(57)【要約】本発明は、ウイルス核酸のセグメントの増幅およびその後の分子量分析によって、インフルエンザウイルス科のメンバーであるウイルスを迅速に同定するための、オリゴヌクレオチドプライマー、それらを含む組成物およびキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマー対の各プライマーメンバーが独立して20〜35核酸塩基長であり、フォワードプライマーがSEQ ID NO: 125と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を含み、リバースプライマーがSEQ ID NO: 126と少なくとも70％の配列同一性を含む、オリゴヌクレオチドプライマー対。
【請求項２】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方が少なくとも一つの修飾核酸塩基を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
修飾核酸塩基が質量修飾核酸塩基である、請求項2記載の組成物。
【請求項４】
質量修飾核酸塩基が5-ヨード-Cである、請求項3記載の組成物。
【請求項５】
修飾核酸塩基がユニバーサル核酸塩基である、請求項2記載の組成物。
【請求項６】
ユニバーサル核酸塩基がイノシンである、請求項5記載の組成物。
【請求項７】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方の5'末端の非鋳型T残基が除去されている、請求項1記載の組成物。
【請求項８】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方が少なくとも一つの分子量修飾タグを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項９】
請求項1記載の組成物を含むキット。
【請求項１０】
一つまたは複数のプライマー対がインフルエンザA型ウイルスのNUC遺伝子を標的化するよう設計されており、一つまたは複数のプライマー対がインフルエンザA型のM1遺伝子を標的化するよう設計されており、一つまたは複数のプライマー対がインフルエンザA型のPA遺伝子を標的化するよう設計されており、一つまたは複数のプライマー対がインフルエンザA型のNSI遺伝子を標的化するよう設計されており、一つまたは複数のプライマー対がインフルエンザA型のNS2遺伝子を標的化するよう設計されており、一つまたは複数のプライマー対がインフルエンザB型のPB2遺伝子を標的化するよう設計されており、一つまたは複数のプライマー対がインフルエンザB型のNUC遺伝子を標的化するよう設計されている、複数のプライマー対を含み、かつ複数のプライマー対がオルソミクソウイルス（orthomyxoviridae）科の一つまたは複数の病原体（bioagent）の属、種、亜種、および遺伝子型を同定する単位複製配列を生成する、請求項9記載のキット。
【請求項１１】
インフルエンザA型ウイルスのNUC遺伝子を標的化するよう設計された一つまたは複数のプライマー対がSEQ ID NO: 15:16を含み、インフルエンザA型のM1遺伝子を標的化するよう設計された一つまたは複数のプライマー対がSEQ ID NO: 39:40を含み、インフルエンザA型のPA遺伝子を標的化するよう設計された一つまたは複数のプライマー対がSEQ ID NO: 55:56を含み、インフルエンザA型のNSI遺伝子を標的化するよう設計された一つまたは複数のプライマー対がSEQ ID NO: 119:120を含み、インフルエンザA型のNS2遺伝子を標的化するよう設計された一つまたは複数のプライマー対がSEQ ID NO: 123:124を含み、インフルエンザB型のPB2遺伝子を標的化するよう設計された一つまたは複数のプライマー対がSEQ ID NO: 31:32を含む、請求項10記載のキット。
【請求項１２】
14〜35核酸塩基の長さであり、かつSEQ ID NO: 39:40、15:16、55:56、5:6、31:32、123:124、119:120、1:2、3:4、7:8、9:10、11:12、13:14、17:18、19:20、21:22、23:24、25:26、27:28、29:30、33:34、35:36、37:38、41:42、43:44、45:46、47:48、49:50、51:52、53:54、59:60、61:62、63:64、65:66、67:68、69:70、71:72、73:74、75:76、125:78、79:80、81:82、83:84、83:86、83:88、83:90、83:92、93:84、93:86、93:88、99:92、99:90、103:84、103:86、103:88、103:92、103:90、113:114、115:116、117:118、123:120、123:124、125:126、127:126、127:130、131:132、133:134、135:136により示されるプライマー対の群の任意のメンバーと70％〜100％の配列同一性を有する、一つまたは複数のプライマー対をさらに含む、請求項10記載のキット。
【請求項１３】
少なくとも一つの病原体を含む疑いのある試料を得る工程；
単位複製配列を得るために、請求項1記載の組成物を用いてインフルエンザウイルス由来の核酸を増幅する工程；
質量分析計を用いて単位複製配列の分子量を決定する工程；
分子量から単位複製配列の塩基組成を算出する工程；および
該分子量または塩基組成を、既知のインフルエンザウイルス病原体およびプライマー対に対する指標である複数の分子量または塩基組成と比較する工程、
を含み、該分子量または塩基組成と複数のメンバーの分子量または塩基組成が一致することにより未知のインフルエンザウイルスが同定される、インフルエンザウイルスの同定方法。
【請求項１４】
少なくとも一つの病原体を含む疑いのある試料を得る工程；
単位複製配列を得るために、請求項1記載の組成物を用いて試料由来の核酸を増幅する工程；
質量分析計を用いて単位複製配列の分子量を決定する工程；
分子量から単位複製配列の塩基組成を算出する工程；および
単位複製配列の分子量または塩基組成を、既知の病原体およびプライマー対に対する指標である分子量または塩基組成のコレクションと比較する工程、
を含み、測定された分子量または算出された塩基組成とコレクション中の分子量または塩基組成の一つが一致することが、試料中にインフルエンザウイルスが存在することを示す、試料中のインフルエンザウイルスの存在または非存在を決定する方法。
【請求項１５】
試料中の未知の病原体を同定するためのプライマー対であって、プライマー対がフォワードプライマーメンバーおよびリバースプライマーメンバーを含み、プライマー対のメンバーはさらにオルソミクソウイルス科に属する二つまたはそれ以上の病原体の遺伝子配列に十分相補的な配列を独立して含み、プライマー対のメンバーの配列は、二つまたはそれ以上の病原体の保存された結合領域および隣接する可変領域にハイブリダイズすることによって二つまたはそれ以上の病原体の各々から単位複製配列を生成するよう設計されており、単位複製配列は分子量測定値の生成に関しておよび二つまたはそれ以上の病原体の各々に対応する塩基組成シグネチャーの算出に関して質量分析計と適合性がある、プライマー対。
【請求項１６】
プライマー対が、遺伝子の保存された結合配列であるPB1、NUC、M1、PA、NS1、NS2、またはPB2とハイブリダイズする、請求項15記載のプライマー対。
【請求項１７】
プライマーとハイブリダイズする二つまたはそれ以上の病原体が、インフルエンザウイルスA属のメンバー、インフルエンザウイルスB属のメンバー、インフルエンザウイルスC属のメンバー、インフルエンザA型ウイルス種のメンバー、インフルエンザB型ウイルス種のメンバー、またはこれらの組み合わせを含む、請求項15記載のプライマー対。
【請求項１８】
プライマー対が生成する単位複製配列が、連続する45核酸塩基長から連続する200核酸塩基長の間である、請求項15記載のプライマー対。
【請求項１９】
プライマー対が生成する単位複製配列の長さが、連続する45核酸塩基長から連続する200核酸塩基長の間である、請求項16記載のプライマー対。
【請求項２０】
単位複製配列が二つまたはそれ以上の病原体のPB1遺伝子から生成され、単位複製配列の塩基組成が病原体の少なくとも一つをインフルエンザウイルスであると同定する、請求項16記載のプライマー対。
【請求項２１】
SEQ ID NO: 125と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するフォワードプライマーを有し、かつSEQ ID NO: 126と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するリバースプライマーを有する、請求項20記載のプライマー対。
【請求項２２】
単位複製配列が二つまたはそれ以上の病原体のNUC、M1、PA、NS1、またはNS2遺伝子から生成され、単位複製配列の塩基組成が病原体の少なくとも一つをインフルエンザA型ウイルスであると同定する、請求項16記載のプライマー対。
【請求項２３】
SEQ ID NO: 39と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するフォワードプライマーを有し、かつSEQ ID NO: 40と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するリバースプライマーを有する、請求項22記載のプライマー対。
【請求項２４】
SEQ ID NO: 15と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するフォワードプライマーを有し、かつSEQ ID NO: 16と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するリバースプライマーを有する、請求項22記載のプライマー対。
【請求項２５】
SEQ ID NO: 55と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するフォワードプライマーを有し、かつSEQ ID NO: 56と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するリバースプライマーを有する、請求項22記載のプライマー対。
【請求項２６】
SEQ ID NO: 123と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するフォワードプライマーを有し、かつSEQ ID NO: 124と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するリバースプライマーを有する、請求項22記載のプライマー対。
【請求項２７】
SEQ ID NO: 19と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するフォワードプライマーを有し、かつSEQ ID NO: 20と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するリバースプライマーを有する、請求項22記載のプライマー対。
【請求項２８】
単位複製配列が、二つもしくはそれ以上の病原体のPB2またはNUC遺伝子から生成され、単位複製配列の塩基組成が病原体の少なくとも一つをインフルエンザB型ウイルスであると同定する、請求項16記載のプライマー対。
【請求項２９】
SEQ ID NO: 5と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するフォワードプライマーを有し、かつSEQ ID NO: 6と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するリバースプライマーを有する、請求項28記載のプライマー対。
【請求項３０】
SEQ ID NO: 31と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するフォワードプライマーを有し、かつSEQ ID NO: 32と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するリバースプライマーを有する、請求項28記載のプライマー対。
【請求項３１】
プライマー対のメンバーのいずれかまたは両方が少なくとも一つの修飾核酸塩基を含む、請求項15記載のプライマー対。
【請求項３２】
修飾核酸塩基が質量修飾核酸塩基またはユニバーサル核酸塩基である、請求項31記載のプライマー対。
【請求項３３】
ユニバーサル核酸塩基がイノシンである、請求項32記載のプライマー対。
【請求項３４】
質量修飾核酸塩基が5-ヨード-Cである、請求項32記載のプライマー対。
【請求項３５】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方の5'末端に、非鋳型T残基が付加されている、請求項15記載のプライマー対。
【請求項３６】
未知の病原体をオルソミクソウイルス科のメンバーであると同定する塩基組成シグネチャーであって、該塩基組成シグネチャーが単位複製配列の質量分析計による分子量測定から算出され、単位複製配列がオルソミクソウイルス科の二つまたはそれ以上のメンバー由来の遺伝子配列の保存された領域および隣接する可変領域とハイブリダイズして二つまたはそれ以上の病原体の各々について複数の単位複製配列を生成するプライマーメンバーを含むプライマー対を用いて生成される、塩基組成シグネチャー。
【請求項３７】
未知の病原体がインフルエンザウイルスであると同定される、請求項36記載の塩基組成シグネチャー。
【請求項３８】
単位複製配列がPB1遺伝子のセグメントである、請求項37記載の塩基組成シグネチャー。
【請求項３９】
プライマー対のプライマーメンバーが、SEQ ID NO: 125と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するフォワードプライマー配列、およびSEQ ID NO: 126と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するリバースプライマーを含む、請求項38記載の塩基組成シグネチャー。
【請求項４０】
未知の病原体がインフルエンザA型ウイルスであると同定される、請求項36記載の塩基組成シグネチャー。
【請求項４１】
単位複製配列が、NUC遺伝子のセグメント、M1遺伝子のセグメント、PA遺伝子のセグメント、NS1遺伝子のセグメント、またはNS2遺伝子のセグメントである、請求項40記載の塩基組成シグネチャー。
【請求項４２】
プライマー対のプライマーメンバーが、SEQ ID NO: 39と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するフォワードプライマー配列、およびSEQ ID NO: 40と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するリバースプライマーを含む、請求項41記載の塩基組成シグネチャー。
【請求項４３】
プライマー対のプライマーメンバーが、SEQ ID NO: 15と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するフォワードプライマー配列、およびSEQ ID NO: 16と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するリバースプライマーを含む、請求項41記載の塩基組成シグネチャー。
【請求項４４】
プライマー対のプライマーメンバーが、SEQ ID NO: 55と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するフォワードプライマー配列、およびSEQ ID NO: 56と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するリバースプライマーを含む、請求項41記載の塩基組成シグネチャー。
【請求項４５】
プライマー対のプライマーメンバーが、SEQ ID NO: 123と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するフォワードプライマー配列、およびSEQ ID NO: 124と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するリバースプライマーを含む、請求項41記載の塩基組成シグネチャー。
【請求項４６】
プライマー対のプライマーメンバーが、SEQ ID NO: 119と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するフォワードプライマー配列、およびSEQ ID NO: 120と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するリバースプライマーを含む、請求項41記載の塩基組成シグネチャー。
【請求項４７】
未知の病原体がインフルエンザB型ウイルスであると同定される、請求項36記載の塩基組成シグネチャー。
【請求項４８】
単位複製配列がNUC遺伝子のセグメントまたはPB2遺伝子のセグメントである、請求項47記載の塩基組成シグネチャー。
【請求項４９】
プライマー対のプライマーメンバーが、SEQ ID NO: 5と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するフォワードプライマー配列、およびSEQ ID NO: 6と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するリバースプライマーを含む、請求項48記載の塩基組成シグネチャー。
【請求項５０】
プライマー対のプライマーメンバーが、SEQ ID NO: 31と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するフォワードプライマー配列、およびSEQ ID NO: 32と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するリバースプライマーを含む、請求項48記載の塩基組成シグネチャー。
【請求項５１】
プライマー対のメンバーのいずれかまたは両方が少なくとも一つの修飾核酸塩基を含む、請求項37記載のプライマー対。
【請求項５２】
