(57)【要約】  本発明は，インフルエンザＡの存在を簡便に，特異的におよび／または高感度で試験するためのオリゴヌクレオチドを提供する。特に，本発明は，インフルエンザＡサブタイプＨ５Ｎ１のためのプライマー，プローブおよび／または試験を提供する。試験において有用なプローブおよび／またはプライマーを含むキットも提供される。
2009515551.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，それらのフラグメント，それらの誘導体，それらの変異体，およびそれらの相補的配列からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドは，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，それらのフラグメント，それらの誘導体，それらの変異体，およびそれらの相補的配列からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を本質的に含む，請求項１記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドは，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，それらのフラグメント，それらの誘導体，それらの変異体およびそれらの相補的配列，およびそれらの相補的配列からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列からなる，請求項１または２に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号２３を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号２１の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項１−３のいずれかに記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号２３を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号３０および配列番号３１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項１−４のいずれかに記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号２４を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号２２の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項１−３のいずれかに記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号２４を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号３２および配列番号３３からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項１−３および６のいずれかに記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号２５を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号１６の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項１−３のいずれかに記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号２５を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号３４を含む少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項１−３および８のいずれかに記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号２６を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号１７の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項１−３のいずれかに記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号２６を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号３５および配列番号３６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項１−３および１０のいずれかに記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号２７を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号１８の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項１−３のいずれかに記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号２７を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号３７−４４からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項１−３および１２のいずれかに記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号２８を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号１９の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項１−３のいずれかに記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号２８を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号４５−４８からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項１−３および１４のいずれかに記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号２９を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号２０の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項１−３のいずれかに記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号２９を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号４９−５０からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項１−３および１６のいずれかに記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
配列番号４，配列番号５，配列番号８，配列番号９，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは，配列番号６および／または配列番号７のヌクレオチド配列またはその一部を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに結合および／またはハイブリダイズすることができる，請求項１−１７のいずれかに記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
配列番号４，配列番号５，配列番号８，配列番号９，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは，配列番号６，配列番号７および／またはインフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプから抽出，精製および／または増幅された核酸の一部から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに結合および／またはハイブリダイズすることができる，請求項１−１８のいずれかに記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
生物学的サンプルにおけるインフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプの存在を判定する方法であって，
（ａ）  生物学的サンプルを用意し；
（ｂ）  少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを，生物学的サンプル中の少なくとも１つの核酸と接触させ，またはオリゴヌクレオチドを生物学的サンプルから抽出，精製，および／または増幅された少なくとも１つの核酸と接触させ，ここで，オリゴヌクレオチドは，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，それらのフラグメント，それらの誘導体，それらの変異体，およびそれらの相補的配列からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み；
そして
（ｃ）  工程（ｂ）における接触から生じた結合を検出し，ここで，結合の検出はインフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプの存在を示す，
の各工程を含む方法。
【請求項２１】
配列番号２３を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号２１の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
配列番号２３を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号３０および配列番号３１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
配列番号２４を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号２２の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
配列番号２４を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号３２および配列番号３３からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項２０または２３に記載の方法。
【請求項２５】
配列番号２５を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号１６の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
配列番号２５を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号３４を含む少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項２０または２５に記載の方法。
【請求項２７】
配列番号２６を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号３５および配列番号３６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項２０記載の方法。
【請求項２８】
配列番号２７を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号１８の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項２０記載の方法。
【請求項２９】
配列番号２７を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号３７−４４からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項２０または２８に記載の方法。
【請求項３０】
配列番号２８を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号１９の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項２０記載の方法。
【請求項３１】
配列番号２８を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号４５−４８からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項２０または３０に記載の方法。
【請求項３２】
配列番号２９を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号２０の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項２０記載の方法。
【請求項３３】
配列番号２９を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号４９および５０からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項２０または３２に記載の方法。
【請求項３４】
工程（ｃ）における検出は，未結合オリゴヌクレオチドと核酸に結合したオリゴヌクレオチドとを区別することを含む，請求項２０−３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
オリゴヌクレオチドは，マイクロビーズに固定化されている，請求項２０−３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
オリゴヌクレオチドはプローブであり，該方法は，
（ｉ）  生物学的サンプルを用意し；
（ｉｉ）  生物学的サンプル中の，またはサンプルから抽出，精製または増幅された少なくとも１つの核酸を少なくとも１つのレポーター標識で標識し；
（ｉｉｉ）  少なくとも１つのプローブを，少なくとも１つの蛍光染料を含む少なくとも１つのマイクロビーズに固定化し，；
（ｉｖ）  少なくとも１つのプローブを，少なくとも１つの核酸と接触させて，プローブと核酸の結合が生じるようにし；
（ｖ）  第１のレーザー光を用いて，少なくとも１つの蛍光染料の蛍光強度に基づいてマイクロビーズを識別し，第２のレーザー光を用いて，識別されたマイクロビーズに固定化されたプローブに対する核酸の結合をレポーター標識に基づいて検出し，ここで，核酸のプローブへの結合が検出されることは，インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプの存在を示す，
ことを含む，請求項２０−３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つのマイクロビーズは少なくとも２つの蛍光染料を含む，請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも２つの蛍光染料は，少なくとも２つの蛍光染料の蛍光強度に基づいて１つのマイクロビーズを別のマイクロビーズから区別することを可能とする，請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
工程（ｉｉ）における少なくとも１つの核酸の標識は，工程（ｉｖ）における接触の後に行われる，請求項３６−３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
工程（ｃ）の検出は，懸濁アレイ技術を用いることにより行われる，請求項３６−３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
工程（ｂ）における接触は，プライマー対を形成する少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを核酸に接触させることを含み，工程（ｃ）の検出はポリメラーゼ連鎖反応により行われる，請求項２０−３４のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
検出は，ポリメラーゼ連鎖反応から得られた少なくとも１つのアンプリコンの分子量を測定することにより行われる，請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
検出は，少なくとも１つのプローブが，ポリメラーゼ連鎖反応から得られた少なくとも１つのアンプリコンに結合することにより行われる，請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
プライマー対は，核酸に結合して，配列番号６の配列を含む少なくとも１つのアンプリコンを増幅し，プライマー対は，配列番号２５のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのフォワードプライマー，および配列番号２６のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのリバースプライマーを含む，請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４５】
フォワードプライマーは，配列番号３４のヌクレオチド配列を含む，請求項４１−４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
リバースプライマーは，配列番号３５および配列番号３６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む，請求項４１−４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
プライマー対は，核酸に結合して，配列番号７の配列を含む少なくとも１つのアンプリコンを増幅させ，プライマー対は配列番号１８のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのフォワードプライマー，および配列番号１９のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのリバースプライマーを含む，請求項４１−４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
