(57)【要約】本発明は、０．１〜１．５０μｍの範囲の平均グレインサイズを有し、実質的に０．１〜１．５０μｍのサイズ範囲のミクロ孔だけから成る多孔度を有し、且つ１０〜４０％の範囲のミクロ孔の表面積百分率を有する多孔性骨誘導性リン酸カルシウム物質に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．１〜１．５０μｍの範囲の平均グレイン（grain）サイズを有し、多孔度が０．１〜１．５０μｍのサイズ範囲のミクロ孔を含み且つ１０〜４０％の範囲のミクロ孔の表面積百分率を有する多孔性骨誘導性リン酸カルシウム物質。
【請求項２】
少なくとも４０％のタンパク質吸着能力を有し、ここで該能力は、２５ｐｐｍのアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）の存在下におけるウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の１％水溶液の３ｍｌの体積から、該リン酸カルシウムの１ｍｌの体積により３７℃で２４時間後に吸収されたタンパク質の百分率として表される、請求項１に記載の多孔性リン酸カルシウム。
【請求項３】
実質的にミクロ孔だけから成る多孔度を有する、請求項１又は２に記載の多孔性リン酸カルシウム。
【請求項４】
該物質が、約５０〜約１５００μｍの粒子サイズを有する微小粒子の形態である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の多孔性リン酸カルシウム。
【請求項５】
該微小粒子が、約２００〜約３００μｍ、好ましくは２１２〜３００μｍの粒子サイズを有する、請求項４に記載の多孔性リン酸カルシウム。
【請求項６】
該リン酸カルシウムが、リン酸オクタカルシウム、アパタイト、例えばヒドロキシアパタイト及びカーボネートアパタイト、ウィットロッカイト、例えばリン酸β−トリカルシウム及びリン酸α−トリカルシウム、及びそれらの組み合わせから成る群から選ばれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多孔性リン酸カルシウム。
【請求項７】
該リン酸カルシウムが吸収可能な二相性リン酸カルシウム（ＢＣＰ）又は吸収可能なリン酸トリカルシウム、好ましくはリン酸β−トリカルシウムである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の多孔性リン酸カルシウム。
【請求項８】
医療的移植物材料又は組織足場として用いる為の、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多孔性リン酸カルシウム。
【請求項９】
生きている生物中の骨組織の形成を誘導する為に、請求項１〜８のいずれか１項に定義された多孔性リン酸カルシウムを使用する方法。
【請求項１０】
非骨部分における自己由来の骨の産生の為に、移植物材料として単独で又は成長因子若しくは／及び細胞と組合せて、請求項１〜８のいずれか１項に定義された多孔性リン酸カルシウムを使用する方法。
【請求項１１】
医療的移植物又は装置の製造の為に、請求項１〜８のいずれか１項に定義された多孔性リン酸カルシウムを単独で又は成長因子若しくは／及び細胞と組合せて使用する方法。
【請求項１２】
歯科の手術における、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項１３】
多孔性骨誘導性リン酸カルシウムセラミックを製造する方法であって、水中に、１．０〜８．０μｍ、好ましくは２．０〜４．０μｍの粒子サイズを有するリン酸カルシウム粉、発泡剤及び任意的に孔形成剤の水性スラリーを用意すること；該スラリーの発泡を引き起こす条件に該スラリーを付すること；得られた発泡したスラリーを乾燥し、任意的に孔形成剤を除去して、多孔性の素地を用意すること、及び１０５０℃〜１１５０℃の温度で該多孔性の素地を焼結して多孔性の焼結リン酸カルシウムを用意すること；並びに任意的に該焼結リン酸カルシウムを粒子へと粉砕しそして約５０〜約１５００μｍの粒子サイズを有する粒子を集めることを含む、上記方法。
【請求項１４】
該粒子が、２１２及び３００μｍのふるいを用いて集められる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該リン酸カルシウム粉が、０．０１〜１．０μｍ、好ましくは０．０５〜０．５０μｍの結晶サイズを有する結晶から構成される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
該発泡剤が過酸化水素である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
該孔形成剤がナフタレン粒子を含み、且つ該孔形成剤が８０〜１１０℃で蒸発により除去される、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
該スラリーの発泡を引き起こす該条件が、約５０〜７０℃へ該スラリーを加熱することを含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
該スラリーの発泡が多孔性の素地を産生する、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
該乾燥され且つ発泡されたスラリーが、ＴＣＰの場合には１０５０〜１１００℃の温度で焼結され、又はＨＡ及び／若しくはＢＣＰの場合には１１００〜１１５０℃の温度で焼結される、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
該リン酸カルシウム粉が、ＴＣＰ又はＢＣＰ粉である、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
該集められた微小粒子が次に、アセトン、エタノール及び／又は水により超音波的に洗浄され、そして任意的に乾燥され及び滅菌される、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
該リン酸カルシウム粉が、不規則な形を有する、オーブン乾燥され粉砕された粉である、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１３〜２３のいずれか１項に記載の方法により入手可能である多孔性骨誘導性リン酸カルシウム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、骨誘導性物質、該物質を調製する方法及びそのように製造された物質に関係する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
患者の自身の骨から採取された自己由来の骨は、大きな骨欠損の修復にとっての究極の骨代用物である。しかしながら、患者から採取可能な自己由来の骨の量は限定され、そして骨の引き抜きそれ自身が重大な健康リスクを生じ且つ残っている骨の構造的完全性の喪失を結果する。
【０００３】
組織エンジニアリングの発展は、例えば足場材料の形成における、合成の移植物を提供し、これは骨細胞の接着及び新たな骨組織の内方成長及び新たな骨塩の続いて起こる沈着を許す。該合成の材料は、移植に先立ち骨細胞とエクスビボで接合されてよく又は周辺から該移植の場所へ骨細胞を引き付ける、裸の足場として移植されてもよい。
【０００４】
組織エンジニアリングにおける最近の進歩は、さまざまな価値ある足場材料を製造した。ヒドロキシアパタイト（ＨＡ；骨のミネラル相）、二相性リン酸カルシウム（ＢＣＰ）及びリン酸α−トリカルシウム又はリン酸β−トリカルシウム（ＴＣＰ）のようなリン酸カルシウムは、骨伝導的（生物活性な）並びに骨誘導的特性を有すること、及び、非常に適当な足場材料を提供することが知られている。リン酸カルシウムの該生物活性な性質は、該足場の表面で新たな無機物質の沈着を通じた骨原性細胞による新たな骨形成の為の鋳型としてそれらが機能することを許し、そして、該足場材料の重要な特徴である。リン酸カルシウムの該骨誘導的性質は質的な特徴であり、すなわち新たな骨組織の発展を誘導する能力であり、従って、新たな物質の沈着の速度の増加は、さまざまな物質のパラメーターに依存する。骨誘導は、間葉系の組織が骨原性になる為にその細胞の構造を変化させることが誘導される機構として一般的に定義される。
【０００５】
一般に、多孔性リン酸カルシウムが、骨誘導性を示すことが発見されている。例えば、Ｙａｍａｓａｋｉらは、Biomaterials 13:308-312(1992)において、多孔性ヒドロキシアパタイトセラミック顆粒の周囲で異所性骨化（通常は骨化しない組織における新生骨の形成）が発生するが密な顆粒の周囲では発生しないことを記載する。該多孔性顆粒は、サイズにおいて２００〜６００μｍであり、そして孔が直径において２〜１０μｍである、連続した且つ相互接続した微小多孔度を有する。
【０００６】
