(57)【要約】  本発明は、被験体から得た生体サンプル、好ましくは、尿または血液サンプル中のＢｃｌ−２を検出することによって、被験体において、癌、例えば、初期または後期段階の卵巣癌を診断、予後診断およびモニタリングする方法に関する。Ｂｃｌ−２は、Ｂｃｌ−２タンパク質を検出もしくは結合する薬剤またはコーディング核酸を検出もしくは結合する薬剤、例えば、Ｂｃｌ−２タンパク質またはその一部と特異的に反応する抗体を用いて測定できる。本発明はさらに、本発明の方法を実施するためのキットに関する。本発明はさらに、体液中のＢｃｌ−２の迅速検出のための装置および体液中のＢｃｌ−２を迅速に測定するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において癌を検出する方法であって、被験体から得た生体サンプル中のＢｃｌ−２の存在を検出するステップを含み、所定の閾値を上回るＢｃｌ−２のレベルが被験体における癌を示すものである前記方法。
【請求項２】
前記検出ステップが、生体サンプルにおいてＢｃｌ−２タンパク質を検出するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出ステップが、生体サンプルにおいてＢｃｌ−２タンパク質をコードする核酸配列を検出するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記検出ステップが、
（ａ）生体サンプルを、Ｂｃｌ−２タンパク質と結合して複合体を形成する結合剤と接触させるステップと、
（ｂ）複合体を検出するステップと、検出された複合体を、サンプル中のＢｃｌ−２タンパク質の量と関連付けるステップと
を含み、高まったＢｃｌ−２タンパク質の存在が癌を示すものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
生体サンプルが、尿、全血、血清、血漿、腹水および腹膜液からなる群から選択される生体液である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
生体サンプルが尿である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
癌が、卵巣癌、原発性腹膜癌および子宮内膜癌からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
癌が卵巣癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
生体サンプルが、尿または血液であり、癌が卵巣癌である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
癌が、乳癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、メラノーマ、神経膠芽腫、肉腫、膀胱癌および頭頸部癌からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
生体サンプルが、尿または血液であり、癌が前立腺癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
結合剤が支持体上に固定されている、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
結合剤が、モノクローナルまたはポリクローナル抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
前記の（ｂ）の検出ステップが、結合剤上に標識を連結する、または組み込むステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記の（ｂ）の検出ステップが、ＥＬＩＳＡに基づく免疫酵素的検出を用いる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記のＢｃｌ−２の検出ステップの前に、間に、または後に、被験体から得られた同一生体サンプルまたは異なる生体サンプルにおいて、癌のバイオマーカーを検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
癌のバイオマーカーが、婦人科癌のバイオマーカーである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
バイオマーカーが、ＣＡ１２５、ＬＰＡまたはＯＶＸＩである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記被験体が癌を患っており、前記検出ステップを、癌の治療の前、間または後に、被験体のモニタリングの一環として、間隔を置いていくつかの時点で実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
生体サンプル中のＢｃｌ−２のレベルを、正常対照サンプル中に存在するＢｃｌ−２のレベルと比較するステップをさらに含み、正常対照サンプル中のレベルと比較して、生体サンプル中の高レベルのＢｃｌ−２が癌を示すものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出ステップが実施される時点で、被験体が癌の症状を示していない、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記検出ステップが実施される時点で、被験体が１以上の癌の症状を示している、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
被験体が、骨盤痛、異常な膣出血、腹部膨隆または腹部膨満、持続性背痛、持続性の胃の不調、排便または排尿パターンの変化、性交痛、１０ポンド以上の意図していない体重減少、外陰部または膣の異常、乳房の変化および疲労からなる群から選択される１以上の症状を示している、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記検出ステップの時点で、被験体の血中ＣＡ１２５レベルが上がっている、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記検出ステップの時点で、被験体の血中ＣＡ１２５レベルが上がっていない、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
癌を有するか、癌を有している疑いのある被験体の予後を評価する方法であって、ａ）被験体から得られた生体サンプル中のＢｃｌ−２のレベルを測定するステップと、ｂ）ステップ（ａ）で測定したレベルを、癌を有していない正常な被験体から得られた生体サンプル中に存在するとわかっているＢｃｌ−２の範囲と比較するステップと、ｃ）ステップ（ｂ）の比較に基づいて被験体の予後を決めるステップとを含み、ステップ（ａ）における高レベルのＢｃｌ−２が、攻撃的な癌の形態、ひいては、不良な予後を示すものである方法。
【請求項２７】
体液のサンプル中のＢｃｌ−２の迅速検出のための装置であって、体液のサンプルを受容するための適用ゾーンと、サンプル中のＢｃｌ−２と結合する結合剤を含有する標識ゾーンと、Ｂｃｌ−２が結合している結合剤がシグナルを与えるよう保持される検出ゾーンとを含み、閾値濃度よりも低いレベルのＢｃｌ−２を有する被験体から得たサンプルに与えられるシグナルが、閾値濃度よりも高いＢｃｌ−２レベルを有する患者から得たサンプルに与えられるシグナルとは異なるものである前記装置。
【請求項２８】
体液が尿であり、前記閾値濃度が０ｎｇ／ｍｌ〜２．０ｎｇ／ｍｌの間である、請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
体液が尿であり、前記閾値濃度が１．８ｎｇ／ｍｌである、請求項２７に記載の装置。
【請求項３０】
閾値濃度と等しいＢｃｌ−２レベルを有する被験体から得たサンプルに対して検出ゾーンにおいて与えられるシグナルと同一強度を有するシグナルを与える参照ゾーンを有する、請求項２７に記載の装置。
【請求項３１】
結合剤がタグを付けた抗体である、請求項２７に記載の装置。
【請求項３２】
抗体にコロイド金でタグが付いている、請求項３１に記載の装置。
【請求項３３】
検出ゾーンが、固定化された抗Ｂｃｌ−２抗体を含む、請求項２７に記載の装置。
【請求項３４】
検出ゾーンを通過する結合剤を保持する検出ゾーンの下流に対照ゾーンを有する、請求項２７に記載の装置。
【請求項３５】
対照ゾーンと参照ゾーンが同一ゾーンである、請求項２７に記載の装置。
【請求項３６】
結合剤がタグを付けたモノクローナル抗体である、請求項２７に記載の装置。
【請求項３７】
体液中のＢｃｌ−２を測定する方法であって、（ａ）被験体から体液のサンプルを得るステップと、（ｂ）サンプルを、サンプル中の任意のＢｃｌ−２と結合する結合剤と接触させるステップと、（ｃ）Ｂｃｌ−２が結合している結合剤を分離するステップと、（ｄ）（ｃ）からの分離された結合剤と関連するシグナルを検出するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）において検出されたシグナルを、閾値濃度と等しいＢｃｌ−２レベルを有する被験体から得たサンプルによって与えられるシグナルに対応する参照シグナルと比較するステップとを含む方法。
【請求項３８】
体液が尿であり、前記閾値濃度が０ｎｇ／ｍｌ〜２．０ｎｇ／ｍｌの間である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
体液が尿であり、前記閾値濃度が１．８ｎｇ／ｍｌの間である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
結合剤を用い、生体液を用いて癌を検出するための、Ｂｃｌ−２に特異的な結合剤と、印刷された説明書とを含む、生体サンプル中の癌を検出するためのキット。
【請求項４１】
生体サンプルに適用される１種以上のプロテアーゼ阻害剤をさらに含む、請求項４０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００６年２月９日に出願された米国仮出願出願番号第６０／７７１，６７７号の利益を主張し、任意の図、表、核酸配列、アミノ酸配列および図面を含めたその全文が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
癌マーカーとは、癌が存在する場合に、身体（通常、血中または尿中）において見られる物質である。それらは、癌またはその他の状態に応じた癌細胞自身または身体の産物であり得る。いくつかの理由のために、癌マーカー自体は、通常、特定のタイプの癌を診断するのに（または除外するのに）十分ではない。ほとんどの癌マーカーは、たとえ、少量であっても、癌細胞に加えて、正常な細胞によっても産生され得る。時には、非癌性疾患もまた、特定の癌マーカーのレベルを正常よりも高くさせる場合もある。さらに、癌を有するすべての人が高レベルの癌マーカーを有するとは限らない。これらの理由のために、ほとんどの医師によって、少量の癌マーカーしか、一般に用いられていない。医師が特定の癌マーカーのレベルを測定する場合には、通常、患者の病歴および理学的検査の結果、およびその他の研究室試験または画像検査とともに企図する。
【０００３】
スクリーニングとは、疾患の症状のない個体において癌を探すことを指すのに対し、早期発見は、広がっている可能性が低い（効果的に治療される可能性が高い）疾患の早期段階で癌を見つけることである。癌マーカーは、最初は、症状のない人において癌について検査するために研究され、開発されたが、このような方法で有益であるとわかっているマーカーはほとんどない。
【０００４】
卵巣癌の死亡率は、婦人科癌の中で最も高い。初期症状がないことおよび卵巣癌を検出するための確実なスクリーニング検査がないために、７０％を超える女性が、疾患が卵巣を超えて広がった後に診断される結果となっており、その結果、予後が不良であり、年間約１２，０００人の死亡が卵巣癌によるものである（５年生存率は３７％程度である）。現在のところ、医師による理学的骨盤内検査、超音波またはＣＡ１２５の血中濃度の測定が、卵巣癌の検出のために利用可能な唯一の標準法である。しかし、これらの方法のうち、卵巣癌を検出するための確実に一貫性があり、正確な方法を提供するものはない。例えば、８０％を超える卵巣癌の女性は、ＣＡ１２５の血中濃度が高いが、ＣＡ１２５の血中濃度は、初期段階の疾患を検出するには約５０％しか正確ではない。すべての卵巣癌を確実かつ正確に検出するための代替の、新規検査の開発が絶対に必要である。したがって、必要なものは、卵巣癌の、確実で、正確で、安全で、費用効率の高い検査という現在欠けている点を克服する技術である。さらに、必要なものは、その多くが現在は検出されないでいるすべての卵巣癌を正確に検出し、ならびに、卵巣癌の過程を通じて疾患の負担をモニターする技術である。
【０００５】
卵巣癌を診断するための正確で、安全で、簡便で、確実な検査は、米国および地理的無医地区を含めた世界中のすべての女性、特に、卵巣癌を発生する危険の高い女性に恩恵をもたらす。米国において毎年約２５，０００人の女性が、卵巣癌の診断を受けることを考えると、疾患の初期および後期段階両方において検出可能な卵巣癌のバイオマーカーは、卵巣癌の診断を裏付けるだけではなく、何千ものこれまでは診断されていない卵巣癌を検出する可能性もある。これは、疾患が卵巣に限局されている初期における卵巣癌の検出にとって特に重要であるが、現在は診断される卵巣癌の１０％未満にしかなっていない。こういった状況で、罹患卵巣の外科的デバルキングは患者の生存を９０％を超えるまでに高めており、医療費を減少させるものと期待される。各患者において疾患の過程を通じて卵巣癌を正確に検出およびモニターする能力は、最初の卵巣癌診断に役立つだけでなく、治療効力および／または再発疾患も示す。市販される、ＦＤＡによって承認されたＥＬＩＳＡに基づく検査の開発は、例えば、卵巣癌の臨床診断のゴールドスタンダードとなろう。
【０００６】
アポトーシスは、組織恒常性の正常な発達および維持のために必須の生物学的過程であるが、組織損傷、変性疾患、免疫学的疾患および癌を含めたいくつかの病的状態にも関与している(ロウ(Lowe)，Ｓ．Ｗ．およびリン(Lin)，Ａ．Ｗ．カルシノジェネシス(Carcinogenesis)、２０００年、２１:４８５〜４９５頁)。膜結合型死受容体によって活性化されたか（アシュケナージ(Ashkenazi)，Ａ．ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション(Journal of Clinical Investigation)、１９９９年、１０４：１５５〜１６２頁；ウォークザック(Walczak)，Ｈ、クラマー(Krammer)，Ｐ．Ｈ．エクスペリメンタル・セル・リサーチ(Experimental Cell Research)、２０００年、２５６：５８〜６６頁）またはその後のシトクロムｃ放出を伴うストレス誘導性ミトコンドリア撹乱によってであろうと（レフラー(Loeffler)，Ｍ．およびクレーマー(Kroemer)，Ｇ．エクスペリメンタル・セル・リサーチ(Experimental Cell Research)、２０００年、２５６：１９〜２６頁；ウェルニグ(Wernig)，Ｆ．およびスー(Xu)，Ｑ．プログレス・イン・バイオフィジックス・アンド・モレキュラー・バイオロジー(Progress in Biophysics and Molecular Biology)、２００２年、７８：１０５〜１３７頁；タカノ(Takano)，Ｔ．ら  アンチオキシド・レドックス・シグナル(Antioxid Redox Signal)、２００２年、４：５３３〜５４１頁）によって活性化されたにかかわらず、下流カスパーゼの活性化は、細胞骨格の破壊、ＤＮＡ複製および修復の停止、染色体ＤＮＡの分解、最後に、細胞のアポトーシス体への分解による段階的な細胞破壊につながる（ナガタ(Nagata)，Ｓ．エクスペリメンタル・セル・リサーチ(Experimental Cell Research)、２０００年、２５６：１２〜１８頁）。アポトーシスの重要な制御因子として、ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーが挙げられる（ファロウ(Farrow)，Ｓ．Ｎ．およびブラウン(Brown)，Ｒ．カレント・オピニオン・イン・ジェネティクス・アンド・ディベロップメント(Current Opinion in Genetics and Development)、１９９６年、６：４５〜４９頁）。
【０００７】
Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーは、アポトーシスカスケードの種々のレベルで作用してアポトーシスを調節する、アポトーシス促進性および抗アポトーシスタンパク質ファミリーメンバーの両方からなる。このｂｃｌ−２ファミリーメンバーは、少なくとも１つのＢｃｌ−２相同（ＢＨ）ドメインを含む(ファロー(Farrow)，Ｓ．Ｎ．およびブラウン(Brown)，Ｒ．カレント・オピニオン・イン・ジェネティクス・アンド・ディベロップメント(Current Opinion in Genetics and Development)１９９６年、６：４５〜４９頁）。すべてのｂｃｌ−２ファミリーメンバーが膜チャネル形成活性を示すが、Ｂｃｌ−２（原型ｂｃｌ−２ファミリーメンバー）チャネルは、そのＥＲおよびミトコンドリア膜だけへの局在のために陽イオン（Ｃａ＋＋）選択的であり（トメニウス(Thomenius)，Ｍ．Ｊ．およびディステルホースト(Distelhorst)，Ｃ．Ｗ．ジャーナル・オブ・セル・サイエンス(Journal of Cell Science)２００３年、１１６：４４９３〜４４９９頁）、Ｂｃｌ−２の抗アポトーシス機能は、ＥＲからのカルシウム放出を妨げるその能力、それに続くミトコンドリア膜撹乱とシトクロムｃ放出によって少なくとも部分的に媒介される。Ｂｃｌ−２は、卵巣癌を含む多数の腫瘍種において過剰発現されるので（シャルマ(Sharma)，Ｈ．ら  ヘッド・ネック(Head Neck)、２００４年、２６：７３３〜７４０頁;ハナオカ(Hanaoka)，Ｔ．ら  インターナショナル・ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー(International journal of Clinical Oncology)、２００２年、７：１５２〜１５８頁；トリシューグリオ(Trisciuoglio)，Ｄ．ら  ジャーナル・オブ・フィジオロジー(Journal of Physiology)、２００５年、２０５：４１４〜４２１頁；ハリーファ(Khalifeh)Ｉ．ら  インターナショナル・ジャーナル・オブ・ギネコロジカル・パソロジー(International Journal of Gynecological Pathology)、２００４年、２３：１６２〜１６９頁；オニール(O'Neill)，Ｃ．Ｊ．ら  アメリカン・ジャーナル・オブ・サージカル・パソロジー(アメリカン・ジャーナル・オブ・サージカル・パソロジー(American Journal of Surgical Pathology)、２００５年、２９：１０３４〜１０４１頁)、アポトーシス傷害に対してミトコンドリア膜を安定化することによる化学耐性の一因となっている。現在のところ、前臨床試験は、Ｂｃｌ−２を阻害するための物質、例えば、Ｇ３，１３９などのアンチセンスオリゴヌクレオチド（アッカーマン(Ackermann)，Ｅ．Ｊ．ら  ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)、１９９９年、２７４：１１２４５〜１１２５２頁）およびＢｃｌ−２の小分子阻害剤（リックライター(Lickliter)，Ｊ．Ｄ．ら  ローケミア(Leukemia)、２００３年、１７：２０７４〜２０８０頁）の開発に焦点を合わせている。このような研究は、治療介入のためにＢｃｌ−２を標的とするが、尿中Ｂｃｌ−２の定量はこれまでに文献で報告されていない。
【０００８】
