(57)【要約】本発明は、アグレカナーゼポリペプチドおよびアグレカナーゼポリペプチド／リガンド複合体、アグレカナーゼおよびアグレカナーゼポリペプチド／リガンド複合体の結晶、ならびに関連する方法およびソフトウェアシステムに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶アグレカナーゼポリペプチド。
【請求項２】
アグレカナーゼポリペプチドがアグレカナーゼ−１ポリペプチドである、請求項１に記載の結晶アグレカナーゼポリペプチド。
【請求項３】
アグレカナーゼポリペプチドが触媒ドメインを含む、請求項１に記載の結晶アグレカナーゼポリペプチド。
【請求項４】
アグレカナーゼポリペプチドが本質的に触媒ドメインおよびディスインテグリン様ドメインからなる、請求項１に記載の結晶アグレカナーゼポリペプチド。
【請求項５】
アグレカナーゼポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の結晶アグレカナーゼポリペプチド。
【請求項６】
結晶アグレカナーゼポリペプチドが空間群Ｐ２１を有する、請求項１に記載の結晶アグレカナーゼポリペプチド。
【請求項７】
結晶アグレカナーゼポリペプチドが単位胞寸法ａ＝１２８．２８Å、ｂ＝８３．６３Å、ｃ＝１５０．１６Å、およびβ＝１１２．４０９°を有する、請求項６に記載の結晶アグレカナーゼポリペプチド。
【請求項８】
アグレカナーゼポリペプチドが哺乳動物種由来である、請求項１に記載の結晶アグレカナーゼポリペプチド。
【請求項９】
アグレカナーゼポリペプチドが非哺乳動物種由来である、請求項１に記載の結晶アグレカナーゼポリペプチド。
【請求項１０】
アグレカナーゼポリペプチドがヒト由来である、請求項１に記載の結晶アグレカナーゼポリペプチド。
【請求項１１】
結晶ポリペプチドが少なくとも約３．５Åの解像度までのＸ線回折能を有する、請求項１に記載の結晶アグレカナーゼポリペプチド。
【請求項１２】
結晶ポリペプチドが表４の構造座標＋／−α炭素原子について１．５Å以下の標準偏差を含む、請求項１に記載の結晶アグレカナーゼポリペプチド。
【請求項１３】
アグレカナーゼポリペプチド；および
リガンド
を含む、結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１４】
リガンドがアグレカナーゼ活性の阻害剤である、請求項１３に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１５】
リガンドが以下の構造：
【化１】
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［式中、ＡおよびＢは環系を表し；Ｌ、Ｍ、およびＹはリンカー部分であり；Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は置換基であり；Ｘは水素結合のアクセプターであり；Ｚは金属キレート化部分である］
を有する、請求項１３に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１６】
Ａが５個以上の原子を有するアリール部分または５個以上の原子を有するヘテロアリール部分である、請求項１５に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１７】
Ｂが５個以上の原子を有するアリール部分または５個以上の原子を有するヘテロアリール部分である、請求項１５に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１８】
Ｌが結合、メチレン、エチレン、酸素、硫黄、アミノ、メチレンオキシ、メチレンアミノ、メチレンチオイル、スルホキシド、またはスルホンである、請求項１５に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１９】
Ｍがメチレン、エチレン、酸素、硫黄、アミノ、メチレンオキシ、メチレンアミノ、メチレンチオイル、スルホキシド、またはスルホンである、請求項１５に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２０】
Ｙがメチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、酸素、硫黄、アミノ、メチレンオキシ、メチレンアミノ、メチレンチオイル、スルホキシドまたはスルホンである、請求項１５に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２１】
Ｒ１が水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、シクリル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、ここで該Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、シクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールが、各々、ニトロ、シアノ、アルキルカルボニル、スルホキシド、スルホン、スルホンアミド、カルボニル、カルボキシアミド、カルバマート、またはカルボナートで置換されていてもよい、請求項１５に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２２】
Ｒ２が水素、フッ素、塩素、臭素、ＯＣ（ハロゲン）３、Ｃ（ハロゲン）３、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルチオイル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルアミノである、請求項１５に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２３】
Ｒ３が水素、フッ素、塩素、臭素、ＯＣ（ハロゲン）３、Ｃ（ハロゲン）３、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルチオイル、またはＣ１〜Ｃ６アルキルアミノである、請求項１５に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２４】
Ｘが硫黄、スルホキシド、スルホン、スルホンアミド、カルボニル、カルボキサミド、尿素、カルバマート、またはカルボナートである、請求項１５に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２５】
Ｚがカルボン酸、ヒドロキサム酸、ヒドロキシ尿素、ヒドラジド、スルホン酸、スルホンアミド、ヒドロキシスルホンアミド、スルホジイミド、リン酸、ホスホン酸、チオール、チオールカルボニル、チイラン、ジチオール、スルホニルヒドラジド、スルホジイミン、チアゾラジンジオン、ピリミジントリオンチアジアジン、バルビツレート、チアジアゾール、チアジアジン、イミダゾリジンジオン、ピリジニオン、アミノメチルベンズイミダゾール、ナプチルヒドロキサメート、ピリジニルアミド、ピリジニロンまたはピロリロンである、請求項１５に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２６】
リガンドがペプチド模倣体化合物である、請求項１３に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２７】
リガンドがマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤である、請求項１３に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２８】
リガンドが化合物１である、請求項１３に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２９】
結晶ポリペプチド−リガンド複合体が空間群Ｐ２１を有する、請求項１３に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項３０】
結晶ポリペプチド−リガンド複合体が単位胞寸法ａ＝８２．０７Å、ｂ＝８３．９６Å、ｃ＝９８．９５Å、およびβ＝８９．９°を有する、請求項１３に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項３１】
アグレカナーゼポリペプチドが触媒ドメインを含む、請求項１３に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項３２】
アグレカナーゼポリペプチドがディスインテグリン様ドメインをさらに含む、請求項３１に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項３３】
リガンドが触媒ドメインと結合している、請求項３１に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項３４】
アグレカナーゼポリペプチドが哺乳動物種由来である、請求項１３に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項３５】
アグレカナーゼポリペプチドが非哺乳動物種由来である、請求項１３に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項３６】
アグレカナーゼポリペプチドがヒト由来である、請求項１３に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項３７】
アグレカナーゼポリペプチドが配列番号１によって定義されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項３８】
少なくとも約３．５Åの解像度までのＸ線の回折能を有する、請求項１３に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項３９】
表４の構造座標±α炭素原子について１．５Å以下の標準偏差を含む、請求項１３に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項４０】
リガンドがアグレカナーゼ−１ポリペプチドのアミノ酸３６２と結合し、アミノ酸３６２がグルタマートまたはグルタミンである、請求項１３に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項４１】
リガンドがアグレカナーゼポリペプチドの活性部位に位置する亜鉛原子と結合する、請求項１３に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項４２】
アグレカナーゼポリペプチドがアグレカナーゼ−１ポリペプチドである、請求項１３に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項４３】
リガンドがアグレカナーゼ−１ポリペプチドのＬｅｕ３３０、Ｇｌｙ３３１、Ａｌａ３３３、Ｈｉｓ３６１、Ｐｈｅ３５７およびＡｌａ２４８の１つまたは複数と結合する、請求項４２に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項４４】
アグレカナーゼ−１ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸を含み、結晶ポリペプチド−リガンド複合体が少なくとも約３．５Åの解像度までＸ線を回折する、請求項４２に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項４５】
リガンドがアグレカナーゼポリペプチドと結合する、請求項４２に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項４６】
アグレカナーゼポリペプチド；および
Ｚｎキレート化部分を有する多環リガンド
を含む結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項４７】
アグレカナーゼポリペプチドがアグレカナーゼ−１ポリペプチドである、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
アグレカナーゼポリペプチド；および
リガンド
を含む結晶を含む組成物。
【請求項４９】
リガンドがアグレカナーゼポリペプチドと結合する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
アグレカナーゼポリペプチドがアグレカナーゼ−１ポリペプチドである、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５１】
リガンドがペプチド模倣体である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５２】
リガンドがマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５３】
リガンドが化合物１である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５４】
リガンドと結合したアグレカナーゼポリペプチドを含む複合体の三次元モデルを用いて、アグレカナーゼポリペプチドと結合する薬剤を設計することを含む方法。
【請求項５５】
三次元モデルがアグレカナーゼポリペプチドの触媒ドメインを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
三次元モデルがアグレカナーゼポリペプチドのディスインテグリン様ドメインをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
三次元モデルがアグレカナーゼポリペプチドの原子の構造座標を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
構造座標が実験で決定された座標である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
三次元モデルがリガンドの構造座標を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
リガンドがペプチド模倣体である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
リガンドが化合物１である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
モデルのリガンドを改変することをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
リガンドの改変がリガンドの構造座標を変化させることを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
リガンドの改変がリガンドの化学構造を変化させることを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
アグレカナーゼポリペプチドがアグレカナーゼ−１ポリペプチドである、請求項５４に記載の方法。
【請求項６６】
三次元モデルが、アグレカナーゼ−１ポリペプチドのアミノ酸Ｌｅｕ３３０、Ｇｌｙ３３１、Ａｌａ３３３、Ｈｉｓ３６１、Ｐｈｅ３５７、およびＡｌａ２４８の原子からなる群から選択される原子の構造座標を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
三次元モデルがアグレカナーゼ−１ポリペプチドのアミノ酸３６２の原子の構造座標を含み、アミノ酸３６２がグルタマートまたはグルタミンである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
アグレカナーゼポリペプチドの原子と薬剤の原子との距離を測定することをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６９】
薬剤とアグレカナーゼポリペプチドとの予測された相互作用を、リガンドとアグレカナーゼポリペプチドとの相互作用と比較することをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項７０】
アグレカナーゼポリペプチドを含む組成物を提供することをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項７１】
組成物がアグレカナーゼポリペプチドと結合するように設計された薬剤を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
薬剤とアグレカナーゼポリペプチドとの相互作用を実験で決定することをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項７３】
薬剤とアグレカナーゼポリペプチドとの相互作用と、第２の薬剤とアグレカナーゼポリペプチドとの相互作用とを比較することをさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
アグレカナーゼポリペプチドの三次元モデルを用いて、アグレカナーゼポリペプチドと結合する薬剤を設計することを含む方法。
【請求項７５】
アグレカナーゼポリペプチドがアグレカナーゼ−１ポリペプチドである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
三次元モデルがアグレカナーゼポリペプチドと結合したリガンドを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
リガンドがペプチド模倣体である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
リガンドがマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
リガンドが化合物１である、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
三次元モデルがリガンドの原子の構造座標を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項８１】
三次元モデルがアグレカナーゼポリペプチドの触媒ドメインを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８２】
薬剤がアグレカナーゼ活性を阻害する、請求項７４に記載の方法。
【請求項８３】
三次元モデルがアグレカナーゼポリペプチドの原子の構造座標を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８４】
構造座標が実験で決定された座標である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
構造座標が表５に従い、α炭素原子について＋／−１．５Å以下の標準偏差である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
三次元モデルが、アグレカナーゼ−１ポリペプチドのアミノ酸Ｌｅｕ３３０、Ｇｌｙ３３１、Ａｌａ３３３、Ｈｉｓ３６１、Ｐｈｅ３５７およびＡｌａ２４８の原子からなる群から選択される原子の構造座標を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項８７】
三次元モデルがアグレカナーゼ−１ポリペプチドのアミノ酸３６２の原子の構造座標を含み、アミノ酸３６２がグルタマートまたはグルタミンである、請求項７５に記載の方法。
【請求項８８】
結晶複合体の三次元構造を用いて合理的薬物設計を行うことによって薬剤を選択すること、ここで該複合体はアグレカナーゼポリペプチドを含み；
薬剤をアグレカナーゼポリペプチドと接触させること；および
アグレカナーゼポリペプチドと結合する薬剤の能力を検出すること
を含む方法。
【請求項８９】
アグレカナーゼポリペプチドがアグレカナーゼ−１ポリペプチドである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
コンピュータモデリングを介して薬剤を選択する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
薬剤を合成することをさらに含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
アグレカナーゼ活性を阻害する薬剤の能力を検出することをさらに含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
軟骨分解をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで阻害または軽減する薬剤の能力を検出することをさらに含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
アグレカナーゼポリペプチドおよび薬剤を含む追加の結晶複合体を得ること；
追加の結晶複合体の三次元構造を決定すること；
追加の結晶複合体の三次元構造を用いて合理的薬物設計を行うことによって第２の薬剤を選択すること；
第２の薬剤をアグレカナーゼポリペプチドと接触させること；および
アグレカナーゼポリペプチドと結合する第２の薬剤の能力を検出すること
をさらに含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９５】
コンピュータモデリングを介して第２の薬剤を選択する、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
第２の薬剤を合成することをさらに含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
アグレカナーゼ活性を阻害する第２の薬剤の能力を検出することをさらに含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
軟骨分解をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで阻害または軽減する第２の薬剤の能力を検出することをさらに含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
アグレカナーゼポリペプチドをリガンドと接触させて組成物を形成すること；および
組成物を結晶化させて、リガンドがアグレカナーゼポリペプチドと結合する結晶複合体を形成させることを含み、
ここで、該結晶複合体が少なくとも約３．５Åの解像度までＸ線を回折することができる、方法。
【請求項１００】
アグレカナーゼポリペプチドがアグレカナーゼ−１ポリペプチドである、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
懸滴蒸気拡散を用いることを含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
リガンドがアグレカナーゼ活性の阻害能を有する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
リガンドが、軟骨分解のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの阻害または軽減能を有する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０４】
リガンドがペプチド模倣体である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０５】
リガンドがマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０６】
リガンドが化合物１である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０７】
コンピュータシステムに、
リガンドと結合したアグレカナーゼポリペプチドの構造に関する情報を受け入れること；
候補薬剤に関する情報を受け入れること；および
候補薬剤とアグレカナーゼポリペプチドとの結合特徴を決定すること
を行わせるための命令を含むソフトウェアシステムであって、決定がリガンドと結合したアグレカナーゼポリペプチドの構造に関する情報および候補薬剤に関する情報に基づくところの、ソフトウェアシステム。
【請求項１０８】
アグレカナーゼポリペプチドがアグレカナーゼ−１ポリペプチドである、請求項１０７に記載のソフトウェアシステム。
【請求項１０９】
１つまたは複数のプロセッサによって実行される際、１つまたは複数のプロセッサに、
リガンドと結合したアグレカナーゼポリペプチドを含む複合体の構造に関する情報を受け入れること；
候補薬剤に関する情報を受け入れること；および
候補薬剤とアグレカナーゼポリペプチドとの結合特徴を決定すること
を行わせる、複数の命令が格納されたコンピュータで読取可能な媒体上に存在するコンピュータプログラムであって、決定がアグレカナーゼポリペプチドの構造に関する情報および候補薬剤に関する情報に基づいてなされるところの、コンピュータプログラム。
【請求項１１０】
アグレカナーゼポリペプチドがアグレカナーゼ−１ポリペプチドである、請求項１０９に記載のコンピュータプログラム。
【請求項１１１】
リガンドと結合したアグレカナーゼポリペプチドを含む複合体の構造に関する情報を受け入れること；および
