(57)【要約】本発明は、独特な標識試薬又は独特な標識試薬のセットを使用する質量分析によって分析物を調べるための方法、混合物、キット及び／又は組成物に関する。標識試薬は、異性体又は同重体であることができ、標識した分析物の多重分析に適した混合物を製造するのに使用できる。この分析物は、あらゆる分子であることができる。この分析物の非限定的な例としては、以下に限定されないが、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、糖質、脂質、ステロイド、アミノ酸及び１，５００ダルトン未満の小分子が挙げられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式：
【化１】
2009526998.tif 000045
で表される少なくとも２つの異なる化合物あるいはその塩形態及び／又は水和物形態を含有するキットであって、式中、それぞれの異なる化合物について独立して、
ＲＧは、求核性基又は求電子性基であるか、あるいは分析物と求核性基又は求電子性基との反応生成物であり；
ｒは、０〜１の整数であり；
Ｓ’は、固体支持体又は親和性リガンドに結合された切断可能なリンカーであり；
Ｘ及びＹは、それぞれ結合であり、Ｘは、ＲＰ及びＬＫのそれぞれの原子又は任意の置換基に結合し、それによってＲＰをＬＫに連結し、且つＹは、ＬＫの原子又は任意の置換基をＲＧに結合し；
ＲＰ及びＬＫは、それぞれ任意に及び独立して置換され、ＲＰは、レポーター基であり及びＬＫは、構造式Ｅ
【化２】
2009526998.tif 000046
（式中、それぞれのｎは、独立して、１〜３の整数であり、及びそれぞれのＲは、独立して、Ｈ、Ｄ、アルキル基、ヘテロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、又はハロ基である）
で表される連結部分ＬＫ５であり；並びに
ＲＰは、それぞれの化合物について固有の総質量を有し、及びＬＫは、それぞれの化合物についての該ＲＰの間の固有の総質量の差を、それぞれの化合物についての該ＲＰ及びＬＫの総質量の総計が同じであるように補う、それぞれの化合物について固有の総質量を有する、キット。
【請求項２】
ＲＰが、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキルであるか、あるいはヘテロアリール又はヘテロシクロアルキル基で置換又は中断された線状又は分岐脂肪族又はへテロ脂肪族基である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記連結部分ＬＫ５が、次の構造式：
【化３】
2009526998.tif 000047
で表される基であるか；又は該基のアイソトポローグである、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
前記化合物の少なくとも１つが、
【化４】
2009526998.tif 000048
であるか又はそのアイソトポローグである、請求項１に記載のキット。
【請求項５】
前記キットの全ての化合物が同重体である、請求項１に記載のキット。
【請求項６】
前記化合物が同重体異性体である、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記化合物が同重体アイソトポローグである、請求項５に記載のキット。
【請求項８】
前記キットのそれぞれの化合物が固有の同位体コード化レポーターを含有する、請求項１に記載のキット。
【請求項９】
ＲＰが場合により置換されるピペラジニルを含み、かつＬＫがアリール又はシクロアルキルであるか、あるいはアリール又はシクロアルキルで置換又は中断された線状又は分岐脂肪族又はへテロ脂肪族基である、請求項１に記載のキット。
【請求項１０】
ＲＧが求核性基又は求電子性基である、請求項１に記載のキット。
【請求項１１】
ＲＧが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、２−ニトロフェニルエステル、４−ニトロフェニルエステル、２，４−ジニトロフェニルエステル、２，４−ジハロフェニルエステル、混合した無水物、マレイミド、ハロゲン化アルキル、α−ハロ−アシルのハロゲン化アリール、ハロゲン化トリチル、及びハロゲン化シリルからなる群から選択される求電子性基である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
ＲＧが、アミン、ヒドロキシル、及びチオールからなる群から選択される求核性基である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
ｒが０である、請求項１に記載のキット。
【請求項１４】
Ｓ’で表される切断可能なリンカーが前記固体支持体に結合される、請求項１に記載のキット。
【請求項１５】
前記キットのそれぞれの異なる化合物が、任意の他の異なる化合物が固定化される支持体とは区別される支持体に固定化される、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記キットのそれぞれの異なる化合物が前記固体支持体上に別々の配列位置で固定化され、それによって該キットが前記異なる化合物のアレイライブラリーである、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記固体支持体が、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、ポリアクリルアミド、ガラス、シリカ、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）、又は逆相シリカを含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１８】
ＲＧが分析物と求核性基又は求電子性基との反応生成物である、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
ＲＧが求核性基又は求電子性基と分析物との反応の生成物でありかつ該分析物がタンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、脂質、ステロイド又は１５００ダルトン未満の小分子である、請求項１に記載のキット。
【請求項２０】
結合Ｘ及びＹの両方が、解離エネルギーレベルに供された場合に前記化合物の少なくとも一部分においてフラグメント化する、請求項１に記載のキット。
【請求項２１】
ＲＰが、解離エネルギーレベルに供された場合に前記化合物の少なくとも一部分においてサブフラグメント化する、請求項１に記載のキット。
【請求項２２】
複数の標識分析物あるいはその塩形態及び／又は水和物形態を含有する混合物であって、次式：
【化５】
2009526998.tif 000049
で表される複数の標識分析物あるいはその塩形態及び／又は水和物形態を含有する混合物であって、式中、それぞれの標識分析物について独立して、
ｒは、０〜１の整数であり；
Ｓ’は、固体支持体又は親和性リガンドに結合された切断可能なリンカーであり；
Ｘ及びＹは、それぞれ結合であり、Ｘは、ＲＰ及びＬＫのそれぞれの原子又は任意の置換基に結合し、それによってＲＰをＬＫに連結し、且つＹは、ＬＫの原子又は任意の置換基を−分析物に結合し；
ＲＰ及びＬＫは、それぞれ任意に及び独立して置換され、ＲＰは、レポーター基であり及びＬＫは、構造式Ｅ：
【化６】
2009526998.tif 000050
（式中、それぞれのｎは、独立して、１〜３の整数であり、及びそれぞれのＲは、独立して、Ｈ、Ｄ、アルキル基、ヘテロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、又はハロ基である）
で表される連結部分ＬＫ５であり；並びに
ＲＰは、それぞれの標識分析物について固有の総質量を有し、及びＬＫは、それぞれの標識分析物についての該ＲＰの間の固有の総質量の差を、それぞれの標識分析物についての該ＲＰ及びＬＫの総質量の総計が同じであるように補う、それぞれの標識分析物について固有の総質量を有する、混合物。
【請求項２３】
それぞれの−分析物が、タンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖質、脂質、ステロイド、アミノ酸又は１５００ダルトン未満の小分子である、請求項２２に記載の混合物。
【請求項２４】
それぞれのＲＰが、前記分析物が由来する試料を同定する固有の同位体コードを含む、請求項２２に記載の混合物。
【請求項２５】
次式：
【化７】
2009526998.tif 000051
で表される同位体濃縮化合物あるいはその塩形態及び／又は水和物形態であって、式中、
ＲＧは、求核性基又は求電子性基であるか、あるいは分析物と求核性基又は求電子性基との反応生成物であり；
Ｘ及びＹは、それぞれ結合であり、Ｘは、ＲＰ及びＬＫのそれぞれの原子又は任意の置換基に結合し、それによってＲＰをＬＫに連結し、且つＹは、ＬＫの原子又は任意の置換基をＲＧに結合し；
ＲＰ及びＬＫは、それぞれ任意に及び独立して置換され、ＲＰは、レポーター基であり及びＬＫは、構造式Ｅ：
【化８】
2009526998.tif 000052
（式中、それぞれのｎは、独立して、１〜３の整数であり、及びそれぞれのＲは、独立して、Ｈ、Ｄ、アルキル基、ヘテロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、又はハロ基である）
で表される連結部分ＬＫ５であり、かつ
該化合物の少なくとも２個の原子が重原子同位体で同位体濃縮される、同位体濃縮化合物、あるいはその塩形態及び／又は水和物形態。
【請求項２６】
ＲＰ及びＬＫそれぞれが、少なくとも１個の重原子同位体を含む、請求項２５に記載の同位体濃縮化合物。
【請求項２７】
ＲＰ及びＬＫそれぞれが、少なくとも２個の重原子同位体を含む、請求項２５に記載の同位体濃縮化合物。
【請求項２８】
ＲＰ及びＬＫそれぞれが、少なくとも３個の重原子同位体を含む、請求項２５に記載の同位体濃縮化合物。
【請求項２９】
ａ）それぞれ１つ以上の分析物を含有する２つ以上の試料を、異なる標識試薬と反応させ、それによってそれぞれ１つ以上の標識分析物を含有する２つ以上の別々に標識された試料を生成する工程であって、該標識試薬は、次式：
【化９】
2009526998.tif 000053
で表されるか、あるいはその塩形態及び／又は水和物形態であり、式中、それぞれの標識試薬について独立して、
ＲＧは、求核性基又は求電子性基であり；
ｒは、０〜１の整数であり；
Ｓ’は、固体支持体又は親和性リガンドに結合された切断可能なリンカーであり；
Ｘ及びＹは、それぞれ結合であり、Ｘは、ＲＰ及びＬＫのそれぞれの原子又は任意の置換基に結合し、それによってＲＰをＬＫに連結し、且つＹは、ＬＫの原子又は任意の置換基をＲＧに結合し；
ＲＰ及びＬＫは、それぞれ任意に及び独立して置換され、ＲＰは、レポーター基であり及びＬＫは、構造式Ｅ：
【化１０】
2009526998.tif 000054
（式中、それぞれのｎは、独立して、１〜３の整数であり、及びそれぞれのＲは、独立して、Ｈ、Ｄ、アルキル基、ヘテロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、又はハロ基である）
で表される連結部分ＬＫ５であり；並びに
ＲＰは、それぞれの標識分析物について固有の総質量を有し、及びＬＫは、それぞれの標識分析物についての該ＲＰの間の固有の総質量の差を、それぞれの標識分析物についての該ＲＰ及びＬＫの総質量の総計が同じであるように補う、それぞれの標識分析物について固有の総質量を有する、工程；ならびに
ｂ）２つ以上の該標識された試料又はその部分と、場合により１つ以上の較正標準とを混合し、それによって混合物を製造する工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
前記２つ以上の試料が酵素消化反応の生成物である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
それぞれの試料が分離プロセスからの画分である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記１つ以上の分析物が、タンパク質、核酸分子、糖質、脂質、ステロイド、アミノ酸、又は１５００ダルトン未満の小分子である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記１つ以上の分析物がペプチドである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記１つ以上の別々に標識された分析物それぞれが、その由来する試料を同定する固有のレポーターを含有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
さらに、
ｃ）試料混合物又はその画分について第１の質量分光分析を行う工程；
ｄ）該第１の質量分光分析からの標識分析物の、選択された質量電荷比の選択イオンを解離エネルギーレベルまで処理し、それによって該選択イオンの少なくとも一部の特徴的イオン及びイオン化娘フラグメントイオンを形成する工程；ならびに
ｅ）該選択イオン、該特徴的イオン及び該娘フラグメントイオン、又はこれらの画分の第２の質量分析を行う工程、
を包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
さらに、ｆ）前記第２の質量分析におけるそれぞれの特徴的イオン部分の総質量及び相対量並びに前記娘フラグメントイオンの総質量を測定する工程を包含する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
さらに、標識分析物の選択イオンについて異なる選択された質量電荷比で工程（ｄ）〜（ｆ）を１回以上反復する工程を包含する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
さらに、工程（ｃ）〜（ｆ）を１回以上反復する工程を包含し、それぞれの回で前記試料混合物の異なる画分を用いる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記レポーターが、前記分析物を調べるために使用される条件下で実質的にサブフラグメント化しない、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記レポーターが、前記分析物を調べるために使用される条件下でサブフラグメント化する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
選択された質量電荷比の前記選択イオンに関連する前記標識分析物の同一性が、前記娘フラグメントイオンの分析によって決定される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記第２の質量分析におけるそれぞれの特徴的イオンの相対量が、その他の特徴的イオンに対して測定される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記同定された分析物に関連するそれぞれの特徴的イオンの相対量が、前記混合物を形成するために加えられるそれぞれの試料の量と関連付けられ、それによって該混合物を形成するために組み合わせられる２つ以上の該試料のそれぞれの中の該分析物の相対量を測定する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
（ｉ）前記混合物が、さらに、前記同定される分析物のための少なくとも１つの較正標準の既知量を含有し、且つそれぞれの特徴的イオンの絶対量が、該較正標準に関連する特徴的イオンの量に関して測定される；ならびに
（ｉｉ）該混合物のそれぞれの異なる試料中の該同定される分析物の絶対量が、それぞれの特徴的イオンの量に関して測定される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
さらに、工程（ｄ）〜（ｆ）を、標識分析物の選択イオンについて異なる選択された質量電荷比で１回以上反復し、それによって前記混合物を形成するために組み合わせられた前記試料の２つ以上のそれぞれの中の１つ以上のその他の分析物の相対量を同定及び／又は測定する工程を包含する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
さらに、工程（ｄ）〜（ｆ）を、標識分析物の選択イオンについて異なる選択された質量電荷比で１回以上反復し、それによって前記混合物を形成するために組み合わせられた前記試料の２つ以上のそれぞれの中の１つ以上のその他の分析物の絶対量を同定及び／又は測定する工程を包含する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
構造式ＶＩ：
【化１１】
2009526998.tif 000055
で表される化合物あるいはその塩形態及び／又は水和物形態を含有するキットであって、式中、
ＲＰ６及びＬＫ６は、それぞれ独立して、ヘテロアリール又はヘテロシクロアルキルであるか、あるいはヘテロアリール又はヘテロシクロアルキルで置換又は中断された線状又は分岐脂肪族又はヘテロ脂肪族基であり、ＲＰ６又はＬＫ６の少なくとも１つは、場合により置換される核酸塩基、あるいは場合により置換される核酸塩基で置換又は中断された線状又は分岐脂肪族又はヘテロ脂肪族基を含み；
ＲＰ６及びＬＫ６の任意の置換基は、独立して、水素、重水素、−ＯＨ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、−Ｒ３、−Ｔ−Ｒ３、リボース、デオキシリボース、又はホスフェートから選択され；
それぞれのＲ３は、独立して、水素、重水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり；
Ｔは、−Ｏ−、−ＮＲ４−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４−、−ＮＲ４ＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＲ４−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｏ−、又は−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ４−であり；
それぞれのＲ４は、独立して、水素、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、又はアラルキルであり；
Ｘは、レポーターの原子とＬＫ６との間の結合であり；及び
Ｙは、リンカーの原子とＲＧの原子との間の結合であり、
ＲＰ６及びＬＫ６の少なくとも１つは、１個以上の重原子同位体で同位体濃縮される、
キット。
【請求項４８】
ＬＫ６のみが核酸塩基である、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
少なくとも１つの化合物が、構造式：
【化１２】
2009526998.tif 000056
で表され、式中、
Ｘは、Ｒ５とＲ６とを結合し及びＹはＲ７とＲＧとを結合し；
Ｒ５は、−Ｃ（Ｊ）２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｊ）２−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｊ）２−Ｃ（ＮＨ）−、又は−Ｃ（Ｊ）２−Ｃ（ＮＲ２）−であり、
ＲＺは、場合によりヘテロ原子を含有していてもよい１〜８個の炭素原子を含有するアルキル基であるか、又は場合により置換されるアリール基であり、該アルキル基又はアリール基の炭素原子は、独立して、連結された水素、重水素及び／又はフッ素原子を含有し；並びに
この場合のそれぞれのＪは、同一であるか又は異なり、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒｚ、ＯＲｚ、ＳＲｚ、ＮＨＲｚ、Ｎ（Ｒｚ）２、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素であり；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、−Ｒ３、−Ｔ−Ｒ３、リボース、デオキシリボース、又はホスフェートであり；この場合のそれぞれのＲ３は、独立して、水素、重水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり；並びに
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、水素、重水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、又はハロゲン化アルキルである、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記化合物の少なくとも１つが：
【化１３】
2009526998.tif 000057
又はそのアイソトポローグである、請求項４８に記載のキット。
【請求項５１】
少なくとも１つの化合物が、構造式Ｉ：
【化１４】
2009526998.tif 000058
で表される、請求項１に記載のキットであって、式中：
ＲＰ１は、構造式Ａ：
【化１５】
2009526998.tif 000059
（式中、
環Ａは、芳香族であり；
それぞれのＺは、独立してＣＨ、ＣＲ２、又はＮであり、但し、２個以下の基ＺがＮであることを条件とし；
ｎは１又は２であり；
それぞれのＲ２は、独立して、水素、重水素、−ＯＨ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、−Ｒ３、又は−Ｔ−Ｒ３から選択され；
それぞれのＲ３は、独立して、水素、重水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり；
Ｔは、−Ｏ−、−ＮＲ４−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４−、−ＮＲ４ＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＲ４−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｏ−、又は−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ４−であり；
それぞれのＲ４は、独立して、水素、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、又はアラルキルである）
で表されるレポーター基であり、
ＬＫ１は、連結部分ＬＫ５であり；
Ｘは、前記レポーターの原子とＬＫ１の間の結合であり；並びに
Ｙは、前記リンカーの原子とＲＧの原子の間の結合であり、
ＲＰ１及びＬＫ１の少なくとも１つは、１個以上の重原子同位体で同位体濃縮される、
キット。
【請求項５２】
環Ａが６員環である、請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
環Ａのオルト位又はパラ位の前記基ＺのいずれかがＣ−Ｔ−Ｒ３である、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
環Ａのオルト位又はパラ位の前記基ＺのいずれかがＣ−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ３又はＣ−ＮＨＳＯ２−Ｒ３であり、かつそれぞれのＲ３が独立して場合により置換されるアルキル基である、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
ＲＰ１が構造式Ａ−１：
【化１６】
2009526998.tif 000060
で表される、請求項５１に記載のキット。
【請求項５６】
少なくとも１つの化合物が、構造式ＩＩ：
【化１７】
2009526998.tif 000061
で表され、式中：
ＲＰ２は、構造式Ｂ：
【化１８】
2009526998.tif 000062
で表されるレポーター基であり、
環Ｂは、であり；
ｎは、１又は２であり；
それぞれのＷは、独立して、Ｏ、Ｓ又はＮＲ４であり；
それぞれのＷ’は、独立して、ＣＨ２、ＣＨＲ２、Ｃ（Ｒ２）２、Ｃ（Ｏ）又はＣ＝Ｎ−Ｒ４であり；
Ｑは、ＣＨ又はＣＲ２であり；
Ｑは、ＣＨ又はＣＲ２であり；
それぞれのＲ２は、独立して、水素、重水素、−ＯＨ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、−Ｒ３、又は−Ｔ−Ｒ３から選択され；
それぞれのＲ３は、独立して、水素、重水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり；
Ｔは、−Ｏ−、−ＮＲ４−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４−、−ＮＲ４ＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＲ４−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｏ−、又は−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ４−であり；
それぞれのＲ４は、独立して、水素、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、又はアラルキルであり；
ＬＫ２は、連結部分ＬＫ５であり；
Ｘは、前記レポーターの原子とＬＫ２の間の結合であり；並びに
Ｙは、前記リンカーの原子とＲＧの原子の間の結合であり、
ＲＰ２及びＬＫ２の少なくとも１つは、１個以上の重原子同位体で同位体濃縮される、請求項１に記載のキット。
【請求項５７】
少なくとも１つの化合物が、構造式ＩＩ−ｄ：
【化１９】
2009526998.tif 000063
で表される、請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
少なくとも１つの化合物が、構造式ＩＩ−ｅ：
【化２０】
2009526998.tif 000064
で表される、請求項５６に記載のキット。
【請求項５９】
少なくとも１つの化合物が、構造式ＩＩＩ：
【化２１】
2009526998.tif 000065
で表され、式中：
ＲＰ３は、構造式Ｃ：
【化２２】
2009526998.tif 000066
で表されるレポーター基であり；
Ｒｘ及びＲｙのそれぞれは、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、又はヘテロアルキルであり、Ｒｘ及びＲｙの任意の置換基は、独立して、水素、重水素、−ＯＨ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｒ３、−Ｔ−Ｒ３、リボース、デオキシリボース又はホスフェートから選択され、あるいはＲｘ及びＲｙは一緒になって環Ｃ’：
【化２３】
2009526998.tif 000067
を形成し；
環Ｃ’は、ヘテロアリール又はヘテロシクロアルキルであり、環Ｃ’の置換基は、独立して、水素、重水素、−ＯＨ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアルキル、−Ｒ３、−Ｔ−Ｒ３、リボース、デオキシリボース又はホスフェートであり；
それぞれのＲ３は、独立して、水素、重水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり；
Ｔは、−Ｏ−、−ＮＲ４−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４−、−ＮＲ４ＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＲ４−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｏ−、又は−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ４−であり；
それぞれのＲ４は、独立して、水素、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、又はアラルキルであり；
ＬＫ３は、連結部分ＬＫ５であり；
Ｘは、前記レポーターの原子とＬＫ３の間の結合であり；並びに
Ｙは、前記リンカーの原子とＲＧの原子の間の結合であり、
ＲＰ３及びＬＫ３の少なくとも１つは、１個又はそれ以上の重原子同位体で同位体濃縮される、請求項１に記載のキット。
【請求項６０】
環Ｃ’が、構造式ＩＩＩ−ｃ：
【化２４】
2009526998.tif 000068
（式中、ｑは０〜６の整数であり及びＬＫ３はカルボニル基を含む）
で表される、請求項５９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、２００６年２月１５日に出願された米国出願第１１／３５５，９０４号（これは、２００５年５月９日に出願された米国出願第６０／６７９，１８３号および２００４年７月１２日に出願された米国出願第６０／５８７，１３８号の利益を主張する、２００５年７月１１日に出願された米国出願第１１／１７９，０６０号の一部継続である）の継続である。上記の出願の全体の教示は、参考として本明細書に援用される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
当業者には、以下に記載の図面は、単に例示を目的とするものであることが理解されるであろう。図面は、本明細書の教示の範囲を何ら限定することを意図するものではない。
【０００３】
１．序論
本発明は、質量分析によって一つ又は複数の分析物を調べるための方法、混合物、キット及び／又は組成物に関する。分析物は、興味のある任意の分子であることができる。分析物の非限定的な例としては、以下に限定されないが、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、糖質、脂質、ステロイド、アミノ酸及び１，５００ダルトン未満の小分子が挙げられる。
【０００４】
標識試薬及び標識分析物は、一般式：
【０００５】
【化２５】
2009526998.tif 000002
（式中、ＲＧは、分析物と反応する反応性基であるか又は反応性基と分析物との反応生成物であり得る）
の化合物あるいはその塩及び／又は水和物で表すことができる。従って、標識分析物は、一般式：
【０００６】
【化２６】
2009526998.tif 000003
を有することができる。前記化合物は、固体支持体に結合させるか又は該化合物をＳ’を介して固体支持体に連結するための部分に結合させることができる。変数ＲＧ、ＲＰ、Ｘ、ＬＫ、Ｓ’、ｒ、ｔ、及びＹは、以下でさらに詳しく説明する。
【０００７】
異性体又は同重体標識試薬のセットは、２つ以上の異なる試料からなる分析物を標識するのに使用でき、この場合に、標識試薬は、それぞれの異なる試料について異なることができ、及び標識試薬は、標識分析物が由来する試料と会合することができる固有のレポーター（「ＲＰ」）を含有することができる。従って、レポーターの存在及び／又は量などの情報は、異なる試料を標識することにより得られる反応生成物を混合することによって誘導される標識分析物の複合混合物の分析からでさえも、試料中の分析物の存在及び／又は量（多くの場合、濃度及び／又は量として表される）と関連付けることができる。このような複合試料混合物の分析は、多数の方法で同じ試料から又は多数の試料から１個又は複数の分析物の測定を可能にする方法で行うことができる。従って、本発明の方法、混合物、キット及び／又は組成物は、複合試料混合物の多重分析に特によく適している。例えば、これらは、プロテオーム分析及び／又はゲノム分析で使用できるし並びにゲノム及び／又はプロテオーム分析に関連した相関研究に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
２．定義
本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切であると認められる場合には、単数形で使用される用語はまた、複数形を包含し、逆もまた同様である。以下に示す定義が、他の文献、例えば本明細書において参照することにより全ての目的に援用される任意の文献と矛盾する場合には、以下に示す定義が支配すべきである：
本明細書で使用する「分析物」とは、測定し得る興味のある分子を指す。分析物の非限定的な例としては、以下に限定されないが、タンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡの両方）、糖質、脂質、ステロイド、アミノ酸及び／又は１５００ダルトン未満の分子量を有するその他の小分子が挙げられる。分析物、又は分析物を含有する試料の供給源は、任意の供給源に由来することができるように限定されない。１つ又は複数の分析物は、天然物又は合成物であることができる。分析物、又は分析物を含有する試料の供給源の非限定的な例としては、以下に限定されないが、細胞又は組織、あるいはこれらの培養物（又は継代培養物）が挙げられる。分析物の供給源の非限定的な例としては、以下に限定されないが、未処理又は処理細胞溶解液（全細胞溶解液を含む）、体液、組織抽出物又は細胞抽出物が挙げられる。分析物の供給源のさらに別の非限定的な例としては、以下に限定されないが、クロマトグラフ分離又は電気泳動分離などの分離プロセスから得られる画分が挙げられる。体液としては、以下に限定されないが、血液、尿、糞便、髄液、脳脊髄液、羊水、リンパ液又は腺分泌物由来の液体が挙げられる。処理細胞溶解液とは、細胞溶解液が、細胞を溶解するのに必要とされる処理の他に処理され、それによって採取材料のさらなる処理を行うことを意味する。例えば、試料は、未処理細胞溶解液の全タンパク質成分をタンパク分解酵素で処理し、それによって１つ又は複数の前駆体タンパク質を消化することによって形成されるペプチドである１つ以上の分析物を含有する細胞溶解液であることができる。誤解を避けるために、分析物という用語は、文脈から明らかに相容れない意味が意図されない限りは、それから誘導される元の分析物及び化合物を包含することができる。例えば、幾つかの実施形態において、分析物という用語は、タンパク質及びそれから該たんぱく質の消化によって誘導されるペプチドに適用することができる。
【０００９】
本明細書で使用されるように、「フラグメンテーション」とは、共有結合の破断を指す。
【００１０】
本明細書で使用されるように、「フラグメント」とは、フラグメンテーション（名詞）の産物又はフラグメンテーション（動詞）を生ずる操作を指す。
【００１１】
原子又は分子の質量は、多くの場合、最も近い整数原子質量単位あるいは原子質量単位の最も近い少数第１位又は最も近い少数第２位に近似することができることが十分に認められるであろう。本明細書で使用されるように、「総質量」とは、使用する異なる同位体種の質量の極めてわずかな相違を検出できるか否かにかかわらず、異なる原子種の同位体の使用が、異なる原子種の同位体がレポーター及び／又はリンカー部分の質量を釣り合わせるために機能的に均等であるように（レポーター／リンカーの組み合わせの総質量が同重体又は異性体標識試薬の１つのセット又はキット内で同じであるように）質量において類似している範囲内にある近似質量及び絶対質量を指す。
【００１２】
例えば、酸素の一般的な同位体は、総質量１６．０（実際の質量１５．９９４９）及び１８．０（実際の質量１７．９９９２）を有し、炭素の一般的な同位体は、総質量１２．０（実際の質量１２．０００００）及び１３．０（実際の質量１３．００３３６）を有し、並びに窒素の一般的な同位体は、総質量１４．０（実際の質量１４．００３１）及び１５．０（実際の質量１５．０００１）を有する。これらの値は近似値であるが、当業者には、１８Ｏ同位体を１つのセット１つのレポーターに使用する場合には、さらに２つの質量単位（総質量１６．０を有する酸素の同位体に関して）を、例えば、１６Ｏを含有する１つのセットの異なるレポーターにおいて、１８Ｏを補うために、該レポーターのどこかに２個の１２Ｃ原子の代わりに２個の炭素１３Ｃ原子を、２個の１４Ｎ原子の代わりに２個の１５Ｎ原子を、場合によっては１個の１２Ｃ及び１個の１４Ｎの代わりに１個の１３Ｃ原子及び１個の１５Ｎ原子を組み込むことによって補うことができることが認識されるであろう。このようにして、上記セットの２つの異なるレポーターは、機能的質量均等である（すなわち、同じ総質量を有する）。なぜならば、２個の１３Ｃ原子（２個の１２Ｃ原子の代わりに）、２個の１５Ｎ原子（２個の１４Ｎ原子の代わりに）、１個の１３Ｃ原子及び１個の１５Ｎ原子（１個の１２Ｃ及び１個の１４Ｎの代わりに）又は１個の１８Ｏ原子（１個の１６Ｏ原子の代わりに）の使用の間の極めてわずかな実際の違いは、それによって前記セット又はキットの標識の全てにおいて、２ダルトンの質量の増加を達成するために、分析の性質に対して障害ではないからである。
【００１３】
これは、図１Ａ〜１Ｈを参照して説明することができる。図１Ａにおいて、レポーター／リンカーの組み合わせ（図１Ａ、反応性ヨード基を含有していない；化学式：Ｃ１１１３Ｃ５Ｈ２０Ｎ１５Ｎ２Ｏ６）は、２個の１５Ｎ原子と５個の１３Ｃ原子を有し且つ全理論質量３５７．２２１３を有する。比較によって、図１Ｃに示されるレポーター／リンカー同重体（化学式Ｃ１０１３Ｃ６Ｈ２０Ｎ２１５ＮＯ６）は、１個の１５Ｎ原子と６個の１３Ｃ原子を有し且つ全理論質量３５７．２２７９を有する。図１Ａ及びＣの化合物は、重原子同位体含有量以外は構造的に及び化学的に区別することができない同重体であるが、絶対質量においてわずかな相違がある（それぞれ、質量３５７．２２１３と質量３５７．２２７９）。しかし、図１Ａ及び１Ｃの化合物の総質量は、本発明の目的には３５７．２である。なぜならば、これは、質量分析計が図１Ａと図１Ｃの同重体の絶対質量の間のわずかな相違を測定するのに十分に感度がよいか否かにかかわらず、分析の障害にならないからである。
【００１４】
図１Ａ〜１Ｈから、構造内の同じ重原子同位体の分布が異性体及び／又は同重体標識試薬のセットの作成のための唯一の考慮すべき事柄ではないことは、明らかである。重原子同位体種を混合して、所望の総質量の異性体又は同重体を得ることができる。このようにして、重原子同位体の選択（組み合わせ）及びこれらの分布の両方は、本発明の実施形態に有用な異性体及び／又は同重体標識試薬の製造において考慮するのに利用できる。
【００１５】
本明細書で使用されるように、「同位体標識（ｉｓｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ）された」とは、１つ以上の重原子同位体（例えば、安定な同位体、例えば重水素、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３７Ｃｌ又は８１Ｂｒ）を用いて合成的に標識されている化合物（例えば、標識試薬）を指す。同位体標識（ｉｓｏｔｏｐｉｃ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）は１００％有効ではないので、濃縮の少ない状態の化合物の不純物が存在し得及びこれらは低い質量を有するであろう。同様に、過剰濃縮（望まれていない濃縮）のために及び天然同位体存在比のために、より大きな質量の不純物が存在し得る。幾つかの実施形態において、それぞれの組み込まれた重原子同位体は、少なくとも８０％の同位体純度で存在し得る。幾つかの実施形態においては、それぞれの組み込まれた重原子同位体は、少なくとも９３％の同位体純度で存在し得る。幾つかの実施形態においては、それぞれの組み込まれた重原子同位体は、少なくとも９６％の同位体純度で存在し得る。
【００１６】
本明細書で使用されるように、「アイソトポローグ（isotopologue）」である化合物は、同じ化学組成を有するが、同位体組成（同位体置換の数）、例えば、メタンアイソトポローグＣＨ４、ＣＨ３Ｄ、及びＣＨ２Ｄ２において異なる。
【００１７】
本明細書で使用されるように、「同重体アイソトポローグ」である化合物は、同じ化学組成を有し且つ同位体組成において異なるが、質量分析計で測定されるように同じ総質量を有する（例えば、メタン同重体アイソトポローグ１４ＣＨ４、１３ＣＨ３Ｄ、及びＣＨ２Ｄ２については、それぞれは１８原子質量単位の総質量を有する）。
【００１８】
幾つかの実施形態は、同位体標識される少なくとも２個の原子を有することができる同位体濃縮化合物である。種々の実施形態において、同位体濃縮化合物は、同位体標識される原子を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５，１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、又はそれ以上有することができる。化合物の化学構造は、前記の式のいずれかによって表すことができ、この場合の変数は一般的に及び本明細書に記載の分類及び下位分類に定義される通りである。
【００１９】
本明細書で使用されるように、「標識試薬」とは、測定のために分析物に印を付けるのに適した部分を指す。標識（ｌａｂｅｌ）という用語は、標識（タグ）及び印（マーク）という用語並びに他の同等の用語及び語句と同義である。例えば、標識分析物はまた、標識（タグ）された分析物又は印（マーク）を付けた分析物と呼ぶこともできる。従って、「標識（ｌａｂｅｌ）」、「標識（タグ）」、「印（マーク）」という用語及びこれらの用語の誘導体は、交換可能であり且つ測定用の分析物に印を付けるのに適した部分、又は測定用の分析物に印を付けた部分を指す。
【００２０】
本明細書で使用されるように、「質量標識」とは、本明細書で使用されるように、特定の総質量を有する基を分析物に付加することによって分析物を標識するか又は印をつけるのに使用できる標識試薬を指す。質量標識の１つのセットは、２つ以上の質量標識を含み、それぞれの質量標識は、同じ質量を有する基を、標識される分析物に付加する。しかし、質量標識の前記セットの質量標識のそれぞれは、前記セットの他の質量標識の特徴的イオンと異なる質量を有する特徴的イオンに解離エネルギーが加えられるとフラグメント化するであろう。質量標識及び標識試薬は、この記載の目的について同等な用語である。従って、質量標識の１つのセットは、標識試薬の１つのセットの均等物である。
【００２１】
本明細書で使用されるように、「支持体」、「固体支持体」又は「固体担体」とは、標識試薬又は分析物を固定化することができる固相物質を指す。固定化は、例えば、標識が支持体上で生じるか否かにかかわらず、分析物を標識するのに使用でき、又は標識試薬を調製するのに使用される。固体支持体は、「樹脂」、「合成支持体」、「固相」、「表面」、「膜」及び／又は「支持体」などの用語を包含する。固体支持体は、有機ポリマー、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、及びポリアクリルアミド、並びにこれらのコポリマー及びグラフトから構成し得る。固体支持体はまた、無機物、例えばガラス、シリカ、制御細孔ガラス（controlled  pore glass）（ＣＰＧ）、又は逆相シリカであることもできる。固体支持体の形状は、ビーズ、球、粒子、顆粒、ゲル、膜又は表面の形状であり得る。表面は、平面、実質的平面、又は非平面であることができる。固体支持体は、多孔性又は非多孔性であることができ、また膨潤特性又は非膨潤特性を有することができる。固体支持体は、ウェル、くぼみ又はその他の入れ物（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、容器（ｖｅｓｓｅｌ）の形状、外観（ｆｅａｔｕｒｅ）又は配置で構成することができる。複数の固体支持体を、試薬の自動送達を処理することができる種々の配置での配列で構成することができ、あるいは検出方法及び／又は装置で構成することができる。
