(57)【要約】  経皮有効成分送達手段は、ＤＮＡウイルスに感染した領域の皮膚に適用可能な皮膚接着性の、でなければ皮膚耐性の支持層を含む。支持層は利尿剤と強心配糖体剤のうちの少なくとも一つからなる群から選択した少なくとも一つの有効成分を含む経皮的に有効なキャリア媒体を含むＤＮＡ治療用組成物を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分経皮送達手段であって、該送達手段は、
ＤＮＡウイルスに感染した皮膚領域に適用可能な皮膚接着性か、でなければ皮膚耐性の支持層を具備し、支持層は、利尿剤（例えばループ利尿剤）と強心配糖体剤のうちの少なくとも一つからなる群から選択された少なくとも一つの有効成分を含む経皮的に有効なキャリア媒体を含むＤＮＡウイルス感染症治療用組成物を含む、有効成分経皮送達手段。
【請求項２】
前記送達手段は一つ又は複数の強心配糖体剤と併せて一つ又は複数のループ利尿剤を含む請求項１に記載の送達手段。
【請求項３】
前記利尿剤はフロセミド、ブメトラニド、エタクリン酸及びトラゼミドのうちの一つ又は複数を含む、請求項１又は請求項２に記載の送達手段。
【請求項４】
前記利尿剤はフロセミドである、請求項３に記載の送達手段。
【請求項５】
前記強心配糖体は、ジゴキシン、ジギトキシン、メディゴキシン、ラナトシドＣ、プロシラリジン、ｋストロファンチン、ペルボシド及びウアバインのうちの一つ又は複数からなるジギタリス配糖体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の送達手段。
【請求項６】
前記強心配糖体はジゴキシンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の送達手段。
【請求項７】
前記キャリア媒体は、医薬許容性の接着剤中有効成分型製剤を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の送達手段。
【請求項８】
前記接着剤は好ましくはアルキルエステル溶媒、例えば酢酸エチル内に溶解又は分散したアクリル系ポリマー接着剤を含む、請求項７に記載の送達手段。
【請求項９】
前記キャリア媒体は、前記有効成分の放出と透過のうちの少なくとも一つを助けるべく一つ又は複数の医薬許容性賦形剤を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の送達手段。
【請求項１０】
前記キャリア媒体は、一つ又は複数の皮膚許容性溶媒を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の送達手段。
【請求項１１】
前記溶媒は、以下の、例えばメタノール、エタノール、プロパノールなどの一価アルコール、例えば酢酸エチルのようなアルキルエステル、例えばプロピレングリコールのようなアルキレングリコール及び水のうちの一つ又は複数を含む、請求項１０に記載の送達手段。
【請求項１２】
前記キャリア媒体は更に、カルボポールかヒドロキシプロピルセルロースのような少なくとも一つの粘度変調剤を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の送達手段。
【請求項１３】
前記組成物からの前記有効成分の放出速度は１０μｇ／ｃｍ２／２４時間より大きく、好ましくは２０μｇ／ｃｍ２／２４時間より大きく、より好ましくは５０μｇ／ｃｍ２／２４時間より大きく、最も好ましくは１００μｇ／ｃｍ２／２４時間より大きい、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の送達手段。
【請求項１４】
前記支持層上か支持層内の前記有効成分の負荷は、前記組成物から前記皮膚に前記有効成分を送達できる前記送達手段のうちの前記部分のｃｍ２当りの一つ又は複数の有効成分が０．５ｍｇ／ｃｍ２より大きく、好ましくは１．０ｍｇ／ｃｍ２より大きく、より好ましくは１．５ｍｇ／ｃｍ２より大きく、最も好ましくは２．０ｍｇ／ｃｍ２より大きい、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の送達手段。
【請求項１５】
利尿剤と強心配糖体の前記モル比は、配糖体モル：利尿剤モルが１００〜０．１の範囲にある、請求項２〜１４のいずれか一項に記載の送達手段。
【請求項１６】
有効成分：接着製剤の前記重量比は１：５〜２０、好ましくは１：５〜１５、より好ましくは１：８〜１２の範囲にある、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の送達手段。
【請求項１７】
前記送達手段において皮膚接着性支持層が用いられ、前記組成物を含有する貯留層は前記支持層に取り付けられ、前記貯留層に放出層が取り付けられる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の送達手段。
【請求項１８】
前記組成物を含浸させた島式貯留層を含む接着性パッチ型である、請求項１７に記載の送達手段。
【請求項１９】
ラッカー組成物を含む皮膚耐性接着膜が用いられる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の送達手段。
【請求項２０】
前記ラッカーは弾性コロジオンラッカーである、請求項１９に記載の送達手段。
【請求項２１】
前記コロジオンはベンゾインチンキ、パラフィン蝋とメチルセルロースを含有する混合物からなる、請求項１９又は請求項２０に記載の送達手段。
【請求項２２】
前記コロジオンはエーテル溶媒で希釈される、請求項２１に記載の送達手段。
【請求項２３】
前記有効成分を含む前記組成物は吸収性貯留層の不在下において乾燥ラッカーの表面に直接適用及び接着される、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の送達手段。
【請求項２４】
前記有効成分を含む前記組成物は、前記有効成分を溶解及び／又は分散させる少なくとも一つの溶媒を含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の送達手段。
【請求項２５】
前記溶媒は水含有アルコール又は無水アルコールを含む、請求項２４に記載の送達手段。
【請求項２６】
前記アルコールは例えばエタノールのアルカノールのような一価アルコールである、請求項２５に記載の送達手段。
【請求項２７】
前記有効成分を溶解及び／又は分散する溶媒が存在し、有効成分：ラッカー組成物：溶媒の前記比率は０．０１：１〜１０：１〜１０の範囲にある、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の送達手段。
【請求項２８】
ＤＮＡウイルスを治療する前記組成物は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症の作用に対する局所適用として有効である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の送達手段。
【請求項２９】
前記組成物は足底イボと手／指と性器イボのうちの少なくとも一つのようなイボへの局所適用として有効である、請求項２８に記載の送達手段。
【請求項３０】
請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の送達手段を製造する方法であって、該方法は、
請求項１において規定される組成物を製剤化する工程と、
弾性コロジオンラッカーを提供する工程であって、これを固化させるか、でなければ粘着性になるようにする工程と、
前記組成物を前記固化又は粘着性コロジオンラッカーに直接適用する工程と、
任意に解除式保護層を前記暴露組成物に適用する工程と、
を含む送達手段の製造方法。
【請求項３１】
例えばヒトパピローマウイルス感染症のＤＮＡウイルス感染症を治療する局所用薬剤の製造における利尿剤と強心配糖体のうちの少なくとも一つを使用する方法であって、前記局所用薬剤は弾性コロジオン層又は接着剤を含む、方法。
【請求項３２】
被験者におけるヒトパピローマウイルス感染症を治療する方法であって、該方法は前記被験者に局所用薬剤を適用する工程を含み、前記局所用薬剤は利尿剤と強心配糖体のうちの少なくとも一つと、弾性コロジオン層又は接着剤と、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ウイルス治療において用いる有効成分を含む経皮送達手段に関し、特にヘルペスウイルス感染症のようなＤＮＡウイルス感染症の予防的及び治療的処置において有用なそのような送達手段、特に通常目障りで不快なイボの原因となるようなＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）感染症を治療するために有用なそのような送達手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘルペスウイルスはＤＮＡウイルスであり、タンパク質性構造内にＤＮＡの中核を備える。ＤＮＡはウイルスを再生すべく遺伝暗号を保有する。ウイルスは再生するために生きた「宿主」細胞を感染させる必要がある。抗ウイルス化学療法の理想的な標的として働く重要な酵素など十分に特徴付けられた多数のウイルス性タンパク質が存在する。これらには、ＤＮＡ複製に必須のＤＮＡポリメラーゼとチミジンキナーゼが含まれる。ウイルス性ＤＮＡの複製はウイルス伝染力に必須である。感染ウイルスの複製が生きた宿主細胞内の天然イオン平衡を変えられることは公知である。
【０００３】
単純ヘルペスウイルスと水疱瘡ウイルスを治療する特定の配糖体の用途が開示されている（例えば特許文献１参照）。ＨＩＶ感染症を治療すべくレトロウイルスの治療におけるループ利尿剤の用途も開示されている（例えば特許文献２参照）。
【特許文献１】欧州特許出願公開第０４４２７４４号明細書
【特許文献２】国際公開第００／１０５７４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は上記した懸案を鑑みてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
驚くべきことに、皮膚バリアを介するループ利尿剤と強心配糖体のうちの少なくとも一つの経皮的適用が実行可能であると共に、それがＤＮＡウイルス感染症の治療的処置において、特にイボのようなパピローマウイルス感染症の症状を示す皮膚領域の局所治療において有効である可能性があることを本発明の発明者らは認めた。
【０００６】
本発明に従って一態様において、ＤＮＡウイルスに感染した皮膚領域に適用できる皮膚接着性、そうでなければ皮膚耐性の支持層を含む有効成分経皮送達手段が提供される。前記支持層は経皮的に有効なキャリア媒体内にループ利尿剤と強心配糖体剤のうちの少なくとも一つからなる群から選択された少なくとも一つの有効成分のＤＮＡウイルス感染症を治療する組成物を含む。
【０００７】
本発明の別の態様において、経皮的に有効なキャリア媒体中にループ利尿剤と強心配糖体のうちの少なくとも一つか両方を含む組成物を形成することと、組成物を固化又は粘着性コロジオン層に適用することとを含む送達手段を製造することを提供する。
【０００８】
上記のループ利尿剤は広範囲の利用可能なそのような薬剤から選択することが可能である。好ましくは、ループ利尿剤はフロセミド、ブメタニド、エタクリン酸かトラセミドのうちのいずれか一つか複数である。ループ利尿剤はフロセミドからなることが最も好ましい。我々の研究に従って、しかしながらいずれかの理論的仮定に束縛されるものではないが、ループ利尿剤はイオン濃度、細胞性イオン平衡、細胞性イオン環境と電位を変化させることによって明らかにそれらの抗ウイルス作用を媒介する。
【０００９】
フロセミドはアントラニル酸誘導体、化学的には４−クロロ−Ｎ−フルフリル−５−スルファモイルアントラニル酸である。中性ｐＨで水にほとんど溶けないフロセミドは、アルカリ中に溶け易い。フロセミドは細胞膜を介する塩化物イオンの輸送を阻止することによってその生理作用を発揮する。フロセミドは作用持続期間が短いループ利尿剤である。フロセミドは肝不全、腎不全か心不全による浮腫の治療と高血圧の治療とに用いられる。フロセミドのバイオアベイラビリティは約６０〜７０％であり、主として未変化薬としてろ過及び分泌によって排泄される。フロセミドはＮａ＋／Ｋ＋／２Ｃｌ−共変換因子に作用する。その利尿作用について、その主要作用は腎臓のヘンレ係蹄上行脚におけるので、用語「ループ利尿剤」が一般的に許容される。ループ利尿剤はＫ＋排泄を著明に促進するので、細胞の細胞内カリウムを枯渇させる。これは長期間の全身性フロセミド用法の最も重要な合併症、即ち血清中カリウムの低下に至る恐れがある。任意の理論的考察に拘束されるものではないが、我々は細胞イオン性カリウムの枯渇がループ利尿剤をＤＮＡウイルスに対して有用なものにすると仮定している。
【００１０】
証拠は、フロセミドの主要な生体変化産物がグルコロニドであることを示唆している。フロセミドは血漿タンパク質、主にアルブミンに広範に結合される。１〜４００μｇ／ｍｌにわたる血漿中濃度は、健常個体において９１〜９９％結合される。未結合のフラクションは治療濃度で２．３〜４．４％に及ぶ。フロセミドの最終的半減期は約２時間であり、大部分は尿中に排泄される。
