(57)【要約】  特に、間充織幹細胞が、次の表面マーカー：ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１０５またはＣＤ１６６の少なくとも１種の発現、およびＣＤ１４、ＣＤ３４またはＣＤ４５の少なくとも１種の発現の欠如を特徴とする、間充織幹細胞を含んでなる、眼の疾病および障害のための細胞に基づくまたは再生療法に適用可能な組成物および方法。
2009500297.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼の変性症状を処置するのに有効な量において、間充織幹細胞を患者に投与することを含んでなり、かつ、間充織幹細胞が、次の表面マーカー：ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１０５またはＣＤ１６６の少なくとも１種の発現、およびＣＤ１４、ＣＤ３４またはＣＤ４５の少なくとも１種の発現の欠如を特徴とする眼の変性症状を有する患者の処置方法。
【請求項２】
間充織幹細胞がインサイチューで眼細胞の生残を促進するが、細胞が光受容体層に類似する構造物を形成せず、そして光受容体に特異的なマーカーを発現しない、請求項１の方法。
【請求項３】
間充織幹細胞がインサイチューで眼細胞から光受容体の形成を促進するが、幹細胞が光受容体それ自体に分化しない、請求項１の方法。
【請求項４】
眼の変性症状が急性の眼の変性症状である、請求項１の方法。
【請求項５】
急性の眼の変性症状が、脳傷害、視神経傷害または眼の病変である、請求項４の方法。
【請求項６】
眼の変性症状が慢性または進行性の変性症状である、請求項１の方法。
【請求項７】
慢性または進行性変性症状が、斑点変性、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、緑内障、辺縁上皮細胞欠乏症である、請求項６の方法。
【請求項８】
細胞が少なくとも１種の他の細胞タイプとともに投与される、請求項１の方法。
【請求項９】
少なくとも１種の他の細胞タイプが、星状細胞、希突起膠細胞、ニューロン、神経始原細胞、神経幹細胞、網膜上皮幹細胞、角膜上皮幹細胞、または他の多能性または多分化性幹細胞である、請求項８の方法。
【請求項１０】
少なくとも１種の他の細胞タイプが、間充織幹細胞と同時に、またはその前または後に投与される、請求項８の方法。
【請求項１１】
細胞が少なくとも１種の他の作用物質とともに投与される、請求項１の方法。
【請求項１２】
少なくとも１の他の作用物質が、細胞と同時に、またはその前または後に投与される、請求項１１の方法。
【請求項１３】
細胞が眼の表面に投与される、請求項１の方法。
【請求項１４】
細胞が眼の内部に投与される、請求項１の方法。
【請求項１５】
細胞が、眼の内または眼に近接した患者の体内にカニューレを通して、または移植されたデバイスから投与される、請求項１４の方法。
【請求項１６】
細胞が、細胞を含有する三次元のマトリックスまたは支持体（ｓｕｐｐｏｒｔ）の移植によって投与される、請求項１４の方法。
【請求項１７】
組成物が、眼の変性症状を処置するのに有効な量における間充織幹細胞、および製薬学的に許容できる担体を含んでなる、眼の変性症状を有する患者を処置するための製薬学的組成物。
【請求項１８】
間充織幹細胞が、次の表面マーカー：ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１０５またはＣＤ１６６の少なくとも１種の発現、およびＣＤ１４、ＣＤ３４またはＣＤ４５の少なくとも１種の発現の欠如を特徴とする、請求項１７の製薬学的組成物。
【請求項１９】
眼の変性症状が急性の眼の変性症状である、請求項１７または１８の製薬学的組成物。
【請求項２０】
急性の眼の変性症状が、脳傷害、視神経傷害または眼の病変である、請求項１９の製薬学的組成物。
【請求項２１】
眼の変性症状が慢性または進行性の変性症状である、請求項１７または１８の製薬学的組成物。
【請求項２２】
慢性または進行性の眼の変性症状が、斑点変性、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、緑内障、辺縁上皮細胞欠乏症である、請求項２１の製薬学的組成物。
【請求項２３】
間充織幹細胞がインサイチューで眼細胞の生残を促進するが、細胞が光受容体層に類似する構造物を形成せず、そして光受容体に特異的なマーカーを発現しない、請求項１７または１８の製薬学的組成物。
【請求項２４】
間充織幹細胞がインサイチューで眼細胞から光受容体の形成を促進するが、幹細胞が光受容体それ自体に分化しない、請求項１７または１８の製薬学的組成物。
【請求項２５】
少なくとも１種の他の細胞タイプを含有する、請求項１７または１８の製薬学的組成物。
【請求項２６】
少なくとも１種の他の細胞タイプが、星状細胞、希突起膠細胞、ニューロン、神経始原細胞、神経幹細胞、網膜上皮幹細胞、角膜上皮幹細胞、または他の多能性または多分化性幹細胞である、請求項２５の製薬学的組成物。
【請求項２７】
少なくとも１種の他の作用物質を含んでなる、請求項２５の製薬学的組成物。
【請求項２８】
少なくとも１種の他の作用物質が眼の変性障害を処置するための薬物である、請求項２７の製薬学的組成物。
【請求項２９】
細胞が眼の表面に投与される、請求項１７または１８の製薬学的組成物。
【請求項３０】
細胞が眼の内部に投与される、請求項１７または１８の製薬学的組成物。
【請求項３１】
製薬学的担体が、細胞を含有する三次元のマトリックスまたは支持体として調合される、請求項１７または１８の製薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、眼の疾病および障害についての細胞に基づくまたは再生療法の分野に関する。特に、本発明は、間充織幹細胞、および場合によっては眼の細胞および組織の再生または修復のための製薬学的組成物、デバイスを用いる方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
身体の複合および感覚器官として、眼は、正常に機能するその能力に影響を与える種々の疾病および他の有害な症状を経験する。これらの症状の多くは、特定の眼の細胞、およびそれらの細胞から作り上げられる組織の損傷または変性に伴われる。１つの例として、眼の神経および網膜の疾病および変性症状は、世界を通じての盲目の筆頭原因である。角膜、水晶体および関連する眼組織の損傷または変性は、視覚喪失のその他の有意な原因を表す。網膜は、光のシグナルを神経のシグナルに変換する細胞およびプロセスを交互に行う７つの層を含有する。網膜の光受容体および隣接する網膜色素上皮（ＲＰＥ）は機能的単位を形成し、これは、多くの障害において、遺伝的突然変異または環境条件（年齢を含む）によりアンバランスになる。このことが光受容体の喪失をもたらし；アポトーシスまたは二次的変性をとおして、これが視覚の進行性変性、そしてある場合には、盲目をもたらす（総説として、例えば非特許文献１、参照）。このパターンに落ち入る２つのクラスの眼の障害は、年齢に関連する斑点変性（ＡＭＤ）および網膜色素変性症（ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）（ＲＰ）である。
【０００３】
ＡＭＤは、米国において５０才以上の高齢者における視覚喪失のもっとも普通の原因であり；そしてその普及は年齢とともに増加する。ＡＭＤにおける一次障害は、ＲＰＥ機能障害およびＢｒｕｃｈ’ｓ膜における変化、例えば、脂質沈着、タンパク質架橋および栄養素に対する透過性の減少によるものと考えられる（非特許文献１）。遺伝的組み立て、年齢、栄養、喫煙および日光への曝露を含む、種々の要素が斑点変性に起因するであろう。
【０００４】
ＲＰは主に遺伝される疾患と考えられる：１００個を超える突然変異が光受容体の喪失に係わっていた（非特許文献１）。多数の突然変異は光受容体を標的とするが、あるものは直接にＲＰＥ細胞を冒す。同時に、これらの突然変異は、例えば、光受容体およびＲＰＥ細胞および光伝達の間の分子的往来のようなプロセスに影響を与える。
【０００５】
他のあまり一般的ではないが、それにも拘わらず、衰弱性の網膜症がまた視覚喪失および盲目をもたらす進行性細胞変性を伴うことがある。これらは、例えば、糖尿病性網膜症および脈絡膜の新生血管膜（ＣＮＶＭ）を含む。糖尿病性網膜症は、（１）毛細血管の透過性の増加、浮腫、出血、小血管瘤および滲出液を特徴とする、非増殖性またはバックグラウンド網膜症、あるいは（２）網膜からガラス体まで伸びる新生血管形成、瘢痕生成、繊維組織形成および網膜剥離を特徴とする、増殖性網膜症として分類されてもよい。ＣＮＶＭでは、脈絡膜から発する異常血管が網膜層を通して成長する。脆弱な新血管は容易に破壊し、網膜の層内に血液および流体を貯留させる。
【０００６】
眼神経および眼の関連神経の損傷または進行性変性は、視覚喪失および盲目のその他の先導原因を構成する。最初の例は、緑内障、視神経に対する損傷によって視覚喪失を惹起する眼疾患のコレクションから組み立てられる眼の症状である。不十分な眼の排液による眼内圧（ＩＯＰ）の上昇は緑内障の主因であるが、それはまた上昇ＩＯＰの不在下でも起き得る。
【０００７】
緑内障は眼の高齢として発生することがあり、あるいはそれは、眼の傷害、炎症、腫瘍の結果として、または白内障または糖尿病の進行症例において発生することもあり、あるいはそれは例えば、ステロイドのようなある種の薬物によって惹起されることもある。緑内障における眼の神経症の第一の特色は、視神経乳頭における特徴的変化、生残する網膜神経節細胞の数の減少、および視覚喪失を含む。事象のカスケードが、疾病において観察される網膜神経節細胞のゆっくりした死による視神経乳頭の変性と結び付いており、そしてこの事象のカスケードが、神経保護剤の使用を通じて遅延させるか、または予防できることが提案された（非特許文献２）。
【０００８】
細胞の損傷および変性症状はまた眼の他の部分に影響を与える。例えば、白内障は眼の水晶体の漸進的混濁からもたらされる。一旦始まると、白内障の発展は、１つ以上の共通経路に沿って進行し、ついにはレンズ線維に対する損傷に達する。この症状は、冒された水晶体の外科的除去および置換によって現在では処置される。その他の例は、眼の表面を形成する角膜および周囲の結膜に関する。角膜と球状の結膜の間にある辺縁上皮は、網膜上皮幹細胞を含有する。辺縁上皮細胞欠乏症（ＬＥＣＤ）は、例えば、Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群および熱または化学火傷において生じる症状である。ＬＥＣＤはしばしば角膜上皮と結膜上皮の間の不均衡をもたらし、ここで、角膜は侵襲する結膜上皮細胞によって覆われ、これが角膜表面を重度に傷つけ、そして視力さに影響する（非特許文献３）。
【０００９】
