(57)【要約】  本発明は、新規なイミンカリックスアレーン誘導体及びその製造方法、そして該製造方法によって製造された自己組織化単分子層、該自己組織化単分子層を利用するオリゴ遺伝子の固定化方法及びこれによって製造されたオリゴ遺伝子チップに関する。  また、本発明は、新規なアミノカリックスアレーン誘導体及びその製造方法、そして該製造方法によって製造された自己組織化単分子層、該自己組織化単分子層に溶液相でオリゴ遺伝子が自発的に分子認識により固定化されるオリゴ遺伝子の固定化方法及びこれによって製造されたオリゴ遺伝子チップに関する。
2009515822.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式１のイミンカリックスアレーン誘導体：
【化１】
2009515822.tif 000033
（前記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、互いに独立して−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＯＣＨ３、−Ｃｌ、−Ｃ６Ｈ５及び−ＣＯＯＲからなる群より選択され、前記−ＣＯＯＲにおけるＲは、−ＣＨ３又は−Ｃ２Ｈ５を示す）
【請求項２】
下記式２のイミンカリックスアレーン誘導体：
【化２】
2009515822.tif 000034
（前記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、互いに独立して−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＯＣＨ３、−Ｃｌ、−Ｃ６Ｈ５及び−ＣＯＯＲからなる群より選択され、前記−ＣＯＯＲにおけるＲは、−ＣＨ３又は−Ｃ２Ｈ５を示す。また、前記Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３及びＹ４は、互いに独立して−Ｈ、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｃ−Ｚ及び−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−１−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｃ−Ｚからなる群より選択される（ｎ＝２〜１５、ｍ＝１〜１０、ｃ＝０〜１０、Ｚ＝−ＳＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ又は−ＮＨ２で定義される））
【請求項３】
下記式３の５，１１，１７，２３−テトラアミノカリックス［４］アレーンを下記式４の芳香族アルデヒドと反応させて請求項１のイミンカリックスアレーン誘導体化合物を製造する方法：
【化３】
2009515822.tif 000035
【化４】
2009515822.tif 000036
（前記式４において、Ｒは、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＯＣＨ３、−Ｃｌ、−Ｃ６Ｈ５及び−ＣＯＯＲ’からなる群より選択され、前記ＣＯＯＲ’におけるＲ’は、−ＣＨ３又は−Ｃ２Ｈ５を示す）
【請求項４】
請求項１のイミンカリックスアレーン誘導体化合物を二官能性化合物と反応させて請求項２のイミンカリックスアレーン誘導体化合物を製造する方法であって、前記二官能性化合物は、Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ＝Ｏ、Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ、Ｘ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ＝Ｏ、Ｘ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ、Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｃ−Ｚ及びＸ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−１−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｃ−Ｚからなる群より選択され、ここで、ｎ＝２〜１５、ｍ＝１〜１０、ｃ＝０〜１０、Ｘ＝−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ又は−ＯＳＯ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ３、Ｚ＝−ＳＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ又は−ＮＨ２で定義される方法。
【請求項５】
チオール基が付着されたイミンカリックスアレーン誘導体を金基質に付着して製造した自己組織化単分子層の固体基質。
【請求項６】
ガラス、シリコンウエハ及び水晶結晶からなる群より選択される固体基質に、イミンカリックスアレーン誘導体をイミン結合を通じて付着して製造した自己組織化単分子層の固体基質。
【請求項７】
ガラス、シリコンウエハ及び水晶結晶からなる群より選択される固体基質に、イミンカリックスアレーン誘導体をエステル、エーテル及びアミド結合からなる群より選択される化学結合を通じて付着して製造した自己組織化単分子層の固体基質。
【請求項８】
請求項５乃至７のうちいずれか一項の自己組織化単分子層の固体基質に、７個以上の連続したグアニン塩基が付着されたオリゴ遺伝子を多重分子認識によって固定化して製造されるオリゴ遺伝子チップ。
【請求項９】
請求項５乃至７のうちいずれか一項の自己組織化単分子層の固体基質に、７個以上の連続したグアニン塩基が付着されたオリゴ遺伝子を多重分子認識によって固定化してオリゴ遺伝子チップを製造する方法。
【請求項１０】
請求項５乃至７のうちいずれか一項において、カリックスアレーンの５，１１，１７，２３−の位置に窒素が付着されている下記式３の５，１１，１７，２３−テトラアミノカリックス［４］アレーンのイミン誘導体を利用して製造した自己組織化単分子層の固体基質。
【化５】
2009515822.tif 000037
【請求項１１】
請求項１０の自己組織化単分子層の固体基質に、７個以上の連続したグアニン塩基が付着されたオリゴ遺伝子を多重分子認識によって固定化して製造されるオリゴ遺伝子チップ。
【請求項１２】
請求項１０の自己組織化単分子層の固体基質に、７個以上の連続したグアニン塩基が付着されたオリゴ遺伝子を多重分子認識によって固定化してオリゴ遺伝子チップを製造する方法。
【請求項１３】
下記式５のアミノカリックスアレーン誘導体：
【化６】
2009515822.tif 000038
（前記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３、Ｒ’４、Ｒ’５、Ｒ’６、Ｒ’７、Ｒ’８は、互いに独立して−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＯＣＨ３、−Ｃｌ、−Ｃ６Ｈ５、−ＯＨ、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｂｒ、−ＣＦ３、−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＣ６Ｈ４ＣＦ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃｌ、−ＯＣＯＣＨ３、−ＮＨＣＯＣＨ３、−ＣＯＮＨＣＨ３、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、及び−ＣＯＯＲからなる群より選択され、前記−ＣＯＯＲにおけるＲは、−ＣＨ３又は−Ｃ２Ｈ５を示す）
【請求項１４】
下記式６のアミノカリックスアレーン誘導体：
【化７】
2009515822.tif 000039
（前記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３、Ｒ’４、Ｒ’５、Ｒ’６、Ｒ’７、Ｒ’８は、互いに独立して−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＯＣＨ３、−Ｃｌ、−Ｃ６Ｈ５、−ＯＨ、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｂｒ、−ＣＦ３、−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＣ６Ｈ４ＣＦ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃｌ、−ＯＣＯＣＨ３、−ＮＨＣＯＣＨ３、−ＣＯＮＨＣＨ３、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、及び−ＣＯＯＲからなる群より選択され、前記−ＣＯＯＲにおけるＲは、−ＣＨ３又は−Ｃ２Ｈ５を示す。また、前記Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３及びＹ４は、互いに独立して−Ｈ、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｃ−Ｚ、及び−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｃ−Ｚからなる群より選択される（ｎ＝２〜１５、ｍ＝１〜１０、ｃ＝０〜１０、Ｚ＝−ＳＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、そして−Ｃ６Ｈ４−とＣ６Ｈ５はフェニル基で定義される））
【請求項１５】
下記式７のアミノカリックスアレーン誘導体：
【化８】
2009515822.tif 000040
（前記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３、Ｒ’４、Ｒ’５、Ｒ’６、Ｒ’７、Ｒ’８は、互いに独立して−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＯＣＨ３、−Ｃｌ、−Ｃ６Ｈ５、−ＯＨ、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｂｒ、−ＣＦ３、−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＣ６Ｈ４ＣＦ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃｌ、−ＯＣＯＣＨ３、−ＮＨＣＯＣＨ３、−ＣＯＮＨＣＨ３、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、及び−ＣＯＯＲからなる群より選択され、前記−ＣＯＯＲにおけるＲは、−ＣＨ３又は−Ｃ２Ｈ５を示す）
【請求項１６】
下記式８のアミノカリックスアレーン誘導体：
【化９】
2009515822.tif 000041
（前記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３、Ｒ’４、Ｒ’５、Ｒ’６、Ｒ’７、Ｒ’８は、互いに独立して−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＯＣＨ３、−Ｃｌ、−Ｃ６Ｈ５、−ＯＨ、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｂｒ、−ＣＦ３、−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＣ６Ｈ４ＣＦ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃｌ、−ＯＣＯＣＨ３、−ＮＨＣＯＣＨ３、−ＣＯＮＨＣＨ３、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、及び−ＣＯＯＲからなる群より選択され、前記−ＣＯＯＲにおけるＲは、−ＣＨ３又は−Ｃ２Ｈ５を示す。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３、Ｒ’４、Ｒ’５、Ｒ’６、Ｒ’７、Ｒ’８が同時に−Ｈである場合は除く。また、前記Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３及びＹ４は、互いに独立して−Ｈ、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｃ−Ｚ、及び−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｃ−Ｚからなる群より選択される（ｎ＝２〜１５、ｍ＝１〜１０、ｃ＝０〜１０、Ｚ＝−ＳＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、そして−Ｃ６Ｈ４−とＣ６Ｈ５は、フェニル基で定義される））
【請求項１７】
前記式６又は式８のアミノカリックスアレーン誘導体のうち、チオール基が付着されたアミノカリックスアレーン誘導体を金基質に付着して製造した自己組織化単分子層の固体基質。
【請求項１８】
アミン作用基が付着されているガラス、シリコンウエハ及び水晶結晶からなる群より選択される固体基質に、前記式６又は式８のアミノカリックスアレーン誘導体のうち、アルデヒド作用基が末端基に付着されたアミノカリックスアレーン誘導体を利用してイミン結合及びアミン結合を通じて付着して製造した自己組織化単分子層の固体基質。
【請求項１９】
アミン作用基が付着されているガラス、シリコンウエハ及び水晶結晶からなる群より選択される固体基質に、前記式６又は式８のアミノカリックスアレーン誘導体のうち、アルデヒド作用基が末端基に付着されたアミノカリックスアレーン誘導体を利用して、エステル、エーテル及びアミド結合からなる群より選択される化学結合を通じて付着して製造した自己組織化単分子層の固体基質。
【請求項２０】
請求項１７乃至１９のうちいずれか一項の自己組織化単分子層の固体基質に、７個以上の連続したグアニン塩基が付着されたオリゴ遺伝子を多重分子認識によって固定化して製造されるオリゴ遺伝子チップ。
【請求項２１】
請求項１７乃至１９のうちいずれか一項の自己組織化単分子層の固体基質に、７個以上の連続したグアニン塩基が付着されたオリゴ遺伝子を多重分子認識によって固定化してオリゴ遺伝子チップを製造する方法。
【請求項２２】
請求項１７乃至１９のうちいずれか一項において、カリックスアレーンの５，１１，１７，２３−の位置に窒素が付着されている下記式９の５，１１，１７，２３−テトラアミノカリックス［４］アレーンのアミン誘導体を利用して製造した自己組織化単分子層の固体基質。
【化１０】
2009515822.tif 000042
【請求項２３】
請求項２２の自己組織化単分子層の固体基質に、７個以上の連続したグアニン塩基が付着されたオリゴ遺伝子を多重分子認識によって固定化して製造されるオリゴ遺伝子チップ。
【請求項２４】
請求項２２の自己組織化単分子層の固体基質に、７個以上の連続したグアニン塩基が付着されたオリゴ遺伝子を多重分子認識によって固定化してオリゴ遺伝子チップを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なイミンカリックスアレーン（ｉｍｉｎｅｃａｌｉｘａｒｅｎｅ）誘導体、及びその製造方法、そして該製造方法によって製造された自己組織化単分子層、該自己組織化単分子層を利用するオリゴ遺伝子の固定化方法及びこれによって製造されたオリゴ遺伝子チップに関する。
【０００２】
より具体的に、本発明は、連続したグアニン塩基を有するオリゴ遺伝子を、分子認識によって固体基質の表面に固定化可能なイミンカリックスアレーン化合物を、ガラス基質又は金基質に単分子層で製造する方法及びその自己組織化単分子層を利用したオリゴ遺伝子の単分子層、即ち、オリゴ遺伝子チップ（ＯｌｉｇｏＤＮＡ  ｃｈｉｐ）を製造する方法に関する。
【０００３】
また、本発明は、新規なアミノカリックスアレーン（ａｍｉｎｏｃａｌｉｘａｒｅｎｅ）誘導体、その製造方法、及び該製造方法によって製造された自己組織化単分子層、該自己組織化単分子層に自発的なオリゴ遺伝子の非可逆的な分子認識によるオリゴ遺伝子の固定化方法及びこれによって製造されたオリゴ遺伝子チップに関する。
【０００４】
より具体的に、本発明は、連続したグアニン塩基を有するオリゴ遺伝子を、多重塩基を非可逆的／自発的な分子認識によって固体基質の表面に固定化するアミノカリックスアレーン誘導体、及びそれをガラスや金基質等の固体基質に単分子層としてバイオチップ基板を製造する技術、及び該製造技術によって製造されたバイオチップ基板にオリゴ遺伝子を単分子層で高密度で固定化したオリゴ遺伝子チップを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
人間ゲノムの研究チームとＣｅｌｅｒａ社によって競争的に進められた人間ゲノムプロジェクト（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）が、２０００年にその遺伝子情報地図が完成されながら、遺伝子の機能研究と変異遺伝子の検索及びこの情報を利用した診断用オリゴ遺伝子チップの開発が全世界的に進められている。特に、単一塩基の変異（ＳＮＰ；ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）検索用オリゴ遺伝子チップは、遺伝子欠陥等による遺伝病や癌の早期診断等に用いられるものと予測されているため、鳥インフルエンザ等のウイルスタイピング（ｔｙｐｉｎｇ；遺伝子型の判別）による正確なウイルス感染経路の分析及び有／無害の把握、癌誘発ウイルス群のタイピングを利用した癌発病予測用遺伝子チップ等の多数のオリゴ遺伝子を一つの基板に固定化したオリゴ遺伝子チップの製造技術に関する研究が世界的に進められている。実際にヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ；ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）をタイピングすることができるオリゴ遺伝子チップは、子宮頸部癌の発病可能性を予測する診断及び予防医学的バイオチップとして、韓国内で世界で初めて韓国食品医薬品安全庁で正式な許可が与えられた。また、子宮頸部癌診断用オリゴ遺伝子チップも、韓国食品医薬品安全庁の許可が与えられ、既に診断に用いられている。
