(57)【要約】  本発明は、分子、特に生体分子、とりわけタンパク質及びペプチドの分離のための方法及び装置に関する。本発明は、分子の二つ以上の特徴に基づく分子の分離に向けられている；好ましい実施態様では、これらの特徴は等電点と荷電／重量比である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の線状次元におけるチャンネルの第一の部分内で、第一の特徴により分子を分離する工程；
前記第一の線状次元におけるチャンネルの第二の部分内で、第二の特徴により前記分子を分離する工程
を含む、分子の少なくとも二つの特徴に従った分子の分離方法であって、前記第一及び第二の分離が、チャンネルの少なくとも部分的に重なった部分内で実施される分離方法。
【請求項２】
前記第一の特徴が荷電である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一の部分内で前記分子を等電点電気泳動する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第二の特徴が荷電／重量比である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第二の部分を横切る電場の適用によって前記分子を分離する工程を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第二の分離の間で分子を検出する工程を更に含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記分子が分離されると検出される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記分子が前記チャンネル内の特定の地点を通過すると検出される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記分子がその固有の特徴を使用して検出される、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
検出器、好ましくはＵＶ検出器を、光源、好ましくはＵＶ光源を使用して照射する工程、及び前記分子による前記光の吸収により、前記検出器と前記光源の間を通過すると前記分子を検出する工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記分子が複数の分離した地点を通過すると検出される、請求項６から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記分離した地点が前記第二の部分の実質的に全長に沿って配置されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記分離した地点が前記チャンネルの実質的に全長に沿って配置されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一の分離の間で前記分子を検出する工程を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
分離の間で検出された分子の速度を測定する工程を含む、請求項６から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
分子の検出された位置を推定することにより前記速度が測定され、等位相空間−時間マップが作成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記分子の第一及び第二の特徴を計算する工程を含む、請求項６から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記測定された速度に基づいて前記分子の荷電／重量比及び等電点を計算する工程を含む、請求項６から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
分子の前記測定された速度を使用して計算が実施され、前記第二の分離が始まる時点での各分子の位置を推定する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
各検出された分子の第二の特徴に対する第一の特徴のグラフを作成する工程を含む、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
