(57)【要約】  抗菌特性を有する生物工学処理コラーゲン構築物が提供される。生物工学処理コラーゲン構築物は、小腸の粘膜下層のような組織源由来の精製コラーゲン組織のシート様層、又は抗菌剤で処理された小腸の粘膜下層由来の処理済み腸コラーゲン層を含む。構築物は生体適合性である。本発明は、創傷被覆剤及び外科用修復デバイスを含めた種々の用途を有する。損傷柔組織又は疾患柔組織の治療方法が提供される。ケア及び治療を必要とする創傷の治療方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物工学処理コラーゲン構築物であって、
小腸の粘膜下層由来の精製コラーゲン組織基質の層であって、抗菌剤で処理された精製コラーゲン組織基質
を含み、前記構築物が生体適合性であり、創傷床に適用されると組織増殖を促す生物工学処理コラーゲン構築物。
【請求項２】
前記構築物がメッシュ加工処理、有窓加工処理又は穿孔加工処理されている、請求項１に記載の生物工学処理コラーゲン構築物。
【請求項３】
前記メッシュのメッシュ比が１：１．５である、請求項２に記載の生物工学処理コラーゲン構築物。
【請求項４】
前記抗菌剤がナノ結晶銀及びＰＨＭＢから成る群から選択される、請求項１に記載の生物工学処理コラーゲン構築物。
【請求項５】
前記構築物が架橋剤、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドと化学的に結合される、請求項１に記載の生物工学処理コラーゲン構築物。
【請求項６】
前記構築物が約０．０５〜約０．０７ｍｍの厚みを有する、請求項１に記載の生物工学処理コラーゲン構築物。
【請求項７】
生体再構築可能である、請求項１に記載の生物工学処理コラーゲン構築物。
【請求項８】
生物工学処理コラーゲン構築物であって、
抗菌剤で処理された加工組織材料の２つ以上の化学的結合層
を含み、前記構築物が哺乳類患者の創傷床中にインプラントされた場合、該構築物が制御された生分解を受けて患者の生細胞により再構築されるように生細胞を十分置換する生物工学処理コラーゲン構築物。
【請求項９】
前記構築物がメッシュ加工処理、有窓加工処理又は穿孔加工処理されている、請求項８に記載の生物工学処理コラーゲン構築物。
【請求項１０】
前記メッシュのメッシュ比が１：１．５である、請求項９に記載の生物工学処理コラーゲン構築物。
【請求項１１】
前記抗菌剤がナノ結晶銀及びＰＨＭＢから成る群から選択される、請求項８に記載の生物工学処理コラーゲン構築物。
【請求項１２】
前記構築物が架橋剤、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドと化学的に結合されている、請求項８に記載の生物工学処理コラーゲン構築物。
【請求項１３】
前記構築物が生体適合性である、請求項８に記載の生物工学処理コラーゲン構築物。
【請求項１４】
前記加工組織材料が小腸の粘膜下層である、請求項８に記載の生物工学処理コラーゲン構築物。
【請求項１５】
加工組織基質の２つ以上の、重ね合わせられ、結合された層を有する抗菌性生体再構築可能補綴の製造方法であって、
（ａ）水和された加工組織基質層の２つ以上のシートを重層する工程、
（ｂ）前記組織層を脱水して、該層を一緒に接着させる工程、
（ｃ）前記組織層を架橋剤と交差結合して、該層を一緒に結合させる工程、
（ｄ）前記層を洗浄して、前記架橋剤を除去する工程、そして
（ｅ）前記結合層を抗菌剤で処理する工程
を包含し、前記補綴が、哺乳類患者中にインプラントされた場合、制御された生分解を受けて前記患者の生細胞により再構築されるように、生細胞の適切な置換により起こる、抗菌性生体再構築可能補綴の製造方法。
【請求項１６】
小腸の粘膜下層由来の加工組織基質の２つ以上の、重ね合わせられ、結合された層を有する抗菌性生体再構築可能補綴の製造方法であって、
（ａ）水和された加工組織基質層の２つ以上のシートを重層する工程、
（ｂ）前記組織層を脱水して、該層を一緒に接着させる工程、
（ｃ）前記組織層を架橋剤と交差結合して、該層を一緒に結合させる工程、
（ｄ）前記層を洗浄して、前記架橋剤を除去する工程、そして
（ｅ）前記結合層を抗菌剤で処理する工程
を包含し、前記補綴が、哺乳類患者中にインプラントされた場合、制御生分解を受けて前記患者の生細胞により再構築されるように、生細胞の適切な置換により起こる抗菌性生体再構築可能補綴の製造方法。
【請求項１７】
小腸の粘膜下層由来の加工組織基質の単一層を有する抗菌性創傷被覆剤の製造方法であって、
（ａ）前記粘膜下層から組織基質を精製する工程、
（ｂ）前記組織基質を抗菌剤で処理する工程
を包含し、前記創傷被覆剤が、創傷に適用された場合に、湿性創傷環境を保持して該創傷中の皮膚組織の再生を促す方法。
【請求項１８】
前記創傷被覆剤がメッシュ加工処理、有窓加工処理又は穿孔加工処理される、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
創傷の治療方法であって、
（ａ）前記創傷及び該創傷周囲の領域を清浄化する工程、
（ｂ）抗菌剤で処理された小腸の粘膜下層由来の精製コラーゲン組織基質を含む抗菌性創傷被覆剤を適用する工程
を包含する方法。
【請求項２０】
前記抗菌性創傷被覆剤がメッシュ加工処理、穿孔加工処理、又は有窓加工処理される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
創傷の治療方法であって、以下の：
（ａ）前記創傷及び該創傷周囲の領域を清浄化する工程、
（ｂ）自家移植片、同種異系移植片又は培養皮膚構築物から成る群から選択される皮膚置換物を前記創傷に適用する工程、
（ｃ）抗菌剤で処理された小腸の粘膜下層由来の精製コラーゲン組織基質を含む抗菌性創傷被覆剤を皮膚置換物に適用する工程
を包含する方法。
【請求項２２】
前記皮膚置換物がメッシュ加工処理、穿孔加工処理又は有窓加工処理される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗菌性創傷被覆剤が前記創傷への適用前にメッシュ加工処理される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記創傷が、部分創傷及び全層創傷、褥瘡性潰瘍、静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、慢性血管潰瘍、トンネル化創傷、穿掘性創傷、外科的創傷、自家移植のためのドナー部位創傷、モース手術後創傷、レーザー手術後創傷、創傷離開、外傷性創傷、擦過傷、裂傷、第二度熱傷、皮膚断裂及び排液性創傷から成る群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
損傷組織を修復又は置換する方法であって、患者に補綴をインプラントする工程を包含し、該方法が、抗菌剤で処理されたコラーゲン材料の２つ以上の、重ね合わせられ、結合された層を含み、前記補綴が、哺乳類患者にインプラントされた場合、前記インプラント補綴が前記患者の生きている細胞により再構築されるように、生細胞の適切な置換により起こる、損傷された組織を修復又は置換する方法。
【請求項２６】
前記補綴が小腸の粘膜下層由来の加工小腸コラーゲンの２〜５枚のシートを含み、該シートが０．１〜１００ｍＭの濃度で塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドと一緒に結合され、架橋されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記補綴がヘルニア修復パッチ、大腿ヘルニア修復プラグ、心膜パッチ、膀胱スリング、子宮スリング、心臓内パッチ、置換心臓弁、血管パッチ、繊維輪修復プラグ、繊維輪修復パッチ、腱板修復補綴、硬膜修復パッチ、膀胱瘤修復デバイス、直腸瘤修復デバイス、膣円蓋脱修復スリング、又は形成外科インプラントである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
修復を必要とする損傷柔組織又は疾患柔組織が腹壁及び胸壁の欠損の治療、筋肉片強化、直腸脱及び膣脱、骨盤底再建、ヘルニア、縫合線強化及び再建手法のために用いられる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
小腸の粘膜下層由来の腸コラーゲン層を含む改質腸コラーゲン層であって、該層が抗菌剤で処理されている改質腸コラーゲン層。
【請求項３０】
前記抗菌剤がナノ結晶銀である、請求項２９に記載の改質腸コラーゲン層。
【請求項３１】
前記ナノ結晶銀が原子欠陥を欠く、請求項３０に記載の改質腸コラーゲン層。
【請求項３２】
前記抗菌剤がＰＨＭＢである、請求項２９に記載の改質腸コラーゲン層。
【請求項３３】
非コラーゲン性構成成分を実質的に含まない哺乳類細胞組織を含む加工組織基質であって、該加工組織基質が抗菌剤で処理されている加工組織基質。
【請求項３４】
前記抗菌剤がナノ結晶銀である、請求項３３に記載の加工組織基質。
【請求項３５】
前記ナノ結晶銀が原子欠陥を欠く、請求項３４に記載の加工組織基質。
【請求項３６】
前記抗菌剤がＰＨＭＢである、請求項３３に記載の加工組織基質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療及び組織工学処理の分野におけるものである。本発明は、動物源由来の加工組織材料又は基質から調製される生物工学処理構築物に向けられる。本発明の生物工学処理構築物は、加工組織基質の生体適合性、細胞適合性、強度及び生体再構築可能性を保存する方法を用いて調製される。抗菌特性が生物工学処理構築物に付与され、これらは、哺乳類宿主における生体組織移植、インプラント、組織修復、創傷修復及び再構築又はその他の用途のために用いられる。
【背景技術】
【０００２】
再生医療及び組織工学処理の分野は、工学処理の手法を生命科学の原理に合わせて、正常及び病的な哺乳動物組織における構造と機能との関係性を理解するものである。再生医療及び組織工学処理の目指すところは、組織機能の修復、維持及び改善のために生体代替物の開発及び最終的な使用を行うことである。
【０００３】
コラーゲンは、体の基本的な構造タンパク質で、体タンパク質全体の約１／３を占めている。それは、皮膚、腱、骨、及び歯の有機物質の殆どを構成し、ほとんどの他の体構造の繊維性包含物として存在している。コラーゲンの特徴のいくつかには、高い張力強度及び低い抗原性が含まれるが、これは或る程度は螺旋構造によって潜在的な抗原決定因子をマスキングするためであり、また低い伸長性、半透性及び溶解性も含まれる。さらに、コラーゲンは細胞接着のための天然物質である。これらの特徴及び他の特徴は、コラーゲンを組織工学処理、並びに移植用生体適合代替物及び生体再構築用補綴の製造に適当な材料となさしめている。
【０００４】
外移植された哺乳動物組織からコラーゲン組織及び組織構造物を得る方法、これらの組織及び組織構造物から補綴を構築するプロセスは、創傷治癒、外科的修復及び組織又は器官の置換に用いるために広く研究がなされてきている。患者の受ける医療水準の向上に成功裏に用いることができる、遺伝子操作した構築物を開発することは、研究者のとどまる事のない目標である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
生物由来コラーゲン材料、例えば腸粘膜下組織は、組織の修復又は置換に用いられ、そして引き続き開発及び改良されている。新規の生物工学処理、生体再構築可能構築物はここで、抗菌特性を付与されて、創傷治癒並びに組織の修復及び置換を含めた再生医療におけるそれらの性能特質を改良する。治癒、修復及び置換のための抗菌特性を有する薄層を形成するために用いられ得る腸粘膜下組織由来の腸コラーゲン（ＩＣＬ）の単一無細胞層を再生するための近似のブタ空腸の機械的及び化学的な加工処理のための方法が開示される。加工処理は、元のコラーゲン組織基質構造を保持しながら、細胞及び細胞屑を取り出す。その結果生じる加工組織基質のシートは、所望の特異性を有する単一層並びに多層化積層架橋構築物を調製するために用いられる。単一層創傷被覆剤製品、柔組織修復のための積層多層パッチ、並びに人工血管として管状化構築物の使用の有効性が研究された。この腸由来の加工組織材料は、最低限の癒合を生じながら必要な物理的支持を提供し、そして周囲を取り囲む元々の組織中に組込まれ、そして宿主細胞に浸潤されるようになる。ｉｎ  ｖｉｖｏ生体再構築は、これらの構築物の機械的結着性を危うくすることはない。弾性係数、縫合保持及び極限引っ張り強さのような移植片の固有で機能的な特性は、層の数及び架橋条件を変えることにより特定要件に関して操作され得る重要なパラメーターである。これらの構築物が用いられる処置部位での微生物活性を制御又は低下させるために、
ここで、抗菌性がこれらの構築物に付与される。
【０００６】
抗菌剤で処理される小腸の粘膜下層のような組織源由来の精製コラーゲン組織基質のシート様層、又は小腸の粘膜下層由来の処理済み腸コラーゲン層を含む抗菌特性を有する生物工学処理コラーゲン構築物を提供することは、本発明の一目的である。本発明の生物工学処理コラーゲン構築物が哺乳類患者の創傷を治療するための創傷被覆剤として用いられる場合、皮膚組織再生を促すために、患者自身の皮膚組織が湿性環境を提供されるように、当該構築物が創傷床に適用されて創傷を実質的に被覆し、構築物中の抗菌剤が創傷中の微生物活性を制御又は低下させる。構築物は生体適合性であり、このことは、構築物が非細胞傷害性であり、皮膚脱感作を引き起こさず、そして一次皮膚刺激を引き起こさない、ということを意味する。
【０００７】
一実施の形態では、創傷被覆剤は、約０．０５〜約０．０７ｍｍの厚みを有する小腸の粘膜下層由来の処理済み腸コラーゲンのシート及び抗菌剤を含む。シート様外形の精製組織基質の場合、それは層化され、次に層は一緒に化学的に結合されて、多層化構築物を提供し得る。したがって別の実施の形態は、一緒に結合され、そして抗菌剤で処理された精製組織基質の２つ以上の層を含む構築物である。本発明の構築物は、創傷床に対するより良好な立体配座、創傷滲出物のより良好な排出のいずれか、又はその両方のために、メッシュ加工処理、穿孔加工、又は有窓加工処理され得る。
【０００８】
ケア及び治療を必要とする創傷、特に抗菌的介入及び保護を必要とする創傷を治療することは、本発明のさらなる目的であり、この場合、当該創傷は、以下の種類の創傷のいずれかひとつを含む：部分創傷及び全層創傷、褥瘡性潰瘍、静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、慢性血管潰瘍、トンネル化／穿掘性創傷、外科的創傷、自家移植のためのドナー部位創傷、モース手術後創傷、レーザー手術後創傷、創傷離開、外傷性創傷、擦過傷、裂傷、第二度熱傷、皮膚断裂又は排液性創傷。
