(57)【要約】  本発明は、肥満細胞関連増殖性疾患の処置用の薬剤製造を目的とするチロシンリン酸阻害剤ＡＭＮ１０７およびＰＫＣ４１２の組み合わせに関するものである。本発明はまた、チロシンリン酸阻害剤および特に侵襲性ＳＭ（ＡＳＭ）および肥満細胞性白血病（ＭＣＬ）を含む全身性肥満細胞症（ＳＭ）を含む、肥満細胞関連増殖性疾患に対して有効であるＴＫ阻害剤の併用処置に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
全身性肥満細胞症の処置または予防方法であって、式（Ｉ）：
【化１】
2009501767.tif 000007
で示される化合物と、式（II）：
【化２】
2009501767.tif 000008
で示される化合物、またはそれらの医薬上許容される塩を組み合わせて投与することを含み、その組み合わせが、全身性肥満細胞症のような肥満細胞関連増殖性疾患を処置または予防する方法。
【請求項２】
肥満細胞関連増殖性疾患が全身性肥満細胞症である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
全身性肥満細胞症がイマチニブに耐性を示すものである、請求項２記載の方法。
（請求項３）
全身性肥満細胞症が、発癌性ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ突然変異に関連するものである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
全身性肥満細胞症処置用の医薬組成物の製造を目的とする、式（Ｉ）：
【化３】
2009501767.tif 000009
で示される化合物と、式（ＩＩ）：
【化４】
2009501767.tif 000010
で示される化合物、またはそれらの医薬上許容される塩の組み合わせの使用。
【請求項５】
発癌性ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ突然変異に関連する全身性肥満細胞症の処置を目的とする、請求項４記載の使用。
【請求項６】
全身性肥満細胞症に罹患した哺乳類の処置方法であって、処置を必要とする哺乳類に、式（Ｉ）：
【化５】
2009501767.tif 000011
で示される化合物と、式（II）：
【化６】
2009501767.tif 000012
で示される化合物、またはそれらの医薬上許容される塩の組み合わせのＫＩＴ活性阻害量を投与することを含む方法。
【請求項７】
式（Ｉ）：
【化７】
2009501767.tif 000013
で示される化合物と、式（II）：
【化８】
2009501767.tif 000014
で示される化合物、またはそれらの医薬上許容される塩の組み合わせを含む、ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ関連全身性肥満細胞症処置用の医薬製剤。
【請求項８】
全身性肥満細胞症に罹患した、ヒトを含む哺乳類の処置方法であって、処置を必要とする哺乳類に、式（Ｉ）：
【化９】
2009501767.tif 000015
で示される化合物と、式（II）：
【化１０】
2009501767.tif 000016
で示される化合物、またはそれらの医薬上許容される塩の組み合わせを投与することを含む方法。
【請求項９】
式（Ｉ）：
【化１１】
2009501767.tif 000017
で示される化合物とチミジンキナーゼ（ＴＫ）阻害剤、またはそれらの医薬上許容される塩の組み合わせを投与することを含む、全身性肥満細胞症の処置または予防方法。
【請求項１０】
式（Ｉ）：
【化１２】
2009501767.tif 000018
で示される化合物とチミジンキナーゼ（ＴＫ）阻害剤、またはそれらの医薬上許容される塩の組み合わせを投与することを含む、全身性肥満細胞症の処置または予防方法であって、その組み合わせにより肥満細胞関連増殖性疾患が処置または予防される方法。
【請求項１１】
肥満細胞関連増殖性疾患が、全身性肥満細胞症、侵襲性全身性肥満細胞症および肥満細胞性白血病から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
肥満細胞関連増殖性疾患がイマチニブに対して耐性を有するものである、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
野生型ＫＩＴまたは発癌性ＫＩＴ Ｇ５６０ＶまたはＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ突然変異に関連する肥満細胞関連増殖性疾患の処置を目的とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
（なし）
【請求項１５】
ＴＫ阻害剤がダサチニブおよび２ＣｄＡから選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
肥満細胞関連増殖性疾患処置用の医薬組成物の製造を目的とする、式（Ｉ）：
【化１３】
2009501767.tif 000019
で示される化合物とチミジンキナーゼ（ＴＫ）阻害剤、またはそれらの医薬上許容される塩の組み合わせの使用。
【請求項１７】
肥満細胞関連増殖性疾患が、全身性肥満細胞症、侵襲性全身性肥満細胞症および肥満細胞性白血病から選択される、請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
肥満細胞関連増殖性疾患がイマチニブに対して耐性を有するものである、請求項１６記載の使用。
【請求項１９】
野生型ＫＩＴまたは発癌性ＫＩＴ Ｇ５６０ＶまたはＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ突然変異に関連する肥満細胞関連増殖性疾患の処置を目的とする、請求項１６記載の使用。
【請求項２０】
ＴＫ阻害剤が、ダサチニブおよび２ＣｄＡから選択される、請求項１６記載の使用。
【請求項２１】
肥満細胞関連増殖性疾患に罹患した哺乳類の処置方法であって、処置を必要とする哺乳類に、式（Ｉ）：
【化１４】
2009501767.tif 000020
で示される化合物とチミジンキナーゼ（ＴＫ）阻害剤、またはそれらの医薬上許容される塩の組み合わせのＫＩＴ活性阻害量を投与することを含む方法。
【請求項２２】
肥満細胞関連増殖性疾患が、全身性肥満細胞症、侵襲性全身性肥満細胞症および肥満細胞性白血病から選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
肥満細胞関連増殖性疾患がイマチニブに対して耐性を有するものである、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
野生型ＫＩＴまたは発癌性ＫＩＴ Ｇ５６０ＶまたはＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ突然変異に関連する肥満細胞関連増殖性疾患の処置を目的とする、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
ＴＫ阻害剤が、ダサチニブおよび２ＣｄＡから選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
式（Ｉ）：
【化１５】
2009501767.tif 000021
で示される化合物とチミジンキナーゼ（ＴＫ）阻害剤、またはそれらの医薬上許容される塩の組み合わせを含む、野生型または突然変異型ＫＩＴ関連肥満細胞関連増殖性疾患の処置を目的とする医薬製剤。
【請求項２７】
肥満細胞関連増殖性疾患が、全身性肥満細胞症、侵襲性全身性肥満細胞症および肥満細胞性白血病から選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
肥満細胞関連増殖性疾患がイマチニブに対して耐性を有するものである、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
野生型ＫＩＴまたは発癌性ＫＩＴ Ｇ５６０ＶまたはＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ突然変異に関連する肥満細胞関連増殖性疾患の処置を目的とする、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
ＴＫ阻害剤が、ダサチニブおよび２ＣｄＡから選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
野生型ＫＩＴまたは発癌性ＫＩＴ Ｇ５６０ＶまたはＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ突然変異に関連する肥満細胞関連増殖性疾患に罹患した、ヒトを含む哺乳類の処置方法であって、処置を必要とする哺乳類に、式（Ｉ）：
【化１６】
2009501767.tif 000022
で示される化合物とチミジンキナーゼ（ＴＫ）阻害剤、またはそれらの医薬上許容される塩の組み合わせを投与することを含む方法。
【請求項３２】
全身性肥満細胞症に罹患した、ヒトを含む哺乳類の処置方法であって、式（Ｉ）：
【化１７】
2009501767.tif 000023
で示される化合物とチミジンキナーゼ（ＴＫ）阻害剤、またはそれらの医薬上許容される塩の組み合わせを投与することを含む方法。
【請求項３３】
肥満細胞関連増殖性疾患が、全身性肥満細胞症、侵襲性全身性肥満細胞症および肥満細胞性白血病から選択される、請求項３１または請求項３２のいずれか１項記載の方法。
【請求項３４】
肥満細胞関連増殖性疾患がイマチニブに対して耐性を有するものである、請求項３１または請求項３２のいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
野生型ＫＩＴまたは発癌性ＫＩＴ Ｇ５６０ＶまたはＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ突然変異に関連する肥満細胞関連増殖性疾患の処置を目的とする、請求項３１または請求項３２のいずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
ＴＫ阻害剤が、ダサチニブおよび２ＣｄＡから選択される、請求項３１または請求項３２のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、全身性肥満細胞症処置用薬剤の製造を目的とするチロシンキナーゼ阻害剤の使用に関するものである。本発明はまた、全身性肥満細胞症の処置方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
全身性肥満細胞症（ＳＭ）は、不活性ＳＭ（臓器機能障害の証拠がほとんどまたは全く無い）、侵襲性ＳＭ（臓器機能障害の存在）、造血系非肥満細胞疾患関連ＳＭ（ＳＭ−ＡＨＮＭＤ）および肥満細胞性白血病に分類され得る。成人ＳＭの場合に現れる臨床症状は様々であり、皮膚疾患（通常、色素性蕁麻疹）、肥満細胞メディエーター放出症状（頭痛、潮紅、ふらつき、失神、アナフィラキシーなど）、および直接的または間接的臓器損傷（溶解性骨病変による骨痛、オステオポローシスまたは骨折、肝脾腫大、骨髄関与による血球減少症）が含まれる。さらに、ＳＭ患者の２０％前後は、顕著なそして時には孤立性の血中好酸球増加症を示し得る（Teffere および Pardanani 2004）。
【０００３】
一般に、肥満細胞性白血病は、生存期間が月単位であり、現在までのところ有効な治療法も無い末期的疾患である。不活性ＳＭの自然史はそれよりかなり良好で、中央生存期間は１０年単位であり、侵襲性ＳＭおよびＳＭ−ＡＨＮＭＤに進行することも稀である。ＳＭ−ＡＨＮＭＤでの結果は、関連したＡＨＮＭＤにより測定され、ＡＨＮＭＤを伴わないＳＭよりも著しく悪い。ＡＨＮＭＤを伴わない不活性および侵襲性の両ＳＭでは、骨髄肥満細胞および好酸球含有率の増加、血清アルカリ性ホスファターゼの上昇、貧血および肝脾腫大が予後の悪さに関連している（TefferiおよびPardanani 2004）。グリベック（Gleevec、登録商標）で処置したとき、ＦＩＰ１Ｌ１−ＰＤＧＦＲα遺伝子融合関連ＳＭ患者において完全な組織学的および臨床的緩解が達成された（Pardanani 2003a、Pardanani 2003b）。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
骨髄新生物に関する幾つかの新生治療概念は、重要なチロシンキナーゼ（ＴＫ）または下流シグナリング分子をターゲッティングする新規薬剤に基づいている１−５。全身性肥満細胞症（ＳＭ）は、大部分の患者では不活性骨髄増殖性疾患としての性質を示す造血系新生物であるが、侵襲性疾患（侵襲性ＳＭを本明細書では「ＡＳＭ」と称す）または白血病、例えば肥満細胞性白血病（本明細書では「ＭＣＬ」と称す）としても現れ得る６−１１。ＡＳＭおよびＭＣＬ患者においては、慣用的治療法に対する応答はほとんどの場合乏しく、予後は深刻なものである６−１２。従って、新生物肥満細胞（ＭＣ）における新規治療標的を同定し、これらの患者についての新たな治療戦略を特定する若干の試みが為されてきた９−１２。
【０００５】
ＡＳＭまたはＭＣＬを有するものとして診断された患者を含む全ＳＭ患者の大多数では、体細胞ｃ−ＫＩＴ点突然変異Ｄ８１６Ｖ（Ａｓｐ８１６Ｖａｌ）が、新生物（肥満）細胞から検出され得る。この点突然変異は、ＫＩＴのリガンド−非依存性リン酸化および活性化、および罹患細胞の自律的分化および増殖と関連している１７，１８。構成的チロシンキナーゼ（ＴＫ）活性とのこの関連性に基づくと、ＫＩＴのＤ８１６Ｖ−突然変異型は、魅力のある治療標的である９−１２、１９。
【０００６】
近年では、ＫＩＴ Ｄ８１６ＶのＴＫ活性を阻害する適切な薬剤を同定するための若干の努力が為されている９−１２，１９−２４。臨床血液学で広範に使用されているＴＫ阻害剤イマチニブ（ＳＴＩ５７１）は、野生型（ｗｔ）ＫＩＴまたはＫＩＴの稀にしか存在しないＦ５２２Ｃ−突然変異型を呈する新生物ＭＣの増殖を妨げることが見出された２０−２３。さらに、この薬剤は、クローン性好酸球増多症およびＦＩＰ１Ｌ１／ＰＤＧＦＲＡ融合遺伝子に伴うＳＭ（慢性好酸球性白血病を伴うＳＭ、本明細書では「ＳＭ−ＣＥＬ」と称す）を呈する患者において新生物細胞の増殖を遮断することが見出された２４−２６。しかしながら、イマチニブでは、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを遮断する新規ＴＫ阻害剤についてのさらなる探求に対する明らかな必要性を示すｃ−ＫＩＴ突然変異Ｄ８１６Ｖ２０−２２をもつ新生物ＭＣの増殖、すなわちＳＭにおける新生物ＭＣの増殖を阻害することができない。
【０００７】
新規ＴＫ−ターゲッティング薬剤ＰＫＣ４１２およびＡＭＮ１０７は、Ｄ８１６Ｖ−ＫＩＴのＴＫ活性を打ち消し、ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖのドキシサイクリン誘導性発現を伴う新生物ヒトＭＣおよびＢａ／Ｆ３細胞の増殖、一次新生物肥満細胞の増殖、およびこのｃ−ＫＩＴ突然変異を含むヒトＭＣＬラインＨＭＣ−１の増殖を阻害する。ＰＫＣ４１２は、ＩＣ５０値が５０〜２５０ｎＭであり、ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖを呈するかまたはこれを欠くＨＭＣ−１細胞間で見られる差異を伴わない優れた薬剤であることが見出された。反対に、ＡＭＮ１０７は、ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ陰性ＨＭＣ−１細胞においてより強力な効果を呈する。野生型またはＤ８１６Ｖ−突然変異ＫＩＴを呈するＢａ／Ｆ３細胞でも対応する結果が得られる。ＨＭＣ−１に対するＰＫＣ４１２およびＡＭＮ１０７の増殖阻害作用は、アポトーシスの誘導およびＣＤ２およびＣＤ６３のダウンレギュレーションに関連する。ＰＫＣ４１２は、ＨＭＣ−１に増殖阻害をもたらす場合にＡＭＮ１０７、イマチニブおよびクラドリビン（すなわち、２ＣｄＡ）と協同することが見出された。我々はまた、ＰＫＣ４１２が、ＨＭＣ−１細胞に増殖阻害をもたらす場合にＡＭＮ１０７およびクラドリビン（２ＣｄＡ）と相乗作用を示すことを証明した。以上のことから、ＰＫＣ４１２およびＡＭＮ１０７は、ＳＭの標的治療用の有望な新規薬剤を提供すると考えられる。
【０００８】
本発明は、ＳＭ、特に発癌性ｃ−ＫＩＴ突然変異Ｄ８１６Ｖに伴うＳＭに対して有効であるＰＫＣ４１２およびＡＭＮ１０７の併用処置に関するものである。本発明はまた、ＳＭ、特に侵襲性ＳＭ（ＡＳＭ）および肥満細胞性白血病（ＭＣＬ）を含む全身性肥満細胞症（ＳＭ）に対して有効であるＰＫＣ４１２およびＴＫ−阻害剤の併用処置に関するものである。好ましい態様では、ＳＭ、ＡＳＭおよびＭＣＬは、特にＤ８１６Ｖを含む、発癌性ｃ−ＫＩＴ突然変異と関連している。
【０００９】
図面の簡単な説明
図１Ａ−Ｄは、新生物細胞におけるＫＩＴリン酸化に対するＴＫ阻害の効果を示す。図１Ａ、Ｂ：４時間、対照培地（対照）、イマチニブＳＴＩ５７１（１μＭ）、ＰＫＣ４１２（１μＭ）、またはＡＭＮ１０７（１μＭ）でのインキュベーション後のＨＭＣ−１.１細胞（図１Ａ）およびＨＭＣ−１.２細胞（ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを呈する：図１Ｂ）におけるＫＩＴリン酸化。図１Ｃ、Ｄ：４時間、対照培地（対照）、イマチニブ（すなわちＳＴＩ５７１）（１μＭ）、ＰＫＣ４１２（１μＭ）、またはＡＭＮ１０７（１μＭ）中でのインキュベーション後のＴｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔ細胞（図１Ｃ）およびＴｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７細胞（図１Ｄ）におけるＫＩＴリン酸化。薬剤暴露の前に、Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔ細胞およびＴｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７細胞を、２４時間ドキシサイクリン、１μｇ／ｍｌ中で保つことにより、ＫＩＴの発現を誘導する。Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔクローンの場合、同様に細胞をＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、４時間）に暴露することにより、ＫＩＴリン酸化（ｐ−ＫＩＴ）を誘導する。全細胞で、抗−ＫＩＴ ｍＡｂ ＳＲ−１を用いることにより、免疫沈降を行う。ｐ−ＫＩＴ検出については抗−ホスホ−ｍＡｂ ４Ｇ１０および総ＫＩＴタンパク質の検出については抗ＫＩＴ ｍＡｂ １Ｃ１を用いて、ウエスタン・ブロッティングを実施する。
【００１０】
図２Ａ−Ｄは、ＨＭＣ−１細胞の増殖に対するＰＫＣ４１２、ＡＭＮ１０７およびイマチニブの効果を示すグラフである。図２Ａ：ＨＭＣ−１.２細胞における３Ｈ−チミジン取り込みに対するＰＫＣ４１２の時間依存的効果。ＨＭＣ−１.２細胞を、示された様々な期間３７℃および５％ＣＯ２で対照培地またはＰＫＣ４１２（３００ｎＭ）とインキュベーションする。インキュベーション後、３Ｈ−チミジン取り込みを分析する。結果は、対照（すなわち、各時点での対照培地における３Ｈ−チミジン取り込み）のパーセントとして表されており、トリプリケイトの平均±Ｓ.Ｄ.を示す。図２Ｂ−Ｄ：ＨＭＣ−１細胞における３Ｈ−チミジン取り込みに対するＴＫ阻害剤の用量依存的効果。ＨＭＣ−１.１細胞（●−●）およびＨＭＣ−１.２細胞（■−■）を、３７℃で４８時間様々な濃度のＰＫＣ４１２（図２Ｂ）、ＡＭＮ１０７（図２Ｃ）またはイマチニブ（図２Ｄ）の非存在下（０）または存在下において対照培地でインキュベーションする。インキュベーション後、３Ｈ−チミジン取り込みを測定する。結果は、対照のパーセント（０、１００％）として表され、少なくとも３独立実験からの平均±Ｓ.Ｄ.を示す。
