(57)【要約】  複数の化合物を足場構造にカップリングさせる組成物および方法が提供される。少なくとも１個の末端アルキン部分と少なくとも１個のアジド部分との反応を触媒する組成物および方法がさらに提供され、ここで、一方の部分は化合物に結合しており、他方の部分は足場構造に結合しており、それにより少なくとも１個のトリアゾールを形成させる。
2009501717.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物を足場構造にカップリングさせる方法であって、
化合物上の少なくとも１個の末端アルキン部分と、足場構造上の少なくとも１個のアジド部分との反応を触媒し、それにより少なくとも１個のトリアゾールを形成させること、
触媒作用は、金属イオンの配位子の存在下に該金属イオンを添加することによりもたらされること、および、
足場構造は、複数の化合物分子が足場構造とカップリングできるように、複数のそのようなアジド部分を有すること、
を含む方法。
【請求項２】
配位子が、単座、二座または多座のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
金属が、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、ＡｕまたはＨｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
金属が、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、ＰｔまたはＡｕである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
金属が、不均一な銅、金属銅、酸化銅または銅塩である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
Ｃｕ（Ｉ）の添加により反応を触媒することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）にその場で還元するための還元剤の存在下でＣｕ（ＩＩ）を添加することにより反応を触媒することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｃｕ（０）をＣｕ（Ｉ）にその場で酸化するための酸化剤の存在下でＣｕ（０）を添加することにより反応を触媒することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ルテニウムの添加により反応を触媒することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
足場構造が、固体表面、タンパク質、核タンパク質、タンパク質凝集体、タンパク質ナノ粒子、核タンパク質ナノ粒子、ヴォールト（vault）タンパク質またはデンドリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質ナノ粒子または核タンパク質ナノ粒子が、ウイルスまたはウイルス性ナノ粒子である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
足場構造が、常磁性粒子、半導体ナノ粒子、量子ドット、金属ナノ粒子、ガラスビーズ、ポリマービーズ、多孔性表面、膜、電極、多孔性物質、多孔性の繊維をベースとする物質、ゼオライト、粘土または細孔性ガラス（controlled-pore glass）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
足場構造毎に多数の化合物分子をカップリングさせることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ウイルス性ナノ粒子毎に多数の化合物分子をカップリングさせることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ウイルス性ナノ粒子毎に１００個またはそれ以上の化合物分子をカップリングさせることをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ウイルス性ナノ粒子毎に１５０個またはそれ以上の化合物分子をカップリングさせることをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ウイルス性ナノ粒子毎に２００個またはそれ以上の化合物分子をカップリングさせることをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ウイルス性ナノ粒子がササゲモザイクウイルスナノ粒子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
化合物が、低分子、金属錯体、ポリマー、炭水化物、タンパク質またはポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
化合物が、トランスフェリン、ＲＧＤ含有ポリペプチド、炭疽毒素の感染防御抗原、ポリエチレングリコールまたは葉酸である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
化合物を足場構造にカップリングさせる方法であって、
化合物上の少なくとも１個のアジド部分と、足場構造上の少なくとも１個の末端アルキン部分との反応を触媒し、それにより少なくとも１個のトリアゾールを形成させること、
触媒作用は、金属イオンの配位子の存在下に金属イオンを添加することによりもたらされること、および、
足場構造は、複数の化合物分子が足場構造とカップリングできるように、複数のそのような末端アルキン部分を有すること、
を含む方法。
【請求項２２】
配位子が、単座、二座または多座のものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
金属が、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、ＡｕまたはＨｇである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
金属が、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、ＰｔまたはＡｕである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
金属が、不均一な銅、金属銅、酸化銅または銅塩である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
Ｃｕ（Ｉ）の添加により反応を触媒することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）にその場で還元するための還元剤の存在下でＣｕ（ＩＩ）を添加することにより反応を触媒することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
Ｃｕ（０）をＣｕ（Ｉ）にその場で酸化するための酸化剤の存在下でＣｕ（０）を添加することにより反応を触媒することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
ルテニウムの添加により反応を触媒することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
足場構造が、固体表面、タンパク質、核タンパク質、タンパク質凝集体、タンパク質ナノ粒子、核タンパク質ナノ粒子、ヴォールトタンパク質またはデンドリマーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
タンパク質ナノ粒子または核タンパク質ナノ粒子が、ウイルスまたはウイルス性ナノ粒子である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
足場構造が、常磁性粒子、半導体ナノ粒子、量子ドット、金属ナノ粒子、ガラスビーズ、ポリマービーズ、多孔性表面、膜、電極、多孔性物質、多孔性の繊維をベースとする物質、ゼオライト、粘土または細孔性ガラスである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
足場構造毎に多数の化合物分子をカップリングさせることをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
ウイルス性ナノ粒子毎に多数の化合物分子をカップリングさせることをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
ウイルス性ナノ粒子毎に１００個またはそれ以上の化合物分子をカップリングさせることをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ウイルス性ナノ粒子毎に１５０個またはそれ以上の化合物分子をカップリングさせることをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
ウイルス性ナノ粒子毎に２００個またはそれ以上の化合物分子をカップリングさせることをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
ウイルス性ナノ粒子がササゲモザイクウイルスナノ粒子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
化合物が、低分子、金属錯体、ポリマー、炭水化物、タンパク質またはポリヌクレオチドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項４０】
化合物が、トランスフェリン、ＲＧＤ含有ポリペプチド、炭疽毒素の感染防御抗原、ポリエチレングリコールまたは葉酸である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
第１の反応物上の少なくとも１個の末端アルキン部分と第２の反応物上の少なくとも１個のアジド部分との反応を触媒し、それにより少なくとも１個のトリアゾールを形成させること、
触媒作用は、金属イオンの配位子の存在下で金属を添加することによりもたらされること、
第１の反応物は、複数の第２の反応物が第１の反応物とカップリングできるように、複数の末端アルキン部分を有するか、または、第２の反応物は、複数の第１の反応物が第２の反応物とカップリングできるように、複数のアジド部分を有すること、
を含む方法。
【請求項４２】
配位子が、単座、二座または多座のものである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
金属が、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、ＡｕまたはＨｇである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
金属が、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、ＰｔまたはＡｕである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
金属が、不均一な銅、金属銅、酸化銅または銅塩である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
Ｃｕ（Ｉ）の添加により反応を触媒することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）にその場で還元するための還元剤の存在下でＣｕ（ＩＩ）を添加することにより反応を触媒することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
Ｃｕ（０）をＣｕ（Ｉ）にその場で酸化するための酸化剤の存在下でＣｕ（０）を添加することにより反応を触媒することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
ルテニウムの添加により反応を触媒することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
第１の反応物が、第２の反応物をカップリングさせるための複数の末端アルキン部分を有する足場構造である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
第２の反応物が、１個またはそれ以上のアジド部分を有する化合物である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
第２の反応物が、第１の反応物をカップリングさせるための複数のアジド部分を有する足場構造である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５３】
第１の反応物が、１個またはそれ以上の末端アルキン部分を有する化合物である、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援の明言
本発明は、国立衛生研究所から助成金番号ＥＢ００４３２およびＮ０１−ＣＯ−２７１８１の政府支援を受けて成された。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願への相互参照
本願は、２００５年７月１４日に出願された米国仮出願番号６０／６９９,９８５、および、速達郵便番号ＥＶ６７０６７２０４４ＵＳでにより２００６年７月１３日に出願された「複数の化合物を足場構造（scaffold）にカップリングさせるための組成物および方法」と題する米国出願の優先権を主張し、これらの全開示を出典明示により本明細書の一部とする。
【０００３】
分野
本発明は、複数の化合物を足場構造にカップリングさせるための組成物および方法に関する。本発明は、さらに、少なくとも１個の末端アルキン部分と少なくとも１個のアジド部分との間の反応を触媒するための組成物および方法を提供し、そこでは、一方の部分が化合物に結合しており、他方の部分が足場構造に結合しており、それにより少なくとも１個のトリアゾールを形成する。
【背景技術】
【０００４】
背景