アグレカナーゼポリペプチドと候補薬剤との結合特徴をモデリングすること
を含み、ソフトウェアシステムによって実行されるところの、方法。
【請求項１１２】
アグレカナーゼポリペプチドがアグレカナーゼ−１ポリペプチドである、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
１つまたは複数のプロセッサによって実行される際、１つまたは複数のプロセッサに、
リガンドと結合したアグレカナーゼポリペプチドを含む複合体の構造に関する情報を受け入れること；および
アグレカナーゼポリペプチドと候補薬剤との結合特徴をモデリングすること
を行わせる、複数の命令が格納されたコンピュータで読取可能な媒体上に存在するコンピュータプログラム。
【請求項１１４】
アグレカナーゼポリペプチドがアグレカナーゼ−１ポリペプチドである、請求項１１３に記載のコンピュータプログラム。
【請求項１１５】
コンピュータシステムに、
リガンドと結合したアグレカナーゼポリペプチドを含む複合体の構造に関する情報を受け入れること；および
アグレカナーゼポリペプチドと候補薬剤との結合特徴をモデリングすること
を行わせるための命令を含むソフトウェアシステム。
【請求項１１６】
アグレカナーゼポリペプチドがアグレカナーゼ−１ポリペプチドである、請求項１１５に記載のソフトウェアシステム。
【請求項１１７】
合理的薬物設計を用いてアグレカナーゼ活性の調節能を有する薬剤を選択すること；および
治療上有効な量の薬剤を対象に投与すること
を含む、対象においてアグレカナーゼ活性を調節する方法。
【請求項１１８】
アグレカナーゼ活性がアグレカナーゼ−１活性である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
薬剤が軟骨分解のｉｎ  ｖｉｖｏでの阻害または軽減能を有する、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２０】
合理的薬物設計が、アグレカナーゼポリペプチドを含む結晶複合体の三次元構造を用いることを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２１】
結晶複合体がリガンドをさらに含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
リガンドがペプチド模倣体である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
リガンドがマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２４】
リガンドが化合物１である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２５】
合理的薬物設計を用いてアグレカナーゼ活性に影響を与える能力を有する薬剤を選択すること；および
治療上有効な量の薬剤を、それを必要としている対象に投与すること
を含む、アグレカナーゼ活性に付随する状態の対象を治療する方法。
【請求項１２６】
アグレカナーゼ活性がアグレカナーゼ−１活性である、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
薬剤がアグレカナーゼ活性の阻害能を有する、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２８】
薬剤が軟骨分解のｉｎ  ｖｉｖｏでの阻害能を有する、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２９】
状態が関節疾患である、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３０】
関節疾患が関節炎障害または関節傷害である、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
関節炎障害が骨関節炎または関節リウマチである、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
対象がアグレカナーゼ活性に付随する状態に感受性を有することを決定すること；
合理的薬物設計を用いてアグレカナーゼ活性に影響を及ぼす能力を有する薬剤を選択すること；および
治療上有効な量の薬剤を対象に投与すること
を含む、アグレカナーゼ活性に付随する状態に感受性のある対象に予防的治療を行う方法。
【請求項１３３】
アグレカナーゼ活性がアグレカナーゼ−１活性である、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
薬剤が軟骨分解の阻害能である、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３５】
状態が関節疾患である、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３６】
関節疾患が関節炎障害または関節傷害である、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
関節炎障害が関節リウマチまたは骨関節炎である、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
アグレカナーゼ−２ポリペプチド、および
リガンド
を含む、結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１３９】
リガンドがアグレカナーゼ活性の阻害剤である、請求項１３８に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１４０】
リガンドが以下の構造：
【化２】
2009508474.tif 000557
［式中、ＤおよびＥはアミドまたはその模倣体を表し；Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は側鎖部分を表し；Ｇは金属キレート化部分を意味する］
を有する、請求項１３８に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１４１】
Ｒ１１がメチル、エチルまたはプロピルである、請求項１４０に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１４２】
Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４の１つまたは複数が、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、シクリル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールシクリルオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、シクリルチオ、ヘテロシクリルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、シクリルオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アリールアルキル、およびヘテロアリールアルキルからなる群から選択される、請求項１４０に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１４３】
Ｒ１２がフェニル部分である、請求項１４０に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１４４】
Ｒ１３がイソプロピル部分である、請求項１４０に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１４５】
Ｒ１４がヘテロアリールチオ部分である、請求項１４０に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１４６】
Ｇがカルボン酸、カルボン酸アミド、またはヒドロキサム酸である、請求項１４０に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１４７】
リガンドがペプチド模倣体化合物である、請求項１３８に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１４８】
リガンドがマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤である、請求項１３８に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１４９】
リガンドがバチマスタットである、請求項１３８に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１５０】
空間群Ｐ３１を有する、請求項１３８に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１５１】
単位胞寸法ａ＝９３．６４Å、ｂ＝９３．６４Å、ｃ＝９２．５９Å、およびγ＝１２０°を有する、請求項１３８に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１５２】
アグレカナーゼ−２ポリペプチドが触媒ドメインを含む、請求項１３８に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１５３】
アグレカナーゼ−２ポリペプチドがディスインテグリン様ドメインをさらに含む、請求項１５２に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１５４】
リガンドが触媒ドメインと結合している、請求項１３８に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１５５】
アグレカナーゼ−２ポリペプチドが哺乳動物種由来である、請求項１３８に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１５６】
アグレカナーゼ−２ポリペプチドが非哺乳動物種由来である、請求項１３８に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１５７】
アグレカナーゼ−２ポリペプチドがヒト由来である、請求項１３８に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１５８】
アグレカナーゼ−２ポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１３８に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１５９】
少なくとも約３．５Åの解像度までのＸ線の回折能を有する、請求項１３８に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１６０】
表６の構造座標±α炭素原子について１．５Å以下の標準偏差を含む、請求項１３８に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１６１】
リガンドがアグレカナーゼ−２ポリペプチドの活性部位に位置する亜鉛原子と結合する、請求項１３８に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１６２】
リガンドがアグレカナーゼ−２ポリペプチドのＧｌｕ４１１、Ａｓｐ３７７、Ｌｅｕ３７９、Ｓｅｒ４１１、およびＬｅｕ４４３の１つまたは複数と結合する、請求項１３８に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１６３】
アグレカナーゼ−２ポリペプチドが配列番号３のアミノ酸を含み、結晶ポリペプチド−リガンド複合体が少なくとも約３．５Åの解像度までＸ線を回折する、請求項１３８に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１６４】
リガンドがアグレカナーゼ−２ポリペプチドと結合している、請求項１３８に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１６５】
アグレカナーゼ−２ポリペプチド；および
金属キレート化部分を有するペプチド模倣体リガンド
を含む結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１６６】
アグレカナーゼ−２ポリペプチド；および
リガンド
を含む結晶を含む組成物。
【請求項１６７】
リガンドがアグレカナーゼ−２ポリペプチドと結合している、請求項１６６に記載の組成物。
【請求項１６８】
リガンドがペプチド模倣体である、請求項１６６に記載の組成物。
【請求項１６９】
リガンドがマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤である、請求項１６６に記載の組成物。
【請求項１７０】
リガンドがバチマスタットである、請求項１６６に記載の組成物。
【請求項１７１】
リガンドと結合したアグレカナーゼ−２ポリペプチドを含む複合体の三次元モデルを用いて、アグレカナーゼ−２ポリペプチドと結合する薬剤を設計することを含む方法。
【請求項１７２】
三次元モデルがアグレカナーゼ−２ポリペプチドの触媒ドメインを含む、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７３】
三次元モデルがアグレカナーゼ−２ポリペプチドのディスインテグリン様ドメインをさらに含む、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
三次元モデルがアグレカナーゼ−２ポリペプチドの原子の構造座標を含む、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７５】
構造座標が実験で決定された座標である、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
三次元モデルがリガンドの構造座標を含む、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７７】
リガンドがペプチド模倣体である、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７８】
リガンドがバチマスタットである、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７９】
モデルのリガンドを改変することをさらに含む、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１８０】
リガンドの改変がリガンドの構造座標を変化させることを含む、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
リガンドの改変がリガンドの化学構造を変化させることを含む、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８２】
三次元モデルが、アグレカナーゼ−２ポリペプチドのアミノ酸Ｇｌｕ４１１、Ａｓｐ３７７、Ｌｅｕ３７９、Ｓｅｒ４４１、およびＬｅｕ４４３の原子からなる群から選択される原子の構造座標を含む、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１８３】
アグレカナーゼ−２ポリペプチドの原子と薬剤の原子との距離を測定することをさらに含む、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１８４】
薬剤とアグレカナーゼ−２ポリペプチドとの予測された相互作用を、リガンドとアグレカナーゼ−２ポリペプチドとの相互作用と比較することをさらに含む、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１８５】
アグレカナーゼ−２ポリペプチドを含む組成物を提供することをさらに含む、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１８６】
組成物がアグレカナーゼ−２ポリペプチドと結合するように設計された薬剤を含む、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
薬剤とアグレカナーゼ−２ポリペプチドとの相互作用を実験で決定することをさらに含む、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１８８】
薬剤とアグレカナーゼ−２ポリペプチドとの相互作用を、第２の薬剤とアグレカナーゼ−２ポリペプチドとの相互作用と比較することをさらに含む、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
アグレカナーゼ−２ポリペプチドの三次元モデルを用いて、アグレカナーゼ−２ポリペプチドと結合する薬剤を設計することを含む方法。
【請求項１９０】
三次元モデルがアグレカナーゼ−２ポリペプチドと結合したリガンドを含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９１】
リガンドがペプチド模倣体である、請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９２】
リガンドがマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤である、請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９３】
リガンドがバチマスタットである、請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９４】
三次元モデルがリガンドの原子の構造座標を含む、請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９５】
三次元モデルがアグレカナーゼ−２ポリペプチドの触媒ドメインを含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９６】
薬剤がアグレカナーゼ活性を阻害する、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９７】
三次元モデルがアグレカナーゼ−２ポリペプチドの原子の構造座標を含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９８】
構造座標が実験で決定された座標である、請求項１９７に記載の方法。
【請求項１９９】
構造座標が表６に従い、α炭素原子について＋／−１．５Å以下の標準偏差である、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２００】
三次元モデルが、アグレカナーゼ−２ポリペプチドのアミノ酸Ｇｌｕ４１１、Ａｓｐ３７７、Ｌｅｕ３７９、Ｓｅｒ４４１、およびＬｅｕ４４３の原子からなる群から選択される原子の構造座標を含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項２０１】
結晶複合体の三次元構造を用いて合理的薬物設計を行うことによって薬剤を選択すること、ここで複合体はアグレカナーゼ−２ポリペプチドを含み；
薬剤をアグレカナーゼ−２ポリペプチドと接触させること；および
アグレカナーゼ−２ポリペプチドと結合する薬剤の能力を検出すること
を含む方法。
【請求項２０２】
コンピュータモデリングを介して薬剤を選択する、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０３】
薬剤を合成することをさらに含む、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０４】
アグレカナーゼ−２活性を阻害する薬剤の能力を検出することをさらに含む、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２０５】
軟骨分解をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで阻害または軽減する薬剤の能力を検出することをさらに含む、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２０６】
アグレカナーゼ−２ポリペプチドおよび薬剤を含む追加の結晶複合体を得ること；
追加の結晶複合体の三次元構造を決定すること；
追加の結晶複合体の三次元構造を用いて合理的薬物設計を行うことによって第２の薬剤を選択すること；
第２の薬剤をアグレカナーゼ−２ポリペプチドと接触させること；および
アグレカナーゼ−２ポリペプチドと結合する第２の薬剤の能力を検出すること
をさらに含む、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０７】
コンピュータモデリングを介して第２の薬剤を選択する、請求項２０６に記載の方法。
【請求項２０８】
第２の薬剤を合成することをさらに含む、請求項２０６に記載の方法。
【請求項２０９】
アグレカナーゼ−２活性を阻害する第２の薬剤の能力を検出することをさらに含む、請求項２０８に記載の方法。
【請求項２１０】
軟骨分解をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで阻害または軽減する第２の薬剤の能力を検出することをさらに含む、請求項２０８に記載の方法。
【請求項２１１】
アグレカナーゼ−２ポリペプチドをリガンドと接触させて組成物を形成すること；および
組成物を結晶化させて、リガンドがアグレカナーゼ−２ポリペプチドと結合している、結晶複合体を形成すること
を含み、ここで結晶複合体が少なくとも約３．５Åの解像度までＸ線を回折することができる、方法。
【請求項２１２】
懸滴蒸気拡散を用いることを含む、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１３】
リガンドがアグレカナーゼ−２活性の阻害能を有する、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１４】
リガンドが、軟骨分解のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの阻害または軽減能を有する、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１５】
リガンドがペプチド模倣体である、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１６】
リガンドがマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤である、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１７】
リガンドがバチマスタットである、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１８】
コンピュータシステムに、
リガンドと結合したアグレカナーゼ−２ポリペプチドの構造に関する情報を受け入れること；
候補薬剤に関する情報を受け入れること；および
候補薬剤とアグレカナーゼ−２ポリペプチドとの結合特徴を決定すること、
を行わせるための命令を含むソフトウェアシステムであって、ここで決定がリガンドと結合したアグレカナーゼ−２ポリペプチドの構造に関する情報および候補薬剤に関する情報に基づくものであるところの、ソフトウェアシステム。
【請求項２１９】
１つまたは複数のプロセッサによって実行される際に、１つまたは複数のプロセッサに、
リガンドと結合したアグレカナーゼ−２ポリペプチドを含む複合体の構造に関する情報を受け入れること；
候補薬剤に関する情報を受け入れること；および
候補薬剤とアグレカナーゼ−２ポリペプチドとの結合特徴を決定すること
を行わせる、複数の命令が格納されたコンピュータで読取可能な媒体上に存在するコンピュータプログラムであって、ここで、決定がアグレカナーゼ−２ポリペプチドの構造に関する情報および候補薬剤に関する情報に基づくものであるところの、コンピュータプログラム。
【請求項２２０】
リガンドと結合したアグレカナーゼ−２ポリペプチドを含む複合体の構造に関する情報を受け入れること；および
アグレカナーゼ−２ポリペプチドと候補薬剤との結合特徴をモデリングすること
を含む方法であって、ソフトウェアシステムによって実行するところの、方法。
【請求項２２１】
１つまたは複数のプロセッサによって実行される際に、１つまたは複数のプロセッサに、
リガンドと結合したアグレカナーゼ−２ポリペプチドを含む複合体の構造に関する情報を受け入れること；および
アグレカナーゼ−２ポリペプチドと候補薬剤との結合特徴をモデリングすること
を行わせる、複数の命令が格納されたコンピュータで読取可能な媒体上に存在する、コンピュータプログラム。
【請求項２２２】
コンピュータシステムに、
リガンドと結合したアグレカナーゼ−２ポリペプチドを含む複合体の構造に関する情報を受け入れること；および
アグレカナーゼ−２ポリペプチドと候補薬剤との結合特徴をモデリングすること
を行わせるための命令を含む、ソフトウェアシステム。
【請求項２２３】
