(57)【要約】個体から得た試料中で、遺伝子の2つの離れた領域が近接している染色体構造の有無を判定し、それによって、該個体が異常な遺伝子発現を有するかどうかを検出または診断する段階を含む、個体における異常な遺伝子発現の検出法または診断法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体から得た試料中で、遺伝子の2つの離れた領域が近接している染色体構造の有無を判定し、それによって、該個体が異常な遺伝子発現を有するかどうかを検出または診断する段階を含む、個体における異常な遺伝子発現を検出または診断する方法。
【請求項２】
-遺伝子疾患を診断するため、または
-癌を診断するため、または
-癌の特定の病期を確認するため、または
-癌の進行リスクを決定するため、または
-癌進行の様式または速度を決定するため
に実施される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
遺伝子の2つの離れた領域が近接している染色体構造を、遺伝子の正常な発現時に該染色体構造が生じる位置とは異なる位置で、遺伝子が含むかどうかを判定する段階を含む方法であって、該染色体構造が任意でループ状のまたは位相的に閉じた構造である、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
遺伝子中のCCマーカーとの結合により遺伝子中の配列が近接しているかどうかを判定することによって染色体構造を検出する段階を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
ループ状の立体構造が、
-近接しているDNAを架橋させること、続いて
-任意で配列に基づく検出方法により、架橋したDNAを検出すること
により検出される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
DNAの架橋の後に、
-架橋したDNAを制限酵素消化に供し、
-消化された構造をライゲーションに供し、かつ
-ライゲーションされた構造を分析/検出する、
請求項5記載の方法。
【請求項７】
ライゲーションされた構造の分析が、遺伝子中には存在しないがライゲーションされた構造中に存在するDNA配列の検出を含む、請求項6記載の方法。
【請求項８】
ライゲーションされた構造中に存在するDNA配列が、配列決定またはPCRによって検出される、請求項7記載の方法。
【請求項９】
ライゲーションされた配列を鋳型として用いてプライマーがPCR生成物の形成に成功するが、同じPCR条件下で遺伝子の配列は増幅しないPCR反応を用いて、ライゲーションされた配列の存在が検出される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
個体の2、3、4種類またはより多くの遺伝子の染色体構造を、前記請求項のいずれか一項に定義された方法により解析する段階を含む、個体のフィンガープリンティングを行う方法。
【請求項１１】
癌に関連する2種類以上の遺伝子が、癌の種類の診断を可能にするために解析され、かつ/または、解析される遺伝子の少なくとも1種類が、異常な発現が起こっている組織の同定を可能にする組織特異的な遺伝子である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
ライゲーションされた構造中に存在するDNA配列を検出することができる1種または複数種のポリヌクレオチドと、任意でDNAを架橋することができる薬剤とを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法を実施するためのキット。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドが、DNA配列を検出することができるプローブまたはプライマー対を含む、請求項12記載のキット。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドが、ライゲーションされた構造中に存在するDNAに結合できる遺伝子の断片または該断片の相同体に相当する、請求項12または13記載のキット。
【請求項１５】
候補物質が、異常な発現の際の異常な構造から正常な構造へと遺伝子の染色体構造を変化させることができるかどうかを判定し、それによって、候補物質が異常な発現を治療できるかどうかを判定する段階を含む、遺伝子の異常な発現を治療するための化合物を同定する方法。
【請求項１６】
候補物質が、一つの発現様式の際の構造から別の発現様式における構造へと遺伝子の染色体構造を変化させることができるかどうかを判定し、それによって、候補物質が遺伝子の発現様式を変化させることが可能かどうかを判定する段階を含む、遺伝子の発現様式を変化させるための化合物を同定する方法。
【請求項１７】
（iii）遺伝子へとCCマーカーを導入する段階、および/または
（iv）任意で1、2、3、またはそれ以上の変異をCCマーカーに導入することにより遺伝子からCCマーカーを除去する段階であって、各変異が核酸塩基の付加、置換、もしくは欠失である、段階
を含む、遺伝子の発現プロファイルを変化させる方法であって、遺伝子のコード配列の少なくとも50%は変化しないままである、方法。
【請求項１８】
遺伝子を複製および/または発現させる段階を更に含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
発現プロファイルがCCマーカー配列の導入および/または除去により変化している遺伝子をゲノム中に少なくとも1つ含む、非ヒト改変真核生物であって、該遺伝子のコード配列の少なくとも50%は変化しないままである、非ヒト改変真核生物。
【請求項２０】
請求項19記載の生物の細胞または器官。
【請求項２１】
生物の細胞中の遺伝子においてCCマーカーを導入または除去する段階、および、多細胞生物の場合には、細胞を成長させて生物とする段階を含む、請求項19記載の改変生物の作製法。
【請求項２２】
遺伝子の発現を変化させるためのCCマーカーを含むポリヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は診断および遺伝子発現に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
既存の疾患診断法は、疾患の確実な診断のため、または疾患の病期を確認するための適切なマーカーを利用できないので、満足のいくものではないことが多い。現行の手法は、タンパク質、mRNA、または抗体の検出の利用を含む。
【発明の開示】
【０００３】
発明の概要
タンパク質、mRNA、または抗体の検出は、これらの分子の検出が疾患と関連する遺伝子の発現に正確に相当するものではないため、多くの診断症例において不適切である。個々の細胞間におけるこれらの分子の発現レベルの確率的変動はかなり高く、更に、半減期は顕著に変動し、非常に短い可能性もあり、例えばc-myc癌原遺伝子ポリペプチドでは約15分間である。さらに、これらの分子の検出は、転写と翻訳という遺伝子発現の順番に、その後の段階を追跡することしかできない。
【０００４】
転写と発現のラウンドが再開される可能性に関する遺伝子の後生的な立体構造の機構は、遺伝子発現のずっと早い時期の診断を可能にし得る。このような立体構造はまた、安定、すなわち半減期が長いようであり、このことは検出をより容易にする。
【０００５】
本発明者らは、ゲノムDNAにおける染色体立体構造の分析が疾患の診断に利用され得ることを見出した。該立体構造は、遺伝子内の遠位部位または非隣接部位の結合または並列により形成される。該部位はCCマーカーである場合もある（下に詳細を述べる）。異なる遺伝子の染色体立体構造の変化は、該遺伝子の発現に変化をもたらすことが分かっており、したがって、特定の立体構造の検出は、遺伝子の異常な発現の検出に利用され得る。
【０００６】
従って、本発明は、個体から得られた試料において、遺伝子の2つの離れた領域が近接している染色体構造の有無を判定し、それによって、該個体が異常な遺伝子発現を有するかどうかを検出または診断する段階を含む、個体における異常な遺伝子発現の検出法または診断法を提供する。
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明により、遺伝子が適合化された三次元の高次の構造の決定に基づいて、および特に、遺伝子内の会合/並列部位の位置/パターンに基づいて、遺伝子の異常発現を検出するための方法が提供される。本方法は、遺伝子内の1つまたは複数の位置における、並列部位の有無、または、そのような並列に起因する染色体立体構造を検出し得る。正常な形態の遺伝子発現とは、通常、生成物（RNAまたはポリペプチド）がその細胞性の/生理学的な機能を実施することを可能にする形態および/または量の、該生成物の発現として定義される。
【０００８】
異常発現とは、（典型的には転写終結位置の変化のために）別の生成物が機能し、かつ/または、変更されたレベルの（またはさらにはゼロの）生成物の量が発現される発現様式として、定義され得る。異常発現は、生物中の疾患状態（本明細書で言及する任意の疾患など）につながる可能性があり、かつ典型的には、異常発現の起こった細胞または組織または器官の生存度および/または機能の減衰につながると考えられる。典型的には、異常発現は、正常な生成物と比べて長いもしくは短いRNAもしくはタンパク質の発現、および/または、正常レベルの発現と比べて高いもしくは低いレベルのRNAもしくはタンパク質の発現を特徴とする。
【０００９】
好ましい態様において、正常発現から異常発現への変化は、CCマーカーによって規定される染色体構造における変化によって起こる。CCマーカーの構造的並列は、通常は転写単位の境界を規定するが、概して異常発現は、正常発現において認められる境界に対して異常な（異なる）境界を課す。
【００１０】
本発明は、個体における疾患状態の診断または疾患の病期の診断を提供する。典型的には疾患とは、1つまたは複数の遺伝子の異常発現が起こっている疾患である。そのような異常発現は、該疾患を引き起こすか該疾患に寄与する可能性がある。遺伝子は、機能的ポリペプチドまたは翻訳されないRNAを発現する遺伝子であり得る（非コードRNA遺伝子および偽遺伝子など）。遺伝子は、調節的役割を有するRNAを発現し得る。
【００１１】
遺伝子とは好ましくは、癌原遺伝子（c-mycなど）または腫瘍抑制遺伝子（BRCA1など）である。遺伝子は、表2に列挙された遺伝子のいずれであってもよい。遺伝子は、hDHFR、hCALCRL、MLH1、PSA、またはBORISであり得る（例えば、GenBankアクセッション番号NM000791、NM005795、NM000249、NM001030047、またはNM080618に開示）。遺伝子は典型的に、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上のCCマーカー配列を有する。遺伝子は、プロモーター近位のイントロン中に、典型的には第1イントロン中に、CCマーカーを含み得る。
【００１２】
疾患とは、腎癌、卵巣癌、膀胱癌、大腸癌、または前立腺癌などの癌であり得る。疾患は、典型的には改変されたRNAもしくはポリペプチド生成物（上記で定義したとおり）の発現に起因し、かつ/または、RNAもしくはポリペプチド生成物の異なる発現レベル（そのような生成物の発現の不在など）に起因する、遺伝病であり得る。
