(57)【要約】  新規な微生物およびこれを用いて２，６−ナフタレンジカルボン酸を高純度に精製する方法に関する。前記微生物は、土壌から分離したシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＨＮ−７２菌株であって、２，６−ジメチルナフタレンを酸化させて生成された粗ナフタレンジカルボン酸（ｃｒｕｄｅ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）に含まれている不純物である２−ホルミル−６−ナフトエ酸を２，６−ナフタレンジカルボン酸に転換する能力を有する。シュードモナス属ＨＮ−７２菌株は、粗ナフタレンジカルボン酸に含まれている不純物である２−ホルミル−６−ナフトエ酸を２，６−ナフタレンジカルボン酸に転換して高純度の２，６−ナフタレンジカルボン酸を高い収率で生産するのに優れた効果がある。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−ホルミル−６−ナフトエ酸（２−ｆｏｒｍｙｌ−６−ｎａｐｈｔｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）を２，６−ナフタレンジカルボン酸（２，６−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）に転換する能力を有するシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＨＮ−７２（寄託番号ＫＣＴＣ−１０８１９ＢＰ）。
【請求項２】
シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＨＮ−７２（寄託番号ＫＣＴＣ−１０８１９ＢＰ）を用いる２，６−ナフタレンジカルボン酸（２，６−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）の精製方法。
【請求項３】
前記精製方法が、
１）シュードモナス属ＨＮ−７２（寄託番号ＫＣＴＣ−１０８１９ＢＰ）を液体培地に接種して振盪培養した後、培養した菌体を回収し、回収した菌体を生理食塩水で洗浄して前記菌体を活性化する段階；
２）基質である粗ナフタレンジカルボン酸（ｃｒｕｄｅ  Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）を緩衝溶液と混合した後、前記混合液のｐＨを調節して精製反応液を調製する段階；および
３）前記１）段階で調製した活性菌体（シュードモナス属ＨＮ−７２）と前記２）段階で調製した反応液とを反応させて２−ホルミル−６−ナフトエ酸（２−ｆｏｒｍｙｌ−６−ｎａｐｈｔｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）を２，６−ナフタレンジカルボン酸（２，６−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）に転換して２，６−ナフタレンジカルボン酸（２，６−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）の純度を高める段階を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記液体培地が、ＬＢまたはＭ９培地である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記振盪培養が、２５〜３７℃温度で行われる請求項３に記載の方法。
【請求項６】
振盪培養した後、前記回収した菌体（シュードモナス属ＨＮ−７２）が、４℃で冷蔵保管するかまたは凍結乾燥して貯蔵される請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記緩衝溶液が、水、リン酸カリウム緩衝溶液（ＫＨ２ＰＯ４−ＫＯＨ）、ピロリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ＨＣｌ）、ホウ酸緩衝溶液（ｂｏｒｉｃ  ａｃｉｄ−ＮａＯＨ）およびホウ酸ナトリウム緩衝溶液（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｏｒａｔｅ−ＨＣｌ）からなる群より選択される請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記緩衝溶液が、ｐＨ６．０〜８．０のリン酸カリウム緩衝溶液（ＫＨ２ＰＯ４−ＫＯＨ）またはホウ酸緩衝溶液（ｂｏｒｉｃ  ａｃｉｄ−ＮａＯＨ）である請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記緩衝溶液が、０．０１〜１００ｍＭの濃度である請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記混合液のｐＨが、７．５〜８．