【００１１】
図３Ａ−Ｂは、Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.細胞における３Ｈ−チミジン取り込みに対するＰＫＣ４１２、ＡＭＮ１０７およびイマチニブの効果を示すグラフである。図３Ａ：Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔ細胞を、対照培地に保つ（白棒）か、またはドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）およびＳＣＦを加えることにより、活性化ｗｔＫＩＴの発現を誘導する（黒棒）。両条件において、細胞を、４８時間（３７℃、５％ＣＯ２）、対照培地（Ｃｏ）または示されている様々な濃度のＰＫＣ４１２、ＡＭＮ１０７またはイマチニブ（ＳＴＩ５７１）に暴露する。その後、テキスト記載の要領で３Ｈ−チミジン取り込みを評価する。結果は、対照（Ｃｏ）のパーセントとして表され、３独立実験からの平均±Ｓ.Ｄ.を示す。図３Ｂ：Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７細胞を、対照培地に保つ（白棒）か、またはドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）を加えることにより、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖの発現を誘導し（黒棒）、次いで４８時間（３７℃、５％ＣＯ２）、対照培地（Ｃｏ）または示されている様々な濃度のＰＫＣ４１２、ＡＭＮ１０７、またはイマチニブ（ＳＴＩ５７１）に暴露する。その後、３Ｈ−チミジン取り込みを測定する。結果は、対照（対照培地に暴露された細胞、本明細書では「Ｃｏ」と称す）のパーセントとして表され、３独立実験からの平均±Ｓ.Ｄ.を示す。
【００１２】
図４は、Ｄ８１６Ｖを呈する一次新生物（肥満）細胞の増殖のＰＫＣ４１２ダウンレギュレーションを示すグラフである。ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを発現する一次新生物骨髄細胞を、くすぶり型全身性肥満細胞症の患者から分離する。分離した細胞を、対照培地（Ｃｏ）または示されている様々な濃度のＰＫＣ４１２、ＡＭＮ１０７およびイマチニブとインキュベーションする。３Ｈ−チミジン取り込みを測定することにより、細胞の増殖を定量する。結果は、対照（Ｃｏは１００％に相当する）のパーセントとして表され、トリプリケイトの平均±Ｓ.Ｄ.を示す。正常骨髄細胞では、ＰＫＣ４１２の効果は認められない（示されていない）。
【００１３】
図５Ａ−Ｆは、ＨＭＣ−１細胞のアポトーシスに対するＴＫ阻害剤の効果を表すグラフである。ＨＭＣ−１.１細胞（図５Ａ、Ｃ、Ｅ）およびＨＭＣ−１.２細胞（図５Ｂ、Ｄ、Ｆ）を、３７℃で２４時間、示されている様々な濃度のＰＫＣ４１２（図５Ａ、Ｂ）、ＡＭＮ１０７（図５Ｃ、Ｄ）またはイマチニブ（図５Ｅ、Ｆ）の非存在下（Ｃｏ）または存在下で培養する。その後、アポトーシス細胞のパーセンテージを光学顕微鏡により定量する。結果は、３独立実験の平均±Ｓ.Ｄ.を表す。
【００１４】
図６Ａ−Ｄは、ＨＭＣ−１細胞におけるＰＫＣ４１２−誘導アポトーシスの電子顕微鏡検査の結果を示す。ＨＭＣ−１.２細胞を、３７℃で２４時間、対照培地（図６Ａ）、ＰＫＣ４１２、５００ｎＭ（図６Ｂ）、またはＰＫＣ４１２、９００ｎＭ（図６Ｃ、Ｄ）とインキュベーションする。次いで、細胞を採取し、アポトーシスの超微細構造的兆候について分析する。対照培地と共に保たれた培養物からは、アポトーシス細胞はほとんど見られず（図６Ａ）、ＰＫＣ４１２（図６Ｂ−Ｄ）中で培養されたＨＭＣ−１.２細胞は、細胞収縮、膜ラッフリング（波打ち運動）、液胞化、および核クロマチンの凝縮を含むアポトーシスの兆候を高頻度で示した。
【００１５】
図７は、３７℃で２４時間、対照培地（対照）、ＰＫＣ４１２（１μＭ）、ＡＭＮ１０７（１μＭ）またはイマチニブ（１μＭ）に暴露されたＨＭＣ−１.２細胞を示す。次いで、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）／アネキシンＶ−ＦＩＴＣ二重染色法により生存能力およびアポトーシスについて細胞を調べる。
【００１６】
図８Ａ−Ｈは、Tunel検定法により評価されたＨＭＣ−１細胞におけるアポトーシスを示す。ＨＭＣ−１.１細胞（図８Ａ−Ｄ）およびＨＣＭ−１.２細胞（図８Ｅ−Ｈ）を、３７℃で２４時間、対照培地（図８Ａ、Ｅ）、ＰＫＣ４１２、１μＭ（図８Ｂ、Ｆ）、ＡＭＮ１０７、１μＭ（図８Ｃ、Ｇ）、またはイマチニブ、１μＭ（図８Ｄ、Ｈ）中でインキュベーションする。その後、細胞を採取し、Tunel検定にかける。見たところ、ＰＫＣ４１２はほとんどのＨＭＣ−１.１およびＨＭＣ−１.２細胞でアポトーシスを誘発し、ＡＭＮ１０７およびイマチニブは、ＨＮＣ−１.１細胞でのみ強力なアポトーシス誘導効果を示したが（図８Ｃ、Ｄ）、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを呈するＨＭＣ−１.２細胞では示さなかった（図８Ｇ、Ｈ）。
【００１７】
図９Ａ−Ｂは、ＨＭＣ−１.２細胞における細胞表面抗原の発現に対するＴＫ阻害剤の効果を表すグラフである。図９Ａ：ＨＭＣ−１.２細胞を、３７℃で２４時間、対照培地（Ｃｏ、白棒）、ＰＫＣ４１２、１μＭ（黒棒）、ＡＭＮ１０７、（斜線入り棒）、またはイマチニブ（すなわち、ＳＴＩ５７１）、１μＭ（灰色棒）に暴露する。結果は対照のパーセントを示し、３独立実験の平均±Ｓ.Ｄ.を表す。図９Ｂ：ＨＭＣ−１.２細胞におけるＣＤ６３の発現に対するＰＫＣ４１２の用量依存的効果。細胞を、３７℃で２４時間、示されている様々な濃度のＰＫＣ４１２とインキュベーションする。その後、細胞を採取し、フローサイトメトリーによりＣＤ６３の発現について調べる。この図は一実験からの典型的な結果を示す。見たところ、ＰＫＣ４１２は、ＣＤ６３の発現を用量依存的に減少させる。
【００１８】
図１０Ａ−Ｊは、ＨＭＣ−１細胞の増殖に対する相乗的薬剤効果を表すグラフである。ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを欠くＨＭＣ−１.１細胞（図１０Ａ−Ｆ）およびＫＩＴ ８１６Ｖを呈するＨＭＣ−１.２細胞（図１０Ｇ−Ｊ）を、３７℃で４８時間、対照培地（０）または示されている様々な組み合わせの薬剤（一定比率で）とインキュベーションすることにより、協同的抗増殖効果を測定する。図１０Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ：単一薬剤（図１０Ａ：ＰＫＣ４１２、■−■；ＡＭＮ１０７、●−●；図１０Ｃ：ＳＴＩ５７１、■−■；ＡＭＮ１０７、●−●；図１０Ｅ：ＳＴＩ５７１、■−■；ＰＫＣ４１２、●−●；図１０Ｇ：ＰＫＣ４１２、■−■；ＡＭＮ１０７、●−●；図１０Ｉ：ＰＫＣ４１２、■−■；２ＣｄＡ、●−●）または薬剤の組み合わせ（▲−▲）とのインキュベーション後、細胞を、３Ｈ−チミジンの取り込みについて分析する。結果は、対照（培地対照、「０」または「１００％」として示す）のパーセンテージとして３Ｈ−チミジン取り込みを示し、一典型実験からのトリプリケイトの平均±Ｓ.Ｄ.を表す（対応する結果は、各薬剤組み合わせについて少なくとも２つの他の実験で得られる）。右側の画像（図１０Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ）は、CalcuSyn ソフトウェアを用いる Chou および Talalay の方法３９に従って得られた各フラクションについて測定された組み合わせ指数値を示す。１.０の組み合わせ指数（ＣＩ）値は付加効果を示し、１.０より大きいＣＩは拮抗作用を示し、１.０未満のＣＩは相乗作用を示す。
【００１９】
図１１Ａ−Ｄは、新生物細胞におけるＫＩＴリン酸化に対するダサチニブの効果を表す。図１１Ａ、Ｂは、４時間、対照培地または様々な濃度のダサチニブ中におけるインキュベーション後のＨＭＣ−１.１細胞（図１１Ａ）およびＨＭＣ−１.２細胞（ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを呈する）（図１１Ｂ）におけるＫＩＴのチロシンリン酸化を表す。図１１Ｃ、Ｄは、４時間、対照培地（０）またはダサチニブ（１０−３〜１０３ｎＭ）中におけるインキュベーション後のドキシサイクリン暴露Ｔｏｎ．Ｋｉｔ．ｗｔ細胞（図１１Ｃ）およびＴｏｎ．Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ．２７細胞（図１１Ｄ）におけるＫＩＴ−リン酸化を表す。薬剤暴露前、Ｔｏｎ．Ｋｉｔ．ｗｔ細胞およびＴｏｎ．Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ．２７細胞を、２４時間、対照培地（対照）またはドキシサイクリン中で保つことにより、ＫＩＴの発現を誘導した。Ｔｏｎ．Ｋｉｔ．ｗｔ細胞の場合はまた、細胞をＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、４時間）に暴露することにより、ＫＩＴのリン酸化（ｐ−ＫＩＴ）を誘導した。全細胞において、抗ＫＩＴｍＡｂ １Ｃ１を用いて免疫沈降を実施した。ｐ−ＫＩＴ検出については抗−ホスホ−ｔｙｒ−ｍＡｂ ４Ｇ１０および総ＫＩＴタンパク質（ＫＩＴ）の検出については抗−ＫＩＴ− ｍＡｂ １Ｃ１を用いて、ウエスタン・ブロッティングを実施した。
【００２０】
図１２Ａ−Ｆは、ＨＭＣ−１細胞の増殖およびＢａＦ／３細胞の増殖およびクラスター形成に対するダサチニブの効果を表す図である。図１２Ａは、ＨＭＣ−１.１細胞（■−■）およびＨＭＣ−１.２細胞（●−●）における３Ｈ−チミジン取り込みに対するダサチニブの時間依存的効果を表す。３７℃および５％ＣＯ２で示されている様々な期間、ＨＭＣ−１.１細胞を１０ｎＭのダサチニブと、そしてＨＭＣ−１.２細胞を1μＭのダサチニブとインキュベーションした。インキュベーション後、３Ｈ−チミジン取り込みを測定した。結果は、対照（＝対照培地で保たれた細胞における３Ｈ−チミジン取り込み）のパーセントとして表され、３独立実験の平均±Ｓ.Ｄ.を示す。図１２Ｂは、ＨＭＣ−１.１細胞（■−■）およびＨＭＣ−１.２細胞（●−●）における３Ｈ−チミジン取り込みに対するダサチニブの用量依存的効果を表す。３７℃で４８時間、様々な濃度のダサチニブの非存在下または存在下、対照培地において細胞をインキュベーションした。インキュベーション後、３Ｈ−チミジン取り込みを測定した。結果は、対照のパーセントとして表され、３独立実験からの平均±Ｓ.Ｄ.を示す。（図１２Ｃ）Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔ細胞の増殖に対するダサチニブの効果。細胞を、ダサチニブとのインキュベーションの前およびその間、ＩＬ−３含有培地で維持する（●−●）か、または２４時間ＩＬ−３の存在下でドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）とプレインキュベーションし、次いで、３７℃で４８時間、ＩＬ−３を含まず、ドキシサイクリンおよびＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む培地中で様々な濃度のダサチニブとインキュベーションした（■−■）。インキュベーション後、細胞を採取し、３Ｈ−チミジン取り込み実験にかけた。結果は、対照のパーセントとして表され、３独立実験の平均±Ｓ.Ｄ.を示す。（図１２Ｄ）Ｔｏｎ．Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ細胞の増殖に対するダサチニブの効果。細胞を、４８時間（３７℃）、ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）の非存在下（●−●）または存在下（■−■）で、対照培地（＋ＩＬ−３）および（示されている）様々な濃度のダサチニブ中においてインキュベーションした。その後、トリパンブルー排除試験により細胞の生存能力を測定した。結果は、対照（ダサチニブ無し＝１００％）と比較した生存し得る細胞のパーセント（トリパンブルー陽性細胞のパーセンテージから計算）として表され、３独立実験の平均±Ｓ.Ｄ.を示す。（図１２Ｅ、Ｆ）Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ２７.細胞におけるＫＩＴ−８１６Ｖ−誘導クラスター形成に対するダサチニブ（図１２Ｅ）およびＡＭＮ１０７（図１２Ｆ）の効果。細胞を、２４時間、示されている様々な濃度のダサチニブまたはＡＭＮ１０７の非存在下または存在下において、ドキシサイクリン無し（Ｃｏ）またはドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）中でインキュベーションした。インキュベーション後、倒立顕微鏡下でクラスターの数を計数した。結果は、対照培地（Ｃｏ）およびドキシサイクリン中で保たれた細胞（＝１００％）と比べたクラスター形成のパーセンテージとして表され、３独立実験の平均±Ｓ.Ｄ.を示す。
【００２１】
図１３は、白血病を伴うＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ−陽性ＳＭを呈する患者においてダサチニブが一次新生物細胞の増殖をダウンレギュレーションすることを示している。一次新生物骨髄細胞を、ＡＭＬに伴うＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ−陽性ＡＳＭを呈する患者から分離した。分離した細胞を、対照培地または示されている様々な濃度のダサチニブ（●−●）、ＰＫＣ４１２（■−■）、ＡＭＮ１０７（▲−▲）、またはイマチニブ（▼−▼）中でインキュベーションした。３Ｈ−チミジン取り込みを測定することにより、細胞増殖を定量した。結果は、対照（対照培地で保たれた細胞＝１００％）のパーセントとして表され、トリプリケイトの平均±Ｓ.Ｄ.を示す。正常な骨髄細胞では、適用されたＴＫ阻害剤の効果は全く認められなかった（示さず）。
【００２２】
図１４Ａ〜Ｃは、ダサチニブがＨＭＣ−１細胞においてアポトーシスを誘導することを示している。（図１４Ａ、Ｂ）ＨＭＣ−１.１細胞（図１４Ａ）およびＨＭＣ−１.２細胞（図１４Ｂ）を、２４時間、示されている様々な濃度のダサチニブの非存在下（Ｃｏ）または存在下で培養した。その後、アポトーシス細胞のパーセンテージを光学顕微鏡により定量した。結果は、３独立実験の平均±Ｓ.Ｄ.を示す。アステリスクは、ｐ＜０.０５を示す。（図１４Ｃ）ＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞におけるダサチニブ誘導アポトーシスの電子顕微鏡検査。ＨＭＣ−１細胞を、２４時間３７℃で対照培地またはダサチニブ（１μＭ）とインキュベーションした。次いで、細胞を採取し、アポトーシスの超微細構造的兆候について分析した。アポトーシス細胞は、対照培地で保たれた培養物からはほとんど認められなかったが、ダサチニブで培養されたほとんどのＨＭＣ−１細胞は、細胞収縮、膜ラッフリング（波打ち運動）、液胞化、および核クロマチンの凝縮を含むアポトーシスの兆候を示した。（図１４Ｄ、Ｅ）Tunel検定法により評価されたＨＭＣ−１細胞におけるダサチニブ誘導アポトーシス。ＨＭＣ−１.１細胞（図１４Ｄ）およびＨＭＣ−１.２細胞（図１４Ｅ）を、３７℃で２４時間、対照培地、示されている様々な濃度のダサチニブ（示されている）、またはＰＫＣ４１２（１００ｎＭおよび１μＭ）中でインキュベーションした。その後、細胞を採取し、Tunel検定法にかけた。見たところ、ダサチニブは、ＨＭＣ−１.１およびＨＭＣ−１.２細胞において用量依存的アポトーシスを誘発した。
【００２３】
図１５Ａ〜Ｆは、ＨＭＣ−１細胞における細胞表面抗原の発現に対するダサチニブの効果を表す。（図１５Ａ）ＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞（図１５Ｂ）を、３７℃で２４時間、対照培地または様々な濃度のダサチニブ（示されている）またはＰＫＣ４１２（１μＭ）に暴露した。インキュベーション後、ＣＤ特異的ｍＡｂを用いてフローサイトメトリーにより様々なＣＤ抗原の発現について細胞を調べた。図１５Ｃ〜Ｄは、対照（＝１００％）のパーセントとして平均蛍光強度（ＭＦＩ）レベルを示す。結果は、３独立実験の平均±Ｓ.Ｄ.を表す。アステリスク：ｐ＜０.５。（図１５Ｅ、Ｆ）３７℃で２４時間、対照培地、様々な濃度のダサチニブ、またはＰＫＣ４１２（１μＭ）中でのインキュベーション後のＨＭＣ−１.１細胞（図１５Ｅ）およびＨＭＣ−１.２細胞（図１５Ｆ）におけるＣＤ６３の発現。フローサイトメトリーをＣＤ６３ ｍＡｂ ＣＬＢ−ｇｒａｎ１２により実施した（黒線）。点線は、イソタイプ適合対照抗体を表す。
【００２４】
図１６Ａ〜Ｄは、ＨＭＣ−１細胞の増殖に対する相乗的薬剤効果を表す。ＨＭＣ−１.１細胞（図１６Ａ〜Ｂ）およびＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを呈するＨＭＣ−１.２細胞（図１６Ｃ〜Ｄ）を、３７℃で４８時間、単一薬剤または様々な薬剤の組み合わせ（一定比率）とインキュベーションした後、３Ｈ−チミジンの取り込みを測定した。（図１６Ａ）ＨＭＣ−１.１を、様々な濃度のダサチニブ（■−■）またはＰＫＣ４１２（●−●）、または両薬剤の組み合わせ（▲−▲）とインキュベーションした。（図１６Ｂ）ＨＭＣ−１.１を、様々な濃度のダサチニブ（●−●）またはイマチニブ（■−■）、または両薬剤の組み合わせ（▲−▲）とインキュベーションした。（図１６Ｃ）ＨＭＣ−１.２細胞を、様々な濃度のダサチニブ（■−■）またはＰＫＣ４１２（●−●）、または両薬剤の組み合わせ（▲−▲）とインキュベーションした。（図１６Ｄ）ＨＭＣ−１.２細胞を、様々な濃度のダサチニブ（■−■）または２ＣｄＡ（●−●）、または両薬剤の組み合わせ（▲−▲）とインキュベーションした。結果は、一典型的実験からのトリプリケイトの平均±Ｓ.Ｄ.を表す。CalcuSyn プログラムにより評価したところによると、薬剤相互作用（図１６Ａ〜Ｄ）は、事実上相乗的であることが見出された。
【００２５】
図１７は、３７℃で４８時間、培養培地または示されている様々な濃度のダサチニブとインキュベーションしたＨＭＣ−１.２細胞を表す。その後、３Ｈ−チミジンの取り込みを測定した。結果は、対照（対照培地で保たれた細胞＝１００％）のパーセントとして表されており、３独立実験の平均±Ｓ.Ｄ.を示す。
【００２６】
詳細な記載
本発明により解決される問題は、全身性肥満細胞症、特に発癌性ｃ−ＫＩＴ突然変異Ｄ８１６Ｖに伴うＳＭの処置におけるＰＫＣ４１２およびＡＭＮ１０７の組み合わせの使用である。
【００２７】
