(57)【要約】  本発明は、ウイルスの再構成エンベロープを含むインフルエンザビロソームの組成物であって、該ウイルスエンベロープが完全にインフルエンザウイルス粒子に由来し、脂質が外部起源から再構成ビロソームに付加されず、該ビロソームがインフルエンザ抗原ヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼまたはそれらの誘導体を含み、別個のアジュバントおよび／または免疫刺激剤が組成物に添加されず、かつ、該組成物は、ヒトに対する調合物の単回の鼻内または吸入投与が、全身性応答がインフルエンザワクチンに関するＣＨＭＰ基準に一致している該インフルエンザ抗原に対する全身性および／または局所性免疫応答および／または細胞傷害性リンパ球応答を誘導するに十分であることを特徴とする鼻内または吸入投与調合物のために存在し、そして１鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの用量が３０μｇ以下かまたはそれに等しい、組成物を提供する。また、本発明は、該組成物の製造のための再構成インフルエンザビロソーム、したがって製造されたワクチン調合物の使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスエンベロープが完全にインフルエンザウイルス粒子に由来し、脂質が外部起源から再構成ビロソームに付加されず、ビロソームがインフルエンザ抗原ヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼまたはそれらの誘導体を含み、別個のアジュバントおよび／または免疫刺激剤が組成物に添加されず、そして組成物は鼻内または吸入投与調合物として設計され、組成物が、ヒトに対する調合物の単回の鼻内または吸入投与がインフルエンザ抗原ヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼまたはそれらの誘導体に対する全身性および／または局所性免疫応答を誘導することができることを特徴とする、該ウイルスの再構成エンベロープを含むインフルエンザビロソームを含んでなる組成物。
【請求項２】
１鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの用量が３０μｇ以下かまたはそれに等しい、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
また、調合物の単回の鼻内または吸入投与が細胞傷害性リンパ球応答を誘導することができる、請求項１または２のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項４】
免疫応答がインフルエンザワクチンに関するＣＨＭＰ基準に一致している、請求項１〜３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項５】
免疫応答が、成人では＞７０％および／または老人では＞６０％のセロプロテクション率、成人では＞４０％および／または老人では＞３０％のセロコンバージョン率、および成人では＞２．５および／または老人では＞２．０の平均倍増の１つ以上を提供する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
１鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの用量が２５μｇ以下かまたはそれに等しい、請求項２〜５のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項７】
１鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの用量が２０μｇ以下かまたはそれに等しい、請求項２〜５のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項８】
１鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの用量が１５μｇ以下かまたはそれに等しい、請求項２〜５のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項９】
１鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの用量が１０μｇ以下かまたはそれに等しい、請求項２〜５のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１０】
１鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの用量が５μｇ以下かまたはそれに等しい、請求項２〜５のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１１】
組成物が鼻内または吸入投与のための製薬学的担体を含んでなるワクチン調合物である、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１２】
ウイルスエンベロープが完全にインフルエンザウイルス粒子に由来し、脂質が外部起源から再構成ビロソームに付加されず、ビロソームがインフルエンザ抗原ヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼまたはそれらの誘導体を含み、そして別個のアジュバントおよび／または免疫刺激剤が組成物に添加されない、鼻内または吸入投与のための組成物の製造のための該ウイルスの再構成エンベロープを含むインフルエンザビロソームの使用であって、組成物が、ヒトに対する組成物の単回の鼻内または吸入投与がインフルエンザ抗原ヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼまたはそれらの誘導体に対する全身
性および／または局所性免疫応答の誘導のために十分であることを特徴とする、上記使用。
【請求項１３】
１鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの用量が３０μｇ以下かまたはそれに等しい、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
また、組成物の単回の鼻内または吸入投与が細胞傷害性リンパ球応答を誘導する、請求項１２または１３のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１５】
免疫応答がインフルエンザワクチンに関するＣＨＭＰ基準に一致している、請求項１２〜１４のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１６】
免疫応答が、成人では＞７０％および／または老人では＞６０％のセロプロテクション率、成人では＞４０％および／または老人では＞３０％のセロコンバージョン率、および成人では＞２．５および／または老人では＞２．０の平均倍増の１つ以上を提供する、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
１鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの用量が２５μｇ以下かまたはそれに等しい、請求項１３〜１６のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１８】
１鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの用量が２０μｇ以下かまたはそれに等しい、請求項１３〜１６のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１９】
１鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの用量が１５μｇ以下かまたはそれに等しい、請求項１３〜１６のいずれか１つに記載の使用。
【請求項２０】
１鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの用量が１０μｇ以下かまたはそれに等しい、請求項１３〜１６のいずれか１つに記載の使用。
【請求項２１】
１鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの用量が５μｇ以下かまたはそれに等しい、請求項１３〜１６のいずれか１つに記載の使用。
【請求項２２】
製造された組成物がワクチン調合物である、請求項１２〜２１のいずれか１つに記載の使用。
【請求項２３】
ウイルスエンベロープが完全にインフルエンザウイルス粒子に由来し、脂質が外部起源から再構成ビロソームに付加されず、ビロソームがインフルエンザ抗原ヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼまたはそれらの誘導体を含み、別個のアジュバントおよび／または免疫刺激剤が組成物に添加されない、該ウイルスの再構成エンベロープを含むインフルエンザビロソームの組成物を含んでなるワクチン調合物であって、ワクチンは、ワクチンがヒトに対する単回の鼻内または吸入投与のための設計されることを特徴とし、そして１単回の鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの用量が３０μｇ以下かまたはそれに等しい、上記ワクチン調合物。
【請求項２４】
１単回の鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの用量が２５μｇ以下かまたはそれに等しい、請求項２３に記載のワクチン調合物。
【請求項２５】
１単回の鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの用量が２０μｇ以下かまたはそれに等しい、請求項２３に記載のワクチン調合物。
【請求項２６】
１単回の鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの用量が１５μｇ以下かまたはそれに等しい、請求項２３に記載のワクチン調合物。
【請求項２７】
１単回の鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの用量が１０μｇ以下かまたはそれに等しい、請求項２３に記載のワクチン調合物。
【請求項２８】
１単回の鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの用量が５μｇ以下かまたはそれに等しい、請求項２３に記載のワクチン調合物。
【請求項２９】
調合物の単回の鼻内または吸入投与が、インフルエンザ抗原ヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼまたはそれらの誘導体に対する全身性免疫応答、インフルエンザ抗原ヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼまたはそれらの誘導体に対する局所性免疫応答、および細胞傷害性リンパ球仲介免疫応答の１つ以上を含む免疫応答を該ヒトにおいて誘導することができる、請求項２３〜２８のいずれか１つに記載のワクチン調合物。
【請求項３０】
免疫応答がインフルエンザワクチンに関するＣＨＭＰ基準に一致している、請求項２９に記載のワクチン調合物。
【請求項３１】
免疫応答が、成人では＞７０％および／または老人では＞６０％のセロプロテクション率、成人では＞４０％および／または老人では＞３０％のセロコンバージョン率、および成人では＞２．５および／または老人では＞２．０の平均倍増の１つ以上を提供する、請求項３０に記載のワクチン調合物。
【請求項３２】
請求項２３〜３１のいずれか１つに記載のワクチン調合物およびワクチンのエアゾル化のための機構を含んでなる鼻内または吸入投与のためのデバイス。
【請求項３３】
単回の鼻内または吸入投与のためのワクチン調合物のある量を含有する、請求項３２に記載のデバイス。
【請求項３４】
使い捨てできる、請求項３２または３３のいずれか１つに記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、単回の鼻内または吸入投与が臨床的防御と明確に相関させられる全身性免疫応答を生じる、不活化インフルエンザワクチンのための組成物および投与経路に関する。
【背景技術】
【０００２】
鼻または口腔咽頭経路を介するインフルエンザに対する免疫化ならびに不活化インフルエンザ抗原の使用のための種々の概念は、皮下または筋肉内免疫に対する針無使用の代替法として探究された。針無使用アプローチを支持する実験データは動物モデルにおいて作成された。動物データによって支持される鼻内経路を介する免疫化のための不活化インフルエンザ抗原（例えば、化学的に不活性化された全ウイルス粒子、またはスプリットウイルス（ｓｐｒｉｔ  ｖｉｒｕｓ）のようなさらに処理されたウイルス構成成分、または精製された表面抗原ヘマグルチニン（ＨＡ）および／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ））の使用は、不活化インフルエンザ抗原と組み合わせてアジュバントまたは免疫刺激剤のいずれかの使用を含むか、または多数回のワクチン接種を必要とする。アジュバントは、それと混合された抗原の免疫原性を増進するすべての物質である。ヒトでは、鼻内経路を介するインフルエンザに対する成功裏のワクチン接種は、（ａ）生（冷温適応株）インフルエンザワクチン（ＦｌｕＭｉｓｔＴＭ，ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｉｎｃ）（非特許文献１、２、３）、（ｂ）Ｅ・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の熱不安定性毒素をアジュバントとして添加されたビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍａｌ）インフルエンザワクチン（ＮａｓａｌＦｌｕ，Ｂｅｒｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ）（非特許文献４）または（ｃ）多量の抗原の使用および反復ワクチン接種（非特許文献５、６、７）について報告されているだけである。生ワクチンは、満足される免疫応答を誘導できるけれども、生ウイルスが存在するという特殊な性質が、さらなる安全性への関心を惹起し、そして上気道において要求されるウイルス複製の循環による副作用を誘導するかもしれない。また、要求される貯蔵条件がこれらの生産物の商業化を制約している。アジュバントとしてのＥ．コリＨＬＴを含有する鼻内インフルエンザワクチンの使用と、顔面神経麻痺（ベル麻痺）との間の強い関連は、市場からＨＬＴをアジュバントとするビロソームワクチンの撤退を引き起こした（非特許文献８）。
【０００３】
一定の集団におけるインフルエンザワクチンの効能は、ワクチン接種後に生成される抗インフルエンザ抗体の量に関係する免疫原性パラメーターを査定することによって評価されてもよい。一般にＣＨＭＰ基準と呼ばれるこれらの免疫原性パラメーターは、不活化インフルエンザワクチンの年毎の再認可のために使用される（非特許文献９）。今日まで、不活化ワクチンの単回の鼻内投与により、そしてワクチンが防御を意図する感染性作用物に由来しないで抗原に対する免疫応答を増進する目的のためにワクチン調合物に添加されるワクチンの付加成分であるアジュバントの添加なしに、これらの免疫要件またはＣＨＭＰ基準に合致している（非特許文献９）、インフルエンザに対するヒトの成功裏の免疫化は記述されていない。したがって、単回の鼻内投与後に満足される全身性免疫応答を惹起することができ、アジュバントを含有せず、そして該単回投与よってＣＨＭＰ基準（非特許文献９）に合致する、不活化インフルエンザワクチン組成物に対する当該技術分野における必要性がなお存在することは認識される。
【０００４】
