(57)【要約】  Ａ−Ｂ−Ａ構造を有し、各Ａは、親水性であり生体適合性である末端ブロックであり、Ｂ中央ブロックは、疎水性のデサミノチロシルチロシンポリカーボネートまたはポリアリーレートである、生体適合性であり無毒のトリブロック共重合体である。前記共重合体は、自然に自己組織化して、疎水性の生物活性化合物または薬剤活性化合物のデリバリービークルとして有用な、低臨界凝集濃度のナノ粒子を形成する。
2009503187.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ−Ｂ−Ａ構造を有し、各Ａ末端ブロックは水溶性、親水性、および無毒であり；Ｂ中央ブロックは式（Ｉ）で表される構造を有する、同一または異なった繰り返し単位を有するポリカーボネートである、トリブロック共重合体：
【化１】
2009503187.tif 000014
この際、Ｘは
【化２】
2009503187.tif 000015
であり；Ｚは２〜約１００であり；Ｒ１はＣＨ＝ＣＨまたは（ＣＨ２）ｎであり、この際、ｎは０〜１８であり；Ｒ２は、水素、約１８までの炭素原子を含む直鎖および分岐のアルキル基ならびに約１８までの炭素原子を含む直鎖および分岐のアルキルアリール基からなる群から選択される。
【請求項２】
前記末端ブロックが、以下の構造を有するポリ（アルキレンオキサイド）である、請求項１に記載のトリブロック共重合体：
【化３】
2009503187.tif 000016
この際、各Ａのｍは、独立して、各Ａの分子量が約１０００〜約１５，０００ｇ／ｍｏｌとなるように選択され；各Ａの、および各Ａ中のＲ３は、独立して、水素および１〜４の炭素原子を含む低アルキル基からなる群から選択され；ａは１以上の整数である。
【請求項３】
前記末端ブロックが、ＣＨ３Ｏ−［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−］ｍの構造を有する、請求項１に記載のトリブロック共重合体。
【請求項４】
Ｚが約１０である、請求項１に記載のトリブロック共重合体。
【請求項５】
Ｒ１およびＲ２の１以上がエーテル結合を含む、請求項１に記載のトリブロック共重合体。
【請求項６】
Ｒ１が−ＣＨ２−ＣＨ２−である、請求項１に記載のトリブロック共重合体。
【請求項７】
Ｒ２が、エチル基、ブチル基、ヘキシル基、オクチル基、デシル基、ドデシル基、およびベンジル基からなる群から選択される、請求項１に記載のトリブロック共重合体。
【請求項８】
請求項１に記載のトリブロック共重合体から形成されるナノ粒子。
【請求項９】
（ａ）Ａ−Ｂ−Ａ構造を有し、各Ａ末端ブロックは水溶性、親水性、および無毒であり；Ｂ中央ブロックは式ＩＩで表される構造を有する、同一または異なった繰り返し単位を有し、疎水性である、トリブロック共重合体のナノ粒子：
【化４】
2009503187.tif 000017
この際、Ｘは
【化５】
2009503187.tif 000018
または
【化６】
2009503187.tif 000019
であり；Ｚは２〜約１００であり；Ｒ１はＣＨ＝ＣＨまたは（ＣＨ２）ｎであり、この際、ｎは０〜１８であり；Ｒ２は、水素、１８までの炭素原子を含む直鎖および分岐のアルキル基ならびに１８までの炭素原子を含む直鎖および分岐のアルキルアリール基からなる群から選択され；Ｒは、結合または１８までの炭素原子を含む直鎖および分岐のアルキル基ならびに１８までの炭素原子を含む直鎖および分岐のアルキルアリール基からなる群から選択される；および
（ｂ）前記ナノ粒子によって複合体化される疎水性化合物；
を含む組成物。
【請求項１０】
前記末端ブロックが、以下の構造を有するポリ（アルキレンオキサイド）である、請求項９に記載の組成物：
【化７】
2009503187.tif 000020
この際、各Ａのｍは、独立して、各Ａの分子量が約１０００〜約１５，０００ｇ／ｍｏｌとなるように選択され；各Ａの、および各Ａ中のＲ３は、独立して、水素および１〜４の炭素原子を含む低アルキル基からなる群から選択され；ａは１以上の整数である。
【請求項１１】
前記末端ブロックが、ＣＨ３Ｏ−［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−］ｍの構造を有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
Ｚが約１０である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｒ、Ｒ１およびＲ２の１以上がエーテル結合を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｒ１が−ＣＨ２−ＣＨ２−である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
Ｒ２が、エチル基、ブチル基、ヘキシル基、オクチル基、デシル基、ドデシル基、およびベンジル基からなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１６】
Ｒが、１２までの炭素原子を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１７】
Ｒが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ（−ＯＨ）−、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−および（−ＣＨ２−）ｚからなる群から選択され、この際、ｚは０〜１２である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記複合体化された疎水性化合物は、生物活性化合物または薬剤活性化合物である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１９】
製薬上許容される担体および有効量の請求項９に記載の組成物を含む、疎水性化合物を必要とする患者にデリバリーするための組成物。
【請求項２０】
前記ナノ粒子がドラッグデリバリーオリゴマーマトリックスに組み込まれる、または分散される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記活性な疎水性化合物は、抗腫瘍剤、抗生物質、抗菌剤、スタチン、ペプチド、タンパク質、ホルモン、およびワクチンからなる群から選択される、請求項１８、１９、または２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記活性な疎水性化合物は、パクリタキセル、カンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、シスプラチン、カルボプラチン、シプロフロキサシン、ドキソルビシン、ロリプラム、シンバスタチン、メトトレキサート、インドメタシン、プロビプロフェン、ケトプロフェン、イロキシカム、ジクロフェナク、シクロスポリン、エトラコナゾール、ラパマイシン、ノコダゾール、コルヒチン、ケトコナゾール、テトラサイクリン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、オフロキサシン、ゲンタマイシン、オクトレオチド、カルシトニン、インターフェロン、テストステロン、プロゲステロン、エストラジオール、エストロゲン、およびインスリンからなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記複合体化された化合物は、造影剤である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１９または２０に記載の組成物を必要とする患者に投与することを含む、部位特異的な、または全身の、ドラッグデリバリーの方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
製薬およびバイオテクノロジー産業が抱える重要な問題点は、疎水性の治療用化合物のための効果的で無毒なデリバリーシステムの利用可能性が限られていることである。例えば、胸部および卵巣の腫瘍の治療に選択されるパクリタキセルは、疎水性である。したがって、パクリタキセルの臨床的な投与には、望ましくない副作用につながる油またはエタノールの賦形剤に分散させる必要がある。
【０００２】
合成ポリマーは、高い溶解性および結合した治療化合物の安定性、および細胞の制限された集団への標的デリバリーの機会を与え、さまざまな薬物のデリバリービークルとして優位性が示されてきた。ナノ粒子、すなわち、サブミクロンレンジの大きさを有する担体は、血管内投与に望ましい。このため、最近の超分子化学の進歩によって、優れた特性を有する材料の設計が可能になった。
【０００３】
非経口デリバリーシステムのためには、ナノサイズの粒子およびリポソームが、腫瘍の漏れやすい血管系からの浸出が可能であるため、癌の治療に大きな可能性があることが示されている。この目的を達成するために、ナノ粒子、ポリマーミセル、リポソーム、および表面修飾したナノ粒子などの、さまざまなナノサイズの粒子またはコロイド担体が提案されている。しかしながら、中でも、体内の薬剤および担体の分布、望ましくない副作用、マクロファージによる速い除去、熱的不安定性、構造的な脆性、および低い薬剤取り込み効率によってこれらのアプローチが制限され、このようなデリバリーシステムが臨床用途に進められたのはわずかであった。
【０００４】
リポソームシステムのためには、その貯蔵安定性の低さおよび取り込みの不十分さが実質的な障壁であった。生分解性であり、抗原性が低く、薬剤用途が認められているために最も広く研究されているＰＬＧＡ［ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）］およびＰＬＡ−ＰＥＧ［ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）−ポリ（エチレングリコール）］とともに、多くのポリマー系が探索されてきたが、その報告された薬剤組み込み濃度は一般に非常に低く、したがって治療効果が得られる十分な薬剤を封入することは困難であった。シアノアクリレートポリマーを用いると薬剤組み込みの改善がみられたが、これらの系はいくらかの毒性を示す。ナノ沈降／溶媒抽出技術を用いて製造された多くのナノ粒子の他の欠点は、ナノ粒子の形成中に界面活性剤が必要なことである。界面活性剤および／または残留溶媒の十分な除去は常に問題である。
