(57)【要約】ＥＧＦＲタンパク質ファミリーのメンバーの過剰発現が関係している様々な形態のガンを処置するために有利に使用することができる、二重特異的単鎖抗体分子が開示される。本発明は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのタンパク質を過剰発現する様々なガンの検出および／または処置において有利に使用することができる、二重特異的（または多特異的）抗体分子（例えば、ｂｓ  ｓｃＦｖ）の同定に関する。したがって、１つの実施形態においては、本発明により、互いに（直接またはリンカーを介して）結合させられた第１の抗体と第２の抗体が含まれている二重特異的抗体が提供される。
2009500005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに結合させられた第１の抗体と第２の抗体が含まれている二重特異的抗体であって、ここで、該第１の抗体と該第２の抗体とは異なるエピトープに対して特異的に結合し、該第１の抗体は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４からなる群より選択される上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つのメンバーの上にある少なくとも１つのエピトープに対する結合特異性を有しており、そして該第２の抗体は、該第１のエピトープとは異なる、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４からなる群より選択されるタンパク質の上にあるエピトープである、上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つのメンバーの上にある第２のエピトープに対する結合特異性を有しており、該抗体は、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号３７からなる群より選択される核酸配列を含むベクターによってコードされる、二重特異的抗体。
【請求項２】
前記抗体が、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号３７からなる群より別々に選択される２つの核酸配列を含むベクターによってコードされる、請求項１に記載の二重特異的抗体。
【請求項３】
前記抗体が、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、および配列番号５７からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターによってコードされる、請求項１に記載の二重特異的抗体。
【請求項４】
前記抗体が、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、および配列番号５７からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列からなる群より別々に選択される２つの核酸配列を含むベクターによってコードされる、請求項１に記載の二重特異的抗体。
【請求項５】
前記ベクターはさらに、配列番号３７のポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項２に記載の二重特異的抗体。
【請求項６】
請求項１に記載の二重特異的抗体と薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項７】
ガンを処置するための方法であって、治療有効量の請求項６に記載の組成物をそれが必要な患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項８】
前記ガンが、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、および唾液腺ガンからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ガンを処置するための方法であって、治療有効量の請求項６に記載の組成物を、化学療法薬、外部線照射、標的化させられた放射性同位元素、およびシグナル伝達阻害因子からなる群より選択される他の細胞毒性薬と組み合わせて、それが必要な患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項１０】
エフェクターに結合させられた請求項１に記載の二重特異的抗体を含む、キメラ部分。
【請求項１１】
前記エフェクターが、細胞毒素、標識、放射性核種、薬物、リポソーム、リガンド、および抗体からなる群より選択される、請求項１０に記載のキメラ部分。
【請求項１２】
前記キメラ部分が融合タンパク質である、請求項１０に記載のキメラ部分。
【請求項１３】
ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４からなる群より選択される上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーに由来する受容体を保有している細胞に対してエフェクター分子を特異的に送達する方法であって：
請求項１に記載の抗体に結合させられた該エフェクター分子を含むキメラ部分を提供する工程；ならびに、
該細胞を該キメラ部分と接触させて、それによって該キメラ部分を該細胞に対して特異的に結合させる工程
を含む、方法。
【請求項１４】
前記エフェクター分子が、細胞毒素、標識、放射性核種、薬物、リポソーム、リガンド、および抗体からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記キメラ部分が融合タンパク質である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞がガン細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、および唾液腺ガンからなる群より選択されるガン細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４からなる群より選択される上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーに由来する受容体を保有している細胞を特異的に死滅させる方法であって：
細胞毒素、放射性部分、および細胞毒素もしくは細胞増殖抑制因子を含むリポソームからなる群より選択されるエフェクターに結合させられた、請求項１に記載の抗体を含むキメラ部分を提供する工程；ならびに、
該細胞を該キメラ部分と接触させて、それによって該キメラ部分を該細胞に対して特異的に結合させて、該細胞の死滅を生じさせる工程
を含む、方法。
【請求項１９】
前記キメラ部分が融合タンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞がガン細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、および唾液腺ガンからなる群より選択されるガン細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つ以上のメンバーを発現している細胞または組織を検出する方法であって：
細胞または組織を、検出可能な標識に結合させられた請求項１に記載の二重特異的抗体を含むキメラ部分と接触させる工程；ならびに、
該標識を検出する工程であって、ここで、該細胞または組織と会合した該標識の検出が、上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つ以上のメンバーを発現している細胞または組織の存在を示す、工程
が含まれる、方法。
【請求項２３】
前記検出可能な標識が、γ放射体、陽電子放射体、ＭＲＩ標識、および蛍光標識からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記検出可能な標識がγ放射体であり、該検出はγ線カメラでの画像化を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記検出可能な標識が陽電子放射体であり、該検出は、陽電子放出型断層撮影法（ＰＥＴ）による画像化を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記検出可能な標識がＭＲＩ標識であり、該検出は核磁気共鳴撮影法による検出を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つ以上のメンバーを発現している細胞または組織が、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４からなる群より選択されるタンパク質を過剰発現する細胞または組織である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つ以上のメンバーを発現している細胞または組織が、ガン細胞または組織である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つ以上のメンバーを発現している細胞または組織が、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、または唾液腺ガンからなる群より選択されるガン細胞あるいは組織である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記検出は非侵襲的画像化技術を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記検出は免疫組織化学を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記検出は、組織試料または生検における検出を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記検出は、組織切片の中での検出を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
前記検出は、ヒトの中での前記細胞または組織の検出を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３５】
前記検出は、ヒトから採取された生物学的試料中の前記細胞または組織の検出を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３６】
２つの異なるエピトープに対して特異的に結合し、タンパク質切断部位が含まれていないリンカー分子を介して作動可能に連結させられた第１のアームと第２のアームとを有している二重特異的単鎖Ｆｖ抗体であって、該アームの一方は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４からなる群より選択される上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つのメンバーの上にある少なくとも１つのエピトープに対する結合特異性を有しており、そして他方のアームは、第１のエピトープとは異なる、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４からなる群より選択される上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つのメンバーの上にある第２のエピトープに対する結合特異性を有している、二重特異的単鎖Ｆｖ抗体。
【請求項３７】
前記第１のアームと前記第２のアームとが、Ｃ６．５、Ｃ６ＭＬ３−９、Ｃ６ＭＨ３−Ｂ１、Ｃ６−Ｂ１Ｄ２、Ｆ５、ＨＥＲ３．Ａ５、ＨＥＲ３．Ｆ４、ＨＥＲ３．Ｈ１、ＨＥＲ３．Ｈ３、ＨＥＲ３．Ｅ１２、ＨＥＲ３．Ｂ１２、ＥＧＦＲ．Ｅ１２、ＥＧＦＲ．Ｃ１０、ＥＧＦＲ．Ｂ１１、ＥＧＦＲ．Ｅ８、ＨＥＲ４．Ｂ４、ＨＥＲ４．Ｇ４、ＨＥＲ４．Ｆ４、ＨＥＲ４．Ａ８、ＨＥＲ４．Ｂ６、ＨＥＲ４．Ｄ４、ＨＥＲ４．Ｄ７、ＨＥＲ４．Ｄ１１、ＨＥＲ４．Ｄ１２、ＨＥＲ４．Ｅ３、ＨＥＲ４．Ｅ７、ＨＥＲ４．Ｆ８、およびＨＥＲ４．Ｃ７からなる群より選択される、請求項３６に記載の二重特異的単鎖Ｆｖ抗体
【請求項３８】
組み換えによって生産された、請求項３６に記載の二重特異的単鎖Ｆｖ抗体。
【請求項３９】
二重特異的単鎖Ｆｖ抗体の第１のアームと第２のアームとを作動可能に連結させるために適しているリンカー分子であって、該リンカーは、約３個から約３０個のアミノ酸の長さの範囲のアミノ酸配列から構成されており、タンパク質切断部位を含まない、リンカー分子。
【請求項４０】
二重特異的単鎖Ｆｖ抗体の第１のアームと第２のアームとを作動可能に連結させるために適しているリンカー分子であって、配列番号１１のアミノ酸配列を有している、リンカー分子。
【請求項４１】
２つの異なるエピトープに対して特異的に結合し、そして請求項４０または４１のいずれか１項に記載のリンカー分子によって作動可能に連結させられた第１のアームと第２のアームとを有している二重特異的単鎖Ｆｖ抗体であって、該第１のアームと該第２のアームとは、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４からなる群より選択される上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つのメンバーの上にある２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有している、二重特異的単鎖Ｆｖ抗体。
【請求項４２】
前記第１のアームと前記第２のアームとが、Ｃ６．５、Ｃ６ＭＬ３−９、Ｃ６ＭＨ３−Ｂ１、Ｃ６−Ｂ１Ｄ２、Ｆ５、ＨＥＲ３．Ａ５、ＨＥＲ３．Ｆ４、ＨＥＲ３．Ｈ１、ＨＥＲ３．Ｈ３、ＨＥＲ３．Ｅ１２、ＨＥＲ３．Ｂ１２、ＥＧＦＲ．Ｅ１２、ＥＧＦＲ．Ｃ１０、ＥＧＦＲ．Ｂ１１、ＥＧＦＲ．Ｅ８、ＨＥＲ４．Ｂ４、ＨＥＲ４．Ｇ４、ＨＥＲ４．Ｆ４、ＨＥＲ４．Ａ８、ＨＥＲ４．Ｂ６、ＨＥＲ４．Ｄ４、ＨＥＲ４．Ｄ７、ＨＥＲ４．Ｄ１１、ＨＥＲ４．Ｄ１２、ＨＥＲ４．Ｅ３、ＨＥＲ４．Ｅ７、ＨＥＲ４．Ｆ８、およびＨＥＲ４．Ｃ７からなる群より選択される、請求項４１に記載の二重特異的単鎖Ｆｖ抗体。
【請求項４３】
組み換えによって生産された、請求項４１に記載の二重特異的単鎖Ｆｖ抗体。
【請求項４４】
前記第１のアームと前記第２のアームとが腫瘍細胞の上に発現させられた異なるエピトープに対して特異的に結合し、そして該二重特異的単鎖Ｆｖ抗体の該エピトープに対する結合によって、該腫瘍細胞の生存の減少が生じる、請求項４１に記載の二重特異的単鎖Ｆｖ抗体。
【請求項４５】
前記第１のアームと前記第２のアームが、Ｃ６．５、Ｃ６ＭＬ３−９、Ｃ６ＭＨ３−Ｂ１、Ｃ６−Ｂ１Ｄ２、Ｆ５、ＨＥＲ３．Ａ５、ＨＥＲ３．Ｆ４、ＨＥＲ３．Ｈ１、ＨＥＲ３．Ｈ３、ＨＥＲ３．Ｅ１２、ＨＥＲ３．Ｂ１２、ＥＧＦＲ．Ｅ１２、ＥＧＦＲ．Ｃ１０、ＥＧＦＲ．Ｂ１１、ＥＧＦＲ．Ｅ８、ＨＥＲ４．Ｂ４、ＨＥＲ４．Ｇ４、ＨＥＲ４．Ｆ４、ＨＥＲ４．Ａ８、ＨＥＲ４．Ｂ６、ＨＥＲ４．Ｄ４、ＨＥＲ４．Ｄ７、ＨＥＲ４．Ｄ１１、ＨＥＲ４．Ｄ１２、ＨＥＲ４．Ｅ３、ＨＥＲ４．Ｅ７、ＨＥＲ４．Ｆ８、およびＨＥＲ４．Ｃ７からなる群より選択される、請求項４４に記載の二重特異的単鎖Ｆｖ抗体。
【請求項４６】
請求項８に記載の二重特異的単鎖Ｆｖ抗体と薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項４７】
ガンを処置するための方法であって、治療有効量の請求項４６に記載の組成物をそれが必要な被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項４８】
前記ガンが、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、および唾液腺ガンからなる群より選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ガンを処置するための方法であって、治療有効量の請求項１０に記載の組成物を、化学療法薬、外部線照射、標的化させられた放射性同位元素、およびシグナル伝達阻害因子からなる群より選択される他の細胞毒性薬と組み合わせて、それが必要な患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項５０】
請求項３６に記載の二重特異的単鎖Ｆｖ抗体をコードする核酸配列を含む、ベクター。
【請求項５１】
プラスミド、コスミド、ファージ、およびウイルスからなる群より選択される、請求項５０に記載のベクター。
【請求項５２】
前記ベクターが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１４からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項５０に記載のベクター。
【請求項５３】
前記ベクターが、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号３７からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項５０に記載のベクター。
【請求項５４】
請求項５０に記載のベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項５５】
腫瘍細胞である、請求項５２に記載の宿主細胞。
【請求項５６】
ＨＥＲ３に対する結合特異性を有している第１のアームと、ＨＥＲ２／ｎｅｕに対する結合特異性を有している第２のアームを含む、二重特異的単鎖Ｆｖ抗体ＡＬＭ。
【請求項５７】
ＨＥＲ３の上にある２つの異なるエピトープに対する結合親和性を有している第１のアームと第２のアームとを含む、二重特異的単鎖Ｆｖ抗体ＡＬＦ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００５年６月１５日に出願されたＵＳＳＮ１１／１５４，１０３号に対する優先権および利益を主張する。ＵＳＳＮ１１／１５４，１０３号は、全ての目的のために、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
政府に支援された研究および開発の下でなされた発明に対する権利に関する声明
本研究は、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ａｒｍｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｃｏｍｍａｎｄ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｇｒａｎｔ  ＮＯ：ＤＡＭＤ１７−０１−１−０５２０、およびＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｐｉｌｏｔ  Ｇｒａｎｔ  ＮＯ：ＮＣＩ  ＣＡ０６９２７による補助金によって、部分的に支援された。米国合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、免疫学および腫瘍学の分野に関し、そしてさらに具体的には、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのタンパク質を過剰発現する様々なガンの検出および／または処置において有利に使用することができる、二重特異的抗体分子（例えば、ｂｓ  ｓｃＦｖ）に関する。本発明の特定の例示的な二重特異的ｓｃＦｖ抗体分子は、ＥＧＦＲファミリーの１つのメンバーの２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有しているか、または、ＥＧＦＲファミリーの２つの異なるメンバーに対して結合特異性を有しているかのいずれかである。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達経路は、体の至るところでのガンの発症および拡散において重要な役割を担っている。ＥＧＦＲは、ｅｒｂ−ｂ１としても知られており、４つの遺伝子からなる１つのファミリー（これには、ＨＥＲ２／ｎｅｕ２（ｅｒｂ−ｂ２）、ＨＥＲ３（ｅｒｂ−ｂ３）、およびＨＥＲ４（ｅｒｂ−ｂ４）もまた含まれる）のメンバーである。ＥＧＦＲは、広い範囲の固形腫瘍（結腸ガン、頭頸部ガン、膵臓ガン、卵巣ガン、および乳ガンが含まれる）において発現される。
【０００５】
ＨＥＲ２／ｎｅｕは、チロシンキナーゼ活性を有している細胞表面受容体タンパク質である。完全なタンパク質は、３つの部分から構成される：細胞内細胞質ドメイン、短い疎水性膜貫通セグメント、およびリガンド結合を担っている細胞外ドメイン（ＥＣＤ）。この受容体タンパク質は、様々な上皮細胞のタイプの細胞膜上で発現されており、そして特異的な成長因子の結合を通じて、細胞増殖・分裂の様々な態様を調節する。
【０００６】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕは、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードする遺伝子であり、プロト−オンコジーンとして知られている遺伝子のグループのメンバーである。プロト−オンコジーンは、正常な細胞の増殖および分化に関係している重要なタンパク質（例えば、成長因子、成長因子受容体、およびアポトーシスタンパク質）をコードする。プロト−オンコジーンが点変異、移動、または遺伝子増幅によって変化すると、これらによって、異常な細胞の形質転換、およびガンの発症を導く可能性がある増殖シグナルが生じる。
【０００７】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕは、多くの正常な細胞の中では低レベルで発現され得るが、様々なガン細胞の中では、通常、過剰発現されている。Ｈｅｒ２／ｎｅｕの過剰発現は、ほとんどの場合は、遺伝子のコピー数の増加（遺伝子増幅）によって、および／または細胞中でのＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子の発現レベルの増大によって引き起こされる。この成長因子受容体の過剰発現は、細胞増殖および発ガン性形質転換の率を高めることによって、腫瘍の進行において鍵となる役割を担っている。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子の遺伝子増幅は、様々なタイプのガン（乳ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、および唾液腺ガンが含まれる）において観察されている（非特許文献１）。乳ガン患者においては、ＨＥＲ２／ｎｅｕは、乳ガン患者においては、これが予後不良、腫瘍の再発、および生存期間の短縮に関係しているので、臨床的に重要であることも示されている。（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。
【０００８】
現在は、ガンの処置のための新しい免疫療法のストラテジーの開発に多くの注目が集まっている。１つのこのようなストラテジーは、抗体をベースとするガン治療法である。抗体をベースとするガン治療法の主要な目的は、毒性のあるペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）（例えば、放射性同位元素、毒素、または薬物）を腫瘍に対して特異的に送達することである。抗体結合部位をベースとする分子の大きさの範囲としては、以下が挙げられる：ＩｇＭ（１０００ｋＤａ）、ＩｇＧ（１５０ｋＤａ）、Ｆ（ａｂ＝）２（１００ｋＤａ）、Ｆａｂ（５０ｋＤａ）、（ｓｃＦｖ＝）２（５５ｋＤａ）、およびｓｃＦｖ（２５ｋＤａ）。免疫不全マウスにおいては、より大きな分子（例えば、ＩｇＧおよびＦ（ａｂ＝）２断片）は、ヒト腫瘍異種移植片の中で高レベルで保持され、低い特異性を有しているが（非特許文献５；非特許文献６）、一方、より小さい分子（例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ＝）２およびＦａｂ）は、比較的低いレベルで腫瘍の中で保持され、大幅に改善された特異性を有している（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。
【０００９】
上記の標的化特性についての最も優勢な決定要因は、初回通過クリアランス（ｆｉｒｓｔ  ｐａｓｓ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ）のについての腎閾値と比較した、抗体をベースとする分子の大きさである。抗体をベースとする分子の別の重要な特徴は価数であり、なぜなら、明らかに大きい腫瘍での保持は、標的抗原に対する多価結合と関係しているからである（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献１０；非特許文献１１）。
【００１０】
ハーセプチン７は、乳ガンを標的化する免疫療法の新しい形態であり、これは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを過剰発現するガン細胞を標的化するために最近開発された。この処置方法は、ＨＥＲ２／ｎｅｕポジティブである転移性乳ガンの患者に有効な処置方法を提供することが、臨床試験において示されている。しかし、この薬物処置方法はコストがかかり、そして、これには有意な発病率および死亡率が伴う。
【００１１】
いくつかの他のタイプの治療方法が、その腫瘍が高レベルでＨｅｒ２／ｎｅｕを発現する乳ガン患者においてより有効である、またはあまり有効ではないことが示されている。これらには、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの発現が増幅されている患者においてより有効であると考えられるアントラサイクリン療法、およびそのＨｅｒ２／ｎｅｕ発現のレベルが高い患者においてはあまり有効ではないホルモン療法が含まれる。
【００１２】
初回通過クリアランスについての腎閾値の範囲内にある分子量を有している、２価の単鎖Ｆｖをベースとする抗体分子の作成にもまた注目が集まっている。これらには、５０ｋＤａのダイアボディ（非特許文献１２），５５ｋＤａの（ｓｃＦｖ＝）２（非特許文献７）、６０〜６５ｋＤａの両親媒性ヘリックスをベースとするｓｃＦｖ二量体（非特許文献１３；非特許文献１４）、ならびに、８０ｋＤａ（ｓｃＦｖ−ＣＨ３）２ＬＤミニボディおよびＦｌｅｘミニボディ（非特許文献１５）が含まれる。これらのタンパク質はそれぞれ２つの抗原分子に結合することができるが、これらは、それらの結合部位の方向、柔軟性、および幅が異なる。これらの新しい、そして刷新的な免疫療法は、全体的に手順の多い治療法であるにもかかわらず、さらに頻繁に再発または進行する乳ガンおよび他のガンにおける治療結果の向上を助けるであろうと考えられる。
【非特許文献１】Ｈｙｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．，１１９８：１６５−１８４
【非特許文献２】Ｓｅｓｈａｄｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１１：１９３６−１９４２
【非特許文献３】Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４８：１２３８−１２４３
【非特許文献４】Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６３：４４４−４４６
【非特許文献５】Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，５：８１−９５
【非特許文献６】Ｍｉｌｅｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：６３６３−６３７１
【非特許文献７】Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：４０２６−４０３４
【非特許文献８】Ｂｅａｕｍｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２６：１１７２−１１７９
【非特許文献９】Ｃｏｌｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８２：１１９１−１１９７
【非特許文献１０】Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３７：４７２
【非特許文献１１】Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２５６０−２５６５
【非特許文献１２】Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８
【非特許文献１３】Ｐａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１−１２７７
【非特許文献１４】Ｐａｃｋ（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：１５７９−１５８４
【非特許文献１５】Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３０５５−３０６１
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのタンパク質を過剰発現する様々なガンの検出および／または処置において有利に使用することができる、二重特異的（または多特異的）抗体分子（例えば、ｂｓ  ｓｃＦｖ）の同定に関する。したがって、１つの実施形態においては、本発明により、互いに（直接またはリンカーを介して）結合させられた第１の抗体と第２の抗体が含まれている二重特異的抗体が提供される。この場合、第１の抗体と第２の抗体は異なるエピトープに特異的に結合し、そして第１の抗体は、上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つのメンバー（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４）の上にある少なくとも１つのエピトープに対して結合特異性を有しており（特異的に結合し）、そして、第２の抗体は、第１のエピトープとは異なる上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つのメンバーの上にある第２のエピトープ（これは、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４からなる群より選択されるタンパク質の上にあるエピトープである）に対する結合特異性を有している（
特異的に結合する）。特定の実施形態においては、抗体はリンカー、より好ましくは、ペプチドリンカーによって、そして最も好ましくは、タンパク質分解的切断部位が含まれていないペプチドリンカー（例えば、配列番号３７のアミノ酸配列有しているリンカー）によって結合させられている。特定の実施形態においては、第１の抗体および／または第２の抗体は、以下からなる群より選択される抗体によって特異的に結合させられたエピトープに特異的に結合する：Ｃ６．５、Ｃ６ＭＬ３−９、Ｃ６ＭＨ３−Ｂ１、Ｃ６−Ｂ１Ｄ２、Ｆ５、ＨＥＲ３．Ａ５、ＨＥＲ３．Ｆ４、ＨＥＲ３．Ｈ１、ＨＥＲ３．Ｈ３、ＨＥＲ３．Ｅ１２、ＨＥＲ３．Ｂ１２、ＥＧＦＲ．Ｅ１２、ＥＧＦＲ．Ｃ１０、ＥＧＦＲ．Ｂ１１、ＥＧＦＲ．Ｅ８、ＨＥＲ４．Ｂ４、ＨＥＲ４．Ｇ４、ＨＥＲ４．Ｆ４、ＨＥＲ４．Ａ８、ＨＥＲ４．Ｂ６、ＨＥＲ４．Ｄ４、ＨＥＲ４．Ｄ７、ＨＥＲ４．Ｄ１１、ＨＥＲ４．Ｄ１２、ＨＥＲ４．Ｅ３、ＨＥＲ４．Ｅ７、ＨＥＲ４．Ｆ８、およびＨＥＲ４．Ｃ７。特定の実施形態においては、第１の抗体および／または第２の抗体には、以下からなる群より選択される抗体の１つ、２つまたは全ての相補性決定領域（単数または複数）が含まれる：Ｃ６．５、Ｃ６ＭＬ３−９、Ｃ６ＭＨ３−Ｂ１、Ｃ６−Ｂ１Ｄ２、Ｆ５、ＨＥＲ３．Ａ５、ＨＥＲ３．Ｆ４、ＨＥＲ３．Ｈ１、ＨＥＲ３．Ｈ３、ＨＥＲ３．Ｅ１２、ＨＥＲ３．Ｂ１２、ＥＧＦＲ．Ｅ１２、ＥＧＦＲ．Ｃ１０、ＥＧＦＲ．Ｂ１１、ＥＧＦＲ．Ｅ８、ＨＥＲ４．Ｂ４、ＨＥＲ４．Ｇ４、ＨＥＲ４．Ｆ４、ＨＥＲ４．Ａ８、ＨＥＲ４．Ｂ６、ＨＥＲ４．Ｄ４、ＨＥＲ４．Ｄ７、ＨＥＲ４．Ｄ１１、ＨＥＲ４．Ｄ１２、ＨＥＲ４．Ｅ３、ＨＥＲ４．Ｅ７、ＨＥＲ４．Ｆ８、およびＨＥＲ４．Ｃ７。特定の実施形態においては、二重特異的抗体または多特異的抗体は、以下からなる群より選択されるポリペプチド配列をコードする核酸配列が含まれているベクターによってコードされる：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１４、配列番号２０、および配列番号２２。特定の実施形態においては、二重特異的抗体または多特異的抗体は、例えば、以下からなる群より別々に選択される、本明細書中に記載される２つの核酸配列によってコードされるポリペプチドをコードする２つの核酸配列が含まれているベクターによってコードされる：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号２０、および配列番号２２。特定の例においては、二重特異的抗体は、例えば、以下からなる群より別々に選択される本明細書中に記載される、特定の場合には少なくとも１つ、そして特定の場合には少なくとも２つの核酸配列が含まれているベクターによってコードされる：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１４、配列番号２０、および配列番号２２。特定の場合には、ベクターにはさらに、配列番号３７の配列を有しているポリペプチドをコードする核酸配列が含まれる。
【００１４】
特定の実施形態においては、第１の抗体および／または第２の抗体（例えば、上記の抗体）は単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ抗体）である。第１の抗体と第２の抗体のいずれもが単鎖抗体である場合には、抗体は、好ましくは、直接結合させられる（１つのポリペプチドを形成するように）か、あるいは、リンカーを介して、より好ましくは、ペプチドリンカー（タンパク質分解的切断部位が含まれていないペプチドリンカー）を介して結合させられて、単鎖二重特異的または多特異的抗体（例えば、ｂｓ−ｓｃＦｖ）が形成される。二重特異的抗体（または多特異的抗体）が単鎖抗体である場合は、上記第２の抗体は単鎖抗体であり、そして上記第１の抗体はペプチドリンカーによって上記第２の抗体に結合させられる。
【００１５】
別の実施形態においては、本発明には、本明細書中に開示され、そして／または請求されるような二重特異的抗体または多特異的抗体と、薬学的に許容される担体が含まれている組成物が含まれる。
【００１６】
本発明によってはまた、ガンを処置する（例えば、ガンの１つ以上の兆候を緩和する）ための方法も提供される。この方法には、通常、その必要がある患者（ヒトまたはヒト以外の動物）に、治療有効量の本明細書中に開示されそして／または請求されるような二重特異的抗体または多特異的抗体と、薬学的に許容される担体を投与する工程が含まれる。ガンとしては、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、および唾液腺ガンからなる群より選択されるガンを挙げることができるが、これらに限定はされない。投与は、任意の様々な従来法によって行うことができ、これには、全身的な注射が可能な投与、腫瘍もしくはガン性の組織への注射、経口投与などが含まれる。
【００１７】
なお別の実施形態においては、本発明により、ガンを処置する（例えば、ガンの１つ以上の兆候を緩和する）ための方法が提供される。この方法には、通常、その必要がある患者（ヒトまたはヒト以外の動物）に、治療有効量の本明細書中に開示されそして／または請求されるような二重特異的抗体または多特異的抗体と、薬学的に許容される担体を、化学療法薬、外部線照射、標的化させられた放射性同位元素、およびシグナル伝達阻害因子からなる群より選択される他の細胞毒性薬と組み合わせて投与する工程が含まれる。ガンとしては、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、および唾液腺ガンからなる群より選択されるガンを挙げることができるが、これらに限定はされない。投与は、任意の様々な従来法によって行うことができ、これには、全身的な注射が可能な投与、腫瘍もしくはガン性の組織への注射、経口投与などが含まれる。
【００１８】
なお別の実施形態においては、本発明により、エフェクターに結合させられた、本明細書中に開示されそして／または請求されるような二重特異的抗体または多特異的抗体が含まれているキメラ部分が提供される。好ましいエフェクターとしては、細胞毒素、標識、放射性核種、薬物、リポソーム、リガンド、および抗体が挙げられるが、これらに限定はされない。特定の場合には、エフェクターはポリペプチドであり、キメラ部分は融合タンパク質、好ましくは、組み換えによって発現させられた融合タンパク質である。
【００１９】
本発明によってはまた、上皮成長因子受容体タンパク質ファミリー（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４）に由来する受容体を保有している細胞に対して、エフェクター分子を特異的に送達するか、または標的化させる方法も提供される。この方法には、本明細書中に記載されそして／または請求されるようなキメラ部分を提供する工程、および細胞をキメラ部分と接触させる工程が含まれる。これによって、キメラ部分は細胞に特異的に結合する。好ましいエフェクターとしては、細胞毒素、標識、放射性核種、薬物、リポソーム、リガンド、抗体などが挙げられるが、これらに限定はされない。特定の実施形態においては、キメラ部分は融合タンパク質である。特定の実施形態においては、細胞はガン細胞であり、好ましくは、ＥＧＦＲタンパク質ファミリーの１つ以上のメンバーを過剰発現するガン細胞である。特に好ましいガン細胞としては、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、および唾液腺ガン細胞が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００２０】
