(57)【要約】  本発明は、血管または細気管支の平滑筋細胞に対する煙の影響を評価し、細気管支または管に対する煙の影響を低減することができる生物活性剤を同定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管または細気管支の平滑筋細胞に対する脂質可溶性煙粒子の影響を評価する方法であって、
ａ．動物から細気管支または管を提供する工程；
ｂ．前記細気管支または管を脂質可溶性煙粒子に晒す工程；
ｃ．前記細気管支を解体する前に、一または複数のレセプターの媒介状態のアップレギュレーションを誘導する工程；
ｄ．前記解体された細気管支をメディウムに浸し、前記細気管支または管に対して張力を適用する工程；
ｅ．前記解体された細気管支または管の収縮応答を決定する工程；および
ｆ．血管または細気管支の平滑筋細胞に対する脂質可溶性煙粒子の影響を評価する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記脂質可溶性煙粒子が、タバコ煙に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レセプターが、エンドセリン、アンギオテンシン、セロトニン、およびブラジキニンからなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
以下の二つの追加の工程を含む、前述の請求項の何れかに記載の方法：
工程ｄ）とｅ）の間に生物活性剤を添加する第一の工程、および
血管または細気管支の平滑筋細胞に対する煙の影響を低減することができる生物活性剤を得る第二の最終工程。
【請求項５】
前記生物活性剤が、キナーゼ阻害剤である、前述の請求項の何れかに記載の方法。
【請求項６】
前記細気管支または管が、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、またはその合成バージョンからなる群より選択される、前述の請求項の何れかに記載の方法。
【請求項７】
前記解体された細気管支または管からサンプルの一部を得る追加の一または複数の工程を含む、前述の請求項の何れかに記載の方法。
【請求項８】
前記レセプターの発現が、前記サンプルの一部においてmRNAのレベルで決定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前述の請求項の何れかに記載の方法により得られる生物活性剤。
【請求項１０】
慢性閉塞性肺疾患または細気管支喘息の後などの細気管支または管の収縮を伴う障害の治療のための請求項９に記載の生物活性剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、煙から得られる脂質可溶性部分の細気管支に対する影響を評価し、血管または細気管支の平滑筋細胞に対する煙の影響を低減することができる生物活性剤を同定する方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
シガレットの喫煙は、高脂質血症および高血圧と共に作用して、アテローム性動脈硬化症の高い発生率とリンクする強い危険因子として昔から認識されている。発作、心筋梗塞、および跛行は、シガレット喫煙者の間で多く発症する（Wyngaarden & & Smith. Cecil Textbook of Medicine, 1-2404 (W.B. Saunders company, Philadelphia, 1988)。心臓血管疾患の直接医療費は、西欧諸国で莫大であり、喫煙は、世界中で一年に500万人の早死を引き起こすことが見出されており、この大多数は、興味深いことに心臓血管系のできごとに由来する（Lightwood. The economics of smoking and cardiovascular disease, Prog Cardiovasc Dis 46, 39-78 (2003)。喫煙粒子は、内皮の局所的な機能不全およびプラーク形成の増大を伴って、動脈壁にダメージを起こすと考えられる（Holden et al., Endothelium-dependent effects of cigarette smoke components on tone of porcine intrapulmonary bronchioles in vitro {Toxicol Appl Pharmacol 104, 191-9 (1990)）。しかし、喫煙がどのようにしてアテローム性動脈硬化症のプロセスに関与し、悪化させることができるかを説明するための分子メカニズムは、あまり理解されていない。したがって、タバコの煙の影響を気管支レベルで評価することができる方法を開発する必要がある。かかる方法の開発により、現存するタバコの影響、並びに新たなタバコ製品の影響を評価することができ、これにより、動脈壁および気道に対する影響を小さくするかまたは全くなくし、望ましくはタバコを消費するヒトへの危険性を少なくすることができる。この方法は、血管または気道の平滑筋細胞においてタバコ製品が誘導する変化を防ぐことができる薬剤をスクリーニングするために使用することもでき、また、この方法を使用して、喫煙により変化し得るレセプターの発現調節を決定する、すなわち、この方法を診断方法として使用することができる。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、解体された細気管支、たとえば動脈または気道の平滑筋細胞に対する、煙から得られる脂質可溶性部分の影響を評価し、血管または細気管支の平滑筋細胞に対する煙の影響を低減することができる生物活性剤を同定する方法に関する。これにより、様々な煙、たとえば様々なタバコまたはタバコ製品に由来する様々な煙を互いに比較し、前記タバコを利用するヒトにとって害が少ないタバコを同定することが初めて可能になるとともに、血管または細気管支の平滑筋細胞内に存在する、煙により影響を受ける全てのレセプター（たとえば動脈壁または気道のエンドセリンレセプター）の発現に影響を及ぼさないか、または低い程度でしか影響を及ぼさず、これにより血管または細気管支の平滑筋細胞の収縮を低減する新規タバコを見出す際に本方法を使用することができる。
