(57)【要約】  （ｉ）マルトデキストリン基質に対する標的タンパク質の結合親和性及び／又は（ｉｉ）標的タンパク質の溶解度の少なくとも１つを増加させるための方法及び組成物が提供される。本方法及び組成物は、修飾されたマルトース結合タンパク質に関する。
2009533058.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾されたマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）であり、タンパク質に融合された場合に、前記修飾されたＭＢＰが（ｉ）マルトデキストリン基質に対する結合親和性及び（ｉｉ）前記タンパク質が限定された溶解度を有する場合における溶解度のうち少なくとも１つの増加を有するようにする変異を有するＭＢＰアミノ酸配列を含む、前記修飾されたマルトース結合タンパク質。
【請求項２】
変異が、タンパク質のへリックスＸＩとＸＩＩの間のヒンジ領域中に位置し、又はＡ３１３の１０オングストローム内の領域中に位置する、請求項１に記載の修飾されたＭＢＰ。
【請求項３】
変異が、タンパク質のＣドメイン中に位置し、又はβシートＦの先頭のＳ１４６の１０オングストローム以内の領域中に位置する、請求項１に記載の修飾されたＭＢＰ。
【請求項４】
変異がＡ３１３Ｖである、請求項１に記載の修飾されたＭＢＰ。
【請求項５】
変異がＳ１４６Ｔである、請求項１に記載の修飾されたＭＢＰ。
【請求項６】
融合タンパク質を形成するために標的タンパク質に融合された、請求項１に記載の修飾されたＭＢＰ。
【請求項７】
融合タンパク質が、標的タンパク質に融合された修飾されていないＭＢＰタンパク質の溶解度より大きな溶解度を有する、請求項６に記載の修飾されたＭＢＰ。
【請求項８】
配列番号４又は配列番号６を含む、請求項１に記載された修飾されたＭＢＰ。  
【請求項９】
配列番号３又は配列番号５を含む、修飾されたＭＢＰをコードする単離されたＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項９に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
形質転換された宿主細胞が形質転換されたイー・コリ宿主細胞である、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
形質転換された宿主細胞が形質転換されたクルイベロミセス宿主細胞である、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
ベクターがｐＫＩＭＦ２である、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１に記載の修飾されたＭＢＰと標的タンパク質を含む融合タンパク質を宿主細胞中で発現させること、
修飾されたＭＢＰ融合タンパク質をマトリックスに結合させること、及び
精製されたタンパク質を取得するために、選択された緩衝液中のマトリックスから融合タンパク質を溶出することを含む、
タンパク質を精製する方法。
【請求項１６】
マトリックスが多糖である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
炭水化物がマルトデキストリンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
修飾されたＭＢＰがＡ３１３Ｖ及びＳ１４６Ｔから選択される変異を有する、請求項１５に記載の方法。  
【請求項１９】
修飾されたＭＢＰが配列番号４を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
修飾されたＭＢＰが配列番号６を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
修飾されたＭＢＰが配列番号３又は配列番号５によってコードされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
宿主細胞がクルイベロミセス又はイー・コリである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
インビボにおいて、融合タンパク質が、変異体ＭＢＰの不存在下で観察できるより大きな程度まで、及び変異されていないＭＢＰを用いて観察されるより大きな程度まで可溶化されるように、標的タンパク質に融合された修飾されたＭＢＰを発現させることを含む、標的タンパク質を可溶化する方法。
【請求項２４】
修飾されたＭＢＰがＡ３１３Ｖ変異又はＳ１４６Ｔ変異を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
修飾されたＭＢＰがＡ３１３Ｖ変異及びＳ１４６Ｔ変異を有する、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
純粋なタンパク質の大量が必要とされる場合には常に、組み換えタンパク質は、バイオテクノロジーにおいて多くの用途を有している。エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び酵母などの微生物発現系は、しばしば、低いコストと高い収率のために、第一の選択肢となる。イー・コリ中で外来タンパク質を発現させる場合には、タンパク質の発現の低いレベル及び／又は不溶性という問題に遭遇することが珍しくない。タンパク質が十分に発現され、可溶性を保ったとしても、細胞抽出液中の他のタンパク質の多数から精製しなければならない。標的タンパク質の発現及び精製を容易にするために、一般的に使用されている１つの方法は、タンパク質に親和性タグを融合することである。優れた親和性タグは、標的タンパク質のＮ末端に融合された場合に、高いレベルの発現を促進するとともに、発現環境から標的タンパク質を精製可能とする単純な一工程のアフィニティー精製を提供する特性を有する。
【０００２】
イー・コリのマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）は、イー・コリ中で産生された外来タンパク質の発現及び精製用のアフィニティータグとして一般に使用される。ＭＢＰの本来の役割は、外膜ポリンのマルトデキストリンを結合し、内膜中のＭａｌＥＦＫ輸送装置にマルトデキストリンを放出することである。標的タンパク質のＮ末端にＭＢＰのＣ末端を融合することによって、イー・コリ中での融合タンパク質の発現が可能となる（図１）。ＭＢＰ及びＭＢＰ融合物は、アミロース、デンプン又は他のマルトデキストリンなどの多数のグルコース−α−＞４−グルコース多糖の何れをも含有するクロマトグラフィーマトリックスへの結合によって、単一の工程で精製することができる（米国特許第５，６４３，７５８号）。本来の宿主中において可溶性である多くのタンパク質は、組み換えタンパク質として発現された場合には不溶性である。これらのタンパク質の多くは、ＭＢＰへの融合によって、可溶性となる（Ｋａｐｕｓｔ  ＆  Ｗａｕｇｈ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．８：１６６８−７４（１９９９））。
【０００３】
親和性タグとしてのＭＢＰの有用性は、ＭＢＰ−標的タンパク質精製におけるタンパク質に応じて、他の融合程うまくアフィニティーマトリックスに結合しない融合もあるという事実によって制限される。さらに、ＴｒｉｔｏｎＸ１００及びＴｗｅｅｎ２０などの非イオン性界面活性剤の存在は、特に、本質的により低い親和性を有するＭＢＰ−標的タンパク質融合物に対する結合を妨害し得る。
【０００４】