組織修復および再生のための幹細胞に基づく療法の近年の出現は、多くの前述の細胞変性病および他の眼の障害のための有望な処置を提供する。幹細胞は自己再生および分化して種々の成熟細胞系統を生成することが可能である。そのような細胞の移植は、標的組織を再構成するための臨床的道具として利用することができ、それによって生理学的および解剖学的機能を回復することができる。幹細胞技術の応用は広範囲であり、組織工学、遺伝子治療送達および細胞治療学、すなわち、生物治療剤を産生または含有する外因的に供給される生存細胞または細胞成分を介する、標的の場所へのそれらの薬剤の送達を含む（総説では、非特許文献４、参照）。
【００１０】
幹細胞技術の治療学的可能性の実現に対する障害は、幹細胞の十分な数を得ることにおける困難であった。幹細胞の１つの起源は胚性または胎児性組織である。胚性幹細胞および始原細胞は、ヒトを含む多数の哺乳動物種から単離され、そして数種のそのような細胞タイプは、自己再生および拡大と、同様に種々の細胞系統への分化が可能であることが示された。動物モデル系では、胚性幹細胞は、ＲＰＥ細胞表現型へ分化すること、ならびに移植後に宿主光受容体の生残を増進することが報告された（非特許文献５；非特許文献６）。しかし、胚性または胎児性起源からの幹細胞の誘導は、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）または多分化性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞の他の起源を同定することによって回避することが望ましいという多くの倫理学的争点をまき起こした。
【００１１】
また成熟組織は細胞に基づく眼治療のために有用な幹細胞を生成することができる。例えば、網膜および角膜の幹細胞それ自体が、眼における細胞置換療法のために利用されてもよい。さらに、海馬由来の神経幹細胞は、ある種の神経およびグリアの特性を採用して、宿主網膜を組み入れることが報告された（参照、総説、非特許文献７）。胎児性ラット皮質から調製された神経幹細胞は、成熟ラットの網膜下間隙中への移植後にＲＰＥ細胞経路に沿って分化することが示された（非特許文献８）。
【００１２】
骨髄幹細胞は、宿主の網膜中への移植後に網膜神経細胞および光受容体に分化することが報告された（非特許文献９；非特許文献１０）。Ｋｉｃｉｃ，Ａ，らは、ＣＤ９０＋間充織幹細胞が宿主網膜中に組み込むことが可能であったことを報告している。これらの細胞は分化を経て、光受容体層に類似する構造物を形成し、そして光受容体特異的マーカー
を発現した。
【００１３】
Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒら（特許文献１）は、眼へのＬｉｎ−／ＣＤ３１＋造血幹細胞の注入による眼における血管および神経回路網の救済を報告している。
【００１４】
培養粘膜上皮幹細胞を利用する、ウサギモデル系における眼表面の再構築がまた報告された（非特許文献３、前出）。これらの報告は、眼のための細胞に基づく療法における成熟始原細胞および幹細胞の使用についての見込みを示しているが、成熟幹細胞集団は比較的稀であり、そしてしばしば侵入的操作によってのみ得ることができることを注意すべきである。
【００１５】
さらに、成熟幹細胞は、胚性幹細胞よりも限定された培養において拡大能力を有するであろう。かくして、眼における喪失した細胞機能を支援し、増大し、または置換する能力を有する細胞の十分な供給の代替起源についてのニーズが存在する。そのような細胞の実質的均一集団の信頼できる十分に特性決定され、かつ潤沢な供給は、薬物スクリーニングアッセイ、眼および他の有用な細胞タイプのエクスビボまたはインビトロの栄養支援、およびインビボの細胞に基づく療法を含む、眼の修復および再生における種々の診断的および治療的応用において得策であろう。
【００１６】
最後に、本発明は、眼の疾病のための療法としての細胞系の使用に対向される。数種の細胞系が、特許文献２に開示される方法にしたがって網膜色素変性症の齧歯類モデルにおいて試験された。本発明は、眼の疾病のための療法として有用であるようなヒト間充織幹細胞の使用を記述している。
【００１７】
【特許文献１】Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＡに譲渡された米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００６３９６１号
【特許文献２】米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００３７４９１号
【非特許文献１】Ｌｕｎｄ，Ｒ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｒｅｔｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：４１５−４４９
【非特許文献２】Ｏｓｂｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，１３（Ｓｕｐｐ．３）：Ｓ１９−Ｓ２６
【非特許文献３】Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．＆Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｓ．，２００３，Ｃｏｒｎｅａ  ２２（Ｓｕｐｐ．１）：Ｓ７５−Ｓ８０
【非特許文献４】Ｔｒｅｓｃｏ，Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ４２：２−３７
【非特許文献５】Ｈａｒｕｔａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉ．４５：１０２０−１０２５
【非特許文献６】Ｓｃｈｒａｅｒｍｅｙｅｒ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １０：６７３−６８０
【非特許文献７】Ｌｕｎｄ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．７４：１５１−１６０
【非特許文献８】Ｅｎｚｍａｎｎ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉ．：５４１７−５４２２
【非特許文献９】Ｔｏｍｉｔａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２０：２７９−２８３
【非特許文献１０】Ｋｉｃｉｃ，Ａ，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：７７４２−７７４９
【発明の開示】
【００１８】
本発明は、眼の疾病および障害についての細胞に基づくまたは再生療法に応用可能な組
成物および方法を提供する。特に、本発明は、場合によっては眼の細胞または組織の修復または再生のための製薬学的組成物またはデバイスとともに、間充織幹細胞を特色とする。一旦、眼中の標的の場所に移植された場合、本発明の間充織幹細胞は、インサイチューで眼の細胞のために栄養支援を提供してもよく、あるいはそれらは、１種以上の表現型にそれ自体分化してもよく、あるいはそれらは、それらの様式の両方において有利な効果を発揮してもよいが、細胞は光受容体層に類似する構造物を形成せず、そして光受容体に特異的なマーカー、例えばロドプシンを発現しない。
【００１９】
本発明の１つの態様は、眼の変性症状を処置するのに有効な量において、多能性または多分化性間充織幹細胞を患者に投与することを含む、眼の変性症状を有する患者を処置する方法を特色とする。ある実施態様では、眼の変性症状は、脳傷害、視神経傷害または眼の病変のような急性の眼の変性症状である。他の実施態様では、それは慢性または進行性変性症状、例えば斑点変性、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、緑内障、辺縁上皮細胞欠乏症または網膜色素上皮細胞欠乏症である。ある実施態様では、細胞は、投与前に神経または上皮系統細胞に分化するようにインビトロで誘導される。
【００２０】
１つの実施態様では、間充織幹細胞は、眼における内因性の光受容体の生残または増殖を促進する。その他の実施態様では、間充織幹細胞は、光受容体への内因性幹細胞または前駆体細胞の分化を促進する。
【００２１】
１つの実施態様では、間充織幹細胞は、次に示すマーカー：ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１０５またはＣＤ１６６の少なくとも１種の発現について陽性である。本細胞は、次に示すマーカー：ＣＤ１４、ＣＤ３４またはＣＤ４５の少なくとも１種の発現について陰性である。
【００２２】
ある種の実施態様では、本細胞は、少なくとも１種の他の細胞タイプ、例えば、星状細胞、希突起膠細胞、ニューロン、神経始原細胞、神経幹細胞、網膜上皮幹細胞、角膜上皮幹細胞、または他の多能性または多分化性幹細胞とともに投与されてもよい。これらの実施態様では、他の細胞タイプは、間充織幹細胞と同時にまたはその前または後に投与されてもよい。同様に、これらおよび他の実施態様では、本細胞は、少なくとも１種の他の作用物質、例えば、眼の治療のための薬物、またはその他の有益な製薬学的作用物質、例えば抗炎症剤、抗アポトーシス剤、抗酸化剤または成長因子とともに投与されてもよい。これらの実施態様では、他の作用物質は、間充織幹細胞と同時にまたはその前または後に投与されてもよい。
【００２３】
本発明における使用のために適当な間充織幹細胞は、例えば、骨髄、臍帯血、羊膜および羊水、胎盤、皮膚、脂肪、筋肉、血管系、肝臓、膵臓または末梢血液のような組織に由来してもよい。本細胞は、起源において異種、同種異系または自己由来であってもよい。細胞は、ドナーから分離され、そして直ちに移植されてもよい。あるいはまた、細胞は移植前にインビトロで拡大されてもよい。
【００２４】
本発明の細胞は低温で保存されてもよい。移植前に、細胞は融解され、そして直ちに移植されてもよい。あるいはまた、融解細胞が、移植前に培養され、そして／または拡大されてもよい。あるいはまた、細胞は凍結ペレットとして移植されてもよい。
【００２５】
種々の実施態様では、本細胞は、眼の表面に投与されてもよく、あるいはそれらは、眼の内部または眼に近接した場所、例えば眼の背後または網膜下の間隙に移植されてもよい。
【００２６】
本細胞は、眼の内部または眼に近接した場所の患者の体内にカニューレを通して、また
は移植されたデバイスから投与されてもよく、あるいはそれらは、細胞を含有するマトリックスまたは支持体（ｓｕｐｐｏｒｔ）の移植によって投与されてもよい。
【００２７】
