(57)【要約】  本発明は、４０％未満がＮ−アセチル化されているＰＮＡＧとキャリアタンパク質との結合方法であって、（ａ）マレイミド基を含むリンカーを添加することによりＰＮＡＧを活性化して、活性化ＰＮＡＧを生成するステップ、（ｂ）スルフィドリル基を含むリンカーを添加することによりキャリアタンパク質を活性化して、活性化キャリアタンパク質を生成するステップ、及び（ｃ）上記活性化ＰＮＡＧと上記活性化キャリアタンパク質とを反応させて、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体を生成するステップを含む方法を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
４０％未満がＮ−アセチル化されているＰＮＡＧとキャリアタンパク質とを結合する方法であって、
（ａ）マレイミド基を含むリンカーを添加することによりＰＮＡＧを活性化して、活性化ＰＮＡＧを生成するステップ；
（ｂ）スルフィドリル基を含むリンカーを添加することによりキャリアタンパク質を活性化して、活性化キャリアタンパク質を生成するステップ；及び
（ｃ）上記活性化ＰＮＡＧと上記活性化キャリアタンパク質とを反応させて、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体を生成するステップ
を含む方法。
【請求項２】
４０％未満がＮ−アセチル化されているＰＮＡＧとキャリアタンパク質とを結合する方法であって、
（ａ）スルフィドリル基を含むリンカーを添加することによりＰＮＡＧを活性化して、活性化ＰＮＡＧを生成するステップ；
（ｂ）マレイミド基を含むリンカーを添加することによりキャリアタンパク質を活性化して、活性化キャリアタンパク質を生成するステップ；及び
（ｃ）上記活性化ＰＮＡＧと上記活性化キャリアタンパク質とを反応させて、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体を生成するステップ
を含む方法。
【請求項３】
４０％未満がＮ−アセチル化されているＰＮＡＧとキャリアタンパク質とを結合する方法であって、
（ａ）スルフィドリル基を含むリンカーを添加することによりＰＮＡＧを活性化して、活性化ＰＮＡＧを生成するステップ；
（ｂ）スルフィドリル基を含むリンカーを添加することによりキャリアタンパク質を活性化して、活性化キャリアタンパク質を生成するステップ；及び
（ｃ）上記活性化ＰＮＡＧと上記活性化キャリアタンパク質とを反応させて、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体を生成するステップ
を含む方法。
【請求項４】
マレイミド基を含むリンカーが、ステップ（ａ）においてＰＮＡＧのアミン基に付加される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
マレイミド基を含むリンカーが、ステップ（ｂ）においてキャリアタンパク質のアミン基に付加される、請求項２記載の方法。
【請求項６】
マレイミド基を含むリンカーが、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＭＢＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＧＭＢＳ及びスルホ−ＳＭＰＢからなる群より選択される、請求項１〜２又は４〜５記載の方法。
【請求項７】
マレイミド基を含むリンカーが、ＧＭＢＳ又はスルホ−ＧＭＢＳである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）において、ＰＮＡＧとマレイミド基を含むリンカーの重量／重量比が１：２〜２：１である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
マレイミド基を含むリンカーを添加することにより活性化するステップが、ｐＨ６．０〜８．０で行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
スルフィドリル基を含むリンカーが、ステップ（ｂ）においてキャリアタンパク質のアミン基に付加される、請求項１、３、４又は６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
スルフィドリル基を含むリンカーが、ＳＰＤＰ、ＬＣ−ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＬＣ−ＳＭＰＴ、スルホ−ＳＰＤＰ、スルホ−ＳＭＰＴ、スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ及びＮ−アセチルホモシステインチオラクトンからなる群より選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
スルフィドリル基を含むリンカーが、ＳＰＤＰ又はＬＣ−ＳＰＤＰである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
スルフィドリル基を含むリンカーが、５〜１０オングストロームのスペーサー長を有する、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
スルフィドリル基を含むリンカーが、１０〜２５又は１５〜２０オングストロームのスペーサー長を有する、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
スルフィドリル基を含むリンカーを添加することにより活性化するステップにおいて、キャリアタンパク質又はＰＮＡＧとスルフィドリル基を含むリンカーの重量／重量比が５０：１〜２：１である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
スルフィドリル基を含むリンカーを添加することにより活性化するステップが、ｐＨ７．０〜９．０で行われる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｃ）において、活性化ＰＮＡＧと活性化キャリアタンパク質の重量／重量比が４：１〜１：４である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｃ）が、ｐＨ６．０〜９．０で行われる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
過剰の活性化基をシステインでブロッキングするさらなるステップ（ｄ）を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
キャリアタンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、ｒＥＰＡ、プロテインＤ、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、Ｆｉｇ、ＭＡＰ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＨａｒＡ、ＳｉｔＣ、αトキシン（Ｈｌａ）、αトキシンＨ３５Ｒ変異体、ＭＲＰＩＩ及びオートリシン、又はこれらの断片からなる群より選択される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法を実施するステップ、及びＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体と薬学的に許容される賦形剤とを混合するさらなるステップを含む、ワクチンの製造方法。
【請求項２２】
ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体とさらなる抗原（複数でもよい）とを混合するさらなるステップを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
さらなる抗原（複数でもよい）が、細菌多糖又はオリゴ糖を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
さらなる抗原が、５型及び／又は８型黄色ブドウ球菌由来の莢膜多糖又はオリゴ糖を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
さらなる抗原（複数でもよい）が、黄色ブドウ球菌由来の３３６抗原を含む、請求項２２又は２３記載の方法。
【請求項２６】
さらなる抗原（複数でもよい）が、ブドウ球菌タンパク質又はその断片を含む、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ブドウ球菌タンパク質又はその断片が、ＷＯ０６／３２４７５号の図１に示される配列のいずれか１つに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体がアジュバントと混合される、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法により得られるＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体。
【請求項３０】
ＰＮＡＧの４０％未満がＮ−アセチル化されており、ＰＮＡＧとキャリアタンパク質が、硫黄原子に結合したマレイミド基を含むリンカーにより結合している、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体。
【請求項３１】
マレイミド基がＰＮＡＧと硫黄原子の間に位置している、請求項３０記載のＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体。
【請求項３２】
マレイミド基がキャリアタンパク質と硫黄原子の間に位置している、請求項３０記載のＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体。
【請求項３３】
以下の構造：
【化１】
2009531389.tif 000009
〔式中、Ｒ１及びＲ２は独立して、場合により置換されていてもよい芳香族若しくは脂肪族鎖、又は結合から選択される。〕
を有する、請求項３０又は３１記載のＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体。
【請求項３４】
以下の構造：
【化２】
2009531389.tif 000010
〔式中、Ｒ１及びＲ２は独立して、場合により置換されていてもよい芳香族若しくは脂肪族鎖、又は結合から選択される。〕
を有する、請求項３０又は３２記載のＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体。
【請求項３５】