直鎖状ポリマーおよびデンドリマーをベースとする炭水化物誘導体の多価クラスター形成は、炭水化物をベースとする細胞の過程の研究において有効な手段であり、治療剤の開発において有用な戦略であることが明らかになった。Spaltenstein and Whitesides, J. Am. Chem. Soc. 113: 686, 1991; Gordon et al., Nature 392: 30, 1998; Griffith et al., J. Am. Chem. Soc. 126: 1608, 2003; Owen et al., Org. Lett. 4: 2293, 2002; Gestwicki et al., Chem. Biol. 9: 163, 2002; Gestwicki and Kiessling, Nature 415: 81, 2002; Cairo et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 1615, 2002; Nagasaki et al., Biomacromolecules  2: 1067, 2001; Woller et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 8820, 2003; Woller and Cloninger, Org. Lett. 4: 7, 2002; Thoma et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41: 3195, 2002; Roy et al., J. Am. Chem. Soc. 123: 1809, 2001; Ortega-Caballero et al., J. Org. Chem. 66: 7786, 2001; Zanini and Roy, J. Org. Chem.  63: 3486, 1998; Page and Roy, Bioconj. Chem. 8: 714, 1997; Page et al., Chem. Commun., 1913, 1996; Roy et al., J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1869, 1993; Bader et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 20: 91, 1981; Matrosovich, FEBS Lett. 252: 1, 1989; Kamitakahara et al., Angew. Chem. Int. Ed. 37: 1524, 1998。炭水化物の濃いクラスターは、末端官能化グリコポリマーをタンパク質などの生体適合性の足場構造に整列させることにより形成できる。そのようなポリマーは、シアノキシル（cyanoxyl）に媒介されるフリーラジカル重合（アミン、カルボン酸、ヒドラジドまたはビオチン部分を有する開始剤を用い、続いて、ビオチン−アビジン結合によりタンパク質を結合させる）、および、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ；Ｎ−ヒドロキシスクシンアミドまたはピリジルジスルフィド末端基を含有する側鎖ＰＥＧまたはポリ（ＨＥＭＡ）ポリマー、リゾチームおよびＢＳＡへのタンパク質の結合を伴う）により、最近調製された。Hou et al., Bioconj. Chem. 15: 954, 2004; Sun et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 7258, 2002; Bontempo et al., J. Am. Chem. Soc. 126: 15372, 2004; Lecolley et al., Chem. Commun., 2026, 2004。
【０００５】
分子を生物学的構造に結合させることによる生物学的結合（bioconjugation）の方法は、"Bioconjugate Techniques" by Greg T. Hermanson, Academic Press, 1996, ISBN 0-12-342336-8 で概説された。生体結合のさらなる方法は、「天然化学連結（native chemical ligation）」を利用する。天然化学連結（ＮＣＬ）のために、２個の完全に保護されていない合成ペプチドフラグメントを、通常（天然）のペプチド結合を連結部位で形成させて、中性水性条件下で化学的に連結させる。ＮＣＬ反応は、ペプチドまたはタンパク質鎖上にＮ−末端システインを必要とし、それ故にその応用において限定される。Gentle et al., Bioconjugate Chem. 15: 658-663, 2004; Muir, Synlett 6: 733-740, 2001。
【０００６】
生体結合は、溶媒としての水と適合し得る最も活性かつ選択的な有機反応を必要とする。最大の可能な範囲の反応パートナーおよびより高い反応速度選択性を可能にするために、上記の方法の改良が必要である。有機アジドは、それらの生物学的分子に対して不活性である性質およびそれらのホスフィン−エステルとのシュタウディンガー連結およびアルキンとの１,３−双極性環化付加反応への参与のために、幅広い適用を達成した。Lemieux and Bertozzi, TIBTECH 16: 506, 1998; Saxon et al., Org. Lett. 2: 2141, 2000; Saxon and Bertozzi, Science 287: 2007, 2000; Kiick et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 19, 2002; Wang et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 3192, 2003; Speers et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 4686, 2003; Link and Tirrell, J. Am. Chem. Soc. 125: 11164, 2003; Link et al., J. Am. Chem. Soc. 126: 10598, 2004。後者の過程は、希釈条件下での生体結合適用の必要性から、並はずれて速く、多用途であり得る。金属触媒を必要とせず、もっと遅いが、生体結合に使用されてきたアジド−アルキン反応の変形物がある。これは、アルキンをより反応性にすることにより行い、従ってそのような分子に限定される。Prescher and Bertozzi, J. Am. Chem. Soc. 126: 15046, 2004。それは、小さいデンドリマー型多価炭水化物集合の創成を含む、幅広い様々な他の応用にも使用されてきた。Wang et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 3192, 2003; Lewis et al., J. Am. Chem. Soc. 126: 9152, 2004; Gupta et al., unpublished results; Calvo-Flores et al., Org. Lett., 2: 2499, 2000; Perez-Balderas et al., Org. Lett., 5: 1951, 2003; Bodine et al., J. Am. Chem. Soc. 126: 1638, 2004。原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）も、複数の炭水化物基を有するポリマー鎖の創成に使用できる。Ｃｕ（Ｉ）錯体は、ＡＴＲＰおよびアジド−アルキン環化付加（ＡＡＣ）反応の両方を触媒するので、それらの組合せは理にかなう。Matyjaszewski et al., Macromolecules 31: 5967, 1998; Xia et al., Macromolecules 31: 5958, 1998; Matyjaszewski et al., Macromolecules 34: 430, 2001; Rostovtsev et al., Angew. Chem. Int. Ed., 41: 2596, 2002; Tornoe et al., J. Org. Chem., 67: 3057, 2002。
【０００７】
ウイルスは、機能的構造の多価的提示のために、興味をそそる足場構造である。化学をベースとする研究には、ウイルスケージ中またはその周辺の無機物質、表面上でのウイルスの組織化、および、有機化合物のウイルスコートタンパク質への化学的結合が含まれた。Klem et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 10806, 2003; Douglas et al., Adv. Mater. 14: 415, 2002; Douglas and Young, Nature 393: 152, 1998; Shenton et al., Adv. Mater. 11: 253, 1999; Douglas and Young, Adv. Mater. 11: 679, 1999; Whaley et al., Nature 405: 665, 2000; Lee et al., Science 296: 892, 2002; Mao et al., Science 303: 213, 2004; Wang et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41: 459, 2002; Wang et al., Chem. Biol. 9: 805, 2002; Wang et al., Chem. Biol. 9: 813, 2002; Wang et al., Bioconj. Chem. 14: 38, 2003; Meunier et al., Chem. Biol. 11: 319, 2004; Gillitzer et al., Chem. Commun., 2390, 2002; Flenniken et al., Nano Lett. 3: 1573, 2003; Hooker et al., J. Am. Chem. Soc. 2004: 3718, 2004; Wu et al., Bioconj. Chem. 6: 587, 1995。この領域の研究は、化学的構成要素としてのウイルス粒子の広範な探索を含み、原型としてササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）に焦点を当てた。この植物ウイルスは、大量に作成および精製でき、原子に近い解像度まで構造的に特徴解析され、疎水および親水分子の両方と適合する様々な条件に対して安定であり、遺伝子レベルで操作して所望の位置に突然変異を導入できる。１つの目標は、キャプシドタンパク質に機能的分子を結合させることによりウイルス粒子に新しい機能を与え、それにより診断および治療的適用を有する新しい種を生成させることである。単一の炭水化物化合物のＣＰＭＶ残基への結合は、多価レクチン結合特性を有するデンドリマー様ディスプレイをもたらす。Raja et al., ChemBioChem 4: 1348, 2003。ＣＰＭＶは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）で誘導体化され、コートタンパク質集合体の外表面に、良好に制御されるポリマーの負荷量をもたらした。Raja et al., Biomacromolecules 4: 472, 2003。得られる結合体は、物理的特性の変化および免疫原性の低下を示し、これは、ＰＥＧ化アデノウイルスベクターに関する過去の報告と合致する。Fisher et al., Polym. Prepr. (Am. Chem. Soc., Div. Polym. Chem.) 41, 1012, 2000; O'Riordan et al., Hum. Gene Ther. 10: 1349, 1999; Marlow et al., Proc. Int. Symp. Controlled Release Bioact. Mater. 26: 555, 1999。ウイルス粒子への共有結合的結合を作る必要性は、生体結合のひとつの例示的適用である。タンパク質への共有結合形成は、タンパク質上の複数の保護されていない基および通常の低い濃度により困難になる。当分野には、結合の効率を高め、各ウイルス粒子に結合できる機能的分子の数を増やすために、より有効な結合過程に対する必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００８】
要約
複数の化合物を足場構造にカップリングさせる組成物および方法が提供される。足場構造は、生物学的または非生物学的表面であり得る。足場構造には、例えば、固体表面、タンパク質、ガラスビーズまたはポリマービーズが含まれる。足場構造には、さらに、ウイルスおよび他の大型集合体を含む、タンパク質または核タンパク質ナノ粒子が含まれる。足場構造には、さらに、例えば、ウイルスナノ粒子上のタンパク質が含まれる。足場構造にカップリングさせる化合物には、例えば、低分子、金属錯体、ポリマー、炭水化物、タンパク質またはポリヌクレオチドが含まれる。Ｃｕ（Ｉ）に触媒される原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）およびアジド−アルキン環化付加反応のための組成物および方法は、協同して、末端官能化化合物、例えば、グリコポリマー、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは金属錯体の合成、および、それらの足場構造、例えば、適切に修飾されたウイルスタンパク質の足場構造への結合に、多用途の方法を提供する。細胞表面レクチンへの多価的結合を目的として、ＡＴＲＰによるアジドで終結するグリコポリマーの構築、フルオロフォアによるそれらの末端標識化、および、後続のこれらの化合物のウイルス粒子への高収率での結合のための、さらなる組成物および方法が提供される。複数の化合物を足場構造に共有結合的にカップリングさせる組成物および方法は、効率と選択性の増加を伴って、幅広い生物学的および非生物学的表面へのカップリング反応を提供する。
【０００９】
化合物を足場構造にカップリングさせる方法が提供され、これは、化合物上の少なくとも１個の末端アルキン部分と足場構造上の少なくとも１個のアジド部分との反応を触媒し、それにより少なくとも１個のトリアゾールを形成させ、触媒作用は、金属イオンの配位子の存在下で金属イオンを添加することによりもたらされ、足場構造は、複数の化合物の分子が足場構造とカップリングできるように、複数のそのようなアジド部分を有することを含む。ある態様では、配位子は、単座、二座または多座のものである。さらなる態様では、金属は、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、ＡｕまたはＨｇである。
【００１０】
さらなる態様では、金属は、不均一な銅、金属銅、酸化銅または銅塩である。この方法は、さらに、Ｃｕ（Ｉ）の添加により反応を触媒することを提供する。この方法は、さらに、Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）にその場で還元するための還元剤の存在下でＣｕ（ＩＩ）を添加することにより反応を触媒することを提供する。この方法は、さらに、Ｃｕ（０）をＣｕ（Ｉ）にその場で酸化するための酸化剤の存在下でＣｕ（０）を添加することにより反応を触媒することを提供する。