侵襲性ＳＭおよび肥満細胞性白血病（ＭＣＬ）を含む、全身性肥満細胞症（ＳＭ）の全患者の大多数では、新生物細胞は、発癌性ｃ−ＫＩＴ突然変異Ｄ８１６Ｖを発現する。この突然変異により、ＫＩＴ受容体のチロシンキナーゼ（ＴＫ）が活性化されるため、魅力のある治療標的が提供される。しかしながら、ＳＴＩ５７１（イマチニブ；Novartis Pharma AG）を含む利用可能なＴＫ阻害剤の大部分は、薬理学的濃度ではＫＩＴ Ｄ８１６ＶのＴＫ−活性を遮断し得ない。我々は、新規ＴＫ−ターゲッティング薬剤ＰＫＣ４１２およびＡＭＮ１０７（Novartis）が、Ｄ８１６Ｖ−突然変異ＫＩＴのＴＫ活性を遮断し、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖのドキシサイクリン誘導性発現を伴うＢａ／Ｆ３細胞の増殖およびこのｃ−ＫＩＴ突然変異を発現するヒト肥満細胞白血病細胞株ＨＭＣ−１の増殖を妨げる証拠を提供している。ＰＫＣ４１２は、ＩＣ５０値が５０〜２００ｎＭであり、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを呈するかまたはこれを欠くＨＭＣ−１細胞間において差異が見られない、より強力な薬剤であることが見出された。反対に、ＡＭＮ１０７は、ＨＭＣ−１細胞においてＫＩＴ Ｄ８１６Ｖの非存在下でのみ強力な効果を呈した（ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ−発現性ＨＭＣ−１：ＩＣ５０１〜５μＭと比べてＩＣ５０５〜１０ｎＭ）。対応する結果は、ＫＩＴの野生型またはＤ８１６Ｖ−突然変異型を呈するＢａ／Ｆ３細胞の場合に得られる。
【００２８】
それに続いて、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを呈するＳＭ患者の骨髄から得られた一次新生物ＭＣに対するＰＫＣ４１２の効果を調べる。我々の細胞株データと同調することには、ＰＫＣ４１２は、この患者における新生物ＭＣにおいて３Ｈ−チミジン取り込みを用量依存的に阻害したが（ＩＣ５０：５０ｎＭ）、ＡＭＮ１０７（０.１〜３μＭ）およびイマチニブ（１μＭ）を用いた場合、有意な効果は見出されなかった。ＨＭＣ−１細胞に対するＰＫＣ４１２およびＡＭＮ１０７の増殖阻害効果は、ホスホブロット実験におけるＫＩＴのＴＫ阻害、および慣用的形態学および電子顕微鏡により評価されるアポトーシスの誘導に関連している。さらに、ＰＫＣ４１２は、ＨＭＣ−１細胞においてＣＤ２およびＣＤ６３（２つの細胞表面抗原はＳＭでアップレギュレーションされている）の発現をダウンレギュレーションすることが見出された。コ−インキュベーション実験で、ＰＫＣ４１２は、ＫＩＴ Ｄ８１６ＶをもつＨＭＣ−１細胞およびＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを欠くＨＭＣ−１細胞での増殖阻害の誘発においてＡＭＮ１０７、イマチニブおよびクラドリビン（２ＣｄＡ）と相乗作用を示すことが見出された。要約すると、我々のデータは、ＰＫＣ４１２およびＡＭＮ１０７を単独および組み合わせて用いることにより、ＫＩＴのＤ８１６Ｖ−突然変異型を発現する新生物肥満細胞の増殖が妨げられることを示している。従って、両薬剤とも、侵襲性ＳＭおよびＭＣＬ患者における標的治療についての有望な新規薬剤であるとみなされ得る。
【００２９】
従って、本発明は、全身性肥満細胞症の処置を目的とする、式（Ｉ）：
【化１】
2009501767.tif 000002
で示されるＮ−［（９Ｓ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｒ）−２,３,１０,１１,１２,１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９,１３−エポキシ−１Ｈ,９Ｈ−ジインドロ［１,２,３−ｇｈ：３’，２’，１’−ｌｍ］ピロロ［３,４−ｊ］［１,７］ベンゾジアゾニン−１１−イル］−Ｎ−メチルベンズアミド（以後：「ＰＫＣ４１２」）と、式（II）：
【化２】
2009501767.tif 000003
で示される４−メチル−３−［［４−（３−ピリジニル）−２−ピリミジニル］アミノ］−Ｎ−［５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−３−（トリフルオロメチル）フェニル］ベンズアミド（以後：「ＡＭＮ１０７」）、またはそれらのいずれか一方または両方の医薬上許容される塩の組み合わせの使用に関するものである。
【００３０】
本明細書で使用されている略語は、特に指示していない場合、本開示の状況の範囲内において、好ましくは以下の意味を有するものとする：
ＡＳＭ        侵襲性全身性肥満細胞症
ｂｍ          骨髄
クラドリビン  ２−クロロデオキシアデノシン
ＦＣＳ        胎児ウシ血清
ＩＦＮα      インターフェロン−アルファ
ＩＰ          免疫沈降
ＭＣＬ        肥満細胞性白血病
ＰＢＳ        リン酸緩衝食塩水
ＰＥ          フィコエリトリン
ｒｈ          組換えヒト
ＲＴ          室温
ＳＣＦ        幹細胞因子
ＳＭ          全身性肥満細胞症
ＳＳＭ        くすぶり型全身性肥満細胞症
ＴＫ          チロシンキナーゼ
ｗｔ          野生型
【００３１】
本願で使用されている語は、好ましくは本開示の明細書内では、特に指示していない場合、以下の意味を有するものとする：
【００３２】
複数形態が化合物、塩などに使用されている場合、これは、単一の化合物、塩なども包含するものとする。
【００３３】
不斉炭素原子は、（Ｒ）−、（Ｓ）−または（Ｒ,Ｓ）−立体配置、好ましくは（Ｒ）−または（Ｓ）−立体配置で存在し得る。すなわち、化合物は、異性体混合物または純粋異性体として、好ましくは純粋鏡像体−ジアステレオマーとして存在し得る。
【００３４】
本発明はまた、式（Ｉ）および式（II）で示される化合物の可能な互変異性体に関するものである。
【００３５】
塩は、特に式（Ｉ）および式（II）で示される化合物の医薬上許容される塩である。式（Ｉ）および式（II）で示される化合物は、連続的または同時に投与され得る。式（Ｉ）および式（II）で示される化合物は、単一製剤または別々の製剤中で組合され得る。
【００３６】
上記の塩は、塩基性窒素原子をもつ式（Ｉ）および／または式（II）で示される化合物から、例えば、好ましくは有機または無機酸との酸付加塩、特に医薬上許容される塩として形成される。適切な無機酸は、例えば、ハロゲン酸、例えば塩酸、硫酸、またはリン酸である。適切な有機酸は、例えば、カルボン酸、ホスホン酸、スルホン酸またはスルファミン酸、例えば酢酸、プロピオン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、グリコール酸、乳酸、フマル酸、コハク酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アミノ酸、例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、シクロヘキサンカルボン酸、アダマンタンカルボン酸、安息香酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、フタル酸、フェニル酢酸、マンデル酸、桂皮酸、メタン−またはエタン−スルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１,２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、１,５−ナフタレン−ジスルホン酸、ドデシル硫酸、２−,３−または４−メチルベンゼンスルホン酸、メチル硫酸、エチル硫酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸、Ｎ−メチル−、Ｎ−エチル−またはＮ−プロピル−スルファミン酸、または他の有機プロトン酸、例えばアスコルビン酸である。
【００３７】
負に荷電した基、例えばカルボキシまたはスルホの存在下においては、塩はまた塩基により形成され、例えば金属またはアンモニウム塩、例えばアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウムまたはカルシウム塩、またはアンモニアまたは適切な有機アミン、例えば第３級モノアミン、例えばトリエチルアミンまたはトリ（２−ヒドロキシエチル）アミン、または複素環塩基、例えばＮ−エチル−ピペリジンまたはＮ,Ｎ’−ジメチルピペラジンによるアンモニウム塩であり得る。
【００３８】
塩基性基および酸性基が同一分子中に存在するとき、式（Ｉ）および／または式（II）で示される化合物はまた内部塩を形成し得る。
【００３９】
分離または精製目的の場合、医薬上許容し得ない塩、例えばピクリン酸塩または過塩素酸塩を使用することも可能である。治療に使用する場合には、医薬上許容される塩または遊離化合物のみが使用され（医薬製剤形態で適用可能な場合）、従って、これらの方が好ましい。
【００４０】
新規化合物の遊離形態および、例えば新規化合物の精製または同定において中間体として使用され得る塩を含むそれらの塩形態間の密接な関係を考えると、本明細書における前記および後記で遊離化合物とある場合、適宜および便宜上、対応する塩も包含するものと理解すべきである。
【００４１】
特許出願または科学文献が引用されているそれぞれの場合において、最終生成物、医薬製剤および請求の範囲の対象について、本願ではこれらを出典明示することにより援用する。引用参考文献および本開示の主張間に矛盾があると思われる場合、本開示の主張が適用されるものとする。
【００４２】
コード番号、一般名または登録商標名により識別される有効成分の構造は、標準総目録“The Merck Index”の現行版またはデータベース、例えば Patents International（例、IMS World Publications）から入手され得る。その対応する内容については、出典明示により援用する。
【００４３】
驚くべきことに、ＡＭＮ１０７およびＰＫＣ４１２の組み合わせは、治療特性を有することから、チロシンキナーゼ活性の阻害剤として、特に発癌性ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ−誘導疾患、例えば全身性肥満細胞症の処置および予防に、特に有用であることが見出された。
【００４４】
本明細書の前記および後記で使用されているＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖは、ｃ−Ｋｉｔ遺伝子の突然変異産物の名称であり、その産物ではＫＩＴポリペプチドの残基８１６のアスパラギン酸をコードする核酸について、バリンをコードするべく突然変異が導入されている。ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖはまた、突然変異発癌性ｃ−ＫＩＴ遺伝子のポリペプチド生成物をいう。
【００４５】
従って、本発明は、発癌性ｃ−ＫＩＴ突然変異Ｄ８１６Ｖ誘導全身性肥満細胞症、または発癌性ｃ−ＫＩＴ突然変異Ｄ８１６Ｖまたはチロシンキナーゼを活性化する同様の突然変異に関連する他の疾患を処置する薬剤の製造を目的とするＡＭＮ１０７およびＰＫＣ４１２の組み合わせの使用に関するものである。
【００４６】
全身性肥満細胞症（ＳＭ）は、不活性ＳＭ、侵襲性ＳＭ、および造血系非肥満細胞疾患関連ＳＭおよび肥満細胞性白血病を包含する。
【００４７】
本明細書で使用されている「肥満細胞症」の語は、全身性肥満細胞症、例えば肥満細胞腫、およびイヌ肥満細胞新生物に関するものである。肥満細胞症は、処置法の選択が制限された、一般的に予後の悪い骨髄増殖性疾患である。肥満細胞症の病因は、受容体チロシンキナーゼＫＩＴの構成的活性化に因るものと考えられている。肥満細胞症患者の大多数において、ＫＩＴの異常なチロシンキナーゼ活性は、インビトロおよびインビボでイマチニブ、または米国ではGleevec（登録商標）、他国ではGlivec（登録商標）として市販されているメシル酸イマチニブに対する耐性を付与するタンパク質のコドン８１６内における突然変異（Ｄ８１６Ｖ）に起因する。
【００４８】
肥満細胞は、本明細書で挙げられているアレルギー疾患での一次エフェクター細胞としての重要な役割を演じる。肥満細胞の抗原特異的ＩｇＥ伝達性脱顆粒により、それに続いて化学的伝達物質および多種サイトカインの放出およびロイコトリエン合成が誘導される。さらに、肥満細胞は、多発性硬化症の病因に関与している。
【００４９】
肥満細胞新生物は、ヒトおよび動物の両方で発現する。イヌの場合、肥満細胞新生物は肥満細胞腫と呼ばれ、よく見られる病気であり、イヌ腫瘍の７％〜２１％を占める。通常一過性または不活性であるヒト肥満細胞症、および予測不能な経過をたどり、攻撃性および転移性であることも多いイヌ肥満細胞腫間については、明確な区別をしなければならない。例えば、ヒト孤立性肥満細胞腫はあまり転移しない。対照的に、９３８匹のイヌでの腫瘍に関して発表された４６の報告の検討後におけるHottendorf および Nielsen（1969）の評価によると、イヌ肥満細胞腫の５０％は悪性腫瘍の経過をたどる。
【００５０】
肥満細胞症の病因におけるＫＩＴ受容体の関与は、ＫＩＴの構成的活性化を誘発する幾つかの突然変異が若干の肥満細胞系から検出されたという観察結果により示唆されている。例えば、ホスホトランスフェラーゼドメインにおけるＡｓｐ８１６のＶａｌによる置換および受容体自動活性化を誘発する、ヒトｃ−ＫＩＴにおける点突然変異は、長期ヒト肥満細胞性白血病株（ＨＭＣ−１）および２種のげっ歯動物肥満細胞系における対応するコドンで見られる。さらに、この活性化突然変異は、ヒト肥満細胞症の若干の症例においてin situで同定されている。２つの他の活性化突然変異がＫＩＴの細胞内膜近接領域から見出されており、それらはヒトＨＭＣ−１肥満細胞系におけるＶａｌ５６０Ｇｌｙ置換、およびＦＭＡ３と呼ばれるげっ歯動物肥満細胞系における７個のアミノ酸欠失（Ｔｈｒ５７３〜Ｈｉｓ５７９）である。
【００５１】
本発明は、さらに具体的には、全身性肥満細胞症処置用の薬剤の製造を目的とするＡＭＮ１０７およびＰＫＣ４１２の組み合わせの使用に関するものである。
【００５２】
別の実施態様では、本発明は、全身性肥満細胞症の処置方法であって、処置を必要とする哺乳類に、ＡＭＮ１０７およびＰＫＣ４１２、またはそれらの医薬上許容される塩またはプロドラッグの組み合わせの治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００５３】
好ましくは、本発明は、全身性肥満細胞症に罹患している哺乳類、特にヒトの処置方法であって、処置を必要とする哺乳類に、ＡＭＮ１０７およびＰＫＣ４１２またはそれらの医薬上許容される塩類の組み合わせのＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ阻害量を投与することを含む方法を提供する。
【００５４】
本明細書において、「処置（または治療）」の語は、罹患の危険に瀕しているかまたは罹患した疑いがある患者および調子が悪い患者の処置を含む、予防的または防止的処置並びに治療的または疾病抑制的処置の両方を包含する。この語は、さらに疾病の進行を遅延させる処置も包含する。
【００５５】
本明細書で使用されている「治療的」の語は、全身性肥満細胞症を含む進行中の症状発現の処置において効力があることを意味する。
【００５６】
「予防的」の語は、全身性肥満細胞症を含む疾患の開始または再発の阻止を意味する。
【００５７】
本明細書で使用されている「進行の遅延」の語は、処置される疾患の前段階または早期にある患者への活性化合物の投与を意味し、上記患者においては、例えば対応する疾患の前形態であると診断されているか、または上記患者は例えば医療処置中の状態または対応する疾患が発現すると思われる、偶発症候から生じた状態にあるものとする。
【００５８】
この予知できない特性の範囲は、ＡＭＮ１０７およびＰＫＣ４１２の組み合わせの使用が、全身性肥満細胞症処置用の医薬の製造にとって特に興味深いものであることを意味する。
【００５９】
この効果は、特に全身性肥満細胞症の患者にとって臨床的に直接関連したものであり得る。
【００６０】
ＡＭＮ１０７およびＰＫＣ４１２の組み合わせが、良好な治療域（margin）および他の利点を伴う全身性肥満細胞症の処置に特に適したものであることを立証するため、臨床試験は当業者に周知の方法で実施され得る。
【００６１】
全身性肥満細胞症の阻止に使用されるＡＭＮ１０７およびＰＫＣ４１２の組み合わせの正確な用量は、宿主、処置されている状態の性質および重症度、投与方法を含む幾つかの因子により変動する。ＡＭＮ１０７およびＰＫＣ４１２の組み合わせは、一緒に、または独立して、経口、非経口、例えば腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、または直腸、または経腸経路を含むいずれかの経路により投与され得る。好ましくは、ＡＭＮ１０７およびＰＫＣ４１２の組み合わせは、体重に基づき好ましくは１〜３００ｍｇ／ｋｇの１日用量で、またはほとんどの大型哺乳類については、５０〜５０００、好ましくは５００〜３０００ｍｇの１日用量で経口投与される。好ましい経口１日用量は、体重に基づくと１〜７５ｍｇ／ｋｇ、またはほとんどの大型霊長類については、１０〜２０００ｍｇの１日用量であり、単一用量または多用量に分割、例えば１日２回の服用として投与される。
【００６２】
ＡＭＮ１０７と組み合わせて投与されるＰＫＣ４１２の正確な用量は、宿主、処置されている状態の性質および重症度、投与方法を含む幾つかの因子により変動する。しかしながら、一般に、ＰＫＣ４１２を、非経口、例えば腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、または直腸、または経腸、例えば経口、好ましくは静脈内、または好ましくは経口、静脈内経路により、体重に基づき０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１〜５ｍｇ／ｋｇの１日用量で投与したとき、満足すべき結果が得られる。ヒトでの試験では、合計用量２２５ｍｇ／日が最大耐量（ＭＴＤ）であると推定される。好ましい静脈内１日用量は、体重に基づいて０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ、またはほとんどの大型霊長類については、２００〜３００ｍｇの１日用量である。典型的な静脈内用量は、週に３〜５回、３〜５ｍｇ／ｋｇである。
【００６３】
最も好ましくは、ＰＫＣ４１２は、例えばマイクロエマルション、ソフトゲルまたは固体分散液といった投薬形態による経口投与で、約２５０ｍｇ／日以下、特に２２５ｍｇ／日の用量で、１日１回、２回または３回投与される。
【００６４】
通常、少量が最初に投与され、処置されている宿主に最適な用量が決定されるまで投薬量は徐々に増やされる。投薬量の上限は、必然的に副作用により左右され、処置されている宿主についての試験により決定され得る。
【００６５】
ＡＭＮ１０７およびＰＫＣ４１２の組み合わせは、独立して、または１種またはそれ以上の医薬上許容される担体および、所望により、１種またはそれ以上の他の慣用的医薬アジュバントと一緒に組み合わされ、経腸的、例えば錠剤、カプセル剤、キャプレッツなどの形態で経口的に、または滅菌注射可能溶液または懸濁液形態で非経口的、例えば腹腔内または静脈内経路により投与され得る。経腸および非経口組成物は、慣用的手段により製造され得る。
【００６６】
ＡＭＮ１０７およびＰＫＣ４１２の組み合わせについては、単独使用するか、またはこれらの病状で使用される少なくとも１種の他の医薬活性化合物と組み合わせ得る。これらの活性化合物を、同一医薬製剤中で、または組合せのパートナーを、独立して、または特有な量の組合せパートナーとの種々の一定した組み合わせの使用により、すなわち同時または異なる時点で投薬し得るという意味で製剤の組み合わせ「複数パーツのキット」の形態として組み合わせ得る。次いで、複数パーツのキットのパーツを、例えば同時または時差的に、すなわち異なる時点で、複数パーツのキットのパーツについて均等または異なる時間間隔をおいて投与し得る。ＡＭＮ１０７およびＰＫＣ４１２の組み合わせと併用するのに挙げられ得る化合物の非限定的な例は、細胞傷害性化学療法薬剤、例えばシトシンアラビノシド、ダウノルビシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ＶＰ−１６、またはイマチニブなどである。さらに、ＡＭＮ１０７およびＰＫＣ４１２の組み合わせを、他のシグナル伝達阻害剤または他のオンコジーン標的薬剤と併用することも可能であり、著しい相乗効果をもたらすことが期待され得る。
