(57)【要約】  本発明は、バイオアッセイ用の支持体及び、細胞培養、細胞に基づく方法及びアッセイにおけるその使用に関する。より詳細には、本発明は、ウイルスの固定化及び細胞接着に適したナノ構造二酸化チタン膜でコーティングされた固体物質を提供する。本発明のナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされた支持体は、遺伝子分析及び表現型分析用のマイクロアレイの作成に特に役立つ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面上にウイルス及び／又は細胞が固定化されたナノ構造ＴｉＯ２膜で少なくとも部分的にコーティングされている生体適合性のある基板物質の固体支持体。
【請求項２】
前記ナノ構造ＴｉＯ２膜が、７５％未満のＴｉＯ２かさ密度でアモルファスＴｉＯ２マトリクス内に埋め込まれた直径２０ｎｍ未満のＴｉＯ２ナノ粒子から成る、請求項１に記載の固体支持体。
【請求項３】
スライド、皿、フラスコ、プレート、カバースリップ、ファイバ、発泡体、粒子、膜、多孔質足場、網またはインプラントの形状である、請求項１または請求項２のいずれかに記載の固体支持体。
【請求項４】
前記基板物質が、ガラス、プラスチック、セラミック、金属、または、生分解性または非分解性の生体高分子物質である、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項５】
ビオチン化ウイルスが、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンを有する前記ナノ構造ＴｉＯ２膜上に固定化されている、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項６】
前記ナノ構造ＴｉＯ２膜がマイクロパターンまたはナノパターンの形状である請求項１から５のいずれか一項に記載の固体支持体を備えたマイクロアレイ装置。
【請求項７】
異なる遺伝子挿入物を有するウイルスが前記ナノ構造ＴｉＯ２膜の表面上にスポットされている、請求項６に記載のマイクロアレイ装置。
【請求項８】
請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の固体支持体を製造するための方法であり、
（ａ）気相からのナノ粒子の堆積によって、ウイルス及び／又は細胞に接触することになる基板材料の少なくとも領域の上に、ナノ構造ＴｉＯ２膜を堆積させる段階と、
（ｂ）前記ナノ構造ＴｉＯ２膜の表面をウイルス及び／又は細胞に接触させる段階とを備える方法。
【請求項９】
前記気相からのナノ粒子の堆積は、パルスマイクロプラズマクラスター源を用いた超音速クラスタービーム堆積（ＳＣＢＤ）によって実行される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞へのウイルス媒介遺伝子送達のための請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の固体支持体の使用。
【請求項１１】
ウイルスとのインビトロ細胞感染のための方法であり、
（ａ）ナノ構造ＴｉＯ２膜で少なくとも部分的にコーティングされている生体適合性のある基板物質の固体支持体を提供する段階と、
（ｂ）感染ウイルスの存在下において前記ナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされている支持体の上で細胞を培養する段階とを備える方法。
【請求項１２】
（ａ）ナノ構造ＴｉＯ２膜で少なくとも部分的にコーティングされている生体適合性のある基板物質の固体支持体を提供する段階と、
（ｂ）前記ナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされている支持体をウイルスに接触させる段階と、
（ｃ）前記ナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされている支持体の表面上に接着した前記ウイルスを細胞調合液に接触させる段階と、
（ｄ）感染が生じるのに十分な時間、細胞を培養する段階とを備える、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）ナノ構造ＴｉＯ２膜で少なくとも部分的にコーティングされている生体適合性のある基板物質の固体支持体を提供する段階と、
（ｂ）前記ナノ構造ＴｉＯ２膜のコーティング上にストレプトアビジン、アビジンまたはニュートラアビジンを固定化する段階と、
（ｃ）前記ナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされている支持体をビオチン化ウイルスに接触させて、固定化した前記ストレプトアビジン、前記アビジンまたは前記ニュートラアビジンとの前記ビオチン化ウイルスの複合体を形成する段階と、
（ｄ）前記複合体を細胞調合液に接触させる段階と、
（ｅ）感染が生じるのに十分な時間、細胞を培養する段階とを備える、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）ナノ構造ＴｉＯ２膜で少なくとも部分的にコーティングされている生体適合性のある基板物質の固体支持体を提供する段階と、
（ｂ）前記ナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされている支持体に細胞調合液を加える段階と、
（ｃ）適切な期間、細胞を培養する段階と、
（ｄ）ウイルス上清を加える段階と、
（ｅ）感染が生じるのに十分な時間、細胞を培養する段階とを備える、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ウイルスが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、または細胞遺伝子操作用のベクターとして利用可能な他のウイルスである、請求項１０から請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルスが遺伝子組み換えされている、請求項１１から請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子治療または細胞置換治療用の手段を生じさせるためのナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされた生体適合性のある物質の使用。