【０００９】
本発明の別の目的は、一緒に結合及び架橋されて、損傷柔組織又は疾患柔組織にインプラントされた場合に、本来のインプラント補綴が患者の生きている細胞により再構築されるように、生きている細胞の適切な置換により起こる制御生分解を受ける生体適合性及び生体再構築可能である多層構築物を形成する小腸の粘膜下層由来の処理済み腸コラーゲンの２つ以上の層、例えば２〜１０の層を含む、柔組織及び器官の治療及び修復のための、外科的修復デバイス、例えばパッチ又はメッシュを提供することである。修復及び抗菌的介入を必要とする損傷柔組織又は疾患柔組織の治療方法であって、損傷柔組織又は疾患柔組織上にインプラントされた場合に、本来のインプラント補綴が患者の生きている細胞により再構築されるように、生きている細胞の適切な置換により起こる制御生分解を受ける抗菌剤と接触された小腸の粘膜下層由来の処理済み腸コラーゲンの２つ以上の重ね合わされ、化学的に結合された層を含む補鉄のインプラントを包含する方法を提供することは本発明のこの態様のさらなる目的である。例えば修復を必要とする損傷柔組織又は疾患柔組織は、創傷、腹壁及び胸壁の欠損、筋肉片強化、直腸脱及び膣脱、骨盤底再建、ヘルニア、縫合線強化及び再建手法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、抗菌剤で処理された小腸の粘膜下層由来の処理済み腸コラーゲン層のような天然組織由来の精製コラーゲン組織基質、加工組織材料のシート様層を含む生物工学処理コラーゲン構築物（例えば補綴、移植片）に向けられる。生物工学処理コラーゲン構築物は、加工組織基質の単一層であるか、又は加工組織基質の多数の重ね合わされた結合層であり得る。本発明の生物工学処理コラーゲン構築物が哺乳類被験体の創傷を治療するために用いられる場合、創傷中及び創傷周辺の微生物活性を制御又は低下させるように皮膚組織再生及び抗菌組成物を促すために、患者自身の皮膚組織が湿性環境を提供されるように
、該構築物が創傷床に適用されて創傷を実質的に被覆する。本発明の生物工学処理コラーゲン構築物が外科用デバイスとして用いられる場合、それは、哺乳類被験体のインプラント部位に埋め込まれて、機能修復、増大又は置換身体パーツ又は組織構造として役立つ。抗菌剤は、構築物上での細菌の付着及び増殖を防止することにより、創傷部位又はインプラント部位における微生物活性を制御又は低下させる。本発明の抗菌性構築物は生体適合性であり、これは、構築物が非細胞傷害性であり、皮膚脱感作を引き起こさず、そして一次皮膚刺激を引き起こさない、ということを意味する。
【００１１】
本発明の補綴は「生体再構築可能」でもあり、新規の組織を作製するために宿主又は患者の細胞により提供される新規の内因性基質による再構築及び置換と同時的に起こる制御化生分解を受けることを意味する。したがって本発明の補綴は、抗菌剤を付与される場合、そして置換組織として用いられる場合、多数の特質を有する。第一に、それは代用身体パーツ又は創傷被覆物として機能する。第二に、依然として代用身体パーツとして機能しながら、それは宿主細胞の内方成長のための再構築鋳型として機能する。第三に、それは、処置部位に局所的な抗菌活性を提供する。
【００１２】
本発明の補綴材料は、それ自体又は別の処理済み精製組織基質と結合され、そして抗菌特性を付与されて、治療を要する被験体の身体上の部位へのインプラント又は埋め込みのための補綴を形成することができる哺乳類由来のコラーゲン組織から創り出される精製コラーゲン性加工組織である。
【００１３】
本発明は、加工処置された組織材料から組織工学的な処置をした補綴の製造方法を含み、その方法は、補綴の生体再構築性を維持しながら、層を同時に結合させるのに、粘着剤、縫合又はステーブルを必要としない。「加工処置した（処理済み）組織基質」及び「加工処置した（処理済み）組織材料」とは、動物源由来、好ましくは哺乳動物由来の、機械的に付属組織を清浄にし、細胞、細胞屑を化学的に清浄にし、非コラーゲン性細胞外基質成分を実質的に含んでいない天然の、通常は細胞性組織を意味する。加工組織基質は、非コラーゲン性成分を実質的に含まずに精製されているが、元々の基質構造、構成、強度、形状の多くを維持している。本発明の生物工学的処置を施された移植片を調製するための組織の原料となる処理済み組成物は、コラーゲンから成る動物組織から得られ、このようなコラーゲン組織源はコラーゲン組織基質から成る、腸、真皮、靭帯、心嚢、硬膜、胎盤及び他の平面又は平らな構造をした組織を（これらに限定されるものではない）含んでいる。これらの組織基質の構造及び形状によって、本発明の生物工学的移植片を調製するという点において、これら組織基質を容易にきれいにし、操作し、そして組み立てることができる。同様の平面構造、形状及び基質組成を有する他の適当な組織源は、本発明に従って、他の動物源において、当業者によって、特定、生成、及び処置され得る。
【００１４】
本発明の生物工学的移植片を調製するためのそのような加工組織基質組成物の一つは、小腸膜の粘膜下組織由来の腸コラーゲン層である。小腸の適当な源は、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ヤギ又はウマのような哺乳動物の器官である一方、ブタの小腸が容易に入手できる源である。
【００１５】
本発明の補綴は、ブタ小腸の粘膜下層由来の加工組織材料である処理済み腸コラーゲン層（時として「腸コラーゲン層」又は「ＩＣＬ」と呼ばれる）から調製され得る。この腸コラーゲン層を得るための一方法では、小腸は哺乳類から採取され、そして付随腸間膜組織が腸から大まかに切除される。例えば腸詰包装機械のものと同様の相対するローラー間に腸原料を機械的に圧搾することにより、小腸の他の層から粘膜下層が分離されるか或いは薄く剥がされて、筋肉層（筋層）及び粘膜（粘膜層）を除去する。小腸の粘膜層は周囲組織より堅く、且つ硬直しているので、ローラーは粘膜下組織からより柔らかい成分を圧搾して、機械的に清浄化された組織基質を生じる。以下の実施例では、ブタ小腸は、腸清
浄化機を用いて機械的に清浄化されて、次に、一連の溶液中で化学的に清浄化されて、加工組織基質が得られた。小腸の粘膜下層由来のこの機械的及び化学的な清浄化腸コラーゲン層は、本明細書では、「ＩＣＬ」と呼ばれ、これは本発明の抗菌構築物が調製される加工組織基質又は材料の一型である。
【００１６】
組成物では、処理済みＩＣＬ組織材料は、乾燥重量約９３％で、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、脂質、非コラーゲン性タンパク質及び核酸、例えばＤＮＡ及びＲＮＡの乾燥重量が約５％未満である無細胞性テロペプチドＩ型コラーゲンであり、そして細胞及び細胞屑を実質的に含有しない。処理済みＩＣＬ組織材料は、その基質構造及び強度のほとんどを保持する。重要なことは、コラーゲンの生体再構築能力に悪影響を及ぼす結合洗剤残渣を含有しないような清浄化工程により、組織基質の生体適合性及び生体再構築可能性が一部分保存される、ということである。さらに、コラーゲン分子は、組織が清浄化工程中に酵素による処理を受けていないので、それらのテロペプチド領域を依然として保有している。
【００１７】
加工組織基質を得るために、適切な動物及び組織源が確定される。組織は、機械的処理及び化学的処理の両方を受け、付随組織を除去し、そして組織から非コラーゲン性成分を除去して、加工組織基質を生じる。例として、ＩＣＬは、本発明の生物工学処理インプラント補綴の製造に用いられる加工組織基質の一型である。加工組織基質を提供し、そしてＩＣＬ及び抗菌剤を含む生物工学処理インプラント補綴を二次加工するために、組織を処理加工する方法を以下に記載する。
【００１８】
ブタＩＣＬを得るために、ブタ小腸の粘膜下層が、本発明の生物工学処理インプラント補綴のための出発材料として用いられる。ブタの小腸は、採取され、付随組織が除去されて、次に機械的作用と水による洗浄との組合せを用いて粘膜下層から脂肪、筋肉及び粘膜層を強制的に除去する腸清浄機械を用いて機械的に清浄化される。機械的作用は、ローラーの間を無傷の腸が通る場合に、圧縮し、そして粘膜下層から連続層を剥ぎ取る一連のローラーとして記述され得る。小腸の粘膜下層は、周囲組織より比較的に堅く、硬直しているので、ローラーは粘膜下組織からより柔らかい成分を圧搾する。当該技術分野における他の機械的清浄化手段は、他の物理的操作、例えば掻取り、圧搾、圧縮及び摩擦を包含するように当業者により確定され得る。機械的清浄化の結果は、腸の粘膜下層が単独で残存するような、機械的に清浄化された腸である。
【００１９】
機械的清浄化の後、好ましくは室温で無菌条件下で行われる化学的清浄化処置を行い、機械的に清浄化された小腸から細胞及び基質成分の除去を行う。機械的に清浄化された小腸を内腔に沿って縦方向に切り、次に長さ約１５ｃｍ〜５０ｃｍの断片に切る。材料を計量し、腸材料に対し約１００：１（ｖ／ｖ）の溶液の割合で容器の中に入れる。Abrahamに対する米国特許第５，９９３，８４４号及び同第６，５９９，６９０号（この開示は本明細書に援用されている）で開示されている方法のような、もっとも好ましい化学的清浄化処置においては、例えば水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の添加等によって、コラーゲン組織をアルカリ性条件下で、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）のような有効量のキレート剤に接触させ、次に塩を含有する有効量の酸、例えば塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含有する塩酸（ＨＣｌ）に接触させ、さらに、１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）／１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のような有効量の緩衝化塩溶液に接触させ、最終的に水を使用して洗浄工程を行う。化学溶液及び洗浄液の作用を高めるために、各々の処置工程を、回転台又は振盪台を使って遂行するのが好ましい。清浄化工程の結果は、処理済み腸コラーゲン層、又はＩＣＬ、即ち小腸の粘膜下層由来の機械的及び化学的な清浄化加工組織基質である。次に洗浄後、ＩＣＬを清浄容器から取り出し、ゆっくりと圧搾するか吸収して過剰な水を取り除く。この時点で、ＩＣＬは−８０℃で凍結保存してもよく、４℃で殺菌リン酸緩衝液の中で、又は補綴に製造されるまで乾燥して保存して
もよい。乾燥して保存する場合には、ＩＣＬのシートを平らな皿のような表面、好ましくは多孔性皿又はポリカーボネート性膜のような膜の上に平らにし、材料の外内腔（abluminal）側面から任意のリンパ管の垂れ下がり（tag）もメスを用いて除去し、室温及び周囲湿度でＩＣＬシートを層流フードの中で乾燥させてもよい。
【００２０】
ＩＣＬは、単層状の材料として用いられるか、又は最終的にその意図される用途による形状を有する補綴として用いることになる様々な型の構築物を製造するのに用いられ得る平らなシート構造物である。本発明の多層補綴を形成するためには、処理済み基質材料の生体適合性及び生体再構築性を保持し続けるだけではなく、置換組織として取り扱われた際にその強度と構造特性を維持し続けることもできる方法を用い、ＩＣＬシートを積層させる。組織由来の加工組織基質は、天然組織基質の構造的完全性を保持し、即ち、本来の組織のコラーゲン基質構造は実質的に無傷のままであり、そしてインプラントされた場合に多数の固有の機能的特性を示すように、物理的特性を保持する。ＩＣＬの多層ラミネートが調製される場合、ＩＣＬのシートは層化されて、別のシートと接触する。接触面積は、層が互いに直接的に重ね合わせられる場合でも、或いは部分的に接触するか、又は重なり合ってより複雑な構造を形成する場合であっても、層が互いに接触する結合領域である。完成構築物では、結合領域は、病院での取り扱われている間、インプラント中、並びに初期治癒段階中、置換身体パーツとして機能しながら、縫合及び引張りに耐え得るものでなければならない。結合領域はさらにまた、患者の細胞が集団を形成し、その後、補綴を生物学的に再構築して新しい組織を形成するまで、十分な強度を保持しなければならない。
【００２１】
加工組織基質は単一層補綴として用いられるか、或いは平面状、管状又は複雑な形状の多層化結合補綴に形成される。本発明の補綴が２つ以上の層或いは加工組織基質を含む場合、架橋剤を用いて一緒に層を化学的に架橋することにより、層は結合される。化学的架橋は多層の加工組織基質を一緒に結合するために用いられるが、化学的架橋の程度は、補綴全体を生体再構築する速度、すなわち補綴が宿主細胞及び組織により再吸収され、置換される速度を調整するために、変更され得る。言い換えれば、本発明の補綴に付与される架橋の程度が高いほど、補綴が受ける生体再構築の速度は遅くなり、逆に、架橋の程度が低いほど、生体再構築の速度は速くなる。外科的適応は、補綴が必要とする生体再構築の程度及び／又は速度を指示する。例えば単一層構築物が創傷被覆剤として用いられる場合、補綴は、化学的に架橋されることもあるし、そうでない場合もある。例えば外科用修復パッチ又はメッシュとして、補綴がより速い速度で生体再構築するように、補綴は低度の架橋を有する多層構築物である。例えば尿失禁を防止するために過可動性膀胱を支持するための膀胱スリングとしては、補綴が、長期間インプラントされた場合と同じように早く生体再構築されないように、即ち、実質的に同一の立体配座を持続するように、補綴は高度の架橋を有する多層構築物である。
【００２２】
コラーゲン基質又は構築物は、シート形態である場合、一般的に２つの相対する大表面積を有する。処理済みコラーゲン基質を抗菌剤で処理する場合、抗菌剤は、処理済みコラーゲン基質のいずれかの側面に接触させることにより適用され、或いは抗菌剤は両側に結合され得る。代替的には、処理済みコラーゲン基質の繊維吸湿性は、繊維加工組織基質の間隙における場合と同様に、例えば抗菌剤を含有する溶液中にコラーゲン基質を浸漬し、そして吸収により溶液を基質に浸透させることにより、処理済みコラーゲン基質の内面に抗菌剤を適用するのに影響を及ぼす。多層構築物の内部に抗菌剤を提供するための別の方法は、単一層の加工組織基質を処理し、次に層を一緒に積層し、結合することである。多層立体配置に関しては、該方法は、抗菌剤で基質シートを処理し、基質シートを層化して、多重層を形成し、そして以下のような任意の順序で架橋剤で構築物を架橋する二次加工処理工程を実行することを包含する：基質シートを抗菌剤で処理し、基質シートを層化して、多重層を形成し、次に、架橋剤で架橋すること、抗菌剤で基質シートを処理し、架橋