合理的薬物設計を用いてアグレカナーゼ−２活性の調節能を有する薬剤を選択すること；および
治療上有効な量の薬剤を対象に投与すること
を含む、対象においてアグレカナーゼ−２活性を調節する方法。
【請求項２２４】
薬剤が軟骨分解のｉｎ  ｖｉｖｏでの阻害または軽減能を有する、請求項２２３に記載の方法。
【請求項２２５】
合理的薬物設計が、アグレカナーゼ−２ポリペプチドを含む結晶複合体の三次元構造を用いることを含む、請求項２２３に記載の方法。
【請求項２２６】
結晶複合体がリガンドをさらに含む、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２２７】
リガンドがペプチド模倣体である、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２２８】
リガンドがマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤である、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２２９】
リガンドがバチマスタットである、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２３０】
合理的薬物設計を用いてアグレカナーゼ−２活性に影響を与える能力を有する薬剤を選択すること；および
治療上有効な量の薬剤を、それを必要としている対象に投与すること
を含む、アグレカナーゼ−２活性に付随する状態の対象を治療する方法。
【請求項２３１】
薬剤がアグレカナーゼ−２活性の阻害能を有する、請求項２３０に記載の方法。
【請求項２３２】
薬剤が軟骨分解のｉｎ  ｖｉｖｏでの阻害能を有する、請求項２３０に記載の方法。
【請求項２３３】
状態が関節疾患である、請求項２３０に記載の方法。
【請求項２３４】
関節疾患が関節炎障害または関節傷害である、請求項２３３に記載の方法。
【請求項２３５】
関節炎障害が骨関節炎または関節リウマチである、請求項２３４に記載の方法。
【請求項２３６】
対象がアグレカナーゼ−２活性に付随する状態に感受性を有することを決定すること；
合理的薬物設計を用いてアグレカナーゼ−２活性に影響を及ぼす能力を有する薬剤を選択すること；および
治療上有効な量の薬剤を対象に投与すること
を含む、アグレカナーゼ−２活性に付随する状態に感受性のある対象に予防的治療を行う方法。
【請求項２３７】
薬剤が軟骨分解のｉｎ  ｖｉｖｏでの阻害能を有する、請求項２３６に記載の方法。
【請求項２３８】
状態が関節疾患である、請求項２３６に記載の方法。
【請求項２３９】
関節疾患が関節炎障害または関節傷害である、請求項２３８に記載の方法。
【請求項２４０】
関節炎障害が関節リウマチまたは骨関節炎である、請求項２３９に記載の方法。
【請求項２４１】
Ａが５個以上の原子を有するアリール部分であり、Ｂが５個以上の原子を有するアリール部分であり、Ｌが結合であり、Ｍがメチレンオキシであり、Ｙがイソプロピレンであり、Ｒ１がアルキルカルボニルで置換されていてもよいアリールであり、Ｒ２が水素であり、Ｒ３が水素であり、Ｘがスルホンアミドであって、Ｚがカルボン酸である、請求項１５に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２４２】
Ａがフェニル部分であって、Ｂがフェニル部分である、請求項２４１に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２４３】
Ｒ１がアルキルカルボニルで置換されていてもよいアリールである、請求項２１に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２４４】
リガンドが２−［４’−（４−イソブチリル−フェノキシメチル）−ビフェニル−４−スルホニルアミノ］−３−メチル−酪酸である、請求項１３に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２４５】
Ｄがアミド結合であり、Ｅがアミドであり、Ｒ１１がメチルであり、Ｒ１２がフェニルであり、Ｒ１３がイソプロピルであり、Ｒ１４がヘテロアリールチオであって、Ｇがヒドロキサム酸である、請求項１４０に記載の結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００５年８月２５日出願の米国仮出願第６０／７１１，４５７号およびやはり２００５年８月２５日出願の米国仮出願第６０／７１１，４５８号の優先権を主張するものである。両仮出願の内容は、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている。
【０００２】
本発明は、アグレカナーゼポリペプチド、アグレカナーゼポリペプチド／リガンド複合体、アグレカナーゼポリペプチドの結晶、アグレカナーゼポリペプチド／リガンド複合体の結晶、ならびに関連する方法およびソフトウェアシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
アグレカナーゼとは、細胞外基質の構成成分である軟骨アグリカンを切断することができる酵素である。軟骨アグリカンには、一般に、軟骨が圧縮力に抵抗することを可能にする複数の機能的ドメインを有するコアタンパク質が含まれる。細胞外基質の構成成分の分解が細胞外基質の構成成分の合成を上回る場合、アグリカンの損失、続いて軟骨の破壊が起こり、その結果、特定の組織種の構造および機能の破壊がもたらされる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
アグリカンの分解は、骨関節炎（ＯＡ）および関節リウマチなどの関節疾患の初期段階で見られる病態生理学的事象であると考えられている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様では、本発明は、結晶アグレカナーゼポリペプチドを特徴とする。
【０００６】
別の態様では、本発明は、アグレカナーゼポリペプチドおよびリガンドが含まれる結晶ポリペプチド−リガンド複合体を特徴とする。
【０００７】
別の態様では、本発明は、アグレカナーゼ−１ポリペプチドおよびリガンドが含まれる結晶ポリペプチド−リガンド複合体を特徴とする。
【０００８】
さらに別の態様では、本発明は、アグレカナーゼポリペプチドおよび亜鉛キレート化部分を有する多環リガンドが含まれる結晶ポリペプチド−リガンド複合体を特徴とする。
【０００９】
別の態様では、本発明は、結晶が含まれる組成物を特徴とする。結晶には、アグレカナーゼポリペプチドおよびリガンドが含まれる。
【００１０】
別の態様では、本発明は、リガンドと結合したアグレカナーゼポリペプチドが含まれる複合体の三次元モデルを用いる方法を特徴とする。三次元モデルは、アグレカナーゼポリペプチドと結合する薬剤を設計するために用いる。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、アグレカナーゼポリペプチドの三次元モデルを用いて、アグレカナーゼポリペプチドと結合する薬剤を設計することが含まれる方法を特徴とする。
【００１２】
別の態様では、本発明は、結晶複合体の三次元構造を用いて合理的薬物設計を行うことによって薬剤を選択することが含まれる方法を特徴とする。アグレカナーゼポリペプチドを薬剤と接触させ、アグレカナーゼポリペプチドと結合する薬剤の能力を検出する。結晶複合体には、アグレカナーゼポリペプチドが含まれる。
【００１３】
さらに別の態様では、本発明は、アグレカナーゼポリペプチドをリガンドと接触させて組成物を形成し、組成物を結晶化させて結晶複合体を形成することが含まれ、リガンドがアグレカナーゼポリペプチドと結合する方法を特徴とする。結晶複合体は、少なくとも約３．５Åの解像度までＸ線を回折することができる。
【００１４】
別の態様では、本発明は、コンピュータシステムに、リガンドと結合したアグレカナーゼポリペプチドの構造に関する情報を受け入れること、候補薬剤に関する情報を受け入れること、および候補薬剤とアグレカナーゼポリペプチドとの結合特徴を決定することを行わせるための命令を含むソフトウェアシステムが含まれるソフトウェアシステムを特徴とする。結合特徴の決定は、リガンドと結合したアグレカナーゼポリペプチドの構造に関する情報および候補薬剤に関する情報に基づく。
【００１５】
別の態様では、本発明は、複数の命令が格納されているコンピュータで読取可能な媒体上のコンピュータプログラムを特徴とする。１つまたは複数のプロセッサによって命令が実行された際、プロセッサは、リガンドと結合したアグレカナーゼポリペプチドが含まれる複合体の構造に関する情報を受け入れる。プロセッサはさらに、候補薬剤に関する情報を受け入れ、候補薬剤とアグレカナーゼポリペプチドとの結合特徴を決定する。結合特徴の決定は、アグレカナーゼポリペプチドの構造に関する情報および候補薬剤に関する情報に基づく。
【００１６】
別の態様では、本発明は、リガンドと結合したアグレカナーゼポリペプチドが含まれる複合体の構造に関する情報を受け入れること、およびアグレカナーゼポリペプチドと候補薬剤との結合特徴をモデリングすることが含まれる方法を特徴とする。そのような方法は、ソフトウェアシステムによって実行する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、複数の命令が格納されているコンピュータで読取可能な媒体上のコンピュータプログラムを特徴とする。１つまたは複数のプロセッサによって命令が実行された際、プロセッサは、リガンドと結合したアグレカナーゼポリペプチドが含まれる複合体の構造に関する情報を受け入れる。プロセッサはさらに、アグレカナーゼポリペプチドと候補薬剤との結合特徴をモデリングする。
【００１８】
別の態様では、本発明は、コンピュータシステムに、リガンドと結合したアグレカナーゼポリペプチドが含まれる複合体の構造に関する情報を受け入れることを行わせるための命令を含むソフトウェアシステムが含まれるソフトウェアシステムを特徴とする。命令はまた、コンピュータシステムに、アグレカナーゼポリペプチドと候補薬剤との結合特徴をモデリングすることを行わせる。
【００１９】
別の態様では、本発明は、対象においてアグレカナーゼ活性を調節する方法を特徴とする。この方法には、合理的薬物設計を用いてアグレカナーゼ活性を調節する能力を有する薬剤を選択すること、および治療上有効な量の薬剤を対象に投与することが含まれる。
【００２０】
別の態様では、本発明は、アグレカナーゼ活性に付随する状態に罹患している対象を治療する方法を特徴とする。この方法には、合理的薬物設計を用いてアグレカナーゼ活性に影響を与える能力を有する薬剤を選択すること、および治療上有効な量の薬剤を、そのような薬剤を必要としている対象に投与することが含まれる。
【００２１】
別の態様では、本発明は、アグレカナーゼ活性に付随する状態に感受性のある対象に予防的治療を行う方法を特徴とする。この方法には、対象が活性に付随する状態に感受性を有することを決定すること、合理的薬物設計を用いてアグレカナーゼ活性をもたらす能力を有する薬剤を選択すること、および治療上有効な量の薬剤を対象に投与することが含まれる。
【００２２】
別の態様では、本発明は、アグレカナーゼ−２ポリペプチドおよびリガンドが含まれる結晶ポリペプチド−リガンド複合体を特徴とする。
【００２３】
別の態様では、本発明は、アグレカナーゼ−２ポリペプチドおよび金属キレート化部分を有するペプチド模倣体リガンドが含まれる結晶ポリペプチド−リガンド複合体を特徴とする。
【００２４】
さらに別の態様では、本発明は、アグレカナーゼ−２ポリペプチドおよびリガンドが含まれる結晶が含まれる組成物を特徴とする。
【００２５】
別の態様では、本発明は、複合体の三次元モデルを用いてアグレカナーゼ−２ポリペプチドと結合する薬剤を設計することが含まれる方法を特徴とする。複合体には、リガンドと結合したアグレカナーゼ−２ポリペプチドが含まれる。
【００２６】
さらなる態様では、本発明は、アグレカナーゼ−２ポリペプチドと結合する薬剤を設計する方法を特徴とする。この方法には、アグレカナーゼ−２ポリペプチドの三次元モデルを用いることが含まれる。
【００２７】
別の態様では、本発明は、アグレカナーゼ−２ポリペプチドが含まれる結晶複合体の三次元構造を用いて合理的薬物設計を行うことによって薬剤を選択する方法を特徴とする。薬剤をアグレカナーゼ−２ポリペプチドと接触させ、薬剤がアグレカナーゼ−２ポリペプチドと結合する能力を検出する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、アグレカナーゼ−２ポリペプチドをリガンドと接触させて組成物を形成し、組成物を結晶化させて結晶複合体を形成することが含まれ、リガンドがアグレカナーゼ−２ポリペプチドと結合する方法を特徴とする。結晶複合体は、少なくとも約３．５Åの解像度までＸ線を回折することができる。
【００２９】
別の態様では、本発明は、コンピュータシステムに、リガンドと結合したアグレカナーゼ−２ポリペプチドの構造に関する情報を受け入れることを行わせるための命令を含むソフトウェアシステムが含まれるソフトウェアシステムを特徴とする。命令はさらに、コンピュータシステムに、候補薬剤に関する情報を受け入れ、候補薬剤とアグレカナーゼ−２ポリペプチドとの結合特徴を決定することを行わせる。決定は、リガンドと結合したアグレカナーゼ−２ポリペプチドの構造に関する情報および候補薬剤に関する情報に基づく。
【００３０】
さらなる態様では、本発明は、複数の命令が格納されているコンピュータで読取可能な媒体上に存在するコンピュータプログラムを特徴とする。１つまたは複数のプロセッサによって命令が実行された際、プロセッサは、リガンドと結合したアグレカナーゼ−２ポリペプチドが含まれる複合体の構造に関する情報を受け入れる。プロセッサはさらに、候補薬剤に関する情報を受け入れ、候補薬剤とアグレカナーゼ−２ポリペプチドとの結合特徴を決定する。そのような決定は、アグレカナーゼ−２ポリペプチドの構造に関する情報および候補薬剤に関する情報に基づく。
【００３１】
別の態様では、本発明は、リガンドと結合したアグレカナーゼ−２ポリペプチドが含まれる複合体の構造に関する情報を受け入れることが含まれる方法を特徴とする。この方法にはさらに、アグレカナーゼ−２ポリペプチドと候補薬剤との結合特徴をモデリングすることが含まれる。そのような方法は、ソフトウェアシステムによって実行する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、複数の命令が格納されているコンピュータで読取可能な媒体上に存在するコンピュータプログラムを特徴とする。１つまたは複数のプロセッサによって命令が実行された際、プロセッサは、リガンドと結合したアグレカナーゼ−２ポリペプチドが含まれる複合体の構造に関する情報を受け入れ、アグレカナーゼ−２ポリペプチドと候補薬剤との結合特徴をモデリングする。
【００３３】
別の態様では、本発明は、コンピュータシステムに、リガンドと結合したアグレカナーゼ−２ポリペプチドが含まれる複合体の構造に関する情報を受け入れることを行わせるための命令を含むソフトウェアシステムが含まれるソフトウェアシステムを特徴とする。命令はさらに、コンピュータシステムに、アグレカナーゼ−２ポリペプチドと候補薬剤との結合特徴をモデリングすることを行わせる。
【００３４】
別の態様では、本発明は、対象においてアグレカナーゼ−２活性を調節する方法を特徴とする。この方法には、合理的薬物設計を用いてアグレカナーゼ−２活性を調節する能力を有する薬剤を選択すること、および治療上有効な量の薬剤を対象に投与することが含まれる。
【００３５】
別の態様では、本発明は、アグレカナーゼ−２活性に付随する状態に罹患している対象を治療する方法を特徴とする。この方法には、合理的薬物設計を用いてアグレカナーゼ−２活性に影響を与える能力を有する薬剤を選択すること、および治療上有効な量の薬剤を、そのような薬剤を必要としている対象に投与することが含まれる。
【００３６】
さらに別の態様では、本発明は、アグレカナーゼ−２活性に付随する状態に感受性のある対象に予防的治療を行う方法を特徴とする。この方法には、対象が状態に感受性を有することを決定すること、合理的薬物設計を用いてアグレカナーゼ−２活性をもたらす能力を有する薬剤を選択すること、および治療上有効な量の薬剤を対象に投与することが含まれる。
【００３７】
本発明の他の特徴および利点は、説明、図面および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００３８】
様々な図面中の同様の参照記号は同様の要素を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
一般に、本発明は、アグレカナーゼポリペプチド、アグレカナーゼポリペプチド／リガンド複合体、アグレカナーゼポリペプチドの結晶、アグレカナーゼポリペプチド／リガンド複合体の結晶、ならびに関連する方法およびソフトウェアシステムに関する。理論に束縛されることを望まずに、アグレカナーゼポリペプチドおよび／またはアグレカナーゼポリペプチド／リガンド複合体の結晶構造は、アグレカナーゼポリペプチドと相互作用することができる他のリガンドの設計または同定に有用である可能性があると考えられている。
【００４０】
例として、Ａｇｇ−１およびＡｇｇ−２アグレカナーゼはアグリカンのＧｌｕ３７３とＡｌａ３７４との間を切断することができ、そのような切断から生じるアグリカン断片は、主に骨関節炎および関節傷害に罹患している患者の潤滑液中に見つかっている。したがって、アグレカナーゼ阻害剤の同定がこれらの障害の治療に有用であり得ると考えられている。
【００４１】
例示的なアグレカナーゼポリペプチドは、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドである。図１Ａは、触媒ドメイン（アミノ酸２１４〜４２８）およびディスインテグリン様ドメイン（アミノ酸４３７〜５０９）ならびにポリペプチドをより結晶化されやすくするアミノ酸３６２（Ｇｌｕ３６２Ｇｌｎ）での突然変異が含まれる、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチド（Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２）の断片のアミノ酸配列（配列番号１）である。位置３６２のグルタミンを太字および下線で示す。ポリペプチドのＣ末端に融合させたＦＬＡＧ−タグ（太字で示す）により、精製が容易になった。図１Ｂは、図１Ａに記載の突然変異ＦＬＡＧ−タグ付け断片に対応するヒトＡｇｇ−１ポリペプチドの断片の野生型アミノ酸配列（配列番号２）である。野生型配列には、触媒ドメイン（アミノ酸２１４〜４２８）およびディスインテグリン様ドメイン（アミノ酸４３７〜５０９）が含まれる。位置３６２の野生型グルタマートを太字および下線で示す。図２は、Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２ポリペプチドの構造を例示するリボン図である（カルシウム原子および亜鉛原子も示す）。Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２ポリペプチドの結晶構造の座標を表４で以下に提供する。
【００４２】
別の例示的なアグレカナーゼポリペプチドは、ヒトＡｇｇ−２ポリペプチドである。図３は、触媒ドメイン（アミノ酸２６５〜４７６）、ディスインテグリン様ドメイン（アミノ酸４８６〜５５６）、およびトロンボスポンジン様ドメイン（アミノ酸５５７〜６２８）が含まれる、ヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの断片のアミノ酸配列（配列番号３）である。
【００４３】
例示的なアグレカナーゼポリペプチド／リガンド複合体は、アグレカナーゼ阻害剤（２−［４’−（４−イソブチリル−フェノキシメチル）−ビフェニル−４−スルホニルアミノ］−３−メチル−酪酸）（「化合物１」）と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドである。図４は化合物１の構造を示し、図５は、阻害化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１−Ａ１Ｃ２ポリペプチドの構造を例示するリボン図である。構造へリックスは、「αＡ」から「αＨ」によって同定し、構造シートは、「βＡ」から「βＫ」によって示す。カルシウム原子および亜鉛原子も示す。図６は、Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２／化合物１複合体の触媒ドメインの構造を例示するリボン図である。Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２ポリペプチド中のジスルフィド結合を棒として示す。ヒトＡｇｇ−１ポリペプチド／化合物１複合体の結晶構造の座標を表５で以下に提供する。
【００４４】
別の例示的なアグレカナーゼポリペプチド／リガンド複合体は、メタロプロテイナーゼ阻害剤バチマスタットと結合したヒトＡｇｇ２ポリペプチドである。図７はバチマスタットの構造を示し、図８は、阻害剤バチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチド（配列番号３）の構造を例示するリボン図である。構造へリックスは、「αＡ」から「αＨ」によって同定する。構造シートは、「βＡ」から「βＫ」によって示す。カルシウム原子および亜鉛原子も示す。図９は、Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２／化合物１複合体のディスインテグリン様ドメインの構造を例示するリボン図である。Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２ポリペプチド中のジスルフィド結合を棒として示す。ヒトＡｇｇ−２ポリペプチド／バチマスタット複合体の結晶構造の座標を表６で以下に提供する。
【００４５】
Ａｇｇ−１またはＡｇｇ−２などのアグレカナーゼの構造を決定するために、以下に記載のようにヒトＡｇｇ１−ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドを調製し、結晶化することができる。一般に、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドは所望に応じて調製することができる。たとえば、一部の実施形態では、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドをＤＮＡプラスミドから発現させる。発現は、誘導性プロモーターなどのプロモーターによって駆動することができる。ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｍｙｃ、ＨＡ、ヘキサヒスチジン、Ｓｔｒｅｐ、またはＦＬＡＧタグなどの適切なタグとの融合タンパク質として発現させることができる。タグは、細菌細胞または哺乳動物細胞系などの細胞からのヒトＡｇｇ−１ポリペプチドの単離を容易にすることができる。たとえば、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で発現させてそれから単離することができる。融合タンパク質は、ポリペプチドとタグとの融合部位またはその付近などの、融合タンパク質内に遺伝子操作したプロテアーゼ部位で切断することができる。ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドと化合物１などのリガンドとの複合体を形成することが望ましい場合は、切断および精製に次いでヒトＡｇｇ−１ポリペプチドをリガンドと接触させることができる。たとえば、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドは、精製前（たとえばポリペプチドタグの切断前）に化合物１と混合することができ、または、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドは、精製後に化合物１と混合することができる。一部の実施形態では、化合物１を、精製前、および精製後に再度ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドと混合することができる。
【００４６】
記載した方法は、ヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの発現および精製にも用いることができる。バチマスタットなどのリガンドを、精製前、精製後、または精製前および後の両方で、ヒトＡｇｇ−２ポリペプチドと混合することができる。
【００４７】
ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドは、スペクトルデータ、ＮＭＲデータを収集するため、または結晶を成長せせるために、溶液中に入れることができる。たとえば、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドは、塩（たとえばナトリウム塩）、ポリマー（たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、および／または有機溶媒の存在下で結晶化することができる。結晶は様々な方法、たとえば静置または懸滴蒸気拡散などによって成長させることができる。一般に、結晶化は、約４℃〜約６０℃の温度（たとえば約４℃〜約４５℃、たとえば約４℃、約１５℃、約１８℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３２℃、約３５℃、約３７℃など）で行うことができる。