【００１１】
足場構造は、生物学的または非生物学的表面であり得る。ある態様では、足場構造は、固体表面、タンパク質、タンパク質凝集体、または、核タンパク質である。足場構造には、さらに、ウイルス、ウイルス性ナノ粒子、ヴォールト（vault）タンパク質、デンドリマーまたは他の大型集合体を含むタンパク質ナノ粒子または核タンパク質ナノ粒子が含まれる。詳細な態様では、ウイルスまたはウイルス性ナノ粒子は、ササゲモザイクウイルスナノ粒子である。足場構造は、タンパク質凝集体、例えば、キーホールリンペットヘモシアニンまたは破傷風毒素であり得る。
【００１２】
足場構造は、非生物学的表面、例えば、粒子、ガラスビーズ、金属ナノ粒子、金粒子、ポリマービーズ、膜、電極、または、繊維をベースとする物質、ゼオライト、粘土もしくは細孔性ガラス（controlled-pore glass）などの多孔性物質であり得る。粒子は、常磁性粒子、半導体ナノ粒子または量子ドットであり得る。
【００１３】
さらなる態様では、化合物は、低分子、金属錯体、ポリマー、炭水化物、タンパク質またはポリヌクレオチドである。詳細な態様では、化合物は、トランスフェリン、ＲＧＤ含有ポリペプチド、炭疽毒素の感染防御抗原、ポリエチレングリコールまたは葉酸である。
【００１４】
この方法は、さらに、足場構造毎に多数の化合物分子をカップリングさせることを提供する。この方法は、さらに、ウイルス性ナノ粒子毎に多数の化合物分子をカップリングさせることを提供する。さらなる詳細な態様では、この方法は、ウイルス性ナノ粒子毎に１００個またはそれ以上の化合物分子をカップリングさせることを提供する。さらなる詳細な態様では、この方法は、ウイルス性ナノ粒子毎に１５０個またはそれ以上の化合物分子をカップリングさせることを提供する。さらなる詳細な態様では、この方法は、ウイルス性ナノ粒子毎に２００個またはそれ以上の化合物分子をカップリングさせることを提供する。
【００１５】
化合物を足場構造にカップリングさせる方法が提供され、これは、化合物上の少なくとも１個のアジド部分と足場構造上の少なくとも１個の末端アルキン部分との反応を触媒し、それにより少なくとも１個のトリアゾールを形成させ、触媒作用は、金属イオンの配位子の存在下で金属イオンを添加することによりもたらされ、足場構造は、複数の化合物の分子が足場構造とカップリングできるように、複数のそのような末端アルキン部分を有することを含む。ある態様では、配位子は、単座、二座または多座のものである。さらなる態様では、金属は、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、ＡｕまたはＨｇである。
【００１６】
さらなる態様では、金属は、不均一な銅、金属銅、酸化銅または銅塩である。この方法は、さらに、Ｃｕ（Ｉ）の添加により反応を触媒することを提供する。この方法は、さらに、Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）にその場で還元するための還元剤の存在下でＣｕ（ＩＩ）を添加することにより反応を触媒することを提供する。この方法は、さらに、Ｃｕ（０）をＣｕ（Ｉ）にその場で酸化するための酸化剤の存在下でＣｕ（０）を添加することにより反応を触媒することを提供する。
【００１７】
ある態様では、足場構造は、固体表面、タンパク質、ガラスビーズまたはポリマービーズである。さらなる態様では、足場構造はウイルス性ナノ粒子である。詳細な態様では、ウイルス性ナノ粒子は、ササゲモザイクウイルスナノ粒子である。さらなる態様では、化合物は、低分子、金属錯体、ポリマー、炭水化物、タンパク質またはポリヌクレオチドである。詳細な態様では、化合物は、トランスフェリン、ＲＧＤ含有ポリペプチド、炭疽毒素の感染防御抗原、ポリエチレングリコールまたは葉酸である。
【００１８】
この方法は、さらに、足場構造毎に多数の化合物分子をカップリングさせることを提供する。この方法は、さらに、ウイルス性ナノ粒子毎に多数の化合物分子をカップリングさせることを提供する。さらなる詳細な態様では、この方法は、ウイルス性ナノ粒子毎に１００個またはそれ以上の化合物分子をカップリングさせることを提供する。さらなる詳細な態様では、この方法は、ウイルス性ナノ粒子毎に１５０個またはそれ以上の化合物分子をカップリングさせることを提供する。さらなる詳細な態様では、この方法は、ウイルス性ナノ粒子毎に２００個またはそれ以上の化合物分子をカップリングさせることを提供する。
【００１９】
第１の反応物上の少なくとも１個の末端アルキン部分と第２の反応物上の少なくとも１個のアジド部分との反応を触媒し、それにより少なくとも１個のトリアゾールを形成させ、触媒作用は、金属イオンの配位子の存在下で金属を添加することによりもたらされ、第１の反応物は、複数の第２の反応物が第１の反応物とカップリングできるように、複数の末端アルキン部分を有するか、または、第２の反応物は、複数の第１の反応物が第２の反応物とカップリングできるように、複数のアジド部分を有することを含む方法が提供される。ある態様では、配位子は、単座、二座または多座のものである。さらなる態様では、金属は、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、ＡｕまたはＨｇである。
【００２０】
さらなる態様では、金属は、不均一な銅、金属銅、酸化銅または銅塩である。この方法は、さらに、Ｃｕ（Ｉ）の添加により反応を触媒することを提供する。この方法は、さらに、Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）にその場で還元するための還元剤の存在下でＣｕ（ＩＩ）を添加することにより反応を触媒することを提供する。この方法は、さらに、Ｃｕ（０）をＣｕ（Ｉ）にその場で酸化するための酸化剤の存在下でＣｕ（０）を添加することにより反応を触媒することを提供する。
【００２１】
ある態様では、第１の反応物は、第２の反応物をカップリングさせるための複数の末端アルキン部分を有する足場構造であり、第２の反応物は、１個またはそれ以上のアジド部分を有する化合物である。
【００２２】
他の態様では、第２の反応物は、第１の反応物をカップリングさせるための複数のアジド部分を有する足場構造であり、第１の反応物は、１個またはそれ以上の末端アルキン部分を有する化合物である。
【００２３】
図面の簡単な説明
図１は、グリコポリマーおよびウイルス−ポリマー結合体の合成を示す。
図２は、（Ａ）野生型ＣＰＭＶおよびグリコポリマー結合体９のサイズ排除ＦＰＬＣ（Superose 6）。（Ｂ）野生型ＣＰＭＶおよびウイルス−ポリマー結合体９のコンカナバリン−Ａ Sepharose カラムでのＦＰＬＣ。（Ｃ）９（レーン１）およびＷＴ−ＣＰＭＶ（レーン２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（Ｄ）ネガティブ染色した９のＴＥＭおよび９で囲まれたＷＴ−ＣＰＭＶ粒子の拡大ＴＥＭ像を示す。
図３は、ポリマーで被覆された表面の構築が、重合、末端標識化および結合段階のＣｕＩ触媒作用により便利になることを示す。
図４は、ｃｏｎ−Ａおよび９の混合物の凝集の時間経過を示す。
図５は、ＣＰＭＶへのＣｕＡＡＣ結合に使用される基質を示す。
図６は、標準的Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル化学を使用して、表面に露出したリジン残基においてアルキンまたはアジドで標識化されたウイルスキャプシドを示す。
図７は、染料積載量の反応物質濃度への依存を示す。
【００２４】
図８は、ＣＰＭＶ−（１３）９０およびＣＰＭＶ−（５）１１０のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
図９は、（Ａ）野生型ＣＰＭＶおよびＣＰＭＶ−（１４）ｎのサイズ除去ＦＰＬＣ。（Ｂ）野生型ＣＰＭＶ、ＴｆｎおよびＣＰＭＶ−（１４）ｎの、SimplyBlue（商標）で染色したゲル。（Ｃ）ネガティブ染色した野生型ＣＰＭＶのＴＥＭ。（Ｄ）ＣＰＭＶ−（１４）ｎのネガティブ染色したＴＥＭを示す。
図１０は、ＣＰＭＶ−５のサイズ排除ＦＰＬＣのトレースを示す。
図１１は、リン酸緩衝塩水中のガレクチン−４およびＣＰＭＶ−８ｂの混合物について、４９０ｎｍでモニターした凝集の時間経過を示す。
図１２は、野生型ＣＰＭＶおよびＣＰＭＶ−１３のサイズ排除ＦＰＬＣを示す。
図１３は、ＣＰＭＶまたはヒトＴｆｎに対するポリクローナル抗体を使用する、ＣＰＭＶ−１４のウエスタンブロットを示す。
図１４は、配位子の例、例えば、二座配位子を示す。
【００２５】
詳細な説明
複数の化合物を足場構造にカップリングさせる組成物および方法が提供される。足場構造は、生物学的または非生物学的表面であり得る。足場構造は、例えば、固体表面、タンパク質、ガラスビーズまたはポリマービーズであり得る。足場構造には、さらに、例えば、ウイルス性ナノ粒子上のタンパク質が含まれる。足場構造にカップリングする化合物は、例えば、低分子、金属錯体、ポリマー、炭水化物、タンパク質またはポリヌクレオチドであり得る。金属に触媒される原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）およびアジド−アルキン環化付加反応のための組成物および方法がさらに提供され、これらは、協同して、末端官能化化合物、例えば、グリコポリマー、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは金属錯体の合成、および、それらの足場構造、例えば、適切に修飾されたウイルスタンパク質の足場構造への結合のための多用途の方法を提供する。金属は、例えば、金属イオンの配位子の存在下のＣｕ（０）、Ｃｕ（Ｉ）またはＣｕ（ＩＩ）であり得る。複数の化合物を足場構造に共有結合的にカップリングさせる組成物および方法は、効率と選択性の増加を伴って、幅広い生物学的および非生物学的表面へのカップリング反応を提供する。
【００２６】
タンパク質への共有結合形成は、それらの複数の保護されていない官能基および通常の低い濃度により困難になる。水溶性スルホン化バソフェナントロリン配位子２は、生物学的に意味のある分子のササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ナノ粒子への化学選択的結合のための、高効率のＣｕ（Ｉ）に媒介されるアジド−アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）反応を促進するために使用できる。連結される基質には、複合糖類、ペプチド、ポリ（エチレンオキシド）ポリマー、および、鉄担持タンパク質のトランスフェリン（Ｔｆｎ）が含まれ、常套の配位子トリス（トリアゾリル）アミン（１）を使用するアジド−アルキンカップリングに以前は抵抗性であった場合でさえ、連結が成功する。４−６当量の基質の使用は、６０−８５％の収率で分子６０−１１５個／ビリオンの積載量を達成するのに十分であった。それは酸素に敏感であるが、Ｃｕ−配位子・２システムの確実に効率的な性能は、それを要求の厳しい生体結合適用に有用な手段にする。
【化１】
2009501717.tif 000003
【００２７】
少なくとも１個の末端アルキン部分と少なくとも１個のアジド部分との反応を触媒する組成物および方法が提供され、ここで、一方の部分は化合物に結合しており、他方の部分は足場構造に結合しており、それにより少なくとも１個のトリアゾールを形成させる。化合物を足場構造にカップリングさせる方法が提供され、これは、化合物に結合した少なくとも１個の末端アルキン部分と、足場構造に結合した少なくとも１個のアジド部分との反応を触媒し、それにより少なくとも１個のトリアゾールを形成させ、配位子の存在下で金属イオンを添加することにより触媒作用をもたらし、複数の化合物分子が足場構造とカップリングできるように、アジド部分を有する複数の部位を足場構造上に提供することを含む。さらなる実施態様は、化合物を足場構造にカップリングさせる方法を提供し、これは、足場構造に結合した少なくとも１個の末端アルキン部分と、化合物に結合した少なくとも１個のアジド部分との連結反応を触媒し、それにより少なくとも１個のトリアゾールを形成させ、配位子の存在下で金属イオンを添加することにより触媒作用をもたらし、複数の化合物分子が足場構造とカップリングできるように、末端アルキン部分を有する複数の部位を足場構造上に提供することを含む。
【００２８】
本発明は、特定の方法、反応物質、化合物、組成物または生物学的システムに限定されず、これらは当然変更できることを理解すべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施態様を説明するためだけのものであり、限定的であることを意図しないことも理解すべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、「ある（a）」「ある（an）」および「この（the）」などで示される単数的表現には、内容が明確にそうではないと示さない限り、複数の指示物が含まれる。従って、例えば、「細胞」への言及には、２個またはそれ以上の細胞の組合せが含まれる、などということである。
【００２９】
量、時間的な期間などの測定可能な値に言及する場合に本明細書で使用するとき、「約」は、特定された値から、±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、より一層好ましくは±１％、そしてさらにより好ましくは±０.１％の変動を、そのような変動は開示される方法の実施に適当であるので、包含することを意味する。
【００３０】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価のいかなる方法および物質も本発明の試験の実施に使用できるが、好ましい物質および方法を本明細書に記載する。本発明の説明および特許請求において、以下の用語を使用する。
【００３１】
「複数の部位」は、足場構造分子毎に２個またはそれ以上の化合物を結合できる、足場構造分子上の２個またはそれ以上の部位を表す。足場構造および化合物の性質に依存して、１００個またはそれ以上、２００個またはそれ以上、または、３００個またはそれ以上の化合物分子を足場構造分子毎に結合させることができる。ある態様では、足場構造分子は、ウイルス性ナノ粒子、例えばＣＰＭＶナノ粒子のタンパク質である。
【００３２】
「末端アルキン部分」は、１個の炭素に結合した水素を有するアセチレン結合（炭素−炭素三重結合）、例えば、Ｒ−Ｃ≡Ｃ−Ｈを表し、ここで、Ｒは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、グリコポリマー、発色団の染料、グリカンまたは脂質を含むがこれらに限定されない化合物である。
