(57)【要約】  本発明は、従来型キャピラリ−フローサイトメータにおける分解能の向上をもたらす改良型毛管を提供する。本発明に従って構成された毛管の断面形状には、対称中心が存在しない。幾つかの実施形態では、毛管は、内部ボアの最も幅の広い寸法部分が集光光学系の最も近くに位置するよう集光系の光軸に対して角度をなして傾けられた内部側壁を有すると共に集光光学系の最も近くに位置した外壁を有し、この外壁は、集光信号に対する外壁屈折の影響を最小限に抑えるのに十分な大きな寸法を有する。毛管の実施形態の例としては、長方形外壁及び台形内壁を備えた管、長方形外壁及び三角形内壁を備えた管、三角形の外壁及び底壁を備えた管、三角形外壁及び台形内壁を備えた管、半球形又は菱形外壁及び台形又は三角形内壁を備えた管が挙げられる。
2009533687.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャピラリ−フローサイトメータ用の毛管であって、
長手方向に延びる壁を有し、前記壁は、前記長手方向に延びるボアを包囲し、前記壁は、内部側壁及び外部側壁を有し、前記内部側壁は、前記ボアの断面形状を定め、前記断面形状は、前記ボアの前記長手方向に対して横方向であり、
前記内部側壁によって定められた前記断面形状には、点対称が存在せず、
前記毛管は、キャピラリ−フローサイトメータ内に配置されると、前記キャピラリ−フローサイトメータの光学式集光系によって集められた実質的に全ての光が、前記光学式集光系の最も近くに位置する前記毛管の前記外部側壁の面を通過するよう構成されている、
ことを特徴とする毛管。
【請求項２】
前記外部側壁により定められ前記壁の前記長手方向に対して横方向の断面形状は、前記内部側壁により定められた前記断面形状と同一の形状のものである、
請求項１記載の毛管。
【請求項３】
前記外部側壁により定められた前記断面形状及び前記内部側壁により定められた前記断面形状は、三角形である、
請求項２記載の毛管。
【請求項４】
前記外部側壁によって定められ前記壁の前記長手方向に対して横方向の断面形状は、前記内部側壁により定められた前記断面形状とは形状が異なっている、
請求項１記載の毛管。
【請求項５】
前記外部側壁により定められた前記断面形状は、長方形であり、
前記内部側壁により定められた前記断面形状は、台形である、
請求項４記載の毛管。
【請求項６】
前記外部側壁により定められた前記断面形状は、長方形であり、
前記内部側壁により定められた前記断面形状は、三角形である、
請求項４記載の毛管。
【請求項７】
前記外部側壁により定められた前記断面形状は、三角形であり、
前記内部側壁により定められた前記断面形状は、台形である、
請求項４記載の毛管。
【請求項８】
前記外部側壁により定められた前記断面形状は、半球形及び菱形から成る群から選択され、
前記内部側壁により定められた前記断面形状は、台形及び三角形から成る群から選択されている、
請求項４記載の毛管。
【請求項９】
前記毛管は、キャピラリ−フローサイトメータ内に配置されると、前記内部側壁が前記キャピラリ−フローサイトメータの光学式集光系の軸線に対して傾けられて前記ボアの最も幅の大きな寸法部分が前記光学式集光系の最も近くに位置するように構成されている、
請求項１記載の毛管。
【請求項１０】
キャピラリ−フローサイトメータであって、
長手方向に延びる壁を備えた毛管を有し、前記壁は、前記長手方向に延びるボアを包囲し、前記壁は、内部側壁及び外部側壁を有し、前記内部側壁は、前記ボアの断面形状を定め、前記断面形状は、前記ボアの前記長手方向に対して横方向であり、前記内部側壁によって定められた前記断面形状には、点対称が存在せず、
前記毛管を通って粒子含有サンプル流体を運ぶフルイディックス系を有し、
前記毛管の一部分を照明するよう構成された励起光学系を有し、
前記サンプル流体が前記毛管の前記照明された部分を通過する際に前記サンプル流体からの光を集めるよう構成された光学式集光系を有し、
前記光学式集光系により集められた光を検出するよう構成された光検出器を有し、
前記光検出器からの信号を分析するデータ収集・分析システムを有し、
前記毛管は、前記光学式集光系によって集められた実質的に全ての光が、前記光学式集光系の最も近くに位置する前記毛管の前記外部側壁の面を通過するよう構成されている、
ことを特徴とするキャピラリ−フローサイトメータ。
【請求項１１】
前記毛管の前記外部側壁により定められていて前記壁の前記長手方向に対して横方向の断面形状は、前記毛管の前記内部側壁により定められた前記断面形状と同一の形状のものである、
請求項１０記載の毛管。
【請求項１２】
前記毛管の前記外部側壁により定められた前記断面形状及び前記毛管の前記内部側壁により定められた前記断面形状は、三角形である、
請求項１１記載の毛管。
【請求項１３】
前記毛管の前記外部側壁によって定められていて前記壁の前記長手方向に対して横方向の断面形状は、前記毛管の前記内部側壁により定められた前記断面形状とは形状が異なっている、
請求項１０記載の毛管。
【請求項１４】
前記毛管の前記外部側壁により定められた前記断面形状は、長方形であり、
前記毛管の前記内部側壁により定められた前記断面形状は、台形である、
請求項１３記載の毛管。
【請求項１５】
前記毛管の前記外部側壁により定められた前記断面形状は、長方形であり、
前記毛管の前記内部側壁により定められた前記断面形状は、三角形である、
請求項１３記載の毛管。
【請求項１６】
前記毛管の前記外部側壁により定められた前記断面形状は、三角形であり、
前記毛管の前記内部側壁により定められた前記断面形状は、台形である、
請求項１３記載の毛管。
【請求項１７】
前記毛管の前記外部側壁により定められた前記断面形状は、半球形及び菱形から成る群から選択され、
前記毛管の前記内部側壁により定められた前記断面形状は、台形及び三角形から成る群から選択されている、
請求項１３記載の毛管。
【請求項１８】