複数のチャンネルにおける複数の分子の混合物を分離する工程を更に含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記分子がペプチドまたはタンパク質である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも部分的に重なっている第一の部分と第二の部分を有するチャンネル；
第一の線状次元に沿って第一の特徴により部分内で分子を分離が可能なように適応した第一の部分；
前記線状次元に沿って第二の特徴により部分内で分子の分離が可能なように適応した第二の部分
を含む、分子の分離における使用のための装置。
【請求項２４】
前記チャンネルが曲線状、Ｓ字条、コイル状、ループ状等である、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
前記分子がペプチドまたはタンパク質である、請求項２３または２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記第一の部分が前記第二の部分内に実質的に完全にまたは完全に含まれている、請求項２３から２５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２７】
前記第一の部分が、前記部分内で前記分子を等電点電気泳動可能なように適応されている、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２８】
前記第一の部分がｐＨ勾配を含む、請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
前記ｐＨ勾配がゲルのような固体マトリックス内で確立されている、請求項２８に記載の装置。
【請求項３０】
前記第一の部分が分離を実施するための電極を含む、請求項２３から２９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３１】
前記第二の部分が電極を含む、請求項２３から３０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３２】
前記第二の部分の少なくとも一つの電極が前記第一の部分と共有されている、請求項３０に従属する場合の請求項３１に記載の装置。
【請求項３３】
分離した分子を検出するための手段を更に含む、請求項２３から３２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３４】
前記分子の固有の特徴が検出される、請求項３３に記載の装置。
【請求項３５】
前記検出手段がＵＶ光源及びＵＶ検出器を含み、前記チャンネルが前記光源と前記検出器の間に挿入されるように並んでいる、請求項３３または３４に記載の装置。
【請求項３６】
複数の検出器が準備されている、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３７】
前記検出器が前記チャンネルの長さに沿って配置されている、請求項３６に記載の装置。
【請求項３８】
分離されている分子の速度を測定するための手段を含む、請求項２３から３７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３９】
前記チャンネルに沿って配置された複数の位置で、検出された分子を表すデータセット由来の等位相点の等位相空間−時間マップを作成するための等位相空間−時間マップ作成器を含む、請求項３８に記載の装置。
【請求項４０】
前記測定された速度から前記第二の分離の開始時の前記分子の位置を推定するための手段を含む、請求項３８または３９に記載の装置。
【請求項４１】
各検出された分子の第二の特徴に対する第一の特徴のグラフを作成するための手段を含む、請求項２３から４０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４２】
前記チャンネルがそこでタンパク質を変性させるように適応されている、請求項２３から４１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４３】
前記チャンネルが分子間の相互作用に影響するように適応されている、請求項２３から４２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４４】
前記チャンネルが温度制御されている、請求項２３から４３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４５】