【００４８】
特定の実施形態では、上述のように、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチド／化合物１複合体もしくはヒトＡｇｇ−２ポリペプチド／バチマスタット複合体のスペクトルデータを収集するため、これら２つの複合体のいずれかのＮＭＲデータを収集するため、またはこれら２つの複合体のいずれかの結晶を成長せせるために、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドおよび化合物１もしくはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドおよびバチマスタットを溶液中で合わせることができる。
【００４９】
一般に、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの結晶は、約３．５Å以下（たとえば、約３．２Å以下、約３．０Å以下、約２．５Å以下、約２．４Å以下、約２．３Å以下、約２．２Å以下、約２．１Å以下、約２．０Å以下、約１．９Å以下、約１．８Å以下、約１．７Å以下、約１．６Å以下、約１．５Å以下、または約１．４Å以下）の解像度までＸ線を回折することができる。一部の実施形態では、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの結晶は、約１．７Å〜約３．０Åの解像度までＸ線を回折することができる（たとえば、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドの結晶は約２．０〜約２．８ÅまでＸ線を回折することができる）。
【００５０】
一般に、化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはバチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの結晶は、約３．５Å以下（たとえば、約３．２Å以下、約３．０Å以下、約２．５Å以下、約２．４Å以下、約２．３Å以下、約２．２Å以下、約２．１Å以下、約２．０Å以下、約１．９Å以下、約１．８Å以下、約１．７Å以下、約１．６Å以下、約１．５Å以下、または約１．４Å以下）の解像度までＸ線を回折することができる。一部の実施形態では、化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはバチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの結晶は、約１．７Å〜約３．０Åの解像度までＸ線を回折することができる（たとえば、化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドの結晶は約２．８ÅまでＸ線を回折することができ、バチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの結晶は約２．９ÅＸ線を回折することができる）。
【００５１】
特定の実施形態では、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドの結晶は空間群Ｐ２１に属し、単位胞パラメータはａ＝１２８．２８Å、ｂ＝８３．６３Å、ｃ＝１５０．１６Å、β＝１１２．４０９°である。他の実施形態では、化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドの結晶は空間群Ｐ２１に属し、単位胞パラメータはａ＝８２．０７Å、ｂ＝８３．９６Å、ｃ＝９８．９５Å、β＝８９．９°である。他の実施形態では、バチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの結晶は空間群Ｐ３１に属し、単位胞パラメータはａ＝９３．６４Å、ｂ＝９３．６４Å、ｃ＝９２．５９Å、γ＝１２０°である。空間群とは、結晶の全体的な対称性をいい、点対称性および空間対称性が含まれる。特定の実施形態では、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドの結晶は、不斉ユニット中に８個のヒトＡｇｇ−１ポリペプチド分子を含むことができ、化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドの結晶は、不斉ユニット中に４個の複合体分子を含むことができ、または、バチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの結晶は、不斉ユニット中に２個の複合体分子を含むことができる。不斉ユニットとは、空間群の対称操作を利用することによって作製することができる結晶構造の最小単位である。結晶は一般に、不斉ユニットに対する空間群の対称操作によって定義されるモチーフ、および結晶格子によるそのモチーフの翻訳からなる。
【００５２】
結晶を説明する構造データは、たとえばＸ線回折によって得ることができる。Ｘ線回折データは、様々な源、Ｘ線波長および検出器によって収集することができる。一部の実施形態では、回転陽極およびシンクロトロン源（たとえば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＬＳ）、カリフォルニア州Ｂｅｒｋｅｌｅｙ；またはＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＰＳ）、イリノイ州Ａｒｇｏｎｎｅ）をＸ線源として用いることができる。特定の実施形態では、回折データを作成するためのＸ線は、約０．５Å〜約１．６Å（たとえば、約０．７Å、約０．９Å、約１．０Å、約１．１Å、約１．３Å、約１．４Å、約１．５Å、または約１．６Å）の波長を有することができる。一部の実施形態では、領域検出器および／または電荷結合素子（ＣＣＤ）を検出器として用いることができる。
【００５３】
ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの結晶、または化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはバチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの複合体のＸ線回折データを用いて、複合体中の原子の構造座標を得ることができる。構造座標は、三次元空間中の原子の位置を複合体中の他の原子と相対的に説明するデカルト座標である。たとえば、表４に記載の構造座標は、結晶ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドの構造座標である。表５および６に記載の構造座標は、それぞれ化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドおよびバチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの結晶複合体の構造座標である。表４の構造座標は、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドの原子の位置を相互の関係で説明し、表５の構造座標は、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドが化合物１と結合している場合にヒトＡｇｇ−１ポリペプチドの原子の位置を相互の関係で説明している。表５の構造座標も、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチド中の原子の位置を化合物１中の原子と相対的に、および化合物１中の原子の位置を相互の関係で説明している。表６の構造座標は、ヒトＡｇｇ−２ポリペプチドがバチマスタットと結合している場合にヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの原子の位置を相互の関係で、ヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの原子の位置をバチマスタット中の原子と相対的に、およびバチマスタット中の原子の位置を相互の関係で説明している。構造座標は、逆数または整数の加算もしくは減算などの数学的操作によって改変することができる。したがって、構造座標は相対座標である。たとえば、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチド、または化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチド、またはバチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチド中の原子の位置を説明する構造座標は、それぞれ表４、５、および６の実際のｘ、ｙ、およびｚ座標に具体的に限定されない。
【００５４】
ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドの構造座標を用いて、ポリペプチドまたはポリペプチドの断片の表現を導くことができる。さらに、化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはバチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの複合体の構造座標を用いて、複合体、複合体の断片、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはヒトＡｇｇ−２ポリペプチド、またはヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの断片の表現を導くことができる（たとえば、二次元表現または三次元表現）。そのような表現は、たとえば、ポリペプチドの活性部位の可視化、同定および特徴づけを含めたいくつかの応用に有用である可能性がある。特定の実施形態では、三次元表現には、表４または５に従ったヒトＡｇｇ−１ポリペプチドの構造座標±アミノ酸のα炭素原子から約１．５Å以下（たとえば、約１．０Å以下、約０．５Å以下）の標準（ｒｍｓ）偏差が含まれることができる。特定の他の実施形態では、三次元表現には、表６に従ったヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの構造座標が含まれることができる。
【００５５】
ＲＭＳ偏差とは、平均からの偏差の二乗の算術平均の平方根であり、構造座標からの偏差または変動を表す一方法である。アミノ酸の保存的置換（以下の記述参照）により、定まったｒｍｓ偏差内の構造座標を有する分子表現がもたらされる可能性がある。たとえば、保存的アミノ酸置換によって互いに異なる２つのポリペプチドの分子モデルは、約１．５Å未満（たとえば、約１．０Å未満、約０．５Å未満）などの定まったｒｍｓ偏差内の主鎖原子の座標を有することができる。ポリペプチドの主鎖原子には、α炭素（ＣαまたはＣＡ）原子、カルボニル炭素（Ｃ）原子、およびアミド窒素（Ｎ）原子が含まれる。
【００５６】
様々なソフトウェアプログラムにより、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチド、化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはバチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの複合体、またはこれらの複合体の１つの断片の表現を得るための、一組の構造座標のグラフィカル表現が可能となる。一般に、そのような表現は、（相対的および／もしくは絶対的な）構造座標、または特徴間の距離もしくは角度などの構造座標から導かれる情報を正確に反映すべきである。一部の実施形態では、表現は、立体視的な二次元図などの二次元図である。特定の実施形態では、表現は、インタラクティブな立体視的二次元ディスプレイなどのインタラクティブな二次元ディスプレイである。インタラクティブな二次元ディスプレイは、たとえば、回転させてポリペプチド、ポリペプチドの断片、複合体および／または複合体の断片の様々な面を示すことができるコンピュータディスプレイであることができる。一部の実施形態では、表現は三次元表現である。例として、三次元モデルは、分子構造の物理的モデルであることができる（たとえば玉棒模型）。別の例として、三次元表現は、分子構造のグラフィカル表現であることができる（たとえば、コンピュータディスプレイ上に提示する線画または図）。二次元グラフィカル表現（たとえば線画）は、二次元表現が三次元情報を反映する場合は、たとえば、遠近法、陰影、またはビューアからより遠位にある特徴をビューアにより近位にある特徴で遮ることを用いることによって、三次元表現に対応することができる。一部の実施形態では、表現を複数のレベルでモデリングすることができる。例として、三次元表現に、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはヒトＡｇｇ−２ポリペプチド、または化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはバチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの複合体等の複合体ポリペプチドが含まれる場合、ポリペプチドを１つまたは複数の構造レベル、たとえば一次（アミノ酸配列）、二次（たとえば、αへリックスおよびβシート）、三次（全体的な折り畳み）、および四次（オリゴマー化状態）構造などで表現することができる。表現には、様々なレベルの詳細が含まれることができる。たとえば、表現には、原子の位置を特定せずにタンパク質の二次構造的特徴の相対位置が含まれることができる。より詳細な表現には、たとえば、原子の位置が含まれることができる。
【００５７】
一部の実施形態では、表現には、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチド、化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはバチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの複合体中の原子の構造座標に加えた情報が含まれることができる。たとえば、表現は、溶媒が接近可能な表面の形状、モデルの原子のファンデルワールス半径、および溶媒（たとえば水）のファンデルワールス半径に関する情報を提供することができる。表現から導くことができる他の特徴には、たとえば、静電電位、大分子構造内の空隙またはポケットの位置、ならびに水素結合および塩橋の位置が含まれる。
【００５８】
ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドと相互作用する（たとえば結合する）薬剤は、いずれかのポリペプチドもしくはいずれかのポリペプチドの断片、または化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはバチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの複合体、またはこれらの複合体のいずれかの断片の表現を用いることが含まれる方法によって、同定または設計することができる。例示的な表現の種類には、上述した表現が含まれる。一部の実施形態では、表現は、類似体ポリペプチド、ポリペプチド断片、複合体または複合体の断片の表現であることができる。表現と相互作用する候補薬剤は、候補薬剤と表現とのコンピュータ適合解析を行うことによって、設計または同定することができる。一般に、薬剤は分子である。薬剤の例には、ポリペプチド、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡを含む）、ステロイドおよび非ステロイド性有機化合物が含まれる。ポリペプチド（たとえば、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチド）と相互作用する薬剤は、ポリペプチドと一過的にまたは安定して相互作用することができる。相互作用は、たとえば、水素結合、静電気力、疎水性相互作用、およびファンデルワールス相互作用を含めた本明細書中に記載した任意の力によって媒介されることができる。
【００５９】
上述のように、Ｘ線結晶構造解析を用いて、化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはバチスマタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの複合体の構造座標を得ることができる。しかし、そのような構造座標は、ＮＭＲ技術を含めた他の技術を用いても得ることができる。さらなる構造的情報は、スペクトル技術（たとえば、旋光分散（ＯＲＤ）、円二色性（ＣＤ））、相同性モデリング、および計算方法（たとえば、分子力学からのデータが含まれることができる計算方法、動力学アッセイからのデータが含まれることができる計算方法）から得ることができる。
【００６０】
一部の実施形態では、Ｘ線回折データを用いて、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチド、化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはバチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの複合体、またはポリペプチドの断片もしくは複合体の断片の電子密度図を構築することができ、電子密度図を用いて、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチド、化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチド、もしくはバチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチド、またはポリペプチドもしくはいずれかの複合体の断片の表現を導くことができる（たとえば、二次元表現、三次元表現）。電子密度図の作成は、典型的には、Ｘ線散乱の位相に関する情報の使用を含む。位相の情報は、たとえば、回折データまたは電子密度図の構築を完了するための補足回折実験のいずれかから抽出することができる。Ｘ線回折データから位相を計算する方法には、たとえば、多波長異常分散（ＭＡＤ）、多重同形置換（ＭＩＲ）、異常分散を伴う多重同形置換（ＭＩＲＡＳ）、異常分散を伴う単一同形置換（ＳＩＲＡＳ）、逆格子空間溶媒平坦化、分子置換、またはその任意の組合せが含まれる。これらの方法では、重原子を含めることまたは既に存在する重原子の散乱強度を変化させることなどによって、ネイティブタンパク質に同形の構造的改変を行うことで位相情報を生成し、その後、ネイティブタンパク質および改変した事例のそれぞれの回折振幅を測定する。追加の重原子の位置またはその散乱強度の変化が知られている場合は、一組の同時位相方程式を解くことによってそれぞれの回折Ｘ線の位相を決定することができる。重原子部位の位置は、ＳＨＥＬＸＳ（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ａｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍｉｅ、ドイツＧｏｔｔｉｎｇｅｎ）などのコンピュータプログラムを用いて同定することができ、回折データは、ＭＯＳＦＬＭ、ＳＣＡＬＡ、ＳＯＬＯＭＯＮ、およびＳＨＡＲＰ（「Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ」、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、セクションＤ、５４：９０５〜９２１、１９９７年；ｄｅＬａ  ＦｏｒｔｅｌｌｅおよびＢｒｉｇｏｇｎｅ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．、２７６：４７２〜４９４、１９９７年）などのコンピュータプログラムを用いて処理することができる。化合物１と結合した結晶ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドのＸ線散乱の位相は、たとえば、ＭＡＤによって、セレノメチオニンで置換したタンパク質の結晶を用いて決定することができる。セレノメチオニンで置換したタンパク質を作製するために、ヒトＡｇｇ−１核酸を発現する哺乳動物細胞をセレノメチオニンの存在下で培養することができる。セレノメチオニンで置換したタンパク質を精製し、化合物１と接触させ、複合体を懸滴技術などの標準方法によって結晶化させる。その後、それぞれ化合物１と複合体形成したネイティブタンパク質およびセレノメチオニンで置換したタンパク質の結晶からＭＡＤによって得られた位相を用いて、複合体の電子密度図を作成することができる。
【００６１】
ポリペプチドまたは複合体（たとえば、リガンドと結合したポリペプチドを含む複合体）の三次元モデルと電子密度図とのアラインメントを行うことによって、電子密度図を用いて、ポリペプチド、複合体、またはポリペプチドもしくは複合体の断片の表現を導くことができる。たとえば、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドに対応する電子密度図と同形置換方法によって導いたヒトＡｇｇ−１ポリペプチド／化合物１複合体に対応する電子密度図とのアラインメントを行うことができる。ヒトＡｇｇ−２ポリペプチド／バチマスタット複合体と、化合物１と複合体形成したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドに対応する電子密度図とのアラインメントを行うことができる。
【００６２】
アラインメントプロセスにより、計算した電子密度図が以前に知られているポリペプチドまたは以前に知られている複合体のモデルから異なっている度合を示す比較モデルがもたらされる。その後、比較モデルを１回または複数回のサイクル（たとえば、２回のサイクル、３回のサイクル、４回のサイクル、５回のサイクル、６回のサイクル、７回のサイクル、８回のサイクル、９回のサイクル、１０回のサイクル）にわたって精密化して、電子密度図とのより良好なフィッティングを生成する。ＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒ他、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、Ｄ５４：９０５〜９２１、１９９８年）などのソフトウェアプログラムを用いてモデルの精密化を行うことができる。比較モデルにおけるフィッティングの品質は、たとえば、ＲｗｏｒｋまたはＲｆｒｅｅ値によって測定することができる。より小さなＲｗｏｒｋまたはＲｆｒｅｅの値は、一般により良好なフィッティングを示す。比較モデルにおけるミスアラインメントを調節して、改良された比較モデルおよびより低いＲｗｏｒｋまたはＲｆｒｅｅ値を提供することができる。調節は、必要に応じて、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチド、ヒトＡｇｇ−２ポリペプチド、化合物１、バチマスタット、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチド／化合物１複合体またはヒトＡｇｇ−２ポリペプチド／バチマスタット複合体に関する情報（たとえば配列情報）に基づくことができる。例として、化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドなどのリガンドと結合したポリペプチドの以前に知られている複合体のモデルを用いる実施形態では、調節には、複合体の化合物１をバチマスタットなどの異なるリガンドで置き換えることが含まれることができる。別の例として、特定の実施形態では、調節には、以前に知られているポリペプチド（たとえばヒトＡｇｇ−１ポリペプチド）中のアミノ酸を、ヒトＡｇｇ−２ポリペプチドなどの異なるアグレカナーゼの対応する部位中のアミノ酸で置き換えることが含まれることができる。改変した比較モデルへの調節が電子密度図に対する最良のフィッティングを満たす場合、生じるモデルはＸ線データが導かれたポリペプチドまたは複合体を説明すると決定されるものである。そのようなプロセスの方法は、たとえば、ＣａｒｔｅｒおよびＳｗｅｅｔ編、「Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第２７７巻、パートＢ、ニューヨーク：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年、およびそれ中の文献、たとえば、ＪｏｎｅｓおよびＫｊｅｌｄｇａａｒｄ、「Ｅｌｅｃｔｒｏｎ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｍａｐ  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ」、１７３ページ、ならびにＫｌｅｙｗｅｇｔおよびＪｏｎｅｓ、「Ｍｏｄｅｌ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、２０８ページに記載されている。
【００６３】