修飾核酸塩基が質量修飾核酸塩基またはユニバーサル核酸塩基である、請求項51記載のプライマー対。
【請求項５３】
ユニバーサル核酸塩基がイノシンである、請求項52記載のプライマー対。
【請求項５４】
質量修飾核酸塩基が5-ヨード-Cである、請求項52記載のプライマー対。
【請求項５５】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方の5'末端に、非鋳型T残基が付加されている、請求項37記載のプライマー対。
【請求項５６】
プライマー対が、個々に、PB1、NUC、M1、PA、NS1、NS2、およびPB2を含む遺伝子配列の一つに結合し、それによって二つまたはそれ以上の病原体の各々から対応する単位複製配列を生成し、単位複製配列が、分子量測定値の生成に関しておよび二つまたはそれ以上の病原体の各々に対応する塩基組成シグネチャーの算出に関して質量分析計と適合性がある、オルソミクソウイルス科に属する少なくとも二つの病原体の属、種、亜型、および遺伝子型を同定するための少なくとも三つのプライマー対の組み合わせ。
【請求項５７】
プライマー対が、個々に、PB1、PA、およびNS1を含む遺伝子配列の一つに結合する、請求項56記載の組み合わせ。
【請求項５８】
第一のプライマー対のプライマーメンバーが、SEQ ID NO: 125と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するフォワードプライマー配列、およびSEQ ID NO: 126と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するリバースプライマーを含み；第二のプライマー対のプライマーメンバーが、SEQ ID NO: 55と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するフォワードプライマー配列、およびSEQ ID NO: 56と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するリバースプライマーを含み；第三のプライマー対のプライマー対メンバーが、SEQ ID NO: 119と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するフォワードプライマー配列、およびSEQ ID NO: 120と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を有するリバースプライマーを含む、請求項57記載の組み合わせ。
【請求項５９】
（a）フォワードプライマーメンバーおよびリバースプライマーメンバーを含むプライマー対を得る工程であって、プライマー対のメンバーがさらに、独立して、オルソミクソウイルス科に属する二つまたはそれ以上の病原体の遺伝子配列に十分相補的な配列を含み、プライマー対のメンバーの配列が、二つまたはそれ以上の病原体の保存された結合領域および隣接する可変領域にハイブリダイズすることによって二つまたはそれ以上の病原体の各々から単位複製配列を生成するよう設計されており、単位複製配列は分子量測定値の生成に関しておよび二つまたはそれ以上の病原体の各々に対応する塩基組成シグネチャーの算出に関して質量分析計と適合性がある、工程；
（b）未知の病原体を含む疑いのある試料とプライマー対を接触させる工程；
（c）単位複製配列を生成する工程；
（d）質量分析計を用いて単位複製配列の質量測定値を得る工程；ならびに
（e）分子量データから塩基組成シグネチャーを算出する工程、
を含み、
該塩基組成シグネチャーを、対応するプライマー対および病原体の実体に対する指標である塩基組成シグネチャーのデータベースに対して問い合わせる、
オルソミクソウイルス科の少なくとも一つのメンバーを同定する塩基組成シグネチャーを生成する方法。
【請求項６０】
プライマー対の各プライマーメンバーが独立して20〜35核酸塩基長であり、かつフォワードプライマーがSEQ ID NO: 15と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を含み、リバースプライマーがSEQ ID NO: 16と少なくとも70％の配列同一性を含む、オリゴヌクレオチドプライマー対。
【請求項６２】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方が少なくとも一つの修飾核酸塩基を含む、請求項61記載の組成物。
【請求項６３】
修飾核酸塩基が質量修飾核酸塩基である、請求項62記載の組成物。
【請求項６４】
質量修飾核酸塩基が5-ヨード-Cである、請求項63記載の組成物。
【請求項６５】
修飾核酸塩基がユニバーサル核酸塩基である、請求項62記載の組成物。
【請求項６６】
ユニバーサル核酸塩基がイノシンである、請求項65記載の組成物。
【請求項６７】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方の5'末端の非鋳型T残基が除去されている、請求項1記載の組成物。
【請求項６８】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方が少なくとも一つの分子量修飾タグを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項６９】
請求項1記載の組成物を含むキット。
【請求項７０】
プライマー対の各プライマーメンバーが独立して20〜35核酸塩基長であり、かつフォワードプライマーがSEQ ID NO: 39と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を含み、リバースプライマーがSEQ ID NO: 40と少なくとも70％の配列同一性を含む、オリゴヌクレオチドプライマー対。
【請求項７１】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方が少なくとも一つの修飾核酸塩基を含む、請求項70記載の組成物。
【請求項７２】
修飾核酸塩基が質量修飾核酸塩基である、請求項71記載の組成物。
【請求項７３】
質量修飾核酸塩基が5-ヨード-Cである、請求項72記載の組成物。
【請求項７４】
修飾核酸塩基がユニバーサル核酸塩基である、請求項71記載の組成物。
【請求項７５】
ユニバーサル核酸塩基がイノシンである、請求項74記載の組成物。
【請求項７６】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方の5'末端の非鋳型T残基が除去されている、請求項70記載の組成物。
【請求項７７】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方が少なくとも一つの分子量修飾タグを含む、請求項70記載の組成物。
【請求項７８】
請求項70記載の組成物を含むキット。
【請求項７９】
プライマー対の各プライマーメンバーが独立して20〜35核酸塩基長であり、かつフォワードプライマーがSEQ ID NO: 55と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を含み、リバースプライマーがSEQ ID NO: 56と少なくとも70％の配列同一性を含む、オリゴヌクレオチドプライマー対。
【請求項８０】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方が少なくとも一つの修飾核酸塩基を含む、請求項79記載の組成物。
【請求項８１】
修飾核酸塩基が質量修飾核酸塩基である、請求項80記載の組成物。
【請求項８２】
質量修飾核酸塩基が5-ヨード-Cである、請求項81記載の組成物。
【請求項８３】
修飾核酸塩基がユニバーサル核酸塩基である、請求項80記載の組成物。
【請求項８４】
ユニバーサル核酸塩基がイノシンである、請求項83記載の組成物。
【請求項８５】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方の5'末端の非鋳型T残基が除去されている、請求項79記載の組成物。
【請求項８６】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方が少なくとも一つの分子量修飾タグを含む、請求項79記載の組成物。
【請求項８７】
請求項79記載の組成物を含むキット。
【請求項８８】
プライマー対の各プライマーメンバーが独立して20〜35核酸塩基長であり、かつフォワードプライマーがSEQ ID NO: 119と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を含み、リバースプライマーがSEQ ID NO: 120と少なくとも70％の配列同一性を含む、オリゴヌクレオチドプライマー対。
【請求項８９】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方が少なくとも一つの修飾核酸塩基を含む、請求項88記載の組成物。
【請求項９０】
修飾核酸塩基が質量修飾核酸塩基である、請求項89記載の組成物。
【請求項９１】
質量修飾核酸塩基が5-ヨード-Cである、請求項90記載の組成物。
【請求項９２】
修飾核酸塩基がユニバーサル核酸塩基である、請求項89記載の組成物。
【請求項９３】
ユニバーサル核酸塩基がイノシンである、請求項92記載の組成物。
【請求項９４】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方の5'末端の非鋳型T残基が除去されている、請求項88記載の組成物。
【請求項９５】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方が少なくとも一つの分子量修飾タグを含む、請求項88記載の組成物。
【請求項９６】
請求項88記載の組成物を含むキット。
【請求項９７】
プライマー対の各プライマーメンバーが独立して20〜35核酸塩基長であり、かつフォワードプライマーがSEQ ID NO: 123と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を含み、リバースプライマーがSEQ ID NO: 124と少なくとも70％の配列同一性を含む、オリゴヌクレオチドプライマー対。
【請求項９８】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方が少なくとも一つの修飾核酸塩基を含む、請求項97記載の組成物。
【請求項９９】
修飾核酸塩基が質量修飾核酸塩基である、請求項98記載の組成物。
【請求項１００】
質量修飾核酸塩基が5-ヨード-Cである、請求項99記載の組成物。
【請求項１０１】
修飾核酸塩基がユニバーサル核酸塩基である、請求項98記載の組成物。
【請求項１０２】
ユニバーサル核酸塩基がイノシンである、請求項101記載の組成物。
【請求項１０３】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方の5'末端の非鋳型T残基が除去されている、請求項97記載の組成物。
【請求項１０４】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方が少なくとも一つの分子量修飾タグを含む、請求項97記載の組成物。
【請求項１０５】
請求項97記載の組成物を含むキット。
【請求項１０６】
プライマー対の各プライマーメンバーが独立して20〜35核酸塩基長であり、かつフォワードプライマーがSEQ ID NO: 5と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を含み、リバースプライマーがSEQ ID NO: 6と少なくとも70％の配列同一性を含む、オリゴヌクレオチドプライマー対。
【請求項１０７】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方が少なくとも一つの修飾核酸塩基を含む、請求項106記載の組成物。
【請求項１０８】
修飾核酸塩基が質量修飾核酸塩基である、請求項107記載の組成物。
【請求項１０９】
質量修飾核酸塩基が5-ヨード-Cである、請求項108記載の組成物。
【請求項１１０】
修飾核酸塩基がユニバーサル核酸塩基である、請求項107記載の組成物。
【請求項１１１】
ユニバーサル核酸塩基がイノシンである、請求項110記載の組成物。
【請求項１１２】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方の5'末端の非鋳型T残基が除去されている、請求項106記載の組成物。
【請求項１１３】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方が少なくとも一つの分子量修飾タグを含む、請求項106記載の組成物。
【請求項１１４】
請求項106記載の組成物を含むキット。
【請求項１１５】
プライマー対の各プライマーメンバーが独立して20〜35核酸塩基長であり、かつフォワードプライマーがSEQ ID NO: 125 31と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％の配列同一性を含み、リバースプライマーがSEQ ID NO: 12632と少なくとも70％の配列同一性を含む、オリゴヌクレオチドプライマー対。
【請求項１１６】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方が少なくとも一つの修飾核酸塩基を含む、請求項115記載の組成物。
【請求項１１７】
修飾核酸塩基が質量修飾核酸塩基である、請求項116記載の組成物。
【請求項１１８】
質量修飾核酸塩基が5-ヨード-Cである、請求項117記載の組成物。
【請求項１１９】
修飾核酸塩基がユニバーサル核酸塩基である、請求項116記載の組成物。
【請求項１２０】
ユニバーサル核酸塩基がイノシンである、請求項119記載の組成物。
【請求項１２１】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方の5'末端の非鋳型T残基が除去されている、請求項115記載の組成物。
【請求項１２２】
プライマーメンバーのいずれかまたは両方が少なくとも一つの分子量修飾タグを含む、請求項115記載の組成物。
【請求項１２３】
請求項115記載の組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して、インフルエンザウイルスの遺伝的同定および定量の分野に関し、この目的において有用な方法、組成物、およびキット、ならびに分子量分析と組み合わせた場合にその以外のものも提供する。
【背景技術】
【０００２】
連邦政府の支援に関する言及
本発明は、CDC契約R01 CI000099およびNIAIDグラント1UC1AI 067232-01の下で米連邦政府の支援を得て行われた。連邦政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
インフルエンザウイルスは、インフルエンザA型、B型、C型、およびトゴトウイルス（Thogotovirus）からなるオルソミクソウイルス（orthomyxoviridae）科に属する。インフルエンザウイルスはエンベロープ型RNAウイルスである。エンベロープは、主として、マトリックスタンパク質（MP）ならびにムラミニダーゼ（NA）および血球凝集素（HA）と呼ばれる二つの糖タンパク質である。NAおよびHAはその表面に存在し、宿主細胞への感染に重要な役割を果たす。エンベロープの内側では、一本鎖のRNAおよび核タンパク質（NP）が分節されている。NPの機能は、RNAを被包することならびに転写、複製、およびパッケージングにおける役割を果たすことである。インフルエンザタイピングによる分類（A、B、またはC）は、NPおよびMPの異なる抗原性に基づく。インフルエンザA型はさらに、HA抗体またはNA抗体の血清学的な交差反応性に基づき亜型に分類される。インフルエンザB型については、HAの亜型が一つおよびNAの亜型が一つのみ公知である。現在、人間において見出されているインフルエンザA型ウイルスの亜型はA(H1N1)およびA(H3N2)である。計15の異なるHA型および9の異なるNA型が記載されているが、これらのセグメントの全ての組み合わせが存在するわけではないことが公知である（Armano, Y et al., Anal Bioanal Chem (2005) 381: 156-164（非特許文献1））。
【０００４】
A型またはB型のインフルエンザウイルスは、ほぼ毎年冬季に流行病を引き起こしている。インフルエンザA型ウイルスは、アヒル、ニワトリ、ブタ、クジラ、ウマ、およびオットセイを含む多くの異なる動物において見出されている。インフルエンザB型ウイルスは、人間の間でのみに広く蔓延している。インフルエンザC型の感染は、軽度の呼吸器疾患を引き起こし、流行病を引き起こすものではないと考えられる。
【０００５】
これらのタイプの多くは単一の宿主種に特異的であり、種をまたぐことはない。しかし、ヒトへの突発的伝染を起こしたトリのH5N1および近年報告されたイヌ／ウマH3N8株は明らかに複数種に適応しており、高い汎発流行性を示す。同様に、ブタは、ブタインフルエンザウイルスに加えて、ヒトおよびトリの両方のインフルエンザウイルスに感染し得る。従って、対応するHA型およびNA型によるインフルエンザA型ウイルスの検出は、新奇の汎発流行株の出現を追跡するのに必要であることは明白である。
【０００６】
インフルエンザウイルスは、二つの異なる方法で変化する。一方は、「抗原連続変異」と呼ばれる。これらは、長期間にわたり継続的に起きる、ウイルスのHAタンパク質およびNAタンパク質に関する小規模かつ段階的な変化である。抗原連続変異は、体内の免疫系によって認識されない可能性のある新規のウイルス株を生じる。もう一方のタイプの変化は「抗原不連続変異」と呼ばれる。抗原不連続変異は、インフルエンザA型ウイルスにおける突発的で大きな変化であり、ヒトに感染するインフルエンザウイルスにおいて新規のHAタンパク質ならびに／または新規のHAタンパク質およびNAタンパク質を生じる。抗原不連続変異は、新規のインフルエンザA型の亜型を生じる。抗原不連続変異が起きたとき、大部分の人間はその新規のウイルスに対してほとんどまたは全く防御できない。インフルエンザA型ウイルスが抗原不連続変異を起こし、新規のHAまたはHA＋NAを得た場合、汎発流行が起こり得る。この抗原不連続変異は、一般大衆が免疫を有さない新規（new）または「新奇（novel）」のウイルスを生じる。新奇のウイルスの出現は、汎発流行の最初のステップである。しかし、新奇のインフルエンザA型ウイルスはまた、汎発流行が起きるためには人から人へと容易に伝播し（および重篤な疾患を起こさ）なければならない。インフルエンザウイルスが絶えず抗原連続変異により変化しているのに対して、抗原不連続変異はたまにしか起きない。A型ウイルスは両方の種類の変化を起こし；インフルエンザB型ウイルスはより段階的な抗原連続変異プロセスによってのみ変化する。