【０００４】
第一の側面に従って、本発明は、血管または細気管支の平滑筋細胞に対する脂質可溶性煙粒子の影響を評価する方法であって、動物から解体された細気管支または管を提供する工程、前記解体された細気管支または管を脂質可溶性煙粒子に晒す工程、前記細気管支または管を解体する前に、一または複数のレセプターの媒介状態のアップレギュレーションを誘導する工程、前記解体された細気管支または管をメディウムに浸し、前記細気管支または管に対して張力を適用する工程、前記解体された細気管支または管の収縮応答を決定する工程、および血管または細気管支の平滑筋細胞に対する煙の影響を評価する工程を含む方法に関する。
【０００５】
第二の側面において、本発明は、血管または細気管支の平滑筋細胞に対するタバコの煙の影響を評価する方法であって、動物から解体された細気管支または管を提供する工程、前記解体された細気管支または管を脂質可溶性煙粒子に晒す工程、前記細気管支または管を解体する前に、一または複数のレセプターの媒介状態のアップレギュレーションを誘導する工程、前記解体された細気管支または管をメディウムに浸し、前記細気管支または管に対して張力を適用する工程、生物活性剤を添加する工程、前記解体された細気管支または管の収縮応答を決定する工程、および血管または細気管支の平滑筋細胞に対する煙の影響を評価し、生物活性剤を得る工程を含む方法に関する。
【０００６】
第三の側面において、本発明は、上記方法により得られる生物活性剤、並びに慢性閉塞性肺疾患または細気管支喘息の後などの管または細気管支の収縮を伴う障害の治療のための前記生物活性剤の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【０００７】
定義
本出願および本発明の文脈において、以下の定義を適用する：
「脂質可溶性煙粒子」の用語は、例１で得られたフラクションを意味することを意図する。
【０００８】
「生物活性剤」の用語は、虚血性脳傷害後の動脈などの血管の血管収縮を減少させるか、または血管拡張を増大させたりすることにより血管状態を正常化することができるタンパク質キナーゼ阻害剤として作用することができる薬剤を意味することを意図する。
【０００９】
「メディウム」の用語は、解体された動脈または細気管支のレセプターがアップレギュレーションされ得る溶液を意味することを意図する。レセプターの例は、エンドセリン、たとえばA1およびA2、アンギオテンシン、たとえばAT1およびAT2、セロトニン、たとえば5HT1B、およびブラジキニン、たとえばB1およびB2である。生理溶液の例は、当業者に明らかである。たとえば、改変KREB’s、DMEM、生理NaCl、リン酸緩衝液などである。
【００１０】
本発明に従って「治療」の用語は、転写および翻訳につながるシグナルを阻害することにより、レセプターのアップレギュレーションが妨害され、これによりたとえば半影ゾーンの損傷およびニューロンの損失につながる続発症（sequel）が取消されることを意味する。
【００１１】
「アップレギュレーション」の用語は、血管および気道のレセプターが、表現型を変化させ、および/または数を増大させ、これが、循環および肺機能に対する悪影響につながることを意味することを意図する。
【００１２】
「細気管支」の用語は、気管の後ろの気道を意味することを意図する。
【００１３】
本発明の方法
本発明は、血管または細気管支の平滑筋細胞に対する煙の影響を評価し、これにより煙中のどの粒子が、ある種の効果を担っているかに関して知識を得る分野に関する。脂質可溶性煙粒子は、様々なタバコ製品、たとえば従来のシガレットまたはシガーに由来し得るものである。粒子は、その後タバコから除去することができ、これによりタバコを喫煙するヒトに対するマイナスの影響が少ない健康的なタバコを得ることができる。タバコの煙は、動脈および気管支の平滑筋細胞（SMC）の少なくともエンドセリンレセプターをアップレギュレートすることが驚くべきことに見出された。本方法は、新規な生物活性剤を同定するために使用することもでき、これは、細気管支または管を伴う障害を治療するため、並びに脂質可溶性煙粒子によりアップレギュレートされるレセプターの発現を決定するために使用することができ、これにより、本方法を使用して、脂質可溶性煙粒子により引き起こされる障害または疾患の程度を決定することができる。
【００１４】