上述したのは、以前に知られているポリペプチドまたは以前に知られている複合体の三次元モデルとポリペプチドまたは複合体の結晶に対応する新しく計算した電子密度図とのアラインメントを行うことによって、複合体の表現を導く方法である。このモデリングプロセスで用いることができる一調節には、以前に知られている複合体の表現中の化合物を化合物１またはバチマスタットで置き換えることが含まれることができる。
【００６４】
コンピュータなどの機械は、メモリ内に、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチド、または化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはバチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの複合体の構造座標を、機械に接続したディスプレイ上に構造座標のグラフィカル表現を作成することができるプログラムと共にプログラミングすることができる。あるいは、またはそれに加えて、ソフトウェアシステムは、構造座標を受け入れて格納するように設計および／または利用することができる。ソフトウェアシステムは、構造座標のグラフィカル表現を作成できる可能性がある。ソフトウェアシステムはまた、化合物１もしくはバチマスタットと類似の構造的特徴を有する化合物を同定するため、および／または候補薬剤がヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドと相互作用する可能性を与え得る特徴を有する１つもしくは複数の候補薬剤を同定するために、外部データベースにアクセスできる可能性もある。
【００６５】
構造データを含むメモリを有する機械またはそのようなデータを含むソフトウェアシステムは、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドアゴニスト、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドアンタゴニスト、ヒトＡｇｇ−２ポリペプチドアゴニスト、またはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドアンタゴニストの合理的な設計または選択を補助することができる。たとえば、そのような機械またはソフトウェアシステムは、薬剤が化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはバチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの複合体と会合する能力の評価を補助することができるか、または、構造的もしくは配列相同性によってヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドに関連する化合物もしくはタンパク質のモデリングを補助することができる。本明細書中で使用するアゴニストとは、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの少なくとも１つの活性を増強する化合物をいう。アンタゴニストとは、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの少なくとも１つの活性を阻害または相殺する化合物をいう。たとえば、化合物１またはバチマスタットなどの化合物は、たとえば、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドによるアグリカン切断率を低下させることによって、または、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドとアグリカンとの相互作用を阻害することでアグリカン切断を阻害することによって、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドのアンタゴニストとして機能し得る。
【００６６】
機械は、化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはバチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの複合体またはいずれかの複合体の断片の表現（たとえば、二次元表現、三次元表現）を作成することができる。たとえば、ソフトウェアシステムは、機械にそのような情報を生成することを行わせることができる。機械には、機械で読取可能なデータをコード化したデータ記憶物質を含めた機械で読取可能なデータ記憶媒体が含まれることができる。機械で読取可能なデータには、化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはバチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの複合体またはいずれかの複合体の断片の原子の構造座標が含まれることができる。機械で読取可能な記憶媒体（たとえばデータ記憶材料）には、たとえば、慣用のコンピュータハードドライブ、フロッピーディスク(登録商標)、ＤＡＴテープ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ならびに機械（たとえばコンピュータ）での使用に適合し得る他の磁気、光磁気、光、および他の媒体が含まれる。機械はまた、機械で読取可能なデータを処理するための命令を記憶するための作動メモリ、ならびに機械で読取可能なデータを所望の三次元表現へと処理する目的のための作動メモリおよび機械で読取可能なデータ記憶媒体に結合された中央処理装置（ＣＰＵ）も有することができる。ユーザに三次元表現が見えるように、ディスプレイをＣＰＵに接続することができる。したがって、データを使用するための命令をプログラミングした機械（たとえば、本明細書中に記載した種類の１つまたは複数のプログラムがロードされたコンピュータ）と用いた場合、この機械は、本明細書中に記載の任意のポリペプチド、ポリペプチド断片、複合体、または複合体断片のグラフィカル表現（たとえば、二次元グラフィカル表現、三次元グラフィカル表現）を表現することができる。
【００６７】
ディスプレイ（たとえばコンピュータディスプレイ）は、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはヒトＡｇｇ−２ポリペプチド、または化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドの複合体もしくはバチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの複合体、またはヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの断片またはいずれかの複合体の断片の表現を示すことができる。ユーザは表現を検査し、表現から得た情報を用いて、リガンドと結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはポリペプチド断片、または化合物１もしくはバチマスタット以外の薬剤が含まれるその複合体もしくは断片のモデルを作成することができる。モデルは、たとえば、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチド、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチド／化合物１複合体またはヒトＡｇｇ−２ポリペプチド／バチマスタット複合体の以前から存在する表現を改変することによって作成することができる。所望により、ユーザは、薬剤の三次元モデルを、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチド、または化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはバチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの表現上に重ね合わせることができる。薬剤は、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドのアゴニスト（たとえば候補アゴニスト）、またはヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドのアンタゴニスト（たとえば候補アンタゴニスト）であることができる。一部の実施形態では、薬剤は、既知の化合物または既知の化合物の断片であることができる。特定の実施形態では、薬剤は、以前に知られていない化合物、または以前に知られていない化合物の断片であることができる。
【００６８】
薬剤が、活性部位の形状を補完する形状を有することが望ましい可能性がある。薬剤の原子とヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの原子との間に好ましい距離、または距離の範囲がある可能性がある。好ましい距離よりも長い距離は、薬剤と活性部位（たとえば、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの活性部位）との間の弱い相互作用に関連し得る。好ましい距離よりも短い距離は、薬剤とポリペプチドとの間の相互作用を弱めることができる反発力に関連し得る。原子間の距離が短すぎる場合、立体衝突が起こる可能性がある。立体衝突は、２つの原子の位置が不合理に近い場合、たとえば、２つの原子がそのファンデルワールス半径の和よりも短い距離によって離れている場合に起こる。立体衝突が存在する場合、ユーザは、立体衝突が取り除かれるまでヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドに対する薬剤の位置を調節することができる（たとえば、剛体翻訳または薬剤の回転）。ユーザは、立体衝突を取り除くために、薬剤または薬剤近傍のヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドのコンホメーションを調節することができる。立体衝突はまた、薬剤の構造を改変することによって、たとえば、芳香環などの「嵩のある基」をメチルもしくはヒドロキシル基などのより小さな基に改変することによって、または、硬い基を、立体衝突を生じないコンホメーションを収容することができる柔軟な基に改変することによって、取り除くこともできる。静電気力も、薬剤とリガンド結合ドメインとの相互作用に影響を与えることができる。たとえば、静電気特性は、薬剤とヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドとの相互作用を弱めることができる反発力に関連している可能性がある。静電気反発は、薬剤の電荷を改変することによって、たとえば、陽性の基を中性の基で置き換えることによって、取り除くことができる。
【００６９】
それぞれ化合物１またはバチマスタットとヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドとの間の結合強度に影響を与える力は、ポリペプチド／薬剤モデルで評価することができる。これらには、たとえば、水素結合、静電気力、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、双極子相互作用、π−スタッキング力、および陽イオン−π相互作用が含まれることができる。ユーザは、これらの力を、たとえば水素結合に適した距離および角度で配置された水素結合のドナー／アクセプター対を注記することによって、視覚的に評価することができる。評価に基づいて、ユーザは、モデルを改変して、より好都合なヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドと薬剤との相互作用を見出すことができる。モデルの改変には、たとえばアミノ酸側鎖のコンホメーションまたは主鎖二面角を改変することによって、ポリペプチドの化学構造を改変せずにその三次元構造を変化させることが含まれることができる。モデルの改変には、上述のように、薬剤の位置またはコンホメーションを改変することが含まれることができる。モデルの改変にはまた、たとえば基を置換、付加、または除去することによって、薬剤の化学構造を改変することが含まれることもできる。たとえば、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチド上の水素結合のドナーが薬剤上の水素結合のドナーの近辺に位置する場合は、ユーザは、薬剤上の水素結合のドナーを水素結合のアクセプターで置き換えることができる。
【００７０】
薬剤およびヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの相対位置、またはそのコンホメーションは、特定の薬剤とヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドとの最適化された結合幾何学を見出すために調節することができる。最適化された結合幾何学は、たとえば、好都合な水素結合の距離および角度、最大の静電気引力、最小限の静電気反発、疎水性部分の水性環境からの隔離、および立体衝突が存在しないことによって特徴づけられる。最適化された幾何学は、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチド／薬剤複合体またはヒトＡｇｇ−２ポリペプチド／薬剤複合体に関して可能な幾何学ファミリーの中で最も低い計算されたエネルギーを有することができる。最適化された幾何学は、たとえば、分子力学または分子動力学の計算によって決定することができる。
【００７１】
異なる薬剤が結合した、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチド、または化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドの複合体、またはバチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの複合体の一連の表現を作成することができる。それぞれの表現についてスコアを計算することができる。スコアは、たとえば、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドと薬剤との相互作用の予測される強度を説明することができる。スコアは、結合強度に影響を与える上述の要素の１つを反映することができる。スコアは、複数の要素を反映する総スコアであることができる。様々な薬剤をそのスコアに応じて順位付けすることができる。
【００７２】
薬剤の設計におけるステップは、機械による自動の様式で実施することができる。たとえば、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの表現を、候補薬剤の表現と共に機械にプログラミングすることができる。機械は、候補薬剤のそれぞれについて活性部位に対する最適化された結合幾何学を見出し、一連の薬剤のうちのどれがヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドと最も強く相互作用する可能性が高いかを決定するためのスコアを計算することができる。
【００７３】
これらのステップを容易にするために、ソフトウェアシステムを設計および／または実行することができる。表現を作成するまたはフィッティング解析を行うために用いるソフトウェアシステム（たとえばコンピュータプログラム）には、たとえば、Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）のＭＣＳＳ、Ｌｕｄｉ、ＱＵＡＮＴＡ、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ、Ｃｅｒｉｕｓ２、ＣＨＡＲＭｍ、およびＭｏｄｅｌｅｒ；ＴＲＩＰＯＳ，Ｉｎｃ．（モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）のＳＹＢＹＬ、Ｕｎｉｔｙ、ＦｌｅＸＸ、およびＬＥＡＰＦＲＯＧ；ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）；ＧＲＩＤ（オックスフォード大学、英国Ｏｘｆｏｒｄ）；ＤＯＣＫ（カリフォルニア大学、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｆｒａｎｓｉｃｓｏ）；ならびにＦｌｏ＋およびＦｌｏ９９（Ｔｈｉｓｔｌｅｓｏｆｔ、ニュージャージー州Ｍｏｒｒｉｓ  Ｔｏｗｎｓｈｉｐ）が含まれる。他の有用なプログラムには、Ｏｐｅｎｅｙｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ニューメキシコ州Ｓａｎｔａ  Ｆｅ）のＲＯＣＳ、ＺＡＰ、ＦＲＥＤ、Ｖｉｄａ、およびＳｚｙｂｋｉ；Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ（オレゴン州Ｐｏｒｔｌａｎｄ）のＭａｅｓｔｒｏ、Ｍａｃｒｏｍｏｄｅｌ、およびＧｌｉｄｅ；ＭＯＥ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、ケベック州Ｍｏｎｔｒｅａｌ）、Ａｌｌｅｇｒｏｗ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ、マサチューセッツ州Ｂｏｓｔｏｎ）、ＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒ他、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌ．、セクションＤ、５４：９０５〜９２１、１９９７年）ならびにＧＯＬＤ（Ｊｏｎｅｓ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４５：４３〜５３、１９９５年）が含まれる。また、構造座標を用いて、ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ、ＲＡＳＴＥＲ３Ｄ、またはＰＹＭＯＬ（Ｋｒａｕｌｉｓ、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、２４：９４６〜９５０、１９９１年；ＢａｃｏｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．、６：２１９〜２２０、１９９８年；ＤｅＬａｎｏ、Ｔｈｅ  ＰＹＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（２００２年）ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ）を用いて、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチド、または化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはバチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの複合体の三次元構造を可視化することもできる。
【００７４】
薬剤は、たとえば、適切なデータベースをスクリーニングすることによって選択するか、適切なソフトウェアシステムを用いてヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの立体配置および電荷電位を解析することによって新規に設計するか、ならびに／または他のアグレカナーゼ酵素もしくは他のメタロプロテイナーゼの既知のリガンドの特徴を用いて設計することができる。この方法を用いて、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを設計または選択することができる。データベース検索、ならびに／または薬剤の選択および設計を容易にするために、ソフトウェアシステムを設計および／または実行することができる。
【００７５】
薬剤を設計または同定した後、これを入手または合成して、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチド活性に対するその効果についてさらに評価することができる。たとえば、薬剤は、それをヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドと接触させ、ポリペプチド活性に対する薬剤の効果を測定することによって評価することができる。薬剤を評価する方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行う活性アッセイが含まれることができる。たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う活性アッセイは蛍光に基づいたアッセイであることができる。薬剤は、Ａｂｚ−ＴＥＧＡＲＧＳＶＩ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）（Ａｂｚ：ｏ−アミノベンゾイル；Ｄｎｐ：２，４ジニトロフェニル）（Ａｎａｓｐｅｃ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）などの蛍光ペプチド基質の切断を阻害するその能力によって評価することができる。ペプチド配列ＴＥＧＡＲＧＳＶＩは、骨関節炎におけるアグリカンのＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４切断部位のアミノ酸配列に基づいている。候補化合物を精製ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドと共に１０分間プレインキュベーションを行うことができ、その後、ペプチド基質を、２５℃〜３７℃の範囲の温度、典型的には３０℃で、この組合せに加えることができる。Ｇｌｕ−Ａｌａ結合の切断により、内部消光からのフルオロフォアが放出される。この結果、４０分間にわたってλｅｘ３４０ｎｍおよびλｅｘ４２０ｎｍで監視される蛍光の増加がもたらされる。基質のそれぞれの濃度における初期速度（ｖ）を以下の方程式に当てはめる：
Ｖ＝Ｖｍａｘ・Ｓｈ／（Ｓ０．５）ｈ＋Ｓｈ）
［式中、ｈはヒル定数であり、Ｓ０．５はＶｍａｘの半分での基質濃度である］。阻害剤の存在下で残存する％活性を阻害剤濃度の関数としてプロットし、ＩＣ５０値はデータを以下の方程式に当てはめることによって決定する：
％活性＝１００ＩＣ５０／（Ｉｏ＋ＩＣ５０）
［式中、Ｉｏは阻害剤の初期濃度である］。
【００７６】
活性アッセイは、細胞に基づいたアッセイなどのｉｎ  ｖｉｖｏアッセイであることができる。細胞に基づいたアッセイには、アグリカン切断に対する候補薬剤の効果を監視することが含まれることができる。阻害剤のそのようなアッセイは、阻害剤をヒトＡｇｇ−１ポリペプチドおよびアグリカンを発現する細胞と接触させること、その後、アグレカナーゼ感受性部位での切断によって生じたアグリカン断片を検出および測定することなどによって、アグリカン切断を測定することを含み得る。アグリカン断片は、免疫組織化学的分析方法などの標準のタンパク質検出技術によって検出することができる。
【００７７】
ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドに対する薬剤の作用に応じて、薬剤は、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチド活性またはヒトＡｇｇ−２ポリペプチド活性のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして作用することができる。たとえば、アゴニストは、アグリカン切断率を増加させるか、またはヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドとアグリカンとの結合親和性を増加させ得る。逆に、アンタゴニストは、アグリカン切断率を低下させるか、またはヒトＡｇｇ−１ポリペプチドもしくはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドとアグリカンとの結合親和性を低下させ得る。薬剤がヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドとアグリカン基質との結合を阻害するかどうかを決定するために、薬剤をアグリカン基質の存在下でヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドと接触させることができる。同定した薬剤と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドを含む結晶を成長させ、構造をＸ線結晶構造解析によって決定することができる。第１の薬剤とヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドとの相互作用に基づいて、第２の薬剤を設計または同定することができる。
【００７８】
様々な分子解析および合理的薬物設計技術は、たとえば、米国特許第５，８３４，２２８号、第５，９３９，５２８号および第５，８５６，１１６号、ならびに国際公開公報ＷＯ９９／０９１４８号として公開されているＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６８７９号にさらに開示されている。
【００７９】
特定の実施形態について記載したが、他の実施形態も企図される。
【００８０】