該ＣＨＭＰ基準は、次のように定義される。インフルエンザワクチンの要件の調和におけるガイダンスに関するＣＨＭＰ覚書（ＣＨＭＰ（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅ）Ｎｏｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆ
ｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ）において、次の血清学的パラメーターが、不活化インフルエンザワクチンの免疫原性を評価するために定義される：
−  セロプロテクション率（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｒａｔｅ），血球凝集阻止（ＨＩ）タイター≧４０として定義されるセロプロテクションによる、
−  セロコンバージョン率（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｒａｔｅ）、ワクチン接種前ＨＩタイター＜１０およびワクチン接種後ＨＩタイター≧４０、またはワクチン接種前ＨＩタイター≧１０かつＨＩタイターにおける少なくとも４倍増加として定義されるセロコンバージョン、
−  平均倍増、これは個人内増加（すなわち、ワクチン接種後ＨＩタイター／ワクチン接種前ＨＩタイター）の幾何平均である。
【０００５】
インフルエンザワクチンの免疫原性に関するＣＨＭＰ要件は、次の基準の少なくとも１つが合致するワクチンにおける３種のウイルス株の各々についての要件である：
【０００６】
【表１】
2009530351.tif 000002
【０００７】
また、本発明は子供に対しても適用され、これに関しては、彼らが成人と比較できる様式で免疫学的に応答することが示された（非特許文献１０）。また本発明は老人にも適用される。老人は６０歳以上である。
【非特許文献１】引用文献１
【非特許文献２】引用文献２
【非特許文献３】引用文献３
【非特許文献４】引用文献４
【非特許文献５】引用文献５
【非特許文献６】引用文献１０
【非特許文献７】引用文献１１
【非特許文献８】引用文献６
【非特許文献９】引用文献７
【非特許文献１０】引用文献８
【発明の開示】
【０００８】
驚くべきことに、そして前臨床の齧歯類データおよびヒトの臨床実験における文献に反して、本発明者らは、再構成されたインフルエンザのエンベロープを含んでなる不活化インフルエンザワクチンによる単回の鼻内ワクチン接種後のヒトにおける免疫応答が、１８〜６０歳の年齢群についてインフルエンザワクチンの効能に関するすべて３つのＣＨＭＰ基準と一致していることを見出だした。１回の鼻内投与は、不活化インフルエンザワクチンの免疫原性に関する上記ＣＨＭＰ基準に合致させるために、ワクチン調合物の投与の反復を必要としない１もしくは両鼻孔を介するワクチン調合物の接種である。ワクチンの１回の投与（鼻内、吸入、経口、皮下または筋肉内経路を介する）は、一般に、プライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）およびブースティング（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）として当該技術分野において既知の数日または数週に分けられるワクチンの多数回投与を含まないワクチン接種スケジュールである。鼻内または吸入投与調合物として設計された調合物は、鼻内または吸入投与を可能とするような方法で調製された１種以上の有効成分と添加物の混合物を含む。本発明は、有利には、ビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍａｌ）・インフルエンザワクチン
の単回の鼻内または吸入投与による、ＣＨＭＰ基準に一致している全身性免疫応答（循環性免疫グロブリンまたは抗体産生Ｂ細胞）を誘導する方法を提供する。また、本発明は、有利には、ビロソーム・インフルエンザワクチンの単回の鼻内または吸入投与による、粘膜の表面におけるＩｇＡとして既知の分泌性免疫グロブリンにおける増加を含む、局所または粘膜性免疫応答を誘導する方法を提供する。鼻内投与後の特異的ＩｇＧおよびＩｇＡの誘導は、鼻腔におけるリンパ様組織の活動（引用文献１２）を含む。そのような組織は、鼻関連リンパ様組織（ＮＡＬＴ）として既知であり、そしてまた、細胞性免疫応答の粘膜誘導部位であることが示されている（引用文献１３）。ビロソームが細胞性免疫応答を誘導する潜在能力を有することが知られている（引用文献１４、１５）ので、本発明は、また、特異的な細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）の誘導方法を提供する。
【０００９】
ビロソームはウイルスの糖タンパク質を含有する脂質二重層である。ビロソームは、一般に、洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）による包膜ウイルスからの膜タンパク質と脂質の抽出と、それに続く該洗剤の除去による特徴的な二重層の再構成によって生成される。また本発明は、１もしくは両鼻孔を介して鼻咽頭または口腔咽頭の粘膜に投与されてインフルエンザに対する全身性および局所性免疫を達成するエアゾルによるワクチン接種の使用のための、再構成されたインフルエンザウイルスのエンベロープ（特に、脂質のさらなる添加なしに、かつ免疫刺激剤（一般にアジュバントと呼ばれる）という免疫モジュレーターの添加なしに、再構成された）を含んでなるインフルエンザビロソームの組成物を提供する。吸入による単回投与もまた可能である。単回の経口粘膜投与もまた可能である。
【００１０】
再構成インフルエンザビロソームは、不活化ウイルスから調製されてもよく、これは疎水性ビーズへの吸着によって除去される非透析性洗剤によって可溶化することができる。調製物は、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ヘマグルチニンの誘導体およびノイラミニダーゼの誘導体から選ばれる１種以上のインフルエンザ抗原の精製懸濁物を含んでもよい。ウイルスの膜タンパク質ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼは、低レベルのエンドトキシンおよびオボアルブミンを含有するウイルス脂質からなる膜において再構成されてもよい（参照、引用文献９）。ヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼの誘導体は、修飾されたアミノ酸配列および／または構造物を有するヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼ分子である。アミノ酸は、例えば、配列に対して欠失、変更または付加されてもよい。またグリコシル化パターンが変更されてもよい。誘導体は、宿主に導入された場合に免疫応答を誘導する能力を保持する。
【００１１】
再構成ビロソームを調製するために使用されるインフルエンザウイルスは、例えば、受精ニワトリ卵において、あるいは接着細胞または懸濁液中の細胞のいずれかの細胞培養において増殖することができる。ウイルスは、例えば、野生株または再構築株（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）もしくは遺伝的に修飾された株であってもよい。ウイルスタイプは、例えば、汎流行性株を含む、いかなるインフルエンザＡもしくはＢサブタイプであってもよい。
【００１２】
また本発明はワクチンを提供する。用語ワクチンは、免疫活性のある製薬学的調製物に向けられると理解される。ある種の実施態様では、ワクチンは、例えば、免疫系を刺激して現実の病原に対する防御を高める病原性微生物の無害の変異体または誘導体を含んでもよい。ある種の実施態様では、ワクチンは、例えば、宿主に投与された場合に適応免疫を誘導する。ワクチンは、病原体の死滅もしくは弱毒化形態物または病原体の成分、例えば病原体の抗原性成分を含有してもよい。ワクチン調製物は、ワクチンが投与されるよう意図される特定の方式のために設計されてもよい製薬学的担体、例えば鼻内または吸入投与のために設計された製薬学的担体をさらに含有してもよい。インフルエンザワクチンは、１種以上の非変性インフルエンザ抗原を含んでもよく、１種以上のこれらはインフルエンザに特異的な免疫応答を誘導することができる。