剤で架橋し、次に基質シートを層化して多重層を形成すること、架橋剤で架橋し、抗菌剤で基質シートを処理し、次に基質シートを層化して多重層を形成すること、架橋剤で架橋し、基質シートを層化して多重層を形成し、次に抗菌剤で基質シートを処理すること、基質シートを層化して多重層を形成し、架橋剤で架橋して、次に抗菌剤で基質シートを処理すること、或いは基質シートを層化して多重層を形成し、抗菌剤で基質シートを処理し、次に架橋剤で架橋すること。いくつかの場合、基質を架橋することは、抗菌剤の中には架橋剤により洗い落とされるものもあり得るため、抗菌剤で被覆後には実用的でないと考えられる。
【００２３】
非処理層及び処理層は異なる配列で一緒に層化されて、局在性抗菌剤を有する補綴を生じ得る。このような多層立体配置を形成するための方法は、抗菌剤で処理された加工組織基質シート並びに非処理基質シートを一緒に層化して、多層構築物を形成し、そして一緒に層を架橋することを包含する。例えば少なくとも２つの基質シートが層化、架橋、及び抗菌処理されて、処理基質構築物を形成し、そして次に1つ又は複数の非処理基質シートが処理基質構築物の上方表面又は下方表面のいずれか又は両方で層化されて、その結果生じた構築物が架橋されて、組合せ構築物を形成し得る。代替的には、少なくとも２つの非処理基質シートが層化され、架橋されて、非処理基質構築物を形成し、次に1つ又は複数の処理基質シートが非処理基質構築物の上方表面又は下方表面のいずれか又は両方で層化されて、その結果生じた構築物が架橋されて、組合せ構築物を形成し得る。別の例では、処理基質シート及び非処理基質シートは代替的に層化され、次に架橋されて組合せ構築物を形成し得る。さらに他の実施形態では、２つの異なる抗菌剤で処理された処理基質シートは交互に又は他の順序で整列されて、組合せ構築物を提供し得る。さらに別の実施例では、処理シート及び非処理シートの互いに対する或いは処理基質構築物又は組合せ基質構築物中の非処理基質構築物に対する配向は、ＩＣＬ材料の側面性を利用して設計され得る。
【００２４】
補綴の選択部分又は区域のみを処理するためには、表面の他の区域を処理させながら、抗菌剤が材料と接触するのをマスクが遮断するように処理されるべき表面の一部をマスクすることにより、材料の表面の一部が抗菌剤で処理され得る。コラーゲン基質上の抗菌剤を局在化するための別の方法は、コラーゲン基質の一部のみが抗菌剤と接触し、他の部分は抗菌処理と接触しないままであるように、浴又は溜め中にコラーゲン材料を部分的に浸漬することである。材料の表面に抗菌剤を局在化するためのさらに別の方法は、相対する表面を非処理にしたまま、材料の一表面上に抗菌剤を噴霧するか、そうでなければ噴射することである。
【００２５】
単一層及び多層の構築物は、抗菌剤で処理されて、構築物に抗菌特性を付与する。抗菌剤に構築物のすべて又は一部だけを接触させることにより、少なくとも１つの抗菌剤が本発明の構築物に適用される。好ましい抗菌剤としては、銀ベースの抗菌剤及び化学物質ベースの抗菌剤が挙げられる。抗生物質も、組成物中に含まれ得る。作用物質の組合せ、例えば銀ベースの抗菌剤及び化学物質ベースの抗菌剤、化学物質ベースの抗菌剤及び抗生物質、銀ベースの抗菌剤及び抗生物質、又は３つの種類の作用物質すべての組合せを用いて、コラーゲン材料を処理して、広範囲の抗菌活性を提供し得る。
【００２６】
銀ベースの抗菌剤が選択されて、加工組織基質を含む補綴に抗菌特性を付与し得る。銀は、いくつかの形態のコラーゲン構築物に適用され得る。銀ベースの抗菌剤としては、銀又は或る程度の抗菌活性を有する銀を含有する化合物を含み、そしてコラーゲン構築物及び患者の両方と適合性である。純銀（元素銀又は不活性銀とも呼ばれる）は、相対的に化学的に不活性であり、正常体温で水又は酸素と反応せず、そして希酸及び希塩基中で可溶性でない。
【００２７】
イオン銀も、用いられ得る。イオン形態の銀は、未だ微生物耐性を生じていないと考えられるし、他の抗菌剤より抗菌性が低いように見える。理論に縛られずに考えると、このイオン形態の銀は、細胞及び細胞壁呼吸、運搬並びに繁殖に直接的に影響を及ぼすことにより、細菌、酵母及び真菌並びに細胞外ウイルスに対して有効である。他の形態の銀も用いられ、例としては、酸化銀、硝酸銀、スルファジアジン銀（sulfazidine）（スルファジジン銀（Ｉ）は、抗菌剤及び抗真菌剤としてのその役割において徐々に銀イオンを放出し、そして重度熱傷の治療に局所的に用いられて、細菌感染を防止し得る不溶性ポリマー化合物を含む）、銀−イミダゾレート、ａｒｇｌａｅｓ（ＡｇＫａＰＯ4）、コロイド銀、銀結晶、例えば創傷部位又はインプラント部位に銀陽イオン及びそのラジカルを送達し、徐放する別の方法である銀ナノ結晶（「ナノ結晶銀」とも呼ばれる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
ナノ結晶銀（「ナノ銀」）組成物は、いくつかの異なる方法に従って作製される。一方法であるパルスプラズマ法は、原子欠陥（atomic disorder）を欠くが密な粒子サイズ分布並びに高度の忠実度を有する形態を示す組織化結晶格子構造を有するナノ結晶を生じる。パルスプラズマ法は、２つの伝導性原料棒を利用する。棒は、大気圧で制御ガス（ほとんどが不活性ガス、例えばアルゴン）を充填された反応小室中に供給される。棒は、高性能パルス放電電源に接続される。ナノ材料は、原料棒を横断してパルス電源から電力を迅速に放電することにより合成される。高性能放電は、原料を除去して、高温、高圧金属プラズマを作り出す。独特の気体力学を用いるため、プラズマは周囲気体中に急速に拡がって、ナノ粒子の均質気相懸濁液を作製する。生成されるナノ粒子は、閉ループ系を用いて連続的に収集される。送風機は、粒子を保有する制御気体を収集系に再循環させる。この方法は、プロセスパラメーターによって、直径１０ｎｍ〜１００ｎｍのナノ結晶銀粒子を生成する。一般的に、１５ｎｍ〜４０ｎｍ又は２０ｎｍ〜２５ｎｍの粒子サイズが本発明で用いるために選択される。
【００２９】
ナノ銀組成物を二次加工するための他の方法としては、米国特許第６，７１９，９８７号（Burrell）に記載されている方法が挙げられる。これらの方法は、原子欠陥により特性化される結晶格子を有する結晶を作製する。Burrell法では、沈着される材料は、例えば蒸発又はスパッタリングにより蒸気相中で生成され、そして温度が制御される大容積中に移される。材料の原子は作業気体大気の原子と衝突して、エネルギーを失い、そして蒸気相から冷支持体、例えば液体窒素冷却フィンガー上に迅速に凝結される。原子欠陥は、十分な原子欠陥が材料中に保持されるように、拡散を制限する条件により作製される。沈着は、銀に関して−１０℃〜１００℃の低基質温度で実行される。通常値より高い作業気体圧が用いられ、入射角は約３０°より低く、高沈着速度が通常より高い原子束を生じる。原子欠陥は、「ドーピング」と呼ばれるプロセスにより、又は反応性気体（即ち酸素）を小室中に混入することにより、金属基質中の異なる原子又は分子の存在によっても達成され得る。この方法によれば、酸素はプロセス気体中の一構成成分である。
【００３０】
化学物質ベースの抗菌剤は、構築物に抗菌特性を付与するためにコラーゲン構築物に適用され得る。網羅的リストではないが、化学抗菌剤は、ポリ塩酸（ヘキサメチレンビグアニド）（ＰＨＭＢ）、クロルヘキサジングルコネート、ビス−アミドポリビグアニド、例えば米国特許第６，３１６，６６９号（この開示内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されたもの、蜂蜜、塩化ベンズアルコニウム、トリクロサン（２，４，４’−トリクロロ−２’−ヒドロキシジフェニルエーテル）、及びシリル第四級アンモニウム塩（オクタデシルデメチルトリメトキシシリルプロピルアンモニウムクロリド）から選択される。
【００３１】
抗菌剤のほかに、コラーゲン構築物は、抗生物質をさらに含み得る。抗生物質は、他の微生物を死滅させるか又はその増殖を阻害するために微生物により産生されるものである
。一般的には、抗生物質は、主に土壌中に生息する微生物により、二次代謝産物として産生される低分子量（非タンパク質）分子である。これらの微生物のほとんどが、いくつかの型の胞子又はその他の休眠細胞を形成し、そして抗生物質産生と胞子形成の過程との間に多少の関係が存在すると考えられる。糸状菌の中で、注目すべき抗生物質手法は、ペニシリウム属及びセファロスポリウム属であり、これらはペニシリン及び関連化合物を含むβラクタム抗生物質の主要供給源である。細菌では、アクチノミセス属、特にストレプトミセス種は、種々の種類の抗生物質、例えばアミノグリコシド、例えばストレプトマイシン、マクロライド、例えばエリスロマイシン、及びテトラサイクリンを産生する。内生胞子形成バシラス種は、ポリペプチド抗生物質、例えばポリミキシン及びバシトラシンを産生する。抗生物質は殺作用を有する可能性があり、これは、「死滅」作用又は静止作用であって、一連の微生物に及ぼす「阻害」作用を意味する。抗生物質の作用範囲は、細菌又は他の微生物がそれにより影響を受ける範囲である。広範囲のグラム陽性及びグラム陰性細菌を死滅するか又は阻害する原核動物に対して有効な抗生物質は「広範囲」と呼ばれ、主にグラム陽性又はグラム陰性細菌に対して有効なものは「狭範囲」であり、そして単一生物体又は疾患に対して有効なものは「限定範囲」である。用いられるべき好ましい抗生物質化合物は、広範囲抗生物質である。抗生物質化合物は、組合せて、例えば狭範囲グラム陽性化合物と狭範囲グラム陰性化合物との組合せでコラーゲン構築物に提供されるが、広範囲、狭範囲及び限定範囲抗生物質の任意の組合せが用いられ得る。
【００３２】
本発明に用いるための抗生物質としては、βラクタム（ペニシリン及びセファロスポリン）、例えばペニシリンＧ、セファロチン、半合成ペニシリン（クラブラン酸も含み得る）、例えばアンピシリン、アモキシシリン及びメチシリン、モノバクタム、例えばアズトレオナム、カルボキシペネム、例えばイミペネム、アミノグリコシド、例えばストレプトマイシン、ゲンタマイシン、糖ペプチド、例えばバンコマイシン、リンコマイシン、例えばクリンダマイシン、マクロライド、例えばエリスロマイシン、ポリペプチド、例えばポリミキシン、バシトラシン、ポリエン、例えばアンフォテリシン、ニスタチン、リファマイシン、例えばリファンピシン、テトラサイクリン、例えばテトラサイクリン、半合成テトラサイクリン、例えばドキシサイクリン、並びにクロラムフェニコールが挙げられる。
【００３３】
加工組織基質は、単一層補綴中で単一層単独として用いられ得るし、或いは２つ以上の層を有する補綴を二次加工するために用いられ得る。単一層として用いられる場合、抗菌剤は加工組織基質に接触されて、基質に抗菌特性を付与する。抗菌剤との接触の前又は後に、加工組織基質は架橋されて、材料の生体再構築及び生分解の速度を制御し得る。言い換えれば、単一層抗菌性構築物は、抗菌剤で処理され、単一層、架橋剤で架橋され、次に抗菌剤で処理される単一層、或いは抗菌剤で処理され、次に架橋剤で架橋される単一層である。
【００３４】
加工組織基質の２つ以上の層を含む多層補綴の製造方法は、ＩＣＬを用いて記載される。
【００３５】
本発明の一実施の形態は、患者の細胞が生体再構築を行い得る移植可能生体材料として使用する、結合及び架橋した二層以上のＩＣＬから成る平板なシート状補綴、及び平板なシート状補綴の製造方法と使用方法を対象とする。ＩＣＬの平板なシート状構造によって、補綴は任意の数の層、好ましくは２〜１０層、さらに好ましくは２〜６層から成るように、構築物の最終的に意図する用途に必要な強度及び大きさに従って容易に製造される。ＩＣＬは一般的に同じ方向に走る構造基質繊維を有している。層状にした場合、加工組織層における一般的な組織繊維の方向を利用するように、層の方向を換えてもよい。シートは、繊維方向が平行又は別々の角度にあるように層状にしてもよい。また、層は重ねられて、補綴の領域を横切って連続する層を有する構築物を形成してもよい。代替的に、重ねられた配置の最終的な大きさが、腸の外周によって限られているので、層をコラージュの
ように互い違いにして配置して、出発物質の直径よりも大きな表面積を有するが、補綴の領域を横切る連続的な層がないシート状構築物を形成してもよい。複雑な特徴、例えば、導管、層の間を走る又は層を横断する導管又は溝のネットワークを導入してもよい。
【００３６】
ＩＣＬから成る多層構築物の製造において、殺菌ＩＣＬ材料を使って開始する場合には構築物の殺菌性を維持するために、無菌環境と殺菌機器とを用いるのが好ましい。ＩＣＬの多層構築物を形成するには、ポリカーボネートの硬いシートのような堅固な第１の殺菌支持体を、層流キャビネットの殺菌面に敷く。ＩＣＬシートが、機械的清浄化工程及び化学的清浄化工程からまだ水和状態にない場合には、水又はリン酸緩衝生理食塩水のような水溶液を使って水和する。ＩＣＬシートを殺菌吸収性布を使って水を吸い取り、材料から過剰な水分を吸収する。今だ終了していない場合には、ＩＣＬ材料は、漿膜表面上にある任意のリンパ管の垂れ下がりが外内腔側面から整えられる。整えられたＩＣＬの第１のシートを、ポリカーボネート製シートの上に敷き、手でポリカーボネート製シートに撫で付け、いかなる気泡、折り目及びヒダも取り除く。第２の整えられたＩＣＬシートを第１のシートの上に敷き、再度、手でいかなる気泡、折り目及びヒダも取り除く。特定の用途のための望ましい数の層が得られるまで、好ましくは２〜１０層になるまで、これを繰り返す。
【００３７】
ＩＣＬは、その本来の管状態に由来する面を有しており、つまり、本来の状態では腸の内腔に面した内部粘膜表面と外内腔に面した反対側の外部漿膜表面である。これらの表面が、補綴の手術後の性能に影響を与え得るが、装置の性能を強めるのに利用し得る特性を有することが見出された。現状では合成装置の使用で、癒着形成は周囲組織からの癒着を解除するために再度の手術の必要が不可欠であり得る。２層のＩＣＬを有する、心膜パッチ又はヘルニア修復補綴の形成においては、粘膜表面がインプラント後の手術後癒着形成を食い止める能力を有することを示しているので、２層の結合領域が漿膜表面の間にあるのが望ましい。他の実施の形態においては、ＩＣＬパッチ補綴の１つの表面が非癒着性、非粘着性で、もう１つの表面が宿主組織へ癒着する親和性を有するということが望ましい。この場合には、補綴は一方に粘膜表面と他方に漿膜表面を有することになる。さらに別の実施の形態では、相対する表面が癒着を生み出すことができ、どちらかの側で接触する組織を共に増殖させるので、補綴が構築物の両側上に漿膜表面を有するということが望ましい。インプラントした場合に、２つのみの外部シートが潜在的に他の体の構造物と接触するので、構築物が３つ以上から成る場合は、内部の層の方向は、手術後の癒着形成の一因とはなりそうにないので、重要性が少ない。