【請求項１８】
ウイルスを積み込んだナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされた生体適合性のある物質の注入可能な粒子または装置。
【請求項１９】
エキソビボ遺伝子治療のための方法であり、
（ａ）遺伝子を組み換えるための細胞を患者から回収する段階と、
（ｂ）回収した細胞から一次細胞の培養を達成する段階と、
（ｃ）対応する遺伝子情報を有するウイルスを用いた請求項１０から請求項１５のいずれか一項に記載の方法によって、細胞を感染させる段階と、
（ｄ）感染させた細胞を患者に再投与する段階とを備える方法。
【請求項２０】
インビボ遺伝子治療のための方法であり、
（ａ）ナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされた生体適合性のある物質の粒子または装置を提供する段階と、
（ｂ）前記粒子または前記装置にウイルスを積み込む段階と、
（ｃ）ウイルスを積み込んだ前記粒子または前記装置を患者の組織内に注入する段階とを備える方法。
【請求項２１】
前記ウイルスが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、または細胞遺伝子操作用のベクターとして利用可能な他のウイルスである、請求項１９または請求項２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記ウイルスが遺伝子組み換えされている、請求項１９から請求項２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
細胞置換治療のための方法であり、
（ａ）ナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされた生体適合性のある物質の粒子または装置を提供する段階と、
（ｂ）患者内で置換される細胞を前記粒子または前記装置に積み込む段階と、
（ｃ）細胞が積み込まれた前記粒子または前記装置を患者の組織内に注入する段階とを備える方法。
【請求項２４】
前記細胞が遺伝子組み換えされている、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオアッセイ用の支持体及び、細胞培養、細胞に基づく方法及びアッセイにおけるその使用に関する。より詳細には、本発明は、ウイルスの固定化及び細胞接着に適したナノ構造二酸化チタン膜でコーティングされた固体物質を提供する。本発明のナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされた支持体は、遺伝子分析及び表現型分析用のマイクロアレイの作成に特に役立つ。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムは完全に配列が決定されたので、正常状態及び病的状態における機能のために、タンパク質の完全なレパートリーを探索することの要求が、新規薬剤ターゲット識別及び遺伝子治療応用の主な目標になっている（非特許文献１）。
【０００３】
遺伝子機能の研究用の高スループット分析は、遺伝子の形質導入の高効率性と、異なる細胞モデルの系を、数千の遺伝子を免疫蛍光のような単純な方法で同時に分析可能な適切な支持体（例えば、スライド）上において、便利なフォーマットで分析できる可能性とを必要とする。
【０００４】
遺伝子の形質導入の方法は複数提案されており、トランスフェクション（非特許文献２）、エレクトロポレーション（非特許文献３）、マイクロインジェクション（非特許文献４）、ウイルス感染（非特許文献５）によるプラスミドＤＮＡの取り込みが挙げられる。
【０００５】
こうした技術の中で最も効率的なのは、ウイルス媒介性遺伝子送達である。何故ならば、異なる種類の細胞系（哺乳類起源の一次細胞及び癌細胞）が、異なるウイルスベクターで上手く形質導入されることが示されているからである。
【０００６】
二酸化チタン（ＴｉＯ２）は生体適合性のある物質として知られており（非特許文献６）、インプラントにおいて幅広く使用されている。ＴｉＯ２膜上のタンパク質及び細胞付着のメカニズムについては研究されている（非特許文献７、非特許文献８）。ナノ結晶ＴｉＯ２膜上のタンパク質の吸着については非特許文献１９において研究されている。ナノスケールでの表面の変更は、細胞接着を改善するために重要であると認識されている。しかしながら、ナノ構造基板上の細胞付着に影響を与えるメカニズムについては、大部分が知られていない（非特許文献９）。
【０００７】
ＴｉＯ２‐オリゴヌクレオチドナノコンポジットが、遺伝物質の細胞内への導入用のベクターとして最近提案されている（非特許文献１０）。こうしたナノコンポジットは、オリゴヌクレオチドＤＮＡの生物活性を保持しており、遺伝子治療を考慮して核酸エンドヌクレアーゼを誘導するために光活性化させることができる。
【０００８】
ウイルスアレイとは、そこで細胞のクラスターのそれぞれが基板に固定化されたウイルス粒子によって感染するものであるが、その実現はまだ挑戦的なものである。即ち、この方法は、ａ）ターゲット細胞に対するウイルスの活性を維持しながら基板上にウイルスを固定化すること、ｂ）ウイルスは固定化されるがターゲット細胞内には侵入できること、ｃ）固定化基板が、細胞の付着、感染及び増殖を可能にするために生体適合性があり、また、光学的に透明であることを可能にしなければならない。
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６３９２１８８号明細書
【非特許文献１】Ｄ．Ｓｔｏｌｌ外、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ：Ｔａｒｇｅｔｓ、２００４年、第３巻、ｐ．２４