かかるタバコ脂質可溶性煙粒子を同定可能にするために、我々は、エンドセリンレセプターなどの一または複数のレセプターのアップレギュレーションと同時に、またはそれと連続して収縮および/または拡張が誘導され得る方法を開発した。本発明者らは、インビボおよびインビトロの両方で虚血状態である組織の血管、たとえば脳底動脈および中大脳動脈が、表現型の変化を受け、その結果、血管収縮薬レセプター集団がアップレギュレートされ、これが過度な動脈収縮につながること、およびエンドセリン、5-ヒドロキシトリプタミンおよびアンギオテンシンレセプターなどが、なかでもアップレギュレートされることを驚くべきことに見出した。かなり強力であるが、同じ効果が、タバコ脂質可溶性煙粒子の使用により観察される。本方法は、たとえばエンドセリンレセプターのアップレギュレーションに関与する分子メカニズムを理解するために使用することができ；このプロセスは、血管系および呼吸器系疾患に関与する。このことから、煙誘導性疾患を治療するために使用することができる生物活性剤を同定することができる。生物活性剤は、タンパク質キナーゼ阻害剤として作用することができる。
【００１５】
動脈または気道のSMCは、動物、たとえばラット、マウス、モルモット（guinea-pig）、イヌ、ネコ、ウマ、またはその合成バージョンから得ることができる。SMCは、Adner et al., Plasticity of contractile endothelin-B receptors in human arteries after organ culture. Br J Pharmacol 119, 1159-66 (1996) に開示される技術を使用することにより得ることができ、気道は、たとえばGranstrom et al., Upregulation of endothelin receptor function of mRNA expression in airway smooth muscle cells following sephadex-induced airway inflammation. Basic&Clinical Pharmacol Toxicol. 2004; 95: 43-48に開示される。単離された動脈または細気管支は、その後、タバコの煙または前記煙から抽出されたタバコの脂質可溶性煙粒子、たとえば水溶性粒子または脂質可溶性粒子に晒される。前記脂質可溶性煙粒子を抽出する一つの方法は、例１である。
【００１６】
細気管支は、タバコ脂質可溶性煙粒子に晒される前または晒された後の何れかに、小さなセグメントまたはディスクに解体することができる。
【００１７】
細気管支は、脂質可溶性煙粒子に晒されている間、エンドセリンレセプターをアップレギュレートするか、またはエンドセリンレセプターは、多かれ少なかれ活性なままである。しかし、評価されたこれまでのすべてのタバコは、エンドセリンレセプターを活性化したため、エンドセリンレセプターをアップレギュレートする粒子がタバコから除去されると、健康的なタバコを得ることができ、あるいは組織は疾患にかかりにくいという結論に至る。したがって、本発明の方法は、重要であり、新規タバコの開発に有用なツールとなるでしょう。本方法は、気道における血管の平滑筋細胞においてタバコ製品が誘導する変化を防ぐことができる薬剤をスクリーニングするために使用することもでき、また、本方法を使用して、喫煙により変化し得るレセプターの発現調節を決定する、すなわち、本方法を診断方法として使用することができる。
【００１８】
以下の実施例は、本発明を更に説明するために盛り込まれ、本発明はこれに限定されるべきではない。
【００１９】
［例１］
DSPの抽出
3つのシガレット（シガレットあたり0.8 mgのニコチン）を、水流吸引器により「喫煙し」、その煙を脱脂綿フィルターに通した。フィルター中に保持された煙粒子を、1 ml  DMSO中に溶解した。DMSO−可溶性煙粒子（DSP）調製物は、ガスクロマトグラフ−水素炎イオン化検出（GC-FID, Agilent 6890N, USA）により、0.23 mm x 15 mm x 0.25 m DB-5MSキャピラリーカラム（Agilent, USA）を用いて分析した。GC-FIDの温度は、50℃から、5℃/分で280℃まで増大させ、3分間維持した。DSP中のニコチンの濃度は、スタンダードのニコチンピーク値と面積に従って計算した。DSP調製物をガスクロマトグラフにより分析した後、スタンダードのニコチン含量（0.11 mg/L）に希釈し、器官培養実験のために使用した。
【００２０】
［例２］
組織調製物
Sprague-Dawleyラット（250〜300 mg、オスまたはメス）をCO2で安楽死させ、頭部を切断し、全血を採った。上腸間膜動脈を静かに取り出し、冷却した酸素添加緩衝溶液（mM: NaCl 119, NaHCO3 15, KCl 4.6, MgC12 1.2, NaH2PO4 1.2, CaC12 1.5, グルコース5.5, pH 7.4）に浸し、光学顕微鏡の下で接着組織から離して解剖した。ヒトの中大脳動脈（MCA）を、Xian Jiaotong大学（中国）の法医学部の3人の被検体から得た。その動脈を3人の男性から収集し、交通事故死から4〜6時間後に器官培養のために使用した。ラットおよびヒトの動脈を使用する実験プロトコールは、Shaanxi省（中国）の地方倫理委員会により承認された。
【００２１】
［例３］
器官培養
我々は、動脈セグメントの所定期間の培養により、血管細胞のGPCRの表現型の変化を誘導するインビトロ方法を開発した（Adner et al., Plasticity of contractile endothelin-B receptors in human bronchioles after organ culture. Br J Pharmacol 119, 1159-66 (1996)）。1ミリの長さのリングセグメント（内皮および外膜を除去した）を、血清フリーDMEM中で、37℃で、5％ CO2リッチの加湿大気中で、24時間、0.2μl/mlのDSPを添加して、または添加せずに、インキュベートする。