フォワードプライマーは，配列番号３７−４４からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む，請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
リバースプライマーは，配列番号４５−４８からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む，４７または４８に記載の方法。
【請求項５０】
配列番号４９および５０からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むプローブはアンプリコンに結合しうる，請求項４７−４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
ポリメラーゼ連鎖反応の後に，アンプリコンの検出および／または精製のために電気泳動を行う，請求項４１−５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
工程（ｂ）における接触および／または工程（ｃ）における結合は，オリゴヌクレオチドまたはプローブと核酸との間に特異的な接触または結合が生ずるのに十分な時間および条件下で行われる，請求項４１−５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
生物学的サンプルは，インフルエンザＢウイルスに感染していることが疑われるヒトまたは非ヒト動物に由来する，請求項２０−５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
オリゴヌクレオチドは標識されている，請求項２０−５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
核酸は標識されている，請求項２０−４０および５０−５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
インフルエンザＢウイルスを検出するためのキットであって，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，それらのフラグメント，それらの誘導体，それらの変異体，およびそれらの相補的配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項５７】
配列番号２３を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号２１の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項５５記載のキット。
【請求項５８】
配列番号２３を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号３０および配列番号３１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項５６または５７に記載のキット。
【請求項５９】
配列番号２４を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号２２の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項５６記載のキット。
【請求項６０】
配列番号２４を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号３２および配列番号３３からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項５６または５９に記載のキット。
【請求項６１】
配列番号２５を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号１６の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項５６記載のキット。
【請求項６２】
配列番号２５を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号３４を含む少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項５６または６１に記載のキット。
【請求項６３】
配列番号２６を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号３５および配列番号３６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項５６記載のキット。
【請求項６４】
配列番号２７を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号１８の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項５６記載のキット。
【請求項６５】
配列番号２７を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号３７−４４からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項５６または６４に記載のキット。
【請求項６６】
配列番号２８を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号１９の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項５６記載のキット。
【請求項６７】
配列番号２８を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号４５−４８からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項５７または６８に記載のキット。
【請求項６８】
配列番号２９を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号２０の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項５５記載のキット。
【請求項６９】
配列番号２９を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号４９および５０からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項５６または６８に記載のキット。
【請求項７０】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが標識されている，請求項５６−６９のいずれかに記載のキット。
【請求項７１】
さらに，少なくとも１つのマイクロビーズ，少なくとも１つの蛍光染料および／または少なくとも１つのレポーター標識を含む，請求項５６−７０のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，インフルエンザＡウイルス感染を検出するためのオリゴヌクレオチド，方法およびキットに関する。特に，本発明は，インフルエンザＡウイルスのサブタイプＨ５Ｎ１を検出するための核酸アッセイを提供する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザＡは，インフルエンザウイルスのＡ型株により引き起こされる動物の感染性疾病であり，これは通常は鳥類に感染し，ブタにはあまり感染しない。インフルエンザＡウイルスには多くのサブタイプがある。これらのサブタイプは，ヘマグルチニン（ＨＡ）セグメント４（１４の変種がある）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）セグメント６（９の変種がある）に基づく。毒性を引き起こすのはウイルスのこれらの２つのセグメントである。インフルエンザＡはオルトミクソウイルスに分類されるＲＮＡウイルスである。
【０００３】
インフルエンザＡサブタイプのうち，Ｈ５Ｎ１は，急速に変異し，高度に病原性であることが示されており，ヒトにおいて重篤な病気を引き起こしうるため，特に懸念されている。
【０００４】
インフルエンザＡサブタイプＨ５Ｎ１または鳥インフルエンザの広まりおよび衝撃は，十分に立証されている。鳥インフルエンザは南東アジアから中国の一部およびロシアに広がり，現在はトルコおよびルーマニアなどのヨーロッパ諸国に広がっている。ヒトの鳥インフルエンザの症例は，香港，インドネシア，ベトナム，カンボジアおよびタイで確認されている。
【０００５】
インフルエンザＡウイルス感染を検出するための現在の実験室の方法は，一般に，抗原の検出，培養細胞における単離，またはリバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によるインフルエンザ特異的ＲＮＡの検出を含む。
【０００６】
規定されたプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ手法を用いることにより，ウイルスの検出ならびにサブタイプの識別が可能である。１９９７年のインフルエンザＡウイルスＨ５Ｎ１株の発生の間に，インフルエンザＡサブタイプＨ５Ｎ１または鳥インフルエンザ用のＰＣＲプライマーが香港大学により設計されている。しかし，インフルエンザＡサブタイプは変異しやすく，したがって，Ｈ５Ｎ１配列から選択された検出配列が変化する確率が高い。このため，現在利用可能な検出方法のいずれも，検出の感度および特異性が低下するかもしれない。
【０００７】
現在利用可能な試験は，簡便な検出方法としては十分に高い感度および特異性をもっていない。インフルエンザＡサブタイプＨ５Ｎ１または鳥インフルエンザについて擬陽性の結果となるリスクは，実際には，他の類似するまたは関連するサブタイプに起因するものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって，インフルエンザＡウイルス感染の特異的かつ感度の高い検出方法が求められている。特に，サブタイプＨ５Ｎ１または鳥インフルエンザに特異的な検出方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は，生物学的サンプル，または生物学的サンプルから単離および／または精製された生物学的材料におけるインフルエンザ型のウイルスの存在または不存在を判定するための方法およびキットに関する。
【００１０】
本発明は，簡便な，感度の高い，および／または特異的な診断試験を提供する。本明細書に記載されるプローブおよび／またはプライマーを用いることにより，本発明の方法および／またはキットは，従来技術の検出方法より感度および／または特異性が高くなる。このような試験は，懸濁アレイ技術によって行うことができる。あるいは，このような試験は，１工程ＰＣＲ法または２工程ＰＣＲ法により行うことができる。
【００１１】
本発明は，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，それらのフラグメント，それらの誘導体，それらの変異体，およびそれらの相補的配列からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。特に，本発明は，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，それらのフラグメント，それらの誘導体，それらの変異体，およびそれらの相補的配列からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を本質的に含む単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。より詳細には，本発明は，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，それらのフラグメント，それらの誘導体，それらの変異体およびそれらの相補的配列，およびそれらの相補的配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。単離されたオリゴヌクレオチドは，配列番号３０−５４からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことができる。
【００１２】
したがって，本発明は，配列番号２１を含む少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。単離されたオリゴヌクレオチドは，配列番号３０および配列番号３１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことができる。
【００１３】
したがって，本発明は，配列番号２２を含む少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。単離されたオリゴヌクレオチドは，配列番号３２および配列番号３３からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことができる。
【００１４】
したがって，本発明は，配列番号１６を含む少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。単離されたオリゴヌクレオチドは，配列番号３４の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことができる。
【００１５】
したがって，本発明は，配列番号２６を含む少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。単離されたオリゴヌクレオチドは，配列番号３５および配列番号３６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことができる。
【００１６】
したがって，本発明は，配列番号１８を含む少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。単離されたオリゴヌクレオチドは，配列番号３７−４４からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことができる。
【００１７】
したがって，本発明は，配列番号１９を含む少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。単離されたオリゴヌクレオチドは，配列番号４５−４８からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことができる。
【００１８】
したがって，本発明は，配列番号２０を含む単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。単離されたオリゴヌクレオチドは，配列番号４９および５０からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことができる。
【００１９】
したがって，本発明は，配列番号９を含む少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。単離されたオリゴヌクレオチドは，配列番号５１および５２からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことができる。
【００２０】
本発明はまた，生物学的サンプルにおけるインフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプの存在を判定する方法を提供し，この方法は以下の各工程を含む：
（ａ）  生物学的サンプルを用意し；
（ｂ）  少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを生物学的サンプル中の少なくとも１つの核酸と接触させ，またはオリゴヌクレオチドを生物学的サンプルから抽出，精製，および／または増幅された少なくとも１つの核酸と接触させ，ここで，オリゴヌクレオチドは，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，それらのフラグメント，それらの誘導体，それらの変異体，およびそれらの相補的配列からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み；そして
（ｃ）  工程（ｂ）における接触により生じた結合を検出し，ここで，結合が検出されることは，インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプの存在を示す。
【００２１】
オリゴヌクレオチドは，配列番号３０−５４からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことができる。工程（ｃ）における検出は，未結合オリゴヌクレオチドと核酸に結合したオリゴヌクレオチドとを区別することを含んでいてもよい。
【００２２】
オリゴヌクレオチドは，粒子，例えばマイクロビーズに固定化してもよい。オリゴヌクレオチドはプローブであってもよく，この方法は，
（ｉ）  生物学的サンプルを用意し；
（ｉｉ）生物学的サンプル中の，またはサンプルから抽出，精製または増幅された少なくとも１つの核酸を少なくとも１つのレポーター標識で標識し；
（ｉｉｉ）  少なくとも１つのプローブを少なくとも１つの蛍光染料を含む少なくとも１つのマイクロビーズに固定化し；
（ｉｖ）  少なくとも１つのプローブを少なくとも１つの核酸と接触させて，プローブが核酸に結合するようにし；
（ｖ）  第１のレーザー光を用いて少なくとも１つの蛍光染料の蛍光強度に基づいてマイクロビーズを識別し，識別されたマイクロビーズに固定化されたプローブへの核酸の結合を，第２のレーザー光を用いてレポーター標識に基づいて検出し；
ここで，核酸のプローブへの結合の検出は，インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプの存在を示す，
の各工程を含む。
【００２３】
少なくとも１つの粒子（例えば，マイクロビーズ）は，少なくとも２つの蛍光染料を含むことができる。少なくとも２つの蛍光染料は，１つのマイクロビーズを，少なくとも２つの蛍光染料の蛍光強度に基づいて別のマイクロビーズから区別することを可能とする。工程（ｉｉ）における少なくとも１つの核酸の標識は，工程（ｉｖ）の接触の後に行うことができ，工程（ｃ）の検出は懸濁アレイ技術を用いて行うことができる。
【００２４】
本発明の１つの観点にしたがえば，工程（ｂ）における接触は，プライマー対を形成する少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを核酸と接触させることを含んでいてもよく，工程（ｃ）の検出は，ポリメラーゼ連鎖反応によって行うことができる。特に，検出は，ポリメラーゼ連鎖反応により得られた少なくとも１つのアンプリコンの分子量を測定することにより行うことができる。より詳細には，検出は，ポリメラーゼ連鎖反応から得られた少なくとも１つのアンプリコンへの少なくとも１つのプローブの結合により行うことができる。