米国特許第６，５１１，５１０号明細書は、Ｙａｍａｓａｋｉらの多孔性ヒドロキシアパタイト顆粒を超える、改善された骨誘導性を示す、生体適合性且つ生分解性リン酸カルシウムを記載する。該生分解性リン酸カルシウムは、２０〜９０％の合計多孔度を有し、そして、０．１〜１．５ｍｍのサイズのマクロ孔並びに０．０５〜２０μｍのサイズのミクロ孔を含む。該生分解性リン酸カルシウム物質は、鋳型に流し込むことにより製造され、そして次に塊がより小さなサイズの粒子へと顆粒化又は切断されうる。該物質は、移植されたときに、（一時的な）骨の代用物として機能するのに適当である。
【０００７】
上記物質のアベイラビリティーにもかかわらず、もし、生きている組織と結合しての使用の為の生体物質がさらにより良い骨誘導的特性、すなわちさらにより速く且つより深い骨形成を結果する上記特性を備えられうるのならば、それは有利だろう。もしそのような骨誘導性物質が、哺乳類の体内に容易に導入されうるならば、最も好ましくは骨及び非骨部分の両方で新生骨の産生の為の容易に移植可能且つ有効な足場材料を提供するようなものであるならば、それもまた有利だろう。そのような物質は、新たな自己由来の骨の産生にとって非常に役立つだろうし、これは次に大きな骨欠損を修復する為の骨代用物として用いられうる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の概要
【０００９】
本発明は、非常に優れた骨誘導的特性を有するリン酸カルシウム物質を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の局面において、本発明は、０．１〜１．５０μｍの範囲の平均のグレイン（grain）サイズを有し、多孔度は０．１〜１．５０μｍのサイズ範囲のミクロ孔を含み、且つ、１０〜４０％の範囲のミクロ孔の表面積百分率を有する多孔性骨誘導性リン酸カルシウム物質を提供する。
【００１１】
好ましい実施態様において、該ミクロ孔の表面積百分率は、４０％未満であり、最も好ましくは１０〜２５％の範囲である。
【００１２】
本発明の多孔性リン酸カルシウムは好ましくは、少なくとも４０％のタンパク質吸着能力を有し、該能力は、３７℃で２４時間後に、２５ｐｐｍのアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）の存在下におけるウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の１％水溶液の３ｍｌの体積から、該リン酸カルシウムの１ｍＬの体積により吸収されたタンパク質の百分率として表される。
【００１３】
好ましい実施態様において、該多孔性リン酸カルシウム物質の多孔度は実質的に、特定のサイズ範囲内のミクロ孔だけからなり、且つマクロ孔はない。
【００１４】
本発明の多孔性リン酸カルシウムは好ましくは、約５０〜約１５００μｍ、より好ましくは約２００〜約３００μｍ、最も好ましくは２１２〜３００μｍの粒子サイズを有する微小粒子の形態にある。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の物質は、生きている組織において非常に優れた骨誘導性挙動を示す。本発明の物質の表面での骨組織の形成は、該物質から作られた移植物の好都合な容認を助ける。さらに、該骨組織の形成は骨格における何らかの損傷の回復を加速し、これは該移植物の適用についての理由を形作る。
【００１６】
微小粒子の形態における本発明の物質の利点は、それが非常に優れた流動する特性を有することである。該微小粒子物質の砂状構造は、それが追加の流体キャリア無しで注入されることを許す。従って、そのような実施態様における該物質は、注入可能なものとして用いられうるが、例えば液体キャリアとの混合物でも用いられうる。
【００１７】
好ましい実施態様において、本発明のリン酸カルシウムは、リン酸オクタカルシウム、アパタイト、例えばヒドロキシアパタイト及びカーボネートアパタイトなど、ウィットロッカイト（whitlockite）、例えばリン酸β−トリカルシウム及びリン酸α−トリカルシウムなど、及びそれらの組み合わせから成る群から選ばれるリン酸カルシウムである。より好ましいリン酸カルシウムは、吸収可能な二相性リン酸カルシウム（ＢＣＰ）及び吸収可能なリン酸トリカルシウムであり、最も好ましくはリン酸β−トリカルシウムである。
【００１８】
他の局面において、本発明は、医療的な移植物材料又は組織足場としての使用の為の
本発明の多孔性リン酸カルシウムに関する。
【００１９】
本発明の物質は、従来技術の物質を超えて改善される骨誘導的特性を有することが発見された。それが微小多孔度（孔＜５μｍ）、好ましくは相互接続された微小多孔度を示すことが、該物質の特徴である。好ましい実施態様において、該物質は、実質的にマクロ孔（０．１〜１．５ｍｍのサイズの孔）がない。
【００２０】
本発明の多孔性リン酸カルシウムは、非骨部分における自己由来の骨の製造の為に又は単独の若しくは成長因子若しくは／及び細胞との組合せの医療的な移植物若しくは装置の製造の為に、移植物材料として単独で若しくは成長因子若しくは／及び細胞と組合せて、生きている生物において骨組織の形成を誘導する為に適当に用いられうる。
【００２１】
本発明の多孔性リン酸カルシウムは、歯科の手術において適当に用いられうる。
【００２２】
他の局面において、本発明は多孔性骨誘導性リン酸カルシウムセラミックを製造する方法であって、水中に、１．０〜８．０μｍ、好ましくは２．０〜４．０μｍの粒子サイズを有するリン酸カルシウム粉、発泡剤及び任意的に孔形成剤（porogenic  agent）の水性スラリーを用意すること；該スラリーの発泡を引き起こす条件に該スラリーを付すること；得られた発泡したスラリーを乾燥し、任意的に該孔形成剤を除去して、多孔性の素地を用意すること、並びに該多孔性の素地を１０５０℃〜１１５０℃の温度で焼結して、多孔性焼結リン酸カルシウムを用意すること；並びに任意的に該焼結リン酸カルシウムを粒子へと粉砕すること及び約５０〜約１５００μｍの粒子サイズを有する粒子を集めることを含む上記方法を提供する。
【００２３】
好ましい実施態様において、該方法はさらに、該焼結リン酸カルシウムを粒子へと粉砕する段階であって、該粒子がふるいを用いることにより、最も好ましくは２１２及び３００μｍのふるいを用いることにより集められて２１２〜３００μｍの微小粒子画分を用意する、上記段階を含む。
【００２４】
本発明の方法の好ましい実施態様において、該リン酸カルシウム粉は、０．０１〜１μｍ、好ましくは０．０５〜０．５μｍの結晶サイズを有する結晶からなる粉である。
【００２５】
本発明の方法の他の好ましい実施態様において、該発泡剤は過酸化水素である。
【００２６】
本発明の方法のさらに他の好ましい実施態様において、該孔形成剤は、ナフタレン粒子を含み、そして、該孔形成剤は８０〜１１０℃での蒸発により除去される。
【００２７】
本発明の方法のさらに他の好ましい実施態様において、該スラリーの発泡を引き起こす該条件は、約５０〜７０℃へと該スラリーを加熱することを含む。
【００２８】
本発明の方法の他の好ましい実施態様において、該乾燥した且つ発泡したスラリーは、ＴＣＰの場合には１０５０〜１１００℃、より好ましくは１０５０℃〜１０７５℃の温度で焼結され、又はＨＡ及び／またはＢＣＰの場合には１１００〜１１５０℃の温度で焼結される。
【００２９】
本発明の方法の他の好ましい実施態様において、該リン酸カルシウム粉はＴＣＰ粉又はＢＣＰ粉である。
【００３０】
本発明の方法のさらに他の好ましい実施態様において、該焼結リン酸カルシウムの粉砕後に集められた該微小粒子は次に、アセトン、エタノール及び／又は水により超音波的に洗浄され、そして任意的に乾燥され及び滅菌される。
【００３１】
本発明の方法のさらなる追加の好ましい実施態様において、該リン酸カルシウム粉は、不規則な形の粒子を有するオーブン乾燥された粉砕された粉である。
【００３２】
他の局面において、本発明は、本発明の方法により入手可能な多孔性骨誘導性リン酸カルシウムに関する。
【００３３】
図面の簡単な説明
【００３４】
図１〜３は、実施例１においてより詳細に記載されるとおり、本発明に従う骨誘導性粒状リン酸トリカルシウムセラミック物質の物理化学的特性を示す。
【００３５】
図１は、実施例１において記載された物質のＸＲＤパターンを示す。
【００３６】
図２は、実施例１において記載された物質のミクロ孔の形態学的な図（ＳＥＭ画像）である。
【００３７】
図３は、実施例１において記載されたとおり、水銀侵入により測定されたとおりの増加する孔容積対平均ミクロ孔直径のプロット（１．１μｍの孔サイズで、増加する孔容積は最高に達することを示す）を表す。
【００３８】
図４は、実施例１において用いられた２つの移植物材料を示す；粒子サイズ１〜３ｍｍ（パネルＡ；比較）及び２１２〜３００μｍ（パネルＢ；本発明に従う）を有するミクロ孔ＴＣＰ粒子。
【００３９】
図５は、実施例１において記載されたとおりの回収された移植物の組織学的調製物の顕微鏡写真を表す。１〜３ｍｍの粒子サイズを有するＴＣＰのミクロ孔粒子に基づく移植物を伴う、イヌの筋肉内での１２週間の移植後の該骨形成（左手側）を、２１２〜３００μｍの粒子サイズを有するＴＣＰのミクロ孔粒子に基づく移植物を伴う骨形成（右手側）と比較した。
【００４０】