上皮成長因子受容体タンパク質ファミリー（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４）に由来する受容体を保有している細胞を特異的に死滅させる、および／またはそのような細胞の成長もしくは増殖を特異的に阻害する方法もまた提供される。この方法には、通常、細胞傷害性もしくは細胞増殖抑制性のエフェクター（例えば、細胞毒素、放射性部分、および細胞毒素もしくは細胞増殖抑制因子が含まれているリポソームなど）に結合させられた、本明細書中に記載されそして／または請求されるようなキメラ部分を提供する工程；ならびに、上記細胞をキメラ部分と接触させる工程が含まれる。これによって、キメラ部分は細胞に特異的に結合して、細胞死、ならびに／あるいは、細胞の成長および／または増殖の阻害を生じる。特定の実施形態においては、キメラ部分融合タンパク質である。特定の実施形態においては、細胞はガン細胞であり、好ましくは、ＥＧＦＲタンパク質ファミリーの１つ以上のメンバーを過剰発現するガン細胞である。特に好ましいガン細胞としては、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、および唾液腺ガン細胞が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００２１】
本発明によってはまた、ガン細胞または組織の存在を検出する、および／または視覚化する、および／または診断する方法も提供される。この方法には、通常、細胞または組織を、検出可能な標識に結合させられた本明細書中に記載されるような二重特異的抗体または多特異的抗体が含まれているキメラ部分と接触させる工程；ならびに、標識を検出する工程が含まれる。ここでは、細胞または組織と会合した標識の検出が、上皮成長因子受容体ファミリータンパク質の１つ以上のメンバーを発現する（または過剰発現する）細胞または組織の存在を示す。好ましい検出可能な標識としては、γ放射体、陽電子放射体、ＭＲＩ標識、および蛍光標識または比色分析用標識が挙げられるが、これらに限定はされない。特定の例においては、検出可能な標識はγ放射体であり、検出には、γ線カメラでの画像化が含まれる。特定の場合には、検出可能な標識は陽電子放射体であり、検出には、陽電子放出型断層撮影法（ＰＥＴ）による画像化が含まれる。特定の場合には、検出可能な標識はＭＲＩ標識であり、検出には核磁気共鳴撮影法による検出が含まれる。特定の実施形態においては、上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つ以上のメンバーを発現する細胞または組織は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４からなる群より選択されるタンパク質を過剰発現する細胞あるいは組織である。上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つ以上のメンバーを発現する細胞または組織は、ガン細胞または組織（例えば、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、または唾液腺ガン）であり得る。診断アッセイは、ガンの鑑別診断の構成要素であり得、そして／または、ＥＧＦＲタンパク質ファミリーの１つまたは複数のメンバーを過剰発現するものとしてガンのタイプを決定するために使用することができ、そして／または、アッセイは、既知のガンを視覚化するために使用することもできる。これら（および他の）場合には、アッセイには、ガン細胞の存在の手がかりは必要なく、そのような細胞または組織がおそらく存在するであろうという単なる暗示だけが必要である。特定の実施形態においては、検出には、非侵襲的画像化技術が含まれる。特定の実施形態においては、免疫組織化学が含まれる。特定の実施形態においては、検出には、組織試料または生検の中での検出が含まれる。特定の実施形態においては、検出には、組織切片の中での検出が含まれる。特定の実施形態においては、検出はインビボでの検出である。
【００２２】
本発明にしたがうと、特定の実施形態においては、ＥＧＦＲタンパク質ファミリーの複数のメンバーに対して結合親和性を有している新規の二重特異的単鎖Ｆｖ抗体分子（ｂｓ−ｓｃＦｖ）が提供される。
【００２３】
本発明の特定の好ましい実施形態においては、ｂｓ−ｓｃＦｖ抗体は、ＥＧＦＲタンパク質ファミリーの異なるメンバー（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４）の上にある２つの異なるエピトープに対して結合親和性を有しているか、あるいは、ＥＧＦＲタンパク質ファミリーの１つのメンバーの上にある２つの異なるエピトープに対して結合親和性を有しており、そして、タンパク質分解的切断部位が含まれていない新規のリンカー分子によって作動可能に連結されている、第１のアームと第２のアームを有している。このリンカーは、本発明の１つの態様を構成する。ｂｓ−ｓｃＦｖ抗体を形成するように互いに対合させられたアームは、以下を含む複数のアームの任意の１つであり得る：Ｃ６．５、Ｃ６ＭＬ３−９、Ｃ６ＭＨ３−Ｂ１、Ｃ６−Ｂ１Ｄ２、Ｆ５、ＨＥＲ３．Ａ５、ＨＥＲ３．Ｆ４、ＨＥＲ３．Ｈ１、ＨＥＲ３．Ｈ３、ＨＥＲ３．Ｅ１２、ＨＥＲ３．Ｂ１２、ＥＧＦＲ．Ｅ１２、ＥＧＦＲ．Ｃ１０、ＥＧＦＲ．Ｂ１１、ＥＧＦＲ．Ｅ８、ＨＥＲ４．Ｂ４、ＨＥＲ４．Ｇ４、ＨＥＲ４．Ｆ４、ＨＥＲ４．Ａ８、ＨＥＲ４．Ｂ６、ＨＥＲ４．Ｄ４、ＨＥＲ４．Ｄ７、ＨＥＲ４．Ｄ１１、ＨＥＲ４．Ｄ１２、ＨＥＲ４．Ｅ３、ＨＥＲ４．Ｅ７、ＨＥＲ４．Ｆ８、およびＨＥＲ４．Ｃ７。特に好ましい実施形態においては、アームは、配列番号１１のアミノ酸配列を有しているリンカー分子で互いに連結させられる。ｓｃＦｖアームとリンカー分子をコードしている核酸配列が含まれているベクターおよび形質転換体もまた提供される。
【００２４】
ＥＧＦＲタンパク質ファミリーの２つのメンバーに対して結合親和性を有している例示的なｂｓ−ｓｃＦｖ抗体はＡＬＭであり、これには、ＨＥＲ３に対して結合特異性を有している１つのアームと、ＨＥＲ２／ｎｅｕに対して結合特異性を有している第２のアームが含まれている。ＥＧＦＲタンパク質ファミリーの１つのメンバーの上にある２つのエピトープに対して結合親和性を有している例示的なｂｓ−ｓｃＦｖ抗体はＡＬＦであり、これは、ＨＥＲ３の上にあるエピトープに対する結合特異性を有している１つのアームと、ＨＥＲ３の上の別のエピトープに対して結合特異性を有している第２のアームを有している。
【００２５】
本発明の別の実施形態においては、ｂｓ−ｓｃＦｖ抗体は、腫瘍細胞によって過剰発現されるＥＧＦＲタンパク質ファミリーの複数のメンバーに対して結合親和性を有している。
【００２６】
本発明のなお別の実施形態においては、ガンを処置するための組成物および方法が提供される。ここでは、患者には、治療有効量の本発明のｂｓ−ｓｃＦｖ抗体分子が薬学的に許容される担体の中で、単独で、あるいは、他の細胞傷害性因子（例えば、化学療法薬、外部線照射、標的化させられた放射性同位元素、およびシグナル伝達阻害因子）と一緒にいずれかで投与される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
定義
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを意味するように本明細書中では同義的に使用される。これらの用語は、その中の１つ以上のアミノ酸残基が、対応する自然界に存在しているアミノ酸残基の人工的な化学的アナログであるアミノ酸のポリマーに対して、ならびに、自然界に存在しているアミノ酸のポリマーに対して適用される。この用語にはまた、ポリペプチドを形成するアミノ酸を連結する従来のペプチド結合に対する変異体も含まれる。好ましい「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、そのα炭素がペプチド結合によって連結させられているアミノ酸の鎖である。したがって、鎖の一方の末端（アミノ末端）にある末端アミノ酸は遊離のアミノ基を有しており、一方、鎖の他の末端（カルボキシ末端）にある末端アミノ酸は遊離のカルボキシル基を有している。本明細書中で使用される場合は、用語「アミノ末端」（Ｎ末端と省略される）は、ペプチドのアミノ末端にあるアミノ酸上の遊離のαアミノ基、または、ペプチドの内部の任意の他の位置にあるアミノ酸のαアミノ基（ペプチド結合に関与している場合には、イミノ基）を意味する。同様に、用語「カルボキシ末端」は、ペプチドのカルボキシ末端上にある遊離のカルボキシル基、またはペプチドの内部の任意の他の位置にあるアミノ酸のカルボキシル基を意味する。ペプチドにはまた、原則として、任意のポリアミノ酸も含まれ、これには、アミド結合とは対照的に、エーテルによって結合されたアミノ酸のようなペプチド模倣物が含まれるが、これに限定はされない。
【００２８】
本明細書中で使用される場合は、「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。認識されている免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域の遺伝子、さらには、無数の免疫グロブリン可変領域の遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、これらは順に、免疫グロブリンのクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥをそれぞれ定義する。
【００２９】
典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位には、四量体が含まれていることが知られている。個々の四量体は、２種類の同じポリペプチド鎖の対から構成され、それぞれの対に、１つの「軽」（約２５ｋＤ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）が含まれている。それぞれの鎖のＮ末端は、抗原認識を主として担っている約１００個から１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を定義する。用語可変軽鎖（ＶＬ）と可変重鎖（ＶＨ）は、これらの軽鎖および重鎖をそれぞれ意味する。
【００３０】
抗体は、完全な免疫グロブリンとして存在するか、または、様々なペプチダーゼでの消化によって生じる多数の十分に特性決定された断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域の中のジスルフィド結合の下で抗体を消化して、それ自体がジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に連結させられた軽鎖であるＦａｂの二量体Ｆ（ａｂ）’２を生じる。Ｆ（ａｂ）’２は、穏やかな条件下で還元されて、ヒンジ領域の中のジスルフィド結合を切断することができ、それによって、（Ｆａｂ’）２二量体をＦａｂ’単量体に変換する。Ｆａｂ’単量体は、本質的には、ヒンジ領域の一部を有しているＦａｂである（他の抗体断片のさらに詳細な記載については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照のこと）。様々な抗体断片が、完全な抗体の消化に関して定義されているが、当業者であれば、そのようなＦａｂ’断片を、化学的に、または組み換えＤＮＡ方法論を利用してのいずれかによって、新たに合成することができることを理解するであろう。したがって、用語抗体には、本明細書中で使用される場合には、完全な抗体、完全な抗体の修飾によって生産されたか、または、組み換えＤＮＡ方法論を使用して新しく合成されたかのいずれかである抗体もまた含まれる。好ましい抗体としては、単鎖抗体（１つのポリペプチド鎖として存在する抗体）、より好ましくは、連続するポリペプチドが形成されるように可変重鎖と可変軽鎖が互いに（直接、またはペプチドリンカーを介して）連結させられた単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。単鎖Ｆｖ抗体は、直接連結させられたかまたはペプチドをコードするリンカーによって連結させられたかのいずれかの、ＶＨコード配列とＶＬコード配列が含まれている核酸から発現させることができる、共有結合させられたＶＨ−ＶＬヘテロ二量体である。Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３。ＶＨおよびＶＬは、１つのポリペプチド鎖として互いに連結されているが、ＶＨドメインとＶＬドメインは、共有結合以外によって会合する。糸状ファージの表面上で発現される第１の機能性抗体分子は単鎖Ｆｖ’（ｓｃＦｖ）であるが、別の発現ストラテジーもまた成功している。例えば、Ｆａｂ分子は、鎖の一方（重鎖または軽鎖）がｇ３キャプシドタンパク質に融合させられている場合にはファージ上にディスプレイされ得、そして相補鎖はペリプラズムに、可溶性分子として輸送される。２つの鎖は、同じレプリコン上にコードされる場合も、また、別のレプリコン上にコードされる場合もある。重要なポイントは、個々のＦａｂ分子の中の２つの抗体鎖が翻訳後にアセンブリし、そして二量体は、例えば、ｇ３ｐに対する鎖の一方の連結によってファージ粒子の中に取り込まれる（例えば、米国特許第５，７３３，７４３号を参照のこと）。抗原結合部位の構造に実質的に類似している三次元構造になるように折りたたまれる分子になるように、自然に凝集した形態へと変換するが、軽鎖ポリペプチドと重鎖ポリペプチドが抗体のＶ領域とは化学的に分かれているｓｃＦｖ抗体と多数の他の構造が、当業者に公知である（例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号、および同第４，９５６，７７８号を参照のこと）。特に好ましい抗体としては、ファージ上にディスプレイされている全ての抗体（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、およびジスルフィド結合させられたＦｖ（Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：１３２３−１３３１）が挙げられるべきであり、そしてまた、二重特異的抗体、三重特異的抗体、四重特異的抗体、および、一般的な多特異的抗体（例えば、ｂｓ  ｓｃＦｖ）も挙げられる。
【００３１】
本発明の抗体に関して、用語「免疫学的に特異的」、「特異的に結合する」は、目的のタンパク質（例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕ）の１つ以上のエピトープに結合するが、抗原性である生物学的分子の混合集団が含まれている試料中の他の分子は実質的には認識せず、それらには結合しない抗体を意味する。
【００３２】
用語「二重特異的抗体」は、本明細書中で使用される場合は、２つの抗原結合部位（第１の結合部位はエピトープ上の第１の抗原またはエピトープに対して親和性を有しており、そして第２の結合部位は、第１のものとは異なる第２の抗原またはエピトープに対して結合親和性を有している）を含む抗体を意味する。
【００３３】
用語「核酸」または「オリゴヌクレオチド」、あるいは本明細書中に文法上の同等の用語は、互いに共有結合させられた少なくとも２つのヌクレオシドを意味する。本発明の核酸は、好ましくは、一本鎖または二本鎖であり、そして通常は、ホスホジエステル結合が含まれているであろうが、場合によっては、以下に概説されるように、別の骨格を有している場合がある核酸アナログが含まれ、これには例えば、以下が含まれる：ホスホルアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９（１０）：１９２５）およびその中で引用されている参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ（１９７０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００；Ｓｐｒｉｎｚｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３４８７；Ｓａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５，Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；およびＰａｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１  ９）、ホスホロチオエート（Ｍａｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７；および米国特許第５，６４４，０４８号）ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）、ならびに、ペプチド核酸骨格および結合（Ｅｇｈｏｌｍ（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５；Ｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８；Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６；Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：２０７を参照のこと）。他のアナログ核酸としては、ポジティブな骨格を有しているもの（Ｄｅｎｐｃｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６０９７）；非イオン性の骨格を有しているもの（米国特許第号５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号、および同第４，４６９，８６３号；Ａｎｇｅｗ．（１９９１）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３０：４２３；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  １３：１５９７；第２章および第３章，ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５；Ｊｅｆｆｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  ３４：１７；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））、ならびに、非リボース骨格を有しているもの（これには、米国特許第５，２３５，０３３号、同第５，０３４，５０６号、ならびに、第６章および第７章，ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋに記載されているものが含まれる）。１つ以上の炭素環式の糖が含まれている核酸もまた、核酸の定義に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．ｐｐ１６９−１７６を参照のこと）。いくつかの核酸アナログは、Ｒａｗｌｓ，Ｃ  ＆  Ｅ  Ｎｅｗｓ，１９９７年６月２日、３５頁に記載されている。リボース−リン酸骨格のこれらの修飾は、標識のようなさらなる部分の付加を容易にするために、または、生理学的環境下でのそのような分子の安定性を高める、および半減期を長くするために行われる場合がある。
【００３４】
用語「〜に特異的にハイブリダイズする」および「特異的ハイブリダイゼーション」および「〜に選択的にハイブリダイズする」は、本明細書中で使用される場合は、ストリンジェントな条件下で特定のヌクレオチド配列に対して優先的に、核酸分子が結合すること、二重鎖を形成すること、またはハイブリダイズすることを意味する。用語「ストリンジェントな条件」は、プローブが、その標的であるサブ配列に対して優先的にハイブリダイズし、そして他の配列に対しては、弱い程度にハイブリダイズするかまたは全くハイブリダイズしない条件を意味する。核酸のハイブリダイゼーションの状況におけるストリンジェントなハイブリダイゼーションおよびストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件は配列に応じて様々であり、様々な環境的パラメーターの下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションについての広範囲にわたる指針は、例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ，第２章，Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮＹ（Ｔｉｊｓｓｅｎ）に見ることができる。一般的には、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、定義されたイオン強度およびｐＨでの特異的配列についての熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、完全に適合しているプローブに対して標的配列の５０％がハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度およびｐＨの下で）である。極めてストリンジェントな条件は、特定のプローブについてのＴｍに等しくなるように選択される。サザンブロットまたはノーザンブロットにおいてアレイ上またはフィルター上に１００個を超える相補性残基を有している相補的な核酸のハイブリダイゼーションについてのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、標準的なハイブリダイゼーション溶液を使用した場合には４２℃であり（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）１〜３巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ、および以下の詳細な議論を参照のこと）、ハイブリダイゼーションは一晩行われる。高いストリンジェンシーの洗浄条件の一例は、７２℃で約１５分間の０．１５ＭのＮａＣｌである。ストリンジェントな洗浄条件の一例は、６５℃で１５分間の、０．２×ＳＳＣでの洗浄である（例えば、ＳＳＣ緩衝液の記載については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）を参照のこと）。多くの場合には、高いストリンジェンシーの洗浄の前には、バックグラウンドのプローブシグナルを除去するための、低いストリンジェンシーでの洗浄が行われる。例えば、１００個を超えるヌクレオチドの二本鎖についての例示的な中程度のストリンジェンシーの洗���は、４５℃で１５分間の１×ＳＳＣである。例えば、１００個を超えるヌクレオチドの二本鎖についての低いストリンジェンシーの洗浄の一例は、４０℃で１５分間の４×から６×ＳＳＣである。
【００３５】
ＲＮＡに対して適用される場合には、用語「単離された核酸」は、上記で定義されたような単離されたＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子を主に意味する。あるいは、この用語は、その自然界での状態（すなわち、細胞の中または組織の中）でそれが会合している他の核酸から十分に分離されているＲＮＡ分子を意味する場合もある。「単離された核酸」（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）はさらに、生物学的手段または合成手段によって直接生産され、そしてその生産の際に存在する他の成分から分離された分子を示す場合もある。
【００３６】
「レプリコン」は任意の遺伝的エレメントであり、例えば、プラスミド、コスミド、バックミド（ｂａｃｍｉｄ）、プラスチド、ファージ、またはウイルスであり、これらは、主に、その自身の制御下で複製することができる。レプリコンはＲＮＡである場合、またＤＡである場合のいずれもがあり、これらは一本鎖である場合も、また、二本鎖である場合もある。
【００３７】
「ベクター」は、結合させられた配列もしくはエレメントの複製が生じるようにそれに対して別の遺伝的配列またはエレメント（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を結合させることができるレプリコン（例えば、プラスミド、コスミド、バックミド、ファージ、またはウイルス）である。
【００３８】
「発現オペロン」は、転写制御配列および翻訳制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えば、ＡＴＧまたはＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどを有することができ、そして宿主細胞または生物の中のポリペプチドをコードする配列の発現を促進する核酸セグメントを意味する。
【００３９】
用語「プライマー」は、本明細書中で使用される場合は、適切な環境に置かれた場合に、鋳型依存性の核酸合成の開始因子として機能的役割を果たすことができる、オリゴヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか、一本鎖または二本鎖のいずれか、生物学的システムに由来するか、制限酵素消化によって作成されたか、または合成によって生産されたかのいずれか）を意味する。核酸の適切なヌクレオシド３リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、適切な補因子、ならびに、適切な温度およびｐＨのような条件と共に提示された場合には、プライマーは、プライマー伸張産物を生じるように、ポリメラーゼの作用または同様の活性によるヌクレオチドの付加によって、その３’末端を伸張させることができる。プライマーは、特定の条件および用途の要件に応じて、様々な長さであり得る。多くの場合は、プライマーは約１５から約２５、またはそれ以上のヌクレオチドの長さの範囲である。プライマーは、通常、所望される伸張産物の合成を感作するために、所望される鋳型に対して十分に相補的である。言い換えると、プライマーは、ポリメラーゼまたは同様の酵素による合成の開始に使用される適切な並置にプライマーの３’ヒドロキシル部位分を提供するために十分な様式で、所望される鋳型鎖とアニーリングすることができる。プライマー配列が所望される鋳型の正確な相補鎖を示すことは必要ではない。例えば、相補的ではないヌクレオチド配列であっても、別の相補的なプライマーの５’末端に結合することができる。あるいは、プライマー配列が伸張産物の合成のための鋳型−プライマー複合体を機能的に提供するために所望される鋳型鎖の配列と十分な相補性を有している限りは、相補的ではない塩基を、オリゴヌクレオチドプライマー配列の中に散りばめて組み入れることができる。
【００４０】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１９５号、および同第４，９６５，１８８号に記載されている。それらの開示全体が引用により本明細書中に組み入れられる
本明細書中で使用される場合は、用語「レポーター」、「レポーターシステム」、「レポーター遺伝子」、または「レポーター遺伝子産物」は、発現させられると容易に測定することができる（例えば、生物学的アッセイ、免疫アッセイ、放射免疫測定によって、または比色、蛍光、化学発光、あるいは他の方法によって）レポーターシグナルを生じる産物をコードする遺伝子が核酸の中に含まれている、動作可能である遺伝的システムを意味するはずである。核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか、直鎖状または環状のいずれか、一本鎖または二本鎖のいずれか、アンチセンスまたはセンス極性のいずれでもあり得、そして、レポーター遺伝子産物の発現に不可欠な制御エレメントに対して作動可能に連結させることができる。制御エレメントは、レポーターシステムの性質によって、そしてレポーター遺伝子がＤＮＡの形態であるかまたはＲＮＡの形態であるかによって様々であろう。これには、例えば、プロモーター、エンハンサー、翻訳制御配列、ポリＡ付加シグナル、転写終結シグナルなどのエレメントが含まれ得るが、これらに限定はされない。
【００４１】
用語「形質転換」、「トランスフェクト」、「形質導入」は、それによって核酸が細胞または宿主生物に導入される任意の方法あるいは手段を意味するはずであり、これらは、同じ意味に変換するための同義的に使用することができる。このような方法としては、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ＰＥＧ−融合などが挙げられるが、これらに限定はされない。導入された核酸は、レシピエント細胞または生物の核酸の中に組み込まれる（共有結合させられる）場合があり、またそうでない場合もある。細菌、酵母、植物、および哺乳動物細胞中では、例えば、導入された核酸はエピソームエレメントまたは独立したレプリコン（例えば、プラスミド）として維持される場合がある。あるいは、導入された核酸は、レシピエント細胞または生物の核酸の中に組み込まれるようになる場合があり、そして細胞または生物の中で安定に維持され、そしてレシピエント細胞または生物の子孫である細胞または生物にさらに継代されるか、あるいは遺伝する場合もある。最後に、導入された核酸は、レシピエント細胞または宿主生物の中に、一時的にしか存在しない場合もある。
【００４２】
用語「選択マーカー遺伝子」は、発現されると選択することができる表現形（例えば、抗生物質耐性）を、形質転換された細胞または植物に付与する遺伝子を意味する。
【００４３】
用語「作動可能に連結された」は、コード配列の発現に不可欠な調節配列が、コード配列の発現を行えるようにコード配列に対して適切な位置でＤＮＡ分子の中に配置されていることを意味する。この同じ定義は、発現ベクター中の転写単位および他の転写制御エレメント（例えば、エンハンサー）の配置について適用される場合もある。
【００４４】
用語「同一」または「同一性」の割合（％）は、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の状況では、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または目視検査によって測定すると、最大の対応のために比較され、そしてアラインメントされた場合に、同じであるか、または一定の割合の同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有している、２つ以上の配列あるいはサブ配列を意味する。本発明のペプチドに関しては、配列同一性は、ペプチドの全長にわたって決定される。
【００４５】
配列比較のためには、通常、１つの配列が参照配列とされ、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムが使用される場合は、試験配列と参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて、サブ配列の座標が設定され、そして配列アルゴリズムプログラムのパラメーターが設定される。その後、配列比較アルゴリズムによって、参照配列と比較した試験配列（単数または複数）についての配列同一性の割合（％）が、設定されたプログラムのパラメーターに基づいて計算される。
【００４６】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性の検索のための方法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実行によって、あるいは、目視検査（一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，前出を参照のこと）によって行うことができる。
【００４７】
有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、進行性の段階的なアルゴリズムを使用して関連する配列の１つのグループから複数の配列アラインメントを作成して、関連性と配列同一性の割合（％）を示す。これによってはまた、アラインメントを作成するために使用されるクラスター化関係を示す樹または系統樹もプロットされる。ＰＩＬＥＵＰでは、Ｆｅｎｇ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０の進行性のアラインメント方法の簡易化が使用される。使用される方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３によって記載されている方法に類似している。このプログラムでは、３００までの配列をアラインメントすることができる。個々の配列は、最大で５，０００個のヌクレオチドまたはアミノ酸の長さである。複数のアラインメント手順が、２つの最も類似している配列の対アラインメントを用いて開始され、これによって２つのアラインメントされた配列のクラスターが生じる。このクラスターは、次いで、次に最も関係している配列またはアラインメントされた配列のクラスターに対してアラインメントされる。配列の２つのクラスターが、２つの個々の配列の対アラインメントの単純な伸張によってアラインメントされる。最終的なアラインメントは、一連の進行性の対アラインメントによって得られる。このプログラムは、配列比較の領域についての特異的な配列およびそれらのアミノ酸もしくはヌクレオチドの座標を設定すること、およびプログラムのパラメーターを設定することによって行われる。例えば、参照配列を、以下のパラメーターを使用して配列同一性の割合（％）の関係を決定するために、他の試験配列に対して比較することができる：デフォルトギャップ荷重（３．００）、デフォルトギャップ長荷重（０．１０）、および加重末端ギャップ。
【００４８】
配列同一性の割合（％）および配列類似性を決定するために適しているアルゴリズムの別の例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公に入手することができる。このアルゴリズムには、最初に、検索配列の長さＷの短い文字列を同定することによって高スコアの配列対（ＨＳＰ）を特定する工程が含まれる。検索配列は、データベース配列中の同じ長さの文字列とともにアラインメントされた場合には、適合しているか、またはある程度のポジティブ値閾値スコア（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｖａｌｕｅｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｓｃｏｒｅ）Ｔを満たすかのいずれかである。Ｔは、文字列スコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，、前出）。これらの最初の文字列のヒットは、それらが含まれているより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するための種子とされる。この文字列のヒットは、その後、累積アルゴリズムスコアを大きくすることができる限りは、個々の配列に沿って両方向に伸張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（適合している残基の対についての褒賞スコア；常に＞０）およびＮ（適合しない残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスは、累積スコアを計算するために使用される。それぞれの方向への文字列のヒットの伸張は、累積アラインメントスコアがその最大到達値よりも量Ｘ小さくなった時；１つ以上のネガティブにスコアされる残基のアラインメントの累積が原因で、累積スコアがゼロまたはそれ未満になった時；またはいずれかの配列の末端に到達した時には、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、Ｔ、およびＸによって、アラインメントの感度および速度が決定される。（ヌクレオチド配列についての）ＢＬＡＳＴＮプログラムでは、デフォルトとして、１１の文字列の長さ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較が使用される。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムでは、デフォルトとして、３の文字列の長さ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスが使用される（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照のこと）。
【００４９】
配列同一性の割合（％）を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによってはまた、２つの配列間の類似性の統計分析も行われる（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５７８７を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定方法は、最少確率合計（ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ（Ｐ（Ｎ））であり、これによって、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間での適合が偶然に起こる可能性の指標が提供される。例えば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較における最少確率合計が、約０．１未満、より好ましくは、約０．０１未満、そして最も好ましくは、約０．００１未満である場合に、参照配列に対して類似していると考えられる。
【００５０】
表現「特異的に標的化する／送達する」は、例えば、本発明のキメラ部分に関して使用される場合には、標的（例えば、標的タンパク質（単数または複数）を過剰発現している細胞に対するその部分の特異的な結合を意味し、これによって、「特異的な」標的化を用いない場合に得られるものと比較して、細胞で、または細胞内でのその部分の局所的な持続期間および／または濃度の増大が生じる。この特異性は必ずしも絶対的なものではないが、正常に標的タンパク質（単数または複数）を発現している細胞（例えば、野生型）について観察されるよりも、または標的タンパク質（単数または複数）を発現していない細胞について観察されるよりも多く標的タンパク質（単数または複数）を発現している細胞について観察されるよりも、検出しやすい／測定しやすいほどに大きい親和力／親和性だけが必要である。
【００５１】
アミノ酸残基は、本出願の中では、標準的な３文字または１文字の省略形（例えば、ＷＩＰＯ標準ＳＴ２５に示されているもの）にしたがって、および／あるいは、表１に示されるように識別される。
