(57)【要約】  多能性間質細胞（ＭＳＣ）を糖尿病マウスに移植すると、血糖が降下し、血中インスリンレベルが上昇し、腎臓病が改善される。よって、本発明は、単離されたＭＳＣを投与することにより、糖尿病を治療または予防するための方法を提供する。本発明はまた、単離されたＭＳＣを移植することにより、糖尿病性腎症を含む糖尿病から起こる合併症を治療または予防するための方法を提供する。
2009535347.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体において糖尿病を治療する方法であって、前記個体に治療上有効な量の単離された多能性間質細胞を投与することを含む、方法
【請求項２】
前記多能性間質細胞の投与が前記個体において膵島の再生を促進する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多能性間質細胞の投与が前記個体において高血糖を軽減する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記多能性間質細胞の投与が前記個体において個体のインスリンレベルを高める、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記多能性間質細胞の投与が前記個体において個体の糖尿病性腎症を改善する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記多能性間質細胞が、骨髄、末梢血、臍帯血および滑膜からなる群から選択される組織から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記多能性間質細胞が骨髄から単離される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記多能性間質細胞が個体に投与する前にインビトロで培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記多能性間質細胞が個体に投与する前にインビトロで拡張する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記多能性間質細胞が自己組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記多能性間質細胞が同種異系である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記多能性間質細胞が前記個体とＨＬＡ適合性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記多能性間質細胞が哺乳類から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳類が、齧歯類、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類およびヒトからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳類がヒトである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記個体が哺乳類である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳類が、齧歯類、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類およびヒトからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳類がヒトである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与が注入によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記注入が、静脈内注入、全身注入、動脈内注入、冠動脈内注入および心臓内注入からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
それを必要とする個体において糖尿病性合併症の進行を予防または阻害する方法であって、該個体に治療上有効な量の単離された多能性間質細胞を投与することを含む、方法。
【請求項２２】
前記糖尿病性合併症が糖尿病性微小血管合併症である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記糖尿病性微小血管合併症が糖尿病性腎症である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記糖尿病性微小血管合併症が糖尿病性神経障害である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記糖尿病性微小血管合併症が糖尿病性網膜症である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記糖尿病性合併症が心血管疾患である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記多能性間質細胞が、骨髄、末梢血、臍帯血および滑膜からなる群から選択される組織から単離される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記多能性間質細胞が骨髄から単離される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記多能性間質細胞が個体に投与する前にインビトロで培養する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記多能性間質細胞が個体に投与する前にインビトロで拡張する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記多能性間質細胞が自己組織または同種異系である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
それを必要とする個体において高血糖症を逆転させる方法であって、前記個体に治療上有効な量の単離された多能性間質細胞を投与することを含む、方法。
【請求項３３】
個体において前記高血糖症が糖尿病により引き起こされる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記多能性間質細胞が、骨髄、末梢血、臍帯血および滑膜からなる群から選択される組織から単離される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記多能性間質細胞が骨髄から単離される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記多能性間質細胞が個体に投与する前にインビトロで培養する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記多能性間質細胞が個体に投与する前にインビトロで拡張する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記多能性間質細胞が自己組織または同種異系である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
それを必要とする個体において低インスリン血症を逆転させる方法であって、前記個体に治療上有効な量の単離された多能性間質細胞を投与することを含む、方法。
【請求項４０】
前記低インスリン血症が膵臓傷害により引き起こされる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記膵臓傷害が糖尿病により引き起こされる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記多能性間質細胞が、骨髄、末梢血、臍帯血および滑膜からなる群から選択される組織から単離される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記多能性間質細胞が骨髄から単離される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記多能性間質細胞が個体に投与する前にインビトロで培養する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記多能性間質細胞が個体に投与する前にインビトロで拡張する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記多能性間質細胞が自己組織または同種異系である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
それを必要とする個体において膵島の再生または修復を促進する方法であって、該個体に治療上有効な量の単離された多能性間質細胞を投与することを含む、方法。
【請求項４８】
前記個体が糖尿病を有している、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
多能性間質細胞の投与が前記個体において膵島の数を増やす、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
多能性間質細胞の投与が前記個体において膵島の大きさを増す、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記多能性間質細胞が、骨髄、末梢血、臍帯血および滑膜からなる群から選択される組織から単離される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記多能性間質細胞が骨髄から単離される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記多能性間質細胞が個体に投与する前にインビトロで培養する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
前記多能性間質細胞が個体に投与する前にインビトロで拡張する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記多能性間質細胞が自己組織または同種異系である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５６】
それを必要とする個体において糖尿病を治療するための単離された多能性間質細胞の使用。
【請求項５７】
それを必要とする個体において糖尿病を治療するための薬剤の製造における単離された多能性間質細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は２００６年４月２８日出願の米国仮出願第６０／７９５，８８９号および２００６年１０月１６日出願の第６０／８５２，０２７号の優先権を主張するものであり、その内容は出典明示により本明細書の一部とされる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は一般に、糖尿病、および腎症を含む糖尿病の合併症の治療における多能性間質細胞の治療的使用に関する。