本発明のその他の態様は、製薬学的に許容できる担体および眼の変性症状を処置するのに有効な量における本発明の間充織幹細胞を含んでなる、眼の変性症状を有する患者を処置するための製薬学的組成物を特色とする。眼の変性症状は、急性、慢性または進行性症状であってもよい。ある実施態様では、本組成物は、組成物の調合前に神経または上皮系統細胞に分化するようにインビトロで誘導された本発明の間充織細胞を含む。あるいはまた、組成物は、移植後にインサイチューで神経または上皮系統細胞に分化する本発明の間充織幹細胞を含む。
【００２８】
ある実施態様では、製薬学的組成物は、少なくとも１種の他の細胞タイプ、例えば、星状細胞、希突起膠細胞、ニューロン、神経始原細胞、神経幹細胞、網膜上皮幹細胞、角膜上皮幹細胞、または他の多能性または多分化性幹細胞を含んでもよい。これらまたは他の実施態様では、製薬学的組成物は、少なくとも１種の他の作用物質、例えば、眼の変性障害を処置するための薬物または他の有益な製薬学的作用物質、例えば抗炎症剤、抗アポトーシス剤、抗酸化剤または成長因子を含んでもよい。
【００２９】
ある実施態様では、製薬学的組成物は、眼の表面に投与するために調合されてもよい。あるいはまた、それらは、眼の内部にまたは眼に近接して（例えば眼の背後）投与するために調合されてもよい。また、組成物は、細胞を含有するマトリックスまたは支持体として調合されてもよい。
【００３０】
本発明のなおその他の態様にしたがえば、キットが、眼の変性症状を有する患者を処置するために提供される。本キットは、製薬学的に許容できる担体、間充織幹細胞の集団、および患者を処置する方法においてキットを使用するための指示書を含んでもよい。またキットは、１種の以上のさらなる構成要素、例えば、細胞を培養するための試薬および指示書、または少なくとも１種の他の細胞タイプ、または眼の変性症状の処置において有用な１種以上の作用物質を含有してもよい。
【００３１】
本発明のその他の実施態様は、眼の変性症状を処置する移植のための細胞の生残、成長または活性を増進する方法を特色とする。本方法は、少なくとも１種の製薬学的作用物質、例えば、成長因子、栄養因子、順化培地、抗炎症剤、抗アポトーシス剤、抗酸化剤、神経栄養因子または神経再生もしくは神経保護薬物と間充織幹細胞を接触させることを含む。あるいはまた、方法は、少なくとも１種の他の細胞タイプ、例えば、星状細胞、希突起膠細胞、ニューロン、神経始原細胞、神経幹細胞、網膜上皮幹細胞、角膜上皮幹細胞、または他の多能性または多分化性幹細胞と間充織幹細胞を、移植前に同時培養することを含んでもよい。例えば、成長因子、栄養因子、順化培地、抗炎症剤、抗アポトーシス剤、抗酸化剤、神経栄養因子または神経再生もしくは神経保護薬物のような作用物質が添加されてもよい。また本方法を実行するためのキットが提供される。キットは、間充織幹細胞および移植のための細胞の生残、成長または活性を増進するのに有効な少なくとも１種の作用物質により細胞を処理するための指示書を含む。本キットは、少なくとも１種の他の細胞タイプ、および少なくとも１種の他の細胞タイプと間充織幹細胞との同時培養に関する指示書を含んでもよい。
【００３２】
図面の簡単な説明
図１：細胞の移植片を受けているＲＣＳラットからのＥＲＧ記録の総括
示されたデータは、移植後６０日（パネルＡ）および９０日（パネルＢ）のラットから得られたＥＲＧ記録の平均振幅（ｍＶ）である（１条件当たり動物数  ｎ＝５）。記録は、臍帯由来細胞を受けているラットの眼（黒色バー）および対側に虚偽（ｓｈａｍ）手術
された眼（黒いハッシュ（ｈａｓｈ）されたバー）から採られた。記録は、Ｃａｍｂｒｅｘ  ＭＳＣ’ｓ（ＰＯＩＥＴＩＣＳＴＭ，Ｃａｔ．Ｎｏ  ＰＴ−２５０１）を受けているラットの眼（灰色バー）および対側に虚偽手術された眼（黒いハッシュされたバー）から採られた。記録は、胎盤由来細胞を受けているラットの眼（白色バー）および対側に虚偽手術された眼（灰色の横線バー）から採られた。
図２：本発明のＭＳＣを受けているＲＣＳラットの視力
示されたデータは、虚偽手術されたラット（白色バー）または本発明のＭＳＣ（黒色バー）からの、４か月齢の動物（ｎ＝７）の視力である。
図３：本発明のＭＳＣを受けているＲＣＳラットの視力の閾値
示されたデータは、左（△）または右（◆）眼に、本発明のＭＳＣの移植片を受けた４か月齢の動物（ｎ＝７）の視力である。対側に虚偽手術された眼（左▲：右■）からのデータが対照として含まれている。
図４：本発明のＭＳＣを受けている動物からの網膜の組織切片
組織切片は、操作後１００日目の移植動物から得られた。
【００３３】
用語「ｏｃｕｌａｒ」、「ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ」および「ｏｐｔｉｃ」は、「眼の、または眼について、または眼に関連した」を定義するために本明細書では交換可能に使用される。用語「眼の変性症状」（または「障害」）は、細胞損傷、変性または喪失を伴う、眼と脳の間の神経連絡を含む、眼の急性および慢性の症状、障害または疾病を包含する総括的な用語である。眼の変性症状は年齢に関係していてもよく、またはそれは傷害または外傷からもたらされてもよく、またはそれは特定の疾病または障害に関係していてもよい。急性の眼変性症状は、限定されるものではないが、脳血管不全症、巣状または散在性の脳外傷、散在性脳損傷、眼の感染または炎症症状、網膜裂傷または剥離、眼内病巣（挫傷貫入、圧迫、破裂）または他の物理的傷害（例えば、物理的または化学的火傷）から生じる症状を含む、眼を冒す細胞の死またはコンプロマイズ（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）に伴われる症状を含む。慢性の眼変性症状（進行性症状を含む）は、限定されるものではないが、網膜症および他の網膜／斑点障害、例えば網膜色素変性症（ＲＰ）、年齢に関連する斑点変性（ＡＭＤ）、脈絡膜の新生血管膜（ＣＮＶＭ）；網膜症、例えば糖尿病性網膜症、閉塞性網膜症、鎌状赤血球網膜症および高血圧性網膜症、中心網膜静脈閉塞、頸動脈の狭窄、眼の神経症、例えば緑内障および関連症候群；水晶体および外部眼の障害、例えば、化学的または熱的傷害において生じるような、また辺縁上皮細胞欠乏（ＬＥＣＤ）とも呼ばれる辺縁幹細胞欠乏（ＬＳＣＤ）、Ｓｔｅｖｅｎ−Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群、コンタクトレンズで誘発される角膜症、眼瘢痕性類天疱瘡、無虹彩Ｉまたは外胚葉異形成の先天性疾患、および多内分泌欠乏に関連する角膜炎を含む。用語、眼変性症状を処置すること（または、の処置）は、本明細書で定義されるような眼変性症状、の影響を緩和すること、またはその進行を遅延、一時停止または逆行させること、またはその開始を遅延または予防することを指す。
【００３４】
用語「有効量」は、本明細書に記述されるような、インビトロまたはインビボの細胞成長および／または分化、または眼変性症状の処置を含む、意図される結果を生成するために有効である、薬剤（ｒｅａｇｅｎｔ）または製薬学的組成物、例えば成長因子、分化因子、栄養因子、細胞集団または他の作用物質（ａｇｅｎｔ）の濃度または量を指す。成長因子に関しては、有効量は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌの範囲であってもよい。インビボで患者に投与されるＭＳＣに関しては、有効量は、数百以下〜数百万以上の範囲であってもよい。特定の実施態様では、有効量は１０３、より特に少なくとも約１０４細胞からの範囲であってもよい。投与される細胞の数は、限定されるものではないが、医学生物学者には周知の他の因子の中でも、処置されるサイズまたは全体積／表面積ならびに処置される領域の場所に対する投与の部位の接近性を含む、処置される障害の特異性に応じて変わることは理解できる。
【００３５】
用語「有効期間」（または「時間」）および「有効な条件」は、その意図される結果を達成する作用物質または製薬学的組成物について必要または好適な、時期間または他の制御可能な条件（例えば、インビトロ法のための温度、湿度）を指す。
【００３６】
用語「患者」または「被験者」は、本明細書に記述される製薬学的組成物により、または方法にしたがって処置される、哺乳動物、好ましくはヒトを含む動物を指す。
【００３７】
本明細書で使用されるような「幹細胞」は、自己再生始原細胞、非再生始原細胞および最終分化細胞を含む、子孫細胞を生成するために、自己再生および分化の両方を行う単一細胞の能力によって定義される未分化細胞を指す。幹細胞はまた、多数の胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）から種々の細胞系統の機能細胞にインビトロで分化する能力、ならびに移植後多数の胚葉の組織を生じる能力、および胚盤胞への注入後に、全部ではなくても実質的にほとんどの組織に寄与する能力を特徴とする。
【００３８】
幹細胞は、全能性、多分化性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）、少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）または単能性であってもよい。全能性細胞は、すべての胚性および胚体外細胞タイプを生じることが可能である。多分化性細胞は、すべての胚性細胞タイプを生じることが可能である。多能性細胞は、細胞系統のサブセットであるが、特定の組織、器官または生理学的系内のすべてを生じることが可能なそれらを含む（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生）、血液細胞に限定される少能性始原細胞、および血液の正常成分であるすべての細胞タイプおよび要素（例えば血小板）を含む、子孫細胞を生成することができる）。少能性である細胞は、多能性幹細胞よりも一層限定される細胞系統のサブセットを生じることができ；そして単能性である細胞は、単一の細胞系統を生じることができる（例えば、精子形成幹細胞）。また幹細胞は、それらが得られる起源に基づいて分類される。成熟幹細胞は、一般に、多数の分化された細胞タイプを含んでなる組織において見出される多能性の未分化細胞である。成熟幹細胞はそれ自体再生することができる。正常な環境下では、それはまた分化して、それが生じた組織の特定の細胞タイプ、および可能ならば他の組織のタイプを生成することができる。
【００３９】
「間充織幹細胞」（「ＭＳＣ」）は、哺乳類の間充織から生じる細胞を指し、これは完全には分化されてなく、そして結合組織、骨および軟骨、筋肉、血液および血管、リンパおよびリンパ様器官、脊索、胸膜、心膜、腎臓および生殖腺：を含む、種々の細胞または組織に分化する潜在能力を有する。
【００４０】
「始原細胞」は、分化によって幹細胞から誘導され、そして、より成熟した細胞タイプへのさらなる分化が可能である細胞を指す。始原細胞は、典型的には、幹細胞に比較してより限定された増殖能力を有する。