【００１３】
ある態様において、本方法は、特に疾患が癌である場合において、疾患の病期を決定するために実施される。本方法は、癌進行のリスクを決定するために実施され得る。従って本方法は、腫瘍または疾患の進行の速度または重篤度を予想するために使用され得る。
【００１４】
診断実施の対象となる個体
診断対象の個体は、本明細書で言及されたいずれかの疾患状態の1つもしくは複数の症状を有し得、かつ/または、任意のそのような疾患状態を有することが疑われ得る。個体は、例えば任意のそのような疾患の家族歴を有することによって、または、該疾患の発症を引き起こすか寄与する環境において生活することによって、該疾患状態のリスクを有し得る。ヒトにおける癌の場合、個体は40歳を上回ってもよく、例えば50歳を上回るか、または60歳を上回る。該個体は喫煙歴を有してもよい。
【００１５】
個体は、自身のゲノムの少なくとも1つの遺伝子中に、CCマーカー（その会合によって染色体構造が規定される）を有する個体であってもよい。個体は、典型的には真核生物であり、例えば、下等真核生物または高等真核生物である。個体は、植物、酵母、昆虫、有袋類、鳥類、または哺乳類であり得る。個体は好ましくは哺乳類であり、例えば、霊長類、ヒト、または齧歯類である。
【００１６】
診断
本発明は、異常な遺伝子発現の診断法、およびしたがって、特定の疾患状態の診断法を提供する。本方法は、個体のDNA中に異常な染色体立体構造が存在するかどうかを、（例えば、実際の染色体構造の検出によって直接的に、または、遺伝子中の会合/並列の部位の検出によって間接的に）検出することを含む。そのような異常な立体構造とは、通常、ある遺伝子中の部位（例えば該遺伝子が正常に発現している場合には、通常はこれらが観察されない部位）における新規の並列（または並列の組み合わせ）の存在、または、（通常は正常発現の際に観察される）1つもしくは複数の並列の不在を含む。上述したように、異常な立体構造は、配列および/または機能および/または量の異なるRNA転写産物を発現する遺伝子をもたらし、発現の違いは、個体において疾患、例えば癌を引き起こすまたは寄与する。異常な染色体立体構造は、異なるスプライス変異体の発現を引き起こす可能性がある。
【００１７】
任意の適切な手段を用いて、解析されるDNAの染色体立体構造を検出/調査することができる。典型的には、検出によって、個体のDNA中の少なくとも1つのループ様構造の位置が決定される。ある態様において、本方法は、CCマーカーの所与の並列対の有無を判定し、それによって例えば、観察された立体構造が正常なものとは異なるという推測を可能にする工程を含む。
【００１８】
典型的には、本方法は、個体由来の試料に対してインビトロで実施される。試料は、例えば5kb、3kb、1kb、500塩基対、または200塩基対未満離れている会合領域に関して、天然状態で会合しているゲノム領域が試料中でも会合したままである（すなわち、後成的な染色体状態が保存されている）状態にある個体のDNAを含む。試料は典型的に、個体の細胞を含む。試料は概して、診断されるべき疾患に関連する組織に由来する細胞を含む。試料は典型的に個体の体液を含み、かつ例えば、口腔スワブなどのスワブを用いて得ることができる。試料は、血液試料または凍結試料であることが好ましい。試料は、腫瘍由来のものなどの生検であってもよい。本方法は、個体由来の単一細胞に対して実施することができる。
【００１９】
典型的には、本方法を実施する前、例えばDNA抽出を実施する前に、試料を処理する。物理的または化学的に（例えば適切な酵素を用いて）、試料中のDNAを切断してもよい。ある態様において、RNAポリメラーゼIIに特異的な抗体を用いて、細胞のその他の成分からDNAを分離する。
【００２０】
会合する配列、例えばループ様構造の基部を形成する配列の決定によって、染色体立体構造を検出することができる。好ましい態様において、そのような決定の前にDNAを架橋工程に供する。架橋は一般に、形成のための共有結合型の連結を含み、かつ一般に、架橋を引き起こす作用物質との接触によって形成される。そのような作用物質は、パラホルムアルデヒドなどのアルデヒド、または、D-ビオチノイル-ε-アミノカプロン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルもしくはジゴキシゲニン-3-O-メチルカルボニル-ε-アミノカプロン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルであり得る。パラホルムアルデヒドは、4オングストローム離れたDNA鎖を架橋することができる。
【００２１】
本方法においては、ループの形成によってより近接している配列の決定により、並列の部位を確認することができる。そのような決定は任意の適切な手段によって実施され得るが、好ましい態様においては、PCRを用いて実施される。
【００２２】
ある態様において、例えばDekker et al (2002) Science 295, 1306に記載の、染色体立体構造捕捉アッセイ法が用いられる。このアッセイ法においては、（例えば上述のように）DNAを架橋する。次に、典型的には制限酵素消化によって架橋DNAを切断し、切断/消化された構造をライゲーションに供する。ライゲーションにより、切断/消化により形成されたDNA鎖の末端が得られ、これらは共にライゲーションされる。したがって一般に、ライゲーションによって、並列部位の両配列を含む、（元の遺伝子中には存在しなかった）新規配列を有するDNAが得られる。新規配列の検出を、立体構造の検出の根拠として（すなわち、特定の部位における並列の存在を検出するために）用いることができる。
【００２３】
ライゲーションによって作製された配列は、任意の適切な手段により検出され得る。典型的には、例えばPCRを用いることによって、その配列に基づいて検出される。ある態様においてPCR検出反応が用いられ、ここで、使用されるPCRプライマーは、ライゲーション箇所のいずれかの側に結合し、かつ、ライゲーション生成物の存在下でPCR反応は成功するが、（典型的には、遺伝子配列上でのプライマーの結合が互いから遠すぎ、かつ、プライマーの方向によってその他の生成物の選択肢が排除されるために（異常な生成物を予防するためにプライマーは同じ方向で選択される）、）関連構造を有さない遺伝子の存在下で実施された場合には、PCR反応は成功しない。この態様において、PCR生成物はライゲーション生成物の存在下でしか検出されないと考えられる（図1を参照されたい）。典型的には、ライゲーション生成物と結合する場合、PCRプライマーは互いに500塩基対以内で結合する。
【００２４】
配列特異的PCRによって、または直接配列決定によって、ライゲーションされた配列を検出/解析してもよい。ゲルベースのシステムを用いて検出を実行することができるが、ここで、ライゲーションされた配列をゲル上に流し、その後、ポリヌクレオチドに結合する検出可能な化合物でゲルを染色する。ライゲーションされた配列に特異的に結合するポリヌクレオチドプローブなどのプローブを用いて、ライゲーションされた配列を検出することができる。
【００２５】
上述のPCR反応において形成されるPCR生成物は、任意の適切な手段によって、例えば、ライゲーション生成物の検出のための上述の方法の中でも任意の適切な方法によって、検出され得る。
【００２６】
ある態様において、本方法はまた、さらなる遺伝子である組織特異的遺伝子の染色体構造を検出する工程も含む。（例えば、本明細書に記載の任意の手段による）さらなる遺伝子の構造の検出によって、該さらなる遺伝子が発現されているかどうかを判定することができ、かつしたがって、発現の組織特異性を決定することができる。これにより、疾患の診断を補助することができる。
【００２７】
本発明のある態様において、診断を補助するために、2つ、3つ、またはそれ以上の遺伝子を解析する。特に癌診断の場合、癌の発生に関係する2つ以上の遺伝子の解析によって、特定の癌の判定を補助することができる。
【００２８】
さらなる態様において、診断を補助するために、本発明の方法によって実施する染色体構造の解析を、疾患組織（例えば癌/腫瘍）に由来する対照生検に対して実施した同様の解析と比較する。
【００２９】
ある態様において、（例えば、特定のインビボ状況における、または特定の組織における）異常な遺伝子発現を有する個体の細胞の割合を決定するために、本発明の方法を定量的様式で実施する。これによって、疾患の病期の決定を補助することができる。
【００３０】
会合して染色体構造を形成する遺伝子中の配列
本明細書において言及するように、本発明の方法は、遺伝子の特定の領域の会合によって形成される染色体構造の存在を検出する工程を含む。そのような領域は同じ染色体上に存在し、典型的には、50,000塩基未満、例えば、20,000塩基未満、10,000塩基未満、5000塩基未満、1000塩基未満、または500塩基未満離れている。配列の会合によって、ループ構造/ループ様構造/位相的に閉じた構造が形成され得る。当業者は、会合している遺伝子の領域の参照が意味することを認識するであろう。そのような領域は、本明細書で言及した任意の架橋剤などによって共に架橋されるのに十分な程度に近い。したがってこれらは典型的には、オングストローム台の距離で離れており、例えば、50オングストローム未満または10オングストローム未満離れている。
【００３１】
会合する配列の一方または両方は、
-転写終結を引き起こし得り、調節し得り、もしくは寄与し得り；かつ/または
-CCマーカーであり得る。
【００３２】
CCマーカーは典型的に、1〜30ヌクレオチド塩基長を有し、例えば5〜20塩基長または10〜15塩基長を有する。
【００３３】
CCマーカーは、表1の情報を用いて、任意の所与の遺伝子配列中で検出され得る。以下の項の1つにおいて、CCマーカー配列を同定する方法を詳細に説明する。表1の情報の使用法の概説は以下の通りである。該表は、4種類の重みのセット（4 sets of weights）を示している。各重みのセットに関して位置を引用し、初期位置に対して、各種のヌクレオチドに関する位置価を与える（表1において、これは初期位置を参照してカラム位置として定義される）。示されるように、第1の重みのセットに関して、グアニン、シトシン、アデニン、およびチミンの値が、位置0〜18に対して与えられる。表1の値を用いて、フォワード鎖およびリバース鎖における所与の配列の各塩基に対してスコアを決定する。この解析は、左から右へ配列を走査すること、および次に、その相補鎖に対してこれを繰り返すことによって行われる。走査の際には、ある塩基を基準点と見なし、該塩基に対するスコアを、4種類の重みのセットの位置価、および、重み間の相対距離を用いて決定する（すなわち、各塩基について、表1においてその位置が位置番号を用いて定義された該塩基の周りの配列に基づいて、スコアを決定する）。このスコアがX（ユーザにより与えられた入力値）を上回る場合、問題の塩基対はCCマーカー内にある。このプロセスを全塩基について繰り返す。
【００３４】
通常、スコアは、指数値（逆対数）スコアに変換される。ある態様において、0.9を上回る、例えば0.95を上回るまたは0.99を上回る逆対数スコアを有するCCマーカーが選択される（対数スコアの計算については、後述の項でより詳細に説明する）。