【００６７】
さらに本発明は、本明細書記載の疾患および状態の処置を目的とするイマチニブとの本明細書記載のＡＭＮ１０７およびＰＫＣ４１２の組み合わせに関するものである。上記組み合わせの投与は、例えば一定の組み合わせの医薬組成物または製剤形態で同時に、または連続的または時差的に実施され得る。上記投薬形態のＡＭＮ１０７およびＰＫＣ４１２およびイマチニブの米国における GLEEVEC（登録商標）（ヨーロッパではGLIVEC（登録商標））の市販形態の組み合わせでこれらの投薬形態について認められた投薬量による投与が現時点では好ましい。
【００６８】
上記組み合わせによる全身性肥満細胞症の治療は、いわゆるファーストライン治療、すなわち化学療法などを先行させていない新たに診断された疾患の治療であり得るか、またはいわゆるセカンドライン治療、すなわち、疾患の重症度または段階および患者の全体的状態などにより、イマチニブまたはＡＭＮ１０７およびＰＫＣ４１２の組み合わせによる先行治療を実施した後における疾患の治療であり得る。
【００６９】
全身性肥満細胞症の治療についてのＡＭＮ１０７およびＰＫＣ４１２の組み合わせの効力を、下記実施例の結果により説明する。これらの実施例は、その範囲を限定することなく本発明を説明するものである。
【実施例】
【００７０】
実施例１：臨床試験
血液および／または骨髄から採取した悪性腫瘍細胞におけるｃ−ＫＩＴ転写物レベルおよびｃ−ｋｉｔの突然変異状態に対する化合物（II）の効果を評価する。ＳＭは、キナーゼ活性の改変により生じ得る。ｃ−Ｋｉｔ Ｄ８１６Ｖに伴うＳＭもまた、ＫＩＴ遺伝子における活性化突然変異から生じ得る。ｃ−ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ転写物についてのＱ−ＲＴ−ＰＣＲ、ベースライン、サイクル１、１５日目、サイクル１、２、３、２８日目および３回ごとの後続サイクル、試験の最後。ｃ−ｋｉｔの突然変異解析：別々の３群、各々以下の患者集団を含む：ＳＭエンドポイント：３ヶ月治療後の応答速度。
【００７１】
実施例２：ＡＭＮ１０７およびＰＫＣ４１２の組み合わせ
最近の研究において、我々は、新規ＴＫ阻害剤ＰＫＣ４１２５およびＡＭＮ１０７２７が、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを発現する新生物ヒトＭＣおよびＢａ／Ｆ３細胞の増殖を全く効果的に妨げることを示している。ＰＫＣ４１２は、この点に関してさらに強力な化合物であると思われる。我々はまた、ＰＫＣ４１２およびＡＭＮ１０７が、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを発現するかまたはこれを欠くＨＭＣ−１細胞における増殖阻害の誘発において相乗作用を呈することを示した。これらのデータは、ＰＫＣ４１２およびＡＭＮ１０７が、肥満細胞症の処置について新規の有望な標的薬剤であり得ることを示している。
【００７２】
材料および方法
試薬
ＴＫ阻害剤イマチニブ（ＳＴＩ５７１）、ＡＭＮ１０７２７およびＰＫＣ４１２５を、Novarits Pharma AG（バーゼル、スイス国）から入手する。ＡＭＮ１０７およびＰＫＣ４１２のストック溶液を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Merck、ダルムシュタット、ドイツ国）に溶かすことにより調製する。組み換えヒト（ｒｈ）幹細胞因子（ＳＣＦ）を、Strathmann Biotech（ハノーバー、ドイツ国）から、ＲＰＭＩ１６４０培地および胎児ウシ血清（ＦＣＳ）をＰＡＡラボラトリーズ（パッシング、オーストリア国）から、Ｌ−グルタミンおよびイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）をGibco Life Technologies（ガイザーズバーグ、メリーランド）から、３Ｈ−チミジンをAmersham（バッキンガムシャー、イギリス国）から、そしてヨウ化プロピジウムをSigma（セントルイス、ミズーリ）から購入する。インターフェロン・アルファ（ＩＦＮα）をRoche（バーゼル、スイス国）から、２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、本明細書では「２ＣｄＡ」と称す）をJanssen Cilag（タイタスビル、ニュージャージー）から、そしてｒｈインターロイキン−４（ＩＬ−４）をPeprotech（ロッキーヒル、ニュージャージー）から入手する。フィコエリトリン（ＰＥ）標識モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＩＶＴＯ８５（ＣＤ２）、ＷＭ１５（ＣＤ１３）、ＹＢ５.Ｂ８（ＣＤ１１７）、Ｎ６Ｂ６.２（ＣＤ１６４）、および９７Ａ６（ＣＤ２０３ｃ）を、Becton Dickinson（サンホセ、カリフォルニア）から、そしてＰＥ−コンジュゲートｍＡｂ ＣＬＢ−ｇｒａｎ１２（ＣＤ６３）をImmunotech（マルセイユ、フランス国）から購入する。
【００７３】
ｃ−ＫＩＴＤ８１６Ｖを発現するかまたはこれを欠くＨＭＣ−１細胞
肥満細胞性白血病患者から発生させたヒト肥満細胞系ＨＭＣ−１２８は、Dr.J.H.Butterfield（Mayo Clinic、ロチェスター、ミネソタ）から恵与された。ＨＭＣ−１の２種のサブクローン、すなわちｃ−ＫＩＴ突然変異Ｖ５６０Ｇをもつが、ｃ−ＫＩＴ突然変異Ｄ８１６Ｖ２０をもたないＨＭＣ−１.１、および第２サブクローン、ｃ−ＫＩＴ突然変異、すなわちＶ５６０ＧおよびＤ８１６Ｖ２０の両方をもつＨＭＣ−１.２を使用する。ＨＭＣ−１細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で、１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、および抗生物質を補ったＩＭＤＭ中において増殖させる。ＨＭＣ−１細胞を、４〜８週間ごとに最初のストックから再解凍し、毎週継代する。「表現型安定性」の対照として、ｉ）異調染色性顆粒の存在、ii）表面ＫＩＴの発現、およびiii）ＫＩＴ発現に対するＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ、４８時間）の下方制御効果について、ＨＭＣ−１細胞を定期的にチェックする２９。これらの対照実験を各実験セットの前に行い、最初のクローン２９の特徴を全て呈するＨＭＣ−１細胞のみを使用する。
【００７４】
ｗｔ ｃ−ＫＩＴまたはｃ−ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖの誘導性発現を伴うＢａ／Ｆ３細胞
ｗｔ ｃ−ＫＩＴ（Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔ）またはｃ−ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖのドキシサイクリン誘導性発現を伴うＢａ／Ｆ３細胞については、他所で詳述している３０。簡単に述べると、逆ｔｅｔ−トランス活性化因子３１,３２を発現するＢａ／Ｆ３細胞を、ｃ−ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ ｃＤＮＡ（またはｗｔ ｃ−ＫＩＴ ｃＤＮＡ、両方とも米国ニューヨーク、コロンビア大学のDr.J.B.Longleyのご好意により提供された）を含むｐＴＲＥ２ベクター（Clontech、パロアルト、カリフォルニア）およびｐＴＫ−Ｈｙｇ（Clontech）により電気穿孔でコ−トランスフェクションする。電気穿孔後、安定してトランスフェクションされた細胞をハイグロマイシン中での増殖により選択し、制限希釈によりクローン化する。本研究においては、サブクローンＴｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７を全実験で使用する。これらのＴｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ細胞は、ドキシサイクリンに暴露すると低い増殖速度を呈する３０。ウエスタン・ブロッティング、免疫細胞化学、ＰＣＲおよび制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析１６で評価したところによると、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖの発現は、ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）への暴露により１２時間以内にＴｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖで誘導され得る３０。
【００７５】
一次新生物肥満細胞の分離
一次骨髄（ｂｍ）ＭＣを、多様な造血系の関与およびＭＣ−および非ＭＣ系骨髄細胞におけるｃ−ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖの検出を特徴とするＳＭの独特な亜変異型である、くすぶり型全身性肥満細胞症（ＳＳＭ）の女性患者（５４歳）から採取する３４−３６。対照目的については、病期分類を受けた悪性リンパ腫（ｂｍ関与無し）に罹患している患者から採取したｂｍを分析する。両患者からｂｍ穿刺前にインフォームド・コンセントを得た。ｂｍ吸引液を後腸骨稜から得、保存料不含有のヘパリンを含む注射器に集める。細胞をFicoll に重層することにより、単核細胞（ＭＮＣ）を分離する。ＭＮＣフラクションは、ＳＳＭ患者では５％ＭＣを含み、対照試料（正常ｂｍ）では１％未満のＭＣを含むことが見出された。細胞生存能力は９０％より大である。ＳＳＭ患者のｂｍ ＭＮＣにおけるｃ−ＫＩＴ突然変異Ｄ８１６Ｖの存在は、以前に報告された要領で実施されるＲＴ−ＰＣＲおよびＲＦＬＰ分析により確認される１６。
【００７６】
ウエスタン・ブロッティングによるＫＩＴリン酸化の分析
ＫＩＴ（Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔ）またはＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ（Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７）のいずれかを含むＨＭＣ−１細胞（１０６／ｍｌ）およびＢａ／Ｆ３細胞（１０６／ｍｌ）を、３７℃で４時間、ＰＫＣ４１２（１μＭ）、ＡＭＮ１０７（１μＭ）、イマチニブ（１μＭ）または対照培地とインキュベーションする。阻害剤への暴露前、Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔ細胞およびＴｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７細胞を、３７℃で２４時間、ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）とインキュベーションすることにより、ＫＩＴの発現を誘導する。Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔ細胞の場合、ｒｈＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加することにより、ＫＩＴリン酸化を誘導する。免疫沈降（ＩＰ）およびウエスタン・ブロッティングを記載された要領で実施する３２。簡単に述べると、細胞を４℃で洗浄し、５０ｍＭのトリス、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、１％nonidet Ｐ４０（ＮＰ−４０）、０.２５％デオキシコール酸、０.１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのエチレン−ジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）、１ｍＭのフッ化ナトリウム（ＮａＦ）、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）および１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム（Ｎａ３ＶＯ４）から成るＲＩＰＡ緩衝液（１０８細胞につき緩衝液１ｍｌ）に再懸濁する。４℃で３０分間、プロテイナーゼ阻害剤カクテル（Roche）を補ったＲＩＰＡ緩衝液中でインキュベーション後（５分ごとに激しく渦状に撹拌）、ライゼートを遠心分離にかけることにより、不溶性粒子を除去する。ＩＰについては、１×１０７細胞からのライゼートを、４℃で一晩、ＩＰ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＮａＦ、および１％ＮＰ４０）中において抗ＫＩＴ抗体ＳＲ１３７（ワシントン、シアトル、ワシントン大学のDr.V.Broudyにより恵与）または抗ＫＩＴ抗体１Ｃ１３８（ドイツ国チュービンゲン大学、Dr.H.-J.Buhringのご好意により提供された）およびプロテインＧ Sepharose ビーズ（Amersham）とインキュベーションする。次いで、ビーズをＩＰ緩衝液中で３回洗浄する。次いで、７.５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により還元的条件下でライゼートおよび免疫沈澱物を分離し、４℃で２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシンおよび２０％メタノールを含む緩衝液中のニトロセルロース膜（Protran、Schleicher & Schuell、キーン、ニューハンプシャー）へ移す。膜を５％遮断試薬（Roche）中で１時間遮断し、次いで、抗ＫＩＴ抗体１Ｃ１またはチロシン−リン酸化タンパク質に対して指向させたモノクローナル抗体４Ｇ１０（Upstate Biotechnology、レークプラシッド、ニューヨーク）と４℃で一晩インキュベーションする。抗体反応性を、ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体および Lumingen ＰＳ−３検出試薬（両方ともAmersham）、および CL-Xposure フィルム（Pierce Biotechnology、ロックフォード、イリノイ）により視覚化する。
【００７７】
３Ｈ−チミジン取り込みの測定
増殖阻害薬剤効果を測定するため、ＳＣＦ−活性化ｗｔ ＫＩＴ（Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔ）またはＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ（Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７）を含むＨＭＣ−１細胞およびＢａ／Ｆ３細胞を、５％ＣＯ２中３７℃で４８時間、９６ウェル培養プレート（ＰＴＴ、トラザディンゲン、スイス国）において、様々な濃度のＰＫＣ４１２（１００ｐＭ〜１０μＭ）、ＡＭＮ１０７（１ｎＭ〜１００μＭ）、またはイマチニブ（３ｎＭ〜３００μＭ）とインキュベーションする。経時変化実験では、ＨＭＣ−１細胞を様々な期間（１、１２、２４、３６および４８時間）ＰＫＣ４１２（３００ｎＭ）に暴露する。選択実験では、ＨＭＣ−１細胞（両サブクローン）を、様々な濃度のＩＦＮα（０.１〜５０００００Ｕ／ｍｌ）または２ＣｄＡ（０.００５〜１０μｇ／ｍｌ）とインキュベーションする。一次細胞（ＳＳＭ患者からのｂｍ細胞および対照ｂｍ細胞）を、阻害剤（ＰＫＣ４１２、５０〜５００ｎＭ；ＡＭＮ１０７、１００ｎＭ〜３０μＭ；イマチニブ、１μＭ）の存在または非存在下で４８時間培養する。
【００７８】
インキュベーション後、１μＣｉの３Ｈ−チミジンを各ウェルに加え、１２時間（３７℃）保つ。次いで、細胞を、Filtermate １９６採取装置（Packard Bioscience）におけるフィルター膜（Packard Bioscience、メリデン、コネティカット）で採取する。フィルターを風乾し、結合した放射能をβ−カウンター（Top-Count NXT、Packard Bioscience）で計数する。
【００７９】
独立した一連の実験において、我々は、新生物ＭＣの増殖に対する薬剤組み合わせの効果（付加的対相乗的）を測定した。この目的のため、ＨＭＣ−１細胞（両サブクローン）を、一定割合の薬剤比率での薬剤（ＰＫＣ４１２、ＡＭＮ１０７、イマチニブ、ＩＦＮα、２ＣｄＡ）の様々な組み合わせに暴露する。市販のソフトウェア（Calcusyn、Biosoft、ファーグソン、ミズーリ）を用いて組み合わせ指数値を計算することにより、薬剤相互作用（付加的対相乗的）を測定する３９。実験は全てトリプリケイトで実施する。
【００８０】
慣用的形態学および電子顕微鏡によるアポトーシスの評価
ＨＭＣ−１細胞におけるアポトーシスに対するＴＫ−阻害剤の効果を、形態学的試験、フローサイトメトリー、および電子顕微鏡により分析する。典型的実験では、ＨＭＣ−１細胞を、３７℃で２４時間、１０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地中の６ウェル培養プレート（ＰＴＴ）において様々な濃度のＰＫＣ４１２（５００ｎＭ〜１μＭ）、ＡＭＮ１０７（５０ｎＭ〜１０μＭ）、イマチニブ（５０ｎＭ〜１０μＭ）または対照培地とインキュベーションする。アポトーシス細胞のパーセンテージを、ライト・ギムザ−染色サイトスピン標本で定量する。アポトーシスは、慣用的細胞形態学的基準（細胞収縮、クロマチン構造の凝縮）に従って定義される４０。
【００８１】
ＨＭＣ−１細胞におけるアポトーシスを確認するため、２４時間、２５ｍｌのプラスチック培養フラスコ（ＰＴＴ）中でＰＫＣ４１２（５００ｎＭ、９００ｎＭ、または１μＭ）、ＡＭＮ１０７（１μＭ）、イマチニブ（１μＭ）、または対照培地に暴露したＨＭＣ−１細胞（両サブクローン）を用いて、記載された要領４１、４２で電子顕微鏡検査を実施する。インキュベーション後、細胞を洗浄し、室温（ＲＴ）で６０分間、０.１ｍｏｌ／Ｌカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.４）で処理した２％パラホルムアルデヒド、２.５％グルタルアルデヒド、および０.０２５％のＣａＣｌ２に固定する。次いで、細胞を、０.１ｍｏｌ／Ｌカコジル酸ナトリウム緩衝液中で３回洗浄し、２％寒天に懸濁し、遠心分離にかける。ペレットを１.３％ＯｓＯ４（０.６６ｍｏｌ／Ｌコリジン中で緩衝剤処理）で二次固定し、ＲＴで２時間、２％酢酸ウラニルおよびマレイン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４.４）で「一まとめにして」染色する。次いで、ペレットをすすぎ、アルコール系で脱水し、ＥＰＯＮ８１２に埋封する。極薄片（８５ｎＭ）を切断し、金グリッド上に置く。断片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で対比染色し、JEOL 1200 EX II 透過型電子顕微鏡（JEOL、東京、日本）で観察する。慣用的形態学的基準（上記参照）を用いてアポトーシス細胞の存在を測定する。
