(57)【要約】  本発明は、両親媒性化合物を用いた水溶性磁性ナノ複合体に関する。特に優れた磁気共鳴映像造影剤（ＭＲＩ）として用いられ、組織特異的結合成分が結合されていることを特徴とする癌診断知能型造影剤として用いられ、薬物を重合するか、または封入して組織特異的結合成分を同時に結合することによって、同時診断及び治療のための薬物伝達体として用いられるだけでなく、磁性を用いた細胞及びタンパク質分離用として用いられる水溶性磁性ナノ複合体及びその製造方法に関するものである。
2009531296.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性ナノ粒子が、一つ以上の疎水性領域と一つ以上の親水性領域とを有する両親媒性化合物で覆われていることを特徴とする磁性ナノ複合体。
【請求項２】
ナノ複合体は、一つ以上の磁性ナノ粒子が疎水性領域に分布されたコア及び親水性領域を含有するシェルを含むことを特徴とする請求項１に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項３】
ナノ複合体は、一つの磁性ナノ粒子が疎水性領域と結合されたコア及び親水性領域を含有するシェルを含むことを特徴とする請求項１に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項４】
磁性ナノ粒子は、直径が１ｎｍ〜１０００ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項５】
磁性ナノ複合体は、直径が１ｎｍ〜５００ｎｍであることを特徴とする請求項２に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項６】
磁性ナノ複合体は、直径が１ｎｍ〜５０ｎｍであることを特徴とする請求項３に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項７】
磁性ナノ粒子は金属、磁性物質、又は磁性合金であることを特徴とする請求項１に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項８】
金属は、Ｐｔ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｕ及びＡｕよりなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項９】
磁性物質は、Ｃｏ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｇｄ、Ｍｏ、ＭＭ’２Ｏ４、及びＭｘＯｙ（ここで、Ｍ及びＭ’はそれぞれ独立して、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｇｄ、又はＣｒを表し、０＜ｘ≦３、０＜ｙ≦５）よりなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項１０】
磁性合金は、ＣｏＣｕ、ＣｏＰｔ、ＦｅＰｔ、ＣｏＳｍ、ＮｉＦｅ及びＮｉＦｅＣｏよりなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項１１】
金属、磁性物質、又は磁性合金は、有機性表面安定剤と結合されていることを特徴とする請求項７に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項１２】
有機性表面安定剤は、アルキルトリメチルアンモニウムハライド、飽和又は不飽和脂肪酸、トリアルキルホスフィン、トリアルキルホスフィンオキシド、アルキルアミン、アルキルチオール、ナトリウムアルキルスルフェート、及びナトリウムアルキルホスフェートよりなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項１１に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項１３】
有機性表面安定剤は、飽和又は不飽和脂肪酸及びアルキルアミンよりなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項１２に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項１４】
疎水性領域は、飽和又は不飽和脂肪酸、又は疎水性高分子であることを特徴とする請求項１に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項１５】
飽和脂肪酸は、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、エイコサン酸、及びドコサン酸よりなる群から選択されるのを特徴とする請求項１４に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項１６】
不飽和脂肪酸は、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、及びエルカ酸よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項１７】
疎水性高分子は、ポリホスファゼン、ポリラクチド、ポリラクチド−コ−グリコリド、ポリカプロラクトン、ポリアンハイドライド、ポリリンゴ酸又はその誘導体、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリヒドロオキシブチレート、ポリカーボネート及びポリオルトエステル、疎水性ポリアミノ酸及び疎水性ビニル系高分子よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項１８】
疎水性高分子は、重量平均分子量が１００〜１００，０００であることを特徴とする請求項１７に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項１９】
親水性領域は、生分解性高分子であることを特徴とする請求項１に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項２０】
生分解性高分子は、ポリアルキレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、親水性ポリアミノ酸及び親水性ビニル系高分子よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１９に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項２１】
生分解性高分子は、重量平均分子量が１００〜１００，０００であることを特徴とする請求項１９に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項２２】
ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項２０に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項２３】
ポリエチレングリコールは、モノメトキシポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項２２に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項２４】
親水性領域は、構造内に一つ以上の親水活性成分結合領域を有することを特徴とする請求項１に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項２５】
親水活性成分は、生体活性成分、高分子、及び無機担体よりなる群から選択されることを特徴とする請求項２４に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項２６】
親水活性成分結合領域（Ｒ２）は、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＰＯ３Ｈ、−ＰＯ４Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＯＨ、−ＮＲ４＋Ｘ−、−スルホネート、−ニトレート、−ホスホネート、−スクシンイミジル基、−マレイミド基、及び−アルキル基よりなる群から選択される一つ以上が官能基を含むことを特徴とする請求項２4に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項２７】
磁性ナノ粒子が、一つ以上の疎水性領域と一つ以上の親水性領域とを有する両親媒性化合物で覆われており、上記親水性領域に存在する一つ以上の親水活性成分結合領域が、組織特異的結合成分と結合されていることを特徴とする請求項１に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項２８】
上記組織特異的結合成分は、抗原、抗体、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ハプテン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、レクチン、セレクチン、放射線同位元素で標識された成分、及び腫瘍マーカーと特異的に結合しうる物質よりなる群から選択されることを特徴とする請求項２７に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項２９】
上記腫瘍マーカーは、リガンド、抗原、受容体、及びこれらをコードする核酸よりなる群から選択されることを特徴とする請求項２８に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項３０】
上記腫瘍マーカーは、シナプトタグミンＩのＣ２、アネキシンＶ、インテグリン、ＶＥＧＦ、アンジオポエチン１、アンジオポエチン２、ソマトスタチン、血管腸ペプチド、癌性胎児性抗原、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原、前立腺特異抗原及び葉酸受容体よりなる群から選択されることを特徴とする請求項２９に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項３１】
上記腫瘍マーカーと特異的に結合しうる物質は、ホスファチジルセリン、ＶＥＧＦＲ、インテグリン受容体、Ｔｉｅ２受容体、ソマトスタチン受容体、血管腸ペプチド受容体、ハーセプチン、リツキサン（Rituxan）及び葉酸よりなる群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項２７に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項３２】
疎水性領域は、構造内に一つ以上の疎水活性成分結合領域を有することを特徴とする請求項１に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項３３】
疎水活性成分は、生体活性成分、高分子、及び無機担体よりなる群から選択されることを特徴とする請求項３２に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項３４】
疎水活性成分結合領域は、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＰＯ３Ｈ、−ＰＯ４Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＯＨ、−スクシンイミジル基、−マレイミド基、及び−アルキル基よりなる群から選択された一つ以上の官能基を含むことを特徴とする請求項３２に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項３５】
磁性ナノ粒子が、一つ以上の疎水性領域と一つ以上の親水性領域とを有する両親媒性化合物で覆われ、上記親水性領域に存在する一つ以上の親水活性成分結合領域が組織特異的結合物質と結合され、上記疎水性領域に薬剤学的活性成分が結合又は封入されていることを特徴とする請求項１に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項３６】
上記薬剤学的活性成分は、抗癌剤、抗生剤、ホルモン、ホルモン拮抗剤、インターロイキン、インターフェロン、成長因子、腫瘍壊死因子、エンドトキシン、リンホトキシン、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子、プロテアーゼ阻害剤、アルキルホスホコリン、放射線同位元素で標識された成分、界面活性剤、心血管系薬物、胃腸管系薬物及び神経系薬物よりなる群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項３５に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項３７】
抗癌剤は、エピルビシン（Epirubicin）、ドセタキセル（Docetaxel）、ゲムシタビン（Gemcitabine）、パクリタキセル（Paclitaxel）、シスプラチン（cisplatin）、カルボプラチン（carboplatin）、タクソール（taxol）、プロカルバジン（procarbazine）、シクロホスファミド（cyclophosphamide）、ジアクチノマイシン（dactinomycin）、ダウノルビシン（daunorubicin）、エトポシド（etoposide）、タモキシフェン（tamoxifen）、ドキソルビシン（doxorubicin）、マイトマイシン（mitomycin）、ブレオマイシン（bleomycin）、プリコマイシン（plicomycin）、トランスプラチナ（transplatinum）、ビンブラスチン（vinblastin）及びメトトレキサート（methotrexate）よりなる群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項３６に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項３８】
両親媒性化合物は、疎水活性成分結合領域−疎水性領域−親水性領域−親水活性成分結合領域からなることを特徴とする請求項１に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項３９】
両親媒性化合物は、疎水活性成分結合領域−疎水性領域−ＮＨ２−親水性領域−親水活性成分結合領域からなることを特徴とする請求項３８に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項４０】
両親媒性化合物は、モノメトキシポリエチレングリコール−ポリラクチド−コ−グリコリド共重合体、又はモノメトキシポリエチレングリコール−ラウリン酸共重合体であることを特徴とする請求項１に記載の磁性ナノ複合体。
【請求項４１】
Ａ）ナノ粒子を溶媒で合成する工程；及び
Ｂ）疎水性領域と親水性領域とを有する両親媒性化合物を、上記ナノ粒子表面に付加して両親媒性化合物とナノ粒子とを結合させる工程；を含む磁性ナノ複合体の製造方法。
【請求項４２】
Ｃ）上記親水性領域に存在する親水活性成分結合領域と腫瘍マーカーと特異的に結合しうる物質を結合させる工程；
を、さらに含む請求項４１に記載の磁性ナノ複合体の製造方法。
【請求項４３】
Ｄ）疎水性領域に、薬剤学的活性成分を結合するか、封入する工程；を、さらに含む請求項４１に記載の磁性ナノ複合体の製造方法。
【請求項４４】
ナノ粒子を溶媒で合成する工程Ａ）は、
ａ）溶媒の存在下に、ナノ粒子前駆体と有機性表面安定剤を反応させる工程；及び
ｂ）上記反応物を熱分解する工程；を含むことを特徴とする請求項４１に記載の磁性ナノ複合体の製造方法。
【請求項４５】
溶媒は、エーテル系化合物、ヘテロ環化合物、芳香族化合物、スルホキシド化合物、アミド化合物、アルコール、炭化水素及び水よりなる群から選択されることを特徴とする請求項４４に記載の磁性ナノ複合体の製造方法。
【請求項４６】
溶媒は、オクチルエーテル、ブチルエーテル、ヘキシルエーテル、デシルエーテル、ピリジン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トルエン、キシレン、メシチレン、ベンゼン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、オクチルアルコール、デカノール、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカン、ドデカン、テトラデカン、ヘキサデカン、又は水であることを特徴とする請求項４５に記載の磁性ナノ複合体の製造方法。
【請求項４７】
工程Ｂ）は、
ａ）ナノ粒子を有機溶媒に溶解して油相を製造する工程；
ｂ）両親媒性化合物を水性溶媒に溶解して水相を製造する工程；
ｃ）上記油相と水相とを混合してエマルジョンを形成する工程；及び
ｄ）上記エマルジョンから油相を分離する工程；
を含むことを特徴とする請求項４１に記載の磁性ナノ複合体の製造方法。
【請求項４８】
工程Ｂ）は、
ｅ）上記ナノ粒子を両親媒性化合物が溶解された溶液で分散して懸濁液を製造する工程；及び
ｆ）上記懸濁液から溶媒を分離する工程；
を含むことを特徴とする請求項４１に記載の磁性ナノ複合体の製造方法。
【請求項４９】
工程Ｃ）は
ｇ）架橋剤を用いて親水性領域の一部に親水活性成分結合領域を提供する工程；及び
ｈ）上記親水活性成分結合領域と組織特異的結合成分を結合する工程；
を含むことを特徴とする請求項42に記載の磁性ナノ複合体の製造方法。
【請求項５０】
工程Ｄ）は、
ｉ）架橋剤を用いて疎水性領域の一部に疎水活性成分結合領域を提供する工程；及び
ｊ）上記疎水活性成分結合領域と薬剤学的活性成分とを結合させる工程；
を含むことを特徴とする請求項４３に記載の磁性ナノ複合体の製造方法。
【請求項５１】
工程Ｄ）は、両親媒性化合物とナノ粒子とを結合する上記工程Ｂ）で、薬剤学的活性成分をナノ粒子と共に溶解して封入することを特徴とする請求項４３に記載の磁性ナノ複合体の製造方法。
【請求項５２】
請求項１〜２６のいずれかに記載の磁性ナノ複合体及び薬剤学的に許容される担体を含む造影剤組成物。
【請求項５３】
請求項２７〜３１のいずれかに記載の磁性ナノ複合体及び薬剤学的に許容される担体を含む診断用組成物。
【請求項５４】
請求項３５〜３７のいずれかに記載の磁性ナノ複合体及び薬剤学的に許容される担体を含む同時診断及び治療用薬剤学的組成物。