【０００７】
インフルエンザウイルス分析の従来のウイルス学的方法は十分に確立している。ウイルスの単離培養およびウイルス抗原の免疫学的確認は、ウイルス検出に関する現在の「ゴールドスタンダード」である。インフルエンザの培養に関して最も一般的な細胞株は、インフルエンザA型、B型、およびC型の成長を支持するという理由から、マディン・ダービーイヌ腎臓細胞（MDCK）である。2〜10日間のウイルスの培養の後、ウイルスは免疫アッセイ手順、例えば免疫蛍光法またはELISAおよびそれに続くウイルスの特徴付けのための血清学的または分子生物学的アッセイを用いて検出される。ウイルス検出法には、補体の結合、血球凝集素の阻害、およびPCRが含まれ得る。これらの検出および特徴付けの方法は、既知のインフルエンザ型または亜型が混合物中に存在するかどうかの問いに対してイエス／ノー式の解答を提供する（Amano, Y et al., Anal Bioanal Chem (2005) 381: 156-164（非特許文献1））。残念ながら、これらのインフルエンザの検出および特徴付けの方法は、すでに知られている型および亜型を同定することしかできない。未知の型または亜型を有するインフルエンザウイルスに関する情報の提供には有効でない。
【０００８】
効果的な抗ウイルス処置を施すためには、時宜を得た診断が必要である。効果的な治療は、兆候の発生から48時間以内に施されなければならず、これは現在使用されているウイルス培養法よりもずっと短い時間である。従来的な検出および特徴付けの方法は、ウイルスが抗原不連続変異または抗原連続変異に起因して新奇であり、検出または特徴付けができない場合に機能しない（Amano, Y et al., Anal Bioanal Chem (2005) 381: 156-164（非特許文献1）; Manalito, M.J., American Family Physician, (2003) 67:111-118（非特許文献2）; Li, J et al., J. Clin. Microbiol. (2001) 39: 696-704（非特許文献3））。
【０００９】
マイクロアレイは、インフルエンザウイルスの検出におけるより迅速なスクリーニング法を提供するために使用されている。Baranyらに対して発行され、Cornell Research Foundation, Inc.に譲渡された米国特許第6,852,487号（特許文献1）は、核酸の違いを検出するためのマイクロアレイを記載する。この特許は、一つまたは複数の異なる核酸配列を検出するための組成物および方法を記載する。ヌクレオチド変異、多型、欠失、または挿入を有する疑いのある核酸領域がPCR増幅される。次いで、増幅された核酸は、リガーゼ検出反応の鋳型として使用される。このアッセイにおいて、二つのプライマーは、変異を有する疑いのある領域の隣接側部にハイブリダイズするよう設計される。このプライマーはリガーゼの存在下で増幅産物とハイブリダイズし、プライマーが鋳型との完全な相補性を有する場合、プライマーは連結する。次いでプライマーは、マイクロアレイに共有結合により付加されたプローブとハイブリダイズし、プライマーが連結したかどうかを決定するためのアッセイがなされる。このアッセイは、プライマーが隣接側部にハイブリダイズするよう設計され得るよう、変異部位を予め知っておく必要がある。従って、このアッセイは、それまで知られていない変異を検出することはできない。
【００１０】
インフルエンザを迅速に検出および特徴付けるアッセイが、当技術分野で求められている。この要望には、アッセイが既知のウイルスおよび未知のウイルスの両方を特異的に検出および特徴付けることができればよいという要望が含まれる。未知のウイルスの検出および特徴付けは、あらゆる変異を有するウイルスを網羅し、追加の検出／特徴付けアッセイを必要としないものであるべきである。迅速な検出および特徴付けは、適当な抗ウイルス療法の時宜を得た開始を可能にし、さらには新規の亜型の迅速な同定によるインフルエンザの流行の制御をも可能にする。
【００１１】
【特許文献１】米国特許第6,852,487号
【非特許文献１】Armano, Y et al., Anal Bioanal Chem (2005) 381: 156-164
【非特許文献２】Manalito, M.J., American Family Physician, (2003) 67:111-118
【非特許文献３】Li, J et al., J. Clin. Microbiol. (2001) 39: 696-704
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明においては特に、オルソミクソウイルス科のメンバーの同定方法を提供する。好ましくは、このメンバーの属を同定し、より好ましくはこのメンバーの種を同定し、さらにより好ましくはこのメンバーの亜種を同定し、より好ましくはこのメンバーの株を同定し、最も好ましくはこのメンバーの遺伝子型を同定する。ウイルス性病原体（bioagent）同定用単位複製配列を規定し、かつ増幅の際にその分子量がインフルエンザウイルスを亜種レベルで同定する手段を提供する単位複製配列を生成するオリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプライマーを含む組成物およびキットも提供する。
【００１３】
本発明においては、プライマーおよびプライマー対を含む組成物；それらを含むキット；ならびにインフルエンザウイルスの同定においてそれらを使用する方法を提供する。プライマーは、ウイルス性病原体同定用核酸単位複製配列を生成するよう設計される。単位複製配列は、好ましくは、ウイルスの複製に必須の遺伝子をコードする核酸部分から生成される。プライマー対を含む組成物およびそれらを含むキットは、インフルエンザウイルスの種および亜種の特徴付けを提供するよう設計される。
【００１４】
いくつかの態様において、インフルエンザウイルスの同定方法を提供する。インフルエンザウイルス由来の核酸を、上記のプライマーを用いて増幅し、単位複製配列を得る。この単位複製配列の分子量は、質量分析計を用いて測定される。単位複製配列の塩基組成は、分子量から算出される。分子量または塩基組成は、複数の既知のインフルエンザウイルス同定用単位複製配列の分子量または塩基組成と比較され、この分子量または塩基組成と複数の分子量または塩基組成のメンバーの間の一致によりインフルエンザウイルスが同定される。
【００１５】
いくつかの態様において、試料中のインフルエンザウイルスの存在または非存在を検出する方法を提供する。試料由来の核酸を、上記の組成物を用いて増幅し、単位複製配列を得る。この単位複製配列の分子量が決定される。単位複製配列の塩基組成は分子量から決定される。この単位複製配列の分子量または塩基組成は、一つまたは複数の既知のインフルエンザウイルス同定用単位複製配列の既知の分子量または塩基組成と比較され、この単位複製配列の分子量または塩基組成と一つまたは複数の既知のインフルエンザウイルス同定用単位複製配列の分子量または塩基組成の間の一致が、試料中にインフルエンザウイルスが存在することを示す。
【００１６】
いくつかの態様において、試料中の未知のインフルエンザウイルスの量を決定する方法を提供する。試料を上記の組成物および較正配列を含む既知の量の較正ポリヌクレオチドと接触させる。試料中の未知のインフルエンザウイルス由来の核酸を、上記の組成物によって同時に増幅し、かつ試料中の較正ポリヌクレオチド由来の核酸を上記の組成物によって同時に増幅して、インフルエンザウイルス同定用単位複製配列を含む第一の単位複製配列および較正用単位複製配列を含む第二の単位複製配列を得る。インフルエンザウイルス同定用単位複製配列および較正用単位複製配列の分子量ならびに存在量（abundance）が決定される。インフルエンザウイルス同定用単位複製配列は、分子量に基づき較正用単位複製配列と区別され、インフルエンザウイルス同定用単位複製配列の存在量と較正用単位複製配列の存在量の比較が、試料中のインフルエンザウイルスの量を示す。インフルエンザウイルス同定用単位複製配列の塩基組成が決定される。
【００１７】
態様の詳細な説明
本明細書中で使用する場合、「病原体」は、任意の微生物もしくは感染性物質、または任意のこのような微生物もしくは感染性物質の任意の天然成分、生物工学的成分、もしくは合成成分、または任意のこのような微生物もしくは感染性物質由来の任意の核酸を意味する。当業者は、本開示を見れば病原体という用語の意味するものを完全に理解するであろう。さらに、病原体の非排他的なリストには、細胞、細胞株、ヒト臨床試料、哺乳動物血液試料、細胞培養物、細菌細胞、ウイルス、ウイロイド、真菌、原生生物、寄生生物、リケッチア、または原生生物が含まれる。試料は、生きている場合も死んでいる場合もあり、植物状態（例えば植物細菌または胞子）の場合もある。好ましくは、病原体はウイルスまたはウイルス由来の核酸である。より好ましくは、病原体はオルソミクソウイルス科のメンバーであり、さらにより好ましくは、病原体はインフルエンザA型、B型、またはC型である。
【００１８】
本明細書中で使用する場合、「インテリジェントプライマー（intelligent primer）」または「プライマー」または「プライマー対」は、二つまたはそれ以上の病原体核酸の保存された配列領域に結合し、病原体同定用単位複製配列を生成するよう設計されたオリゴヌクレオチドである。結合したプライマーは、保存された結合配列の間に介在する可変領域の側面に位置する。増幅の際、プライマー対は、二つまたはそれ以上の病原体の間の塩基組成のばらつきを提供する単位複製配列を生成する。塩基組成のばらつきは、塩基組成の違いに基づき二つまたはそれ以上の病原体から一つまたは複数の個々の病原体を同定することを可能にする。プライマー対はまた、分子量分析に適した単位複製配列を生成するよう設計される。本明細書中で使用する場合、プライマー対の命名法は、参照配列からの命名を含む。例えば、プライマー対1259番のフォワードプライマーは、FLUAPB2_NC004518_66_92_Fと命名される。このプライマーが参照する参照配列はGenBankアクセッション番号NC_004518（初期登録日2003年1月11日）である。このプライマーは、一対のうちのフォワードプライマーであり（「_F」で示される）、参照配列である参照インフルエンザA型ウイルスのPB2遺伝子の残基66〜92（66_92）にハイブリダイズする。しかし、プライマー対は、二つまたはそれ以上の病原体にハイブリダイズするよう選択および設計される。従って、使用される命名法は、参照配列を提供するためにすぎず、プライマーが参照配列とハイブリダイズし参照配列からのみ病原体同定用単位複製配列を生成することを示すためではない。さらに、プライマー対のプライマーメンバーの配列は、参照病原体の保存された領域に完全に相補的であるとは限らない。むしろ、配列は、複数の病原体の間でこれらの保存された結合配列に「ベストフィット」するよう設計される。従って、プライマー対のプライマーメンバーは、参照病原体を含む病原体の保存された領域に対して実質的な相補性を有する。
【００１９】
本明細書中で使用する場合、「実質的な相補性」という用語は、プライマー対のプライマーメンバーが、任意の所定の病原体の保存された結合配列に対して約70％〜100％、または約80％〜100％、または約90％〜100％、または約95％〜100％の同一性、または約99％〜100％の配列同一性を有することを意味する。これらの同一性の範囲は、列挙された範囲の数値に内包される全ての自然数および不完全数（partial number）を包含する。例えば、しかし限定せず、75.667％、82％、91.2435％、および97％の配列同一性は全て、上記の70％〜100％の範囲に含まれる数値であり、従ってこの表現の一部を構成する。
【００２０】
本明細書中で使用する場合、「広範囲サーベイプライマー（broad range survey primer）」は、未知の病原体を特定の区分（例えば、目、科、クラス、クレード、または属）のメンバーとして同定するよう設計されたインテリジェントプライマーである。しかし、いくつかの場合、広範囲サーベイプライマーはまた、未知の病原体を種または亜種レベルで同定することもできる。本明細書中で使用する場合、「ディビジョンワイドプライマー（division wide primer）」は、病原体を種レベルで同定するよう設計されたインテリジェントプライマーであり、「ドリルダウン（drill-down）」プライマーは病原体を亜種レベルで同定するよう設計されたインテリジェントプライマーである。本明細書中で使用する場合、「亜種」レベルの同定には、株、亜型、変種、および分離菌が含まれるがこれらに限定されない。好ましくは、しかし限定せず、科はオルソミクソウイルス科であり；属はインフルエンザウイルスA属、インフルエンザウイルスB属、インフルエンザウイルスC属、イサウイルス（Isavirus）属、またはトゴトウイルス属であり；種はインフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルス、またはインフルエンザC型ウイルスであり、亜種はHXNY亜型および／または菌株参照表記（strain reference notation）である。いくつかの場合においては、広範囲サーベイインテリジェントプライマーがこの同定の目的の達成に十分な同定分解能（resolution）を提供するので、ドリルダウンプライマーが常に亜種レベルでの同定に必要とされる訳ではない。
【００２１】
本明細書中で使用する場合、「可変領域」という用語は、本明細書中に記載される任意の一対のプライマーの間に挟まれる領域を表すのに使用される。この領域は、少なくとも二つの病原体の間で異なる塩基組成を有するため、少なくとも一つの病原体が、科、属、種、または亜種のレベルで同定され得る。少なくとも二つの病原体の間のばらつきの程度は、本明細書中に記載されるように、質量スペクトル分析を用いて同定するのに十分な程度しか必要としない。このような違いは、二つの病原体の間で生じる単一ヌクレオチドの相違程度の僅かなものであってもよい。
【００２２】
本明細書中で使用する場合、「単位複製配列」または「病原体同定用単位複製配列」という用語は、本明細書中に記載のプライマー対を用いて生成される核酸を意味する。単位複製配列は、好ましくは二本鎖DNAであるが、RNAおよび／またはDNA：RNAであってもよい。単位複製配列は、保存された領域／プライマー対および介在する可変領域の配列を含む。本明細書中で考察するように、プライマー対は、二つまたはそれ以上の病原体から単位複製配列を生成するよう設計される。従って、任意の所定の単位複製配列の塩基組成は、プライマー対、プライマー対の相補鎖、単位複製配列を生成するために増幅された病原体由来の保存された領域および可変領域を含み得る。当業者は、設計されたプライマー対の配列が任意の単位複製配列に組み込まれることにより、そのプライマー結合部位におけるネイティブのウイルス配列およびその相補鎖が置き換えられることを理解しているであろう。プライマーを用いて標的領域を増幅した後、プライマー配列を有する得られる単位複製配列は、分子量データを生成する。プライマー結合部位の任意のネイティブウイルス配列またはその相補鎖を有する単位複製配列は、その存在量の少なさゆえに検出できない。それは、任意の特定のプライマー対を用いて一つまたは複数の病原体を同定する際に考慮される。単位複製配列はさらに、質量スペクトル分析に適合する長さを有する。病原体同定用単位複製配列は、好ましくは病原体の実体ごとに固有の塩基組成シグネチャーを生成する。
【００２３】
質量分析計により生成された分子量からの塩基組成の算出は、単位複製配列の長さが増すのに比例して複雑さが増す。未修飾核酸を含む単位複製配列については、実施する上での長さの限界としての上限の長さは、連続する約200核酸塩基である。単位複製配列への修飾ヌクレオチドの組み込みにより、この上限を高くすることができる。一つの態様において、任意の単一のプライマー対を用いて生成された単位複製配列は、少なくとも一つの病原体の、科、属、種、または亜種レベルでの同定を行うのに十分な塩基組成情報を提供し得る。
【００２４】
好ましくは、単位複製配列は、連続する約45〜約200核酸塩基（すなわち約45〜約200個の連結されたヌクレオシド）を含む。当業者は、この範囲が、明確に言うと、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、および200核酸塩基長の化合物を包含することを理解するであろう。当業者はさらに、上記の範囲が単位複製配列の長さの絶対的な限界ではなく、好ましい長さの範囲を表すことを理解するであろう。この範囲外の単位複製配列の長さもまた、その単位複製配列が本明細書中に記載されるような塩基組成シグネチャーの算出に適する限り、本発明に含まれる。
【００２５】
本明細書中で使用する場合、「未知の病原体」という用語は、（i）その存在が知られていない病原体（例えばSARSコロナウイルスは2003年4月以前は未知であった）および／または（ii）その存在は知られている（例えば周知の細菌種、黄色ブドウ球菌）が分析する試料中に存在することは知られていない病原体を意味する。例えば、同一出願人による米国特許出願第10/829,826号（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に開示されるコロナウイルスの同定方法が、臨床試料中のSARSコロナウイルスを同定するために2003年4月以前に使用された場合、SARSコロナウイルスは2003年4月以前は科学的に知られておらず、かつその試料中にどの病原体（この場合はコロナウイルス）が存在するかが知られていないので、「未知」の病原体の両方の意味が適用できる。他方、米国特許出願題10/829,826号の方法が、臨床試料中のSARSコロナウイルスを同定するために2003年4月以降に使用された場合、SARSコロナウイルスは2003年4月以降は科学的に知られるに至っていたが、その試料中にどの病原体が存在するかは知られていないので、「未知」の病原体の第二の意味（ii）のみが適用できる。