【００３８】
所望の数のＩＣＬシートを層状にした後、結合領域、すなわちシート同士が接している部分で脱水を行ってシート同士を結合させる。理論に拘束されるのを望みはしないが、ＩＣＬ基質の繊維の間から水分が除去された場合に、脱水は、ＩＣＬ層のコラーゲン繊維でも一緒に行われる。層は、第１の支持体の上で、又は第１の支持体とポリカーボネート製の第２のシートのような第２の支持体との間で何も覆いをしないで脱水してもよく、その第２の支持体は、乾燥前にＩＣＬの最上層の上に置かれ、第１の支持体に留められて、少しの圧力をかけて、又は圧力をかけないで、全ての層を共に平板で平らな配置にする。脱水を促進するために、支持体は多孔性のものであってもよく、空気及び水分が脱水されている層を通りぬけることができるようにする。層は、大気下、真空下、又はアセトン、若しくはエチルアルコール若しくはイソプロピルアルコールのようなアルコールによって化学的手段で乾燥され得る。脱水は、約１０％Ｒｈ〜約２０％Ｒｈ以下の室内湿度、又は約１０％〜２０％ｗ／ｗ以下の湿気にまで脱水され得る。脱水は、ポリカーボネート製シートを保持するフレームを折り曲げ、ＩＣＬ層を層流キャビネットの噴出し口に、室内温度約２０℃の室内湿度下において少なくとも約１時間〜最大２４時間さらすことによって容易になされ得る。
【００３９】
一実施の形態では、必要とはされていないが、脱水した層を互いに架橋する前に再水和する。脱水したＩＣＬ層は、多孔性支持体を共に剥がし、水溶性の再水和薬剤、望ましくは水で層を再水和し、この場合、脱水したＩＣＬ層を、分離又は積層剥離が起こらないように層を再水和するために再水和薬剤を含む容器の中に、温度約４℃〜約２０℃で少なくとも約１０分間〜約１５分間浸す方法を採る。
【００４０】
脱水、又は脱水及び再水和し結合している層は次に、架橋用薬剤、好ましくはＩＣＬ材料の生体再構築性を保持する化学架橋用薬剤を有する層になったＩＣＬに接触させて、結合領域において相互架橋を施す。上記に述べたように、脱水により、共にＩＣＬ層に隣接する基質中のコラーゲン線維は共に結合する結果となり、これらの層を共に架橋させると、層を結合する成分の間の化学的結合を形成する。結合した補綴装置を架橋すると、強度及び耐久性も装置にもたらし、取り扱い性が向上する。架橋用薬剤については、当該技術分野では様々な種類が知られており、リボース及び他の糖類、酸化剤及び脱水温熱（ＤＨＴ）法等が使用され得る。好ましい架橋用薬剤は、塩酸１−エチル−３（３−ジメチルアミノピロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）である。別の好ましい方法としては、ＥＤＣ架橋剤にスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドが添加され、これは、Staros J. V.、Biochem. 21, 3950-3955, 1982に記述されている。化学的架橋剤に加え、層は、フィブリンをベースとした接着剤、又はポリウレタン、ビニルアセテート若しくはポリエポキシのような医療用接着剤によって結合してもよい。もっとも好ましい方法においては、ＥＤＣを好ましくは約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭ、さらに好ましくは約１．０ｍＭ〜約１０ｍＭ、もっとも好ましくは約１．０ｍＭの濃度で水に溶解する。水に加えて、リン酸緩衝生理食塩水又は（２−［Ｎ−モルフォリノ］エタンスルホン酸）（ＭＥＳ）緩衝剤を使って、ＥＤＣを溶解してもよい。他の薬剤を溶液に添加してもよく、例えば、アセトン、又はアルコールを水中で最大９９％ｖ／ｖ、通常は５０％まで加えて、架橋をより均質且つ効率的にする。これらの薬剤は、層から水を除去し、基質繊維を結合させて、これらの繊維間の架橋を増進させる。架橋剤中のこれらの薬剤対水の比は、架橋を制御するために使用される。ＥＤＣ架橋溶液は、使用直前に調製されるが、これはＥＤＣが、時間とともに活性がなくなるためである。架橋剤をＩＣＬに接触させるには、水和し、結合したＩＣＬ層を浅い皿状等の容器に移し、架橋剤を静かにその容器に注入し、このとき、ＩＣＬ層が両面共に薬剤に浸って、自由に浮いた状態であり、またＩＣＬ構築物の層の下、若しくは中に気泡が入っていないことを確実にする。この容器はフタをされ、ＩＣＬ層は、約４時間〜約２４時間、より好ましくは８時間〜約１６時間かけて、温度約４℃〜約２０℃で架橋されていく。架橋は温度により制御できる。温度が低ければ反応が遅くなるので、架橋は効率的に行われる。温度が高くなると、ＥＤＣが安定性を失うので、架橋の効率性は低下する。
【００４１】
架橋の後、架橋剤を静かに抜き取り、処分し、残留架橋剤を除去するために、構築物は、洗浄剤を用いて接触させることによって容器の中で洗浄する。好ましい洗浄剤は、水又は他の水性溶液である。好ましくは、十分な洗浄とは、化学的に結合された構築物を、一回の洗浄につき約５分間、同量の殺菌した水を使用して３回接触させることによって達成される。本明細書中に記載されるように、抗菌特性は、各処置済み組織基質層を独立して接触させるか又は処理することにより、或いは多層中間体構築物を接触させるか又は処理することにより、抗菌剤と構築物を接触させることによって構築物に付与される。抗菌剤による単一形態又は多層形態の加工組織基質の処置方法は、用いられる抗菌剤の種類によって変わるが、加工組織基質の生体再構築可能特性、生体機械特性及び生体適合特性を保存する方法であるべきである。
【００４２】
ナノ結晶銀が抗菌剤として選択される場合、それは、コラーゲン基質材料をナノ結晶銀に接触させることにより、コラーゲン基質材料に適用され得る。抗菌剤は、溶液中に作用物質を懸濁することによりそれを被覆することによって、処理済み基質材料を被覆することにより適用され得る。ナノ結晶銀は、水、水性溶液、又は溶媒中に分散されて、分散化
ナノ結晶銀の溶液を生成する。ＩＣＬが浸漬される場合、ナノ結晶銀がＩＣＬに付着するように、ＩＣＬは、ナノ結晶銀溶液の容積を有するトレイ中に浸漬される。溶液はさらにまた、浸漬中にかき回すか又は撹拌され得る。次にＩＣＬは溶液から除去され、そして結合銀を有するＩＣＬから水又は溶媒を蒸発させて、ナノ結晶銀のコーティングを有するＩＣＬ構築物を生じる環境中に置かれる。ナノ結晶銀を含有する分散液でＩＣＬを被覆するための他の方法は、溶媒を噴霧し、そしてＩＣＬから蒸発させることを包含する。
【００４３】
ＰＨＭＢが抗菌剤として選択される場合、ＰＨＭＢ溶液が基質を飽和するように、加工組織基質が浸漬される水中に０．０９％ｖ／ｖ〜０．５％ｖ／ｖを用いて溶液にＰＨＭＢが付加される。加工組織基質中への溶液の飽和のために十分な時間の後、基質は溶液から除去され、そして溶媒が蒸発した場合にＰＨＭＢが基質上に残存するように、乾燥させられる。
【００４４】
多層化結合インプラント補綴の二次加工の前又は後に、加工組織基質及び構築物は物理的に又は化学的に処理又は改質され得る。物理的改質、例えば清浄化組織基質及び構築物を成形すること、伸長及び弛緩により状態調節すること、或いは穿孔加工処理、メッシュ加工処理、又は有窓加工処理することが実施され得る。状態調節は材料の全体的歪みを少なくするが、一方、穿孔加工処理、メッシュ加工処理又は有窓加工処理は、創傷床に対するより良好な立体配座、或いは滲出物のより良好な通過及び排出を、或いはその両方を提供する。化学的改質、例えば結合性成長因子、選択細胞外基質成分、遺伝物質、並びに治療、修復又は置換されている身体部分の生体再構築及び修復に影響を及ぼすその他の作因を結合することも実施され得る。
【００４５】
本発明の組織基質及び構築物を物理的に改質する方法は、構築物の必要な性能特性を考慮する場合、当業者に確定され得る。構築物は、前面にパターンで整列される針、刃又は釘を有するダイを備えるプレスを用いることにより、構築物の反対側を通して連通する穿孔の一パターンを提供する。構築物は、台上に置かれ、そして構築物を破壊しながら、針、刃又は釘が構築物を通して台に押し付けられるように、ダイが押し下げられる。スリット又はメッシュ加工処理パターンを提供するための方法は、自己由来皮膚移植手法に常習的に用いられるものと類似の皮膚メッシュ加工処理装置を用いる。このような一装置は、ジマー皮膚メッシュ加工処理装置である。構築物は、レーザー穴あけされて、エクシマー・レーザー（例えばＫｒＦ又はＡｒＦ波長で）を用いて、細胞内方成長を補助するために完成補綴を通してミクロンサイズの孔を作り得る。構築物は、該プロセスの任意の時点で穿孔加工処理、有窓加工処理、又はレーザードリル加工処理されて補綴を製作し得るが、好ましくは汚染除去又は最終滅菌前になされる。いくつかの適応症のためには、穿孔又はレーザートリル加工処理した孔は、補綴のすべての層を通して連通して、細胞通過又は流体排出を補助する、というのが好ましい。他の適応症に関しては、穴が多層構築物の内部への又は構築物の新血管形成を補助するための細胞アクセスを提供するように、それらは層を横断するすべての層を通過するというわけではない、というのが好ましい。
【００４６】
単一層構築物に対するその他の物理的改質は、構築物の両面を連通する穿孔又は有窓化である。単一層構築物に対する別の物理的改質は構築物をメッシュ加工処理することであり、これは、メッシュに類似するように、構築物にスリットの整列パターンを提供することである。ジマーにより作製されたもののようなスキンメッシュ機により提供されるものに類似するメッシュ比を有するパターンで、スリットは作製される。メッシュ比は、１：１．５又は２：１に設定され得る。抗菌特性を有する単一層ＩＣＬ構築物を製造するために、ＩＣＬは、平滑ポリカーボネートシート上に粘膜側を下にして広げられて、しわ、気泡及び視覚的リンパ性タグの除去を確実にする。ポリカーボネートシート全体へのＩＣＬの展開は、寸法を最適にするために実施される。材料は、その全表面にわたって任意に適切に乾燥される。次に少なくとも１つの抗菌剤が、材料に適用される。材料は、メッシュ
加工処理又は穿孔加工処理により任意に物理的に改質され、次にある大きさに切断して、包装され、そして最終的に滅菌仕様書に従って滅菌される。代替的実施形態では、材料がメッシュ、穿孔又は有窓により物理的に改質された後に、抗菌処理が適用される。
【００４７】
加工組織基質が調製され、抗菌剤で被覆された後、構築物は所望のサイズに調整される。例証のために、使用サイズは約６平方インチ（約１５．２ｃｍ×１５．２ｃｍ）であるが、任意のサイズが調製されて、患者への移植のために用いられる。
【００４８】
抗菌剤処理コラーゲン基質は次に、最終的滅菌、貯蔵及び分配のために封止可能な容器中に包装される。抗菌処理コラーゲン基質は、乾燥状態又は湿性状態で容器中に包装され得る。好ましい包装材料は、抗菌処理、コラーゲン基質に、そして湿性状態で包装される場合、製品を湿性に保持する任意の作用物質に適合性である。光感受性抗菌剤、例えば銀ベースの抗菌剤で処理される構築物に関しては、光の通過を防止又は濾過する包装材料が用いられて、製品を包装して、抗菌活性の低下及び構築物の褪色を防止する。
【００４９】
構築物は次に、医療デバイス滅菌の当該技術分野に既知である手段を用いて最終的に滅菌される。滅菌のための好ましい方法は、米国特許第５，４６０，９６２号（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に従って、十分量の１０Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で中和された滅菌０．１％過酢酸（ＰＡ）処理に構築物を接触することによる。汚染除去は、振盪器台上の容器、例えば１ＬのＮａｌｇｅ容器中で、約１８±２時間実施される。次に、構築物は、１回当たり１０分間３倍量の滅菌水と接触させることにより洗浄される。さらに好ましい方法では、ＩＣＬ構築物は、２５〜３７ｋＧｙのγ線照射を用いて滅菌される。γ線照射は、有意に、しかし有害にではなく、ヤングの弾性率、極限引張り強さ及び収縮温度を低減する。γ線照射後の機械的特性は、一連の用途に用いるために依然として十分であり、そしてγ線照射は、移植用医療デバイスの分野に広範に用いられるように、滅菌のための好ましい一手段である。線量測定指示器は、線量が特定範囲内であることを立証するために各滅菌実施を伴って包含される。構築物は、構築物の組成物と適合性であるパッケージ材料及び設計を用いて包装されて、貯蔵中の滅菌性を確実にする。好ましい包装手段は二重層剥ぎ取り可能包装であって、この場合、第１のパッケージは、ポリエチレン／ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）ラミネートから成る第２の溶封小袋で封入される紙製表面仕上げ箔蓋を有するポリエチレンテレフタレート、グリコール改質（ＰＥＴＧ）トレーから成る溶封ブリスターパッケージである。全体的に、第１のパッケージ及び第２のパッケージの両方、並びにそれに含入されるＩＣＬ構築物は、γ線照射を用いて滅菌される。
【００５０】
本発明の補綴は、平面状、管状、又は複合形状を有し得る。形成される補綴の形状は、その意図される使用により決定される。したがって本発明の補綴の結合層を形成する場合、成型又は平板支持成員は、所望の形状を収容するように作り上げられ得る。平板な多層補綴は、疾患器官又は損傷器官、例えば腹壁、心膜、ヘルニア並びに種々のその他の器官及び構造、例えば骨、骨膜、軟骨膜、椎間円板、関節軟骨、真皮、腸、靭帯及び腱（これらに限定されない）を修復、増大、又は置換するためにインプラントされ得る。さらに、平板な多層補綴は、血管又は心臓内のパッチとして、或いは置換心臓弁として用いられ得る。
【００５１】
平板なシート補綴（単一層又は多層）は、創傷部位が安定化されて治癒を開始する場合、被験体の創傷を被覆して湿気バリアを形成するため、創傷部位に平滑性及び快適性を提供するために、そして抗菌活性を提供するために、創傷治癒に用いられる。