３の範囲で調節される請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記混合液が、有機溶媒をさらに含む請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記有機溶媒が、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）、ジメチルアセトアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅ）およびテトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）からなる群より選択される少なくとも一種である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記有機溶媒の添加濃度が、０．０１〜１０％である請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記３)段階での反応が、３０〜５０℃の温度範囲で行われる請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２，６−ジメチルナフタレン（２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ；以下、２，６−ＤＭＮ）を酸化させて生成された粗ナフタレンジカルボン酸（ｃｒｕｄｅ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ；以下、ｃＮＤＡ）に含まれている不純物である２−ホルミル−６−ナフトエ酸（２−ｆｏｒｍｙｌ−６−ｎａｐｈｔｈｏｉｃ  ａｃｉｄ；以下、ＦＮＡ）を２，６−ナフタレンジカルボン酸（２，６−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ；以下、ＮＤＡ）に転換する能力を有する新規な微生物およびこれを用いて２，６−ナフタレンジカルボン酸を高純度に精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナフタレンジカルボン酸のジエステルは、ポリエステルおよびポリアミドのような様々な高分子物質を製造するのに有用である。特に有用なジエステルの一例としては、ジメチル−２，６−ナフタレンジカルボキシレート（以下、ＮＤＣ）がある。ＮＤＣは、エチレングリコールと縮合反応して高性能ポリエステル物質であるポリ（エチレン２，６−ナフタレート）（以下、ＰＥＮ）を生成することができる。ＰＥＮから製造された繊維およびフィルムは、ポリ（エチレンテレフタレート）（以下、ＰＥＴ）から製造されたそれらに比べて強度が高くて熱的性質に優れている。これらの利点により、ＰＥＮは、磁気記録テープおよび電子部品の製造に使用できる薄膜のような商用品を製造するのにとても適している。また、ＰＥＮは、気体拡散、特に二酸化炭素、酸素および水蒸気に対する抵抗性に優れるため、ＰＥＮから製造されたフィルムは、食品容器、特に高温充填する食品容器を製造するのに有用である。さらに、ＰＥＮは、タイヤコード製造に有用な強化繊維を製造するのに用いることができる。
【０００３】
現在、ＮＤＣは、２，６−ジメチルナフタレン（以下、２，６−ＤＭＮ）を酸化させて粗ナフタレンジカルボン酸（以下、ｃＮＤＡ）を生産した後、このｃＮＤＡをエステル化して生産されており、ＰＥＮ合成時、主原料として用いられている。しかし、ＰＥＮ合成時、主原料としてＮＤＣを用いる場合、２，６−ナフタレンジカルボン酸（以下、ＮＤＡ）を主原料として用いる場合に比べていくつかの問題を抱えている。第一に、ＮＤＡ縮合反応時には副産物として水が生成される反面、ＮＤＣの場合には副産物としてメタノールが生成されて爆発の危険がある。第二に、純粋なＮＤＣを得るためにＮＤＡをエステル化して精製工程を通じてＮＤＣを生産するため、ＮＤＡに比べて一つの段階を追加で必要とする。第三に、既存のＰＥＴ生産設備を利用する場合、ＮＤＣの使用は適切ではない。このようなＮＤＣの使用により引き起こされる問題点にもかかわらず、ＰＥＮ製造時、ＮＤＣが優先的に用いられる理由は、未だにＰＥＮの重合に必要な純度を有する精製したＮＤＡの製造が難しいためである。
【０００４】
２，６−ジメチルナフタレン（以下、２，６−ＤＭＮ）の酸化時には、２−ホルミル−６−ナフトエ酸（以下、ＦＮＡ）、２−ナフトエ酸、トリメリット酸などの各種の不純物を含むｃＮＤＡが生成される。特に、ｃＮＤＡ中のＦＮＡは、ＰＥＮを製造するための重合反応を停止させて重合体（すなわちＰＥＮ）の物理的特性に悪い影響を与えるため、ｃＮＤＡ中のＦＮＡを除去しなければならないが、ＦＮＡを除去するのには難しい問題が存在する。
【０００５】