【００１３】
本発明は、組成物が鼻内または吸入投与調合物として設計される、該ウイルスの再構成エンベロープを含むインフルエンザビロソームを含んでなる組成物を提供する。また、本発明は、ビロソームがインフルエンザ抗原ヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼまたはそれらの誘導体を含む、該組成物を提供する。また本発明は、ウイルスエンベロープが完全にウイルス粒子に由来する該組成物を提供する。また本発明は、脂質が外部起源から再構成ビロソームに付加されない該組成物を提供する。また本発明は、別個のアジュバントおよび／または免疫刺激剤が組成物に添加されない該組成物を提供する。また本発明は、被験者に対する調合物の単回の鼻内または吸入投与が全身性免疫応答を誘導することができる該組成物を提供する。また本発明は、被験者に対する調合物の単回の鼻内または吸入投与がまた局所性免疫応答を誘導することができる該組成物を提供する。また本発明は、被験者に対する調合物の単回の鼻内または吸入投与がまた細胞傷害性リンパ球応答を誘導することができる該組成物を提供する。また本発明は、全身性免疫応答および／または局所性免疫応答および／または細胞傷害性リンパ球応答を誘導する能力がヒトにおいて発揮される該組成物を提供する。また本発明は、免疫応答がインフルエンザ抗原ヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼまたはそれらの誘導体に向けられた免疫応答を含む該組成物を提供する。好適な実施態様では、また本発明は、免疫応答がインフルエンザワクチンに関するＣＨＭＰ基準に一致している該組成物を提供する。また本発明は、免疫応答が、成人では＞７０％および／または老人では＞６０％のセロプロテクション率、成人では＞４０％および／または老人では＞３０％のセロコンバージョン率、および成人では＞２．５および／または老人では＞２．０の平均倍増の１つ以上を提供する、該組成物を提供する。特に好適な実施態様では、また本発明は、１鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの用量が３０μｇに等しいかまたはそれ以下である該組成物を提供する。最後にまた、本発明は、組成物が鼻内または吸入投与のための製薬学的担体を含んでなるワクチン調合物である該組成物を提供する。
【００１４】
さらに本発明は、鼻内または吸入投与のための組成物の製造のための該ウイルスの再構成エンベロープを含むインフルエンザビロソームの使用を提供する。また本発明は、インフルエンザビロソームがインフルエンザ抗原ヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼまたはそれらの誘導体を含む、該使用を提供する。また本発明は、ウイルスエンベロープが完全にインフルエンザウイルス粒子に由来する該使用を提供する。また本発明は、脂質が外部起源から組成物中のインフルエンザビロソームに付加されない該使用を提供する。また本発明は、別個のアジュバントおよび／または免疫刺激剤が組成物に添加されない該使用を提供する。また本発明は、被験者に対する組成物の単回の鼻内または吸入投与が全身性免疫応答の誘導のために十分である該使用を提供する。また本発明は、組成物の単回の鼻内または吸入投与がまた局所性免疫応答を誘導する該使用を提供する。また本発明は、組成物の単回の鼻内または吸入投与がまた細胞傷害性リンパ球応答を誘導する該使用を提供する。また本発明は、投与を受ける被験者がヒトである該使用を提供する。また本発明は、組成物がインフルエンザ抗原ヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼまたはそれらの誘導体に向けられた免疫応答を含む免疫応答を誘導する該使用を提供する。好適な実施態様では、また本発明は、組成物が、インフルエンザワクチンに関するＣＨＭＰ基準に一致している免疫応答を誘導する該使用を提供する。また本発明は、免疫応答が、成人では＞７０％および／または老人では＞６０％のセロプロテクション率、成人では＞４０％および／または老人では＞３０％のセロコンバージョン率、および成人では＞２．５および／または老人では＞２．０の平均倍増の１つ以上を提供する、該使用を提供する。特に好適な実施態様では、また本発明は、１鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの投与用量が３０μｇに等しいかまたはそれ以下である該使用を提供する。最後にまた、本発明は、製造された組成物がワクチン調合物である該使用を提供する。
【００１５】
かくして、１つの実施態様では、本発明は、ウイルスの再構成エンベロープを含むインフルエンザビロソームの組成物であって、該ウイルスエンベロープが完全にインフルエンザウイルス粒子に由来し、脂質が外部起源から再構成ビロソームに付加されず、該ビロソームがインフルエンザ抗原ヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼまたはそれらの誘導体を含み、別個のアジュバントおよび／または免疫刺激剤が組成物に添加されず、かつ、該組成物は、ヒトに対する調合物の単回の鼻内または吸入投与が、全身性応答がインフルエンザワクチンに関するＣＨＭＰ基準に一致している該インフルエンザ抗原に対する全身性および／または局所性免疫応答を誘導することができることを特徴とする、鼻内または吸入投与調合物として設計され、そして１鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの用量が３０μｇ以下かまたはそれに等しい、組成物を提供する。
【００１６】
その他の実施態様によれば、本発明は、鼻内または吸入投与のための組成物の製造のためのウイルスの再構成エンベロープを含むインフルエンザビロソームの使用であって、該ウイルスエンベロープが完全にインフルエンザウイルス粒子に由来し、脂質が外部起源から再構成ビロソームに付加されず、該ビロソームがインフルエンザ抗原ヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼまたはそれらの誘導体を含み、そして別個のアジュバントおよび／または免疫刺激剤が組成物に添加されない使用であり、鼻内または吸入投与のための組成物の製造のための該インフルエンザビロソームの使用は、ヒトに対する組成物の単回の鼻内または吸入投与が、応答がインフルエンザワクチンに関するＣＨＭＰ基準に一致している該インフルエンザ抗原に対する全身性および／または局所性免疫応答の誘導のために十分であることを特徴とし、そして１鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの用量が３０μｇ以下かまたはそれに等しい、使用を提供する。
【００１７】
その他の実施態様によれば、本発明は、ウイルスの再構成エンベロープを含むインフルエンザビロソームの組成物を含んでなるワクチン調合物であって、該ウイルスエンベロープが完全にインフルエンザウイルス粒子に由来し、脂質が外部起源から再構成ビロソームに付加されず、該ビロソームがインフルエンザ抗原ヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼまたはそれらの誘導体を含み、別個のアジュバントおよび／または免疫刺激剤が組成物に添加されないワクチン調合物であり、このワクチンは、ワクチンがヒトに対する単回の鼻内または吸入投与のための設計されることを特徴とし、そして１単回の鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの用量が３０μｇ以下かまたはそれに等しい、ワクチン調合物を提供する。有利には、該、調合物の単回の鼻内または吸入投与は、該ヒトにおける全身性および／または局所性免疫応答を誘導することができる。本発明によれば、また、単回の鼻内または吸入投与のための該ワクチン調合物のある量を含んでなるデバイスが提供される。