【００１１】
上述した強心配糖体は、ジゴキシン、ジギトキシン、メディゴキシン、ラナトシドＣ、プロシラリジン、ｋ−ストロファンチン、ペルボシド及びウアバインのうちのいずれか一つか複数であることが可能である。ジゴキシンを単独で用いることが最も好ましい。ジギタリス種の植物（例えばｄｉｇｉｔａｌｉｓ・ｐｕｒｐｕｒａ，ｄｉｇｉｔａｌｉｓ・ｌａｎａｔａ）は集合的にジギタリスとして知られているジゴキシンとジギトキシンのような強心配糖体を含有する。他の植物は、化学的にジギタリス配糖体に関連し、これらはジギタリスとも称されることが多い強心配糖体を含有する。従って用語ジギタリスは、配糖体群の全体を示すべく用いられる。配糖体は二つの成分、糖とカルデノリドからなる。ウアバインはアフリカ原産のストロファンツス属（ストロファンチジンＧとしても公知）から得られ、静脈内型（経口から吸収されない）で利用でき、その溶解度が比較的大きいために配糖体の研究において多くの室内実験で用いられている。ウアバインは事実上、ジゴキシンと同一様式の作用を備える。
【００１２】
ジゴキシンは化学的に（３ｂ，５ｂ，１２ｂ）−３−［０−，６−ジジオキシ−ｂ−Ｄ−リボ−ヘキサピラノシル−（１”４）−０−２，６−ジデオキシ−ｂ−Ｄ−リボ−ヘキサピラノシル−（１”４）−２，６−ジデオキシ−ｂ−Ｄ−リボ−ヘキサピラノジル）オキシ］−１２，１４−ジヒドロキシ−カルド−２０−２２）−エノリドと記載される。その分子式はＣ４１Ｈ６４Ｏ１４であり、その分子量は７８０．９５である。ジゴキシンは、２３０℃より上で分解して融ける無臭の白色結晶として存在する。前記薬物は水とエーテルにほとんど溶けず、希釈した（５０％）アルコールにおいてとクロロホルムにおいて僅かに溶け、ピリジンに溶けやすい。
【００１３】
患者によってはジゴキシンの副作用を特に受け易くなり得るので、患者の臨床状態が必要とするように薬物投与量を選択し、慎重に調節する。
細胞レベルでジギタリスは、ナトリウム輸送酵素ナトリウム・カリウム・アデノシン・トリホスファターゼ（Ｎａ／Ｋ  ＡＴＰａｓｅ）の阻害によってその主要作用を発揮する。即ちこれは、心筋に及ぼす電気生理学的作用に直接起因し、更に理論的仮定に従って、しかしながらそれに拘束されるものではないが、ＤＮＡウイスルに対するその活性にも起因する。
【００１４】
組成物における特に好適な組合せは、強心配糖体ジゴキシンと組み合わせて併用するループ利尿剤フロセミドである。二つの有効成分を短期間分離して使用し、順次適用する個別送達手段を提供することは、本発明の範囲内である。
【００１５】
試験（Ｘ線微量分析を含めて）は、本発明に従う組成物を含む送達手段の抗ウイルスＤＮＡ作用が、ウイルス感染宿主細胞内カリウムイオンの枯渇に寄与できることを示した。これらの試験を簡単に以下に示す。
・低カリウムを置換することによって、ＤＮＡ合成、従ってウイルス複製が修復されることになる。
・フロセミドとジゴキシンを組み合わせて使用することは、カリウム枯渇に匹敵する作用を有する。
・カリウム枯渇レベルは正常に細胞を機能させるのに十分である。
・カリウム枯渇は細胞障害性作用を備えない。
【００１６】
従ってループ利尿剤と強心配糖体を適用して、イオンの細胞性濃度、細胞性イオン平衡、細胞イオン環境及び細胞電位を変更させることによって、細胞代謝を細胞内の正常機能を損ねることなく変更できるが、ＤＮＡウイルス複製は阻害される。従って、経皮的に有効なキャリア内のループ利尿剤と強心配糖体のうちの少なくとも一方の使用は、ウイルス性ＤＮＡの複製を阻害することによるウイルス複製を防止又は制御する上で有益である。抗ウイルス有効性は、ＤＮＡウイルスＨＳＶ１とＨＳＶ２，ＣＭＶ，ＶＺＶ、哺乳類ヘルペスウイルスとパポウイルス；アデノウイルスに対して示されてきた。
【００１７】
我々はパルボウイルス；仮性狂犬病；ヘパドノウイルス及びポックスウイルスに対しても有効性が示され得ると考える。
本発明の経皮送達手段は好都合なことに、単純ヘルペスウイルスのようなＤＮＡウイルスによって感染した皮膚上の部位へ接着することによって外用投与するのに適し得る。皮膚バリアを介する経皮的に有効な局所適用は最も有用であり得る。送達手段内の組成物は、特に徐放性に製剤化されることが可能である。組成物を局所経皮的に有効に適用すべく製剤化されることは本発明の非常に好適な特徴である。組成物内の他の成分は、抗ウイルス活性を損なわなければ、含むことが可能である。例として保存剤、添加物、賦形剤、増粘剤及び溶媒が含まれる。好ましくは、本発明は角膜の眼感染症を治療する緩衝化生理食塩水製剤における局所適用としてのフロセミドとジゴキシンの組合せを含む送達手段を提供する。
【００１８】
本発明の好適な適用は、イボの原因となるＨＰＶウイルス感染症を極めて効果的に治療すべく局所濃度のループ利尿剤と強心配糖体を使用することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
次に本発明は例示する目的でのみ以下の実施例を参照して記載することになる。
実施例１〜３は、ＨＳＶウイルスで感染した細胞に対してジゴキシンとフロセミドを含む組成物の相乗作用を含む作用を示すべく、例証として含まれる。しかしながら、そのような実施例は本発明の範囲内の経皮的に有効な送達手段を完全に明示していないが、それでもなお有効性の有用な指標であることを本明細書において強調されるべきである。
【実施例１】
【００２０】
フロセミド（１ｍｇ／ｍｌ）とジゴキシン（３０μｇ／ｍｌ）を同時投与した抗ウイルス活性について単純ヘルペスウイルスを用いてインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で生物学的アッセイを行った。培地とアッセイ方法は単純ヘルペスウイルスとベロ細胞についてレンネッテ（Ｌｅｎｎｅｔｔｅ）とシュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）（１９７９）が記載した方法を僅かに変更した方法に従う。
使用した単純ヘルペス菌株：
１型単純ヘルペス菌株ＨＦＥＭは、ロッカーフェラー（Ｒｏｃｋｅｒｆｅｌｌｅｒ）菌株ＨＦ（ウイルディ（Ｗｉｌｄｙ）１９５５）の派生型であり、２型単純ヘルペス菌株３３４５、陰茎単離体（スキナー（Ｓｋｉｎｎｅｒ）ら１９７７）を原型菌株として使用した。これらの原型は必要時まで−８０℃で保存した。
細胞培養物：
アフリカミドリザル腎細胞（ベロ）は、英国国立生物学的製剤研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＵＫ）から得られ、実施例における全実験の唯一の細胞株として用いた。
培養培地：
細胞とウイルスは１０％ウシ胎仔血清を加えたグラスゴー（Ｇｌａｓｇｏｗｓ）修正培地で維持した。
結果：
【００２１】
【表１】
2009508814.tif 000002
この実施例は、低濃度のフロセミドと配糖体の原液をＨＳＶ１に感染したベロ細胞に適用することによってウイルス活性がほとんど除去されたことを示す。より高濃度でウイルス活性は完全に阻止された。この原液の抗ウイルス作用は、フルセミドかジゴキシンの単独の作用よりも遥かに大きかった。細胞外ウイルスに及ぼす直接的な殺ウイルス活性はなかった。
【００２２】
これらの実験はＨＳＶ２菌株を用いて繰り返し、ほとんど同一の結果を得た。
【実施例２】
【００２３】
実施例１の方法を１型ヘルペスウイルス菌株ｋｏｓを用いることによって繰り返した。類似の結果が得られた。
【実施例３】
【００２４】
フロセミドとジゴキシンとを、同時及び単独の両方で適用した場合の、フロセミドとジゴキシンの抗ウイルス活性についてインビトロで生物学的アッセイを行った。
組成物を異なる型のベロ細胞（アフリカミドリザル腎細胞とＢＨＫ１細胞）に適用し、低度、中等度及び高度の感染多重度（ＭＯＩ）で２型単純ヘルペスウイルス（菌株３３４５と１８０）に感染させた。ウイルス複製の阻害を以下の尺度で採点した。
【００２５】
阻害なし        −
２０％阻害      ＋
４０％阻害      ＋＋
６０％阻害      ＋＋＋
８０％阻害      ＋＋＋＋
１００％阻害      ＋＋＋＋＋
Ｔは薬物毒性を示す。
【００２６】
以下の結果は、アフリカミドリザル腎細胞と２型単純ヘルペス菌株３３４５を用いることによって得られた。
【００２７】
【表２】
2009508814.tif 000003
ジゴキシン単独の最大作用（＋＋＋）は低感染多重度でのみ３０μｇ／ｍｌのジゴキシンを適用した場合に生じた。
【００２８】
フロセミド単独の最大作用（＋＋＋）は低度と中等度の感染多重度で１ｍｇ／ｍｌのフロセミドを適用した場合に生じた。
ループ利尿剤と強心配糖体が感染細胞に同時に適用された場合、最大作用（＋＋＋＋＋）は３０μｇ／ｍｌのジゴキシンと１ｍｇ／ｍｌのフロセミドを用いることによって得られた。ＨＳＶ２複製の１００％阻害は、低度、中等度及び高度の感染多重度で示された。
【００２９】
類似の結果は、ベロ細胞と２型単純ヘルペス菌株の他の組合せを用いることによって得られた。
この実施例は、ＨＳＶ２の複製がフロセミド又はジゴキシンを単独に適用することによって極限まで阻害されないことを示す。しかしながらフロセミドとジゴキシンを組み合せると、ＨＳＶ２複製が完全に阻害された。
【実施例４】
【００３０】
この実施例は経皮送達デバイスからジゴキシンとフロセミドのインビトロでの放出と透過を明示する。送達システムは、放出と透過の両方を助ける付加賦形剤の存在下と不在下において適用する製剤として評価された。三つのアクリルポリマー系グルーを用いた。
【００３１】
材料
ジゴキシンとフロセミドはシグマ（ＳＩＧＭＡ）社（ＵＫ）から購入した。Ｄｕｒｏｔａｋアクリル系グルーはナショナル・スターチ・アンド・ケミカル社（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）から調達した。Ｄｕｒｏ−ｔａｋ８７−９００Ａ（グルー１），８７−２０５２（グルー２）及び８７−２０１Ａ（グルー３）を用いた。放出と透過性に用いた溶媒と化学薬品は全てシグマから購入した。合成皮膚バリアとして用いたシリコーンシートはアドバンスト・バイオテクノロジーズ社（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）から購入した。
【００３２】
方法
ジゴキシンとフロセミドの送達用の製剤と経皮パッチのインビトロでの評価の概要を以下に述べる。
【００３３】
ジゴキシンとフロセミドのＨＰＬＣ方法の開発
有効に治療するためには、薬物は皮膚を透過する前にまず製剤から放出されなければならない。そのため各々の場合において薬物放出量又は透過速度を定量することが必要になる。ＧＨＰＬＣは放出された薬物量を定量する信頼できる手段を提供する。両薬物のＨＰＬＣ分析を詳述する幾つかの公表された方法が存在する。用いたＨＰＬＣはＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃ１８（１５０×４．６０ｍｍ、５ミクロン）カラムを備えるＡｇｉｌｅｎｔ  Ｓｅｒｉｅｓ  １１００であった。移動相は水、メタノール及びアセトニトリル（４０：３０：３０）であり、流速は１ｍｌ／分であった。２０μｌの試料を注入し、可変波長検出器（ＶＷＤ）によって２２０ｎｍで検出した。
【００３４】
図１は用いたＨＰＬＣ法に従うジゴキシン濃度の検量線を示す。
ＨＰＬＣはグルー３から放出されたジゴキシンを検出できなかったので、ジゴキシンはこのグルー内に優先的に結合されていることを示す。
【００３５】
グルー１は高速度にて放出する両薬物の最も良好な放出を示した。放出グラフは全薬物が三日間にわたって放出されたことを示したので、このグルー内の薬物の負荷量を増加させることによって、薬物放出が増加し得ると考えられた。
【００３６】
図２は用いたＨＰＬＣ方法に従うフロセミド濃度の検量線を示す。
【実施例５】
【００３７】
送達デバイスの製造
ジゴキシンとフロセミドでの使用に適当であり得る特性を備えるアクリル系圧力感受性接着剤はナショナル・スターチ・アンド・ケミカル社から調達した。様々な溶媒における薬物の溶解度を測定する試験を実施した。
【００３８】
【表３】
2009508814.tif 000004
グルーを含む溶媒に溶解した薬物を混合した後、厚さが４００ミクロンの薄膜をバッキング膜（Ｓｃｏｔｃｈｐａｋ１１０９）上に鋳造した。これは、溶媒を蒸発させるため、室温で約４５分間、上を覆わないで（しかしながら光からは保護して）放置した。十分に乾燥したら（約４５分間）、暴露面をライナ（Ｓｃｏｔｃｈｐａｋ１０２０）で覆うことによって、更に溶媒が失われないようにした。全ての材料を測定サイズに切断し、気密容器内で室温保存した。既知重量の各々のパッチは既知薬物含有量を有し、この場合、表面積当りの高い負荷が要求される。
【００３９】
薬物と併せて用いられる溶媒には酢酸エチル、メタノール、エタノール、プロパノールと、乾燥薬物粉末をグルーと直接混合した物と、が含まれた。
【実施例６】