【００２６】
本明細書中で使用する場合、「分子量」という用語は、質量分析計を用いて決定される化合物の質量を意味する。本発明においては、化合物は好ましくは核酸であり、より好ましくは二本鎖核酸であり、さらにより好ましくは二本鎖DNA核酸であり、最も好ましくは単位複製配列である。核酸が二本鎖である場合、分子量は両方の鎖について決定される。本発明においては、鎖は質量分析計への導入前に分離されるか、または鎖は質量分析計によって分離される（例えば、エレクトロスプレーイオン化法はハイブリダイズした鎖を分離する）。各々の鎖の分子量は、質量分析計によって測定される。
【００２７】
本明細書中で使用する場合、「塩基組成」という用語は、単位複製配列を含む各残基の数を意味し、単位複製配列の鎖におけるこれらの残基の直鎖上の配置を考慮しない。単位複製配列の残基は、アデノシン（A）、グアノシン（G）、シチジン（C）、（デオキシ）チミジン（T）、ウラシル（U）、イノシン（I）、ニトロインドール、例えば5-ニトロインドールまたは3-ニトロピロール、dPまたはdK（Hill et al.）、5-ニトロインダゾールを含む非環式ヌクレオシドアナログ（Van Aerschot et al., Nucleosides and Nucleotides, 1995, 14, 1053-1056）、プリンアナログ1-（2-デオキシ-ベータ-D-リボフラノシル）-イミダゾール-4-カルボキサミド、2,6-ジアミノプリン、5-プロピニルウラシル、5-プロピニルシトシン、G-クランプを含むフェノキサジン、5-プロピニルデオキシ-シチジン、デオキシ-チミジンヌクレオチド、5-プロピニルシチジン、5-プロピニルウリジン、および7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5-三リン酸、5-ヨード-2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸、5-ブロモ-2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸、5-ヨード-2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸、5-ヒドロキシ-2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸、4-チオチミジン-5'-三リン酸、5-アザ-2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸、5-フルオロ-2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸、O6-メチル-2'-デオキシグアノシン-5'-三リン酸、N2-メチル-2'-デオキシグアノシン-5'-三リン酸、8-オキソ-2'-デオキシグアノシン-5'-三リン酸、またはチオチミジン-5'-三リン酸を含むそれらの質量タグ修飾型を含む。いくつかの態様において、質量修飾核酸塩基は、15Nもしくは13Cまたは15Nおよび13Cの両方を含む。好ましくは、本明細書中で使用する非天然核酸塩基には、5-プロピニルウラシル、5-プロピニルシトシン、およびイノシンが含まれる。本明細書中では、非修飾DNA単位複製配列の塩基組成は、AwGxCyTzという記号で表す。ここで、w、x、y、およびzは各々独立して単位複製配列中のヌクレオシド残基の数を表す自然数である。修飾ヌクレオシドを含む単位複製配列の塩基組成は同様に、単位複製配列中の天然ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオシドの数を示すよう記号で表す。塩基組成は、以下に記載するように、単位複製配列の分子量測定から算出する。次いで、任意の所定の単位複製配列について算出された塩基組成を、塩基組成のデータベースと比較する。算出した塩基組成と一つのデータベースエントリーとの一致が、その病原体の実体を明らかにする。
【００２８】
本明細書中で使用する場合、「塩基組成シグネチャー」という用語は、任意の一つの特定の単位複製配列により生成された塩基組成を意味する。
【００２９】
本明細書中で使用する場合、「塩基組成確率クラウド（base composition probability cloud）」は、所定の種、科、または属の異なる分離菌の間に存在する配列のばらつきに起因する塩基組成の多様性の表示である。複数の単位複製配列についての塩基組成の算出値は、疑似四次元プロット上に配置される。科、属、または種の関連するメンバーは、典型的にはこのプロット内で一群となり、塩基組成確率クラウドを形成する。
【００３０】
本明細書中で使用する場合、「データベース」という用語は、塩基組成データの集合を指すのに用いる。データベース中の塩基組成データは、病原体およびプライマー対に対する指標となる。データベースに報告された塩基組成データは、各プライマーを用いることで各病原体について生成されるであろう単位複製配列中の各ヌクレオシドの数を含む。データベースは、経験的データで満たされ得る。データベースを満たすこの局面において、単位複製配列を生成する病原体が選択され、プライマー対が使用される。単位複製配列の分子量を、質量分析計を用いて決定し、そこから塩基組成を算出する。データベースへの登録は、塩基組成と病原体および使用したプライマー対とを関連付けるように行われる。データベースはまた、病原体情報を含む他のデータベースを用いて満たされてもよい。例えば、GenBankデータベースを用いることで、プライマー対の電気的表示を用いて電気的なPCRを行うことが可能である。このインシリコ法は、GenBankデータベースに保存された任意のまたは全ての選択された病原体についての塩基組成を提供する。次いで、この情報を使用して、上記の塩基組成データベースが満たされる。塩基組成データベースは、インシリコ、書面上の表、参考図書、スプレッドシート、または一般的にデータベースに適する任意の形式であり得る。好ましくは、データベースはインシリコである。
【００３１】
本明細書中で使用する場合、「核酸塩基」という用語は、「ヌクレオチド」、「デオキシヌクレオチド」、「ヌクレオチド残基」、「デオキシヌクレオチド残基」、「ヌクレオチド三リン酸（NTP）」、またはデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）を含む、当技術分野で使用される他の用語の同義語である。本明細書中で使用する場合、核酸塩基には、本明細書中に記載されるように、天然残基および修飾残基が含まれる。
【００３２】
本明細書の文脈上、「ウイルス核酸」には、DNA、RNA、または例えば逆転写反応を行うことによってウイルスRNAから得られたDNAが含まれるがこれらに限定されない。ウイルスRNAは、（プラス鎖またはマイナス鎖の）一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。
【００３３】
本明細書中で使用する場合、「ウォッブル塩基」は、DNAトリプレットにおいて三番目のヌクレオチド位置に見出される塩基のばらつきである。配列の保存された領域におけるばらつきは、アミノ酸コードの冗長性に起因してしばしば三番目のヌクレオチド位置で見られる。
【００３４】
本明細書中で使用する場合、「ハウスキーピング遺伝子」または「コアウイルス遺伝子」は、病原体の生存および複製に必要とされる基本機能に関与するタンパク質またはRNAをコードする遺伝子を意味する。ハウスキーピング遺伝子には、翻訳、複製、組換えおよび修復、転写、ヌクレオチド代謝、アミノ酸代謝、脂質代謝、エネルギー生成、取り込み、分泌等に関与するRNAまたはタンパク質をコードする遺伝子が含まれるがこれらに限定されない。好ましくは、本明細書中で考察されるコアウイルス遺伝子は、ポリメラーゼ（PB1、PB2、およびPA）、核タンパク質（NUCまたはNP）、マトリックスタンパク質（MまたはM1）、非構造タンパク質（NS1およびNS2）、ならびに糖タンパク質（HAおよびNA）である。
【００３５】
本明細書中で使用する場合、「病原体の門」は、種レベルより上位の病原体のグループと定義され、目、科、属（genus）、クラス、クレード、属（genera）、またはその他のこのような種レベルより上位の病原体のグループが含まれるがこれらに限定されない。
【００３６】
本明細書中で使用する場合、「亜種の特徴」は、同じ病原体種の二つのメンバーを区別する手段を提供する遺伝的な特徴である。例えば、あるウイルス株は、ウイルス遺伝子の一つ、例えばRNA依存性RNAポリメラーゼ内に遺伝的変化（例えばヌクレオチド欠失、付加、または置換）を有することによって、同じ種の別のウイルス株から区別され得る。
【００３７】
本明細書中で使用する場合、「三角同定（triangulation identification）」は、病原体の同定用の対応する単位複製配列を生成するために複数のプライマー対を使用することを意味する。複数のプライマー対は、別々のウェルでまたは多重型PCRアッセイにおいて使用することができる。別の方法では、PCR反応は、各ウェルに異なるプライマー対を含む、単一のウェルにおいて行ってもよい。増幅後、単位複製配列は単一のウェルまたは容器にプールされ、その後分子量分析に供される。プールされた単位複製配列の組み合わせは、個々の単位複製配列の分子量の予想される範囲が重複しないように、従ってシグナルの同定が複雑にならないように選択することができる。三角法は、第一のプライマー対が、未知の病原体が病原体群のうちの一つであり得ることを同定する、消去法プロセスとして利用できる。後のプライマー対は、三角同定において、前のプライマー対によって得られた選択肢のサブセットの中で病原体の同定をさらに進めるのに使用される。三角同定は、病原体の実体が決定されたときに完了する。三角同定プロセスはまた、偽陰性および偽陽性のシグナルを減らし、ハイブリッドまたはそれ以外では遺伝子操作された病原体の起源の再構築を可能にするためにも使用される。例えば、予想される炭疽菌ゲノム由来のシグネチャーの不在下での炭疽菌に典型的な三種類の毒素遺伝子の同定（Bowen et al., J. Appl. Microbiol., 1999, 87, 270-278）は、遺伝子操作事象を示唆する。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「単一プライマー対同定」という用語は、一つまたは複数の病原体を、単一のプライマー対を用いて同定できることを意味する。単位複製配列についての塩基組成シグネチャーは、一つまたは複数の病原体を単独で同定し得る。
【００３９】
本明細書中で使用する場合、「病因」と言う用語は、疾患または異常な生理学的状態の原因または起源を意味する。
【００４０】
本発明においては、病原体同定用単位複製配列を用いて、不偏的な様式で、病原体を検出および同定する方法を提供する。病原体由来の核酸の保存された配列領域にハイブリダイズするようプライマーを選択し、これは変動配列領域を挟み込んで、増幅可能であり分子量決定に適する病原体同定用単位複製配列を生成する。分子量は、単位複製配列内の各ヌクレオチドの数を示す塩基組成に変換される。次いで、単位複製配列の分子量または対応する塩基組成シグネチャーを、病原体および単位複製配列を生成するのに使用したプライマー対に対して指標となる分子量または塩基組成シグネチャーのデータベースに対して問い合わせする。測定された塩基組成と塩基組成のデータベースエントリーとの一致は、試料の病原体とデータベース内の指標となる病原体とを関連付ける。従って、未知の病原体の実体が決定される。未知の病原体についての事前の知識は必要ではない。いくつかの例において、測定された塩基組成は、複数の塩基組成のデータベースエントリーと関連付けられる。従って、三角同定によって、第二の／それに続くプライマー対を使用して単位複製配列を生成し、その測定された塩基組成を同じ様にデータベースと比較することで、その実体が決定される。さらに、この方法は、高速並行多重分析（rapid parallel multiplex analyses）に適用でき、その結果は三角同定ストラテジーにおいて使用され得る。本発明の方法は、高スループットを提供し、病原体の検出および同定のために、増幅された標的配列の核酸配列決定を必要としない。
【００４１】
生物学的多様性は莫大であるにもかかわらず、地球上の全ての生命形態は、それらのゲノム内に共通する必須の特徴を共有している。遺伝的なデータは本発明による病原体の同定における基礎を提供することから、各々の個々の病原体を区別するのに十分なばらつきを理想的に提供しかつその分子量が分子量決定に適している核酸のセグメントを選択することが必要である。
【００４２】
全生物に渡る多くの遺伝子の保存（すなわちハウスキーピング遺伝子）がみられる細菌ゲノムと異なり、ウイルスは、全てのウイルス科の間で必須でありかつ保存されている単一の遺伝子を共有していない。従って、ウイルスの同定は、関連するウイルスの小グループ内、例えば特定のウイルス科または属のメンバー内で達成される。例えば、RNA依存性RNAポリメラーゼは、全ての一本鎖RNAウイルスに存在し、ウイルス科内での幅広いプライミングおよび分解のために使用され得る。
【００４３】
いくつかの態様において、少なくとも一つのウイルス核酸セグメントが、病原体を同定するプロセスにおいて増幅される。従って、本明細書中では、本明細書中に開示されるプライマーによって増幅することができ、かつ各々の個々の病原体を区別するのに十分なばらつきを提供し、かつその分子量が分子量決定に適する核酸セグメントを、病原体同定用単位複製配列と表現する。
【００４４】
プライマーがハイブリダイズする核酸セグメント（ハイブリダイゼーション部位）および病原体同定用単位複製配列を含むプライマーハイブリダイゼーション部位の間の可変領域は、病原体の部分の組み合わせである。
【００４５】
いくつかの態様において、本明細書中に記載されるプライマーにより生成される、分子量決定に適した病原体同定用単位複製配列は、分子量決定の特定の様式と、長さ、サイズ、または質量の点で適合するか、または分子量決定の特定の様式と長さの点で適合する予測可能な断片を得るために予測可能な断片化パターンを提供する手段と適合するかのいずれかである。このような単位複製配列の予測可能な断片化パターンを提供する手段には、例えば、制限酵素による切断または切断プライマーが含まれるがこれらに限定されない。従って、いくつかの態様において、病原体同定用単位複製配列は、200核酸塩基よりも長く、かつ制限消化後の分子量決定に適したものである。制限酵素および切断プライマーを使用する方法は、当業者に周知である。
【００４６】
いくつかの態様において、病原体同定用単位複製配列に対応する単位複製配列は、分子生物学分野の当業者にとってルーチンな方法であるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて得られる。他の増幅法、例えばリガーゼ連鎖反応（LCR）、低ストリンジェンシー単一プライマーPCR、および多重鎖置換型増幅（MDA）を使用することもできる。これらの方法もまた、当業者に公知である（Michael, SF., Biotechniques (1994), 16: 411-412およびDean et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2002), 99, 5261-5266）。
【００４７】
プライマーの選択および検証プロセスにおいて使用される典型的な工程図を、図1に概説する。各々の生物グループについて候補標的配列が同定され（200）、そこからヌクレオチドアラインメントが作製され（210）、分析される（220）。次いで、候補プライマー対の選択（240）を容易にするために、適当なプライミング領域（230）を選択することによってプライマーが設計される。プライマー対の配列は、整列された配列の中で「ベストフィット」するものであり、このことは、プライマー対の配列がそのアラインメントにおける病原体のいずれか一つのハイブリダイゼーション領域に完全に相補的である場合もそうでない場合もあることを意味する。従って、ベストフィットするプライマー対の配列は、二つまたはそれ以上の病原体に対する十分な相補性を有し、二つまたはそれ以上の病原体とハイブリダイズして単位複製配列を生成するものである。次いで、プライマー対は、電気的PCR（ePCR）によるインシリコ分析に供され（300）、病原体同定用単位複製配列がGenBank等の配列データベースまたは他の配列集合体から得られ（310）、インシリコで特異性について検査される（320）。GenBankの配列のePCRから得られた病原体同定用単位複製配列（310）を、所定の単位複製配列の未知の病原体を同定する能力を予測する確率モデルにより分析することもできる。好ましくは、好ましい確率スコアを有する単位複製配列の塩基組成は、その後に塩基組成データベースに保存される（325）。別の方法では、プライマーおよびGenBankの配列から得られた病原体同定用単位複製配列の塩基組成を、塩基組成データベースに直接入力することができる（330）。候補プライマー対（240）は、生物の集合からの核酸のPCR分析（400）等の方法によるインビトロ増幅によって検証される（410）。このようにして得られた単位複製配列は、単位複製配列を得るのに使用されたプライマーの感受性、特異性、および再現性を確認するために分析される（420）。
【００４８】
プライマーの合成は当技術分野で周知でありルーチンである。プライマーは、固相合成の周知技術を通じて簡便かつ日常的に作製され得る。このような合成のための機器は、例えばApplied Biosystems（Foster City, CA）を含む様々な販売元から販売されている。当技術分野で公知のこのような合成の任意の他の手段が、付加的または代替的に使用され得る。
【００４９】