【００３５】
本発明者らは、表1の情報を用いて、ヒト、酵母、およびショウジョウバエ（キイロショウジョウバエ（D. melanogaster)）の配列におけるCCマーカーを検出した。
【００３６】
本方法を実施するためのキット
本発明は、本方法を実施するためのキットも提供する。典型的には、本キットは、遺伝子中の特定の並列配列を検出するための手段を含む。典型的には、本キットは、（例えば、本明細書に記載のライゲーション生成物を検出することによって）並列配列を検出するために用いられ得る、プライマー対またはプローブを含む。典型的には、一方もしくは両方のプライマーおよび/またはプローブが、遺伝子配列または該遺伝子配列に相同的な配列の断片である配列を含む（当然ながら、一方のプライマーが遺伝子配列に結合しかつ他方のプライマーが相補的配列に結合するので、遺伝子配列への言及には相補的配列も含まれることが理解されよう）。そのような遺伝子配列は、コード配列の5'側（例えばプロモーター配列）でも、コード配列でも、イントロン配列でも、コード配列の3'側でもよい。
【００３７】
典型的には、プライマーまたはプローブは少なくとも10、15、20、30、またはそれ以上の塩基長であり、通常は一本鎖形態のDNAを一般的に含む。プライマーまたはプローブは、単離された形態で存在してもよい。プライマーまたはプローブは、露出した（revealing）/検出可能な標識を有してもよい。適切な標識には、32Pもしくは35Sなどの放射性同位体、蛍光標識、酵素標識、またはビオチンなどその他のタンパク質標識が含まれる。
【００３８】
本キットには、本発明の方法を実施するための説明書が含まれてもよい。本キットは、本明細書で言及した任意の架橋剤などの、DNAを架橋することができる架橋剤を含み得る。
【００３９】
ある態様において、本キットは、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上の遺伝子など、2つ以上の遺伝子の染色体構造を解析する本発明の態様の実施を目的とする。そのような場合、本キットは2つ、3つ、4つ、またはそれ以上の異なる遺伝子を解析するためのプライマーまたはプローブも含み得る。
【００４０】
本キットはさらに、上記で言及した任意の本方法の態様の実施を可能にする、1つまたは複数のその他の試薬または説明書を含んでもよい。そのような試薬または説明書には、以下のうちの1つまたは複数が含まれる：検出可能な標識（蛍光標識など）、ポリヌクレオチドに対して作用できる酵素（典型的には、ポリメラーゼ、制限酵素、リガーゼ、RNaseH、またはポリヌクレオチドに対する標識に付着できる酵素）、酵素試薬用の適切な緩衝液（水溶液）、陽性および/もしくは陰性対照、ゲル電気泳動装置、試料からDNAを単離するための手段、個体から試料を入手するための手段（スワブまたは、針を備えた器具など）、または、検出反応を行うことができる壁を備えた支持体。
【００４１】
スクリーニング法
本発明は、遺伝子の異常発現を治療するための化合物を同定する方法を提供するが、該方法は、候補物質が、異常発現の際に適合化された異常構造から正常構造へと該遺伝子の染色体構造を変化させることができるかを判定し、それによって、候補物質が異常発現を治療できるかどうかを判定する工程を含む。染色体構造における変化は、本明細書に記載の任意の適切な方法を用いて検出され得る。また本方法は、候補化合物が遺伝子の構造中に変化を起こすことができるかどうかを再度判定することによって、遺伝子の発現の変化（例えば、ある発現様式から別の発現様式への転換）を引き起こすことができる化合物を同定するために実施することもできる。
【００４２】
本方法は、インビトロ（細胞の内側または外側）においても、インビボ（非ヒト生物）においても実施することができる。ある態様において、本方法は、遺伝子を含む細胞、細胞培養物、細胞抽出物、組織、器官、または生物に対して行われる。典型的には細胞は、遺伝子の異常発現が認められる細胞である。
【００４３】
典型的には本方法は、遺伝子、細胞、細胞培養物、細胞抽出物、組織、器官、または生物と候補物質とを接触させる工程（または投与する工程）、および、正常染色体構造に変化が起こっているかどうかを判定する工程によって実施される。
【００４４】
上記のスクリーニング法において試験される適切な候補物質には、抗体作用物質（例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ならびにCDR移植抗体）が含まれる。さらに、コンビナトリアルライブラリ、規定された化学的同一性、ペプチドおよびペプチド模倣体、オリゴヌクレオチド、ならびに、ディスプレイライブラリ（例えばファージディスプレイライブラリ）などの天然作用物質ライブラリも、試験することができる。候補物質は化学的化合物であってもよく、これは典型的には、本明細書で言及する作用物質（本明細書で言及する有機化合物など）の特性のいずれかを有し得る小分子を中心とした合成に由来する。候補物質群を、例えば反応1回あたり10種類の物質による初回スクリーニングにおいて用いることができ、改変を示す群の物質を個々に試験した。
【００４５】
改変された遺伝子および生物
本発明は、(i) CCマーカーを遺伝子に導入する工程；および/または(ii) 任意で1つ、2つ、3つ、もしくはそれ以上の変異をCCマーカーに導入することによって、遺伝子からCCマーカーを除去する工程であって、各変異が、ヌクレオチド塩基の付加、置換、もしくは欠失である工程を含む、遺伝子の発現プロファイルを変更する方法を提供するが、本方法では、遺伝子のコード配列の少なくとも50%が変更されないままである。
【００４６】
ある態様において、本方法ではCCマーカー配列（すなわち機能的CCマーカー配列）の総数は変更されないままである。
【００４７】
「CCマーカーを除去する工程」に関しては、CCマーカー配列全体を除去する必要はなく、その代わりに、ある態様においては改変CCマーカー配列がもはや遺伝子の領域の会合を引き起こすことができないように、CCマーカー配列に変異を導入してこれを不活性にすることができることが理解される。
【００４８】
遺伝子に由来するRNAまたはポリペプチド生成物は機能的活性を保持しており、あるいは、（非改変遺伝子由来の生成物と比較して）異なる活性を有してもよく、または活性を有さなくてもよい。改変遺伝子とは、本明細書で言及する遺伝子のいずれかであり得る。改変遺伝子は、複製され、かつ/または発現され、かつ/または細胞に導入され得る。
【００４９】
本発明は、遺伝子の発現を変更するためのCCマーカーを含むポリヌクレオチドの使用を提供する。本明細書記載の任意の改変遺伝子の場合のように、そのようなポリヌクレオチドを用いてCCマーカーを導入または遺伝子から除去することができる。ポリヌクレオチドは、典型的にはDNA分子である。ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターなどのベクター形態であってもよい。ポリヌクレオチドは、トランスポゾンの形態であってもよい。
【００５０】
本発明はまた、CCマーカー配列の導入および/または除去によって発現プロファイルが変更された遺伝子少なくとも1つをゲノム中に含む、非ヒト改変真核生物も提供するが、ここで、該遺伝子のコード配列の少なくとも50%は変更されないままである。したがって該生物は、上述した本発明の改変遺伝子を含んでもよい。該（トランスジェニック）生物は、本明細書で言及する任意の生物であってよい。また本発明は、改変遺伝子を含む生物の一部、例えば該生物の細胞または器官も提供する。
【００５１】
本発明は、本発明の改変生物を作製する方法を提供し、該方法は、該生物の細胞中の遺伝子においてCCマーカーを導入または除去する工程、および、多細胞生物の場合には、細胞を増殖させて生物とする工程を含む。CCマーカーの導入または除去は、生殖細胞または胚幹細胞に対して実施することができる。
【００５２】
相同体
ポリヌクレオチド配列の相同体について本明細書で言及する。典型的にはそのような相同体は、例えば少なくとも15、20、30、100、またはそれ以上の連続ヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも70%の相同性、好ましくは少なくとも80%、90%、95%、97%、または99%の相同性を有する。相同性は、ヌクレオチド同一性（「強い相同性（hard homology）」と称する場合もある）に基づいて算出できる。
【００５３】
例えば、UWGCGパッケージにより、相同性を計算するために使用可能なBESTFITプログラムが提供される（例えば、そのデフォルト設定で使用される）（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395）。例えばAltschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10に記載のように、PILEUPおよびBLASTアルゴリズムを用いて、相同性を計算するか、または配列を整列させることができる（例えば、（典型的にはそのデフォルト設定における）同等のまたは対応する配列の同定など）。
【００５４】
BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）により公に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列において同じ長さのワードと共に整列された場合、ある程度の正の値の閾値スコアTに一致するかまたはこれを満たす、問い合わせ配列における長さWの短いワードを同定することにより、高スコア配列ペア（HSP）をまず同定することを含む。Tは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al.,  前記）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むHSPを見つけるための検索開始用の種としてはたらく。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加できる限り、各配列に沿って両方向に延長される。各方向へのワードヒットの延長は以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアが最大達成値から量Xだけ減少する場合；累積スコアが、1つまたは複数の負のスコアの残基アラインメントの蓄積によってゼロまたはそれ以下になる場合；あるいは、いずれかの配列の末端に達する場合。BLASTアルゴリズムパラメータであるW、T、およびXは、アラインメントの検出感度および速度を決定する。BLASTプログラムは、デフォルトとして、ワード長（W）＝11、BLOSUM62スコア行列（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919参照）アラインメント（B）＝50、期待値（E）＝10、M＝5、N＝4、および両方の鎖の比較を用いる。
【００５５】