【０００５】
特に興味深いのは、ブロック共重合体の自己組織化を介して形成されたナノ粒子である。低分子量の脂質または界面活性剤分子と同様に、両親媒性のブロック共重合体は、親水性のブロックおよび疎水性のブロックの、少なくとも２つの部分から構成される。このような両親媒性のブロック共重合体は、その疎水性によって、水溶液中で自己組織化しうる。高濃度ではラメラ液晶相を構築する一方、希釈水溶液中ではミセルまたは多孔質構造のようなさまざまな形状の超構造を形成しうる。
【０００６】
適当な中性の両親媒性のブロック共重合体は、希釈水溶液中で自然にナノメートルサイズの、明確な中空球の構造を形成する。これらの構造は、脂質または界面活性剤分子の高分子量アナログとしてみなされうる。しかしながら、これらは、その遅い動態のために通常のリポソームよりもはるかに安定な超構造を形成する。さらに、例えば球状に閉じた脂質二重層などのリポソームは、免疫系に速やかに認識され、血流から除かれる。ブロック共重合体化学の幅広い多様性によって、免疫原性反応を避けるための完全な合成材料を調製することができる。
【０００７】
適当なブロック共重合体はナノ粒子を形成しうることはよく知られているが、希釈水溶液中で、生体適合性であって生分解性の構造に自己組織化するように設計されたものはほとんどなかった。両親媒性のブロックオリゴマーの自然な凝集の一例が、ポリ（メチルオキサゾリン）−ブロック−ポリ（ジメチル−シロキサン）−ブロック−ポリ（メチル−オキサゾリン）、ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡトリブロックオリゴマーで報告されている。押し出し技術と組み合わせた注入によって、そのサイズが５０〜５００ｎｍに制御できるベシクルが形成される。しかしながら、細胞毒性のない、生分解性のトリブロック共重合体ベシクルの必要性は残っている。
【０００８】
ブロック共重合体ベシクルは、多くの理由で、ドラッグデリバリーへの適用に関心が持たれている。第１に、疎水性の薬剤はブロック共重合体ミセルのコアに物理的にトラップされ、その本来の水溶性を超える濃度でデリバリーされうる。第２に、しばしばポリ（エチレンオキサイド）（ＰＥＯ）から構成される親水性ブロックは、水性の環境と水素結合を形成し、ミセルのコアの周辺に緊密なシェルを形成しうる。結果的に、疎水性コアの内容物は、加水分解および酵素分解から効果的に保護される。さらに、ＰＥＯコロナは、細網内皮系による認識を防ぎ、したがってミセルの血流からの初期の脱離を防ぐ。
【０００９】
したがって、安定性、コスト、および製剤の容易性の利点のため、ポリマーナノ粒子の使用がより好ましい。薬剤の組み込みおよび薬剤放出の制御は、薬剤との相互作用のレベルを向上させうる部分をポリマーに導入することで変化させることができると期待されている。このストラテジーは、インビボの生分解およびそれに続く体内からの除去を可能にする生分解性ポリマーを必要とする。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明者らのアプローチによって、幅広い疎水性の治療薬をデリバリーできる、ナノ粒子のための多用途の共重合体アーキテクチャが開発されてきた。本発明者らは、本明細書中に、ナノ粒子は、抗腫瘍剤であるパクリタキセルなどの疎水性分子と強く複合体化し、これをインビトロで腫瘍細胞に効果的にデリバリーすることをさらに示す。
【００１１】
ナノ粒子に自己組織化する一群のＡＢＡ型トリブロック共重合体は、現在では、重要な疎水性化合物を複合体化できることが示されている。これらの共重合体は、水溶液中で自然にナノ粒子に自己組織化し、前記ナノ粒子の性質は、ＡおよびＢブロックの分子量、およびペンダントエステルのＲ基の分子組成を含む、いくつかの独立した容易に制御できる合成上のバリエーションの関数であることが示されている。
【００１２】
前記トリブロック共重合体は、水溶性、親水性、および無毒である末端ブロックと、ポリアリーレートまたはポリカーボネートの中央ブロックとから誘導される。したがって、本発明の具体的な一形態によれば、Ａ−Ｂ−Ａ構造を有し、各Ａ末端ブロックは水溶性、親水性、および無毒であり；Ｂ中央ブロックは式（Ｉ）で表される構造を有する、同一または異なった繰り返し単位を有するポリカーボネートである、トリブロック共重合体が提供される：
【００１３】
【化１】
2009503187.tif 000003
【００１４】
この際、Ｘは
【００１５】
【化２】
2009503187.tif 000004
【００１６】
であり；Ｚは２〜約１００であり；Ｒ１はＣＨ＝ＣＨまたは（ＣＨ２）ｎであり、この際、ｎは０〜１８であり；Ｒ２は、水素、約１８までの炭素原子を含む直鎖および分岐のアルキル基ならびに約１８までの炭素原子を含む直鎖および分岐のアルキルアリール基からなる群から選択される。
【００１７】
前記トリブロック共重合体は自然に自己組織化し、非常に低い濃度の場合でも薬剤および他の活性物質のデリバリーに有用な、生体適合性、生分解性のナノ粒子を形成する。
【００１８】
したがって、本発明の他の形態によれば、（ａ）Ａ−Ｂ−Ａ構造を有し、各Ａ末端ブロックは水溶性、親水性、および無毒であり；Ｂ中央ブロックは下記式（ＩＩ）で表される構造を有する、同一または異なった繰り返し単位を有し、疎水性である、トリブロック共重合体のナノ粒子：
【００１９】
【化３】
2009503187.tif 000005
【００２０】
この際、Ｘは
【００２１】
【化４】
2009503187.tif 000006
【００２２】
または
【００２３】
【化５】
2009503187.tif 000007
【００２４】
であり；Ｚは２〜約１００であり；Ｒ１はＣＨ＝ＣＨまたは（ＣＨ２）ｎであり、この際、ｎは０〜１８であり；Ｒ２は、水素、１８までの炭素原子を含む直鎖および分岐のアルキル基ならびに１８までの炭素原子を含む直鎖および分岐のアルキルアリール基からなる群から選択され；Ｒは、結合または１８までの炭素原子を含む直鎖および分岐のアルキル基ならびに１８までの炭素原子を含む直鎖および分岐のアルキルアリール基からなる群から選択される；および（ｂ）前記ナノ粒子によって複合体化される疎水性化合物；を含む組成物が提供される。
【００２５】
前記末端ブロックは、好ましくは、以下の構造を有するポリ（アルキレンオキサイド）である：
【００２６】
【化６】
2009503187.tif 000008
【００２７】
この際、各Ａのｍは、独立して、各Ａの分子量が約１０００〜約１５，０００ｇ／ｍｏｌとなるように選択され；各Ａの、および各Ａ中のＲ３は、独立して、水素および１〜４の炭素原子を含む低アルキル基からなる群から選択され；ａは１以上の整数である。好ましい実施形態においては、前記末端ブロックは、ＣＨ３Ｏ−［ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−］ｍの構造を有する。
【００２８】
特に、本発明の共重合体ナノ粒子は、抗腫瘍剤、抗生物質、抗菌剤、スタチン、ペプチド、タンパク質、ホルモン、ワクチン、および造影剤などの、薬剤または他の活性成分、すなわち、原則的に広い意味での任意の有用な薬剤または生物剤を複合体化するために用いられ、複合体化された材料の持続放出の手段を提供する。したがって、本発明のさらに他の形態によれば、製薬上許容される担体と、疎水剤を本発明のトリブロック共重合体とを複合体化するナノ粒子の有効量とを含む、疎水性の活性剤を必要とする患者にデリバリーするための組成物が提供される。
【００２９】
本発明のこの形態の好ましい実施形態は、活性化合物のナノ粒子が有効な部位特位的な、または全身のデリバリーに十分な量で存在する、ナノ粒子と複合体化された生物活性化合物または薬剤活性化合物を提供する。担体は前記ナノ粒子が懸濁する水溶液またはドラッグデリバリーマトリックスでありうる。本発明のこの形態は、本発明の共重合体ナノ粒子がマトリックスベースの制御放出デバイス中の活性剤のリザーバーとして機能する実施形態を含む(例えば、Ｐ．Ｓｉｎｋｏ  ａｎｄ  Ｊ．Ｋｏｈｎ，“Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ：Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ”，Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｍ．Ａ．Ｅｌ−Ｎｏｋａｌｙ，Ｄ．Ｍ．Ｐｉａｔｔ  ａｎｄ  Ｂ．Ａ．Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，ｅｄｓ．），ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．５２０，１９９３，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，１８−４１．に記載されるようなハイドロゲルまたは任意の他の種類の制御放出システム）。
【００３０】
本発明の共重合体ナノ粒子のこの有用性が与えられれば、本発明のさらに他の形態によれば、本発明のポリマーナノ粒子によって複合体化された疎水性活性化合物の有効量を必要とする患者に投与することによる、部位特異的なまたは全身のデリバリーの方法が提供される。
【００３１】
本発明は、ドラッグデリバリーおよび活性剤の制御（または長時間）放出の分野において幅広い有用性を与える、重要な技術的進歩を示す。具体的には、本明細書中に記載される一群のトリブロック共重合体は、他のトリブロック共重合体に対して、少なくとも３つの大きな、特徴的な利点を有する：
１．一群のトリブロック共重合体は、患者に導入された後、完全に再吸収可能である。前記組成物は、無毒のビルディングブロックのみから誘導されるため、前記トリブロック共重合体はそれ自体、予想されるインビボの分解産物と同様、無毒であって生体適合性である。
