(57)【要約】少なくとも１つ標的領域のメチル化の程度を決定するための方法およびキットが、開示される。代表的に、サンプルは、改変型ヌクレオチドを含む改変されたサンプルを得るために改変剤に曝される。上記改変されたサンプル中の少なくとも１つの標的領域が、増幅される。開示される方法のいくつかは、少なくとも１つのさらなる増幅反応を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの移動度シフトアナログは、増幅反応の間にアンプリコン中に組み込まれる。上記アナログは、分析され、そして少なくとも１つの標的領域のメチル化の程度が、決定される。
2009508475.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の少なくとも１つのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）標的領域のメチル化の程度を決定するための方法であって、
該サンプルを改変剤に曝して、改変されたサンプルを得る工程；
少なくともいくつかの該改変されたサンプルと、各標的領域に対する標的特異的プライマー対と、第１のＤＮＡポリメラーゼとを含む第１の増幅組成物を形成する工程；
該第１の増幅組成物を増幅の少なくとも１つの第１のサイクルに供して、少なくとも１つの第１の増幅産物を産生する工程；
該少なくとも１つの第１の増幅産物の少なくとも一部を分析する工程；および
少なくとも１つの標的領域のメチル化の程度を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記分析する工程は、電気泳動を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の増幅組成物は、レポータープローブ、挿入剤、またはレポータープローブおよび挿入剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記改変剤は、少なくとも１つのメチル化されていない標的ヌクレオチドを改変型ヌクレオチドへと改変するが、少なくとも１つのメチル化されている標的ヌクレオチドを改変型ヌクレオチドへと改変しない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのｇＤＮＡ標的領域は、多数の異なるｇＤＮＡ標的領域を含み、そして前記少なくとも１つの標的特異的プライマー対は、多数の異なる標的特異的プライマー対を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の増幅組成物は、多数の異なる第１の増幅組成物を含み、該多数の異なる第１の増幅組成物は、それぞれ、（ａ）少なくともいくつかの前記改変されたサンプルおよび（ｂ）１つの標的特異的プライマー対、２つの異なる標的特異的プライマー対、３つの異なる標的特異的プライマー対、４つの異なる標的特異的プライマー対、５つの異なる標的特異的プライマー対、または６つの異なる標的特異的プライマー対を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つのプライマー対は、第１のレポーター基を含む順方向プライマー、第２のレポーター基を含む逆方向プライマー、または第１のレポーター基を含む順方向プライマーおよび第２のレポーター基を含む逆方向プライマーを含み、該第１のレポーター基および該第２のレポーター基は、同一であるか、または異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記増幅の少なくとも１つの第１サイクルは、増幅の多数のサイクルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
サンプル中の少なくとも１つのｇＤＮＡ標的領域のメチル化の程度を決定するための方法であって、
該サンプルを改変剤に曝して、改変されたサンプルを得る工程；
少なくともいくつかの該改変されたサンプルと、各標的領域に対する標的特異的プライマー対と、移動度シフトアナログと、第１のＤＮＡポリメラーゼとを含む第１の増幅組成物を形成する工程；
該第１の増幅組成物を増幅の少なくとも１つの第１サイクルに供して、少なくとも１つの移動度シフトアナログを含む少なくとも１つの第１の増幅産物を産生する工程；
該第１の増幅産物の少なくとも一部を分析する工程；および
該少なくとも１つの標的領域のメチル化の程度を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１０】
前記決定する工程は、少なくとも１つの標的領域中のメチル化されている標的ヌクレオチドの数を同定する工程を包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの移動度シフトアナログは、ビオチン部分、フルオロフォア、炭化水素、炭化水素の複素環式誘導体、ボラノ三リン酸、ポリエチレングリコール部分、およびチオ三リン酸のうちの少なくとも１つを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記分析する工程は、電気泳動を包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の増幅組成物は、レポータープローブ、挿入剤、またはレポータープローブおよび挿入剤をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記改変剤は、少なくとも１つのメチル化されていない標的ヌクレオチドを改変型ヌクレオチドへと改変するが、少なくとも１つのメチル化されている標的ヌクレオチドを改変型ヌクレオチドへと改変しない、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのｇＤＮＡ標的領域は、多数の異なるｇＤＮＡ標的領域を含み、そして前記少なくとも１つの標的特異的プライマー対は、多数の異なる標的特異的プライマー対を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の増幅組成物は、多数の異なる第１の増幅組成物を含み、該多数の異なる第１の増幅組成物は、それぞれ、（ａ）少なくともいくつかの前記改変されたサンプルおよび（ｂ）１つの異なる標的特異的プライマー対、２つの異なる標的特異的プライマー対、３つの標的特異的プライマー対、４つの異なる標的特異的プライマー対、５つの異なる標的特異的プライマー対、または６つの異なる標的特異的プライマー対を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１つのプライマー対は、第１のレポーター基を含む順方向プライマー、第２のレポーター基を含む逆方向プライマー、または第１のレポーター基を含む順方向プライマーおよび第２のレポーター基を含む逆方向プライマーを含み、該第１のレポーター基および該第２のレポーター基は、同一であるか、または異なる、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
前記増幅の少なくとも１つの第１サイクルは、増幅の多数のサイクルを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
サンプル中の少なくとも１つのｇＤＮＡ標的領域のメチル化の程度を決定するための方法であって、
該サンプルを亜硫酸水素ナトリウムに曝して、改変されたサンプルを得る工程；
少なくともいくつかの該改変されたサンプルと、各標的領域に対する標的特異的プライマー対と、少なくとも１つの移動度シフトアナログと、第１のＤＮＡポリメラーゼとを含む第１の増幅組成物を形成する工程であって、少なくとも１つの順方向プライマー、少なくとも１つの逆方向プライマーまたは標的特異的プライマー対の両方のプライマーが、蛍光レポーター基を含み、そして該少なくとも１つの移動度シフトアナログが、ビオチン部分、フルオロフォア、炭化水素、炭化水素の複素環式誘導体、ボラノ三リン酸、ポリエチレングリコール部分、およびチオ三リン酸のうちの少なくとも１つを含む、工程；
該第１の増幅組成物を増幅の少なくとも１つの第１サイクルに供して、少なくとも１つの移動度シフトアナログを含む少なくとも１つの第１の増幅産物を産生する工程；
該少なくとも１つの第１の増幅産物の少なくとも一部をキャピラリー電気泳動を使用して分析する工程；および
該少なくとも１つの標的領域のメチル化の程度を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２０】
サンプル中の少なくとも１つのｇＤＮＡ標的領域のメチル化の程度を決定するための方法であって、
該サンプルを改変剤に曝して、改変されたサンプルを得る工程；
少なくともいくつかの該改変されたサンプルと、各標的領域に対する標的特異的プライマー対と、第１のＤＮＡポリメラーゼとを含む少なくともいくつかの該改変されたサンプルを含む第１の増幅組成物を形成する工程；
該第１の増幅組成物を増幅の少なくとも１つの第１サイクルに供して、少なくとも１つの第１の増幅産物を産生する工程；
少なくともいくつかの該第１の増幅産物と、少なくとも１つの第１の増幅産物プライマーと、第２のＤＮＡポリメラーゼと、移動度シフトアナログとを含む第２の増幅組成物を形成する工程；
該第２の増幅組成物を増幅の少なくとも１つの第２のサイクルに供して、少なくとも１つの移動度シフトアナログを含む少なくとも１つの第２の増幅産物を産生する工程；
該少なくとも１つの第２の増幅産物の少なくとも一部を分析する工程；および
該少なくとも１つの標的領域のメチル化の程度を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２１】
前記決定する工程は、少なくとも１つの標的領域中のメチル化されている標的ヌクレオチドの数を同定する工程を包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの移動度シフトアナログは、ビオチン部分、フルオロフォア、炭化水素、炭化水素の複素環式誘導体、ボラノ三リン酸、ポリエチレングリコール部分、およびチオ三リン酸のうちの少なくとも１つを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの第１の増幅産物プライマーは、ユニバーサルプライミング配列またはその相補体を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの第１の増幅プライマーは、少なくとも１つの第１の増幅産物プライマー対を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
該少なくとも１つの第１の増幅産物プライマー対のうちの少なくとも１つのプライマーは、ユニバーサルプライミング配列またはその相補体を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１のＤＮＡ  ポリメラーゼおよび第２のＤＮＡポリメラーゼは、同一であるか、または異なる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記分析する工程は、電気泳動を包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記第２の増幅組成物は、レポータープローブ、挿入剤、またはレポータープローブおよび挿入剤をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記改変剤は、少なくとも１つのメチル化されていない標的ヌクレオチドを改変型ヌクレオチドへと改変するが、少なくとも１つのメチル化されている標的ヌクレオチドを改変型ヌクレオチドへと改変しない、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つのｇＤＮＡ標的領域は、多数の異なるｇＤＮＡ標的領域を含み、そして前記少なくとも１つの標的特異的プライマー対は、多数の異なる標的特異的プライマー対を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の増幅組成物は、多数の異なる第１の増幅組成物を含み、該多数の異なる第１の増幅組成物は、それぞれ、（ａ）少なくともいくつかの前記改変されたサンプルおよび（ｂ）１つの異なる標的特異的プライマー対、２つの異なる標的特異的プライマー対、３つの異なる標的特異的プライマー対、４つの異なる標的特異的プライマー対、５つの異なる標的特異的プライマー対、または６つの異なる標的特異的プライマー対を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも１つの第１の増幅産物プライマーは、第１のレポーター基を含む第１の増幅産物の順方向プライマー、第２のレポーター基を含む第１の増幅産物の逆方向プライマー、または第１のレポーター基を含む第１の増幅産物の順方向プライマーおよび第２のレポーター基を含む第１の増幅産物の逆方向プライマーを含み、該第１のレポーター基および該第２のレポーター基は、同一であるか、または異なる、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）（ｉ）前記第１の増幅組成物を増幅の少なくとも１つの第１サイクルに供する工程、（ｉｉ）前記第２の増幅組成物を増幅の少なくとも１つの第２のサイクルに供する工程、または（ｉｉｉ）前記第１の増幅組成物を増幅の少なくとも１つの第１サイクルに供する工程および前記第２の増幅組成物を増幅の少なくとも１つの第２のサイクルに供する工程は、（ｂ）増幅の多数のサイクルを包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
Ｑ−ＰＣＲ反応をさらに包含し、そして少なくとも１つの増幅産物が、レポータープローブ結合部分をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
前記増幅の第２のサイクルは、Ｑ−ＰＣＲを包含し、少なくとも１つの第１の増幅産物は、レポータープローブ結合部分を含み、そして前記第２の増幅組成物は、少なくとも１つのレポータープローブをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
サンプル中の少なくとも１つのｇＤＮＡ標的領域のメチル化の程度を決定するための方法であって、
該サンプルを亜硫酸水素ナトリウムに曝して、改変されたサンプルを得る工程；
少なくともいくつかの前記改変されたサンプルを含む第１の増幅組成物と、各標的領域に対する標的特異的プライマー対と、第１のＤＮＡポリメラーゼとを形成する工程；
該第１の増幅組成物を増幅の少なくとも１つの第１サイクルに供して、少なくとも１つの第１の増幅産物を産生する工程；
少なくともいくつかの該第１の増幅産物と、蛍光レポーター基を含む少なくとも１つの増幅産物の順方向プライマーと、許容ＤＮＡポリメラーゼと、移動度シフトアナログとを含む第２の増幅組成物を形成する工程であって、該少なくとも１つの移動度シフトアナログは、ビオチン部分、フルオロフォア、炭化水素、炭化水素の複素環式誘導体、ボラノ三リン酸、ポリエチレングリコール部分、およびチオ三リン酸のうちの少なくとも１つを含む、工程；
該第２の増幅組成物を増幅の少なくとも１つの第２のサイクルに供して、少なくとも１つの移動度シフトアナログを含む少なくとも１つの第２の増幅産物を産生する工程；
前記少なくとも１つの第２の増幅産物の少なくとも一部をキャピラリー電気泳動を使用して分析する工程；ならびに
前記少なくとも１つの標的領域のメチル化の程度を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項３７】
Ｑ−ＰＣＲ反応をさらに包含し、そして少なくとも１つの増幅産物が、レポータープローブ結合部分をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記増幅の第２のサイクルは、Ｑ−ＰＣＲを含み、少なくとも１つの第１の増幅産物は、レポータープローブ結合部分を含み、そして前記第２の増幅組成物は、少なくとも１つのレポータープローブをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
第１のＤＮＡポリメラーゼと、移動度シフトアナログと、各標的領域に対する標的特異的プライマー対とを備える、キット。
【請求項４０】
制御配列、改変剤、増幅産物プライマー、許容ＤＮＡポリメラーゼ、レポータープローブ、挿入剤、およびレポーター基のうちの少なくとも１つをさらに備える、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
前記移動度シフトアナログは、ビオチン部分、フルオロフォア、炭化水素、炭化水素の複素環式誘導体、ボラノ三リン酸、ポリエチレングリコール部分、およびチオ三リン酸のうちの少なくとも１つを含む、請求項３９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（分野）
本教示は、一般に、生化学、細胞生物学、およびの分野に関連する。より具体的には、方法およびキットは、少なくとも１つのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）標的領域のメチル化の程度を評価するために提供される。
【背景技術】
【０００２】
（導入）
目的とする特定のｇＤＮＡ標的領域のメチル化の程度を決定することは、多くの研究分野、診断分野、医学分野、法医学分野、および産業分野において有用である。ｇＤＮＡ中のシトシン残基のメチル化は、真核生物における重要な後成的な変化である。Ｉｎ  ヒトおよび他の哺乳動物のメチルシトシンは、シトシン−グアニン（ＣｐＧ）ジヌクレオチドにおいてほぼ例外なく見出される。ｇＤＮＡメチル化は、遺伝子調節において重要な役割を果たし、そしてメチル化パターンの変化は、報告によると、多くのヒトの癌および特定のヒトの疾患に関与する。共通して、最古でありかつ最も一般的なヒトの悪性疾患において観察される遺伝的変化は、ＣｐＧ島（特に、遺伝子の５’調節領域内に位置するＣｐＧ島）の異常なメチル化であり、その変化は、このような遺伝子の発現の変化をもたらす。次いで、早期発見、リスクアセスメント、治療的評価、再発のモニタリングなどについての診断的指標としてＤＮＡメチル化マーカーを使用することに大きな関心が存在する（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；および非特許文献７を参照のこと）。
【非特許文献１】Ｗｉｄｓｃｈｗｅｎｄｔｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００４年、第１０巻、ｐ．５６５−７１
【非特許文献２】Ｄｕｌａｉｍｉら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００４年、第１０巻、ｐ．１８８７−９３
【非特許文献３】Ｔｏｐａｌｏｇｌｕら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００４年、第１０巻、ｐ．２２８４−８８
【非特許文献４】Ｌａｉｒｄ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００３年、第３巻、ｐ．２５３−２６６
【非特許文献５】Ｆｒａｇａら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２００２年、第３３巻、ｐ．６３２−４９
【非特許文献６】Ａｄｏｒｊａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００２年、第３０巻、第５号、ｅ２１
【非特許文献７】Ｃｏｌｅｌｌａら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２００３年、第３５巻、第１号、ｐ．１４６−１５０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
大きな科学的関心が、とりわけ、胚形成、細胞分化、トランスジーン発現、転写調節、および維持メチル化におけるＤＮＡメチル化の役割に存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（要旨）
本教示は、サンプル中の少なくとも１つのｇＤＮＡ標的領域のメチル化の程度を決定するための方法およびキットに関する。いくつかの実施形態において、第１のサンプル中の１つ以上の標的領域のメチル化の程度は、第２のサンプル中の同じ標的領域のメチル化の程度と比較され、例えば、その第２のサンプルは、生検サンプルおよびコントロールサン
プル、「処理された」サンプルおよび「未処理」のサンプル、「前」のサンプルおよび「後」のサンプル、胚性サンプルおよび新生児サンプル、若年性サンプル、または成人サンプルなどであるが、これらに限定されない。
【０００５】