【００１８】
また、１鼻内または吸入投与当たり１ウイルス株についてのヘマグルチニンの本発明による適用用量は、２５μｇ、２０μｇ、１５μｇ、１０μｇまたは５μｇ以下かまたはそれに等しくてもよい。
【００１９】
【表２】
2009530351.tif 000003
【００２０】
【表３】
2009530351.tif 000004
【実施例】
【００２１】
［例１］
８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＬＰＰ−ビロソームワクチン；最適以下のＨＡ用量レベルにおける種々のＨＡ／ＬＰＰ比の鼻内の比較
１０匹のインフルエンザ・セロネガティブのメスＢａｌｂ／ｃマウスの群が、１：１．５、１：０．７、１：０．４、１：０（すなわち、ＬＰＰ（リポペプチド）無添加）のＨＡ／ＬＰＰ比において、かつ１用量当たり２μｇのＨＡを含有する鼻内投与によってＬＰＰ−ビロソームワクチンを受けた。さらに、１０匹のメスのマウスの対照群が０μｇＨＡ／用量（媒質の鼻内投与）を受けた。
【００２２】
ＬＰＰ−含有ビロソームの４種の調製物が調製された。簡単に言えば、３０〜４０％スクロース溶液中不活化インフルエンザウイルスが遠心によって沈殿された。ウイルスは、洗剤オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル（ＯＥＧ）を含有するバッファー中に再懸濁され、可溶化された。続いて、ウイルスのヌクレオキャプシドが超遠心によって除去された。ＯＥＧ含有上澄液が４つの等容量に分けられ、そしてＯＥＧ含有バッファー中異なる量のリポペプチドＰ３ＣＳＫ４が添加された（Ｐ３ＣＳＫ４：Ｎ−パルミトイル−Ｓ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２ＲＳ）−プロピル］−［Ｒ］−システイニル−［Ｓ］−セリル−［Ｓ］−リジル−［Ｓ］−リジル−［Ｓ］−リジル−［Ｓ］−リジン）。容量はＯＥＧ含有バッファーを用いて調節された。ＯＥＧは疎水性樹脂への吸着によって除去された。これにより、ＬＰＰ含有ビロソーム、それらの膜中にＨＡおよびＮＡならびに（場合によっては）それらの膜中にＬＰＰを含有する再構成ウイルス粒子の形成がもたらされた。ＯＥＧの除去後、ビロソームは、０．２２μｍの孔径を有するＰＶＤＦメンブランを通して濾過された。
【００２３】
出発材料は、２５２Ｉ．Ｕ．エンドトキシン／１００μｇＨＡを含有する、インフルエンザＡ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／２００３  Ｘ−１４７（Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００  （Ｈ３Ｎ２）様株）からのＨＡの２０ｍｇであった。可溶化後、４バッチが表１に略記されたように調製された。
【００２４】
【表４】
2009530351.tif 000005
【００２５】
媒質は、５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）からなった。群Ｅ（表２参照）では、媒質は、０．２２μｍの孔径を有するＰＶＤＦメンブランを通して濾過された。調製されたビロソームの４バッチは、鼻内免疫のためには２００μｇ／ｍｌおよび筋肉内免疫のためには６７μｇ／ｍｌの濃度に希釈され、そして表２に指示されるように１−ｍｌバイアル（１群当たり２個）に分けられた。ワクチンのこれらの群は表４に略記されるように使用された。
【００２６】
【表５】
2009530351.tif 000006
【００２７】
調合物の分析
この研究のために使用された調合物は、表３に指示されるようにいくつかの変数について分析された。
【００２８】
【表６】
2009530351.tif 000007
【００２９】
ａ  Ｌｏｗｒｙアッセイ、原理：タンパク質は、アルカリ性硫酸銅およびＦｏｌｉｎ−ｃｉｏｃａｌｔｅｕフェノール試薬による処理後に青色を形成する。タンパク質含量は、参考としてアルブミンＢＳＡ標準を使用して、７５０ｎｍにおける吸収から測定された。
Ｌｏｗｒｙ，ＯＨ，ＮＪ  Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ，ＡＬ  Ｆａｒｒ，ａｎｄ  ＲＪ  Ｒａｎｄａｌｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５．１９５１．
Ｏｏｓｔｒａ，ＧＭ，ＮＳ  Ｍａｔｈｅｗｓｏｎ，ａｎｄ  ＧＮ  Ｃａｔｒａｖａｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８９：３１．１９７８．
Ｓｔｏｓｃｈｅｃｋ，ＣＭ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８２：５０−６９（１９９０）．
Ｈａｒｔｒｅｅ，ＥＦ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４８：４２２−４２７（１９７２）
ｂ  ＰｈＥｕｒ：ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  ２０５３  ａｎｄ  ｓｅｃｔｉｏｎ  ２．７．１
ｃ  原理：各リン脂質は１個のリン原子を含有し、これはリン脂質の定量のために使用することができる。リン脂質は、過塩素酸によって分解され、そして生成されたリン酸イオンがモリブデン酸塩によって錯体化され、これがアスコルビン酸によって還元されて青色生成物を生じる。着色は８１２ｎｍにおいて分光光度計により測定される。サンプル中のリン脂質の量はホスフェートカリブレーター（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）を含むことによって定量される。
Ａｍｅｓ  ＢＮ．Ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｔｏｔａｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９６６；８：１１５−１１８
Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒ  ＣＪＦ，ｖａｎ  Ｇｅｎｔ  ＣＭ  ＆  Ｐｒｉｅｓ  Ｃ．Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｕｂ−ｍｉｃｒｏ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９６１；２４：２０３−２０４
ｄ  Ｐｈ．Ｅｕｒ．２．６．１４
ｅ  オボアルブミンＥＬＩＳＡは、捕捉のための固定化ポリクローナル抗オボアルブミン抗体および検出系としての抗オボアルブミン−ＨＲＰコンジュゲートを使用する直接サンドイッチ酵素イムノアッセイである。コンジュゲートおよびサンプルが同時にインキュベートされる。非結合成分は洗浄段階によって除去される。基質（ＴＭＢおよびＨ２Ｏ２）がウェルに添加される。ウェル中の特異的に結合されたコンジュゲートの存在は、青色の発色によって指示される。硫酸が基質に添加されて反応を停止し、そしてこれが黄色への生成物における着色変化をもたらす。吸光度（ＯＤ）が４５０ｎｍにおいて読まれる。最適の結果のために、６２０ｎｍにおける参考フィルターが使用される。標準曲線は、アッセイに含まれるオボアルブミン標準（０．３〜２０．０ｎｇ／ｍｌ）の応答値から作成される。未知のサンプルの濃度は、標準曲線から内挿することができる。
ｆ  ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  ０８６９および２０５３による：一価のプールされた回収物（ｈａｒｖｅｓｔ）の純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって試験された。電気泳動：Ｐｈ．Ｅｕｒ  ２．２．３１による。
【００３０】
試験システム
試験動物