【請求項５５】
請求項５２に記載の造影剤組成物を生体又は試料に投与する工程；及び
上記生体又は試料から磁性ナノ複合体によって発散される信号を感知して映像を収得する工程；
を含む造影剤組成物の利用方法。
【請求項５６】
請求項５３に記載の診断用組成物を生体又は試料に投与する工程；及び
上記生体又は試料から磁性ナノ複合体によって発散される信号を感知して映像を収得する工程；
を含む疾患の診断方法。
【請求項５７】
請求項５４に記載の薬剤学的組成物を生体又は試料に投与する工程；及び
上記生体又は試料から磁性ナノ複合体によって発散される信号を感知して映像を収得する工程；
を含む疾患の同時診断及び治療方法。
【請求項５８】
造影剤組成物を生体又は試料に投与する工程は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下又は局部投与することを特徴とする請求項５２に記載の利用方法。
【請求項５９】
上記信号を感知する工程で、磁気共鳴映像装置を利用することを特徴とする請求項５２に記載の利用方法。
【請求項６０】
上記磁気共鳴映像装置は、Ｔ２スピン−スピン緩和磁気共鳴映像装置であることを特徴とする請求項５９に記載の利用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は両親媒性化合物を用いた水溶性磁性ナノ複合体に関する。特に優れた磁気共鳴映像（ＭＲＩ）造影剤として用いられ、組織特異的結合成分が結合されていることを特徴とする癌診断知能型造影剤として用いられ、薬物を重合するか、又は封入して同時に組織特異的結合成分を同時に結合することによって同時診断及び治療のための薬物伝達体として用いられるだけでなく、磁性を用いた標的物質分離用として用いられる水溶性磁性ナノ複合体及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ナノ技術は物質を原子、分子水準で調節及び制御する技術であり、新物質、または新素子創出に好適で、その応用分野が電子、材料、通信、機械、医薬、農業、エネルギー、及び環境など非常に多岐にわたる。
【０００３】
現在、ナノ技術は多様に発展しており、大きく３つ分野に分類されている。
第一に、ナノ素材で極微細サイズの新しい物質と材料を合成する技術に関するものである。
第二に、ナノ素子でナノサイズの材料を組み合せるか、又は配列して一定の機能を発揮する装置を製造する技術に関するものである。
第三に、ナノ−バイオ技術と呼ばれるナノ技術を生命工学に応用する技術に関するものである。
【０００４】
特に、ナノ−バイオ分野の中で、磁性ナノ粒子は、生体物質の分離、磁気共鳴映像診断プローブ、巨大磁気抵抗センサーを含むバイオセンサー、マイクロ流体系センサー、薬物／遺伝子伝達、及び磁性高熱治療などの広い応用範囲にわたって使用されている。
【０００５】
具体的に、磁性ナノ粒子は、分子磁気共鳴映像の診断プローブ（造影剤）として用いられる。磁性ナノ粒子は、ナノ粒子周辺の水分子の水素原子のスピン−スピン弛緩時間を短縮させ、磁気共鳴映像信号を増幅させる効果を示し、今まで共鳴映像診断に広く使われている。
【０００６】
さらに、磁性ナノ粒子は、巨大磁気−抵抗バイオセンサー（ＧＭＲ ｓｅｎｓｏｒ）のプローブ物質として作用できる。磁性ナノ粒子が巨大磁気抵抗バイオセンサー表面にパターンされている生体分子を感知して結合すれば、磁性粒子によって巨大磁気抵抗センサーの電流信号が変わるようになり、これを利用すれば、生体分子を選択的に検出することが可能になる（特許文献１、２、３、４）。
【０００７】
また、磁性ナノ粒子は、生体分子の分離にも応用しうる。例えば、特定の生体マーカーを発現する細胞と他の種々細胞が混ざっている時、磁性ナノ粒子が特定の生体マーカーと選択的に結合するようにした後、外部から磁場をかければ、磁場方向に所望の細胞だけを分離することができる（特許文献５、６、７、８）。また、細胞の分離だけでなく、タンパク質、抗原、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びウイルスなど様々な生体分子の分離に応用することができる。また、磁性ナノ粒子は、磁性マイクロ流体センサーに応用され、生体分子の分離及び検出することができる。チップ上に、非常に小さなチャネルを作って、その中に磁性ナノ粒子を流すことによって、マイクロ単位の流体系から検出と分離が可能になる。
【０００８】
一方、磁性ナノ粒子は薬物または遺伝子の伝達を介した生体治療にも用いられる。磁性ナノ粒子に、化学的な結合または吸着を通じて薬物または遺伝子をロードし、外部磁場を利用して所望の位置に移動させ、特定部位に薬物及び遺伝子の放出を可能にして、選択的な治療効果が得られるようにする（特許文献９）。
【０００９】
磁性ナノ粒子を用いた生体治療への応用の他の例として、磁性スピンエネルギーを用いた高熱治療が挙げられる（特許文献１０、１１）。磁性ナノ粒子は、外部のラジオ周波数の交流電流を流すと、スピンフリッピング（flipping）過程を介して熱が放出される。この時、ナノ粒子周辺の温度が４０℃以上になると、細胞が高い熱によって死ぬようになり、疾患細胞を選択的に死滅させることができる。
【００１０】
磁性ナノ粒子が前述した用途に利用されるためには、磁気的性質に優れ、生体内、即ち、水溶性環境で安定的に運搬及び分散しなければならなく、生体活性物質と容易に結合しなければならない。このような条件を満足させるために、現在まで様々な技術が開発されてきた。
【００１１】
特許文献１２には、酸化鉄のような金属を含む常磁性ナノ粒子に関するもので、上記ナノ粒子の表面に組織特異的な結合物質、診断または薬剤学的に活性である物質とカップリングする結合部位を含む無機物質を付着したナノ粒子を開示している。
【００１２】
特許文献１３は、酸化鉄のような金属を含む常磁性ナノ粒子に関するもので、上記ナノ粒子の表面に特定のカルボン酸を付着し、重力または磁場でナノ粒子が凝集及び沈殿されることを防止する方法を開示している。上記特定のカルボン酸には、マレイン酸、酒石酸、またはグルカル酸などの脂肪族ジカルボン酸、またはクエン酸、シクロヘキサン、またはトリカルボン酸などの脂肪族ポリジカルボン酸が用いられる。
【００１３】
特許文献１４は、単層（monolayer）で被覆された機能性ナノ粒子に関するもので、上記単層には二官能性（bifunctional）ペプチドが付着され、上記ペプチドにはＤＮＡ及びＲＮＡを含む様々なバイオポリマーが結合される。
【００１４】
特許文献１５はタンパク質鋳型内に磁性ナノ粒子形成工程を含む磁性ナノ粒子の製造方法に関するもので、アポフェリチンに磁性ナノ粒子をカプセル化する方法を開示している。
【００１５】
特許文献１６は二重ミセル(bi-micellear vesicle)内でマンガン亜鉛酸化物をナノ粒子で形成させる方法に関するものであり、形成された磁性ナノ粒子の熱処理過程を介して向上された性質を示すナノ粒子を記述された。
【００１６】
特許文献１７は１６−メルカプトヘキサデカン酸で覆われた水溶性磁性ナノ粒子の合成と合成された磁性ナノ粒子に相転移剤であるＴＡＴペプチドを利用して細胞内磁気的ラベリングで実験マウス内のウイルス及びｍＲＮＡ検出に関して記述した。
【００１７】
特許文献１８は澱粉コーティングと任意のポリアルキレンオキシドコーティングを備えた超常磁性鉄酸化物コア粒子を含む粒子とこれを含むＭＲＩ造影剤を開示している。
【００１８】
しかし、上記方法で製造された水溶性ナノ粒子は、次のような短所を持っている。特許文献１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８において、開示されたナノ粒子は、主に水溶液で合成されているので、ナノ粒径の調節が難しく、合成されたナノ粒子は不均一な粒径分布度を示す。また、低温で合成されているので、ナノ粒子の結晶性が低いし、非化学量論的化合物(non-stoichiometric compound）が形成される傾向がある。従って、上記方法で製造されたナノ粒子は、水溶液でコロイド安定性が低下し、生体溶融時、凝集、及び高い非選択性結合などを示す問題点を持っている。
【特許文献１】米国特許６，４５２，７６３ Ｂ１
【特許文献２】米国特許６，９４０，２７７ Ｂ２
【特許文献３】米国特許６，９４４，９３９ Ｂ２
【特許文献４】米国公開特許第２００３／０１３３２３２ Ａ１号
【特許文献５】米国特許４，５５４，０８８号
【特許文献６】米国特許５，６６５，５８２号
【特許文献７】米国特許５，５０８，１６４号
【特許文献８】米国公開特許第２００５／０２１５６８７ Ａ１号
【特許文献９】米国特許６，８５５，７４９号
【特許文献１０】米国特許６，５３０，９４４ Ｂ２
【特許文献１１】米国特許５，４１１，７３０号
【特許文献１２】米国特許６，２７４，１２１号
【特許文献１３】米国特許６，６３８，４９４号
【特許文献１４】米国公開特許第２００４／５８４５７号
【特許文献１５】イギリス特許GB２２３，１２７号
【特許文献１６】米国公開特許第２００３／１９０，４７１号
【特許文献１７】米国公開特許第２００５／１３０，１６７号
【特許文献１８】大韓民国特許出願第１０−１９９８−０７０５２６２号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、上記のような問題を解決するためのものであり、本発明の目的は、水溶液で、安定性が高く、生体毒性が少なく、生体の診断及び治療に広範囲に応用することができる磁性ナノ複合体であって、磁性ナノ粒子が一つ以上の疎水性領域と一つ以上の親水性領域とを有する両親媒性化合物で覆われていることを特徴とする磁性ナノ複合体を提供することにある。
【００２０】
本発明の別の目的は、磁性ナノ粒子が一つ以上の疎水性領域と一つ以上の親水性領域とを有する両親媒性化合物で覆われており、上記親水性領域に存在する一つ以上の親水活性成分結合領域が組織特異的結合成分（tissue-specific binding substances）と結合されていることを特徴とする知能型磁性ナノ複合体（インテリジェント型磁性ナノ複合体）を提供することにある。
【００２１】
本発明のさらに別の目的は、磁性ナノ粒子が一つ以上の疎水性領域と一つ以上の親水性領域とを有する両親媒性化合物で覆われており、上記親水性領域に存在する一つ以上の親水活性成分結合領域が組織特異的結合成分と結合され、上記疎水性領域に薬剤学的活性成分が結合または封入されていることを特徴とする同時診断及び治療用磁性ナノ複合体を提供することにある。
【００２２】
本発明のさらに別の目的は、磁性ナノ粒子が一つ以上の疎水性領域と一つ以上の親水性領域とを有する両親媒性化合物で覆われており、上記親水性領域に存在する一つ以上の親水活性成分結合領域が組織特異的結合成分と結合されていることを特徴とする磁性ナノ複合体と標的物質を結合し、上記磁性ナノ複合体と標的物質の結合物に磁場を加え、標的物質を分離する方法を提供することにある。
【００２３】
本発明のさらに別の目的は、上記本発明に係る磁性ナノ複合体の製造方法を提供することにある。
【００２４】
本発明のさらに別の目的は、上記本発明に係る磁性ナノ複合体及び薬剤学的に許容可能な担体を含む造影剤組成物、診断用組成物、薬剤学的組成物及びこれを利用する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
以下、本発明に係る磁性ナノ複合体をより詳細に説明する。
本発明に係る上記磁性ナノ複合体の特徴は、ナノ粒子の表面に両親媒性化合物を付加して両親媒性化合物の疎水性領域がナノ粒子の表面と結合し、両親媒性化合物の親水性領域がナノ複合体の最外郭に分布していることである。ここで、両親媒性化合物の疎水性領域は、水素結合、 ファン・デル・ワールス力 、及び極性引力などの物理的結合によってナノ粒子の表面と結合する。従って、上記疎水性領域は疎水性領域のメトリックス内にナノ粒子を分布させるか、ナノ粒子の表面と結合する役割を果たすだけでなく、必要に応じて疎水性領域のメトリックス内に薬物を物理的に封入するか、疎水性領域の一末端に薬物を化学的に結合させることができる。一方、両親媒性化合物の親水性領域は、ナノ複合体の最外殻に分布して水不溶性のナノ粒子を水溶性媒体中で安定化させ、生体利用率を極大化することができる。
【００２６】
さらに、本発明に係る上記磁性ナノ複合体の他の特徴は、磁性ナノ粒子の金属、磁性物質、または磁性合金が有機性表面安定剤と結合することができることである。ここで、上記有機性表面安定剤と金属、磁性物質、または磁性合金の結合は、金属、磁性物質、または磁性合金の前駆物質に、有機性表面安定剤が配位して錯体化合物形成して行われる。上記有機性表面安定剤は、両親媒性化合物の疎水性領域を安定化させる役割を果たす。
【００２７】
また、本発明に係る上記磁性ナノ複合体のさらに別の特徴は、上記疎水性領域はその構造内の一部分に一つ以上の疎水活性成分結合領域（Ｒ１）を有し、上記親水性領域は、その構造内の一部分に親水活性成分結合領域（Ｒ２）を有しうることである。上記親水活性成分結合領域及び疎水活性成分結合領域に、様々な活性成分を付着する場合、本発明に係る磁性ナノ複合体は癌診断知能型造影剤、癌診断及び治療を同時に遂行できる薬物伝達体、磁性を用いた細胞及びタンパク質分離用製剤等の様々な用途で使用でき、これに関する模式図を図１に示した。
【００２８】
上記のような本発明に係る上記磁性ナノ複合体は、図２で示されるように、その製造方法によって、一つ以上の磁性ナノ粒子が疎水性領域に分布されたコア及び親水性領域を含有するシェル（殻）を含む磁性ナノ複合体（以下、‘エマルジョン型磁性ナノ複合体’)と一つの磁性ナノ粒子が疎水性領域と結合されたコア及び親水性領域を含有するシェル（殻）を含む磁性ナノ複合体（以下、‘サスペンション型磁性ナノ複合体’)とを含む。
【００２９】
上記エマルジョン型及びサスペンション型磁性ナノ複合体の磁性ナノ粒子はいずれも有機性表面安定剤が金属、磁性物質、または磁性合金と配位結合されていることが好ましく、磁性ナノ粒子と両親媒性化合物の疎水性領域が物理的に結合されていることが好ましい。
【００３０】
また、上記エマルジョン型ナノ複合体の好ましい直径は、１ｎｍ〜５００ｎｍ、より好ましい直径は２５ｎｍ〜１００ｎｍであり、サスペンション型磁性ナノ複合体の好ましい直径は１ｎｍ〜５０ｎｍ、より好ましい直径は５ｎｍ〜３０ｎｍである。
【００３１】
また、本発明に係る磁性ナノ複合体は磁性ナノ粒子が、一つ以上の疎水性領域と一つ以上の親水性領域とを有する両親媒性化合物で覆われており、上記親水性領域に存在する一つ以上の親水活性成分結合領域が組織特異的結合成分と結合されていることが好ましい。
【００３２】
また、本発明に係る磁性ナノ複合体は磁性ナノ粒子が、一つ以上の疎水性領域と一つ以上の親水性領域とを有する両親媒性化合物で覆われており、上記親水性領域に存在する一つ以上の親水活性成分結合領域が組織特異的結合成分と結合され、上記疎水性領域に薬剤学的活性成分が結合または封入されていることが好ましい。
【００３３】
本発明に係る磁性ナノ複合体の“磁性ナノ粒子”とは磁性を有し、直径が１ｎｍ〜１０００ｎｍ、好ましくは２ｎｍ〜１００ｎｍの粒子であれば特に制限なく用いることができるが、好ましくは金属物質、磁性物質、または磁性合金である。
【００３４】
上記金属は特に制限されないが、Ｐｔ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｕ及びＡｕよりなる群から選択されるのが好ましい。
【００３５】
上記磁性物質は、特に制限されないが、Ｃｏ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｇｄ、Ｍｏ、ＭＭ’２Ｏ４、及びＭｘＯｙ（ここで、Ｍ及びＭ’はそれぞれ独立して、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｇｄ、またはＣｒを表し、０＜ｘ≦３、０＜ｙ≦５）よりなる群から選択されるのが好ましい。
【００３６】
また、上記磁性合金は特に制限されないが、ＣｏＣｕ、ＣｏＰｔ、ＦｅＰｔ、ＣｏＳｍ、ＮｉＦｅ及びＮｉＦｅＣｏよりなる群から選択されるのが好ましい。
【００３７】
また、上記金属、磁性物質、または磁性合金は有機性表面安定剤と結合されていることが好ましい。有機性表面安定剤は、本発明のナノ粒子の状態とサイズを安定化させることができる有機機能性分子を意味し、代表的な例は界面活性剤が含まれる。
【００３８】
上記界面活性剤は、アルキルトリメチルアンモニウムハライドを含むカチオン界面活性剤；オレイン酸、ラウリン酸、またはドデカン酸のような飽和または不飽和脂肪酸、トリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）、トリオクチルホスフィン（ＴＯＰ）、またはトリブチルホスフィンのようなトリアルキルホスフィンまたはトリアルキルホスフィンオキシド、ドデシルアミン、オレイックアミン（oleicamine）、トリオクチルアミン、またはオクチルアミンのようなアルキルアミン、またはアルキルチオールを含む中性界面活性剤；及びナトリウムアルキルスルフェート、またはナトリウムアルキルホスフェートを含むアニオン界面活性剤が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
【００３９】
特に、ナノ粒子の安定化及び均一な粒径分布を考慮する時、飽和または不飽和脂肪酸及び／又はアルキルアミンを使用することが好ましい。
【００４０】
本発明に係る両親媒性化合物は、一つ以上の疎水性領域（Ｐ１）と一つ以上の親水性領域（Ｐ２）とを有する化合物であれば、特に制限されない。上記両親媒性化合物において、疎水性領域（Ｐ１）及び親水性領域（Ｐ２）は多数個連結され付着することができる。即ち、本発明に係る両親媒性化合物はＰ１−Ｐ２、Ｐ１−Ｐ２−Ｐ１、Ｐ２−Ｐ１−Ｐ２、Ｐ１−（Ｐ２−Ｐ１）ｎ−Ｐ２、Ｐ１−（Ｐ２−Ｐ１）ｎ−Ｐ１、Ｐ２−（Ｐ１−Ｐ２）ｎ−Ｐ１、またはＰ２−（Ｐ１−Ｐ２）ｎ−Ｐ２など様々な形態を有することができる。勿論、構造内に疎水性領域または親水性領域が繰返して存在することもできる。
【００４１】
本発明に係る両親媒性化合物の疎水性領域は、化合物または高分子で構成され得る。例えば、生体親和的な飽和または不飽和脂肪酸、または疎水性高分子などが用いられる。
【００４２】
上記飽和脂肪酸は、特に制限されないが、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸（ドデカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、エイコサン酸、及びドコサン酸よりなる群から選択される一つ以上が用いられる。不飽和脂肪酸も特に制限されないが、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、及びエルカ酸よりなる群から選択される一つ以上が挙げられる。