【００２２】
本明細書で使用されるように、「ライブラリー」は、複数の異なる化合物（例えば、標識試薬、質量標識、標識分析物など）、典型的には５個、１０個、２５個、５０個、１００個、２５０又はそれ以上の異なる化合物である。ライブラリーは、典型的には、その中の異なる化合物の１つ、複数及び／又は全てに対して連続、無作為、及び／又は並列アクセスを容易にするために構成される。例えば、多数の異なる化合物のライブラリーは、同じフラスコ内にあることができるし、あるいは１つ以上の固体支持体などに固定化することができる。典型的には、ライブラリーは、例えば物理的に異なる支持体（例えば、ビーズ、球、粒子、顆粒など）上に種々の配置で又は同じ支持体上に処理可能な配置で（例えば、固体支持体上に無作為又は規則的配列として）固定化された少なくとも２種類の異なる化合物を有することができる。ライブラリー中の異なる化合物は、別の化合物と接触させることができる（例えば、１つ以上の分析物は、標識試薬のライブラリーと反応させることができる）し、又は分析することなどができる（例えば、標識分析物のライブラリーは分析することができる）。例えば、幾つかの実施形態において、ライブラリーは、複数の異なる標識試薬を含有することができ、それぞれの異なる標識試薬は、公知のアドレス（ａｄｄｒｅｓｓ）で固体支持体上に規則正しい配置で固定化することができる。ライブラリーは、特定の標識試薬を用いて、分析物試料をそれぞれの異なる固定化標識試薬に別々にスポットし（接触させ）、それによって複数の標識分析物を得ることによって、複数の別々の分析物試料を標識するのに使用できる。別の例において、標識試薬のライブラリーは、複数の固体粒子の表面に固定された異なる標識試薬を有することができる。ライブラリーは、それぞれの固体粒子を異なる分析物試料と接触させ、それによって複数の標識分析物を固体粒子に固定化することによって用いることができる。
【００２３】
本明細書で使用されるように、「親和性リガンド」とは、分子認識系の一員である分子を指す。
【００２４】
本明細書で使用されるように、「分子認識系」とは、互いについて分子認識の高い能力及び互いに特異的に結合する高い能力を有する少なくとも２つの分子又は複合体の系を指す。幾つかの実施形態において、結合は特異的であり、親和性リガンドは結合対の一部である。
【００２５】
共有結合として明記されない限りは、「結合」又は「結合された」という用語は、共有結合及び非共有結合の両方を含む。
【００２６】
本明細書で使用されるように、「特異結合」とは、分子認識系の親和性リガンドが１つ以上の分子又は複合体に、前記分子又は複合体と、試料のその他の成分又は混入物とを区別するのに十分な特異性を示して結合する場合を指す。本発明で使用される分子認識系は、慣用のものであり、本明細書では詳しく説明しない。このような系を調製及び利用する方法は、当該技術において周知であり、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｐ．の刊行物“Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ”（１９８８），ｅｄｓ．Ｂｕｒｄｏｎ  ａｎｄ  Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒに例示されており、その教示全体が本明細書で援用される。分子認識系の例としては、例えば、抗原／抗体、抗原／抗体断片、アビジン／ビオチン、ストレプトアビジン／ビオチン、タンパク質Ａ／Ｉｇ又はレクチン／糖質が挙げられる。
【００２７】
本明細書で使用されるように、「天然同位体存在比」とは、自然界における１つ又は複数の同位体の天然の存在に基づいて化合物中に見出される１つ以上の同位体の量（又は分布）を指す。例えば、生きている植物から得られる天然化合物は、典型的には１２Ｃに対して約１．０８％の１３Ｃを含有することができる。
【００２８】
本明細書で使用されるように、「アミノ酸」とは、−ＮＨ−ＣＨＲ＃−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒは＃、水素、重水素、脂肪族基、置換脂肪族基、芳香族基又は置換芳香族基である）で表される基を指す。「天然アミノ酸」は、自然界に見出される。例としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リシン、オルニチン、プロリン、ヒドロキシプロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニン及びヒスチジンが挙げられる。幾つかの実施形態において、Ｒ＃は、天然アミノ酸の側鎖であり得る。天然アミノ酸側鎖の例としては、メチル（アラニン）、イソプロピル（バリン）、ｓｅｃ−ブチル（イソロイシン）、−ＣＨ２ＣＨ（−ＣＨ３）２（ロイシン）、ベンジル（フェニルアラニン）、ｐ−ヒドロキシベンジル（チロシン）、−ＣＨ２−ＯＨ（セリン）、−ＣＨＯＨＣＨ３（トレオニン）、−ＣＨ２−３−インドイル（トリプトファン）、−ＣＨ２ＣＯＯＨ（アスパラギン酸）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ（グルタミン酸）、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２（アスパラギン）、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２（グルタミン）、−ＣＨ２ＳＨ（システイン）、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３（メチオニン）、−（ＣＨ２）４ＮＨ２（リシン）、−（ＣＨ２）３ＮＨ２（オルニチン）、−｛（ＣＨ）２｝４ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２（アルギニン）及び−ＣＨ２−３−イミダゾイル（ヒスチジン）が挙げられる。
【００２９】
他の天然アミノ酸の側鎖は、ヘテロ原子含有官能基、例えば、アルコール（セリン、チロシン、ヒドロキシプロリン及びトレオニン）、アミン（リシン、オルニチン、ヒスチジン及びアルギニン）、チオール（システイン）又はカルボン酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）を含有する。ヘテロ原子含有官能基が修飾されて保護基を含有する場合には、側鎖は、アミノ酸の「保護側鎖」と呼ばれる。幾つかの実施形態において、ＲＷは、アミノ酸の保護側鎖である。
【００３０】
適当な保護基の選択は、保護される官能基、保護基が暴露される条件及び分子中に存在し得るその他の官能基に依存する。上記で論じた官能基に適した保護基は、当該技術において周知であり、多数の例が、Ｇｒｅｅｎｅ及びＷｕｔｓ、“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９１）に記載されている。当業者は、日常実験のみを使用して、開示された合成で使用するのに適した保護基（例えば、以下に記載の保護基以外の保護基）及び、保護基を適用し除去する条件を選択することができる。
【００３１】
本明細書で使用されるように、「ペプチド」とは、アミド（ペプチド）結合により一緒に連結された２個以上のアミノ酸を含有するポリマーを指す。
【００３２】
本明細書で使用されるように、「場合により置換される」及び「置換又は非置換」という用語は、同意義である。
【００３３】
本明細書で使用されるように、ハロ基とは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、又は−Ｉを指す。
【００３４】
本明細書で使用されるように、「アルキル」という用語は、直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ２０炭化水素又は完全に飽和されている環状Ｃ３−Ｃ２０炭化水素を指す。本明細書で使用される場合に、「アルキル」という用語は、置換されていてもよいし又は置換されていなくてもよい基を指す。幾つかの実施形態において、アルキルは、直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ６炭化水素又は完全に飽和されている環状Ｃ３−Ｃ６炭化水素であり得る。
【００３５】
本明細書で使用されるように、「アルキレン」という用語は、場合により置換されていてもよく且つ少なくとも２つの部分に対して少なくとも２つの結合点を有する直鎖又は分岐アルキル鎖又は環状アルキル（例えば、｛−ＣＨ２−、メチレン｝、−｛ＣＨ２ＣＨ２−、エチレン｝、
【００３６】
【化２７】
2009526998.tif 000004
など、この場合の括弧は、結合点を示す）を指す。本明細書で使用される場合には、「アルキレン」という用語は、置換されていてもよいし又は置換されていなくてもよい基を指す。
【００３７】
本明細書で使用されるように、「アルケニル」という用語は、１個以上の二重結合を有する直鎖又は分岐Ｃ２−Ｃ２０炭化水素又は環状Ｃ３−Ｃ２０炭化水素を指す。本明細書で使用される場合には、「アルケニル」という用語は、置換されることができ又は非置換であることができる基を指す。幾つかの実施形態において、アルケニル基は、１個以上の二重結合を有する直鎖又は分岐Ｃ２−Ｃ６炭化水素又は環状Ｃ３−Ｃ６炭化水素であり得る。
【００３８】
本明細書で使用されるように、「アルケニレン」という用語は、少なくとも２つの部分に対する２つの結合点を有するアルケニル基を指す。本明細書で使用される場合に、「アルケニレン」という用語は、置換されていてもよく又は置換されていなくてもよい基を指す。
【００３９】
本明細書で使用されるように、「アルキニル」という用語は、１個以上の三重結合を有する直鎖又は分岐Ｃ２−Ｃ２０炭化水素又は環状Ｃ３−Ｃ２０炭化水素を指す。本明細書で使用される場合には、「アルキニル」という用語は、置換されることができ又は非置換であることができる基を指す。幾つかの実施形態において、アルキニル基は、１個以上の三重結合を有する直鎖又は分岐Ｃ２−Ｃ６炭化水素又は環状Ｃ３−Ｃ６炭化水素であり得る。
【００４０】
本明細書で使用されるように、「アルキニレン」という用語は、少なくとも２つの部分に対する２つの結合点を有するアルキニル基を指す。本明細書で使用される場合に、「アルキニレン」という用語は、置換されていてもよく又は置換されていなくてもよい基を指す。
【００４１】
本明細書で使用されるように、「脂肪族」という用語は、上記で定義したような直鎖、分岐又は環状のアルキル、アルケニル、及びアルキニル部分のいずれかを指す。本明細書で使用される場合に、「脂肪族」という用語は、置換されていてもよく又は置換されていなくてもよい基を指す。
【００４２】
本明細書で使用されるように、「ヘテロアルキル」という用語は、アルキル鎖の１個以上のメチレン基が−Ｏ−、−Ｓ−、及び−ＮＲ−などのヘテロ原子で置換されているアルキル基を指す。Ｒは、水素、重水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、又はヘテロシクロアルキルであることができる。本明細書で使用される場合には、「ヘテロアルキル」という用語は、置換されることができ又は非置換であることができる基を指す。
【００４３】
本明細書で使用されるように、「ヘテロアルキレン」という用語は、式−｛（アルキレン−Ｘ’）ｒ−アルキレン｝−（式中、Ｘ’は、それぞれの出現について、−Ｏ−、−ＮＲ−、又は−Ｓ−であり；及びｒは１〜１０の整数である）を有する基を指す。本明細書で使用される場合には、「ヘテロアルキレン」という用語は、置換されることができ又は非置換であることができる基を指す。幾つかの実施形態において、ｒは１〜５の整数であることができる。
【００４４】
本明細書で使用されるように、「アザアルキレン」という用語は、少なくとも１個のＸ’が−ＮＲ−であるヘテロアルキレンを指す。本明細書で使用される場合には、「アザアルキレン」という用語は、置換されることができ又は非置換であることができる基を指す。
【００４５】
「アリール」という用語は、本明細書で使用されるように、単独で又は別の部分（例えば、アリールアルキルなど）の一部として、フェニルなどの炭素環式芳香族基を指す。また、アリール基としては、炭素環式芳香族環が別の炭素環式芳香族環（例えば、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントラシル、２−アントラシルなど）に縮合しているか又は炭素環式芳香族環が１個以上の炭素環式非芳香族環（例えば、テトラヒドロナフチレン、インダン、など）に縮合している縮合多環式芳香族環系を挙げることができる。本明細書で使用される場合に、「アリール」という用語は、置換されていてもよく又は置換されていなくてもよい基を指す。
【００４６】
本明細書で使用されるように、「アリーレン」という用語は、少なくとも２つの部分に対する少なくとも２つの結合点を有するアリール基（例えば、フェニレンなど）を指す。炭素環式非芳香族環に縮合されるアリーレンの結合点は、芳香族環又は非芳香族環上であり得る。本明細書で使用されるように、「アリーレン」という用語は、置換されていてもよく又は置換されていなくてもよい基を指す。
【００４７】
本明細書で使用されるように、「アリールアルキル」という用語は、別の部分にアルキレンリンカーを介して結合されているアリール基を指す。本明細書で使用されるように、「アリールアルキル」という用語は、置換されていてもよく又は置換されていなくてもよい基を指す。
【００４８】
本明細書で使用されるように、「アリールアルキレン」という用語は、少なくとも２つの部分に対する少なくとも２つの結合点を有するアリールアルキル基を指す。第二の結合点は、芳香族環又はアルキレン上であり得る。本明細書で使用されるように、「アリールアルキレン」という用語は、置換されていてもよく又は置換されていなくてもよい基を指す。アリールアルキレンが置換される場合には、置換基は、芳香族環又はアリールアルキレンのアルキレン部分上のいずれか又は両方であり得る。
【００４９】
本明細書で使用されるように、「ヘテロアリール」という用語は、窒素、硫黄及び酸素から独立して選択される１個、２個、３個又は４個のヘテロ原子を含有する芳香族複素環を指す。本明細書で使用されるように、「ヘテロアリール」という用語は、置換されていてもよく又は置換されていなくてもよい基を指す。ヘテロアリールは、１個又は２個の環、例えばシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールに縮合していてもよい。分子に対するヘテロアリールの結合点は、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル又はアリール環上にあり得、ヘテロアリール基は、炭素又はヘテロ原子を介して結合し得る。ヘテロアリール基は、置換されていてもよく又は置換されていなくてもよい。ヘテロアリール基の例としては、イミダゾリル、フリル、ピロリル、チエニル、オキサゾリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、ピリジニル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、キノリル、イソキノリニル、インダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチアゾリル、インドリジニル、イミダゾピリジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、テトラゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、インドリル、テトラヒドロインドリル、アザインドリル、イミダゾピリジル、キナゾリニル、プリニル、ピロロ［２，３］ピリミジル、ピラゾロ［３，４］ピリミジル又はベンゾ（ｂ）チエニルが挙げられ、これらのそれぞれは場合により置換される。
【００５０】
本明細書で使用されるように、「ヘテロアリーレン」という用語は、少なくとも２つの部分に対する少なくとも２つの結合点を有するヘテロアリール基を指す。本明細書で使用されるように、「ヘテロアリーレン」という用語は、置換されていてもよく又は置換されていなくてもよい基を指す。
【００５１】
本明細書で使用されるように、「アザアリーレン」という用語は、ヘテロ原子の一つが窒素であるヘテロアリーレンを指す。アザアリーレンはまた、１個、２個又は３個の非窒素ヘテロ原子、例えばＳ及びＯを含有していてもよい。本明細書で使用されるように、「アザアリーレン」という用語は、置換されていてもよく又は置換されていなくてもよい基を指す。
【００５２】
本明細書で使用されるように、「ヘテロアリールアルキル」という用語は、別の部分にアルキレンリンカーを介して結合されているヘテロアリール基を指す。本明細書で使用されるように、「ヘテロアリールアルキル」という用語は、置換されていてもよく又は置換されていなくてもよい基を指す。
【００５３】
本明細書で使用されるように、「ヘテロアリールアルキレン」という用語は、少なくとも２つの部分に対する少なくとも２つの結合点を有するヘテロアリールアルキル基を指す。第２の結合点は、芳香族複素環又はアルキレン上のいずれかであり得る。本明細書で使用されるように、「ヘテロアリールアルキレン」という用語は、置換されていてもよく又は置換されていなくてもよい基を指す。ヘテロアリールアルキレンが置換される場合には、置換基は、ヘテロアリールアルキレンの芳香族化複素環又はアルキレン部分上のいずれか又は両方であり得る。
【００５４】
本明細書で使用されるように、「ヘテロシクロアルキル」という用語は、１個以上の酸素、窒素又は硫黄を含有する非芳香族環（例えば、モルホリン、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、及びチオモルホリン）を指す。本明細書で使用されるように、「ヘテロシクロアルキル」という用語は、置換されていてもよく又は置換されていなくてもよい基を指す。
【００５５】
本明細書で使用されるように、「ヘテロシクロアルキレン」という用語は、少なくとも２つの部分に対する少なくとも２つの結合点を有するヘテロシクロアルキルを指す。本明細書で使用されるように、「ヘテロシクロアルキレン」という用語は、置換されていてもよく又は置換されていなくてもよい基を指す。
【００５６】
本明細書で使用されるように、「アザシクロアルキレン」という用語は、１個のヘテロ原子が窒素であるヘテロシクロアルキレンを指す。アザシクロアルキレンはまた、１個、２個又は３個の非窒素ヘテロ原子、例えばＳ及びＯを含有していてもよい。本明細書で使用されるように、「アザシクロアルキレン」という用語は、置換されていてもよく又は置換されていなくてもよい基を指す。
【００５７】
アルキル、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキル、ヘテロアルキレン、アザアルキレン、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、アザシクロアルキレン、アリール、アリーレン、アリールアルキル、アリールアルキレン、ヘテロアリール、ヘテロアリーレン、アザアリーレン、ヘテロアリールアルキル、及びヘテロアリールアルキレン基に適した置換基としては、本発明の質量標識を用いて分析物を標識するのに使用される反応条件下で安定である置換基が挙げられる。アルキル、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキル、ヘテロアルキレン、アザアルキレン、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、アザシクロアルキレン、アリール、アリーレン、アリールアルキル、アリールアルキレン、ヘテロアリール、ヘテロアリーレン、アザアリーレン、ヘテロアリールアルキル、及びヘテロアリールアルキレンの置換基の例としては、重水素、アリール（例えば、フェニル）基、アリールアルキル（例えば、ベンジル）基、ニトロ基、シアノ基、ハロ（例えば、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素）基、アルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、シクロヘキシル、など）基、ハロアルキル（例えば、トリフルオロメチル）基、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、など）基、ヒドロキシ基、−ＮＲＷＲＷ、−ＮＲＷＣ（Ｏ）ＲＯ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＷＲＷ、−Ｃ（Ｏ）ＲＷ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＷが挙げられ、それぞれのＲＷは、独立して、水素、重水素、アルキル、アリール、又はアリールアルキルであり；及びそれぞれの出現するＲＯは、独立して、アルキル、アリール、又はアリールアルキルである。また、アリール、アリーレン、ヘテロアリール又はヘテロアリーレンの置換基は、親和性リガンドを含有する基であるか又は固体支持体を含有する基であり得る。
【００５８】
さらに、アルキル、アルキレン、ヘテロアルキル、ヘテロアルキレン、アザアルキレン、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、アザシクロアルキレン基、並びにアルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、アリールアルキル、アリールアルキレン、ヘテロアリールアルキル、及びヘテロアリールアルキレン基の飽和部分は、＝Ｏ、＝Ｓ、＝Ｎ−ＲＷで置換されていてもよい。
【００５９】
ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、ヘテロアリール、ヘテロアリーレン、ヘテロアリールアルキル、又はヘテロアリールアルキレン基が窒素原子を含有する場合には、これらの基は、置換されていてもよいし又は置換されていなくてもよい。ヘテロアリール基の芳香族環の窒素原子が置換基を有する場合には、窒素は、四級窒素であってもよい。
【００６０】
脂肪族基、非芳香族複素環式基、ベンジル基、アリール基環炭素及びヘテロアリール環炭素に適した置換基は、開示化合物の反応性基の標識反応を実質的に妨害しない基である。適当な置換基の例としては、重水素、−ＯＨ、ハロゲン（−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ）、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−ＳＲａ、−Ｃ（Ｓ）Ｒａ、−ＯＣ（Ｓ）Ｒａ、−Ｃ（Ｓ）ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲａ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲａ、−Ｓ（Ｏ）Ｒａ、−ＳＯ２Ｒａ、−ＳＯ３Ｒａ、−ＰＯ２ＲａＲｂ、−ＰＯ３ＲａＲｂ、−ＯＰＯ３ＲａＲｂ、−Ｎ（ＲａＲｂ）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲａＲｂ）、−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＮＲｂＳＯ２Ｒｃ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＳＯ２Ｒｃ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＣＮ、−ＳＯ２Ｎ（ＲａＲｂ）、−ＮＲａＳＯ２Ｒｃ、−ＮＲｃＣ（Ｏ）Ｒａ、−ＮＲｃＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＮＲｃＣ（Ｏ）Ｎ（ＲａＲｂ）、−Ｃ（ＮＲｃ）−Ｎ（ＲａＲｂ）、−ＮＲｄ−Ｃ（ＮＲｃ）−Ｎ（ＲａＲｂ）、−ＮＲａＮ（ＲａＲｂ）、−ＣＲｃ＝ＣＲａＲｂ、−Ｃ≡ＣＲａ、＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＣＲａＲｂ、＝ＮＲａ、＝ＮＯＲａ、＝ＮＮＲａ、場合により置換されるアルキル基、場合により置換されるシクロアルキル基、場合により置換される脂肪族基、場合により置換される脂環式基、場合により置換される非芳香族複素環式基、場合により置換されるベンジル基、場合により置換されるアリール基、及び場合により置換されるヘテロアリール基を挙げることができ、この場合のＲａ〜Ｒｄは、それぞれ独立して、−Ｈ、重水素（Ｄ）、あるいは場合により置換される脂肪族基、場合により置換される脂環式基、場合により置換される非芳香族複素環式基、場合により置換されるベンジル基、場合により置換されるアリール基、又は場合により置換されるヘテロアリール基、好ましくはアルキル基、ベンジル基又はフェニル基である。また、−Ｎ（ＲａＲｂ）は、一緒になって、場合により置換される複素環式基であることができる。
【００６１】
非芳香族複素環式基、ベンジル基又はアリール基はまた、置換基として脂肪族基又は置換脂肪族基を有することもできる。置換脂肪族基はまた、置換基として非芳香族複素環、置換非芳香族複素環、ベンジル基、置換ベンジル基、アリール基又は置換アリール基を有することもできる。置換脂肪族基、非芳香族複素環式基、置換アリール基、又は置換ベンジル基は、２個以上の置換基を有することができる。
【００６２】
他のヘテロアリール環原子に対して３個の共有結合を有するヘテロアリール環窒素原子に適した置換基としては、−ＯＨ及び低級アルコキシ（好ましくは、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ）が挙げられる。他のヘテロアリール環原子に対して３個の共有結合を有する置換ヘテロアリール環窒素原子は、正に帯電し、これは対アニオン、例えばクロリド、ブロミド、ギ酸塩、酢酸塩などで釣り合わせることができる。他の適当な対アニオンの例は、薬学的に許容し得る塩に関して以下の欄で提供される。
【００６３】
他の原子に対して２個の共有結合を有する窒素原子（例えば、他の環原子に対して２個の共有結合を有するヘテロアリール環窒素原子）に適した置換基としては、例えば、場合により置換されるアルキル基、場合により置換されるシクロアルキル基、場合により置換される脂肪族基、場合により置換される脂環式基、場合により置換される複素環式基、場合により置換されるベンジル基、場合により置換されるアリール基、場合により置換されるヘテロアリール基、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−ＳＲａ、−Ｓ（Ｏ）Ｒａ、−ＳＯ２Ｒａ、−ＳＯ３Ｒａ、−Ｎ（ＲａＲｂ）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲａＲｂ）、−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＮＲｂＳＯ２Ｒｃ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＳＯ２Ｒｃ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＣＮ、−ＳＯ２Ｎ（ＲａＲｂ）、−ＳＯ２Ｎ（ＲａＲｂ）、−ＮＲｃＣ（Ｏ）Ｒａ、−ＮＲｃＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＮＲｃＣ（Ｏ）Ｎ（ＲａＲｂ）などが挙げられる。さらに典型的には、他の原子に対して２個の共有結合を有する窒素原子の置換基は、アルキル、置換アルキル（例えば、ハロアルキル）、フェニル、置換フェニル、−Ｓ（Ｏ）２−（アルキル）、−Ｓ（Ｏ）２−ＮＨ（アルキル）及び−Ｓ（Ｏ）２−ＮＨ（アルキル）２であることができる。
【００６４】
窒素含有ヘテロアリール又は非芳香族複素環は、酸素で置換して、例えばピリジル  Ｎ−オキシド、ピペリジル  Ｎ−オキシドなどにおけるようにＮ−オキシドを形成することができる。
【００６５】
本明細書で使用されるように、「塩形態」という用語は、化合物（標識試薬）の塩、又は化合物の塩の混合物を包含する。また、化合物の双性イオンの形もまた、「塩形態」という用語に包含される。アミン基、又はその他の塩基性基を有する質量標識の塩は、例えば適当な有機酸又は無機酸、例えば塩化水素、臭化水素、酢酸、過塩素酸などと反応させることによって得ることができる。四級アンモニウム基を有する化合物もまた、対アニオン、例えばクロリド、ブロミド、ヨージド、酢酸塩、過塩素酸塩、などを含有し得る。カルボン酸、又は他の酸性官能基を有する化合物の塩は、該化合物を適当な塩基、例えば、水酸化物塩基と反応させることによって調製することができる。従って、酸性官能基を有する塩は、対アニオン、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどを有し得る。
【００６６】
「水和物形態」という用語は、化合物の水和状態又は化合物の２以上の水和状態の混合物を含む。本発明の質量標識は、半水和物、一水和物、二水和物などであることができる。
【００６７】
３．総括
要旨
反応性基：
前記の方法、混合物、キット及び／又は組成物の実施形態で使用される１つ又は複数の標識試薬の変数「ＲＧ」は、反応性基、例えば試料の１つ以上の反応性分析物と反応することができる求電子性基又は求核性基であるか、あるいは該反応性基と該分析物との反応生成物であるかいずれかであり得る。反応性基は、予め存在させることができるし、又はその場で調製することができる。幾つかの実施形態において、反応性基のその場での調製は、反応性分析物の不在下で進めることができるし、幾つかの実施形態においては反応性分析物の存在下で進めることができる。例えば、カルボン酸基は、水溶性カルボジイミド〔例えば、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩；ＥＤＣ〕を用いてその場で修飾し、それによってアミノ基などの求核性基と反応させることができる救電子性基を調製することができる。幾つかの実施形態において、標識試薬のカルボン酸基のＥＤＣによる活性化は、アミン（求核性基）含有分析物の存在下で行うことができる。幾つかの実施形態において、アミン（求核性基）含有分析物はまた、ＥＤＣとの初期反応を行った後に加えることもできる。幾つかの実施形態において、反応性基は、保護基をその場で除去することによってその場で生成させることができる。その結果、存在するか又は新たに作成される１つ又は複数の試薬であって、求核性基及び／又は求電子性基の反応によって分析物の誘導体化を行うことができる試薬は、本発明の方法、混合物、キット及び／又は組成物の実施形態によって意図される。
【００６８】
標識試薬の反応性基が求電子性基である場合には、該反応性基は、１つ又は複数の分析物の適当な求核性基と反応することができる。標識試薬の反応性基が求核性基である場合には、該反応性基は、１つ又は複数の分析物の適当な救電子性基と反応することができる。適当な求核性基と救電子性基の多数の対が知られており、化学及び生化学技術において使用される場合が多い。分析物（例えば、タンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、糖質、脂質、ステロイド、又は１，５００ダルトン未満のその他の小分子など）に結合させてその誘導体化を行うことができる適当な求核性基又は求電子性基を含有する試薬の非限定的な例は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＆  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ａ  Ｐｅｒｓｔｏｒｐ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ），Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ６１１０５，ＵＳＡ）に記載されている。他の適当な試薬は、当該技術において周知であり、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈなどの多数の製造供給業者から市販されている。
【００６９】
標識試薬の反応性基は、アミン反応性基であることができる。例えば、アミン反応性基は、活性エステルであることができる。活性エステルとは、ペプチド合成において周知であり、ペプチド合成において一般的に使用される条件下でアミノ酸のＮ−αアミンと容易に反応するある種のエステルを指す。アミン反応性の活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、２−ニトロフェニルエステル、４−ニトロフェニルエステル、２，４−ジニトロフェニルエステル、又は２，４−ジハロフェニルエステルであることができる。
【００７０】
図８は、それぞれのＧが独立してＯ又はＳであり、典型的にはＯである活性エステルのアルコール基又はチオール基の脱離基（ＬＧ）の典型的な式を例証する。これらの基は全て、ペプチド化学の分野において活性エステル類を形成することが知られているアルコール基又はチオール基であり、前記のアルコール基又はチオール基は、アミノ酸のＮ−α−アミンとエステルのカルボニル炭素との反応によって置換される。本明細書に記載の適当な標識試薬の活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）は、周知の方法を使用して調製できることは明らかであろう〔Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６）．“Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ”ｉｎ“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”Ｃｈａｐｔｅｒ  ２  ｐａｇｅｓ  １３７−１６５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（ＮｅｗＹｏｒｋ）参照；またＩｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  Ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｅｄｉｔｏｒ：Ｒｏｇｅｒ  Ｅｐｔｏｎ，ＳＰＣＣ（ＵＫ）Ｌｔｄ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，１９９０も参照〕。一般式：ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧの標識試薬の代表的な例であるモルホリン酢酸、ピペリジン酢酸、ピペラジン酢酸及びＮ−置換ピペラジン酢酸化合物の活性エステルの形成方法は、２００４年１月２７日付けで出願された同時継続中で共有の米国特許出願第１０／７５１，３５４号明細書に記載されており、その全ての教示は、本明細書において全ての目的に参照することにより援用される。
【００７１】
幾つかの実施形態において、標識試薬の反応性基は、混合した無水物がアミン基と効果的に反応し、それによってアミド結合を生成することが知られていることから、混合した無水物であり得る。
【００７２】
標識試薬の反応性基は、チオール反応性基であり得る。例えば、チオール反応性基は、マレイミド、ハロゲン化アルキル、α−ハロ−アシルのハロゲン化アリール（ａ．ｋ．ａ．ハロゲン化アシル）であり得る。ハロゲン化物及びハロとは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を指す。幾つかの実施形態において、基ＲＧは、Ｉ−（ＣＨ２）Ｃ（Ｏ）−である。
【００７３】
標識試薬の反応性基は、ヒドロキシル反応性基であり得る。例えば、ヒドロキシル反応性基は、ハロゲン化トリチル、又はハロゲン化シリル反応性部分であり得る。ハロゲン化トリチル反応性部分は、置換することができ（例えば、Ｙ−メトキシトリチル、Ｙ−ジメトキシトリチル、Ｙ−トリメトキシトリチルなど）又は非置換であることができ、この場合のＹは以下で定義される。シリル反応性部分は、アルキル置換シリルハライド、例えばＹ−ジメチルシリル、Ｙ−ジトリエチルシリル、Ｙ−ジプロピルシリル、Ｙ−ジイソプロピルシリルなどであり得、この場合のＹは以下で定義される。
【００７４】
標識試薬の反応性基は、求核性基であり得る。幾つかの実施形態において、基ＲＧは、アミン基、ヒドロキシル基、チオール基又は−ＮＨ−ＮＨ２基であり、さらに典型的にはアミン基、ヒドロキシル基、水酸基、又はチオール基である。
【００７５】
反応性基は、分析物のグアニジン基と反応することができる基であり得る。幾つかの実施形態において、基ＲＧは、
【００７６】
【化２８】
2009526998.tif 000005
である。
【００７７】
反応性基は、光反応性基であり得る。幾つかの実施形態において、基ＲＧは、
【００７８】
【化２９】
2009526998.tif 000006
である。
【００７９】
幾つかの実施形態において、本発明の標識試薬は、２個以上の基ＲＧを含有する。従って、式ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−（Ｙ−ＲＧ）ｙ（式中、ｙは１〜３である）の標識試薬が提供される。幾つかの実施形態において、ｙは２である。
【００８０】
レポーター部分：
方法、混合物、キット及び／又は組成物の実施形態において使用される１つ又は複数の標識試薬のレポーター部分は、測定できる固有の質量（又は質量電荷比）を有する基である。従って、１つのセットのそれぞれのレポーターは、固有の総質量を有することができる。異なるレポーターは、その固有の質量を達成するために１つ以上の重原子同位体を含有することができる。例えば、炭素の同位体（１２Ｃ、１３Ｃ、及び１４Ｃ）、窒素の同位体（１４Ｎ及び１５Ｎ）、酸素の同位体（１６Ｏ及び１８Ｏ）、又は水素の同位体（水素、重水素、及び三重水素）が存在し、レポーター部分の種々の基の調製に使用できる。安定な重原子同位体の例としては、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ及び重水素が挙げられる。標識試薬の費用は、軽減することができ、同素体純度は、試薬中の１８Ｏを避けることによって高めることができる。同位体のこれらの例は、他の軽原子同位体及び重原子同位体もまたレポーターに使用できることから、限定されない。軽原子同位体及び重原子同位体を含有するレポーターを調製するのに適した基本出発原料は、種々の商業的供給源、例えばＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ（ｗｗｗ．ｉｓｏｔｏｐｅ．ｃｏｍでのリスト又は「基本出発原料」参照）及びＩｓｏｔｅｃ（ａ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から入手できる。Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＩｓｏｔｅｃはまた、注文合成契約の下で所望の化合物も調製するであろう。同上（Ｉｄ）。
【００８１】
固有のレポーターは、興味のある試料と結合し、それによってその試料の１つ又は多数の分析物を、前記レポーターを含有する標識試薬で標識することができる。このようにして、レポーターに関する情報は、試料の分析物の１つ又は全部に関する情報と関係付けることができる。しかし、レポーターは、レポーターを測定する場合に、分析物に物理的に連結する必要はない。むしろ、レポーターの固有の総質量は、例えば、標識分析物のイオンをフラグメント化してそれによって娘フラグメントイオン及び検出可能なレポーターを生成させた後に、タンデム質量分析器の第２の質量分析において測定することができる。測定されたレポーターは、測定される分析物が由来する試料を同定するのに使用できる。さらに、他のレポーターに対するか、あるいは１つ以上の較正標準（例えば、特定のレポーターで標識された分析物）に対する固有のレポーターの量は、１つ又は複数の試料中の分析物の相対量又は絶対量（多くの場合、濃度及び／又は量として表される）を測定するのに使用できる。従って、情報、例えば特定の試料中の１つ以上の分析物の量を、それぞれの特定の試料を標識するのに使用されるレポーター部分と関連付けることができる。１つ又は複数の分析物の同一性も測定する場合には、その情報を異なるレポーターに関連する情報と相関させ、それによって１つ又は複数の試料中のそれぞれの標識分析物の同一性及び量の測定を促進させることができる。
【００８２】
レポーターは、固定電荷を含有するか、又はイオン化されることができる。レポーターが固定電荷を含有するか又はイオン化されることができることから、標識試薬は、塩又は双性イオンの形で反応性分析物を単離し得、又は標識するのに使用し得る。レポーターのイオン化は、質量分析計での該レポーターの測定を促進する。従って、レポーターは、イオン〔時には特徴的イオン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｉｏｎ）とも呼ばれる〕として測定することができる。イオン化した場合に、レポーターは、１つ以上の正味の正電荷又は負電荷を含有することができる。従って、レポーターは、１つ以上の酸性基又は塩基性基を含有することができる。その理由は、このような基が、質量分析計内で容易にイオン化し得るからである。例えば、レポーターは、１つ以上の塩基性窒素原子（正荷電）を含有するか、あるいは１つ以上のイオン化し得る酸性基、例えばカルボン酸基、スルホン酸基又はリン酸基（負電荷）を含有することができる。幾つかの実施形態において、レポーターは、置換又は非置換ベンジルイオンを含有することができる。
【００８３】
レポーターは、分析物の分析に典型的な条件下で、実質的にサブフラグメント化しないように選択することができる。レポーターは、質量分析計において標識分析物の選択イオンの少なくとも一部の二つの結合Ｘ及びＹのフラグメンテーションを生じさせるために加えられる解離エネルギーの条件下で実質的にサブフラグメント化しないように選択することができる。「実質的にサブフラグメント化しない」とは、レポーターのフラグメントが、興味のある分析物の良好な分析に適用された場合に、バックグラウンドノイズよりも高く検出することが困難であるか又は不可能であることを意味する。レポーターの総質量は、測定しようとする分析物の質量又は分析物の予測されるフラグメントのいずれかと比較して、異なるように意図的に選択することができる。例えば、タンパク質又はペプチドが分析物である場合には、レポーターの総質量は、任意の天然アミノ酸又はペプチド、あるいはこれらの予測されるフラグメントと比較して異なるように選択することができる。このことは、分析物の測定を促進することができる。なぜなら、分析物に依存して、同じ一致質量を有する試料の任意の可能な成分の欠如が任意の分析の結果に対して信頼性を加えることができることからである。バックグラウンドがペプチドについてほとんど予測できない質量範囲の例は、表１において認めることができる。