【非特許文献２】Ｍ．Ｊｏｒｄａｎ、Ｆ．Ｗｕｒｍ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００４年、第３３巻、ｐ．１３６
【非特許文献３】Ｄ．Ｊ．Ｗｅｌｌｓ、Ｔｈｅｒａｐｙ、２００４年、第１１巻、ｐ．１３６３
【非特許文献４】Ｔ．Ｈ．Ｃｈｏｕ、Ｓ．Ｂｉｓｗａｓ、Ｓ．Ｌｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２００４年、第２４５巻、ｐ．１４７
【非特許文献５】Ａ．Ｃ．Ｈａｎｓｅｎ、Ｆ．Ｓ．Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２００２年、第４巻、ｐ．３２４
【非特許文献６】Ｎ．Ｂｒｕｎｅｅｌ、Ｊ．Ａ．Ｈｅｌｓｅｎ、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、１９８８年、第２２巻、ｐ．２０３
【非特許文献７】Ｆ．Ｈｏｏｋ外、Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  Ｓｕｒｆ．Ｂ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、２００２年、第２４巻、ｐ．１５５
【非特許文献８】Ｌ．Ｇ．Ｇｕｔｗｅｉｎ、Ｔ．Ｊ．Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｊ．Ｎａｎｏｐａｒｔ．Ｒｅｓ．、２００２年、第４巻、ｐ．２３１
【非特許文献９】Ｂ．Ｋａｓｅｍｏ、Ｓｕｒｆ．Ｓｃｉ．、２００２年、第５００巻、ｐ．６５６
【非特許文献１０】Ｔ．Ｐａｕｎｅｓｋｕ外、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒ．、２００３年、第２巻、ｐ．３４３
【非特許文献１１】Ｋ．Ｃｏｒｎｅｔｔａ、Ｗ．Ｆ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８９年、第２３巻、ｐ．１８７
【非特許文献１２】Ｈ．Ｈａｎｅｎｂｅｒｇ外、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９６年、第２巻、ｐ．８７６
【非特許文献１３】Ｅ．Ｂａｒｂｏｒｉｎｉ外、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．、２００２年、第８１巻、ｐ．３０５２
【非特許文献１４】Ｅ．Ｂａｒｂｏｒｉｎｉ外、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．、２０００年、第７７巻、ｐ．１０５９
【非特許文献１５】Ｅ．Ｂａｒｂｏｒｉｎｉ外、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｄ、１９９９年、第３２巻、ｐ．Ｌ１０５
【非特許文献１６】Ｐ．Ｐｉｓｅｒｉ外、Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．、２００１年、第７２巻、ｐ．２２６１
【非特許文献１７】Ｔ．Ｍ．Ｋｉｎｓｅｌｌａ外、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１９９６年、第７巻、ｐ．１４０５
【非特許文献１８】Ｃ．Ｈｕｇｈｅｓ外、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２００１年、第３巻、ｐ．６２３
【非特許文献１９】Ｅ．Ｔｏｐｏｇｌｉｄｉｓ外、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９８年、第７０巻、ｐ．５１１１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明の根底にある技術的な課題は、ウイルス及び／又は細胞を使用するバイオアッセイにおいて用いられる新規支持体を提供することである。
【００１１】
上述の技術的な課題の解決策は、特許請求の範囲において特徴付けられる本発明の実施形態によって提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
特に、気相からのナノ粒子の堆積によって得られたナノ構造ＴｉＯ２は、ウイルス吸着及び細胞接着用の利用価値の高い基板を提供し、細胞培養及び成長に完全に互換性があることがわかっている。
【００１３】
第一側面によると、本発明は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）バイオアッセイに特に適した固体支持体を対象としており、表面上に固定化したウイルス及び／又は細胞を有するナノ構造ＴｉＯ２膜で少なくとも部分的にコーティングされた生体適合性のある基板物質から成る。
【００１４】
細胞または組織培養に適した、また、細胞に基づいたアッセイに適したあらゆる物質を、ＴｉＯ２膜コーティング用の基板として使用することができ、好ましくは、ガラス、プラスチック、セラミック、金属、または、生分解性または非分解性の生体高分子物質が使用される。従来用いられているように、「生体適合性のある」という用語は、物質が、正常な細胞活性（例えば、インビトロ成長及び増殖）に影響を与えたり干渉したりせず、または、細胞培養の準備において使用される基板に相互作用したり、基板を変更したりしないということを指す。
【００１５】
支持体材料は、求められる応用及びアッセイフォーマットに応じて、様々な形に成形される。適切な支持体として、特に、高スループット法用のマイクロアッセイのための、及び、細胞培養のための、スライド（例えば顕微鏡用スライド）、皿、フラスコ、プレート（例えば、多重（例えば９６の）ウェルを有するマイクロタイタープレート）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の支持体の他の適切な形状は、カバースリップ、ファイバ、発泡体、粒子、膜、多孔質足場、網、インプラントである。
【００１６】