【００５２】
【表１−１】
2009500005.tif 000003
【００５３】
【表１−２】
2009500005.tif 000004
本明細書中に記載される鏡像異性体アミノ酸は、「Ｌ」異性体形態であることが好ましい。しかし、ポリペプチドの所望される特性がたも垂れる限りは、「Ｄ」異性体形態の残基で、任意のＬアミノ酸残基を置換することができる。本明細書中に示される全てのアミノ酸残基の配列は、従来の左から右に向かってアミノ末端からカルボキシ末端方向であることに合わせられる。
【００５４】
用語「単離されたタンパク質」または「単離され、そして精製されたタンパク質」が、時折、本明細書中で使用される。この用語は、主に、本発明の単離された核酸分子の発現によって生産されるタンパク質を意味する。あるいは、この用語は、「実質的に純粋な」形態で存在するように、それが自然界において会合している他のタンパク質とは十分に分離されているタンパク質を意味し得る。「単離された」は、他の化合物もしくは材料との人工的または合成による混合物、あるいは、基本的な活性を妨害することはなく、そして、不完全な精製、安定剤の添加、または、例えば、免疫学的調製物もしくは薬学的に許容される調製物にするための配合が原因で存在する可能性がある、不純物の存在を排除することは意味しない。
【００５５】
用語「実質的に純粋」は、所定の材料（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）が少なくとも５０〜６０重量％を占めている調製物を意味する。より好ましくは、調製物には、任意の化合物が、少なくとも７５重量％、そして最も好ましくは、９０〜９５重量％含まれる。純度は、所定の化合物に適している方法（例えば、クロマトグラフィー方法、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）によって測定される。
【００５６】
用語「機能的」は、本明細書中で使用される場合は、核酸またはアミノ酸配列が記載されるアッセイまたは目的について機能的であることを暗に意味する。
【００５７】
表現「原則として〜から構成されている」は、特定のヌクレオチドまたはアミノ酸について言及される場合には、所定の配列番号の特性を有している配列を意味する。例えば、アミノ酸配列に関して使用される場合には、この表現には、配列自体と、配列の基本的な特性と新規の特性に影響を与えることのない分子修飾が含まれる。
【００５８】
用語「タグ」、「タグ配列」、または「タンパク質タグ」は、化学的部分（ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはアミノ酸、ペプチド、もしくはタンパク質、あるいは他の化合物）を意味し、これらは、別の配列に対して付加されると、さらなる有用性を提供するか、またはその配列の有用な特性（具体的には、検出または単離における有用な特性）を付加する。したがって、例えば、ホモポリマー核酸配列または捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列が、伸張産物またはハイブリダイズした産物のその後の単離を容易にするために、プライマーまたはプローブ配列に付加される場合がある。タンパク質タグの場合には、ヒスチジン残基（例えば、４個から８個の連続しているヒスチジン残基）が、キレート金属クロマトグラフィーによるタンパク質の単離を容易にするために、タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに付加される場合もある。あるいは、特異的な抗体分子または他の分子（例えば、ｆｌａｇエピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、インフルエンザＡ型ウイルスヘマグルチニンタンパク質の膜貫通エピトープ、プロテインＡ、セルロース結合ドメイン、カルモジュリン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼなど）と反応するエピトープまたは結合決定基を提示するアミノ酸配列、ペプチド、タンパク質、または融合パートナーが、複数の手順（例えば、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫アフィニティークロマトグラフィー）によるタンパク質の単離を容易にするために、タンパク質に付加される場合がある。化学的タグ部分としては、核酸またはタンパク質のいずれかに付加することができ、そしてアビジン試薬との相互作用により単離または検出を容易にするビオチンのような分子などが挙げられる。多数の他のタグ部分が公知であり、これらは、当業者であれば用意に想定することができ、そして、この定義の範囲にあると意図される。
【００５９】
「クローン」または「クローン細胞の集団」は、例えば、有糸分裂によって、１つの細胞または共通の先祖から導かれた細胞の集団である。
【００６０】
「細胞株」は、多くの世代へとインビトロで安定に増殖することができる初代細胞のクローンまたは細胞集団である。
【００６１】
詳細な説明
腫瘍は、多くの場合には、様々なリガンドに結合して、際限のない腫瘍の増殖を促進する、複数の成長因子受容体を過剰発現する。このような成長因子受容体の一例は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）タンパク質ファミリーである。
【００６２】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）タンパク質ファミリーのメンバーを介したシグナル伝達は、リガンドの結合によって誘発されるホモ二量体またはヘテロ二量体の形成に応じて様々である。この受容体ファミリーは、４つの膜結合タンパク質：ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４から構成されている。これらのタンパク質の過剰発現は、多数のタイプのガン（乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、および唾液腺ガンが含まれるが、これらに限定はされない）における予後不良と関係している。多数のグループによって、腫瘍の増殖を阻害するためにＥＧＦＲタンパク質ファミリーの個々のメンバー（例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕまたはＥＧＦＲ）を標的化するストラテジーが開発されてきたが、いずれの処置も、これらの形態のガンを最終的に治癒できることは証明されていない。
【００６３】
本発明にしたがって、ＥＧＦＲタンパク質ファミリーの複数のメンバー（または所定のメンバー上の複数の部位）を同時に標的化することができる新規の抗体構築物が開発された。この抗体構築物には、通常、互いに結合させられた第１の抗体と第２の抗体が含まれる。ここでは、第１の抗体と第２の抗体は、ＥＧＦＲタンパク質ファミリーの同じメンバーまたは異なるメンバー上の異なるエピトープに対して特異的に結合する。特定の実施形態においては、二重特異的抗体構築物は、二重特異的単鎖分子（例えば、二重特異的単鎖Ｆｖ（ｂｓ−ｓｃＦｖ））であるが、構築物は必ずしもそれに限定はされない。したがって、例えば、化学的に結合させられた完全な抗体、または抗体断片もまた、本発明の範囲内であると意図される。一般的には、二重特異的抗体が本明細書中で記載される場合には、三重特異的またはそれ以上の一般的な多特異的抗体もまた意図されることが理解されるであろう。
【００６４】
本発明の二重特異的抗体は、ＥＧＦＲタンパク質ファミリーの選択されたメンバー（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４）に結合して、リガンドによって誘導されるシグナル伝達を妨げる、ならびに／または、細胞増殖抑制効果および／または細胞毒性作用を誘発する。二重特異的抗体はまた、ガン細胞、固形腫瘍などを特異的に標識するために、そしてより一般的には、任意に結合させられたかもしくは別の方法でカップリングさせられたエフェクター（例えば、放射性同位元素、標識、細胞毒素、薬物、リポソーム、抗体、核酸、デンドリマーなど）をガン細胞（単離されたガン細胞、転移性細胞、固形腫瘍の細胞などが含まれるが、これらに限定はされない）に対して特異的に標的化／送達するためにも使用することができる。
【００６５】
特定の好ましい実施形態においては、本発明の二重特異的抗体は二重特異的単鎖Ｆｖ抗体（ｂｓ−ｓｃＦｖ）である。単鎖Ｆｖ抗体断片には操作された抗体誘導体が含まれ、これには、ペプチドリンカー分子によって連結させられた重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方が含まれ、そして、それらの大きさが小さくなったことによってそれらがＩｇＧ抗体よりも容易に組織および固形腫瘍に浸潤できるとの理由から、修飾されていないＩｇＧ抗体よりもおそらく有効である。
【００６６】
１つの実施形態においては、本発明の二重特異的抗体（例えば、ｂｓ−ｓｃＦｖ抗体分子）には、２つの異なる結合特異性を提供する２つのドメインが含まれる。第１のドメインは、ＥＧＦＲタンパク質ファミリーの１つのメンバーの上にある１つのエピトープに対して結合親和性を有しており、そして第２のドメインは、ＥＧＦＲタンパク質ファミリーの第２のメンバーの上にあるエピトープに対する結合親和性を有している。本発明の例示的なｂｓ−ｓｃＦｖ分子は「ＡＬＭ」であり、これは、ＨＥＲ２／ｎｅｕの上にあるエピトープに対して結合特異性を示す第１のアーム（ドメイン）と、ＨＥＲ３の上にあるエピトープに対して結合特異性を示す第２のアーム（ドメイン）を用いて作成された二重特異的抗体である。
【００６７】
あるいは、本発明の二重特異的抗体は、１つのドメインがＥＧＦＲタンパク質ファミリーの１つのメンバーの上にあるエピトープに対して結合特異性を有しており、そして第２のドメインがＥＧＦＲタンパク質ファミリーの同じメンバーの上にある第２の異なるエピトープに対して結合特異性を有するように、作成することができる。このタイプの例示的なｂｓ−ｓｃＦｖは「ＡＬＦ」であり、これは、２つの異なるｓｃＦｖ分子（いずれも、ＨＥＲ３に対して特異性を有している）から構成されている。
【００６８】
Ｉ．本発明の二重特異的抗体または多特異的抗体を形成する抗体。
【００６９】
上記に示されるように、本発明の二重特異的抗体または多特異的抗体には、通常、その少なくとも２つがＥＧＦＲタンパク質ファミリーの異なるエピトープに特異的である、２つ以上の結合ドメインが含まれる。本発明の好ましい抗体には、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４のエピトープに特異的なドメインが含まれる。
【００７０】
ファージディスプレイアプローチを使用して、ＥＧＦＲタンパク質ファミリーのこれらのメンバーの上にある様々なエピトープに特異的な多数の単鎖抗体が惹起させられている。これらの単鎖Ｆｖ抗体は、本発明の二重特異的抗体または多特異的抗体を構築するためのドメイン／アームとして使用することができる。多数のこれらの抗体は、表２に、そして図１３および１４において、以下で提供される。個々のアーム（抗体）は、ＥＧＦＲタンパク質ファミリーの別のメンバーの上にある２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有しているｂｓ−ｓｃＦｖ抗体、またはＥＧＦＲタンパク質ファミリーの同じメンバーの上にある２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有しているｂｓ−ｓｃＦｖ抗体のいずれかを形成するように、異なるアームと対合させることができる。
【００７１】
【表２−１】
2009500005.tif 000005
【００７２】
【表２−２】
2009500005.tif 000006
＊配列は、Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５５（１）：２８−４３に開示されている。Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：７３−８１もまた参照のこと。
＊＊配列は、本明細書中以下の別表Ａ（Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ａ）に提供される。
＊＊＊配列は、図１３および１４にも示される。
【００７３】
しかし、本発明の二重特異的抗体または多特異的抗体は、表２および／または図１３もしくは１４に列挙される特定の抗体の使用に必ずしも限定はされない。事実上、表２および／または図１３もしくは１４に列挙される個々の抗体は、ＥＧＦＲタンパク質ファミリーの１つのメンバーのエピトープを特定し、これらの抗体は同じエピトープに結合する他の抗体を同定するために容易に使用することができる。したがって、特定の実施形態においては、本発明の二重特異的抗体または多特異的抗体には、表２および／または図１３もしくは１４の抗体（例えば、Ｃ６．５、Ｃ６ＭＬ３−９、Ｃ６ＭＨ３−Ｂ１、Ｃ６−Ｂ１Ｄ２、Ｆ５、ＨＥＲ３．Ａ５、ＨＥＲ３．Ｆ４、ＨＥＲ３．Ｈ１、ＨＥＲ３．Ｈ３、ＨＥＲ３．Ｅ１２、ＨＥＲ３．Ｂ１２、ＥＧＦＲ．Ｅ１２、ＥＧＦＲ．Ｃ１０、ＥＧＦＲ．Ｂ１１、ＥＧＦＲ．Ｅ８、ＨＥＲ４．Ｂ４、ＨＥＲ４．Ｇ４、ＨＥＲ４．Ｆ４、ＨＥＲ４．Ａ８、ＨＥＲ４．Ｂ６、ＨＥＲ４．Ｄ４、ＨＥＲ４．Ｄ７、ＨＥＲ４．Ｄ１１、ＨＥＲ４．Ｄ１２、ＨＥＲ４．Ｅ３、ＨＥＲ４．Ｅ７、ＨＥＲ４．Ｆ８、およびＨＥＲ４．Ｃ７からなる群より選択される抗体）が特異的に結合するエピトープに特異的に結合する１つ以上のドメインが含まれる。
【００７４】
このような抗体は、抗体全体、抗体断片、または単鎖抗体を、標的タグが含まれているタンパク質に結合するそれらの能力について表２に列挙される抗体と競合するそれらの能力についてスクリーニングすることによって容易に同定される。言い換えると、候補の抗体は、ＥＧＦＲタンパク質ファミリーの中の標的タンパク質に対する表２および／または図１３もしくは１４に列挙される抗体との交差反応性についてスクリーニングすることができる。
【００７５】
好ましい実施形態においては、本発明の抗体は、表２および／または図１３もしくは１４に列挙される抗体によって認識される１つ以上のエピトープに特異的に結合する。言い換えると、特に好ましい抗体は、これらの抗体の１つ以上と交差反応する。交差反応性についてのアッセイする手段は当業者に周知である（例えば、Ｄｏｗｂｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：４７０３−４７１１を参照のこと）。
【００７６】
例えば、特定の実施形態においては、交差反応性は、固体支持体に結合させられた単離されたＥＧＦＲファミリーのメンバー（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４、またはそれらの断片）を提供すること、そして、標的タンパク質への結合について表２に列挙される抗体の１つ以上と競合する試験抗体の能力をアッセイすることによって確認することができる。したがって、競合結合形式の免疫アッセイは、交差反応性の決定に使用することができる。例えば、１つの実施形態においては、ＥＧＦＲファミリーのメンバーのポリペプチドが固体支持体に固定される。試験される抗体（例えば、ファージディスプレイライブラリーからの選択によって作成されたか、または全抗体ライブラリーにおいて作成された）は、固定されたポリペプチドに対する結合について、表２および／または図１３もしくは１４に列挙される抗体の１つ以上との競合アッセイに加えられる。試験抗体の、表２および／または図１３もしくは１４の抗体の固定されたタンパク質に対する結合と競合する能力が比較される。次いで、上記タンパク質の交差反応性の割合（％）は、標準的な計算を使用して計算することができる。試験抗体が表２および／または図１３もしくは１４の抗体の１つ以上と競合し、そして対応する（競合する）抗体（例えば、表２の抗体）と同様またはそれ以上の親和性で、約１×１０−８Ｍに匹敵するかまたはそれよりも大きい、より好ましくは、１×１０−９よりも大きい、あるいは、１×１０−１０、またはそれよりも大きい結合親和性を有している場合には、抗体は本発明での使用に十分に適している。
【００７７】
特に好ましい実施形態においては、交差反応性は、ＢＩＡｃｏｒｅでの表面プラズモン共鳴を使用することによって行われる。ＢＩＡｃｏｒｅフローセルの中で、ＥＧＦＲタンパク質はセンサーチップに結合させられる。５（ｌ／分の典型的な流速、１００ｎＭから１（Ｍの滴定で、抗体は、表面のほぼ飽和した状態を生じる抗体濃度を決定するために約５分間、フローセル表面上に注入される。エピトープマッピングまたは交差反応性が、その後、ほぼ飽和した状態を生じる濃度の抗体の対を使用して評価され、そして、少なくとも１００ＲＵの抗体が結合する。結合した抗体の量が、対のそれぞれのメンバーについて決定され、その後、２つの抗体が一緒に混合されて、個々の抗体の測定に使用される濃度と等しい最終濃度とされる。様々なエピトープを認識する抗体は、一緒に注射された場合には、結合したＲＵの付加的増加を原則として示すが、同じエピトープを認識する抗体は、ＲＵのわずかな増加しか示さない。特に好ましい実施形態においては、抗体は、一緒に「注射」された場合に、それらが、原則的な付加的増加（好ましくは、少なくとも約１．４倍の増加、より好ましくは、少なくとも約１．６倍の増加、そして最も好ましくは、少なくとも約１．８または２倍の増加）を示すならば、交差反応性であると言われる。
【００７８】
表２および／または図１３もしくは１４に列挙された抗体によって認識されるエピトープでの交差反応性は、多数の他の標準的な技術（例えば、Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１０２：２５９−２７４を参照のこと）によって確認することができる。
【００７９】
加えて、表２に特定された多数の抗体は配列決定されている（例えば、図１３および１４を参照のこと）。したがって、相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれているアミノ酸配列は公知である。この配列情報を使用して、同じであるか、または類似する相補性決定領域を、例えば、種適合性を確実にするために、血清半減期を長くするために、などのために、キメラ全長抗体および／または抗体断片を生じさせるために、他の抗体中に操作することができる。キメラ抗体を作成する多数の方法は当業者に周知である（例えば、米国特許第５，５０２，１６７号、同第５，５００，３６２号、同第５，４９１，０８８号、同第５，４８２，８５６号、同第５，４７２，６９３号、同第５，３５４，８４７号、同第５，２９２，８６７号、同第５，２３１，０２６号、同第５，２０４，２４４号、同第５，２０２，２３８号、同第５，１６９，９３９号、同第５，０８１，２３５号、同第５，０７５，４３１号、および同第４，９７５，３６９号を参照のこと）。
【００８０】
簡単に言うと、日常的に使用されている方法を使用して、表２に列挙された抗体を同じエピトープに結合する他の抗体（全長、抗体断片、単鎖など）を作成または同定するために、容易に使用することができる。同様に、表２に列挙された抗体は、同じであるかまたは類似する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有している他の抗体を作成するために容易に利用することができる。
【００８１】
ＩＩ．二重特異的抗体分子の調製
多数のＥＧＦＲタンパク質ファミリーのメンバーの上で見られるエピトープに対する抗体（例えば、表２に列挙された抗体）を使用して、本発明の二重特異的抗体または多特異的抗体を調製することができる。２つ（またはそれ以上）の抗体を、様々な方法を使用して調製することができる。例えば、抗体は、（化学的なタンパク質合成方法、組み換え発現方法、ハイブリドーマ技術などを使用して）別々に調製し、その後、直接またはリンカーを介してのいずれかで、互いに化学的に結合させることができる。抗体がいずれも、末端で直接結合させられたか、またはリンカーを介して結合させられた単鎖抗体である場合は、二重特異的分子または多特異的分子を化学的に合成することができ、また、より好ましくは、組み換えによって発現させることができる。
【００８２】
分子を化学的に結合させる手段は当業者に周知である。２つの抗体を化学的にカップリングさせるための手順は単純である。ポリペプチドには通常、様々な官能基（例えば、カルボン酸（ＣＯＯＨ）または遊離のアミン（−ＮＨ２）基）が含まれており、これらは、対応する抗体またはリンカー上の適切な官能基との反応に利用される。
【００８３】
あるいは、抗体は、さらなる反応性官能基を露出させるかまたは結合させるように誘導することもできる。誘導には、多数のリンカー分子のうちの任意のもの（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓから入手することができるもの）の結合が含まれ得る。様々な適切なリンカーが当業者に公知であり（例えば、欧州特許出願番号１８８，２５６；米国特許第４，６７１，９５８号、同第４，６５９，８３９号、同第４，４１４，１４８号、同第４，６９９，７８４号、同第４，６８０，３３８号、同第４，５６９，７８９号、および同第４，５８９，０７１号；ならびに、Ｂｏｒｌｉｎｇｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：４０７１−４０７５を参照のこと）、そして適切なリンカーは、二重特異的抗体に対するエフェクターの結合に関して、以下にも記載される。
【００８４】
本発明の特に好ましい実施態様においては、ｂｓ−ｓｃＦｖ抗体分子は、宿主細胞の中で生産された組み換え体である抗体断片の発現によって生産される。ＥＧＦＲタンパク質ファミリーの複数のメンバーの上にある様々なエピトープを標的化するｓｃＦｖ分子のいくつかの遺伝子がクローニングされており（例えば、別表Ａ（Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ａ）およびＳｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１）：２８−４３を参照のこと）、これらのｓｃＦｖ遺伝子の対（または他の組み合わせ）を、直接またはリンカー分子を介して、作動可能に連結させることができる。得られた、ｂｓ−ｓｃＦｖ抗体断片をコードする核酸分子は発現ベクターの中に挿入され、そして宿主細胞の中に導入される。その後、得られたｂｓ−ｓｃＦｖ抗体分子が単離され、そして発現システムから精製される。
【００８５】
本発明の特定の好ましい実施形態においては、ｓｃＦｖ抗体分子は、ｂｓ−ｓｃＦｖ抗体分子をタンパク質分解から保護するように設計された新規のリンカー分子と対合させられる。このリンカーには通常、タンパク質分解的切断部位は含まれておらず、これは、通常は、主に中性（電荷を有していない）アミノ酸が含まれることを特徴とする。１つのこのようなリンカー配列ｉは、以下の配列を有している：Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ（配列番号３７）。
【００８６】
表２に提供されたｓｃＦｖは、以下の要因に基づいて新しいｂｓ−ｓｃＦｖの中に取り込まれる：（１）所定の標的に対する親和性の低下、（２）抗鎖反応性エピトープを含まないこと（ＢＩＡｃｏｒｅ上でのサンドイッチアッセイおよび結合阻害によって決定される）、（３）まだ結合していないＥＧＦＲファミリーのメンバーの対を標的化する組み合わせ、ならびに、（４）他のｂｓ−ｓｃＦｖの組み合わせで使用された場合に、増殖の阻害およびシグナル伝達の変化を導くｓｃＦｖアームが含まれること。
【００８７】
本発明のｂｓ−ｓｃＦｖ抗体の純度は、当業者に公知の標準的な方法を使用してアッセイすることができ、これには、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、ウェスタンブロッティング、表面プラズモン共鳴、および質量スペクトル分析が含まれるが、これらに限定はされない。
【００８８】
本明細書中で提供される抗体、核酸配列、および他の教示を使用して、本発明の二重特異的抗体または多特異的抗体を、日常的に使用される方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、またはＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｎ．Ｙ．に示されている方法）を使用して組み換えによって発現させることができる。加えて、本発明の組み換え体である二重特異的単鎖抗体を生産する例示的な方法は、実施例で示される。特異的な材料が記載される範囲については、これは、単なる説明の目的のためのものにすぎず、本発明を限定するようには意図されない。
【００８９】
ＩＩＩ．二重特異的抗体および／または多特異的抗体が含まれているキメラ部分
多くの実施形態においては、本発明の二重特異的および／または多特異的抗ＥＧＦＲファミリーメンバー抗体は、いずれのさらなる「エフェクター」を使用することもなく、ガン細胞の成長および／または増殖を阻害することができ、特定の実施形態においては、二重特異的抗体および／または多特異的抗体がエフェクターに対してさらに結合させられ、それによって、ＥＧＦＲファミリーのメンバー（単数または複数）を過剰発現しているエフェクターを優先的に標的化／送達（ｄｅｌｉｇｅｒ）するキメラ部分が形成される。
【００９０】
ＥＧＦＲタンパク質は多くの場合は、ガン細胞の中でアップレギュレートされることが明らかにされているので、これらのタンパク質は、様々なガン細胞（例えば、単離された細胞、転移性の細胞、固形腫瘍の細胞など）に対する（特に、上皮ガン細胞（例えば、乳ガン細胞）に対する）エフェクター（例えば、細胞毒素、放射標識などのエフェクター分子）の効率的であり、特異的な送達のための標的（単数または複数）として、有効に使用することができる。標的ＥＧＦＲタンパク質（単数または複数）は、必ずしも、有効な標的を提供するためだけにガン細胞の上に存在しているのではない。健常な細胞と比較した、ガン細胞上でのＥＧＦＲのディファレンシャルな発現は、有意であり、そして有用な標的化の利点を提供するために、すなわち、標的（例えば、ガン）細胞へおよび／または標的細胞の中へのエフェクター部分の優先的な送達を生じるために十分である。
【００９１】
特定の好ましい実施形態においては、本発明の二重特異的抗体または多特異的抗体は、
「プレ標的化」ストラテジー（これによって、エフェクター部分の投与後に標的部位でのキメラ部分の形成が生じる）において、または「標的化」ストラテジー（この場合は、二重特異的抗体および／または多特異的抗体がエフェクター分子に結合させられて、その後、キメラ部分が提供されるように使用される）において利用される。
【００９２】
キメラ分子またはキメラ組成物またはキメラ部分は、それらの自然界での状態においては別々に存在している２つ以上の分子または組成物が、その構成成分であるメンバーの所望される機能性を有している１つの分子部分または組成物を形成するように一緒に結合させられている、分子または組成物を意味する。通常は、キメラの構成成分である分子の１つであるｐｏｅｔｕは「標的化分子」であり、すなわち、本発明の場合には、ＥＧＦＲファミリーの１つ以上のメンバーに特異的に結合する二重特異的抗体または多特異的抗体である。
【００９３】
キメラ分子の別の構成成分は「エフェクター」である。エフェクター分子は、標的細胞（例えば、ＥＧＦＲファミリーのメンバーを過剰発現している細胞）に特異的に輸送される１つの分子または分子のグループを意味する。エフェクター分子は、通常、標的細胞に送達される特徴的な活性を有している。エフェクター分子としては、細胞毒素、標識、放射性核種、リガンド、抗体、薬物、リポソームなどが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００９４】
特定の実施形態においては、エフェクターは検出可能な標識であり、好ましくは、放射性核種が含まれている検出可能な標識である。本発明の放射性核−キレート化剤−（例えば、ビオチン）結合体において有用な放射性核種および標識の中でも、γ放射体、陽電子放射体、ｘ線放射体、および蛍光放射体は、領域の特定、診断および／もしくは病期診断、ならびに／または治療に適しており、一方、β放射体およびα放射体、ならびに電子捕捉因子および中性子捕捉因子（例えば、ホウ素およびウラン）もまた治療に使用することができる。
【００９５】
検出可能な標識は、外部検出器および／または内部検出器と組み合わせて使用することができ、例えば、１つ以上のＥＧＦＲファミリーのメンバーを過剰発現しているガン細胞を効率よく領域を特定する、および／または視覚化するための手段が提供される。このような検出／視覚化は、手術前および手術中の設定が含まれるが、これらに限定はされない様々な状況において有用であり得る。したがって、特定の実施形態においては、本発明は、哺乳動物の体内のＥＧＦＲファミリーのマーカーを有している組織を手術中に検出するおよび領域を特定する方法に関する。これらの方法には、通常、検出器（例えば、γ線検出プローブ）、による検出のために十分な量の、検出可能な標識で標識された本発明の二重特異的抗体および／または多特異的抗体（例えば、放射性同位元素（例えば、１６１Ｔｂ、１２３Ｉ、１２５Ｉなど）で標識された本発明の抗ＭＵＣ−１抗体）が含まれている組成物を哺乳動物に投与する工程、ならびに、標的組織に活性のある物質を取り込ませた後に、そして好ましくは、標識の血液からのクリアランス後に、哺乳動物を、体の関係する部分の放射免疫検出技術に供する（例えば、γ線検出プローブを使用することによる）工程が含まれる。
【００９６】
標識が結合した二重特異的抗体および／または多特異的抗体は、放射線誘導手術の技術において使用することができる。ここでは、被験体の体内の関連する組織を、検出器（例えば、γ線検出プローブ）によって手術中に検出し、領域を特定することができる。執刀医は、手術中に、このプローブを使用して、放射性同位体で標識された化合物がその中に取り込まれた（すなわち、例えば、低エネルギーγ光子放射体が取り込まれた）組織を見つけることができる。
【００９７】
検出可能な標識に加えて、好ましいエフェクターとしては、細胞毒素（例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エクソトキシン、リシン、アブリン、ジフテリア毒素など）、あるいは、細胞傷害性薬物またはプロドラッグ（この場合、キメラ部分は強力な細胞死滅因子として作用することができ、ＥＧＦＲファミリーのメンバー（単数または複数）を保有している細胞に対して細胞毒素を特異的に標的化させる）が挙げられる。
【００９８】
なお他の実施形態においては、エフェクターには、薬剤（例えば、抗ガン剤、例えば、ドキソルビシン、ビンブラスチン、タキソールなど）、免疫システムの成分による結合した細胞の認識を刺激する抗原、免疫システムの成分に特異的に結合して、それらを標的細胞（単数または複数）に対して指向させる抗体などがカプセル化されているリポソームが含まれ得る。
【００９９】
Ａ）二重特異的または多特異的である、抗ＥＧＦＲファミリーメンバー標的化分子
本発明の方法および組成物の好ましい実施形態においては、標的化部分は、本明細書中に記載されるＥＧＦＲファミリーの１つ以上のメンバーに特異的に結合する二重特異的抗体および／または多特異的抗体である。二重特異的抗体および／または多特異的抗体には、全長の抗体、抗体断片（単数または複数）（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂなど）、ならびに／あるいは、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が含まれ得る。
【０１００】
Ｂ）特に好ましいエフェクター
１）画像化組成物
特定の実施形態においては、本発明のキメラ分子は、腫瘍部位に対して検出可能な標識を指向させるために使用することができる。これにより、腫瘍の検出および／または領域の特定を容易にすることができる。特定の特に好ましい実施形態においては、キメラ分子のエフェクター成分は、「放射線不透過性」の標識であり、例えば、ｘ線を使用して容易に視覚化することができる標識である。放射線不透過性の材料は当業者に周知である。最も一般的な放射線不透過性の材料としては、ヨウ化物、臭化物、またはバリウム塩が挙げられる。他の放射線不透過性の材料もまた公知であり、これらには、有機ビスマス誘導体（例えば、米国特許第５，９３９，０４５号を参照のこと）、放射線不透過性ポリウレタン（米国特許第５，３４６，９８１０号を参照のこと）、有機ビスマス複合物（例えば、米国特許第５，２５６，３３４号を参照のこと）、放射線不透過性バリウムポリマー複合体（例えば、米国特許第４，８６６，１３２号を参照のこと）などが含まれるが、これらに限定はされない。
【０１０１】
本発明の二重特異的抗体および／または多特異的抗体は、放射線不透過性部分に直接結合させることができ、また、以下に記載されるような放射線不透過性材料を保有しているかまたは放射線不透過性材料が含まれている「パッケージ」（例えば、キレート、リポソーム、ポリマーマイクロビーズなど）に結合させることもできる。
【０１０２】
放射線不透過性標識に加えて、他の標識もまた、本発明での使用に適している。本発明のキメラ分子のエフェクター分子成分としての使用に適している検出可能な標識としては、分光高度的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、または化学的手段、によって検出することができる任意の組成物が挙げられる。本発明において有用な標識としては、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用される他の酵素）、ならびに比色標識（例えば、コロイド金または着色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズ））が挙げられる。
【０１０３】
様々な好ましい放射標識としては、以下が挙げられるが、これらに限定はされない：９９Ｔｃ、２０３Ｐｂ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、９７Ｒｕ、６２Ｃｕ、６４ｌＣｕ、５２Ｆｅ、５２ｍＭｎ、５１Ｃｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、７７Ａｓ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、１６９Ｅｒ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、１６１Ｔｂ、１０９Ｐｄ、１６５Ｄｙ、１４９Ｐｍ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５７Ｇｄ、１５９Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１７２Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１０５Ｒｈ、および１１１Ａｇ。
【０１０４】
このような標識を検出する手段は当業者に周知である。したがって、例えば、放射標識は、写真用フィルム、シンチレーション検出器などを使用して検出することができる。蛍光マーカーは、放射された発光を検出するための光検出器を使用して検出することができる。酵素標識は、通常、酵素を基質とともに提供すること、および基質に対する酵素の作用によって生産される反応産物を検出することによって検出され、そして比色標識は、着色された標識を単に視覚化することによって検出される。
【０１０５】
特定の特異的な実施形態においては、本発明により、腫瘍および／または他のガン細胞の検出のための免疫結合体（キメラ部分）の使用が意図される。したがって、例えば、本発明の二重特異的抗体は、γ線カメラでの検出のためにはγ線を放射する放射性同位元素（例えば、Ｎａ−２２、Ｃｒ−５１、Ｃｏ−６０、Ｔｃ−９９、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｃｓ−１３７、ＧＡ−６７、Ｍｏ−９９）に対して、陽電子放出型断層撮影法（ＰＥＴ）装置上での検出のためには陽電子を放射する同位元素（例えば、Ｃ−１１、Ｎ−１３、Ｏ−１５、Ｆ−１８など）に対して、そして核磁気共鳴検出方法（ＭＲＩ）のための金属造影剤（例えば、Ｇｄが含まれている試薬、Ｅｕが含まれている試薬など）に対して、結合させることができる。加えて、本発明の二重特異的抗体は、従来の免疫組織化学（例えば、蛍光標識、ナノ結晶標識、酵素標識および比色標識など）において使用することもできる。
【０１０６】
２）放射線増感剤
別の実施形態においては、エフェクターは、細胞に対する電離放射線（例えば、６０Ｃｏまたはｘ線源によって生じる可能性があるもの）の細胞傷害作用を促進する放射線増感剤であり得る。多数の放射線増感剤が公知であり、これには、ベンゾポルフィリン誘導化合物（例えば、米国特許第５，９４５，４３９号を参照のこと）、１，２，４−ベンゾトリアジンオキサイド（例えば、米国特許第５，８４９，７３８号を参照のこと）、特定のジアミンが含まれている化合物（例えば、米国特許第５，７００，８２５号を参照のこと）、ＢＣＮＴ（例えば、米国特許第５，８７２，１０７号を参照のこと）、放射線増感性のニトロ安息香酸アミド誘導体（例えば、米国特許第４，４７４，８１４号を参照のこと）、様々な複素環誘導体（例えば、米国特許第５，０６４，８４９号を参照のこと）、白金錯体（例えば、米国特許第４，９２１，９６３号を参照のこと）などが含まれるが、これらに限定はされない。
【０１０７】
３）リガンド
エフェクター分子はまた、リガンド、エピトープタグ、または抗体である場合もある。特に好ましいリガンドおよび抗体は、免疫細胞上の表面マーカーに結合するものである。このような抗体をエフェクター分子として利用するキメラ分子は、リガンドまたは抗体に対する結合パートナーを保有している免疫細胞と、ＥＧＦＲファミリーのメンバー（単数または複数）を発現している腫瘍細胞との間での会合を確立する二官能性リンカーとしての役割を果たす。
【０１０８】
３）キレート
本明細書中に記載される医薬品および／または放射標識の多くは、特に、プレ標的化ストラテジーが利用される場合には、キレートとして提供されることが好ましい。キレート化を行う分子は、通常は、二重特異的抗体および／または多特異的抗体に結合させられたエピトープタグに特異的に結合する分子（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンなど）に結合させられる。