【００３２】
２．一群のトリブロック共重合体は、自己組織化して臨界凝集濃度（ＣＡＣ）の低いナノ粒子を形成し、非常な高希釈下であっても安定に保たれる。
【００３３】
３．一群のトリブロック共重合体は、有機合成における技術を有する者によって変更されうる、基本性質（生体再吸収率、形成されるナノ粒子の物理的特性、および封入された活性剤について得られる放出プロファイルなど）の調整を可能にする一方で、全体的な化学構造において互いに密接に関連する、幅広い構造パラメータを提供する。
【００３４】
本発明のより完全な応用および多くの他の意図される利点は、発明の原理およびこれを実施するための現在検討されている最良の形態を開示した、以下の好ましい実施形態の詳細な説明、および特許請求の範囲を参照することによって、容易に得られるであろう。
【００３５】
図面の簡単な説明
図１は、ＰＥＧ−ｂ−オリゴ（ＤＴＲ−ＳＡ）−ｂ−ＰＥＧトリブロック共重合体の典型的な構造を示す図面である。
【００３６】
図２は、オリゴ（ＤＴＲ−ＳＡ）ブロックおよびＰＥＧ−ｂ−オリゴ（ＤＴＲ−ＳＡ）−ｂ−ＰＥＧトリブロック共重合体の熱挙動を示す表である。
【００３７】
図３は、ＰＥＧ−ｂ−オリゴ（ＤＴＲ−ＳＡ）−ｂ−ＰＥＧトリブロック共重合体の分子量特性およびその対応するナノ粒子の流体力学直径を示す表である。
【００３８】
図４Ａは、以下の、５Ｋ／ＤＴＯ−ＳＡナノ粒子の存在下または非存在下での蛍光を示す：（１）遊離フルオレセイン；（２）ナノ粒子／フルオレセイン；（３）遊離ＤＡＦ；（４）ナノ粒子／ＤＡＦ。
【００３９】
図４Ｂは、超遠心分離で精製した５Ｋ／ＤＴＯ−ＳＡナノ粒子を２．５μＭのＤＡＦ溶液（▲）または０．２５％ＤＭＦ中の１μＭのフルオレセイン溶液（●）に添加したときの、ナノ粒子の濃度の関数としての相対的な蛍光を示すグラフである。
【００４０】
図５Ａ〜５Ｄは、以下のように、ゲルろ過クロマトグラフィーの後の、フルオレセイン−５Ｋ／ＤＴＯ−ＳＡおよびＤＡＦ−５Ｋ／ＤＴＯ−ＳＡナノ粒子のフラクションの分析を示す：
図５Ａは、遊離フルオレセイン分画後のナノ粒子（▲）、およびフルオレセイン存在下で調製したナノ粒子（●）の検出を示す；
図５Ｂは、遊離ＤＡＦ分画後のナノ粒子（▲）およびＤＡＦ存在下１９で調製したナノ粒子（●）の検出を示す；
図５Ｃは、遊離フルオレセイン分画後のナノ粒子（▲）およびフルオレセイン存在下で調製したナノ粒子（●）の検出を示す；
図５Ｄは、遊離ＤＡＦ分画後のナノ粒子（▲）およびＤＡＦ存在下で調製したナノ粒子（●）の検出を示す。
【００４１】
【表１】
2009503187.tif 000009
【００４２】
図７は、ゲルろ過クロマトグラフィーのフラクションの関数としての吸光度を示すグラフであり、パクリタキセル存在下で形成され、ゲルろ過クロマトグラフィーによって分画された５Ｋ／ＤＴＯＳＡナノ粒子の奇数フラクションならびにフラクション７および９は、２６０ｎｍでの吸光度によって検出された（●）、パクリタキセルの活性は各フラクションを２０μＬ用いたＫＢ細胞増殖の関数として決定され、細胞増殖はＭＴＳアッセイを用いて決定され、４９０ｎｍで測定された（▲）。
【００４３】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明の共重合体は、Ａ−Ｂ−Ａ型のトリブロックである。Ａ末端ブロックは水溶性、親水性、および無毒であり、好ましくはポリ（アルキレンオキサイド）から選択され、疎水性の中央のＢブロックはポリアリーレートまたはポリカーボネートである。好ましいポリアリーレートの実施形態においては、中央ブロックは、チロシン誘導ジフェノールのフェノール性ヒドロキシル基と二酸のカルボン酸基との間のエステル結合によって互いに結合する、チロシン誘導ジフェノールおよび二酸から共重合される。他の好ましい実施形態においては、前記ポリカーボネート中央ブロックは、同一のジヒドロキシモノマーから共重合される。
【００４４】
中でも、より好ましいポリ（アルキレンオキサイド）末端ブロックは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、プルロニック（商標）ポリマーなどである。ポリエチレングリコールが好ましい。
【００４５】
本発明のポリアリーレート中央ブロックは、ジフェノール化合物が、脂肪族または芳香族のジカルボン酸と、４−（ジメチル−アミノ）−ピリジニウム−ｐ−トルエンスルホネート（ＤＰＴＳ）を触媒として用いて、カルボジイミド媒介直接ポリエステル化で反応する、米国特許第５，２１６，１１５号に記載される方法に従って、二酸のジフェノールとの縮合によって調製される。米国特許第５，２１６，１１５号の開示は、この点で本明細書中に参照として組み込まれる。ビス−二酸は、Ａ末端ブロックが共重合体の各末端に結合できるようにポリアリーレート中央ブロックとして選択される。
【００４６】
ジフェノール化合物は、その両方の開示もまた本明細書中に参照として組み込まれる、米国特許第５，５８７，５０７号および第５，６７０，６０２号のチロシン誘導ジフェノールモノマーである。ポリアリーレートは、式ＩＩＩの構造を有するチロシン誘導ジフェノールモノマーを用いて調製される：
【００４７】
【化７】
2009503187.tif 000010
【００４８】
この際、Ｒ１およびＲ２は上述の式ＩＩについて記載したものと同様である。
【００４９】
好ましいジフェノールモノマーは、デサミノチロシル−チロシンカルボン酸およびそのエステルであり、この際、Ｒ１は−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、これをＤＴエステルと称する。本発明の目的上、エチルエステル（Ｒ２＝エチル）をＤＴＥ、ベンジルエステル（Ｒ２＝ベンジル）をＤＴＢｎ、などのように称する。両特許はこれらのモノマーが調製されうる方法を開示している。本発明の目的上、デサミノチロシル−チロシン遊離カルボン酸（Ｒ２＝水素）をＤＴと称する。
【００５０】
ポリアリーレートジカルボン酸は以下の構造を有する：
【００５１】
【化８】
2009503187.tif 000011
【００５２】
この際、Ｒは上述の式ＩＩについて記載したものと同様であり、好ましくは１２までの炭素原子を含む。Ｒは、好ましくは、出発物質として採用されるジカルボン酸が、重要な天然の代謝産物または高度に生体適合性の化合物であるように選択される。したがって、好ましい式ＩＶのジカルボン酸は、クレブス回路として知られる細胞呼吸経路の中間体のジカルボン酸を含む。これらのジカルボン酸としては、アルファ−ケトグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、およびオキサロ酢酸；この際、Ｒは、それぞれ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ＝、−ＣＨ２−ＣＨ（−ＯＨ）−、および−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−である；が挙げられる。
【００５３】
他の天然の、好ましいジカルボン酸は、ビートの汁にみられるアジピン酸（Ｒ＝（−ＣＨ２−）４）である。他の好ましい生体適合性のジカルボン酸としては、シュウ酸（Ｒを有さない）、マロン酸（Ｒ＝−ＣＨ２−）、グルタル酸（Ｒ＝（ＣＨ２−）３）、ピメリン酸（Ｒ＝（−ＣＨ２−）５）、スベリン酸（Ｒ＝（−ＣＨ２−）６）およびアザライン酸（Ｒ＝（−ＣＨ２−）７）が挙げられる。言い換えれば、ジカルボン酸の中でも、本発明における使用に適したものは、Ｒが（−ＣＨ２−）ｚであり、この際、ｚは０〜１２の整数である、化合物である。高い生体適合性の芳香族ジカルボン酸の好ましい類は、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパンなどのビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）アルカンである。
【００５４】
前記ポリアリーレートトリブロックオリゴマーは、官能基を有さないポリ（アルキレンオキサイド）モノアルキルエーテルとオリゴ（ＤＴＯスベレート）とのインサイチュのカルボジイミドカップリングを用いてワンポット反応で合成される。以下は、この一般設計の具体的な例であり、ＰＥＧ−オリゴ−（ＤＴＯスベレート）−ＰＥＧの合成を示す：
【００５５】
【化９】
2009503187.tif 000012
【００５６】
本発明のポリカーボネート中央ブロックは、その開示が参照として本明細書中に組み込まれる米国特許第５，０９９，０６０号に記載されるような、ジフェノールをこれに重合させるための通常の方法によって調製されうる。これらの方法は、その開示が参照として本明細書中に組み込まれる、米国特許第４，９８０，４４９号に記載されるものを含むアミノ酸誘導ジフェノール化合物のホスゲンまたはホスゲン前駆体（例えばジホスゲンまたはトリホスゲン）との触媒存在下での反応を含む。適当な工程、関連する触媒および溶媒は当業者に公知であり、その教示が参照として本明細書中に組み込まれる、ＳｃｈｎｅｌｌのＣｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅｓ（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９６４）に記載されている。
【００５７】
ペンダントのないカルボン酸基を有するオリゴマーを、遊離カルボン酸基をコモノマーと交差反応させることなく、ペンダントのないカルボン酸基を有するジフェノールから重合することはできない。したがって、ＤＴＢｎのようなベンジルエステルジフェニルモノマーのホモポリマーまたはコポリマーは、同時係属中であって共通所有の米国特許第６，１２０，４９１号によって開示される、パラジウム接触水素化分解法によるベンジル基の選択的な除去を通して、対応する遊離カルボン酸ホモポリマーおよびコポリマーに変換されうる。この特許の開示は参照として組み込まれる。接触水素化分解は、オリゴマー骨格の不安定性がより厳しい加水分解の方法の採用を妨げるため、必要である。同時係属中であって共通所有の米国特許出願第１０／９５２，２０２号に開示される他の方法は、ｔｅｒｔ−ブチルエステル基を加水分解に不安定なポリマーから選択的に除去し、前記ｔｅｒｔ−ブチルエステル基の代わりに遊離カルボン酸基を有する新たなポリマー組成物を形成することを含む。この出願の開示もまた参照として組み込まれる。