１０匹のメスＢａｌｂ／ｃマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌ）の７群、各々が使用された。処置の開始時には、マウスは８〜９週齢で、体重１７〜１９ｇであった。動物は、一価のＬＰＰビロソームインフルエンザワクチン（Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ）を用いて０日および１４日目に鼻内にワクチン接種され、そして第２回のワクチン接種２１日後に検視された。
【００３１】
鼻内：試験物質は、背面位の動物を用いて軽いイソフラン／Ｏ２／Ｎ２Ｏ麻酔下で鼻内に（両に鼻孔に分けられた１０μｌ）接種された。
【００３２】
【表７】
2009530351.tif 000008
【００３３】
第１回のワクチン接種前および第１回ワクチン接種１４日後に、眼窩の血液サンプルがイソフラン／Ｏ２／Ｎ２Ｏ麻酔下で収集された。３５日目に、動物は犠牲にされ、そして血液サンプルが収集された（腹部大動脈または心臓穿刺によるＯ２／ＣＯ２麻酔下の瀉血）。全サンプルからの血清が回収され、強く凍結され、そして処理するまで＜−１０℃でポリプロピレンチューブにおいて保存された。
【００３４】
インフルエンザウイルスは赤血球（ＲＢＣ）を凝集するが、これはウイルスに対する十分な特異的抗体の存在下で阻止される。この現象は血球凝集阻止（ＨＩ）アッセイの基礎を提供し、これが血清中の特異的抗ウイルス抗体を検出し、定量するために使用される。血清がインフルエンザウイルスおよびシチメンチョウＲＢＣに添加された。数種の希釈液が試験された（滴定）。ＨＩタイターは、血球凝集をなお阻止する最高希釈の逆数として定義される。幾何平均タイター（ＧＭＴ）は次のように計算された：
１）２つの並列値の算術平均として個々のｌｏｇ（タイター）を計算する：
［ｌｏｇ（タイター１）＋ｌｏｇ（タイター２）］／２
２）個々のｌｏｇ（タイター）の算術平均を計算する
３）ＧＭＴ（群）＝１０ＥＸＰ（群平均ｌｏｇ（タイター））
【００３５】
統計
ＨＩタイターが幾何平均タイターを用いて、ワクチン接種群および日毎で総括された。群のｌｏｇ変換された３５日目のＨＩタイターが線形回帰の平均値によって分析されて、ワクチン中のＬＰＰ量とＧＭＴとの間の用量−応答関係が調査された。
【００３６】
結果
ＨＩタイター分析
ＧＭＴが表５に示される。
【００３７】
【表８】
2009530351.tif 000009
【００３８】
０日目では、ＨＡに特異的な抗体は、マウスにおいて検出できなかった（すなわち、全ＨＩタイター＜１０）。
１４日目には、鼻内経路（ｉ．ｎ．）によってワクチン接種されたマウスの大部分でＨＡ特異的抗体は検出できなかった。全ＨＩタイターは、群Ａにおける１マウス（ＨＩタイター：８０）、群Ｃにおける１マウス（ＨＩタイター：３５）および群Ｄにおける１マウス（ＨＩタイター：１６０）を除いて、≦１０であった。
３５日目には、ＨＡ特異的抗体の生成における用量−応答が観察された、すなわち、ワクチンへの、より多くのＬＰＰの添加が、より高い抗体タイターをもたらした。
（ｌｏｇ変換された）３５日目のＨＩタイターが、線形回帰の平均値によって群間で比較された。適合された回帰傾斜（ｓｌｏｐｅ）は高度に有意であった（ｐ＜０．０００１）。かくして、ワクチン中のＬＰＰ量とＧＭＴとの間の観察された用量−応答関係は統計的に有意であった。
【００３９】
結論
アジュバント無添加の再構成インフルエンザビロソームによるマウスの反復鼻内ワクチン接種は、測定可能な全身性免疫応答を誘導しなかった。同じＨＡ用量レベル（２μｇＨＡ／用量）で、かつＬＰＰの増加用量によるＬＰＰアジュバントを添加された再構成インフルエンザビロソームを使用する反復鼻内ワクチン接種は、ＬＰＰ用量依存様式において全身性免疫応答を示した。本発明とは明らかに反対に（下記例２参照）、これらのデータは、たとえ、インフルエンザ抗原（ＨＡ）が再構成ビロソーム中に存在していても、免疫刺激剤（この場合、ＬＰＰ）の使用が、不活化インフルエンザワクチンによる鼻内ワクチン接種のために不可欠であるという当該技術分野における一致した見解を支持すると以前には考えられていた。
【００４０】
［例２］
年齢１８〜４０歳の健康な若い成人において鼻内送達後の、リポペプチド・アジュバントの安全性ならびにビロソームサブユニット・インフルエンザワクチンの効能に及ぼすその影響を調査するための二重盲検、無作為化、並行群研究
健康なヒトのボランティアが、ＬＰＰ（リポペプチド）アジュバントを添加された再構成インフルエンザビロソームにより、１株について１５０ｍｃｇ  ＨＡ／ｍｌと３１５ｍｃｇ  ＬＰＰ／ｍｌを含有する０．２ｍｌ（１鼻孔に０．１ｍｌ）の用量容量において鼻内にワクチン接種された。類似の群は、１株について１５０ｍｃｇ  ＨＡ／ｍｌを含有する０．２ｍｌ（１鼻孔に０．１ｍｌ）の用量容量においてＬＰＰを含有しない再構成インフルエンザビロソームにより鼻内にワクチン接種された。研究の目的は、不活化インフルエンザワクチンによる鼻内ワクチン接種後に満足できる全身性免疫応答を得るために、アジュバント（例えば、ＬＰＰ）の使用が要求されるというマウスにおいて示されたような概念の証明を、ヒトにおいて確認することであった。
【００４１】
研究計画
これは、年齢１８〜４０歳の健康な若い被験者における二重盲検、無作為化並行群研究であった。この研究は、１研究センター：Ｓｗｉｓｓ  Ｐｈａｒｍａ  Ｃｏｎｔｒａｃｔ
Ｌｔｄ．，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄにおいて実施された。主任研究者はＤｒ．Ｍ．Ｓｅｉｂｅｒｌｉｎｇであった。研究は２パートを有した。パートＩでは、ＬＰＰアジュバント添加のビロソームサブユニット・インフルエンザワクチンの安全性が１２人の被験者において評価された。９被験者はＬＰＰ−ＲＶＭ（ＬＰＰで再構成されたウイルス膜；ＬＰＰをアジュバント添加された、インフルエンザワクチン−表面抗原、不活化，ビロソーム−）により、そして３被験者はＲＶＭ（インフルエンザワクチン−表面抗原、不活化，ビロソーム−）によりワクチン接種された。研究のパートＩＩでは、ＬＰＰ−ＲＶＭの効能および安全性が１００人の被験者（１群当たり５０）において評価された。
【００４２】
研究は健康な被験者において実施された。さらに、研究のパートＩＩに参加する被験者は、研究の開始前に３年間インフルエンザに対してワクチン接種されていなかった。このことは、インフルエンザに対する予め存在する抗体を有する被験者の数を最小化することによって、パートＩＩにおける研究集団の同質性を増大する。
【００４３】
パートＩ：
ワクチン接種前１４日間（Ｖｉｓｉｔ  １）に、被験者はインフォームドコンセントを与えられた後、男性または女性は、基準に合致するか、しないか（ｉｎ−ｏｒ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）について選別され、そして身体検査を受けた。この訪問（ｖｉｓｉｔ）では、鼻の上皮細胞のサンプルが細胞検査（ｃｙｔｏｌｏｇｙ）のために採取され、そして基礎繊毛活動がサッカリン試験により測定された。
【００４４】
Ｖｉｓｉｔ  ２（１日目）には、４〜６ｍｌの血液サンプルが標準血液学的分析のために採取され、６〜１０ｍｌのサンプルが標準生化学的分析のために採取され、そして生活徴候が評価された。無作為化の後、被験者は２種のワクチン調合物の１つを接種され、そしてワクチン接種後最初の２４時間はその場所に留められて、即時的局所および全身反応、および副作用がモニターされた。生活徴候は、ワクチン接種後４時間と２４時間目に評価された。さらに、２４時間後、２つの血液サンプルが標準血液学的（４〜６ｍｌ）および生化学的（６〜１０ｍｌ）分析のために採取された；鼻上皮細胞のサンプルが細胞検査のために採取され、そしてワクチン接種後の繊毛活動がサッカリン試験により測定された。
【００４５】
被験者は、その翌日（３日目）に局所および全身反応を評価するために、質問票（質問票１）を与えられて帰宅した。
【００４６】