【００４３】
本発明に係る両親媒性化合物に使用可能な飽和または不飽和脂肪酸を下記表１及び表２に示した。
【００４４】
【表１】
2009531296.tif 000003
【００４５】
【表２】
2009531296.tif 000004
【００４６】
一方、本発明に係る両親媒性化合物に使用可能な上記疎水性高分子は、特に制限されないが、ポリホスファゼン、ポリラクチド、ポリラクチド−コ−グリコリド、ポリカプロラクトン、ポリアンハイドライド、ポリリンゴ酸またはその誘導体、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリヒドロキシブチレート、ポリカーボネート、ポリオルトエステル、疎水性ポリアミノ酸及び疎水性ビニル系高分子よりなる群から選択される一つ以上が好ましい。また、上記疎水性高分子は重量平均分子量が１００〜１００，０００が好ましい。重量平均分子量が１００未満のとき生体毒性を表し、１００，０００を超えると応用が難しい。
【００４７】
本発明に係る両親媒性化合物の親水性領域は化合物または高分子で構成される。例えば、生体親和性高分子などが用いられる。
【００４８】
上記生体親和性高分子は、特に制限されないが、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、親水性ポリアミノ酸及び親水性ビニル系高分子よりなる群から選択された一つ以上を含むことが好ましく、ポリエチレングリコールがさらに好ましい。また、上記生分解性高分子は重量平均分子量が１００〜１００，０００が好ましい。重量平均分子量が１００未満のとき生体毒性を表し、１００，０００を超えると応用が難しい。
【００４９】
特に、上記ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が好ましく、特にカルボキシルまたはアミンで置換されたポリエチレングリコールがより好ましい。
【００５０】
また、上記疎水性領域（Ｐ１）は、その構造内の一部分、好ましくは末端に一つ以上の疎水活性成分結合領域（Ｒ１）を有することが好ましく、上記親水性領域（Ｐ２）はその構造内の一部分、好ましくは末端に親水活性成分結合領域（Ｒ２）を有することが好ましい。
【００５１】
上記親水活性成分結合領域（Ｒ２）は、例えば、腫瘍マーカーと特異的に結合しうる物質と結合する場合、本発明に係る磁性ナノ複合体は癌診断知能型造影剤（ガン診断用インテリジェント型造影剤）として使用することができる。
【００５２】
また、疎水活性成分結合領域（Ｒ１）または疎水性領域（Ｐ１）に薬物を重合するか、封入して、同時に親水活性成分結合領域（Ｒ２)に腫瘍マーカーと特異的に結合しうる物質を結合する場合、本発明に係る磁性ナノ複合体は癌診断及び治療を同時に遂行することができる薬物伝達体（ドラッグデリバリーシステム）として使用することができる。
【００５３】
一方、親水活性成分結合領域（Ｒ２）に、機能性細胞、幹細胞または癌細胞などの表面抗原に対する特異な抗体、またはタンパク質を結合する場合、本発明に係る磁性ナノ複合体は磁性を用いた細胞及びタンパク質分離用として使用することができる。
【００５４】
また、本発明に係る磁性ナノ複合体の上記親水性領域（Ｐ２）は、その構造内の一部分、好ましくは末端に親水活性成分結合領域（Ｒ２）を有し、上記親水活性成分結合領域（Ｒ２）は組織特異的結合成分と結合されていることを特徴とする。
【００５５】
上記親水活性成分は生体活性成分、高分子、及び無機担体よりなる群から選択することができる。本発明の明細書で“生体活性成分”とは、下記の“組織特異的結合成分”または“薬剤学的活性成分”と同じ意味であり、これらは相互交換的に使用できる。
【００５６】
上記親水活性成分結合領域（Ｒ２）は、結合される親水活性成分、即ち、組織特異的結合成分によって任意に変化され得、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＰＯ３Ｈ、−ＰＯ４Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＯＨ、−ＮＲ４＋Ｘ−、−スルホネート、−ニトレート、−ホスホネート、−スクシンイミジル基、−マレイミド基、及び-アルキル基よりなる群から選択される一つ以上が官能基を含むことが好ましいが、これに制限されない。
【００５７】
上記組織特異的結合成分は抗原、抗体、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ハプテン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン(neutravidin)、プロテインＡ、プロテインＧ、レクチン、セレクチン、放射線同位元素で標識された成分、または腫瘍マーカーと特異的に結合しうる物質を含むが、これに制限されない。
【００５８】
本発明の上記ナノ複合体は腫瘍と関連した様々な疾患、例えば、胃癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、肝癌、気管支癌、鼻咽腔癌、喉頭癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸癌及び子宮頸癌を診断及び／又は治療に利用できる。
【００５９】
このような腫瘍細胞は、正常細胞では殆どまたは全く生産されない特定物質を発現及び／又は分泌する。これらは一般的に“腫瘍マーカー（tumor marker）”呼ばれる。そのような腫瘍マーカーと特異的に結合しうる物質を上記水溶性ナノ粒子の活性成分結合領域に結合して作ったナノ複合体は、腫瘍診断に有用に利用できる。当業界には、様々な腫瘍マーカーだけでなく、これらと特異的に結合しうる物質が公知されている。
【００６０】
また、本発明で腫瘍マーカーは、作用機序によってリガンド、抗原、受容体、及びこれらをコードする核酸に分類される。
【００６１】
【表３】
2009531296.tif 000005
【００６２】
腫瘍マーカーがリガンドの場合には、上記リガンドと特異的に結合しうる物質を本発明に係るナノ複合体の活性成分として導入できるが、上記リガンドと特異的に結合しうる受容体または抗体が好適である。本発明で利用可能なリガンド及びこれと特異的に結合しうる受容体の例には、シナプトタグミンのＣ２とホスファチジルセリン、アネキシンＶとホスファチジルセリン、インテグリンとその受容体、ＶＥＧＦ（Vascular Endothelial Growth Factor）とその受容体、アンジオポエチンとＴｉｅ２受容体、ソマトスタチンとその受容体、血管腸ペプチド（vasointestinal peptide）とその受容体などが挙げられるが、これに制限されるものではない。
【００６３】
腫瘍マーカーが抗原の場合、上記抗原と特異的に結合しうる物質を本発明に係るナノ複合体の活性成分として導入できるが、上記抗原と特異的に結合しうる抗体が好適である。本発明で利用可能な抗原及びこれと特異的に結合する抗体の例は、癌性胎児性抗原（carcinoembryonic antigen−大腸癌標識抗原）とハーセプチン(Genentech, USA)、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原（HER2/neuantigen−乳癌標識抗原）とハーセプチン、前立腺特異抗原（prostate-specific membrane antigen−前立腺癌標識抗原）とリツキサン（Rituxan）（IDCE/Genentech, USA）などがある。
【００６４】
腫瘍マーカーが“受容体”の代表的な例は、卵巣癌細胞で発現される葉酸受容体がある。上記受容体と特異的に結合しうる物質（葉酸受容体の場合には葉酸）が本発明に係るナノ複合体の活性成分として導入できるが、上記受容体と特異的に結合しうるリガンドまたは抗体が好適である。
【００６５】
前述するように、抗体は、本発明において特に好ましい活性成分である。抗体は、特定対象とのみ選択的で安定的に結合する性質を有している。抗体のＦｃ領域にあるリジンの−ＮＨ２、システインの−ＳＨ、アスパラギン酸及びグルタミン酸の−ＣＯＯＨは、水溶性ナノ複合体の活性成分結合領域官能基と結合するのに有用に利用できるからである。
【００６６】
このような抗体は商業的に入手するか、当業界に公知された方法によって製造することができる。一般的に哺乳動物（例、マウス、ラット、ヤギ、ウサギ、馬または羊）を適切な量の抗原で１回以上免疫化させる。一定時間後、力価が適正水準に至った時、哺乳動物の血清から回収する。回収した抗体は、所望の場合、公知された工程を利用して精製し、使用時まで冷凍緩衝溶液に保管する。このような方法の詳細な事項は当業界によく知られている。
【００６７】
一方、上記“核酸”は、前述したリガンド、抗原、受容体またはその一部分をコードするＲＮＡ及びＤＮＡを含む。核酸は当業界に知らされた通りに相補的な配列間に塩基対を形成する特徴を有しているため、特定塩基配列を持つ核酸は、上記塩基配列に相補的な塩基配列を持つ核酸を利用して検出することができる。上記酵素、リガンド、抗原、受容体をコードする核酸と相補的な塩基配列を持つ核酸を、本発明に係るナノ複合体の活性成分として用いられる。
【００６８】
また、核酸は、５’−及び３’−末端に−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＯＯＨなどの官能基があるので、活性成分結合領域の官能基と結合するのに有用に利用できる。
【００６９】
このような核酸は、当業界に公知された標準方法により、例えば、自動ＤＮＡ合成装置（例、バイオサーチ、アプライドバイオシステムズなどから購入できる）を使用して合成することができる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは文献（Stein et al. Nucl. Acids Res. 1988, vol.16, p.3209）に記述された方法で合成することができる。メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは調節されたガラス重合体担体を使用して製造することができる（Sarin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1988, vol.85, p.7448）。
【００７０】
一方、本発明に係る磁性ナノ複合体の上記疎水性領域（Ｐ１）は、その構造内の一部分、好ましくは末端に一つ以上の疎水活性成分結合領域（Ｒ１）を有することが好ましい。上記疎水活性成分結合領域（Ｒ１）または疎水性領域（Ｐ１）に疎水活性成分を結合するか、封入できる。
【００７１】
上記疎水活性成分は、生体活性成分、高分子、及び無機担体よりなる群から選択されることが好ましい。例えば、疎水活性成分の薬物を結合又は封入し、同時に親水活性成分結合領域（Ｒ２）に組織特異的結合成分を結合する場合、本発明に係る磁性ナノ複合体は癌診断及び治療を同時に遂行できる薬物伝達体として用いられる。
【００７２】
上記疎水性領域（Ｐ１）の疎水活性成分結合領域（Ｒ１）は、結合される疎水活性成分の種類によって任意に変化され得、代表的に、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＰＯ３Ｈ、−ＰＯ４Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＯＨ、−スクシンイミジル基、−マレイミド基、及び−アルキル基よりなる群から選択された一つ以上の官能基を含むことが好ましいが、これに制限されない。
【００７３】
上記疎水活性成分は、薬剤学的活性成分であれば特に制限されないが、抗癌剤、抗生剤、ホルモン、ホルモン拮抗剤、インターロイキン、インターフェロン、成長因子、腫瘍壊死因子、エンドトキシン、リンホトキシン、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子、プロテアーゼ阻害剤、アルキルホスホコリン、放射線同位元素で標識された成分、界面活性剤、心血管系薬物、胃腸管系薬物及び神経系薬物よりなる群から選択された一つ以上が好ましい。
【００７４】
一方、上記疎水性領域に存在する疎水活性成分、特に抗癌剤は物理的封入、化学的封入、またはこの二つの組み合わせも可能である。エマルジョン方法とサスペンション方法によって磁性ナノ複合体が製造される中に、両親媒性高分子の疎水活性成分と抗癌剤の物理的な結合を介して薬物の封入が達成され得る。また、磁性ナノ複合体を構成する両親媒性高分子の疎水活性成分結合領域と化学的結合が可能な抗癌剤の場合、適当な架橋剤を用いて両親媒性高分子の疎水活性成分結合領域と抗癌剤の結合が可能になり、磁性ナノ複合体に薬物の封入が達成され得る。
【００７５】
本発明に係る治療方法で利用できる抗癌剤には、これに制限されないが、エピルビシン、ドセタキセル、ゲムシタビン、パクリタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、タクソール、プロカルバジン、シクロホスファミド、ジアクチノマイシン、ダウノルビシン、エトポシド、タモキシフェン、ドキソルビシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、トランスプラチナ（transplatinum）、ビンブラスチン（vinblastin）及びメトトレキサート（methotrexate）などがある。
【００７６】
本発明に係る磁性ナノ複合体において、両親媒性化合物は、疎水性領域−親水性領域、または親水性領域−疎水性領域−親水性領域からなることが好ましい。また、親水性及び疎水性領域に、それぞれの活性成分結合領域が含まれる場合、疎水活性成分結合領域−疎水性領域−親水性領域−親水活性成分結合領域、または親水活性成分結合領域−親水性領域−疎水性領域（−疎水活性成分結合領域）−親水性領域−親水活性成分結合領域からなっていてもよい。特に、疎水活性成分結合領域−疎水性領域−ＮＨ２−親水性領域−親水活性成分結合領域のように上記親水性領域と疎水性領域に−ＮＨ２−のような官能基があることが好ましい。上記親水性領域と疎水性領域に存在する−ＮＨ２−基は、両親媒性化合物が磁性ナノ粒子の表面に付加される場合、より安定な構造を有することができる。
【００７７】
また、本発明に係る磁性ナノ複合体において、両親媒性化合物の最も好ましい例は、カルボキシルポリエチレングリコール−ポリラクチド−コ−グリコリド共重合体または両末端がカルボキシル基で置換されたポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）共重合体である。
【００７８】
また、本発明は、Ａ）ナノ粒子を溶媒で合成する工程；及び Ｂ）疎水性領域と親水性領域を有する両親媒性化合物を上記ナノ粒子表面に付加して両親媒性化合物とナノ粒子を結合させる工程;を含む磁性ナノ複合体の製造方法に関するものである。
【００７９】
上記本発明に係る磁性ナノ複合体の製造方法は、任意に、Ｃ）上記親水性領域に存在する親水活性成分結合領域と腫瘍マーカーと特異的に結合しうる物質を結合させる工程；及び Ｄ）疎水性領域に薬剤学的活性成分を結合または封入する工程；を、さらに含むことができる。
【００８０】
以下、本発明に係る磁性ナノ複合体の製造方法の各工程をさらに具体的に説明する。
【００８１】
上記ナノ粒子を溶媒で合成する工程Ａ）は、ナノ粒子前駆体と表面安定剤を反応させる工程であって、
ａ）溶媒の存在下に、ナノ粒子前駆体と有機性表面安定剤とを反応させる工程；及び
ｂ）上記反応物を熱分解する工程を含むことが好ましい。
【００８２】
上記工程ａ）は、有機性表面安定剤が含まれた溶媒に、ナノ粒子前駆体を投入してナノ粒子表面に有機性表面安定剤を配位させる工程である。
【００８３】
上記工程ａ）のナノ粒子は、金属、磁性物質、または磁性合金を使用することが好ましく、有機性表面安定剤はアルキルトリメチルアンモニウムハライド、飽和または不飽和脂肪酸、トリアルキルホスフィンオキシド、アルキルアミン、アルキルチオール、ナトリウムアルキルスルフェート、及びナトリウムアルキルホスフェートよりなる群から選択される。上記金属、磁性物質、磁性合金及び有機性表面安定剤の具体的な種類は前述の通りである。
【００８４】
上記工程ａ）のナノ粒子前駆体は、金属と−ＣＯ、−ＮＯ、−Ｃ５Ｈ５、アルコキシドまたはその他の公知のリガンドが結合された金属化合物が挙げられる。具体的に、鉄ペンタカルボニル（Ｆｅ（ＣＯ）５）、フェロセン、またはマンガンカルボニル（Ｍｎ２（ＣＯ）１０）などの金属カルボニル系の化合物；または鉄アセチルアセトネート（Ｆｅ（ａｃａｃ）３）などの金属アセチルアセトネート系の化合物等の様々な有機金属化合物が挙げられる。また、ナノ粒子前駆体は金属とＣｌ−、またはＮＯ３−などの公知されたアニオンと結合された金属イオンを含む金属塩が挙げられる。具体的に、トリクロロ化鉄（ＦｅＣｌ３）、ジクロロ化鉄（ＦｅＣｌ２）、または硝酸鉄（Ｆｅ（ＮＯ３）３）などが挙げられる。また、合金ナノ粒子と複合ナノ粒子合成では、前述した２種以上の金属の前駆体の混合物を用いることができる。
【００８５】
上記工程ａ）で使用可能な溶媒は、ナノ粒子表面に有機性表面安定剤が配位錯体化合物の熱分解温度に近接する高沸点を有することが好ましくい。例えば、エーテル系化合物、ヘテロ環化合物、芳香族化合物、スルホキシド化合物、アミド化合物、アルコール、炭化水素及び水で構成される群から選択されるものを使用することができる。
【００８６】
具体的に、上記溶媒は、オクチルエーテル、ブチルエーテル、ヘキシルエーテル、またはデシルエーテルのようなエーテル系化合物；ピリジン、またはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）のようなヘテロ環化合物；トルエン、キシレン、メシチレン、またはベンゼンなどの芳香族化合物；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のようなスルホキシド化合物；ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）のようなアミド化合物；オクチルアルコール、またはデカノールのようなアルコール；ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカン、ドデカン、テトラデカン、またはヘキサデカンのような炭化水素、または水が用いられる。