【００２２】
［例４］
インビトロ薬理学
収縮実験のために、細気管支を、以下の組成（mM）の温度制御された緩衝溶液中に浸漬された2本のワイヤー（Myograph, J.P. Trading, Denmark）の上に載せる：NaCl 119, NaHCO3 15, KCl 4.6, MgCl2 1.2, NaH2PO4 1.2, CaCl2 1.5およびグルコース 5.5。緩衝液は、5％ CO2リッチの酸素を連続して通気し、pHを7.4にする。測定は、パーソナルコンピューターに連続的に記録するためのPowerLabユニット (AD Instruments, Hastings, England) により記録し、ソフトウエアプログラムChart（登録商標）で解析する（Adner et al., Plasticity of contractile endothelin-B receptors in human bronchioles after organ culture. Br J Pharmacol 119, 1159-66 (1996)）。
【００２３】
［例４］
免疫組織化学
管セグメント、各グループにつき3サンプルを、Tissue TEK（Gibco）上に置き、凍結させ、その後、8μMの厚さのスライスに切断した。使用した一次抗体は、ウサギ抗ヒトETB（IBL,16207）、1:400希釈、ヤギ抗ヒトETA（Santa Cruz Biotechnologies, sc-2 1194）、1:100希釈、マウス抗ラット平滑筋アクチン（Serotec, MCA 1 905T）、1:100希釈、およびマウス抗ラットCD3 1（Serotec, MCA1746）、希釈1:200であった。すべての希釈は、10％ウシ胎仔血清を含むPBSで行った。使用した二次抗体は、10％ウシ胎仔血清を含むPBS中のロバ抗マウスCyTM5コンジュゲート（Jackson ImmunoResearch, 715- 175-150）1:100、ロバ抗ウサギCyTM3コンジュゲート（Jackson lmmunoResearch, 711-165-152）1:100であった。抗体は、その後、共焦点顕微鏡（Zeiss, USA）で、適切な波長で検出した。コントロールとして、二次抗体のみを使用した。絶対蛍光を、Image J（http://rsb.info.nih.gov/ij）を用いて調べ、バックグラウンド蛍光を引き算した。測定は、平滑筋アクチンについてポジティブな染色がみられるところ、従って管の筋部分で行った。得られた値は、選択された領域の平均蛍光であった。
【００２４】
［例５］
細胞内シグナル伝達研究
器官培養の後、管を収集し、氷上に置き、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む溶解緩衝液（10 mM Tris pH 7.4, 50 mM β-グリセロホスフェート, 100μM Na3VO4, 0.5% デオキシコレート, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 mM NaF, 20 mM Na4P2O7, 1% Triton X-IOO, 1 mM DTT, 20μM ペプスタチン, 20μM ロイペプチン, 0.1 U/ml アプロチニン, 1 nM カリクリンおよび1 mM PMSF）中でホモジナイズした。トータルタンパク質濃度は、BioRad DCキット（Hercules, CA, USA）およびGenesys 6分光光度計（Thermo, Waltham, MA, U.S.A.）を用いて決定した。45μgのトータルタンパク質を、10％ SDS-PAGEゲルに1レーンあたりロードし、Hybond PVDFメンブレンに30分間1.5 mA/cm2でブロットした。その後、メンブレンを、5％脱脂乳中で室温（RT）で1時間ブロックし、一次抗体と4℃で一晩、二次抗体（Pierce, Rockford, IL, U.S.A.）とRTで1時間インキュベートした。メンブレンを、Supersignal Duraキット（Pierce, Rockford, IL, U.S.A.）で現像し、Fujifilm LAS-1000 発光イメージアナライザー（Stamford, CT, U.S.A.）を用いて視覚化した。pAktSER.473, pJNK, phospho-p38, (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, U.S.A.), pELKl, pPKCδSER645, pPKCεSER729 (Biosource, Camarillo, CA, U.S.A.), ETAおよびETB (Chemicon, Temecula, CA, U.S.A.) は、1:1000で使用した。pERK (Promega, Madison, WI, U.S.A.) は、1:2500で使用した。
【００２５】
［例６］
インビトロ薬理学
二つの軟骨セグメントを含む環状セグメントを、気管および気管支から切断した。各セグメントから、直径1 mmの金属トレッド（tread）およびファイングレードのやすりとしての面を用いてその上皮を剥がし、混同する遅延効果を回避した（Hadj-Kaddour et al, 1996）。