【００８４】
表１：標識フラグメントイオンｍ／ｚの選択について可能な「クワイエット・ゾーン（ｑｕｉｅｔ  ｚｏｎｅ）」
【００８５】
【表１】
2009526998.tif 000007
レポーターの総質量は、２５０ダルトン未満であり得る。このような小分子は、第２の質量分析で容易に測定することができ、第１の質量分析において同じ一致質量を有する試料の他の成分を含有しない。この文脈において、第２の質量分析は、典型的にはタンデム質量分析計で、第１の質量分析で測定される選択イオンについて行うことができる。特定の質量電荷比のイオンは、可能なフラグメンテーション及びさらなる質量分析のために第１の質量分析から特異的に選択することができるので、第１の質量分析からの非選択イオンは、第２の質量分析に繰り越されず、従って第２の質量分析のスペクトラムに悪影響を及ぼさない。さらに、質量分析計の感度及び検出器の直線性（定量のために）は、この低い質量範囲においてかなりしっかりした（ｒｏｂｕｓｔ）ものであり得る。さらに、質量分析計の技術の現状は、この質量範囲で１ダルトン未満の基準質量解像度を可能にし得る。これらの因子は、当該技術の状態に対して有用な前進であると判明し得る。
【００８６】
リンカー部分：
方法、混合物、キット及び／又は組成物の実施形態について使用される化合物のＬＫ、ＬＫ１、ＬＫ２、ＬＫ３、ＬＫ４、ＬＫ５及びＬＫ６で表されるリンカー部分は、分析物との反応が生じたか否かに応じて、レポーターを分析物に結合させるか、又はレポーターを反応基に連結する。リンカーは、二つの結合Ｘ及びＹがフラグメント化される（すなわち、二つの結合Ｘ及びＹのフラグメンテーションの際にニュートラルロスを受ける）場合に、中性種を生成するために選択することができる。リンカーは、カルボニル基又はチオカルボニル基などの極めて小さな部分であり得る。例えば、リンカーは、少なくとも１個の重原子同位体を含有することができ且つ式：
【００８７】
【化３０】
2009526998.tif 000008
（式中、それぞれのＲ１は、同一であるか又は異なり、１〜８個の炭素原子を含有するアルキル基であって場合によりヘテロ原子あるいは置換又は非置換アリール基を含有していてもよいアルキル基であり、前記アルキル基及びアリール基の炭素原子は、独立して、連結された水素原子、重水素、及び／又はフッ素原子を含有する）
を含有することができる。リンカーは、アミノ酸又はヘテロアルキルなどの大きな部分であり得る。リンカーは、ポリマー又は生体高分子（例えば、ペプチド）であり得る。リンカーは、解離エネルギーレベル、例えばサブフラグメンテーションに暴露された場合にサブフラグメント化し、それによってリンカーの１個以上の中性フラグメントを生成するように設計することができる。幾つかの実施形態において、中性のフラグメントのみが、リンカーから生成される。
【００８８】
図９Ａ〜９Ｂは、幾つかの実施形態において基ＬＫが含有し得る部分ｉ〜ｘｉｖを表す。波線で終わるそれぞれの結合は、レポーター、支持体、反応性基又は分析物に対する結合点を示す。リンカー部分は、その質量が、混合物のそれぞれの標識分析物について、又あるいは試薬のセット及び／又はキットについてのレポーター同士の間の総質量の相違を補正するように、１種以上の重原子同位体を含有することができる。さらに、レポーター−リンカーの組み合わせの総計総質量（ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｇｒｏｓｓ  ｍａｓｓ）（すなわち、全体として得られる総質量）は、混合物のそれぞれの標識分析物について、あるいはセット及び／又はキットの試薬について同じであることができる。さらに具体的には、リンカー部分は、複数の異なる試料からの標識分析物のレポーター同士の間の総質量の相違を補正することができ、この場合に、レポーターの固有の総質量は、標識分析物が由来する試料と関連があり且つレポーター−リンカーの組み合わせの合計総質量は、それが由来する試料に関わりなく試料混合物のそれぞれの標識分析物について同一である。このようにして、２つ以上の異なる試料中の同じ分析物の総質量は、標識され、次いで試料混合物を生成させるために混合される場合には、同じ総質量を有することができる。
【００８９】
例えば、標識分析物又は分析物を標識するための１つのセット及び／又はキットの標識試薬（例えば、質量標識）は、異性体又は同重体であり得る。従って、特定の質量電荷比のイオン（試料混合物から得られる）が、質量分析計において試料混合物の初期質量分析から選択される（すなわち、選択イオン）場合には、試料混合物を構成する別の試料由来の同じ分析物同士は、これらの試料混合物中の濃度及び／又は量に比例して選択イオンで表される。従って、リンカーは、レポーターを分析物に連結するばかりではなく、固有のレポーター部分の異なる質量を補正するのにも役立ち得、それによって種々の試料の標識分析物中のレポーター−リンカーの組み合わせの総質量を調和させる。
【００９０】
リンカーは、レポーター−リンカーの組み合わせの総計総質量が１つのセット又はキットの全ての試薬について同一であるように、標識試薬においてレポーターの質量バランスとして働き得ることから、リンカーの原子の数が多ければ多いほど、１つのセット及び／又はキットの異なる異性体／同重体標識試薬の可能な数が多い。別の言い方をすれば、一般に、リンカーが含有する原子の数が多ければ多いほど、存在する潜在的なレポーター−リンカーの組み合わせの数が多い。なぜならば、同位体は、多くてもリンカーの任意の位置で置換することができ、それによってリンカー部分の異性体又は同重体を生成するからであり、この場合にはリンカー部分はレポーター部分の異なる質量を相殺するのに使用され、それによってレポーター−リンカー異性体又は同重体の１つのセットを作成する。このような複数の標識試薬の種々のセットは、同じ試料及び／又は異なる試料中の分析物の多重分析に特によく適している。
【００９１】
１つのセット及び／又はキットの標識試薬の総数は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又はそれ以上である。１つのセット又はキットの標識試薬の多様性は、レポーター及びリンカー部分の原子の数、軽同位体を置換するのに利用できる重原子同位体、並びに同位体を合成的に配置し得る種々の合成的配置によってのみ制限される。しかし、上記で示唆されるように、多数の同位体標識基本出発原料は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＩｓｏｔｅｃなどの製造業者から容易に入手できる。このような同位体標識基本出発原料は、同重体及び異性体標識試薬のセットを製造するのに使用される合成法において使用でき、又は同重体及び異性体標識試薬のセットを製造するのに使用される合成法において使用できる同位体標識出発原料を製造するのに使用できる。標識試薬の１つのセットにおいて使用するのに適した同重体標識試薬の調製の幾つかの例は、以下の実施例の欄において見出すことができる。
【００９２】
レポーター−リンカーの組み合わせ：
本明細書に記載の標識試薬は、結合Ｘを介して連結されるレポーターとリンカーから構成される。上記のように、レポーター−リンカーの組み合わせは、標識試薬の１つのセット及び／又はキットのそれぞれの構成要素について総質量が同じであり得る。さらに、標識試薬のレポーター−リンカーの組み合わせの結合Ｘは、解離エネルギーレベルに供された場合に、選択イオンの少なくとも一部分においてフラグメント化し、それによって分析物からレポーターを放出するように設計することができる。従って、レポーターの総質量（ｍ／ｓ比として）とその強度は、ＭＳ／ＭＳ分析において直接に観察することができる。
【００９３】
レポーター−リンカーの組み合わせは、１つのセット又はキットの種々の標識試薬の中に、同じか又は異なる重原子同位体の種々の組み合わせを含有し得る。科学文献において、これは、時にはコード化又は同位体コード化と呼ばれている。例えば、Ａｂｅｒｓｏｌｄらは、同位体コード化親和性標識（ＩＣＡＴ；  ＷＯ００／１１２０８号明細書を参照）を開示している。１つの態様において、Ａｂｅｒｓｏｌｄらの試薬は、Ａｂｅｒｓｏｌｄが異性体又は同重体標識試薬などの２つ以上の同じ質量の標識試薬を教示していない点で、本発明の標識試薬と異なる。
【００９４】
質量分析計／質量分析法（ＭＳ）
本発明の方法は、タンデム質量分析計と、分子イオンを選択し、フラグメント化する能力を有する他の質量分析計とを使用して実施することができる。タンデム質量分析計（及び低度単段（ｌｅｓｓｅｒ  ｄｅｇｒｅｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔａｇｅ）質量分析計）は、質量電荷（ｍ／ｚ）比に従って分子イオンを選択し、フラグメント化し、次いで得られるフラグメント（娘）イオンスペクトルを記録する能力を有する。さらに具体的には、娘フラグメントイオンスペクトルは、選択イオンを解離エネルギーレベル（例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ））に暴露させることによって生じさせ得る。例えば、特定のｍ／ｚ比の標識ペプチドに対応するイオンは、第１の質量分析から選択し、フラグメント化し、第２の質量分析で再度分析することができる。このようなタンデム質量分析を行うことができる代表的装置としては、以下に限定されないが、扇形４磁場質量分析計、タンデム飛行時間質量分析計、三連四重極質量分析計、イオントラップ質量分析計、及びハイブリッド四重極飛行時間（Ｑ−ＴＯＦ）質量分析計が挙げられる。
【００９５】
これらの種類の質量分析計は、種々のイオン化源、例えば以下に限定されないが、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）及びマトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）と共に使用し得る。イオン化源は、分析物が未だ固定電荷を有してない第１の質量分析のための電荷種を生成させるために使用し得る。追加の質量分析装置及びフラグメンテーション方法としては、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ装置でのポストソース分解及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（飛行時間）−ＴＯＦ  ＭＳを使用する高エネルギーＣＩＤが挙げられる。タンデム質量分析計についての最近の概説については、Ｒ．Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  ａｎｄ  Ｄ．Ｇｏｏｄｌｅｔｔ，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０１：２６９−２９５（２００１）を参照されたい。また、ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析技術の考察について、米国特許第６，３１９，４７６号（あらゆる目的に本明細書において参照することにより援用される）も参照されたい。
【００９６】
解離エネルギーレベルによるフラグメンテーション
結合が質量分析計で生じるプロセスの結果としてフラグメント化することができることが十分に認められるであろう。さらに、結合のフラグメンテーションは、質量分析計においてイオンを解離エネルギーレベルに暴露させることによって誘導し得る。例えば、解離エネルギーレベルは、質量分析計において衝突誘起解離（ＣＩＤ）によって生じさせ得る。質量分析の当業者には、フラグメンテーションを引き起こす解離エネルギーレベルを課すための他の典型的な技術として、以下に限定されないが、光解離、電子捕獲、及び表面誘起解離が挙げられることが認められるであろう。
【００９７】
衝突誘起解離によって結合をフラグメント化する方法は、選択イオンの運動エネルギー状態を結合のフラグメンテーションが生じる点まで高めることを伴う。例えば、運動エネルギーは、衝突セル内で不活性ガス（例えば、窒素、ヘリウム、又はアルゴン）との衝突によって移動させることができる。イオンに移動させることができる運動エネルギーの量は、衝突セルに入ることを許される気体分子の数に比例する。より多くの気体分子が存在する場合には、より多くの量の運動エネルギーを選択イオンに移動させることができ、より少ない気体分子が存在する場合には、より少ない運動エネルギーが移動される。
【００９８】
従って、質量分析計での解離エネルギーレベルを制御できることは明らかである。また、ある種の結合が他の結合よりも不安定であることも十分に認められる。分析物又はレポーター−リンカー部分の結合の不安定性は、分析物又はレポーター−リンカー部分の性質に依存する。従って、解離エネルギーレベルは、分析物及び／又は標識（例えば、レポーター−リンカーの組み合わせ）を、測定可能な方法でフラグメント化させることができるように調整することができる。当業者には、どのようにこのような常用の調整を質量分析計の構成要素について行い、それによって解離エネルギーの適切なレベルを達成し、それによって標識分析物のイオンの少なくとも一部分をイオン化レポーター部分及び娘フラグメントイオンにフラグメント化させることが認められるであろう。
【００９９】
例えば、解離エネルギーは、第１の質量分析から選択／分離されるイオンに加えることができる。タンデム質量分析計では、抽出イオンは、解離エネルギーレベルに暴露させ、次いで第２の質量分析計へ移動させることができる。選択イオンは、選択された質量電荷比を有することができる。質量電荷比は、質量分析計の特性に応じて質量電荷比の範囲内にあり得る。解離誘起解離が使用される場合には、イオンは、解離エネルギーを加え、それによってフラグメントイオンを生じさせることができる衝突セルにイオンを通すことによって、第１の質量分析計から第２の質量分析計に移動させることができる。例えば、分析のために第２の質量分析計に送られるイオンは、残りの（フラグメント化されていない）選択イオンの全部、幾つか、又は一部、並びに標識分析物のレポーターイオン（特徴的イオン）及び娘フラグメントイオンを含有することができる。
【０１００】
コンピュータ支援データベース解析による分析物測定
幾つかの実施形態において、分析物は、公知又は「理論」分析物のスペクトルとのコンピュータ支援比較によって解析される娘イオンフラグメンテーションパターンに基づいて測定することができる。例えば、低エネルギーＣＩＤの条件下でフラグメント化されたペプチドイオンの娘フラグメントイオンのスペクトルは、多くの個々のフラグメンテーション事象の合計と考えられる。一般的な命名法は、娘フラグメントイオンを、破断するアミド結合及び結合分裂後の電荷を保持するペプチドフラグメントに従って区別する。分裂性アミド結合のＮ末端側の電荷保持は、ｂ−型イオンの形成をもたらす。電荷が、破断されたアミド結合のＣ末端側に残る場合には、フラグメントイオンは、ｙ型イオンと呼ばれる。ｂ−型イオン及びｙ−型イオンの他に、ＣＩＤ質量スペクトルは、他の診断フラグメントイオン（娘フラグメントイオン）を含有していてもよい。これらは、グルタミン、リシン、及びアルギニンからのアンモニア（−１７ａｍｕ）のニュートラルロス（ｎｅｕｔｒａｌ  ｌｏｓｓ）あるいはセリン及びスレオニンなどのヒドロキシル含有アミノ酸からの水（−１８ａｍｕ）のニュートラルロスによって生じたイオンを含む。ある種のアミノ酸は、他のアミノ酸よりも低エネルギーＣＩＤの条件下でより容易にフラグメント化することが観察されている。これは、特に、プロリン又はアスパラギン酸残基を含有するペプチドについて明らかであり、アスパルチル−プロリン結合ではなおさらそうである（Ｍａｋ，Ｍ．ら、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１２：８３７−８４２）（１９９８）。従って、Ｚ−ｐｒｏダイマー又はＺ−ａｓｐダイマーのペプチド結合（この場合、Ｚは任意の天然アミノ酸であり、ｐｒｏはプロリンであり及びａｓｐはアスパラギン酸である）は、全ての他のアミノ酸のダイマーの組み合わせの間のペプチド結合と比較して、より不安定である傾向がある。
【０１０１】
従って、ペプチド及びタンパク質試料について、低エネルギーＣＩＤスペクトルは、重複ｂ−及びＹ−系イオン、同一ペプチド由来の内部フラグメントイオン、並びにイモニウム及び他のニュートラルロスイオンの余分な配列特異的情報を含む。新規親ペプチドのアミノ酸配列を組み立てるためにこのようなＣＩＤスペクトルを解釈することは、困難であり、時間を要する。ペプチド配列の同定における最も顕著な進歩は、ペプチドＣＩＤスペクトルを、タンパク質及びＤＮＡ配列データベースにすでに存在するペプチド配列と互いに関係付けるコンピュータアルゴリズムの開発であった。このようなアプローチは、ＳＥＱＵＥＳＴ〔Ｅｎｇ，Ｊ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，５：９７６−９８９（１９９４）〕及び〔ＭＡＳＣＯＴ（Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｄ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２０：３５５１−３５６７（１９９９）〕などのプログラムによって例示される。
【０１０２】
要するに、実験的ペプチドＣＩＤスペクトル（ＭＳ／ＭＳスペクトル）は、タンパク質又はゲノム配列データベースから得られるペプチド配列から計算により生じた「理論」娘フラグメントイオンスペクトルと一致又は相関する。一致又は相関は、ＭＳ／ＭＳモードで娘フラグメントイオンの予測質量と実測質量の間の類似性に基づく。可能な一致又は相関は、実験フラグメントパターンと「理論」フラグメントパターンがどの位よく一致するかに従って記録される。所定のペプチドアミノ酸配列を検索するデータベース上の制約は、よく識別できるので、単一ペプチドのＣＩＤスペクトルが全ゲノム又は発現配列標識（ＥＳＴ）データベースにおいて任意の所定のタンパク質を同定するのに適切であり得る。他の概説については、Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．Ｔｒｅｎｄｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６：５−８（２０００）及びＹａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９：８９３−９００（１９９８）を参照されたい。
【０１０３】
従って、ＭＳ／ＭＳスペクトルの娘フラグメントイオン分析は、標識分析物の分析物を調べるだけではなく、測定された分析物が由来する分析物を調べるのにも使用できる。例えば、ＭＳ／ＭＳ分析におけるペプチドの同定は、ペプチドがタンパク質の酵素消化の結果として開裂したタンパク質を調べるのに使用できる。このような分析は、他の分析物、例えばオリゴヌクレオチドに適用できることが意図される。
【０１０４】
結合Ｘ及びＹ
Ｘは、レポーターの原子とリンカーの原子の間の結合である。Ｙは、リンカーの原子と、反応性基の原子、又は標識試薬が反応性分析物とすでに反応している場合には該分析物の原子との間の結合である。本発明の実施形態において使用できる種々の標識試薬（すなわち、ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧ）の結合Ｘ及びＹは、解離エネルギーレベルに供された場合に選択イオンの少なくとも一部分にフラグメント化することができる。従って、この結合Ｘ及びＹが標識分析物（すなわち、ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−分析物）の選択イオンの少なくとも一部分にフラグメント化するように、解離エネルギーレベルを質量分析計で調節することができる。結合Ｘのフラグメンテーションは、レポーターが分析物から独立して測定できるように、該分析物からレポーターを解離する。結合Ｙのフラグメンテーションは、結合Ｘがすでにフラグメント化されているか否かに応じて、分析物からレポーター−リンカーの組み合わせを解離するか、又は分析物からリンカーを解離する。結合Ｙは、結合Ｘよりも不安定であり得る。結合Ｘは、結合Ｙよりも不安定であり得る。結合Ｘ及びＹは、同じ相対不安定性であり得る。
【０１０５】
幾つかの実施形態において、結合Ｘは、結合Ｙよりも不安定であり得る。幾つかの実施形態において、結合Ｘが開裂し及び結合Ｙは無傷のままである。さらに別の実施形態にいて、結合Ｘが開裂し及び結合Ｙが開裂する。
【０１０６】
興味がある分析物がタンパク質又はペプチドである場合には、結合Ｘ及びＹの相対不安定性は、アミド（ペプチド）結合に関して調節することができる。結合Ｘ、結合Ｙ、又は結合Ｘ及び結合Ｙの両方は、典型的なアミド（ペプチド）結合と比較して、それよりも不安定であるか、同様に不安定であるか、又はそれよりも不安定でないものであり得る。例えば、解離エネルギーの条件下で、結合Ｘ及び／又は結合Ｙは、Ｚ−ｐｒｏダイマー又はＺ−ａｓｐダイマー（但し、Ｚは任意の天然アミノ酸であり、ｐｒｏはプロリンであり、及びａｓｐはアスパラギン酸である）のペプチド結合と比較して、フラグメンテーションしにくい傾向がある。幾つかの実施形態において、結合Ｘ及びＹは、典型的なアミド結合とほぼ同じ解離エネルギーのレベルでフラグンメント化するであろう。幾つかの実施形態において、結合Ｘ及びＹは、典型的なアミド結合と比較して、より大きい解離エネルギーのレベルでフラグンメント化するであろう。
【０１０７】
幾つかの実施形態において、結合Ｘ及びＹは、結合Ｙのフラグメンテーションが結合Ｘのフラグメンテーションをもたらし、その逆もあるように存在することもできる。このようにして、結合Ｘ及びＹの両方は、相当な量の分析物又はその娘フラグメントイオンが第２の質量分析において部分標識を含有しないように本質的に同時にフラグメント化することができる。「相当な量の分析物」とは、２５％未満、好ましくは１０％未満の部分的に標識された分析物がＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて測定し得ることを意味する。
【０１０８】
第２の質量分析（ＭＳ／ＭＳ）のスペクトルにおいて分析物の標識フラグメントと非標識フラグメントの間に明確な境界が存在し得ることから、この特徴は、娘フラグメントイオンスペクトルのコンピュータ支援解析による分析物の同定を単純化することができる。さらに、分析物のフラグメントイオンは、幾つかの実施形態おいて、レポーター／リンカー部分により完全に標識されるか又は標識されない（しかし部分的標識ではない）ものであり得るので、例えば、第２の質量分析で通常決定される部分標識分析物の単一の不安定結合のそれぞれの側に同位体が存在する場合であるように、分裂した結合にわたって同位体分布によって生じた娘フラグメントイオンの質量にばらつきがほとんどないか又は全くないものであり得る。
【０１０９】
分析物の標識：
分析物は、分析物の官能基を、標識試薬の反応性基（ＲＧ）と反応させることによって標識できる。先に論じたように、分析物の官能基は、求電子性基又は求核性基の一方のものであり得、標識試薬の官能基（すなわち、ＲＧ又は反応性基）は、求電子性基又は求核性基の他方のものであり得る。求電子性基及び求核性基は、反応して、分析物と標識試薬の間で共有結合を形成することができる。
【０１１０】
標識反応は、溶液中で行うことができる。幾つかの実施形態において、分析物又は標識試薬の一方は、支持体に結合させることができる。標識反応は、時には、水性条件で行うことができる。水性条件は、生体分子、例えばタンパク質、ペプチド、ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドを標識するために選択することができる。標識反応は、特には、有機溶媒又は有機溶媒の混合物中で行うことができる。有機溶媒は、小分子である分析物について選択することができる。水と１種又は複数の有機溶媒との混合物は、広い範囲にわたって使用できる。例えば、水と約６０％〜約９５％（ｖ／ｖ）の１種又は複数の有機溶媒との溶液を、分析物を標識するために調製し、使用できる。幾つかの実施形態において、水と約６５％〜約８０％（ｖ／ｖ）の１種又は複数の有機溶媒との溶液を、分析物を標識するために調製し、使用できる。有機溶媒の非限定的な例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、並びにアルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパノール及び／又はブタノールが挙げられる。
【０１１１】
標識反応を行う場合には、ｐＨを調節することができる。ｐＨは４〜１０の範囲にあり得る。ｐＨはこの範囲外であることができる。一般に、非水性反応の塩基性は、非求核性有機塩基の添加によって調節することができる。適当な塩基の非限定的な例としては、Ｎ−メチルモルホリン、トリエチルアミン及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンが挙げられる。あるいは、含水溶媒のｐＨは、生物学的緩衝液、例えば（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）又は４−モルホリンエタン−スルホン酸（ＭＥＳ）、あるいは無機緩衝剤、例えば炭酸ナトリウム及び／又は重炭酸ナトリウムを使用して調節することができる。反応性基の少なくとも１つが求電子性であり得ることから、求核性基を含有していない緩衝剤を選択することが望ましいものであり得る。当業者には、通常に実験の応用で、標識試薬による分析物の標識を促進するように、標識反応のｐＨを調節するのに使用できる別の緩衝剤が認められるであろう。
【０１１２】
試料処理：
本発明のある実施形態において、試料は、分析物を標識する前に及び後に処理することができる。処理は、試料の全体に又はその画分に適用することができる。処理は、試料混合物又はその画分に適用することができる。処理は、試料を複雑化させないために使用できるし又は試料を分析のためによりよい形にするために使用できる。処理は、分析物の標識を促進することができる。処理は、試料成分（例えば、標識分析物）の分析を促進することができる。処理は、試料の取り扱いを簡素化することができる。処理は、前述の２つ以上を促進することができる。
【０１１３】
例えば、試料は、酵素で処理することができる。酵素は、プロテアーゼ（タンパク質及びペプチドを分解するために）、ヌクレアーゼ（オリゴヌクレオチドを分解するために）、又は幾つかの他の酵素を用いて処理することができる。酵素は、極めて予測可能な分解パターンを有するように選択することができる。２種以上のプロテアーゼ及び／又は２種以上のヌクレアーゼ酵素も一緒に使用するか、あるいは他の酵素と一緒に使用して、それによって試料成分を分解してもよい。
【０１１４】
例えば、タンパク質分解酵素トリプシンは、リシン又はアルギニンと非特異的アミノ酸との間のペプチド結合を切断し、それによってアミン末端（Ｎ−末端）とリシン又はアルギニンカルボキシル末端アミノ酸（Ｃ−末端）とを含有するペプチドを生成するセリンプロテアーゼである。このようにして、タンパク質の切断により生じるペプチドは予測可能であり、トリプシン消化により得られる試料中のペプチドの存在及び／又は量は、その由来するタンパク質の存在及び／又は量を示すことができる。さらに、ペプチドの遊離アミン末端は、その標識化を促進する良好な求核性試薬であり得る。他の典型的なタンパク質分解酵素として、パパイン、ペプシン、ＡｒｇＣ、ＬｙｓＣ、Ｖ８プロテアーゼ、ＡｓｐＮ、プロナーゼ、キモトリプシン、及びカルボキシペプチダーゼＣが挙げられる。
【０１１５】
例えば、タンパク質（例えば、プロテインＺ）は、トリプシンなどのプロテアーゼで消化された場合に３種類のペプチド（例えば、ペプチドＢ、Ｃ及びＤ）を生成し得る。従って、タンパク質分解酵素、例えばトリプシンで消化されており且つ分析した場合にペプチドＢ、Ｃ及びＤを含むことが確認される試料は、元来プロテインＺを含有していたと言える。ペプチドＢ、Ｃ及びＤの量もまた、消化された試料中のタンパク質Ｚの量と相関する。このようにして、一つの試料（又はその画分）中のペプチドＢ、Ｃ及びＤの１つ以上の同定及び／又は定量のいずれの測定も、元の試料（又はその画分）中のタンパク質Ｚの同定及び／又は定量に使用することができる。
【０１１６】
酵素の活性は予測可能であることから、公知の配列のタンパク質の分解により生成されるペプチドの配列は、予測することができる。この情報によって、「理論的」ペプチド情報を生み出し得る。従って、実際の試料の質量分析から得られる娘フラグメントイオン（上記の通り）のコンピュータ支援分析における「理論的」ペプチドフラグメントの測定は、１つ以上の未知試料中の１つ以上のペプチド又はタンパク質を測定するのに使用できる。
【０１１７】
幾つかの場合には、試料処理は、標識すべき１つ又は複数の分析物に対する前駆体の処理を包含する。例えば、標識すべき１つ又は複数の分析物が消化されたタンパク質から誘導されるペプチドであり且つ標識試薬が、この例について、ペプチド又はペプチド分析物のアミン基（例えば、リシンのＮ−α−アミン基及びＮ−ε−アミン基）と反応させるために選択される場合には、試料のタンパク質（分析物前駆体分子）は、標識反応を促進するような方法で処理し得る。この例において、タンパク質は、還元剤〔例えば、トリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ）〕用いて還元し、次いでチオール基を遮断試薬〔例えば、メチル＝メタンチオスルホネート（ＭＭＴＳ）〕との反応によって遮断し得る。このようにして、タンパク質のチオール基は遮断され、従って分析物のアミンと標識試薬の間の反応を妨害しない。
【０１１８】
当業者には、ある別の前駆体分子の処理は、日常実験を用いて適合させ得る容易に入手できる試薬及びプロトコルを使用して行うことができることが認められるであろう。試薬及び条件の厳密な選択は、標識すべき分析物及び標識試薬の性質に応じて選択することができる。
【０１１９】
幾つかの実施形態において、試料処理は、標識試薬を用いて標識されるか否かにかかわらず、分析物質又は分析物前駆体の固体支持体に対する固定化を含むことができる。幾つかの実施形態において、固定化は、試料複雑性を軽減することを促進し得る。幾つかの実施形態において、固定化は、分析物の標識を促進し得る。幾つかの実施形態において、固定化は、分析物前駆体の標識を促進し得る。幾つかの実施形態において、固定化は、ある種の特性を有する試料成分の画分（例えば、これらはシステイン部分を含有するか又は欠いている）の選択的標識を促進し得る。固定化は前記の２つ以上を促進し得る。
【０１２０】
分離：
幾つかの実施形態において、標識分析物の試料又は試料混合物の処理は、分離を含むことができる。１つ以上の分離は、標識又は未標識分析物、標識又は未標識分析物前駆体、あるいはこれらの画分について行うことができる。１つ以上の分離は、固相捕獲により得られる１つ以上の画分について行うことができる。分離は、前記の２つ以上について行うことができる。
【０１２１】
例えば、種々の試料由来の複数の別々に標識された分析物を含有する試料混合物を、調製することができる。別々に標識されたとは、複数の標識のそれぞれが同定できる固有の性質を有する（例えば、ＭＳ／ＭＳ分析で固有の「特徴的イオン」生じる固有のレポーター部分を含有する）ことを意味する。試料混合物を分析するために、試料混合物の成分を分離し、質量分析を該試料混合物の画分のみについて行うことができる。このようにして、分析の複雑性を実質的に減らすことができる。なぜならば、分離された分析物を質量について個々に分析し、それによって分析法の感度を高めることができるからである。もちろん、分析は試料混合物の１つ以上のさらなる画分について１回以上繰り返して、それによって試料混合物の全ての画分の分析を可能にし得る。
【０１２２】
別々に標識されている複数の同一の分析物が、ある濃度で又はある量で、すなわち試料混合物中のその存在量に比例して同時に溶出する分離条件を使用して、試料混合物に加えられるそれぞれの試料の量が知られていることを条件として、試料混合物を含有する試料のそれぞれの標識分析物の量を測定することができる。従って、幾つかの実施形態において、試料混合物の分離は、試料混合物中の別々に標識された標識分析物の量と、質量分析（例えば、ＭＳ／ＭＳ分析）で測定されるシグナルの間の相関関係を保ちながら、分析を簡素化することができる。
【０１２３】
分離は、クロマトグラフィーで行うことができる。例えば、液体クロマグログラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）を使用して、このような試料の分離及び質量分析を行うことができる。さらに、興味がある分析物を分離するのに適した任意のクロマトグラフィー分離法を使用することができる。例えば、クロマトグラフィー分離は、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグラフィーであることができる。
【０１２４】
分離は電気泳動で行うことができる。使用できる電気泳動分離法の非限定的な例として、以下に限定されないが、１Ｄ電気泳動分離、２Ｄ電気泳動分離、及び／又はキャピラリー電気泳動分離が挙げられる。
【０１２５】
１つの同重体標識試薬又は１つのセットの試薬を使用して、１つの試料の複数の分析物を標識することができる。１つのセットの標識試薬の複数の同重体標識は、構造的に及び化学的に区別できない（及び、フラグメンテーションがレポーターを分析物から除去するまで、総質量によって区別できない）ことから、同重体状標識試薬は、分離工程を実施する場合に特に有用である。従って、異なる同重体標識で標識される同一組成の全ての分析物は、正確に同じ方法（すなわち、同時溶出）でクロマトグラフィー分離することができる。これらの分析物は構造的に及び化学的に区別できないことから、分離プロセスからの溶出液は、それぞれの同重体標識分析物の量を、すなわち試料混合物中のその標識分析物の量に比例して含有することができる。さらに、どのようにして試料混合物を調製したか〔試料の一部分、試料混合物を調製するために加えられた他の任意成分（例えば、較正標準）〕という知見から、試料混合物中の標識分析物の量を、それが由来する試料中のその標識分析物の量に関連付けることが可能である。
【０１２６】
標識試薬はまた、異性体であり得る。異性体は、時にはクロマトグラフィーにより分離することができるが、条件依存性である状況が存在し、そこでは分離プロセスを操作して、標識分析物の全部の量が溶出物中に試料混合物中のそれらの濃度及び／又は量に比例して存在する、別々に標識される同じ分析物の全部を同時に溶出させることができる。
【０１２７】
本明細書で使用されるように、同重体は同じ総質量の構造的に及び化学的に区別できない化合物（同位体含有量及び／又は分布を除く）であり（例えば、図１参照）、これに対して異性体は同じ総質量の構造的に及び／または化学的に区別することができる化合物であるという点で、同重体は異性体とは異なる。
【０１２８】
ワークフロー：
幾つかの実施形態において、試料の分析物の標識は、試料処理工程を行う前に行うことができる。幾つかの実施形態において、分析物の標識は、その他の試料処理工程の間に行うことができる。幾つかの実施形態において、分析物の標識は、試料処理の最後の工程及び／又は試料混合物の調製の直前である。
【０１２９】
非限定的な例としてプロテオーム解析を使用すると、使用し得る少なくとも幾つかの可能なワークフローが存在する。以下の考察の理解を助けるために、時には、前駆体タンパク質と分析物ペプチドの間で区別がなされる。しかし、タンパク質及びペプチドのいずれか又は両方が本明細書に記載の分析物とみなし得ることが理解されるべきである。
【０１３０】
ワークフローの一つの型において、前駆体タンパク質は、その後に標識試薬で標識することができるペプチド分析物に消化することができる。ワークフローの別の型において、前駆体タンパク質は、標識試薬で標識し、次いで標識ペプチド分析物に消化することができる。ワークフローの別の型において、前駆体タンパク質は、固体支持体上に捕獲し、消化することができ、次いで支持体に結合されたペプチドを標識することができる。場合によっては、ペプチドを介する流れも標識することができる。ワークフローの別の型において、前駆体タンパク質は、固体支持体上に捕獲し、標識することができ、次いで支持体に結合されたタンパク質を消化して標識ペプチドを生成させることができる。場合によっては、ペプチドを介する流れも分析することができる。ワークフローに関わらず、追加の試料処理（例えば、分離工程）を、ＭＳ分析の前に所望のように標識ペプチドについて行うことができる。
【０１３１】
要約すれば、分析物は、１つ以上の分離工程及び／又は試料処理工程を行う前に又は後に標識することがでる。分析物の標識を行う場合には、１つ以上の試料の分析物を標識することができ且つ１つ以上の試料混合物を別々に標識された試料から調製することができる限りは、それは本発明の限定ではない。
【０１３２】
分析物の相対定量及び絶対定量
幾つかの実施形態において、試料混合物の別々に標識された複数の同じ分析物の相対定量が可能である。別々に標識された複数の同じ分析物の相対定量は、第１の質量分析で観察された選択された標識分析物について第２の質量分析で測定されるレポーターの相対量（例えば、報告されたピークの強度、面積及び／又は高さ）を比較することによって可能である。言い換えれば、それぞれのレポーターを、試料混合物を生成するために使用される特定の試料についての情報と関係付けることができる場合には、そのレポーターの相対量は、第２の質量分析で観察される他のレポーターに対して、試料混合物中のその分析物の相対量である。試料混合物を形成するために組み合わされる成分が公知である場合には、試料混合物を調製するために使用されるそれぞれの試料中の分析物の相対量は、第１の質量分析から選択された標識分析物のイオンについて観察されたレポーターの相対量に基づいて逆算することができる。このプロセスは、第１の質量分析で観察された異なる標識分析物の全てについて反復することができる。このようにして、試料混合物を生成するために使用される複数の異なる試料のそれぞれの中のそれぞれの反応性分析物の相対量（多くの場合、濃度及び／又は量で表現される）を測定することができる。
【０１３３】
幾つかの実施形態において、分析物の絶対定量を測定することができる。これらの実施形態について、既知量の１つ以上の別々に標識された分析物（１つ又は複数の較正標準）を、試料混合物に添加することができる。較正標準は、較正標準のためのレポーターが試料混合物を形成するために使用される試料のいずれかと比較して独特であることを条件として、試料混合物の分析物を標識するのに使用される標識のセットの異性体又は同重体標識で標識される予測される分析物であることができる。１つ又は複数の較正標準ためのレポーターの相対量が、試料混合物の別々に標識された分析物のためのレポーターの相対量に関して測定されると、該試料混合物中の別々に標識された分析物の全部の絶対量（多くの場合、濃度及び／又は量で表現される）を計算することが可能である。このようにして、それぞれの別々に標識された分析物（それについて、分析物が由来する試料中に較正標準が存在する）の絶対量もまた、どのようにして試料混合物が調製されたかという知見に基づいて測定し得る。
【０１３４】
前記にかかわらず、必要に応じて、レポーター内の天然同位体又は人工的に作り出した同位体存在比について、レポーターイオン（すなわち、特徴的イオン）の強度（あるいは面積又は高さ）に対する補正を行うことができる。これらのタイプの補正のより洗練された例はまた、２００３年１１月２６日付けで出願された“Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｆｏｒ  Ｄｅ−Ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｎｇ  Ａ  Ｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ”という名称の同時係属中で且つ共有の米国仮特許出願第６０／５２４，８４４号明細書に見出すことができる。それぞれのレポーターの強度を正確に定量するためによりいっそう注意を払えば払うほど、元の試料中の分析物の相対量及び絶対量の定量がよりいっそう正確になるであろう。
【０１３５】
要するに、これらの方法を使用して、特定の特徴的イオンに関連するアップ質量及びダウン質量同位体ピークの強度は、特徴的イオン（すなわち、レポーター）に関連する主要な強度ピークに、全ての強度の寄与が正しいレポーターに適切に起因し得るように加えることができる。特定の特徴的イオンに関連しないピーク強度は、必要に応じて推定し得る。全てのピーク強度を適切な特徴的イオンに割り当てることによって、特徴的イオンに関連する相対定量及び絶対定量情報は、きわめて正確であり得る。強度が正しいレポーターにより正確に割り当てられれば割り当てられるほど、定量的決定がより正確であり得る。
【０１３６】
プロテオーム解析：
本発明の方法、混合物、キット及び／又は組成物は、試料が多くの部分からなり、質量分析技術を使用して迅速で且つ反復する方法で分析され且つ再分析され得ることから、複合分析に使用できる。例えば、試料混合物は、１つ以上の試料中の個々の分析物の量について分析することができる。これらの分析物の量（多くの場合、濃度及び／又は量で表される）は、試料混合物を構成する試料にについて測定することができる。試料処理及び質量分析を迅速に行うことができることから、これらの方法は、試料混合物の多数の別々に標識された分析物の量を、分析物が由来する試料中のそれらの相対量及び／又は絶対量に関して測定することができるように、多数回反復することができる。
【０１３７】
そのような迅速多重分析が有用な１つの用途は、プロテオーム解析の領域にある。プロテオミックスは、構造、機能、及び生物学的プロセスの調節に関してゲノム配列にコードされる情報を説明するための実験的アプローチとして見ることができる。これは、細胞又は組織によって発現される全タンパク質成分の系統的分析によって達成し得る。本発明の方法、混合物、キット及び／又は組成物の実施形態と組み合わせて使用される質量分析は、このような広範なタンパク質分析のための一つの可能なツールである。
【０１３８】
例えば、４種類の同重体標識試薬のセットを用いて、例えば特定の刺激剤に対する増殖細胞の反応に基づいてタンパク質の発現の上方制御又は下方制御を調べるために、１回の実験で４つ時点を得ることが可能である。より少ない時点で実行することも可能であるが、１つ又は２つの対照を組み込むことも可能である。全ての場合に、タンパク質の発現の上方制御又は下方制御は、場合により対照に関して、単一の多重実験で測定することができる。さらに、処理が平行して行われるので、結果は直接比較可能である。なぜなら、プロトコルでのわずかな変化が結果に影響を及ぼし得る危険性がないからである。
【０１３９】
４．発明の種々の実施形態の説明
種々の実施形態としては、以下の欄に記載するような１つ以上のキット、アレイ、ライブラリー、混合物、化合物、標識分析物、及び方法が挙げられる。
【０１４０】
Ａ．化合物
種々の実施形態のそれぞれは、構造式ＩＷ：
【０１４１】
【化３１】
2009526998.tif 000009
で表される１つ以上の化合物、あるいはその塩形態及び／又は水和物形態を用いることができる。変数ｍは、１〜３の整数、典型的には１であり、この場合には化合物は、構造式Ｉ＃：
【０１４２】
【化３２】
2009526998.tif 000010