【０００３】
本発明は一部、国立衛生研究所からの助成金の支援を得て行われた。本発明において連邦政府は権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
糖尿病は、空腹状態または経口糖負荷試験中のグルコース投与後における高い血漿グルコースレベルすなわち高血糖を特徴とする疾病プロセスを指す。持続的または制御されない高血糖症は罹患率および死亡率の上昇ならびに早期罹患および早期死亡に関連している。グルコース恒常性の異常は脂質、リポタンパク質およびアポリポタンパク質代謝の変化、ならびに他の代謝疾患および血流力学性疾患と直接的および間接的に関連している。従って、真性糖尿病患者は、冠動脈性心疾患、脳卒中、末梢血管疾患、高血圧症、腎症、神経障害および網膜症を含む大血管性合併症および微小血管性合併症のリスクが特に高い。
【０００５】
糖尿病には一般に認知されている２つの形態がある。１型糖尿病またはインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）では、患者はグルコースの利用を調節するホルモンであるインスリンをほとんど産生しないか、全く産生しない。２型糖尿病または非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）では、患者の血漿インスリンレベルは非糖尿病対象と比べて同等かまたは高くさえある場合が多いが、これらの患者は、筋肉、肝臓および脂肪組織である主要なインスリン感受性組織においてグルコースおよび脂質の代謝を刺激するインスリンに対して抵抗性を発達させており、これらの血漿インスリンレベルは、高いとしても、著しいインスリン抵抗性を克服するには不十分である。インスリン抵抗性は基本的にインスリン受容体の数の減少によるものではなく、まだ完全には理解されていないインスリン受容体結合後欠陥によるものである。このインスリン応答に対する抵抗性は、筋肉おけるグルコース取り込み、酸化および貯蔵の不十分なインスリン活性化、ならびに脂肪組織における脂肪分解の、また、肝臓におけるグルコース産生および分泌の不十分なインスリン抑制をもたらす。
【０００６】
１型および２型双方の糖尿病を特徴付ける異常に高い血糖（高血糖症）は、治療しないまま放置すれば、早期失明、神経傷害、心血管疾患、脳卒中および腎不全を含む種々の病態をきたす(Sheetz and King, JAMA 288:2579-2588 (2002))。例えば、糖尿病性腎症は真性糖尿病の主要な長期合併症であり、米国での透析および腎臓移植の主要な適応症である(Marks and RaSKIN, Med. Clin. North Am. 82:877-907 (1998))。糖尿病性腎症の発症は１型および２型糖尿病患者の２５〜５０％に見られる。よって、糖尿病性腎症は西欧諸国の末期腎疾患および腎不全の最も多い原因である。
【０００７】
糖尿病の可能性のある治療としては、β細胞機能を回復させて、インスリンの放出が血糖レベルの変化に応じて動的に調節されるようにすることであろう。これは膵臓移植によって果たすことができるが、このアプローチは一般に腎不全のために腎臓移植が必要な糖尿病に限られる。また、膵臓移植は、同種異系移植片拒絶および移植された腎臓の自己免疫破壊を防ぐために終生の免疫抑制が必要である。
【０００８】
最近、単離されたヒト膵島調製物の移植片がヒト対象で長期間、インスリン依存性糖尿病を逆転させることに成功した。しかしながら、各レシピエントに多量のドナー膵島細胞材料が必要であり、膵島細胞材料の供給は需要を満たすのに十分ではない。
【０００９】
ドナー膵島の不足は、幹細胞／前駆細胞を用いる可能性を含め、グルコース応答性のインスリン産生細胞の別の供給源へと研究を促した。齧歯類起源の胚幹細胞で有望な結果が報告されているが（例えば、Horiら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:16105-10 (2002); Lumelskyら、Science 292:1389-97 (2001)参照）、ヒト疾病を治療するためのヒト胚幹細胞の使用の可能性は、この時、大部分は、糖尿病マウスで見られたような胚幹細胞の腫瘍を形成する傾向のために科学的に明らかではない(Fujikawaら、Am. J. Pathtol. 166:1781-1791 (2005))。結果として、いくつかのグループが成体幹細胞／前駆細胞の種々の可能性のある供給源を研究した。
【００１０】
骨髄由来幹細胞または前駆体細胞は糖尿病患者への移植に有用な細胞を作出する魅力的な供給源である。骨髄は幹細胞を単離するために容易に入手でき、骨髄移植は３０年以上、白血病やその他の障害を有する患者の治療に用いられてきた。さらに、他の器官とは異なり、骨髄細胞はそれほど多くの細胞を損なうことなく長期間冷凍（低温保存）することができる。
【００１１】
糖尿病を治療するための骨髄移植の研究はβ細胞機能の回復に焦点を当てて来、骨髄由来の細胞が真性糖尿病の可能性のある治療法となり得るかどうかについては矛盾した所見が示されている。
【００１２】
１つのアプローチとしては、未分画の全骨髄を用いてきた。このアプローチでは、全骨髄を一般に移植前に標識し、標識されたインスリン産生細胞をレシピエントマウスで同定する。ＣＲＥ−ＬｏｘＰ−ＧＦＰ系を用いたある研究では、レシピエントマウスの膵島の１．７〜３％の細胞が骨髄由来であったこと、および膵島から単離されたＧＦＰ標識ドナー細胞がインスリン、グルコース輸送体２および一般にβ細胞で見られる転写因子が発現することが見出された(Ianusら、2003)。しかしながら、この報告は、マウスにＧＦＰを発現する骨髄を移植したが、レシピエントマウスの膵臓において骨髄細胞がインスリン産生細胞となっているという証拠は見出せなかった３つの後続報告(Choiら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 330:1299-1305 (2005); Lechnerら、Diabetes 53:616-623 (2004); Taneeraら、Diabetes 55:290-296 (2006))を勘案して、広く批判された。骨髄は少なくとも２種類の幹細胞を含む。造血幹細胞（ＨＳＣ）は骨髄の中でも多大な幹細胞であり、間葉幹細胞または多能性間質細胞（ＭＳＣ）と様々に呼ばれる非造血組織の幹細胞ははるかに希である。Ｉａｎｕｓらの最初の報告は、それが膵島で見られたＨＳＣであることを示唆している。
【００１３】
第二の戦略もまた、糖尿病性モデルで移植された幹細胞が膵臓インスリン産生細胞の再生を促進できるかどうかを調べるためのＨＳＣならびに全骨髄の使用に特に焦点を当てたものである。Ｈｅｓｓらは、生着を促進するために、部分的骨髄アブレーションを行った糖尿病動物にｃ−ｋｉｔ＋ＨＳＣまたは全骨髄を移植した(Nat. Biotechnol. 21:763-770 (2003))。この研究は、糖尿病がＳＴＺで誘発されたＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおいて、部分的骨髄アブレーションの後にＧＦＰ標識全骨髄またはＧＦＰ標識ｃ−ｋｉｔ＋骨髄由来ＨＳＣのいずれかを移植すると、膵島の再生が促進され、血糖が降下し、血中インスリンレベルが増加した。さらなる実験では、未分画全骨髄細胞を、ＳＴＺ誘発糖尿病マウスに何回か注入すると、血糖が降下し、膵臓の組織形態が改善された(Banerjeeら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 328:318-325 (2005))。１型糖尿病のモデルとしてＮＯＤマウスが用いられた実験では、野生型骨髄の移植は、移植が高血糖症の発症前に行われた場合には血糖を降下させたが、発症後では降下させなかった(Kangら、Exp. Hematol. 33:699-705 (2005))。
【００１４】
移植用の細胞を作出する第三の戦略は、移植前にまず、培養で骨髄由来細胞をインスリン産生細胞に分化させることであった。４つの最近の報告は、プラスチック接着骨髄細胞として確認されるＭＳＣをインビトロでインスリン分泌細胞へと分化させることが可能であることが示されている(Ohら、Lab. Invest. 84:607-617 (2004)); Chenら、World J. Gastroenterol. 10:3016-3020 (2004); Choiら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 330:1299-1305 (2005);およびTangら、Diabetes 53:1721-1732 (2004))。これら２つの報告はまた、これらのインビトロ分化細胞の移植が糖尿病マウスにおいて血糖を降下させることができたことを証明した(Oh et al. (2004); Tang et al. (2004))。
【００１５】
糖尿病において膵島が果たす中枢的な役割を考え、これまでの大多数の幹細胞移植研究の注目は膵臓の修復に注がれてきた。しかしながら、多くが慢性高血糖症によって起こる糖尿病性合併症が糖尿病患者における罹患率および死亡率の主因である。腎臓、神経および網膜を含む非膵臓組織に対する移植幹細胞の効果に取り組んだ研究はほとんどない。ある研究では、２型糖尿病の遺伝モデルであるマウスに多数のヒト臍帯細胞を移植したところ、血糖が降下し、腎肥大が弱まった(Endeら、2004)。他の２つの研究では、腎臓傷害が糖尿病によって引き起こされたのではなく、抗体またはグリセロールのいずれかを注射することによって誘発された腎症の動物モデルにおいてＭＳＣ移植の効果を調べた(Haugerら、Radiology 238:200-210 (2006); Herreraら、Int. J. Mol. Med. 14:1035-1041 (2004))。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
従って、糖尿病、ならびに腎症、神経障害、網膜症、脳卒中および心血管疾患を含む糖尿病に付随する合併症を治療するための新たな治療法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
ヒト多能性間質細胞（ＭＳＣ）を糖尿病マウスに移植すると、血糖が降下し、血中インスリンレベルが上昇し、膵島の数および大きさが増大し、腎症が改善する。よって、本発明は、ＭＳＣを投与することにより糖尿病を治療または予防する方法を提供する。本発明はまた、ＭＳＣを移植することにより、糖尿病性腎症を含む、糖尿病から起こる合併症を治療または予防する方法を提供する。
【００１８】
本発明の一実施形態は、個体において糖尿病を治療する方法であって、該個体に治療上有効な量の多能性間質細胞を投与することを含む方法を提供する。多能性間質細胞の投与は、膵島の再生を促進し、高血糖を軽減し、個体のインスリンレベルを高め、個体の糖尿病性腎症を改善する。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、治療上有効な量の多能性間質細胞を投与することにより、個体において糖尿病性合併症の進行を予防または阻害する方法を提供する。糖尿病性合併症としては、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害および糖尿病性網膜症を含む微小血管合併症、ならびに脳卒中および心疾患などの心血管疾患が挙げられる。