【００４０】
製剤化パッチからの薬物放出の測定
透過試験の前にスクリーニング試験として薬物放出試験を行った。直径が１ｃｍの製剤円形パッチをとり、過剰量の放出溶媒（２ｍｌ）を含有する密閉容器内に設置した。バイアルを密封し、制御速度と温度（３７℃）で４８時間振盪させた。設定時点；１，２，４，６，８，１２，２４及び４８時間目に試料（０．５ｍｌ）を分析用に除去した。試料を除去する度に、２ｍｌの全容量を維持すべく、新鮮放出溶媒と置き換えた。各々の試料のＨＰＬＣ分析によって、経時的薬物放出のプロットを可能にした。最良の放出を示すプロットを指摘すべく、製剤を比較した。臨床条件においてパッチは約０．２５ｃｍ２になり、必要な放出は２４時間当り２５μｇになるので、放出速度は１００μｇ／ｃｍ２／２４時間より大きくなければならない。
【００４１】
図３はグルー１（８７９００Ａ）からの両薬物の放出を示す。
図４はグルー２（８７２６７７）からの両薬物の放出を示す。
図５はグルー３（８７２０１Ａ）からの両薬物の放出を示す。
【００４２】
図６〜図１０は記載したような緩衝溶液内に放出する記載の溶媒における薄膜からの薬物放出のＨＰＬＣトレースを示す。
上記のグラフ（図１１と図１２）の比較は、薬物を溶解すべくプロピレングリコールよりはむしろメタノールを使用して製剤が形成されるとき、薬物がより良好に放出されることを示す。
【実施例７】
【００４３】
製剤化パッチからの薬物透過の測定
最大放出を示す薬物を組み込む感圧接着剤を選択し、皮膚への透過を評価した。フランツセル装置を用いることによって、皮膚膜への接着製剤からの薬物透過を測定した。
【００４４】
フランツセルにおいて上層は経皮製剤を示し、下層は皮膚を示す。皮膚の下方の容器は液体で充填され（放出試験において用いられるものと同じ）、定速で撹拌された。指定の時間間隔でサイドポートを用いて下方容器から試料を採取し、薬物含有量についてＨＰＬＣを用いて分析した。従って経時的な薬物の膜透過性を算出することができる。
【００４５】
本試験において用いる膜は、アドバンスト・バイオテクノロジーズ社（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）から購入した合成シリコーン性皮膚膜であった。
【００４６】
透過実施例のデータは、薬物が合成膜を透過することを示唆する。
【実施例８】
【００４７】
ジゴキシンとフロセミドの組成物
薬物粉末を１：１の重量比で混合し、５００ｍｇのこの混合物を１０ｍｌのグルー１と配合した。次にこの混合物を８０×１２０ｍｍの範囲にわたって３Ｍ・Ｓｃｏｔｃｈｐａｋ１０２０の放出ライナ上に鋳造した。溶媒を蒸発させ、薄膜を３Ｍ・Ｓｃｏｔｃｈｐａｋ１１０９・ポリエステルフィルムラミネートバッキングで覆った。
【００４８】
その場合の薬物負荷は、製剤内で２．６ｍｇ／ｃｍ２の両薬物である。
直径１ｃｍのパッチの表面積は０．７８５ｃｍ２である。
各々の小パッチは１．０２ｍｇのジゴキシンと１．０２ｍｇのフロセミドを含有する。
【００４９】
直径２ｃｍのパッチの表面積は３．１４２ｃｍ２である。
各々のパッチは４．０８ｍｇのジゴキシンと４．０８ｍｇのフロセミドを含有する。
【実施例９】
【００５０】
以下参照
ＨＰＶ感染症の多種多様な解剖学的部位を検討すべくジゴキシンとフロセミドの望ましさが＞１の高い剤型を検討し、提案された相違点には以下のものが含まれた。
【００５１】
・足底イボ：グルー中薬物・プラスター型の適用
・手／指イボ：ラッカー／塗布剤
この後の実施例の目的は、経皮接着剤に基づくグルー中薬物型製剤の実行可能性と弾性コロジオンＢＰに基づくラッカー／塗布製剤の実行可能性の両方を示すことである。
【００５２】
実施例９−材料
ジゴキシン（Ｄ）バッチ番号１８１１０４とフロセミド（Ｆ）バッチ番号１１４３１０は、ビーユーエフエー・ファルマシューティカル・プロダクツｂｖ社（ＢＵＦＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｂｖ）（Ｖｉｔｇｅｅｓｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得た。セトリミド、ロット番号Ａ０１２６３３４０１はアクロク・オルガニック社（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ）（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）から得た。Ｄｕｒｏ−ｔａｋ（登録商標）３８７−２２８７（グルー４）接着剤はナショナル・スターチ・アンド・ケミカル社（Ｚｕｔｐｈｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得た。弾性コロジオンＢＰはジェエム・ラブリッジ・ピーエルシー（ＪＭ  Ｌｏｖｅｒｉｄｇｅ  ｐｌｃ）（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＫ）から得た。ＨＰＬＣ等級アセトニトリル、エタノール及びメタノールは、フィッシャー・サイエンティフィック社（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ）から得た。ブタの耳は蒸気洗浄する前に地元の食肉処理場から得た。水はＥＬＧＡ実験室蒸留器から引いた。
【００５３】
実施例９−接着剤中薬物型製剤
Ｆ：Ｄ選択混合物の比は１：１，１：２５及び１：１００（ｗ／ｗ）であったので、かなり過剰のジゴキシンを提供した。これはジゴキシンがＦより実質的にウイルス静止力が大きいことを示唆する証拠に基づいた（１０頁を参照）。この証拠は過剰のジゴキシンを送達した製剤がウイルス負荷を低下させるのに有効であり得ることを示唆する。各々の比率がジゴキシンとフロセミドの放出に及ぼした作用を例示し、各々の有効成分の最適放出を生成し得る比率を検討する。
【００５４】
接着剤中薬物型製剤は、所望の送達特性に必要な薬物量に基づいて薬物と賦形剤とが溶解又は分散され得るマトリックス系型である（ベンカトラマン（Ｖｅｎｋａｔｒａｍａｎｎ）とガレ（Ｇａｌｅ）、１９９８）。接着剤中の溶媒は、蒸発することによって固体マトリックス生成物を形成するので、熱力学的活量の概念は適用しない。しかしながら、いずれかの具体的な理論に束縛されるものではないが、溶媒は乾燥によりマトリックスにマイクロチャネルを生成することによって皮膚への薬物用「経路」を形成するので、重要な成分であると思われる。一般的に組み込める薬物量において制限となる因子は、生体接着特性が失われる点である。
【００５５】
モデルパッチの組成物と調製方法を改良すべく予備研究を行った。５ｇの接着剤に対して０．５ｇの薬物混合物の負荷用量が最適であると認められた。その理由は、更に薬物混合物を添加することによって、パッチの接着特性が低下したからである。薬物混合物は直接接着剤に添加したが、粘度を減らすと共にパッチから追い出し易くするために２．５ｍｌのメタノールを混合物に添加した。
【００５６】
パッチ厚さを一定にするためには、水平なポリマー裏打ちペーパー上に接着剤中薬物型混合物を注いだ後、紙を垂直に保持し、混合物がペーパーを流れ落ち得るようにすることが好ましかった。この方法は再現性のあることが認められ、接着剤中薬物は約８ｃｍ２の表面積を覆い、その深さはほぼ正確に１ｍｍであると測定された。
【実施例１０】
【００５７】
接着剤中薬物型パッチの調製
０．５ｇの薬物混合物を５ｇの接着剤（湿重量）に直接加えることによってパッチを調製した。異なるモル比でＦ：Ｄを含有する三つの薬物混合物を調製した。薬物混合物の組成を表１において示す。適量の薬物混合物と接着剤を直接ガラスバイアル内に化学天秤を用いることによって正確に秤量し、２．５ｍｌのメタノールを混合物に添加した。各々のバイアルを３分間ボルテックス混合し、血清回転装置で一晩回転させることによって、薬物混合物が確実に均一に分散されるようにした。薬物混合物を含まない対照パッチも、同じ方法によって調製した。次に各々の接着混合物を上記のようなポリマー裏打ちペーパー上にて成型した。パッチを覆い、４８時間溶媒を蒸発させた（チェッジ（Ｃｈｅｄｇｚｙ）ら２００１）。次にパッチバッキングの機能を果たすべく、透明ポリエチレンフィルムをパッチの暴露側に接着した。個々の球形パッチを直径が１ｃｍ（約０．７８５ｃｍ２）の穿孔器を用いて切り取った。
【００５８】
【表４】
2009508814.tif 000005
【実施例１１】
【００５９】
レセプター相
レセプター相の機能は、放出薬物又は透過薬物の有効なシンクを提供することである。我々が研究を行う上でのルールは、薬物量が所与シンクにおいてその溶解度の１０％を超えるべきでないことである。更にシンクは放出過程または透過過程を妨害してはいけない（ハード（Ｈｅａｒｄ）ら、２００２）。二つのレセプター相がこの研究において考慮される。これらは水性セトリミド３０ｍｇ／ｍｌ、イオン系界面活性剤及びＥｔＯＨ／水１０：９０ｖ／ｖであった。これらは両薬物が各々の溶媒に溶けやすいことが分かっているので選択された。
【００６０】
各々の原液をメスフラフコにおいて調製し、使用前に０．４５膜で抜き取ることによって脱気した。しかしながら、セトリミドはＨＰＬＣ分析を有意に妨害するので、この研究の残りはＥｔＯＨ／水＝２０：９０ｖ／ｖをレセプター相として用いた。
【００６１】
実施例１０のパッチからのＤとＦ混合物の拡散放出
ポリマー裏打ちペーパーをパッチから剥がすことによってパッチの片側を暴露した。次に各々のパッチを７ｍｌの一般ガラススクリューキャップバイアルの底に少量のグルー４をポリマー薄膜に塗り付けることによって個々に固定化し、３０分間乾燥させた。用いた溶出溶媒はセトリミド３０ｍｇ／ｍｌかＥｔＯＨ／水１０：９０ｖ／ｖであり、各々の５ｍｌを個々に各々のバイアルに加えた。次にバイアルを７０ｒｐｍに設定されたＳｔｕａｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｇｙｒｏ−Ｒｏｃｋｅｒ（フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ），ＵＫ）上に設置することによって、溶出溶媒が確実に十分混合されるようにし、実験室インキュベータ（ゲンラブ（Ｇｅｎｌａｂ））中において３２℃（皮膚温度）でインキュベートした。１，３，６，１２及び２４時間目の時点で（予測適用期間）０．５ｍｌの溶出溶媒を試料採取し、ＨＰＬＣ自動試料採取装置のバイアルに入れた。各々の試料を採取した後、レセプター相を同様に３２℃の０．５ｍｌの原液溶出溶媒で補充した。２４時間後にＨＰＬＣ分析するまで２〜４℃で試料を冷蔵した。各々のレセプター相における各々の処理について総計３回繰り返した。最適放出を示した製剤を透過実施例の間使用した。
【００６２】
膜選択の論理的根拠
イボを治療する新規の局所製剤を検討するため、ヒトイボ組織を介する送達がインビトロモデルにおいて最も適切になるだろう。しかしながら、このような材料は入手できないので適切なモデルが必要であった。適切な代用品としてブタの皮膚を使用することが幾つかの研究において示されており、耳はヒト皮膚に最も近い透過特性を提供する部分である（ディック（Ｄｉｃｋ）及びスコット（Ｓｃｏｔｔ），１９９２；シモン（Ｓｉｍｏｎ）及びマイバッハ（Ｍａｉｂａｃｈ），２０００）。透過実験を用いることによってこの皮膚薬物送達系を試験した。透過性は局在化（基底層における経皮吸収）を予測できるので、フラックスが大きいほど、健常皮膚よりもイボにおいて数が多いケラチン生成細胞を含む角質層を通る透過性が大きい。イボ病変は「正常」皮膚と比較して比較的多く角質化される。しかしながら、正常皮膚を介する透過測定は、特にスクリーニングモードでイボを介する透過を予測し得る。これは、ケラチンが皮膚透過速度の測定において重要な部分を果たす幾つかの証拠が存在するので正当化される（ハシグチ（Ｈａｓｈｉｇｕｃｈｉ）ら、１９９８；ハード（Ｈｅａｒｄ）ら、２００３）。
【００６３】
新鮮な解体ブタを蒸気洗浄によってルーチン的に消毒した。蒸気洗浄は表皮全体を除去する効果を備える。この研究において用いるブタの耳は、蒸気洗浄の前に得、表皮と角質層は無傷のままであった。
【実施例１２】
【００６４】
ブタ耳の皮膚の調製
耳を流水下で洗浄し、外科用メスを用いて背面皮膚の全層を鈍的切開によって軟骨から分離した後、電気カミソリを用いて毛を除去した。皮膚を約２ｃｍ２の試料に切断し、外観検査によって各々の片に表皮剥離や血管がないことを確認した。次に試料を必要時までアルミニウム箔上で皺のない状態にして−２０℃で貯蔵した。
【実施例１３】
【００６５】
パッチからブタ耳の皮膚を介するＤ及びＦの混合物の透過