で表すことができる。前記の構造式の変数は、それぞれの化合物について、以下の通りに独立して選択することができる：
ＲＧは、求核性基又は求電子性基であるか、あるいは分析物と求核性基又は求電子性基との反応生成物であり得る；
ｒ及びｔは、両方共に０であることができるし、又はｒ及びｔの一方が１であることができ且つ他方が０であることができる；
ｒ及びｔの一つが１である場合には、Ｓ’は、リンカー、例えば固体支持体又は親和性リガンドに結合された切断可能なリンカーであり得る；
Ｘ及びＹは、それぞれ結合であり得、Ｘは、ＲＰ及びＬＫのそれぞれの原子又は任意の置換基を連結し、それによってＲＰをＬＫに連結することができ、且つＹは、ＬＫの原子又は任意の置換基をＲＧに結合することができる；
ＲＰ及びＬＫは、それぞれ場合により及び独立して置換されることができ、この場合に、ＲＰ及びＬＫは、それぞれ独立してヘテロアリール又はヘテロシクロアルキルであるか、あるいはヘテロアリール又はヘテロシクロアルキルで置換又は中断された線状又は分岐脂肪族又はヘテロ脂肪族基であり得るか；あるいは
ＬＫは、連結部分であり得及びＲＰは、四級アミン、環窒素でＸに結合された４〜９員含窒素ヘテロアリール又はヘテロシクロアルキル、５〜６員アリールメチレン、５〜６員ヘテロアリールメチレン、又は５〜６員ヘテロシクロアルキルであり得る。
【０１４３】
幾つかの実施形態において、前記の値は、次の条件：
１）ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−はポリマーではない；
２）ＲＰ及びＬＫは共にピペラジニルを含有しないこと；ＲＰ及びＬＫは、共にアミノ酸（例えば、天然アミノ酸）、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、及びタンパク質からなる群から選択されないこと；並びに
３）ｔで０である場合には、基ＲＰは、ＬＫ’が−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（ＮＨ）−、又は−Ｃ（ＮＲｚ）−であるような式−Ｃ（Ｊ）２−ＬＫ’−の置換又は非置換部分でＮ−アルキル化される環窒素原子を含有する場合により置換される５員、６員又は７員ヘテロシクロアルキルではないこと〔式中、Ｒｚは、１〜８個の炭素原子を含有し、場合によりヘテロ原子を含有していてもよいアルキル基であるか又は場合により置換されるアリール基であり、前記アルキル基及びアリール基の炭素原子は、独立して、連結された水素、重水素及び／又はフッ素原子を含有し及びそれぞれのＪは、同一であるか又は異なり、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒｚ、ＯＲｚ、ＳＲｚ、ＮＨＲｚ、Ｎ（Ｒｚ）２、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素である〕
から選択される一つ以上の条件に従い得る。
【０１４４】
種々の実施形態において、ＲＧは、ＲＧで表される求核性基又は求電子性基であり得、及びそれぞれの化合物は標識試薬であり得る；並びに複数の化合物は、標識試薬キット、標識試薬のライブラリーなどであり得る。
【０１４５】
幾つかの実施形態において、ＲＧは、ＲＧについて定義された分析物と求核性基又は求電子性基との反応性生成物を指すことができ、この場合のそれぞれの化合物は、標識分析物であり得る。複数のこのような化合物は、標識分析物の混合物、標識分析物のライブラリーなどであり得る。このような実施形態のある描写における参照の正確のために、ＲＧについて定義された分析物と求核性基又は求電子性基の反応生成物は、−分析物で表される。
【０１４６】
幾つかの実施形態は、構造式ＩＷ又はＩ＃で表される単一の同位体濃縮化合物であり得る。種々の実施形態において、複数の化合物が、同位体標識され得る。同位体標識される化合物は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、最大で１５個、最大で２０個、最大で２５個又はそれ以上の同じか又は異なる重原子同位体に富むものであり得る。
【０１４７】
幾つかの実施形態は、複数の異なる化合物、例えば２つ以上の化合物を包含し得、この場合に前記複数の化合物は、キット、ライブラリー、アレイ、混合物などであり得る。このような実施形態において、ＲＰ及びＬＫは、それぞれ、それぞれの化合物についてのＲＰ及びＬＫの総計総質量が同じあり得るようにそれぞれの化合物についてＲＰの間の固有の総質量の差を補うことができるそれぞれの異なる化合物について固有の総質量を有することができる。幾つかの実施形態において、２つ以上の異なる化合物は、同重体異性体であり得、この場合に前記化合物は異性体化学構造を有するが同じ総質量を有する。幾つかの実施形態において、２つ以上の異なる化合物は、同重体アイソトポローグであり得、この場合に前記化合物は同じ化学構造と同じ総質量を有するが、異なる同位体組成を有し、例えば少なくとも１つの同重体状アイソトポローグは同位体標識される。
【０１４８】
種々の実施形態において、ｒ及びｔの一つは１であり得、並びにＳ’は固体支持体又は親和性リガンドに結合された切断可能なリンカーであり得る。従って、Ｓ’が固体支持体である場合には、種々の実施形態は、標識試薬の固体支持ライブラリー、標識分析物の固体支持ライブラリーなどを包含し得る。
【０１４９】
幾つかの実施形態において、それぞれの異なる化合物について、Ｓ’で表される切断可能なリンカーは、固体支持体上に別々の配列位置（array location）で固体支持体に結合させることができ、固体支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、ポリアクリルアミド、ガラス、シリカ、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）、又は逆相シリカ、ゲルの形態の基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、膜又は表面からなり、それによってキットは複数の異なる化合物のアレイライブラリーである。幾つかの実施形態において、ＲＧは、求核性基又は求電子性基であることができ、それによってキットは、標識試薬のアレイライブラリーであるか；あるいはＲＧは、分析物と求核性基又は求電子性基との反応生成物であることができ；それによってキットは、標識分析物のアレイライブラリーである。
【０１５０】
幾つかの実施形態において、それぞれの異なる化合物について、Ｓ’で表される切断可能なリンカーは、固体支持体に、別個の固体支持ビーズ、球、粒子、又は顆粒で結合させることができ、固体支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、ポリアクリルアミド、ガラス、シリカ、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）、又は逆相シリカからなり、それによってキットは異なる化合物の固体支持体ライブラリーである。幾つかの実施形態において、ＲＧは、求核性基又は求電子性基であることができ、それによってキットは、標識試薬の固体支持体ライブラリーであるか；あるいはＲＧは、分析物と求核性基又は求電子性基との反応生成物であることができ；それによってキットは、標識分析物の固体支持体ライブラリーである。
【０１５１】
幾つかの実施形態において、それぞれの異なる化合物について、Ｓ’で表される切断可能なリンカーは、抗原、抗体、抗体断片、アビジン、ビオチン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、レクチン、及び糖質からなる群から選択される異なる親和性リガンドに結合させることができ、それによってキットは、親和性リガンドライブラリーである。幾つかの実施形態において、ＲＧは、求核性基又は求電子性基であることができ、それによってキットは、標識試薬の親和性リガンドライブラリーであるか；あるいはＲＧは、分析物と求核性基又は求電子性基との反応生成物であることができ；それによってキットは、標識分析物の親和性リガンドライブラリーである。
【０１５２】
種々の実施形態において、キット、アレイ、ライブラリー、標識分析物混合物、及び方法の化合物、並びに同位体濃縮化合物は、さらに、構造式Ｉ−Ｓ’〜ＶＩ−Ｓ’又はＩ〜ＶＩ：
【０１５３】
【化３３】
2009526998.tif 000011
の１つで表すことができるか又はそのアイソトポローグであり得る。変数ｒ、ｓ、Ｓ’、Ｘ、及びＸは、前記の通り又は以下にさらに詳述する通りであり且つ前記の対応する条件に従い得る。変数ＲＰ１、ＲＰ２、ＲＰ３、ＲＰ４、ＲＰ５、ＲＰ６、ＬＫ１、ＬＫ２、ＬＫ３、ＬＫ４、ＬＫ５、及びＬＫ６は、以下でさらに詳しく説明する通りであり且つＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−並びにその変数ＲＰ／ＲＰ’及びＬＫ／ＬＫ’について前記の対応する条件に従い得る。例えば、構造式Ｖ又はＶ−Ｓ’で表すことができる化合物について、ＬＫ５は、構造式Ｅで表される連結部分であることができる（標識試薬の残部に対する結合点は、構造中に波線で特定されることが理解されるであろう）：
【０１５４】
【化３４】
2009526998.tif 000012
〔式中；
ＲＰ５は、レポーター基ＲＰ（上記で定義した通りである）であることができ及びＬＫ５は、構造式Ｅ：
【０１５５】
【化３５】
2009526998.tif 000013
（式中、それぞれのｎは、独立して、１〜３の整数であることができ；及びそれぞれのＲは、独立して、Ｈ、Ｄ、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、又はハロ基であることができる）
で表される連結部分であることができる〕。
【０１５６】
種々の実施形態において、少なくとも１つの化合物は、構造式Ｄ：
【０１５７】
【化３６】
2009526998.tif 000014
で表すことができる。
【０１５８】
別の例において、構造式Ｉ又はＩ−Ｓ’で表すことができる化合物について、ＲＰ１は、構造式Ａ：
【０１５９】
【化３７】
2009526998.tif 000015
で表されるレポーター基であることができる（標識試薬の残部に対する結合点は、構造中に波線で特定されることが理解されるであろう）；
環Ａは、芳香族であることができ；
それぞれのＺは、独立してＣＨ、ＣＲ２、又はＮであることができ、但し、２個以下の基ＺがＮであることを条件とし；
ｎは、環Ａが６員環であるように１又は２、典型的には２であることができ；
それぞれのＲ２は、独立して、定義に記載の適当な置換基から選択することができ、あるいはさらに典型的には、水素、重水素、−ＯＨ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、−Ｒ３、又は−Ｔ−Ｒ３から選択することができ；
それぞれのＲ３は、独立して、水素、重水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルから選択することができ；
Ｔは、−Ｏ−、−ＮＲ４−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４−、−ＮＲ４ＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＲ４−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｏ−、又は−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ４−であることができ；
それぞれのＲ４は、独立して、水素、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、又はアラルキルであり；
ＬＫ１は、連結部分であり；
Ｘは、レポーターの原子とＬＫ１の間の結合であり；並びに
Ｙは、リンカーの原子とＲＧの原子の間の結合である。
【０１６０】
種々の実施形態において、ＲＰ１及びＬＫ１の少なくとも１つは、１個以上の重原子同位体、例えば、ＲＰ１で同位体標識することができる。幾つかの実施形態において、ＲＰ１及びＬＫ１の両方は、それぞれ、１個以上の重原子同位体で同位体濃縮することができる。幾つかの実施形態において、ＲＰ１及びＬＫ１のそれぞれは、少なくとも２個の重原子同位体を含有する。幾つかの実施形態において、ＲＰ１及びＬＫ１のそれぞれは、少なくとも３個の重原子同位体を含有する。
【０１６１】
幾つかの実施形態において、ｎは２であり、それによって環Ａは６員環であることができる。幾つかの実施形態において、環Ａのオルト位又はパラ位の基Ｚのいずれかは、Ｃ−Ｔ−Ｒ３であることができる。種々の実施形態において、環Ａのオルト位又はパラ位の基Ｚのいずれかは、Ｃ−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ３又はＣ−ＮＨＳＯ２−Ｒ３であることができ、それぞれのＲ３は、独立して、場合により置換されるアルキル基であることができる。幾つかの実施形態において、ｎは２であり及びそれぞれのＺは独立してＣＨ又はＣＲ２であり、従ってＲＰ１は、構造式Ａ−１：
【０１６２】
【化３８】
2009526998.tif 000016
で表すことができる。
【０１６３】
幾つかの実施形態において、式Ａの少なくとも１個の原子は、重原子同位体で同位体濃縮される。
【０１６４】
幾つかの実施形態において、ＬＫ１は、アミノ酸、ペプチド、Ｃ１−１２アルキレン鎖からなり得、前記アルキレン鎖の１〜４個のメチレン単位は、独立して、アミノ酸、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＮＲＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＲ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−、あるいはアリーレン、アリールアルキレン、ヘテロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、ヘテロアリーレン、又はヘテロアラルキレンで置換され、この場合のそれぞれのＲは、独立して、水素、重水素、又は場合により置換されるＣ１−６アルキル基である。アミノ酸部分は、グリシン、アスパラギン酸、セリン、システイン、リシン、プロリン、又はオルニチンであることができる。
【０１６５】
幾つかの実施形態において、ＬＫ１は、場合により置換されるＣ１−１２アルキレン鎖であることができ、この場合の前記アルキレン鎖の１〜４個のメチレン単位は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、又はアミノ酸で置換することができ、基Ａに対するメチレン単位αは、−Ｏ−、−Ｓ−、又は−ＮＨ−で置換することができる。
【０１６６】
幾つかの実施形態において、ＬＫ１のメチレン単位の一つは、場合により置換されるアザアルキレン、アザシクロアルキレン、又はアザアリーレンで置換することができる。
【０１６７】
種々の実施形態において、少なくとも１個の化合物は、構造式Ｉ−１：
【０１６８】
【化３９】
2009526998.tif 000017
で表すことができる。
【０１６９】
種々の実施形態において、少なくとも１個の化合物は、
【０１７０】
【化４０】
2009526998.tif 000018
【０１７１】
【化４１】
2009526998.tif 000019
（式中、炭素原子の隣の記号「＊」は、その炭素が１３Ｃ同位体であることができることを示すことができ及び窒素原子の隣の記号「＊」は、その窒素が１５Ｎ同位体であることができることを示すことができる）
から選択される構造式で表すことができる。
【０１７２】
幾つかの実施形態において、少なくとも１個の化合物は、構造式Ｉ−１：
【０１７３】
【化４２】
2009526998.tif 000020
で表すことができる。
【０１７４】
幾つかの実施形態において、少なくとも１個の化合物は、
【０１７５】
【化４３】
2009526998.tif 000021
から選択される構造式で表すことができる。
【０１７６】
種々の実施形態において、少なくとも１個の化合物は、
【０１７７】
【化４４】
2009526998.tif 000022
〔式中、Ｒ８は、共有結合、アルキレン、又は−（ＣＨ２）Ｓ−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）Ｐ−（ＣＨ２）Ｓ−であることができ；ｐは１、２、３、又は４であることができ；及びそれぞれのｓは独立して０、１、２、又は３であることができる〕
から選択される構造式で表すことができる。
【０１７８】
幾つかの実施形態において、化合物は、構造式ＩＩ又はＩＩ−Ｓ’で表すことができ、式中のＲＰ２は、構造式Ｂ
【０１７９】
【化４５】
2009526998.tif 000023
で表されるレポーター基であることができ；
環Ｂは、非芳香族であることができ；
ｎは、１又は２であることができ；
それぞれのＷは、独立してＯ、Ｓ、又はＮＲ４であることができ；幾つかの実施形態において、構造式ＩＩのそれぞれのＷは、Ｏ又はその同位体であることができ；
それぞれのＷ’は、独立してＣＨ２、ＣＨＲ２、Ｃ（Ｒ２）２、Ｃ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、又はＣ＝Ｎ−Ｒ４であることができ；
Ｑは、ＣＨ又はＣＲ２であることができ；
それぞれのＲ２は、独立して、定義に記載の適当な置換基から選択することができ、さらに典型的には、水素、重水素、−ＯＨ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、−Ｒ３、又は−Ｔ−Ｒ３から選択することができ；
それぞれのＲ３は、独立して、水素、重水素、あるいは場合により置換されるアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであることができ；
Ｔは、−Ｏ−、−ＮＲ４−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４−、−ＮＲ４ＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＲ４−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｏ−、又は−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ４−であることができ；
それぞれのＲ４は、独立して、水素、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、又はアラルキルであることができ；
ＬＫ２は、連結部分であることができ；
Ｘは、レポーターの原子とＬＫ２の間の結合であることができ；並びに
Ｙは、リンカーの原子とＲＧの原子の間の結合であることができる。
【０１８０】
幾つかの実施形態において、少なくとも１個のＷ部分は、Ｏであり及び少なくとも１個のＷ’部分はＣＨＲ２である。
【０１８１】
種々の実施形態において、ＲＰ２及びＬＫ２の少なくとも１つは、１個以上の重原子同位体、例えば、ＲＰ２で同位体標識されることができる。幾つかの実施形態において、ＲＰ２及びＬＫ２の両方は、それぞれ、１個以上の重原子同位体で同位体濃縮されることができる。幾つかの実施形態において、ＲＰ２及びＬＫ２のそれぞれは、少なくとも２個の重原子同位体を含有する。幾つかの実施形態において、ＲＰ２及びＬＫ２のそれぞれは、少なくとも３個の重原子同位体を含有する。種々の実施形態において、ＬＫ２は、ＬＫ１の種々の実施形態について定義した通りであり得る。
【０１８２】
幾つかの実施形態において、レポーター基は、ｎが２であり且つそれぞれのＷがＯである式Ｂの基である。従って、式Ｂ−１のレポーター基は、
【０１８３】
【化４６】
2009526998.tif 000024
（式中、それぞれのＲ２は上記及びここで定義した通りである）
で提供される。
【０１８４】
幾つかの実施形態において、レポーター基は、ｎが１であり且つそれぞれのＷがＯである式Ｂの基である。従って、式Ｂ−２のレポーター基は、
【０１８５】
【化４７】
2009526998.tif 000025
（式中、それぞれのＲ２は上記及びここで定義した通りである）
で提供される。幾つかの実施形態において、化合物は、構造式ＩＩ−ｄ：
【０１８６】
【化４８】
2009526998.tif 000026
で表すことができる。
【０１８７】
幾つかの実施形態において、化合物は、構造式ＩＩ−ｅ：
【０１８８】
【化４９】
2009526998.tif 000027
で表すことができる。
【０１８９】
幾つかの実施形態において、ＲＰ１の少なくとも１個の原子は、重原子同位体で同位体濃縮される。
【０１９０】
種々の実施形態において、化合物は、構造式ＩＩＩ又はＩＩＩ−Ｓ’で表すことができ、式中のＲＰ３は、構造式Ｃ：
【０１９１】
【化５０】
2009526998.tif 000028
で表されるレポーター基であることができ；
Ｒｘ及びＲｙのそれぞれは、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、又はヘテロアルキルであることができ、Ｒｘ及びＲｙの適当な任意の置換基は、独立して、定義に記載の適当な置換基から選択することができ、さらに典型的には、水素、重水素、−ＯＨ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、−Ｒ３、−Ｔ−Ｒ３、リボース、デオキシリボース又はホスフェートから選択することができ、あるいはＲｘ及びＲｙは、一緒になって環Ｃ’：
【０１９２】
【化５１】
2009526998.tif 000029
を形成することができ；
環Ｃ’は、場合により置換されるヘテロアリール又はヘテロシクロアルキルであることができ、環Ｃの適当な任意の置換基は、独立して、定義に記載の適当な置換基から選択することができ、さらに典型的には、水素、重水素、−ＯＨ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、−Ｒ３、−Ｔ−Ｒ３、リボース、デオキシリボース又はホスフェートから選択することができ；
それぞれのＲ３は、独立して、水素、重水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであることができ；
Ｔは、−Ｏ−、−ＮＲ４−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４−、−ＮＲ４ＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＲ４−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｏ−、又は−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ４−であることができ；
それぞれのＲ４は、独立して、水素、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、又はアラルキルであることができ；
ＬＫ３は、連結部分であることができ、但し、Ｒｘ及びＲｙが一緒になって環Ｃ’を形成する場合には、Ｒｘ及びＲｙを連結する環窒素は、ＬＫ’が−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（ＮＨ）−、又は−Ｃ（ＮＲｚ）−であるような式−Ｃ（Ｊ）２−ＬＫ’−の置換又は非置換部分以外の基に連結されることを条件とし〔但し、Ｒｚは、１〜８個の炭素原子を含有し、場合によりヘテロ原子を含有していてもよいアルキル基であるか又は場合により置換されるアリール基であり、前記アルキル基及びアリール基の炭素原子は、独立して、連結された水素、重水素及び／又はフッ素原子を含有し及びＪは、同一であるか又は異なり、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒｚ、ＯＲｚ、ＳＲｚ、ＮＨＲｚ、Ｎ（Ｒｚ）２、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素である〕；
Ｘは、レポーターの原子とＬＫ３の間の結合であることができる；並びに
Ｙは、リンカーの原子とＲＧの原子の間の結合であることができる。
【０１９３】
種々の実施形態において、ＲＰ３及びＬＫ３の少なくとも１つは、１個以上の重原子同位体、例えばＲＰ３で同位体標識することができる。幾つかの実施形態において、ＲＰ３及びＬＫ３の両方は、それぞれ１個以上の重原子同位体で同位体濃縮することができる。幾つかの実施形態において、ＲＰ３及びＬＫ３のそれぞれは、少なくとも２個の重原子同位体を含有する。幾つかの実施形態において、ＲＰ３及びＬＫ３のそれぞれは、少なくとも３個の重原子同位体を含有する。
【０１９４】
幾つかの実施形態において、ＬＫ３は、Ｒｘ及びＲｙが一緒になって環Ｃを形成する場合にはＬＫが−Ｃ（Ｊ）２Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｊ）２Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｊ）２＝ＮＨ−、又は−Ｃ（Ｊ）２＝ＮＲ４−〔式中、それぞれのＪは、独立して、Ｈ、重水素、Ｒ４、ＯＲ４、ＳＲ４、ＮＨＲ４又はＮ（Ｒ４）２であることができる〕以外であることができるという条件に従う連結部分である。種々の実施形態において、ＬＫ３は、ＬＫ１の種々の実施形態について定義した通りであることができる。
【０１９５】
幾つかの実施形態において、レポーター基は、式中のＲｘ及びＲｙが一緒になって環Ｃ’を形成する式Ｃの基である。従って、式Ｃ”のレポーター基は、
【０１９６】
【化５２】
2009526998.tif 000030
（式中、ｑは０〜６であり及び環Ｃは上記及びここで定義した通りである）
で提供される。
【０１９７】
幾つかの実施形態において、レポーター基は、環Ｃ”がヘテロシクロアルキルであり及びｑが２、３又は４であるＣで表すことができる。従って、式Ｃ−１のレポーター基は、
【０１９８】
【化５３】
2009526998.tif 000031
で提供される。
【０１９９】
幾つかの実施形態において、式Ｃ−１の少なくとも１個の原子は、重原子同位体で同位体濃縮される。幾つかの実施形態において、式Ｃ−１の少なくとも１個の原子は、２個の重原子同位体で同位体濃縮される
幾つかの実施形態において、レポーター基Ｃについて前記の構造は、リンカーが、窒素原子に結合Ｘを介してＮ−アルキル化される置換又は非置換酢酸部分でないことを必要とする。
【０２００】
幾つかの実施形態において、化合物は、構造式ＩＩＩ−ｃ：
【０２０１】
【化５４】
2009526998.tif 000032
（式中、ｑは０〜６の整数であることができ、及びＬＫはカルボニルを含有することができる）
で表すことができる。
【０２０２】
幾つかの実施形態において、化合物は、
【０２０３】
【化５５】
2009526998.tif 000033
から選択される構造式で表すことができる。
【０２０４】
種々の実施形態において、ＲＰは、場合により置換されるピペラジニルを含有することができ及びＬＫは、アリール又はシクロアルキルであるか、あるいはアリール又はシクロアルキルで置換又は中断された線状又は分岐脂肪族又はヘテロ脂肪族基であることができる。
【０２０５】
また、構造式ＶＩ又はＶＩ−Ｓ’で表すことができる化合物について、
ＲＰ６又はＬＫ６の少なくとも１つは、場合により置換される核酸塩基を含有するか、あるいは場合により置換される核酸塩基で置換又は中断された線状又は分岐脂肪族又はヘテロ脂肪族基を含有することができ；
ＲＰ６及びＬＫ６の任意の置換基は、独立して、水素、重水素、−ＯＨ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、−Ｒ３、−Ｔ−Ｒ３、リボース、デオキシリボース、又はホスフェートから選択することができ；
それぞれのＲ３は、独立して、水素、重水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであることができ；
Ｔは、−Ｏ−、−ＮＲ４−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４−、−ＮＲ４ＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＲ４−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｏ−、又は−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ４−であることができ；
それぞれのＲ４は、独立して、水素、重水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、又はアラルキルであることができ；
Ｘは、レポーターの原子とＬＫ６の間の結合であり；並びに
Ｙは、リンカーの原子とＲＧの原子の間の結合であり、
この場合に、ＲＰ６及びＬＫ６の少なくとも１つは、１個以上の重原子同位体で同位体濃縮されることができる；
但し、ＲＰ６がヘテロシクロアルキルである場合には、ヘテロシクロアルキルは、ＬＫ’が−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（ＮＨ）−、又は−Ｃ（ＮＲｚ）−であるような式−Ｃ（Ｊ）２−ＬＫ’−の置換又は非置換部分でＮ−アルキル化される環窒素原子を含有する５員、６員又は７員ヘテロシクロアルキルではないことを条件とする〔式中、Ｒｚは、１〜８個の炭素原子を含有し、場合によりヘテロ原子を含有していてもよいアルキル基であるか、又は場合により置換されるアリール基であり、前記アルキル基及びアリール基の炭素原子は、独立して連結された水素、重水素及び／又はフッ素原子を含有し、且つＪは、同一である又は異なり、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒｚ、ＯＲｚ、ＳＲｚ、ＮＨＲｚ、Ｎ（Ｒｚ）２、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素である〕。
【０２０６】
また、構造式ＶＩ又はＶＩ−Ｓ’で表すことができる化合物について、ＲＰ４及びＬＫ４は、それぞれ独立して、ヘテロアリール又はヘテロシクロアルキルであるか、あるいはヘテロアリール又はヘテロシクロアルキルで置換又は中断された線状又は分岐脂肪族又はヘテロ脂肪族基であることができ、
ＲＰ４及びＬＫ４の適当な任意の置換基は、独立して定義に記載の適当な置換基から選択することができ、さらに典型的には、水素、重水素、−ＯＨ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、−Ｒ３、−Ｔ−Ｒ３、リボース、デオキシリボース又はホスフェートから選択することができ；
それぞれのＲ３は、独立して、水素、重水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルから選択することができ；
Ｔは、−Ｏ−、−ＮＲ４−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４−、−ＮＲ４ＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＲ４−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲ４Ｃ（Ｏ）Ｏ−、又は−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ４−であることができ；
それぞれのＲ４は、独立して、水素、重水素、アルキル、アリール、又はアラルキルであることができ；
Ｘは、レポーターの原子とＬＫ４の間の結合であり；並びに
Ｙは、リンカーの原子とＲＧの原子の間の結合である。
【０２０７】
種々の実施形態において、ＲＰ４及びＬＫ４の少なくとも１つは、１個以上の重原子同位体、例えばＲＰ４で同位体標識されることができる。幾つかの実施形態において、ＲＰ４及びＬＫ４の両方は、それぞれ１個以上の重原子同位体で同位体濃縮されることができる。幾つかの実施形態において、ＲＰ４及びＬＫ４のそれぞれは、少なくとも２個の重原子同位体を含有する。幾つかの実施形態において、ＲＰ４及びＬＫ４のそれぞれは、少なくとも３個の重原子同位体を含有する。
【０２０８】
種々の実施形態において、ＲＰ４及びＬＫ４のヘテロアリール又はヘテロシクロアルキル基は、それぞれ独立して、場合により置換されるイミダゾリル、フリル、ピロリル、チエニル、オキサゾリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、チアゾアゾリル、オキサジアゾリル、ピリジニル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、キノリル、イソキノリニル、インダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチアゾリル、インドリジニル、イミダゾピリジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、テトラゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、インドリル、テトラヒドロインドリル、アザインドリル、イミダゾピリジル、キナゾリニル、プリニル、ピロロ［２，３］ピリミジル、ピラゾロ［３，４］ピリミジル、ベンゾ（ｂ）チエニル、モルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピロリジニル、及びチオモルホリニルから選択することができる。
【０２０９】
種々の実施形態において、ＲＰ４及びＬＫ４の少なくとも１つは、場合により置換されるピペラジニルを含有するか、あるいはピペラジニルで置換又は中断された線状又は分岐脂肪族又はヘテロ脂肪族基を含有することができ、あるいは幾つかの実施形態において、ＲＰ４は、場合により置換されるピペラジニル、例えばＮ−メチルピペラジニルであることができる。
【０２１０】
種々の実施形態において、ＲＰ４及びＬＫ４の少なくとも１つは、場合により置換される核酸塩基（例えば、場合により置換されるプリニル又はピリミジニル）を含有するか、あるいは場合により置換される核酸塩基で置換又は中断された線状又は分岐脂肪族又はヘテロ脂肪族基を含有することができる。幾つかの実施形態において、ＬＫ４は、場合により置換される核酸塩基であるか、あるいは場合により置換される核酸塩基で置換又は中断された線状又は分岐脂肪族又はヘテロ脂肪族基であることができる。
【０２１１】
核酸塩基、例えばＬＫ４の核酸塩基は、場合により置換される９Ｈ−プリン−６−アミン、２−アミノ−１Ｈ−プリン−６（９Ｈ）−オン、４−アミノピリミジン−２（１Ｈ）−オン、５−メチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンなどであることができる。核酸塩基は、置換又は非置換であることができる。
【０２１２】
種々の実施形態において、化合物は、
【０２１３】
【化５６】
2009526998.tif 000034
【０２１４】
【化５７】
2009526998.tif 000035
から選択される構造式で表すことができる。
【０２１５】
上のように環を横切って引かれた結合は、その結合がその環の置換可能な原子に結合されることができることを示し；２つの環を横切って引かれた結合は、これら２つの環のいいずれかの置換可能な原子に結合されることができる。
【０２１６】
基Ｒ５は、−Ｃ（Ｊ）２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｊ）２−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｊ）２−Ｃ（ＮＨ）−、又は−Ｃ（Ｊ）２−Ｃ（ＮＲＺ）−〔式中、ＲＺは、１〜８個の炭素原子を含有し、場合によりヘテロ原子を含有していてもよいアルキル基であるか又は場合により置換されるアリール基であり、前記アルキル基及びアリール基の炭素原子は、独立して、連結された水素、重水素及び／又はフッ素原子を含有し；且つそれぞれのＪは、同一であるか又は異なり、Ｈ、重水素（Ｄ）、Ｒｚ、ＯＲｚ、ＳＲｚ、ＮＨＲｚ、Ｎ（Ｒｚ）２、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素である〕であることができる。
【０２１７】
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、−Ｒ３、−Ｔ−Ｒ３、リボース、デオキシリボース、又はホスフェートであることができ、それぞれのＲ３は、独立して、水素、重水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルである。
【０２１８】
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、Ｈ、重水素（Ｄ）、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、又はハロゲン化アルキル（例えば、ＣＦ３基）であることができる。
【０２１９】
幾つかの実施形態において、化合物は、
【０２２０】
【化５８】
2009526998.tif 000036
【０２２１】
【化５９】
2009526998.tif 000037
であることができる。
【０２２２】
Ｂ．方法
本発明の方法によれば、測定すべき分析物は、分析物を、開示化合物、例えば式中のＲＧが求核性基又は求電子性基である反応性基である構造式Ｉ−Ｓ’〜ＩＶ−Ｓ’又はＩ〜ＩＶの１つで表される化合物と反応させることによって標識することができる。標識分析物、分析物それ自体、分析物の１つ以上のフラグメント及び／又は標識のフラグメントは、質量分析で測定することができる。幾つかの実施形態において、本発明の方法は、同じ試料中の複数の異なる分析物の分析並びに２つ以上の異なる試料中の同じ分析物及び／又は異なる分析物の多重分析に使用できる。２つ以上の試料は、混合して試料混合物を形成することできる。多重分析において、標識試料は、試料混合物のどの試料から分析物が由来するかを調べるのに使用できる。試料混合物を形成するために組み合わせられる２つ以上の試料のそれぞれの中の分析物の絶対量及び／又は相対量（異なる試料中の同一の分析物に関して）（多くの場合、濃度又は量で表される）が測定できる。さらに、分析物のフラグメント（例えば、娘フラグメントイオン）の質量分析は、分析物及び／又は該分析物に対する前駆体を同定するのに使用でき；例えば、分析物に対する前駆体分子が分解される場合に使用できる。
【０２２３】
記載のアプローチの一つの特徴は、複数の異なる試料由来の複数の分析物が、化学的に異性体又は同重体（等しい質量を有する）であり且つ分析物が由来する試料を同定する固有の標識で別々に同位体標識（すなわち、同位体コード化）されることができることにある。別々に標識された複数の分析物は、これらが全て同じ（総）質量電荷比を有することから、質量分析計のＭＳモードでは区別されない。しかし、例えば衝突誘起解離（ＣＩＤ）によって解離エネルギーレベルに供された場合には、標識は、フラグメント化して、質量分析計で質量（質量電荷比）により分解し得る固有のレポーターを生成することができる。質量スペクトルで観察されたレポーターの相対量は、試料混合物中の標識分析物の相対量及び暗には分析物が由来する試料中の該分析物の量と相互に関係付けることができる。従って、レポーター（すなわち、特徴的イオン）の相対的強度は、試料混合物を形成するために組み合わせられた２つ以上の異なる試料中の１つ又は複数の分析物の相対量を測定するのに使用できる。レポーター情報から、絶対定量が望まれるそれぞれの分析物用の較正標準が試料混合物に取り込まれる場合には、２つ以上の試料中の１つの又は複数の分析物の絶対量（多くの場合、濃度及び／又は量で表される）を誘導することができる。
【０２２４】
例えば、分析物は、試料を処理するために酵素消化反応を使用してタンパク質の分解から得られるペプチドであり得る。タンパク質分解は、試料をタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン、パパイン、ペプシン、ＡｒｇＣ、ＬｙｓＣ、Ｖ８プロテアーゼ、ＡｓｐＮ、プロナーゼ、キモトリプシン又はカルボキシペプチダーゼＣ）で処理することによって達成できる。試料混合物中のペプチドの同一性及び量を測定し且つそれが由来する試料を同定し、場合によりその試料由来の他のペプチドの測定と結びつけることによって、分解ペプチドに対する前駆体タンパク質が、それが由来する試料について同定及び／又は定量できる。この方法は、２個以上の試料中（すなわち、試料混合物中）の１個又は複数のタンパク質の多重測定を可能とすることから多重方法である。
【０２２５】
幾つかの実施形態において、本発明は、２つ以上の試料（それぞれの試料は、１つ以上の反応性分析物を含有する）を、標識試薬の１つのセットの異なる標識試薬（この場合の前記セットの異なる標識試薬それぞれは、式：ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧを有する）と反応させることからなる方法に関する。その結果、それぞれの試料の１つ以上の分析物は、該分析物の求核性基又は求電子性基と、異なる標識試薬の求電子性又は求核性反応基（ＲＧ）それぞれとの反応によって、「ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−」部分で標識される。この標識プロセスは、それぞれ１つ以上の標識分析物を含有する２つ以上の別々に標識された試料を生成することができる。上記セットの標識試薬は、異性体又は同重体であることができる。それぞれの標識試薬のレポーターは、それぞれの標識分析物が由来する試料を用いて同定することができ、従って該試料を同定するのに使用できる。
【０２２６】
ＲＧは反応基であり、その特徴はすでに記載されている。ＲＰは、レポーター部分であり、その特徴はすでに記載されている。それぞれのレポーターの総質量は、前記セットのそれぞれの試薬について異なることができる。ＬＫは、リンカー部分であり、その特徴はすでに記載されている。リンカーの総質量は、レポーター−リンカーの組み合わせの総計総質量が前記セットのそれぞれの試薬について同じであるように、異なる標識試薬に対するレポーター同士の間の総質量の差を補正することができる。Ｘは、レポーターの原子とリンカーの原子の間の結合である。Ｙは、リンカーの原子と反応性基の原子の間の結合である（又は分析物との反応後には、Ｙは、リンカーの原子と分析物の原子の間の結合である）。結合Ｘ及びＹは、質量分析計において解離エネルギーレベルに供された場合には、標識分析物の少なくとも一部分にフラグメント化する。結合Ｘ及びＹの特徴は、すでに記載されている。
【０２２７】
それぞれの試料の分析物が、該試料に固有の標識化試薬によって標識されると、２つ以上の別々に標識された試料又はその一部分は、試料混合物を生成させるために混合することができる。定量が望まれる場合には、試料混合物を生成させるために組み合わされたそれぞれの試料の容量及び／又は量を記録することができる。試料混合物の全試料容量及び／又は量に対するそれぞれの試料の容量及び／又は量は、試料混合物の分析からそれぞれの試料中の同定される分析物の量（多くの場合に、濃度及び／又は分量として表される）を測定するのに必要な比を測定するのに使用できる。従って、試料混合物は、同一及び／又は異なる分析物の相対量を、２つ以上の試料のそれぞれの分析物の量の相対定量、又は較正標準も試料混合物に加えられる絶対定量のいずれかによって同定及び／又は定量することができる複合混合物を含むことができる。