例として、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチド、化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチド、およびバチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドを含む実施形態について記載したが、本明細書中の説明はより一般的に任意のアグレカナーゼポリペプチドおよび任意のリガンドに向けられている。
【００８１】
アグレカナーゼポリペプチドは、アグレカナーゼポリペプチドの任意のアイソフォームの完全長アミノ酸配列を含めた、完全長の成熟ポリペプチドであることができる。アイソフォームとは、その一次構造が異なるタンパク質のいくつかの複数の形態のうちの、任意のものである。
【００８２】
アグレカナーゼポリペプチドは、プロペプチドドメイン、触媒ドメイン、ディスインテグリン様ドメイン、トロンボスポンジン１型ドメイン、システインに富んだドメイン、スペーサードメイン、またはその組合せなどの、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドの断片またはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの断片であることができる。
【００８３】
アグレカナーゼポリペプチドは活性部位を有することができる。たとえば、触媒ドメインとは、アグレカナーゼの活性部位である。一般に、活性部位には、リガンド結合部位、またはリン酸化、グリコシル化、アルキル化、アシル化、もしくは他の共有結合修飾の部位が含まれることができる。リガンド結合部位は、アグリカン結合部位またはアゴニストもしくはアンタゴニストの結合部位であることができる。活性部位には、コンドロイチン硫酸およびケラチン硫酸などの硫酸化グリコサミノグリカンの付着部位、またはフューリン切断部位などのプロテアーゼ切断部位が含まれることができる。活性部位は、ヘパリンまたはインテグリンなどの細胞外基質の構成成分と相互作用することができる。リガンド結合部位には、リガンドとの相互作用の際に活性に影響を与え得る、実際の結合部位に隣接するまたは近位の補助結合部位が含まれることができる。ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドの活性部位には、配列番号１または配列番号２のアミノ酸が含まれることができる（それぞれ図１Ａまたは図１Ｂ）。たとえば、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドの活性部位には、配列番号１および配列番号２のアミノ酸の位置によって定義されるアミノ酸Ｌｅｕ３３０、Ｇｌｙ３３１、Ａｌａ３３３、Ｈｉｓ３６１、Ｐｈｅ３５７、およびＡｌａ２４８のうちの１つまたは複数が含まれることができる。ヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの活性部位には、配列番号３のアミノ酸が含まれることができる（図３）。たとえば、ヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの活性部位には、配列番号３のアミノ酸の位置によって定義されるアミノ酸Ｇｌｕ４１１、Ａｓｐ３７７、Ｌｅｕ３７９、Ｓｅｒ４４１、およびＬｅｕ４４３のうちの１つまたは複数が含まれることができる（図３）。
【００８４】
ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、本明細書中に記載のものと異なる場合があり、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの配列は同じ三次元構造をもたらす特定の保存的アミノ酸置換を含み得る。たとえば、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドの番号付けは、図１Ａまたは図１Ｂに記載のものと異なる場合があり、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドの配列は保存的アミノ酸置換を含み得るが、表４および５の座標によって定義され、図２、５、６、１０、および１１に例示したものと同じ構造をもたらす。ヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの番号付けは、図３に記載のものと異なる場合があり、ヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの配列は保存的アミノ酸置換を含み得るが、表６の座標によって定義され、図８に例示したものと同じ構造をもたらす。他のアイソフォームまたは類似体中の対応するアミノ酸および保存的置換は、関連するアミノ酸配列の目視検査によって、または市販の相同性ソフトウェアプログラム（たとえば、ＭＯＤＥＬＬＡＲ、ＭＳＩ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を用いることによって、容易に同定される。
【００８５】
類似体とは、保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドである。保存的置換には、１つのアミノ酸を、類似の極性、立体配置を有する、または同じクラス（たとえば、疎水性、酸性もしくは塩基性）の別のアミノ酸に切り替えることが含まれることができ、ポリペプチドと相互作用する薬剤の同定および設計、ならびに分子置換分析および／または相同性モデリングに関して、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドまたはヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの三次元構造に対して重要でない効果を有する置換が含まれる。
【００８６】
Ａｇｇ−１ポリペプチドおよびＡｇｇ−２ポリペプチドなどのアグレカナーゼポリペプチドは、非哺乳動物または哺乳動物種に由来することができる。哺乳動物アグレカナーゼポリペプチドは、たとえばヒトに由来することができる。例示的な非ヒト哺乳動物には、非ヒト霊長類（サルまたは類人猿）、マウス、ラット、ヤギ、雌ウシ、雄ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イノシシ、ラッコ、ネコ、およびイヌが含まれる。例示的な非哺乳動物種には、ニワトリ、シチメンチョウ、エビ、ワニ、および魚類が含まれる。
【００８７】
薬剤は、たとえば、化学物質（たとえば、ポリペプチド、核酸、ペプチド模倣体）であることができる。ペプチド模倣体とは、タンパク質および核酸などの特定の生理的分子を認識するペプチドの能力を模倣することができる化学物質である。一部の例では、ペプチド模倣体には、天然の親ペプチドの生物学的作用（または複数の作用）を模倣または拮抗する能力を有する、非ペプチド構造要素が含まれる。たとえば、容易に切断できるペプチド結合を、１つまたは複数の容易に切断できないジペプチドアイソスターで置き換えることができる。
【００８８】
一般に、Ａｇｇ−１ポリペプチドと相互作用する薬剤はＡｇｇ−２ポリペプチドとも相互作用し得、Ａｇｇ−２ポリペプチドと相互作用する薬剤はＡｇｇ−１ポリペプチドとも相互作用し得る。たとえば、本明細書中に記載の組成物および方法は、化合物１がＡｇｇ−２ポリペプチドと結合している場合、およびバチマスタットがＡｇｇ−１ポリペプチドと結合している場合の使用に適している。
【００８９】
化合物１またはバチマスタットがリガンドである実施形態について記載したが、より一般的に他の化合物もリガンドとして用い得る。
【００９０】
例として、結晶複合体の構造から導いた化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１ポリペプチドの表現に基づいて、かつ理論に束縛されることを望まずに、活性部位中のＺｎ原子が化合物１のカルボキシラート酸素原子の一方と約２．１Åの距離でキレート化し（図１２参照）、また、他方のカルボキシラート酸素がＡｌａ３３３の主鎖原子との水媒介の水素結合に関与すると考えられている。しかし、この水媒介の相互作用はタンパク質の突然変異形態中にのみ存在するとも考えられている。さらに、カルボキシラートＭＭＰ阻害剤は一般に、プロトン化されている場合に、活性部位Ｇｌｕ（Ｇｌｕ３６２）のカルボキシラートと直接水素結合を形成することができるのでより好都合に結合すると考えられており、これは突然変異体結晶タンパク質中ではＧｌｎで置き換えられている（図１Ａおよび１Ｂを比較されたい）。突然変異体結晶タンパク質では、一次アミドでカルボキシラートが置き換えられており（Ｇｌｕ→Ｇｌｎの突然変異によって）、したがって、水媒介の水素結合を行うことができないと考えられている。したがって、化合物１の第２の酸素がタンパク質の部分と自由に相互作用すると考えられている。化合物１とヒトＡｇｇ−１ポリペプチドとの相互作用の第２の領域が、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチド内の亜鉛原子付近の水素結合のアクセプターの部位にあると考えられている。また、化合物１のスルホンアミドの酸素原子の１つが、Ｌｅｕ３３０およびＧｌｙ３３１の両方の主鎖ＮＨとの、それぞれ２．７Åおよび３．１Åの距離での相互作用を介して、この領域を占有するとも考えられている。さらに、約１５Åにわたる活性部位のＳ１’ポケットが、化合物１の置換ビフェニル部分によって満たされていると考えられている。さらに、Ｓ１’ポケット内で、ビフェニル部分とＡｇｇ−１活性部位のＨｉｓ３６１と間に好都合なπスタッキング相互作用が存在すると考えられている（約３．７Åの隔離）。ビフェニル上の置換されたフェニル部分とＰｈｅ３５７との間でさらなる好都合なπ相互作用が起こると考えられている。また、フェニル部分上の置換基であるカルボニル部分がαＢの主鎖原子と水媒介の（２．５Å）水素結合を形成するとも考えられている。
【００９１】
この情報に基づいて、かつ理論に束縛されることを望まずに、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドと１つまたは複数の類似の相互作用を有することができる他の化合物も、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドのリガンドとして作用する能力を有し得ると考えられる。そのような化合物は、以下の構造を有し得る：
【００９２】
【化１】
2009508474.tif 000003
［式中、それぞれのＡおよびＢは環（たとえば、シクリル環、ヘテロシクリル環、アリール環、またはヘテロアリール環）を表し、それぞれのＬ、Ｍ、およびＹはリンカー部分であり、それぞれのＲ１、Ｒ２、およびＲ３は置換基であり、Ｘは水素結合のアクセプターであり、Ｚは金属キレート化部分である］。
【００９３】
一般に、それぞれのＡおよびＢは、独立して、少なくとも５個の原子（たとえば、５個の原子、６個の原子、７個の原子、８個の原子、９個の原子、１０個の原子、１１個の原子、１２個の原子、１３個の原子、１４個の原子）から形成される。１個または複数個の原子（たとえば、１個の原子、２個の原子、３個の原子、４個の原子）は、独立して、異種原子（たとえば、Ｎ、Ｓ、Ｏ）であることができる。たとえば、一部の実施形態では、それぞれのＡおよびＢは、独立して、アリールまたはヘテロアリール部分である。そのようなアリールおよびヘテロアリール部分の例には、フェニル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジル、チオフェニル、フラニル、およびピロリルが含まれる。
【００９４】
一部の実施形態では、それぞれのＬおよびＭは、単結合、たとえば、ＡとＢとの直接の付着を提供することができる。特定の実施形態では、それぞれのＬおよびＭは、独立して、スペーサー、たとえば一緒に連結された２つの部分の間の１個または２個の原子のスペーサーを提供することができる。そのようなリンカーの例には、メチレン、エチレン、酸素、硫黄、アミノ、メチレンオキシ、メチレンアミノ、メチレンチオイル、スルホキシド、またはスルホンが含まれる。
【００９５】
Ｙは、一般に、水素結合のアクセプターＸを金属キレート剤Ｚと連結する部分である。一部の実施形態では、Ｙはリンカーである。リンカーの例には、分枝側鎖（たとえばイソプロピル側鎖）を有するアルキルリンカーなどのアルキルリンカーが含まれる。リンカーのさらなる例には、アルキレンリンカー（たとえば、メチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、またはイソブチレン）、酸素、硫黄、アミノリンカー、メチレンオキシ、メチレンアミノ、メチレンチオイル、スルホキシドおよびスルホンが含まれる。一部の実施形態では、Ｙは単結合である。
【００９６】
Ｒ１は、一般に、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチドのＳ１’ポケット内に伸長することができるＡ環上の部分である（たとえば図１２参照）。一部の実施形態では、Ｒ１はＨである。特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｓ１’ポケット内により深く伸長するより大きな部分である。例として、一部の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル（たとえば、Ｃ１アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル）、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル（たとえば、Ｃ１アルケニル、Ｃ２アルケニル、Ｃ３アルケニル、Ｃ４アルケニル、Ｃ５アルケニル、Ｃ６アルケニル）またはＣ２〜Ｃ６アルキニル（たとえば、Ｃ１アルキニル、Ｃ２アルキニル、Ｃ３アルキニル、Ｃ４アルキニル、Ｃ５アルキニル、Ｃ６アルキニル）である。別の例として、特定の実施形態では、Ｒ１は、シクリル環、ヘテロシクリル環、アリール環、またはヘテロアリール環などの環部分である。一部の実施形態では、Ｒ１は、融合環系、たとえば、融合シルシル、アリール、ヘテロシクリルまたはヘテロアリール環系である。一部の実施形態では、ヘテロシクリルまたはヘテロアリール環系中の１つまたは複数の異種原子が、Ａｌａ２４８のペプチド主鎖との水素結合（たとえば水媒介の水素結合）に関与する。一部の実施形態では、Ｒ１は置換されている。特定の実施形態では、置換基の１つまたは複数が、Ａｌａ２４８のカルボニル主鎖との水素結合のアクセプターとして関与することができる（たとえば水分子を介して）。たとえば、置換基は、ニトロ、シアノ、アルキルカルボニル、スルホキシド、スルホン、スルホンアミド、カルボニル、カルボキサミド、カルバマート、またはカルボナートであることができる。
【００９７】
一般に、それぞれのＲ２およびＲ３は、独立して、約８個未満の非水素原子が含まれる中性置換基である。中性置換基は正味も正電荷または負電荷を有さない。そのような置換基の例には、水素、ハロゲン（たとえば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＯＣ（ハロゲン）３、Ｃ（ハロゲン）３、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ（たとえば、Ｃ１アルコキシ、Ｃ２アルコキシ、Ｃ３アルコキシ、Ｃ４アルコキシ、Ｃ５アルコキシ、Ｃ６アルコキシ）、Ｃ１〜Ｃ６アルキル（たとえば、Ｃ１アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルキルチオイル（たとえば、Ｃ１アルキルチオイル、Ｃ２アルキルチオイル、Ｃ３アルキルチオイル、Ｃ４アルキルチオイル、Ｃ５アルキルチオイル、Ｃ６アルキルチオイル）、またはＣ１〜Ｃ６アルキルアミノ（たとえば、Ｃ１アルキルアミノ、Ｃ２アルキルアミノ、Ｃ３アルキルアミノ、Ｃ４アルキルアミノ、Ｃ５アルキルアミノ、Ｃ６アルキルアミノ）が含まれる。一部の実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、それらが付着している環原子と一緒になって、環を形成する（たとえば、ＡおよびＢと共に融合三環系を提供する）。たとえば、Ｒ２およびＲ３は、ＡおよびＢの付着原子と一緒になって、シクリル環、ヘテロシクリル環、アリール環、またはヘテロアリール環を形成することができる。一部の実施形態では、中性置換基は疎水性である。
【００９８】
Ｘは、一般に、水素結合のアクセプターである。水素結合のアクセプターの例には、硫黄、スルホキシド、スルホン、スルホンアミド、カルボニル、カルボキサミド、尿素、カルバマートおよびカルボナートが含まれる。
【００９９】
Ｚは、一般に、金属キレート化部分である。たとえば、Ｚは、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ、またはＺｎなどの金属とキレート化することができる二座金属キレート剤であることができる。金属キレート化部分の例には、カルボン酸、カルボン酸アミド、ヒドロキサム酸（たとえば逆ヒドロキサム酸）、ヒドロキシ尿素、ヒドラジド、スルホン酸、スルホンアミド、ヒドロキシスルホンアミド、スルホジイミド、リン酸、ホスホン酸、チオール、チオールカルボニル、チイラン、ジチオール、スルホニルヒドラジド、複素環部分（たとえば、スルホジイミン、チアゾラジンジオン、ピリミジントリオンチアジアジン、バルビツレート、チアジアゾール（たとえば、ペプチドのチアジアゾールまたはチアジアゾールチオン）、チアジアジン、イミダゾリジンジオン、プリジニオン、アミノメチルベンズイミダゾール）ナプチルヒドロキサメート、またはアミドもしくはカルボニル部分と結合した複素環部分（たとえば、ピリジニルアミド、ピリジニロン、もしくはピロリロン）が含まれる。
【０１００】
別の例として、結晶複合体の構造から導いたバチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの表現に基づいて、かつ理論に束縛されることを望まずに、バチマスタットのヒドロキサメート部分は、活性部位金属（たとえばＯ−Ｚｎ距離２．１Åおよび２．６Åを有する）ならびに水素結合（Ｏ−Ｏ距離２．４Å）を介して触媒グルタミン酸（Ａｇｇ−２のＧｌｕ４１１）のカルボキシラート側鎖のどちらとも、相互作用すると考えられている。また、ペプチド模倣体阻害剤バチマスタットが、伸長したβシート様コンホメーションでヒトＡｇｇ−２ポリペプチドと相互作用するとも考えられている。さらに、バチマスタットの３つの側鎖（チオフェン、イソブチル、およびベンジル）が連続的な基質結合ポケットと相互作用する一方で、２つの主鎖アミド基がタンパク質と４つのβシート様水素結合を生じると考えられている。さらに、チオフェン、イソブチル、およびベンジル側鎖がそれぞれＳ１、Ｓ１’、およびＳ２’部位を占有する一方で、介在アミド部分がＡｓｐ３７７、Ｌｅｕ３７９、Ｓｅｒ４４１、およびＬｅｕ４４３の主鎖原子と水素結合を形成すると考えられている。これらの水素結合の重原子の距離は、それぞれ２．８Å、３．１Å、２．７Å、および２．７Åであると考えられている。
【０１０１】
この情報に基づいて、かつ理論に束縛されることを望まずに、ヒトＡｇｇ−２ポリペプチドと１つまたは複数の類似の相互作用を有することができる他の化合物も、ヒトＡｇｇ−２ポリペプチドのリガンドとして作用する能力を有し得ると考えられる。そのような化合物は、以下の構造を有し得る：
【０１０２】
【化２】
2009508474.tif 000004
［式中、ＤおよびＥのそれぞれはアミド結合または他の結合を表し、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４のそれぞれは、側鎖部分、たとえば天然に存在するアミノ酸の側鎖または天然に存在しないもしくは人工のアミノ酸の側鎖を表し；Ｇは金属キレート化部分である］。
【０１０３】
一部の実施形態では、それぞれのＤおよびＥは、独立して、アミド、スルホンアミド、アミノメチレンヒドロキシル、カルバマート、カルボナート、ビニル、または尿素である。
【０１０４】
一般に、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４のそれぞれは、それぞれヒトＡｇｇ−２ポリペプチドのポケットＳ３’、Ｓ２’、Ｓ１’、およびＳ１を満たすような大きさおよび形状である（たとえば図１３参照）。たとえば、Ｓ３’ポケットは比較的小さいので、一部の実施形態では、Ｒ１１は、たとえば、水素、または好ましくはメチル、エチル、もしくはプロピルなどの低級アルキルである。ポケットＳ２’、Ｓ１’およびＳ１のそれぞれはＳ３’よりもわずかに大きいので、より大きな側鎖部分を収容することができる。したがって、一部の実施形態では、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４のそれぞれは、独立して、たとえば環部分、鎖部分、または環および鎖部分の組合せなどの中性部分である。たとえば、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４のそれぞれは、独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル（たとえば、Ｃ１アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル）、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル（たとえば、Ｃ１アルケニル、Ｃ２アルケニル、Ｃ３アルケニル、Ｃ４アルケニル、Ｃ５アルケニル、Ｃ６アルケニル）またはＣ２〜Ｃ６アルキニル（たとえば、Ｃ１アルキニル、Ｃ２アルキニル、Ｃ３アルキニル、Ｃ４アルキニル、Ｃ５アルキニル、Ｃ６アルキニル）、シクリル、ヘテロシクリ、アリール、ヘテロアリールシクリルオキシ、ヘテロシクリオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、シクリルチオ、ヘテロシクリチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、シクリルオキシ、ヘテロシクリルアルキル、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキルであることができる。一部の実施形態では、Ｒ１２はアリール部分である（たとえばフェニル部分）。一部の実施形態では、Ｒ１３はアルキル部分である（たとえばイソプロピル部分）。一部の実施形態では、Ｒ１４はヘテロアリールチオ部分である（たとえばチオフェニルチオ部分）。一部の実施形態では、中性部分は疎水性部分である。
【０１０５】
上述のように、一般に、Ｇは、金属キレート化部分である。たとえば、Ｇは、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ、またはＺｎなどの金属とキレート化することができる二座金属キレート剤であることができる。一部の例では、Ｇは、ヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの触媒金属（たとえば触媒Ｚｎ）の近辺で水素結合のアクセプターとの水素結合に関与することもできる。一部の実施形態では、この水素結合のアクセプターは、ペプチド主鎖中のアミドカルボニルを介して基質を安定化することができる。金属キレート化部分の例には、カルボン酸、カルボン酸アミド、ヒドロキサム酸（たとえば逆ヒドロキサム酸）、ヒドロキシ尿素、ヒドラジド、スルホン酸、スルホンアミド、ヒドロキシスルホンアミド、スルホジイミド、リン酸、ホスホン酸、チオール、チオールカルボニル、チイラン、ジチオール、スルホニルヒドラジド、複素環部分（たとえば、スルホジイミン、チアゾラジンジオン、ピリミジントリオンチアジアジン、バルビツレート、チアジアゾール（たとえば、ペプチドのチアジアゾールまたはチアジアゾールチオン）、チアジアジン、イミダゾリジンジオン、ピリジニオン、アミノメチルベンズイミダゾール）、ナプチルヒドロキサメート、またはアミドもしくはカルボニル部分と結合した複素環部分（たとえば、ピリジニルアミド、ピリジニロン、もしくはピロリロン）が含まれる。
【０１０６】
上述の構造を有するリガンドは、化合物１またはバチマスタットに類似の生理的効果を有することができると考えられる。たとえば、リガンドがアグリカンの切断を阻害することができると考えられる。
【０１０７】
以下の実施例は例示的なものであり、限定することを意図しない。
【実施例】
【０１０８】
実施例１．化合物１と結合したＡｇｇ−１−Ａ１Ｃ２およびＡｇｇ−１−Ａ１Ｃ２を結晶化し、その構造を決定した。
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で発現させるために、組換えヒトＡｇｇ−１ポリペプチドの突然変異形態をベクター内にクローニングした。構築体はＡ１Ｃ２突然変異体Ａｇｇ−１（本明細書中以降、Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２）をコードしており、これは、アミノ酸位置３６２でグルタマートの代わりにグルタミンを保有しており（図１Ａ）、タンパク質分解に対して安定であり、その野生型の対応物よりも結晶化されやすいと見られ、完全長野生型タンパク質と類似の特異性および阻害剤への感度を有していた。
【０１０９】