【０１０９】
キレート化を行う基は当業者に周知である。特定の実施形態においては、キレート化を行う基は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、シクロヘキシル１，２−ジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、エチレングリコール−Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシベンジル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ニ酢酸（ＨＢＥＤ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、ヒドロキシエチルジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、１，４，８，１１−テトラ−アザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＴＥＴＡ）、置換されたＤＴＰＡ、置換されたＥＤＴＡなどに由来する。
【０１１０】
特定の好ましいキレート化剤の例としては、置換された、または未置換の、２−イミノチオランおよび２−イミノチアシクロヘキサン、特に、２−イミノ−４−メルカプトメチルチオラン、およびＳＡＰＳ（Ｎ−４−［２１１Ａｔ］アスタトフェネチル）スクシニメート）が挙げられる。
【０１１１】
１つのキレート化剤である１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）は、診断上および治療上重要な多数の金属（例えば、放射性各種および放射標識）をキレート化するその能力の理由から、特に目的となるものである。
【０１１２】
ＤＯＴＡとタンパク質（例えば、抗体）の結合体が記載されている。例えば、米国特許第５，４２８，１５６号には、ＤＯＴＡを抗体および抗体断片に結合させるための方法が教示されている。これらの結合体を作成するためには、ＤＯＴＡの１つのカルボン酸基が活性のあるエステルへと変換され、これが、抗体または抗体断片上のアミンもしくはスルフヒドリル基と反応することができる。Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：５６５−５７６には同様の方法が記載されており、ここでは、ＤＯＴＡの１つのカルボキシル基が活性のあるエステルに変換され、活性化させられたＤＯＴＡは抗体と混合され、抗体のリジン残基のε−アミノ基を介してＤＯＴＡに対して抗体が連結させられ、それによってＤＯＴＡの１つのカルボキシル基がアミド部分に変換される。
【０１１３】
あるいは、キレート化剤を、直接、またはリンカーを介して、エピトープタグに、またはエピトープタグに結合する部分に結合させることができる。ＤＯＴＡとビオチンの結合体が記載されている（例えば、Ｓｕ（１９９５）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，３６（５  Ｓｕｐｐｌ）：１５４Ｐを参照のこと、ここには、ＤＯＴＡ−ＬＣ−ビオチンまたはＤＯＴＡ−ベンジル−４−（６−アミノ−カプロアミド）−ビオチンのような利用することができるアミノ側鎖ビオチン誘導体を介するビオチンへのＤＯＴＡの結合が開示されている）。Ｙａｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ  ９５／１５３３５には、ビオチンに結合させることができるニトロ−ベンジル−ＤＯＴＡ化合物を生産する方法が開示されている。この方法には、ヒドロキシル基の一時的な射出；アミンのトシル化；一時的に保護されたヒドロキシ基の脱保護；脱保護されたヒドロキシ基のトシル化；および分子内トシル基の環化による環化反応が含まれる。Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，１９（２）：２３９−２４４には、１１１ＩＮおよび９０Ｙでのタンパク質の放射標識のためのマイクロ環（ｍｉｃｒｏｃｙｃｌｉｃ）キレート化剤の合成が開示されている。Ｗｕ  ｅｔ  ａｌによって、実験用のモデルタンパク質である、アビジンとの結合体の安定性および生体分布を研究するための標識されたＤＯＴＡ−ビオチン結合体が作成された。この結合体は、インサイチュで作成された活性化されたＤＯＴＡ誘導体と反応させられる遊離のアミノ基が含まれているビオチンヒドラジドを使用して作成された。
【０１１４】
４）細胞毒素
特に好ましい細胞毒素としては、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エクソトキシン、ジフテリア（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）毒素、リシン、およびアブリンが挙げられる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エクソトキシンおよびジフテリア（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）毒素が最も好ましい。
【０１１５】
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エクソトキシンＡ（ＰＥ）は極めて活性の高い単量体タンパク質（分子量６６ｋＤ）であり、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）によって分泌され、これは、そのＡＤＰ−リボシル化を触媒する（ＥＦ−２上への酸化されたＮＡＤのＡＤＰリボシル部分の導入を触媒すること）ことによる伸張因子２（ＥＦ−２）の不活化を介して真核生物細胞の中でのタンパク質の合成を阻害する。
【０１１６】
毒素には３つの構造ドメインが含まれ、これは、細胞傷害性を引き起こすように共同して作用する。ドメインＩａ（アミノ酸１〜２５２）は細胞の結合を媒介する。ドメインＩＩ（アミノ酸２５３〜３６４）は、細胞質ゾルへの移動を担っており、そしてドメインＩＩＩ（アミノ酸４００〜６１３）は、伸張因子２のＡＤＰリボシル化を媒介し、これは、タンパク質を不活化させて、細胞死を引き起こす。ドメインＩｂ（アミノ酸３６５〜３９９）の機能はまだ同定されていないが、その大部分であるアミノ酸３６５〜３８０は、細胞傷害性を失うことなく欠失させることができる。Ｓｉｅｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２５６−１４２６１を参照のこと。
【０１１７】
標的化分子（例えば、抗ＭＵＣ−１）がＰＥに融合させられる場合には、好ましいＰＥ分子は、ドメインＩａ（アミノ酸１から２５２）が欠失させられており、そしてアミノ酸３６５から３８０がドメインＩｂから欠失させられているものである。しかし、ドメインＩｂ全体と、ドメインＩＩの一部（アミノ酸３５０から３９４）は、特に、欠失させられた配列がＧＧＧＧＳ（配列番号１１）のような連結ペプチドで置き換えられる場合には、欠失させることができる。
【０１１８】
加えて、ＰＥ分子はさらに、特定の所望される用途のために分子を変化させるために、部位特異的突然変異誘発または当該分野で公知の他の技術を使用してさらに修飾することができる。本明細書中に記載されるＰＥ分子によって提供される機能的利点に実質的には影響が及ばない様式でＰＥ分子を変化させるための手段もまた使用することができ、このように得られた分子は、本明細書中に含まれるように意図される。
【０１１９】
好ましいＰＥ分子の最大細胞傷害特性のためには、分子に対するいくつかの修飾が推奨される。組み換え体分子に対する適切なカルボキシル末端配列は、分子を標的細胞の細胞質ゾルへと移動させることが好ましい。有効であることが明らかにされているアミノ酸配列としては、ＲＥＤＬＫ（配列番号２３）（自然界に存在しているＰＥとして）、ＲＥＤＬ（配列番号２４）、ＲＤＥＬ（配列番号２５）、もしくはＫＤＥＬ（配列番号２６）、それらの繰り返し、または小胞体の中でタンパク質を維持するかもしくはその中へとタンパク質を再利用させるように機能する他の配列（本明細書中では「小胞体保持配列（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」と呼ばれる）が挙げられる。例えば、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：３０８−３１２、およびＳｅｅｔｈａｒａｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１７３７６−１７３８１を参照のこと。ＰＥの好ましい形態には、ＰＥ３８ＱＱＲと命名されたＰＥ分子（Ｄｅｂｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，５：４０（１９９４））およびＰＥ４Ｅ（例えば、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１６３０６を参照のこと）が含まれる。
【０１２０】
様々なリガンドに対して融合させられたＰＥをコードする遺伝子をクローニングする方法は当業者に周知である（例えば、Ｓｉｅｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，３：２６４７−２６５２；ａｎｄ  Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：４５３８−４５４２を参照のこと）。
【０１２１】
ＰＥと同様に、ジフテリア毒素（ＤＴ）は、ＡＤＰ−リボシル化伸張因子２によって細胞を死滅させ、それによってタンパク質の合成を阻害する。しかし、ジフテリア毒素は、ジスルフィド結合によって連結させられた２つの鎖ＡとＢに分けられる。ＰＥとは対照的に、カルボキシル末端上にあるＤＴの鎖Ｂは受容体の結合を担っており、アミノ末端上にある鎖Ａには酵素活性が含まれる（Ｕｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９７２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７５：９０１−９０３；Ｕｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４８：３８３８−３８４４）。
【０１２２】
好ましい実施形態においては、本発明の標的化分子−ジフテリア（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）毒素融合タンパク質は、ジフテリア（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）毒素Ｂ鎖の短縮によって除去される自然界に存在している受容体結合ドメインを有している。ＤＴ３８８が特に好ましく、この場合、カルボキシル末端配列が残基３８９で始まるＤＴが除去される。Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１８０：５４５−５５１。ＰＥキメラ細胞毒素と同様に、ＤＴ分子はＭＵＣ−１抗体に化学的に結合させることができるが、特に好ましい実施形態においては、標的化分子は、組み換え手段によってジフテリア（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）毒素に融合させられるであろう（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１８８５−１１８８９を参照のこと）。
【０１２３】
５）他の治療用部分
他の適切なエフェクター分子としては、医薬品、または様々な医薬品が含まれているカプセル化システムが挙げられる。したがって、キメラ分子の標的化分子は薬物に直接結合させることができ、これは、腫瘍に直接送達される。このような薬物は当業者に周知であり、これには、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ゲニステイン、アンチセンス分子などが含まれるが、これらに限定はされない。
【０１２４】
あるいは、エフェクター分子は、ウイルスキャプシド、リポソーム、ミセルのようなカプセル化システムであり得、これらには、薬物、核酸（例えば、アンチセンス核酸）、または循環システムに直接曝されることによって好ましくはシールドされる別の治療用部分のような、治療用組成物が含まれる。抗体に結合させられたリポソームを調製する手段は当業者に周知である。例えば、米国特許第４，９５７，７３５号、Ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．，２８：３４１−３６５を参照のこと。
【０１２５】
Ｃ）エフェクター分子への標的化分子の結合
当業者は、本発明の二重特異的抗体および／または多特異的抗体とエフェクター部分を、通常は、いずれの順序でも、一緒に連結させることができることを理解するであろう。したがって、例えば、標的化分子は単鎖タンパク質である場合には、エフェクター分子を、標的化分子のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに連結させることができる。エフェクターはまた、二重特異的抗体および／または多特異的抗体の内部領域に連結させることができ、またその逆も可能である。同様に、二重特異的抗体および／または多特異的抗体は、エフェクター分子の内部位置にも、また、末端にも連結させることができる。いずれの場合にも、二重特異的および／または多特異的抗体あるいはエフェクターのそれぞれの活性を妨害しない連結点が選択される。
【０１２６】
二重特異的抗体および／または多特異的抗体とエフェクター分子は、当業者に周知の多数の手段のいずれかによって結合させることができる。通常、エフェクター分子は、直接、またはリンカー（スペーサー）を介してのいずれかで、二重特異的抗体に結合させられる。しかし、エフェクター分子と二重特異的抗体の両方がいずれもポリペプチドである場合には、キメラ分子を一本鎖の融合タンパク質として組み換えによって発現させることが好ましい。
【０１２７】
１）標的化分子へのエフェクター分子の結合
１つの実施形態においては、二重特異的抗体および／または多特異的抗体は、エフェクター分子（例えば、細胞毒素、標識、リガンド、薬物、抗体、リポソームなど）に対して化学的に結合させられる。分子を化学的に結合させる手段は当業者に周知である。
【０１２８】
抗体または他のポリペプチド標的化分子に対して１つの因子を結合させるための手順は、その因子の化学構造にしたがって様々であろう。ポリペプチドには、通常、様々な官能基（例えば、カルボン酸（ＣＯＯＨ）または遊離のアミン（−ＮＨ２）基）が含まれ、これらは、それに対してエフェクターを結合させるためのエフェクター分子上の適切な官能基との反応に利用することができる。
【０１２９】
あるいは、二重特異的抗体および／またはエフェクター分子は、さらに別の反応性官能基を露出させるかまたは結合させるように誘導することができる。誘導には、任意の多数のリンカー分子（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓから入手できるもの）の結合が含まれる。
【０１３０】
「リンカー」は、本明細書中で使用される場合は、エフェクター分子に対して標的化分子を結合させるために使用される分子である。リンカーは、標的化分子とエフェクター分子の両方に対して共有結合を形成することができる。適切なリンカーは当業者に周知であり、これには、直鎖または分岐鎖の炭素リンカー、複素環炭素リンカー、あるいはペプチドリンカーが含まれるが、これらに限定はされない。二重特異的抗体および／または多特異的抗体とエフェクター分子がポリペプチドである場合には、リンカーを、それらの側基を介して（例えば、システインに対するジスルフィド結合を介して）構成アミノ酸に連結させることができる。しかし、好ましい実施形態においては、リンカーは、末端アミノ酸のα−炭素のアミノ基およびカルボキシル基に対して結合させられるであろう。
【０１３１】
特定の因子上の基と反応する１つの官能基と抗体と反応する別の基を有している二官能性リンカーを、所望される免疫結合体を形成させるために使用することができる。あるいは、誘導には、二重特異的抗体および／または多特異的抗体の化学的処理（例えば、遊離のアルデヒド基を生じさせるための過ヨウ素酸塩での糖タンパク質抗体の糖部分のグリコール切断）が含まれ得る。抗体上の遊離のアルデヒド基を１つの因子上の遊離のアミンまたはヒドラジン基と反応させて、それに対してその因子を結合させることができる。（米国特許第４，６７１，９５８号を参照のこと）。ポリペプチド（例えば、抗体または抗体断片）上に遊離のスルフヒドリル基を生じさせるための手順もまた公知である（米国特許第４，６５９，８３９号を参照のこと）。
【０１３２】
様々な化合物（放射性核金属キレート、毒素、および薬物が含まれる）のタンパク質（例えば、抗体）への結合のための多くの手順およびリンカー分子が公知である（例えば、欧州特許出願番号；米国特許第１８８，２５６；米国特許第４，６７１，９５８号、同第４，６５９，８３９号、同第４，４１４，１４８号、同第４，６９９，７８４号、同第４，６８０，３３８号、同第４，５６９，７８９号、および同第４，５８９，０７１号、ならびにＢｏｒｌｉｎｇｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：４０７１−４０７５を参照のこと）。具体的には、様々な免疫毒素の生産が当該分野で周知であり、例えば、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｉｍｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍａｇｉｃ  Ｂｕｌｌｅｔ，”Ｔｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１６８−１９０（１９８２），Ｗａｌｄｍａｎｎ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：１６５７、米国特許第４，５４５，９８５号および同第４，８９４，４４３号に見ることができる。
【０１３３】
いくつかの状況では、キメラ部分がその標的部位と反応すると、二重特異的抗体および／または多特異的抗体からエフェクター分離が遊離させられることが所望される。したがって、エフェクターが標的部位で遊離させられる場合には、標的部位の近くで切断することができる連結が含まれているキメラ結合体を使用することができる。抗体から因子を放出させるための連結の切断は、免疫結合体が標的細胞の内部で、または標的部位の近くのいずれかで曝される酵素活性または条件によって促進される場合がある。標的部位が腫瘍である場合には、腫瘍部位に存在している条件下で（例えば、腫瘍関連酵素または酸性ｐＨに曝された場合に）切断することができるリンカーが使用される場合がある。
【０１３４】
多数の様々な切断することができるリンカーが当業者に公知である。例えば、米国特許第４，６１８，４９２号；同第４，５４２，２２５号；および同第４，６２５，０１４号を参照のこと。これらのリンカー基から因子を解離させるための機構としては、例えば、光解離性の結合の照射および酸で触媒される加水分解が挙げられる。例えば、米国特許第４，６７１，９５８号には、患者の補体システムのタンパク質分解酵素によってインビボにおいて標的部位で切断されるリンカーが含まれている免疫結合体の記載が含まれる。様々な放射線画像診断用化合物、放射線治療用化合物、薬物、毒素、および他の因子を抗体に結合させるための多数の方法が報告されていることを考慮して、当業者は、抗体または他のポリペプチドに対して任意の因子を結合させるための適切な方法を決定することができるであろう。
【０１３５】
２．キレートの結合
特に好ましい実施形態においては、エフェクターには、抗体に対して、またはエピトープタグに対して結合させられたキレートが含まれる。二重特異的抗体および／または多特異的抗体は、対応するエピトープタグまたは抗体を有しており、その結果、キレートに対して二重特異的抗体および／または多特異的抗体を単に接触させることによって、エフェクターに対する抗体の結合が生じる。混合工程は、この部分が使用された後に行うことができ（プレ標的化ストラテジー）、また、標的組織を、二重特異的抗体および／または多特異的抗体に結合させて、その後にキレートを誘導することもできる。様々な標的化分子に結合させるために適しているキレートを生産する方法は、当業者に周知である（例えば、米国特許第６，１９０，９２３号、同第６，１８７，２８５号、同第６，１８３，７２１号、同第６，１７７，５６２号、同第６，１５９，４４５号、同第６，１５３，７７５号、同第６，１４９，８９０号、同第６，１４３，２７６号、同第６，１４３，２７４号、同第６，１３９，８１９号、同第６，１３２，７６４号、同第６，１２３，９２３号、同第６，１２３，９２１号、同第６，１２０，７６８号、同第６，１２０，７５１号、同第６，１１７，４１２号、同第６，１０６，８６６号、同第６，０９６，２９０号、同第６，０９３，３８２号、同第６，０９０，８００号、同第６，０９０，４０８号、同第６，０８８，６１３号、同第６，０７７，４９９号、同第６，０７５，０１０号、同第６，０７１，４９４号、同第６，０７１，４９０号、同第６，０６０，０４０号、同第６，０５６，９３９号、同第６，０５１，２０７号、同第６，０４８，９７９号、同第６，０４５，８２１号、同第６，０４５，７７５号、同第６，０３０，８４０号、同第６，０２８，０６６号、同第６，０２２，９６６号、同第６，０２２，５２３号、同第６，０２２，５２２号、同第６，０１７，５２２号、同第６，０１５，８９７号、同第６，０１０，６８２号、同第６，０１０，６８１号、同第６，００４，５３３号、および同第６，００１，３２９を参照のこと）。
【０１３６】
３）融合タンパク質の生産
二重特異的抗体および／または多特異的抗体、ならびに／あるいはエフェクター分子がいずれも単鎖タンパク質であり、比較的短い（すなわち、約５０アミノ酸未満）である場合には、これらは、標準的な化学的なペプチド合成技術を使用して合成することができる。いずれの成分も比較的短い場合は、キメラ部分は、１つの連続するポリペプチドとして合成することができる。あるいは、二重特異的抗体および／または多特異的抗体とエフェクター分子は、別々に合成し、その後、一方の分子のアミノ末端を他方の分子のカルボキシル末端と縮合させ、それによってペプチド結合を形成させることによって融合させることもできる。あるいは、二重特異的抗体および／または多特異的抗体とエフェクター分子は、それぞれ、ペプチドスペーサー分子の一方の末端で縮合させることができ、それによって連続する融合タンパク質を形成させることができる。
【０１３７】
配列のＣ末端が不溶性支持体に結合させられ、その後、配列中の残りのアミノ酸が連続的に付加される固相合成は、本発明のポリペプチドの化学合成の好ましい方法である。固相合成のための技術は、Ｂａｒａｎｙ  ａｎｄ  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；  ３−２８４頁、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第２巻：Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ  Ａ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５６（１９６３）、およびＳｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）に記載されている。
【０１３８】
好ましい実施形態においては、二重特異的抗体および／または多特異的抗体が単鎖ポリペプチドであり、そしてエフェクターがポリペプチドである場合には、本発明のキメラ融合タンパク質は、組み換えＤＮＡ方法を使用して合成される。一般的には、これには、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を作成する工程、特定のプロモーターの制御下になるように発現カセットの中にＤＮＡを配置する工程、宿主の中でタンパク質を発現させる工程、発現させられたタンパク質を単離する工程、および必要に応じて、タンパク質を再度復元する（ｒｅｎａｔｕｒｉｎｇ）工程が含まれる。
【０１３９】
本発明の融合タンパク質（例えば、ＡＬＭ−ＰＥ３８ＱＱＲ）をコードするＤＮＡは、任意の適切な方法によって調製することができ、これには例えば、適切な配列のクローニングおよび制限、またはＮａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−１８６２のジエチルホスホルアミダイト法のような方法による直接的な化学合成；ならびに、米国特許第４，４５８，０６６号の固相方法が含まれる。
【０１４０】
化学合成によって一本鎖のオリゴヌクレオチドが得られる。これは、相補的な配列とのハイブリダイゼーションによって、または鋳型としてこの一本鎖を使用するＤＮＡポリメラーゼを用いた重合によって、二本鎖のＤＮＡに変換される場合もある。当業者は、ＤＮＡの化学合成は約１００塩基の配列に限定されるが、より長い配列を、より短い配列の連結によって得ることができることを理解している。
【０１４１】
あるいは、サブ配列をクローニングして、そして、適切なサブ配列を適切な制限酵素を使用して切断することができる。その後、断片を所望されるＤＮＡ配列が得られるように連結させることができる。
【０１４２】
好ましい実施形態においては、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡが、ＤＮＡ増幅方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））を使用してクローニングされる場合もある。したがって、例えば、二重特異的抗体および／または多特異的抗体をコードする核酸は、ＮｄｅＩの制限部位が含まれているセンスプライマーと、ＨｉｎｄＩＩＩの制限部位が含まれているアンチセンスプライマーを使用してＰＣＲ増幅される。これにより、二重特異的抗体および／または多特異的抗体配列をコードしており、そして末端に制限部位を有している核酸が得られる。ＰＥ３８ＱＱＲ断片は、Ｄｅｂｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７４４−７４８に記載されているプラスミドｐＷＤＭＨ４−３８ＱＱＲまたはプラスミドｐＳＧＣ２４２ＦｄＮ１の切断産物であり得る。二重特異的抗体および／または多特異的抗体とＰＥ３８ＱＱＲ配列の連結、ならびに、ベクターへの挿入によっては、ＰＥ３８ＱＱＲのアミノ末端（ＰＥの２５３位）に連結させられた二重特異的抗体および／または多特異的抗体をコードするベクターが得られる。２つの分子は、制限部位によって導入されたグルタミン酸、アラニン、およびフェニルアラニンからなる３個のアミノ酸の連結部分によって連結される。
【０１４３】
２つの分子は、互いに直接連結されることが本質的には好ましいが、当業者は、複数の分子が、１つ以上のアミノ酸からなるペプチドスペーサーによって間隔が隔てられる場合があることを理解するであろう。一般的には、スペーサーは、タンパク質を連結させること、またはそれらの間に一定の最小限の距離もしくは他の空間的関係を保つ以外の他の特異的な生物学的活性は有していないであろう。しかし、スペーサーの構成アミノ酸は、折り畳み、正味の電荷、または疎水性のような分子のいくつかの特性に影響を与えるように選択することもできる。
【０１４４】
融合タンパク質をコードする核酸配列は、様々な宿主細胞の中で発現させることができ、これには、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、他の細菌宿主、酵母、および様々なより高等な真核生物細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、およびＨｅＬａ細胞株、ならびに骨髄腫細胞株）が含まれる。組み換え体タンパク質の遺伝子は、個々の宿主について適切な制御配列に対して作動可能に連結させられるであろう。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）については、これには、プロモーター（例えば、Ｔ７、ｔｒｐ、またはλプロモーター）、リボソーム結合部位、および好ましくは、転写終結シグナルが含まれる。真核生物細胞については、制御配列には、プロモーター、および、好ましくは、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０サイトメガロウイルスなどに由来するエンハンサーと、ポリアデニル化配列が含まれるであろう。これには、スプライシングドナー配列とアクセプター配列が含まれる場合がある。
【０１４５】
本発明のプラスミドは、周知の方法（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の塩化カルシウム形質転換、およびリン酸カルシウムでの処理、または哺乳動物細胞についてはエレクトロポレーション）によって、選択された宿主細胞に導入することができる。プラスミドで形質転換された細胞は、プラスミドに含められた遺伝子（例えば、ａｍｐ、ｇｐｔ、ｎｅｏ、およびｈｙｇ遺伝子）によって付与された抗生物質に対する耐性によって選択することができる。
【０１４６】
一旦発現させられると、組み換え体である融合タンパク質は、当該分野で標準的である手順にしたがって精製することができ、これには、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などが含まれる（一般的には、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ（１９８２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８２巻：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。少なくとも約９０から９５％の均質性である実質的に純粋な組成物が好ましく、９８から９９％、またはそれ以上の均質性が、医薬品への使用には最も好ましい。一旦、部分的に、または所望される均質性になるように精製されると、その後、ポリペプチドは治療的に使用することができる。
【０１４７】
当業者は、化学合成、生物学的発現、または精製の後に、ＥＧＦＲポリペプチドを標的化する融合タンパク質が、構成要素であるポリペプチドの自然界での立体構造とは実質的に異なる立体構造を有する可能性があることを理解するであろう。この場合、ポリペプチドを変性させ、そして還元させること、その後、ポリペプチドを好ましい立体構造へと再度折り畳ませることが必要な場合がある。タンパク質を還元させ、そして変性させる方法、および再折り畳みを誘導する方法は当業者に周知である（Ｄｅｂｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１４０６５−１４０７０；Ｋｒｅｉｔｍａｎ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，４：５８１−５８５；および、Ｂｕｃｈｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０５：２６３−２７０を参照のこと）。
【０１４８】
当業者は、それらの生物学的活性を低下させることなく、融合タンパク質に対して修飾を行うことができることを理解している。いくつかの修飾によって、標的化分子のクローニング、発現、または融合タンパク質への取り込みが容易にすることができる。このような修飾は当業者には周知であり、これには、例えば、開始部位を提供するためのアミノ末端へのメチオニンの付加、または便利であるように配置された制限部位もしくは終結コドンを作成するためのいずれかの末端へのさらなるアミノ酸の配置が含まれる。
【０１４９】
ＩＶ．二重特異的抗体分子および／またはキメラ部分の使用
２つの異なる抗原に対して親和性を有している二重特異的抗体は、治療および診断において広範な用途を有している。特に、本発明のｂｓ−抗体分子（例えば、ｂｓ−ｓｃＦｖ）は：（１）ＥＧＦＲタンパク質ファミリーのメンバーを過剰発現している腫瘍の成長を直接変化させるために；（２）他の細胞傷害性因子（例えば、化学療法薬、外部線照射、標的化させられた放射性同位元素、および他の抗体またはシグナル伝達阻害因子）と一緒に；そして（３）ＥＧＦＲタンパク質ファミリーのメンバーを発現する標的化された腫瘍細胞に対して直接に多種多様の細胞傷害性因子またはエフェクター細胞を動員するために、使用することができる。
【０１５０】
本発明のｂｓ−ｓｃＦｖ抗体を利用する特異的な腫瘍細胞に対する細胞傷害性因子またはエフェクター細胞の標的化によっては、正常な組織と比較した腫瘍細胞上でのこれらの標的の発現の増大が原因で、付加された腫瘍に対する特異性が提供される。加えて、二重特異的抗体は、複数の受容体または受容体の構成成分に結合することができ、それによって、複数の受容体または受容体の複数の構成成分を架橋して、細胞傷害作用および／または細胞増殖抑制効果を生じる。正常な組織上の１つの標的にしか結合しない抗体をベースとする試薬は、通常は、複数の受容体を架橋することはなく、細胞毒性の結果を誘発することもない。
【０１５１】
加えて、単特異的抗体は、通常、標的細胞に対して低い親和力を示す。対照的に、本発明の二重特異的抗体は、標的細胞（単数または複数）に対して高い親和力を示し、これは、抗体／標的複合体を安定化させることを助け、そして抗体の細胞との長期間にわたる会合を提供し、したがって、両方の標的を過剰発現する腫瘍細胞に対するさらなる特異性を試薬に提供する。
【０１５２】
加えて、ＥＧＦＲタンパク質ファミリーの複数のメンバーに対する抗体の結合によっては、多くの場合に、これらのタンパク質のインターナライゼーションが誘発され、これによってこれらの抗体は、毒素、薬物、放射性同位体、または他の細胞傷害性因子の送達のための効果的な足場が作成される。ＡＬＭは、腫瘍細胞の表面上にあるＨＥＲ２／ｎｅｕおよびＨＥＲ３の量の減少を媒介し、このことは、同様のインターナライゼーション機構を示唆している。したがって、これらのｂｓ−ｓｃＦｖ分子と細胞傷害性因子または他の因子（エフェクター）との（例えば、キメラ部分の中での）結合によって、両方の標的を過剰発現する細胞に対する効率的な送達が生じ、したがって、治療の特異性および効率が増大するであろう。エフェクター細胞と相互作用するさらなる配列（例えば、Ｆｃ受容体標的化アーム）を取り込ませることによって、標的化特異性における同様の増大もまた、エフェクター細胞をベースとする処置ストラテジーに取り込ませることができる。
【０１５３】
本発明の二重特異的抗体分子はまた、治療薬（例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エクソトキシン、ジフテリア（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）毒素、様々な腫瘍抑制因子遺伝子、様々な標識など）をコードする核酸の直接的な標的化およびインターナライゼーションのための遺伝子治療に使用することもできる。加えて、二重特異的抗体は、細胞毒性放射性部分（例えば、２１１Ａｔ）に対して、放射線増感剤に対して、および様々な検出可能な標識（例えば、放射線不透過性標識）に対して、例えば、キレートを介して結合させることができる。加えて、二重特異的抗体分子は、脂質、リポソーム、デンドリマーなどに結合させることができる。脂質、リポソーム、およびデンドリマーは、様々な治療用部分（例えば、以下が含まれるが、これらに限定はされない抗ガン剤：アルキル化剤（例えば、ブスルファン、クロラムブシル、シス−プラチン、シアノモルホリノドキソルビシンなど）、抗生物質（例えば、アロコルヒチン、コルヒチン（ｃｏｈｃｈｉｃｉｎｅ）、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチンなど）、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、カンプトテシン、アミノカンプトテシンなど）、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、ドキソルビシン、アモナフィド、ダウノルビシン、デオキシドキソルビシン、ミトキサントロンなど）、ＲＮＡ／ＤＮＡ代謝拮抗物質（例えば、アシビシン、フトラフール、メトトレキセート、トリメトレキセートなど）；ＤＮＡ代謝拮抗物質（例えば、２’デオキシ−５−フルオソウリジン、シクロシチジン、グアナゾールなど））と複合体を組み合わせ、そして／また、それらをカプセル化することができる。脂質、リポソーム、およびデンドリマーはまた、タンパク質治療薬、例えば、治療用部分をコードする核酸などとも組み合わせることができる。
【０１５４】
上記のように、キメラ部分の標的化成分として使用される場合は、本発明の二重特異的抗体および／または多特異的抗体は、標的ＥＧＦＲタンパク質を発現している標的細胞（単数または複数）に対して会合させられたエフェクターを優先的に標的化／送達する。細胞とのエフェクターの会合（例えば、接触時間または接触量）（接触または非常な接近）を増大させることにより、本発明の抗体の、細胞の中にエフェクターをインターナライズす可能性、および／またはその細胞に対してその特徴的な活性を発揮する可能性が高まる。
【０１５５】
したがって、例えば、二重特異的抗体または多特異的抗体によって標的化されたリポソームあるいは他の治療用媒体（リポソーム、ウイルスなど）は、標的である腫瘍に対する暴露の増加を示す。例示的な実施形態においては、リポソームは、腫瘍の特異的な標的化を促進させるために、本発明のｂｓ−ｓｃＦｖ抗体分子に散りばめることができる。抗ガン剤（例えば、化学療法薬、抗体、アンチセンス分子、および／または放射性同位元素）は、そのように修飾されたリポソームの中にカプセル化することができる。
【０１５６】
別の実施形態においては、二重特異的抗体または多特異的抗体（例えば、ｂｓ−ｓｃＦｖ抗体）分子を使用して、遺伝子治療ベクター（修飾されたウイルスが含まれるが、これに限定はされない）を標的抗原を両方発現している細胞に対して指向させることができる。ウイルスはまた、それらが生産され得て細胞のマイクロ環境に分泌され得る腫瘍細胞に対して、これらのｂｓ−ｓｃＦｖ抗体分子の遺伝子を送達するために利用することができ、あるいは、さらなる細胞内標的化配列の付加によって、これらを、特異的な細胞の構成成分に局在化させてそれらの標的の発現をノックアウトしてしまうイントラボディーへと変化させることもできる。