前記毛管の前記内部側壁は、前記ボアの最も幅の大きな寸法部分が前記光学式集光系の最も近くに位置するよう前記キャピラリ−フローサイトメータの光学式集光系の軸線に対して傾けられている、
請求項１０記載の毛管。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、粒子を計数するフローサイトメータ、特に、キャピラリ−フローサイトメータに関する。
【０００２】
〔関連出願の説明〕
本願は、２００６年４月１１日に出願された米国特許仮出願第６０／７９１，００２号（発明の名称：Improved Capillary Design for Capillary Flow Cytometers）の優先権主張出願であり、この特許文献を本願に援用し、その記載内容全体を本明細書の一部とする。
【背景技術】
【０００３】
微生物の検出及び計数のため並びに臨床診断学、臨床免疫学、タンパク及び核酸の検出、血液学及び腫瘍学を含む生命科学全体にわたる様々な用途のためにフローサイトメータシステムが用いられている。市販の機器は、広範なバイオテクノロジー向きに構成されている場合のある複雑な実験室システムから能力が制限された安価なベンチトップシステムまでの範囲にわたる。現在のバイオテクノロジー市場では、フローサイトメータの価格は、一般に、その測定精度及びフローサイトメータが実施することのできる様々な測定の種類の数につれて高くなる。
【０００４】
フローサイトメータは、典型的には、流体サンプル中の特定の性質を持つ粒子を突き止めてこれらを計数するために用いられる。本明細書において、「サンプル粒子」という用語は、例えば、ラテックス球体、細菌、ウイルス、ＤＮＡ断片、細胞、分子又は全血の成分を意味している。サンプル粒子は、励起光を直接散乱させ又は適当な波長の光によって照明されると蛍光を発する場合がある。多くの場合、蛍光放出特性は、プローブ分子をサンプル粒子全体又は粒子内の顕微鏡的組織に取り付けることにより特定の測定に合わせて最適化される。
【０００５】
典型的なフローサイトメータでは、サンプル粒子は、流動している流体によって励起容積部まで運ばれ、ここで、レーザ又は別の光源の集束出力ビームで照明される。照明されたサンプル粒子によって散乱されたり放出されたりする光は、従来型光学系を用いて集められて放出角度及び波長に従って分離される。サンプル粒子は、高速で励起容積部を通って移動するので、光は、粒子の寸法形状、これら粒子が励起容積部を通過する際のこれらの速度及び集光系の光学的性質によって定まる振幅及び時間プロフィールを有するパルスの形態で散乱されたり放出されたりする。理想的な場合では、同一の物理的性質を持つサンプル粒子は、同一の光パルスを生じさせる。実際には、パルス形状のばらつきが、サンプル粒子速度及び集光効率の空間依存性ばらつき及び多数の粒子の同時照明によって引き起こされる。
【０００６】
光学系により放出角度及び波長に従って分離された光パルスは、光電子増倍管、固体（半導体）検出器又は別の光検出器によってアナログ電子パルスに変換される。通常、アナログ信号を次のディジタル信号プロセッサ又はコンピュータによる分析が可能なようにディジタルデータストリームに変換するためにデータ収集システムが用いられる。
【０００７】
特定の種類のサンプル粒子が励起容積部内に存在しているかどうかは、検出器パルスの振幅を一定の基準レベルと比較することにより決定される。サンプル粒子検出プロセスにおける誤差は、多数のサンプル粒子の同時照明及び同一のサンプル粒子によって生じるパルスの振幅及び形状のばらつきによって引き起こされる。単一のサンプル粒子の照明により、典型的には、シングレットパルス（singlet pulse）と呼ばれる１つのピークを持つ検出器パルスが発生する。２つのサンプル粒子の同時照明により、典型的には、ダブレットパルス（doublet pulse）と呼ばれる２つのピークを持つ検出器パルスが発生する。典型的なシステムでは、３つ以上のサンプル粒子を照明する確率は低い。個々のサンプル粒子が逐次的に励起容積部を通過し、同一のサンプル粒子が同一の形状及び振幅を持つパルスを生じさせるシステムでは、測定精度及び再現性が極限まで高められる。
【０００８】
図１は、サンプル流体が気体又は液体の状態にある場合があるシース流体によって包囲された従来型のシース−フローサイトメータシステム１００の略図である。サンプルは、コアインジェクタ１０２によってシース流体中に注入され、組み合わされた流体は、典型的には流管軸線からの半径方向距離の放物線関数である滑らかで定常的な層状の速度分布の流管１０４を通って流れる。サンプル流体中の粒子は、コアインジェクタ１０２から見て下流側に位置する励起容積部１０８内の集束励起源１０６からの光と相互作用する。コアインジェクタ１０２と励起容積部１０８との間のネックダウン領域１１０内における流管１０４の直径を次第に減少させることによりサンプル粒子の直径を減少させる。理想的な場合では、励起容積部１０８を含む流管１０４の領域のサンプル粒子の直径は、細胞（又は他のサンプル粒子）が一度に１つずつ励起容積部１０８を通過するほど小さい。サンプル直径の減少により、粒子速度の半径方向ばらつき及び集光効率の半径方向ばらつきが最小限に抑えられるという追加の利点が得られる。
【０００９】
図１のサイトメータシステム１００では、シース流体は、加圧入口１１４を通って流管１０４の台形部分１１２中に導入される。サンプル流体は、代表的には流管軸線と一致した軸線を持つ加圧コアインジェクタノズル１０２を通って包囲シース流体中に注入される。組合せ状態の流体は、ネックダウン領域１１０を通って励起容積部１０８に流れ、ここで、サンプル流体は、レーザ、レーザ駆動型周波数非線形変換器、例えば周波数二倍器、周波数三倍器又は周波数四倍器、光学パラメトリック発振器、発光ダイオード、超光発光ダイオード、アークランプ又は輝度と出力波長の適当な組合せを持つ別の光源１０６によって発生可能な集束励起光ビームによって照明される。
【００１０】