卵巣癌などの癌を検出するための、安全な、感受性のある、特異的な、経済的な方法を提供する利用可能なアッセイを有することは有利であり、世界中の社会に恩恵をもたらす。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、癌スクリーニングに関する。Ｂｃｌ−２は、生殖器の癌などの癌の予後、診断およびモニタリングのためのバイオマーカーとなる。例えば、Ｂｃｌ−２は、早期段階および後期段階の卵巣癌を診断およびモニターするために使用できる。Ｂｃｌ−２は、術前および再発後の癌のバイオマーカーとして使用できる。Ｂｃｌ−２、およびＢｃｌ−２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと結合する物質を用いて、卵巣癌およびその他の生殖器の癌または非生殖器の癌を検出およびモニターできる。
【００１０】
したがって、より詳しくは、本発明は、尿、血液（例えば、全血、血清または血漿)および腹水などの生体サンプル中の上昇したＢｃｌ−２レベルのスクリーニングによる癌の検出に関する。一実施形態では、癌は卵巣癌である。もう１つの実施形態では、癌は、乳癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、メラノーマ、神経膠芽腫、肉腫、膀胱癌および頭頸部癌からなる群から選択されるタイプである。本方法は、場合により、被験体が検出される癌を患っていることを確認すること（例えば、１種以上の癌の症状の存在を評価すること、さらなる癌マーカーを検出すること、画像診断法、例えば、Ｘ線、ＣＴ、核画像（ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴ）、超音波、ＭＲＩによって癌の存在を検出すること）および／または被験体を、検出された癌について治療すること（例えば、手術、化学療法および／または放射線照射によって）をさらに含む。
【００１１】
本発明はまた、本発明の方法を実施するためのキットに関する。
【００１２】
もう１つの態様では、本発明は、血液または尿などの体液中のＢｃｌ−２の迅速な検出のための装置に関する。装置は側方流動装置であることが好ましい。一実施形態では、本装置は、血液または尿などの体液のサンプルを受容するための適用ゾーンと、サンプル中のＢｃｌ−２と結合する結合剤を含有する標識ゾーンと、Ｂｃｌ−２が結合している結合剤がシグナルを与えるよう保持される検出ゾーンとを含み、閾値濃度よりも低いレベルのＢｃｌ−２を有する被験体から得たサンプルに与えられるシグナルが、閾値濃度と等しいか、閾値濃度よりも高いＢｃｌ−２レベルを有する患者から得たサンプルに与えられるシグナルとは異なる。
【００１３】
もう１つの態様では、本発明は、家庭で、診察室において、または患者のベッドサイドで被験体によって使用できる、現在利用可能な家庭内での妊娠検査と同様の、血液または尿などの体液中のＢｃｌ−２のための、簡便で、迅速で、確実で、正確で、費用効率の高い検査に関する。
【００１４】
一実施形態では、本検査は、（ａ）被験体から血液または尿などの体液のサンプルを得ることと、（ｂ）サンプルを、サンプル中の任意のＢｃｌ−２と結合する結合剤と接触させることと、（ｃ）Ｂｃｌ−２が結合している結合剤を分離することと、（ｄ）（ｃ）からの分離された結合剤と関連するシグナルを検出することと、（ｅ）ステップ（ｄ）において検出されたシグナルを、閾値濃度と等しいＢｃｌ−２レベルを有する被験体から得たサンプルによって与えられるシグナルに対応する参照シグナルと比較することとを含む、体液中のＢｃｌ−２を測定する方法である。一実施形態では、体液は尿であり、閾値濃度は、０ｎｇ／ｍｌ〜２．０ｎｇ／ｍｌの間である。もう１つの実施形態では、体液は尿であり、閾値濃度は１．８ｎｇ／ｍｌである。
【００１５】
卵巣癌を検出するために、Ｂｃｌ−２の尿中レベルを使用できるかどうかを評価するために、正常な、健常なボランティアから、卵巣癌の患者から尿を集め、ＥＬＩＳＡによってＢｃｌ−２について測定した。癌患者の尿中のＢｃｌ−２の平均量は、通常、健常な対照より少なくとも１０×高い。さらに、良性の婦人科疾患（例えば、奇形腫、卵巣嚢胞、平滑筋腫、多嚢胞卵巣疾患、腺線維腫または嚢胞腺腫）を有する３５人の女性から集めた尿サンプルのうち、Ｂｃｌ−２レベルが、正常な、健常なボランティアにおいて見られるものを上回るものはなかった。デバルキング手術後の卵巣癌患者では、Ｂｃｌ−２の尿中レベルは最大１００％低下した。卵巣癌と関連している尿中Ｂｃｌ−２の上昇についての感度および特異性は、ほぼ１００％であったのに対し、ＣＡ１２５＞３５Ｕ／ｍｌの血中濃度では卵巣癌患者の６８％しか同定されなかった。臨床パラメータの比較によって、Ｂｃｌ−２の尿中レベルは、腫瘍のステージおよびグレードとよく相関するということが示された。しかし、Ｂｃｌ−２の尿中レベルは、患者の年齢または腫瘍の大きさとは関連していなかった。したがって、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイによる尿中Ｂｃｌ−２の定量化は、卵巣癌を検出するための、疾患の過程を通じて卵巣癌をモニターするための、治療結果および予後結果を予測するための、安全で、感度の高い、特異的で、経済的な方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
Ｂｃｌ−２は、卵巣癌などの癌の有効な分子マーカーである。癌マーカー（腫瘍マーカーとも呼ばれる）は、癌と関連しており、その測定または同定が患者の診断または臨床管理において有用である、身体において見られるホルモン、酵素および免疫グロブリンなどの分子である。それらは、癌細胞自身の産物である場合もあるし、癌またはその他の状態に応じた身体の産物である場合もある。ほとんどの癌マーカーは、タンパク質である。いくつかの癌マーカーは単一のタイプの癌においてのみ見られるが、その他のものは数タイプの癌において検出され得る。Ｂｃｌ−２は、その他の癌マーカーと同様に、癌の存在についての健常な集団またはハイリスク集団のスクリーニング、癌または卵巣癌などの特定のタイプの癌の診断を行うこと、被験体の予後を決めること、および寛解における、または手術、放射線照射、化学療法もしくはその他の癌治療を受けている間の被験体の経過をモニターすることなどの種々の目的で使用できる。
【００１７】
Ｂｃｌ−２の尿中レベルを用いて、卵巣癌を検出できるかどうかを評価するために、正常な健常なボランティア（Ｎ＝２１）から、ならびに卵巣癌（Ｎ＝３４）および原発性腹膜癌（Ｎ＝２）の患者から尿を採取し、Ｂｃｌ−２について市販のＥＬＩＳＡキット（ＢｅｎｄｅｒＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＢＭＳ２４４／３）を用い、製造業者の使用説明書に従って３連で測定した。結果は、平均ｎｇ／ｍｌ  Ｂｃｌ−２±Ｓ．Ｅ．として表した。健常なボランティアの尿中のＢｃｌ−２の平均量は０．２０４ｎｇ／ｍｌであったのに対し、手術前の癌患者から得たものは平均して３．１２ｎｇ／ｍｌであり、概して、正常な対照において見られるものよりも少なくとも１０×高かった。スチューデントのｔ検定分析によって、ｐ＜０．００００１で正常および癌試料間に統計的差異が示された。臨床パラメータの比較によって、Ｂｃｌ−２の尿中レベルが腫瘍のステージおよびグレードとよく相関していることが示された（図３Ａおよび３Ｂ）。
【００１８】
上記のこれらの同一の個体の何人かから得た血漿サンプルを、ＣＡ１２５レベルについて市販のＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏ−Ｑｕａｎｔ、カタログ番号ＢＱ１０１３Ｔ）によって、製造業者の使用説明書に従って３連で調べた。卵巣癌検出と関連している尿中Ｂｃｌ−２の上昇の感度および特異性は、ほぼ１００％であったのに対し、ＣＡ１２５＞３５Ｕ／ｍｌという血中濃度、卵巣癌検出のための現在の基準は、卵巣癌患者の６８％しか正しく同定しなかった。
【００１９】
卵巣癌を検出するための尿中Ｂｃｌ−２のレベルの精度をさらに試験するために、尿中Ｂｃｌ−２のレベルを、最初のデバルキング手術（すべての目に見える腫瘍の除去）の直前およびその後２週間以内の入手可能な卵巣癌患者におけるもので比較した。最初の手術の前後に尿サンプルを採取した７人の患者について、Ｂｃｌ−２レベルが腫瘍の外科的除去後に最大１００％低下した。その結果、これらのデータは、腫瘍は、卵巣癌の患者の尿において上昇が見られたＢｃｌ−２の供給源であるということを示唆する。さらに、最初の手術の後７〜１１ヶ月の範囲のその後のフォローアップ臨床外来で、これら７人の患者のうち５人から尿サンプルを採取し、Ｂｃｌ−２について測定した。３人のフォローアップ患者（４１、４３、５４番）では、尿中Ｂｃｌ−２レベルは低いままであり、２人の患者（５、２７番）では上昇した。予備カルテ審査は、患者４１、４３および５４番は、フォローアップ外来時に化学療法を受けていることおよび彼女らの卵巣癌疾患は制御下にあることを示した。対照的に、カルテ審査は、患者５、２７番は再発疾患を有していたことおよび患者２７番はさらなる腫瘍デバルキング手術を受けたことを示す。臨床情報と一致して、化学療法を受けており、明らかな残留病変を有さないか、または最小の残留病変しか有さない患者（４１、４３、５４番）では、尿中Ｂｃｌ−２レベルは減少したままであった。同様に、尿中Ｂｃｌ−２レベルの上昇は、再発疾患の存在と相関し（５、２７番）、その後の疾患デバルキングで減少した（２７ｃ番）。
【００２０】
総合すると、これらのデータは、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイによる尿中Ｂｃｌ−２の定量化は、卵巣癌の検出のための新規の、安全な、感度の高い、特異的な、経済的な方法を提供するようであるということを示す。さらに、Ｂｃｌ−２の尿中レベルを用いて、疾患の過程を通じて卵巣癌の存在をモニターでき、治療結果および予後結果を予測できる。
【００２１】
一態様では、本発明は、尿、血液、腹膜水または腹水などの被験体から得た生体サンプル中のＢｃｌ−２の存在を検出することを含み、所定の閾値を上回るＢｃｌ−２のレベルが被験体中の癌を示す、被験体において癌を検出する方法を含む。検出は、定量的スロット−ブロットアッセイ（例えば、ＢｉｏＲａｄから市販されているもの）によって行われないことが好ましい。
【００２２】
本発明の方法、装置およびキットを用いて検出および／またはモニタリングする癌として、それだけには限らないが、乳癌（例えば、浸潤性（侵襲性）、前浸潤性、炎症性、パジェット病、転移性または再発性）；胃腸癌／消化器癌（例えば、虫垂、胆管、結腸、食道、胆嚢、胃(gastric)、腸、肝臓、膵臓、腎臓および胃(stomach)）；泌尿生殖器癌(genitourinary cancer)／泌尿生殖器癌(urinal cancer)癌（例えば、副腎、膀胱、腎臓癌、陰茎、前立腺、睾丸および泌尿器）；婦人科癌（例えば、子宮頸部、子宮内膜、卵管、卵巣、子宮、膣および外陰部）；頭頸部癌（例えば、眼、頭頸部、下顎、咽頭、鼻腔、口腔癌、咽頭、唾液腺、副鼻腔、咽喉、甲状腺、舌および扁桃）；血液癌(hematological cancer)／血液癌(blood cancer)（例えば、ホジキン病、白血病（急性リンパ性白血病、急性顆粒球白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病）、多発性骨髄腫、リンパ腫およびリンパ節）；筋骨格の癌／軟部組織癌（例えば、骨、骨肉腫、メラノーマ、皮膚（基底細胞、扁平細胞）、肉腫（ユーイング肉腫、カポジ肉腫））；神経系の癌（例えば、脳（星状細胞腫、神経膠芽腫、グリオーマ）、下垂体、脊髄））；および呼吸器の癌／肺癌（例えば、肺、（腺癌、燕麦細胞、非小細胞、小細胞、扁平細胞）および中皮腫）が挙げられる。一実施形態では、癌は、卵巣癌である。もう１つの実施形態では、癌は、乳癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、メラノーマ、神経膠芽腫、肉腫、膀胱癌および頭頸部癌からなる群から選択されるタイプである。
【００２３】
本発明の方法の一実施形態では、検出は、（ａ）生体サンプルを、Ｂｃｌ−２タンパク質と結合して複合体を形成する結合剤と接触させることと、（ｂ）複合体を検出することと、検出された複合体を、サンプル中のＢｃｌ−２タンパク質の量と関連付けることとを含み、高まったＢｃｌ−２タンパク質の存在が癌を示す。特定の実施形態では、（ｂ）の検出は、薬剤上に標識を連結または組み込むことまたはＥＬＩＳＡに基づく免疫酵素的検出を用いることをさらに含む。
【００２４】
場合により、本発明の方法は、前記のＢｃｌ−２の検出の前に、間に、または後に、被験体から得られた同一生体サンプルまたは異なる生体サンプルにおいて、癌のバイオマーカーを検出することをさらに含む。一実施形態では、癌のバイオマーカーは、生殖器系の癌、例えば、婦人科癌のバイオマーカーである。もう１つの実施形態では、バイオマーカーは、ＣＡ１２５またはＯＶＸＩである。被験体は、Ｂｃｌ−２の検出が実施される時点で、血中ＣＡ１２５レベルが上がっている場合もあるし、Ｂｃｌ−２の検出が実施される時点で、血中ＣＡ１２５レベルが上がっていない場合もある。
【００２５】
いくつかの実施形態では、被験体は卵巣癌などの癌を患っており、検出を癌の治療の前、間または後に、被験体のモニタリングの一環として、間隔を置いていくつかの時点で実施する。
【００２６】
場合により、本発明の方法は、生体サンプル中のＢｃｌ−２のレベルを、正常対照サンプル中に存在するＢｃｌ−２のレベルと比較することをさらに含み、正常対照サンプル中のレベルと比較して、生体サンプル中の高レベルのＢｃｌ−２が卵巣癌などの癌を示す。
【００２７】
いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２の検出が実施される時点で、被験体は癌の症状を示さない。その他の実施形態では、Ｂｃｌ−２の検出が実施される時点で、被験体は１以上の癌の症状を示す。例えば、婦人科癌（例えば、卵巣癌)に関しては、１以上の婦人科癌の症状として、骨盤痛、異常な膣出血、腹部の膨隆または腹部膨満、持続性背痛、持続性の胃の不調、排便または排尿パターンの変化（例えば、便秘、下痢、血便、ガス、薄い便、排尿回数または尿意切迫、便秘)、性交痛、１０ポンド以上の意図していない体重減少、外陰部または膣の異常（例えば、水疱、皮膚の色の変化または分泌）、乳房の変化（例えば、塊、ひりひりする痛み、乳頭分泌、くぼみ、発赤または腫大)および疲労からなる群から選択されるものが挙げられる。
【００２８】
もう１つの実施形態では、本発明は、ａ）被験体から得られた尿、血液または腹水などの生体サンプル中のＢｃｌ−２のレベルを測定することと、ｂ）ステップ（ａ）で測定したレベルを、癌を有していない正常な被験体から得られた生体サンプル中に存在するとわかっているＢｃｌ−２の範囲と比較することと、ｃ）ステップ（ｂ）の比較に基づいて被験体の予後を決めることとを含み、ステップ（ａ）における高レベルのＢｃｌ−２が、攻撃的な癌の形態、ひいては、不良な予後を示す、癌を有するか、癌を有している疑いのある被験体の予後を評価する方法を含む。
【００２９】
用語「検出」または「検出する」とは、標的Ｂｃｌ−２（Ｂｃｌ−２をコードする核酸配列またはＢｃｌ−２遺伝子産物（ポリペプチド））そのサブユニット、標的と結合している薬剤の組合せなどの有無をアッセイすること、そうでなければ確立すること、あるいは、婦人科癌、転移、ステージもしくは類似の状態の１以上の実際の特徴についてアッセイすること、調べること、確認すること、確立すること、そうでなければ決定することを含む。この用語は、Ｂｃｌ−２およびその他の癌バイオマーカーの診断適用、予後適用およびモニタリング適用を包含する。この用語は、定量的、半定量的および定性的検出方法を包含する。Ｂｃｌ−２タンパク質の検出を含む本発明の実施形態では（Ｂｃｌ−２タンパク質をコードする核酸分子とは対照的に）、検出方法はＥＬＩＳＡに基づく方法であることが好ましい。本発明の種々の実施形態では、検出方法は、被験体から得たサンプル中のＢｃｌ−２の存在、不在または量に関する情報を含むアウトプット（すなわち、読み出しまたはシグナル）を提供することが好ましい。例えば、アウトプットは、定性的（例えば、「陽性」もしくは「陰性」）または定量的（例えば、１ミリリットルあたりのナノグラムなどの濃度）であり得る。
【００３０】
一実施形態では、本発明は、（ａ）生体サンプルを、検出可能な物質で直接または間接的に標識されているＢｃｌ−２に特異的な抗体と接触させること（反応させること）と、（ｂ）検出可能な物質を検出することと含む、被験体から得た尿などの生体サンプル中のＢｃｌ−２タンパク質またはコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を定量することによって被験体において癌を検出する方法に関する。
【００３１】
一実施形態では、本発明は、（ａ）生体サンプルを、検出可能な物質で直接または間接的に標識されているＢｃｌ−２に特異的な抗体と反応させることと、（ｂ）検出可能な物質を検出することとを含む、被験体から得た尿または血液などの生体サンプル中のＢｃｌ−２を定量することによって、被験体において癌を診断および／またはモニタリングする方法に関する。
【００３２】
本発明の方法の実施形態は、（ａ）被験体から得た生体サンプルを、酵素で直接または間接的に標識されているＢｃｌ−２に特異的な抗体と接触させることと、（ｂ）酵素の基質を加えることとを含み、ここで、基質は、基質または酵素と基質の反応生成物が蛍光複合体を形成するよう選択され、（ｃ）蛍光複合体の蛍光を測定することによってサンプル中のＢｃｌ−２を定量することと、（ｄ）定量されたレベルを、標準のものと比較することとを含む。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態は、以下のステップを含む：
（ａ）生体サンプルを、検出可能な物質で直接または間接的に標識されているＢｃｌ−２に特異的な一次抗体および固定されているＢｃｌ−２に特異的な二次抗体とともにインキュベートすることと、
（ｂ）一次抗体を二次抗体と分離して、一次抗体相および二次抗体相を提供することと、
（ｃ）一次または二次抗体相中の検出可能な物質を検出し、それによって生体サンプル中のＢｃｌ−２を定量することと、
（ｄ）定量されたＢｃｌ−２を標準と比較すること。
【００３４】
本発明の方法に用いられる標準は、健常な対照被験体から得た、良性の疾患（例えば、良性の婦人科疾患）の被験体、初期の婦人科癌の被験体から得たサンプルについて得られた、またはその他の被験体のサンプルから得たＢｃｌ−２レベルに対応し得る。標準と比較したＢｃｌ−２レベルの上昇は、初期または後期の卵巣癌などの癌を示し得る。
【００３５】
本発明はまた、本明細書に記載される方法、装置およびキットを、１種以上のさらなる癌のマーカー（「バイオマーカー」）とともに用いることを企図する。したがって、本発明は、生体サンプルを、Ｂｃｌ−２の存在について分析し、同一サンプルまたは同一被験体に由来する別の生体サンプルを、癌の特異的指標であるその他のマーカーについて分析する方法を企図する。１種以上のさらなるマーカーは、Ｂｃｌ−２の検出が実施される前、その間、および／または後に検出できる。マーカーの例として、ＣＡ１２５、ＬＰＡおよびＯＶＸＩが挙げられる。好ましい実施形態では、マーカーはＢｃｌ−２およびＣＡ１２５である。本明細書に記載される方法、装置およびキットは、さらなるマーカーまたはマーカーをコードする核酸を検出するための薬剤を含めることによって改変できる。
【００３６】