【０００６】
オリゴ遺伝子チップは、１５−５０ｍｅｒ水準の短い長さの遺伝子（オリゴ遺伝子）を固定化しなければならない。従って、変異遺伝子分析用として用いられてきたｃ−ＤＮＡチップが、従来単純に物理吸着方式を利用したことと異なり、現在アルデヒドとアミンとの間の化学的結合によるイミン結合方式を利用した固定化方式、又はアルデヒドとアミン作用基との間の化学的結合後、結合の強度を高めるための還元反応を経てアミン結合方式を利用した固定化方式等、数十年前に開発された方式がまだ利用されている。その理由は、主に再現性及び使用簡便性の面でまだアルデヒドチップを凌ぐに足るバイオチップ基板が開発されていないためである。しかし、アルデヒドチップ基板は、オリゴ遺伝子の末端基に合成技術により付着したアミン作用基がアルデヒドチップ上にイミン結合で化学結合されるため、固定化された遺伝子の量と、実際にハイブリダイゼーションでｃ−ＤＮＡと結合可能な固定化されたオリゴ遺伝子の量が、理論的な最大密度と大きな差異があり、固定化されたオリゴ遺伝子の密度が固定化条件により多くの影響を受けていつも変わるため、再現性のあるチップの開発に非常に大きな困難を経ている。
【０００７】
その他に、ストレプトアビジン−ビオチン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ）の結合方式を応用した技術も広く用いられているが、上記技術は、固体基質の表面にストレプトアビジンを物理吸着、化学結合方式等を利用して固定化した後、ビオチンが付着されたオリゴ遺伝子のビオチン作用基をストレプトアビジンに分子認識させてオリゴ遺伝子を製造する方式である（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９３年  Ｖｏｌ．２６２、ｐｐ１７０６−１７０８）。しかし、このような多様な化学結合方式やストレプトアビジン−ビオチンの結合方式を応用した技術等は、まだアルデヒドチップ基板の性能を凌いでいない。
【０００８】
一方、タンパク質チップでは、抗体の活性位置が表面に固定化されたタンパク質の１ヶ所に存在するため、この位置が抗原と結合することができる位置に存在さえすれば、結果を得るのに大きい問題はない。しかし、オリゴ遺伝子チップでは、オリゴ遺伝子のほとんどがハイブリダイゼーションで接近してくるｃ−ＤＮＡと一定個数以上の塩基が結合されなければならないため、ｃ−ＤＮＡが最大限オリゴ遺伝子が固定化されている底まで接近して結合される塩基個数を最大化させなければならない。この問題を解決するために、固定化されるオリゴ遺伝子の間にｃ−ＤＮＡの自由な出入りが可能な水準の空間を維持しなければならない必要があるという見解が、２００３年ヨーロッパ学会から提起され始め、現在空間確保技術という研究が競争的に進められる先端研究課題になっている。分子水準で表面に固定化されるオリゴ遺伝子は、自発的に近くに集まって結合される傾向を示すため、化学結合したオリゴ遺伝子チップには空間確保技術の適用が相対的に難しい。これによって、接近するｃ−ＤＮＡが底まで下がる必要がないように２０−２５−ｍｅｒ水準であれば、十分なオリゴ遺伝子の長さを最大５０−ｍｅｒ水準まで引き上げてｃ−ＤＮＡの接近を容易にし、ハイブリダイゼーション時に結合される塩基の数を増やして診断の結果を再現性のあるように得ようとしている。しかし、明確な読出しが可能な結果は、最小数時間から一日以上を要する水準から外れておらず、鳥インフルエンザウイルスの分析等で既存の診断技術との差別化をなしていない状況である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記化学結合方式及びストレプトアビジン−ビオチン方式等の既存のオリゴ遺伝子の固定化方法は、下記のような問題点を有している。
【００１０】
１．固定化密度の均一性：化学結合方式は最も広く用いられる方式であって、オリゴ遺伝子が固定化される時、アルデヒド作用基（−ＣＨＯ）とアミン作用基（−ＮＨ２）の間に化学反応が進められて化学的に固定化されるものと知られている。この時、水分子（Ｈ２Ｏ）一つが抜けるとともにイミン結合（−Ｃ＝Ｎ−）の形態に固定化される。しかし、上記反応が水溶液相で進められるため、固定化密度が均一に、即ち、再現性のあるように進められない。また、イミン結合は、水溶液相元来の作用基に戻る逆反応が容易に進められるため、オリゴ遺伝子の密度が均一に進められ難いという問題がある。また、このような逆反応を最小化するために、イミン結合をＮａＢＨ４等の還元剤を利用して還元反応を行えば、オリゴ遺伝子の結合に影響を与えて固定化されたオリゴ遺伝子の長さが一定に維持されない。これによって、製造する度に異なる水準の結果を示すようになり、新しいオリゴ遺伝子チップの開発が長期化される傾向があり、オリゴ遺伝子チップの製品化に大きな障害物として認識されている。同時に、固定化されたオリゴ遺伝子は、その密度に比例して蛍光物質（Ｃｙ−３等）が付着されたｃ−ＤＮＡと結合してｃ−ＤＮＡの存在の有無及び濃度を知らせて診断目的等に用いられるが、オリゴ遺伝子の密度が同一に維持されなければ、製品化が不可能になる場合が示され、現在多くの企業がオリゴ遺伝子チップの製品化に莫大な費用を支払ったのにも拘らず、結果を得ていないのが実情である。
【００１１】
２．ｃ−ＤＮＡの接近のためのオリゴ遺伝子間の空間確保の必要性（超高速ハイブリダイゼーション不可能）：オリゴ遺伝子チップは、窮極的に病原菌の鋳型遺伝子をＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を通じて増幅されたｃ−ＤＮＡが付着されなければならない。しかし、図７で示すように、固定化された遺伝子が極めて狭い間隔で存在するようになれば、ｃ−ＤＮＡがオリゴ遺伝子の下の部分に接近し難くなる。現在ハイブリダイゼーション時間は数時間から一日以上の時間を要するオリゴ遺伝子チップが多いが、これは全的に接近してくるｃ−ＤＮＡが容易に底まで接近できず、固定化されているオリゴ遺伝子の底部分の塩基までの間に割り込んで結合しなければならないほど空間が確保されていないからである。従って、適切な水準のオリゴ遺伝子間の空間確保技術の必要性が台頭されているが、現在までは解決策が提示されていない。このような問題を解決するためには、連続した塩基の表面結合を利用して常にｃ−ＤＮＡが遺伝子チップ基板まで自由に出入りを可能とする適切な水準の空間確保技術が開発されなければならない。
【００１２】
３．作用基の付着：化学結合又はストレプトアビジン−ビオチン結合を利用するオリゴ遺伝子の固定化技術は、結合がなされるオリゴ遺伝子にビオチン又はアミン作用基を付着しなければ固定化が不可能である。ところで、オリゴ遺伝子の合成後、このような作用基の付着において、現在まで作用基の付着がほとんどないオリゴ遺伝子に比べて３倍から１０倍以上の高いオリゴ遺伝子の合成費用が必要である。また、オリゴ遺伝子チップの製品化のために、最小数十個のオリゴ遺伝子を固定化しても、数百乃至数千個のオリゴ遺伝子をテストしなければならず、この時必要な技術開発費用が数億乃至数十億水準であるため、製品化に困難を経ている。また、完成された製品の製造にも多くの費用を要する。このような問題を最小化するために、作用基の付着のないオリゴ遺伝子を利用したオリゴ遺伝子チップの製造技術の開発が必要である。
【００１３】
４．Ａ、Ｃ、Ｇの３個の塩基に付着されたアミン作用基とアルデヒドチップ基板の作用基と化学結合：アルデヒドチップ基板は、アミン作用基が付着されたオリゴ遺伝子を利用して表面のアルデヒド作用基と反応してオリゴ遺伝子を固定化したオリゴ遺伝子チップを製造する。ところで、オリゴ遺伝子に付着されている多くの数の塩基のうち、３／４を占める３個の塩基にアミン作用基が既に付着されており、これらがオリゴ遺伝子の末端基に付着された一つのアミン作用基とアルデヒドが反応して固定化されることよりさらに早く中間部分のオリゴ遺伝子が固定化されて、実際に接近してくる蛍光付着されたｃ−ＤＮＡと多重水素結合できる塩基の数が十分ではなくなる。さらに接近してくるｃ−ＤＮＡの塩基ともアルデヒドが水素結合することができ、これを除去するためにオリゴ遺伝子の固定化後に化学的処理を進めなければならず、この時製造された遺伝子チップの再現性の問題がさらに大きくなるものと知られている。
【００１４】
５．単一塩基の変異（ＳＮＰ）診断技術：鳥インフルエンザ、豚コレラ、癌転移の疑いのあるウイルス等の多数のウイルスに存在する多種の遺伝子を同時にタイピングすることは、現存する遺伝子の分析技術のうちオリゴ遺伝子チップだけが保有している最大の長所であるといえる。ところで、このようなウイルスはほとんど原種ウイルスの変異を通じて生成された新しい形態のウイルスであり、これは、原種ウイルスと塩基配列において大きな差がない場合が多く、特に問題になることは、単一塩基や２個ほどの塩基差を示すウイルス群が多く存在しているという点である。従って、オリゴ遺伝子チップを開発する多くの研究陣で最も力点を置いているのが単一塩基の変異をｏｎ−ｏｆｆ（確診）水準で判別可能な、即ち、ＳＮＰの診断が可能な水準のオリゴ遺伝子チップを製造することである。現在最も多く用いられるアルデヒドチップ基板を利用して製造されるオリゴ遺伝子チップでは、このような単一塩基の変異を判別するのに必須な適切な水準の空間が固定化されたオリゴ遺伝子の間に存在しておらず、単一塩基の変異を読み出す診断用オリゴチップの製造が不可能であるということに多くの研究陣が同意している。
【００１５】
６．低価用チップの製造技術：オリゴ遺伝子を固定化するために、アミン、ビオチン等の作用基を付着する場合、オリゴ遺伝子自体の価格が１０倍以上高くなりながら、塩基の表面結合等を妨害するために高濃度で表面に遺伝子を塗布してチップを製造しなければならないので、オリゴ遺伝子チップの製造費用が非常に高くなる問題を有している。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の詳細な説明
技術的課題
本発明の目的は、前述した従来のオリゴ遺伝子の固定化方法で発生する固定化密度の均一性問題、オリゴ遺伝子間の空間確保の問題及び作用基の付着問題等を解決するために、連続したグアニン基を有するオリゴ遺伝子に対する分子認識が可能なイミンカリックスアレーン誘導体及びその製造方法を提供することである。
【００１７】
本発明のまた他の目的は、上記イミンカリックスアレーン誘導体化合物を、アミン作用基を有するガラス基質（アミンスライドガラス）又は金基質（金薄膜又は金）に付着することにより、すべての種類のオリゴ遺伝子が何らの加工過程なしに適切な水準の空間を維持したまま、高密度で満たされたオリゴ遺伝子の単分子層、即ち、オリゴ遺伝子チップを生成することができるイミンカリックスアレーン誘導体の単分子層を提供することである。
【００１８】
より詳しくは、本発明は、７個以上の連続したグアニンを保有したオリゴ遺伝子が何らの加工過程なしに適切な水準の空間を維持したまま、高密度で満たされたオリゴ遺伝子の単分子層、即ち、オリゴ遺伝子チップを生成することができるイミンカリックスアレーン誘導体の単分子層を提供することを目的とする。
【００１９】
また、本発明の他の態様として、本発明の目的は、前述した既存のオリゴ遺伝子チップの製造技術で示される超高速ハイブリダイゼーション不可能、単一塩基の変異（ＳＮＰ）診断技術の確保不可、Ａ、Ｃ、Ｇの３個の塩基に付着されたアミン作用基とアルデヒドチップ基板の作用基と化学結合問題、製造されたチップでオリゴ遺伝子の均一密度の固定化の難しさ等の現存する遺伝子チップの製造技術で示されるすべての問題点を一挙に解決することができる、連続したグアニン基の非可逆的な分子認識が可能なアミノカリックスアレーン誘導体、及びその自己組織化単分子層の形態で製造されるオリゴ遺伝子チップの基板製造技術、及びチップ基板の表面で自発的な分子認識によってオリゴ遺伝子が非可逆的に固定化されて製造されるオリゴ遺伝子チップを提供することである。
【００２０】
本発明のまた他の目的は、上記化合物をアミン作用基を有するガラス基質（アミンスライドガラス）等の固体基質に単分子層で付着又は金基質（金薄膜又は金）に付着することにより、すべての種類のオリゴ遺伝子が何らの加工過程なしに適切な水準の空間を維持したまま、最高密度の水準で固定化されたオリゴ遺伝子の単分子層、即ち、オリゴ遺伝子チップを製造することができるアミノカリックスアレーン誘導体を利用して製造されたチップ基板を提供することである。
【００２１】
また、本発明の目的は、オリゴ遺伝子が連続したグアニン塩基が表面に長く固定化されて、何らの追加の工程なしに適切な水準の空間を維持したまま、高密度で固定化されたオリゴ遺伝子の単分子層、即ち、オリゴ遺伝子チップの製造技術を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
技術的解決方法
本発明の新規なイミンカリックスアレーン誘導体は、下記化学式１又は２の構造を有する。上記イミンカリックスアレーン誘導体は、７個以上の連続したグアニン基を有するオリゴ遺伝子の固定化方法で用いる自己組織化単分子層に必須な化合物である。
【００２３】
【化１】
2009515822.tif 000003
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、互いに独立して−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＯＣＨ３、−Ｃｌ、−Ｃ６Ｈ５及び−ＣＯＯＲからなる群より選択され、上記−ＣＯＯＲにおけるＲは、−ＣＨ３又は−Ｃ２Ｈ５を示す。）
【００２４】
【化２】
2009515822.tif 000004
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、互いに独立して−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＯＣＨ３、−Ｃｌ、−Ｃ６Ｈ５及び−ＣＯＯＲからなる群より選択され、上記−ＣＯＯＲにおけるＲは、−ＣＨ３又は−Ｃ２Ｈ５を示す。また、上記Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３及びＹ４は、互いに独立して−Ｈ、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｃ−Ｚ及び−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−１−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｃ−Ｚからなる群より選択される（ｎ＝２〜１５、ｍ＝１〜１０、ｃ＝０〜１０、Ｚ＝−ＳＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ又は−ＮＨ２で定義される）。）
本発明は、また上記化学式１及び化学式２のイミンカリックスアレーン誘導体化合物を製造する方法を提供する。
【００２５】
下記化学式３の５，１１，１７，２３−テトラアミノカリックス［４］アレーン化合物は、カリックス［４］アレーンを下記参考文献１の方法によって５，１１，１７，２３−テトラニトロカリックス［４］アレーンに変換した後、還元反応によって合成する［参考文献１：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９０年  Ｖｏｌ  ５５、ｐｐ５６３９−５６４３；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７９年  Ｖｏｌ  ４４、ｐｐ１２３３−１２３８］。
【００２６】
【化３】
2009515822.tif 000005
本発明の上記化学式１のイミンカリックスアレーン誘導体化合物は、上記化学式３の５，１１，１７，２３−テトラアミノカリックス［４］アレーン化合物を出発物質として化学式３のアミン作用基を下記化学式４の芳香族アルデヒドと反応させて合成する（下記実施例の反応式２参照）。
【００２７】
【化４】
2009515822.tif 000006
（上記化学式４において、Ｒは、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＯＣＨ３、−Ｃｌ、−Ｃ６Ｈ５及びＣＯＯＲ’からなる群より選択され、上記ＣＯＯＲ’におけるＲ’は、−ＣＨ３又は−Ｃ２Ｈ５を示す。）
また、本発明の化学式２のイミンカリックスアレーン誘導体化合物は、化学式１の化合物と末端基にハロゲンが付着されたアルデヒド化合物を反応させて、化学式１の化合物の１番目及び３番目の−ＯＨ基の位置にアルデヒド又はチオールが付着された末端基を有するように合成する（下記実施例の反応式３乃至反応式５参照）。
【００２８】
上記ハロゲン化アルデヒドは、Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ＝Ｏ、Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ、Ｘ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ＝Ｏ、Ｘ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ、Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｃ−Ｚ及びＸ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−１−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｃ−Ｚからなる群より選択され、ここで、ｎ＝２〜１５、ｍ＝１〜１０、ｃ＝０〜１０、Ｘ＝−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ又は−ＯＳＯ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ３、Ｚ＝−ＳＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ又は−ＮＨ２で定義される。
【００２９】
また、本発明は、チオール基が付着されたイミンカリックスアレーン誘導体を金基質に付着して製造した自己組織化単分子層の固体基質を提供する。
【００３０】