被験者は、帰宅２日後に研究場所に戻らねばならなかった；Ｖｉｓｉｔ３（４日目）。この訪問では、局所および全身反応が評価され、そして前回と今回の訪問の間に起きた何らかの自然発生の副作用が記録された。さらに、２つの血液サンプルが標準血液学的（４〜６ｍｌ）および生化学的（６〜１０ｍｌ）分析のために採取され、そして生活徴候が評価された。
【００４７】
被験者は、最初のワクチン接種２週間後、１５日目に研究場所に戻った（Ｖｉｓｉｔ４）。この訪問では、鼻上皮細胞のサンプルが、細胞検査のために採取され、繊毛活動がサ
ッカリン試験により測定され、そしてＶｉｓｉｔ３とＶｉｓｉｔ４の間に起きた副作用が記録された。
【００４８】
パートＩＩ：
最初の血液と鼻洗浄液のサンプリング前１４日間（Ｖｉｓｉｔ  １）に、被験者はインフォームドコンセントを与えられた後、男性または女性は、基準に合致するか、しないか選別され、そして彼らの健康が身体検査によってチェックされた。
【００４９】
Ｖｉｓｉｔ  ２（１日目；この訪問はＶｉｓｉｔ  １と一緒にすることができる）には、６〜１０ｍｌの血液サンプルが基礎血球凝集阻止（ＨＩ）タイター測定のために採取され、そして血液サンプルが、標準血液学的（４〜６ｍｌ）および標準生化学的（６〜１０ｍｌ）分析のために採取された。鼻洗浄サンプルは、基礎鼻ＩｇＡ抗体タイターの測定のために回収された。
【００５０】
翌日、生活徴候の評価後のＶｉｓｉｔ３（１日目）では、被験者は、無作為化されて鼻インフルエンザワクチンの２種の調合物の１つの単回用量を接種された。何らかの即時的局所反応、全身反応および副作用が、ワクチン接種後１時間の間その場所でモニターされた。その後、生活徴候が再評価され、そして被験者は、ワクチン接種後最初の７日間の局所および全身反応を毎日記録するために、質問票を与えられて帰宅した。
【００５１】
２週間後（Ｖｉｓｉｔ４；１５日目）に、６〜１０ｍｌの血液サンプルが、ＨＩタイター測定のために採取され、２つのさらなる血液サンプルが、標準血液学的（４〜６ｍｌ）および生化学的（６〜１０ｍｌ）分析のために採取され、鼻洗浄液サンプルが鼻ＩｇＡ抗体タイターのために採取された。
【００５２】
効能評価
効能を評価するために、血液サンプルおよび鼻洗浄サンプルが１日目（基礎）および１５日目に収集された。
【００５３】
血液サンプル
６〜１０ｍｌの血液が収集されて、血球凝集阻止（ＨＩ）抗体タイターが測定された（参照、Ｐａｌｍｅｒ  ＤＦ，Ｄｏｗｄｌｅ  ＷＲ，Ｃｏｌｅｍａｎ  ＭＴ，Ｓｃｈｉｌｄ  ＧＣ．Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｌｔｈ．Ｅｄ．Ｗｅｌｆａｒｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓ．Ａｔｌａｎｔａ；１９７５：２５−６２）。血液の収集および凝固（室温で少なくとも３０分）後、血清が分離され、そして滴定まで凍結保存（−２０℃）された。抗体滴定は、２並列で行われた。サンプルに帰せられるタイターは、２つの測定値の幾何平均であった。ワクチン接種前，後の血清が同時に滴定された。
【００５４】
鼻洗浄サンプル
鼻洗浄サンプルの収集のために、予備加温（３７℃）された食塩水６ｍｌが、一方の鼻孔内に鼻鏡制御下で適用された。被験者は、洗浄用流体が流れるように、６０°角に彼らの頭を傾けるよう求められた。収集された洗浄液は第２の鼻鏡に適用され、これが同条件下で洗浄された。サンプルには保存液が添加された（サンプル容量の１／１００）。保存液は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８中に溶解されたウシ血清アルブミン１０ｍｇ／ｍｌを含有した。サンプルは，直接，低速遠心によって清澄化され（８００ｘｇで１０分）、一定分量に分けられ（後のサンプルの反復融解を避けるために）、そして−８０℃に移行するまでドライアイス上に置かれた。
【００５５】
鼻洗浄サンプル中のＩｇＡレベルはＥＬＩＳＡによって決定され、そしてＷｉｌｃｏｘｏｎ検定により統計学的に解析された。インフルエンザワクチンは、９６穴プレートにおいてコーティング抗原として使用された。非特異的結合部位はブロッキングバッファーとのインキュベーションによってブロックされた。鼻洗浄液が、９６穴プレート上の抗原へのインフルエンザ特異的抗体の吸着のために、ブロッキングバッファー中２倍希釈液（１サンプルについて１２希釈液）において適用された。９６穴プレートは、酵素共役抗ヒト抗体（共役されたセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）とのインキュベーション前に洗浄された。未結合の抗ヒト抗体は洗浄によって除去され、そしてインフルエンザ株特異的抗体の量が、酵素反応のための基質の添加後の光学濃度を測定することによって決定された。
【００５６】
ワクチン調合物
インフルエンザワクチンの２種の異なる調合物がこの研究において使用された。両調合物は、０．２ｍｌの１用量当たり１株について３０ｍｃｇの用量レベルにおいて、２００５年度の南半球に対してＷＨＯによって推薦されたウイルス抗原を含有した（参照、ＷＨＯ．Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ２００５  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｓｅａｓｏｎ．Ｗｅｅｋｌｙ  Ｅｐｉｄｅｍ  Ｒｅｃ．２００４；７９：３６９−３７６）。
−Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）様株
−Ａ／Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ／１／２００４（Ｈ３Ｎ２）様株
−Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２様株
【００５７】
簡単に言えば、３０〜４０％スクロース溶液中の不活化インフルエンザウイルスが遠心によって沈降された。ウイルスは、洗剤オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル（ＯＥＧ）を含有するバッファー中に再懸濁され、溶解された。続いて、ウイルスのヌクレオキャプシドが超遠心によって除去された。ＯＥＧ含有上澄液は、ＯＥＧ含有バッファー中リポペプチドＰ３ＣＳＫ４によるか、またはＬＰＰを含有しない再構成ウイルス膜の場合にはＯＥＧ含有バッファーのみにより調節された（Ｐ３ＣＳＫ４：Ｎ−パルミトイル−Ｓ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２ＲＳ）−プロピル］−［Ｒ］−システイニル−［Ｓ］−セリル−［Ｓ］−リジル−［Ｓ］−リジル−［Ｓ］−リジル−［Ｓ］−リジン）。ＯＥＧは疎水性樹脂への吸着によって除去された。これにより、ＬＰＰ含有またはＬＰＰを含有しない再構成ウイルス膜（それらの膜中にＨＡとＮＡを有し、そして場合によっては、それらの膜中にＬＰＰを有する再構成ウイルス粒子）の形成をもたらした。ＯＥＧの除去後、ビロソームは、０．２２μｍの孔径を有するＰＶＤＦメンブランを通して濾過された。
【００５８】
ウイルスの各株について、ＬＰＰを含有するかまたは含有しない別々の調製物が作成された（表６）。添加されたＬＰＰ量は、１：０．７（ｗ／ｗ）のＨＡ／ＬＰＰ比に対応した。
【００５９】
【表９】
2009530351.tif 000010
【００６０】
【表１０】
2009530351.tif 000011
【００６１】
ａ  Ｌｏｗｒｙアッセイ、原理：タンパク質は、アルカリ性硫酸銅およびＦｏｌｉｎ−ｃｉｏｃａｌｔｅｕフェノール試薬による処理後に青色を形成する。タンパク質含量は、参考としてアルブミンＢＳＡ標準を使用して、７５０ｎｍにおける吸収から決定された。
Ｌｏｗｒｙ，ＯＨ，ＮＪ  Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ，ＡＬ  Ｆａｒｒ，ａｎｄ  ＲＪ  Ｒａｎｄａｌｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５．１９５１．