【０２２８】
次いで、混合物は、第１の質量分析を第１の質量分析計を使用して試料混合物又はその画分について行うことができる分光分析法に供することができる。次いで、第１の質量分析から特定の質量電荷比のイオンを選択することができる。次いで、選択イオンを解離エネルギーレベル（例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ））に供して、それによって選択イオンのフラグメンテーションを誘導することができる。標識分析物の特定の質量電荷比を有する選択イオンを解離エネルギーレベルに供することによって、結合Ｘ及び／又はＹは、選択イオンの少なくとも一部分にフラグメント化することができる。両方の結合Ｘ及びＹのフラグメンテーションは、レポーター−リンカー部分のフラグメンテーションを生じることができ且つ帯電又はイオン化レポーターを分析物から放出させることができる。解離エネルギーレベルに暴露されたイオンはまた、分析物のフラグメンテーションを生じることができ、それによって分析物の娘フラグメントイオンを生成することができる。次いで、イオン（残りの選択イオン、娘フラグメントイオン、及び帯電又はイオン化レポーター）又はその画分は、第２の質量分析計に指向させることができる。
【０２２９】
第２の質量分析は、選択イオン及びそのフラグメントについて行うことができる。第２の質量分析は、選択された質量電荷比で存在するそれぞれの固有のレポーターの総質量（すなわちｍ／ｚ）及び相対量、並びに試料混合物の少なくとも１つの反応性分析物の娘フラグメントイオンの総質量を測定することができる。選択された質量電荷比で存在するそれぞれの分析物について、娘フラグメントイオンを使用して、選択された質量電荷比で存在する１種類又は複数の分析物を同定することができる。例えば、この分析は、すでに「コンピュータ支援データベース解析による分析物測定」という表題の欄にすでに記載したようにして行うことができる。
【０２３０】
幾つかの実施形態において、前記方法の幾つかの工程は、１回以上繰り返すことができる。例えば、幾つかの実施形態において、すでに選択された質量電荷比とは異なる、第１の質量分析からの選択された質量電荷比のイオンは、解離エネルギーレベルまで処理し、それによってすでに説明したように、幾つかのイオン化レポーター部分と、選択イオンの少なくとも一部のイオン化娘フラグメントイオンとを形成する。選択イオン、イオン化レポーター部分及び娘フラグメントイオン、又はこれらの画分の第２の質量分析を行うことができる。第２の質量分析におけるそれぞれのレポーター部分の総質量及び相対量並びに娘フラグメントイオンの総質量もまた測定できる。このようにして、情報は、第１の質量分析から１つ以上の別の分析物を同定及び定量化するのに利用することができる。
【０２３１】
幾つかの実施形態において、前記方法全体を１回以上繰り返すことができる。例えば、試料混合物が分画されている場合（例えば、クロマトグラフィー又は電気泳動によって分離される）には前記方法を１回以上繰り返すことが有用であり得る。前記方法をそれぞれの試料について繰り返すことによって、試料混合物全体の全てを分析することが可能である。幾つかの実施形態において、前記方法全体が１回以上繰り返され、これらの繰り返しのそれぞれの範囲内で、ある工程もまた上記のように１回以上繰り返されることが意図される。このようにして、試料混合物の内容物を調べ、十分に可能な範囲まで測定することができる。
【０２３２】
質量分析の当業者には、第１及び第２の質量分析はタンデム質量分析計で行うことができることが分かるであろう。タンデム質量分析を行うのに適した装置は、本明細書にすでに記載されている。タンデム質量分析計が好ましいが、単一段質量分析計を使用してもよい。例えば、分析物フラグメンテーションは、コーン電圧フラグメンテーション、次いで得られたフラグメントを単一段四重極又は飛行時間質量分析計を使用する質量分析によって誘導し得る。別の例では、分析物は、レーザ源を使用して解離エネルギーレベルに暴露させて、得られたフラグメントを、時間飛行又はタンデム時間飛行（ＴＯＦ−ＴＯＦ）質量分析計においてポストソース分解の後で記録し得る。幾つかの実施形態において、単一の分析器を有する装置は、第１の質量分析及び第２の質量分析の両方を行うことができる。
【０２３３】
先に開示した多重法に従って、幾つかの実施形態において、結合Ｘは、分析物の結合（例えば、ペプチド骨格中のアミド（ペプチド）結合）のフラグメンテーションと比較して、フラグメンテーションの傾向が高い又は低い、あるいは実質的に等しい。幾つかの実施形態において、結合Ｙは、分析物の結合（例えば、ペプチド骨格中のアミド（ペプチド）結合）のフラグメンテーションと比較して、フラグメンテーションする傾向が高い又は低い。幾つかの実施形態において、上記セットのそれぞれの試薬のためのリンカーは、結合Ｘ及びＹのフラグメンテーション後に電荷において中性である（すなわち、リンカーはフラグメント化して質量のニュートラルロスを生じ、従ってＭＳ／ＭＳスペクトラムでは観察されない）。さらに幾つかの別の実施形態において、結合Ｘ及びＹの位置は、１つのセットの複数の標識試薬内で、混合物の複数の標識分析物内で、又は１つのキットの標識試薬内で変化しない。幾つかの別の実施形態において、上記セットのそれぞれの試薬のためのレポーターは、分析物（例えば、ペプチド骨格のアミド（ペプチド）結合）をフラグメント化させるのに使用される条件下では、実質的にサブフラグメント化しない。幾つかの他の実施形態において、結合Ｘは、結合Ｙと比較してフラグメンテーションする傾向が小さい。幾つかの他の実施形態において、結合Ｙは、結合Ｘと比較してフラグメンテーションする傾向が小さい。幾つかの別の実施形態において、結合Ｘ及びＹは、ほぼ同じ不安定性を有するか、あるいは結合Ｘ又はＹの一方のフラグメンテーションが結合Ｘ又はＹの他方のフラグメンテーションをもたらすように選択される。
【０２３４】
幾つかの実施形態において、本発明の方法は、それぞれ１つ以上の分析物を含有する２つ以上の試料を異なる標識試薬と反応させ、それによって２つ以上の異なる標識試料（但し、それぞれの標識試料は、１つ以上の標識分析物を含有する）を生成させ、標識試料の２つ以上、あるいはこれらの部分及び場合によっては１つ以上の較正標準を混合し、それによって本明細書に記載の標識試薬で標識された分析物を含有する混合物を生成させることからなる。幾つかの実施形態において、それぞれの試料は、分析物を同定し、前記混合物を生成させるために使用される混合物及び／又はそれが由来する試料中の相対量又は絶対量を定量するのに使用できる固有のレポーターを含有する標識試薬で標識された。
【０２３５】
種々の実施形態において、標識試薬又は「同重体質量標識」は、式中のＲＧが求核性基又は求電子性基を表し且つ残りの変数が前記化合物について上記で定義した通りである構造式ＩＷ、Ｉ＃、Ｉ−Ｓ’〜ＩＶ−Ｓ’又はＩ〜ＩＶのいずれか、典型的にはＩ〜ＩＶの１つで表すことができる。
【０２３６】
例えば、幾つかの実施形態において、本発明の方法は、２つ以上の試料（但し、それぞれの試料は、１つ以上の反応性分析物を含有する）を、同重体質量標識の１つのセットと反応させ、それによって２つ以上の別々に標識された試料（但し、それぞれの標識試料は、１つ以上の標識分析物を含有する）を生成させ、２つ以上の別々に標識された試料又はその部分、及び場合によって１つ以上の較正標準を混合し、それによって試料混合物を生成させることからなる。
【０２３７】
標識試薬が反応性分析物と反応すると、結合Ｙはリンカーを分析物に連結し；ＲＰ（それぞれ、前記種々の式中のＲＰ１、ＲＰ２、ＲＰ３、ＲＰ４、ＲＰ５、及びＲＰ６で表される）及びＬＫ（それぞれ、前記種々の式中のＬＫ１、ＬＫ２、ＬＫ３、ＬＫ４、ＬＫ５及びＬＫ６で表される）の少なくとも１つは、１つ以上の重原子同位体で同位体濃縮することができ；同重体質量標識と分析物の反応に際し、それぞれの質量標識は、同じ質量を分析物に付加することができ；且つフラグメンテーションに際し、それぞれの同重体質量標識のＲＰ（それぞれ、前記種々の式中のＲＰ１、ＲＰ２、ＲＰ３、ＲＰ４、ＲＰ５、及びＲＰ６で表される）は、前記セットの他の同重体質量標識の特徴的イオンと異なる質量を有する特徴的イオンを生成することができる。
【０２３８】
幾つかの実施形態によれば、試料からの分析物は、固体支持体と反応させることができ（それぞれの試料は、異なる固体支持体、従って異なるレポーターと反応する）、反応性基と反応しない試料の樹脂固定化成分は、場合により洗い流すことができる。次いで、１つ又は複数の標識分析物は、それぞれの固体支持体から、支持体を切断可能なリンカーＳ’を切断する条件下で処理し、それによってレポーター−リンカー−分析物複合体を支持体から放出させることによって除去することができる。それぞれの支持体は、同様に、切断可能なリンカーを切断する条件下で処理し、それによって２以上の異なる試料（それぞれの試料は、１つ以上の標識分析物を含有する）を得ることができ、特定の試料に関連する標識分析物は、固有のレポーターを標識分析物に連結することによって同定及び／又は定量することができる。次いで、採取した試料は、前記のようにして混合して試料混合物を形成することができる。
【０２３９】
例えば、前記の方法で使用するセットのそれぞれの異なる標識試薬は、固体支持体に結合させることができる。
【０２４０】
標識試薬を含有する支持体は、幾つかの方法（例えば、以下の実施例の欄参照）で調製することができる。幾つかの実施形態において、同重体質量標識のアミノ基、ヒドロキシル基又はチオール基は、適当な支持体の切断可能なリンカーと反応させることができる。切断可能なリンカーは、「立体障害型の切断可能なリンカー」であることができる。切断可能なリンカーの切断は、支持体から標識分析物を放出するであろう。
【０２４１】
立体障害固体支持体の非限定的な例としては、：トリチルクロリド樹脂（トリチル−Ｃｌ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ０１−６４−００７４）、２−クロロトリチルクロリド樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ０１−６４−００２１）、ＤＨＰＰ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｐ／ＮＱ−１７５５）、ＭＢＨＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐ／Ｎ４００３７７）、４−メチルトリチルクロリド樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ０１−６４−００７５）、４−メトキシトリチルクロリド樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ０１−６４−００７６）、ヒドロキシ−（２−クロロフェニル）メチル−ＰＳ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ０１−６４−０３４５）、Ｒｉｎｋ  Ａｃｉｄ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ０１−６４−０３８０、Ｐ／Ｎ０１−６４−０２０２）、ＮｏｖａＳｙｎＴＧＴアルコール樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐ／Ｎ０１−６４−００７４）が挙げられる。
【０２４２】
幾つかの実施形態において、本発明の方法は、さらに、「試料処理」という表題の欄にで上記でさらに詳しく説明したしたように、試料の分析物の標識を行う前に、それぞれの試料を、少なくとも１つの酵素で消化して、試料の成分を部分的に又は完全に分解させることからなることができる。例えば、酵素は、プロテアーゼ（タンパク質及びペプチドを分解するため）又はヌクレアーゼ（オリゴヌクレオチドを分解するため）であることができる。また、複数の酵素を一緒に使用して、それによって試料成分を分解させてもよい。酵素は、タンパク分解酵素、例えばトリプシン、パパイン、ペプシン、ＡｒｇＣ、ＬｙｓＣ、Ｖ８プロテアーゼ、ＡｓｐＮ、プロナーゼ、キモトリプシン又はカルボキシペプチダーゼＣであることができる。
【０２４３】
幾つかの実施形態において、方法は、さらに、「分離」という表題の欄において上記でさらに詳しく説明したしたように、第１の質量分析を行う前に、試料混合物を分離することからなることができる。このようにして、第１の質量分析は、試料混合物の画分のみについて行うことができる。分離は、任意の分離法で、例えばクロマトグラフィー又は電気泳動で行うことができる。例えば、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を使用して、このような試料分離を行い、次いで質量分析を行うことができる。また、興味のある分析物を分離するのに適した任意のクロマトグラフ分離法を使用できる。適当なクロマトグラフ分離法及び電気泳動分離法の非限定的な例は、本明細書に記載されている。
【０２４４】
さらに別の実施形態において、本発明の方法は、試料成分を分解させる酵素処理と、分離工程との両方を含むことができる。
【０２４５】
前記のように、娘フラグメントイオンの総質量の分析によって選択イオンに関連する分析物を測定することができる。一つのこのような測定方法は、「コンピュータ支援データベース解析による分析物測定」という表題の欄に記載されている。
【０２４６】
分析物が測定されると、第２の質量分析におけるそれぞれのレポーター部分の総質量及び相対量並びに娘フラグメントイオンの総質量に関する情報は、試料混合物についてのその他の情報を調べるための基礎を提供する。レポーターの量は、質量スペクトルのピーク強度によって測定できる。幾つかの実施形態において、レポーターの量は、質量分析計を使用して得られるレポーター（特徴的イオン）信号のピーク高さ又はピーク幅の分析によって測定できる。それぞれの試料は、異なる標識試薬で標識することができ且つそれぞれの標識試薬が特定の試料と相互に関係付けることができる固有のレポーターを含有することができることから、第２の質量分析において異なるレポーターの測定は、選択される分析物のイオンが由来する試料を同定する。多数のレポーターが見出される（例えば、本発明の多重法に従って）場合には、それぞれのレポーターの相対量は、他のレポーターに対して測定できる。測定されたそれぞれのレポーターの相対量は、試料混合物中の分析物の相対量と相互に関係があることから、試料混合物を形成するために組み合わせられたそれぞれの試料中の分析物の相対量（多くの場合、濃度及び／又は量として表される）が測定できる。必要に応じて、レポーターに関連するピーク強度の補正は、「分析物の相対定量及び絶対定量」という表題の欄ですでに論じたように、天然同位体存在比又は人工的に作り出された同位体存在比について行うことができる。さらに具体的には、試料混合物に組み合わせられるそれぞれの試料の容量及び／又は量が知られている場合には、それぞれの試料中の分析物の相対量（多くの場合、濃度及び／又は量として表される）は、測定されたそれぞれのレポーターの相対量に基づいて算出することができる。
【０２４７】
この分析は、異なる質量電荷比の選択イオンについて１回以上繰り返し、それによって試料混合物を形成するのに組み合わせられたそれぞれの試料中の１つ以上の別の分析物の相対量を得ることができる。必要に応じて、レポーターに関連するピーク強度の補正は、天然同位体存在比又は人工的に作り出された同位体存在比について行うことができる。
【０２４８】
分析物に連結された固有のレポーターを含有し、選択された質量電荷比を有する較正標準が既知量（多くの場合、濃度及び／又は量として表される）の試料混合物に添加されている場合には、較正標準に関連する固有のレポーターの量は、試料混合物を形成するために組み合わせられたそれぞれの試料中の分析物の絶対量（多くの場合、濃度及び／又は量として表される）を測定するのに使用できる。これは、較正標準のためのレポーターに関連する分析物の量が公知であり及び全てのその他のレポーターの相対量が選択イオンに関連する標識分析物について測定できることから可能である。固有のレポーター（例えば、較正標準用のレポーター）のそれぞれについて測定されたレポーターの相対量は、試料混合物を形成するために組み合わせられたそれぞれの試料と関連する分析物の量に比例することから、それぞれの試料中の分析物の絶対量（多くの場合、濃度及び／又は量として表される）は、試料混合物を生成させるために使用される配合に関して算出される比に基づいて測定できる。必要に応じて、レポーターに関連するピーク強度の補正は、天然同位体存在比又は人工的に作り出された同位体存在比について行うことができる。
【０２４９】
この分析は、異なる質量電荷比の選択イオンについて１回以上繰り返し、それによって試料混合物を形成するのに組み合わせられたそれぞれの試料中の１つ以上の別の分析物の絶対量を得ることができる。必要に応じて、レポーターに関連するピーク強度の補正は、天然同位体存在比又は人工的に作り出された同位体存在比について行うことができる。
【０２５０】
幾つかの実施形態において、前記方法は、消化工程及び／又は分離工程を用いて実施できる。幾つかの実施形態において、前記方法の工程は、消化工程及び／又は分離工程を用いて又は用いずに、１回以上繰り返し、それによって１つの試料中の１つ以上の他の分析物あるいは２以上の試料（支持体に結合された標識試薬で標識された試料を含む）のそれぞれの１つ以上の分析物を同定及び／又は定量することができる。較正標準が特定の分析物のための試料混合物中に存在するか否かに応じて、定量は他の標識分析物に対するものであり得、それは絶対的なものであり得る。このような分析方法は、特に標識分析物の予備分離（例えば、液体クロマトグラフィー分離又は電気泳動分離）が第１の質量分析に先立つ場合には、複雑な性質を有する多重試料のプロテオーム分析に特に有用であり得る。
【０２５１】
幾つかの実施形態において、分析物は、試料又は試料混合物中のペプチドであることができる。試料又は試料混合物中のペプチドの分析は、１つ以上の試料中のタンパク質を第１の質量分析に先立って分解することができる試料又は試料混合物中の同定可能なタンパク質の量（多くの場合、濃度及び／又は量として表される）を測定するのに使用できる。また、異なる試料由来の情報は、測定を行うために比較でき、例えば細胞増殖に影響を及ぼし得る物質の種々の濃度でインキュベートされる細胞のタンパク質量に対する効果を比較するために比較できる。別の非限定的な例としては、罹患及び正常組織又は細胞培養物の発現されたタンパク質成分の比較を挙げ得る。これは、感染体、例えば細菌又はウイルスによる感染症、あるいはその他の疾患、例えば癌の後の細胞、組織又は体液中の発現されたタンパク質量の比較を包含し得る。別の例において、経時的なタンパク質濃度の変化（経時変化）の研究は、細胞又は組織の発現されたタンパク質に対する薬物治療の効果を調べるのに採用し得る。さらに別の例において、経時的に採取される異なる試料由来の情報は、疾患（例えば、癌）又は感染症の結果として組織、器官又は体液中の特定のタンパク質の濃度を検出及び監視するのに使用し得る。
【０２５２】
幾つかの実施形態において、分析物は、試料又は試料混合物中の核酸フラグメントであることができる。核酸フラグメントに関する情報は、試料が第１の質量分析に先立って分解された試料又は試料混合物中の同定可能な核酸分子の量（多くの場合、濃度及び／又は量として表される）を測定するのに使用できる。また、異なる試料からの情報は、上記のように測定を行うために比較することができる。
【０２５３】
Ｃ．混合物
幾つかの実施形態において、本発明は、混合物（例えば、試料混合物）に関する。混合物は、２つの標識された分析物のそれぞれが異なる試料から由来することができ且つ式ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−分析物を含有する少なくとも２つの別々に標識された分析物を含有することができる。それぞれの異なる標識について、混合物の標識分析物の幾つかは、同じであることができ、また該標識分析物の幾つかは異なることができる。原子、部分又は結合、Ｘ、Ｙ、ＲＰ及びＬＫは、すでに説明されており、これらの特徴は開示されている。混合物は、２つ以上の標識反応であって、それぞれの標識反応が一般式：ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧ（式中、原子、部分、又は結合Ｘ、Ｙ、ＲＰ、ＬＫ、ＲＧは、すでに説明されており、それらの特徴は開示されている）の異なる標識試薬を使用する２つ以上の標識反応の生成物の全部又は一部を混合することによって形成することができる。標識試薬は、同位体コード化異性体又は同重体標識試薬であることができる。それぞれの異なる標識試薬の固有のレポーターは、どの標識反応から２つ以上の標識分析物のそれぞれが誘導されるを示すことができる。標識試薬は、異性体又は同重体であり得る。従って、混合物の２つ以上の標識分析物は、異性体又は同重体であり得る。混合物は、前記の方法のいずれかに開示されたような試料混合物であり得る。これらの方法に関連する標識試薬及び標識分析物の特徴は、すでに論じられている。
【０２５４】
混合物の分析物はペプチドであり得る。混合物の分析物は、タンパク質であり得る。混合物の分析物は、ペプチド及びタンパク質であり得る。混合物の分析物は、核酸分子であり得る。混合物の分析物は、糖質であり得る。混合物の分析物は、脂質であり得る。混合物の分析物は、ステロイドであり得る。混合物の分析物は、１，５００ダルトン未満の小分子であり得る。混合物の分析物は、２つ以上の分析物種を含有する。分析物種は、例えば、ペプチド、タンパク質、核酸、糖質、脂質、ステロイド及び／又は１，５００ダルトン未満の小分子から選択することができる。
【０２５５】
種々の実施形態において、本発明の混合物は、標識分析物の少なくとも１つが混合物を形成するために組み合わせられる他の標識分析物と異なる試料から由来する少なくとも２種類の標識分析物を含有する。例えば、分析物は、タンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、糖質、脂質、ステロイド又は１，５００ダルトン未満の小分子であることができる。
【０２５６】
種々の実施形態において、標識分析物は、ＲＧが求核性基又は求電子性基と分析物との反応生成物を表す構造式ＩＷ、Ｉ＃、Ｉ−Ｓ’〜ＶＩ−Ｓ’又はＩ〜ＶＩ、典型的にはＩ〜ＶＩのいずれかで表すことができ、例えば、標識分析物は、次の式：
【０２５７】
【化６０】
2009526998.tif 000038
（式中、変数は前記で定義した通りである）
で表すことができ、あるいはその塩形態及び／又は水和物形態であることができる。典型的には、ＲＰ／ＬＫ（あるいはＲＰ１／ＬＫ１、ＲＰ２／ＬＫ２、ＲＰ３／ＬＫ３、ＲＰ４／ＬＫ４、ＲＰ５／ＬＫ５又はＲＰ６／ＬＫ６）の少なくとも１つは、１個以上の重原子同位体で同位体濃縮することができ；それぞれの標識分析物の基ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−（あるいはＲＰ１−Ｘ−ＬＫ１−、ＲＰ２−Ｘ−ＬＫ２−、ＲＰ３−Ｘ−ＬＫ３−、ＲＰ４−Ｘ−ＬＫ４−、ＲＰ５−Ｘ−ＬＫ５−又はＲＰ６−Ｘ−ＬＫ６−）は、同じ質量を有することができる。
【０２５８】
標識試薬と分析物との反応によって分析物に付加された部分のフラグメンテーションに際し、それぞれの標識分析物のＲＰは、この場合には分析物が由来する試料を同定する特徴的イオンを生じることができる。従って、特徴的イオンの強度は、混合物中の分析物の量及び試料混合物を形成するのに加えられる元の試料中の分析物の量に関する。幾つかの実施形態において、ＲＰ及びＬＫのそれぞれは、少なくとも２個の重原子同位体を含有する。幾つかの実施形態において、ＲＰ及びＬＫのそれぞれは、少なくとも３個の重原子同位体を含有する。
【０２５９】
例えば、幾つかの実施形態において、本発明の方法は、２つ以上の試料（それぞれの試料は、１つ以上の反応性分析物を含有する）を、標識試薬又は「同重体状質量標識」の１つのセットと反応させ、それによって１つ以上の標識分析物を含有する２つ以上の別々に標識された試料それぞれを生成させ、２つ以上の別々に標識された試料、又はその一部、及び場合により１つ以上の較正標準を混合し、それによって試料混合物を生成させることからなる。
【０２６０】
標識試薬が反応性分析物と反応すると、結合Ｙは、リンカーを分析物に連結することができ；ＲＰ（それぞれ、前記種々の式のＲＰ１、ＲＰ２、ＲＰ３、ＲＰ４、ＲＰ５、及びＲＰ６で表される）及びＬＫ（それぞれ、前記種々の式のＬＫ１、ＬＫ２、ＬＫ３、ＬＫ４、ＬＫ５及びＬＫ６で表される）の少なくとも１つ、例えばＲＰは、１個以上の重原子同位体で同位体濃縮することができ；同重体質量標識と分析物の反応に際し、それぞれの質量標識は、同じ質量を分析物に加えることができ；フラグメンテーションに際し、それぞれの同重体質量標識のＲＰ（それぞれ、前記種々の式中のＲＰ１、ＲＰ２、ＲＰ３、ＲＰ４、ＲＰ５、及びＲＰ６で表される）は、前記セットの他の同重体質量標識の特徴的イオンと異なる質量を有する特徴的イオンを生成することができる。
【０２６１】
前記の方法に従って分析物を標識するのに使用できる典型的な化合物（例えば、質量標識／標識試薬）は、「化合物」という表題の下ですでに論じられている。
【０２６２】
Ｄ．キット
種々の実施形態において、本発明のキットは、１つ以上の標識試薬又は「同重体質量標識」を含有することができ、その少なくとも１つは、構造式ＩＷ、Ｉ＃、Ｉ−Ｓ’〜ＶＩ−Ｓ’又はＩ〜ＶＩ、典型的にはＩ〜ＶＩ（式中、ＲＧは求核性基又は求電子性基を表し且つ残りの変数は前記の通りである）のいずれかで表すことができ、あるいはその塩形態及び／又は水和物形態であることができる。
【０２６３】
キットで使用するために選択される化合物は、典型的には「同位体コードされる」であろう。「同位体コードされる」とは、キットの化合物のそれぞれの同位体の分布が、それぞれの異なる化合物（すなわち標識試薬）について、固有の質量を有するレポーターを生成するために選択されることを意味する。
【０２６４】
典型的には、レポーター基及びリンカー基（例えば、前記種々の式のＲＰ／ＬＫ、ＲＰ１／ＬＫ１、ＲＰ２／ＬＫ２、ＲＰ３／ＬＫ３、ＲＰ４／ＬＫ４、ＲＰ５／ＬＫ５又はＲＰ６／ＬＫ６）の少なくとも１つは、１個以上の重原子同位体で同位体濃縮されることができ；及びそれぞれの標識分析物の基ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−（あるいは、ＲＰ１−Ｘ−ＬＫ１−、ＲＰ２−Ｘ−ＬＫ２−、ＲＰ３−Ｘ−ＬＫ３−、ＲＰ４−Ｘ−ＬＫ４−、ＲＰ５−Ｘ−ＬＫ５−又はＲＰ６−Ｘ−ＬＫ６−）が、同じ質量を有する。典型的には、フラグメンテーションに際し、それぞれの標識分析物のＲＰは、前記キットの他の同重体質量標識の特徴的イオンと異なる質量を有する特徴的イオンを生成することができる。
【０２６５】
標識試薬の他の特性は、同様に開示されている。例えば、標識試薬は、同じ試料、あるいは２つ以上の異なる試料中の１つ以上の分析物の多重分析に有用であり得る。
【０２６６】
キットのそれぞれの同重体標識試薬（すなわち、質量標識）は、少なくとも１個の重原子同位体で同位体濃縮（コード）される。標識試薬は、２個以上の重原子同位体を含有するために同位体標識することができる。標識試薬は、３個以上の重原子同位体を含有するために同位体標識することができる。標識試薬は、４個以上の重原子同位体を含有するために同位体標識することができる。幾つかの実施形態において、少なくとも１個の重原子同位体は、標識試薬のカルボニル基又はチオカルボニル基に組み込むことができ及び少なくとも１個の他の重原子同位体は、標識試薬のレポーター基に組み込むことができる。
【０２６７】
標識試薬は、固定電荷を含有するか又はイオン化できるレポーター基を含有する。従って、レポーター基は、容易にイオン化される塩基性又は酸性部分を含有し得る。幾つかの実施形態において、レポーターは、カルボン酸基、スルホン酸基又はリン酸基含有化合物であることができる。従って、幾つかの実施形態において、標識試薬はその塩の形で単離することができる。
【０２６８】
幾つかの実施形態において、標識試薬は、カルボニル又はチオカルボニルリンカーを含有することができる。カルボニル又はチオカルボニルリンカーを含有する標識試薬は、分析物を標識するために活性エステルの形で使用できる。活性エステルにおいて、アルコール基は、脱離基（ＬＧ）を形成し、例えば、幾つかの実施形態において、脱離基は図９に示される。幾つかの実施形態において、活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル  エステルであることができる。
【実施例】
【０２６９】
本教示の態様は、以下の実施例に照らしてさらに理解し得る。以下の実施例は、いずれにしろ本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【０２７０】
実施例で使用される略語の幾つかについての定義は、以下の通りである：ＨＭＩは、ヘキサメチレンイミンを表し、Ｐｂｆは、２，２，４，６，７−ペンタメチル−ジヒドロベンゾフラン−５−スルホニルを表し、Ｆｍｏｃは、９−フルオレニルメトキシカルボニルを表し、Ｔｒｔは、トリチルを表し、Ｍｐｅは、３−メチル−ペンタ−３−イルを表し、ＨＡＴＵは、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートを表し、ＮＭＰは、１−メチル−２−ピロリジノンを表し、ＦｍｏｃＯＳｕは、（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミドを表し、ＤＭＡＰは、４−ジメチルアミノピリジンを表し、ＴＨＦは、テトラヒドロフランを表し、ＨＢＴＵは、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートを表し、及びＨＯＢＴは、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物を表す。
【０２７１】
質量標識上に反応性基を生成させるためのアミンアシル化の一般的なプロトコル：
図１０は、シスチンアミノ酸のチオール基と反応させるのに適した質量標識上に反応性基を生成させるアミンアシル化ためのプロトコルＩ及びプロトコルＩＩを説明する。
【０２７２】
プロトコルＩ：反応性アミン（１〜４００μモル）を、水性重炭酸ナトリウム（０．２Ｍ）及びアセトニトリル（ｖ／ｖで２：１又は１：１）に溶解した。典型的には、アミンの濃度は、約０．０１〜約０．１Ｍの範囲内にあった。反応混合物をボルテックスしながら、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルヨードアセテートのアセトニトリル溶液（約０．４Ｍ、遊離アミンに対して約１０倍過剰）を加えた。混合物を、室温で約１０分〜約３０分間振盪した。生成物を、ＨＰＬＣで精製し、質量分析（ＭＳ）で確認した。
【０２７３】
プロトコルＩＩ：ＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）に溶解した無水ヨード酢酸（０．７４ｇ、２．１ミリモル）を、反応性アミン（１．９ミリモル）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１．９ミリモル）との攪拌溶液に、室温で加えた。反応溶液を、さらに室温で１．５〜３時間攪拌し、次いで塩化メチレンと水の間で分配した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空中で濃縮し、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製した。生成物を、ＮＭＲ及び／又はＭＳで特定した。
【０２７４】
質量標識（標識試薬）の合成
Ｉ．質量標識（１）の合成
【０２７５】
【化６１】
2009526998.tif 000039
市販の３，４−ジメトキシベンジルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ）を、プロトコルＩＩに従ってアシル化して質量標識（１）を形成した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ３．７２（ｓ，２Ｈ），３．９０（ｓ，６Ｈ），４．６０（ｄ，２Ｈ），６．６１（ｄ，２Ｈ），７．２８（ｔ，１Ｈ）。ＭＳでの［Ｍ＋Ｈ］＋：３３６．０（計算値）；３３６．０（実測値）。
【０２７６】
ＩＩ．質量標識（２）の合成
図１１は、質量標識（２）の合成を説明する。４−アミノ−ベンジルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ、１ミリモル）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（Ｐｉｅｒｃｅ、１ミリモル）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１００μＬ）を、ジクロロメタン（１０ｍＬ）中で混合し、室温で１時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去した。生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで、ヘキサン、酢酸エチル（２０％〜６０％）を用いて溶出することにより精製し、４−アミノ−Ｎ−ヨードアセチルベンジルアミンを得た（収率６２．２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：７．１（ｄ，２Ｈ），６．７５（ｄ，２Ｈ），４．２１（ｓ，２Ｈ），３．６５（ｓ，２Ｈ）。ＭＳでの［Ｍ＋Ｈ］＋：２９１．０（計算値）；２９１．０（実測値）。
【０２７７】
４−アミノ−Ｎ−ヨードアセチルベンジルアミン（０．１７２ミリモル）、無水酢酸（０．２ｍｌ）、及びＤＩＥＡ（０．２ｍｌ）を、アセトニトリル（３ｍｌ）中で１．５時間攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させた。残留物を、ジクロロメタンと水の間で分配した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、真空中で濃縮した。褐色残留物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで、ジクロロメタン及びメタノールで溶出して精製し、生成物、すなわち質量標識（２）を得た（３５ｍｇ、収率６１％）。ＭＳでの［Ｍ＋Ｈ］＋：３３３．０（計算値）；３３３．０（実測値）。
【０２７８】
ＩＩＩ．質量標識（３）の合成
図１２は、質量標識（３）の合成を説明する。Ｎ−Ｂｏｃ−β−ｔｅｒｔ−ブチル−α−スクシンイミド−アスパラギン酸（Ｂｏｃ−Ａｓｐ（Ｂｕｔ）−ＯＳｕ）（Ｂａｃｃｈｅｍ、０．１ミリモル）をＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解した混合物に、ヘキサメチレンイミン（Ａｌｄｒｉｃｈ、０．４ミリモル）を加えた。さらにＤＭＦ（２ｍｌ）を加えた。混合物を室温で２時間振盪して、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（Ｂｕｔ）−ＨＭＩを形成した。Ｂｏｃ−Ａｓｐ（Ｂｕｔ）−ＨＭＩを、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで特定した〔［Ｍ＋Ｈ］＋：３７１．３（計算値）；３７１．１（実測値）〕。
【０２７９】
Ｂｏｃ−Ａｓｐ（Ｂｕｔ）−ＨＭＩのＢｏｃ−保護アミン基を、塩化メチレン（０．１ｍｌ）及びトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、０．１ｍｌ）の溶液に室温で２０分間暴露することによって脱保護した。溶媒を、真空中で、４０℃で蒸発させて乾固した。次いで、遊離アミンを、プロトコルＩを用いてアシル化して、質量標識（３）を得た〔［Ｍ＋Ｈ］＋：３８３．０（計算値）；３８３．０（実測値）〕。
【０２８０】
ＩＶ．質量標識（４）及び質量標識（５）の合成
図１３は、質量標識（４）及び質量標識（５）を説明する。
【０２８１】
質量標識（４）は、プロトコルＩを使用して市販のＯ−ベンジルセリンのアミン基をアシル化することによって製造した〔ＭＳでの［Ｍ＋Ｈ］＋：３６４．０（計算値）；３６４．０（実測値）〕。
【０２８２】
質量標識（５）は、プロトコルＩを使用して市販のＳ−（ｐ−メチルベンジル）システインのアミン基をアシル化することによって製造した〔ＭＳでの［Ｍ＋Ｈ］＋：３９４．０（計算値）；３９４．０（実測値）〕。
【０２８３】
Ｖ．質量標識（６）、（７）及び（８）の合成
図１４は、質量標識（６）、（７）及び（８）の合成を説明する。
【０２８４】
Ａ．質量標識（６）の合成
ＢｏｃＮＨ−ＯＨ（１〜２ミリモル）をＤＭＦ（２〜４ｍｌ）に溶解した溶液を、氷水浴を用いて冷却した。水素化ナトリウム（ＢｏｃＮＨ−ＯＨに対して１．５〜２当量）を加えた。水素ガスの発生が止んだ後に、混合物をボルテックスしながら臭化ベンジル（Ａｌｄｒｉｃｈ、ＢｏｃＮＨ−Ｒ−ＯＨに対して１当量）を加えた。混合物を室温で５時間振盪した。遠心分離後に、生成物、すなわちＢｏｃＮＨ−Ｏ（Ｂｚｌ）を、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで特定した。
【０２８５】
ＢｏｃＮＨ−Ｏ（Ｂｚｌ）のＢｏｃ−保護アミン基を、２５％ＴＦＡの塩化メチレン溶液４〜８ｍｌに室温で３０分間暴露することによって脱保護した。脱保護化合物、すなわちＮＨ２−Ｏ（Ｂｚｌ）を水で２回抽出し、次いで、分取ＨＰＬＣで精製するか又は溶媒を蒸発させた後にアシル化反応に直接に使用した。
【０２８６】
ＮＨ２−Ｏ（Ｂｚｌ）を、プロトコルＩを用いてアシル化して、質量標識（６）を得た〔［Ｍ＋Ｈ］＋：２９２．０（計算値）；２９２．０（実測値）〕。
【０２８７】
Ｂ．質量標識（７）の合成
ＢｏｃＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ（１〜２ミリモル）をＤＭＦ（２〜４ｍｌ）に溶解した溶液を、氷水浴を用いて冷却した。水素化ナトリウム（ＢｏｃＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨに対して１．５〜２当量）を加えた。水素ガスの発生が止んだ後に、混合物をボルテックスしながら臭化ベンジル（Ａｌｄｒｉｃｈ、ＢｏｃＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨに対して１当量）を加えた。混合物を室温で５時間振盪した。遠心分離後に、生成物、すなわちＢｏｃＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ（ＢＺｌ）を、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで特定した。
【０２８８】
ＢｏｃＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ（ＢＺｌ）のＢｏｃ−保護アミン基を、２５％ＴＦＡの塩化メチレン溶液４〜８ｍｌに室温で３０分間暴露することによって脱保護した。脱保護化合物、すなわちＮＨ２−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ（Ｂｚｌ）を、水で２回抽出し、次いで分取ＨＰＬＣで精製するか又は溶媒を蒸発させた後にアシル化反応に直接に使用した。
【０２８９】
ＮＨ２−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ（Ｂｚｌ）を、プロトコルＩを用いてアシル化して、質量標識（７）を得た〔［Ｍ＋Ｈ］＋：３２０．０（計算値）；３２０．０（実測値）〕。
【０２９０】
Ｃ．質量標識（８）の合成
ＢｏｃＮＨ−（ＣＨ２）５−ＯＨ（１〜２モル）をＤＭＦ（２〜４ｍｌ）に溶解した溶液を、氷水浴を用いて冷却した。水素化ナトリウム（ＢｏｃＮＨ−（ＣＨ２）５−ＯＨに対して１．５〜２当量）を加えた。水素ガスの発生が止んだ後に、混合物をボルテックスしながら臭化ベンジル（Ａｌｄｒｉｃｈ、ＢｏｃＮＨ−（ＣＨ２）５−ＯＨに対して１当量）を加えた。混合物を室温で５時間振盪した。遠心分離後に、生成物、すなわちＢｏｃＮＨ−（ＣＨ２）５−Ｏ（Ｂｚｌ）を、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで特定した。
【０２９１】
ＢｏｃＮＨ−（ＣＨ２）５−Ｏ（Ｂｚｌ）のＢｏｃ−保護アミン基を、２５％ＴＦＡの塩化メチレン溶液４〜８ｍｌに室温で３０分間暴露することによって脱保護した。脱保護化合物、すなわちＮＨ２−（ＣＨ２）５−Ｏ（Ｂｚｌ）を水で２回抽出し、次いで分取ＨＰＬＣで精製するか又は溶媒を蒸発させた後にアシル化反応に直接に使用した。
【０２９２】
ＮＨ２−（ＣＨ２）５−Ｏ（Ｂｚｌ）を、プロトコルＩを用いてアシル化して、質量標識（８）を得た〔［Ｍ＋Ｈ］＋：３６２．１（計算値）；３６２．２（実測値）〕。
【０２９３】
ＶＩ．質量標識（９）、（１０）及び（１１）の合成
図１５は、質量標識（９）、（１０）及び（１１）の合成を説明する。
【０２９４】
Ａ．質量標識（９）の合成
ＦｍｏｃＧｌｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、１ミリモル）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル（スクシンイミド）−ウラニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ、１ミリモル）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、Ａｌｄｒｉｃｈ、２ミリモル）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、Ｂｕｒｄｉｃｋ  ＆  Ｊａｃｋｓｏｎ、６ｍｌ）に溶解した。混合物を、室温で１．５時間振盪した。溶媒を蒸発させてＦｍｏｃＧｌｙ−ＯＳｕを形成し、これを直接次の工程で使用した。
【０２９５】
ＤＭＦ（０．８ｍｌ）及び０．２Ｍ水性重炭酸ナトリウム（２．８ｍｌ）に溶解したＬ−セリン（Ｂｚｌ）（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ、０．４ミリモル）に、ＤＭＦ（２．４ｍｌ）に溶解したＦｍｏｃＧｌｙ−ＯＳｕ（０．４ミリモル）を、ボルテックスしながら加えた。混合物を室温で２０分間振盪した。化合物、すなわちＦｍｏｃＧｌｙ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）を、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで特定した〔［Ｍ＋Ｈ］＋：４７５．２（計算値）；４７５．２（実測値）〕。
【０２９６】