【００４１】
「順化培地」とは、細胞の集団が培地において増殖し、そしてその培地に可溶性ファクターを寄与することが意味される。１つのそのような使用では、細胞は培地から除去されるが、これらの細胞によって生産された可溶性ファクターは残る。次いで、この培地は、最初の細胞集団によって生産された可溶性ファクターの存在下で細胞の異なる集団に栄養を与えるために使用される。
【００４２】
本明細書で使用されるような「マーカー」は、関心のある細胞において分別して発現される核酸またはポリペプチド分子である。本文脈では、分別発現は、陽性マーカーではマーカーのレベル増大、および陰性マーカーではレベル減少を意味する。マーカー核酸またはポリペプチドの検出可能なレベルは、関心のある細胞が、当該技術分野において既知の種々の方法を用いて、同定され、そして他の細胞と区別できるように、他の細胞に比較し
て関心のある細胞において十分に高いかまたは低い。
【００４３】
「Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」（ＣＤ）分子は、細胞タイプ、分化の段階および細胞の活性状態を同定するために使用される、抗体の特異的なセットによって認識されるような細胞表面におけるマーカーである。ＣＤマーカーの機能および名称は、当該技術分野において十分に確立されている。例えば、Ｔｈｅ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｆａｃｔ  Ｂｏｏｋ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂａｒｃｌａｙ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ  １９９７、参照。
【００４４】
「ＣＤ１４」は、リポ多糖（ＬＰＳ）およびＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）の複合体に対して高い親和力の受容体である。ＣＤ１４抗原は、ＣＤ１４、ＴＬＲ４およびＭＤ−２からなる機能的ヘテロメリック（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ）ＬＰＳ受容体複合体の一部である。ＣＤ１４は、末梢血液、他の体液および種々の組織、例えばリンパ節および脾臓におけるほとんどのヒト単球およびマクロファージにおいて強く発現される。ＣＤ１４は、ヒト好中球および骨髄樹状細胞のサブ集団において弱く発現される。
【００４５】
「ＣＤ２９」はまた、「フィブロネクチン受容体、βポリペプチド」と呼ばれる。
【００４６】
「ＣＤ３４」は、内皮細胞および造血幹細胞において構成的に発現される膜貫通型糖タンパク質である。セリンおよびトレオニンに富むムチン様ドメインを含有するこの高度にＯ−グリコシル化された分子は、Ｌ−セレクチンに結合する。
【００４７】
「ＣＤ４４」は、また「Ｈｅｒｍｅｓ抗原」と呼ばれ、そしてヒアルロナン（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ）に対する主な細胞表面受容体である。このＣＤは、肝細胞、若干の上皮細胞および心筋のような組織／細胞を除いて、ほとんどの細胞タイプにおいて主に発現される。
【００４８】
「ＣＤ４５」は、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｎｏ．Ｙ００６３８において開示された配列、またはその天然に存在する変異配列（例えば、対立遺伝子変異体）を有する白血球共通抗原を指す。
【００４９】
「ＣＤ１０５」は、また「Ｅｎｄｏｇｌｉｎ」と呼ばれ、そして内皮細胞、単球、マクロファージ、ストローマ細胞および骨髄間充織細胞において主に発現される。
【００５０】
「ＣＤ１６６」は、活性Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球において発現されるタイプ１糖タンパク質であり、そしてＣＤ６（１．２）に対するリガンドであると考えられる。ヒトＣＤ１６６はＴ細胞の活性化のために重要であろう。
【００５１】
用語「製薬学的に許容できる担体」（または「媒質」）は、用語「生物学的に適合性の担体」または「媒質」と交換可能に使用されてもよいが、これは、細胞および治療学的に投与される他の作用物質と適合性であるのみならず、また、過剰の毒性、刺激、アレルギー応答、または合理的な利益／危険比と釣り合った他の複雑な問題もなしに、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するために、安全な医学的判定の範囲内において適当な、試薬、細胞、化合物、材料、組成物、および／または用量形態物を指す。
【００５２】
数種の用語は本明細書では細胞置換療法に関して使用される。用語「自己転移（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ」、「自己移植」、「自己移植片（ａｕｔｏｇｒａｆｔ）」などは、細胞ドナーがまた細胞置換療法のレシピエントである処置を指す。用語「同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）転移］、「同種異系移植」、「同種異系移植片（ａｌｌ
ｏｇｒａｆｔ）」などは、細胞ドナーが細胞置換療法のレシピエントとして同種であるが、同一個体ではない処置を指す。ドナーの細胞がレシピエントと組織適合的に一致した細胞転移は、時に「同系（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）転移」と呼ばれる。用語「異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）転移」、「異種移植」、「移植移植片」などは、細胞ドナーが細胞置換療法のレシピエントと異なる種のものである処置を指す。
【００５３】
間充織幹細胞の単離および特性決定
本発明の方法における使用のために適当な間充織幹細胞は、例えば、骨髄、臍帯血、羊膜、羊水、胎盤、皮膚、脂肪、筋肉、血管系、肝臓、膵臓または末梢血液のような組織から、当該技術分野において周知の方法を用いて得られてもよい。間充織幹細胞の集団の単離は、ＭＳＣの表面において発現されるモノクローナル抗体特異的タンパク質を用いて達成されてもよい。モノクローナル抗体は結合された細胞の分離を容易にするために基質に付着されてもよい。本発明における使用のために適当なＭＳＣを単離するために使用されてもよい方法は当業者によって選択することができる。そのような方法の例は、米国特許第６０８７１１３号、同第６２６１５４９号、同第５９１４２６２号、同第５９０８７８２号および同第２００４００５８４１２号において教示されている。
【００５４】
ＭＳＣは、例えば、成長特性（例えば、集団倍加能力、倍加時間、老化までの継代）、核型分析（例えば、正常核型；母性または新生児の系統）、流動細胞計測（例えば、ＦＡＣＳ分析）、免疫組織化学および／または免疫細胞化学（例えば、エピトープの決定）、遺伝子発現プロフィル決定（例えば、遺伝子チップアレイ；ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、および慣用のＰＣＲ））、タンパク質アレイ、タンパク質セレクション−１９（例えば、血漿凝固アッセイまたはＰＤＰ順化培地の分析による、例えば酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））、混合リンパ球反応（例えば、ＰＢＭＣｓの刺激の測定のような）、および／または当該技術分野において既知の他の方法によって特性決定されてもよい。
【００５５】
本発明の方法における使用のために適当な間充織幹細胞は、また、市販の起源、例えば、販売名ＰＯＩＥＴＩＣＳＴＭ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＰＴ−２５０１，Ｃａｍｂｒｅｘ）として販売されるヒトの間充織幹細胞から得られる細胞を含んでもよい。これらの間充織幹細胞は次のマーカー：ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１０５およびＣＤ１６６の発現について陽性である。この細胞は、マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５の発現については陰性である。
【００５６】
単離されたＭＳＣ、またはＭＳＣが得られる組織は、細胞培養を開始または接種するために使用されてもよい。単離された細胞は、細胞外基質またはリガンド、例えばラミニン、コラーゲン（ネイティブ、変性または架橋された）、ゼラチン、フィブロネクチン、および他の細胞外基質タンパク質によりコートされてもコートされなくてもよい無菌の組織培養容器に移される。ＭＳＣは、細胞の成長を維持することが可能なすべての培養基、例えば、ＤＭＥＭ（高または低グルコース）、進歩したＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１、Ｅａｇｌｅの基礎培地、Ｈａｍ’ｓＦ１０培地（Ｆ１０）、Ｈａｍ’ｓＦ１２培地（Ｆ１２）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ−１７培地、間充織幹細胞成長培地（ＭＳＣＧＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ  １６４０、およびＣＥＬＬ−ＧＲＯ−ＦＲＥＥにおいて培養されてもよい。培養基は、例えば、胎児ウシ血清（ＦＢＳ）；ウマ血清（ＥＳ）；ヒト血清（ＨＳ）を含む１種以上の成分；β−メルカプトエタノール（ＢＭＥまたは２−ＭＥ）、好ましくは約０．００１％（ｖ／ｖ）；１種以上の成長因子、例えば血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インシュリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、白血球阻止因子（ＬＩＦ）およびエリトロポイエチン；Ｌ−バリンを含むアミノ酸；および単独でもまた組み合わせても微生物汚染を制御するための１種以上の抗生物質および
／または抗糸状菌剤、例えばペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ，ゲンタマイシンおよびナイスタチンを補足されてもよい。細胞は細胞の成長を可能にする密度において培養容器中に接種されてもよい。
【００５７】