本発明とともに使用できる癌マーカーとして、それだけには限らないが、例えば、膵臓、腎臓、卵巣、子宮頸部、および睾丸の癌についてのαフェトプロテイン（ＡＦＰ）；例えば、肺、膵臓、腎臓、乳房、子宮、肝臓、胃および結腸直腸の癌についての発癌性胚抗原（ＣＥＡ）；例えば、肺、膵臓、乳房、卵巣および肝臓の癌についての糖鎖抗原１５−３（ＣＡ１５−３）；例えば、肺、卵巣、子宮、肝臓、胃、結腸直腸および胆管の癌についての糖鎖抗原１９−９（ＣＡ１９−９）；例えば、肺、膵臓、乳房、卵巣、子宮頸部、子宮、肝臓、胃および結腸直腸の癌についての癌抗原１２５（ＣＡ１２５）；前立腺癌についての遊離前立腺特異的抗原および前立腺特異的抗原−α（１）（ＰＳＡ）；前立腺および結腸直腸の癌についての遊離前立腺特異的抗原（ＰＳＡＦ）；前立腺癌についての前立腺特異的抗原−α（１）抗キモトリプシン複合体（ＰＳＡＣ）；前立腺癌についての前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；甲状腺癌またはウィルムス腫瘍についてのヒトチログロブリン（ｈＴＧ）；例えば、肺、膵臓、腎臓、卵巣、子宮、睾丸、肝臓、結腸直腸、膀胱および脳の癌についてのヒト絨毛性ゴナドトロピンβ（ｈＣＧｂ）；例えば、肺癌、睾丸癌、咽頭の癌、バーキットリンパ腫、神経芽細胞腫および白血病についてのフェリチン（Ｆｅｒｒ）；肺癌、甲状腺癌、ウィルムス腫瘍および神経芽細胞腫についてのニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）；腎臓癌および多発性骨髄腫についてのインターロイキン２（ＩＬ−２）；腎臓癌、乳癌、卵巣癌および多発性骨髄腫についてのインターロイキン６（ＩＬ−６）；腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、白血病、多発性骨髄腫およびリンパ腫についてのβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）；ならびに前立腺癌についてのα２ミクログロブリン（Ａ２Ｍ）が挙げられる。前記の癌マーカーが診断的および／または予後徴候的である生体サンプル（例えば、血液または尿）の選択は、当業者によって容易に決定することができる。
【００３７】
上記のように、本発明は、被験体から得た生体サンプル中のＢｃｌ−２を検出することによる、被験体におけるモニタリング、診断のためのまたは卵巣癌などの癌の予後診断のための方法を提供する。一実施形態では、本方法は、サンプルを、検出可能な物質で直接または間接的に標識されているＢｃｌ−２に特異的な抗体と接触させることと、検出可能な物質を検出することとを含む。
【００３８】
本発明の方法は、非疾患状態と比較して上回るか、もしくは下回るＢｃｌ−２の存在量または疾患状態（例えば、卵巣癌）または疾患状態への進行に相関する改変された（例えば、全長未満）Ｂｃｌ−２の存在、のいずれかの検出のために使用できる。本明細書に記載された方法を用いて、悪性または前癌状態の細胞の存在の可能性を評価できる。このような方法を用いて、腫瘍を検出でき、その増殖を定量でき、また婦人科癌の診断および予後診断に役立ち得る。本方法を用いて癌転移の存在を検出でき、ならびに手術、癌化学療法および／または放射線療法後にすべての腫瘍組織の不在または除去を確認できる。それらはさらに、癌化学療法および腫瘍再出現をモニターするために使用できる。
【００３９】
本発明の方法は、初期の卵巣癌（例えば、被験体が無症候である時）の診断において、また、卵巣癌疾患の進行および死亡の予後診断にとって特に有用である。本明細書に示されるように、標準（例えば、正常なまたは良性の障害のレベル）に対する、サンプル（例えば、尿、血清、血漿、全血、腹水）において検出されたＢｃｌ−２レベルの上昇は、進行した疾患ステージ、漿液性組織学的タイプ、不十分なデバルキング、大きな残存腫瘍および／または疾患進行および死亡の危険の増大を示す。
【００４０】
用語「サンプル」、「生体サンプル」などは、Ｂｃｌ−２を発現するか含有することがわかっているか、疑われる材料のタイプ、例えば、尿を指す。試験サンプルは、供給源から得られたとおり直接用いてもよいし、サンプルの特徴を改変するための前処理後に用いてもよい。サンプルは任意の生物学的起源に由来するもの、例えば、組織または抽出物、例えば、細胞（例えば、腫瘍細胞）および例えば、全血、血漿、血清、腹膜水、腹水などといった生理液であり得る。サンプルは、動物、好ましくは、哺乳類、最も好ましくは、ヒトから得たものであり得る。サンプルを任意の方法で前処理し、かつ／またはアッセイを妨げない任意の便宜な媒体中に調製してもよい。サンプルを処理し、その後、使用してもよい。例えば、血液から血漿を調製し、粘性液を希釈し、尿などのサンプルに１種以上のプロテアーゼ阻害剤（例えば、４−（２アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオリド、ＥＤＴＡ、ロイペプチンおよび／またはペプスタチン）などを適用する。サンプル処理は、濾過、蒸留、抽出、濃縮、干渉成分の不活化、試薬の添加などを含み得る。
【００４１】
ｂｃｌ−２の存在は、種々の生体サンプル、例えば、組織またはその抽出物において検出できる。Ｂｃｌ−２は、ヒト尿において検出されることが好ましい。
【００４２】
本発明の実施形態では、本明細書に記載される方法は、被験体から得た生体サンプル中のＢｃｌ−２を定量することによって、婦人科癌を診断およびモニタリングするのに適している。試験されている被験体から得たサンプルにおいて定量されたＢｃｌ−２の量を、別のサンプルまたは被験体から得た以前のサンプルについて定量されたレベル、または対照サンプルについて定量されたレベルと比較することが好ましい。健常な被験体から得た対照サンプルのレベルは、前向きおよび／または後向き統計的研究によって確立できる。統計的研究のために、臨床上明らかな疾患または異常のない健常な被験体を選択できる。診断は、対照サンプルまたは同一被験体について定量された以前のレベルと比較して統計上異なるレベルのＢｃｌ−２を見い出すことによって行うことができる。
【００４３】
用語「Ｂｃｌ−２」とは、ヒトＢ細胞リンパ腫タンパク質２（Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２としても知られる）、リンパ球などのいくつかの細胞のアポトーシス死を妨げるミトコンドリア外内在性タンパク質（integral outer mitochondrial protein）を指す(参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、クリアリー(Cleary)Ｍ．Ｌ．ら、セル(Cell)、１９８６年、４７（１）：１９〜２８頁；ツジモト(Tsujimoto)Ｙ．およびクローチェ(Croce)Ｃ．Ｍ．、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America)１９８６年、８３：５２１４〜５２１８頁）。用語「Ｂｃｌ−２」は、Ｂｃｌ−２遺伝子産物（ポリペプチド）をコードする核酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１４７４５；配列番号１）ならびにＢｃｌ−２ポリペプチド（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ３５５９１；配列番号２）を含む。この用語は、ＧｅｎＢａｎ受託番号Ｍ１４７４５およびＡＡＡ３５５９１というヒトＢｃｌ−２の、すべての相同体、天然に存在する対立遺伝子変異体、アイソフォームおよび前駆体を含む。通常、ヒトＢｃｌ−２の天然に存在する対立遺伝子変異体は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１４７４５およびＡＡＡ３５５９１に示される配列と相当な配列相同性（７０〜９０％）を共有する。対立遺伝子変異体は、Ｂｃｌ−２配列からの保存的アミノ酸の置換を含む場合もあり、Ｂｃｌ−２相同体中の対応する位置に由来するアミノ酸置換を含む。選択的スプライシングによって生じる、２種の転写変異体、αおよびβは、Ｃ末端が異なる。α変異体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００６２４（配列番号４）およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００６３３（配列番号３））は、より長い転写物に相当し、より長いアイソフォーム（α）をコードし、βはより短い（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００６４８（配列番号６）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００６５７（配列番号５）。β変異体は、Ｃ末端の他に、α変異体と比較して、３'ＵＴＲおよびコード領域が異なる。特定の実施形態では、本発明の方法、装置およびキットは、Ｂｃｌ−２（例えば、配列番号１、２、３、４、５および／または６）に特異的であるが、「Ｂｃｌ−２様」分子として当技術分野において知られる核酸分子またはポリペプチド、例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、２００２年８月８日に公表された、ルーベン(Ruben)ら、米国特許出願公開２００２／０１０６７３１  Ａ１に記載されるものには特異的ではない（例えば、Ｂｃｌ−２に特異的な（例えば、免疫反応性の）結合剤を用いても、Ｂｃｌ−２様分子とは反応しない。
【００４４】
用語「被験体」および「患者」は、本明細書では同義的に用いられ、癌に苦しむ可能性のある温血動物、例えば、哺乳類を指す。いくつかの癌では、被験体はヒト女性または非ヒト哺乳類の雌である。その他の癌では、被験体はヒト男性または非ヒト哺乳類の雄である。
【００４５】
被験体の生体サンプル中のＢｃｌ−２を検出できる薬剤とは、Ｂｃｌ−２ポリペプチドまたはＢｃｌ−２をコードする核酸分子と相互作用または結合するものである。このような薬剤（本明細書では結合剤とも呼ばれる）の例として、それだけには限らないが、Ｂｃｌ−２と結合するＢｃｌ−２抗体またはその断片、Ｂｃｌ−２結合パートナーおよびＢｃｌ−２ポリペプチドをコードする核酸分子とハイブリダイズする核酸分子が挙げられる。結合剤は、検出可能な物質（例えば、検出可能な部分）で標識されていることが好ましい。結合剤は、それ自体が、標識として機能してもよい。
【００４６】
Ｂｃｌ−２抗体
本発明の方法において用いられるＢｃｌ−２に特異的な抗体は、科学的供給源または市販の供給源から得ることができる。あるいは、単離された天然Ｂｃｌ−２または組換えＢｃｌ−２を利用して、抗体、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、および免疫学的に活性な断片（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２断片）、抗体重鎖、抗体軽鎖、ヒト化抗体、遺伝子操作された一本鎖Ｆｖ分子（ラドン(Ladne)ら、米国特許第４，９４６，７７８号）またはキメラ抗体、例えば、マウス抗体の結合特異性を含むが、残存する部分はヒト起源である抗体を調製できる。抗体、例えば、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、断片およびキメラは、当業者に公知の方法を用いて調製できる。好ましくは、本発明の方法に用いられる抗体は、１０７Ｍ以上のＫａで結合する場合に、Ｂｃｌ−２に対して反応性である。本発明のサンドイッチイムノアッセイでは、マウスポリクローナル抗体およびウサギポリクローナル抗体を用いる。
【００４７】
モノクローナル抗体を作製するために、宿主哺乳類にＢｃｌ−２タンパク質またはペプチドを接種し、次いで、ブーストする。最後のブースト後、数日で接種された哺乳類から脾臓を採取する。ケーラー(kohler)およびミルスタイン(Milstein)（ネイチャー(Nature)、１９７５年、２５６：４９５〜４９７頁）によって記載される一般的な方法に従って、脾臓由来の細胞懸濁液を、腫瘍細胞と融合する。有用であるには、ペプチド断片は、検出されるＢｃｌ−２分子のエピトープを規定するのに十分なアミノ酸残基を含まなくてはならない。
【００４８】
断片が、免疫原性であるには短すぎる場合には、担体分子とコンジュゲートさせてもよい。いくつかの適した担体分子として、キーホールリンペットヘモシアニンおよびウシ血清アルブミンが挙げられる。コンジュゲーションは、当技術分野で公知の方法によって実施できる。１つのこのような方法として、断片のシステイン残基と担体分子上のシステイン残基を組み合わせることがある。ペプチド断片は、当技術分野で公知の方法によって合成できる。いくつかの適した方法が、スチュアート(Stuart)およびヤング(Young)によって、「ソリッド・フェーズ・ペプチド・シンセシズ(Solid Phase Peptide Synthesis)」、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８４）に記載されている。
【００４９】
抗体または断片の精製は、当業者に公知の種々の方法、例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムによる沈殿と、それに続く生理食塩水に対する透析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーまたはイムノアフィニティークロマトグラフィーならびにゲル濾過、ゾーン電気泳動などによって達成できる(モノクローナル・アンチボディーズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice)、第２版、１０４〜１２６頁、Ｏｒｌａｎｄ、Ｆｌａ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ中、ゴディング(Goding))。婦人科癌患者または危険にあるものの体液における、好ましくは、卵巣癌患者の尿または血液におけるＢｃｌ−２の検出には、精製された抗体またはＢｃｌ−２結合領域の少なくとも一部を有する精製された抗体の断片、例えば、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ断片を用いることが好ましい（ハーロー(Harlow)およびレーン(Lane)、１９８８年、アンチボディー・コールド・スプリング・ハーバー(Antibody Cold Spring Harbor)）。
【００５０】
癌の検出および／またはモニタリングにおいて使用するために、精製された抗体は、Ｂｃｌ−２の存在の検出を可能にするためのレポーター基として働く化合物と直接的にまたはリンカーを介してのいずれかで共有結合させることができる。それだけには限らないが、酵素、色素、放射性金属および非金属同位元素、蛍光性化合物、蛍光化合物などをはじめとする種々の異なる種類の物質がレポーター基として働き得る。検出、モニタリングに有用な、本発明の抗体（またはその断片）の抗体コンジュゲートを調製する方法は、米国特許第４，６７１，９５８号、同４，７４１，９００号および同４，８６７，９７３号に記載されている。
【００５１】
本発明の一態様では、好ましい結合エピトープは、公知のＢｃｌ−２遺伝子配列およびそのコードされるアミノ酸配列から同定でき、高い結合親和性を有するＢｃｌ−２抗体を作製するために使用できる。また、Ｂｃｌ−２上の結合エピトープの同定は、好ましい抗体の設計および構築において使用できる。例えば、Ｂｃｌ−２上の好ましいエピトープをコードするＤＮＡを、そのエピトープと選択的に結合する抗体を選択するために、組換えによって発現させ、用いることができる。次いで、選択された抗体を、抗体の、Ｂｃｌ−２上の特異的結合エピトープとの特異的結合を可能にするのに十分な条件下でサンプルに曝露し、次いで、形成された複合体の量を検出する。特異的抗体法は、十分に理解されており、文献に記載されている。それらの調製についてのより詳細な説明は、例えば、プラクティカル・イムノロジー(Practical Immunology)、ブット(Butt)Ｗ．Ｒ．編、マーセル・デッカー(Marcel Dekker)、ニューヨーク、１９８４年に見ることができる。
【００５２】
本発明はまた、Ｂｃｌ−２抗体の検出を企図する。Ｂｃｌ−２は婦人科癌特異的マーカーである。したがって、被験体の生体液中のＢｃｌ−２抗体の検出は、婦人科癌の診断を可能にし得る。
【００５３】
タンパク質結合アッセイ
Ｂｃｌ−２と特異的に反応する抗体、または誘導体、例えば、酵素コンジュゲートまたは標識誘導体を用いて、種々の生体サンプル中のＢｃｌ−２を検出できる。例えば、タンパク質の抗原決定基間と抗体の間の結合相互作用に頼る任意の公知のイムノアッセイにおいてそれらを用いることができる。このようなアッセイの例として、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光、免疫沈降、ラテックス凝集、血球凝集および組織化学的検査がある。
【００５４】
Ｂｃｌ−２に特異的な抗体は、検出可能な物質で標識し、検出可能な物質の存在に基づいて生体サンプル中の位置を特定できる。検出可能な物質の例として、それだけには限らないが、以下の同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、ルミノールなどの発光標識、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ビオチニル基(印を付けたアビジン、例えば、光学的方法または熱量測定法によって検出できる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジンによって検出できる）、第２のレポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)が挙げられる。Ｂｃｌ−２に対して反応性の抗体に対して特異性を有する二次抗体の導入によって、一次抗原−抗体反応が増幅される間接法も用いることができる。例えば、Ｂｃｌ−２に対して特異性を有する抗体がウサギＩｇＧ抗体である場合、二次抗体は、本明細書に記載される検出可能な物質で標識されたヤギ抗ウサギγグロブリンであり得る。
【００５５】
上記で論じられた抗体をコンジュゲートまたは標識する方法は、当業者ならば容易に達成できる（抗体を、酵素またはリガンド結合パートナーを用いてコンジュゲートまたは標識する方法に関しては、例えば、イマン(Imman)、メソッヅ・イン・エンジモロジー(Methods In Enzymology)、第３４巻、アフィニティー・テクニーク，エンザイム・プリフィケーション(Affinity Techniques, Enzyme Purification)：パートＢ、ヤドビ(Jakoby)およびウィチェック(Wichek)（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、３０頁、１９７４年；およびウィルチェック(Wilchek)およびバイエル(Bayer)、「ジ・アビジン−ビオチン・コンプレックス・イン・バイオアナリティカル・アプリケーションズ(The Avidin-Biotin Complex in Bioanalytical Applications)」、アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry)１７１：１〜３２頁、１９８８年参照のこと）。
【００５６】
時間分解蛍光測定法を用いて、シグナルを検出できる。例えば、従来の時間分解蛍光光度計を用いて、クリストポーロス(Christopoulos)Ｔ．Ｋ．およびディアマンディス(Diamandis)Ｅ．Ｐ．、アナリティカル・ケミストリー(Analytical Chemistry)、１９９２年：６４：３４２〜３４６頁に記載される方法を用いることができる。
【００５７】
したがって、本発明の実施形態にしたがい、Ｂｃｌ−２抗体が酵素で標識されており、基質または酵素と基質の反応生成物がランタニド金属と蛍光複合体を形成するよう選択された酵素基質が加えられる方法を提供する。ランタニド金属を加え、蛍光複合体の蛍光を測定することによってサンプル中のＢｃｌ−２を定量する。Ｂｃｌ−２に特異的な抗体は、酵素を用いて直接または間接的に標識できる。酵素は、酵素の基質または酵素と基質の反応生成物の、ユウロピウムおよびテルビウムなどのランタニド金属と複合体を形成する能力に基づいて選択する。適した酵素の例として、アルカリホスファターゼおよびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。酵素はアルカリホスファターゼであることが好ましい。Ｂｃｌ−２抗体はまた、酵素を用いて間接的に標識できる。例えば、抗体は、リガンド結合対の一方のパートナーとコンジュゲートでき、酵素をリガンド結合対のもう一方のパートナーとカップリングできる。代表的な例として、アビジン−ビオチンおよびリボフラビン−リボフラビン結合タンパク質が挙げられる。抗体をビオチン化し、酵素をストレプトアビジンとカップリングさせることが好ましい。