また、本発明は、ガラス、シリコンウエハ又は水晶結晶等の固体基質にイミンカリックスアレーン誘導体をイミン結合を通じて付着して製造した自己組織化単分子層の固体基質、そしてガラス、シリコンウエハ又は水晶結晶等から選択される固体基質にイミンカリックスアレーン誘導体をエステル、エーテル又はアミド結合等の化学結合を通じて付着して製造した自己組織化単分子層の固体基質を提供する。
【００３１】
また、本発明は、上記化学式２のイミンカリックスアレーン誘導体化合物を金基質又はアミン作用基が付着されたガラス基質に付着することにより、すべての種類のオリゴ遺伝子が高密度で固定化されたオリゴ遺伝子の単分子層、即ち、オリゴ遺伝子チップ及びその製造方法を提供する。
【００３２】
図１は、本発明のイミンカリックスアレーン誘導体のガラス基質上での自己組織化単分子層の製造過程を概略的に示している。
【００３３】
アミン作用基が付着されたガラス基質にイミンカリックスアレーン誘導体の自己組織化単分子層を製造するための具体的な方法は、次のとおりである。
【００３４】
まず、上記アミン作用基が付着されたガラス基質（ガラススライドガラス）は、下記参考文献２の方法によってシラノール（−Ｓｉ−ＯＨ）作用基が豊富なガラス基質の表面に化学反応を通じてアミン末端基を有するガラス基質（アミンスライドガラス又はアミンチップ）の形態で製造した［参考文献２：Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１９９７年、Ｖｏｌ  １３、ｐｐ４３０５−４３０８；Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１９９６年、Ｖｏｌ  １２、ｐｐ５３３８−５３４２］。このように製造されたアミン作用基が付着されたガラス基質と化学式２の化合物を０．１−５ｍＭの濃度で溶かしたクロロホルムとＴＨＦの混合溶液（ＣＨＣｌ３：ＴＨＦ＝９：１）に仕込んで置く。１−５時間後、クロロホルム、アセトン及びエタノールの順で洗浄した後、乾燥させれば、図１のようなイミンカリックスアレーンの自己組織化単分子層が完成される。上記単分子層の生成は、表面反射赤外線分光分析法を利用して確認する。上記ガラス基質として市販されるすべての種類のスライドガラス又はガラスを用いることができる。結合に用いられるイミン結合は、水中で長期間保存する場合、結合が崩れる場合がある。しかし、オリゴ遺伝子のような生体物質は、ほとんどｐＨが７−８の間の緩衝溶液で溶かして製造するため、このような用途で用いる時は、イミン結合された形態で直ちに用いても問題がないことを確認した。
【００３５】
図２は、本発明のイミンカリックスアレーン誘導体の金基質上での自己組織化単分子層が製造される過程を概略的に示す。
【００３６】
金基質にイミンカリックスアレーン誘導体の自己組織化単分子層を製造するための具体的な方法は、次のとおりである。
【００３７】
クロロホルム（ＣＨＣｌ３）等の有機溶媒に化学式２の化合物のうちチオールが付着された化合物を０．１−５ｍＭの濃度で溶かした溶液を製造する。金基質を上記製造された溶液に仕込んで１−５時間の間浸した後、取り出してこれをクロロホルム、アセトン及び水でそれぞれ洗浄した後、乾燥させれば、図２のようなイミンカリックスアレーン誘導体の自己組織化単分子層が完成される。上記金基質は、いかなる種類の金薄膜でも可能であるが、一般的にガラス、溶融石英（ｆｕｓｅｄ  ｓｉｌｉｃａ）、シリコンウエハ、プラスチック基質等にクロム（Ｃｒ）やチタニウム（Ｔｉ）等を２−１０ｎｍで真空蒸着させた後、金を５０−２００ｎｍの厚さで真空蒸着させた基質が好ましい。このように製造された金基質は、使用直前にピラニア溶液（Ｐｉｒａｎｈａ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ；濃硫酸：３０％過酸化水素水＝３：１）に１分ほど浸した後、精製水で洗って窒素を吹き込みながら乾燥させて用いることが一般的である。上記単分子層の生成は、表面反射赤外線分光分析法を利用して確認する。
【００３８】
また、本発明は、上記固体基質に連続したグアニン塩基が付着されたオリゴ遺伝子を多重分子認識によって固定化してオリゴ遺伝子チップを製造する方法及び製造されたオリゴ遺伝子チップを提供する。
【００３９】
より詳しく、本発明は、上記イミンカリックスアレーン誘導体の４個の窒素原子を通じて連続したグアニン作用基を分子認識して多重分子認識によるオリゴ遺伝子の固定化方法を提供する。
【００４０】
本発明のオリゴ遺伝子の固定化方法は、オリゴ遺伝子を利用したすべての種類の分析方法の基盤になるものであり、現在まで全世界的にこれと類似する研究結果も発表されたことがない新規なものである。
【００４１】
図３は、本発明の連続したグアニン基を有するオリゴ遺伝子の固定化方法に関する概路図である。
【００４２】
固定化に用いられた連続したグアニン基を有するオリゴ遺伝子は、５’−ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＡＡＡ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  Ａ−３’（配列番号１）である。ここに結合される蛍光付着されたｃ−ＤＮＡは、５’−Ｃｙ３−ＧＴ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＧＧＴ  ＴＧＡ  ＴＴ−３’（配列番号２）として固定化されたオリゴ遺伝子と相補的なＤＮＡ配列を有しており、末端基に蛍光物質Ｃｙ−３（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ、米国）を付着して付着された位置においてのみ蛍光が示されるようにすることにより、固定化されたオリゴ遺伝子の密度を測定した。オリゴ遺伝子を５４μｇ／ｍｌ（６．７５ｐｍｏｌ／ｍｌ）の濃度で１５％のグリセロールが含まれた５００ｍＭ  ＫＣｌの水溶液に溶かした後、Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎ社（韓国）で購入したマイクロアレイを用いて製造されたイミンカリックスアレーンの単分子層上に直径約１５０μｍの水準で塗布することにより、オリゴ遺伝子を固定する。１−４時間ほどの後、０．１％のＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）が含まれた２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝ｓｏｄｉｕｍ  ｓｉｔｒａｔｅ  １５ｍＭ＋ＮａＣｌ  １５０ｍＭ）水溶液で洗浄し、０．１×ＳＳＣ水溶液で３分間洗浄した後、乾燥して製造する。製造されたオリゴ遺伝子の単分子層は、最小６ヶ月以上測定するに足る変化がないことを確認した。
【００４３】
図４及び図５は、本発明のオリゴ遺伝子の単分子層でのオリゴ遺伝子の密度を蛍光分析する概路図である。
【００４４】
図３で製造されたオリゴ遺伝子の単分子層に固定化に用いられた連続したグアニン基を有するオリゴ遺伝子は、５’−ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＡＡＡ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  Ａ−３’（配列番号１）である。ここに結合される蛍光付着されたｃ−ＤＮＡは、５’−Ｃｙ３−ＧＴ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＧＧＴ  ＴＧＡ  ＴＴ−３’（配列番号２）として固定化されたオリゴ遺伝子と相補的なＤＮＡ配列を有しており、末端基に蛍光を示す蛍光物質Ｃｙ−３（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ、米国）を付着して付着された位置においてのみ蛍光が示されるようにすることにより、固定化されたオリゴ遺伝子の密度を測定した。固定化されたオリゴ遺伝子に蛍光付着されたｃ−ＤＮＡが０．１７ｎｍｏｌ／ｍｌの濃度で溶いている４×ＳＳＣ＋０．００２％ＳＤＳ＋５０％グリセロールの混合溶液６０μｌを塗布し、５０℃で３０分間ハイブリダイゼーションさせた。その後、常温で０．１％ＳＤＳが含まれた４×ＳＳＣ溶液で１次洗浄し、４×ＳＳＣ溶液で２次洗浄した後、乾燥してスキャナ（ＧＳＩ  ｌｉｔｅ、米国）を利用して結果を確認した。
【００４５】
固定化に用いられたオリゴ遺伝子としてそれぞれ９個の連続したＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇの塩基配列を有する下記ＤＮＡ配列を有しているオリゴ遺伝子、グアニンと類似する作用基であるビオチンが付着されたオリゴ遺伝子及び連続した塩基配列のないオリゴ遺伝子を利用して、連続したグアニン塩基のみが選択的に固定化されることを実験を通じて確認した。固定化の比較に用いられたＤＮＡ配列は、次のとおりである。
【００４６】
９Ｇ  ５’−ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＡＡＡ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  Ａ−３’（配列番号１）
９Ｔ  ５’−ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＡＡ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  Ａ−３’（配列番号３）
９Ａ  ５’−ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＴＡＡ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  Ａ−３’（配列番号４）
９Ｃ  ５’−ＣＣＣ  ＣＣＣ  ＣＣＣ  ＣＡＡ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  Ａ−３’（配列番号５）
ビオチン  ５’−ビオチン−Ｔ  ＡＴＡ  ＴＡＡ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  Ａ−３’（配列番号６）
ｎｏ  ５’−ＡＡ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  Ａ−３’（配列番号７）
【００４７】
これらとハイブリダイゼーションして結合されたｃ−ＤＮＡは、相補的な塩基配列を有するように合成した。
５’−Ｃｙ３−ＧＴ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＧＧＴ  ＴＧＡ  ＴＴ−３’（配列番号２）
同時に蛍光物質（Ｃｙ３）を付着して蛍光スキャナで付着されたｃ−ＤＮＡの密度、即ち、ｃ−ＤＮＡが付着された固定化されたオリゴ遺伝子の密度を相対的に分析することができるようにした。実際の実験結果によれば、それぞれのオリゴ遺伝子を上記条件で同一に塗布し、固定化した後、ｃ−ＤＮＡを表面に最大に固定化され得るオリゴ遺伝子の量の３倍を塗布して固定化されたオリゴ遺伝子のすべてに十分に蛍光付着されたｃ−ＤＮＡが結合されるようにした後、洗って乾燥して蛍光スキャナで分析した。
【００４８】
実際の実験結果は、６×６で結果が示される図５の中間図であり、この蛍光を数値で分析して棒グラフで示した結果が図５の右側の図表である。実際の実験結果は、グアニン基が９個連続した９Ｇオリゴ遺伝子の場合が異なる塩基が連続したオリゴ遺伝子、ビオチンが付着されたこと又は連続した塩基が付着されない場合に比べて１０倍から約４０倍の水準の高い蛍光の強さを示している。上記結果は、オリゴ遺伝子の固定化時に連続したグアニン塩基がある場合にのみ分析が可能な水準のオリゴ遺伝子がイミンカリックスアレーンの表面に固定化されるということを示している。
【００４９】
図６は、本発明のイミンカリックスアレーン誘導体の自己組織化単分子層にオリゴ遺伝子の固定化時に７個以上の連続したグアニン作用基が必須的であることを示している。
【００５０】
オリゴ遺伝子の固定化条件は、図３で提示された条件で進め、ｃ−ＤＮＡも図４で用いられた蛍光付着されたオリゴ遺伝子を利用して上記提示された条件によってハイブリダイゼーションを行った。
【００５１】
１Ｇ  ５’−ＧＡＡ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  Ａ−３’（配列番号８）
４Ｇ  ５’−ＧＧＧ  ＧＡＡ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  Ａ−３’（配列番号９）
７Ｇ  ５’−ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＡＡ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  Ａ−３’（配列番号１０）
９Ｇ  ５’−ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＡＡＡ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  Ａ−３’（配列番号１）
１２Ｇ  ５’−ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＡＡ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  Ａ−３’（配列番号１１）
１５Ｇ  ５’−ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＡＡ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  Ａ−３’（配列番号１２）
ｃ−ＤＮＡ  ５’−Ｃｙ３−ＧＴ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＧＧＴ  ＴＧＡ  ＴＴ−３’（配列番号２）（Ｃｙ−３；蛍光物質）
上記提示された条件と同一にオリゴ遺伝子を塗布して洗った後乾燥した。実際の実験結果によれば、それぞれのオリゴ遺伝子を上記条件で同一に塗布して固定化した後、ｃ−ＤＮＡを表面に最大に固定化され得るオリゴ遺伝子の量の３倍を塗布して固定化されたオリゴ遺伝子のすべてに十分に蛍光付着されたｃ−ＤＮＡが結合され得るようにした後、洗って乾燥して蛍光スキャナで分析した。
【００５２】
実際の実験結果は、６×６で結果が示される図６の中間図であり、この蛍光を数値で分析して棒グラフで示した結果が図６の右側の図表である。連続したグアニン塩基配列が１又は４個ほどである時は、ほとんど表面固定化がなされない結果を示しており、７個の連続したグアニン（７Ｇ）を有する時から蛍光を強く示し始め、９個（９Ｇ）で最大値の蛍光を示す結果を示している。この時、９個より長さがさらに長い１２個（１２Ｇ）及び１５個（１５Ｇ）の連続したグアニン塩基を有するオリゴ遺伝子を用いて固定化した場合は、９Ｇの場合より少しずつ蛍光感度が減少し始める。これは、９個のグアニン塩基が分子認識による固定化に十分な水準であり、長さがさらに長いグアニン塩基を利用するようになれば、理論的に１２Ｇである場合、９Ｇであるオリゴ遺伝子の固定化に必要な空間より約１／３の水準をさらに必要として結果的に蛍光感度が１／３水準減少する結果を示している。１５Ｇである場合は、固定化に必要な空間が９Ｇより２／３水準をさらに必要として理論的に固定化される量が３／５水準であり、即ち、６０％水準に減少するようになり、実際には蛍光感度が９Ｇに比べて約５５％減少した結果で示されている。上記結果を総合すれば、固定化に必要な連続したグアニンは７個以上であることが分かる。好ましくは、上記連続したグアニンは７乃至１５個であり、さらに好ましくは９乃至１２個であり、最も好ましくは９個である。
【００５３】
図７は、本発明のイミンカリックスアレーン誘導体の自己組織化単分子層にオリゴ遺伝子の固定化時、グアニン基が分子認識によって選択的に認識されるということを証明するために類似する構造を有するイミダゾール作用基を利用した競争反応の結果である。
【００５４】
図７では、連続したグアニン塩基が固定化時に分子認識によって固定化されるということをグアニン塩基と類似する分子認識が可能なイミダゾールを含ませて固定化を進めて実際に得た研究結果である。イミダゾールは、グアニン塩基に比べてイミンカリックスアレーン内に分子認識が相対的に弱いため、固定化されるオリゴ遺伝子より高い濃度を用いて分子認識を競争反応させた。固定化は、図３での固定化条件と同一であり、蛍光感度の測定方式もｃ−ＤＮＡを利用して図４で用いられた方式と同一に進めた。図７の左側図は、実際の実験結果を示しており、右側の図表は、蛍光感度を競争反応させたイミダゾールの濃度による蛍光感度の減少を示している。実際に約２０ｍＭの水準で減少が始まり、３０ｍＭの水準で半分の水準に減少しており、１００ｍＭ以上ではオリゴ遺伝子の固定化がほとんど進められない結果を示している。このような結果は、オリゴ遺伝子の固定化が９個の連続したグアニン塩基がイミンカリックスアレーン誘導体内に多重分子認識されて進められることを示すものである。
【００５５】
このような結果は、イミンカリックスアレーン誘導体の自己組織化単分子層が９個の連続したグアニン塩基を多重分子認識して非可逆的に固定化し、特に蛍光分析によって示された固定化されたオリゴ遺伝子の量が既存に知られた方式に比べて５−３０倍水準の高い固定化密度を示している。
【００５６】
このように、本発明は、連続したグアニン塩基が単分子層の表面に固定化されながら、その長さほどの空間（２．５−３．５ｎｍ）が診断や研究目的等で特定塩基配列を有する遺伝子の分析時に数百個以上の塩基配列を有するｃ−ＤＮＡが固定化されたオリゴ遺伝子との強い結合のためにオリゴ遺伝子の下の部分まで下がるのに必要な空間を提供することにより、既存の１２時間以上かかっていたｃ−ＤＮＡ結合に必要なハイブリダイゼーション時間を１−２時間以内に画期的に短縮させて空間確保が可能な新規のオリゴ遺伝子の固定化方法を提供する。
【００５７】
本発明の他の態様として、本発明の新規なアミノカリックスアレーン誘導体は、下記化学式５乃至８の構造を有する。上記アミノカリックスアレーン誘導体は、連続したグアニン基を有するオリゴ遺伝子の固定化方法で用いる自己組織化単分子層に必須な化合物である。
【００５８】
【化５】
2009515822.tif 000007