【００５２】
平板なシートは、例えば膀胱又は子宮のような器官のためのスリングとしてシートを用いることにより、下垂又は過可動性器官を支持するための器官支持体としても用いられ得
る。管状補綴は、例えば血管、食道、気管、腸及びファロピウス管のような管状器官の断面を置換するために用いられ得る。これらの組織は、外部表面と内部管腔表面とを有する基礎的な管状形状である。さらに、平板なシート及び管状構造物は、一緒に形成されて、心臓弁又は静脈弁を置換するか又は増大するための複雑な構造物を形成し得る。
【００５３】
本発明の抗菌性構築物の二次加工に用いられるＩＣＬ材料は、生体適合性である。生体適合性試験は、医療デバイスの生物学的評価に関するトリパータイト及びＩＳＯ−１０９９３指針の両方に従ってＩＣＬから製造される補綴に関して実施されてきた。「生体適合性」とは、補綴は非細胞傷害性、血液適合性、非発熱性、内毒素無含有、非遺伝毒性、非抗原性であり、そして皮膚感作応答を引き出さず、一次皮膚刺激応答を引き出さず、急性全身性毒性を引き出さず（case）、亜慢性毒性を引き出さない、ということを意味する。これらの生体適合特質を、以下でより詳細に考察する。
【００５４】
ＩＣＬから調製される構築物の試験品は、試験表題「ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性に関するＬ９２９寒天上塗り試験（L929 Agar Overlay Test for Cytotoxicity In Vitro）」を用いた場合に試験品の曝露器官後にＬ９２９細胞中で観察される生物学的反応性（等級０）又は細胞傷害性を示さなかった。陽性対照品（等級３）及び陰性対照品（等級０）に対して観察された細胞応答は、試験系の妥当性を確証した。ＵＳＰ指針に従って、試験及び評価を実行した。本発明の補綴は非細胞傷害性であると考えられ、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性に関するＬ９２９寒天上塗り試験（L929 Agar Overlay Test for
Cytotoxicity In Vitro）の要件を満たす。
【００５５】
本発明の補綴の血液適合性（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ溶血、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変法ＡＳＴＭ抽出法試験を使用）試験は、変法ＡＳＴＭ抽出法に従って実行した。試験条件下では、デバイス抽出物に関する平均溶血性指数は０％である、一方、陽性対照及び陰性対照は、予測どおりに実施された。試験結果は、本発明の補綴が非溶血性及び血液適合性であることを示す。
【００５６】
ウサギにおける発熱物質試験に関する現行のＵＳＰプロトコルに従って、本発明の補綴を発熱性試験に付した。この試験条件下で、観察期間中のウサギ温度の全体的上昇は、許容可能ＵＳＰ限度内であった。結果は、本発明の補綴が非発熱性である、ということを確証した。本発明の補綴は、好ましくは０．０６ＥＵ／ｍｌ（生成物１ｃｍ2当たり）以下のレベルで内毒素無含有である。内毒素とは、細菌及び夾雑物質により選別されるグラム陰性細菌の細胞壁の一部である特定発熱物質を指す。
【００５７】
本発明の補綴は、皮膚感作応答を引き出さない。ブタ腸コラーゲンを清浄化するために用いられる化学物質が感作応答を引き出す、或いはコラーゲンを改質して応答を引き出す、ということを示す文献中の報告はない。化学的清浄化ＩＣＬから形成された本発明の補綴に関する感作試験の結果は、補綴が感作応答を引き出さない、ということを示す。
【００５８】
本発明の補綴は、一次皮膚刺激応答を引き出さない。化学的清浄化ＩＣＬに関する刺激試験の結果は、化学的清浄化ＩＣＬから形成された本発明の補綴が一次皮膚刺激応答を引き出さない、ということを示す。
【００５９】
本発明の補綴を調製するために用いられる化学的清浄化ＩＣＬに関して、急性全身性毒性及び皮内毒性試験を実施した。その結果は、試験した補綴の間の毒性の欠如を実証した。したがって動物移植試験では、化学的清浄化ブタ腸コラーゲンが急性全身性毒性を引き起こすという証拠は認められなかった。
【００６０】
ブタ腸コラーゲンを含有する本発明の補綴の亜慢性毒性試験は、デバイス亜慢性毒性の
欠如を確証した。
【００６１】
ブタ腸コラーゲンを清浄化するために用いられる化学物質が遺伝毒性に関する潜在性に影響を及ぼすか、或いはこのような応答を引き出すようにコラーゲンを改質する、ということを示す文献中の報告はない。ブタ腸コラーゲンを含有する本発明の補綴の遺伝毒性試験は、デバイス遺伝毒性の欠如を確証した。
【００６２】
本発明の補綴を調製するために用いられるブタ腸コラーゲンに関する化学物質清浄化法の目的は、細胞、細胞残渣、並びに非コラーゲン性及び非エラスチン性の基質成分を除去することにより、抗原性を最小にすることである。ブタ腸コラーゲンを含有する本発明の補綴は、化学的清浄化ブタ腸コラーゲンを用いて実施した移植試験により確証されたように、デバイス抗原性の欠如を確証した。
【００６３】
本発明のＩＣＬ構築物は、好ましくはウイルス不活性にさせられる。製造プロセスにおいて、４つの関連ウイルス及びモデルウイルスを不活性化するための２つの化学的清浄化手法、即ちＮａＯＨ／ＥＤＴＡアルカリ性キレート溶液（ｐＨ１１〜１２）及びＨＣｌ／ＮａＣｌ酸性塩溶液（ｐＨ０〜１）の効力を試験した。モデルウイルスを供給源ブタ材料に基づいて、そして広範囲の物理化学的特性（ＤＮＡ、ＲＮＡ、エンベロープウイルス及び非エンベロープウイルス）を表わすために、選択した。ウイルスは、仮性狂犬病ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、レオウイルス−３及びブタパルボウイルスを包含した。ＦＤＡ及びＩＣＨ指針書、例えば、ＣＢＥＲ／ＦＤＡ「生物学的製剤に用いられる細胞株の特徴付けにおける考察のポイント（Points to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals (1993)）」、ＩＣＨ 「バイオテクノロジー製品の品質の指針に対する注意書き：ヒト又は動物源の細胞株由来のバイオテクノロジー製品のウイルス安全性評価（Note for Guidance on Quality of Biotechnological Products: Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin）」（ＣＰＭＰ／ＩＣＨ／２９５／９５）、及びＣＰＭＰバイオテクノロジー作業委員会「ウイルス評価試験の指針に対する注意書き：ウイルスの不活性化及び除去を評価する試験の設計、寄与及び解釈（Note for Guidance on Virus Validation Studies: The Design, Contribution and Interpretation of Studies Validating
the Inactivation and Removal of Viruses）」（ＣＰＭＰ／ＢＷＰ／２６８／９５）に基づいて、試験を実行した。試験の結果は、２つの化学的清浄化工程の累積的ウイルス不活性化は、４つのモデルウイルスすべてに関して１０6個より大きい清浄率（clearance）である、ということを実証する。データは、化学的清浄化手法が、非常に種々のウイルス作因の不活性化に関する潜在性を保持する堅固で有効な方法である、ということを示す。
【００６４】
本発明の補綴は、生体再構築可能性である。本発明の補綴は、体の一部の置換物又は支持物として機能するが、本発明の補綴は宿主細胞の内方成長のための生体再構築性基質骨格としても機能する。「生体再構築性」は、本明細書では宿主細胞及び酵素の力で、インプラントされた補綴の基質成分の生分解、再形成、置換とほぼ同等の速度での、宿主細胞の内方成長による、内因性構造コラーゲン、血管新生、及び細胞の再集団化を生み出すことを意味している。移植片補綴は、それらがインプラントされた被験体によって全て、又は、ほぼ全部の宿主組織へと再構築を施されるが、その構造特性を保持し、その組織の類似物として機能し、修復又は置換を行う。これらの生体再構築性のほかに、加工組織基質の２つ以上の層から作製される本発明の補綴は、望ましい生体機械特性を組入れるために調製される。
【００６５】
ヤング率（ＭＰａ）は、緊迫と緊張との間の直線状比例定数として定義される。最終引張強度（Ｎ／ｍｍ）は、補綴にわたる強度の測定値である。これらの特性の両方は、補綴におけるＩＣＬ層の数の関数である。耐荷装置又は支持装置として用いる場合、最初の治
癒段階と全体の再構築の間、物理的活性の厳密さに耐えることができなければならない。
【００６６】
結合領域の積層強度を、ピール検査を使って測定する。インプラント手術の直後、物理的応力下で層の積層が壊れないことが重要である。動物実験では、外植された材料に、何も積層が壊れた事実はなかった。インプラントの前、１ｍＭ  ＥＤＣ架橋多層構築物の２つの相対する層の間の粘着強度は約８．１±２．１Ｎ／ｍｍであった。
【００６７】
収縮温度（℃）は、基質の架橋程度の指標である。収縮温度が高くなれば、材料中の基質の架橋は多くなる。非架橋、γ線照射ＩＣＬは、約６０．５℃±１．０℃の収縮温度を有している。好ましい実施形態では、５０％アセトンの１ｍＭ  ＥＤＣ〜約１００ｍＭ  ＥＤＣ中で架橋される装置に用いるＥＤＣ架橋補綴は、それぞれ約６４．０℃±０．２℃〜約７２．５℃±１．１℃の収縮温度を有するのが好ましい。
【００６８】
機械的特性には機械的完全性が含まれ、補綴は生体再構築の間に起きる歪（creep）に抵抗を示し、それに加えて柔軟且つ縫い合わせ可能なものである。「柔軟」という用語は、臨床で使用する際に求められる簡便さのための優れた取り扱い特性ということを意味している。
【００６９】
「縫い合わせ可能」という単語は、層の機械的特性が、天然の組織の切片に補綴を縫合した際に、針と縫合材とを補綴材料に通らせることができる縫合保留力を含んでいるということを意味している。縫合の間、このような補綴は、縫合によって補綴に加えられる張力の結果として破れることがあってはならず、また結び目を作る際に破れることがあってもならない。補綴の縫合性、即ち縫合の間における破れへの補綴の耐性能力は、補綴材料本来の機械的強度、移植片の厚さ、縫合にかかる応力、結び目を引っ張って閉じる速さに関係している。１００ｍＭ  ＥＤＣ及び５０％アセトンの中で高度に架橋した平板の６層補綴の縫合保持は、約６．７Ｎ±１．６Ｎである。水に溶かした１ｍＭ  ＥＤＣの中で架橋した２層補綴の縫合保持は、約３．７Ｎ±０．５Ｎである。縫合時の外科医師の力が約１．８Ｎであるので、架橋した平板の２層補綴の好ましい低縫合保持強度は、約２Ｎである。
【００７０】
本明細書で用いる、「非歪」という単語は、補綴の生物機械的特性が耐久性を与え、それによって補綴がインプラント後に通常の限界を超えて、伸びたり、広がったり、又は膨張したりしないということを意味している。以下に記述するように、本発明のインプラント補綴の全伸張は、許容可能な限界内に収まっている。本発明の補綴は、生分解と再構築からのインプラント材料の機械的強度の減少よりも早い速度で宿主細胞が構造コラーゲンを置換することによって、インプラント後の細胞性生体再構築の機能として伸張に対する耐性を獲得する。
【００７１】
本発明の加工組織材料は、層状にされ、結合されても、「半浸透性」である。半浸透性は、再構築のため、又は生体再構築性、細胞内方成長、癒着阻止若しくは癒着促進、又は血流に影響を及ぼす薬剤及び成分の堆積のために、宿主細胞の内方成長を可能にする。補綴の「非多孔性」特徴は、補綴のインプラントによって保持するように意図される液体の通過を阻止する。逆にいえば、孔又はミシン目を入れることが補綴の使用の際に求められる場合には、補綴に孔、ミシン目、穿孔、切れ目、又は網目を形成する場合がある。
【００７２】
本発明の補綴の機械的完全性は、構築物の積層を損なうことなく、又は端をほつれさせることなく、補綴を切るか、又は整えてきれいな端を得ることができるのと同様に、それにヒダを付けたり、それを折りたたんだりできるということでもある。
【００７３】
小腸の粘膜下層由来の処理済み腸コラーゲンのシートは、通常は、約０．０５ｍｍ〜約
０．０７ｍｍの厚みを有する。精製組織基質がシート様外形であるとすると、それは層化され、次に層は一緒に化学的に結合されて、より厚い多層化構築物を提供し得る。本発明の多層化結合補綴デバイスの加工組織基質層は、２つ以上の層のＩＣＬのような同一コラーゲン材料由来、或いは1つ又は複数の層のＩＣＬ及び1つ又は複数の層の大腿筋膜のような異なるコラーゲン材料由来であり得る。
【００７４】
抗菌特性を有する構築物は、部分創傷及び全層創傷、褥瘡性潰瘍、静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、慢性血管潰瘍、トンネル化／穿掘性創傷、外科的創傷（例えば自家移植のためのドナー部位創傷、モース手術後創傷、レーザー手術後創傷、創傷離開）、外傷性創傷（例えば擦過傷、裂傷、第二度熱傷及び皮膚断裂）、並びに排液性創傷を含めた創傷の処置のために用いられ得る。創傷被覆剤は、機械的及び化学的に清浄化されたブタ腸コラーゲン、少なくとも１つの抗菌剤から成る単一層シート又は多層構築物であり、各加工組織基質シートは約０．０５ｍｍ〜約０．０７ｍｍの厚みを有し、シートの両面間を連通する窓を含有する。この生成物は、主に、その天然形態のＩ型ブタコラーゲン（約９５％超）を、約０．７％未満の脂質及び検出不可能なレベルのグリコサミノグリカン（約０．６％未満）及びＤＮＡ（約０．１ｎｇ／μｌ未満）とともに含む。ブタ腸コラーゲンは、細胞及び細胞残渣を実質的に含有しない。本発明の創傷被覆剤は、架橋されることもされないこともあるが、架橋される場合、患者の細胞による被覆剤の生分解、生体再構築又は置換を調節し、制御する程度に架橋される。物理的改質が創傷被覆剤に提供されて、通過流体を容認する。創傷被覆剤は、感覚神経末端を被覆することにより患者に対する細菌汚染並びに疼痛軽減を制御し、最小限にするためのバリアである湿性治癒環境を提供する。抗菌剤は、創傷部位中及びその周囲の微生物汚染に対する有効な防御を提供する。
【００７５】