【００３３】
「アジド部分」は、Ｎ≡Ｎ＋−Ｎ−−の部分を表す。アジド部分は、一般構造Ｎ≡Ｎ＋−Ｎ−−Ｒを有する化合物に結合でき、ここで、Ｒは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、グリコポリマー、発色団の染料、グリカンまたは脂質を含むがこれらに限定されない化合物である。
【００３４】
本発明は、活発な重合過程のためにアジドを含有する開始剤を使用し、続いて唯一のアジド末端基のクリック化学的生成を行う、化合物、例えば、グリコポリマー、ポリエチレングリコール、発色団の染料、葉酸、グリカン、脂質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質またはトランスフェリンの末端官能化のための効率的な戦略を提供する。銅に触媒される環化付加反応は、カップリング剤、化合物分子および足場構造分子を効率的に使用して、そのようなポリマーの官能化ウイルスコートタンパク質への非常に効率的なカップリングをもたらす。本発明のある実施態様では、単一の活性化された鎖の末端を有する十分に定義された側鎖ネオグリコポリマーは、「バイオ直交（bioorthogonal）」様式で、タンパク質または生体ナノ粒子に効率的に化学的に結合できる。生体分子のバイオ直交的標識化は、生体分子の機能および細胞の運命を研究するために重要な手段である、独特のインビボ標識を提供する。細胞の溶解は多くの人為的結果を導入するので、注目は、生きている細胞における生体分子の標識化に徐々に集まっている。この方法は、さらに、連結反応に使用される標識の性質において高い多様性を提供する。
【００３５】
ある実施態様では、化合物を足場構造にカップリングさせる方法は、金属イオンを配位子の存在下で添加することにより、末端アルキン部分を有する第１の反応物と、アジド部分を有する第２の反応物との反応を触媒し、トリアゾール部分を有する生成物を形成させることを含む。金属イオンには、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、ＡｕまたはＨｇが含まれるが、これらに限定されない。詳細な実施態様では、金属には、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、ＰｔまたはＡｕが含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＰＣＴ国際出願ＷＯ２００３／１０１９７２参照。
【００３６】
さらなる詳細な実施態様では、金属は、不均一な銅、金属銅、酸化銅または銅塩である。
銅（Ｉ）塩、例えば、Ｃｕ（Ｉ）、ＣｕＯＴｆ・Ｃ６Ｈ６および［Ｃｕ（ＮＣＣＨ３）４］ＰＦ６は、還元剤の非存在下で直接使用することもできる。これらの反応は、通常、共溶媒としてのアセトニトリルおよび１当量の窒素塩基（例えば、２,６−ルチジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンまたはピリジン）を必要とする。しかしながら、望まれない副生成物、主にジアセチレン類、ビス−トリアゾール類および５−ヒドロキシトリアゾール類の形成がしばしば観察された。Ｃｕ（Ｉ）錯体と二酸素の反応の最近の要約には、Schindler, Eur. J. Inorg. Chem. 2311-2326, 2000 and Blackman and Tolman in Structure and Bonding, B. Meunier, Ed., Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 97: 179-211, 2000 参照。Ｃｕ（Ｉ）種の直接使用に伴うこの厄介事は、２,６−ルチジンを使用すると最小化され、酸素の排除は、さらに生成物の純度と収率を改善した。
【００３７】
ある実施態様では、連結反応は、Ｃｕ（Ｉ）の添加により触媒できる。Ｃｕ（Ｉ）塩を直接使用するならば、還元剤は必要ないが、アセトニトリルまたは他の上記の配位子の１種を溶媒として使用でき（Ｃｕ（Ｉ）のＣｕ（ＩＩ）への急速な酸化を防止するため）、１当量のアミンを添加して反応を加速できる。この場合、より良好な収率および生成物の純度のために、酸素を排除すべきである。従って、アスコルビン酸塩または任意の他の還元操作が、還元しない操作よりもしばしば好ましい。還元剤の使用は、操作的に単純であり、トリアゾール生成物を優れた収率および高い純度でもたらす。トリエチルアミンまたは２,６−ルチジンなどのアミンのアセトニトリル系への添加は、反応性の問題を解決する−生成物は、約８時間後に定量的収率で形成される。
【００３８】
さらなる実施態様では、Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）にその場で還元するための還元剤の存在下でＣｕ（ＩＩ）を添加することにより、連結反応を触媒できる。Ｃｕ（ＩＩ）塩、例えば、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏは、Ｃｕ（Ｉ）塩よりも安価で、しばしばより純粋であり得る。この反応で有用な還元剤には、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、キノン、ヒドロキノン、ビタミンＫ１、グルタチオン、システイン、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋および電位の適用が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Davies, Polyhedron 11: 285-321 1992, and Creutz, Inorg. Chem. 20: 4449, 1981 参照。さらなる例では、Ｃｕ（Ｉ）触媒または他の金属触媒の酸化状態を維持するために、金属を還元剤として用いることができる。金属性還元剤には、Ｃｕ、Ａｌ、Ｂｅ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ、ＮｉおよびＺｎが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、触媒の酸化状態を維持するために、電位の適用を用いることができる。
【００３９】
さらなる実施態様では、連結反応は、Ｃｕ（０）をＣｕ（Ｉ）にその場で酸化するための酸化剤の存在下でＣｕ（０）を添加することにより触媒できる。金属製容器も、連結反応を触媒する触媒種の供給源として使用できる。例えば、銅容器、Ｃｕ（０）は、連結反応を触媒するのに用いることができる。必要なイオンを供給するために、反応溶液は、容器の銅表面と物理的接触を成さなければならない。あるいは、反応は、非金属製容器中で行うことができ、そして、触媒金属イオンは、反応溶液を、銅線、銅屑または他の構造と接触させることにより供給される。これらの反応には、完了まで進行するのにより長い時間がかかり得るが、この実験操作は介在する段階の数を減らす。
【００４０】
ある実施態様では、化合物を足場構造にカップリングさせる方法は、金属イオンの配位子の存在下で金属イオンを添加することにより、末端アルキン部分を有する第１の反応物と、アジド部分を有する第２の反応物との反応を触媒し、トリアゾール部分を有する生成物を形成させることを含む。金属イオンは、そのような金属イオンを溶媒内に可溶化するために、そのような金属イオンの酸化を阻害するために、そして、全体または部分的に、反応の触媒の間にそのような金属イオンから解離させるために、配位子に配位させる。配位子は、例えば、単座配位子、二座（キレート化）配位子、または、多座配位子であり得る。単座配位子は、金属原子に１対（「単」）の電子を供与するルイス塩基を表す。単座配位子は、イオン（通常陰イオン）または中性分子のいずれかであり得る。単座配位子には、フッ化物イオン（Ｆ−）、塩化物イオン（Ｃｌ−）、臭化物イオン（Ｂｒ−）、ヨウ化物イオン（Ｉ−）、水（Ｈ２Ｏ）、アンモニア（ＮＨ３）、水酸化物イオン（ＯＨ−）、一酸化炭素（ＣＯ）、シアン化物（ＣＮ−）、または、チオシアン酸塩イオン（ＣＮ−Ｓ−）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
二座配位子またはキレート化配位子は、金属原子に２対の電子を供与するルイス塩基を表す。二座配位子には、エチレンジアミン、アセチルアセトナトイオン、フェナントロリン、スルホン化バソフェナントロリンまたはシュウ酸イオンが含まれるが、これらに限定されない。二座またはキレート化配位子のさらなる例を、図１４に示す。
【００４２】
配位子には、アセトニトリル、シアン化物、ニトリル、イソニトリル、水、第一級、第二級もしくは第三級アミン、窒素を有する複素環、カルボン酸塩、ハロゲン化物、アルコールおよび硫化チオール、ホスフィンおよび亜リン酸塩が含まれるが、これらに限定されない。詳細な実施態様では、ハロゲン化物は塩化物であり、１−５Ｍの濃度で使用できる。ニトリル、イソニトリル、第一級、第二級または第三級アミン、窒素を有する複素環、カルボン酸塩、ハロゲン化物、アルコール、チオール、硫化物、ホスフィンおよび亜リン酸塩から選択される１個またはそれ以上の官能基を含む多価配位子も用いることができる。
【００４３】
本明細書で提供される連結反応は、化合物を足場構造にカップリングさせる方法において有用である。この方法は、１個またはそれ以上の末端アルキン部分と、１個またはそれ以上のアジド部分との連結反応を触媒し、トリアゾール部分を有する生成物を形成させ、その連結反応は、配位子の存在下での金属イオンの添加により触媒され、足場構造は１個またはそれ以上の化合物にカップリングするための多価の部位を有することを提供する。ある態様では、１個またはそれ以上の末端アルキン部分は化合物に結合しており、１個またはそれ以上のアジド部分は足場構造に結合している。さらなる態様では、１個またはそれ以上の末端アルキン部分は足場構造に結合しており、１個またはそれ以上のアジド部分は、化合物に結合している。詳細な態様では、足場構造は、ウイルス性ナノ粒子上のタンパク質、例えば、ササゲモザイクウイルスのナノ粒子であり得る。
【実施例】
【００４４】
例示的実施態様
実施例１
ウイルス性ナノ粒子上に多価的に表示される炭水化物
多価的に表示される炭水化物と標的細胞との間の結合相互作用の強度および選択性は、恐らく、配列した糖の数および可撓性に依存する。本発明のある態様では、ビリオンを、炭水化物基で可能な限り密に被覆することができる。ウイルスの被覆度を高めることは、反応性ポリマー末端基が、ポリマー合成および／または生成に適合し、要求の厳しい後続のウイルスコートタンパク質への連結−低濃度で存在する２個の大型分子の結合−を達成するに十分なほど反応性であることを必要とする。
【００４５】
側鎖ネオグリコポリマー３を、アジド含有開始剤１を使用して、メタクリルオキシエチルグルコシド（２）の原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）により調製した（図１）。Gaynor et al., Macromolecules 31: 5951, 1998; Narain and Armes, Macromolecules 36: 4675, 2003。ポリマー中のアジド鎖末端の存在を、比色分析試験および赤外スペクトルにおける２１００ｃｍ−１での特徴的なピークの存在により確認した。Punna and Finn, Synlett, 99, 2004。ＧＰＣ分析は、その物質の純粋な性質および平均分子量（Ｍｎ）１３,０００、多分散性１.３を確証し、これは、使用した開始剤：モノマー比および水中のアクリレートのＡＴＲＰの予測と合致した。Narain and Armes, Macromolecules 36, 4675, 2003; Matyjaszewski, Chem. Eur. J. 5: 3095, 1999; Coessens and Matyjaszewski, J. Macromol. Sci.-Pure Appl. Chem. A36: 667, 1999; Li et al., J. Polym. Sci. A: Polym. Chem. 38: 4519, 2000。
【００４６】
アジドで終結するポリマー３を、フルオレセインジアルキン４との反応により、アルキンで終結する形態５にした。図１。過剰の染料を濾過により除去し、ポリマー生成物をサイズ排除クロマトグラフィー（Sephadex G-15）によりさらに生成した。アジドのアルキン末端基への完全な変換は、ネガティブ比色分析試験の観察、および、アジドＩＲ共鳴（対応するアルキン共鳴はあまり強くなく、従って見えない）の消滅により確認した。かくして設置された発色団は、後の操作の分光学的レポーターとして役立つ。少ない副生成物として２分子の３および１個の４の反応から形成される二量体のポリマーは、生体結合に参与できないので、５から分離しなかった。
【００４７】
ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）を、コートタンパク質のリジン側鎖にアジド基を設置するために、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド６（ＮＨＳ）で誘導体化した。図１。ＮＨＳエステルはキャプシドの外表面のリジン残渣をアシル化し、積載量は、全体的濃度、ｐＨおよび反応時間により制御されると以前に確立された。Wang et al., Chem. Biol. 9: 805, 2002。この場合、約２４０個の溶媒が接近可能なリジン側鎖の実質的な部分の誘導体化をもたらす条件を用いた（図１でｍ＝約１５０）。次いで、得られるアジド標識化ウイルス（７）を、２０当量のポリマー−アルキン５と、銅（Ｉ）トリフレートおよびスルホン化バソフェナントロリン配位子８の存在下、不活性雰囲気下で縮合し、結合していないポリマーを除去するスクロース−グラジエント沈降による精製の後、グリコポリマー−ウイルス結合体９を優れた収率で産生した。Lewis et al., J. Am. Chem. Soc. 126: 9152, 2004。較正した染料の吸光度により、共有結合したポリマー鎖の数は、粒子１個につき１２５±１２個であると見出され、これは、５６０万Ｄａのビリオンへの約１６０万ダルトンの質量の付加を表す。この操作（その一般的適用は他の箇所で説明する）は、同様の結果を達成するためにアジドに対して１００当量の５を必要とした以前のＣｕ（Ｉ）−に媒介される方法よりも遙かに効率的である。Wang et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 3192, 2003。
【００４８】
実施例２
ＣＰＭＶタンパク質サブユニットのグリコポリマーによる共有結合的標識化