上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３、Ｒ’４、Ｒ’５、Ｒ’６、Ｒ’７、Ｒ’８は、互いに独立して−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＯＣＨ３、−Ｃｌ、−Ｃ６Ｈ５、−ＯＨ、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｂｒ、−ＣＦ３、−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＣ６Ｈ４ＣＦ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃｌ、−ＯＣＯＣＨ３、−ＮＨＣＯＣＨ３、−ＣＯＮＨＣＨ３、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、及び−ＣＯＯＲからなる群より選択され、上記−ＣＯＯＲにおけるＲは、−ＣＨ３又は−Ｃ２Ｈ５を示す。
【００５９】
【化６】
2009515822.tif 000008
上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３、Ｒ’４、Ｒ’５、Ｒ’６、Ｒ’７、Ｒ’８は、互いに独立して−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＯＣＨ３、−Ｃｌ、−Ｃ６Ｈ５、−ＯＨ、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｂｒ、−ＣＦ３、−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＣ６Ｈ４ＣＦ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃｌ、−ＯＣＯＣＨ３、−ＮＨＣＯＣＨ３、−ＣＯＮＨＣＨ３、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、及び−ＣＯＯＲからなる群より選択され、上記−ＣＯＯＲにおけるＲは、−ＣＨ３又は−Ｃ２Ｈ５を示す。また、上記Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３及びＹ４は、互いに独立して−Ｈ、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｃ−Ｚ、及び−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｃ−Ｚからなる群より選択される（ｎ＝２〜１５、ｍ＝１〜１０、ｃ＝０〜１０、Ｚ＝−ＳＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、そして−Ｃ６Ｈ４−とＣ６Ｈ５はフェニル基で定義される）。
【００６０】
【化７】
2009515822.tif 000009
上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３、Ｒ’４、Ｒ’５、Ｒ’６、Ｒ’７、Ｒ’８は、互いに独立して−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＯＣＨ３、−Ｃｌ、−Ｃ６Ｈ５、−ＯＨ、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｂｒ、−ＣＦ３、−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＣ６Ｈ４ＣＦ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃｌ、−ＯＣＯＣＨ３、−ＮＨＣＯＣＨ３、−ＣＯＮＨＣＨ３、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、及び−ＣＯＯＲからなる群より選択され、上記−ＣＯＯＲにおけるＲは、−ＣＨ３又は−Ｃ２Ｈ５を示す。
【００６１】
【化８】
2009515822.tif 000010
上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３、Ｒ’４、Ｒ’５、Ｒ’６、Ｒ’７、Ｒ’８は、互いに独立して−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＯＣＨ３、−Ｃｌ、−Ｃ６Ｈ５、−ＯＨ、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｂｒ、−ＣＦ３、−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＣ６Ｈ４ＣＦ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃｌ、−ＯＣＯＣＨ３、−ＮＨＣＯＣＨ３、−ＣＯＮＨＣＨ３、−ＣＮ、ＣＯＯＨ、及び−ＣＯＯＲからなる群より選択され、上記−ＣＯＯＲにおけるＲは、−ＣＨ３又は−Ｃ２Ｈ５を示す。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３、Ｒ’４、Ｒ’５、Ｒ’６、Ｒ’７、Ｒ’８が同時に−Ｈである場合は除く。また、上記Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３及びＹ４は、互いに独立して−Ｈ、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｃ−Ｚ、及び−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｃ−Ｚからなる群より選択される（ｎ＝２〜１５、ｍ＝１〜１０、ｃ＝０〜１０、Ｚ＝−ＳＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、そして−Ｃ６Ｈ４−とＣ６Ｈ５は、フェニル基で定義される）。
【００６２】
本発明は、また上記化学式５乃至８のアミノカリックスアレーン誘導体化合物を製造する方法を提供する。
【００６３】
【化９】
2009515822.tif 000011
上記化学式９のテトラアミノカリックス［４］アレーンは、カリックス［４］アレーン（ｃａｌｉｘ［４］−ａｒｅｎｅ）を、上記参考文献１の方法によってテトラニトロカリックス［４］アレーンに変換した後、還元反応によって合成する。
【００６４】
本発明の化学式５及び化学式７の化合物は、上記公知された方法によって合成された化学式９のテトラアミノカリックス［４］アレーンを出発物質として、下記実施例１３の方法によって化学式９のアミン作用基をベンジルクロライドやベンジルブロマイド系列の誘導体と反応させて化学式５のアミノカリックスアレーン誘導体を合成する。また他の方法としては、下記実施例１６の方法によって化学式９の作用基を芳香族アルデヒドと反応させた後、還元剤を用いて還元反応を進めた後、ベンジルクロライドやベンジルブロマイド系列の誘導体と反応させて化学式５のアミノカリックスアレーン誘導体を合成する。
【００６５】
本発明の化学式６及び化学式８の化合物は、下記実施例１７乃至１９によってそれぞれ化学式５及び化学式７の化合物と末端基にハロゲンが付着されたアルデヒド等の作用基を有する化合物を反応させて下の−ＯＨ、即ち、アルコール作用基のうち１、３番目のアルコール作用基をアルキル基の末端にアルデヒド又はチオールが付着されたアミノカリックスアレーン誘導体の化学式６及び化学式８の化合物を合成する。
【００６６】
また、本発明は、上記化学式６又は８のアミノカリックスアレーン誘導体を金基質又はアミン等の多様な作用基が付着されたガラス等の固体基質に付着することにより、すべての種類のオリゴ遺伝子を高密度で固定化が可能なオリゴ遺伝子の単分子層の製造のためのオリゴ遺伝子チップ基板の製造方法を提供する。
【００６７】
また、本発明は、アミン作用基が付着されているガラス、シリコンウエハ及び水晶結晶からなる群より選択される固体基質に、上記化学式６又は化学式８のアミノカリックスアレーン誘導体のうち、アルデヒド作用基が末端基に付着されたアミノカリックスアレーン誘導体を利用してイミン結合及びこれを還元したアミン結合を通じて付着して製造した自己組織化単分子層の固体基質を提供する。
【００６８】
また、本発明は、アミン作用基が付着されているガラス、シリコンウエハ及び水晶結晶からなる群より選択される固体基質に、上記化学式６又は化学式８のアミノカリックスアレーン誘導体のうち、アルデヒド作用基が末端基に付着されたアミノカリックスアレーン誘導体を利用してエステル、エーテル又はアミド結合等から選択される化学結合を通じて付着して製造した自己組織化単分子層の固体基質を提供する。
【００６９】
また、本発明は、上記オリゴ遺伝子チップ基板に何らの操作なしに連続した塩基を有するオリゴ遺伝子を非可逆的に分子認識によって固定化してオリゴ遺伝子の単分子層、即ち、オリゴ遺伝子チップの製造方法を提供する。
【００７０】
図８は、本発明のアミノカリックスアレーン誘導体のガラス、シリコンウエハ、溶融石英（ｆｕｓｅｄ  ｓｉｌｉｃａ）等の固体基質上での自己組織化単分子層の製造過程を概略的に示す。
【００７１】
アミン作用基が付着されたガラス基質にアミノカリックスアレーン誘導体の自己組織化単分子層を製造するための具体的な方法は、次のとおりである。
【００７２】
まず、用いられたアミン作用基が付着されたガラス基質（ガラススライドガラス）は、上記参考文献２に記載の方法によってシラノール（−Ｓｉ−ＯＨ）作用基が表面に豊富なガラス基質の表面に化学反応を通じてアミン末端基を有するガラス基質（アミンスライドガラス、又はアミンチップ）の形態で製造した。このように製造されたアミン作用基が付着されたガラス基質を化学式６又は８の化合物を０．１−５ｍＭの濃度で溶かしたクロロホルムとＴＨＦの混合溶液（ＣＨＣｌ３：ＴＨＦ＝９：１）に仕込んで置く。１−５時間後にクロロホルムとアセトン、エタノールの順で洗浄した後に乾燥させれば、図８のようなアミノカリックスアレーン誘導体の自己組織化単分子層、即ち、ＢＭＴ遺伝子チップの基板Ａ型が完成される。単分子層の生成は、表面反射赤外線分光分析法を利用して確認する。ここに用いられるガラス基質は、一般的に市販されるすべての種類のスライドガラス又はガラスである。結合に用いられるイミン結合は、水中で長期間保存する場合、結合が崩れる場合があるが、オリゴ遺伝子のような生体物質は、ほとんどＰＨが７−８の間の緩衝溶液で溶かして製造するため、このような用途で用いる時は、イミン結合された形態で直ちに用いても問題がないという研究結果を確認した。
【００７３】
製造されたチップ基板を図８におけると同様に、ＢＨ３−ＴＨＦ又は１−５％ＮａＢＨ４の還元剤が溶いてある有機溶媒にＢＭＴ遺伝子チップ基板のＡ型を１−１０分ほど浸すと、イミンがさらに強力なアミンに還元されて長期保管やＰＨが異なる範囲で遺伝子チップを製造する場合、優れた安定性を確保することができる。
【００７４】
図９は、本発明のアミノカリックスアレーン誘導体の金基質上での自己組織化単分子層が製造される過程を概略的に示す。
【００７５】
金基質にアミノカリックスアレーン誘導体の自己組織化単分子層を製造するための具体的な方法は、次のとおりである。
【００７６】
クロロホルム（ＣＨＣｌ３）等の有機溶媒に化学式６又は８の化合物のうちチオールが付着された化合物を０．１−５ｍＭの濃度で溶かした溶液を製造する。金基質を上記製造された溶液に仕込んで１−５時間の間浸した後、取り出してこれをクロロホルム及びアセトン、そして水でそれぞれ洗浄した後に乾燥させれば、図９のようなアミノカリックスアレーン誘導体の自己組織化単分子層が完成される。ここに用いられる金基質は、いかなる種類の金薄膜でも可能であるが、一般的にガラス、溶融石英、シリコンウエハ、プラスチック基質等にクロム（Ｃｒ）やチタニウム（Ｔｉ）等を２−１０ｎｍで真空蒸着させた後、金を５０−２００ｎｍの厚さで真空蒸着させた基質が好ましい。このように製造された金基質は、使用直前にピラニア溶液（Ｐｉｒａｎｈａ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ；濃硫酸：３０％過酸化水素水＝３：１）に１分ほど浸した後、精製水で洗った後、窒素を吹き込みながら乾燥させて用いることが一般的である。単分子層の生成は、表面反射赤外線分光分析法を利用して確認する。
【００７７】
また、本発明は、上記固体基質に連続したグアニン塩基が付着されたオリゴ遺伝子を多重分子認識によって固定化してオリゴ遺伝子チップを製造する方法及び製造されたオリゴ遺伝子チップを提供する。
【００７８】
より詳しく、本発明は、上記アミノカリックスアレーン誘導体の４個の窒素原子を通じて連続したグアニン作用基を分子認識して多重分子認識によるオリゴ遺伝子の固定化方法を提供する。
【００７９】
本発明の固定化方式は、オリゴ遺伝子を利用したすべての種類のバイオチップの製造技術を提供する基盤技術であって、現在までは世界的に類似した研究結果も発表されたことがない新規な発明である。
【００８０】
図１０及び図１１は、自発的な分子認識による高密度のオリゴ遺伝子チップの製造技術に関する概路図及び単分子層を構成するアミノカリックスアレーン誘導体の個数を理論的に計算するための模式図である。さらに理論的に計算されたアミノカリックスアレーン誘導体の単分子層上に固定化され得る最大濃度のオリゴ遺伝子の濃度を比較確認した実際の実験結果である。
【００８１】
理論的な最大値の固定化されたオリゴ遺伝子の量は、次のような方式を利用して計算した。Ｘ−線決定法によって得られたアミノカリックスアレーンの直径は２．１−２．２ｎｍと明らかになった。これらが単分子層で表面に自己組織化される時に必要な分子の個数は、３個のアミノカリックスアレーン誘導体の中心を連結する線で構成される三角形の２個の面積と同一であるため、次の式によって一つのカリックスアレーン誘導体が表面に占める面積を求めることができる。
【００８２】
２．１ｎｍ×２．１ｎｍ×ｓｉｎ６０゜＝３．８２×１０−１４ｃｍ２
そのため、１ｃｍ２当たり存在するアミノカリックスアレーン誘導体の個数は、１／３．８２×１０−１４ｃｍ２＝２．６２×１０１３個＝４３．５ｐｍｏｌ／ｃｍ２のようである。一つのオリゴ遺伝子が固定化されるのに６−７個のアミノカリックスアレーン誘導体が結合された面積を用いるようになるので、固定化最高のオリゴ遺伝子の密度は４３．５／（６〜７）ｐｍｏｌ／ｃｍ２＝６．２〜７．２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２である。固定化用オリゴ遺伝子５’−ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＡＡＡ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  Ａ−３’（配列番号１６）を実施例２４の方法によって最大密度で固定化したオリゴ遺伝子チップに蛍光付着されたｃ−ＤＮＡ  ５’−ｃｙ３−ＧＴ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＧＧＴ  ＴＧＡ  ＴＴ−３’（配列番号１９）とハイブリダイゼーションした後、実施例１３の方法によって洗って乾燥した後、蛍光スキャナ（ＧＳＩ、米国）を利用して蛍光感度を測定した結果が図１１の２）のハイブリダイゼーション結果に示されている。その蛍光感度と類似する感度をハイブリダイゼーションに用いられたものと同一のｃ−ＤＮＡ  ５’−ｃｙ３−ＧＴ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＧＧＴ  ＴＧＡ  ＴＴ−３’（配列番号１９）を多様な濃度で乾燥して蛍光スキャナを利用して類似する蛍光感度を測定した結果、理論的な計算値の半分水準である３．８ｐｍｏｌ／ｃｍ２の濃度で塗布して乾燥した場合に似ている水準の蛍光感度を得ることができた。この結果は、図１１の１）の蛍光付着されたオリゴ遺伝子を乾燥した結果に示されている。この結果は、本発明で開発されたＢＭＴオリゴ遺伝子チップ基板がオリゴ遺伝子をほとんど理論的な最大値に近く固定化してオリゴ遺伝子チップを製造することができ、同時に３０分のハイブリダイゼーションでも最大値の蛍光の約５０％水準の結果を得ることができ、超高速のハイブリダイゼーションを可能にし、同時に高密度の固定化技術を具現した世界最初のオリゴ遺伝子チップの製造技術であることを示している。
【００８３】
図１２は、最適の連続した塩基個数を把握するために、グアニン塩基が連続的に付着された同一の塩基配列を有するオリゴ遺伝子を利用して実施例２２によって５倍の濃度のオリゴ遺伝子（６．７５ｎｍｏｌ／ｍＬ、１ｎＬ）を固定化させ、実施例２２によってハイブリダイゼーションを行った後、洗って乾燥した後、蛍光スキャナ（ＧＳＩ、米国）を利用して分析した結果である。図１２の実験には、表４に示された塩基配列を有する遺伝子が用いられ、ハイブリダイゼーションには表４の蛍光付着されたｃ−ＤＮＡが用いられた。
【００８４】
実際の実験結果は、図１２の中間に示される６×６で結果が示されるスキャンデータであり、この蛍光を数値で分析して棒グラフで示した結果が図１２の下に示される図表である。連続したグアニン塩基配列が１又は４個ほどである時は、ほとんど表面固定化がなされない結果を示しており、７個の連続したグアニンを有する時から蛍光を強く示し始め、９個から７個の２倍水準の蛍光を示す結果を示している。この時、９個より長さがさらに長い１２個と１５個の連続したグアニン塩基を有するオリゴ遺伝子を用いて固定化した場合は、９個でより１／２、１／３水準が減少された蛍光感度を示している。これは、９個のグアニン塩基が分子認識による固定化に十分な水準であり、長さがさらに長いグアニン塩基を利用するようになれば、理論的に１２個である場合、長さが９個であるオリゴ遺伝子の固定化に必要な空間よりさらに広い空間を必要とし、結果的に蛍光感度が１／２水準に減少する結果を示している。１５Ｇである場合には、固定化に必要な空間が９Ｇより２／３水準をさらに必要として固定化されるオリゴ遺伝子の量が３０％水準に減少するようになって、蛍光感度が９Ｇに比べて約１／３水準に減少した結果を示している。総合すれば、固定化に最適の連続したグアニンは９個であることが分かり、それ以下の場合、十分な水準の分子認識による非可逆的なオリゴ遺伝子の固定化が起こらないことが分かり、９Ｇより多くの数の連続したグアニン塩基を有する場合には、固定化に必要な面積である９Ｇより広くて実際に固定化されるオリゴ遺伝子の個数が減少される結果と判断される。
【００８５】
