(57)【要約】トランスジーンまたは他の複雑なDNA構築物の合成のための一群のモジュラークローニングベクタープラスミド。本発明は、操作の量を低減するように最適化されたクローニングベクターを用いることにより、様々なDNAフラグメントをデノボDNA構築物へと組み立てるのに有用である。モジュールベクターは、線形パターンに配置された、少なくとも1つの多重クローニング部位ならびにまれな制限部位および/またはユニークなホーミングエンドヌクレアーゼ(「H」)部位の複数のセットを含む。この配置により、ユーザーが、前のクローニング段階においてPE3ベクターへすでに組み入れられたDNAエレメントの完全性を妨げることなく、ドメインモジュールまたは挿入断片をPE3トランスジーンベクター構築物へ配置することを可能にするモジュラー構造が規定される。本発明を用いて作製されたPE3トランスジーンは、細菌、酵母、マウス、および他の真核生物を含む様々な生物体において、ほとんどまたは全くさらなる改変を加えずに、用いられうる。2009508533.tif 000013
2009508533.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象となる遺伝物質を多重クローニング(MC)モジュールへサブクローニングするための多重クローニング(MC)モジュールを含むDNAクローニングベクターからなるドメインモジュールドッキングベクターであって、MCモジュールが以下を含む、ドメインモジュールドッキングベクター：
a. MCモジュールの5'部分を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第一遺伝子ピボット(GP)；
b. 対象となる遺伝物質のMCモジュールへのクローニングのためのクローニング部位を提供するための、ドメインモジュールドッキングベクター内でユニークである一般的な制限部位から選択される複数の制限部位を含む多重クローニング部位(MCS)を含む核酸配列；および
c. MCモジュールの3'部分を規定するように機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第二遺伝子ピボット。
【請求項２】
第一遺伝子ピボットおよび第二遺伝子ピボットが独立して、少なくとも3つ、かつ4つより多くない非可変性のまれな制限部位を含む、請求項1記載のドメインモジュールドッキングベクター。
【請求項３】
対象となる遺伝物質が、プロモータードメイン、発現ドメイン、および3'制御ドメインからなる群より選択される、請求項1記載のドメインモジュールドッキングベクター。
【請求項４】
非可変性のまれな制限部位が、AsiS I、Pac I、Sbf I、Fse I、Asc I、Mlu I、SnaB I、Not I、Sal I、Swa I、Rsr II、BSiW I、Sfo I、Sgr AI、AflIII、Pvu I、Ngo MIV、Ase I、Flp I、Pme I、Sda I、Sgf I、Srf I、およびSse8781 Iからなる群より選択される、請求項1記載のドメインモジュールドッキングベクター。
【請求項５】
対象となる遺伝物質がプロモータードメインである場合、非可変性のまれな制限部位の第一群が少なくともAsiS I、Pac I、およびSbf Iからなる群より選択され、かつ非可変性のまれな制限部位の第二群が少なくともFse I、Asc I、およびMlu Iからなる群より選択される；
対象となる遺伝物質が発現ドメインである場合、非可変性のまれな制限部位の第一群が少なくともFse I、Asc I、およびMlu Iからなる群より選択され、かつ非可変性のまれな制限部位の第二群が少なくともSnaB I、Not I、およびSal Iからなる群より選択される；ならびに
対象となる遺伝物質が3'制御ドメインである場合、非可変性のまれな制限部位の第一群が少なくともSnaB I、Not I、およびSal Iからなる群より選択され、かつ非可変性のまれな制限部位の第二群が少なくともSwa I、Rsr II、およびBSiW Iからなる群より選択される、
請求項4記載のドメインモジュールドッキングベクター。
【請求項６】
対象となる遺伝物質がプロモータードメインである場合、非可変性のまれな制限部位の第一群が順にAsiS I、Pac I、およびSbf Iからなり、かつ非可変性のまれな制限部位の第二群が順にFse I、Asc I、およびMlu Iからなる；
対象となる遺伝物質が発現ドメインである場合、非可変性のまれな制限部位の第一群が順にFse I、Asc I、およびMlu Iからなり、かつ非可変性のまれな制限部位の第二群が順にSnaB I、Not I、およびSal Iからなる；ならびに
対象となる遺伝物質が3'制御ドメインである場合、非可変性のまれな制限部位の第一群が順にSnaB I、Not I、およびSal Iからなり、かつ非可変性のまれな制限部位の第二群が順にSwa I、Rsr II、およびBSiW Iからなる、
請求項5記載のドメインモジュールドッキングベクター。
【請求項７】
複数のドメインモジュールをPE3クローニングモジュールへクローニングするために構成された、複数のクローニングモジュールを含むPE3クローニングモジュールを含むDNAクローニングベクターからなるPE3ドッキングベクターであって、PE3クローニングモジュールが以下を含む、PE3ドッキングベクター：
a. クローニングの際、プロモーターモジュールの5'部分を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第一遺伝子ピボット；
b. クローニングの際、プロモーターモジュールにより置換されるスタッファーを含む第一核酸配列からなる第一スタッファーモジュール；
c. クローニングの際、プロモーターモジュールの3'部分と発現モジュールの5'部分の間の共有接合部を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第二遺伝子ピボット；
d. クローニングの際、発現モジュールにより置換されるスタッファーを含む第二核酸配列からなる第二スタッファーモジュール；
e. クローニングの際、発現モジュールの3'部分と3'制御モジュールの5'部分の間の共有接合部を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第三遺伝子ピボット；
f. クローニングの際、3'制御モジュールにより置換されるスタッファーを含む第三核酸配列からなる第三スタッファーモジュール；および
g. クローニングの際、3'制御モジュールの3'部分を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第四遺伝子ピボット。
【請求項８】
第一遺伝子ピボットおよび第二遺伝子ピボットが独立して、少なくとも3つ、かつ4つより多くない非可変性のまれな制限部位を含む、請求項7記載のPE3ドッキングベクター。
【請求項９】
非可変性のまれな制限部位が、AsiS I、Pac I、Sbf I、Fse I、Asc I、Mlu I、SnaB I、Not I、Sal I、Swa I、Rsr II、BSiW I、Sfo I、Sgr AI、AflIII、Pvu I、Ngo MIV、Ase I、Flp I、Pme I、Sda I、Sgf I、Srf I、およびSse8781 Iからなる群より選択される、請求項7記載のPE3ドッキングベクター。
【請求項１０】
対象となる遺伝物質がプロモータードメインである場合、非可変性のまれな制限部位の第一群が少なくともAsiS I、Pac I、およびSbf Iからなる群より選択され、かつ非可変性のまれな制限部位の第二群が少なくともFse I、Asc I、およびMlu Iからなる群より選択される；
対象となる遺伝物質が発現ドメインである場合、非可変性のまれな制限部位の第一群が少なくともFse I、Asc I、およびMlu Iからなる群より選択され、かつ非可変性のまれな制限部位の第二群が少なくともSnaB I、Not I、およびSal Iからなる群より選択される；ならびに
対象となる遺伝物質が3'制御ドメインである場合、非可変性のまれな制限部位の第一群が少なくともSnaB I、Not I、およびSal Iからなる群より選択され、かつ非可変性のまれな制限部位の第二群が少なくともSwa I、Rsr II、およびBSiW Iからなる群より選択される、
請求項9記載のドメインモジュールドッキングベクター。
【請求項１１】
対象となる遺伝物質がプロモータードメインである場合、非可変性のまれな制限部位の第一群が順にAsiS I、Pac I、およびSbf Iからなり、かつ非可変性のまれな制限部位の第二群が順にFse I、Asc I、およびMlu Iからなる；
対象となる遺伝物質が発現ドメインである場合、非可変性のまれな制限部位の第一群が順にFse I、Asc I、およびMlu Iからなり、かつ非可変性のまれな制限部位の第二群が順にSnaB I、Not I、およびSal Iからなる；ならびに
対象となる遺伝物質が3'制御ドメインである場合、非可変性のまれな制限部位の第一群が順にSnaB I、Not I、およびSal Iからなり、かつ非可変性のまれな制限部位の第二群が順にSwa I、Rsr II、およびBSiW Iからなる、
請求項10記載のドメインモジュールドッキングベクター。
【請求項１２】
PE3モジュールを多重遺伝子ドッキングベクターへ挿入するための手段をさらに含む、請求項7記載のPE3ドッキングベクター。
【請求項１３】
プロモーターモジュール、発現モジュール、および3'制御モジュールをPE3クローニングモジュールへクローニングするために構成された、以下を含む、PE3クローニングモジュールを含むDNAクローニングベクターからなるPE3多重クローニング(MC)ドッキングベクターであって：
a. クローニングの際、プロモーターモジュールの5'部分を規定するように機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第一遺伝子ピボット；
b. 第一核酸配列；
c. クローニングの際、プロモーターモジュールの3'部分と発現モジュールの5'部分の間の共有接合部を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第二遺伝子ピボット；
d. 第二核酸配列；
e. クローニングの際、発現モジュールの3'部分と3'制御モジュールの5'部分の間の共有接合部を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第三遺伝子ピボット；
f. 第三核酸配列；および
g. クローニングの際、3'制御モジュールの3'部分を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第四遺伝子ピボット、
ここで、第一、第二、および第三核酸配列の少なくとも1つが、対象となる遺伝物質の多重クローニングモジュールへのクローニングのためのクローニング部位を提供するために、PE3ドッキングベクター内でユニークである一般的な制限部位から選択される複数の制限部位を含む多重クローニング部位(MCS)を含む多重クローニングモジュールであり、残りの核酸配列がスタッファーである、PE3多重クローニング(MC)ドッキングベクター。
【請求項１４】
第一核酸配列が多重クローニングモジュールであり、かつ第一遺伝子ピボットが、少なくともAsiS I、Pac I、およびSbf Iからなる群より選択され、かつ第二遺伝子ピボットが、少なくともFse I、Asc I、およびMlu Iからなる群より選択される、請求項13記載のPE3 MCドッキングベクター。
【請求項１５】
第二核酸配列が多重クローニングモジュールであり、かつ第二遺伝子ピボットが、少なくともFse I、Asc I、およびMlu Iからなる群より選択され、かつ第三遺伝子ピボットが、少なくともSnaB I、Not I、およびSal Iからなる群より選択される、請求項13記載のPE3 MCドッキングベクター。
【請求項１６】
核酸配列が多重クローニングモジュールであり、かつ第二遺伝子ピボットが、少なくともSnaB I、Not I、およびSal Iからなる群より選択され、かつ第三遺伝子ピボットが、少なくともSwa I、Rsr II、およびBSiW Iからなる群より選択される、請求項13記載のPE3 MCドッキングベクター。
【請求項１７】
第一遺伝子ピボットが順にAsiS I、Pac I、およびSbf Iからなり、第二遺伝子ピボットが順にFse I、Asc I、およびMlu Iからなり、第三遺伝子ピボットが順にSnaB I、Not I、およびSal Iからなり；ならびに第四遺伝子ピボットが順にSwa I、Rsr II、およびBSiW Iからなる、請求項13記載のPE3 MCドッキングベクター。
【請求項１８】
多重遺伝子ドッキングベクターへの挿入のためにPE3モジュールをPE3ベクターから遊離させるための手段をさらに含む、請求項13記載のPE3 MCドッキングベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、クローニングベクタープラスミドの分野、およびDNA構築物またはトランスジーンを構築するためのクローニングベクタープラスミドの使用に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、一部継続出願であり、2002年10月9日に出願された仮出願第60/417,282号の35 U.S.C. 119(e)による恩典を主張する2003年10月9日に出願された出願第10/682,764号の35 U.S.C. 120による恩典を主張する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
分子生物学の基盤は組換えDNAテクノロジーであり、それは、ここでは、核酸およびそれらのタンパク質産物の構造ならびに機能を研究することを目的として、核酸の改変および増殖と要約されうる。
【０００４】
個々の遺伝子、遺伝子制御領域、遺伝子のサブセット、およびそれらが含まれる、まさに染色体全体が、通常、それぞれ頭文字A、T、G、およびCで識別される、ヌクレオチドのアデニン、チミン、グアニン、およびシトシンの二本鎖逆平行配列ですべて構成されている。これらのDNA配列、加えて、mRNA(メッセンジャーRNA)から導かれる二本鎖DNAコピーであるcDNA配列は、遺伝子産物を研究するために、別個のフラグメントへ切断され、単離され、細菌プラスミドのようなベクターへ挿入されうる。プラスミドは、もともとは細菌から引き出された染色体外のDNA断片であり、遺伝子産物の研究または産生を目的として、操作され、宿主細菌へ再導入されうる。プラスミドのDNAは、それが、遺伝子および遺伝子制御領域をコードする同じA、T、G、ならびにCヌクレオチドで構成される点において、すべての染色体DNAと類似しているが、約30,000塩基対、すなわち30キロベース(kb)、未満で構成される相対的に小さい分子である。加えて、二本鎖プラスミドのヌクレオチド塩基対は、またプラスミドDNAを染色体DNAのそれから区別する、連続的な環状分子を形成する。
【０００５】
プラスミドは、細菌生物体間の遺伝物質の迅速な交換を促進し、温度、食料供給、または他の負荷のような環境における変化に対する迅速な適応を可能にする。獲得される任意のプラスミドは宿主の生存に寄与する遺伝子を発現しなければならない、さもないとそれは、不必要なプラスミドの維持は資源の浪費であろうために、破壊されるまたは捨てられるであろう。細胞のクローン集団は、それが有しうる任意のプラスミドを含む同一の遺伝物質を含む。宿主細胞のそのようなクローン集団におけるDNA挿入断片を含むクローニングベクタープラスミドの使用は、利用可能な対象となるDNAの量を増幅する。そのようにクローニングされたDNAは、その後、DNA構築物を構築するのに必要とされる段階における次の操作のために単離および回収されうる。従って、クローニングベクタープラスミドが、対象となる大量のDNA挿入断片を迅速に産生する能力を提供する、遺伝子機能の研究における有用なツールであることは認識されうる。
【０００６】
プラスミドに見出されるエレメントは、天然であるものもあれば、DNAベクターとしてのプラスミドの有用性を高めるために操作されているものもある。これらには、とりわけ、抗生物質抵抗性または化学物質抵抗性遺伝子、および多重クローニング部位(MCS)が挙げられる。これらのエレメントのそれぞれは、先行技術においてだけでなく、本発明においても役割をもつ。各エレメントが果たす役割の記載は、先行技術の限界を浮き彫りにし、本発明の有用性を示すと思われる。
【０００７】
宿主により獲得されうる特に有用なプラスミド生まれの遺伝子は、抗生物質抵抗性を与えるものである。組換えDNAテクノロジーの毎日の実践において、抗生物質抵抗性遺伝子は、所望のプラスミドの培養および増幅を他のプラスミドのそれを超えて優先的に増強する陽性または陰性選択エレメントとして利用される。
【０００８】
宿主細菌により維持されるために、プラスミドはまた、プラスミドを複製するように宿主に指示する配列のセグメントを含まなければならない。複製起点(origin of replicatoin)(ORI)エレメントとして知られた配列は、宿主に、その細胞性酵素を用いてプラスミドのコピーを生成するように指示する。そのような細菌が分裂した場合、娘細胞はそれぞれ、任意のそのようなプラスミドのコピーを保持する。大腸菌(E. coli)のある特定の菌株は、この複製(duplication)を最大にするように導かれており、細菌あたり300個より多くのコピーを産生する。このように、所望のプラスミドの培養は増強されうる。
【０００９】