複数のチャンネルを含む、請求項２３から４４のいずれか一項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子、特に生体分子、とりわけタンパク質及びペプチドの分離のための方法及び装置に関する。本発明は、分子の二つ以上の特徴に基づく分子の分離に向けられている；好ましい実施態様では、これらの特徴は等電点と荷電／重量比である。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の分離及び分析は、プロテオミクスの発達による更なる重要性を考慮して、分子生物学における鍵となる方法であり、それによる意図は、全細胞の全タンパク質含量を研究することである。タンパク質の二次元（２Ｄ）分析は、分子の二つの特徴、典型的には荷電と分子量に従ってタンパク質を分離することを可能にする。タンパク質は、第一に二次元ゲルの第一の次元に沿って、等電点電気泳動により分離され、第二に第一のものとは直交する第二の次元に沿って、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離されるであろう。この二重の分離は、共通の特徴を有する各種のタンパク質を単離することを可能にする；例えば、同じ分子量を有するが異なる荷電を有する二つのタンパク質を分離できる。
【０００３】
全細胞から由来するタンパク質の二次元マップは、疾患の進行のマーカーとしての特定のタンパク質の強度のモニタリングのようなプロテオミクスにおける多くの応用について発達している。ゲルを通じたいずれかの所定のタンパク質の移動が、環境により影響されることに気付くことは重要である。くっついたマーカー分子の存在は、移動プロフィールを改変し得る。
【０００４】
第一の分離は等電点電気泳動により、これはゲル上にタンパク質を配置するために、タンパク質の固有の荷電特性を使用する。典型的なプロトコールでは、組織または細胞培養物のサンプルが準備され、各タンパク質がその正味の荷電が中性であるゲル上の位置に移動するまで、２１時間（〜８．８Ｋｖ）５％アクリルアミドｐＨ勾配ゲルで移動する。次いでタンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により〜７時間分離される。ラベルされていないゲルは、例えばクマシーブルーでの染色により視覚化される。この点でのタンパク質の位置を視覚化するための染料の添加は、同定される分子に対する更なる操作の複雑性を増大する。サイトカインまたは他の因子での細胞の刺激のような外的な刺激に応答するタンパク質の発現における変化を調査するために、二次元電気泳動は、刺激の前後でのサンプルに対して実施され、二つのゲルを比較しても良い。タンパク質発現の上流調節は、特定のタンパク質スポットにおける強度の変化として出現するはずである。
【特許文献１】ＷＯ０３／０３６３０２
【特許文献２】ＷＯ０３／１０２２３８
【特許文献３】ＷＯ９６／３５９４６
【特許文献４】ＷＯ０２／１２８７６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
二次元電気泳動は、巨大分子の分離のために非常に強力で確立した方法である。しかしながら、従来の分離技術には数多くの欠点が存在する。二つの異なるゲルを比較する際、いずれかのタンパク質における読み取られる変化の量は、この技術の正確性に依存している。このデータは、クマシーブルーのような染料でゲルマトリックスを染色することによって得られる。ゲルにおけるタンパク質を視覚化するためのゲルの染色は、この方法それ自体がタンパク質の見掛けの強度に影響するため、誤りがちな方法である。それ故、タンパク質の誘導または抑制がアーティファクトであり得る場合、染色方法における小さな誤差はゲルにおいて大きな誤差を導くことがある。
【０００６】
ゲルは、準備して、稼動させて、本質的に同等であることが困難である；多くの当業者は、このシステムの使用を必要としている。
【０００７】
複雑なイメージ回収、デジタル化、不十分な解像度と信頼できない定量性を導くピーク位置に対する必要性により、データ分析は複雑化されている。
【０００８】
方法全体が煩雑であって自動化が困難であり、そのことが操作者と装置の違いにより結果の分散を生ずる。典型的な二次元稼動は２４時間かかり、自動化システムが利用可能である場合、それらは信頼できないと解されるであろう。
【０００９】