【００８２】
Tunel検定法およびフローサイトメトリーによるアポトーシスの評価
２４時間ＰＫＣ４１２（１μＭ）、ＡＭＮ１０７（１μＭ）、またはイマチニブ（１μＭ）に暴露されたＨＭＣ−１細胞におけるアポトーシスを確認するため、Tunel（in situ ターミナルトランスフェラーゼを用いたｄＵＴＰ蛍光ニックエンド−ラベリング）検定法を記載された要領で適用する４３，４４。簡単に述べると、細胞をまずリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１５分間０℃でｐＨ７.４の１％ホルムアルデヒドに固定する。次いで、細胞を７０％エタノール（氷冷）で１時間処理し、ＰＢＳ中で洗浄し、３７℃で１０分間、ＣｏＣｌ２、ＤＮＡデオキシ−ヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼ、およびビオチン−１６−２’−デオキシ−ウリジン−５’−三リン酸を含むターミナルトランスフェラーゼ反応溶液（ドイツ国、製造会社Boehringer Mannheim の説明書に従って製造）中でインキュベーションする。インキュベーション後、細胞を洗浄し、次いで３７℃で２０分間ストレプトアビジンフルオレセイン（Boehringer Mannheim）（１０μｇ／ｍｌ）とインキュベーションする。次いで、ＨＭＣ−１細胞を洗浄し、Nikon Microphot-FXA 蛍光顕微鏡（東京、日本）で分析する。
【００８３】
アポトーシスおよび細胞生存能力のフローサイトメトリー測定を行うため、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム併用染色を実施する。この目的のため、ＨＭＣ−１細胞を、３７℃で２４時間、ＰＫＣ４１２（０.５、１および２.５μＭ）、ＡＭＮ１０７（０.５、１および２.５μＭ）、イマチニブ（０.５、１および２.５μＭ）または対照培地に暴露する。その後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次いでＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７.４）、ＮａＣｌ（１４０ｍＭ）およびＣａＣｌ２（２.５ｍＭ）を含む結合緩衝液中においてアネキシンＶ−ＡＰＣ（Alexix Biochemicals、ラウゼン、スイス国）とインキュベーションする。その後、ヨウ化プロピジウム（１μｇ／ｍｌ）を加える。次いで、細胞を洗浄し、FACSCalibur（Becton Dickinson）でのフローサイトメトリーにより分析する。
【００８４】
ＨＭＣ−１細胞における活性化による表面抗原の発現の評価
ＫＩＴ Ｄ８１６ＶをもつＨＭＣ−１細胞（ＨＭＣ−１.２細胞）における細胞表面抗原の発現を、対照培地またはＴＫ阻害剤（ＰＫＣ４１２、１μＭ；ＡＭＮ１０７、１μＭ；イマチニブ、１μＭ）含有培地中で短期（２４時間）培養後、フローサイトメトリーにより測定する。選択実験では、様々な濃度のＰＫＣ４１２（５０、１００、２５０、５００および１０００ｎＭ）を適用する。薬剤とのインキュベーション後、ＨＭＣ−１細胞を洗浄し、ＳＭにおける新生物ＭＣで過剰発現される（正常ＭＣの場合と比べて）か、および／または肥満細胞発生の初期段階で発現されることが知られているＭＣ抗原（ＣＤ２、ＣＤ１３、ＣＤ６３、ＣＤ１１７、ＣＤ１６４、ＣＤ２０３ｃ）に対するＰＥ−コンジュゲート抗体を用いる単色フローサイトメトリーにかける４５〜４７。記載された要領２９で、FACSan（Becton Dickinson）においてフローサイトメトリーを実施する。
【００８５】
統計分析
阻害剤へのＨＭＣ−１細胞暴露後の増殖速度、アポトーシス、および表面発現レベル間の差異における有意性を測定するため、従属サンプルについてのスチューデントのｔ検定を適用する。ｐが０.０５より小であるとき、結果は統計的に有意であると考えられる。
【００８６】
結果
Ｄ８１６Ｖ−突然変異ＫＩＴのＴＫ活性に対するＰＫＣ４１２およびＡＭＮ１０７の効果
ＩＰおよびウエスタン・ブロッティングで評価したところ、ＰＫＣ４１２（１μＭ）は、ＨＭＣ−１.１細胞（ｃ−ＫＩＴ突然変異Ｄ８１６Ｖではなく、ｃ−ＫＩＴ突然変異Ｖ５６０Ｇを呈する）およびＫＩＴのＶ５６０Ｇ−突然変異体およびＤ８１６Ｖ−突然変異体をもつＨＭＣ−１.２細胞においてＫＩＴのリン酸化を減少させた（図１Ａおよび１Ｂ）。新規ＴＫ阻害剤ＡＭＮ１０７（１μＭ）は、ＨＭＣ−１.１細胞においてＫＩＴリン酸化を強く低下させたが、１μＭでＨＭＣ−１.２細胞においてはＫＩＴリン酸化に対して弱い効果しか示さなかった。同様に、イマチニブ（１μＭ）は、ＨＭＣ−１.１細胞においてＫＩＴリン酸化を低下させたが、ＨＭＣ−１.２細胞においてはＫＩＴリン酸化を阻害しなかった（図１Ａおよび１Ｂ）。次の段階で、我々は、ドキシサイクリンへの暴露後にＢａ／Ｆ３のｗｔ ＫＩＴを呈する（Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔ）細胞またはＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを呈する（Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７）細胞に対するＴＫ阻害剤の効果を調べた。Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔ細胞において、ＫＩＴは、ＳＣＦの存在下で（非存在下ではない）リン酸化されると思われ、Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７細胞において、ＫＩＴは構成的にリン酸化されることが見出された（図１Ｃ）。図１Ｃから明らかなように、３種のＴＫ阻害剤（ＰＫＣ４１２、ＡＭＮ１０７、イマチニブ、各々１μＭ）は全て、Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔ細胞においてＫＩＴのＳＣＦ−誘導リン酸化を減少させた。対照的に、ＰＫＣ４１２および程度は劣るがＡＭＮ１０７のみ、Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ−２７細胞においてＫＩＴのＳＣＦ−非依存的リン酸化を減少させた。イマチニブ（１μＭ）は、これらの細胞においてＫＩＴのリン酸化に対する検出可能な効果を示さなかった（図１Ｄ）。これらのデータは、ＰＫＣ４１２が、ｗｔＫＩＴ、ＫＩＴ Ｖ５６０Ｇ、およびＫＩＴ Ｄ８１６ＶのＴＫ活性の強力な新規阻害剤であること、およびＡＭＮ１０７が、ｗｔＫＩＴおよびＫＩＴ Ｖ５６０Ｇの強力な新規阻害剤、およびＫＩＴ Ｄ８１６Ｖの（自動）リン酸化の弱い阻害剤であることを示している。
【００８７】
ＨＭＣ−１細胞における３Ｈ−チミジン取り込みに対するＴＫ阻害剤の効果
経時変化実験において、ＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞の増殖に対するＰＫＣ４１２、ＡＭＮ１０７、およびイマチニブの最大阻害効果は、３６〜４８時間後に観察される。図２Ａは、ＨＭＣ−１.２細胞の増殖に対するＰＫＣ４１２（３００ｎＭ）の時間依存的効果を示す。図２Ｂおよび２Ｃで示されているところによると、ＰＫＣ４１２およびＡＭＮ１０７は、用量依存的にＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞において３Ｈ−チミジン取り込みを妨げることが見出された。興味深いことに、これら２種のサブクローンでのＰＫＣ４１２の効果についてのＩＣ５０は、同じ範囲（５０〜２５０ｎＭ）にあると思われる（図２Ｂ）。対照的に、増殖に対するＡＭＮ１０７の効果についてのＩＣ５０値は、ＨＭＣ−１.１細胞で見出される効果（３〜１０ｎＭ）と比べてＨＭＣ−１.２細胞における方が著しく高い（１〜５μＭ）（図２Ｃ）。予想通り、イマチニブは、ＨＭＣ−１.１細胞において薬理学的に関連性のある濃度で有効性を示すのみで（ＩＣ５０：１０〜３０ｎＭ）、ＨＭＣ−１.２細胞に対するイマチニブの抗増殖効果はあまり観察されない（図２Ｄ）ことから、以前のデータを確認する結果となった２０〜２２。興味深い観察結果は、（ｃ−ＫＩＴ突然変異Ｄ８１６Ｖではなく）ｃ−ＫＩＴ突然変異Ｖ５６０Ｇを呈するＨＭＣ−１.１細胞に対する上記３薬剤の増殖阻害効果を比較したとき、ＡＭＮ１０７が最も強力な化合物（モルに基づいて）であったことである（図２Ｂ〜Ｄ）。
【００８８】
ｗｔ ＫＩＴまたはＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを発現するＢａ／Ｆ３細胞の増殖に対するＴＫ阻害剤の効果
図３Ａに示されているところによると、３種のＴＫ阻害剤は全て、ドキシサイクリン暴露（ＫＩＴ発現性）Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔ細胞のＳＣＦ−依存的増殖を用量依存的に阻害し、ＩＣ５０値は、ＰＫＣ４１２については３〜３０ｎＭ、ＡＭＮ１０７については３０〜３００ｎＭ、およびイマチニブについては３〜３０ｎＭであることが見出された。対照的に、Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ細胞では、ＰＫＣ４１２（ＩＣ５０：１００〜３００ｎＭ）、および程度は劣るがＡＭＮ１０７（ＩＣ５０：１〜３μＭ）のみが、３Ｈ−チミジン取り込みを阻害することが見出され、試験用量範囲でのイマチニブからは有意な効果は得られなかった（図３Ｂ）。使用されている３種の阻害剤はどれも、ドキシサイクリンの非存在下、すなわちＫＩＴの非存在下ではＴｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔ細胞またはＴｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７細胞の増殖を阻害しないことが見出された（図３Ａおよび３Ｂ）。さらなる対照実験では、ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）もＴＫ阻害剤（イマチニブ、ＰＫＣ４１２、ＡＭＮ１０７）も、対照（非トランスフェクション）Ｂａ／Ｆ３細胞に対する増殖阻害効果を示さなかった（図示せず）。
【００８９】
ＰＫＣ４１２およびＡＭＮ１０７は、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを発現する一次新生物（肥満）細胞の増殖を妨げる
全身性肥満細胞症におけるＰＫＣ４１２およびＡＭＮ１０７の抗増殖効果を再確認するため、我々は、ほとんどの骨髄細胞（ＭＣおよび非ＭＣ系細胞）がＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを呈するＳＭの特殊な亜変異型である、くすぶり型ＳＭの患者における一次新生物骨髄（ｂｍ）ＭＣの応答を調べた。事実、ＭＣの純度は４％に過ぎないが、この試料中の骨髄細胞のほとんどはＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを呈した。これらの新生物ｂｍ細胞において、ＰＫＣ４１２およびＡＭＮ１０７は、用量依存的に３Ｈ−チミジンの自然発生的取り込みを阻害することが見出されたが、イマチニブ（１μＭ）ではあまり効果が見られなかった（図４）。対照試料（正常ｂｍ、造血系疾患無し）では、ＰＫＣ４１２は、３Ｈ−チミジン取り込みに対する効果を示さなかった（図示せず）。
【００９０】
ＰＫＣ４１２およびＡＭＮ１０７は、ＨＭＣ−１細胞においてアポトーシスを誘導する
ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを呈するかまたはこれを欠く新生物ヒトＭＣに対するＰＫＣ４１２およびＡＭＮ１０７の増殖阻害効果の根元にある機構を調べるため、我々は、薬剤暴露後のＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞におけるアポトーシスの形態学的および生化学的兆候を分析した。これらの実験では、ＰＫＣ４１２は、用量依存的に両ＨＭＣ−１サブクローンにおいてアポトーシスを誘導することが見出された（図５Ａおよび５Ｂ）。ＡＭＮ１０７もまた、両ＨＭＣ−１サブクローンにおいて用量依存的にアポトーシスを誘導することが見出されたが、この化合物については、ＨＭＣ−１.２細胞の場合に見出される効果（図５Ｄ）と比べてＨＭＣ−１.１細胞で見られる効果の方が著しく高い（図５Ｃ）。同様に、イマチニブは、ＨＭＣ−１.１細胞でアポトーシスを誘発することが見出されたが（図５Ｅ）、ＨＭＣ−１.２細胞に対しては効果を示さなかった（図５Ｆ）。ＨＭＣ−１細胞に対する薬剤のアポトーシス誘導効果は、電子顕微鏡により確認され得る。また、３薬剤（各々１μＭ）は全て、ＨＭＣ−１.１細胞でアポトーシスを誘導することが見出されたが、ＨＭＣ−１.２細胞では、ＰＫＣ４１２および程度は劣るがＡＭＮ１０７のみが、ＨＭＣ−１.２細胞においてアポトーシスを誘発することが見出された。図６は、ＨＭＣ−１.２細胞に対するＰＫＣ４１２（１μＭ、２４時間）のアポトーシス誘導効果を示す。見たところ、ＰＫＣ４１２に暴露されたＨＭＣ−１細胞の多くは（図６Ｂ〜Ｄ）、対照培地で維持された細胞と比べてアポトーシスの典型的な超微細構造的兆候を呈していた（図６Ａ）。最後に、我々は、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム二重染色法およびフローサイトメトリー（図７）およびTunel検定法（図８）によりＨＭＣ−１細胞におけるＰＫＣ４１２およびＡＭＮ１０７のアポトーシス誘導効果を立証することができる。両検定法では、ＫＣ４１２（１μＭ）および程度は劣るがＡＭＮ１０７（１μＭ）は、ＨＭＣ−１.２細胞においてアポトーシスを誘導することが見出され、イマチニブは、全く効果を示さなかった（図７および８Ｅ〜Ｈ）。対照的に、ＨＭＣ−１.１細胞では、３化合物は全て、Tunel検定法により評価したところ、アポトーシスを誘導することが見出された（図８Ａ〜Ｄ）。
【００９１】
これらのデータは、ＨＭＣ−１細胞に対するＰＫＣ４１２およびＡＭＮ１０７の増殖阻害効果が、アポトーシスの誘導に関連していることの証拠を提供している。
【００９２】
ＰＫＣ４１２は、ＨＭＣ−１細胞における活性化誘導およびＳＭ関連細胞表面抗原の発現をダウンレギュレーションする
典型的にはＳＭにおける新生物ＭＣで（過剰）発現される幾つかの細胞表面抗原は、新生物細胞の増殖、活性化、または分布においてある一定の役割を演じ得る４５、４６。これらの分子の中には、ＫＩＴのＤ８１６Ｖ突然変異体により直接アップレギュレーションされ得るものもある３０。従って、我々は、ＰＫＣ４１２、ＡＭＮ１０７またはイマチニブが、ＨＭＣ−１.２細胞における細胞表面抗原の発現に影響を及ぼすか否かを調べることにした。非刺激ＨＭＣ−１.２細胞は、ＬＦＡ−２（ＣＤ２）、アミノペプチダーゼ−Ｎ（ＣＤ１３）、ＣＤ６３、ＫＩＴ（ＣＤ１１７）、ＣＤ１６４およびＥ−ＮＰＰ３（ＣＤ２０３ｃ）を発現することが見出されることから、以前のデータが確認された４５〜４７。ＰＫＣ４１２とＨＭＣ−１.２細胞のインキュベーションにより、ＣＤ２、ＣＤ６３およびＣＤ１６４の発現の著しい減少がもたらされた（ｐ＜０.０５）（図９Ａ）。対照的に、ＣＤ１３またはＣＤ２０３ｃの発現に対するＰＫＣ４１２の効果はあまり見られなかった（図９Ａ）。ＫＩＴの場合、ＨＭＣ−１.２細胞における発現の僅かな減少がＰＫＣ４１２への暴露後（およびＡＭＮ１０７またはイマチニブへの暴露後）に見出されたが、効果は有意なものではない（ｐ＜０.０５）（図９Ａ）。ＣＤ２およびＣＤ６３の発現に対するＰＫＣ４１２の効果は、用量依存的であることが見出された。図９Ｂは、ＨＭＣ−１.２細胞でのＣＤ６３の発現に対する様々な濃度のＰＫＣ４１２の効果を示す。ＰＫＣ４１２とは対照的に、ＨＭＣ−１.２細胞におけるＣＤ抗原の発現に対するＡＭＮ１０７またはイマチニブの有意な効果は認められなかった（図９Ａ）。
【００９３】
ＰＫＣ４１２は、ＨＭＣ−１細胞における増殖阻害の誘発において他の標的−および慣用的薬剤と協同する
３Ｈ−チミジン取り込みにより評価したところでは、ＰＫＣ４１２は、ＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞での増殖阻害の誘発においてＡＭＮ１０７と協同することが見出された（図１０、表１）。ＨＭＣ−１.１細胞の場合、薬剤相互作用は明らかに相乗的であることが見出され、ＨＭＣ−１.２細胞では、相互作用は相乗的ではなく付加的である（図１０、表１）。さらに、ＰＫＣ４１２および、侵襲性肥満細胞症の処置に効果的に使用される薬剤である２ＣｄＡは、ＨＭＣ−１.１細胞の増殖を相乗的に阻害することが見出され、同じ相乗効果は、ＰＫＣ４１２およびイマチニブの場合にも見られた（表１）。しかしながら、また、ＨＭＣ−１.２細胞の増殖に対するＰＫＣ４１２および２ＣｄＡの明白な相乗効果は見られない。また、ＡＭＮ１０７およびイマチニブは、ＫＩＴ Ｄ８１６ＶをもつＨＭＣ−１.２細胞（表１）ではなく、ＨＭＣ−１.１細胞でのみ相乗的阻害効果をもたらした（図１０）。ＰＫＣ４１２およびインターフェロン−アルファ（ＩＦＮα）またはＡＭＮ１０７およびＩＦＮαを組み合わせても、ＨＭＣ−１細胞の増殖に対する相乗的または付加的な効果は全く見られない（表１）。薬剤相互作用の要約を表１に示す。
【表１】
2009501767.tif 000004
【００９４】
表１で示されているように、ＨＭＣ−１.１細胞（上方右、白い四角）およびＨＭＣ−１.２細胞（下方左、灰色四角）の増殖に対する様々な薬剤組み合わせの効果を、３Ｈ−チミジン取り込み検定法により測定する。少なくとも３つの独立した実験で各薬剤組み合わせを試験する。薬剤を一定割合で適用し、生じた効果（および薬剤相互作用のタイプ）を、calcusyn ソフトウェアにより測定する。スコア：＋、相乗的増殖阻害効果；＋／−、付加的効果；−、付加的ではない（拮抗的）効果。ｎ.t.、試験せず。
【００９５】
検討
体細胞ｃ−ＫＩＴ突然変異Ｄ８１６Ｖは、（新生物）ＭＣの増殖、従ってＳＭの病因に決定的に関与するＫＩＴ受容体のＴＫドメインの構成的活性化をまねく遺伝子欠損である１３〜１７。従って、最近の試みは、ＫＩＴのＤ８１６Ｖ−突然変異体のＴＫ活性を阻害し得ることにより、ＳＭ患者において新生物ＭＣの増殖を阻害し得る薬理学的化合物の同定および開発に焦点を絞っている９〜１２。我々は、本明細書において、ＴＫ阻害剤ＰＫＣ４１２、および程度は劣るがＡＭＮ１０７が、ＫＩＴ−Ｄ８１６ＶのＴＫ活性およびこの特定ｃ−ＫＩＴ突然変異をもつ新生物ヒトＭＣの増殖を阻害することを報告している。さらに、我々は、両薬剤が、新生物ＭＣにおいて増殖阻害を誘発する際、互いに、そして他の標的および慣用的薬剤とも協同することを立証している。
【００９６】