任意のクローニングベクターにおけるもう一つの必須エレメントは、対象となる遺伝物質の挿入のための位置である。これは、「野生型」プラスミドへ操作されている合成エレメントであり、それに従って、クローニングベクターとしての有用性を与える。任意の典型的な市販されているクローニングベクタープラスミドは、多重クローニング部位(MCS)として知られた少なくとも1つのそのような領域を含む。MCSは典型的には、単一または一連の制限エンドヌクレアーゼ酵素(以下、「制限酵素」と呼ぶ)により切断されうるヌクレオチド配列を含み、それぞれが、別個のエンドヌクレアーゼ制限部位および切断パターンを有する。DNA分子にコードされたこれらのエンドヌクレアーゼ部位またはエンドヌクレアーゼ制限部位(以下、「制限部位」と呼ぶ)は、典型的には、二本鎖パリンドロームの配列を含む。ある制限酵素については、少なくも4〜6個のヌクレオチドが制限部位を提供するのに十分であるし、一方、ある制限酵素は8個またはそれ以上のヌクレオチドの制限部位を必要とする。例えば、酵素EcoR1はヘキサヌクレオチド配列：5'G-A-A-T-T-C3'を認識し、5'は慣例により「上流」末端として知られた分子の末端を示し、3'は同様に、「下流」末端を示す。制限部位の相補鎖は、その逆平行鎖、3'G-A-A-T-T-C-5'である。従って、二本鎖制限部位は、それが存在するより大きな二本鎖分子内に以下のように表されうる：
2009508533.tif 000003
【００１０】
多くの他の制限酵素のように、EcoR1は、ダイアド対称軸で正確に切断せず、「/」により示されたヌクレオチド間の2つのDNA鎖における4ヌクレオチド離れた位置：
2009508533.tif 000004
で切断するので、二本鎖DNA分子が切断されて、新しく形成された「末端」に結果として生じたヌクレオチドの配置を有する：
2009508533.tif 000005
【００１１】
このねじれ型切断は、突出5'末端を有するDNAのフラグメントを生じる。A-TおよびG-C対はお互いに近くにある場合、自発的に形成されるため、これらのような突出末端は、付着または「粘着」末端と呼ばれる。これらの末端のいずれか1つが、同じ制限酵素で切断された任意の他の相補的末端と水素結合を形成できる。特定の制限部位を含む任意のDNAは、同じ配列を含む任意の他のDNAと同じ様式で切断されるため、それらの切断された末端は相補的である。それゆえに、同じ制限酵素で切断された任意のDNA分子の末端は、ジグゾーパズルの隣接したピースが「マッチする」方法でお互いに「マッチし」、酵素的に結合されうる。組換えDNA分子の形成を可能にし、外来DNAフラグメントの細菌プラスミドへの、または任意の他のDNA分子への導入を許すのはこの性質である。
【００１２】
組換えDNA分子を構築する場合に考慮すべきさらなる一般的な原理は、対象となる部位だけではなく、分子内に存在するすべての制限部位が特定の制限酵素で切断されることである。DNA分子が大きければ大きいほど、任意の制限部位が再三存在する可能性は高い。任意の制限部位はDNA分子に沿ってランダムに分布すると仮定すれば、テトラヌクレオチド部位は、平均して、44(すなわち、256)ヌクレオチドごとに1回存在し、ヘキサヌクレオチド部位は46(すなわち、4096)ヌクレオチドごとに1回存在し、オクタヌクレオチド部位は48(すなわち、114,688)ヌクレオチドごとに1回存在する。従って、より短い制限部位は頻繁に存在するが、より長いものはめったに存在しないことが容易に認識されうる。トランスジーンまたは他の組換えDNA分子の構築を計画する場合、そのようなプロジェクトは、しばしば、様々なサイズの数個のDNA断片の組み立てを必要とするため、これは極めて重要な問題である。これらの断片が大きければ大きいほど、用いたいと望む部位が数片のDNA構成要素に存在する可能性は高く、せいぜい、操作を困難にさせるだけである。
【００１３】
頻繁に存在する制限部位は、本明細書では、一般的な制限部位と呼ばれ、これらの部位を切断するエンドヌクレアーゼは一般的な制限酵素と呼ばれる。6ヌクレオチドより大きい同族配列に関する制限酵素は、まれな制限酵素と呼ばれ、それらの同族部位はまれな制限部位と呼ばれる。しかしながら、統計学的に予測されるより低頻度で存在する6bpのいくつかの制限部位があり、これらの部位およびそれらを切断するエンドヌクレアーゼもまた、まれと呼ばれる。従って、「まれな」および「一般的な」という名称は、任意の特定の制限酵素の相対的存在量または利用能を差すのではなく、むしろ、任意のDNA分子もしくはDNA分子の単離されたフラグメント、または任意の遺伝子もしくはそのDNA配列内のその同族制限部位を構成するヌクレオチドの配列の出現頻度を指す。
【００１４】
第二クラスの制限酵素が最近、単離されており、ホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)酵素と呼ばれている。HE酵素は、大きな非対称の制限部位(12〜40塩基対)を有する。HE制限部位は極めてまれである。例えば、I-SceIとして知られたHEは、ランダム配列の7×1010塩基対ごとに1回のみ存在すると予測される、18bpの制限部位
2009508533.tif 000006
を有する。この出現率は、20個の哺乳動物サイズのゲノムにおけるたった1つの部位と等価である。HE部位のまれな性質は、HE部位がクローニングベクタープラスミドにおいて適切な位置に含まれている場合には、遺伝子工学者が、トランスジーンの完全性を崩壊させることなく最終のトランスジーン産物を切断できる見込みを大いに増加させる。
【００１５】
任意の供給源の生物体由来のDNA分子はその同族制限酵素により同一の様式で切断されるため、任意の種由来の外来DNA断片は、制限酵素で切断され、同じ制限酵素で切断された細菌プラスミドベクターへ挿入され、適した宿主細胞において増幅されうる。例えば、ヒト遺伝子は、EcoR1として知られた制限酵素で2カ所で切断される可能性があり、EcoR1末端を有する所望のフラグメントが単離され、ライゲーション反応物またはライゲーション混合物として一般に公知なものにおいて、同様にEcoR1で切断されたプラスミドと混合されうる。ライゲーション混合物における適切な条件下で、単離されたヒト遺伝子フラグメントの一部は、プラスミド分子の末端とマッチする。これらの新しく連結された末端は、結合して、今やその新しいDNA挿入断片を含むプラスミドを酵素的に再環状化することができる。ライゲーション混合物は、その後、大腸菌またはもう一つの適した宿主へ導入され、新しく操作されたプラスミドは細菌が分裂する時に増幅される。このように、ヒト遺伝子の比較的多数のコピーが得られ、細菌から収集されうる。これらの遺伝子コピーは、その後、研究、分析、またはその遺伝子産物タンパク質の産生を目的としてさらに操作されうる。
【００１６】
組換えDNAテクノロジーは、いわゆる「トランスジーン」の作製においてしばしば、具体化される。トランスジーンは、しばしば、1つまたは複数のドナー生物体から引き出され、宿主生物体へ導入される様々な遺伝物質を含む。典型的には、トランスジーンは、プロジェクトの出発点または「バックボーン」としてクローニングベクターを用いて構築され、一連の複雑なクローニング段階は、そのベクター内に最終生成物を組み立てるように計画される。ヌクレオチド配列を含むトランスジーンのエレメントには、限定されるわけではないが、1)制御プロモーターおよび/またはエンハンサーエレメント、2)mRNA分子として発現する遺伝子、3)mRNAメッセージに安定化を与えるDNAエレメント、4)哺乳動物のイントロン遺伝子領域を模倣するヌクレオチド配列、ならびに5)天然のmRNAの末端に付加されたポリAテールのようなmRNAプロセシングのためのシグナルが挙げられる。場合によっては、実験設計は、遺伝子産物の特定の細胞内部位への輸送を提供するために局在化シグナルの付加を必要としうる。これらのエレメントのそれぞれは、ドナーゲノムから切断されるより大きなDNA分子のフラグメントである、または、場合によっては、実験室で合成される。各断片は、その他のものと共に正確な順序かつ5'-3'配向でクローニングベクタープラスミドへ組み立てられる。
【００１７】
任意の遺伝子のプロモーターは、DNAフラグメントとして単離され、対象となるプロモーターの刺激に必要な条件が提供されうると仮定して、所望の遺伝子の発現を指示するようにプラスミドのような合成分子内に配置されうる。例えば、インスリン遺伝子のプロモーター配列は単離され、レポーター遺伝子と共にクローニングベクタープラスミドに配置され、適切な細胞型においてインスリン遺伝子の発現に必要とされる条件を研究するために用いられうる。または、インスリン遺伝子プロモーターは、クローニングベクタープラスミドにおいて対象となる任意の遺伝子のタンパク質コード配列と連結され、そのように構築されたDNAトランスジーン内にすべての必要なエレメントが存在すると仮定して、インスリン発現細胞において対象となる遺伝子の発現を作動させるために用いられうる。
【００１８】
レポーター遺伝子は、いくつかの型のトランスジーンの特に有用な構成要素である。レポーター遺伝子は、トランスジーンにおいてそれが連結している対象となる特定のプロモーターの指揮下で発現するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、プロモーター活性の測定可能な生化学的応答を提供する。レポーター遺伝子は、典型的には、内因性細胞タンパク質のバックグランドに対して検出または測定するのが容易である。一般的に用いられるレポーター遺伝子には、限定されるわけではないが、LacZ、緑色蛍光タンパク質、およびルシフェラーゼ、ならびに他のレポーター遺伝子が挙げられ、それらの多くは当業者にとって周知である。
【００１９】
哺乳動物遺伝子内の非コード領域であるイントロンは、細菌ゲノムに見出されないが、哺乳動物細胞におけるmRNA分子の正しい形成に必要とされる。それゆえに、哺乳動物系に用いる任意のDNA構築物は、少なくとも1個のイントロンを有しなければならない。イントロンは、任意の哺乳動物遺伝子から単離され、哺乳動物細胞がイントロンを切除し、残りのmRNA末端を合わせてスプライスすることを可能にする適切なスプライシングシグナルと共にDNA構築物へ挿入されうる。
【００２０】
mRNA安定化エレメントは、いくつかのmRNAを分解から保護する結合タンパク質により認識されるDNAの配列である。mRNA安定化エレメントの包含は、しばしば、いくつかの哺乳動物細胞型においてそのmRNAからの遺伝子発現のレベルを増強し、それゆえ、いくつかのDNA構築物またはトランスジーンにおいて有用でありうる。mRNA安定化エレメントは、DNA構築物における包含のために、天然のDNAもしくはRNAから単離されうる、または合成的に製造されうる。
【００２１】
局在化シグナルは、対象となるタンパク質の細胞内経路指定のためのタンパク質シグナルをコードするDNAの配列である。例えば、核局在化シグナルはタンパク質を核へ方向づける；原形質膜局在化シグナルはそれを原形質膜へ方向づけるなど。従って、局在化シグナルは、所望の細胞内位置へそのタンパク質産物の転位置を促進するためにDNA構築物へ組み入れられうる。
【００２２】
タグ配列は、タンパク質産物が、付着した固有領域を有するように、DNA構築物においてコードされうる。この固有領域は、その内因性対応物からそれを区別できるタンパク質タグとしての役割を果たす。または、それは、限定されるわけではないが、RT-PCR、免疫組織化学、またはインサイチューハイブリダイゼーションを含む当技術分野において周知の幅広い種類の技術により検出されうる識別子としての役割を果たしうる。
【００２３】
複雑なトランスジーンに関して、またはDNAの特に大きな領域を含むものに関して、これらのDNA断片に複数の制限部位がある見込みは増加する。任意の1つのヘキサヌクレオチド部位をコードする制限部位は4096bp(46)ごとに存在することを思い出してほしい。プロモーター配列が3000bpであり、かつ1500bpの対象となる遺伝子が3000bpのクローニングベクターへ組み立てられることになっている場合には、任意の使用可能な部位はその断片の2個だけに存在しなければならないため、6個またはそれ未満のヌクレオチドの多くの部位は役に立たないことは統計学的に非常に可能性が高い。さらになお、部位は、組み立てられることになっている適切な分子の適切な領域に存在する必要がある。加えて、たいていのクローニングプロジェクトは、付加される追加のDNAエレメントを有する必要があり、それにより、成長する分子の複雑性および任意の特定の部位の都合の悪い反復の見込みを増加させる。任意の制限酵素はDNA分子におけるその制限部位の全部を切断するため、制限酵素部位が再三存在する場合には、すべての都合の悪い部位は所望の部位と共に切断され、分子の完全性を破壊する。従って、各クローニング段階は、先行するエレメントを組み入れるためにすでに用いられている制限酵素でそれを切断することにより成長する分子を分裂させないように注意深く計画されなければならない。そして最後に、研究者が、完成されたトランスジーンを哺乳動物生物体へ導入したい場合、完全に組み立てられたトランスジーン構築物は、しばしば、トランスジーンの少なくとも1つの末端におけるユニークな制限部位で線状化されなければならず、それに従って、構築物において他のどこにも見出されないさらにもう一つのユニークな部位を必要とする。たいていのDNA構築物は単一の目的のために設計されるため、行われる必要がありうるいかなる将来的改変に対してもほとんど思考を向けず、将来の実験的変化にとって困難をさらに増加させている。
【００２４】
伝統的に、トランスジーン設計および構築は、以下を含むいくつかの理由でかなりの量の時間およびエネルギーを消費する：
1. 末端のアレイを作製する、利用可能な幅広い種類の制限酵素およびHE酵素がある；しかしながら、これらの大部分はお互いに適合性がない。EcoRIのような多くの制限酵素は突出5'付着末端または「テール」を有するDNAフラグメントを生成する；別のもの(例えば、Pst1)は3'突出テールを有するフラグメントを生成するが、さらに別のもの(例えば、Bal1)は対称軸で切断し、平滑末端化されたフラグメントを生じる。これらの一部は、他の制限酵素および/またはHE酵素での切断により形成された末端と適合性があるが、有用なものの大多数は適合性がない。各DNAフラグメント単離手順で生成されうる末端は、DNA構築物を設計するのに注意深く考慮されなければならない。
2. DNA構築物またはトランスジーンの組み立てに必要とされるDNAフラグメントは、まず、それらの供給源のゲノムから単離され、プラスミドクローニングベクターへ配置され、有用な量を得るために増幅されなければならない。段階は、市販されている、または個々に改変されたクローニングベクターのいくつでも用いて行われうる。異なる市販されているクローニングベクタープラスミドのそれぞれは、大部分、独立して開発され、それに従って、対象となる遺伝子または遺伝的エレメントのDNAフラグメントについての異なる配列および制限部位を含む。遺伝子は、それゆえに、任意の与えられたセットの実験に必要とされるようなこれらのベクターのそれぞれに適応するように個々に合わせられなければならない。同じDNAフラグメントは、しばしば、次の実験、または新しいDNA構築物もしくはトランスジーンのための他の組み合わせへのクローニングのためにさらに改変される必要がある。各DNA構築物またはトランスジーンは、それが次にどのように用いられるかの思考または知識をもたずに特定の適用のためにオーダーメイドされるため、それは、しばしば、次の適用のために「レトロフィット(retro-fit)」されなければならない。
3. 加えて、任意の与えられた遺伝子または遺伝的エレメントのDNA配列は異なっており、それを現在利用可能なベクターと不適合性にさせる内部制限部位を含むことがあり得、それにより操作を複雑にする。これは、特に、数個のDNAフラグメントを単一のDNA構築物またはトランスジーンへ組み立てる場合、真実である。
【００２５】
制限酵素は遺伝物質を操作するために用いられうるが、MCSまたはトランスジーンの他の構成要素が、デノボ合成、リコンビニアリング、および/またはPCRターミネーターオーバーハングクローニングにより作製されうることは公知である。トランスジーンの構成要素エレメントの合成の一つのそのような方法には、米国特許第6,358,712号(特許文献1)においてJarrellらにより開示された方法が挙げられる。Jarrellはトランスジーンのエレメントを合わせて「接合する(welding)」方法を開示するが、その先行技術は、いったんそれらが組み立てられたならば、これらのエレメントを「非接合化して」、再び組み立てるための方法または手段を教示していない。
【００２６】
それゆえに、トランスジーンの各構成要素をその他のものと共に正確な順序かつ5'-3'配向でクローニングベクタープラスミドへ組み立てるための手段を提供することは有益であると思われる。ユーザーが、いくつかのDNAフラグメントを、これらのDNAフラグメントの末端に、およびそれぞれの内に、見出される制限部位の重複性にもかかわらず、1つの分子へ迅速に組み立てることを可能にする系の必要性もまたある。選択されたDNAフラグメントの末端を、それらに制限部位を付加するために迅速に変化させる簡単な手段を提供することも有用であると思われる。HE制限部位の単一または対向するペアの包含は、クローニングのためのユニークな部位を有する見込みを高めると思われる。1つまたは複数のフラグメントの容易な置換または除去も可能にする系は、ユーザにとって現在利用できない多角性のレベルを加えると思われる。それゆえに、DNAフラグメントを、クローニングベクター内の固定されたまれな制限部位に隣接する「カセット」領域へ挿入する、または「カセット」領域から除去することを可能にする「モジュラー」系は、特に有用であり、組換えDNAテクノロジーの分野にとって歓迎されると思われる。
【００２７】
従って、本発明の一つの局面は、クローニングベクタープラスミドを用いることによりDNA構築物またはトランスジーンを迅速に組み立てる方法を提供することである。もう一つの局面は、「挿入断片」、またはプロモーターヌクレオチド配列、発現ヌクレオチド配列、および3'制御ヌクレオチド配列のような「モジュール」の両方でも知られている、DNAフラグメントをクローニングベクタープラスミドへ逐次的様式で組み入れることである。
【００２８】
【特許文献１】米国特許第6,358,712号
【発明の開示】
【００２９】
発明の簡単な概要
本発明は、中に遺伝子ピボットとして公知の専用ドッキング点を有するモジュラークローニングベクター内のバックボーンを提供することにより、遺伝的ドメインモジュール、PE3トランスジーン、および他の複雑なDNA構築物の合成のためのモジュラークローニングベクターを作製するための構造および方法を提供する。