図１３は、オリゴ遺伝子の固定化時に連続した塩基によって適切な空間を確保して固定化されたオリゴ遺伝子の間に確保された空間を通じて、ｃ−ＤＮＡがチップの底まで接近が可能であり、超高速で出入りすることができるように十分な水準の空間を維持しているということを示す模式図である。同時にオリゴ遺伝子が固定化される時、実際に６−７個のアミノカリックスアレーン誘導体が固定化されている表面積を利用するということを示す模式図である。
【００８６】
図１４及び図１５は、実際に表５に示されているそれぞれ１個ずつの塩基配列が異なるＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ型オリゴ遺伝子を実施例２３によって固定化させた。その後、実施例２３の蛍光が付着されたＤＮＡ（Ｃｙ３−ＤＮＡ）を検出するためのｃ−ＤＮＡとのハイブリダイゼーションによってこれらとそれぞれ結合することができる相補的なｃ−ＤＮＡを実施例２３によってハイブリダイゼーションを行った後、表５の蛍光付着されたオリゴ遺伝子を用いて実施例２３によって蛍光付着させた。その後、洗って乾燥させて蛍光スキャナ（ＧＳＩ、米国）を利用して蛍光感度を分析した。図１４及び図１５は、３０分ほどの短いハイブリダイゼーション時間にも単一塩基の変異差異をＯｎ−Ｏｆｆの水準で蛍光感度を差別化して分析することができる超高速のハイブリダイゼーションが可能でありながら、ＳＮＰの差別化がＯｎ−Ｏｆｆの水準で進められるオリゴ遺伝子チップ基板であることを示す結果である。また、本発明で提案されたオリゴ遺伝子チップの製造技術が超高速のハイブリダイゼーションを可能にし、単一塩基の変異（ＳＮＰ）を簡便で且つ再現性高く分析することができるようにする新技術であることを示す結果である。
【００８７】
図１６は、固定化に他の塩基よりグアニン塩基だけが選択的に高速固定化を行うという実際の競争反応の結果である。実施例２５によって表６にある蛍光付着されたオリゴ遺伝子と結合されない９Ｇが付着されたオリゴ遺伝子（９Ｇ−１）を同一の濃度で用いながら、蛍光付着されたオリゴ遺伝子（Ｃｙ−３−ＤＮＡ）と相補的な塩基配列を有しながら、９Ａ、９Ｇ、９Ｔ、９Ｃが付着された４種類のオリゴ遺伝子をオリゴ遺伝子（９Ｇ−１）の１倍、２倍、４倍の濃度で混ぜた混合物を図１６のような順序で塗布して遺伝子を固定化した。この時、９Ａ、９Ｃ、９Ｔ、９Ｇが同一の濃度で混ざっている９Ｇが付着されたオリゴ遺伝子（９Ｇ−１）よりさらに早く固定化されれば、実施例２５によって進められたハイブリダイゼーションで蛍光付着されたオリゴ遺伝子と結合するようになって蛍光が示されるようになり、９Ｇが付着されたオリゴ遺伝子（９Ｇ−１）がさらに早く固定化されれば、もちろん蛍光は示されないものと予測される。図１６の実際の実験結果によれば、９Ｇを固定化した位置では固定化時のオリゴ遺伝子の濃度が増加するにつれて蛍光感度が漸次増加して９Ｇ−１：９Ｇ＝１：１で約５０％の蛍光感度を、そして１：４では８０％水準の蛍光感度を示すことを確認することができる。９Ｔ、９Ｃでは蛍光感度が極めて微弱に増加されることを確認することができ、９Ａの場合にも、１６Ｇの量の４倍水準になってから若干の蛍光感度を示すものと確認され、実際の固定化時に９Ｇが付着されたオリゴ遺伝子を利用すれば、ハイブリダイゼーションで用いられなければならない、即ち、ｃ−ＤＮＡと結合する時に用いられなければならない塩基のある部分が固定化には参加しないという、即ち、選択的に９Ｇが付着された位置だけが本発明で提案されたアミノカリックスアレーン誘導体の単分子層に最高密度で結合されて再現性のあるオリゴ遺伝子チップを製造することができるということを示す結果である。
【００８８】
上記結果を総合すれば、本発明で開発されたアミノカリックスアレーン誘導体の自己組織化単分子層が連続したグアニン塩基を多重分子認識して非可逆的にオリゴ遺伝子を単分子層の表面に固定化してオリゴ遺伝子チップを製造することができ、蛍光分析によって示された固定化されたオリゴ遺伝子の量が理論的な最高密度に近く常に固定化が可能であって、再現性のあるオリゴ遺伝子チップの製造のための基盤技術であることを示す結果である。
【００８９】
さらに本発明は、連続したグアニン塩基が単分子層の表面に固定化されながら、図１３で示されるように、固定化されたオリゴ遺伝子が連続した塩基長さほどの空間を確保して配列される。この空間は、診断や研究目的等で特定の塩基配列を有する遺伝子を分析する時、数十−数百個以上の塩基配列を有するｃ−ＤＮＡが自由に超高速でチップ基板の表面まで容易に接近が可能になり、最大値の塩基が相補的に結合されて１０分−１時間の短い時間内に超高速のハイブリダイゼーションを可能とする。同時に単一塩基の変異までも簡便に診断することができる固定化された遺伝子間の空間を十分に確保する技術が適用されたオリゴ遺伝子の単分子層の製造技術、即ち、オリゴ遺伝子チップを製造する基盤技術を提案する発明である。
【００９０】
以下、本発明を下記実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、本発明がここに限定されるものではない。
【実施例】
【００９１】
実施例１
５，１１，１７，２３−テトラアミノカリックス［４］アレーンの製造
【化１０】
2009515822.tif 000012
５，１１，１７，２３−テトラニトロカリックス［４］アレーン（ＴＮＣＡ；ｔｅｔｒａｎｉｔｒｏｃａｌｉｘ［４］ａｒｅｎｅ）を出発物質とし、下記参考文献３に提示された合成方法で合成して、淡黄色の固体生成物５，１１，１７，２３−テトラアミノカリックス［４］アレーン（ＴＡＣＡ；ｔｅｔｒａａｍｉｎｏｃａｌｉｘ［４］−ａｒｅｎｅ）を７５％の収率で得た［参考文献３：ＶａｎＷａｇｅｎｉｇｅｎ，Ａ．Ｍ．Ａ．；Ｓｎｉｐ，Ｅ．；Ｖｅｒｂｏｏｍ．Ｗ．；Ｒｅｉｎｈｏｕｄｔ，Ｄ．Ｎ．；Ｂｏｅｒｒｉｇｔｅｒ，Ｈ．；Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎ／Ｒｅｃｕｅｉｌ  １９９７年．ｐｐ２２３５−２２４５］。上記反応を反応式１に示した。
【００９２】
実施例２
５，１１，１７，２３−テトラベンジルイミンカリックス［４］アレーンの製造
【化１１】
2009515822.tif 000013
乾燥された丸底フラスコに、ＴＡＣＡ  ５００ｍｇ（１．０３ｍｍｏｌ）と無水ＭｇＳＯ４を２００ｍｇ仕込み、１５０ｍｌのアセトニトリルとベンズアルデヒド０．８４ｍｌ（８．２４ｍｍｏｌ）を同時に仕込んだ後、常温で窒素交流の下に２時間の間撹拌させた。反応後、濾過して固体生成物を除去した後、溶液を減圧して余分の溶媒を除去し、５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に完全に溶かした後、３０ｍｌのｎ−ヘキサンを加えれば、５，１１，１７，２３−テトラベンジルイミンカリックス［４］アレーン（ＴＢＩＣＡ；ｔｅｔｒａｂｅｎｚｙｌｉｍｉｎｅ−ｃａｌｉｘ［４］ａｒｅｎｅ）が淡紅色の固体に結晶化される。減圧フィルターをし、余分の溶媒を減圧下で除去してＴＢＩＣＡ（８２２ｍｇ、収率９５．７％）を得た。上記反応を反応式２に示した。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １０．１５（ｓ，４Ｈ，ＯＨ），８．３４（ｓ，４Ｈ，Ｎ＝ＣＨ），７．８２−７．７８（ｍ，８Ｈ，Ａｒ），７．４０−７．３８（ｍ，１２Ｈ，Ａｒ），７．０１（ｓ，８Ｈ，Ａｒ），４．３１（ｄ，４Ｈ，ＡｒＣＨ２Ａｒ，Ｊ＝１３Ｈｚ），３．６３（ｄ，４Ｈ，ＡｒＣＨ２Ａｒ，Ｊ＝１３Ｈｚ）
１３Ｃ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １５９．２６，１４６．２８，１３６．４０，１３１．３２，ｔ１２８．８６，１２１．９０，３２．４７
【００９３】
実施例３
５，１１，１７，２３−テトラベンジルイミンアルコキシカリックス［４］アレーンの製造
【化１２】
2009515822.tif 000014
乾燥された丸底フラスコに、ＴＢＩＣＡ  ５００ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）、無水Ｋ２ＣＯ３（８３０ｍｇ、６ｍｍｏｌ）及びヨウ化ナトリウム（８１０ｍｇ、５．４ｍｍｏｌ）を仕込み、アセトニトリル１５０ｍｌを仕込んだ後、窒素交流の下に撹拌させた。１０分後、６−ブロモヘキサナール（ｂｒｏｍｏｈｅｘａｎａｌ）（６４４ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ）を仕込み、反応容器の温度を８０℃に上げた後、２４時間の間撹拌させた。反応後、アセトニトリルを減圧して除去させ、ＣＨ２Ｃｌ２１５０ｍｌを用いて反応物を溶かした。反応時に生成されるＫＢｒ、ＫＩ、Ｋ２ＣＯ３等は溶かないため、減圧濾過して除去し、濾液は減圧して溶媒を除去した後、５ｍｌのエチルアセテートに完全に溶かした後、４０ｍｌのｎ−ヘキサンを加えれば、５，１１，１７，２３−テトラベンジルイミンアルコキシカリックス［４］アレーン（ＴＢＩＣＯＣＡ；ｔｅｔｒａｂｅｎｚｙｌｉｍｉｎｅａｌｋｏｘｙ−ｃａｌｉｘ［４］ａｒｅｎｅ）が黄色の固体に析出される。これをＣＨＣｌ３／ｎ−ヘキサンに再結晶して淡黄色の固体生成物ＴＢＩＣＯＣＡ（５７０ｍｇ、収率９０％）を得た。上記反応を反応式３に示した。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ９．８１（ｔ，２Ｈ，ＣＨＯ），８．４６（ｓ，２Ｈ，Ｎ＝ＣＨ），８．２４（ｓ，２Ｈ，Ｎ＝ＣＨ），７．８６−７．８２（ｍ，４Ｈ，Ａｒ），７．７３−７．７０（ｍ，４Ｈ，Ａｒ），７．４３−７．３１（ｍ，１２Ｈ，Ａｒ），７．０７（ｓ，４Ｈ，Ａｒ），６．８３（ｓ，４Ｈ，Ａｒ），４．３３（ｄ，４Ｈ，ＡｒＣＨ２Ａｒ，Ｊ＝１３Ｈｚ），４．０４（ｔ，４Ｈ，ＯＣＨ２），３．４６（ｄ，４Ｈ，ＡｒＣＨ２Ａｒ，Ｊ＝１３Ｈｚ），２．５７（ｔ，４Ｈ，ＣＨ２ＣＨＯ），２．１０（ｔ，４Ｈ，ＯＣＨ２ＣＨ２），１．８８−１．７０（ｍ，８Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２）
１３Ｃ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ２０２．０７，１９７．１１，１５９．６１，１５８．９０，１４８．２１，１４７．１９，１４５．９３，１４３．１０，ｔ１３６．０７，１３０．５９−１２９．５７，１２８．８３−１２８．０８，１２２．１０，１２１．５４，４３．８４，３１．７３，２５．５７
【００９４】
実施例４
５，１１，１７，２３−テトラベンジルイミンブロモブトキシカリックス［４］アレーンの製造
【化１３】
2009515822.tif 000015
乾燥された丸底フラスコに、ＴＢＩＣＡ（５００ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）、無水Ｋ２ＣＯ３（８３０ｍｇ、６ｍｍｏｌ）及びヨウ化ナトリウム（１．０８ｇ、７．２ｍｍｏｌ）を仕込み、アセトニトリル１５０ｍｌを仕込んだ後、常温で１０分間撹拌した。反応容器に、１，４−ジブロモブタン（１．３ｇ、０．７２ｍｌ、６ｍｍｏｌ）を仕込み、反応容器の温度を８０℃に上げた後、２４時間の間に反応させた。反応容器を常温で冷やした後、溶媒は減圧して除去し、ＣＨ２Ｃｌ２１５０ｍｌにて残渣物を溶かした。反応時に生成されるＫＢｒ、ＫＩ、Ｋ２ＣＯ３等は溶けないため、減圧濾過して除去し、濾液は、減圧して溶媒を除去した。エチルアセテート／ｎ−ヘキサンにて析出した後、減圧濾過して、黄土色の固体生成物、５，１１，１７，２３−テトラベンジルイミンブロモブトキシカリックス［４］アレーン（ＴＢＢＣＡ；ｔｅｔｒａｂｅｎｚｙｌｉｍｉｎｅ−ｂｒｏｍｏｂｕｔｏｘｙ−ｃａｌｉｘ［４］ａｒｅｎｅ）を得た。この固体をＣＨＣｌ３／ｎ−ヘキサンで再結晶して、淡黄色のＴＢＢＣＡ（４８０ｍｇ、７２％）を得た。上記反応を反応式４に示した。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ８．４７（ｓ，２Ｈ，Ｎ＝ＣＨ），８．２４（ｓ，２Ｈ，Ｎ＝ＣＨ），７．９８（ｓ，２Ｈ，ＡｒＯＨ），７．８６−７．８３（ｄｄ，４Ｈ，ＡｒＨ），７．７３−７．７０（ｄｄ，４Ｈ，ＡｒＨ），７．４１−７．３１（ｍ，１２Ｈ，ＡｒＨ），７．０８（ｓ，４Ｈ，Ａｒ），６．８３（ｓ，４Ｈ，Ａｒ），４．３３（ｄ，４Ｈ，ＡｒＣＨ２Ａｒ，Ｊ＝１３Ｈｚ），４．０６（ｔ，４Ｈ，ＯＣＨ２），３．４９（ｓ，４Ｈ，ＡｒＣＨ２Ａｒ，Ｊ＝１３Ｈｚ），３．４５（ｔ，４Ｈ，ＣＨ２Ｂｒ），２．３７−２．２９（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ２）２．２４−２．１８（ｍ，ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ）
【００９５】
実施例５
５，１１，１７，２３−テトラベンジルイミンメルカプトブトキシカリックス［４］アレーンの製造
【化１４】
2009515822.tif 000016
乾燥された丸底フラスコに、ＴＢＢＣＡ（５００ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）及びカリウムチオアセテート（１１４．２１ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を仕込み、アセトン６０ｍｌに溶かした後、窒素交流下、室温で９０分間の間にソニック反応させた。反応後、溶媒を減圧下で除去し、３０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で溶かして、不溶の沈殿物は、減圧濾過した後、濾液を水で２回洗い、有機層を分離して、ＭｇＳＯ４で乾燥した。有機層を減圧濾過して、濾液を減圧乾燥した後、得られた固体を、エチルアセテート／ｎ−ヘキサンを用いて再結晶し、減圧濾過して、淡黄色の固体結晶を得た。得られた固体結晶を丸底フラスコに仕込み、ＣＨ２Ｃｌ２：メタノール＝５：１の比率の混合溶液に溶かして、常温で、窒素交流下でソニック反応させた。１分後、１．０Ｍ  ＫＯＨ（１ｍｌ、１ｍｍｏｌ）を仕込み、３０分間ソニック反応させた。反応後、溶媒を減圧下で除去した後、５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で溶かし、０．１Ｍ  ＨＣｌ水溶液で１回洗浄した。有機層を分離して、ＭｇＳＯ４で乾燥した後、減圧濾過し、濾液の溶媒を減圧下で除去して、淡黄色の５，１１，１７，２３−テトラベンジルイミンメルカプトブトキシカリックス［４］アレーン（ＴＢＩＭＢＣＡ；ｔｅｔｒａｂｅｎｚｙｌｉｍｉｎｅｍｅｒｃａｐｔｏｂｕｔｏｘｙｃａｌｉｘ［４］ａｒｅｎｅ）を得た。得られたＴＢＩＭＢＣＡをエチルアセテート／ｎ−ヘキサンで再結晶し、ＴＢＩＭＢＣＡ（４５０ｍｇ、収率７３％）を白色の固体結晶として得た。上記反応を反応式５に示した。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ８．４８（ｓ，２Ｈ，Ｎ＝ＣＨ），８．１７（ｓ，２Ｈ，Ｎ＝ＣＨ），７．８４（ｍ，４Ｈ，ＡｒＯＨ），７．６８（ｍ，４Ｈ，ＡｒＯＲ），７．３８（ｍ，６Ｈ，ＡｒＨ），７．２８（ｍ，６Ｈ，ＡｒＯＲ），７．１０（ｓ，４Ｈ，ＡｒＨ），６．８１（ｓ，４Ｈ，ＡｒＨ），４．３４（ｄ，４Ｈ，ＡｒＣＨＡ２ｒ），４．０４（ｔ，４Ｈ，ＡｒＯＣＨ２），３．４７（ｄ，４Ｈ，ＡｒＣＨ２Ａｒ，Ｊ＝１３Ｈｚ），３．０３（ｔ，４Ｈ，ＳＨＣＨ２），２．３８（ｍ，４Ｈ，ＡｒＯＣＨ２ＣＨ２），２．１１（ｍ，４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２）
【００９６】
実施例６
イミンカリックスアレーン誘導体単分子層の製造
ＣＨＣｌ３等の有機溶媒に、実施例３で合成したＴＢＩＣＯＣＡを０．１−５ｍＭの濃度で溶かした溶液を製造した。図１と同様に、アミン作用基が付着されたスライドグラス（アミンチップ）を、製造された溶液に１−２４時間の間浸漬した後、取り出して、これをクロロホルム、アセトン及び水でそれぞれ洗浄した後、乾燥して、本発明のイミンカリックスアレーン単分子層を製造した。同一の方法によって他のイミンカリックスアレーン誘導体単分子層を製造した。
【００９７】
実施例７
金基質におけるイミンカリックスアレーン誘導体単分子層の製造
ＣＨＣｌ３等の有機溶媒に、実施例５で合成されたＴＢＩＭＢＣＡを０．１−５ｍＭの濃度で溶かした溶液を製造した。図２のように、金基質を、製造された溶液に１−２４時間の間浸漬した後、取り出して、これをクロロホルム、アセトン及び水でそれぞれ洗浄した後、乾燥して、本発明のイミンカリックスアレーン単分子層を製造した。同一の方法で他のイミンカリックスアレーン誘導体単分子層を製造した。上記金基質は多様な形態で用いることができるが、一般的に、ガラス、溶融石英、シリコンウエハ、プラスチック等にクロム（Ｃｒ）やチタン（Ｔｉ）等を５−２０ｎｍで真空蒸着した後、金を１００−３００ｎｍの厚さで真空蒸着した基質が好ましい。このようにして製造された金基質は、使用直前にピラニア（ｐｉｒａｎｈａ）溶液（濃硫酸：３０％過酸化水素水＝３：１で混合した混合溶液）に１０秒乃至１分間程浸漬した後、水で洗浄し、窒素交流下で乾燥し、直ちに用いた。単分子層の生成は、表面反射赤外線分光分析法（ＦＴＩＲ−ＥＲＳ）を用いて分析した。
【００９８】
実施例８
多重分子認識によるオリゴ遺伝子の固定化方法
図３に示したオリゴ遺伝子の固定化には、ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）のマイクロアレイ装置（イギリス）とプロテオゼン（Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎ  Ｃｏ．）のマイクロアレイ装置（韓国）を用いた。連続した９個のグアニン塩基を有するオリゴ遺伝子を６．７５ｐｍｏｌ／μｌでＢＭＴスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）溶液に溶かし、固定化溶液を製造した。上記固定化溶液を、アレイピンを用いて、実施例６と同様の方式で製造された図１に提示された形態のイミンカリックスアレーン誘導体単分子層のガラス基質（ガラススライド）に１−５ｎＬずつ塗布して、オリゴ遺伝子を直径１５０−１８０μｍのスポット内に固定化した。１−４時間後にガラススライドを５００ｍｌのＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−１溶液で１分間１回洗浄し、ＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−２溶液で２回洗浄した後、乾燥して、製造した。オリゴ遺伝子が固定化された以外の位置をブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）するために、洗浄したガラススライドを２５０ｍｌのＢＭＴブロッキング溶液内に入れ、３０分間処理を行った。その後、さらに５００ｍｌのＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−１溶液で３分間１回洗浄し、ＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−２溶液で２回洗浄した後、水分を除去して乾燥して、製造した。