皮膚試料を冷凍庫から取り出して、完全に解凍させた。フランツ型拡散セル（図１３を参照）のドナー区画とレセプター区画にグリースを塗ることによって密封し、レセプター相からの任意の漏出を防止した。ポリマー裏打ちペーパーをパッチから除去して片側を暴露し、各々の皮膚片の表面の中心にしっかりと押し付けた。確実に接着した後、皮膚を拡散セルのレセプター区画（公称容量２．５ｍｌ）のフランジ上に取り付けることによって、パッチが確実にフランジ開口の直接上方に設置されるようにした。次にドナー区画をレセプター区画の上部に設置し、更にピンチクランプを用いて締め付けた。ＥｔＯＨ／水１０：９０のレセプター相（３７℃に維持される）を用いて慎重にレセプター区画を満たし、皮膚の下面と接触する気泡がなく、レセプター相が皮膚と接触することを確認した。小さな磁気撹拌器を加えてレセプター相が確実に均質に混合されるようにした。フランツセルを水浴（ベルコン含有）中に沈めた磁気撹拌器上に置き、３７℃の一定温度（従って皮膚の表面は約３２℃であった）で維持した。湿度から保護する市販パッチのバッキング層を真似るべくドナーの開口を塞ぎ、レセプター相の蒸発を防止すべく試料採取アームを塞いだ。３，６，１２，２４，４８時間目の時点で０．２μｌのレセプター相を試料採取し、自動試料採取器バイアル内に移し、分析に必要とされるまで２〜４℃で冷蔵した。次にレセプター相を補充した。各々の処理に対して総計５回繰り返した。
【００６６】
塗布剤溶媒の選択
ＤとＦの局所投与に利用できる一連の賦形剤のうちの塗布様製剤かラッカー製剤が一般イボ及び性器イボの治療に特に魅力的であると考えられた。これはこのような治療が比較的簡単であり、表皮剥離に対してある程度の抵抗性を提供するからである。またこのような製品、例えばサリチル酸コロジオンＢＰ（Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｌｌｏｄｉｏｎ  ＢＰ）は現在市販されている。
【実施例１４】
【００６７】
コロジオン製剤
市販のコロジオンＢＰは液体であり、高い溶媒含有量を有する（主にジエチルエーテル）。皮膚への適用によってコロジオンの揮発性成分は速やかに蒸発し、液体溶液を乾燥した固体薄膜に変換し、これが皮膚に接着することになる。グルー中薬物型接着剤におけるように、賦形剤の物理的状態の変化は、液体／半固体皮膚系のうちの熱力学的活量が最初の液体製剤に加わるだけであり、固体状態における製剤には関係ないことを意味する。従って液体製剤に対する溶媒の割合を増加させることによって、より多くの薬物混合物を添加できるので、有効成分のある程度までの溶解度は自由裁量による。しかしながら固化によって製剤中の溶媒が蒸発した後、化合物の結晶化が起こることになる。そのため結晶は製剤のマトリックス中に保持されることになる。これは、結晶体と皮膚の間で直接接触することによって優れた送達が提供されることが多いので（しかしながら、この正確な機構はわかっていない）送達速度を増加させ得る。顕微鏡観察レベルで薬物送達をもたらす皮膚との親密な接触を維持するコロジオンの能力に影響を及ぼすもの、即ち制限因子は皮膚への接着であろう。
【００６８】
幾つかの予備実験を行うことによって、コロジオン中の薬物混合物の最大負荷を測定した。遭遇した問題には、コロジオン中の溶解度が制限されることによる薬物混合物の沈殿が含まれた。薬物混合物は振り混ぜることによって容易に再懸濁しなかった。これは薬物混合物の少量だけがコロジオン中に溶解し得ることを意味する。この問題を克服するためとコロジオン中の薬物混合物の溶解度を増やすため、沈殿の薬物溶解速度／減少速度（粘度が低下すれば、増加するだろう）と乾燥（溶媒蒸発）速度との間の平衡が認められるまで、種々量のエタノールを製剤に添加した。５ｍｌのコロジオン中の０．０１ｇの薬物混合物と５ｍｌのエタノールが良好な妥協点であると結論付けた。この製剤は優れた接着性も示した。
【実施例１５】
【００６９】
コロジオン製剤の調製
０．０２ｇ（原料を製造）の薬物混合物（組成については表２を参照）を化学天秤（精度小数第５位まで）で秤量し、マッカートニー（ＭｃＣａｒｔｈｎｅｙ）瓶中の１０ｍｌのコロジオンと１０ｍｌのエタノールに直接添加した。接着剤中薬物型と比較して少量の薬物混合物を使用したので、用いたＦ：Ｄのモル比は１：１，１：２．５（２：５）及び１：１０であった。これによって測定可能量のＦが使用できた。各々のマッカートニー瓶を３分間ボルテックス混合し、血清回転装置上で一晩回転させることによって、混合物が確実に均質になるようにし、何れの気泡も分散されるようにした。同様に同じ方法によって調製したが、薬物混合物を添加しなかった対照コロジオンを調製した。
【００７０】
【表５】
2009508814.tif 000006
【実施例１６】
【００７１】
コロジオンからのＤとＦの拡散放出
異なるモル比の二つの薬物を用いて各々の薬物の放出速度と放出程度に及ぼす影響を測定した。２００μｌのコロジオンをギルソンピペットで７ｍｌの一般ガラススクリューキャップバイアルの底に分配し、３時間乾燥させた。次に再度脱気したＥｔＯＨ／水１０：９０の溶解溶媒２ｍｌを各々のバイアルに加えた。試料採取及び補充するレセプター相の量は２００μｌであり、各々の処理に対して総計５回繰り返した。最適放出を示した製剤を皮膚透過実験に選択した。
【実施例１７】
【００７２】
コロジオンからブタ耳の皮膚を介するＤ及びＦの透過
方法は実施例１６において記載したものと本質的に同じであった。２００μｌのコロジオンを皮膚膜に取り付け、レセプター相を加える前に３０分間乾燥させた。各々の処理に対して総計４回繰り返した。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析
先に記載したものと同じ方法、即ちＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ｋｉｎｇｓｏｒｂ５ｍｍのＣ１８カラム２５０×４．６ｍｍ（フェノメネックス社（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ），Ｍａｃｃｌｅｓｆｉｅｌｄ，ＵＫ）とＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｓｅｃｕｒｉｇｕａｒｄガードカラムが装着されたアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）シリーズ１１００自動化システムを用いてＨＰＬＣ分析を行った。ＤとＦは波長２２０ｎｍに設定された紫外線（ＵＶ）検出器を用いて検出した。移動相は４０：３０：３０の水：ＭｅＯＨ：ＭｅＣＮから構成され、０．４５膜で抜き取ることによって脱気し、１ｍｌ／分の流速で１０分間、定組成で稼動させた。各々の試料の注入容量は２０μｌであった。Ｆ及びＤの保持時間は通常、それぞれ２．６分と５．２分であった（図１５を参照）。データはアジレントソフトウエアを用いて得た。標準検量線は、レセプター相において５，１０，２０，４０，８０及び１００μｇ／ｍｌの標準溶液を用いて測定することによって、ソルバトクロミック作用を防止した。検出限界は０．１μｇ／ｍｌであった。
データ処理
クロマトグラムのピークを手動で積分し、データを希釈効果について補正した。累積放出を測定し、時間の平方根に対してプロットすることによって放出速度を測定した。フラックスを得るため、累積透過データを測定し、時間に対してプロットした。データ処理にエクセルを用い、統計分析にミニタブ（Ｍｉｎｉｔａｂ）を用いた。
【実施例１８】
【００７３】
パッチからのジゴキシンの拡散放出
放出したジゴキシンの累積質量
モル比が１：１，１：２５，１：１００のＦ：Ｄを含有する接着剤からのジゴキシンの累積放出（質量／面積）グラフを２４時間にわたって測定し、図１４において例示する。ジゴキシンはパッチ全てから放出された。２４時間後の最大累積放出における傾向（表３）は、１：１００＞１：１＞１：２５であった。１：１と１：１００の比率を含むパッチは類似のグラフを有し、１：１のモル比を含むパッチから最長１２時間までに最大放出が観察された。エラーバーは小さかった。
モデルパッチからのジゴキシン負荷用量の放出パーセント
モル比が１：１，１：２５及び１：１００のＦ：Ｄを含有する接着剤からのジゴキシン負荷用量の放出パーセントを２４時間にわたって測定し、図１５に示した。放出パーセントは図１４において観察された傾向に良く似ている。２４時間後のジゴキシンの最大放出パーセント値を表３に例示する。エラーバーは小さかった。
【００７４】
【表６】
2009508814.tif 000007
【実施例１９】
【００７５】
パッチからのジゴキシン放出データを示す主作用プロット
図１６において例示した主作用プロットを用いることによって、モデルパッチからのジゴキシンの拡散放出データを視覚的に要約した。ジゴキシン負荷用量の放出パーセントの比率における傾向と、放出パーセントがどのように経時的に増加するかとを示す。
【実施例２０】
【００７６】
パッチからのジゴキシンの（負荷の）放出速度の測定
図１４における累積放出（質量／面積）グラフによって示される直線性は、三つのモル比全てからゼロ次放出速度過程を示した。放出速度は、各々のグラフの傾向線の勾配から測定した。理想的な直線性はＲ２＝１である。放出値を表４において例示する。
【００７７】
【表７】
2009508814.tif 000008
【実施例２１】
【００７８】
モデルパッチからのフロセミドの拡散放出
放出されたＦの累積質量
モル比が１：１，１：２５，１：１００のＦ：Ｄを含有する接着剤からのＦの累積放出（質量／面積）グラフを２４時間にわたって測定し、図１７において例示する。フロセミドはパッチ全てから放出される。１：１の比率は、典型的な放出グラフを示すが、１：２５と１：１００の放出は直線状である。２４時間後の最大累積放出における傾向は１：１＞１：２５＞１：１００であった（最大放出値については表３．３を参照）。エラーバーは小さかった。
【実施例２２】
【００７９】
モデルパッチからのフロセミド負荷用量の放出パーセント
フロセミド負荷用量の放出パーセントにおける傾向（図１８）は、３．６において観察される傾向とよく似ており、２４時間後の最大放出パーセントについては表５を参照する。エラーバーは小さかった。
【００８０】
【表８】
2009508814.tif 000009
【実施例２３】
【００８１】
パッチからのフロセミドの放出データを示す主作用プロット
図１９において示す主作用プロットは、モデルパッチからのフロセミドの拡散放出データを要約する。主作用プロットはＦ負荷用量の放出パーセントの比率における傾向と、フロセミド負荷の放出パーセントがどのように経時的に増加したかとを示す。
【実施例２４】
【００８２】
パッチからのブタ耳の皮膚を介するジゴキシン及びフロセミド混合物の透過
パッチからブタ耳の皮膚を介するジゴキシンの透過
ブタ皮膚を介するジゴキシンの透過をジゴキシン負荷の累積質量／面積と透過パーセントの両方として示し、それぞれ図２０と２１において示す。そのグラフは類似の形状であり、非定型の透過グラフである。しかしながら、それらの図はジゴキシンがブタ皮膚を透過したことを示す。エラーバーは放出結果よりも大きい。見掛けの最大フラックス（最大透過値と共に表６）を図２１から算出したが、遅延時間とＫｐはこれらのグラフから算出できなかった。
【実施例２５】
【００８３】
パッチからブタ耳の皮膚を介するフロセミドの透過
ブタ皮膚を介するフロセミドの透過をフロセミド負荷の累積放出（質量／面積）と透過パーセントの両方として示し、おのおの図２２と図２３において示す。両グラフは類似の形状であり、非定型透過グラフである。しかしながら、それらは、フロセミドがブタ皮膚を透過したことを示す。エラーバーはブタ皮膚を介するジゴキシンの放出と透過の場合よりも大きい。見掛けの最大フラックス値（表６と最大透過値）を算出したが、遅延時間とＫｐは図２２から算出できなかった。
【００８４】
【表９】
2009508814.tif 000010
【実施例２６】
【００８５】
１：１の比率でＦ：Ｄを含有するパッチから放出された質量と、皮膚を介して透過された質量との間の比較
パッチから放出されたジゴキシンの質量／面積と、皮膚を透過したジゴキシンの質量／面積との間の比較
図２４はパッチから放出されたジゴキシンの質量／面積と、皮膚を透過したジゴキシンの質量／面積とを例示し、比較できるようにする。皮膚を透過したジゴキシンより多量のジゴキシンがパッチから放出された。
【実施例２７】
【００８６】
パッチから放出されたフロセミドの質量／面積と、皮膚を透過したフロセミドの質量／面積との間の比較
図２５はパッチから放出されたフロセミドの質量／面積と、皮膚を透過したフロセミドの質量／面積とを例示し、比較できるようにする。皮膚を透過したフロセミドより多量のフロセミドがパッチから放出された。
【実施例２８】
【００８７】
コロジオンからのジゴキシンの拡散放出
コロジオンから放出されたジゴキシンの累積質量／面積
各々のコロジオンから放出された、モル比が１：１，１：２．５及び１：１０のＦ：Ｄを含有するコロジオンからのジゴキシン累積放出グラフを２４時間にわたって測定し、図２６において例示する。２４時間後の最大累積放出における傾向（表７を参照）は１：１００，１：２．５＞１：１０であった。三つのグラフの形状は類似し、エラーバーは小さかった。
【実施例２９】
【００８８】
コロジオンからのジゴキシン負荷用量の放出パーセント
モル比が１：１，１：２．５及び１：１０のＦ：Ｄを含有するコロジオンからのジゴキシン負荷用量の放出パーセントを２４時間にわたって測定し、図２７において示す。放出パーセントは図２６において観察された傾向によく似ている。２４時間後のジゴキシンの最大放出パーセント値を表８において例示する。エラーバーは小さかった。