【００３０】
本発明は、対象となる遺伝物質を多重クローニング(MC)モジュールへサブクローニングするための多重クローニング(MC)モジュールを含む、DNAクローニングベクターからなるドメインモジュールドッキングベクターに関し、MCモジュールは以下を含む：a)MCモジュールの5'部分を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第一の遺伝子ピボット(GP)；b)対象となる遺伝物質のMCモジュールへのクローニングのためのクローニング部位を提供するためにドメインモジュールドッキングベクター内においてユニークである一般的な制限部位から選択された複数の制限部位を含む多重クローニング部位(MCS)を含む核酸配列；およびc)MCモジュールの3'部分を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第二の遺伝子ピボット。
【００３１】
本発明はまた、以下を含むドメインモジュールを含むDNAクローニングベクターからなるドメインモジュールベクターに関する：a)ドメインモジュールの5'部分を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第一の遺伝子ピボット；b)対象となる遺伝物質を含む核酸配列からなる対象となる遺伝子モジュール；およびc)ドメインモジュールの3'部分を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第二の遺伝子ピボット。
【００３２】
本発明はまた、少なくとも第一ドメインモジュールをPE3クローニングモジュールへクローニングするために配置された少なくとも1つのクローニングモジュールを含むPE3クローニングモジュールを含む、DNAクローニングベクターからなるPE3ドッキングベクターに関し、PE3クローニングモジュールは以下を含む：a)クローニングの際、少なくとも第一ドメインモジュールの5'部分を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第一の遺伝子ピボット；b)クローニングの際、第一ドメインモジュールにより置換されるスタッファーを含む第一核酸配列からなるスタッファーモジュール；およびc)クローニングの際、少なくとも第一ドメインモジュールの3'部分を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第二の遺伝子ピボット。
【００３３】
本発明はまた、複数のドメインモジュールをPE3クローニングモジュールへクローニングするために配置された複数のクローニングモジュールを含むPE3クローニングモジュールを含む、DNAクローニングベクターからなるPE3ドッキングベクターに関し、PE3クローニングモジュールは以下を含む：a)クローニングの際、第一ドメインモジュールの5'部分を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第一の遺伝子ピボット；b)クローニングの際、第一ドメインモジュールにより置換されるスタッファーを含む第一核酸配列からなる第一スタッファーモジュール；c)クローニングの際、第一ドメインモジュールの3'部分と第二ドメインモジュールの5'部分の間の共有接合部を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第二の遺伝子ピボット；d)クローニングの際、第二ドメインモジュールにより置換されるスタッファーを含む第二核酸配列からなる第二スタッファーモジュール；e)クローニングの際、第二ドメインモジュールの3'部分と第三ドメインモジュールの5'部分の間の共有接合部を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第三の遺伝子ピボット；f)クローニングの際、第三ドメインモジュールにより置換されるスタッファーを含む第三核酸配列からなる第三スタッファーモジュール；およびg)クローニングの際、第三ドメインモジュールの3'部分を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第四の遺伝子ピボット。
【００３４】
本発明は、少なくとも3つのドメインモジュールをPE3クローニングモジュールへクローニングするために配置されたPE3クローニングモジュールを含む、DNAクローニングベクターからなるPE3多重クローニング(MC)ドッキングベクターにさらに関し、PE3クローニングモジュールは以下を含む：a)クローニングの際、第一ドメインモジュールの5'部分を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第一の遺伝子ピボット；b)第一の核酸配列；c)クローニングの際、第一ドメインモジュールの3'部分と第二ドメインモジュールの5'部分の間の共有接合部を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第二の遺伝子ピボット；d)第二の核酸配列；e)クローニングの際、第二ドメインモジュールの3'部分と第三ドメインモジュールの5'部分の間の共有接合部を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第三の遺伝子ピボット；f)第三の核酸配列；およびg)クローニングの際、第三ドメインモジュールの3'部分の間の共有接合部を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第四の遺伝子ピボット；第一、第二、および第三核酸配列の少なくとも1つは、対象となる遺伝物質の、多重クローニングモジュールへのクローニングのためのクローニング部位を提供するためにPE3ドッキングベクター内においてユニークである一般的な制限部位から選択される複数の制限部位を含む多重クローニング部位(MCS)を含む多重クローニングモジュールであり、残りの核酸配列はスタッファー配列である。
【００３５】
本発明は、プロモーターモジュール、発現モジュール、および3'制御モジュールを含むPE3モジュールを含む、DNAクローニングベクターからなるPE3ベクターにさらに関し、PE3モジュールは以下を含む：a)プロモーターモジュールの5'部分を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第一の遺伝子ピボット；b)プロモーターモジュール；c)プロモーターモジュールの3'部分と発現モジュールの5'部分の間の共有接合部を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第二の遺伝子ピボット；d)発現モジュール；e)発現モジュールの3'部分と3'制御モジュールの5'部分の間の共有接合部を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第三の遺伝子ピボット；f)3'制御モジュール；およびg)3'制御モジュールの3'部分を規定するよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第四の遺伝子ピボット。
【００３６】
本発明はまた、PE3ドッキングベクター、PE3ベクター、およびPE3多重クローニング(MC)ドッキングベクターのいずれか1つが、典型的には遺伝子ピボットに隣接したプロモータードメイン、発現ドメイン、および3'制御ドメインモジュールを含むPE3モジュールを、多重遺伝子ドッキングベクターへの挿入のためにPE3ベクターから遊離させるための手段を含みうることを提供する。PE3クローニングモジュールを遊離および挿入するための1つの手段は、PE3クローニングモジュールを含む核酸配列に隣接するPE3ドッキングベクターまたはPE3 MCドッキングベクターに配置された1ペアのホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)を含む。プロモータードメイン、発現ドメイン、および3'制御ドメインのPE3クローニングモジュールへの挿入またはクローニング後、HEのペアは、多重遺伝子ベクター内の適合性ドッキング位置への挿入のためにPE3ベクターからPE3モジュールを切除する1つの手段を提供し、適合性ドッキング位置は典型的にはHEの同じペアにより規定される。任意のホーミングエンドヌクレアーゼは、第一位置(切除されたPE3モジュールの5'末端における)かまたは第二位置(切除されたPE3モジュールの3'末端における)のいずれかに用いられうるが、好ましいHEペアは、第一位置におけるI-Ceu Iおよび第二位置での逆転されたISce-Iからなる。PE3ドッキングベクターまたはPE3 MCドッキングベクターの他の態様において、異なる切除および挿入手段がHEの代わりに用いられうる。そのような異なる切除および挿入手段は、遺伝子ピボットにおけるものとは異なるまれな制限部位の1ペアを含む1つもしくは複数の非可変性のまれな制限部位の1ペア、または隣接する遺伝子ビポット(GP1およびGP4)自身を含みうる。挿入手段は、下記に考察されるリコンビニアリングを用いる。
【００３７】
本発明は、以下の段階を含む、PE3モジュラーベクターを構築する方法を提供する：a)PE3クローニングモジュールを含むPE3クローニングベクターを提供する段階であって、PE3クローニングモジュールが順に以下を含む、段階：少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第一遺伝子ピボット、少なくとも、スタッファーを含む核酸配列からなる第一スタッファーモジュール、および第二遺伝子ピボット；b)少なくとも、順に以下を含む第一ドメインモジュールベクターを提供する段階：第一遺伝子ピボット、対象となる遺伝物質を含む核酸配列からなる対象となる遺伝子モジュール；および第二遺伝子ピボット；c)第一遺伝子ピボットのまれな制限部位の1つについての第一の同族制限酵素、および第二遺伝子ピボットのまれな制限部位の1つについての第二の同族制限酵素を提供する段階；d)第一および第二の同族制限酵素を用いて第一ドメインモジュールベクターから対象となる遺伝子モジュールを切除および単離する段階；e)第一および第二の同族制限酵素を用いてPE3クローニングベクターのPE3クローニングモジュールから第一スタッファーモジュールを切除する段階；ならびにf)対象となる遺伝子モジュールをPE3クローニングモジュールへライゲーションする段階。方法はまた、対象となる第二の遺伝子モジュールを切除して、PE3クローニングモジュールへライゲーションするために第三遺伝子ピボットおよび同族制限酵素を用いて、対象となる第二の遺伝子モジュールをPE3へ挿入することを提供する。同様に、対象となる第三の遺伝子モジュールは、対象となる第二の遺伝子モジュールを切除して、PE3クローニングモジュールへライゲーションするために第三遺伝子ピボットおよび同族制限酵素を用いてPE3へ挿入されうる。方法は、対象となる遺伝子モジュールのPE3クローニングベクターへの逐次的配置を提供する。典型的には、対象となる第一、第二、および第三の遺伝子モジュールは、それぞれ、プロモーターモジュール、発現モジュール、および3'制御モジュールに対応する。
【００３８】
本発明のもう一つの態様は、バックボーンを含むクローニングベクタープラスミドを提供する段階であって、バックボーンが少なくとも第一、第二、第三、および第四のドッキング点を有し、ドッキング点が5'-3'方向で逐次的に配置され、それぞれが制限酵素により切断されるように機能する少なくとも1つの非可変性のまれな制限部位を有する、段階；第一ドッキング点の少なくとも1つの非可変性のまれな制限部位の1つに対応する第一制限酵素で第一ドッキング点を切断して、露出した3'末端を有する切断された第一ドッキング点を残す段階；第二ドッキング点の少なくとも1つの非可変性のまれな制限部位の1つに対応する第二制限酵素で第二ドッキング点を切断して、露出した5'末端を有する切断された第二ドッキング点を残す段階；5'末端、対象となるヌクレオチド配列、および3'末端を含む第一挿入断片を提供する段階であって、第一挿入断片の5'末端が切断された第一ドッキング点の露出した3'末端に適合性であり、かつ第一挿入断片の3'末端が切断された第二ドッキング点の露出した5'末端に適合性である、段階；ならびに第一挿入断片および切断されたクローニングベクタープラスミドを、第一ドッキング点と第二ドッキング点の間のバックボーン内で第一挿入断片のライゲーションおよび自己配向を引き起こすのに適切な反応混合物に入れる段階であって、バックボーンが再組み立てされる、段階を含む、トランスジーンを作製する方法である。
【００３９】
この態様において、第二ドッキング点は、その後に、第二制限酵素で切断されて、露出した3'末端を有する切断された第二ドッキング点を残すことができ、第三ドッキング点は、第三ドッキング点の少なくとも1つの非可変性のまれな制限部位の1つに対応する第三制限酵素で切断されて、露出した5'末端を有する切断された第三ドッキング点を残すことができ、その後、5'末端、対象となるヌクレオチド配列、および3'末端を含む第二挿入断片を提供する段階であって、第二挿入断片の5'末端が切断された第二ドッキング点の露出した3'末端に適合性であり、かつ第二挿入断片の3'末端が切断された第三ドッキング点の露出した5'末端に適合性である、段階；ならびに第二挿入断片および切断されたクローニングベクタープラスミドを、第二ドッキング点と第三ドッキング点の間のバックボーン内で第二挿入断片のライゲーションおよび自己配向を引き起こすのに適切な反応混合物に入れる段階であって、バックボーンが再組み立てされる、段階が続く。
【００４０】
さらに、この態様は、その後に、バックボーンを第三ドッキング点で第三制限酵素で切断して、露出した3'末端を有する切断された第三ドッキング点を残す段階；第四ドッキング点を、第四ドッキング点の少なくとも1つの非可変性のまれな制限部位の1つに対応する第四制限酵素で切断して、露出した5'末端を有する切断された第四ドッキング点を残す段階；5'末端、対象となるヌクレオチド配列、および3'末端を含む第三挿入断片を提供する段階であって、第三挿入断片の5'末端が切断された第三ドッキング点の露出した3'末端に適合性であり、かつ第三挿入断片の3'末端が切断された第四ドッキング点の露出した5'末端に適合性である、段階；ならびに第三挿入断片および切断されたクローニングベクタープラスミドを、第四ドッキング点と第二ドッキング点の間のバックボーン内で第三挿入断片のライゲーションおよび自己配向を引き起こすのに適切な反応混合物に入れる段階であって、バックボーンが再組み立てされる、段階を含みうる。
【００４１】
本発明のさらにもう一つの態様は、トランスジーンまたは他の複雑なDNA構築物の合成のためのモジュラークローニングベクタープラスミドを作製する方法であって、バックボーンを含むクローニングベクタープラスミドを提供する段階であって、バックボーンが少なくとも第一および第二のドッキング点を有し、ドッキング点それぞれが制限酵素により切断されるよう機能する少なくとも1つの非可変性のまれな制限部位を有する、段階；第一ドッキング点の少なくとも1つの非可変性のまれな制限部位の1つに対応する第一制限酵素で第一ドッキング点を切断して、露出した3'末端を有する切断された第一ドッキング点、および露出した5'末端を有する切断されたバックボーンを残す段階；5'末端、対象となるヌクレオチド配列、および3'末端を含む第一挿入断片を提供する段階であって、第一挿入断片の5'末端が切断された第一ドッキング点の露出した3'末端に適合性であり、かつ第一挿入断片の3'末端が、切断されたバックボーンの露出した5'末端と結合した場合、第三制限酵素により切断されるよう機能する少なくとも1つの非可変性のまれな制限部位を有する第三ドッキング点を形成するよう機能する、段階；第一挿入断片および切断されたクローニングベクタープラスミドを、第一ドッキング点と第三ドッキング点の間で、かつ第二ドッキング点から上流のバックボーン内で第一挿入断片のライゲーションおよび自己配向を引き起こすのに適切な反応混合物に入れる段階であって、バックボーンが再組み立てされる、段階；その後、第三ドッキング点を第三制限酵素で切断して、露出した3'末端を有する切断された第三ドッキング点および露出した5'末端を有する切断されたバックボーンを残す段階；5'末端、対象となるヌクレオチド配列、および3'末端を含む第二挿入断片を提供する段階であって、第二挿入断片の5'末端が切断された第三ドッキング点の露出した3'末端に適合性であり、かつ第二挿入断片の3'末端が、切断されたバックボーンの露出した5'末端と結合した場合、第四制限酵素により切断されるよう機能する少なくとも1つの非可変性のまれな制限部位を含む第四ドッキング点を形成するよう機能する、段階；第二挿入断片および切断されたクローニングベクタープラスミドを、第三ドッキング点と第四ドッキング点の間で、かつ第二ドッキング点から上流のバックボーン内で第二挿入断片のライゲーションおよび自己配向を引き起こすのに適切な反応混合物に入れる段階であって、バックボーンが再組み立てされる、段階；その後、第四ドッキング点を第四制限酵素で切断して、露出した3'末端を有する切断された第四ドッキング点を残す段階；第二ドッキング点を、第二ドッキング点の少なくとも1つの非可変性のまれな制限部位の1つに対応する第二制限酵素で切断して、露出した5'末端を有する切断された第二ドッキング点を残す段階；5'末端、対象となるヌクレオチド配列、および3'末端を含む第三挿入断片を提供する段階であって、第三挿入断片の5'末端が切断された第四ドッキング点の露出した3'末端に適合性であり、かつ第三挿入断片の3'末端が切断された第二ドッキング点の露出した5'末端に適合性である、段階；ならびに第三挿入断片および切断されたクローニングベクタープラスミドを、第四ドッキング点��第二ドッキング点の間のバックボーン内で第三挿入断片のライゲーションおよび自己配向を引き起こすのに適切な反応混合物に入れる段階であって、バックボーンが再組み立てされる、段階を含む。
【００４２】