【００２０】
本発明の別の実施形態は、治療上有効な量の多能性間質細胞を投与することにより、個体において高血糖症を逆転させる方法を提供する。一実施形態では、高血糖症は糖尿病により引き起こされたものである。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、治療上有効な量の多能性間質細胞を投与することにより、個体において低インスリン血症を逆転させる方法を提供する。一実施形態では、低インスリン血症は、糖尿病により引き起こされた傷害を含む膵臓傷害により引き起こされたものである。
【００２２】
本発明の別の実施形態は、治療上有効な量の多能性間質細胞を投与することにより、個体において膵島の再生または修復を促進する方法を提供する。
【００２３】
多能性間質細胞は、骨髄、末梢血、臍帯血および滑膜を含む組織から単離することができる。好ましい一実施形態では、多能性間質細胞は骨髄から単離される。投与前に、多能性間質細胞をインビトロで培養することもできる。好ましい一実施形態では、多能性間質細胞は、個体に投与する前にインビトロで拡張する。
【００２４】
投与用の多能性間質細胞は治療される個体から単離することもできるし（すなわち、自己組織）、または別の個体から単離することもできる（すなわち、同種異系）。同種異系多能性間質細胞の場合、ドナーと治療される個体はＨＬＡ適合性であることが好ましい。多能性間質細胞は、齧歯類、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類およびヒトを含む哺乳類から単離することができる。特定の実施形態では、ヒト多能性間質細胞が好ましい。
【００２５】
多能性間質細胞で治療される個体は、齧歯類、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類およびヒトを含む哺乳類であり得る。特定の好ましい実施形態では、哺乳類はヒトである。
【００２６】
多能性間質細胞は、静脈内注入、全身注入、動脈内注入、冠動脈内注入および心臓内注入を含む注入により投与することができる。
【００２７】
本発明の一実施形態は、それを必要とする個体において糖尿病を治療するための単離された多能性間質細胞の使用を提供する。別の実施形態は、それを必要とする個体において糖尿病を治療するための薬剤の製造における単離された多能性間質細胞の使用を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明者らは今般、糖尿病の動物モデルにおけるヒト多能性幹細胞の投与が、膵島の再生を促進し、高血糖症を軽減し、個体のインスリンレベルを上昇させ、個体の糖尿病性腎症を改善することを見出した。よって、本発明は、個体に治療上有効な量の間葉幹細胞を投与することにより、糖尿病および糖尿病の合併症を治療するための細胞に基づく療法を提供する。
【００２９】
Ｉ．細胞に基づく療法
本発明の一実施形態は、個体において糖尿病を治療する方法であって、該個体に治療上有効な量のＭＳＣを投与することを含む方法を提供する。
【００３０】
本明細書において、「糖尿病」とは１型真性糖尿病および２型真性糖尿病、ならびにインスリンの軽度の低下または血糖レベルの軽度の上昇を特徴とする初期糖尿病および前糖尿病症状を含む。「１型真性糖尿病」はインスリン依存性真性糖尿病を指し、「２型真性糖尿病」は非インスリン依存性真性糖尿病を指す。１型真性糖尿病の徴候としては、高血糖症、糖尿、インスリン欠乏、多尿症、多飲症(poludypsia)および／またはケトン尿症を含む。２型真性糖尿病の徴候としてが、１型のものの他、インスリン抵抗性を含む。
【００３１】
本発明の方法は、膵島の数および大きさを増し、それにより失われた膵臓β細胞を補うことにより、１型糖尿病患者を治療するために使用することができる。本発明の方法はまた、膵島の数および大きさを増し、それによりインスリンの産生を高めることにより、２型糖尿病患者を治療するために使用することができる。
【００３２】
本発明の方法では、糖尿病に罹患している患者にＭＳＣを、患者において有効レベルの内因性のインスリンを提供するのに十分な量で投与する。患者において内因性インスリンの「有効」または「正常」レベルとは一般に、健康な患者、すなわち、糖尿病に罹患していない患者において内因的に産生されるインスリンのレベルを指す。あるいは、「有効な」レベルとはまた、糖尿病の徴候を緩和するのに医学上有効となるように医師によって決定されるインスリンのレベルも指す。
【００３３】
ＭＳＣの投与が個体において糖尿病または付随する症状を改善するかどうかを決定するには、種々のエンドポイントのいくつかを使用することができる。例えば、ＭＳＣの移植は膵島における機能的β細胞量を増すことができる。他のエンドポイントとしては、グルコースまたはアルギニンなどのβ細胞刺激剤をマウスに注射した後の循環Ｃペプチドおよびインスリンの血漿レベルの増強；膵島移植片から導き出されたインスリン免疫反応性またはｍＲＮＡレベルの上昇により示されるガストリン／ＥＧＦ治療に対する応答；および治療された個体にける膵島の形態学的測定により示されるβ細胞の数の増大の測定を含む。
【００３４】
本発明の別の実施形態は、治療上有効な量のＭＳＣを投与することにより、個体において糖尿病性合併症の進行を予防または阻害する方法を提供する。糖尿病性合併症としては、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害および糖尿病性網膜症を含む微小血管合併症、ならびに脳卒中および心疾患などの心血管疾患が挙げられる。糖尿病の他の合併症としては、限定されるものではないが、大血管障害、肥満、高インスリン血症、糖代謝障害、高脂血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、脂質代謝障害、浮腫、高尿酸血症および痛風が挙げられる。
【００３５】
本発明の一実施形態では、ＭＳＣの移植が糖尿病性腎症を治療または予防するために使用される。１型または２型糖尿病患者における糖尿病性腎症および他の腎障害の発症に関連する原因リスク因子としては、高血糖症、高血圧症、糸球体血行力学の変化、ならびにトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、血管内皮増殖因子−ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）および結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）を含む種々の増殖因子の発現の増強または異常が挙げられる。例えば、Flyvbjerg, Diabetologia 43:1205-23 (2000); Brosius, Exp. Diab. Res. 4:225-233 (2003); Gilbertら、Diabetes Care 26:2632-2636 (2003)；および国際公開番号ＷＯ００／１３７０６参照。
【００３６】
糖尿病性腎症を治療するためのＭＳＣＴの移植は、腎症を治療するための他のいずれかの治療計画と併用することができる。糖尿病性腎症の進行を緩慢にすることをねらいとした現行の治療戦略では、食生活の改善による最適な血糖管理および／またはインスリン療法および高血圧管理を含む種々のアプローチを用い、成功の程度は様々であることが示されている。例えば、高血圧症を軽減するためにアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤およびアンギオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）の双方の投与は、腎症およびマクロアルブミン尿症の進行または発症を遅延させることが示されている。
【００３７】
本発明の別の実施形態は、治療上有効な量の多能性間質細胞を投与することにより個体において高血糖症を治療する、かつ／または逆転させる方法を提供する。一実施形態では、高血糖症は糖尿病により引き起こされる。
【００３８】
高血糖症により引き起こされる障害としては、網膜症、神経障害、腎症、潰瘍および大血管障害などの糖尿病性合併症；肥満；高インスリン血症；糖代謝障害；高脂血症；高コレステロール血症；高トリグリセリド血症；脂質代謝障害；動脈硬化性心血管疾患；高血圧症；うっ血性不全；浮腫；高尿酸血症および痛風が挙げられる。
【００３９】
「高血糖症の治療」とは、治療された個体のグルコースレベルが治療を行わない場合の個体のグルコースレベルに比べて降下していることを意味する。グルコースレベルは当技術分野で公知の技術を用いて測定することができる。例えば、血糖レベルはＥｌｉｔｅ（登録商標）糖尿病ケアシステム(Bayer, Germany)などのグルコメーターで測定することができる。
【００４０】
本発明の別の実施形態は、治療上有効な量のＭＳＣを投与することにより、個体において低インスリン血症を治療する、および／または逆転させる方法を提供する。一実施形態では、低インスリン血症は、糖尿病膵臓傷害により引き起こされる。
【００４１】
「低インスリン血症」は、体内を循環する正常量のインスリンよりも低いことを特徴とする症状である。肥満は一般に関与しない。この症状には１型糖尿病が含まれる。
【００４２】
「低インスリン血症の治療」とは、治療された個体のインスリンレベルが治療を行わない場合の個体のインスリンレベルに比べて上昇していることを意味する。インスリンレベルは、循環インスリンレベル（血清インスリンレベルと呼ばれることもある）ならびに膵臓インスリンレベルの測定を含む、当技術分野で公知の技術を用いて測定することができる。
【００４３】
本発明の別の実施形態は、治療上有効な量のＭＳＣを投与することにより、個体において膵島の再生または修復を促進する方法を提供する。
【００４４】
個体において膵島の再生を評価するためには、新たに発生したβインスリン分泌細胞または膵島の大きさを、膵島β細胞質量、膵島β細胞数、膵島β細胞％、血糖、血清グルコース、血中グリコシル化ヘモグロビン、膵臓β細胞質量、膵臓β細胞数、空腹時血漿Ｃペプチド含量、血清インスリンおよび／または膵臓インスリン含量のいずれかを含む標準的な生理学的または診断的パラメーターを用いて測定することができる。
【００４５】
その徴候の軽減をもたらす糖尿病治療を提供する本発明の方法は、糖尿病の徴候を示す動物において治療することもでき、この動物はヒトにおける糖尿病治療に有用な方法および手法のモデルとして役に立つ。よって、まず、動物に可能性のある治療薬を投与し、その効果を観察し、治療動物と非治療動物を比較することにより、動物モデルにおいて可能性のある糖尿病治療を検討することができる。
【００４６】