創傷被覆剤は、治療を必要とする創傷を有する患者に適用される。適用前に、標準創傷被覆剤技法を用いて、創傷区域は浄化され、そして瘢痕組織を切除され得る。好ましくは壊死組織切除は、創傷縁が成育可能組織を含有する程度である。本発明の被覆剤を適用するために、被覆剤は、創傷区域の輪郭に切断される。創傷が単一被覆剤片より大きい場合、多数片が用いられ、全創傷を覆うように重複され得る。被覆剤が乾燥状態である場合、それは、滅菌生理食塩水又はその他の等張溶液を用いて再水和され得る。被覆剤の縁は、無傷組織と接触し、次にその場で平滑化されて、被覆剤が下層にある創傷床と接触することを確実にする。過剰な滲出物がシート下に集まった場合には、小開口をシートに切開して、滲出物を排出させ得る。
【００７６】
本発明の抗菌性創傷被覆剤は、創傷と慣用的又は二次的創傷被覆剤との間の界面として用いられ得る。代替的には、本発明の抗菌性創傷被覆剤は、皮膚置換物、例えば自家移植片、同種異系移植片又は培養皮膚構築物に対する上張りとして用いられ得る。上張りとして用いられる場合、より迅速な創傷閉鎖のためにいずれかの皮膚置換物由来の細胞が創傷床を集団形成し得るように、創傷被覆剤は湿性創傷環境を供給する。
【００７７】
適用後、湿性創傷環境を保持するために、適切な非接着性二次被覆剤が好ましくは適用される。最適二次被覆剤は、創傷の位置、サイズ、深さ及び使用者の好みにより確定される。二次被覆剤は、湿性清浄創傷区域を保持する必要があるので、交換され得る。被覆剤交換の頻度は、処置されている創傷の種類、サイズ及び深さ、産生される滲出物の量、並びに用いられる被覆剤の種類によって異なる。治癒が起きた場合、創傷被覆剤は置換される必要があり、この場合、完全に治癒が達成されるまで、創傷被覆剤の付加的適用が実施され得る。
【００７８】
本発明の他の実施形態は、抗菌特性を付与される多層構築物に向けられる。本発明の補綴デバイスは、一緒に結合される２つ以上の重層コラーゲン層を有する。本明細書中で用いる場合、「結合コラーゲン層」とは、当該層が互いに重層され、そして自己積層化及び
化学的架橋により一緒に十分に保持されるように、処置される２つ以上の層の同一の又は異なるコラーゲン材料から成ることを意味する
【００７９】
さらに特定的には、補綴デバイスは、腹壁及び胸壁の欠損の治療、筋肉片強化、直腸脱及び膣脱、骨盤底再建、ヘルニア、筋膜欠損における間隙の架橋、縫合線強化及び再建手法（これらに限定されない）を含めた柔組織を強化するためのインプラントに用いられるように意図される外科用メッシュ又は移植片である。本発明の補綴メッシュ又は移植片の一例は、約０．２０ｍｍ〜約０．２５ｍｍの厚みの５層シートのブタＩＣＬ及び抗菌剤を含む。この生成物は、主にその天然形態のＩ型ブタコラーゲン（約９５％超）を、約０．７％未満の脂質及び非検出可能レベルのグリコサミノグリカン（約０．６％未満）及びＤＮＡ（約０．１ｎｇ／μｌ未満）とともに含む。ブタ腸コラーゲンは、細胞及び細胞残渣を実質的に含有しない。この補綴は、二重層剥ぎ取り可能パッケージング中で５×５ｃｍ〜１２×３６ｃｍの範囲のサイズの滅菌シート形態で供給される。この補綴は、約５８±５℃の変性温度、１５Ｎより大きい引張り強さ、２−０ブレードシルク縫合糸を用いた２Ｎより大きい縫合保持強度、並びに０．０６ＥＵ／ｍｌ（生成物１ｃｍ2当たり）以下の内毒素レベルを有する。特に、この補綴は、水中で１ｍＭの塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）と結合され、架橋される５層のＩＣＬ及び抗菌剤から成る平板シート構築物である。この構築物を形成するために、ＩＣＬの第１のシートが平滑ポリカーボネートシート上に粘膜側を下にして広げられ、しわ、気泡及び視覚的リンパ性タグの除去を確実にする。ＩＣＬの展開は、寸法を最適にするために実行される。ＩＣＬの３つのシート（粘膜側を下にする）は、第１のシートの上面に層化され、各シートが層化されると、しわ、気泡及び視覚的リンパ性タグの除去が確実になる。第５のシートは、粘膜側を上にして層化されて、しわ及び気泡を確実に除去する必要がある。視覚的リンパ性タグは、この第５のシートの層化の前に除去される。層は、一緒に２４±８時間乾燥される。層は、ここで、一緒に乾燥されて、次に３０ｃｍの５層シート当たり５００ｍＬの架橋溶液中で、１８±２時間、１ｍＭ  ＥＤＣ水中で架橋される。各生成物は、滅菌水で洗浄されて、次に水和しながら、最終サイズ規格に切断される。
【００８０】
代替的実施形態では、補綴デバイスは、恥骨尿道支持、脱出症修復（尿道、膣、直腸及び結腸）、骨盤底の再構築、膀胱支持、仙骨膣吊り下げ（sacrocolposuspension）、再構築手法及び組織修復（これらに限定されない）を含めて弱点が存在する柔組織を強化し、支持するためにインプラントを意図される少なくとも１つの抗菌剤を伴う外科用スリングである。別の最も好ましい実施形態では、補綴デバイスは、少なくとも１つの抗菌剤で処理された３〜５つの層の結合架橋ＩＣＬから成る外科用スリングである。５層デバイスを二次加工するために、ＩＣＬは粘膜側を下にして平滑ポリカーボネートシート上に広げられ、しわ、気泡及び視覚的リンパ性タグの除去を確実にする。ＩＣＬの展開は、寸法を最適にするために実行される。ＩＣＬの第２、第３及び第４のシート（粘膜側を下にする）は、第１のシートの上面に層化され、各シートが層化されると、しわ、気泡及び視覚的リンパ性タグの除去が確実になる。第５のシートの層化の前に、視覚的リンパ性タグは除去されるべきである（三層構築物は、ＩＣＬの第１のシートが平滑ポリカーボネートシート上に粘膜側を下にして広げられ、しわ、気泡及び視覚的リンパ性タグの除去を確実にし、ＩＣＬの第２のシート（粘膜側を下にする）が第１のシートの上面に層化され、そして第３のシートが第２のシートの上に粘膜側を上にして層化されることにより製造される）。層は２４±８時間乾燥され、一旦乾燥すると、３０ｃｍの５層シート当たり５００ｍＬの架橋溶液中で、１８±２時間、９０％アセトン中の１０ｍＭ  ＥＤＣで架橋される。各結合架橋構築物は、滅菌水で洗浄されて、水和しながら、最終サイズ規格に切断される。恥骨尿道支持を提供することにより、尿道過可動性又は固有括約筋欠損に起因する尿失禁の治療のためにスリングが用いられる。外科用スリングは、約０．２０ｍｍ〜約０．２５ｍｍの厚みのブタ腸コラーゲンの５層積層シート並びに抗菌剤から成る。このデバイスは、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）で架橋
される。このデバイスは、主に、その天然形態のＩ型ブタコラーゲン（約９５％超）を、約０．７％未満の脂質及び非検出可能レベルのグリコサミノグリカン（約０．６％未満）及びＤＮＡ（約０．１ｎｇ／μｌ未満）とともに含む。ブタ腸コラーゲンは、細胞及び細胞残渣を含有しない。補綴の変性温度は、約６３℃より大きく、その引っ張り強さは約１５Ｎより大きく、その縫合保持強度は２−０ブレードシルク縫合糸を用いて約２Ｎより大きく、そして最終内毒素レベルは０．０６ＥＵ／ｍｌ（生成物１ｃｍ2当たり）以下である。スリングの生体再構築可能的態様は、変更され、影響を受け得るが、本発明のスリング補綴は置換身体部分ではなく、補助構造物としてインプラントされる器官支持デバイスである。スリングのＩＣＬ層はより高度に架橋されて、スリングの生体再構築可能性を低減する、というのが好ましい。スリング補綴は、インプラントされる場合、器官支持デバイスとして機能しながら、必要な構造的支持及び強度を保持する高度に生体適合性な柔軟性コラーゲン構造物である。
【００８１】
さらに別の代替的実施形態では、補綴デバイスは、インプラントのために意図されて、中枢神経系を保護する強靭な膜である脳硬膜を修復する硬膜修復パッチである。本発明の硬膜修復デバイスは、４つの層の結合架橋ＩＣＬ及び抗菌剤を含む。４層デバイスを二次加工するために、ＩＣＬは粘膜側を下にして平滑ポリカーボネートシート上に広げられ、しわ、気泡及び視覚的リンパ性タグの除去を確実にする。ＩＣＬの展開は、寸法を最適にするために実行される。ＩＣＬの第２のシート及び第３のシート（粘膜側を下にする）は、第１のシートの上面に層化され、各シートが層化されると、しわ、気泡及び視覚的リンパ性タグの除去を確実にする。第４のシートは、粘膜側を上にして層化され、しわ及び気泡の除去を確実にする。視覚的リンパ性タグは、この第４のシートの層化の前に除去されるべきである。層は２４±８時間乾燥され、一旦乾燥すると、３０ｃｍの４層シート当たり５００ｍＬの架橋溶液中で、１８±２時間、２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液中の約０．１ｎＭ〜約１ｍＭのＥＤＣで架橋される。各結合架橋構築物は、滅菌水で洗浄されて、水和されながら、最終サイズ規格に切断される。硬膜修復デバイスは、約０．１４ｍｍ〜約０．２１ｍｍの厚みの４層積層シートのブタ腸コラーゲンから成る。このデバイスは、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）で架橋される。このデバイスは、主に、その天然形態のＩ型ブタコラーゲン（約９５％超）を、約０．７％未満の脂質及び検出不可能なレベルのグリコサミノグリカン（約０．６％未満）及びＤＮＡ（約０．１ｎｇ／μｌ未満）とともに含む。ブタ腸コラーゲンは、細胞及び細胞残渣を含有しない。補綴の変性温度（ＤＳＣ）は、約６３℃より大きく、その引っ張り強さは約１５Ｎより大きく、縫合保持強度は２−０ブレードシルク縫合糸を用いて約２Ｎより大きく、そして最終内毒素レベルは０．０６ＥＵ／ｍｌ（生成物１ｃｍ2当たり）以下である。硬膜修復を必要とする患者にインプラントされる場合、新しい宿主組織が長時間に亘ってデバイスを置換するように、デバイスを分解し、置換する宿主の細胞により長時間に亘って生体再構築されながら、硬膜修復デバイスが硬膜置換物として機能するように、この硬膜修復デバイスは、生体適合性及び生体再構築可能性である。
【００８２】
例えばＩＣＬの多層構築物は、身体壁構造を修復するために用いられる。それは、例えば心膜パッチ、心筋パッチ、血管パッチ、膀胱壁パッチ又はヘルニア修復デバイス（引張りなしのパッチ又はプラグ）として用いられ得るし、或いは過可動性又は脱出性の器官（直腸瘤、膣円蓋脱、膀胱脱）を支持するためのスリングとして用いられ得る。多層構築物は、腱板又は被膜修復のように、結合組織を治療するために有用である。多層構築物は、開頭手術後の頭蓋欠損を修復するための、或いは脊髄に沿って硬膜管を修復するための硬膜修復に有用である。この材料は、繊維輪がヘルニア形成される場合（即ち椎間板ヘルニア）、輪状修復に有用であり、そして椎間板ヘルニアにより作られた穴のプラグとして、又は穴への被覆として、或いはその両方に用いられる。この材料は、形成外科手法、例えば乳房固定術、腹腔手術、並びに顔面形成術（額及び頬のリフト）に有用である。単一層
及び多層のＩＣＬ材料はともに、創傷修復を補助するための創傷被覆又は被覆剤として用いられ得る。さらに、それは、組織充填及び強化のために平坦化され、巻かれ、折りたたまれてインプラントされ得る。ＩＣＬの多数の層は充填又は強化適応のために構築物中に組入れられ得る。インプラント前に、この層をさらにコラーゲン又はその他の細胞外基質成分、ヒアルロン酸、ヘパリン、成長因子、ペプチド又は培養細胞で処理されるか又は被覆され得る。
【００８３】
以下の実施例は、本発明の実施をよく説明するもので、本発明の範囲をどのような方法でも限定することを了解するべきものではない。その組成、形状、及び厚さに関する装置設計は、構築物の最終的な指示に従って選択されるべきであるということが認識される。当業者は、本明細書中に記述された方法に対して、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができるということを認識する。
【実施例】
【００８４】
〔実施例１〕
機械的に清浄化を施したブタ小腸の化学的清浄化
ブタの小腸を採取し、機械的作用と水による洗浄の組み合わせを使用して強制的に脂肪、筋肉、粘膜層を粘膜下組織から除去するＢｉｔｔｅｒｌｉｎｇ腸清浄機（Nottingham、UK）を使って、機械的に剥いだ。機械的作用は、損なわれていない腸がローラーの間を通る際に、圧搾し、粘膜下組織から連続する層を剥ぎ取る一連のローラーとして記述することができる。小腸の粘膜下組織は、周囲組織よりも比較的硬く、堅固であるので、ローラーは粘膜下組織から柔らかい成分を圧搾する。機械による清浄化の結果、腸の粘膜下層だけが残ることになる。
【００８５】
この工程の残り、Abraham他への国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９８／４９９６９号（その開示は、参照により本明細書中に援用される)に従った化学的清浄化を無菌条件下、室温で行った。化学溶液は、全て室温で用いる。次に腸を内腔に沿って縦に切り、１５ｃｍの切片に切る。材料を計量し、腸材料に対し溶液比（ｖ／ｖ）約１００：１で容器の中に入れる。
【００８６】
腸を入れた各容器に、０．２２μｍ（ミクロン）のフィルターで殺菌した１００ｍＭエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）／１０ｍＭ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液を約１Ｌ添加する。次に、容器を振盪台に置き、約２００ｒｐｍで約１８時間振盪する。振盪後、ＥＤＴＡ／ＮａＯＨ溶液を各ボトルから除去する。
【００８７】
次いで、各容器に、０．２２μｍのフィルターで殺菌した１Ｍ塩酸（ＨＣｌ）／１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の溶液を約１Ｌ添加する。次に容器を振盪台に置き、約２００ｒｐｍで約６時間〜８時間振盪する。振盪後、ＨＣｌ／ＮａＣｌ溶液を、各容器から除去する。
【００８８】
次に、各容器に、０．２２μｍのフィルターで殺菌した１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）／１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を約１Ｌ添加する。次に容器を振盪台に置き、２００ｒｐｍで約１８時間振盪する。振盪後、ＮａＣｌ／ＰＢＳ溶液を各容器から除去する。
【００８９】
次に、各容器に、０．２２μｍのフィルターで殺菌した１０ｍＭ  ＰＢＳ溶液を約１Ｌ添加する。次に容器を振盪台に置き、２００ｒｐｍで約２時間振盪する。次に振盪後、リン酸緩衝生理食塩水を各容器から除去する。
【００９０】
次いで最後に、各容器に０．２２μｍのフィルターで殺菌した水を約１Ｌ添加する。次
に容器を振盪台に置き、２００ｒｐｍで約１時間振盪する。次に振盪後、水を各容器から除去する。