図６は、実施例２において記載されたＴＣＰ−０１（Ａ）及びＴＣＰ−０２（Ｂ）のグレインサイズを示すＳＥＭ画像を示す。
【００４１】
図７は、実施例２において記載されたＴＣＰ−０１（Ａ）及びＴＣＰ−０２（Ｂ）のミクロ孔サイズを示す顕微鏡写真を示す（黒：ＴＣＰグレイン；白：ミクロ孔）。
【００４２】
図８は、実施例２において記載されたとおり、１％ＦＢＳからの２４時間におけるＴＣＰセラミックのタンパク質吸着の棒グラフでの結果を示す。
【００４３】
図９は、実施例２において記載されたとおり、イヌの筋肉内の１２週間の移植後のＴＣＰ−０１（Ａ）における骨形成及びＴＣＰ−０２（Ｂ）において骨形成がなかったことの組織学的顕微鏡写真を示す。
【００４４】
図１０は、実施例３において記載されたとおり、粉Ｅの粒子サイズ分布を示す。
【００４５】
図１１は、実施例３において記載されたとおり、ＳＥＭ観察下の４のＴＣＰ粉の形態を示す（Ａ、粉Ａ；Ｂ：粉Ｄ；Ｃ：粉Ｅ及びＤ：粉Ｆ）。
【００４６】
図１２は、実施例３において記載されたとおり、種々のセラミック（Ａ，セラミックＡ；Ｂ，セラミックＤ；Ｃ，セラミックＥ及びＤ，セラミックＦ）中のグレインを示す。
【００４７】
図１３は、実施例３において記載されたとおり、種々のセラミックの表面上のミクロ孔を示す（Ａ，セラミックＡ；Ｂ，セラミックＤ；Ｃ，セラミックＥ及びＤ，セラミックＦ）（黒：ＴＣＰグレイン；白：ミクロ孔）。
【００４８】
図１４は、実施例３において記載されたとおり、１％ＦＢＳからの２４時間における種々のセラミックのタンパク質吸着を示す。
【００４９】
図１５は、実施例４において記載されたとおり、ＴＣＰセラミック中のグレインを示す（Ａ，ＴＣＰ−Ｈ２Ｏ２及びＢ：ＴＣＰ−ｐｒｅｓｓ）。
【００５０】
図１６は、実施例４において記載されたとおり、セラミック表面上のミクロ孔を示す（Ａ，ＴＣＰ−Ｈ２Ｏ２及びＢ：ＴＣＰ−ｐｒｅｓｓ）（黒：ＴＣＰグレイン；白：ミクロ孔）。
【００５１】
図１７は、実施例４において記載されたとおり、２４時間における１％ＦＢＳからのセラミックのタンパク質吸着を示す。
【００５２】
図１８は、実施例５において記載されたとおり、種々の温度（Ａ，１０５０℃；Ｂ，１０７５℃及びＣ，１１００℃）で焼結されたＴＣＰセラミック中のグレインを示す。
【００５３】
図１９は、実施例５において記載されたとおり、種々の温度（Ａ，１０５０℃；Ｂ，１０７５℃及びＣ：１１００℃）で焼結された種々のセラミックの表面上のミクロ孔を示す。
【００５４】
図２０は、実施例５において記載されたとおり、２４時間における１％ＦＢＳからのセラミックのタンパク質吸着を示す（Ｂ１０５０、ＴＣＰ  １０５０℃；Ｂ１０５７、ＴＣＰ１０７５℃及びＢ１１００、ＴＣＰ１１００℃）。
【００５５】
発明の詳細な説明
【００５６】
語「粒子」は、本明細書において、粒状又は粉状の物質（粒子の絶対サイズに依存する用語）を指す為に用いられる。微小粒子は、１ｍｍ未満（すなわち、数μｍ〜数百μｍ）のサイズを有する粒子である。
【００５７】
本発明の物質は実質的に、開いた孔の構造を有し、ここで個々の孔は、開口又はすき間により相互接続されている。リン酸カルシウムマトリックスそれ自体の構造は、顕微鏡観察において、滑らかでなく粒々であり、該構造的物質は、孔により間隔をあけられた、詰め込まれたグレインの形態に構造的に組織化される。語「グレイン」は、ＳＥＭ顕微鏡写真中に見られるように、該多孔性リン酸カルシウムの連続的マトリックスを形成する、個々に認識できる「粒子群」、すなわち他のグレインと構造的に連結された、セラミック物質中に埋め込まれたような結晶である。語「グレイン」及び「結晶」は、本明細書において交換可能に用いられてよいが、語「グレイン」は、該マトリックス中の最小の個々に認識できる構造的な「要素群」の球状の性質をより良く指す。語「グレイン」は従って、該物質の粒状又は粒子状形態に関係しないが、内部構造を指す。
【００５８】
語「不規則な形を有する粒子」は、リン酸カルシウム粉（それ自身も粒々の構造を有しうる）の粒子が球形でないことを意味する。
【００５９】
語「ミクロ孔」は、それの技術分野で認められる形において用いられ、そして５０μｍ未満、好ましくは１０μｍ未満、より好ましくは１．５μｍ未満のサイズを有する、多孔性物質中の孔を指す。ＳＥＭ顕微鏡写真中に見ることのできるような最大のミクロ孔の少なくとも１０の平均（又は中間）の直径が、該多孔性リン酸カルシウム中のミクロ孔のサイズを決定する為に測定される。
【００６０】
語「ミクロ孔の表面積百分率」は、ミクロ孔及び密な物質の両方に関する合計表面積の百分率としての、該多孔性リン酸カルシウムの断面図のミクロ孔に関する表面積を指す。
【００６１】
語「タンパク質吸着」は、２５ｐｐｍのＮａＮ３を含有する１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）水溶液の３ｍｌ中に浸されたとき、３７℃で２４時間のインキュベーション後に、該多孔性リン酸カルシウムの１ｍｌの体積により吸収されたタンパク質の量を指すが、該吸収された量は、（１００％−溶液中に残る百分率）であり且つそのタンパク質含有量は該リン酸カルシウムとの接触の前及び後で測定される。
【００６２】
本発明の局面における多孔性リン酸カルシウム物質は、任意のリン酸カルシウム（ＣａＰ）、例えば低温での水溶液からの沈殿により又は高温（熱性）プロセスにより得られるＣａＰなどに基づいてよい。非常に好ましいリン酸カルシウムは、オルトリン酸カルシウムである。本明細書において用いられるときの語「オルトリン酸カルシウム」は化合物のファミリーをいい、その夫々は、カルシウムカチオン、Ｃａ２＋、及びホスフェートアニオン、ＰＯ４３−を含む。この定義の下、複数のオルトリン酸カルシウムがあり、オルトリン酸モノカルシウム（一塩基性）、オルトリン酸ジカルシウム（二塩基性）、オルトリン酸トリカルシウム（三塩基性）及びヒドロキシアパタイト（トリリン酸ペンタカルシウム）を含む。
【００６３】
本発明は主に、オルトリン酸カルシウムに関して記載されるが、本明細書において有用な他の適当な物質は例えば、カルシウムピロホスフェート（例えば、ジカルシウムジホスフェート（Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、同義語：カルシウムピロホスフェート）、カルシウムピロホスフェートジハイドレート（ＣＰＰＤ、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７・２Ｈ２Ｏ）、及びカルシウムジハイドロジェンジホスフェート（ＣａＨ２Ｐ２Ｏ７；同義語：酸性カルシウムピロホスフェート、モノカルシウムジハイドロジェンピロホスフェート））、及びポリホスフェート（（ＣａＰ２Ｏ６）ｎ、ｎ≧２；同義語：カルシウムメタホスフェート、カルシウムポリメタホスフェート）、及び種々のホスフェートの組み合わせを含む。
【００６４】
本発明の局面において用いられうるリン酸カルシウム化合物の非限定的な例は：
−リン酸α−トリカルシウム（α−ＴＣＰ、α−Ｃａ３（ＰＯ４）２、同義語：ウィットロッカイト、リン酸トリカルシウム、リン酸カルシウムトリベーシック）、無水又は水和物として；
−リン酸β−トリカルシウム（β−ＴＣＰ、β−Ｃａ３（ＰＯ４）２、同義語：ウィットロッカイト、リン酸トリカルシウム、リン酸カルシウムトリベーシック）無水又は水和物として；
−非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ、Ｃａ３（ＰＯ４）２・ｎＨ２Ｏ、ｎ＝３〜４．５、Ｃａ／Ｐ比＝１．５）
−アパタイト（カルシウムフルオロ−ホスフェート、Ｃａ５（Ｆ、Ｃｌ、ＯＨ）（ＰＯ４）３）
−カルシウムジハイドロジェンホスフェート（Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２）；
−カルシウムジハイドロジェンホスフェートハイドレート（Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２・Ｈ２Ｏ）
−カルシウムハイドロジェンホスフェートハイドレート（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）；
−カルシウムハイドロジェンホスフェート、無水物（ＣａＨＰＯ４）、
−カルシウム欠損ヒドロキシアパタイト又は沈降ヒドロキシアパタイト（ＰＨＡ）１．５〜１．６７のＣａ／Ｐ比を有するＣａ１０−Ｘ（ＨＰＯ４）Ｘ（ＰＯ４）６−Ｘ（ＯＨ）２−Ｘ（０≦Ｘ≦１）
−カーボネートアパタイト（Ｃａ５（ＰＯ４、ＣＯ３）３Ｆ）
−リン酸ジカルシウム無水物（ＤＣＰＡ、ＣａＨＰＯ４）
−リン酸ジカルシウム二水和物（ＤＣＰＤ、ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）；
−フルオロアパタイト（ＦＡ、Ｃａ５（ＰＯ４）３Ｆ）；
−ヒドロキシアパタイト（ＨＡ、Ｃａ５（ＰＯ４）３ＯＨ、同義語；（ペンタ）カルシウムトリホスフェート）；
−リン酸モノカルシウム無水物（ＭＣＰＡ、Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２）；