特定の方法に従って、少なくとも１つのｇＤＮＡ標的領域を含む少なくとも１つのサンプルは、少なくとも１つの改変型ヌクレオチドを含む少なくとも１つの標的領域を含む少なくとも１つの改変されたサンプルを産生するために、改変剤に曝される。少なくともいくつかの上記改変されたサンプルと、評価される各標的領域に対する標的特異的プライマー対と、第１のＤＮＡポリメラーゼとを含む第１の増幅組成物が、形成される。上記第１の増幅組成物は増幅の少なくとも１つのサイクルに供され、そして第１の増幅産物が、産生される。いくつかの方法に従って、増幅のサイクルは、多数の増幅サイクルを含む。第１のアンプリコンは、少なくとも１つの改変型ヌクレオチドまたはアンプリコンにおけるその相補体の存在または非存在を決定するために分析され、そして少なくとも１つの標的領域についてのメチル化の程度が、推測される。いくつかの実施形態において、分析することは、少なくとも１つの第１のアンプリコンに存在する改変型ヌクレオチドまたはその相補体の数を決定することを包含する。
【０００６】
特定の方法に従って、少なくとも１つのｇＤＮＡ標的領域を含む少なくとも１つのサンプルは、少なくとも１つの改変型ヌクレオチドを含む少なくとも１つの標的領域を含む少なくとも１つの改変されたサンプルを産生するために、改変剤に曝される。少なくともいくつかの上記改変されたサンプルと、評価される各標的領域に対する標的特異的プライマー対と、移動度シフトアナログ（ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔｉｎｇ  ａｎａｌｏｇ）（ＭＳＡ）と、第１のＤＮＡポリメラーゼとを含む第１の増幅組成物が、形成される。上記第１の増幅組成物は、増幅の少なくとも１つのサイクルに供され、そして少なくとも１つの組み込まれたＭＳＡを含む第１の増幅産物が、産生される。少なくとも１つのＭＳＡの増幅産物への組み込みは、ＭＳＡを含まないことを除いて同じ配列の増幅産物に対して、増幅産物の移動度を変化させる。いくつかの方法に従って、増幅のサイクルは、多数の増幅サイクルを含む。上記第１の増幅産物は、少なくとも１つの改変型ヌクレオチドまたはその相補体の存在または非存在を決定するために分析され、そして少なくとも１つの標的領域についてのメチル化の程度が、推測される。いくつかの実施形態において、分析することは、第１の増幅産物に存在する改変型ヌクレオチドまたはその相補体の数を決定することを含む。
【０００７】
特定の方法に従って、少なくとも１つのｇＤＮＡ標的領域を含む少なくとも１つのサンプルは、少なくとも１つの改変型ヌクレオチドを含む少なくとも１つの標的領域を含む少なくとも１つの改変されたサンプルを産生するために、改変剤に曝される。少なくともいくつかの上記改変されたサンプルと、評価される各標的領域に対する標的特異的プライマー対と、第１のＤＮＡポリメラーゼとを含む第１の増幅組成物が、形成される。上記第１の増幅組成物は、増幅の少なくとも１つサイクルに供され、そして第１の増幅産物が、産生される。いくつかの方法に従って、上記増幅の第１サイクルは、増幅の多数のサイクルを含む。少なくともいくつかの上記第１の増幅産物と、増幅産物プライマーと、ＭＳＡと、第２のＤＮＡポリメラーゼとを含む第２の増幅組成物が、形成される。いくつかの実施形態において、上記増幅産物プライマーは、増幅産物の順方向プライマーと増幅産物の逆方向プライマーとを含む増幅産物プライマー対を含む。上記第２の増幅組成物は、増幅の少なくとも１つのサイクルに供され、そして少なくとも１つの組み込まれたＭＳＡを含む第２の増幅産物が、産生される。いくつかの方法に従って、増幅の第２のサイクルは、多数の増幅サイクルを含む。少なくとも１つの組み込まれたＭＳＡを含む第２の増幅産物は、改変型ヌクレオチドまたはその相補体の存在または非存在を決定するために、分析され、そして少なくとも１つの標的領域についてのメチル化の程度が、推測される。いくつかの実施形態において、分析することは、第２の増幅産物に存在する改変型ヌクレオチドま
たはその相補体の数を決定することを包含する。
【０００８】
特定の開示された方法を行うためのキットもまた、提供される。特定の実施形態において、キットは、ＭＳＡ、第１のＤＮＡポリメラーゼ、および少なくとも１つの標的特異的プライマー対を備える。いくつかの実施形態において、キットは、多数の異なる標的特異的プライマー対を備える。特定の実施形態において、キットは、制御配列、改変剤、増幅産物プライマー、増幅産物プライマー対、第２のＤＮＡポリメラーゼ、レポータープローブ、挿入剤、およびレポーター基のうちの少なくとも１つのを備える。
【０００９】
本教示のこれらの特徴および他の特徴は、本明細書中に示される。
【００１０】
当業者は、添付の図面は例示のみを目的とすることが理解される。これらの図面は、決して本教示の範囲を限定することを意図しない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（例示的な実施形態の説明）
上記の一般的説明および以下の詳細な説明の両方は例示かつ説明であり、そして本教示の範囲を限定することを意図しないことが、理解されるべきである。本願において、単数形の使用は、別途具体的に言及されない限り、複数を包含する。例えば、「順方向プライマー」は、１つより多い順方向プライマーが存在し得ることを意味する；例えば、特定の順方向プライマー種の１つ以上のコピー、および１つ以上の異なる順方向プライマー種。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、またはそれらの基語の修飾（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）」、および「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」であるが、これらに限定されない）の使用は、限定することを意図しない。用語「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」は、前と後の用語が一緒かまたは独立して用いられ得ることを意味する。例示目的であるが、限定としてではなく、「Ｘおよび／またはＹ」は、「Ｘ」または「Ｙ」あるいは「ＸおよびＹ」を意味し得る。
【００１２】
本明細書中で使用される節の見出しは構成上の目的のためだけであり、記載された主題を限定するとして決して解釈されるべきではない。特許、特許出願、論文、書籍、学術論文およびインターネットウェブページを含む本願において引用される全ての文献および類似する資料は、明示的に、あらゆる目的のためにその全体が参考として援用される。援用された文献および類似する資料の１つ以上が本願における用語の定義と矛盾するような様式で用語を定義または使用する事象において、本願が支配する。本教示が種々の実施形態と組み合せて記載される一方で、本教示がこのような実施形態に限定されることを意図しない。一方で、本教示は、当業者に認識されるような種々の変更、改変、および等価物を包含する。
【００１３】
発明の名称「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ  Ｋｉｔｓ  ｆｏｒ
Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ」である米国仮特許出願第６０／６５４１６２号（２００５年２月１８日出願）（ここに、米国特許出願第１１／３５２１４３号）は、明示的に、あらゆる目的のためにその全体が参考として援用される。
【００１４】
（いくつかの定義）
本明細書中で使用される場合、用語「親和性タグ」とは、多成分複合体の成分をいい、その多成分複合体の成分は、互いに特異的に相互作用または結合する。多成分親和性タグ複合体のいくつかの非限定的な例としては、リガンドおよびそれらのレセプター（例えば、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、およびビオチン、ストレプトアビジン、またはアビジンの誘導体（２−イミノビオチン、デスチオビオチン、Ｎｅｕｔｒ
Ａｖｉｄｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ＣａｐｔＡｖｉｄｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）などを含む）であるが、これらに限定されない）；結合タンパク質／ペプチドおよびそれらの結合パートナー；エピトープタグ（例えば、ｃ−ＭＹＣ、ＨＡ、ＶＳＶ−Ｇ、およびＦＬＡＧ  ＴａｇＴＭ、ならびにそれらの対応する抗エピトープ抗体であるが、これらに限定されない）；ハプテン（例えば、ジニトロフェノール（「ＤＮＰ」）およびジゴキシゲニン（「ＤＩＧ」）、ならびにそれらの対応する抗体であるが、これらに限定されない）；アプタマーおよびそれらの結合パートナー；蛍光レポーター基および対応する抗蛍光レポーター基抗体；などが挙げられる。いくつかの実施形態において、親和性タグは、レポーター基を含む。特定の実施形態において、親和性タグまたはハイブリダイゼーションタグ成分は、固体支持体にカップリングされ得る。特定の実施形態において、親和性タグおよび／または固体支持体は、分離する手段の一部、検出する手段の一部、またはその両方である。
【００１５】
用語「アニーリングすること」および「ハイブリダイズすること」（基語であるハイブリダイズするおよびアニーリングするのバリエーションを含む）は、交換可能に使用され、そして二重鎖、三重鎖、または他の高次構造の形成を生じる、１つの核酸と別の核酸とのヌクレオチド塩基対形成相互作用を意味する。一次相互作用は、代表的に、ワトソン−クリック型水素結合およびフーグスティーン型水素結合によってヌクレオチド塩基特異的（例えば、Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、およびＧ：Ｃ）である。特定の実施形態において、塩基スタッキングおよび疎水性相互作用はまた、二重鎖の安定性に寄与し得る。
【００１６】
用語「少なくともいくつかの」は、例えば、サンプルまたは改変されたサンプルに関して使用される場合、サンプルまたは改変されたサンプルの全てが使用され得るか、あるいはサンプルまたは改変されたサンプルのいくつか（しかし、全てではない）が使用され得る（例えば、アリコート）ことを意味する。用語「の少なくとも一部」は、例えば、増幅産物を分析することに関して使用される場合、全増幅産物が分析され得るか、二本鎖増幅産物の個々の鎖のうちの一方または両方が分析され得るか、あるいは増幅産物のフラグメント、部分、または断片が分析され得ることを意味する。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、用語「またはそれらの組み合せ」は、この用語の前におかれている列挙された項目のすべての順列および組み合せを示す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの組み合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣまたはＡＢＣのうちの少なくとも１つを含むことが意図され、そして、順序が特定の状況において重要であるならば、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣまたはＣＡＢもまた含むことが意図される。この例を続けると、１つまたは複数の項目または用語の反復を含有する組み合せ、例えば、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどが明らかに含まれる。当業者は、状況から別途明らかでない限り、代表的には、任意の組み合せにおける項目または用語の数に対する制限がないことを理解する。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、用語「対応する」とは、この用語が関連する要素の間での少なくとも１つの特異的な関係をいう。例えば、特定のプライマー対の逆方向プライマーは、同じプライマー対の順方向プライマーに対応し、そしてその逆も同様である。少なくとも１つの増幅産物プライマーは、少なくとも１つの対応するアンプリコンのプライマー結合部分とアニーリングするように設計される。標的特異的な逆方向プライマーの標的特異的部分は、対応する下流の標的領域フランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列の相補領域または実質的な相補領域と選択的にハイブリダイズするように設計される。特定の親和性タグは、対応する親和性タグに結合する（例えば、ストレプトアビジンに対するビオチンの結合であるが、これに限定されない）。特定のハイブリダイゼーションタグは、その対応するハイブリダイゼーションタグ相補体；などとアニーリングする。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「メチル化の程度」とは、ｇＤＮＡ標的領域に関して使用される場合、メチル化されていない標的領域の量に対するメチル化されているサンプル内の同じ標的領域の量、または標的領域中のメチル化されているヌクレオチドの相対数、あるいはその両方をいう。特定の実施形態において、サンプルは、完全にメチル化されている標的領域、メチル化されていない標的領域、完全にメチル化されているいくつかのコピーとメチル化されていないいくつかのコピーを有するとを有する標的領域を含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、いくつか（しかし、全てではない）のメチル化されているその標的ヌクレオチドを有する標的領域のコピー（中間のメチル化）を含み、そのコピーとしては、１つの量の中間のメチル化を有するいくつかのコピーおよび少なくとも１つの異なるレベルの中間のメチル化を有するいくつかの他のコピーが挙げられる。いくつかの実施形態において、特定の標的領域についてのメチル化の程度を決定することは、メチル化されていない標的領域に対するメチル化されている標的領域の比を得ることを包含する、それは、例えば、同じであるがメチル化されていない標的領域に由来するアンプリコンのピーク高さ（メチル化されている標的領域に由来するアンプリコンのピーク高さと比較したもの）の間の比であるが、これに限定されない。特定の実施形態において、特定の標的領域についてのメチル化の程度を決定することは、標的領域中のメチル化されているヌクレオチドの数を同定すること（例えば、少なくとも１つのＭＳＡを含むアンプリコンの増加性の移動度シフトを評価することおよびアンプリコンが由来する標的領域中のメチル化されているヌクレオチドの数を決定する増加性の移動度シフトの大きさに基づいて組み込まれたＭＳＡの数を計算することであるが、これらに限定されない）を包含する。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「変性させること」または「変性」とは、二本鎖ポリヌクレオチド（二本鎖増幅産物または二本鎖ｇＤＮＡフラグメントを含む）が２つの一本鎖ポリヌクレオチドに変換される任意の工程をいう。二本鎖ポリヌクレオチドを変性させることとしては、二重鎖を変性させるための種々の熱的技術および化学技術を変性させ、それによってその２つの一本鎖成分を放出することが挙げられるが、これに限定されない。当業者は、使用される変性させる技術は、一般に、それが次の分析および／または分析する工程を阻害しないかまたはかなり妨害しない限り制限されていないことを理解する。
【００２１】
用語「ＤＮＡポリメラーゼ」は、本明細書において広い意味で使用され、そして核酸ポリマーに対するデオキシリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのアナログの鋳型依存的様式における付加を触媒し得る任意のポリペプチドをいう。例えば、プライマー伸長反応の間に核酸鋳型にアニーリングするプライマーの３’末端に対するデオキシリボヌクレオチドの連続的付加であるが、これに限定されない。代表的に、ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素を含む）が挙げられる。特定の逆転写酵素は、特定の反応条件下でＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する（ＡＭＶ逆転写酵素およびＭＭＬＶ逆転写酵素を含む）。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するこのような逆転写酵素は、開示された方法で使用するのに適切であり得、そして明らかに、本教示の企図の範囲内である。ＤＮＡポリメラーゼの記載は、別の場所において、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、ＮｅｌｓｏｎおよびＣｏｘ、Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２０００（特に、第２６章および第２９章）；Ｔｗｙｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９９；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００５年５月の補遺を含む）（以下「Ａｕｓｕｂｅｌら」）；ＬｉｎおよびＪａｙｓｅｎａ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７１：１００−１１、
１９９７；Ｐａｖｌｏｖら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２５３−６０、２００４；ならびにＥｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｇｕｉｄｅ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ、１９９８、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩに見出され得る。明らかに、用語「ＤＮＡポリメラーゼ」の意図された範囲に、その酵素的に活性な変異体または改変体（異なる温度感受性特性を与える改変された酵素（例えば、米国特許第５，７７３，２５８号；同第５，６７７，１５２号；および同第６，１８３，９９８号；ならびにＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＤｅｍｉｄｏｖおよびＢｒｏｕｄｅ（編）、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、２００４（特に、第１．１章）を参照のこと）を含む）が含まれる。
【００２２】
用語「挿入剤」は、広い意味で使用され、そして（１）（ａ）ポリヌクレオチドのヌクレオチド塩基の間に挿入され得るか、または（ｂ）ポリヌクレオチドの鎖の間に挿入され得（時として、溝結合因子（ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ）とも称される）、そして（２）直接的かまたは間接的に検出可能である任意の化合物または物質を含む。挿入剤の非限定的な例としては、特定の抗生物質および抗腫瘍物質（例えば、アクチノマイシンＤ、ヒカントン、ベレニル（ｂｅｒｅｎｉｌ）、ネトロプシン（ｎｅｔｒｏｐｓｉｎ）、ジスタマイシン、ブレオマイシン、およびダウノマイシン）が挙げられ、それらは、レポーター基（ソラレン、挿入色素（例えば、アクリジンオレンジ、ジアミノクリジン、ＳＹＢＲＯ
Ｇｒｅｅｎ、プロフラビン、エチジウムブロマイド、チアゾールオレンジ（ＴＯ）ファミリー色素（ＴＯＴＯ色素を含む）、ＰＯＰＯファミリー色素、オキサゾールイエロー（ＹＯ）ファミリー色素（ＹＯＹＯ色素、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、およびクロロキンを含む）、そしてこのような化合物の誘導体を含む）をさらに含んでも含まなくてもよい。溝結合因子を含む挿入剤の記載は、別の場所において、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、ＢｌａｃｋｂｕｒｎおよびＧａｉｔ（編）、１９９６、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕ．Ｋ．（以下「ＢｌａｃｋｂｕｒｎおよびＧａｉｔ」）（特に、第８．３節〜第８．５節）；ならびにＨａｕｇｌａｎｄ、Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、第１０版、２００５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ（以下「Ｈａｕｇｌａｎｄ」）に見出され得る。
【００２３】
用語「メチル化されているアンプリコン」とは、少なくとも１つのメチル化されている標的ヌクレオチド（例えば、５ｍＣであるが、これに限定されない）を含む標的領域に由来する増幅産物をいう。メチル化されているアンプリコンは、二本鎖または一本鎖のいずれかであり得、そして第１の増幅産物、第２の増幅産物、またはその両方であり得る。用語「メチル化されていないアンプリコン」とは、メチル化されている標的ヌクレオチドを含まない標的領域に由来する増幅産物をいう。メチル化されていないアンプリコンは、二本鎖または一本鎖のいずれかであり得、そして第１の増幅産物、第２の増幅産物、またはその両方であり得る。