【００５８】
本方法の一実施形態では、酵素の基質を添加することによってサンプル中のＢｃｌ−２と結合している抗体を検出する。基質は、ランタニド金属（例えば、ユウロピウム、テルビウム、サマリウムおよびジスプロシウム、好ましくは、ユウロピウムおよびテルビウム)の存在下で、基質または酵素と基質の反応生成物が、ランタニド金属と蛍光複合体を形成するよう選択する。このような蛍光複合体を提供する酵素および酵素の基質の例は、ディアマンディス(Diamandis)の米国特許第５，３１１２，９２２号に記載されている。例として、抗体がアルカリホスファターゼで直接または間接的に標識されている場合には、本方法に用いられる基質は、４−メチルウンベリフェリルホスフェートまたは５−フルオロサリチルホスフェートであり得る。複合体の蛍光強度は、通常、時間分解蛍光光度計、例えば、ＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ６１５Ｉｍｍｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｎｏｒｄｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ｋａｎａｔａ  Ｏｎｔａｒｉｏ）を用いて測定する。
【００５９】
サンプル、Ｂｃｌ−２に特異的な抗体またはＢｃｌ−２は、担体上に固定化できる。適した担体の例として、アガロース、セルロース、デキストラン、セファデックス、セファロース、リポソーム、カルボキシメチルセルロースポリスチレン、濾紙、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ガラスビーズ、ポリアミン−メチルビニルエーテル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共重合体、エチレン−マレイン酸共重合体、ナイロン、シルクなどがある。担体は、例えば、チューブ、試験プレート、ウェル、ビーズ、ディスク、球などの形であってよい。固定化された抗体は、公知の化学的方法または物理的方法、例えば、臭化シアンカップリングを用いて、材料を適した不溶性担体と反応させることによって調製できる。
【００６０】
本発明は、実施形態にしたがい、イムノアッセイによってＢｃｌ−２を測定することによって、尿などの適当なサンプル中のＢｃｌ−２を測定するための方法を提供する。種々のイムノアッセイ法を用いてＢｃｌ−２を測定できることは当業者には明らかであろう。一般に、Ｂｃｌ−２イムノアッセイ法は、競合的である場合も、非競合的である場合もある。競合法は、通常、Ｂｃｌ−２の固定化された抗体または固定化可能な抗体（抗Ｂｃｌ−２）と、Ｂｃｌ−２の標識された形を用いる。サンプルＢｃｌ−２および標識されたＢｃｌ−２は、抗Ｂｃｌ−２との結合について競合する。抗Ｂｃｌ−２と結合して、標識されたＢｃｌ−２（結合画分）を、結合していないままのもの（非結合画分）から分離した後、結合画分または非結合画分のいずれかにおける標識の量を測定し、任意の従来法で、例えば、標準曲線と比較することによって、生体サンプル中のＢｃｌ−２の量と相関させることができる。
【００６１】
Ｂｃｌ−２の測定には、非競合法を用いることが好ましく、最もよく見られる方法は「サンドイッチ」法である。このアッセイでは、２種の抗Ｂｃｌ−２抗体を用いる。抗Ｂｃｌ−２抗体の一方を直接または間接的に標識し（「検出抗体」とも呼ばれる）、もう一方は固定化されるか、または固定化可能である（「捕獲抗体」とも呼ばれる）。捕獲および検出抗体を、生体サンプルと同時にまたは逐次接触させることができる。逐次法は、捕獲抗体をサンプルとともにインキュベートし、その後、所定の時間で検出抗体を加えることによって達成でき（「フォワード法」と呼ばれることもある）、またはまず、検出抗体をサンプルとインキュベートし、次いで、捕獲抗体を加えることもできる（「リバース」法と呼ばれることもある）。アッセイを完了するのに必要なインキュベーション（類）を行った後、捕獲抗体を、液体試験混合物から分離し、分離された捕獲抗体相または液体試験混合物の残部の少なくとも一部中の標識を測定する。通常、捕獲抗体相において測定するが、これは捕獲抗体および検出抗体によって結合されている（間に「サンドイッチされている」）Ｂｃｌ−２を含むからである。
【００６２】
Ｂｃｌ−２のための通常の２部位免疫測定(immunometric)アッセイでは、捕獲抗体および検出抗体のうち一方または両方が、ポリクローナル抗体である。検出抗体に用いられる標識は、当技術分野において従来知られているもののいずれかから選択することができる。タンパク質検出アッセイのその他の実施形態と同様に、標識は、例えば、酵素または化学発光部分または放射性同位元素、蛍光体、検出可能なリガンド（例えば、リガンドの標識された結合パートナーによる二次結合によって検出可能）などであり得る。抗体は、酵素と基質の反応生成物が蛍光複合体を形成するよう選択されている基質を加えることによって検出される酵素で標識されていることが好ましい。捕獲抗体は、試験混合物の残部から分離される方法を提供するよう選択される。したがって、捕獲抗体は、すでに固定化されているか、不溶性の形でアッセイに導入してもよいし、固定化可能な形、すなわち、捕獲抗体をアッセイに導入するためにその後に達成される固定化を可能にする形であってもよい。固定化された捕獲抗体は、共有結合によってまたは非共有結合によって、磁性粒子、ラテックス粒子、マイクロタイターマルチウェルプレート、ビーズ、キュベットまたはその他の反応容器などの固相と結合している抗体を含み得る。固定化可能な捕獲抗体の例として、リガンド部分、例えば、ハプテン、ビオチンなどで化学的に修飾されており、続いて、固定化された形のリガンドの結合パートナー、例えば、抗体、アビジンなどとの接触によって固定化され得る抗体がある。一実施形態では、捕獲抗体は、固相と結合している捕獲抗体の種特異的抗体を用いて固定化できる。
【００６３】
本発明の特定のサンドイッチイムノアッセイ法は、Ｂｃｌ−２に対して反応性である２種の抗体、酵素標識で標識されたＢｃｌ−２に対して反応性である抗体に対して特異性を有する二次抗体および酵素の蛍光性基質を用いる。一実施形態では、酵素はアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）であり、基質は５−フルオロサリチルホスフェートである。ＡＬＰは、蛍光性基質、５−フルオロサリチルホスフェートからリン酸を切断して、５−フルオロサリチル酸（ＦＳＡ）を生成する。次いで、５−フルオロサリチル酸は、ＦＳＡ−Ｔｂ（３＋）−ＥＤＴＡの形の高度に蛍光性の三重複合体を形成し、これは時間分解様式でＴｂ３＋蛍光を測定することによって定量可能である。蛍光強度は、通常、本明細書に記載される時間分解蛍光光度計を用いて測定する。
【００６４】
上記のイムノアッセイ法および形式は例示であるよう意図されたものであって制限するものではないが、これは、通常、本発明において任意のイムノアッセイ法または形式を使用できると理解されるからである。
【００６５】
本発明のタンパク質検出法、装置およびキットは、サンプル中のＢｃｌ−２の検出のために、ナノワイヤーセンサー技術(参照により本明細書に組み込まれる、ゼン(Zhen)ら、ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)、２００５年、２３（１０）：１２９４〜１３０１頁；リーバー(Lieber)ら、アナリティカル・ケミストリー(Analytical Chemistry)、２００６年、７８（１３）：４２６０〜４２６９頁）またはマイクロカンチレバー技術（参照により本明細書に組み込まれる、リー(Lee)ら、バイオセンサーズ・アンド・バイオエレクトロニクス(Biosensors and Bioelectronics)、２００５年、２０（１０）：２１５７〜２１６２頁；ウィー(Wee)ら、バイオセンサーズ・アンド・バイオエレクトロニクス(Biosensors and Bioelectronics)、２００５年、２０（１０）：１９３２〜１９３８頁；キャンベル(Campbell)およびムサラサン(Mutharasan)、バイオセンサーズ・アンド・バイオエレクトロニクス(Biosensors and Bioelectronics)、２００５年、２１（３）：４６２〜４７３頁；キャンベル(Campbell)およびムサラサン(Mutharasan)、バイオセンサーズ・アンド・バイオエレクトロニクス(Biosensors and Bioelectronics)、２００５年、２１（４）：５９７〜６０７頁；ウォン(Hwang)ら、ラボチップ(Lab Chip)、２００４年、４（６）：５４７〜５５２頁；ムコパディヤ(Mukhopadhyay)ら、ナノレターズ(Nano Letters)、２００５年、５（１２）：２８３５〜２３８８頁）を利用できる。さらに、ファン(Huang)らは、Ｂｃｌ−２の検出に適したものであり得る、市販の表面プラズモン共鳴バイオセンサーでの前立腺特異的抗原イムノアッセイを記載している（参照により本明細書に組み込まれる、バイオセンサーズ・アンド・バイオエレクトロニクス(Biosensors and Bioelectronics)、２００５年、２１（３）：４８３〜４９０頁）。高感度小型化イムノアッセイも、Ｂｃｌ−２の検出に利用できる(参照により本明細書に組み込まれる、チェザーロ−タディック(Cesaro-Tadic)ら、ラボチップ(Lab Chip)、２００４年、４（６）：５６３〜５６９頁；ジンマーマン(Zimmerman)ら、バイオメディカル・マイクロデバイセズ(Ｂiomedical Microdevices)、２００５年、７（２）：９９〜１１０頁）。
【００６６】
核酸
Ｂｃｌ−２をコードする核酸とハイブリダイズする、天然に存在する核酸、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび合成オリゴヌクレオチドを含めた核酸は、婦人科癌患者の、または婦人科癌の危険のあるものの生体サンプル中の、好ましくは、卵巣癌患者または卵巣癌の危険のあるものの尿中のＢｃｌ−２の存在を検出するための薬剤として有用である。本発明は、婦人科癌患者の、または婦人科癌の危険にあるものの生体サンプル中の、好ましくは、卵巣癌患者または卵巣癌の危険のあるものの尿中のＢｃｌ−２の発現を検出するための薬剤として使用するための、Ｂｃｌ−２のコード配列およびその相補配列に対応する核酸配列、ならびにコード配列からさらに上流または下流に生じるＢｃｌ−２転写配列に相補的な配列（例えば、５’および３’非翻訳領域に含まれるか、５’および３’非翻訳領域中に伸長する配列）の使用を企図する。
【００６７】
生体サンプル中のＢｃｌ−２の存在を検出するために好ましいオリゴヌクレオチドとは、Ｂｃｌ−２をコードするｃＤＮＡ配列の少なくとも一部と相補的であるものである。これらの相補配列はまた、当技術分野では、「アンチセンス」配列として知られる。これらのオリゴヌクレオチドは、オリゴリボヌクレオチドであっても、オリゴデオキシリボヌクレオチドであってもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは、生物学的に重要なヌクレオチド、すなわち、Ａ（アデニン）、ｄＡ（デオキシアデニン）、Ｇ（グアニン）、ｄＧ（デオキシグアニン）、Ｃ（シトシン）、ｄＣ（デオキシシトシン）、Ｔ（チミン）およびＵ（ウラシル）から成る天然のオリゴマーであってもよいし、または例えば、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合においてリン酸酸素がメチル基または硫黄原子と置換している、修飾されたオリゴヌクレオチド種であってもよい。さらに、これらのヌクレオチド自体、および／またはリボース部分が修飾されていてもよい。
【００６８】
オリゴヌクレオチドは、当技術分野で十分に記載されている、任意の公知の化学的オリゴヌクレオチド合成法を用いて化学合成できる。例えば、オリゴヌクレオチドは、任意の市販の、自動核酸シンセサイザーを用いることによって調製できる。あるいは、オリゴヌクレオチドは、例えば、非コード鎖の転写を誘導する標準組換えＤＮＡ技術によって作製できる。Ｂｃｌ−２をコードするＤＮＡ配列は、非コード鎖が転写されるよう、組換えＤＮＡ系において反転していてもよく、例えば、適したプロモーターの下流に逆方向に挿入してもよい。
【００６９】
任意の長さのリゴヌクレオチドを利用してＢｃｌ−２をコードする核酸とハイブリダイズできるが、通常、８〜１００個のヌクレオチドの範囲内のオリゴヌクレオチドが好ましい。尿サンプル中のＢｃｌ−２の検出において使用するためのオリゴヌクレオチドとしては、１５〜５０個のヌクレオチドの範囲内のものが最も好ましい。
【００７０】
次いで、化学的合成によってであろうと、組換えＤＮＡ技術によってであろうと、Ｂｃｌ−２核酸分子とハイブリダイズために選択されたオリゴヌクレオチドを、標準技術を用いて単離、精製し、次いで、好ましくは、標準標識プロトコールを用いて標識する（例えば、３５Ｓまたは３２Ｐを用いて）。
【００７１】
本発明はまた、生体サンプルにおけるＢｃｌ−２の発現を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるオリゴヌクレオチド対の使用を企図する。オリゴヌクレオチド対は、フォワードＢｃｌ−２プライマーおよびリバースＢｃｌ−２プライマーを含む。
【００７２】
患者から得たサンプル中のＢｃｌ−２の存在は、核酸ハイブリダイゼーション、例えば、それだけには限らないが、ノーザンブロット分析、ドットブロッティング、サザンブロット分析、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）およびＰＣＲによって調べることができる。クロマトグラフィー、好ましくは、ＨＰＬＣおよびその他の公知のアッセイも、サンプル中のＢｃｌ−２のメッセンジャーＲＮＡレベルを測定するために使用できる。
【００７３】
Ｂｃｌ−２をコードする核酸分子は、おそらくは、調査中の体液中に排出されるか放出されているＢｃｌ−陽性癌細胞内の生体液において見られる。
【００７４】
一態様では、本発明は、患者の生体サンプルにおいてＢｃｌ−２を検出するための薬剤としての核酸の使用を企図し、これでは、核酸が標識されている。ヌクレイックエージェント(nucleic agent)は、放射性標識、蛍光標識、酵素、化学発光タグ、比色分析タグまたは上記で論じられるか、当技術分野で公知であるその他の標識もしくはタグを用いて標識する。
【００７５】
もう１つの態様では、本発明は、体液のサンプル中のＢｃｌ−２  ｍＲＮＡの存在を検出するためのノーザンブロット分析の使用を企図する。分析の第１のステップは、ゲル電気泳動によってＢｃｌ−２核酸を含有するサンプルを分離することを含む。次いで、分散された核酸を、ニトロセルロースフィルターまたは別のフィルターに移す。続いて、適したハイブリダイズ条件、例えば、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning):ア・ラボラトリー・マニュアル(A Laboratory Manual)、マニアティス(Maniatis)ら（１９８２年、ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に記載される、４２℃の、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、２×デンハート液、０．１％  ＳＤＳ下で標識したオリゴヌクレオチドをフィルターに曝露させる。当技術分野で公知のその他の有用な手順として、溶液ハイブリダイゼーション、ドットおよびスロットＲＮＡハイブリダイゼーションおよびプローブベースのマイクロアレイが挙げられる。当技術分野で公知の標準手順を用いてハイブリダイズしている断片の放射活性を測定することで、患者の生体液中に存在するＢｃｌ−２核酸の量を定量する。
【００７６】
ドットブロッティングは、注目する核酸を含有するサンプルをメンブランに適用することを含む。核酸を、メンブランに適用する前または後に変性させることができる。メンブランを、標識したプローブとともにインキュベートする。ドットブロット手順は、当業者にはよく知られており、米国特許第４，５８２，７８９号および同４，６１７，２６１号により十分に記載されており、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、プライマーおよび重合のための薬剤を用いて核酸サンプル中に存在する１種以上の特定の核酸配列を増幅し、次いで、増幅された配列を検出するプロセスである。一方のプライマーの伸長産物が、もう一方とハイブリダイズされた場合に、所望の特定の核酸配列の製造のための鋳型となり、逆もまた同様であり、このプロセスを所望の量の配列を製造するのに必要なだけ反復する。当業者は、所望の配列の存在を検出するために（米国特許第４，６８３，１９５号）、ポリメラーゼ連鎖反応を日常的に用いている。
【００７８】
所望の配列を検出するために当業者によって日常的に実施されるＰＣＲの特定の例として、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ；サイキ(Saiki)ら、サイエンス(Science)、１９８５年、２３０、１３５０頁；シェルフ(Scharf)ら、サイエンス(Science)、１９８６、２３３：１０７６頁）がある。ＲＴ−ＰＣＲは、生体液から全ＲＮＡを単離することと、所望の核酸配列を認識するプライマーの存在下でＲＮＡを変性することと、プライマーを用い、逆転写によってＲＮＡのｃＤＮＡコピーを作製することと、ｃＤＮＡを特定のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅することと、電気泳動または当業者に公知のその他の方法によって増幅されたｃＤＮＡを検出することとを含む。
【００７９】
好ましい一実施形態では、婦人科癌患者、またはその危険にあるものの生体液、好ましくは、卵巣癌患者またはその危険にあるものの尿中のＢｃｌ−２核酸を検出する方法は、ノーザンブロット分析、ドットブロッティング、サザンブロット分析、ＦＩＳＨおよびＰＣＲを含む。
【００８０】
装置
本発明の方法は、固体支持体で実施できる。用いられる固体支持体は、生体サンプル中の分析物をアッセイすることを目的とした従来のものであり得、通常、セルロース、多糖、例えば、セファデックスなどといった材料から構成され、固体支持体の保護および／または取り扱いのための覆いによって部分的に取り囲まれていてもよい。固体支持体は、所望の適用に応じて、剛性であっても、半剛性であっても屈曲性であっても、弾性（形状記憶を有する）などであってもよい。Ｂｃｌ−２は、サンプルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で検出できる。本発明の実施形態に従って、サンプル中のＢｃｌ−２の量がサンプルを身体から採取することなく（すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏで）測定される場合には、支持体は被験体にとって無害なものでなくてはならず、身体の適当な部分に挿入するのに便宜な任意の形であり得る。例えば、支持体は、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスチレンまたはその他の剛性の有害でないプラスチック材料製で、被験体に導入されるのを可能にする大きさおよび形状を有するプローブであり得る。適当な不活性な支持体の選択は、意図される目的のための寸法のように、当業者の能力の範囲内である。
【００８１】