ＰＮＡＧの４０％未満がＮ−アセチル化されており、ＰＮＡＧとキャリアタンパク質が、硫黄原子に結合した硫黄原子を含むリンカーにより結合している、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体。
【請求項３６】
以下の構造：
【化３】
2009531389.tif 000011
〔式中、Ｒ１及びＲ２は独立して、場合により置換されていてもよい芳香族若しくは脂肪族鎖、又は結合から選択される。〕
を有する、請求項３５記載のＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体。
【請求項３７】
Ｒ１がＣ１−Ｃ６アルキルである、請求項３３、３４又は３６記載のＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体。
【請求項３８】
Ｒ２がＣ１−Ｃ６アルキルである、請求項３３、３４、３６又は３７記載のＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体。
【請求項３９】
以下の構造：
【化４】
2009531389.tif 000012
を有する、請求項３４記載のＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体。
【請求項４０】
マレイミド基を含むリンカーと共有結合している、４０％未満がＮ−アセチル化されている活性化ＰＮＡＧ。
【請求項４１】
以下の構造：
【化５】
2009531389.tif 000013
〔式中、Ｒ１は、場合により置換されていてもよい芳香族若しくは脂肪族鎖（例えばＣ１−Ｃ６若しくはＣ３アルキル）、又は結合から選択される。〕
を有する、請求項４０記載の活性化ＰＮＡＧ。
【請求項４２】
請求項２９〜３９のいずれか１項に記載のＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体及び薬学的に許容される賦形剤を含むワクチン。
【請求項４３】
ブドウ球菌疾患の治療又は予防に使用するための、請求項２９〜３９のいずれか１項に記載のＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体。
【請求項４４】
ブドウ球菌疾患の治療又は予防のためのワクチンの製造における、請求項２９〜３９のいずれか１項に記載のＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体の使用。
【請求項４５】
請求項４２記載のワクチンをヒト又は動物患者に投与するステップを含む、ブドウ球菌疾患の治療又は予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結合（複合体形成）の分野に関し、ＰＮＡＧとキャリアタンパク質との結合方法を提供する。ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体（コンジュゲート）はさらに製剤化されて、ワクチンを提供しうる。本発明はまた、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体を含むワクチン、及び治療におけるそれらの使用を包含する。
【背景技術】
【０００２】
静脈内デバイスの使用の増加に伴い、地域感染及び病院獲得感染の数はいずれも近年増加の一途をたどっている。病院獲得（院内）感染は、特に、毎年２百万人以上の患者が罹患する米国では、罹病及び死亡の主な原因となっている。様々な研究から、米国人患者の約６％が入院中に感染するとされる。米国における経済的負担は、１９９２年に４５億ドルを超えると推定された（Emori及びGaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428）。最も頻度が高い感染は、尿管感染（ＵＴＩ：感染の３３％）、次いで肺炎（１５．５％）、外科手術部位感染（１４．８％）及び主要血流感染（１３％）が続く（Emori及びGaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428）。
【０００３】
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、血液凝固酵素陰性ブドウ球菌（ほとんどが表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、腸球菌、大腸菌（Escherichia coli）及び緑濃菌（Pseudomonas aeruginosa）は、主な院内病原体である。これらの病原体はほぼ同数の感染を引き起こすが、これらが生み出しうる障害の重症度と、抗生物質耐性分離菌の頻度を考え合わせると、このような順位、すなわち、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌を最も重要な院内病原体とする順位になる。
【０００４】
黄色ブドウ球菌は、院内感染の最も一般的な病原体であり、有意な罹病率及び死亡率を有する（Romero-Vivasら、1995, Infect, Dis. 21; 1417）。これは、場合によっては、骨髄炎、心内膜炎、敗血性関節炎、肺炎、膿瘍及びトキシックショック症候群の原因となることがある。
【０００５】
表皮ブドウ球菌は、通常の皮膚共生生物であり、これは、移植した医療デバイスの感染及び手術部位での感染を引き起こす重要な日和見性病原体でもある。表皮ブドウ球菌が感染する医療デバイスとして、心臓ペースメーカー、髄液シャント、持続携帯式腹膜透析カテーテル、整形外科デバイス及び人工弁が挙げられる。
【０００６】
黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌感染は抗生物質で治療され、ペニシリンが選択薬であるが、メチシリン耐性分離株にはバンコマイシンが使用される。抗生物質に対する広スペクトル耐性を示すブドウ球菌の割合は、１９８０年代以来ますます優勢となっており（Panliloら、1992, Infect. Control Hosp. Epidemiol, 13; 582）、有効な抗菌剤療法にとって脅威となっている。加えて、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌株が最近出現したため、いかなる有効な治療も利用可能でないメチシリン耐性黄色ブドウ球菌株が出現して蔓延するであろうという恐怖感が広まった。
【０００７】
受動免疫療法でブドウ球菌抗原に対する抗体を用いる別の手法が研究されている。ポリクローナル抗血清の投与を含む治療法（ＷＯ００／１５２３８号、ＷＯ００／１２１３２号）、並びにリポテイコ酸に対するモノクローナル抗体による治療（ＷＯ９８／５７９９４号）も開発中である。
【０００８】
別の手法は、活性ワクチン接種を用いて、ブドウ球菌に対する免疫応答を生じさせることである。ワクチン成分として含有させるいくつかの候補が確認されている。このような成分としてポリＮ−アセチル化グルコサミン（ＰＮＡＧ）があり、これは、ブドウ球菌、例えば黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌で見出されている表面多糖である。特にこの抗原が脱アセチル化形態（ｄＰＮＡＧ）である場合には、オプソニンによる免疫応答を誘発することが示されている（ＷＯ０４／４３４０５号）。ＷＯ０４／４３４０５号は、有機シアン化剤である１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）を用いたＰＮＡＧとキャリアタンパク質との結合、及びグルタルアルデヒドを用いたキャリアタンパク質の活性化とその後の還元的アミノ化によるｄＰＮＡＧとキャリアタンパク質との結合を開示している。
【０００９】
記載されているＣＤＡＰ結合はｄＰＮＡＧでの使用には適当ではない。なぜなら、活性化ｄＰＮＡＧはｄＰＮＡＧ上のＮＨ２基と反応することができ、そのためＣＤＡＰ化学を利用する場合にｄＰＮＡＧが架橋するリスクがあるためである。ｄＰＮＡＧの結合について記載された方法は、最初のステップとしてグルタルアルデヒド処理を用いてキャリアタンパク質上にアルデヒド基を導入するという欠点を有する。グルタルアルデヒド処理は、異なるバッチのグルタルアルデヒドによって結果が異なることになる可能性があるため信頼性ある再現性がない傾向にある。グルタルアルデヒド処理はまたキャリアタンパク質の架橋を引き起こす可能性もある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ワクチン成分としてのＰＮＡＧの有効性を最大限にするために、グルタルアルデヒドの使用を回避する、脱アセチル化ＰＮＡＧとキャリアタンパク質とを結合する別の方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様においては、４０％未満がＮ−アセチル化されているＰＮＡＧとキャリアタンパク質との結合方法であって、
（ａ）マレイミド基を含むリンカーを添加することによりＰＮＡＧを活性化して、活性化ＰＮＡＧを生成するステップ；
（ｂ）スルフィドリル基を含むリンカーを添加することによりキャリアタンパク質を活性化して、活性化キャリアタンパク質を生成するステップ；及び
（ｃ）上記活性化ＰＮＡＧと上記活性化キャリアタンパク質とを反応させて、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体を生成するステップ；
を含む、あるいは
（ａ）スルフィドリル基を含むリンカーを添加することによりＰＮＡＧを活性化して、活性化ＰＮＡＧを生成するステップ；
（ｂ）マレイミド基を含むリンカーを添加することによりキャリアタンパク質を活性化して、活性化キャリアタンパク質を生成するステップ；及び
（ｃ）上記活性化ＰＮＡＧと上記活性化キャリアタンパク質とを反応させて、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体を生成するステップ；
を含む、あるいは
（ａ）スルフィドリル基を含むリンカーを添加することによりＰＮＡＧを活性化して、活性化ＰＮＡＧを生成するステップ；
（ｂ）スルフィドリル基を含むリンカーを添加することによりキャリアタンパク質を活性化して、活性化キャリアタンパク質を生成するステップ；及び
（ｃ）上記活性化ＰＮＡＧと上記活性化キャリアタンパク質とを反応させて、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体を生成するステップ
を含む方法を提供する。
【００１２】
本発明の第２の態様においては、本発明の結合方法を実施するステップ、及びＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体と薬学的に許容される賦形剤とを混合するさらなるステップを含む、ワクチンの製造方法を提供する。
【００１３】