【００８９】
【表１０】
2009508814.tif 000011
【実施例３０】
【００９０】
コロジオンからのジゴキシン負荷の放出速度の測定
図２８は時間の平方根に対してプロットした三つの異なるコロジオンからのジゴキシンの累積放出を例示する。プロットの直線性は一次放出速度過程を示し、１：１０は最大放出速度を示す。Ｒ２と放出速度を表９において例示する。
【００９１】
【表１１】
2009508814.tif 000012
【実施例３１】
【００９２】
コロジオンからのフロセミドの拡散放出
コロジオンから放出されたフロセミドの累積質量／面積
モル比が１：１，１：２．５及び１：１０のＦ：Ｄを含有するコロジオンからのフロセミドの累積放出グラフを２４時間にわたって測定し、図２９において示す。フロセミドは異なるコロジオン全てから放出され、典型的な放出グラフを生成した。２４時間後の最大累積放出における傾向は、１：１＞１：２．５＞１：１０であった（最大放出値について表１０を参照）。エラーバーの大きさは変化した。
【実施例３２】
【００９３】
コロジオンからのフロセミド負荷用量の放出パーセント
フロセミド負荷用量の放出パーセントにおける傾向（図３０）は、累積放出の傾向によく似ている。２４時間後の最大放出パーセントについては表１０を参照する。エラーバーは小さかった。
【００９４】
【表１２】
2009508814.tif 000013
【実施例３３】
【００９５】
コロジオンからのフロセミドの放出速度
図３１は時間の平方根に対してプロットした三つの異なるモル比を含有するコロジオンからのフロセミド累積放出を示す。直線性は１：１から報告され、一次反応速度過程を示した。放出値については表１１を参照する。
【００９６】
【表１３】
2009508814.tif 000014
【実施例３４】
【００９７】
コロジオンからブタ耳の皮膚を介するジゴキシン及びフロセミド混合物の透過
コロジオンからのブタ耳の皮膚を介するジゴキシンの透過
ブタ皮膚を介するジゴキシンの透過をジゴキシン負荷の累積質量／面積と累積パーセントの両方で例示し、おのおの図３２と図３３において例示する。両グラフは形状において類似し、非定型の透過グラフである。しかしながら両グラフはコロジオンからのジゴキシンが皮膚を透過することを示す。エラーバーはコロジオン放出結果の場合よりも大きかった。ＡＦＭと最大透過値については表１２を参照する。遅延時間とＫｐはこれらのグラフから算出できなかった。
【実施例３５】
【００９８】
コロジオンからブタ耳の皮膚を介するフロセミドの透過
累積質量／面積と累積パーセントの両方でブタ耳の皮膚を介するフロセミドの透過を示し、おのおの図３４と図３５において示す。両グラフは類似した形状であり、非定型透過グラフである。しかしながら、両グラフはフロセミドがブタの皮膚を透過したことを示す。エラーバーは大きい。ＡＦＭと最大透過値は表１２において示す。しかしながら遅延時間とＫｐは図３４から算出できなかった。
【００９９】
【表１４】
2009508814.tif 000015
【実施例３６】
【０１００】
１：１のモル比でＦ：Ｄを含有するコロジオンから放出された質量と、ブタの皮膚から透過された質量との間の比較
対照
対照はこの研究を通じて用いた。放出試験中、有効成分を含有しない製剤を対照として用いた。対応クロマトグラムは検出波長にピークを示さなかった。
【０１０１】
透過試験の間、有効成分を含有しない製剤と、製剤を適用しない皮膚を対照として用いた。対応クロマトグラムは検出波長にピークを示さなかった。
パッチからのジゴキシンとフロセミドの拡散放出
皮膚表面で活性化合物を放出する皮膚用製剤が必要とされる。場合によっては律速段階が製剤からの活性化合物の放出である可能性はあるが、一般的に皮膚透過における律速段階は角質層を介する輸送であると考えられる。これが認められる場合には、化合物のバイオアベイラビリティが影響を受ける可能性はある。これは硬くなったイボ物質を介してジゴキシンとフロセミドが透過中に起こる確率は低い。イボは正常皮膚と比較して大きな割合のケラチン生成細胞を含有し、これは吸収の程度と速度を変調することが可能である。
【０１０２】
接着剤からのジゴキシンとフロセミドの放出は、三つのパラメータ：即ちモル比、薬物負荷及び薬物と接着剤の相互作用によって制限される可能性があるだろう。この研究の目的は、最大ジゴキシン質量と十分なフロセミド質量を放出し得るモル比を確立し、それによって次の透過試験において使用し得るモル比を確立することであった。全体としてジゴキシンの放出は実施例１４に示すフロセミドより比率の選択において大きな影響を有するだろう。
【０１０３】
パッチからのジゴキシンの拡散放出
これらの結果はジゴキシンの負荷質量の一部が全てのパッチから放出されたことを示した。放出の程度は放出されたジゴキシンの最大質量／面積を確立すべく累積放出（質量／面積）に関して観察した。この結果から患者の皮膚表面と潜在的に接触することが可能であった最大用量を予測することができた。これは約１３６．１８μｇ／ｃｍ２であると分かった。ジゴキシンの放出における初期バーストが全てのパッチから認められた。これは１：１と１：１００のモル比を含有するパッチからが最も突出していた。これはパッチの表面、又は表面付近でジゴキシン分子が放出するためであり得る。三つの全比率からの放出は直線性であり、これはゼロ次放出速度過程を示すので、望ましい局所送達デバイスである。最大放出（質量／面積）の傾向は、１：１００＞１：１＞１：２５であった。１：１００の比率は、最大質量／面積のジゴキシンを含有したので、期待通り放出最大質量／面積を与えた。１：１の比率は、最小質量のジゴキシンを含有したので期待されなかったが、類似の結果を与えたため、負荷が放出の律速因子ではなかったことを示唆する。
【０１０４】
パッチ調製における僅かな差異を考慮できるようにし、更に製剤間の比較を可能にすべく負荷用量の放出パーセントを算出した。放出パーセントは、マトリックス中に保持される薬物が大量であれば、小さいことが予測された。
【０１０５】
負荷の放出パーセントにおいて認められた傾向は、累積放出（質量／面積）と同じであった。各々の製剤から負荷の放出パーセントにおいて認められた差は、放出パーセントが薬物負荷に比例しなかったことを示した。でなければ各々の製剤からの放出パーセントは同じになるだろう。
【０１０６】
二元配置ＡＮＯＶＡによって行われた統計学的評価は、１：２５と他の比率の間でジゴキシン負荷の放出パーセントにおいて有意差が存在したことを示した。各々の時点で放出パーセントにおける有意差も示され、経時的に増加した。これは、ジゴキシンのかなりの割合が２４時間後もなお放出されていたことを示唆する。臨床診療におけるジゴキシンの送達に関してパッチはこの時間枠内に取り換える必要がないだろう。その結果投与頻度が減るので患者のコンプライアンスが増加する。
【０１０７】
最短時間でＤの最大送達を与え得る製剤に関して、１：１と１：１００の間で識別するために放出速度を試験した。１：１００からの放出速度は５．１９μｇ／ｃｍ２／時間で最大であったが、１：１の場合の放出速度は４．８４μｇ／ｃｍ２／時間で驚くべきことに類似していた。
【０１０８】
パッチからのフロセミドの拡散放出
全パッチから一部のフロセミドが放出されたため、両薬物がマトリックスから同時に放出されたことが確認され、従って、両薬物は潜在的に同時に皮膚を透過し得るだろう。
【０１０９】
放出された最大質量、従って患者の皮膚と潜在的に接触し得るフロセミドの最大用量を確立すべく再度、累積放出（質量／面積）として放出の程度を観察した。これは約４３２．０２μｇ／ｃｍ２であると分かった。
【０１１０】
フロセミドの放出において初期バーストが観察されなかったので、フロセミドがマトリックス中に均一に分配されたことを示唆する。放出における傾向は１：１＞１：２５＞１：１００であった。１：１の比率は典型的な放出グラフを与えたので、３時間後のフロセミドの枯渇と、他の比率よりもフロセミドの累積放出が大きいことを示す。これは１：１が最大質量のフロセミドを含有したので予測されたが、他の比率の放出量における差は予測されなかった。１：２５と１：１００の比率は、望ましいゼロ放出速度過程を示す直線性放出グラフを与えた。
【０１１１】
負荷放出パーセントは累積放出と同じ傾向をたどった。放出パーセントは２２．８２％（１：１）〜３．８５％（１：１００）に及び、１：１から比較的高いＦの放出パーセントを示した。全体としてフロセミドの放出パーセント値はジゴキシンで得られたものよりも大きかった。
【０１１２】
二元配置ＡＮＯＶＡによる統計学的評価は、１：１と他の比率の間に有意差が存在したことを示した。主作用プロットは、最適放出パーセントが１：１から得られ、同様により大きな質量／面積が放出されたことを例示した。各々の時点での放出パーセントにおける有意差（ジゴキシンでも認められた）は経時的に増加することが主作用プロットにより示されたので、これらのパッチの投与頻度は多くとも２４時間ごとに一回であろうと結論付けた。
【０１１３】
試料間の優れた再現性を示すエラーバー
フグチ（Ｈｕｇｕｃｈｉ）（１９６２）は、パッチのようなマトリックスデバイスからの薬物放出は時間の平方根の関数であることが多いと述べた。直線性プロットは一次放出速度過程を示す。１：１の比率では次数を確立するために時間の平方根に対して累積放出（質量／面積）をプロットすることが必要であったが、累積放出（質量／面積）としての反応速度はゼロ次放出速度過程を示さなかった。１：１の比率は一次放出速度過程を示したが、放出速度は他の比率よりもずっと大きく、放出された質量／面積は他の比率よりもかなり大きかったので、１：１の比率はフロセミド送達に関して第一選択であったことを示唆する。
【０１１４】
要約すればこのデータは、透過試験の最も期待できる製剤を合理的に選択できるようにする十分な情報を提供した。従って１：１のモル比でＤ：Ｆを含有するパッチが選択された。ジゴキシンとフロセミドの両方の放出パーセントは他の比率の場合よりも大きい。１：１の比率は同様に両薬物の最大質量／面積を放出した。
【０１１５】
濃度勾配が大きいほど、透過速度が高い。この比率は最大放出速度も提供した。即ち最適質量が最短期間に放出される。
１：１のモル比を含有するモデルパッチからブタの皮膚を介するジゴキシン及びフロセミド混合物の透過
皮膚吸収は幾つかの過程を伴う。まず有効成分は製剤から放出される。次に有効成分は皮膚の表面に遭遇し、角質層貯留層を構築する。これによってバリアを透過し、最終的に皮膚の別の区画内に拡散するようになる（シェーファー（Ｓｃｈａｅｆｅｒ）及びレーデルメーラー（Ｒｅｄｅｌｍｅｌｅｒ），１９９６）。
【０１１６】
全負荷の累積質量／面積と累積透過パーセントとして透過グラフが示された。累積透過結果は、ジゴキシンとフロセミドの両方が皮膚を透過したので、将来の局在化抗パピローマウイルス治療としての可能性を備えることを例示した。皮膚を介する透過は、局在化を推定できるので、ジゴキシンとフロセミドの両方が表皮の基底層と接触状態になることが可能である。
【０１１７】
１：１のＦ：Ｄを含有するモデルパッチから放出されたジゴキシンとフロセミドの質量と、皮膚透過質量との間の比較
放出された質量が透過された質量よりも大きかったという点において、パッチから放出されたジゴキシンとフロセミドの質量／面積と、皮膚を介して透過されたジゴキシンとフロセミドの質量／面積とにおいて差が観察された。パッチから溶出溶媒へジゴキシンとフロセミドが放出された質量が角質層で放出されたものとほぼ同じであると仮定する。これは各々の多量の有効成分が皮膚において保持され得ることを示唆する。図２６と図２７の目視検査からフロセミドより高い割合のジゴキシンが皮膚において保持されることを観察することができる。感染部位に過剰のジゴキシンを有することが望ましいので、これは肯定的な結果であった。
【０１１８】
コロジオンからのジゴキシンとフロセミドの拡散放出
パッチに関するようにコロジオンからのジゴキシンとフロセミドの放出は、三つのパラメータ、即ちモル比と、薬物負荷と、薬物とコロジオンマトリックスの間の相互作用とによって潜在的に制限されるだろう。この実験の目的は、最大量のジゴキシンと十分量のフロセミドを放出したＤ：Ｆのモル比を含有したコロジオンを確立することであった。これは更に透過試験に使用されるだろう。全体としてジゴキシンの放出は比率の選択においてフロセミドの放出を超える大きな影響を備えるだろう（実施例１４）。
【０１１９】
コロジオンからのジゴキシンの拡散放出
結果は、ジゴキシンの負荷質量の一部が三つのコロジオン全てから放出され、放出が経時的に増加したことを例示した。累積放出（質量／面積）プロットは放出の程度を示し、２４時間後に放出された最大用量を例示した。２４時間後に放出されたジゴキシンの最大用量は約３４．０１μｇ／ｃｍ２であったが、理論的には患者の皮膚表面に送達された用量であった。
【０１２０】