本発明のアッセイ（方法）における接触ステップは、生体サンプルと固体支持体、例えば、反応容器、微小容器、試験管、微小試験管、ウェル、マルチウェルプレートまたはその他の固体支持体を接触させること、組合せること、または混合することを含み得る。本発明の一実施形態では、生体サンプル（例えば、尿）と接触される固体支持体は、アッセイされる液体媒体の側方流動のための吸収パッドまたはメンブラン、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｂｅｎｆｏｒｄ、ＭＡ）から入手可能なもの、例えば、それだけには限らないが、Ｈｉ−Ｆｌｏｗ  ＰｌｕｓＴＭメンブランおよびメンブランカードおよびＳｕｒｅＷｉｃｋＴＭパッド材料を有する。
【００８２】
本発明の方法を実施するのに有用な診断装置は、意図される用途に適している任意の形に構成できる。したがって、一実施形態では、本発明の装置は、Ｂｃｌ−２レベルが測定される、尿または血液などの生体サンプルと接触される、使い捨てのまたは再利用可能な試験ストリップまたはスティックとして構築され得る。もう１つの実施形態では、装置は、留置診断用途のために、解剖学的部位、例えば、腹膜腔に埋め込まれるか、注射可能なニードル様の実施形態を製造するための当技術分野で認識される微小製造技術を用いて構築できる。その他の実施形態では、反復実験室使用を意図される装置は、細長いプローブの形に構築できる。
【００８３】
好ましい実施形態では、本発明の装置は、尿、全血、血清、血漿、腹膜液または腹水などの生体サンプルの流路を規定する側方流動マトリックスとして機能する表面を有する固体支持体（例えば、ストリップまたは尿試験紙）を含む。
【００８４】
注目する種々の分析物を検出するための、側方流動検査ストリップまたは簡単にストリップ検査としても知られる、イムノクロマトグラフィックアッセイがしばらくの間知られており、Ｂｃｌ−２の検出に用いることができる。側方流動検査の利益として、使いやすい形式、迅速な結果、さまざまな気候にわたる長期安定性および比較的低い製造費用が挙げられる。これらの特徴が側方流動検査を、家庭での検査、迅速なポイント・オブ・ケア・検査および種々の分析物のための現場での検査を含む適用にとって理想的なものにしている。検査の裏にある原理は、簡単なものである。本質的に、視覚的に検出可能な固体支持体、例えば、染められたミクロスフェアに結合され得る任意のリガンドを、定性的に、多くの場合には、さらに半定量的に検査できる。例えば、血清中の遊離および全前立腺特異的抗原の検出のための一段階側方流動イムノストリップが、フェルナンデス−サンチェス(Fernandez-Sanchez)ら(参照により本明細書に組み込まれる、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッヅ(Journal of Immunological Methods)、２００５年、３０７（１−２）：ｌ〜１２頁）に記載されており、血液または尿などの生体サンプル中のＢｃｌ−２の検出に適したものであり得る。
【００８５】
現在市場に出ている、いくつかのより一般的なイムノクロマトグラフィックアッセイとして、妊娠（店頭販売の（ＯＴＣ）試験キットとして）、連鎖球菌性咽頭炎およびクラミジアについての検査がある。イムノクロマトグラフィックアッセイ法を用いる、周知の抗原についての多数の新規試験が現在開発されている。例えば、市中肺炎の最も一般的な原因の抗原は、１９１７年から知られているが、簡単なアッセイは最近になって開発され、これはこの簡単な検査ストリップ法を用いて行われた(マードック(Murdoch)，Ｄ．Ｒ．らジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー(Journal of Clinical Microbiology)、２００１、３９：３４９５〜３４９８頁）。同様のアッセイを用いて、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）が、プールされた血液において迅速に検出されている(ソロカ(Soroka)，Ｓ．Ｄ．ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ビロロジー(Journal of Clinical Virology)２００３、２７：９０〜９６頁）。ニトロセルロースメンブランカードもまた、炭素のナノ粒子の移動および結合を検出することによって住血吸虫症を診断するために用いられている(バン・ダム(van Dam)，  Ｇ．Ｊ．ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー(Journal of Clinical Microbiology)、２００４、４２：５４５８〜５４６１頁）。
【００８６】
イムノクロマトグラフィックアッセイへの２つのよくあるアプローチとして、非競合（または直接）および競合（または競合阻害）反応スキームがある（技術注記３０３番、総説００１番、１９９９年、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｆｉｓｈｅｒｓ，  ＩＮ）。複数の抗原部位を有する大きな分析物、例えば、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）およびＨＩＶを試験する場合には、通常、直接（二重抗体サンドイッチ）形式が用いられる。この場合には、捕獲ラインでミクロスフェアの一部が捕獲されず、固定化された抗体の第２のライン、対照ゾーンに向かって流れ続けるよう、過剰未満のサンプル分析物が望まれる。この対照ラインは、ミクロスフェア上のコンジュゲート抗体に特異的な、種特異的抗免疫グロブリン抗体を用いる。遊離抗原は、存在すれば、サンプル（尿、血清など）をサンプル添加パッド上に加えることによって装置上に導入される。次いで、遊離抗原は、抗体−ミクロスフェア複合体と結合する。サンプル抗原のエピトープ１に特異的な抗体１を、色素ミクロスフェアとカップリングさせ、装置上で乾燥させる。サンプルを添加すると、ミクロスフェア−抗体複合体が再水和され、液体によって捕獲ゾーンおよび対照ラインに運ばれる。サンプル抗原の第２の抗原部位（エピトープ２）に特異的な抗体２を、捕獲ラインのメンブラン上で乾燥させる。抗体３、抗体１と反応する種特異的な抗免疫グロブリン抗体を、対照ラインのメンブラン上で乾燥させる。サンプル中に抗原が存在する場合には（すなわち、陽性試験）、その２つの抗原部位によって、抗体１（ミクロスフェアにコンジュゲートされている）および抗体２（捕獲ラインのメンブラン上で乾燥されている）の両方と結合する。抗体１でコーティングされたミクロスフェアは、抗原が存在するか否かにかかわらず、対照ラインの抗体３によって結合する。サンプル中に抗原が存在しない場合（陰性試験）には、ミクロスフェアは、捕捉されることなく捕獲ラインを通過するが、対照ラインによって捕らえられる。
【００８７】
２種の抗体と同時に結合できない単一の抗原決定基を有する小さな分子を試験する場合には、通常、競合反応スキームが用いられる。二重抗体サンドイッチアッセイと同様に、遊離抗原は、存在すれば、サンプルをサンプルパッド上に加えることによって装置上に導入される。サンプル中に存在する遊離抗原は、抗体−ミクロスフェア複合体と結合する。抗体１は、サンプル抗原に特異的であり、染められたミクロスフェアとカップリングする。抗原−担体分子（通常ＢＳＡ）コンジュゲートは、捕獲ラインのメンブラン上で乾燥させる。抗体２（Ａｂ２）は、対照ラインのメンブラン上で乾燥させ、試薬粒子を捕獲し、試験が完了したことを確認する種特異的抗免疫グロブリンである。サンプル中に抗原が存在する場合には（陽性試験）、ミクロスフェア上の抗体（Ａｂ１）は、サンプルに由来する抗原ですでに飽和されており、したがって、捕獲ラインで結合されている抗原コンジュゲートはそれと結合しない。抗原担体分子によって捕獲されないミクロスフェアはいずれも、対照ライン上のＡｂ２によって捕獲され得る。サンプル中に抗原が存在しない場合（陰性試験）には、抗体でコーティングされ、染められたミクロスフェアは、捕獲ラインで結合されている抗原コンジュゲートによって捕獲されることが可能である。
【００８８】
通常、これらの装置上の適所に抗体を保持するために用いられるメンブランは、ニトロセルロースなどの主な疎水性材料から成る。固相支持体として用いられるミクロスフェアとコンジュゲート抗体の両方が疎水性であり、それらのメンブランとの相互作用により、メンブラン上で効率的に乾燥されることが可能となる。
【００８９】
マルチプレックス検出または分析のため、サンプルおよび／またはＢｃｌ−２特異的結合剤を固体支持体上に配置してもよいし、複数の支持体を利用してもよい。「配列させること」とは、ライブラリーのメンバー（例えば、種々のサンプルのアレイまたは同一の標的分子または異なる標的分子を標的とする装置のアレイ）またはその他の収集物を、論理的アレイまたは物理的アレイに組織するまたは並べるという行為を指す。したがって、「アレイ」とは、例えば、生体サンプルの物理的または論理的配列を指す。物理的アレイは、対応するライブラリーメンバーの物理的徴候が順序正しく並べられており、コンビナトリアルスクリーニングに適する、任意の「空間形式」または物理的に格子のついた形式であり得る。例えば、個々のまたはプールされたサンプルライブラリーのメンバーに対応するサンプルを、例えば、マルチウェルプレート上の一連の番号が付けられた行および列に並べることができる。同様に、結合剤を、例えば、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルのマイクロタイタープレート（またはトレイ）にプレーティングするか、そうでなければ蒸着させることができる。場合により、Ｂｃｌ−２特異的結合剤を、固体支持体上に固定化してもよい。
【００９０】
サンプルで実施される、Ｂｃｌ−２および癌バイオマーカーの検出ならびにその他のアッセイは、その他の標的分子の検出と同時にまたは逐次実施でき、自動様式で実施してもよいし、ハイスループット形式で実施してもよい。
【００９１】
Ｂｃｌ−２特異的結合剤は蒸着させることができるが、コンジュゲートゾーンにおいて「遊離」（固定化されていない）であってもよいし、固体支持体の捕獲ゾーンに固定化されてもよい。Ｂｃｌ−２特異的結合剤は、例えば、非特異的吸収によって支持体上に固定化されてもよいし、支持体との共有結合によって固定化されてもよい。結合剤を支持体上に固定化する技術は、当技術分野では公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，３９９，２１７号、同４，３８１，２９１号、同４，３５７，３１１号、同４，３４３，３１２号および同４，２６０，６７８号に記載されている。本発明では、このような技術を用いて結合剤を固定化できる。固体支持体がポリテトラフルオロエチレンである場合には、ナトリウムおよびアンモニアを用いて支持体を活性化してアミノ化することと、カルボジイミド反応によって抗体を活性化された支持体と共有結合によって結合させることとによってホルモン抗体を支持体上にカップリングさせることが可能である(「ラジオイムノアッセイ・アンド・リレイテッド・プロセデュアズ・イン・メディシン(Radioimmunoassay and Related Procedures in Medicine)１９８２」、インターナショナル・アトミック・エネルギー・エージェンシー・ビエナ(International Atomic Energy Agency, Vienna)（１９８２）、５７〜６２頁中、ヨン・クリッチング(yon Klitzing)、シュルテック(Schultek)、ストラスバーガー(Strasburger)、フリック(Fricke)およびウッド(Wood)）。
【００９２】
本発明の診断装置は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）に対する抗体に基づいた店頭販売の初期妊娠検査ストリップなどのいくつかのその他の迅速ストリップアッセイ系に適用されている側方流動ストリップ（ＬＦＳ）技術を用いることができる。多数のその他の診断装置と同様に、本装置は、結合剤を利用して標的分子（Ｂｃｌ−２）と結合する。本装置は、血液または尿などの生体サンプルを受容するための適用ゾーンと、サンプル中のＢｃｌ−２と結合する標識を含有する標識ゾーンと、Ｂｃｌ−２標識が保持される検出ゾーンとを有する。
【００９３】
検出ゾーンにおいて保持される結合剤は、シグナルを与え、シグナルは、生体サンプル中のＢｃｌ−２レベルが所与の閾値濃度よりも低いか、同等であるか、高いかに応じて異なる。例えば、卵巣癌の検出のための尿中Ｂｃｌ−２の場合には、閾値濃度は０ｎｇ／ｍｌ〜２．０ｎｇ／ｍｌの間であり得る。もう１つの実施形態では、卵巣癌の検出のための尿中Ｂｃｌ−２の場合には、閾値濃度は１．８ｎｇ／ｍｌである。Ｂｃｌ−２レベルが所与の参照Ｂｃｌ−２濃度以上である被験体から得たサンプルは「閾値レベル」、「閾値量」または「閾値サンプル」と呼ぶことができる。装置中の適用ゾーンは、アッセイされる生体サンプルを受容することに適している。通常、吸い取り紙などの吸収材料から形成される。標識ゾーンは、サンプル中の任意のＢｃｌ−２と結合する結合剤を含む。一実施形態では、結合剤は抗体(例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片)である。検出を容易にするために、結合剤は、肉眼で見えるシグナルを提供する標識と関連していることが好ましく、例えば、蛍光タグまたは着色タグ、例えば、ピンク色として見えるコンジュゲートされたコロイド金でタグを付けている。
【００９４】
検出ゾーンは、結合剤が結合しているＢｃｌ−２を保持する。これは、通常、固定化された結合剤、例えば、固定化された抗体を用いて達成される。標識ゾーンおよび検出ゾーン中の結合剤が、両方とも抗体である場合には、それらは、通常、標的分子（Ｂｃｌ−２タンパク質）上の異なるエピトープを認識する。これによって、抗体−Ｂｃｌ−２−抗体を含む「サンドイッチ」の形成が可能となる。
【００９５】
検出ゾーンは、適用ゾーンの下流であり、標識ゾーンは通常、２つの間に位置する。したがって、サンプルは適用ゾーンから標識ゾーン中に移動し、ここでサンプル中の任意のものが標識と結合する。Ｂｃｌ−２−結合剤複合体は、過剰の結合剤とともに検出ゾーン中に移動し続ける。Ｂｃｌ−２−結合剤複合体が捕獲試薬と出会うと、複合体は保持されるが、サンプルおよび過剰の結合剤は移動し続ける。サンプル中のＢｃｌ−２レベルが高まるにつれ、検出ゾーンにおいて保持される結合剤（Ｂｃｌ−２−結合剤複合体の形で）の量が比例的に増加する。
【００９６】
好ましい実施形態では、本発明の装置は、閾値濃度に従ってサンプル間を区別する能力を有する。これは種々の方法で達成できる。
【００９７】
ある種類の装置は、検出ゾーンにおいて保持される結合剤の量が比較できる、固定された強度のシグナルを含む参照ゾーンを含み、検出ゾーンにおけるシグナルが参照ゾーンにおけるシグナルと同等である場合には、サンプルは閾値サンプルであり、検出ゾーンにおけるシグナルが参照ゾーンよりも強くない場合には、サンプルは閾値サンプルよりも少ないＢｃｌ−２を含み、検出ゾーンにおけるシグナルが参照ゾーンよりも強い場合には、サンプルは閾値サンプルよりも多いＢｃｌ−２を含む。
【００９８】
適した参照ゾーンは、難なく調製し、較正できる。この種類の装置には、結合剤は、通常、サンプル中のＢｃｌ−２に対して過剰で存在し、参照ゾーンは、検出ゾーンの上流または好ましくは、下流であり得る。参照ゾーン中のシグナルは、検出ゾーン中のシグナルと同一の種類のものである。すなわち、それらは、通常、両方とも肉眼で見える。例えば、それらは、同一のタグを用いる。この種類の装置中の好ましい参照ゾーンは、コロイド金でタグを付けられた固定化されたタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）を含む。
【００９９】
本発明のもう１つの装置では、参照ゾーンは、検出ゾーンの下流であり、結合剤を捕獲する試薬（例えば、固定化された抗結合剤抗体）を含む。装置を通って流れる結合剤は、過剰では存在しないが、その５０％が、閾値濃度のＢｃｌ−２を有するサンプルによって結合されるような濃度である。したがって、閾値サンプルでは、検出ゾーンにおいて結合剤の５０％が保持され、参照ゾーンにおいて５０％が保持される。サンプル中のＢｃｌ−２レベルが閾値サンプル中よりも高い場合には、５０％未満の結合剤が参照ゾーンに達し、検出ゾーンは、参照ゾーンよりもより強いシグナルを与え、逆に、サンプル中のＢｃｌ−２レベルが閾値サンプルよりも低い場合には、５０％未満の結合剤が検出ゾーンにおいて保持され、参照ゾーンが検出ゾーンよりも強いシグナルを与える。
【０１００】
同様の原理に従って作動する本発明のもう１つの装置では、参照ゾーンは、検出ゾーンの下流であり、制限量の、結合剤を捕獲する試薬（例えば、固定化された抗結合剤抗体）を含む。試薬は、閾値サンプルについて検出ゾーンと結合する同量の標識を保持し、過剰の標識が参照ゾーンを越えて移動し続けるようなレベルで存在する。
【０１０１】
したがって、これら３種の装置では、検出ゾーンと参照ゾーン間の比較を用いて、サンプルを閾値濃度と比較する。検出：参照結合比は、眼で見て決定できることが好ましい。２つのゾーンにおけるシグナル強度の目視による比較を容易にするには、検出および参照ゾーンの近接並置が好ましい。
【０１０２】
第４の種類の装置では、参照ゾーンは必要ではないが、検出ゾーンは、本質的にオン／オフ反応を与えるよう、例えば、閾値濃度を下回ればシグナルは与えられないが閾値以上でシグナルが与えられるよう構成される。
【０１０３】
第５の種類の装置では、参照ゾーンは必要ではないが、閾値濃度に対応する外部参照を用いる。これは種々の形、例えば、検出ゾーン中のシグナルを比較することができる印刷されたカード、または検出ゾーンにおいて測定される絶対値（例えば、熱量測定シグナル）を、機械に保存されている参照値に対して比較する機械的リーダーをとり得る。
【０１０４】
本発明のいくつかの実施形態では、装置は、検出ゾーンの下流に対照ゾーンを含む。これは通常、検出および／または参照ゾーンを通って通過する過剰の結合剤を捕獲するために用いられる（例えば、固定化された抗結合剤抗体を用いて）。結合剤が対照ゾーンで保持される場合には、これによって結合剤の流動および装置を通っての移動の両方が起きたことが確認される。当然のことながら、この機能は参照ゾーンによって達成され得る。
【０１０５】
好ましい一実施形態では、検出、参照および対照ゾーンは、ニトロセルロース支持体上に形成されることが好ましい。
【０１０６】
適用ゾーンから検出ゾーンへの移動は、通常、毛細管移動を助けるための検出ゾーンの下流の芯によって補助される。この芯は、通常、吸い取り紙またはクロマトグラフィーペーパーなどの吸収材料から形成される。
【０１０７】
本発明の装置は、尿試験紙の形に、簡単に、安価に、都合よく製造できる。さらに、例えば、ホームユーザーによって極めて容易に使用できる。したがって、本発明は、卵巣癌などの癌の検査として自宅で使用できる装置を提供する。
【０１０８】
婦人科癌を診断またはモニタリングするためのキット
一態様では、本発明は、癌を診断またはモニタリングするために必要な要素を含むキットを含む。本キットは、患者から生体液を採取するための容器と、その液体中のＢｃｌ−２またはそのコーディング核酸の存在を検出するための薬剤を含むことが好ましい。キットの構成要素は、水性媒体中または凍結乾燥した形のいずれかで詰めることができる。
【０１０９】
本発明の方法は、血液または尿などのサンプルにおいてＢｃｌ−２を定性的にまたは定量的に検出するための診断キットを用いて実施できる。一例として、キットは、Ｂｃｌ−２に特異的な結合剤（例えば、抗体）、酵素で標識された抗体に対する抗体および酵素の基質を含み得る。本キットはまた、マイクロタイターマルチウェルプレートなどの固体支持体、標準、アッセイ希釈液、洗浄バッファー、粘着性のプレートカバーおよび／またはキットを用いて本発明の方法を実施するための使用説明書を含み得る。一実施形態では、本キットは、アッセイされる生体サンプル（例えば、血液または尿）に適用される、１種以上のプロテアーゼ阻害剤（例えば、プロテアーゼ阻害剤カクテル）を含む。
【０１１０】