プライマーは、以下のように、ウイルス性病原体の同定法において使用するための組成物として使用される：プライマー対組成物を、未知のウイルス性病原体の核酸（例えばDNAウイルス由来のDNAまたはRNAウイルスのRNAから逆転写したDNA）と接触させる。次いで核酸増幅技術、例えばPCRにより核酸を増幅し、単位複製配列を得る。これが病原体同定用単位複製配列となる。二本鎖の単位複製配列の各々の鎖の分子量を、分子量測定技術、例えば質量分析によって決定する。好ましくは、二本鎖の単位複製配列の二つの鎖はイオン化プロセスの間に分離されるが、それらは質量スペクトルの測定の前に分離されてもよい。いくつかの態様において、質量分析計は、エレクトロスプレーフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型質量分析計（ESI-FTICR-MS）またはエレクトロスプレー飛行時間型質量分析計（ESI-TOF-MS）である。可能性のある塩基組成のリストが、各々の鎖について得られた分子量の値について生成され得、そのリストからの正確な塩基組成の選択は、一方の鎖の塩基組成ともう一方の鎖の相補的な塩基組成を一致させることによって進められる。次いで、測定された分子量またはそこから算出された塩基組成を、プライマー対および既知のウイルス性病原体に対する指標である分子量または塩基組成のデータベースと比較する。単位複製配列の測定された分子量または塩基組成とその指標となるプライマー対についてのデータベースの分子量または塩基組成の間の一致は、測定された分子量または塩基組成を、指標となるウイルス性病原体と関連付け、それによって未知の病原体の実体が示される。いくつかの態様において、使用されるプライマー対は、表2のプライマー対のうちの一つである。いくつかの態様において、この方法は、同定プロセスにおける潜在的な曖昧さを解決するため、または実体の特定における信頼性のレベルを向上させるために、異なるプライマー対を用いて反復される（三角同定）。
【００５０】
いくつかの態様において、病原体同定用単位複製配列は、低ストリンジェンシー単一プライマーPCR（LSSP-PCR）等の適当な増幅法が選択される限り、単一のプライマーのみ（任意の所定のプライマー対のフォワードプライマーまたはリバースプライマーのいずれか）を用いて生成され得る。当業者は、過度の実験を行うことなく、病原体同定用単位複製配列を生成するためにこの増幅法を適応することができる（Pena, SDJ et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A (1994) 91, 1946-1949）。
【００５１】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドプライマーは、配列は異なるが全ての既知のインフルエンザウイルスに共通の遺伝子である、PB1遺伝子またはNUC遺伝子をコードする核酸の保存された領域にハイブリダイズする広範囲サーベイプライマーである。広範囲プライマーは、試料中に存在する病原体によるが、未知の病原体を同定し得る。他の場合、単位複製配列の分子量または塩基組成は、未知の病原体を任意の一つのウイルス病原体として種レベルまたはそれより下位のレベルで明確に同定するのに十分な分解能を提供しない。これらのケースは、少なくとも一つのさらなる広範囲サーベイプライマー対から、または少なくとも一つのさらなるディビジョンワイドプライマー対から、または少なくとも一つのさらなるドリルダウンプライマー対から生成された、一つまたは複数の単位複製配列のさらなる分析から利益を享受する。多くの場合、亜種の特徴の同定は、ウイルス感染に対する適当な臨床的処置を決定するために、または新規のウイルス株の出現に迅速に対応して大規模な流行もしくは汎発流行を防止するために重要である。
【００５２】
いくつかの態様において、増幅に使用されるプライマーは、ゲノムDNA、細菌プラスミドのDNA、DNAウイルスのDNA、またはRNAウイルスのRNAから逆転写されたDNAにハイブリダイズおよび増幅する。特に、非ウイルス核酸またはウイルス核酸と非ウイルス核酸の混合物の同定は、生物工学的な病原体を検出するのに有用である。
【００５３】
いくつかの態様において、増幅に使用されるプライマーは、ウイルスRNAに直接ハイブリダイズし、ウイルスRNAの直接増幅からDNAを得るための逆転写プライマーとして機能する。逆転写酵素を用いてcDNAを生成するためにRNAを増幅する方法は当業者に周知であり、過度の実験を行うことなく日常的に確立することができる。
【００５４】
増幅プライマー設計の分野の当業者は、所定のプライマーが、増幅反応において相補的な核酸鎖の合成を効果的に刺激するために100％の相補性でハイブリダイズする必要がないことを認識しているであろう。プライマー対の配列は、整列させた病原体配列の中で「ベストフィット」するものであり得、従ってアラインメントにおける病原体の任意の一つのハイブリダイゼーション領域に完全に相補的でない場合もある。さらに、プライマーは、一つまたは複数のセグメントにまたがってハイブリダイズしてもよく、介在または隣接するセグメントがハイブリダイゼーション現象に関与しない（例えばループ構造またはヘアピン構造）。プライマーは、表2に列挙されるプライマーのいずれかと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％の配列同一性を有してもよい。従って、いくつかの態様において、本明細書中に開示される特定のプライマー配列に対して70％〜100％の程度のばらつき、またはその間の任意の範囲の配列同一性が生じ得る。配列同一性の決定は、以下の例で示される：二つの非同一残基を有する別の20核酸塩基プライマーと同一の20核酸塩基長のプライマーは20分の18の同一性の残基（18/20＝0.9または90％の配列同一性）を有する。別の例において、全ての残基が20核酸塩基長のプライマー内の15核酸塩基セグメントと同一の15核酸塩基長のプライマーは、20核酸塩基プライマーと15/20＝0.75または75％の配列同一性を有する。パーセント同一性は、自然数である必要はなく、例えば連続する28核酸塩基プライマーが連続する31核酸塩基プライマーと完全に同一の場合（28/31＝0.9032または90.3％の同一性）がある。
【００５５】
パーセント相同性、配列同一性、または相補性は、例えば、Gapプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison WI）を、SmithおよびWatermanのアルゴリズム（Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489）を使用するデフォルト設定で使用することによって決定することができる。いくつかの態様において、ウイルス核酸の保存されたプライミング領域に対するプライマーの相補性は、約70％〜約80％の間である。他の態様において、相同性、配列同一性、または相補性は、約80％〜約90％の間である。さらに他の態様において、相同性、配列同一性、または相補性は、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％である。
【００５６】
いくつかの態様において、本明細書中に記載されるプライマーは、本明細書中に具体的に開示されるプライマー配列と少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％、または100％の（またはその間の任意の範囲の）配列同一性を有する。
【００５７】
当業者は、パーセント配列同一性またはパーセント配列相同性を算出することができ、かつ過度の実験を行うことなく、対応する病原体同定用単位複製配列の単位複製配列の生成のために、核酸の相補鎖の合成をプライミングする上で、その役割におけるプライマーの機能に対するプライマーの配列同一性のばらつきの効果を決定することができる。
【００５８】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドプライマーは、13〜35核酸塩基長（13〜35個の連結されたヌクレオチド残基）である。これらの態様は、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、もしくは35核酸塩基長の、またはその間の任意の範囲のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【００５９】
いくつかの態様において、任意の所定のプライマーは、プライマーの5'末端に、非鋳型T残基の付加（すなわち、付加されたT残基は増幅される核酸にハイブリダイズするとは限らない）を含む修飾を含む。非鋳型T残基の付加は、分子量分析の結果を不明瞭にする可能性のある現象であるTaqポリメラーゼの非特異的酵素活性の結果としての非鋳型A残基の付加を、最小限に抑える効果を有する（Magnuson et al., Biotechniques, 1996, 21, 700-709）。
【００６０】
プライマーは、一つまたは複数のユニバーサル塩基を含み得る。種の間で保存された領域において（三番目の位置におけるコドンのゆらぎに起因する）何らかのばらつきが、DNA（またはRNA）トリプレットの三番目の位置で生じる可能性があるため、オリゴヌクレオチドプライマーは、この位置に対応するヌクレオチドが複数のヌクレオチドに結合できる塩基（本明細書中ではこれを「ユニバーサル核酸塩基」と称する）となるよう設計され得る。例えば、この「ウォッブル型」塩基対の下では、イノシン（I）はU、C、またはAに結合し、グアニン（G）はUまたはCに結合し、ウリジン（U）はUまたはCに結合する。他のユニバーサル核酸塩基の例には、ニトロインドール、例えば5-ニトロインドールまたは3-ニトロピロール（Loakes et al., Nucleosides and Nucleotides, 1995, 14, 1001-1003）、縮重ヌクレオチドdPまたはdK（Hill et al.）、5-ニトロインダゾールを含む非環式ヌクレオシドアナログ（Van Aerschot et al., Nucleosides and Nucleotides, 1995, 14, 1053-1056）、またはプリンアナログ1-(2-デオキシ-ベータ-D-リボフラノシル)-イミダゾール-4-カルボキサミド（Sala et al., Nucl. Acids Res., 1996, 24, 3302-3306）が含まれる。
【００６１】
いくつかの態様において、ウォッブル塩基による幾分弱い結合を補うために、オリゴヌクレオチドプライマーは、各トリプレットの一番目および二番目の位置が非修飾ヌクレオチドよりも高い親和性で結合するヌクレオチドアナログで占められるように設計される。これらのアナログの例には、チミジンに結合する2,6-ジアミノプリン、アデニンに結合する5-プロピニルウラシル、ならびにGに結合する、5-プロピニルシトシンおよびG-クランプを含むフェノキサジンが含まれるがこれらに限定されない。プロピニル化ピリミジンは、各々が同一出願人による特許でありかつその全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,645,985号、第5,830,653号、および第5,484,908号に記載されている。プロピニル化プライマーは、米国特許前公報第2003-0170682号に記載されており；これもまた同一出願人によるものでありかつその全体が参照により本明細書に組み入れられる。フェノキサジンは、各々その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,502,177号、第5,763,588号、および第6,005,096号に記載されている。G-クランプは、各々その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,007,992号および第6,028,183号に記載されている。
【００６２】
いくつかの態様において、進化速度の速いRNAウイルスの広範なプライミングを可能にするため、プライマーのハイブリダイゼーションは、5-プロピニルデオキシ-シチジンヌクレオチドおよびデオキシ-チミジンヌクレオチドを含むプライマーおよびプローブを使用することで強化される。これらの修飾プライマーは、高い親和性および塩基対形成の選択性を提供する。
【００６３】
いくつかの態様において、増幅効率を改善するためプライマー・鋳型二本鎖の融解温度（Tm）を上昇させるために非鋳型プライマータグを使用する。非鋳型タグは、鋳型に相補的でないプライマー内の少なくとも三連続するAまたはTヌクレオチド残基である。任意の所定の非鋳型タグにおいて、AはCまたはGで置き換えることができ、TもまたCまたはGで置き換えることができる。ワトソン・クリックハイブリダイゼーションが鋳型よりも非鋳型タグの方で生じるということは考えられないが、A-T対よりも過剰なG-C対における水素結合は、プライマー・鋳型二本鎖の安定性を高め、かつプライマーが前のサイクルで合成された鎖にハイブリダイズした場合にその後の増幅サイクルにおける増幅効率を改善する。
【００６４】
他の態様において、非鋳型タグと同様の様式でプロピニル化タグを使用する。二つまたはそれ以上の5-プロピニルシチジン残基または5-プロピニルウリジン残基がプライマー内の鋳型と一致する残基の代わりに使用される。他の態様において、プライマーは、修飾インターヌクレオシド結合、例えばホスホロチオエート結合を含む。
【００６５】
いくつかの態様において、プライマーは質量修飾タグを含む。特定の分子量の核酸の潜在的な塩基組成の総数を減らすことで、単位複製配列の塩基組成の決定における、曖昧さの普遍的原因を回避する手段を提供する。所定のプライマーの特定の核酸塩基への質量修飾タグの付加は、所定の病原体同定用単位複製配列の塩基組成の、その分子量からのデノボ決定を簡素化させ得る。
【００６６】
いくつかの態様において、質量修飾核酸塩基は、以下のうちの一つまたは複数を含む：例えば、7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5-三リン酸、5-ヨード-2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸、5-ブロモ-2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸、5-ヨード-2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸、5-ヒドロキシ-2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸、4-チオチミジン-5'-三リン酸、5-アザ-2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸、5-フルオロ-2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸、O6-メチル-2'-デオキシグアノシン-5'-三リン酸、N2-メチル-2'-デオキシグアノシン-5'-三リン酸、8-オキソ-2'-デオキシグアノシン-5'-三リン酸、またはチオチミジン-5'-三リン酸。いくつかの態様において、質量修飾核酸塩基は、15Nもしくは13Cまたは15Nおよび13Cの両方を含む。
【００６７】
いくつかの態様において、所定の病原体同定用単位複製配列の分子量は、質量分析により決定される。質量分析は様々な利点を有し、その利点とは特に、広範囲の質量対電荷比（m/z）にわたって多くの分子ピークを分離（および単離）する能力により特徴付けられる大きな帯域幅である。従って質量分析は、本質的に並行検出スキームであり、あらゆる単位複製配列がその分子量により同定されるため、放射能標識または蛍光標識を必要としない。質量分析における当技術分野の現在の状況では、試料の分子的内容物についての情報を得るためにフェムトモル未満の量の物質を容易に分析できる。その物質の分子量の正確な評価は、その試料の分子量が数百原子質量単位（amu）もしくはダルトンであろうが10万を超えるものであろうが関係なく、素早く得ることができる。
【００６８】
いくつかの態様において、インタクトな分子イオンは、試料を気相に変換するための様々なイオン化技術の一つを用いて、単位複製配列から生成される。これらのイオン化方法には、エレクトロスプレーイオン化（ES）法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（MALDI）、および高速原子衝撃イオン化法（FAB）が含まれるがこれらに限定されない。イオン化により、異なる電荷を有するイオンが形成されるため、一つの試料からいくつかのピークが観察される。単一の質量スペクトルから得られる分子量の複数の読み取り値を平均化することにより、病原体同定用単位複製配列の分子量の概算値が得られる。エレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）は、相当量の断片化を起こすことなく試料の多価分子の分布を形成するため、超高分子量のポリマー、例えば10kDaより大きな分子量を有するタンパク質および核酸に特に有用である。
【００６９】
使用される質量検出器には、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型質量分析計（FT-ICR-MS）、または飛行時間型（TOF）、イオントラップ型、四重極型、磁場型、Q-TOF、および三連四重極型が含まれるがこれらに限定されない。
【００７０】
いくつかの態様において、過去に観察されていない塩基組成（「真に未知の塩基組成」としても公知である）の所定の系統への割り当ては、パターン分類モデルアルゴリズム（pattern classifier model algorithm）の使用を通じて達成され得る。塩基組成は、配列と同様、例えば種の中で菌株ごとに若干異なる。いくつかの態様において、パターン分類モデルは、変異確率モデル（mutational probability model）である。他の態様において、パターン分類モデルはポリトープ（polytope）モデルである。
【００７１】
一つの態様において、各々の種についての組成面の制約を取り囲むよう「塩基組成確率クラウド」を形成することによってこの多様性を管理することが可能である。これにより、配列分析と同様の様式で生物を同定することが可能になる。塩基組成確率クラウドの概念を視覚化するのに「偽四次元プロット」を使用することができる。最適なプライマー設計には、最適な病原体同定用単位複製配列の選択が必要であり、これは個々の病原体の塩基組成シグネチャー間の分離を最大にする。クラウドが重複する領域は、誤分類の可能性のある領域を示し、これは、塩基組成確率クラウドの重複による影響を受けない病原体同定用単位複製配列を用いる三角同定プロセスにより克服される問題である。
【００７２】
いくつかの態様において、塩基組成確率クラウドは、潜在的な塩基組成の誤分類を回避するために、可能性のあるプライマー対をスクリーニングする手段を提供する。他の態様において、塩基組成確率クラウドは、その核酸配列における進化上の歩みに起因して、その割り当てられた塩基組成が過去に観察されておらずかつ／または病原体同定用単位複製配列の塩基組成データベースにおいて指標とされていない未知の病原体の実体を予測するための手段を提供する。従って、プローブベースの技術と異なり、質量分析による塩基組成の決定は、測定を行うために組成または配列についての事前の知識を必要としない。