【００２６】
その後、これらを二つのL-字型の金属プロング（prong）の上に載せた。一つのプロングは、等しい張力の連続的記録のためにコンピュータに取り付けられたフォース置換トランスデューサーに接続し、もう一つは、置換デバイスに接続した。その後、セグメントを、同じ緩衝溶液を含有する小さな（2.5 ml）温度制御（37℃）ティッシュバスに浸した。その溶液は、O2中の5％CO2で平衡化し、pHを7.4にした。最初に、1 mNの張力を各セグメントに適用し、その後、このレベルの張力で60分間安定させた。各セグメントの収縮能力を、カリウムリッチ（60 mM）の緩衝溶液（組成については下記参照）に晒すことによりまず調査した。2回の強い（＞1 mN）再現性のある収縮が誘導された後のみ、個々のセグメントを更なる研究のために使用した。K+-溶液（60 mM）により誘導される収縮は、収縮性レファレンスとして使用した。上皮を剥がしたセグメントと上皮が完全なセグメントとの実験を比較すると、収縮能力は、上皮剥脱による影響も被害も受けないことが分かった。
【００２７】
濃度−応答実験は、3つのパートで行った：第一に、気管のエンドセリンレセプターは、エンドセリン-1およびS6cを用いて、エンドセリンETA−アンタゴニストFR139317（10μM）、エンドセリンETB−アンタゴニストBQ788（10μM）の存在下もしくは非存在下、またはこれら二つのアンタゴニストの組合せの存在下、またはETレセプターアンタゴニストbosentan（10μM）との組合せで、特徴付けを行った。第二に、好酸球性炎症が確証された（24h）後、エンドセリン-1およびS6の影響を、ラットの気道、気管および気管支の二つのレベルで研究した。エンドセリンアゴニストにより最大収縮に到達したときに、アセチルコリンを添加した（1 mM）。すべてのセグメントが、この研究で使用可能であり、すなわち、上皮の除去によっても、セファデックス誘導性炎症によってもセグメントはダメージを受けなかった。気道の上皮細胞は、木製のスティックにより機械的に除去し、結果は、実験後に組織学的調査によりコントロールした（ヘマトキシリン−エオシン染色）。
【００２８】
緩衝溶液および薬剤
標準緩衝溶液 (mM)：NaCl 119, NaHCO3 15, KCl 4.6, MgC12 1.2, NaH2PO4 1.2, CaCl2 1.5, グルコース 5.5。分析グレードの化学薬品およびダブル蒸留水を、すべての溶液を調製するために使用した。
【００２９】
およびET-I (Auspeptide, Aus)を、ウシ血清アルブミン(Kabi, Sweden) (0.1% w/v)を含む水に溶解した。すべてのMAPK阻害剤をDMSO中に溶解し、水で希釈した。PD98059, SB239063, SB408039, SB386023bおよびSB203580は、Sigma, St. Louis, USAから購入した。
【００３０】
計算および統計
データは、平均値±S.E.M.で表す。各セグメントの収縮応答は、K+-誘導性収縮のパーセンテージで表す。Emaxは、アゴニストにより誘導される最大収縮を表し、それぞれの管セグメントについて、絶対値またはK+-誘導性応答のパーセンテージで表す。pEC50値は、濃度−応答曲線の中間点より上の濃度と下の濃度の間の直線から計算した。すべての統計解析のために、ダンのポストホック（Dunn’s post-hoc）検定を用いたクラスカル・ワリス（Kruskal-Wallis）ノンパラメトリック検定を使用した。P＜0.05で有意と考えた。
【００３１】
［例７］
PCRリアルタイム
肺のサンプルは、取得後すぐに液体窒素ですばやく凍結（snap-frozen）し、トータル細胞RNAは、TRIzol試薬（Gibco BRL）を用いて供給会社の指示に従って抽出した。得られたRNAペレットは、最後に70％氷冷エタノールで洗浄し、空気乾燥し、10μlピロ炭酸ジエチル（DEPC）処理水に再溶解した。RNAの量は、分光測光法（DU64分光光度計；Beckman, Fullerton, CA, USA）により、ＯＤ260:280＞1.6の比を純粋と考えて決定した。
【００３２】
RT-PCRは、GeneAmp RNA PCRキット（Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA）を用いて、DNAサーマルサイクラー（Perkin-Elmer）で行った。ラットのエンドセリンETA−（264塩基対の産物をつくる）およびエンドセリンETBレセプター（560塩基対の産物をつくる）に特異的なプライマーは、以下のとおり設計した：
エンドセリンETA−レセプター
フォーワード：5’-TACAAGGGCGAGCAGCACAGGA-3’
リバース：5’-CACAGGGCGAAGATGACAACCAA-3’
エンドセリンETB−レセプター
フォーワード：5’-TGACGCCACCCACTAAGAC-3’
リバース：5’-GACAGCCAGAACCACAGAGA-3’
【００３３】