Ｂｃｌ−２タンパク質を検出する１種以上の薬剤、例えば、それだけには限らないが、Ｂｃｌ−２抗体、その断片またはＢｃｌ−２結合パートナーを含む婦人科癌を診断またはモニタリングするためのキットを調製できる。薬剤（類）は、患者から生体液を採取するための容器とともに詰めることができる。キットにおいて抗体または結合パートナーが、放射性金属イオンなどの標識が結合されているコンジュゲートまたは一部の形で用いられる場合には、このようなコンジュゲートの構成要素は、完全にコンジュゲートされた形、中間体の形またはキットのユーザーによってコンジュゲートされる分離された部分としてのいずれかで供給され得る。
【０１１１】
Ｂｃｌ−２核酸、例えば、それだけには限らないが、全長Ｂｃｌ−２核酸、Ｂｃｌ−２オリゴヌクレオチドおよびＢｃｌ−２プライマー対を検出する１種以上の薬剤を含むキットも調製できる。薬剤（類）は、患者から生体サンプルを採取するための容器とともに詰めることができる。核酸は標識された形であってもよいし、標識されようとする形であってもよい。
【０１１２】
キットのその他の構成要素は、それだけには限らないが、生体サンプルを採取するための手段、検出剤（結合剤）を標識する手段、生体サンプル中のＢｃｌ−２タンパク質またはＢｃｌ−２核酸を固定化するためのメンブラン、生体サンプルをメンブランに適用するための手段、薬剤を被験体の生体サンプル中のＢｃｌ−２と結合させるための手段、二次抗体、被験体の生体液から全ＲＮＡを単離するための手段、ゲル電気泳動を実施するための手段、単離された全ＲＮＡからｃＤＮＡを作製するための手段、ハイブリダイゼーションアッセイを実施するための手段およびＰＣＲを実施するための手段などを含み得る。
【０１１３】
本明細書において、用語「ＥＬＩＳＡ」とは、サンプル中に存在する抗原（例えば、Ｂｃｌ−２）または抗体を検出およびその量を定量するために、固相と結合している抗体または抗原と、酵素−抗原または酵素−抗体コンジュゲートを用いる酵素結合免疫吸着測定法を含む。ＥＬＩＳＡ技術についての説明は、Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，  Ｃａｌｉｆ．によって出版された、Ｄ．Ｐ．サイテス(Sites)ら、１９８２によるベーシック・アンド・クリニカル・イムノロジー(Basic and Clinical Immunology)の第４版の２２章に、および米国特許第３，６５４，０９０号、同３，８５０，７５２号および同４，０１６，０４３号に見られ、それらの開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。ＥＬＩＳＡとは、サンプル中の注目する抗原、タンパク質またはその他の分子の量を定量するために使用できるアッセイである。特に、ＥＬＩＳＡは、固体支持体（例えば、ポリ塩化ビニル）上に、注目する抗原またはタンパク質に特異的な抗体を結合させることによって実施できる。抗体−抗原複合体を形成するために、注目する細胞抽出物またはその他のサンプル、例えば、尿を加えることができ、余分な結合していないサンプルを洗い流す。抗原上の異なる部位に特異的な、酵素が結合している抗体を加える。支持体を洗浄して、結合していない酵素が結合している二次抗体を除去する。酵素が結合している抗体として、それだけには限らないが、アルカリホスファターゼが挙げられる。二次抗体上の酵素は、加えられた無色の基質を有色の生成物に変換できるか、または非蛍光基質を蛍光生成物に変換できる。本明細書において提供されるＥＬＩＳＡに基づくアッセイ法は、単一のチャンバーにおいて、またはチャンバーのアレイで実施でき、自動化プロセスに適したものであり得る。
【０１１４】
これらの例示的実施形態では、抗体はＦＲＥＴ色素の対、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）タンパク質、蛍光色素−クエンチャー色素の組み合わせ、βガラクトシダーゼ補完アッセイタンパク質断片を用いて標識できる。抗体は、例えば、蛍光、比色分析または増強化学発光（ＥＣＬ）シグナルを発生するための、ＦＲＥＴ、ＢＲＥＴ、蛍光クエンチングまたはβガラクトシダーゼ補完に加わり得る。
【０１１５】
これらの方法は、抗原特異的抗体反応の検出において日常的に用いられており、一般的な免疫学の教本、例えば、イバン・ロアット(Ivan Roitt)、ジョナサン・ブロストフ(Jonathan Brostoff)およびデイビット・メール(David Male)によるイムノロジー(Immunology)（Ｌｏｎｄｏｎ：  Ｍｏｓｂｙ、ｃｌ９９８、第５版およびイムノバイオロジー：イミュン・システム・イン・ヘルス・アンド・ディジーズ(Immunobiology: Immune System in Health and Disease)/チャールス(Charles)Ａ．、Ｊａｎｅｗａｙ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ  Ｔｒａｖｅｒｓ．  Ｏｘｆｏｒｄ：Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉ．  Ｐｕｂ．、１９９４）に十分に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
定義
本明細書において、用語「癌」および「癌性」とは、通常、未制御の細胞増殖を特徴とする哺乳類における生理学的状態、すなわち、増殖性障害を指すか説明する。このような増殖性障害の例として、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病などの癌、ならびに本明細書に開示されるその他の癌が挙げられる。このような癌のより詳しい例として、乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、腹膜癌、肝臓癌、例えば、肝臓癌腫、膀胱癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫、腎臓癌および甲状腺癌が挙げられる。
【０１１７】
癌のその他の非制限例として、基底細胞癌腫、胆道癌、骨癌(bone cancer)、脳およびＣＮＳ癌、絨毛腫、結合組織癌、食道癌、眼癌、頭頸部の癌、胃癌(gastric cancer)、上皮内腫瘍、咽頭癌、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫をはじめとするリンパ腫、メラノーマ、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌（例えば、唇、舌、口および咽頭)、膵臓癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系の眼、肉腫、皮膚癌、胃癌(stomach cancer)、精巣癌、子宮癌、泌尿器系の癌ならびにその他の癌腫および肉腫がある。表１に癌の種類の例を列挙する。
【０１１８】
【表１−１】
2009526234.tif 000002
【表１−２】
2009526234.tif 000003
【表１−３】
2009526234.tif 000004
【０１１９】
本明細書において、用語「腫瘍」とは、悪性または良性にかかわらず、すべての腫瘍性細胞成長および増殖ならびにすべての前癌状態および癌性の細胞および組織を指す。例えば、特定の癌は、固体塊腫瘍を特徴とし得る。固体腫瘍塊は、存在すれば、原発性腫瘍塊であり得る。原発性腫瘍塊とは、その組織の正常細胞の形質転換に起因する組織における癌細胞の増殖を指す。ほとんどの場合、原発性腫瘍塊は、視覚法または触診法によって、または組織の形、質感または重量の異常によって見い出すことができる嚢胞の存在によって同定される。しかし、いくつかの原発性腫瘍は触知されず、Ｘ線（例えば、マンモグラフィー）、超音波、ＣＴおよびＭＲＩなどの医用画像技術によってまたは針吸引によってでしか検出できない。これらの後者の技術の使用は、早期発見ではより一般的である。通常、組織内の癌細胞の分子分析および表現型分析によって、癌が組織にとって内因性であるかどうか、または病変が別の部位からの転移によるものであるかどうかが確認される。
【０１２０】
「サンプル」（生体サンプル）は、任意の物理的状態（例えば、固体、液体、半固体、蒸気）の、また任意の複雑性の、ヒトまたは非ヒト被験体に由来する注目する物質の任意の組成物であり得る。サンプルは、本発明の方法、装置およびキットによって分析できるＢｃｌ−２を含むと合理的に疑われる任意の組成物であり得る。サンプルは液体（生体液）であることが好ましい。サンプルとして、ヒトまたは動物サンプルが挙げられる。サンプルは、試験管、培養容器、マルチウェルプレートまたは任意のその他の溶液または支持基板内に含まれ得る。サンプルは、例えば、細胞培養物、ヒトまたは動物組織であり得る。細胞組織の液体ホモジネートは、本発明による検出のためのＢｃｌ−２を含み得る生体液である。
【０１２１】
サンプルの「複雑性」とは、サンプル中に存在する種々の分子種の相対数を指す。
【０１２２】
本明細書において、用語「体液(body fluid)」および「体液(bodily fluid)」とは、ヒトまたは動物被験体から得られた組成物を指す。体液としては、それだけには限らないが、尿、全血、血漿、血清、涙、精液、唾液、痰、呼気、鼻汁、咽頭浸出液、気管支肺胞洗浄、気管吸引、間質液、リンパ液、髄膜液、羊水、腺液、糞便、汗、粘液性の、膣または尿道分泌物、脳脊髄液および経皮性浸出液が挙げられる。体液はまた、前記の溶液のすべての実験的に分離された画分またはホモジナイズした固体物質、例えば、糞便、組織および生検サンプルを含有する混合物を含む。
【０１２３】
本明細書において、用語「ｅｘ  ｖｉｖｏ」とは、被験体の外側の環境を指す。したがって、被験体から採取された体液のサンプルは、本発明によって企図されるところの、体液のｅｘ  ｖｉｖｏサンプルである。本発明の方法および装置の留置実施形態では、サンプルはｉｎ  ｖｉｖｏで得られる。
【０１２４】
本明細書において、用語「コンジュゲート」とは、場合により、連結基を介して一緒に結合しており、単一の構造を形成する２種以上の分子を含む化合物を指す。結合は、分子間の直接連結（例えば、化学結合）によって行われてもよいし、連結基の使用によって行われてもよい。
【０１２５】
本明細書において、用語固体「支持体」、「基板」および「表面」とは、ストリップ、ロッド、粒子、ビーズまたはマルチウェルプレートなどのいくつかの形のうちいずれかを有し得る、有孔または無孔の水に不溶性の物質である固相を指す。いくつかの実施形態では、支持体は、好ましくは、マイクロタイタートレイなどの組織化マトリックスとして機能する固定された組織的な支持マトリックスを有する。固体支持体材料としては、それだけには限らないが、セルロース、多糖、例えば、セファデックス、ガラス、ポリアクリロイルモルホリド、シリカ、制御孔ガラス（ＣＰＧ）、ポリスチレン、ポリスチレン／ラテックス、ポリエチレン、例えば、超高分子量ポリエチレン（ＵＰＥ）、ポリアミド、ポリビニリジンフルオリド（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ；ＴＥＦＬＯＮ）、カルボキシル修飾テフロン、ナイロン、ニトロセルロースならびに金属および合金、例えば、金、プラチナおよびパラジウムが挙げられる。固体支持体は、個々の適用に応じて、粒子、鎖、沈殿物、ゲル、シート、パッド、カード、ストリップ、尿試験紙、試験ストリップ、管、球、容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、プレート、スライドなどとして存在する、生物学的であっても、非生物学的であっても、有機であっても、無機であっても、これらのうち任意の組合せであってもよい。固体支持体は、尿、全血、血漿、血清、腹膜液または腹水などの生体サンプルとの接触を容易にするために、平面の形であることが好ましい。その他の適した固体支持体材料は、当業者には容易に明らかとなる。固体支持体は裏打ち（例えば、ポリエチレンまたはポリエステルカード裏打ち）を含むか含まないメンブラン、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から入手可能なもの、例えば、Ｈｉ−ＦｌｏｗＴＭＰｌｕｓメンブランカードであり得る。固体支持体の表面は、核酸、タンパク質などの結合のために、反応基、例えば、カルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、チオールなどを含み得る。固体支持体の表面は、必ずしもそうではないが、支持体と同一材料からなることがある。したがって、表面は、広範な材料、例えば、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖、シリカまたはシリカベースの材料、炭素、金属、無機ガラス、メンブランのいずれか、または前記の支持体材料のいずれか（例えば、層またはコーティングとして）からなり得る。
【０１２６】
本明細書において、用語「標識」および「タグ」とは、検出可能なシグナルを付与し得る物質を指し、それだけには限らないが、酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素およびホースラディッシュペルオキシダーゼ、リボザイム、ＱＢレプリカーゼなどのレプリカーゼの基質、プロモーター、色素、蛍光物質、例えば、フルオレセイン、イソチオシネート、ローダミン化合物、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレサミン、化学発光物質、例えば、イソルミノール、増感剤、補酵素、酵素基質、放射性標識、ラテックスまたは炭素粒子などの粒子、リポソーム、細胞などが挙げられ、これらは色素、触媒またはその他の検出可能な基を用いてさらに標識できる。
【０１２７】
本明細書において、用語「受容体」および「受容体タンパク質」とは、本明細書では、Ｂｃｌ−２などのその他の分子と特異的に結合する生物学的に活性なタンパク質性分子を示すよう用いられる。
【０１２８】
本明細書において、用語「リガンド」とは、特異的相互作用によって特定の受容体タンパク質と結合される構造部分を含む分子を指す。
【０１２９】
本明細書において、用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（断片）、すなわち、抗体結合部位またはパラトープを含む分子を指す。この用語は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含めている。
【０１３０】
本明細書において、用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、特定の抗原と免疫反応可能な1つだけの抗体結合部位を含む抗体分子を指す。したがって、モノクローナル抗体組成物は、通常、免疫反応する任意の抗原について単一の結合親和性を示す。モノクローナル抗体組成物は、通常、1種のみの抗体分子を分泌する（産生する）ハイブリドーマと呼ばれる単一細胞のクローンによって産生された抗体からなる。ハイブリドーマ細胞は、抗体産生細胞を骨髄腫またはその他の自己永続化細胞株と融合することによって形成される。このような抗体は、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、ケーラー(kohler)およびミルスタイン(Milstein)（ネイチャー(Nature)、１９７５年、２５６：４９５〜４９７頁によって最初に記載された。１つの例示的ハイブリドーマ技術が、ニーマン(Niman)ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America)、１９８３年、８０：４９４９〜４９５３頁によって記載されている。モノクローナル抗体、ハイブリドーマ細胞またはハイブリドーマ細胞培養物を製造するその他の方法も周知である。例えば、アンチボディーズ：ア・ラボラトリー・マニュアル(Antibodies:A Laboratory Manual)、ハーロー(Harlow)ら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年；またはササトリー(Sasatry)ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America)１９８９年、８６：５７２８〜５７３２頁およびヒューズ(Huse)ら、サイエンス(Science)、１９８１年、２４６：１２７５〜１２８１頁によって記載される免疫学的レパートリーからモノクローナル抗体を単離する方法を参照のこと。本明細書によって引用された参照文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３１】
本明細書において、半透膜とは、液体に対して不透過性であり、それを通るガスの移動は可能にすることができる生体適合性材料を指す。このようなガスとして、それだけには限らないが、酸素、水蒸気および二酸化炭素が挙げられる。半透膜は、フローチャンバー空洞を規定する囲いの少なくとも一部を形成するために使用できる材料の一例である。半透膜は、微生物汚染を排除することができる（例えば、孔サイズが、細胞などの分析物を汚染し得る微生物の通過を排除するのに十分なほど特徴的に小さい）。特定の態様では、半透膜は、色、増殖、大きさ、形態、画像化および当技術分野で周知のその他の目的で、細胞などの分析物の観察を可能にするのに十分な、光透過性および透明度を有し得る。
【０１３２】
本明細書において、用語「結合する」とは、永久的である場合も、一時的である場合もある、物理的付着または近接結合を指す。結合は、例えば、水素結合、疎水性力、ファン・デル・ワールス力、共有結合またはイオン結合に起因するものであり得る。
【０１３３】
本明細書において、用語「粒子」とは、任意の形状、例えば、それだけには限らないが、球、糸様、ブラシ様および不規則な形の不溶性材料を含む。粒子は、内に規則的またはランダムなチャンネルを含む多孔性であり得る。粒子は磁性であり得る。粒子の例として、それだけには限らないが、シリカ、セルロース、セファロースビーズ、ポリスチレン(固体、多孔性、誘導体化)ビーズ、制御孔ガラス、ゲルビーズ、磁性ビーズ、ゾル、生体細胞、細胞内粒子、微生物（原虫、細菌、酵母、ウイルスおよびその他の感染性病原体)、ミセル、リポソーム、シクロデキストリンおよびその他の不溶性材料が挙げられる。
【０１３４】
「コード配列」または「コード領域」とは、ｍＲＮＡに転写され、かつ／またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。例えば、コード配列は、注目するポリペプチドをコードし得る。コード配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドンおよび３’末端の翻訳停止コドンによって決まる。コード配列としては、それだけには限らないが、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよび組換えポリヌクレオチド配列が挙げられる。
【０１３５】
本明細書において、用語「ポリペプチド」とは、２個以上の任意の数のアミノ酸を含む任意のポリマーを指し、本明細書において、用語「タンパク質」、「遺伝子産物」および「ペプチド」と同義的に用いられる。
【０１３６】
本明細書において、用語「ヌクレオシド」とは、共有結合によってリボースまたはデオキシリボース糖と連結しているプリンまたはピリミジン塩基を有する分子を指す。例示的ヌクレオシドとして、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジンおよびチミジンが挙げられる。
【０１３７】
用語「ヌクレオチド」とは、エステル結合で糖部分に結合された1個以上のリン酸基を有するヌクレオシドを指す。例示的ヌクレオチドとして、ヌクレオシド一リン酸、二リン酸および三リン酸が挙げられる。