ＰＫＣ４１２は、ＰＫＣ、およびＫＤＲ、ＰＤＧＦＲＡ、ＦＬＴ３およびＫＩＴを含む幾つかのＴＫの新規スタウロスポリン関連阻害剤である５。最近の研究で、我々は、ＰＫＣ４１２が、ＫＩＴのＤ８１６Ｖ突然変異体を発現する新生物ヒトＭＣおよびＢａ／Ｆ３細胞の増殖を阻害することを立証した。Ｂａ／Ｆ３細胞に関して、我々のデータは、Growney et al４８の結果と一致している。興味深いことに、Ｂａ／Ｆ３細胞に関して有効な用量範囲は、ＫＩＴ Ｄ８１６ＶをもつＨＭＣ−１.２細胞で見出される範囲と同じであることが見出された。もう一つの興味深い観察結果は、（ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを発現するかまたはこれを欠く）ＨＭＣ−１の２種のサブクローンに対するＰＫＣ４１２の効果についてのＩＣ５０が同じ範囲にあると思われることである。最後に、我々は、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを発現する一次新生物ヒト（肥満）細胞についてのＰＫＣ４１２の増殖阻害効果を確認し得た。ｃ−ＫＩＴ突然変異Ｄ８１６Ｖが、病気のサブタイプとは関係の無い全ＳＭ患者の大多数から検出され得ることから１３〜１７、これらのデータはかなりの重要性を有する。事実、ＰＫＣ４１２は、ＫＩＴ ｗｔ発現性ＭＣの場合と同様にしてＫＩＴ Ｄ８１６ＶをもつヒトＭＣの増殖を阻むと報告されている第一のＴＫ阻害剤であると思われる。また、この点に関して、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ陽性細胞に対するＰＫＣ４１２の阻害効果が、ＡＭＮ１０７およびイマチニブの抗増殖活性を明らかに凌ぐことは注目すべきことである。これらの観察結果に基づくと、ＰＫＣ４１２は、（侵襲性）ＳＭまたはＭＣＬ患者における臨床試験での使用が考えられる魅力的な新規標的薬剤であると思われる。
【００９７】
最近のデータは、ＡＭＮ１０７が、ＢＣＲ／ＡＢＬ ＴＫ活性の最も強力な阻害剤であることを示唆している２７。また、ＡＭＮ１０７は、野生型ＫＩＴのＴＫ活性を阻害するとも報告されている２７。本研究で、我々は、ＡＭＮ１０７が、ｃ−ＫＩＴ突然変異Ｖ５６０ＧをもつＨＭＣ−１細胞に対しては強力な効果を発揮するが、ＫＩＴ Ｖ５６０ＧおよびＫＩＴ Ｄ８１６Ｖの両方をもつＨＭＣ−１細胞に対しては弱い効果しか呈しないことを見出した。同様に、ＡＭＮ１０７は、ＫＩＴのＤ８１６Ｖ突然変異体を発現するＢａ／Ｆ３細胞の増殖に対して弱い効果しか示さなかった。これらのデータは、ＡＭＮ１０７が依然としてイマチニブと比べてＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ陽性ＨＭＣ−１細胞に対し阻害効果を保持しているにせよ、ｃ−ＫＩＴ突然変異Ｖ５６０Ｇではなく、ｃ−ＫＩＴ突然変異Ｄ８１６Ｖが、ＡＭＮ１０７に対して相対的耐性を付与することを示唆している。Ｖ５６０Ｇ−陽性細胞に対するＡＭＮ１０７の印象的な抗増殖効果はまた、この化合物が、胃腸管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）についての魅力的な筆頭候補薬剤であり得ることを示唆しており、ｃ−ＫＩＴのコドン５６０における突然変異については最近報告されている４９。
【００９８】
前腫瘍形成分子のＴＫ活性をターゲッティングする若干の薬理学的阻害剤が、臨床血液学分野で開発されている５,１２,１９,２７。（適切な標的を発現する）新生物細胞に対するこれらのＴＫ阻害剤の増殖阻害効果は、通常ＴＫ活性の喪失およびそれに続くアポトーシスに関連している。本研究において、我々は、新生物ヒトＭＣ（ＨＭＣ−１）に対するＰＫＣ４１２の増殖阻害効果が、（突然変異）ＫＩＴのＴＫ阻害およびアポトーシスに関連していることを立証し得た。事実、我々は、ＰＫＣ４１２が、（ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖではなく、ＫＩＴ Ｖ５６０Ｇを発現する）ＨＭＣ−１.１細胞および（ＫＩＴ Ｖ５６０ＧおよびＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを発現する）ＨＭＣ−１.１細胞においてアポトーシスを誘導することを立証し得る。ＰＫＣ４１２のアポトーシス誘導効果は、光学および電子顕微鏡およびフローサイトメトリーにより、さらにはTunel検定法で立証され得る。予想通り、ＡＭＮ１０７およびイマチニブは、ＨＭＣ−１.１細胞に対して著しいアポトーシス誘導効果を示したが、ＨＭＣ−１.２細胞に対しては有意な効果を呈しなかった。
【００９９】
若干の細胞表面抗原は、典型的には新生物ヒトＭＣで（過剰）発現される。同様に、正常ＭＣとは対照的に、ＳＭ患者における新生物ＭＣは、ＣＤ２およびＣＤ２５を発現する４５，４６。さらに、ＳＭにおける新生物ＭＣで発現されるＣＤ６３およびＣＤ２０３ｃのレベルは、正常ＭＣの場合と比べて高い。例えばＣＤ６３などの幾つかの場合では、ＫＩＴのＤ８１６Ｖ突然変異体は、直接表面発現の増強をまねき得る３０。従って、我々は、ＰＫＣ４１２によるＨＭＣ−１細胞でのＤ８１６Ｖ突然変異ＫＩＴのターゲッティングが、「ＳＭ関連」表面ＣＤ抗原の発現の減少と関連しているか否かを知ることに興味を抱いている。我々の実験結果は、ＰＫＣ４１２が、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを呈するＨＭＣ−１.２細胞におけるＣＤ２、ＣＤ６３、およびＣＤ１６４の発現をダウンレギュレーションすることを示している。ＫＩＴ発現に対するＰＫＣ４１２（およびＡＭＮ１０７）の重要ではないが軽微な効果も観察される。興味深い観察結果は、ＡＭＮ１０７が、ＨＭＣ−１.２細胞におけるＣＤ２およびＣＤ６３の発現を抑制し得ないことである。これは、ＫＩＴ Ｄ８１６ＶのＴＫ活性に対するこの化合物の効果が、ＰＫＣ４１２の効果と比べて弱いことに起因すると思われる。
【０１００】
若干の最近のデータは、ＴＫ阻害剤による骨髄新生物の単剤処置では、長期間にわたって病気を制御するのに不十分であり得ることを示唆している。これは、（進行性）ＣＭＬにおけるイマチニブの使用について詳細に記録されており５０，５１、ＡＳＭまたはＭＣＬの患者にも当てはまり得る５２。ＡＳＭまたはＭＣＬ患者の場合、突然変異Ｄ８１６Ｖが、イマチニブに対するＫＩＴの一次（相対的）耐性および、程度は劣るが、ＡＭＮ１０７に対する相対耐性を付与するため、これは特別な問題である。耐性を克服するため、若干の異なる薬理学的戦略が構想され得る。一つの可能性は、薬剤組み合わせを適用することである。従って、我々は、ＰＫＣ４１２およびＡＭＮ１０７が、ＨＭＣ−１.１およびＨＭＣ−１.２細胞に対して相乗的抗増殖効果を呈するか否かを知ることに関心がある。実際に、我々のデータは、ＰＫＣ４１２が、両ＨＭＣ−１クローンにおいて増殖阻害を誘導する際にイマチニブおよびＡＭＮ１０７と協同することを示している。さらに、ＰＫＣ４１２および２ＣｄＡ、すなわち（侵襲性）ＳＭ患者においてインビボで新生物ＭＣの増殖を阻害することが報告されている薬剤は、ＨＭＣ−１.１およびＨＭＣ−１.２細胞の増殖に対して協同的阻害効果を示した。しかしながら、興味深いことに、薬剤相互作用は、ＨＭＣ−１.２細胞においてではなく、ＨＭＣ−１.１細胞に対してのみ相乗的であることが見出された。これは、ＨＭＣ−１.１細胞に対する同薬剤の非常に優れた効果と比べて、ＫＩＴ ＴＫ活性、従ってＤ８１６ＶをもつＨＭＣ−１.２細胞の増殖に対する併用適用薬剤の効果が相対的に弱い（ＡＭＮ１０７）かまたはこれを欠いている（イマチニブ）ことにより説明され得る。ＡＭＮ１０７またはＰＫＣ４１２とＩＦＮαを組み合わせたとき、協同的な薬剤効果は全く見られなかった。ＰＫＣ４１２および他の（標的化）薬剤から成る薬剤組み合わせがＡＳＭまたはＭＣＬ患者において臨床的に価値があるか否かは依然として未知である。
【０１０１】
すなわち、これまでのところ、ＳＭ患者においてインビボで新生物ＭＣに対する抗増殖効果をもつことが詳細に記録された薬剤は僅かしか提示されておらず、これらの薬剤の中でＡＳＭまたはＭＣＬ患者において永続的で完全な緩解をもたらすものは無い。ＰＫＣ４１２がＫＩＴのＤ８１６Ｖ突然変異体をもつ新生物ヒトＭＣの極めて強力な新規増殖阻害剤であるという考えは、この点に関して特に興味深いものである。
【０１０２】
要約すると、我々は、ＰＫＣ４１２およびＡＭＮ１０７が、ＳＭにおける野生型ＫＩＴおよびＫＩＴの突然変異体をターゲッティングする有望な新規薬剤であることを証明した。２種の薬剤は各々ＫＩＴの突然変異体に対して特有な効果をもつ独特な薬理学的プロフィールを呈し得ることから、非常に有効かつ有望な方法は、両薬剤を互いに、または臨床的に確立された薬剤２ＣｄＡと組み合わせて、将来的にＡＳＭまたはＭＣＬ患者を処置することであり得る。
【０１０３】
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【０１０４】
実施例２：ダサチニブとＰＫＣ４１２の組み合わせ
侵襲性ＳＭおよび肥満細胞性白血病（ＭＣＬ）を含む全身性肥満細胞症（ＳＭ）の全患者の大多数において、新生物細胞はＫＩＴのＤ８１６Ｖ突然変異体を示す。ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖは、構成的チロシンキナーゼ（ＴＫ）活性を呈し、悪性腫瘍増殖に関与している。従って、ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖターゲッティング薬剤を同定する幾つかの試みが行われてきた。我々は、ＴＫ阻害剤ダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）が、ドキシサイクリン誘導性ＫＩＴ発現を伴うＢａ／Ｆ３細胞において野生型（ｗｔ）ＫＩＴおよびＫＩＴ−Ｄ８１６ＶのＴＫ活性を打ち消すことを見出した。さらに、ダサチニブは、Ｂａ／Ｆ３細胞におけるＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ誘導クラスター形成および生存能並びにＨＭＣ−１.１細胞（ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ−陰性）およびＨＭＣ−１.２細胞（ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ−陽性）の増殖を阻害することが示されている。ダサチニブの効果は用量依存的であり、ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖを欠く細胞の場合と比べてＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖをもつ細胞での方がＩＣ５０値は１００〜１０００倍高い。ＨＭＣ−１.１細胞におけるダサチニブの阻害効果は、アポトーシスおよびＣＤ２−およびＣＤ６３−発現の減少に伴うことが見出された。さらに、ダサチニブは、増殖阻害を誘発する際、ＰＫＣ４１２、ＡＭＮ１０７、イマチニブおよび２ＣｄＡと協同することが見出された。ＨＭＣ−１.１細胞において、適用された全薬剤相互作用は相乗的であることが見出された。対照的に、ＨＭＣ−１.２細胞では、「ダサチニブ＋ＰＫＣ４１２」および「ダサチニブ＋２ＣｄＡ」の組み合わせのみが相乗効果をもたらす。すなわち、これらの薬剤組み合わせは、侵襲性ＳＭまたはＭＣＬの興味深い薬理学的治療法を提示し得る。
【０１０５】
緒論
受容体チロシンキナーゼ、例えば血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）または幹細胞因子受容体（ＳＣＦＲ、ＫＩＴ）は、制御不能に陥ることが多く、造血系新生物患者において構成的チロシンキナーゼ（ＴＫ）活性を示す１〜５。すなわち、これらの分子は、薬物療法にとって魅力のある標的を提示する。事実、過去数年間、幾つかの新生治療概念は、新生物骨髄細胞において決定的ＴＫをターゲッティングする新規薬剤に基づくものであった１〜５。
【０１０６】
全身性肥満細胞症（ＳＭ）は、一つまたはそれ以上の臓器における新生物肥満細胞（ＭＣ）の異常な増殖および蓄積を特徴とする骨髄新生物である。ＳＭの不活性および侵襲性変異型についても報告されている６〜９。侵襲性ＳＭ（ＡＳＭ）患者およびＳＭの白血病変異型、すなわち肥満細胞性白血病（ＭＣＬ）に罹患している患者では、慣用的薬剤に対する応答が乏しく、予後は深刻なものである６〜１２。従って、新生物ＭＣにおける新たな治療標的を同定し、それぞれの治療概念を発展させるために若干の試みが為されている９〜１２。
【０１０７】
ＡＳＭまたはＭＣＬ患者を含むＳＭに罹患したほとんどの患者では、ＫＩＴ突然変異Ｄ８１６Ｖが検出され得る１３〜１７。この突然変異は、ＫＩＴのリガンド非依存的リン酸化および細胞の自律的増殖と関連している１７，１８。この考えに基づき、ＫＩＴのＤ８１６Ｖ−突然変異体は、主たる治療標的として認識されている９〜１２，１９。すなわち、ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖのリン酸化および新生物ＭＣの増殖を妨げるＴＫ−阻害剤を同定すべく若干の努力が為されてきた９〜１２、１９〜２４。ＢＣＲ／ＡＢＬの強力な阻害剤である、イマチニブ（ＳＴＩ５７１）は、野生型（ｗｔ）ＫＩＴまたはＫＩＴの稀にしか見られないＦ５２２Ｃ−突然変異体を呈する新生物ＭＣの増殖を妨げることが最近報告された２０〜２３。さらに、この薬剤は、ＳＭが共存する場合もしない場合も含め、ＦＩＰ１Ｌ１／ＰＤＧＦＲＡ融合遺伝子をもつ慢性好酸球性白血病に罹患した患者において新生物細胞の増殖を遮断することが見出された２４〜２６。しかしながら、イマチニブは、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖをもつ新生物ＭＣの増殖を阻害し得なかった２０〜２２。さらに最近、我々および他の研究者は、ＰＫＣ４１２２７がＫＩＴ−Ｄ８１６ＶのＴＫ活性を妨げることによって、新生物ＭＣの増殖をダウンレギュレーションさせることを示した２８〜３０。また、新規ＴＫ阻害剤ＡＭＮ１０７３１は、相対的に高い薬剤濃度でＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖを呈する新生物細胞の増殖を妨げることも報告された。しかしながら、これらの化合物の大部分は、少なくとも単剤としては、ＡＳＭまたはＭＣＬ患者において永続的で完全な緩解をもたらし得ない。さらに、上述したところによると、これらの薬剤の幾つかは、ｗｔ ＫＩＴを呈するＭＣに対してのみ作用するが、ＫＩＴ−Ｄ８１６ＶをもつＭＣの増殖を阻害することはない。従って、新規ＫＩＴ−ターゲッティングＴＫ阻害剤についてさらに探求し、協同的薬剤効果を調べることは重要である。薬剤組み合わせに関して、我々は、ＰＫＣ４１２およびＡＭＮ１０７がＨＭＣ−１細胞において協同的増殖阻害効果を生じることを最近証明している３０。しかしながら、この薬剤組み合わせは、ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖを欠くＨＭＣ−１細胞では相乗的阻害効果を誘発するが、ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖを発現するＨＭＣ−１.２細胞の場合相乗効果は全く観察されなかった３０。他の薬剤組み合わせもまた、ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖを呈する肥満細胞においては相乗的阻害効果を発揮し得なかった３０。
【０１０８】
ダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）は、ｓｒｃキナーゼおよびＫＩＴを含む幾つかのＴＫ（阻害剤）の新規阻害剤である３３，３４。また、ダサチニブは、ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖのリン酸化および新生物ＭＣの増殖を阻害することも報告されている３４、３５。最新の研究で、我々は、ダサチニブが、生存およびクラスター形成およびＣＤ２およびＣＤ６３の発現を含む新生物細胞におけるＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ依存疾患関連機能の幾つかを遮断することを示している。さらに、我々のデータは、ダサチニブが、ＨＭＣ−１.２細胞において増殖阻害を誘発する際にＰＫＣ４１２および２ＣｄＡと相乗的に作用することを示している。我々の知る限り、これが、ＫＩＴ−Ｄ８１６ＶをもつＭＣに対して相乗的に作用することが報告されたＴＫ阻害剤の第一の組み合わせである。我々のデータはまた、ダサチニブが単独または他の薬剤と組み合わされた形でＡＳＭまたはＭＣＬ患者の有望な治療薬であり得ることを示唆している。
【０１０９】
材料および方法
試薬
ダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）３３は、Bristol-Myers Squibb（ニューブランスウィック、ニュージャージー）により、そしてイマチニブ（ＳＴＩ５７１）、ＡＭＮ１０７３１およびＰＫＣ４１２２７は、Novartis Pharma AG（バーゼル、スイス国）により提供された。ダサチニブ、ＡＭＮ１０７およびＰＫＣ４１２のストック溶液は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Merck、ダルムシュタット、ドイツ国）に溶解することにより製造された。組換えヒト（ｒｈ）幹細胞因子（ＳＣＦ）は、Strathmann Biotech（ハノーヴァー、ドイツ国）から、ＲＰＭＩ１６４０培地および胎児牛血清（ＦＣＳ）は、PAAラボラトリーズ（パッシング、オーストリア国）から、Ｌ−グルタミンおよびイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）は、Gibco Life Technologies（ガイザーズバーグ、メリーランド）から、３ＨチミジンはAmersham（バッキンガムシャー、イギリス国）から、２−クロロ−デオキシアデノシン（クラドリビン＝２ＣｄＡ）はSigma（セントルイス、ミズーリ）から、ｒｈインターロイキン−４（ＩＬ−４）は、Peprotech（ロッキーヒル、ニュージャージー）から購入した。ＰＥ−標識モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＲＰＡ−２.１０（ＣＤ２）、ＷＭ１５（ＣＤ１３）、ＹＢ５.Ｂ８（ＣＤ１１７）、およびＮ６Ｂ６.２（ＣＤ１６４）およびＭＯＰＣ−２１（ｍＩｇＧ１）およびＧ１５５−１７８（ｍＩｇＧ２ａ）は、Becton Dickinson（サンホセ、カリフォルニア）から、ＰＥ−コンジュゲートｍＡｂ ＣＬＢ−ｇｒａｎ１２（ＣＤ６３）は、Immunotech（マルセイユ、フランス国）から購入した。ＰＥ−標識ｍＡｂ ＶＩＭ５（ＣＤ８７）は、Dr. Otto Majdic（Institute of Immunology、Medical University of Vienna、オーストリア国）のご好意により提供された。
【０１１０】
ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを発現するかまたはこれを欠くＨＭＣ−１細胞
ＭＣＬ患者から生成されたヒト肥満細胞系ＨＭＣ−１３６は、Dr. J.H.Butterfield（Mayo Clinic、ロチェスター、ミネソタ）のご好意により提供された。ＨＭＣ−１の２種のサブクローン、すなわち、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖではなく、ＫＩＴ突然変異Ｖ５６０ＧをもつＨＭＣ−１.１２０、および第二のサブクローン、両ＫＩＴ突然変異、すなわち、Ｖ５６０ＧおよびＤ８１６ＶをもつＨＭＣ−１.２２０を使用した。ＨＭＣ−１細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で、１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、アルファ−チオグリセリン（Sigma）および抗生物質を補ったＩＭＤＭ中において増殖させた。細胞を４〜８週間ごとに最初のストックから再解凍し、毎週継代した。ｉ）異調染色性顆粒の存在、ii）ＫＩＴの発現、およびiii）ＫＩＴ−発現に対するＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ、４８時間）のダウン−モジュレーション効果について、ＨＭＣ−１細胞を周期的にチェックした３７。