本発明によるナノ構造ＴｉＯ２（ｎｓ‐ＴｉＯ２）膜は、直径２０ｎｍ未満のＴｉＯ２ナノ粒子（つまり、微結晶）から成ることが好ましく、７５％未満のＴｉＯ２のかさ密度でアモルファスマトリクス（つまり、ＴｉＯ２から成る）内に埋め込まれている。ｎｓ‐ＴｉＯ２膜は、基板上への気相からのナノ粒子の堆積によって基板物質上に形成可能であり、特許文献１の装置を用いた超音速クラスタービーム堆積（Ｓｕｐｅｒｓｏｎｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｂｅａｍ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ，ＳＣＢＤ）を用いることが好ましい。
【００１７】
従って、本発明は更に、上述の固体支持体を製造するための方法に関する。本方法は、
（ａ）基板上への気相からのナノ粒子の堆積、例えば、パルスマイクロプラズマクラスター源を用いた超音速クラスタービーム堆積（ＳＣＢＤ）によって、生体物質（つまり、ウイルス及び／又は細胞）に接触することになる基板物質の少なくとも領域の上には、ナノ構造ＴｉＯ２膜を形成する段階と、
（ｂ）ナノ構造ＴｉＯ２膜の表面をウイルス及び／又は細胞に接触させる段階とを備える。
【００１８】
簡潔に言えば、ＳＣＢＤ法の本質は、超音速膨張で生じたクラスターを集結させることにある。クラスター間にリンクを生成し、物質を成長させるのには十分な衝撃エネルギーではあるが、衝突粒子の構造を破壊するには十分でない衝撃エネルギーを提供するために、クラスターは、超高温エネルギーへと空気力学的に加速される。この生成プロセスは、パルスマイクロプラズマクラスター源（Ｐｕｌｓｅｄ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｓｍａ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ，ＰＭＣＳ）として知られるクラスター源を利用する。このプロセスによって、クラスターの質量分布及び運動エネルギーを精密に制御して、ナノ構造薄膜を堆積させることが可能になる。ＰＭＣＳ技術の本質は、不活性キャリアガスを用いた所望の物質（つまり、ＴｉＯ２）のプラズマの凝縮によるクラスターの発生にある。このプロセスは、基板を室温に保ったままで実行することができる。堆積装置及び方法の更なる詳細については、本願において参照される特許文献１に開示されている。
【００１９】
ｎｓ‐ＴｉＯ２膜の堆積プロセスは、基板物質を完全にまたは部分的にコーティングするように設定可能である。一般的に、ｎｓ‐ＴｉＯ２膜は、生体物質（つまり、ウイルス及び／又は細胞）に接触することになる支持体表面上に堆積される。
【００２０】
本願において使用される“固定化”という用語は、ウイルス及び／又は細胞が、何らかの化学的方法（例えば、ストレプトアビジン／ビオチン、抗原／抗体等の結合パートナーを使用することによって）または物理的方法（例えば、接着、吸着）によって、ナノ構造ＴｉＯ２膜の表面に付着することを意味する。
【００２１】
従って、更なる側面において、本発明は、好ましくはパルスマイクロプラズマクラスター源を用いた超音速クラスタービーム堆積によって得られたナノ構造ＴｉＯ２膜の、ウイルス吸着または細胞接着用の基板としての使用を提供する。
【００２２】
紫外光電子分光法（Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，ＵＰＳ）分析は、堆積したｎｓ‐ＴｉＯ２膜の価電子バンドが、フェルミ準位（ＥＦ）に対して３から９ｅＶまでのエネルギー状態で特徴付けられるということを示す。この範囲内では、略６ｅＶでのピーク及び略８ｅＶでのピークが、π（非結合）及びσ（結合）のＯの２ｐ軌道に対応する。ＥＦの下０．８ｅＶに顕著なギャップ状態の存在が観測される。この状態は、酸素空孔によるＴｉ３＋の点欠陥に関係する。ｎｓ‐ＴｉＯ２膜の高い多孔性と化学吸着サイトの存在は、タンパク質の付着、ウイルスの吸着及び細胞の接着が、表面上に分布する正電荷の存在によって、また、大きな活性表面領域によって好ましいものになり得るということを意味する。
【００２３】
細胞またはウイルスは、細胞調合液（例えば、懸濁液）またはウイルス含有溶液の単純な接触によって、ＴｉＯ２膜の表面上に接着または吸着可能である。
【００２４】
本発明の他の実施形態によると、ストレプトアビジン、アビジンまたはニュートラアビジンを、ｎｓ‐ＴｉＯ２膜上への付着するビオチン化ウイルスと相互作用させるために、適切な支持体上に堆積させたｎｓ‐ＴｉＯ２膜上に固定化する。
【００２５】
本発明は更に、細胞をウイルスに感染させるための、特に細胞へのウイルス媒介遺伝子送達のための本発明による固体支持体の使用に関する。
【００２６】
従って、本発明は一般的に、ウイルスとのインビトロ細胞感染のための方法を提供する。本方法は、
（ａ）ナノ構造ＴｉＯ２膜で少なくとも部分的にコーティングされている生体適合性のある基板物質の固体支持体を提供する段階と、
（ｂ）感染ウイルスの存在下においてナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされている支持体の上で細胞を培養する段階と、を備える。
【００２７】
従って、本発明による細胞感染の方法は、感染ウイルスの存在下においてナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされている支持体の上で単純に細胞を培養することによって実行可能であり、ビオチン／ストレプトアビジン等の結合ペアを利用しない。ｎｓ‐ＴｉＯ２膜の固有の特徴のおかげで、実際のところ、ポリブレンや他のポリカチオン等の感染エンハンサーを用いた場合の同程度の効率で、ウイルスは基板表面に接着し、細胞を感染させる。しかしながら、ポリブレンやポリカチオンとは異なり、ｎｓ‐ＴｉＯ２でコーティングされた支持体は、毒性の問題を生じさせることがなく、細胞の機能性に影響を与えることがない（非特許文献１１）。
【００２８】
好ましい実施形態によると、感染方法は、