励起ビームを励起容積部１０８内に集中させるために励起光学系１１６が用いられる。励起光学系１１６は、図１では単一のレンズとして示されているが、従来型回折光学部品、反射光学部品及び屈折光学部品の群から選択された１つ又は２つ以上のコンポーネントを含んでも良い。励起波長のところに高い透過率を持つオプションとしてのバンドパスフィルタ１１８が、励起波長とは異なる波長で励起源１０６により放出された光を遮るために励起光源１０６と励起容積部１０８との間に配置される場合がある。
【００１１】
集束励起光は、蛍光励起、吸光、小角散乱及び大角散乱を含む幾つかの物理的プロセスを介して励起容積部１０８を通って流れるサンプル粒子と相互作用する。サンプル粒子は、運動中の粒子が励起ビームによって照明されたときに生じる光パルスの波長、振幅、持続時間及び形状を測定することによって識別されて計数される。
【００１２】
散乱された励起光は、典型的には、散乱粒子の寸法形状によって定まる角度分布を有している。したがって、励起ビーム伝搬軸線に対して大角（＞４５°）及び小角（＜１０°）をなして同時に散乱される光の時間依存性振幅を測定することが有利である。蛍光は、典型的には、励起光の偏光及び場合によっては他の要因で決まる分布状態を持つ４π立体角の状態に放出される。
【００１３】
蛍光及び散乱光が暗い背景に対して見えるときにＳＮ比が最大になる。大角散乱及び蛍光測定では、励起ビーム伝搬方向に対して大角をなす光を集め、非粒子散乱光源を遮るよう設計されたアパーチュアを用いることにより背景光レベルが最小限に抑えられる。順方向散乱測定では、背景光レベルは、典型的には、励起ビームを遮ることによって最小限に抑えられる。
【００１４】
図１のサイトメータシステム１００では、大角発光用光学式集光系１２０が、蛍光及び励起ビーム伝搬軸線に垂直な軸線回りの角度の円錐体の状態に散乱される光を集める。散乱された光は、二色（ダイクロイック）ビームスプリッタ１２２，１２４を通過し、そしてレンズ１２８又は別の合焦光学系により大角散乱検出器１２６の能動素子上に合焦される。第１の波長の蛍光は、第１の二色ビームスプリッタ１２２により反射されて第１の蛍光検出器１３０に差し向けられ、第２のこれとは異なる波長の蛍光は、第２の二色ビームスプリッタ１２４により反射されて第２の蛍光検出器１３２に差し向けられる。典型的には、１つ又は２つ以上の光学バンドパスフィルタ１３４が、各検出器１２６，１３０，１３２に到達する波長を制限するために励起容積部１０８と検出器１２６，１３０，１３２との間に配置される。
【００１５】
励起ビーム伝搬軸線に対して小角をなして散乱された光は、順方向散乱画像化システム１３６によって集められる。典型的には、非散乱励起ビームが順方向散乱画像化システム１３６に達するのを阻止するためにビームブロック１３８が励起容積部１０８と順方向散乱画像化システム１３６との間に配置される。ビームブロック１３８の縁周りを通過した順方向散乱光は、集められて順方向散乱検出器１４０の能動素子上に合焦される。典型的には、バンドパスフィルタ１４２が、励起波長の光を透過し、他の波長の光を遮るために励起容積部１０８と順方向散乱検出器１４０との間に挿入される。
【００１６】
典型的なシース−フローサイトメータシステム１００では、励起容積部１０８は、厳密集束（tightly focused）型レーザ励起源と典型的な直径が数ミクロンのサンプル流体流の交差によって構成される。サンプル粒子から散乱されたり放出される光は、点源に酷似した小励起容積部１０８から出る。
【００１７】
蛍光は、典型的には、プローブ分子（例えば有機色素分子）により生じ、これらプローブ分子は、これらが流れ中に導入される前に、或る特定のサンプル粒子又は或る特定のサンプル粒子内の特定の組織に生物化学的に結合される。プローブ分子は、典型的には、励起光の強力な吸収体であり、吸収した光エネルギーを放出蛍光に効果的に変換する。励起光波長に対する蛍光光波長のレッドシフト（ストークスシフト）により、蛍光を従来型透過フィルタ又は格子により励起光から分離できる。蛍光光子は、典型的には、励起ビームからの光子の吸収後、数ナノ秒以内に放出される。この遅れは、粒子が典型的なシース−フローサイトメータシステム１００内の励起容積部１０８を通過するのに必要な時間と比べて短い。
【００１８】
或る特定の用途では、種々の発光スペクトル又は種々の励起スペクトルを持つプローブ分子を互いに異なる種類のサンプル粒子又は単一の種類のサンプル粒子内の互いに異なる組織に結合するのが良い。互いに異なる波長の蛍光パルスの振幅を測定することにより、単一の粒子に対して同時測定を行い、互いに異なるサンプル粒子又は組織により生じる信号を識別することが可能である。
【００１９】
散乱励起光を用いると、互いに異なるサンプル粒子の種類を判別することができる。励起ビームの伝搬軸線に対して小角をなして散乱された光の量は、粒子サイズによって異なり、大角散乱は、粒子の粒状度及び他のパラメータと共に増大する。小角散乱と大角散乱の比を測定することにより或る特定の粒子種を判別することができる。
【００２０】
検出器１２６，１３０，１３２，１４０に達した光パルスの形状及び振幅は、粒子の光学的性質、粒子の速度、励起容積部１０８の寸法形状、光源１０６の特性、光学式集光システム１２０，１３６及び励起光学系１１６の光学的設計によって決定される。粒子の光学的性質は、粒子に結合されたプローブの吸光及び発光特性に加えて、これらの寸法形状及び透明度で決まる。蛍光放出光のための量子収率が高い強吸光型プローブは、典型的には、最大振幅のパルスを発生させる。
【００２１】
典型的な用途では、少なくとも１つの検出器１２６，１３０，１３２，１４０は、粒子が励起ビームにより照明されると、光パルスを受け取る。粒子と励起ビームとの間の各相互作用は、「事象（event ）」と呼ばれている。理想的な場合では、粒子は、事象中に生じる検出器パルスの特性から識別できる。例えば、小角散乱信号及び大角散乱信号の相対的大きさを測定することによりサンプル中の単球、顆粒球、リンパ球を計数し、これらを互いに判別することが可能である。滑らかな層流からのずれ、粒子速度及び集光効率の空間的ばらつき及び多数の粒子の同時照明により誤差が粒子識別プロセス中に導入される。