これらの状況下、ｃＮＤＡ中のＦＮＡを除去するために、またはＮＤＡを精製するために、例えば、ｃＮＤＡの再結晶法、ｃＮＤＡをもう一度酸化する方法、ｃＮＤＡをメタノールで処理してＮＤＣを製造した後に水和させてＮＤＡを製造する方法、ｃＮＤＡの水素化工程により精製したＮＤＡを製造する方法などが研究されてきた。その他にも、溶媒処理、溶融結晶、高圧結晶、超臨界抽出など多様なＮＤＡの精製方法が用いられているが、未だに満足できる純度を有するＮＤＡを製造することができなかった。また、前記精製方法は、ＮＤＡの純度を高めることができてもＮＤＡの収率が低いため、実際の生産に適用しにくいのが実情である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はこのような問題点に鑑みてなされたもので、その目的とするところは、微生物を用いた生物学的な方法によりｃＮＤＡ中に含まれている不純物であるＦＮＡを選択的にＮＤＡに転換させて高純度のＮＤＡを生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するための本発明の一つの態様は、２−ホルミル−６−ナフトエ酸（２−ｆｏｒｍｙｌ−６−ｎａｐｈｔｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）を２，６−ナフタレンジカルボン酸（２，６−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）に転換する能力を有するシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＨＮ−７２（寄託番号ＫＣＴＣ−１０８１９ＢＰ）に関する。
【０００８】
本発明の他の態様は、前記シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＨＮ−７２（寄託番号ＫＣＴＣ−１０８１９ＢＰ）を用いて高純度の２，６−ナフタレンジカルボン酸（２，６−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）を精製する方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の菌株シュードモナス属ＨＮ−７２は、２−ホルミル−６−ナフトエ酸を２，６−ナフタレンジカルボン酸に転換するのに優れた効果がある。したがって、本発明のシュードモナス属ＨＮ−７２は、経済的および環境親和的な方法で高純度の２，６−ナフタレンジカルボン酸を生産することに寄与して産業的に極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の新規菌株についてより詳細に説明する。
【００１１】
本発明者らは、ＦＮＡをＮＤＡに転換する能力を有する新規な菌株を土壌から分離するのに成功した。本発明の新規な菌株は、１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分シークエンシング方法によりシュードモナス属に属する菌株として同定され、シュードモナス属（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＨＮ−７２と命名された。前記シュードモナス属ＨＮ−７２菌株は、２００５年６月２１日国際寄託機関である韓国生命工学研究所遺伝子銀行（ＫＲＩＢＢ）に寄託番号ＫＣＴＣ−１０８１９ＢＰとして寄託された。本発明のシュードモナス属ＨＮ−７２（ＫＣＴＣ−１０８１９ＢＰ）菌株は、２−ホルミル−６−ナフトエ酸と同じ位置にホルミル基を有する２−ナフトアルデヒドを酸化して、２−ナフトアルデヒドのホルミル基をカルボキシル基に変換させる微生物である。したがって、本発明の菌株は、２，６−ジメチルナフタレンを酸化させて生成された粗ナフタレンジカルボン酸に含まれている２−ホルミル−６−ナフトエ酸を選択的に２，６−ナフタレンジカルボン酸に転換する能力に優れている。このような本発明の菌株のシュードモナス属ＨＮ−７２（ＫＣＴＣ−１０８１９ＢＰ）の転換能は、同一の転換能を有する既特許出願（韓国特許出願番号１０−２００２−００８７８１９）に記載される菌株のバシラス属Ｆ−３に比べて顕著に優れている。
【００１２】
本発明のシュードモナス属ＨＮ−７２（寄託番号ＫＣＴＣ−１０８１９ＢＰ）菌株は、２５〜３７℃の広い範囲の温度で液体培地を用いて容易に培養することができる。
【００１３】
以下、前記シュードモナス属ＨＮ−７２菌株を用いた本発明の２，６−ナフタレンジカルボン酸の精製方法に対してより詳細に説明する。
【００１４】
本発明の前記２，６−ナフタレンジカルボン酸の精製方法は、具体的に、１）シュードモナス属ＨＮ−７２（寄託番号ＫＣＴＣ−１０８１９ＢＰ）を液体培地に接種して振盪培養した後、培養した菌体を回収し、回収した菌体を生理食塩水で洗浄して菌体を活性化する段階；２）基質である粗ナフタレンジカルボン酸（ｃｒｕｄｅ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）を緩衝溶液と混合した後、前記混合液のｐＨを調節して精製反応液を調製する段階；および３）前記１）段階で調製した活性菌体（シュードモナス属ＨＮ−７２）と前記２）段階で調製した反応液とを反応させて粗ナフタレンジカルボン酸に含まれている２−ホルミル−６−ナフトエ酸（２−ｆｏｒｍｙｌ−６−ｎａｐｈｔｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）を２，６−ナフタレンジカルボン酸（２，６−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）に転換して２，６−ナフタレンジカルボン酸（２，６−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）の純度を高める段階を含む。