本発明の第３の態様においては、本発明の方法により得られるＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体を提供する。
【００１４】
本発明の第４の態様においては、ＰＮＡＧの４０％未満がＮ−アセチル化されており、ＰＮＡＧとキャリアタンパク質が、硫黄原子に結合したマレイミド基又は硫黄原子に結合した硫黄原子を含むリンカーにより結合している、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体を提供する。
【００１５】
本発明の第５の態様においては、マレイミド基を含むリンカーと共有結合している、４０％未満がＮ−アセチル化されている活性化ＰＮＡＧを提供する。
【００１６】
本発明の第６の態様においては、本発明の方法により得られるＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体を含むワクチンを提供する。
【００１７】
本発明のさらなる態様においては、ブドウ球菌疾患の治療又は予防に使用するための本発明のＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体を提供する。
【００１８】
本発明のさらなる態様においては、ブドウ球菌疾患の治療又は予防のためのワクチンの製造における、本発明のＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体の使用を提供する。
【００１９】
本発明のさらなる態様においては、本発明のワクチンをヒト又は動物患者に投与するステップを含む、ブドウ球菌疾患の治療又は予防方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満又は５％未満がＮ−アセチル化されているＰＮＡＧとキャリアタンパク質とを結合する方法であって、
（ａ）マレイミド基を含むリンカーを添加することによりＰＮＡＧを活性化して、活性化ＰＮＡＧを生成するステップ；
（ｂ）スルフィドリル基を含むリンカーを添加することによりキャリアタンパク質を活性化して、活性化キャリアタンパク質を生成するステップ；及び
（ｃ）上記活性化ＰＮＡＧと上記活性化キャリアタンパク質とを反応させて、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体を生成するステップ
を含む方法を記載する。
【００２１】
本発明の独立した態様として、本発明は、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満又は５％未満がＮ−アセチル化されているＰＮＡＧとキャリアタンパク質とを結合する方法であって、
（ａ）マレイミド基を含むリンカーを添加することによりキャリアタンパク質を活性化して、活性化キャリアタンパク質を生成するステップ；
（ｂ）スルフィドリル基を含むリンカーを添加することによりＰＮＡＧを活性化して、活性化ＰＮＡＧを生成するステップ；及び
（ｃ）上記活性化ＰＮＡＧと上記活性化キャリアタンパク質とを反応させて、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体を生成するステップ；
を含む方法を記載する。
【００２２】
本発明の独立した態様として、本発明は、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満又は５％未満がＮ−アセチル化されているＰＮＡＧとキャリアタンパク質とを結合する方法であって、
（ａ）スルフィドリル基を含むリンカーを添加することによりキャリアタンパク質を活性化して、活性化キャリアタンパク質を生成するステップ；
（ｂ）スルフィドリル基を含むリンカーを添加することによりＰＮＡＧを活性化して、活性化ＰＮＡＧを生成するステップ；及び
（ｃ）上記活性化ＰＮＡＧと上記活性化キャリアタンパク質とを反応させて、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体を生成するステップ
を含む方法を記載する。
【００２３】
用語「ＰＮＡＧ」には、ｄＰＮＡＧ及びＰＮＡＧの両方が含まれる。ＰＮＡＧは、主に脱アセチル化形態となるように、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満又は１％未満がＮ−アセチル化されている。ＰＮＡＧの脱アセチル化エピトープは、オプソニンによるグラム陽性菌、好ましくは黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌の死滅を媒介ことができる抗体を誘導することができる。一実施形態において、ＰＮＡＧは、その２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満又は０．１％未満の残基でＯ−スクシニル化されていないか又はＯ−スクシニル化されている。
【００２４】
ＰＮＡＧは、４００ｋＤａを超えるものから、７５〜４００ｋＤａまで、１０〜７５ｋＤａまで、３０以下の反復単位からなるオリゴ糖まで、様々なサイズのものでよい。本発明の方法においては、あらゆるサイズのＰＮＡＧ多糖又はオリゴ糖を用いることができ、例えば４０、５０、６０、８０、１００若しくは２００ｋＤａを超えるもの、又は４０〜４００ｋＤａ、５０〜３５０ｋＤａ、４０〜３００ｋＤａ、６０〜３００ｋＤａ、５０〜２５０ｋＤａ、６０〜２００ｋＤａ、７０〜１５０ｋＤａ若しくは８０〜１２０ｋＤａである。サイジングは当該分野で公知のあらゆる方法、例えば、マイクロ流動体化、超音波照射又は化学的切断（ＷＯ０３／５３４６２号、欧州特許第４９７，５２４号、欧州特許第４９５，５２５号）により行うことができる。
【００２５】
一実施形態では、天然の多糖を化学的に処理することにより、ＰＮＡＧを脱アセチル化して、ｄＰＮＡＧを形成する。例えば、天然ＰＮＡＧを塩基性溶液で処理し、ｐＨが１０を超えるようにする。例えば、０．１〜５Ｍ、０．２〜４Ｍ、０．３〜３Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．７５〜１．５Ｍ、約１．５Ｍ、約２Ｍ、約５Ｍ又は約１ＭのＮａＯＨ、ＫＯＨ又はＮＨ４ＯＨでＰＮＡＧを処理する。処理は、２０〜１００℃、２５〜８０℃、３０〜６０℃若しくは３０〜５０℃又は３５〜４５℃の温度で、少なくとも１０若しくは３０分、又は１、２、３、４、５、１０、１５、２０若しくは２４時間かけて実施する。ｄＰＮＡＧは、ＷＯ０４／４３４０５号に記載されているように調製することもできる。
【００２６】
結合は、ＰＮＡＧとキャリアタンパク質との共有結合である。これは、直接的であってもよいし又は間接的であってもよく、活性化ＰＮＡＧ及び活性化キャリアタンパク質のマレイミド基及びスルフィドリル基と反応性を有するさらなる架橋化合物を組み込みうる。
【００２７】
「リンカー」という用語は、完全な複合体（コンジュゲート）においてＰＮＡＧとキャリアタンパク質とを共有結合により連結する分子を意味する。リンカーは、結合反応に使用した２つの分子の共有結合から生じるものでありうる。あるいは、リンカーは、結合反応に用いた１つの分子に由来するものであってもよい（例えば、キャリアタンパク質のシステイン残基からのスルフィドリル基が活性化ＰＮＡＧにおけるマレイミド基又はスルフィドリル基と反応する場合)。
【００２８】
最初の実施形態の態様において、マレイミド基を含むリンカーは、ステップ（ａ）においてＰＮＡＧのアミン基に付加される。
【００２９】
第２の実施形態の態様において、マレイミド基を含むリンカーは、ステップ（ｂ）においてキャリアタンパク質のアミン基に付加される。
【００３０】
一実施形態において、リンカーは、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＭＢＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＧＭＢＳ及びスルホ−ＳＭＰＢからなる群より選択される化合物に由来するマレイミド基を含む。
【００３１】
一実施形態において、マレイミド基を含むリンカーは、５〜１０、６〜８、１０〜２０、１２〜１７、約７、約１０又は約１５オングストロームのスペーサー長を有する。
【００３２】
一実施形態において、ステップ（ａ）において、ＰＮＡＧとマレイミド基を含むリンカーの重量／重量比は、１：５〜５：１、１：２〜２：１、１：１．５〜１．５：１、又は約１：１である。
【００３３】
「およそ」又は「約」とは、その数字が示されたものの１０％以内となる必要があることを意味する。
【００３４】
一実施形態において、マレイミド基を含むリンカーを添加することによりＰＮＡＧ又はキャリアタンパク質のいずれかを活性化するステップは、ｐＨ６．０〜８．０、６．５〜７．５又は約７．０で行われる。
【００３５】
一実施形態において、スルフィドリル基を含むリンカーは、ステップ（ａ）又は（ｂ）においてキャリアタンパク質のアミン基に付加される。一実施形態において、スルフィドリル基を含むリンカーは、ステップ（ｂ）においてＰＮＡＧのアミン基に付加される。
【００３６】
一実施形態において、リンカーは、ＳＰＤＰ、ＬＣ−ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＬＣ−ＳＭＰＴ、スルホ−ＳＰＤＰ、スルホ−ＳＭＰＴ、スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ及びＮ−アセチルホモシステインチオラクトンからなる群より選択される化合物から誘導された又は誘導可能なスルフィドリル基を含む。
【００３７】
一実施形態において、スルフィドリル基を含むリンカーは、４〜２５、５〜１０、６〜８、１０〜２０、１３〜１７、５〜２０、約７又は約１５オングストロームのスペーサー長を有する。
【００３８】
ＰＮＡＧが第１リンカーの添加により活性化され、キャリアタンパク質が第２リンカーの添加により活性化される実施形態において、第１及び第２リンカーは、任意により、それぞれＧＭＢＳとＳＰＤＰ；ＧＭＢＳとＬＣ−ＳＰＤＰ；スルホ−ＧＭＢＳとＳＰＤＰ；スルホ−ＧＭＢＳとＬＣ−ＳＰＤＰ；ＳＰＤＰとＧＭＢＳ；ＳＰＤＰとスルホ−ＧＭＢＳ；ＬＣ−ＳＰＤＰとＧＭＢＳ；又はＬＣ−ＳＰＤＰとスルホ−ＧＭＢＳから誘導された又は誘導可能なものであってよい。
【００３９】
ＰＮＡＧがスルフィドリル基を含む第１リンカーの添加により活性化され、キャリアタンパク質がスルフィドリル基を含む第２リンカーの添加により活性化される実施形態において、第１及び第２リンカーは、同じであってもよいし又は異なっていてもよい。例えば第１及び第２リンカーは、それぞれＳＰＤＰとＳＰＤＰ；ＳＰＤＰとＬＣ−ＳＰＤＰ；ＳＰＤＰとＳＭＰＴ；ＳＤＰＤとＬＣ−ＳＭＰＴ；ＬＣ−ＳＰＤＰとＳＤＰＤ；ＬＣ−ＳＰＤＰとＬＣ−ＳＰＤＰ；ＬＣ−ＳＰＤＰとＳＭＰＴ；ＬＣ−ＳＤＰＤとＬＣ−ＳＭＰＴ；ＳＭＰＴとＳＰＤＰ；ＳＭＰＴとＬＣ−ＳＰＤＰ；ＳＭＰＴとＳＭＰＴ；ＳＭＰＴとＬＣ−ＳＭＰＴ；ＬＣ−ＳＭＰＴとＳＰＤＰ；ＬＣ−ＳＭＰＴとＬＣ−ＳＤＰＤ；ＬＣ−ＳＭＰＴとＳＭＰＴ；又はＬＣ−ＳＭＰＴとＬＣ−ＳＭＰＴから誘導された又は誘導可能なものである。