【００２５】
プライマー対は，核酸に結合し，配列番号６の配列を含む少なくとも１つのアンプリコンを増幅することができる。プライマー対は，配列番号２５のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのフォワードプライマーと，配列番号２６のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのリバースプライマーとを含むプライマー対であることができる。特に，フォワードプライマーは，少なくとも配列番号３４のヌクレオチド配列を含むことができ，リバースプライマーは，配列番号３５および配列番号３６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことができる。
【００２６】
プライマー対は，核酸に結合し，配列番号７の配列を含む少なくとも１つのアンプリコンを増幅することができる。プライマー対は，配列番号１８のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのフォワードプライマーと，配列番号１９のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのリバースプライマーとを含むプライマー対であることができる。特に，フォワードプライマーは，配列番号３７−４４からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことができ，リバースプライマーは，配列番号４５および配列番号４８からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことができる。配列番号４９および５０からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含むプローブはアンプリコンに結合することができる。
【００２７】
プライマー対は，核酸に結合し，配列番号７のＮＡ−３００遺伝子の少なくとも１つの部分を増幅することができる。プライマー対は，配列番号８のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのフォワードプライマーおよび配列番号９のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのリバースプライマーを含むプライマー対であってもよい。特に，リバースプライマーは，配列番号５１および配列番号５２からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことができる。配列番号６０を含むプローブはアンプリコンに結合することができる。
【００２８】
ポリメラーゼ連鎖反応の後に電気泳動を行って，アンプリコンを検出および／または精製することができる。
【００２９】
本発明の方法にしたがえば，工程（ｂ）における接触および／または工程（ｃ）における結合は，オリゴヌクレオチド（例えばプローブ）と核酸との間に特異的接触または結合が生ずるのに十分な時間および条件下で行う。
【００３０】
生物学的サンプルは，インフルエンザＢウイルスに感染していると疑われるヒトまたは非ヒト動物から得たものであってもよい。オリゴヌクレオチドを標識してもよい。核酸を標識してもよい。
【００３１】
本発明はまた，インフルエンザＢウイルスを検出するためのキットを提供し，このキットは，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，それらのフラグメント，それらの誘導体，それらの変異体，およびそれらの相補的配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。特に，オリゴヌクレオチドは，配列番号３０−５４からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことができる。少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを標識することができる。懸濁アレイ技術により検出するためのキットは，少なくとも１つのマイクロビーズ，少なくとも１つの蛍光染料および／または少なくとも１つのレポーター標識を含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
図面の簡単な説明
図１は，本発明のキット２のプライマーの，他のインフルエンザＡサブタイプと比較してＨ５Ｎ１サブタイプに対する特異性を示すゲルを示す。レーン１はマーカーであり，レーン２はＨ５Ｎ１（−１）Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｖｉｅｔｎａｍ／８／２００４（ＨＰＡＩ）であり，レーン３はＨ５Ｎ３（−１）Ａｔｅｒｎ／Ａｕｓｔｒａｌｉａ／７５／（ＬＰＡＩ）であり，レーン４はＨ７Ｎ３（−１）Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ／１９９４（ＨＰＡＩ）であり，レーン５はＨ７Ｎ７（−１）Ａ／ｄｕｃｋ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／１９７６（ＬＰＡＩ）である。ＮＡの配列番号７を含む領域を増幅するプライマーは約３００ｂｐであることができ，ＨＡの配列番号１０を含む領域を増幅するプライマーは約１６８ｂｐであることができ，ＨＡの配列番号１を含む領域を増幅するプライマーは約１１４ｂｐであることができる。
【００３３】
図２は，本発明にしたがうプライマーを用いて達成されるインフルエンザＡサブタイプＨ５Ｎ１の検出の感度を示す。負荷したサンプルあたりのウイルスコピー数は反応あたり５００コピーから反応あたり０．５コピーまで変化させた。レーン１はマーカーであり，レーン２および３は５μｌあたり５００コピーのウイルスを含み，レーン４および５は５μｌあたり５０コピーのウイルスを含み，レーン６および７は５μｌあたり５コピーのウイルスを含み，レーン８および９は５μｌあたり０．５コピーのウイルスを含み，レーン１０は無関係のウイルスの陰性対照を含む。陽性ＤＮＡ対照は，対応するアンプリコンに由来する個々にクローニングしたＤＮＡから調製した。
【００３４】
図３は，本発明のキット３のプライマーの，他のインフルエンザＡサブタイプと比較してＨ５Ｎ１サブタイプに対する特異性を示すゲルを示す。レーン１はマーカーであり，レーン２はＨ５Ｎ１（−１）Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｖｉｅｔｎａｍ／８／２００４（ＨＰＡＩ）であり，レーン３はＨ５Ｎ３である。ＮＡの配列番号７を含む領域を増幅するプライマーは，約３００ｂｐであることができ，ＨＡの配列番号１を含む領域を増幅するプライマーは約１９５ｂｐであることができる。
【００３５】
発明の詳細な説明
本明細書において用いられるいくつかの用語を以下に明確性の目的のために定義する。当該技術分野においてよく知られる一般的な分子生物学的方法および手法であって，ここに特に記載されないものは，例えば，Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１などの教科書に見いだすことができる。この書籍はまた，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ．ｃｏｍ／においてオンライン参照することができる。
【００３６】
定義
ヌクレオチド：ヌクレオチドとしては，限定されないが，糖に連結された塩基を含むモノマー，例えば，ピリミジン，プリンまたはこれらの合成類似体，またはペプチド核酸（ＰＮＡ）におけるもののようなアミノ酸に連結された塩基が含まれる。ヌクレオチドはポリヌクレオチド中の１つのモノマーである。ヌクレオチド配列とは，ポリヌクレオチド中の塩基の配列を表す。
【００３７】
ポリヌクレオチド：ポリヌクレオチドとは，任意の長さの核酸配列（直鎖状の配列等）である。したがって，ポリヌクレオチドには，オリゴヌクレオチド，および染色体に見いだされる遺伝子配列が含まれる。"オリゴヌクレオチド"とは，天然のホスホジエステル結合により連結された複数のヌクレオチドである。オリゴヌクレオチド類似体とは，オリゴヌクレオチドと同様に機能するが天然に生じない部分を有する成分を表す。例えば，オリゴヌクレオチド類似体は，天然に生じない部分，例えば変更された糖成分または糖間結合を含んでいてもよく，例えば，ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドが挙げられる。天然に生ずるポリヌクレオチドの機能的類似体は，ＲＮＡまたはＤＮＡに結合することができ，ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子を含む。ポリヌクレオチドはポリ核酸とも称され，これらの２つの用語は互換的に用いられる。"ポリ核酸"との用語は，ＲＮＡまたはＤＮＡ，ならびにＲＮＡまたはＤＮＡに対応したまたはこれに相補的なｍＲＮＡおよびｃＤＮＡを表す。本発明にしたがえば，“ポリヌクレオチドとの用語はまた，ペプチド核酸（ＰＮＡ）を包含する。"遺伝子"との用語は，ペプチド，プレペプチド，蛋白質またはマーカーをコードするポリ核酸のセンスおよびアンチセンス鎖の両方，またはそのようなポリ核酸を含むベクターまたはプラスミドを含み，ただし，通常はセンス鎖の配列のみが示される。ポリヌクレオチドのフラグメントとは，長さのより短いポリヌクレオチドである。
【００３８】
ヌクレオチド配列の多義性：ヌクレオチド配列においては，数個のヌクレオチドが時間とともに変化するかまたは変異するかもしれない。そのような変化または変異においては，元のヌクレオチドは別のもので置き換えられているかまたは置換されており，特に１つのプリンが別のプリンと，または１つのピリミジンが別のピリミジンと置き換えられている。しかし，１つのプリンがピリミジンで置き換えられていてもよく，その逆でもよい。ヌクレオチド位置があいまいであり，１またはそれ以上のヌクレオチドにより表すことができる場合には，当業者によく知られ，本明細書の配列表に示される標準化された記号または文字を用いる。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＩＵＰＡＣ；Ｃｏｒｎｉｓｈ−Ｂｏｗｄｅｎ（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３０２１−３０３０）により提唱されているそのような記号または文字は（大文字でも小文字でも）次のとおりであり，これはＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５添付書類２，表１にも対応している。
ＩＵＰＡＣヌクレオチド多義コード
【表１】
2009515551.tif 000003
【００３９】
プライマー：プライマーとは，短い核酸，例えば２またはそれ以上のヌクレオチドの長さ，例えば，６，９８または１０ヌクレオチドの長さのＤＮＡオリゴヌクレオチドであり，これは核酸ハイブリダイゼーションにより相補的な標的ＤＮＡ鎖とアニーリングして，プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間にハイブリッドを形成し，次にＤＮＡポリメラーゼ酵素により標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長する。プライマー対は，例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当該技術分野において知られる他の核酸増幅方法により，核酸配列を増幅するために用いることができる。
【００４０】
本明細書において用いる場合，プローブおよび／またはプライマーは，例えば，特定の蛋白質をコードすることが示されている核酸配列の少なくとも１０ヌクレオチドを含む。しかし，プローブおよび／またはプライマーは，１０ヌクレオチド未満であってもよい。
【００４１】
ポリヌクレオチド，ポリ核酸，プローブおよび／またはプライマーはある種の配列を有する。本発明にしたがって興味深い配列は下記に記載される。ある長さの２つのポリヌクレオチド，ポリ核酸，プローブまたはプライマーが同じ配列をもつ場合，これらは同じ配列を有すると言われる。しかし，本発明にしたがえば，プローブまたはプライマーが両方の配列に結合することができる場合にも，これらの２つの配列は同じであると言われる。
【００４２】
プローブおよび／またはプライマーに関して述べる場合，（標的配列に）特異的であるとの用語は，プローブおよび／またはプライマーが，ストリンジェントな条件下で，標的配列を含む所定のサンプル中で実質的に標的配列にのみハイブリダイズすることを示す。
【００４３】
ハイブリダイゼーション：ハイブリダイゼーションとは，オリゴヌクレオチドおよび／またはその類似体が相補的な塩基間で水素結合により結合する過程であり，ワトソン・クリック，フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合を含む。一般に，核酸は，ピリミジン（シトシン（Ｃ），ウラシル（Ｕ），およびチミン（Ｔ））またはプリン（アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））のいずれかである窒素性塩基から構成される。これらの窒素性塩基は，プリンと結合したピリミジンからなる水素結合を形成し，ピリミジンのプリンへの結合は"塩基対形成"と称される。より詳細には，ＡはＴまたはＵと結合し，ＧはＣと結合する。"相補的"とは，２つの別々の核酸配列の間，または同じ核酸配列の２つの別々の領域の間に生ずる塩基対形成を表す。
【００４４】
"特異的にハイブリダイズしうる"および"特異的に相補的な"とは，オリゴヌクレオチド（またはその類似体）とＤＮＡまたはＲＮＡ標的との間に安定かつ特異的な結合が生ずるのに十分な程度の相補性を示す用語である。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は，特異的にハイブリダイズしうるためには，その標的配列に対して必ずしも１００％相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドまたは類似体の標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子への結合が，標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を妨害し，かつ，特異的結合が望まれる条件下で，例えば，インビボアッセイの場合には生理学的条件下で，オリゴヌクレオチドまたは類似体が非標的配列に非特異的に結合することを回避するのに十分な程度の相補性がある場合に，オリゴヌクレオチドまたは類似体は，特異的にハイブリダイズしうる。そのような結合は，"特異的ハイブリダイゼーション"と称される。特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は，選択されるハイブリダイゼーション方法の性質およびハイブリダイズする核酸配列の組成物および長さによって様々である。一般に，ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは，ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーションバッファのイオン強度（特にＮａ＋濃度）により決まる。
【００４５】
当業者は，状況によって，“結合する”，“ハイブリダイズする”または“ハイブリダイゼーション”との用語は曖昧さを生ずることなく互換的に用いることができることを理解するであろう。
【００４６】
したがって，本発明にしたがう少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブを用いて，インフルエンザＡウイルス核酸に特異的にハイブリダイズさせることができる。特に，本発明にしたがう少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブを用いて，インフルエンザＡウイルス核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）のＨ５Ｎ１サブタイプに特異的にハイブリダイズし，インフルエンザＡ核酸の他のサブタイプまたは他のウイルスの核酸にクロスハイブリダイズしないようにすることができる。すなわち，プライマーまたはプローブは，その配列，およびプライマーまたはプローブが本発明にしたがう診断アッセイを実施するために選択される条件下でＨ５Ｎ１ウイルス核酸に特異的にハイブリダイズする能力を損なわない追加のヌクレオチドを含む場合，本質的にそのヌクレオチド配列からなる。
【００４７】
インビトロ増幅：
サンプルまたは検体中の核酸分子のコピー数を増加させる手法
増幅の一例は，ポリメラーゼ連鎖反応であり，ここでは，被験者から採取した生物学的サンプルを，サンプル中の核酸テンプレートに対するプライマーのハイブリダイゼーションを可能とする条件下で，一対のオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー対）と接触させる。プライマー対は，“上側”ないし“フォワード”プライマーおよび“下側”ないし“リバース”プライマーを含むものとして定義することができる。プライマー対の各プライマーは増幅すべきＤＮＡテンプレート配列の（センスまたはアンチセンス）鎖にハイブリダイズする。プライマーは適当な条件下で伸長し，テンプレートから解離し，次に再アニーリングし，伸長し，解離して，核酸のコピー数を増幅させる。インビトロ増幅の生成物は，電気泳動，制限エンドヌクレアーゼ切断パターン，オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションまたはライゲーション，および／または核酸配列決定により，標準的な手法を用いて特徴づけることができる。
【００４８】
アンプリコン：インビトロ核酸増幅プロセスの生成物はアンプリコンと称される。アンプリコンの長さは，通常は増幅すべき配列の上側（センスまたはコーディング）鎖の固定されたヌクレオチド位置に対する上側および下側プライマーの出発位置から導き出すことができる。例えば，センスまたはコーディング鎖に対して，理論的な２０−ｂｐのフォワードプライマーは１００位から始まって１２０位で終わり，２０−ｂｐのリバースプライマーは１０００位で始まって９８０位で終わる（センスまたはコーディング鎖に対して）。このプライマー対は，１００−１０００位から９００ｂｐのアンプリコンを増幅するであろう。アンプリコンはフォワードおよびリバースプライマーを含む。アンプリコンの長さは，本発明のプライマー配列のハイブリダイゼーションの成功を確認するために用いることもできる。