【００５８】
本発明のトリブロック共重合体は、ヨウ素または臭素置換されていてもよく、これは共重合体を放射線不透過にする。これらの共重合体およびその調製方法は、米国特許第６，４７５，５７７号に開示されている。この特許の開示は参照として本明細書中に組み込まれる。放射線不透過の共重合体は、芳香環、アルキレン炭素、またはその両方の１以上の水素がヨウ素原子または臭素原子で置換された繰り返し構造単位を含む。本発明のトリブロック共重合体は、同様にヨウ素および臭素置換であってもよい。式Ｉの繰り返し構造単位を含む本発明による共重合体は、前記共重合体もまた放射線不透過の繰り返し構造単位、好ましくは、芳香環、アルキレン炭素、またはその両方の１以上の水素がヨウ素原子または臭素原子で置換された、ＡまたはＢブロックの１以上を含むように、放射線不透過のモノマーと共重合した場合、放射線不透過である。
【００５９】
前記トリブロック共重合体の分子量は、反応時間または成分の比を限定することによって制御されうる。分子量はまた、用いられるカルボジイミドカップリング試薬の量によって制御されうる。
【００６０】
好ましいポリアリーレートは、約１，０００〜１００，０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは約３，０００〜５０，０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは約１０，０００〜２５，０００ｇ／ｍｏｌの重量平均分子量を有する。分子量は、ゲル透過クロマトグラフィーを用いて、テトラヒドロフラン中のポリスチレン標準に対して、更なる補正をせずに計算した。したがって、トリブロック共重合体は、約２，５００〜１３０，０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは約５，０００〜８０，０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは約１０，０００〜５０，０００ｇ／ｍｏｌの重量平均分子量を有する。
【００６１】
本発明によれば、好ましいポリカーボネートは、約１，０００〜１００，０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは約３，０００〜５０，０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは約１０，０００〜２５，０００ｇ／ｍｏｌの重量平均分子量を有する。分子量は、ゲル透過クロマトグラフィーを用いて、テトラヒドロフラン中のポリスチレン標準に対して、更なる補正をせずに計算した。したがって、トリブロック共重合体は、約２，５００〜１３０，０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは約５，０００〜８０，０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは約１０，０００〜５０，０００ｇ／ｍｏｌの重量平均分子量を有する。
【００６２】
前記トリブロック共重合体は、加水分解によって元の出発物質、すなわち、チロシン誘導ジフェノール、ジカルボン酸、および水溶性、親水性であり無毒のオリゴマー末端ブロックに分解される。本発明の共重合体は、高い親水性を有し、ナノ粒子のドラッグデリバリーシステムに有利である。しかしながら、共重合体の親水性：疎水性のバランスは、いくつかの方法で変化しうる。ジフェノールのペンダント鎖のエステルを変化させることもでき、長鎖のエステル基ほど疎水性は高くなる。例えばポリ（アルキレンオキサイド）のアルキレン基の炭素数の増加などによるＡ末端ブロックの分子量の増加は、疎水性をも高めるであろう。ジカルボン酸の変化は、親水性：疎水性のバランスをも変化させるであろう。
【００６３】
本発明のトリブロック共重合体は、希釈水溶液中で５〜２００ｎｍの範囲（直径）で多孔質構造を形成する。好ましい構造は、５０〜１５０ｎｍの直径を有する。例えば、ポリ（エチレングリコール）−ブロック−オリゴ−（ＤＴＯスベレート）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）、すなわちＰＥＧ−オリゴ−（ＤＴＯスベレート）−ＰＥＧトリブロックオリゴマーは、希釈水溶液中で約１００ｎｍの範囲の直径を有する多孔質構造を形成する。気孔は、通常の手法、すなわち光散乱で特性評価される。
【００６４】
トリブロック共重合体は、上述のように、ナノ粒子の疎水性ドラッグデリバリーシステムを形成するために用いられうる。無毒であって生分解性のビルディングブロックを含み、自己組織化工程によってナノ粒子を形成することができるトリブロック共重合体の合成は、特に制限されないが、疎水性薬剤の担体としての使用を含む、多くの生物医学的用途における使用に重要である。本発明の目的上、疎水性活性剤は、オクタノールに対してｌｏｇＰ＞０であり、この際Ｐは分配係数である、薬剤または他の生物活性物質などの活性剤として定義する。
【００６５】
両親媒性分子の自己組織化は根底にある物質の相互関係のあるいくつかの性質、すなわち、その化学構造、アーキテクチャ、または分子量に依存することは十分に確立されている。しかしながら、自己組織化の駆動力は主に疎水性相互作用によって支配されると仮定すると、自己組織化するブロック共重合体の設計は本質的に、その分子量および疎水性の親水性に対するバランスに依存する。希釈水溶液中のトリブロック共重合体の自己組織化は、単純な滴下による添加によって誘起され、超音波処理、高せん断混合、ナノ沈殿、または乳化の方法によって促進されうる。活性な疎水性生成物は、ナノ粒子の形成の前に適当な溶媒中でトリブロックと疎水性生成物とをプレミックスすることによって、または生成物が複合体化される溶液もしくは懸濁液中でナノ粒子を形成することによって、複合体化される。
【００６６】
したがって、本発明はまた、注射に適した溶液中での活性化合物のナノ粒子との複合体化によって形成された、生物活性化合物または薬剤活性化合物の注射可能なデリバリーシステムを含む。前記デリバリーシステムおよびその調製方法は、他の小さな薬理活性分子および造影剤に加えて、薬理活性なタンパク質、ペプチド、ワクチンなどの活性化合物との使用に特に好適である。具体的な活性化合物としては、パクリタキセル、カンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、シスプラチン、カルボプラチン、シプロフロキサシン、ドキソルビシン、ロリプラム、シンバスタチン、メトトレキサート、インドメタシン、プロビプロフェン、ケトプロフェン、イロキシカム、ジクロフェナク、シクロスポリン、エトラコナゾール、ラパマイシン、ノコダゾール、コルヒチン、ケトコナゾール、テトラサイクリン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、オフロキサシン、ゲンタマイシン、オクトレオチド、カルシトニン、インターフェロン、テストステロン、プロゲステロン、エストラジオール、エストロゲン、およびインスリンが挙げられる。
【００６７】
デリバリーされる疎水剤を封入したナノ粒子はまた、薬剤のリザーバーとして、制御放出装置のオリゴマーマトリックス中に分散されうる。ホストオリゴマーマトリックスは、ハイドロゲルまたは他の生体内分解性オリゴマーであってもよい。このような分散液は、例えば、経皮ドラッグデリバリー装置に貯蔵する活性剤としての有用性を有する。
【００６８】
本発明のデリバリーシステムは、全身のデリバリーが求められる状況に加えて、局所的なデリバリーが求められる応用に適している。治療上有効な投与量は、インビボ法またはインビトロ法で決定されうる。本発明のそれぞれの特定の化合物について、必要とされる最適な投与量を決定するために、個々に決定が行われうる。治療上有効な投与量の範囲は、投与経路、治療目的、および患者の状態に当然影響される。さまざまな適切な投与経路において、吸収効率は、薬理学において公知の方法で各活性化合物について個々に決定されなければならない。したがって、治療者は、最適な治療効果を得るために、必要に応じて投与量を調整し、投与経路を変更することが必要であろう。有効な投与量の値、すなわち所望の結果に到達するために必要な投与量の決定は、当業者の技術の範囲である。典型的には、化合物の投与は、低い投与量で開始され、所望の結果に到達するまで投与量を増加させる。本発明の製剤からの活性化合物の放出速度はまた、治療する治療状態に依存して、当業者の通常の技術の範囲で、有利なプロフィールを決定するために変更される。
【００６９】
典型的な投与量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは約０．１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇでありうる。有利には、本発明の化合物は毎日数回投与されうるが、他の用法もまた有用でありうる。
【００７０】
前記組成物は、坐薬、埋め込みのペレットまたは小さなシリンダー、エアロゾル、経口投与製剤ならびに軟膏、ドロップ、および経皮貼布などの局所製剤などのさまざまな投与形態を採用し、皮下、筋肉内、結腸内、直腸内、経鼻で、経口で、または腹腔内に投与されうる。投与形態は、任意で１以上の担体を含んでもよい。
【００７１】