【００２２】
典型的な毛管（細管）では、流速は、管中心部に最大の速度を持つ放物線分布を有する。放物線分布は、管軸線の近くではほぼフラット（半径方向偏差がほぼゼロ）であり、この軸線近くの領域を移動している粒子は、ほぼ同一の速度を有する。キャピラリ−フローサイトメータでは、管の壁の近くを移動している粒子は、速度が著しく低く、中心の近くを移動しているパルスよりも長いパルスを生じさせる。層流条件からの偏差（乱流）により、パルスの形状について予測できない時間依存性のばらつきが生じる。
【００２３】
殆どの商用及び研究用フローサイトメータは、図１に示すと共に上述したようなシース−フロー型セルを利用しているが、フローサイトメータの中にはサンプル流体が正方形毛管セルを完全に満たす別のより簡単なフロー−セル設計を利用するもの（例えば、グアバ・テクノロジーズ（Guava Technologies）社製のフローサイトメータ）がある。図２Ａ及び図２Ｂは、それぞれ、代表的なシース−フロー型セル及びキャピラリ−フロー型セルの断面図である。従来型シース−フローサイトメータは、例えば、米国特許第４，６６２，７４２号明細書及び同第４，７４５，２８５号明細書に記載されている。技術の現状のキャピラリ−フロー型システムが、米国特許出願公開第２００２／００２８４３４（Ａ１）号明細書に記載されている。
【００２４】
図２Ａのシース−フロー型セルでは、粒子含有サンプル流体２００は、透明なシース流体２０２によって毛管軸線の近くの領域に閉じ込められる。上述したように、サンプル２００は、特別設計のコアインジェクタ１０２によりシース流体２０２中に導入され、２つの流体２００，２０２は、シース流体入口２０４及びサンプル流体入口２１２によって提供される正圧下においてセルを通って流れる。コアインジェクタ１０２と励起容積部１０８との間で、組合せ状態のシース流体２０２とサンプル流体２００は、流れ断面が減少したテーパ付きネックダウン領域１１０を通過する。流管１０４の直径のこの減少により、流速が増大すると共にサンプル流体２００及びシース流体２０２の直径が減少する。シース−フローサイトメータシステム１００の励起領域１０８内におけるサンプル流体２００の典型的な直径は、２μｍ〜２５μｍであり、シース流体２０２の直径は、典型的には、１００μｍ以上である。
【００２５】
図２Ｂのキャピラリ−フロー型システム２０６では、シース流体が存在せず、サンプル流体２００及び励起容積部１０８が、毛管２０８の断面全体を占める。サンプル流体２００は、毛管２０８の下流側端部に設けられたポンプ（図示せず）によりサンプルリザーバ２１０から引き出され、そして励起容積部１０８中に圧送される。サンプル粒子は、毛管２０８の断面全体にわたりあらゆる箇所で光を放出すると共に散乱する。励起領域１０８内のサンプル流体２００の断面寸法は、シース−フロー型システム１００内のサンプル流体の断面寸法よりも著しく大きい。例えば、キャピラリ−フローサイトメータ内の正方形毛管２０８に関する典型的な内縁寸法は、１００μｍである。
【００２６】
一般に、従来型シース−フローサイトメータ１００は、キャピラリ−フローサイトメータと比べると、以下の性能上の利点を有している。
（１）  励起容積部１０８内における流速のばらつきが小さい。サンプル流体２００は、粒子速度の１階導関数の値が小さい放物線流速分布の領域に制限される。これは、粒子が毛管２０８の断面全体を通って流れるキャピラリ−フロー型システムとは対照的である。
（２）  光学式集光効率のばらつきが小さい。サンプル流体２００は、流管軸線の近くの狭い領域に閉じ込められるので、励起容積部１０８は、典型的には、固定点源のように作用し、壁面効果は、パルス振幅に対して無視できるほどの効果を有する。これは、壁面効果が典型的には、パルス振幅の相当大きな位置依存性ばらつきを生じさせる従来型キャピラリ−フロー型計器とは対照的である。
（３）  シース−フロー型計器内における小さな励起容積部１０８により、大きな開口数を持つ集光レンズを用いることができる。また、小さな励起容積部は、背景ノイズレベルを減少させると共に多数の粒子を同時に照明する確率を低くする。
【００２７】
しかしながら、多くの測定に関し、キャピラリ型システムは、まずまずの測定精度を提供すると共にシース−フロー型システム１００と比較して以下の利点をもたらす。
（１）  キャピラリ型システムは、価格が低く且つ複雑さが少ない。シース−フロー型セルは、複雑且つ高価であり、しかも適正に位置合わせするのが困難である。キャピラリ−フロー型セルは、単純且つ安価であり、しかも位置合わせ不良傾向が小さい。
（２）  サンプル流体２００は、ポンプにより毛管２０８を通って引き出され、それにより、サンプル流体２００中の粒子濃度の直接測定が容易になる。シース−フローサイトメータ１００では、サンプル流体２００及びシース流体２０２は、圧力下で流管１０４中に注入され、粒子濃度は、典型的には、粒子濃度が既知であるサンプル流体２００をシステム中に導入することにより間接的に測定される。
（３）  シース流体２０２及び関連のフルイディックスが省かれる。キャピラリ−フロー型計器の単純なフルイディックスにより、測定精度の低下を容認できる或る特定の通常の測定については相当な費用節減が達成される。
【００２８】
シャピロ（Shapiro）（「プラクティカル・フロー・サイトメトリ（Practical Flow Cytometry）」，第４版，ワイリー（Wiley），ホボケン（Hoboken），２００３年）によれば、「サイトメータの測定精度は、慣例上、“ほぼ同一の粒子”からの蛍光又は光散乱強度の測定値の分布を累積し、測定値に関する標準偏差を算術平均又は相加平均で除算した値を１００倍した百分率として表わされるばらつき計数（ＣＶ）を計算して定められることを特徴としている」。ＣＶが小さいことは、精度が高いことと関連している。