【００４９】
制限部位：制限部位とは，制限酵素により認識され切断される特定の核酸配列である。内部制限部位は，目的とする特定の核酸配列の内部に位置する制限部位である。
【００５０】
標識：標識とは，標識が適用，付着，カップリング，ハイブリダイズまた結合されている任意の分子，表面または物質とともに標識を検出することを可能とする化学成分ないしは分子である。標識の例としては，染料，放射標識，蛍光標識，磁気標識および酵素的標識が挙げられる。標識を用いて，標識が適用，付着，カップリング，ハイブリダイズまたは結合している分子，表面または物質の存在を示すことができる。そのような標識はまた，レポーター標識またはレポーター分子とも称される。
【００５１】
生物学的サンプル：生物学的サンプルとは，ヒト，動物または植物からの任意の組織または体液からのサンプルである。
【００５２】
説明
本発明は，生物学的サンプル，または生物学的サンプルから単離および／または精製された生物学的材料における，インフルエンザタイプおよび／またはサブタイプウイルスの存在を判定するためのオリゴヌクレオチド，方法およびキットを提供する。
【００５３】
本発明は，生物学的サンプルにおけるインフルエンザＡウイルスのタイプまたはサブタイプの存在または非存在を判定する方法を提供する。この方法はまず，インフルエンザＡサブタイプに共通する遺伝子配列の存在，および／または，特定のサブタイプ中に存在する１またはそれ以上の遺伝子配列の存在を判定することにより行うことができる。
【００５４】
本発明の方法は，一般に，インフルエンザＡウイルスの配列を認識する核酸配列またはオリゴヌクレオチドを用いて，感度の高い検出手段を提供することを特徴とする。判定は，例えば，ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または懸濁アレイ手法を用いて行うことができる。しかし，任意の他の適当な検出手法を用いてもよい。
【００５５】
オリゴヌクレオチド
本発明は，インフルエンザウイルスを検出するためのプローブおよび／またはプライマーとして用いるためのオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のプローブ／プライマーは，特定の位置における単一塩基の変異を許容しながら，インフルエンザＡおよびそのＨ５Ｎ１サブタイプ中の配列の認識を提供するよう設計される。
【００５６】
本発明のプローブまたはプライマーは，９−５０ヌクレオチドの長さの範囲であることができる。特に，これらは，１２−３０ヌクレオチドの長さの範囲であることができる。さらに，これらは，１５−２５ヌクレオチドの長さの範囲であることができる。本発明において用いるプローブおよびプライマーの配列は以下に記載される。
【００５７】
例えば，本発明の方法およびキットは，Ｈ５Ｎ１のＨＡセグメント４の高度に病原性の領域の周囲で設計された特異的オリゴヌクレオチド（プローブおよび／またはプライマー対）を用いることができる。
【００５８】
本発明にしたがえば，少なくとも１つのプライマー対は，すべてのインフルエンザＡ株において保存されているＭ遺伝子（マトリクス蛋白質をコードする）を検出し，これは，インフルエンザＡウイルスの確認として作用する。少なくとも１つのさらなるプライマー対は，Ｈ５Ｎ１株のヘマグルチニン（ＨＡ）セグメントまたは領域を検出し，一方，少なくとも１つの別のさらなるプライマー対は，Ｈ５Ｎ１株のノイラミニダーゼ（ＮＡ）セグメントまたは領域を検出する。これらのプライマー対は，この特定の組み合わせで用いると，インフルエンザＡサブタイプＨ５Ｎ１の正しい株についての内部確認と外部確認との組み合わせとして作用する，特徴的なアガロースゲルパターンを生ずる。
【００５９】
インフルエンザＡウイルスは，８個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードし，これには，ＰＢ１（セグメント１），ＰＢ２（セグメント２），ＰＡ（セグメント３），ＨＡ（セグメント４），ＮＰ（セグメント５），ＮＡ（セグメント６），Ｍ（セグメント７）およびＮＳ（セグメント８）が含まれる。
【００６０】
本発明においては，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８および／または配列番号１９はウイルスのＨＡ領域に向けられている。
【００６１】
当業者には，プローブまたはプライマーはさらに少なくとも１つの標識を含んでいてもよいことが理解される。
【００６２】
本発明は，適当な標識および／またはレポーター分子で標識されたオリゴヌクレオチド（例えば，プローブおよび／またはプライマー）および核酸を提供する。すなわち，プローブはまた，選択された検出方法について，ハイブリダイズしたプローブおよび標的配列を検出するための他の分子を含んでいてもよい。例えば，そのような分子は，ビオチン，アビジンおよび／またはストレプトアビジンでありうる。そのような分子は，標識またはレポーター分子が目的とする核酸配列に結合したことを認識することを可能とする。
【００６３】
したがって，本発明は，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，それらのフラグメント，それらの誘導体，それらの変異体，およびそれらの相補的配列からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。特に，本発明は，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，それらのフラグメント，それらの誘導体，それらの変異体，およびそれらの相補的配列からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を本質的に含む単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。より詳細には，本発明は，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，それらのフラグメント，それらの誘導体，それらの変異体およびそれらの相補的配列，およびそれらの相補的配列からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列からなる単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。単離されたオリゴヌクレオチドは，配列番号３０−６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むことができる。
【００６４】
特定の態様にしたがえば，ＰＣＲアッセイ，特に１工程ＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いてＨ５Ｎ１サブタイプをもつインフルエンザＡウイルスを検出しうる１またはそれ以上の特異的プライマー対が提供される。特に，１工程ＲＴ−ＰＣＲアッセイでＨ５Ｎ１サブタイプをもつインフルエンザＡを検出し確認しうる特異的プライマー対が提供される。例えば，本発明の方法およびキットは，Ｈ５Ｎ１のＨＡセグメント４の高度に病原性の領域の周囲に設計された特異的プライマー対を利用することができる。特に，プローブ，プライマーまたはプライマー対は，配列番号１またはそのフラグメントにハイブリダイズするかまたはこれに相補的な少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことができる。
【００６５】
配列番号１またはそのフラグメントは，制限酵素で切断されることができる内部確認部位を含んでいてもよい。任意の適当な制限酵素を用いることができる。例えば，制限酵素はＭｏｂＩＩである。しかし，当業者には，他の適当な制限酵素が明らかであろう。検出領域中の制限酵素部位は，配列番号１にハイブリダイズした，生物学的サンプル中の核酸配列または生物学的サンプルから抽出，精製，および／または増幅された核酸配列は，実際にインフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプの高度に病原性の領域に由来するものであることを確実にする追加のレベルの確認を可能とする。これは，類似するインフルエンザＡサブタイプからの擬陽性の結果の確率を低下させる。検出領域中の任意の適当な制限酵素部位は，Ｈ５Ｎ１サブタイプを識別するための内部確認の起源を提供することができる。
【００６６】
本発明の方法は，インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプのＨＡセグメントの高度に病原性の領域の高感度および高特異度の検出を提供する。検出が高度に病原性の領域に対するものである場合，および高度に病原性の領域の配列が変異している場合，病原体の病原性もまた変化していると考えられる。インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプのＨＡセグメント４（配列番号１）の高度に病原性の領域は，Ｈ５Ｎ１サブタイプに独特のようである。ＨＡセグメントは，Ｎ５Ｎ１サブタイプを，Ｈ５Ｎ３またはＨ５Ｎ２サブタイプ等のインフルエンザＡの他のサブタイプから区別することができる。したがって，ＨＡセグメントまたは領域は，Ｈ５Ｎ１サブタイプの検出領域として用いることができる。
【００６７】
検出領域中の制限酵素部位を利用して，配列番号１にハイブリダイズする，生物学的サンプル中の核酸配列または生物学的サンプルから抽出，精製，および／または増幅された核酸配列が，実際に，インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプのＨＡセグメント４の高度に病原性の領域からのものであることを確実にするための，追加のレベルの確認を行うことができる。このことは，インフルエンザＡの類似のサブタイプから生ずる擬陽性の確率を低下させる。検出領域中の任意の適当な制限酵素部位は，Ｈ５Ｎ１サブタイプを同定するための内部確認の起源を提供することができる。本発明にしたがえば，配列番号２または配列番号３に記載されるヌクレオチド配列を含むプライマーも提供される。
【００６８】
配列番号４または配列番号５に記載されるヌクレオチド配列を含むプライマーも提供される。
【００６９】
本発明にしたがうプライマー対は，配列番号２および３に記載されるヌクレオチド配列を含んでいてもよい。特に，配列番号２および３に記載されるプライマー対は配列番号６を増幅する。
【００７０】
本発明にしたがうプローブは，配列番号１に記載される配列またはそのフラグメントとハイブリダイズするかまたはこれに相補的なヌクレオチド配列を含むプローブであってもよい。
【００７１】
プライマー対は，配列番号４および５に記載されるヌクレオチド配列を含むことができる。特に，配列番号２および３または配列番号４および５に記載されるプライマー対は，配列番号１を含む配列またはそのフラグメントとハイブリダイズするかまたはこれと相補的な配列を増幅する。
【００７２】
この方法はさらに，配列番号７のセクションに（例えば，配列番号７の少なくとも１５ヌクレオチドのセクションに）特異的にハイブリダイズするさらなる核酸プローブまたはプライマーを生物学的サンプル中の核酸配列と，またはさらなるプローブまたはプライマーを生物学的サンプルから抽出，精製または増幅された核酸と，特異的ハイブリダイゼーションが生ずるのに十分な時間および条件下で接触させることにより，Ｈ５Ｎ１のＮＡセグメント６を検出することを含む。特に，ハイブリダイゼーションは，さらなるプローブまたはプライマーと核酸またはサンプルとの間に特異的ハイブリダイゼーションが生ずるのに十分な時間および条件で行われ，ここで，さらなるプローブまたはプライマーは，配列番号７のセクションに相補的なヌクレオチド配列から構成される。特に，本発明にしたがうさらなるプライマーは，配列番号８または配列番号９に記載されるヌクレオチド配列を含むことができる。さらなるプライマー対は，配列番号８および９に記載されるヌクレオチド配列を含むことができる。特に，配列番号８および９に記載されるさらなるプライマー対は配列番号７を増幅する。好ましい態様においては，さらなるプローブは，配列番号７に記載される少なくとも１５ヌクレオチドのセクションを含む。より詳細には，配列番号８のフォワードプライマーおよび配列番号５１または５２のいずれかのリバースプライマーは配列番号７を増幅し，配列番号６０の配列を含むプローブはこのアンプリコンに結合することができる。
【００７３】
インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプのノイラミニダーゼ（ＮＡ）セグメント６が検出されることにより，生物学的サンプルまたは生物学的サンプルから抽出，精製または増幅された核酸において，インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプのヘマグルチニン（ＨＡ）セグメント４の高度に病原性の領域からの配列番号１にハイブリダイズすると検出されたものが確かにＨ５Ｎ１サブタイプであることがさらに確認される。このことは，擬陽性の確率をさらに低下させる。サンプルにおいて配列番号７が検出されることは，外部確認の起源を提供する。
【００７４】
別の観点においては，生物学的サンプルにおけるあるタイプまたはサブタイプのインフルエンザＡウイルスの存在または非存在を検出する方法が提供され，この方法は，以下の工程を含む：生物学的サンプルを用意し；少なくとも１つの核酸プローブ，プライマーまたはプライマー対を生物学的サンプルと接触させるか，またはプローブ，プライマーまたはプライマー対を生物学的サンプルから抽出，精製，および／または増幅された核酸と接触させ，ここで，プローブ，プライマーまたはプライマー対は，配列番号１０のセクション（例えば，配列番号１０の少なくとも１５ヌクレオチドのセクション）またはそのフラグメントにハイブリダイズし；そして，接触工程から生ずるハイブリダイゼーションを検出し，ここで，プローブ，プライマーまたはプライマー対の，サンプルまたは前記生物学的サンプルから抽出，精製，および／または増幅された核酸に対するハイブリダイゼーションが検出されると，生物学的サンプル中のインフルエンザＡウイルスのタイプまたはサブタイプのマトリクスセグメントが判定される。好ましい態様においては，この方法はさらに，他のプローブまたはプライマーと核酸またはサンプルとの間に特異的ハイブリダイゼーションが生ずるのに十分な時間および条件下で，配列番号１０のセクション（例えば，配列番号１０の少なくとも１５ヌクレオチドのセクション）に特異的にハイブリダイズする別の核酸プローブ，プライマーまたはプライマー対を，生物学的サンプルと接触させるか，または他のプローブ，プライマーまたはプライマー対を生物学的サンプルから抽出，精製，および／または増幅された核酸と接触させ，ここで，他のプローブ，プライマーまたはプライマー対は配列番号１０のセクションと相補的なヌクレオチド配列から構成され，このことにより，すべてのインフルエンザＡウイルスサブタイプのマトリクスセグメントを検出することを含む。
【００７５】
インフルエンザＡウイルスのすべてのサブタイプにわたって保存されこれに特異的なマトリクスセグメント７の検出は，生物学的サンプルまたは生物学的サンプルから抽出，精製，および／または増幅された核酸において検出された，ヘマグルチニン（ＨＡ）セグメント４の高度に病原性の領域からの配列番号１またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）セグメント６の配列番号７にハイブリダイズする陽性の結果が，実際にインフルエンザＡウイルスに由来するものであることのさらなる確認を提供することができる。このことは，擬陽性の確率をさらに低下させる。サンプルにおける配列番号１０の検出は，外部確認のさらに別の起源を提供する。
【００７６】
プライマーは，配列番号１１または配列番号１２に記載されるヌクレオチド配列を含む。別のプライマー対は，配列番号１１および１２に記載されるヌクレオチド配列を含む。特に，配列番号１１および１２に記載される別のプライマー対は配列番号１０を増幅する。別の観点にしたがえば，プローブは，配列番号１０に記載される１５ヌクレオチドのセクションを含む。
【００７７】
別の観点にしたがえば，本発明の方法はさらに，さらなるプローブまたはプライマーと核酸またはサンプルとの間に特異的ハイブリダイゼーションが生ずるのに十分な時間および条件下で，配列番号１３のセクション（例えば，配列番号１３の少なくとも１５ヌクレオチドのセクション）に特異的にハイブリダイズするさらなる核酸プローブ，プライマーまたはプライマー対を生物学的サンプルと接触させることにより，またはさらなるプローブ，プライマーまたはプライマー対を生物学的サンプルから抽出，精製，および／または増幅された核酸と接触させ，ここで，さらなるプローブ，プライマーまたはプライマー対は配列番号１３のセクションに相補的なヌクレオチド配列を含むことにより，Ｈ５Ｎ２のＮＡセグメント６を検出することを含む。
【００７８】
インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ２サブタイプのノイラミニダーゼ（ＮＡ）セグメント６が検出されることは，生物学的サンプルまたは生物学的サンプルから抽出，精製，および／または増幅された核酸において検出されたものはＨ５Ｎ１サブタイプではないという陰性確認を提供する。サンプルは，インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ２サブタイプのノイラミニダーゼ（ＮＡ）セグメント６の配列番号１３にハイブリダイズし，Ｎ５Ｈ１の配列番号１または７にはハイブリダイズしない。このことによりさらに擬陽性の確率が低くなる。サンプルにおける配列番号１３の検出は，外部陰性確認の別の起源を提供する。
【００７９】
さらなるプライマーは，配列番号１４または配列番号１５に記載されるヌクレオチド配列を含むことができる。特に，さらなるプライマー対は，配列番号１４および１５に記載されるヌクレオチド配列を含む。配列番号１４および１５に記載されるさらなるプライマー対は配列番号１３を増幅させる。別の観点にしたがえば，さらなるプローブは配列番号１３に記載される１５ヌクレオチドのセクションを含む。
【００８０】
別の観点にしたがえば，配列番号１，２，３，４，５，６，７，８，および９またはその相補的配列からなる群より選択される１またはそれ以上のプローブ，プライマーまたはプライマー対を用いるインフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプの存在または非存在の検出は，クロマトグラフィーにより分析される。
【００８１】
本発明は，簡便な，高感度の，および／または特異的な診断試験を提供する。本明細書に記載されるプローブおよび／またはプライマー用いることにより，本発明の方法および／またはキットは，従来技術の検出方法より高感度かつ高特異度である。そのような試験は，懸濁アレイ技術方法により行うことができる。あるいは，そのような試験は，１工程ＰＣＲ法または２工程ＰＣＲにより行うことができる。他の任意の適当な手法も用いることができる。