【００１５】
前記１）段階でシュードモナス属ＨＮ−７２菌体を培養するための液体培地としては、特に制限されることはないが、ＬＢまたはＭ９培地を用いることができる。また、前記シュードモナス属ＨＮ−７２菌株の振盪培養は、２５〜３７℃の温度範囲で行うことが好ましく、３０℃の温度で行うことがより好ましい。
【００１６】
前記１）段階で振盪培養した後、回収した菌体（シュードモナス属ＨＮ−７２）は、できる限り菌体の反応活性を長期間維持させるために、４℃で冷蔵保管するか、または凍結乾燥して貯蔵することが好ましい。
【００１７】
前記２）段階で緩衝溶液としては、特に制限されることはないが、水、リン酸カリウム緩衝溶液（ＫＨ２ＰＯ４−ＫＯＨ）、ピロリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ＨＣｌ）、ホウ酸緩衝溶液（ｂｏｒｉｃ  ａｃｉｄ−ＮａＯＨ）またはホウ酸ナトリウム緩衝溶液（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｏｒａｔｅ−ＨＣｌ）を用いることができ、リン酸カリウム緩衝溶液（ＫＨ２ＰＯ４−ＫＯＨ）またはホウ酸緩衝溶液（ｂｏｒｉｃ  ａｃｉｄ−ＮａＯＨ）を用いることが好ましい。
【００１８】
ｃＮＤＡ反応は、反応液のｐＨが減少する反応であって、ｃＮＤＡ反応が終了した後、反応液のｐＨが７．０〜８．０の範囲で形成されるため、ｐＨ６．０〜８．０のリン酸カリウム緩衝溶液（ＫＨ２ＰＯ４−ＫＯＨ）を用いることが好ましい。このとき、前記緩衝溶液の濃度は、０．０１〜１００ｍＭであることが好ましい。
【００１９】
一方、前記３）段階のｃＮＤＡ精製反応で、精製反応液のｐＨはとても重要な反応要素であり、前記２）段階の混合液のｐＨは、７．５〜８．３の範囲で調節されることが好ましい。反応液の初期ｐＨが７．５未満またはｐＨ８．３を超過する場合には、前記３）段階で反応がおこらない。
【００２０】
さらに、前記２）段階での混合液には、ｃＮＤＡを溶解させるための目的として、有機溶媒をさらに添加することができる。好ましい有機溶媒の例としては、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，“ＤＭＳＯ”）、ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ，“ＤＭＦ”）、ジメチルアセトアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅ，“ＤＭＡ”）、テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ，“ＴＨＦ”）などが挙げられ、このうちジメチルスルホキシドを用いることが酵素活性面において最も好ましい。このとき、前記有機溶媒の添加濃度が、０．０１〜１０％であることが好ましいが、より好ましくは、添加しないことが良い。前記濃度が１０％を超過すると、微生物の細胞膜を溶解させて反応を阻害する結果をもたらす。
【００２１】
前記３)段階での反応温度は、３０〜５０℃であることが好ましい。前記反応温度がこの範囲外の場合には、反応性が顕著に減少する。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例を挙げてより詳しく本発明の構成および効果を説明するが、これら実施例は説明を目的としたものに過ぎず、本発明の範囲を制限するものではない。
【００２３】
実施例１：菌株分離
微生物の分離のために、韓国京畿道所在の排水処理場、油類貯蔵所またはガソリンスタンド付近の土壌を採取して使用した。それぞれの土壌サンプル５ｇを０．８５％生理食塩水５０ｍｌに入れて振盪した後、濾過した濾過液を適度に希釈してｃＮＤＡ混合物が入っているＬＢ固体培地に塗抹して３０℃の培養器で培養した。培養した結果、２００余種の微生物が分離された。
【００２４】