【００４０】
一実施形態において、スルフィドリル基を含むリンカーを添加することによりキャリアタンパク質を活性化するステップにおいて、キャリアタンパク質とスルフィドリル基を含むリンカーの重量／重量比は、１００：１〜１：１、５０：１〜２：１、２０：１〜３：１、１５：１〜５：１又は約１０：１である。
【００４１】
一実施形態において、スルフィドリル基を含むリンカーを添加することによりキャリアタンパク質を活性化するステップは、ｐＨ７．０〜９．０、７．５〜８．５又は約８．０で行われる。
【００４２】
一実施形態において、ステップ（ｃ）において、活性化ＰＮＡＧと活性化キャリアタンパク質の重量／重量比は、１０：１〜１：１０、９：１〜１：５、８：１〜１：２、７：１〜１：１、５：１〜１：１又は約２：１である。
【００４３】
一実施形態において、ステップ（ｃ）は、ｐＨ６．０〜９．０、６．０〜８．０、６．５〜７．５又は約７．０で行われる。
【００４４】
一実施形態において、ステップ（ｃ）の終了後のＰＮＡＧとキャリアタンパク質との間のリンカーの長さは、５〜４０、１０〜３０、１２〜２５、１０〜１５、１５〜２５、２０〜２５、２０〜３０、２５〜３０、３０〜４０、約１４、約２３、約２８、又は約３０オングストロームである。
【００４５】
一実施形態において、本発明の方法は、過剰のマレイミド基をシステインでブロッキングするさらなるステップ（ｄ）を含む。
【００４６】
一実施形態において、キャリアタンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、ｒＥＰＡ、プロテインＤ、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、Ｆｉｇ、ＭＡＰ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＨａｒＡ、ＳｉｔＣ、αトキシン（Ｈｌａ）、αトキシンＨ３５Ｒ変異体、ＭＲＰＩＩ及びオートリシン、又はこれらの断片からなる群より選択される。
【００４７】
多糖又はオリゴ糖免疫原に結合するために現在使用されているキャリアタンパク質の例としては、ジフテリア及び破傷風トキソイド（それぞれＤＴ、ＤＴ  ＣＲＭ１９７及びＴＴ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）エキソプロテインＡ（ｒＥＰＡ）、並びに、ツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）由来のプロテインＤ、ニューモリシン、又はこれらのうちいずれかの断片が挙げられる。用いるのに適した断片として、Ｔヘルパーエピトープを含む断片が挙げられる。特に、プロテインＤ断片は、タンパク質のＮ末端側の３分の１を含んでいるのが好ましい。プロテインＤは、インフルエンザ菌由来のＩｇＤ結合タンパク質である（ＥＰ０  ５９４  ６１０Ｂ１）。
【００４８】
本発明の方法において使用するための別のキャリアタンパク質は、単一のブドウ球菌タンパク質若しくはその断片、又は少なくとも１、２、３若しくは４の又は正確に１、２、３若しくは４の又はそれ以上のブドウ球菌タンパク質、例えば後述するもの又はその断片から選択されるタンパク質を含む、融合タンパク質である。
【００４９】
一実施形態において、αトキシンをキャリアタンパク質として使用する。これは結合の過程で毒性が低減する又は除去されることから、この天然形態を多糖と結合させてもよい。好ましくは、残留毒性がより低減するため、Ｈｉｓ３５Ｌｅｕ又はＨｉｓ３５Ａｒｇ変異体のような遺伝的に解毒したαトキシンを使用する。あるいは、架橋試薬、ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドでの処理により、αトキシンを化学的に解毒する。場合により、遺伝的に解毒したαトキシンを、好ましくは、架橋試薬、ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドでの処理により化学的に解毒し、毒性をさらに低減してもよい。
【００５０】
一実施形態において、本発明の方法は、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体を、薬学的に許容される賦形剤（場合によりアジュバントを含んでもよい）と混合するさらなるステップを含む。
【００５１】
好適なアジュバントとして、アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）又はリン酸アルミニウムが挙げられるが、カルシウム、マグネシウム、鉄若しくは亜鉛の塩でもよく、あるいは、アシル化チロシン、若しくはアシル化糖、カチオン性若しくはアニオン性に誘導体化した多糖、又はポリホスホスファゼンの不溶性懸濁液でもよい。
【００５２】
一実施形態において、アジュバントは、ＴＨ１型又はＴＨ２型応答のいずれかの選択的誘導物質である。高レベルのＴｈ１型サイトカインは、所与の抗原に対する細胞性免疫応答の誘導を助ける傾向があるのに対し、高レベルのＴｈ２型サイトカインは、該抗原に対する体液性免疫応答の誘導を助ける傾向がある。
【００５３】
Ｔｈ１及びＴｈ２型免疫応答の区別は絶対的ではないことに留意することが重要である。実際には、個体は、主にＴｈ１又は主にＴｈ２として説明される免疫応答を支持する。しかし、多くの場合、Mosmann及びCoffmanによりマウスＣＤ４陽性Ｔ細胞クローンについて記載されている（Mosmann, T.R.及びCoffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173）ような表現でサイトカインのファミリーを考えるのが好都合である。伝統的には、Ｔｈ１型応答は、Ｔ−リンパ球によるＩＮＦ−γ及びＩＬ−２サイトカインの産生と関連している。Ｔｈ１型免疫応答の誘導に直接関連することが多いその他のサイトカインは、Ｔ細胞（例えば、ＩＬ−１２）により産生されない。対照的に、Ｔｈ２型応答は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０の分泌に関連する。主にＴｈ１型応答を促進する好適なアジュバント系を以下に挙げる：モノホスホリルリピドＡ又はその誘導体、具体的には３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）（その調製については、ＧＢ２２２０２１１  Ａを参照）；並びに、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと、アルミニウム塩（例えば、リン酸アルミニウム若しくは水酸化アルミニウム）又は水中油型エマルションのいずれかとの組合せ。このような組合せの場合、同じ粒状構造に抗原と３Ｄ−ＭＰＬを含有させることにより、抗原性及び免疫刺激シグナルのさらに効率的な送達が可能になる。研究から、３Ｄ−ＭＰＬはミョウバン吸着抗原の免疫原性をさらに増強できることが明らかにされた［Thoelenら、Vaccine (1998) 16:708-14；ＥＰ６８９４５４−Ｂ１］。
【００５４】
増強された系には、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体の組合せ、特に、ＷＯ９４／００１５３号に開示されているようなＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組合せ、若しくは、ＷＯ９６／３３７３９号に開示されているように、ＱＳ２１をコレステロールでクエンチする低反応原性（less reactogenic）組成物が含まれる。水中油型エマルション中のＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ及びトコフェロールを含む特に効力の高いアジュバント製剤がＷＯ９５／１７２１０号に記載されている。場合により、ワクチンはさらに、サポニン、より好ましくはＱＳ２１を含む。製剤はまた、水中油型エマルションとトコフェロール（ＷＯ９５／１７２１０号）を含んでもよい。本発明は、薬学的に許容される賦形剤、例えば、３Ｄ−ＭＰＬと一緒に本発明のＰＮＡＧ複合体を混合することを含む、ワクチン製剤の製造方法も提供する。非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＷＯ９６／０２５５５号）もまたＴＨ１応答の選択的誘導物質であり、本発明における使用に適している。アジュバントは、場合によりリポソーム構造又はＩＳＣＯＭ構造を形成してもよい。
【００５５】
ＱＳ２１：ステロールの比は、典型的におよそ１：１００〜１：１重量／重量である。一実施形態において、過剰ステロールが存在し、ＱＳ２１：ステロールの比は、少なくとも１：２ｗ／ｗである。ヒトへの投与のために、典型的には、ＱＳ２１とステロールは、１用量当たり約１μｇ〜約１００μｇ、又は約１０μｇ〜約５０μｇの範囲でワクチン中に存在する。
【００５６】
リポソームは、場合により、中性脂質、例えば、ホスファチジルコリンを含み、これは、場合により室温で非晶質であり、例えば、卵黄ホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン又はジラウリルホスファチジルコリンである。リポロームはまた、飽和脂質からなるリポソームのリポソーム−ＱＳ２１構造の安定性を高める荷電脂質を含んでもよい。これらの場合には、荷電脂質の量は場合により１〜２０％ｗ／ｗ、場合により５〜１０％である。ステロールとリン脂質の比は１〜５０％（モル／モル）、最も好ましくは２０〜２５％である。
【００５７】
一実施形態において、アジュバントは、ＭＰＬ（３−脱アシル化モノ−ホスホリルリピドＡ、３Ｄ−ＭＰＬとしても知られる）を含む。３Ｄ−ＭＰＬは、３種類の脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと４、５若しくは６のアシル化鎖との混合物としてＧＢ２  ２２０  ２１１（Ribi）で公知であり、Ribi Immunochem（モンタナ州）により製造されている（ＷＯ９２／１１６５５６号）。
【００５８】
一実施形態において、アジュバントは、初めにＭＰＬなしで調製され、次に、場合により１００ｎｍ粒子としてＭＰＬが添加されて調製されたリポソームを含む。従って、ＭＰＬは小胞膜内に含まれない（ＭＰＬアウトとして知られる）。ＭＰＬが小胞膜内に含まれる（ＭＰＬインとして知られる）組成物も本発明の一態様をなす。抗原は、小胞膜内又は小胞膜外のいずれに含有させてもよい。場合により、可溶性抗原は膜外にあり、また、疎水性若しくは脂質化抗原は膜内又は膜外のいずれかに含まれる。
【００５９】