【００９９】
実施例９
多重分子認識によって９個の連続したグアニン塩基を有するオリゴ遺伝子だけを非可逆的に固定化する方法
図４に示したオリゴ遺伝子の固定化には、ジェネティクスのマイクロアレイ装置（イギリス）を用いた。下記表１の９Ａ、９Ｇ、９Ｃ、９Ｔ、ｎｏ、ビオチン等の６種のそれぞれ異なる固定化用作用基の固定化効率を確認するために、それぞれのオリゴ遺伝子を６．７５ｐｍｏｌ／μｌでＢＭＴスポッティング溶液に溶かし、固定化溶液を製造した。上記固定化溶液を、アレイピンを用いて、実施例６と同様の方式で製造された図１に提示された形態のイミンカリックスアレーン誘導体単分子層ガラス基質（ガラススライド）に１−５ｎＬずつ塗布して、オリゴ遺伝子を直径１５０−１８０μｍのスポット内に固定化した。１−４時間後にガラススライドを５００ｍｌのＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−１溶液で１分間１回洗浄し、ＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−２溶液で２回洗浄した後、乾燥して、製造した。オリゴ遺伝子が固定化された以外の位置をブロッキングするために、洗浄したガラススライドを２５０ｍｌのＢＭＴブロッキング溶液内に入れ、３０分間処理を行った後、さらに５００ｍｌのＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−１溶液で３分間１回洗浄し、ＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−２溶液で２回洗浄した。水分を除去して乾燥した後、図４に示したオリゴ遺伝子チップを製造した後、直径が０．８ｃｍのハイブリダイゼーション用チャンバを強固に付着した。
【０１００】
【表１】
2009515822.tif 000017
次の蛍光付着された標的遺伝子とのハイブリダイゼーションのために、１．５ｍｌのチューブに、２ｐｍｏｌ／μｌの濃度の蛍光が付着された標的遺伝子２μｌと、ＢＭＴ  ｈｙｂ−ｍｉｘＡ５８μｌとの比率で混合溶液を製造した。これを１００℃の水で３分間加熱し、氷の上で３分間放置して冷却した後、６０μｌの混合溶液を、ハイブリダイゼーション用チャンバが付着されたガラススライドに注入した。ガラススライドを、湿度が保持される恒温オーブンにて、５０℃で３０分間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションが終わったガラススライドを、３０℃の恒温槽においてＢＭＴ  Ｗａ−Ｂ−１（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）溶液で２分間、常温でＢＭＴ  Ｗａ−Ｂ−２（４×ＳＳＣ）溶液で２分間ずつ、２回繰り返して洗浄した。乾燥した後、マイクロアレイスキャナ（ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ、米国）を用いて蛍光感度を定量的に分析した。実際の結果は、図５に示されたとおりである。上記結果は、９個のグアニン塩基を有するオリゴ遺伝子は高密度で固定化が進められ、他の塩基は、固定化に影響を与えないことを示す。
【０１０１】
実施例１０
１−１５個の連続したグアニン塩基を有するオリゴ遺伝子が多重分子認識によって非可逆的に固定化されるときの効率比較方法
図６に示したオリゴ遺伝子の固定化には、ジェネティクスのマイクロアレイ装置（イギリス）を用いた。下記表２の１Ｇ、４Ｇ、７Ｇ、９Ｇ、１２Ｇ、１５Ｇ等の６種のそれぞれ異なる固定化用作用基の固定化効率を確認するために、それぞれのオリゴ遺伝子を６．７５ｐｍｏｌ／μｌでＢＭＴスポッティング溶液に溶かし、固定化溶液を製造した。上記固定化溶液を、アレイピンを用いて、実施例６と同様の方式で製造された図１に提示された形態のイミンカリックスアレーン誘導体単分子層のガラス基質（ガラススライド）に１−５ｎＬずつ塗布して、オリゴ遺伝子を直径１５０−１８０μｍのスポット内に固定化した。４時間後にガラススライドを５００ｍｌのＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−１溶液で１分間１回洗浄し、ＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−２溶液で２回洗浄した後、乾燥して、製造した。オリゴ遺伝子が固定化された以外の位置をブロッキングするために、洗浄したガラススライドを２５０ｍｌのＢＭＴブロッキング溶液内に入れ、３０分間処理を行った。さらに、５００ｍｌのＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−１溶液で３分間１回洗浄し、ＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−２溶液で２回洗浄した後、水分を除去した。乾燥した後、図４に示されたオリゴ遺伝子チップを製造し、直径が０．８ｃｍのハイブリダイゼーション用チャンバを強固に付着した。
【０１０２】
【表２】
2009515822.tif 000018
次の実施例９において用いられたものと同一の蛍光付着された標的遺伝子とのハイブリダイゼーションのために、１．５ｍｌのチューブに、２ｐｍｏｌ／μｌの濃度の蛍光が付着された標的遺伝子２μｌと、ＢＭＴ  ｈｙｂ−ｍｉｘＡ５８μｌとの比率で混合溶液を製造した。これを１００℃の水で３分間加熱し、氷の上で３分間放置して冷却した後、６０μｌの混合溶液を、ハイブリダイゼーション用チャンバが付着されたガラススライドに注入した。ガラススライドを、湿度が保持される恒温オーブンにて、５０℃で３０分間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションが終わったガラススライドを、３０℃の恒温槽においてＢＭＴ  Ｗａ−Ｂ−１（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）溶液で２分間、常温でＢＭＴ  Ｗａ−Ｂ−２（４×ＳＳＣ）溶液で２分間ずつ、２回繰り返して洗浄した。乾燥した後、マイクロアレイスキャナ（ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ、米国）を用いて蛍光感度を定量的に分析した。実際の結果は、図６に示されたとおりである。上記結果は、固定化のために７個の連続したグアニン塩基以上の連続したグアニン塩基が必要であることを示している。さらに、９個の連続したグアニン塩基の場合に、最も高い固定化密度を示すことが分かる。
【０１０３】
実施例１１
イミダゾールとの競争反応を通じた多重分子認識によるオリゴ遺伝子固定化の証明
図７で示したオリゴ遺伝子の固定化には、ジェネティクスのマイクロアレイ装置（イギリス）を用いた。５’−ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＡＡＡ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  Ａ−３’（配列番号１）の塩基配列を有するオリゴ遺伝子を６．７５ｐｍｏｌ／μｌでＢＭＴスポッティング溶液に溶かし、固定化溶液を製造した。上記固定化溶液を、アレイピンを用いて、実施例６と同様の方式で製造された図１に示された形態のイミンカリックスアレーン誘導体単分子層ガラス基質（ガラススライド）に１−５ｎＬずつ塗布して、オリゴ遺伝子を直径１５０−１８０μｍのスポット内に固定化した。但し、それぞれ異なる濃度のイミダゾールを図７に示した濃度で含まれるようにして、固定化溶液を塗布した。３時間後、ガラススライドを５００ｍｌのＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−１溶液で１分間１回洗浄し、ＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−２溶液で２回洗浄し、乾燥して、製造した。オリゴ遺伝子が固定化された以外の位置をブロッキングするために、洗浄したガラススライドを２５０ｍｌのＢＭＴブロッキング溶液内に入れ、３０分間処理を行った。さらに、５００ｍｌのＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−１溶液で３分間１回洗浄し、ＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−２溶液で２回洗浄した後、水分を除去して乾燥した後、図４に示されたオリゴ遺伝子チップを製造し、直径が０．８ｃｍのハイブリダイゼーション用チャンバを強固に付着した。
【０１０４】
次に実施例９において用いられたものと同一の蛍光付着された標的遺伝子とのハイブリダイゼーションのために、１．５ｍｌのチューブに、２ｐｍｏｌ／μｌの濃度の蛍光が付着された標的遺伝子２μｌと、ＢＭＴ  ｈｙｂ−ｍｉｘＡ５８μｌとの比率で混合溶液を製造した。これを１００℃の水で３分間加熱し、氷の上で３分間放置して冷却した後、６０μｌの混合溶液を、ハイブリダイゼーション用チャンバが付着されたガラススライドに注入した。ガラススライドを、湿度が保持される恒温オーブンにて、５０℃で３０分間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションが終わったガラススライドを、３０℃の恒温槽においてＢＭＴ  Ｗａ−Ｂ−１（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）溶液で２分間、常温でＢＭＴ  Ｗａ−Ｂ−２（４×ＳＳＣ）溶液で２分間ずつ、２回繰り返して洗浄した。乾燥した後、マイクロアレイスキャナ（ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ、米国）を用いて蛍光感度を定量的に分析した。実際の結果は、図７に示されたとおりである。上記結果は、イミダゾールが連続したグアニンの多重分子認識による固定化を阻害し、１００ｍＭ以上のイミダゾールが含まれると、オリゴ遺伝子の固定化はほとんど進まないことが示された。即ち、分子認識によってイミダゾールが競争しながら、連続した９個のグアニン塩基を有するオリゴ遺伝子の固定化速度を落としてしまうことを示した。
【０１０５】
実施例８−１１において固定化、洗浄等のために用いられた溶液の組成は、次のとおりである。
【０１０６】
ＢＭＴスポッティング溶液（４×ＳＳＣ、１５％グリセロール、１×ＰＢＳ）
ＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−１（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）
ＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−２（０．１×ＳＳＣ）
ＢＭＴブロッキング溶液（牛乳カゼイン５％水溶液）
ＢＭＴ  ｈｙｂ−ｍｉｘＡ（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０％グリセロール、１×ＰＢＳ）
ＢＭＴ  Ｗａ−Ｂ−１（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）
ＢＭＴ  Ｗａ−Ｂ−２（４×ＳＳＣ）
【０１０７】
実施例１２
５，１１，１７，２３−テトラアミノカリックス［４］アレーンの合成
【化１５】
2009515822.tif 000019
５，１１，１７，２３−テトラニトロカリックス［４］アレーン（ＴＮＣＡ；ｔｅｔｒａｎｉｔｒｏｃａｌｉｘ［４］ａｒｅｎｅ）を出発物質として用い、上記参考文献３に提示された合成方法で合成して、淡黄色の固体生成物、５，１１，１７，２３−テトラアミノカリックス［４］アレーン（ＴＡＣＡ；ｔｅｔｒａａｍｉｎｏｃａｌｉｘ［４］−ａｒｅｎｅ）を７５％の収率で得た。
【０１０８】
実施例１３
５，１１，１７，２３−テトラ（２，４−ジメチル）ジベンジルアミノカリックス［４］アレーンの合成
【化１６】
2009515822.tif 000020
乾燥された丸底フラスコに、マグネチック棒とＴＡＣＡ（１．０ｇ、２．０５ｍｍｏｌ）とヨウ化ナトリウム（３．０ｇ、２０．５ｍｍｏｌ）を仕込み、減圧乾燥した。乾燥後、無水アセトニトリル５０ｍｌを仕込んだ後、窒素交流下、加熱器で撹拌した。５分後、２，４−ジメチルベンジルブロマイド（１６．２ｇ、８２ｍｍｏｌ）を反応容器に仕込んだ後、温度をあげて交流撹拌しながらピリジン（６．６２ｍｌ、８２ｍｍｏｌ）を仕込み、６時間の間反応させた。反応後、反応容器は、常温で冷やした後、溶媒は減圧下で除去した後、ＣＨ２Ｃｌ２１５０ｍｌに溶かした後、水で２回有機層を洗浄した。有機層を乾燥した後、減圧下で濾過し、濾液は減圧除去した後、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨで再結晶し、淡灰色の固体生成物、５，１１，１７，２３−テトラ（２，４−ジメチル）ジベンジルアミノカリックス［４］アレーン（２，４−ＤＭＴＤＢＡＣＡ）２．１ｇ（収率８０％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）；δ  １０．１４（ｓ，４Ｈ，ＡｒＯＨ），７．２８  ７．１２（ｍ，２４Ｈ，ＡｒＨ），６．０３（ｓ，８Ｈ，ＡｒＨ），４．２４（ｓ，１６Ｈ，ＡｒＮＣＨ２），４．１１（ｄ，４Ｈ，ＡｒＣＨ２Ａｒ，１３Ｈｚ），３．１０（ｄ，４Ｈ，ＡｒＣＨ２Ａｒ，１３Ｈｚ），２．４３（ｓ，１２Ｈ，ＡｒＣＨ３），２．２８（ｓ，１２Ｈ，ＡｒＣＨ３）
【０１０９】
実施例１４
５，１１，１７，２３−（２，４−ジメチル）ベンジルイミンカリックス［４］アレーンの合成
【化１７】
2009515822.tif 000021
乾燥された丸底フラスコに、ＴＡＣＡ（１００ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）とマグネチック棒を仕込み、準備した。反応容器に１５ｍｌのアセトニトリルを仕込んだ後、撹拌した。２，４−ジメチルベンズアルデヒド（３２２ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）を仕込んだ後、窒素交流下で、２時間の間に常温で撹拌反応させた。反応後、減圧濾過して、減圧下で溶媒を除去した後、反応物を適正量のＣＨ２Ｃｌ２に溶かし、ｎ−ヘキサン１５ｍｌを注いで、淡褐色の固体生成物を得た。生成物は、さらに３ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶かした後、ｎ−ヘキサン１５ｍｌを加え、淡褐色の固体生成物、５，１１，１７，２３−テトラ（２，４−ジメチル）ベンジルイミンカリックス［４］アレーン（２，４−ＤＭＩＣＡ）１５５ｍｇ（収率８１％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）；δ  １０．１９（ｓ，４Ｈ，ＡｒＯＨ），８．５４（ｓ，８Ｈ，Ｎ＝ＣＨ），７．７９（ｄ，４Ｈ，ＡｒＨ），７．０２（ｓ，４Ｈ，ＡｒＨ），７．０１（ｄ，４Ｈ，ＡｒＨ），６．９６（ｓ，８Ｈ，ＡｒＨ），４．３０（ｄ，４Ｈ，ＡｒＣＨ２Ａｒ，１３Ｈｚ），３．６１（ｓ，４Ｈ，ＡｒＣＨ２Ａｒ，１３Ｈｚ），２．４３（ｓ，１２Ｈ，ＡｒＣＨ３），２．３０（ｓ，１２Ｈ，ＡｒＣＨ３）
【０１１０】
実施例１５
５，１１，１７，２３−テトラ（２，４−ジメチル）ベンジルアミノカリックス［４］アレーンの合成
【化１８】
2009515822.tif 000022
乾燥された丸底フラスコに、２，４−ＤＭＩＣＡ（１００ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）とマグネチック棒を仕込み、減圧乾燥した後、窒素交流下、無水ＴＨＦ２０ｍｌを仕込んで撹拌した。１０分後にＢＨ３／ＴＨＦ１．０Ｍ溶液（０．８ｍｌ、０．８ｍｍｏｌ）を仕込んだ後、常温で３時間反応させた。反応後、溶媒は減圧下で除去し、フラスコに残留する生成物は、ＣＨ２Ｃｌ２に溶かした後、０．１Ｍ  ＨＣｌ水溶液でそれぞれ２回洗った後、蒸留水で２回洗った。有機層を分離して、乾燥した後、減圧濾過して、濾液を減圧除去し、ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサンで再結晶して、淡黄色の固体生成物、５，１１，１７，２３−テトラ（２，４−ジメチル）ベンジルアミノカリックス［４］アレーン（２，４−ＴＤＭＢＡＣＡ）７２ｍｇ（収率７５％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）；δ  ９．８６（ｓ，４Ｈ，ＡｒＯＨ），７．３３−７．１８（ｍ，１２Ｈ，ＡｒＨ），６．２１（ｓ，８Ｈ，ＡｒＨ），４．２１−４．０９（ｍ，１６Ｈ，ＡｒＣＨ２Ａｒ，ＡｒＮＨＣＨ２），３．５８（ｓ，４Ｈ，ＮＨ），３．２２（ｄ，４Ｈ，ＡｒＣＨ２Ａｒ），２．４３（ｓ，１２Ｈ，ＡｒＣＨ３），２．２８（ｓ，１２Ｈ，ＡｒＣＨ３）
【０１１１】
実施例１６
５，１１，１７，２３−テトラ（２，４−ジメチルテトラベンジル）ベンジルアミノカリックス［４］アレーンの合成
【化１９】
2009515822.tif 000023