三つの比率の累積放出（質量／面積）グラフは典型的な放出であり、６時間後にプラトーになり始めた。放出の傾向は１：１０＞１：２．５＞１：１であり、その傾向が予測されたので、コロジオン中のジゴキシンの初期質量とコロジオンから放出された質量との間に比例関係が示された。これらの結果から負荷質量、モル比又は賦形剤（コロジオン）との相互作用は、放出質量における制限因子であり得る可能性がある。
【０１２１】
負荷用量の放出パーセントの放出グラフを同様にプロットすることによって、各々のバイアルへのコロジオンピペット容量の差異を考慮に入れ、製剤間の比較を可能にした。放出パーセントは２５．５４〜３０．３６％で変動し、この変動は予測された約１０％と比較して及びパッチと比較的して相対的に高かった。この結果は、接着剤とコロジオンマトリックスの間の差に原因があり得ることを示唆する。考えられる説明として、溶媒が乾燥して蒸発すると、コロジオンのマトリックス中により大きなミクロチャネルが形成されることであるかもしれないし、あるいはコロジオンの溶媒含有量がより高いためパッチの場合よりも多数が形成されるからかもしれない。
【０１２２】
負荷用量の放出パーセントは累積放出質量／面積と同じ傾向をたどらなかったが、その代わり傾向は１：１＞１：１０＞１：２．５であった。しかしながらこの傾向はパッチからのジゴキシンの放出累積質量／面積における傾向と相関した。この結果は、賦形剤の作用が三つの全コロジオン全てからの放出程度全てにわたって及ぼす影響を有するだけであることと、モル比の差が傾向に寄与することとを示唆した。
【０１２３】
二元配置ＡＮＯＶＡによる統計学的評価は、１：１と他の比率の間に有意差が存在したことを例示した。最適放出パーセントは１：１から得られたが、これは最大放出質量／面積を与えなかった。各々の時点での放出パーセントにおいて有意差が観察され（ジゴキシンと同様に）、この有意差は経時的に増加したので、パッチのようなジゴキシン送達用コロジオンの投与頻度は多くても２４時間ごとに一回であろうと結論付けた。
【０１２４】
試料間の良好な再現性を示すエラーバーは小さかった。研究のこの段階で要約すると、パッチと同様に透過試験に用いるコロジオンの決定は、１：１〜１：１０の間（即ち最低と最大の過剰モルのジゴキシン）にある。
【０１２５】
直線状プロットは、一次放出速度過程を示した。全般的に放出速度は類似していた。しかしながら１：１０は最大放出速度を与えたが、一方１：１は最小放出速度を与え、最適モル比はこのデータから測定できなかった。
【０１２６】
コロジオンからのフロセミドの拡散放出
フロセミドは全てのコロジオンから放出され、全コロジオンがジゴキシンとフロセミドの同時放出を示したので、全コロジオンが潜在的に透過試験において使用し得ることを示す。４８時間後に放出された最大用量は約６．０２μｇ／ｃｍ２であった。
【０１２７】
コロジオンからのフロセミドの累積放出（質量／面積）はパッチと異なりジゴキシンの場合よりも低かったので、感染部位により多くのジゴキシンを送達する可能性があり、これは望ましかった。全モル比のグラフは典型的な放出であり、初期バーストは１〜６時間の間に認められ、６時間目ではグラフにおいてプラトーであった。これはジゴキシン放出特性に匹敵した。これは、枯渇のためである可能性が最も高かった。その理由は、それは両薬物から観察され、パッチ（より高用量のジゴキシンとフロセミドを含有した）において程度が低かったからである。累積放出（質量／面積）における傾向は１：１＞１：２．５＞１：１００であり、１：１が最低（質量／面積）のフロセミドを含有したので、この傾向は予測されなかった。この傾向は放出パーセントデータにおいても観察され、ジゴキシンがフロセミドの放出に及ぼす作用を有することを示した。でなければ、フロセミドの放出パーセントが各々の比率で同じであると予測し得るからである。
【０１２８】
二元配置ＡＮＯＶＡによる統計学評価は、１：１と他の比率の間に有意差を示した。最適放出パーセントは１：１から得られた。１：１はまた、最大質量を放出した。各々の時点における放出パーセントの有意差がジゴキシンと同様に示されたが、６時間後の時点内を観察したとき、それほどの増加を示さなかった。これは、フロセミドを最適に送達するためにはコロジオンをより頻繁に投与する必要があり得ることを示唆する。
【０１２９】
エラーバーは研究のこの部分を通じて小さかったので、試料間の優れた再現性を示した。このデータを要約すると、Ｆの送達には１：１の比率が最強候補であると思われた。
時間の平方根に対するフロセミドの放出累積質量／面積は、１：１の比率で直線性を示し、Ｒ２値は１に近かった。この比率は最大速度の放出も例示した。しかしながら他の比率のＲ２値は１に近くなかったので、相関性が悪いことを示す。
【０１３０】
コロジオンからのジゴキシンとフロセミドの放出データ間の比較
要約すると、ジゴキシンとフロセミドの最適な送達を潜在的に提供し得る比率の決定は、特にジゴキシンの放出に関してパッチほど明確ではなかった。
【０１３１】
この研究は透過試験に選択すべきモル比の十分な情報を提供した。ジゴキシンとフロセミドの両方の放出パーセントが本質的に他の比率よりも大きかったので、１：１のモル比でＤ：Ｆを含有するパッチを使用した。１：１の比率は同様に最大質量／面積のフロセミドを放出した。最大濃度勾配が提供された。
【０１３２】
１：１のモル比でジゴキシンとフロセミドを含有するコロジオンからブタ皮膚を介するジゴキシンとフロセミドの透過
累積質量／面積と総負荷の透過パーセントとして透過データを示した。透過データはフロセミドとジゴキシンの両方が同時に皮膚を透過したことを示したので、透過データを局在化の予測に使用することが可能である。
【０１３３】
ジゴキシンとフロセミドの両方の透過グラフは、パッチの透過グラフであったように非定型であった。従ってこれは個別か組み合わせた有効成分の性質に関連し得ることを示唆する。しかしながら、ジゴキシンのグラフはフロセミドのグラフと違い、第一相中のみが典型的グラフと異なっている。ジゴキシンの放出パーセントグラフはこの形状によく似ている。フロセミドのグラフはパッチから認められたグラフと類似した形状であった。
【０１３４】
透過グラフのＳＥＭは放出グラフよりも大きかった。これは放出データと比較してデータの再現性が劣ることを示した。放出実験と透過実験の間の主要な差は、皮膚の導入であったので、これが結果に影響を及ぼしたかもしれない。ＳＥＭはまたジゴキシンと比較してフロセミドで大きかった。この理由は、液体状態のコロジオン（調製中、全溶媒がパッチから蒸発した）中に存在する溶媒量であるかもしれない。溶媒は皮膚の完全性に影響を及ぼすと共に、反復測定間の再現性を低下させる可能性がある。反復数はパッチの５と比較して４であった。これも影響を及ぼしたかもしれない。
【０１３５】
これらのグラフの非定型性は、ＳＳＦを正確に測定できなかったことと、その代わりにＡＭＦを測定したこととを意味した。ジゴキシンではこれを１２〜２４時間で算出し、０．３１３μｇ／ｃｍ２／時間であったが、フロセミドでは６〜１２時間で算出し、４．３４２３μｇ／ｃｍ２／時間であった。遅延時間の測定は不可能だったのでｋｐの概算だけを行った。
【０１３６】
皮膚を透過したジゴキシンの質量／面積は、フロセミドの２８．４９μｇ／ｃｍ２（８．６２×１０−８μｇ／ｃｍ２）と比較して８．０２μｇ／ｃｍ２（１．０３×１０−８μｇ／ｃｍ２）であったので、基底層への薬物送達が事実であることを示唆した。透過したフロセミドのより大きな質量／面積が大きなＳＥＭに関連し得るという考察は、これらの結果が試料間の再現性に欠けたことを示す。皮膚の完全性が低下したなら、フロセミドはジゴキシンよりも小さいので皮膚をより効果的に透過し得る可能性がある。脂溶性も低くなるので皮膚の区画中に捕捉される可能性が低くなる。皮膚を透過したフロセミドの負荷パーセントがジゴキシンより大きかったが、この結果はパッチと同じであった。
【０１３７】
皮膚を透過したＤ：Ｆのモル比は１：８であった。これはフロセミドが皮膚をより容易に透過したことを裏付けた。
パッチとコロジオンの間の比較
コロジオン製剤とパッチ製剤を統計学的に比較することはできなかった。何故なら比率の選択の背後にある根拠は同じであったが、各々の製剤について選択された実際の比率が僅かに異なったからである。これまでの考察はパッチとコロジオンから得られたデータを比較してきたが、この次の考察部分は製剤間の質的な差を比較する。
【０１３８】
賦形剤の差異
皮膚への適用時、コロジオン中に多量のエタノールが存在したが、パッチにはエタノールは存在しなかった。コロジオン製剤中のエタノールは性器イボの治療において潜在的な問題になるかもしれない。イボ組織の性質が皮膚イボと異なるのでスティンギング（チクチクとした痛み）を惹起する可能性がある。周囲の感受性粘膜に適用しないでイボの領域に適用を限定することも難しい。これを克服する可能な製剤溶液、例えばリグノカインのような局所麻酔剤を製剤に含めた製剤溶液が存在する。しかしながらこれは製剤中の有効成分数を増加させることになり、製品の医薬品許諾を複雑にするだろう。更にある程度のスティンギングは、これらのイボの部位を考慮して、および重篤度に依存して患者が我慢して受け入れるかもしれない。他方エタノールを包含させることによって、基底層への経皮吸収が助けられるかもしれない。角質化皮膚の脱水は皮膚を亀裂させ、作用部位への顕微鏡的経路を形成する可能性がある。エタノールは脂質を普通の皮膚中に可溶化することによって透過増強剤として働くことも公知である。ＨＰＶに感染した皮膚におけるこの程度はまだわかっていないが、恐らくこの種類の組織における脂質の割合が低いため低下するだろう。
【０１３９】
パッチは性器イボの治療において非実用的ではあるが、その固体物理的状態は、有効成分の適用を皮膚と足底のイボの健常周囲組織に制限することが難しくはないだろうということを意味する。
【０１４０】
剤型の性質
パッチはコロジオンよりも厚い薄膜を提供するので、より大きな質量の二成分の薬物の組合せを製剤内に組み込むことが可能であり、恐らく持続性治療を提供するのでコンプライアンスを増加させる。コロジオンの薄膜の厚さは約５〜２０ミクロンであり、パッチの約１ｍｍと比較して皮膚へ適用される有効成分の量を制限する（シェーファー及びレーデルミラー，１９９６）。これは、パッチの上面からバルクマトリックスを通ってパッチ中の大部分の範囲まで分子が移動するので、投薬の頻度を減らし、コンプライアンスを助けることを示唆する。両剤型は弾力性であり、イボ組織において可動性はほとんどないが、足底イボだけが平面なので弾力特性が必要とされる。一般イボの治療におけるこれらのパッチの適合性を次の臨床試験において確立する。概して、製剤は作用の発現、生物学的反応の持続期間と程度に影響を及ぼす経皮吸収の速度過程と程度を決定する。
【実施例３７】
【０１４１】
グルー中薬物型包帯で治療した足底イボ患者の初期結果
【０１４２】
【表１５】
2009508814.tif 000016
図３８は患者の足の下側の非関連病変を示す。
【０１４３】
図３９は図４０における病変の拡大図である。
図４０は本発明に従う送達手段による治療中の病変を示す。
図４１は２１日間の治療後の病変を示す。
【０１４４】
図４２は超接写した治癒病変を示す。
上記の実施例に加えて、以下の追加実施形態は、経皮送達デバイスからのジゴキシンとフロセミドのインビトロでの放出と透過を示す。異なる量のジゴキシンとフロセミドを含有する幾つかのグルー中薬物型製剤をそれらの薬物放出速度、ブタの皮膚を介する薬物透過速度及び皮膚試料内の薬物濃度について比較した。皮膚飽和を提供すべく有効成分の比率を変えることによって、フロセミドとジゴキシンを送達する最適製剤を検討した。
【０１４５】
材料
ジゴキシンとフロセミドはシグマ社（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）から購入した。グルー１はナショナル・スターチ・アンド・ケミカル社から調達した。放出と透過試験に用いた溶媒と化学薬品はシグマから購入した。皮膚バリアとして用いたブタ耳の皮膚は、地元の食肉処理場から購入した。
【０１４６】
試験プロトコル：
都合の良い薬物負荷は、アクリレート系グルー内に１：１の比率で含まれるジゴキシンとフロセミドの両薬物とも２５ｍｇ／ｍｌである。薬物の総濃度が５０ｍｇ／ｍｌで維持されるなら、以下の系を試験することが可能である。
５０ｍｇ／ｍｌのジゴキシン
４６．７ｍｇ／ｍｌのジゴキシンと３．３ｍｇ／ｍｌのフロセミド（１４：１の比率）  
４０ｍｇ／ｍｌのジゴキシンと１０ｍｇ／ｍｌのフロセミド（４：１の比率）
３０ｍｇ／ｍｌのジゴキシンと２０ｍｇ／ｍｌのフロセミド（３：２の比率）
２５ｍｇ／ｍｌのジゴキシンと２５ｍｇ／ｍｌのフロセミド（１：１の比率）
２０ｍｇ／ｍｌのジゴキシンと３０ｍｇ／ｍｌのフロセミド（２：３の比率）
１０ｍｇ／ｍｌのジゴキシンと４０ｍｇ／ｍｌのフロセミド（１：５の比率）
３．３ｍｇ／ｍｌのジゴキシンと４６．７ｍｇ／ｍｌのフロセミド（１：１４の比率）
５０ｍｇ／ｍｌのフロセミド
グルーのみを用いる対照
上記の系は質量比で比率を測定する。薬物のモル比はＦ：Ｄの比率１：１，１：２５及び１：１００でも試験し、結果を表１３に提供する。
【０１４７】
【表１６】
2009508814.tif 000017
方法
薬物放出試験