BLASTアルゴリズムは、2つの配列間の類似性の統計学的解析を実施する；例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787を参照されたい。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の1つの尺度は最小合計確率（P(N)）であり、これによって、2つのポリヌクレオチド配列の間の一致が偶然に起こる確率の目安が提供される。例えば、ある配列と別の配列の比較において最小合計確率が約1未満、好ましくは約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合、第1の配列は第2の配列に類似していると見なされる。
【００５６】
典型的には、相同配列は、2、3、5、または8塩基未満が異なる（これはヌクレオチドの置換、欠失、または挿入であり得る）。相同性の計算に関して、これらの変更は、上記で言及する任意の領域にわたって測定され得る。
【００５７】
以下の実施例により本発明を説明する。
【００５８】
遺伝子の構造的組織を調査するためのパターン認識解析の使用
真核生物学の新興パラダイムとは、核組織の構造的局面が、遺伝子の転写調節において直接的役割を果たすということである。染色体テリトリーから遺伝子ループまでの多様な構造レベルが、特異的転写応答の重要な構成要素として浮上している（1〜3）。本明細書において、本発明者らは、インビボにおいて転写された遺伝子の構造的組織化に関与するこれらの特性のいくつかを同定するために、2つのアプローチを組み合わせた。本発明者らは、応用数学から、一般化線型モデルおよびベイズの定理に基づくパターン認識解析を採用し、RNAポリメラーゼII（RNAPII）転写単位の境界を同定するためにこれを用いた。本発明者らは、分子生物学から、転写活性のスペクトルおよび該部位における構造的な染色体下（sub-chromosomal）ドメイン組織化を解析および説明するためのインビボアッセイ法を用いた。
【００５９】
パターン認識解析は、医学、工学、および言語学などの多様な研究分野に広く適用されており、ここで、画像解析およびデータ解読によって、複合系において根底にある特徴的なマーカーの同定が可能になる。本発明者らは、RNAPIIによってプロセシングされた転写単位に関してヒトゲノムデータを解析するために、パターン認識方法論を用いた。ヒト第22染色体上の手動解析された（manually curated）遺伝子422個（4）由来の配列セットを、コンピュータによる調節シグナル同定のために用いた。所与の調査に関して、本発明者らは、パターン認識のために使用可能な全ての方法の中から、最も成功可能性が高いものとして適合ベクターマシン（Relevance Vector Machine；RVM）（5〜6）を見出した。RVMトレーナー（trainer）は、調節シグナル間で注目される距離変動に対処する、スパース（sparse）ベイズ原理を適用する（7）。所与の配列セットから、トレーナーはそれらを規定するマーカーを走査して、確率的（probabilistic）一般化線形モデルを構築する。その後、この「トレーニング済み（trained）」モデルを用いて、規定されたマーカーの存在に関して最適な配列を分類できる。このモデルの導出は、以下に与えられるベイズ定理の条件付き確率に基づく：
2009526543.tif 000002
式中、データとはDNA配列のセットを表す。P(モデル|データ)とは、該モデルに由来する配列の確率を与える、事後確率である。これは、該モデルに与えられた該データの確率ならびに、該モデルおよび該データの確率に左右される。
【００６０】
配列xの特徴を規定する各マーカーは、切断部位に対するDNA重み行列として与えられる。数学的には、これは以下のように表される：
2009526543.tif 000003
式中、Pは位置確率であり、W(x,i)は、切断部位に対するオフセットiのDNA重み行列確率（DNA weight matrix probability）である。次に、これらのマーカーの組み合わせを用いて、一般化線形モデルを構築する：
2009526543.tif 000004
式中、Mは該遺伝子を規定するマーカーのセットであり、βは各マーカーの所与の重み（すなわち重要度）である。
【００６１】
第22染色体由来の注釈付きヒト遺伝子422個についてトレーニング済みのモデルによって、3'端において3種類の一般的マーカーが同定された（図1A）。同定された3種類のマーカーのうちの2つが、RNAPII転写遺伝子の3'端近傍の既知の転写終結シグナルであるポリ(A)シグナルおよびU-リッチ部位である。この結果により、mRNAの3'端の終結およびプロセシングに機能的に関連する既知の配列が明白に確認されたので、本発明者らのアプローチが実証された（8〜10）。興味深いことに、RVMトレーナーにより同定された第三の種類のマーカーは、以前は未知であった。これは、U-リッチ部位の更に下流に位置しており、複数のDNA重み行列からなった。各種類のマーカーにおいて注目される距離変動は、ガウス分布として捕捉した。興味深いことに、ヒト第20染色体配列上のモデルを試験した際には、該マーカーは注釈付き遺伝子の3'末端に限定されておらず、5'末端にも存在した。新たに規定されたマーカーと転写単位の境界との結合のために、本発明者らは、冷戦時から配置された最も有名なベルリンの国境に因んでこれをチェックポイント・チャーリー（Checkpoint Charlie；CC）マーカーと名付けた。
【００６２】
ポリ(A)部位とは異なり、本発明者らがCCマーカーに関して延長された一次配列コンセンサスを全く同定できなかったことは、興味深い。このことは、本発明者らが、パターン認識解析を通じて、対応する配列の二次構造および三次構造において符号化された情報によって共通の特性を有する部位を同定していたことを示唆するものである。実際、Zukerアルゴリズムを用いたCCマーカーの配列解析（11）によって、対応する転写産物に関する高次の二次構造および三次構造の特徴である、低い折りたたみ自由エネルギーが示されている。
【００６３】
転写調節に対するCCマーカーの機能的関連性を決定するために、本発明者らは、既に規定された調節エレメントの中から、CCマーカーの全ての例を検索した。ヒト遺伝子に対してトレーニング済みのアルゴリズムは多くの種にわたる真核生物中のCCマーカーを同定可能であったことに言及することが重要である（図5）。本発明者らはこのことを、マーカーの高次構造が媒介する進化的に保存された機能に帰するものと考えた。
【００６４】
本明細書において、本発明者らは、転写調節に機能的に関連するCCマーカーの2つの例を示す。CCマーカーの第1の例は、複数の研究所によりその特性が広範に研究されている、ヒトβグロビン遺伝子中で見出された。近年の報告によって、βグロビン遺伝子中の転写の終結が、ポリ(A)部位の認識だけではなく、更に下流の同時転写切断部位（CoTC）にも左右されることが実証された（7、12〜14）。興味深いことに、CoTC部位は同定されたCCマーカーと一致し、かつ、前述したように低い折りたたみエネルギーを示す（図1B）。この知見は、CCマーカーと転写された遺伝子の境界との潜在的関連性を確認するだけでなく、転写終結の調節機構におけるその機能的介入も示唆するものである。
【００６５】
CCマーカーの第2の例は、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）のX染色体上で見出されたものであり、これは、染色体バンド7B2内のgypsyインスレーターと一致した（図1C）。gypsyとは、複数のSu(Hw)結合部位を有する、十分に特徴決定された350bpのインスレーターエレメントであるが、これは、より高次のクロマチンループ構造を導く（15）。ショウジョウバエ（Drosophila）におけるcut遺伝子座において行った実験により、染色体バンド7B2および7B8における2つのインスレーター部位が核周辺部で一緒になり、その間に遺伝子座を囲むことが示された（16）（図1C）。インスレーター間のクロストークにより媒介されるクロマチン線維の類似の組織化も、scsおよびscs'境界配列に関して示されている（17）。全体としてこれらの知見は、以前に報告された染色体構造捕捉（Chromosome Conformation Capture；3C）アッセイ法（18）により検出され得る、染色体下ドメイン構造を含む高次構造組織化においても、機能的CCマーカーが役立ち得るという事実と一致している。
【００６６】
上述の知見を実証するために、本発明者らは、調節されたヒト遺伝子2種類におけるCCマーカーの系統的解析を実施した（図2）。両モデル遺伝子−細胞周期調節ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）（19）および細胞型特異的カルシトニン受容体様受容体（CALCRL）遺伝子（20〜22）−は、別の様式の転写活性調節を示す。本発明者らの解析において、本発明者らは、CCマーカーが (i) RNAPII転写の範囲を制限できるかどうか、および (ii) 任意の特定の染色体立体構造と相互に関連するかどうかを知ることに特に関心があった。
【００６７】
ヒトDHFR（hDHFR）は細胞周期に調節される遺伝子であり、上流のマイナープロモーターおよび下流のメジャープロモーターから制御を受ける。該遺伝子は第5染色体中の28.5kbに及び、6つのエキソンを含む（図2A）。独立した研究によって、細胞周期のS期に入るとhDHFR発現が誘導され、静止細胞（G0）中では停止されることが示されている（図2A）（23）。G1/S期においてhDHFR遺伝子の増殖性転写がメジャープロモーターから駆動されるが、静止細胞中では、転写活性は抑制されないが、上流のマイナープロモーターから開始して第2イントロンで能動的に終結する別の様式へと切り替えられる。マイナープロモーター由来の転写産物は不安定であるが、RT-PCRにより静止細胞中で大量に検出できる。
【００６８】
hDHFR遺伝子は、以下の3種類のCCマーカーを含む：(i) 両プロモーターの上流（CCDHFR-1）；(ii) 第2イントロン内（CCDHFR-2）；(iii) 機能的ポリ(A)シグナルの下流（CCDHFR-3）（図3A）。興味深いことに、平行解析によって、同一の遺伝子内に存在する40個を上回る潜在的ポリ(A)シグナルが示されている。記載された3種類のCC部位全てが低い折りたたみ自由エネルギーを示したが、これは、高度に構造化された一本鎖核酸に特徴的である（図3A）。各CC部位の終結特性を確認するため、本発明者らは、CC部位の上流および下流の大量のインビボ転写産物（不安定かつ微量の（rare）転写産物を含む）をRT-PCRによって定量した。3種類全ての場合において、本発明者らは、CC部位における転写産物の終結に関する証拠を見出した（図3A）。CCDHFR-1部位において、本発明者らは、微量の遺伝子間転写産物の転写終結を検出した。静止細胞中で、短い非コード転写産物はCCDHFR-2部位で終結した。また、基準AATAAA部位はCCDHFR-2部位の近傍にも存在し、DNA配列のこの部分は、公的データベースに由来する多様な発現配列タグおよびcDNAと一致する。増殖細胞中で、CCDHFR-3部位は、他の箇所で言及した増殖性転写の終結の印となっていた。CCDHFR-3部位と機能的ポリ(A)シグナルとの関連は、以前に記載されたβグロビン遺伝子中での相互関係と類似している。
【００６９】
