(57)【要約】  本発明は、第１形態の細胞において細胞外環境に接近しやすいが、第１形態若しくは関連の細胞とは別の形態、又は形質転換細胞形態では細胞外環境に接近しにくいＨＡＳ分子の一部を特異的に標的とする、化合物、作用物質、薬学的に活性な作用物質、薬物、治療、活性、薬剤等に関する。特に、本発明は、悪性細胞又は炎症細胞又は増殖細胞において細胞外環境に接近しやすいが、一部「正常」細胞では外部環境に接近しにくいＨＡＳの一部を標的とする化合物を提供する。この例での「正常」細胞は、非悪性細胞、非炎症細胞、又は非増殖細胞である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少又は変更する単離化合物であって、該化合物が前記ＨＡＳのアミノ酸配列のエピトープを標的とし、該エピトープが正常細胞に比べて疾患細胞において細胞外環境により接近しやすい、ヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少又は変更する単離化合物。
【請求項２】
ヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少又は変更することができる単離化合物であって、該化合物が前記ＨＡＳのアミノ酸配列のエピトープを標的とし、該エピトープが正常細胞に比べて疾患細胞において細胞外環境により接近しやすい、ヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少又は変更することができる単離化合物。
【請求項３】
前記エピトープが細胞外空間において疾患細胞で、及び細胞内空間又は原形質膜において非疾患細胞で提示される、請求項１又は２に記載の単離化合物。
【請求項４】
前記エピトープが前記細胞内空間において疾患細胞で、及び前記細胞外空間又は前記原形質膜において非疾患細胞で提示される、請求項１又は２に記載の単離化合物。
【請求項５】
前記エピトープが前記原形質膜において疾患細胞で、及び前記細胞外空間又は前記細胞内空間において非疾患細胞で提示される、請求項１又は２に記載の単離化合物。
【請求項６】
前記化合物が、治療抗体、エピトープ結合断片、その誘導体、その一部、そのキメラ、又はその脱免疫型である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離化合物。
【請求項７】
ヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少し、前記化合物がＨＡＳのＩＮＴ−２配列又はＥＸ−１配列と機能的に類似したアミノ酸配列を標的とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離化合物。
【請求項８】
ヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少し、前記化合物が前記ＨＡＳのアミノ酸配列のＩＮＴ−２若しくはＥＸ−１から選択されるアミノ酸配列を標的とするか、又はＩＮＴ−２若しくはＥＸ−１の１つ又は複数の保存的なアミノ酸置換を含有するアミノ酸配列を標的とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離化合物。
【請求項９】
前記化合物が前記アミノ酸配列ＩＮＴ−２又はＩＮＴ−２の保存的なアミノ酸置換を標的とする、請求項８に記載の単離化合物。
【請求項１０】
悪性細胞又は疾患細胞を治療する方法であって、単離化合物を投与することを含み、該化合物がヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少又は変更し、該化合物が前記ＨＡＳのアミノ酸配列のエピトープを標的とし、該配列が正常細胞に比べて疾患関連細胞において細胞外環境により接近しやすい、悪性細胞又は疾患細胞を治療する方法。
【請求項１１】
前記化合物が、治療抗体又はエピトープ結合断片、その誘導体、その一部、そのキメラ、又はその脱免疫型から成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記エピトープが前記細胞外空間において前記疾患細胞で、及び前記細胞内空間又は前記原形質膜において非疾患細胞で存在する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記エピトープが前記原形質膜において前記疾患細胞で、及び前記細胞外空間又は前記細胞内空間において非疾患細胞で存在する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物がヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少し、ＩＮＴ−２又はＥＸ−１から選択される１つ又は複数の保存的な置換を含有するアミノ酸、又は配列を標的とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物がヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少し、前記化合物がＨＡＳの前記ＩＮＴ−２配列又は前記ＥＸ−１配列と機能的に類似したアミノ酸配列を標的とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物がＩＮＴ−２を標的とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物がＥＸ−１を標的とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記疾患細胞が癌細胞である、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記疾患細胞が乳癌細胞である、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＨＡＳが、アイソフォームＨＡＳ  Ｉ、ＨＡＳ  ＩＩ及びＨＡＳ  ＩＩＩから成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
前記アイソフォームがＨＡＳ  ＩＩである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＨＡＳが、アイソフォームＨＡＳ  Ｉ、ＨＡＳ  ＩＩ及びＨＡＳ  ＩＩＩから成る群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項２３】
前記アイソフォームがＨＡＳ  ＩＩである、請求項１に記載の化合物。
【請求項２４】
悪性細胞又は疾患細胞の治療用の薬物の調製における化合物の使用であって、該化合物がヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少又は変更し、前記ＨＡＳのアミノ酸配列内に含有されるエピトープを標的とし、該エピトープが正常細胞に比べて疾患関連細胞において細胞外環境により接近しやすい、悪性細胞又は疾患細胞の治療用の薬物の調製における化合物の使用。
【請求項２５】
ヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少することができる、単離抗体又は断片、その誘導体、その一部、そのキメラ、又はその完全な脱免疫型であって、前記抗体又は前記断片、その誘導体、その一部、そのキメラ、又はその完全な脱免疫型が前記ＨＡＳのアミノ酸配列のエピトープを標的とし、該エピトープが正常細胞に比べて疾患関連細胞において細胞外環境により接近しやすい、ヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少することができる単離抗体又は断片、その誘導体、その一部、そのキメラ、又はその完全な脱免疫型。
【請求項２６】
ＩＮＴ−２を標的とする、請求項２５に記載の単離抗体又はエピトープ結合断片、その誘導体、その一部、そのキメラ、又はその完全な脱免疫型。
【請求項２７】
前記疾患細胞が癌細胞である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２８】
前記疾患細胞が乳癌細胞である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２９】
ヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少し、前記化合物が、前記アミノ酸配列、又はＩＮＴ−２若しくはＥＸ−１の１つ若しくは複数の保存的な置換を含有する配列を標的とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離化合物。
【請求項３０】
ヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少し、前記化合物がＨＡＳの親水性領域を標的とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離化合物。
【請求項３１】
ヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少し、前記化合物がアミノ酸配列ＩＮＴ−２若しくはＥＸ−１、又はその機能的に同等の変異型を標的とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離化合物。
【請求項３２】
前記化合物が、ヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少し、前記化合物がＨＡＳの親水性領域を標的とする、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞増殖、並びに特に過剰増殖状態を含む、癌及び炎症性障害の治療及び予防に一般的に関する。より詳細には、本発明は、癌及び炎症等の細胞増殖状態の制御を容易にするヒアルロナン同化を標的とする。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において言及した刊行物の書誌詳細も、本記載の末尾にまとめて収載する。
【０００３】
本明細書における任意の先行技術に関する言及は、この先行技術がいかなる国においても一般的知識の一部を形成することを認めたわけではなく、いかなる形で示唆したわけでもなく、又はそのように解釈すべきではない。