もっとも適当な培養基、培地調製物および細胞培養技術を選択する方法は、当該技術分野において周知であり、そしてＤｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），１９９５，ＣＥＬＬ  ＆  ＴＩＳＳＵＥ  ＣＵＬＴＵＲＥ：ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ；およびＨｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ（ｅｄｓ．），１９９１，ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＲＥＡＣＴＯＲＥＳ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｂｏｓｔｏｎを含む、種々の起源において記述されている。
【００５８】
眼の疾病を処置するための間充織幹細胞の使用
本発明の１つの態様では、ＭＳＣは、眼の変性症状を処置するための細胞療法として使用される。眼の中の標的の場所に移植されると、ＭＳＣはインサイチューで眼細胞に対して栄養支援を提供することができ、あるいはそれらは１種以上の表現型にそれ自体分化することができ、あるいはそれらは、なかんずくそれらの両方式で有益な効果を発揮することができる。
【００５９】
ＭＳＣは、単独で（例えば、実質的に均一な集団として）または他の細胞との混合物として投与されてもよい。ＭＳＣは、慣用の製薬学的に許容できる担体を用いる製薬学的調製物において投与されてもよい。ＭＳＣが他の細胞とともに投与される場合、それらは他の細胞と同時に、または連続して（他の細胞の前でも後でも）投与されてもよい。ＭＳＣとともに投与されてもよい細胞は、限定されるものではないが、ニューロン、星状細胞、希突起膠細胞、神経始原細胞、神経幹細胞、眼始原細胞、網膜または角膜上皮幹細胞、および／または他の多能性または多分化性幹細胞を含む。異なるタイプの細胞は、投与直前または短時間前にＭＳＣと混合されてもよく、あるいはそれらは投与前に一定時間一緒に同時培養されてもよい。
【００６０】
ＭＳＣは、少なくとも１種の製薬学的作用物質、例えば、成長因子、栄養因子、順化培地、または当該技術分野において既知の他の活性作用物質、例えば抗炎症剤、抗アポトーシス剤、抗酸化剤、神経栄養因子または神経再生または神経保護薬物とともに投与されてもよい。ＭＳＣが他の作用物質とともに投与される場合、それらは、単一の製薬学的組成物において一緒に、または別々の製薬学的組成物において他の作用物質と同時にまたは連続して（他の細胞の前でも後でも）投与されてもよい。
【００６１】
間充織幹細胞とともに投与されてもよい他の成分の例は、限定されるものではないが、少し名を挙げれば、（１）他の神経保護または神経有益薬物；（２）選ばれた細胞外基質成分、例えば当該技術分野において既知の１種以上のコラーゲンのタイプ、および／または成長因子、血小板に富む血漿および薬物（あるいはまた、細胞が成長因子を発現および産生するように遺伝子工学的に作成されてもよい）；（３）抗アポトーシス剤（例えば、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯ疑似体、トロンボポイエチン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ，肝細胞成長因子、カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）阻害剤）；（４）抗炎症性化合物（例えば、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＴＧＦ−βインヒビター、スタチング（ｓｔａｔｉｎｇ）、ＩＬ−６およびＩＬ−１インヒビター、ＰＥＭＩＲＯＬＡＳＴ、ＴＲＡＮＩＬＡＳＴ、ＲＥＭＩＣＡＤＥ、ＳＩＲＯＬＩＭＵＳ、および非ステロイド系抗炎症性薬物（ＮＳＡＩＤＳ）（例えば−３６ＴＥＰＯＸＡＬＩＮ、ＴＯＬＭＥＴＩＮおよびＳＵＰＲＯＦＥＮ）；（５）免疫抑制または免疫調節剤、例えばカルシニューリン・インヒビター、ｍＴＯＲインヒビター、抗増殖薬（ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｓ）、コルチコステロイドおよび種々の抗体；（６）抗酸化剤、例え
ばプロブコル（ｐｒｏｂｕｃｏｌ）、ビタミンＣおよびＥ、コエンザイムＱ−１０、グルタチオン、Ｌ−システインおよびＮ−アセチルシステイン；および（６）局所麻酔薬を含む。
【００６２】
１つの実施態様では、ＭＳＣは、未分化細胞として、すなわち成長培地で培養されるような細胞として投与されてもよい。あるいはまた、ＭＳＣは、所望の表現型に向かう分化を刺激する条件に培養において曝露した後に投与されてもよい。細胞は、眼の損傷または疲弊部位に、外科的に移植されるか、注入されるか、または他の方法で直接または間接的に投与されてもよい。細胞が半固形または固形デバイスにおいて投与される場合、体内の正確な場所への外科的移植が典型的には適当な投与手段である。しかしながら、液体または流体の製薬学的組成物は、眼におけるより一般的な場所に（例えば、局所的または眼内に）投与されてもよい。
【００６３】
他の実施態様は、ＭＳＣ細胞成分（例えば、細胞溶解物またはその成分）または生産物（例えば、ＭＳＣによって天然に、または遺伝的改変、ＭＳＣ培養からの順化培地をとおして産生される栄養および他の生物学的因子）を含んでなる製薬学的組成物を投与することによって眼の変性症状を処置する方法を包含する。
【００６４】
またこれらの方法は、他の活性作用物質、例えば当該技術分野において既知である、成長因子、神経栄養因子、または神経再生または神経保護薬物を投与することをさらに含んでもよい。
【００６５】
本明細書で記述されるＭＳＣまたは他の製薬学的組成物のいずれかを投与するための用量形態物および用法は、個々の患者の状態、例えば、眼変性症状の性質および程度、年齢、性別、体重および一般的医学症状、および医学従事者には既知の他のファクターを考慮して、ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ（医薬品の製造および品質管理に関する基準）にしたがって開発される。かくして、患者に投与される製薬学的組成物の有効量は、当該技術分野において既知であるようにこれらを考慮して決定される。
【００６６】
細胞療法を開始する前に患者を薬理学的に免疫抑制することが望ましくまた適当であろう。これは、全身的または局部的な免疫抑制剤の使用をとおして実施されてもよく、あるいはそれは、被胞化デバイスにおいて細胞を送達することによって実施されてもよい。移植細胞に対する免疫応答を軽減または除去するためのこれらおよび他の手段は当該技術分野において既知である。代替的に、ＭＳＣはそれらの免疫原性を低下させるために遺伝的に改変されてもよい。
【００６７】
本発明のその他の態様によれば、本方法は、眼変性症状を処置するために有効な量において間充織幹細胞から作成された調製物を患者に投与することを含んでもよい、眼変性症状を有する患者を処置するために提供され、ここで、調製物は、ＭＳＣの細胞溶解物、またはＭＳＣが成長された順化培地、またはＭＳＣの細胞外基質を含む。溶解物は、ＭＳＣの細胞以下画分、例えば細胞質膜画分の少なくとも１部または全部を含んでもよい。細胞を溶解する方法は、当該技術分野において周知であり、そして機械的破壊、酵素的破壊または化学的破壊、またはそれらの組み合わせという種々の手段を含む。そのような細胞溶解物は、それらの成長培地において直接、細胞から調製されてもよく、かくして分泌された成長因子などを含有するか、あるいは、例えば、ＦＢＳまたは他の溶液における培地を含有しない洗浄された細胞から調製されてもよい。洗浄された細胞は、好適であれば最初の集団密度よりも大きい濃度において再懸濁されてもよい。１つの実施態様では、全細胞溶解物は、例えば、細胞を破壊することによって細胞画分のその後の分離なしに調製されてもよい。その他の実施態様では、細胞膜画分は、当該技術分野において既知の日常的方法、例えば遠心分離、濾過または類似の方法によって細胞の可溶性画分から分離される。
【００６８】
ＭＳＣの集団から調製された細胞溶解物または細胞可溶性画分は、例えば、超遠心または凍結乾燥によってさらに濃縮されるか、または乾燥さえされ、部分的に精製され、当該技術分野において既知である製薬学的に許容できる担体または希釈剤と組み合わされるか、または生物製剤、例えば製薬学的に有用なタンパク質組成物のような他の化合物と組み合わされて、使用されてもよい。細胞溶解物またはその画分は、単独または例えば、自己または同種異系の生細胞とともに、インビトロまたはインビボにおいて使用されてもよい。インビボで導入される場合、溶解物は、例えば、患者にとって必要とされる細胞成長因子を提供するために、処置の部位に局所的にまたは離れて導入されてもよい。
【００６９】
その他の態様では、本発明は、製薬学的に許容できる担体、およびＭＳＣの細胞溶解物、ＭＳＣの細胞外基質またはＭＳＣが成長された順化培地であってもよい間充織幹細胞から作成された調製物を含んでなる製薬学的組成物を特色とする。本発明のこの態様を実施するためのキットがまた提供される。これらは、１種以上の製薬学的に許容できる担体または他の作用物質または試薬、１種以上の細胞溶解物またはその画分、ＭＳＣからの細胞外基質または順化培地、およびキット構成要素の使用のための指示書を含んでもよい。
【００７０】
製薬学的調合物
本発明の製薬学的組成物は、製薬学的に許容できる担体または媒質とともに調合された、分娩後細胞ＭＳＣ、またはその成分または生産物を含んでもよい。適当な製薬学的に許容できる担体は、水、塩溶液（例えばリンゲル液のような）、アルコール、油、ゼラチン、および炭水化物、例えばラクトース、アミロースまたは澱粉、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニルピロリジンを含む。そのような調製物は、滅菌され、そして所望ならば、補助剤、例えば滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤および着色剤と混合されてもよい。典型的には、限定されるものではないが、生細胞ではなくて細胞成分または生産物を含んでなる製薬学的組成物は、液剤として調合される。生のＭＳＣを含んでなる製薬学的組成物は、典型的には、液剤、半固形剤（例えば、ゲル剤）または固形剤（例えば、眼の組織構築のために適当であるマトリックス、支持体など）として調合される。
【００７１】
製薬学的組成物は医化学者または生物学者には熟知されている補助成分を含んでもよい。例えば、それらは、使用される抗酸化剤の種類に応じて変わる範囲で抗酸化剤を含有してもよい。通常使用される抗酸化剤の合理的な範囲は、ＥＤＴＡの約０．０１％〜約０．１５％（ｗ／ｖ）、亜硫酸ナトリウムの約０．０１％〜約２．０％（ｗ／ｖ）およびメタ重亜硫酸ナトリウムの約０．０１％〜約２．０％（ｗ／ｖ）である。当業者は上記の各々について約０．１％（ｗ／ｖ）の濃度を使用するであろう。他の代表的な化合物は、メルカプトプロピオニルグリシン、Ｎ−アセチルシステイン、β−メルカプトエチルアミン、グルタチオンおよび類似の種類を含むが、眼の投与のために適当な他の抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸およびその塩または亜硫酸塩またはメタ重亜硫酸ナトリウムもまた使用されてもよい。