【００２４】
特定の実施形態において、少なくとも１つの標的領域を含むｇＤＮＡサンプルは、少なくとも１つの改変型標的ヌクレオチドを含む改変されたサンプルを得るために、改変剤を用いて処理される。用語「改変剤」とは、核酸を改変し得る任意の試薬をいう（例えば、少なくとも１つのｇＤＮＡ標的領域中の少なくとも１つの標的ヌクレオチドであるが、これに限定されない）。いくつかの改変剤は、メチル化されていない標的ヌクレオチドを改変型ヌクレオチドに変換するが、メチル化されている標的ヌクレオチドを改変型ヌクレオチドに変換しない（少なくとも著しい程度ではない）。
【００２５】
特定の実施形態において、亜硫酸水素塩は、改変剤として使用される。核酸配列（例えば、ｇＤＮＡ）を亜硫酸水素塩と一緒にインキュベートすることは、メチル化されていないシトシンの実質的部分の脱アミノ化をもたらし、このインキュベーションは、このようなシトシンをウラシルに変換する。メチル化されているシトシンは、測定可能により低い程度まで脱アミノ化される。特定の実施形態において、次いで、サンプルは、増幅され、チミンによって置換されるウラシル塩基を生じる。したがって、特定の実施形態において、メチル化されていない標的シトシンの実質的部分は、最終的に、チミンになるが、メチル化されているシトシンの実質的部分は、シトシンを保持する。特定の実施形態において、標的領域中に改変型ヌクレオチド（例えば、ウラシルまたはチミンであるが、これらに限定されない）の存在は、本教示の方法およびキットを使用して決定され得る。亜硫酸水素塩処理の記載は、別の場所において、米国特許第６，２６５，１７１号および同第６，３３１，３９３号；ＢｏｙｄおよびＺｏｎ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２６：２７８−２８０、２００４；米国仮特許出願第６０／４９９，１１３号；同第６０／５２０，９４２号；同第６０／４９９，１０６号；同第６０／５２３，０５４号；同第６０／４９８，９９６号；同第６０／５２０，９４１号；同第６０／４９９，０８２号；および同第６０／５２３，０５６号に見出され得る。
【００２６】
用語「ヌクレオチドターミネーター（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）」または「ターミネーター」とは、増幅反応において次のヌクレオチドの組み込みを支援しない酵素的に組み込み可能なヌクレオチド（したがって、伸長可能なヌクレオチドではない）をいう。いくつかの実施形態において、第１の増幅組成物および／または第２の増幅組成物は、ヌクレオチドターミネーターを含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドターミネーターは、レポーター基を含む。
【００２７】
用語「レポーター基」は、本明細書において広い意味で使用され、そして任意の同定可能なタグ、標識、または部分をいう。当業者は、多くの異なる種のレポーター基は個別かまたは１つ以上の異なるレポーター基と組み合せて本教示において使用され得ることを認識する。
【００２８】
用語「選択的にハイブリダイズする」およびそのバリエーションは、適切な条件下で、所与の配列がヌクレオチドの相補体または実質的に相補的な線（ｓｔｒｉｎｇ）を含む第２の配列とアニーリングするが、望まれない配列にアニーリングしないことを意味する。本願において、１つの配列が別の配列と選択的にハイブリダイズするかまたはアニーリングするという記載は、配列の両方の全体が互いにハイブリダイズする状況、および配列の一方または両方の一部のみが他の配列全体または他の配列の一部にハイブリダイズする状況を包含する。この定義に関して、用語「配列」は、核酸配列、ポリヌクレオチドｓ、オリゴヌクレオチド、プライマー、標的特異的部分、増幅産物特異的部分、プライマー結合部位、ハイブリダイゼーションタグ、およびハイブリダイゼーションタグ相補体を含む。
【００２９】
本願において、１つの配列が別の配列と同一であるか、実質的に同一であるかか、相補的であるか、または実質的に相補的であるという記載は、配列の両方が互いに完全に同一であるか、実質的に同一であるか、もしくは相補的であるかまたは実質的に相補的である状況、および配列の１つの部分のみが一部または他の配列全体と同一であるか、実質的に同一であるか、相補的であるか、または実質的に相補的である状況を含む。この定義の目的に関して、用語「配列」は、核酸配列、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、プライマー、標的特異的部分、増幅産物特異的部分、プライマー結合部位、ハイブリダイゼーションタグ、およびハイブリダイゼーションタグ相補体を含む。
【００３０】
（特定の例示的な構成要素）
用語「サンプル」は、本明細書において広い意味で使用され、そしてｇＤＮＡを含かま
たはｇＤＮＡを含むと推定されるこのような生物学的材料に由来するかまたはそれから抽出される広範な生物学的材料および組成物を含むことが意図される。例示のサンプルは、全血；有核の赤血球；白血球；バフィーコート；毛；爪および角質物質；スワブ（口腔スワブ、咽頭スワブ、膣スワブ、尿道スワブ、頚部スワブ、直腸スワブ、病変スワブ、膿瘍スワブ、鼻咽頭スワブなどを含む）；尿；痰；唾液；精液；リンパ液；羊水；脳脊髄液；腹水；胸水；嚢胞由来の流体；滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｌｕｉｄ）；硝子体液；房水；滑液（ｂｕｒｓａ  ｆｌｕｉｄ）；洗眼液；眼の吸引液（ｅｙｅ  ａｓｐｉｒａｔｅ）；血漿；肺洗浄液；肺の吸引液；および組織（肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、脳、心臓、筋肉、膵臓、生検材料などを含む）。当業者は、上記の例示的な生物学的サンプルのいずれかから得られる溶解物、抽出物、または材料もまた本教示の範囲内であることを認識する。組織培養細胞（拡大培養材料（ｅｘｐｌａｎｔｅｄ  ｍａｔｅｒｉａｌ）、一次細胞、二次細胞などを含む）、および任意の細胞から得られる溶解物、抽出物、または物質もまた、本明細書中で使用される用語「サンプル」の意味の範囲内である。法医学的設定、農業的設定、および／または環境的設定から得られる少なくとも１つのｇＤＮＡ標的領域を含むかまたは含むと推定される材料もまた、用語「サンプル」の意図される意味の範囲内である。特定の実施形態において、サンプルは、合成核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、完全に合成であり、それは、例えば、少なくとも１つの合成核酸配列を含む緩衝溶液を含むコントロールサンプルであるが、これに限定されない。
【００３１】
本教示の第１の増幅組成物は、対応する第１のフランキング配列と第２のフランキング配列との間に位置する少なくとも１つの標的領域を含むｇＤＮＡを含む。「第１の標的フランキング配列」は、代表的に、標的領域の上流（すなわち、標的領域の５’側）に位置し、そして対応する「第２の標的フランキング配列」は、代表的に、標的領域の下流（すなわち、標的領域の３’側）に位置する。例示を目的として、その２つの標的フランキング配列に対する例示の標的領域の配向は、５’−第１の標的フランキング配列−標的領域−第２の標的フランキング配列−３’である。標的フランキング配列が標的領域と隣接し得るが必ずしもそうではないことを、理解する。したがって、さらなるヌクレオチドは、標的フランキング配列と標的領域との間に存在し得る。順方向標的特異的プライマーの標的結合部分は、第１の標的フランキング配列内第１の標的フランキング配列または下位配列の相補体と選択的にハイブリダイズするように設計される配列を含む。逆方向標的特異的プライマーの標的結合部分は、第２の標的フランキング配列内の第２の標的フランキング配列または下位配列と選択的にハイブリダイズするように設計される配列を含む。
【００３２】
用語「標的領域」とは、メチル化されているヌクレオチドの存在または非存在を決定し、そして標的領域のメチル化の程度を推測するために増幅および分析されるべきｇＤＮＡセグメントをいう。標的領域は、特定の生理学的条件下でメチル化されていることが公知であるかまたはそれが推定される目的の遺伝子のプロモーターエレメントまたは調節エレメントに位置し得る。標的領域は、一般に、２つのフランキング配列の間に位置する（第１の標的フランキング領域と第２の標的フランキング領域との間、標的領域のいずれかの側に位置する）が、必ずしも標的領域に隣接しない。いくつかの実施形態において、ｇＤＮＡセグメントは、複数の異なる標的領域を含む。いくつかの実施形態において、標的領域は、１つ以上の異なる標的領域と連続している（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｗｉｔｈ）かまたは隣接する（ａｄｊａｃｅｎｔ  ｔｏ）。いくつかの実施形態において、所与の標的領域は、第１の標的領域の５’末端上で第１の標的領域か、第２の標的領域の３’末端上で第２の標的領域か、またはその両方と重複し得る。
【００３３】
標的領域は、合成か、または天然に存在するかのいずれかであり得る。特定の標的領域（適切な場合に、フランキング配列を含む）は、当該分野において周知であるオリゴヌクレオチド合成方法を使用して合成され得る。このような教示の詳細な記載は、別の場所において、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｅａｕｃａｇｅら（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００５年５月の改訂を含む）（以下、「Ｂｅａｕｃａｇｅら」）；ならびにＢｌａｃｋｂｕｒｎおよびＧａｉｔに見出され得る。標的領域およびプライマーを合成するのに有用な自動化ＤＮＡ合成機は、多くの供給源から市販されており、それとしては、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  Ｍｏｄｅｌｓ  ３８１Ａ、３９１、３９２、および３９４（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）が挙げられる。標的領域（適切な場合に、フランキング領域を含む）はまた、当該分野において周知であるインビボの方法論および／またはインビトロの方法論を使用して生合成的に産生され得る。このような方法論の記載は、別の場所において、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら」）；およびＡｕｓｕｂｅｌらに見出され得る。ゲノムＤＮＡはまた、当該分野において公知である任意のサンプル調製技術を使用して生物学的材料から得られ得る。精製されたか、または部分的に精製されたｇＤＮＡは、多くの供給源（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ；およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡを含む）から市販されている。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」は、交換可能に使用され、そしてヌクレオチド間ホスホジエステル結合連結またはヌクレオチド間アナログ、および関連する対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋など）によって連結されたヌクレオチドモノマー（２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ））の一本鎖ポリマーおよび二本鎖ポリマーをいう。ポリヌクレオチドは、全体が、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドから構成され得るか、またはそのキメラ混合物であり得る。そのヌクレオチドモノマー単位は、本明細書中に記載される任意のヌクレオチドを含み得、そのヌクレオチドとしては、ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログが挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、代表的に、それらが時として当該分野においてオリゴヌクレオチドとして称される場合、いくつかのモノマー単位（例えば、５〜４０）〜数千のモノマーヌクレオチド単位の範囲である。他に示されない限り、ポリヌクレオチド配列が示される場合はいつでも、他に記載されない限り、ヌクレオチドは、左から右に５’から３’であること、および「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシトシンを示すかまたはおそらく５−メチルデオキシシトシン（５ｍＣ）を示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示し、そして「Ｕ」デオキシウリジンを示すことが、理解される。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド塩基」は、置換または非置換の芳香族環をいう。特定の実施形態において、上記芳香族環は、少なくとも１つの窒素原子を含有する。特定の実施形態において、ヌクレオチド塩基は、相補的なヌクレオチド塩基とのワトソン−クリック型水素結合またはフーグスティーン型水素結合を形成し得る。例示的なヌクレオチド塩基およびそのアナログとしては、天然に存在するヌクレオチド塩基アデニン、グアニン、シトシン、５ｍＣ、ウラシル、およびチミン、ならびに天然に存在するヌクレオチド塩基のアナログ（７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザ−８−アザアデニン、Ｎ６−Δ２−イソペンテニルアデニン（６ｉＡ）、Ｎ６−Δ２−イソペンテニル−２−メチルチオアデニン（２ｍｓ６ｉＡ）、Ｎ２−ジメチルグアニン（ｄｍＧ）、７−メチルグアニン（７ｍＧ）、イノシン、ネブラリン（ｎｅｂｕｌａｒｉｎｅ）、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、プソイドシトシン、プソ
イドイソシトシン、５−プロピニルシトシン、イソシトシン、イソグアニン、７−デアザグアニン、２−チオピリミジン、６−チオグアニン、４−チオチミン、４−チオウラシル、Ｏ６−メチルグアニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｏ４−メチルチミン、５，６−ジヒドロチミン、５，６−ジヒドロウラシル、ピラゾロ［３，４−Ｄ］ピリミジン（例えば、米国特許第６，１４３，８７７号および同第６，１２７，１２１号ならびにＰＣＴ出願公開ＷＯ  ０１／３８５８４を参照のこと）、エテノアデニン、インドール（例えば、ニトロインドールおよび４−メチルインドール）、およびピロール（例えば、ニトロピロール）を含む）が挙げられる。ヌクレオチド塩基の非限定的な例は、例えば、Ｆａｓｍａｎ、１９８９、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｐｐ．３８５−３９４、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．、およびその中に引用される参考文献に見出され得る。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオシド」は、ヌクレオチド塩基が糖（例えば、リボース、アラビノース、キシロース、およびピラノース）、およびその糖アナログのＣ−１’炭素に共有結合的に連結している化合物をいう。用語「ヌクレオチド」はまた、ヌクレオチドアナログを包含する。上記糖は、置換されていても置換されていなくてもよい。置換されたリボース糖としては、炭素原子（例えば、２’炭素原子）の１つ以上が１つ以上の同じであるかまたは異なる、−Ｒ、−ＯＲ、−ＮＲ２アジド、シアニドまたはハロゲン基によって置換されているリボースが挙げられるが、これに限定されず、各Ｒは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ２−Ｃ７アシル、またはＣ５−Ｃ１４アリールである。例示のリボースとしては、２’−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシリボース、２’−（Ｃ５−Ｃ１４）アリールオキシリボース、２’，３’−ジデヒドロリボース、２’−デオキシ−３’−ハロリボース、２’−デオキシ−３’−フルオロリボース、２’−デオキシ−３’−クロロリボース、２’−デオキシ−３’−アミノリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシリボースおよび２’−デオキシ−３’−（Ｃ５−Ｃ１４）アリールオキシリボース、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’−ハロリボース、２’−フルオロリボース、２’−クロロリボース、および２’−アルキルリボース（例えば、２’−Ｏ−メチル）、４’−α−アノマーヌクレオチド、１’−α−アノマーヌクレオチド、２’−４’−連結型および３’−４’−連結型ならびに他の「ロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）」または「ＬＮＡ」、二環性糖改変（例えば、ＰＣＴ出願公開ＷＯ  ９８／２２４８９、ＷＯ  ９８／３９３５２、およびＷＯ  ９９１１４２２６；ならびにＢｒａａｓｃｈおよびＣｏｒｅｙ、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：１−７、２００１を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。「ＬＮＡ」または「ロックされた核酸」は、リボース環が、例えば、２’−酸素と３’−炭素または４’−炭素との間であるが、これに限定されないメチレン連結によって制約されるように立体配座的にロックされるＤＮＡアナログである（すなわち、２’−５’骨格を有する３’−４’ＬＮＡ）（例えば、米国特許第６，２６８，４９０号および同第６，６７０，４６１号）。上記連結によって強いられる立体配座制約は、多くの場合、相補配列について結合親和性を増大させ、そしてそのような二重鎖の熱安定性を増大させる。ポリヌクレオチド内の例示のＬＮＡ糖アナログは、以下の構造を含む：
【００３７】
【化１−１】
2009508475.tif 000003
Ｂは、任意のヌクレオチド塩基である。
【００３８】
リボースの２’位または３’位は、改変されて、水素、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、シアノ、アミド、イミド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロおよびブロモを含み得る。ヌクレオチドは、Ｌ型光学異性体形態と同様に、天然のＤ型光学異性体を含む（Ｇａｒｂｅｓｉ（１９９３）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：４１５９−６５；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ（１９９０），Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：７４５３；Ｕｒａｔａ（１９９３），Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒ．Ｎｏ．２９：６９−７０）。核酸塩基がプリン（例えば、ＡまたはＧ）であるとき、リボース糖は核酸塩基のＮ９位に結合する。核酸塩基がピリミジン（例えば、Ｃ、ＴまたはＵ）であるとき、ペントース糖は核酸塩基のＮ１位に結合する（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，（１９９２）ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第２版，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）。
【００３９】
ヌクレオチドのペントース炭素の１つまたは複数を、下記の式を有するリン酸エステルにより置換することができる：
【００４０】
【化１−２】
2009508475.tif 000004
式中、αは０〜４の整数である。特定の実施形態において、αは２であり、リン酸エステルがペントースの３’位または５’位の炭素に結合する。特定の実施形態において、ヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基が、プリン、７−デアザプリン、ピリミジン、ユニバーサルヌクレオチド塩基、特定のヌクレオチド塩基、または、それらのアナログであるヌクレオシドである。「ヌクレオチド  ５’−三リン酸」とは、５’位置に三リン酸エステル基を有するヌクレオチドをいい、そして時として、特にリボース糖の構造的特徴を指摘するために「ｒＮＴＰ」、または「ｄＮＴＰ」および「ｄｄＮＴＰ」と示されるか、あるいは一般的に「ＮＴＰ」と示される。三リン酸エステル基は、種々の酸素に関する硫黄置換を含み得る（例えば、α−チオ−ヌクレオチド５’−三リン酸）。ヌクレオチド化学の概