一実施形態において、本発明の方法は、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体とさらなる抗原（複数でもよい）を混合するさらなるステップを含む。一実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のさらなる抗原が添加される。一実施形態において、さらなる抗原（複数でもよい）は細菌多糖又はオリゴ糖を含む。
【００６０】
そのような抗原の例としては、５型及び／又は８型黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に由来する莢膜多糖又はオリゴ糖が挙げられる。
【００６１】
ヒトへの感染を引き起こす黄色ブドウ球菌のほとんどの菌株が、５型又は８型多糖のいずれかを含む。約６０％のヒト菌株が８型であり、約３０％が５型である。５型及び８型莢膜多糖抗原の構造は、Moreauら、Carbohydrate Res. 201; 285 (1990)及び Fournierら、Infect. Immun. 45; 87 (1984) に記載されている。両者とも、その反復単位にＦｕｃＮＡｃｐと、スルフヒドリル基を導入するのに用いることができるＭａｎＮＡｃＡを有する。
【００６２】
近年（Jones, Carbohydrate Research 340, 1097-1106 (2005)）、ＮＭＲ分光学的方法により、これらの莢膜多糖の構造は以下に示す構造に訂正された：
５型
→4)-β-D-ManNAcA-(1→4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
８型
→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-α-D-FucNAc(1→
【００６３】
多糖は、当業者に周知の方法（例えば、米国特許第６２９４１７７号に記載の方法）を用いて、黄色ブドウ球菌の好適な菌株から抽出することができる。例えば、ＡＴＣＣ１２９０２は５型黄色ブドウ球菌株であり、ＡＴＣＣ１２６０５は８型黄色ブドウ球菌株である。
【００６４】
多糖は天然のサイズでもよいし、あるいは、例えば、マイクロ流動体化、超音波照射又は化学処理によりサイジングしてもよい。本発明の方法では、オリゴ糖を使用してもよい。
【００６５】
本発明の方法で使用される５及び８型多糖は、場合により、（例えば米国特許第４３７２９４５号、米国特許第４４７４７５７号、米国特許第４３５６１７０号、米国特許第４８３０８５２号又はＷＯ９５／０８３４８号のいずれかに記載される方法を用いて）、上述したもののいずれかのキャリアタンパク質と結合させるか、あるいは、結合させない。
【００６６】
一実施形態では、さらなる抗原（複数でもよい）は、米国特許第６２９４１７７号に記載の黄色ブドウ球菌３３６抗原を含む。
【００６７】
一実施形態において、３３６抗原は、天然のサイズの多糖であるか、あるいは、例えば、マイクロ流動体化、超音波照射又は化学処理によりサイジングされたものであってもよい。３３６抗原から誘導したオリゴ糖を使用することもできる。３３６抗原は、好ましくは、公知の結合方法、例えば米国特許第４３７２９４５号、米国特許第４４７４７５７号、米国特許第４３５６１７０号、米国特許第４８３０８５２号又はＷＯ９５／０８３４８号に記載の方法を用いて、キャリアタンパク質と結合させるか、あるいは、結合させない。
【００６８】
表皮ブドウ球菌のＡＴＣＣ−３１４３２株、ＳＥ−３６０株及びＳＥ−１０株は、３つの異なる型の莢膜、それぞれＩ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型を特徴とする（Ichiman及びYoshida 1981, J. Appl. Bacteriol. 51; 229）。表皮ブドウ球菌の各血清型から抽出される莢膜多糖は、Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型多糖を形成する。多糖は、いくつかの方法（例えば、米国特許第４１９７２９０に記載の方法、又はIchimanら、1991, J. Appl. Bacteriol. 71; 176に記載の方法など）により抽出することができる。
【００６９】
本発明の一実施形態では、さらなる抗原（複数でもよい）は、表皮ブドウ球菌由来のＩ型及び／又はＩＩ型及び／又はＩＩＩ型多糖又はオリゴ糖を含む。多糖は、天然のサイズの多糖であるか、あるいは、例えば、マイクロ流動体化、超音波照射又は化学処理によりサイジングされたものである。さらなる抗原（複数でもよい）はまた、表皮ブドウ球菌株から抽出されたオリゴ糖も包含する。これらの多糖又はオリゴ糖は、結合させないか、あるいは、公知の結合方法、例えば米国特許第４３７２９４５号、米国特許第４４７４７５７号、米国特許第４３５６１７０号、米国特許第４８３０８５２号又はＷＯ９５／０８３４８号に記載の方法を用いて結合させることが好ましい。
【００７０】
一実施形態において、さらなる抗原（複数でもよい）は、ブドウ球菌タンパク質又はその断片を含む。例えば、黄色ブドウ球菌（S. aureus）又は表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）に由来するタンパク質である。本発明のいくつかの実施形態は、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の両方に由来するタンパク質を含む。さらなる抗原（複数でもよい）は、例えば、ＷＯ０６／３２４７５号の図１のいずれかの配列のアミノ酸配列に対し、少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性、又は完全な同一性を有するアミノ酸配列を含む単離タンパク質である。
【００７１】
本明細書でタンパク質について具体的に述べるとき、これは、天然又は組換えの全長タンパク質、あるいは場合によりあらゆるシグナル配列が除去された成熟タンパク質を意味する。タンパク質は、ブドウ球菌株から直接単離してもよいし、又は組換えＤＮＡ技術により作製してもよい。タンパク質の免疫原性断片を本発明の免疫原性組成物に組み込むこともできる。これらは、タンパク質のアミノ酸配列から連続的に取り出した少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、又は少なくとも１００個のアミノ酸を含む断片である。加えて、このような免疫原性断片は、ブドウ球菌タンパク質に対して生起された抗体、又はブドウ球菌による哺乳動物宿主の感染により生起された抗体と免疫学的に反応性であるか、あるいはＴ細胞エピトープを含有する。免疫原性断片はまた、有効量で投与される（単独で、又はキャリアに結合したハプテンとして）と、ブドウ球菌感染に対する防御免疫応答を誘発し、場合によりそれは黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌感染に対して防御的である。このような免疫原性断片としては、例えば、Ｎ末端リーダー配列及び／又は膜貫通ドメイン及び／又はＣ末端アンカードメインを欠損するタンパク質が挙げられる。一実施形態では、本発明の方法において用いられる免疫原性断片は、ＷＯ０６／３２４７５号の図１から選択される配列のアミノ酸配列に対し、断片配列の全長にわたって、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、又は少なくとも９７〜９９％の同一性を有するタンパク質の細胞外ドメインの実質的に全部を含む。
【００７２】
一実施形態において、さらなる抗原（複数でもよい）は、ブドウ球菌タンパク質又はブドウ球菌タンパク質の断片の融合タンパク質を含んでもよい。このような融合タンパク質は、組換えにより作製することができ、少なくとも２、３、４、５又は６種のブドウ球菌タンパク質の１部を含むことができる。あるいは、融合タンパク質は、少なくとも２、３、４又は５種のブドウ球菌タンパク質の複数の部分を含んでいてもよい。これらは、様々なブドウ球菌タンパク質又はその断片を同じタンパク質において組み合わせたものとすることができる。あるいは、本発明は、異種配列との融合タンパク質としての、ブドウ球菌タンパク質又はその断片の個々の融合タンパク質も含み、このような異種配列として、Ｔ細胞エピトープ若しくは精製タグの供給物、例えば、βグラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、エピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧ、ｍｙｃタグ、ポリヒスチジン）、又はウイルス表面タンパク質（例えば、インフルエンザウイルス赤血球凝集素）若しくは細菌タンパク質（例えば、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７）が挙げられる。
【００７３】
さらなる抗原（複数でもよい）は、場合により、ブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質、又はブドウ球菌輸送体タンパク質、又はブドウ球菌のトキシン若しくは病原性調節因子を含んでもよい。さらなる抗原（複数でもよい）は、場合により、少なくとも１、２、３、４、５若しくは６つの、又は正確に１、２、３、４、５若しくは６つのブドウ球菌タンパク質を含んでもよい。細胞外成分結合タンパク質の例として、ラミニン受容体、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、自己溶解素（オートリシン）、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、Ｆｉｇ及びＭＡＰが挙げられる。ブドウ球菌輸送体タンパク質の例として、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ及びＮｉ  ＡＢＣ輸送体が挙げられる。ブドウ球菌のトキシン若しくは病原性調節因子の例として、αトキシン（Ｈｌａ）、αトキシンＨ３５Ｒ変異体及びＲＮＡ  ＩＩＩ活性化タンパク質（ＲＡＰ）が挙げられる。
【００７４】
本発明のさらなる態様は、本発明の方法によって得られる又は得られたＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体である。
【００７５】
本発明のＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体は、４０％未満がＮ−アセチル化されているＰＮＡＧを含み、ＰＮＡＧとキャリアタンパク質が、硫黄原子に結合したマレイミド基を含むリンカーにより結合している。
【００７６】
一実施形態において、マレイミド基は、ＰＮＡＧと硫黄原子の間に位置している。あるいは、マレイミド基は、キャリアタンパク質と硫黄原子の間に位置している。
【００７７】
一実施形態において、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体は、以下の構造を有する：