【０００４】
ヒアルロナン（ＨＡ）代謝は、ＨＡの合成速度と分解速度との間の複雑なバランスであり、ＨＡが果たす生理的役割に応じて、合成及び分解が同時に注意深く制御される。ヒアルロナンは、ヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）アイソフォームＨＡＳ１、ＨＡＳ２及びＨＡＳ３と呼ばれる、異なるが関連する膜貫通タンパク質のファミリーによって合成され、これらはそれぞれ、マウスの胚形成の際及び成熟組織における一時的で差次的な発現によって、並びに産生されたＨＡの分子量においても互いに区別することができる。細胞外マトリクス多糖ＨＡ又はその酸性型であるヒアルロン酸は、（β１−３）Ｄ−グルクロネート−（β１−４）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの反復二糖単位から成る直鎖状の高分子量ポリマーである（Weissman & Meyer, J. Am. Chem. Soc. 76:1753, 1954）。
【０００５】
細胞外マトリクス（ＥＣＭ）は、腫瘍細胞の挙動に影響を与える重大な環境要素の１つである。ＥＣＭは、腫瘍細胞が接着及び移動し、悪性細胞に潜在的に有益な成長因子及びサイトカインのレシーバ（reservoir）の機能を果たす足場として働く（Ruoslahti & Yamaguchi, Cell 64:867-869, 1991）。 ヒアルロナン（ＨＡ）は、細胞外マトリクスの必須成分である負に帯電した高分子量の多糖である。何年もの間、ＨＡはＥＣＭの「空間充填物」と考えられてきたが、ＨＡ細胞表面の受容体の発見により、ＨＡは細胞挙動においてより複雑な役割を果たすということが明らかになった（Laurent & Fraser, FASEB J 6:2397-2404, 1992）。最近になって、ＨＡは、発生中に起こるために、細胞分裂及び細胞移動（Toole, J. Internal Medicine 242:35-40, 1981）、組織リモデリング（Knudson & Knudson, FASEB J. 7:1233, 1993）、炎症、及び腫瘍の発生、進行又は浸潤（Knudson他著「ヒアルロナンの生物学（The Biology of Hyaluronan）」 143:150-169, 1989）を含む多くの様々な細胞過剰増殖プロセスとの関連性が明らかになっている。
【０００６】
３つのＨＡＳタンパク質の中で最も活性が低いＨＡＳ１は、高分子量ＨＡ（２×１０６Ｄ）の合成を誘導し、そのためＨＡＳ１は、多くの細胞型において低いが必要レベルのＨＡ合成を維持する役割を果たし得る。ＨＡＳ２は胚発生を通じて広く発現され、ＨＡＳ１よりも活性が高く、細胞周囲ゲルの形態で原形質膜に接着する高分子量ＨＡ（２×１０６Ｄ）も合成する（Fulop, Arch. Iochem. Iophys. 337:261-266, 1997）。大量の高分子量ＨＡのＨＡＳ２産生には、組織の構造及び容量に対して重要な効果があり、したがって腫瘍増殖を伴う発生プロセスにおいて重要な役割を果たし得る。ＨＡＳ３は３つのＨＡＳタンパク質の中で活性が最も高いが、短い（２×１０５〜３×１０５Ｄ未満）ＨＡ鎖の合成を誘導する。ＨＡＳ３発現を活性化して、大量の低分子量ＨＡ（細胞表面のＨＡ受容体と相互作用し得る）を産生することができ、細胞挙動の変化をもたらすシグナル伝達カスケードを誘発する。
【０００７】
ＨＡＳ２は侵襲性の高い乳癌細胞株において重要である（Udabage他, Cancer Res 65:6139-6150, 2005）。アンチセンス技術を用いたＨＡＳ２の阻害によって、細胞の侵襲性が９７％阻害された。さらに、アンチセンスＨＡＳ２癌細胞がヌードマウスに移植された場合、腫瘍は悪性状態における機能的なヒアルロナンシンターゼの阻害の潜在的な治療的価値を明らかにしなかった。
【０００８】
これらの上記の研究によって、ＨＡ合成が足場非依存性（anchorage-independent）増殖を促進し、悪性の表現型の特性である腫瘍侵襲性を増大させる可能性がある場合、癌に関するＨＡＳアイソフォームの重要性が明らかになる。
【０００９】
驚くべきことに、本出願人は、ＨＡＳアミノ酸配列の様々な部分と相互作用し、正常細胞に比べて、疾患関連細胞において細胞外環境により接近しやすいＨＡＳエピトープ内に含有された結合エピトープを特異的に標的とする化合物、例えば抗体を発見した。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、第１形態の細胞において細胞外環境に接近しやすいが、第１形態若しくは関連の細胞とは別の形態、又は形質転換細胞形態では細胞外環境に接近しにくいＨＡＳ分子の一部を特異的に標的とする、化合物、作用物質、薬学的活性剤、薬物、治療剤、活性剤（actives）、薬剤等に関する。特に、本発明は、悪性細胞又は炎症細胞又は増殖細胞において細胞外環境に接近しやすいが、一部「正常」細胞では外部環境に接近しにくいＨＡＳの一部を標的とする化合物を提供する。この例での「正常」細胞は、非悪性細胞、非炎症細胞、又は非増殖細胞である。
【００１１】
好ましい化合物等は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体等の抗体である。本発明の化合物を含む薬学的な他の組成物も提供される。悪性細胞、炎症細胞及び増殖細胞、並びにしたがってこれらを伴う状態に対する診断アッセイを含む、細胞、組織又は動物においてＨＡＳ活性のモジュレータをスクリーニングする方法も意図される。ＨＡレベル若しくはＨＡＳ活性に関連する疾患又は病態を患っている疑いがあるか、又はこれらに罹りやすい動物、特にヒトを治療する方法も本明細書に開示されている。このような方法は、治療的又は予防的に有効な量の１つ又は複数の本発明の化合物若しくは組成物を、治療が必要である、又は治療若しくは予防が必要な疑いがある被験体に投与することを含む。
【００１２】
したがって一実施の形態において、本発明は、選択された細胞型でＨＡＳ活性を選択的に減少するが、選択されない細胞型ではＨＡＳ活性を実質的に減少しない化合物を提供する。特に、本発明は悪性細胞、炎症細胞、増殖細胞又は他の疾患関連細胞において細胞外環境に接近しやすいが、一部疾患に関連しない細胞では細胞外環境に実質的に接近しにくいＨＡＳ分子の一部を選択的に標的とする化合物に関する。
【００１３】
一態様において、本発明は、ヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少又は変更する単離化合物であって、当該化合物がＨＡＳのアミノ酸配列のエピトープを標的とし、当該エピトープが正常細胞に比べて疾患細胞において細胞外環境により接近しやすい、ヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少又は変更する単離化合物を提供する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、ヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少又は変更することができる単離化合物であって、当該化合物がＨＡＳのアミノ酸配列のエピトープを標的とし、当該エピトープが正常細胞に比べて疾患細胞において細胞外環境により接近しやすい、ヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少又は変更することができる単離化合物を提供する。
【００１５】
好ましくは、エピトープは細胞外空間において疾患細胞で、及び細胞内空間又は原形質膜において非疾患細胞で提示される。
【００１６】
好ましくは、エピトープは細胞内空間において疾患細胞で、及び細胞外空間又は原形質膜において非疾患細胞で提示される。
【００１７】
好ましくは、エピトープは原形質膜において疾患細胞で、及び細胞外空間又は細胞内空間において非疾患細胞で提示される。
【００１８】
好ましくは、化合物は治療抗体、エピトープ結合断片、その誘導体、その一部、そのキメラ、又はその脱免疫型である。
【００１９】
好ましくは、上記化合物は、ＨＡＳ内のＩＮＴ−２若しくはＥＸ−１から選択されたアミノ酸配列、又はＩＮＴ−２若しくはＥＸ−１の１つ又は複数の保存的なアミノ酸置換を含有する配列を特異的に標的とする。
【００２０】
好ましくは、上記化合物は、アミノ酸配列ＩＮＴ−２を特異的に標的とする。
【００２１】
別の態様において、本発明は、悪性細胞又は疾患細胞を治療する方法であって、単離化合物を投与することを含み、このような化合物がヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少又は変更し、当該化合物がＨＡＳのアミノ酸配列のエピトープを標的とし、当該配列が正常細胞に比べて疾患関連細胞において細胞外環境により接近しやすい、悪性細胞又は疾患細胞を治療する方法を提供する。
【００２２】
好ましくはこの方法によれば、化合物は治療抗体、エピトープ結合断片、その誘導体、その一部、そのキメラ、又はその脱免疫型から成る群から選択される。
【００２３】
好ましくはこの方法によれば、エピトープは、細胞外空間において疾患細胞で、及び細胞内空間又は原形質膜において非疾患細胞で存在する。
【００２４】
好ましくはこの方法によれば、エピトープは、原形質膜において疾患細胞で、及び細胞外空間又は細胞内空間において非疾患細胞で存在する。
【００２５】
好ましくはこの方法によれば、化合物はヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベルを減少し、当該化合物は、ＨＡＳ内のＩＮＴ−２若しくはＥＸ−１から選択されるアミノ酸配列、又はＩＮＴ−２若しくはＥＸ−１の１つ又は複数の保存的なアミノ酸置換を含有する配列を標的とする。
【００２６】
好ましくはこの方法によれば、化合物はＩＮＴ−２又はＥＸ−１から選択されるアミノ酸配列を特異的に標的とする。
【００２７】
好ましくはこの方法によれば、化合物はＩＮＴ−２を標的とする。
【００２８】
好ましくはこの方法によれば、化合物はＥＸ−１を標的とする。
【００２９】
好ましくはこの方法によれば、悪性細胞又は疾患細胞は乳癌細胞である。
【００３０】
好ましくはこの方法によれば、ヒアルロナンシンターゼは、アイソフォームＨＡＳ  Ｉ、ＨＡＳ  ＩＩ及びＨＡＳ  ＩＩＩから成る群から選択される。