研究者は、ＭＢＰの結合特性を変化させるために、ＭＢＰの構造を使用し指定された変異を作製してきた。ＭＢＰのＸ線結晶構造は、「Ｓｐｕｒｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：５２０２−５２１９（１９９１）」によって報告されてきた。ＭＢＰは２つのドメインからなり、ドメイン間に間隙を有し、ここに多糖が結合する。Ｎ末端を含有するドメインはＮドメインと名付けられ、Ｃ末端を含有するドメインはＣドメインと名付けられている。３つのループは、２つのドメイン間を横断して、ヒンジを形成する。２つのグループは、マルトース及びマルトトリオースに対するＭＢＰの親和性を増加させるヒンジ後方の領域に対して指定された変異を施すために、本構造を使用してきた（Ｍａｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８：７９５−７９８（２００１）；Ｔｅｌｍｅｒ  ＆  Ｓｈｉｌｔｏｎ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４５５５−３４５６７  （２００３））。しかしながら、ＭＢＰへの修飾はタンパク質の表面の疎水性を増加させ、従って、その溶解度を減少させるので、このアプローチは固有の欠点を有している。このため、融合タンパク質を不溶性にするその傾向を増加させることによって、親和性タグとしてのその有用性が低下する。
【発明の開示】
【０００５】
本発明の一実施形態において、修飾されたマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）であり、修飾されたＭＢＰ融合タンパク質が（ｉ）マルトデキストリン基質に対する増加した親和性及び（ｉｉ）限定された溶解度を有する標的タンパク質に融合された際の増加した溶解度から選択される少なくとも１つの特性を有するようにする変異を有するＭＢＰアミノ酸配列によって特徴付けられる修飾されたＭＢＰが提供される。本発明のさらなる実施形態において、修飾されたＭＢＰは、へリックスＸＩとＸＩＩの間のヒンジ領域中に、又はタンパク質のＡ３１３の１０オングストローム内の領域中に位置する変異を有する。例えば、変異は、Ｃドメイン中に、又はＭＢＰのβシートＦの先頭のＳ１４６の１０オングストローム以内の領域中に位置し得る。修飾は、具体的には、Ａ３１３Ｖ又はＳ１４６Ｔであり得る。
【０００６】
本発明のさらなる実施形態において、修飾されたＭＢＰは、融合タンパク質を形成するために標的タンパク質に融合され得、例えば、標的タンパク質に融合された修飾されていないＭＢＰタンパク質の溶解度を上回る溶解度を有し得る。
【０００７】
本発明の一実施形態において、修飾されたＭＢＰは、配列番号４若しくは配列番号６から選択されるアミノ酸配列又は配列番号３若しくは配列番号５から選択されるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有し得る。ＤＮＡは、クルイベロミセス又はイー・コリなどの宿主細胞中で発現用ｐＫＬＡＣ１ベクターなどのベクター中に取り込まれ得る。
【０００８】
本発明の一実施形態において、クルイベロミセス又はイー・コリなどの宿主細胞中で、上記修飾されたＭＢＰ及び標的タンパク質の何れかを含む融合タンパク質を発現させることを含む、タンパク質を精製するための方法が提供される。修飾されたＭＢＰ融合タンパク質は、マルトデキストリンを例とする多糖などのマトリックスに結合することが可能である。次いで、精製されたタンパク質を取得するために、融合タンパク質は、選択された緩衝液中のマトリックスから溶出することが可能である。
【０００９】
本発明のさらなる実施形態において、融合タンパク質が、変異体ＭＢＰの不存在下で観察できるより大きな程度まで、及び変異されていないＭＢＰを用いて観察されるより大きな程度まで可溶化されるように、標的タンパク質に融合されたＭＢＰ変異体を発現させることを含む、標的タンパク質を可溶化する方法が提供される。変異の例には、Ａ３１３Ｖ変異及び／又はＳ１４６Ｔ変異が含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書において使用される用語が、以下に論述されている。
【００１１】
「野生型」ＭＢＰは、ポリリンカー中に停止コドンを有するｐＭＡＬ−２プラスミドの１つ、例えば、ｐＫＯ１４８３の誘導体からの発現によって産生されたＭＢＰタンパク質が含まれる。
【００１２】
「変異体ＭＢＰに融合されたタンパク質の増強された溶解度」とは、野生型ＭＢＰに融合された同じタンパク質と比べた場合における可溶性タンパク質の量の増加である。溶解度は、例えば、不溶性材料が、例えば、遠心によって不溶性物質が除去される前に存在する当該タンパク質の全量に対する可溶性タンパク質の比として表すことができる。
【００１３】
「変異体ＭＢＰの増加された親和性」又は「変異体ＭＢＰ融合タンパク質」には、一連の所定の条件下における、マルトデキストリンなどの固体基質に結合するタンパク質の量の増加が含まれる。アフィニティー精製の効率は、カラムに適用されたタンパク質の総量に対する、指定の条件下でのマルトデキストリンに結合し、次いで、指定の緩衝液で溶出されるタンパク質の比として表すことができる。
【００１４】
本発明の本実施形態は、標的タンパク質に融合された場合に、インビボでの発現の間に、融合タンパク質の溶解度を増強し、精製の間の融合タンパク質の親和性を改善することもできるＭＢＰ変異体を提供する。本実施形態には、野生型ＭＢＰが部分的な結合を示す条件下で培地に適用された場合に、多糖溶媒（マルトデキストリンを含むものなど）への増加した結合を示す変異体ＭＢＰが含まれる。次いで、例えば、可溶性マルトデキストリンの溶液を用いて、修飾されたＭＢＰを培地から溶出し、野生型ＭＢＰと比較した場合に、少なくとも１．５から１０倍多いタンパク質を与える。
【００１５】
ＭＢＰのこれらの改良された変異体を発見するために、多数の試料を取り扱えるようにする技術を開発することなどの技術的な障壁を乗り越えなければならない。大規模な精製に対して音波処理が実用的でなく、溶解緩衝液がＭＢＰのアフィニティー結合を妨害し得る場合に、これには、可溶化された融合タンパク質を放出するために宿主細胞を切断するための改善された方法が必要とされる。界面活性剤及びリゾチームを滴定することによって、結合親和性に対して悪影響を与えずに、宿主細胞を効果的に切断するためのこれらの溶解試薬の適切な濃度及び比を同定することが可能であることが発見された。
【００１６】
所望の結合親和性特性を有する変異体に対してスクリーニングするために、各ウェルが融合タンパク質を結合するためのミクロマトリックスを含有し、フィルター装置がろ液中のきょう雑物を除去する９６ウェルミクロプレートが使用された。これにより、多数の試料の迅速なスクリーニングが可能となった。
【００１７】
タンパク質を精製するための改善されたタグとして、修飾された変異体ＭＢＰタンパク質を取得及び検査するためのスクリーニング法は、実施例に記載されている。マトリックスに対してより高い親和性を有するこのような修飾されたＭＢＰは、マトリックスへの結合が乏しい、又は非イオン性界面活性剤の存在によって、結合が破壊されるＭＢＰ融合タンパク質の野生型ＭＢＰに付随する問題を解決する。
【００１８】
実施例において、スクリーニング操作を用いて単離された、改善された溶解度及び多糖マトリックスへの改善された結合親和性という所望の特性を有する２つの変異（Ｓ１４６Ｔ及びＡ３１３Ｖ）が記載されている。Ｓ１４６Ｔ変異は、βシートＦの先頭のＭＢＰのＣドメイン中に存在する。不溶性である標的タンパク質がこの変異を含有するＭＢＰに融合されると、融合タンパク質の溶解度が増強される。本明細書中に記載されているＡ３１３Ｖ変異は、２つのドメイン間を横切る第三のヒンジ領域中、特に、ヘリックスＸＩとＸＩＩの間のループ中に位置する。この変異は、融合タンパク質の溶解度と親和性の両者を増強する。イー・コリ中の外来タンパク質を発現させると、タンパク質は、不溶性凝集物の形態で部分的に又は完全に発現され得る。特定の実施例では、溶解度は、総溶解度の上限を伴って、１．１又はそれ以上、上方向に増加され得る。
【００１９】
本明細書に引用される全ての参考文献及び２００６年４月１４日に出願された米国仮出願第６０／７９２，１３３号は、参照により、組み込まれる。
【００２０】
実施例
材料