説は、別の場所において、Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．およびＢｏｇｄａｎｏｖ，Ａ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、ＶＣＨ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４；ならびにＢｌａｃｋｂｕｒｎおよびＧａｉｔに見出され得る。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチドアナログ」とは、ヌクレオチドのペントース糖またはヌクレオチド塩基またはリン酸エステルの１つ以上がそのそれぞれのアナログによって置換され得る実施形態をいう。特定の実施形態において、例示のペントース糖アナログは、上に示されるものである。特定の実施形態において、ヌクレオチドアナログは、上に記載されるようなヌクレオチド塩基アナログを有する。特定の実施形態において、例示のリン酸エステルアナログとしては、アルキルホスホネート、メチルホスホネート、ホスホラミデート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボラノホスフェートなどが挙げられるが、これらに限定されず、そして関連する対イオンを含み得る。
【００４２】
用語「移動度シフトアナログ」または「ＭＳＡ」とは、アンプリコンに組み込まれる場合に、同じ配列を含むがＭＳＡではない天然のヌクレオチドを有するアンプリコンと比較して、分析する技術（例えば、移動度依存性分析技術）において移動速度またはアンプリコンを検出可能に変化させるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、またはｄＴＴＰのヌクレオチドアナログをいう。換言すれば、組み込まれたＭＳＡを含むアンプリコンは、その長さから期待される少なくとも１つ分析技術における異なる位置に移動する。いくつかの実施形態において、ＭＳＡを含むアンプリコンは、ＭＳＡを欠くその対応物よりも速く移動する。他の実施形態において、ＭＳＡを含むアンプリコンは、ＭＳＡを欠くその対応物よりもゆっくりと移動する。移動度シフトを誘導するのに適切であり得るヌクレオチドアナログの非限定的な例としては、ボラノ三リン酸（ｂｏｒａｎｏｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（α−Ｐ−ボラノ三リン酸を含む）、チオ三リン酸（デオキシ−５’−（α−チオ）三リン酸（例えば、ｄＣＴＰαＳ））、長いリンカーアーム（例えば、（ＣＨ２）ｎおよび／または（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎであるが、これらに限定されない）を含むヌクレオチドアナログ（ビオチン−１１−ｄＣＴＰ、ビオチン−１１−ｄＣＴＰ、ビオチン−１１−ｄＵＴＰ、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ、ビオチン−アミノヘキシルアクリルアミド−ｄＣＴＰ（ビオチン−ａｈａ−ｄＣＴＰ）、ビオチン−ａｈａ−ｄＵＴＰ、ビオチン−１４−ｄＣＴＰ、ビオチン−３６−ｄＵＴＰ、ビオチン−３６−ｄＣＴＰ、ビオチン−３６−ｄｃＡＴＰ、および複素環（例えば、ビオチン、Ｎ−置換ビオチン、およびホモビオチン同族体（ｃｏｇｎａｔｅ）であるが、これらに限定されない）を含む）、炭化水素の複素環式誘導体、およびポリエチレングリコール同族体、当業者は、ＭＳＡとして使用するための特定のヌクレオチドアナログの適合性が、部分的に、標的領域、増幅反応のために使用されるＤＮＡポリメラーゼ、各アナログによって与えられる移動度シフト、分離手段および／もしくは検出手段、ソフトウェア、またはその組み合せに依存することを認識する。当業者は、１つ以上のＭＳＡの適合性が、例えば、公知のメチル化状態の標的領域を出発物質として使用し、そして所望の反応条件または種々の反応条件下で本開示の方法の１つ以上を行って、過度な実験を行うことなく、実験的に評価され得ることを理解する。
【００４３】
用語「プライマー」とは、ｇＤＮＡ標的フランキング配列または増幅産物の対応するプライマー結合部位に選択的にハイブリダイズし；そしてその３’末端から対応するポリヌクレオチド鋳型と相補的な配列の合成を可能にするポリヌクレオチドをいう。
【００４４】
本教示の「標的特異的プライマー対」は、順方向標的特異的プライマーおよび逆方向標的特異的プライマーを含む。順方向標的特異的プライマーは、第１または上流の標的フラ
ンキング配列のヌクレオチド配列と同じであるかまたは実質的に同じ配列、および別の場所において、逆方向の鎖増幅産物に存在する上流標的フランキング配列の相補体と選択的にハイブリダイズするように設計される配列を含む第１の標的特異的部分を含む。いくつかの実施形態において、順方向標的特異的プライマーはさらに、第１の標的特異的部分の上流に位置し、第１のプライマー結合部位を含む第１の尾部をさらに含む。プライマー対の逆方向標的特異的プライマーは、第２または下流の標的領域フランキング配列と相補的であるかまたは実質的に相補的な配列、および第２または下流の標的領域フランキング配列と選択的にハイブリダイズするように設計される配列を含む第２の標的領域特異的部分を含む。いくつかの実施形態において、逆方向標的特異的プライマーは、第２の標的特異的部分の上流に位置し、第２のプライマー結合部位を含む第２の尾部をさらに含む。いくつかの実施形態において、逆方向標的特異的プライマーの尾部は、特定のＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長産物の末端に対するヌクレオチド（代表的に、Ａ）の非鋳型性（ｎｏｎ−ｔｅｍｐｌａｔｅｄ）の付加（時としてＣｌａｒｋ反応（例えば、Ｃｌａｒｋ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６（２０）：９６７７−８４，１９８８を参照のこと）と称される）を増強するように設計される配列をさらに含む。このような配列のいくつかの非限定的な例としては、ＧＴＴＴＣＴＴ、ＧＴＴＴ、およびＧＴＴ（時としてＰＩＧｔａｉｌ配列と称される（例えば、Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０（６）：１００４−１０、１９９６））、またはテイルドプライマー（ｔａｉｌｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ）の５’末端における単一のＧが挙げられる。特定の実施形態において、少なくとも１つの順方向標的特異的プライマー、少なくとも１つの逆方向標的特異的プライマー、または少なくとも１つの順方向標的特異的プライマーおよび少なくとも１つの逆方向標的特異的プライマーは、レポータープローブ結合部位、さらなるプライマー結合部位、またはレポーター基（例えば、蛍光レポーター基であるが、これに限定されない）のうちの少なくとも１つをさらに含む。特定の実施形態において、標的特異的プライマー対の順方向プライマーおよび対応する逆方向プライマーは、温度ベースの非対称ＰＣＲを可能にする異なる融解温度（Ｔｍ）を有する。
【００４５】
いくつかの実施形態において、標的特異的プライマー対は、ｇＤＮＡ標的領域の上流（５’）に位置する第１の標的フランキング配列と同じであるかまたは実質的に同じである第１の標的結合部分を含む（１）順方向標的特異的プライマーおよび同じｇＤＮＡ標的領域の下流（３’）に位置する対応する第２の標的フランキング配列と相補的であるかまたは実質的に相補的である第２の標的結合部分を含む対応する（２）逆方向標的特異的プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的特異的プライマー対、（ａ）ｇＤＮＡ標的領域の上流（５’）に位置する第１の標的フランキング配列と同じであるかまたは実質的に同じである第１の標的結合部分、および（ｂ）第１の標的結合部分の上流に位置する第１の尾部を含む（１）順方向標的特異的プライマーを含み、尾部配列は、第１のプライマー結合部位；ならびに（ａ）同じｇＤＮＡ標的領域の下流（３’）に位置する対応する第２の標的フランキング配列と相補的であるかまたは実質的に相補的である第２の標的結合部分および（ｂ）第２の標的結合配列の上流に位置する第２の尾部配列を含む（２）対応する逆方向標的特異的プライマーを含み、その第２の尾部配列は、第２のプライマー結合部位を含む。
【００４６】
当業者は、特定の改変剤（例えば、硫酸水素ナトリウムであるが、これに限定されない）によるｇＤＮＡの処理がメチル化されていないＣをＵへと脱アミノ化させることを認識する。メチル化されていないＣを含むｇＤＮＡフランキング領域は、亜硫酸水素ナトリウム処理後に、対応する標的特異的プライマーの選択的にハイブリダイズする能力を妨げ得るかまたは減少させ得る、改変されたサンプルのフランキング領域中の改変型ヌクレオチドを生じる。本教示の標的特異的プライマーは、代表的に、外部ＣｐＧ島である標的フランキング配列に選択的にハイブリダイズして標的領域アンプリコンを標的領域のメチル化状態にかかわらず産生させるように設計される。
【００４７】
用語「増幅産物プライマー対」とは、順方向増幅産物プライマーおよび対応する増幅産物の逆方向プライマーをいう。いくつかの実施形態において、増幅プライマー対は、ユニバーサルプライマーまたはユニバーサルプライマー対を含み、そして同じプライマー対は、増幅産物の少なくとも２つの異なる種を増幅するために使用される。いくつかの実施形態において、増幅産物プライマー対は、１つの増幅産物種を増幅するように設計される順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。例えば、特定の一本鎖の第１の増幅産物種の上流プライマー結合部位の相補体と選択的にハイブリダイズするように設計される配列を含む第１の増幅産物の順方向プライマーおよび同じ一本鎖の第１の増幅産物種の対応する下流プライマー結合部位と選択的にハイブリダイズするように設計される第１の増幅産物の逆方向プライマーを含む第１の増幅産物プライマー対であるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、増幅産物プライマー対は、標的特異的プライマー対（ネステッドプライマー対を含む）の結合部位または標的特異的プライマー対の結合部位と部分的に重複する結合部位の内部である、増幅産物の対応する領域またはその相補体と選択的にハイブリダイズするように設計される。特定の実施形態において、少なくとも１つの  増幅産物の順方向プライマー、少なくとも１つの増幅産物の逆方向プライマー、または少なくとも１つの増幅産物の順方向プライマーおよび少なくとも１つの増幅産物の逆方向プライマーは、レポータープローブ結合部位、さらなるプライマー結合部位、およびレポーター基（例えば、蛍光レポーター基であるが、これに限定されない）のうちの少なくとも１つをさらに含む。特定の実施形態において、増幅産物プライマー対の順方向プライマーおよび対応する逆方向プライマーは、温度ベースの非対称ＰＣＲを可能にする異なる融解温度を有する。
【００４８】
特定の実施形態において、プライマーの相補体の１つ以上は、１つ以上の他のプライマー相補体と重複し得るか、または部分的に重複し得る。例えば、標的特異的部分は、プライマー結合部位、レポータープローブ結合部位、ハイブリダイゼーションタグ、親和性タグ、レポーター基と重複し得るか、または部分的に重複し得るが、これに限定されない。
【００４９】
当業者は、本開示のｇＤＮＡ標的領域の相補体、プライマー、標的特異的部分、プライマー結合部位、またはそれらの組み合わせが本教示の特定の実施形態において使用され得ることを認識する。例えば、特定のｇＤＮＡは、ｇＤＮＡ標的領域およびその相補体の両方を含み得るが、これに限定されない。したがって、特定の実施形態においてｇＤＮＡサンプルが変性される場合、標的領域およびその相補体の両方がサンプルに存在し、一本鎖配列および一本鎖配列のいずれかまたは両方が増幅および分析され得る。しかし、当業者は、特定の状況において、標的領域を含む二本鎖ｇＤＮＡセグメントは半メチル化され得ることを認識する。例えば、二本鎖ｇＤＮＡセグメントの１つの鎖がメチル化されている標的ヌクレオチドを含み得る一方で、相補的なｇＤＮＡ鎖中の対応する標的ヌクレオチドがメチル化されていないが、これに限定されない。特定の実施形態において、問題のｇＤＮＡセグメントのメチル化状態の正確な理解を得るために、標的領域およびその相補体の両方のメチル化の程度を決定することが、望まれる。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、用語「順方向」および「逆方向」は、ポリヌクレオチド配列に対するプライマー対の対応するプライマーの相対的な方向性を示すために使用される。例示を目的とするが限定ではなく、左側にその５’末端を伴って左から右の方向で水平に、一本鎖ポリヌクレオチドが示されると見なす。「逆方向」プライマーは、５’から３’への方向性（右から左）で、この例示のポリヌクレオチドの「３’末端」かまたはその近傍の下流プライマー結合部位とアニーリングするように設計される。対応する「順方向プライマーは、５’から３’である「順方向」の方向性で左から右に、ポリヌクレオチドの「５’末端」かまたはその近傍で上流プライマー結合部位の相補体とアニーリングするように設計される。したがって、逆方向プライマーは、ポリヌクレオチドの逆方向ま
たは下流のプライマー結合部位に相補的である配列を含み、そして順方向プライマーは、順方向または上流のプライマー結合部位と同一である配列を含む。この節で使用される場合、用語「３’末端」および「５’末端」とは、例示としてのみであり必ずではなく、文字通り、ポリヌクレオチドの各末端をいう。むしろ、唯一の制限は、この例示のプライマー対の逆方向プライマーが、対応する順方向プライマーと同じ配列または実質的に同じ配列を含む順方向プライマー結合部位の下流または右側にある逆方向プライマー結合部位とアニーリングすることである。当業者によって認識されるように、これらの用語は、限定を意図せず、むしろ所与の実施形態における例示的な方向性を提供することを意図する。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「プライマー結合部位」とは、プライマーが任意の当該分野において公知である種々のプライマー伸長反応（例えば、ＰＣＲであるが、これに限定されない）のためにアニーリングし得る鋳型のような、ポリヌクレオチド配列（例えば、直接かまたはその相補体に基づいて機能し得るテイルドプライマーまたは増幅産物）の領域をいう。テイルドプライマーがプライマー結合部位を含む場合、代表的にプライマーの配列特異的結合部分（例えば、順方向標的特異的プライマーの第１の標的結合部分または増幅産物の逆方向プライマーの第２のプライマー結合部分であるが、これらに限定されない）の上流に位置する。
【００５２】
当業者は、増幅産物が特定の増幅技術（プライマー結合部位の相補体が相補的な鎖において合成される）によって増幅されることを認識する。したがって、プライマー結合部位の相補体が、明確に、他に記載されない限り用語「プライマー結合部位」の意図された意味の範囲内に含まれることが、理解される。
【００５３】
いくつかの実施形態において、プライマー結合部位は、少なくともいくつか増幅産物がユニバーサルプライマーまたはユニバーサルプライマーの対を使用して産生されることを可能にするユニバーサルプライミング配列（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）またはその相補体を含む。いくつかの実施形態において、配列決定プライマーは、ユニバーサルプライミング配列を含む。「ユニバーサルプライマー」は、増幅産物の１つより多い種の対応するプライマー結合部位に選択的にハイブリダイズし得る。「ユニバーサルプライマー対」は、増幅産物の複数の種とハイブリダイズするように設計される順方向ユニバーサルプライマーおよび逆方向ユニバーサルプライマーを含む。特定の実施形態において、ユニバーサルプライマーまたはユニバーサルプライマー対は、反応において増幅産物の全部または大部分と選択的にハイブリダイズする。Ｍ１３ユニバーサルプライマーおよびＴ７ユニバーサルプライマー、およびそれらの使用を含むユニバーサルプライマー／プライミング配列（時として、共通プライマーまたは一般的プライマーと称される）が、当該分野において周知である（例えば、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｌｌｅｒ、ＰＣＲ  Ｔｈｅ  Ｂａｓｉｃｓ、Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．、２０００（以下、「ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ」（特に、第５章の第４．２節）を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ユニバーサルプライマーまたはユニバーサルプライマーの対は、配列決定反応のために配列決定プライマーとして使用され得る；そして、二本鎖増幅産物のいずれかまたは両方の鎖が配列決定され得る。ユニバーサルプライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＢ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、およびＰｒｏｍｅｇを含む多くの供給業者から市販されている。当業者は、「カスタム（ｃｕｓｔｏｍ）」のユニバーサルプライマーもまた、当該分野において公知である方法を使用して設計および合成され得ることを理解する。
【００５４】
いくつかの実施形態において、多数の異なるプライマー対は、増幅する工程（例えば、多重の増幅反応であるが、これに限定されない）において使用され、ことなるプライマー対は、多数の異なるｇＤＮＡ標的領域または多数の異なる増幅産物を含む多数の異なるヌ
クレオチド配列を増幅するように設計される。
【００５５】
プライマーが相補的であるかまたは実質的に相補的な配列に選択的にハイブリダイズする条件は、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＨａｒｒｉｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（編）、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．（１９８５）ならびにＷｅｔｍｕｒおｙぼいＤａｖｉｄｓｏｎ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３４９、１９６８に記載されるように、当該分野において周知である。一般に、このようなアニーリングが起きるか否かは、とりわけ、増幅産物中のプライマーの相補部分の長さおよびそれらの対応する標的領域フランキング配列または対応するプライマー結合部位、ｐＨ、温度、一価カチオンおよび二価カチオン、ハイブリダイズする領域中のＧヌクレオチドおよびＣヌクレオチドの割合、媒体の粘度、ならびに変性因子の存在によって影響を受ける。このような変数は、ハイブリダイゼーションに必要な時間に影響を及ぼす。プライマーおよび／または対応する増幅産物の配列特異的部分における特定のヌクレオチドアナログまたは副溝結合因子（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ）の存在もまた、ハイブリダイゼーション条件に影響を及ぼし得る。したがって、好ましいアニーリング条件は、特定の用途に依存する。しかし、このような条件は、過度な実験を行なうことなく、当業者によって慣用的に使用され得る。代表的に、アニーリング条件は、反応において、本開示のプライマーを、対応する標的領域フランキング配列または対応する増幅産物中の相補的であるかまたは実質的に相補的な配列と選択的にハイブリダイズさせるが、任意の有意な程度で他の望ましくない配列に対してハイブリダイズさせないように選択される。
【００５６】