【００３１】
好ましくはこの方法によれば、アイソフォームはＨＡＳ  ＩＩである。
【００３２】
好ましくはこの方法によれば、ヒアルロナンシンターゼは、アイソフォームＨＡＳ  Ｉ、ＨＡＳ  ＩＩ及びＨＡＳ  ＩＩＩから成る群から選択される。
【００３３】
好ましくはこの方法によれば、アイソフォームはＨＡＳ  ＩＩである。
【００３４】
別の態様において、本発明は、悪性細胞又は疾患細胞の治療用の薬物の調製における化合物の使用であって、当該化合物がヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少又は変更し、ＨＡＳのアミノ酸配列内に含有されるエピトープを標的とし、当該エピトープが正常細胞に比べて疾患関連細胞において細胞外環境により接近しやすい、悪性細胞又は疾患細胞の治療用の薬物の調製における化合物の使用を提供する。
【００３５】
別の態様において、本発明は、ヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少することができる、単離抗体又は断片、その誘導体、その一部、そのキメラ、又はその完全な脱免疫型であって、当該抗体又は当該断片、その誘導体、その一部、そのキメラ、又はその完全な脱免疫型がＨＡＳのアミノ酸配列のエピトープを標的とし、当該エピトープが正常細胞に比べて疾患関連細胞において細胞外環境により接近しやすい、ヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）活性レベル又はＨＡの細胞外放出を減少することができる、単離抗体又は断片、その誘導体、その一部、そのキメラ、又はその完全な脱免疫型を提供する。
【００３６】
好ましくは、単離抗体、エピトープ結合断片、その誘導体、その一部、そのキメラ、又はその完全な脱免疫型はＨＡＳエピトープであるＩＮＴ−２を特異的に標的とする。
【００３７】
【表１】
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【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本明細書を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（comprise）」という用語、又は「含む（comprises）」若しくは「含んでいる（comprising）」のような変形形態は、記述の要素若しくは整数、又は要素若しくは整数の群を含むが、他のいかなる要素若しくは整数、又は要素若しくは整数の群も排除しないことを意味すると理解される。
【００３９】
提唱されたＨＡＳの細胞内ループの実験によって、最も有意な相同性及び保存されたモチーフの存在が示された（図１、太字／下線のアミノ酸）。ＨＡＳタンパク質ファミリーが図１に示され、タンパク質配列はアライメントされている。ＨＡＳ１、ＨＡＳ２及びＨＡＳ３は、予測分子量が６３．１〜６４．８Ｍｒ（×１０３）に及ぶそれぞれ５７８、５５２及び５５３アミノ酸長である。アミノ酸レベルでは、全て約５２〜８５％の同一性を示す。アミノ酸置換研究に基づき、太字で示された鍵となるモチーフがＨＡＳ活性に必須であることが示されている。バリンで置換された場合、ＳＧＰＬモチーフ（太字）におけるロイシン残基がＨＡＳ活性の喪失を引き起こす。
【００４０】
したがって、本発明は、癌細胞又は炎症細胞又は増殖細胞等の疾患に関連する細胞においてＩＮＴ−ａ（これには限定されない）等のＨＡＳ部分が細胞外環境に接近しやすい。「正常」細胞、すなわち癌、炎症又は増殖に関連しない細胞では、これらの部分は細胞外環境に接近しにくい。したがって（therefor）、新規の標的が疾患関連細胞においてＨＡＳを選択的に標的とする化合物を発生させることができる細胞状態によって、ＨＡＳ分子のトポロジーが変化する。
【００４１】
したがって、本発明の一態様は、悪性細胞、炎症細胞、増殖細胞又は他の疾患関連細胞において細胞外環境に接近しやすいが、その部分は疾患に関連しない細胞では細胞外環境に実質的に接近しにくいＨＡＳ分子の一部を選択的に標的とする化合物に関する。
【００４２】
「化合物」、「作用物質」、「試薬」、「薬理学的活性剤」、「薬物」、「治療剤」、「活性」及び「薬剤」という用語は本明細書中で交換可能に用いられ、悪性細胞、炎症細胞又は増殖細胞において細胞外環境に接近しやすいが、正常細胞では実質的に接近しにくいＨＡＳの一部と結合することができる抗体又は他の相互作用分子を表す。この用語は、本明細書中で具体的に言及されるこれらの活性剤の薬学的に許容され且つ薬理学的に活性な成分も包含する。「作用物質」、「試薬」、「化合物」、「薬理学的活性剤」、「薬物」、「治療剤」、「活性」及び「薬剤」という用語が用いられる場合、活性物質（entity）自体、並びに抗体の組換え型およびキメラ、薬学的に許容される薬理学的に活性な塩がこれに含まれることが理解される。
【００４３】
「作用物質」、「化学物質」、「化合物」、「薬理学的活性剤」、「薬物」、「治療剤」、「活性」及び「薬剤」に対する言及は、２つ以上の活性剤の組み合わせを含む。作用物質が別々に準備され、別々に与えられるか、又は投薬されるか、又は投薬前に共に混合される場合、「組み合わせ」は二部分組成物等の多部分組成物も含む。例えば、多部分医薬パックは、別々に維持された２つ以上の作用物質を有し得る。したがって、本発明のこの態様は併用療法を含む。併用療法は、疾患関連細胞において外部環境にのみ接近しやすいＨＡＳの一部にそれぞれ特異的な２つの抗体の同時投与を含む。
【００４４】
本明細書において用いられる「有効量」及び「治療的に有効な量」の作用物質という用語は、所望の治療的又は生理的な効果又は転帰を提供するのに十分な量の作用物質を意味する。このような効果又は転帰は、細胞性疾患の症状の低減又は改善を含む。望ましくない効果、例えば副作用は、望ましい治療効果と共に出現することもあり、したがって、医師は、適切な「有効量」を決定する際に、潜在的リスクと潜在的利益とのバランスをとる。正確な必要量は、被験体の種類、年齢、及び全身状態、投与様式等に応じて被験体によって変わる。したがって、正確な「有効量」を明記することは不可能であり得る。しかし、任意の個々の症例における適切な「有効量」は、通常の実験のみを用いて当業者によって決定され得る。一般的に、作用物質（複数可）は、悪性細胞を含む細胞の炎症及び／又は増殖を低減するのに十分な量で、且つ十分な条件下で投与される。
【００４５】
本発明は、抗体及び他の免疫グロブリン（断片、誘導体、抗原結合部、組換え型、キメラ型、及びＨＡＳの機能を調節するのに用いる対象のＨＡＳ分子に関するそのヒト化型を含む脱免疫型を含む）（これらに限定されない）等の化合物、並びに特定の実施形態ではＨＡＳ１、ＨＡＳ２及び／又はＨＡＳ３を利用する。本明細書で用いられるように、ＨＡＳに対する言及は同じ機能を有する任意の分子を含む。好ましい態様では、「ＨＡＳ」に対する言及は、アイソフォームＨＡＳ１、ＨＡＳ２又はＨＡＳ３に対する言及を含む。抗体は、疾患関連細胞において細胞外環境に曝露されるか、又は接近しやすいＨＡＳの一部に特異的である。
【００４６】
したがって本発明は、疾患細胞と非疾患細胞とでＨＡＳの機能又は活性に選択的に作用させることができる単離化合物を提供する。
【００４７】
したがって本発明は、ＨＡＳの機能又は活性のアンタゴニストを提供する。このようなアンタゴニストは、ＨＡＳの効果を低下させるのに、したがってＨＡＳのレベルを低下又は上昇させるのに有用である。
【００４８】
したがって好ましい態様において、本発明は、ＨＡＳと結合するか、又は相互作用するか、又はそうでなければ結び付き、正常細胞ではなく疾患関連細胞においてＨＡＳの機能又は活性を低減する抗体を提供する。
【００４９】
上記で示されたように、「正常」細胞は、悪性、炎症又は増殖と関連のない細胞である。
【００５０】
抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。一般的に、抗体は、単離された均一な、又は完全若しくは部分的に精製された形で存在する。
【００５１】
抗体は、ヒト化抗体若しくはキメラ抗体であってもよく、又はヒトに投与するのに適したヒト抗体である。これらには、例えばマウスモノクローナル抗体から調製されたヒト化抗体、及び例えば下記のトランスジェニックマウスを用いて、又はファージディスプレイによって調製されてもよいヒトモノクローナル抗体が含まれる。「ヒト化」抗体には、脱免疫抗体が含まれる。
【００５２】
好ましくは、抗体は、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、若しくはＨＡＳ３、又はその免疫原性部等のＨＡＳ、或いは免疫学的に相同な分子に対して作製される。好ましくは、抗体は、疾患細胞と非疾患細胞とで、細胞外環境に別々に曝露されるＨＡＳエピトープに対して作製される。
【００５３】
「抗体」又は「抗体（複数）（antibodies）」に対する言及には、例えばモノクローナル抗体を含む完全な抗体（例えば、無傷のＦｃ領域を有する）；例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片を含む抗原結合抗体断片；ヒト化抗体；ヒト抗体（例えば、トランスジェニック動物において又はファージディスプレイによって産生された）；並びに遺伝子操作技法によって産生された免疫グロブリン由来ポリペプチドを含む（これらに限定されない）様々な形態の全ての抗体に対する言及が含まれる。特に明記していなければ、本明細書において用いられる「抗体」又は「抗体（複数）」という用語は、完全な抗体及びその抗原結合断片の両方を包含する。
【００５４】
特に明記していなければ、本発明の抗体に関する特異性は、抗体が非関連タンパク質とはほとんど結合を示さずに、その標的抗原のみと実質的に結合することを意味すると意図される。しかし、２つ以上の関連タンパク質と結合するように抗体を設計又は選択することが可能である。関連タンパク質には、同じタンパク質の異なるスプライス変異型若しくは断片、又は異なる種由来の相同なタンパク質が含まれる。このような抗体は依然として、それらのタンパク質に対して特異性を有すると考えられ、本発明に包含される。「実質的に」という用語は、この文脈で、基礎レベル、すなわち非特異的レベルを超えた非標的抗原との検出可能な結合は存在しないことを意味する。
【００５５】