そのうち、ＦＮＡと同じ位置にホルミル基（ｆｏｒｍｙｌ  ｇｒｏｕｐ）を有する２−ナフトアルデヒド（２−ｎａｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）を分解する微生物を一次選別するために、前記２００余種の微生物をそれぞれＬＢ液体培地５ｍｌに接種して３０℃、２００ｒｐｍで１６時間振盪しながら培養した後、その培養液を遠心分離して回収した菌体を０．８５％生理食塩水１ｍｌに懸濁した。次いで、全てのガラスキュベットにβ―ＮＡＤ溶液（０．２５ｍｇ／ｍｌ；１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）に溶解）３ｍｌを入れた後、サンプルキュベットには２−ナフトアルデヒド溶液（５０μｇ／ｍｌ；ＤＭＳＯに溶解）０．２ｍｌを、ブランクキュベットにはＤＭＳＯ０．２ｍｌをそれぞれ添加して混合した。その後、上記キュベットを分光器に入れて３分間安定化した。上記微生物懸濁液０．０５ｍｌをそれぞれ添加して５分後、３４０ｎｍで吸光度を測定してブランクキュベットとの吸光度の差を比べることで、ホルミル基のカルボキシル基への酸化可否を確認した。その結果、吸光度の差が最小０．１以上である４種の微生物を分離した。一次選別した４種の微生物を再びＬＢ液体培地に接種して３０℃、２００ｒｐｍで１６時間振盪しながら培養した。その培養液を遠心分離して菌体を回収し、０．８５％生理食塩水で洗浄した。その後、下記表１に示す組成の反応液と３０℃の反応槽で３時間反応させた後、反応生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析してＦＮＡ除去能力の優れた菌株を最終選別した。ＨＰＬＣ分析条件は下記表２に示す。ＨＰＬＣ分析した結果、ＨＮ―７２と命名した菌株が高いＦＮＡ分解能力を持っていることを確認することができた。
【００２５】
【表１】
2009517017.tif 000002
【００２６】
【表２】
2009517017.tif 000003
実施例２
（１）分離微生物の同定
上記実施例１で得られた菌株を同定するために、１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分シークエンシング（ｐａｒｔｉａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行い、その結果を配列表に示した。この結果によると、本発明の菌株は、シュードモナス属に属するものと確認された。したがって、前記菌株をシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＨＮ−７２と命名し、２００５年６月２１日国際寄託機関である韓国生命工学研究所遺伝子銀行に寄託番号ＫＣＴＣ−１０８１９ＢＰとして寄託した。
【００２７】
前記菌株（シュードモナス属ＨＮ−７２）の形態学的および生化学的性質を測定した結果は、下記表３および４のようである。
【００２８】
【表３】
2009517017.tif 000004
【００２９】
【表４】
2009517017.tif 000005
（２）シュードモナス属ＨＮ−７２と公知の菌株との比較
本発明のシュードモナス属ＨＮ−７２菌株のようにＦＮＡを除去する能力を有する既特許出願の菌株のバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）Ｆ−３（韓国特許出願番号１０−２００２−００８７８１９）との反応効率を比較するために、上記表１に示す組成を有する反応液にそれぞれバシラス属Ｆ−３菌株およびシュードモナス属ＨＮ−７２菌株を添加した実験群を同一条件下で反応させてＨＰＬＣで分析して比較した。ＨＰＬＣ分析は上記表２で示す条件下で行った。
【００３０】
１％および５％のｃＮＤＡ濃度を有する反応液に二つの菌株（バシラス属Ｆ−３、シュードモナス属ＨＮ−７２）を添加して３０℃で反応させた後、前記反応液を分析した結果を下記表５に示す。
【００３１】
下記表５の結果から、シュードモナス属ＨＮ−７２が、より高い濃度のｃＮＤＡ中でも反応することができ、ＦＮＡをＮＤＡに転換させるＮＤＡ収率および純度においてもバシラス属Ｆ−３菌株より優れていることを確認することができた。
【００３２】
【表５】
2009517017.tif 000006
実施例３：反応温度の影響
最適反応温度を確認するために、下記表６に示す組成を有するｃＮＤＡ反応液をそれぞれ３０、３５、４０および５０℃で反応させた。このとき、酵素液としては、シュードモナス属ＨＮ−７２をＬＢ液体培地に接種して１６時間、３０℃の振盪培養器で培養した後、その培養液を遠心分離して菌体を回収し、回収した菌体を０．８５％生理食塩水で洗浄した後、また０．８５％生理食塩水に懸濁して得たものを調製した。反応液中の最終菌体濃度は、０．０５ｇ／ｍｌになるようにした。その結果、下記表７から明らかなように、反応温度が上がるほど有利であったが、４０℃以上ではほとんど変化がなかった。
【００３３】
【表６】
2009517017.tif 000007
【００３４】
【表７】
2009517017.tif 000008
実施例４：ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；ＤＭＳＯ）の影響
