(57)【要約】  本発明は、免疫調節性ポリペプチド、例えばＩＬ−１０をコードする核酸配列を移植される臓器の細胞に形質導入し、その発現が宿主の免疫系による移植臓器の拒絶反応の可能性を減少させるための組み換え体アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの使用に関する。患者に臓器を移植する前に、単離した臓器にＩＬ−１０をコードするｒＡＡＶベクターを投与することにより臓器移植の効率を改善する方法もまた記載される。形質導入される臓器は、心臓、腎臓、肝臓、膵島、肺、または腸であってもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者に臓器移植を行う方法であって、
移植される臓器に免疫調節性導入遺伝子をコードする組み換え体アデノ随伴ウイルス    （ｒＡＡＶ）を投与し；次いで
前記患者に前記臓器を移植すること
を含む方法。
【請求項２】
免疫調節性導入遺伝子がＩＬ−１０である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記患者に免疫調節剤を投与することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国法典第３５編１１９条（ｅ）項の下で２００５年７月７日に提出した米国仮出願第６０／６９７４５９号に対して優先権を主張するものであり、その内容を出典明示により本明細書に一体化させる。
【０００２】
本発明は、臓器移植に関する分野であり、特に移植した臓器の免疫により媒介される拒絶を予防するためのより効果的な方法である。
【背景技術】
【０００３】
臓器移植の成功は、宿主免疫系による移植した臓器の拒絶によって制限される。急性移植片拒絶反応は、移植直後の免疫応答を意味し、慢性拒絶反応は、同種反応性抗体形成、白血球浸潤および心臓移植に見られるような慢性移植片動脈疾患に顕著であるより長期の拒絶反応を意味する。全身性の一般的な免疫抑制が臓器の拒絶を予防することに用いられうるが、かかる全身性の免疫抑制は、患者を日和見感染症、がん（例えば、血液がん）、ならびに骨粗鬆症、高血圧、肥満症、糖尿病、創傷治癒の低下、クッシング様、気分変動、骨髄圧迫、肝機能不全、脱毛、腎毒性、心筋症、特に慢性拒絶反応に対抗するために長期間にわたって用いられた時の消化の問題を含むその他の望ましくない合併症に晒す。慢性拒絶反応を回避する臓器移植の改善方法が必要である。
【０００４】
ＩＬ−１０は、末梢性Ｔ細胞寛容において重要な役割を果たす免疫抑制性調節因子である。ＩＬ−１０は、長期生着移植片に関連するＴｈ−１からＴｈ−２までのサイトカイン産生に影響することが示されている。Ｔｈ１−分化サイトカインであるＩＬ−１２の合成を阻害することにより、ＩＬ−１０は、Ｔ１の発生、サイトカインＩＮＦ−γの産生およびＩＬ−２を妨害し、それゆえにＣＴＬ反応により起こりうる移植片破壊を免れる。ＩＬ−１０はまた、移植片生着のメカニズムのうちの１つであるＦａｓ／ＦａｓＬ経路を媒介して同種反応性Ｔ細胞のアポトーシスを促進することが示されている。加えて、ＩＬ−１０は、ＭＨＣクラスＩＩおよびＡＰＣにおける共刺激分子ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を下方調節する。結果的に、ＩＬ−１０の存在下における同種抗原によるＴ細胞の反復的な刺激は、ＩＬ−１０を産生する調節性Ｔ細胞および抑制活性を有するＴＧＦ−βを誘導し、移植片拒絶反応の予防となる。
【０００５】
ＩＬ−１０遺伝子治療は、様々な移植モデルにおいて試験されている（表１）。表１の数字は、関連する研究を記載する参考文献を意味する。
（表１）
臓器移植におけるＩＬ−１０遺伝子治療実験（引用した文献）
【０００６】
【表１】
2009500417.tif 000002
【０００７】