【００７３】
所定の病原体を同定するのに十分なレベルで病原体を分類する情報を、本明細書中に提供する。さらに、所定の病原体について以前に知られていなかった（例えば、配列情報が利用可能でない場合）塩基組成を決定するプロセスは、塩基組成データベースを満たすさらなる病原体の指標となる情報を提供することによって、以降の段階で有用となる。従って将来の病原体同定のプロセスは、より多くの塩基組成シグネチャーの指標が塩基組成データベースにおいて利用可能になるため大きく改善される。
【００７４】
いくつかの態様において、未知の病原体の実体および量は、図4に示されるプロセスを用いて決定することができる。プライマー（500）および既知の量の較正ポリヌクレオチド（505）を、未知の病原体の核酸を含む試料に添加する。次いで、試料中の総核酸を増幅反応（510）に供し、単位複製配列を得る。単位複製配列の分子量が決定され（515）、ここから分子量および存在量データを得る。病原体同定用単位複製配列の分子量（520）はその実体を提供し（525）、較正ポリヌクレオチドから得られた較正単位複製配列の分子量（530）はその量を提供する（535）。病原体同定用単位複製配列の存在量データは記録され（540）、較正データの存在量データは記録され（545）、その両方が、試料中の未知の病原体の量を決定する計算に使用される（550）。
【００７５】
未知の病原体を含む試料を、その病原体由来の核酸を増幅するプライマー対および較正配列を含む既知の量のポリヌクレオチドと接触させる。増幅率は、病原体の核酸および較正配列について類似すると合理的に仮定される。次いで、増幅反応により、病原体同定用単位複製配列および較正単位複製配列の二つの単位複製配列が生成される。病原体同定用単位複製配列および較正単位複製配列は、本質的に同じ率で増幅されるが、分子量によって識別可能なはずである。差次的な分子量の提供は、較正配列として、典型的な病原体同定用単位複製配列を（病原体の特定の種から）選択し、例えば二つのプライミング部位の間の可変領域内に2〜8核酸塩基の欠失または挿入を行うことによって達成され得る。次いで、病原体同定用単位複製配列および較正単位複製配列を含む増幅された試料を、例えば質量分析による分子量分析に供する。得られる病原体および較正配列の核酸の分子量分析値は、病原体および較正配列の核酸についての分子量データおよび存在量データを提供する。病原体の核酸について得られる分子量データは、塩基組成分析により未知の病原体の同定を可能にする。存在量データは、試料と接触させた較正ポリヌクレオチドの量の知識に基づき、病原体の量の算出を可能にする。
【００７６】
いくつかの態様において、試料に加えられた較正ポリヌクレオチドの量を変化させた標準曲線の作製は、試料中の病原体の量の決定について、さらなる分解能および信頼性の向上を提供する。分子量の分析的決定のために標準曲線を使用することは、当業者に周知であり、過度の実験を行うことなく実施することができる。あるいは、較正ポリヌクレオチドは、病原体と同一条件下で独自の反応ウェルにおいて増幅され得る。標準曲線はそこから作製され、病原体の相対的な存在量は直線回帰等の方法によって決定することができる。いくつかの態様において、複数の病原体同定用単位複製配列が複数のプライマー対によって増幅され、このプライマー対が対応する標準較正配列をも増幅するという多重増幅が行われる。この態様または他の態様において、標準較正配列は、必要に応じて、較正ポリヌクレオチドとして機能する単一の構築物（好ましくはベクター）内に含まれる。競合的PCR、定量PCR、定量競合的PCR、多重較正ポリヌクレオチドは全て、当業者に周知の方法および物質であり、過度の実験を行うことなく実施することができる。
【００７７】
いくつかの態様において、較正ポリヌクレオチドは、増幅条件およびその後の分析工程が測定可能な単位複製配列を生成するのに好条件であることを確認するための内部陽性対照として使用される。病原体のゲノムのコピーが存在しない場合でさえも、較正ポリヌクレオチドは較正単位複製配列を生成するはずである。測定可能な較正単位複製配列が生成されないことは、増幅またはその後の分析工程、例えば単位複製配列の精製または分子量決定が良くないことを示す。このような失敗が起きたという結論に達すること自体は、有用なことである。いくつかの態様において、較正配列はDNAで構成される。いくつかの態様において、較正配列はRNAで構成される。
【００７８】
好ましい態様において、較正配列はベクターに挿入され、そのベクター自体が較正ポリヌクレオチドとして機能する。いくつかの態様において、複数の較正配列がベクターに挿入され、そのベクターが較正ポリヌクレオチドとして機能する。このような較正ポリヌクレオチドは、本明細書中では「混合型較正ポリヌクレオチド」と称する。ポリヌクレオチドをベクターに挿入するプロセスは、当業者にとってルーチンであり、過度の実験を行うことなく達成することができる。従って、較正方法は本明細書中に記載される態様に限定されるべきではないことが理解されるはずである。較正方法は、適当な標準較正ポリヌクレオチド配列が設計および使用された場合に、任意の病原体同定用単位複製配列の量の決定に適用することができる。較正物質の挿入に適したベクターを選択するプロセスもまたルーチンであり、過度の実験を行うことなく当業者により達成することができる。
【００７９】
いくつかのプライマー対がインフルエンザウイルスの保存度の高い領域内で病原体同定用単位複製配列を生成し、他のプライマー対がより迅速に進化している可能性のある領域内で病原体同定用単位複製配列を生成することが好ましい。プライマー認識点の先で進化するであろう確率が低い保存された領域内で単位複製配列を特徴付けるプライマー対は、広範囲サーベイ型のプライマーとして有用である。進化しているゲノム領域に対応する単位複製配列を特徴付けるプライマー対は、顕現性変種株を区別するのに有用である。
【００８０】
本明細書中に記載されるプライマー対は、顕現性ウイルスにより引き起こされる疾患を同定するためのプラットフォームを構築する。塩基組成分析は、ハイブリダイゼーションプローブを作製するために病原体の配列を事前に理解する必要性をなくす。従って、別の態様において、ウイルスの同定プロセスが臨床状況で行われる場合、およびウイルスが過去に観察されなかった新種である場合でさえも、ウイルス感染の病因を決定する方法を提供する。これは、この方法が、自然に発生する進化上のばらつき（迅速に進化するウイルスを特徴付けるためにプローブベースの方法または配列決定に依存的な方法を用いた場合の大きな関心事である）による影響を受けないために実現可能なのである。分子量の測定および塩基組成の決定は、配列に関する偏見およびプローブを用いる場合に必要とされるような特異性に対する要件のない不偏的様式で達成される。
【００８１】
別の態様は、異なる場所で得られた複数の試料を疫学的状況下で上記の方法により分析する場合に、ウイルスの任意の種または株の伝播を追跡する手段を提供する。例えば、複数の異なる場所由来の複数の試料は、病原体同定用単位複製配列を生成するプライマーによって分析され、そのサブセットが特定のウイルスを含む。ウイルスを含有するサブセットのメンバーの対応する場所は、特定のウイルスが対応する場所に伝播したことを示す。
【００８２】
本明細書中に記載する方法を実行するためのキットもまた提供する。いくつかの態様において、キットは、病原体同定用単位複製配列を形成するために病原体由来の標的ポリヌクレオチドに対する増幅反応を行うのに十分な量の一つまたは複数のプライマー対を含み得る。いくつかの態様において、キットは、1〜50個のプライマー対、1〜20個のプライマー対、1〜10個のプライマー対、1〜8個のプライマー対、または2〜5個のプライマー対を含み得る。いくつかの態様において、キットは、表2に列挙される一つまたは複数のプライマー対を含み得る。
【００８３】
いくつかの態様において、キットは、一つまたは複数の広範囲サーベイプライマー、ディビジョンワイドプライマー、もしくはドリルダウンプライマー、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。特定の病原体の同定用に選択されたプライマー対を含むよう、キットを設計してもよい。例えば、広範囲サーベイプライマーキットを、未知の病原体をオルソミクソウイルス科のメンバーとして同定するために、最初に使用してもよい。別のディビジョンワイドキットの例は、例えば、ヒトインフルエンザウイルスA型とインフルエンザウイルスB型またはC型を区別するために使用されてもよい。ドリルダウンキットは、例えば、異なるインフルエンザウイルスまたは遺伝子操作されたインフルエンザウイルスの血清型を区別するために使用されてもよい。いくつかの態様において、インフルエンザウイルスを同定することができるように、広範囲サーベイプライマーおよびディビジョンワイドプライマーの組み合わせを含むよう任意のこれらのキットを組み合わせてもよい。いくつかの態様において、キットは、内部増幅較正物質として使用するための標準化型較正ポリヌクレオチドを含み得る。
【００８４】
いくつかの態様において、キットはまた、上記の増幅プロセスのために、十分な量の逆転写酵素（例えばRNAウイルスを同定する場合）、DNAポリメラーゼ、適当なヌクレオシド三リン酸（上記のいずれかを含む）、DNAリガーゼ、および／もしくは反応緩衝液、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。キットはさらに、キットの特定の態様に適した説明書を含み得、このような説明書は、この方法の実行のためにプライマー対および増幅条件を解説するものである。キットはまた、増幅反応用容器、例えば微量遠心分離管等を含み得る。キットはまた、例えば界面活性剤、溶媒、または磁気ビーズに連結され得るイオン交換樹脂を含む、増幅産物から病原体核酸または病原体同定用単位複製配列を単離するための試薬またはその他の物質を含み得る。キットはまた、このキットのプライマー対を用いて測定または算出された病原体の分子量および／または塩基組成の表を含み得る。
【００８５】
以下の実施例は、例示にすぎず、限定として扱うべきではない。
【００８６】
実施例
実施例1：インフルエンザウイルス用の病原体を同定する単位複製配列を定義するプライマーの設計の選択および検証
インフルエンザウイルスを同定する単位複製配列を定義するプライマーの設計のために、インフルエンザウイルスゲノムセグメント配列の系を入手し、整列させ、PCRプライマー対が約45〜約150ヌクレオチド長の産物を増幅し、それらの分子量または塩基組成によって種（インフルエンザウイルスA型、B型、およびC型）および／または個々の株を相互に区別する領域をスキャンした。図1に示される典型的なプロセスをこのタイプの分析に用いる。
【００８７】
各々のプライマー領域について予想される塩基組成のデータベースを、インシリコPCR検索アルゴリズム、例えば（ePCR）を用いて作製した。既存のRNA構造検索アルゴリズム（その全体が参照により本明細書に組み入れられるMacke et al., Nucl. Acids Res., 2001, 29, 4724-4735）を、PCRパラメータ、例えばハイブリダイゼーション条件、ミスマッチ、および熱力学値を含むよう修正した（その全体が参照により本明細書に組み入れられるSantaLucia, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1998, 95, 1460-1465）。これはまた、選択されたプライマー対のプライマー特異性に関する情報を提供する。
【００８８】
広範囲インフルエンザプライマーに加えて、インフルエンザA型およびインフルエンザB型の種に特異的ないくつかの他のプライマーもまた作製した。表1は、プライマーの設計のために使用したインフルエンザのセグメントおよび標的ウイルス種の特異性を示す。PB1遺伝子のインフルエンザB型配列における6つのヌクレオチド欠失は、インフルエンザウイルスを同定する単位複製配列を、既知のインフルエンザ株（ヒト、トリ、ブタ等）を同時に同定できるプライマー対1299番（SEQ ID NO: 81：82）を用いて得る場合に、インフルエンザウイルスA型およびC型からこの種を区別するのを助けることに留意されたい。図2は、プライマー対1299番により刺激された場合の、インフルエンザウイルスの三つの主要な種のインフルエンザウイルスを同定する単位複製配列の分解図を示す三次元ダイアグラムである。
【００８９】
（表１）インフルエンザウイルス種の増幅のためのM1、NUC、PA、PB2、およびPB1遺伝子を標的化するプライマー対の数
2009515509.tif 000002
【００９０】
合計78のプライマー対を設計し、そのうちの5つが全ての既知のインフルエンザ種を幅広く標的化した（プライマー名に「FUL_ALL」を含む）。残りのプライマー対は、本明細書中に記載される方法を用いてインフルエンザウイルスを同定するために設計された（フォワードプライマー名によりソートされた）プライマーのコレクションである表2に示されるような、種タイプ特異的なものであった。「I」は、イノシンを表す。プライマー対の番号は、本発明者らのデータベースのインデックス番号である。プライマー部位は、PB1、PB2、NUC、M1、およびPAを含むインフルエンザウイルス遺伝子上で同定された。表2に示されるフォワードプライマーまたはリバースのプライマーの名称は、プライマーが参照配列においてハイブリダイズするウイルスゲノムの遺伝子領域を示す。フォワードプライマー名FLUAPB2_NC004518_66_92_Fは、フォワードプライマー（「_F」）が参照ウイルスのPB2遺伝子（「PB2」）の残基66〜92（「66_92」）にハイブリダイズすることを示す。この例における参照ウイルスは、インフルエンザA型ウイルス（「FLUA」）であり、これはGenBankにおいてアクセッション番号NC_004518（「_NC004518_」）で参照されている。プライマー名における参照ウイルスの命名法は、参照を提供するよう選択されており、必ずしも、プライマー対が参照ウイルス内のその標的部位に100％の相補性を有するよう設計されていることを意味するわけではない。プライマー設計の解説は本明細書中に提供されている。「MODS」という用語は、以前に設計されたプライマー対に対する少なくとも一つの修飾を有するプライマー対を意味する。例えば、プライマー対2780番（フォワードプライマー名FLUPB1_1297MODS_J02151_1212_1235_F）は、プライマー対1297番のフォワードプライマーに対するイノシン置換を有する。
【００９１】
（表２）インフルエンザウイルス同定用のプライマー対
2009515509.tif 000003
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【００９２】
これらのプライマーを、ATCC（Manassas, VA 20108）から入手したインフルエンザウイルス分離菌のパネルに対して試験した。上記のウイルス遺伝子の各々について、インフルエンザA型種およびB型種に特異的となるようT7タグ標識をしたプライマーの系列を設計した。この実験の目的は、ATCCウイルスストックのプライマーの検証および定量のために使用できる、一つまたは複数のウイルス遺伝子のセグメントのインビトロ転写物（IVT）を生成することであった。T7プライマーは、インフルエンザA型（VR-1520）およびインフルエンザB型（VR-296）のPB1セグメントおよびNUCセグメントを標的化するものであり、IVT-1520A-PB1、IVT-1520A-NP、IVT-296-PB1、およびIVT-296-NPと名付けた4つのcDNAを生成した。
【００９３】
図3のゲル画像に示されるように、ブロードプライマーは、約100コピーの投入濃度でインフルエンザA型およびインフルエンザB型の両方の構築物を検出することができた。より特異的なプライマーは、PCR反応の推計限度（およそ3〜15コピー）に対して感受性であった。これらのIVT構築物を用いて、ATCCストック（VIR 1520およびVIR 296）に対する限界希釈系列実験を行い、それらのゲノム濃度を概算した。これらの概算値を、表2に記載される残りのプライマーの検証に使用した。最後に、プライマーを、1000および100ゲノムコピーで上記試験ウイルスのパネルに対して試験した。試験パネルは、8つのインフルエンザA型分離菌（6つのH1N1分離菌および2つのH3N2分離菌）ならびに7つのインフルエンザB型分離菌を含み、これらは全て、ATCCから入手した（表3）。全てのインフルエンザA型およびB型プライマーは、1000ゲノムコピーの対応する試験分離菌に対して作用し、いくつかは100ゲノムコピーでも作用した。これらのプライマーのサブセットを、インフルエンザA型ウイルスの種および亜型に関して宿主を区別するそれらの能力のバイオインフォマティクス分析に基づき、さらなる検討のために選択した。
【００９４】
（表３）表2のプライマー対を試験するために使用したインフルエンザウイルス種A型およびB型の株
2009515509.tif 000009
【００９５】
いくつかのプライマー対由来の増幅産物の塩基組成を分析し、インフルエンザA型ウイルスの高速同定を提供しかつ菌株分解能を有するプライマーのサブセットを決定した。単一プライマー対を用いた分析は、全グループの50％分解をもたらした。さらなる分解を、三角同定において複数のプライマー対を用いて行った。4つのプライマー対の組み合わせは、種レベルで＞90％の分解をもたらした。三角同定において生成されたデータのさらなる分析は、98％より高い分解能で、宿主種特異性に沿って様々なH型およびN型への分類を提供した。3つのヒトH5N1株から分解されなかった一つのトリH5N1種のグループ（9つの分離菌）を除いて、全ての他のトリ分離菌は、相互にかつ他の種のタイプから明確に区別された。例外は、ベトナムおよびタイにおいて2004年に出現した分離菌由来のものであった。この2004年に出現したウイルス由来のヒトH5N1ウイルスは、トリH5N1種と均一かつ類似であった（Cimons, ASM News (2005), 71(9), 420-4）。同様に、1996/97年に日本で得られたヒトH3N2分離菌のうちの二つは、本明細書中に記載される4つのプライマー対に基づき、同じ時期に得られた和豚分離菌から宿主レベルで識別不能であった。これらの例外については、ウイルスは、プライマー対および塩基組成分析を用いて同定されたが；これらのウイルスはトリおよびブタウイルスであるため、宿主種はそれぞれトリまたはブタであるものと推定される。他のデータ（示さず）は、このアプローチが他の宿主／タイプの組み合わせについても同様にはっきりと作用することを示している。