【０１５７】
加えて、本発明の二重特異的抗体または多特異的抗体（例えば、ｂｓ−ｓｃＦｖ抗体）分子は、ＥＧＦＲタンパク質ファミリーの複数のメンバーの異常な発現を検出するためにも有利に使用することができる。このような検出によっては、これらの細胞表面タンパク質によって促進される異常な腫瘍の増殖が関係しているガンの初期診断が導かれ得る。一般的には、免疫複合体の形成の検出は当該分野で周知であり、多数のアプローチの適用によって行うことができる。これらの方法は、一般的には、標識またはマーカー（例えば、当該分野で標準的に使用されている任意の放射性、蛍光、生物学的、もしくは酵素タグまたは標識）の検出に基づく。このような標識の使用に関する米国特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号が挙げられる。もちろん、当業者であれば、当該分野で公知であるように、二次抗体のような二次結合リガンドの使用、またはアビジン／ビオチン結合処理の使用によってさらなる利点を見出すことができるであろう。
【０１５８】
Ｖ．ｂｓ−ｓｃＦｖ抗体分子の投与：
Ａ）薬学的処方物
本明細書中に記載されるように、二重特異的抗体またはｂｓ−ｓｃＦｖ抗体分子またはキメラ部分には、直接、そして／または単位投与量形態の調製物の中で使用することができる、非薬学的組成物（例えば、純粋ではない組成物または滅菌されていない組成物）、および薬学的組成物（すなわち、被験体もしくは患者（すなわち、ヒト被験体もしくはヒト以外の被験体）への投与に適している組成物）の製造に有用な、バルクの薬物組成物が含まれる。特定の実施形態においては、このような組成物には、治療有効量の１つ以上の治療薬（例えば、二重特異的抗体および／もしくは多特異的抗体、あるいは／またはこのような抗体が含まれているキメラ部分）と、薬学的に許容される担体が含まれる。
【０１５９】
上記のように、本発明の薬剤は、他種多様な状況で使用することができ、これには、腫瘍またはガン細胞の検出および／もしくは画層化、腫瘍の成長および／またはガン細胞の成長および／もしくは増殖の阻害などが含まれるが、これらに限定はされない。本発明の１つ以上の二重特異的抗体、および／または機能化させられた二重特異的抗体、および／またはキメラ部分は、注射によって、すなわち、静脈内に、筋肉内に、皮内に、皮下に、十二指腸内に、または腹腔内に投与することができる。また、特定の実施形態においては、化合物は、吸入によって、例えば、鼻腔内に投与することができる。加えて、特定の化合物は、経口で、または経皮的に投与することができる。
【０１６０】
特異的な実施形態においては、用語「薬学的に許容される」は、連邦政府もしくは州政府の監督官庁によって承認されたこと、あるいは、米国薬局方または他の一般的に認識されている動物（より具体的には、ヒト）での使用についての薬局方に列挙されていること、あるいは、動物またはヒトへの投与に適していることを意味する。用語「担体」は、治療薬がそれとともに投与される、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイト（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ）のアジュバント（完全なアジュバントおよび不完全なアジュバント））、賦形剤、または媒体を意味する。このような薬学的担体は、滅菌の液体（例えば、水性または油性）であり得、これには、ワセリン、動物、植物、もしくは合成の起源のもの（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）の滅菌の液体が含まれる。薬学的組成物が静脈内に投与される場合には、水が好ましい担体である。生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、液体担体として、特に注射用の溶液に使用することができる。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、コムギ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物にはまた、所望される場合には、主要ではない量の、湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含まれ得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放処方物などの形態とすることができる。
【０１６１】
一般的には、本発明の組成物の成分は、別々に、または単位投与量形態に一緒に混合されてのいずれかで、例えば、凍結乾燥粉末、または水を含まない濃縮物として、特定の量の有効成分を示す密閉されシールされた容器（例えば、アンプルまたは小さい包み（ｓａｃｈｅｔｔｅ））の中に、供給される。組成物が注入によって投与される場合には、これは、滅菌された薬学的等級の水または生理食塩水が含まれている注入用ボトルを用いて分散させることができる。組成物が注射によって投与される場合は、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され、成分を投与前に混合することができる。
【０１６２】
本発明の組成物は、中性の形態または塩の形態として提供することができる。薬学的に許容される塩としては、陰イオンを用いて形成されたもの（例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されたもの）、ならびに、陽イオンを用いて形成されたもの（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されたもの）が挙げられる。
【０１６３】
本発明の二重特異的抗体および／または機能化させられた二重特異的抗体および／またはキメラ部分が含まれている薬学的組成物は、通常の、混合、溶解、顆粒化、糖衣錠を作成すること、ゲル化（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、捕捉、または凍結乾燥のプロセスによって製造することができる。薬学的組成物は、薬学的に使用することができる調製物にするための分子の処理を容易にする、生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または助剤の１つ以上を使用して、従来の様式で処方することができる。適切な処方物は、選択される投与経路に応じて様々である。
【０１６４】
局所または経皮投与については、本発明の二重特異的抗体および／または機能化させられた二重特異的抗体および／またはキメラ部分は、当該分野で周知であるように、溶液剤、ゲル剤、軟膏、クリーム剤、ローション剤、エマルジョン、懸濁剤などとして処方することができる。全身用の処方物には、注射（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内、または腹腔内注射）による投与のために設計された処方物、ならびに、経皮、経粘膜、吸入、経口、または肺投与のために設計された処方物が含まれる。
【０１６５】
注射については、本発明の二重特異的抗体および／または機能化させられた二重特異的抗体および／またはキメラ部分は、水溶液に、好ましくは、生理学的に適合する緩衝液（例えば、ハンクス（Ｈａｎｋｓ’ｓ）溶液、リンガー（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ）溶液、または生理食塩緩衝液）の中に処方することができる。溶液には、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤のような処方剤を含めることができる。あるいは、鉄キレート剤（単数または複数）が含まれている組成物は、使用前に、適切な媒体（例えば、滅菌の発熱物質が含まれていない水）で構成するための粉末の形態であり得る。
【０１６６】
経粘膜投与については、透過させられるバリアに適している浸透剤が処方物の中で使用される。このような浸透剤は通常は当該分野で公知である。
【０１６７】
経口投与については、本発明の二重特異的抗体および／または機能化させられた二重特異的抗体および／またはキメラ部分は、薬剤（単数または複数）を当該分野で周知の薬学的に許容される担体と混合することによって容易に処方することができる。このような担体は、薬剤（単数または複数）を、処置される患者によって経口摂取される、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして処方できるようにする。経口用の固形の処方物（例えば、散剤、カプセル剤、および錠剤）については、適切な賦形剤には、増量剤（例えば、糖（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、およびソルビトール）；セルロース調製物（例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ））；造粒剤；ならびに結合剤が含まれる。所望される場合には、崩壊剤（例えば、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム））が添加される場合がある。
【０１６８】
所望される場合には、固体の投与量形態は、標準的な技術を使用して、糖でコーティングされる場合も、また、腸溶性コーティングされる場合もある。
【０１６９】
経口用の液体調製物（例えば、懸濁剤、エリキシル剤、および溶液剤）については、適切な担体、賦形剤、または希釈剤には、水、グリコール、油、アルコールなどが含まれる。加えて、香味剤、保存剤、着色剤などを添加することができる。
【０１７０】
舌下投与については、鉄キレート剤（単数または複数）は、通常の様式で処方された、錠剤、トローチ剤などの形態とすることができる。
【０１７１】
吸入による投与については、本発明の二重特異的抗体および／または機能化させられた二重特異的抗体および／またはキメラ部分は、通常は、適切な推進剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切な気体）を使用して、加圧型のパックまたはネブライザーからエアゾールスプレーの形態で送達される。加圧型エアゾールの場合には、投与量単位は、定量を送達するためのバルブを備えることによって決定することができる。吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ）または吸入器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）で使用するためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジを処方することができ、これには、鉄キレート剤（単数または複数）と適切な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプン）の混合粉末が含まれる。
【０１７２】
本発明の二重特異的抗体および／または機能化させられた二重特異的抗体および／またはキメラ部分はまた、（例えば、従来の坐剤基剤（例えば、ココアバターまたは他のグリセリド）が含まれている）直腸用組成物または膣用組成物（例えば、坐剤または停留浣腸）に処方することもできる。
【０１７３】
上記に記載された処方物に加えて、本発明の二重特異的抗体および／または機能化させられた二重特異的抗体および／またはキメラ部分は、デポー調製物として処方することもできる。このような長期作用型の処方物は、移植（例えば、皮下または筋肉内）によって、あるいは、筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、本発明の薬剤（単数または複数）は、適切なポリマー材料または疎水性材料とともに（例えば、許容可能な油の中のエマルジョンとして）、あるいは、イオン交換樹脂と共に、あるいは、難溶性誘導体として（例えば、難溶性の塩として）処方することができる。
【０１７４】
他の薬学的送達システムもまた使用することができる。リポソームとエマルジョンは、本発明の二重特異的抗体および／または機能化させられた二重特異的抗体および／またはキメラ部分を送達するために使用することができる送達媒体の周知の例である。特定の有機溶媒（例えば、ジメチルスルフォキシド）もまた使用することができるが、通常は、毒性がより大きくなる。加えて、本発明の二重特異的抗体および／または機能化させられた二重特異的抗体および／またはキメラ部分は、徐放システム（例えば、治療薬が含まれている固体のポリマーの半透過性マトリックス）を使用して送達することができる。様々な徐放性の材料が確立されており、当業者に周知である。徐放カプセルは、それらの化学的性質に応じ様々であり得、数日間、数週間、または１００日を越えて有効成分（単数または複数）を放出することができる。薬剤（単数または複数）の化学的性質および生物学的安定性に応じて、安定化のためのさらなるストラテジーを使用することができる。
【０１７５】
本発明の二重特異的抗体および／または機能化させられた二重特異的抗体および／またはキメラ部分に、電荷を有している側鎖または末端が含まれる場合には、これらは、遊離の酸もしくは塩基として、または薬学的に許容される塩として、上記の処方物の任意のものに含めることができる。薬学的に許容される塩は、遊離の塩基の生物学的活性を実質的に保持しており、そして無機酸との反応によって調製されるそれらの塩である。水性溶媒および他のプロトン性溶媒の中でより溶解する傾向がある薬学的な塩は、対応する遊離の塩基の形態である。
【０１７６】
Ｂ）有効投与量
本発明の二重特異的抗体および／または機能化させられた二重特異的抗体および／またはキメラ部分は、一般的には、意図される目的（例えば、腫瘍もしくはガン細胞を画像化するため、ガン細胞の成長および／もしくは増殖を阻害するためなど）を達成するために有効量で使用されるであろう。特定の好ましい実施形態においては、本発明の方法で利用される二重特異的抗体および／または機能化させられた二重特異的抗体および／またはキメラ部分は、ガン細胞の増殖および／もしくは成長を部分的または完全に阻害するために、あるいは、ＥＧＦＲファミリーのタンパク質の過剰発現を特徴とするガン細胞もしくは腫瘍の視覚化を可能にするために有効な用量で投与される。特定の実施形態においては、ガン細胞の成長および／または増殖を９０％、より好ましくは、９５％、そして最も好ましくは、９８％または９９％の信頼水準で阻害する投与量が選択される。好ましい有効量は、腫瘍の成長を減少させるかもしくは妨げる、あるいは、ガン細胞の検出および／または視覚化を容易にする量である。細胞の成長および増殖の阻害因子に関しては、化合物は同じ用量レベルで予防的に使用することもできる。
【０１７７】
通常、本発明の二重特異的抗体および／または機能化させられた二重特異的抗体および／またはキメラ部分、あるいはそれらの薬学的組成物は、治療有効量で投与または塗布される。治療有効量は、ガン細胞および／または腫瘍の発症もしくは進行（例えば、成長および／または増殖）を減少させる、あるいは防ぐために有効な量である。治療有効量の決定は、特に、本明細書中に提供される詳細な開示を考慮して、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１７８】
全身投与については、治療有効用量は、インビトロでのアッセイによって最初に概算することができる。例えば、用量は、動物モデルにおいて処方することができ、細胞培養物中で決定されたＩＣ５０が含まれる循環濃度の範囲が得られる。このような情報は、ヒトに有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０１７９】
初期量もまた、インビボでのデータ（例えば、動物モデル）から、当該分野で周知の技術を使用して概算することができる。当業者は、動物でのデータに基づいてヒトへの投与を容易に最適化することができる。
【０１８０】
投与量および間隔は、治療効果を維持するために十分な阻害剤の血漿レベルが提供されるように、個別に調整することができる。
【０１８１】
典型的な治療薬についての投与量は当業者に公知である。さらに、このような投与量は、通常、事実上は助言的なものであり、特定の治療状況、患者の耐容性などに応じて調整することができる。組成物の単回投与または複数回投与を、患者が必要としているかまたは寛容化できる投与量および頻度に応じて投与することができる。
【０１８２】
特定の実施形態においては、約１μｇの初期量、好ましくは、一日に約１ｍｇから約１０００ｍｇ／ｋｇが有効であろう。約５から７５ｍｇの一日量の範囲が好ましい。しかし投与量は、患者の要望、処置される症状の重篤度、および使用される化合物に応じて変わり得る。特定の状況についての適切な投与量の決定は当業者の能力の範囲内である。一般的には、処置は、化合物の最適用量よりも少ない、少量の投与量を用いて開始される。その後、投与量は、その状況下での最適な効果が得られるまで、少量の増分で増加させられる。便宜上、一日量の合計は、分割することができ、そして所望される場合には、１日の間に複数回投与することができる。典型的な投与量は、約０．１から約５００ｍｇ／ｋｇであり、理想的には、約２５から約２５０ｍｇ／ｋｇであろう。
【０１８３】
局所投与または選択的取り込みの場合には、二重特異的抗体および／またはキメラ分子の有効な局所濃度は、血漿濃度にはおそらく関係はない。当業者は過度の実験を行うことなく、治療上有効な局所投与量を最適化することができるであろう。抗体および／またはキメラ部分の量は、もちろん、処置される被験体、被験体の体重、苦痛の重篤度、投与形式、および処方する医師の判断に応じて様々であろう。
【０１８４】
治療は断続的に繰り返すことができる。特定の実施形態においては、二重特異的抗体分子が含まれている薬学的調製物は、適切な間隔で、病理学的兆候が軽減するかまたは緩和されるまで、例えば、１日に少なくとも２回以上、投与することができる。その後、投与量は、維持レベルにまで減少させることができる。特定の場合には、適切な間隔は、通常は患者の症状に応じて様々である。治療は、単独で提供することができ、また、他の薬物、および／または放射線治療、および／または外科手術手順と組み合わせて提供することもできる。
【０１８５】
Ｃ）毒性
好ましくは、本明細書中に記載される本発明の二重特異的抗体および／または機能化させられた二重特異的抗体および／またはキメラ部分の治療有効量によっては、実質的な毒性を引き起こすことなく、治療的利点が提供されるであろう。
【０１８６】
本明細書中に記載される薬剤の毒性は、細胞培養物中で、または実験用動物において標準的な薬学的手順によって、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％を致死させる用量）またはＬＤ１００（集団の１００％を致死させる用量）を決定することによって決定することができる。毒性作用と治療効果との間での線量率（ｄｏｓｅ  ｒａｔｉｏ）が治療指数である。高い治療指数を示す試薬が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験によって得られたデータを、ヒトで使用される毒性のない投与量範囲を定義するために使用することができる。本発明の二重特異的抗体および／または機能化させられた二重特異的抗体および／またはキメラ部分の投与量は、毒性が低いかまたは毒性のない有効量が含まれる循環濃度の範囲にあることが好ましい。投与量は、使用される投与量形態および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変えることができる。正確な処方、投与経路、および投与量は、患者の症状を考慮して個々の医師によって選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第１章、１ページを参照のこと）。
【０１８７】
ＶＩ．キット
本発明にはさらに、インビボで、および／または生物学的試料中でＥＧＦＲタンパク質ファミリーの複数のメンバーを発現するあるいは過剰発現する細胞を検出することに使用されるキットが含まれる。上皮成長因子ファミリー（例えば、ガン細胞）の複数のメンバーを発現している、または過剰発現している細胞の成長および／または増殖を阻害するためのキットもまた提供される。
【０１８８】
特定の実施形態においては、キットには、ＥＧＦＲタンパク質ファミリーの複数のメンバーの上にある少なくとも２つのエピトープに特異的な１つ以上の本発明の二重特異的抗体および／または多特異的抗体が含まれる。特に好ましい実施形態においては、抗体は二重特異的ｓｃＦｖ抗体である。用途に応じて、抗体は、本明細書中に記載されるようなエフェクター（例えば、放射性部分、リポソーム、細胞毒素、別の抗体など）に結合させるためのリンカーおよび／またはキレート剤で機能化させることができる。
【０１８９】
特定の実施形態においては、キットには、例えば、ＥＧＦＲタンパク質ファミリーの複数のメンバーに特異的な本発明のｂｓ−ｓｃＦｃ抗体分子、ならびに、ｂｓ−ｓｃＦｖ抗体分子の検出に使用される緩衝液および他の成分が含まれ得る。
【０１９０】
キットにはまた、例えば、ガン細胞を検出するための抗体の使用を教示している、および／または機能化試薬との抗体の結合を教示している、あるいは、画像化および／または治療的用途のための機能化させられた抗体の使用を教示している説明用の材料も含まれる。特定の実施形態においては、（第２の容器の中の）１つ以上のエフェクター（例えば、細胞毒素、放射標識）を伴う（第１の容器の中の）リンカーおよび／またはキレート剤を用いて機能化させられた抗体が提供される。その結果、２つの成分は、別々に投与することができ（例えば、プレ−標的化アプローチにおいて）、また、２つの成分を使用の直前に投与することもできる。
【０１９１】
特定の説明用の材料によっては、推奨される投与レジュメ、カウンターの指示などが提供されるであろう。説明用の材料には通常、記載された材料または印刷された材料が含まれるが、これらはそれらに限定はされない。このような説明を保存し、そして末端の使用者に連絡をとることができる任意の媒体が、本発明によって想定される。このような媒体としては、電気的保存媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）などが挙げられるが、これらに限定はされない。このような媒体には、それらが提供されているインターネットサイト上のアドレスが含まれる場合がある。
【実施例】
【０１９２】
以下の実施例は説明のために提供され、請求される本発明を限定するためのものではない。
【０１９３】
実施例１
Ｂｓ−Ｓｃｆｖ抗体分子の調製
ＥＧＦＲとＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現は、多くの固形腫瘍において予後不良と関係している。これらの受容体を介するシグナル伝達を混乱させる抗体（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ７（抗ＨＥＲ２）およびＣ２２５（抗ＥＧＦＲ）は、ガンの処置における有意な有用性が明らかにされている。ＥＧＦＲファミリーの複数のメンバー（ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ３、およびＨｅｒ４）を介するシグナル伝達は、リガンドの結合によって誘発されるこれらの受容体のホモ二量体、ヘテロ二量体、またはヘテロ多量体の形成に依存する。これらの受容体タンパク質の複数のエピトープの対が組み合わせられている二重特異的ｓｃＦｖ抗体分子を、ガン性の腫瘍細胞中でのこれらのシグナル伝達複合体の形成を防ぐことにおける使用のために、本明細書中で以下に記載するように作成した。
【０１９４】
Ｉ．材料および方法：
以下の材料および方法を本発明の実施を容易にするために提供した：
Ａ．クローニング：
ＥＧＦＲファミリーの様々なメンバー（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４）に特異的な単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体分子をコードする遺伝子は全て、Ｊｉｍ  Ｍａｒｋｓ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）から入手した。ｓｃＦｖ遺伝子は、大きな処理していないヒトｓｃＦｖライブラリーから単離した。ＥＧＦＲタンパク質に特異的なｓｃＦｖ遺伝子は、これらのタンパク質の細胞外ドメインに対する選択によって単離した。ｓｃＦｖ遺伝子は全て、ｐＵＣ１１９ｍｙｃ／ｈｉｓベクターの中の、ＮｃｏＩ制限部位とＮｏｔＩ制限部位の間にある挿入断片として提供された。これらのアームの配列は別表Ａ（Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ａ）に示される（配列番号１〜１０、１９、および２１）。
【０１９５】
１．２０アミノ酸のリンカー分子の構築：
循環中のｂｓ−ｓｃＦｖ抗体のタンパク質分解によって、それらの有効性が限られる場合がある。したがって、全ての明らかになっているタンパク質分解部位が含まれていない新しい２０アミノ酸のリンカーを設計し、そして合成した。リンカーの構築に使用したアミノ酸は、細菌のペリプラズム空間へのタンパク質効率的な輸送を促進するように、主に中性（電荷を有していない、疎水性、または親水性）であるように選択した。新しいリンカー分子をコードする以下の２つのプライマーを合成した：ＬＷ５８３（５＝
【０１９６】
【数１】
2009500005.tif 000007
これらのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって、ＥｃｏＲＩで消化された末端とＨｉｎｄＩＩＩで消化された末端を有している「粘着」末端リンカーを形成させた。この産物を、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで予め消化しておいたｐＥＴ２０ｂ（＋）ベクターに挿入した。プラスミドＤＮＡを、ＤＮＡプラスミドの単離および精製のための市販されているキット（ＱｉａｇｅｎまたはＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｃｏ．）を使用して形質転換されたＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から作成し、その後、「ｐＥＴ２０ｂ（＋）／リンカー（ｐＥＴ２０ｂ（＋）／Ｌｉｎｋｅｒ）」と命名した。リンカー分子は、以下の核酸配列によってコードされ：５’
【０１９７】
【数２】
2009500005.tif 000008
【０１９８】
【数３】
2009500005.tif 000009
（配列番号１４）、そして得られるリンカー分子は以下のアミノ酸配列を有している：
【０１９９】
【数４】
2009500005.tif 000010
（配列番号１１）。
【０２００】
２．ｐＥＴ２０ｂ（＋）／リンカーベクターへの抗ＨＥＲ３遺伝子のクローニング
抗ＨＥＲ３  ｓｃＦｖ抗体分子をコードする遺伝子であるＡ５を、以下の２つのプライマーを用いて、Ａ５−ｐＵＣ１１９ｍｙｃ／ｈｉｓプラスミドから増幅させた：
【０２０１】
【数５】
2009500005.tif 000011
増幅産物とベクターｐＥＴ２０ｂ（＋）／リンカーを、いずれも、ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩ酵素で消化し、連結させ、そしてプラスミドＤＮＡの生産のためにコンピテントＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中に形質転換した。選択した酵素は、リンカーの上流にあるＡ５遺伝子を指向する。次いで、「ｐＥＴ２０ｂ（＋）Ａ５／リンカー」と呼ぶ新しいプラスミドを単離し、そして精製した。
【０２０２】
３．ｐＥＴ２０ｂ（＋）Ａ５／リンカーベクターへの抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子のクローニング：
抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｓｃＦｖ抗体分子をコードする遺伝子ＭＬ３．９を、以下の２つのプライマーを使用してＭＬ３．９−ｐＵＣ１１９ｍｙｃ／ｈｉｓプラスミドから増幅させた：
【０２０３】
【数６】
2009500005.tif 000012
ＰＣＲ増幅産物とプラスミドＤＮＡ（ｐＥＴ２０ｂ（＋）Ａ５／リンカー）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化し、連結させ、そして新しいプラスミドＤＮＡであるｐＥＴ２０ｂ（＋）Ａ５／Ｌｉｎｋｅｒ／ＭＬ３．９の生産のためにコンピテントＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換した。選択した酵素は、リンカー配列の下流にあるＭＬ３．９遺伝子を指向する。次いで、「ＡｐＥＴ２０ｂ（＋）Ａ５／Ｌｉｎｋｅｒ／ＭＬ３．９」と呼ぶ新しいプラスミドを単離し、そして精製した。
【０２０４】
４．ｐＵＣ１１９／ｍｙｃ／ｈｉｓベクターへのＡ５／リンカー／ＭＬ３．９遺伝子のクローニング：
ｐＥＴ２０ｂ（＋）に由来するｂｓ−ｓｃＦｖ産物をコードする核酸分子を、ｐＵＣ１１９ｍｙｃ／ｈｉｓベクターにクローニングした。（ヒスチジン）６タグと１つの「停止」コドン（これは、ｐＥＴベクターの一部である）を、Ａ５／リンカー／ＭＬ３．９核酸構築物と一緒に増幅させた。ＰＣＲ増幅を、以下の２つのプライマーを使用して行った：ＬＷ６８７
【０２０５】
【数７】
2009500005.tif 000013
ｐＵＣ１１９ｍｙｃ／ｈｉｓベクターと増幅産物の、ＮｃｏＩとＮｏｔＩ酵素での消化を行い、その後、連結工程と、ＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）への形質転換を行った。その後、「ｐＵＣ／ＡＬＭ」と呼ぶ得られたプラスミドＤＮＡを精製し、そして単離した（図１）。
【０２０６】
Ｂ．発現クローンの形質転換、ＴＧ１：
ｐＵＣ／ＡＬＭを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１株に形質転換し、Ａ５／リンカー／ＭＬ３．９ｂｓ−ｓｃＦｖ抗体分子を生産するクローンを以下のように単離した。ｂｓ−ｓｃＦｖ分子を一晩透析し、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して固定金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製し、その後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用してＨＰＬＣシステム上でのサイズ排除クロマトグラフィーを行った。
【０２０７】
ＩＩ．結果：
概念の実証として、２つの異なるｂｓ−ｓｃＦｖ抗体分子を作成した。「ＡＬＭ」と命名した第１の抗体分子は、Ａ５  ｓｃＦｖとＭＬ３．９  ｓｃＦｖから構成されており、これは、ＨＥＲ３とＨＥＲ２／ｎｅｕの両方に、それぞれが特異的に結合する。「ＡＬＦ」と命名した第２のｂｓ−ｓｃＦｖ抗体分子は、Ａ５とＦ４の２つの異なるｓｃＦｖ分子から構成され、これらはいずれもＨＥＲ３に対して特異性を有している。両方のｂｓ−ｓｃＦｖ抗体分子をクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中で発現させた。
【０２０８】
ＡＬＭを、一連のインビトロでのアッセイとインビボでのアッセイにおいて評価した。ＨＥＲ３とＨＥＲ２／ｎｅｕの両方に同時に、別々に、そして同時に結合するその能力を、ＢＩＡｃｏｒｅ装置上での表面プラズモン共鳴によって明らかにした（図２、３、および４）。インビトロでは、ＨＥＲ３とＨＥＲ２／ｎｅｕの両方を過剰発現しているヒトＢＴ−４７４乳ガン細胞とのＡＬＭのインキュベーションによって、ＨＥＲ２／ｎｅｕおよびＨＥＲ３の細胞表面での発現の低下（図５）、ＭＴＴアッセイにおいては増殖の低下（図６）、クローン形成性のアッセイにおいては生存の減少（図７）、そしてＡＫＴ２（アポトーシス経路における重要なタンパク質）のリン酸化の増加とその後の顕著な脱リン酸化（図８）が導かれた。これらの効果は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ７を使用して観察された効果（データは示さない）に匹敵するものであったか（ＭＴＴアッセイ）、またはそれよりも大きかった（ＡＫＴ２の脱リン酸化）。
【０２０９】
インビボでは、放射性ヨウ化ＡＬＭは、ｓ．ｃ．ヒトＢＴ−４７４腫瘍異種移植片を有している免疫不全マウスへの投与後、２４時間以内に、高い特異的な腫瘍標的化を示した（図９）。
【０２１０】
これらの結果は、ＥＧＦＲタンパク質を過剰発現する腫瘍細胞の処置についての本発明のｂｓ−ｓｃＦｖ抗体分子の有用性を示している。新しいｂｓ−ｓｃＦｖ抗体分子は、様々なガン（乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、および唾液腺ガンが含まれるが、これらに限定はされない）を処置するために、単独で使用することも、また、既存の化学療法と組み合わせて使用することもできる。
【０２１１】
実施例２
併用される化学療法のアプローチ
ＨＥＲ２／ｎｅｕは、これが様々な腫瘍の中で過剰発現されており、そしてその過剰発現が予後不良と関係しているので、併用する化学療法のアプローチのための有力な標的である。ＨＥＲ２／ｎｅｕは、そのチロシンキナーゼドメインを介してシグナル伝達を誘発することができるリガンドを欠いているが、高濃度で過剰発現されると、ＨＥＲ２／ｎｅｕは自発的にホモ二量体を形成することができる（Ｙａｒｄｅｎ  ａｎｄ  Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：１２７−１３７）。ＨＥＲ３は、色々な意味で、ＨＥＲ２／ｎｅｕとは反対である。これは、リガンドに対して活発に結合するが、機能性のチロシンキナーゼドメインは含まれておらず、したがって、シグナル伝達のためには、ＨＥＲ２／ｎｅｕとのヘテロ二量体の形成が必要である。実際、この組み合わせが、ＥＧＦＲファミリーの複数のメンバーによって形成されるシグナル伝達複合体の最強のものであると多くの人によって考えられている（Ｌｏｈｒｉｓｃｈ  ａｎｄ  Ｐｉｃｃａｒｔ（２００１）Ｓｅｍ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２８）Ｓｕｐｐｌ  １８：３−１１）。
【０２１２】
多くの化学療法薬によって、正常な細胞の中でアポトーシスを引き起こすであろう損傷が導かれる。しかし、いくつかの腫瘍細胞は、正常なアポトーシスのシグナル伝達経路を妨害する異常なシグナル伝達を有している。ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現している腫瘍細胞中のＡＫＴ２のリン酸化によっては、化学療法薬または生物学的薬剤の抗腫瘍作用を妨害する可能性がある抗アポトーシス性のカスケードが導かれる（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：８０２７−８０３１）。したがって、既存の化学療法による処置と組み合わせたｂｓ−ｓｃＦｖ抗体分子でのＨＥＲ２／ｎｅｕの標的化は、化学療法だけよりも、腫瘍細胞を死滅させることにおいて有効であろう。
【０２１３】
実施例３
２１１Ａｔで標識された二重特異的ｓｃＦｖのインビボでの効力
２１１Ａｔで標識された二重特異的ｓｃＦｖ抗体の腫瘍に対する効力を評価するためのインビボでの実験を行った。二重特異的抗体を、２１１Ａｔ−ＳＡＰＳキレート（Ｎ−（４−［２１１Ａｔ］アスタトフェネチル）スクシニメート）を使用して標識した（例えば、図１０を参照のこと）。
【０２１４】
ＢＴ４７４乳ガン細胞の注射前の４日間、マウスにはβ−エストラジオールの錠剤を移植した。０日目に、マウスに５×１０６個のＢＴ４７４乳ガン細胞を注射した。１４日目には、２１１ＡＴを結合させた二重特異的抗体（ＡＬＴ）の初回治療量を、８０μｇの高用量と、１０μｇの低用量で、ｉ．ｐ．で投与した。続く治療用量を、１６日目および１８日目に投与した。その後、腫瘍の容積を、図１１Ａから１１Ｃに示すように追跡した。
【０２１５】
腫瘍の容積は、全体的には、未処置の対照（図１１Ａ）と比較して、処置した動物（図１１Ｂおよび１１Ｃ）においては少なかった。
【０２１６】
実施例４
ガンの画像化
図１２は、ヨウ素−１２４で標識したＡＬＭ二重特異的単鎖Ｆｖを使用した２匹のマウスのＰＥＴ−ＣＴ画像を示す。マウスに、５０マイクロキュリー（５０マイクログラム）の標識したＡＬＭを注射し、４８時間後に画像化した。
【０２１７】
これは、ガンの検出についての本発明の二重特異的抗体の効力を示しているはずである。
【０２１８】
本明細書中に記載される実施例および実施形態は説明の目的のためのものにすぎず、その認識の中での様々な修飾または変更が当業者に示唆され、そして本出願および添付の特許請求の範囲に含まれるであろうことが理解される。本明細書および付随する添付物の中に記載されている全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的についてそれらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
【０２１９】
【数８】
2009500005.tif 000014
【０２２０】
【数９】
2009500005.tif 000015
【０２２１】
【数１０】
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【０２２２】
【数１１】
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【０２２３】
【数１２】
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【０２２４】
【数１３】
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【０２２５】
【数１４】
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【０２２６】
【数１５】
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【０２２７】
【数１６】
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【０２２８】