【化１】
2009531389.tif 000002
【００７８】
〔式中、Ｒ１及びＲ２は独立して、場合により置換されていてもよい芳香族若しくは脂肪族鎖、又は結合から選択される〕。一実施形態において、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルキル、Ｃ３−Ｃ４アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、又はＣ５アルキルである。一実施形態において、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルキル、Ｃ３−Ｃ４アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、又はＣ５アルキルである。
【００７９】
一実施形態において、本発明のＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体は、以下の構造を有する：
【化２】
2009531389.tif 000003
【００８０】
〔式中、Ｒ１及びＲ２は独立して、場合により置換されていてもよい芳香族若しくは脂肪族鎖、又は結合から選択される〕。一実施形態において、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルキル、Ｃ３−Ｃ４アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、又はＣ５アルキルである。一実施形態において、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルキル、Ｃ３−Ｃ４アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、又はＣ５アルキルである。
【００８１】
本発明の別の態様は、ＰＮＡＧの４０％未満がＮ−アセチル化されており、ＰＮＡＧとキャリアタンパク質が、硫黄原子に結合した硫黄原子を含むリンカーにより結合している、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体である。
【００８２】
一実施形態において、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体は、以下の構造を有する：
【化３】
2009531389.tif 000004
【００８３】
〔式中、Ｒ１及びＲ２は独立して、場合により置換されていてもよい芳香族若しくは脂肪族鎖、又は結合から選択される〕。一実施形態において、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルキル、Ｃ３−Ｃ４アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、又はＣ５アルキルである。一実施形態において、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルキル、Ｃ３−Ｃ４アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、又はＣ５アルキルである。
【００８４】
一実施形態において、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体は、以下の構造を有する：
【化４】
2009531389.tif 000005
【００８５】
本発明の別の態様は、マレイミド基を含むリンカーと共有結合している、４０％未満がＮ−アセチル化されている活性化ＰＮＡＧである。一実施形態において、マレイミド基は、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＭＢＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＧＭＢＳ及びスルホ−ＳＭＰＢからなる群より選択される化合物から誘導される又は誘導可能である。
【００８６】
一実施形態において、活性化ＰＮＡＧは、以下の構造を有する：
【化５】
2009531389.tif 000006
【００８７】
〔式中、Ｒ１は、場合により置換されていてもよい芳香族若しくは脂肪族鎖、又は結合から選択される〕。一実施形態において、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルキル、Ｃ３−Ｃ４アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、又はＣ５アルキルである。一実施形態において、リンカーは、５〜４０、１０〜３０、１２〜２５、１０〜１５、１５〜２５、２０〜２５、２０〜３０、２５〜３０、３０〜４０、約１４、約２３、約２８、又は約３０オングストロームの長さである。
【００８８】
本発明の方法により作製されるＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体及びワクチン調製物を用いて、全身又は粘膜経路を介した該ワクチンの投与により、感染しやすい哺乳動物を防御又は治療することができる。このような投与としては、筋内、腹腔内、皮内若しくは皮下経路；又は、経口／消化管、気道、尿生殖管への粘膜投与が挙げられる。本発明のワクチンは単回用量として投与することもできるが、その複数の成分を同時に、又は時間を変えて共投与してもよい。共投与のために、任意のＴｈ１アジュバントを様々な投与形態の一部又は全部に存在させてもよいが、これは、ワクチンの細菌タンパク質成分と組み合わせて含有する場合に好ましい。単一の投与経路以外にも、２つの異なる投与経路を用いてもよい。例えば、多糖をＩＭ（又はＩＤ）投与し、細菌タンパク質をＩＮ（又はＩＤ）投与することができる。さらには、本発明のワクチンを初回免疫ではＩＭ投与し、追加免疫ではＩＮ投与することも可能である。
【００８９】
各ワクチン用量における複合体抗原の量は、典型的なワクチンにおいて有意な有害副作用を起こさずに、免疫防御性応答を誘発する量として選択する。このような量は、使用する具体的な免疫原、またその提示方法に応じて変動する。一般に、各用量は、０．１〜１００μｇの多糖、好ましくは０．１〜５０μｇの多糖複合体、好ましくは０．１〜１０μｇ、さらに好ましくは１〜１０μｇを含み、中でも１〜５μｇがさらに好ましい範囲であると予想される。
【００９０】
ワクチン中のタンパク質抗原の含量は、典型的には１〜１００μｇ、好ましくは５〜５０μｇ、最も典型的には５〜２５μｇの範囲にある。最初のワクチン接種後、適切な間隔をおいて、１又は複数回の追加免疫を被験者に実施してもよい。
【００９１】
ワクチン製剤は、Vaccine Design（“The subunit and adjuvant approach” (Powell M.F.及びNewman M.J.編) (1995 Plenum Press New York)に概要が記載されている。リポソーム内への包膜はFullertonにより、米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。
【００９２】
本発明のワクチンは溶液として、又は凍結乾燥させて保存することができる。好ましくは、スクロース、トレハロース若しくはラクトースのような糖の存在下で溶液を凍結乾燥する。さらには、凍結乾燥し、使用前に即座に再構成するのが好ましい。凍結乾燥によって、さらに安定した組成物（ワクチン）が得られ、３Ｄ−ＭＰＬの存在下で、しかもアルミニウムベースのアジュバントの非存在下で、より高い抗体力価を達成できると考えられる。
【００９３】
本明細書中の用語「含んでいる」、「含む」については、本発明者は、場合によりそれぞれ「〜から構成される」、「〜からなる」で随意に言い換えてもよいことを意図している。
【００９４】
本特許明細書に引用する参照文献及び特許出願はすべて、本明細書に参照として組み込むものとする。
【００９５】
本発明がさらによく理解されるように、以下に実施例を記載する。これらの実施例は、説明を目的にするにすぎず、いかなる意味でも本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【実施例１】
【００９６】
ＰＮＡＧ−ＴＴ複合体の調製
ｄＰＮＡＧをＷＯ０４／４３４０５号に記載のように調製した。ｄＰＮＡＧをさらにＳｕｐｅｒｏｓｅ６カラムで精製した。
【００９７】
ｄＰＮＡＧの活性化
ｄＰＮＡＧ（１２ｍｇ）を、３００μｌの５Ｍ  ＨＣｌ＋３００μｌの５Ｍ  ＮａＯＨ＋１７００μｌの１×ＰＢＳ（ｐＨ７．０）に溶解し、ｐＨ７．０に調整した。サンプルを０．２２μｍフィルターを通してろ過し、再度ｐＨを７．０に調整した。１２ｍｇのＧＭＢＳを２００μｌのＤＭＳＯに溶解し、サンプルを暗所で室温にて２時間ゆっくりと攪拌した。０．５Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを７．０に維持した。１×ＰＢＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）バッファーで平衡化した脱塩カラム（ＰＤ１０カラム）を用いて過剰のＧＭＢＳを除き、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１０ＫＤａ  ＭＷＣＯ濃縮デバイスを用いてサンプルを０．６ｍｌになるまで濃縮した。
【００９８】
ＴＴの活性化
破傷風トキソイド（ＴＴ）（６．５ｍｇ；１９５μｌ原液）を１１０５μｌの１×ＰＢＳ含有１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に添加した。１３０μｌのＳＰＤＰ（ＤＭＳＯ中６．２ｍｇ／ｍｌ）をタンパク質溶液に添加し、暗所で室温にて１時間ゆっくりと攪拌した。０．５Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを８．０に維持した。１×ＰＢＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）バッファーで平衡化した脱塩カラム（ＰＤ１０カラム）を用いて過剰のＳＰＤＰを除き、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１０ＫＤａ  ＭＷＣＯを用いてサンプルを１．３ｍｌになるまで濃縮した。０．６５ｍｌのＤＴＴ（１×ＰＢＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）バッファー中２３ｍｇ／ｍｌ）を１．３ｍｌのＳＰＤＰ活性化ＴＴに添加した。サンプルを暗所で室温にて３０分間インキュベートした。０．５Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを８．０に維持した。１×ＰＢＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）バッファーで平衡化した脱塩カラム（ＰＤ１０カラム）を用いて過剰のＤＴＴを除き、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１０ＫＤａ  ＭＷＣＯ濃縮デバイスを用いてサンプルを０．６ｍｌになるまで濃縮した。