大部分のＣＰＭＶタンパク質サブユニットのグリコポリマーによる共有結合的標識化は、変性ゲル電気泳動により確認した（図２Ｃ）。粒子集合体の無傷の性質およびそのより大きいサイズは、サイズ排除ＦＰＬＣ（図２Ａ）並びに透過型電子顕微法（ＴＥＭ、図２Ｄ）により立証した。ＴＥＭ像は、ウイルス結合体がより丸い形であり、ウラニルアセテート染色で異なって見え、直径で野生型粒子よりも１２−１５％大きいことを明らかにした。９の流体力学的半径および分子量は、マルチアングル動的光散乱（ＤＬＳ）により、劇的に大きいことが同様に見出された：野生型ＣＰＭＶの１３.４±１.３ｎｍおよび６.１±０.３ｘ１０６Ｄａと比較して、３０.３±３.４ｎｍおよび１.４±０.４ｘ１０７Ｄａ。半径および分子量の値が両方とも予測より実質的に大きいことは、これらの独特なポリマー−ウイルスハイブリッド種の光散乱データの較正および解釈の不確実性を反映している。
【００４９】
グリコシル化された粒子は、固定化形態のグルコース結合タンパク質コンカナバリンＡ（図２Ｂ）および溶液中の四量体ｃｏｎＡの両方と、強く相互作用した。後者の過程は、大型凝集体の形成をもたらし、その速度を４９０ｎｍでの光散乱によりモニターした。９ ０.７ｍｇ／ｍＬ（ビリオン中、約０.１μＭ）およびｃｏｎＡ０.３ｍｇ／ｍＬの濃度で、大型かつ多価の粒子による効率的なネットワーク形成に予測される通り、数秒で凝集が起こった。実施例４および５参照。
【００５０】
図２は、（Ａ）野生型ＣＰＭＶおよびグリコポリマー結合体９のサイズ排除ＦＰＬＣ（Superose 6）を示す。解離した粒子に由来するタンパク質は、ここで観察されるピークよりも長い保持時間で現れ、Ａ２６０／Ａ２８０比は、両サンプルについて、無傷のＲＮＡ含有キャプシドに特徴的なものである。１０ｍＬはカラムの空隙容量であるので、９のより迅速な溶出は、粒子サイズの実質的な増加を示すものである。４９５ｎｍでの染料の吸光度は、９にのみ現れる。（Ｂ）野生型ＣＰＭＶおよびウイルス−ポリマー結合体９の、コンカナバリン−Ａ Sepharose カラムでのＦＰＬＣ。溶出バッファーは、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.１ｍＭ Ｃａ２＋および０.１ｍＭ Ｍｎ２＋を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.４（溶液Ａ）および１Ｍグルコース（溶液Ｂ）の表示したグラジエント混合物であった。（Ｃ）９（レーン１）およびＷＴ−ＣＰＭＶ（レーン２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。右（明るい背景）は、クーマシーブルー染色後に可視化したゲルである；タンパク質−グリコポリマー結合に予測される通り、タンパク質のほぼ全てが遅く溶出する形態に変換されていることに留意されたい。左（暗い背景）は、染色前に紫外線で照射したゲルである（レーン２は発光を示さず、省略する）。矢印は、小型（Ｓ）および大型（Ｌ）サブユニットに由来するバンドの中心を示す；それらの幅が広い性質は、ポリマーの多分散性およびタンパク質サブユニット１個につき１個より多いポリマーが結合している可能性に由来する。（Ｄ）（左）９のネガティブ染色ＴＥＭ。（右）９に囲まれたＷＴ−ＣＰＭＶ粒子の拡大ＴＥＭ像。
【００５１】
本発明は、生体の重合過程のためにアジドを含有する開始剤を使用し、続いて唯一のアジド末端基のクリック化学的生成を行う、グリコポリマーの末端官能化の効率的な戦略を立証した。発色団のジアルキンを用いるアジド−アルキン環化付加は、ポリマーを単一の染料分子で標識し、さらなる操作の便利なモニタリングを可能にするのに役立った。銅に触媒される環化付加反応は、かかるポリマーの官能化ウイルスコートタンパク質への非常に効率的なカップリングを提供する。この方法は、活性化エステルによるリジンのアミン基のアシル化およびシステインのチオールの２−チオピリジルジスルフィドとの反応などの、過去にタンパク質へのポリマーの結合に使用された生体結合操作よりも優れた性能を有する。我々の知る限り、これは、単一の活性化された鎖の末端を有する十分に定義された側鎖ネオグリコポリマーが、タンパク質または生体ナノ粒子にこのような「バイオ直交」様式で化学的に結合した初めてのものである。
【００５２】
９などの粒子は、標準的赤血球凝集アッセイにおいて、レクチンに対して並はずれて高い結合親和性を有する。ＡＴＲＰ／ＡＡＣ方法論は、癌細胞で過剰発現される炭水化物受容体を標的とする幅広いグリコポリマー−ＣＰＭＶ結合体を合成するのに使用されようとしている。
【００５３】
実施例３
ウイルス粒子足場構造上のフルオロフォアで標識されたグリコポリマー鎖
ポリマーで被覆された表面の構築は、重合、末端標識化および結合段階のＣｕ（Ｉ）触媒作用により、便利に行われる。ここで記載する例は、ウイルス粒子足場構造上のフルオロフォアで標識されたグリコポリマー鎖である。図３参照。
【００５４】
実施例４
化学的反応物質によるＣＰＭＶの修飾の一般操作
最終溶媒混合物がバッファー８０％およびＤＭＳＯ２０％からなるように、有機反応物質をウイルスの溶液に導入した。断りのない限り、「バッファー」は、０.１Ｍリン酸塩ｐＨ７.０を表す。大量の誘導体化ウイルス（＞１ｍｇ）の精製は、０−４０％スクロースグラジエント上での超遠心、回収されたウイルスのペレット化、および、得られる物質のバッファー中での溶媒和により実施した。誘導体化されたウイルスの質量回収率は、典型的には６０−８０％であった；全てのそのようなサンプルは、分析的サイズ排除ＦＰＬＣにより測定される通り、＞９５％の無傷の粒子で構成された。ウイルス濃度は、２６０ｎｍでの吸光度により測定した；０.１０ｍｇ／ｍＬのウイルスは、０.８０の標準的吸光度をもたらす。較正された消衰係数７０,０００を適用して４９５ｎｍの吸光度を測定することにより、フルオレセイン濃度を得た。各データポイントは、３回の独立した平行反応から得られた値の平均である；積載値（ウイルスに結合した単位の数）は、実験誤差±１０％である。ＣＰＭＶビリオンの平均分子量は、５.６ｘ１０６である。
【００５５】
実施例５
合成
図１のグリコポリマーおよびウイルス−ポリマー結合体の合成。実施例１ないし５で言及する化合物は、図１中にある。
【００５６】
２−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］エタノール：水（５０ｍＬ）中の２−［２−（２−クロロエトキシ）エトキシ］エタノール（５.００ｇ、２９.７ｍｍｏｌ）、アジ化ナトリウム（９.６ｇ、１５０ｍｍｏｌ）および少量のヨウ化カリウムの混合物を、８０℃で２４時間撹拌した。反応混合物をエーテルで抽出し、有機溶液を塩水で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させ、生成物を真空で乾燥し、無色油状物を得た。1H NMR (CDCl3, δ) 3.3-3.8 (m, 10H), 2.4 (m, 2H); ESI-MS m/z = 198.1 (M+Na); IR (KBr, cm-1) 2100。
【００５７】
２−ブロモ−２−メチルプロピオン酸２−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］エチルエステル（１）：ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の２−ブロモイソブチリルブロミド（２.９ｇ、１２.６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１.３ｇ、１２.８ｍｍｏｌ）の溶液を、３口丸底フラスコ中で０℃に冷却した。ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の２−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］エタノール（２.０ｇ、１１.４ｍｍｏｌ）の溶液を、撹拌しながら滴下して添加した。次いで、反応混合物を室温で４時間撹拌し、濾過し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。粗生成物を冷却（氷浴）５％（Ｎａ２ＣＯ３）水溶液に添加し、得られる混合物を酢酸エチル（３ｘ１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を水で洗浄し、無水（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥させ、蒸発させ、１を黄色油状物として得た。1H NMR (CDCl3, δ) 4.2 (t, 2H), 3.4-3.8 (m, 8H), 3.2, (m, 2H), 1.9 (s, 6H), ESI-MS m/z = 346 (M+Na); IR (KBr, cm-1) 2100。
【００５８】
ポリ（メタクリルオキシエチルグルコシド）（３）。メタクリルオキシエチルグルコシド（２.４８ｇ、８.５ｍｍｏｌ）、２,２'−ビピリジン（０.０８８２ｇ、０.５６ｍｍｏｌ）および１（０.０９１ｇ、０.２８ｍｍｏｌ）を、シュレンクフラスコ中で３：２メタノール／水（２０ｍＬ）に溶解した。混合物に窒素を１５分間激しく通気し、ＣｕＢｒ（０.０４０５ｇ、０.２８２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を窒素の陽圧下に室温で終夜維持した。反応混合物を空気に曝し、重合を停止させた。メタノールを減圧下で除去し、水１０ｍＬを反応混合物に添加した。市販の銅結合樹脂 Cuprisorb（商標）を使用して過剰の銅を除去し、得られる溶液を酢酸エチル（３ｘ１５ｍＬ）で洗浄し、未反応の開始剤およびビピリジンを除去した。得られる水性ポリマー溶液を終夜凍結乾燥し、白色の薄片状粉末を得た。改変ニンヒドリン試験およびＩＲスペクトルにおけるアジドピーク（２１００ｃｍ−１）の存在により、アジドの存在を確認した。Punna and Finn, Synlett 1: 99-100, 2004。1H NMR (D2O, δ) 3.0-4.2 (m, 10H), 1.9 (m, 3 H), 0.7-1.1, (m, 2H)。ポリエチレングリコールおよびポリ（Ｎ,Ｎ−ジメチルアクリルアミド）較正サンプルを水中の標準条件下で使用して、ＧＰＣを実施した：Ｍｎ＝１３,０００、Ｍｗ＝１０,０００、多分散性＝１.３０。
【００５９】
５−（３,５−ビス−プロプ−２−イニルオキシ−ベンゾイルアミノ）−２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−９,９ａ−ジヒドロ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−安息香酸（４）。乾燥ＴＨＦ（３０ｍＬ）中のフルオレセインアミン（１.５３ｇ、４.４ｍｍｏｌ）および重炭酸ナトリウム（０.８ｇ、９.５ｍｍｏｌ）の混合物を氷浴中で冷却し、Ｎ２下で１５分間撹拌した。乾燥ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の３,５−ビス−プロプ−２−イニルオキシ−ベンゾイルクロリド（１.２ｇ、４.８４ｍｍｏｌ）を滴下して添加し、混合物を終夜室温で撹拌した。固体の重炭酸塩を濾過により除去し、溶媒を蒸発させ、４を橙色固体として得、それをカラムクロマトグラフィーにより精製した（シリカゲル、溶離剤９５：５ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ）。1H NMR (CD3OD, δ) 8.4 (s, 1H), 8.2 (d, 2H), 7.3 (m, 3H), 6.8-7 (m, 3H), 6.6-6.8 (m, 4H), 4.8 (d, 4H ) (s, 6 H), 3.1 (t, 2H). ESI-MS m/z = 560.1 (MH+); UV-VIS (0.1 M リン酸塩, pH 7) λmax 494 nm, ε = 64,000。ここで使用される反応条件は、便利であるが、より高速の環化付加をもたらすために、Ｃｕ（Ｉ）の配位子の使用により調節し得ることに留意されたい。Lewis et al., J. Am. Chem. Soc. 126: 9152-9153, 2004。
【００６０】
ポリマー５。ＴＨＦ（２ｍＬ）中の４（１２０ｍｇ、０.２１４ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）中の３（１０７ｍｇ、０.００８２ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、続いてｔ−ＢｕＯＨ２ｍＬを添加した。アスコルビン酸ナトリウム（１３ｍｇ、０.０６５ｍｍｏｌ）を添加し、続いて硫酸銅（８ｍｇ、０.０３２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物に蓋をし（他の手段で酸素から保護されることなく）、４８時間室温で撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、水（１０ｍＬ）を添加し、過剰の４の殆どを酢酸エチルでの抽出により除去した。水相を蒸発により濃縮し、残っている残渣の４を、Sephadex G-15 のカラムクロマトグラフィーにより水で溶出して除去した。アジドのアルキン末端基への完全な変換を、改変ニンヒドリン試験およびＩＲスペクトルのアジドピーク（２１００ｃｍ−１）の消失により確認した。1H NMR (D2O, δ) 3.0-4.2 (m, 10H), 1.9 (3 H), 0.7-1.1, (2H)；芳香族性末端基のシグナルは、容易には観察されなかった。Punna and Finn, Synlett 1: 99-100, 2004。
【００６１】
５−（３−アジドプロピルアミノ）−５−オキソペンタン酸ＮＨＳエステル６。乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）中の５−（３−アジドプロピルアミノ）−５−オキソペンタン酸（４１０ｍｇ、１.９ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２４２ｍｇ、２.１ｍｍｏｌ）の混合物に、固体の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、４０４ｍｇ、２.１ｍｍｏｌ）を窒素下で添加した。反応を１２時間室温で進行させた。次いで、それを水（３ｘ２０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧下で蒸発させ、白色固体（４１７ｍｇ、７０％）を得た。1H NMR (CDCl3, δ) 6.2 (幅広い, NH),3.3-3.4 (m, 4H), 2.9 (s, 4H), 2.7 (t, 2H), 2.3 (t, 3H), 2.1 (m, 2H), 1.8 (m, 2H).
【００６２】