【数１７】
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【０２２９】
【数１８】
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【０２３０】
【数１９】
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【０２３１】
【数２０】
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【０２３２】
【数２１】
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【０２３３】
【数２２】
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【０２３４】
【数２３】
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【０２３５】
【数２４】
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【０２３６】
【数２５】
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【０２３７】
【数２６】
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【０２３８】
【数２７】
2009500005.tif 000033
【０２３９】
【数２８】
2009500005.tif 000034
【０２４０】
【数２９】
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【０２４１】
【数３０】
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【０２４２】
【数３１】
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【０２４３】
【数３２】
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【０２４４】
【数３３】
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【０２４５】
【数３４】
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【０２４６】
【数３５】
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【０２４７】
【数３６】
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【０２４８】
【数３７】
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【０２４９】
【数３８】
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【０２５０】
【数３９】
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【０２５１】
【数４０】
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【０２５２】
【数４１】
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【０２５３】
【数４２】
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【０２５４】
【数４３】
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【０２５５】
【数４４】
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【０２５６】
【数４５】
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【０２５７】
【数４６】
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【０２５８】
【数４７】
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【０２５９】
【数４８】
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【０２６０】
【数４９】
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【０２６１】
【数５０】
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【０２６２】
【数５１】
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【０２６３】
【数５２】
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【０２６４】
【数５３】
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【０２６５】
【数５４】
2009500005.tif 000060
【図面の簡単な説明】
【０２６６】
【図１】図１は、ｐＵＣ／ＡＬＭベクターの模式図を示す。
【図２】図２は、ＢＩＡｃｏｒｅチップ上のＨＥＲ３細胞外ドメインに対するＡＬＭタンパク質の結合を示しているグラフを示す。
【図３】図３は、ＢＩＡｃｏｒｅチップ上のＨＥＲ２／ｎｅｕ細胞外ドメインに対するＡＬＭタンパク質の結合を示しているグラフを示す。
【図４】図４は、ＢＩＡｃｏｒｅチップ上のＨＥＲ３タンパク質とＨＥＲ２／ｎｅｕに対するＡＬＭタンパク質の同時の結合を示しているグラフを示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、ＡＬＭをＨＥＲ２／ｎｅｕとＨＥＲ３の両方を発現しているヒトＢＴ−４７４乳ガン細胞とともにインビトロでインキュベートした後の、細胞表面のＨＥＲ２／ｎｅｕとＨＥＲ３の減少を示している、フローサイトメトリーの結果のグラフを示す。
【図６】図６は、ＭＴＴアッセイの結果のグラフを示しており、これは、ＡＬＭが、ＨＥＲ２／ｎｅｕとＨＥＲ３の両方を発現しているＢＴ−４７４乳ガン細胞の増殖を減少させることを示している。
【図７】図７は、１７日間のコロニー形成アッセイの結果を示すグラフを示しており、これは、細胞表面のＨＥＲ２／ｎｅｕの発現と等しいモル濃度のＡＬＭとのＢＴ−４７４細胞のインキュベーションによって、コロニーの形成（細胞の生存）の５０％の減少が導かれることを示している。
【図８】図８は、ウェスタンブロット分析を示しており、これは、ＨＥＲ２／ｎｅｕとＨＥＲ３の両方を発現しているヒトＢＴ−４７４乳ガン細胞と共に、様々な濃度のＡＬＭをインビトロでインキュベーションした後、４８時間の間のＡＫＴリン酸化の変化を示している。
【図９】図９は、免疫不全マウスにおける、４８時間にわたるＩで標識されたＡＬＭの生体分布をマップしているグラフを示す。
【図１０】図１０は、本発明の二重特異的抗体を標識するために使用したキレート２１１Ａｔ−ＳＡＰＳを示す。
【図１１Ａ】図１１Ａから１１Ｃは、未処理の対照（図１１Ａ）と比較した、１０μｇの低い投与量（図１１Ｃ）および高用量の８０μｇ（図１１Ｂ）の２１１Ａｔを結合させたＡＬＭの効果を示している。
【図１１Ｂ】図１１Ａから１１Ｃは、未処理の対照（図１１Ａ）と比較した、１０μｇの低い投与量（図１１Ｃ）および高用量の８０μｇ（図１１Ｂ）の２１１Ａｔを結合させたＡＬＭの効果を示している。
【図１１Ｃ】図１１Ａから１１Ｃは、未処理の対照（図１１Ａ）と比較した、１０μｇの低い投与量（図１１Ｃ）および高用量の８０μｇ（図１１Ｂ）の２１１Ａｔを結合させたＡＬＭの効果を示している。
【図１２】図１２は、１２４Ｉで標識された二重特異的抗体（ＡＬＭ）を使用した、マウスでの特異的腫瘍の標識を示している。ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原とＨＥＲ３抗原を発現しているＳＫ−ＯＶ−３卵巣ガン異種移植片を有しているｓｃｉｄマウスのＰＥＴ（上段右）およびＣＴ（上段左）の画像、ならびに、ＦＣＣＣでのＧ．Ｅ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＬＳについての注射の４８時間後を画像化した。ＣＴスライドの厚みは０．６３ｍｍである。画像融合（下段右）は、ＭＩＭソフトウェアを用いて行った。
【図１３】図１３は、Ａｄａｍｓ  Ｌａｂによって決定され、そして特定のｂｓ−ｓｃＦｖ分子の構築に使用したＳｃＦｖ軽鎖および重鎖の配列を示す。以下についての配列が提供される：Ｃ６．５重鎖（配列番号３８）、Ｇ９８Ａ重鎖（配列番号３９）、ＭＬ３−９重鎖（配列番号４０）、Ｈ３Ｂ１重鎖（配列番号４１）、Ｂ１Ｄ２重鎖（配列番号４２）、Ｃ６．５軽鎖（配列番号４３）、Ｇ９８Ａ軽鎖（配列番号４４）、ＭＬ３−９軽鎖（配列番号４５）、Ｈ３Ｂ１軽鎖（配列番号４６）、およびＢ１Ｄ２軽鎖（配列番号４７）。
【図１４】図１４は、Ｍａｒｋｓ  ｌａｂ．によって提供された、ＩＤＥＣベクター中で生産される全てのＩｇＧの重鎖および軽鎖可変領域の推定されるタンパク質配列を示す。特定の実施形態においては、ｓｃＦｖの配列はこれとは異なる場合がある。以下について配列が提供される：Ｃ６．５重鎖（配列番号４８）、Ｇ９８Ａ重鎖（配列番号４９）、ＭＬ３−９重鎖（配列番号５０）、Ｈ３Ｂ１重鎖（配列番号５１）、Ｂ１Ｄ２重鎖（配列番号５２）、Ｃ６．５軽鎖（配列番号５３）、Ｇ９８Ａ軽鎖（配列番号５４）、ＭＬ３−９軽鎖（配列番号５５）、Ｈ３Ｂ１軽鎖（配列番号５６）、およびＢ１Ｄ２軽鎖（配列番号５７）。
【０２６７】
SEQUENCE LISTING
<110> ADAMS, GREGORY P.
HORAK, EVA M.
WEINER, LOUIS M.
JAMES, MARKS D.
<120> BISPECIFIC SINGLE CHAIN Fv ANTIBODY MOLECULES AND METHODS OF USE 
THEREOF
<130> 407T-000420US
<150> US 60/370,276
<151> 2002-04-02
<150> US10/406,830
<151> 2003-04-04
<160> 57    
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 291
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic antibody.
<400> 1
Met Lys Tyr LeuLeu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 
1              5                  10                 15      
Ala Gln Pro AlaMet Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 
20                 25                 30          
Leu Val Gln ProGly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 
35                 40                 45             
Phe Thr Phe ArgSer Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 
50                 55                 60                 
Lys Gly Leu GluTrp Val Ser Ala Ile Ser Gly Arg Gly Asp Asn Thr 
65                 70                 75                 80  
Tyr Tyr Ala AspSer Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 
85                 90                 95      
Ser Lys Asn ThrLeu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 
100                105                110         
Thr Ala Val TyrTyr Cys Ala Lys Met Thr Ser Asn Ala Phe Ala Phe 
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Asp Tyr Trp GlyGln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 
130                135                140                 
Gly Ser Gly GlyGly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu 
145                150                155                160 
Thr Gln Pro ProSer Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile 
165                170                 175    
Ser Cys Thr GlySer Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Gly Val His 
180                185                190         
Trp Tyr Gln GlnLeu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly 
195                200                205            
Asn Thr Asn ArgPro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Phe Lys 
210                215                220                
Ser Gly Thr SerAla Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp 
225                230                235                240 
Glu Ala Asp TyrTyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Trp 
245                250                255     
Val Phe Gly GlyGly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu 
260                265                270         
Gln Lys Leu IleSer Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His 
275                280                285             
His His His 
290     
<210> 2
<211> 291
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic antibody.
<400> 2
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1              5                  10                 15      
Ala Gln Pro AlaMet Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 
20                 25                 30          
Leu Val Gln ProGly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 
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Phe Thr Phe ArgSer Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 
50                 55                 60                 
Lys Gly Leu GluTrp Val Ser Ala Ile Ser Gly Arg Gly Asp Asn Thr 
65                 70                 75                 80  
Tyr Tyr Ala AspSer Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 
85                 90                 95      
Ser Lys Asn ThrLeu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 
100                105                110         
Thr Ala Val TyrTyr Cys Ala Lys Met Thr Ser Asn Ala Phe Ala Phe 
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Asp Tyr Trp GlyGln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 
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Gly Ser Gly GlyGly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu 
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Thr Gln Pro ProSer Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile 
165                170                175     
Ser Cys Thr GlySer Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Gly Val His 
180                185                190         
Trp Tyr Gln GlnLeu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly 
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Asn Thr Asn ArgPro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Phe Lys 
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Ser Gly Thr SerAla Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp 
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Glu Ala Asp TyrTyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Trp 
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Val Phe Gly GlyGly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu 
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Gln Lys Leu IleSer Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His 
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His His His 
290     
<210> 3
<211> 288
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic antibody.
<400> 3
Met Lys Tyr LeuLeu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 
1              5                  10                 15      
Ala Gln Pro AlaMet Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly 
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Leu Val Lys ProGly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 
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Phe Thr Phe SerSer Tyr Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Val Pro Gly 
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Lys Gly Leu GluTrp Val Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile 
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Ala Lys Asn SerLeu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp 
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Gly Gly Gly GlySer Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Ser Gln 
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Pro Pro Ser ValSer Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys 
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Thr Gly Ser SerSer Asn Ile Gly Ala Ser Phe Asp Val Gln Trp Tyr 
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Asn Arg Pro SerGly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser Lys Ser Gly 
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic antibody.
<400> 4
Met Lys Tyr LeuLeu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 
1              5                  10                  15     
Ala Gln Pro AlaMet Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly 
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Tyr Tyr Val AspSer Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp 
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Thr Ala Val TyrTyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Val Gly Tyr Phe Asp 
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Leu Trp Gly ArgGly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 
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Ser Gly Gly GlyGly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr 
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Gly Asn Thr AlaSer Leu Ile Ile Ser Gly Leu Gln Ala Asp Asp Glu 
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Ala Asp Tyr TyrCys Ser Ser Tyr Gly Ser Ser Ser Thr His Val Ile 
245                250                255     
Phe Gly Gly GlyThr Lys Val Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu Gln 
260                265                270         
Lys Leu Ile SerGlu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His 
275                280                285             
His His 
290 
<210> 5
<211> 287
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic antibody.
<400> 5
Met Lys Tyr LeuLeu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 
1              5                  10                 15      
Ala Gln Pro AlaMet Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 
20                 25                 30          
Val Val Gln ProGly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 
35                 40                 45             
Phe Thr Phe SerAsp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 
50                 55                 60                 
Lys Gly Leu GluTrp Met Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys 
65                 70                 75                 80  
Tyr Tyr Ala AlaSer Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 
85                 90                 95      
Ser Lys Asn ThrVal Ser Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 
100                105                110         
Thr Ala Val TyrTyr Cys Ala Arg Asp Leu Tyr Gly Asp Tyr Ala Leu 
115                120                125             
Asp Tyr Trp GlyGln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 
130                135                140                
Gly Ser Gly GlyGly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met 
145                150                155                160 
Thr Gln Ser ProSer Thr Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr 
165                170                175     
Ile Thr Cys ArgAla Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp Leu Ala Trp Tyr 
180                185                190         
Gln Gln Lys ProGly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser 
195                200                205             
Thr Leu Glu SerGly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly 
210                215                220                
Thr Glu Phe ThrLeu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 
225                230                235                240 
Thr Tyr Tyr CysGln Lys Leu Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly 
245                250                255     
Gly Thr Lys ValGlu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile 
260                265                 270        
Ser Glu Glu AspLeu Asn Gly Ala Ala His His His His His His 
275                280                285         
<210> 6
<211> 291
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic antibody.
<400> 6
Met Lys Tyr LeuLeu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 
1              5                  10                 15      
Ala Gln Pro AlaMet Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly 
20                 25                 30          
Leu Val Gln ProGly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 
35                 40                 45             
Phe Thr Phe AspAsp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 
50                 55                 60                 
Lys Gly Leu GluTrp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile 
65                 70                 75                 80  
Gly Tyr Ala AspSer Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 
85                 90                 95      
Ala Lys Asn SerLeu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 
100                105                110         
Thr Ala Val TyrTyr Cys Ala Arg Asp Leu Gly Ala Lys Gln Trp Leu 
115                120                125             
Glu Gly Phe AspTyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
130                135                140                
Gly Gly Gly GlySer Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn 
145                150                155                160 
Phe Met Leu ThrGln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr 
165                170                175     
Val Arg Ile ThrCys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 
180                185                190         
Trp Tyr Gln GlnLys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly 
195                200                205             
Lys Asn Asn ArgPro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Thr 
210                215                220                
Ser Gly Asn SerAla Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp 
225                230                235                240 
Glu Ala Asp TyrTyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Trp 
245                250                255     
Val Phe Gly GlyGly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu 
260                265                270         
Gln Lys Leu IleSer Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His 
275                280                285             
His His His 
290     
<210> 7
<211> 295
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic antibody.