ヒト糖尿病の特定の適切なモデルである１型またはインスリン依存性糖尿病の１つの重要なモデルが、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス(Kikutano and Makino, Adv. Immunol. 52:285 (1992)およびその中に引用されている参考文献）。ＮＯＤマウスにおける１型糖尿病の発症は外的な刺激なく、内発的に突如として起こる。ＮＯＤマウスが糖尿病を発症すると、慢性的自己免疫疾患により引き起こされるβ細胞の進行的破壊を受ける。ＮＯＤマウスにおけるインスリン依存性真性糖尿病の発症は、自己免疫インスリン炎（膵島のリンパ性炎症）の誘発と膵島の破壊および明確な糖尿病の進行の二段階に大きく分けることができる。糖尿病ＮＯＤマウスは正常血糖(euglycemia)または正常な血糖レベルを持って産まれるが、このＮＯＤマウスは約１５〜１６週齢で高血糖となり始め、それらの膵臓β細胞の大多数の破壊を示し、それに応じて膵臓は十分なインスリンを産生することができない。インスリン欠乏と高血糖に加え、糖尿病ＮＯＤマウスは重篤な糖尿、多飲症および多尿症を受け、急速な体重減少を伴う(Kikutano and Makino, 1992)。従って、疾病の原因および進行は双方とも、１型糖尿病に罹患しているヒト患者と同じである。ＮＯＤマウスでは一時的緩解はまれにしか見られず、これらの糖尿病動物は、インスリン療法を受けなければ、糖尿病の発症後１〜２か月で死に至る。よって、ＮＯＤマウスは、ＭＳＣを投与することによる糖尿病の治療の種々の方法の有効性を調べるための動物モデルとして使用することができる。
【００４７】
ＮＯＤマウスの糖尿病に対する本発明の治療方法の有効性は、多飲症、多尿症、糖尿、高血糖症およびインスリン欠乏症、ならびに体重低下に関してＮＯＤマウスを検査することを含む、当業者に公知の手段により、ＮＯＤマウスにおいて糖尿病をアッセイすることによりモニタリングすることができる。例えば、尿グルコースのレベル（糖尿）はＴｅｓｔａｐｅ(Eli Lilly, Indianapolis, Ind.)でモニタリングすることができ、血漿グルコースレベルは、出典明示により本明細書の一部とされる米国特許第５，８８８，５０７号に記載されているように、グルコメーター３血糖測定器(Miles, Inc., Elkhart, Ind.)  でモニタリングすることができる。これらの方法によりグルコース血漿グルコースのレベルをモニタリングする際、ＮＯＤマウスはＴｅｓｔａｐｅ値＋１以上または血漿グルコースレベル＞２５０ｍｇ／ｄＬの一連の２つの尿陽性判定後に糖尿病とみなされる（米国特許第５，８８８，５０７号）。
【００４８】
ＮＯＤマウスにおいて糖尿病をアッセイする別の手段として、膵臓インスリンレベルを調べるものがある。膵臓インスリンレベルは、例えば、イムノアッセイにより測定し、治療マウスと対照マウスとを比較すればよい（出典明示により本明細書の一部とされる米国特許第５，４７０，８７３号）。この場合、マウス膵臓からインスリンを抽出し、標品としてのマウスインスリンを用い、ラジオイムノアッセイ技術などにより、その反応性によって濃度を決定する（米国特許第５，８８８，５０７号）。
【００４９】
２型または非インスリン依存性糖尿病を調べるには、次の齧歯類モデル：ＺｕｃｋｅｒＤｉａｂｅｔｉｃ  Ｆａｔｔｙ  （ＺＤＦ）ラット、Ｗｉｓｔａｒ−Ｋｙｏｔｏラット、糖尿病（ｄｂ）マウス、および肥満（ｏｂ）マウス(Pickup and Williams, eds, Textbook of Diabetes, 2nd Edition, Blackwell Science)を含む、いくつかの動物モデルが有用である。
【００５０】
ＺＤＦラットは、ヒト２型糖尿病患者で見られるものと同じ多くの糖尿病の特性を示すことから、広く用いられている２型糖尿病の動物モデルである(Clarkら、Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 173:68 (1983))。これらの糖尿病の特徴としては、インスリン抵抗性、耐糖能異常者、高血糖症、肥満、高インスリン血症、高脂血症および軽度の高血圧症を含む。ＺＤＦラットの糖尿病は一般に、常染色劣性体肥満（ｆａ）遺伝子に付与され、連結され、その結果、ＺＤＦラットは脂肪遺伝子に関して同形接合（ｆａ／ｆａ）となる。ＺＤＦラットは一般に、およそ８〜１０週齢の間に糖尿病の徴候を発症し、この間にβ細胞の不全および明確な糖尿病への進行が起こる。
【００５１】
ＺＤＦラットにおける糖尿病に対する本発明の治療方法の有効性は、血漿グルコースレベル、血漿インスリンレベルおよび重量増に関してＺＤＦラットを検査することを含む、当業者に公知の手段により、ＺＤＦラットにおいて糖尿病をアッセイすることによりモニタリングすることができる。血漿グルコースレベルは一般に週１〜２回確認し、グルコメーター３血糖測定器(Miles, Inc., Elkhart, Ind.)でモニタリングすることができる。この方法により非空腹時血漿グルコースレベルをモニタリングする際、ＺＤＦラットは血漿グルコースレベルが高く維持されている（＞２５０ｍｇ／ｄＬ）か、さらに上昇している場合に糖尿病とみなされ、維持されている血漿グルコースレベル（およそ１００〜２００ｍｇ／ｄＬ）の低下を根拠としてラットを非糖尿病とする(Yakubu-Madusら、Diabetes 48:1093 (1999))。
【００５２】
非空腹時インスリンレベルは市販のラジオイムノアッセイキット(Diagnostics, Products,  Los Angeles, Calif.)で、標品としてブタおよびラットインスリン(Yakubu-Madus, 1999)を用いてモニタリングすることができる。このアッセイでは、血漿インスリンは１週間に１回モニタリングし、治療が糖尿病に対して有効であれば標準レベル以上に維持されるが、糖尿病のままであるＺＤＦラットでは４週間でおよそ２〜３倍低下する。
【００５３】
空腹時血漿グルコースおよびインスリンレベルは、一晩絶食させたマウスで経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を行うことにより測定することができる。典型的なＯＧＴＴでは，ラットに胃管栄養法によって２ｇグルコース／ｋｇ体重を与え、０分、１０分、３０分、６０分、９０分および１２０分の時点で血液サンプルを採取する(Yakubu-Madus (1999))。糖尿病ＺＤＦラットでは、空腹時グルコース値は０時点のおよそ１００〜２００ｍｇ／ｄｌから３０〜６０分時点の約４００〜５００ｍｇ／ｄｌに上昇し、その後、１２０分時点までに約３５０〜４５０ｍｇ／ｄｌに低下する。糖尿病が緩和されれば、空腹時グルコース血漿値は３０〜６０分時点で約２００〜２５０ｍｇ／ｄｌと初期低下がより低く、その後、１２０分時点までに約１００〜１５０ｍｇ／ｄｌに低下する。空腹ＺＤＦラットにおいてＯＧＴＴ前およびＯＧＴＴ中に測定した血漿インスリンレベルは一般に１０分までに二倍となり、その後、後のアッセイでは最初の値へと再び低下する。これに対し、ＺＤＦラットにおける糖尿病の有効な治療では、１０分時点での血漿インスリンにおける４〜５倍の上昇、その後の９０分時点のほぼ最初の値への直線的低下により示される(Yakubu-Madus, 1999)。
【００５４】
ＺＤＦラットにおいて糖尿病をアッセイする別の手段として、ＺＤＦラットにおける膵臓インスリンレベルを調べるものがある。例えば、膵臓インスリンレベルは、糖尿病のＮＯＤマウス動物モデルに関して上記したように．イムノアッセイにより調べ、治療ラットと対照ラットを比較することができる。
【００５５】
ＩＩ．多能性間質細胞（ＭＳＣ）
骨髄は造血幹細胞（ＨＳＣ）と本明細書で多能性間質細胞（ＭＳＣ）と呼ばれる非造血組織の幹細胞の、少なくとも２種類の幹細胞を含む。骨髄から単離されたこれらのプラスチック接着幹細胞／前駆細胞は初期には繊維芽細胞様コロニー形成単位と呼ばれていたが、後に、血液学の文献では骨髄幹細胞と呼ばれ、またその後は間葉幹細胞と呼ばれ、最近では多能性間質細胞（ＭＳＣ）と呼ばれ、また、これらの細胞は間葉幹細胞、骨髄間質細胞または単に間質細胞とも呼ばれる（例えば、Prockop, Science 276:71-74 (1997)参照）。ＭＳＣは骨(Beresford et al. (1992) J. Cell Sci. 102:341-351 (1992))、軟骨(Lennonら、Exp. Cell Res. 219:211-222 (1995))、脂肪(Beresfordら、1992)および筋肉(Wakitaniら、Muscle Nerve 18:1417-1426 (1995))を含む複数の中胚葉組織にも分化することができることから、間葉幹細胞と呼ばれることもある。
【００５６】
ＭＳＣの１つの好ましい集団は、「ＲＳ細胞」または「ＲＳ−ＭＳＣ」と呼ばれることもある小さく、急速に自己再生するＭＳＣの集団である。ＲＳ−ＭＳＣは、出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる米国特許第７，０５６，７３８号に詳細に記載されている。ＲＳ−ＭＳＣは、免疫不全マウスに移植した際に分化および肥大が向上することが示されている(Leeら、Blood 107:2153-2161 (2006))。
【００５７】
ＭＳＣは、条件によって、３つ全ての胚葉になり得る(Kopenら、1999; Liechtyら、Nature Med. 6:1282-1286 (2000); Kottonら、Development 128:5181-5188 (2001); Tomaら、Circulation 105:93-98 (2002); Jiangら、Nature 418:41-49 (2002))。例えば、インビボにおける証拠は、非分画骨髄由来細胞ならびに純粋なＭＳＣ集団が、肺の上皮細胞を含む上皮細胞種となり得る(Krauseら、Cell 105:369-377 (2001); Petersenら、Science 284:1168-1170 (1999))。同様に、ニューロンマーカーを発現するニューロン様細胞への分化も報告されている(Woodburyら、J. Neurosci. Res. 61:364-370; Sanchez-Ramosら、Exp. Neurol. 164:247-256 (2002); Dengら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 282:148-152 (2001))。生理学的条件下で、ＭＳＣは骨髄の構造を維持し、それぞれに種々の細胞接着分子の助けとサイトカインの分泌によって造血を調節する(Clarkら、Ann. NY Acad. Sci. 770:70-78 (1995))。
【００５８】
ＭＳＣは、骨形成不全症(Pereiraら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:1142 (1998))、パーキンソン症候群(Schwartzら、Hum. Gene Ther. 10:2539 (1999))、脊髄損傷(Choppら、Neuroreport 11:3001 (2000); Wuら、J. Neurosci. Res. 72:393 (2003))および心障害(Tomitaら、Circulation 100:247 (1999); Shakeら、Ann. Thorac. Surg. 73:1919 (2002))を含む動物疾病モデルにおける移植のため、有望な結果で使用されてきた。また、骨形成不全症に関する臨床試験でも有望な結果が報告されており(Horwitzら、Blood 97:1227 (2001); Horowitzら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:8932 (2002))、異種骨髄移植の生着を促進している(Frassoniら、Int. Society for Cell Therapy SA006 (abstract) (2002); Kocら、J. Clin. Oncol. 18:307 (2000))。いくつかの研究では、ＭＳＣの生着は組織損傷により促進されることが報告されている(Ferrariら、Science 279:1528-1530 (1998); Okamotoら、Nature Med. 8:1101-1017 (2002))。