第2の最適モデル遺伝子は、細胞型特異的なヒトCALCRL遺伝子（hCALCRL）であった（図2）。これは、7回膜貫通型Gタンパク質共役受容体（GPCR）をコードする。哺乳動物GPCRは、細胞内シグナルへの細胞外刺激を伝達するという主要な機能を有するタンパク質の大きく多様なファミリーを構成する。GPCRの大部分は、ペプチド、脂質、神経伝達物質、またはヌクレオチドなどの内因性シグナル（endoGPCR）に応答する。endoGPCRは高度に保存されており、独特な発現プロファイルを有し、これによって、生理的プロセスの改変のための数千の組織特異的かつ細胞特異的な受容体の組み合わせが生じる。ヒトにおいてendoGPCRのレパートリーは367個の受容体からなる。しかし、その特異的発現および機能を調節する機構については、大部分が未だ未知である。hCALCRL遺伝子によってコードされるendoGPCRは、細胞の増殖、生存、および進路決定において必須の役割を果たすペプチドのカルシトニンファミリーメンバーの活性の調節における重要な分子と見なされている。ヒトCALCRL遺伝子（103.15 kb）は第2染色体上に局在し、15個のエキソンを含み、かつ、様々なヒト組織および腫瘍中で転写される。ノーザンブロッティングおよび免疫組織化学的検査によって示されるとおり、hCALCRL遺伝子は、内皮細胞中ではその全長まで転写されるが非内皮細胞ではそうではない（図2B）。しかし、非内皮細胞において、第1イントロンにおける非コード転写産物の終結が検出された（図2B）。本発明者らは、hCALCRL遺伝子を、遺伝子発現の細胞型特異的調節の良好なモデルとみなした（22）。
【００７０】
hDHFRと同様に、hCALCRL遺伝子のプロモーターの上流（CCCALCRL-1）および機能的ポリ(A)シグナルの下流（CCCALCRL-3）の両方においてCCマーカーを検出することができた。さらなる第三のCCマーカー（CCCALCRL-2）は、遺伝子の第1イントロン中に存在する（図3B）。全転写産物がCCCALCRL-1マーカーの下流で開始され、上流からは開始されないことが、第1イントロンからの5'RACEによって確認される。これは、CCCALCRL-1が、hCALCRL転写単位に干渉し得る遺伝子間転写産物を終結させ得ることを示唆するものである。3'RACE解析によって、CCCALCRL-2部位（第1イントロン中）およびCCCALCRL-3部位（切断部位の下流領域）近傍の終結された転写産物の存在を確認する。3種類のCCマーカー部位全てが、上記で示した低い折りたたみ自由エネルギーを示す（図3B）。したがって、インビボで、hDHFR遺伝子およびhCALCRL遺伝子の両方においてCCマーカーは転写終結特性を示す。
【００７１】
CCマーカーの第2の示唆された特性を実証するために、本発明者らは次に、これらが3Cアッセイ法により規定されたいずれかの特定の染色体立体構造に関係するかどうかを試験した。このアッセイ法は、ループ様構造の形成に関連する遠位部位の空間的近接を検出することによって、高い柔軟性を有するインビボ染色体立体構造をモニターするために開発された。本発明者らは、ヒト細胞における検出の収率および感度を改善するために該アッセイ法の条件を調整した（材料および方法の項を参照されたい）。重要なことに、該アッセイ法の最初の段階は、抗RNAPII免疫沈降法（24）による、転写された染色体遺伝子座の濃縮も伴う。
【００７２】
hDHFR遺伝子について解析したところ、29kbを上回る間隔を空けて配置されたCCDHFR-1マーカーおよびCCDHFR-3マーカーの部位が、正常増殖細胞中で隣接していることが見出された（図4A）。これら2つの部位の空間的近接は非常に特異的であり（図4A、増殖細胞中の1+2、1+3の比較）、RNAPIIの存在、架橋、制限酵素切断、ライゲーション、およびPCRに左右される（図4A、hDHFR対照）。以前に示したとおり（図3A）、これらの部位の両方は、増殖細胞中でも転写終結特性を示す。
【００７３】
静止条件下のhDHFR遺伝子における転写様式の変化は、何よりも、第2イントロン内で終結する短い転写産物の産生に関連する。重要なことに、hDHFR遺伝子は同じ部位に位置する第3のCCマーカーを含む。静止状態におけるhDHFR転写についての以前の解析によって、短い非コード転写産物に対する終結部位としてCCDHFR-2マーカーが活性化されることが示された（図3A）。従って本発明者らは、静止状態において、CCDHFR-2マーカーに関する別の転写様式が代替的な染色体立体構造と相互関係を有するかどうかの解析を試みた。実際、図4Aにおいて示されるように、CCDHFR-1マーカーおよびCCDHFR-2マーカーが並列するインビボ立体構造は、静止細胞において3Cアッセイ法により検出することができる。増殖細胞集団においては、この立体構造は低レベルでしか検出されなかった。興味深いことに、観察されたCCDHFR-1：CCDHFR-2立体構造は、増殖細胞に関して以前記載されたCCDHFR-1：CCDHFR-3立体構造を消滅させていなかった。3Cアッセイ法の特性を考慮に入れると、この結果は複数通り解釈できる。第一に、保持されたCCDHFR-1：CCDHFR-3構造上で、静止状態特異的な立体構造が課されている可能性がある。第二に、一方の立体構造からもう一方へと細胞が転換されるので、この結果は2つの細胞集団を表している可能性がある。重要なことに、CCDHFR-1：CCDHFR-2立体構造は静止様式の転写に特異的であり、かつ検出された転写産物の範囲と一致していた。したがって本発明者らは、hDHFR遺伝子に関して、CCマーカーの空間的近接を特徴とするインビボ染色体立体構造を検出した。CCDHFR-1マーカーおよびCCDHFR-2マーカーの近接は、細胞周期の静止状態に関して記載された転写様式に特異的であった。
【００７４】
CCマーカーが、hCALCRL遺伝子の細胞型特異的発現に関連するいずれかの構造的配置に関係するかどうかを試験するために、本発明者らは、転写許容（内皮、HMVEC）細胞および非許容（非内皮、HEK293T）細胞におけるその立体構造を調査した。HMVEC細胞において、活性hCALCRL遺伝子は、3種類のCCCALCRLマーカー全てが並列し、CCCALCRL-1：CCCALCRL-2とCCCALCRL-1：CCCALCRL-3との間が密に近接する立体構造プロファイルを示す（図4B；CCCALCRL-2：CCCALCRL-3に関するデータは示さず）。重要なことに、これら2種類の潜在的ループ構造の境界が、HMVEC細胞中で検出された2種類の転写産物の境界に対応していた（図2B）。これらの立体構造のいずれがHMVEC細胞に固有であるかを試験するため、本発明者らは、転写非許容細胞HEK293TにおいてhCALCRLを解析した。本発明者らはCCCALCRL-1およびCCCALCRL-2の並列を検出したが、hCALCRL遺伝子の全長を包含するCCCALCRL-1とCCCALCRL-3の間の相互作用は全く存在しなかった（図4B）。CCCALCRL-1：CCCALCRL-2立体構造は、HEK293T細胞内のCCCALCRL-2部位において第1イントロン中で終結する短いhCALCRL転写産物の存在と重なる（図2B）。したがって、hCALCRL遺伝子の細胞型特異的発現は、CCCALCRL-1マーカーとCCCALCRL-3マーカーの間で検出されるような固有の染色体立体構造に関連する。重要なことに、この立体構造は、HMVEC細胞中で産生される増殖性転写産物の全長を包含する。
【００７５】
注釈付きヒト遺伝子422個の境界に対するパターン認識分析の適用によって、以前は未知であった、転写調節に関係するマーカーを含む複数のマーカーが、同定され定義された。マーカーであるチェックポイント・チャーリーは、多様なスペクトルの種におけるコード転写単位と非コード転写単位の境界と一貫して相関し（図5も参照されたい）、対応する転写産物に関して高度に規則正しい二次構造および三次構造を示し、インビボにおけるRNAPIIによる転写終結の調節と関連し、かつ、転写依存的な代替的染色体立体構造の形成を導く。注目すべきことに、細胞周期特異的hDHFR遺伝子および細胞型特異的hCALCRL遺伝子について解析する場合、マーカーは、一方または他方の様式の転写活性に特徴的な別個の高次構造の立体構造と機能的に関連する。並列CCマーカーは、RNAPIIと共にロードされたクロマチン下の（sub-chromatin）構造と相関するだけでなく、該構造内部で合成された転写産物の境界の輪郭も描く。本発明者らのデータは、高次構造が転写依存的様式で形成されかつ転写再開のために重要であるという、以前の示唆と一致する。
【００７６】
転写調節は、DNA配列特異的漸増、クロマチン修飾、およびCCマーカーの再構築に関連する多数の活性により、多様かつ重要なレベルで実施され、関連する構造的組織化は、インビボにおいて様々な転写単位の外側境界の確立と明確に関連する。
【００７７】
ノーザンブロッティング
U2OS細胞から単離した総RNAから、hDHFRに対するノーザンブロッティングを実施した。10% FCS存在下で増殖細胞を培養する一方、0.5% FCS存在下での接触阻害のもとで細胞の休止を行った。hDHFRの第4エキソンと第6エキソンの間の配列を包含する鋳型を用いて合成したプローブを、プローブとして用いた。
【００７８】
hCALCRLに対するノーザンブロッティングは、以前に記載されたように実施した（25）。全長ヒトCLをRT-PCR増幅し、pcDNA 3.1ベクターにクローニングした。得られたベクターを、Applied Biosystems 377 Genetic分析器を用いて配列決定し、GenBankデータベースに対して配列を照合した。挿入物を抽出し、プローブを作製するための鋳型として用いた。
【００７９】
いずれの場合にも、MegaPrime標識キット（Amersham, UK）を用いて、プローブを32P-dCTPで標識した。ハイブリダイゼーションおよびストリンジェントな洗浄の後、ブロットをHyperfilm（Amersham, UK）に曝露し、その後Phosphoscreenに曝露した。ハイブリダイゼーションシグナルは、ImageQuantソフトウェアを用いて解析した。
【００８０】
蛍光活性化細胞選別（FACS）
増殖U2OS細胞および静止U2OS細胞のFACS選別は、以前に記載されたように実施した（26）。
【００８１】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）
hDHFRにおける転写産物の終結を確認するための逆転写PCRは、U2OS細胞より単離した総RNAに対して実施した。CCDHFR-1部位、CCDHFR-2部位、およびCCDHFR-3部位に対して、以下のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いた。
2009526543.tif 000005
【００８２】
Qiagen（英国）製のOmniscript Reverse Transcriptionキットを用いてRT-PCRを実施した。
【００８３】
cDNA末端の迅速増幅法（RACE）
本質的には以前に記載されたとおりに（27）、RACEを実施した。報告されたヒトCALCRL cDNAの配列に基づき、
2009526543.tif 000006
および
2009526543.tif 000007
に対して遺伝子特異的なプライマーを設計した（28）。5'RACEおよび3'RACE（第1イントロン内で終結）からの転写産物を配列決定し、GenBankデータベースに寄託した。
【００８４】