【００７２】
緩衝剤は、眼の刺激を最少にするために、点眼調合物のｐＨを約４．０〜約８．０の範囲に維持するように使用されてもよい。直接のガラス体内または眼内の注入では、調合物はｐＨ７．２〜７．５、あるいはｐＨ７．３〜７．４でなければならない。眼科用組成物はまた、眼の投与のために適当な等張化剤を含んでもよい。それらの中では、０．９％生理食塩水とほぼ等張の調合物を作成するために塩化ナトリウムが適当である。
【００７３】
ある実施態様では、製薬学的組成物は粘度増進剤とともに調合される。そのような薬剤は、例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロースおよびポリビニルピロリドンであってもよい。製薬学的組成物は、必要ならば添加
された共溶媒を有してもよい。適当な共溶媒は、グリセリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリソルベート、プロピレングリコール、およびポリビニルアルコールを含んでもよい。例えば、塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズエトニウム、クロロブタノール、酢酸または硝酸フェニル水銀、チメロサール（ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ），またはメチルまたはプロピルパラベンのような保存剤がまた含まれてもよい。
【００７４】
注入のための調合物は、単回使用の投与のために設計されてもよく、そして保存剤を含有しない。注入液剤は、０．９％塩化ナトリウム溶液と同等の等張性（２９０〜３００ミリオスモルの浸透圧）を有してもよい。これは、塩化ナトリウムまたは上記の他の共溶媒、または上記の緩衝剤および抗酸化剤のような添加物の添加によって達成されてもよい。
【００７５】
眼の前室の組織は水性体液によって浸されているが、一方網膜はガラス体に連続して接触している。これらの流体／ゲルは、それらが抗酸化化合物および酵素を含有するので、高度に還元的な状態下に存在している。したがって、眼科組成物中に還元剤を含むことが有利であろう。適当な還元剤は、Ｎ−アセチルシステイン、アスコルビン酸または塩形態物、および亜硫酸またはメタ重亜硫酸ナトリウムを含み、注入液のためにはアスコルビン酸および／またはＮ−アセチルシステインまたはグルタチオンが特に適当である。
【００７６】
細胞、細胞成分または細胞生産物を含んでなる製薬学的組成物は、当該技術分野において既知の数種の送達方式の１つ以上において患者の眼に送達されてもよい。若干の例における使用のために適当であろう１つに実施態様では、組成物は眼の点滴液または洗浄液において局所的に眼に送達される。その他の実施態様では、組成物は、定期的な眼内注入により、またはＢＳＳまたはＢＳＳ  ＰＬＵＳ（Ａｌｃｏｎ  ＵＳＡ，Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ）のような潅注溶液における注入によって、眼の中の種々の場所に送達されてもよい。あるいはまた、組成物は、予め形成されるか、またはインサイチューで形成されるゲル剤またはリポソーム剤、例えば、Ｈｅｒｒｅｒｏ−Ｖａｎｒｅｌｌに対する米国特許第５，７１８，９２２号において開示されたような、当該技術分野において既知の他の眼科用量形態物において適用されてもよい。その他の実施態様では、組成物は、コンタクトレンズ（例えば、Ｌｉｄｏｆｉｌｃｏｎ  Ｂ．Ｂａｕｓｃｈ  ＆  Ｌｏｍｂ  ＣＷ７９またはＤＥＬＴＡＣＯＮ（Ｄｅｌｔａｃｏｎ  Ａ））または眼の表面に一時的に容れられる他の物体を介して、処置の必要な眼の水晶体に対してまたはそれをとおして送達されてもよい。他の実施態様では、コラーゲン角膜シールド（例えば、ＢＩＯ−ＣＯＲ可溶性角膜シールド、Ｓｕｍｍｉｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，Ｍａｓｓ．）のような支持体が用いられてもよい。
【００７７】
また、組成物は、浸透ポンプ（ＡＬＺＥＴ，Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｆ．）からカニューレを通して、または定時放出（ｔｉｍｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）カプセル（ＯＣＣＵＳＥＮＴ）または生分解性ディスク（ＯＣＵＲＥＸ，ＯＣＵＳＥＲＴ）の移植によって、眼球中に注入することによって投与されてもよい。これらの投与経路は、眼への製薬学的組成物の連続供給を提供するという利点を有する。これは例えば、角膜への局所送達のために有利であろう。
【００７８】
半固形または固形担体中に生細胞を含んでなる製薬学的組成物は、典型的には、眼の損傷または疲弊部位における外科的移植のために調合される。また液状組成物が外科的操作によって投与されてもよいことは評価できる。特定の実施態様では、半固形または固形製薬学的組成物は、半透過性ゲル、ラティス（ｌａｔｔｉｃｅ）、細胞支持体などを含んでもよく、これらは非生分解性または生分解性であってもよい。例えば、ある実施態様では、外因性の細胞をそれらの周辺細胞から分離するが、本細胞が周辺細胞に対して生物分子を分泌し、送達することを可能にさせることが望ましいし、また適当である。これらの実施態様では、細胞は、宿主組織から移植細胞を物理的に分離する非分解性の選択的透過性
バリヤーによって包囲された、生存ＭＳＣまたはＭＳＣを含んでなる細胞集団を含んでなる自律的移植片として調合されてもよい。そのような移植片は、ある場合には、「免疫防御性（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）」と呼ばれ、それらは、薬理学的に誘導された免疫抑制の不在下で、免疫細胞およびマクロファージが移植細胞を殺傷することを防ぐ能力を有する（そのようなデバイスおよび方法の総説では、例えば、Ｐ．Ａ．Ｔｒｅｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．４２：３−２７、参照）。
【００７９】
支持体（ｓｕｐｐｏｒｔｓ）
１つの態様では、本発明のＭＳＣは、移植前に支持体材料中に組み入れられてもよい。本発明の目的のための使用に適当な支持体材料は、組織修復のために適当な組織鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）、導管、バリヤーおよびレザーバーを含む。特に、生物組織を再構築または再生するため、ならびに組織の成長を誘導するための走化性薬剤を送達するために、インビトロおよびインビボで使用された、フォーム、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル（ｈｙｄｒｏｇｅｌ）、織物および不織構造物の形態における合成および天然材料が、本発明の方法の実施において使用するために適当である。参照、例えば、米国特許第５，７７０，４１７号、同第６，０２２，７４３号、同第５，５６７，６１２号、同第５，７５９，８３０号、同第６，６２６，９５０号、同第６，５３４，０８４号、同第６，３０６，４２４号、同第６，３６５，１４９号、同第６，５９９，３２３号、同第６，６５６，４８８号および同第６，３３３，０２９号において開示される材料。本発明における使用のために適当な代表的ポリマーは、米国特許公開出願第２００４／００６２７５３Ａ１号および米国特許第４，５５７，２６４号において開示されている。
【００８０】
製薬学的作用物質を組み入れられた支持体を形成するために、製薬学的作用物質は、支持体を形成する前にポリマー溶液と混合されてもよい。あるいはまた、製薬学的作用物質は、好ましくは製薬学的担体の存在下で、形成された支持体上にコートされてもよい。製薬学的作用物質は、液体、微粉砕固形物またはいずれか他の適当な物理的形態物として存在してもよい。あるいはまた、添加物が支持体に添加されて、製薬学的作用物質の放出速度を変えてもよい。その他の実施態様では、支持体は、抗炎症性化合物である少なくとも１種の製薬学的化合物、例えば米国特許第６，５０９，３６９号において開示される化合物を組み入れられる。
【００８１】
１つの実施態様では、支持体は、抗アポトーシス化合物である少なくとも１種の製薬学的化合物、例えば米国特許第６，７９３，９４５号において開示される化合物を組み入れられる。
【００８２】
その他の実施態様では、支持体は、繊維症のインヒビターである少なくとも１種の製薬学的化合物、例えば米国特許第６，３３１，２９８号において開示される化合物を組み入れられる。
【００８３】
さらなる実施態様では、支持体は、血管形成を増進することができる少なくとも１種の製薬学的化合物、例えば米国特許公開出願第２００４／０２２０３９３号および同第２００４／０２０９９０１号において開示される化合物を組み入れられる。
【００８４】
なおその他の実施態様では、支持体は、免疫抑制化合物である少なくとも１種の製薬学的化合物、例えば米国特許公開出願第２００４／０１７１６２３号において開示される化合物を組み入れられる。
【００８５】
さらなる実施態様では、支持体は、成長因子である少なくとも１種の製薬学的化合物、例えば、なかんずくＴＧＦ−β１、２および３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、
骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２および−１３）、繊維芽細胞成長因子−１および−２、血小板由来成長因子−ＡＡおよび−ＢＢ、血小板に富む血漿、インシュリン成長因子（ＩＧＦ−Ｉ，ＩＩ）、成長分化因子（ＧＤＦ−５，−６，−８，−１０，−１５）、血管内皮細胞由来成長因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドテリンを組み入れられる。他の製薬学的化合物は、例えば、ニコチンアミド、低酸素誘導因子１−α、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−１）、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２疑似体、およびＩＩ，Ｅｘｅｎｄｉｎ−４、レチノン酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、上皮小体ホルモン、テネイシン−Ｃ、トロポエラスチン、トロンビン由来ペプチド、カテリシジン（ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ）、デフェンシン、ラミニン、フィブロネクチンおよびビトロネクチンのような粘着性細胞外基質タンパク質の細胞−およびヘパリン−結合性ドメインを含有する生物学的ペプチド、ＭＡＰＫインヒビター、例えば、米国特許公開出願第２００４／０２０９９０１号および同第２００４／０１３２７２９号において開示される化合物を含んでもよい。