（ａ）ナノ構造ＴｉＯ２膜で少なくとも部分的にコーティングされている生体適合性のある基板物質の固体支持体を提供する段階と、
（ｂ）ナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされている支持体をウイルスに接触させる段階と、
（ｃ）ナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされている支持体の表面上に接着したウイルスを細胞調合液に接触させる段階と、
（ｄ）感染が生じるのに十分な時間、細胞を培養する段階とを備える。
【００２９】
代わりに、感染方法は、
（ａ）ナノ構造ＴｉＯ２膜で少なくとも部分的にコーティングされている生体適合性のある基板物質の固体支持体を提供する段階と、
（ｂ）ナノ構造ＴｉＯ２膜のコーティング上にストレプトアビジン、アビジンまたはニュートラアビジンを固定化する段階と、
（ｃ）ナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされている支持体をビオチン化ウイルスに接触させて、固定化したストレプトアビジン、アビジンまたはニュートラアビジンとのビオチン化ウイルスの複合体を形成する段階と、
（ｄ）この複合体を細胞調合液に接触させる段階と、
（ｅ）感染が生じるのに十分な時間、細胞を培養する段階とを備える。
【００３０】
ビオチン化ウイルス（例えばレトロウイルス）の生成は、例えば非特許文献１８に開示されているような当該分野において周知の方法により、実行可能である。
【００３１】
代わりに、本発明の感染方法は、
（ａ）ナノ構造ＴｉＯ２膜で少なくとも部分的にコーティングされている生体適合性のある基板物質の固体支持体を提供する段階と、
（ｂ）ナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされている支持体に細胞調合液を加える段階と、
（ｃ）適切な期間、細胞を培養する段階と、
（ｄ）ウイルス上清を加える段階と、
（ｅ）感染が生じるのに十分な時間、細胞を培養する段階とを備える。
【００３２】
本発明において使用されるのに好ましいウイルスはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ‐Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ，ＡＡＶ）及び、細胞の遺伝子操作用のベクターとして利用可能な他のウイルスである。本発明による「細胞」は、バクテリア等の原核細胞、並びに、イースト菌、植物細胞、動物細胞（好ましくは哺乳類細胞、特に人間細胞）等の真核細胞を含む。
【００３３】
一般的に、本発明によるｎｓ‐ＴｉＯ２膜でコーティングされた支持体を用いて、細胞へのウイルス媒介遺伝子送達に適したあらゆる方法を実行することができる。ｎｓ‐ＴｉＯ２膜でコーティングされた支持体上のウイルスの固定化は、例えば、適切な支持体（例えばペトリ皿やフラスコ）の表面上にコーティングされた際に細胞内へのレトロウイルス媒介遺伝子形質導入を顕著に増強する人間のフィブロネクチンのキメラペプチドや、レトロネクチン等のアンカー分子によって、達成可能である（非特許文献１２）。代わりに、ウイルスまたは細胞の遺伝子を組み換えて、これらの表面上に、ｎｓ‐ＴｉＯ２膜上に固定化されたタンパク質または抗体によって認識及び結合される結合ペプチドまたは抗原を晒すことが可能である。
【００３４】
好ましい実施形態では、本発明によるｎｓ‐ＴｉＯ２膜でコーティングされた支持体を用いて、マイクロアレイシステムを構成する。従って、本発明はまた、ナノ構造ＴｉＯ２膜がマイクロパターンまたはナノパターンの形状である本発明の固体支持体を備えたマイクロアレイ装置も提供する。ＳＣＢＤ法によって得られる極端に高いコリメーションによって、実際に、マイクロ及びナノパターン化ｎｓ‐ＴｉＯ２膜を、非常に高い解像度で製造することができる（非特許文献１３、非特許文献１４）。マイクロまたはナノパターン化膜は、所望の応用に応じて、異なる機能性を有することができる。例えば、マイクロアレイパターン化ｎｓ‐ＴｉＯ２膜でコーティングされた支持体を、遺伝子及び表現型アッセイにおいて使用することができる。こうした応用に対しては、異なる遺伝子挿入物を有するウイルスをマイクロアレイ上にスポットして、細胞を感染させるために使用する。その後、感染した細胞を、適切な検出システムを用いて、外来性遺伝物質の発現または統合のために分析する。
【００３５】
更に、本発明によるｎｓ‐ＴｉＯ２でコーティングされた物質を用いて、遺伝子治療及び細胞置換治療用の方法を開発することができる。例えば、ウイルスを積み込んだＴｉＯ２ナノ粒子を介した局所的な感染を実施するためのシステムでは、高レベルの局所的な遺伝子形質導入に有利に働くように、特定の組織内に注入することができる。また、本発明によるｎｓ‐ＴｉＯ２でコーティングした物質は、エキソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）遺伝子治療に有用である。本発明によるエキソビボ遺伝子治療の典型的な方法は、遺伝子を組み換えるための細胞を患者から回収する段階と、一次細胞の培養を達成する段階と、対応する遺伝子情報を有するウイルスでの感染という感染方法によって細胞を感染させる段階と、感染させた細胞を患者に投与する段階とを備える。
【００３６】
従って、本発明は、ウイルスを積み込んだナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされた生体適合性のある物質の注入可能な粒子または装置、つまり、二次元または三次元体（例えばチップ）を提供する。ウイルスは、ナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされた物質の表面に接着または吸着され得て、または、結合ペアまたは上述の他の方法を用いることによって、付着し得る。
【００３７】
更に、本発明は、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）遺伝子治療用の方法にも関する。本方法は、