本発明の性質および利点のさらなる理解は、以下の図面および詳細な説明に関してより完全に認識されると思われる。
【００４３】
本発明を記載するために用いられる用語の定義
本発明のために、以下の用語が以下のとおり定義される。
【００４４】
「クロマチン修飾ドメイン」(CMD)は、クロマチン構造を維持することおよび/または変化させることに関連した様々なタンパク質と相互作用するヌクレオチド配列を指す。
【００４５】
「クローニング」は、DNA分子をプラスミドへライゲーションし、宿主の増殖中の複製(duplication)のために適切な宿主細胞へそれを移入する過程を指す。
【００４６】
「クローニングベクター」という用語は、複製起点、抗生物質抵抗性遺伝子のようなベクターを含む宿主細胞の陽性選択のための手段；および多重クローニング部位を、最低限含む環状DNA分子を指す。クローニングベクターは、プラスミド、コスミド、人工染色体(BAC、PAC、YACなど)、またはウイルスベクターバックボーンからなりうる。
【００４７】
「同族配列(cognate sequence)」は、制限酵素がDNA分子または遺伝子を結合および切断するのに必要とされる最小のヌクレオチド列を指す。
【００４８】
「一般的な」とは、ゲノム内で相対的に頻繁に存在する任意の制限部位を指す。
【００４９】
「に適合性の」とは、同じ制限酵素で切断されたか、または何かの他の方法により生成されたかのいずれかである任意の他の相補的な終端と水素結合を形成することができるDNA鎖の5'もしくは3'のいずれかの終端または末端を指す。制限酵素についての特異的な制限部位を含む任意のDNAは、同じ配列を含む任意の他のDNAと同じ様式で切断されるため、それらの切断された末端は相補的であり、従って、適合性である。それゆえに、同じ制限酵素で切断された任意のDNA分子の末端は、ジグゾーパズルの隣接したピースが「マッチする」方法でお互いに「マッチし」、酵素的に結合されうる。適合性末端は、一緒に組み合わされる場合、特定の制限酵素についての制限部位を形成する。
【００５０】
「デノボ合成」は、全体の所望のDNA分子の部分配列である相補的な一本鎖DNA分子適合性オーバーハングを連結することにより、任意の長さの二本鎖DNA分子を合成する過程を指す。
【００５１】
「DNA構築物」は、クローニングベクタープラスミド内に、連続的なクローニング段階により合成されたDNA分子を指し、一般的に、インビトロの培養細胞またはインビボのトランスジェニックマウスのような任意の適切な細胞宿主において遺伝子発現を指示するために用いられる。そのようなマウスを作製するために用いられるトランスジーンもまた、特に、トランスジーンが設計および合成されている間、DNA構築物と呼ばれうる。
【００５２】
「DNAフラグメント」は、限定されるわけではないが、タンパク質コード配列、レポーター遺伝子、プロモーター、エンハンサー、イントロン、エキソン、ポリAテール、多重クローニング部位、核局在化シグナル、もしくはmRNA安定化シグナルを含むDNAの任意の単離された分子、または任意の他の天然もしくは合成のDNA分子を指す。または、DNAフラグメントは、完全に、インビトロで作製された合成起源でありうる。さらに、DNAフラグメントは、単離された天然フラグメントおよび/または合成フラグメントの任意の組み合わせを含みうる。
【００５３】
「ドッキングプラスミド」は、DNAフラグメントをDNA構築物へ組み立てるために本発明に用いられる特殊化されたクローニングベクタープラスミドを指す。
【００５４】
本明細書で「制限酵素」とも一般的に呼ばれる「エンドヌクレアーゼ」または「エンドヌクレアーゼ酵素」は、DNA分子におけるコードされた制限部位に結合し、その配列内または近くの正確な位置でDNA分子を切断する触媒性分子の分類のメンバーを指す。
【００５５】
「エンドヌクレアーゼ制限部位」または「制限部位」(加えて、上記の「同族配列」)という用語は、制限酵素がDNA分子または遺伝子を結合および切断するのに必要とされる最小のヌクレオチド列を指す。
【００５６】
「エンハンサー領域」は、標的遺伝子の発現に必要とされないが、適切な条件下で遺伝子発現のレベルを増加させるヌクレオチド配列を指す。
【００５７】
「遺伝子発現宿主選択遺伝子」(GEH-S)は、光学センサー、PCR増幅、生化学的アッセイにより、または細胞/生物体生存アッセイ(適切な抗生物質または化学物質で処理された場合の、細胞もしくは生物体の抵抗性または細胞もしくは生物体に対する毒性)により選択、追跡、または検出されうる形質を宿主生物体に与えることができる遺伝的エレメントを指す。
【００５８】
「遺伝子プロモーター」または「プロモーター」(P)という用語は、交換可能に用いられえ、遺伝子の発現に必要とされるヌクレオチド配列を指す。
【００５９】
「挿入断片」および「モジュール」という用語は本質的に交換可能であり、唯一の微細な区別は、「挿入断片」はベクターへ挿入され、いったんそれが挿入されれば、それはその後、より一般的には「モジュール」と呼ばれるということである。モジュールは、その後、ベクターから除去されうる。また、挿入断片という用語は、一般的に、モジュラーアクセプターベクターへの挿入断片として用いられる単離されたモジュールに用いられる。
【００６０】
「イントロン」は、2つのタンパク質コード領域またはエキソンの間に見出される遺伝子の非タンパク質コード領域のヌクレオチド配列を指す。
【００６１】
「局在化シグナル」(LOC)は、対象となるタンパク質の細胞内経路指定のためのシグナルをコードするヌクレオチド配列を指す。
【００６２】
「多重クローニング部位」(MCS)は、DNAフラグメントをクローニングベクタープラスミドへクローニングする目的で、少なくとも1つのユニークな制限部位、およびより典型的には、ユニークな制限部位の群を含むヌクレオチド配列を指す。
【００６３】
「mRNA安定化エレメント」という用語は、いくつかのmRNAを分解から保護すると考えられる結合タンパク質により認識される、DNAの配列を指す。
【００６４】
一群の制限部位に言及する場合に、「規定するよう機能する」という用語は、その群における制限部位のいずれか1つが同族制限酵素の1つで切断される場合、オーバーハング残基が、その制限部位の群から下流のヌクレオチド配列の5'部分を表すことを意味する。
【００６５】
「複製起点(Origin of Replicatoin)」(ORI)という用語は、宿主細胞内でプラスミドの複製(replication)または複製(duplication)を指示するヌクレオチド配列を指す。
【００６６】
「PCRターミネーターオーバーハングクローニングテクノロジー」は、相補的なDNAオーバーハングとの接合部位としての役割を果たしうる保護された5'オーバーハングヌクレオチドを有する一本鎖DNAプライマーと共にポリメラーゼ連鎖反応を用いて遺伝子モジュールを増幅する方法を指す。
【００６７】
「ポリAテール」は、メッセンジャーRNA(mRNA)分子の末端に一般的に見出されるアデニン(A)ヌクレオチドの配列を指す。ポリAテールシグナルは、対象となる遺伝子の発現を促進するために、DNA構築物またはトランスジーンの3'末端へ組み入れられる。
【００６８】
「プライマー部位」は、一本鎖DNAオリゴヌクレオチドがDNAシーケンシング、PCR増幅、および/またはRNA転写を開始することを目的にアニールできるDNA鋳型として働くヌクレオチド配列を指す。
【００６９】
「pUC19」という用語は、当業者に周知のプラスミドクローニングを指し、アクセッション番号L09137としてNCBI GenBankデータベースに見出されうる。
【００７０】
「ランダムヌクレオチド配列」は、同じ分子の構成要素と特定される他のエレメントをコードする配列を重複しないヌクレオチオド配列の任意の組み合わせを指す。ランダム配列に必要とされるヌクレオチドの数は、ランダム配列に隣接する制限酵素の要求に依存する。たいていのエンドヌクレアーゼは、DNA結合を安定化するために最少限2〜4個の追加のランダム配列を必要とする。ランダム配列の数は、コドンを構成するヌクレオチドの数に対応する、3の倍数であることが好ましい。ランダム配列の好ましい最小限の数は、それゆえ、6であるが、より少ないまたはより多いヌクレオチドを用いてもよい。
【００７１】
「まれな」とは、ゲノム内に相対的に低頻度で生じる制限部位を指す。
【００７２】
「組換えアーム」は、トランスジェニックDNAとゲノムDNAの間の相同組換えを促進するヌクレオチド配列を指す。組換えの成功には、相同組換えにより宿主ゲノムへ組み入れられるべきトランスジェニックDNAの領域に隣接する左組換えアーム(LRA)および右組換えアーム(RRA)の存在が必要である。
【００７３】
「リコンビニアリング」は、1つのDNA分子由来の遺伝物質の一部を異なるDNA分子へ転位置するために、リコンビナーゼ酵素により作用されうるDNA配列と共にランダムリコンビナーゼ酵素または部位選択的リコンビナーゼ酵素を用いる方法を指す。
【００７４】
「レポーター遺伝子」は、対象となる特定のプロモーターの活性をモニターするのに有用なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す。
【００７５】
「制限エンドヌクレアーゼ」または「制限酵素」は、DNAの同族配列に結合し、その配列内の正確な位置でDNA分子を切断する触媒性分子の分類のメンバーを指す。
【００７６】
「シャトルベクター」は、DNAフラグメントの末端を改変する中間分子を作製するために本発明に用いられる、特殊化されたクローニングベクタープラスミドを指す。
【００７７】
「タグ配列」(TAG)は、検出されること、または場合によっては、任意の内因性対応物から区別されることを可能にする固有のタンパク質領域をコードするヌクレオチド配列を指す。
【００７８】
「非翻訳領域」(UTR)は、mRNA分子の非タンパク質コード領域を含むヌクレオチド配列を指す。これらの非翻訳領域は、mRNA分子の5'末端(5'UTR)または3'末端(3'UTR)に存在する。
【００７９】
「ユニークな」とは、特定のDNA分子内の他の場所に見出されない任意の制限エンドヌクレアーゼまたはHE部位を指す。
【００８０】
発明の詳細な説明
本発明は、モジュラークローニングまたはドッキング点を有するバックボーンをその中に提供することによる、PE3トランスジーンまたは他の複雑なDNA構築物の合成のための、典型的には、プラスミドベクターであり、モジュラークローニングベクターとも呼ばれる、多重遺伝子ドッキングベクターの構造およびそれを作製するための方法を提供する。本発明は、頻繁に必要とされる操作の量を低減するように最適化されたクローニングベクターを用いることにより、様々なDNAフラグメントをデノボDNA構築物またはトランスジーンへ組み立てるのに有用である。本明細書ではPE3ドッキングベクターまたはドッキングプラスミドと呼ばれる、PE3トランスジェニックベクターは、典型的には、線形パターンに配置された、少なくとも1つの多重クローニング部位(MCS)、ならびにまれな制限部位および/またはユニークなホーミングエンドヌクレアーゼ(「HE」)部位の複数のセットを含む。この配置により、ユーザーが、以前のクローニング段階でドッキングプラスミドへすでに組み入れられているDNAエレメントの完全性を妨げることなくPE3トランスジーン構築物へ挿入断片としてドメインモジュールを配置することを可能にするモジュラー構造が規定される。
【００８１】
本発明は、遺伝的ドメインモジュールをPE3トランスジーンモジュールへ構築するためのモジュラーベクターおよび方法、ならびにプラスミドクローニングベクターである多重遺伝子ベクターへの挿入のためのPE3トランスジーンモジュールを開示かつ例示するが、類似した方法を、コスミドまたは細菌人工染色体(BAC)を含む人工染色体のようなより大きな染色体外DNA分子において遺伝的ドメインモジュールおよびPE3トランスジーンモジュールを構築するために用いることができる。プラスミドクローニングベクターへ組み入れられうる幅広い種類の遺伝的エレメントはまた、ほとんどさらなる操作を加えずに、最終のPE3トランスジーン生成物の幅広い種類の宿主生物体への移入を可能にする。
【００８２】
本発明は、ドッキング点(遺伝子ピボット)のそれぞれ、およびドメインモジュールまたは挿入断片のそれぞれの5'末端ならびに3'末端の両方が、すべて、もう一つのドッキング点または挿入断片の対応する末端と適合性であることを提供する。例えば、第一ドッキング点がSgrAIのような非可変性のまれな制限酵素についての制限部位を含み、しかもドッキング点がその後切断される場合には、切断された第一ドッキング点の3'末端に挿入されることを意図された第一挿入断片は、挿入断片が第一ドッキング点と組み合わされる場合、SgrAIについての制限部位を生じるように適合性5'末端を含む。プラスミド内の第二ドッキング点は、例えば、SwaIのような非可変性制限酵素についての制限部位を有しうる。任意の第二挿入断片は、SwaIについての制限部位を生じるように切断された第二ドッキング点の切断された5'末端と組み合わせうる適合性ヌクレオチド配列をその3'末端として有する。さらに、モジュラークローニングベクタープラスミドへ適応して挿入され、かつまたその後、同じ点で除去されるために第一挿入断片の3'末端および第二挿入断片の5'末端は、例えば、PacIまたはSalIのような第三の非可変性のまれな制限酵素についての第三制限部位を生じうる適合性末端を含まなければならない。
【００８３】
PE3ドッキングベクター内へドメインモジュールにシャトルするための、本明細書で「シャトルベクター」としても知られる、本発明のドメインモジュールドッキングベクターは、少なくともまれな制限部位に隣接する一般的な制限部位、および任意でHE部位を有する多重クローニング部位を含む。シャトルベクターは、まれな制限部位の間の一般的な制限部位へDNAのフラグメントをクローニングするために設計される。クローニングされたフラグメントは、その後、まれな制限(またはHE)部位での切断により遊離され、シャトルベクターに見出される同じまれな制限および/またはHE部位を用いてPe3ドッキングベクターへ組み入れられうる。
【００８４】
従って、従来のクローニングベクターと違って、MCSの設計は、ドメインモジュール(DNAフラグメントの「カセット」またはモジュール)が、一群のまれな制限部位を含む規定された遺伝子ピボットを用いてPE3ドッキングベクター(ドッキングプラスミド)のモジュラー領域へ挿入されることを可能にしている。同様に、それぞれは、同じまれな制限酵素および/またはHE酵素を用いて容易に除去され、対象となる任意の他のDNAフラグメントと置換されうる。この特徴は、ユーザーが、実験プロジェクトの方向をDNA構築物全体を再構築する必要に迫られることなく、迅速かつ容易に変化させることを可能にする。それゆえに、本発明のドメインモジュールおよびPE3クローニングベクターは、ユーザーが、一般的な制限部位を用いてDNAフラグメントを中間ドメインモジュールベクターへクローニングして、カセット受容モジュールを作製するのを可能にし、およびその後、まれな制限部位を用いて最終構築物における所望のモジュラースポットへそのモジュラーフラグメントを移入することを可能にする。さらになお、それにより、PE3ドッキングプラスミドにおいて個々のモジュールを他のカセットモジュールと置換する分子への後での変化が可能になる。以下の説明は、先行技術と比較した本発明の差異を際立たせている。
【００８５】
各ドッキング点(遺伝子ピボットにより定義される)は、好ましくは、少なくとも2つの固定された非可変性のまれな制限部位、およびより好ましくは、少なくとも3つの非可変性のまれな制限部位の固定された群、および最も好ましくは、4つより多くない非可変性のまれな制限部位の固定された群がある領域を表す。各ドッキング点の特定の制限部位は、その同族制限酵素により切断される。これは、プロモーター配列、発現配列、または制御ヌクレオチド配列などの、選択されたヌクレオチド配列を含む、事前に構築された挿入断片の1つの相補的な5'末端または3'末端と適合性である所望の5'末端または3'末端のいずれかを生じる。それぞれが対象となる切断されたドッキング点と適合性である5'末端および3'末端を有する少なくとも2つの挿入断片は、切断されたクローニングベクタープラスミドと共に適切な反応混合物へ加えられ、適切な熱力学的環境を仮定すれば、挿入断片は、同時に、すなわち、単一段階で、クローニングベクタープラスミドへ統合されうる。この単一の付加およびライゲーション反応中に、ドッキング点は再編成され、クローニングベクタープラスミドは、ドッキング点および2つのモジュール間の結合部が適切な制限酵素で再切断されうる点において、モジュラーになる。その後、モジュールを、後で除去することができ、その場所に新しいモジュールを挿入できる。
【００８６】
モジュールに隣接するピボット点に単一の制限部位を用いることは可能であるが、単一の「まれな」制限部位がその特定のDNA分子内にかなり頻繁にあるというはっきりとした可能性がある。制限酵素部位の頻度は、上で説明されているように、4nの関数であることを思い出されたい。例えば、クローニングベクタープラスミドにおける特定のプロモーターモジュールは、そのピボット点にも存在するまれな制限部位をそのDNA配列内に含む可能性があり、それゆえに、ピボット点に複数の制限部位を有することが有利になっている。従って、複数の制限部位が対象となるモジュールのDNA配列内に存在する統計学的確率はずっと少ないため、単一のピボット点に複数のまれな制限部位を用いることが好ましい。しかしながら、3つまたは4つより多くない制限部位が単一のピボット点に位置することも好ましく、さもないと、「一団となった」制限部位は標的分子の転写/翻訳に影響を及ぼし始める。この数に関して、一団となった制限部位の組み合わせは多くても18〜24bp長である。
【００８７】
ドメインモジュールベクター：