本発明は、分子の分離のための代替的な方法及び装置を提供する。本発明の特定の実施態様は、ラベルフリーの固有のイメージング（ＬＦＩＩ）を使用する。分子分離に外的な染料とマーカーを取り込ませるよりもむしろ、ＬＦＩＩは検出のために分離されている分子の固有の特徴に依存する。好ましい特徴は、ＵＶ光の吸収である。本発明者らは以前に、国際特許出願ＷＯ０３／０３６３０２及びＷＯ０３／１０２２３８においてＬＦＩＩの使用を記載しており、これらは核酸及びタンパク質の検出を開示している。本発明者らはまた以前に、ミクロ流動チャンネル内での荷電／重量比による分子の分画化のための分子分離技術と組み合わせたＬＦＩＩの使用を記載している。これらの技術は、例えばＷＯ９６／３５９４６及びＷＯ０２／１２８７６に記載されている。これらの文献では、分子が一連の検出器を通過するミクロ流動チャンネルを通じて移動するため、電気泳動による分子の分離及び前記分子の検出の技術が記載されている。検出されたデータは、分子の速度を測定し、よって分子の分子量または他の特徴を推定するために使用される。ここに記載された全ての文献の開示は、参考として取り込まれる。
【００１０】
本発明は、特定の実施態様では、且つ一部として、上述の分離及び検出技術を使用する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第一の特徴点では、
第一の線状次元におけるチャンネルの第一の部分内で、第一の特徴により分子を分離する工程；
前記第一の線状次元におけるチャンネルの第二の部分内で、第二の特徴により前記分子路分離する工程
を含む、分子の少なくとも二つの特徴に従った分子の分離方法であって、前記第一及び第二の分離が、チャンネルの少なくとも部分的に重なった部分内で実施される分離方法を提供する。
【００１２】
かくして本発明は、分子が単一の線状次元を横切る二つの特徴によって分離されるため、「バーチャル二次元分離」を提供する。第一の分離は、第二の分離の開始が第一の分離の一部に依存するように、第二の分離が各種の開始点で分子に実施されることを可能にする。
【００１３】
第一の特徴は好ましくは荷電であり、前記方法は第一の部分内で分子を等電点電気泳動する工程を含む。例えば、第一の部分内に確立されたｐＨ勾配内で、分子に電場を適用しても良い。
【００１４】
第二の特徴は好ましくは荷電／重量比であり、前記方法は第二の部分を横切る電場の適用によって分子を分離する工程を含む。
【００１５】
前記方法は好ましくは、第二の分離の間で分子を検出する工程を更に含む。好ましくは前記分子は、それらが分離されると検出される；例えば、前記分子がチャンネル内の特定の地点を通過する際に検出される。前記検出は、前記分子に取り込まれたラベルを使用して実施されてもよいが、好ましくは前記分子は、前記分子の固有の特徴を使用して検出される。従来では、前記方法は、光源、好ましくはＵＶ光源で、検出器、好ましくはＵＶ検出器を照射する工程と、前記分子の光の吸収により、前記検出器と前記光源の間を通過する際に分子を検出する工程を含む。
【００１６】
好ましくは前記分子は、分離された複数の地点を通過する際に検出される；この地点は、第二の部分の実質的に全ての長さに沿って、好ましくは前記チャンネルの実質的に全ての長さに沿って配置されて良い。前記分子は、第一の分離の間、並びに第二の分離の間で検出されて良い。
【００１７】
前記方法は、分離の間で検出される分子の速度を測定する工程を更に含んでも良い。前記速度は、等位相空間−時間マップを与えるために、分子の検出される位置を推定することによって測定されても良い。前記方法は好ましくは、測定される速度に基づく分子についての第一及び第二の特徴、好ましくは荷電／重量比及び等電点を計算する工程を含む。これは例えば、時間ゼロ；即ち第二の分離が始まる時間で、各分子の位置を推定するために分子の測定された速度を使用することによって実施されても良い。第一及び第二の特徴が等電点及び荷電／重量比のそれぞれであることを仮定すると、時間ゼロでは、各分子の位置はその等電点である。速度自体は、分子の荷電／重量比に特徴的である。
【００１８】
前記方法はまた更に、各検出された分子についての第二の特徴に対する第一の特徴のグラフを作成する工程を含む。これは、分離された分子の「バーチャル」二次元電気泳動マップを提供する。
【００１９】
前記方法は、複数のチャンネルで複数の分子の混合物を分離する工程を含んでも良い。
【００２０】
本発明の更なる特徴点によれば、
少なくとも部分的に重なっている第一の部分と第二の部分を有するチャンネル；
第一の線状次元に沿って第一の特徴により部分内で分子を分離が可能なように適応した第一の部分；
前記線状次元に沿って第二の特徴により部分内で分子の分離が可能なように適応した第二の部分
を含む、分子の分離における使用のための装置を提供する。
【００２１】