本発明の抗体は、既知の手法によって調製してもよい。例えば、「モノクローナル抗体、ハイブリドーマ：生物学的解析の新たな局面（Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses）」、Kennet他（編）, Plenum Press, New York (1980)、及び「抗体：実験マニュアル（Antibodies : A Laboratory Manual）」、Harlow and Lane（編）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,（1988）を参照されたい。
【００５６】
本発明は、ハイブリドーマ細胞株を産生する方法であって、マウス又はトランスジェニックマウス等の非ヒト動物を、ＨＡＳ又はその免疫原性部によって免疫化すること、免疫化した動物から脾細胞を採取すること、採取した脾細胞を骨髄腫細胞株と融合してハイブリドーマ細胞を発生させること、及びＨＡＳと結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含むハイブリドーマ細胞株を産生する方法を意図する。
【００５７】
このようなハイブリドーマ細胞株及びそれらによって産生されるＨＡＳモノクローナル抗体は、本発明に包含される。ハイブリドーマ細胞株によって分泌されるモノクローナル抗体は、従来の技法によって精製される。ハイブリドーマ又はそれらによって産生されるモノクローナル抗体をさらにスクリーニングして、特に望ましい特性を有するモノクローナル抗体を同定してもよい。
【００５８】
本発明の抗体を産生する初期段階において動物を免疫化するために用いられ得るＨＡＳ分子又はその免疫原性部は、いかなる哺乳類起源由来であってもよい。
【００５９】
本発明の抗体の抗原結合断片は、従来の技法によって産生し得る。このような断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及び一本鎖Ｆｖ断片（ｓＦｖ又はｓｃＦｖと呼ばれる）を含むＦｖ断片が挙げられるが、これらに限定されない。ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、一本鎖可変領域ドメイン（Ａｂｓ）分子、ミニボディ（minibodies）、及びディアボディ（diabodies）等の、抗体断片及び遺伝子操作技法によって産生された誘導体も、本発明に従って用いることが意図される。
【００６０】
ＨＡＳ分子に関するモノクローナル抗体のこのような断片及び誘導体を調製して、本明細書に記載のアッセイを含む既知の技法によって所望の特性に関してスクリーニングしてもよい。或る特定の技法は、対象ｍＡｂのポリペプチド鎖（又はその一部）をコードするＤＮＡを単離すること、及び組換えＤＮＡ技術によってＤＮＡを操作することを伴う。ＤＮＡは、別の対象ＤＮＡに融合させてもよく、例えば１つ又は複数のアミノ酸残基を付加、欠失、又は置換するように（例えば、変異誘発又は他の従来の技法によって）変化させてもよい。
【００６１】
抗体ポリペプチド（例えば、重鎖又は軽鎖、可変領域のみ又は完全長）をコードするＤＮＡを、修飾ＬＩＦ分子で免疫化したマウスのＢ細胞から単離してもよい。ＤＮＡは、従来の手法を用いて単離してもよい。ファージディスプレイは、既知の技法の別の例であり、これによって抗体の誘導体を調製し得る。１つのアプローチにおいて、対象の抗体の成分であるポリペプチドを、任意の適した組換え発現系において発現させ、発現されたポリペプチドを集合させて、抗体分子を形成することが可能である。
【００６２】
一本鎖抗体は、アミノ酸架橋（短いペプチドリンカー）を介して重鎖及び軽鎖の可変領域（Ｆｖ領域）断片を連結させることによって形成してもよく、これによって一本のポリペプチド鎖が得られる。このような一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖｓ）は、２つの可変領域ポリペプチド（ＶＬ及びＶＨ）をコードするＤＮＡの間にペプチドリンカーをコードするＤＮＡを融合させることによって調製される。本明細書において提供される抗体に由来する一本鎖抗体は、本発明に包含される。
【００６３】
一実施形態において、本発明は、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２及び／又はＨＡＳ３等のＨＡＳと結合する本発明の抗体の抗体断片、キメラ型、組換え型又は合成型を提供する。
【００６４】
対象の抗体から異なるサブクラス又はアイソタイプの抗体を得る技法、すなわちサブクラススイッチングが既知である。このように、例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ４モノクローナル抗体を、ＩｇＭモノクローナル抗体から得ることができ、その逆もまた同じである。このような技法によって、所定の抗体（親抗体）の抗原結合特性を保持するが、親抗体とは異なる、抗体アイソタイプ又はサブクラスに関連した生物特性も示す新規の抗体を調製することができる。組換えＤＮＡ技法を利用してもよい。特定の抗体ポリペプチドをコードするクローン化ＤＮＡ、例えば所望のアイソタイプの抗体の定常領域をコードするＤＮＡを、このような手法に利用してもよい。
【００６５】
上記のモノクローナル抗体産生プロセスは、動物、例えばマウスにおいて、モノクローナル抗体を産生するために用いてもよい。このような動物に由来する従来の抗体、例えばマウス抗体は、それらが免疫応答を引き起こす可能性があることから、ヒトへの投与には一般的に不適であることが知られている。したがって、このような抗体は、ヒトへの投与に適した抗体を提供するために修飾する必要があり得る。キメラ抗体及び／又はヒト化抗体を調製するプロセスは当該技術分野において既知であり、下記でさらに詳細に記載する。
【００６６】
本明細書中のモノクローナル抗体には、特に重鎖及び／又は軽鎖の可変ドメインが、非ヒト種（例えばマウス）に由来する抗体における対応する配列と同一又は相同であるが、この鎖（複数可）の残りの部分はヒトに由来する抗体における対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体、並びに所望の生物活性を示す限りはこのような抗体の断片が含まれる。
【００６７】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体である。たいていの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）が、所望の特性、例えば特異性及び親和性を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）由来の対応するＣＤＲに置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域残基が対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体において見出されない残基を含んでもよい。
【００６８】
これらの修飾は、抗体の性能をさらに高めるために行われる。一般的にヒト化抗体は、相補性決定領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、フレームワーク領域残基の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列の領域である、少なくとも１つ、及び典型的に２つの可変ドメインを実質的に全て含む。ヒト化抗体はまた、必要に応じて免疫グロブリン、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）を少なくとも一部含む。
【００６９】
非ヒト動物においてヒト抗体を生成する手法が開発され、当業者に周知である。例えば、１つ又は複数のヒト免疫グロブリン鎖をコードする遺伝子材料が導入されているトランスジェニックマウスを用いて、本発明の抗体を産生してもよい。動物において産生された抗体は、動物に導入されたヒト遺伝子材料によってコードされたヒト免疫グロブリンポリペプチド鎖を組み込む。
【００７０】
ヒト抗体を生成する別の方法はファージディスプレイである。ヒト抗体を生成するためのファージディスプレイ技法は、当業者に周知であり、これには、Cambridge Antibody Technology及びMorphoSys等の企業によって用いられる方法が含まれる。
【００７１】
本発明の化合物は、創薬及び標的検証の領域に適用することもできる。本発明は、ＨＡ、ＨＡＳ、又はＨＡ／ＨＡＳ相互作用と、疾患状態、表現型、又は病態との間にある関係性を解明するために創薬努力で本明細書において同定された化合物及び好ましい標的セグメントの使用を含む。これらの方法には、試料、組織、細胞、又は生物を本発明の化合物に接触させること、処置後の何らかの時点でＨＡＳの核酸又はタンパク質のレベル及び／又は関連する表現型又は化学的エンドポイントを測定すること、及び必要に応じて無処置試料又は本発明のさらなる化合物によって処置した試料とで測定値を比較することを含み、ＨＡＳを検出又は調節することが含まれる。これらの方法は他の実験と並行して、又は組み合わせて行い、標的検証プロセスのために未知遺伝子の機能を求める、又は特定の疾患、病態、若しくは表現型の治療又は予防のための標的として特定の遺伝子産物の有効性を求めることもできる。
【００７２】
本発明は、ＨＡに関連した疾患及び障害を患う被験体を治療する治療物質としての本明細書に記載の化合物の使用を意図する。本発明の組成物及び化合物を用いて治療される被験体には、このような治療によって利益を受けることができる任意の動物が含まれる。これらとしては、ヒト、マーモセット、オランウータン、及びゴリラ、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ロバ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ）、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ）及び捕獲された野生動物（例えば、齧歯類、キツネ、シカ、カンガルー）が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい宿主は、ヒト、霊長類、又は家畜動物である。
【００７３】
