を同時に発現させることによって、細胞濃度が高くなり、それによって、分泌生産される量が共に増加すると同時に純粋な目的タンパク質を効率よく生産する方式であるので従来技術よりかなり簡単である。よって、本発明によれば、多様な目的タンパク質を大腸菌を用いて培養液で分泌生産することができる。
【図１】
2009501021.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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