【００９９】
ＧＭＢＳ活性化ｄＰＮＡＧ（０．６ｍｌ）及びＳＨ−ＳＰＤＰ−ＴＴ（０．６ｍｌ）を混合し、暗所で室温にて２時間ゆっくりと攪拌した。１×ＰＢＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）バッファー１００μｌ中の３ｍｇのシステインを用いて過剰のマレイミドをブロッキングした。サンプルに対して、泳動バッファーとして１×ＰＢＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）を１ｍｌ／分で用いてＳｕｐｅｒｏｓｅ６カラムにおけるクロマトグラフィーを行った。ブラッドフォードアッセイを用いて画分をタンパク質について試験した。複合体を含む画分をプールし、Ｓｐｅｃｔｒａ／ゲル吸着剤を用いて２５ｍｌになるまで濃縮した。最終的な複合体を、多糖及びタンパク質組成について試験した。
【０１００】
ｄＰＮＡＧ−ＴＴの組成
ｄＰＮＡＧ：１５３．３７μｇ／ｍｌ    （４６．３％）
ＴＴ：      １７８．０６μｇ／ｍｌ    （５３．７％）
【実施例２】
【０１０１】
ｄＰＮＡＧの活性化及びカップリング
ｄＰＮＡＧ−ＴＴ複合体
本明細書の以下に記載する手法を用いて、下記の複合体を生成した：
ｄＰＮＡＧ−ＴＴ０１０：ｄＰＮＡＧ−Ｓ−ＧＭＢＳ＋ＤＴＴ処理ＴＴ−ＬＣ−ＳＰＤＰ
ｄＰＮＡＧ−ＴＴ０１１：ｄＰＮＡＧ−Ｓ−ＧＭＢＳ＋ＤＴＴ処理ＴＴ−ＬＣ−ＳＰＤＰ
ｄＰＮＡＧ−ＴＴ０１２：ｄＰＮＡＧ−Ｓ−ＧＭＢＳ＋ＤＴＴ処理ＴＴ−ＳＰＤＰ
ｄＰＮＡＧ−ＴＴ０１４：ｄＰＮＡＧ−ＳＰＤＰ＋ＤＴＴ処理ＴＴ−ＳＰＤＰ
ｄＰＮＡＧ−ＴＴ０１７：ＤＴＴ処理ｄＰＮＡＧ−ＳＰＤＰ＋ＴＴ−ＬＣ−ＳＰＤＰ
ｄＰＮＡＧ−ＴＴ０１９：ｄＰＮＡＧ−Ｓ−ＧＭＢＳ＋ＤＴＴ処理ＴＴ−ＳＰＤＰ
ｄＰＮＡＧ−ＴＴ０２０：ｄＰＮＡＧ−Ｓ−ＧＭＢＳ＋ＤＴＴ処理ＴＴ−ＳＰＤＰ
【０１０２】
ｄＰＮＡＧ
１ｇのＰＮＡＧを２０ｍｇ／ｍｌの濃度で５Ｎ  ＨＣｌに溶解し、１時間インキュベートした。続いて５Ｎ  ＮａＯＨを用いて中和した。この溶液を５μｍ膜において清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲにおいて精製した。目的の画分、すなわち「中間の分子サイズ」（Infection and Immunity, 70: 4433-4440 (2002)を参照）に相当するものをプールし、濃縮したあと、脱Ｎ−アセチル化処理を行った。
【０１０３】
溶液を１Ｍ  ＮａＯＨで調整し、３７℃で２４時間放置した。中和後、生成物を透析及び濃縮に供した。
【０１０４】
ｄＰＮＡＧの活性化
Ｓ−ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミド、Ｐｉｅｒｃｅ）を０．２Ｍ  ＮａＣｌ中のｄＰＮＡＧに添加し（比Ｓ−ＧＭＢＳ／ＰＳ（ｗ／ｗ）：１／１）、ｐＨ７．０（１Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨ調節）にて室温で２時間にわたりインキュベートした。ＴｏｙｏｐｅａｒｌＨＷ−４０ＦにおいてＰＢＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）を溶出バッファーとして６０ｍｌ／時の一定の流速で用いて精製することにより過剰のＧＭＢＳと副産物を除去した。溶出プールを光学密度（ＵＶ＝２０６ｎｍ）の関数で選択し、続いてＶｉｖａｓｐｉｎ管３，０００ＭＷＣＯ又はＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ  １０，０００ＭＷＣＯにおいて濃縮した。
【０１０５】
カップリング
ＧＭＢＳ活性化ｄＰＮＡＧ及びＤＴＴ還元（reduced）ＴＴ−ＳＰＤＰを混合し、室温で攪拌した。使用した条件に応じて、システイン（リン酸ナトリウムバッファーｐＨ８．０中４ｍｇ／ｍｌ）を３０分かけて添加することにより２０〜１２０分後に反応を停止させた。複合体を５μｍフィルターを用いて清澄化し、精製のためにＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００ＨＲ樹脂（ＸＫ１６／１００）に注入した。２００ｍＭ  ＮａＣｌを用いて３０ｍｌ／時の一定の流速で溶出を行った。溶出画分をヘキソサミンにより及びタンパク質用量により分析した。目的の画分をプールし、０．２２μｍ  Ｓｔｅｒｉｖｅｘにおいてろ過した。最終的な複合体は、多糖（ヘキソサミン用量）及びタンパク質組成（ローリー用量）について試験した。
【０１０６】
2009531389.tif 000007
【０１０７】
ｄＰＮＡＧ−ＳＰＤＰ：
ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド，Ｍｅｒｃｋ）に溶解した５倍モル過剰のＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート，ＭＷ：３１２．４，Ｐｉｅｒｃｅ）を、１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）中５ｍｇ／ｍｌのｄＰＮＡＧ１００ｍｇに添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物をＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ  １０，０００ＭＷＣＯ（３０００ｒｐｍで２８分間の遠心）で±６ｍｌにまで濃縮した後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ１００ＨＲ（ＸＫ１６／４０）で精製を行った。リン酸バッファー（ｐＨ７．４）を用いて６０ｍｌ／時の一定の流速で溶出を行った。目的の画分（２０６ｎｍで読み取り）をプールし、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ  １０，０００ＭＷＣＯ（３０００ｒｐｍで３０分間の遠心）において１．１ｍｌになるまで濃縮した。
【０１０８】
ＴＴ−ＳＰＤＰ：
ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド，Ｍｅｒｃｋ）に溶解した１５倍モル過剰のＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）を、１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）中のＴＴ（５０／ｍｌ）１ｇに添加し、室温で８０分間インキュベートした。続いて、生成物をＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ１００ＨＲ（ＸＫ１６／４０）に注入し、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡを６０ｍｌ／時の一定の流速で用いて溶出した。溶出プールを光学密度（ＵＶ＝２８０ｎｍ）の関数で選択し、続いてＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ  １０，０００ＭＷＣＯ（３０００ｒｐｍで７５分間の遠心）において１９．６ｍｌになるまで濃縮した。
【０１０９】
ＴＴ−ＬＣ−ＳＰＤＰは、ＴＴ−ＳＰＤＰとしてＬＣ−ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート，Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、インキュベーション時間を６０分として生成した。
【０１１０】
ＴＴ−ＳＨ又はＴＴ−ＬＣ−ＳＨ
ＤＴＴをＴＴ−ＳＰＤＰ又はＴＴ−ＬＣ−ＳＰＤＰにＤＴＴ／ＴＴ比（ｍｇ／ｍｇ）が０．７／１となるよう添加した。室温で２時間後、ピリジン−２−チオンが放出されて、その特徴的な吸収が３４３ｎｍとなった。ゲルろ過（ＰＤ−１０，Ａｍｅｒｓｈａｍ）によりチオール化タンパク質を過剰のＤＴＴから精製した。ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ  １０，０００ＭＷＣＯにおいて濃縮した後、タンパク質含量をローリー用量により評価した。
【０１１１】
ｄＰＮＡＧ−ＳＰＤＰ＋ＴＴ−ＳＨ又はＴＴ−ＬＣ−ＳＨ（ｄＰＮＡＧ−ＴＴ０１４及び０１６）
カップリングは、連続的に攪拌しながら、初期ＴＴ／ＰＳ比（ｗ／ｗ）２／１で、室温にて実施した。
【０１１２】
ｄＰＮＡＧ及びＴＴ−ＳＨを混合して、最終ＰＳ濃度２０ｍｇ／ｍｌ及び最終タンパク質濃度４０ｍｇ／ｍｌを得た。３０分後、未反応のスルフヒドリル基を２−ヨードアセトアミド（Ｍｅｒｃｋ）の添加によりクエンチした。
【０１１３】
ｄＰＮＡＧ及びＴＴ−ＬＣ−ＳＨを混合して、最終ＰＳ濃度１０ｍｇ／ｍｌ及び最終タンパク質濃度２０ｍｇ／ｍｌを得た。７５分後、未反応のスルフヒドリル基を２−ヨードアセトアミド（Ｍｅｒｃｋ）の添加によりクエンチした。
【０１１４】
続いて、複合体を５μｍ  Ｍｉｎｉｓａｒｔフィルターを用いて清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００ＨＲ（ＸＫ１６／１００）に注入した。２００ｍＭ  ＮａＣｌを用いて３０ｍｌ／時の一定の流速で溶出を行った。
【０１１５】
溶出画分をヘキソサミンにより及びタンパク質用量により分析した。目的の画分をプールし、０．２２μｍ  Ｓｔｅｒｉｖｅｘにおいてろ過した。
【０１１６】
得られた複合体は、最終ＴＴ／ＰＳ比（ｗ／ｗ）が２．１８（ＴＴ−ＳＨ）及び２．２４（ＴＴ−ＬＣ−ＳＨ）だった。
【０１１７】
ｄＰＮＡＧのチオール化
１１．６ｍｇのＤＴＴ（１，４−ジチオトレイトール，Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＭＷ：１５４．２４）を１６．５ｍｇのｄＰＮＡＧ−ＳＰＤＰに添加した。室温で２時間後、ピリジン−２−チオンが放出されて、その特徴的な吸収が３４３ｎｍとなった。ゲルろ過（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ４０Ｆ）によりチオール化ＰＳを過剰のＤＴＴから精製し、続いてＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ  １０，０００ＭＷＣＯにおいて８６０μｌになるまで濃縮した。
【０１１８】
ｄＰＮＡＧ−ＳＨ＋ＴＴ−ＳＰＤＰ（ｄＰＮＡＧ−ＴＴ０１７）
カップリングは、連続的に攪拌しながら、初期ＴＴ／ＰＳ比（ｗ／ｗ）１．７／１で、室温にて実施した。