抗体産生および特徴決定
ヒトCL（hCL）タンパク質（アクセッション番号AAC41994およびAAA62158；CALCRL遺伝子によりコードされる）の最もC末端の427位〜461位の残基
2009526543.tif 000008
に対応する合成ペプチドに対してウサギポリクローナル抗体LN-1436を産生させた。抗体の特異性は、HEK293T細胞において一過性に発現したCLの免疫ブロット解析により特徴付けられた。
【００８５】
免疫細胞化学的検査
ホルマリン固定しパラフィン包埋した、正常ヒト組織20種類の検体（n=74）を、オックスフォード大学、ジョン・ラドクリフ病院の細胞病理学科（The Department of Cellular Pathology, John Radcliffe Hospital, University of Oxford)(Oxford, UK）の長期保管ファイルから選択した。レシピエントTMAブロック内に高密度で整列させた各検体に対する円柱形のコア（直径1.0 mm）を得ることによって、多組織マイクロアレイ（TMA）を作製した（29）。抗hCL抗体LN-1436を用いて免疫組織化学的検査を行う前に、脱ロウし再水和した4μm切片に対して抗原回収手順を実施した。本質的には以前に記載されたとおりに、免疫組織化学的検査を実施した（30）。ビオチン化二次抗体、ストレプトアビジン-アルカリホスフェート複合体Vectastain ABC-APキット、およびVector Red検出システム（全てVector（Burlingame, US）製）を用いた。対照として、適切な濃度で使用されるウサギ免疫前血清を含めた。
【００８６】
染色体立体構造捕捉（3C）
以前の記載に以下の修正を加えた3C解析を実施した（31）。室温で10分間、2%ホルムアミドで処理することによって、約4×106個の全細胞を架橋させた。等モル量のグリシンを用いて架橋を停止させ、細胞を回収して低張緩衝液（10 mM Tris-HCl [pH7.2]、2 mM MgCl2、および0.5% TritonX-100）中で溶出させた。その後、CSK緩衝液（100 mM NaCl、300 mMショ糖、10 mM PIPES [pH 6.8]、3 mM MgCl2、10μM ロイペプチン、1 mM EGTA、1.2 mM PMSF、および0.5% TrionX-100）中、核を再懸濁して、氷上で20分間インキュベーションした。Hettich Mikro 22R遠心機中、4℃、5000rpmで懸濁液を遠心分離し、ペレットを2M NaClで処理した。氷上で10分間インキュベーションした後、十分量の水を添加してNaCl濃度を150 mMまで低下させた。この試料を用いて、以前に記載されたように、RNAPIIクロマチン免疫沈降アッセイ法を実施した（32）。RNAPII抗体（H-224；Santa Cruz Biotechnology Inc., USA）によって免疫沈降させたクロマチンを、次に、制限酵素BglII（New England Biolabs, UK）を用いて制限酵素切断し、T4 DNAリガーゼ（Roche, UK）を用いてライゲーションした。プロテイナーゼK（Roche, UK）でタンパク質を消化してリボヌクレアーゼA（Sigma, UK）でRNAを消化した後、エタノールを用いてDNAを抽出した。タカラバイオ（日本）製のTaKaRa LA Taq（商標）と共に遺伝子特異的プライマーを用いて、抽出されたDNAに対するPCR解析を行った。
【００８７】
卵巣癌および前立腺癌の診断
正常組織および卵巣癌組織中のMLH1発現（図8参照） 
腫瘍抑制遺伝子は、細胞の生存および維持において不可欠な役割を有する。腫瘍抑制因子のサイレンシングは、癌へと至る無秩序増殖のシグナルとなる。フェイルセーフ機構として、無秩序増殖に関するそのようなシグナルが検出されたら、細胞はアポトーシスを受ける。
【００８８】
大腸菌（Escherichia coli）mutL遺伝子のヒトホモログである大腸癌非ポリポーシスタイプ2（MLH1）は、DNAミスマッチ修復遺伝子をコードする遺伝子である。修復機構に関するMLH1シグナルはDNA損傷によって開始され、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する。この遺伝子は3p21.3遺伝子座に位置し、細胞が老化するにつれて様々な変異および修飾を蓄積する。そのような変化の1つである、MLH1のプロモーター領域におけるメチル化レベルの上昇は、遺伝性非ポリポーシス大腸癌と関連している。同じく、MLH1代替的スプライス変異体は組織特異的でありかつ遺伝性の癌における表現型多様性に寄与することが示されている。
【００８９】
スプライス変異により誘発されるMLH1変異が卵巣癌に関連するかどうかを調べるために、本発明者らは、転写単位を包含するCC部位を探した。MLH1配列を走査することで、本発明者らは、第8イントロン中のCCマーカーおよび3'UTR中の別のCCマーカーが代替的スプライス変異体の境界を形成していることを見出した。これら2つの部位に対して実施した3C解析によって、正常患者のみにおいてCC部位が並列していることが示されている。一方、卵巣癌患者から採取した組織および体液試料は、並列を示さなかった。したがってMLH1 CC部位は、卵巣癌を識別するためのマーカーとして使用できる。
【００９０】
前立腺癌
前立腺診断マーカーに関する試験を、良性および後期の腫瘍増殖のいずれかを示す細胞系に対して行った。最適遺伝子はPSAおよびBORISであった。
【００９１】
正常組織および前立腺癌組織におけるBORISおよびPSAの発現（図9参照）
精巣癌遺伝子ファミリーの新規メンバーである、刷り込み部位の調節因子Brother（Brother of the regulator of imprinted sites；BORIS）は、精母細胞のみで発現し、正常体細胞では発現しない。しかしその発現は、乳癌および肺癌を含む複数のヒト癌に関連している。BORISは、別のZnフィンガー転写因子である、ヒト悪性病変における後成的動揺に関するCTCFと競合する。したがって本発明者らは、BORISとヒト前立腺癌（LNCaP）との関連を試験することを決定した。
【００９２】
BORISは、染色体位置20q13.31に規定の転写単位を包含する2つのCC部位を有する。悪性病変中で遺伝子が有意に発現するので、本発明者らは、LNCaP中での2つのCC部位の並列を試験することを決定した。添付の図面において示された結果からは、CC部位の並列がLNCaP中のみで生じ、ヒト骨肉腫（U2OS）細胞系においては生じない。PCR生成物の配列決定により、さらなる確認が立証された。
【００９３】
同じく本発明者らは、十分に確立された別の前立腺癌マーカーである前立腺特異的抗原（PSA）に着目した。血中のPSAタンパク質のレベルを検出することによって、ヒトカリクレイン3（KLK3）遺伝子にコードされるPSAを、前立腺癌の診断および予後判定のために用いる。しかし本明細書において本発明者らは、ヒト骨肉腫細胞および良性前立腺肥大症（BPH1）細胞系中のPSA遺伝子に着目するために、3C技術を用いた。BORIS中で見られるように、KLK3転写単位もまた2つのCC部位によって規定されており、その一方は5'UTR中に、もう一方は3'UTR中に存在する。結果によって、これらの2つのCC部位はBPH1細胞中でのみクロストークし、U2OS中ではクロストークしないことが示されている。
【００９４】
したがって、PSAおよびBORISを、良性および悪性の前立腺癌細胞をそれぞれ同定するためのバイオマーカーとして用いることができる。
【００９５】
PCR法
MLH1
3C制限酵素 - BssSI
MLH1プライマー
2009526543.tif 000009
PCR反応の第1ラウンド
2×緩衝液I           25μl 
dNTP（2.5 mM）       8μl
DNA                  1μl
プライマー（25μM）
フォワード（MREI2）  1μl
リバース（MF3UTR2）  1μl
TakaRa LA Taq        0.5μl
水                   13.5μl
計                   50μl
プライマー
MREI2 - MF3UTR2
PCRプログラム
94℃ - 5 min
94℃ - 1 min
57℃ - 1 min    30サイクル
72℃ - 45 sec
72℃ - 5 min
生成物の予想サイズ
MREI2 - MF3UTR2 - 527 bp 
PCR反応の第2ラウンド
2×緩衝液I          25μl 
dNTP（2.5 mM）       8μl
DNA                  2μl
プライマー（25μM）
フォワード（MREI1）  1μl
リバース（MF3UTR1）  1μl 
TakaRa LA Taq        0.5μl
水                   12.5μl
計                   50μl
プライマー
MREI1 - MF3UTR1
試料
混合液を48μl、第1ラウンド由来の各PCR反応液を2μl採取する。
PCRプログラム
94℃ - 5 min 
94℃ - 1 min
59℃ - 1 min    25サイクル
72℃ - 30 sec 
72℃ - 5 min
生成物の予想サイズ
MREI1 - MF3UTR1 - 325 bp
【００９６】
BORIS
3C制限酵素 - TaqI
BORISプライマー
2009526543.tif 000010
PCR反応の第1ラウンド
2×緩衝液I            25μl 
dNTP（2.5 mM）         8μl 
DNA                    1μl
プライマー（25μM） 
フォワード（BR5UTR4）  1μl 
リバース（BR3UTR2）    1μl 
TakaRa LA Taq          0.5μl 
水                     13.5μl
計                     50μl
プライマー
BR5UTR4 - BR3UTR2
PCRプログラム
94℃ - 5 min 
94℃ - 45 sec
57℃ - 30 sec    30サイクル
72℃ - 25 sec
72℃ - 5 min
生成物の予想サイズ
BR5UTR4 - BR3UTR2 - 430または784 bp
注：3C制限酵素（TaqI）はCCマーカー近傍の2種類の制限酵素部位のいずれかで切断するので、2種類のサイズの生成物が得られる。
PCR反応の第2ラウンド
2×緩衝液I            25μl 
dNTP（2.5 mM）         8μl
DNA                    2μl
プライマー（25μM） 
フォワード（BR5UTR3）  1μl 
リバース（BR3UTR1）    1μl 
TakaRa LA Taq          0.5μl 
水                     12.5μl
計                     50μl
プライマー
BR5UTR3 - BR3UTR1 
試料
混合液を48μl、第1ラウンド由来の各PCR反応液を2μl採取する。
PCRプログラム
94℃ - 5 min
94℃ - 45 sec
55℃ - 30 sec    25サイクル 