−リン酸モノカルシウムモノハイドレート（ＭＣＰＭ、Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２・Ｈ２Ｏ）；
−リン酸オクタカルシウム（ＯＣＰ、Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ）；
−オキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｏ）；
−リン酸テトラカルシウム（ＴＴＣＰ、Ｃａ４（ＰＯ４）２Ｏ）；
−上記の２以上の混合物、例えばＭＣＰＭ又はＭＣＰＡと他のＣａＰ、例えばリン酸α−トリカルシウム又はリン酸β−トリカルシウム、及び
−上記の２以上の複合物、例えばβ−ＴＣＰとヒドロキシアパタイト（Ｃａ／Ｐ−１．６７）、例えば二相性リン酸カルシウム（ＢＣＰ）
である。
【００６５】
該リン酸カルシウムは、特にそれらが天然の源に由来する場合、使用の前にか焼されうる。本発明の骨誘導性物質は好ましくは生きている組織中において移植物として用いられるので、該リン酸カルシウムは好ましくは合成的である。さらに、該骨誘導性物質は好ましくは、生きている組織中での移植物としての使用のために十分に適合的であり且つ十分に生分解性である。従って、該骨誘導性物質が基礎とするリン酸カルシウムは好ましくは（生物学的に）吸収可能であり、これは哺乳類体内に置かれたときにそれが化学的な分解及び細胞により仲介される吸収を示すことを意味する。
【００６６】
本発明に従う骨誘導性物質は好ましくは、ＨＡ、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、リン酸オクタカルシウム、又はそれらの組み合わせ、例えばＢＣＰなどに基づく。本発明に従う骨誘導性物質は最も好ましくは、ＢＣＰ又はＴＣＰに基づく。
【００６７】
本発明の物質は多孔性である。該物質の多孔度はマクロ孔及びミクロ孔を含みうるが、好ましくは実質的に、０．１〜３．０μｍ、好ましくは０．１〜２μｍ、より好ましくは０．１〜１．５μｍ、さらにより好ましくは０．５〜１．５μｍのサイズ範囲のミクロ孔から成る。合計の多孔度は、２０〜９０％、好ましくは４０〜７０％の範囲である。
【００６８】
本発明はさらに、上記で記載されたとおりの骨誘導性物質を調製する方法及び該方法により入手可能な骨誘導性物質に関係する。
【００６９】
リン酸カルシウムに基づく骨誘導性物質を製造する為の本発明の方法は、水中に、リン酸カルシウム粉、発泡剤及び任意的に孔形成剤の水性スラリーを用意すること；該スラリーの発泡を引き起こす条件に該スラリーを付すること；得られた発泡したスラリーを乾燥すること及び任意的に該孔形成剤を除去すること、並びに乾燥し且つ発泡したスラリーを焼結して多孔性焼結リン酸カルシウムセラミックを得ることの段階を含む。該方法は任意的に、該焼結リン酸カルシウムセラミックを粒子へと粉砕すること及び所望の粒子サイズを有する粒子を集めることの段階により続かれる。
【００７０】
素地の調製は、リン酸カルシウム（ＣａＰ）のスラリーの形成を適当に含み、該ＣａＰは好ましくは粉の形態であり、発泡剤を含有する溶液に懸濁される。該発泡剤溶液中の発泡剤（例えばＨ２Ｏ２）の濃度は適当に、０．１％〜１０．０％の範囲であり、且つ該溶媒は適当に水である。発泡剤溶液（例えばＨ２Ｏ２、水中で０．１〜１０．０％）及びリン酸カルシウムがスラリーを形成する為に混合される比は適当に、ＣａＰの１００ｇ当たり、発泡剤溶液の１０〜３００ｍｌである。ＣａＰの１００ｇ当たりに用いられる孔形成剤（例えばナフタレン粒子、＜１４００μｍ）の量は適当に、０〜１５０ｇである。該スラリーは次に、発泡され（例えばＨ２Ｏ２を用いたとき、それは５０〜７０℃でありうる）、そして次に例えば８０℃〜１１０℃で乾燥されて、多孔性の素地を形成し、これは次に焼結され、そして任意的に粉砕されて本発明の微小粒子を形成する。
【００７１】
本骨誘導性物質の調製の為に、リン酸カルシウムに基づく物質は、上記で記載されたとおりの骨誘導性物質が得られるような条件下で焼結される。
【００７２】
好ましくは、本発明のリン酸カルシウムは、該多孔性素地を８００〜１３００℃の温度で、任意的に圧力下で、焼結することを含む方法により形成される。最終産物の特性は、温度、圧力及びリン酸カルシウム出発物質の特定の組み合わせを選ぶことにより調整されうる。例えば、純粋なＨＡは、１．６７のＣａ／Ｐ比を有するアパタイトを用いることにより形成されうる一方で、ＴＣＰは１．５のＣａ／Ｐ比を有するアパタイトを用いることにより形成されうる。例えば種々のＣａ／Ｐ比を有するアパタイトが焼結されるとき、ＨＡ及びＴＣＰの種々の量が最終セラミックにおいて形成され、二相性リン酸カルシウム（ＢＣＰ）を結果する。焼結パラメーターにより決定される他の要素は、残余の微小多孔度である。該セラミックの該微小多孔度は、それらの製造の方法のいくつかの実施態様において、該焼結された粒子の間に残った隙間に起因しうるし、代わりに、用いられたＣａＰの結晶化により影響される。
【００７３】
本発明の好ましい実施態様に従い、該多孔性リン酸カルシウムセラミックは、結晶（すなわちグレイン）から構成される。好ましくは、該結晶のサイズはミクロ孔のサイズと同様である。従って、該結晶のサイズは好ましくは０．１〜３μｍ、より好ましくは０．１〜２μｍ、なおより好ましくは０．１〜１．５μｍ、さらにより好ましくは０．５〜１．５μｍである。
【００７４】
密であり且つ多孔性のリン酸カルシウムセラミックは一般に、種々の焼結技術により製造される。密なセラミックは、高圧下での圧縮により製造され、しばしば言われる「グリーン（green）」状態を結果し、そして該圧縮過程後に焼結される。本発明の多孔性リン酸カルシウムは例えば、該リン酸カルシウム出発物質の水性スラリー中に組み込まれた適切なサイズのナフタレン粒子を孔形成剤として用いることにより製造されうる。高圧下での圧縮後、ナフタレンの除去は昇華により達成され、これは多孔性のグリーン状態を残す。この多孔性のグリーン状態の完全性は、焼結段階を通じて維持される。ナフタレン粒子の使用方法は例えば、Moore et al.(2001) Australian and New Zealand Journal of Surgery 71:354-361及びLi et al.(2003) Journal of the American Ceramic Society 86:65-72において記載される。
【００７５】
多孔性セラミックを製造する他の方法は例えば、孔が充満した構造を産生する為の過酸化水素の分解に頼る。そのような場合、該過酸化水素は発泡剤として作用し、それにより脱出するガスが、最終的には孔を形成するすき間を作る。当業者は、他の発泡剤も多孔性素地を製造する為に用いられてよく、それは乾燥の際に、要求される多孔度を有する、リン酸カルシウムに基づく物質を製造する為に焼結されうることを理解するであろう。該スラリー中の該リン酸カルシウムの濃度は好ましくは、追加の安定剤又は増粘剤が要求されないようなものである。
【００７６】
ＴＣＰに基づく本発明の多孔性リン酸カルシウムセラミックを調製する方法は以下のとおりに記載されうる（当業者は、同様の手順が他のリン酸カルシウム出発物質について追随されることを理解するであろう）：ＴＣＰ粉（Ｄ（ｖ.０．５）で２．８２μｍの粒子サイズを有する不規則な形のＴＣＰ粉）が、Ｈ２Ｏ２水溶液（０．１〜５．０重量％；通常は２重量％）及びナフタレン粒子（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから市販で購入された粒子が、メッシュサイズ１４００μｍを通じてふるいにかけられうる、１４００μｍ未満の画分が適当に用いられる）と混合されて、１００〜２５０ｍｌのＨ２Ｏ２溶液中のＴＣＰ粉の１００ｇのスラリーを得る。その後、該スラリーは、該スラリーを、攪拌すること無く５０〜７０℃の温度で、通常は一晩、オーブン中に置くことにより発泡される。次に、該発泡したスラリーは、８０〜１１０℃の温度でオーブン中で乾燥されて、多孔性の素地を得る。該素地は次に、約１０５０〜１１００℃の温度で焼結される。該焼結された物質は、その後、セラミック粒子を用意するために適当に粉砕され、そして次に２１２〜３００μｍ（セラミック微小粒子）又は１〜３ｍｍ（セラミック粒子）の適当な画分がふるいを用いて集められうる。該セラミック粒子はその後、使用のために洗浄され且つ滅菌されうる。該焼結された多孔性リン酸カルシウムは粉砕されずに用いられてもよく、特に該スラリーは、鋳型に流し込まれ、乾燥され、焼結されそして足場として直接に用いられてもよいことが理解されるべきである。
【００７７】
上記で説明されたとおり、該孔のサイズは、出発物質のリン酸カルシウム粉の粒子サイズにより、発泡剤のタイプと量により、発泡した「素地」を得る為に該出発物質のスラリーが付される条件により、任意的な孔形成剤のタイプ、粒子サイズ及び量により、並びに焼結温度により調節されうる。好ましくは、該焼結は、８００℃〜１２５０℃、最も好ましくは１０５０℃〜１１５０℃の温度で実施される。該焼結段階の時間は適当に、１〜１０時間、好ましくは７〜９時間で選ばれうる。
【００７８】