ウイルスアジド結合体７。野生型ＣＰＭＶ（２４ｍｇ、タンパク質非対称単位で０.２５μｍｏｌ）を、６（２８.２ｍｇ、９０μｍｏｌ）と共に、２０％ＤＭＳＯを含有するバッファー６ｍＬ中、室温で１２時間インキュベートした。同様の反応について以前に記載された通り、生成物を、スクロースグラジエント沈降、超遠心によるペレット化、および、０.１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７.０）中での再懸濁により単離した。Wang et al., Chem. Biol. 9: 805-811, 2002。
【００６３】
ウイルス結合体９。ウイルス−アジド７（４ｍｇ、ウイルスキャプシドで７.１ｘ１０−４μｍｏｌ；アジドで約０.１１μｍｏｌ）を、５（１４０ｍｇ、約１０.７μｍｏｌ）と共に、ＤＭＦ（２００μＬ）およびトリスバッファー（ｐＨ８、０.１Ｍ、１８００μＬ）の混合物中、ＴＣＥＰ（４ｍＭ）、スルホン化バソフェナントロリン配位子８（４ｍＭ）および硫酸銅（２ｍＭ）の存在下、２４時間４℃でインキュベートした。スクロースグラジエント沈降、超遠心によるペレット化、および、０.１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７.０）中での再懸濁の操作を２回続けることにより、生成物を精製した。これらの物質は、サイズ排除ＦＰＬＣにより、過剰の５を含まないと示された。
【００６４】
配位子１０−様々な生体結合適用に本来推奨および使用される添加物−の使用は、本件のような要求の厳しい定量的な状況では、あまり効率的な反応をもたらさなかった。Chan et al., Org. Lett. 6: 2853-2855, 2004; Link and Tirrell, J. Am. Chem. Soc. 125: 11164-11165, 2003; Link et al., J. Am. Chem. Soc. 126: 10598-10602, 2004。例えば、スルホン化バソフェナントロリン８ではなく１０を最適に使用することは、下記の通り、同様の結果を達成するために５倍量の５の同時使用を要する。ウイルス−アジド７（４ｍｇ、ウイルスキャプシドで７.１ｘ１０−４μｍｏｌ；アジドで約０.１１μｍｏｌ）を、５（１４０ｍｇ、約１０.７μｍｏｌ）と共に、ＤＭＦ（２００μＬ）およびトリスバッファー（ｐＨ８、０.１Ｍ、１８００μＬ）の混合物中、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（４ｍＭ）、配位子１０（４ｍＭ）および硫酸銅（２ｍＭ）の存在下、２４時間４℃でインキュベートした。スクロースグラジエント沈降、超遠心によるペレット化、および、０.１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７.０）中での再懸濁の連続操作を２回続けることにより、生成物９を精製した。同じ積載量が、しかし、僅かに低い全体的なウイルスの回収レベルが観察された。
【化２】
2009501717.tif 000004
【００６５】
ｃｏｎＡによる９の凝集速度を、便利に４９０ｎｍでモニターした。ここで、正二十面体の糖タンパク質集合体またはｃｏｎ−Ａのどちらの吸光度も観察されなかった（図４）。図４は、０.１ｍＭ Ｃａ２＋およびＭｎ２＋を含むＰＢＳバッファー中のｃｏｎ−Ａ（０.３２ｍｇ／ｍＬ）および９（０.７ｍｇ／ｍＬ）の混合物（ｃｏｎ−Ａ四量体のウイルス粒子に対するモル比２６：１、７０秒の時点で混合）について、４９０ｎｍでモニターした凝集の時間経過を示す。
【００６６】
実施例６
実験材料
ＣＰＭＶへのＣｕ（Ｉ）に媒介されるアジド−アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）結合のための、使用する基質および反応スキームを、図５および６に示す。実施例６ないし１３で言及される化合物は、図５および６中にある。
【００６７】
材料。フルオレセイン−ＰＥＧ−ＮＨＳ−３４００を、Nektar (Huntsville, AL）から得た。バソフェナントロリン配位子２は、ＧＦＳから購入した。ヒトホロ−トランスフェリン（９８％）は、Sigma から供給された。樹脂Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｗａｎｇ（０.７７ｍｍｏｌ／ｇ、１００−２００メッシュ）およびＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｗａｎｇ（０.１２ｍｍｏｌ／ｇ、１００−２００メッシュ）、並びに他のＦｍｏｃ−保護アミノ酸は、Chem-Impex International から購入した。化合物５、６および［Ｃｕ（ＭｅＣＮ）４］（ＯＴｆ）は、既に記載した通りに製造した；７ａおよび８ａは、the Consortium for Functional Glycomics at The Scripps Research Institute により提供された。Wang et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 3192-3193, 2003; Kubas, Inorg. Synth. 19: 90-92, 1979。ＣＰＭＶ−アルキンおよび−アジド結合体３および４は、以前に記載された通り、酸担持リンカーの精製ＮＨＳエステルを使用して製造した。Wang et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 3192-3193, 2003。Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロパルギルグリシンは、CSPS (San Diego, CA）から購入した。断りのない限り、全ての他の化学的反応物質は、商業的供給者から入手し、受け取ったまま使用した。図５および６。
【００６８】
装置。空気に敏感な操作は、Vacuum Atmospheres glovebox 中、窒素下で実施した。分取ＨＰＬＣは、Dynamax/Rainin Preppy SD-1 装置、Vydac タンパク質およびペプチド逆相カラムで実施し、グラジエント溶媒混合物（溶媒Ａ＝Ｈ２Ｏ／０.１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ／０.１％ＴＦＡ）で溶出する。The Scripps Research Institute の the Mass Spectrometry Facility により、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を実施した。ＦＰＬＣ分析は、Superose-6 サイズ排除カラムを備えた AKTA Explorer (Amersham Pharmacia Biotech) で実施した。ＴＥＭ用サンプルは、サンプルのアリコート２０μＬを１００−メッシュ炭素被覆銅格子に沈着させ、続いて２％ウラニルアセテート２０μＬで染色することにより得た。Philips CM100 電子顕微鏡を使用して、像を得た。
【００６９】
ＣＰＭＶのＮＨＳエステルによる修飾。最終混合物が＜２０％ＤＭＳＯを含有するように、ＣＰＭＶ溶液に反応物質を導入した。断りのない限り、使用したバッファーは、０.１Ｍリン酸塩、ｐＨ７.０であった。誘導体化されたウイルス（＞１ｍｇ）の精製は、１０−４０％スクロースグラジエントでの超遠心、回収されたウイルスのペレット化、および、得られた物質のトリスバッファー（０.１Ｍ、ｐＨ８）中での溶解により実施した。誘導体化されたウイルスの質量回収率は、典型的には６０−８０％であった；全てのそのようなサンプルは、分析的サイズ排除ＦＰＬＣにより測定して、＞９５％の無傷の粒子で構成されていた。ウイルス濃度は、２６０ｎｍの吸光度により測定した；０.１０ｍｇ／ｍＬのウイルスは、０.８０の標準的吸光度を与える。４９５ｎｍの吸光度を、消衰係数７０,０００Ｍ−１ｃｍ−１を適用して測定することにより、フルオレセイン濃度を得た。各データポイントは、３回の独立した平行反応から得られた値の平均である；積載値（ウイルスに結合した基質分子の数）は、実験誤差±１０％であった。ＣＰＭＶビリオンの平均分子量は、５.６ｘ１０６ｇ／ｍｏｌｅである。
【００７０】
化合物７ｂおよび８ｂ。Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）中の７ａ（１０ｍｇ、１２.４μｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ（１ｍＬ）中の９（７０ｍｇ、０.１２５ｍｍｏｌ）を添加した。ｔ−ＢｕＯＨ（１ｍＬ）を添加し、続いてアスコルビン酸ナトリウム（０.５Ｍ、Ｈ２Ｏ中、７２μＬ、３６μｍｏｌ）およびＣｕＳＯ４（０.５Ｍ、Ｈ２Ｏ中、２４μＬ、１２μｍｏｌ）を添加した。反応混合物を密閉バイアル中で４８時間室温で撹拌し、続いて揮発性溶媒をロータリーエバポレーターにより除去し、Ｈ２Ｏ５ｍＬを添加した。過剰の９は、主としてＥｔＯＡｃによる抽出により除去した。ＴＬＣ（Ｒｆ＝０.６、８：３：３：２ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ中）並びにＦＴ−ＩＲ分光法を使用するアジドピーク（２１００ｃｍ−１）の消失により、反応をモニターした。水相を蒸発により濃縮し、残渣９をカラムクロマトグラフィーにより除去し（Sephadex G-15、９５：５Ｈ２Ｏ／ＢｕＯＨ）、集めた分画を凍結乾燥すると、黄色固体（１１ｍｇ、収率６５％）を得た。MALDI-TOF: [M+H]+ = 1361, [M+Na]+ = 1383, [M+K]+ =1399。化合物８ｂは、同じ方法を使用して、８ａから収率５５％で合成した。MALDI-TOF: [M+Na]+ = 1472, [M+K]+ =1488。
【００７１】
化合物９。乾燥ＴＨＦ（３０ｍＬ）中のフルオレセインアミン（１.５７ｇ、４.５４ｍｍｏｌ）および重炭酸ナトリウム（１.５７ｇ、１.８７ｍｍｏｌ）の混合物を、氷浴中で冷却し、Ｎ２下で１５分間撹拌した。乾燥ＴＨＦ（３０ｍＬ）中の３,５−ビス−プロプ−２−イニルオキシ−ベンゾイルクロリド（１.１５ｇ、４.９９ｍｍｏｌ）を滴下して添加し、混合物を終夜室温で撹拌した。固体の重炭酸塩を濾過により除去し、溶媒を蒸発させ、４を橙色固体として得、それを、カラムクロマトグラフィーにより精製した（シリカゲル、９５：５ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ）。1H NMR (CD3OD, δ) 8.4 (s, 1H), 8.2 (d, 2H), 7.3 (m, 3H), 6.8-7 (m, 3H), 6.6-6.8 (m, 4H), 4.8 (d, 4H ) (s, 6 H), 3.1 (t, 2H). ESI-MS m/z = 560.1 (MH+); UV-vis (0.1 M リン酸塩、pH 7) λmax 494 nm, ε = 64,000。
【００７２】
ペプチド１０および１１。０.２ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｗａｎｇ樹脂を使用して、固相Ｆｍｏｃペプチド合成の標準的技法により化合物１０を製造した。Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロパルギルグリシンのカップリングは、他で報告された通りに実施した。Punna et al., Angew. Chem. Int. Ed. 44: 2005、印刷中。フルオレセインのペプチド鎖のＮ末端への結合は、５（６）−カルボキシフルオレセイン（４１４ｍｇ、１.１ｍｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（４１７ｍｇ、１.１ｍｍｏｌ）を含有するＤＭＦ／ｉＰｒ２ＮＥｔ（２：１ｖ／ｖ）溶液を排出した樹脂に添加することにより達成した。混合物を終夜撹拌し、樹脂から切り離した後、逆相ＨＰＬＣにより精製した。MALDI-TOF: [M+H]+ = 1579。0.1 mmol Fmoc-Lys(Boc)-Wang 樹脂を使用する同様の方法でペプチド１１を得た。MALDI-TOF: [M+H]+= 1571, [M+Na]+ = 1593。
【００７３】
ポリマー１２。３−アジド−１−プロピルアミン（０.６６Ｍ、３３４μＬ、０.２２ｍｍｏｌ）のトルエン溶液を、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中のフルオレセイン−ＰＥＧ−ＮＨＳ−３４００（１５０ｍｇ、０.０４４ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応を終夜撹拌し、続いて減圧下で溶媒を除去した。Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ）を添加し、溶液をＥｔＯＡｃで抽出し、過剰のアジド化合物を除去した。水性溶液を凍結乾燥し、黄色粉末を得た（１３５ｍｇ、収率９０％）。
【００７４】
ポリマー１３。乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中のフルオレセイン−ＰＥＧ−ＮＨＳ−３４００（１５０ｍｇ、０.０４４ｍｍｏｌ）の溶液に、プロパルギルアミン（１２.１ｍｇ、０.２２ｍｍｏｌ）を添加した。反応を終夜撹拌し、１２について記載した通りに後処理した。化合物１３を黄色粉末として単離した（１３５ｍｇ、収率９０％）。
【００７５】
トランスフェリン−アルキン結合体１４。リン酸バッファー（０.１Ｍ、ｐＨ７、２ｍＬ）中のヒトホロ−トランスフェリン（５０ｍｇ、０.６２５μｍｏｌ）に、ＤＭＳＯ（５００μＬ）中のＮ−（Ｎ−（プロプ−２−イニル）ヘキサンアミジル）マレイミド（３.９ｍｇ、９.１μｍｏｌ）を添加し、反応を終夜室温でインキュベートした。G-15 Sephadex カラムを通して精製し、続いて透析および凍結乾燥し、１４を桃色粉末として得た（３０ｍｇ）。
【００７６】
ＣｕＡＡＣ反応によるＣＰＭＶの修飾。ＣＰＭＶ結合体３または４（２ｍｇ／ｍＬ溶液として１ｍｇ）を、相補的なアジドまたはアルキン化合物（表１に示す濃度）と、２（３ｍＭ）および［Ｃｕ（ＭｅＣＮ）４］（ＯＴｆ）（１ｍＭ）を含有するトリスバッファー（０.１Ｍ、ｐＨ８、０.５ｍＬ）中で、二酸素を厳密に排除しながら、１２時間室温でインキュベートした。ＣＰＭＶ−１２、ＣＰＭＶ−１３およびＣＰＭＶ−１４結合体を、上記の通りにスクロースグラジエントおよびペレット化により精製した。他で記載された通りに、全ての他のＣＰＭＶ結合体を、Bio-Gel（登録商標） P-100 を満たした Bio-Spin（登録商標）使い捨てクロマトグラフィーカラムを使用して、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。Wang et al., Chem. Biol. 9: 805-811, 2002。