本開示のプライマーの配列特異的部分は、適切な場合、標的フランキング配列および／またはアンプリコン中の相補的であるかまたは実質的に相補的な配列との特異的にアニーリングを可能にするのに十分な長さである。配列特異的プライマーを設計するための判定基準は、当業者に周知である。プライマー設計の記載は、別の場所において、ＤｉｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｒａｐｌｅｙ、Ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（２０００）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（以下、「Ｒａｐｌｅｙ」）；ならびにＫｗｏｋら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１８：９９９−１００５（１９９０）に見出され得る。プライマー設計ソフトウェアプログラムもまた、市販されている（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ５、ＰＲＥＭＩＥＲ  Ｂｉｏｓｏｆｔ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ；Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ４、Ｓｃｉ−Ｅｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ；Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｖｅ、ＣｌｏｎＴｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ；Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ、ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ；およびｉＯｌｉｇｏ、Ｃａｅｓａｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ、ＮＨ）。
【００５７】
当業者は、本教示のプライマーおよびプライマー対が単数形で記載され得る一方で、複数のプライマーが単数の用語によって包含され得ることを認識する。したがって、例えば、特定の実施形態において、標的特異的プライマー対は、代表的に、複数の順方向標的特異的プライマーおよび複数の対応する逆方向標的特異的プライマーを含む。
【００５８】
当業者は、本開示の方法およびキットによって使用するのに適切であるプライマーおよびプライマー対が、過度な実験を行なうことなく、本教示および当該分野において公知である慣用的な方法を使用して実験的に同定され得ることを、理解する。例えば、適切なフランキング配列を含む適切な標的領域は、公知であるかまたは推定される抗メチル化部位または低メチル化部位を列挙するかまたは同定する関連した科学文献（適切なデータベースを含む）を検索することによってか；または実験的分析によって得られ得る。標的領域
および適切なフランキング領域が同定される場合、試験プライマーは、周知のオリゴヌクレオチド合成技術（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら；ＢｌａｃｋｂｕｒｎおよびＧａｉｔ；Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００２  Ｃａｔａｌｏｇ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ；ならびにＳｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００３／２００４、Ｂｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｄｅｘｔｅｒ、ＭＩを参照のこと）を使用して合成され得る。試験プライマーは、本教示によって使用され得、そしてアンプリコンの産生に対するそれらの適合性が、評価され得る。所望される場合、標準曲線が、合成の鋳型または公知のメチル化状態のｇＤＮＡ配列の所定の混合物または連続希釈物を使用し、本教示の方法を使用し、そして標準的な条件下で作成され得る。
【００５９】
いくつかの実施形態において、順方向プライマー、逆方向プライマー、ＭＳＡ、アンプリコン、またはそれらの組み合わせは、レポーター基を含む。特定の実施形態において、レポーター基は、蛍光シグナル、化学発光シグナル、生物発光シグナル、リン光シグナル、または電気化学発光シグナルを放出する。レポーター基のいくつかの非限定的な例としては、フルオロフォア、放射性同位体、色原体、酵素、エピトープタグを含む抗原、半導体ナノ結晶（例えば、量子ドット）、重金属、色素、リン光基、化学発光基、電気化学検出部分、結合性タンパク質、リン光体、希土類錯体、遷移金属錯体、近赤外線色素、電気化学発光標識、および質量分析適合性レポーター基（例えば、質量タグ、電荷タグ、および同位体）が挙げられる（例えば、ＨａｆｆおよびＳｍｉｒｎｏｖ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３７４９−５０、１９９７；Ｘｕら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：３５９５−３６０２、１９９７；Ｓａｕｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：ｅ６３、２００３を参照のこと）。「量子ドット」とは、第１のエネルギーに応答して第２のエネルギーを放出し得る半導体ナノ結晶化合物をいう。代表的に、単一の量子ドットによって放出されるエネルギーは、同一の予測可能な波長を有する。例示の半導体ナノ結晶化合物としては、ＣｄＳｅの結晶、ＣｄＳの結晶、およびＺｎＳの結晶が挙げられるが、これらに限定されない。量子ドットの記載は、別の場所において、米国特許第５，９９０，４７９号および同第６，２０７，３９２  Ｂ１号ならびにＨａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９：６３１−６３５、２００１に見出され得る。
【００６０】
用語「レポーター基」はまた、複数エレメントレポーターシステムのエレメントを包含し、それとしては、１つのエレメントが検出可能なシグナルのポテンシャルに影響を与えるためにそのシステムの１つ以上の他のエレメントと相互作用する親和性タグ（例えば、ビオチン：アビジン、抗体：抗原など）が挙げられる。複数エレメントレポーターシステムのいくつかの非限定的な例としては、ビオチンレポーター基およびストレプトアビジン結合体化フルオロフォア（その逆も同様）を含むオリゴヌクレオチド；ＤＮＰレポーター基およびフルオロフォア標識抗ＤＮＰ抗体を含むオリゴヌクレオチド；などが挙げられる。レポーター基を核酸に結合するための詳細なプロトコルは、別の場所において、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９６；Ｂｅａｕｃａｇｅら；およびＨａｕｇｌａｎｄに見出され得る。
【００６１】
複数エレメント相互作用レポーター基はまた、用語「レポーター基」（例えば、フルオロフォア−クエンチャー対（蛍光クエンチャーおよび非蛍光クエンチャーとしても公知であるダーククエンチャー（ｄａｒｋ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ）を含む））の意図された範囲内である。蛍光クエンチャーは、蛍光レポーター基から放出された蛍光シグナルを吸収し得、そして十分な蛍光エネルギーを吸収した後、その蛍光クエンチャーは、特徴的な波長で蛍光を放出し得る（例えば、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ））。例えば、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ対は、４９２ｎｍ（ＦＡＭに対する励起ピーク）にて照らされ得、そして５８０ｎｍ（ＴＡＭＲＡに対する放出ピーク）にて蛍光を放出するが、これに限定されない。蛍光レポーター基と適切に対形成されるダーククエンチャーは、フルオロフォアから蛍光
エネルギーを吸収するが、ダーククエンチャー自体は、蛍光性ではない。むしろ、ダーククエンチャーは、代表的には熱のような吸収したエネルギーを消散する。ダーククエンチャーまたは非蛍光クエンチャーのいくつかの非限定的な例としては、Ｄａｂｃｙｌ、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅクエンチャー、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ、ＱＳＹ−７、Ａｂｓｏｌｕｔｅクエンチャー、Ｅｃｌｉｐｓｅ非蛍光クエンチャー、金属クラスター（例えば、金ナノ粒子）などが挙げられる。蛍光レポーター基−クエンチャー対を含む特定の二重標識プローブは、その対のメンバーが物理的に分離される場合に蛍光を放出し得、それは、例えば、ヌクレアーゼプローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）であるが、これに限定されない。蛍光レポーター基−クエンチャー対を含む他の二重標識プローブは、その対のメンバーが空間的に分離される場合に蛍光を放出し得、それは、例えば、ハイブリダイゼーションプローブ（例えば、分子ビーコン）または伸長プローブ（例えば、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー）であるが、これらに限定されない。フルオロフォア−クエンチャー対は、当該分野において周知であり、そして種々のレポータープローブに対して広範に使用される（例えば、Ｙｅｕｎｇら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３６：２６６−７５、２００４；Ｄｕｂｅｒｔｒｅｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：３６５−７０、２００１；およびＴｙａｇｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：１１９１−９６、２０００を参照のこと）。
【００６２】
いくつかの実施形態において、プライマーおよび／または増幅産物は、親和性タグを含む。いくつかの実施形態において、親和性タグは、レポーター基を含む。特定の実施形態において、親和性タグは、分離するために使用されるか、検出手段の一部であるか、またはその両方である。
【００６３】
いくつかの実施形態において、プライマーおよび／または増幅産物は、ハイブリダイゼーションタグ、ハイブリダイゼーションタグ相補体、またはその両方を含む。特定の実施形態において、同じハイブリダイゼーションタグは、多数の異なるエレメントと一緒に使用されて、塊の分離および／または固体表面に対する結合に影響を与え、それは、例えば、特定のハイブリダイゼーションベースのプルアウト（ｐｕｌｌｏｕｔ）形式（例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＤｕｐｌｅｘＴＭ  ３８４  Ｗｅｌｌ  ＦＩＲ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを参照のこと）であるが、これに限定されない。種々の実施形態において、ハイブリダイゼーションタグ相補体は、ハイブリダイゼーションタグ：エレメント複合体を固体支持体に結合するための捕捉部分（例えば、マイクロアレイまたはビーズアレイ上の特定のアドレスまたは位置であるが、これに限定されない）として機能するか；塊の分離手順またはハイブリダイゼーションベースのプルアウトのために「プルアウト」配列として機能するか；または捕捉部分およびプルアウト配列の両方として機能する。特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションタグ相補体は、レポーター基、移動度改変因子、レポータープローブ結合部分（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブまたは他のヌクレアーゼプローブ、分子ビーコンプローブまたは他のハイブリダイゼーションプローブ、スコルピオン（ｓｃｏｒｐｉｏｎ）プライマーまたは他の伸長プライマーなどと選択的にハイブリダイズする配列であるが、これに限定されない）、あるいはそれらの組み合わせを含む。
【００６４】
代表的に、ハイブリダイゼーションタグおよびそれらの対応するハイブリダイゼーションタグ相補体は、内部の自己ハイブリダイゼーションまたは異なるハイブリダイゼーションタグ種、増幅組成物中のヌクレオチド配列（ｇＤＮＡを含む）、ハイブリダイゼーションタグ相補体の異なる種、プライマー、プライマー結合部位または増幅産物のプロモーター配列などとの交差ハイブリダイゼーションを最小にするように選択されるが；ハイブリダイゼーションタグとその対応するハイブリダイゼーションタグ相補体との間の容易なハイブリダイゼーションに適応するべきである。しかし、いくつかの実施形態において、増幅産物のプライマー結合部位、またはこれらの配列の少なくとも一部は、ハ増幅産物に対
するイブリダイゼーションタグとして機能し得る（例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＤｕｐｌｅｘＴＭ  ３８４  Ｗｅｌｌ  ＦＩＲ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを参照のこと）。ハイブリダイゼーションタグ配列およびハイブリダイゼーションタグ相補体配列は、任意の適切な方法（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９６／１２０１４号および同第ＷＯ  ９６／４１０１１号および欧州特許公開ＥＰ  ７９９，８９７に記載されるようなコンピューターアルゴリズム；ならびにＳａｎｔａＬｕｃｉａ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ）．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１４６０−６５、１９９８のアルゴリズムおよびパラメータであるが、これらに限定されない）によって選択され得る。ハイブリダイゼーションタグ、ハイブリダイゼーションタグ相補体、およびそれらの使用の記載は、別の場所において、米国特許第６，３０９，８２９号（その中で「タグセグメント」と称される）；同第６，４５１，５２５号（その中で「タグセグメント」と称される）；同第６，３０９，８２９号（その中で「タグセグメント」と称される）；同第５，９８１，１７６号（その中で「グリッドオリゴヌクレオチド（ｇｒｉｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」と称される）；同第５，９３５，７９３号（その中で「同定因子タグ」と称される）；およびＰＣＴ公開第ＷＯ  ０１／９２５７９号（その中で「アドレス可能な支持体特異的配列」と称される）；Ｇｅｒｒｙら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２：２５１−２６２、１９９９）（その中で「ジップ−コード」および「ジップ−コード相補体」と称される）；およびＢｒｅｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：１６６５−７０、２０００（その中で「オリゴヌクレオチドタグ」、「タグ」、および「アンチタグ」と称される）に見出され得る。当業者は、ハイブリダイゼーションタグおよびその対応するハイブリダイゼーションタグ相補体が、定義の通り、互いに相補的であること、および用語「ハイブリダイゼーションタグ」および「ハイブリダイゼーションタグ相補体」が、相対的であり、そしてほとんどの文脈において本質的に交換可能に使用され得ることを認識する。
【００６５】
ハイブリダイゼーションタグは、プライマーおよび／または増幅産物の末端またはその近傍に位置し得るか；またはそれらは、内部に位置し得る。特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションタグは、リンカーアームを介してプライマーおよび／または増幅産物に結合される。特定の実施形態において、そのリンカーアームは、切断可能である。
【００６６】
特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションタグは、少なくとも１２塩基長、少なくとも１５塩基長、１２〜６０塩基長、または１５〜３０塩基長である。特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションタグは、１２塩基長、１５塩基長、２０塩基長、２１塩基長、２２塩基長、２３塩基長、２４塩基長、２５塩基長、２６塩基長、２７塩基長、２８塩基長、２９塩基長、３０塩基長、４５塩基長、または６０塩基長である。特定の実施形態において、少なくとも２つのハイブリダイゼーションタグ：ハイブリダイゼーションタグ相補体二重鎖は、互いの１０℃より大きくないΔＴｍ範囲（Ｔｍａｘ−Ｔｍｉｎ）内にある融解温度を有する。特定の実施形態において、少なくとも２つのハイブリダイゼーションタグ：ハイブリダイゼーションタグ相補体二重鎖は、互いの５℃未満のΔＴｍ範囲内にある融解温度を有する。
【００６７】
いくつかの実施形態において、プライマー、ＭＳＡ、および増幅産物のうちの少なくとも１つのは、移動度改変因子を含む。特定の実施形態において、移動度改変因子は、異なる移動度を達成する異なる長さのヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、移動度改変因子は、非ヌクレオチドポリマー（例えば、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリグリコール酸、ポリウレタンポリマー、ポリペプチド、およびオリゴ糖）を含む。特定の実施形態において、移動度改変因子は、ポリヌクレオチドにサイズを追加することによってか、または実質的にサイズを追加することなく媒体を移動する間の分子の「抗力」を増大させることによって作用し得る。特定の移動度改変因子（ＰＥＯ’ｓを含む）は、別の場所において、米国特許第５，４７０，７０５号；同第５，５８０，７３２号；同第５，
６２４，８００号；および同第５，９８９，８７１号ならびに米国特許出願第ＵＳ  ２００３／０１９０６４６  Ａ１号に記載されている。
【００６８】
本開示の方法およびキットの特定の実施形態は、サンプル調製；増幅反応；精製する工程；および増幅産物の少なくとも一部を分析する工程のうちの少なくとも１つののためのマイクロフルイディクス（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）デバイスを含む。マイクロフルイディクスデバイスは、一般に１ミリメートル以下の内部寸法を備える少なくとも１つのマイクロチャネルを備える反応容器である。マイクロフルイディクスデバイスは、代表的に、非常に小さい反応体積（多くの場合、マイクロリットル、ナノリットル（ｎＬ）、またはピコリットル（ｐＬ）の桁）を用いる。当業者は、マイクロフルイディクスデバイスのサイズ、形状、および組成が本教示の限定ではないことを認識する。むしろ、種々の適切なマイクロフルイディクスデバイスが、本開示の方法の１つ以上の工程を実施するのに使用され得る。例示のマイクロフルイディクスデバイスおよびその使用の記載は、別の場所において、ＦｉｏｒｉｎｉおよびＣｈｉｕ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３８：４２９−４６、２００５；ＫｅｌｌｙおよびＷｏｏｌｌｅｙ、Ａｎａｌｙｔ．Ｃｈｅｍ．７７（５）：９６Ａ−１０２Ａ、２００５；Ｃｈｅｕｋ−Ｗａｉ  Ｋａｎら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２５：３５６４−８８、２００４；ならびにＹｅｕｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１１：４０５−１２、２００１に見出され得る。
【００６９】
用語「レポータープローブ」とは、アンプリコンに結合するかまたはアンプリコンとアニーリングし、そして検出（強度または放出される波長の強度の変化を含む）される場合に、対応するアンプリコンを同定および／または定量するために使用される、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの配列をいう。レポータープローブは、代表的に、リアルタイム検出技術および特定のエンドポイント検出技術において使用される。ほとんどのレポータープローブは、それらの作用様式に基づいて分類され得る（例えば、ヌクレアーゼプローブ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（例えば、Ｌｉｖａｋ、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １４：１４３−１４９、１９９９；Ｙｅｕｎｇら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３６：２６６−７５、２００４を参照のこと）；伸長プローブ（例えば、スコルピオンプライマーｓ、ＬｕｘＴＭプライマー、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒなど）；ハイブリダイゼーションプローブ（例えば、分子ビーコン、Ｅｃｌｉｐｓｅプローブ、ライトアップ（ｌｉｇｈｔ−ｕｐ）プローブ、単一に標識されたレポータープローブの対、ハイブリダイゼーションプローブ対など）；またはそれらの組み合わせであるが、これらに限定されない）。特定の実施形態において、レポータープローブは、アミド結合、ＬＮＡ、ユニバーサル塩基、またはそれらの組み合わせを含み、そしてステムループレポータープローブ立体配置およびステムレス（ｓｔｅｍ−ｌｅｓｓ）レポータープローブ立体配置を含む。特定のレポータープローブは、単一に標識されるが、他のレポータープローブは、二重に標識される。隣接してハイブリダイズしたプローブの間にＦＲＥＴを含むか、または蛍光−クエンチャー対を集合的に含む二重プローブシステムは、用語「レポータープローブ」の意図された範囲内である。