ＩＬ−１０をコードするプラスミドＤＮＡおよびアデノウイルスベクターを用いる研究は、急性移植片拒絶反応におけるＩＬ−１０の有効性を示した。しかしながら、プラスミドまたはアデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびレトロウイルスのごときウイルスベクターからのＩＬ−１０発現は、移植片において遺伝子導入効率が限定されていることおよび導入遺伝子の発現が一時的であることにより、同種移植片の生着を延長する際の成功は限られたものであった（３−９、１５）。
【０００８】
慢性移植片拒絶反応の可能性を減少させるのに十分持続性のある局所的ＩＬ−１０発現を生じる、臓器移植のためのＩＬ−１０遺伝子治療の改良された方法が必要である。
【０００９】
（要約）
一の態様では、本発明は、免疫調節性ポリペプチド、例えばＩＬ−１０をコードする核酸配列を伴って、移植される臓器の形質導入細胞への組み換え体アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの使用であって、その発現が宿主免疫系による移植臓器の拒絶反応の可能性を減少させる使用に関する。
【００１０】
別の具体例では、移植される臓器へのｒＡＡＶ形質導入に加えて、本発明は、急性拒絶反応を抑制する免疫調節剤の使用をさらに含む。一の具体例では、免疫抑制剤はほぼ移植時に投与される。別の具体例では、免疫抑制剤は移植前に投与される。さらにさらなる具体例では、免疫抑制剤は、ＩＬ−１０およびＦＫ５０６を含むが、それらだけに限らない群から選択される１つまたはそれ以上の薬剤である。他の具体例では、免疫調節剤による処理は、いったん免疫調節性ポリペプチド、例えばＩＬ−１０のｒＡＡＶにより調節される発現が開始されると、削減または中止される。
【００１１】
別の態様では、本発明は、患者に臓器を移植する前に、単離された臓器にＩＬ−１０をコードするｒＡＡＶベクターを投与することによって臓器移植の効率を改善する方法に関する。一の具体例では、ＩＬ−１０は、ｒＡＡＶベクターの投与後、少なくとも単離された臓器の細胞のいくつかで発現される。別の具体例では、ＩＬ−１０の発現は、Ｔｈ１様からＴｈ２様の免疫反応への変化を引き起こす。様々な具体例では、移植される臓器は心臓、腎臓、肝臓、膵島、肺および腸である。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
一の具体例では、本発明は、患者への臓器の移植前に、免疫調節性ポリペプチド、例えばＩＬ−１０をコードするｒＡＡＶベクターによって単離された臓器を処置することに関する。免疫調節性ポリペプチドをコードする核酸配列は、本明細書では導入遺伝子と称される。移植した臓器の細胞および組織内における導入遺伝子の発現は、移植片拒絶反応を遅延させるものであってもよく、または／および予防するものであってもよい。
【００１３】
本発明の方法で用いられてもよい適する免疫調節性ポリペプチドは、ＩＬ−１０、ＩＬ−１阻害因子、ＣＤ−４０リガンド阻害因子、ＴＧＦ−β、ＧＩＴＲおよびＦＯＸＰ３を含むが、それらだけに限らない。
【００１４】
ＡＡＶベクターは微量の組織免疫反応を伴って持続的な導入遺伝子の発現を提供するが、ＡＡＶベクターからの導入遺伝子発現の開始は、通常、アデノウイルスベクターでは数時間であることと比較して１−２週間遅延する。それゆえ、ＡＡＶベクターの使用は免疫調節剤と組み合わされてほぼ移植と同時に投与されてよく、他の具体例では、免疫調節剤は、いったん導入遺伝子の発現が開始されると、削減または中止される。さらにさらなる具体例では、免疫調節剤の投与は、いったん導入遺伝子が移植片拒絶反応を予防するのに十分なレベルで発現されると中止される。
【００１５】
本明細書で用いられるように、免疫調節剤は、遺伝子治療による導入遺伝子、例えば、小分子、ペプチドまたはタンパク質として送達されない免疫調節物質のいずれかを意味する。免疫調節剤は、ＩＬ−１０タンパク質、ＦＫ５０６、シクロスポリン、ラパミシン、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、シクロホスファミド、レフルノミド、およびコルチコステロイドを含むが、それらだけに限らない。本発明の様々な具体例では、単一の免疫調節剤が用いられてもよく、または２もしくはそれ以上の免疫調節剤が経時的もしくは同時的に組み合わせて用いられてもよい。