【００５９】
ＭＳＣは骨髄の少量の吸引物から容易に単離され、単細胞コロニーを容易に形成する。組織培養プラスチックに選択的に接着させることにより骨髄細胞懸濁液から増殖させたＭＳＣは効率的に拡張させ(Aziziら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3908-3913 (1998); Colterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3213-218 (2000))、遺伝子操作することができる(Schwarzら、Hum. Gene. Ther. 10:2539-2549 (1999))。
【００６０】
一般に、本発明の多能性間質細胞（ＭＳＣ）療法は次の工程：１）ＭＳＣの単離；および２）インビトロでのＭＳＣの培養と拡張、その後、生化学操作または遺伝子操作を行う、または行わずに、被治療個体へＭＳＣを投与することを含む。
【００６１】
Ａ．ＭＳＣの単離
本発明の方法で使用するための多能性間質細胞はそれらの起源組織の他の細胞から単離する。本明細書において「単離される」とは、それらの細胞が、そのＭＳＣが得られた組織中に存在する他の細胞、細胞成分および／または細胞外材料から実質的に精製されていることを意味する。例えば、骨髄由来ＭＳＣは、骨髄中に存在する造血幹細胞などの他の細胞から実質的に精製されている。本発明の方法で使用するための多能性間質細胞は分化していないが、多能性を維持している。
【００６２】
本発明の方法で使用するための多能性間質細胞は、骨髄、末梢血、臍帯血および滑膜を含む種々の組織源から単離さることができる。ヒト多能性間質細胞の他の供給源としては、限定されるものではないが、胚の卵黄嚢、胎盤、脂肪、胎児および未熟な皮膚および筋肉組織が挙げられる。特定の好ましい実施形態では、多能性間質細胞は骨髄から単離することができる。
【００６３】
本発明の方法で使用するためのＭＳＣ単離法は、当技術分野で公知である。骨髄からＭＳＣを単離する方法は、米国特許第５，４８６，３５９号、ならびに米国特許公報第２００３／０００３０９０号、同第２００４／０２３５１６６号、同第２００５／００８４４９４号および同第２００４／０２３５１６５号に記載されている（これらは出典明示により本明細書の一部とされる）。臍帯血からＭＳＣを単離する方法は、出典明示により本明細書の一部とされるEricesら、Br. J. Haematol. 109:235-42 (2000)に記載されている。滑膜からＭＳＣを単離する方法は、例えば、出典明示により本明細書の一部とされるDjouadら、Arthritis Res. & Ther. 7:R1304-R1315 (2005)に記載されている。一般に、ＭＳＣの迅速単離技術としては、限定されるものではないが、ロイコフェレシス(leucopheresis)、密度勾配分画、免疫選択、示差的接着分離などが含まれる。
【００６４】
ＭＳＣを単離する１つの好ましい方法は、例えば腸骨稜から骨髄吸引物を採取すること、密度勾配で単核細胞を単離すること、およびこれらの細胞を培養系にプレーティングして非接着細胞を除去すること（残っているプラスチック接着細胞がＭＳＣである）を含む。例えば、非接着細胞は、培養２４時間後に培養培地を除去し、接着細胞を洗浄することによって除去することができる。この方法は例えば米国特許公報第２００３／０００３０９０号、同第２００４／０２３５１６６号、同第２００５／００８４４９４号および同第２００４／０２３５１６５号（これらは出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる）に詳細に記載されている。骨髄細胞は腸骨稜、大腿、脛骨、脊椎、肋骨または他の髄質空間から得られる。
【００６５】
ＭＳＣを単離する１つの好ましい方法は、出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる米国特許第７，０５６，７３８号に詳細に記載されている。この方法では、ＭＳＣは、小さく、急速に自己再生するＭＳＣの集団である「ＲＳ細胞」である。この方法では、骨髄吸引物から有核細胞を単離し、プラスチック接着細胞を単離し、得られた細胞を低密度（例えば、３細胞／ｃｍ２）でプレーティングし、その培養系がＲＳ細胞またはＲＳ−ＭＳＣと呼ばれる、小さな紡錘型の細胞の特殊な部分集団を保持するように密集に達する前に採取する。ＲＳ−ＭＳＣは、集密度のより高い培養系で見られる大きな、複製の遅い細胞よりも容易に分化し、免疫不全マウスにより効率的に生着する(Leeら、Blood 107:2153-2161 (2006))。
【００６６】
免疫選択もまた、骨髄由来ｈＭＳＣにより発現される表面抗原に対して作製されたモノクローナル抗体を用い、ｈＭＳＣを単離するために使用することができる。例えば、米国特許第６，３８７，３６７号にはモノクローナル抗体ＳＨ２、ＳＨ３またはＳＨ４の使用が記載されており、ＳＨ２抗体はエンドリン（ＣＤ１０５）と結合し、ＳＨ３とＳＨ４はＣＤ７３と結合する。ｓｔｒｏ−１抗体がGronthosら、1996, J. Hematother. 5: 15-23に記載されている。ヒトＭＳＣを富化するために使用可能なさらなる細胞表面マーカーがFibbeら、Ann. N.Y. Acad. Sci. 996: 235-244 (2003)の２３７頁表Ｉに記載されている。
【００６７】
ＭＳＣは、限定されるものではないが、齧歯類、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコおよび非ヒト霊長類、ならびにヒトを含む、いずれの動物からも誘導可能である。
【００６８】
本発明の方法で使用するためのＭＳＣは、自己、同種異系または異種であり得る。本明細書において「自己」とは、移植片がレシピエントの細胞、組織または器官に由来していることを意味する。本明細書において「同種異系」とは、移植片が、レシピエントと同じ種であるが、抗原性が異なる細胞、組織または器官に由来していることを意味する。本明細書において「異種」とは、移植片が異種に起源する細胞、組織または器官に由来していることを意味する。
【００６９】
Ｂ．インビトロにおけるＭＳＣの培養および拡張
ＭＳＣは単離直後に使用することができる。あるいは、ＭＳＣは使用前、例えば２４時間以内に一時的に培養することができる。ＭＳＣはまた、本発明の方法で使用する前に培養系で拡張することができる。
【００７０】
本明細書に記載の方法の一実施形態では、ＭＳＣは、個体に投与する前に総細胞数を増やすために培養拡張することができる。ＭＳＣを培養系で拡張する方法は例えば米国特許公報第２００４／０２３５１６６号、同第２００５／００８４４９４号および同第２００４／０２３５１６５号、ならびに米国特許第７，０５６，７３８号に記載されている。
【００７１】
ＭＳＣは単離後に冷凍し、それらの機能、多能性または生存力を損なわない時間保存することができる。ＭＳＣは単離直後に冷凍することもできるし、あるいは単離後、冷凍前に培養および拡張することもできる。その後、冷凍細胞を解凍し、本発明の方法に使用することができる。
【００７２】
本発明の方法で使用するためのＭＳＣは培養培地で維持することができ、この培養培地は化学的に定義された血清不含培地であってもよいし、あるいは１０％血清を添加したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）などの「完全培地」であってもよい。化学的に定義された好適な血清不含培地および完全培地は当技術分野で周知である。例えば、米国特許第５，９０８，７８２、ＷＯ９６／３９４８７および米国特許第５，４８６，３５９号参照。化学的に定義された培地は一般に、ヒト血清アルブミン、ヒトＥｘ  Ｃｙｔｅリポタンパク質、トランスフェリン、インスリン、ビタミン、必須および非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、グルタミンおよびマイトジェンを添加したイスコフの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）などの最小必須培地を含む。これらの培地は、分化させずに、多能性間質細胞の増殖を刺激する。
【００７３】
本発明はまた、ヒトへ投与する前に、非ヒト血清タンパク質を除去するための条件下でＭＳＣを培養する方法も提供する。このような方法としては、非ヒト血清タンパク質を代謝的に除去するための、ヒト血清または血小板溶解液中での短時間培養の使用を含む(Yamadaら、2004; Doucetら、2005; Speesら、Molc. Ther. 9:747-756 (2004))。
【００７４】
ある特定の実施形態では、ＭＳＣは、個体に投与する前に遺伝的に修飾することができる。例えば、ＭＳＣは、増殖因子、ケモカインもしくはサイトカインなどの組換えポリペプチド、または増殖因子、ケモカインもしくはサイトカインと結合する受容体を発現するように遺伝的に修飾することができる。ＭＳＣはまた、レシピエント内でそれらの同定を可能とするＧＦＰなどのマーカータンパク質を発現するように遺伝的に修飾することもできる。
【００７５】
ＩＩＩ．投与方法
本明細書においてＭＳＣを「移植する」とは、当技術分野で公知の方法により、または本明細書に示されているように、哺乳類の身体へ細胞、組織または器官組成物を導入することを意味する。この組成物が「移植片」であり、哺乳類がレシピエントである。
【００７６】
移植片とレシピエントは同系、同種異系または異種であり得る。本明細書において「同系」とは、移植片がレシピエントと同じ種のものであり、免疫応答を惹起しないよう十分抗原性が同じまたは類似している、すなわち組織適合性である細胞、組織または器官に由来していることを意味する。同系細胞は、本明細書において「ＨＬＡ適合性」と言われることがある。本明細書において「同種異系」とは、移植片がレシピエントの同種のものであるが、抗原性が異なる細胞、組織または器官に由来していることを意味する。本明細書において「異種」とは、異なる種に起源する細胞、組織または器官に由来していることを意味する。一実施形態では、ＭＳＣは自己である。本明細書において「自己」とは、移植片がレシピエントの細胞、組織または器官の由来していることを意味する。
【００７７】
一実施形態では、多能性間質細胞が投与される動物は哺乳類である。哺乳類は齧歯類、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、およびヒトであり得る。
