(57)【要約】  本発明は樹脂上での分画により得られるヤナギ属の植物の抽出物およびその調製方法に関する。  本発明の抽出物は、サリシン誘導体の含有量の多さと、高分子量タンニンの含有量の少なさ、およびいくつかの組織のメタル・プロテアーゼを抑制するために十分な量のプロアントシアニジンを含むことによって特徴づけられる。本製品はオメガ−３／オメガ−６の多価不飽和脂肪酸に富んだ油中に処方されることで、抽出物活性成分のよりよい吸収と、相乗的な作用の増大がもたらされる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の段階からなる、ヤナギ属の植物の枝および樹皮からの抽出方法：
ａ）ヤナギ属の植物の枝および樹皮の、所望の生産物（抽出物全体）を可溶化する適切な溶剤による抽出；
ｂ）水に不溶（または難溶性）のタンニンの除去；
ｃ）水溶性のタンニンの除去；
ｄ）吸着樹脂カラム上で精製を通じたサリシン誘導体の含有量の増大。
【請求項２】
段階（ａ）が、Ｃ１−Ｃ３アルコールもしくはこれらの溶媒の混合物またはこれらの溶媒の水溶液または水単独で植物質を抽出することで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抽出溶媒がエタノールである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抽出溶媒がアルコール容量で３０％の水−エタノール溶液である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記抽出溶媒がアセトンである請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記抽出溶媒が８０容量％の水−アセトン溶液である請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記抽出が１０℃〜８０℃の温度で、好ましくは２５℃で行われる請求項２〜６（のいずれか１項）に記載の方法。
【請求項８】
段階（ｃ）がポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）を用いて行われる請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記クロマトグラフィー分離がスチレン−ジビニルベンゼンまたはアクリル樹脂を用いて行われる請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
サリシン誘導体含有量が５０％以下、タンニン含有量が５％以下およびオリゴマーのプロシアニンジン含有量が５％以上である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により得られた抽出物。
【請求項１１】
請求項１０の抽出物を含有する組成物。
【請求項１２】
関節症、関節リウマチおよび関節の慢性変性病変の治療のための薬剤の調製のための、請求項１０の抽出物の使用（方法）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は樹脂上での分画により得られるヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）の植物の抽出物およびその調製方法に関する。
【０００２】
本発明の抽出物は、サリシン誘導体の含有量の多さと、高分子量タンニンの含有量の少なさ、およびいくつかの組織のメタル・プロテアーゼを抑制するのに十分な量のプロアントシアニジンを含むことによって特徴づけられる。この製品は、ω−３およびω−６酸に富んだ油の中に処方されることにより、活性成分の吸収の向上とともに、その作用の相乗的な増大がもたらされる。
【背景技術】
【０００３】