【０１１９】
ｄＰＮＡＧ−ＳＨ及びＴＴ−ＳＰＤＰを混合して、最終ＰＳ濃度７．７３ｍｇ／ｍｌ及び最終タンパク質濃度１３．３ｍｇ／ｍｌを得た。９０分後、未反応のスルフヒドリル基を２−ヨードアセトアミド（Ｍｅｒｃｋ）の添加によりクエンチした。
【０１２０】
続いて、複合体を５μｍ  Ｍｉｎｉｓａｒｔフィルターを用いて清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００ＨＲ（ＸＫ１６／１００）に注入した。２００ｍＭ  ＮａＣｌを用いて３０ｍｌ／時の一定の流速で溶出を行った。
【０１２１】
溶出画分をヘキソサミンにより及びタンパク質用量により分析した。目的の画分をプールし、０．２２μｍ  Ｓｔｅｒｉｖｅｘにおいてろ過した。
【０１２２】
得られた複合体は、最終ＴＴ／ＰＳ比（ｗ／ｗ）が２．７４だった。
【実施例３】
【０１２３】
黄色ブドウ球菌ｄＰＮＡＧ−ＴＴ複合体の免疫原性
３０匹のマウスの群に、黄色ブドウ球菌ｄＰＮＡＧ−ＴＴ複合体（糖用量０．３μｇ）をアジュバント無添加で又は３Ｄ−ＭＰＬアジュバントと組み合わせて皮下接種した。マウスには、０日、１４日及び２８日目に３回の接種を行った。４１日目にマウスから血清を採取し、各血清サンプルをＥＬＩＳＡで試験して、ＰＮＡＧに対する免疫応答を評価した。１０匹のマウスの群を対照群として使用し、生理食塩水を接種した。
【０１２４】
抗ＰＮＡＧ  ＥＬＩＳＡ：
精製ＰＮＡＧ（２．５μｇ／ｍｌ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈したメチル化ＨＳＡ（２．５μｇ／ｍｌ）と混合し、高結合マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）に４℃で一晩かけてコーティングした。
【０１２５】
そのプレートをＰＢＳ−ＢＳＡ１％で室温で攪拌しながら３０分かけてブロッキングした。マウス抗血清を予め１／１００に希釈し、続いてさらにマイクロプレートにおいて２倍希釈を行って、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、結合したマウス抗体を、ＰＢＳ−ＢＳＡ０２％−ｔｗｅｅｎ０．０５％に１：５０００で希釈したペルオキシダーゼ結合ａｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、参照番号１１５−０３５−００３）を用いて検出した。検出抗体を攪拌しながら室温で３０分間インキュベートした。０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ４．５）１０ｍｌ当たり４ｍｇＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ）＋５μｌ  Ｈ２Ｏ２を用いて暗所で室温にて１５分かけて呈色を行った。反応を５０μｌ  ＨＣｌを用いて停止させ、光学密度を６５０ｎｍと比較して４９０ｎｍで読み取った。
【０１２６】
結果（表１に示す）は、プール血清についての中点力価で表す。個々の血清分析については、３０のサンプル（対照は１０サンプル）の中点力価に対してＧＭＴを計算した。
【表１】
2009531389.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成20年12月2日(2008.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
４０％未満がＮ−アセチル化されているＰＮＡＧとキャリアタンパク質とを結合する方法であって、
（ａ）マレイミド基を含むリンカーを添加することによりＰＮＡＧを活性化して、活性化ＰＮＡＧを生成するステップ；
（ｂ）スルフィドリル基を含むリンカーを添加することによりキャリアタンパク質を活性化して、活性化キャリアタンパク質を生成するステップ；及び
（ｃ）上記活性化ＰＮＡＧと上記活性化キャリアタンパク質とを反応させて、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体を生成するステップ
を含む方法。
【請求項２】
４０％未満がＮ−アセチル化されているＰＮＡＧとキャリアタンパク質とを結合する方法であって、
（ａ）スルフィドリル基を含むリンカーを添加することによりＰＮＡＧを活性化して、活性化ＰＮＡＧを生成するステップ；
（ｂ）マレイミド基を含むリンカーを添加することによりキャリアタンパク質を活性化して、活性化キャリアタンパク質を生成するステップ；及び
（ｃ）上記活性化ＰＮＡＧと上記活性化キャリアタンパク質とを反応させて、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体を生成するステップ
を含む方法。
【請求項３】
４０％未満がＮ−アセチル化されているＰＮＡＧとキャリアタンパク質とを結合する方法であって、
（ａ）スルフィドリル基を含むリンカーを添加することによりＰＮＡＧを活性化して、活性化ＰＮＡＧを生成するステップ；
（ｂ）スルフィドリル基を含むリンカーを添加することによりキャリアタンパク質を活性化して、活性化キャリアタンパク質を生成するステップ；及び
（ｃ）上記活性化ＰＮＡＧと上記活性化キャリアタンパク質とを反応させて、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体を生成するステップ
を含む方法。
【請求項４】
マレイミド基を含むリンカーが、ステップ（ａ）においてＰＮＡＧのアミン基に付加される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
マレイミド基を含むリンカーが、ステップ（ｂ）においてキャリアタンパク質のアミン基に付加される、請求項２記載の方法。
【請求項６】
マレイミド基を含むリンカーが、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＭＢＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＧＭＢＳ及びスルホ−ＳＭＰＢからなる群より選択される、請求項１、２、４又は５記載の方法。
【請求項７】
スルフィドリル基を含むリンカーが、ステップ（ｂ）においてキャリアタンパク質のアミン基に付加される、請求項１、３、４又は６記載の方法。
【請求項８】
スルフィドリル基を含むリンカーが、ＳＰＤＰ、ＬＣ−ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＬＣ−ＳＭＰＴ、スルホ−ＳＰＤＰ、スルホ−ＳＭＰＴ、スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ及びＮ−アセチルホモシステインチオラクトンからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
キャリアタンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、ｒＥＰＡ、プロテインＤ、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、Ｆｉｇ、ＭＡＰ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＨａｒＡ、ＳｉｔＣ、αトキシン（Ｈｌａ）、αトキシンＨ３５Ｒ変異体、ＭＲＰＩＩ及びオートリシン、又はこれらの断片からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法を実施するステップ、及びＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体と薬学的に許容される賦形剤とを混合するさらなるステップを含む、ワクチンの製造方法。
【請求項１１】
ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体とさらなる抗原（複数でもよい）とを混合するさらなるステップを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により得られるＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体。
【請求項１３】
ＰＮＡＧの４０％未満がＮ−アセチル化されており、ＰＮＡＧとキャリアタンパク質が、硫黄原子に結合したマレイミド基を含むリンカーにより結合している、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体。
【請求項１４】
以下の構造：
【化１】
2009531389.tif 000014
〔式中、Ｒ１及びＲ２は独立して、場合により置換されていてもよい芳香族若しくは脂肪族鎖、又は結合から選択される。〕
を有する、請求項１３記載のＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体。
【請求項１５】
以下の構造：
【化２】
2009531389.tif 000015
〔式中、Ｒ１及びＲ２は独立して、場合により置換されていてもよい芳香族若しくは脂肪族鎖、又は結合から選択される。〕
を有する、請求項１３記載のＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体。
【請求項１６】
ＰＮＡＧの４０％未満がＮ−アセチル化されており、ＰＮＡＧとキャリアタンパク質が、硫黄原子に結合した硫黄原子を含むリンカーにより結合している、ＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体。
【請求項１７】
以下の構造：
【化３】
2009531389.tif 000016
〔式中、Ｒ１及びＲ２は独立して、場合により置換されていてもよい芳香族若しくは脂肪族鎖、又は結合から選択される。〕
を有する、請求項１６記載のＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体。
【請求項１８】
マレイミド基を含むリンカーと共有結合している、４０％未満がＮ−アセチル化されている活性化ＰＮＡＧ。
【請求項１９】
請求項１２〜１７のいずれか１項に記載のＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体及び薬学的に許容される賦形剤を含むワクチン。
【請求項２０】
ブドウ球菌疾患の治療又は予防に使用するための、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載のＰＮＡＧ−キャリアタンパク質複合体。
【国際調査報告】
2009531389.tif 000017
2009531389.tif 000018
2009531389.tif 000019
2009531389.tif 000020