治療用途の許容される製薬上の担体は、製薬分野でよく知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｔ．１９８５）に記載されている。このような材料は、採用される投与量および濃度で受容者に無毒であり、希釈剤、可溶化剤、潤滑剤、懸濁化剤、封入材料、溶媒、増粘剤、分散剤、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩および他の有機酸塩などの緩衝剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、保存料、ポリアルギニンなどの低分子量（約１０残基未満）ペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリ（ビニルピロリジノン）などの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンなどのアミノ酸、セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖、二糖および他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの対イオン、および／またはＴｗｅｅｎ（商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）またはＰＥＧなどの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【００７２】
本発明のナノ粒子−薬剤複合体は、凍結乾燥を含む、共重合体の完全性の維持に加えて、薬剤活性の保持に適した条件下での貯蔵のために調製されうる。典型的には常温または冷蔵温度での貯蔵に適する。滅菌は通常の方法によって容易に達成されうる。
【００７３】
以下の非制限的な実施例は、発明の特定の形態を説明するものである。部およびパーセントは特にことわりのないかぎり全て重量基準であり、温度は全て摂氏である。ジカルボン酸および他の全ての試薬は純粋な形態で購入し、そのまま用いた。溶媒は「ＨＰＬＣグレード」のものであった。ジフェノールモノマー（例えばデサミノチロシル−チロシンのエステル）は、米国特許第５，０９９，０６０号の実施例Ｉに与えられる手順に従って調製した。この手順は特にＤＴＨに関するが、ヘキシルエステル以外のエステルを有するモノマーも同様の基礎的な手順によって容易に調製されうる。ＤＰＴＳ触媒は、Ｍｏｏｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，２３（１），６５−７０（１９９０）に記載される方法で調製した。
【実施例】
【００７４】
実施例
実施例１−２：ポリ（エチレングリコール）−ブロック−オリゴ−（ＤＴＲスベレート）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）自己組織化ナノ粒子の調製
命名：一群のＡＢＡトリブロック共重合体であるポリ（エチレングリコール）−ブロック−オリゴ−（ＤＴＲスベレート）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）を以下のように略す：対称ＰＥＧのＡ−ブロックを、２０００または５０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する意味で、それぞれ２Ｋまたは５Ｋと略す；オリゴＢ−ブロック（デサミノチロシル−チロシンアルキルエステル（ＤＴＲ）のスベリン酸エステル（ＳＡ））は、そのペンダントエステルのＲ基で区別され、この際、ＲはＥ＝エチル、Ｂ＝ｎ−ブチル、Ｏ＝ｎ−オクチル、またはＢｎ＝ベンジルである（図１）。例えば、トリブロックオリゴマーであるＰＥＧ５Ｋ−ｂ−オリゴ（デサミノチロシル−チロシンエチルエステルスベレート）−ｂ−ＰＥＧ５Ｋは、５Ｋ／ＤＴＥ−ＳＡと略す。
【００７５】
試薬：デサミノチロシルチロシンオクチルエステル（ＤＴＯ）は、公知の方法を用いて調製した。塩化メチレン（ＨＰＬＣグレード）、２−プロパノール、およびメタノールは、ペンシルバニア州ピッツバーグのＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。スベリン酸、４−ジメチルアミノピリジニウム−ｐ−トルエンスルフェート（ＤＭＰＴＳ）、ポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテル（Ｍｗ：２０００または５０００ｇ／ｍｏｌ）、およびセチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）は、ウィスコンシン州ミルウォーキーのＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から購入した。ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）は、Ｔａｎａｂｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（サンディエゴ、カリフォルニア州）から購入した。５−ドデカノイルアミノフルオレセイン（ＤＡＦ）およびオレゴングリーンは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（ユージーン、オレゴン州）から購入した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１×ＰＢＳは０．１３８ＭのＮａＣｌおよび０．００２７ＭのＫＣｌを含む０．０１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水である；ｐＨ７．４）、ブルーデキストラン、フルオレセイン、ウサギ肝臓エステラーゼ、およびパクリタキセルはＳｉｇｍａ社（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）は、Ｍｅｒｃｋ社（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ダルムシュタット、ドイツ）から購入した。ジメチルスルホキシドは、Ｍｅｒｃｋ社およびＳｉｇｍａ社から購入した。これらの試薬は、さらなる精製をせずに用いた。
【００７６】
合成手順：トリブロック共重合体は、その開示が本明細書中に参照として組み込まれる、Ｎａｒｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｉｎｕｉｒ，ｖｏｌ．２０，１１７２１−２５（２００４）に開示される、ＰＥＧとオリゴ（ＤＴＲ−ＳＡ）とのインサイチュのカルボジイミドカップリングを用いて２０℃でワンポット反応で合成された。この方法によってランダムブロック共重合体ではなくＡＢＡトリブロック共重合体が生成したことを確認するために、オリゴ（ＤＴＯ−ＳＡ）Ｂブロックが、ＤＴＯとスベリン酸とのＤＩＰＣおよびＤＭＰＴＳ−触媒反応で調製される、２段階合成の調製も行った。ＣＴＡＢおよび水でクエンチした後、このオリゴマーを沈殿によって単離し、精製し、特性評価した。
【００７７】
別の反応で、オリゴ（ＤＴＯ−ＳＡ）をモノメトキシ末端ＰＥＧ（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＨ）と同一のカップリング条件下で反応させた。
【００７８】
ブロック共重合体の物理的特性の評価：分子量（ＭｎおよびＭｗ）を、ゲル透過クロマトグラフィー、ＧＰＣ（ＰＬ−ｇｅｌカラム、ポアサイズ１０４および１０５Å、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｓｈｅｌｔｏｎ，ＣＴ；Ｗａｔｅｒｓ  ４１０  ＲＩ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）で、１ｍＬ／ｍｉｎのＴＨＦ流速でポリスチレン標準を用いて決定した。１Ｈ−核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを、ＣＤＣｌ３中、４００ＭＨｚ（Ｖａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ  ４００  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）で得た：６．９８−７．２０ｐｐｍ（Ａｒ−Ｈ），５．９８（ｄ，ＮＨ），４．８６（ｄ，チロシンのＣＨ），４．０８（ｍ，ＤＴＲのＯＣＨ２），３．６５（ＰＥＧのＣＨ２ＣＨ２），３．３８（ｓ，ＰＥＧのＯＣＨ３），３．０５（ｔ，ＤＴのＣＨ２），２．９５（ｔ，ＳＡのＣＨ２），２．５６（ｍ，ＳＡのＣＨ２；ＤＴのＣＨ２；ＤＴのＣＨ２），１．７８（ｐ，ＳＡのＣＨ２），１．６０（ｐ，ＲのＣＨ２），１．５０（ｐ，ＳＡのＣＨ２），１．３（ｍ，ＲのＣＨ２）および０．９２（ｔ，ＲのＣＨ３）。
【００７９】
溶液の示差走査熱量測定、ＤＳＣ（ＤＳＣ−７熱量計、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｓｈｅｌｔｏｎ，ＣＴ）は、２℃／分の昇温／降温速度で行われた。固体のＤＳＣ（２９２０変調示差走査熱量計、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ−Ｗａｔｅｒ  ＬＬＣ，Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）は、その内容が本明細書中に参照として組み込まれる、ｄ’Ａｃｕｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｖｏｌ．３５，９３６６−７１（２００２）に記載される方法で行われた。
【００８０】
ＰＥＧの添加前に１段階反応混合物のサンプリングによって得られた（ＤＴＲ−ＳＡ）ブロックの分子量、およびワンポット工程で作製される最終的なＰＥＧ−ｂ−オリゴ（ＤＴＲ−ＳＡ）−ｂ−ＰＥＧトリブロックの分子量を、これらが製造するナノ粒子の流体力学直径とともに図２にまとめた。２Ｋ  ＰＥＧ含有トリブロックのＭｎ値は、１０，３００〜１１，５００ｇ／ｍｏｌの狭い範囲内であった。５Ｋ  ＰＥＧ含有トリブロックのＭｎ値は、１５，２００〜１５，７００ｇ／ｍｏｌの狭い範囲内であった。これらの結果は、各トリブロック共重合体のＰＥＧブロックに依存する共重合体の分子量の差に一致する。さらに、１Ｈ−ＮＭＲの研究によって、ＧＰＣによって決定された分子量の精度が支持される。ＤＴＲ−ＳＡとＰＥＧブロックとの積分ピーク面積の比は、トリブロック中の（ＤＴＲ−ＳＡ）繰り返し単位の数を与え（データは示さず）、既知のＤＴＲ−ＳＡモノマーおよびＰＥＧの分子量を用いると、ＧＰＣの分子量の値とほぼ一致する共重合体の分子量が得られる。