【００８２】
すなわち，１つの態様においては，本発明のＨ５Ｎ１検出の方法およびキットは，概して，ウイルスの存在を検出するためにＭ遺伝子ならびにＨＡ遺伝子の高度に病原性の領域およびインフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプゲノムのＮＡ遺伝子に特異的なプローブのセットを使用することに基づく。
【００８３】
この方法は，例えば，インフルエンザＡウイルスのＭ遺伝子を認識しこれにハイブリダイズする１またはそれ以上のプローブを用いて，サンプル中に存在するウイルス核酸配列を検出することにより行うことができる。ＨＡ遺伝子のヌクレオチド９９９からヌクレオチド１０９１を認識しこれにハイブリダイズするさらに別のプローブを用いてもよく，または，ＨＡ遺伝子のヌクレオチド９４３からヌクレオチド１１１４の領域ならびにＮＡ遺伝子を認識しこれにハイブリダイズする１またはそれ以上のプローブを用いてもよい。
【００８４】
懸濁アレイ技術による検出
本発明にしたがえば，懸濁アレイ技術により検出する前に，サンプル核酸を任意に，例えばＰＣＲにより増幅することができる。懸濁アレイ手法において用いる場合，本発明の配列の１またはそれ以上を粒子またはマイクロビーズ等の支持体に結合させる。１つの態様にしたがえば，各プローブを用いて，特定の波長の光により励起したときにユニークな蛍光シグナルを与える２つの染料の特定の比率により識別可能なユニークマイクロビーズを標識する。次に，サンプルからの結合したまたはハイブリダイズした核酸を有するマイクロビーズを，結合またはハイブリダイズした核酸を有しないマイクロビーズから選別または分離により区別する。次に，結合したまたはハイブリダイズした核酸を有するマイクロビーズを，第１のレーザー光により，特定の強度で蛍光を発する２つの染料に基づいて識別する。第２のレーザー光は，プローブまたは核酸のいずれかに結合した標識から蛍光を発生させることにより，サンプルからの核酸に結合したまたはハイブリダイズしたプローブの量を定量する。
【００８５】
懸濁アレイ技術は，Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによる米国特許６，９３９，７２０，６，９１６，６６１，６，９３９，７２０または６，５１４，２９５（その内容の全体は参照として本明細書に取り込まれる）に例示されている。
【００８６】
この技術にしたがえば，それぞれ異なる比率の，スペクトルの異なる２つの蛍光団で着色または染色した，１００セットまでの５．６ミクロンのマイクロビーズの液体懸濁アレイを用いることにより，１００セットのマイクロビーズのそれぞれを区別することができる。マイクロビーズの各セットは，異なる捕捉分子，例えば本発明のプローブとコンジュゲート化してもよい。次にコンジュゲート化したマイクロビーズを混合し，マイクロプレートのウエル中でサンプルとともにインキュベーションして，サンプル中の核酸（例えば，サンプルから精製したＲＮＡ，サンプルから変換したｃＤＮＡ，またはＰＣＲにより増幅されたＤＮＡアンプリコン）をマイクロビーズとコンジュゲート化したプローブとハイブリダイズさせることができる。未結合核酸は，例えば遠心分離により分離することができる。サンプル中の核酸は，例えばビオチンで予め標識してもよい。ビオチン標識は，別の蛍光レポーター分子，例えばストレプトアビジン−フィコエリスリンと結合させることができる。蛍光で標識されたレポーター分子とともにインキュベーションした後，各マイクロプレートウエルの内容物をフローサイトメータに引き込み，ここで，マイクロビーズをフローセルを介して１列に並べることにより分析する。２つのレーザーはマイクロビーズを個別に励起させる。第１の（赤）分類レーザーは，各マイクロビーズ中の染料を励起して蛍光シグナルを放出し，この蛍光シグナルの強度は各マイクロビーズのスペクトルアドレスないし同一性を識別する。第２の（緑）レポーターレーザーは，マイクロビーズまたはサンプルに付随するレポーター分子を励起し，これは捕捉されたサンプル核酸の定量を可能とする。次に，各マイクロビーズについて蛍光シグナルを同時に記録し，シグナルをデータに翻訳して，各ビーズに基づくアッセイを行う。この分析工程はまた，捕捉されたサンプル核酸を有するマイクロビーズを捕捉されたサンプル核酸を有しないビーズから区別する。
【００８７】
したがって，本発明は，懸濁アレイ技術によるオリゴヌクレオチドおよびサンプルおよび／または核酸の結合の検出を提供する。懸濁アレイ技術は以下の工程を含むことができる：
（ａ）  生物学的サンプルを用意し；
（ｂ）  少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを生物学的サンプル中の少なくとも１つの核酸と接触させるか，またはオリゴヌクレオチドを生物学的サンプルから抽出，精製，および／または増幅された少なくとも１つの核酸と接触させ，ここで，オリゴヌクレオチドは，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，それらのフラグメント，それらの誘導体，それらの変異体；およびそれらの相補的配列からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み；そして
（ｃ）  工程（ｂ）の接触により生じた結合を検出し，ここで，結合が検出されることは，インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプが存在することを示す。
【００８８】
したがって，本発明の方法は，
（ｉ）  生物学的サンプルを用意し；
（ｉｉ）  生物学的サンプル中の，またはサンプルから抽出，精製または増幅された，少なくとも１つの核酸を，少なくとも１つのレポーター標識で標識し；
（ｉｉｉ）  少なくとも１つのプローブを少なくとも１つの蛍光染料を含む少なくとも１つのマイクロビーズに固定化し；
（ｉｖ）  少なくとも１つのプローブを少なくとも１つの核酸と接触させて，プローブと核酸が結合できるようにし；
（ｖ）  第１のレーザー光を用いて少なくとも１つの蛍光染料の蛍光強度に基づいてマイクロビーズを識別し，識別されたマイクロビーズに固定化したプローブに対する核酸の結合を第２のレーザー光を用いてレポーター標識に基づいて検出し；
ここで核酸のプローブに対する結合が検出されることは，インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプの存在を示す，
の各工程を含むことができる。
【００８９】
本発明の方法は，増幅工程により結合またはハイブリダイゼーションを検出することを含んでいてもよい。例えば，この方法は，１またはそれ以上のプローブまたはプライマーまたはプライマー対を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）フォーマットを含む検出手段を含んでいてもよい。
【００９０】
ポリメラーゼ連鎖反応による検出
当業者は，本発明のプローブは，増幅することができる核酸のストレッチの境界を画定するため，ＰＣＲ検出用のプライマーとしても用いることができることを理解するであろう。したがって，プライマーおよびプローブとの用語は，これらが用いられる文脈または検出方法によって互換的に用いることができる。本発明にしたがうリアルタイムＰＣＲ検出は，ＰＣＲプラットフォーム，例えば，Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（商標），ｔｈｅ  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ，ｔｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ  ７０００  ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ａｎａｌｙｚｅｒまたは他の適当な検出プラットフォームを用いて実施することができる。
【００９１】
この方法は，例えばＰＣＲにより，インフルエンザＢゲノムの領域，例えばマトリクス遺伝子に選択的なフォワードプライマーおよびリバースプライマー対を用いてサンプル中に存在する核酸を増幅して，増幅産物ないしアンプリコンを得ることにより行うことができる。次に，生じた結合，ハイブリダイゼーションおよび／または増幅産物を検出することができる。増幅産物は，例えば，クロマトグラフィー法またはゲル電気泳動法のいずれかによって増幅産物のヌクレオチド長さを決定することにより，検出することができる。電気泳動は，例えば，２または３％アガロースで，適当な解像度の分子量マーカーセットとともに流すことにより行うことができる。フォワードプライマーの長さと，リバースプライマーの長さと分離長さとの合計のヌクレオチド長さを有する増幅産物の存在は，サンプル中におけるインフルエンザＢウイルスのマトリクス核酸の存在を示す。
【００９２】
あるいは，生成物は，ハイブリダイゼーションプローブを用い，例えばリアルタイム蛍光検出，例えばＴａｑｍａｎ（商標）システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて，ＰＣＲにより検出することができ，ここで，プローブに結合した蛍光標識は，プローブが標的配列と結合またはハイブリダイズしてポリメラーゼにより伸張された場合に，ポリメラーゼにより放出される。このようにして放出された標識の量は，サンプル中に存在する標的配列の量を示す。
【００９３】
ハイブリダイゼーションを検出するためにＰＣＲ方法を用いる場合には，ハイブリダイゼーションプローブは，選択された増幅プライマーとテンプレートとしてインフルエンザＢウイルスゲノム核酸とを用いて得られる増幅産物の一部と同じヌクレオチド配列を含むことができる。
【００９４】
ＰＣＲにおいて用いる場合，本発明の１対の配列は，インフルエンザＢ配列のストレッチに対してフォワード（または上側）プライマーおよび下側（またはリバース）プライマーとして機能することができる。次にこれらのプライマーにより，インフルエンザＢ配列のストレッチをＰＣＲ法により増幅することができる。このようにして得られるアンプリコンは，ゲル電気泳動から，および／またはアンプリコンへのプローブの結合から，そのサイズ（長さまたは分子量）により識別することができる。
【００９５】
本発明にしたがえば，少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは，プライマー対を形成する２つのオリゴヌクレオチドであることができ，検出の工程（ｃ）はポリメラーゼ連鎖反応によって行うことができる。
【００９６】
一例として，インフルエンザＡのＨ５Ｎ１サブタイプの存在を検出するためには，ＨＡ−１１４アンプリコンを増幅することができる。プライマー対は，核酸に結合し，配列番号６の配列を含む少なくとも１つのアンプリコンを増幅することができる。プライマー対は，配列番号２５のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのフォワードプライマー，および配列番号２６のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのリバースプライマーを含むことができる。特に，フォワードプライマーは，少なくとも配列番号３４のヌクレオチド配列を含むことができ，リバースプライマーは，配列番号３５および配列番号３６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。
【００９７】
別の例としては，ＨＡ−１９５アンプリコンを増幅させることができる。プライマー対は核酸に結合し，配列番号７の配列を含む少なくとも１つのアンプリコンを増幅させることができる。プライマー対は，配列番号１８のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのフォワードプライマー，および配列番号１９のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのリバースプライマーを含むことができる。特に，フォワードプライマーは，配列番号３７−４４からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことができ，リバースプライマーは，配列番号４５および配列番号４８からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことができる。配列番号４９および５０からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含むプローブは，アンプリコンに結合することができる。
【００９８】
検出工程は，ポリメラーゼ連鎖反応により放出された少なくとも１つの標識の検出によって，またはポリメラーゼ連鎖反応により得られた少なくとも１つのアンプリコンの分子量の測定によって，行うことができ，および／または，検出は，少なくとも１つのプローブの少なくとも１つのアンプリコンに対する結合を検出することによって行うことができる。ポリメラーゼ連鎖反応の次に電気泳動を行ってもよい。
【００９９】
ＰＣＲによる検出のためには，接触させる工程（ｂ），および／または結合させる工程（ｃ），および／またはプローブのアンプリコンへの結合は，オリゴヌクレオチドとサンプルまたは核酸との間に，および／またはプローブがアンプリコンに対して，特異的な接触または結合が生ずるのに十分な時間および条件で行う。
【０１００】
生物学的サンプルは，インフルエンザＡＨ５Ｎ１ウイルスに感染していると疑われるヒトまたは非ヒト動物に由来するものであってもよい。さらに，オリゴヌクレオチドおよび／またはサンプルまたは核酸は標識してもよい。
【０１０１】
キット
本発明はまた，一般に，生物学的サンプル，または生物学的サンプルから単離および／または精製された生物学的材料におけるインフルエンザウイルスの存在を判定するためのキットに関する。
【０１０２】
本発明はまた，少なくとも１つの核酸を含むキットを提供し，核酸は，配列番号８，配列番号９，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，およびまたはそれらのフラグメントからなる群より選択される。
【０１０３】
特に，キットは，インフルエンザＡウイルスの存在または非存在を検出するためのものであってもよい。さらに，キットは，インフルエンザＡサブタイプＨ５Ｎ１ウイルスの存在または非存在を検出するためのものであってもよい。キットは，生物学的サンプルについて用いるためのものであってもよく，サンプルはインフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプに感染している可能性のあるヒトまたは動物から得られたものであってもよい。
【０１０４】
キットはさらに，キットを使用するための情報を含んでいてもよい。これは，例えば，製造元により提供される例示的情報であってもよい。特に，本発明は，簡単なＲＴ−ＰＣＲ検出キットを提供する。そのようなキットは，本発明にしたがう１またはそれ以上のプライマーおよび／またはプローブを含み，例えば，キットは，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９のヌクレオチド配列を含む１またはそれ以上のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントからなるプライマーを含むことができる。懸濁アレイ技術により検出するためのキットは，少なくとも１つのマイクロビーズ，少なくとも１つの蛍光染料，少なくとも１つのレポーター標識および／または少なくとも１つのプローブを含むことができる。
【０１０５】
本発明にしたがうキットは，任意に，陽性対照の核酸，例えば，Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡウイルスのＨＡ，ＮＡおよび／またはＭ領域を含む核酸またはその少なくとも一部を，ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかとして含んでいてもよい。
【０１０６】
当業者は，プローブおよび／またはプライマーは少なくとも１つの標識をさらに含んでいてもよいことを理解するであろう。標識は，標識が適用，付着，カップリング，ハイブリダイズまたは結合している任意の分子，表面または材料とともに標識を検出することを可能とする化学物質，成分または分子であることができる。標識の例としては，染料，放射性標識，蛍光標識，磁気標識および酵素標識が挙げられる。
【０１０７】
さらに，プローブは，ハイブリダイズしたプローブと標的配列を検出するために選択される検出方法のための他の分子を含んでいてもよい。そのような分子の例としては，ビオチン，アビジンおよび／またはストレプトアビジンが挙げられる。そのような分子は，標識またはレポーター分子が目的とする配列を認識しまたはこれに結合することを可能とする。
【０１０８】
本発明を一般的に説明してきたが，以下の実施例を参照することにより本発明をより容易に理解しうるであろう。実施例は例示のために提供されるものであり，本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１０９】
実施例１：材料および方法
当該技術分野において知られ，特定的に記載されていない標準的な分子生物学の手法は，一般に，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）の記載にしたがった。
【０１１０】
標準品
健康なボランティアから得た血清中でストックウイルスの１０倍希釈物を調製した。ＲＮＡはＱＩＡＧＥＮ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧＭｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて抽出した。
【０１１１】
患者検体
鳥インフルエンザ症例の血清検体からウイルスの単離を行った。ＲＮＡは，Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡａｍｐ  ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（カタログ番号５２９０６）を用いて，製品に付属の使用説明書にしたがって，検体から直接抽出した。
【０１１２】
ＲＮＡはまた，感染した鳥から当業者に理解される方法により抽出し，グアニジンおよびβ−メルカプトエタノールを含む私有のＱｉａｇｅｎ  ＲＬＴバッファで処理した。
【０１１３】
単離したサンプルは以下のとおりである：
H5N1(-1)A/chicken/Vietnam/8/2004(HPAI),
H5N3(-1)Atern/Australia/75/(LPAI),
H7N3(-1)A/chicken/queensland/1994(HPAI)
および
H7N7(-1)A/duck/Victoria/1976(LPAI)