【０１１１】
ｗｔ ＫＩＴまたはＫＩＴ Ｄ８１６Ｖの誘導性発現を伴うＢａ／Ｆ３細胞
ｗｔ ｃ−ＫＩＴ（Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔ）またはｃ−ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖのドキシサイクリン誘導性発現を伴うＢａ／Ｆ３細胞の生成については、以前に報告されている３９、４０。簡単に述べると、逆ｔｅｔ−トランス活性化因子３９、４０を発現するＢａ／Ｆ３細胞を、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ ｃＤＮＡ（またはｗｔ ＫＩＴ ｃＤＮＡ、両方ともDr. J.B.Longley（Columbia University、ニューヨーク、米国）のご好意により提供された）を含むｐＴＲＥ２ベクター（Clontech、パロアルト、カリフォルニア）およびｐＴＫ−Ｈｙｇ（Clontech）で電気穿孔によりコ−トランスフェクションした。安定してトランスフェクションされた細胞を、ハイグロマイシン中で増殖させることにより選択し、制限希釈によりクローン化した。この研究では、サブクローンＴｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７３８を全実験で使用した。ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖの発現は、ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）への暴露によりこれらの細胞において（１２時間以内に）誘導され得る３８。
【０１１２】
一次新生物細胞の単離
一次骨髄（ｂｍ）細胞を、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ陽性ＡＳＭおよび関連するＡＭＬの一患者およびｂｍが正常な一患者から得た。ｂｍ吸引試料を、保存料不含有のヘパリンを含む注射器に集めた。細胞を Ficoll上に重層することにより、単核細胞（ＭＮＣ）を単離した。細胞生存能力は両場合とも９０％より大であった。ＡＳＭ−ＡＭＬ患者の場合、単離ＭＮＣは、９０％を超える割合で芽細胞を含むことが見出された。両患者からは、ｂｍ穿刺または採血前に書面でインフォームド・コンセントを得た。この試験は、地元の治験審査委員会により是認され、ヘルシンキ宣言に従って実施された。
【０１１３】
ウエスタン・ブロッティングによるＫＩＴリン酸化の分析
ＨＭＣ−１細胞（１０６／ｍｌ）、およびｗｔ ＫＩＴ（Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔ）またはＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ（Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７）を含むＴｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７（１０６／ｍｌ）細胞を、ダサチニブ（１ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ）、ＰＫＣ４１２（１μＭ）、ＡＭＮ１０７（１μＭ）、イマチニブ（１μＭ）または対照培地と３７℃で４時間インキュベーションした。阻害剤への暴露前、Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔ細胞およびＴｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７細胞を、３７℃で２４時間、ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）とインキュベーションすることにより、ＫＩＴの発現を誘導した。Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔ細胞の場合、ｒｈＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加することにより、ＫＩＴリン酸化を誘導した。免疫沈降（ＩＰ）およびウエスタン・ブロッティングを記載された要領で実施する３０、４０。簡単に述べると、細胞を４℃で洗浄し、５０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％nonidet Ｐ４０（ＮＰ−４０）、０.２５％デオキシコール酸、０.１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのエチレン−ジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）、１ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリドおよび１ｍＭのＮａ３ＶＯ４を含むＲＩＰＡ緩衝液（１０８細胞につき緩衝液１ｍｌ）に再懸濁する。４℃で３０分間、プロテイナーゼ阻害剤カクテル（Roche）を補ったＲＩＰＡ緩衝液中でインキュベーション後、ライゼートを遠心分離にかけた。ＩＰについては、１０７細胞からのライゼートを、４℃で一晩、ＩＰ緩衝液（５０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７.４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＮａＦ、および１％ＮＰ４０）中において抗ＫＩＴ抗体１Ｃ１（ドイツ国チュービンゲン大学、Dr.H.-J.Buhringにより恵与された）４３およびプロテインＧ Sepharose ビーズ（Amersham）とインキュベーションした。次いで、ビーズをＩＰ緩衝液中で３回洗浄した。７.５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により還元的条件下でライゼートおよび免疫沈澱物を分離し、４℃で２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシンおよび２０％メタノールを含む緩衝液中のニトロセルロース膜（Protran、Schleicher & Schuell、キーン、ニューハンプシャー）へ移した。膜を５％遮断試薬（Roche）中で１時間遮断し、次いで、抗ＫＩＴ抗体１Ｃ１または抗ホスホ−タンパク質ｍＡｂ ４Ｇ１０（Upstate Biotechnology、レークプラシッド、ニューヨーク）と４℃で一晩インキュベーションした。抗体反応性を、ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体および Lumingen ＰＳ−３検出試薬（両方ともAmersham）により、 CL-Xposure フィルム（Pierce Biotechnology、ロックフォード、イリノイ）で視覚化した。
【０１１４】
Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７細胞の増殖および機能に対する薬剤効果の評価
Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７細胞を、３７℃で２４〜４８時間、ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）および様々な濃度のダサチニブまたはＡＭＮ１０７とインキュベーションした。細胞生存能力を、トリパンブルー排除試験により測定した。倒立顕微鏡によりクラスター形成を分析した。以前の研究は、Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７におけるＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖの発現が顕著なクラスター形成に伴うこと、およびイマチニブではなくＰＫＣ４１２が、Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７細胞においてクラスター形成をダウンレギュレーションすることを示している３８。本研究では、Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７細胞のクラスター形成に対するダサチニブ（１ｐＭ〜１μＭ）およびＡＭＮ１０７の効果を分析した。対照目的については、ＰＫＣ４１２およびイマチニブの効果も調べた。クラスター形成を光学顕微鏡により測定し（強拡大視野＝ＨＰＦごとのクラスターとして計数した）、対照（薬剤無しでドキシサイクリン単独＝１００％）のパーセントとして表した。実験は全てトリプリケイトで実施した。
【０１１５】
３Ｈ−チミジン取り込みの測定
増殖阻害薬剤効果を測定するため、ＨＭＣ−１細胞を、３７℃で４８時間、９６ウェル培養プレート（ＴＰＰ、トラザディンゲン、スイス国）において、様々な濃度のダサチニブ（１００ｆＭ〜１０μＭ）、ＰＫＣ４１２（１００ｐＭ〜１０μＭ）、ＡＭＮ１０７（１ｎＭ〜１００μＭ）、またはイマチニブ（３ｎＭ〜３００μＭ）とインキュベーションした。経時変化実験では、ＨＭＣ−１細胞を、１２、２４、３６または４８時間ダサチニブ（ＨＭＣ−１.１：１０ｎＭ；ＨＭＣ−１.２：１μＭ）に暴露した。選択実験では、ＨＭＣ−１細胞を、様々な濃度の２ＣｄＡ（０.００５〜１０μｇ／ｍｌ）とインキュベーションした。一次細胞（ＡＳＭ−ＡＭＬ患者からのｂｍ細胞；対照ｂｍ細胞）を、対照培地、ダサチニブ（１００ｐＭ〜１０μＭ）、ＰＫＣ４１２（１００ｐＭ〜１０μＭ）、ＡＭＮ１０７（１００ｐＭ〜１０μＭ）、またはイマチニブ（１００ｐＭ〜１０μＭ）中で４８時間培養した。インキュベーション後、１μＣｉの３Ｈ−チミジンを加えた（３７℃、１２時間）。次いで、細胞を、Filtermate １９６採取装置（Packard Bioscience）におけるフィルター膜（Packard Bioscience、メリデン、コネティカット）で採取した。フィルターを風乾し、結合した放射能をβ−カウンター（Top-Count NXT、Packard Bioscience）で計数した。細胞増殖に対する潜在的な付加的または相乗的薬剤効果を測定するため、ＨＭＣ−１細胞（両サブクローン）を、一定割合の薬剤濃度での薬剤（ダサチニブ、ＰＫＣ４１２、ＡＭＮ１０７、イマチニブ、２ＣｄＡ）の様々な組み合わせに暴露した。Calcusyn ソフトウェア（Calcusyn、Biosoft、ファーグソン、ミズーリ）を用いて組み合わせ指数（ＣＩ）値を計算することにより、薬剤相互作用（付加的、相乗的）を測定した４４。１のＣＩ値は付加的効果を示し、１未満のＣＩ値は薬剤効果の相乗作用を示している。実験は全てトリプリケイトで実施した。
【０１１６】
慣用的形態学および電子顕微鏡によるアポトーシスの評価
アポトーシスに対するＴＫ−阻害剤の効果を、形態学的試験、フローサイトメトリー、および電子顕微鏡により分析した。典型的実験では、ＨＭＣ−１細胞を、３７℃で２４時間、１０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ中の６ウェル培養プレート（ＴＰＰ）において様々な濃度のダサチニブ（１ｐＭ〜１μＭ）または対照培地とインキュベーションした。アポトーシス細胞のパーセンテージを、ライト・ギムザ−染色サイトスピン標本で定量した。アポトーシスは、慣用的細胞形態学的基準に従って定義された４５。ＨＭＣ−１細胞におけるアポトーシスを確認するため、２４時間、ダサチニブ（１ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ）、ＰＫＣ４１２（１μＭ）、または対照培地に暴露したＨＭＣ−１細胞（両サブクローン）を用いて、記載された要領４６、４７で電子顕微鏡検査を実施した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、１時間０.１ｍｏｌ／Ｌカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.４）で処理した２％パラホルムアルデヒド、２.５％グルタルアルデヒド、および０.０２５％のＣａＣｌ２に固定した。次いで、細胞を、洗浄し、２％寒天に懸濁し、遠心分離にかけた。ペレットを１.３％ＯｓＯ４（０.６６ｍｏｌ／Ｌコリジン中で緩衝剤処理）で二次固定し、２時間、２％酢酸ウラニルおよびマレイン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４.４）中で「一まとめにして」染色した。次いで、ペレットをすすぎ、アルコール系で脱水し、ＥＰＯＮ８１２に埋封した。極薄片を切断し、金グリッド上に置いた。断片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で対比染色し、JEOL 1200 EX II 透過型電子顕微鏡（JEOL、東京、日本）で観察した。
【０１１７】
Tunel検定法によるアポトーシスの評価
ダサチニブ（１ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ）またはＰＫＣ４１２（１００ｎＭ、１μＭ）に暴露後のＨＭＣ−１細胞におけるアポトーシスを確認するため、Tunel（in situ ターミナルトランスフェラーゼを用いたｄＵＴＰ蛍光ニックエンド−ラベリング）検定法を、製造者の使用説明書に従って“In Situ Cell Death Detection Kit Fluorescein”（Roche Diagnostics、マンハイム、ドイツ国）を用いて実施した。簡単に述べると、細胞を、サイトスピン上に置き、ＲＴで６０分間、ｐＨ７.４、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドに固定し、洗浄し、次いで０.１％の TritonX-100 および０.１％クエン酸ナトリウム中で透過性にした。その後、細胞を洗浄し、３７℃で６０分間、ＣｏＣｌ２、末端デオキシ−ヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼ、およびフルオレセイン標識ｄＵＴＰを含むターミナルトランスフェラーゼ反応溶液中でインキュベーションした。次いで、細胞を洗浄し、Nikon Eclipse E 800 蛍光顕微鏡（東京、日本）で分析した。
【０１１８】
ＨＭＣ−１細胞における活性化による表面抗原の発現の評価
ＨＭＣ−１細胞（両サブクローン）における細胞表面抗原の発現を、対照培地またはＴＫ阻害剤（ダサチニブ、１ｐＭ〜５μＭ；ＰＫＣ４１２、１μＭ）含有培地中において２４時間３７℃で培養後、フローサイトメトリーにより測定した。薬剤とのインキュベーション後、細胞を洗浄し、新生物ＭＣで異常（選択的）発現されることが知られている決定基を含む幾つかのＭＣ分化抗原に対するＰＥ−コンジュゲート抗体を用いる単色フローサイトメトリーにかけた４８〜５１。分析したマーカーは、ＣＤ２、ＣＤ１３、ＣＤ６３、ＣＤ８７、ＣＤ１１７およびＣＤ１６４であった。記載された要領３０、３７、５１で FACScan（Becton Dickinson）においてフローサイトメトリーを実施した。
【０１１９】
統計分析
阻害剤へのＨＭＣ−１細胞暴露後の増殖速度、アポトーシス、および表面発現レベル間の差異における有意性を測定するため、従属サンプルについてのスチューデントのｔ検定を適用した。ｐが０.０５より小であるとき、結果は統計的に有意であるとみなされた。
【０１２０】
結果
ＫＩＴ−Ｄ８１６ＶのＴＫ活性に対するダサチニブの効果
ＩＰおよびウエスタン・ブロッティングで評価したところ、ダサチニブ（１ｎＭ〜１μＭ）は、ＨＭＣ−１.１細胞（ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖではなく、ＫＩＴ−Ｖ５６０Ｇを発現する）においてＫＩＴのリン酸化を減少させた（図１１Ａ）。両突然変異（ＫＩＴ−Ｖ５６０ＧおよびＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ）を含むＨＭＣ−１.２細胞において、ダサチニブは、１μＭでＫＩＴのリン酸化を減少させたが、それより低濃度ではＫＩＴのリン酸化を妨げなかった（図１１Ｂ）。次に、我々は、ドキシサイクリンへの暴露後にＢａ／Ｆ３のｗｔ ＫＩＴを発現する（Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔ）細胞またはＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを発現する（Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７）細胞に対するダサチニブの効果を調べた。Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔ細胞において、ＫＩＴは、ＳＣＦの存在下でリン酸化されると思われ、Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７細胞において、ＫＩＴは構成的にリン酸化されることが見出された。図１１Ｃから明らかなように、ダサチニブ（１０ｎＭ〜１μＭ）は、Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔ細胞においてＫＩＴのＳＣＦ−誘導リン酸化を減少させた。対照的に、Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７細胞（ドキシサイクリンへの暴露後にＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖを発現する）では、ダサチニブは、０.１および１μＭでＫＩＴのリン酸化を減少させたが、それより低濃度ではＫＩＴ−リン酸化を減少させ得なかった（図１１Ｄ）。
【０１２１】
ＨＭＣ−１細胞における３Ｈ−チミジン取り込みに対するＴＫ−阻害剤の効果
経時変化実験において、ＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞の増殖に対するダサチニブの最大阻害効果は、３６〜４８時間後に観察される。図１２Ａは、これらの細胞の増殖に対するダサチニブ（ＨＭＣ−１.１細胞については１０ｎＭ；ＨＭＣ−１.２細胞については１μＭ）の時間依存的効果を示す。図１２Ｂで示されているところによると、ダサチニブは、用量依存的にＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞における３Ｈ−チミジン取り込みを妨げることが見出された。興味深いことに、ＨＭＣ−１.２細胞におけるダサチニブの効果についてのＩＣ５０（２００〜５００ｎＭ）は、ＨＭＣ−１.１細胞について得られたＩＣ５０値（１ｎＭ）と比べてかなり高かった（図１２Ｂ；図１７）。それにもかかわらず、ダサチニブは、イマチニブ（並行して試験した）よりも、モルに基づいた場合非常に有効にＨＭＣ−１.２細胞の増殖を阻害することが見出された。表２は、ＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞で適用されたＴＫ阻害剤の効果について得られたＩＣ５０値の要約を示す。イマチニブ、ＡＭＮ１０７およびＰＫＣ４１２の効果に関して、これらのデータは以前の結果を確認するものであった３０。
【表２】
2009501767.tif 000005
【０１２２】
ｗｔ ＫＩＴまたはＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを発現する（Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７）Ｂａ／Ｆ３細胞の増殖に対するＴＫ−阻害剤の効果