乾燥された丸底フラスコに、マグネチック棒と２，４−ＴＤＭＢＡＣＡ（５００ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）とヨウ化ナトリウム（８０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）とを仕込み、減圧乾燥した。乾燥後、無水アセトニトリル５０ｍｌを仕込んだ後、窒素交流下、加熱器で撹拌した。５分後、ベンジルブロマイド（１．１ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）を反応容器に仕込み、交流攪拌した。反応容器にピリジン（０．８ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）を仕込んだ後、６時間の間反応させた。反応後、反応容器は常温で冷やした後、溶媒は減圧除去して、ＣＨ２Ｃｌ２６０ｍｌに溶かし、水で洗った後、有機層を乾燥して減圧濾過し、濾液は減圧除去した後、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨで再結晶して、淡灰色の固体生成物、５，１１，１７，２３−テトラ（２，４−ジメチルテトラベンジル）ベンジルアミノカリックス［４］アレーン（ＴＢ（２，４−ＤＭＴＢ）ＡＣＡ）５２１ｍｇ（収率７９％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １０．０１（ｓ，４Ｈ，ＡｒＯＨ），７．３５−７．１０（ｍ，３４Ｈ，ＡｒＨ），６．２０−６．０６（ｂｒ，８Ｈ，ＡｒＨ），４．３１−４．０１（ｍ，１６Ｈ，ＡｒＣＨ２Ａｒ，ＡｒＮＨＣＨ２），３．１４（ｄ，４Ｈ，ＡｒＣＨ２Ａｒ），２．４５（ｓ，１２Ｈ，ＡｒＣＨ３），２．２７（ｓ，１２Ｈ，ＡｒＣＨ３）
【０１１２】
実施例１７
５，１１，１７，２３−テトラ（２，４−ジメチル）ジベンジルアミノカリックス［４］アレーン−１，３−ヘキサナールの合成
【化２０】
2009515822.tif 000024
乾燥された丸底フラスコに、マグネチック棒と２，４−ＤＭＴＤＢＡＣＡ（５００ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（４８７ｍｇ、３．５ｍｍｏｌ）、ヨウ化ナトリウム（４７３ｍｇ、３．１５ｍｍｏｌ）を順次仕込んだ後、無水アセトニトリル１３０ｍｌを、窒素交流下、反応容器に仕込み、加熱器で撹拌した。６−ブロモヘキサナール（３７６ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）を仕込んだ後、１６時間交流撹拌した。反応後、反応物を常温で冷やした後、減圧下で溶媒を除去する。１３０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に反応物を溶かして、減圧濾過し、濾過された濾液は減圧除去した後、ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で再結晶し、減圧濾過して、淡黄色の固体生成物、５，１１，１７，２３−テトラ（２，４−ジメチル）ジベンジルアミノカリックス［４］アレーン−１，３−ヘキサンアルデヒド（２，４−ＤＭＴＤＢＡＣＡＨＡ）４３２ｍｇ（収率７６％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）；δ  ９．７８（ｓ，２Ｈ，ＣＨＯ），７．３１７．０４（ｍ，１２Ｈ，ＡｒＨ），６．１１−６．０２（ｂｒ，８Ｈ，ＡｒＨ），４．４１−４．１３（ｍ，２０Ｈ，ＡｒＮＣＨ２，ＡｒＣＨ２Ａｒ），３．８９（ｔ，４Ｈ，ＯＣＨ２），３．０５（ｄ，４Ｈ，ＡｒＣＨ２Ａｒ，１３Ｈｚ），２．５７−２．４９（ｔ，４Ｈ，ＣＨＯＣＨ２），２．４５−２．３９（ｍ，１２Ｈ，ＡｒＣＨ３），２．３１−２．２５（ｍ，１２Ｈ，ＡｒＣＨ３），２．１２−１．９８（ｔ，ＯＣＨ２ＣＨ２），１．７８−１．６２（ｍ，８Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２）
【０１１３】
実施例１８
５，１１，１７，２３−テトラ（２，４−ジメチルテトラベンジル）ベンジルアミノブロモブトキシカリックス［４］アレーンの合成
【化２１】
2009515822.tif 000025
乾燥された丸底フラスコに、２，４−ＴＤＭＢＡＣＡ（５００ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）と、無水Ｋ２ＣＯ３（６１９ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ）と、ヨウ化ナトリウム（６７４ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ）を仕込み、無水アセトニトリル１６０ｍｌを仕込んで、常温で１５分間撹拌した。反応容器に１、４−ジブロモブタン（１．０３ｇ、０．６ｍｌ、５．０ｍｍｏｌ）を仕込み、２０時間の間交流撹拌した。反応容器を常温で冷やした後、溶媒は減圧除去し、ＣＨ２Ｃｌ２に溶かした後、減圧濾過して、濾液は減圧除去した後、ＥＡ／ヘキサンで再結晶し、減圧濾過して、淡褐色の固体生成物、５，１１，１７，２３−テトラ（２，４−ジメチルテトラベンジル）ベンジルアミノブロモブトキシカリックス［４］アレーン（ＴＢ（２，４−ＤＭＴＢ）ＡＢＣＡ）６１０ｍｇ（収率７７％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）；δ  ７．８１（ｓ，２Ｈ，ＡｒＯＨ），７．２９７．０４（ｍ，３４Ｈ，ＡｒＨ），６．０６−６．０２（ｄ，８Ｈ，ＡｒＨ），４．３８−４．１１（ｍ，２０Ｈ，ＡｒＮＣＨ２，ＡｒＣＨ２Ａｒ），３．８９（ｔ，４Ｈ，ＯＣＨ２），３．０４（ｄ，４Ｈ，ＡｒＣＨ２Ａｒ，１３Ｈｚ），２．４６−２．４３（ｍ，１２Ｈ，ＡｒＣＨ３），２．４１−２．４０（ｍ，１２Ｈ，ＡｒＣＨ３）２．３１−２．２７（ｔ，４Ｈ，ＢｒＣＨ２），２．１６−２．０６（ｍ，８Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２）
【０１１４】
実施例１９
５，１１，１７，２３−テトラ（２，４−ジメチルテトラベンジル）ベンジルアミノメルカブトブトキシカリックス［４］アレーンの合成
【化２２】
2009515822.tif 000026
乾燥された丸底フラスコに、ＴＢ（２，４−ＤＭＴＢ）ＡＢＣＡ（５００ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）と、カリウム  チオアセテート（２１２ｍｇ、１．８６ｍｍｏｌ）を仕込み、無水アセトン６０ｍｌに溶かして、窒素交流下、９０分間常温でソニック反応させた。反応後、溶媒を減圧除去した後、３０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶かして減圧濾過した後、濾液を水で２回洗い、有機層を分離して、乾燥した。有機層を減圧濾過し、濾液を減圧乾燥した後、得られた固体をＥＡ／ｎ−ヘキサンを用いて再結晶し、減圧濾過して、淡黄色の固体結晶を得た。得られた固体結晶を丸底フラスコに仕込み、ＣＨ２Ｃｌ２：メタノール＝５：１の比率の混合溶液に溶かして、常温で、窒素交流下でソニック反応させた。１分後、１．０Ｍ  ＫＯＨ（１．５ｍｌ、１．５ｍｍｏｌ）を仕込み、３０分間ソニック反応させた。反応後、溶媒を減圧除去した後、ＣＨ２Ｃｌ２に溶かし、０．１Ｍ  ＨＣｌ水溶液で洗った。有機層を分離した後、乾燥して、減圧濾過し、濾液は減圧下で溶媒を除去し、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨを用いて再結晶すると、淡黄色の５，１１，１７，２３−テトラ（２，４−メトキシ）ベンジルアミノメルカプトブトキシカリックス［４］アレーン（ＴＢ（２，４−ＤＭＴＢ）ＡＭＢＣＡ）を３２０ｍｇ（収率７３％）得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）；δ  ７．８４（ｓ，２Ｈ，ＡｒＯＨ），７．２９７．０１（ｍ，３４Ｈ，ＡｒＨ），６．２５−６．１９（ｂｒ，８Ｈ，ＡｒＨ），４．３６−４．１１（ｍ，２０Ｈ，ＡｒＮＣＨ２，ＡｒＣＨ２Ａｒ），３．９０（ｔ，４Ｈ，ＯＣＨ２），３．０５（ｄ，４Ｈ，ＡｒＣＨ２Ａｒ，１３Ｈｚ），２．３０（ｔ，４Ｈ，ＳＨＣＨ２），２．４５−２．３９（ｍ，１２Ｈ，ＡｒＣＨ３），２．３１−２．２５（ｍ，１２Ｈ，ＡｒＣＨ３）２．０５−２．０２（ｍ，ＣＨ２ＣＨ２）
【０１１５】
実施例２０
図８のようなアミノカリックスアレーン誘導体単分子層の製造
ＣＨＣｌ３等の有機溶媒に、実施例１７で合成された２，４−ＤＭＴＤＢＡＣＡＨＡを０．１−５ｍＭの濃度で溶かした溶液を製造した。図８のように、アミン作用基が付着されたスライドグラス（アミンチップ）を、製造した溶液に１−２４時間の間浸漬した後、取り出して、これをクロロホルムとアセトン、及び水でそれぞれ洗浄し、乾燥すると、図８に示されたアミノカリックスアレーン誘導体単分子層（ＢＭＴオリゴ遺伝子チップＡ型）が製造される。前述したＡ型を、ＢＨ３−ＴＨＦやＮａＢＨ４ｉｎＭｅＯＨ還元剤の中に１−１０分間入れて置いた後、水（ＤＩ  ｗａｔｅｒ）で３回洗浄して、窒素雰囲気下で乾燥し、図８に示されたアミノカリックスアレーン誘導体単分子層（ＢＭＴオリゴ遺伝子チップＢ型）を製造する。
【０１１６】
実施例２１
図９のような金基質におけるアミノカリックスアレーン誘導体単分子層の製造
ＣＨＣｌ３等の有機溶媒に、実施例１９で合成されたＴＢ（２，４−ＤＭＴＢ）ＡＭＢＣＡを０．１−５ｍＭの濃度で溶かした溶液を製造した。図９のように、金基質を製造した溶液に１−２４時間の間浸漬した後、取り出して、これをクロロホルムとアセトン、及び水でそれぞれ洗浄し、乾燥すると、図９に示されたアミノカリックスアレーン誘導体単分子層が製造される。アミノカリックスアレーンの他の誘導体も、同様の方法で単分子層が製造される。ここに用いられる金基質は、多様な形態で用いることができるが、一般的に、ガラス、溶融石英（ｆｕｓｅｄ  ｓｉｌｉｃａ）、シリコンウエハ、プラスチック等にクロム（Ｃｒ）やチタン（Ｔｉ）等を２−１０ｎｍで真空蒸着した後、金を５０−２００ｎｍの厚さで真空蒸着した基質が好ましい。このようにして製造された金基質は、使用直前にピラニア溶液（濃硫酸：３０％過酸化水素水＝３：１で混合した混合溶液）に１０秒乃至１分間程浸漬した後、水で洗浄し、窒素交流下で乾燥して、直ちに用いる。単分子層の生成は、表面反射赤外線分光分析法（ＦＴＩＲ−ＥＲＳ）を用いて分析する。
【０１１７】
実施例２２乃至２５において用いられた溶液とオリゴ遺伝子、蛍光付着されたオリゴ遺伝子、及びｃ−ＤＮＡ塩基配列
【表３】
2009515822.tif 000027
【０１１８】
【表４】
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【０１１９】
【表５】
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【０１２０】
【表６】
2009515822.tif 000030
【０１２１】
【表７】
2009515822.tif 000031
【０１２２】
【表８】
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【０１２３】
実施例２２
図１２のアミノカリックスアレーン誘導体単分子層上に多重分子認識によって非可逆的に固定化されたグアニン塩基の最適個数の判別
−多重分子認識によるアミノカリックスアレーン誘導体単分子層上におけるオリゴ遺伝子の固定化
アミノカリックスアレーン誘導体単分子層上に多重分子認識に適合したグアニン個数の決定のために用いられるサンプル溶液及び濃度組成等は、表３のとおりである。先ず、オリゴ遺伝子の固定化のために用意されたアミノカリックスアレーン誘導体単分子層上に、下記表４の１Ｇ、４Ｇ、７Ｇ、９Ｇ、１２Ｇ、１５Ｇ個の連続したグアニン塩基を有したそれぞれのオリゴ遺伝子（１００ｐｍｏｌ／μｌ）１０μｌと、ＢＭＴスポッティング溶液３の１４８μｌとの混合溶液を、マイクロアレイヤ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ）（Ｇｅｎｅｔｉｘ  Ｑａｒｒａｙ２）を用いて１−５ｎｌずつ塗布し、直径が１５０−１８０μｍの大きさで、常温で時間別に、１時間、２時間、４時間の間、それぞれを固定化用チャンバにて固定化した。固定化後に、アミノカリックスアレーン誘導体単分子層は、余分のオリゴ遺伝子を除去するために、ＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−１（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で常温で１分間洗浄した後、ＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−２（０．１×ＳＳＣ）で洗浄し、ＢＭＴブロッキング溶液（牛乳カゼイン５％水溶液）により常温で３０分間ブロッキングを行った。処理されたアミノカリックスアレーン誘導体単分子層は、ＢＭＴ  Ｗａ−Ｂ−１（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で常温で３分間洗浄した後、ＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−２（０．１×ＳＳＣ）洗浄瓶（ｗａｓｈ−ｂｏｔｔｌｅ）で洗浄し、乾燥した。
【０１２４】
−蛍光付着されたＤＮＡ（Ｃｙ３−ＤＮＡ）とのハイブリダイゼーション
オリゴ遺伝子の固定化後に乾燥したアミノカリックスアレーン誘導体単分子層は、蛍光が付着されたＣｙ３−ＤＮＡとのハイブリダイゼーションのために、先ず、ハイブリダイゼーション用チャンバを単分子層上に付着した後、表４に明示されたＣｙ３−ＤＮＡ（５ｎｍｏｌ／ｍｌ）２μｌをＢＭＴｈｙｂ−ｍｉｘＡ（４×ＳＳＣ、０．００２％ＳＤＳ、５０％グリセロール、１×ＰＢＳ）５８μｌと混合して、１００℃の水で３分間加熱し、氷の上で３分間放置した後、マイクロピペットを用いて６０μｌずつ塗布し、その後、湿度が維持される恒温インキュベーターにおいて５０℃で３０分間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、アミノカリックスアレーン誘導体単分子層の洗浄のために、ＢＭＴ  Ｗａ−Ｂ−１（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で３０℃で２分間洗浄した後、ＢＭＴ  Ｗａ−Ｂ−２（４×ＳＳＣ）で常温で２分間の洗浄を２回繰り返して乾燥し、蛍光スキャナ（ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ、米国）を用いて、示される蛍光感度を分析した。実際の結果は、図１２のとおりである。上記結果は、アミノカリックスアレーン誘導体単分子層上に多重分子認識によってオリゴ遺伝子が固定化されるとき、最小７個以上のグアニン塩基が必要であり、９個のグアニン塩基の場合が、もっとも高密度で固定化されることを示す結果である。
【０１２５】
実施例２３
図１４及び図１５の最適空間配列による単一塩基変異（ＳＮＰ；Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）の差別化確認実験
−アミノカリックスアレーン誘導体単分子層上におけるＳＮＰの確認
アミノカリックスアレーン誘導体単分子層上におけるＳＮＰの確認のための実験は、先ず、オリゴ遺伝子の固定化のために用意したアミノカリックスアレーン誘導体単分子層上に、表６の塩基配列が同じ位置で１個ずつだけ異なるそれぞれのオリゴ遺伝子（１００ｐｍｏｌ／μｌ）９．１μｌと、ＢＭＴスポッティング溶液１の３５．９μｌとを混合した混合溶液を、マイクロアレイヤ（Ｇｅｎｅｔｉｘ  Ｑａｒｒａｙ２）を用いて１−５ｎｌずつ１５０−１８０μｍの大きさで塗布した後、常温で３時間の間固定化用チャンバにおいて固定化した。固定化後に、アミノカリックスアレーン誘導体単分子層は、余分のオリゴ遺伝子を除去するために、ＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−１（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で常温で１分間洗浄した後、ＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−２（０．１×ＳＳＣ）で洗浄し、ＢＭＴブロッキング溶液（牛乳カゼイン５％水溶液）により常温で３０分間ブロッキングを行った。処理されたアミノカリックスアレーン誘導体単分子層は、ＢＭＴ  Ｗａ−Ｂ−１（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で常温で３分間洗浄した後、ＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−２（０．１×ＳＳＣ）洗浄瓶で洗浄した後、乾燥した。
【０１２６】
−蛍光付着されたＤＮＡ（Ｃｙ３−ＤＮＡ）を検出するためのＣ−ＤＮＡとのハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションのために、先ず、ハイブリダイゼーション用チャンバを単分子層上に付着した後、表６に明示されたそれぞれのｃ−ＤＮＡ（５ｎｍｏｌ／μｌ）２μｌをＢＭＴｈｙｂ−ｍｉｘＡ（４×ＳＳＣ、０．００２％ＳＤＳ、５０％グリセロール、１×ＰＢＳ）２８μｌと混合して、１００℃の水で３分間加熱し、氷の上で３分間放置して冷やした後、マイクロピペットを用いて３０μｌずつ塗布し、５５℃の恒温インキュベーターにおいて３０分間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、アミノカリックスアレーン誘導体単分子層の洗浄のために、ＢＭＴ  Ｗａ−Ｂ−１（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で３０℃で２分間洗浄した後、ＢＭＴ  Ｗａ−Ｂ−２（４×ＳＳＣ）で常温で２分間の洗浄を２回繰り返して乾燥し、蛍光が付着されたＤＮＡ（Ｃｙ３−ＤＮＡ）とハイブリダイゼーションが可能なオリゴ遺伝子単分子層を用意した。
【０１２７】
−Ｃ−ＤＮＡと蛍光が付着されたＣｙ３−ＤＮＡとのハイブリダイゼーション