【００９１】
処理済みＩＣＬ試料を切断し、組織学的分析に用いるのに固定する。ヘモトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）とＭａｓｓｏｎとのトリクロム染色を、対照組織と加工組織両方の断面試料と側面試料で行った。処理済みＩＣＬ組織試料は、未処理コントロール試料が通常、期待通りに非常に細胞性であると見えるのに対し、細胞及び細胞屑がなくなったかに見えた。
【００９２】
ＩＣＬのこの単一層材料は、単一層として用いられ得るし、或いは結合多層構築物、管状構築物、又は複雑な管状及び平板外形を有する構築物を形成するために用いられ得る。
【００９３】
〔実施例２〕
多層ＩＣＬ構築物の製造方法
実施例１の方法に従って処理を施されたＩＣＬを用いて、２層のＩＣＬを有する多層構築物を形成した。多孔性ポリカーボネート（孔の大きさ、製造業者）の殺菌シートを層流キャビネットの殺菌面に敷いた。殺菌ＴＥＸＷＩＰＥＳ（LYM-TECH Scientific、Chicopee MA）を使ってＩＣＬを吸い取り、材料から過剰の水分を吸収する。ＩＣＬ材料を整えて、リンパ管の垂れ下がりを外内腔側面から取り、長さ約６インチ（約１５．２ｃｍ）の切片にする。整えたＩＣＬの第１のシートを、ポリカーボネート製シートの上に粘膜側を下にして載せ、手を使って任意の気泡、折り目及びヒダも取り除いた。整えたＩＣＬの第２のシートを、第２のシートの外内腔側面を第１のシートの外内腔側面に接触させて、第１のシートの最上部に面して又は外内腔側面に載せ、再度手を使って任意の気泡、折り目及びヒダも取り除いた。ＩＣＬ層を載せたポリカーボネートシートの角度を上げて、ＩＣＬ層を層流キャビネットの対向気流と向かい合わせにする。層を、キャビネット中で約１８±２時間、約２０℃の室温で乾燥させた。次に、層を分離又は剥離することなく、乾燥させたＩＣＬ層からポリカーボネートシートを剥がし、室温の水浴に移し、約１５分間層を水和させた。
【００９４】
ＥＤＣは時間と共にその活性をなくすので、１００ｍＭ  ＥＤＣ／５０％アセトンの化学架橋溶液を、架橋直前に調製した。次に、水和した層を浅い皿に移し、層が薬剤に浸って、且つ自由に浮いているのを確実にし、気泡が構築物の下又は内部に存在しないことを確実にしながら架橋剤を静かに皿に入れる。皿を覆い、約１８±２時間ヒュームフード（fume hood：ドラフト）に置いた。架橋溶液を捨て、処理した。構築物を、皿の中で殺菌水で３回、各回の洗浄につき約５分間洗浄した。メスと定規を用いて、構築物を望ましい大きさに整えた。
【００９５】
米国特許第５，４６０，９６２号（この開示は、本明細書に援用される）に従って、構築物を、水酸化ナトリウム１０Ｎ  ＮａＯＨで中和した殺菌０．１％過酢酸（ＰＡ）処理で汚染除去を行った。振盪台の上に載せた１Ｌ  Ｎａｌｇｅ容器の中で、構築物を約１８±２時間汚染除去した。次に、構築物を３倍量の殺菌水で各洗浄につき１０分間洗浄し、ＰＡ活性をＭｉｎｎｃａｒｅ  ｓｔｒｉｐ検査でモニタリングして、構築物からＰＡが除去されていることを確認した。
【００９６】
次に、構築物を真空密封装置を使ってプラスティック製バッグに包装し、このプラスティック製バッグを、２５．０〜３５．０ｋＧｙのγ線照射に用いる気密バッグの中に入れた。
【００９７】
〔実施例３〕
阻害検定帯域
本実施例の目的は、微生物バリア並びに微生物キラーを提供する実施例１に開示された方法に従って調製されるブタ腸粘膜下層（ＩＣＬ）由来の加工組織材料から調製される単一層構築物に対する抗菌物質の有効量に関する試験方法を例証することである。以下のような溶液中に抗菌物質を溶解するか又は懸濁することにより、いくつかの抗菌物質をＩＣＬに適用した。
１．  ０．５％硝酸銀溶液
２．  １％硝酸銀溶液
３．  イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）中の１〜２％ナノ結晶銀溶液
４．  １×ＰＢＳ中の１〜２％ナノ結晶銀溶液
５．  リン酸塩緩衝生理食塩溶液中の１〜２％ポリヘキサメチレンビグアニド（ＰＨＭＢ）
６．  精製水中の１〜２％ポリヘキサメチレンビグアニド（ＰＨＭＢ）
【００９８】
化学的清浄化ＩＣＬを４ｃｍ×６ｃｍ片に切断し、各片を水和状態及び脱水状態の両方で、約１００ｍＬの各溶液中にいれ、そして一晩放置した。次に処理ＩＣＬを溶液から取り出し、乾燥した。対照条件として供するために、非処理ＩＣＬ試料を用いた。円形片を各試料片から切り出した。寒天プレートに、細菌を画線した。試料をプレート上に載せ、観察のために２４時間インキュベートさせた。
【００９９】
ＩＰＡ中に作製したナノ結晶銀（Ｎ．Ｓ．）溶液は溶液中に完全に分散し、留まったが、一方、１×ＰＢＳ中のＮ．Ｓ．は溶液中に留まらず、ＩＣＬに溶液を付加する前に振盪を要した。ＩＰＡは一晩蒸発し、ＩＣＬの水和片及び脱水片の両方に関して一様で且つ均一に見え、脱水片はより限定された形状を保持し、取扱いが容易であった。両片は、炭黒色に変色した。トレー上に下向きにしたＩＣＬの側面はそれに対する側面性を有したが、それはＩＣＬのコーティングに、又は大きな阻害帯域（ＺＯＩ）を作製するに際しての材料の有効性に影響を及ぼすようには思えなかった。Ｎ．Ｓ．生成物は最良のＺＯＩを作製し、そして他の試料のいくつかの場合のように４日後に２４時間ＺＯＩへ細菌増殖しないＺＯＩも作製した。硝酸銀試料はＮ．Ｓ．より小さいが、他のものより大きいＺＯＩを示したが、硝酸銀の報告された毒性は必ずしもそれをＩＣＬに対する理想的添加剤としない。硝酸銀の既知の抗菌特性は、硝酸銀に対してＮ．Ｓ．を比較するために硝酸銀を有用にし、そしてＮ．Ｓ．は硝酸銀の有効性を超えた。
【０１００】
ＰＨＭＢ溶液はともに等しく見えたが、一方、浸漬後のＩＣＬはそうではなかった。ＰＢＳ溶液では、不均一塩残渣であると思われるものを有するＩＣＬが残ったが、一方、ＷＦＩ溶液では見かけの変化を伴わないＩＣＬが残った。両方とも、同様のＺＯＩを生じた。それらはより小さく、そしてＮ．Ｓ．のＺＯＩを有するようにそれらを作製しなかった。
【０１０１】
ナノ結晶銀及びＰＨＭＢはともに、この検定におけるそれらの殺菌作用により立証されるように、ＩＣＬ構築物に適用され得る有効な抗菌剤であることが判明した。
【０１０２】
〔実施例４〕
抗菌性ナノ結晶銀又はＰＨＭＢを含有する２層コラーゲン構築物の処理
積層２層ＩＣＬを調製し（積層化及び架橋化の両方）、次に抗菌剤で処理して、抗菌性を有する２層構築物を製造した。
【０１０３】
実施例２に従って、１２個の２層ＩＣＬ構築物（各々、約９ｃｍ×９ｃｍのサイズ）を調製した。それらの調製に際しては、１０ｍＭのＥＤＣ／０．１ＭのＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］（Pierce, Rockford, IL）緩衝液を用いて１６〜２０時間、これらのＩＣＬ構築物を架橋し、そして３０分間滅菌濾過水中で３回洗浄した。次に
調製構築物を抗菌剤で処理した。
【０１０４】
抗菌剤を、溶液として又は分散液として調製した。１０、１．０、０．１、０．０１、０．００１ｇのナノ結晶銀（Nanotechnologies（Ａｇ−２０）又は等価物、Austin, TX）を、１Ｌの分散剤、例えばイソプロピルアルコール（滅菌濾過水も許容可能な分散剤である）中で混合することにより、５つのナノ結晶銀分散液を調製した。コスモシルＣＱ（２０％ＰＨＭＢ溶液、ArchChemicals, Inc., Norwalk, CT）をＲＯＤＩ／ＷＦＩと混合することにより、０．２％、０．１％、０．０２％、０．００２％ＰＨＭＢ溶液を調製した。
【０１０５】
積層構築物及び架橋構築物を抗菌剤で被覆するために、水和構築物を、９．５ｃｍ×９．５ｃｍトレー中に入れた。５０ｍＬの各作用物質をトレー中にデカントし、トレーを振盪台に載せた。被覆時間は、１０秒、１時間、３時間及び一晩（約１８時間）であった。設定被覆時間の完了時に、層流生物学的安全キャビネットの滅菌気流中のポリカーボネートシート上で試料を乾燥させて、１０〜２０％Ｒｈに乾燥した。
【０１０６】
その結果生じた構築物は、積層され、架橋され、そして抗菌剤で処理されて構築物に抗菌特性を付与した２層ＩＣＬ構築物であった。
【０１０７】
［実施例５］
２層抗菌性構築物を二次加工するために用いられる抗菌性ナノ結晶銀又はＰＨＭＢによる単一層コラーゲン基質の処理
単一層ＩＣＬ構築物を調製し、架橋し、抗菌剤で処理して、次に積層して２層構築物を形成し、抗菌特性を有する２層加工組織基質構築物を製造した。抗菌剤による処理後に構築物を積層することにより、ＩＣＬ加工組織基質の層の間により多くの抗菌剤を組入れた。
【０１０８】
実施例１に従ってＩＣＬを調製し、ポリカーボネートシート上に広げて、リンパタグを除去した。約１０ｃｍ×９ｃｍのサイズに片を切断した。次にＩＣＬの各片を１０ｍＭのＥＤＣ／０．１ＭのＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］（Pierce, Rockford, IL）緩衝液（２６片当たり２リットル）中で架橋し、４に設定した振盪台上で１６〜２０時間掻き回して、次に１回洗浄当たり最低２０分間、最低２Ｌの滅菌濾過水中で３回洗浄した。
【０１０９】
抗菌剤を、溶液として又は分散液として調製した。１．０、０．１、０．０１ｇのナノ結晶銀組成物（Nanotechnologies（Ａｇ−２０）又は等価物、Austin, TX）を１Ｌの分散剤、例えばイソプロピルアルコール（滅菌濾過水も許容可能な分散剤である）中で混合することにより、３つのナノ結晶銀分散液を調製した。コスモシルＣＱ（２０％ＰＨＭＢ溶液、ArchChemicals, Inc., Norwalk, CT）をＲＯＤＩ／ＷＦＩと混合することにより、０．２％、０．１％、０．０２％ＰＨＭＢ溶液を調製した。
【０１１０】
抗菌剤でＩＣＬを被覆するために、正方形の１２５ｍｌ滅菌容器（Nalgene）中に１つの容器当たり４片で片を入れた。抗菌剤を含有する溶液又は分散液１００ｍＬを各容器にデカントして、構築物を浸漬した。容器を回転振盪台上で掻き混ぜながら、ＩＣＬを３〜６時間浸漬させたままにした。
【０１１１】
次に抗菌処理ＩＣＬを層化して、ポリカーボネートシートに対して平らにＩＣＬの一処理片を置くことにより、２層構築物を形成した。次に、層間に気泡が存在しないように、ＩＣＬの第２の処理片を第１の片の上面に直接、広げて載せた。構築物を有するポリカーボネートシートを次に、層流生物学的安全キャビネットの滅菌気流中に入れて、１０〜２０％Ｒｈで最低１２時間乾燥した。
【０１１２】
その結果生じた構築物は、架橋され、そして構築物に抗菌性を付与するために抗菌剤で処理され、そして次に構築物の外表面だけでなく構築物の層の間にも抗菌剤を組入れるように積層された２層ＩＣＬ構築物であった。
【０１１３】
〔実施例６〕
抗菌性ナノ結晶銀を含有する２層コラーゲン構築物の処理
積層２層ＩＣＬ構築物を調製し（積層化及び架橋化の両方）、次に抗菌剤で処理して、抗菌性を有する２層構築物を製造した。
【０１１４】
実施例２に従って、１２個の２層ＩＣＬ構築物（各々、約３５〜４０ｃｍ×９ｃｍのサイズ）を調製した。それらの調製に際しては、水中の１０ｍＭのＥＤＣ／０．１ＭのＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］（Pierce, Rockford, IL）緩衝液を用いて１６〜２０時間、これらのＩＣＬ構築物を架橋し、そして３０分間滅菌濾過水中で３回洗浄した。次に調製構築物を抗菌剤で処理した。
【０１１５】
抗菌剤を、分散液として調製した。１０．０、５．０、１．０ｇのナノ結晶銀（Nanotechnologies（Ａｇ−２０）又は等価物、Austin, TX）を、１Ｌのイソプロピルアルコール（滅菌濾過水も許容可能な分散剤である）中で混合することにより、ナノ結晶銀に対する分散液として調製した。
【０１１６】
抗菌剤で構築物を被覆するために、１Ｌの正方形容器（Nalgene）中に１つの容器当たり４構築物の割合で構築物を入れた。抗菌剤を含有する溶液又は分散液２００ｍＬを各容器にデカントして、構築物を浸漬した。容器を回転振盪台上で掻き混ぜながら、構築物を３〜６時間浸漬させたままにした。ナノ結晶銀分散液と接触された構築物を、１Ｌの滅菌濾過水で１回洗浄した。次に抗菌剤処理構築物を、層流生物学的安全キャビネットの滅菌気流中のポリカーボネートシート上に平らに載せて、１０〜２０％Ｒｈで最低１２時間乾燥した。
【０１１７】
その結果生じた構築物は、積層され、架橋され、そして抗菌剤で処理されて構築物に抗菌特性を付与した２層ＩＣＬ構築物であった。
【０１１８】
〔実施例７〕
２層抗菌性構築物を二次加工するために用いられる抗菌性ナノ結晶銀による単一層コラーゲン基質の処理
架橋単一層ＩＣＬ構築物を調製し、架橋し、抗菌剤で処理して、次に積層して２層構築物を形成し、抗菌特性を有する２層構築物を製造した。抗菌剤による処理後に構築物を積層することにより、外表面を被覆するよりも多くの抗菌剤を構築物中に組入れることが可能であり、そして構築物の層の間により多くの抗菌剤が存在した。
【０１１９】
実施例１に従ってＩＣＬを調製した。次に、ＩＣＬを３５〜４０ｃｍ長×９ｃｍ幅のポリカーボネートシート上に広げて、リンパタグを除去した。次にＩＣＬの各片を１０ｍＭのＥＤＣ／０．１ＭのＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］（Pierce, Rockford, IL）緩衝液（３０片当たり３リットル）中で架橋し、４に設定した振盪台上で１６〜２０時間掻き回して、次に１回の洗浄当たり３０分間、３〜５Ｌの滅菌濾過水中で３回洗浄した。
【０１２０】
抗菌剤を、分散液として調製した。１０．０、５．０、１．０ｇのナノ結晶銀（Nanotechnologies（Ａｇ−２０）又は等価物、Austin, TX）を１Ｌの分散剤、例えばイソプロピルアルコール中で混合することにより、４つのナノ結晶銀分散液を調製した。１ＬのＲＯ
ＤＩ中で、５．０ｇのナノ結晶も調製された。
【０１２１】
抗菌剤でＩＣＬを被覆するために、２５０ｍｌの滅菌容器（Nalgene）中に１つの容器当たり４片で片を入れた。抗菌剤を含有する溶液又は分散液２００ｍＬを各容器にデカントして、構築物を浸漬した。容器を回転振盪台上で掻き混ぜながら、ＩＣＬを３〜６時間浸漬させたままにした。ナノ結晶銀分散液に接触させたＩＣＬを、１Ｌの滅菌濾過水中で１回洗浄した。
【０１２２】