【００１６】
当業者は、本発明の方法によって臓器移植を受ける患者に免疫調節剤を送達する最適な時期を動物実験または臨床検査により容易に決定することができるであろう。同様に、当業者は、ｒＡＡＶにより媒介されるＩＬ−１０発現が開始するまでに、急性拒絶反応を予防するのに最適である既知の免疫調節剤を決定するための実験を行うことができるであろう。
【００１７】
移植臓器における長期のＩＬ−１０発現が慢性拒絶反応を予防するかどうかは、一部には同種反応性抗体形成、白血球浸潤、および心臓移植に見られるような慢性移植片動脈疾患によって調べられるであろう。
【００１８】
実施例１．同系の心臓および腎臓の移植片におけるｒＡＡＶ−ＩＬ−１０の使用
以下の実験を、コントロールとしてＡＡＶ−ヌルベクターで処置したラットを用いて、同系の心臓および腎臓の移植片におけるＡＡＶ２−ラットＩＬ−１０（ｒＩＬ−１０）の形質導入効率を決定するために実施した。この実験を用いることにより、エクソビボ形質導入後の移植片における導入遺伝子ｒＩＬ−１０発現の開始時期、レベル、持続期間を確立する。
＊  順行性（Ａｎｔｅｒｏｇｒａｄｅ）／単離された心臓または腎臓は、冷却状態において１ｘ１０１２ｖｇベクターで２０分間灌流される。
＊  臓器は自己宿主に移植される。
＊  形質導入効率を７、１４、２８、５６および１８０日に調べた。
１．ＤＮＡ  ＦＩＳＨを導入遺伝子ｒＩＬ−１０  ＤＮＡについて行い、                ＩＦを移植片におけるｒＩＬ−１０タンパク質発現について行った。
２．体内分布を、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓および末梢血単核球を含む                様々な組織におけるＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲによって調べた。
３．全身のｒＩＬ−１０の産生を血清ｒＩＬ−１０レベルのＥＬＩＳＡア
ッセイにより測定した。
【００１９】
【表２】
2009500417.tif 000003
【００２０】
実施例２．心臓および腎臓の同種移植片におけるｒＡＡＶ−ＩＬ−１０の使用
以下の実験を行い、同種移植片生着を延長する時のＡＡＶ２−ｒＩＬ−１０の形質導入効率を決定する。ラット群は、表３に示されるように、ＡＡＶベクターで形質導入した移植臓器を受容する。ｒＩＬ−１０タンパク質をいくつかの実験における免疫調節剤として投与して、形質導入と導入遺伝子発現の開始の間の時間差を埋める。ＩＬ−１０の全身投与がマウスにおける心臓同種移植片拒絶反応の悪化を示すことから、ＡＡＶにより媒介されるＩＬ−１０発現が確立される時まで、その他の実験においてはＩＬ−１０の代わりに慣用的な免疫調節剤ＦＫ５０６を投与する。コントロール実験は、未処理；ＡＡＶ２−ヌルベクター；およびＡＡＶベクターなしの慣用的な免疫調節剤のみを含む。
【００２１】
【表３】
2009500417.tif 000004
【００２２】
下記の解析を行う。移植片生着の持続期間を決定する。モノカインであるＴｈ１サイトカインの発現を測定することにより、それらがＡＡＶ２−ｒＩＬ−１０により形質導入された移植片で下方調節されるかどうかを決定する。ＩＬ−１０によって調節されるサイトカインのより広域なスペクトルをスクリーニングすることが必要ならば、サイトカインのタンパク質チップを用いてもよい。最終的に、同種特異的Ｔ細胞の反応性の場合と同様に、同種反応性抗体および白血球浸潤のレベルを決定する。
【００２３】
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【国際調査報告】
2009500417.tif 000005
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