焼結後に、該物質は任意的に有機酸の水溶液により処理されそして洗浄される。該洗浄は、アセトン、エタノール、水又はそれらの組み合わせを用いて適当に実施されうる。
【００７９】
本発明の重要な局面は、骨誘導性物質の物理的構造である。非常に好ましい実施態様において、該物質は微小粒子又は顆粒の形態であり、すなわち、粒子サイズにおいて５０〜１５００μｍ、好ましくは１００〜５００μｍ、より好ましくは２００〜３００μｍ、最も好ましくは２１２〜３００μｍのサイズ範囲の粒子からなる顆粒状の、ゆるい物質である。それ故に、該焼結後、例えばボールミル中において、該物質は好ましくは砕かれて、粒子サイズにおいて５０〜１５００μｍ、好ましくは１００〜５００μｍ、より好ましくは２００〜３００μｍ、最も好ましくは２１２〜３００μｍのサイズ範囲の微小粒子を含む、比較的粗い粉を産生する。特定のサイズ範囲は、ふるい、例えば２１２及び３００μｍのふるいを用いることにより回収されうる。
【００８０】
最後に、該骨誘導性物質の得られた微小粒子を滅菌処理、例えば蒸気滅菌、エチレンオキシド滅菌又はガンマ線滅菌に付すことが好ましい。
【００８１】
特に顆粒状形態の、本発明の物質は、「粉」の形態で単独で又はペーストの形態で液体キャリアと組合せて、注入可能な形態で用いられうる。
【００８２】
本発明の物質は例えばリン酸カルシウムセメントとして用いられてよく、又はそれは生きている生物中の骨組織の形成を誘導する為に用いられうる。
【００８３】
本発明の物質は移植物材料として、すなわち足場として、非骨部分における自己由来の骨の産生の為に適当に用いられうる。この能力は該物質の高度に骨誘導的な特性に起因する。
【００８４】
従って、本発明の物質は、リン酸カルシウムで作られる医療的移植物又は医療的装置として用いられうる。該物質は、金属又はポリマー物質のような、異なる物質の医療的移植物であって、その上に、本発明に従う該骨誘導性物質が被覆の形態で存在する上記移植物と一緒に用いられることも可能である。
【００８５】
本発明の物質の種々の使用方法は、骨の修復における全般的な外科的な適用並びに、歯科の手術における適用を包含することが注目されるべきである。
【００８６】
本発明は今、以下の非限定的な実施例により説明されるであろう。これらの実施例は、リン酸カルシウムセラミック（すなわち焼結リン酸カルシウムであって、該リン酸カルシウムは、本明細書において記載されたとおりの任意の物質、好ましくはＨＡ、ＢＣＰ及び／又はＴＣＰを形成しうる）の骨形成性能力を改善する為の方法を記載する。該改善されたリン酸カルシウムセラミックは、１．５０μｍ未満のグレインサイズ（例えば、０．１０〜１．５０μｍの範囲）、それらの表面上の１．５０μｍより小さいミクロ孔のサイズ（例えば０．１０〜１．５０μｍの範囲）及びそれらの表面上の１０〜４０％のミクロ孔の面積百分率を有する。好ましい結晶のグレインサイズ、ミクロ孔のサイズ及びミクロ孔の面積百分率は、セラミック上へのタンパク吸着の高い濃度及び高い骨形成性能力（非骨部位における誘導的骨形成）を結果する。該改善されたリン酸カルシウムセラミックは、２４時間で、３ｍｌの１％ウシ胎仔血清溶液から１．０ｍｌ（又は約４００ｍｇ）多孔性セラミック粒子（８０％の合計多孔度を有する）へ、４０％超（４０〜８０％）のタンパク質と同等の量でタンパク質をその表面に吸着させることを示した。本発明の改善されたリン酸カルシウムセラミックは好ましくは、不規則な形を有し且つ好ましくは８．０μｍ  Ｄ（ｖ.０．５）以下（例えば２．００〜４．００μｍ）の粒子サイズを有する、オーブン乾燥され粉砕されたリン酸カルシウム粉を用いた方法により調製される。そのような物質は、８．０μｍ  Ｄ（ｖ.０．５）より大きい規則的な球状の粒子を有する、スプレー乾燥されたリン酸カルシウム粉の使用を超えて好まれる。本発明のリン酸カルシウムセラミックを製造する方法において、発泡剤（例えばＨ２Ｏ２）を用いる方法が、静水圧プレスなどの他の方法を超えて好まれる。加えて、焼結温度は好ましくは１０５０〜１１５０℃である。個々のリン酸カルシウムについて、焼結温度はさらに最適化されうる。ＴＣＰについての好ましい焼結温度は例えば１０５０〜１１００℃の温度であり、他方ＨＡ及びＢＣＰについて好ましい焼結温度は、１１００〜１１５０℃である。
【００８７】
多孔性リン酸カルシウムセラミックの骨誘導的特性に重要である、多孔性リン酸カルシウムセラミックの特徴及び特性は：
−グレインサイズ（約１０〜２０μｍ×５〜１５μｍの面積を表す該物質の表面の顕微鏡写真の拡大及び検査に基づく、例えば図６において示されるようなＳＥＭ顕微鏡写真において見られるとおり、連続したマトリックスを形成する、最大の個々に認識できる「粒子群」、すなわち該セラミック物質中に埋め込まれ且つ他のグレインとその中で構造的に連結されたようなグレインの少なくとも１０の平均直径）；
−ミクロ孔サイズ（約１０〜２０μｍ×５〜１５μｍの該物質の表面領域の拡大及び検査に基づき、例えば図７において示されたような、ＳＥＭ顕微鏡写真において見られるとおりの最大のミクロ孔の少なくとも１０の平均直径）；
−ミクロ孔の面積百分率（例えば、デジタル画像中における、選ばれた表面領域の画素の総数の百分率としての、ミクロ孔に関する画素数：該物質の断面図におけるミクロ孔の面積百分率）；及び
−タンパク質吸着（例えば、２５ｐｐｍのＮａＮ３における３ｍｌの１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）溶液中に浸されたときに、３７℃で２４時間のインキュベーション後での、多孔性セラミックの１ｍｌの体積により吸収されたタンパク質の量、そして溶液中に残る量から吸収された量を、例えばＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  Ｉｌ，  ＵＳＡ）を用いて決定する）。
【００８８】
より高い骨形成性能力を示す物質は、より小さなグレインサイズ、より高いミクロ孔の面積百分率及びより高いタンパク質吸着を有する。実施例２のＴＣＰ−０１は、改善されたリン酸カルシウムセラミックのようなものの例である。概して、はるかに改善された骨誘導的特性を示すリン酸カルシウムセラミックは、１．５０μｍより小さい（０．１０〜１．５０μｍ）グレインサイズ、１．５０μｍより小さい（０．１０〜１．５０μｍ）ミクロ孔サイズ、１０％より高い（１０〜４０％）リン酸カルシウムセラミック表面上のミクロ孔の面積百分率及びより高いタンパク質吸着（３ｍｌの１％ウシ胎仔血清溶液から１．０ｍｌ（又は約４００ｍｇ）の多孔性セラミック粒子（８０％の合計多孔度を有する）への２４時間における４０％超（４０〜８０％）のタンパク質と同等である）を有する。
【００８９】
実施例
【００９０】
実施例１  ２１２〜３００μｍのサイズ及び０．５〜１．５μｍの孔サイズを有するＴＣＰ微小粒子
【００９１】
１．１物質の調製
【００９２】
リン酸トリカルシウムセラミック。
【００９３】
ＴＣＰ粉（Ｐｌａｓｍａ  Ｂｉｏｔａｌ、ＵＫ）が、Ｈ２Ｏ２溶液（水中で１．０〜２．０％、１００〜２００ｍｌ／１００ｇＴＣＰ粉）及びナフタレン粒子（５００〜１４００μｍ、０〜１５０ｇ／１００ｇ粉）と混合され、そして５０〜７０℃で発泡されて、多孔性の素地を得た。乾燥され、そして、ナフタレンが８０〜１１０℃で蒸発された後、該素地が１１００℃で８時間焼結された。セラミック粒子（１．０〜３．０ｍｍ）及び微小粒子（２１２〜３００μｍ）が作られ、そしてアセトン、エタノール及び水により超音波的に洗浄され、最後に８０℃で乾燥された。
【００９４】
１．２．該物質の特徴付け
【００９５】
該物質の化学的性質がＸＲＤにより分析され、ミクロ孔がＳＥＭ（形態学）及び水銀侵入（ミクロ孔サイズ）により分析された。
【００９６】
該結果は、図１〜３に提示され、そして、調製された該物質が化学的に、微量のヒドロキシアパタイトを含有するリン酸β−トリカルシウムであることを示す（図１）。２μｍより小さい相互連結されたミクロ孔は、該物質中に均一に分布する（図２）。該ミクロ孔のサイズは、水銀侵入により測定されたとおり、０．５〜１．５μｍである（図３）。
【００９７】
１．３  動物実験及び組織学
【００９８】
移植物は、セラミック粒子の１．０ｃｃの体積からなった。対照移植物は、１〜３ｍｍの粒子サイズを有する移植物からなり（比較例；図４Ａ）そして試験移植物は２１２〜３００μｍの粒子サイズを有する移植物からなった（本発明に従う物質；図４Ｂ）。両方のタイプのインプラントが、イヌの背部筋肉中に移植された。８のイヌが１２週間両方の移植物を受けた。１２週間後、該移植物が、いくらかの周囲の組織を含んで回収され、そして、１０％の緩衝されたホルマリン（formation）（ｐＨ＝７．４）中に固定化された。該固定化されたサンプルは、系列エタノール溶液（７０％、８０％、９０％、９６％及び１００％×２）により脱水され、そして最後にＭＭＡ中に包埋された。脱灰されない部分（１０〜２０μｍ）が作成されそして、形成に関する組織学的観察及び組織形態計測的分析のために、メチレンブルー及び塩基性フクシンにより染色された。組織形態計測は、利用可能な空間において形成された骨の百分率に関して、該移植物の真ん中を横切った部分上で実施された。