【０１１４】
他のウイルス
ＲＮＡは，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；ＶＡ，ＵＳＡ）から取得したストックバイアルから，ＱＩＡＧＥＮ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ  ＧＭｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて，製品に含まれる指針にしたがって直接抽出した。当業者には，任意の非インフルエンザウイルスから単離したＲＮＡは適当な陰性対照を与えるのに十分であることが理解されるであろう。
【０１１５】
ＭＲＣ−５細胞株
総ＲＮＡは，正常２倍体ヒト線維芽細胞株ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１）からＱｉａｇｅｎＲＮＡ抽出キット（カタログ番号７４１０４）を用いて直接抽出し，ＲＮＡは分光光度計を用いて定量した。
【０１１６】
プライマー対を用いる検出
既知の方法により評価してインフルエンザＡサブタイプＨ５Ｎ１のＲＮＡを含むと考えられるサンプルからＲＮＡを抽出した。次にリバーストランスクリプターゼまたは当該技術分野において知られる他の任意の方法を用いて，ＲＮＡをＤＮＡに変換した。サンプル混合物を，１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，カタログ番号１４８３１８８）を用いて典型的な方法によりｃＤＮＡに変換した。
【０１１７】
懸濁アレイ
懸濁アレイ装置およびマイクロビーズはＬｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手し，Ａｌｅｘａ４８８蛍光染料はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）から入手した。用いた装置はＬｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）のＬｕｍｉｎｅｘ  １００Ｓｅｔであった。
【０１１８】
実施例２：懸濁アレイ技術によるインフルエンザＢウイルス検出
プローブ
本発明の以下のプローブを設計して，懸濁アレイ技術によりインフルエンザＡウイルスを検出し，さらにサブタイプＨ５Ｎ１を特異的に検出することができる。しかし，当業者は，他の適当な検出方法，例えば，インサイチューハイブリダイゼーション，ヌクレアーゼ保護アッセイ等において，インフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５Ｎ１用の以下の配列を用いてもよいことを理解するであろう。
【０１１９】
Ｍ遺伝子用のプローブ
Ｍ遺伝子（マトリクス遺伝子セグメント７）のヌクレオチド２８からヌクレオチド１７１の部分を認識および／または境界を画定することによりすべてのインフルエンザＡ型を検出する包括的プローブとして，以下のプローブを設計した。
ＭＰ−１６８（上側）
5'-GAGNCTTCTAACCGAGGTCGAAAC-3'（配列番号２３）
Ｎ＝Ａ，Ｔ，ＣまたはＧ
特に，配列は次のとおりである：
5'-GAGYCTTCTAACCGAGGTCGAAAC-3'（配列番号２１）
Ｙ＝Ｃ／Ｔ
したがって，ＭＰ−１６８（上側）の特定の変種は次のとおりである：
5'-GAGCCTTCTAACCGAGGTCGAAAC-3'（配列番号３０）
5'-GAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAAC-3'（配列番号３１）
ＭＰ−１６８（下側）
5'-TTAGTCAGAGGTGACAGNATTGGTC-3'（配列番号２４）
Ｎ＝Ａ，Ｔ，ＣまたはＧ
特に，配列は次のとおりである：
5'-TTAGTCAGAGGTGACAGRATTGGTC-3'（配列番号２２）
Ｒ＝Ａ／Ｇ
したがって，ＭＰ−１６８（下側）の特定の変種は次のとおりである：
5'-TTAGTCAGAGGTGACAGAATTGGTC-3'（配列番号３２）
5'-TTAGTCAGAGGTGACAGGATTGGTC-3'（配列番号３３）
ＭＰ−１６８（プローブ）
5'-GCTTTGAGGGGGCCTGANGGN-3'（配列番号５３）
Ｎ＝Ａ，Ｔ，ＣまたはＧ
特に，配列は次のとおりである：
5'-GCTTTGAGGGGGCCTGAYGGR-3'（配列番号５４）
Ｙ＝Ｃ／Ｔ，Ｒ＝Ａ／Ｇ
したがって，ＭＰ−１６８プローブの特定の変種は次のとおりである：
5'-GCTTTGAGGGGGCCTGACGGA-3'（配列番号５６）
5'-GCTTTGAGGGGGCCTGATGGA-3'（配列番号５７）
5'-GCTTTGAGGGGGCCTGACGGG-3'（配列番号５８）
5'-GCTTTGAGGGGGCCTGATGGG-3'（配列番号５９）
【０１２０】
ＨＡ遺伝子用のプローブ
ＨＡ遺伝子のＨＡ遺伝子セグメントのヌクレオチド９９９からヌクレオチド１０９１の部分を認識および／または境界を画定することにより，インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプのＨＡ遺伝子のセグメント４を検出するよう，以下の２つのプローブを設計した。
ＨＡ−１１４（上側）
5'-CAAACANATTANTNCTTGCNACWG-3'（配列番号２５）
Ｎ＝Ａ，Ｔ，ＣまたはＧ
特に，配列は次のとおりである：
5'-CAAACARATTARTYCTTGCDACWG-3'（配列番号１６）
Ｒ＝Ａ／Ｇ，Ｙ＝Ｃ／Ｔ，Ｄ＝Ａ／Ｇ／Ｔ，Ｗ＝Ａ／Ｔ
特に，配列は次のとおりである：
5'-CAAACAGATTAGTYCTTGCGACTG-3'（配列番号３４）
ＨＡ−１１４（下側）
5'-CCTGCCATCCTCCNTCTATAAA-3'(配列番号26)
Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｃ，またはＧ
特に，配列は次のとおりである：
5'-CCTGCCATCCTCCYTCTATAAA-3'（配列番号１７）
Ｙ＝Ｃ／Ｔ
したがって，ＨＡ−１１４（下側）の特定の変種は次のとおりである：
5'-CCTGCCATCCTCCCTCTATAAA-3'（配列番号３５）
5'-CCTGCCATCCTCCTTCTATAAA-3'（配列番号３６）
【０１２１】
ＨＡ遺伝子のＨＡ遺伝子セグメントのヌクレオチド９４３からヌクレオチド１１１４の部分を認識および／または境界を画定することにより，インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプのＨＡ遺伝子のセグメント４を検出するよう，以下のプローブを設計した。
ＨＡ−１９５（上側）
5'-GCCATTCCACAANATNCANCC-3'（配列番号２７）
Ｎ＝Ａ，Ｔ，ＣまたはＧ
特に，配列は次のとおりである：
5'-GCCATTCCACAAYATMCAYCC-3'（配列番号１８）
Ｙ＝Ｃ／Ｔ，Ｍ＝Ａ／Ｃ
したがって，ＨＡ−１９５（上側）の特定の変種は次のとおりである：
5'-GCCATTCCACAACATACACCC-3'（配列番号３７）
5'-GCCATTCCACAATATACACCC-3'（配列番号３８）
5'-GCCATTCCACAACATCCACCC-3'（配列番号３９）
5'-GCCATTCCACAATATCCACCC-3'（配列番号４０）
5'-GCCATTCCACAACATACATCC-3'（配列番号４１）
5'-GCCATTCCACAATATACATCC-3'（配列番号４２）
5'-GCCATTCCACAACATCCATCC-3'（配列番号４３）
5'-GCCATTCCACAATATCCATCC-3'（配列番号４４）
ＨＡ−１９５（下側）
5'-TANCCATACCAACCATCTANCATT-3'（配列番号２８）
Ｎ＝Ａ，Ｔ，ＣまたはＧ
特に，配列は次のとおりである：
5'-TAYCCATACCAACCATCTAYCATT-3'（配列番号１９）
Ｙ＝Ｃ／Ｔ
したがって，ＨＡ−１９５（下側）の特定の変種は次のとおりである：
5'-TACCCATACCAACCATCTACCATT-3'（配列番号４５）
5'-TACCCATACCAACCATCTATCATT-3'（配列番号４６）
5'-TATCCATACCAACCATCTACCATT-3'（配列番号４７）
5'-TATCCATACCAACCATCTATCATT-3'（配列番号４８）
ＨＡ−１９５（プローブ）
5'-GNCATTCCCCGATGGTGAGAGG-3'（配列番号２９）
Ｎ＝Ａ，Ｔ，ＣまたはＧ
特に，配列は次のとおりである：
5'-GRCATTCCCCGATGGTGAGAGG-3'（配列番号２０）
Ｒ＝Ａ／Ｇ
したがって，ＨＡ−１９５（プローブ）の特定の変種は次のとおりである：
5'-GACATTCCCCGATGGTGAGAGG-3'（配列番号４９）
5'-GGCATTCCCCGATGGTGAGAGG-3'（配列番号５０）
【０１２２】
Ｈ５Ｎ１のＮＡ遺伝子用のプローブ
ＮＡ遺伝子のＮＡ遺伝子セグメントのヌクレオチド５２８からヌクレオチド８０５の３００塩基対の部分を認識および／または境界を画定することにより，インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプのＮＡ遺伝子のセグメント６を検出するよう，以下のプローブを設計した。
ＮＡ−３００（上側）
5'-TGATGGCACCAGTTGGTTGAC-3'（配列番号８）
ＮＡ−３００（下側）
5'-GCATCAGGATAACAGGAGCAYTC-3'（配列番号９）
Ｙ＝Ｃ／Ｔ
したがって，ＮＡ−３００（下側）プライマーの特定の変種は次のとおりである：
5'-GCATCAGGATAACAGGAGCACTC-3'（配列番号５１）
5'-GCATCAGGATAACAGGAGCATTC-3'（配列番号５２）
ＮＡ−３００（プローブ）
5'-ACAGCCACAGCCCCATTGTCTG-3'（配列番号６０）
【０１２３】
陰性の確認としてのＨ５Ｎ２ゲノムのＮＡ遺伝子用のプローブ
ＮＡ遺伝子のヌクレオチド４４０からヌクレオチド７７４のＮＡ遺伝子セグメントの３６１塩基対部分を増幅することにより，インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ２サブタイプのＮＡ遺伝子のセグメント６を検出するよう，特異的プライマー対を設計した。当業者は，アンプリコンの長さは，ヌクレオチド位置の差（７７４マイナス４４０）＋リバースプライマーの長さ（２７ｂｐ）を含み，アンプリコンの長さは３６１であることを理解するであろう。この特異的プライマー対は，特異性の確認としてＨ５Ｎ２サブタイプ−ＮＡ遺伝子を検出するよう設計されている。
ＮＡ遺伝子に対する上側プライマー，４４０位で開始
5'-AATGAGTTGGGTGTTCCGTTTC-3'（配列番号１４）（２２−ｍｅｒ）
ＮＡ遺伝子に対する下側プライマー，７７４位で終了
5'-AACAGGAACATTCCTCTATATGCTGAG-3'（配列番号１５）（２７−ｍｅｒ）
【０１２４】
プローブのマイクロビーズへの固定化
プローブは，マイクロビーズの表面のカルボキシル基を介してＬｕｍｉｎｅｘマイクロビーズに固定化した。固定化後，マイクロビーズを混合して，マルチプレックスセットを作成した。サンプルの包括的スクリーニング用には，本発明のプローブ配列のすべての可能な組み合わせをマルチプレックスセットに含めることができる。適当な対照配列を固定化したマイクロビーズもマルチプレックスセットに含めることができる。
【０１２５】
サンプル
インフルエンザＡＨ５Ｎ１およびＨ７Ｎ３サブタイプの両方，ならびにインフルエンザＢサンプルからの核酸をｃＤＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ（下記の実施例３のプロトコル）により増幅し，推定コピー数をマイクロビーズと混合して，ハイブリダイゼーションを行った。
【０１２６】
ハイブリダイゼーション
次に，サンプルを，ほぼ等量のＨＡ−１９５プローブ変種（配列番号４９および５０），ほぼ等量のＭＰ−１６８プローブ変種（配列番号５６−５９），およびＮＡ−３００プローブ（配列番号６０）を個別に含むマルチプレックスマイクロビーズのセットと接触させた。２，２５ｍｏｌ／Ｌのテトラメチルアンモニウム，０．７５ｇ／Ｌのドデシル硫酸ナトリウム，３７．５ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）および１．５ｎｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含むハイブリダイゼーションバッファ中で，３７℃で１時間，ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの後，ストレプトアビジン−フィコエリスリンの１０ｇ／Ｌ溶液を２μＬ加え，室温で３０分間インキュベーションした。
【０１２７】
次に，混合物を２００μＬのハイブリダイゼーションバッファで希釈し，Ｌｕｍｉｎｅｘ１００システム装置で分析して，サンプル中の標的核酸配列の存在を検出および定量した。
【０１２８】
結果
懸濁アレイ検出アッセイの結果を，装置から得られた蛍光強度（測定のユニット数）として表１および２に示す。両方の表について，１００の強度を任意のしきい値カットオフとして選択した。
【０１２９】
増幅工程において用いたプライマー変種は以下のとおりであった：
ＦｌｕＡ，ＮＡ３００，Ｈ５Ｎ１サブタイプに特異的（配列番号８および９）
ＦｌｕＡ，ＨＡ１９５，Ｈ５Ｎ１サブタイプに特異的（配列番号３７および４５）
ＦｌｕＡ，マトリクス１６８，任意のインフルエンザＡに特異的（配列番号３１および３３）。
【０１３０】
両方の表について，存在する非標的核酸のコピー数が高いにもかかわらず，本発明のプローブは低いコピー数のＨ５Ｎ１核酸を検出することができたことがわかる。このことは本発明のプローブの特異性を示す。
【０１３１】
【表２】
2009515551.tif 000004
【０１３２】
【表３】
2009515551.tif 000005
【０１３３】
実施例３：ポリメラーゼ連鎖反応による検出およびＨ５Ｎ１およびＨ５Ｎ２サブタイプの確認
これらのプライマーは，インフルエンザＡウイルスを検出し，さらにサブタイプＨ５Ｎ１およびＨ５Ｎ２を特異的に検出するよう設計した。これらのプライマーセットは，ゲルに基づくＲＴ−ＰＣＲ用に設計した。すなわち，増幅された産物は，アガロースゲル電気泳動後に増幅産物を臭化エチジウム染色することにより検出される。本明細書に記載されるすべてのプライマーは，ＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ｉｎｆｌｕｅｎｚａ／ｌｉｓｔ．ｃｇｉ）により提供される配列に基づいて設計した。
【０１３４】
すべてのインフルエンザＡサブタイプのＭ遺伝子用のプライマー対
Ｍ遺伝子（マトリクス遺伝子セグメント７）のヌクレオチド２８からヌクレオチド１７１の１６８塩基対部分を増幅することによりすべてのインフルエンザＡタイプを検出する一般的プライマー対として，１つのプライマー対を設計した。
Ａ．  上側プライマー
フォワードプライマー（本明細書において上側プライマーとも称される）は，Ｍ遺伝子にハイブリダイズし，２８位で始まる２４−ｍｅｒであり，配列番号１１の配列を有する：
5'-GAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAAC-3'
Ｂ．  下側プライマー
リバースプライマー（本明細書において下側プライマーとも称される）は，Ｍ遺伝子にハイブリダイズし，１７１位で終わる２５−ｍｅｒであり，配列番号１２の配列を有する：
5'-TTAGTCAGAGGTGACAGGATTGGTC-3'
Ｃ．  このプライマーセットにより生成するアンプリコン
このプライマーセットにより生成するアンプリコンは配列番号１０の配列を有する：
GAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCGCAGAAACTTGAAGATGTCTTTGCAGGAAAGAACACCGATCTCGAGGCTCTCATGGAGTGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAA(168bp)
【０１３５】
Ｈ５Ｎ１中のＨＡ遺伝子用のプライマー対
ＨＡ遺伝子のヌクレオチド９９９からヌクレオチド１０９１の１１４塩基対部分のＨＡ遺伝子セグメントを増幅することにより，インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプのＨＡ遺伝子のセグメント４を検出するよう，別の特異的プライマー対を設計した。
Ａ．  上側プライマー
フォワードプライマー（本明細書において上側プライマーとも称される）は，ＨＡ遺伝子にハイブリダイズし，９９９位から始まる２４−ｍｅｒであり，配列番号２の配列を有する：
5'-CAAACAGATTAGTCCTTGCGACTG-3'（２４ｂｐ）
Ｂ．  下側プライマー
リバースプライマー（本明細書において下側プライマーとも称される）は，ＨＡ遺伝子にハイブリダイズし，１０９１位で終わる２２−ｍｅｒであり，配列番号３の配列を有する：
5'-CYTGCCATCCTCCCTCTATAAA-3'（２２ｂｐ）
この場合，ＹはＣまたはＴである。
Ｃ．  このプライマーセットにより生成するアンプリコン
このプライマーセットにより生成するアンプリコンは，配列番号６の配列を有する：
CAAACAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGCCCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGACTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCARG(114bp)
【０１３６】
この増幅された領域は，配列番号１（５'−ＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧ−３'）の高度に病原性の領域の配列を含む。配列番号１または６のいずれかを制限酵素ＭｂｏＩＩで消化して，インフルエンザＡのＨ５Ｎ１サブタイプのＨＡ遺伝子セグメント４のこの領域の検出が生じたことの内部確認を与えることができる。
【０１３７】
Ｈ５Ｎ１中のＨＡ遺伝子用の別のプライマー対
ＨＡ遺伝子のヌクレオチド９４３からヌクレオチド１１１４の１９５塩基対部分のＨＡ遺伝子セグメントを増幅することによりインフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプのＨＡ遺伝子セグメント４を検出するよう，別の特異的プライマー対を設計した
Ａ．  上側プライマー
フォワードプライマー（本明細書において上側プライマーとも称される）は，ＨＡ遺伝子にハイブリダイズし，９４３位から始まる２１−ｍｅｒであり，配列番号４の配列を有する：
5'-GCCATTCCACAAYATACACCC-3'(21bp)
この場合，ＹはＣまたはＴでありうる。
Ｂ．  下側プライマー