【００８７】
上記工程ａ）の反応条件は特に制限されなく、金属前駆体及び表面安定剤の種類によって適宜に調節することができる。反応は、室温またはその以下の温度でも発生される。通例的には、約３０〜２００℃の範囲で加熱及び保持することが好ましい。
【００８８】
上記工程ｂ）は、ナノ粒子表面に有機性表面安定剤が配位錯体化合物を熱分解してナノ粒子を成長させる工程である。この時、反応条件によって均一なサイズ及び形状の金属ナノ粒子を形成することができ、熱分解温度も金属前駆体及び表面安定剤の種類によって適宜に調節することができる。好ましくは、約５０〜５００℃で反応させることが好適である。上記工程ｂ）で製造されたナノ粒子は公知の手段を通じて分離及び精製することができる。
【００８９】
本発明に係る磁性ナノ複合体の製造方法において、工程Ｂ）は、疎水性領域と親水性領域とを有する両親媒性化合物を上記ナノ粒子表面に付加して両親媒性化合物とナノ粒子を結合する工程である。
【００９０】
上記磁性ナノ粒子の表面に両親媒性化合物を付加する方法は、前述するように、エマルジョンによる方法とサスペンションによる方法とに区分され、これに関する模式図を図２に示した。
【００９１】
さらに具体的に、上記付加工程Ｂ）は、
ａ）ナノ粒子を有機溶媒に溶解して、油相を製造する工程；
ｂ）両親媒性化合物を水性溶媒に溶解して、水相を製造する工程；
ｃ）上記油相と水相とを混合して、エマルジョンを形成する工程；及び
ｄ）上記エマルジョンから油相を分離する工程；を含むことが好ましく、上記工程ａ）〜ｄ）を含む方法によって、本発明に係るエマルジョン型磁性ナノ複合体を製造することができる。
【００９２】
また、上記付加工程Ｂ）は、
ｅ）上記ナノ粒子を両親媒性化合物が溶解された溶液で分散して、懸濁液（サスペンション）を製造する工程；及び
ｆ）上記懸濁液（サスペンション）から溶媒を分離する工程；を含むことが好ましく、上記工程ｅ）及びｆ）を含む方法によって、本発明に係るサスペンス型磁性ナノ複合体を製造することができる。
【００９３】
上記付加工程Ｂ）において、上記疎水性領域は、飽和または不飽和脂肪酸、または疎水性高分子が好ましく、上記親水性領域は、生分解性高分子が好ましく、これに対する具体的な種類は前述した通りである。
【００９４】
一方、付加工程Ｂ）において、両親媒性化合物は、当業界に公知された方法によって製造することができる。例えば、親水性基を構成するジアミンポリエチレングリコール（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＮＨ２）と疎水性基を構成する生分解性高分子の一種である、ポリラクチド−コ−グリコリドを重合させて製造することができる。
【００９５】
また、両親媒性高分子のアミン基で置換された親水活性成分結合領域に、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカボネートを用いて、親水活性成分結合領域をスクシンイミジル基で置換が可能である。また、親水性基を構成するカルボキシル／アミンポリエチレングリコール（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）と疎水性基を構成する生分解性高分子の一種である、ポリラクチド−コ−グリコリドを重合して両親媒性高分子の親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換することができる。また、生分解性両親媒性高分子はラクチドを単量体として用いて開環重合によって製造することができる。ラクチドの重合は、カルボキシル／アミンポリエチレングリコールのアミン基によって開始される。触媒としてはオクタン酸第１スズ（stannous octoate）が用いられる 。重合は窒素大気下で及び１００〜１８０℃の条件で遂行される。この時、初期クロイニシエーターであるカルボキシル／アミンポリエチレングリコールの量と分子量を調節して、共重合体の分子量を調節することができる。
【００９６】
また、親水性領域に存在する親水活性成分結合領域と腫瘍マーカーと特異的に結合しうる物質を結合させる工程Ｃ）は、
ｇ）架橋剤を用いて親水性領域の一部に親水活性成分結合領域を提供する工程；及び
ｈ）上記親水活性成分結合領域と腫瘍マーカーと特異的に結合しうる物質を結合させる工程；を含むことが好ましい。
【００９７】
上記工程ｇ）において、使われる架橋剤は特に制限されないが、１，４−ジイソチオシアナートベンゼン、１，４−フェニレンジイソシアネート、１，６−ジイソシアナートヘキサン、４−（４−マレイミドフェニル）酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、ホスゲン、４−（マレイミド)フェニルイソシアネート、１，６−ヘキサンジアミン、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１，１’−カルボニルジイミダゾール、３−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、エチレンジアミン、ビス（４−ニトロフェニル)カルボネート、スクシニルクロリド、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボイミドヒドロクロリド、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボネート、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ)プロピオネート、及び無水コハク酸よりなる群から選択された一つ以上を含むことが好ましい。上記架橋剤は、親水性領域の一部と反応し、前述した−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＰＯ３Ｈ、−ＰＯ４Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＯＨ、−ＮＲ４＋Ｘ−、−スルホネート、−ニトレート、−ホスホネート、−スクシンイミジル基、−マレイミド基、または−アルキル基のような親水活性成分結合領域を提供する。
【００９８】
上記工程ｈ）において、上記親水性活性成分結合領域の官能基は、活性成分、即ち、組織特異的結合成分の種類及びその一般式によって変えることができる。
【００９９】
本発明に係るナノ複合体の製造方法において、疎水性領域に薬剤学的活性成分を結合又は封入する工程Ｄ）は、薬剤学的活性成分を疎水性領域に物理的に封入する工程及び薬剤学的活性成分を疎水性領域と化学的に結合させる工程とに区分される。
【０１００】
上記化学的結合工程は、
ｉ）架橋剤を用いて、疎水性領域の一部に疎水活性成分結合領域を提供する工程；及び
ｊ）上記疎水活性成分結合領域と薬剤学的活性成分を結合させる工程；を含むことが好ましい。
【０１０１】
上記工程ｉ）で使用可能な架橋剤としては、前述した工程ｇ）の架橋剤を制限することなく用いることができる。上記架橋剤は、疎水性領域の一部と反応して前述した−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＰＯ３Ｈ、−ＰＯ４Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＯＨ、−スクシンイミジル基、−マレイミド基、または−アルキル基のような疎水活性成分結合領域を提供する。
【０１０２】
一方、物理的封入工程は、両親媒性化合物とナノ粒子を結合する上記工程Ｂ）で、薬剤学的活性成分をナノ粒子と共に溶解して封入することができる。より具体的に、エマルジョン型ナノ複合体に、薬剤学的活性成分を封入する場合、前述したナノ粒子を有機溶媒に溶解して、油相を製造する工程ａ）で、薬剤学的活性成分をナノ粒子と共に有機溶媒に溶解し、水相と混合してエマルジョンを形成した後、油相を分離すれば、疎水性領域に薬剤学的活性成分を物理的に封入することができる。また、サスペンション型ナノ複合体に薬剤学的活性成分を封入する場合、前述したナノ粒子を両親媒性化合物が溶解された溶液で分散させ、懸濁液（サスペンション）を製造する工程ｅ）で、薬剤学的活性成分をナノ粒子と共に分散させ、懸濁液（サスペンション）を製造した後、溶媒を分離すれば、疎水性領域に薬剤学的活性成分を物理的に封入することができる。
【０１０３】
上記工程ｈ）及び工程ｉ）の親水または疎水活性成分結合領域と親水または疎水活性成分の結合は、各活性成分の種類及びその一般式によって変わる。その具体例を下記表４に示した。
【０１０４】
【表４】
2009531296.tif 000006
【０１０５】
上記工程Ａ）、Ｂ）、Ｃ）及びＤ）により生成された水溶性ナノ複合体は、当業界に公知された方法を利用して分離することができる。一般的に水溶性ナノ複合体は、沈澱物として生成されるため、遠心分離または濾過を利用して分離することが好ましい。
【０１０６】
また、 本発明は本発明に係る両親媒性化合物を用いた磁性ナノ複合体及び薬剤学的に許容される担体を含む造影剤組成物；組織特異的結合成分と上記磁性ナノ複合体の結合物及び薬剤学的に許容される担体を含む疾患の診断用組成物；及び組織特異的結合成分及び薬剤学的活性成分と上記磁性ナノ複合体の結合物及び薬剤学的に許容される担体を含む同時診断及び治療用薬剤学的組成物に関するものである。
【０１０７】
本発明に係る上記組成物に使用される担体は、医薬分野で通常使用される担体及びビヒクルを含む。具体的に、イオン交換、アルミナ、アルミニウムステアレート、レシチン、血清タンパク質（例、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例、種々のリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、カリウムソルベート、飽和植物性脂肪酸の部分的なグリセリド混合物）、水、塩または電解質（例、プロタミンスルフェート、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム及び亜鉛塩）、コロイド状シリカ、マグネシウムトリケイ酸塩、ポリビニルピロリドン、セルロース系基質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレングリコールまたはラモリンなどを含むが、これに制限されない。また、本発明の組成物は上記成分の以外に潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、または保存剤などをさらに含んでいてもよい。
【０１０８】
一形態において、本発明に係る組成物は、非経口投与のための水溶性溶液で製造できる。好ましくは、ハンクス溶液、リンガー溶液または物理的に緩衝された食塩水のような緩衝溶液を使用することができる。水溶性注入懸濁液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランのように懸濁液の粘度を増加させる基質を添加することができる。
【０１０９】
本発明の組成物の他の好ましい形態は、水性または油性懸濁液の滅菌注射用製剤の形態である。このような懸濁液は好適な分散剤または湿潤剤（例えば、ツイーン８０)及び懸濁化剤を使用して、本分野に公知された技術によって製剤化することができる。また滅菌注射用製剤は、無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液)であってもよい。使用可能なビヒクル及び溶媒は、マンニトール、水、リンガー溶液及び等張性塩化ナトリウム溶液を含む。また、滅菌非揮発性油が通例的に溶媒または懸濁化媒体として使用される。このような目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含み、刺激性の少ない非揮発性油は、そのいずれも使用できる。
【０１１０】
また、 本発明は本発明に係る造影剤組成物を、生体または試料に投与する工程；及び 上記生体または試料から磁性ナノ複合体によって発散される信号を感知して、映像を収得する工程；を含む造影剤組成物の利用方法に関するものである。
【０１１１】
また、 本発明は本発明に係る上記診断用組成物を生体または試料に投与する工程；及び 上記生体または試料から磁性ナノ複合体によって発散される信号を感知して、映像を収得する工程；を含む疾患の診断方法に関するものである。
【０１１２】
また、 本発明は本発明に係る上記薬剤学的組成物を生体または試料に投与する工程；及び 上記生体または試料から磁性ナノ複合体によって発散される信号を感知して、映像を収得する工程；を含む疾患の同時診断及び治療方法に関するものである。
【０１１３】
上記で使用された用語“試料”とは、診断しようとする対象から分離した組織または細胞を意味する。また、上記造影剤組成物を生体または試料に注入する工程は、医薬分野から通常的に利用される経路を通じて投与でき、非経口投与が好ましく、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または局部経路を通じて投与できる。
【０１１４】
上記利用方法において、磁性ナノ複合体によって発散される信号は、磁場を利用する各種装備によって感知することができ、特に磁気共鳴映像装置（ＭＲＩ）が好ましい。
【０１１５】
磁気共鳴映像装置は強力な磁場内に生体を入れ、特定周波数の電波を照射して生体組織にある水素などの原子核がエネルギーを吸収して、エネルギーが高い状態にした後、上記電波を中断し、上記水素などの原子核エネルギーが放出されるようにし、このエネルギーを信号に変換し、コンピュータで処理して映像化する装置である。磁気または電波は脳によって妨害されないので、固い骨周囲または脳や骨髄の腫瘍に対して、縦断、横断、任意の角度で鮮明な立体的な断層像を得ることができる。特に上記磁気共鳴映像装置はＴ２スピン−スピン緩和磁気共鳴映像装置が好ましい。
【０１１６】
本発明は磁性ナノ粒子が一つ以上の疎水性領域と一つ以上の親水性領域とを有する両親媒性化合物で覆われており、上記親水性領域に存在する一つ以上の親水活性成分結合領域が組織特異的結合成分と結合されていることを特徴とする磁性ナノ複合体と標的物質を結合し、上記磁性ナノ複合体と標的物質の結合物に磁場を加えて、標的物質を分離する方法に関するものである。
【０１１７】
本発明に係る分離方法において、標的物質の好ましい例は、生体分子を意味している。より具体的に細胞、タンパク質、抗原、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはウイルスなどを含むが、これらに制限されない。
【０１１８】
本発明によって形成された磁性ナノ複合体は生体分子の分離、診断、治療などのナノプローブ（probe）及び薬物または遺伝子伝達体（delivery vehicle）等に用いることができる。
【０１１９】
磁性ナノ複合体を用いた生体診断の一例は、分子磁気共鳴映像診断または磁性緩和センサーが挙げられる。磁性ナノ複合体は、そのサイズが大きくなるにつれてさらに大きなＴ２造影効果を示す。このような性質を利用すれば生体分子を検出するセンサーとして使用できる。即ち、特定の生体分子が磁性ナノ複合体の凝集を誘導し、それにより、Ｔ２磁気共鳴映像効果が増大する。このような差を利用して生体分子を検出する。
【０１２０】
また、本発明に係る磁性ナノ複合体は巨大磁気−抵抗バイオセンサー(ＧＭＲsensor）の診断物質になりうる。磁性ナノ複合体は、既存のマイクロメートル（１０−６ｍ）サイズのビーズ（ 米国特許６，４５２，７６３Ｂ１； 米国特許６，９４０，２７７Ｂ２； 米国特許６，９４４，９３９Ｂ２； 米国公開特許第 ２００３／０１３３２３２Ａ１）より優れた磁気的特徴、水溶液でのコロイド安定性、低い非選択性結合を示すので、既存巨大磁気抵抗バイオセンサーの検出限界を大きく改善する可能性を持っている。
【０１２１】
また、本発明に係る磁性ナノ複合体は、磁性マイクロ流体センサーを用いた分離及び検出、薬物または遺伝子の伝達、磁性高温治療法に用いることができる。
【０１２２】
一方、本発明に係る磁性ナノ複合体は、他の診断プローブと結合され、二重または多重診断プローブとして用いることができる。例えば、水溶性磁性ナノ複合体にＴ１磁気共鳴映像診断プローブを結合すれば、Ｔ２磁気共鳴映像及びＴ１磁気共鳴映像診断を同時に遂行することができる。光学診断プローブを結合すれば、磁気共鳴映像と光学イメージングを同時に遂行でき、ＣＴ診断プローブを結合すれば、磁気共鳴映像とＣＴ診断を同時に遂行することができる。また、放射線同位元素と結合すれば、磁気共鳴映像とＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ診断を同時に酢効できる。
【０１２３】
上記Ｔ１磁気共鳴映像診断プローブは、Ｇｄ化合物、Ｍｎ化合物などを含み、光学診断プローブは有機蛍光染料、量子ドット、あるいは染料標識（dye labelled）無機担体（例、ＳｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３)を含み、ＣＴ診断プローブはＩ（ヨウ素）化合物、金ナノ粒子を含み、放射線同位元素はＩｎ、Ｔｃ、Ｆなどを含む。
【発明の効果】
【０１２４】
本発明に係る疎水性領域と親水性領域とを有する両親媒性化合物で覆われている磁性ナノ複合体は、高感度磁気共鳴映像造影剤として使用でき、親水性領域に腫瘍マーカーと特異的に結合しうる物質を結合して癌診断知能型造影剤として使用でき、疎水性領域に薬物を重合または封入すると同時に、親水性領域に腫瘍マーカーと特異的に結合しうる物質を結合して癌診断及び治療のための薬物伝達体として使用することができ、機能性細胞、幹細胞または癌細胞などの表面抗原に対する特異な抗体またはタンパク質を結合して磁性を用いた細胞及びタンパク質分離用製剤として使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１２５】
以下、実施例を通して本発明をより具体的に説明する。しかし下記実施例は本発明を例示するためのものであり、いかなる意味にも本発明を制限しない。
【０１２６】
＜製造例１＞
飽和脂肪酸を用いる高感度磁性ナノ粒子の製造
６ｎｍのマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）は、ベンジルエーテル溶媒でドデカン酸（０．６モル）とドデシルアミン（０．６モル）及び鉄トリアセチルアセトネート（Aldrich）を２９０℃で、３０分間、熱分解化学反応して合成した。１２ｎｍ酸化鉄ナノ粒子は、ドデカン酸（０．２モル）、ドデシルアミン（０．１モル）、上記６ｎｍ酸化鉄ナノ粒子（１０ｍｇ／ｍＬ）及び鉄トリアセチルアセトネートを含むベンジルエーテル溶液を、２９０℃で、３０分間加熱して製造した。マンガンフェライト（ＭｎＦｅ２Ｏ４）は、上記反応にマンガンＩＩセチルアセトネートを添加して製造した。製造されたマグネタイト及びマンガンフェライトの透過電子顕微鏡写真をそれぞれ図４の (ａ)及び(ｂ)に示した。上記マグネタイト及びマンガンフェライトの磁気的特性はＶＳＭを用いて測定しており、これをそれぞれ点線及び実線で表示して図４の (ｃ)に示した。
【０１２７】
＜製造例２＞
不飽和脂肪酸を用いる高感度磁性ナノ粒子の製造
６ｎｍのマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）は、ベンジルエーテル溶媒でオレイン酸（０．６モル）とオレイルアミン（０．６モル）及び鉄トリアセチルアセトネート（Aldrich）を２９０℃で、３０分間熱分解化学反応して合成した。１２ｎｍ酸化鉄ナノ粒子は、オレイン酸（０．２モル）、オレイルアミン（０．１モル）、上記６ｎｍ酸化鉄ナノ粒子（１０ｍｇ／ｍＬ）及び鉄トリアセチルアセトネートを含むベンジルエーテル溶液を２９０℃で、３０分間加熱して製造した。マンガンフェライト（ＭｎＦｅ２Ｏ４）は、上記反応にマンガンＩＩアセチルアセトネートを添加して製造した。製造されたマグネタイト及びマンガンフェライトの透過電子顕微鏡写真を、それぞれ図５の（ａ）及び（ｂ）に示した。上記マグネタイト及びマンガンフェライトの磁気的特性はＶＳＭを用いて測定しており、これをそれぞれ点線及び実線で表示して図５の（ｃ）に示した。
【０１２８】
＜製造例３＞
生分解性両親媒性高分子モノメトキシポリエチレングリコール−ポリラクチド−コ−グリコリドの重合
２ｇのモノメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ、分子量５０００）を減圧下で水分を除去した。触媒として、２．０ｍｇのオクタン酸第１スズを水分が除去されたトルエンに加えた後、１００℃で２０〜３０分間減圧し、反応物に１．１５ｇのＤ，Ｌ−ラクチドと０．９３ｇのグリコリドを加えて、１４０℃で１２時間重合した。生成されたブロック共重合体を、５ｍＬのクロロホルムを加えて溶かした後、過量のジエチルエーテルに少量ずつ滴下し、生成された沈澱物を濾過して、ジエチルエーテルで洗浄した後、５０℃で、一日間、減圧、乾燥してモノメトキシポリエチレングリコール−ポリラクチド−コ−グリコリドのブロック共重合体を得た（収率７２．５％、損失量含む）。
【０１２９】
上記の方法と同様にして、下記表５に示された各成分を用いて、様々な二重ブロック共重合体を製造した。製造された二重ブロック共重合体等の製造量及び収率は以下の通りである。
【０１３０】
【表５】
2009531296.tif 000007
【０１３１】
製造されたブロック共重合体は、３．６ｐｐｍ近くでポリエチレングリコールのピークを、４．９ｐｐｍと１．６ｐｐｍ近くでポリラクチド−コ−グリコリドのピークを水素核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）で確認した。また、製造されたブロック共重合体のゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）による相対分子量及び分子量分布を下記表６に示した。
【０１３２】
【表６】
2009531296.tif 000008
【０１３３】
＜製造例４＞
脂肪酸両親媒性化合物モノメトキシポリエチレングリコール−ドデカン酸の重合
脂肪酸両親媒性化合物モノメトキシポリエチレングリコール−ドデカン酸の重合過程を図６に示した。５ｇの平均分子量が５，０００のモノメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）と０．６ｇのドデカン酸（ＤＡ）を、メチレンクロリド（塩化メチレン）に溶解した後、０．９１ｇの１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドと０．３７グラムの４−ジメチルアミノピリジンを添加して、反応を遂行した。２４時間後、生成された副産物は濾過して除去し、冷たい過量のジエチルエーテルを添加した。生成された沈澱物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、減圧乾燥してモノメトキシポリエチレングリコール−ドデカン酸（ＭＰＥＧ−ＤＡ）の両親媒性高分子を製造した（収率９２．５％）。赤外線分光法（ＦＴ−ＩＲ）と水素核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）によって重合体の構造を確認した。これを、それぞれ図７及び８に示した。図７で、（ａ）はモノメトキシポリエチレングリコール、（ｂ）はドデカン酸、（ｃ）はモノメトキシポリエチレングリコール−ドデカン酸、そして（ｄ）はモノメトキシポリエチレングリコール−ドデカン酸を用いた水溶性磁性ナノ複合体の分光スペクトルを示す。図７に示されるように、赤外線分光法でドデカン酸のカルボン酸（−ＣＯＯＨ）のピークは１６９５ｃｍ−１で確認された。ドデカン酸とポリエチレングリコールの結合部位であるエステル結合のピークは１７３４ｃｍ−１で確認された。また、図８に示されるように、水素核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）を用いて、３．６２ｐｐｍでモノメトキシポリエチレングリコールの−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ピークを確認し、１．２７ｐｐｍでドデカン酸のピークを確認した。
【０１３４】
＜製造例５＞
親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換された生分解性両親媒性高分子の合成
Ａ．高分子の活性成分を結合して親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換された生分解性両親媒性高分子の合成
高分子の活性成分を結合して親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換された生分解性両親媒性高分子の合成過程を図９に示した。０．０５モルのポリラクチド−コ−グリコリドと０．２モルのＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）と１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）をメチレンクロリドに溶解した後、常温で窒素大気下に２４時間反応した。反応物はフィルタに通して濾過し、冷たいジエチルエーテルに落とし、沈澱した。この沈澱物はジエチルエーテルで数回洗浄後、真空状態で保管した。
【０１３５】
上記方法で活性化された高分子を０．０１モル採り、８ｍＬのメチレンクロリドに溶解した後、両端末端官能基がアミン基とカルボキシル基で置換されたポリエチレングリコール０．０１モルを採り、２ｍＬのメチレンクロリドに溶解して、少しずつ落としながら反応した。反応は常温で、窒素大気下に１２時間、行った。反応物は前述の方法を介して洗浄、保管した。合成された高分子の構造は、水素核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）と赤外線分光（ＦＴ−ＩＲ）で分析しており、これを図１０及び１１に示した。
【０１３６】
Ｂ．親水性高分子の活性成分を介した親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換された生分解性両親媒性高分子の重合
親水性高分子の活性成分を介した親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換された生分解性両親媒性高分子の重合過程を図１２に示した。０．２ｇの両端末端官能基がアミン基とカルボキシル基で置換されたポリエチレングリコール（分子量３４００）を減圧下で水分を除去した。触媒として２０ｍｇのオクタン酸第１スズを、水分が除去されたトルエンに加えた後、１００℃で２０〜３０分間、減圧し、反応物に０．１１９ｇのＤ，Ｌ−ラクチドを加えて、１４０℃で１２時間重合した。生成されたブロック共重合体を、５ｍＬのクロロホルムを加えて溶かした後、過量のジエチルエーテルに少量ずつ落として生成された沈澱物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、５０℃で一日間、減圧乾燥してカルボキシルポリエチレングリコール−ポリラクチドのブロック共重合体を得た（収率８７．２％）。
【０１３７】
＜製造例６＞
商用界面活性剤の親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換された両親媒性高分子の合成
プルロニック（Pluronic）系の非イオン性商用界面活性剤は、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド−ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ、親水性−疎水性−親水性）の形態を有する。この界面活性剤の末端ヒドロキシル基（−ＯＨ）を抗体などのリガンドを結合しうるカルボキシル基で置換した。３０ｇのプルロニックＦ−１２７とカルボキシル基置換基で４７６．５ｍｇの無水コハク酸、触媒として２９０．９ｍｇの４−ダイメチルアミノピリジン、３３１．９μＬのトリエチルアミンを溶媒である５００ｍＬの１，４−ジオキサンに溶解させ、２４時間常温で、反応を遂行した。反応後、凍結乾燥して溶媒を除去し、四塩化炭素を加えた後、フィルタを介して濾過し、反応していない無水コハク酸などを除去した。残りの不純物を除去するために、濾過した反応物を冷たいジエチルエーテルに落とし、沈澱させた。この沈澱物をジエチルエーテルで数回洗浄後、保管した。親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換されたプルロニックＦ−１２７は、赤外線分光法及び核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）分析を介して確認しており、これをそれぞれ図１３及び１４に示した。図１３で、（ａ）は親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換されたプルロニックＦ−１２７、（ｂ）はプルロニックＦ−１２７及び（ｃ）無水コハク酸のピークを示す。一方、図１４で、（ａ）は本発明の他の製造例に係る親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換される前のプルロニックＦ−１２７の核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）の結果であり、（ｂ）はカルボキシル基で置換されたＦ−１２７の核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）の結果を示したグラフである。
【０１３８】
＜製造例７＞
親水活性成分結合領域がスクシンイミジル基で置換された生分解性両親媒性高分子の合成
親水活性成分結合領域がスクシンイミジル基で置換された生分解性両親媒性高分子の合成は図１５Ａに示した過程を介して行われる。０．０５モルのポリラクチド−コ−グリコリド、０．４モルのＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）及び１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドをメチレンクロリドに溶解させた後、常温で、窒素大気下で、２４時間反応した。反応物はフィルタを介して濾過した後、冷たいジエチルエーテルに落とし沈澱させた。この沈澱物はジエチルエーテルで数回洗浄後、真空状態で保管した。上記方法で活性化された高分子０．０１モルを採り、８ｍＬのメチレンクロリドに溶解させた後、両端末端官能基がアミン基で置換されたポリエチレングリコール（分子量３，４００）０．０５モルを採り、２ｍＬのメチレンクロリドに溶解し、少しずつ落としながら反応させた。反応は常温で、窒素大気下に１２時間行った。反応物は前述した方法を介して洗浄、保管した。そして、生分解性両親媒性高分子のアミン基で置換された親水性末端官能基を抗体のアミン基と結合が可能なスクシンイミジル基に変換するためにＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカボネートを使用した。０．０１モルの Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカボネートを採り、４ｍＬのメチレンクロリドに溶解させた後、０．０５モルの親水性部分がアミン基で置換された両親媒性高分子を１ｍＬのメチレンクロリドに溶解して、少しずつ落としながら反応させた。反応は、窒素大気下で４時間行った。ゲル濾過（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５）と過程を介して高分子と結合しない Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカボネートを除去した。
【０１３９】
＜製造例８＞
磁性ナノ複合体に薬物を封入するための両親媒性高分子の製造
両親媒性高分子の疎水活性結合領域に抗癌剤の結合は、図１５の (b)に示した過程を介して行った。製造例５．Ｂで製造した親水活性成分結合領域が、カルボキシル基で置換された生分解性両親媒性高分子とｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（p-Nitrophenyl chloroformate）を水分が除去されたメチレンクロリドに溶解し、０℃で、ピリジンを加えて、常温で、窒素大気下に３時間反応し、活性化された両親媒性高分子と抗癌剤との結合のために、ドキソルビシン（ＤＯＸ）が溶解されているジメチルホルムアルデヒドにトリエチルアミンを加えて、常温で、窒素大気下に３時間、反応を行った。反応しないＤＯＸとその他の物質は数回の分離によって除去した。
【０１４０】
＜実施例１＞
生分解性両親媒性高分子を用いたエマルジョン型磁性ナノ複合体の製造
上記製造例３で製造した１００ｍｇの両親媒性生分解性高分子（モノメトキシポリエチレングリコール−ポリラクチド−コ−グリコリド）を２０ｍＬの水相の超純水に溶解させ、製造例１で製造した２０ｍｇの磁性ナノ粒子を油相の５ｍＬのクロロホルムに溶解させた。上記水相と油相を混合した後、この混合物を３００Ｗの超音波で１０分間飽和させた。上記エマルジョンを１２時間撹拌し、油相を蒸発し、遠心分離とゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００）を介して不純物が除去されたエマルジョン型磁性ナノ複合体を製造した。上記生分解性両親媒性高分子モノメトキシポリエチレングリコール−ポリラクチド−コ−グリコリドを用いるエマルジョン型磁性ナノ複合体の模式図を図３の(ａ)に示した。製造された粒子は透過電子顕微鏡と動的レーザー光散乱法を用いて確認しており、これをそれぞれ図１６の(ａ)及び(ｂ)に示した。
【０１４１】
＜実施例２＞
生分解性両親媒性高分子を用いたサスペンション型磁性ナノ複合体の製造
上記製造例１で製造した３ｍｇの磁性ナノ粒子を、製造例３で製造した５０ｍｇの両親媒性生分解性高分子モノメトキシポリエチレングリコール−ポリラクチド−コ−グリコリドが溶解されているクロロホルムに分散させた。分散液を撹拌しながら、４０℃に加熱して溶媒を蒸発させ、０．５ｍＬのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）溶液に再分散させた。上記溶液を、３０℃で、６時間加熱／撹拌し、懸濁液を完成した。遠心分離を介して磁性粒子を含まないミセルを除去し、０．５ｍＬのＰＢＳ溶液に再分散させた。上記生分解性両親媒性高分子のモノメトキシポリエチレングリコール−ポリラクチド−コ−グリコリドを用いるサスペンション型磁性ナノ複合体の模式図を図３の(ｂ)に示した。製造された粒子は透過電子顕微鏡と動的レーザー光散乱法を用いて確認しており、これをそれぞれ図１７の(ａ)及び(ｂ)に示した。
【０１４２】
＜実施例３＞
脂肪酸両親媒性化合物を用いたエマルジョン型磁性ナノ複合体の製造
上記製造例４で製造した６００ｍｇの脂肪酸両親媒性重合体モノメトキシポリエチレングリコール−ドデカン酸を、２０ｍＬの水相の超純水に溶解させ、製造例１で製造した２０ｍｇの磁性ナノ粒子を、油相の５ｍＬのクロロホルムに溶解させた。上記水相と油相を混合した後、この混合物を３００Ｗの超音波で１０分間飽和させた。上記エマルジョンを６時間撹拌し、油相を蒸発し、遠心分離とゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００）を介して不純物が除去された高感度磁気共鳴映像用ナノ複合体を製造した。上記脂肪酸両親媒性高分子のモノメトキシポリエチレングリコール−ドデカン酸を用いるエマルジョン型磁性ナノ複合体の模式図を図３ｃに示した。製造された粒子は透過電子顕微鏡と動的レーザー光散乱法を用いて確認しており、これをそれぞれ、図１８の(ａ)及び(ｂ)に示した。磁気的特性は振動試料磁力計によって超常磁性であることを確認しており、これを図１９に示した。実線は磁性ナノ粒子、点線は脂肪酸両親媒性化合物を用いるエマルジョン型磁性ナノ複合体のヒステリシスループを示す。また、赤外線分光法を介して両親媒性重合体モノメトキシポリエチレングリコール−ドデカン酸と磁性ナノ粒子の存在可否を確認し、これを図７の(ｄ)に示した。
【０１４３】
＜実施例４＞
生分解性両親媒性高分子を用いた親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換されたエマルジョン型磁性ナノ複合体の製造