図1は、ドメインモジュールドッキングベクター1の本発明の第一態様の単純化された表示を示す。ベクター1は、多重クローニング部位2を有するDNAのひと続きからなり、典型的にはプラスミドである。ドメインモジュールドッキングベクターは、順に配置された5つのクローニング部位、MC-1、MC-2、MC-3、MC-4、およびMC-5からなる多重クローニングモジュール(MCモジュール)を含む。多重クローニング部位は、本明細書に後で記載されているように、一般的な制限部位から独立して選択される複数の制限部位を含む。2つの制限部位は、対象となる遺伝子3として示された対象となる遺伝物質についてのドッキング位置を規定する。MCモジュールは、MCモジュールの多重クローニング部位における2つの制限部位の間での対象となる遺伝物質のサブクローニングを可能にする。対象となる遺伝子3は、典型的には、対象となる遺伝子ベクターから遊離され(非呈示)、MC-1およびMC-3として示されたクローニング部位4aおよび4bの1ペアを含む。
【００８８】
ドメインモジュールドッキングベクターはまた、多重クローニング部位2に隣接する遺伝子ピボット5および6と呼ばれる1ペアの制限部位を含む。遺伝子ピボットそれぞれは、本明細書に後で定義されているように、少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む。遺伝子ピボット5および6は、MCモジュールの、それぞれ、5'部分および3'部分を規定するよう機能する。
【００８９】
本発明の第二の態様において、同族制限酵素MC-1およびMC-3(非呈示)は、対象となる遺伝子をそのベクターから切断し、MC-1およびMC-3のMC部位の両方においてMCモジュールを開き、それにより、MC-1とMC-3のMC部位の間へ対象となる遺伝子のライゲーションを可能にし、それにより、ドメインモジュールベクター7を形成することができる。図示された態様において、対象となる遺伝子は、ドメインモジュールが発現モジュールであり、ドメインモジュールベクターがより好ましくは発現モジュールベクターであるように、発現ドメインを含む。発現モジュールベクターは、発現ドメインを含むサブクローニングされた対象となる遺伝子3を含む核酸配列に隣接する第一および第二遺伝子ピボット5ならびに6を含む発現モジュール8を含む。
【００９０】
図示された態様において、対象となる遺伝子は発現ドメインを含み、第一遺伝子ピボット(または発現ドメインの5'部分)は以下GP2と呼ばれ、第二遺伝子ピボット(または発現ドメインの3'部分)はGP3と呼ばれる。代替の態様において、対象となる遺伝子は、プロモータードメインまたは3'制御ドメインを含むことができ、それらのサブクローニングは、それぞれ、プロモーターモジュールベクター内においてプロモーターモジュール、および3'制御モジュールベクター内において3'制御モジュールを提供することが理解されうる。プロモーターモジュールドッキングベクターについて、第一遺伝子ピボット(またはプロモータードメインの5'部分)は、以下GP1と呼ばれ、第二遺伝子ピボット(またはプロモータードメインの3'部分)はGP2と呼ばれる。3'制御モジュールドッキングベクターについて、第一遺伝子ピボット(または3'制御ドメインの5'部分)は、以下GP3と呼ばれ、第二遺伝子ピボット(または3'制御ドメインの3'部分)はGP4と呼ばれる。
【００９１】
遺伝子ピボットGP1、GP2、GP3、およびGP4を含むドメインモジュールドッキングベクターのいずれかについての遺伝子ピボットは、AsiS I、Pac I、Sbf I、Fse I、Asc I、Mlu I、SnaB I、Not I、Sal I、Swa I、Rsr II、BSiW I、Sfo I、Sgr AI、AflIII、Pvu I、Ngo MIV、Ase I、Flp I、Pme I、Sda I、Sgf I、Srf I、およびSse8781 Iからなる群より選択される、ならびにより典型的には、AsiS I、Pac I、Sbf I、Fse I、Asc I、Mlu I、SnaB I、Not I、Sal I、Swa I、Rsr II、BsiW Iからなる群より選択される、まれな制限部位を含みうる。遺伝子ピボットのより典型的な態様は、一連の、少なくとも3つ、かつ4つより多くない、まれな制限部位を含み、典型的には、任意の1つの遺伝子ピボットは、任意の他の遺伝子ピボットのまれな制限部位を含まない。
【００９２】
好ましい態様において、遺伝子ピボットGP1は、少なくともAsiS I、Pac I、およびSbf Iからなる群より選択され、遺伝子ピボットGP2は、少なくともFse I、Asc I、およびMlu Iからなる群より選択され、遺伝子ピボットGP3は、少なくともSnaB I、Not I、およびSal Iからなる群より選択され、遺伝子ピボットGP4は、少なくともSwa I、Rsr II、およびBSiW Iからなる群より選択される。特に好ましい態様において、遺伝子ピボットGP1は、順に、AsiS I、Pac I、およびSbf Iからなり；遺伝子ピボットGP2は、順に、Fse I、Asc I、およびMlu Iからなり；遺伝子ピボットGP3は、順に、SnaB I、Not I、およびSal Iからなり；ならびに遺伝子ピボットGP4は、順に、Swa I、Rsr II、およびBSiW Iからなる。
【００９３】
多重クローニング部位は、より大きな数またはより小さな数の部位での、逆の順序での(例えば、MC-5、MC-4、MC-3、MC-2、およびMC-1)、および他の型のクローニング部位を用いての、制限部位の他の組み合わせを含むことができることもまた理解されうる。多重クローニング部位は、対象となる特定の遺伝子についてのクローニング部位のペアに適応するように変ってもよい。
【００９４】
代替の態様においてまた企図されるのは、幅広い種類の対象となる遺伝子を容易にサブクローニングするために用いられうる、ドメインモジュールドッキングベクターのライブラリーである。ドメインモジュールドッキングベクターのライブラリーは、特定のドメインモジュールドッキングベクターについて選択された遺伝子ピボットの型に依存して、専用のプロモータードメインモジュールベクター、発現ドメインモジュールベクター、または3'制御モジュールベクターとして働くように構成されうる。プロモーター、発現、および3'制御ドメインモジュールベクターの各サブライブラリーは、それぞれのドメインモジュールを下記のより高次のPE3ドッキングベクターへの適切なクローニングを保証するために遺伝子ピボットのそれら自身の専用のペア(すなわち、GP1とGP2、GP2とGP3、およびGP3とGP4)を有する。
【００９５】
PE3ドッキングベクターおよびPE3 MCドッキングベクター：
図2は、第一のPE3ドッキングベクター10の、本発明の第三の態様の単純化された表示を示す。PE3ドッキングベクター10は、少なくとも第一クローニングモジュール11bを有するひと続きのDNAからなり、典型的には、プラスミドである。少なくとも第一クローニングモジュールは、少なくとも、スタッファー18bを含む核酸配列に隣接する、GP2およびGP3として示された、第一および第二の遺伝子ピボットを含む。DNAスタッファードメインは、PE3ドッキングベクター内に存在する制限部位または任意の他の生物学的機能についてコードしないランダムなヌクレオチド配列である。スタッファーDNAは、制限酵素が結合することができる、より長いDNA列を提供することにより制限酵素切断活性の効率を増加させる働きをする。多くの制限酵素が、DNAの長さが限定される場合には、それらの同族認識部位に結合して切断することができないため、これは重要である。第一および第二の遺伝子ピボットは、本明細書で前に記載されているとおりである。第一クローニングモジュール11bは、少なくとも第一ドメインモジュールをPE3クローニングモジュールへクローニングするために構成されている。第一クローニングモジュールが発現ドメインクローニングモジュールである図示された態様において、第一および第二の遺伝子ピボットは、本明細書で前に定義されているように、GP2およびGP3と表される。発現スタッファーモジュールとも名付けられたスタッファーを含む第一クローニングモジュール11bは、適合性遺伝子ピボットを含む発現ドメインモジュールの挿入のためのドッキング位置を提供する。適合性遺伝子ピボットは、クローニングモジュールの遺伝子ピボットと同一の制限部位を有する、またはクローニングモジュールの遺伝子ピボットと共通した少なくとも1つのユニークなまれな制限部位を含むものである。
【００９６】
同様に図示された、第二のクローニングモジュール11aは、GP1としてのその第一遺伝子ピボット12、およびクローニングモジュール11bの5'部分との共有接合部であるGP2としてのその第二遺伝子ピボット13を有するプロモータースタッファーモジュールである。プロモータースタッファーモジュール11aは、スタッファーを含み、クローニングの際にプロモータースタッファーモジュールを置換する適合性遺伝子ピボットを有するプロモータードメインモジュールの挿入のためのドッキング位置を提供する。第三のクローニングモジュール11cは、クローニングモジュール11bの3'部分との共有接合部であるGP3としてのその第一遺伝子ピボット14、およびGP4としてのその第二遺伝子ピボット15を有する3'制御スタッファーモジュールである。3'制御スタッファーモジュール11cは、スタッファーを含み、クローニングの際に3'制御スタッファーモジュールを置換する適合性遺伝子ピボットを有する3'制御ドメインモジュールの挿入のためのドッキング位置を提供する。
【００９７】
本発明の第四の態様において、発現モジュール7を例示する、ドメインモジュールベクターの1つについての各遺伝子ピボットに含まれるまれな制限部位の1つについての同族制限酵素は、その残留するベクターからまれな制限部位を切断でき、同様に、対応する遺伝子ピボットGP2およびGP3における同じまれな制限部位でPE3ドッキングベクターを開き、それにより発現スタッファーモジュールを発現モジュールと置換することができる。別々のクローニング事象において、プロモーターモジュール(非呈示)についての遺伝子ピボット、ならびにプロモータースタッファーモジュール11aの対応する遺伝子ピボット12および13についての適切な同族制限酵素は、プロモーターモジュールをPE3モジュールへライゲーションし、それにより、プロモータースタッファーモジュールをプロモーターモジュールと置換するために用いられうる。同様に、3'制御モジュールもPE3モジュールへライゲーションされうる。
【００９８】
本発明において、少なくとも2つ、およびより典型的には少なくとも3つのまれな制限部位が、ドッキングピボットまたは遺伝子ピボットとして用いられる。遺伝子配列におけるまれな制限部位のまれさにより、2部位遺伝子ピボットにおける両方のまれな制限部位がドッキングベクターに見出されることの可能性が低くなり、3部位遺伝子ピボットにおけるすべての3つのまれな制限部位がドッキングベクターに見出される可能性が非常に低くなる。DNAクローニングベクターが、遺伝子ピボットのまれな制限部位の1つを含むことが見出される事象において、熟練したユーザーは、他の同族のまれな制限酵素の1つで遺伝子ピボットを切断できる。例として、GP2がFse I、Asc I、およびMlu Iからなり、PE3ドッキングベクターまたはEドメイン自身がその配列内にAsc Iを有する場合には、熟練したユーザーは遺伝子ピボットを切断するためにFse IまたはMlu Iのいずれかを用いることができる。
【００９９】
PE3ベクターのDNAクローニングベクターはまた、典型的には、本明細書に後で記載されているように、多重遺伝子ドッキングベクターへクローニングするためにPE3クローニングモジュールをPE3ドッキングベクターから遊離するための手段を含む。
【０１００】
図3は、PE3多重クローニング(MC)ドッキングベクター20へドメインモジュールにクローニングするための代替の態様を示す。PE3 MC-プロモータードッキングベクター20aと呼ばれる第一のPE3 MCドッキングベクターは、少なくとも第一クローニングモジュール21aを有するDNAのひと続きからなり、典型的には、プラスミドである。第一クローニングモジュール21aは、本明細書に後で記載されているように、少なくとも、一般的な制限部位から独立して選択された複数の制限部位を含む多重クローニング部位(MCS)を含む核酸配列に隣接する、GP1およびGP2として図示された、第一および第二の遺伝子ピボットを含む。図示された態様において、PE3 MC-プロモータードッキングベクター20は、本明細書に記載されているように、それぞれが遺伝子ピボットGP1、GP2、GP3、およびGP4により結合した、3つのクローニングモジュール、21a、21b、および21cを有する。第二および第三のクローニングモジュールは、スタッファーを含む核酸配列を含むスタッファーモジュールとして示されている。
【０１０１】
多重クローニング部位は、順に配置された5つのクローニング部位、MC-1、MC-2、MC-3、MC-4、MC-5、およびMC-6からなる。制限部位のいずれか2つが、対象となる遺伝物質についてのドッキング位置を規定できる。PE3 MCドッキングベクター20aにおいて、対象となる遺伝物質は、典型的には、プロモータードメインである。対象となる2つのクローニング部位の選択は、これらの制限部位がPE3 MCドッキングベクター20a内においてユニークであるという理解に基づきうる。
【０１０２】
代替の態様は、第二クローニングモジュール21bが多重クローニング部位を含み、残りの第一および第三クローニングモジュール21aおよび21cがスタッファーを含む、PE3 MC-発現ドッキングベクター、ならびに第三クローニングモジュール21cが多重クローニング部位を含み、残りの第一および第二クローニングモジュール21aおよび21bがスタッファーを含む、PE3 MC-3制御ドッキングベクターを含む。他の代替の態様においては、3つのクローニングモジュールのうちの2つが多重クローニング部位を含みうる。
【０１０３】
PE3ドッキングベクターにおける、対象となる遺伝物質での多重クローニング部位のサブクローニング、およびドメインモジュールのスタッファーモジュールへのクローニングは、本明細書で前に記載されているように、達成できる。
【０１０４】
GP1、GP2、GP3、およびGP4遺伝子ピボットは、本明細書で前に記載されているように、プロモーター、発現、および3'制御ドメインモジュールにおけるそれぞれのモジュールの位置に相関している。
【０１０５】
本発明はまた、モジュラードメインベクターおよびPE3モジュラークローニングベクターからPE3ベクターを作製することを提供する。PE3モジュラーベクターを構築する第一の方法は、以下の段階を含む：
a)PE3クローニングモジュールを含むPE3クローニングベクターを提供する段階であって、PE3クローニングモジュールが順に以下を含む段階：少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を含む第一遺伝子ピボット、少なくとも、スタッファーを含む核酸配列からなる第一スタッファーモジュール、および第二遺伝子ピボット；
b)少なくとも、順に以下を含む第一ドメインモジュールベクターを提供する段階：第一遺伝子ピボット、対象となる遺伝物質を含む核酸配列からなる対象となる遺伝子モジュール；および第二遺伝子ピボット；
c)第一遺伝子ピボットのまれな制限部位の1つについての第一の同族制限酵素、および第二遺伝子ピボットのまれな制限部位の1つについての第二の同族制限酵素を提供する段階；
d)第一および第二同族制限酵素を用いて対象となる遺伝子モジュールを第一ドメインモジュールベクターから切除および単離する段階；
e)第一および第二同族制限酵素を用いて第一スタッファーモジュールをPE3クローニングベクターのPE3クローニングモジュールから切除する段階；ならびに
f)対象となる遺伝子モジュールをPE3クローニングモジュールへライゲーションする段階。
【０１０６】
さらに方法はまた、提供されたPE3クローニングモジュールが、以下のさらなる段階を用いて、第二遺伝子ピボットの後に順に、第二スタッファーモジュールおよび第三遺伝子ピボットをさらに含むことを提供する：
g)順に、第二遺伝子ピボット、対象となる第二遺伝物質を含む核酸配列からなる対象となる第二の遺伝子モジュール；および第三遺伝子ピボットを含む第二ドメインモジュールベクターを提供する段階；
h)第三遺伝子ピボットのまれな制限部位の1つについての第三同族制限酵素を提供する段階；
i)第二および第三同族制限酵素を用いて対象となる第二の遺伝子モジュールを第二ドメインモジュールベクターから切除および単離する段階；
j)第二および第三同族制限酵素を用いて第二スタッファーモジュールをPE3クローニングベクターのPE3クローニングモジュールから切除する段階；ならびに
j)対象となる第二の遺伝子モジュールをPE3クローニングモジュールへライゲーションする段階。
【０１０７】
同様に、対象となる第三の遺伝子モジュールが、対象となる第二の遺伝子モジュールを切除して、PE3クローニングモジュールへライゲーションするための第三遺伝子ピボットおよび同族制限酵素を用いてPE3へ挿入されうる。方法は、対象となる遺伝子モジュールのPE3クローニングベクターへの逐次的配置を提供する。典型的には、対象となる第一、第二、および第三の遺伝子モジュールは、それぞれ、プロモーターモジュール、発現モジュール、および3'制御モジュールに対応する。典型的な態様において、本明細書で前に記載されているように、第一遺伝子ピボットはGP1であり、第二遺伝子ビポットはGP2であり、第三遺伝子ピボットはGP3であり、第四遺伝子ピボットはGP4である。
【０１０８】
もう一つの態様において、PE3クローニングベクターを作製するための方法は、以下の段階を含む方法である：
a)バックボーンを有するPE3クローニングベクターを提供する段階であって、バックボーンが少なくとも第一、第二、第三、および第四遺伝子ピボットを含み、遺伝子ピボットが5'-3'方向に逐次的に配置され、それぞれが同族制限酵素により切断されるよう機能する少なくとも2つの非可変性のまれな制限部位を有する、段階；
b)第一遺伝子ピボットの非可変性のまれな制限部位の1つに対する第一同族制限酵素で第一遺伝子ピボットを切断し、露出した3'末端を有する切断された第一遺伝子ピボットを残す段階；
c)第二遺伝子ピボットの非可変性のまれな制限部位の1つに対する第二同族制限酵素で第二遺伝子ピボットを切断し、露出した5'末端を有する切断された第二遺伝子ピボットを残す段階；