本発明の化合物は、診断、治療、予防のために、並びに研究試薬及びキットとして利用することができる。さらに、ＨＡＳに非常に強い特異性で影響を及ぼすことができるＨＡＳに対する抗体は、特定の遺伝子若しくは遺伝子産物の機能を解明するため、又は様々な生物学的経路の機能を区別するために、当業者によって用いられることが多い。
【００７４】
キット及び診断に用いるために、本発明の化合物は単独又は他の化合物若しくは治療剤と併用して異なる分析及び／又は組み合わせ分析におけるツールとして用い、細胞及び組織内で発現された遺伝子の一部又は相補体全体の発現パターンを解明することができる。
【００７５】
本発明の化合物は、これらの化合物がＨＡＳ自体と結合することから、研究及び診断にとって有用である。例えば、抗体を造影目的、診断目的、又は定量目的のために酵素及び放射標識を含むレポーター分子で標識してもよい。試料においてＨＡＳレベルを検出するのにこのような検出手段を用いるキットも同様に調製してもよい。
【００７６】
抗体の特異性及び感受性は、当業者によって治療的用途にも利用される。このような化合物は、ヒトを含む動物における疾患状態の治療において治療成分として用いられている。
【００７７】
治療のために、ＨＡＳの発現を調節することによって治療することができる疾患又は障害を有する疑いがある動物、好ましくはヒトを、ＨＡＳ活性を阻害する抗体を用いて治療することができる。例えば、１つの非制限的な実施形態において、この方法は、疾患細胞においてＨＡＳ発現を選択的に阻害する治療的に有効な量の抗体を、治療を必要とする動物に投与する工程を含む。一実施形態では、動物におけるＨＡＳの活性又は発現は約１０％阻害される。好ましくは、動物におけるＨＡＳの活性又は発現は約３０％阻害される。より好ましくは、動物におけるＨＡＳの活性又は発現は５０％以上阻害される。
【００７８】
例えば、ＨＡＳ遺伝子の発現の低減は、動物の血清、脂肪組織、皮膚細胞、肝臓、又は任意の他の体液、組織、若しくは器官において測定することができる。好ましくは、分析される当該体液、組織、又は器官内に含有される細胞は、ＨＡＳタンパク質をコードする核酸分子を含有する。
【００７９】
したがって、本発明は、例えば、候補化合物をＨＡＳに接触させることを含む、化合物のスクリーニング法を意図する。スクリーニング手法には、（ｉ）薬剤とＨＡＳとの複合体の存在をアッセイすること、及び（ｉｉ）疾患細胞及び非疾患細胞においてＨＡＳの発現レベルの変化に関してスクリーニングすることが含まれる。細胞と薬剤との間の相互作用に関して、全細胞をスクリーニングしてもよい。
【００８０】
アッセイの一形態は、競合的結合アッセイを包含する。このような競合的結合アッセイにおいて、候補化合物又はＨＡＳは典型的に標識される。遊離ＨＡＳを任意の推定の複合体から分離し、遊離（すなわち複合体形成していない）標識の量が、調べる作用物質の標的分子との結合の指標とする。同様に、遊離ではなく結合したＨＡＳの量を測定してもよい。ＨＡＳではなく化合物を標識すること、及び調べる化合物の存在下及び非存在下でＨＡＳと結合する化合物の量を測定することも可能である。このような化合物は、例えば、ＨＡＳの阻害剤を発見するのに有用であるＨＡＳを阻害し得る。
【００８１】
薬剤スクリーニングの別の技法は、標的に対して適した結合親和性を有する化合物にハイスループットスクリーニングを提供する。簡単に説明すると、多数の異なる小ペプチド試験化合物を、プラスチックピン又は幾つかの他の表面等の固体基板上で合成する。ペプチド試験化合物をＨＡＳと反応させて、洗浄する。次に、結合したＨＡＳ分子を当該技術分野で周知の方法によって検出する。この方法を、非ペプチド化学物質のスクリーニングに適合させてもよい。したがって、この態様は、ＨＡＳアンタゴニスト又はアゴニストのスクリーニングに対する組み合わせアプローチに及ぶ。
【００８２】
精製ＨＡＳは、上記の薬剤スクリーニング技法において用いるためにプレート上に直接コーティングすることができる。しかし、標的に対する非中和抗体を用いて、固相上で標的を固定することもできる。
【００８３】
上記のように、本発明は、上記のように同定され、ＨＡＳと結合してその活性を阻害する低分子阻害剤にも及ぶ。
【００８４】
特に明記していなければ、変化する可能性があるので、本発明は特定の成分の処方、製造法、投与レジメン（regiments）、治療プロトコール等に限定されないと理解すべきである。本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのためのものであって、限定を意図するものではないことも理解されるべきである。
【００８５】
本明細書において用いられるように、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その（the）」には、文脈が明らかにそうでないことを明記している場合を除き、複数形の態様が含まれることを留意しなければならない。したがって、例としては、「化合物（a compound）」に対する言及には、単一の化合物、並びに２つ以上の化合物が含まれ、「抗体（an antibody）」に対する言及には、単一の抗体、並びに２つ以上の抗体が含まれる等である。
【００８６】
「化合物」、「活性物質」、「薬理学的活性剤」、「薬物」、「活性」及び「薬剤」という用語は、本明細書において交換可能に用いられ、ＨＡＳ機能若しくは活性のアンタゴニスト、又は炎症を制御して、癌の増殖を抑える（これらに限定されない）等の所望の薬理学的及び／又は生理学的な作用を誘導する、これらをコードする遺伝子材料の発現のアンタゴニストを指す。この用語は、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝産物、類似体等を含む（これらに限定されない）、本明細書において特に言及したこれらの活性物質の薬学的に許容される薬理学的に活性な成分も包含する。「化合物」、「活性物質」、「薬理学的活性剤」、「薬物」、「活性」及び「薬剤」という用語を用いる場合、活性物質自体、及び薬学的に許容される薬理学的に活性な塩、エステル、アミド、プロドラッグ、代謝産物、類似体等もこれに含まれると理解すべきである。
【００８７】
本明細書に用いられる「有効量」及び「治療的に有効な量」の化合物という用語は、炎症を阻害する、又は癌細胞の増殖若しくは伝幡を抑える等の所望の治療的又は生理的な効果を提供するのに十分な量の作用物質を意味する。望ましくない効果、例えば副作用は、望ましい治療効果と共に出現することもあり、したがって、医師は、適当な「有効量」を決定する場合に、潜在的リスクと潜在的利益とのバランスをとる。正確な必要量は、被験体の種類、年齢、及び全身状態、投与様式等に応じて被験体によって変わる。したがって、正確な「有効量」を明記することは不可能であり得る。しかし、任意の個々の症例における適当な「有効量」は、通常の実験のみを用いて当業者によって決定され得る。本発明は、治療又は予防に及ぶ。
【００８８】
「薬学的に許容される」担体、賦形剤、又は希釈剤とは、生物学的ではない又はそうでなければ所望のものではない（undesirable）材料（すなわちこの材料を、選択された活性物質と共に被験体に投与しても、いかなる又は実質的な副作用を引き起こし得ない）から成る薬学的ビヒクルを意味する。担体としては、賦形剤、及び希釈剤、洗浄剤、着色剤、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、保存剤等の他の添加剤が挙げられ得る。
【００８９】
同様に、本明細書において提供される化合物の「薬理学的に許容される」塩、エステル、アミド、プロドラッグ、又は誘導体は、生物学的ではない又はそうでなければ所望のものではない塩、エステル、アミド、プロドラッグ、又は誘導体である。
【００９０】
本明細書において用いられる「治療すること」及び「治療」という用語は、疾患若しくは障害の症状、又は生理的状態の重症度及び／又は頻度の減少、症状及び／又は基となる原因の消失、疾患の症状及び／又はその基となる原因の発生の予防、並びにサイトカイン活性に関連する病態の改善又は回復を指す。
【００９１】
患者を「治療すること」とは、罹患しやすい個体における障害、又は疾患状態、又は生理的事象の予防、及び疾患又は障害を阻害することによる臨床的に症候性の個体の治療を伴い得る。
【００９２】
したがって、本発明の別の態様は、ＨＡＳのレベル又は活性を低下させ、したがってＨＡレベルを低下させることができる化合物を含む治療的又は予防的な組成物に関する。
【００９３】
本発明の組成物及び化合物は、ＨＡに関連した疾患の治療又は予防に用いることができる。
【００９４】
本発明の化合物は、有効量の化合物を適した薬学的に許容される希釈剤又は担体に添加することによって、薬学的組成物に利用することができる。本発明の化合物及び方法の使用は、予防的にも有効であり得る。
【００９５】
本発明の化合物は、取り込み、分布、及び／又は吸収を助けるために、例えばリポソーム、受容体標的分子、経口製剤、直腸製剤、局所製剤、又は他の製剤として他の分子、分子構造、又は化合物の混合物と混合、封入、結合、又はそうでなければ会合させてもよい。
【００９６】
「プロドラッグ」という用語は、身体又はその細胞内で、内因性の酵素又は他の化学物質の作用及び／又は条件によって活性型に変換する、不活性型で調製された治療物質（すなわち薬剤）を示す。
【００９７】
「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の生理的及び薬学的に許容される塩、すなわち親化合物の所望の生物活性を保持し、それに望ましくない毒性作用を付与しない塩を指す。
【００９８】
本発明には、本発明の相互作用化合物又は抗体が含まれる薬学的組成物及び製剤も含まれる。本発明の薬学的組成物は、局所治療又は全身治療が望ましいか否かに応じて、及び治療される部位に応じて、いかなる方法で投与してもよい。投与は、局所（眼内並びに膣内及び直腸送達を含む粘膜が含まれる）、例えばネブライザーによる場合を含む、粉末又はエアロゾルの吸入又は吹送による肺内；気管内、鼻腔内、上皮及び経皮）、経口、又は非経口であってもよい。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、若しくは筋肉内の注射若しくは注入；又は頭蓋内、例えば髄腔内若しくは脳室内の投与が挙げられる。化合物は、経口投与のために修飾してもよい。局所投与用の薬学的組成物及び製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、スプレー、液剤及び散剤が挙げられ得る。従来の薬学的担体、水溶液、散剤、又は油性基剤、増粘剤等が必要であるか又は望まれる場合がある。コーティングしたコンドーム、手袋等も有用である場合がある。