【００９９】
該移植物のサイズ又は体積は、１２週間のイヌにおける筋肉内移植後に減少しており（１ｃｃ未満）、これはＴＣＰの吸収可能な性質を示した。さらに、１〜３ｍｍ粒子の該移植物の残ったサイズは、２１２〜３００μｍのサイズを有する粒子に基づく移植物よりも大きく、これは２１２〜３００μｍ微小粒子が、１〜３ｍｍ粒子より早く吸収されることを示す。該物質の吸収は、組織学的にも観察された（図５）。損なわれていないＴＣＰ粒子が、１〜３ｍｍ粒子に基づくＴＣＰ移植物中に見ることができたが、大抵のＴＣＰ微小粒子（２１２〜３００μｍ）は分解されそして吸収された。
【０１００】
２１２〜３００μｍ微小粒子の８のＴＣＰ移植物のうち６において、そして１〜３ｍｍの８のＴＣＰ移植物のうち８において、骨形成が見られた。しかしながら、最も劇的な効果は、２１２〜３００μｍ微小粒子に基づく移植物について観察された。１〜３ｍｍの粒子に伴う骨形成は限定され且つ該粒子それ自身に制限されたが（図５、左手側）、大量且つ広範囲に及ぶ骨形成が、２１２〜３００μｍの微小粒子に伴うことが発見されそして骨が微小粒子の間に主として形成されたことがわかった(図５、右手側）。さらに、大抵の微小粒子は１２週間の移植後に吸収され、そして、該移植物は実際に、「本物の」自己由来の骨へ変えられた。
【０１０１】
１．４考察及び結論
【０１０２】
本発明は、０．５〜１．５μｍのサイズのミクロ孔を有するミクロ孔リン酸カルシウムを有する移植物に関係する高められた誘導的骨形成を提示する。高められた骨形成は、粒状の形態においてこの物質を用いることにより且つ移植物中の特定の粒子サイズ（すなわち微小粒子、例えば２１２〜３００μｍ）を用いることにより観察される。
【０１０３】
この試みはこれから、非骨部分における本物の自己由来の骨を産生することの可能性および該リン酸カルシウム足場材料の完全な吸収に示す。
【０１０４】
実施例２．２つのリン酸トリカルシウムセラミックの骨形成性能力に影響する物質特性
【０１０５】
この実施例において、骨誘導研究モデル（非骨的な移植）における、異なるグレインサイズ及びミクロ孔サイズ、並びに異なるタンパク質吸着及び骨形成性能力を有する２つのリン酸トリカルシウムセラミックの間で比較が実施された。
【０１０６】
２．１  物質
【０１０７】
１のＴＣＰセラミック（ＴＣＰ−０１）が、Ｄ（ｖ．０．５）で２．８２μｍのサイズを有する不規則な形のＴＣＰ粉から、Ｈ２Ｏ２を発泡剤として用いる本発明の方法に従い調製された（表１）。手短に言うと、該ＴＣＰ粉が、希釈されたＨ２Ｏ２溶液（０．１〜５．０％；通常は２重量％）及びナフタレン粒子（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販で購入された粒子が(任意的に粉砕されそして）メッシュサイズ１４００μｍを有するふるいを通じてふるいにかけられる、１４００μｍ未満の画分が本実施例において用いられる）と混合されて、１００〜２５０ｍｌのＨ２Ｏ２溶液中の１００ｇのＴＣＰ粉のスラリーを得た。その後、該スラリーが、通常は一晩、５０〜７０℃の温度で攪拌無しでオーブン中にスラリーを置くことにより発泡された。次に、該発泡したスラリーが、８０〜１１０℃の温度でオーブン中で乾燥されて、多孔性の素地を得る。該多孔性の素地が、１１００℃で焼結されて、ＴＣＰ−０１を得た。該焼結した物質が、セラミック粒子を用意するために粉砕され、そして１〜３ｍｍの画分がふるいを用いて集められた。該セラミック粒子は次に使用のために洗浄されそして滅菌された。他方のＴＣＰ（ＴＣＰ−０２）はＶｉｔｏｓｓ  ＴＣＰ（１〜４ｍｍ、Ｏｒｔｈｏｖｉｔａ  Ｉｎｃ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ，ＵＳＡから市販で入手可能）であり、そして購入されたままで用いられた。
【０１０８】
表１．ＴＣＰ−０１＊についてのＴＣＰ粉の粒子サイズ分析
2009526600.tif 000002
Ｄ（ｖ．０．５）＝２．８２μｍ：体積において粒子の５０％が２．８２μｍより小さい。
【０１０９】
２．２  ＴＣＰセラミックのグレインサイズ
【０１１０】
ＴＣＰセラミックのグレインサイズが、５０００倍の倍率での走査型電子顕微鏡画像において測定された。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（商標）ソフトウェアを用いて、セラミックの最大のグレインがマークされそして測定された（図６）。１０のグレインが、それぞれのＴＣＰセラミックについてマークされそして測定された。ＴＣＰ−０１における最大のグレインのサイズは１．０１±０．１０μｍであり、他方ＴＣＰ−０２における最大のグレインのサイズは２．０６±０．４２μｍであった。
【０１１１】
２．３  ミクロ孔サイズ及びミクロ孔の面積百分率
【０１１２】
ＴＣＰセラミックのミクロ孔サイズが、２５００倍の倍率で走査型電子顕微鏡画像中で測定された。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（商標）Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを用いて、ミクロ孔及びＴＣＰグレインがマジックワンドツール（magic wand tool）により選ばれ、そして夫々にシュードカラー化（pseudocolored）された（図７）。ミクロ孔サイズを測定する為に、該シュードカラー化された画像がプリントされそして１０の最大のミクロ孔が測定された。ＴＣＰ表面上のミクロ孔の面積百分率を測定する為に、関心のある領域が選ばれ、そして、該選択の領域中の画素の総数が数えられた。次に、該ミクロ孔が、マジックワンドツールを用いて選ばれ、そして、ミクロ孔に関する画素数が数えられた。最後に、ＴＣＰ表面上のミクロ孔の面積百分率が、選ばれた表面積の画素の総数の百分率としてのミクロ孔に関するデジタル画像中における画素数として計算された。ＴＣＰ−０１は、０．９５±０．２８μｍより小さいミクロ孔及び２２．４％のミクロ孔の面積百分率を有する一方で、ＴＣＰ−０２は、１．０４±０．３３μｍより小さいミクロ孔及び４．４％のミクロ孔の面積百分率を有する。
【０１１３】
２．４  タンパク質吸着
【０１１４】
タンパク質吸着を試験する為に、１ｍｌのＴＣＰセラミックが、２５ｐｐｍのＮａＮ３における３ｍｌの１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）溶液中に浸された。３７℃で２４時間、サンプルをインキュベーションした後、タンパク質分析がＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて実施された。２４時間で、ＴＣＰ−０１は、３ｍｌの１％ＦＢＳからタンパク質の６０±３％を吸収したこと、そしてＴＣＰ−０２は１８±２％吸収したことが分かった（図８を参照されたい）。
【０１１５】
２．５  骨形成性能力
【０１１６】
骨形成性能力を試験する為に、ＴＣＰ−０１及びＴＣＰ−０２の１ｍｌセラミック粒子が８のイヌの背部筋肉中に移植された。１２週間後、該動物は屠殺され、そして、該サンプルは周囲の組織と一緒に回収された。回収されたサンプルは次に、緩衝ホルマリンにより固定化され、脱水されそしてＭＭＡ中に包埋された。脱灰されない部分が作成され、そして、組織学的観察及び組織形態計測の為にメチレンブルー及び塩基性フクシンにより染色された。イヌの筋肉内の１２週間の移植後の全てのＴＣＰ−０１移植物（ｎ＝８）において豊富な骨が形成され、ＴＣＰ−０２においては骨は見られなかった（図９）。ＴＣＰ−０１における骨の面積百分率は１５±９％であった。
【０１１７】
２．６  結論
【０１１８】
２つのリン酸トリカルシウムセラミックのグレインサイズ、ミクロ孔サイズ、ミクロ孔の面積百分率、タンパク質吸着及び骨形成性能力を考慮すると、グレインサイズ、ミクロ孔サイズ、ミクロ孔の面積百分率、タンパク質吸着及び骨形成性能力の間の関係が発見された。より小さいグレインサイズ、ミクロ孔のより高い面積百分率及びタンパク質吸着のより多い量を有するほど、ＴＣＰ−０１はより高い骨形成性能力を有しそしてとても改善されたリン酸カルシウムセラミックである。該改善されたリン酸カルシウムセラミックは従って、１．５０μｍより小さい（０．１０〜１．５０μｍ）グレインサイズ、１．５０μｍより小さい（０．１０〜１．５０μｍ）ミクロ孔サイズ、１０％より高いリン酸カルシウムセラミック表面上のミクロ孔の面積百分率（１０〜４０％）及び、３ｍｌの１％ウシ胎仔血清溶液から１．０ｍｌ（又は約４００ｍｇ）多孔性セラミック粒子（８０％の合計の多孔度を有する）への２４時間での４０％超（４０〜８０％）のタンパク質と同等のより高いタンパク質吸着を有するリン酸カルシウムセラミックとして定義される。
【０１１９】
実施例３  セラミック特性に対するリン酸カルシウム粉のタイプの効果
【０１２０】
この実施例は、改善されたリン酸カルシウムセラミックについてのリン酸カルシウム粉を記載した。
【０１２１】
３．１  リン酸カルシウム粉
【０１２２】