セレノメチオニンで標識したＡｇｇ−１−Ａ１Ｃ２を発現させるために、ＣＨＯ細胞を、７５ｍｌの維持培地（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．３で緩衝したＲ１培地、１．２５ｍｇ／ＬのＦｕｎｇｉｚｏｎｅ、１０％の透析かつ熱失活させたウシ胎児血清、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン、０．５ｇ／ＬのＧ４１８、５０ｎＭのメトトレキサート）を含む１７５ｃｍ２のフラスコ中、５％ＣＯ２、３７℃の加湿したインキュベーター内で増殖させた。その後、２．５×１０７個の細胞を、４００ｍｌの維持培地を含む１７００ｃｍ２のローラーボトルに移した。細胞を、Ｂｅｌｌｃｏの機械（Ｂｅｌｌｃｏ  Ｇｌａｓｓ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州Ｖｉｎｅｌａｎｄ）内でゆっくりと回転させながら３７℃で増殖させた。
【０１１０】
細胞が＞９０％のコンフルエンスに達した後、培地を廃棄し、ローラーボトルをリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄した。細胞を、セレノメチオニンを用いて、３７℃で、ゆっくりと回転させながら、３００ｍｌの標識培地（１．２５ｍｇ／ＬのＦｕｎｇｉｚｏｎｅ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン、３０ｍｇ／Ｌのセレノメチオニン、５０ｍｇ／Ｌのヘパリン、０．５ｇ／ＬのＧ４１８、５０ｎＭのメトトレキサートを含む、メチオニンを含まないＤＭＥ培地）中で４日間標識した。標識後、培地を収集し、濾過し、−８０℃で保存した。ローラーボトルに残った細胞を、３００ｍｌの新鮮な標識培地中で３日間、３７℃でさらに培養した。その後、培地を収集し、濾過し、−８０℃で保存した。分泌されたセレノメチオニン標識のヒトＡｇｇ−１ポリペプチドを含む合計１０リットルの馴化培地が調製された。発現レベルは１ｍｇ／Ｌであると推定された。質量分析により、標識したタンパク質中で＞９０％のセレンの取り込みが示された。
【０１１１】
Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２構築体を発現する馴化ＣＨＯ培地を２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．８、５ｍＭのＣａＣｌ２、１０μＭのＺｎＣｌ２で希釈し、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＨＱカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）に結合させ、５０ｍＭ〜１ＭのＮａＣｌの直線勾配で溶出させた。Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２含有画分を、１．２Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４中でポリプロピルアスパルトアミド疎水性相互作用カラム（Ｎｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ、マサチューセッツ州Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ）に載せた。Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２は、（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度を低下することによって溶出された。続く精製ステップには、ゲル濾過（Ｇ３０００ＳＷ）および抗Ｆｌａｇ  Ｍ２アフィニティークロマトグラフィーが含まれる。Ｆｌａｇ親和性カラムからの結合していない物質を、開始バッファーである２５ｍＭのＭＭＴ、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＮａＣｌを用いてＭｏｎｏ  Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合させ、１ＭのＮａＣｌまでの直線勾配を用いて溶出させた。タンパク質を、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．８、５ｍＭのＣａＣｌ２、１０μＭのＺｎＣｌ２、３００ｍＭのＮａＣｌからなる最終バッファー中で透析した。すべての精製ステップは４℃で行った。
【０１１２】
Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２タンパク質を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０μＭのＺｎＣｌ２、５ｍＭのＣａＣｌ２中で８ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２／化合物１複合体は、タンパク質を１．２モル濃度過剰の阻害剤と共にインキュベートすることによって得られた。リガンドなしのＡｇｇ−１−Ａ１Ｃ２およびＡｇｇ−１−Ａ１Ｃ２／化合物１複合体の結晶を、懸滴技術によって、１８℃で、１０％のＰＥＧ４Ｋ、０．１ＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０を析出溶液として用いて成長させた。最適化された結晶は、８〜１５ｍＭのＬ−システインの添加を伴った線条シーディングおよびマクロシーディングによって得た。結晶は約２〜３週間で最大０．４×０．４×０．２ｍｍ３の大きさまで成長した。セレノメチオンで置換したＡｇｇ−１−Ａ１Ｃ２タンパク質からの結晶を、上述のように同じ技術を用いて成長させた。阻害剤と結合したタンパク質の結晶は、単斜空間群Ｐ２１に属し、単位胞パラメータａ＝８２．５６６Å、ｂ＝８２．６１８Å、ｃ＝９９．３２６Å、β＝９０．６２６°を有し、結晶不斉ユニットあたり４個の分子を有する。リガンドなしのタンパク質は、空間群Ｐ２１で結晶化し、単位胞パラメータａ＝１２８．２８Å、ｂ＝８３．６３Å、ｃ＝１５０、１６Å、β＝１１２．４０９°を有し、不斉ユニットあたり８個の分子を有する。データ収集のために、結晶を結晶化試薬＋２５％のグリセロールを含む溶液に移し、液体窒素中、１００Ｋで急速冷凍した。
【０１１３】
阻害剤と結合したＡｇｇ−１−Ａ１Ｃ２の構造は、セレノメチオニンで置換したタンパク質の結晶から多波長異常回折（ＭＡＤ）によって得られた位相を用いて決定した。ＭＡＤデータを、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ、カリフォルニア州Ｂｅｒｋｅｌｅｙのビームライン５．０．２上の３つの波長で、Ｑｕａｎｔｕｍ−４ＣＣＤ検出器（Ａｒｅａ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて収集した。データをＭＯＳＦＬＭで統合し、その後、ＳＣＡＬＡで基準化した（「Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ」、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、セクションＤ、５０：７６０〜７６３、１９９４年）。セレン部位はＳＨＥＬＸＳを用いて位置決定した。ＳＯＬＯＭＯＮによる異常散乱パラメータの精密化、位相の計算および密度改変、ならびにすべてを、ＳＨＡＲＰを用いて行った（ｄｅ  Ｌａ  ＦｏｒｔｅｌｌｅおよびＢｒｉｇｏｇｎｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍ．、２７６：４７２〜４９４、１９９７年）。初期モデルを構築するために実験的な図を用い（ＱＵＡＮＴＡ）、続いてネイティブデータに対してＣＮＳで再構築および精密化を繰り返した（Ｂｒｕｎｇｅｒ他、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌ．、セクションＤ、５４：９０５〜９２１、１９９７年）。２．８Åのネイティブデータ組をＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅで収集し、ＭＯＳＦＬＭで処理し、ＳＣＡＬＡで基準化した（「Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ」、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、セクションＤ、５０：７６０〜７６３、１９９４年）。Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２／化合物１複合体のデータ収集、位相調整および精密化のための統計を表１に要約する。
【０１１４】
【表１】
2009508474.tif 000005
【０１１５】
Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２／化合物１複合体の精密化したモデルの構造座標を以下の表５に提示する。表５では、「＃」段は、座標を与えたそれぞれの原子に指数を割り当てる。「名称」段は原子の種類を示し、「ｒｅｓ」段は原子が属する残基の種類を示す。「鎖」は、原子が属するポリペプチドを示す。「Ｒｅｓ＃」は、原子に残基番号を与える。たとえば、原子番号１（表５の第１列）はＡｌａ２１４のβ炭素（ＣＢ）である。そのｘ、ｙ、およびｚ構造座標をそれぞれＸ、Ｙ、およびＺ段に与える。「ｏｃｃ」と先頭に示した段は、原子に割り当てられた占有率を記載し（１．００＝完全占有）、「Ｂ」段はÅ２の単位でＢ因子（または温度因子）を提供する。結合した化合物１の座標はｒｅｓ段で「ＷＡＹ」と記載して示し、水は「ＨＯＨ」によって示し、亜鉛およびカルシウム原子はそれぞれ「ＺＮ」および「ＣＡ」によって示した。
【０１１６】
続いて、Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２のリガンドなしの形態の結晶構造を、ＡＭＯＲＥ（「Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ」、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、セクションＤ、５０：７６０〜７６３、１９９４年）およびＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒ他、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、セクションＤ、５４：９０５〜９２１、１９９７年）を用いた分子置換方法によって、阻害剤と結合した形態の精密化した構造を用いて解析した。リガンドなしの酵素の結晶からの回折データをＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅで３Åの解像度まで収集し、ＭＯＳＦＬＭおよびＳＣＡＬＡを用いて処理および縮小した（「Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ」、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、セクションＤ、５０：７６０〜７６３、１９９４年）。データ収集および精密化の統計を表２に示す。
【０１１７】
Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２ポリペプチドの精密化したモデルの構造座標を以下の表４に提示する。段および表現は表５について記載したとおりである。
【０１１８】
【表２】
2009508474.tif 000006
【０１１９】
Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２／化合物１複合体の構造を図５に示す。Ｎ末端残基２１４〜４２８は酵素の触媒ドメインを表し、Ｃ末端残基４３８〜５０９はディスインテグリン様ドメインを表す。２つのドメインは、亜鉛結合領域の反対側の触媒ドメインの表面にわたって伸びる９個の残基のクロスオーバーリンカー（残基４２９〜４３８）によって連結されている。
【０１２０】
Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２の触媒ドメインは、亜鉛ペプチダーゼスーパーファミリーと構造的特徴を共有する特徴的なポリペプチドの折り畳みを表す。これは、５つのβ鎖（βＡ〜βＥ）のコアを取り囲む６つのαへリックス（αＡ〜αＦ）からなるα／β構造を有しており、ＭＭＰよりもヘビ毒メタロプロテイナーゼ（ＳＶＭＰ）に位相幾何学的に類似している。触媒的亜鉛の環境は、亜鉛原子と配位する３つのヒスチジン（Ｈｉｓ３６１、Ｈｉｓ３６５およびＨｉｓ３７１）を有する特徴的な亜鉛キレート化モチーフ３６１ＨＥｘｘＨｘｘｘｘｘＨ３７１、および亜鉛結合部位の構造的完全性に必須の不変のメチオニン（Ｍｅｔ３９１）を有するＭｅｔ−ターンモチーフ３９０ｘＭｘ３９２を含む。亜鉛結合領域（ＨＥｘｘＨｘｘＧｘｘＨ）中に保存されたグリシン残基を共通して持つＳＶＭＰおよびＭＭＰと比較して、Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２中の位相幾何学的に等価なアスパラギン（Ａｓｎ３６８）は、ポリペプチド鎖中の急なターンを可能にする類似のコンホメーションで配置されている。触媒グルタミン酸（Ｇｌｕ３６２）の代わりにグルタミン残基（Ｇｌｎ３６２）の収容することは、活性部位の構造に影響を与えない。
【０１２１】
図６により詳細に示すように、１〜３個の範囲のジスルフィド結合を有するＳＶＭＰとは対照的に、この構造的配置は、ＡＤＡＭＴＳファミリー中で保存されているシステイン間に形成される４つのジスルフィド橋、すなわち、Ｃｙｓ２９３−Ｃｙｓ３４５、Ｃｙｓ３２２−Ｃｙｓ３２７、Ｃｙｓ３３９−Ｃｙｓ４２３およびＣｙｓ３７７−Ｃｙｓ４０７によって補助されている。これらのうち、Ｃｙｓ３３９−Ｃｙｓ４２３のジスルフィド連結はＳＶＭＰ構造中に構造的な等価物を有するが、他のものはアグレカナーゼに固有であると見られる。Ｃｙｓ２９３−Ｃｙｓ３４５橋は長いαＣヘリックス（Ｃｙｓ２９３）をβシート（Ｃｙｓ３４５）に固定し、Ｃｙｓ３２２−Ｃｙｓ３２７ジスルフィドはＳ状ループ（Ｓ−ループ、ＭＭＰ用語）の順序的に遠位の部分を一緒に保ち、Ｃｙｓ３７７−Ｃｙｓ４０７の連結は小さなαＥヘリックス（Ｃｙｓ３７７）をＣ末端ヘリックスαＦ（Ｃｙｓ４０７）に対して固定する。さらに、電子密度の大きなピークによって同定された３つのカルシウムイオンが存在する。１つのＣａ２＋イオンはＣｙｓ３２２−Ｃｙｓ３２７ジスルフィド橋の近辺に見つかり、３つのカルボニル酸素（Ｌｅｕ３２１、Ｃｙｓ３２７、Ｔｈｒ３２９）および３つのカルボキシラート酸素（Ａｓｐ３２０、Ｇｌｕ３４９）と接触を形成している。２つのカルシウムイオンを抱える別の部位は、Ｃｙｓ３３９−Ｃｙｓ４２３橋の近傍、ＳＶＭＰ中のカルシウム結合部位と類似の位置である。しかし、Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２では、この領域は、アトロリシンＣおよびアダマリシンＩＩについて記載された構造などのようにＳＶＭＰ構造中に１つのカルシウムイオンと対照的に、２つのカルシウムイオンが可能となる高度に帯電した環境を表す。２つのＣａ２＋イオンは４．３Åによって隔てられており、集合的に３つのアスパラギン酸（Ａｓｐ３０４、Ａｓｐ３１１、Ａｓｐ４２６）、１つのグルタマート（Ｇｌｕ２２１）および２つのカルボニル基（Ａｓｐ３０４、Ｃｙｓ４２３）と配位している。Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２構造を用いた比較アミノ酸配列分析により、両部位でカルシウムイオンと配位している残基がアグレカナーゼファミリーにわたって高レベルの保存を有することが示された。
【０１２２】
Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２のディスインテグリン様ドメインは、２つの小さなαへリックス、続いて２つの高度にねじれた逆平行βシートからなる。それぞれのβシートは、不規則な連結および長いループによって中断された３つの短いβ鎖を有する。この配置は、図８に示すように、８つの保存されたシステイン間の４つのジスルフィド橋、すなわち、Ｃｙｓ４４９−Ｃｙｓ４７２、Ｃｙｓ４６０−Ｃｙｓ４８２、Ｃｙｓ４６７−Ｃｙｓ５０１、Ｃｙｓ４９５−Ｃｙｓ５０６によって定位置に保たれている。このドメインの配向は、触媒ドメイン中のいくつかの静電気的相互作用および疎水性相互作用によって維持されている。
【０１２３】
Ａｇｇ−１の活性部位は、ＭＭＰおよびＳＶＭＰのものに非常に類似している（ＲｕｓｈおよびＰｏｗｅｒｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４：１３１１〜１３２７、２００４年）。一般に、活性部位は、βＤに平行して走る触媒ドメインの表面上の狭いくぼんだ溝によって広く定義される。この溝の中央には、基質のペプチド結合の加水分解の原因である水分子を活性化するのでプロテアーゼ活性に重要である触媒Ｚｎが存在する。上述のように、ヒスチジン３６１、３６５および３７１の窒素原子はＡｇｇ−１の触媒Ｚｎと配位する。いくつかの内向ポケットおよび主要な活性部位の溝に隣接する溶媒に向かった溝の存在も、他のプロテアーゼ部位に共通している。タンパク質のこれらの特徴は基質の側鎖を収容し、したがって、選択性について側鎖に対して識別するために有用である。最後に、触媒Ｚｎ近辺の水素結合のアクセプターの「ホットスポット」が、タンパク質のアミドカルボニルの１つとの水素結合によって基質を安定化し得る。Ａｇｇ−１では、この「ホットスポット」は、βＤに先行する主鎖中の急なターンに位置し、Ｌｅｕ３３０およびＧｌｙ３３１の２つの内向主鎖ＮＨによって形成される。
【０１２４】
ＭＭＰおよびＳＶＭＰの最も知られている阻害剤は、いつかの特徴を共有する。１つめは、活性部位のＺｎ原子の第４配位部位を占有するＺｎキレート化基である。この相互作用は、顕著な量のエネルギーを結合の自由エネルギーに寄与する。同じ相互作用が本明細書中に記載した阻害剤で観察され、これは、Ｚｎを、カルボキシラート酸素原子の１つを介して、２．１Åの距離でキレート化する。他のカルボキシラート酸素は、Ａｌａ３３３の主鎖原子との水媒介の水素結合に関与する。カルボキシラートＭＭＰ阻害剤は、プロトン化されている場合に、活性部位Ｇｌｕ（Ａｇｇ−１中のＧｌｕ３６２）のカルボキシラートと直接水素結合を形成することができるので、より好都合に結合することが知られている。したがって、本発明者らは、Ａｌａ３３３との水媒介の相互作用が、タンパク質の突然変異形態中にのみ存在することを予想する。Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２中では、カルボキシラートが一次アミドによって置換されているので（Ｇｌｕ３６２Ｇｌｎの突然変異によって）、同じ水素結合を生じることができず、したがって、阻害剤の第２の酸素が他の箇所で自由に相互作用を行う。
【０１２５】
ＭＭＰ阻害剤の別の共通の特徴は、上述の活性部位の「ホットスポット」での水素結合のアクセプターの配置である。この場合、ホットスポットは、化合物１のスルホンアミド基の酸素原子の１つによって占有されている。Ｌｅｕ３３０およびＧｌｙ３３１の主鎖ＮＨまでのＯ−Ｎ距離は、それぞれ２．７Åおよび３．１Åである。
【０１２６】
典型的には、ポリペプチド基質のそれぞれのアミノ酸の側鎖が基質／プロテアーゼ相互作用の特異性に関与している。それぞれの基質残基の側鎖が、集合的に亜部位と呼ばれる酵素の領域によって認識される。プロテアーゼの亜部位の一般的に受け入れられている学名、およびその対応する基質残基を以下に示し、二重斜線は結合の切断位置を表す。プロテアーゼ亜部位：Ｓ４、Ｓ３、Ｓ２、Ｓ１、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’、Ｓ４’；基質残基：Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、／／Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’、Ｐ４’。既知のＭＭＰ阻害剤の別の共通の特徴は、活性部位のＳ１’ポケットを満たす阻害基であるＰ１’基の存在である。これは、Ｓ１’ポケットが通常は非常に大きな疎水性ポケットであり、したがって、この空間を利用する阻害剤は疎水効果によって自由エネルギーを得ることができることに原因がある可能性が高い。このＡｇｇ−１構造では、Ｓ１’ポケットは実際に約１５Åにわたるチャネルであり、阻害剤によって完全に満たされる。
【０１２７】
化合物１とＡｇｇ−１−Ａ１Ｃ２とのいつかの相互作用は、既知のＭＭＰ阻害剤の間であまり一般的でない。たとえば、ビフェニルπ系と活性部位のＨｉｓ３６１との間に好都合なπスタッキング相互作用が存在する（約３．７Åの隔離）。また、Ｐ１’フェニル環とＰｈｅ３５７との間に第２のπスタッキング相互作用が存在する（約３．７Åの隔離）。最後に、Ｐ１’基のカルボニル酸素とαＢの主鎖原子との間に水媒介の（２．５Å）水素結合が存在する。阻害剤−タンパク質の相互作用を図１２に例示する。
【０１２８】
Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２ポリペプチドの全体的構造（図２参照）は化合物１と結合したＡｇｇ−１−Ａ１Ｃ２ポリペプチドに類似している。重ね合わせた場合、２つの構造は２８０個の等価なＣα対についてｒｍｓ偏差１．４Åを示す。しかし、結合していない形態の活性部位の構造は、阻害剤と結合した形態と比較して顕著なコンホメーションの変化を示す。これらの変化には、Ｓ−ループの再構成およびそれ内の残基の位置的再配置が含まれる。電子密度図（図１０）により、リガンドなしの構造では、Ｌｅｕ３２１からＬｅｕ３３０までの全領域が活性部位に向かってループとなり、Ｓ’ポケットへの入口を完全に遮断していることが明らかとなった。局所的ではあるが、再配置は、Ｃｙｓ３２２およびＣｙｓ３２７のＣα原子のそれぞれで約２．７Åおよび約６．６Åの移動が顕著である。このポジションでは、Ｃｙｓ３２２−Ｃｙｓ３２７ジスルフィド橋が維持され、この橋がループの移動および「阻害性」コンホメーションを安定化させる。この配置の予期しなかった特徴は、Ｃｙｓ３２７、Ａｓｐ３２８およびＴｈｒ３２９に続く残基が、その側鎖を触媒Ｚｎ２＋イオン近辺のポケットに挿入し、ここで、Ａｓｐ３２８のカルボキシラート基が金属原子とキレート化することである（図１１参照）。したがって、Ｓ−ループは、２つの側面から「自己阻害」要素であると見られる。第１に、これは、ペプチド基質が結合する空間を物理的に占有することによって酵素−基質認識を妨げ、第２に、Ａｓｐ３２８は、Ａｓｐ３２８が除去されるまでＺｎ原子が酵素的に活性になることを妨げる。これらのデータは、リガンドとの相互作用に際して結合ポケットが空くことを示唆している。
【０１２９】
実施例２．アグレカナーゼ−２／バチマスタット複合体を結晶化し、その構造を決定した。
組換えヒトＡｇｇ−２ポリペプチドをＣＨＯ細胞から発現させた。発現されたＡｇｇ−２ポリペプチドには、酵素の触媒ドメイン、ディスインテグリン様ドメイン、およびトロンボスポンジン様ドメイン、ならびに、ポリペプチドをＣ末端で切断する、タンパク質のアミノ酸Ｐｈｅ６２８と融合したＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）（ＩＢＡ、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）が含まれる（図３）。３つのアミノ酸リンカーを、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）に先行する空間的に保存されたフェニルアラニンの直後に含めた。Ａｇｇ−２を発現するＣＨＯ細胞系は、製造者が推奨するリポフェクションのプロトコルを用いて、Ａｇｇ−２＿Ｐｈｅ６２８＿Ｓｔｒｅｐ構築体をＣＨＯ／ＤＵＫＸ細胞内に形質移入することによって確立した（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）。クローンを０．０２、０．０５および０．１μＭのメトトレキサート中で選択した。ＣＨＯ馴化培地中の組換えタンパク質を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした抗ストレプトアビジン抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、アラバマ州Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）を用いたウエスタンブロッティング、続いてＥＣＬ化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）およびオートラジオグラフィーによって監視することによって、最も高いレベルの組換えタンパク質を発現する細胞系を選択した。
【０１３０】