【００７８】
多能性間質細胞は、種々の手法によって個体に投与することができる。多能性間質細胞は静脈投与、動脈投与または腹腔内投与によるなど全身投与することもできるし、あるいは多能性間質細胞は、例えば組織または器官への直接注射によるなど、膵臓または腎臓などの組織または器官へ直接投与することもできる。
【００７９】
ＭＳＣは上記のように、治療上有効な量で個体に投与される。一般に、ＭＳＣは約１×１０５細胞／ｋｇ〜約１×１０７細胞／ｋｇの量で投与する。ＭＳＣの厳密な投与量は、患者の齢、体重および性別、ならびに治療する症状の程度および重篤度を含む種々の因子によって異なる。
【００８０】
ＭＳＣは、許容される医薬担体と一緒に投与することができる。例えば、ＭＳＣは、薬学上許容される注射用液体媒体中の細胞懸濁液として投与することができる。
【００８１】
多能性間質細胞は、上述の療法および治療に使用する際には、当業者に公知の他の治療薬と組み合わせて投与することができる。一実施形態では、レシピエントにタクロリムス、シロリムス、シクロスポリンおよびコルチゾンならびに当技術分野で公知の他の薬剤など、免疫系を抑制する薬剤を投与することができる。例えば、米国特許公報第２００４／０２０９８０１号参照。使用可能な他の免疫抑制薬として、抗ＣＤ１１抗体がある。
【００８２】
以下の例は本発明の例示的実施形態を示す。当業者ならば、本発明の精神または範囲を変えることなく実施可能な多くの改変および変更が分かるであろう。このような改変および変更も本発明の範囲内に包含される。実施例は本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００８３】
実施例１：骨髄由来ヒト多能性間質細胞（ＭＳＣ）は糖尿病ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおいてインスリン産生膵島の再生を促進する
糖尿病を治療するための最も有望な候補のいくつかが、コロニー形成単位繊維芽細胞、多能性間質細胞、間葉幹細胞、多能性間質細胞またはＭＳＣと様々に呼ばれる、ヒト骨髄から単離可能なプラスチック接着細胞である(Owen and Friedenstein, 1988; Caplan, 1991; Prockop, 1997)。ＭＳＣは患者から容易に得られ、培養系で迅速に拡張されることから、患者への極めて多数の自己細胞の投与が実現できる。全身注入後、これらの細胞は損傷組織に定着し、多様な細胞表現型への分化、サイトカインおよびケモカインの提供、組織に内在する幹細胞／前駆細胞の増殖の促進、またはミトコンドリアの細胞融合もしくは移動を含むいくつかの異なるメカニズムによりそれらを修復する(Prockopら、2003; Speesら、2003; Munozら、2005; Speesら、2006)。さらに、ＭＳＣは数種の免疫応答を抑制する(Le Blancら、2003)。ＭＳＣのさらに有望な特徴は、いくつかの形態の骨形成不全(Horwitzら、2001)、ムコ多糖沈着症(Kocら、2002)および移植片対宿主病(Lazarusら、2005; Le Blancら、2004)に関する臨床試験で調べられている。これらの個々の臨床試験は、患者に明らかな毒性なく、有望な結果を示している。
【００８４】
本発明者らは、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）で軽度の糖尿病が発症した免疫不全ＮＯＤ／ｓｃｉｄにおいて、ヒト骨髄（ｈＭＳＣ）由来ＭＳＣの有効性を調べることにした。この戦略により、人為的結果を示すおそれのある外因性の標識を用いずに、ドナーヒト細胞を容易に検出し、その有効性をアッセイすることができた。
【００８５】
材料および方法
マウスにおけるＳＴＺ誘発糖尿病：  ７〜８週齢の雄免疫不全ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ； Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME）に、１日目〜４日目に毎日、３５ｍｇ／ｋｇ  ＳＴＺ(Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)を腹膜内（ＩＰ）注射した。ＳＴＺをクエン酸ナトリウムバッファーｐＨ４．５に溶かし、調製１５分以内に注射した。マウスは、Tulane University and the Ochsner Clinic Foundationの実験動物委員会(Institutional Animal Care and Utilization Committees)により認可されたプロトコールのもと、無菌条件下で維持した。
【００８６】
ｈＭＳＣの調製および注入：  継代培養２代目のｈＭＳＣの冷凍バイアルをTulane Center for the Preparation and Distribution of Adult Stem Cells (http://www.som.tulane.edu/gene_therapy/distribute.shtml)から入手した。治験審査委員会(Institutional Review Board)により認可されたプロトコールを用い、正常な志願者から、記載のようにして(Sekiyaら、2002)調製されたものである。約約１０６の継代培養１代目ヒトＭＳＣの冷凍バイアルを解凍し、２０％ウシ胎児血清(Sekiyaら、2002)を含有する完全培養培地中、１８０ｃｍ２培養プレート（Ｎｕｎｃ）に２５ｍｌ培地としてプレーティングし、５％加湿ＣＯ２下、３７℃でインキュベートした。２４時間後、培地を除去し、接着活性のある細胞をＰＢＳで２回洗浄し、３７℃で約５分間０．２５％トリプシンおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて採取し、１００細胞／ｃｍ２で再びプレーティングした。これらの細胞を７〜９日間、集密度７０％となるまでインキュベートし、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて採取した。移植のため、細胞を、ＰＢＳを用いた遠心分離によって洗浄し、
ハンクスのバランス塩溶液に２０，０００細胞／μｌの濃度で懸濁させ、４℃で維持した。マウスをケタミン（９１ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（９ｍｇ／ｋｇ）の混合物０．０７ｍｌでＩＰ麻酔し、１５０μｌの細胞懸濁液を胸壁から左心室に注射した。
【００８７】
血糖およびインスリンのアッセイ：  血糖は、朝に４時間の絶食をさせた後、グルコメーター(Elite Diabetes Care System; Bayer, Germany)を用いて尾の静脈血でアッセイした。血中インスリンは、３２日目に屠殺する前に麻酔したマウスの心臓内穿刺により得た血液でにおいて、マウス特異的ＥＬＩＳＡキットおよびヒト特異的ＥＬＩＳＡキット(Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA, およびInsulin Ultrasensitive ELISA; Mercodia, Uppsala, Sweden)の双方を用いてアッセイした。
【００８８】
組織サンプルの調製：  マウスはケタミン／キシラジンのＩＰ注射により屠殺し、左心室を２０ｍｌのＰＢＳで潅流した後、右心室を５ｍｌのＰＢＳで潅流した後、解剖により組織を単離した。ＤＮＡおよびＲＮＡアッセイのため、膵臓の遠位半分、一方の腎臓および他の器官を−８０℃で急速凍結した。膵臓の近位半分を１０％緩衝ホルマリン中で一晩固定し、３０％スクロース／ＰＢＳ中、４℃で一晩インキュベートした。次に、これらのサンプルをゲル(Tissue-Tek Oct Compound; Sakura Finetek, Torrance, CA)中に包埋し、５〜８μｍの凍結切片を作製した。組織学のため腎臓サンプルを同じプロトコールで固定し、これを用いて５〜８μｌのパラフィン切片を作製した。免疫組織学のための腎臓サンプルもゲルに包埋し、これを用いて８〜３０μｍの凍結切片を作製した。
【００８９】
リアルタイムＰＣＲアッセイおよびＲＴ−ＰＣＲアッセイ：  凍結組織をホモジナイズし、フェノール／クロロホルム(Phase Lock Gel; Eppendorf/Brinkmann Instruments, Inc., Westbury, NY)でＤＮＡを抽出し、全ＤＮＡを吸光度によりアッセイした。リアルタイムＰＣＲアッセイは、２００ｎｇの標的ＤＮＡ、Ａｌｕ特異的プライマーおよび蛍光プローブ(McBrideら、2003)とともに、自動装置(Model 7700; Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて行った。各サンプルにおける標的ＤＮＡの量の値を、１コピーマウスアルブミン遺伝子に関するアッセイ(Leeら、2006)により補正した。
【００９０】
ＲＴ−ＰＣＲアッセイでは、マウス膵臓の遠位部からＲＮＡを単離した（ＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ単離キット； Qiagen, Valencia, CA）。対照として、ヒト膵臓由来のＲＮＡを商業的供給者(Clontech; Mountain View, CA)から得た。およそ１００ｎｇの全ＲＮＡを、逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成（Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴキット； Invitrogen, Carlsbad, California）のために用いた。これらのサンプルを３７℃で５０分間、次いで７０℃で１５分間インキュベートし、逆転写酵素を不活性化した。これらのｃＤＮＡを、９４℃３０秒、６０℃３０秒および７２℃３０秒の３０サイクルを用いるＰＣＲ（組換えＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ； Invitrogen, Carlsbad, California）により増幅した。ＰＣＲプライマーはヒトインスリンフォワード：５’−ＡＧＣ  ＣＴＴ  ＴＧＴ  ＧＡＡ  ＣＣＡ  ＡＣＡ  ＣＣ−３’（配列番号１）およびヒトインスリンリバース：５’−ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＡＣＣ  ＧＡＴ  ＧＴＧ  ＡＴ−３’（配列番号２）であった。サンプルはＳｂｆＩまたはＥｃｏＮＩ(New England Biolabs, Ipswich, MA)での事前の切断を行って、または行わずに、２％アガロースゲル上で分離した。逆転写の効率に関する補正を行うために、フォワードプライマー：５’−ＴＣＡ  ＡＣＧ  ＧＡＴ  ＴＴＧ  ＧＴＣ  ＧＴＡ  ＴＴＧ  ＧＧ−３’（配列番号３）；リバース：５’−ＴＧＡ  ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＡＧＧ  ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＧＣ−３’（配列番号４）を用いてヒトＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに関して、また、フォワードプライマー：５’−ＣＧＴ  ＣＣＣ  ＧＴＡ  ＧＡＣ  ＡＡＡ  ＡＴＧ  ＧＴ−３’（配列番号５）；およびリバース：５’−ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＴＴＴ  ＴＣＡ  ＧＣＣ  ＴＴＧ  ＡＣ−３’（配列番号６）を用いてマウスＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに関してもサンプルをアッセイした。