基質として使用するｃＮＤＡは、水溶液に溶解されないため、溶媒としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を使用して反応を行った。ＤＭＳＯが反応にどのような影響を与えるかを確認するために、上記表６に示す組成を有する反応液で下記表８に示すＤＭＳＯ濃度を変化させてその差を比較した。すなわち、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝溶液（ＫＨ２ＰＯ４−ＫＯＨ，ｐＨ８．０）と０％、５％および１０％の濃度のＤＭＳＯを含む５％ｃＮＤＡ反応液とを４０℃で反応させた。その結果、下記表８に示すように、ＤＭＳＯを添加しない場合が最も良い結果を示した。
【００３５】
【表８】
2009517017.tif 000009
実施例５：緩衝溶液の影響
この実験では、緩衝溶液の種類による効果を確認するため、類似のｐＨ緩衝範囲を有する様々な緩衝溶液を用いた。前記緩衝溶液は微生物菌体の恒常性を維持するために使用した。上記表６に示す組成を有する反応液で緩衝溶液を変化させて実験した。
【００３６】
実験では、リン酸カリウム緩衝溶液（ＫＨ２ＰＯ４−ＫＯＨ）、ピロリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ＨＣｌ）、ホウ酸緩衝溶液（ｂｏｒｉｃ  ａｃｉｄ−ＮａＯＨ）およびホウ酸ナトリウム緩衝溶液（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｏｒａｔｅ−ＨＣｌ）を用い、全ての緩衝溶液の濃度は５０ｍＭ、ｐＨは８．０にした。
【００３７】
下記表９に示した実験結果より、リン酸カリウム緩衝溶液（ＫＨ２ＰＯ４−ＫＯＨ）およびホウ酸緩衝溶液（ｂｏｒｉｃ  ａｃｉｄ−ＮａＯＨ）が優れていた。ｃＮＤＡ反応は、反応液のｐＨが減少する反応であって、具体的には、ｃＮＤＡ反応が終了した後、反応液のｐＨは７．０〜８．０の範囲であるため、ｐＨ６．０〜８．０のリン酸カリウム緩衝溶液（ＫＨ２ＰＯ４−ＫＯＨ）を用いることが最も好ましいと判断される。
【００３８】
また、リン酸カリウム緩衝溶液（ＫＨ２ＰＯ４−ＫＯＨ）の濃度を０〜１００ｍＭまで変化させて反応液の組成における前記緩衝溶液の影響を確認したが、下記表１０に示すように、緩衝溶液の濃度変化によっても反応液の組成の差はなかった。
【００３９】
【表９】
2009517017.tif 000010
【００４０】
【表１０】
2009517017.tif 000011
実施例６：反応液の初期ｐＨ
ｐＨが高いほどｃＮＤＡの溶解度が増加するため、ｃＮＤＡ精製反応で反応液のｐＨは、とても重要な反応要素である。よってこの実験では、上記表１に示す組成を有する反応液の初期ｐＨを７．０〜９．０まで変化させた。その結果、初期ｐＨ７．５以下およびｐＨ８．３以上では、反応が進まなかった。したがって、適正ｐＨ範囲が７．５〜８．３であることがわかった。また、初期ｐＨ７．８〜８．１の範囲がｃＮＤＡ精製反応の最適ｐＨ範囲であることがわかり、このｐＨ範囲では反応後にｃＮＤＡ反応液の組成の差がほとんどなかった。
【００４１】
実施例７：ｃＮＤＡ中のＦＮＡ含量、ｃＮＤＡ濃度および菌体量の影響
この実験では、１〜１０％の範囲の異なるＦＮＡ含量を有するｃＮＤＡの精製反応を行った結果、ｃＮＤＡ中のＦＮＡ含量、反応液中のｃＮＤＡ濃度およびＦＮＡ完全除去のために必要な菌体量の間には密接な関係があることが明らかになった。すなわち、ｃＮＤＡ中のＦＮＡ含量および反応液中のｃＮＤＡ濃度が高いほど、ＦＮＡを処理するために多量の菌体（シュードモナス属ＨＮ−７２）が必要であった。下記表１１および１２は、ｃＮＤＡ中のＦＮＡ含量およびｃＮＤＡ濃度に応じて必要な菌体（シュードモナス属ＨＮ−７２）の量を示している。
【００４２】
【表１１】
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【００４３】
【表１２】
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実施例８：回収菌体（シュードモナス属ＨＮ−７２）の保管
一般的に、微生物の活性は、培養後、時間が経過するほど減少する。したがって、できる限り菌体の活性を長く維持させることが本発明の精製方法にとって有利である。培養した菌体（シュードモナス属ＨＮ−７２）の活性を長期間維持させるために、上記実施例１に記載した条件下で培養した菌体を遠心分離して回収した後、４℃で冷蔵保管または凍結乾燥した。その結果、４日間４℃で冷蔵保管しても菌体の反応活性が維持され、凍結乾燥した場合はより長期間の保管が可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明によるシュードモナス属ＨＮ−７２を用いる精製方法は、経済的かつ環境親和的で、高純度の２，６−ナフタレンジカルボン酸を生産することができる。したがって、本発明のシュードモナス属ＨＮ−７２は産業的に極めて有用である。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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