【００２９】
典型的な測定では、検出器からのパルスの振幅が所定のしきい値よりも大きいときにはいつでも、計数が増大する。同一粒子により生じるパルス振幅のばらつきにより、計数の誤差が生じ、この結果、測定に関するＣＶの望ましくない増大が生じる。従来型キャピラリ−フローサイトメータのＣＶは、キャピラリ−フローサイトメータの励起容積部１０８が大きいという理由及び粒子からの光の放出が毛管軸線から遠くにずれているという理由で、シース−フロー型計器１００のＣＶよりも大きいのが通例である。
【００３０】
キャピラリ−フローサイトメータについて行われる測定のＣＶは、毛管軸線の近くの狭い領域内のサンプル粒子の濃度を高めることにより改善できる。米国特許第６，７１０，８７１号明細書は、例えば、磁気的に荷電された粒子が毛管２０８の絞られた断面領域内を流れるようにするために磁界が用いられるキャピラリ−フローサイトメータシステムを記載している。
【００３１】
キャピラリ−フローサイトメータについて行われる測定のＣＶも又、パルス速度を求め、２つ又は３つ以上の粒子の同時照明によって発生するパルスをリアルタイムで識別するディジタル信号処理アルゴリズムの使用により改善できる（即ち、減少できる）。シース−フロー型計器１００と比較して、２つの粒子を同時に照明する確率は、励起容積部１０８が大きいので増大する。キャピラリ−フロー型計器における改良型のダブレット検出は、アール・ピー・ウェルスト他（R.P. Wersto, et. al.）著，「ダブレット・ディスクリミネイション・イン・ディーエヌエー・セル−サイクル・アナリシス（Doublet Discrimination in DNA Cell-Cycle Analysis）」，４６：ｐ．２９６〜３０６，２００１年に概要が述べられているように速度決定アルゴリズムと従来型のシース−フロー型手法の組合せを適用することによって達成できる。
【００３２】
従来型キャピラリ−フローサイトメータで用いられる大角発光用光学式集光系は、集光システム軸線回りの角度の円錐体の状態に放出され又は散乱される光を集める。流管の壁による光の反射及び屈折により、典型的には、流管内の互いに異なる箇所で励起される同一粒子からの互いに異なる量の光の収集が行われる。集められた光の量のばらつきにより、検出器により生じた電子パルスの振幅又は形状のばらつきが生じ、この結果、計器で行われる測定に関するＣＶが増大する。
【００３３】
原理的には、励起容積部１０８は、小さなボアを備える毛管２０８を用いることによって縮小できるが、毛管２０８の直径の減少により、サンプル粒子が集まって塊を作り、毛管２０８を詰まらせる確率が増大する。毛管の詰まりは、どのような測定にとっても致命的であり、粒子のサイズによって定められる正方形毛管２０８のボア寸法に実用上の下限をもたらす。
【００３４】
【特許文献１】米国特許第４，６６２，７４２号明細書
【特許文献２】米国特許第４，７４５，２８５号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００２／００２８４３４（Ａ１）号明細書
【特許文献４】米国特許第６，７１０，８７１号明細書
【非特許文献１】シャピロ（Shapiro）著，「プラクティカル・フロー・サイトメトリ（Practical Flow Cytometry）」，第４版，ワイリー（Wiley），ホボケン（Hoboken），２００３年
【非特許文献２】アール・ピー・ウェルスト他（R.P. Wersto, et. al.）著，「ダブレット・ディスクリミネイション・イン・ディーエヌエー・セル−サイクル・アナリシス（Doublet Discrimination in DNA Cell-Cycle Analysis）」，４６：ｐ．２９６〜３０６，２００１年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３５】
壁面効果を減少させる経済的且つ効率的な方法は、先行技術では知られていない。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
上記のことを考慮して、本発明は、キャピラリ−フローサイトメータ用の改良型毛管を提供する。本発明に従って構成された毛管の断面形状には点対称が存在しない。これにより、毛管壁による光の散乱及び屈折により生じるパルス形状及び振幅の位置依存性ばらつきが大幅に減少する。毛管の外壁及び内壁の形状は、測定ＣＶを小さくする（改善する）。
【００３７】
幾つかの実施形態では、毛管は、内部ボアの最も幅の広い寸法部分が集光光学系の最も近くに位置するよう集光系の光軸に対して角度をなして傾けられた内部側壁を有すると共に集光光学系の最も近くに位置した外壁を有し、この外壁は、集光信号に対する外壁屈折の影響を最小限に抑えるのに十分な大きな寸法を有する。集められた光の位置に敏感なばらつき及びこれに関連した測定ＣＶに対する影響は、集光光学系の開口数及び視野絞り直径に従って内壁傾斜角度及び外壁寸法を選択することにより最小限に抑えることができる。
【００３８】
毛管の実施形態の例としては、長方形外壁及び台形内壁を備えた管、長方形外壁及び三角形内壁を備えた管、三角形の外壁及び底壁を備えた管、三角形外壁及び台形内壁を備えた管が挙げられる。毛管の中には、半球形又は菱形外壁及び台形又は三角形内壁を備えたものがある。
【００３９】
本発明の別の実施形態は、集光軸線に平行な方向における壁寸法が励起ビームと外壁の相互作用を最小限に抑えるに足るほど大きいものであるようにすることにより集光光学系に入る散乱励起光の量を最小限に抑える。
【００４０】
特許請求の範囲は、本発明の特徴を具体的に記載しているが、本発明は、その目的及び利点と共に、添付の図面と関連して行われる以下の詳細な説明から最も良く理解できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