前記装置は、同じ線状次元に沿って二つの特徴により分子を分離することを可能にする。前記分離は、反対の方向で実施されても良い；例えば、前記分子は、前記チャンネル内で前後に移動しても良い。前記チャンネルは、曲線状、Ｓ字状、コイル状、ループ状等であっても良い。つまり、分子は線状次元で実施されるが、チャンネルは厳密に直線である必要は無い。チャンネルに曲げまたはカーブを導入することは、前記チャンネルを含む必要のある体積を著しく増大することなく、チャンネルの有効な長さを増大することを可能にする。
【００２２】
前記分子は好ましくは生体分子であり、より好ましくは生物学的ポリマーであり、もっとも好ましくはペプチドまたはタンパク質である。二つの用語「ペプチド」及び「タンパク質」は、他に記載がある場合を除き、ここでは互換的に使用される。
【００２３】
第一の部分は好ましくは、第一の部分と少なくとも半分の長さで、好ましくは４分の３の長さで重なり、もっとも好ましくは第一の部分は、実質的に完全にまたは完全に第二の部分内に含まれる。
【００２４】
第一の特徴は好ましくは荷電であり、第一の部分はこの部分内で分子の等電点電気泳動が可能なように適応される。第一の部分は好ましくはｐＨ勾配を含む。前記勾配は、各種のｐＨの一つ以上の半透過性膜で互いに分割されている流動領域によって確立されても良い；または、ゲルのような固体マトリックス内で確立されたｐＨ勾配によって確立されても良い。別法として、第一の部分は、各種のｐＨ範囲でバッファーを含む隣接した一連のチェンバーに配置されても良い；前記チェンバーは、ｐＨ勾配が前記部分内で確立されるように、半透過膜によって第一の部分を分離しても良い。第一の部分は好ましくは、分離を実施するための電極を含み、好ましくは前記電極によって境界を画されている。
【００２５】
第二の特徴は好ましくは荷電／重量比である。第二の部分は好ましくは電極を含み、前記電極によって境界を画されている。少なくとも一つの電極が第一の部分と第二の部分で共通なように、第二の部分の少なくとも一つの電極は、第一の部分と共有されても良い。
【００２６】
前記装置は好ましくは、分離された分子を検出するために手段を更に含む。前記分子は検出を可能にするためにラベルされても良いが、好ましくは前記分子はラベルされず、前記分子の固有の特徴が検出される。好ましい実施態様では、前記分子による光、好ましくはＵＶ光の吸収が検出される。そのような実施態様における検出手段は、ＵＶ光源及びＵＶ検出器を含み、前記光源と検出器の間にチャンネルが挿入されても良い。複数の検出器が準備されても良い；好ましくは検出器は、チャンネルの長さに沿って、より好ましくは実質的にチャンネルの全長に沿って配置される。
【００２７】
前記装置はまた好ましくは、分離されている分子の速度を測定するための手段を含む。例えば前記装置は、チャンネルに沿って配置された複数の位置で、検出された分子を表すデータセットから等位相点の等位相空間−時間マップを作成するための等位相空間−時間マップ作成器を含んでも良い。そのようなシステムはＷＯ０２／１２８７６に記載されており、その内容は参考としてここに取り込まれる。分離している分子の速度の測定は、このまたは同様なシステムを使用して、各分子の荷電／重量比及び等電点の計算を可能にする。移動している分子の速度を測定するための代替的なシステムはＷＯ９６／３５９４６に記載されている。前記装置は、測定された速度から第二の分離の開始時の分子の位置を推定するための手段を含んでも良い。
【００２８】
前記装置は、各検出された分子についての第二の特徴に対する第一の特徴のグラフを作成するための手段を更に含んでも良い。
【００２９】
前記チャンネルは好ましくは、そこでタンパク質を変性するように適応する；例えば前記チャンネルは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドのような変性ゲルを含んでも良い。前記チャンネルはまた、あるいはその代わりに、分子の間の相互作用に影響するように適応されても良い；例えば前記チャンネルは温度制御されても良い；タンパク質または核酸を変性するために高温が使用されても良い一方、タンパク質の活性を減少するために低温が使用されても良い。
【００３０】
前記装置は複数のチャンネルを含んでも良い。これは複数の分子を同時に分離することを可能にする；これは、ハイスループットスクリーニングのために使用されても良く、または二つのサンプル、例えば刺激の前後での細胞サンプルのタンパク質含量の直接的な比較のために使用されても良い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