【００７０】
特定の実施形態において、レポータープローブは、蛍光レポーター基、クエンチャーレポーター基（ダーククエンチャーおよび蛍光クエンチャーを含む）、親和性タグ、ハイブリダイゼーションタグ、ハイブリダイゼーションタグ相補体、またはそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションタグ相補体を含むレポータープローブは、対応するハイブリダイゼーションタグとアニーリングし、多成分レポーター基のメンバーは、多成分レポーター基の対応するメンバー、またはそれらの組み合わせを含むレポータープローブに結合する。例示のレポータープローブとしては、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ；Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブ（スコルピオンプライマーとも称される）；ＬｕｘＴＭ  プライマー；ＦＲＥＴプライマー；Ｅｃｌｉｐｓｅプローブ；分子ビ
ーコン（ＦＲＥＴベースの分子ビーコン、マルチカラー（ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）分子ビーコン、アプタマービーコン、ＰＮＡビーコン、および抗体ビーコン；レポーター基標識ＰＮＡクランプ、レポーター基標識ＰＮＡオープナー、レポーター基標識ＬＮＡプローブ、ならびにナノ結晶、金属ナノ粒子および同様のハイブリッドプローブを含むプローブ（例えば、Ｄｕｂｅｒｔｒｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：３６５−７０、２００１；Ｚｅｌｐｈａｔｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２８：３０４−１５、２０００を参照のこと）。特定の実施形態において、レポータープローブは、溝結合因子（ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢ−ＮＦＱプローブ（両方とも、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を含む）をさらに含む。特定の実施形態において、レポータープローブ検出は、蛍光偏光検出（例えば、ＳｉｍｅｏｎｏｖおよびＮｉｋｉｆｏｒｏｖ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：ｅ９１、２００２を参照のこと）を含む。
【００７１】
（特定の例示的な構成要素技術）
本発明の教示に従って、ｇＤＮＡは、任意の生きている生物体、またはかつて生きていた生物体（原核生物、古細菌（ａｒｃｈａｅａ）、または真核生物（例えば、昆虫（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａを含む）、蠕虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓを含む）、植物、および動物（ヒトを含む）であるが、これらに限定されない）を含み；そして原核細胞ならびに真核生物から得られた細胞、組織、および器官（例えば、培養細胞および血球であるが、これらに限定されない）を含む）から得られ得る。特定のウイルスゲノムＤＮＡもまた、本教示の範囲内である。特定の実施形態において、ｇＤＮＡは、二本鎖形態または一本鎖形態で存在し得る。当業者は、ｇＤＮＡが完全長物質だけではなく、多数の手段（例えば、酵素消化、超音波、せん断力などであるが、これらに限定されない）によって産生されるフラグメントを含むことを認識すること、および全てのこのような物質が、完全長であるかまたは断片化されているかにかかわらず、本教示の増幅する反応のために鋳型として機能し得るｇＤＮＡの形態を示すことを認識する。
【００７２】
種々の方法が、本教示に使用するためのｇＤＮＡを得るために利用可能である。メチル化されているｇＤＮＡおよびメチル化されていないｇＤＮＡもまた、市販されている。上記ｇＤＮＡが生物学的マトリックスからの単離によって得られる場合、好ましい単離技術としては、（１）例えば、自動化ＤＮＡ抽出器（例えば、Ｍｏｄｅｌ  ３４１  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ））を使用し、例えば、フェノール／クロロホルム有機試薬を使用する有機抽出（その後に、エタノール沈殿を伴う）（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ａｕｓｕｂｅｌらを参照のこと）；（２）固定相吸着方法（例えば、Ｂｏｏｍら、米国特許第５，２３４，８０９号；Ｗａｌｓｈら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １０（４）：５０６−５１３、１９９１）；および（３）塩誘導性のＤＮＡ析出方法（例えば、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６（３）：９−１０、１９８８）が挙げられ、このような析出方法は、代表的には、「塩析」方法と称される。特定の実施形態において、ｇＤＮＡ単離技術は、サンプルから望ましくないタンパク質を排除するのに役立つ酵素消化工程（例えば、プロテイナーゼＫまたは他の同様のプロテイナーゼによる消化であるが、これに限定されない）；界面活性剤；またはそれらの両方（例えば、米国特許出願公開第２００２／０１７７１３９号；および米国特許出願公開第０９／７２４，６１３号および同第１０／６１８４９３号を参照のこと）を包含する。市販の核酸抽出システムとしては、とりわけ、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）６１００  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎおよびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）６７００  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｗｏｒｋ  Ｓｔａｔｉｏｎが挙げられ；核酸サンプル調製試薬およびキットもまた、市販されており、それらとしては、ＮｕｃＰｒｅｐＴＴＭ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＢｌｏｏｄＰｒｅｐＴＭ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＴｒａｎｓＰｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ、およびＰｒｅｐＭａｎＴＭ  Ｕｌｔｒａ  
Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（全て、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）が挙げられる。
【００７３】
用語「移動度依存性分析技術」とは、異なる分析物の間の移動の異なる速度に基づく任意の分析方法をいう。移動度依存性分析技術の非限定的な例としては、クロマトグラフィー、沈降、勾配遠心分離、フィールドフローフラクショネーション（ｆｉｅｌｄ−ｆｌｏｗ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、多段階抽出技術、質量分析、および電気泳動（スラブゲル、等電点電気泳動、およびキャピラリー電気泳動を含む）が挙げられる。
【００７４】
用語「増幅すること」および「増幅」は、広い意味で使用され、そして標的領域、アンプリコン、またはアンプリコンの少なくとも一部が、代表的には鋳型依存的様式で、再生産されるかまたは複製される任意の技術（相補鎖の合成を含む）をいい、その技術は、線形かまたは指数的のいずれかで核酸配列を増幅するための技術の広い範囲を含む。増幅技術のいくつかの非限定的な例としては、プライマー伸長（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＲＴ−ＰＣＲ、非同期性（ａｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ）ＰＣＲ（Ａ−ＰＣＲ）、および非対称ＰＣＲ、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、複数置換増幅（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＭＤＡ）、核酸鎖ベースの増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｔｒａｎｄ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介性増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＭＡ）など（多重化バージョンおよび／またはそれらの組み合わせを含む）を含む）が挙げられる。特定の増幅技術の記載は、別の場所において、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、第３版、２００１（以下、「ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ」）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ａｕｓｕｂｅｌら；ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｄｉｆｆｅｎｂａｃｈ（編）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｍｓｕｉｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．３４：５０１−０７（１９９６）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ；Ｒａｐｌｅｙ；米国特許第６，０２７，９９８号および同第６，５１１，８１０号；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９７／３１２５６号および同第ＷＯ  ０１／９２５７９号；Ｅｈｒｌｉｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１６４３−５０（１９９１）；Ｆａｖｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：５６１−６４（２０００）；Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ＆  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｇｕｉｄｅ、ｒｅｖ．９／０４、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ；ならびにＲａｂｅｎａｕら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ２８：９７−１０２（２０００）に見出され得る。
【００７５】
用語「増幅産物」および「アンプリコン」は、本明細書中で本質的に交換可能に使用され、そして任意の増幅反応の増幅の任意のサイクルから産生される核酸配列をいい、例えば、文脈から明らかでない限り、第１のアンプリコンは、第１の増幅反応の間に産生され、そして第２のアンプリコン産物は、第２の増幅反応の間に産生される。アンプリコンは、二本鎖増幅産物から得られる分離した構成要素の鎖を含む二本鎖または一本鎖のいずれかであり得る。
【００７６】
特定の実施形態において、増幅技術は、増幅の少なくとも１つのサイクル（例えば、プライマーを標的領域フランキング配列またはアンプリコンのプライマー結合部位（または必要な場合、いずれかの相補体）に選択的にハイブリダイズさせる工程；ポリメラーゼを使用して鋳型依存的様式でヌクレオチドの鎖を合成する工程；および得られた核酸二重鎖を変性させてその鎖を分離する工程であるが、これらに限定されない）を含む。そのサイクルは、繰り返されても繰り返されなくてもよい。
【００７７】
増幅は、温度循環（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）を含み得るか、または等温的に行な
われ得る。いくつかの実施形態において、増幅することは、サーモサイクラー（例えば、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００サーモサイクラー、９６００サーモサイクラー、２７００サーモサイクラー、または２４００サーモサイクラー（全て、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）であるが、これらに限定されない）を含む。いくつかの実施形態において、二本鎖増幅産物は、最初に変性されないが、１つ以上のその後の工程においてそれらの二本鎖形態で使用される。特定の実施形態において、一本鎖アンプリコンは、増幅反応（例えば、非対称ＰＣＲまたはＡ−ＰＣＲであるが、これらに限定されない）において産生される。
【００７８】
本教示によるプライマー伸長は、鋳型にアニーリングしているプライマーを、鋳型依存性ポリメラーゼを使用して５’から３’の方向に伸ばすことを包含する増幅プロセスである。特定の実施形態にしたがって、適切な緩衝液、塩、ｐＨ、温度、および適切なｄＮＴＰ（少なくとも１つのＭＳＡを含み得るが、それを含む必要はない）を用いて、鋳型依存性ポリメラーゼは、アニーリングしたプライマーの３’末端にて開始して鋳型鎖に相補的なヌクレオチドを組み込んで相補鎖を産生する。特定の実施形態において、プライマー伸長のために使用されるポリメラーゼは、５’−エキソヌクレアーゼ活性、３’−エキソヌクレアーゼ活性、またはその両方を欠くかまたは実質的に欠く。特定のプライマー伸長反応の説明は、別の場所において、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、ならびにＡｕｓｕｂｅｌらに見出され得る。
【００７９】
特定の実施形態において、増幅反応は、多数のことなる標的領域、多数の異なる増幅産物種、またはその両方が多数の異なるプライマー対を使用して同時に増幅される多重増幅（例えば、Ｈｅｎｅｇａｒｉｕら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：５０４−１１、１９９７；およびＲａｐｌｅｙ（特に、第７９章）を参照のこと）を含む。本開示の方法の特定の実施形態は、多重増幅反応および一重増幅反応（並行して行なわれる多数の一重反応を含む）を含む。
【００８０】
特定の実施形態において、増幅する反応は、非対称ＰＣＲを含む。特定の実施形態にしたがって、非対称ＰＣＲは、以下を含む増幅組成物を含む：（ｉ）プライマー対の対応するプライマーに対して過剰（例えば、５倍過剰、１０倍過剰、または２０倍過剰であるが、これらに限定されない）な１つのプライマが存在する少なくとも１つのプライマー対；（ｉｉ）順方向プライマーのみかまたは逆方向プライマーのみを含む少なくとも１つのプライマー対；（ｉｉｉ）一方の鎖の増幅をもたらすプライマーおよび無力化される対応するプライマーを所与の増幅条件の間に含む少なくとも１つのプライマー対；あるいは（ｉｖ）上記の（ｉ）および（ｉｉｉ）の両方の記載を満たす少なくとも１つプライマー対。結果的に、ｇＤＮＡ標的領域または増幅産物が増幅される場合、次なる増幅産物の過剰（その相補体と比較して）な一方の鎖が、産生される。非対称ＰＣＲの記載は、別の場所において、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（特に、第５章）；およびＲａｐｌｅｙ（特に、第６４章）に見出され得る。
【００８１】
特定の実施形態において、少なくとも１つのプライマー対を使用し得、一方のプライマーの融解温度（Ｔｍ５０）は、他方のプライマーのＴｍ５０よりも高い（時として、Ａ−ＰＣＲと称される（例えば、公開された米国特許出願第２００３−０２０７２６６
Ａ１号を参照のこと））。特定の実施形態において、順方向プライマーのＴｍ５０は、対応する逆方向プライマーのＴｍ５０とは少なくとも４〜１５℃異なる。特定の実施形態において、順方向プライマーのＴｍ５０は、対応する逆方向プライマーのＴｍ５０とは少なくとも８〜１５℃異なる。特定の実施形態において、順方向プライマーのＴｍ５０は、対応する逆方向プライマーのＴｍ５０とは少なくとも１０〜１５℃異なる。特定の実施形態において、順方向プライマーのＴｍ５０は、対応する逆方向プライマーのＴｍ５０とは少なくとも１０〜１２℃異なる。特定の実施形態において、少なくとも１つのプライマー
対において、順方向プライマーのＴｍ５０は、対応する逆方向プライマーのＴｍ５０と、少なくとも約４℃、少なくとも約８℃、少なくとも約１０℃、または少なくとも約１２℃異なる。
【００８２】
Ａ−ＰＣＲの特定の実施形態において、プライマー対におけるプライマーのＴｍ５０の差に加えて、プライマー対における他方のプライマーに対して過剰な一方のプライマーが、存在する。特定の実施形態において、プライマー対における他方のプライマーに対して５倍〜２０倍過剰な一方のプライマーが、存在する。Ａ−ＰＣＲの特定の実施形態において、プライマー濃度は、少なくとも５０ｎＭである。
【００８３】
特定の実施形態に従うＡ−ＰＣＲにおいて、増幅の第１サイクルにおいて、両方のプライマーがアニーリングし、そして二本鎖アンプリコンの両方の鎖またはｇＤＮＡが増幅されるような従来のＰＣＲを使用し得る。しかし、同じ増幅反応のその後のサイクルにおいて温度を上昇させることによって、一方のみの鎖が増幅されるような低いＴｍによってプライマーを無力化し得る。したがって、低いＴｍを有するプライマーが無力化されるＡ−ＰＣＲのその後のサイクルは、非対称増幅をもたらす。結果的に、標的領域または増幅産物が増幅される場合、次なる増幅産物の過剰（その相補体と比較して）な一方の鎖が、産生される。
【００８４】
Ａ−ＰＣＲの特定の実施形態にしたがって、増幅のレベルは、従来のＰＣＲ周期の第１の相の間に、サイクル数を変えることによって制御され得る。このような実施形態において、最初の従来のサイクル数を変えることによって、低いＴｍを有するプライマーが無力化されるより高い温度でのＰＣＲのその後のサイクルに供される二本鎖増幅産物の量を、変化させ得る。
【００８５】
増幅反応を最適化する特定の方法は、当業者にとって公知である。例えば、ＰＣＲはアニーリング、重合、および変性の時間および温度を変化させること、ならびに反応組成物中の緩衝液、塩、および他の試薬を変えることによって最適化され得ることが、公知である。最適化はまた、使用されるプライマーの設計によって影響され得る。例えば、プライマーの長さ、およびＧ−Ｃ：Ａ−Ｔ比は、プライマーのアニーリングの効率を変化させ、したがって増幅反応を変化させ得る。増幅の最適化の記載は、別の場所において、Ｊａｍｅｓ  Ｇ．Ｗｅｔｍｕｒ、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｓ，Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｐｐ．６０５−８（Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ編、１９９５）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（特に、第４章）；Ｒａｐｌｅｙ；およびＰｒｏｔｏｃｏｌｓ  ＆  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｇｕｉｄｅ、ｒｅｖ．９／０４、Ｐｒｏｍｅｇａに見出され得る。
【００８６】
特定の増幅組成物は、ｄＵＴＰおよびウラシル−Ｎ−グルコシダーゼ（ＵＮＧ）を含む。ｄＵＴＰおよびＵＮＧの使用の記載は、例えば、Ｋｗｏｋら、Ｎａｔｕｒｅ、３３９：２３７−２３８、１９８９；およびＬｏｎｇｏら、Ｇｅｎｅ、９３：１２５−１２８、１９９０に見出され得る。
【００８７】