上記製造例５．Ａで製造した１００ｍｇの両親媒性生分解性高分子を、水相の２０ｍＬの超純水に溶解し、製造例１で製造した２０ｍｇの磁性ナノ粒子のマグネタイト及びマンガンフェライトをドキソルビシン２ｍｇと共に、油相の５ｍＬのクロロホルムに溶解させた。上記水相と油相を混合した後、この混合物を３００Ｗの超音波で１０分間飽和させた。上記エマルジョンを１２時間の撹拌し、油相を蒸発し、遠心分離とゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００）を介して不純物が除去された磁性ナノ複合体を製造した。上記抗癌剤が封入され、親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換されたエマルジョン型水相磁性ナノ複合体の模式図を図３の(ｄ)に示した。製造された粒子は動的レーザー光散乱法と透過電子顕微鏡を用いて確認し、これを図２０に図示した。図２０において、(ａ)はマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）が封入されたエマルジョン型磁性ナノ複合体、(ｂ)はマンガンフェライト（ＭｎＦｅ３Ｏ４）が封入されたエマルジョン型磁性ナノ複合体、(ｃ)は磁性ナノ複合体の粒径分布度である。また、封入された磁性ナノ粒子の重量比は、熱重量分析方法によって分析し、その結果を図２１に示した。磁気的特性はＶＳＭを利用して測定し、これを図２２に示した。
【０１４４】
＜実施例５＞
生分解性両親媒性高分子を用いた親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換されたサスペンション型磁性ナノ複合体の製造
上記製造例１で製造した３ｍｇの磁性ナノ粒子を、製造例５．Ｂで製造した５０ｍｇの両親媒性生分解性高分子が溶解されているクロロホルムに分散させた。分散液を撹拌しながら、４０℃に加熱し、溶媒を蒸発させ、０．５ｍＬのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）溶液に再分散させた。上記溶液を、３０℃で、６時間加熱／撹拌し、懸濁液を完成した。遠心分離を介して磁性粒子を含まないミセルを除去した後、０．５ｍＬのＰＢＳ溶液に再分散させた。上記親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換されたサスペンション型水相磁性ナノ複合体の模式図を図３の(ｅ)に示した。製造された粒子は動的レーザー光散乱法と透過電子顕微鏡を用いて確認しており、これを図２３の(ａ)及び(ｂ)に示した。封入された磁性ナノ粒子の重量比は熱重量分析方法によって分析し、その結果を図２４に示した。
【０１４５】
＜実施例６＞
親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換された商用界面活性剤を用いたエマルジョン型磁性ナノ複合体の製造
上記製造例６で製造した１ｇの両親媒性高分子重合体を、４０ｍＬの水相の超純水に溶解し、上記製造例１で製造した３０ｍｇの磁性ナノ粒子を油相の５ｍＬのヘキサンに溶解した。上記水相と油相を混合させた後、この混合物を１９０Ｗの超音波を加えながら、１０分間撹拌した。その後、超音波除去状態で３０分間撹拌し、さらに１０分間、６００Ｗ超音波を加えて飽和させた。このエマルジョンは、２４時間の撹拌を介して油相を蒸発させて高感度磁気共鳴映像用ナノ複合体を製造した。上記親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換された商用界面活性剤を用いたエマルジョン型磁性ナノ複合体の模式図を図３の(ｆ)に示した。製造された粒子は動的レーザー光散乱法と透過電子顕微鏡を用いて確認しており、これを図２５に示した。製造された磁性ナノ複合体は赤外線分光法を介して両親媒性重合体プルロニックＦ−１２７と磁性ナノ粒子の存在可否を確認しており、これを図２６に示した。
【０１４６】
＜実施例７＞
新規な腫瘍特異的知能型磁気共鳴映像用造影剤の製作
上記実施例６で製造した磁性ナノ複合体を用いて、次ぎのような方法によって腫瘍特異的知能型磁気共鳴映像用造影剤を製作した。実施例６で製造した磁性ナノ複合体、治療用抗体であるハーセプチン［ナノ複合体とハーセプチンモル比１００：１]、架橋剤であるＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）及びＥＤＣ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチル−カルボジイミドヒドロクロリド（ＮＨＳ及びＥＤＣモル比１：２）を、２ｍＬのＰＢＳバッファーに混合させた後、約６時間反応させた。反応後、不純物はゲル濾過カラムで除去した。
【０１４７】
＜実施例８＞
親水活性成分結合領域がスクシンイミジル基で置換されたエマルジョン型磁性ナノ複合体の製造
抗癌剤が封入され、親水活性成分結合領域がスクシンイミジル基で置換されたエマルジョン型水相磁性ナノ複合体（図３の(ｇ)）の製造のために、油相としてクロロホルムを用いて、ドキソルビシン（ＤＯＸ）２ｍｇを溶解し、製造例１で製造した２０ｍｇの磁性ナノ粒子を分散させた。水相として上記製造例７で製造した１００ｍｇの両親媒性生分解性高分子が溶解されている２０ｍＬの超純水を使用した。上記２つ相を混合して飽和させた後、この混合物を超音波で１０分間乳化させた。このエマルジョンを１２時間撹拌し、油相を蒸発し、数回の遠心分離とＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００カラムを介して純度の高い水相磁性ナノ複合体を得た。
【０１４８】
＜実施例９＞
親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換されたサスペンション型磁性ナノ複合体の製造
Ａ．抗癌剤が物理的にだけ封入されたサスペンション型磁性ナノ複合体の製造
抗癌剤が物理的にだけ封入され、親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換されたサスペンション型水相磁性ナノ複合体（図３の(ｈ)）の製造のために、上記製造例１で製造した３ｍｇの磁性ナノ粒子と２ｍｇのＤＯＸを、製造例５．Ｂで製造した５０ｍｇの両親媒性生分解性高分子が溶解されているクロロホルムに分散させた。分散液を撹拌しながら、４０℃に加熱し、溶媒を蒸発させ、０．５ｍＬのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）溶液に再分散させた。上記溶液を３０℃で、６時間加熱／撹拌し、懸濁液を完成した。遠心分離を介して磁性粒子を含まないミセルを除去し、０．５ｍＬのＰＢＳ溶液に再分散させた。
【０１４９】
Ｂ．抗癌剤が化学的にだけ封入されたサスペンション型磁性ナノ複合体の製造
抗癌剤が化学的にだけ封入され、親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換されたサスペンション型水相磁性ナノ複合体（図３の(ｈ)）の製造のために、上記製造例１で製造した３ｍｇの磁性ナノ粒子を、製造例８で製造した５０ｍｇの抗癌剤が結合された両親媒性生分解性高分子が溶解されているクロロホルムに分散させた。分散液を撹拌しながら、４０℃に加熱して溶媒を蒸発させ、０．５ｍＬのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）溶液に再分散させた。上記溶液を３０℃で、６時間加熱／撹拌して懸濁液を完成した。遠心分離を介して磁性粒子を含まないミセルを除去し、０．５ｍＬのＰＢＳ溶液に再分散させた。
【０１５０】
Ｃ．抗癌剤が物理的な方法と化学的な方法で封入されたサスペンション型磁性ナノ複合体の製造
抗癌剤が物理的な方法と化学的な方法で封入され、親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換されたサスペンション型水相磁性ナノ複合体（図３の(ｈ)）の製造のために、上記製造例１で製造した３ｍｇの磁性ナノ粒子と２ｍｇのＤＯＸを、製造例５．Ｂで製造した２５ｍｇの両親媒性生分解性高分子と製造例８で製造した２５ｍｇの抗癌剤が結合された両親媒性生分解性高分子が溶解されているクロロホルムに分散させた。分散液を撹拌しながら、４０℃に加熱して溶媒を蒸発させ、０．５ｍＬのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）溶液に再分散させた。上記溶液を３０℃で、６時間加熱／撹拌して懸濁液を完成した。遠心分離を介して磁性粒子を含まないミセルを除去し、０．５ｍＬのPBS溶液に再分散させた。製造された粒子は、動的レーザー光散乱法と透過電子顕微鏡を用いて確認しており、これを図２７の(ａ)及び(ｂ)に示した。封入された磁性ナノ粒子の重量比は熱重量分析方法によって分析し、その結果を図２８に示した。
【０１５１】
＜実施例１０＞
癌の同時診断と治療のためのハーセプチン−磁性ナノ複合体の製造
Ａ．スクシンイミジル基-磁性ナノ複合体を用いたハーセプチン-磁性ナノ複合体の製造
ハーセプチン−磁性ナノ複合体は、上記実施例８で製造した３ｍｇの水相磁性ナノ複合体をｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液に分散させた後、ハーセプチン０．1ｍｇを添加し、常温で４時間反応させた。反応が終わった後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００カラムを介して反応しないハーセプチンと水相磁性ナノ複合体を除去して、ハーセプチン−磁性ナノ複合体を製造した。
【０１５２】
Ｂ．カルボキシル基−磁性ナノ複合体を用いたハーセプチン−磁性ナノ複合体の製造
【０１５３】
ハーセプチン−磁性ナノ複合体は、上記実施例４で製造した親水性高分子の末端官能基がカルボキシル基で置換された磁性ナノ複合体を０．５ｍＬのＰＢＳ溶液に分散させた。この水相磁性ナノ複合体をｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液に分散させた後、ハーセプチン０．５ｍｇを添加し、常温で４時間反応させた。反応が終わった後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００カラムを介して反応しないハーセプチンと水相磁性ナノ複合体を除去して、ハーセプチン−磁性ナノ複合体を製造した。抗体と結合された磁性ナノ複合体の細胞選択性を確認するために、標的細胞と反応しない免疫グロブリン（ＩｇＧ）を上記方法で磁性ナノ複合体と結合して、ＩｇＧ−磁性ナノ複合体を製造した。
【０１５４】
Ｃ．カルボキシル基-磁性ナノ複合体を用いたハーセプチン−磁性ナノ複合体の製造
ハーセプチン−磁性ナノ複合体は上記実施例９．Ｃで製造した親水性高分子の末端官能基がカルボキシル基で置換された磁性ナノ複合体を０．５ｍＬのＰＢＳ溶液に分散させた。この水相磁性ナノ複合体をｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液に分散させた後、ハーセプチン０．５ｍｇを添加し、常温で４時間反応させた。反応が終わった後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００カラムを通して反応しないハーセプチンと水相磁性ナノ複合体を除去して、ハーセプチン−磁性ナノ複合体を製造した。抗体と結合された磁性ナノ複合体の細胞選択性を確認するために、標的細胞と反応しない免疫グロブリン（ＩｇＧ）を上記方法で磁性ナノ複合体と結合して、ＩｇＧ−磁性ナノ複合体を製造した。
【０１５５】
＜実施例１１＞
親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換されたエマルジョン型磁性ナノ複合体の製造
親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換されたエマルジョン型水相磁性ナノ複合体の製造のために、油相としてクロロホルムが用いられ、上記製造例３で製造した１００ｍｇの両親媒性生分解性高分子を溶解させ、製造例１で製造した２０ｍｇの磁性ナノ粒子を分散させた。磁性ナノ複合体に蛍光性を与えるために、２ｍｇのナイルレッドを油相に追加した。水相として２０ｍＬの超純水が使われた。上記２つ相を混合して飽和させた後、この混合物を超音波で１０分間乳化させた。上記エマルジョンを１２時間撹拌し、油相を蒸発させ、数回の遠心分離とＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００カラムを通して純度高い水相磁性ナノ複合体を得た。製造された粒子は透過電子顕微鏡と動的レーザー光散乱法を用いて確認しており、これを図２９に示した。封入された磁性ナノ粒子の重量比は熱重量分析方法によって分析し、磁気的特性はＶＳＭを利用して測定しており、その結果を図３０に示した。
【０１５６】
＜実施例１２＞
磁場で細胞の分離のためのハーセプチン−磁性ナノ複合体の製造
ハーセプチン−磁性ナノ複合体は、上記実施例１１で製造した親水性高分子の末端官能基がカルボキシル基で置換された磁性ナノ複合体を０．５ｍＬのＰＢＳ溶液に分散させた。上記水相磁性ナノ複合体をｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液に分散させた後、ハーセプチン０．５ｍｇを添加し、常温で４時間反応させた。反応が終わった後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００カラムを通して反応しないハーセプチンと水相磁性ナノ複合体を除去して、ハーセプチン−磁性ナノ複合体を製造した。上記抗体が付着された磁性ナノ複合体は外部磁場（Ｎｄ−Ｂ−Ｆｅ磁石、０．３５Ｔ）に敏感に整列することを図３１で確認した。抗体と結合された磁性ナノ複合体の細胞選択性を確認するために、標的細胞と反応しない免疫グロブリン（ＩｇＧ）を上記方法で磁性ナノ複合体と結合して、ＩｇＧ−磁性ナノ複合体を製造した。
【０１５７】
＜試験例１＞
生分解性両親媒性高分子を用いたエマルジョン型磁性ナノ複合体の安定性実験
上記製造例１で製造された有機磁性ナノ粒子を、ヘキサンに溶解した後、水を付加する一方、実施例１で製造された生分解性両親媒性高分子を用いたエマルジョン型磁性ナノ複合体を水に溶解した後、ヘキサンを付加して溶解度変化を分析し、これを図３２に示した。図３２に示されるように、表面に脂肪酸表面安定剤を有する有機性ナノ粒子（図３２の(ａ)）が水溶性ナノ複合体（図３２の(ｂ)）に転換されたことが確認できた。また、肉眼で観察した時、沈澱または凝集が生じなかったので、上記水溶性酸化鉄ナノ粒子が水溶液でよく分散されることが分かった。
【０１５８】
＜試験例２＞
脂肪酸両親媒性化合物を用いたサスペンション型磁性ナノ複合体の安定性実験
上記製造例１で製造された有機磁性ナノ粒子をヘキサンに溶解した後、水を付加する一方、実施例３で製造された生分解性両親媒性高分子を用いたエマルジョン型磁性ナノ複合体を水に溶解した後、ヘキサンを付加して溶解度変化を分析した。これを図３３に示した。図３３に示されるように、表面に脂肪酸表面安定剤を有する有機性ナノ粒子（図３３の(ａ)の左側）が水溶性ナノ複合体（図３３の(ａ)の右側）に転換されたことが確認できた。外部磁場（Ｎｄ−Ｂ−Ｆｅ磁石、０．３５Ｔ）を加えた時、敏感に反応することが確認できた（図３３の(ｂ)）。また、肉眼で観察した時、沈澱または凝集が発生されなかったので、上記水溶性酸化鉄ナノ粒子が、水溶液でよく分散されることが分かった。
【０１５９】
実施例３で製造されたナノ複合体の塩（ＮａＣｌ）濃度とｐＨによる安定性試験を行った。これを図３４に示した。図３４の(ａ)はナノ複合体の０．０〜１．０Ｍの濃度によるナノ複合体のサイズ変化グラフであり、濃度によるナノ複合体のサイズ変化がほとんどないことが確認された。そして、図３４の(ｂ)はナノ複合体のｐＨ５〜ｐＨ１０の変化によるナノ複合体のサイズ変化グラフであり、ｐＨによるナノ複合体のサイズ変化もほとんどないことが確認された。
【０１６０】
＜試験例３＞
親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換された商用界面活性剤を用いたエマルジョン型磁性ナノ複合体の安定性実験
実施例６で製造したナノ複合体のｐＨによる分散安定性実験を行った結果を図３５に示した。図３５に示されるように、上記ナノ複合体はｐＨ４〜１３の範囲で粒子の凝集が確認されなく、粒径変化もほとんどないことが確認できた。また、塩（ＮａＣｌ）の濃度による安定性試験を行った。これを図３６に示した。図３６に示されるように、０．００５Ｍの濃度から１．０Ｍの濃度による粒子の凝集は確認されなく、粒径変化もほとんどないことが確認できた。
【０１６１】
＜試験例４＞
生分解性両親媒性高分子を用いたエマルジョン型磁性ナノ複合体の造影剤としての可能性の確認
水溶性磁性ナノ複合体の磁気共鳴映像造影効果を確認するために、上記実施例１で製造された水溶性磁性ナノ複合体を０．１、０．０５、０．０２５及び０．１２５μg／μＬの濃度で滴定し、ＰＣＲチューブに注入した。磁気共鳴映像の造影効果を見るために、１．５Ｔ（Intera； Philips Medical Systems, Best, The Netherlands）システムを用いており、ｍｉｃｒｏ−４７コイルを用いた。ＦＦＥ（Fast Field Echo）パルスシーケンスを有して、冠状面の映像を得た。具体的なパラメーターは次ぎの通りであった：解像度１５６×１５６μｍ、薄板膜厚０．６ｍｍ、ＴＥ＝２０ｍｓ、ＴＲ＝４００ｍｓ、映像励起回数  １、映像獲得時間６分。図３７に示されるように、上記水溶性磁性ナノ複合体の濃度が高くなるほど磁気共鳴映像信号が増幅されることを確認できた。
【０１６２】
＜試験例５＞
脂肪酸両親媒性化合物を用いたエマルジョン型磁性ナノ複合体の造影剤としての可能性の確認
水溶性磁性ナノ複合体の磁気共鳴映像造影効果を確認するために、上記実施例３で製造された水溶性磁性ナノ複合体を滴定し、マイクロチューブに注入した。磁気共鳴映像の造影効果を見るために、１．５Ｔ（Intera； Philips Medical Systems, Best, The Netherlands）システムを使用し、ｍｉｃｒｏ−４７コイルを利用した。ＦＦＥ（Fast Field Echo）パルスシーケンスを有して冠状面の映像を得た。具体的なパラメーターは次ぎの通りであった：解像度１５６×１５６μｍ、薄板膜厚０．６ｍｍ、ＴＥ＝２０ｍｓ、ＴＲ＝４００ｍｓ、映像励起回数  １、映像獲得時間  ６分。図３８に示されるように、水溶性磁性ナノ複合体の濃度が高くなるほど磁気共鳴映像信号が増幅されることを確認できた。
【０１６３】
＜試験例６＞
親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換されたエマルジョン型磁性ナノ複合体の造影剤としての可能性の確認