様々な種のヤナギの樹皮および枝の抽出物は、記録に残らない昔から関節リウマチ形成や痛風の治療に用いられてきた。ところが、ヤナギ抽出物は、１９世紀の末にヤナギに存在する化合物の酸化により得られるサリチル酸をアセチル化することによりアスピリンが合成されると、実質上見捨てられた。しかしながら、アスピリンとヤナギ抽出物には、作用の仕組みおよび骨関節での活性の点から見て根本的な違いがある。この抽出物が酵素ＣＯＸ２に作用するのに対して、アスピリンは主にＣＯＸ１に作用し、消化管および血液凝固によく知られた副作用を伴うが、これは関節症および関節リウマチのような慢性変性病変の場合に必要とされる長期に渡る使用を厳しく制限するものである。
【０００４】
ヤナギ抽出物はサリシン誘導体の含有量が非常に変わりやすく、平均で１５％以下、またタンニン含有量は８〜２０％の範囲であることが文献から知られている。ヤナギ抽出物中に存在するタンニンは、すべての没食子性およびカテキン性のタンニンと同様に、タンパク質およびプロテオグリカンと強い親和性を有し、これは長期間の治療の場合に組織の損傷を伴う。
【０００５】
したがって、工業への適用が容易で、活性成分の含有量が標準化された抽出物を提供する簡便なプロセスが必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、サリシン誘導体の含有量の多さと、高分子量タンニンの含有量の少なさ、およびいくつかの組織のメタル・プロテアーゼを抑制するために十分な量のプロアントシアニジンを含むことによって特徴づけられる、ヤナギ属の植物の新規な抽出物の調製方法に関する。
【０００７】
驚くべきことに、適切な条件のもとでのヤナギの樹皮または枝の抽出、および得られた抽出物の特有の精製処理により、サリシン誘導体含有量が最大５０％、タンニン含有量５％以下、およびオリゴマー状態のプロシアニンジンの含有量が５％より多い抽出物が提供されることが見出された。
【０００８】
ヤナギ抽出物、特にサリシン誘導体単独と比較した場合の本発明の抽出物を用いる利点は、強いラジカル・スカベンジャーであり、白血球ＩＬ−１の過度の発現による関節炎条件下で活性化するメタル・プロテアーゼの強力な抑制剤であるプロアントシアニジンの存在と関係がある。
【０００９】
本発明のヤナギ抽出物の調製方法は、抽出物中のサリシンおよびその誘導体の含有量において、並びに、抽出物中の治療の役に立つプロアントシアニジンを保持しながらタンニン含有量の選択的低減をもたらすような充填剤の使用において、従来技術によるものと異なっている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の方法は４つの主要な段階からなる：
ａ）ヤナギ属の植物の枝および樹皮の、所望の生産物（抽出物全体）を可溶化する適切な溶剤による抽出；
ｂ）水に不溶（または難溶性）のタンニンの除去；
ｃ）水溶性のタンニンの除去；
ｄ）吸着樹脂カラム上での精製を通じたサリシン誘導体の増大。
【００１１】
段階（ａ）は、植物の樹皮および枝からなる植物質を、Ｃ１−Ｃ３アルコールもしくはアセトンまたはこれらの溶剤の混合物あるいはこれらの溶剤の水溶液または水単独で抽出することによりなされる。３０容量％水−エタノール溶液が好ましい。
【００１２】
抽出温度は１０℃〜８０℃の範囲とすることが可能であり、好ましくは２５℃である。
【００１３】
段階（ｂ）は水に不溶の、特に高分子量のタンニンの抽出物からの除去を可能にする。
【００１４】
段階（ｃ）はほとんどの水溶性のタンニンの抽出物からの除去を可能にする。これは任意に行われる段階であり、段階（ｂ）の後の抽出物に依然存在するいかなるタンニンをも取り除くために行うことができる。これらの代謝産物はポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）を用いることで除去できる。
【００１５】
段階（ｄ）は抽出物の分画によりたいていの無用の代謝産物（糖類など）を除去しながら所望の二次代謝産物、すなわちサリシン 誘導体およびオリゴマー状態のプロアントシアニジンを保持することを可能にする。この段階はポリマー樹脂上での吸着によるクロマトグラフィー分離である。この目的にかなう樹脂の例としては、アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）ＨＰ２０（登録商標）またはＲｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ  ＸＡＤ１１８０（登録商標）のようなスチレン−ＤＶＢ樹脂、およびＲｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ  ＸＡＤ７ＨＰ（登録商標）のようなアクリル樹脂が挙げられる。