d)5'末端、対象となる第一遺伝物質、および第一遺伝子ピボット3'末端を含む第一ドメインモジュールを提供する段階であって、第一ドメインモジュールの5'末端が切断された第一遺伝子ピボットの露出した3'末端に適合性であり、かつ第一ドメインの3'末端が切断された第二遺伝子ピボットの露出した5'末端に適合性である、段階；ならびに
e)第一遺伝子ピボットと第二遺伝子ピボットの間のバックボーン内に第一ドメインモジュールのライゲーションおよび自己配向を引き起こすように、第一ドメインモジュールおよび切断されたPE3クローニングベクターを適切な反応混合物に入れる段階であって、バックボーンが再組み立てされる、段階。
【０１０９】
方法はさらに以下の段階を含みうる：
f)その後、第二遺伝子ピボットを第二同族制限酵素で切断し、露出した3'末端を有する切断された第二遺伝子ピボットを残す段階；
g)第三遺伝子ピボットのまれな制限部位の1つに対する第三同族制限酵素で第三遺伝子ピボットを切断し、露出した5'末端を有する切断された第三遺伝子ピボットを残す段階；
h)5'末端、対象となる第一遺伝物質、および3'末端を含む第二ドメインモジュールを提供する段階であって、第二ドメインモジュールの5'末端が切断された第二遺伝子ピボットの露出した3'末端に適合性であり、かつ第二ドメインモジュールの3'末端が切断された第三遺伝子ピボットの露出した5'末端に適合性である、段階；ならびに
i)第二遺伝子ピボットと第三遺伝子ピボットの間のバックボーン内に第二ドメインモジュールのライゲーションおよび自己配向を引き起こすように、第二ドメインモジュールおよび切断されたPE3クローニングベクターを適切な反応混合物に入れる段階であって、バックボーンが再組み立てされる、段階。
【０１１０】
方法はなおさらに以下の段階を提供しうる：
j)その後、第三遺伝子ピボットにおけるバックボーンを第三同族制限酵素で切断し、露出した3'末端を有する切断された第三遺伝子ピボットを残す段階；
k)第四遺伝子ピボットのまれな制限部位の1つに対する第四同族制限酵素で第四遺伝子ピボットを切断し、露出した5'末端を有する切断された第四遺伝子ピボットを残す段階；
l)5'末端、対象となる第三遺伝物質、および3'末端を含む第三ドメインモジュールを提供する段階であって、第三ドメインモジュールの5'末端が切断された第三遺伝子ピボットの露出した3'末端に適合性であり、かつ第三ドメインモジュールの3'末端が切断された第四遺伝子ピボットの露出した5'末端に適合性である、段階；ならびに
m)第三遺伝子ピボットと第四遺伝子ピボットの間のバックボーン内に第三ドメインモジュールのライゲーションおよび自己配向を引き起こすように、第三ドメインモジュールおよび切断されたPE3クローニングベクターを適切な反応混合物に入れる段階であって、バックボーンが再組み立てされる、段階。
【０１１１】
典型的には、対象となる第一、第二、および第三の遺伝子モジュールは、それぞれ、プロモーターモジュール、発現モジュール、および3'制御モジュールに対応する。典型的な態様において、本明細書で前に記載されているように、第一遺伝子ピボットはGP1であり、第二遺伝子ビポットはGP2であり、第三遺伝子ピボットはGP3であり、第四遺伝子ピボットはGP4である。
【０１１２】
多重遺伝子クローニングベクター：
本発明のPE3ドッキングベクターおよびMCドッキングベクターは、対象となるPE3トランスジーンの1つまたは複数を容易かつ迅速に組み立てる手段を提供する。本発明はまた、PE3モジュールの1つまたは複数をモジュラー多重遺伝子ベクターへ迅速かつ容易に挿入する手段を提供する。図4は、1つまたは複数のPE3モジュールの挿入を可能にするように容易に遊離されうる1つまたは複数(図示されているように)のPE3スタッファーモジュールを含む多重遺伝子ドッキングベクターへのPE3モジュールの挿入の単純化した概略図を示す。多重遺伝子ベクターは、より詳細に、以下および図16〜21に記載されている。
【０１１３】
本発明に用いられる制限部位は、出現の階層に従って選択される。制限部位の出現頻度を決定するために、19個の異なる遺伝子に対応するDNA配列情報が、Vector NTIソフトウェアを用いて解析された。この検索は、DNA配列の合計110,530個のヌクレオチドを網羅した。これらの解析からの結果は、解析された110,530個のヌクレオチド内に出現する制限部位の実例の数に従って計算された。制限部位は、その後、4つの分類による階層名を割り当てられ、「一般的な」部位は110,530ヌクレオチドあたり25回より多く存在し、「より低頻度の6bp部位」は110,530ヌクレオチドあたり6〜24回の間で存在し、「まれな」部位は110,530ヌクレオチドあたり0〜5回の間で存在する。「適した」酵素の部分的なリストは、これによって、それらの出現分類に従って列挙されている。
【０１１４】
一般的な制限部位：
適した一般的な制限酵素には、限定されるわけではないが、Ase I、BamH I、Bgl II、Blp I、BstX I、EcoR I、Hinc II、Hind III、Nco I、Pst I、Sac I、Sac II、Sph I、Stu I、Xba Iが挙げられうる。
【０１１５】
6bp認識部位を有するが、出現がより低頻度である適した制限部位には、限定されるわけではないが、
2009508533.tif 000007
が挙げられうる。
【０１１６】
まれな制限部位：
適したまれな酵素には、限定されるわけではないが、
2009508533.tif 000008
が挙げられうる。
【０１１７】
ホーミングエンドヌクレアーゼ：
適したホーミングエンドヌクレアーゼには、限定されるわけではないが、
2009508533.tif 000009
が挙げられうる。
【０１１８】
発明の詳細な態様
PE3ベクターまたはトランスジーンの個々の構成要素は、プロモーターエンハンサーモジュール(「P」と名付けられる)、発現したタンパク質モジュール(「E」)、および/または3'制御領域モジュール(「3」)であり、ドメインモジュール(または「シャトル」)ベクターから移入されるモジュールとしてPE3ドッキングベクター(ドッキングステーションとも呼ばれる)へ組み立てられうる。図5は、切除されて、PE3ドッキングベクターへあらかじめ決められたドッキング位置に挿入されうるプロモーターベクター内のプロモーターモジュールを示す。図5にも示されているように、より高次の複雑性が必要とされる場合には、組み立てられるPE3モジュラートランスジーンまたは他のヌクレオチド配列は、その後、多重遺伝子ドッキングベクター(一次ドッキングステーションプラスミド(Primary Docking Station Plasmid)とも呼ばれる)へ、または遺伝子座ターゲティングドッキングベクターへ移入されうる。クローニングベクタープラスミドの5つの型(プロモーターモジュールベクター、発現モジュールベクター、および3'制御モジュールベクター、PE3ドッキングベクター、ならびに多重遺伝子ベクター)のそれぞれは、より詳細に説明され、それぞれへ組み入れられた構成要素が例示される。
【０１１９】
典型的には一般的な制限部位を含み、かつ典型的にはまれな制限部位および/またはHE部位を含む遺伝子ピボットに隣接した多重クローニング部位を含む、「シャトルベクター」としても知られたドメインモジュールドッキングベクター。ドメインモジュールドッキングベクターは、pUC19バックボーンから構築され、pUC19バックボーンへの以下の改変を有し、配列がpUC19 GenBank配列ファイル、アクセッション番号L09137により番号付けされている：
1. 806位から2617位(Afl3〜Aat2)までの配列のみがドッキングプラスミドに用いられる。
2. pUC19における1729位のBspH 1部位がTCATGAからGCATGAへ変異されている。
3. pUC19における1493位のAcl 1部位がAACGTTからAACGCTへ変異されている。
4. pUC19における1120位のAcl 1部位がAACGTTからCACGCTへ変異されている。
5. pUC19におけるAhd 1部位がGACNNNNNGCTからCACNNNNNGTCへ変異されている。
【０１２０】
BspH 1/I-Ppo 1/BspH 1をコードする配列は、上記のリストにおける変異段階2の後にpUC19における残りの唯一のBspH I部位に挿入される。
【０１２１】
本発明の3つの個々のシャトルベクターである、プロモーターモジュールドッキングベクター、発現モジュールドッキングベクター、および3'制御モジュールドッキングベクターは、特定の態様において記載され、それぞれ、シャトルベクタープロモーター/イントロン(「SVP」)、シャトルベクター発現(「SVE」)、およびシャトルベクター3'制御(「SV3」)として認定される。それぞれは下にさらに十分に説明されている。
【０１２２】
シャトルベクターP
SVPは図10に示されており、それは、本明細書で前に記載されているように、PE3ドッキングベクター(トランスジーン構築物)への組み立てのためのプロモーターおよびイントロン配列を調製するために用いることができるクローニングベクタープラスミドである。
【０１２３】
図11は、列挙された順序でMCSに以下の逐次的エレメントを含むSVPプラスミドの例を示す：
1. 上記の変異されたpUC19ベクターについて5'挿入部位を規定する2つの非可変性かつユニークな一般的な制限部位(例えば、Aat IIおよびBlp I)、
2. T7プライマー部位、
3. T7プライマー部位の下流のシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能にする非可変性かつユニークな一般的な制限部位(例えば、Eco0109 I)、
4. プロモーターモジュールの5'部分を規定する非可変性のまれな制限部位の固定された群(例えば、AsiS IおよびSgrA I)、
5. シャトルベクターにユニークである一般的なまたはまれな制限部位の任意の群を含む可変性MCS(例えば、図11に示された一連の制限部位)、
6. プロモーターモジュールの3'部分を規定する非可変性のまれな制限部位の固定された群(例えば、Pac I、Asc I、およびMlu I)、
7. T3プライマー部位の上流のシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能にする非可変性かつユニークな一般的な制限部位(例えば、BspE I)、
8. 逆配向T3プライマー部位、および
9. 上記の変異されたpUC19ベクターについて3'挿入部位を規定する2つの非可変性かつユニークな一般的な制限部位(例えば、Pme IおよびSap I)。
【０１２４】
代替の例において、プロモーターモジュールの5'部分(GP1遺伝子ピボット)を規定する非可変性のまれな制限部位の固定された群は、AsiS I、Pac I、およびSbf Iを含み、プロモーターモジュールの3'部分(GP2遺伝子ピボット)を規定するまれな制限部位は、Fse I、Asc I、およびMlu Iを含む。より具体的な例において、GP1遺伝子ピボットは、AsiS I、Pac I、およびSbf Iの配列からなり、GP2遺伝子ピボットは、Fse I、Asc I、およびMlu Iの配列からなる。
【０１２５】
シャトルベクターE(SVE)
図12に示されているSVEは、本明細書で前に記載されているように、PE3ベクター(トランスジーン構築物)へのモジュラー組み立てのためのトランスジーンにより発現されうる配列を調製するために用いることができるクローニングベクタープラスミドである。
【０１２６】
図13は、列挙された順序でMCSに以下の逐次的エレメントを含むSVEプラスミドの例を示す：
1. 上記の変異されたpUC19ベクターについて5'挿入部位を規定する2つの非可変性かつユニークな一般的な制限部位(例えば、Blp I)、
2. T7プライマー部位、
3. T7プライマー部位の下流のシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能にする非可変性かつユニークな一般的な制限部位(例えば、Eco0109 I)、
4. 発現モジュールの5'部分を規定する非可変性のまれな制限部位の固定された群(例えば、Pac I、Asc I、およびMlu I)、
5. シャトルベクターにユニークである一般的なまたはまれな制限部位の任意の群からなる可変性MCS(例えば、図13に示された一連の制限部位)、
6. 発現モジュールの3'部分を規定する非可変性のまれな制限部位の固定された群(例えば、SnaB I、Not I、およびSal I)、
7. T3プライマー部位の上流のシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能にする非可変性かつユニークな一般的な制限部位(例えば、BspE I)、
8. 逆配向T3プライマー部位、および
9. 上記の変異されたpUC19ベクターについて3'挿入部位を規定する2つの非可変性かつユニークな一般的な制限部位(例えば、Pme I)。
【０１２７】
代替の例において、発現モジュールの5'部分(GP2遺伝子ピボット)を規定する非可変性のまれな制限部位の固定された群は、Fse I、Asc I、およびMlu Iを含み、発現モジュールの3'部分(GP3遺伝子ピボット)を規定するまれな制限部位は、SnaB I、Not I、およびSal Iを含む。より具体的な例において、GP2遺伝子ピボットは、Fse I、Asc I、およびMlu Iの配列からなり、GP3遺伝子ピボットは、SnaB I、Not I、およびSal Iの配列からなる。
【０１２８】
シャトルベクター3(SV3)
図14に示されているSV3は、本明細書で前に記載されているように、PE3ベクター(トランスジーン構築物)への組み立てのための3'制御配列を調製するために用いることができるクローニングベクタープラスミドである。
【０１２９】
図15において、SV3プラスミドの例は、列挙された順序でMCSに以下のエレメントを含みうる：
1. 上記の変異されたpUC19ベクターについて5'挿入部位を規定する2つの非可変性かつユニークな一般的な制限部位(例えば、Blp I)、
2. T7プライマー部位、
3. T7プライマー部位の下流のシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能にする非可変性かつユニークな一般的な制限部位(例えば、Eco0109 I)、
4. 3'制御モジュールの5'部分を規定する非可変性のまれな制限部位の固定された群(例えば、SnaB I、Not I、およびSal I)、
5. シャトルベクターにユニークである一般的なまたはまれな制限部位の任意の群からなる可変性MCS(例えば、図15に示されている一連の制限部位)、
6. 3'制御モジュールの3'部分を規定する非可変性のまれな制限部位の固定された群(例えば、Swa I、Rsr II、およびBsiW I)、
7. T3プライマー部位の上流のシャトルベクターモジュールの効率的なクローニングを可能にする非可変性かつユニークなまれでない制限部位(例えば、BspE I)、
8. 逆配向T3プライマー部位、および
9. 上記の変異されたpUC19ベクターについて3'挿入部位を規定する2つの非可変性かつユニークなまれでない制限部位(例えば、Pme I)。
【０１３０】
代替の例において、発現モジュールの5'部分(GP3遺伝子ピボット)を規定する非可変性のまれな制限部位の固定された群は、SnaB I、Not I、およびSal Iを含み、発現モジュールの3'部分(GP4遺伝子ピボット)を規定するまれな制限部位は、Swa I、Rsr II、およびBsiW Iを含む。より具体的な例において、GP3遺伝子ピボットは、SnaB I、Not I、およびSal Iの配列からなり、GP4遺伝子ピボットは、Swa I、Rsr II、およびBsiW Iの配列からなる。
【０１３１】
図6に示されたPE3ドッキングベクター(PE3ドッキングプラスミド)は、上の例におけるように、改変されたpUC19バックボーンを含む。
【０１３２】
図7に示されている、PE3ドッキングプラスミドにおける多重クローニング部位(MCS)は、列挙された順序で以下の逐次的エレメントを含む：
1. 上記の変異されたpUC19ベクターについて5'挿入部位を規定する3つの非可変性かつユニークな一般的な制限部位(例えば、Aat II、Blp I、およびEcoO109 I)、
2. T7プライマー部位、
3. 第一のユニークなHE部位(例えば、I-Sce I(ここでは、順配向で))、
4. クロマチン改変ドメインアクセプターモジュールとして働きうるランダムなヌクレオチド配列(RNAS-CMD-1)に隣接する、非可変性かつユニークな一般的な制限部位の1ペア(例えば、Kpn IおよびAvr II)、
5. プロモーターモジュールの5'部分を規定する非可変性のまれな制限部位の固定された群。プロモーターモジュールの5'末端にピボットとして用いる非可変性のまれな制限部位の例には、好ましくは、AsiS I、Pac 1、およびSfo Iが挙げられるが、Pvu I、AsiS I、およびSgrA Iもまた挙げられうる。
6. プロモーター/イントロンアクセプターモジュールとして働きうるランダムなヌクレオチド配列(RNAS-P)、
7. プロモーター/イントロンモジュールの3'部分と発現モジュールの5'部分の間の共有接合部を規定する非可変性のまれな制限部位の固定された群。プロモーターモジュールの3'末端にピボットとして用いる非可変性のまれな制限部位の例には、好ましくは、Fse 1、Asc I、およびMlu Iが挙げられるが、Pac 1もまた挙げられうる。
8. 発現アクセプターモジュールとして働きうるランダムなヌクレオチド配列(RNAS-E)、
9. 発現モジュールの3'部分と3'制御モジュールの5'部分の接合部を規定する非可変性のまれな制限部位の固定された群(例えば、SnaB I、Not I、およびSal I)。
10. 3'制御ドメインアクセプターモジュールとして働きうるランダムなヌクレオチド配列(RNAS-3)、
11. 3'制御モジュールの3'部分を規定する非可変性のまれな制限部位の固定された群(例えば、Swa I、Rsr II、およびBsiW I)、