トータルRNAのcDNAへの逆転写およびその後のPCRは、GeneAmp RNA PCRキット（Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA）を用いて、Perkin-Elmer DNAサーマルサイクラーで行った。第一鎖cDNAは、1μgトータルRNAから、20μl反応体積で、プライマーとしてランダムヘキサマーを用いて合成した。反応混合物は、25℃で10分、42℃で15分インキュベートし、99℃で5分加熱し、5℃で5分冷却した。各プライマー対に対して、得られたcDNAの一部9μlを、PCRにより、50μlの最終体積で増幅した。PCRは、以下のプロファイルで行った：95℃で5分を1サイクル、その後95℃で1分、57℃で1分、72℃で30秒をサイクル；最後の伸長は72℃で7分とした。すべての実験にブランク（水）を含めた。コントロール実験は、30サイクルがPCRの対数期の範囲内であることを示した（図示せず）。
【００３４】
PCR産物の同一性は、以下のとおり制限分析により確認した：エンドセリンETA産物は、SpH I（Boehringer Mannheim, Germany）で消化し、それぞれ27、78および159塩基対の3つのフラグメントを生成した。エンドセリンETB産物は、Eco RV（Boehringer）で切断し、それぞれ106および454塩基対の2つのフラグメントを生成した。
【００３５】
肺組織は、除去後、-80℃にすばやく凍結した。トータル細胞RNAは、FastRNATM キット-GREENおよびFastPrep(登録商標) FP 120 Cell Disrupter（BIO101, Qbiogene, Carlsbad CA, USA）を用いて供給会社の指示に従って抽出した。得られたペレットは、最後に10μlピロ炭酸ジエチル（DEPC）処理水に再溶解した。トータルRNAのcDNAへの逆転写は、GeneAmp RNA PCRキット（PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いて、Perkin-Elmer DNAサーマルサイクラーで行った。第一鎖cDNAは、1μgトータルRNAから、20μl反応体積で、プライマーとしてランダムヘキサマーを用いて合成した。反応混合物は、25℃で10分、42℃で15分インキュベートし、99℃で5分加熱し、5℃で5分冷却した。リアルタイムPCRは、GeneAmp 5700配列検出システム（Perkin-Elmer, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）で、GeneAmp SYBR(登録商標)グリーンキット（Perkin-Elmer, Applied Biosystems Foster City, CA, USA）を用いて、鋳型として上記で合成したcDNAを用いて、50μl反応体積で行った。すべての実験に鋳型コントロールを含めなかった。GeneAmp 5700配列検出システムは、DNAの増殖を、光学およびイメージングシステムを用いてリアルタイムで、二本鎖DNAへの蛍光色素の結合を介してモニターする。ラットのETAおよびETBレセプターに特異的なプライマーは、以下のとおり設計した：
ETAレセプター
フォーワード；5’-ATTGCCCTCAGCGAACAC-3’
リバース；5’-CAACCAAGCAGAAAGACGGTC-3’
ETBレセプター
フォーワード；5’-GATACGACAACTTCCGCTCCA-3’
リバース；5’-GTCCACGATGAGGACAATGAG-3’
【００３６】
延長因子-1（EF-1）のmRNAは、細胞内に一定の量で継続して発現されるハウスキーピング遺伝子の産物であるため、レファレンスとして使用した。EF-1プライマーは、以下のとおり設計した：
EF-1  フォーワード；5’-GCAAGCCCATGTGTGTTGAA-3’
リバース；5’-TGATGACACCCACAGCAACTG-3’
【００３７】
リアルタイムPCRは、以下のプロファイルで行った：50℃で2分、95℃で10分、95℃で15秒、40回、および60℃で1分。EF-1およびETレセプターのcDNAが、リアルタイムPCRの間に同じ効率で増幅することを証明するために、標準曲線を作成し、ここでＣT-値は、等式：ＣT＝(lg(1＋E))-1lg(濃度)（ここでEは、最適値が１の増幅効率である）に基いてcDNA濃度に対してプロットした。各プライマー対がPCR産物を一つだけ生成することを証明するために、PCR産物のアガロースゲル電気泳動を行った。
【００３８】
薬剤
PCR：PCRアッセイのためのオリゴヌクレオチドおよび試薬は、Perkin-Elmer, Applied Biosystems Foster City, CA, USAから購入した。
【００３９】
計算
PCR：PCR実験は、ｎ匹のセファデックス処理ラットおよびｎ匹の生理食塩水処理ラットについて行った。ETAおよびETBレセプター mRNAの量は、式：X0/R0＝２CtR-CtX（ここでX0＝ETレセプター mRNAの当初の量、R0＝EF-1 mRNAの当初の量、CtR＝EF-1のＣT-値、CtX＝ETレセプターのＣT-値である）により、同一サンプル中のEF-1 mRNAの量に対して計算した。統計解析を行い、ｐ＜0.05を有意と考えた。
【００４０】
［例８］
他のレセプターの分子生物学
データは、他のレセプターを示唆する。生理溶液の例は、AT1 5-HT1BおよびB1のそれぞれもアップレギュレートする。肺疾患の状況で変化するか、または過剰発現し、このことが、喘息の過剰な血管収縮にも寄与し得る、まだ定義されていない他のレセプターがなお存在するかもしれない。ついでに言うと、膜結合レセプターが、肺フローの調節に寄与するだけでなく、異なるタイプのイオンチャンネルの活性と結びつくことも関連がある。まとめると、潜在的に有益な生物活性剤を同定する効果的な方法は、様々なメカニズムの動きを追跡する能力を必要とするでしょう。