【００８１】
２段階反応工程で調製された５Ｋ／ＤＴＯ−ＳＡトリブロックの分子量は、Ｍｎ＝１５３００ｇ／ｍｏｌおよびＭｗ＝２５３００ｇ／ｍｏｌである。１段階および２段階の手順で調製された５Ｋ／ＤＴＯ−ＳＡトリブロック生成物のＮＭＲスペクトルは同一であった。他のトリブロックの同様の比較（図示せず）は、１段階および２段階反応による生成物が等価であることを矛盾なく示す。
【００８２】
疎水性オリゴ（ＤＴＲ−ＳＡ）ブロックのガラス転移温度Ｔｇは、すべて０℃より高く、ペンダントＲ基の長さが増加するにつれて低下する（図３）。純粋なＰＥＧホモポリマーの分子量が２０００ｇ／ｍｏｌから５０００ｇ／ｍｏｌに増加すると、融点Ｔｍは５３℃から６３℃に上昇する。トリブロック共重合体２Ｋ／ＤＴＯ−ＳＡおよび５Ｋ／ＤＴＯ−ＳＡにおいては、ＰＥＧの分子量が２０００ｇ／ｍｏｌから５０００ｇ／ｍｏｌに増加すると、同様にＴｍが４９℃から５４℃に上昇する。すべての場合において共重合体の融点は対応する純粋なＰＥＧブロックの融点よりも低く、これはＤＴＲ−ＳＡユニットがＰＥＧの結晶化度の程度を低下させることを示唆する。同様に、すべてのトリブロックのＴｇ値（−３３℃）とＰＥＧホモポリマーのＴｇ値（−４０℃）との差は、トリブロックにおける混合相のモルフォロジーに起因するものでありうる。
【００８３】
ナノ粒子の調製：共重合体のナノ粒子への自己組織化は、ＴＨＦ溶液中の１００ｍｇ／ｍＬのトリブロックオリゴマーを、最終的なオリゴマー濃度が４ｍｇ／ｍＬになるまで、ゆっくりとした撹拌下で脱イオン水に滴下して添加することによって誘導された。得られた不透明な水性分散液を０．４５μｍ、０．２２μｍおよび０．１μｍのサイズのＰＶＤＦシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に順に通してろ過し、澄明なろ液をすべての物理的特性の評価に用いた。ナノ粒子の流体力学直径は、動的光散乱（ＰＳＳ  Ｎｉｃｏｍｐ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＳａｎｔａＢａｒｂａｒａ，ＣＡ）によって、３０℃で、累積解析およびストークス−アインシュタインの式を用いて決定され、Ｎａｒｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，ｖｏｌ．２０，１１７２１−２５（２００４）に開示される電子顕微鏡によって測定された粒子サイズと一致した。
【００８４】
精製したナノ粒子を、１２．２５ｍＬのナノ粒子溶液を２５℃で６５，０００ｒｐｍ（２９０，０００×ｇ）で２．５時間超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｌ８−７０Ｍ  ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）することによって単離した。上澄みを取り除いた後、ペレット状のナノ粒子を水で２回洗浄し、２５℃で１ｍＬの水中でゆっくりと撹拌して再懸濁させた。再懸濁したペレットの体積は、水の添加によって１２．２５ｍＬに増加し、溶液はフィルター殺菌された。
【００８５】
ナノ粒子の特性の評価：本明細書中に記載したすべてのトリブロック共重合体は、水溶液にゆっくり添加すると自然にナノ粒子に自己組織化する。ナノ粒子の流体力学直径は、２Ｋまたは５ＫのいずれのＰＥＧブロックを含むかに依存して、それぞれ、約４６ｎｍおよび７０ｎｍの２つの群になり、特定のペンダントＲ基には依存しなかった。超遠心分離の前後の５Ｋ／ＤＴＯ−ＳＡナノ粒子のサイズ分布は、それぞれ、６２．９±３１．３ｎｍおよび６０．６±２５．９ｎｍであり、ナノ粒子調製における残留した共溶媒の存在も超遠心分離もナノ粒子の構造に有意な影響を与えないことを示した。ナノ粒子の自己組織化は非共有相互作用によって引き起こされるため、ナノ粒子は、臨界凝集濃度（ＣＡＣ）未満に希釈すると分解する。しかしながら、２Ｋ／ＤＴＯ−ＳＡトリブロックの０．２６μｇ／ｍＬのＣＡＣは、他の自己組織化ブロックオリゴマー系で以前に発表された値よりも有意に低い。
【００８６】
ナノ粒子のＴｇは、溶液ＤＳＣで決定すると、全てのナノ粒子組成物において２１℃である。水和したＰＥＧブロックの存在は、Ｔｇが２１℃以上の疎水性のＤＴＲ−ＳＡコア成分のガラス転移を柔軟にすると考えられる。
【００８７】
この一群のトリブロック共重合体は、生理条件下で生体適合性化合物に分解するように設計される。ＨＰＬＣ分析から、約７０％のＤＴＥモノマー（図１、Ｒ＝エチルエステル）が、ウサギ肝臓エステラーゼの存在下での３０分間のインキュベーションの後、遊離酸であるデサミノチロシン（ＤＴ）に変換されたことがわかった。５Ｋ／ＤＴＯ−ＳＡナノ粒子は、ＰＢＳ中、ｐＨ７．４、３７℃でインキュベートされたとき、白色の沈殿が形成され、ろ過によってＤＬＳで検出可能なすべての構造が失われる、６か月まで安定に見える。
【００８８】
実施例３：ナノ粒子−モデル化合物相互作用
モデル化合物と複合体化したナノ粒子を、２０ｍｇのトリブロック共重合体を、２００μＬのＤＭＦ中の１００μｇのフルオレセイン色素または１％のＤＭＳＯを含む２００μＬのＤＭＦ中の２００μｇのパクリタキセルと結合させることによって調製した。これらの溶液を、４．８ｍＬの脱イオン水に撹拌しながら滴下して添加し、得られたナノ粒子−溶質複合体をろ過（孔径０．２２μｍ）し、使用前にガラスまたはポリプロピレンの容器に室温で保存した。特定の用途には、この手順を３倍にスケールアップした。トリブロック共重合体を入れないこと以外は上記と同様にして遊離の溶質の溶液を調製した。
【００８９】
ナノ粒子−溶質複合体のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、ＰＢＳを移動相として行った。カラムのボトムフリットは、多孔性ポリテトラフルオロエチレン（Ｓｍａｌｌ  Ｐａｒｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉａｍｉ  Ｌａｋｅｓ，Ｆｌ）であり、これはカラムから出る疎水性分子の結合を有意に減少させた。一般に、３６×０．２５ｍＬのフラクションを収集した。カラム空隙容量は、高分子量蛍光標識デキストランを用いて決定した。ナノ粒子は、そのＵＶ吸光度（２６０ｎｍ；ＰｏｗｅｒＷａｖｅ，Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）によって検出し、蛍光色素は、その蛍光（励起４８５ｎｍ／発光５３８ｎｍ；Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって検出した。必要に応じて、ナノ粒子依存性消光を除くために、蛍光決定の前に５０μＬの各フラクションを１５０μＬのＤＭＦ／ＰＢＳ（１：１）と結合させた。
【００９０】
ナノ粒子複合体におけるパクリタキセル濃度は、高速液体クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ（３ｃｍ  Ｃ１８  ＨＰＬＣカラム、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｓｈｅｌｔｏｎ，ＣＴ）によって、移動層として水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸の０．１％の勾配で決定された。ナノ粒子−パクリタキセル複合体は、６０ｍｇのトリブロックオリゴマーを１％のＤＭＳＯを含む６００μＬのＤＭＦ中の６００μｇのパクリタキセルと結合させ、これに１４．４ｍＬの水を滴下して加えることによって調製した。遊離のパクリタキセルを、上述のように超遠心分離によってパクリタキセル含有ナノ粒子から分離した。次いで、１．５ｍＬの再懸濁させたパクリタキセル−ナノ粒子懸濁液を凍結乾燥し、０．１５ｍＬの塩化メチレンおよび０．１ｍＬのアセトニトリルに激しいボルテックス下で再溶解させた。塩化メチレンを窒素気流下で蒸発させ、最終的な澄明な溶液の、それぞれ一定量をＨＰＬＣで分析した；パクリタキセルは２３０ｎｍでの吸光度によって検出された。溶離ピークの面積は、アセトニトリル中の遊離パクリタキセル標準との比較によって定量した。薬剤の結合効率は、与えられたパクリタキセル−ナノ粒子複合体における、ｇ共重合体あたりのパクリタキセルのｍｇとして表される。
【００９１】
細胞毒性アッセイ：結合した薬剤分子の非存在下でのナノ粒子の細胞毒性アッセイのために、ＫＢ子宮頸癌細胞（５００〜５０００細胞）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む、合わせて１００μＬのＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）中で、９６穴プレートに設置した。約１〜２時間後、１０μＬのナノ粒子溶液を細胞に添加し、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で８〜７２時間増殖させた。細胞数は、製造者によって記載された条件に従い、ＭＴＳアッセイによって間接的に決定された（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。ＫＢ細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＬ−１７；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入し、ストックは、１０％の加熱不活性化したＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンの存在下で、葉酸フリーＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で３７℃／５％ＣＯ２で維持した。
【００９２】
パクリタキセルの活性を決定するために、５Ｋ／ＤＴＯ−ＳＡナノ粒子を、上述のようにパクリタキセルの存在下で調製し、超遠心分離によってペレットにした。上澄みを回収し、ナノ粒子のペレットを洗浄し、もとの開始体積に再懸濁させた。初期の調製（遠心分離前）、回収した上澄み、および再懸濁させたナノ粒子のペレットの段階希釈液を調製し、それぞれ１０μＬをＫＢ細胞に投与した。３日間増殖させた後、５０％の増殖阻害に必要な体積を決定した。