12. クロマチン改変ドメインアクセプターモジュールとして働きうるDNAのランダムなヌクレオチド配列(RNAS-CMD-2)に隣接する非可変性かつユニークな一般的な制限部位の1ペア(例えば、Xho IおよびNhe I)、
13. 第二のユニークなHE部位(ここでは、上の項目3におけるもの(I-Sce 1)と同一で、かつまた逆配向での)。しかしながら、その2つのユニークなHE部位がお互いに同一で、かつ逆配向である場合には、好ましくない組換え事象が起こりうることが最近観察された。従って、第一のユニークなHE部位と同一ではない第二のユニークなHE部位を用いることが好ましい可能性がある。
14. 逆配向でのT3プライマー部位、ならびに
15. 上記の変異されたpUC19ベクターについて3'挿入部位を規定する4つの非可変性かつユニークな一般的な制限部位(例えば、BspE I、Pme I、Sap I、およびBspH I)。
【０１３３】
代替の例において、プロモーターモジュールの5'部分(GP1遺伝子ピボット)を規定する非可変性のまれな制限部位の固定された群はAsiS I、Pac I、およびSfo Iを含み；プロモーターモジュールの3'部分および発現モジュールの5'部分(GP2遺伝子ピボット)を規定するまれな制限部位はFse I、Asc I、およびMlu Iを含み；発現モジュールの3'部分および3'制御モジュールの5'部分(GP3遺伝子ピボット)を規定するまれな制限部位はSnaB I、Not I、およびSal Iを含み；ならびに3'制御モジュールの3'部分(GP4遺伝子ピボット)を規定するまれな制限部位はSwa I、Rsr II、およびBsiW Iを含む。
【０１３４】
より具体的な例において、GP1遺伝子ピボットは、AsiS I、Pac I、およびSbf Iの配列からなり、GP2遺伝子ピボットは、Fse I、Asc I、およびMlu Iの配列からなり、GP3遺伝子ピボットは、SnaB I、Not I、およびSal Iの配列からなり、GP4遺伝子ピボットは、Swa I、Rsr II、およびBsiW Iの配列からなる。
【０１３５】
多重遺伝子ドッキングベクター：
図16は、ベクターバックボーンモジュールに隣接するモジュール境界を作り出すために追加の制限部位を包むことを除いて、PE3ドッキングベクターのバックボーンと同一のpUC19バックボーンを含む多重遺伝子ドッキングベクターを示す。これらのバックボーンモジュールは、複製宿主選択(Replication Host Selector)(RHS)遺伝子モジュールおよび複製起点遺伝子モジュール(ORI)を含む。RHSは、ベクターバックボーンピボット(VB)Aat II、複製宿主選択遺伝子をコードするDNA配列、ならびに2つの追加のベクターバックボーンピボットAge IおよびAvr IIにより定義される。図16におけるRHSモジュールは、ベクターバックボーンピボットVB-1＝Aat II、RHSモジュール＝アンピシリン耐性遺伝子、ならびにベクターバックボーンピボットVB-2＝Age IおよびVB-3＝Avr IIにより定義される。ORIは、ベクターバックボーンピボットAge IおよびAvr II、複製起点をコードするDNA配列、ベクターバックボーンピボットPme Iにより定義される。図16におけるORIモジュールは、ベクターバックボーンピボットVB-2＝Age IおよびVB-3＝Avr II、ORIモジュール＝pUC10複製起点、ならびにベクターバックボーンピボットVB-4＝Pme Iにより定義される。
【０１３６】
多重遺伝子ドッキングベクターは、ドメインアクセプター領域の多様なアレイを作製する目的で、ランダムなヌクレオチド配列、ならびに一般的なエンドヌクレアーゼ、まれなエンドヌクレアーゼ、およびホーミングエンドヌクレアーゼの部位を規定する非ランダムなヌクレオチド配列の正確な配置により定義される。これらのモジュールアクセプターは、以下のクラスにより定義される：GHS、BRD、SRS、CMD、(CMD/BRD)、PE3スタッファー、PE3 MCS。これらのモジュールは以下として定義される：
A. GHS＝ゲノム発現宿主選択遺伝子(例：NEOまたはPURO)
B. BRD＝「リコンビニアリングコンピテント」細菌細胞株における相同組換えのための部位として用いられうる非ランダムな核酸配列
C. SRS＝部位特異的リコンビナーゼ遺伝子産物により媒介される部位特異的相同組換えのための部位として用いられうる非ランダムな核酸配列(例：Cre/LoxまたはFlp/Frt)
D. CMD＝宿主ゲノムのクロマチン構造を変えることができる非ランダムな核酸配列(例：HS4ニワトリβグロビンインシュレータ)
E. CMD/BRD＝「リコンビニアリングコンピテント」細菌細胞株における相同組換えのためのDNA配列として働きうるクロマチン改変ドメインをコードする非ランダムな核酸配列
F. PE3スタッファー＝多重遺伝子ドッキングベクター内に存在する、制限部位または任意の他の生物学的機能をコードしないランダムなヌクレオチド配列
G. PE3 MCS＝多重遺伝子ドッキングベクターにユニークである複数の制限部位からなる非ランダムなヌクレオチド配列
【０１３７】
これらのモジュールには、モジュールドッキングベクターを作製するために用いることができる制限部位が隣接している。これらのモジュール関連制限部位は、以下の分類に従って定義できる：
A. VB＝ベクターバックボーンモジュールの境界を規定する制限部位
B. ES＝ゲノム発現宿主選択モジュールの境界を規定する制限部位
C. TX＝特定のまれなおよびホーミングエンドヌクレアーゼの部位に適合性のオーバーハングを生じる合成BstX I部位(例：I-Ceu I、I-Sce I、Sbf I)
D. CM＝クロマチン改変モジュールの境界を規定する制限部位
E. SB＝部位特異的組換えモジュールの境界を規定する制限部位
F. BL＝平滑末端を生じる制限部位
【０１３８】
本発明の一つの態様は、ベクターバックボーンピボットVB-1とVB-5の間に存在するヌクレオチド配列により定義することができ、ここでVB-1＝Aat IIおよびVB-5＝BspE Iである。
1. VB-1はAat IIである
2. 配列なし、またはランダムなヌクレオチド配列
3. ES-1＝SexA I
4. ランダムなヌクレオチド配列スタッファー(またはGHSモジュール)
5. ES-2＝Srf I
6. ランダムなヌクレオチド配列スタッファー(またはBRDモジュール)
7. HE-3＝I-Ppo I
8. ランダムなヌクレオチド配列スタッファー(またはSRSモジュール)
9. 配列なし、またはランダムなヌクレオチド配列スタッファー
10. CM-1＝Kpn I
11. ランダムなヌクレオチド配列(またはCMDモジュール)
12. CM-2＝Sac I
13. 配列なし、またはランダムなヌクレオチド配列スタッファー
14. TX-1＝BstX I(I-Ceu I)順配向
15. ランダムなヌクレオチド配列スタッファー(またはPE3モジュール)
16. TX-2＝BstX I(I-Sce I)逆配向
17. 配列なし、またはランダムなヌクレオチド配列スタッファー
18. CM-3＝Mfe I
19. ランダムなヌクレオチド配列スタッファー(またはCMDモジュール)
20. CM-4＝Sac II
21. 配列なし、またはランダムなヌクレオチド配列スタッファー
22. GP-1＝(AsiS I/Pac I/Sbf I)
23. ランダムなヌクレオチド配列スタッファー(またはPE3モジュール)
24. G-4/CM-5＝(Swa I/Rsr II/BsiW I)
25. ランダムなヌクレオチド配列スタッファー(またはCMDモジュール)
26. CM-6＝Nar I、Kas Iと同じモチーフを有する
27. 配列なし、またはランダムなヌクレオチド配列スタッファー
28. SB-1＝Nsi I、粘着性のオーバーハングがSbf Iに適合性がある
29. 配列なし、またはランダムなヌクレオチド配列スタッファー
30. BL-1＝Sfo I
31. 配列なし、またはランダムなヌクレオチド配列スタッファー
32. BL-2＝Pvu II
33. 配列なし、またはランダムなヌクレオチド配列スタッファー
34. BL-3＝Nru I
35. 配列なし、またはランダムなヌクレオチド配列スタッファー
36. SB-2＝BsrG I、粘着性のオーバーハングがBsiW Iに適合性がある
37. 配列なし、またはランダムなヌクレオチド配列スタッファー
38. CM-7＝Spe I
39. ランダムなヌクレオチド配列スタッファー(またはCMDモジュール)
40. CM-8＝Sph I
41. ランダムなヌクレオチド配列スタッファー(またはSRSモジュール)
42. HE-4＝PI-Sce I(順配向)
43. ランダムなヌクレオチド配列スタッファー(またはBRDモジュール)
44. VB-5＝BspE I
【０１３９】
図17、18、および19は、2つまたはそれ以上のPE3モジュールを有する多重遺伝子ベクターを構築するために、通常のサブクローニング方法を用いて、図16における多重遺伝子ドッキングベクターがどのようにDNAバックボーンとして働きうるかを示す。3つの別個のPE3モジュールで多重遺伝子ベクターを構築するこの例は、ドッキングベクターにPE3アクセプタードメインを作製するために必要とされるピボットが、多重遺伝子ベクターバックボーン内にすでに含まれる任意のPE3モジュールに存在しないと考えられる統計学的確率に基づいて好ましい順序のサブクローニング事象を用いる。
【０１４０】
PE3モジュールを図16に示された多重遺伝子ドッキングベクターへサブクローニングする好ましい順序は以下のとおりである：
1. PE3モジュールを、最初にPE3-2スタッファードメインへサブクローニングするべきであり、このPE3モジュールは、以下の部位の順序づけられた非存在に従って選択されるべきである：
i. Nsi IまたはBsrG I
ii. Sfo I、Pvu II、またはNru I
iii. BstX I
2. 第二PE3モジュールを、次にPE3-3ドメインへサブクローニングするべきであり、このPE3モジュールは、以下の部位の順序づけられた非存在に従って選択されるべきである：
iv. Sbf IまたはBsiW I
v. Sbf Iのみ
vi. BsiW I
vii. BstX I
3. 第三PE3モジュールをPE3-1ドメインへサブクローニングするべきである。
【０１４１】
項目1に列挙された基準を満たすPE3モジュールを、2つの制限酵素で消化することによりベクターバックボーンおよびPE3モジュールを独立して調製することにより、多重遺伝子ドッキングベクターへサブクローニングすることができ、1つの酵素はGP-1ドメインにおける単一の制限部位を認識し、第二の酵素はGP-4ドメインにおける単一の制限部位を認識する。選択された酵素は、PE3モジュール内で切断してはならない。この過程の例が、図17に示されている。図17におけるPE3-AモジュールをPE3-2スタッファードメインへサブクローニングする一つの方法は、多重遺伝子ドッキングベクターを酵素AsiS IおよびRsr IIで切断することにより生じる線状化ベクターバックボーンの調製を必要とする。この分子生物学プロトコールは、AsiS I特異的およびRsr II特異的な粘着性のオーバーハングを有するDNAドッキング点を生じる。所望のPE3-Aモジュールを含む線状DNA断片もまた、AsiS IおよびRsr IIで消化することにより調製できる。結果として生じたベクターバックボーンおよびPE3-Aモジュールを、DNAリガーゼ酵素を用いて生化学的に結合して、PE3-Aモジュールを含む多重遺伝子ベクターを生成させることができる。
【０１４２】
図18は、項目2における基準を満たすPE3モジュールを、PE3-Aモジュールを含む多重遺伝子ドッキングベクターへPE3-3多重クローニング部位(PE3-3 MCS)においてサブクローニングしうる一つの方法を紹介している。この例において、PE3-Aモジュールは、Nsi I部位またはBsrG I部位(図16において、それぞれ、SB-1およびSB-2と名付けられている)をいずれも含まず、PE3-BモジュールはSbf I部位またはBsiW I部位を含まない。図18に描かれているように、線状化PE3-Bモジュールは、PE3-BモジュールベクターをSbf IおよびBsiW Iで消化することにより生成される。線状化多重遺伝子ベクターバックボーンは、Nsi IおよびBsrG Iで消化することにより調製される。PE3-Bモジュールおよび多重遺伝子ベクターバックボーンにおける相補的な粘着性付着末端は、DNAリガーゼ酵素を用いて生化学的に結合されうる。結果として生じるDNA分子は、PE3-AおよびPE3-Bモジュールが今やDNA分子の連続した部分となっている多重遺伝子ベクターからなる。
【０１４３】
図18は、多重遺伝子ドッキングベクターのPE3-3スタッファードメインへPE3モジュールをサブクローニングする多数のストラテジーの1つのみを表す。他のサブクローニングストラテジーは、線状化PE3モジュール、および粘着/平滑、平滑/粘着、または平滑/平滑ドッキング点を示す線状化多重遺伝子ドッキングベクターの作製を含む。これらの代替のサブクローニングストラテジーは、粘着/粘着ストラテジーより、ライゲーション産物を生じるのに、より低い成功率を示すことが予測される。これらの代替のストラテジーは、PE3-AまたはPE3-Bのいずれかのモジュールの構造が項目2に列挙された基準の1つまたは複数に合わない場合に選択される可能性がある。
【０１４４】
図19は、PE3-Cモジュールを、どのようにしてPE3-AおよびPE3-Bモジュールを含む多重遺伝子ベクターへサブクローニングできるかを図示している。このストラテジーでは、PE3-AもPE3-BもBstX I部位を含まない必要がある。このストラテジーにおいて、多重遺伝子ドッキングベクターは、BstX Iで消化することにより線状化される。PE3-Cモジュールは、ホーミングエンドヌクレアーゼI-Ceu IおよびI-Sce Iで消化することにより線状化される。結果として生じる線状PE3-Cモジュールおよび多重遺伝子ドッキングベクターは、DNAリガーゼ酵素を用いて生化学的に結合される。結果として生じるDNA分子は、PE3-A、PE3-B、およびPE3-Cモジュールが今やDNA分子の連続した部分となっている多重遺伝子ベクターからなる。
【０１４５】
図21は、クロマチン改変ドメイン(CMD)かまたは細菌リコンビニアリングドメイン(BRD)のいずれかが隣接しているPE3モジュールを、どのようにして、細菌リコンビニアリング方法を用いて多重遺伝子ドッキングベクターへ導入できるかを図示している。この例において、PE3モジュールは、PE3モジュールベクターにおけるPE3モジュールおよび多重遺伝子ドッキングベクターにおけるPE3-1スタッファードメインの両方に隣接するCMD/BRDドメイン間で、相同組換えの作用を通してPE3-1スタッファードメインを置換する。このストラテジーには、組換え酵素の発現を環境変化(化学的、温度、または代謝的)により誘導できる補助的なDNAベクターまたは特別な細菌株の使用が必要である。
【０１４６】
図16に示されている本発明のもう一つの態様は、ベクターバックボーンピボットVB-1およびVB-5の間に存在するヌクレオチド配列により定義することができ、ここで、VB-1＝Aat IIおよびVB-5＝BspE Iである。
1. VB-1はAat IIである
2. 配列なし、またはランダムなヌクレオチド配列
3. ES-1＝SexA I
4. ランダムなヌクレオチド配列スタッファー(またはGHSモジュール)
5. ES-2＝Srf I
6. ランダムなヌクレオチド配列スタッファー(またはBRDモジュール)
7. HE-3＝I-Ppo I
8. ランダムなヌクレオチド配列スタッファー(またはSRSモジュール)
9. 配列なし、またはランダムなヌクレオチド配列スタッファー
10. CM-1＝Kpn I
11. ランダムなヌクレオチド配列(またはCMDモジュール)
12. CM-2＝Sac I
13. 配列なし、またはランダムなヌクレオチド配列スタッファー
14. HE-1＝I-Ceu I順配向
15. ランダムなヌクレオチド配列スタッファー(またはPE3モジュール)
16. HE-2＝I-Sce I逆配向
17. 配列なし、またはランダムなヌクレオチド配列スタッファー
18. CM-3＝Mfe I
19. ランダムなヌクレオチド配列スタッファー(またはCMDモジュール)
20. CM-4＝Sac II
21. 配列なし、またはランダムなヌクレオチド配列スタッファー
22. GP-1＝(AsiS I/Pac I/Sbf I)
23. ランダムなヌクレオチド配列スタッファー(またはPE3モジュール)
24. G-4/CM-5＝(Swa I/Rsr II/BsiW I)
25. ランダムなヌクレオチド配列スタッファー(またはCMDモジュール)
26. CM-6＝Nar I、Kas Iと同じモチーフを有する
27. 配列なし、またはランダムなヌクレオチド配列スタッファー
28. TX-1＝BstX I(I-Ceu I)順配向
29. SB-1＝Nsi I、粘着性のオーバーハングがSbf Iに適合性がある
30. 配列なし、またはランダムなヌクレオチド配列スタッファー
31. BL-1＝Sfo I
32. 配列なし、またはランダムなヌクレオチド配列スタッファー
33. BL-2＝Pvu II
34. 配列なし、またはランダムなヌクレオチド配列スタッファー
35. BL-3＝Nru I
36. 配列なし、またはランダムなヌクレオチド配列スタッファー
37. SB-2＝BsrG I、粘着性のオーバーハングがBsiW Iに適合性がある
38. 配列なし、またはランダムなヌクレオチド配列スタッファー
39. TX-2＝BstX I(I-Sce I)逆配向
40. 配列なし、またはランダムなヌクレオチド配列スタッファー
41. CM-7＝Spe I
42. ランダムなヌクレオチド配列スタッファー(またはCMDモジュール)
43. CM-8＝Sph I
44. ランダムなヌクレオチド配列スタッファー(またはSRSモジュール)
45. HE-4＝PI-Sce I(順配向)