ＦｍｏｃＧｌｙ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）（０．１７ミリモル）を、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液４ｍｌに室温で１５分間暴露して、Ｆｍｏｃ−保護基を除去した。溶媒を、真空中で４０℃で蒸発させ、残留物を分取ＨＰＬＣで精製した。得られた化合物、すなわちＧｌｙ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）をＭＳで特定した〔［Ｍ＋Ｈ］＋：２５３．１（計算値）；２５３．２（実測値）〕。
【０２９７】
ＤＭＦ（０．４８ｍｌ）に溶解したＦｍｏｃＧｌｙ−ＯＳｕ（０．０８ミリモル）を、ＤＭＦ（２．６ｍｌ）及び０．２Ｍ水性重炭酸ナトリウム（０．２６ｍｌ）に溶解したＧｌｙ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）に、ボルテックスしながら加えた。混合物を室温で２０分間振盪した。生成した化合物、すなわちＦｍｏｃＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）を、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで特定した〔［Ｍ＋Ｈ］＋：５３２．２（計算値）；５３２．２（実測値）〕。
【０２９８】
ＦｍｏｃＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）（０．５ｍｇ）を、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液０．２ｍｌに室温で１０分間暴露して、Ｆｍｏｃ−保護基を除去した。溶媒を、真空中で４０℃で蒸発させて乾固した。脱保護アミンを、プロトコルＩを使用してアシル化して、質量標識（９）を得た〔ＭＳでの［Ｍ＋Ｈ］＋：４７８．０（計算値）；４７８．０（実測値）〕。
【０２９９】
Ｂ．質量標識（１０）の合成
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）を欄Ａに記載のようにして調製し、プロトコルＩを使用してアシル化して、質量標識（１０）を得た〔［Ｍ＋Ｈ］＋：４２１．０（計算値）；４２１．０（実測値）〕。
【０３００】
Ｃ．質量標識（１１）の合成
ＦｍｏｃＧｌｙ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）（０．０１ミリモル）、ＴＳＴＵ（０．０２ミリモル）、及びＤＩＥＡ（０．０２ミリモル）を、ＤＭＦ（０．１ｍｌ）に溶解した。混合物を、室温で４０分間振盪し、次いで水（０．０５ｍｌ）に溶解したグリシン（０．１ミリモル）及び重炭酸ナトリウム（０．２ミリモル）中に、ボルテックスしながら移した。混合物を室温で３０分間振盪した。生成物、すなわちＦｍｏｃＧｌｙ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｇｌｙを、半分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで特定した〔［Ｍ＋Ｈ］＋：５３２．２（計算値）；５３２．２（実測値）〕。
【０３０１】
ＦｍｏｃＧｌｙ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｇｌｙ（１ｍｇ）を、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液０．２ｍｌに室温で１０分間暴露して、Ｆｍｏｃ−保護基を除去した。溶媒を真空中で４０℃で蒸発させた後に、脱保護アミンを、プロトコルＩを使用してアシル化して、質量標識（１１）を得た〔［Ｍ＋Ｈ］＋：４７８．０（計算値）；４７８．０（実測値）〕。
【０３０２】
ＶＩＩ．質量標識（１２）の合成
図１６は、質量標識（１２）の合成を説明する。
【０３０３】
ＦｍｏｃＧｌｙ（１ミリモル）、ＴＳＴＵ（１ミリモル）、及びＤＩＥＡ（１．５ミリモル）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解した。混合物を、室温で４０分間振盪し、次いで０．２Ｍ水性重炭酸ナトリウム５ｍｌに溶解したグリシン（４ミリモル）の溶液にボルテックスしながら移した。混合物を室温で２０分間振盪した。生成物、すなわちＦｍｏｃＧｌｙ−Ｇｌｙを、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで特定した〔［Ｍ＋Ｈ］＋：３５５．２（計算値）；３５５．２（実測値）〕。
【０３０４】
ＢｏｃＮＨ−Ｏ（Ｂｚｌ）（調製について欄Ｖ．Ａ及び図１４参照）（０．２ミリモル）を、２５％ＴＦＡの塩化メチレン溶液５ｍｌに３０分間暴露させてＢｏｃ−保護基を除去してＮＨ２−Ｏ（Ｂｚｌ）を形成させた。ＮＨ２−Ｏ（Ｂｚｌ）を、水で抽出し、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで特定した〔［Ｍ＋Ｈ］＋：１２４．１（計算値）；１２４．２（実測値）〕。
【０３０５】
ＦｍｏｃＧｌｙ−Ｇｌｙ（０．０２ミリモル）、ＴＳＴＵ（０．０２ミリモル）、及びＤＩＥＡ（０．０３ミリモル）を、ＤＭＦ（０．２ｍｌ）に溶解した。混合物を、室温で４０分間振盪し、次いでＮＨ２−Ｏ（Ｂｚｌ）（２ｍｇ）をＤＭＦ（０．１ｍｌ）及び０．２Ｍ水性重炭酸ナトリウム（０．１ｍｌ）に溶解した溶液に、ボルテックスしながら移した。混合物を室温で２０分間振盪した。生成物、すなわちＦｍｏｃＧｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ−Ｏ（Ｂｚｌ）を、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで特定した〔［Ｍ＋Ｈ］＋：４０６．０（計算値）；４０５．８（実測値）〕。
【０３０６】
ＦｍｏｃＧｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨ−Ｏ（Ｂｚｌ）を、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液０．２ｍｌに室温で１０分間暴露させてＦｍｏｃ−保護基を除去した。溶媒全部を蒸発させた後に、脱保護アミンをプロトコルＩを使用してアシル化して、質量標識（１２）を得た〔［Ｍ＋Ｈ］＋：４０６．０（計算値）；４０５．８（実測値）〕。
【０３０７】
ＶＩＩＩ．質量標識（１３）の合成
【０３０８】
【化６２】
2009526998.tif 000040
Ｏ−ベンジルチロシンを、プロトコルＩを使用してアシル化して、質量標識（１３）を形成した〔ＭＳでの［Ｍ＋Ｈ］＋：４４０．０（計算値）；４４０．２（実測値）〕。
【０３０９】
ＩＸ．質量標識（１４）及び（１５）の合成
図１７は、質量標識（１４）及び（１５）を説明する。
【０３１０】
ε−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−リシンのα−アミン基を、プロトコルＩを使用してアシル化して、質量標識（１４）を形成した〔ＭＳでの［Ｍ＋Ｈ］＋：４３５．０（計算値）；４３５．０（実測値）〕。
【０３１１】
α−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−リシンのε−アミン基を、プロトコルＩを使用してアシル化して、質量標識（１５）を形成した〔ＭＳでの［Ｍ＋Ｈ］＋：４６３．１（計算値）；４６３．０（実測値）〕。
【０３１２】
Ｘ．質量標識（１６）、（１７）、（１８）、（１９）及び（２０）の合成用の一般的なプロトコル
図１８は、質量標識（１６）、（１７）、（１８）、（１９）及び（２０）の合成用の一般的なプロトコルを説明する。
【０３１３】
０．２Ｍ水性重炭酸ナトリウム（１〜４ｍｌ）中のジアミン（ＮＨ２−Ｒ’−ＮＨ２）（０．４〜４ミリモル）に、ＤＭＦ（１〜４ｍｌ）に溶解したクロロギ酸ベンジル（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、０．１〜２ミリモル）を、ボルテックスしながら加えた。Ｒ’は、図１８において定義される。クロロギ酸ベンジル対ジアミンのモル比は、１：２〜６であった。混合物を、室温で５〜２０分間振盪した。生成物、すなわちＮＨ２−Ｒ’−ＮＨ（Ｚ）を、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで特定した。次いで、モノアミンを、プロトコルＩを使用してアシル化して、適切な質量標識を得た。
【０３１４】
質量標識（１６）〔ＭＳでの［Ｍ＋Ｈ］＋：３３５．０（計算値）；３３５．０（実測値）〕。質量標識（１７）〔ＭＳでの［Ｍ＋Ｈ］＋：３７７．０（計算値）；３７７．０（実測値）〕。質量標識（１８）〔ＭＳでの［Ｍ＋Ｈ］＋：４０７．１（計算値）；４０７．２（実測値）〕。質量標識（１９）〔ＭＳでの［Ｍ＋Ｈ］＋：４５１．１（計算値）；４５１．０（実測値）〕。質量標識（２０）〔ＭＳでの［Ｍ＋Ｈ］＋：４７９．１（計算値）；４７９．２（実測値）〕。
【０３１５】
ＸＩ．質量標識（２１）、（２２）、（２３）及び（２４）の合成
図１９は、質量標識（２１）、（２２）、（２３）及び（２４）の合成を説明する。
【０３１６】
Ａ．質量標識（２１）の合成
α−Ｎ−Ｆｍｏｃ−γ−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）オルニチン（ＦｍｏｃＯｒｎ（Ｚ））（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ、０．２５ミリモル）、ＴＳＴＵ（０．２５ミリモル）、及びＤＩＥＡ（０．３７５ミリモル）を、ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解した。混合物を、室温で１時間振盪し、次いで１ミリモルのグリシンと重炭酸ナトリウムとを水（３ｍＬ）に溶解した溶液に移した。混合物を、室温で３０〜６０分間振盪した。生成物、すなわちＦｍｏｃＯｒｎ（Ｚ）−Ｇｌｙを、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで特定した〔ＦｍｏｃＯｒｎ（Ｚ）−Ｇｌｙ：［Ｍ＋Ｈ］＋：５４６．２（計算値）；５４６．４（実測値）〕。
【０３１７】
ＦｍｏｃＯｒｎ（Ｚ）−Ｇｌｙ（２ｍｇ）を、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液０．１ｍＬに１０分間暴露させて、Ｆｍｏｃ−保護基を除去した。溶媒全部を蒸発させた後に、脱保護アミンを、プロトコルＩを使用してアシル化して、質量標識（２１）を得た〔［Ｍ＋Ｈ］＋：４９２．１（計算値）；４９２．０（実測値）〕。
【０３１８】
Ｂ．質量標識（２２）の合成
α−Ｎ−Ｆｍｏｃ−γ−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）オルニチン（ＦｍｏｃＯｒｎ（Ｚ））（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ、０．２５ミリモル）、ＴＳＴＵ（０．２５ミリモル）、及びＤＩＥＡ（０．３７５ミリモル）を、ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解した。混合物を、室温で１時間振盪し、次いで、１ミリモルのＬ−アラニンと重炭酸ナトリウムとを水（３ｍｌ）に溶解した溶液に移した。混合物を、室温で３０〜６０分間振盪した。生成物、すなわちＦｍｏｃＯｒｎ（Ｚ）−Ａｌａを、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで特定した〔ＦｍｏｃＯｒｎ（Ｚ）−Ａｌａ：［Ｍ＋Ｈ］＋：５６０．２（計算値）；５６０．２（実測値）〕。
【０３１９】
ＦｍｏｃＯｒｎ（Ｚ）−Ａｌａ（２ｍｇ）を、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液０．１ｍｌに１０分間暴露させて、Ｆｍｏｃ−保護基を除去した。溶媒全部を蒸発させた後に、脱保護アミンを、プロトコルＩを使用してアシル化して、質量標識（２２）を得た〔［Ｍ＋Ｈ］＋：５０６．１（計算値）；５０５．８（実測値）〕。
【０３２０】
Ｃ．質量標識（２３）の合成
ＦｍｏｃＯｒｎ（Ｚ）−Ｇｌｙ（０．１ミリモル）、ＴＳＴＵ（０．２ミリモル）、及びＤＩＥＡ（０．３ミリモル）を、ＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解した。混合物を、室温で１時間振盪し、次いで重炭酸ナトリウム（１．５ミリモル）及びＬ−アラニン（１ミリモル）を水（１ｍｌ）に溶解した溶液に移した。混合物を室温で３０分間振盪した。生成物、すなわちＦｍｏｃＯｒｎ（Ｚ）−Ｇｌｙ−Ａｌａを、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで特定した〔［Ｍ＋Ｈ］＋：６１７．２（計算値）；６１７．２（実測値）〕。
【０３２１】
ＦｍｏｃＯｒｎ（Ｚ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ（２ｍｇ）を、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液０．１ｍｌに１０分間暴露させて、Ｆｍｏｃ−保護基を除去した。溶媒全部を蒸発させた後に、脱保護アミンを、プロトコルＩを使用してアシル化して、質量標識（２３）を得た〔［Ｍ＋Ｈ］＋：５６３．１（計算値）；５６３．２（実測値）〕。
【０３２２】
Ｄ．質量標識（２４）の合成
ＦｍｏｃＯｒｎ（Ｚ）−Ａｌａ（０．１ミリモル）、ＴＳＴＵ（０．２ミリモル）、及びＤＩＥＡ（０．３ミリモル）を、ＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解した。混合物を、室温で１時間振盪し、次いで重炭酸ナトリウム（１．５ミリモル）及びグリシン（１ミリモル）を水（１ｍｌ）に溶解した溶液に移した。混合物を、室温で３０分間振盪した。生成物、すなわちＦｍｏｃＯｒｎ（Ｚ）−Ａｌａ−Ｇｌｙを、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで特定した〔［Ｍ＋Ｈ］＋：６１７．２（計算値）；６１７．２（実測値）〕。
【０３２３】
ＦｍｏｃＯｒｎ（Ｚ）−Ａｌａ−Ｇｌｙ（２ｍｇ）を、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液０．１ｍｌに１０分間暴露させた。溶媒全部を蒸発させた後に、脱保護アミンを、プロトコルＩを使用してアシル化して、質量標識（２４）を得た〔［Ｍ＋Ｈ］＋：５６３．１（計算値）；５６３．２（実測値）〕。
【０３２４】
ＸＩＩ．質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド
［Ｇｌｕ１］−フィブリノペプチドＢヒト［Ｇｌｕ−Ｆｉｂ、配列番号２５  ＧＶＮＤＮＥＥＧＦＦＳＡＲ）、ＣＡＳ＃：１０３２１３−４９−６］：前記ペプチドを、トリチルクロリド樹脂（Ｐ／Ｎ：Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、０１−６４−００７４）上で、標準Ｆｍｏｃ−ペプチド合成プロトコル（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍカタログ、２００４−２００５）を使用して組み立てた。次のアミノ酸誘導体を使用した：Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（Ｐ／Ｎ：Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、０４−１２−１１４５）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（Ｐ／Ｎ：Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、０４−１２−１０２０）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（Ｐ／Ｎ：Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、０４−１２−１００１）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（Ｐ／Ｎ：Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、０４−１２−１０３９）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｐ／Ｎ：Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、０４−１２−１０８９）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｍｐｅ）−ＯＨ（Ｐ／Ｎ：Ｂａｃｈｅｍ、Ｂ−３５６０）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（Ｐ／Ｎ：Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、０４−１２−１０３０）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（Ｐ／Ｎ：Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、０４−１２−１０３３）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（Ｐ／Ｎ：Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、０４−１２−１００６）。
【０３２５】
Ａ．質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（３８）（図３０参照）の合成
約１０ｍｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−Ｆｉｂ−トリチルクロリド樹脂を、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンのＤＭＦ溶液で処理し（２ｍＬ×１分、濾過、次いで２ｍＬ×５分）、濾過し、洗浄した（ＮＭＰ）。４−（Ｆｍｏｃ−アミノ）安息香酸（Ｐ／Ｎ：Ｂａｃｈｅｍ、Ｂ−３２６０；樹脂上のＧｌｕ−Ｆｉｂ量に対して１０当量）を、ＮＭＰ（〜１ｍＬ）中でＨＡＴＵ（Ｐ／Ｎ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３１７０３３、９．５当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３０当量）で活性化させ、前記樹脂に加え、３０分間混合した。次いで、樹脂を濾過し、ＮＭＰで洗浄し、Ｆｍｏｃ基を切断した。次いで、ピペラジン酢酸−ＴＦＡ塩（１０当量）を、ＮＭＰ（〜１．５ｍＬ）中でＨＡＴＵ（９．５当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６０当量）で活性化させ、前記樹脂に加えた。３０分後に、樹脂をＮＭＰで洗浄し、次いでＣＨ３ＣＮで洗浄した。共役ペプチドを、９５：５のＴＦＡ−水（２００μＬ、２ｈ）を使用して樹脂から切断し（及び脱保護し）、Ｅｔ２Ｏを使用して沈殿させた。化合物（３８）（図３０参照）の分析を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用して行った（シナピン酸マトリックス、計算値［Ｍ＋Ｈ］＋＝１８４３．８、実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝１８４４．９）。
【０３２６】
さらなる質量スペクトル分析：質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（３８）のＭＳ／ＭＳ分析を、ＭＡＬＤＩプラットフォーム及びエレクトロスプレープラットフォームを用いて行った。データは、質量標識はＭＡＬＤＩプラットフォームの良好な候補であるが、特徴的イオンピークの強度はエレクトロスプレープラットフォームにおいて極めて弱かったことを示す（データは示さない）。別々に１３Ｃ、１５Ｎ及び／又は２Ｈで標識したアミノ安息香酸は、市販されておらず、合成する必要がある。
【０３２７】
Ｂ．質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（３９）（図３０参照）の合成
約１０ｍｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−Ｆｉｂ−トリチルクロリド樹脂を、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンのＤＭＦ溶液で処理し（２ｍＬ×１分、濾過、次いで２ｍＬ×５分）、濾過し、洗浄した（ＮＭＰ）。４−（Ｆｍｏｃ−アミノメチル）安息香酸（Ｐ／Ｎ：Ｆｌｕｋａ、０４０６２；樹脂上のＧｌｕ−Ｆｉｂ量に対して１０当量）を、ＮＭＰ（〜１ｍＬ）中でＨＡＴＵ（Ｐ／Ｎ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１７０３３、９．５当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３０当量）で個々に活性化させ、前記樹脂に加え、３０分間混合した。次いで、樹脂を濾過し、ＮＭＰで洗浄し、Ｆｍｏｃ基を切断した。次いで、ピペラジン酢酸−ＴＦＡ塩（１０当量）を、ＮＭＰ（〜１．５ｍＬ）中でＨＡＴＵ（９．５当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６０当量）で活性化させ、前記樹脂に加えた。３０分後に、樹脂をＮＭＰで洗浄し、次いでＣＨ３ＣＮで洗浄した。共役ペプチドを、９５：５のＴＦＡ−水（２００μＬ、２ｈ）を使用して樹脂から切断し（及び脱保護し）、Ｅｔ２Ｏを使用して沈殿させた。化合物（３９）（図３０参照）の分析を、ＥＳ−ＭＳを使用して行った（水に直接導入、計算値［Ｍ＋Ｈ］＋＝１８２９．８、実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝１８２９．９）。
【０３２８】
さらなる質量スペクトル分析：質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（３９）のＭＳ／ＭＳ分析を、ＭＡＬＤＩプラットフォーム及びエレクトロスプレープラットフォームを用いて行った。データは、質量標識はＭＡＬＤＩプラットフォームの良好な候補であるが、特徴的イオンピークの強度はエレクトロスプレープラットフォームにおいて極めて弱かったことを示す（データは示さない）。別々に１３Ｃ、１５Ｎ及び／又は２Ｈで標識したアミノ安息香酸は市販されておらず、合成する必要がある。
【０３２９】
Ｃ．質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（４０）（図３１参照）の合成
約１０ｍｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−Ｆｉｂ−トリチルクロリド樹脂を、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンのＤＭＦ溶液で処理し（２ｍＬ×１分、濾過、次いで２ｍＬ×５分）、濾過し、洗浄した（ＮＭＰ）。Ｆｍｏｃ−４−カルボキシメチル−ピペラジン（Ｐ／Ｎ：Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ、０４９６０；樹脂上のＧｌｕ−Ｆｉｂ量に対して１０当量）を、ＮＭＰ（〜１ｍＬ）中でＨＡＴＵ（Ｐ／Ｎ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３１７０３３、９．５当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３０当量）で活性化させ、前記樹脂に加え、３０分間混合した。次いで、樹脂を濾過し、ＮＭＰで洗浄し、Ｆｍｏｃ基を切断した。次いで、ピペラジン酢酸−ＴＦＡ塩（１０当量）を、ＮＭＰ（〜１．５ｍＬ）中でＨＡＴＵ（９．５当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６０当量）で活性化させ、前記樹脂に加えた。３０分後に、樹脂をＮＭＰで洗浄し、次いでＣＨ３ＣＮで洗浄した。共役ペプチドを、９５：５のＴＦＡ−水（２００μＬ、２ｈ）を使用して樹脂から切断し（及び脱保護し）、Ｅｔ２Ｏを使用して沈殿させた。化合物（４０）（図３１参照）の分析を、ＥＳ−ＭＳを使用して行った（水に直接導入、計算値［Ｍ＋Ｈ］＋＝１８３６．９、実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝１８３７．０）。
【０３３０】
さらなる質量スペクトル分析：質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（４０）のＭＳ／ＭＳ分析を、ＭＡＬＤＩプラットフォーム及びエレクトロスプレープラットフォームを用いて行った。データは、質量標識はＭＡＬＤＩプラットフォーム及びエレクトロスプレープラットフォームの良好な候補であることを示す。ペプチドの特徴的イオン強度及びフラグメンテーションパターンは、現行ｉＴＲＡＱＴＭ試薬Ｎ−メチルピペラジン酢酸と同様であった（データは示さない）。
【０３３１】
Ｄ．質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（４１）（図３２参照）の合成
化合物（４１ｂ）：チミン酢酸プロピルエステル（４１ａ）（Ａｌａｈｉａｎｅ，Ａ．；Ｔａｏｕｒｉｒｔｅ，Ｍ．；Ｒｏｃｈｄｉ，Ａ．；Ｒｅｄｗａｎｅ，Ｎ．；Ｓｅｂｔｉ，Ｓ．；Ｅｎｇｅｌｓ，Ｊ．Ｗ．；Ｌａｚｒｅｋ，Ｈ．Ｂ．，“Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋｓ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙａｍｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ：  Ｆａｃｉｌｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ  ｄｏｐｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｓ  ｂａｓｉｃ  ｃａｔａｌｙｓｔ”，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２００３，２２，１０９−１１４に従って合成できる；１．３３ｇ、５．８８ミリモル）及び２−Ｂｏｃ−（アミノ）−エチルブロミド（Ｐ／Ｎ：Ｆｌｕｋａ、１７３５４、２．９７８ｇ、１３．２９ミリモル）をＤＭＦ（３０ｍＬ）に溶解した溶液に、Ｋ２ＣＯ３（３．４ｇ、２４．６０ミリモル）を固体として加え、周囲温度で２０時間攪拌した。この時点でのＴＬＣ分析は、単一の生成物（４１ｂ）の形成を示した（Ｒｆ＝０．３３、シリカプレート、１：１  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン；ＵＶ２５４ｎｍ、ＴＬＣは、ＥｔＯＨに溶解したニンヒドリンの３％（ｗ／ｖ）溶液と共に加熱することによって発色させた）。ＤＭＦを減圧下で除去した後に、得られた油状物を、ＥｔＯＡｃ（３５０ｍＬ）と希ＨＣｌ（１５０ｍＬ、０．５Ｍ）の間で分配した。次いで、ＥｔＯＡｃ層を、食塩水（１００ｍＬ×２）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して無色油状物を得た。得られた油状物をフラッシュ−クロマトグラフィーで精製して（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ精製装置、１２０ｇカラム、８５ｍＬ／分、２７０ｎｍ、０〜５分  ２０％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液、次いで８０％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液、１８ｍＬの画分を採取した、画分２４−３０は、純粋な生成物を有していた）、２．０２ｇ（収率９３％）の生成物（４１ｂ）を得た。ＥＳ−ＭＳ（ＭｅＯＨに直接導入、計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋＝［Ｃ１７Ｈ２７Ｎ３Ｏ６＋Ｎａ］＋＝３９２．１８、実測値［Ｍ＋Ｎａ］＋＝３９２．１５）。
【０３３２】
化合物（４１ｃ）：化合物（４１ｂ）（１．１０ｇ、２．９８ミリモル）をＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解した溶液に、ＮａＯＨ溶液（３．６ｍＬ、１Ｍ）を加え、３０分間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物を、９５％ＴＦＡ水溶液水（２０ｍＬ）で、周囲温度で１時間処理した。ＴＦＡ−水を減圧下で除去し、そのようにして得られた油状物を、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１５ｍＬ、ｐＨ＝８〜９）に溶解し、ＦｍｏｃＯＳｕ（１．２０ｇ、３．５８ミリモル）をアセトン溶液（８０ｍＬ）として加えた。反応混合物を１９時間攪拌した。この時点でＴＬＣ分析は、単一の生成物（４１ｃ）の形成を示した（Ｒｆ＝０．２２、シリカプレート、９：１：０．０１  ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−ＡｃＯＨ、ＵＶ２５４ｎｍ、ＴＬＣは、ＥｔＯＨに溶解したニンヒドリンの３％（ｗ／ｖ）溶液と共に加熱することによって発色させた）。次いで、反応混合物を濃縮してアセトンを除去し、そのようにして得られた残留物を水（１００ｍＬ）で希釈した。非極性不純物を、Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ×３）で抽出することにより除去した。水性層を酸性化し（ｐＨ〜１、ＨＣｌ、１Ｍ）、ＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ×３）で抽出した。ＣＨ２Ｃｌ２層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して１．４１ｇの生成物（４１ｃ）（収率９８％）を白色固体として得た。ＥＳ−ＭＳ（ＭｅＯＨ−直接導入）計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋＝［Ｃ２４Ｈ２３Ｎ３Ｏ６＋Ｎａ］＋＝４７２．１５、実測値［Ｍ＋Ｎａ］＋＝４７２．０９。
【０３３３】
約１０ｍｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−Ｆｉｂ−トリチルクロリド樹脂を、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンのＤＭＦ溶液で処理し（２ｍＬ×１分、濾過、次いで２ｍＬ×５分）、濾過し、洗浄した（ＮＭＰ）。化合物（４１ｃ）（樹脂上のＧｌｕ−Ｆｉｂ量に対して１０当量）を、ＮＭＰ（〜１ｍＬ）中でＨＡＴＵ（Ｐ／Ｎ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１７０３３、９．５当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３０当量）で活性化させ、前記樹脂に加え、３０分間混合した。次いで、樹脂を濾過し、ＮＭＰで洗浄し、Ｆｍｏｃ基を切断した。次いで、ピペラジン酢酸−ＴＦＡ塩（１０当量）を、ＮＭＰ（〜１．５ｍＬ）中でＨＡＴＵ（９．５当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６０当量）で活性化させ、前記樹脂に加えた。３０分後に、樹脂をＮＭＰで洗浄し、次いでＣＨ３ＣＮで洗浄した。共役ペプチドを、９５：５のＴＦＡ−水（２００μＬ、２ｈ）を使用して樹脂から切断し（及び脱保護し）、Ｅｔ２Ｏを使用して沈殿させた。化合物（４１）の分析を、ＥＳ−ＭＳを使用して行った（水に直接導入、計算値［Ｍ＋Ｈ］＋＝１９１９．９、実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝１９２０．３）。
【０３３４】
さらなる質量スペクトル分析：質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（４１）のＭＳ／ＭＳ分析を、ＭＡＬＤＩプラットフォーム及びエレクトロスプレープラットフォームを用いて行った。データは、質量標識がＭＡＬＤＩプラットフォーム及びエレクトロスプレープラットフォームの良好な候補であることを示す。特徴的イオン強度は強く及び所望のペプチドフラグメンテーションパターンが観察された（データは示さない）。
【０３３５】
Ｅ．質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（４２）（図３３参照）の合成
化合物（４２ｂ）：５−フルオロウラシル（４２ａ）（Ｐ／Ｎ：Ｏａｋｗｏｏｄ、００３２４１、０．５ｇ、３．８４ミリモル）及びＤＭＡＰ（４６ｍｇ、０．３８４ミリモル）をアセトニトリル（２５ｍＬ）に溶解した溶液に、ジカルボン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（Ｐ／Ｎ：Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ、００１２８、０．８３５ｇ、３．８４ミリモル）を加え、ＲＴ（ＲＴは室温を表す）で１７時間攪拌した。ＴＬＣ分析は、単一生成物Ｎ−１−Ｂｏｃ−５−フルオロウラシル（４２ｂ）の形成を示した（Ｒｒ＝０．８６、シリカプレート、７：３  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン、ＵＶ２５４ｎｍ、参考文献：Ｊａｉｍｅ−Ｆｉｇｕｅｒｏａ，Ｓ．；Ｚａｍｉｌｐａ，Ａ．；Ｇｕｚｍaｎ，Ａ．；ＭｏｒＧａｎｓ，Ｄ．Ｊ．，“Ｎ−３−Ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｒａｃｉｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｖｉａ  Ｎ−１−Ｂｏｃ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ”，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００１，３１，３７３９−３７４６）。溶媒を除去した後に得られた白色固体を、さらにこれ以上精製することなく次の反応に使用した。
【０３３６】
化合物（４２ｃ）：化合物（４２ｂ）（３．８４ミリモル）をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。この溶液に、ＮａＨ（１８４ｍｇ、４．６０ミリモル、６０％油中分散物）を固体として加え、ＲＴで３０分間攪拌した。この時点で、ＢｒＣＨ２ＣＯＯＭｅ（Ｐ／Ｎ：Ａｃｒｏｓ、１６９５５、０．４３７ｍＬ、４．６０ミリモル）を加え、反応混合物をＲＴで２時間攪拌した。ＴＬＣ分析は、新たな生成物の形成を示した（Ｒｆ＝０．６４、シリカプレート、１：１  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン、ＵＶ２５４ｎｍ）。揮発物をロータリーエバポレーターを使用して除去し、得られた油状物をＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）とＨＣｌ（０．５Ｍ、１００ｍＬ）の間で分配した。次いで、ＥｔＯＡｃ層を、食塩水（１００ｍＬ×２）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、無色油状物に濃縮した。得られた油状物を、フラッシュクロマトグラフィーで精製し（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ精製装置、４０ｇカラム、４０ｍＬ／分、２７０ｎｍ、勾配：２５分間にわたってヘキサン中のＥｔＯＡｃを１０〜６５％に上昇、１８ｍＬの画分を採取した、画分１５−２５は、純粋な生成物を有していた）、０．８３０ｇ（収率７１％）の生成物（４２ｃ）を得た。ＥＳ−ＭＳ（ＭｅＯＨに直接導入、計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋＝［Ｃ１２Ｈ１５ＦＮ２Ｏ６＋Ｎａ］＋＝３２５．０８、実測値［Ｍ＋Ｎａ］＋＝３２５．１２）。
【０３３７】
化合物（４２ｄ）：化合物（４２ｃ）（０．４０３ｍｇ、１．３３ミリモル）を、ＴＦＡ−ＣＨ２Ｃｌ２（１：１、１０ｍＬ）溶液で１５分間処理し、揮発物を除去して化合物（４２ｄ）（０．２５０ｇ、収率９３％、Ｒｆ＝０．４０、シリカプレート、１：１  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン、ＵＶ２５４ｎｍ）を白色固体として得た。ＥＳ−ＭＳ（ＭｅＯＨに直接導入、計算値［Ｍ＋Ｈ］＋＝［Ｃ７Ｈ７ＦＮ２Ｏ４＋Ｈ］＋＝２０３．０５、実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝２０３．０９）。
【０３３８】
化合物（４２ｅ）：（４２ｄ）（０．２５０ｇ、１．２３ミリモル）及びＢｒＣＨ２ＣＨ２ＮＨＢｏＣ（Ｐ／Ｎ：Ｆｌｕｋａ、１７３５４、０．４８２ｇ、２．１５ミリモル）をＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解した溶液に、Ｋ２ＣＯ３（０．５０９ｇ、３．６９ミリモル）を固体として加え、得られた懸濁液をＲＴで２３時間攪拌した。ＴＬＣ分析は、単一生成物（４２ｅ）の形成を示した（Ｒｆ＝０．２８、シリカプレート、１：１  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン、ＵＶ２５４ｎｍ、ＴＬＣは、ＥｔＯＨに溶解したニンヒドリンの３％（ｗ／ｖ）溶液と共に加熱することによって発色させた）。溶媒及び揮発物をロータリーエバポレーターを使用して除去し、得られた油状物をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）と希ＨＣｌ（１００ｍＬ、ｐＨ＝３〜４）の間で分配した。次いで、ＥｔＯＡｃ層を、食塩水（５０ｍＬ×２）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、無色油状物に濃縮した。得られた油状物を、フラッシュクロマトグラフィーで精製し（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ精製装置、４０ｇカラム、４０ｍＬ／分、２７０ｎｍ、勾配：２５分間にわたってヘキサン中のＥｔＯＡｃを４０〜６０％に上昇、１８ｍＬの画分を採取した、画分１２−２０は、純粋な生成物を有していた）、０．３８２ｇ（収率９０％）の生成物（４２ｅ）を得た。ＥＳ−ＭＳ（ＭｅＯＨに直接導入、計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋＝［Ｃ１４Ｈ２０ＦＮ３Ｏ６＋Ｎａ＋］＝３６８．１２、実測値［Ｍ＋Ｎａ］＋＝３６８．２３）。
【０３３９】
化合物（４２ｆ）：ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（５５ｍｇ、２ｍＬの水に溶解した１．３２ミリモル）を、（４２ｅ）（０．２２６ｇ、０．６６ミリモル）をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解した溶液に加え、２０分間攪拌し、この時にＴＬＣ分析はメチルエステルの完全な加水分解を示した（Ｒｆ＝０、シリカプレート、１：１  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン、ＵＶ２５４ｎｍ、ＴＬＣは、ＥｔＯＨに溶解したニンヒドリンの３％（ｗ／ｖ）溶液と共に加熱することによって発色させた）。揮発物を減圧下で除去し、残留物を、ＴＦＡ−水（９：１、１０ｍＬ）で、ＲＴで１時間処理した。ＴＦＡ−水を除去した後に、残留物を飽和ＮａＨＣＯ３（３０ｍＬ、ｐＨ＝８〜９）に溶解した。次いで、得られた水溶液に、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（Ｐ／Ｎ：Ａｄｖａｎｃｅ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  ＲＣ８０１５、０．２６８ｇ、０．７９ミリモルアセトン溶液（３０ｍＬ））の溶液を加え、周囲温度で１時間攪拌した。ＴＬＣ分析は、生成物（４２ｆ）の形成を示した（Ｒｆ＝０．２０、シリカプレート、９：１：０．０１  ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−ＡｃＯＨ、ＵＶ２５４ｎｍ、ＴＬＣは、ＥｔＯＨに溶解したニンヒドリンの３％（ｗ／ｖ）溶液と共に加熱することによって発色させた）。次いで、反応混合物を濃縮してアセトンを除去し、そのようにして得られた残留物を水（１５０ｍＬ）で希釈した。非極性不純物を、Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ×２）で抽出することにより除去した。水性層を酸性化し（ｐＨ〜１、ＨＣｌ、１Ｍ）、ＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）で抽出した。ＥｔＯＡｃ層を、食塩水（５０ｍＬ×２）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して０．１０７ｇ（３工程にわたる収率３５％）の生成物（４１ｆ）を無色粘性油状物として得た。ＥＳ−ＭＳ（ＭｅＯＨ−直接導入）計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋＝［Ｃ２３Ｈ２０ＦＮ３Ｏ６＋Ｎａ］＋＝４７６．１２、実測値［Ｍ＋Ｎａ］＋＝４７６．２０。
【０３４０】
約１０ｍｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−Ｆｉｂ−トリチルクロリド樹脂を、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンのＤＭＦ溶液で処理し（２ｍＬ×１分、濾過、次いで２ｍＬ×５分）、濾過し、洗浄した（ＮＭＰ）。化合物（４２ｆ）（樹脂上のＧｌｕ−Ｆｉｂ量に対して１０当量）を、ＮＭＰ（〜１ｍＬ）中でＨＡＴＵ（Ｐ／Ｎ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１７０３３、９．５当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３０当量）で活性化させ、前記樹脂に加え、３０分間混合した。次いで、樹脂を濾過し、ＮＭＰで洗浄し、Ｆｍｏｃ基を切断した。次いで、ピペラジン酢酸−ＴＦＡ塩（１０当量）を、ＮＭＰ（〜１．５ｍＬ）中でＨＡＴＵ（９．５当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６０当量）で活性化させ、前記樹脂に加えた。３０分後に、樹脂をＮＭＰで洗浄し、次いでＣＨ３ＣＮで洗浄した。共役ペプチドを、９５：５のＴＦＡ−水（２００μＬ、２ｈ）を使用して樹脂から切断し（及び脱保護し）、Ｅｔ２Ｏを使用して沈殿させた。化合物（４２）の分析を、ＥＳ−ＭＳを使用して行った（水に直接導入、計算値［Ｍ＋Ｈ］＋＝１９２３．８、実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝１９２４．０）。