制限酵素、β−アガラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４リガーゼ、南極ホスファターゼ、Ｌｉｔｍｕｓ３８、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ及びｐＭＡＬ−ｃ２Ｇを含むｐＭＡＬタンパク質融合及び精製系、アミロース樹脂（＃Ｅ８０２１）、西洋ワサビペルオキシダーゼに連結された抗ＭＢＰモノクローナル抗体（＃Ｅ８０３８）、ＵＳＥＲＦｒｉｅｎｄｌｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  キット、ベクターｐＫＬＡＣ１、宿主株ＴＢ１、ＥＲ１９９２、ＥＲ２５０２、ＥＲ２９８４、ＮＥＢ５−α及びＮＥＢＴｕｒｂｏを含むＫ．ラクティスタンパク質発現キット並びに合成オリゴヌクレオチドは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、  Ｉｎｃ．（ＮＥＢ）、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡから取得した。フィルター底付きのＵｎｉｆｉｌｔｅｒ８００マイクロタイターマイクロプレートは、Ｗｈａｔｍａｎ、Ｂｒｅｎｔｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄから購入した。Ｍｉｎｅｌｕｔｅ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎキットは、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡから購入した。Ｍｅｇａ１０は、Ｄｏｊｉｎｄｏ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤから購入した。ニワトリ卵白リゾチーム、クマシーブリリアントブルーＲ及び酸洗浄されたガラスビーズ（４２５から６００ミクロン）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから購入した。Ｓｅａ  Ｐｌａｑｕｅ  ＧＴＧ低融点アガロースは、Ｃａｍｂｒｅｘ、  Ｅ．  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、  ＮＪから購入した。使い捨てポリプロピレンカラム（＃７３２−６００８）は、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡから購入した。１０から２０％のグラジエントゲルは、Ｄａｉｉｃｈｉ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ又はＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ／Ｎｏｖｅｘ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡの何れかから購入した。ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭプロテアーゼ阻害剤カクテルは、Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから購入した。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅｓｔａｉｎは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから購入した。ヒトジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）ｃＤＮＡクローンｐＯＴＢ７−ＤＨＦＲは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＭＧＣ：８５７）から購入した。ＧＡＰＤＨ遺伝子は、ｐＪＦ９３１から入手した（Ｆｏｘ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５３７：５３−５７（２００３））。
【００２１】
技術
セラチア・マルセッセンスヌクレアーゼは、ＰＣＴ／ＵＳ０５／２８７３９に記載されているとおりに取得した。プラスミドＤＮＡのＭｉｎｉｐｒｅｐは、Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎキットを用いて調製した。ランダムＰＣＲ突然変異導入は、「Ｆｒｏｍａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２４，  ３４７−３５３  （１９９５）」に記載されているとおりに実施した。ＰＣＲは、注記されていることを除き、Ｖｅｎｔ（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて行った。１％ＳｅａＰｌａｑｕｅＧＴＧ低融点アガロース上で電気泳動を行い、バンドを切り出し、ＭｉｎｅｌｕｔｅＤＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いてＤＮＡを精製し、又は７５℃で５分間、ＤＮＡを融解させ、３７℃まで冷却し、βアガロースで１から２時間消化することによって、ＤＮＡ断片をゲル精製した。ＤＮＡ配列決定は、ＢｉｇＤｙｅ標識された色素ターミネーター化学（ＡＢＩ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を使用し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの（ＡＢＩの）自動化されたＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒモデル３１００ＡＢＩ上で行った。アクリルアミドゲルの供給者の指示書に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、別段の記載がある場合を除いて、クマシーブリリアントブルーＲでの染色によって、タンパク質を可視化した。
【００２２】
ｐＭａｌ−ｃ２Ｘ又はｐＭａｌ−ｃ２Ｇ又はｐＭａｌ−ｃ２Ｇの誘導体の何れかからＭＢＰを発現させた。ｍａｌＥ中の変異を特定するための塩基の付番は、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ配列中の塩基番号を表す（図２Ａ−１、２Ａ−２、２Ｂ−１、２Ｂ−２、２Ｃ−１及び２Ｃ−２（配列番号１から６））。ｐＭＡＬ−ｃ２Ｇ誘導体ｐＳＮ１５７８は、ＢｓｍＩ及びＢｓｉＷＩでプラスミドを切断し、４つのｄＮＴＰを全て加えて、ＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗ断片で産物を処理した後、ｍａｌＥ遺伝子内に欠失を作出するために連結することによって作製した。
【００２３】
「Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３３：６２２５−６２３４（２００５）」に記載されているように、位置指定突然変異導入は、４プライマーのＰＣＲ突然変異導入を用いて実施した。ＭＢＰ及びＭＢＰ融合タンパク質は、幾つかの事例において、音波処理の代わりにリゾチーム／界面活性剤溶液で細胞を溶解したことを除き、ｐＭＡＬＰｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍの指示書に記載されているとおりに精製した。
【００２４】
培養の５００ないし１０００ｍＬから調製された未精製細胞抽出を用いて、大規模な精製を実施し、アミロース樹脂１５ｍＬを含有する２．５ｃｍ直径のカラム上に搭載した（ＮＥＢ  ＃Ｅ８０２１，  Ｉｐｓｗｉｃｈ，  ＭＡ）。培養の６７ｍＬから調製された未精製抽出物を用いて、小規模な精製を実施し、アミロース樹脂１ｍＬを含有する使い捨てポリプロピレンカラム上に搭載した。１０から２０％グラジエントゲルを用いて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した。ゲルバンドの定量のために、セロファンシートの間でゲルを乾燥させ、Ｍｉｃｒｏｔｅｋ  ＩＩＩ  ｓｃａｎｎｅｒ  Ｍｉｃｒｏｔｅｋ，  Ｃａｒｓｏｎ，  ＣＡを用いて走査し、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して濃度測定行った。
【実施例１】
【００２５】
改善された特性を有するＭＢＰ中の変異体の単離
精製後の改善された収率に対するスクリーニング：