72℃ - 20 sec
72℃ - 5 min
生成物の予想サイズ
BR5UTR3 - BR3UTR1 - 260または564 bp
注：3C制限酵素（TaqI）はCCマーカー近傍の2種類の制限酵素部位のいずれかで切断するので、ここでは2種類のサイズの生成物が得られる。図9は、配列決定によって確認された564 bpのバンドを示す。
【００９７】
PSA
3C制限酵素 - TaqI
PSAプライマー
2009526543.tif 000011
PCR反応の第1ラウンド
2×緩衝液I            25μl 
dNTP（2.5 mM）         8μl
DNA                    1μl 
プライマー（25μM） 
フォワード（PR5UTR2）  1μl
リバース（PF3UTR2）    1μl 
TakaRa LA Taq          0.5μl
水                     13.5μl
計                     50μl
プライマー
PR5UTR2 - PF3UTR2 
PCRプログラム
94℃ - 5 min
94℃ - 45 sec 
61℃ - 30 sec    30サイクル
72℃ - 25 sec
72℃ - 5 min
生成物の予想サイズ
PR5UTR2 - PF3UTR2 - 481 bp
PCR反応の第2ラウンド
2×緩衝液I            25μl
dNTP（2.5 mM）         8μl
DNA                    2μl
プライマー（25μM）
フォワード（PR5UTR1）  1μl
リバース（PF3UTR1）    1μl
TakaRa LA Taq          0.5μl
水                     12.5μl
計                     50μl
プライマー
PR5UTR1 - PF3UTR1
試料
混合液を48μl、第1ラウンド由来の各PCR反応液を2μl採取する。
PCRプログラム
94℃ - 5 min
94℃ - 45 sec
61℃ - 30 sec      25サイクル
72℃ - 20 sec
72℃ - 5 min
生成物の予想サイズ 
PR5UTR1 - PF3UTR1 - 266 bp 
【００９８】
CCマーカーの詳細
MLH1
CC1 - TSSの24367 bp下流 
2009526543.tif 000012
CC2 - TSSの57357 bp下流 
2009526543.tif 000013
（太字の下線付き文字は、CCマーカー配列を表す。）
正常組織中においては、代替的転写産物によって遺伝子が発現する。1つのそのような転写産物は、CC1が存在する第8イントロンで開始され、CC2マーカーで終結する。卵巣癌組織中においては、不完全な転写産物をもたらすか転写産物を全く生じない変異、欠失、およびメチル化が蓄積するので、遺伝子はダウンレギュレートされる。本発明者らは、正常組織においてCC1とCC2の並列を見出したが、卵巣癌組織においては見られなかった。このことは、これらの組織における遺伝子の転写様式の転換に関連する。
【００９９】
BORIS
CC1 - TSSの5282 bp上流 
2009526543.tif 000014
CC2 - TSSの28038 bp下流 
2009526543.tif 000015
（太字の下線付き文字は、CCマーカー配列を表す。）
BORISは2つのCC部位を有するが、そのうちの一方は5'UTR中に、もう一方は3'UTR中に存在する。U2OS細胞中では、BORIS発現は予想されておらず、したがって、CCマーカーの並列も見られないはずである。ところが、ヒト前立腺癌細胞系（LNCaP）において、BORISが発現する。本発明者らは、CC1とCC2の並列をLNCaP中で見出したが、U2OS中では見られなかった。
【０１００】
PSA/KLK3
CC1 - TSSの408 bp上流
2009526543.tif 000016
CC2 - TSSの5843 bp下流
2009526543.tif 000017
（太字の下線付き文字は、CCマーカー配列を表す。）
KLK3は2つのCC部位を有するが、そのうちの一方は5'UTR近傍に、もう一方は3'UTR中に存在する。U2OS細胞中で、KLK3発現は予想されておらず、したがって、CCマーカーの並列も見られないはずである。ところが、良性前立腺肥大症細胞系（BPH-1）において、KLK3が発現する。したがって、CC1とCC2の並列がBPH-1では見られるが、U2OSでは見られない。
【０１０１】
参考文献
2009526543.tif 000018
2009526543.tif 000019
【０１０２】
CCマーカーおよびその検出の説明
パターン認識解析は、医学、工学、および言語学などの多様な研究分野に広く適用されており、ここで、画像解析およびデータ解読によって、複合系において根底にある特徴的なマーカーの同定が可能になる。本発明者らは、RNAポリメラーゼIIによってプロセシングされた転写単位に関してヒトゲノムデータを解析するために、パターン認識方法論を用いた。ヒト第22染色体上の手動解析された遺伝子422個由来の配列セットを、転写単位の境界上に存在する調節シグナルのコンピュータによる同定のために用いた。転写単位の3'末端におけるシグナルの同定について特に配慮した。これにより、インビボにおいてシグナルが終結特性を有することを確認したその後の実験との、機能的関連性が示された。
【０１０３】
境界において認められたパターンは複合シグナルを有しており、これは、以下の3つの重要局面を説明するXMLフォーマットで表される：
(a) 同定された各シグナルのDNAアルファベット；
(b) ガウス分布幅としての各シグナルの位置変化；
(c) パターン中の各シグナル間の距離（塩基対）。
【０１０４】
パターンが転写単位の境界上に見られたので、本発明者らはこれを「チェックポイント・チャーリー」（CC）マーカーと命名した。
【０１０５】
未知の配列上のCCマーカーは、「Scanner（スキャナ）」として識別される一連のコードを用いて同定することができる。Scannerは、ユーザによる3つのデータ入力を必要とする：
(a) 調査対象の配列；
(b) XMLフォーマットのパターン；
(c) 弱いCCマーカーを除外するためのストリンジェンシー係数（逆対数スコア）（例えばデフォルト値＝0.99）。
【０１０６】
Scannerは入力DNAを読み取り、配列内のパターンに適合させるよう試みる。これは、各塩基を基準点とすることによりDNA配列に沿って進むことによって、行われる。Scannerは基準点としての第1の塩基から開始し、XMLフォーマットで規定されるパターンに適合させるよう試みる。適合性の程度は、スコアによって測定される。このスコアがユーザによって与えられたストリンジェンシー係数よりも大きい場合に、CCマーカーが認められた。同定されたCCマーカーの位置は標準的GFFフォーマットで与えられ、Scannerは入力配列の第2の塩基へと移動する。
【０１０７】
Scannerが入力DNAおよびその相補鎖の全塩基を読み取るまで、このプロセスを繰り返す。
【０１０８】
CCマーカーパターンに対するこの走査の最終結果は、入力配列上の潜在的CCマーカー位置と共にその各スコアをGFFフォーマットで示したテキストファイルとなる。
【０１０９】
CCマーカー検出
所与の配列中のCCマーカー検出を説明するために、以下の配列を考慮されたい。
2009526543.tif 000020
【０１１０】
この配列を考えると、CCマーカーを見出すために左から右へと走査が実施される。ここで、50番目の塩基（下線）を基準点とする。この塩基がCCマーカーであるかどうかを判定するため、表1記載の4種類の重みのセットをこの配列にマッチさせる。単純にするために、4種類の重みのセット（同じく下線）が全て存在している例を示す。
【０１１１】
以前に記載したように、4種類の重みのセットは、基準点に対して、互いの間の相対距離を有する。例えば表1から、第1の重みのセットは、基準点に対して位置8で開始することがわかる。この第1の重みのセットは、この位置に現れる各タイプのヌクレオチドに対して19の位置価を有する。例えば、第1の位置に関して、グアニンは値0.19を得、チミンは0.33を得る。同様に、第2の位置に関して、グアニンは0.20を得、チミンは0.39を得る。第2のスコアを、第1のスコアと掛け合わせる。全19の位置価を読み取ってその前の値と掛け合わせるまで、これを繰り返す。
【０１１２】
本発明者らの例において、基準点に対して8番目の塩基で開始する
2009526543.tif 000021
を有する。したがって、この重みのセットに関するスコアは（0.33*0.39*0.34*0.35*0.41...）などである。
【０１１３】
他の3種類の重みのセットについても同様にこのプロセスを繰り返し、毎回、位置価を、これまでに計算した前の値と掛け合わせる。
【０１１４】
4種類の重みのセット全てに由来する最終スコアを、処理を容易にするために、指数値（逆対数）スコアに変換する。対数スコアは1.0/(1+e-X)に等しく、式中、Xは、表1の重みを用いて上記のプロセスによって得られるスコアである。この対数スコアが（例えば）0.90より大きい場合、該塩基はCCマーカーとみなされる。本発明者らの例において、全4種類の重みのセット由来の位置価を掛け合わせることで、逆対数スコア0.99999が得られた。この値は0.99より大きいので、50番目の塩基Aは、CCマーカー配列中に含まれる。配列中のその他の塩基の解析によって、CCマーカーとしての41〜56番目の塩基の配列の同定が可能になる（最終スコア0.99968）。
【０１１５】
インビボにおけるCCマーカー並列の検出に使用される方法
以下に記載される方法は、組織試料中のCCマーカー並列の検出における重要な段階を大まかに明らかにするものである。これは、患者に由来する冷凍組織試料を解析するための第一の開発された方法論である。
・ 組織試料をスライドガラス上でスライスして薄片にする。
・ 1 mlの氷冷1×PBSをスライドガラスに加え、5分間洗浄する。
・ 0.67Mパラホルムアルデヒドを加えてタンパク質とDNAを架橋させる。
・ ロッキングプラットフォーム上、室温で10分間インキュベーションする。
・ 1Mグリシンを加えて架橋反応をクエンチする。
・ 細胞をかき落とし、エッペンドルフチューブに細胞を移す。
・ 13,000 rpmで1分間遠心分離して、室温で細胞を回収する。
・ 上清を除去し、1 mlの氷冷低張緩衝液を加える。
・ 細胞を数回ピペッティングして、細かい細胞懸濁液にする（必要ならば、短時間の小規模なスピンを行う）。
・ 氷上で10分間インキュベーションし、細胞を膨潤させて核を出現させる。
・ 5,000 rpmで5分間、4℃で遠心分離を行い、核を回収する。
・ サイトゾル上清を排出し、1 mlのCSK緩衝液中で核ペレットを溶解させる。
・ 氷上で20分間インキュベーションする。
・ 5,000 rpmで5分間、4℃で遠心分離を行い、核を回収する。
・ 可能な限り上清を排出し、ペレットを保持する。
・ 核ペレットを2M NaCl中に溶解させる（溶液は粘性になる）。
・ 氷上で10分間インキュベーションする。
・ 試料を十分な水で希釈し、NaCl濃度を150 mMまで低下させる。