【００８６】
支持体中への本発明の細胞の組み入れは、支持体上への細胞の単純な沈着によって達成されてもよい。細胞は単純な拡散によって細胞中に入ることができる（Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．２３（１  Ｐｔ２）：３−９（１９８８））。いくつかの他のアプローチが、細胞の接種の効率を増進するために開発された。例えば、スピンナー（ｓｐｉｎｎｅｒ）フラスコが、ポリグリコール酸支持体上への軟骨細胞の接種において使用された（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１４（２）：１９３−２０２（１９９８））。細胞を接種するためのその他のアプローチは、遠心の使用であり、これは、接種された細胞に対して最小のストレスを生じ、そして接種効率を増進する。例えば、Ｙａｎｇらは、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＣＣＩ）と呼ばれる、細胞接種法を開発した（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．５５（３）：３７９−８６（２００１））。
【００８７】
生活患者における移植細胞の生残は、種々の走査技術、例えば、コンピューター断層撮影（ＣＡＴまたはＣＴ）スキャン、磁気共鳴断層撮影（ＭＲＩ）または陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）スキャンの使用をとおして決定されてもよい。
【００８８】
移植片の生残の決定は、また、死後に組織を除去し、そしてそれを肉眼的にまたは顕微鏡をとおして検査することによって実施されてもよい。あるいはまた、細胞は、神経または眼の細胞またはその生産物、例えば神経伝達物質について特異的である染色により処理されてもよい。また移植細胞は、ローダミンまたはフルオレセイン標識したミクロスフェア、ファストブルー、鉄微粒子、ビスベンズアミドのようなトレーサー染料、または遺伝的に導入されるレポーター遺伝子産物、例えばβ−ガラクトシダーゼまたはβ−グルクロニダーゼを前以て組み入れることによって同定されてもよい。
【００８９】
損傷または罹患された眼の機能回復の検査は、被験者の眼組織への移植細胞の機能的完成を調査してもよい。例えば、斑点変性または他の網膜症の処置における有効性は、視力の改善、および立体カラー基底部写真の異常および格付けについての評価によって決定されてもよい（Ａｇｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｅｙｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｓｔｕｄｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒｏｕｐ，ＮＥＩ，ＮＩＨ，ＡＲＥＤＳ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．８，２００１，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１９：１４１７−１４３６）。
【００９０】
本発明は、次の実施例によってさらに具体的に説明されるが、それによって限定されるものではない。
【実施例】
【００９１】
網膜色素変性症の処置における間充織幹細胞の使用
Ｒｏｙａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｏｎ（ＲＣＳ）ラットは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の一次機能障害によって惹起される有意な視覚喪失を蒙るように遺伝的に素因づくりされている。このモデルを使用して、ＲＣＳラットにおいて光受容体を維持するための間充織幹細胞集団の網膜下移植の効果が試験された。この変性モデルでは、桿状体機能は生後３０〜６０日以内に失われる。錐状体機能の喪失は通常３カ月以内に起きる。
【００９２】
移植のためのＭＳＣの調製
ヒト成熟ＭＳＣの培養物（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＰＴ−２５０１，Ｃａｍｂｒｅｘ）が、インビトロで全６継代の間拡大された。全細胞は、製造者（Ｃａｍｂｒｅｘ）の指示にしたがって補足された間充織幹細胞成長培地中に、コートされていないＴ７５フラスコにおいて、最初に５，０００細胞／ｃｍ２で接種された。続く継代では、全細胞が次のように処理された。トリプシン消化後、生存細胞がトリパンブルー染色後にカウントされた。簡単に言えば、細胞懸濁液５０ｍｌが０．０４％トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）の５０ｍｌと合わせられ、そして生存細胞数が血球計を用いて評価された。細胞はトリプシン消化され、そして補足物を含有しないＤＭＥＭ：低グルコース培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で３回洗浄された。継代６のヒトＭＳＣ細胞の培養物がトリプシン消化され、そしてＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）において２回洗浄されて、血清成分が除去された。移植操作では、異栄養のＲＣＳラットは、キシラジン−ケタミン（次の混合液の１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．：２．５ｍｌのキシラジン２０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｌのケタミン１００ｍｇ／ｍｌおよび０．５ｍｌの蒸留水）により麻酔され、そして頭部がノーズ・バー（ｎｏｓｅ  ｂａｒ）によって固定された。血清を除いた細胞がＬｅｉｂｏｖｉｔｚ，Ｌ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）２ｍｌ中に再懸濁（１注入当たり２Ｘ１０４細胞）され、そして細いガラスピペット（内径７５〜１５０ｍｍ）を用いてｔｒａｎｓ−ｓｃｅｒａｌｌｙで移植された。細胞は、麻酔された３週齢の異栄養色素沈着（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ−ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ）ＲＣＳラットの背側頭（ｄｏｒｓｏ−ｔｅｍｐｏｒａｌ）網膜下の間隙中に送達された（総Ｎ＝１０／細胞タイプ）。
【００９３】
細胞は右眼中に一側性で注入され、一方左眼は担体媒質（虚偽対照；Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓＬ−１５培地）のみを注入された。残りの未注入細胞の生存率は、細胞注入の終了時にトリパンブルー排除によって調査されて、９５％超が残っていた。細胞注入が実施された後、動物は移植後１０日間デキサメタソン（２ｍｇ／ｋｇ）を注入された。研究期間中、動物は、移植２日前から研究終了まで、経口シクロスポリンＡ（２１０ｍｇ／Ｌ飲用水：得られる血液濃度：２５０〜３００ｍｇ／Ｌ）（Ｂｅｄｆｏｒｄ  Ｌａｂｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｏｈｉｏ）において維持された。食餌および水は自由に摂取された。動物は手術後６０または９０日に犠牲にされたが、動物の残りは、細胞移植に伴われる短期変化の組織学的検査のために早期時点において犠牲にされた。
【００９４】
また、ＲＣＳラットにおいて観察された眼の変性を処置する他の細胞タイプの能力が試験された。細胞組成物は、ヒト臍由来の細胞（米国特許出願公開第２００５／００５４０９８号において開示される細胞）、ヒト胎盤由来の細胞（米国特許出願公開第２００５／００５８６３１号において開示される細胞）および繊維芽細胞から調製された。細胞組成物は前記方法にしたがって並列の動物群に投与された。
【００９５】
機能アッセイ
網膜電位図の記録：  網膜電位図（ＥＲＧ）は、網膜内に生成される（典型的には光のフラッシュに応じて）電位（活動電位）の記録である。それは眼の角膜の上または接近して置かれた１本の電極と、頭皮上に置かれた他の電極の２本の電極を用いて記録される。一夜暗所に順応させた後、動物は、Ｓａｕｖｅら、２００４により記述されているように
、薄暗い赤色光下でのＥＲＧ記録のために準備された。簡単に言えば、麻酔（１５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．ケタミン、および１０ｍｇ／ｍｌ  ｉ．ｐ．キシラジンの混合液による）下で、頭部が定位頭部ホルダー（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  ｈｅａｄ  ｈｏｌｄｅｒ）によって固定され、そして体温が直腸温度計をとおして記録され、そして恒温毛布を用いて３８℃に維持された。瞳孔が、局部的な２．５％フェニルエフリンと１％トロピカミド（ｔｒｏｐｉｃａｍｉｄｅ）の等しい割合を用いて拡張された。０．７５％ブピバカイン（ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ）による局部麻酔を使用してすべての角膜反射を防ぎ、かつしばしば０．９％食塩水の１滴を角膜に適用してその脱水を防ぎ、そして記録用電極（金の針金の輪）と電気的に接触させた。頭皮の下、２つの眼の間に挿入された２５ゲージの針が参照電極として使われた。増幅（１〜１０００Ｈｚバンドパス（ｂａｎｄｐａｓｓ）、ノッチ・フィルタリング（ｎｏｔｃｈ  ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）なし）、刺激提示およびデータ取得は、ＬＫＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）製ＵＴＡＳ−３０００システムによって与えられた。
【００９６】