【００７７】
実施例７
反応条件の最適化
スルホン化バソフェナントロリン２は、蛍光クエンチング触媒アッセイにおいて非常に効率的な配位子であり、適切に誘導体化されたＣＰＭＶ粒子への化合物のカップリングのために、さらに２を調査することを我々に促した。Lewis et al., J. Am. Chem. Soc. 126: 9152-9153, 2004。標準的Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル化学を使用して、ウイルスキャプシドをアルキン（３）またはアジド（４）により表面に露出しているリジン残基で標識した（図６）。Wang et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 3192-3193, 2003。当初の実験は、生体結合の成功がＵＶ−ｖｉｓ分光法を用いて容易にモニターできるので、官能化フルオレセイン染料を使用して実施した。従って、フルオレセイン誘導体５および６（図５）を各々３および４と、トリスバッファー（ｐＨ８）中のＣｕ・２の存在下、不活性雰囲気下で縮合し、ＣＰＭＶ−染料結合体を良好な積載量で濃度依存的に得た。Wang et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 3192-3193, 2003。全ての場合で、反応収率（低分子を除くタンパク質精製の後に回収されるウイルスのパーセント）および純度（無傷のウイルス粒子対解離したウイルスタンパク質）は高かった。かくして、＞８５％のタンパク質が各場合で回収され、サイズ排除ＦＰＬＣは、ビリオンの＞９５％が無傷の粒子であることを示した。詳細については支持情報を参照。紫外線下で可視化されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＣＰＭＶの小型および大型サブユニットに対応する２つの染料で標識されたバンドを明らかにし、ウイルスの両方のサブユニットが化学的に修飾されてことを示す。Ｃｕ（Ｉ）の非存在下では結合は見られず、染料のウイルスへの非特異的吸着を排除する。リン酸バッファーの使用は反応の有効性を低減させるが、ＨＥＰＥＳバッファーは、トリスと少なくとも同等またはそれ以上に良好であることにも留意すべきである。
【００７８】
実施例８
染料積載量の反応物質濃度への依存
観察された積載量（ビリオン毎の染料結合）の基質濃度に対する依存を、図７に示す。２ｍｇ／ｍＬの４（ウイルス粒子中、０.３６μＭ）を、４上のアジド基に関して５倍のモル過剰に相当する２００μＭの６で処理すると、ＣＰＭＶ粒子は完全に標識されると見出された（〜１１０個の染料／粒子）。３＋５で同様の結果が得られた。対照的に、配位子１をそれ以外は同一の条件で使用することは、そのような染料積載量を達成するために、５ｍＭ濃度の６（２５０当量）を必要とした。さらに、Ｃｕ・１に媒介される反対の「方向性」の反応（３＋５）は、４＋６より有意に悪かった。図５および６参照。
【００７９】
図７は、染料積載量の反応物質濃度に対する依存を示す。使用する条件：２ｍｇ／ｍＬ３または４、相補的フルオレセイン誘導体５または６、１ｍＭ［Ｃｕ（ＭｅＣＮ）４］（ＯＴｆ）、３ｍＭ２、トリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８）、室温、１４時間。
【００８０】
［Ｃｕ（ＭｅＣＮ）４］（ＯＴｆ）、［Ｃｕ（ＭｅＣＮ）４］（ＰＦ６）またはＣｕＢｒをＣｕＩ供給源として使用して、各配位子に同じ結果が得られた。最適な銅濃度は、１ｍＭであると判明した；より低い濃度は、有意にカップリング効率を低下させた。配位子−対−金属比も重要である。２対ＣｕＩの３：１の比が、最良の結果を与えた；より低い比は、ウイルスキャプシドの有意な分解をもたらし、一方、より大きい配位子の過剰は、反応を低速化させ、不十分な標識化をもたらした。Ｃｕ・２に媒介されるＡＡＣ過程の効率は、それにより、標準的ＮＨＳおよびマレイミドのリジンおよびシステイン側鎖とのカップリング反応のものを各々遙かに上回る。例えば、１０倍過剰のフルオレセインＮＨＳエステルをＣＰＭＶに同様の条件下で添加することは、約２０個の染料が各キャプシドに結合することをもたらし、スルフヒドリル基の局所的環境に依存して、フルオレセインマレイミドが１０個ないし２５個の染料分子で表面システイン残渣を有するＣＰＭＶ突然変異に沈着する。Wang et al., Chem. Biol. 9: 805-811, 2002; Strable and Finn, Unpublished work。アジドおよびアルキンをＣＰＭＶに結合させるのに使用するリンカーは、これらの基を粒子の天然および突然変異型のリジンまたはシステイン側鎖よりも接近可能にし得るが、多数の表面ペプチド残渣の溶媒露出が高い性質を考慮すると、差異は小さいと思われる。
【００８１】
実施例９
ＣＰＭＶ−炭水化物結合体の製造
かくして最適反応条件が確立されたので、生物学的に意味のある基質をＣＰＭＶキャプシドに結合させた（図５；表１）。炭水化物７ａは、乳癌細胞の早期マーカーであるタンパク質ガレクチン−４に結合する。Blixt et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101: 17033-17038, 2004; Huflejt and Leffler, Glycoconj. J. 20: 247-255, 2004。そのアジド誘導体が８ａであるシアリルルイスＸは、癌細胞で過剰発現され、炎症においても役割を果たす。Ohyama et al., EMBO J. 18: 1516-1525, 1999。これらの２種の化合物のウイルス粒子表面への結合は、薬物の標的化に、そして、炭水化物エピトープに対する抗体生成の特定できない目標のために、有用であり得る。Seitz, ChemBioChem 1: 214-246, 2000。これらの非蛍光化合物の結合の容易な定量を可能にするために、アジドをフルオレセインジアルキン反応物質９とのＣｕＡＡＣ反応に付し、染料−アルキン誘導体７ｂおよび８ｂを提供する。次いで、Ｃｕ・２システムを使用して、７ｂおよび８ｂを、連続的に、ビリオン毎に１１５個および１０５個の積載量でウイルス−アジド４に移植した。２上のアジド基毎に４当量のみの７ｂまたは８ｂが、ウイルス濃度１−２ｍｇ／ｍＬでこのレベルの積載量に達する必要があった。多価的に表示された７の完全性および炭水化物活性の保持は、ＣＰＭＶ−（７ｂ）１１５を二量体ガレクチン−４に添加した際のゲルの形成により立証した。詳細については、支持情報を参照。７ａおよび８ａを粒子３と共に同様の条件下で使用することは、同様に、ガレクチン−４の溶液を効率的にクロスリンクする能力を備えた無傷の誘導体化ビリオンを高収率でもたらした。これらの場合では、我々は広範囲の研究により基質の性質はＣｕＡＡＣ反応の効率に殆ど影響がないことを確立したので、フルオレセインタグを欠く低分子の積載量は、それらの蛍光の対応物と殆ど同じであった。
【００８２】
ＣｕＡＡＣ連結による複雑な保護されていない糖のタンパク質へのこのたやすい結合は、標準的生体結合反応のために炭水化物上の二官能性リンカーを用いる現存する方法に対する有意な進歩を意味する。典型的には、スクアレート（squarate）およびマレイミド−ヒドラジドまたはマレイミド−ＮＨＳエステルリンカーがこの目的で用いれられ、糖を適切に官能化するのにさらなる合成段階が必要とされ、乏しい全体的カップリング収率をもたらす。Seitz, ChemBioChem 1: 214-246, 2000; et al., Carb. Res. 313: 15-20, 1998; Hossany et al., Bioorg. Med. Chem. 12: 3743-3754, 2004; Allen et al., Chem. Eur. J. 6: 1366-1375, 2000。対照的に、アジドは、合成の早期に炭水化物足場構造に容易に組み込むことができ、後続の合成段階を妨害しない。
【００８３】
表１．ＣＰＭＶ（２ｍｇ／ｍＬ；３についてアルキンで４７μＭ、４についてアジドで４３μＭ）への、様々な基質を用いるアジド−アルキン環化付加
【表１】
2009501717.tif 000005
（ａ）測定せず
【００８４】
実施例１０
ペプチドのＣＰＭＶへの結合
ＣＰＭＶキャプシド構造の選択された領域へのペプチドループの遺伝学的導入は十分に確立されているが、そのようなキメラの生成は、サイズ、位置および配列に関する制約を受ける。Taylor et al., Biol. Chem. 280: 387-392, 1999; Taylor et al., J. Mol. Recog. 13: 71-82, 2000; Chatterji et al., Intervirology 45: 362-370, 2002。環状および直鎖状ペプチドの、幅広く多様な生化学、分子認識および薬物開発における標的に対する多大な重要性を考慮すると、天然および非天然オリゴペプチドを多価足場構造に結合させる確固とした方法は、興味深いものである。これに関して、ＣｕＡＡＣ反応の長所を立証するために、カルボン酸またはアミン側鎖官能基を含有し、従って標準的ペプチドカップリング方法で導入されるには保護／脱保護の戦略を必要とするペプチドを選択した。今日まで、機能的ペプチドによる全長タンパク質の装飾は、天然化学連結またはマレイミド−システイン反応を用いて支配的に達成されてきた。Dawson et al., Science 266: 776-779, 1994; Dawson and Kent, Ann. Rev. Biochem. 69: 923-960, 2000。これらの戦略は、両方ともタンパク質中に接近可能なシステイン残渣の存在を、前者はＮ末端に、必要とする。Dibowski and Schmidtchen, Angew. Chem., Int. Ed. 37: 476-478, 1998。
【００８５】
２種の機能的ペプチドを用いてＣｕ・２システムを試験した。１０のアルギニン−グリシン−アスパラギン酸塩（ＲＧＤ）配列を、多くの癌細胞で過剰発現される細胞外マトリックス受容体であるαｖインテグリンに結合するアデノウイルス血清型から誘導する。Nemerow and Stewart, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63: 725-734, 1999。１１のアミノ酸配列は、浮腫因子（ＥＦ）および致死因子（ＬＦ）に結合し、これらの毒素を細胞に侵入させる部分である、炭疽毒素の感染防御抗原（ＰＡ）の一部に由来する。Mogridge et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 7045-7048, 2002; Cunningham et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 7049-7053, 2002; Bradley et al., Nature 414: 225-229, 2001。６倍過剰のみの基質および標準的なＣｕ・２条件を使用して、ペプチド１０は成功裏に４に結合し、ウイルス粒子毎に６０個のペプチドの積載量を伴った。重要なことに、５ｍＭまでの基質の存在下で配位子１を用いたとき、ペプチドの結合は観察されなかった。１１の結合は、ペプチド１１５個／ビリオンの積載量をもたらし、ＵＶ照射によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＣＰＭＶの小型および大型サブユニットの両方がＰＡペプチドで修飾されたことを示した（データは開示しない）。アルキン基の合成ペプチドへの容易な導入は、Ｃｕ・２−に媒介されるＡＡＣ反応がペプチドの生体分子足場構造への結合のための一般的戦略として役立つことを可能にする。Punna et al., Angew. Chem. Int. Ed. 44: 2005 印刷中。
【００８６】
実施例１１
ウイルス−ポリマー構築物の調製
ＣＰＭＶは、以前に、ＮＨＳエステル誘導体を使用して、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＧ）で誘導体化され、外側のコートタンパク質集合体上に、良好に制御されたポリマーの積載量をもたらした。Raja et al., Biomacromolecules 4, 472-476, 2003。野生型ＣＰＭＶと比較して、ＰＥＧ化粒子は、変更された物理的特性およびマウスでの低減された免疫原性反応を示した。ＰＥＧで活性化されたエステルとのリジンの反応性は、ビリオン１個につき最大３０個のＰＥＧ分子の結合への到達しか可能にしなかった。過去のこの値の積載量を高める試みは、反応が起こる前にウイルス粒子が沈降するような高い濃度のＰＥＧ反応物質を必要とした。しかしながら、Ｃｕ・２触媒の活性の増強は、今や、我々がこの以前の結果を改善することを可能にした。従って、フルオレセイン末端官能化ＰＥＧ反応物質１２および１３は、ウイルス粒子が安定である容易に利用可能な濃度を使用して、それらの相補的ＣＰＭＶのアルキンおよびアジド足場構造にカップリングし、ビリオン１個につき６０および９０個のＰＥＧ鎖の積載量を各々もたらす（表１）。得られる粒子は、再度、スクロースグラジエント沈降で密度が低く、サイズ排除ＦＰＬＣにより示される通り、より大きい。詳細については、支持情報を参照されたい。図８は、ＵＶ照射およびタンパク質染色により可視化されたＣＰＭＶ−（１３）９０およびＣＰＭＶ−（５）１１０の変性ゲルを示す。両方の場合で、予想通り、ＣＰＭＶコートタンパク質の大型（Ｌ）および小型（Ｓ）サブユニットの両方が標識された。ＰＥＧ結合体ＣＰＭＶ−１３は、各サブユニットに２個のより高い分子量のバンドを生じさせ、これらは、ポリマーによるサブユニットの単一および二重の標識に相当する。この結合体のタンパク質染色は、低い割合の非修飾サブユニットの存在も明らかにした。
【００８７】
図８は、ＣＰＭＶ−（１３）９０（レーン１）およびＣＰＭＶ−（５）１１０（レーン２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。右（明るい背景）には、SimplyBlue（商標）染色後の可視化したゲルを示す；２つの余分なバンドは、１個または２個のＰＥＧ−３４００部分による修飾から生じる各サブユニットに対応する。左（暗い背景）にあるのは、タンパク質染色に先立ちＵＶ光で照射したゲルである。ＰＥＧ−３４００はフルオレセインで標識されているので、修飾されたサブユニットのみがレーン１で可視である。レーン２に現れている２個の小型−サブユニットのバンドは、インビボの不完全なＣ−末端ペプチド切断から生じ、本実験とは無関係である。Taylor et al., Virology 255: 129-137, 1999。