ｐＭＡＬ−ｃ２ｘから得られるｍａｌＥ遺伝子のランダムな突然変異導入は、プライマー：オリゴ１：５’ＧＧＡＧＡＣＡＵＧＡＡＴＴＣＡＡＴＧＡＡＡＡＴＣＧＡＡＧＡＡ（配列番号９）及びオリゴ２：５’ＧＧＧＡＡＡＧＵＡＡＧＣＴＴＡＡＴＣＣＴＴＣＣＣＴＣＧＡＴＣ（配列番号１０）を使用する変異性のＰＣＲによって達成した。
【００２６】
製造業者の指示書に従い、ＵＳＥＲＦｒｉｅｎｄｌｙＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて、直鎖化されたｐＮＥＢ２０８Ａ中にＰＣＲ断片をクローニングした。１ｍＬＬＢ＋１ｍＭＩＰＴＧ及び１００μｇ／ｍＬアンピシリン中で形質転換体を一晩増殖させた後、０．３ｍｇ／ｍＬリゾチーム及びＳ．マルッセンスヌクレアーゼ２０単位を添加によって溶解させ、１０分間温置し、次いで、２％Ｔｗｅｅｎ２０の０．１ｍＬを添加することによって溶解した。
【００２７】
Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ８００マイクロプレート中のアミロース樹脂カラム（ＮＥＢ＃Ｅ８０２１，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）５０μＬに、未精製抽出物を適用し、２０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、０．２ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４の０．７ｍＬ（カラム緩衝液）で、次いで、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．２ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．２の０．７ｍＬで各ウェルを洗浄した。次いで、１０ｍＭマルトース、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．２ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．２の０．２ｍＬで、アミロース樹脂に結合されたタンパク質を溶出した。Ｉｍｍｕｌｏｎ２ＨＢミクロタイタープレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に溶出液を移し、４℃で一晩温置した。次いで、マイクロタイターウェルを空にし、２０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５（ＴＢＳＴ）で二回洗浄し、次いで、３７℃で１時間、０．３６ｍＬＴＢＳＴ＋３％ウシ血清アルブミンでブロッキングを行った。
【００２８】
ＴＢＳＴで、ウェルを二回洗浄し、次いで、ＴＢＳＴ＋３％ウシ血清アルブミン中の、西洋ワサビペルオキシダーゼに連結された抗ＭＢＰモノクローナル抗体の１：２０００希釈物の０．１ｍＬを各ウェルに添加し、３７℃で１時間、プレートを温置した。ウェルを空にし、次いで、ＴＢＳＴで二回洗浄した。０．０１％ｏ−フェニレンジアミン、０．００３％過酸化水素水で、ウェルを展開した。４ＭＨ２ＳＯ４０．０２５ｍＬを添加することによって検出反応を停止させ、４９０ｎｍで、ウェルを分光学的にアッセイした。野生型ＭＢＰと比べて、より高い結合及び溶出を示した試料に対応する可溶化液から細胞を回収した。より高い結合及び溶出を確認するために、これらの候補を増殖し、再度検査した。
【００２９】
ランダム突然変異誘発後に得られた変異の性質決定及び分離
増加した結合及び溶出特性を有するＵＳＥＲ中のライブラリーから得た２つの単離株を配列決定した（図２）。１つの単離株Ｇ８−１は、サイレント変異とともに、単一のミスセンス変異Ｇ１９６４Ｃを有することが見出された。Ｇ１９６４Ｃ変異は、ＭＢＰ中のアミノ酸変化Ｓ１４６Ｔに対応する。他の単離株Ａ９は、サイレント変異とともに、３つのミスセンス変異Ａ１５８３Ｇ、Ａ２４１９Ｇ及びＣ２４６５Ｔを有することが見出された。Ａ１５８３Ｇ、Ａ２４１９Ｇ及びＣ２４６５Ｔ変異は、それぞれ、アミノ酸変化Ｎ１９Ｓ、Ｋ２９８Ｅ及びＡ３１３Ｖに対応する。
【００３０】
ｐＭａｌ−Ｃ２Ｘ又はｐＳＮ１５７８中へのサブクローニング
以下のプライマー：オリゴ３：５’ＧＡＣＴＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧＧＴＡＡＡＣＴＧＧＴＡＡＴＣＴＧＧＡＴＴＡＡＣＧＧＣ（配列番号１１）及びオリゴ４：５’ＡＴＡＴＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＣＴＴＣＣＣＴＣＧＡＴＣＣＣＧＡＧＧＴ（配列番号１２）を用いて、各単離株をＰＣＲによって増幅した。増幅されたＤＮＡをエタノール沈殿し、ＮＥＢｕｆｆｅｒ４（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）中のＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ゲル精製した。ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでｐＳＮ１５７８を切断し、ベクター骨格をゲル精製した。Ｇ８−１及びＡ９断片をｐＳＮ１５７８断片と混合し、連結し、ＴＢ１を形質転換するために、この連結を使用した。各形質転換体から得たプラスミド調製物の配列を決定し、Ｇ８−１に関してはｐＩＨ１５９６と命名し、Ａ９に関してはｐＩＨ１５９３と命名した。本実験における３’プライマーは、ｍａｌＥ翻訳がｐＭＡＬのｌａｃＺα断片中に進行するのを防ぐために、正しいリーディングフレーム中に停止コドンを有する。従って、これらのサブクローンは、ポリリンカーによってコードされるアミノ酸配列．．．ＩＥＧＲの後で終了する修飾されたＭＢＰを産生する。野生型ｍａｌＥ遺伝子後に停止コドンを含有する対照プラスミドは、ｍａｌＥとｌａｃＺａの間のポリリンカー中のｐＭＡＬ−ｃ２ＸをＸｂａＩで切断することによって構築された。ＤＮＡポリメラーゼＩ、巨大断片（Ｋｌｅｎｏｗ）及び４つの全てのｄＮＴＰを用いて、ＸｂａＩ突出部を充填し、次いで、Ｔ４リガーゼでの処理によって、プラスミドを再度環状化した。これは、ｍａｌＥと同じ読み枠中に停止コドンを導入し、この誘導体は、ポリリンカーによってコードされる８残基の伸長を除き、Ｇ８−１及びＡ９によって産生されるものと同等のＭＢＰを産生する。この対照プラスミドは、ｐＫＯ１４８３と名付けられた。ＬＢ＋０．１％グルコース及び１００μｇ／ｍＬアンピシリンの５００ｍＬ培養物中で、２×１０８細胞／ｍＬになるまで、ｐＫＯ１４８３、ｐＩＨ１５９６及びｐＩＨ１５９３を含有するイー・コリＴＢ１を増殖させ、０．３ｍＭＩＰＴＧで誘導し、３７℃で２時間増殖させ、次いで、採集した。カラム緩衝液２５ｍＬ（１０ｍＭマルトース、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．２ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．２の０．２ｍＬ）＋１０ｍＭβ−メルカプトエタノール中に細胞を再懸濁し、次いで、音波処理によって溶解された。９０００×ｇで３０分間遠心することによって、抽出物を清澄化し、次いで、カラム緩衝液を用いて１:４希釈し、アミロース樹脂の１５ｍＬカラム上に搭載した。約１２５ｍＬカラム緩衝液でカラムを洗浄し、カラム緩衝液＋１０ｍＭマルトースで溶出した。３つの株の間で、ＭＢＰの収率を比較した（図３）。結果は、修飾されたＭＢＰがアミロースへの増加した結合及び適切な緩衝液中への溶出を示したことを確認する。
【００３１】