【００９３】
ナノ粒子の蛍光モデル化合物との相互作用：すべてのナノ粒子は、疎水性色素であるＤＡＦの蛍光を消光するが、親水性色素であるフルオレセインに対してはほとんど影響しない（図４Ｂ）。ナノ粒子の濃度が２５μｇ／ｍＬであり、オリゴマー１モルあたりのＤＡＦのモル数の比がおよそ２のとき、ＤＡＦの蛍光は、ほぼ一桁減少した。対照的に、オリゴマー１モルあたりのフルオレセインのモル数の比が１であっても、蛍光は１５％しか減少しない。ＤＡＦの蛍光に対するこれらのナノ粒子依存性効果は、ナノ粒子によるＤＡＦ分子の物理的な複合体化を示している。ナノ粒子の非存在下では、ＤＡＦおよびフルオレセインの平均蛍光は、それぞれ、４２００および８３００ユニットであった。
【００９４】
ナノ粒子によるＤＡＦの強い結合はまた、ＳＥＣ実験におけるＤＡＦおよびナノ粒子の共転移からも明らかである（図５）。ナノ粒子は、色素の存在下（図５Ａおよび５Ｂ）または非存在下（データは示さず）にかかわらず、空隙容量であるフラクション７および８に現れる。ナノ粒子の非存在下で、ＤＡＦおよびフルオレセインはそれぞれフラクション２０および２２に現れる（図５Ｃおよび５Ｄ）。蛍光のピークはまた、フルオレセイン存在下で形成されたナノ粒子のフラクション２０（図５Ｃ）および他の親水性蛍光色素であるオレゴングリーン（データは示さず）存在下で形成されたナノ粒子のフラクションで現れる。これらの結果は、ナノ粒子と親水性分子との間に有意な複合体形成がないことを示す。一方、蛍光のピークは、ＤＡＦ存在下で形成されたナノ粒子のフラクション７および８（図５Ｄ）で生じる。５Ｋ／ＤＴＯＳＡナノ粒子は、２６０の吸光度によって検出され、フルオレセインおよびＤＡＦは蛍光によって検出された。ナノ粒子依存性消光を除くために、すべての蛍光読み取りは、上述のようにＤＭＦ／ＰＢＳの存在下で行った。
【００９５】
ナノ粒子結合色素を遊離色素から分離するために超遠心分離を用いると、５Ｋ／ＤＴＯ−ＳＡナノ粒子と強く結びついているＤＡＦ分子のフラクションは、超遠心分離前のナノ粒子／ＤＡＦ調製、並びに超遠心分離後に回収された上澄みおよび再懸濁されたナノ粒子のペレットの蛍光分析に基づいて、約９５％（４．７５ｍｇ／ｇオリゴマー）であることがわかった。ＤＡＦのわずか１％が上澄みに残る。ＤＡＦ分子の残りの４％は、おそらく、ナノ粒子と弱く結びついて、洗浄の間に除去される。ＤＡＦをあらかじめ形成されたナノ粒子に添加して超遠心分離すると、投入したＤＡＦの、９５％および３％が、それぞれペレットおよび上澄みに回収される。したがって、ナノ粒子は、疎水性分子を吸収し結合する有効なシンクとして作用する。ＤＡＦ含有ナノ粒子が水に対して透析される場合、全ＤＡＦ濃度（蛍光によって決定される）の約３０％の初期損失がはじめの２４時間で観察され、次いで色素の少量の損失が次の４日間にわたって観察される。したがって、ナノ粒子は、疎水性分子を吸収し結合する有効なシンクとして作用する。
【００９６】
ナノ粒子のパクリタキセルとの相互作用：ナノ粒子によるパクリタキセルの結合に対するオリゴマーの疎水性の影響の予備的な研究において、ろ過および超遠心分離の後、ナノ粒子に結合しているパクリタキセルの濃度は、５Ｋ／ＤＴＯ−ＳＡおよび２Ｋ／ＤＴＯＳＡの両方で、３．５ｍｇパクリタキセル／ｇオリゴマーであることがＨＰＬＣ分析によって明らかになった。より疎水性の低いエチルペンダントエステルオリゴマーである５Ｋ／ＤＴＥ−ＳＡおよび２Ｋ／ＤＴＥＳＡでは、ナノ粒子に結合したパクリタキセルの量は、３．２ｍｇ／ｇオリゴマーであった。これらの結果は、このオリゴマーシステムの「調節可能な」性質を示す。
【００９７】
ナノ粒子およびパクリタキセル−ナノ粒子複合体の細胞毒性：細胞がインビトロで超遠心分離−精製された５Ｋ／ＤＴＯ−ＳＡナノ粒子に０．１〜４ｍｇ／ｍＬの濃度でさらされたとき、短期間の細胞毒性効果またはＫＢ細胞の生存能力の変化はみられなかった（図６）。さらに、５Ｋ／ＤＴＥ−ＳＡ、５Ｋ／ＤＴＢ−ＳＡ、または５Ｋ／ＤＴＢｎ−ＳＡのナノ粒子に１ｍｇ／ｍＬで７２時間さらされたＫＢ細胞において、細胞毒性効果は観察されなかった（データは示さず）。これらの結果は、先に２Ｋ／ＤＴＯ−ＳＡナノ粒子で行った予備的な短期間の細胞毒性試験と一致する。
【００９８】
パクリタキセルによるＫＢヒト癌細胞の増殖阻害は、ＳＥＣ実験において、５Ｋ／ＤＴＯ−ＳＡナノ粒子と共分画することがわかった（図７）。ここでＭＴＳアッセイにおいて４９０ｎｍでの吸光度測定によって測定される生存細胞集団によって定量されるＫＢ細胞増殖阻害は、所定のカラムフラクションに存在するパクリタキセル−ナノ粒子複合体の量に正比例して生じる。致死効果のピークは、パクリタキセル−ナノ粒子複合体の溶出濃度のピーク（フラクション８）と正確に同じフラクションで生じる。さらに、超遠心分離後のパクリタキセル−ナノ粒子複合体によるＫＢ細胞の５０％増殖阻害の相対的な活性は、ＫＢ細胞を初期の調製および再懸濁したペレットの一定量で滴定することによって決定すると、初期の調製の活性の４０％である（データは示さず）。同様の方法で、上澄みの相対的な活性は、初期の調製の活性の９％であることが明らかになった。これらの活性は、ナノ粒子に結合するパクリタキセルについてＨＰＬＣによって得られた濃度と一致し、パクリタキセルが水溶液に溶けにくいことを反映する。５Ｋ／ＤＴＯ−ＳＡ−パクリタキセルおよび遊離パクリタキセルのＫＢ細胞の増殖阻害のＬＣ５０は、それぞれ、２．２±０．３ｎＭおよび２．９±１．１ｎＭであることがわかった。したがって、ナノ粒子は、複合体化したパクリタキセルの活性を阻害しない。薬剤の非存在下で調製され、同様の方法で分取されたナノ粒子は、ＫＢ細胞の増殖を阻害しなかった（データは示さず）。
【００９９】
実施例４：ポリ（エチレングリコール）−ブロック−オリゴ−（ＤＴＯカーボネート）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）自己組織化ナノ粒子の調製
試薬：デサミノチロシルチロシンオクチルエステル（ＤＴＯ）は既知の手法を用いて調製した。塩化メチレン（ＤＣＭ）（ＨＰＬＣグレード）およびピリジン（認証ＡＣＳ）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（ペンシルバニア州ピッツバーグ）から購入した。トリホスゲン（ＴＰ）はＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（ウィスコンシン州ミルウォーキー）から購入した。ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）（Ｍｗ＝５０００）はＦｌｕｋａ社（スイス）から購入した。これらの試薬は、さらなる精製をせずに用いた。
【０１００】
合成手順：機械的撹拌子およびポンプを備えた０．５Ｌの三つ口フラスコを、Ｎ２で１５分間パージした。フラスコにＰＥＧを添加し、次いでＴＰ（固体）およびＤＣＭを添加した。混合物を澄明な溶液が得られるまで撹拌した（１０〜１５分）。この時点で、反応混合物は、「活性化されたＰＥＧ」−ＰＥＧ−クロロギ酸エステルおよび過剰の未反応のＴＰを含む。ＤＴＯおよびＤＣＭをねじ口びんに入れ、ＴＰ溶液をＦＭＩポンプを用いて反応混合物に添加した（１時間超）。添加が完了した後、１０ｍｌのＤＣＭをびんに加え、反応混合物にポンプを用いて１０分超の時間をかけて添加した。添加が完了した後、１５０ｍＬを抜き取り、蒸発させて空気で乾燥させ、１ｍＬのＴＨＦで希釈し、ろ過し、ろ液をＧＰＣで分析して分子量分布を決定した。ＧＰＣクロマトグラムによって、生成物および反応したモノマーが明らかになった。ＧＰＣランが完了した後、１００ｍＬのＨ２Ｏを加えて反応を停止させた。
【０１０１】
試験：反応混合物の全体を、濃いシロップ状（全体で約１０ｍＬ）までエバポレーションによって濃縮し、次いでこれを６０ｍＬの２−プロパノール（滴下して添加）を用いて沈殿させ、静置した。生成物は、黄色の濃い油として得られ、溶媒はデカンテーションで除かれた。沈殿を２０分間乾燥させ（Ｎ２下）、１０ｍＬの塩化メチレンに再溶解させ、６０ｍＬの２−プロパノールで沈殿させた。段階３は、ａ）５０ｍＬのメタノール：ＩＰＡ＝ｌ：１；ｂ）５０ｍＬのメタノールで、さらに２回繰り返された。生成物（濃いゴム状）を窒素気流下で乾燥させ、次いで真空乾燥させた。
【０１０２】
ブロック共重合体の物理的特性の評価：ＰＥＧ５Ｋ−オリゴＤＴＯカーボネート−ＰＥＧ５Ｋの分子量は、ゲル透過クロマトグラフィー、ＧＰＣ（ＰＬ−ｇｅｌカラム、ポアサイズ１０４および１０５Å、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｓｈｅｌｔｏｎ，ＣＴ；Ｗａｔｅｒｓ  ４１０  ＲＩ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）で、１ｍＬ／ｍｉｎのＴＨＦ流速でポリスチレン標準を用いて、Ｍｎ＝３９，１０２およびＭｗ＝５３，７５８と決定された。１Ｈ−核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを、ＤＭＳＯ中、４００ＭＨｚ（Ｖａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ  ４００  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）で取得し、ＰＥＧに対して約１８０の（ＤＴＯカーボネート）ユニットが示され、これはＰＥＧ５Ｋ−オリゴＤＴＯカーボネート−ＰＥＧ５Ｋ構造に一致した。
【０１０３】