【０３４１】
さらなる質量スペクトル分析：質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（４２）のＭＳ／ＭＳ分析を、ＭＡＬＤＩプラットフォーム及びエレクトロスプレープラットフォームを用いて行った。データは、質量標識がＭＡＬＤＩプラットフォーム及びエレクトロスプレープラットフォームの良好な候補であることを示す。特徴的イオン強度は強く及び所望のペプチドフラグメンテーションパターンが観察された（データは示さない）。
【０３４２】
Ｆ．質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（４３）（図３４参照）の合成
化合物（４３ｂ）：（４３ａ）（Ｐ／Ｎ：Ｏａｋｗｏｏｄ、００３３３３、１．０ｇ、５．５５ミリモル）及びＤＭＡＰ（６７ｍｇ、０．５５ミリモル）をアセトニトリル（４０ｍＬ）に溶解した溶液に、ジカルボン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（Ｐ／Ｎ：Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ、００１２８、１．２１ｇ、５．５５ミリモル）を加え、ＲＴで２時間攪拌した。ＴＬＣ分析は、単一生成物（４３ｂ）の形成を示した（Ｒｒ＝０．８１、シリカプレート、１：１  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン、ＵＶ２５４ｎｍ、参考文献：Ｊａｉｍｅ−Ｆｉｇｕｅｒｏａ，Ｓ．；Ｚａｍｉｌｐａ，Ａ．；Ｇｕｚｍaｎ，Ａ．；Ｍｏｒｇａｎｓ，Ｄ．Ｊ．，“Ｎ−３−Ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｒａｃｉｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｖｉａ  Ｎ−１−Ｂｏｃ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ”，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００１，３１，３７３９−３７４６）。溶媒を除去した後に得られた白色固体を、さらにこれ以上精製することなく次の反応に使用した。
【０３４３】
化合物（４３ｃ）：化合物（４３ｂ）（５．５５ミリモル）をＤＭＦ（３５ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。この溶液に、ＮａＨ（２６７ｍｇ、６．６６ミリモル、６０％油中分散物）を固体として加え、ＲＴで３０分間攪拌した。この時点で、ＢｒＣＨ２ＣＯＯｔＢｕ（Ｐ／Ｎ：Ａｌｄｒｉｃｈ、１２４２３０、０．９８４ｍＬ、６．６６ミリモル）を加え、反応混合物をＲＴで１時間攪拌した。ＴＬＣ分析は、一つの主生成物（４３ｃ）の形成を示した（Ｒｆ＝０．６０、シリカプレート、１：４  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン、ＵＶ２５４ｎｍ）。揮発物をロータリーエバポレーターを使用して除去し、得られた油状物をＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）とＨＣｌ（０．５Ｍ、１００ｍＬ）の間で分配した。次いで、ＥｔＯＡｃ層を、食塩水（５０ｍＬ×２）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して無色油状物を得た。得られた油状物を、フラッシュ−クロマトグラフィーで精製し（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ精製装置、１２０ｇカラム、８５ｍＬ／分、２７０ｎｍ、２５％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液、１８ｍＬの画分を採取した）、０．５２８ｇ（収率２０％）の生成物（４３ｃ）を得た。ＥＳ−ＭＳ（ＭｅＯＨに直接導入、計算値［Ｍ２＋Ｎａ］＋＝［Ｃ３２Ｈ４２Ｆ６Ｎ４Ｏ１２＋Ｎａ］＋＝８１１．２６、実測値［Ｍ２＋Ｎａ］＋＝８１１．４２）。
【０３４４】
化合物（４３ｄ）：化合物（４３ｃ）（０．５２８ｇ、１．３４ミリモル）を、ＴＦＡ−ＣＨ２Ｃｌ２（１：９、１５ｍＬ）溶液で５分間処理し、揮発物を除去して化合物（４３ｄ）（０．３９０ｇ、収率９９％、Ｒｆ＝０．２２、シリカプレート、１：４  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン、ＵＶ２５４ｎｍ）を白色固体として得た。ＥＳ−ＭＳ（ＭｅＯＨに直接導入、計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋＝［Ｃ１１Ｈ１３Ｆ３Ｎ２Ｏ４＋Ｎａ］＋＝３１７．０７、実測値［Ｍ＋Ｎａ］＋＝３１７．１５）。
【０３４５】
化合物（４３ｅ）：（４３ｄ）（０．３９０ｇ、１．３２ミリモル）及びＢｒＣＨ２ＣＨ２ＮＨＢｏＣ（Ｐ／Ｎ：Ｆｌｕｋａ、１７３５４、１．１１２ｇ、４．６２ミリモル）をＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解した溶液に、Ｋ２ＣＯ３（１．０９４ｇ、７．９２ミリモル）を固体として加え、得られた懸濁液をＲＴで２３時間攪拌した。ＴＬＣ分析は、単一生成物の形成を示した（Ｒｆ＝０．７０、シリカプレート、１：１  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン、ＵＶ２５４ｎｍ、ＴＬＣは、ＥｔＯＨに溶解したニンヒドリンの３％（ｗ／ｖ）溶液と共に加熱することによって発色させた）。揮発物をロータリーエバポレーターを使用して除去し、得られた油状物をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）と希ＨＣｌ（１００ｍＬ、ｐＨ＝３〜４）の間で分配した。次いで、ＥｔＯＡｃ層を、食塩水（５０ｍＬ×２）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して無色油状物を得た。得られた油状物を、フラッシュクロマトグラフィーで精製し（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ精製装置、４０ｇカラム、４０ｍＬ／分、２７０ｎｍ、３５％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液、１８ｍＬの画分を採取した、画分１０−１５は、純粋な生成物を有していた）、０．２５６ｇ（収率４０％）の生成物（４３ｅ）を得た。ＥＳ−ＭＳ（ＭｅＯＨに直接導入、計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋＝［Ｃ１８Ｈ２６Ｆ３Ｎ３Ｏ６＋Ｎａ］＋＝４６０．１７、実測値［Ｍ＋Ｎａ］＋＝４６０．３０）。
【０３４６】
化合物（４３ｆ）：化合物（４３ｅ）（０．２５６ｇ、０．５９ミリモル）をＴＦＡ−水（９５：５、１０ｍＬ）で処理し、１時間攪拌した。揮発物を減圧下で除去して、残留物をＥｔ２Ｏで洗浄した。そのようにして得られた白色沈殿物を、飽和ＮａＨＣＯ３（３０ｍＬ、ｐＨ＝８〜９）に溶解した。次いで、得られた水溶液に、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（Ｐ／Ｎ：Ａｄｖａｎｃｅ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  ＲＣ８０１５、０．２３９ｇ、０．７１ミリモルアセトン溶液（２ｍＬ））の溶液を加え、周囲温度で１時間攪拌した。ＴＬＣ分析は、生成物（４３ｆ）の形成を示した（Ｒｆ＝０．２４、シリカプレート、９：１：０．０１  ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−ＡｃＯＨ、ＵＶ２５４ｎｍ、ＴＬＣは、ＥｔＯＨに溶解したニンヒドリンの３％（ｗ／ｖ）溶液と共に加熱することによって発色させた）。次いで、反応混合物を濃縮してアセトンを除去し、そのようにして得られた残留物を水（１５０ｍＬ）で希釈した。非極性不純物を、Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ×２）で抽出することにより除去した。水性層を酸性化し（ｐＨ〜１、ＨＣｌ、１Ｍ）、ＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ×２）で抽出した。ＥｔＯＡｃ層を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して０．２６６ｇの生成物（４３ｆ）を白色固体として得た。ＥＳ−ＭＳ（ＭｅＯＨ−直接導入）計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋＝［Ｃ２４Ｈ２０Ｆ３Ｎ３Ｏ６＋Ｎａ］＋＝５２６．１２、実測値［Ｍ＋Ｎａ］＋＝５２６．２０。
【０３４７】
約１０ｍｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−Ｆｉｂ−トリチルクロリド樹脂を、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンのＤＭＦ溶液で処理し（２ｍＬ×１分、濾過、次いで２ｍＬ×５分）、濾過し、洗浄した（ＮＭＰ）。化合物（４３ｆ）（樹脂上のＧｌｕ−Ｆｉｂ量に対して１０当量）を、ＮＭＰ（〜１ｍＬ）中でＨＡＴＵ（Ｐ／Ｎ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３１７０３３、９．５当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３０当量）で活性化させ、前記樹脂に加え、３０分間混合した。次いで、樹脂を濾過し、ＮＭＰで洗浄し、Ｆｍｏｃ基を切断した。次いで、ピペラジン酢酸−ＴＦＡ塩（１０当量）を、ＮＭＰ（〜１．５ｍＬ）中でＨＡＴＵ（９．５当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６０当量）で活性化させ、前記樹脂に加えた。３０分後に、樹脂をＮＭＰで洗浄し、次いでＣＨ３ＣＮで洗浄した。共役ペプチドを、９５：５のＴＦＡ−水（２００μＬ、２ｈ）を使用して樹脂から切断し（及び脱保護し）、Ｅｔ２Ｏを使用して沈殿させた。化合物（４３）の分析を、ＥＳ−ＭＳを使用して行った（水に直接導入、計算値［Ｍ＋Ｈ］＋＝１９７３．８、実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝１９７４．０）。
【０３４８】
さらなる質量スペクトル分析：質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（４３）のＭＳ／ＭＳ分析を、ＭＡＬＤＩプラットフォーム及びエレクトロスプレープラットフォームを用いて行った。データは、質量標識がＭＡＬＤＩプラットフォーム及びエレクトロスプレープラットフォームの良好な候補であることを示す。特徴的イオン強度は強く及び所望のペプチドフラグメンテーションパターンが観察された（データは示さない）。
【０３４９】
Ｇ．質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（４６）（図３６参照）の合成
化合物（４６ｂ）：（４６ａ）（Ｐ／Ｎ：Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  ０１３４３、２．７３ｇ、５．８８ミリモル）をＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解した溶液に、０℃で、ＢＨ３・ＴＨＦ（１４．７ｍＬ、１Ｍ）溶液を加え、ＲＴで１８時間反応させた。少量のアリコート（ＭｅＯＨで反応を停止させた）のＴＬＣ分析は、新たな生成物と若干のＢｏｃ−脱保護生成物の形成を示した（Ｒｆ（４６ｂ）＝０．５０、シリカプレート、１：１  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン、ＵＶ２５４ｎｍ、ＴＬＣは、ＥｔＯＨに溶解したニンヒドリンの３％（ｗ／ｖ）溶液と共に加熱することによって発色させ、Ｂｏｃ脱保護生成物は、ＴＬＣの基線スポットから同定され、そのＴＬＣは極めてニンヒドリン陽性であった。（化合物（４６ａ）とは異なる）。反応をＭｅＯＨを用いて停止させ、ジカルボン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（Ｐ／Ｎ：Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ、００１２８、１．２８ｇ、５．８８ミリモル）を加え、ＲＴで１時間攪拌した。この段階でのＴＬＣ分析は、化合物（４６ｂ）だけの存在を示した。反応混合物を濃縮し、得られた油状物を、フラッシュクロマトグラフィーで精製し（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ精製装置、１２０ｇカラム、８５ｍＬ／分、２７０ｎｍ、０〜１５分  １０％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液、次いで６０％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液、１８ｍＬの画分を採取した）、２．１２ｇ（収率８０％）の生成物（４６ｂ）を得た。ＥＳ−ＭＳ（ＭｅＯＨ−直接導入）計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋＝［Ｃ２７Ｈ３１ＮＯ３Ｓ＋Ｎａ］＋＝４７２．１９、実測値［Ｍ＋Ｎａ］＋＝４７２．１７。
【０３５０】
化合物（４６ｃ）：（４６ｂ）（１．０７ｇ、２．３８ミリモル）及びＣＢｒ４（Ｐ／Ｎ：Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ１１０８１、１．１８ｇ、３．５７ミリモル）をＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）に溶解した溶液に、ＰＰｈ３溶液（Ｐ／Ｎ：Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｔ８４４０９、０．６８５ｇ、３ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中に２．３９ミリモル）をＲＴで４時間にわたって加えた（注射器を使用して）。ＰＰｈ３添加の完了後に、反応物をさらに１時間攪拌した。ＴＬＣは、主生成物（４６ｃ）の形成を示した（Ｒｆ＝０．５０、シリカプレート、１：４  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン、ＵＶ２５４ｎｍ、ＴＬＣは、ＥｔＯＨに溶解したニンヒドリンの３％（ｗ／ｖ）溶液と共に加熱することによって発色させた）。溶媒を減圧下で除去し、得られた油状物を、フラッシュクロマトグラフィーで精製し（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ精製装置、１２０ｇカラム、８５ｍＬ／分、２７０ｎｍ、０〜５分  ５％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液、次いで２０％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液、１８ｍＬの画分を採取した）、０．６９０ｇ（収率５６％）の生成物（４６ｃ）を得た。ＥＳ−ＭＳ（ＭｅＯＨ−直接導入）計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋＝［Ｃ２７Ｈ３０ＢｒＮＯ２Ｓ＋Ｎａ］＋＝５３４．１１、実測値［Ｍ＋Ｎａ］＋＝５３４．０６。
【０３５１】
化合物（４６ｅ）：（４６ｃ）（０．４６１ｇ、０．９０ミリモル）及び（４６ｄ）（０．２４４ｇ、１．０８ミリモル）をＤＭＦ（２５ｍＬ）に溶解した溶液に、固体Ｋ２ＣＯ３（０．３７２ｇ、２．７０ミリモル）を加え、ＲＴで６８時間攪拌した。ＴＬＣは、生成物（４６ｅ）（Ｒｆ＝０．５０、シリカプレート、１：１  ＥｔＯＡｃ−ヘキサン、ＵＶ２５４ｎｍ、ＴＬＣは、ＥｔＯＨに溶解したニンヒドリンの３％（ｗ／ｖ）溶液と共に加熱することによって発色させた）、未反応（４６ｃ）及び（４６ｄ）の存在を示した。ＤＭＦを減圧下で除去した後に、得られた油状物を、ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）と希ＨＣｌ（１５０ｍＬ、０．５Ｍ）の間で分配した。次いで、ＥｔＯＡｃ層を、食塩水（５０ｍＬ×２）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して無色油状物を得た。得られた油状物を、フラッシュ−クロマトグラフィーで精製し（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ精製装置、４０ｇカラム、４０ｍＬ／分、２６５ｎｍ、０〜１分  ２０％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液、次いで１〜１０分  ３５％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液、次いで５０％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液、１８ｍＬの画分を採取した、画分１９−２７は純粋な生成物を有していた）、０．２００ｇ（収率３４％）の生成物（４６ｅ）を得た。ＥＳ−ＭＳ（ＭｅＯＨに直接導入）計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋＝［Ｃ３７Ｈ４３Ｎ３Ｏ６Ｓ＋Ｎａ］＋＝６８０．２８、実測値［Ｍ＋Ｎａ］＋＝６８０．２３。
【０３５２】
化合物（４６ｆ）：化合物（４６ｅ）（０．２００ｇ、０．３０４ミリモル）を、ＴＦＡ−ＣＨ２Ｃｌ２（９：１、１０ｍＬ）で、ＲＴで３０分間処理し、次いでＴＦＡ−ＣＨ２Ｃｌ２を減圧下で除去した。そのようにして得られた黄色油状物を、該油状物が無色になる（チオール基の再トリチル化）まで、ＴＨＦと同時に蒸発させた。次いで、油状物をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（Ｐ／Ｎ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４００１３６、ｐＨ９〜１０、湿潤ｐＨ紙）を用いて塩基性にした。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２０６ｍＬ、１．１９ミリモル）を、Ｎ−Ｍｅ−ピペラジン酢酸・２ＴＦＡ（０．１５２ｇ、０．３９５ミリモル）及びＨＡＴＵ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４３１７０３３、０．１３８ｇ、０．３６４ミリモル）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した溶液に加え；１分間混合し、Ｂｏｃ脱保護（４６ｃ）の上記の溶液に加えた。１時間後に、反応混合物を、ＨＣｌ（１Ｍ）で酸性にし、食塩水（１５０ｍＬ）で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）で抽出した。ジクロロメタン層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して０．２０７ｇの生成物（４６ｆ）を白色フォーム状物として得た（９８％）。ＥＳ−ＭＳ（ＭｅＯＨに直接導入）計算値［Ｍ＋Ｈ］＋＝［Ｃ３９Ｈ４７Ｎ５Ｏ５Ｓ＋Ｈ］＋＝６９８．３３、実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝６９８．２７。
【０３５３】
化合物（４６ｇ）：（４６ｆ）（７２ｍｇ、０．１ミリモル）をＴＨＦ−水（２：１、３ｍＬ）に溶解した溶液に、ＮａＯＨ溶液（０．２０ｍＬ、１Ｍ）を加え、３０分間混合した。反応物をＴＦＡ溶液（１Ｍ）でｐＨ＝３まで中和し、真空下で乾燥して生成物（４６ｇ）を得た。
【０３５４】
約１０ｍｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−Ｆｉｂ−トリチルクロリド樹脂を、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンのＤＭＦ溶液で処理し（２ｍＬ×１分、濾過、次いで２ｍＬ×５分）、濾過し、洗浄した（ＮＭＰ）。化合物（４６ｇ）（樹脂上のＧｌｕ−Ｆｉｂ量に対して１０当量）を、ＮＭＰ（〜１ｍＬ）中でＨＡＴＵ（Ｐ／Ｎ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３１７０３３、９．５当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６０当量）で活性化させ、前記樹脂に加え、３０分間混合した。次いで、樹脂を濾過し、ＮＭＰで洗浄し、次いでＣＨ３ＣＮで洗浄した。共役ペプチドを、９５：５のＴＦＡ−水（２００μＬ、２ｈ）を使用して樹脂から切断し（及び脱保護し）、Ｅｔ２Ｏを使用して沈殿させた。生成物ペプチドの氷冷溶液（１：５  ＣＨ３ＣＮ−水、０．６０ｍｌ）に、過ギ酸溶液（０．６ｍＬ）を加え、０℃で５分間混合した〔過ギ酸（ＨＣＯＯＯＨ）酸性溶液の調製：４ｍＬのＨＣＯＯＨ（９９％）＋０．４５ｍＬのＨ２Ｏ２（３０％）＋０．２５ｍＬの水を混合し、ＲＴで１時間放置した〕。ＥＳ−ＭＳ分析は、所望の酸化生成物（４６）の存在を示した。計算値［Ｍ＋Ｈ］＋＝２０１３．８、実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝２０１３．７。
【０３５５】
さらなる質量スペクトル分析：質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（４６）のＭＳ／ＭＳ分析を、ＭＡＬＤＩプラットフォームを用いて行った。データは、質量標識がＭＡＬＤＩプラットフォームの良好な候補であることを示す（データは示さない）。ＭＳ分析（エレクトロスプレー）において、＋３帯電種の量は、チミン核酸塩基含有標識のみの場合よりもはるかに少なかった。この化合物は、ＭＡＬＤＩプラットフォーム上で分析した場合のペプチドフラグメンテーションの際に「ｙ」イオン系列のみを与えた（データは示さない）−従って分析のためのＭＳ／ＭＳスペクトルの複雑性を実質的に減らす。
【０３５６】
Ｇ．質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（４７）（図３７参照）の合成
システイン酸（Ｐ／Ｎ：ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｃ０５１４、１ｇ、５．９０ミリモル）を水性ＮａＨＣＯ３（ｐＨ＝８〜９、〜５０ｍＬ）に溶解した溶液に、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ溶液（２．４ｇ、アセトン１５０ｍＬ中に７．０８ミリモル）を加え、ＲＴで１８〜１９時間攪拌した。アセトンを減圧下で除去し、得られた懸濁物を１５０ｍＬの水で希釈した。非極性不純物を、Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ×３）で抽出することにより除去した。水性層を、濃ＨＣｌでｐＨ１に酸性にし、次いでアンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）ＩＲ−１２０−Ｈ樹脂（Ｐ／Ｎ：Ａｌｄｒｉｃｈ  ２１６５３４、１２ｇ、１．９ミリモル／ｇ−ＳＯ３Ｈ基）を加え、混合し、濾過した。濾液を凍結乾燥して、２．５２ｇのＦｍｏｃ−システイン酸を、白色吸湿性固体として得た。ＥＳ−ＭＳ（水に直接導入ネガティブモード、計算値［Ｍ−Ｈ］−＝［Ｃ１８Ｈ１７ＮＯ７Ｓ−Ｈ］−＝３９０．０６、実測値［Ｍ−Ｈ］−＝３９０．０３）。
【０３５７】
約１０ｍｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−Ｆｉｂ−トリチルクロリド樹脂を、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンのＤＭＦ溶液で処理し（２ｍＬ×１分、濾過、次いで２ｍＬ×５分）、濾過し、洗浄した（ＮＭＰ）。Ｆｍｏｃ−システイン酸（樹脂上のＧｌｕ−Ｆｉｂ量に対して１０当量）を、ＮＭＰ（〜１ｍＬ）中でＨＡＴＵ（Ｐ／Ｎ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３１７０３３、９．５当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３０当量）で個々に活性化させ、前記樹脂に加え、３０分間混合した。次いで、樹脂を濾過し、ＮＭＰで洗浄し、Ｆｍｏｃ基を切断した。ピペラジン酢酸−ＴＦＡ塩（１０当量）を、ＮＭＰ（〜１．５ｍＬ）中でＨＡＴＵ（９．５当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６０当量）で活性化させ、前記樹脂に加えた。３０分後に、樹脂をＮＭＰで洗浄し、次いでＣＨ３ＣＮで洗浄した。共役ペプチドを、９５：５のＴＦＡ−水（２００μＬ、２ｈ）を使用して樹脂から切断し（及び脱保護し）、Ｅｔ２Ｏを使用して沈殿させた。化合物（４７）の分析を、ＥＳ−ＭＳを使用して行った（水に直接導入、計算値［Ｍ＋Ｈ］＋＝２０７０．９、実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝２０７１．８）。
【０３５８】
さらなる質量スペクトル分析：質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（４７）のＭＳ／ＭＳ分析を、ＭＡＬＤＩプラットフォームを用いて行った。データは、質量標識がＭＡＬＤＩプラットフォームについて良好な候補であることを示す（データは示さない）。ＭＳ分析（エレクトロスプレー）において、＋３帯電種の量は、チミン核酸塩基含有標識のみの場合よりもはるかに少なかった。この化合物は、ＭＡＬＤＩプラットフォーム上で分析した場合のペプチドフラグメンテーションの際に「ｙ」イオン系列のみを与えた（データは示さない）−従って分析のためのＭＳ／ＭＳスペクトルの複雑性を実質的に減らす。
【０３５９】
Ｈ．質量標で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（４９）（図３８参照）の合成
Ｂｒ（ＣＨ２）３ＣＯ２Ｅｔ（Ｐ／Ｎ：Ａｌｄｒｉｃｈ  １６７１１８、０．６４５ｍＬ、４．５ミリモル）をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）に溶解した溶液に、１−メチルピペラジン（Ｐ／Ｎ：Ａｌｄｒｉｃｈ  １３０００１、１ｍＬ、９．０ミリモル）を加え、一夜攪拌した。沈殿物を濾過した後に、ＥｔＯＡｃ層を濃縮し、そのようにして得られた油状物を、フラッシュクロマトグラフィーで精製し（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ精製装置、１２ｇシリカカラム、３０ｍＬ／分、２０％メタノールのＣＨ２Ｃｌ２溶液、１８ｍＬの画分を採取した）、生成物（４９ａ）を得た。生成物（４９ａ）を水（４ｍＬ）に溶解し、９５℃で４時間加熱した。水を除去した後に、得られた固体（４９ｂ）をＴＨＦで洗浄し、真空下で乾燥した。ＥＳ−ＭＳ（水に直接導入計算値［Ｍ＋Ｈ］＋＝［Ｃ９Ｈ１８Ｎ２Ｏ２＋Ｈ］＋＝１８７．１４、実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝１８７．１８）。
【０３６０】
約１０ｍｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−Ｆｉｂ−トリチルクロリド樹脂を、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンのＤＭＦ溶液で処理し（２ｍＬ×１分、濾過、次いで２ｍＬ×５分）、濾過し、洗浄した（ＮＭＰ）。化合物（４９ｂ）（樹脂上のＧｌｕ−Ｆｉｂ量に対して１０当量）を、ＮＭＰ（〜１ｍＬ）中でＨＡＴＵ（Ｐ／Ｎ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３１７０３３、９．５当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３０当量、化合物２１について６０当量）で活性化させ、前記樹脂に加え、３０分間混合した。次いで、樹脂を濾過し、ＮＭＰで洗浄し、次いでＣＨ３ＣＮで洗浄した。共役ペプチドを、９５：５のＴＦＡ−水（２００μＬ、２ｈ）を使用して樹脂から切断し（及び脱保護し）、Ｅｔ２Ｏを使用して沈殿させた。化合物（５０）の分析を、ＥＳ−ＭＳを使用して行った（水に直接導入、計算値［Ｍ＋Ｈ］＋＝１７３８．８、実測値［Ｍ＋Ｈ］＋＝１７３９．２）。
【０３６１】
さらなる質量スペクトル分析：質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（４９）のＭＳ／ＭＳ分析を、ＭＡＬＤＩプラットフォーム及びエレクトロスプレープラットフォームを用いて行った。データは、プロピオン酸誘導体（４９）が適当な候補であることを示す（データは示さない）。しかし、ＭＳ／ＭＳパターンの綿密な分析は、標識の一部が未だ結合されている幾つかのペプチドフラグメントの存在を示す。
【０３６２】
前述の合成法は、重原子同位体を含有する出発原料を組み込むことによって同位体コード化標識試薬の調製に適用できる。以下の実施例により、同位体コード化同重体標識試薬を製造する種々の方法を実証する。
【０３６３】
同重体状質量標識（標識試薬）の合成
Ｉ．重水素同位体で同位体コードされた同重体質量標識
Ａ．質量標識（２５）の合成
図２０は、質量標識（２５）の合成を説明する。
【０３６４】
ＦｍｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ）（１ミリモル）、ＴＳＴＵ（１ミリモル）及びＤＩＥＡ（２ミリモル）を、ＤＭＦ（６ｍＬ）に溶解した。得られた混合物を、室温で半時間振盪した。溶媒を蒸発させて、ＦｍｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＳｕを形成し、これを直接次の工程で使用した。
【０３６５】
グリシン（０．４ミリモル）をＤＭＦ（０．８ｍｌ）及び０．２Ｍ水性重炭酸ナトリウム（２．８ｍｌ）に溶解した溶液に、ＤＭＦ（２．４ｍｌ）に溶解したＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＳｕ（０．４ミリモル）を、ボルテックスしながら加えた。得られた混合物を、室温で２０分間振盪した。得られた化合物、すなわちＦｍｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｇｌｙを、分取ＨＰＬＣで精製した。
【０３６６】
ＦｍｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｇｌｙ（５０ｍｇ）を、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液（５ｍｌ）に１０分間暴露させて、Ｆｍｏｃ−保護基を除去した。溶媒を蒸発させた後に、生成物Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｇｌｙを、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで特定した〔［Ｍ＋Ｈ］＋：２５３．１（計算値）；２５３．０（実測値）〕。
【０３６７】
ＦｍｏｃＧｌｙｓｉｎｅ−２，２−ｄ２（ＩＳＯＴＥＣ、０．１４ミリモル）、ＴＳＴＵ（０．２１ミリモル）、及びＤＩＥＡ（０．２８ミリモル）を、ＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解した。得られた混合物を、室温で４５分間振盪し、次いでＳｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｇｌｙ（０．１４ミリモル）を０．２Ｍ水性重炭酸ナトリウム（２ｍｌ）に溶解した溶液に移した。さらにＤＭＦ（１ｍｌ）を加えた。得られた混合物を、室温で２０分間振盪した。得られた化合物、すなわちＦｍｏｃＧｌｙ（ｄ２）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｇｌｙを、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで特定した〔［Ｍ＋Ｈ］＋：５３４．２（計算値）；５３４．２（実測値）〕。
【０３６８】
ＦｍｏｃＧｌｙ（ｄ２）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｇｌｙを、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液（５ｍｌ）に１５分間暴露させて、Ｆｍｏｃ−保護基を除去した。溶媒を蒸発させた後に、得られた化合物、すなわちＧｌｙ（ｄ２）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｇｌｙを、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで特定した〔［Ｍ＋Ｈ］＋：３１２．１（計算値）；３１２．０（実測値）〕。
【０３６９】
Ｇｌｙ（ｄ２）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｇｌｙを、プロトコルＩを使用してアシル化して、質量標識（２５）を得た〔［Ｍ＋Ｈ］＋：４８０．１（計算値）；４８０．０（実測値）〕。
【０３７０】
Ｂ．質量標識（２６）の合成
図２１は、質量標識（２６）の合成を説明する。
【０３７１】
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ＮｏｖａＢｉｃｈｅｍ、２ミリモル）をＤＭＦ（４ｍｌ）に溶解した溶液を、氷−水浴を用いて冷却した。水素化ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ、６ミリモル）を加えた。水素ガスの発生が止んだ後に、ベンジル−α，α−ｄ２ブロミド（ＩＳＯＴＥＣ、２ミリモル）を、ボルテックスしながら加えた。得られた混合物を、室温で５時間振盪した。生成物、すなわちＢｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ−ｄ２）を、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで特定した〔［Ｍ＋Ｈ］＋：２９８．２（計算値）；２９８．２（実測値）〕。
【０３７２】
ＢｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ−ｄ２）（０．４ミリモル）、ＴＳＴＵ（０．６ミリモル）、及びＤＩＥＡ（０．８ミリモル）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解した。得られた混合物を、室温で１時間振盪し、次いでグリシン（２ミリモル）を３ｍＬの１Ｍ水性重炭酸ナトリウムに溶解した溶液に滴加して移した。混合物を、室温で３０分間振盪した。生成物、すなわちＢｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ−ｄ２）−Ｇｌｙを、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで特定した〔［Ｍ＋Ｈ］＋：３５５．３（計算値）；３５５．２（実測値）〕。
【０３７３】
ＢｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ−ｄ２）−Ｇｌｙ（６４ｍｇ）を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、１ｍｌ）及び塩化メチレン（２ｍｌ）の溶液に室温で３０分間暴露させて、Ｂｏｃ−保護基を除去した。得られた混合物を、水で２回抽出した（それぞれ１．５ｍｌ）。抽出物を一緒にし、分取ＨＰＬＣで精製した。生成物、すなわちＳｅｒ（Ｂｚｌ−ｄ２）−Ｇｌｙを、ＭＳで特定した。〔［Ｍ＋Ｈ］＋：２５５．１（計算値）；２５５．２、（実測値）〕。
【０３７４】
ＦｍｏｃＧｌｙ（０．３ミリモル）、ＴＳＴＵ（０．３ミリモル）、及びＤＩＥＡ（０．４５ミリモル）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解した。混合物を、室温で１時間振盪し、次いでＳｅｒ（Ｂｚｌ−ｄ２）−Ｇｌｙを０．２Ｍ水性重炭酸ナトリウム（２ｍｌ）に溶解した溶液に滴加して移した。さらにＤＭＦ（１ｍｌ）を加えた。得られた混合物を室温で２０分間振盪した。生成物、すなわちＦｍｏｃＧｌｙ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ−ｄ２）−Ｇｌｙ、を、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで特定した〔［Ｍ＋Ｈ］＋：５３４．３（計算値）；５３４．４（実測値）〕。
【０３７５】
ＦｍｏｃＧｌｙ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ−ｄ２）−Ｇｌｙを、５ｍＬの２０％ピペリジンＤＭＦ溶液に室温で１０分間暴露させて、Ｆｍｏｃ−保護基を除去した。溶媒を蒸発させた後に、生成物、すなわちＧｌｙ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ−ｄ２）−Ｇｌｙを、分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで特定した〔［Ｍ＋Ｈ］＋：３１２．２（計算値）；３１２．４（実測値）〕。
【０３７６】
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ−ｄ２）−Ｇｌｙを、プロトコルＩを使用してアシル化して質量標識（２６）を得た〔［Ｍ＋Ｈ］＋：４８０．１（計算値）；４８０．２（実測値）〕。
【０３７７】
ＩＩ．１２Ｃ／１３Ｃ及び１４Ｎ／１５Ｎで同重体コードした同重体質量標識
Ａ．質量標識（２７）の合成
図２２は、質量標識（２７）の合成を説明する。
【０３７８】
ＦｍｏｃＧｌｙ（１３Ｃ２，１５Ｎ）（ＩＳＯＴＥＣ、０．３３ミリモル）、ＴＳＴＵ（０．６６ミリモル）及びＤＩＥＡ（０．６６ミリモル）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解した。得られた混合物を、室温で４０分間振盪し、次いでＬ−セリン（Ｂｚｌ）（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ、２ミリモル）をＤｌＥＡ（４ミリモル）、ＤＭＳＯ（８ｍｌ）及び水（２ｍｌ）に溶解した溶液に、ボルテックスしながら滴加して移した。混合物を室温で２０分間振盪した。濾過した後に、濾液（これは生成物を含有している）を、分取ＨＰＬＣで精製した。生成物、すなわちＦｍｏｃＧｌｙ（１３Ｃ２，１５Ｎ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）を、ＭＳで特定した〔［Ｍ＋Ｈ］＋：４７８．２（計算値）；４７８．２（実測値）〕。
【０３７９】
ＦｍｏｃＧｌｙ（１３Ｃ２，１５Ｎ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、ＴＳＴＵ（０．６ミリモル）及びＤＩＥＡ（０．６ミリモル）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解した。得られた混合物を、室温で１時間振盪し、Ｇｌｙ（１３Ｃ２，１５Ｎ）（ＩＳＯＴＥＣ、１ミリモル）を水（２ｍｌ）に溶解した溶液に、重炭酸ナトリウム（２ミリモル）と共にボルテックスしながら滴下して移した。さらにＤＭＦ（４ｍｌ）を加えた。得られた混合物を室温で３０分間振盪した。遠心分離後に、上清（これは、生成物を含有している）を、分取ＨＰＬＣで精製した。生成物、すなわちＦｍｏｃＧｌｙ（１３Ｃ２，１５Ｎ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｇｌｙ（１３Ｃ２，１５Ｎ）を、ＭＳで特定した〔［Ｍ＋Ｈ］＋：５３８．２（計算値）；５３８．２（実測値）〕。
【０３８０】
ＦｍｏｃＧｌｙ（１３Ｃ２，１５Ｎ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｇｌｙ（１３Ｃ２，１５Ｎ）（４ｍｇ）を、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液０．２ｍｌに室温で１０分間暴露させて、Ｆｍｏｃ−保護基を除去した。溶媒全部を除去した後に、脱保護アミンを、プロトコルＩを使用してアシル化して質量標識（２７）を得た〔［Ｍ＋Ｈ］＋：４８４．１（計算値）；４８４．０（実測値）〕。
【０３８１】
Ｂ．質量標識（２８）の合成
図２３は、質量標識（２８）の合成を説明する。
【０３８２】
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ、５．８２ミリモル）を、ＤＭＦ（６ｍｌ）に溶解し、氷−水浴で冷却した。水素化ナトリウム（１７．４６ミリモル）を、ボルテックスしながら加えた。得られた混合物を、室温で１５分間振盪した。これ以上ガスが放出されなくなった後に、ベンジル（α−１３Ｃ）ブロミド（ＩＳＯＴＥＣ、２．９１ミリモル）を、ボルテックスしながら加えた。得られた混合物を、室温で４時間振盪し、次いで分取ＨＰＬＣで精製した。生成物、ＢｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ−α−１３Ｃ）を、ＭＳで特定した〔［Ｍ＋Ｈ］＋：２９７．１（計算値）；２９７．２（実測値）〕。
【０３８３】
ＢｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ−α−１３Ｃ）（３００ｍｇ）を、３０％ＴＦＡの塩化メチレン溶液１０ｍｌを用いて３０分間脱保護し、次いで水で２回抽出した（それぞれ３ｍＬ）。水性層を一緒にし、分取ＨＰＬＣで精製した。生成物、すなわちＳｅｒ（Ｂｚｌ−α−１３Ｃ）を、ＭＳで特定した〔［Ｍ＋Ｈ］＋：１９７．１（計算値）；１９７．０（実測値）〕。
【０３８４】
ＦｍｏｃＧｌｙ（２−１３Ｃ，１５Ｎ）（ＩＳＯＴＥＣ、１ミリモル）、ＴＳＴＵ（２ミリモル）及びＤＩＥＡ（２ミリモル）を、ＤＭＦ（３ｍｌ）に溶解した。得られた混合物を、室温で１時間振盪し、次いで３ｍｌの０．２Ｍ重炭酸ナトリウム水溶液中のＳｅｒ（Ｂｚｌ−α−１３Ｃ）に、ボルテックスしながら移した。得られた混合物を、室温で２０分間振盪し、分取ＨＰＬＣで精製した。生成物、すなわちＦｍｏｃＧｌｙ（２−１３Ｃ，１５Ｎ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ−α−ｌ３Ｃ）を、ＭＳで特定した〔［Ｍ＋Ｈ］＋：４７８．２（計算値）；４７８．２（実測値）〕。