３つの変異のうち何れがＡ９バリアントの増加した結合に必要であるかを確認するために、ｐＳＮ１５７８（ｍａｌＥ遺伝子の内部に欠失（これは、挿入物を受容したクローンの簡単な同定を可能とする。）を有するｐＭＡＬ−ｃ２Ｇ誘導体）中に、３つの変異を別個にサブクローニングした。Ａ１５８３Ｇ及びＡ２４１９変異は何れも、アフィニティー精製におけるＭＢＰの収率にまったく影響がなく、又は収率を低下させ、廃棄された。Ｎ末端ＰＣＲ断片を作製するためにプライマーオリゴ５：５’ＣＴＴＣＡＡＧＧＧＴＣＡＡＣＣＡＴＣＣＡＡＡＣＣ（配列番号１３）及びオリゴ６：５’ＡＡＴＡＣＧＣＧＧＡＴＣＴＴＴＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＴＣ（配列番号１４）を用い、並びにＣ末端ＰＣＲ断片を作製するためにプライマーオリゴ７：５’ＧＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＴＣＣＧＣＧＴＡＴＴ（配列番号１５）及びオリゴ８：５’ＣＴＧＡＧＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＣＣＴＴＣＣＣＴＣＧＡＴ（配列番号１６）を用いる、第一のテンプレートとしてｐＭＡＬ−ｃ２Ｘを使用する４プライマーの位置指定ＰＣＲ突然変異誘発によって、Ｃ２４６５Ｔ変異を分離して再現した。テンプレートとしてのゲル精製されたＮ末端及びＣ末端断片並びにプライマーオリゴ５及びオリゴ８を用いて、集合工程を実施した。最終ＰＣＲ断片をＢｌｐＩ及びＡｖａＩを用いて切断し、ゲル精製し、ＢｌｐＩ及びＡｖａＩを用いて切断されたｐＭＡＬ−ｃ２Ｘに連結し、ゲル精製した。ＴＢ１を形質転換するために連結を使用し、形質転換体からプラスミドを精製し、Ｃ２４６５Ｔ変異を確認するために配列を決定した。さらなる研究のために単離株を選択し、ｐＩＨ１６０６と名付けた。
【００３２】
ｐＩＨ１６０６の構築において、ＭＢＰの末端の停止コドンは保存されていなかった。この構築物は、ＬａｃＺａａ断片に融合されたＭＢＰを発現する。Ｃ２４６５Ｔ変異の効果をその親Ａ９に対して比較するために、ｐＩＨ１６０６中のｍａｌＥ遺伝子の後に、停止コドンを導入した。ＸｂａＩで、本プラスミドを切断し、Ｋｌｅｎｏｗ＋ｄＮＴＰで充填し、ｐＫＯ１４８３に関して上述されているように、再連結した。停止コドンを有するＣ２４６５Ｔ誘導体は、ｐＰＲ１６１０と称された。ｐＫＯ１４８３及びＡ９と平行して行われた、このプラスミドを有するＴＢ１の大規模ＭＢＰ精製は、Ａ９において見出されたＭＢＰの収率の増加が全て、Ｃ２４６５Ｔ変異によって説明され得ることを示した。この変異は、ＭＢＰのアラニン３１３をバリン（Ａ３１３Ｖ）に変化させる。
【００３３】
ＭＢＰ（Ｓ１４６Ｔ）を野生型ＭＢＰ及び正確に同性質をもつ構築物を有する誘導体中のＭＢＰ（Ａ３１３Ｖ）と比較できるようにするために、ｐＫＯ１４８３と同じ停止コドンを有するＭＢＰ（Ｓ１４６Ｔ）のバージョンを構築した。ｐＩＨ１５９６からのＮｄｅＩ、ＢｌｐＩ断片を精製し、ＮｄｅＩ及びＢｌｐＩを用いて切断されたｐＫＯ１４９３中にサブクローニングし、ｐＩＨ１６１９を作製した。
【実施例２】
【００３４】
ＭＢＰ融合タンパク質の増加した収率
Ａ：ＭＢＰ−Ｋｌｅｎｏｗ
修飾されたＭＢＰが、精製後に、融合タンパク質の収率を増加させることができるかどうかを検査するために、イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片をコードする遺伝子を、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ、ｐＩＨ１６１９（Ｓ１４６Ｔ）及びｐＰＲ１６１０（Ａ３１３Ｖ）中にクローニングした。アミロースカラムに対して本質的に低い親和性を有し、親和性精製の間に、ＭＢＰ−Ｋｌｅｎｏｗタンパク質の幾つかは、結合せずに、アミロースカラムを流出するので、ＭＢＰ−Ｋｌｅｎｏｗ融合物を選択した。ＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位間において、ｐＢＲ３２２中にクローニングされたｐｏｌＡ遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋｅｃｏｐｏｌＡ：２０６−４１２７）のＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含有するプラスミドｐＰｏｌＡから、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ部分にＰＣＲ反応を行った。プライマー：オリゴ９：５’ＣＣＡＧＡＡＧＴＧＡＣＧＧＣＡＡＣＧＧＴＧＡＴＴ（配列番号１７）及びオリゴ１０：５’ＡＡＧＴＧＣＧＧＣＧＡＣＧＡＴＡＧＴＣＡＴＧＣＣＣＣＧＣＧＣ（配列番号１８）を用いて、ＰＣＲを実施した。
【００３５】
ＨｉｎｄＩＩＩを用いてＰＣＲ断片を切断し、ｐＭＡＬ−ｃ２に連結し、ＸｍｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでこれを切断した。得られた構築物は、ｐＩＨ１０４０と名付けた。挿入物中でのＰＣＲの誤りの可能性を減らすために、ＸｈｏＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの領域を、ｐＰｏｌＡ由来の対応する断片で置換した。この構築物を配列決定によってチェックし、ｐＩＨ１０６２と名付けた。ｐＰｏｌＡをテンプレートとして使用し、プライマー：オリゴ１１：５’ＧＴＧＡＴＴＴＣＴＴＡＴＧＡＣＡＡＣＴＡＣＧＴＣＡＣＣＡＴＣＣＴＴＧＡＴＧ（配列番号１９）及びオリゴ１２：５’ＴＴＡＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＧＣＧＣＣＴＧＡＴＣＣＣＡＧＴ（配列番号２０）を使用するＰＣＲによって、Ｋｌｅｎｏｗ断片をコードする遺伝子をｐＰＲ１６１０及びｐＩＨ１６１９中にクローニングした。
【００３６】
ＢａｍＨＩを用いて、ＰＣＲ断片を切断し、ＸｍｎＩ及びＢａｍＨＩを用いて、ベクターを切断し、精製し、ＰＣＲ断片と混合し、連結した。ＮＥＢＴｕｒｂｏ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を形質転換するために、この連結物を使用し、制限分析によって、並びにＭＢＰ−Ｋｌｅｎｏｗ融合物の発現及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析によって、正しい構造に関して形質転換体をチェックした。ｐＩＨ１６１０−Ｋｌｅｎｏｗ構築物をｐＩＨ１６４３と名付け、ｐＩＨ１６１９−Ｋｌｅｎｏｗ構築物をｐＩＨ１６４４と名付けた。
【００３７】
ｐＩＨ１０６２、ｐＩＨ１６４３及びｐＩＨ１６４４を含有する細胞を用いて、ＭＢＰ−Ｋｌｅｎｏｗのアフィニティー精製を行った。各株から得られた未精製抽出物、カラム流出物及び溶出液画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図４）。Ａ２８０を測定することによって、溶出されたタンパク質を定量し、ＭＢＰ−Ｋｌｅｎｏｗタンパク質の予想吸光係数を用いて定量した（表１）。ｐＩＨ１６４３を有し、ＭＢＰ−Ａ３１３Ｖ修飾を担持する細胞は、野生型ＭＢＰ又はＳ１４６Ｔ修飾されたＭＢＰ融合プラスミドを含有する細胞より２倍多くの融合タンパク質を生成した。
【００３８】
Ｂ．ＭＢＰ−キチン結合ドメイン：
変異体ＭＢＰが親和性精製からの融合タンパク質の収率を増加させる能力が一般的な特性であるかどうかを検査するために、アミロースに対して本質的に低い親和性を有する別の融合タンパク質を検査した。バチラス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）のキチン結合ドメインに融合されたＭＢＰ（ＭＢＰ−ＣＢＤ）は、プラスミドｐＭＢ５０によってコードされる（図５）。ＭＢＰ−Ｋｌｅｎｏｗと同様に、このＭＢＰ−ＣＢＤ融合タンパク質のかなりの割合が、アフィニティー精製の間に、アミロースカラムから流出する傾向がある。ＭＢＰ（Ａ３１３Ｖ）をコードするｐＰＲ１６１０の一部を、ＨａｐＩ及びＳａｃＩを用いて、プラスミドから切断し、断片を精製した。同じ酵素でｐＭＢ５０を切断し、骨格も精製し、２つの断片を連結し、ＥＲ２５２３中に形質転換した。得られたプラスミドは、ｐＩＨ１６６０と名付けられた。
【００３９】
５００ｍＬ培養物から採集されたｐＭＢ５０及びｐＩＨ１６６０を含有する細胞を用いて、ＭＢＰ−ＣＢＤのアフィニティー精製を行った。Ａ２８０を測定し、ＭＢＰ−ＣＢＤタンパク質の予想吸光係数を使用することによって、溶出されたタンパク質を定量した（表２）。ｐＩＨ１６６０を有し、ＭＢＰ−Ａ３１３Ｖ修飾を担持する細胞は、野生型ＭＢＰ融合プラスミドを含有する細胞よりほぼ２倍多くの融合タンパク質を生成した。