（ａ）ナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされた生体適合性のある物質の粒子または装置を提供する段階と、
（ｂ）粒子または装置にウイルスを積み込む段階と、
（ｃ）ウイルスを積み込んだ粒子を患者の組織内に注入する段階と、を備える。
【００３８】
上述のように、本発明によるｎｓ‐ＴｉＯ２でコーティングされた物質は、細胞置換治療において有用である。従って、本発明の更なる実施形態は、細胞置換治療方法に関する。本方法は、
（ａ）ナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされた生体適合性のある物質の粒子または装置を提供する段階と、
（ｂ）患者内で置換される細胞（好ましくは遺伝子組み換え細胞）を粒子または装置に積み込む段階と、
（ｃ）細胞が積み込まれた粒子または装置を患者の組織内に注入する段階と、を備える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明を、下記の非限定的な例及び添付図面によって、更に例示する。
【００４０】
〈１．ｎｓ‐ＴｉＯ２基板の作製〉
ナノ構造ＴｉＯ２膜を、パルスマイクロプラズマクラスター源（Ｐｕｌｓｅｄ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｓｍａ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ，ＰＭＣＳ）源を備えた超音速クラスタービーム堆積（Ｓｕｐｅｒｓｏｎｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｂｅａｍ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ，ＳＣＢＤ）装置によって堆積させた（非特許文献１５）。簡潔に言うと、チタンターゲットを、不活性ガス（ＨｅまたはＡｒ）の閉じ込めプラズマジェットによって、スパッタリングする。スパッタリングされたＴｉ原子は不活性ガス内で熱運動化して、凝集してクラスターを形成する。このＴｉクラスターは、真空背景内の残留ガスとの相互作用、または、プロセス中の適切な量の酸素の導入のどちらかによって酸化される。その後、クラスター及び不活性ガスの混合物は、ノズルを介して真空中に抽出され、シーディングされた超音速ビームを形成するが、このビームは、ビームの軌跡上に位置する基板上に収集される。クラスターの運動エネルギーは分裂を避けるのに十分低いものであり、従って、ナノ構造膜が成長する。クラスターの質量分布は、膜のナノ構造を調節するために、空気力学的な集束によって制御可能である（非特許文献１６）。
【００４１】
〈２．ｎｓ‐ＴｉＯ２アレイ上の細胞感染アッセイ〉
ウイルスベクターを、アンホトロピックフェニックスパッケージング細胞内のＣａ（ＰＯ４）２トランスフェクション法によって生成する（非特許文献１７）。細胞をインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でビオチン化する（非特許文献１８）。また、ウイルス上清を収集して、４℃で一晩培養した後で、８％のＰＥＧ８０００で１０倍に濃縮し、−８０℃で１００μｇ／ｍｌの安定化糖（好ましくはトレハロース）の存在下で、等分する。
【００４２】
ウイルス滴定は、１０８から１０１２ｃｆｕ／ｍｌまでの範囲の異なるウイルス濃度を示す。
【００４３】
ＨＥＰＥＳ１０ｍＭ／ＮａＣｌ１５０ｍＭのバッファ中の１μｇ／ｍｌから０．１μｇ／ｍｌまでの範囲のタンパク質（ストレプトアビジン）の単層を、ロボットスポッティングによってナノ構造ＴｉＯ２スライド上に作成し、吸着するように培養し、この単層を１０％の血清によって安定化させる。その後、ビオチン化ウイルスを、ロボットスポッティングによって、機能性基板上に堆積させる。ウイルスを結合させるための培養時間後に、洗浄段階によって余剰ウイルスを除いて、細胞を基板上にプレートする。
【００４４】
４８〜７２時間後に、感染したアレイの分析を実施するため、細胞を、顕微鏡による免疫検出用に処理するか、または、適切な抗生物質（ピューロマイシン、ハイグロマイシン、Ｇ４１８）で処理して、選別を実施し、クラスター中に成長し、高効率で対象の遺伝子を示すまたは下方制御する一様な分布の細胞を得る。選別の最後には、スライドを、顕微鏡またはスキャナー検出用に処理する。
【００４５】
〈３．ｎｓ‐ＴｉＯ２上へのストレプトアビジンの吸着〉
１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ中でＣｙ３でラベルした０．１μｇ／ｍｌのストレプトアビジンを、ナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされたスライド上にスポットした。
【００４６】
スライドを、異なる時間点（０、８、２４、４８時間）に対して、３７℃で生理食塩水中で培養して、スポットされたタンパク質がＴｉＯ２表面上に安定に吸着したかどうかを検証した。その後、スライドを走査して、蛍光強度を決定した。結果（図１）は、８時間後に、蛍光強度が一定であり、ストレプトアビジン分子がＴｉＯ２上に吸着された安定な層を形成するということを示す。
【００４７】
〈４．ポリブレンが存在しない場合のｎｓ‐ＴｉＯ２媒介メラニン細胞感染〉
一次メラニン細胞をターゲット細胞として使用した。簡潔に言うと、従来通りの感染プロトコルに対して、細胞を、プラスチック支持体（対照）の上及びｎｓ‐ＴｉＯ２コーティングされたカバースリップの上にプレートした。２４時間後に、細胞を、ポリブレンが存在または存在しない下で溶液中においてＧＦＰ発現ウイルスで１２時間感染させた。７２時間後に、細胞を４％のパラホルムアルデヒドで１０分間固定して、核をＤＡＰＩで染色した。
【００４８】
細胞を蛍光顕微鏡で分析した。画像分析ソフトウェアを用いて、感染効率及び平均蛍光強度をそれぞれのサンプルに対して計算した。
【００４９】
結果（図２Ａ）は、ポリブレンが無い場合のｎｓ‐ＴｉＯ２を介した感染と、ポリブレンが有る場合のプラスチック支持体上の感染とのそれぞれが、同じ効率及び平均強度を有するということを示す。