いくつかの実施形態において、「洗浄（ｃｌｅａｎ−ｕｐ）」工程または「精製」工程が、増幅反応の後に続き、増幅組成物の少なくともいくつかの成分は、少なくともいくつかのアンプリコンから除去され、それによってそのアンプリコンが精製される。精製することは、代表的に、酵素（例えば、ヌクレアーゼまたはホスファターゼ）を含む分解手段、あるいは物理的分離手段（例えば、スピンカラム）またはハイブリダイゼーションに基づく分離（例えば、ハイブリダイゼーションベースのプルアウト）を含む分離手段を含む。例えば、組み込まれていないプライマー、組み込まれていないＮＴＰ、酵素（ポリメラ
ーゼを含む）、塩、他の増幅組成物成分、またはそれらの組み合わせのうちの少なくともいくつかを分解および／または分離することであるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、増幅産物を精製することは、「スピンカラム」もしくは他の遠心分離手段またはゲルベースの分離手段；例えば、エキソヌクレアーゼ、ホスファターゼ、もしくはその両方（例えば、ＥｘｏＳＡＰ−Ｉｔ（登録商標）試薬．ＵＳＢ  Ｃｏｒｐ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）（すなわち、エキソヌクレアーゼおよびアピラーゼ）を含む分解反応；ハイブリダイゼーションベースの分離手段；あるいは沈殿工程（例えば、塩（例えば、酢酸ナトリウムまたは酢酸カリウム）の存在下でのエタノール沈殿であるが、これに限定されない）。当業者は、特定の実施形態において、増幅産物を精製することが、とりわけ、その後の増幅反応において必要とされるプライマーの量を減少させ得、可能な副反応を減少させ得、そして／または先の増幅反応由来の組み込まれていないプライマーおよび／もしくはｄＮＴＰに起因する競合を低下させ得ることを、認識する。
【００８８】
用語「分解すること」は、本明細書中で広い意味で使用され、そして組み込まれていないｄＮＴＰまたはヌクレオチドアナログが、代表的に、ホスファターゼによる酵素分解によって組み込み不可能にされるか、；組み込まれていないプライマーが、代表的に、ヌクレアーゼによって消化されるか；またはその両方である任意の技術をいう。
【００８９】
いくつかの実施形態において、精製することは、ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ、大豆ヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴ、またはそれらの組み合わせであるが、これらに限定されない））を含む。いくつかの実施形態において、ｄＮＴＰおよび／または組み込まれていないプライマーは、分解される。いくつかの実施形態において、組み込まれていないｄＮＴＰは、アピラーゼまたはホスファターゼ（エビ由来アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）または仔ウシの腸内ホスファターゼ（ＣＩＰ）を含む）を使用して分解される。いくつかの実施形態において、組み込まれていないプライマーおよび組み込まれていないｄＮＴＰを分解することは、アピラーゼ、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）、およびエキソヌクレアーゼを含む。当業者は、所望のポリヌクレオチド（代表的に、増幅産物）が分解されないかまたは少なくとも実質的に分解されない一方で、組み込まれていないプライマーおよびｄＮＴＰが分解される、組み込まれていないプライマーおよび／または組み込まれていないｄＮＴＰを分解するための方法（これに限定されない）が、代表的には提供されることを認識する。
【００９０】
いくつかの実施形態において、組み込まれていないプライマー、組み込まれていないｄＮＴＰ、増幅組成物試薬、またはそれらの組み合わせは、例えば、ゲルまたはカラムによる精製、沈降、濾過、ビーズ（ストレプトアビジンコーティングビーズを含む）、磁気分離、またはハイブリダイゼーションベースのプルアウト（ハイブリダイゼーションタグを含む増幅産物を固体支持体にアニーリングさせることを含む）（これらに限定されない）によって増幅産物から分離される。このような分離技術のための多くのキットおよび試薬は、市販されている（Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＱｉＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＱｉＡｑｕｉｃｋ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ、ＱｉＡｑｕｉｃｋ
９６  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＫｉｔまたはＢｉｏＲｏｂｏｔ  Ｋｉｔ（全て、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ製）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、あるいはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＤｕｐｌｅｘＴＭ  ３８４  Ｗｅｌｌ  Ｆ／Ｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐ／Ｎ  ４３０８０８２）が挙げられる）。いくつかの実施形態において、増幅産物は、その後の増幅する反応の前に精製されない。
【００９１】
特定の実施形態において、本開示の方法およびキットは、固体支持体を含む。固体支持
体の非限定的な例としては、アガロース、セファロース、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ガラス、メンブレン、シリカ、半導体物質、シリコン、有機ポリマー；光学的に同定可能なマイクロシリンダー；変換器を備えるバイオセンサー；適切に処理またはコーティングされた反応容器および表面（例えば、微量遠心チューブまたは反応チューブ、複数ウェルマイクロプレートのウェル、ならびにガラススライド、石英スライドまたはプラスチックスライドおよび／またはカバースリップであるが、これらに限定されない）；ならびにビーズ（例えば、磁性ビーズ、常磁性ビーズ、ポリマービーズ、金属ビーズ、色素によって含浸または標識されたビーズ、コーティングされたビーズ、ガラスビーズ、マイクロスフェアおよびナノスフェアであるが、これらに限定されない）が挙げられる。いくつかの実施形態において、固体支持体は、分離する工程および／または検出する工程において使用される（例えば、増幅産物を精製および／または分析するためであるが、これらに限定されない）。当業者は、多数の固体支持体が本開示の方法およびキットにおいて使用され得ること、ならびに固体支持体の形状および組成が一般には限定されていないことを認識する。
【００９２】
いくつかの実施形態において、本教示の方法は、Ｑ−ＰＣＲ反応の前、Ｑ−ＰＣＲ反応の後、またはＱ−ＰＣＲ反応との組み合わせで行なわれる。用語「定量的ＰＣＲ」（すなわち、「Ｑ−ＰＣＲ」）とは、特異的核酸配列に対するポリメラーゼ連鎖反応の結果を定量するために使用される種々の方法をいう。このような方法は、代表的に、一般に、限界サイクル（Ｃｔ）を決定することなどの増幅因子を決定または比較する速度論ベースのシステム、あるいは一般に、標的および標準的な鋳型の同時増幅から産生される産物の量を比較する同時増幅方法として分類される。多くのＱ−ＰＣＲ技術は、レポータープローブ、挿入剤、またはその両方を含む。例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ｉ−プローブ、分子ビーコン、Ｅｃｌｉｐｓｅプローブ、スコルピオンプライマー、ＬｕｘＴＭプライマー、ＦＲＥＴプライマー、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、およびＰｉｃｏＧｒｅｅｎｔ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）であるが、これらに限定されない。
【００９３】
いくつかの実施形態において、本教示の方法は、配列決定反応の前、配列決定反応の後、または配列決定反応との組み合わせで行なわれる。用語「配列決定すること」は、本明細書中で広い意味で使用され、そして同定されるべきポリヌクレオチドの少なくとも一部における少なくともいくつかの連続したヌクレオチドの順序を与える当該分野において公知である任意の技術をいう。配列決定技術のいくつかの非限定的な例としては、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシターミネーター法ならびにＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔの化学的切断法（それらの方法のバリエーションを含む）；ハイブリダイゼーションによる配列決定；ならびに制限酵素マッピングが挙げられる。いくつかの配列決定方法は、電気泳動（キャピラリー電気泳動およびゲル電気泳動を含む）；ハイブリダイゼーション（マイクロアレイハイブリダイゼーションを含む）による配列決定；質量分析；および単一分子検出を含む。いくつかの実施形態において、配列決定は、直接的配列決定、二重鎖配列決定、サイクルシークエンシング、一塩基伸長配列決定（ＳＢＥ）、固相配列決定、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配列決定は、機器（例えば、ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０、３１００、３１００−Ａｖａｎｔ、３７３０、または３７３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７００  ＤＮＡ
Ａｎａｌｙｚｅｒ（全て、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）、あるいは質量分析器であるが、これらに限定されない）を使用して配列決定する産物を検出することを含む。いくつかの実施形態において、配列決定は、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、またはそれらの組み合わせを含む）を増幅産物に組み込み、そしてｄＮＴＰのジデオキシリボヌクレオチドバージョンを増幅産物に含める
ことを含む。
【００９４】
当業者は、使用される配列決定方法が代表的に本発明の方法の限定ではないことを、認識する。むしろ、対応する伸長産物の少なくとも一部の少なくともいくつかの連続したヌクレオチドまたは伸長産物に由来するベクター挿入物の少なくとも一部の少なくともいくつかの連続したヌクレオチドの順序を提供する任意の配列決定技術が、代表的に、本方法によって使用され得る。配列決定技術の記載は、別の場所において、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（特に、第５章）；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ；Ａｕｓｕｂｅｌら；Ｓｉｕｚｄａｋ、Ｔｈｅ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＭＣＣ  Ｐｒｅｓｓ、２００３（特に、第７章）；およびＲａｐｌｅｙに見出され得る。
【００９５】
用語「分析すること」は、第１のアンプリコン、第１のアンプリコンの部分、第２のアンプリコン、第２のアンプリコンの部分、またはそれらの組み合わせに関して使用される場合、アンプリコンまたは得られるアンプリコンの少なくとも一部の１つ以上のパラメータを与える任意の技術を含む。特定の実施形態において、分析することは、（１）１つのアンプリコンを別のアンプリコン種（異なる標的領域に由来するアンプリコンおよび同じ標的領域に由来するがメチル化の異なる程度（例えば、完全にメチル化されている、メチル化されていない、そして中間レベルのメチル化（時として、「関連したアンプリコン」の群またはファミリーと称される））を有するアンプリコンを含む）から（少なくとも部分的に）分離すること、（２）分離されたアンプリコンおよび／または部分的に分離されたアンプリコンを検出すること、および（３）１つ以上のアンプリコンパラメータ（例えば、アンプリコンピーク高さ、アンプリコンピーク下の積分した面積、およびアンプリコン強度（組み込まれた蛍光レポーター基の蛍光強度、組み込まれた生物発光レポーター基、化学発光レポーター基、および／またはリン光レポーター基の発光強度、ならびに組み込まれた同位体の放射能強度を含む））を得て、それを評価することを含む。代表的に、１つのアンプリコンの１つ以上のパラメータは、標的領域メチル化の程度を決定する（定性的決定、半定量的決定、および定量的決定を含む）ために、別のアンプリコンの同じパラメータと比較される。少なくとも１つ標的領域のメチル化の程度は、代表的に、推測（例えば、改変されたサンプルに由来するアンプリコンが改変型ヌクレオチドまたはその相補体を含むか否かを決定すること、および対応する標的領域がメチル化されているかまたはメチル化されていないかを推測することであるが、これらに限定されない）によって決定される。
【００９６】
いくつかの実施形態において、本開示の方法およびキットは、マイクロフルイディクスデバイス、「ラボオンチップ（ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ）」、またはマイクロトータル分析システム（ｍｉｃｒｏｔｏｔａｌ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍ）（μＴＡＳ）を含む。いくつかの実施形態において、サンプル調製は、マイクロフルイディクスデバイスを使用して行なわれる。いくつかの実施形態において、増幅反応は、マイクロフルイディクスデバイスを使用して行なわれる。いくつかの実施形態において、配列決定またはＱ−ＰＣＲ反応は、マイクロフルイディクスデバイスを使用して行なわれる。いくつかの実施形態において、増幅産物の少なくとも一部のヌクレオチド配列は、マイクロフルイディクスデバイスを使用して得られる。例示的なマイクロフルイディクスデバイスの記載は、別の場所において、公開されたＰＣＴ出願第ＷＯ／０１８５３４１号および同第ＷＯ  ０４／０１１６６６号；ＫａｒｔａｌｏｖおよびＱｕａｋｅ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：２８７３−７９、２００４；ならびにＦｉｏｒｉｎｉおよびＣｈｉｕ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３８：４２９−４６、２００５に見出され得る。
【００９７】
（特定の例示的な実施形態）
本教示は、標的領域内の特定の標的ヌクレオチドを改変し、次いでその改変された標的
領域のアンプリコンを分析することによって、少なくとも１つの標的領域のメチル化の程度を決定するためおよび所与の標的領域中のメチル化されているヌクレオチドの数を定量するための方法およびキットを、提供する。特定のｇＤＮＡ標的領域は同じ数のヌクレオチドを有するが、そのｇＤＮＡ標的領域がいくつかのメチル化されているヌクレオチドを含むか、またはそのｇＤＮＡ標的領域が全体的にメチル化されていないヌクレオチドからなるかにかかわらず、本発明者らは、本教示にしたがって改変剤による処理後に、このようなメチル化されている標的領域に由来するアンプリコン、部分的にメチル化されている標的領域に由来するアンプリコン、およびメチル化されていない標的領域に由来するアンプリコンが、適切な条件下でそれらの相対的な移動度に基づいて区別され得；そして対応するｇＤＮＡ標的領域のメチル化の程度が、推測され得ることを見出した。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＭＳＡは、特定のアンプリコン中に組み込まれ、そしてメチル化されている標的領域に由来するアンプリコン、部分的にメチル化されている標的領域に由来するアンプリコン、およびメチル化されていない標的領域に由来するアンプリコンが、それらの相対的な移動度に基づいて区別され得；そしてサンプル中の対応するｇＤＮＡ標的領域のメチル化の程度が、推測され得る。特定の実施形態において、ｇＤＮＡ標的領域中のメチル化されているヌクレオチドの数が、決定され得る。いくつかの実施形態において、二本鎖アンプリコンの移動度または二本鎖アンプリコンの少なくとも一部の移動度が、移動度依存性分析技術を使用して分析される。いくつかの実施形態において、一本鎖アンプリコンの移動度または一本鎖アンプリコンの少なくとも一部の移動度が、移動度依存性分析技術を使用して分析される。いくつかの実施形態において、移動度依存性分析技術は、電気泳動（例えば、ゲル電気泳動およびキャピラリー電気泳動であるが、これらに限定されない）を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのアンプリコンは、それらが少なくとも２つの個別のピークとして検出されるように、完全に分離される（例えば、図１、下部の左側を参照のこと）。いくつかの実施形態において、２つのアンプリコンは、完全には分離されず、そして部分的に重複するが区別可能な２つのピークとして検出される（例えば、図１、中央の左側を参照のこと）。本教示にしたがい、少なくとも１つのＭＳＡを少なくとも１つアンプリコン中に組み込むことならびに／または１つ上の分離条件（例えば、緩衝液組成、ｐＨ、温度、ポリマー組成および／または濃度であるが、これらに限定されない）およびキャピラリーの長さを変えることによって、重複する２つのアンプリコンピークは、少なくとも部分的に分離され得るか、部分的に重複する２つのアンプリコンピークは、完全に分解され得るか、またはその両方であり得る。
【００９８】
特定の実施形態において、アンプリコンは、フラグメントが機器（例えば、キャピラリー電気泳動機器）の検出器アセンブリを通過するときに、ＵＶ吸収またはレーザー誘導性の蛍光によって自動的に検出され、検出データは、コンピューターに収集および保存され、そしてその検出データは、フラグメントの移動度および特定の他の関連するパラメータ（例えば、ピーク高さ、ピーク下面積、蛍光強度などであるが、これらに限定されない）を決定するために、付属のソフトウェアによって分析される。特定の実施形態において、標的領域メチル化の程度は、完全にメチル化されている標的領域のアンプリコン、少なくともいくつかの中間のメチル化を有する対応する標的領域のアンプリコン、および／または対応するメチル化されていない標的領域のアンプリコンについての１つ以上の移動パラメータの比を得ることによって決定される。このような分析は、少なくとも１つの試験アンプリコンパラメータと少なくとも１つのコントロールアンプリコンパラメータとの比較を含み得、その試験アンプリコンは、評価される標的領域に由来する。
【００９９】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的領域のメチル化の程度を決定することは、内部標準またはコントロール配列（例えば、対応する標的領域についての検量線、サイズの内部標準、完全にメチル化されている標的領域のコントロール配列、完全にメチル化されていない標的領域のコントロール配列、既知の中間レベルのメチル化を含む標
的領域のコントロール配列、またはそれらの組み合わせ）を評価することを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的領域のメチル化の程度を分析することは、少なくとも１つの試験アンプリコンと少なくとも１つコントロール配列アンプリコンとの相対的な移動速度または他の測定可能なパラメータを比較することを含む。いくつかの実施形態において、コントロール配列は、レーン間、キャピラリー間、および／またはアッセイ間の変動性を説明するために使用される。
【０１００】