パッチから移動相溶液への薬物放出を９種の質量比の製剤について測定した。これは薬物放出に影響を及ぼす薬物負荷を比較するために行った。
【０１４８】
薬物透過試験
ブタ耳の皮膚を介する薬物透過をフランツ拡散セルを用いて測定した。組織を透過した両薬物の量を経時的に測定し、パッチ内の初期薬物負荷と比較した。モル比パッチをこの試験において用いた。ブタ耳の皮膚をモデル膜として用い、この組織を介する薬物の放出をフランツセル装置を用いて測定した。皮膚はＨＰＬＣ分析内の移動相に用いるような水：メタノール：アセトニトリル（４０：３０：３０）を含有する受容液の上に取り付けた。
【０１４９】
全システムを密封することによって、水分の損失を防止し、試料は０，４，８，１２，２４、４８及び７２時間の間隔で受容液から採取した。受容液を連続的に撹拌することによって、確実に受容溶液を均質にした。この溶液内のフロセミドとジゴキシンの両濃度はＨＰＬＣ分析によって測定した。７２時間後、皮膚を均質にし、この組織内の両薬物を測定することによって（抽出によって）、「飽和」濃度を書き留めた。
【０１５０】
皮膚飽和試験
皮膚は薬物の保持能を備えることが十分に裏付けられている。一般的に薬物のｌｏｇＰ値が高い程、皮膚内に保持される程度が大きいと考えられる。７２時間の終了時の皮膚試料中に存在した薬物の量は、パッチを投与した皮膚を均質化し、薬物を抽出することによって測定した。各々のフランツセルにはＱを含有し得る直径２ｃｍのパッチを負荷した。
【０１５１】
結果
グルーから放出された薬物の累積量か皮膚を透過した薬物の累積量、Ｑ（μｇ／ｃｍ２）を図４５において時間に対してプロットした。このような傾斜（少なくとも５つのデータ点を使用）の直線状部分は、定常フラックス、Ｊｓｓであると考えられた。次にグルーから放出されるか、皮膚を通るかいずれかにより拡散できる速度を決定する各々の薬物の定数、透過係数、Ｋｐ（単位＝ｃｍ／時間）を以下の式によって算出した。
【０１５２】
Ｋｐ＝Ｊｓｓ／Ｃｖ
式中Ｃｖはドナー区画内の透過物の濃度である（パッチ内のジゴキシンかフロセミドの濃度、単位＝μｇ／ｃｍ３）。
【０１５３】
薬物放出試験
パッチを最初の９製剤から製造し、これらの製剤から移動相溶液内への薬物放出を測定した。
【０１５４】
幾つかの実施例データを以下に示す。図４３において各々の製剤から放出されたジゴキシンの質量を時間に対してプロットした。類似のプロットをフロセミドについて作図した。
【０１５５】
これらの結果の勾配を算出したが、勾配はパッチからの定常フラックス、Ｊｓｓの尺度である。定常フラックスを初期濃度で割る割り算によって透過係数が与えられ、この値はパッチからの薬物放出の速度を決定する定数である。以下の表は４日目に各々のパッチからの薬物放出量と、各々の製剤の定常フラックスと透過係数との両方を測定するデータを提供する。
【０１５６】
パッチからのジゴキシンとフロセミドの両方の速度を以下の表に列挙する。
【０１５７】
【表１７】
2009508814.tif 000018
表１４は、例えば製剤１と９を比較して、類似の濃度値でフロセミドはジゴキシンより大きな程度まで放出されることを示す。パッチ内の薬物の初期負荷が増加すると、各々の薬物の定常状態フラックスは増加する。これは、予測通り薬物負荷と放出溶媒の間に存在する濃度勾配のためパッチから薬物が放出されるからである。透過係数は秒当りｃｍでのパッチからの各々の薬物の薬物放出速度の尺度である。これらの値は、二つの薬物が互いの放出において干渉しないことを示す全製剤では比較的一定である。各々の薬物単独のＫｐ値は、両薬物を含有するパッチにおける値と類似している。フロセミドのＫｐはジゴキシンのＫｐよりもほぼ４倍大きく、これはフロセミドのサイズが比較的小さいためである可能性が高い。
【０１５８】
以下の表は、パッチから放出された薬物であって皮膚を透過した薬物のデータを示す。
【０１５９】
【表１８】
2009508814.tif 000019
表１５は皮膚の透過を示し、フラックス値と透過係数値は共に上記の表において列挙される製剤からの薬物の放出よりもずっと低い。これは予測され、皮膚のバリア性を反映している。フロセミドは、ジゴキシンよりほぼ８倍高い透過係数によって示されるように、ジゴキシンよりも大きな程度まで皮膚を透過する。
【０１６０】
皮膚に蓄積される薬物もまた測定した。皮膚の２ｃｍの直径の断面に存在していた薬物は、全て４つの製剤について計算した。
ジゴキシンのレベルは、負荷製剤に無関係であった。それは皮膚が３．１４ｃｍ２に４０μｇ、即ち、１２．７３μｇ／ｃｍ２の濃度にてジゴキシンで飽和されたことを示す。フロセミドは皮膚内には蓄積されず、皮膚を解して直接透過した。７２時間にて測定された濃度は、負荷濃度に依存する皮膚内のフロセミドの一時的な兆候であった。結果を図４４に示す。
【０１６１】
ある速度にてフロセミドがパッチから放出され、パッチのＫｐは６．５３×１０−１０ｃｍ／秒であった。これは、ブタ耳の皮膚を４．３２×１０−８ｃｍ／秒にて透過するフロセミドの速度と比較して非常に遅かった。
【０１６２】
ジゴキシンは、薬物放出に関しても皮膚の透過に関してもかなり遅く、透過係数は、パッチ及び皮膚に対してそれぞれ、１．６０×１０−７ｃｍ／秒及び５．５２×１０−８ｃｍ／秒である。
【０１６３】
パッチのジゴキシン初期濃度を皮膚を介する定常状態のフラックスに対してプロットした場合、図４５に示されるように、ゼロより大きいフラックスに対して、パッチ内の初期濃度は８０４．５μｇ／ｃｍ３に違いないことが示された。
【０１６４】
２５０００μｇ／ｃｍ３は、皮膚試験にて使用される最も低い濃度であった。効果的な治療に必要とされるフラックスは一日当たり２５μｇであり、仮にこれが１ｃｍ２の表面積のパッチに由来すると仮定した場合、負荷用量は以下のとおりである。
【０１６５】
即ち、フラックス＝２５ｊｉｇ／日／ｃｍ２＝１．０４μｇ／ｃｍ２／時間であり、１ｃｍ３当たり６００４．５μｇの負荷用量が必要である。
しかしながら、この試験は、非常に親油性の物質をドナー相に使用して、ジゴキシン及びフロセミドの両方の皮膚透過を最大化するために濃度勾配を高めているので、皮膚を介するジゴキシン全体の透過が高められた。
【０１６６】
二つの特に効果的な薬物はジゴキシン及びフロセミドであり、それらの５０％プラーク阻害濃度（ＩＣ５０）を以下に示した（表Ａ）。ＩＣ５０は、異なる薬物を比較する際に、抗ウイルス薬の効力の有用性及び利便性に対して頻繁に引用される指標である。別々に使用した場合、ジゴキシン及びフロセミドのいずれも広範囲のウイルスの複製を明らかに阻害した。
【０１６７】
【表１９】
2009508814.tif 000020
しかしながら、抗ウイルス活性の代替的な指標は、これらの薬物の実際の効力を示す。ＩＣＶＴは非感染ウイルス蛋白質の合成も許容し、かつこれらの蛋白質はＩＣ５０の決定の根拠を形成する細胞病理学における変化を部分的に引き起こす（細胞変性作用）ので、これらの薬物の効力はＩＣ５０の決定により過小評価される。これに代えて、代替的な指標は感染した細胞により形成される感染性ウイルス粒子の全体数を測定する。
【０１６８】
例えば、ジゴキシンを使用した、単純ヘルペスウイルスの４０％から６０％の間のプラーク形成の阻害、即ち、ＩＣ５０の効果（図４６のグラフの上側の線）は、感染性ウイルス粒子形成の９０％から９９％までの阻害に対応する（図４６のグラフの下側の線）。
【０１６９】
ジゴキシン及びフロセミドを別々に使用した、別のウイルス、即ち、ネコのヘルペスウイルスに対しては、それらのＩＣ５０の値の各々はウイルス複製をほぼ完全に阻害した（表Ｂ）。感染性ウイルスの産生は９８．５％（ジゴキシン）及び９９．５％（フロセミド）まで低減されたが、依然として低レベルのウイルスの複製、即ち、１．５％（フロセミド）及び０．５％（ジゴキシン）のウイルスの複製が存在する。
【０１７０】
【表２０】
2009508814.tif 000021
しかしながら、この残りの部分、即ち、低レベルのウイルスの複製を、薬物の組み合わせを使用することにより効果的に排除することが可能である。組み合わせられた場合の抗ウイルス効果は、薬物を別々に適用した場合より大きい、即ち薬物は相乗効果を示す（表Ｃ）。
【０１７１】
【表２１】
2009508814.tif 000022
従って、ウイルスの複製は、９９．９９９９９％低減された。
【０１７２】
その他のウイルスの複製、例えば、水疱瘡ウイルス（ＶＺＶ）も、組み合わせた薬物を使用することにより最も効果的に阻害された。しかしながら、ＶＺＶは非常に細胞結合型のウイルスであるために関与する感染性ＶＺＶ粒子の詳細な数を定量することは不可能である。代わりに、ウイルスプラーク形成における個々のＩＣ５０及び組み合わせた場合のＩＣ５０の効果を比較した（表Ｄ）。
【０１７３】
フロセミド及びジゴキシンは、各々の対応するＩＣ５０にて、それぞれがＶＺＶプラーク形成を阻害した：約５０％と期待していたように、フロセミド３３／６１プラーク、ジゴキシン２１／６１プラークであった。しかしながら、それらのＩＣ５０にて両方の薬物を組み合わせにて適用した場合、ＶＺＶのプラーク形成は、低い感染多重度（低度ＭＯＩ）にて完全に阻害した。実際に、ＶＺＶプラーク形成は、試験した系における１００倍も感染したウイルス、即ち高度ＭＯＩにおいても完全に阻害した。この効力指標を使用して、薬物は、組み合わせて使用した場合には１００倍以上の効力であった。
【０１７４】
【表２２】
2009508814.tif 000023
小部分のＩＣ５０の組み合わせた場合の効果の比較は、二つの薬物の単独の場合と組み合わせた場合の相対的な効力を比較することによる別の指標を提供する。以下のアデノウイルスを使用する例において、組み合わせにて使用した場合、薬物単独のＩＣ５０の場合と同じ抗ウイルス効果を引き起こすために使用される量は、各薬物のＩＣ５０の４分の１のみで十分であった（図４７）。
【０１７５】
同様の現象は、別の強力な細胞結合型ウイルスであるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）でも認められ、二つの薬物を組み合わせにて使用した場合、薬物単独のＩＣ５０の場合と同じ抗ウイルス効果を引き起こすためには、各薬物のＩＣ５０の３分の１のみで十分であった（図４８）。
【０１７６】
要約すると、ジゴキシン及びフロセミドは、ＩＣＶＴに適用した場合には相乗効果を示した。抗ウイルス活性のこの独特の機構（ＩＣＶＴ）により、標準的なＩＣ５０の指数は、増加した組み合わせた効果がこの指標を用いて明らかになった場合でさえも実際の薬物の効力より過小評価される。
【０１７７】
最も顕著なことに、感染性ウイルスの産生は、薬物を組み合わせて使用した場合には９９．９９９９９％まで低減する。
ジゴキシン、ジギトキシン及びラノキシン（ＩＶ）の溶解度及びＩＣＶＴ効力の比較
１）ＩＣＶＴ活性（ＩＣＶＴ−ｉｖｉｔｉｅｓ）（イオン性反ウイルス療法−活性）の比較
ジゴキシン及びジギトキシン溶液は、粉末から、７０％エタノール１ｍｌ当たり２５０μｇの濃度に調製した。それらのＩＣＶＴ活性を、「標準」ジゴキシン調製物、即ち、１０％エタノール１ｍｌ当たり２５０μｇにて供給されているＩＶラノキシンと比較した。
【０１７８】
粉末及びラノキシン（円形）（図４９）から調製されたジゴキシンのＩＤ５０値は６０ｎｇ／ｍｌと非常に類似していた。ジギトキシン（四角形）は、３０ｎｇ／ｍｌのＩＤ５０を用いた場合僅かに良好であるように思われた。
【０１７９】
２）溶解度の比較
ジゴキシン及びジギトキシンの飽和溶液を９０％エタノールで調製し、そのＩＣＶＴ活性を「標準」ジゴキシン調製物、即ちラノキシンと比較した。
【０１８０】
粉末から調製したジゴキシン溶液はラノキシン（円形）と同程度に効果的であった（図５０）。
ジギトキシン（四角形）はここでもジゴキシンより効果的であった。
【０１８１】
ジギトキシンはジゴキシンより可溶性であり、９０％エタノール飽和溶液の調製物（１７．５ｍｇ／ｍｌ）は、エタノールの眼内安全濃度（２．５％）において、４８６μｇ／ｍｌの最大濃度にて使用することが可能となろう。
【０１８２】
ジゴキシンは、６２．５μｇ／ｍｌの濃度にてこれまでに使用した。
４８６μｇ／ｍｌは約８倍も濃縮されており、仮にジギトキシンが実際に２倍の効力があるとすれば、これまでの用量の１６倍も効果的であるものを使用することが可能になるであろう。無論、このより高濃度のものの毒性についても試験する必要がある。
【０１８３】
３）ＩＣＶＴ活性の比較
ジゴキシンとジギトキシンの新たな溶液を粉末から７０％エタノール１ｍｌ当たり２５０μｇの濃度に調製し、それらのＩＣＶＴ活性を、それらの相対的な効力を更に調べるために、「標準」ジゴキシン調製物、即ち、ＩＶラノキシンと比較した。結果を図５１に示す。
【０１８４】
上記の例に加えて、以下の更なる実施形態は、フロセミド及びジゴキシンのそれぞれ個別の効果及び組み合わせによる効果を、インビトロにおける水疱瘡ウイルスの複製及びＭＲＣ５細胞の複製及び代謝において示す。
【０１８５】
１．１．ＭＲＣ５