最も高いレベルの組換えタンパク質を発現する細胞系を選択した濃縮馴化培地をバッファーＡ（２０ｍＭのトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭのＣａＣｌ２、１０μＭのＺｎＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ）で３倍希釈し、バッファーＡで事前に平衡化したＰｏｒｏｓ（登録商標）ＨＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）陰イオン交換カラムに載せた。同じバッファー中に１．０ＭまでのＮａＣｌ勾配によってカラムを洗浄および展開した。Ａｇｇ−２含有画分をプールし、バッファーＢ（２０ｍＭのトリス．Ｃｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭのＣａＣｌ２、１０μＭのＺｎＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中のＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ、ドイツＧｏｔｔｉｎｇｅｎ）アフィニティークロマトグラフィーに供した。カラムを洗浄し、バッファーＢ中に２．５ｍＭのデスチオビオチンを用いてＡｇｇ−２タンパク質を溶出させた。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００ゲル濾過カラムを用いて、バッファーＣ（２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５、５ｍＭのＣａＣｌ２、１０μＭのＺｎＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ）を移動相として用いて、タンパク質をさらに精製した。生じたＡｇｇ−２含有画分をプールし、結晶構造解析研究のために５ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。
【０１３１】
阻害剤と結合したＡｇｇ−２は、濃縮タンパク質を１．２モル濃度過剰の阻害剤、バチマスタットと共にインキュベートすることによって得られた。結晶を、懸滴技術によって、１８℃で、１０％のＰＥＧ８Ｋ；０．２ＭのＮａＣｌ；０．１ＭのＣＨＥＳ、ｐＨ９．５を析出溶液として用いて成長させた。結晶は空間群Ｐ３１に属し、単位胞パラメータａ＝９３．６４Å、ｂ＝９３．６４Å、ｃ＝９２．５９Å、およびγ＝１２０°を有し、結晶不斉ユニットあたり２個の分子を有する。データ収集のために、結晶を結晶化試薬（１０％のＰＥＧ８Ｋ、０．２ＭのＮａＣｌ；０．１ＭのＣＨＥＳ、ｐＨ９．５）＋２５％のグリセロールを含む溶液に移し、液体窒素中、１００Ｋで急速冷凍した。
【０１３２】
Ａｇｇ−２／バチマスタット複合体の構造を、ＡＭＯＲＥ（Ｎａｖａｚａ、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、Ａ５０：１５７〜１６３、１９９４年）を用いた分子置換方法によって、化合物１と結合したＡｇｇ−１−Ａ１Ｃ２の構造を検索モデルとして用いて決定した。回折データをＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（カリフォルニア州Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）で２．９Åの解像度まで収集し、ＭＯＳＦＬＭおよびＳＣＡＬＡで処理および縮小した（「Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ」、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、セクションＤ、５０：７６０〜７６３、１９９４年）。強度の確率分布の解析により、結晶が欠面双晶化していることが示され、双晶化画分は０．４２であった。ＱＵＡＮＴＡでの再構築およびＣＮＳでの精密化（Ｂｒｕｎｇｅｒ他、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、セクションＤ、５４：９０５〜９２１、１９９７年）は、双晶化を考慮して行った。データ収集および精密化の統計を表３に示す。
【０１３３】
【表３】
2009508474.tif 000007
【０１３４】
Ａｇｇ−２／バチマスタットポリペプチドの精密化したモデルの構造座標を以下の表６に提示する。表６の段および表現は表５に記載したとおりであるが、残基の表示「ＷＡＹ」はバチマスタット原子を同定するものである。
【０１３５】
Ａｇｇ−２／バチマスタット構造のリボン図を図８に示す。Ｎ末端残基２６５〜４７６は酵素の触媒ドメインを形成し、Ｃ末端残基４８６〜５５６はディスインテグリン様ドメインを形成する。トロンボスポンジン様ドメイン、残基５５７〜６２８では電子密度が観察されず、結晶構造中でこの領域が乱れていることを示唆している。触媒ドメインおよびディスインテグリン様ドメインは、亜鉛結合領域の反対側の触媒ドメインの表面にわたって伸びる９個の残基のクロスオーバーリンカー（残基４７７〜４８６）によって連結されている。
【０１３６】
Ａｇｇ−２の触媒ドメインは、亜鉛ペプチダーゼスーパーファミリーと構造的特徴を共有する特徴的なポリペプチドの折り畳みを表す。これは、５つのβ鎖（βＡ〜βＥ）のコアを取り囲む６つのαへリックス（αＡ〜αＦ）からなるα／β構造を有しており、ＭＭＰよりもヘビ毒メタロプロテイナーゼ（ＳＶＭＰ）に位相幾何学的に類似している。触媒的亜鉛の環境は、亜鉛原子と配位する３つのヒスチジン（Ｈｉｓ４１０、Ｈｉｓ４１４およびＨｉｓ４２０）を有する特徴的な亜鉛キレート化モチーフ４１０ＨｅｘｘＨｘｘＧｘｘＨ４２０および亜鉛結合部位の構造的完全性に必須の不変のメチオニン（Ｍｅｔ４３９）を有するＭｅｔ−ターンモチーフ４３８ｘＭｘ４４０を含む。
【０１３７】
１〜３個の範囲のジスルフィドプロテイナーゼのＳＶＭＰとは対照的に、Ａｇｇ−２／バチマスタット複合体中のＡｇｇ−２の構造的配置は、ＡＤＡＭＴＳファミリー中で保存されているシステイン間に形成される４つのジスルフィド橋、すなわち、Ｃｙｓ３４２−Ｃｙｓ３９４、Ｃｙｓ３７１−Ｃｙｓ３７６、Ｃｙｓ３８８−Ｃｙｓ４７１およびＣｙｓ４２６−Ｃｙｓ４５５によって補助されている。これらのうち、Ｃｙｓ３８８−Ｃｙｓ４７１のジスルフィド連結はすべてのＳＶＭＰ構造中に構造的な等価物を有するが、他のものはアグレカナーゼに固有であると見られる。Ｃｙｓ３４２−Ｃｙｓ３９４橋は長いαＣヘリックス（Ｃｙｓ３４２）をβシート（Ｃｙｓ３９４）に固定し、Ｃｙｓ３７１−Ｃｙｓ３７６ジスルフィドはＳ状ループ（「Ｓ−ループ」）の順序的に遠位の部分を繋ぎ止め、Ｃｙｓ４２６−Ｃｙｓ４５５の連結は小さなαＥヘリックス（Ｃｙｓ４２６）をＣ末端ヘリックスαＦ（Ｃｙｓ４５５）に対して固定する。さらに、電子密度の大きなピークから同定された３つのカルシウムイオンが存在する。１つのＣａ２＋イオンはＣｙｓ３７１−Ｃｙｓ３７６ジスルフィド橋の近辺に見つかり、３つのカルボニル酸素（Ｌｅｕ３７０、Ｃｙｓ３７１、Ｔｈｒ３７８）および３つのカルボキシラート酸素（Ａｓｐ３６９、Ｇｌｕ３９８）と接触を形成している。２つのカルシウムイオンを抱える別の部位は、Ｃｙｓ３８８−Ｃｙｓ４７１橋の近傍、ＳＶＭＰ中のカルシウム結合部位と類似の位置である。しかし、Ａｇｇ−２では、この領域は高度に帯電しており、アトロリシンＣまたはアダマリシンＩＩのＳＶＭＰ構造で見られる１つのカルシウムイオンの代わりに、２つのカルシウムイオンが可能となっている。２つのＣａ２＋イオンは４．８Åによって隔てられており、３つのアスパラギン酸（Ａｓｐ３５３、Ａｓｐ３６０、Ａｓｐ４７４）、１つのグルタマート（Ｇｌｕ２７０）および２つのカルボニル基（Ａｓｐ３５３、Ｃｙｓ４７１）と配位する。Ａｇｇ−２構造とアラインメントした比較アミノ酸配列分析により、両部位でカルシウムイオンと配位している残基がアグレカナーゼファミリーにわたって高レベルの保存を有することが示された。
【０１３８】
Ａｇｇ−２のディスインテグリン様ドメインは、２つの小さなαへリックス、続いて２つの高度にねじれた逆平行βシートからなる独特な構造を表す。それぞれのβシートは、不規則な連結および長いループによって中断された３つの短いβ鎖を有する。この配置は、８つの保存されたシステイン間の４つのジスルフィド橋、すなわち、Ｃｙｓ４９７−Ｃｙｓ５１９、Ｃｙｓ５０８−Ｃｙｓ５２９、Ｃｙｓ５１４−Ｃｙｓ５４８、およびＣｙｓ５４２−Ｃｙｓ５５３によって定位置に保たれている。このドメインの配向は、触媒ドメインとのいくつかの静電気的相互作用および疎水性相互作用によって維持されている。
【０１３９】
Ａｇｇ−２の活性部位は、ＭＭＰおよびＳＶＭＰのものに非常に類似している（ＲｕｓｈおよびＰｏｗｅｒｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４：１３１１〜１３２７、２００４年；Ｓｋｉｌｅｓ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、８：４２５〜４７４、２００１年）。一般に、活性部位は、βＤに平行して走る触媒ドメインの表面上の狭いくぼんだ溝によって広く定義される。この溝の中央には、基質のペプチド結合の加水分解の原因である水分子を活性化するのでプロテアーゼ活性に重要である触媒Ｚｎが存在する。上述のように、ヒスチジン４１０、４１４および４２０の窒素原子はＡｇｇ−２の触媒Ｚｎと配位する。いくつかの内向ポケットおよび主要な活性部位の溝に隣接する溶媒に向かった溝の存在も、他のプロテアーゼ部位に共通している。これらの特徴によりタンパク質が基質の側鎖を収容することが可能となり、したがって、選択性について側鎖を識別するために有用である。最後に、触媒Ｚｎ近辺の水素結合のアクセプターの「ホットスポット」が、タンパク質のアミドカルボニルの１つとの水素結合を介して基質を安定化し得る。Ａｇｇ−２では、この「ホットスポット」は、βＤに先行する主鎖中の急なターンに位置し、  Ｌｅｕ３７９およびＧｌｙ３８０の２つの内向主鎖ＮＨによって形成される。
【０１４０】
バチマスタットとＡｇｇ−２との最も強力なエンタルピー相互作用は、ヒドロキサメート部分と活性部分の様々な構成成分との相互作用である可能性が高い。このバチマスタット／ＭＭＰ構造および既に報告されている構造では、ヒドロキサメートは、活性部位Ｚｎ（Ｏ−Ｚｎ距離２．１Åおよび２．６Å）ならびに水素結合（Ｏ−Ｏ距離２．４Å）を介して触媒グルタミン酸のカルボン酸側鎖（Ａｇｇ−２中のＧｌｕ４１１）のどちらとも相互作用する。これらの相互作用は、タンパク質−リガンド相互作用のエンタルピーに顕著に寄与する可能性が高い。
【０１４１】
バチマスタットは本質的にペプチド模倣体阻害剤であり、したがって、伸長したβシート様コンホメーションのタンパク質と相互作用する。その３つの「側鎖」（チオフェン、イソブチルおよびベンジル置換基）は連続的な基質結合ポケットと相互作用する一方で、２つの主鎖アミド基はタンパク質と４つのβシート様Ｈ結合を生じる。Ａｇｇ−２では、チオフェン、イソブチルおよびベンジル側鎖がそれぞれＳ１、Ｓ１’およびＳ２’部位を占有する一方で、介在アミド基がＡｓｐ３７７、Ｌｅｕ３７９、Ｓｅｒ４４１、およびＬｅｕ４４３の主鎖原子と水素結合する（Ｓ１、Ｓ１’およびＳ２’はＡｇｇ−２結合部位中の亜部位を表す）（図１３）。これらの水素結合の重原子の距離は、それぞれ２．８Å、３．１Å、２．７Åおよび２．７Åであることが観察されている。
【０１４２】
【表４−１】
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【０１４３】
【表４−２】
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【０１４４】
【表４−３】
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【０１４５】
【表４−４】
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【０１４６】
【表４−５】
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【０１４７】
【表４−６】
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【０１４８】
【表４−７】
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【０１４９】
【表４−８】
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【０１５０】
【表４−９】
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【０１５１】
【表４−１０】
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【０１５２】
【表４−１１】
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【０１５３】
【表４−１２】
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【０１５４】
【表４−１３】
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【０１５５】
【表４−１４】
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【０１５６】
【表４−１５】
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【０１５７】
【表４−１６】
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【０１５８】
【表４−１７】
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【０１５９】
【表４−１８】
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【０１６０】
【表４−１９】
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【０１６１】
【表４−２０】
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【０１６２】
【表４−２１】
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【０１６３】
【表４−２２】
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【０１６４】
【表４−２３】
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【０１６５】
【表４−２４】
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【０１６６】
【表４−２５】
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【０１６７】
【表４−２６】
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【０１６８】
【表４−２７】
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【０１６９】
【表４−２８】
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【０５８５】
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【０６００】
【表５−１４８】
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【表５−１５５】
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【表６−１】
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【表６−２】
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【０６３７】
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【０６３８】
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【０６４０】
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【０６４１】
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【０６５４】
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【０６５５】
【表６−４８】
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【０６５６】
【表６−４９】
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【０６５７】
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【０６５８】
【表６−５１】
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【０６５９】
【表６−５２】
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【０６６０】
【表６−５３】
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【０６６５】
【表６−５８】
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【０６６６】
【表６−５９】
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【０６６７】
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【０６６８】
【表６−６１】
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【０６６９】
【表６−６２】
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【０６７０】
【表６−６３】
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【０６７１】
【表６−６４】
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【０６７２】
【表６−６５】
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【０６７３】
【表６−６６】
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【０６７４】
【表６−６７】
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【０６７５】
【表６−６８】
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【０６７６】
【表６−６９】
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【０６７７】
【表６−７０】
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【０６７８】
【表６−７１】
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【０６７９】
【表６−７２】
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【０６８０】
【表６−７３】
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【０６８１】
【表６−７４】
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【０６８２】
【表６−７５】
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【０６８３】
【表６−７６】
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【０６８４】
【表６−７７】
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【０６８５】
【表６−７８】
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【０６８６】
【表６−７９】
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【０６８７】
【表６−８０】
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【０６８８】
【表６−８１】
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【０６８９】
【表６−８２】
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【図面の簡単な説明】
【０６９０】
【図１Ａ】触媒ドメイン（アミノ酸２１４〜４２８）およびディスインテグリン様ドメイン（アミノ酸４３７〜５０９）ならびにポリペプチドをより結晶化されやすくするアミノ酸３６２（Ｇｌｕ３６２Ｇｌｎ）での突然変異が含まれる、ヒトＡｇｇ−１ポリペプチド（Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２）の断片のアミノ酸配列（配列番号１）である。位置３６２のグルタミンを太字および下線で示す。ポリペプチドのＣ末端に融合させたＦＬＡＧ−タグ（太字で示す）により、精製が容易になった。
【図１Ｂ】図１Ａに記載の突然変異ＦＬＡＧ−タグ付け断片に対応するヒトＡｇｇ−１ポリペプチドの断片の野生型アミノ酸配列（配列番号２）である。野生型配列には、触媒ドメイン（アミノ酸２１４〜４２８）およびディスインテグリン様ドメイン（アミノ酸４３７〜５０９）が含まれる。位置３６２の野生型グルタマートを太字および下線で示す。
【図２】Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２ポリペプチドの構造を例示するリボン図である。カルシウム原子および亜鉛原子も示す。
【図３】触媒ドメイン（アミノ酸２６５〜４７６）、ディスインテグリン様ドメイン（アミノ酸４８６〜５５６）、およびトロンボスポンジン様ドメイン（アミノ酸５５７〜６２８）が含まれる、ヒトＡｇｇ−２ポリペプチドの断片のアミノ酸配列（配列番号３）である。ポリペプチドのＣ末端にｓｔｒｅｐ−タグを融合し、これを太字で示す。
【図４】２−［４’−（４−イソブチリル−フェノキシメチル）−ビフェニル−４−スルホニルアミノ］−３−メチル−酪酸（化合物１）の化学構造を示す図である。
【図５】阻害化合物１と結合したヒトＡｇｇ−１−Ａ１Ｃ２ポリペプチドの構造を例示するリボン図である。構造へリックスは、「αＡ」から「αＨ」によって同定する。構造シートは、「βＡ」から「βＫ」によって示す。カルシウム原子および亜鉛原子も示す。
【図６】Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２／化合物１複合体の触媒ドメインの構造を例示するリボン図である。Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２ポリペプチド中のジスルフィド結合を棒として示す。
【図７】バチマスタットの化学構造を示す図である。
【図８】阻害剤バチマスタットと結合したヒトＡｇｇ−２ポリペプチド（配列番号３）の構造を例示するリボン図である。構造へリックスは、「αＡ」から「αＨ」によって同定する。構造シートは、「βＡ」から「βＫ」によって示す。カルシウム原子および亜鉛原子も示す。
【図９】Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２／化合物１複合体のディスインテグリン様ドメインの構造を例示するリボン図である。Ａｇｇ−１−Ａ１Ｃ２ポリペプチド中のジスルフィド結合を棒として示す。
【図１０】リガンドなしのＡｇｇ−１−Ａ１Ｃ２の活性部位の電子密度図である。
【図１１】リガンドなしのＡｇｇ−１−Ａ１Ｃ２およびＡｇｇ−１−Ａ１Ｃ２／化合物１複合体の活性部位の構造の重ね合わせを示す図である。
【図１２】阻害化合物１の構造を示す図である。化合物１とＡｇｇ−１−Ａ１Ｃ２ポリペプチドとの相互作用、および活性亜鉛原子を示す。Ｓ１およびＳ１’は連続的な基質結合ポケットを表す。
【図１３】バチマスタットの構造を示す図である。バチマスタットとヒトＡｇｇ−２ポリペプチド（配列番号３）のアミノ酸残基との相互作用、および活性部位の亜鉛原子を示す。Ｓ１、Ｓ２’、Ｓ３’およびＳ１’は、連続的な基質結合ポケットを表す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年4月25日(2008.4.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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