46. ランダムなヌクレオチド配列スタッファー(またはBRDモジュール)
47. VB-5＝BspE I
【０１４７】
図20は、どのようにしてホーミングエンドヌクレアーゼを用いて、PE3モジュールを上記の多重遺伝子ドッキングベクターへ導入できるかを図示する。この例において、PE3モジュールおよび多重遺伝子ドッキングベクターは、ホーミングエンドヌクレアーゼI-Ceu IおよびI-Sce Iで消化することにより線状化される。結果として生じる線状PE3モジュールを、DNAリガーゼ酵素を用いて生化学的に線状多重遺伝子ドッキングベクターへ結合できる。このサブクローニングストラテジーは、多重遺伝子ドッキングベクター内の、またはドッキングベクターへ導入されることになっているPE3モジュールが、項目1〜3に列挙された基準の1つまたは複数に合わない場合に用いることができる。
【０１４８】
図8に示された多重遺伝子ドッキングベクター(一次ドッキングプラスミド)は、最初にPE3ドッキングステーションプラスミドにおいて構築される2つの完成したPE3トランスジーン、もしくは遺伝子ターゲティングトランスジーンを構築するために必要とされる2つの相同性アームを組み立てるために、または2つの型の陽性もしくは陰性選択エレメントを導入するために、用いることができる。
【０１４９】
多重遺伝子(または一次)ドッキングプラスミドの多重クローニング部位(MCS)の非限定的例は図9に示されており、以下の逐次的エレメントを列挙された順序で含む：
1. 上記の変異されたpUC19ベクターについて5'挿入部位を規定する2つの非可変性かつユニークな一般的な制限部位(例えば、Aat IIおよびBlp I)、
2. M13リバースプライマー部位、
3. ゲノム発現宿主選択遺伝子アクセプターモジュールとして働きうるDNAのランダムなヌクレオチド配列(RNAS-GEH-S1)に隣接する、反対の配向のユニークなHE部位の1ペア(例えば、PI-Sce I(順配向)およびPI-Sce I(逆配向))、
4. HEペアの下流のシャトルベクターモジュールのクローニングを可能にする非可変性かつユニークな一般的な制限部位(例えば、Eco0109 I)、
5. 左組換えアームモジュールの5'部分を規定する、非可変性のまれな制限部位の固定された群(例えば、SgrA IおよびAsiS I)、
6. 左組換えアームアクセプターモジュールとして働きうるランダムなヌクレオチド配列(RNAS-LRA)、
7. 左組換えアームアクセプターモジュールの3'部分を規定する、非可変性のまれな制限部位の固定された群(例えば、Pac I、Mlu I、およびAsc I)、
8. ユニークなHE部位(例えば、I-Ceu I(順配向))、
9. クロマチン改変ドメインアクセプターモジュールとして働きうるDNAのランダムなヌクレオチド配列(RNAS-CMD-1)に隣接する、非可変性かつユニークな一般的な制限部位の1ペア(例えば、Kpn IおよびAvr II)、
10. T7プライマー部位、
11. 複雑なトランスジーンアクセプターモジュールとして働きうるDNAのランダムなヌクレオチド配列(RNAS-PE3-1)に隣接する、反対の配向のユニークなBstX I部位の1ペア(BstX I制限部位における可変性ヌクレオチド領域は、逆相補的配向で配置された2つの同一のHE制限部位、例えば、PI-Sce I(順配向)およびPI-Sce I(逆配向)の整列により生じた非相補的テールと同一のヌクレオチドにより定義される)、
12. 複雑なトランスジーンアクセプターモジュールとして働きうるDNAのランダムなヌクレオチド配列(RNAS-PE3-2)に隣接する、反対の配向のユニークなHE部位の1ペア(例えば、I-Sce I(順配向)およびI-Sce I(逆配向))、
13. 逆配向でのT3プライマー部位
14. クロマチン改変ドメインアクセプターモジュールとして働きうるDNAのランダムなヌクレオチド配列(RNAS-CMD-2)に隣接する、非可変性かつユニークな一般的な制限部位の1ペア(例えば、Xho IおよびNhe I)、
15. ユニークなHE部位(ここでは、上の項目8におけるもの(I-Sce 1)と同一で、かつまた逆配向の)、
16. 右組換えアームモジュールの5'部分を規定する、非可変性のまれな制限部位の固定された群(例えば、SnaB I、Sal IおよびNot I)、
17. 右組換えアームアクセプターモジュールとして働きうるランダムなヌクレオチド配列(RNAS-RRA)、
18. 右組換えアームアクセプターモジュールの3'部分を規定する、非可変性のまれな制限部位の固定された群(例えば、Rsr II、Swa I、およびBsiW I)、
19. HEペアの上流のシャトルベクターモジュールのクローニングを可能にする非可変性かつユニークな一般的な制限部位(例えば、BspE I)、
20. ゲノム発現宿主選択遺伝子アクセプターモジュールとして働きうるDNAのランダムなヌクレオチド配列(RNAS-GEH-S2)に隣接する、反対の配向のユニークなHE部位の1ペア(例えば、PI-Psp I(順配向)およびPI-Psp I(逆配向))、
21. 逆配向に置かれたM13フォワードプライマー部位、
22. 上記の変異されたpUC19ベクターについて3'挿入部位を規定する3つの非可変性かつユニークな一般的な制限部位(例えば、Pme I、Sap I、およびBspH I)。
【０１５０】
本発明を実施する方法の例として、以下のこれらのエレメントを含むトランスジーンが構築されうる：
1. サーファクタントタンパク質C(SP-C)についてのヒトプロモーターのヌクレオチド配列、
2. マウス遺伝子顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体β-c(GMRβc)のタンパク質産物をコードする配列、
3. ウサギβグロビンイントロン配列、および
4. SV40ポリAシグナル。
【０１５１】
SP-C配列は内部のBamH 1部位を含み、Not 1およびEcoR 1のみを用いてその親のプラスミドから遊離できる。GMRβcは、内部のNot 1部位を有し、BamH 1およびXho 1を用いてその親のプラスミドから切断できる。ウサギβグロビンイントロン配列は、EcoR 1を用いてその親のプラスミドから切り出せる。SV-40ポリAテールはXho 1およびSac 1を用いてその親のプラスミドから切断できる。数個の制限部位の重複性のため、親のプラスミドのいずれも、すべての必要なフラグメントを組み立てるために用いることはできない。
【０１５２】
本発明のPE3ドッキングプラスミドにおいて所望のトランスジーンを構築するために用いられる段階は以下のとおりである：
1. Not 1およびPspOM 1は適合性の付着末端を生じるため、ヒトSP-Cプロモーター配列を、Not 1およびEcoR 1で切除し、シャトルベクターPのPspOM 1およびEcoR 1部位へクローニングする。この反応の産物はpSVP-SPCと呼ばれる。
2. 当業者に周知の増殖および回収段階の後、ウサギβグロビンイントロン配列を、pSVP-SPCのEcoR 1部位へクローニングする。結果として生じる中間構築物におけるイントロンの配向を、pSVP-SPC-rβGと呼ばれる産物をシーケンシングすることにより検証する。
3. プロモーターおよびイントロンを、AsiS 1およびAsc 1を用いてpSVP-SPC-rβGからの1つの連続したフラグメントとして切除および単離する。同時に、PE3ドッキングプラスミドを、プロモーター/イントロンセグメントとのライゲーションに備えて、AsiS 1およびAsc 1で切断する。プロモーター/イントロンフラグメントを、ドッキングプラスミドへライゲーションし、増殖、回収する。
4. GMRβcフラグメントのXho 1部位を、当業者に周知の技術を用いて、平滑3'末端を生じるように埋める。次いで、それを、pSVP-SPC-rβGのBamH 1部位および平滑末端化Pvu2部位へクローニングする。結果として生じるプラスミド(pDP-SPC-GMRβc-rβG)を増殖し、回収する。
5. 最終クローニング段階は、SV-40ポリAテールの付加である。SV40-ポリAフラグメントを、レシピエントベクターがpDS1-SPC-GMRβc-rbβGであるため、Xho 1およびSac 1で切断する。両方のDNA断片をゲル精製し、回収する。ライゲーション混合物は、SV-40ポリA対pDS1-SPC-GMRβc-rβGを10:1モル比で調製する。ライゲーション産物を増殖し、収集する。
【０１５３】
新規のプラスミド、pDS1-SPC-GMRβc-rβG-pAは、pDS1-SPC-GMRβc-rβG-pAプラスミド全体を、真核細胞へのトランスフェクションまたは受精卵の前核へのマイクロインジェクションのために線状化できる、3'末端のユニークな制限部位を含む、トランスジーンに必要とされる全エレメントを含む。
【０１５４】
それぞれ少なくとも1つのHE制限酵素により切断できる、HE部位、典型的には少なくとも2つのHE制限部位に関して、自己アニールできない遺伝子カセットアクセプター部位を生成する目的で、モジュラー領域に隣接して置かれる。さらに、必要に応じて、お互いに反対の配向でこれらのHE部位を配置することは、必要とされるわけではないが、可能である。すなわち、HE部位は非対称かつ非パリンドロームであるため、2つのHE制限部位を反対の配向に配置することにより、非相補的な突出3'付着テールを生成することが可能である。例えば、HE I-Sce Iは、「/」によって示されているように、その同族制限部位を切断する：
2009508533.tif 000010
【０１５５】
MCS内の第二部位の逆配置は、2つの非相補的付着突出テールを生じる：
2009508533.tif 000011
【０１５６】
これは、ベクターに大きなトランスジーンを組み入れることが望まれる場合、特に有用である。挿入断片の大きなサイズのために、ベクターが大きな挿入断片を受け入れるよりむしろ自己アニールする方が熱力学的により有利である。HE制限部位の配置により生じた非相補的テールの存在は、自己ライゲーションについての熱力学的傾向に対抗する好ましい化学力を提供する。
【０１５７】
さらに、たいていのHE突出テールの非対称性性質もまた、BstX I制限酵素部位(5'CCANNNNN/NTGG3')と組み合わせて用いられる場合、強力なクローニングツールを生み出す。BstX Iの配列的中立ドメイン(「N」は任意のヌクレオチドでありうる)を用いて、自己アニーリングを排除すると同時に、2つの逆配向性HE突出テールについて適合性付着末端を生じることができる。
2009508533.tif 000012
【０１５８】
これらのリストに含まれない他のエンドヌクレアーゼもまた、同じ機能性ならびに本発明の真意および意図を維持して、用いることができる。
【０１５９】
本発明の多くの利点の中で、典型的にはプロモーターモジュール、発現モジュール、および3'制御モジュールを含む、トランスジーンを非常に短い時間で迅速に組み立てることができ、加えて、迅速かつ容易に、新しく組み立てられたトランスジーンを変更または再設計できることが容易に認識できる。組み立てられたトランスジーンを公知の方法を用いて変更するための従来の努力は、通常、1年またはそれ以上の実験期間がかかると思われる。本発明の方法を用いて、数日または数週間以内に所望のトランスジーンを作製することができ、その後、それぞれの所望の試験を行い、それにより研究者の重要な時間および費用を節約できる。もともと、デノボ合成、リコンビニアリング、およびPCRターミネーターオーバーハングクローニング方法により作製されたシャトルが、採用されて、これらのあらかじめ作製されたエレメントを多数のトランスジーンへと迅速に組み立てるために本発明のドッキング点テクロノジーと共に用いられうる。本発明を用いて作製されたPE3トランスジーンは、単一の生物体において、または細菌、酵母、マウス、および他の真核生物を含む様々な生物体において、ほとんどさらなる改変を加えずに、用いることができる。
【０１６０】
本発明はその態様の説明により例示されており、かつ態様はかなり詳細に記載されているが、添付された特許請求の範囲の範囲をそのような詳細に制限する、または多少なりとも限定することは意図されない。追加の利点および改変は、当業者にとって容易に明らかであると思われる。そのより広い局面における本発明は、それゆえに、示された、および記載された、特定の詳細、代表的な方法および構造、ならびに図示された実施例に限定されない。従って、主張されている本発明の範囲から外れることなく、そのような詳細からの逸脱がなされうる。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
本明細書に組み入れられ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明の態様を図示し、上で与えられた本発明の一般的な説明および詳細な説明と共に、本発明の原理を説明する役割を果たす。
【図１】遺伝子モジュールにおけるクローニングのための多重クローニング部位を含むドメインモジュールドッキングベクターの概略図である。
【図２】ドメインモジュールにおけるクローニングのためのドメインクローニングモジュールを含むPE3ドッキングベクターの概略図である。
【図３】遺伝子モジュールにおけるクローニングのための多重クローニング部位を含むPE3多重クローニングドッキングベクターの代替の態様の概略図である。
【図４】PE3ベクターにおけるクローニングのための手段を含む多重遺伝子ベクターの概略図である。
【図５】本発明のモジュール概念のもう一つの概略図である。
【図６】ドッキングプラスミドマップである。
【図７】ドッキングプラスミドMCSに含まれうる制限酵素部位の例を示す線形制限マップである。
【図８】多重遺伝子(または一次)ドッキングプラスミドマップである。
【図９】多重遺伝子ドッキングプラスミドMCSに含まれうる制限酵素部位の例を示す線形制限マップである。
【図１０】シャトルベクターP(「SVP」)プラスミドマップである。
【図１１】シャトルベクターP MCSに含まれうる制限酵素部位の例を示す線形制限部位マップである。
【図１２】シャトルベクターE(「SVE」)プラスミドマップである。
【図１３】シャトルベクターE MCSに含まれうる制限酵素部位の例を示す線形制限部位マップである。
【図１４】シャトルベクター3'(「SV3」)マップである。
【図１５】シャトルベクター3' MCSに含まれうる制限酵素部位の例を示す線形制限部位マップである。
【図１６】本発明に従って作製され、PE3モジュールと共に用いられる多重遺伝子ドッキングベクターの概略図である。
【図１７】PE3モジュールを含む多重遺伝子ベクターを提供するための、遺伝子ピボットを用いる、PE3モジュールの多重遺伝子ドッキングベクターへの挿入の概略図である。
【図１８】多重遺伝子ベクターにおける多重クローニング部位を用いる、PE3モジュールの多重遺伝子ドッキングベクターへの挿入の概略図である。
【図１９】多重遺伝子ベクターにおけるBstX 1制限部位を用いる、PE3モジュールの多重遺伝子ドッキングベクターへの挿入の概略図である。
【図２０】多重遺伝子ベクターにおけるホーミングエンドヌクレアーゼを用いる、PE3モジュールの多重遺伝子ドッキングベクターへの挿入の概略図である。
【図２１】PE3ベクターと多重遺伝子ベクターの間のリコンビニアリングを用いる、PE3モジュールの多重遺伝子ドッキングベクターへの挿入の概略図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１６２】
本明細書に組み入れられ、本明細書の一部を構成する添付の配列リストは、本発明の態様を図示し、上で与えられた一般的な説明および詳細な説明と共に、本発明の原理を説明する役割を果たす。
SEQ:ID 01
PE3ドッキングプラスミドMCSについてのヌクレオチド配列の例である。
SEQ:ID 02
PE3ドッキングプラスミドについてのヌクレオチド配列の例である。
SEQ:ID 03
一次ドッキングプラスミドMCSについてのヌクレオチド配列の例である。
SEQ:ID 04
一次ドッキングプラスミドについてのヌクレオチド配列の例である。
SEQ:ID 05
シャトルベクターPプラスミドMCSについてのヌクレオチド配列の例である。
SEQ:ID 06
シャトルベクターPプラスミドについてのヌクレオチド配列の例である。
SEQ:ID 07
シャトルベクターEプラスミドMCSについてのヌクレオチド配列の例である。
SEQ:ID 08
シャトルベクターEプラスミドについてのヌクレオチド配列の例である。
SEQ:ID 09
シャトルベクター3プラスミドMCSについてのヌクレオチド配列の例である。
SEQ:ID 10
シャトルベクター3プラスミドについてのヌクレオチド配列の例である。
【図１】
2009508533.tif 000014
【図２】
2009508533.tif 000015
【図３】
2009508533.tif 000016
【図４】
2009508533.tif 000017
【図５】
2009508533.tif 000018
【図６】
2009508533.tif 000019
【図７】
2009508533.tif 000020
【図８】
2009508533.tif 000021
【図９】
2009508533.tif 000022
【図１０】
2009508533.tif 000023
【図１１】
2009508533.tif 000024
【図１２】
2009508533.tif 000025
【図１３】
2009508533.tif 000026
【図１４】
2009508533.tif 000027
【図１５】
2009508533.tif 000028
【図１６】
2009508533.tif 000029
【図１７】
2009508533.tif 000030
【図１８】
2009508533.tif 000031
【図１９】
2009508533.tif 000032
【図２０】
2009508533.tif 000033
【図２１】
2009508533.tif 000034
【配列表】
2009508533000001.app
【国際調査報告】
2009508533.tif 000035