図１は、本発明による分子の分離のための装置の模式図を示す。本発明の原理は、電気泳動分離チャンネルが組み立てられているチップの使用を含む。チャンネルのスタートで、ｐＨ勾配ゲルを含む等電点電気泳動部分が存在する。ｐＨ勾配は、半透過膜を横切って誘導され、埋め込まれた電極によって発揮される電場によって制御できるであろう。分離される分子は、電気泳動部分に配置され、別の電場の影響下で等価的な位置に移動する。これらの電極の位置決めと制御は、生成した電場が複雑であるため最も重要性を有する。数時間ではなく数分で達成される電気泳動の後、次いで分子の電気泳動状態は変更され、電気泳動及び分離部分の全長を横切って高電圧が適用される。分子はその位置と速度が跡を残す分離部分内に、電気泳動部分から電場の影響下で移動する。軌跡は典型的に、ラベルフリーの固有のイメージング（ＬＦＩＩ）を使用して実施され、そこでは分子のＵＶ吸収が、ＵＶ光源及び検出器を通過する際に測定される；検出された光の強度変化は、分子のバンドが検出器を通過していることを示す。
【００３２】
この情報を使用して、各分子の荷電／重量比及び等電点を測定することが可能である。これは、本発明者の早期の特許出願ＷＯ０２／１２８７６及びＷＯ９６／３５９４６に記載されたもののような高速シグナルプロセッシングアルゴリズムを使用して実施できる。この情報の測定の代表例が図２に示されている。タンパク質はその荷電／重量比によって分離され、それらがチャンネルに沿って配置された検出器を通過する際に、その速度が測定される。既知の位置（検出器の位置から）及び既知の速度を使用して、ｔ＝０での位置が計算される。ｔ＝０での位置はその等電点を表し、それはタンパク質が第一の分離を受けた後に達する。図２に示された例では、位置１及び２がその等電点（ｐＩ）によって解像されないが、ｐＩについて得られた値が不正確であることを意味するものではない；それらはたまたま縮重したのである。一致したｐＩ及びＭｗ（分子量、または荷電／重量比）の両方を有する可能性は非常に低いことに注意すべきである。
【００３３】
更に、チップが複数の同一のチャンネルを有するのであれば、サンプル間の直接的で迅速な比較をすることが可能であるはずである。
【００３４】
この方法は、二次元のレベルのデータが、一次元のミクロ流動システムから獲得されることを可能にするであろう−これは「バーチャル二次元（Ｖ２Ｄ）電気泳動」である。サンプルから得られる広範囲のタンパク質についての等電点に対する荷電／重量比のプロットにより、二次元マップを作成できる。図３は、ｐＩに対してプロットされたｋＤａ単位のＭｗを示すＶ２Ｄアウトプットにおける１００００のタンパク質のドットを示すそのようなマップのシミュレーションである。このレベルの詳細は達成することが非常に困難であり、実践的な観点で解像できるタンパク質の典型的な数は、１０（典型的なラダー）から１００（典型的な細胞溶解物）の範囲であってよい。ここに記載される方法の解像度、感度、及び定量度は、ゲルにおいて可能なものをはるかに超えている。
【００３５】
特定の場合、タンパク質のバンドは互いに影響を受け得る−これは、例えば翻訳後の修飾に関するものといった非常に臨床的な重要性を有するタンパク質の場合に最も当てはまる。互いに移動するバンドは、Ｍｗ（傾斜から）の測定の誤差、及びｐＩを得るための後の推定における誤差に影響してその誤差を引き起こすかもしれない。解決法は、優れた化学的知見の組み合わせにあるかもしれない−ＳＤＳはタンパク質のほとんどを変性し、互いにより容易に移動させることが可能である；高電場；残余のタンパク質−タンパク質相互作用は、非常に高い電場を使用することによって無視できるものになるかもしれない；固有のタンパク質相互作用を最小化するための温度制御の使用；及び興味ある形状；バンド−バンド相互作用は、分離、特に第一の分離の長さを長く維持することによって最小化されるかもしれない。これらのストラテジーのいずれかまたは全てが、タンパク質相互作用を減少するために使用されて良い。
【００３６】
更に、分離の大部分を通じたタンパク質のモニタリングが使用されても良い。その全軌跡を造影することにより、いずれかのバンド−バンド相互作用についてモニターして較正することが可能であってよい。
【００３７】
前記システムの利点