【実施例３】
【００４０】
ＭＢＰ融合タンパク質の溶解度の増強
ＭＢＰ融合物の構築
修飾されたＭＢＰがＭＢＰに融合されたタンパク質の溶解度を増強する能力を保持するかどうかを調べるために、イー・コリ中で不溶性である傾向がある２つのタンパク質であるジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を、ｐＩＨ１６１９（Ｓ１４６Ｔ）及びｐＩＨ１６１０（Ａ３１３Ｖ）中にクローニングした。対照として、「ＭＢＰ−ＤＭ」と名付けられた、Ｔｅｌｍｅｒらの修飾されたＭＢＰ中に変異を含有するｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ及びｐＭＡＬ−ｃ２Ｇ誘導体中に、同じ２つのタンパク質をクローニングした。ＭＢＰ−ＤＭをコードするベクターを、以下のように構築した。まず、４プライマー位置指定ＰＣＲによって、ヌクレオチド２０３０に翻訳的にサイレントなＮｓｉＩ部位を有するｐＭＡＬ−ｃ２Ｇ誘導体を構築した。Ｎ末端及びＣ末端断片の両方に対するテンプレートは、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘであった。Ｎ末端断片を作製するために、プライマーオリゴ１３：５’ＣＣＡＴＡＧＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧ（配列番号２１）及びオリゴ１４：５’ＣＴＴＧＡＡＴＧＣＡＴＡＡＣＣＣＣＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣ（配列番号２２）を使用し、Ｃ末端断片を作製するために、プライマーオリゴ１５：５’ＧＧＴＴＡＴＧＣＡＴＴＣＡＡＧＴＡＴＧＡＡＡＡＣＧＧＣＡＡＧ（配列番号２３）及びオリゴ８を使用した。ＰＣＲ断片をゲル精製し、次いで、プライマーオリゴ１３及びオリゴ８を用いた集合工程中でのテンプレートとして使用した。最終ＰＣＲ断片をエタノール沈殿し、ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、ゲル精製した。ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩでｐＭＡＬ−ｃ２Ｘを切断し、ゲル精製し、２つの断片を混合し、連結した。ＥＲ２５０２を形質転換するために、連結物を使用し、培養物を一晩増殖させ、ミニプレプＤＮＡを調製した。ＮｓｉＩ部位を獲得した、正しいサイズの幾つかの形質転換体を取得したが、予想に反して、それらの全てはＥｃｏＲＩ部位を欠如していた。この組の代表（ｐＰＲ１６２９と名付けられた。）をＮｄｅＩ及びＡｖａＩで切断し、ｍａｌＥ断片をゲル精製した。同じ２つの酵素でｐＳＮ１５７８を切断し、プラスミド骨格をゲル精製した。これら２つのＤＮＡ断片を連結し、ＥＲ２５０２を形質転換するためにこの連結物を使用し、１つの形質転換体から得られるプラスミドＤＮＡを配列決定し、ｐＰＲ１６３３と名付けた。次に、Ｔｅｌｍｅｒ及びＳｈｉｌｔｏｎによってＤＭと称される修飾されたＭＢＰに対する遺伝子を、以下のように、４プライマーのＰＣＲ部位指定突然変異生成によって構築した。両Ｎ及びＣ末端断片に対するテンプレートは、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘであった。Ｎ末端断片に対して使用されたプライマーは、オリゴ１６：５’ＴＡＴＧＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＣＧＧＴＧＡＣＡＴＴＡＡＡＧＡＣＧＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴ（配列番号２４）及びオリゴ１７：５’ＧＣＧＧＣＧＴＴＴＴＣＣＧＣＡＧＴＧＧＣＧＧＣＡＡＴＡＣＧＴＧＧＡＴＣＴＴＴＣ（配列番号２５）であった。Ｃ末端断片は、プライマーオリゴ１８：５’ＧＣＧＧＡＡＡＡＣＧＣＣＧＣＧＡＡＡＧＧＴＧＡＡＡＴＣＡＴＧＣＣＧＡＡＣＡＴＣ（配列番号２６）及びオリゴ８を用いて作製された。オリゴ１６及びオリゴ８をプライマーとして使用し、精製されたＮ末端及びＣ末端断片を用いて集合ＰＣＲを実行した。ＰＣＲ断片をエタノール沈殿し、ＥｃｏＲＶで直鎖化されたＬｉｔｍｕｓ３８に連結し、南極ホスファターゼで処理した。ＮＥＢ５−α（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を形質転換するために連結物を使用し、構築物を確認するために１つの形質転換体から得られたプラスミドＤＮＡを配列決定し、ｐＰＲ１６３８と名付けた。プラスミドＤＮＡｐＰＲ１６３３及びｐＰＲ１６３８をＮｓｉＩ及びＡｖａＩで切断し、ｐＰＲ１６３３由来のプラスミド骨格及びｐＰＲ１６３８由来のｍａｌＥ断片をゲル精製し、連結し、ＮＥＢＴｕｒｂｏを形質転換するために連結物を使用した。配列決定のために、１つの形質転換体由来のプラスミドＤＮＡを選択し、ｐＰＲ１６３９と名付けた。
【００４１】
ｐＯＴＢ７−ＤＨＦＲをテンプレートとして使用し、プライマーオリゴ１９：５’ＧＧＡＴＧＧＴＴＧＧＴＴＣＧＣＴＡＡＡＣＴＧＣＡＴＣＧＴＣ（配列番号２７）及びオリゴ２０：５’ＴＡＴＴＡＡＴＣＡＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＡＴＡＣＴＴＣＡＡＡ（配列番号２８）を使用して、ＤＨＦＲ遺伝子にＰＣＲを行い、次いで、室温で１５分間、Ｔ４ポリメラーゼ及びｄＴでＰＣＲ断片を処理した。この処理によって、断片の各末端上に短い３‘突出（ＤＨＦＲ遺伝子の上流末端上にＧＧ及び下流末端上にＡ）が生じる。ＸｍｎＩで切断し、次いで、Ｔ４ポリメラーゼ及びｄＡで処理することによって、ベクターｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ及びｐＰＲ１６１０を調製し、同様に、ｍａｌＥ領域の末端に３’ＣＣ突出部及びｌａｃＺａ末端上にＴを生成する。ベクターＤＮＡをＤＨＦＲ断片に連結し、ＥＲ１９９２を形質転換するためにこの連結物を使用した。各ベクターに関して、制限分析及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された予想サイズの融合タンパク質の発現によって形質転換体を確認した。ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ−ＤＨＦＲ単離株をｐＩＨ１６１６と名付け、ｐＩＨ１６１０−ＤＨＦＲ単離株をｐＩＨ１６１７と名付けた。次いで、以下のように、ＤＨＦＲ挿入物をｐＩＨ１５９６中にサブクローニングした。ＮｄｅＩ及びＢｌｐＩでｐＩＨ１６１６を切断し、消化物をゲル上で走行させ、（ＤＨＦＲ遺伝子を含む）骨格を切除し、ゲル精製した。ＮｄｅＩ及びＢｌｐＩでｐＩＨ１５９６を切断し、ｍａｌＥ’をゲル精製した。ｍａｌＥ’断片にベクター骨格を連結し、ＥＲ１９９２を形質転換するためにこの連結物を使用した。制限分析及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された予想サイズの融合タンパク質の発現によって、単離株を確認し、ｐＩＨ１６１８と名付けた。ｐＰＲ１６３９及びｐＩＨ１６１６の両者をＡｖａＩ及びＳａｌＩで切断し、ｐＰＲ１６３９由来のベクター骨格及びｐＩＨ１６１６由来のＤＦＨＲ断片をゲル精製し、２つの断片を連結することによって、ＤＨＦＲ挿入物をｐＰＲ１６３９中にサブクローニングした。ＮＥＢＴｕｒｂｏを形質転換するために、この連結物を使用し、配列決定によって形質転換体を確認し、ｐＩＨ１６４６と名付けた。
【００４２】
ｐＪＦ９３１をテンプレートとして使用し、プライマーオリゴ２１：５’ＧＧＡＴＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＧＴＧＡＡＣＧＧ（配列番号２９）及びオリゴ２２：５’ＴＡＴＴＡＣＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＧＴＡＧＧＣＣＡ（配列番号３０）を使用して、ＧＡＰＤＨ遺伝子にＰＣＲに供し、次いで、Ｔ４ポリメラーゼ及びｄＴでＰＣＲ断片を処理した。