【０１３８】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」および「ヌクレオチド分子」は、本明細書において同義的に用いられ、５’と３’炭素原子間のホスホジエステル結合によって一緒に結合されているヌクレオチドのポリマーを指す。ポリヌクレオチドは、例えば、Ｂｃｌ−２ポリペプチドなどのポリペプチドをコードする場合もあり（発現されるか発現されないかに関わらず）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンス核酸（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、アプタマー、リボザイム（触媒ＲＮＡ）または三重鎖形成オリゴヌクレオチド（すなわち、アンチジーン）である場合もある。
【０１３９】
本明細書において、用語「ＲＮＡ」または「ＲＮＡ分子」または「リボ核酸分子」とは、一般に、リボヌクレオチドのポリマーを指す。用語「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」またはデオキシリボ核酸分子」とは、一般に、デオキシリボヌクレオチドのポリマーを指す。ＤＮＡおよびＲＮＡ分子は、天然に合成され得る（例えば、それぞれＤＮＡ複製またはＤＮＡの転写によって）。ＲＮＡ分子は翻訳後修飾され得る。ＤＮＡおよびＲＮＡ分子はまた、化学合成できる。ＤＮＡおよびＲＮＡ分子は、一本鎖（すなわち、それぞれｓｓＲＮＡおよびｓｓＤＮＡ）である場合もあるし、複数鎖（例えば、二本鎖、すなわち、それぞれｄｓＲＮＡおよびｄｓＤＮＡ）である場合もある。しかし、本発明の性質に基づいて、用語「ＲＮＡ」または「ＲＮＡ分子」または「リボ核酸分子」はまた、リボヌクレオチドを主に（すなわち、８０％を超えて、または好ましくは、９０％を超えて）含むが、場合により、少なくとも１個の非リボヌクレオチド分子、例えば、少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチドおよび／または少なくとも１個のヌクレオチド類似体を含むポリマーを指し得る。
【０１４０】
本明細書において、用語「ヌクレオチド類似体」または「核酸類似体」はまた、本明細書において、変更されたヌクレオチド／核酸または修飾されたヌクレオチド／核酸と呼ばれ、非標準的ヌクレオチド、例えば、天然に存在しないリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを指す。好ましいヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドの特定の化学特性を変更するが、ヌクレオチド類似体の、その意図される機能を実施する能力は保持するよう任意の位置で修飾されている。例えば、ロックト核酸(locked nucleic acids)（ＬＮＡ）は、相補ＤＮＡおよびＲＮＡに向かって極めて高い親和性および優れた特異性を有するヌクレオチド類似体の一種類である。ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、アンチセンス分子としてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で適用されている(ジェプセン(Jepsen)Ｊ．Ｓ．ら、オリゴヌクレオチド(oligonucleotides)、２００４年、１４（２）：１３０〜１４６頁）。
【０１４１】
本明細書において、用語「ＲＮＡ類似体」とは、対応する変更されていないか、修飾されていないＲＮＡと比較して、少なくとも１個の変更されたか、修飾されたヌクレオチドを有するが、対応する変更されていないか、修飾されていないＲＮＡと同一または同様の性質または機能を保持しているポリヌクレオチド（例えば、化学合成されたポリヌクレオチド）を指す。上記で論じたように、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合を有するＲＮＡ分子と比較して、ＲＮＡ類似体の遅い加水分解速度をもたらす結合で連結されていてもよい。例示的ＲＮＡ類似体として、糖および／または骨格が修飾されたリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドが挙げられる。このような変更または修飾は、非ヌクレオチド材料の、例えば、ＲＮＡの末端（両末端）または内部への付加（ＲＮＡの１以上のヌクレオチドでの）をさらに含み得る。
【０１４２】
用語「含む」、「からなる」および「本質的にからなる」は、それらの標準的な意味に従って定義される。これらの用語は、各用語に伴われる特定の意味を添えるために、本出願を通じて互いに置き換えてもよい。
【０１４３】
用語「単離された」または「生物学的に純粋な」とは、天然の状態において見られるように、通常、材料に伴われる構成要素を実質的にまたは本質的に含まない材料を指す。
【０１４４】
本明細書において、単数形「1つの(ａ)」、「１つの(ａｎ)」および「その(the)」は、特に明確に断りのない限り、複数形の言及を含む。したがって、例えば、「一抗体」への言及は、１を超えるこのような抗体を含む。「一分子」への言及は、１を超えるこのような分子を含むなど。
【０１４５】
本発明の実施は、特に断りのない限り、当業者の範囲内である、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、電気生理学および薬理学の従来技術を用いることができる。このような技術は、文献に十分に説明されており（例えば、サムブロック(Sambrook)、フレッチ＆マニアティス(Fritsch & Maniatis)、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第２版（１９８９）；ディーエヌエークローニング(DNA Cloning)、第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．グローバー(Glover)編、１９８５）；パーバル(Perbal),Ｂ．、ア・プラティカル・ガイド・トゥー・モレキュラー・クローニング（A Practical Guide to Molecular Cloning)（１９８４）;ザ・シリーズ、メソッズ・イン・エンジモロジー(the series, Methods In Enzymology)（Ｓ．コロウィック(Colowick)およびＮ．カプラン(Kaplan)編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；トランスクリプション・アンド・トランスレーション(Transcription and Translation)(ハメス(Hames)ら編１９８４年）；ジーン・トランスファー・ベクター・フォー・マンマリアン・セルズ(Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells)（Ｊ．Ｈ．ミラー(Miller)ら編（１９８７年）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）；スコープス，プロテイン・プリフィケーション：プリンシプルズ・アンド・プラクティス(Scopes, Protein Purification:Principles and practice)(第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）；およびピーシーアール：ア・プラクティカル・アプローチ(PCR:A Practical Approach)(マクファーソン(McPherson)ら編（１９９１）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）参照のこと)、これらの各々は参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【０１４６】
以下は、本発明を実施するための材料、方法および手順を示す実施例である。実施例は例示的なものであって、制限と解釈されてはならない。
【０１４７】
材料および方法
患者コホート。事前の制度的承認を取り、Ｈ．Ｌｅｅ  Ｍｏｆｆｉｔｔ癌センターで、健常な正常な対照ボランティア（Ｎ＝２１）、良性の婦人科障害を有する女性（Ｎ＝３５）および卵巣癌の患者（Ｎ＝３４）から尿および血液サンプルを採取した。８試料を除くすべては、最初の外科的デバルキングの前に採取したが、後者の８試料は、研究への登録時に再発疾患を患って提供された。可能であれば、パラフィンブロックを同定し、ＦＩＧＯスコアに従ってスライドを再調査して組織学的診断を確認した。これらの女性の医療記録も再調査し、患者の年齢、腫瘍のタイプ、ステージ、グレード、大きさおよび入手可能な場合は取り除かれた外科的処置に関する情報も再調査した。
【０１４８】
サンプル調製。患者にインフォームドコンセントを行って、患者から尿および血漿サンプルが採取され、患者の身元を保護するために匿名にされ、コードが付けられて、この調査プロトコールのためにＨ．Ｌｅｅ  Ｍｏｆｆｉｔｔ癌センターから放出された。すべてのサンプルは氷中に維持された。尿サンプルは、標準プロテアーゼ阻害剤カクテル（８０μｇ／ｍｌ  ４−（２アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオリド、２００μｇ／ｍｌ  ＥＤＴＡ、０．２μｇ／ｍｌロイペプチン、０．２μｇ／ｍｌペプスタチン、Ｓｉｇｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＩ）で処理し、３０００×ｇで遠心分離した。次いで、尿の上清および血漿サンプルをアリコートに分け、−２０℃で保存した。
【０１４９】
酵素結合免疫吸着測定法。患者の尿中のＢｃｌ−２レベルを測定するために、定量的サンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用い、製造業者の使用説明書に従ってサンプルをアッセイした。被験体の血漿中のＣＡ１２５レベルを測定するために、ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏ−Ｑｕａｎｔ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）によって、製造業者の使用説明書に従ってサンプルをアッセイした。酵素反応は、Ｄｙｎｅｘ  ＭＲＸプレートリーダー（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）を用いて４５０ｎｍで検出し、Ｂｃｌ−２結果は、３連のサンプルの平均吸光度±Ｓ．Ｅ．として表し、他方、ＣＡ１２５結果は、２連のサンプルの平均として表した。
【０１５０】
統計分析。Ｂｃｌ−２  ＥＬＩＳＡのサンプルを３連で実施し、データを正規分布についてクラスカル−ワリス検定に付した。次いで、マン・ホイットニーのＵ検定によってデータを分析して、正常対照、良性疾患の患者および卵巣癌患者から得たサンプル間の統計的有意性を調べた。同様に、ＳＡＳシステムを用いる判別分析を用いて、各群において適当な構成員を決めた（正常対良性対癌）。
【実施例１】
【０１５１】
卵巣癌患者では尿中Ｂｃｌ−２レベルは上昇している
９０人の個人から尿および血液を採取し、サンプルは正常対照（Ｎ＝２１）、良性疾患の女性（Ｎ＝３５）および卵巣癌の女性（Ｎ＝３４）から採取した。後者のカテゴリーは、類内膜（Ｎ＝１）、粘液性（Ｎ＝７）ならびに漿液性卵巣癌（Ｎ＝２４）および卵巣癌と関連していることが多い原発性腹膜癌（Ｎ＝２）と診断された女性からなる。良性の婦人科疾患の女性から採取したサンプルは、良性の嚢胞性奇形腫（Ｎ＝２）、単純嚢胞（Ｎ＝１Ｏ）、平滑筋腫（Ｎ＝８）、多嚢胞卵巣疾患（Ｎ＝１）、卵巣腺線維腫（Ｎ＝４）、粘液性嚢胞腺腫（Ｎ＝２）および漿液性嚢胞腺腫（Ｎ＝８）の女性からなっていた。このコホートは、小パイロット研究を含むが、組織学、グレードおよびステージ分布に関しては、典型的な臨床診察を代表するものである。
【０１５２】
卵巣癌の新規分子マーカーとしての、尿中Ｂｃｌ−２レベルの適合性の可能性を調べるために、正常対照、良性の婦人科疾患の女性および卵巣癌患者から得た尿サンプル試料を、ＥＬＩＳＡ分析によってスクリーニングした（図１）。尿中Ｂｃｌ−２の量は、正常対照サンプルでは、通常、無視できるものであった（平均０．２１ｎｇ／ｍｌ）。対照的に、卵巣癌および原発性腹膜癌と関連している尿中Ｂｃｌ−２は、通常、正常対照サンプルにおいて見られるものの＞１０×（３．４ｎｇ／ｍｌ）であった（図１Ａ）。Ｂｃｌ−２＞１．８ｎｇ／ｍｌを含んでいた正常尿サンプルはなかったのに対し、癌サンプルのうち２つしか、１．８ｎｇ／ｍｌ未満（１．１２ｎｇ／ｍｌおよび１．７８ｎｇ／ｍｌ）のＢｃｌ−２を示さなかった。漿液性癌腫は、上皮性卵巣癌の大部分に相当するので、漿液性腺癌の患者の尿中Ｂｃｌ−２レベルを、疾患グレード（図１Ａ）およびステージ（図１Ｂ）によって調べた。腫瘍グレードおよびステージが増すに連れて、Ｂｃｌ−２レベルの上昇の傾向があったが、腫瘍グレードおよびステージ間のＢｃｌ−２レベルの相違は、統計的に有意ではなかった。同様に、尿採取時に血清クレアチニンを測定し、これは、尿中Ｂｃｌ−２レベルは腎機能障害と関連していないということを示した（データは示していない）。一人の患者（７７番）が、その他の顕著な臨床症状がなく、極端に上昇した尿中Ｂｃｌ−２レベル（＞９ｎｇ／ｍｌ）を示したことは注目すべきである。
【０１５３】
表２には、図１および２に示される結果が、尿試料中の平均Ｂｃｌ−２レベルについて要約されている。括弧内の数字は、それぞれの群各々の中のサンプル数を示す。さらに、データは、正常個体と卵巣癌組織学的サブタイプ、腫瘍グレードおよび腫瘍ステージ間の平均Ｂｃｌ−２レベル（ｎｇ／ｍｌ）を示すためにグループ化されている。データは、健常なボランティアの尿中のＢｃｌ−２の平均レベルは、０．２０４ｎｇ／ｍｌであるが、すべての癌患者に由来するものは、概して、１０倍高い（３．１２ｎｇ／ｍｌ）ということを示す。さらに、尿中Ｂｃｌ−２レベルは、漿液性卵巣癌（最もよく発生するタイプの卵巣癌）間での腫瘍のステージと強く関連しており、腫瘍のグレードと中程度に関連していると思われる。
【０１５４】
【表２】
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【実施例２】
【０１５５】
良性の婦人科疾患の患者では尿中Ｂｃｌ−２は上昇していない
図８Ａに示されるように、３５人の良性の婦人科疾患の女性から得た尿中Ｂｃｌ−２のＥＬＩＳＡ測定によって（患者の治療の直前に採取された尿）、平均０．０２ｎｇ／ｍｌのＢｃｌ−２レベルが示され、＞１．８ｎｇ／ｍｌ  Ｂｃｌ−２のサンプルはなかった。これらの良性疾患は、良性の奇形腫、単純嚢胞、平滑筋腫、多嚢胞卵巣、線維腫および腺腫を含んでいた。これらの値は、正常対照と同様であったが卵巣癌サンプルよりも大幅に低く、このことは、尿中Ｂｃｌ−２レベルの１．８ｎｇ／ｍｌを超える上昇は卵巣癌と関連していたということを示唆する。
【０１５６】
クラスカル−ワリス検定を用いて、データの正規分布を調べた。「正常」群は、おそらくはサンプリング数が少ないために正規分布を満たさなかったので、マン・ホイットニーのＵ検定によって群間の相違を分析した。結果は、正常および良性間に有意差がない（ｐ＜０．５）が、ｐ＜０．００１で正常と癌の間または良性と癌群の間に有意差があるということを示した。この研究群の尿中Ｂｃｌ−２レベルの要約は、図８Ｂに提示されている。同様に、ＳＡＳシステムを用いる判別分析により、正常／良性または癌群における適当な構成員の可能性が＞９０％であると示された。
【実施例３】
【０１５７】
尿中Ｂｃｌ−２は患者の年齢または腫瘍の大きさと相関しない
臨床パラメータの比較により、尿中Ｂｃｌ−２レベルは患者の年齢と関連していないということが示唆された（図５参照のこと）。正常対照の年齢範囲および平均年齢（２９〜８１歳、平均４８．５±Ｓ．Ｄ．１２．７歳）および良性婦人科疾患の年齢範囲および平均年齢（２８〜８４歳、平均５５．９±Ｓ．Ｄ．１３．９歳）は、卵巣癌の女性のもの（２６〜９２歳、平均６２．２±Ｓ．Ｄ．１３．８歳）よりも幾分か低かったが、この研究では相違は統計的に有意ではなかった。同様に、尿中Ｂｃｌ−２レベルは、顕微鏡でしか見えない大きさ〜＞１０ｃｍの範囲の、デバルキング手術で測定された腫瘍の大きさと相関しておらず（図６）、個人間の生物学的変動または腫瘍組成の変動を反映している可能性がある。
【実施例４】
【０１５８】
尿中Ｂｃｌ−２は、血中ＣＡ１２５よりも正確に卵巣癌を検出する
尿中Ｂｃｌ−２の上昇が、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）よりも良好な卵巣癌の診断指標であるかどうかに取り組むために、１２人の正常対照および２３人の卵巣癌患者において尿中Ｂｃｌ−２をＣＡ１２５レベルと比較した（図４Ａおよび４Ｂ）。調べた患者の中では、卵巣癌検出と関連している尿中Ｂｃｌ−２の上昇は、ほぼ１００％であった。尿中Ｂｃｌ−２の上昇（＞１．８ｎｇ／ｍｌ）は、１７／１７の漿液性腺癌患者、４／４の粘液性卵巣癌患者および１／２の原発性腹膜癌患者を卵巣癌陽性と同定した（図４Ａ）。正常対照のうち＞１．８ｎｇ／ｍｌの尿中Ｂｃｌ−２レベルを有していたものはなく、その結果、癌陰性として正しく分類された。対照的に、ＣＡ１２５＞３５Ｕ／ｍｌという血中濃度、卵巣癌検出についての現在の基準は、１３／１７すなわち７６％の漿液性腺癌患者を同定した（図４Ｂ）。同様に、ＣＡ１２５分析は、３／４すなわち７５％の粘液性卵巣癌患者を同定したが、これらの患者におけるＣＡ１２５レベルは、４１〜４３Ｕ／ｍｌの間の範囲であり、また１／２すなわち５０％の原発性腹膜癌患者を癌陽性として同定した。ＣＡ１２５レベルの上昇はまた、２／１２すなわち１６％の健常な個体を癌陽性として誤って同定し、このことは、尿中Ｂｃｌ−２の上昇は、ＣＡ１２５よりも正確に卵巣癌を検出するようであるということを示唆する。
【実施例５】
【０１５９】
尿中Ｂｃｌ−２はデバルキング手術後に低下する
卵巣癌を検出するための高レベルの尿中Ｂｃｌ−２の精度をさらに調べるために、７人の卵巣癌患者において、すべての目に見える腫瘍の除去のための最初のデバルキング手術の直前の（図７Ａおよび７Ｂ、黒色バー）およびその後２週間以内の（白色バー）尿中Ｂｃｌ−２のレベルを比較した。最初の手術の前後に尿サンプルを採取した患者については、Ｂｃｌ−２レベルが腫瘍の外科的除去後に最大１００％低下し、このことは、腫瘍の存在が、卵巣癌患者における尿中Ｂｃｌ−２の上昇とよく相関するということを示唆する。
【０１６０】
現在のところ、前臨床試験は、Ｂｃｌ−２を阻害するための物質、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＢｃｌ−２の小分子阻害剤の開発に焦点を合わせている。このような研究は、治療介入のためにＢｃｌ−２を標的とするが、本データは、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイによる尿中Ｂｃｌ−２の定量化は、米国のみならず、地理的無医地区を含めた世界中のすべての女性、特に、卵巣癌を発生する危険の高い女性に恩恵をもたらす、卵巣癌を検出するための、新規の、安全な、感受性のある、特異的な、経済的な方法を提供し得るということを示す。さらに、米国において毎年約２５，０００人の女性が、卵巣癌の診断を受けることを考えると、疾患の初期および後期段階両方における卵巣癌の尿中Ｂｃｌ−２検出は、卵巣癌の診断を裏付けるだけではなく、何千ものこれまでは診断されていない卵巣癌を検出する可能性もある。これは、診断される卵巣癌の１０％未満にしかなっていない、初期における卵巣癌の検出にとって特に重要であるが、罹患卵巣の外科的デバルキングが患者の生存を９０％を超えるまでに高めているところでは、生涯の医療費を減少させると期待される。最後に、新規診断機能を果たすことに加え、Ｂｃｌ−２の尿中レベルを用いて、疾患の過程を通じての卵巣癌の存在をモニターすることができ、これは治療結果および予後結果に影響を及ぼし得る。Ｂｃｌ−２の尿中レベルが卵巣癌のバイオマーカーとして働く可能性を確認するためのより大きな集団研究、ならびに卵巣癌における尿中Ｂｃｌ−２の上昇の原因となる分子的機序(類)への調査が必要とされることは明らかである。しかし、尿の検出またはＢｃｌ−２のいずれかを、卵巣癌のバイオマーカーとして用いる報告はないので、このパイロット研究は、ＥＬＩＳＡによる尿中Ｂｃｌ−２の測定値が、すべての卵巣癌を検出し、場合により、毎年何千という女性を死亡させる潜行性疾患の死亡率を低下させるための、革新的な、簡単な方法を提供し得るということを示唆する。