【００９９】
本発明の薬学的製剤（便宜的に単位剤形で与えられてもよい）は、製薬産業において周知の従来の技術に従って調製してもよい。このような技法には、活性成分を薬学的担体（複数可）又は賦形剤（複数可）に会合させる工程が含まれる。一般的に、製剤は、活性成分を液体担体若しくは細粉化された固体担体又はその両方に均一且つ緊密に会合させて、それから必要であれば製品を成形することによって調製される。
【０１００】
本発明の組成物は、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、ソフトゲル、坐剤、及び浣腸（これらに限定されない）等の多くの可能性がある剤形のいずれかで調製してもよい。本発明の組成物は、水性、非水性、又は混合媒体において懸濁液として配合してもよい。水性懸濁液はさらに、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、及び／又はデキストランを含む懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。懸濁液は、安定化剤を含有してもよい。
【０１０１】
本発明の薬学的組成物としては、液剤、乳濁剤、フォーム、及びリポソーム含有製剤が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の薬学的組成物及び製剤は、１つ又は複数の浸透増強剤、担体、賦形剤、又は他の活性成分若しくは不活性成分を含んでもよい。
【０１０２】
乳濁剤は典型的に、通常直径０．１μｍを超える液滴の形態で別の液体に分散させた１つの液体の不均一系である。乳濁剤は、分散相の他にさらなる成分と、水相若しくは油相のいずれかで溶液として、又はそれ自体が分離相として存在し得る活性剤とを含有してもよい。マイクロエマルジョンは、本発明の一実施形態として含まれる。
【０１０３】
本発明の製剤には、リポソーム製剤が含まれる。本発明において用いられる「リポソーム」という用語は、球状の二重層（複数可）で配列された両親媒性脂質から成る小胞を意味する。リポソームは、親油性材料で形成された膜と送達される組成物を含有する水性の内部（interior）とを有する単層又は多層の小胞である。
【０１０４】
リポソームには、「立体的に安定化された」リポソームも含まれ、この用語は、本明細書で用いられるように、リポソームに組み込まれた場合に、このような特殊な脂質を欠損するリポソームと比べて循環中の半減期の増加が起こる１つ又は複数の特殊な脂質を含むリポソームを指す。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部の部分が１つ若しくは複数の糖脂質を含むか、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分等の１つ又は複数の親水性ポリマーによって誘導体化されるリポソームである。
【０１０５】
本発明の薬学的製剤及び組成物には、界面活性剤も含まれ得る。医薬品、製剤及び乳濁剤における界面活性剤の使用は、当該技術分野で周知である。
【０１０６】
当業者は、製剤がその意図する用途、すなわち投与経路に従って通常設計されることを認識する。
【０１０７】
好ましい局所投与製剤には、本発明の化合物又は抗体が脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート物質、及び界面活性剤等の局所送達物質と混合されている製剤が含まれる。好ましい脂質及びリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジル（distearolyphosphatidyl）コリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ））及びカチオン性（cationic）（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピル（ＤＯＴＡＰ）及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＴＭＡ））が挙げられる。
【０１０８】
局所投与又は他の投与のために、本発明の化合物又は抗体は、リポソーム内に封入してもよく、又はそれに対して、特にカチオン性リポソームに対して複合体を形成してもよい。代替的には、化合物又は相互作用分子（例えば、抗体）は脂質、特にカチオン性脂質と複合体を形成してもよい。
【０１０９】
経口投与用の組成物及び製剤としては、散剤、又は顆粒剤、微粒子、ナノ粒子、水若しくは非水性媒体の懸濁液若しくは溶液、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤、錠剤、又はミニ錠剤が挙げられる。増粘剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、又は結合剤が望まれる場合もある。好ましい経口製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが１つ又は複数の浸透増強剤、界面活性剤、及びキレート剤と共に投与される製剤である。好ましい界面活性剤としては、脂肪酸及び／又はそのエステル又は塩、胆汁酸及び／又はその塩が挙げられる。浸透増強剤、例えば脂肪酸／塩と胆汁酸／塩との組み合わせも好ましい。特に好ましい組み合わせはラウリン酸、カプリン酸、及びＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透増強剤には、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが含まれる。本発明の化合物、又は抗体、又は他の相互作用分子は、噴霧乾燥粒子を含む顆粒状で、又は複合体を形成して微粒子又はナノ粒子を形成して経口送達してもよい。
【０１１０】
非経口投与、髄腔内投与、又は脳室内投与用の組成物及び製剤としては、緩衝液、希釈剤、並びに浸透増強剤、担体化合物、及び他の薬学的に許容される担体又は賦形剤（これらに限定されない）等の他の好適な添加剤も含有し得る滅菌水溶液が含まれ得る。
【０１１１】
本発明の或る特定の実施形態は、１つ又は複数の化合物又は抗体と、１つ又は複数の他の化学療法物質とを含有する薬学的組成物を提供する。このような化学療法物質の例としては、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マフォスファミド、イフォスファミド、シトシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロソウレア（bis-chloroethylnitrosurea）、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソウレア（methylcyclohexylnitrosurea）、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスホルアミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、ゲンシタビン、テニポシド、シスプラチン、及びジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）等の癌化学療法物質が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の化合物と共に用いる場合、このような化学療法物質は、個々に（例えば、５−ＦＵ及びオリゴヌクレオチド）、連続的に（例えば、一定期間の５−ＦＵ及びオリゴヌクレオチドの後にＭＴＸ及びオリゴヌクレオチド）、又は１つ若しくは複数の他のこのような化学療法物質と組み合わせて（例えば、５−ＦＵ、ＭＴＸ、及びオリゴヌクレオチド、又は５−ＦＵ、放射線療法、及びオリゴヌクレオチド）用いてもよい。非ステロイド性抗炎症剤及びコルチコステロイドを含む（これらに限定されない）抗炎症剤、並びにリビビリン、ビダラビン、アシクロビル及びガンシクロビルを含む（これらに限定されない）抗ウイルス剤も、本発明の組成物と併用することができる。２つ以上の併用化合物を共に、又は連続的に用いてもよい。
【０１１２】
別の関連する実施形態において、本発明の組成物は第一のタンパク質に対する標的となる抗体等の１つ又は複数の相互作用分子と、第二のタンパク質に対する標的となる１つ又は複数のさらなる化合物とを含有してもよい。代替的には、本発明の組成物は、同じタンパク質の異なる領域に対する標的となる２つ以上の相互作用化合物を含有してもよい。
【０１１３】
治療組成物の製剤及びその後の投与（投薬）は当業者の範囲内である。投薬は、治療される疾患状態の重症度及び反応性に依存し、治療期間は数日から数ヶ月間、又は治癒が起こるまで、又は疾患状態の減退が得られるまで継続する。最適な投薬スケジュールは、患者の身体における薬剤の蓄積の測定から算出することができる。当業者は最適な用量、投薬法及び反復回数を容易に決定することができる。最適な用量は、個々の化合物の相対効力に応じて変化する可能性があり、一般的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの動物モデルにおいて有効であることが判明したＥＣ５０に基づいて推測することができる。一般的に、用量は体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇであり、これを毎日、毎週、毎月、若しくは毎年１回若しくは複数回、又は２〜２０年ごとに１回投与してもよい。当業者は、体液又は組織における薬剤の測定された残留時間及び濃度に基づいて、投薬の反復回数を容易に推測することができる。治療の成功後、疾患状態の再発を防止するために、患者に維持療法を行うことが望ましい場合があり、この場合、化合物は体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇの範囲の維持用量で、１日１回又は複数回〜２０年ごとに１回投与する。有効量の例としては、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、及び１００ｇ／ｋｇ（体重）が挙げられる。