【００８８】
実施例１２
トランスフェリンタンパク質の結合
Ｃｕ・２が効率的にＡＡＣ反応を促進する能力の最後の例として、大型タンパク質のＣＰＭＶの外表面へのカップリングを実施した。脊椎動物の鉄担持タンパク質であるトランスフェリン（Ｔｆｎ）の受容体は、様々な癌細胞で過剰発現される。従って、リポソームおよび酸化鉄ナノ粒子などの足場構造上のＴｆｎの多価集合体が、癌細胞標的化のために調製された。Hogemann-Savellano et al., Neoplasia 5: 495-506, 2003; Ryschich et al., Eur. J. Cancer 40: 1418-1422, 2004; Derycke et al., J. Nat. Cancer Inst. 96: 1620-1630, 2004。Ｔｆｎの複数のコピーをＣＰＭＶ上に表示することは、同様に、受容体担持細胞に強く選択的に結合する粒子をもたらし得る。
【００８９】
８０ｋＤａの二葉の糖タンパク質であるヒトホロ−トランスフェリンを、高濃度（２０ｍｇ／ｍＬ）で、１５当量のマレイミド−アルキンリンカーと共に、ｐＨ７でインキュベートし、１個またはそれ以上の利用可能なシステイン（および恐らく、より少ない程度で、リジン）残基で成された結合により、アルキンで誘導体化されたタンパク質１４を得る。アルキンのＴｆｎへの好結果の結合を、ＣｕＡＡＣ条件下での１４のフルオレセイン誘導体５との反応により確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、Ｔｆｎの全てが少なくとも１個のフルオレセイン分子で共有結合的に標識されたことを裏付けた（データは開示しない）。
【００９０】
次いで、ＣＰＭＶ−Ｔｆｎ結合体ＣＰＭＶ−（１４）ｎを、Ｃｕ・２を使用する４の１４との反応により調製した。ＦＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＴＥＭ（図９）およびウエスタン免疫ブロットによる生成物の調査は、有意な数のＴｆｎ分子が粒子上に配列していることを示した。詳細については、支持情報を参照されたい。重要なことに、ウイルス−タンパク質結合体は、個々の粒子として単離され、１個以上のアルキンを担持するＴｆｎ種が多価ＣＰＭＶアジドにカップリングする場合に予想され得る凝集の証拠はなかった。ネガティブ染色による電子顕微鏡観察では、個々のＣＰＭＶ−（１４）ｎ粒子は、野生型ＣＰＭＶより直径で約１６ｎｍ大きく、野生型ビリオンの滑らかな六角形と対比して、明確なコブ状の外見を示した。これらの観察は、Ｔｆｎ分子が共有結合により、ＣＰＭＶ表面上に均一に結合したことを裏付ける。予備的測定は、結合したＴｆｎ分子が標的受容体との結合において活性であることを示す。
【００９１】
タンパク質（２２ｋＤまで）のＣＰＭＶへの結合にチオール−マレイミド化学を用いる最近の報告は、ウイルスの非対称単位に関して、５０倍過剰のタンパク質の使用を必要とし、同様に、所望の結合体を後にクロマトグラフィー的に精製することを必要とした。Chatterji et al., Bioconj. Chem. 15: 807-813, 2004。我々は、ＮＨＳエステル−リジン並びにチオール−求電子反応物質の反応について、多くの同様の結果を得た。対照的に、タンパク質の結合は、ＣｕＡＡＣ反応により、天然化学連結（ＮＣＬ）のものに匹敵する効率で達成された。Dawson et al., Science 266: 776-779, 1994; Dawson and Kent, Ann. Rev. Biochem. 69: 923-960, 2000。ここで、６倍過剰のＴｆｎが必要なだけであり、用いた比較的少量のＴｆｎは、スクロースグラジエントおよびペレット化による簡単な精製を可能にした。ＮＣＬ反応は、典型的にはほぼ等モル比のカップリング剤を用いて実行されるが、チオエステルおよびＮ−末端システインの反応パートナーの濃度は、典型的には、本発明で使用するＣＰＭＶアジドおよびアルキンよりもかなり高い（０.１−１ｍＭ）。Dawson et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 4325-4329, 1997; Xu et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96: 388-393, 1999; Offer et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 4642-4646, 2002; Bang and Kent, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 102: 5014-5019, 2005。従って、Ｃｕ・２−に媒介されるＡＡＣのプロトコールは、適切に官能化されたタンパク質のカップリングの優れた代替法である。Bausinger et al., ChemBioChem 6: 625-628, 2005。
【００９２】
本発明の実施態様は、化学選択的連結に単純な銅（Ｉ）塩およびスルホン化バソフェナントロリン（２）を使用する、非常に効率的なアジド−アルキン環化付加のプロトコールを提供する。この触媒系は、複雑な炭水化物、ペプチド、ポリマーおよびタンパク質の生体高分子への結合を、過去に確立された方法で可能なものよりも遙かに優れた収率および基質積載量で可能にする。Ｃｕ・２に媒介されるＡＡＣ法の利点には、適度に過剰の所望のカップリングパートナーの使用および簡単な精製が含まれる。銅イオンがペプチドおよびポリヌクレオチドの加水分解的切断を加速する不都合な傾向は、金属中心への接近を制限するのに十分な配位子の使用により十分に制御される。改良されたＣｕＡＡＣ反応は、高価であるか、または少量でしか入手できない基質を加えることを望むものに、そして、アジドまたはアルキンが生合成的方法により導入される生物学的分子に、特に有利であり得る。３３この系の唯一の欠点は、反応を不活性雰囲気下で実施するという要件である；この問題を解決するように設計された配位子は、現在開発中である。
【００９３】
図９は、（Ａ）野生型ＣＰＭＶおよびＣＰＭＶ−（１４）ｎのサイズ排除ＦＰＬＣを示す。解離した粒子由来のタンパク質は、ここで観察されるピークより長い保持時間で現れ、Ａ２６０／Ａ２８０比は、両サンプルについて、無傷のＲＮＡ含有キャプシドに特徴的なものである。ＣＰＭＶ−（１４）ｎのより迅速な溶出は、１０ｍＬはほぼカラムの空隙容量であるので、粒子の実質的なサイズの増加を示す。（Ｂ）野生型ＣＰＭＶ（４２および２４ｋＤａのサブユニット）（レーン１）、Ｔｆｎ（８０ｋＤａ）（レーン２）およびＣＰＭＶ−（１４）ｎ（レーン３）の、SimplyBlue（商標）で染色したゲル（４−１２％ビス−トリス）。Ｔｆｎと結合したＣＰＭＶサブユニットに対応する、レーン３における約１０２および１２２ｋＤａの２つの強いバンドの出現に留意されたい。（Ｃ）野生型ＣＰＭＶのネガティブ染色ＴＥＭ。（Ｄ）ＣＰＭＶ−（１４）ｎのネガティブ染色ＴＥＭ。粒子の自動測定は、野生型について３０±１ｎｍ、ＣＰＭＶ−（１４）ｎについて４６±５ｎｍの平均直径を示した。
【００９４】
実施例１３
ＣＰＭＶ結合体の特徴解析
全てのＣＰＭＶ結合体を、分析的サイズ排除ＦＰＬＣにより特徴解析した。図１０に示す代表的なトレースは、ＣＰＭＶ−５のものである；他の結合体は、特記しない限り、本質的に同一のクロマトグラムを示す。ＣＰＭＶに共有結合したフルオレセインを示す、４９６ｎｍでモニターされたトレースに留意されたい。基質の積載量は、４９６ｎｍの吸光度の値を使用して算出した。全ての結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析も実施した。図１０は、ＣＰＭＶ−５のサイズ排除ＦＰＬＣのトレースを示す。３つの異なる波長でトレースをモニターした。特記しない限り、図８（レーン２）に示すものと本質的に同一であるゲルが、全てのサンプルについて得られた。粒子直径の測定にＥＭＡＮプログラムを使用した（www.software-ncmi.bcm.tmc.edu/ncmi/homes/stevel/EMAN/doc)。
【００９５】
ＣＰＭＶ−８ｂ。８ｂのＣＰＭＶへの結合を、ＣＰＭＶ−８ｂの二量体ガレクチン−４との凝集速度を４９０ｎｍでモニターすることによりさらに確認した。ここで、正十二面体のＣＰＭＶ−８ｂまたはガレクチン−４の吸光は観察されない（図１１）。ゲル形成は、１.０ｍｇ／ｍＬのウイルス濃度で迅速であった。図１１は、リン酸緩衝塩水中のガレクチン−４（３００μｇ／ｍＬ、５０μＬ）およびＣＰＭＶ−８ｂ（１.０ｍｇ／ｍＬ、７７μＬ）の混合物について、４９０ｎｍでモニターした凝集の時間経過を示す。
【００９６】
ＣＰＭＶ−１３。ＣＰＭＶ−１３の分析的サイズ排除ＦＰＬＣを、図１２に示す。野生型ＣＰＭＶと比べてより迅速なＣＰＭＶ−ＰＥＧの溶出は、実質的な粒子サイズの増加を示す。図１２は、野生型ＣＰＭＶおよびＣＰＭＶ−１３のサイズ排除ＦＰＬＣを示す。解離した粒子に由来するタンパク質は、観察されたピークより長い保持時間で現れるであろう。両サンプルは、無傷のＲＮＡ含有キャプシドに特徴的なＡ２６０／Ａ２８０比を示す。カラムの空隙容量は１０ｍＬである。
【００９７】
ＣＰＭＶ−１４。ＣＰＭＶおよびヒトＴｆｎの両方に対する抗体を使用する、結合体ＣＰＭＶ−１４のウエスタンブロットは、高分子量のバンドが両抗体と反応することを示し、ＴｆｎによるＣＰＭＶの修飾を示している（図１３）。図１３は、ＣＰＭＶまたはヒトＴｆｎに対するポリクローナル抗体を使用するＣＰＭＶ−１４のウエスタンブロットを示す。４−１２％ビス−トリスゲルで変性させたタンパク質を、ＰＶＤＦ膜に移し、５％ミルクでブロックした。次いで、膜をＣＰＭＶ（the Manchester laboratory により産生されたもの、１：２０００希釈）またはヒトＴｆｎ（ヤギ、Sigma；１：２０００希釈）に対する抗体とインキュベートした。続いて、製造業者の推奨する希釈で使用するヤギ−抗−ウサギ（抗−ＣＰＭＶ用）またはウサギ−抗−ヤギ（抗−Ｔｆｎ用）のＨＲＰ結合体とインキュベートし、続いてＴＭＢ膜ペルオキシダーゼ基質によりタンパク質のバンドを可視化した。サンプルは、以下の通りである：４（レーン１、５）；１４（レーン２、６）；分子量マーカー（レーン３、７）；ＣＰＭＶ−（１４）ｎ（レーン４、８）。
【００９８】
実施例１４
ルテニウム触媒の存在下のアルキン−アジドカップリング方法
ルテニウムに触媒されるアルキン−アジドカップリングの基本的方法は、下記に示す通りである。例えば、J. Am. Chem. Soc., 127: 15998-15999, 2005 参照。
【化３】
2009501717.tif 000006
【００９９】
アルキンアジド触媒の注目に値する特徴は、ルテニウムに触媒される反応が、内部のアルキン（Ｒ２およびＲ３が両方ともＨではない）を許容し、一方銅に触媒される反応は、Ｒ２またはＲ３がＨであることを必要とすることである。最も活性であるルテニウム触媒は、銅の反応と反対の位置化学をもたらす：Ｒ２＝Ｈであるとき、銅は生成物Ｂを作るが、Ｒｕは生成物Ａを作る。
【０１００】
当技術の現在の理解では、多くの他の種類のアルキンよりも速く反応する、１などのプロパルギルの基質が好ましい。
【化４】
2009501717.tif 000007
【０１０１】
上記のルテニウム触媒の構造は、アルキンアジド環化付加反応において活性を有すると示された。ルテニウム触媒の変形物および他のルテニウム含有構造は、足場構造への化合物のカップリングの方法のために、アルキンアジド環化付加反応において触媒として働くと見込まれる。
【０１０２】
本明細書で引用する全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が特定的かつ個別に全目的で出典明示により本明細書の一部とすると示されているかのように、全目的で出典明示により全体を本明細書の一部とする。
【０１０３】
上述の発明は、ある程度詳細に、明確な理解のために例示および実施例により説明したが、当業者には、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱せずにある種の変更および改変を行い得ることが容易に理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１は、グリコポリマーおよびウイルス−ポリマー結合体の合成を示す。
【図２】図２は、（Ａ）野生型ＣＰＭＶおよびグリコポリマー結合体９のサイズ排除ＦＰＬＣ（Superose 6）。（Ｂ）野生型ＣＰＭＶおよびウイルス−ポリマー結合体９のコンカナバリン−Ａ Sepharose カラムでのＦＰＬＣ。（Ｃ）９（レーン１）およびＷＴ−ＣＰＭＶ（レーン２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（Ｄ）ネガティブ染色した９のＴＥＭおよび９で囲まれたＷＴ−ＣＰＭＶ粒子の拡大ＴＥＭ像を示す。
【図３】図３は、ポリマーで被覆された表面の構築が、重合、末端標識化および結合段階のＣｕＩ触媒作用により便利になることを示す。
【図４】図４は、ｃｏｎ−Ａおよび９の混合物の凝集の時間経過を示す。
【図５】図５は、ＣＰＭＶへのＣｕＡＡＣ結合に使用される基質を示す。
【図６】図６は、標準的Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル化学を使用して、表面に露出したリジン残基においてアルキンまたはアジドで標識化されたウイルスキャプシドを示す。
【図７】図７は、染料積載量の反応物質濃度への依存を示す。
【図８】図８は、ＣＰＭＶ−（１３）９０およびＣＰＭＶ−（５）１１０のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図９】図９は、（Ａ）野生型ＣＰＭＶおよびＣＰＭＶ−（１４）ｎのサイズ除去ＦＰＬＣ。（Ｂ）野生型ＣＰＭＶ、ＴｆｎおよびＣＰＭＶ−（１４）ｎの、SimplyBlue（商標）で染色したゲル。（Ｃ）ネガティブ染色した野生型ＣＰＭＶのＴＥＭ。（Ｄ）ＣＰＭＶ−（１４）ｎのネガティブ染色したＴＥＭを示す。
【図１０】図１０は、ＣＰＭＶ−５のサイズ排除ＦＰＬＣのトレースを示す。
【図１１】図１１は、リン酸緩衝塩水中のガレクチン−４およびＣＰＭＶ−８ｂの混合物について、４９０ｎｍでモニターした凝集の時間経過を示す。
【図１２】図１２は、野生型ＣＰＭＶおよびＣＰＭＶ−１３のサイズ排除ＦＰＬＣを示す。
【図１３】図１３は、ＣＰＭＶまたはヒトＴｆｎに対するポリクローナル抗体を使用する、ＣＰＭＶ−１４のウエスタンブロットを示す。
【図１４】図１４は、配位子の例、例えば、二座配位子を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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