図面を参照すると（図中、同一の参照符号は、同一の要素を示している）、本発明は、適当な環境で実施されるものとして示されている。以下の説明は、本発明の実施形態に基づいており、かかる説明は、本明細書において明示的に説明されていない別の実施形態に関して本発明を制限するものではない。
【００４２】
先行技術のキャピラリ−フローサイトメータの毛管壁による光の散乱及び屈折によって生じるパルス形状及び振幅の位置依存性ばらつきは、改良型毛管設計の使用により大幅に減少させることができる。先行技術の正方形及び丸形毛管とは対照的に、改良型毛管の断面形状には、点対称が存在しない。従来型の正方形毛管を本発明を具体化した非対称毛管で置き換えることにより、壁面効果が最小限に抑えられる。改良型毛管を組み込んだキャピラリ−フローサイトメータにより実施される蛍光計数測定のＣＶは、主として、壁面効果によってではなく、ダブレット及び背景光に起因する体積効果によって制限されることが見込まれる。改良型装置は、従来型シース−フローサイトメータで得られるＣＶの値の約２倍未満のＣＶを達成する。この性能は、シース−フロー型計器のＣＶの５倍〜１０倍であるＣＶを有する従来型キャピラリ−フロー型計器とは対照的であると言える。
【００４３】
本発明の実施形態は、有利には、先行技術で知られている超高集積化技術を用いて大量生産できる。例えば、広範な内側ボア幾何学的形状を有する毛管を、高精度粉末ブラスチング及び光学結合技術、フォトリソグラフィー、ガラス成形及び打抜き加工の利用により製造できる。これらは又、従来型ガラス引抜き技術を用いて製造できる。
【００４４】
先行技術の対称毛管設計の固有の欠点を説明するため、図３に示す代表的な正方形毛管２０８を考察する。この正方形毛管２０８は、グアバ・テクノロジーズ社の商用キャピラリ−フローサイトメータに用いられているものに類似している。図示のように、外部側壁３００と内部側壁３０２（これは、毛管２０８のボア３０４を画定している）の両方は、ほぼ正方形である。
【００４５】
図３の毛管２０８内のサンプル粒子からの蛍光放出光は、図４の代表的な大角発光用光学式集光系１２０を備えた単一の光電子増倍管検出器１２６中に画像化できる。このシステムでは、光は、開口数が０．５０であり、有効焦点距離が８．００ｍｍのＡＲ被覆成形ガラス非球面レンズ４００によって集められる。非球面レンズ４００は、典型的には、毛管２０８の壁から５．８ｍｍの距離を置いたところに位置決めされる。非球面レンズ４００から光電子増倍管検出器１２６までの距離は、約１５０ｍｍである。リレーレンズ４０２が、非球面レンズ４００から約９０ｍｍのところに位置決めされている。システム性能は、ロングパスフィルタ４０４の位置及びバンドパスフィルタ１３４の位置によって影響されることはない。図４の代表的な光学系に加えて、本発明の毛管からの光は、フローサイトメータ技術で知られている別の光学系を用いて集光できる。
【００４６】
図５Ａ〜図５Ｇは、図３の正方形毛管２０８のボア３０４内の種々の位置のところに存在する同一の蛍光粒子からの集光状態を示している。粒子は、各図では同一程度で照明されている。以下の表では、粒子の位置は、毛管２０８の対称中心のところに原点を持つ直角座標系に関して特定される。ｘ軸は、毛管２０８の外部側壁３００に平行に水平に差し向けられ、ｙ軸は、これに直角な垂直方向に差し向けられている。励起ビームの焦線は、座標系のｙ軸と一致している。個々の光線経路（光路）は、図５Ａ〜図５Ｇでは線として示され、集められた光線は、陰影をつけた灰色である。
【００４７】
〔表１〕
図          毛管ボア内における粒子の位置
５Ａ        中心：（０，０）
５Ｂ              （０，−４５μｍ）
５Ｃ              （０，４５μｍ）
５Ｄ              （−４５μｍ，０）
５Ｅ              （４５μｍ，０）
５Ｆ              （−３５μｍ，３５μｍ）
５Ｇ              （３５μｍ，−３５μｍ）
【００４８】
図５Ａでは、粒子は、正方形毛管２０８のボア３０４の中心のところに位置している。光線は、あらゆる方向に放出され、毛管２０８の外部側壁３００のところの空気−ガラスインタフェースで屈折する。サンプルと毛管２０８の内部側壁３０２との間のインタフェースのところでの屈折は、屈折率の差が小さいので無視できる。図５Ａの最上部のところの陰影をつけた灰色である光線は、成形ガラス非球面レンズ４００（図４参照）により集められ、１つ又は２つ以上の検出器１２６に差し向けられる。毛管２０８の中心の一点からの集光に関する重要な特徴は、空気−ガラス境界部での屈折という単純明快な作用効果であり、即ち、この屈折は、毛管２０８内の集められた光線の円錐体を細くし、集光光学系１２０（図１及び図４参照）の開口数を効果的に減少させる。
【００４９】
図５Ｂ〜図５Ｇは、毛管２０８のボア３０４の中心からずれて位置している粒子からの集光状態を示している。図５Ｂ〜図５Ｇを注意深く吟味すると、これらオフアクシス（軸外し）箇所から集められた光の量は、次の２つの影響、即ち、
（１）  毛管２０８の外部側壁３００のところの空気／ガラス境界部のところの屈折、及び
（２）  サンプルと毛管２０８の内部側壁３０２との間のインタフェースのところの小角反射、
によって影響を受けていることが示されている。オンアクシス（軸上）エミッタと比較して、外壁屈折により、或る特定のオフアクシス箇所から集められた光の光線の本数が増大し、これに対し、内部側壁３０２からの反射により、集められた光線の本数が減少する。これら効果及び測定ＣＶに関するこれらの最終的な効果の相対的大きさは、光学系の開口数、視野絞り直径及び毛管２０８の形状の関数である。集められた光線の本数の位置依存性ばらつきは、キャピラリ−フローサイトメータの精度に悪影響を及ぼす。集光効率のばらつきにより、同一の粒子に対して行われる測定結果に関する標準偏差が増大し、有害なことに、ＣＶが増大する。
【００５０】