Ｃ−ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを終えた単分子層上において蛍光が付着されたＣｙ３−ＤＮＡとのハイブリダイゼーションのために、先ず、ハイブリダイゼーション用チャンバを付着した後、表６のＣｙ３−ＤＮＡ（５ｎｍｏｌ／ｍｌ）２μｌをＢＭＴｈｙｂ−ｍｉｘＡ（４×ＳＳＣ、０．００２％ＳＤＳ、５０％グリセロール、１×ＰＢＳ）２８μｌと混合して、１００℃の水で３分間加熱した後、氷の上で３分間放置して冷やし、マイクロピペットを用いて３０μｌずつ塗布した後、恒湿インキュベーターにおいて４５℃で３０分間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、アミノカリックスアレーン誘導体単分子層の洗浄のために、ＢＭＴ  Ｗａ−Ｂ−１（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で３０℃で２分間洗浄した後、ＢＭＴ  Ｗａ−Ｂ−２（４×ＳＳＣ）で常温で２分間の洗浄を２回繰り返して乾燥し、蛍光スキャナ（ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ、米国）を用いてＳＮＰ差別化の有無を蛍光感度で確認した。結果は、図１４及び図１５に示されたとおりであり、ハイブリダイゼーションにおいて、一つの差がある何らのオリゴ遺伝子が固定化された箇所にも他の遺伝子は結合しないという結果を見せており、本発明において開発された技術が、固定化されるオリゴ遺伝子を適切な水準の空間を確保して配列し、オリゴ遺伝子の間の最適の空間配列により、迅速かつ正確にＳＮＰの差別化を具現することができる結果を示した。
【０１２８】
実施例２４
図１０及び図１１の最高密度固定化実験
−オリゴ遺伝子の固定化
アミノカリックスアレーン誘導体単分子層上にオリゴ遺伝子を固定化する方法は、先ず、オリゴ遺伝子の固定化のために用意したアミノカリックスアレーン誘導体単分子層上に、表７のオリゴ遺伝子（１００ｐｍｏｌ／μｌ）９．１μｌと、ＢＭＴスポッティング溶液１の３５．９μｌとの混合溶液を、マイクロアレイヤ（Ｇｅｎｅｔｉｘ  Ｑａｒｒａｙ２）を用いて１−５ｎｌずつ塗布した後、常温で３時間の間固定化用チャンバにおいて固定化した。固定化後に、アミノカリックスアレーン誘導体単分子層は、余分のオリゴ遺伝子を除去するために、ＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−１（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で常温で１分間洗浄した後、ＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−２（０．１×ＳＳＣ）で洗浄し、ＢＭＴブロッキング溶液（牛乳カゼイン５％水溶液）により常温で３０分間ブロッキングを行った。処理されたアミノカリックスアレーン誘導体単分子層は、ＢＭＴ  Ｗａ−Ｂ−１（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で常温で３分間洗浄した後、ＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−２（０．１×ＳＳＣ）洗浄瓶で洗浄した後、乾燥した。
【０１２９】
−蛍光付着されたＣｙ３−ＤＮＡとのハイブリダイゼーション
蛍光付着されたＣｙ３−ＤＮＡとのハイブリダイゼーションのために、先ずハイブリダイゼーション用チャンバを付着した後、表７のＣｙ３−ＤＮＡ（５ｎｍｏｌ／ｍｌ）２μｌをＢＭＴｈｙｂ−ｍｉｘＡ（４×ＳＳＣ、０．００２％ＳＤＳ、５０％グリセロール、１×ＰＢＳ）２８μｌと混合して、１００℃の水で３分間加熱し、氷の上で３分間放置して冷やした後、マイクロピペットを用いて３０μｌずつ塗布した後、５０℃のインキュベーターにおいて３０分間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、アミノカリックスアレーン誘導体単分子層の洗浄のために、ＢＭＴ  Ｗａ−Ｂ−１（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で３０℃で２分間洗浄した後、ＢＭＴ  Ｗａ−Ｂ−２（４×ＳＳＣ）で常温で２分間の洗浄を２回繰り返して乾燥し、蛍光スキャナを用いて、示される蛍光感度を確認し、理論的な蛍光感度との比較分析をした。
【０１３０】
−蛍光付着されたｃ−ＤＮＡの量をチップ基板に乾燥させ、理論的な量の最大値と比較分析
アミノカリックスアレーン誘導体の上で、表７の蛍光が付着されたＣｙ３−ＤＮＡを理論的な最大値の１／２（０．６７５ｆｍｏｌ／ｎｌ）１−５ｎｌを、マイクロアレイヤ（Ｇｅｎｅｔｉｘ  Ｑａｒｒａｙ２）を用いて塗布し、乾燥した後、蛍光スキャナを用いて分析した。理論的な蛍光感度と実験的な蛍光感度とを比較した結果は図１０及び図１１に示されており、理論的な最大値の１／２水準の蛍光付着されたＣｙ３−ＤＮＡを用いた結果が、ハイブリダイゼーションを介して固定化されたオリゴ遺伝子において現われる結果と同様に示され、理論的な最大値に近接した水準のオリゴ遺伝子が固定化されていることを示す結果となった。
【０１３１】
実施例２５
図１６の９Ａ、９Ｔ、９Ｇ、９Ｃ−ＤＮＡとの競争反応を用いた９個のグアニン塩基のみの非可逆的固定化確認実験
競争反応のためのオリゴ遺伝子の準備は、表７のような組成で用意した。このとき、競争反応に用いられた他のＤＮＡは表８に明示されており、濃度は、０倍、１倍、２倍、４倍で含まれるようにした。オリゴ遺伝子の固定化は、アミノカリックスアレーン誘導体単分子層上に、表７と同様の方法で製造されたそれぞれのオリゴ遺伝子混合溶液をマイクロピペットにより１μｌずつ２ｍｍの大きさでスポッティングし、常温で１時間の間固定化用チャンバにおいて固定化した。固定化後に、アミノカリックスアレーン誘導体単分子層は、余分のオリゴ遺伝子を除去するために、ＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−１（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で常温で１分間洗浄した後、ＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−２（０．１×ＳＳＣ）で洗浄し、ＢＭＴブロッキング溶液（牛乳カゼイン５％水溶液）により常温で３０分間ブロッキングを行った。処理されたアミノカリックスアレーン誘導体単分子層は、ＢＭＴ  Ｗａ−Ｂ−１（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で常温で３分間洗浄した後、ＢＭＴ  Ｗａ−Ａ−２（０．１×ＳＳＣ）洗浄瓶で洗浄し、乾燥した。
【０１３２】
−蛍光付着されたＣｙ３−ＤＮＡとのハイブリダイゼーション
蛍光付着されたＣｙ３−ＤＮＡとのハイブリダイゼーションのために、先ず、ハイブリダイゼーション用チャンバを付着した後、表８のＣｙ３−ＤＮＡ（１０ｎｍｏｌ／ｍｌ）１０μｌをＢＭＴｈｙｂ−ｍｉｘＡ（４×ＳＳＣ、０．００２％ＳＤＳ、５０％グリセロール、１×ＰＢＳ）５９０μｌと混合して、マイクロピペットを用いて６００μｌずつ塗布した後、５０℃のインキュベーターにおいて３０分間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、アミノカリックスアレーン誘導体単分子層の洗浄のために、ＢＭＴ  Ｗａ−Ｂ−１（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で３０℃で２分間洗浄した後、ＢＭＴ  Ｗａ−Ｂ−２（４×ＳＳＣ）で常温で２分間の洗浄を２回繰り返して乾燥し、蛍光スキャナ（ＧＳＩ）を用いて、示される蛍光感度を確認した。上記結果は図１６に示されており、この結果は、９個のグアニンだけが非可逆的な多重分子認識によって固定化され、実際に、他の塩基は、連続しているかしていないかに関係なく、固定化に大きな影響を及ばせないことを示す結果である。この結果は、ハイブリダイゼーションに用いられるべき塩基が固定化に参加せずに連続した特定の塩基配列のみが固定化に参加して、ハイブリダイゼーションに必須な塩基が常に一定の数を維持し、かつ再現性のあるハイブリダイゼーションの結果が得られる、オリゴ遺伝子チップの製造技術を示す実際の実験結果である。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明は、世界的に一般化されて用いられている化学結合又は物理吸着方式によりオリゴ遺伝子を固定化する既存の方式とは全く差別化されたものであって、連続したグアニン塩基を多重分子認識という分子認識概念を適用して非可逆的にオリゴ遺伝子を固体基質上に固定化する新規な方法である。
【０１３４】
本発明は、オリゴ遺伝子チップの製造時、オリゴ遺伝子を固体基質に固定化するために既存の化学結合方式において主に用いられてきた、アミン作用基が付着された高価のオリゴ遺伝子とアルデヒドスライドガラス（アルデヒドチップ基板）との間の化学反応を通じてオリゴ遺伝子をアルデヒドチップ基板に固定化するときに生じる多数の問題を解決することにより、誰でも容易にオリゴ遺伝子チップを製造することができる新規な方法である。
【０１３５】
高価の作用基が付着されたオリゴ遺伝子を用いて製造するオリゴ遺伝子チップは、固定化段階において再現性を確保することが非常に難しいため、研究開発期間が長期化してしまい、多くのバイオ企業が研究開発段階から製品化段階へ進められない原因となっている。また、数百乃至数千個のオリゴ遺伝子塩基配列を検証して最上のハイブリダイゼーション結果をもたらすオリゴ遺伝子を選択するとき、研究開発費用の負担のために製品開発をあきらめる場合がある。
【０１３６】
本発明は、図３に説明されているように、連続したグアニン塩基がイミンカリックスアレーン誘導体単分子層（ＢＭＴイミンチップ）に多重分子認識によって固定化されるため、同一の条件で固定化されるオリゴ遺伝子の密度が常に均一であり、数千乃至数万個のオリゴ遺伝子チップを製造しても非常に高い再現性を示す。また、図３において連続したグアニン塩基が基質の表面に固定化されて生成される空間は、図４で見られるハイブリダイゼーションの際に、基質の表面まで結合されるべきｃ−ＤＮＡが固定化されたオリゴ遺伝子の間に容易に入ってきてハイブリダイゼーションを行う。従って、オリゴ遺伝子が密に固定化されている既存のオリゴ遺伝子チップに比して数倍乃至数十倍速成でハイブリダイゼーションを進めることができ、速成診断が可能であるという長所がある。分子認識によって固定化されるオリゴ遺伝子は、溶液上でＢＭＴイミンチップに多重分子認識によって固定化されるため、用いられるオリゴ遺伝子の濃度を既存の１／３−１／１０の水準で用いても、高密度でオリゴ遺伝子が固定化されたオリゴ遺伝子チップの製造が可能となる。
【０１３７】
さらに、本発明は、オリゴ遺伝子の固定化に約２−４時間、それから洗浄及び乾燥して製造するため、オリゴ遺伝子チップの製造のための製造工程の単純化及び迅速化が可能となる。
【０１３８】
特に、図４及び図６は、イミンカリックスアレーン誘導体自己組織化単分子層が９個の連続したグアニン塩基を多重分子認識して非可逆的に固定化し、ハイブリダイゼーションを通じて得られた蛍光分析の結果は、固定化されたオリゴ遺伝子の量が、既存の知られた方式に比べて最小５倍乃至３０倍程の高いオリゴ遺伝子の固定化密度を有することを示している。
【０１３９】
このように、本発明は、既存のオリゴ遺伝子の固定化によるオリゴ遺伝子チップの製造技術に比して迅速に製造可能であり、高水準の再現性に基づいた研究開発費用の節減、並びに製品製造の際に、既存の１／３−１／５の水準で製品の生産が可能となるようにした画期的な新技術である。従って、今後、本発明に基づいて多様なＤＮＡチップの製造等の応用が可能となるだろう。
【０１４０】
また、本発明の他の態様であって、本発明は、上述した既存のオリゴ遺伝子チップの製造技術で現われる超高速ハイブリダイゼーションの不可能、単一塩基変異（ＳＮＰ）診断技術の確保不可、Ａ、Ｃ、Ｇの３つの塩基に存在するアミン作用基とアルデヒドチップ基板のアルデヒド作用基とが化学結合しながら示されるハイブリダイゼーションの結果を同様に維持することが難しいため生じる遺伝子チップの再現性確保の困難さ、製造されたチップにおいてオリゴ遺伝子を均一に固定化する均一密度固定化の困難さ等の、現存する遺伝子チップの製造技術において現われる全ての問題点をいっぺんに解決することができる新技術である。
【０１４１】
本発明は、連続したグアニン基の非可逆的分子認識が可能なアミノカリックスアレーン誘導体及びその自己組織化単分子層の形態に製造されるオリゴ遺伝子チップ基板の製造技術並びにチップ基板表面で自発的な分子認識によってオリゴ遺伝子が非可逆的に固定化されて製造されるオリゴ遺伝子チップ及びその製造技術を提供する。このような固定化技術は、上記実施例及び図面で説明したように、塩基が固定化されつつ配列されるとき、連続した塩基が底に非可逆的に固定化されながら占める面積だけ塩基間の間隔が自動的に適切に維持され、このような間隔は、ハイブリダイゼーション時、ｃ−ＤＮＡがチップ基板の底まで自由に出入するのに十分な空間であるため、ハイブリダイゼーション時間が超高速で進められ、同時に、ハイブリダイゼーションにおいて塩基間の結合に用いられる塩基の数が常に最大に一定して維持することができ、単一塩基の差をｏｎ−ｏｆｆの水準で確認可能な程、ハイブリダイゼーションを高い特異性で進めることができるようにする新技術である。
【０１４２】
さらに、本発明は、上記化合物をアミン作用基を有するガラス基質（アミンスライドガラス）等の固体基質に付着又は金基質（金薄膜又は金）に付着することにより、全ての種類のオリゴ遺伝子が何らの加工過程なく、適切な水準の空間を維持したまま最高密度水準で固定化されたオリゴ遺伝子単分子層、つまり、オリゴ遺伝子チップを製造することができる、アミノカリックスアレーン誘導体が単分子層として製造されたオリゴ遺伝子の固定化用チップ基板を提供して、全ての固体基質においてオリゴ遺伝子チップを同一かつ再現性よく製品化するのに必須の基盤技術を提供する。
【０１４３】
その上、本発明は、オリゴ遺伝子が、多重分子認識という新技術により固定化が水溶液上で空き空間なく行われるため、最大数値のオリゴ遺伝子が固定化される、つまり最大密度でオリゴ遺伝子が固定化されながらも、ハイブリダイゼーションは超高速で進行可能となるように、オリゴ遺伝子が自発的に配列されるようにする新技術であるため、低濃度のｃ−ＤＮＡも感知して診断が可能な世界最高水準の高感度オリゴ遺伝子チップの製造技術を提供する。同時に、常に最高密度のオリゴ遺伝子が固定化されるため、製品化に必須の再現性のあるオリゴ遺伝子チップの製造技術を提供する。これは、既存に用いられてきたチップ基板は、高価の作用基が付着されたオリゴ遺伝子を用いて製造しなければならず、オリゴ遺伝子の固定化段階で再現性を確保することが非常に難しいため、研究開発期間が長くなってしまい、研究開発段階から製品化段階へ進むことができない原因となっていたが、容易に製作可能な本発明において提供する分子認識技術を用いて、数百乃至数千個のオリゴ遺伝子の塩基配列を検証し、最上のハイブリダイゼーション結果をもたらすオリゴ遺伝子を選択してオリゴ遺伝子チップの開発及び製品化を進めるとき、研究開発費用の負担を節減し、再現性を確保することにより、迅速且つ適期に最適のオリゴＤＮＡチップの発売を可能とする新技術を提供する。本発明において提供されるチップ製造のための基盤技術を用いると、多様な遺伝子チップの製造及び製品化が速かに進められる。
【０１４４】
また、本発明は、分子認識によって固定化されるオリゴ遺伝子が、表面に固定化される量の３−５倍水準だけを用いても高密度のオリゴ遺伝子チップの製造が可能であり、既存のオリゴ遺伝子チップの製造時に用いられたオリゴ遺伝子価格の１／１０〜１／１００程度のみを使ってもチップの製造が可能であるため、製造費用の莫大な節減が可能となる新技術である。
【０１４５】
そして、本発明は、世界的に一般化されて用いられている既存の化学結合又は物理吸着方式でオリゴ遺伝子を固定化する方式とは全く差別化される、連続したグアニン塩基を多重分子認識という分子認識概念を適用して非可逆的にオリゴ遺伝子を固体基質上に固定化する新技術である。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】図１は、本発明のイミンカリックスアレーン誘導体のガラス基質（アミンスライドガラス）上での自己組織化単分子層の製造過程の概路図である。
【図２】図２は、本発明のイミンカリックスアレーン誘導体の金基質上での自己組織化単分子層の製造過程の概路図である。
【図３】図３は、本発明の連続したグアニン基を有するオリゴ遺伝子の固定化方法に関する概路図である。
【図４】図４は、連続したグアニン基を有するオリゴ遺伝子のみ選択的に固定化する過程を示した図である。
【図５】図５は、蛍光が付着されたｃ−ＤＮＡを用いて固定化したオリゴ遺伝子の密度を分析した結果を示す。
【図６】図６は、本発明のイミンカリックスアレーン誘導体自己組織化単分子層にオリゴ遺伝子を固定化する際に、７個以上の連続したグアニン作用基が必要であることを示す図である。
【図７】図７は、本発明のイミンカリックスアレーン誘導体自己組織化単分子層にオリゴ遺伝子を固定化する際に、グアニン基が分子認識によって選択的に認識されることを証明するために、これと類似の構造を有するイミダゾール作用基を用いた競争反応の結果を示す図である。
【図８】図８は、本発明のアミノカリックスアレーン誘導体のガラス基質上での自己組織化単分子層の製造過程の概路図である。
【図９】図９は、本発明のアミノカリックスアレーン誘導体の金基質の上での自己組織化単分子層の製造過程の概路図である。
【図１０】図１０は、本発明の自発的な分子認識によって連続したグアニン基を有するオリゴ遺伝子の固定化方法に関する概路図である。
【図１１】図１１は、本発明の自発的な分子認識によって連続したグアニン基を有するオリゴ遺伝子の最高密度固定化の実際の実験結果である。
【図１２】図１２は、最大密度固定化のために連続したグアニン塩基の最適個数の決定のための実際の実験結果である。
【図１３】図１３は、オリゴ遺伝子の固定化の際に、連続した塩基により適切な空間を確保して固定化されたオリゴ遺伝子の間に確保された空間を通じてｃ−ＤＮＡがチップの底まで接近可能であることを示す模式図である。
【図１４】図１４は、超高速ハイブリダイゼーションを用いてＳＮＰの差別化がｏｎ−ｏｆｆの水準まで可能であることを示す実際の実験結果である。
【図１５】図１５は、超高速ハイブリダイゼーションを用いてＳＮＰの差別化がｏｎ−ｏｆｆの水準まで可能であることを示す実際の実験結果である。
【図１６】図１６は、固定化に他の塩基よりもグアニン塩基のみが選択的に高速固定化を遂行するという実際の競争反応の結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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