次に各抗菌処理ＩＣＬを層化して、ポリカーボネートシートに対して平らにＩＣＬの一処理片を置くことにより、２層構築物を形成した。次に、層間に気泡が存在しないように、ＩＣＬの第２の処理片を第１の片の上面に直接、広げて載せた。構築物を有するポリカーボネートシートを次に、層流生物学的安全キャビネットの滅菌気流中に入れて、１０〜２０％Ｒｈで最低１２時間乾燥した。
【０１２３】
その結果生じた構築物は、架橋され、そして構築物に抗菌性を付与するために抗菌剤で処理され、そして次に構築物の層の間により多くの抗菌剤を組入れるように積層された２層ＩＣＬ構築物であった。
【０１２４】
〔実施例８〕
架橋後及び積層前の被覆
架橋単一層ＩＣＬ構築物を調製し、架橋し、次に抗菌剤で処理し、そして次に積層して、２層構築物を形成し、抗菌特性を有する２層構築物を製造した。抗菌剤による処理の後に構築物を積層することにより、より多くの抗菌剤がＩＣＬの層間に組入れられた。
【０１２５】
実施例１に従ってＩＣＬを調製した。次にＩＣＬ片をポリカーボネートシート上に広げて、リンパタグを除去し、約３５〜４０ｃｍ長×９ｃｍ幅に切断した。次にＩＣＬの各片を１０ｍＭのＥＤＣ／０．１ＭのＭＥＳ緩衝液［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］（Pierce, Rockford, IL）（３０片当たり３リットル）中で架橋し、４に設定した振盪台上で１６〜２０時間掻き回して、次に１回の洗浄当たり３０分間、３〜５Ｌの滅菌濾過水中で３回洗浄した。
【０１２６】
抗菌剤を、溶液として又は分散液として調製した。５．０ｇのナノ結晶銀（Nanotechnologies（Ａｇ−２０）又は等価物、Austin, TX）を１Ｌの分散剤、ＲＯＤＩ中で混合することにより、ナノ結晶銀分散液を調製した。１０００ｍＬのＲＯＤＩ／ＷＦＩ当たり５．０ｍＬのコスモシルＣＱ（２０％ＰＨＭＢ溶液）を混合することにより、０．１％ＰＨＭＢ溶液を調製した。
【０１２７】
ＩＣＬをＰＨＭＢ剤で被覆するために、２８〜３０個のＩＣＬ片を５Ｌの清浄パイレックスガラス瓶中に入れた。０．１％ＰＨＭＢ溶液３０００ｍＬを添加した。容器を回転振盪台上で掻き混ぜながら、ＩＣＬを３〜６時間浸漬させたままにした。
【０１２８】
ナノ結晶銀分散液でＩＣＬを被覆するために、２００ｍＬを２５０ｍＬ滅菌容器（Nalgene）中に添加した。４片のＩＣＬを各容器中に入れて、３〜６時間掻き混ぜた。ナノ結晶銀分散液と接触させておいたＩＣＬを、２５０ｍＬのＲＯＤＩ中で１５分間、１回、そして積層されるまで、５００ｍＬのＲＯＤＩ中で最低５分間、１回洗浄した。ＰＨＭＢ溶液と接触させておいたＩＣＬは、洗浄しなかった。
【０１２９】
次に抗菌処理ＩＣＬを層化して、ポリカーボネートシートに対して平らにＩＣＬの一処理片を置くことにより、２層構築物を形成した。次に、層間に気泡が存在しないように、ＩＣＬの第２の処理片を第１の片の上面に直接、広げて載せた。構築物を有するポリカー
ボネートシートを次に、層流生物学的安全キャビネットの滅菌気流中に入れて、１０〜２０％Ｒｈで最低１２時間乾燥した。
【０１３０】
その結果生じた構築物は、架橋され、そして構築物に抗菌性を付与するために抗菌剤で処理され、そして次に構築物の層の間により多くの抗菌剤を組入れるように積層された２層ＩＣＬ構築物であった。
【０１３１】
〔実施例９〕
部分層創傷モデルにおけるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の増殖に関する３つの抗菌性被覆剤の評価
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とともにコロニー形成した部分層創傷に対する３つの抗菌性被覆剤の抗菌活性を検査した。
【０１３２】
その皮膚が形態学的にヒトの皮膚に類似するため、ブタ１頭を実験研究動物として用いた。ブタは体重約２５〜３０ｋｇで、実験開始前に２週間、屋内に保持した。ブタには基本餌を自由に与え、制御温度（１９〜２１℃）及び光（明暗１２時間／１２時間）に設定した動物小屋（ＵＳＤＡコンプライアンスを満たす）に単独で収容した。ブタをテラゾール（５ｍｇ／ｋｇ）、キシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）、アトロピン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉注射、並びにイソフルオラン及び酸素の組合せの吸入を用いて麻酔した。ブタの背中の毛を標準動物用バリカンで刈り込んだ。非抗生物質性石鹸（ニュートロゲナ（登録商標））及び滅菌水で洗浄することにより、ブタの背中の両側面の皮膚を準備した。動物を滅菌ガーゼで吸い取り乾燥した。特殊な電気角膜計（electrokeratome）を用いて、３６個の部分層創傷（１０×７×０．３ｍｍ）を背部皮膚上に作った。次に創傷にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ３３５９３を接種した。
【０１３３】
細菌接種を準備するために、アメリカ培養細胞コレクション（ＡＴＣＣ）（Rockville,
Maryland）から直接入手した病原性単離物の新鮮な培養物を用いた。接種物は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ３３５９３であった。凍結乾燥細菌培養物を、ＡＴＣＣ標準回収プロトコルによって回収した。懸濁液の混濁度がＭａｃＦａｒｌａｎｄの８番の混濁度標準のものと等価になるまで、培養プレートからの一晩増殖物を擦り取って通常生理食塩水５ｍｌ中に入れることにより、すべての接種懸濁液を作製した。これは、約１０8コロニー形成単位／ｍｌ（ＣＦＵ／ｍｌ）の懸濁液濃度を生じる。１０8懸濁液を連続希釈して、約１０6ＣＦＵ／ｍｌの濃度を有する接種物懸濁液を作製した。少量の接種物懸濁液を培地上でプレート播種して、生育可能生物体の正確な濃度を定量した。接種物懸濁液を直接用いて、各創傷部位に接種した。懸濁液の０．０２５ｍｌ（２５μｌ）アリコートは、滅菌ガラスシリンダー（直径２２ｍｍ）中で、各創傷のセンターに寄託する。懸濁液を、滅菌テフロンへらを用いて１０秒間各検査部位に擦って、３分間乾燥させた。接種の１０分以内に、創傷にコロニー形成するための時間を細菌に与えるために全接種創傷をポリウレタンフィルム被覆剤で２４時間被覆した後、処理を開始した。
【０１３４】
３つの付加的創傷を作製し、接種して、ベースラインＣＦＵ／ｍｌを得た後、処理を開始した：接種物：Ｌｏｇ４．２４ＣＦＵ／ｍＬ、ベースライン数：Ｌｏｇ５．３８ＣＦＵ／ｍＬ。以下の実験計画により分かるように、６つの創傷を種々の処置群に割り当てた。疼痛又は不快の任意の観察可能な徴候に関して、動物被験体を毎日モニタリングした。考え得る不快を最小限にするのを助けるために、鎮痛薬（デュラゲシック−２５μｇ／時間で溶離するフェンタニル経皮系）を全実験中に用いた。
１）被覆剤Ａは、実施例８に従って作製された２層ＰＨＭＢ処理構築物であった。
２）被覆剤Ｂは、実施例８に従って作製された２層ナノ結晶銀処理構築物であった。
３）被覆剤Ｃは、実施例８に従って作製された１層ナノ結晶銀処理構築物であった。
４）対照（石油ガーゼ又はポリウレタン皮膜のみ）。
５）陽性対照（競合体抗菌性被覆剤又はバクトロバン軟膏）。
６）非処理空気曝露対照。
非処理群以外の全処理群を、ポリウレタン皮膜で被覆した（供給元と相談）。処理群を、区域１、２、３、４、５又は６に無作為に割り当てた。合計で１つの処理群当たり３つの創傷を１日ごとに評価した。
【０１３５】
処理後２４時間及び７２時間目に、各処理群から３つの創傷を培養した。各試料採取時間に、部位を定量的に培養した。各部位は、１回だけ培養した。２つの取っ手により適所に保持される滅菌ガラスシリンダー（外径２２ｍｍ）により、この区域を包含した。１ｍｌのスクラブ溶液をガラスシリンダー中にピペット分取して、滅菌テフロンへらでこの部位を３０秒間擦り取った。連続希釈液を作製して、Ｓｐｉｒａｌ  Ｐｌａｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（これは、少限定量（４０μｌ）の懸濁液を回転寒天プレートの表面全体に沈着する）を用いてスクラブ溶液を定量する。
【０１３６】
ミューラーヒストン寒天、４％ＮａＣｌ及び６μｇのオキサシリン／ｍｌを有する選択培地上でＭＲＳＡを増殖させた。オキサシリンは、より安定であるため、メチシリンの代わりに用いた。インキュベート期間（２４時間）後、プレート上のコロニーを計数し、そして１ｍＬ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍｌ）を算定した。
【０１３７】
この試験からの結果を、表１に示す。結果は、２層ＰＨＭＢ、２層ナノ結晶銀及び１層ナノ結晶銀が、創傷からの細菌の根絶に有効であった、ということを示した。
【０１３８】
【表１】
2009515569.tif 000002
【０１３９】
〔実施例１０〕
多層ＩＣＬ補綴の機械的試験技術及び特性
多層ＩＣＬパッチ構築物の好ましい実施形態を試験した。５０％アセトン中の１００ｍＭ  ＥＤＣ（１００／５０）で架橋されたＩＣＬの２、４及び６層の構築物及び水中の７ｍＭ  ＥＤＣ／９０％（ｖ／ｖ）アセトン（７／９０）及び水中の１ｍＭ  ＥＤＣ（１／０）で架橋された６層構築物を、多数の測定値とともに評価した。結果を、表２に要約する。
【０１４０】
サーボ油圧式ＭＴＳ試験システムをＴｅｓｔＳｔａｒ−ＳＸソフトウエアとともに用いて、引張り疲労試験を実施した。単軸引張りで、０．０１３／ｓの一定引張り率で、幅１．２５ｃｍの細片を引張って疲労させた。線形領域の勾配（ＥY）及び最大引張り強さ（ＵＴＳ）を応力歪曲線から算定した。
【０１４１】
接着剤の試験のための標準プロトコル（ＡＳＴＭ  Ｄ１８７６−９５）を用いて、層間の接着強度を試験した。接着強度は、０．５ｃｍ／秒の一定速度で積層ＩＣＬの２つの層を引き剥がすために要する平均力である。
【０１４２】
示差走査熱量計を用いて、熱制御条件下での試料から及び試料への熱流量を測定した。収縮温度は、温度−エネルギープロットにおける変性ピークの開始温度と定義された。１ｍＭのＥＤＣ中、アセトンなしで架橋された２層構築物（極く少し結合される）に関する縫合保持（３．７Ｎ±０．５Ｎ）は２Ｎ最小規格を十分に上回るため、１００ｍＭのＥＤＣ及び５０％アセトンで架橋された２層構築物又は４層構築物に関しては縫合保持は実施しなかった。ＩＣＬ層間の積層強度並びに収縮温度は、構築物中の層の数というよりむしろ、架橋濃度及びアセトンの付加によっている。
【０１４３】
【表２】
2009515569.tif 000003
【０１４４】
〔実施例１１〕
抗菌剤処理構築物による創傷の治療方法
実施例１からのＩＣＬの単一シート層又は実施例２の方法により形成されるＩＣＬの結合多層シート構築物を用いて、全層皮膚創傷を治療する。シートをメッシュ加工処理又は有窓加工処理して、小開口部を作製して、創傷滲出物を滲出させる。
【０１４５】
第二度熱傷、裂傷、断裂及び擦過傷、癌性増殖の除去又は自家移植皮膚ドナー部位からの外科的切除創傷、並びに皮膚潰瘍、例えば静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、褥瘡性（床ずれ）潰瘍並びにその他の慢性潰瘍を含めた皮膚創傷を、ＩＣＬを単一又は多層形態で用いて処置する。コラーゲン性ＩＣＬ基質は、水分を保持し、創傷から排出させながら、創傷床を保護する。ＩＣＬが創傷に適用される前に、創傷床を、その適用のために準備する。
【０１４６】
移植を要する熱傷創傷を有する患者を選択する。ＩＣＬを、直接切除創傷床上に置くか、或いは拡大されないか、又は２：１以上の割合で拡大されるメッシュ加工処理自家移植片の上に載せる。試験部位（ＩＣＬ）及び対照部位（自家移植片）は、用いられる場合、
同一メッシュ比を有する。熱傷皮膚区域が完全に切除されるように、例えば標準実施に従った処置の前に、壊死組織切除により移植されるべき熱傷性創傷部位を調製する。切除床は、清浄で、臨床的に非感染性であるように見える。
【０１４７】
外科的切除を受けている患者に、局所麻酔をする。術前区域を抗菌剤／消毒皮膚清浄剤（Ｈｉｂｉｃｌｅｎｓ（登録商標））で清浄化して、通常生理食塩水で洗浄する。深い部分層創傷を皮膚に作製し、それが癌性でない限り、皮膚を他の箇所に移植する。ＩＣＬを創傷床に適用して、滅菌被覆剤を適用する。
【０１４８】
いずれかの創傷の場合に、処置創傷の検査、清浄化、被覆剤取替え等において、適切な術後ケアを患者に提供する。処置部位の状態の完全な記録を保持して、手法、必要な医薬品、被覆剤交換の頻度及び為される観察のすべてを実証する。創傷床を外部環境及び水分から防護したままで、創傷の処置及び治癒を補助する。
【０１４９】
創傷被覆剤を、動物モデルで試験した。本発明の創傷被覆剤構築物は、実施例１及び実施例２の方法により形成されるＩＣＬから作製される単一又は多層のシート構築物である。ラット全層創傷治癒モデル（創傷被覆剤製品に関する一般的に用いられるモデル）を用いて、ＩＣＬの単一層材料から作製される創傷被覆剤構築物の性能を評価した。合計２０匹の動物（１評価時点当たり４匹）は、その背中の上に作製された２つの２ｃｍ×２ｃｍ全層切開創傷を有した。試験品及び対照品を創傷周辺よりわずかに大きく切断して、無作為化適用スキームに従っていずれかの創傷に乾燥を適用した。必要な場合、創傷流体及び滅菌生理食塩水により被覆剤は再水和される。石油ガーゼの二次被覆剤を各試験品及び対照品全体に適用して、毎週、又は各評価時点で取り替えた。処置後３、７、１４、２８及び４２日目に、創傷を評価した。評価は、外植創傷部位の創傷閉鎖の速度及びパーセンテージ（創傷追跡検査に基づいて）、紅斑、滲出物及び組織学的知見を包含した。
【０１５０】
創傷閉鎖のパーセンテージ及び速度の分析の結果によれば、創傷被覆剤構築物処置部位は、対照部位よりわずかに速いが、統計的に有意というわけではない創傷閉鎖を実証した。時間対完全創傷閉鎖の分析は、試験部位と対照処置部位との間に差異を見出さなかった。紅斑、滲出物及び組織学分析の結果は、２つの生成物に関して等価であった。組織学的知見は、単一層ＩＣＬから作製された創傷被覆剤構築物が長時間に亘る必要な治癒特質、創傷の再上皮形成、及びコラーゲン性材料の吸収を示す、ということを示した。試験対象による構築物に対する悪反応の証拠は認められなかった。
【０１５１】
上述の発明は、明確化及び理解のために図と実施例という方法によって詳しく記述されているが、当業者にとっては、或る種の改質及び変更を添付の特許請求の範囲内で行ってもよいことは明らかであろう。