親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換されたエマルジョン型水溶性磁性ナノ複合体の磁気共鳴映像造影効果を確認するために、上記実施例４で製造された水溶性磁性ナノ複合体を滴定し、マイクロチューブに注入した。磁気共鳴映像の造影効果を見るために、１．５T（Intera； Philips Medical Systems, Best, The Netherlands）システムを使用し、ｍｉｃｒｏ−４７コイルを利用した。 ＦＦＥ（Fast Field Echo）パルスシーケンスを有して冠状面の映像を得た。具体的なパラメーターは次ぎの通りであった：解像度１５６×１５６μｍ、薄板膜厚０．６ｍｍ、ＴＥ＝２０ｍｓ、ＴＲ＝４００ｍｓ、映像励起回数  １、映像獲得時間  ６分。図３９に示されるように、水溶性磁性ナノ複合体の濃度が高くなるほど磁気共鳴映像信号が増幅されることを確認できた。
【０１６４】
＜実験例７＞
親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換された商用界面活性剤を用いたエマルジョン型磁性ナノ複合体の造影剤としての可能性の確認
実施例６で製造した親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換された商用界面活性剤を用いたエマルジョン型磁性ナノ複合体が、十分な磁気共鳴映像造影効果を示すのか否かを確認するために、上記水溶性磁性ナノ複合体を１．０、２．０、５．０、１０．０、２０．０、４０．０及び８０．０μｇ／ｍＬの濃度に滴定し、マイクロチューブに注入した。磁気共鳴映像の造影効果を見るために、１．５Ｔ（Intera； Philips Medical Systems, Best, The Netherlands）システムを使用し、ｍｉｃｒｏ−４７コイルを利用した。 ＦＦＥ（Fast Field Echo）パルスシーケンスを有して冠状面の映像を得た。具体的なパラメーターは次ぎの通りであった：解像度１５６×１５６μｍ、薄板膜厚０．６ｍｍ、ＴＥ＝２０ｍｓ、ＴＲ＝４００ｍｓ、映像励起回数  １、映像獲得時間  ６分。磁気共鳴映像造影効果の定量的評価のために、Ｔ２マッピングを遂行した。具体的なパラメーターは次ぎの通りであった：解像度１５６×１５６μｍ、薄板膜厚０．６ｍｍ、ＴＲ＝４０００ｍｓ、ＴＥ＝２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０ｍｓ、映像励起回数  ２、映像獲得時間  ４分。図４０及び４１に示されたように、水溶性磁性ナノ複合体の濃度が高くなるほど磁気共鳴映像信号が増幅されることを確認できた。これは生分解性高分子を利用して製造した水溶性磁性ナノ複合体がナノ造影剤への使用が可能であるということを表す。
【０１６５】
＜試験例８＞
磁性ナノ複合体の造影剤としての可能性の確認
Ａ．親水活性成分結合領域がスクシンイミジル基で置換されたエマルジョン型磁性ナノ複合体の造影剤としての可能性確認
親水活性成分結合領域がスクシンイミジル基で置換されたエマルジョン型水溶性磁性ナノ複合体の磁気共鳴映像造影効果を確認するために、上記実施例８で製造された水溶性磁性ナノ複合体を滴定し、マイクロチューブに注入した。磁気共鳴映像の造影効果を見るために、１．５Ｔ（Intera； Philips Medical Systems, Best, The Netherlands）システムを使用し、ｍｉｃｒｏ−４７コイルを利用した。 ＦＦＥ（Fast Field Echo）パルスシーケンスを有して冠状面の映像を得た。具体的なパラメーターは次ぎの通りであった：解像度１５６×１５６μｍ、薄板膜厚０．６ｍｍ、ＴＥ＝２０ｍｓ、ＴＲ＝４００ｍｓ、映像励起回数  １、映像獲得時間  ６分。抗原特異性に対する磁気共鳴映像造影効果の定量的評価のために、Ｔ２マッピングを遂行した。具体的なパラメーターは次ぎのとおりであった：解像度１５６×１５６μｍ、薄板膜厚０．６ｍｍ、ＴＲ＝４０００ｍｓ、ＴＥ＝２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０ｍｓ、映像励起回数  ２、映像獲得時間  ４分。図４２に示されたように、水溶性磁性ナノ複合体の濃度が高くなるほど磁気共鳴映像信号が増幅されることを確認できた。
【０１６６】
Ｂ．親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換されたサスペンション型磁性ナノ複合体の造影剤としての可能性の確認
親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換されたサスペンション型水溶性磁性ナノ複合体の磁気共鳴映像造影効果を確認するために、上記実施例９．Ｃで製造された水溶性磁性ナノ複合体を滴定し、マイクロチューブに注入した。磁気共鳴映像の造影効果を見るために、１．５Ｔ（Intera； Philips Medical Systems, Best, The Netherlands）システムを使用し、ｍｉｃｒｏ−４７コイルを利用した。 ＦＦＥ（Fast Field Echo）パルスシーケンスを有して冠状面の映像を得た。具体的なパラメーターは以下の通りであった：解像度１５６×１５６μｍ、薄板膜厚０．６ｍｍ、ＴＥ＝２０ｍｓ、ＴＲ＝４００ｍｓ、映像励起回数  １、映像獲得時間  ６分。抗原特異性に対する磁気共鳴映像造影効果の定量的評価のために、Ｔ２マッピングを遂行した。具体的なパラメーターは以下の通りであった：解像度１５６×１５６μｍ、薄板膜厚０．６ｍｍ、ＴＲ＝４０００ｍｓ、ＴＥ＝２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０ｍｓ、映像励起回数  ２、映像獲得時間  ４分。図４３に示されたように、水溶性磁性ナノ複合体の濃度が高くなるほど磁気共鳴映像信号が増幅されることを確認できた。
【０１６７】
＜実験例９＞
新規な腫瘍特異的磁気共鳴映像用造影剤の細胞結合度及び造影効果の確認
実施例７で製造した不純物が除去された新規知能型磁気共鳴映像用造影剤は、治療用抗体、ハーセプチンと抗原−抗体特異的結合に対して陽性であるＮＩＨ３Ｔ６．７細胞と陰性であるＭＤＡＭＢ２３１細胞との結合度の確認を通して知能型造影剤としての可能性を確認した。蛍光染色試薬ＦＩＴＣ（Fluorescein isothiocyanate）が付着された第２次抗体を付着し、蛍光活性化セルソーター（Fluorescence Affinity Cell Sorter）を通して分析したし、これを図４４に示した。図４４において、（ａ）は本発明に係る知能型磁気共鳴映像用造影剤と反応しない細胞の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）蛍光強度を表し、（ｂ）は知能型磁気共鳴映像用造影剤と反応した抗体陰性細胞（ＭＤＡＭＢ２３１）の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）蛍光強度を表し、（ｃ）は知能型磁気共鳴映像用造影剤と反応した抗体陽性細胞（ＮＩＨ３Ｔ６．７）の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）蛍光強度を表す。図１２に示されるように、陽性であるＮＩＨ３Ｔ６．７細胞が陰性のＭＤＡＭＢ２３１細胞に比べて、高い蛍光強度を表し散ることが分かる。これは製造された造影剤が特定腫瘍に特異的結合が可能な知能型造影剤への使用が可能であることを意味する。また抗体に対して陽性のＮＩＨ３Ｔ６．７細胞の場合、磁気共鳴映像を通してその造影効果があることを確認した、これを図４５に示した。
【０１６８】
＜試験例１０＞
フローサイトメトリー分析を介した腫瘍特異性磁性ナノ複合体の癌細胞選択性の確認
Ａ．フローサイトメトリー分析を介したスクシンイミジル基−磁性ナノ複合体を用いたハーセプチン−磁性ナノ複合体の癌細胞選択性確認
上記実施例１０．Ａで製造されたハーセプチン−磁性ナノ複合体の乳癌標識抗原に対する結合特異性及び効率を分析するために、ＦＡＣＳを利用した。それぞれの細胞株に対して、一万回のイベントを測定した。蛍光指標は蛍光強度分布の平均値と中間値範囲を利用しており、その結果を図４６に示した。ハーセプチン−磁性ナノ複合体及び対照群ナノ複合体粒子を、それぞれＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体を発現する細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株＜＜ＮＩＨ３Ｔ６．７細胞株）に処理した後、上記同様にＦＩＴＣ重合二次抗体と反応させ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体の発現程度の増加に伴って蛍光発現強度も増加することを確認することができた。ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体発現程度が低いＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の場合は、対照群のナノ複合体を使用した場合より蛍光発現強度が若干増加することを示しており、受容体発現程度の増加に伴って蛍光発現強度も徐々に増加することを確認することができた。
【０１６９】
Ｂ．フローサイトメトリー分析を介したエマルジョン型カルボキシル基−磁性ナノ複合体を用いたハーセプチン−磁性ナノ複合体の癌細胞選択性の確認
上記実施例１０．Ｂで製造されたハーセプチン−磁性ナノ複合体の乳癌標識抗原に対する結合特異性及び効率を分析するために、ＦＡＣＳを利用した。それぞれの細胞株に対して、一万回のイベントを測定した。蛍光指標は蛍光強度分布の平均値と中間値範囲を利用した。ハーセプチン−磁性ナノ複合体及び対照群ナノ複合体粒子を、それぞれＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体を発現する細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＮＩＨ３Ｔ６．７細胞株）に処理した後、上記同様にＦＩＴＣ重合二次抗体と反応させ、蛍光発現可否を、ＦＡＣＳを利用して確認し、その結果を図４７に示した。ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体の発現程度の増加に伴って蛍光発現強度も増加することを確認することができた。
【０１７０】
Ｃ．フローサイトメトリー分析を介したサスペンション型カルボキシル基−磁性ナノ複合体を用いたハーセプチン−磁性ナノ複合体の癌細胞選択性の確認
上記実施例１０．Ｃで製造されたハーセプチン−磁性ナノ複合体の乳癌標識抗原に対する結合特異性及び効率を分析するために、ＦＡＣＳを利用した。それぞれの細胞株に対して、一万回のイベントを測定した。蛍光指標は蛍光強度分布の平均値と中間値範囲を利用した。ハーセプチン−磁性ナノ複合体及び対照群ナノ複合体粒子を、それぞれＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体を発現する細胞株に処理した後、上記同様にＦＩＴＣ重合二次抗体と反応させて蛍光発現可否をＦＡＣＳを利用して確認し、その結果を図４８に示した。ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体の発現程度の増加に伴って蛍光発現強度も増加することを確認することができた。
【０１７１】
＜試験例１１＞
磁気共鳴映像を介した腫瘍特異性磁性ナノ複合体の細胞選択性の確認
Ａ．磁気共鳴映像を解したエマルジョン型カルボキシル基−磁性ナノ複合体を用いたハーセプチン-磁性ナノ複合体の癌細胞選択性確認
磁気共鳴映像を利用して、上記実施例１０．Ｂで製造されたハーセプチン−磁性ナノ複合体の抗原特異性を分析するために、それぞれの細胞をＰＣＲ用チューブに移した後、遠心分離して細胞を沈殿させた。各細胞株の抗原特異性による磁気共鳴映像の造影効果を見るために、１．５Ｔ（Intera； Philips Medical Systems, Best, The Netherlands）システムを使用し、ｍｉｃｒｏ−４７コイルを利用した。 ＦＦＥ（Fast Field Echo）パルスシーケンスを有して冠状面の映像を得て、これを図４９に示した。具体的なパラメーターは以下の通りであった：解像度１５６×１５６μｍ、薄板膜厚０．６ｍｍ、ＴＥ＝２０ｍｓ、ＴＲ＝４００ｍｓ、映像励起回数  １、映像獲得時間  ６分。抗原特異性に対する磁気共鳴映像造影効果の定量的評価のために、Ｔ２マッピングを遂行した。具体的なパラメーターは以下の通りであった：解像度１５６×１５６μｍ、薄板膜厚０．６ｍｍ、ＴＲ＝４０００ｍｓ、ＴＥ＝２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０ｍｓ、映像励起回数  ２、映像獲得時間  ４分。
【０１７２】
図４９の結果は、図４７に示された蛍光発現結果と一致しており、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体発現程度が徐々に増加することに伴って磁気共鳴映像信号が徐々に灰色から黒色に変わっていくことを確認した。発現程度の低い細胞株の場合、対照群ナノ複合体を使用した場合より若干暗い色に変わることを確認することができ、受容体発現程度が増加することに伴って徐々に黒色に変わっていくことを確認することができた。これは、ハーセプチン−磁性ナノ複合体がＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体を発現する細胞株に選択的に結合することによって、磁気共鳴映像信号が次第に黒色に現われるもので、本発明のハーセプチン−磁性ナノ複合体が生体外乳癌診断に用いることができることを確認することができた。
【０１７３】
Ｂ．磁気共鳴映像を介したサスペンション型カルボキシル基−磁性ナノ複合体を用いたハーセプチン-磁性ナノ複合体の癌細胞選択性の確認
磁気共鳴映像を利用して上記実施例１０．Ｃで製造されたハーセプチン−磁性ナノ複合体の抗原特異性を分析するために、それぞれの細胞をＰＣＲ用チューブに移した後、遠心分離して細胞を沈殿した。各細胞株の抗原特異性による磁気共鳴映像の造影効果を見るために、１．５Ｔ（Intera； Philips Medical Systems, Best, The Netherlands）システムを使用し、ｍｉｃｒｏ−４７コイルを利用した。 ＦＦＥ（Fast Field Echo）パルスシーケンスを有して冠状面の映像を得て、これを図５０に示した。具体的なパラメーターは以下の通りであった：解像度１５６×１５６μｍ、薄板膜厚０．６ｍｍ、ＴＥ＝２０ｍｓ、ＴＲ＝４００ｍｓ、映像励起回数  １、映像獲得時間  ６分。抗原特異性に対する磁気共鳴映像造影効果の定量的評価のために、Ｔ２マッピングを遂行した。具体的なパラメーターは次ぎの通りであった：解像度１５６×１５６μｍ、薄板膜厚０．６ｍｍ、ＴＲ＝４０００ｍｓ、ＴＥ＝２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０ｍｓ、映像励起回数  ２、映像獲得時間  ４分。
【０１７４】
図５０の結果は、図４８に示された蛍光発現結果と一致しており、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体発現程度が次第に増加することに伴って、磁気共鳴映像信号が次第に灰色から黒色に変わっていくことを確認した。発現程度の低い細胞株の場合、対照群ナノ複合体を使用した場合より若干暗い色に変わっていくことを確認することができ、受容体発現程度の増加に伴って、黒色に変わっていくことを確認することができた。これは、ハーセプチン−磁性ナノ複合体がＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体を発現する細胞株に選択的に結合することによって、磁気共鳴映像信号が次第に黒色に現われるもので、本発明のハーセプチン−磁性ナノ複合体が生体外乳癌診断に用いることが確認することができた。
【０１７５】
＜試験例１２＞
磁性ナノ複合体の薬物放出挙動分析
Ａ．スクシンイミジル基−磁性ナノ複合体を用いたハーセプチン−磁性ナノ複合体の薬物放出挙動分析
上記実施例１０．Ａで製造された抗癌剤が封入された水相磁性ナノ複合体に対する薬物放出実験はＵＶを用いた滴定曲線を作成した後、一定の時間の間隔で試料を抽出し、濃度を測定して行った。その結果を図５１に示した。
【０１７６】
Ｂ．カルボキシル基−磁性ナノ複合体を用いたハーセプチン−磁性ナノ複合体の薬物放出挙動分析
上記実施例１０．Ｂで製造された抗癌剤が封入された水相磁性ナノ複合体に対する薬物放出実験はＵＶを用いた滴定曲線を作成した後、一定の時間の間隔で試料を抽出し、濃度を測定して行った。その結果を図５２に示した。
【０１７７】
Ｃ．サスペンション型ハーセプチン−磁性ナノ複合体の薬物放出挙動分析
上記実施例１０．Ｃで製造された抗癌剤が封入された水相磁性ナノ複合体に対する薬物放出実験はＵＶを用いた滴定曲線を作成した後、一定の時間の間隔で試料を抽出し、濃度を測定して行った。その結果を図５３に示した。薬物が物理的な方法だけで封入された場合（図５３の(ｂ）)には、初期放出量が多く、化学的な方法だけで封入された場合（図５３の(ｃ)）には放出速度が非常に遅かったが、線形的な放出挙動を示した。そして、物理的な方法と化学的な方法を同時に利用して、抗癌剤を封入した場合、線形的であり、相対的に短時間に１００％に近い薬物放出挙動を示した（図５３の(ａ）)。
【０１７８】
＜試験例１３＞
フローサイトメトリー分析を介した細胞特異性エマルジョン型磁性ナノ複合体の標的細胞選択性の確認
上記実施例１２で製造されたハーセプチン-磁性ナノ複合体の癌細胞標識抗原に対する結合特異性及び効率を分析するために、ＦＡＣＳ（Flow cytometer, FACScan, Becton Dickinson, SanDiego, CA）を利用した。それぞれの細胞株（ＭＣＦ−７細胞株＜＜ＮＩＨ３Ｔ６．７細胞株）に対して、一万回のイベントを測定した。蛍光指標は蛍光強度分布の平均値と中間値範囲を利用した。ハーセプチン−磁性ナノ複合体を、それぞれＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体を発現する細胞株に処理した後、蛍光発現可否を、ＦＡＣＳを利用して確認し、その結果を図５４に示した。図５４に示されるように、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体の発現程度の増加に伴って蛍光発現強度も増加することを確認することができた。またＩｇＧ−磁性ナノ複合体の場合、細胞選択性がないことも確認できた。