【００９６】
実施例2：試料の調製およびPCR
Qiagen QIAamp Virus BioRobot MDx キット（Valencia, CA 91355）を用いてウイルスのゲノム物質を得るため、試料を処理した。得られたゲノム物質をMJサーモサイクラーDyadユニット（BioRad laboratories, Inc., Hercules, CA 94547）を用いて増幅し、その単位複製配列をBruker Daltonics Micro TOF 機器（Billerica, MA 01821）で特徴付けを行った。得られた分子量測定値を塩基組成に変換し、プライマー対および病原体で指標となる塩基組成を含むデータベースに対して問い合わせを行った。
【００９７】
全てのPCR反応物を、Packard MPII 液体ハンドリングロボットプラットフォーム（Perkin Elmer, Bostan, MA 02118）およびMJ. Dyadサーモサイクラー（BioRad, Inc., Hercules, CA 94547）を用いて混合し、96ウェルマイクロタイタープレートフォーマットの50μl反応物とした。このPCR反応混合物は、4ユニットのAmplitaq Gold、1×緩衝液II（Applied Biosystems, Foster City, CA）、1.5mM MgCl2、0.4M ベタイン、800μM dNTP混合物、および250nMの各プライマーからなるものであった。以下の典型的なPCR条件を使用した：95℃で10分間、その後に95℃で30秒間、48℃で30秒間、および72℃で30秒間を8サイクル（48℃のアニーリング温度は8回のサイクルの各々につき0.9℃ずつ上昇させた）。次いでPCRを、95℃で15秒間、56℃で20秒間、および72℃で20秒間を37サイクル追加で継続した。当業者は、PCR反応を理解しているであろう。
【００９８】
実施例3：PCR産物の質量分析のためのイオン交換樹脂-磁気ビーズによる液相捕獲精製
核酸の磁気ビーズに連結されたイオン交換樹脂による液相捕獲のために、2.5mg/mLのBioCloneアミン末端超常磁性ビーズ（San Diego, CA 92126）25μlを、約10pMの単位複製配列を含むPCR(またはRT-PCR)反応液25〜50μlに添加した。前記懸濁液を、激しく攪拌またはピペッティングすることにより、約5分間混合し、その後磁気分離装置を使用した後にその液体を除去した。その後結合したPCR単位複製配列を含むビーズを、50mM炭酸水素アンモニウム/50％MeOHまたは10OmM炭酸水素アンモニウム/50％MeOHで3回洗浄し、その後50％MeOHでさらに3回洗浄した。結合したPCR単位複製配列を、25mMピペリジン、25mMイミダゾール、ペプチド較正標準を含む35％MeOHの溶液で溶離した。
【００９９】
実施例4：質量分析および塩基組成分析
ESI-FTICR質量分析計は、積極的に(actively)遮蔽した7テスラ超伝導磁石を使用する、Bruker Daltonics(Billerica, MA) Apex II 7Oeエレクトロスプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロン共鳴型質量分析計をベースにした。積極的遮蔽は、超伝導磁石からの漏れ磁場(fringing magnetic field)の大半を、比較的小さい容積へと限定する。従ってCRTモニター、ロボット構成部品、および他の電子製品などの、漂遊磁場から有害に作用され得る部品を、FTICR質量分析計に非常に近接して操作することができる。パルス配列の制御およびデータ獲得の全ての局面は、600MHz Pentium IIデータステーションで、Windows NT 4.0 オペレーションシステム上でBruker's Xmassソフトウェアを走らせて行った。典型的には15μlの試料アリコートを、96-ウェルマイクロタイタープレートから、FTICRデータステーションにより始動される、CTC HTS PAL自動試料採取器(LEAP Technologies, Carrboro, NC)を使用し、直接抽出した。試料を、ESI源へ流量100μl/時で供給するフルイディックス操作システムと一体化された、10μl試料ループに直接注入した。イオンを、off軸を使用し、ガラス製脱溶媒キャピラリーの金属末端から約1.5cmに配置されたエレクトロスプレープローブが接地された、改良型Analytica(Branford, CT)給源において、エレクトロスプレーイオン化により発生した。データ獲得時に、ガラス製キャピラリーの大気圧末端に、ESI針に対し6000Vでバイアスをかけた。無水N2の向流流れを使用し、脱溶媒過程を補助した。イオンを、rf-オンリー(only)ヘキサポール、スキマーコーンおよび補助ゲート電極で構成された外部イオン貯蔵庫に蓄積し、その後捕獲用イオンセルへ注入し、そこでこれらの質量を分析した。イオン化デューティサイクル＞99％を、同時にイオン検出時に外部イオン貯蔵庫内にイオンを蓄積することにより実現した。各検出事象は、2.3秒でデジタル化された1Mデータ点で構成された。シグナルノイズ比(S/N)を改善するために、32スキャンを、総データ獲得時間74秒で、同時追加(co-added)した。
【０１００】
ESI-TOF質量分析計は、Bruker Daltonics MicroTO（商標）をベースにしている。ESI源からのイオンは、直交イオン引き出し(orthogonal ion extraction)を受け、検出前にリフレクトロンにおいて焦点化される。TOFおよびFTICRは、先に説明された同じ自動化された試料操作およびフルイディックスが装着される。イオンは、FTICR ESI源と同じoff-軸スプレー装置およびガラス製キャピラリーを装着した、標準MicroTOF（商標）ESI源において形成される。結果的に、給源の条件は、先に説明されたものと同じであった。データ獲得時のイオン化デューティサイクルを向上するために、外部イオン蓄積も使用した。TOF上の各検出事象は、75μ秒でデジタル化された75,000データ点で構成された。
【０１０１】
この試料送達スキームは、試料アリコートが、エレクトロスプレー源へ、高い流速で迅速に注入され、引き続き改善されたESI感度のために、はるかに低い流量でエレクトロスプレー処理されることを可能にする。試料の注入の前に、試料の汚染/キャリーオーバーを防ぐために、トランスファーラインおよびスプレー針をすすぐために、大量の緩衝液を高流量で注入した。すすぎ工程の後、自動試料採取装置に、次の試料を注入し、流量を低流量にスイッチした。短い平衡化遅滞の後、データ獲得を開始した。スペクトルを同時追加したので、自動試料採取装置はシリンジのすすぎを継続し、緩衝液を採取し、注入器および試料トランスファーラインをすすいだ。一般に、2回のシリンジすすぎ、1回の注入器すすぎが、試料のキャリーオーバーを最小化するために必要であった。慣習的なスクリーニングプロトコールの間に、新規の試料混合物を、106秒毎に注入した。より最近になって、シリンジ針の迅速洗浄ステーションが実行され、これはより短い獲得時間と組み合わせた場合、正に1スペクトル/分以下の速度で質量スペクトルの獲得を促進する。
【０１０２】
生の質量スペクトルは、内部質量標準により後較正し、モノアイソトピック分子量へデコンボルーションした。曖昧でない塩基組成は、相補的一本鎖オリゴヌクレオチドの正確な質量測定値に由来した。定量結果は、1ウェルにつき500分子で、各PCRウェル毎に存在する内部PCR較正標準との、ピーク高さの比較により得た。較正法は、特許権保有者が共通の米国特許仮出願第60/545,425号に開示されており、これは全体が本明細書に参照として組み入れられている。
【０１０３】
実施例5：分子量が修飾されたデオキシヌクレオチド三リン酸を使用する単位複製配列の塩基組成のデノボ決定
4種の天然の核酸塩基の分子量は、比較的接近した分子量範囲を有する(A＝313.058、G＝329.052、C＝289.046、T＝304.046、ダルトン値、表4参照)ので、塩基組成の割り当てにおける曖昧さの執拗な原因は、以下のように生じる：塩基組成の差異を有する2つの核酸鎖は、2本の鎖の間の塩基組成の差異が、C<->T(+15.000)と組み合わせたG<->A(-15.994)である場合に、約1Daの差異を有し得る。例えば、塩基組成A27G30C21T21を有する1本の99-mer核酸鎖は、理論的に分子量30779.058を有するが、塩基組成A26G31C22T20を有する別の99-mer核酸鎖は、理論的に分子量30780.052を有し、分子量の差異はわずか0.994Daである。分子量の1Daの差異は、分子量測定の実験誤差の範囲内であり得、従って4種の天然の核酸塩基の相対的に狭い分子量範囲は、このタイプの状況下で不確実性要因をもたらす。この理論上の1Daの不確実性要因を排除する1つの方法は、1つの質量タグ標識した核酸塩基および3つの天然核酸塩基を有する核酸の増幅を使用する。
【０１０４】
増幅反応、またはプライマーそれら自身における、4種の核酸塩基(dNTP)のひとつへの付加の意味のある質量は、C<->Tと組み合わせたG<->A事象などの曖昧さから生じる得られた単位複製配列の質量の有意差(1Daよりも大きい)を生じるであろう（表4）。従って同じく5-ヨード-C<->T(-110.900)事象と組み合わせたG<->A(-15.994)事象は、126.894Daの分子量差を生じるであろう。塩基組成A27G30 5-ヨード-C21T21(33422.958)の分子量を、A26G31 5-ヨード-C22T20(33549.852)と比較する場合、理論的分子量差は+126.894である。分子量測定値の実験誤差は、この分子量差に関して有意ではない。さらに99-mer核酸の測定された分子量と一致する唯一の塩基組成は、A27G30 5-ヨード-C21T21である。対照的に、質量タグを伴わない類似の増幅は、18種の可能性のある塩基組成を有している。
【０１０５】
（表４）天然の核酸塩基および質量-修飾された核酸塩基5-ヨード-Cの分子量ならびに転移から得られる分子量の差異
2009515509.tif 000010
【０１０６】
病原体同定用単位複製配列の質量スペクトルは、例えばレーダーシグナル処理において広範に使用されるもののような、最尤法演算処理装置を用いて分析できる。このプロセッサーは、最初に入力データ上の各塩基組成アグリゲートについて一致したフィルターを試行することにより、各プライマーに関する質量分析計への入力の最尤推定値を作製する。これは、各プライマーに関する較正物質に対する応答を含む。
【０１０７】
このアルゴリズムは、天然の生物および環境汚染物質の複雑なバックグラウンドが関与する条件に関する、検出確率、対、偽アラーム確率のプロットが頂点に達する性能予測を強調している。一致したフィルターは、各病原体について使用されたプライマーのセットを与えた、シグナル値の先験的予測からなる。ゲノム配列データベースを使用し、質量塩基カウントの一致したフィルターを定義する。このデータベースは、公知の細菌病原体の配列を含み、および脅威の生物に加え良性の背景生物を含む。後者を使用し、背景生物により作製されたスペクトルシグネチャーを推測しおよび減算する。公知の背景生物の最尤検出は、一致したフィルターおよびノイズ共分散のランニングサム推定値を用いて実行される。背景シグナル強度は、概算され、一致したフィルターと共に使用され、シグネチャーを形成し、これは次に減算される。最尤法過程は、それらの生物に関する一致されたフィルター、およびクリーナップされたデータのノイズ共分散のランニングサム推定値を使用する同様の方法でこの「クリーンアップ」されたデータに適用される。
【０１０８】
各プライマーに関する病原体同定用単位複製配列の全ての塩基組成の増幅は、較正され、生物当たりの最終最尤振幅(amplitude)の推定値は、複数の単独プライマー推定値を基に作製される。全てのシステムノイズのモデルは、この2段階最尤法計算を考慮している。プロセッサーは、スペクトルに含まれる各塩基組成の分子の数を報告する。適当なプライマーセットに対応する単位複製配列の量に加え、増幅反応の完了時に残存するプライマーの量が報告される。
【０１０９】
塩基カウントの不鮮明化は、以下のように実行され得る。電気的PCRが、各プライマー対について得られる異なる予想される塩基カウントを得るために、所望の病原体のヌクレオチド配列について実行され得る。例えば、Schuler, Genome Res. 7:541-50, 1997；または国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI, NIH, Bethesda, MD 20894）から入手可能なe-PCRプログラムを参照のこと。ひとつの例示的態様は、複数のスプレッドシートを含むワークブック（例えばMicrosoft Excel）の1つまたは複数のスプレッドシートを使用する。この例において最初に、ワークブック名に類似した名称を伴うワークシートが存在し；このワークシートは、生の電気的PCRデータを含む。第二に、「フィルターをかけた病原体塩基カウント」と称されるワークシートが存在し、これは病原体名および塩基カウントを含む；属および種について同定されない配列を取り除いた後、および10未満の菌株の病原体に関する全ての配列を取り除いた後、各菌株について個別の記録が存在する。第三に、このプライマー対の置換、挿入または欠失の頻度を含む、「シート1」のワークシートが存在する。このデータは、「フィルターをかけた病原体塩基カウント」ワークシートの中のデータからピボットテーブルを最初に作成し、およびExcel VBAマクロを実行することにより作成される。このマクロは、同じ種で異なる株の病原体に関する塩基カウントの差異の表を作成する。当業者は、過度の実験をすることなく、同様の表の差分を得る、追加の経路を理解することができる。
【０１１０】
例示的スクリプトの適用は、ユーザーが、各病原体に関して塩基カウントの参照セットにより提示される菌株の画分を特定する閾値を定義することに関連している。各病原体の塩基カウントの参照セットは、閾値に合致するかまたはこれを超えることが必要であるので、多くの差のある塩基カウントを含み得る。参照塩基カウントのセットは、最も豊富な株の塩基型の組成を採用し、および参照セットを加え、その後閾値に合致するかまたはこれを超えるまで、次に最も豊富な株の塩基型の組成を追加することにより、定義される。現時点のデータセットは、経験的に得られた閾値55％を用いて得られた。
【０１１１】
各塩基カウントに関して、病原体の参照塩基カウントセットは含まれず、このスクリプトは、その時点の塩基カウントが、参照セットの塩基カウントの各々とは異なる様式を決定するように、次に進行する。この差異は、置換Si＝Xi、および挿入Ii＝Yi、または欠失Di＝Ziの組み合わせとして表され得る。1種よりも多い参照塩基カウントが存在する場合、報告された差異は、変化の数を最小化すること、および同じ数の変化を伴う場合には、挿入または欠失の数を最小化することを目的とする規則を用いて選択される。従って原則は、例えば、2個の置換よりも1個の挿入であるような、最小和(Xi＋Yi)または(Xi＋Zi)による差異を同定する。最小和により2個またはそれよりも多い差異が存在する場合、それは最大の置換を含むと報告される。
【０１１２】
塩基カウントと参照組成の間の差異は、1、2またはそれよりも多い置換、1、2またはそれよりも多い挿入、1、2またはそれよりも多い欠失、ならびに置換および挿入または欠失の組み合わせとして群別される。核酸塩基変化の差異のクラスおよびそれらの発生の確率は、米国特許出願公開第2004209260号(米国特許出願第10/418,514号)に開示されており、これは全体が本明細書に参照として組み入れられている。
【０１１３】
実施例6：インフルエンザウイルス監視パネル
本明細書中に記載される組成物および方法は、一つまたは複数の未知の病原体を含む疑いのある試料をスクリーニングしてその病原体の少なくとも一つの実体を決定するのに有用である。少なくとも一つの病原体の同定は、オルソミクソウイルス科の二つまたはそれ以上のメンバーにより共有される遺伝子部分についての塩基組成シグネチャーを生成することによって達成される。次いで、塩基組成シグネチャーを、プライマー対および病原体に対する指標である複数の塩基組成シグネチャーと比較する。このコレクション内の複数の塩基組成シグネチャーは、少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも5つ、さらにより好ましくは少なくとも14、さらにより好ましくは少なくとも19、さらにより好ましくは少なくとも25、さらにより好ましくは少なくとも35である。この複数を含む塩基組成シグネチャーは、測定および算出された病原体の塩基組成シグネチャーをその複数に対して問い合わせることで、少なくとも一つの病原体を同定する。
【０１１４】
三種全てのインフルエンザウイルス種（A型、B型、およびC型）および亜型（HxNy）を異なる動物宿主（ヒト、トリ、ブタ等）から増幅し、塩基組成シグネチャーを用いてそれらの本質的な分子的特徴を区別することのできる全インフルエンザウイルスPCRプライマーセットを作製した。特定の種における全ての既知のメンバーを幅広く増幅するが、異なる種のメンバーを交差的に増幅しない、さらなるプライマーを設計した（例えばインフルエンザA型およびインフルエンザB型特異的プライマー）。1つの全インフルエンザプライマー対（表2のプライマー対2798）、5つのインフルエンザA型特異的プライマー対（表2のプライマー対1266、1279，1287，2775、および2777）、ならびに2つのインフルエンザB型特異的プライマー対（表2のプライマー対1261および1275）を含む、8つのプライマーの監視パネルを選択した。図5。網羅する範囲およびこのパネルにより提供される分解能を測定するため、本発明者らは、63種のトリ分離菌、18種のヒトインフルエンザA型分離菌（8種のH1N1、10種のH3N2）、6種のヒトインフルエンザB型分離菌、4種のブタ分離菌（1つの新奇のタイプを含む）、ならびに1種のウマ分離菌を含む、92種の異なるインフルエンザウイルス分離菌を試験した。トリ分離菌は、北米およびアジア／中東にまたがり採取した16種の異なるトリ種から得て、28の異なるH/N型および29のHPAI（H5N1）を表す。この試料設定の多様性にもかかわらず、広範囲プライマーは全ての分離菌から単位複製配列を生成し、これらのプライマーを用いて得た単位複製配列由来の塩基組成シグネチャーは、図6aおよび6bに示されるように分離菌を区別した。ほとんどの分離菌は、既存の配列データのバイオインフォマティクス分析に基づき対応するH/N亜型について予想されたシグネチャーと一致する塩基組成を示した。しかし、分離菌のうちの二つは、いくつかのプライマー座において以前に示されていなかった塩基組成シグネチャーを示した。このことは、これらが新奇のインフルエンザウイルス血清型であることを示唆しており、図6aにおいては「新規」血清型と記している。