リバースプライマー（本明細書において下側プライマーとも称される）は，ＨＡ遺伝子にハイブリダイズし，１１１４位で終わる２４−ｍｅｒであり，配列番号５の配列を有する：
5'-TACCCATACCAACCATCTACCATT-3'(24bp)
Ｃ．  このプライマーセットにより生成するアンプリコン
このプライマーセットにより生成するアンプリコンは，配列番号５５の配列を有する：
GCCATTCCACAACATACACCCTCTCACCATCGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGCCCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGACTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTA(195bp)
【０１３８】
この増幅された領域は，配列番号１の高度に病原性の領域配列を含む。
5'-AGAAGAAGAAAAAAG-3'
したがって，配列番号１または６のいずれかを制限酵素ＭｂｏＩＩで消化して，インフルエンザＡのＨ５Ｎ１サブタイプのＨＡ遺伝子セグメント４のこの領域が検出されたことの内部確認を与えることができる。
【０１３９】
Ｈ５Ｎ１のＮＡ遺伝子用のプライマー対
ＮＡ遺伝子のヌクレオチド５２８からヌクレオチド８０５の３００塩基対部分のＮＡ遺伝子セグメントを増幅することにより，インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプのＮＡ遺伝子のセグメント６を検出するよう，別の特異的プライマー対を設計した。
Ａ．  上側プライマー
フォワードプライマー（本明細書において上側プライマーとも称される）は，５２８位から始まるＮＡ遺伝子にハイブリダイズし，配列番号８の配列を有する２１−ｍｅｒである：
5'-TGATGGCACCAGTTGGTTGAC-3'(21)
Ｂ．  下側プライマー
リバースプライマー（本明細書において下側プライマーとも称される）は，８０５位で終了するＮＡ遺伝子にハイブリダイズし，配列番号９の配列を有する２２−ｍｅｒである。5'-GCATCAGGATAACAGGAGCAYTC-3'
この場合，ＹはＣまたはＴでありうる。したがって，下側プライマーは，配列番号５１または５２の配列を含むことができる。
Ｃ．  このプライマーセットにより生成するアンプリコン
このプライマーセットにより生成するアンプリコンは配列番号７の配列を有する：
TGATGGCACCAGTTGGTTGACAATTGGAATTTCTGGCCCAGACAATGGGGCTGTGGCTGTATTGAAATACAATGGCATAATAACAGACACTATCAAGAGTTGGAGGAATAACATACTGAGAACTCAAGAGTCTGAATGTGCATGTGTAAATGGCTCTTGCTTTACTGTAATGACTGACGGACCAAGTAATGGTCAGGCATCACATAAGATCTTCAAAATGGAAAAAGGGAAAGTGGTTAAATCAGTCGAATTGGATGCTCCCAATTATCACTATGAGGARTGCTCCTGTTATCCTGATGC(300bp)
【０１４０】
Ｈ５Ｎ２中のＮＡ遺伝子用のプライマー対
ＮＡ遺伝子のヌクレオチド４４０からヌクレオチド７７４の３６１塩基対部分のＮＡ遺伝子セグメントを増幅することにより，インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ２サブタイプのＮＡ遺伝子のセグメント６を検出するよう，特異的プライマー対を設計した。この特異的プライマー対は，特異性の確認として，Ｈ５Ｎ２サブタイプ−ＮＡ遺伝子を検出するよう設計した。
Ａ．  上側プライマー
フォワードプライマー（本明細書において上側プライマーとも称される）は，４４０位から始まるＮＡ遺伝子にハイブリダイズし，配列番号１４の配列を有する２２−ｍｅｒであった。
5'-AATGAGTTGGGTGTTCCGTTTC-3'
Ｂ．  下側プライマー
リバースプライマー（本明細書において下側プライマーとも称される）は，７７４位からコードされるＮＡ遺伝子にハイブリダイズし，配列番号１５の配列を有する２７−ｍｅｒであった。
5'-AACAGGAACATTCCTCTATATGCTGAG-3'
Ｃ．  このプライマーセットにより作成されるアンプリコン
このプライマーセットにより作成されるアンプリコンは配列番号１３の配列を有する：
AATGAGTTGGGTGTTCCGTTTCACTTGGGAACCAAACAAGTGTGCATAGCATGGTCCAGTTCAAGTTGCCATGACGGGAAAGCATGGTTGCACGTCTGTGTTACTGGGGATGATAGAAATGCGACTGCTAGTTTCATTTATGATGGGATGCTCGTTGACAGTATAGGTTCATGGTCTCAAAATATCCTCAGAACTCAGGAGCCAGAGTGCGTTTGCATCAATGGGACTTGTACAGTAGTAATGACTGATGGAAGCGCATCAGGGAAAGCCGACACTAGAATATTATTCATTGAAGAGGGGAAAGTTGTTCACATTAGCCCATTGTCGGGAAGTGCTCAGCATATAGAGGAATGTTCCTGTT
(361bp)
【０１４１】
実施例４：検出キット
本発明を実施するために，懸濁アレイ技術による検出用にキット１を用い，ＰＣＲ用にキット２を用いた。
【０１４２】
懸濁アレイ技術において用いるためのキット１
一般的インフルエンザＡウイルスの検出
サンプル中のインフルエンザＡウイルスの存在を一般に検出し判定するためには，配列番号２１および／または２２の少なくとも１つの核酸配列（すべてのインフルエンザサブタイプに共通するＭＰ−１６８上側および下側プローブ）とともに固定化されたマイクロビーズを含むキットを用意する。
【０１４３】
Ｈ５Ｎ１サブタイプのサブタイピング用には，キットはさらに，Ｈ５Ｎ１特異的配列の群から選択される少なくとも１つの配列を含んでいてもよい。この群は，配列番号８および９（Ｈ５Ｎ１サブタイプ中のＮＡ遺伝子用のプローブ／プライマー），配列番号１６および１７（Ｈ５Ｎ１サブタイプのＨＡ領域用のプローブ／プライマー），および配列番号１８および１９（Ｈ５Ｎ１サブタイプのＨＡ−１９５領域用のプローブ／プライマー），および配列番号２０（配列番号１８および１９により増幅されたアンプリコン用のプローブ）から構成されることができる。したがって，キットは配列番号３０−６０の配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【０１４４】
キットは任意に，Ｌｕｍｉｎｅｘシステムにより定量するための適当な染料または標識，およびこのキットの使用に関する情報を含んでいてもよい。
【０１４５】
ＰＣＲ技術で用いるためのキット２
インフルエンザＡウイルスの一般的検出およびＨ５Ｎ１の確認
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＭＣＢ），ＦｌｕＡ検出キット−２
ＲＴ−ＰＣＲ診断キット
１００反応／キットで−２０℃で保存，ロット１，シリアル番号００１
霜取り不要ではない冷凍庫
製品の説明
このリバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）キットは，一般的インフルエンザＡウイルスの存在の検出およびＨ５Ｎ１の確認のために作成されている。第１鎖ｃＤＮＡ反応は，以下の試薬を示される濃度で用いて行った。
【０１４６】
このキットは，３セットのプライマー，すなわち，１）Ｈ５Ｎ１に特異的なＨＡプライマー対，２）すべてのインフルエンザＡ用のＭプライマー対，および３）Ｈ５Ｎ１に特異的なＮＡプライマー対を使用した。増幅産物は，アガロースゲル電気泳動の後に増幅産物を臭化エチジウムで染色することにより検出した。
全行程は１工程で実施した。
Ｑｉａｇｅｎ  １工程ＲＴ−ＰＣＲキット［カタログ番号２１０２１０］を用いた。
成分
このキットは下記の２つのチューブを含む：
【０１４７】
【表４】
2009515551.tif 000006
【０１４８】
１工程ＲＴ−ＰＣＲのプロトコル
サンプルの調製
無ＲＮａｓｅエッペンドルフチューブ（０．５ｍｌまたは０．２ｍｌのサイズ）中で，１試験／１反応あたり以下の試薬を加えた：
【０１４９】
【表５】
2009515551.tif 000007
【０１５０】
結果を確認するために，陽性および陰性対照を含めた。陽性対照は配列番号１，７および１０を含むｃＤＮＡの形であり，陰性対照は非インフルエンザ型ウイルスから単離された任意のＲＮＡである。
【０１５１】
熱サイクルプロトコル−Ａ
３ブロック型ＰＣＲサイクラー例えば，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製，ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ（登録商標）用の熱サイクル条件
【表６】
2009515551.tif 000008
【０１５２】
熱サイクルプロトコル−Ｂ
１ブロック型ＰＣＲサイクラー，例えばＴｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社製のＰｘ２Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ用の熱サイクル条件
【表７】
2009515551.tif 000009
【０１５３】
ＰＣＲ反応の停止
（この工程は任意である）
チューブあたり３０ｕｌのクロロホルムを加える。５秒間ボルテックスする。
２分間遠心分離する（上＝水性相，下＝有機相）
【０１５４】
電気泳動
上述の生成物をＤＮＡゲル電気泳動により分離した。
（１）ＤＮＡ電気泳動は３％アガロースゲルを用いる
（２）例えば，１００Ｖで３０分間
【０１５５】
評価結果
予測生成物サイズは，ＨＡについては１１４ｂｐ，マトリクス蛋白質については１６８ｂｐ，ＮＡについては３００ｂｐであり，これは図１に示される。
【０１５６】
ＰＣＲ技術で用いるためのキット３
インフルエンザＡＨ５Ｎ１ウイルスの検出
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＭＣＢ），ＦｌｕＡ検出キット−３
ＲＴ−ＰＣＲ診断キット
−２０℃で保存
１００反応／キット，ロット１，シリアル番号００１
霜取り不要ではない冷凍庫
製品の説明
このリバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）キットは，インフルエンザＡサブタイプＨ５Ｎ１ウイルスＲＮＡの存在を検出するために作成されたものである。第１鎖ｃＤＮＡ反応は，以下の試薬を示される濃度で用いて実施した。
【０１５７】
このキットは２セットのプライマー，すなわち，１）Ｈ５に特異的なＨＡプライマー対，および２）Ｎ１に特異的なＮＡプライマー対を使用する。増幅産物はアガロースゲル電気泳動の後に増幅産物を臭化エチジウム染色することにより検出した。
全手順は１工程で行った。
Ｑｉａｇｅｎ  １工程ＲＴ−ＰＣＲキット［カタログ番号２１０２１０］を用意した。
成分
このキットは以下の２つのチューブからなる：
【０１５８】
【表８】
2009515551.tif 000010
【０１５９】
プロトコル，１工程ＲＴ−ＰＣＲ
サンプルの調製
無ＲＮａｓｅのエッペンドルフチューブ（０．５ｍｌまたは０．２ｍｌのサイズ）に，１試験／１反応あたり以下の試薬を加える：
【表９】
2009515551.tif 000011
【０１６０】
結果を確認するために，陽性および陰性対照を含めた。陽性対照は配列番号１，７および１０を含むｃＤＮＡの形であり，陰性対照は非インフルエンザ型ウイルスから単離した任意のＲＮＡである。
【０１６１】
熱サイクルプロトコル−Ａ
３ブロック型のＰＣＲサイクラー，例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製のＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ（登録商標）用の熱サイクル条件
【表１０】
2009515551.tif 000012
【０１６２】
熱サイクルプロトコル−Ｂ
１ブロック型のＰＣＲサイクラー，例えばＴｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社製のＰｘ２Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ用の熱サイクル条件
【表１１】
2009515551.tif 000013
【０１６３】
ＰＣＲ反応の停止
（この工程は任意である）
（１）チューブあたり３０μｌのクロロホルムを加える。５秒間ボルテックスする。
（２）２分間遠心分離する。（上＝水性相，下＝有機相）
【０１６４】
電気泳動
上述の産物をＤＮＡゲル電気泳動により分離する。
（１）３％アガロースゲルでＤＮＡ電気泳動を行う。
（２）例えば電圧１００Ｖで３０分間
【０１６５】
確認結果
ＨＡバンドの予測生成物サイズは，Ｈ５Ｎ１については１９５ｂｐ，Ｈ５Ｎ３については約１８３ｂｐであった。すなわち，図３に示されるように，２つのサブタイプを区別することができ，ＮＡバンドの予測生成物サイズはＨ５Ｎ１について３００ｂｐである。
【０１６６】
この実施例にしたがうキットは，典型的には，５０または１００種類の反応を含むよう製造した。キットは霜取り不要ではない冷凍庫で−２０℃で保存した。図１はキット２を用いて得られる結果を，図３はキット３を用いて得られる結果を示す。
【０１６７】
本明細書に記載されるリバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）キットは，選択された適当なＲＮＡ抽出法により検体から抽出されたサンプル中のインフルエンザＡのＨ５Ｎ１サブタイプ（鳥インフルエンザ）ＲＮＡの存在を検出するために用いることができる。このキットは，５μｌの試験サンプル中の数分子のウイルスＲＮＡを検出するよう最適化されており，全手順は１工程で実施する。
【０１６８】
電気泳動
ＰＣＲ反応の生成物は，ＤＮＡゲル電気泳動により，１レーンあたり５μｌの生成した反応混合物を用いて分離した。３％アガロースゲルにより優れた解像度が得られた。ゲルは１００Ｖで３０分間泳動した。
【０１６９】
実施例５：プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲの特異性
実施例４において記載されるキット２およびキット３において設計されたプライマーセットが，インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプを特異的に検出するために用いることができることを確認するために実施した。選択されたウイルスの増幅を，キット２については配列番号２，３，８，９，および１１および１２のプライマーセットを，キット３については配列番号４，５，８および９のプライマーセットを用いて，ＲＴ−ＰＣＲにより調べた。以下のインフルエンザＡウイルスサブタイプを，示されるタイターで試験して，プライマーセットの特異性を調べた：
H5N1(-1)A/chicken/Vietnam/8/2004(HPAI),
H5N3(-1)Atern/Australia/75/(LPAI),
H7N3(-1)A/chicken/queensland/1994(HPAI)
および
H7N7(-1)A/duck/Victoria/1976(LPAI)
【０１７０】
図１および３の結果は，インフルエンザＡのＨ５Ｎ１サブタイプに対するプライマー対の特異性を示す。すなわち，プライマー対はインフルエンザＡのＨ５Ｎ１サブタイプの検出に対して高度に特異的であることがわかる。
【０１７１】
実施例６：ヒト患者サンプルの分析
多数のヒト患者から臨床サンプルを得て，本発明のアッセイ方法によりキット２またはキット３のプライマーセットを用いて分析した。
ＰＣＲ診断キット（ＲＴ−ＰＣＲ）
この実施例のキットは，典型的には，５０または１００種類の反応を含むよう調製される。このリアルタイムリバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼ連鎖反応キットは，生物学的サンプルにおけるインフルエンザＡのＨ５Ｎ１サブタイプのＲＮＡの存在を検出するよう，最適化される。
【０１７２】
このキットは，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ，ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７５００で用いるよう最適化されているが，このシステムに限定されるものではない。キットは，本明細書に記載される他の適当な検出プラットフォームでも用いることができる。
【０１７３】
キットは，各ＲＴ−ＰＣＲ反応において数分子のＲＮＡを検出するのに十分に高い感度である。
成分
この実施例のキットは，以下の４つのチューブからなる：
チューブ１：反応ミックス（例えば，ＡＢＩカタログ番号４３０９１６９）
チューブ２：酵素ミックス（例えば，ＡＢＩカタログ番号４３０９１６９）
チューブ３：プローブミックス（３μＭ上側プライマー（配列番号２，４，８，１１，および／または１４），３μＭ下側プライマー（配列番号３，５，９，１２および／または１５）および２μＭプローブ（配列番号１），２０ｍＭＴｒｉｓ，１ｍＭＥＤＴＡｐＨ８．２中）
チューブ４：陽性対照（プライマーが標的とする遺伝子のＲＮＡ転写産物）
【０１７４】
プロトコル
１．ＲＴ−ＰＣＲ
９６ウエル光学プレート上に以下の反応混合物を調製する。
【表１２】
2009515551.tif 000014
【０１７５】
２．熱サイクル条件
【表１３】
2009515551.tif 000015
【０１７６】
プライマーセットおよびプローブを，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍｘ３０００Ｐを用いてインフルエンザＡのＨ５Ｎ１サブタイプを検出することができるか否かについて試験した。システムは製造元の指針にしたがって使用して，感染患者からのサンプルを試験した。サンプルを数倍に希釈して５μｌあたりのウイルスの総コピー数を７．５−６の範囲にした。
【０１７７】
その結果，プライマーセットおよびプローブは，インフルエンザＡのＨ５Ｎ１サブタイプについて，臨床設定において有用な高感度の特異的なアッセイを提供することが示された。
【０１７８】
実施例６の結果
図２は，種々の濃度において，インフルエンザＡサブタイプＨ５Ｎ１の検出用のプライマーを用いて達成されたプライマーの感度を示す。ここでは，負荷したサンプルあたりのウイルスコピー数を１反応あたり５００コピーから１反応あたり０．５コピーとした。レーン１はマーカーであり，レーン２および３は５μｌあたり５００コピーのウイルスを含み，レーン４および５は５μｌあたり５０コピーのウイルスを含み，レーン６および７は５μｌあたり５コピーのウイルスを含み，レーン８および９は５μｌあたり０．５コピーのウイルスを含み，レーン１０は無関係ウイルスの陰性対照を含む。陽性ＤＮＡ対照は，対応するアンプリコンに由来する個々にクローニングしたＤＮＡから調製した。