【００１６】
適切な溶剤混合物を用いたカラム分画段階の間、遊離したサリシンをその誘導体から分離することができ、遊離したサリシンに富み、その誘導体の量が低下した画分と、全く異なる組成物の画分が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
ヤナギの樹皮および枝を３０％エタノールで抽出して得られた抽出物全量は、乾燥残留物が５〜５０重量％、好ましくは２５重量％となるように濃縮し、１℃〜２０℃、好ましくは４℃で撹拌せずに１時間〜２４時間、好ましくは１６時間放置する。
【００１８】
得られた懸濁液を４℃で遠心分離して残余の高分子量の誘導体およびタンニンを含む沈殿を澄んだ水溶液から除去する。
【００１９】
全抽出物中に含まれる水に不溶または難溶性のタンニンは、水を用いて精製することにより除去されるが、これはポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）を用いた任意の処理（段階ｃ）によりさらに改善される。部分的な水を用いた精製（段階ｂ）はタンニンの一部を除去するに過ぎない（５０重量％以上のタンニンが残存する）のに対し、ＰＶＰＰ精製は残余のタンニンを最終的な抽出物重量の５％未満になるまで除去する。
【００２０】
したがって、段階ｂ）からの澄んだ水溶液はＰＶＰＰで処理され（処理すべき水抽出物の乾燥残留物に対して１−５０重量％、好ましくは１：３０、最も好ましくは１：２０）、１時間以上攪拌状態に保たれる。
【００２１】
溶液はＰＶＰＰと吸着されたタンニンから濾過される。次いで水溶液は樹脂上に吸着され、担体は望ましくない可溶性物質を除去するために水で徹底的に洗浄される。保持されなかった溶液は廃棄される。
【００２２】
製品は水含有量が５０容量％〜０容量％、好ましくは１０容量％である水−アルコール溶液（Ｃ１−Ｃ３アルコール、好ましくはエタノール）により溶離される。あるいは、水含有量が５０容量％〜０容量％、好ましくは１０容量％である水−アセトン溶液を用いることもできる。この−水エタノール溶液は乾燥もしくは霧化により濃縮される。得られた抽出物は通常の固形薬またはカプセル中の油性懸濁液、特にオメガ−３／オメガ−６の多価不飽和脂肪酸に富んだ油中の懸濁液として処方することができる。特に好ましいのは月見草油および魚油、ならびにその誘導体である。
【００２３】
ヒトにおける関節症および関節リウマチの治療のための活性用量は、治療する疾患の重症度に応じて毎日１００〜１０００ｍｇの範囲とする。
【００２４】
本発明は下記の実施例においてより詳細に説明される。
【実施例】
【００２５】
（実施例１）
ヤナギの枝および樹皮の水−エタノール溶液を用いた抽出（段階ａ）：
この段階では、後続のカラム・クロマトグラフィー分離のための出発原料として用いられる全体抽出物を調製する。
【００２６】
ヤナギの枝および樹皮１０００ｇをスタティック・パーコレーター（静止浸透濾過器）中において３０容積％エタノール１．５Ｌで２０℃で４時間にわたり覆う。４時間後、浸出液は回収され、同一条件下で繰り返し６回抽出されるが、今度は１回の抽出ごとに１Ｌの溶剤が使用され、合計で約７Ｌの浸出液が得られる。浸出液をまとめて、不純物や植物性の残留物を濾過して除去する。この溶液（製品１）の全乾燥残留物は１５４ｇで、出発原料に対する収率は１５．４重量％である。
【００２７】
遊離サリシンの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による含有量は４．６３％であり；サリシン全体のＨＰＬＣによる含有量は１５．４重量％である。タンニン含有量は１６．２６重量％である。
【００２８】
（実施例２）
ヤナギの枝および樹皮の水−アセトン溶液を用いた抽出（段階ａ）：