【００４１】
トータルRNAの抽出：トータル細胞RNAは、FastRNATM キット-GREEN（BIO 101, Carlsbad CA, USA）を用いて供給会社の指示に従って抽出した。得られたペレットは、最後に75％エタノールで洗浄し、空気乾燥し、40μlピロ炭酸ジエチル（DEPC）処理水に再溶解した。
【００４２】
トータルRNAのcDNAへの逆転写は、GeneAmp RNA PCRキット（PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いて、Perkin-Elmer DNAサーマルサイクラーで行った。第一鎖cDNAは、トータルRNAから、40μl反応体積で、プライマーとしてランダムヘキサマーを用いて合成した。反応混合物は、25℃で10分インキュベートし、42℃で15分加熱し、更に99℃で5分加熱し、5℃で5分冷却した。リアルタイムPCRは、GeneAmp 5700配列検出システムで、GeneAmp SYBR(登録商標)グリーンキット（Perkin-Elmer, Applied Biosystems Foster City, CA, USA）を用いて、鋳型として上記で合成したcDNAを用いて、50μl反応体積で行った。すべての実験に鋳型コントロールを含めなかった。GeneAmp 5700配列検出システムは、DNAの増殖を、光学およびイメージングシステムを用いてリアルタイムで、二本鎖DNAへの蛍光色素の結合を介してモニターした。AT1およびAT2レセプター、ACEおよびNF-κBに特異的なプライマーは、以下のとおり設計した：
AT1レセプター
フォーワード：5’-GGATGGTTCTCAGAGAGAGTACAT-3’
リバース：5’-CCTGCCCTCTTGTACCTGTTG-3’
AT2レセプター
フォーワード：5’-TCTGTTAGTGGGATGCATGTAATCA-3’
リバース：5’-TGTGGGCCTCCAAACCATT-3’
ACE
フォーワード：5’-CCCGGAAATACGAAGAATTGC-3’
リバース：5’-GGCTCTCCCCACCTTGTCTC-3’
NF-κB
フォーワード：5’-GAGAGCCAGTAGCACGCATG-3’
リバース：5’-CCTGGGTTCGTGGAATGAGT-3’
【００４３】
延長因子-1（EF-1）およびグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）のmRNAは、内部標準として使用し、プライマーは、以下のとおり設計した：
EF-1
フォーワード：5’-GCAAGCCCATGTGTGTTGAA-3’
リバース：5’-TGATGACACCCACAGCAACTG-3’
GAPDH
フォーワード：5’-GGCCTTCCGTGTTCCTACC-3’
リバース：5’-CGGCATGTCAGATCCACAAC-3’
【００４４】
リアルタイムPCRは、以下のプロファイルで行った：50℃で2分、その後、95℃で15秒、95℃で15秒と60℃で1分を40サイクル。
【００４５】
計算
PCR：PCR実験は、試験されるプライマーにつき5-6匹のラットについて行った（各サンプル2回）。mRNAの量は、式：X0/R0＝２CtR-CtX（ここでX0＝ターゲットmRNAの当初の量、R0＝EF-1/GAPDH mRNAの当初の量、CtR＝EF-1/GAPDHのＣT-値、CtX＝ターゲットのＣT-値である）により、同一サンプル中のEF-1およびGAPDH mRNAの量に対して計算した。ＣT-値により、我々は、特定の時点における、あるサンプル中の遺伝子産物ごとに行われたPCRサイクルの数を言及する。データは、平均値±SEMで表す。統計解析をアンペアの（unpaired）スチューデントのｔ検定で行い、ｐ＜0.05を有意と考えた。
【００４６】
［例９］
ウェスタンブロット
ウェスタンブロットは、細気管支において活性化された（リン酸化された）MAPKsの存在を確認するために使用した。ウェスタンブロットのために使用される細気管支のセグメントは、0.5、1、2、3または24 h培養し、液体窒素ですばやく凍結し、その後使用するまで-80℃で保存した。
【００４７】
ウェスタンブロットのために使用される組織は、500 L Laemmli溶液でまずインキュベートし、polytron（IKA labortechnik, Germany）でホモジナイズした。その溶解物を、5000 X gで、4℃で5分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。更にLaemmli溶液を添加し、約75 mg組織/mLの濃度にした。その溶解物は、使用するまで-20℃で保存した。
【００４８】