【０１７９】
＜試験例１４＞
上記実施例１２で製造されたハーセプチン-磁性ナノ複合体を用いた標的細胞の分離可能性を確認するために、４×１０４個のＮＩＨ３Ｔ６．７細胞株に、１ｍｇ／ｍＬのハーセプチン−磁性ナノ複合体を３０分間培養し、反応しない磁性ナノ複合体を分離し、マイクロチューブに挿入し、チューブの片方の壁面に外部磁場（Ｎｄ−Ｂ−Ｆｅ磁石、０．３５Ｔ）を加えた。磁場を加えた後、数秒以内に磁石のある方向に敏感に動いていることを、蛍光顕微鏡を利用して確認した。その結果を図５５に示した。
【０１８０】
＜試験例１５＞
脂肪酸両親媒性化合物を用いたエマルジョン型磁性ナノ複合体の造影剤としての細胞毒性実験
上記実施例３で製造された水溶性磁性ナノ複合体の細胞毒性を確認するために、ＮＩＨ３Ｔ６．７細胞を対象とし、ナノ複合体の濃度による細胞毒性分析を行った。これを図３４に示した。ナノ複合体の濃度は１０−４〜１００ｍｇ／ｍＬの条件で実験しており、細胞と培養する時間を０〜７２時間とし、細胞毒性可否を確認してみた。図５６に示されるように、上記磁性ナノ複合体は高濃度でも細胞毒性を確認できなかった。
【０１８１】
＜実験例１６＞
親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換された商用界面活性剤を用いたエマルジョン型磁性ナノ複合体の細胞毒性実験
実施例６で製造した親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換された商用界面活性剤を用いたエマルジョン型磁性ナノ複合体の細胞毒性を確認するために、ＭＣＦ７細胞とＳＫＢＲ３、及びＮＩＨ３Ｔ６．７細胞を対象とし、ナノ造影剤の濃度によるＭＴＴ分析を行った。これを図５７に示した。図５７より明らかなように高濃度でも細胞毒性は確認できなかった。
【０１８２】
＜試験例１７＞
磁性ナノ複合体の細胞毒性実験
製造された磁性ナノ複合体の細胞毒性実験はＮＩＨ３Ｔ６．７細胞とＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対して行った。純粋ＤＯＸ、純粋ハーセプチン、ＤＯＸとハーセプチン、ハーセプチン−磁性ナノ粒子、ＩｇＧ−磁性ナノ複合体、及びハーセプチン−磁性ナノ複合体に対して、細胞成長に妨害となる程度を割合で表して、細胞毒性を確認した。９６−ウェルに４×１０３個の細胞を注入し、同量のハーセプチンとＤＯＸを基準にし、細胞のあるウェルに挿入した。４時間後、残留物質を洗浄し、７２時間、さらに成長させて、ＭＴＴ試薬を通して得た細胞毒性を図５８に示した。ＤＯＸが封入されたハーセプチン−磁性ナノ複合体の細胞毒性はハーセプチンとＤＯＸが共に作用した場合より（図２６の(ｉ)）高く現れて、ナノ粒子を利用してハーセプチンとＤＯＸを細胞と反応させた場合よりも非常に高い細胞毒性を示した。また、ハーセプチンが作用した場合、ＮＩＨ３Ｔ６．７細胞株がＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株より低い生存率を表し、細胞選択成があることを確認した。これらの結果は、上記図２で示されるように、ＤＯＸが封入されたハーセプチン−磁性ナノ複合体が癌細胞を選択的に相乗的な治療効果を有する可能性を示す結果といえる。
【０１８３】
＜試験例１８＞
動物モデルを介した脂肪酸両親媒性化合物を用いたエマルジョン型磁性ナノ複合体のナノ造影剤としての可能性の確認
ヌードマウスを動物モデルとして、生体内実験を行った。ＮＩＨ３Ｔ６．７細胞を注入して癌細胞を発現させ、１０日後、癌細胞のサイズが３０ｍｍ程度になった時、実施例３で製造されたナノ複合体（８０μｇ  Ｆｅ＋Ｍｎ）を注入した。注入前後の磁気共鳴映像を図５９に示した。 図５９は上記ナノ複合体注入前（ａ）、注入直後（ｂ）、注入１時間後（ｃ）、注入２時間後（ｄ）、注入５時間後（ｅ）の磁気共鳴映像である。図５９に示されるように、肝と癌細胞の映像変化が明らかであり、１時間、２時間、及び５時間が経過した後にも、造影効果が保持されることが確認できた。上記映像を介して時間によるＴ２値の変化をグラフで描いてみた結果、５時間が過ぎた後にも、注入前とＴ２値の差が大きく保持されることを確認できた（図５９の（ｆ））。
【０１８４】
＜実験例１９＞
動物モデルを介したナノ造影剤としての可能性の確認
ヌードマウスを動物モデルとして、生体内実験を行った。抗体に対して陽性のＮＩＨ３Ｔ６．７細胞を注入して癌細胞を発現させ、２日後、癌細胞のサイズが１０ｍｍ程度になった時、実施例６で製造された造影剤を注入した。注入前後の磁気共鳴映像を図６０に示した。図６０において、（ａ）は造影剤注入直前、（ｂ）は注入直後、（ｃ）は注入後２時間後の磁気共鳴映像写真である。図６０に示されるように、肝と癌細胞の映像変化が明確であった。また、造影剤注入前から２時間までの時間によるＲ２値の変化を図６１に示した。図６１に示されるように、造影剤注入後、Ｔ２値で大きな変化があることを確認することができた。
【０１８５】
＜試験例２０＞
動物モデルを通した磁性ナノ複合体のナノ造影剤としての可能性確認
磁性ナノ複合体が動物モデルで癌細胞を追跡することができるか否かを確認するために、  一グループのヌードマウスの太腿にＮＩＨ３Ｔ６．７細胞をインプラントした。磁気共鳴映像の造影効果を見るために、１．５Ｔ（Intera； Philips Medical Systems, Best, The Netherlands）システムを使用し、ｍｉｃｒｏ−４７コイルを利用した。 ＦＦＥ（Fast Field Echo）パルスシーケンスを有して冠状面の映像を得た。具体的なパラメーターは次ぎの通りであった：解像度１５６×１５６×μｍ、薄板膜厚０．６ｍｍ、ＴＥ＝２０ｍｓ、ＴＲ＝４００ｍｓ、映像励起回数  １、映像獲得時間  ６分。造影効果は経時的に確認した。実施例１０．Ｂで製造した磁性ナノ複合体投入前（preliminary,  Pre）、尾静脈に投入直後（immediately,  Immed)、４時間後、１２時間後、映像を得て、その結果を図６２及び６３に示した。注入後１２時間が過ぎた後にも、ヌードマウスの太腿で非常に高い造影効果が現れることを確認できた。ハーセプチンが結合されていない、ＩｇＧ−磁性ナノ複合体の場合、造影効果が落ちることも確認できた。この結果からハーセプチン−磁性ナノ複合体が癌細胞に選択的に標的化されることを確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１８６】
本発明に係る疎水性領域と親水性領域を有する両親媒性化合物で覆われている磁性ナノ複合体は高感度磁気共鳴映像造影剤として使用することができ、親水性領域に腫瘍マーカーと特異的に結合しうる物質を結合して癌診断知能型造影剤でとして使用することができ、疎水性領域に薬物を重合または封入すると同時に、親水性領域に腫瘍マーカーと特異的に結合しうる物質を結合して癌診断及び治療のための薬物伝達体として使われることができ、機能性細胞、幹細胞または癌細胞などの表面抗原に対する特異な抗体またはタンパク質を結合して磁性を用いた細胞及びタンパク質分離用製剤として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】本発明に係る磁性ナノ複合体の応用分野を図示した模式図である。
【図２】本発明の一実施例に係る両親媒性高分子を用いた磁性ナノ複合体の製造方法を図示した模式図である。
【図３】本発明の一実施例に係るエマルジョン型またはサスペンション型磁性ナノ複合体の概念図である。
【図４】本発明の一実施例に係る飽和脂肪酸を用いた磁性ナノ粒子の透過電子顕微鏡写真及び磁気的特性を図示したグラフである。
【図５】本発明の別の実施例に係る不飽和脂肪酸を用いた磁性ナノ粒子の透過電子顕微鏡写真及び磁気的特性を図示したグラフである。
【図６】本発明の一実施例に係る脂肪酸両親媒性化合物を用いた磁性ナノ複合体の製造方法を図示した模式図である。
【図７】本発明の一実施例に係る磁性ナノ粒子と磁性ナノ複合体の赤外線分光法（ＦＴ−ＩＲ）の結果を図示したグラフである。
【図８】本発明の一実施例に係る脂肪酸両親媒性化合物の水素核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）の結果を図示したグラフである。
【図９】本発明の一実施例に係る高分子等の活性成分を結合して親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換された生分解性両親媒性高分子の重合過程を図示した模式図である。
【図１０】本発明に係る親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換された生分解性両親媒性高分子を核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）の結果を図示したグラフである。
【図１１】本発明に係る親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換された生分解性両親媒性高分子を赤外線分光法の結果を図示したグラフである。
【図１２】本発明に係る親水性高分子の活性成分を通した親水活性成分結合領域がカルボキシル基で置換された生分解性両親媒性高分子の重合過程を図示した模式図である。
【図１３】本発明の一実施例に係る両親媒性高分子の赤外線分光法（ＦＴ−ＩＲ）の結果を図示したグラフである。
【図１４】本発明の他の製造例に係る両親媒性高分子の核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）の結果を図示したグラフである。
【図１５Ａ】本発明に係る親水活性成分結合領域で置換された生分解性両親媒性高分子の合成過程である。
【図１５Ｂ】本発明に係る親水活性成分結合領域で置換された生分解性両親媒性高分子の合成過程である。
【図１６】本発明の一実施例に係るナノ粒子及び生分解性両親媒性高分子を用いたエマルジョン型磁性ナノ複合体の電子顕微鏡写真及び粒径分布を示すグラフである。
【図１７】本発明の一実施例に係るナノ粒子及び生分解性両親媒性高分子を用いたサスペンション型磁性ナノ複合体の電子顕微鏡写真及び粒径分布を示すグラフである。
【図１８】本発明の一実施例に係るナノ粒子及び脂肪酸両親媒性高分子を用いたエマルジョン型磁性ナノ複合体の電子顕微鏡写真及び粒径分布を示すグラフである。
【図１９】本発明の一実施例に係る脂肪酸両親媒性化合物を用いたエマルジョン型磁性ナノ複合体のヒステリシスループの結果を図示したグラフである。
【図２０】本発明に係る磁性ナノ粒子がカルボキシルポリエチレングリコール−ポリラクチド−コ−グリコリドによって封入された電子顕微鏡写真及びナノ複合体の粒径分布度を図示したグラフである。
【図２１】本発明に係るナノ粒子がカルボキシルポリエチレングリコール−ポリラクチド−コ−グリコリドによって封入された質量比を図示したグラフである。
【図２２】本発明に係るナノ磁性粒子と磁性ナノ複合体のヒステリシスループである。
【図２３】本発明に係るサスペンション方法で製造された磁性ナノ複合体の電子顕微鏡写真及び動的レーザー光散乱法による粒径分布度を図示したグラフである。
【図２４】本発明に係るサスペンション方法で製造された磁性ナノ粒子の熱重量分析グラフである。
【図２５】本発明の一実施例に係る水溶性磁性ナノ複合体の透過電子顕微鏡写真及び動的レーザー光散乱法結果を図示したグラフである。
【図２６】本発明の一実施例に係る水溶性磁性ナノ複合体の赤外線分光法の結果を図示したグラフである。
【図２７】本発明に係るサスペンション方法で製造された磁性ナノ複合体の電子顕微鏡写真及び光散乱方法による粒径分布度である。
【図２８】本発明に係るサスペンション方法で製造された磁性ナノ粒子の熱重量分析グラフである。
【図２９】本発明のエマルジョン方法で製造されたＭｎＦｅ２Ｏ４がポリラクチドコ−グリコリド−ポリエチレングリコールによって封入されたナノ複合体の電子顕微鏡写真及び光散乱方法による粒径分布度である。
【図３０】本発明に係る熱重力分析方法を通して製造されたＭｎＦｅ２Ｏ４がポリラクチドコ−グリコリド−ポリエチレングリコールによって封入された質量比を求めた結果及びヒステリシスループである。
【図３１】本発明に係る蛍光染料が封入された磁性ナノ複合体が外部磁場により整列した写真である。
【図３２】本発明の一実施例に係る有機性ナノ粒子の有機溶媒に対する溶解度及び生分解性両親媒性化合物を用いた水溶性磁性ナノ複合体の水溶液に対する溶解度を示したもののである。
【図３３】本発明の一実施例に係る有機性ナノ粒子の有機溶媒に対する溶解度及び脂肪酸両親媒性化合物を用いた水溶性磁性ナノ複合体の水溶液に対する溶解度及び外部磁場に反応する様子を示す写真である。
【図３４】本発明の一実施例に係る脂肪酸両親媒性化合物を用いた水溶性磁性ナノ複合体の塩濃度及びｐＨによる安定性試験の結果を図示したグラフである。
【図３５】本発明の一実施例に係る水溶性磁性ナノ複合体のｐＨによる粒子安定性写真とサイズ変化グラフである。
【図３６】本発明の一実施例に係る水溶性磁性ナノ複合体の塩濃度による粒子安定性写真とサイズ変化グラフである。
【図３７】本発明の一実施例に係る生分解性両親媒性化合物を用いた水溶性磁性ナノ複合体の濃度による磁気共鳴映像信号（Ｔ２）の変化を図示したグラフである。
【図３８】本発明の別の実施例に係る脂肪酸両親媒性化合物を用いた水溶性磁性ナノ複合体の濃度による磁気共鳴映像信号（Ｒ２）の変化を図示したグラフである。
【図３９】本発明に係るサスペンション方法で製造された磁性ナノ粒子が分散された溶液の磁気共鳴映像を濃度によって確認した写真及びＲ２値変化グラフである。
【図４０】本発明の一実施例と係る水溶性磁性ナノ複合体の溶液磁気共鳴映像写真である。
【図４１】本発明の一実施例に係る水溶性磁性ナノ複合体のＦｅ濃度による磁気共鳴映像のＴ２値を図示したグラフである。
【図４２】本発明に係る親水性末端基がスクシンイミジル基で置換された磁性ナノ複合体が分散された溶液の磁気共鳴映像を濃度によって確認した写真及び濃度によるＴ２値変化グラフである。
【図４３】本発明に係るサスペンション方法で製造された磁性ナノ粒子が分散された溶液の磁気共鳴映像を濃度によって確認した写真及び濃度によるＴ２値変化グラフである。
【図４４】本発明の一実施例に係る知能型磁気共鳴映像用造影剤と反応した細胞の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）蛍光強度を示したグラフである。
【図４５】本発明の一実施例に係る知能型磁気共鳴映像用造影剤と反応した抗体陽性細胞の磁気共鳴映像写真である。
【図４６】本発明に係るハーセプチン−磁性ナノ複合体の細胞特異性を分析した結果である。
【図４７】本発明に係るＭｎＦｅ２Ｏ４が封入されているハーセプチン−磁性ナノ複合体の癌細胞に対する親和性をフローサイトメトリーで確認した図である。
【図４８】本発明に係るハーセプチン−磁性ナノ複合体の細胞との結合程度を評価するためにフローサイトメトリー分析で確認した図である。
【図４９】本発明の別の実施例に係る製造されたエマルジョン型ハーセプチン−磁性ナノ複合体と標的細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＮＩＨ３Ｔ６．７細胞株）の反応後、磁気共鳴映像を通して獲得した写真及びＴ２値の比較グラフである。
【図５０】本発明のさらに別の実施例に係る本発明に係るサスペンション型ハーセプチン−磁性ナノ複合体と標的細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＮＩＨ３Ｔ６．７細胞株）の反応後磁気共鳴映像を通して獲得した写真及びＴ２値の比較グラフである。
【図５１】本発明の一実施例に係るエマルジョン型磁性ナノ複合体の薬物放出挙動グラフである。
【図５２】本発明の別の実施例に係るエマルジョン型磁性ナノ複合体の薬物放出挙動グラフである。
【図５３】本発明のさらに別の実施例に係るサスペンション型磁性ナノ複合体の薬物放出挙動グラフである。
【図５４】本発明に係るＭｎＦｅ２Ｏ４が封入されている磁性ナノ複合体の標的細胞に対する親和性をＦＡＣＳで確認した図である。
【図５５】本発明に係るＭｎＦｅ２Ｏ４が封入されている磁性ナノ複合体が付着された標的細胞が外部磁場により一方の壁面に移動する様子を確認した写真である。
【図５６】本発明の一実施例に係る水溶性磁性ナノ複合体の細胞毒性実験結果を図示したグラフである。
【図５７】本発明の一実施例に係る水溶性磁性ナノ複合体の細胞毒性実験結果を図示したグラフである。
【図５８】本発明の一実施例に係る水溶性磁性ナノ複合体の細胞毒性実験結果を図示したグラフである。
【図５９】本発明の一実施例に係る水溶性磁性ナノ複合体を使用して撮影した動物モデルでの磁気共鳴映像である。
【図６０】本発明の一実施例に係る水溶性磁性ナノ複合体を使用して撮影した動物モデルでの磁気共鳴映像である。
【図６１】本発明の一実施例に係る知能型磁気共鳴映像用造影剤注入時間によるＲ２値の変化を図示したグラフである。
【図６２】本発明の一実施例に係る水溶性磁性ナノ複合体を使用して撮影した動物モデルでの磁気共鳴映像である。
【図６３】本発明の一実施例に係る知能型磁気共鳴映像用造影剤注入時間によるＲ２値の変化を図示したグラフである。
【図２】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図３０】
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【図３４】
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【図４１】
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【図４７】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図６１】
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【図６３】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２９】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６２】
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【国際調査報告】
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