この段階では、後続のカラム・クロマトグラフィー分離のための出発原料として用いられる全体抽出物を調製する。
【００２９】
ヤナギの枝および樹皮１０００ｇを静止浸透濾過器中において８０容積％アセトン１．５Ｌで２０℃で４時間にわたり抽出する。４時間後、浸出液は回収され、同一条件下で繰り返し６回抽出されるが、今度は１回の抽出ごとに１Ｌの溶剤が使用され、合計で約７Ｌの浸出液が得られる。浸出液をまとめて熱濾過し、６０℃の減圧下で回転式蒸発器を用いて濃縮する。この抽出物の全乾燥残留物は１４３ｇで、出発原料に対する収率は１４．３重量％である。
【００３０】
遊離サリシンのＨＰＬＣによる含有量は４．３％であり；サリシン全体のＨＰＬＣによる含有量は１５．７重量％である。タンニン含有量は１５．４２重量％である。
【００３１】
（実施例３）
ヤナギの枝および樹皮の水を用いた抽出（段階ａ）：
この段階では、後続のカラム・クロマトグラフィー分離のための出発原料として用いられる全体抽出物を調製する。
【００３２】
ヤナギの小枝および樹皮１０００ｇを静止浸透濾過器中において水１．５Ｌで２０℃で４時間にわたり覆う。４時間後、浸出液は回収され、同一条件下で繰り返し６回抽出されるが、今度は１回の抽出ごとに１Ｌの溶剤が使用され、合計で約７Ｌの浸出液が得られる。浸出液をまとめて吸引濾過し、６０℃の減圧下で回転式蒸発器を用いて濃縮する。この抽出物の全乾燥残留物は１６７ｇで、出発原料に対する収率は１６．７重量％である。
【００３３】
遊離サリシンのＨＰＬＣによる含有量は３．９４％であり；サリシン全体のＨＰＬＣによる含有量は１３．６重量％である。タンニン含有量は６．８重量％である。
【００３４】
（実施例４）
ヤナギの枝および樹皮のメタノールを用いた抽出（段階ａ）：
この段階では、後続のカラム・クロマトグラフィー分離のための出発原料として用いられる全体抽出物を調製する。
【００３５】
ヤナギの枝１０００ｇを静止浸透濾過器中においてメタノール１．５Ｌで２０℃で４時間にわたり覆う。４時間後、浸出液は回収され、同一条件下で繰り返し６回抽出されるが、今度は１回の抽出ごとに１Ｌの溶剤が使用され、合計で約７Ｌの浸出液が得られる。浸出液をまとめて濾過し、６０℃の減圧下で回転式蒸発器を用いて濃縮する。この抽出物の全乾燥残留物は１０１ｇで、出発原料に対する収率は１０．１重量％である。
【００３６】
遊離サリシンのＨＰＬＣによる含有量は５．９％であり；サリシン全体のＨＰＬＣによる含有量は１９．９重量％である。タンニン含有量は１４．５重量％である。
【００３７】
（実施例５）
ヤナギの枝および樹皮の抽出物の精製（段階ｂ）：水不溶性物質の除去
実施例１（段階ａ）に記載された処理の結果得られる溶液１を、回転式蒸発器を用いて６０℃で減圧下で濃縮することにより、乾燥残留物の割合が全体の２５重量％である水性懸濁液が得られ、その液の全重量は６１５ｇである。
【００３８】
得られた水性懸濁液を４℃に冷却して１６時間放置し、冷却したままの水性懸濁液を３０００×ｇで２０分間遠心分離することで清澄な水溶液から沈殿した残留物を分離する。この沈殿は１６．３ｇの乾燥残留物を有し、タンニンおよび高分子量の生産物に富んでいるため、除去される。
【００３９】
得られた清澄溶液（溶液２）は、部分的に精製された抽出物１３７ｇに相当する乾燥残留物を有し、ここで遊離サリシンのＨＰＬＣによる含有量は５．０％であり；サリシン全体のＨＰＬＣによる含有量は１６．７重量％である。タンニン含有量は６．９重量％である。
【００４０】
出発原料に対する重量収率は１３．７重量％である。
【００４１】
（実施例６）
ヤナギの枝および樹皮の抽出物の精製（段階ｃ）：
段階ｂの部分的な精製工程の結果得られる清澄水溶液（実施例５、溶液２）は、乾燥残留物を１３７ｇ含むが、これを処理して水溶性のタンニンを除去する。
【００４２】
この溶液に、処理される抽出物の乾燥残留物の約１０重量％に相当する１４ｇのＰＶＰＰを加える。室温で１時間攪拌した後、ＰＶＰＰを遠心分離により溶液から分離する。
【００４３】