【００９１】
組織学および形態学：  膵臓の組織学のため、切片をヘマトキシリン／エオジンで染色した。腎臓の組織学のため、切片を過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ(PAS, Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI)で染色した。免疫組織化学のために、凍結切片を４℃で１８時間、抗ヒトβ２−ミクログロブリン(1:200; Roche, Switzerland)、抗ヒト核抗原(1:200; Chemicon, Temecula, CA)、抗ヒトインスリン(1:40; Calbiochem, San Diego, CA)、抗マウスインスリン(1:50; R&D Systems, Minneapolis, MN)、抗マウス／ヒトＰＤＸ−１(1:50; R&D Systems)、抗マウス／ヒトポドカリキシン(1:100; R&D Systems)、抗マウスマクロファージ／単球(1:25, Chemicon)、抗マウス／ヒトフィブロネクチン(1:80; Chemicon, Temecula, CA)または抗マウス／ヒトＣＤ３１(1:500; BD Biosciences, San Jose, CA)に対する一次抗体とともにインキュベートした。スライドをＰＢＳで５分、３回洗浄し、室温で４５分、種特異的二次抗体（１：１０００；  Ａｌｅｘａ−５９４またはＡｌｅｘａ−４８８； Molecular Probes, Eugene, Oregon）とともにインキュベートした。対照として、一次抗体を除いたものを含めた。スライドをエピ蛍光顕微鏡(Eclipse E800; Nikon, Melville, NY)により評価した。画像デコンボルーションのため、自動ｘ、ｙ、ｚステージおよびＣＣＤカメラを備えたライカＤＭＲＸＡ顕微鏡(Sensicam, Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO)を用いた。０．４μｍ間隔で採取した画像を、市販のソフトウエア(Slidebook Software, Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO)を用いてデコンボルーションした。
【００９２】
尿検査：  ３９〜４５日目のマウスを個々の代謝ケージ(NALGENE Labware, Rochester, NY)に入れ、１８時間の尿サンプルをアルブミンに関してアッセイした(QuantichromTM BCG Albumin Assay Kit; Bioassay Systems, Haywood, CA)。
【００９３】
結果
糖尿病モデル  ＳＴＺを用いてＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスに糖尿病を誘発した。これらのマウスは糖尿病を自発的に発症しないが、機能的Ｂ細胞およびＴ細胞を欠き、正常な造血系微小環境とともに、リンパ球減少症と低ガンマグロブリン血症を示すし(Serrezeら、1995)。薬物の腎毒性を最小限にする傾向のある条件下(Tayら、2005)で、マウスに複数回の低用量ＳＴＺを投与した（図１，上のパネル）。最初の実験で、本発明者らは、Hess et al. (2003)のプロトコールに従い、５日毎日、３５ｍｇ／ｋｇのＳＴＺを投与したが、マウスは死亡したか、または重度の体重減少と悪液質のために３〜５日後に屠殺した。よって、本発明者らは、３５ｍｇ／ｋｇ、４日間のみに用量を引き下げた。この４日間の投与計画を用いると、血糖レベルは正常レベル（５．９２ｍＭ＋／−０．９８Ｓ．Ｅ．）から重度の高血糖レベルまで上昇した（図１Ａ）が、マウスはインスリンを投与せずに１か月生存した。糖尿病マウスは対照よりも体重が軽かった（２４．０３ｇ＋／−３．１３Ｓ．Ｄ．対２７．８３ｇ＋／−１．６５Ｓ．Ｄ．；ｎ＝５，ｐ＝０．０２）。また、糖尿病マウスは３９〜４５日目に尿量が著しく増加した（５．０４ｍｌ＋／−３．１８Ｓ．Ｄ．対０．４４ｍｌ＋／−０．３Ｓ．Ｄ．；ｎ＝７，ｐ＝０．００５）。しかしながら、アルブミン尿症を発症したマウスはいなかった。
【００９４】
ｈＭＳＣの注入は血糖を降下させ、血中インスリンを上昇させた
約２．５×１０６のｈＭＳＣを糖尿病マウスに１０日目と、再び１７日目に注入した。ｈＭＳＣの凝集を避けるため、また、再現性のある送達を確保するために、ｈＭＳＣを多量のバッファー（１５０μｌ）中に約１７，０００細胞／μｌの濃度で懸濁させ、胸壁から左心室に注射した。ｈＭＳＣ治療糖尿病マウスの血糖レベルは、２４日目および３２日目に有意に降下した（それぞれｐ＝０．０００３および０．００１９；図１Ａ）。非治療糖尿病マウスとｈＭＳＣ治療糖尿病マウスでは、体重において有意差は無かった（２３．７ｇ＋／−２．３７Ｓ．Ｄ．；ｎ＝１５）が、尿量の減少が見られた（２．２０ｍｌ＋／−３．３Ｓ．Ｄ．；ｎ＝７対５．０４ｍｌ＋／−３．１８Ｓ．Ｄ．；ｎ＝７，ｐ＝０．０２９）。同じ条件下で糖尿病マウスに注入したヒト皮膚繊維芽細胞では、血糖レベルに影響は無かった（図１Ｂ）。
【００９５】
血液に対するＥＬＩＳＡアッセイでは、糖尿病マウスへのｈＭＳＣ投与が循環マウスインスリンのレベルを上昇させた（０．７０μｇ／Ｌ＋／−０．１１Ｓ．Ｄ．対０．３０μｇ／Ｌ＋／−０．０４Ｓ．Ｄ．；ｎ＝５または９；ｐ＝０．００１８；図１Ｃ）ことが示された。ヒトインスリンに対する同じサンプルのアッセイは陰性であった（示されていない）。
【００９６】
糖尿病ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの膵臓および腎臓におけるｈＭＳＣ由来のヒトＤＮＡの検出  ｈＭＳＣ治療糖尿病マウスからの組織の生着を、ヒトＡｌｕ配列に関するリアルタイムＰＣＲアッセイ(McBrideら、2003)によりアッセイした。１３匹中１９匹のマウスで、ｈＭＳＣとして注入されたＤＮＡの０．１１〜２．９％に相当するヒトＤＮＡが１７日目または３２日目に膵臓で検出された（表１）。１３匹中４匹のマウスでは、おそらく左心室へ細胞を一貫して注射することが技術的に難しいために、３２日目にヒトゲノムＤＮＡが検出されなかった。膵臓でヒトＤＮＡが検出された６匹のマウスでは、腎臓でもヒトＤＮＡが検出された（表１）。この６匹中４匹のマウスでは、腎臓におけるヒトＤＮＡの回収率が極めて高く、ｈＭＳＣとして注入されたヒトＤＮＡの６．７〜１１．６％に相当した。ｈＭＳＣが注入されたマウスの心臓では、様々な量のヒトＤＮＡ（注入されたＤＮＡの０〜０．２２％に相当）が検出された（示されていない）。ヒトＡｌｕ配列は肺、肝臓および脾臓では検出されなかった。ヒトＡｌｕ配列はまた、培養ヒト繊維芽細胞の注入２４日後の同じいずれの組織にも検出されなかった（表１）。
【表１】
2009535347.tif 000003
【００９７】
ｈＭＳＣ治療糖尿病マウスにおける膵島の上昇
恒例ベルのヒトＡｌｕ配列を有する組織を顕微鏡で選択した。ＳＴＺ糖尿病マウスからの膵臓では、膵島が小さいことが明らかになった（図２Ａ）。それらは抗体を用いた標識によりアッセイされるようにマウスインスリン含量の低下を示し（図２Ｂおよび２Ｃ）、一切片当たりの膵島数に低下を示した（図２Ｄ）。ｈＭＳＣ治療糖尿病マウスからの膵臓では、非治療糖尿病マウス由来の膵島の比べて膵島が大きいことが明らかであった（図２Ａ）。また、膵島は、抗体を用いた標識によりアッセイされるようにマウスインスリンの増加を示し（図２Ｂおよび２Ｃ）、一切片当たりの膵島数も増加していた（図２Ｄ）。ｈＭＳＣ治療糖尿病マウスにおける膵島の多くが膵管から出芽しているのが見て取れた（図２Ａおよび３）。
【００９８】
切片をヒトβ２−ミクログロブリンおよびマウスインスリンに対する抗体で標識することにより、ｈＭＳＣ治療糖尿病マウスの膵島で少数のヒト細胞が検出された（図３）。ヒトβ２−ミクログロブリンに関して標識された細胞のうち少数のものが、ＰＤＸ−１とヒトインスリンの双方に対するヒト特異的抗体で同時標識された（図６Ａ）。１匹のｈＭＳＣ治療糖尿病マウスの膵臓に由来するＲＮＡの定性的ＲＴ−ＰＣＲアッセイにより、ヒトインスリンのｍＲＮＡが検出された（図６Ｂ）。しかしながら、１１のさらなるｈＭＳＣ治療糖尿病マウス由来のサンプルは、免疫標識およびＲＴ−ＰＣＲアッセイの双方により、ヒトインスリンに関して陰性であった。
【００９９】
ｈＭＳＣ治療糖尿病マウスにおける糸球体の形態学  ３２日目の非治療糖尿病マウス由来の腎臓は、糸球体間質において細胞外マトリックスタンパク質の付着が増えた、多くの異常な糸球体を含んでいた（図４Ａ）。高レベルのヒトＡｌｕ配列を有するｈＭＳＣ治療糖尿病マウス由来の腎臓において、糸球体はさらに異常な外観を呈していた。これらの違いを、マウスマクロファージ／単球に対する抗体で腎臓切片を標識することで強調した（図４Ｂおよび４Ｃ）。非治療糖尿病マウスでは、糸球体中のマクロファージに著しい増加が見られ、ｈＭＳＣ治療糖尿病マウス由来の糸球体にはほとんど見られなかった。
【０１００】
ヒトＡｌｕ配列の高レベルの生着を示した腎臓（表１）を、ヒト細胞に関してもアッセイした。ヒト核抗原に対する抗体で標識された凍結切片は、ｈＭＳＣ治療糖尿病マウスの糸球体にヒト細胞が存在することを示した（図５、７および８）。いくつかの切片では、糸球体の約５分の１にヒト細胞が存在し（図７）、所見はヒトＡｌｕ配列に関するＰＣＲアッセイと一致している（表１）。尿細管にはヒト細胞は見られなかった。ほとんどの陽性糸球体はヒト細胞を１つ含んでいた。２つ以上のヒト細胞を有する糸球体は希であり、このような糸球体では、ヒト細胞は通常広く拡散していた。これらの結果は、ヒト細胞が腎臓に生着した後に増殖したものではないことを示す。
【０１０１】
二重免疫組織化学によれば、いくつかのヒト細胞がＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）および内皮細胞膜エピトープに対するモノクローナル抗体でも標識されたことを示唆した（図５Ｉ〜Ｌ、７および８）。ＣＤ３１は培養ｈＭＳＣでは発現されなかった（示されていない）。また、細胞が適当な向きに捕捉されているいくつかの切片では、ＣＤ３１を発現したヒト細胞は、内皮細胞の細長い形態を有していた（図５Ｌおよび図８）。これらの結果は、ヒト細胞のいくつかが内皮細胞へと分化したことを示す。また、ヒト細胞のいくつかは糸球体間質細胞で発現されるタンパク質であるフィブロネクチンを発現した（図５Ａ〜５Ｌ）。同時標識された細胞は糸球体間質細胞の丸い形態を持っていた。しかしながら、培養ｈＭＳＣでもフィブロネクチンが発現されることから、これらの細胞が糸球体間質細胞へと分化したかどうかは明らかでなかった。ヒト核抗原と、有足細胞で発現されるタンパク質であるポドカリキシンに対する抗体で同時標識された細胞は見られなかった（図５Ｅ〜５Ｈ）。