【００５０】
“逆感染”プロトコル用に、異なる基板に対して感染効率を比較した。つまり、ｎｓ‐ＴｉＯ２でコーティングしたカバースリップ、ゼラチンでコーティングしたカバースリップ、及びプラスチックウェルを、４℃で４時間、ウイルス調合液（ＧＥＰ発現ウイルス）で培養した（ウイルス‐ＰＥＧは１０倍に濃縮したウイルス調合液に対応し、ウイルス‐上清は濃縮していないウイルス調合液に対応する）。
【００５１】
ＰＢＳで簡単に洗浄した後、メラニン細胞を全てのサンプル上にプレートした。７２時間後に、細胞を蛍光顕微鏡で分析した。画像分析ソフトウェアを用いて、感染効率及び平均蛍光強度をそれぞれのサンプルに対して計算した。
【００５２】
結果（図２Ｂ）は、ポリブレンが無い場合のｎｓ‐ＴｉＯ２によって媒介させた感染が、他の基板（ゼラチン及びプラスチック）のものと比較して、より効率的であるということを示す。
【００５３】
〈５．Ｕ２ＯＳ細胞を有するレトロウイルスマイクロアレイ〉
スライドを、超音速クラスタービーム堆積を用いてｎｓ‐ＴｉＯ２膜でコーティングした。スライドをストレプトアビジンでスポットして、培養及び洗浄して、余剰タンパク質を除いた。続いて、ビオチン化ウイルスを対応するスポット中にスポットした。異なる細胞内コンパートメントに位置し、細胞全体及び核小体のドットを染色する二つの異なるウイルスエンコーディング蛍光タンパク質を使用した。このシステムによって、異なるウイルスを特に発現する細胞クラスターの識別が可能になる。
【００５４】
スライドを、ストレプトアビジン／ウイルス結合を可能にするように培養し、洗浄した。その後、細胞をプレートした。７２時間後、スライドを４％のパラホルムアルデヒドで１０分間固定し、細胞核をＤＡＰＩで染色した。画像の獲得及び分析は自動顕微鏡を用いて実行した。結果を図３に示す。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ｎｓ‐ＴｉＯ２上のストレプトアビジンの吸着。ｎｓ‐ＴｉＯ２の層の上のストレプトアビジン‐Ｃｙ３のスポッティング。異なる時間（０、８、２４及び４８時間）に対する培養液中での３７℃での培養。
【図２Ａ】レトロウイルス上清（ＧＦＰ）でのメラニン細胞の従来通りの感染。
【図２Ｂ】レトロウイルス上清（ＧＦＰ）でのメラニン細胞の“逆感染”。異なる基板（プラスチック、ゼラチンでコーティングしたカバースリップ、ｎｓ‐ＴｉＯ２）の感染効率に関する比較。
【図３】Ｕ２ＯＳ細胞を有するレトロウイルスマイクロアレイ。
【図１】
2009501539.tif 000002
【図２Ａ】
2009501539.tif 000003
【図２Ｂ】
2009501539.tif 000004
【図３】
2009501539.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月24日(2007.5.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面上にウイルス及び／又は細胞が固定化されたナノ構造ＴｉＯ２膜で少なくとも部分的にコーティングされている生体適合性のある基板物質の固体支持体であり、
前記ナノ構造ＴｉＯ２膜が、７５％未満のＴｉＯ２かさ密度でアモルファスＴｉＯ２マトリクス内に埋め込まれた直径２０ｎｍ未満のＴｉＯ２ナノ粒子から成る、固体支持体。
【請求項２】
スライド、皿、フラスコ、プレート、カバースリップ、ファイバ、発泡体、粒子、膜、多孔質足場、網またはインプラントの形状である、請求項１に記載の固体支持体。
【請求項３】
前記基板物質が、ガラス、プラスチック、セラミック、金属、または、生分解性または非分解性の生体高分子物質である、請求項１または請求項２のいずれかに記載の固体支持体。
【請求項４】
ビオチン化ウイルスが、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンを有する前記ナノ構造ＴｉＯ２膜上に固定化されている、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項５】
前記ナノ構造ＴｉＯ２膜がマイクロパターンまたはナノパターンの形状である請求項１から４のいずれか一項に記載の固体支持体を備えたマイクロアレイ装置。
【請求項６】
異なる遺伝子挿入物を有するウイルスが前記ナノ構造ＴｉＯ２膜の表面上にスポットされている、請求項５に記載のマイクロアレイ装置。
【請求項７】
請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の固体支持体を製造するための方法であり、
（ａ）気相からのナノ粒子の堆積によって、ウイルス及び／又は細胞に接触することになる基板材料の少なくとも領域の上に、ナノ構造ＴｉＯ２膜を堆積させる段階と、
（ｂ）前記ナノ構造ＴｉＯ２膜の表面をウイルス及び／又は細胞に接触させる段階とを備える方法。
【請求項８】
前記気相からのナノ粒子の堆積は、パルスマイクロプラズマクラスター源を用いた超音速クラスタービーム堆積（ＳＣＢＤ）によって実行される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞へのウイルス媒介遺伝子送達のための請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の固体支持体の使用。
【請求項１０】
ウイルスとのインビトロ細胞感染のための方法であり、
（ａ）７５％未満のＴｉＯ２かさ密度でアモルファスＴｉＯ２マトリクス内に埋め込まれた直径２０ｎｍ未満のＴｉＯ２ナノ粒子から成るナノ構造ＴｉＯ２膜で少なくとも部分的にコーティングされている生体適合性のある基板物質の固体支持体を提供する段階と、
（ｂ）感染ウイルスの存在下において前記ナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされている支持体の上で細胞を培養する段階とを備える方法。
【請求項１１】