ダブルフラッシュ・プロトコールが使用されて桿状体および錐状体応答の分離が決定された（Ｎｉｘｏｎら、２００１）。プローブフラッシュ（ｐｒｏｂｅ  ｆｌａｓｈ）は、計算された全範囲（ｇａｎｚｆｅｌｄ）を有するＵＴＡＳ−３０００システム（ＬＫＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い；シミュレーターの完全なリチャージ（ｒｅｃｈａｒｇｅ）を確立して、順化フラッシュの１秒後に与えられた。この操作における順化フラッシュの役割は、それらがプローブフラッシュに対して無応答にされるように、一過性に桿状体を飽和することであった。プローブフラッシュに対する応答は、錐状体作動活性（ａ波（ａ−ｗａｖｅ））を反射するようにとられた。桿状体作動ｂ波（ｂ−ｗａｖｅ）は、混合応答から錐状体作動応答を差し引くことによって得られた（プローブフラッシュのみの提供後に得られる、すなわち、いかなる順化フラッシュによっても先行されない）。
【００９７】
暗所適応ｂ波の定量では、記録は単回フラッシュ提供（１０μ秒期間）からなり、必要ならば、応答の信頼性を確認し、シグナル対ノイズの比を改善するために３〜５回反復された。刺激は、−３．６〜１．４ｌｏｇカンデラ／ｍ２の輝度範囲において１  ｌｏｇ単位段階の６段階の増加強度で与えられた。桿状体の潜在性露光（ｂｌｅａｃｈｉｎｇ）を最小化するために、刺激間の間隔は、刺激輝度が最小刺激強度における１０秒から最高刺激強度における２分まで上昇されるように増加された。最大ｂ波振幅は、刺激強度に無関係に、フラッシュ強度シリーズから得られるように定義された（Ｎｕｓｉｎｏｗｉｔｚら、１９９９）。
【００９８】
臍細胞の注入を受けた動物（ｎ＝６）は、６０日目に試験された全結果の測定値、ａ波（２７±１１）対虚偽対照（０）、混合ｂ波（１１７±６７）対虚偽対照（１８±１３）、錘状体ｂ波（５５±２５）対虚偽対照（２８±１１）において、そして桿状体寄与（ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）（４９±１６％）対虚偽対照（６±７％）において改善を例証した。さらに、９０日目では改善された応答が２動物において測定され、測定値は、ａ波（１５±７）対虚偽対照（０）、混合ｂ波（３７±１５）対虚偽対照（０）、錘状体ｂ波（１６±１１）対虚偽対照（７±５）であり、そして桿状体寄与（ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）（５８±３９％）対虚偽対照（０％）であった（図１）。これらの動物で観察された応答は未処置または虚偽処置動物において見られるよりもはるかに大きかった。５８日目のＭＳＣ注入（ｎ＝５）は、ａ波測定値（１６．４±１３．１）対虚偽対照（１４．６±１２．５）の応答を示した。視覚の機能維持は、混合ｂ波応答（８１．６±１５．３）対虚偽（５４．４±２４．５）、および分離された錘状体ｂ波応答（１３４±６８）対虚偽（７２．４±４０．８）において、そして桿状体寄与（４１±１６．８％）対虚偽（２１±１９．３４）の全測定値において例証された。例証されたこれらの結果は、これらの動物における６０日目の光受容体機能の維持を例証している。
【００９９】
同じ動物における８８日目のＭＳＣ注入（ｎ＝５）は、虚偽対照に比較した場合、全ＥＲＧ測定値において有意な維持を例証した。ａ波に対する応答測定値（１４．３±１２．１）対虚偽対照（０）。視覚の機能維持は、混合ｂ波応答（６４．５±２４）対虚偽（０）、および分離された錘状体ｂ波応答（３２．６±２２．７）対虚偽（８±４）において、そして桿状体寄与（４７．５±２９）対虚偽（０）の全測定値において例証された。これらの結果は、虚偽対照に比較した場合、視覚応答における改善を例証した。かくして、データは、視覚機能が、視覚が９０日目には喪失する虚偽対照に対して、ＭＳＣ注入を受けているＲＣＳ動物では維持されることを例証している。
【０１００】
６０日目の胎盤細胞移植（ｎ＝４）は、ａ波（２０±２０）対虚偽対照（０）では改善を示さなかったが、混合ｂ波（８１±７２）対虚偽（１．５±２）ではわずかな改善、そして錘状体ｂ波（５０±１９）対虚偽対照（７±７）、および桿状体寄与（３０％）対虚偽対照（０）において良好な改善を示した。これらの結果は、虚偽対照に比較した場合、視覚応答における若干の改善を示した。このことは、光受容体救済が、これらの動物において小程度に観察されたことを示唆している（図１）。
【０１０１】
反対に、繊維芽細胞移植を受けている動物は試験されたいずれのパラメーターにおいても改善を示さなかった。
【０１０２】
機能調査：  生理学的な網膜感度試験が薄暗い光に対する網膜応答を例証するために実施された。これらの試験では、動物はウレタンにより１．２５ｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．で麻酔された。これらの動物における生理学的調査は、動物における移植後９０日目に、それぞれの視覚受容分野の照明に対する上丘における多単位（ｍｕｌｔｉｕｎｉｔ）の細胞外活性を記録することによって試験された（Ｌｕｎｄら、２００１）。この操作は、視野を覆う、２０の独立した点（視野における約１０〜１５０置換に対応する各段階により、２００ｍｍ間隔において）について繰り返された。視覚閾値は、バックグラウンド以上で、かつライト３０のスポットで上丘の表面２００ｍｍの直径における活性化単位のために必要とされる、０．０２カンデラ／ｍ２（ルミネセンス（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）単位）に維持された強度における増加として測定された。応答パラメーターは、移植された眼と媒質のみを受けた眼との間で比較された。
【０１０３】
視力：  ＲＣＳラットのはっきりしない（ｇｒａｔｉｎｇ）視力が、月齢３〜４カ月後に試験された。正常な動物は３カ月齢において０．５サイクル／度の視力を例証する。３カ月後にＭＳＣを注入された眼は、平均０．２サイクル／度の視力を保持する虚偽処置された動物に対して、平均０．４７サイクル／度（ｎ＝１４）の視力を維持した。かくして、視力は移植後９０日のこれらの動物において維持された。４カ月齢でＭＳＣ移植された動物は、基礎ラインレベルにおける視力を保持する虚偽処置された動物に対して、平均０．３６サイクル／度（ｎ＝７）の視力を維持した（図２）。
【０１０４】
視覚閾値：  視覚喪失の防御における移植の効力が、４匹の動物における電気生理学的応答の調査によって追跡された。光に対する閾値感度応答は、虚偽注入された対照の眼対ＭＳＣを移植された眼における視野救済の面積を定義するために使用された。非異栄養ラットでは、視覚閾値は、決してバックグラウンド以上の０．５ｌｏｇカンデラ／ｍ２を越えることはなかった。外科処置されなかった異栄養ラットでは、閾値は、通常４ｌｏｇカンデラ／ｍ２単位の大きさである（ＢｌａｋｅｍａおよびＤｒａｇｅｒ、１９９１）。これに対して、外科処置されなかった虚偽注入された異栄養ラットでは、閾値は、２．９〜４．９ｌｏｇカンデラ／ｍ２単位のオーダーにあって、平均閾値４．０ｌｏｇカンデラ／ｍ２単位を有し、ある場合には記録が得られなかった（図３）。かくして、虚偽注入されたラットは、一時性の網膜における若干の高度に局部的な機能救済を示した。しかしながら、ヒトＭＳＣ移植されたラットは、平均閾値１．３ｌｏｇカンデラ／ｍ２単位を有する
、０．８〜２．１ｌｏｇカンデラ／ｍ２単位の範囲の閾値をもつ実質的に大きいレベルの視覚維持を示した（図３）。虚偽注入された対照における１８％に対して、ＭＳＣ注入された動物では、閾値の平均６０％における応答が２．１  ｌｏｇカンデラ／ｍ２単位以下であった。
【０１０５】
組織学：  この研究の最後に、動物はウレタンの過剰用量（１２．５ｇ／ｋｇ）により犠牲にされた。眼の方向が、摘出前に上方の直筋をとおして６．０縫合をすることによって維持された。角膜切開をした後、眼は、０．１Ｍカコジル酸塩バッファー（ｐＨ７．４）中２．５％パラホルムアルデヒド、２．５％グルタルアルデヒド、０．０１％ピクリン酸により固定された。固定後、角膜および水晶体が毛様体の周囲を切ることによって除去された。方向の維持を助けている上方直筋を除去する前に、後方の網膜の周囲に小さい切り目が作られた。次いで、網膜が１％四酸化オスミウム中で１時間、後固定された。エポキシプロパンに対する一連のアルコールにより脱水後、網膜はＴＡＡＢ包埋用樹脂（ＴＡＡＢ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｌｄｅｍａｒｓｔｏｎ，ＵＫ）中に包埋された。半ば薄い切片が１％ホウ酸バッファー中１％トルイジンブルーにより染色され、そして超薄切片が酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛により対比染色された。
【０１０６】
Ｎｉｓｓｌ染色では、切片が０．７５％クレシルバイオレット（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）により染色され、この後、それらが７０、９５および１００％２回の段階別アルコールにより脱水された。次いで、それらがキシレン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中に容れられ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で洗浄され、カバーガラスをされ、そしてＤＰＸ  ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）により検鏡標本を作製された。
【０１０７】
ＭＳＣ処置された動物において９０〜１００日時点で組織学的に、宿主光受容体の解剖学的救済が明瞭に例証された（図４）。光受容体は、他の網膜細胞から形成される、内部の核層から間隙によって分離された厚い層を形成している。虚偽対照における外層の幅は、移植された眼における３〜５細胞の厚さに対して、最良でも不連続な単層である。正常な動物に比較して、これは、正常に観察される光受容体細胞層の厚さの半分よりわずかに厚い程度である。
【０１０８】
本文書を通じて引用される公表物は、完全に引用によって本明細書に組み入れられている。本発明の種々の態様は、実施例および好適な実施態様を参照して先に具体的に説明されたが、本発明の範囲が、前記説明のみならず、特許法の原則下で適当に考えられる次の請求項によって定義されることは評価できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】細胞の移植片を受けているＲＣＳラットからのＥＲＧ記録の総括
【図２】本発明のＭＳＣを受けているＲＣＳラットの視力
【図３】本発明のＭＳＣを受けているＲＣＳラットの視力の閾値
【図４】本発明のＭＳＣを受けている動物からの網膜の組織切片
【図１】
2009500297.tif 000003
【図２】
2009500297.tif 000004
【図３】
2009500297.tif 000005
【図４】
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