【０１７９】
上述の実施例を参照して本発明を詳細に説明してきたが，本発明の精神から逸脱することなく種々の改変をなしうることが理解される。本明細書において参照されるすべての引用特許，特許出願および公開は，その全体が参照として本明細書に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】図１は，本発明のキット２のプライマーの，他のインフルエンザＡサブタイプと比較してＨ５Ｎ１サブタイプに対する特異性を示すゲルを示す。
【図２】図２は，本発明にしたがうプライマーを用いて達成されるインフルエンザＡサブタイプＨ５Ｎ１の検出の感度を示す。
【図３】図３は，本発明のキット３のプライマーの，他のインフルエンザＡサブタイプと比較してＨ５Ｎ１サブタイプに対する特異性を示すゲルを示す。
【図１】
2009515551.tif 000016
【図２】
2009515551.tif 000017
【図３】
2009515551.tif 000018
【配列表】
2009515551000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月8日(2008.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号２２，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２８，配列番号２９，配列番号３０，および配列番号３８−４４からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む，単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８および配列番号２９からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列からなる，単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２２を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号３２および配列番号３３からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２５を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号１６および配列番号３４からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２６を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号１７，配列番号３５および配列番号３６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２８を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号１９および配列番号４５−４８からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；および／または，配列番号２９を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号２０および配列番号４９−５０からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項１記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号２３からなるオリゴヌクレオチドは，配列番号２１，配列番号３０および配列番号３１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２４からなるオリゴヌクレオチドは，配列番号２２，配列番号３２および配列番号３３からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２５からなるオリゴヌクレオチドは，配列番号１６および配列番号３４からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２６からなるオリゴヌクレオチドは，配列番号１７，配列番号３５および配列番号３６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２７からなるオリゴヌクレオチドは，配列番号１８および配列番号３７−４４からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２８からなるオリゴヌクレオチドは，配列番号１９および配列番号４５−４８からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；および／または，配列番号２９からなるオリゴヌクレオチドは，配列番号２０および配列番号４９−５０からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項２記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
生物学的サンプルにおけるインフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプの存在を判定する方法であって，
（ａ）  生物学的サンプルを用意し；
（ｂ）  少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを生物学的サンプル中の少なくとも１つの核酸と接触させ，またはオリゴヌクレオチドを生物学的サンプルから抽出，精製および／または増幅された少なくとも１つの核酸と接触させ，ここで，オリゴヌクレオチドは，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２８，配列番号２９，および配列番号３８−４４からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み；
そして
（ｃ）  工程（ｂ）における接触の結果生ずる結合を検出し，ここで，結合が検出されることは，インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプが存在することを示す，
の各工程を含む方法。
【請求項６】
生物学的サンプルにおいてインフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプの存在を判定する方法であって，
（ａ）  生物学的サンプルを用意し；
（ｂ）  少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを生物学的サンプル中の少なくとも１つの核酸と接触させ，，またはオリゴヌクレオチドを生物学的サンプルから抽出，精製および／または増幅された少なくとも１つの核酸と接触させ，ここで，オリゴヌクレオチドは，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列からなり；
そして
（ｃ）  工程（ｂ）における接触の結果生ずる結合を検出し，ここで，結合が検出されることは，インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプが存在することを示す，
の各工程を含む方法。
【請求項７】
配列番号２３を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号２１，配列番号３０および配列番号３１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２４を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号２２，配列番号３２および配列番号３３からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２５を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号１６および配列番号３４からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２６を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号１７，配列番号３５および配列番号３６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２８を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号１９および配列番号４５−４８からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；および／または，配列番号２９からなるオリゴヌクレオチドは，配列番号２０および配列番号４９−５０からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項５記載の方法。
【請求項８】
配列番号２３からなるオリゴヌクレオチドは，配列番号２１，配列番号３０および配列番号３１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２４からなるオリゴヌクレオチドは，配列番号２２，配列番号３２および配列番号３３からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２５からなるオリゴヌクレオチドは，配列番号１６および配列番号３４からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２６からなるオリゴヌクレオチドは，配列番号１７，配列番号３５および配列番号３６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２７からなるオリゴヌクレオチドは，配列番号１８および配列番号３７−４４からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２８からなるオリゴヌクレオチドは，配列番号１９および配列番号４５−４８からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；および／または，配列番号２９からなるオリゴヌクレオチドは，配列番号２０および配列番号４９−５０からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項６記載の方法。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドはプローブであり，前記方法は，
（ｉ）  生物学的サンプルを用意し；
（ｉｉ）  生物学的サンプル中の，またはサンプルから抽出，精製または増幅された少なくとも１つの核酸を少なくとも１つのレポーター標識で標識し；
（ｉｉｉ）  少なくとも１つのプローブを少なくとも１つの蛍光染料を含む少なくとも１つのマイクロビーズに固定化し；
（ｉｖ）  少なくとも１つのプローブを少なくとも１つの核酸と接触させて，プローブと核酸とが結合できるようにし；
（ｖ）  第１のレーザー光を用いて少なくとも１つの蛍光染料の蛍光強度に基づいてマイクロビーズを識別し，そして第２のレーザー光を用いてレポーター標識に基づいて，識別されたマイクロビーズ上に固定化されたプローブへの核酸の結合を検出し；
ここで，核酸のプローブへの結合が検出されることは，インフルエンザＡウイルスのＨ５Ｎ１サブタイプの存在を示す，
請求項５−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｉｉ）における少なくとも１つの核酸の標識が，工程（ｉｖ）における接触の後に行われる，請求項９記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｃ）における検出が，懸濁アレイ技術を用いて行われる，請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｂ）における接触が，プライマー対を形成する少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを核酸と接触させることを含み，および工程（ｃ）における検出が，ポリメラーゼ連鎖反応によって行われる，請求項５−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
プライマー対は核酸に結合して，配列番号６の配列を含む少なくとも１つのアンプリコンを増幅し，プライマー対は配列番号２５のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのフォワードプライマー，および配列番号２６のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのリバースプライマーを含む，請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
フォワードプライマーは配列番号３４のヌクレオチド配列を含み，および／または，リバースプライマーは配列番号３５および配列番号３６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む，請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
プライマー対は核酸に結合して，配列番号７の配列を含む少なくとも１つのアンプリコンを増幅し，プライマー対は，配列番号１８のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのフォワードプライマー，および配列番号１９のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのリバースプライマーを含む，請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
フォワードプライマーは，配列番号３７−４４からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み，および／または，リバースプライマーは，配列番号４５−４８からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む，請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
配列番号４９および５０からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むプローブは，アンプリコンに結合することができる，請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
インフルエンザＡウイルスを検出するためのキットであって，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号２２，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２８，配列番号２９，配列番号３０，および配列番号３８−４４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするキット。
【請求項１９】
インフルエンザＡウイルスを検出するためのキットであって，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするキット。
【請求項２０】
配列番号２２を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号３２および配列番号３３からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２５を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号１６および配列番号３４からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２６を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号１７，配列番号３５および配列番号３６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２８を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号１９および配列番号４５−４８からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；および／または，配列番号２９を含むオリゴヌクレオチドは，配列番号２０および配列番号４９−５０からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項１８記載のキット。
【請求項２１】
配列番号２３からなるオリゴヌクレオチドは，配列番号２１，配列番号３０および配列番号３１からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２４からなるオリゴヌクレオチドは，配列番号２２，配列番号３２および配列番号３３からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２５からなるオリゴヌクレオチドは，配列番号１６および配列番号３４からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２６からなるオリゴヌクレオチドは，配列番号１７，配列番号３５および配列番号３６からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２７からなるオリゴヌクレオチドは，配列番号１８および配列番号３７−４４からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；配列番号２８からなるオリゴヌクレオチドは，配列番号１９および配列番号４５−４８からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり；および／または，配列番号２９からなるオリゴヌクレオチドは，配列番号２０および配列番号４９−５０からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項１９記載のキット。
【国際調査報告】
2009515551.tif 000035
2009515551.tif 000036
2009515551.tif 000037
2009515551.tif 000038
2009515551.tif 000039
2009515551.tif 000040