【０１１４】
原形質膜の会合が予測されるＨＡＳタンパク質構造中の疎水性配列が全てのＨＡＳタンパク質で共通である。膜貫通ドメインの予測クラスターがタンパク質のいずれかの末端で見られ、アミノ末端ではその数は１〜２で異なり、カルボキシル末端では４〜６で異なる。真核細胞（members）に対する細胞質ループの長さは３０７〜３２８残基で異なり、ＨＡ合成に関する触媒ドメインを含有している可能性がある。
【０１１５】
Itano & Kimata, Biochm. Biophys. Res. Comm. 222:816-821, 1996によって求められるＨＡＳ１に対する予測アミノ酸配列に基づき、３つの短い抗原性ペプチドを設計し、固相アミノ酸合成によって合成して、逆相高速クロマトグラフィによって精製した。このペプチドは質量分析法で示されるように純度が９９．９％であると測定された。このペプチドの産生、精製、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）との結合、及び純度試験はChiron Mimitopes （Melbourne, Victoria, Australia）によって行われた。３つの免疫化ペプチドのそれぞれの配列を設計した：ＨＡＳ４１８（ＩＮＴ−１）、ＨＡＳ４１９（ＥＸ−１）及びＨＡＳ４２１（ＩＮＴ−２）。これらの免疫化ペプチドは、本発明者等による以前の特許出願の主題であった（ＰＣＴ／ＡＵ０４／０１３８３、国際公開特許第ＷＯ０５／０３５５４８号）。
【０１１６】
膜貫通予測プログラムを用いて（ＴＭ予測（predict））、それぞれのシンターゼは推定６、７個の膜貫通ドメインを含有する。皮膚線維芽細胞等の非悪性細胞に対するＨＡＳ抗血清の反応性に基づいた予備データに従って、シンターゼが原形質膜にどのように配向するかの推測モデルを提唱することができる（図２を参照されたい）。ＥＸ−１エピトープはＴＭＤ５とＴＭＤ６との間に位置している。ＴＭＤはシンターゼにおいて最後の疎水性配列であるので、このＴＭＤは細胞質内にカルボキシル末端がある。ＨＡＳ抗血清に対するエピトープ位置でヒアルロナンシンターゼの予測トポロジーが示される。
【０１１７】
本発明に繋がる研究において、予測アミノ酸配列に基づき（図１）、ＥＸ−１、ＩＮＴ−１及びＩＮＴ−２に対する抗体がＨＡＳ１の活性のみに影響を与えることが予測されたにもかかわらず、これらの抗体は、正常細胞及び／又は悪性細胞において異なるＨＡＳアイソフォームの活性に影響を与えることができることが観察された。さらに、非悪性細胞のＨＡシンターゼのトポロジーは予測トポロジーと一致すると考えられたが、驚くべきことに乳癌細胞ではトポロジーは明らかに変化したことが見出された。これらのデータによって、潜在的にヒアルロナン合成の選択的治療的阻害剤として作用することができる新規のＨＡＳエピトープに特異的な阻害性抗体のさらなる評価が保証され、これにより癌に対する新規の治療法がもたらされた。したがって、ＨＡＳ、及び特にＨＡＳ１、ＨＡＳ２及び／又はＨＡＳ３は有用な薬剤標的となる。
【０１１８】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
【実施例】
【０１１９】
実施例１
【０１２０】
ＨＡＳ抗血清の作製
ＨＡＳ１（Itano & Kimata, 1996）の予測アミノ酸配列に基づき、３つの短い抗原ペプチドを設計し、固相アミノ酸合成によって合成して、逆相高速クロマトグラフィによって精製した。このペプチドは、質量分析法によって示されるように、純度９９．９％であると測定された。このペプチドの産生、精製、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）との結合、及び純度試験は、Chiron Mimitopes（Melbourne, Australia）によって行なわれた。それぞれの免疫化したペプチドの配列を表２に示した。
【０１２１】
【表２】
2009531333.tif 000003
【０１２２】
ボーダーレスターとメリノとの交雑ヒツジに、フロイント完全アジュバントに溶解したこれらのペプチド（０．２〜０．５ｍｇ）を２箇所筋肉内注射し、再度２週間後にフロイント不完全アジュバントを注射した。３５日目にヒツジを放血し、血清を遠心分離により分離し、−２０℃で貯蔵した。回収した全ての血清を、そのペプチド及び担体タンパク質に特異的な抗体に関する酵素免疫測定法で試験した。免疫化ペプチドを、臭化シアンの活性化によって、チオプロピル−セファロース６Ｂゲル（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）に結合し、特異的な抗体を、ポリクローナルのヒツジＨＡＳ抗血清から、アフィニティクロマトグラフィによって抽出した。要するに、５ｍＬの血清を、３ｍＬのＰＢＳと混合し、アフィニティ／リガンド樹脂と室温で１時間混合した後、５ｍＬのＰＢＳで３回洗浄した。抗体を、０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．８）で溶離し、０．１ＭのＮａＯＨの添加によって、直ちにｐＨを７．２に中和した。
【０１２３】
それからＨＡＳポリクローナル抗体を、ＹＭ３０  Ｄｉａｆｌｏフィルタを取り付けたＡｍｉｃｏｎ細胞濃縮器で濃縮した。各アフィニティ精製抗体のタンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Pierce, U.S.A）によって求めた。免疫組織化学又は免疫ブロット法において用いた抗体の無菌性を０．１%（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを添加することによって確実にした後、アリコートで−２０℃で貯蔵した。細胞培養物へ添加する予定の抗体は、アジ化物を含まずに、−２０℃で貯蔵した。
実施例２
【０１２４】
ＨＡＳ抗血清の機能的特徴
白血球から単離された最初の粗原形質膜調製物を、還元状態及び非還元状態で１０％アクリルアミドゲル中で分解させた。ウェスタンブロット分析によって、還元状態で３つ全ての抗体がヒアルロナンシンターゼの予測分子量に従った約６００００Ｄａの分子質量の単一バンドを検出したことが確認された。 
【０１２５】
非還元状態では、分子量標準の範囲外で単一バンドが検出された。このバンドは２１００００Ｄａ超と推測され、ＨＡ前駆体の供給を誘導するのに必要な補助タンパク質、特にＨＡ合成に必要なＵＤＰ−グルクロネート及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを表し得る（表３参照）。
実施例３
【０１２６】
皮膚線維芽細胞の培養物中における増殖速度及びヒアルロナン合成に対するＨＡＳ抗体の効果
培養物中の皮膚線維芽細胞に対するそれぞれのヒアルロナンシンターゼ抗体の効果を試験した。３つの皮膚線維芽細胞株の単層培養物は、２４ウェル組織培養プレートにおいて樹立された（１７０００細胞数／ｍＬ（培地）／ウェル）。１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳと、１．９ｍＭのグルタミンと、２０ｍＭのＨＥＰＥＳと、０．０９％（ｗ／ｖ）重炭酸塩と、１００単位のペニシリン、０．１ｍｇのストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢから成る抗生剤／抗真菌剤溶液とが添加されたＢＭＥ中で、３７℃、５％ＣＯ２で細胞を培養した。ＰＢＳ中に０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン／ＥＤＴＡが入った４つのウェルをトリプシン処理し、Ｍｏｄｅｌ−ＺＭコールターカウンターで定量化することによって、２４時間の沈降後の平均のコロニー形成率及び細胞数を求めた。ＨＡＳ抗体４１８、４１９、４２１及びヒツジＩｇＧを培養培地で最終濃度が３００μｇ／ｍＬになるまで希釈し、残りのウェルに入れた。最終容量は１つのウェル当たり１ｍＬであった。その後、培地を回収し、細胞数を１日目、２日目、４日目、及び８日目で概算した。ＨＡ放射法でＨＡを定量するまで、保存剤として０．０２％アジ化ナトリウムを用いて培養培地を４℃で保存した。
【０１２７】
ヒツジＩｇＧ又は抗体なしの対照と比べるとＨＡＳ４１８（ＩＮＴ−１）又はＨＡＳ４２１（ＩＮＴ−２）のいずれかの存在下では、皮膚線維芽細胞の増殖速度は影響を受けなかった。これらの結果は、ＨＡＳ４１８及びＨＡＳ４２１エピトープが細胞内に位置しているという推測と一致する。全ての実験条件で合成されたＨＡの量は、調べた３つの細胞株の内の１つでより少なかった（図４）。このことが増殖速度を調べたとき、この特定の細胞株の密集度の状態を反映していると考えられる。ヒアルロナン合成速度は細胞分裂をほとんどしない高密度培養物よりも活発に増殖する細胞培養物でより高かった。最も特筆すべき結果は、ヒアルロナンの合成に対するＨＡＳ４１９（ＥＸ−１）の阻害効果であった（図４及び図５）。皮膚線維芽細胞の培養物中のヒアルロナン合成は、３００μｇ／ｍＬのＨＡＳ４１９との２４時間のインキュベート後に完全に阻害された。細胞数は全ての群で１又は２日目から８日目にかけて徐々に減少した。このことは細胞数の漸進的低下に相関があった。このことは、皮膚線維芽細胞においてＨＡＳ４１９（ＥＸ−１）に対するエピトープが細胞表面上に位置していることを示す。他のヒアルロナンシンターゼ抗体、ＨＡＳ４１８（ＩＮＴ−１）及びＨＡＳ４２１（ＩＮＴ−２）はＨＡ合成阻害効果を何も示さなかったか、又は増殖速度に影響を与えなかった。これらの実験に用いた実験系は、補体による抗体−抗原相互作用に起因する任意の急性細胞溶解を回避するために補体を含んでいなかった。
【０１２８】
ＨＡＳ抗体エピトープの配向を確認するために、非浸透性（non-permeablised）皮膚線維芽細胞において蛍光活性化細胞選別分析（ＦＡＣＳ）を利用してさらなる研究を行った。図６ａ、図６ｂ及び図６ｃはそれぞれ、皮膚線維芽細胞をＩＮＴ−１、ＩＮＴ−２及びＥＸ−１と反応させたときに得られた典型的なヒストグラムのプロットの結果を示す。
【０１２９】