本発明によれば、毛管の内部側壁及び外部側壁の形状を変えることにより測定ＣＶを最小限に抑えることができる。最適な毛管寸法は、集光光学系の開口数及び視野絞り直径で決まる。本発明の幾つかの実施形態では、毛管は、集光系の光軸に対して角度をなして傾けられた内部側壁を有し、内部ボアの最も大きな寸法部分が集光光学系の最も近くに位置するようになっている。更に、集光光学系の最も近くに位置する毛管の外部側壁は、集められた光信号に対する外壁屈折の影響を最小限に抑えるほどの大きさの寸法を有している。集光光学系の開口数及び視野絞りに基づいて内壁傾斜角度及び外壁寸法を選択することにより、集められた光の位置敏感性ばらつき及びこれに関連した測定ＣＶに対する影響を有利には最小限に抑えることができる。
【００５１】
図６は、本発明の種々の観点を具体化した改良型毛管６００を示している。毛管６００は、サンプル粒子により散乱され又は放出されて開口数が０．５の光学系によって集められた光の量の位置によるばらつきを最小限に抑える。毛管６００は、ｘ軸方向における幅が６８０μｍ、ｙ軸方向における幅が３００μｍである長方形の外部側壁６０２を有している。内部ボア６０４の断面は、台形であり、ボア６０４は、長方形外部側壁６０２内に心出しされている。台形の長辺は、長さが１５０μｍであり、短辺は長さが５０μｍである。長辺と短辺は、１００μｍの垂直距離だけ互いに離れている。
【００５２】
図７Ａ〜図７Ｇは、それぞれ、図６の毛管６００のボア６０４の中心から図５Ａ〜図５Ｇの距離に等しい距離だけずれて位置する同一粒子からの集光状態を示している（以下の表を参照されたい）。外壁屈折の影響及び小角反射の影響は、この実施形態が台形であり、しかも外壁の形状が長方形であることにより著しく減少している。特に、図５Ｂと図７Ｂを比較する。図５Ｂでは、毛管２０８の側面から屈折した光は、光学式集光系に向かって（図示されていないが、図５Ｂの頂部に向かって）差し向けられている。これとは対照的に、図７Ｂでは、光学系の最も近くに位置する毛管６００の延長された面は、この光が光学式集光系に達するのを阻止する。その結果として、図７Ａ〜図７Ｇの光学式集光系に達した光の実質的に全ては、毛管６００のこの前面を通過する。この場合、「実質的に全て」という用語は、光学式集光系に達した光のうちの７５％以上が、毛管６００の前面を通過することを意味する。これよりも高い百分率が好ましく、幾つかの実施形態では、百分率は、９０％を超える。
【００５３】
〔表２〕
図          毛管ボア内における粒子の位置
７Ａ        中心：（０，０）
７Ｂ              （０，−４５μｍ）
７Ｃ              （０，４５μｍ）
７Ｄ              （−４５μｍ，０）
７Ｅ              （４５μｍ，０）
７Ｆ              （−３５μｍ，３５μｍ）
７Ｇ              （３５μｍ，−３５μｍ）
【００５４】
図８は、粒子が毛管の内部で一様に分布し、毛管が同一程度に照明されているという仮定の下で、図５Ａ〜図５Ｇ（最上部の行）及び図７Ａ〜図７Ｇ（最下部の行）の集光効率に関する光線追跡法による数値計算の結果をまとめて示している。真ん中の行は、正方形内部ボア及び長方形外部ボアを備えた毛管の場合の追加の計算結果をまとめて示している。列２〜８は、ボア内部の互いに異なる位置における粒子からの光を光学系で集めた百分率を示している。列９は、列２〜８の平均値を示し、列１０は、他の列のデータから計算されたＣＶの値を示している。最下部の行と他の２つの行を比較すると、集められた光のばらつき及び対応のＣＶのばらつきは、本発明の観点に従って構成された毛管６００により著しく減少している。
【００５５】
従来、正方形毛管を有する先行技術のキャピラリ型サイトメータの測定ＣＶを減少させるには、アパーチュアを集光光学系に配置して側壁屈折光の一部分を遮る場合がある。残念ながら、補正アパーチュアの挿入により、集められる光の量が減少し、それにより、感度が低下するという望ましくない結果が生じる。アパーチュア補正式システムは、毛管により厳しい寸法上の許容誤差を課し、又、アパーチュア及び毛管の相対位置に敏感であり、最適結果を得るために動的な位置合わせを必要とする場合が多い。最善の場合、アパーチュア補正式キャピラリ−フローサイトメータにより行われた測定結果のＣＶは、図６の台形実施形態を組み込んだキャピラリ−フロー型計器で行った測定結果の理論的ＣＶの２倍〜３倍である。
【００５６】
図６の実施形態は、大角発光用光学式集光系の性能の著しい向上をもたらすが、サンプル励起及び小角順方向散乱の測定に対して殆ど影響を及ぼさない。サンプル／ガラス内部インタフェースの僅かな屈折率ステップのところでの屈折は無視できる。順方向散乱検出器に達する光の量に対する内壁のところの反射及び外壁のところの屈折の影響は、従来型正方形毛管で観察された影響と大きさが同等である。
【００５７】
本発明の幾つかの変形実施形態は、図６の実施形態と以下の特性を共有している。
（１）  大角発光用光学式集光系の軸線に垂直な方向における外壁の寸法は、外部側壁屈折及び角の屈折に起因する信号への影響を最小限に抑えるように選択される。
（２）  内部側壁は、小角反射及び集められた光信号の位置に敏感な対応のばらつきの影響を最小限に抑えるために集光系の軸線に対して傾けられている。内部側壁角度の大きさは、集光光学系の開口数で決まり、開口数が０．５のシステムでは２０°よりも大きく、開口数が０．１のシステムでは５°よりも大きい。
【００５８】
これら設計原理を取り入れた２、３の変形実施形態が、図９に示されている。かかる実施形態は、台形の外壁及び内壁を有する設計例（９００）、長方形の外壁及び三角形の内壁を有する設計例（９０２）及び三角形の外壁及び内壁を有する設計例（９０４）を含む。これら変形例に限られる訳ではなく、これら変形例は、本発明を具体化した毛管設計の代表例であると考えられるべきである。
【００５９】