・ 10μlのPol II抗体（H-224）をエッペンドルフチューブに添加する。
・ 撹拌または回転させながら4℃で一晩インキュベーションする。
・ 約20μlの乾燥ビーズを得るために30μlのプロテインGセファロースビーズスラリーを採取する（必要ならばピペット先端を切断する）。
・ ビーズを回収するために2,000 rpmで3分間遠心分離する。
・ 1 mlのミリQ水で2回洗浄し、2,000 rpmで3分間遠心分離して、ビーズを回収する。
・ 1 mlの制限酵素洗浄緩衝液をビーズに加える。
・ ウェルを混合し、（必要ならば）別々のエッペンドルフチューブに分注し、洗浄して、2,000 rpmで3分間遠心分離し、ビーズを回収する。
・ ビーズと共に全内容物をエッペンドルフチューブに移し、ウェルを混合する。
・ 撹拌または回転させながら4℃で1時間インキュベーションする。
・ 4℃で3分間、1000rpmでスピンを行い、上清を除去する。未結合画分について上清を解析してもよい。
・ 1 mlの制限酵素洗浄緩衝液を加え、4℃で5分間回転させ、2000 rpmで3分間、4℃で遠心分離する。上清を除去する。
・ 1 mlの制限酵素洗浄緩衝液を加え、4℃で5分間回転させ、2000 rpmで3分間、4℃で遠心分離する。上清を除去する。
・ 1 mlの制限酵素洗浄緩衝液を加え、4℃で5分間回転させ、2000 rpmで3分間、4℃で遠心分離する。上清を除去する。
・ ビーズおよび残った制限酵素緩衝液の量を計量し、以下を加える：
・ 制限酵素緩衝液  1× 
・ 制限酵素        30〜60ユニット
・ 水              100μl反応用に可変
・ 37℃で一晩インキュベーションすることによってDNAを消化する。
・ 65℃で10分間インキュベーションして、制限酵素消化を停止させる。
・ > 200μg/mlのRNase Aを緩衝液に加える。
・ 37℃で30分間インキュベーションする。
・ 400μlのミリQ水を加えて制限酵素反応液を希釈する。
・ 以下を加える：
・ ライゲーション緩衝液  1×
・ T4 DNAリガーゼ        30ユニット
・ 水                    100μl反応用に可変
・ 16℃で4時間インキュベーションする。
・ 65℃で一晩インキュベーションして、架橋を転換する。
・ 450μgのプロテイナーゼKを各試料に加える。
・ 42℃で1時間インキュベーションして、タンパク質を消化する。
・ 660μlのフェノール、pH7.9（等量）を各試料に加えて、ボルテックスにかける。
・ 13,000 rpmで10分間遠心分離する。
・ 上清を1.5 mlエッペンドルフチューブに移す。
・ 0.3 MのNaClおよび0.5μgのグリコゲンを加える。
・ ウェルを混合し、1 mlの氷冷エタノールを加える。
・ -80℃で1時間、DNAを沈降させる。
・ 14,000 rpmで20分間、4℃で遠心分離する。
・ 10μlのRNase非含有水中で、DNAペレットを再懸濁する。
・ 各試料用のTaKaRa PCR反応液を準備する：
・ PCR緩衝液            1×
・ dNTP                  各NTP 200μM
・ DNA                   1μl
・ フォワードプライマー  0.5μM
・ リバースプライマー    0.5μM
・ TakaRa LA Taq         2.5ユニット
・ 水                    50μl反応用に可変
・ 2%アガロースゲル中で試料を流す。
【０１１６】
【表１】
2009526543.tif 000022
2009526543.tif 000023
2009526543.tif 000024
2009526543.tif 000025
2009526543.tif 000026
2009526543.tif 000027
2009526543.tif 000028
【０１１７】
【表２】
2009526543.tif 000029
2009526543.tif 000030
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】パターン認識アルゴリズムによるRNAPII転写単位に関するマーカーの同定を示す。(A) マーカーモデルのトレーニングおよびテストに関するスキーム。収束モデルが得られるまで、103サイクルの間、注釈付きヒト遺伝子422個をサンプリングし、試験して、フィードバックする。遺伝子の3'において、コンセンサスには、明確なポリ(A)シグナルおよびU-リッチコンセンサス部位に沿って、今まで未知であった複合パターンのシグナルであるチェックポイント・チャーリーが含まれた。(B) ヒトβグロビン遺伝子の3'端において、CCマーカー（ガウス分布で記されている）は、U-リッチ部位の下流に存在し、以前記載されたCoTC部位に対応する。グラフは、その隣接配列と比較した、CC/CoTC部位におけるエネルギー価の低下を示す（グレーで強調）。(C) キイロショウジョウバエのX染色体上で、CCマーカー（ガウス分布）は、7B2バンド内のgypsyインスレーターと一致する。CC予測の密度は、Su（Hw）結合部位と関連する。以前の研究では、cut遺伝子座の周りのループの形成に並列する、染色体バンド7B2および7B8におけるgypsyエレメントを示している。
【図２】モデル遺伝子の発現調節を示す。(A) hDHFR遺伝子からの転写は、メジャープロモーターおよびマイナープロモーター上で、細胞周期依存的様式で調節される。静止細胞中では、上流のマイナープロモーターから短い転写産物が開始される。10% FCS (1) の存在下で増殖させて0.5% FCSの存在下で接触阻害状態としたU2OS細胞の蛍光活性化細胞選別（FACS）を、実験において用いた。各条件下におけるG0、G2/M、S、およびG1細胞のパーセンテージを図に示す。以前の報告と一致して、静止細胞（レーン4）と比較した増殖細胞（レーン3）におけるDHFR mRNAの蓄積が、ノーザンブロッティングによって確認される。増殖細胞（レーン5）および静止細胞（レーン6）における、マイナープロモーターから開始された転写産物のリアルタイムRT-PCR解析。示された値は、3回の独立した実験から計算される。(B) 全長hCALCRL転写産物は、内皮細胞（HMVEC、レーン1）においてしか産生されず、非内皮細胞（HEK293T、レーン2）においては産生されない。第1エキソンからの3'RACEによって検出されたとおり、短い非コード転写産物が両細胞型において存在する（レーン3：内皮細胞、レーン4：非内皮細胞）。受容体発現はインビボにおいて内皮細胞に制限され（黒色の矢印）、上皮細胞や間質細胞ではみられない（白色の矢印）ことが、免疫化学により確認されている。
【図３】CCマーカーの終結特性を示す。(A) ヒトDHFR遺伝子は3種類のCCマーカーを含む（中実の三角）。マーカーの転写終結特性は、スキームに示したRT-PCRによって分析した。リバースプライマー（B、C）は、被験CCマーカー位置の前または後にある。CCDHFR-2はその条件下でしか終結特性の調節を示さなかったので、CCDHFR-2に関するRT-PCRは静止細胞において分析した。Zukerアルゴリズムを用いた折りたたみの自由エネルギーに関するプロファイルは、3種類のCCマーカー全てについて値の低下を示す（グレーで強調）。(B) ヒトCALCRL遺伝子構造は3種類のCCマーカーを含む（黒色の三角）。hCALCRL中のCCマーカー（CCCALCRL-1、CCCALCRL-2、およびCCCALCRL-3）もまた、転写終結の可能性を示す。第1エキソンからの5'RACEによって、全転写産物がCCCALCRL-1の下流から発生することが確認され、全ての潜在的遺伝子間転写産物の終結に成功する。CCCALCRL-2およびCCCALCRL-3における転写終結の証拠は、3'RACEによって確認された。RACE転写産物のアクセッション番号を、括弧内に示す。下方パネルにおいて、グラフは、各hCALCRL CCマーカーに関する折りたたみの自由エネルギーの低下を示す（グレーで強調）。
【図４】CCマーカーの染色体立体構造特性を示す。(A) 統合された（integrated）3Cアッセイ法を、増殖条件下および静止条件下でhDHFR遺伝子上のCC部位に対して実施した。対照は、RNAPIIの架橋、制限酵素切断、ライゲーション、PCR、および、免疫沈降による濃縮に対するアッセイ法の完全な依存を示す。増殖細胞においては、hDHFR遺伝子内の部位CCDHFR-1とCCDHFR-3の間（レーン1+3）では空間的近接が検出されるが、CCDHFR-1とCCDHFR-2の間（レーン1+2）では検出されない。静止細胞においては、部位CCDHFR-1とCCDHFR-2の間（レーン1+2）でも、空間的近接が検出される。試験された条件下での3Cアッセイ法により検出された、可能性のある立体構造の模式図。(B) 統合された3Cアッセイ法は、内皮細胞系および非内皮細胞系におけるhCALCRL遺伝子上のCC部位について実施した。対照は、架橋、制限酵素切断、ライゲーション、PCR、および、免疫沈降によるRNAPIIの濃縮に対するアッセイ法の完全な依存を示す。内皮細胞においては、CCCALCRL-1、CCCALCRL-2、およびCCCALCRL-3の間で相互作用が検出されたが、これは、全マーカーを並列させる立体構造を示す（レーン1+2および1+3、スキームを参照されたい）。非内皮細胞においては、CCCALCRL-1とCCCALCRL-2の間の相互作用しか検出できず（レーン1+2、スキームを参照されたい）、CCCALCRL-1とCCCALCRL-3の間の相互作用は、内皮細胞中の全長増殖性転写に固有であった。
【図５】その他の生物におけるチェックポイント・チャーリー予測を示す。ヒト遺伝子422個に対してトレーニング済みのモデルは、その他の種においてCCマーカー（赤色の三角）を同定する。RGF3の場合、単一のCCマーカーが2つの注釈付き遺伝子を隔て、一方の遺伝子に対する3'マーカーおよび他方に対する5'マーカーとしてはたらくことに留意されたい。エキソンおよびイントロンはそれぞれ、緑色およびグレーの四角で表す。中実の線は、遺伝子間配列を表す。
【図６】3Cアッセイ法を用いる染色体立体構造検出の原理を示す。
【図７】腎癌診断のためのc-mycの分類を示す。CCマーカー1および2は、P0プロモーターを囲むように配置される。P0を隔離しP0からの開始を阻害するがP1、P2からの開始は阻害しない、閉じた構造の形成が、CC1-CC2の並列によって引き起こされる。組織試料における立体構造的並列CC1-CC2の解析によって特定のPCR生成物の存在が示され、これによって、正常組織（N1〜3）には存在しないが腎腫瘍患者（T1〜3）に存在する立体構造が確認される。非関連遺伝子であるカルシトニン受容体様受容体（CRLR）における安定な立体構造の存在について、全試料を独立に試験した。この立体構造は全組織中に存在し、アッセイ法の内部対照としてはたらく（対照として示す）。
【図８】mlh1による卵巣癌の染色体立体構造プロファイリングを示す。
【図９】前立腺細胞系における立体構造的調節解除を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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