Ｏｏｓｔｒａ，ＧＭ，ＮＳ  Ｍａｔｈｅｗｓｏｎ，ａｎｄ  ＧＮ  Ｃａｔｒａｖａｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８９：３１．１９７８．
Ｓｔｏｓｃｈｅｃｋ，ＣＭ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８２：５０−６９（１９９０）．
Ｈａｒｔｒｅｅ，ＥＦ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４８：４２２−４２７（１９７２）
ｂ  ＰｈＥｕｒ：ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  ２０５３  ａｎｄ  ｓｅｃｔｉｏｎ  ２．７．１
ｃ  原理：各リン脂質は１個のリン原子を含有し、これはリン脂質の定量のために使用することができる。リン脂質は、過塩素酸によって分解され、そして生成されたリン酸イオンがモリブデン酸塩によって錯体化され、これがアスコルビン酸によって還元されて青色生成物を生じる。着色は８１２ｎｍにおいて分光光度計により測定される。サンプル中のリン脂質の量はホスフェートカリブレーター（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）を含むことによって定量される。
Ａｍｅｓ  ＢＮ．Ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｔｏｔａｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９６６；８：１１５−１１８
Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒ  ＣＪＦ，ｖａｎ  Ｇｅｎｔ  ＣＭ  ＆  Ｐｒｉｅｓ  Ｃ．Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｕｂ−ｍｉｃｒｏ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９６１；２４：２０３−２０４
ｄ  Ｐｈ．Ｅｕｒ．２．６．１４
ｅ  オボアルブミンＥＬＩＳＡは、捕捉のための固定化ポリクローナル抗オボアルブミン抗体および検出系としての抗オボアルブミン−ＨＲＰコンジュゲートを使用する直接サンドイッチ酵素イムノアッセイである。コンジュゲートおよびサンプルが同時にインキュベートされる。未結合成分は洗浄段階によって除去される。基質（ＴＭＢおよびＨ２Ｏ２）がウェルに添加される。ウェル中の特異的に結合されたコンジュゲートの存在は、青色の発色によって示される。硫酸が基質に添加されて反応を停止し、そしてこれが黄色への生成物における着色変化をもたらす。吸光度（ＯＤ）が４５０ｎｍにおいて読まれる。最適の結果のために、６２０ｎｍにおける参考フィルターが使用される。標準曲線は、アッセイに含まれるオボアルブミン標準（０．３〜２０．０ｎｇ／ｍｌ）の応答値から作成される。未知のサンプルの濃度は、標準曲線から内挿することができる。
ｆ  ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  ０８６９および２０５３による：一価のプールされた回収物（ｈａｒｖｅｓｔ）の純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって試験された。電気泳動：Ｐｈ．Ｅｕｒ  ２．２．３１による。
【００６２】
効能
各ウイルス株について、１５日目のｌｏｇ変換ＨＩ抗体タイターおよび１５日目の鼻ＩｇＡ抗体タイターが、両側有意水準０．０５において、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定によって２つのワクチン接種群間で比較された。
【００６３】
また、１５日目におけるＨＩ抗体タイターが、１ウイルス株および１ワクチン接種群に
ついて次の３種のパラメーターを計算することによって分析された：
−  セロプロテクション率（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｒａｔｅ），ＨＩタイター≧４０として定義されるセロプロテクションによる、
−  セロコンバージョン率（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｒａｔｅ）、ワクチン接種前ＨＩタイター＜１０およびワクチン接種後ＨＩタイター≧４０、またはワクチン接種前ＨＩタイター≧１０かつ少なくとも４倍のＨＩタイターにおける上昇として定義されるセロコンバージョンによる、
−  平均倍増、すなわち、ＨＩタイターにおける倍増の幾何平均。
【００６４】
効能データは、ｐｅｒ−ｐｒｏｔｏｃｏｌおよびｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ原理の両方にしたがって分析された。しかしながら、これが、いわゆるｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ研究であったならば、ｐｅｒ−ｐｒｏｔｏｃｏｌ分析が第１次の分析とみなされた。ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−ｔｒｅａｔサンプルは、若干のワクチン接種後の効能データをもつワクチン接種被験者によって構成された。ｐｅｒ−ｐｒｏｔｏｃｏｌサンプルは、そのプロトコールを終了し、かつ、その者について重大なプロトコール違反（ｖｉｏｌａｔｉｏｎ）が生じなかったワクチン接種被験者によって構成された。重大な違反は（なかんずく）、基準に合致するか、しないか（ｉｎ−ｏｒ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）の違反および禁じられた投薬の使用：を含む。さらにまた、研究所確認の併発インフルエンザ感染を有する被験者および第１次効能データを失っている被験者も、ｐｅｒ−ｐｒｏｔｏｃｏｌサンプルから排除された。被験者がｐｅｒ−ｐｒｏｔｏｃｏｌサンプルから排除されるべきか排除されるべきではないかは、研究データベースが明らかにされる前に決定された。
【００６５】
【表１１】
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【００６６】
【表１２】
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【００６７】
【表１３】
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【００６８】
【表１４】
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【００６９】
結論
予期せぬことに、また同じワクチンバッチにより得られた前臨床データ（実施例１）に反して、そしてＷＯ０４／１１０４８６および臨床データ（Ｇｌｕｃｋ  Ｕ，Ｇｅｂｂｅｒｓ  ＪＯ，Ｇｌｕｃｋ  Ｒ，Ｐｈａｓｅ  １  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｖｉｒｏｓｏｍａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｗｉｔｈ  ａｎｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ  ｔｏｘｉｎ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９９  Ｓｅｐ；７３（９）：７７８０−６）に記述されたように、インフルエンザワクチンに関するＣＨＭＰ基準に一致している満足される全身性免疫応答が、アジュバント無添加の再構成ビロソームインフルエンザワクチンにより１回のみワクチン接種されたヒトのグループにおいて観察された。
【国際調査報告】
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