本発明の別の実施形態は、集光軸線に平行な方向における壁寸法が励起ビームと外壁の相互作用を最小限に抑えるのに必要な大きさにすることにより集光光学系に入る屈折励起光の量を最小限に抑える。例えば、１／ｅパワーポイント（power point ）でビーム直径が０．７ｍｍの照明用レーザでは、背景光レベルを大角集光軸線に平行な方向における毛管外壁の寸法が０．７ｍｍよりも大きい毛管設計によって最小限に抑えることができる。有利には、内部ボアの面積を詰まりにより課される限度まで減少させることにより、検出器に達する背景光の量を一段と減少させることができる。
【００６０】
本発明の特徴を具体化した毛管は、超高集積化技術により大量生産できる。かかる技術は、例えば、オランダ国５６００ＡＡアイントホーベン・ピー・オー・ボックス３３所在のアンテリオン・ビー・ブイ（Anteryon BV）により商業的に実施されている。例えば図６の毛管６００を製作するため、アンテリオン社の高精度粉末ブラスチング技術を利用して第１のガラスプレートに多数の台形ボアを作る。台形の形を第１のプレートに形成した後、第１のプレートを第２のガラスプレートに結合することにより中空の台形コアを形成する。結合状態のプレートの厚さは、ｙ方向におけるコアの位置及び厚さが図６のものとマッチするよう選択される。ｘ方向における適当な寸法は、結合状態のプレートを鋸引きすることによって得られる。これらの技術を用いて多数の毛管を１回のプロセスで製作し、それにより、個々の毛管の費用を最小限に抑える。この毛管製造方法により、多種多様なコアの幾何学的形状の製作が可能であり、かかる毛管製造方法を改造すると、両方のプレートのブラスチングを必要とする構造体を形成することができる。
【００６１】
本発明の原理を利用できる多くの実施形態を想到できることに鑑みて、図面を参照して本明細書において説明した実施形態は、例示に過ぎず、フローサイトメトリ又は光学式製作技術の当業者であれば、本発明を図６及び図９に示す毛管設計以外の毛管設計を利用して実施できることは理解されよう。かかる毛管設計は、大角集光信号に対する外壁屈折及び内壁反射の影響を同時に減少させるが、外壁及び内壁に関する別の幾何学的形状を有しても良い。例えば、半球形又は菱形の外壁及び台形又は三角形の内壁を有する毛管は、本発明の特徴を明確に具体化する。したがって、本明細書において説明した本発明は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲及びその均等範囲に属する限り、かかる実施形態を全て想定している。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】先行技術の従来のシース−フローサイトメータシステムの略図である。
【図２Ａ】典型的なシース−フローサイトメータのノズル及び励起容積部の断面図である。
【図２Ｂ】典型的なキャピラリ−フローサイトメータの流管及び励起容積部の断面図である。
【図３】従来型の正方形毛管の断面図である。
【図４】例示の大角発光用光学式集光系の略図である。
【図５Ａ】正方形毛管内の或る位置における粒子からの光収集の略図である。
【図５Ｂ】正方形毛管内の別の位置における粒子からの光収集の略図である。
【図５Ｃ】正方形毛管内の更に別の位置における粒子からの光収集の略図である。
【図５Ｄ】正方形毛管内の更に別の位置における粒子からの光収集の略図である。
【図５Ｅ】正方形毛管内の更に別の位置における粒子からの光収集の略図である。
【図５Ｆ】正方形毛管内の更に別の位置における粒子からの光収集の略図である。
【図５Ｇ】正方形毛管内の更に別の位置における粒子からの光収集の略図である。
【図６】点対称が無い本発明の例示の毛管の断面図である。
【図７Ａ】図６の例示の毛管内の或る位置における粒子からの光収集の略図である。
【図７Ｂ】図６の例示の毛管内の別の位置における粒子からの光収集の略図である。
【図７Ｃ】図６の例示の毛管内の更に別の位置における粒子からの光収集の略図である。
【図７Ｄ】図６の例示の毛管内の更に別の位置における粒子からの光収集の略図である。
【図７Ｅ】図６の例示の毛管内の更に別の位置における粒子からの光収集の略図である。
【図７Ｆ】図６の例示の毛管内の更に別の位置における粒子からの光収集の略図である。
【図７Ｇ】図６の例示の毛管内の更に別の位置における粒子からの光収集の略図である。
【図８】３つの互いに異なる毛管を用いた場合におけるキャピラリ−フローサイトメータで捕捉された光の百分率を比較する表、
【図９】点対称の無い本発明の３つの例示の毛管の断面図である。
【図１】
2009533687.tif 000003
【図２Ａ】
2009533687.tif 000004
【図２Ｂ】
2009533687.tif 000005
【図３】
2009533687.tif 000006
【図４】
2009533687.tif 000007
【図５Ａ】
2009533687.tif 000008
【図５Ｂ】
2009533687.tif 000009
【図５Ｃ】
2009533687.tif 000010
【図５Ｄ】
2009533687.tif 000011
【図５Ｅ】
2009533687.tif 000012
【図５Ｆ】
2009533687.tif 000013
【図５Ｇ】
2009533687.tif 000014
【図６】
2009533687.tif 000015
【図７Ａ】
2009533687.tif 000016
【図７Ｂ】
2009533687.tif 000017
【図７Ｃ】
2009533687.tif 000018
【図７Ｄ】
2009533687.tif 000019
【図７Ｅ】
2009533687.tif 000020
【図７Ｆ】
2009533687.tif 000021
【図７Ｇ】
2009533687.tif 000022
【図８】
2009533687.tif 000023
【図９】
2009533687.tif 000024
【国際調査報告】
2009533687.tif 000025