ヒト胎児肺組織由来の細胞系であるＭＲＣ５細胞（ヤコブス（Ｊａｃｏｂｓ）ら、１９７０年）をバイオウィッタカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）から入手した。細胞を１０（ｖ／ｖ）％仔牛血清（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社）を補充したイーグル培地（ライフテクノロジーズ社）中にて増殖させた。ＭＲＣ５細胞は水疱瘡ウイルス（ＶＺＶ）原料製品に対して使用し、ＶＺＶ複製におけるイオン性反ウイルス効果を検討する実験にて使用した。
【０１８６】
１．２．細胞形態
正常細胞において許容される薬物最大濃度を、薬物含有培地におけるコンフルエントに達していない培養物を７２時間培養することにより決定した。細胞は位相差顕微鏡を使用して直接調べた。
【０１８７】
１．３．細胞複製
細胞の複製を可能にする薬物最大濃度を、７２時間後の細胞を採取し、かつ計数して、同様に決定した。細胞数における１０倍の増加は、正常細胞の複製の典型であるとみなした（７２時間において最小でも３つの集団で倍加）。
【０１８８】
１．４．ＭＴＴ（ジメチルチアゾールジフェニルテトラゾリウムブロマイド）アッセイ
ＭＴＴアッセイは、抗ウイルス法及びプロトコル（キンチントン（Ｋｉｎｃｈｉｎｇｔｏｎ），２０００年）に記載したように実施した。
【０１８９】
１．５．水疱瘡ウイルス（ＶＺＶ）
ＶＺＶのエレン菌株をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手した。
１．６．ＶＺＶモノレイヤープラーク阻害アッセイ
ＶＺＶ感染細胞は、５ｃｍのペトリ皿内のＭＲＣ５細胞の予め形成されたモノレイヤーに、感染細胞懸濁液の５ｍｌを接種して、７２時間、又はウイルスのｃｐｅが最適となるまで培養することにより、試験した。細胞をホルモル生理食塩水で固定し、カルボルフクシンで染色した。
【０１９０】
２．結果
２．１．インビトロでのＶＺＶ複製におけるフロセミドの効果
１．０ｍｇ／ｍｌの濃度のフロセミドはＭＲＣ５細胞により十分に耐えられ、細胞形態及び複製された細胞において有害な効果は認められなかった。フロセミドは、この濃度にて、ＶＺＶプラーク形成を５０％阻害した。
【０１９１】
フロセミドＩＤ５０：１．０ｍｇ／ｍｌ［表Ｅ］
ＶＺＶの複製は、２．０ｍｇ／ｍｌ濃度におけるフロセミドにより完全に阻害された。
２．２．インビトロでのＶＺＶ複製におけるジゴキシンの効果
０．０５μｇ／ｍｌ濃度のジゴキシンはＭＲＣ５細胞により十分に耐えられ、細胞形態及び複製された細胞において有害な効果は認められなかった。ジゴキシンは、この濃度にて、ＶＺＶプラーク形成を５０％阻害した。
【０１９２】
ジゴキシンＩＤ５０：０．０５μｇ／ｍｌ［表Ｅ］
ＶＺＶ複製は、０．１μｇ／ｍｌの濃度におけるジゴキシンにより完全に阻害された。
２．３．インビトロでのＶＺＶ複製におけるフロセミド及びジゴキシンの効果
ＶＺＶ複製は、フロセミド及びジゴキシンの組み合わせたものにより、それらの個々のＩＤ５０濃度にて完全に阻害された［表Ｅ］。組み合わせられた用量では、ＭＲＣ５細胞により等しく耐えられ、細胞形態及び複製された細胞において有害な効果は認められなかった。
【０１９３】
インビトロでの水痘帯状疱疹ウイルスに対する、フロセミド及びジゴキシンの個々の効果及び組み合わせによる効果［表Ｅ］
ＮＢ。隣接する感染多重度（ＭＯＩ）の間では１０倍の差が存在した。
【０１９４】
【表２３】
2009508814.tif 000024
２．４．ＭＲＣ５細胞の複製におけるフロセミドの効果
未感染のＭＲＣ５細胞は、ＶＺＶのＩＤ５０と同じ濃度である１．０ｍｇ／ｍｌの濃度のフロセミドの存在下にて正常の産生にて複製した。
【０１９５】
２．５．ＭＲＣ５細胞の複製におけるジゴキシンの効果
未感染のＭＲＣ５細胞は、ＶＺＶのＩＤ５０と同じ濃度である０．０５μｇ／ｍｌの濃度のジゴキシンの存在下にて正常の産生にて複製した。
【０１９６】
２．６．ＭＲＣ５細胞の複製におけるフロセミド及びジゴキシンの効果
未感染のＭＲＣ５細胞は、フロセミド及びジゴキシンの両者がそれぞれのＶＺＶのＩＤ５０の濃度にて存在している場合、正常の産生までとはいかなかったが、複製した。これらの濃度にて、ＶＺＶの複製は完全に阻害された。
【０１９７】
２．７  ＭＲＣ５細胞の代謝におけるフロセミド及びジゴキシンの効果
ＭＲＣ５細胞の代謝におけるフロセミド及びジゴキシンの効果をＭＴＴアッセイにて調べた。フロセミド又はジゴキシンを、それぞれのＶＺＶのＩＤ５０の濃度にて培養した未感染の細胞において、代謝は正常レベルであった。フロセミド及びジゴキシンの両者がそれぞれのＶＺＶのＩＤ５０の濃度にて存在しているもので培養した未感染の細胞においても正常な代謝であった。これらの濃度において、組み合わせたものは、ＶＺＶ複製を完全に阻害した（２．３）。
【０１９８】
上記した実施例に加えて、以下の更なる実施形態は、代替的な利尿剤及び強心配糖体の効果を示す。
チアジド（ヒドロクロロチアジド及びメトラゾン）、スルホニル尿素（トルブタミド）、スルホナミド（フロセミド、アセタゾラミド、ブメタニド、トラセミド及びエタクリン酸）及びカリウム保持性利尿剤（アミロリド）の実施例についてＩＣＶＴ活性を試験した。強心配糖体であるジゴキシン、ジギトキシン、ラノキシン及びストロファンチンＧについても試験した。
【０１９９】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を使用して、標準的なプラーク阻害アッセイを使用して、５０％のプラーク阻害用量（ＩＤ５０）を決定した。試験を容易にするために種々の溶媒が必要とされるが、これらの溶媒は時として、その濃度によっては組織培養物に対して有害であった。ある種の化合物は強力なＩＣＶＴ活性を誘引し（フロセミド、ジゴキシン、ラノキシン及びジギトキシン）、そしてそれらは高希釈、即ち溶媒の毒性が排除される実験条件下においても活性を示した。
【０２００】
その他の化合物は「ボーダーライン」のＣＶＩ活性のみを誘引した。これらの化合物（アセタゾラミド、トルブタミド及びヒドロクロロチアジン）は同じ試験系（即ち、プラーク阻害アッセイ）にて代替的な溶媒を使用して更なる試験をし、別のもの（ブメタニド、トラセミド、トルブタミド及びヒドロクロロチアジド）は、ウイルスの産生における影響を決定するべく、ＩＣＶＴ活性に対する更に感受性の高い試験を実施した。ウイルスの産生における強心配糖体ジゴキシン及びストロファンチンの効果もまたこのアッセイにて試験した。
【０２０１】
【表２４】
2009508814.tif 000025
2009508814.tif 000026
従って、これらの及びその他のループ利尿薬及び／又は強心配糖体は、経皮有効成分送達手段において有用であり、特に吸着剤内にて提供される、又は吸着剤とともに提供された場合、有用であろう。
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１】用いたＨＰＬＣ法に従うジゴキシン濃度の検量線を示す。
【図２】用いたＨＰＬＣ方法に従うフロセミド濃度の検量線を示す。
【図３】グルー１（８７９００Ａ）からの両薬物の放出を示す。
【図４】グルー２（８７２６７７）からの両薬物の放出を示す。
【図５】グルー３（８７２０１Ａ）からの両薬物の放出を示す。
【図６】記載したような緩衝溶液内に放出する記載の溶媒における薄膜からの薬物放出のＨＰＬＣトレースを示す。
【図７】記載したような緩衝溶液内に放出する記載の溶媒における薄膜からの薬物放出のＨＰＬＣトレースを示す。
【図８】記載したような緩衝溶液内に放出する記載の溶媒における薄膜からの薬物放出のＨＰＬＣトレースを示す。
【図９】記載したような緩衝溶液内に放出する記載の溶媒における薄膜からの薬物放出のＨＰＬＣトレースを示す。
【図１０】記載したような緩衝溶液内に放出する記載の溶媒における薄膜からの薬物放出のＨＰＬＣトレースを示す。
【図１１】メタノール中に薬物を溶解し、次いでグルーに加えることにより作製されたグルーからの、緩衝液：メタノール：アセトニトリル（６０：２０：２０）中へのフィルムからの薬物の放出を示す。
【図１２】プロピレングリコール中に薬物を溶解し、次いでグルーに加えることにより作製されたグルーからの、緩衝液：メタノール：アセトニトリル（６０：２０：２０）中へのフィルムからの薬物の放出を示す。
【図１３】皮膚透過試験時のフランツ型拡散セルを示す。
【図１４】モル比が１：１，１：２５，１：１００のＦ：Ｄを含有する接着剤からのジゴキシンの累積放出（質量／面積）グラフである。
【図１５】モル比が１：１，１：２５及び１：１００のＦ：Ｄを含有する接着剤からのジゴキシン負荷用量の放出パーセントを示す。
【図１６】パッチからのジゴキシン放出データを示す主作用プロットである。
【図１７】モル比が１：１，１：２５，１：１００のＦ：Ｄを含有する接着剤からのフロセミドの累積放出（質量／面積）を示す。
【図１８】フロセミド負荷用量の放出パーセントを示す。
【図１９】モデルパッチからのフロセミドの拡散放出データを示す。
【図２０】ブタ皮膚を介するジゴキシンの透過をジゴキシン負荷の累積質量／面積として示す。
【図２１】ブタ皮膚を介するジゴキシンの透過をジゴキシン負荷の透過パーセントとして示す。
【図２２】ブタ皮膚を介するフロセミドの透過をフロセミド負荷の累積放出（質量／面積）として示す。
【図２３】ブタ皮膚を介するフロセミドの透過をフロセミド負荷の透過パーセントとして示す。
【図２４】パッチから放出されたジゴキシンの質量／面積と、皮膚を透過したジゴキシンの質量／面積とを例示する。
【図２５】パッチから放出されたフロセミドの質量／面積と、皮膚を透過したフロセミドの質量／面積とを例示する。
【図２６】モル比が１：１，１：２．５及び１：１０のＦ：Ｄを含有するコロジオンからのジゴキシン累積放出グラフを示す。
【図２７】モル比が１：１，１：２．５及び１：１０のＦ：Ｄを含有するコロジオンからのジゴキシン負荷用量の放出パーセントを示す。
【図２８】時間の平方根に対してプロットした三つの異なるコロジオンからのジゴキシンの累積放出を示す。
【図２９】モル比が１：１，１：２．５及び１：１０のＦ：Ｄを含有するコロジオンからのフロセミドの累積放出グラフを示す。
【図３０】フロセミド負荷用量の放出パーセントにおける傾向を示す。
【図３１】時間の平方根に対してプロットした三つの異なるモル比を含有するコロジオンからのフロセミド累積放出を示す。
【図３２】ブタ皮膚を介するジゴキシンの透過をジゴキシン負荷の累積質量／面積で示す。
【図３３】ブタ皮膚を介するジゴキシンの透過をジゴキシン負荷の累積パーセントで示す。
【図３４】ブタ耳の皮膚を介するフロセミドの透過をフロセミド負荷の累積質量／面積で示す。
【図３５】ブタ耳の皮膚を介するフロセミドの透過をフロセミド負荷の累積パーセントで示す。
【図３６】ジゴキシンの化学構造を示す。
【図３７】フロセミドの化学構造を示す。
【図３８】患者の足の下側の非関連病変を示す。
【図３９】図４０における病変の拡大図である。
【図４０】本発明に従う送達手段による治療中の病変を示す。
【図４１】２１日間の治療後の病変を示す。
【図４２】超接写した治癒病変を示す。
【図４３】各々の製剤から放出されたジゴキシンの質量を時間に対してプロットしたグラフである。
【図４４】７２時間後の皮膚における薬物質量を示す。
【図４５】パッチのジゴキシン初期濃度を皮膚を介する定常状態のフラックスに対してプロットしたグラフである。
【図４６】ジゴキシンを使用した、単純ヘルペスウイルスの４０％から６０％の間のプラーク形成の阻害、即ち、ＩＣ５０の効果及び感染性ウイルス粒子形成の９０％から９９％までの阻害を示す。
【図４７】アデノウイルスを使用する例において、組み合わせにて使用した場合、薬物単独のＩＣ５０の場合と同じ抗ウイルス効果を引き起こすために使用される量は、各薬物のＩＣ５０の４分の１のみで十分であることを示す図である。
【図４８】サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）において、二つの薬物を組み合わせにて使用した場合、薬物単独のＩＣ５０の場合と同じ抗ウイルス効果を引き起こすためには、各薬物のＩＣ５０の３分の１のみで十分であることを示す図である。
【図４９】ジゴキシン、ジギトキシン及びラノキシンのＩＣＶＴ効力を比較するグラフである。
【図５０】ジゴキシン、ジギトキシン及びラノキシンのＩＣＶＴ効力を比較するグラフである。
【図５１】ジゴキシン、ジギトキシン及びラノキシンのＩＣＶＴ効力を比較するグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2009508814.tif 000034
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
2009508814.tif 000074
【図４９】
2009508814.tif 000075
【図５０】
2009508814.tif 000076
【図５１】
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【国際調査報告】
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