<400> 7
Met Lys Tyr LeuLeu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 
1              5                  10                 15      
Ala Gln Pro AlaMet Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu 
20                 25                 30          
Val Lys Lys ProGly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 
35                 40                 45             
Gly Thr Phe SerSer Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 
50                 55                 60                 
Gln Gly Leu GluTrp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala 
65                 70                 75                 80  
Asn Tyr Ala GlnLys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu 
85                 90                 95      
Ser Thr Ser ThrAla Tyr Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 
100                105                110         
Thr Ala Val TyrTyr Cys Ala Arg Glu Glu Gly Pro Tyr Cys Ser Ser 
115                120                125             
Thr Ser Cys TyrGly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 
130                135                140                
Thr Val Ser SerGly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
145                150                155                160 
Gly Gly Ser GlnSer Val Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala 
165                170                175     
Leu Gly Gln ThrVal Lys Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser 
180                185                190         
Tyr Phe Ala SerTrp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Thr Leu 
195                200                205             
Val Met Tyr AlaArg Asn Asp Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe 
210                215                220                
Ser Gly Ser LysSer Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 
225                230                235                240 
Gln Ser Glu AspGlu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser 
245                250                255     
Leu Asn Gly TyrLeu Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 
260                265                270         
Ala Ala Ala GluGln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala 
275                280                285             
Ala His His HisHis His His 
290                295 
<210> 8
<211> 286
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic antibody.
<400> 8
Met Lys Tyr LeuLeu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 
1              5                  10                  15     
Ala Gln Pro AlaMet Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly 
20                 25                 30          
Leu Val Lys ProSer Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly 
35                 40                 45             
Gly Ser Phe ArgSer Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Pro Pro Gly Lys 
50                 55                 60                 
Gly Leu Glu TrpIle Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr 
65                 70                 75                 80  
Asn Pro Ser LeuLys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 
85                 90                 95      
Asn Gln Phe SerLeu Lys Leu Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala 
100                105                110         
Val Tyr Tyr CysAla Arg Gly His Leu Gly Glu Leu Gly Trp Phe Asp 
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Pro Trp Gly GlnGly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly 
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Ser Gly Gly GlyGly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr 
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Gln Ser Pro SerSer Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile 
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Thr Cys Gln AlaSer Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln 
180                185                190         
Gln Lys Pro GlyLys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Arg 
195                200                205             
Leu Ala Ser GlyVal Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 
210                215                220                
Asp Phe Ser LeuThr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr 
225                230                235                240 
Tyr Tyr Cys LeuGln Asp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly 
245                250                255     
Thr Lys Val GluIle Lys Arg Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser 
260                265                270         
Glu Glu Asp LeuAsn Gly Ala Ala His His His His His His 
275                280                285     
<210> 9
<211> 291
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic antibody.
<400> 9
Met Lys Tyr LeuLeu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 
1              5                  10                 15      
Ala Gln Pro AlaMet Ala Gln Val Gln Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gly 
20                 25                 30          
Leu Val Gln ProGly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 
35                 40                 45             
Phe Thr Phe SerSer Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 
50                 55                 60                 
Lys Gly Leu GluTrp Leu Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr 
65                 70                 75                 80  
Tyr Tyr Ala AspSer Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 
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Ser Lys Asn ThrLeu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 
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Thr Ala Val TyrTyr Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Asn Trp Asn 
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Asn Trp Tyr PheAsp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 
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Ser Gly Gly GlyGly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
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Asp Val Val MetThr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
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Asp Arg Val ThrIle Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 
180                185                190         
Leu Asn Trp TyrGln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile 
195                200                205             
Tyr Ala Ala SerArg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
210                215                220                
Ser Gly Ser GlyThr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
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Asp Asp Phe AlaThr Tyr Tyr Gly Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Trp 
245                250                255     
Thr Phe Gly ArgGly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Glu 
260                265                270         
Gln Lys Leu IleSer Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His 
275                280                285             
His His His 
290     
<210> 10
<211> 291
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic antibody.
<400> 10
Met Lys Tyr LeuLeu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 
1              5                  10                 15      
Ala Gln Pro AlaMet Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly 
20                 25                 30          
Met Val Gln ProGly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 
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Phe Thr Phe SerSer Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 
50                 55                 60                 
Lys Gly Leu GluTrp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr 
65                 70                 75                 80  
Tyr Tyr Ala AspSer Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 
85                 90                 95      
Ser Lys Asn ThrLeu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 
100                105                110         
Thr Ala Leu TyrTyr Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Asn Trp Asn 
115                120                125             
Asn Trp Tyr PheAsp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 
130                135                140                
Ser Gly Gly GlyGly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
145                150                155                 160
Glu Ile Val LeuThr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
165                170                175     
Asp Arg Val ThrIle Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 
180                185                190        
Leu Asn Trp TyrGln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
195                200                205             
Tyr Ala Ala SerSer Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
210                215                220                
Ser Gly Ser GlyThr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
225                230                235                240 
Asp Asp Phe AlaThr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp 
245                250                255     
Thr Phe Gly GlnGly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Glu 
260                265                270         
Gln Lys Leu IleSer Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His 
275                280                285             
His His His 
290     
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Peptide linker.
<400> 11
Gly Gly Gly GlySer 
1              5   
<210> 12
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Olidonucleotide primer.
<400> 12
aattcaggtgctggtacttc aggttcaggt gcttcaggtg aaggttcaggttcaa          55
<210> 13
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Olidonucleotide primer.
<400> 13
agctttgaacctgaaccttc acctgaagca cctgaacctg aagtaccagcacctg          55
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Olidonucleotide primer.
<400> 14
aattcaggtg ctggtacttcaggttcaggt gcttcaggtg aaggttcagg ttcaaagcta     60
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Olidonucleotide primer.
<400> 15
cgaccatggcccaggtgcagctggtgcag                                      29
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Olidonucleotide primer.
<400> 16
cgaattcacctaggacggtcagcttgg                                        27
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Olidonucleotide primer.
<400> 17
gggaagcttcaggtgcagct ggtgcagtctgg                                  32
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Olidonucleotide primer.
<400> 18
gggctcgagacctaggacgg tcagcttggttcc                                 33
<210> 19
<211> 243
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic antibody.
<400> 19
Met Ala Gln ValGln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro 
1              5                  10                 15      
Gly Arg Ser LeuArg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 
20                 25                 30          
Ser Tyr Gly MetHis Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 
35                 40                 45             
Trp Val Ala ValIle Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp 
50                 55                 60                 
Ser Val Lys GlyArg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 
65                 70                 75                 80  
Leu Tyr Leu GlnMet Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Glu Tyr 
85                 90                 95      
Tyr Cys Ala LysTyr Pro Leu Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 
100                105                110         
Val Ser Ser GlyGly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 
115                120                125             
Gly Ser Gln SerAla Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro 
130                135                140                
Gly Gln Ser IleThr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly 
145                150                155                160 
Gly Tyr Asn TyrAla Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro 
165                170                175     
Lys Leu Met IleTyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Phe Asn 
180                185                190         
Arg Phe Ser GlyAla Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser 
195                200                205             
Gly Leu Gln AlaGlu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Thr 
210                215                220                
Ser Ser Ser ThrTrp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
225                230                235                240 
Gly Asn Ser 
<210> 20
<211> 729
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Nucleic acid encoding single chain antibody.
<400> 20
atggcccaggtgcagctggt ggagtctggg ggaggcgtgg tccagcctgg gaggtccctg    60
agactctcctgtgcagcctc tggattcacc ttcagtagct atggcatgca ctgggtccgc    120
caggctccaggcaaggggct ggagtgggtg gcagttatat catatgatgg aagtaataaa    180
tactatgcagactccgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaattc caagaacacg    240
ctgtatctgcaaatgaacag cctgagagct gaggacacgg ctgagtatta ctgtgcgaag    300
tatcctttaaactggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctcaggtgg aggcggttca    360
ggcggaggtggctctggcgg tggcggatcg cagtctgctc tgactcagcc tgcctccgtg    420
tctgggtctcctggacagtc gatcaccatc tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt    480
ggttataactatgcttcctg gtaccaacag cacccaggca aggcccccaa actcatgatt    540
tatgaggtcagtaatcggcc ctcaggggtt ttcaatcgct tctctggcgc caagtctggc    600
aacacggcctccctgaccat ctctgggctc caggctgagg acgaggctga ttattactgc    660
aactcatatacaagcagcag cacttgggtg ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta    720
gggaattcc                                                           729
<210> 21
<211> 295
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic antibody.
<400> 21
Met Ala Gln ValGln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro 
1              5                  10                 15      
Gly Arg Ser LeuArg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys 
20                 25                 30          
Ser Tyr Gly MetHis Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 
35                 40                 45             
Trp Val Ser AlaIle Ser Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 
50                 55                 60                 
Ser Val Lys GlyArg Phe Thr Ile Phe Arg Asp Asn Ser Glu Asn Ser 
65                 70                 75                 80  
Leu Tyr Leu GlnMet Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 
85                 90                 95      
Tyr Cys Ala ArgAsp Ser Ser Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 
100                105                110         
Thr Leu Val ThrVal Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
115                120                125             
Ser Gly Gly GlyGly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr 
130                135                140                
Leu Ser Ala SerIle Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 
145                150                155                160 
Glu Gly Ile TyrHis Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 
165                170                 175    
Ala Pro Lys LeuLeu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ala 
180                185                190         
Pro Ser Arg PheSer Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Thr Ile Thr Cys 
195                200                205            
Arg Ala Ser GluGly Ile Tyr His Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 
210                215                220                
Pro Gly Lys AlaPro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala 
225                230                235                240 
Ser Gly Ala ProSer Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 
245                250                255     
Thr Leu Thr IleSer Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr 
260                 265                270         
Cys Gln Gln TyrTyr Arg Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 
275                280                285             
Leu Glu Asn LysArg Asn Ser 
290                295 
<210> 22
<211> 885
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Nucleic acid encoding single chain antibody.
<400> 22
atggcccaggtgcagctgca ggagtcgggg ggaggcgtgg tccagcctgg gaggtccctg    60
agactctcctgtgcagcgtc cggattcacc ttcaagagct atggcatgca ctgggtccgc    120
caggctccagggaaggggct ggagtgggtc tcagctatta gtgctagtgg tggtagcaca    180
tactacgcagactccgtgaa gggccgcttc accatcttca gagacaattc cgagaactca    240
ctgtatcttcaaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtctatta ctgtgcgaga    300
gattcaagtgggtcctttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcaggt    360
ggaggcggttcaggcggagg tggctctggc ggtggcggat cggacatcgt gatgacccag    420
tctccttccaccctgtccgc atctattgga gacagagtca ccatcacctg ccgggccagt    480
gagggtatttatcactggtt ggcctggtat cagcagaagc cagggaaagc ccctaaactc    540
ctgatctataaggcctctag tttagccagt ggggccccat caaggttcag cggcagtgga    600
tctgggacagataccatcac ctgccgggcc agtgagggta tttatcactg gttggcctgg    660
tatcagcagaagccagggaa agcccctaaa ctcctgatct ataaggcctc tagtttagcc    720
agtggggccccatcaaggtt cagcggcagt ggatctggga cagatttcac tctcaccatc    780
agcagcctgcaggctgaaga tgtggcagta tactactgtc agcaatatta tagaagtccg    840
ctcactttcggtggagggac caagctggag aacaaacggaattcc                   885
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Translocation signaling sequence.
<400> 23
Arg Glu Asp LeuLys 
1              5   
<210> 24
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Translocation signaling sequence.
<400> 24
Arg Glu Asp Leu
1              
<210> 25
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Translocation signaling sequence.
<400> 25
Arg Asp Glu Leu
1              
<210> 26
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Translocation signaling sequence.
<400> 26
Lys Asp Glu Leu
1              
<210> 27
<211> 873
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Nucleic acid encoding single chain antibody.
<400> 27
atgaaatacctattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc    60
atggcccagg tgcagctggtggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg    120
agactctcctgtgcagcctc tggattcacc tttcgcagct atgccatgag ctgggtccgc    180
caggctccagggaaggggct ggagtgggtc tcagctatta gtggtcgtgg tgataacaca    240
tactacgcagactccgtgaa gggccggttc accatctcca gagacaattc caagaacacg    300
ctgtatctgcaaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtttatta ctgtgcgaaa    360
atgacaagtaacgcgttcgc atttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc    420
tcaggtggaggcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggatcgca gtctgtgttg    480
acgcagccgccctcagtgtc tggggcccca gggcagaggg tcaccatctc ctgcactggg    540
agcagctccaacatcggggc aggttatggt gtacactggt accagcagct tccaggaaca    600
gcccccaaactcctcatcta tggtaacacc aatcggccct caggggtccc tgaccgattc    660
tctggcttca agtctggcacctcagcctcc ctggccatca ctgggctcca ggctgaggat    720
gaggctgattattactgcca gtcctatgac agcagcctga gtggttgggt gttcggcgga    780
gggaccaagctgaccgtcct aggtgcggcc gcagaacaaa aactcatctc agaagaggat    840
ctgaatggggccgcacatca ccatcatcac cat                                873
<210> 28
<211> 873
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Nucleic acid encoding single chain antibody.
<400> 28
atgaaatacctattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc    60
atggcccagg tgcagctggtggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg    120
agactctcctgtgcagcctc tggattcacc tttcgcagct atgccatgag ctgggtccgc    180
caggctccagggaaggggct ggagtgggtc tcagctatta gtggtcgtgg tgataacaca    240
tactacgcag actccgtgaagggccggttc accatctcca gagacaattc caagaacacg    300
ctgtatctgcaaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtttatta ctgtgcgaaa    360
atgacaagtaacgcgttcgc atttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc    420
tcaggtggaggcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggatcgca gtctgtgttg    480
acgcagccgccctcagtgtc tggggcccca gggcagaggg tcaccatctc ctgcactggg    540
agcagctccaacatcggggc aggttatggt gtacactggt accagcagct tccaggaaca    600
gcccccaaactcctcatcta tggtaacacc aatcggccct caggggtccc tgaccgattc    660
tctggcttcaagtctggcac ctcagcctcc ctggccatca ctgggctcca ggctgaggat    720
gaggctgattattactgcca gtcctatgac agcagcctga gtggttgggt gttcggcgga    780
gggaccaagctgaccgtcct aggtgcggcc gcagaacaaa aactcatctc agaagaggat    840
ctgaatggggccgcacatca ccatcatcaccat                                873
<210> 29
<211> 864
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Nucleic acid encoding single chain antibody.
<400> 29
atgaaatacctattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc    60
atggcccagg tacagctgcagcagtcaggg ggaggcctgg tcaaacctgg ggggtccctg    120
agactctcctgtgcagcctc tggattcacc ttcagtagct atagcatgaa ctgggtccgc    180
caggtcccagggaaggggct ggagtgggtc tcatccatta gtagtagtag tagttacata    240
tactacgcagactctgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaatgc caagaactca    300
ctgtatctgcaaatgaacag cctgagagac gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga    360
gatgacggtccccccatcca gcactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcacgt    420
ggaggcggttcaggcggagg tggctctggc ggtggcggat cgcagtctgt gttgagccag    480
ccgccctcggtatctggggc cccagggcag agggtcacca tctcctgcac tgggagcagc    540
tccaacatcggggcaagttt tgatgtacag tggtaccagc aacttccagg aacagccccc    600
aaactcctcatctatggtaa caacaatcgg ccctcagggg tccctgaccg attctctgcc    660
tccaagtctggcacctcagc ctccctgggc atcaccggac tccagatcgg ggacgaggcc    720
gattattactgcggctcata tacaggcacc tactcttggg tgttcggcgg agggaccaag    780
gtcaccgtcctaggtgcggc cgcagaacaa aaactcatct cagaagagga tctgaatggg    840
gccgcacatcaccatcatcaccat                                          864
<210> 30
<211> 870
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Nucleic acid encoding single chain antibody.
<400> 30
atgaaatacctattgccgac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc    60
atggcccaggtgcagctgca ggagtcgggg ggaggcttgg tcaagcctgg ggggtccctg    120
agactctcctgtgcagcctc tggattcacc tttagtagct attggatgag ctgggtccgc    180
caggctccaggaaaggggct ggagtgggtc gccaacataa accgcgatgg aagtgccagt    240
tattatgtggactctgtgaa gggccgattc accatctcca gagacgacgc caagaactca    300
ctgtatctgcaaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga    360
gatcggggcgtggggtactt cgatctctgg ggccgtggca ccctggtcac cgtctcctca    420
ggtggaggcggttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcgcagtc tgccctgact    480
cagcctgcct ccgtgtctggatctcctgga cagtcgatca ccatctcctg cactggaacc    540
agcagtgatgttggtggtta taactttgtc tcctggtacc aacagcaccc aggcaaagcc    600
cccaaactcatgatttatga tgtcagtgat cgaccctcag gggtctctga tcggttctct    660
ggctccaagtctggcaacac ggcctccctg atcatctctg gcctccaggc tgacgacgag    720
gctgattattactgcagctc atatggaagc agcagcaccc atgtgatttt cggcggaggg    780
accaaggtcaccgtcctagg tgcggccgca gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg    840
aatggggccgcacatcaccatcatcaccat                                    870
<210> 31
<211> 861
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Nucleic acid encoding single chain antibody.
<400> 31
atgaaatacctattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc    60
atggcccagg tgcagctggtggagtctggg ggaggcgtgg tccagcctgg gaggtccctg    120
agactctcctgtgcagcctc tggattcacc ttcagtgact attatataca ctgggtccgc    180
caggctccaggcaaggggct ggagtggatg gcagttattt catatgatgg caataataaa    240
tactacgccgcctccgtgaa ggaccgattc accatctcca gagacaattc caagaacacg    300
gtgtctctgcaaatgaacag cctgagagct gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga    360
gatctctacggtgactacgc tcttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc    420
tcaggtggaggcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggatcgga catccagatg    480
acccagtctccttccaccct gtctgcatct ctgggagaca gagtcaccat cacttgccgg    540
gccagtcagagtattggtag ctggttggcc tggtatcagc agaaaccagg gaaagcccct    600
aaactcctgatctataaggc gtctacttta gaaagtgggg tcccatcaag gttcaccggc    660
agtggatctg ggacagaattcactctcaca atcagcggcc tccagcctga agattttgca    720
acttattactgtcagaagct tagtagttac ccgctcactt tcggcggagg gaccaaggtg    780
gaaatcaaacgtgcggccgc agaacaaaaa ctcatctcag aagaggatct gaatggggcc    840
gcacatcaccatcatcaccat                                             861
<210> 32
<211> 873
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Nucleic acid encoding single chain antibody.
<400> 32
atgaaatacctattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc    60
atggcccagg tgcagctggtgcagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg caggtccctg    120
agactctcctgtgcagcctc tggattcacc tttgatgatt atgccatgca ctgggtccgg    180
caagctccagggaagggcct ggagtgggtc tcaggtatta gttggaatag tggtagcata    240
ggctatgcggactctgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaacgc caagaactca    300
ctgtatctgcaaatgaacag cctgagacct gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga    360
gatcttggtgccaagcagtg gctggagggg tttgactact ggggccaggg caccctggtc    420
accgtctcctcaggtggagg cggttcaggc ggaggtggct ctggcggtgg cggatcgaat    480
tttatgctgactcaggaccc tgctgtgtct gtggccttgg gacagacagt caggatcaca    540
tgccaaggagacagcctcag aagctattat gcaagctggt accagcagaa gccaggacag    600
gcccctgtacttgtcatcta tggtaaaaac aaccggccct cagggatccc agaccgattc    660
tctggctcca cctcaggaaactcagcttcc ttgaccatca ctggggctca ggcggaagat    720
gaggctgactattactgtaa ctcccgggac agcagtggta accattgggt gttcggcgga    780
gggaccaaggtcaccgtcct aggtgcggcc gcagaacaaa aactcatctc agaagaggat    840
ctgaatggggccgcacatca ccatcatcac cat                                873
<210> 33
<211> 885
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Nucleic acid encoding single chain antibody.
<400> 33
atgaaatacctattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc    60
atggccgaggtgcagctggt gcagtctggg gctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg    120
aaggtctcctgcaaggcttc tggaggcacc ttcagcagct atgctatcag ctgggtgcga    180
caggcccctggacaaggcct tgagtggatg ggagggatca tccctatctt tggtacagca    240
aactacgcac agaagttccagggcagagtc acgattaccg cggacgaatc cacgagcaca    300
gcctacatggaggtgagcag cctgagatct gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga    360
gaggaggggccatattgtag tagtaccagc tgctatgggg cttttgatat ctggggccaa    420
ggcaccctggtcaccgtctc ctcaggtgga ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt    480
ggcggatcgcagtctgtgct gactcaggac cctgctgtgt ctgtggcctt gggacagaca    540
gtcaagatcacatgccaagg agacagcctc agaagctatt ttgcaagctg gtaccagcag    600
aagccaggacaggcccctac acttgtcatg tatgctagaa atgaccggcc cgcaggggtc    660
cctgaccgattctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cagtgggctc    720
cagtctgaggatgaggctga ttattattgt gcagcatggg atgacagcct gaatggttat    780
ctcttcggagctgggaccaa gctgaccgtc ctaggtgcgg ccgcagaaca aaaactcatc    840
tcagaagaggatctgaatgg ggccgcacat caccatcatcaccat                   885
<210> 34
<211> 861
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Nucleic acid encoding single chain antibody.
<400> 34
atgaaatacctattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc    60
atggcccagg tgcagctgcaggagtcgggc ccaggactgg tgaagccttc ggagaccctg    120
tccctcacctgcactgtctc tggtggctcc ttcagaagtt actactggag ctggatccgg    180
tagcccccagggaagggact ggagtggata gggtatatct tttacagtgg gagcaccaac    240
tacaatccctccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc    300
tccctgaagctgagctcttt gaccgctgcg gacacggccg tgtattattg tgcgagagga    360
catttgggggagttaggatg gttcgacccc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc    420
tcaagtggaggcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggatcgga catccagatg    480
acccagtctccatcctccct gtctgcatct gtaggagaca gagtcaccat cacttgccag    540
gcgagtcaggacattagcaa ctatttaaat tggtatcagc agaagccggg gaaagcccct    600
aaactcctgatctttgctgc atcccgttta gcgagcgggg tcccctcaag attcagcggc    660
agtggatctggcacagattt cagtctcacc atcagcagcc tgcagcctga cgattttgca    720
acttattattgtctacaaga ttccgattac cccctcactt tcggcggagg gaccaaggtg    780
gaaatcaaacgtgcggccgc agaacaaaaa ctcatctcag aagaggatct gaatggggcc    840
gcacatcaccatcatcaccat                                             861
<210> 35
<211> 873
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic antibody.
<400> 35
atgaaatacctattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc    60
atggcccaggtgcagctgtt gcagttcggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg    120
agactctcctgtgcagcctc tggattcacc tttagcagct atgccatgag ctgggtccgc    180
caggctccagggaaggggct ggagtggctg tcagctatta gtggtagtgg tggtagcaca    240
tactacgcagactccgtgaa gggccggttc accatctcca gagacaattc caagaacacg    300
ctgtatctgc aaatgaacagcctgagagcc gaggacacgg ccgtatatta ctgtgcaaga    360
gagggatatagcagcaactg gaataactgg tacttcgatc tctggggccg tggcaccctg    420
gtcaccgtctcctcaggtgg aggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg    480
gatgttgtga tgactcagtctccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc    540
atcacttgccgggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca    600
gggaaggcccctgaactcct gatctatgct gcatcccgtt tacaaagtgg ggtcccatca    660
aggttcagtggcagtggatc tgggaccgaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct    720
gatgattttgcaacttatta cggccaacaa tattataatt atccgtggac gttcggccga    780
gggaccaaggtggaaatcaa acgtgcggcc gcagaacaaa aactcatctc agaagaggat    840
ctgaatggggccgcacatca ccatcatcaccat                                873
<210> 36
<211> 873
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Nucleic acid encoding single chain antibody.
<400> 36
atgaaatacctattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc    60
atggcccaggtgcagctgca ggagtcgggg ggaggcatgg tccagcctgg gaggtccctg    120
agactctcctgtgcagcctc tggattcacc tttagcagct atgccatgag ctgggtccgc    180
caggctccagggaaggggct ggagtgggtc tcagctatta gtggtagtgg tggtagcaca    240
tactacgcagactccgtgaa gggccggttc accatctcca gagacaattc caagaacacg    300
ctgtatctgc aaatgaacagcctgagagcc gaggacacgg ccctgtatta ctgtgcaaga    360
gagggatatagcagcaactg gaataactgg tacttcgatc tctggggccg tggcaccctg    420
gtcaccgtctcctcaggtgg aggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg    480
gaaattgtgc tgactcagtctccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc    540
atcacttgccgggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca    600
gggaaagcccctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca    660
aggttcagtggcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct    720
gacgattttgcaacttatta ctgccaacag tataatagtt acccttggac gttcggccaa    780
gggaccaagctggagatcaa acgtgcggcc gcagaacaaa aactcatctc agaagaggat    840
ctgaatggggccgcacatca ccatcatcaccat                                873
<210> 37
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Peptide linker.
<400> 37
Asn Ser Gly AlaGly Thr Ser Gly Ser Gly Ala Ser Gly Glu Gly Ser 
1              5                  10                 15      
Gly Ser Lys Leu
20  
<210> 38
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Artificial antibody VH sequence.
<400> 38
Gln Val Gln LeuVal Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 
1              5                  10                 15      
Ser Leu Lys IleSer Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 
20                 25                 30          
Trp Ile Ala TrpVal Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met 
35                 40                 45             
Gly Leu Ile TyrPro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe 
50                 55                 60                 
Gln Gly Gln ValThr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 
65                 70                 75                 80  
Leu Gln Trp SerSer Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 
85                 90                 95      
Ala Arg His AspVal Gly Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala Lys Trp 
100                105                110         
Pro Glu Tyr PheGln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 
115                120                125             
Ser 
<210> 39
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Artificial antibody VH sequence.
<400> 39
Gln Val Gln LeuVal Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 
1              5                  10                 15      
Ser Leu Lys IleSer Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 
20                 25                 30          
Trp Ile Ala TrpVal Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met 
35                 40                 45             
Gly Leu Ile TyrPro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe 
50                 55                 60                 
Gln Gly Gln ValThr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 
65                 70                 75                 80  
Leu Gln Trp SerSer Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 
85                 90                 95      
Ala Arg His AspVal Ala Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala Lys Trp 
100                105                110         
Pro Glu Tyr PheGln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 
115                120                125             
Ser 
<210> 40
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Artificial antibody VH sequence.
<400> 40
Gln Val Gln LeuVal Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 
1              5                  10                 15      
Ser Leu Lys IleSer Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 
20                 25                 30          
Trp Ile Ala TrpVal Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met 
35                 40                 45             
Gly Leu Ile TyrPro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe 
50                 55                 60                 
Gln Gly Gln ValThr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 
65                 70                 75                 80  
Leu Gln Trp SerSer Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 
85                 90                 95      
Ala Arg His AspVal Gly Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala Lys Trp 
100                105                110         
Pro Glu Tyr PheGln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 
115                120                125             
Ser 
<210> 41
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Artificial antibody VH sequence.
<400> 41
Gln Val Gln LeuVal Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 
1              5                  10                 15      
Ser Leu Lys IleSer Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 
20                 25                 30          
Trp Ile Ala TrpVal Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met 
35                 40                 45             
Gly Leu Ile TyrPro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe 
50                 55                 60                 
Gln Gly Gln ValThr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 
65                 70                 75                 80  
Leu Gln Trp SerSer Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 
85                 90                 95      
Ala Arg His AspVal Gly Tyr Cys Thr Asp Arg Thr Cys Ala Lys Trp 
100                105                110         
Pro Glu Tyr PheGln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 
115                120                125             
Ser 
<210> 42
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Artificial antibody VH sequence.
<400> 42
Gln Val Gln LeuVal Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 
1              5                  10                 15      
Ser Leu Lys IleSer Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 
20                 25                 30          
Trp Ile Ala TrpVal Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met 
35                 40                 45             
Gly Leu Ile TyrPro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe 
50                 55                 60                 
Gln Gly Gln ValThr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 
65                 70                 75                 80  
Leu Gln Trp SerSer Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 
85                 90                 95      
Ala Arg His AspVal Gly Tyr Cys Thr Asp Arg Thr Cys Ala Lys Trp 
100                105                110         
Pro Glu Trp LeuGly Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 
115                120                125             
Ser 
<210> 43
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Artificial antibody VL sequence.
<400> 43
Gln Ser Val LeuThr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 
1              5                  10                 15      
Lys Val Thr IleSer Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
20                 25                 30          
Tyr Val Ser TrpTyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
35                 40                 45             
Ile Tyr Gly HisThr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 
50                 55                 60                 
Gly Ser Lys SerGly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg 
65                 70                 75                 80  
Ser Glu Asp GluAla Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 
85                 90                 95      
Ser Gly Trp ValPhe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 
100                105                110     
<210> 44
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Artificial antibody VL sequence.