ナノ粒子の調製および特性の評価：オリゴマーのナノ粒子への自己組織化は、ＴＨＦ溶液中の１００ｍｇ／ｍＬのトリブロックオリゴマーを、最終的なオリゴマー濃度が４ｍｇ／ｍＬになるまでゆっくりとした撹拌下で脱イオン水に滴下して添加することによって誘導された。得られた不透明な水性分散液を０．４５μｍ、０．２２μｍおよび０．１μｍのサイズのＰＶＤＦシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に順に通してろ過し、澄明なろ液をすべての物理的特性の評価に用いた。ナノ粒子の流体力学直径は、動的光散乱（ＰＳＳ  Ｎｉｃｏｍｐ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＳａｎｔａＢａｒｂａｒａ，ＣＡ）によって、３０℃で、累積解析およびストークス−アインシュタインの式を用いて決定され、ろ過後、以下の結果を得た：０．４５μｍ：１３２．４±４８．６ｎｍ；０．２２μｍ：１２１．５±３９．０ｎｍ；および０．１μｍ：１１１．９±３２．０ｎｍ。本明細書中に記載したトリブロック共重合体はすべて、水溶液にゆっくりと添加すると、ナノ粒子に自然に自己組織化する。前記ナノ粒子の流体力学直径は、約１１２ｎｍである。
【０１０４】
上述の実施例および好ましい実施形態の記載は、説明のためのものであって、特許請求の範囲によって規定される本発明を限定するものではない。容易に理解されるように、上述の特徴のさまざまな変化および組み合わせは、特許請求の範囲に示される本発明から逸脱することなく用いられうる。このような変化は、発明の精神およびスクリプトから逸脱しないものと考えられ、このような変化のすべては以下の特許請求の範囲に含まれることを意図するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】ＰＥＧ−ｂ−オリゴ（ＤＴＲ−ＳＡ）−ｂ−ＰＥＧトリブロック共重合体の構造を示す図面である。
【図２】は、オリゴ（ＤＴＲ−ＳＡ）ブロックおよびＰＥＧ−ｂ−オリゴ（ＤＴＲ−ＳＡ）−ｂ−ＰＥＧトリブロック共重合体の熱挙動を示す表である。
【図３】は、ＰＥＧ−ｂ−オリゴ（ＤＴＲ−ＳＡ）−ｂ−ＰＥＧトリブロック共重合体の分子量特性およびその対応するナノ粒子の流体力学直径を示す表である。
【図４】図４Ａは、以下の、５Ｋ／ＤＴＯ−ＳＡナノ粒子の存在下または非存在下での蛍光を示す：（１）遊離フルオレセイン；（２）ナノ粒子／フルオレセイン；（３）遊離ＤＡＦ；（４）ナノ粒子／ＤＡＦ。図４Ｂは、超遠心分離で精製した５Ｋ／ＤＴＯ−ＳＡナノ粒子を２．５μＭのＤＡＦ溶液（▲）または０．２５％ＤＭＦ中の１μＭのフルオレセイン溶液（●）に添加したときの、ナノ粒子の濃度の関数としての相対的な蛍光を示すグラフである。
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、以下のように、ゲルろ過クロマトグラフィー後の、フルオレセイン−５Ｋ／ＤＴＯ−ＳＡおよびＤＡＦ−５Ｋ／ＤＴＯ−ＳＡナノ粒子のフラクションの分析を示す：図５Ａは、遊離フルオレセイン分画後のナノ粒子（▲）、およびフルオレセイン存在下で調製したナノ粒子（●）の検出を示す；図５Ｂは、遊離ＤＡＦ分画後のナノ粒子（▲）およびＤＡＦ存在下１９で調製したナノ粒子（●）の検出を示す；図５Ｃは、遊離フルオレセイン分画後のナノ粒子（▲）およびフルオレセイン存在下で調製したナノ粒子（●）の検出を示す；図５Ｄは、遊離ＤＡＦ分画後のナノ粒子（▲）およびＤＡＦ存在下で調製したナノ粒子（●）の検出を示す。
【０１０６】
【表２】
2009503187.tif 000013
【図７】ゲルろ過クロマトグラフィーのフラクションの関数としての吸光度を示すグラフであり、パクリタキセル存在下で形成され、ゲルろ過クロマトグラフィーによって分画された５Ｋ／ＤＴＯＳＡナノ粒子の奇数フラクションならびにフラクション７および９は、２６０ｎｍでの吸光度によって検出された（●）、パクリタキセルの活性は各フラクションを２０μＬ用いたＫＢ細胞増殖の関数として決定され、細胞増殖はＭＴＳアッセイを用いて決定され、４９０ｎｍで測定された（▲）
【図１】
2009503187.tif 000021
【図２】
2009503187.tif 000022
【図３】
2009503187.tif 000023
【図４】
2009503187.tif 000024
【図５】
2009503187.tif 000025
【図６】
2009503187.tif 000026
【図７】
2009503187.tif 000027
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月12日(2008.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一のＡ−Ｂ−Ａ構造から構成され、各Ａ末端ブロックは水溶性、親水性、および無毒であり；Ｂ中央ブロックは式（Ｉ）で表される構造を有する、同一または異なった繰り返し単位を有し、疎水性である、トリブロックオリゴマー：
【化１】
2009503187.tif 000028
この際、Ｘは
【化２】
2009503187.tif 000029
であり；Ｚは２〜１００であり；Ｒ１はＣＨ＝ＣＨまたは（ＣＨ２）ｎであり、この際、ｎは０〜１８であり；Ｒ２は、水素、１８までの炭素原子を含む直鎖および分岐のアルキル基ならびに１８までの炭素原子を含む直鎖および分岐のアルキルアリール基からなる群から選択される。
【請求項２】
前記末端ブロックが、以下の構造を有する、請求項１に記載のオリゴマー：
【化３】
2009503187.tif 000030
この際、各Ａのｍは、独立して、各Ａの分子量が１０００〜１５，０００ｇ／ｍｏｌとなるように選択される。
【請求項３】
Ｚが１０である、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項４】
Ｒ１およびＲ２の１以上がエーテル結合を含む、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項５】
Ｒ１が−ＣＨ２−ＣＨ２−である、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項６】
請求項１に記載のトリブロックオリゴマーから形成される多孔質ナノ粒子。
【請求項７】
（ａ）単一のＡ−Ｂ−Ａ構造から構成され、各Ａ末端ブロックは水溶性、親水性、および無毒であり；Ｂ中央ブロックは式ＩＩで表される構造を有する、同一または異なった繰り返し単位を有し、疎水性である、トリブロックオリゴマーの多孔質ナノ粒子：
【化４】
2009503187.tif 000031
この際、Ｘは
【化５】
2009503187.tif 000032
または
【化６】
2009503187.tif 000033
であり；Ｚは２〜１００であり；Ｒ１はＣＨ＝ＣＨまたは（ＣＨ２）ｎであり、この際、ｎは０〜１８であり；Ｒ２は、水素、１８までの炭素原子を含む直鎖および分岐のアルキル基ならびに１８までの炭素原子を含む直鎖および分岐のアルキルアリール基からなる群から選択され；Ｒは、結合または１８までの炭素原子を含む直鎖および分岐のアルキル基ならびに１８までの炭素原子を含む直鎖および分岐のアルキルアリール基からなる群から選択される；および
（ｂ）前記ナノ粒子によって複合体化される疎水性化合物；
を含む組成物。
【請求項８】
前記末端ブロックが、以下の構造を有する、請求項７に記載の組成物：
【化７】
2009503187.tif 000034
この際、各Ａのｍは、独立して、各Ａの分子量が１０００〜１５，０００ｇ／ｍｏｌとなるように選択される。
【請求項９】
Ｚが１０である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｒ、Ｒ１およびＲ２の１以上がエーテル結合を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｒ１が−ＣＨ２−ＣＨ２−である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
Ｒが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ（−ＯＨ）−、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−および（−ＣＨ２−）ｚからなる群から選択され、この際、ｚは０〜１２である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１３】
前記複合体化された疎水性化合物は、生物活性化合物または薬剤活性化合物である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１４】
製薬上許容される担体および有効量の請求項７に記載の組成物を含む、疎水性化合物を必要とする患者にデリバリーするための組成物。
【請求項１５】
前記ナノ粒子がドラッグデリバリーオリゴマーマトリックスに組み込まれる、または分散される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記活性な疎水性化合物は、抗腫瘍剤、抗生物質、抗菌剤、スタチン、ペプチド、タンパク質、ホルモン、およびワクチンからなる群から選択される、請求項１３、１４、または１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記活性な疎水性化合物は、パクリタキセル、カンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、シスプラチン、カルボプラチン、シプロフロキサシン、ドキソルビシン、ロリプラム、シンバスタチン、メトトレキサート、インドメタシン、プロビプロフェン、ケトプロフェン、イロキシカム、ジクロフェナク、シクロスポリン、エトラコナゾール、ラパマイシン、ノコダゾール、コルヒチン、ケトコナゾール、テトラサイクリン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、オフロキサシン、ゲンタマイシン、オクトレオチド、カルシトニン、インターフェロン、テストステロン、プロゲステロン、エストラジオール、エストロゲン、およびインスリンからなる群から選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記複合体化された化合物は、造影剤である、請求項１４に記載の組成物。
【国際調査報告】
2009503187.tif 000035