ダサチニブは、用量依存的にドキシサイクリン暴露（ＫＩＴ−発現性）Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔ細胞のＳＣＦ−依存的増殖を妨げることが見出された（ＩＣ５０：１ｎＭ〜１０ｎＭ）（図１２Ｃ）。Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７細胞においても、ダサチニブは、増殖および細胞生存能力を阻害することが見出された（図１２Ｄ）。ダサチニブは、ドキシサイクリンの非存在下、すなわちＫＩＴの非存在下においてＴｏｎ.Ｋｉｔ.ｗｔ細胞の増殖を妨げなかった（図１２Ｃ）。同様に、ダサチニブは、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ（−ドキシサイクリン）の非存在下ではＴｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７細胞において大きな増殖阻害効果をもたらすことはなかった（図１２Ｄ）。さらに、別の対照実験において、ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）は、非トランスフェクションＢａ／Ｆ３細胞に対して増殖阻害効果を示さなかった（示さず）。
【０１２３】
Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７細胞におけるＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ−依存的クラスター形成に対するダサチニブおよびＡＭＮ１０７の効果
以前に、我々は、ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖが、Ｂａ／Ｆ３細胞において肥満細胞分化およびクラスター形成を誘導することを証明しており、肥満細胞のクラスター形成がＳＭにおける一次所見および主たる疾病判定基準であることから、これは特に興味深いことである３８。また、ＰＫＣ４１２が、Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.Ｄ８１６Ｖ.２７細胞においてドキシサイクリン／ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ−誘導クラスター形成をダウンレギュレーションすることも報告されている３８。本研究では、我々は、ダサチニブ（１００ｎＭ〜１μＭ）および程度は劣るがＡＭＮ１０７（２００ｎＭ〜１μＭ）が、Ｂａ／Ｆ３細胞においてＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ−依存的クラスター形成を用量依存的に妨げることを見出した（図１２Ｅおよび１２Ｆ）。
【０１２４】
ダサチニブは、ＡＭＬを伴うＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ−陽性ＳＭの患者において一次新生物細胞の増殖を阻害する
ＳＭにおけるダサチニブの抗増殖薬剤効果を確認するため、我々は、ＡＭＬに伴うＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ−陽性ＡＳＭの患者における一次新生物細胞を調べた。この患者において、ダサチニブ（ＩＣ５０：０.３〜１.０ｎＭ）およびＰＫＣ４１２（ＩＣ５０：１０〜３０ｎＭ）は、用量依存的に白血病細胞の自然発生的増殖（３Ｈ−チミジンの取り込み）を阻害することが見出された。ＡＭＮ１０７もまた増殖阻害効果を示したが（１００〜３００ｎＭ）、イマチニブ（ＩＣ５０＞１.０μＭ）がこの患者において新生物細胞の増殖を阻害することはなかった（図１３）。対照試料、すなわち正常ｂｍ細胞では、ダサチニブも他の試験阻害剤も、３Ｈ−チミジン取り込みに対する効果を示さなかった（図示せず）。
【０１２５】
ダサチニブは、ＨＭＣ−１細胞においてアポトーシスを誘導する
ダサチニブの増殖阻害効果の根元にある機構を調べるため、我々は、薬剤暴露後のＨＭＣ−１細胞におけるアポトーシスの形態学的および生化学的兆候を分析した。光学顕微鏡で評価したところ、ダサチニブは、両ＨＭＣ−１サブクローンにおいてアポトーシスを誘導する（すなわち、アポトーシス細胞の数を増加させる）ことが見出された（図１４Ａおよび１４Ｂ）。ＰＫＣ４１２は対照として適用され、これもまた、両ＨＭＣ−１サブクローンにおいてアポトーシスを誘導することが見出されたが、イマチニブは、ＨＭＣ−１.１細胞でアポトーシスを誘発することが見出されたが、ＨＭＣ−１.２細胞に対しては全く効果を示さなかった（図示せず）。ＨＭＣ−１細胞に対するダサチニブのアポトーシス誘導効果を電子顕微鏡により確認した。事実、ダサチニブは、１μＭでＨＭＣ−１.１細胞およびＨＭＣ−１.２細胞の両方においてアポトーシスを誘導した（図１４Ｃ）。最後に、我々は、Tunel検定法でＨＭＣ−１細胞におけるダサチニブのアポトーシス誘導効果を立証し得た（図１４Ｄおよび１４Ｅ）。この検定法で、ダサチニブは、１〜１０００ｎＭ間でＨＭＣ−１.１細胞においてアポトーシスを誘導し、１００〜１０００ｎＭ間でＨＭＣ−１.２細胞においてアポトーシスを誘導することが見出された。ＰＫＣ４１２（１μＭ）も対照として並行試験にかけたところ、これもまた両細胞株においてアポトーシスを誘導した（図１４Ｄおよび１４Ｅ）。対照的に、イマチニブ（１μＭ）は、ＨＭＣ−１.１細胞でのみアポトーシスを誘導したが、ＨＭＣ−１.２細胞に対しては全く効果を示さず（図示せず）、以前のデータが確認された３０。
【０１２６】
ダサチニブは、ＨＭＣ−１細胞における活性化による細胞表面抗原の発現をダウンレギュレーションする
幾つかの細胞表面抗原、例えばＣＤ２またはＣＤ６３は、典型的にはＳＭにおける新生物ＭＣで（過剰）発現される４８〜５０。興味深いことに、これらの分子の中には、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ−依存的に新生物ＭＣで発現され得るか３８、または／およびヒト肥満細胞発生の初期段階で発現されるものもある５１。従って、我々は、ダサチニブが、ＨＭＣ−１細胞におけるこれらの表面抗原の発現に影響を及ぼすか否かを調べることにした。非刺激ＨＭＣ−１.１細胞は、ＣＤ１３、ＣＤ６３、ＣＤ８７、ＣＤ１１７およびＣＤ１６４を発現することが見出され、ＨＭＣ−１.２細胞は、ＣＤ２、ＣＤ１３、ＣＤ６３、ＣＤ８７、ＣＤ１１７およびＣＤ１６４を発現することから、以前のデータが確認された３０、３８、５０。ダサチニブとＨＭＣ−１.１細胞のインキュベーションにより、ＣＤ１３、ＣＤ６３、ＣＤ８７、およびＣＤ１１７の発現の著しい減少がもたらされた（ｐ＜０.０５）（図１５Ｃ）。ＨＭＣ−１.２細胞では、ダサチニブは、ＣＤ２、ＣＤ６３およびＣＤ８７の発現を著しく減少させたが（ｐ＜０.０５）、ＣＤ１３、ＣＤ１１７、またはＣＤ１６４の発現の著しい減少をもたらすことはなかった（図１５Ｄ）。フローサイトメトリー実験におけるダサチニブのダウンレギュレーション効果は、図１５Ｅ（ＨＭＣ−１.１）および図１５Ｄ（ＨＭＣ−１.２）でＣＤ６３に関して例証されている。
【０１２７】
ダサチニブは、ＨＭＣ−１細胞において増殖阻害を誘発する際に他のＴＫ阻害剤および２ＣｄＡと協同する
３Ｈ−チミジン取り込みにより評価したところ、ダサチニブは、ＨＭＣ−１細胞での増殖阻害の誘発においてＰＫＣ４１２、ＡＭＮ１０７、イマチニブおよび２ＣｄＡと協同することが見出された（表３、図１６）。ＨＭＣ−１.１細胞の場合、試験された薬剤相互作用は全て本質的に相乗的であることが見出された（図１６Ａおよび１６Ｂ）。対照的に、ＨＭＣ−１.２細胞では、「ダサチニブおよびＰＫＣ４１２」および「ダサチニブおよび２ＣｄＡ」の組み合わせのみが、明白な相乗作用を生じ（図１６Ｃおよび１６Ｄ）、他の薬剤組み合わせは、細胞増殖に対して相乗的ではなく付加的増殖阻害効果を示した（表３）。表３に示されているところでは、ＨＭＣ−１.２細胞（上方パネル、灰色）およびＨＭＣ−１.１細胞（下方パネル、濃灰色）の増殖に対する協同的薬剤効果を、３Ｈ−チミジン取り込みを測定することにより測定した。協同的薬剤効果をcalcusynソフトウェアにより計算した。
【表３】
2009501767.tif 000006
薬剤相互作用：＋、相乗的効果；±、付加的効果；−、拮抗的効果。
【０１２８】
検討
ＳＭ患者の場合、ＭＣの因子非依存的自律的増殖および蓄積は、疾病変異型全てに共通した独特の特徴である。体細胞ＴＫ突然変異Ｄ８１６Ｖは、ＫＩＴの構成的活性化および細胞の自律的増殖に関与すると考えられるＳＭ関連欠損である１３〜１７。従って、最近では、ＫＩＴ−Ｄ８１６ＶのＴＫ活性、すなわち新生物細胞の増殖／蓄積を阻害する薬理学的化合物を同定する試みが為されている９〜１２。我々は、新規ＴＫ阻害剤ダサチニブが、ＫＩＴ−Ｄ８１６ＶのＴＫ活性および新生物細胞における幾つかのＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ依存的疾患関連機能を遮断することを報告した。さらに、我々は、ダサチニブが、新生物ＭＣにおいて増殖阻害を誘発する際にＰＫＣ４１２および他の標的および慣用的薬剤と相乗作用することを証明している。
【０１２９】
ＢＭＳ−３５４８２５としても知られているダサチニブは、ＢＣＲ／ＡＢＬおよびＫＩＴを含む幾つかのＴＫに対して優れた効果を発揮する新規ＴＫ阻害剤であり、幾つかのｓｒｃキナーゼに対して重大な活性を示す３３〜３５。その「ＴＫ−ターゲッティング」活性に基づき、ダサチニブは、最近では様々な骨髄新生物における新生物細胞の増殖を阻害し得る抗新生物薬として考えられている３３〜３５。本研究で、我々は、ダサチニブが、ＳＭ関連腫瘍タンパク質ＫＩＴ−Ｄ８１６ＶのＴＫ活性を打ち消し、このＫＩＴ突然変異をもつヒトＭＣのインビトロ増殖を阻害することを見出しており、これは以前の発表を確認するものである３４、３５。さらに、我々は、ダサチニブが、Ｂａ／Ｆ３細胞におけるＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ−依存的クラスター形成およびＨＭＣ−１.２細胞におけるＣＤ２およびＣＤ６３の発現を妨げることを見出した。すなわち、ダサチニブは、新生物ＭＣにおける幾つかの疾患（ＳＭ）関連およびＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ−依存的機能を遮断する。増殖阻害に関して、ｗｔ ＫＩＴまたはＫＩＴ Ｇ５６０Ｖに対するダサチニブの効果が、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖで見られる効果と比べてかなり優れていることは、興味深い観察結果であった。最近では、類似した観察結果がＡＭＮ１０７およびイマチニブについても報告されている３０。しかしながら、ＫＩＴ突然変異Ｄ８１６Ｖはイマチニブに対してほぼ完全な耐性を付与し、他の２種のＴＫ阻害剤、すなわちＡＭＮ１０７およびダサチニブは、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖに対して相当な活性を保持しており、モルに基づいてＡＭＮ１０７と比べた場合、ダサチニブについて得られたＩＣ５０値の方が低いが、このことは、種々の薬剤標的相互作用またはダサチニブがＫＩＴのＴＫ活性だけでなく、可能性のある他の幾つかの標的、例えばｓｒｃキナーゼも打ち消すという事実により説明され得る。ＨＭＣ−１.２細胞に対するダサチニブの増殖阻害効果が薬理学的濃度で生じるということは、興味深い観察結果であり、以前の発表を確認するものであった３４、３５。
【０１３０】
ほとんどの場合、ＴＫ阻害剤は、後続のアポトーシスを伴うＴＫ依存的細胞増殖を遮断することにより増殖阻害剤として作用する３０、３５。同様に、ダサチニブの場合、我々は、ＨＭＣ−１細胞の増殖阻害が、ＴＫ活性の喪失に関連し、アポトーシスの兆候を伴うことを証明し得た。ダサチニブのアポトーシス誘導効果は、光学および電子顕微鏡により、およびTunel検定法で証明され得た。予想通り、ダサチニブは、ＨＭＣ−１.２細胞よりもＨＭＣ−１.１細胞に対して強力なアポトーシス誘導効果を示しており、このことは、最近発表された結果と一致している３５。
【０１３１】
ＳＭにおける重大な特徴および主たるＷＨＯ判定基準は、内臓におけるＭＣのクラスター形成である４１、４２。最近、我々は、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖが、Ｂａ／Ｆ３細胞において肥満細胞分化およびクラスター形成を誘導することを立証した３８。すなわち、ＭＣクラスター形成は、ＳＭの病因における最初の極めて重要な段階であり得る。本研究で、我々は、ダサチニブおよびＡＭＮ１０７が、Ｂａ／Ｆ３細胞においてＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ誘導クラスター形成を阻害することを立証し得た。この観察結果は、これらの薬剤の特異的作用および有効性についてのさらなる証拠を提供している。
【０１３２】
幾つかの細胞表面膜抗原は、典型的には新生物ＭＣで（過剰）発現される４８〜５０。同様に、正常ＭＣとは対照的に、ＳＭにおける新生物ＭＣは、ＣＤ２およびＣＤ２５を発現する４８〜５０。さらに、幾つかの細胞表面分子、例えばＣＤ６３は、正常ＭＣと比べた場合新生物ＭＣの方で過剰発現される４９。（ＣＤ６３のように）場合によっては、ＣＤ分子の発現は、ＫＩＴ−Ｄ８１６Ｖ依存的なものであり得る３８。従って、我々は、ダサチニブによるＫＩＴ Ｄ８１６Ｖのターゲッティングが、これらのＣＤ抗原の発現の減少に伴うか否かを調べることにした。我々の研究結果は、ダサチニブが、（ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを呈する）ＨＭＣ−１.２細胞においてＣＤ２、ＣＤ６３およびＣＤ８７の発現をダウンレギュレーションし、ＣＤ１３、ＣＤ１１７＝ＫＩＴ、またはＣＤ１６４の発現の有意な阻害は見出されなかったことを示している。反対に、ＨＭＣ−１.１細胞の場合、ダサチニブは、ＣＤ１３およびＫＩＴの発現をダウンレギュレーションすることが見出された。この矛盾に関する一つの説明は、ダサチニブに対する２種のＨＭＣ−１サブクローンの感受性（ＩＣ５０）の違いである。別の可能性は、ＨＭＣ−１.２細胞では、ＣＤ１３およびＫＩＴが、薬剤誘導モジュレーションに対して一般に感受性を示さないことである。この仮説は、ＰＫＣ４１２に関するＩＣ５０値は２種のＨＭＣ−１サブクローンにおいて同一であるが、ＣＤ１３およびＫＩＴが同化合物とのインキュベーション後も同レベルで発現されたという観察結果により裏付けられる。
【０１３３】
多くの最近のデータは、ＴＫ阻害剤による骨髄新生物の単剤処置では、長期間にわたって病気を制御するのに不十分であり得ることを示唆している。これは、イマチニブおよび進行性ＣＭＬについて詳細に記録されており５１、５２、ＡＳＭまたはＭＣＬ患者にも当てはまり得る２９。すなわち、これらの患者の多くからは薬剤耐性が見出される。耐性を克服するために、若干の薬理学的戦略が構想され得る。妥当な一方法は、薬剤の組み合わせを適用することであり得る。
【０１３４】
以前の研究で、我々は、ＰＫＣ４１２、ＡＭＮ１０７、および２ＣｄＡが、ＨＭＣ−１細胞において強力な協同的薬剤効果を呈すること見出した３０。しかしながら、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを欠くＨＭＣ−１.１細胞ではほとんどの薬剤組み合わせにより相乗効果が見られるが、ＫＩＴ Ｄ８１６ＶをもつＨＭＣ−１.２細胞の場合、（付加的なものに過ぎず）相乗的薬剤相互作用は全く見られなかった。従って、我々は、単剤としてＫＩＴ Ｄ８１６Ｖをもつ肥満細胞において強力な効果を呈するダサチニブが、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖの他の強力な阻害剤と組み合わせたとき、これらの細胞に対して相乗効果をもたらすか否かを知ることに非常に関心があった。実際、我々の結果は、ダサチニブおよびＰＫＣ４１２並びにダサチニブおよび２ＣｄＡ、すなわちＡＳＭおよびＭＣＬの処置に使用される薬剤５４が、ＨＭＣ−１.２細胞の増殖を相乗的に阻害することを示している。我々の知る限り、これは、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖをもつ新生物ＭＣの増殖に対して相乗効果を生じさせるＴＫ阻害剤の第一の組み合わせである。
【０１３５】
要約すると、我々は、ダサチニブおよびＰＫＣ４１２が、ＡＳＭおよびＭＣＬの処置にとって最も有望な標的薬剤であることを証明した。我々のデータに基づくと、ＡＳＭまたはＭＣＬの患者における治療を改良するためにこれらの薬剤の組み合わせまたはこれらの薬剤および２ＣｄＡ間の組み合わせの適用を考えることは妥当であると思われる。
【０１３６】
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【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】図１Ａ−Ｄは、新生物細胞におけるＫＩＴリン酸化に対するＴＫ阻害の効果を示す。
【図２】図２Ａ−Ｄは、ＨＭＣ−１細胞の増殖に対するＰＫＣ４１２、ＡＭＮ１０７およびイマチニブの効果を示すグラフである。
【図３】図３Ａ−Ｂは、Ｔｏｎ.Ｋｉｔ.細胞における３Ｈ−チミジン取り込みに対するＰＫＣ４１２、ＡＭＮ１０７およびイマチニブの効果を示すグラフである。
【図４】図４は、Ｄ８１６Ｖを呈する一次新生物（肥満）細胞の増殖のＰＫＣ４１２ダウンレギュレーションを示すグラフである。
【図５】図５Ａ−Ｆは、ＨＭＣ−１細胞のアポトーシスに対するＴＫ阻害剤の効果を表すグラフである。
【図６】図６Ａ−Ｄは、ＨＭＣ−１細胞におけるＰＫＣ４１２−誘導アポトーシスの電子顕微鏡検査の結果を示す。
【図７】図７は、３７℃で２４時間、対照培地（対照）、ＰＫＣ４１２（１μＭ）、ＡＭＮ１０７（１μＭ）またはイマチニブ（１μＭ）に暴露されたＨＭＣ−１.２細胞を示す。
【図８】図８Ａ−Ｈは、Tunel検定法により評価されたＨＭＣ−１細胞におけるアポトーシスを示す。
【図９】図９Ａ−Ｂは、ＨＭＣ−１.２細胞における細胞表面抗原の発現に対するＴＫ阻害剤の効果を表すグラフである。
【図１０】図１０Ａ−Ｊは、ＨＭＣ−１細胞の増殖に対する相乗的薬剤効果を表すグラフである。
【図１１】図１１Ａ−Ｄは、新生物細胞におけるＫＩＴリン酸化に対するダサチニブの効果を表す。
【図１２】図１２Ａ−Ｆは、ＨＭＣ−１細胞の増殖およびＢａＦ／３細胞の増殖およびクラスター形成に対するダサチニブの効果を表す図である。
【図１３】図１３は、白血病を伴うＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ−陽性ＳＭを呈する患者においてダサチニブが一次新生物細胞の増殖をダウンレギュレーションすることを示している。
【図１４】図１４Ａ〜Ｃは、ダサチニブがＨＭＣ−１細胞においてアポトーシスを誘導することを示している。
【図１５】図１５Ａ〜Ｆは、ＨＭＣ−１細胞における細胞表面抗原の発現に対するダサチニブの効果を表す。
【図１６】図１６Ａ〜Ｄは、ＨＭＣ−１細胞の増殖に対する相乗的薬剤効果を表す。
【図１７】図１７は、３７℃で４８時間、培養培地または示されている様々な濃度のダサチニブとインキュベーションしたＨＭＣ−１.２細胞を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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