【０１０２】
本明細書で得られた知見の２つの側面、すなわち、糖尿病マウスの膵島と腎糸球体の双方へのｈＭＳＣの選択的定着およびそれらの細胞の組織修復能は、注目に値する。
【０１０３】
ここで得られた結果は、注入されたｈＭＳＣの最大３％が糖尿病マウスの膵臓に生着し、注入された細胞の最大１１％が腎臓に生着したことを示す（表Ｉ）。これまでの報告では、損傷を受けていない成体齧歯類にＭＳＣを全身注入した後には極めて低いレベルの生着が示されているに過ぎなかった(Leeら、2006)。細胞の静注の代わりに心臓内注入を行うことで、おそらく、肺の毛細血管床における細胞の捕捉が少なくなるが、糖尿病モデルにおいて損傷を受けた２つの器官で最高レベルの生着が見られたことは明白であり、肺、肝臓または脾臓では有意な数の細胞は検出されなかった。腎糸球体内の細胞は単一細胞であり、この知見は、それらはマウスに全身注入された直後に、おそらく損傷を受けた組織からの特異的シグナルに応答して生着したことを示唆する。
【０１０４】
注入されたｈＭＳＣは糖尿病マウスにおいて、高血糖症を改善し、マウスインスリンの血中レベルを高めた。膵臓に生着したヒト細胞のいくつかは分化して、ＰＤＸ−１およびヒトインスリンの双方を発現するようになる。しかしながら、ｈＭＳＣ治療の主な作用はマウス膵島とマウスインスリン産生細胞の数を増すことであった。治療された糖尿病マウスでは、新しい膵島が、膵臓の初期発達の際に膵島の供給源となる(Hardikarら、2004)膵管から出芽しているのが見て取れた。これらの知見は、免疫不全マウスの海馬の歯状回に移植されたｈＭＳＣが近傍の内在マウス神経幹細胞の増殖、移動および神経分化を促進したという最近の知見(Munozら、2005)と同様である。
【０１０５】
ｈＭＳＣの腎臓への生着には糸球体形態の改善、糸球体間質の肥厚の低下およびマクロファージの浸潤の低下が伴った。ＳＴＺはＤＮＡアルキル化試薬であり、単回の大用量は尿細管の壊死をもたらすが、低用量の反復、その結果としての高血糖が糖尿病性腎症に典型的な、しかし同じでない糸球体変化をもたらす(Tayら、2005)。ここでの知見は、糸球体の改善は治療された糖尿病マウスにおいて低血糖に続発したものである可能性を排除するものではない。しかしながら、ヒト細胞がもっぱら糸球体で見られたこと、およびそれらの細胞が内皮細胞の特徴を有する細胞へといくらか分化したということは注目に値することであった。これらの結果は、ｈＭＳＣの投与が、糸球体の病的変化を防ぐこと、またはそれらの再生を促進することのいずれかにより、腎臓病変を改善したことを示す。
【０１０６】
ここで示された知見は、ｈＭＳＣが、糖尿病性患者に見られる高血糖症および高血糖症に関連する腎臓傷害の双方を治療するのに有用であり得ることを示す。自己ｈＭＳＣは患者から数週間で容易に再生し(Sekiyaら、2002)、患者への自己ｈＭＳＣ投与からのリスクは比較的最小限である考えられる。骨髄由来のＭＳＣまたは関連細胞は、種々の疾病の動物モデルで、また、現在、多医療施設で行われている心疾患における臨床試験を含むいくつかの臨床試験で有益な作用をもたらすことが示されている(Prockopら、2003; Yeら、2006; Fazelら、2005)。糖尿病患者における自己ｈＭＳＣの全身注入もまた、疾病によって損傷を受けた多くの組織のいくつかで有益な作用を有する可能性がある。
【０１０７】
本明細書は、本明細書に引用されている参照文献の教示に照らせば、最もよく理解される。本明細書の具体例は本発明の実施形態の例を示すものであり、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきでない。当業者ならば、他の多くの実施形態が本発明に包含されることが容易に分かるであろう。本開示に引用されている全ての刊行物、特許および生物学的配列は、出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる。出典明示により本明細書の一部とされる文献が本明細書と矛盾する、または一致しない場合には、本明細書がそのような文献に優先する。本明細書におけるいずれの参照文献の引用も、そのような参照文献が本発明の先行技術であることを認めるものではない。
【０１０８】
特に断りのない限り、特許請求の範囲を含め本明細書で使用される成分、細胞培養、治療条件などの量を表す全ての数は全ての場合、「約」という言葉で修飾されると理解される。よって、特に断りのない限り、数値パラメーターは近似値であり、本発明で得ようとする所望の特性によって異なる。特に断りのない限り、一連の要素の最初につく少なくとも」という用語は、その一連の各要素につくものと理解される。当業者ならば、本明細書に記載の発明の特定の実施形態に対する多くの等価物が分かるか、または慣例の実験だけを用いて確認することができる。このような等価物も特許請求の範囲に包含されるものとする。
【０１０９】
参考文献
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Yeら、Exp. Biol. Med. 231:8-19 (2006).
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１Ａ−１Ｃは、ＳＴＺ誘発糖尿病ＮＯＤ／ｓｃｉｄＳＣＩＤマウスにおける血糖およびマウスインスリンレベルに対するｈＭＳＣの効果を示す。実験計画は上のパネルに示されている。図１Ａは、非治療糖尿病マウス（ＳＴＺ治療マウス）およびｈＭＳＣ治療糖尿病マウス（ＳＴＺ治療マウス＋ｈＭＳＣ）における血糖レベルを示す。値は平均値＋／−Ｓ．Ｅ．である。図１Ｂは、非治療糖尿病マウスおよびヒト繊維芽細胞を注入した糖尿病マウス（ＳＴＺ治療マウス＋ｈ繊維芽細胞）における血糖レベルを示す。１０日目の違いは、繊維芽細胞が注入される前の非治療マウスにおける変動を表している。値は平均値＋／−Ｓ．Ｄ．である。図１Ｃは、糖尿病マウス（ＳＴＺ）、ｈＭＳＣ治療糖尿病マウス（ＳＴＺ＋ｈＭＳＣ）および正常マウスにおける３２日目のマウスインスリンの血中レベルを示す。値は平均値＋／−Ｓ．Ｄ．である。アスタリスクはｐ＝０．００１８で異なる値を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、３２日目の糖尿病マウス（ＳＴＺ治療）、ｈＭＳＣ治療糖尿病マウス（ＳＴＺ＋ｈＭＳＣ）および対照マウス（正常）由来の膵臓の免疫組織化学的結果を示す。図２Ａは、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色した膵島の形態を示す顕微鏡写真である。５μｍの切片が４００倍に拡大されている。図２Ｂは、マウスインスリンに対する抗体で標識した膵島を示す一連の顕微鏡写真であり、核をＤＡＰＩで標識した。５μｍの切片が４００倍に拡大されている。図２Ｃは、膵島当たりのインスリン画素数を示すグラフである。値は平均値＋／−Ｓ．Ｄである。アスタリスクはｐ＝０．００７９で異なる値を示す。図２Ｄは、切片当たりの膵島数を示すグラフである。値は平均値＋／−Ｓ．Ｄ．である。アスタリスクはｐ＝０．００２で異なる値を示す（ｎ＝４または５）。
【図３】３２日目のｈＭＳＣ治療糖尿病ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス由来の膵臓の免疫組織化学を示す一連の顕微鏡写真である。切片をヒト細胞（β２−マイクログロブリン）およびマウスインスリンに対する抗体で同時に標識し、核をＤＡＰＩで染色した。５μｍの切片が４００倍に拡大されている。点線は膵管の輪郭を示し、矢印はヒト細胞を示し、矢印の先はマウスインスリンに関して同時標識されたヒト細胞を示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、３２日目の糖尿病マウス（ＳＴＺ）、ｈＭＳＣ治療糖尿病マウス（ＳＴＺ＋ｈＭＳＣｓ）および正常マウス由来の腎糸球体を示す。図４Ａは、過ヨウ素酸シッフで染色された糸球体の顕微鏡写真を示す。８μｍの切片が４００倍に拡大されている。図４Ｂでは、糸球体をマウスマクロファージ／単球に対する抗体で標識した。８μｍの切片が４００倍に拡大されている。図４Ｃは、マウスマクロファージ／単球に対する抗体で標識された切片における、糸球体当たりの画素数を示す。値は平均値＋／−Ｓ．Ｄ．である。アスタリスクはｐ＜０．００５で異なる値を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｌは、３２日目のｈＭＳＣ治療糖尿病マウス由来の腎糸球体を示す顕微鏡写真。５μｍの切片が４００倍に拡大されている。図５Ａ〜５Ｄは、ヒト核抗原およびマウス／ヒトフィブロネクチンに対する抗体で標識された糸球体を示す。同時に標識されたいくつかのヒト細胞が、糸球体間質細胞の丸い形態を持っている。図５Ｅ〜５Ｈは、ヒト核抗原およびマウス／ヒトポドカリキシンに対する抗体で標識された糸球体を示す。図５Ｉ〜５Ｌは、ヒト核抗原およびマウス／ヒト内皮細胞のマーカーであるＣＤ３１に関して標識された糸球体のデコンボルーション画像を示す。いくつかのヒト細胞が同時標識されたと見え、内皮細胞の細長い形態を持っている。矢印：ヒト細胞。点線矢印は、デコンボルーションの面を示し、点線は、糸球体の輪郭を示す。さらなるデコンボルーション画像を図７、８および９に示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、３２日目のｈＭＳＣ治療糖尿病マウス由来の膵臓の分析から得られた結果を示す。図６Ａは、ヒト細胞（β２−マイクログロブリン）およびＰＤＸ−１またはヒトインスリンに関する同時標識を示す膵臓切片の一連の顕微鏡写真である。核をＤＡＰＩで標識し、５μｍの切片が４００倍に拡大されている。矢印は、マウス／ヒトＰＤＸ−１またはヒトインスリンで同時標識されたヒト細胞を示す。図６Ｂは、膵臓から単離されたヒトインスリンｍＲＮＡに関するＲＴ−ＰＣＲアッセイを示す。このｃＤＮＡの推定サイズは２４５ｂｐであり、ＳｂｆＩおよびＥｃｏＮＩにより、推定サイズのフラグメントに切断される。他の１１のｈＭＳＣ治療糖尿病マウスにおけるヒトインスリンｍＲＮＡに関するＲＴ−ＰＣＲアッセイは陰性であった。
【図７】ｈＭＳＣ治療糖尿病マウス由来の腎臓の顕微鏡写真を示す。サンプルはヒト核抗原およびマウス／ヒトＣＤ３１に対する抗体で同時標識した。核はＤＡＰＩで標識した。１０μｍの切片が４０倍に拡大されている。挿入は、ヒト核抗原で標識され、ＤＡＰＩで染色された糸球体の拡大画像である。
【図８】ｈＭＳＣ治療糖尿病マウス由来の糸球体の三次元デコンボルーション顕微鏡の顕微鏡写真である。切片をヒト核抗原およびマウス／ヒトＣＤ３１に対する抗体で同時標識した。１０、２０または３０μｍの切片が４００倍に拡大されている。矢印は、デコンボルーション画像の面を示す。
【図１−１】
2009535347.tif 000004
【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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