【０１１５】
塩基組成シグネチャーはさらに、様々なウイルス由来のゲノムの多次元フィンガープリントを提供する。これらのフィンガープリントは、図7において三つのプライマー対について示されるような、三次元プロットを用いて視覚化される。プロットの各軸は、表2のプライマー対2798、1266、および1287を用いた場合の、示された遺伝子についての塩基組成シグネチャーを含む。プロットに表されたデータは、GenBankの配列データのバイオインフォマティクス分析（中空形状）ならびに図6aおよび6bの塩基組成シグネチャーの実験測定値（塗り潰し形状）を含む。この実験において、ヒトH3N2およびH1N1ウイルスは、独立してクラスター化し、三つの軸全てにおける塩基組成の違いにより区別される。トリH5N1およびH1N1もまた、独立したクラスターとなり、塩基組成により軸に沿って分離される。さらなる分解は、さらなるプライマー対を用いることで提供される。トリH5N1クラスターにおける球体（トリ分離菌）の中で入れ子になっている立方体（ヒト分離菌）（矢印）は、最近報告された、ヒトから単離されたトリH5N1ウイルスの例を表す。
【０１１６】
このクラスターのより深いレベルでの分析は、監視（インフルエンザが存在するかどうかを示す広範囲プライミング）、宿主（例えばトリ、ヒト）およびウイルス（例えばインフルエンザA型、インフルエンザB型）の種形成、サブタイピング（例えばHx Ny）、ならびに遺伝子型解析（例えばH5 N1 - エジプト型、イラク型）を可能にする。図12は、この点を例証する。ここでは、アッセイしたウイルスの遺伝子型をさらに決定するため、図7のトリH5 N1クラスターを分析する。図7は、病原体がインフルエンザであり、ヒトおよびトリ宿主種由来であり、かつインフルエンザA型種であることを示した。図7における塩基組成分析は、トリインフルエンザA型ウイルス種について、二つの亜型：H1 N1およびH5 N1が存在することをさらに示した。図12においては、トリH5 N1の亜型についてより深く分析を行う。図12において、イラク分離菌の近くにクラスター化された一つのエジプト分離菌を除いて、様々な分離菌がひとまとまりのクラスターを形成することが観察される。クラスター内の空間的な違いは遺伝子型の微量のばらつきである。
【０１１７】
実施例7：本発明の組成物および方法を用いたヒト臨床試料の分析および従来的な臨床診断方法との比較
プライマー対およびPCR-ESI/MS法を使用して、656種のヒト臨床試料を盲検分析した。試料は、1999年から2006年までの7年間の間に収集した。プライマー対2798、1266、1279、1287、2775、2777、1261、および1275を三角同定に使用した。収集技術には、咽頭用綿棒、鼻腔用綿棒、および洗浄が含まれた。得られた結果を、ウイルスの単離および標準的なRT-PCR法による同一試料の従来的型の分析と比較した。253試料が、PCR-ESI/MSおよび従来型の培養／RT-PCRの両方により、インフルエンザ陽性であった。10試料が、PCR-ESI/MSにより陽性および培養またはRT-PCRにより陰性であり、8試料が培養／RT-PCRにより陽性でありPCR-ESI/MSにより陰性であり、これらは、従来的な診断法との比較で、PCR-ESI/MS法の98％の感受性および特異性に相当した。
【０１１８】
PCR-ESI/MS分析は、253のインフルエンザ陽性試料のうち、186試料をインフルエンザA型ウイルス、67試料をインフルエンザB型ウイルスであると同定した。PB1、NP、M1、PA、NS1、およびNS2遺伝子の領域の塩基組成の分析と、公開されたインフルエンザウイルス配列由来の推定塩基組成との比較の組み合わせは、高い精度で、これらのウイルスのHおよびNの亜型を推定した。ヒトインフルエンザA型ウイルスは、従来的な血清学的分析およびRT-PCRによる直接的HおよびNタイピングに基づき、152試料のH3N2および34試料のH1N1の亜型に分類された。当然、HまたはNの遺伝子セグメントが混ぜ合わされ（re-assort）、新規の他の遺伝子セグメントのセットと結び付いた場合は、他の遺伝子との関係に基づくHおよびN型の推定は誤る可能性があった。H1N2試料のうちの3試料は、これらのウイルスの亜型がH1N1ウイルス由来のH遺伝子とH3N2ウイルス由来の他の遺伝子セグメントの混ぜ合わせ（re-assortment）により生じていたため、PCR-ESI/MSアプローチによってはサブタイピングができなかった（Holmes, E.C., et al., PLoS Biol. (2005), 3, e300）。
【０１１９】
実施例8：本発明の組成物および方法を用いる混合ウイルス集団の同定
異なるインフルエンザウイルスによる共感染は、異なる塩基組成を有する増幅したウイルス核酸が質量スペクトルにおいて異なる位置で現われるため、PCR-ESI/MSによって高感度で同定できる。混合型PCR-ESI/MS検出のダイナミックレンジは、およそ100：1であることが以前に決定されており（Hofstadler, S. A. et al., Inter. J. Mass Spectrom. (2005) 242, 23）、1％というわずかな混合集団中の存在量でウイルスの変種の検出が可能である。このPCR-ESI/MS監視法を用いる検出は、二次的な試験を必要としない。混合インフルエンザウイルス集団を、オリジナルの患者試料およびそこから得た培養物の両方において同定した（図8）。図8aは、M1の領域を増幅するプライマー対（プライマー対1279）による感染培養液中に存在するインフルエンザA型ウイルスの増幅から得たスペクトルを示す。フォワード鎖が左側、リバース鎖が右側である。そこに示される二つのウイルス種は、標的配列内のAからGの単一ヌクレオチド多型（SNP）により相互に異なり、大まかに言うと試料中に60：40の混合物として存在する。図8bは、プライマー対2775（NS1）を用いた患者試料由来のスペクトルを示し、ウイルス集団のおよそ2％の低存在量の種が存在する。フォワード鎖は、ピークの左側に肩状の盛り上がりを示し、リバース鎖は右側に同様の肩部分を示し、これらはそれぞれ、主要ピークの大きさのおよそ2％の、AからGのばらつきおよびそれに相補的なTからCの質量のシフトに対応する。これらのピークが混合ウイルス集団を表すことを実証するため、PCR単位複製配列をクローニングし、450の独立コロニーを配列決定した。これらの450クローンのうちのわずか9クローンがAからGの変異を有しており、これは測定された低存在量ピークの大きさに十分相関した。図8cおよびdは、それぞれプライマー対1279および2775を用いて分析した2つの追加の臨床試料由来のスペクトルを示す。各々は2006年に収集された試料中で観察された2つの異なる蔓延ウイルスの混合物であり、大まかに言うと20〜40％混合物として2つのウイルス種を含む。これらのウイルスの遺伝子型解析による特徴付けを以下の実施例に記載する。
【０１２０】
実施例9：インフルエンザウイルスの遺伝子型解析および追跡
塩基組成シグネチャーは、出現した菌株の時間的な追跡および地理的な追跡の両方を可能にする。例えば、図9aおよび9bに示されるように、患者試料由来のH3N2陽性分離菌のPCR-ESI/MS塩基組成シグネチャーの分析は、サンプリング期間内に蔓延していたウイルスの公知の系統発生学との高い整合性を示した（4）。
【０１２１】
インフルエンザウイルスの進化と関連する塩基組成の分布を理解するために、本発明者らは、GenBankの世界中のヒトインフルエンザウイルス（H3N2）配列の完全ゲノム配列およびプライマー対2798、1266、1279、1287、2775、および2777を用いて生成した塩基組成シグネチャーの両方を分析した。GenBank配列を、この研究に使用した6つの遺伝子座（ウイルスゲノムの5％以下）にまたがる塩基組成シグネチャーに分解した。各標的遺伝子座における各々の固有の塩基組成シグネチャーに固有の文字記号（例えばA、B、C）を割り当て、6つの遺伝子座をひとつにつなげて、固有の対立遺伝子型を形成した（例えばAADFAA）。図11に示される実験により測定した塩基組成にも文字記号を割り当てた。これらの塩基組成を、Holmesらにより記載されたヒトH3N2の系統発生分布に戻してマッピングした（図11）。このようにして、95の固有の塩基組成型を、配列データからコンピュータ処理により得た（黒で示す）または実験により測定した（赤で示す）合計731のH3N2の塩基組成から決定した。実験により決定した塩基組成がGenBank由来の配列決定した分離菌と一致した場合、配列決定した菌株のみのデータを示す。さらにこのツリーを、2005〜2006年の間にテキサスおよびボルティモアで収集した900未満のインフルエンザ試料（200試料はH3N2について陽性）の現在進行中の分析によって拡張した。
【０１２２】
塩基組成によるこれらの分離菌の関連性の分析は、Holmesらの配列由来のクレードと非常に類似する分布を示す。2002から03年までおよび2003から04年までの二つの異なる蔓延クレードの存在について確かな証拠がある。クレードAで終わるブランチは、1999〜2004年の間の優勢なブランチを表し、同じ時期のクレードBのブランチの世界規模の同時蔓延についての確かな証拠が存在する。しかし、注目すべきは、クレードBの分離菌は、2003〜4年以降のシーズンで世界中で蔓延した優勢なインフルエンザA型ウイルスであるという点である。これは、Genbankの配列データおよび近年の試料から実験により決定した塩基組成の分析により立証されている。蔓延ウイルスの時期的および地理的な関連性は垂直のバーにより示され、様々なインフルエンザウイルスの季節にまたがるインフルエンザウイルスの地球規模の進化を示している。例えば、最近の北米（テキサス／ボルティモア；2005〜6）由来の試料の分析は、前のシーズンにニュージーランド（A/クライストチャーチ／2005）で蔓延した遺伝子型の一つである、親の蔓延ウイルス型（遺伝子型AADFAA）の存在を示した。この試料セットにおいて観察された他の遺伝子型の大部分は、明らかにこの主要な遺伝子型から派生した一つまたは二つの変異であったが、少なくとも二つの他の前のシーズンからの直系子孫についての潜在的な証拠が存在する。これらの分離菌において観察された変異の全てを、PCR産物の直接的配列決定によって検証し、実験により決定した塩基組成を確認した（データは示さず）。従って、本明細書中に記載される塩基組成分析は、地球規模の伝播を特徴付け、新奇のインフルエンザウイルスの出現を観察するための迅速なツールとして使用できる。
【０１２３】
実施例10：高スループットのインフルエンザ検出および分析
有効な監視プログラムにおいては、試料は迅速にアッセイされなければならない。このことは、本発明の組成物および方法を用いることで達成された。PCR-ESI/MS法のスループットを測定するため、336の気道検体を、4つのプライマーセットを用いて分析した。この実験を、リアルタイム監視研究所における試料分析を促進し、研究所の技術者による300を超える試料の核酸抽出が作業日内に完了し、PCRおよび質量分析が自動様式でその日の午後に始まり夜通し（無人で）行われ翌朝に完了するよう設計した。336の試料を26時間で分析した（24時間あたり312試料のスループット）。高スループット実験のタイムテーブルを図10に示す。同一の336試料を再試験する同一実験を次の日に繰り返すことで、このペースが毎週（5日間）1,500を超える試料のスループットで維持できる証拠を提供した。
【０１２４】
上述の記載から、本明細書の記載に対する様々な修正が当業者に明らかとなろう。このような修正は、本発明および添付の特許請求の範囲の意図および範囲内に含まれる。本願において引用した各参考文献（学術文献、米国および米国以外の特許、特許出願公報、国際特許出願公報、遺伝子バンクのアクセッション番号、インターネットウェブサイト等を含むがこれらに限定されない）は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２５】
上記の要旨および詳細な説明は、添付図面と合わせて読むことでより理解が深まる。これらの図面は例示の目的で含まれるものであり、限定の目的を有さない。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】典型的なプライマー選択プロセスを例示する工程図である。
【図２】インフルエンザウイルスの塩基組成の典型的な三次元プロットであり、プライマー対1299番（SEQ ID NO: 81:82）により得られた単位複製配列の長さ、AおよびCの数を示す。各々の球体は、一つまたは複数のウイルス分離菌を表し、これらは全てGenBankにおいてインフルエンザウイルスに関して入手可能なヌクレオチド配列に基づくものである。
【図３】インビトロ転写されたcDNAに対して試験したインフルエンザプライマーについての検証データを提供する。PB1（パネルAおよびB）ならびにNUC（またはNP）（パネルC）を標的とするプライマーを試験した。上パネルにおけるレーンの割り当ては以下の通りである：L1/L5：水；L2〜L4およびL6〜8はブロードPB1プライマーのうちの三つであった。レーン2および3のプライマー（1297および1298）は、インフルエンザA型（パネルA）およびインフルエンザB型（パネルB）の両方について、約100コピーの投入物に対して感受性があった。パネルCは、インフルエンザA型またはB型のいずれかに特異的な、二つの異なるプライマーVIR 1268（インフルエンザA型）およびVIR 1274（インフルエンザB型）を示す。これらのプライマーは、3〜15コピーの投入した鋳型に対して感受性があった。
【図４】較正法の態様を例示する工程図である。
【図５】あるインフルエンザウイルスの監視スキームの代表例である。全インフルエンザウイルスプライマー（PB1）および追加のインフルエンザA型特異的およびインフルエンザB型特異的プライマーを含むプライマーのパネルは、異なる宿主（例えばトリ、ヒト、ブタ）由来の全ての既知のインフルエンザウイルスを検出する。PCR単位複製配列のESI/MS分析は、投入試料の塩基組成シグネチャーを提供する。このシグネチャーは、同定およびタイピングのために既知の塩基組成のデータベースと比較される。
【図６】図6aおよび6bは、様々なウイルス分離菌のパネルについてのインフルエンザウイルス標的遺伝子および観察された塩基組成シグネチャーを示す。
【図７】重要なヒトおよびトリのインフルエンザウイルス亜型の検出および特徴付け。各軸は、単一のプライマー対からの塩基組成シグネチャーを表す。白抜きのシンボルは、公開された配列から決定された算出された塩基組成であり、塗りつぶしのシンボルは、上記実施例における測定値を表す。
【図８】図8a〜8dは、混合ウイルス集団の検出を示すヒートマップおよびスペクトルプロットである。ヒートマップは、そのデータの荷電状態の表示であり；スペクトルプロットは、シグナル表示  対  質量を作製するために電荷状態の反応をフィルタリングすることによって作製される。スペクトルプロットの主要ピークは主要な単位複製配列であり、上部のヒートマップ画像においてはホットスポットとして表れている。二次的な単位複製配列は、ヒートマップにおいて、リバース鎖およびフォワード鎖のそれぞれ左側および右側に「雲状（cloudy）」の領域として表れている。4つのパネルは、混合感染が検出された4つの異なる例を表す。パネルa、c、およびdは、比較的高い割合（20〜50％混合物）で二つの種を含むが、パネルbは、低存在量（2〜5％）混合物の検出を示す。観察された混合物が2005〜06年に蔓延した遺伝子型のうちの二つ（AおよびDまたはAおよびNとして記録）を含んでいた二つの特別な例を、それぞれパネルcおよびdに示す。
【図９】図9aおよび9bは、インフルエンザウイルスのPCR-ESI/MS遺伝子型解析および追跡を示す。図9bは、遺伝子型解析スキームを示す。遺伝子型は、各々のPCR遺伝子座における塩基組成シグネチャーの固有の組み合わせを表す。図9aは、試験した試料において観察された様々なインフルエンザA型の遺伝子型の分布を示す。これらの遺伝子型をGenBankにおいて利用可能な塩基組成情報と比較し、その最も一致する株を示す。図に示される遺伝子型は、収集年（the year of collection）およびその年の優勢な蔓延クレード（the predominant circulating clades during that year）と一致した。
【図１０】未知の病原体を含む336の患者試料の高スループット検出および分析を表す時系列である。
【図１１】既知のインフルエンザウイルスの世界的な広がりおよび新奇のインフルエンザウイルスの出現を特徴付けかつ追跡するインフルエンザウイルスのクレード分布プロット（clade distribution plot）である。このプロットは、1996年〜2006年の間のインフルエンザウイルス（H3N2）分離菌の塩基組成の分析結果である。地理的なサンプリング地域およびインフルエンザ流行期を捉えるため、分離菌を、北半球または南半球を反映する「北」および「南」で標識した。クレードAおよびクレードBの指定は、Holmesらによる分析に基づく。縦棒：直系の先祖；横棒：単一突然変異。
【図１２】複数のトリインフルエンザA型ウイルスH5 N1分離菌由来の塩基組成シグネチャーのプロットに基づく病原体の遺伝子型分析を例示する。病原体は、塩基組成シグネチャーの関数としてグラフにプロットしている。クラスターは、高度に類似する遺伝子型を有する分離菌を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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