（ａ）７５％未満のＴｉＯ２かさ密度でアモルファスＴｉＯ２マトリクス内に埋め込まれた直径２０ｎｍ未満のＴｉＯ２ナノ粒子から成るナノ構造ＴｉＯ２膜で少なくとも部分的にコーティングされている生体適合性のある基板物質の固体支持体を提供する段階と、
（ｂ）前記ナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされている支持体をウイルスに接触させる段階と、
（ｃ）前記ナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされている支持体の表面上に接着した前記ウイルスを細胞調合液に接触させる段階と、
（ｄ）感染が生じるのに十分な時間、細胞を培養する段階とを備える、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）７５％未満のＴｉＯ２かさ密度でアモルファスＴｉＯ２マトリクス内に埋め込まれた直径２０ｎｍ未満のＴｉＯ２ナノ粒子から成るナノ構造ＴｉＯ２膜で少なくとも部分的にコーティングされている生体適合性のある基板物質の固体支持体を提供する段階と、
（ｂ）前記ナノ構造ＴｉＯ２膜のコーティング上にストレプトアビジン、アビジンまたはニュートラアビジンを固定化する段階と、
（ｃ）前記ナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされている支持体をビオチン化ウイルスに接触させて、固定化した前記ストレプトアビジン、前記アビジンまたは前記ニュートラアビジンとの前記ビオチン化ウイルスの複合体を形成する段階と、
（ｄ）前記複合体を細胞調合液に接触させる段階と、
（ｅ）感染が生じるのに十分な時間、細胞を培養する段階とを備える、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）７５％未満のＴｉＯ２かさ密度でアモルファスＴｉＯ２マトリクス内に埋め込まれた直径２０ｎｍ未満のＴｉＯ２ナノ粒子から成るナノ構造ＴｉＯ２膜で少なくとも部分的にコーティングされている生体適合性のある基板物質の固体支持体を提供する段階と、
（ｂ）前記ナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされている支持体に細胞調合液を加える段階と、
（ｃ）適切な期間、細胞を培養する段階と、
（ｄ）ウイルス上清を加える段階と、
（ｅ）感染が生じるのに十分な時間、細胞を培養する段階とを備える、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ウイルスが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、または細胞遺伝子操作用のベクターとして利用可能な他のウイルスである、請求項１０から請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ウイルスが遺伝子組み換えされている、請求項１１から請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子治療または細胞置換治療用の手段を生じさせるための、７５％未満のＴｉＯ２かさ密度でアモルファスＴｉＯ２マトリクス内に埋め込まれた直径２０ｎｍ未満のＴｉＯ２ナノ粒子から成るナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされた生体適合性のある物質の使用。
【請求項１７】
ウイルスを積み込んだ、７５％未満のＴｉＯ２かさ密度でアモルファスＴｉＯ２マトリクス内に埋め込まれた直径２０ｎｍ未満のＴｉＯ２ナノ粒子から成るナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされた生体適合性のある物質の注入可能な粒子または装置。
【請求項１８】
エキソビボ遺伝子治療のための方法であり、
（ａ）遺伝子を組み換えるための細胞を患者から回収する段階と、
（ｂ）回収した細胞から一次細胞の培養を達成する段階と、
（ｃ）対応する遺伝子情報を有するウイルスを用いた請求項１０から請求項１５のいずれか一項に記載の方法によって、細胞を感染させる段階と、
（ｄ）感染させた細胞を患者に再投与する段階とを備える方法。
【請求項１９】
インビボ遺伝子治療のための方法であり、
（ａ）７５％未満のＴｉＯ２かさ密度でアモルファスＴｉＯ２マトリクス内に埋め込まれた直径２０ｎｍ未満のＴｉＯ２ナノ粒子から成るナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされた生体適合性のある物質の粒子または装置を提供する段階と、
（ｂ）前記粒子または前記装置にウイルスを積み込む段階と、
（ｃ）ウイルスを積み込んだ前記粒子または前記装置を患者の組織内に注入する段階とを備える方法。
【請求項２０】
前記ウイルスが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、または細胞遺伝子操作用のベクターとして利用可能な他のウイルスである、請求項１８または請求項１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルスが遺伝子組み換えされている、請求項１８から請求項２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
細胞置換治療のための方法であり、
（ａ）７５％未満のＴｉＯ２かさ密度でアモルファスＴｉＯ２マトリクス内に埋め込まれた直径２０ｎｍ未満のＴｉＯ２ナノ粒子から成るナノ構造ＴｉＯ２膜でコーティングされた生体適合性のある物質の粒子または装置を提供する段階と、
（ｂ）患者内で置換される細胞を前記粒子または前記装置に積み込む段階と、
（ｃ）細胞が積み込まれた前記粒子または前記装置を患者の組織内に注入する段階とを備える方法。
【請求項２３】
前記細胞が遺伝子組み換えされている、請求項２２に記載の方法。
【国際調査報告】
2009501539.tif 000006
2009501539.tif 000007
2009501539.tif 000008
2009501539.tif 000009
2009501539.tif 000010