<400> 44
Gln Ser Val LeuThr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 
1              5                  10                 15      
Lys Val Thr IleSer Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
20                 25                 30          
Tyr Val Ser TrpTyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
35                 40                 45             
Ile Tyr Gly HisThr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 
50                 55                 60                 
Gly Ser Lys SerGly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg 
65                 70                 75                 80  
Ser Glu Asp GluAla Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu 
85                 90                 95      
Ser Gly Trp ValPhe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 
100                105                110     
<210> 45
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Artificial antibody VL sequence.
<400> 45
Gln Ser Val LeuThr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 
1              5                  10                 15      
Lys Val Thr IleSer Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
20                 25                 30          
Tyr Val Ser TrpTyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
35                 40                 45             
Ile Tyr Asp HisThr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 
50                 55                 60                 
Gly Ser Lys SerGly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg 
65                 70                 75                 80  
Ser Glu Asp GluAla Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu 
85                 90                 95      
Ser Gly Trp ValPhe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 
100                105                110     
<210> 46
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Artificial antibody VL sequence.
<400> 46
Gln Ser Val LeuThr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 
1              5                  10                 15      
Lys Val Thr IleSer Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
20                 25                 30          
Tyr Val Ser TrpTyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
35                 40                 45             
Ile Tyr Asp HisThr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 
50                 55                 60                 
Gly Ser Lys SerGly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg 
65                 70                 75                 80  
Ser Glu Asp GluAla Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu 
85                 90                 95      
Ser Gly Trp ValPhe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 
100                105                110     
<210> 47
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Artificial antibody VL sequence.
<400> 47
Gln Ser Val LeuThr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 
1              5                  10                 15      
Lys Val Thr IleSer Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
20                 25                 30          
Tyr Val Ser TrpTyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
35                 40                 45             
Ile Tyr Asp HisThr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 
50                 55                 60                 
Gly Ser Lys SerGly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg 
65                 70                 75                 80  
Ser Glu Asp GluAla Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu 
85                 90                 95      
Ser Gly Trp ValPhe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 
100                105                110     
<210> 48
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Artificial antibody VH sequence.
<400> 48
Gln Val Gln LeuLeu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 
1              5                  10                 15      
Ser Leu Lys IleSer Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 
20                 25                 30          
Trp Ile Ala TrpVal Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met 
35                 40                 45             
Gly Leu Ile TyrPro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe 
50                 55                 60                 
Gln Gly Gln ValThr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 
65                 70                 75                 80  
Leu Gln Trp SerSer Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 
85                 90                 95      
Ala Arg His AspVal Gly Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala Lys Trp 
100                105                110         
Pro Glu Tyr PheGln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 
115                120                125             
Ser 
<210> 49
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Artificial antibody VH sequence.
<400> 49
Gln Val Gln LeuLeu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 
1              5                  10                 15      
Ser Leu Lys IleSer Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 
20                 25                 30          
Trp Ile Ala TrpVal Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met 
35                 40                 45             
Gly Leu Ile TyrPro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe 
50                 55                 60                 
Gln Gly Gln ValThr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 
65                 70                 75                 80  
Leu Gln Trp SerSer Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 
85                 90                 95      
Ala Arg His AspVal Ala Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala Lys Trp 
100                105                110         
Pro Glu Tyr PheGln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 
115                120                125             
Ser 
<210> 50
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Artificial antibody VH sequence.
<400> 50
Gln Val Gln LeuLeu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 
1              5                  10                 15      
Ser Leu Lys IleSer Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 
20                 25                 30          
Trp Ile Ala TrpVal Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met 
35                 40                 45             
Gly Leu Ile TyrPro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe 
50                 55                 60                 
Gln Gly Gln ValThr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 
65                 70                 75                 80  
Leu Gln Trp SerSer Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 
85                 90                 95      
Ala Arg His AspVal Gly Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala Lys Trp 
100                105                110         
Pro Glu Tyr PheGln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 
115                120                125             
Ser 
<210> 51
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Artificial antibody VH sequence.
<400> 51
Gln Val Gln LeuLeu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 
1              5                  10                 15      
Ser Leu Lys IleSer Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 
20                 25                 30          
Trp Ile Ala TrpVal Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met 
35                 40                 45             
Gly Leu Ile TyrPro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe 
50                 55                 60                 
Gln Gly Gln ValThr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 
65                 70                 75                 80  
Leu Gln Trp SerSer Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 
85                 90                 95      
Ala Arg His AspVal Gly Tyr Cys Thr Asp Arg Thr Cys Ala Lys Trp 
100                105                110         
Pro Glu Tyr PheGln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 
115                120                125             
Ser 
<210> 52
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Artificial antibody VH sequence.
<400> 52
Gln Val Gln LeuLeu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 
1              5                  10                 15      
Ser Leu Lys IleSer Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 
20                 25                 30          
Trp Ile Ala TrpVal Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met 
35                 40                 45             
Gly Leu Ile TyrPro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe 
50                 55                 60                 
Gln Gly Gln ValThr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 
65                 70                 75                 80  
Leu Gln Trp SerSer Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 
85                 90                 95      
Ala Arg His AspVal Gly Tyr Cys Thr Asp Arg Thr Cys Ala Lys Trp 
100                105                110         
Pro Glu Trp LeuGly Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 
115                120                125             
Ser 
<210> 53
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Artificial antibody VL sequence.
<400> 53
Gln Ser Val LeuThr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 
1              5                  10                 15      
Lys Val Thr IleSer Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
20                 25                 30          
Tyr Val Ser TrpTyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
35                 40                 45             
Ile Tyr Gly HisThr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 
50                 55                 60                 
Gly Ser Lys SerGly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg 
65                 70                 75                 80  
Ser Glu Asp GluAla Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 
85                 90                 95      
Ser Gly Trp ValPhe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 
100                105                110     
<210> 54
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Artificial antibody VL sequence.
<400> 54
Glu Ser Val LeuThr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 
1              5                  10                 15      
Lys Val Thr IleSer Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
20                 25                 30          
Tyr Val Ser TrpTyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
35                 40                 45             
Ile Tyr Asp HisThr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 
50                 55                 60                 
Gly Ser Lys SerGly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg 
65                 70                 75                 80  
Ser Glu Asp GluAla Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu 
85                 90                 95      
Ser Gly Trp ValPhe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 
100                105                110     
<210> 55
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Artificial antibody VL sequence.
<400> 55
Glu Ser Val LeuThr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 
1              5                  10                 15      
Lys Val Thr IleSer Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
20                 25                 30          
Tyr Val Ser TrpTyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
35                 40                 45             
Ile Tyr Asp HisThr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 
50                 55                 60                 
Gly Ser Lys SerGly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg 
65                 70                 75                 80  
Ser Glu Asp GluAla Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu 
85                 90                 95      
Ser Gly Trp ValPhe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 
100                105                110     
<210> 56
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Artificial antibody VL sequence.
<400> 56
Glu Ser Val LeuThr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 
1              5                  10                 15      
Lys Val Thr IleSer Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
20                 25                 30          
Tyr Val Ser TrpTyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
35                 40                 45             
Ile Tyr Asp HisThr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 
50                 55                 60                 
Gly Ser Lys SerGly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg 
65                 70                 75                 80  
Ser Glu Asp GluAla Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu 
85                 90                 95      
Ser Gly Trp ValPhe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 
100                105                110     
<210> 57
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Artificial antibody VL sequence.
<400> 57
Glu Ser Val LeuThr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 
1              5                  10                 15      
Lys Val Thr IleSer Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
20                 25                 30          
Tyr Val Ser TrpTyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
35                 40                 45             
Ile Tyr Asp HisThr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 
50                 55                 60                 
Gly Ser Lys SerGly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg 
65                 70                 75                 80  
Ser Glu Asp GluAla Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu 
85                 90                 95      
Ser Gly Trp ValPhe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 
100                105                110     
B10, 抗EGFR ECD
ATGGCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGATTACTACTGGAGTTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCCCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATGTCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTAAAGATAGTAGTCGGGGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCATCGGCCTCGGGGGCCGAATTGGGCGGCGGCGGCTCCGGAGGAGGAGGATCTGGTGGTGGTGGTTCGACTAGTGAAATTGTGATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCCATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACGCTCGAGC
B2, 抗EGFR ECD
ATGGCCCAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAATAATCAACCCTAGTGGTGGTAGCACAAGCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGGGACTACGGGGGAGAACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCATCGGCCTCGGGGGCCGAATTGGGCGGCGGCGGCTCCGGAGGAGGAGGATCTGGTGGTGGTGGTTCGACTAGTGACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAACAGGCTAACAGTTTCCCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACGCTCGAGC
H2, 抗Her2 ECD
ATGGCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTNTGGTGGGTCCTTCAGTGGTTACTACTGGAGTTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAGTCAATCATAGTGGAAGGACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGCATAGCAGCTCCTATGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCATCGGCCTCGGGGGCCGAATTGGGCGGCGGCGGCTCCGGANGAGGAGGATCTGGTGGTGGTGGTTCGACTAGTCAGACTGTGGTGACCCAGGAGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTTCACTGGTACCGGCAGCTTCCAGGAACAGTCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACACCAATCGGCCCTCAGGGGTCACTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCTCCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCATCCTGAGTGGTTATGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTAGGCTCGAG
H3 抗Her2 ECD
ATGGCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAATAATCAACCCTAGTGGTGGTAGCACAAGCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGGAGCAGTTGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCATCGGCCTCGGGGGCCGAATTGGGCGGCGGCGGCTCCGGAGGAGGAGGATCTGGTGGTGGTGGTTCGACTAGTGATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCGTATACAGTGATGGATACACCTACTTGAGTTGGTTTCACCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTATAAGGTTTCTAACCGGGACTCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGGTACACACTGGCCCCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGCTCGAGGC
【図１】
2009500005.tif 000061
【図２】
2009500005.tif 000062
【図３】
2009500005.tif 000063
【図４】
2009500005.tif 000064
【図５】
2009500005.tif 000065
【図６】
2009500005.tif 000066
【図７】
2009500005.tif 000067
【図８】
2009500005.tif 000068
【図９】
2009500005.tif 000069
【図１０】
2009500005.tif 000070
【図１１Ａ】
2009500005.tif 000071
【図１１Ｂ】
2009500005.tif 000072
【図１１Ｃ】
2009500005.tif 000073
【図１２】
2009500005.tif 000074
【図１３】
2009500005.tif 000075
【図１４】
2009500005.tif 000076
【配列表】
2009500005000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月3日(2008.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに結合させられた第１の抗体と第２の抗体が含まれている二重特異的抗体であって、ここで、該第１の抗体と該第２の抗体とは異なるエピトープに対して特異的に結合し、該第１の抗体は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４からなる群より選択される上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つのメンバーの上にある少なくとも１つのエピトープに対する結合特異性を有しており、そして該第２の抗体は、該第１のエピトープとは異なる、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４からなる群より選択されるタンパク質の上にあるエピトープである、上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つのメンバーの上にある第２のエピトープに対する結合特異性を有しており、該抗体は、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号３７からなる群より選択される核酸配列を含むベクターによってコードされる、二重特異的抗体。
【請求項２】
前記抗体が、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号３７からなる群より別々に選択される２つの核酸配列を含むベクターによってコードされる、請求項１に記載の二重特異的抗体。
【請求項３】
前記抗体が、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、および配列番号５７からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターによってコードされる、請求項１に記載の二重特異的抗体。
【請求項４】
前記抗体が、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、および配列番号５７からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列からなる群より別々に選択される２つの核酸配列を含むベクターによってコードされる、請求項１に記載の二重特異的抗体。
【請求項５】
前記ベクターはさらに、配列番号３７のポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項２に記載の二重特異的抗体。
【請求項６】
請求項１に記載の二重特異的抗体と薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の二重特異的抗体を含む、ガンを処置するための組成物。
【請求項８】
前記ガンが、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、および唾液腺ガンからなる群より選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
ガンを処置するための、請求項１に記載の二重特異的抗体を含む組成物であって、該組成物は、化学療法薬、外部線照射、標的化させられた放射性同位元素、およびシグナル伝達阻害因子からなる群より選択される他の細胞毒性薬と組み合わせて投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項１０】
エフェクターに結合させられた請求項１に記載の二重特異的抗体を含む、キメラ部分。
【請求項１１】
前記エフェクターが、細胞毒素、標識、放射性核種、薬物、リポソーム、リガンド、および抗体からなる群より選択される、請求項１０に記載のキメラ部分。
【請求項１２】
前記キメラ部分が融合タンパク質である、請求項１０に記載のキメラ部分。
【請求項１３】
ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４からなる群より選択される上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーに由来する受容体を保有している細胞に対してエフェクター分子を特異的に送達するための組成物であって：
請求項１に記載の抗体に結合させられた該エフェクター分子を含むキメラ部分を含み、
該細胞は該キメラ部分と接触させられて、それによって該キメラ部分を該細胞に対して特異的に結合させることを特徴とする、組成物。
【請求項１４】
前記エフェクター分子が、細胞毒素、標識、放射性核種、薬物、リポソーム、リガンド、および抗体からなる群より選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記キメラ部分が融合タンパク質である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記細胞がガン細胞である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記細胞が、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、および唾液腺ガンからなる群より選択されるガン細胞である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４からなる群より選択される上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーに由来する受容体を保有している細胞を特異的に死滅させるための組成物であって：
細胞毒素、放射性部分、および細胞毒素もしくは細胞増殖抑制因子を含むリポソームからなる群より選択されるエフェクターに結合させられた、請求項１に記載の抗体を含むキメラ部分を含み、
該細胞は該キメラ部分と接触させられて、それによって該キメラ部分を該細胞に対して特異的に結合させて、該細胞の死滅を生じさせることを特徴とする、組成物。
【請求項１９】
前記キメラ部分が融合タンパク質である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記細胞がガン細胞である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記細胞が、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、および唾液腺ガンからなる群より選択されるガン細胞である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つ以上のメンバーを発現している細胞または組織を検出するための組成物であって：
検出可能な標識に結合させられた請求項１に記載の二重特異的抗体を含むキメラ部分を含み、ここで、該組成物は、該細胞または組織と接触させられ、該標識が検出され、ここで、該細胞または組織と会合した該標識の検出が、上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つ以上のメンバーを発現している細胞または組織の存在を示すことを特徴とする、組成物。
【請求項２３】
前記検出可能な標識が、γ放射体、陽電子放射体、ＭＲＩ標識、および蛍光標識からなる群より選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記検出可能な標識がγ放射体であり、該検出はγ線カメラでの画像化を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記検出可能な標識が陽電子放射体であり、該検出は、陽電子放出型断層撮影法（ＰＥＴ）による画像化を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
前記検出可能な標識がＭＲＩ標識であり、該検出は核磁気共鳴撮影法による検出を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２７】
上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つ以上のメンバーを発現している細胞または組織が、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４からなる群より選択されるタンパク質を過剰発現する細胞または組織である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２８】
上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つ以上のメンバーを発現している細胞または組織が、ガン細胞または組織である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２９】
上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つ以上のメンバーを発現している細胞または組織が、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、または唾液腺ガンからなる群より選択されるガン細胞あるいは組織である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３０】
前記検出は非侵襲的画像化技術を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３１】
前記検出は免疫組織化学を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３２】
前記検出は、組織試料または生検における検出を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３３】
前記検出は、組織切片の中での検出を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記検出は、ヒトの中での前記細胞または組織の検出を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３５】
前記検出は、ヒトから採取された生物学的試料中の前記細胞または組織の検出を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３６】
２つの異なるエピトープに対して特異的に結合し、タンパク質切断部位が含まれていないリンカー分子を介して作動可能に連結させられた第１のアームと第２のアームとを有している二重特異的単鎖Ｆｖ抗体であって、該アームの一方は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４からなる群より選択される上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つのメンバーの上にある少なくとも１つのエピトープに対する結合特異性を有しており、そして他方のアームは、第１のエピトープとは異なる、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４からなる群より選択される上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つのメンバーの上にある第２のエピトープに対する結合特異性を有している、二重特異的単鎖Ｆｖ抗体。
【請求項３７】
前記第１のアームと前記第２のアームとが、Ｃ６．５、Ｃ６ＭＬ３−９、Ｃ６ＭＨ３−Ｂ１、Ｃ６−Ｂ１Ｄ２、Ｆ５、ＨＥＲ３．Ａ５、ＨＥＲ３．Ｆ４、ＨＥＲ３．Ｈ１、ＨＥＲ３．Ｈ３、ＨＥＲ３．Ｅ１２、ＨＥＲ３．Ｂ１２、ＥＧＦＲ．Ｅ１２、ＥＧＦＲ．Ｃ１０、ＥＧＦＲ．Ｂ１１、ＥＧＦＲ．Ｅ８、ＨＥＲ４．Ｂ４、ＨＥＲ４．Ｇ４、ＨＥＲ４．Ｆ４、ＨＥＲ４．Ａ８、ＨＥＲ４．Ｂ６、ＨＥＲ４．Ｄ４、ＨＥＲ４．Ｄ７、ＨＥＲ４．Ｄ１１、ＨＥＲ４．Ｄ１２、ＨＥＲ４．Ｅ３、ＨＥＲ４．Ｅ７、ＨＥＲ４．Ｆ８、およびＨＥＲ４．Ｃ７からなる群より選択される、請求項３６に記載の二重特異的単鎖Ｆｖ抗体
【請求項３８】
組み換えによって生産された、請求項３６に記載の二重特異的単鎖Ｆｖ抗体。
【請求項３９】
二重特異的単鎖Ｆｖ抗体の第１のアームと第２のアームとを作動可能に連結させるために適しているリンカー分子であって、該リンカーは、約３個から約３０個のアミノ酸の長さの範囲のアミノ酸配列から構成されており、タンパク質切断部位を含まない、リンカー分子。
【請求項４０】
二重特異的単鎖Ｆｖ抗体の第１のアームと第２のアームとを作動可能に連結させるために適しているリンカー分子であって、配列番号１１のアミノ酸配列を有している、リンカー分子。
【請求項４１】
２つの異なるエピトープに対して特異的に結合し、そして請求項４０または４１のいずれか１項に記載のリンカー分子によって作動可能に連結させられた第１のアームと第２のアームとを有している二重特異的単鎖Ｆｖ抗体であって、該第１のアームと該第２のアームとは、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４からなる群より選択される上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つのメンバーの上にある２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有している、二重特異的単鎖Ｆｖ抗体。
【請求項４２】
前記第１のアームと前記第２のアームとが、Ｃ６．５、Ｃ６ＭＬ３−９、Ｃ６ＭＨ３−Ｂ１、Ｃ６−Ｂ１Ｄ２、Ｆ５、ＨＥＲ３．Ａ５、ＨＥＲ３．Ｆ４、ＨＥＲ３．Ｈ１、ＨＥＲ３．Ｈ３、ＨＥＲ３．Ｅ１２、ＨＥＲ３．Ｂ１２、ＥＧＦＲ．Ｅ１２、ＥＧＦＲ．Ｃ１０、ＥＧＦＲ．Ｂ１１、ＥＧＦＲ．Ｅ８、ＨＥＲ４．Ｂ４、ＨＥＲ４．Ｇ４、ＨＥＲ４．Ｆ４、ＨＥＲ４．Ａ８、ＨＥＲ４．Ｂ６、ＨＥＲ４．Ｄ４、ＨＥＲ４．Ｄ７、ＨＥＲ４．Ｄ１１、ＨＥＲ４．Ｄ１２、ＨＥＲ４．Ｅ３、ＨＥＲ４．Ｅ７、ＨＥＲ４．Ｆ８、およびＨＥＲ４．Ｃ７からなる群より選択される、請求項４１に記載の二重特異的単鎖Ｆｖ抗体。
【請求項４３】
組み換えによって生産された、請求項４１に記載の二重特異的単鎖Ｆｖ抗体。
【請求項４４】
前記第１のアームと前記第２のアームとが腫瘍細胞の上に発現させられた異なるエピトープに対して特異的に結合し、そして該二重特異的単鎖Ｆｖ抗体の該エピトープに対する結合によって、該腫瘍細胞の生存の減少が生じる、請求項４１に記載の二重特異的単鎖Ｆｖ抗体。
【請求項４５】
前記第１のアームと前記第２のアームが、Ｃ６．５、Ｃ６ＭＬ３−９、Ｃ６ＭＨ３−Ｂ１、Ｃ６−Ｂ１Ｄ２、Ｆ５、ＨＥＲ３．Ａ５、ＨＥＲ３．Ｆ４、ＨＥＲ３．Ｈ１、ＨＥＲ３．Ｈ３、ＨＥＲ３．Ｅ１２、ＨＥＲ３．Ｂ１２、ＥＧＦＲ．Ｅ１２、ＥＧＦＲ．Ｃ１０、ＥＧＦＲ．Ｂ１１、ＥＧＦＲ．Ｅ８、ＨＥＲ４．Ｂ４、ＨＥＲ４．Ｇ４、ＨＥＲ４．Ｆ４、ＨＥＲ４．Ａ８、ＨＥＲ４．Ｂ６、ＨＥＲ４．Ｄ４、ＨＥＲ４．Ｄ７、ＨＥＲ４．Ｄ１１、ＨＥＲ４．Ｄ１２、ＨＥＲ４．Ｅ３、ＨＥＲ４．Ｅ７、ＨＥＲ４．Ｆ８、およびＨＥＲ４．Ｃ７からなる群より選択される、請求項４４に記載の二重特異的単鎖Ｆｖ抗体。
【請求項４６】
請求項８に記載の二重特異的単鎖Ｆｖ抗体と薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項４７】
ガンを処置するための、請求項８に記載の二重特異的単鎖Ｆｖ抗体を含む、組成物。
【請求項４８】
前記ガンが、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、および唾液腺ガンからなる群より選択される、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
ガンを処置するための組成物であって、該組成物は、治療有効量の請求項１０に記載のキメラ部分を含み、ここで、該組成物は、化学療法薬、外部線照射、標的化させられた放射性同位元素、およびシグナル伝達阻害因子からなる群より選択される他の細胞毒性薬と組み合わせて投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項５０】
請求項３６に記載の二重特異的単鎖Ｆｖ抗体をコードする核酸配列を含む、ベクター。
【請求項５１】
プラスミド、コスミド、ファージ、およびウイルスからなる群より選択される、請求項５０に記載のベクター。
【請求項５２】
前記ベクターが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１４からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項５０に記載のベクター。
【請求項５３】
前記ベクターが、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号３７からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項５０に記載のベクター。
【請求項５４】
請求項５０に記載のベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項５５】
腫瘍細胞である、請求項５２に記載の宿主細胞。
【請求項５６】
ＨＥＲ３に対する結合特異性を有している第１のアームと、ＨＥＲ２／ｎｅｕに対する結合特異性を有している第２のアームを含む、二重特異的単鎖Ｆｖ抗体ＡＬＭ。
【請求項５７】
ＨＥＲ３の上にある２つの異なるエピトープに対する結合親和性を有している第１のアームと第２のアームとを含む、二重特異的単鎖Ｆｖ抗体ＡＬＦ。
【請求項５８】
ガンを処置するための医薬の製造における、請求項１に記載の二重特異的抗体の、使用。
【請求項５９】
前記ガンが、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、および唾液腺ガンからなる群より選択される、請求項５８に記載の使用。
【請求項６０】
ガンを処置するための医薬の製造における、請求項１に記載の二重特異的抗体の使用であって、該医薬は、化学療法薬、外部線照射、標的化させられた放射性同位元素、およびシグナル伝達阻害因子からなる群より選択される他の細胞毒性薬と組み合わせて投与されることを特徴とする、使用。
【請求項６１】
ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４からなる群より選択される上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーに由来する受容体を保有している細胞に対してエフェクター分子を特異的に送達するための医薬の製造における、請求項１に記載の抗体に結合させられた該エフェクター分子を含むキメラ部分の使用であって、ここで、
該細胞は該キメラ部分と接触させられて、それによって該キメラ部分を該細胞に対して特異的に結合させることを特徴とする、使用。
【請求項６２】
前記エフェクター分子が、細胞毒素、標識、放射性核種、薬物、リポソーム、リガンド、および抗体からなる群より選択される、請求項６１に記載の使用。
【請求項６３】
前記キメラ部分が融合タンパク質である、請求項６１に記載の使用。
【請求項６４】
前記細胞がガン細胞である、請求項６１に記載の使用。
【請求項６５】
前記細胞が、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、および唾液腺ガンからなる群より選択されるガン細胞である、請求項６４に記載の使用。
【請求項６６】
ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４からなる群より選択される上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーに由来する受容体を保有している細胞を特異的に死滅させるための医薬の製造における、細胞毒素、放射性部分、および細胞毒素もしくは細胞増殖抑制因子を含むリポソームからなる群より選択されるエフェクターに結合させられた、請求項１に記載の抗体を含むキメラ部分の使用であって、ここで、
該細胞は該キメラ部分と接触させられて、それによって該キメラ部分を該細胞に対して特異的に結合させて、該細胞の死滅を生じさせることを特徴とする、使用。
【請求項６７】
前記キメラ部分が融合タンパク質である、請求項６６に記載の使用。
【請求項６８】
前記細胞がガン細胞である、請求項６６に記載の使用。
【請求項６９】
前記細胞が、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、および唾液腺ガンからなる群より選択されるガン細胞である、請求項６８に記載の使用。
【請求項７０】
上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つ以上のメンバーを発現している細胞または組織を検出するための医薬の製造における、検出可能な標識に結合させられた請求項１に記載の二重特異的抗体を含むキメラ部分の使用であって、ここで、該医薬は、該細胞または組織と接触させられ、そして該標識が検出され、該細胞または組織と会合した該標識の検出が、上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つ以上のメンバーを発現している細胞または組織の存在を示すことを特徴とする、使用。
【請求項７１】
前記検出可能な標識が、γ放射体、陽電子放射体、ＭＲＩ標識、および蛍光標識からなる群より選択される、請求項７０に記載の使用。
【請求項７２】
前記検出可能な標識がγ放射体であり、該検出はγ線カメラでの画像化を含む、請求項７０に記載の使用。
【請求項７３】
前記検出可能な標識が陽電子放射体であり、該検出は、陽電子放出型断層撮影法（ＰＥＴ）による画像化を含む、請求項７０に記載の使用。
【請求項７４】
前記検出可能な標識がＭＲＩ標識であり、該検出は核磁気共鳴撮影法による検出を含む、請求項７０に記載の使用。
【請求項７５】
上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つ以上のメンバーを発現している細胞または組織が、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４からなる群より選択されるタンパク質を過剰発現する細胞または組織である、請求項７０に記載の使用。
【請求項７６】
上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つ以上のメンバーを発現している細胞または組織が、ガン細胞または組織である、請求項７０に記載の使用。
【請求項７７】
上皮成長因子受容体タンパク質ファミリーの１つ以上のメンバーを発現している細胞または組織が、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、または唾液腺ガンからなる群より選択されるガン細胞あるいは組織である、請求項７０に記載の使用。
【請求項７８】
前記検出は非侵襲的画像化技術を含む、請求項７０に記載の使用。
【請求項７９】
前記検出は免疫組織化学を含む、請求項７０に記載の使用。
【請求項８０】
前記検出は、組織試料または生検における検出を含む、請求項７０に記載の使用。
【請求項８１】
前記検出は、組織切片の中での検出を含む、請求項７０に記載の使用。
【請求項８２】
前記検出は、ヒトの中での前記細胞または組織の検出を含む、請求項７０に記載の使用。
【請求項８３】
前記検出は、ヒトから採取された生物学的試料中の前記細胞または組織の検出を含む、請求項７０に記載の使用。
【請求項８４】
ガンを処置するための医薬の製造における、請求項８に記載の二重特異的単鎖Ｆｖ抗体の、使用。
【請求項８５】
前記ガンが、乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、胃ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、および唾液腺ガンからなる群より選択される、請求項８４に記載の使用。
【請求項８６】
ガンを処置するための医薬の製造における、請求項１０に記載のキメラ部分の使用であって、該医薬は、化学療法薬、外部線照射、標的化させられた放射性同位元素、およびシグナル伝達阻害因子からなる群より選択される他の細胞毒性薬と組み合わせて投与されることを特徴とする、使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９９】
【数４】
2009500005.tif 000121
（配列番号３７）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０５】
【数７】
2009500005.tif 000122
ｐＵＣ１１９ｍｙｃ／ｈｉｓベクターと増幅産物の、ＮｃｏＩとＮｏｔＩ酵素での消化を行い、その後、連結工程と、ＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）への形質転換を行った。その後、「ｐＵＣ／ＡＬＭ」と呼ぶ得られたプラスミドＤＮＡを精製し、そして単離した（図１）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009500005000001.app