【００４３】
ＸｍｎＩで切断した後、上述のようにＴ４ポリメラーゼ及びｄＡで処理することによって、ベクターｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ、ｐＰＲ１６１０及びｐＩＨ１６１９を調製した。ベクターＤＮＡをＧＡＰＤＨ断片に連結し、ＥＲ１９９２を形質転換するためにこの連結物を使用した。各ベクターに関して、制限分析及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された予想サイズの融合タンパク質の発現によって形質転換体を確認した。ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ−ＧＡＰＤＨ単離株をｐＩＨ１６２５と名付け、ｐＰＲ１６１０−ＧＡＰＤＨ単離株をｐＩＨ１６２６と名付け、ｐＩＨ１６１９−ＧＡＰＤＨ単離株をｐＩＨ１６２７と名付けた。次いで、ｐＰＲ１６３９及びｐＩＨ１６２５の両者をＡｖａＩ及びＳａｌＩで切断し、ｐＰＲ１６３９由来のベクター骨格及びｐＩＨ１６２５由来のＧＡＰＤＨ断片をゲル精製し、２つの断片を連結することによって、ＧＡＰＤＨ挿入物をｐＰＲ１６３９中にサブクローニングした。ＮＥＢＴｕｒｂｏを形質転換するために、この連結物を使用し、制限分析及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された予想サイズの融合タンパク質の発現によって、形質転換体を確認し、ｐＩＨ１６４５と名付けた。
【００４４】
溶解度特性
８つのｐＭＡＬプラスミド（ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ、ｐＩＨ１６１９（Ｓ１４６Ｔを担持する。）及びｐＰＲ１６１０（Ａ３１３Ｖを担持する。）、各プラスミドは、ＤＨＦＲ又はＧＡｐＤＨをコードするＤＮＪＡをさらに含有する。）を含有するＴＢ１の２０ｍＬ培養物を、ＬＢａｍｐ中で、２×１０８／ｍｌまで増殖させ、０．３ｍＭＩＰＴＧを用いて誘導し、さらに２時間温置し、次いで、微量遠心管中にて、３０００×ｇでの遠心によって、細胞を採集した。５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．９、５０ｍＭＮａＣｌ、０．７５ｍＭＥＤＴＡ、０．６％Ｍｅｇａ１０、１５０μｇ／ｍＬリゾチーム及び２０Ｋｕｎｉｔｚ単位／ｍＬセラチア・マルセッセンスヌクレアーゼ２ｍＬ中に各ペレットを再懸濁し、室温で１０分間温置した。再懸濁されたペレットは、全細胞抽出物と表記した。１２５μＬの試料を取り出し、１４，０００×ｇで、２分間遠心した。上清を取り出し、可溶性画分と表記した。同じ緩衝液１２５μＬ中にペレットを再懸濁し、不溶性画分と表記した。各株に対して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に各画分の試料（５μＬ）を走行させた（図５）。ゲルを乾燥させ、走査し、遠心前の細胞可溶化液中に存在するタンパク質に対する可溶性タンパク質の比として、各レーン中のＭＢＰ融合タンパク質の量を定量した（表２）。ＤＨＦＲ及びＧＡＰＤＨ融合物の両者に関して、Ａ３１３Ｖ及びＳ１４６Ｔ修飾されたＭＢＰは、野生型ＭＢＰに比べて、融合タンパク質の溶解度を増強した。ＤＭによって修飾されたＭＢＰを用いて作製された融合物は、予想通り、野生型ＭＢＰと比べて、低下した溶解度を示した。
【実施例４】
【００４５】
Ｋ．ラクティス中でのＭＢＰ変異体の使用
Ｋ．ラクティスＭＢＰ（Ａ３１３Ｖ）−融合発現ベクターの構築
それぞれ、フォワード及びリバースプライマー：
【００４６】
【化１】
2009533058.tif 000003
を使用するＰＣＲによって、変異体マルトース結合タンパク質ＭＢＰ（Ａ３１３Ｖ）をコードする遺伝子を増幅した。フォワードプライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位（太字）を含有し、直前にｍａｌＥ遺伝子開始コドン（下線）が先行するＫｏｚａｋコンセンサス配列（斜字体）が続くように構築された。リバースプライマーは、ＸｈｏＩ制限酵素部位（太字）を含有し、プロテアーゼエンテロキナーゼのタンパク分解認識部位（斜字及び下線）をコードするＤＮＡが直後に続くように構築された。フレーム内Ｃ末端ＭＢＰ（Ａ３１３Ｖ）融合発現カセットの構築を可能とするために、リバースプライマー上に停止コドンは取り込まれなかった。Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを用いて、完全長遺伝子を含有するプラスミドｐＰＲ１６１０からｍａｌＥ遺伝子を増幅した。Ｋ．ラクティスＭＢＰ（Ａ３１３Ｖ）融合発現ベクター（ｐＫＩＭＦ２）を作製するために、Ｋ．ラクティス発現ベクターｐｋＬＡＣ１のＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ制限部位中に、増幅された遺伝子がクローニングされた。このクローニング戦略は、ｍａｌＥ遺伝子による、ｐＫＬＡＣ１中のＫ．ラクティスα接合因子プレプロシグナル配列の置換をもたらす。従って、ＭＢＰ及びＭＢＰ（Ａ３１３Ｖ）融合タンパク質は、分泌経路に誘導されず、代わりに、酵母サイトゾル中に保持される。
【００４７】
Ｋ．ラクティス中のＭＢＰ（Ａ３１３Ｖ）融合タンパク質の発現及び精製
以下のプライマーを用いて、パラミオシンの切断型をコードする遺伝子（Ｓｔｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：３９１７−３９２３（１９９０））をＰＣＲによって増幅した。
【００４８】
【化２】
2009533058.tif 000004
フォワードプライマーは、ＸｈｏＩ制限部位（太字）を含有するように構築された。リバースプライマーは、ＰＭデルタＳａｌ停止コドン（斜字体）のすぐ上流にＮｏｔＩ制限部位（太字）を含有するように構築された。
【００４９】
クローニング戦略は、以下のとおりであった。約７５０ｂｐパラミオシン遺伝子を増幅し、精製した。ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで、断片を二重消化し、発現ベクターｐＫＩＭＦ２のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ制限部位中にクローニングし、ＰＭデルタＳａｌのＣ末端及びＮ末端の間にフレーム内融合物を作出する。このようにして構築されたプラスミドは、ｐＫＬＭＦ２−ＰＭデルタＳａｌと名付けられた（図７）。
【００５０】
ＳａｃＩＩ制限消化によって、ＭＢＰ（Ａ３１３Ｖ）−ＰＭデルタ融合ベクター（ｐＫＩＭＦ２−ＰＭデルタＳａｌ）を直鎖化し、その指示書に従って、Ｋ．ラクティスＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、化学的に形質転換受容性のＫ．ラクティス細胞中に精製された産物を形質転換した。アセトアミドプレート上で、形質転換体コロニーを選択し、上記キットに記載されているように、細胞全体のＰＣＲによって、正しく組み込まれたＭＢＰ（Ａ３１３Ｖ）−ＰＭデルタＳａｌ発現カセットを含有するクローンを同定した。
【００５１】
ＹＰＧａｌａｃｔｏｓｅ培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％ガラクトース）２０ｍＬ培養物に、複数コピーの組み込まれたＭＢＰ（Ａ３１３Ｖ）−ＰＭデルタＳａｌ発現カセットを含有するＫ．ラクティス細胞の株を接種し、振盪プラットフォームを有する温置装置中において、４日間、３０℃で増殖させた。増殖後の培養物の合計細胞含量は、約８．２×１０１０細胞（すなわち、約４．１×１０８細胞／ｍＬ）であると測定された。４℃で１０分間、８，０００ｒｐｍの遠心によって、細胞を採集した。過剰な培地を除去するために、蒸留水中で、細胞を一回洗浄した。
【００５２】