【実施例６】
【０１６１】
Ｂｃｌ−２試験のための尿保存条件
尿中ｂｃｌ−２の貯蔵安定性を調べる研究は、サンプルを、プロテアーゼ阻害剤のカクテルを添加して調製した場合には、これらの尿サンプルは、ｂｃｌ−２検出を喪失することなく、−２０℃で１年を超えて保存できるということを示す（図１１中、「対照」＆「−２０℃」参照のこと）。これは、先のサンプルを現在のもので再試験することが望ましい個人にとって有益である。あるいは、これらのサンプルはまた、尿中Ｂｃｌ−２の検出に悪影響を及ぼさずに、４℃で最大４日間保存できる。これらは、尿サンプルにプロテアーゼ阻害剤が添加されており、尿サンプルが冷たく維持されている場合には、患者の尿サンプルを、Ｂｃｌ−２試験のために（離れている可能性がある地理的地域から）実験室に輸送するのに必要とされる可能性がある時間が、尿中ｂｃｌ−２の結果に悪影響を及ぼさないことを示すので重要な結果である。しかし、室温で４日間保存したサンプルではＢｃｌ−２の減少が測定され、−８０℃で保存した尿サンプルではＢｃｌ−２は検出できなかった。したがって、Ｂｃｌ−２検出のための尿サンプルを、室温または−８０℃のいずれかで保存することは禁制的であると思われる。
【０１６２】
すべての特許、特許出願、仮出願および本明細書において上記または下記で参照または引用された刊行物は、参照により、すべての図面および表を含めたその全文が、本明細書の明確な技術と矛盾しない範囲内で組み込まれる。
【０１６３】
本明細書に記載される実施例および実施形態は、単に例示目的であって、それを踏まえて、種々の改変または変更は当業者に示唆され、本願の趣旨および範囲内に含まれるということは理解されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】Ｂｃｌ−２の尿中レベルを表すヒストグラムである。Ｂｃｌ−２の尿中レベルは、正常な健常なボランティアと比較して卵巣癌の患者では高い。尿は、正常な健常なボランティアから、卵巣癌（例えば、組織学的サブタイプ漿液性、粘液性）および腹膜癌の患者から採取した。漿液性卵巣癌は、ステージ１（漿液性群中の左の最初の３つのバー）、ステージ２（漿液性群中の次の８のバー（すなわち、漿液性群中の左のバー４〜１１）およびステージ３（漿液性群の右側部分の１１のバー（すなわち、漿液性群の左のバー１２〜２２）にさらに細分した。尿は、ＥＬＩＳＡ（Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ製ＥＬＩＳＡキット、カタログ番号ＢＭＳ２４４／３）によってＢｃｌ−２について３連で試験し、結果は平均ｎｇ／ｍｌ  Ｂｃｌ−２±Ｓ．Ｅ．として表した。データは、癌患者の尿中のＢｃｌ−２の一貫して上昇したレベルを示す。スチューデントのｔ検定分析によって、ｐ＜０．００００１で正常および癌試料間の統計的な差異が示された。
【図２】正常および癌患者におけるＢｃｌ−２の尿中レベルを表すヒストグラムである。正常な健常なボランティアから、および卵巣癌（例えば、組織学的サブタイプエンドメトロイド(endometroid)、漿液性および粘液性）および腹膜癌の患者から、さらなる尿試料を採取した。漿液性卵巣癌はさらに、ステージ１（漿液性群中の最も左の７つのバー）、ステージ２（漿液性群中の左からバー８〜１７）およびステージ３（漿液性群中の最も右の１２のバー）にさらに細分した。尿は、ＥＬＩＳＡ（Ｂｅｎｄｅｒ  Ｍｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製のＥＬＩＳＡキット）によってＢｃｌ−２について３連で試験し、結果は平均ｎｇ／ｍｌ  Ｂｃｌ−２として表し、今までに試験した、すべての正常および手術前癌尿試料に相当する。図１と一致して、データは、癌患者の尿中のＢｃｌ−２の一貫して上昇したレベルを示す。スチューデントのｔ検定分析によって、ｐ＜０．００００１で正常および癌試料間に統計的な差異が示される。
【図３Ａ】尿中Ｂｃｌ−２が腫瘍のステージおよびグレードと、それぞれ関連していることを実証するヒストグラムである。尿中Ｂｃｌ−２のレベルを、すべての入手可能な組織学的卵巣癌サブタイプ（漿液性、エンドメトロイド(endometroid)、粘液性）から得た腫瘍のステージに対してプロットした。ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶは、ローマ数字で表され、下にグループ分けされている。図３Ａは、Ｂｃｌ−２の尿中レベルが、正常対照よりも依然として相当高いが、疾患が卵巣および腹膜腔にそれぞれ限局される、ステージＩおよびＩＩの腫瘍において最低である（平均ｎｇ／ｍｌ  Ｂｃｌ−２＝２．２）ことを示す。Ｂｃｌ−２の尿中レベルは、疾患がそれぞれ卵巣を超えて十分に広がっているか、再発疾患であるステージＩＩＩおよびＶの間で最大であった（平均ｎｇ／ｍｌ  Ｂｃｌ−２＝４．２２）。
【図３Ｂ】尿中Ｂｃｌ−２が腫瘍のステージおよびグレードと、それぞれ関連していることを実証するヒストグラムである。尿中Ｂｃｌ−２のレベルを、すべての入手可能な組織学的卵巣癌サブタイプ（漿液性、エンドメトロイド(endometroid)、粘液性）から得た腫瘍のステージに対してプロットした。ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶは、ローマ数字で表され、下にグループ分けされている。
【図４】卵巣癌の検出における、ＣＡ１２５の血漿レベルの測定値（図４Ｂ）と比較した尿中Ｂｃｌ−２の能力（図４Ａ）を表す一対のヒストグラムである。可能な限り、図１〜３において先に示した尿中Ｂｃｌ−２のレベルを、同一の正常な健常なボランティアおよび癌患者から得たＣＡ１２５の血漿レベルと比較した。後者の群は、粘液性卵巣癌（Ｍｕｃ）、原発性腹膜癌（ＰＰ）および漿液性卵巣癌（Ｓｅｒｏｕｓ）の患者を含んでいた。ＣＡ１２５レベルは、ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏ−Ｑｕａｎｔ製のキット、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、カタログ番号ＢＱ１０１３Ｔ）によって３連で調べた。データは、平均ｎｇ／ｍｌ  Ｂｃｌ−２（Ａ）および平均Ｕ／ｍｌ  ＣＡ１２５（図４Ｂ）として表されている。尿中Ｂｃｌ−２レベルの上昇によって卵巣癌を検出するための感度および特異性は、ほぼ１００％であった。対照的に、ＣＡ１２５血中濃度＞３５Ｕ／ｍｌ、卵巣癌検出についての現在の基準は、卵巣癌患者の６８％しか正しく同定しなかった。
【図５】尿中Ｂｃｌ−２が患者の年齢と相関しないことを示すヒストグラムである。癌患者におけるＢｃｌ−２の尿中レベルの上昇が、患者の年齢と相関するかどうかを調べるために、尿中Ｂｃｌ−２レベル（図１〜３および４Ａ〜４Ｂにおいて先に調べた）を何歳かにわたり患者の年齢に対して比較した。この研究における正常な健常なボランティアの平均年齢（５４．８歳）は、癌患者（６６．２歳）よりも幾分低かったが、幅広い年齢のために群間の年齢において統計的差異はなかった（図５中の挿入を参照のこと）。さらに、癌患者の平均年齢は、文献および臨床データと一致しており、このことは、卵巣癌は、通常、閉経前後および閉経後の女性を標的とするということを示す。しかし、Ｂｃｌ−２の尿中レベルと患者の年齢の間には相関はないようであった。
【図６】尿中Ｂｃｌ−２は卵巣腫瘍の大きさと相関しないことを示すヒストグラムである。癌患者におけるＢｃｌ−２の尿中レベルの上昇が腫瘍の大きさと相関するかどうかを調べるために、尿中Ｂｃｌ−２のレベル（図１〜３および４Ａ〜４Ｂにおいて先に調べた）を腫瘍の大きさに対して比較した。腫瘍を以下のとおりにグループ分けした：１＝顕微鏡でしか見えない大きさ、３＝３ｃｍ未満の腫瘍、６＝３〜６ｃｍの間の腫瘍、１０＝６ｃｍを超えて最大１０ｃｍまでの腫瘍、１１＝１０ｃｍを超える腫瘍。データは、Ｂｃｌ−２の尿中レベルと腫瘍の大きさの間に相関がないようであったことを示す。
【図７】卵巣癌デバルキング手術後に尿中Ｂｃｌ−２が減少することを示す一対のヒストグラムである。卵巣癌を検出するための尿中Ｂｃｌ−２の精度をさらに調べるために、最初のデバルキング手術（すべての目に見える腫瘍の除去）の直前の（黒色バー）およびその後２週間以内の（灰色バー）入手可能な卵巣癌患者のものにおいて、尿中Ｂｃｌ−２のレベルを比較した（図７Ａ）。最初の手術の前後に尿サンプルを採取した７人の患者について、Ｂｃｌ−２レベルが腫瘍の外科的除去後に最大１００％低下した。その結果、これらのデータは、腫瘍は、卵巣癌の患者の尿において上昇が見られたＢｃｌ−２の供給源であるということおよび尿中Ｂｃｌ−２のレベルは卵巣癌の存在と同時に起こるということを示唆する。さらに、図７Ａでは、最初の手術の後７〜１１ヶ月の範囲のその後のフォローアップ臨床外来で、７人の患者のうち５人から尿サンプルを採取し、Ｂｃｌ−２について測定した（青色バー）（図７Ｂ）。尿中Ｂｃｌ−２レベルは、３人のフォローアップ患者（４１、４３、５４番）では低いままであり、２人の患者（５、２７番）では上昇していた。予備カルテ審査は、患者４１、４３、５４番は、フォローアップ外来時に化学療法を受けていることおよび彼女らの卵巣癌疾患は制御下にあることを示した。対照的に、カルテ審査は、患者５、２７番は再発疾患を有していたこと（５Ｂ、２７Ｂ）および患者２７ｂ番はさらなる腫瘍デバルキング手術を受けたことを示唆した。臨床情報と一致して、化学療法を受けており、明らかな残留病変を有さないか、または最小の残留病変しか有さない患者（４１、４３、５４番）では、尿中Ｂｃｌ−２レベルは低下したままであった。同様に、尿中Ｂｃｌ−２レベルの上昇は、再発疾患の存在と相関し（５ｂ、２７Ｂ番）、その後の疾患デバルキングで低下した（２７ｃ番）。
【図８Ａ】良性の婦人科疾患の患者におけるＢｃｌ−２試験の結果を示す図である。良性の婦人科疾患の患者において、尿サンプルをＢｃｌ−２についてＥＬＩＳＡによって調べた。サンプルは３連で調べ、データは、Ｂｃｌ−２の平均ｎｇ／ｍｌ±Ｓ．Ｅ．として表した（図８Ａ）。良性の婦人科疾患サンプルを、タイプ（良性の嚢胞性奇形腫、単純嚢胞、平滑筋腫、多嚢胞卵巣、腺線維腫、粘液性および漿液性嚢胞腺腫）によって細分し、卵巣癌患者サンプル４１番を内部陽性対照として用いた（白色バー）。良性疾患の中での平均尿中Ｂｃｌ−２ｎｇ／ｍｌ±Ｓ．Ｅ．は、そのそれぞれの見出しの下に示された。
【図８Ｂ】図８Ｂに示されるように、図２および図３Ａから得たサンプルを再プロットして、この研究群についてのＢｃｌ−２発現の分布を示した（ｎ＝９２）。良性、癌および正常な個体におけるＢｃｌ−２レベルはそれぞれ、０．１１５〜１．０１６ｎｇ／ｍｌ、１．１２〜９．８ｎｇ／ｍｌおよび０〜１．２６ｎｇ／ｍｌの範囲であり、平均して０．６１４ｎｇ／ｍｌ、３．４ｎｇ／ｍｌおよび０．２１ｎｇ／ｍｌであった。
【図９】Ｂｃｌ−２は細胞培養コンディショニング培地中に分泌され得るということを示すヒストグラムである。コンディショニング培地（ＣＭ）は、卵巣癌（ＯＶ２００８、ＳＫＯＶ３、ＰＡ１）、子宮頸癌（Ｈｅｌａ）、前立腺癌（ＬＮＣａｐ、ＤＵ１４５、ＰＣ−３）、頭頸部癌（ＨＮ５ａ）およびリンパ腫（Ｒａｊｉ）に相当する確立された癌細胞株から集め、Ｂｃｌ−２の存在についてＥＬＩＳＡによって調べた。データは、３連のサンプルの平均として表されている。卵巣癌、子宮頸癌および前立腺癌細胞培養物のＣＭ中のＢｃｌ−２の存在は、これらの癌細胞がＢｃｌ−２を産生し、分泌することを示唆する。
【図１０】Ｂｃｌ−２がいくつかの癌細胞において過剰発現されることを示す図である。卵巣癌（ＳＷ６２６、Ｃ１３）、頭頸部癌（ＨＮ５ａ）、子宮頸癌（Ｈｅｌａ）および前立腺癌（ＤＵ１４５）に相当する確立された癌細胞株から得た細胞溶解物をＢｃｌ−２についてウエスタンイムノブロッティングした。アクチンをローディングコントロールとして用い、ＦＨＩＯＳＥ１１８細胞（ＳＶ−４０  ラージＴ抗原によってトランスフェクトされたヒト卵巣表面上皮細胞）を正常な非悪性卵巣表面上皮対照細胞として用いた。デンシトメトリーによる分析の後、Ｂｃｌ−２のレベルをアクチンに対して正規化し、ブロットの下に記した。正常な細胞は、無視できる量のＢｃｌ−２しか含んでいなかったが、卵巣癌および子宮頸癌細胞は最大量のＢｃｌ−２を含んでいた。
【図１１】貯蔵後のＢｃｌ−２タンパク質濃度を示す図である。正常な健常な個体（５０６、５０８番）および卵巣癌の患者（７７、９７番）から得た尿サンプルを、この研究の一環としてＢｃｌ−２について最初に試験し（対照）、室温（２５℃）、冷蔵（４℃）る、−２０℃フリーザー（−２０℃）または−８０℃フリーザー（−８０℃）における４日間の貯蔵後、試験した。すべてのサンプルをＢｃｌ−２の尿中レベルについてＥＬＩＳＡキット（ＢｅｎｄｅｒＭｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて２連で試験した。
【図１２】リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）で処理した後の癌細胞株、例えば、ＤＵ１４５、前立腺癌細胞株のコンディショニング培地（ＣＭ）中のＢｃｌ−２タンパク質濃度を示す図である。この図は、自己分泌ループ方法で癌細胞に与えられることが多いＬＰＡでの処理が、Ｂｃｌ−２のいくつかの癌細胞株のＣＭ中への分泌を刺激するということを示す。これらの癌細胞株は、卵巣癌細胞株がそうであるように、Ｂｃｌ−２をそのＣＭ中に分泌するので、このような細胞株のｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍対応物はＢｃｌ−２を生体液、例えば、尿および／または血液中に分泌する可能性があり、これは本発明を用いて検出され得る。
【０１６５】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ヒトＢｃｌ−２ＤＮＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｍ１４７４５）；コード領域（ＣＤＳ）；塩基３２〜７５１である。
配列番号２は、ヒトＢｃｌ−２タンパク質（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ３５５９１）である。
配列番号３は、ヒトＢｃｌ−２ＤＮＡ、転写物変異体α（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００６３３）；ＣＤＳ；塩基４９４〜１２１３である。
配列番号４は、ヒトＢｃｌ−２タンパク質、転写物変異体α（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００６２４）である。
配列番号５は、ヒトＢｃｌ−２ＤＮＡ、転写物変異体β（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００６５７）；ＣＤＳ；塩基４９４〜１１１１である。
配列番号６は、ヒトＢｃｌ−２タンパク質、転写物変異体β（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００６４８）である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年2月13日(2009.2.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において癌を検出する方法であって、被験体から得た生体サンプル中のＢｃｌ−２の存在を検出するステップを含み、所定の閾値を上回るＢｃｌ−２のレベルが被験体における癌を示すものである前記方法。
【請求項２】
前記検出ステップが、
（ａ）生体サンプルを、Ｂｃｌ−２タンパク質と結合して複合体を形成する結合剤と接触させるステップと、
（ｂ）複合体を検出するステップと、検出された複合体を、サンプル中のＢｃｌ−２タンパク質の量と関連付けるステップと
を含み、高まったＢｃｌ−２タンパク質の存在が癌を示すものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生体サンプルが尿である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
癌が卵巣癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
結合剤が支持体上に固定されている、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記の（ｂ）の検出ステップが、ＥＬＩＳＡに基づく免疫酵素的検出を用いる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記のＢｃｌ−２の検出ステップの前に、間に、または後に、被験体から得られた同一生体サンプルまたは異なる生体サンプルにおいて、癌のバイオマーカーを検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
バイオマーカーが、ＣＡ１２５、ＬＰＡまたはＯＶＸＩである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記検出ステップが実施される時点で、被験体が癌の症状を示していない、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
体液のサンプル中のＢｃｌ−２の迅速検出のための装置であって、体液のサンプルを受容するための適用ゾーンと、サンプル中のＢｃｌ−２と結合する結合剤を含有する標識ゾーンと、Ｂｃｌ−２が結合している結合剤がシグナルを与えるよう保持される検出ゾーンとを含み、閾値濃度よりも低いレベルのＢｃｌ−２を有する被験体から得たサンプルに与えられるシグナルが、閾値濃度よりも高いＢｃｌ−２レベルを有する患者から得たサンプルに与えられるシグナルとは異なるものである前記装置。
【請求項１１】
体液が尿であり、前記閾値濃度が０ｎｇ／ｍｌ〜２．０ｎｇ／ｍｌの間である、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
体液が尿であり、前記閾値濃度が１．８ｎｇ／ｍｌである、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
閾値濃度と等しいＢｃｌ−２レベルを有する被験体から得たサンプルに対して検出ゾーンにおいて与えられるシグナルと同一強度を有するシグナルを与える参照ゾーンを有する、請求項１０に記載の装置。
【請求項１４】
結合剤がタグを付けたモノクローナル抗体である、請求項１０に記載の装置。
【請求項１５】
体液中のＢｃｌ−２を測定する方法であって、（ａ）被験体から体液のサンプルを得るステップと、（ｂ）サンプルを、サンプル中の任意のＢｃｌ−２と結合する結合剤と接触させるステップと、（ｃ）Ｂｃｌ−２が結合している結合剤を分離するステップと、（ｄ）（ｃ）からの分離された結合剤と関連するシグナルを検出するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）において検出されたシグナルを、閾値濃度と等しいＢｃｌ−２レベルを有する被験体から得たサンプルによって与えられるシグナルに対応する参照シグナルと比較するステップとを含む方法。
【請求項１６】
体液が尿であり、前記閾値濃度が０ｎｇ／ｍｌ〜２．０ｎｇ／ｍｌの間である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
体液が尿であり、前記閾値濃度が１．８ｎｇ／ｍｌの間である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
結合剤を用い、生体液を用いて癌を検出するための、Ｂｃｌ−２に特異的な結合剤と、印刷された説明書とを含む、生体サンプル中の癌を検出するためのキット。
【請求項１９】
生体サンプルに適用される１種以上のプロテアーゼ阻害剤をさらに含む、請求項１８に記載のキット。
【国際調査報告】
2009526234.tif 000034
2009526234.tif 000035