さまざまな様式により調製され且つさまざまな形及びサイズを有する４つのＴＣＰ粉が本実施例において用いられた。それらは、粉Ａ、粉Ｄ、粉Ｅ及び粉Ｆであった。粉Ａ及び粉Ｅはオーブン乾燥され粉砕され、他方、粉Ｄ及びＦはスプレー乾燥された。
【０１２３】
全ての４の粉は、同様の正規の粒子サイズ分布を有したが、異なる粒子サイズを有した。さまざまな粉についてのＤ（ｖ.０．５）での粒子サイズは：Ａ、２．７９μｍ；Ｄ、１１．６０μｍ；Ｅ、２．８２μｍ、Ｆ、７．８０μｍであった。走査型電子顕微鏡下で比較されたとおり、粉Ａ及び粉Ｅはより小さな不規則な粒子である一方で、粉Ｄ及び粉Ｆはより大きく且つより球形の粒子を有した（図１１）。
【０１２４】
３．２  リン酸カルシウムセラミックの調製
【０１２５】
ＴＣＰ粉が、希釈されたＨ２Ｏ２溶液（０．１〜５．０％）及びナフタレン粒子（＜１４００μｍ）と混合されて、スラリーを形成した。該スラリーは、、素地を用意するために、４０〜７０℃で発泡されそして８０〜１１０℃で乾燥された。その後、該素地が、８時間１１００℃で焼結された。最後に、セラミック粒子（１〜２ｍｍ）が形成され、洗浄され、乾燥されそして１２１℃で滅菌された。４つのリン酸カルシウムセラミックが、４つのリン酸トリカルシウム粉から夫々調製された。それらは、セラミックＡ（粉Ａから）、セラミックＤ（粉Ｄから）、セラミックＥ（粉Ｅから）及びセラミックＦ（粉Ｆから）であった。
【０１２６】
３．３  グレインサイズ
【０１２７】
４のＴＣＰセラミックのグレインサイズが、５０００倍の倍率で、走査型電子顕微鏡画像において測定された。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（商標）ソフトウェアを用いて、該セラミックの最大のグレインがマークされそして印刷された（図１２）。夫々のＴＣＰセラミックについて、１０のグレインがマークされ且つ測定された。最大のグレインのサイズは、セラミックＡにおいて１．１４±０．１２μｍ、セラミックＤにおいて１．５６±０．３６、セラミックＥにおいて１．０１±０．１０μｍ及びセラミックＦについて１．３０±０．３１μｍであった。
【０１２８】
３．４  ミクロ孔サイズ及びミクロ孔の面積百分率
【０１２９】
ＴＣＰセラミックのミクロ孔サイズが、２５００倍の倍率で、走査型電子顕微鏡画像において測定された。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（商標）Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを用いて、ミクロ孔及びＴＣＰグレインが、マジックワンドツールにより選ばれ、そして夫々についてシュードカラー化された（図１３）。ミクロ孔サイズを測定する為に、該シュードカラー化された画像がプリントされ、そして１０の最大のミクロ孔が測定された。ＴＣＰ表面上のミクロ孔の面積百分率を測定する為に、関心のある領域が選ばれ、そして画素が数えられ、次に該ミクロ孔がマジックワンドツールにより選ばれ、そして画素が数えられた。最後に、ＴＣＰ表面上のミクロ孔の面積百分率が、実施例２において記載されたとおりに計算された。セラミック表面上のミクロ孔サイズ及びミクロ孔の面積百分率は夫々、セラミックＡについて０．７３±０．１２μｍ及び１０．１％、セラミックＤについて１．２３±０．３３μｍ及び１４．５％、セラミックＥについて０．９５±０．２８μｍ及び２２．４％、並びに、セラミックＦについて１．２３±０．２１μｍ及び１６．１％であった。
【０１３０】
３．５  タンパク質吸着
【０１３１】
タンパク質吸着を試験する為に、１ｍｌのＴＣＰセラミックが、２５ｐｐｍのＮａＮ３溶液中の３ｍｌの１％ＦＢＳ中に浸された。３７℃で２４時間の該サンプルのインキュベーション後、タンパク質分析が、ＢＣＡキットにより実施された。２４時間で、セラミックＡは、３ｍｌの１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）溶液から４８±４％タンパク質を吸着し、セラミックＤは３６±３％吸着し、セラミックＥは５９±２％吸着し及びセラミックＦは４１±２％吸着した（図１４）。
【０１３２】
３．６  結論
【０１３３】
４のＴＣＰ粉から調製されたセラミックは、該粉が製造された様式及び／又は粒子サイズ及び／又は粒子サイズ分布に起因して、多様な特徴を有した。表２は、粉Ａ[オーブン乾燥され粉砕された、Ｄ（ｖ.０．５）で２．７９μｍの粉の粒子サイズを有する不規則な粒子）、粉Ｅ[オーブン乾燥され粉砕された、Ｄ（ｖ.０．５）で２．８２μｍの粉の粒子サイズを有する不規則な粒子]及び粉Ｆ[スプレー乾燥された、Ｄ（ｖ.０．５）で７．８０μｍの粉の粒子サイズを有する球形の粒子]から調製されたセラミックは、試験されたさまざまなパラメータにわたり非常に類似の特徴を有し、そして小さなグレインサイズとの組み合わせにおいて特に改善されたタンパク質吸収を示した。他方、粉Ｄ[スプレー乾燥された、Ｄ（ｖ.０．５）で１１．６０μｍの粉の粒子サイズを有する球形粒子]から調製されたセラミックＤは、１．５μｍ超のグレインサイズとの組み合わせにおいて、減少されたタンパク質吸収能力を示した。それ故に、不規則な形を有し且つＤ（ｖ.０．５）で２．００〜４．００μｍの粉の粒子サイズを有するオーブン乾燥され粉砕された粉が、改善されたリン酸カルシウムセラミックを製造する為に好ましく、８．０μｍより大きい球形の粒子を有するスプレー乾燥された粉はより適当でないことが結論付けられる。
【０１３４】
2009526600.tif 000003
【０１３５】
実施例４  改善された骨誘導的特性を有するリン酸カルシウムセラミックを調製する方法
【０１３６】
この実施例は、静水圧プレスを用いた方法と比較して、発泡剤としてＨ２Ｏ２を用いた本発明の方法を用いたリン酸カルシウムセラミックの製造を記載する。
【０１３７】
４．１  リン酸カルシウム粉
【０１３８】
本実施例で用いられたリン酸カルシウム粉は、Ｄ（ｖ.０．５）で７．８０μｍのサイズを有する球形の粒子を有するスプレー乾燥されたリン酸トリカルシウム（ＴＣＰ）粉であった。
【０１３９】
４．２  セラミック
【０１４０】
２つのセラミック粒子が作成され、本明細書においてＴＣＰ−Ｈ２Ｏ２及びＴＣＰ−ｐｒｅｓｓといわれた。
【０１４１】
ＴＣＰ−Ｈ２Ｏ２が、発泡剤としてＨ２Ｏ２を用いて調製された。手短に言うと、ＴＣＰ粉が、希釈されたＨ２Ｏ２溶液（０．１〜５．０％）及びナフタレン粒子（＜１４００μｍ）と混合されてスラリーを形成し、次に該スラリーが４０〜７０℃で発泡され、そして８０〜１１０℃で乾燥されて素地を得た。その後、該素地が８時間１１００℃で焼結された。最後に、セラミック微小粒子（２１２〜３００μｍ）が粉砕により作成され、そして粒子が洗浄され且つ乾燥された。
【０１４２】
ＴＣＰ−ｐｒｅｓｓは、静水圧プレスにより調製された。ＴＣＰ粉が水と混合され、そして最初に１ＭＰａで１分間圧縮され、次に５ＭＰａで５分間圧縮された。（シリンダーの形の）得られた物質は、６０℃で乾燥され、そして次に１１００℃で焼結された。最後に、セラミック微小粒子（２１２〜３００μｍ）が粉砕により作成され、そして粒子が洗浄され且つ乾燥された。
【０１４３】
４．３  グレインサイズ
【０１４４】
２つのＴＣＰセラミックのグレインサイズが、５０００倍の倍率で走査型電子顕微鏡を用いて測定された。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（商標）ソフトウェアを用いて、セラミックの最大のグレインがマークされそして測定された（図１５を参照されたい）。夫々のＴＣＰセラミックについて、１０のグレインがマークされそして測定された。最大のグレインのサイズは、ＴＣＰ−Ｈ２Ｏ２において１．１５±０．２１μｍ、ＴＣＰ−ｐｒｅｓｓにおいて１．０７±０．２０μｍであった。
【０１４５】
４．４  ミクロ孔サイズ及びミクロ孔の面積百分率
【０１４６】
２のＴＣＰセラミックのミクロ孔サイズが、２５００倍の倍率で走査型電子顕微鏡画像を用いて測定された。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（商標）Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（商標）ソフトウェアを用いて、ミクロ孔及びＴＣＰグレインが、「マジックワンド」ツールを用いて選ばれ、そしてシュードカラーを用いて夫々塗りつぶされた（図１６）。ミクロ孔サイズを測定する為に、該シュードカラー化画像がプリントされ、そして最大のミクロ孔の５が測定された。ＴＣＰ表面上のミクロ孔の面積百分率を測定する為に、関心のある領域が選ばれそして画素が数えられ、次に該ミクロ孔が「マジックワンド」ツールを用いて選ばれ、そしてそれによってマークされた画素が数えられた。これらの２の計数から、ＴＣＰ表面当たりのミクロ孔の面積百分率は、上記で記載されたとおり計算された。セラミック表面上のミクロ孔サイズ及びミクロ孔の面積百分率は夫々、ＴＣＰ−Ｈ２Ｏ２について１．２８±０．１０μｍ及び１４．１％、ＴＣＰ−ｐｒｅｓｓについて１．０６±０．４５μｍ及び５．４％であった。
【０１４７】
４．５  タンパク質吸着