【０３８５】
ＦｍｏｃＧｌｙ（２−ｌ３Ｃ，ｌ５Ｎ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ−α−１３Ｃ）（０．０２１ミリモル）、ＴＳＴＵ（０．０４２ミリモル）及びＤＩＥＡ（０．０４２ミリモル）を、ＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶解した。得られた混合物を、室温で１時間振盪し、０．５ｍｌの０．２Ｍ重炭酸ナトリウム水溶液中のＧｌｙｃｉｎｃ（ｌ３Ｃ２，１５Ｎ）（ＩＳＯＴＥＣ、０．１ミリモル）に移した。得られた混合物を、室温で２０分間振盪し、分取ＨＰＬＣで精製した。生成物、すなわちＦｍｏｃＧｌｙ（２−ｌ３Ｃ，ｌ５Ｎ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ−α−１３Ｃ）−Ｇｌｙ（ｌ３Ｃ２、１５Ｎ）を、ＭＳで特定した〔［Ｍ＋Ｈ］＋：５３８．２（計算値）；５３８．０（実測値）〕。
【０３８６】
ＦｍｏｃＧｌｙ（２−ｌ３Ｃ，ｌ５Ｎ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ−α−１３Ｃ）−Ｇｌｙ（ｌ３Ｃ２，１５Ｎ）（１２ｍｇ）を、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液０．８ｍｌを用いて室温で１０分間脱保護した。溶媒全部を蒸発させた後に、遊離アミンを、プロトコルＩを使用してアシル化して質量標識（２８）を得た〔［Ｍ＋Ｈ］＋：４８４．１（計算値）；４８４．０（実測値）〕。
【０３８７】
同重体状質量標識を有する固体支持体
Ｉ．ＦｍｏｃＧｌｙ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ−１３Ｃ６）の合成
図２４は、ＦｍｏｃＧｌｙ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ−１３Ｃ６）（２９）の合成を説明する。
【０３８８】
前記化合物は、ＦｍｏｃＧｌｙ（２−ｌ３Ｃ，ｌ５Ｎ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ−α−１３Ｃ）を調製する方法と同じ方法で調製した。〔ＭＳでの［Ｍ＋Ｈ］＋：４８１．２（計算値）；４８１．２（実測値）〕（重原子同位体で同位体コードされた同重体質量標識の合成、§ＩＩＢ参照）。
【０３８９】
ＩＩ．樹脂結合質量標識の合成
図２５は、樹脂結合同重体同位体コード化質量標識（３０）、（３１）及び（３２）の合成を説明する。
【０３９０】
Ａ．樹脂結合同重体同位体コード化質量標識（３０）の合成
１ｇの湿潤アミノＰＥＧＡ樹脂（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ、０．０５ミリモル置換）を、水、ＤＭＦ、ＤＣＭ、メタノール、ＤＣＭ及びＤＭＦで洗浄した。樹脂を、典型的には２回それぞれの溶媒（それぞれ約５ｍｌ）で洗浄した。ＦｍｏｃＰＡＬリンカー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、０．１５ミリモル）、ＴＳＴＵ（０．１５ミリモル）及びＤＩＥＡ（０．２２５）を、ＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解した。得られた混合物を、室温で２０分間振盪し、次いで約１ｍｌのＤＭＦに懸濁させた樹脂に移した。得られた混合物を、室温で１時間振盪した。濾過後に、樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭ、メタノール、ＤＣＭ及びＤＭＦで２回洗浄した。
【０３９１】
得られた樹脂を、５ｍｌの２０％ピペリジンＤＭＦ溶液で１回洗浄し、次いで５ｍｌの２０％ピペリジンを用いて室温で１０分間完全に脱保護した。濾過後に、樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭ、メタノール、ＤＣＭ及びＤＭＦで２回洗浄した。
【０３９２】
ＦｍｏｃＧｌｙ（１３Ｃ２，１５Ｎ）（ＩＳＯＴＥＣ、０．１ミリモル）、ＴＳＴＵ（０．１ミリモル）及びＤＩＥＡ（０．１５ミリモル）を、ＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解した。得られた混合物を、室温で２０分間振盪し、次いで約１ｍｌのＤＭＦに懸濁させた樹脂に移した。得られた混合物を、室温で２時間振盪した。濾過後に、樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭ、メタノール、ＤＣＭ及びＤＭＦで２回洗浄した。
【０３９３】
得られた樹脂を、５ｍｌの２０％ピペリジンＤＭＦ溶液で１回洗浄し、次いで５ｍｌの２０％ピペリジンを用いて室温で１０分間完全に脱保護した。濾過後に、樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭ、メタノール、ＤＣＭ及びＤＭＦで２回洗浄した。
【０３９４】
ＦｍｏｃＧｌｙ（１３Ｃ２，１５Ｎ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）（０．１ミリモル）、ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、０．１ミリモル）及びＤＩＥＡ（０．１５ミリモル）を、ＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解した。得られた混合物を、室温で２時間振盪した。濾過後に、樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭ、メタノール、ＤＣＭ及びＤＭＦで２回洗浄した。
【０３９５】
得られた樹脂を、５ｍｌの２０％ピペリジンＤＭＦ溶液で１回洗浄し、次いで５ｍｌの２０％ピペリジンを用いて室温で１０分間完全に脱保護した。濾過後に、樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭ、メタノール、ＤＣＭ及びＤＭＦで２回洗浄した。
【０３９６】
ヨード酢酸（０．１５ミリモル）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．１５ミリモル）を、ＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶解した。ＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶解したＤＣＣ（Ａｌｄｒｉｃｈ、０．１５ミリモル）を、ボルテックスしながら加えた。得られた混合物を、室温で１時間振盪した。濾過後に、得られた溶液を、重炭酸ナトリウム（０．１５ミリモル）と共に１ｍｌのＤＭＦに懸濁させた樹脂に加えた。得られた混合物を、室温で１時間振盪した。濾過後に、樹脂結合質量標識（３０）を、水、ＤＭＦ、ＤＣＭ、メタノール、ＤＣＭ、ＤＭＦ及びＤＣＭで２回洗浄した。樹脂結合質量標識を、カートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＵＦＣ３ＯＬＧ２５）に同じ量に分け、ＳｐｅｅｄＶａｃで乾燥し、今後使用するために冷凍庫（−３０℃）に保存した。それぞれのカートリッジは、約４ｍｇの乾燥した樹脂結合質量標識（３０）を有していた。
【０３９７】
Ｂ．樹脂結合同重体同位体コード化質量標識（３１）の合成
樹脂結合質量標識（３１）を合成する方法は、ＦｍｏｃＧｌｙ（１３Ｃ２，ｌ５Ｎ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）をＦｍｏｃＧｌｙ（２−１３Ｃ，Ｉ５Ｎ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ−α−１３Ｃ）に代えた以外は、樹脂結合質量標識（３０）を合成する方法と同じであった。
【０３９８】
Ｃ．樹脂結合同重体同位体コード化質量標識（３２）の合成
樹脂結合質量標識（３１）を合成する方法は、ＦｍｏｃＧｌｙ（１３Ｃ２，ｌ５Ｎ）及びＦｍｏｃＧｌｙ（１３Ｃ２，ｌ５Ｎ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）をＦｍｏｃＧｌｙｃｉｎｅ及びＦｍｏｃＧｌｙ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ−α−１３Ｃ）にそれぞれ代えた以外は、樹脂結合質量標識（３０）を合成する方法と同じであった。
【０３９９】
標識試薬を含有する核酸塩基の合成：図２６は、化合物（３３）から出発し、中間体化合物（３４）及び（３５）を経由して進行する質量標識（３６ａ）への核酸塩基（チミン）の組み込みを説明する。このような転化のための手順を、以下の通りに説明する：
化合物（３４）の合成：
チミン酢酸エチルエステル（３３）（５００ｍｇ、２．３５ミリモル）及び２−Ｂｏｃ−（アミノ）−エチルブロミド（６３４ｍｇ、２．８２ミリモル）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解した溶液に、Ｋ２ＣＯ３（９７４ｍｇ、７．０５ミリモル）を加えた。得られた反応物を、周囲温度で１８時間攪拌した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析は、単一の生成物の形成を示した（シリカプレート、ＥｔＯＡｃ溶媒；Ｒｆ＝０．７；ＵＶ、ニンヒドリン）。ＤＭＦを減圧下で除去した後に、生成物を、フラッシュクロマトグラフィーで精製した（ＩＳＣＯ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ精製装置；４０ｇ  ＳｉＯ２カラム、２６０ｎｍで検出、流量＝４０ｍＬ／分；未反応２−Ｂｏｃ−（アミノ）−臭化エチルを除去するために０〜７分  ５０％ＥｔＯＡｃヘキサン溶液、次いで生成物を溶出するために１００％ＥｔＯＡｃ）。ＥＳ−ＭＳ（メタノールに直接導入）［Ｍ＋Ｈ］＋３５６．１８（計算値）、３５６．１８（実測値）〕。
【０４００】
注：化合物（３３）は、“Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋｓ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙａｍｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ：Ｆａｃｉｌｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ  ｄｏｐｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｓ  ｂａｓｉｃ  ｃａｔａｌｙｓｔ．Ａｌａｈｉａｎｅ，Ａ．；Ｔａｏｕｒｉｒｔｅ，Ｍ．；Ｒｏｃｈｄｉ，Ａ．；Ｒｅｄｗａｎｅ，Ｎ．；Ｓｅｂｔｉ，Ｓ．；Ｅｎｇｅｌｓ，Ｊ．Ｗ．；Ｌａｚｒｅｋ，Ｈ．Ｂ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（２００３），２２（２），１０９−１１４”に従って調製することができる。これらの開示全体は、本明細書において全ての目的のために参照することにより援用される。
【０４０１】
化合物３５の合成：
化合物（３４）（４６５ｍｇ、１．３ミリモル）を、９０％ＴＦＡのジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液を用いて周囲温度で３０分間処理し、この時のＴＬＣ分析は、完全なＢｏｃ脱保護を示した。ＴＦＡ−ＤＣＭ溶液を減圧下で除去し、そのようにして得られたフォーム状物をＤＭＦ（２５ｍＬ）に溶解した。次いで、得られた溶液を、ジイソプロピルエチルアミンを加えることにより中和した（湿潤ｐＨ紙で調べた）。この中性溶液に、ＤＭＦ（２５ｍＬ）に溶解したピペラジン酢酸（２０６ｍｇ、１．３ミリモル）、ＨＡＴＵ（４９４ｍｇ、１．３ミリモル）及びジイソプロピルエチルアミン（０．６７９ｍＬ、３．９ミリモル）の混合物を加えた。３０分後に、ＴＬＣ分析は、生成物の形成を示した（シリカプレート、ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ（１：１）溶媒；Ｒｆ＝０．２；ＵＶ、ニンヒドリン）。ＤＭＦを減圧下で除去した後に、生成物を、フラッシュクロマトグラフィーで精製した（ＩＳＣＯ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ精製装置；４０ｇ  ＳｉＯ２カラム、２６０ｎｍで検出、流量＝４０ｍＬ／分；０〜１分  ９５％ＥｔＯＡｃのＭｅＯＨ溶液、１〜１０分  ５０％ＥｔＯＡｃのＭｅＯＨ溶液、１０〜３０分  １０％ＥｔＯＡｃのＭｅＯＨ溶液）。ＥＳ−ＭＳ（水に直接導入）［Ｍ＋Ｈ］＋３９６．２２（計算値）、３９６．２８（実測値）。
【０４０２】
化合物（３６ａ）の合成：
化合物（３５）（３００ｍｇ、０．７６ミリモル）を水（２０ｍＬ）に溶解した溶液に、ＮａＯＨ溶液（１．１４ｍＬ、１Ｎ）を加えた。得られた溶液を、周囲温度で３時間攪拌した。ＴＬＣ分析は、エチルエステルの加水分解の完結を示した。次いで、反応混合物を、ＴＦＡを用いて酸性にし、次いで減圧下で濃縮した。そのようにして得られた油状物を、それ以上精製することなく直接に使用した。ＥＳ−ＭＳ（水に直接導入）［Ｍ＋Ｎａ］＋３９０．１８（計算値）、３９０．４０（実測値）。
【０４０３】
化合物（３７ａ）の合成：
化合物（３７ａ）（これは、反応性基ＲＧを含有する）は、「反応性基」という表題の欄で論じた周知の方法で調製することができる。
【０４０４】
核酸塩基を含有する別の標識試薬の調製及び前記標識試薬を同位体コードする方法：図２７Ａは、９０％を超える収率で６−メチルウラシルを合成するための公知の合成手順を説明する。図２６に要約した一般的手順は、６−メチルウラシルを化合物（３６ａ）に類似する異性体（３６ｂ）に転化させるのに使用でき、同様に反応性基ＲＧを含有する化合物（３７ａ）及び（３７ｂ）に転化させるのに使用できる。化合物（３６ａ）及び（３７ｂ）は、核酸塩基がリンカー（ＬＫ）の成分であり及びＮ−メチルピペラジンがレポーター（ＲＰ）の成分である一般式ＲＰ−Ｘ−ＬＫ−Ｙ−ＲＧの化合物の実施形態である。
【０４０５】
図２７Ｂ及び２７Ｃは、図７Ａに例示したような６−メチルウラシルの同位体標識された変形を製造するのに使用できる市販の同位体置換出発原料（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｓ、Ａｎｄｏｖｅｒ  ＭＡ）を同定する。説明したように、炭素原子の隣の記号「＊」は、炭素が１３Ｃ同位体であることを示し及び窒素原子の隣の記号「＊」は、窒素が１５Ｎ同位体であることを示す。従って、公知の合成法及び同位体置換出発原料を用いることによって、種々様々な同位体置換標識試薬及びその前駆体を作成することができる。
【０４０６】
図２８Ａ〜２８Ｂは、これらの市販の同位体置換出発原料及び図２７Ａに例示した方法を使用して調製できる６−メチルウラシルの多数の同位体標識の変形を例示する。図２８Ａ及び２８Ｂにおいて記号表示＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６及び＋７は、１個、２個、３個、４個、５個、６個及び７個の重原子同位体それぞれを含有する６−メチルウラシルの変形を表すのに使用する。６−メチルウラシルの変形は、重原子同位体を有していないものから最大７個までの重原子同位体を有するものまでの任意のものを調製することができることから、一般式（３７ｂ）の少なくとも８種類の異なる同重体標識試薬を調製することが可能である。幾つかの同位体コード化標識試薬を図２８Ｃに例証する。
【０４０７】
注：６−メチルウラシルは、以下の文献に従って調製できる：１．Ｄｏｎｌｅａｖｙ，Ｊ．Ｊ．；Ｋｉｓｅ，Ｍ．Ａ．６−Ｍｅｔｈｙｌ  Ｕｒａｃｉｌ，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，Ｃｏｌｌ．Ｖｏｌ．２，ｐ．４２２；Ｖｏｌ．１７，ｐ．６３；  ２．Ｊｉａｎｇ，Ｚ．；Ｗａｎｇ，Ｚ．；Ｍａ，Ｄ．；Ｚｈｏｕ，Ｙ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ６−ｍｅｔｈｙｌｕｒａｃｉｌ．Ｔｏｎｇｊｉ  Ｄａｘｕｅ  Ｘｕｅｂａｏ，Ｚｉｒａｎ  Ｋｅｘｕｅｂａｎ，２００３，３１（２），２５０−２５２：  ３．６−Ｍｅｔｈｙｌｕｒａｃｉｌ．ＳＡＩＪＩＹＯＵ  ＳＨＩＧＥＹＡ；ＮＩＳＨＩＮＡＫＡ  ＴＯＳＨＩＹＯＳＨＩ（Ｙｏｄｏｇａｗａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）．Ｊｐｎ．Ｋｏｋａｉ  Ｔｏｋｋｙｏ  Ｋｏｈｏ（１９８１），２ｐｐ．ＪＰ５６１３９４６７；日本語で書かれた特許。要約：ＭｅＣＯＣＨ２ＣＯ２Ｍｅを尿素及びｐ−ＭｅＣ６Ｈ４ＳＯ３Ｈと共にヘキサン中でＨ２Ｏを共沸除去しながら６時間還流すると、Ｍｅ３−ウレイドクロトネートが得られ、これを１０％ＮａＯＨと共に９５℃で０．５時間加熱して９２．６％の６−メチルウラシルを得た。
【０４０８】
ＩＩＩ．ワンステップ固相ｉＴＲＡＱのプロトコル
Ａ．タンパク質消化
ａ．タンパク質試料（５０〜１００μｇ）を、５０μｌの変性緩衝液（０．２Ｍ水性ＮＨ４ＨＣＯ３、８Ｍ尿素及び２０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する）に溶解した。
【０４０９】
ｂ．２μｌのトリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ、Ｓｉｇｍａ、５０ｍＭ）を試料溶液に加え、３７℃で１時間インキュベートした。
【０４１０】
ｃ．１μｌのメチル＝メタンチオスルホネート（ＭＭＴＳ）試薬（Ａｌｄｒｉｃｈ、２００ｍＭ）を加え、試料溶液を１０分間ボルテックスした。
【０４１１】
ｄ．試料溶液を０．１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１、５μｌ）で希釈した。
【０４１２】
ｅ．２μｌのＬｙｓＣ（Ｗａｋｏ、１μｇ／μｌ）を試料溶液に加え、試料溶液を３７℃で１時間インキュベートしてタンパク質を消化した。
【０４１３】
ｆ．消化溶液を水（１：１、１００μｌ）で希釈した。
【０４１４】
ｇ．１０μｌ（〜５μｇ）のトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｖ５１１３、０．５μｇ／μｌ）を消化溶液に加え、消化溶液を３７℃で４〜６時間インキュベートした。
【０４１５】
ｈ．４μｌのＴＣＥＰを消化溶液に加え、消化溶液を３７℃で１時間インキュベートした。
【０４１６】
Ｂ．システインアミノ酸を有するペプチドの捕獲及び標識
ａ．Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（ＵＦＣ３ＯＬＧ２５、上記で調製した）内の樹脂結合同重体同位体コード化質量標識を、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）（３×３００μｌ）で洗浄した。
【０４１７】
ｂ．タンパク質消化溶液（〜２００μｌ）を、工程ａの予め状態調節したカートリッジに移した。
【０４１８】
ｃ．前記カートリッジを低速で３０〜６０分間ボルテックスした。
【０４１９】
ｄ．カートリッジを遠心分離して未結合ペプチドを除去した。濾液を、ＨＰＬＣで分析した（捕獲の完結を調べるため）。
【０４２０】
ｅ．カートリッジ内の樹脂を、０．１％水性ＴＦＡ溶液（３×３００μｌ）で洗浄した。
【０４２１】
ｆ．樹脂をさらにＳｐｅｅｄＶａｃ中で乾燥した。
Ｃ．樹脂から標識ペプチドの放出
ａ．２００μｌのＴＦＡ（９５％）及びＴＩＰＳ（Ａｌｄｒｉｃｈ、５％）の切断カクテルを、前記カートリッジに加えた。
【０４２２】
ｂ．前記カートリッジを室温で９０分間放置した。
【０４２３】
ｃ．前記カートリッジを低速（６×１０００ｇ）で遠心分離し、得られた濾液を保持した。
【０４２４】
ｄ．さらに１００μｌの０．１％ＴＦＡを前記カートリッジに加え、カートリッジを管に再度遠心分離し、濾液を保持した。
【０４２５】
ｅ．濾液を貯め、次いでＳｐｅｅｄＶａｃで乾燥して、質量標識ペプチドを含有する残留物を得た。
【０４２６】
ＭＳ及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用して同重体質量標識で標識されたペプチドの分析
質量標識（３８）及び（３９）は、広範囲にわたって試験された一対の質量標識である。質量標識（３８）及び（３９）は、次の構造式：
【０４２７】
【化６３】
2009526998.tif 000041
を有する。
【０４２８】
質量標識（３８）及び（３９）は、適切な同位体置換出発原料を、任意の公知アミノ酸合成と共に用いることによって合成することができ、例えば、適切な同位体置換出発原料は、図２５に示した方法と共に、固体樹脂支持体から質量標識を放出させるための切断工程と組み合わせて用いることができる。
【０４２９】
質量標識（３８）及び（３９）の両方は、４７９．０５Ｄａの質量を有し、解離エネルギーレベルに暴露させるとベンジル基を失うことが予測される。しかし、それぞれの質量標識への重水素置換基の配置により、質量標識（３８）は、９１．０５Ｄａの質量を有する特徴的イオンを有するであろうし、また質量標識（３９）は９３．０７Ｄａの質量を有する特徴的イオンを有するであろう。
【０４３０】
Ａ．質量標識（３８）でアルキル化されたペプチドのＱＴＲＡＰＴＭ２０００分析
次式：
配列番号１  ＩＡＶＡＡＱＮＣＹＫ
配列番号２  ＩＩＹＧＧＳＶＴＧＡＴＣＫ
を有する合成ペプチド配列番号１及び配列番号２のシステインアミノ酸残基を、質量標識（３８）を用いてアルキル化し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。精製標識ペプチドを、０．１％ＴＦＡ中で１μＭの濃度で再構成した。質量スペクトルを、ＱＴＲＡＰＴＭ２０００装置でＴｕｒｂｏＩｏｎＳｐｒａｙ操作を使用して注入実験で生じさせた。合計０．５分（４０スキャン）を採取した。図２Ａ及び図２Ｂに示すように、標識された配列番号１及び２について分子イオンのフラグメンテーション（９１Ｄａを喪失）の割合は小さかった（それぞれ約３％及び１０％）。ＱＴＲＡＰＴＭ２０００のＭＳ／ＭＳモードにおいて、標識された配列番号１及び配列番号２は、９１Ｄａの特徴的イオンを生じた（図３Ａ及び３Ｂそれぞれ参照）。これらの強度はペプチド依存性であり、典型的には少なくともインモニウムイオンの強さと少なくともほぼ同じ強さであった。標識されたペプチドの配列イオンは、ヨード酢酸を用いてアルキル化した対応ペプチドの配列イオンと、存在及び強度の両方において比較できた。
【０４３１】
Ｂ．４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して質量標識（３８）又は（３９）を用いてアルキル化されたペプチドの分析
配列番号１及び配列番号３（ＤＣＧＡＴＷＶＶＬＧＨＳＥＲ）を、質量標識（３８）を用いてアルキル化し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、０．１％水性ＴＦＡで１００μＬに希釈した。それぞれの試料（１μＬ）を、前記マトリックス（１μＬ飽和溶液）と混合し、次いでそれぞれの混合物（１μＬ）を、分析用のＭＡＬＤＩプレートに装填した。標識された配列番号１及び配列番号３についての親イオンは、ｍ／ｚ１４３１．７及び１８８０．８それぞれであった。両方のペプチドは安定であり、ＭＳステージにおける親イオンによる特徴的イオンの喪失は観察されなかった（図４Ａ及び４Ｂ参照）。
【０４３２】
Ｍ／ｚ  １４３１．７における標識された配列番号１のＭＳ／ＭＳスペクトル及びｍ／ｚ  １８８０．８における標識された配列番号３のＭＳ／ＭＳスペクトルは、１×１０−５トールで設定したＣＩＤガス圧を使用して生じさせ、合計２，０００ショットを採取した（図５Ａ及び５Ｂ参照）。得られた特徴的イオン及び配列イオンを、図に示す。ＭＳ／ＭＳステージにおける特徴的イオンの強度は、ペプチド依存性であり、典型的にはＱＴＲＡＰＴＭ２０００を使用して得られた強度よりも小さかった。しかし、強度は、ＣＩＤを大きくした場合に著しく高めることができる（データは示さない）。配列範囲は、ヨード酢酸を用いてアルキル化された対応ペプチドについて得られた配列範囲と一致した。
【０４３３】
Ｃ．ＱＴＲＡＰＴＭ２０００を用いた質量標識を使用するペプチドの定量
試料中のタンパク質発現の相対定量を評価するために、５個のペプチドを有する２つの試料を調製した。５個のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムは、図６Ａ〜Ｃに示した通りである。これらのペプチドを、これらのもっとも早い保持時間からもっとも長い保持時間までの保持時間に基づいて、配列番号１〜５と命名する。
配列番号１  ＩＡＶＡＡＱＮＣＹＫ
配列番号２  ＩＩＹＧＧＳＶＴＧＡＴＣＫ
配列番号３  ＤＣＧＡＴＷＶＶＬＧＨＳＥＲ
配列番号４  ＶＰＡＤＴＥＶＶＣＡＰＰＴＡＹＩＤＦＡＲ
配列番号５  ＶＡＨＡＬＳＥＧＬＧＶＩＡＣＩＧＥＫ。
【０４３４】
第１の試料を還元し、質量標識（３８）でアルキル化し、トリプシンで消化した。第２の試料は、第１の試料と同じ５個のペプチドを含有していたが、質量標識（３８）の代わりに質量標識（３９）でアルキル化した。第１の試料をアリコートとして分取し（それぞれ５ピコモル）、それぞれのアリコートを、２５０ｆモルから５０ピコモルまでの種々の量の第２の試料と一緒にした。それぞれの試料混合物を、ＱＴＲＡＰＴＭ２０００を使用してＭＲＭスキャンモードを使用してＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験で分析した。質量標識（３８）で標識されたペプチドは、９１Ｄａで特徴的イオンを生じ、これに対して質量標識（３９）で標識されたペプチドは、ＭＳ／ＭＳにおいて９３Ｄａで特徴的イオンを生じた。ＭＲＭ実験において、特異的分子イオンからフラグメントイオンへの遷移が測定された。それぞれの試料混合物は、２種類の標識でアルキル化された５個のｃｙｓ−ペプチドを含有していたことから、合計１０ＭＲＭ遷移（又は対）が監視された：配列番号１については７１６．５／９１及び７１６．５／９３；配列番号２については８１１．５／９１及び８１１．５／９３；配列番号３については６２８．５／９１及び６２８．５／９３；配列番号４については８２９．９／９１及び８２９．９／９３並びに配列番号５については７０７．５／９１及び７０７．５／９３。図６において認められるスペクトルは、ＲＰＬＣ−保持時間の関数として対応する分子イオン（すなわち、無傷ペプチドイオン）から特異的フラグメントイオン（すなわち、９１Ｄａ及び９３Ｄａのイオン）の存在比を示した。
【０４３５】
表１から認めることができるように、予測された比は、実験で得られた比と一致した。ダイナミックレンジは、２桁よりも大きい範囲にわたる１／０．０５〜１／１０であった。比１／０．１について質量標識（３８）由来の９１Ｄａイオン及び比１／１０について質量標識（３９）由来の９３Ｄａイオンは、バックグラウンドノイズよりもさらに大きかったことから、ダイナミックレンジは３桁以上のものであり得る。
【０４３６】
Ｄ．４７００Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いた質量標識を使用するペプチドの定量
上記の欄Ｃからの試料１及び２の混合物を調製した。得られた混合物において、試料１由来のペプチドの濃度は、０．２μＭに固定した。次いで、それぞれ（１μＬ）を前記マトリックス（１μＬ）と混合した。次いで、それぞれの混合物（１μＬ）をＭＡＬＤＩプレートに装填し、４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒで分析した。ＣＩＤは、９×１０−６に設定し、それぞれのＭＳ／ＭＳ実験について合計３，０００ショットを採取した。９１−イオン及び９３−イオンのピーク面積強度を使用して、実験比を算出した（表１参照）。
【０４３７】
ダイナミックレンジは、２桁よりも大きい範囲にわたる１／０．０５〜１／１０であった。比１／０．１について質量標識（３８）由来の９１Ｄａイオン及び比１／１０について質量標識（３９）由来の９３Ｄａイオンは、バックグラウンドノイズよりもさらに大きかったことから、ダイナミックレンジは３桁以上のものであり得る。
【０４３８】
相対定量について、１桁のダイナミックレンジを有するプローブは、典型的な相対タンパク質発現が１０倍よりも小さいことから、十分であり得る。しかし、絶対定量については、大きなダイナミックレンジを有するプローブが望ましい。本発明の質量標識は２桁よりも大きいダイナミックレンジを有することから、タンパク質の絶対定量及び相対定量に使用できる。
【０４３９】
【表２】
2009526998.tif 000042
表１：ＱＴＲＡＰＴＭ又は４７００  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用する質量標識タンパク質の相対定量
Ｅ．複合タンパク質混合物の分析
それぞれ１９個のペプチドを含有する２つの同じタンパク質混合物を、質量標識（３８）又は質量標識（３９）でアルキル化した。従って、質量標識（３８）でアルキル化された混合物中のペプチドは、９１Ｄａの特徴的イオンを生じるであろうし、これに対して質量標識（３９）でアルキル化された混合物中のペプチドは、９３Ｄａの特徴的イオンを生じるであろう。上記２つのタンパク質混合物を、１：１の比率又は１：２の比率で混合し、混合物をＱＴＲＡＰＴＭで分析して、それぞれの分子イオンについてＭＳ／ＭＳステージにおける特徴的イオン（９１／９３）の比に基づいてそれぞれの試料中のそれぞれのペプチドの比を測定した。表２のデータから認めることができるように、１：１混合物及び１：２混合物の実験結果は、１９個のペプチドそれぞれについて予測された比と密接に対応していた。
【０４４０】
【表３−１】
2009526998.tif 000043
【０４４１】
【表３−２】
2009526998.tif 000044
本発明を、その好ましい実施形態に関連して具体的に示し、説明したが、当業者には、形態の種々の変化及び詳細を添付の特許請求の範囲に包含される発明の範囲から逸脱することなくなし得ることが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０４４２】
【図１−１】図１Ａ−１Ｄは、同じ分子量を有するが、解離エネルギーレベルに供された場合にはフラグメント化して異なる分子量を有する特徴的イオンを生じるであろう一組の８種類の同重体質量標識の構造式を表す。
【図１−２】図１Ｅ−１Ｈは、同じ分子量を有するが、解離エネルギーレベルに供された場合にはフラグメント化して異なる分子量を有する特徴的イオンを生じるであろう一組の８種類の同重体質量標識の構造式を表す。
【図２Ａ】質量標識（３２）を用いてアルキル化された配列番号１のＱＴＲＡＰＴＭ２０００によるＭＳ分析である。
【図２Ｂ】質量標識（３２）を用いてアルキル化された配列番号２のＱＴＲＡＰＴＭ２０００によるＭＳ分析である。
【図３Ａ】質量標識（３２）を用いてアルキル化された配列番号１のＱＴＲＡＰＴＭ２０００によるＭＳ／ＭＳ分析である。
【図３Ｂ】質量標識（３２）を用いてアルキル化された配列番号２のＱＴＲＡＰＴＭ２０００によるＭＳ／ＭＳ分析である。
【図４】図４Ａは、４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用する、質量標識（３２）を用いてアルキル化された配列番号１のＭＳ分析である。図４Ｂは、４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用する、質量標識（３２）を用いてアルキル化された配列番号３のＭＳ分析である。
【図５Ａ】４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用する、質量標識（３２）を用いてアルキル化された配列番号１のＭＳ／ＭＳ分析である。
【図５Ｂ】４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用する、質量標識（３２）を用いてアルキル化された配列番号３のＭＳ／ＭＳ分析である。
【図６Ａ】一方の試料が質量標識（３２）を用いてアルキル化されており、他方の試料が質量標識（３３）を用いてアルキル化されており、質量標識（３２）を用いて標識された試料と質量標識（３３）を用いて標識された試料の比が１：０．０５である２つの試料のＱＴＲＡＰＴＭ２０００を用いて行ったＭＲＭ実験を表す。
【図６Ｂ】一方の試料が質量標識（３２）を用いてアルキル化されており、他方の試料が質量標識（３３）を用いてアルキル化されており、質量標識（３２）を用いて標識された試料と質量標識（３３）を用いて標識された試料の比が１：１である２つの試料にのＱＴＲＡＰＴＭ２０００を用いて行ったＭＲＭ実験を表す。
【図６Ｃ】一方の試料が質量標識（３２）を用いてアルキル化されており、他方の試料が質量標識（３３）を用いてアルキル化されており、質量標識（３２）を用いて標識された試料と質量標識（３３）を用いて標識された試料の比が１：１０である２つの試料のＱＴＲＡＰＴＭ２０００を用いて行ったＭＲＭ実験を表す。
【図７Ａ】図７Ａ−１及び７Ａ−２は、４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用する図６Ａの試料のＭＳ／ＭＳモードでの質量スペクトルである。
【図７Ｂ】図７Ｂ−１及び７Ｂ−２は、４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用する図６Ｂの試料のＭＳ／ＭＳモードでの質量スペクトルである。
【図７Ｃ】図７Ｃ−１及び７Ｃ−２は、４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用する図６Ｃの試料のＭＳ／ＭＳモードでの質量スペクトルである。
【図８】それぞれのＧが独立してＯ又はＳであり、典型的にはＯである活性エステルのアルコール基又はチオール基のための脱離基（ＬＧ）の代表的な式を例示する。
【図９Ａ】幾つかの実施形態における基ＬＫによって構成され得る部分ｉ〜ｘｉｖを例示する。
【図９Ｂ】幾つかの実施形態における基ＬＫによって構成され得る部分ｉ〜ｘｉｖを例示する。
【図１０】質量標識に反応性基を生成させるアミンアシル化のためのプロトコルＩ及びＩＩを説明する。
【図１１】質量標識（２）の合成を説明する。
【図１２】質量標識（３）の合成を説明する。
【図１３】質量標識（４）及び（５）を説明する。
【図１４】質量標識（６）、（７）及び（８）の合成を説明する。
【図１５】質量標識（９）、（１０）及び（１１）の合成を説明する。
【図１６】質量標識（１２）の合成を説明する。
【図１７】質量標識（１４）及び（１５）を説明する。
【図１８】質量標識（１６）、（１７）、（１８）、（１９）及び（２０）の合成のための一般的なプロトコルを説明する。
【図１９】質量標識（２１）、（２２）、（２３）及び（２４）の合成を説明する。
【図２０】質量標識（２５）の合成を説明する。
【図２１】質量標識（２６）の合成を説明する。
【図２２】質量標識（２７）の合成を説明する。
【図２３】質量標識（２８）の合成を説明する。
【図２４】ＦｍｏｃＧｌｙ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ−１３Ｃ６）（２９）の合成を説明する。
【図２５】樹脂結合質量標識（３０）、（３１）及び（３２）の合成を説明する。
【図２６】チミン核酸塩基を含有する標識試薬／質量標識（ＸＸ）（３７ａ）の合成を説明する。
【図２７】図２７Ａは、６−メチルウラシル核酸塩基（３７ｂ）を含有する標識試薬（質量標識）を調製することができる６−メチルウラシルの合成用の公知の方法を説明する。図２７Ｂは、６−メチルウラシルの同位体標識バージョンの製造において使用できるアセト酢酸エチルの種々の市販の同位体置換バージョンを例示する。図２７Ｃは、６−メチルウラシルの同位体標識バージョンの製造において使用できる尿素の種々の市販の同位体置換バージョンを例示する。
【図２８Ａ】図２７Ｂ及び２７Ｃに例示した化合物を使用して、図２７Ａに例示した方法と組み合わせて製造することができる６−メチルウラシルの種々の同位体標識バージョンを例示する。＊で標識された原子は、重原子同位体である。
【図２８Ｂ】図２７Ｂ及び２７Ｃに例示した化合物を使用して、図２７Ａに例示した方法と組み合わせて製造することができる６−メチルウラシルの種々の同位体標識バージョンを例示する。＊で標識された原子は、重原子同位体である。
【図２９Ａ】図２６、２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃに例示した方法及び市販の化合物、並びに図２８Ａ及び２８Ｂに例示した同位体置換６−メチルウラシルを使用して製造することができる種々の同位体コード化標識試薬を例示する。
【図２９Ｂ】図２６、２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃに例示した方法及び市販の化合物、並びに図２８Ａ及び２８Ｂに例示した同位体置換６−メチルウラシルを使用して製造することができる種々の同位体コード化標識試薬を例示する。
【図２９Ｃ】図２６、２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃに例示した方法及び市販の化合物、並びに図２８Ａ及び２８Ｂに例示した同位体置換６−メチルウラシルを使用して製造することができる種々の同位体コード化標識試薬を例示する。
【図２９Ｄ】図２６、２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃに例示した方法及び市販の化合物、並びに図２８Ａ及び２８Ｂに例示した同位体置換６−メチルウラシルを使用して製造することができる種々の同位体コード化標識試薬を例示する。
【図２９Ｅ】図２６、２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃに例示した方法及び市販の化合物、並びに図２８Ａ及び２８Ｂに例示した同位体置換６−メチルウラシルを使用して製造することができる種々の同位体コード化標識試薬を例示する。
【図３０】質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（３８）及び（３９）の化学構造を例示する。
【図３１】質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（４０）の化学構造を例示する。
【図３２】質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（４１）の合成を説明する。
【図３３】質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（４２）の合成を説明する。
【図３４】質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（４３）の合成を説明する。
【図３５】質量標識（４４）及び（４５）の合成を説明する。
【図３６】質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（４６）の合成を説明する。
【図３７】質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（４７）及び質量標識（４８）の化学構造を説明する。
【図３８】質量標識で標識されたＧｌｕ−Ｆｉｂペプチド（４９）の合成を説明する。
【図１Ａ】
2009526998.tif 000069
【図１Ｂ】
2009526998.tif 000070
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
2009526998.tif 000072
【図１Ｅ】
2009526998.tif 000073
【図１Ｆ】
2009526998.tif 000074
【図１Ｇ】
2009526998.tif 000075
【図１Ｈ】
2009526998.tif 000076
【図２Ａ】
2009526998.tif 000077
【図２Ｂ】
2009526998.tif 000078
【図３Ａ】
2009526998.tif 000079
【図３Ｂ】
2009526998.tif 000080
【図４】
2009526998.tif 000081
【図５Ａ】
2009526998.tif 000082
【図５Ｂ】
2009526998.tif 000083
【図６Ａ】
2009526998.tif 000084
【図６Ｂ】
2009526998.tif 000085
【図６Ｃ】
2009526998.tif 000086
【図７Ａ】
2009526998.tif 000087
【図７Ｂ】
2009526998.tif 000088
【図７Ｃ】
2009526998.tif 000089
【図８】
2009526998.tif 000090
【図９Ａ】
2009526998.tif 000091
【図９Ｂ】
2009526998.tif 000092
【図１０】
2009526998.tif 000093
【図１１】
2009526998.tif 000094
【図１２】
2009526998.tif 000095
【図１３】
2009526998.tif 000096
【図１４】
2009526998.tif 000097
【図１５】
2009526998.tif 000098
【図１６】
2009526998.tif 000099
【図１７】
2009526998.tif 000100
【図１８】
2009526998.tif 000101
【図１９】
2009526998.tif 000102
【図２０】
2009526998.tif 000103
【図２１】
2009526998.tif 000104
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
2009526998.tif 000110
【図２８Ａ】
2009526998.tif 000111
【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
2009526998.tif 000113
【図２９Ｂ】
2009526998.tif 000114
【図２９Ｃ】
2009526998.tif 000115
【図２９Ｄ】
2009526998.tif 000116
【図２９Ｅ】
2009526998.tif 000117
【図３０】
2009526998.tif 000118
【図３１】
2009526998.tif 000119
【図３２】
2009526998.tif 000120
【図３３】
2009526998.tif 000121
【図３４】
2009526998.tif 000122
【図３５】
2009526998.tif 000123
【図３６】
2009526998.tif 000124
【図３７】
2009526998.tif 000125
【図３８】
2009526998.tif 000126
【国際調査報告】
2009526998.tif 000127
2009526998.tif 000128
2009526998.tif 000129
2009526998.tif 000130
2009526998.tif 000131
2009526998.tif 000132