そのタンパク質を、97-100℃で3-5分加熱し、ほとんどのタンパク質を変性させた。同量のボイルした上清フラクションを、10％ポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動で分離し（Mini-protean 3, Bio-Rad, CA）、その後、半乾式ブロッティング（Trans-blot SD, Bio-Rad）によりセミブロットPVDFメンブレン（Bio-Rad）に移した。ウェスタンブロットは、TBS-T（TBS中の0.1％ Tween-20）中の5％スキムミルクの溶液を用いてブロックし、スキムミルクおよび適切な希釈のポリクローナル抗体を含有するTBS-T中で、4℃で一晩インキュベートした。そのメンブレンを、TBS-T中で洗浄し、抗ウサギIgGホースラディシュペルオキシダーゼ標識二次抗体（1:50000）と90分インキュベートした。PVDFメンブレンを、更に洗浄した後、SuperSignal Westを行い、Luminiscent Image Analyzer（Fujifilm Science Imaging systems, Japan）により化学発光を検出した。p38およびAkt-タンパク質キナーゼゲルにおいて、ラットの細気管支から得た細胞抽出物を、ポジティブコントロールとしてゲルに添加した。方法論の更なる詳細については（Frodin et al., 2002）が参照される。
【００４９】
ERK1/2を検出するためにヤギポリクローナル抗体を使用し（Santa Cruz Biotechnology, USA）、ホスホ-ERK1/2キナーゼを検出するためにポリクローナルウサギ抗体（Promega, USA）を使用した。p38 MAPキナーゼ、ホスホ-p38 MAPキナーゼ(Thr180/Tyr182)、Aktプロテインキナーゼ、ホスホ-Aktプロテインキナーゼ(Thr308)、およびホスホ-Akt(Ser473)を検出するためにウサギポリクローナル抗体（Cell Signaling Technology, USA）を使用した。二次抗体として、ペルオキシダーゼを結合した抗ヤギ（DAKO, Denmark）および抗ウサギ（Amersham Pharmacia Biotech, UK）免疫グロブリンを使用した。発色のために、我々は、SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate（Pierce, Perbio, USA）を使用した。
【００５０】
［例１０］
DSPとニコチンの比較
DSPは、0.11 mg/Lのニコチンを含有するため、ニコチンが血管拡張のDSP誘導性低減において重要な物質であるか調査するためにこの濃度を使用した。DSPは、ニコチンと比較して、Ach誘導性拡張の低減において有意に強い効果を有していた。しかし、ニコチンは、DMSO（コントロール）と比較して、有意な血管拡張の低減を引き起こさなかった（図１）。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ACh−誘導性血管拡張に対する、DSPと比較したニコチンの影響。DSP中のニコチン濃度、0.11 mg/Lのニコチン濃度を使用した。ニコチンおよび煙粒子はDMSO中に溶解するため、同体積のDMSOを培地に添加し、コントロールとして使用した。動脈を、ニコチンまたはDSPで6時間（A）および12時間（B）処理した。データは、平均±S.E.M.として示す。n=8。*p<0.05および**p<0.01 vs.コントロール。
【図１】
2009500032.tif 000002
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月31日(2007.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管または細気管支の平滑筋細胞に対する脂質可溶性煙粒子の影響を評価する方法であって、
ａ．動物から細気管支または管を提供する工程；
ｂ．前記細気管支または管を脂質可溶性煙粒子に晒す工程；
ｃ．前記細気管支を解体する前に、一または複数のレセプターの媒介状態のアップレギュレーションを誘導する工程；
ｄ．前記解体された細気管支をメディウムに浸し、前記細気管支または管に対して張力を適用する工程；
ｅ．前記解体された細気管支または管の収縮応答を決定する工程；および
ｆ．血管または細気管支の平滑筋細胞に対する脂質可溶性煙粒子の影響を評価する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記脂質可溶性煙粒子が、タバコ煙に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レセプターが、エンドセリン、アンギオテンシン、セロトニン、およびブラジキニンからなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
以下の二つの追加の工程を含む、前述の請求項の何れかに記載の方法：
工程ｄ）とｅ）の間に生物活性剤を添加する第一の工程、および
血管または細気管支の平滑筋細胞に対する煙の影響を低減することができる生物活性剤を得る第二の最終工程。
【請求項５】
前記生物活性剤が、キナーゼ阻害剤である、前述の請求項の何れかに記載の方法。
【請求項６】
前記細気管支または管が、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、またはその合成バージョンからなる群より選択される、前述の請求項の何れかに記載の方法。
【請求項７】
前記解体された細気管支または管からサンプルの一部を得る追加の一または複数の工程を含む、前述の請求項の何れかに記載の方法。
【請求項８】
前記レセプターの発現が、前記サンプルの一部においてmRNAのレベルで決定される、請求項７に記載の方法。
【国際調査報告】
2009500032.tif 000003
2009500032.tif 000004
2009500032.tif 000005
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