得られた溶液（溶液３）は、部分的に精製された抽出物１２５ｇに相当する乾燥残留物を有し、ここで遊離サリシンのＨＰＬＣによる含有量は５．３％であり；サリシン全体のＨＰＬＣによる含有量は８重量％である。タンニン含有量は１．２重量％である。
【００４４】
出発原料に対する重量収率は１２．５重量％である。
【００４５】
（実施例７）
ヤナギの枝および樹皮の抽出物のクロマトグラフィー精製（段階ｄ）：
段階ｃで得られた水溶液（実施例６、溶液３）を、水で調製したＲｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ  ＸＡＤ１１８０（登録商標）樹脂１２５０ｍｌを入れたクロマトグラフィーカラムに注ぎ込む。水−アルコール溶液は樹脂に吸着されるが、ここで保持されずにカラムを出た溶液は廃棄される。樹脂はその後１．２５リットルの水で洗浄し、この溶液は所望の成分の量が無視できるのでやはり除去する。これら廃棄される水溶液（生成物１）は全乾燥残留物が５２．６ｇで、遊離サリシンのＨＰＬＣによる含有量は０．８７％であり、サリシン全体のＨＰＬＣによる含有量は０．９２重量％である。
【００４６】
カラムは９０容積％エタノール水溶液３．７５リットルにより溶離される。得られた溶出液を回収し、６０℃で減圧下で乾燥して乾燥製品（生成物２）７２．４ｇを得る。出発原料に対する収率は７．２重量％である。遊離サリシンのＨＰＬＣによる含有量は８．９５％であり、サリシン全体のＨＰＬＣによる含有量は３０．０重量％である。オリゴマーの プロアントシアニジンの含有量は１１．２重量％であり、タンニンの含有量は２．１重量％である。
【００４７】
（実施例８）
ヤナギの枝および樹皮の抽出物のクロマトグラフィー精製（段階ｄ）および遊離サリシンの誘導体からの分離：
段階ｃで得られた水溶液（実施例６、溶液３）を、水で調製したＲｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ  ＸＡＤ１１８０（登録商標）樹脂１２５０ｍｌを入れたクロマトグラフィーカラムに注ぎ込む。水−アルコール溶液は樹脂に吸着されるが、ここで保持されずにカラムを出た溶液は廃棄される。樹脂はその後１．２５リットルの水で洗浄し、この溶液は所望の成分の量が無視できるのでやはり除去する。これら廃棄される水溶液（生成物３）は全乾燥残留物が５１．７ｇで、遊離サリシンのＨＰＬＣによる含有量は１．３４％であり、サリシン全体のＨＰＬＣによる含有量は１．４１重量％である。
【００４８】
樹脂を１０容積％エタノール水溶液２．５リットルで洗い、乾燥残留物１７．１ｇ（出発原料に対する収率は１．７重量％）である溶液（生成物４）を得る。遊離サリシンのＨＰＬＣによる含有量は３４．６％であり；サリシン全体のＨＰＬＣによる含有量は３４．９重量％である。
【００４９】
カラムは９０容積％エタノール水溶液３．７５リットルにより溶離される。得られた溶出液を回収し、６０℃で減圧下で乾燥して乾燥製品（生成物５）４３．２ｇを得る。出発原料に対する収率は４．３重量％である。遊離サリシンのＨＰＬＣによる含有量は０．４５％であり、サリシン全体のＨＰＬＣによる含有量は３９．７重量％である。
【００５０】
（実施例９）
ソフトゼラチンカプセル中の抽出物製剤
ソフトゼラチンカプセルのための油性懸濁液中のサリックス・ルブラ（Ｓａｌｉｘ  ｒｕｂｒａ）抽出物の製剤。
【００５１】
単位組成物：
実施例７のサリックス・ルブラ（Ｓａｌｉｘ  ｒｕｂｒａ）抽出物  ２５０ｍｇ
モノステアリン酸グリセリン  １０ｍｇ
大豆レシチン  １０ｍｇ
月見草油  適量（７００ｍｇまで）
調製：
１）  月見草油を約７０℃で加熱し、溶融したステアリン酸グリセリンを攪拌しながら加える。
【００５２】
２）  大豆レシチンを得られた溶液に加える。
【００５３】
３）  適切な攪拌システムを用いて得られた溶液中のサリックス・ルブラ（Ｓａｌｉｘ  ｒｕｂｒａ） 抽出物を分散し、均一な分布となるのを促進する。
【００５４】
得られた溶液を攪拌しながらゆっくり冷却する。
【国際調査報告】
2009501165.tif 000002
2009501165.tif 000003
2009501165.tif 000004