プロテオミクスの基本的な進歩は、タンパク質を特徴づけてこの分析を疾患状態と結びつける能力が著しく改良されていることを意味する一方、この知見を生きた患者のケアの場合に移行できる前に、解決しなければならないボトルネックが存在している。本発明者らは、特定の範囲のテーラーメード治療の場合に有効に反応するより規定された患者群をできるだけ正確に標的化できる一方、そのような分析を実施する全体のコストの利益は、各治療の場合がより小さい患者のベースに制限されると最小化し、Ｒ＆Ｄに還元して最小化し、治療上のケアの維持コストを増大化する。前記システムの一つの鍵となるボトルネックは、患者から採取される複雑なタンパク質サンプルの初期分析にある。現在の方法体系は高価であり、時間を浪費し、技術的に特別化されている。このタイプの分析の結果が主として学術部門、大産業、及びわずかな専門化の病院の場面に閉じ込められているためである。本発明者らの方法体系は、結果にいたる時間を劇的に減少し、技術的な特別化を減少し、装置のコストを減少するために単純であるが非常に強力なアルゴリズムを使用し、かくしてより広範囲のヘルスケア業界内の採用に対するバリアを低下する方法体系の使用を通じて、この点の全てを解決する。
【００３８】
ラベルフリーの固有のイメージング（ＬＦＩＩ）は、電気泳動による分離の間の生体分子を検出するために、化学的ラベルを使用しない新規なイメージングシステムである。ＬＦＩＩは、ラベルを含まないシグナルの多大なロスを補償する高速シグナルプロセッシングおよびパターン認識ツールを必要とする。これは、高エネルギー粒子物理学から直接的に適応されるアルゴリズムを使用することによって達成され、本発明者らの早期の特許出願に記載されている。本発明者らの装置は、分離システムとして毛管を使用してよいが、チップでの核酸とタンパク質の両者の分離を実施することが好ましく、分離の速度、増大した解像度、及び物理的サイズにおいて有利である。それはラベルを組み合わせることが無く、高速シグナルプロセッシング、ＬＦＩＩにその重要性を与えるミクロ流動を組み合わせる。利点には以下のものが含まれる：
健康上及び安全性の利点−インターカレーション化学種または放射活性を使用しない。使い捨てを考慮しなくて良い。
相対的な定量化−分子の相対的濃度の測定時の±１％の正確性。本発明者らの所有のシグナルプロセッシングは、定量化のための情報として、領域よりもむしろピークの高さを使用する。
解像度−４００Ｄａから１５ｋＤａの分子量でまでが好適。本発明者らは優れた結果を再現性を得ている。
感度−１μｇ／ｍｌで６ｋＤａから２００ｋＤａの分子量範囲で検出可能。
分析速度−迅速なサンプル注入時間でサンプルの高速スループット。
【００３９】
容易なサンプルローディングと衝撃耐性能力は、非常に容易な使用性と信頼性を意味する。
結果は、自動化分析を容易にする固有のデジタルフォーマットに生成される。
データ操作と分析ツールの強力な組み合わせは、「オールインワン」の結果分析を可能にする。ルーチンユーザーのための著しい使用容易性と、スペシャリストまたはパワーユーザーのための深い分析洞察性。
【００４０】
これまでの電気泳動技術において、最も一般的な方法は二次元ゲル電気泳動である；この汎用性にもかかわらず、この技術は２５年間の使用にわたりほとんど変化しておらず、実施するための複雑な手動工程（９を超える工程が必要とされる）を有し、時間を浪費し、再生産が困難であり（試薬及び装置の両者による）、誤差の傾向を有し、それを実施する全ての人に最も重要な不人気の方法である技術のままである。
【００４１】
二次元電気泳動を単純化し、自動化し、それに関するコストを減少するが、分離／分析当たりのほぼ同等の能力とコストを与える技術について必要性が存在する。ここに記載されたミクロ流動電気泳動装置及び方法は、この要求に適合するように機能できる。本発明者らは、チップ等電点（ＩＥＦ）電気泳動（ｐＨ勾配）、ＩＥＦと同じチャンネルでの荷電質量分離；上記を含む挿入されたポリマー基体；リアルタイムシステム分析及びコントロールソフトウエアアルゴリズムを準備することを目的とする。生成した装置は、廃棄可能なチップ内に十分に自動化された高解像度タンパク質分析が可能であろう。次いでチップフォーマットは、デスクトップ装置をシステムの稼動、流体の扱い、及び結果の提供に可能とするであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、本発明の実施態様に従った分子の分離のための装置の模式図を示す。
【図２】図２は、検出された分子についての荷電／重量比及び等電点を測定するための説明図を示す。
【図３】図３は、本発明の方法を使用して得ることができても良い結果の説明である、複数のタンパク質の等電点に対する荷電／重量比のプロットのシュミレーションを示す。
【図１】
2009531702.tif 000003
【図２】
2009531702.tif 000004
【図３】
2009531702.tif 000005
【国際調査報告】
2009531702.tif 000006
2009531702.tif 000007