【０１４８】
タンパク質吸着を試験する為に、１ｍｌのＴＣＰセラミックが２５ｐｐｍＮａＮ３溶液中の３ｍｌの１％ＦＢＳ中に浸された。３７℃で２４時間の該サンプルのインキュベーション後、タンパク質分析がＢＣＡキットにより実施された。２４時間において、ＴＣＰ−Ｈ２Ｏ２は、３ｍｌの１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）溶液から７８±５％タンパク質を吸着し、ＴＣＰ−ｐｒｅｓｓは２４±２％吸着した（図１７）。
【０１４９】
４．６  結論
【０１５０】
Ｈ２Ｏ２方法及び静水圧プレスにより調製されたセラミックは、多様な特徴を有した。表３は、ＴＣＰ−Ｈ２Ｏ２が、ＴＣＰ−ｐｒｅｓｓよりも、高いミクロ孔の面積百分率を提示し且つ良いタンパク質吸収特徴を有したことを示した。それ故に、リン酸カルシウムセラミックの骨誘導的特性の改善において、Ｈ２Ｏ２方法が静水圧プレス方法を超えて好ましいことが結論付けられる。
【０１５１】
2009526600.tif 000004
【０１５２】
実施例５  リン酸カルシウムセラミックに対する焼結温度の影響
【０１５３】
この実施例は、このように調製されたリン酸カルシウムセラミックの骨誘導的特性に対する、リン酸カルシウムセラミックを調製する方法における焼結温度の影響を記載する。
【０１５４】
５．１  リン酸カルシウム粉
【０１５５】
本実施例において用いられたリン酸カルシウム粉は、Ｄ（ｖ．０．５）で２．１１μｍのサイズを有する不規則な粒子を有するオーブン乾燥され粉砕されたＴＣＰ粉であった。
【０１５６】
５．２  セラミック
【０１５７】
セラミックが、Ｈ２Ｏ２方法により調製されたが、１０５０℃、１０７５℃及び１１００℃の種々の温度で焼結された。手短に言うと、ＴＣＰ粉が、希釈されたＨ２Ｏ２溶液（０．１〜５．０％）及びナフタレン粒子（＜１４００μｍ）と混合されてスラリーを形成し、次に該スラリーは４０〜７０℃で発泡され、そして８０〜１１０℃で乾燥されて、多孔性の素地を得た。その後、該素地は、１０５０℃、１０７５℃及び１１００℃で夫々８時間焼結された。最後に、セラミック粒子（１〜２ｍｍ）が作成され、洗浄され、乾燥されそして１２１℃で滅菌された。
【０１５８】
５．３  グレインサイズ
【０１５９】
３のＴＣＰセラミックのグレインサイズが、５０００倍の倍率で走査型電子顕微鏡画像において測定された。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（商標）ソフトウェアを用いて、セラミックの最大のグレインがマークされそしてプリントされた（図１８）。夫々のＴＣＰセラミックについて１０のグレインがマークされそして測定された。最大のグレインのサイズは、１０５０℃で焼結されたＴＣＰにおいて０．７６±０．０８μｍ、１０７５℃で焼結されたＴＣＰにおいて１．３０±０．１２μｍ及び１１００℃で焼結されたＴＣＰにおいて１．５３±０．２０μｍであった。
【０１６０】
５．４  ミクロ孔サイズ及びミクロ孔の面積百分率
【０１６１】
ＴＣＰセラミックのミクロ孔サイズは、２５００倍の倍率で走査型電子顕微鏡画像において測定された。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（商標）Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを用いて、ミクロ孔及びＴＣＰグレインが、マジックワンドツールにより選ばれ、そして夫々シュードカラー化された（図１９）。ミクロ孔サイズを測定する為に、該シュードカラー化された画像がプリントされ、そして１０の最大のミクロ孔が測定された。
【０１６２】
ＴＣＰ表面上のミクロ孔の面積百分率を測定する為に、関心のある領域が選らばれ、そして画素が読まれ、次に該ミクロ孔がマジックワンドツールにより選ばれそして画素が読まれた。最後に、ＴＣＰ表面上のミクロ孔の面積百分率が計算された。セラミック表面上のミクロ孔サイズ及びミクロ孔の面積百分率は夫々、１０５０℃で焼結されたＴＣＰについて０．５８±０．０９μｍ及び２４．２％、１０７５℃で焼結されたＴＣＰについて０．６２±０．１２μｍ及び１１．３％、１１００℃で焼結されたＴＣＰについて０．４７±０．１９μｍ及び４．５％であった。
【０１６３】
５．５  タンパク質吸着
【０１６４】
タンパク質吸着を試験する為に、１ｍｌのＴＣＰセラミックが、２５ｐｐｍのＮａＮ３溶液中の３ｍｌの１％ＦＢＳ中に浸された。３７℃で２４時間のサンプルのインキュベーション後、タンパク質分析がＢＣＡキットにより実施された。２４時間において、１０５０℃で焼結されたＴＣＰは、３ｍｌの１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）溶液から６８±７％タンパク質を吸着し、１０７５℃で焼結されたＴＣＰは５９±８％吸着し、及び１１００℃で焼結されたＴＣＰは３７±５％吸着した（図２０）。
【０１６５】
５．６結論
【０１６６】
種々の温度で焼結されたセラミックは、多様な特徴を有した。表４は、１１００℃で焼結されたＴＣＰが、１０５０℃又は１０７５℃で焼結されたリン酸カルシウムセラミックよりも、大きなグレインサイズ及び低いタンパク質吸収能力を提示したことを示した。
それ故に、リン酸トリカルシウムセラミックの骨誘導的特性を改善する為に、焼結温度は、好ましくは１１００℃を超えないべきであり、好ましくは約１０５０〜１０７５℃であるべきであることが結論付けられる。
【０１６７】
2009526600.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】実施例１において記載された物質のＸＲＤパターンを示すグラフである。
【図２】実施例１において記載された物質のミクロ孔の形態学的な図である。
【図３】水銀侵入により測定されたとおりの増加する孔容積対平均ミクロ孔直径のプロットを表すグラフである。
【図４】実施例１において用いられた２つの移植物材料を示す図である。
【図５】回収された移植物の組織学的調製物の顕微鏡写真を表す図である。
【図６】実施例２において記載されたＴＣＰ−０１（Ａ）及びＴＣＰ−０２（Ｂ）のグレインサイズを示すＳＥＭ画像を示す図である。
【図７】実施例２において記載されたＴＣＰ−０１（Ａ）及びＴＣＰ−０２（Ｂ）のミクロ孔サイズを示す顕微鏡写真を示す図である。
【図８】１％ＦＢＳからの２４時間におけるＴＣＰセラミックのタンパク質吸着のグラフである。
【図９】イヌの筋肉内の１２週間の移植後のＴＣＰ−０１（Ａ）における骨形成及びＴＣＰ−０２（Ｂ）において骨形成がなかったことの組織学的顕微鏡写真を示す図である。
【図１０】粉Ｅの粒子サイズ分布を示すグラフである。
【図１１】ＳＥＭ観察下の４のＴＣＰ粉の形態を示す図である。
【図１２】種々のセラミック中のグレインを示す図である。
【図１３】種々のセラミックの表面上のミクロ孔を示す図である。
【図１４】１％ＦＢＳからの２４時間における種々のセラミックのタンパク質吸着を示すグラフである。
【図１５】ＴＣＰセラミック中のグレインを示す図である。
【図１６】セラミック表面上のミクロ孔を示す図である。
【図１７】２４時間における１％ＦＢＳからのセラミックのタンパク質吸着を示すグラフである。
【図１８】種々の温度で焼結されたＴＣＰセラミック中のグレインを示す図である。
【図１９】種々の温度で焼結された種々のセラミックの表面上のミクロ孔を示す図である。
【図２０】２４時間における１％ＦＢＳからのセラミックのタンパク質吸着を示すグラフである。
【図１】
2009526600.tif 000006
【図２】
2009526600.tif 000007
【図３】
2009526600.tif 000008
【図４】
2009526600.tif 000009
【図５】
2009526600.tif 000010
【図６】
2009526600.tif 000011
【図７】
2009526600.tif 000012
【図８】
2009526600.tif 000013
【図９】
2009526600.tif 000014
【図１０】
2009526600.tif 000015
【図１１】
2009526600.tif 000016
【図１２】
2009526600.tif 000017
【図１３】
2009526600.tif 000018
【図１４】
2009526600.tif 000019
【図１５】
2009526600.tif 000020
【図１６】
2009526600.tif 000021
【図１７】
2009526600.tif 000022
【図１８】
2009526600.tif 000023
【図１９】
2009526600.tif 000024
【図２０】
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【国際調査報告】
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2009526600.tif 000027
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