可溶化液の調製のために、１Ｍソルビトール中の１０ｍｇ／ｍＬリチカーゼの２ｍＬ溶液中に細胞を再懸濁し、３７℃で１時間温置した。微量遠心管中での２分間の穏やかな遠心（７，０００ｒｐｍ）によって、細胞を採集した。プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭプロテアーゼ阻害剤カクテル、Ｒｏｃｈｅ）を含有する氷冷アミロースカラム緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＣｌｐＨ７．４、０．２ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ）３ｍＬの総容量中に、細胞ペレットを再懸濁した。細胞スラリーをガラスチューブに移し、氷の上に配置した。酸洗浄されたガラスビーズ（４２５から６００ミクロン、Ｓｉｇｍａ）の等量を細胞スラリーに添加し、それぞれ、１分間１０回のボルテックスによって、細胞を破壊した。細胞可溶化液を新しいチューブに移し、カラム緩衝液１ｍＬで、ガラスビーズを４回洗浄した。細胞可溶化液及び洗浄液をプールし、遠心によって、細胞破砕物を除去した。清澄化された細胞可溶化液を、カラム緩衝液で、８ｍＬになるように希釈した。
【００５３】
融合タンパク質精製のために、カラム緩衝液１５ｍＬで予め平衡化された１．６ｍＬアミロース樹脂カラム上に、細胞可溶化液を通過させた。カラム緩衝液２４ｍＬでカラムを洗浄し、１０ｍＭマルトースを含有するカラム緩衝液で、０．４ｍＬ画分中に、結合されたタンパク質を溶出した。１０から２０％Ｔｒｉｓ−グリシン勾配ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、細胞可溶化液及び精製されたタンパク質を分離した。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅｓｔａｉｎによって、タンパク質を同定した。図６は、主要な溶出されたタンパク質が、ＭＢＰ（Ａ３１３Ｖ）−ＰＭデルタＳａｌ融合タンパク質に対して予想されたサイズ（６８．５ｋＤａ）に対応することを示している。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
【表２】
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【００５６】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、標的タンパク質に融合されたＭＢＰをコードするＤＮＡを発現し、融合タンパク質をアミロースに選択的に結合させ、マルトース含有緩衝液中に標的タンパク質を溶出し、次いで、プロテアーゼ切断によって、精製された融合タンパク質から標的タンパク質を回収することによる、標的タンパク質のクローニング及び精製を記載する模式図を示している。
【図２Ａ−１】野生型ＭＢＰを修飾されたＭＢＰと比較する配列を提供する。ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘから得られる、野生型ＭＢＰ（配列番号２）をコードするＤＮＡ配列（配列番号１）。
【図２Ａ−２】野生型ＭＢＰを修飾されたＭＢＰと比較する配列を提供する。ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘから得られる、野生型ＭＢＰ（配列番号２）をコードするＤＮＡ配列（配列番号１）。
【図２Ｂ−１】野生型ＭＢＰを修飾されたＭＢＰと比較する配列を提供する。ＭＢＰ変異体Ａ９（配列番号４）をコードするＤＮＡ配列（配列番号３）。修飾されたＭＢＰ配列中の変化は、太字で示されている。
【図２Ｂ−２】野生型ＭＢＰを修飾されたＭＢＰと比較する配列を提供する。ＭＢＰ変異体Ａ９（配列番号４）をコードするＤＮＡ配列（配列番号３）。修飾されたＭＢＰ配列中の変化は、太字で示されている。
【図２Ｃ−１】野生型ＭＢＰを修飾されたＭＢＰと比較する配列を提供する。ＭＢＰ変異体Ｇ８−１（配列番号６）をコードするＤＮＡ配列（配列番号５）。修飾されたＭＢＰＤＮＡ及びアミノ酸配列中の変化は、太字で示されている。
【図２Ｃ−２】野生型ＭＢＰを修飾されたＭＢＰと比較する配列を提供する。ＭＢＰ変異体Ｇ８−１（配列番号６）をコードするＤＮＡ配列（配列番号５）。修飾されたＭＢＰＤＮＡ及びアミノ酸配列中の変化は、太字で示されている。
【図３】野生型ＭＢＰ（ｐＫＯ１４８３）又は修飾されたＭＢＰ（Ａ９又はＧ８−１）を用いたタンパク質の収率を比較するヒストグラムを示している。ＭＢＰの収率は、ｍｇ／５００ｍｌ培養で記載されている。
【図４】野生型ＭＢＰ、ＭＢＰＡ３１３Ｖ及びＳ１４６Ｔ修飾を含有するｐＭＡＬからのＭＢＰ−Ｋｌｅｎｏｗの精製された産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に示している。プラスミド：ＷＴ＝ｐＩＨ１０６２、Ａ３１３Ｖ＝ｐＩＨ１６４３、Ｓ１３６Ｔ＝ｐＩＨ１６４４。レーン：ＣＥ＝未精製抽出物、ＦＴ＝流出物及びＥ＝溶出液。表記画分の等しい一部を、各レーンに搭載した。ＭＢＰ融合タンパク質の有意により高い収率が、野生型ＭＢＰからより、Ａ３１３Ｖ変異体ＭＢＰから得られた（表１も参照）。
【図５−１】ＭＢＰ−ＣＢＤ融合タンパク質を発現させるために使用されるｐＭＢ５０（配列番号７）の配列（表２参照）。
【図５−２】ＭＢＰ−ＣＢＤ融合タンパク質を発現させるために使用されるｐＭＢ５０（配列番号７）の配列（表２参照）。
【図５−３】ＭＢＰ−ＣＢＤ融合タンパク質を発現させるために使用されるｐＭＢ５０（配列番号７）の配列（表２参照）。
【図５−４】ＭＢＰ−ＣＢＤ融合タンパク質を発現させるために使用されるｐＭＢ５０（配列番号７）の配列（表２参照）。
【図５−５】ＭＢＰ−ＣＢＤ融合タンパク質を発現させるために使用されるｐＭＢ５０（配列番号７）の配列（表２参照）。
【図６】溶解度に対する、ＤＨＦＲ及びＧＡＰＤＨへの野生型及び修飾されたＭＢＰの融合の効果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。ＤＨＦＲ融合プラスミド：ＷＴ＝ｐＩＨ１６１６；Ａ３１３Ｖ＝ｐＩＨ１６１７；Ｓ１４６Ｔ＝ｐＩＨ１６１８；ＤＭ＝ｐＩＨ１６４６。ＧＡＰＤＨ融合プラスミド：ＷＴ＝ｐＩＨ１６２５；Ａ３１３Ｖ＝ｐＩＨ１６２６；Ｓ１４６Ｔ＝ｐＩＨ１６２７；ＤＭ＝ｐＩＨ１６４５。レーン：Ｔ＝総細胞抽出物；Ｓ＝可溶性抽出物；Ｉ＝不溶性材料の再懸濁。表記画分の等しい一部を、各レーンに搭載した。不溶性タンパク質に対する可溶性タンパク質の比は、野生型ＭＢＰと比較して、両変異体に関してより大きかった。
【図７−１】ｐＫＬＭＦ２−ＰＭデルタＳａｌ（配列番号８）の配列を提供する。
【図７−２】ｐＫＬＭＦ２−ＰＭデルタＳａｌ（配列番号８）の配列を提供する。
【図７−３】ｐＫＬＭＦ２−ＰＭデルタＳａｌ（配列番号８）の配列を提供する。
【図７−４】ｐＫＬＭＦ２−ＰＭデルタＳａｌ（配列番号８）の配列を提供する。
【図８】アミロース樹脂カラムを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の融合タンパク質のアフィニティー精製から得られた画分を示している。ＭＢＰ（Ａ３１３Ｖ）−ＰＭデルタＳａｌ発現カセットを担持するクルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）細胞中のＭＢＰ（Ａ３１３Ｖ）ＰＭデルタＳａｌを発現させることによって、修飾されたＭＢＰ融合タンパク質の増強された収率が産生された。  レーン１：ＮＥＢ広範囲マーカー、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ；  レーン２−未精製抽出搭載物；  レーン３−カラム流出物；  レーン４−カラム洗浄物；  レーン５，６及び７、カラム緩衝液＋マルトースで溶出。
【図１】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図２Ｃ−１】
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【図２Ｃ−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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