ＦＡＣＳ結果によって、ＩＮＴ−１及びＩＮＴ−２の両方のエピトープが、非浸透性（non-permeabalised）皮膚線維芽細胞で非反応性であることが示され、このことはこれらのエピトープが細胞内に位置していることを示唆している。このことは、ＩＮＴ−１及びＩＮＴ−２抗体が増殖速度及びヒアルロナン合成を乱さなかった（did not perturb）場合に行われた機能的研究と十分に相関がある。これに対して、ＥＸ−１に対するエピトープがＨＡ合成を乱し、細胞数の減少を引き起こして、ＦＡＣＳで分析したときに正に反応したことを示した。このことによって、ＥＸ−１に対するエピトープが細胞表面上に位置していることが示される。
【０１３０】
ヒアルロナンシンターゼの膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を考慮すると、ＥＸ−１に対するエピトープは、ＴＭＤ５とＴＭＤ６との間に見出される。これは細胞外のこれら２つのＴＭＤ間にループがある。さらに、ＴＭＤ６が最後の疎水性セグメントであるので、細胞内にカルボキシル末端がある。
実施例４
【０１３１】
乳癌細胞株の培養物中における増殖速度及びヒアルロナン合成に対するＨＡＳ抗体の効果
異数性のヒト乳腺癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１が、ＨＡ受容体の様々な発現、侵襲／転移能及びＨＡ産生の程度に基づいて選択された。
【０１３２】
細胞株を２４ウェルプレートでプレート培養した。細胞を２４時間接着させたあと、３００μｇ／ｍｌのＩＮＴ−１、ＩＮＴ−２、ＥＸ−１抗血清とヒツジＩｇＧ（種アイソタイプ対照（species isotype control））とを添加した１０％非処理ＦＣＳ又は１０％補体不活性ＦＣＳを含有する細胞特異的培地を添加した。培養物を樹立した後、それぞれ１日目、２日目、４日目、６日目及び８日目の時点で細胞を回収し、自動コールターカウンター法を用いて、細胞数を求めた。試験培養物及び対照培養物それぞれから培地を保持し、ＨＡ存在に関して定量的にアッセイを行った。対照培地（細胞接触なし）におけるＨＡの濃度を用いて、増殖培地中の内因性のＨＡレベルを求め、それぞれ次のＨＡ測定値から差し引いた。
【０１３３】
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対するＨＡＳ抗体の初期滴定を行い、２４時間、それぞれの抗体の存在下で細胞をインキュベートして、その後細胞数を推測した。それぞれの抗体の滴定範囲は、１０〜１００００ｎｇ／ｍＬであった。同様の傾向がそれぞれの細胞株で見られたので、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の結果が示される。
【０１３４】
図７から、ＥＸ−１エピトープに対する抗体に加えて、ＩＮＴ−２が細胞増殖を阻害し、細胞数の顕著な減少が引き起こされたことに留意されたい。このことは、悪性状態のヒアルロナンシンターゼの膜トポロジーが、皮膚線維芽細胞等の非悪性細胞で見られたものと異なるという指標であった。両方の乳癌細胞株を３００μｇ／ｍＬのそれぞれの抗体とインキュベートして、さらなる実験を行った際に、これらの見解は機能的関連性に変換された。それぞれの時点で細胞を回収し、自動コールターカウンターを用いて細胞数を推測した。それぞれの試験培養物及び対照培養物から培地を保持した後に、ＨＡ存在に関してアッセイを行った。図８によって、ＥＸ−１に加えて、調べた両方の乳癌細胞株におけるＨＡ産生が、ＩＮＴ−１ではなく、ＩＮＴ−２によっても阻害されたことが明らかに示される。
【０１３５】
ＨＡ合成の阻害によって、生存乳癌と非悪性線維芽細胞とが分離された。培養細胞の顕微鏡試験によって、抗体添加の２４時間後、細胞間の明らかな形態的相違が示された。異なるシンターゼエピトープに対する抗体が、様々な細胞変化をもたらした。例えば、ＩＮＴ−１に対する抗体は細胞形態において劇的な変化を何も示さなかった。ＩＮＴ−２及びＥＸ−１に対する抗体は、細胞収縮、膜結合小胞の形成、並びに原形質膜及び核膜の広範な小胞形成（blebbing）等の特性をもたらした。それぞれの抗体の存在下で培養したＭＤＡ−ＭＢ−２３１で得られた画像は図９で示される。
【０１３６】
膨潤細胞が明らかに見られる場合のＩＮＴ−２及びＥＸ−１の存在下で培養した細胞の出現、並びに核膜膨潤に留意されたい。これは、これらの細胞の生存状態を確かめる論理的方向性であった。ＤＡＰＩ染色（核アポトーシスを検出するため）及びＤＮＡ断片化アッセイを行った。これらの結果は以下の図１０で示される。
【０１３７】
ＨＡＳ抗血清の存在下で培養した分離細胞及び接着細胞の両方でＤＡＰＩ染色を行ったとき、核はＤＮＡ断片化を示さなかった（図１０のパネルＡ及びパネルＢ）。この見解は、ＤＮＡがこれらの細胞から抽出され、標準的な電気泳動技法で分解された場合にも確認された。ＤＮＡ断片化は観察されなかった（図１１のパネルＡ及びパネルＢ）。
【０１３８】
乳癌細胞株に対するＨＡＳ抗血清の細胞反応性を確認するために、皮膚線維芽細胞が初めに特徴付けられたときと同一の様式でＦＡＣＳを利用した。２つのさらなる乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５及びＺＲＬ−７５−１も、ＨＡＳ抗血清に対する反応性に関して評価した。
【０１３９】
備考：ヒストグラムが灰色で塗りつぶしたプロットで表される場合、これはＨＡＳ抗体に対する反応性を表し、白色の（unfilled）プロットは抗体対照に対応する。プロットが黒線で表される場合、これらのプロットは二次ＦＩＴＣから測定された対照のみのバックグラウンド蛍光を表す。緑色プロットは、上記の乳癌細胞株に対するそれぞれのＨＡＳ抗体の反応性を表す。調べた４つの乳癌細胞株由来のＦＡＣＳデータによって、悪性状態におけるＥＸ−１及びＩＮＴ−２に対するエピトープが細胞外で発現されることが強く示唆される。
実施例５
【０１４０】
様々なＨＡＳアイソフォームとのＨＡＳ抗血清の交差反応性
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて、上記の乳癌細胞株それぞれのｍＲＮＡレベルを特徴付けている。ノーザンブロット分析と併用した比較ＲＴ−ＰＣＲも行い、皮膚線維芽細胞においてＨＡＳアイソフォーム発現を特徴付けている。これらの結果を表３で要約する。
【０１４１】
【表３】
2009531333.tif 000004
【０１４２】
当業者は、本明細書に記載された発明を、具体的に記載されたもの以外で、変更及び修飾させることができることを認識する。本発明は、このような変更及び修飾を全て含むことが理解される。本発明は、本明細書において個別に又は集合的に言及又は指定された全ての工程、特性、組成物及び化合物、並びにいずれか２つ以上の工程又は特性の任意又は全ての組み合わせも含む。
【０１４３】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１ａ】ヒトのヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）ファミリー間の複数のアミノ酸アライメントの図である。
【図１ｂ】ヒトのヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）ファミリー間の複数のアミノ酸アライメントの図である。（図１ａのつづき）
【図２】非悪性状態で予測されるトポロジーの図である。
【図３】分子量標準の範囲外に単一のバンドが検出された非還元状態を示す写真図である。このバンドは、２１００００Ｄａを超えるものと推測され、ＨＡ前駆体、特にＨＡ合成に必要とされるＵＤＰ−グルクロネート及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの供給を誘導するのに必要とされる補助タンパク質を表し得る。
【図４】ＩＮＴ−１又はＩＮＴ−２又はＥＸ−１のいずれの存在にも影響を与えない皮膚線維芽細胞の増殖速度を示す図である。
【図５】皮膚線維芽細胞がヒツジＩｇＧと反応する場合に得られた典型的なヒストグラムプロットの結果を示す図である。
【図６】皮膚線維芽細胞上のＨＡＳ抗体のフローサイトメトリ分析を示す図である。皮膚線維芽細胞は、ａ）ＩＮＴ−１、ｂ）ＩＮＴ−２及びｃ）ＥＸ−１と反応した。塗りつぶされた（灰色の）プロットはＨＡＳ抗体を示し、白色のプロットは、対応する対照抗体によって発生したバックグラウンド蛍光を示す。パネルｃにおける蛍光強度のシフトは、反応性エピトープが細胞表面に存在することを示すことに留意されたい。
【図７】細胞増殖に対するＨＡＳ抗体の効果を示す図である。
【図８】悪性の乳癌細胞においてＨＡＳ抗体の適用によるＨＡ産生の阻害を示す図である。
【図９】細胞形態に対するＨＡＳ抗血清の効果を示す写真図である。細胞株はＭＤＡ−ＭＢ−２３１で示される。それぞれの顕微鏡写真の倍率は４００倍である。
【図１０】ＤＡＰＩ染色を示す写真図である。（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、（Ｂ）ＭＤＡ−ＭＤ−４６８。備考：核の断片化は検出されなかった。
【図１１】（Ａ）ＨＡＳ抗血清による乳癌のインキュベーション後の細胞ペレットから抽出したＤＮＡを示す写真図である。ＤＮＡ断片は検出されなかった。（Ｂ）細胞質画分を示す細胞溶解物から抽出したＤＮＡを示す図である。断片化したＤＮＡは細胞質で検出されなかった。
【図１２】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８の図である。
【図１３】ＺＲＬ−７５−１及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５の図である。備考：ヒストグラムが灰色で塗りつぶしたプロットで示される場合、これはＨＡＳ抗体に対する反応性を示し、白色のプロットは対応する抗体対照を示す。プロットが黒線で示される場合、これらは二次ＦＩＴＣの対照のみから測定されるバックグラウンド蛍光を示す。緑色のプロットは、上記の乳癌細胞株に対するそれぞれのＨＡＳ抗体の反応性を示す。調べた４つの乳癌細胞株由来のＦＡＣＳデータによって、悪性状態のＥＸ−１及びＩＮＴ−２に対するエピトープが細胞外で発現されることが強く示唆される。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009531333.tif 000021
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