本開示の方法は、１つの標的領域または複数の異なる標的領域のメチル化の程度を決定するための「独立型（ｓｔａｎｄ−ａｌｏｎｅ）」技術として機能し得る（例えば、多重反応または並行した一重反応のシリーズであるが、これらに限定されない）。本開示の方法はまた、他の分子生物学方法（例えば、Ｑ−ＰＣＲ、配列決定法、または特定の他のメチル化分析技術（例えば、ＦｒａｇａおよびＥｓｔｅｌｌｅｒ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３３：６３２−４９、２００２；ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ＭｉｌｌｓおよびＲａｍｓａｈｏｙｅ（編）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００２；ならびに米国特許第６，３３１，３９３号を参照のこと）であるが、これらに限定されない）と組み合わせてか、その分子生物学方法の前か、またはその分子生物学方法の後に使用され得る。特定の本開示の方法の前か、その後か、そして／またはそれとの組み合わせで使用され得るメチル化の検出方法および／または定量方法の非限定的な例としては、改変された標的領域および／または改変されていない標的領域の融解曲線分析、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ、メチルアクセプターアッセイ、酵素的局所メチル化アッセイ（ＥＲＭＡ）、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼおよびメチル化不感性制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＨｐａＩＩ／ＭｓｐＩイソ制限酵素対であるが、これに限定されない）を使用した特定のアッセイ、混合型の亜硫酸水素塩制限分析（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｂｉｓｕｌｆａｔｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＣＯＢＲＡ）、ライゲーション媒介ＰＣＲ（ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲ）を伴うか、またはそれを伴わないヒドラジンおよび／または過マンガン酸塩処理、制限酵素ランドマークゲノムスキャニング（ＲＬＧＳ）、識別的メチル化ハイブリダイゼーション、メチル化特異的オリゴヌクレオチドマイクロアレイ技術、ヌクレオチド組み込みによるメチル化アッセイ（ＭＡＮＩＣ）、メチル化感受性一ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ−ＳｎｕＰＥ）、ピロシークエンスメチル化分析（ＰｙｒｏＭｅｔｈＡ）、ＤＨＰＬＣベースのＤＮＡメチル化分析；ならびに亜硫酸水素塩ゲノム配列決定（例えば、Ｈｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：９８２１−２６、１９９６；Ｙａｍａｍｏｔｏら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３６（５）：８４６−５４、２００４；Ｅａｄｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（８）：ｅ３２、２０００；Ｃｏｌｌｅｌａら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３５（１）：１４６−５０、２００３；ＸｉｏｎｇおよびＬａｉｒｄ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１２）：２５３２−３４，１９９７；Ｇｒａｎａｕら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２９（１３）：ｅ６５、２００１；Ｃｏｕｖｅｒｔら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３４（２）：３５６−６２、２００３；ならびにＫｕｐｐｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３（５）：８４３−４６、１９９７を参照のこと）が挙げられる。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、増幅組成物は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー対、ｄＡＴＰと、ｄＣＴＰと、ｄＧＴＰと、ｄＴＴＰと、（ｉ）ｄＣＴＰのＭＳＡ、（ｉｉ）ｄＧＴＰのＭＳＡ、または（ｉｉｉ）ｄＣＴＰのＭＳＡおよびｄＧＴＰのＭＳＡとを含むヌクレオチドの混合物を含む。特定のこのような実施形態において、プライマー対は、逆方向プライマーに対する順方向プライマーの等しくないモル比を含み、そして増幅反応は、複数サイクルの非対称ＰＣＲを包含し、後のサイクルは、代表的に、線形増幅を含む。特定のこのような実施形態において、ヌクレオチドの混合物は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄｄＮＴＰ（例えば、第１のレポーター基を含むｄｄＣＴＰ、第２のレポーター基を含むｄｄＧＴＰ、または第１のレポーター基を含むｄｄＣＴＰおよび
第２のレポーター基を含むｄｄＧＴＰであるが、これらに限定されない）を含む。特定のこのような実施形態において、増幅産物の少なくとも一部が、分析され、そして少なくとも１つの標的領域のメチル化の程度が、決定される。
【０１０２】
特定の実施形態において、２つ以上のサンプル中の標的領域のメチル化の程度が、同一であるかまたは並行した反応において決定される。いくつかの実施形態において、本開示の方法およびキットは、特定の二次的増幅産物の存在および観察されるべきプライマーダイマーの形成を可能にする。このような増幅アーチファクトは、いくつかの定量的方法において不正確性をもたらし得るが、その方法において検出されない可能性がある。
【０１０３】
本開示の方法にしたがって、少なくとも１つのｇＤＮＡ標的領域を含むサンプルは、改変剤に曝され、そして改変されたサンプルが、得られる。用語「改変されたサンプル」とは、少なくとも１つの改変型ヌクレオチドを産生するために改変剤に適した条件下で改変剤に曝されたサンプルをいう。代表的に、改変剤は、ｇＤＮＡ中の少なくとも１つの標的ヌクレオチドと相互作用するか、またはその標的ヌクレオチドを変換して、少なくとも１つの改変型ヌクレオチドを産生する。適切な改変剤として機能し得る化合物の非限定的な例としては、亜硫酸水素化合物（例えば、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸水素マグネシウム、亜硫酸水素マンガン、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素アンモニウムであるが、これらに限定されない）；５−ブロモウラシル；および特定のスルフヒドリル化合物（例えば、メルカプトエタノール、システインメチルエステル、グルタチオン、およびシステアミンであるが、これらに限定されない）が挙げられる。例示的な改変剤の記載は、別の場所において、Ｈａｙａｔｓｕ、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：７５−１２４、１９７５；Ｈａｙａｔｓｕ、Ｐｒｏｃ．Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ａｃａｄ．Ｓｅｒ．Ｂ、８０：１８９−９４、２００４；ＢｏｙｄおよびＺｏｎ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２６：２７８−８０、２００４；米国特許出願第１０１９２６，５３０号；ならびに公開された米国特許出願第ＵＳ  ２００５−００８９８９Ａ１号に見出され得る。
【０１０４】
特定の実施形態において、ｇＤＮＡを含むサンプルは、メチル化されていないシトシン（「標的ヌクレオチド」）をウラシル（「改変型ヌクレオチド」）に変換する改変剤（亜硫酸水素ナトリウム）によって処理されるが、メチル化されているシトシン（同様に、標的ヌクレオチド）は、一般に、非反応性である。亜硫酸水素処理したｇＤＮＡ中の少なくとも１つの標的領域は、代表的には標的特異的プライマーを使用したＰＣＲによって増幅されて、ウラシル残基がチミンに変換される第１のアンプリコンを生じるが、メチル化されているシトシンは、シトシンとして増幅される。混合された細胞集団を含むサンプル（例えば、正常細胞および癌性細胞の両方を含む腫瘍生検サンプルであるが、これに限定されない）の場合において、種々の細胞亜集団から増幅されたＤＮＡのシトシン含量は、非常に異なり得、メチル化されていないＤＮＡは、変換後にＴが豊富でありかつＣが欠乏しており、一方で、メチル化されている標的領域由来のアンプリコンは、少なくともある程度の元のシトシン含量を保持し得る。
【０１０５】
特定の実施形態において、２つ以上の異なるサンプルは、２つ以上の異なる改変されたサンプルを得るために、別個の反応において個別に改変剤に対して曝される。いくつかの実施形態において、２つ以上の異なる改変されたサンプルは、本開示の方法に従って並行した反応において増幅され、そして２つ以上のサンプル中の少なくとも１つの標的領域のメチル化の程度が、比較される。
【０１０６】
特定の方法に従って、少なくとも１つのｇＤＮＡ標的領域を含むかまたはそれを含むと推定される少なくとも１つのサンプルは、代表的には少なくとも１つの改変型ヌクレオチドを含む少なくとも１つの改変されたサンプルを得るために、改変剤に曝される。特定の
実施形態において、改変剤は、亜硫酸水素ナトリウムを含み、そして改変型ヌクレオチドは、メチル化されていないシトシンに由来するウラシルを含む。少なくともいくつかの改変されたサンプルと、評価される各標的領域に対する標的特異的プライマー対と、適切なｄＮＴＰの混合物と、第１のＤＮＡポリメラーゼとを含む第１の増幅組成物が、形成される。第１の増幅組成物は、増幅の少なくとも１つのサイクルに供され、そして第１の増幅産物が、産生される。いくつかの方法に従って、増幅のサイクルは、増幅の多数のサイクル（例えば、約３サイクル〜約４５サイクル（明示的に、３〜４５の全ての数を含む）であるが、これに限定されない）を含む。第１の増幅産物は、それらの相対的な移動速度を決定するために、代表的には移動度依存性分析技術を使用して分析され、そして少なくとも１つの標的領域についてのメチル化の程度が、推測される。特定の実施形態において、少なくとも１つアンプリコンの移動速度は、検量線を使用してか、またはコントロール配列（例えば、１つ以上のサイズ標準（既知のヌクレオチドおよび／またはアナログの組成および長さの１つ以上の核酸フラグメントを含む）であるが、これに限定されない）との比較によって決定される。いくつかの実施形態において、分析することは、第１のアンプリコンまたは改変された標的領域の配列の少なくとも一部を含む第１のアンプリコンの少なくとも１つの鎖もしくはその相補体に存在する改変型ヌクレオチドまたはその相補体の数を決定することを含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、図１に示されるように、少なくともいくつか改変されたサンプルと、標的特異的プライマー対と、ＤＮＡポリメラーゼと、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の混合物とを含む第１の増幅組成物が、形成される。標的特異的プライマー対は、（ａ）上流の標的フランキング配列の相補体と同じであるかまたは実質的に同じであり、かつ上流の標的フランキング配列の相補体と選択的にハイブリダイズするように設計される配列を含む第１の標的特異的部分と、必要に応じて、（ｂ）第１の標的特異的部分の上流に位置するプライマー結合部位を含む尾部とを含む（１）順方向標的特異的プライマー；ならびに（ａ）下流の標的フランキング配列と相補的であるかまたは実質的に相補的であり、かつ下流の標的フランキング配列と選択的にハイブリダイズするように設計される配列を含む第２の標的特異的部分と、必要に応じて、（ｂ）第２の標的特異的部分の上流に位置するプライマー結合部位を含む尾部とを含む（２）逆方向標的特異的プライマーを含む。第１の反応組成物は、代表的に、鋳型変性と、プライマーのアニーリングと、プライマー伸長との連続的な工程を包含する増幅の少なくとも１つのサイクルに供され、そして図１に示されるように、第１の二本鎖アンプリコンが、産生される。いくつかの実施形態において、増幅反応は、非対称ＰＣＲまたはＡ−ＰＣＲを含み、そして少なくともいくつかの第１の一本鎖アンプリコンが、産生される。特定の実施形態において、一本鎖アンプリコンおよび二本鎖アンプリコンの両方が、増幅反応の間に産生される。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、第１のアンプリコンの少なくとも一部、第２のアンプリコンの少なくとも一部、またはその両方が、代表的には移動度依存性分析技術を使用して分析される。いくつかの実施形態において、分析することは、水平型または垂直型のスラブゲル上でのゲル電気泳動を含み、そしてアンプリコンまたはアンプリコンフラグメントの移動速度または他の測定可能なパラメータが、決定される。特定の実施形態において、分析することは、キャピラリー電気泳動を含み、そしてアンプリコンまたはアンプリコンのフラグメントの移動速度または他の測定可能なパラメータが、決定される。いくつかの実施形態において、アンプリコンまたはアンプリコンフラグメントは、少なくとも１つのコントロール配列（例えば、分子サイズマーカーであるが、これに限定されない）または同じ標的領域に由来するが既知の程度のメチル化を有するアンプリコンもしくはアンプリコンのセットと一緒に同時に電気泳動される。いくつかの実施形態において、アンプリコンの相対的なピーク高さ、ピーク（曲線）下面積、または別の測定可能なパラメータが、少なくとも１つの標的領域のメチル化の程度を評価するために、代表的にはコンピュータ
ーおよび付属のソフトウェアによって決定される。いくつかの実施形態において、所与のアンプリコンまたはアンプリコンの少なくとも一部についての相対的なピーク高さまたはピーク下面積は、少なくとも１つ標的領域のメチル化の程度を評価するために、検量線と比較される。
【０１０９】
例示目的であるが限定としてではなく、混合された細胞集団を含む例示的な生検標本が、とりわけ、標的領域Ａのメチル化の程度を決定するために、癌患者から得られる。例示の標的領域Ａは、５個のＣＧ対を含み、そして上記標本中のｇＤＮＡは、完全にメチル化されている（すなわち、５個全てのＣＧ対が、５ｍＣを含む）標的領域Ａのいくつかのコピー、２個のＣＧ対と３個の５ｍＣＧ対とを含む（部分的にメチル化されている）いくつかのコピー、メチル化されていない（５ｍＣＧなし）いくつかのコピーを含む。ｇＤＮＡは、上記標本から抽出され、そしてサンプルは、改変されたサンプルを産生するために、亜硫酸水素ナトリウムに曝される。標的領域Ａは、標的領域Ａ特異的プライマー対を含む第１の増幅組成物においてＰＣＲによって増幅され、順方向の標的領域Ａ特異的プライマーは、蛍光レポーター基、ＤＮＡポリメラーゼ、およびｄＮＴＰの混合物を含む。完全にメチル化されている標的領域Ａに由来するアンプリコンの順方向鎖は、５個のＣを含み、標的領域Ａの部分的にメチル化されているコピーに由来するアンプリコンの順方向鎖は、３個のＣを含み、そして標的領域Ａのメチル化されていないコピーに由来するアンプリコンの順方向鎖は、（フランキング配列および／またはプライマー尾部に存在し得る任意のＣを除外して）Ｃを全く含まない。これらの例示的な第１のアンプリコンは、適切なＤＮＡサイズラダーを伴うキャピラリー電気泳動によって分析され、そして異なり、部分的に重複する３つのアンプリコンピークが、検出され、それらのピークは、標的領域Ａの完全にメチル化されている種、少なくとも１つの部分的にメチル化されている種、およびメチル化されていない種がサンプル中に存在することを示す。
【０１１０】
特定の方法に従って、少なくとも１つのｇＤＮＡ標的領域を含むかまたはそれを含むと推定される少なくとも１つのサンプルは、少なくとも１つの改変型ヌクレオチドを含む少なくとも１つの標的領域を含む少なくとも１つの改変されたサンプルを産生するために、改変剤に曝される。少なくともいくつかの改変されたサンプルと、評価される各標的領域に対する標的特異的プライマー対と、少なくとも１つＭＳＡを含む適切なｄＮＴＰの混合物と、第１のＤＮＡポリメラーゼとを含む第１の増幅組成物が、形成される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的特異的プライマー対の順方向プライマー、逆方向プライマー、または順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、レポーター基（例えば、蛍光レポーター基であるが、これに限定されない）を含む。第１の増幅組成物は、増幅の少なくとも１つのサイクルに供され、そして少なくとも１つの組み込まれたＭＳＡを含む第１の増幅産物が、産生される。増幅産物中への少なくとも１つのＭＳＡの組み込みは、ＭＳＡを除いて同じ配列を有する増幅産物（例えば、４種の天然のヌクレオチドを含むアンプリコンであるが、これに限定されない）と比較して、増幅産物の移動度を変化させる。特定の実施形態において、増幅のサイクルは、多数のサイクル（例えば、約３サイクル〜約４５サイクル（明示的に、３〜４５の全ての数字を含む）であるが、これに限定されない）にわたって繰り返される。少なくとも１つの組み込まれたＭＳＡを含む第１の増幅産物は、それらの相対的な移動速度または他の測定可能なアンプリコンパラメータを決定するために分析され、そして少なくとも１つの標的領域についてのメチル化の程度が、推測される。いくつかの実施形態において、分析することは、第１のアンプリコンまたは改変された標的領域の配列の少なくとも一部を含む第１の二本鎖アンプリコンの少なくとも１つの鎖もしくはその相補体に存在する改変型ヌクレオチドまたはその相補体の数を決定すること含む。
【０１１１】
特定の実施形態において、少なくともいくつかの亜硫酸水素改変されたサンプルと、標的特異的プライマー対と、ポリメラーゼと、ＭＳＡを含む適切なｄＮＴＰの混合物とを含
む第１の増幅組成物が、形成される。特定の実施形態において、少なくとも１つのＭＳＡを含む適切なｄＮＴＰの混合物は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ならびに（ｉ）ｄＣＴＰの移動度シフトアナログ、（ｉｉ）ｄＧＴＰの移動度シフトアナログ、または（ｉｉｉ）ｄＣＴＰのＭＳＡおよびｄＧＴＰのＭＳＡのいずれかを含む。標的特異的プライマー対は、（１）第１の標的特異的部分を含む順方向標的特異的プライマー、および（２）第２の標的特異的部分を含む逆方向標的特異的プライマーを含む。いくつかの実施形態において、順方向プライマー、逆方向プライマー、またはその両方は、レポーター基（代表的に、常にとは限らないが、プライマーの５’末端またはその近傍に位置する）をさらに含む。第１の増幅組成物は、増幅の多数のサイクル（例えば、５サイクルの増幅、１０サイクルの増幅、２０サイクルの増幅、２５サイクルの増幅、３０サイクルの増幅、または３５サイクルの増幅であるが、これらに限定されない）に供され、そして移動度シフトｄＣＴＰアナログおよび／または移動度シフトｄＧＴＰアナログを含む第１のアンプリコンが、産生される。サンプルは亜硫酸水素ナトリウム処理によって改変されるので、標的領域中のメチル化されていないＣは、Ｕへと脱アミノ化されるはずであり、一方で標的領域中のメチル化されているＣは、改変されない。改変されたサンプルが、ｄＣＴＰの移動度シフトアナログを含む増幅組成物において増幅される場合、逆方向標的特異的プライマーは、下流の標的フランキング領域とアニーリングし、そしてポリメラーゼによって伸長されて、順方向標的特異的プライマーに対する鋳型として機能する第１の合成された鎖を産生する。アニーリングした第１のプライマーは、第１の鎖鋳型上で伸長され、そして移動度シフトｄＣＴＰアナログが、標的配列が改変されていないメチル化されているシトシンを含む場合にアンプリコンの順方向鎖に組み込まれるが、Ｔが、標的配列が改変型ヌクレオチド（脱アミノ化されたＣ）を含む場合に組み込まれる。したがって、レポーター基によって標識されたアンプリコンが分析される場合、その移動速度は、ＭＳＡの存在に起因して変化するはずである。いくつかの実施形態において、ＭＳＡの存在は、メチル化されている標的配列のアンプリコンをメチル化されていない同じ標的配列のアンプリコンからより容易に区別することを可能にする。特定の実施形態において、標的領域中に存在するメチル化されているヌクレオチドの数は、改変されたメチル化されていない標的領域から産生されたアンプリコン、公知のメチル化のコントロール配列、またはその両方に対する、アンプリコンの移動速度における増加性の変化によって決定され得る。
【０１１２】
特定の方法に従って、少なくとも１つのｇＤＮＡ標的領域を含むかまたはそれを含むと推定される少なくとも１つのサンプルは、少なくとも１つの改変型ヌクレオチドを含む少なくとも１つの標的領域を含む少なくとも１つの改変されたサンプルを産生するために、改変剤に曝される。少なくともいくつかの改変されたサンプルと、評価される各標的領域に対する標的特異的プライマー対と、ｄＮＴＰの混合物と、第１のＤＮＡポリメラーゼとを含む第１の増幅組成物が、形成される。第１の増幅組成物は、増幅の少なくとも１つのサイクルに供され、そして第１の増幅産物が、産生される。いくつかの方法に従って、増幅の第１のサイクルは、増幅の多数のサイクル（例えば、約３サイクル〜約４５サイクル（明示的に、３〜４５の全ての数字を含む）であるが、これに限定されない）を含む。少なくともいくつかの第１の増幅産物と、増幅産物プライマー対または少なくとも１つ増幅プライマー（図１において「増幅産物特異的プライマー（対）」と示される）と、ＭＳＡを含む適切なｄＮＴＰの混合物と、第２のＤＮＡポリメラーゼとを含む第２の増幅組成物が、形成される。いくつかの実施形態において、第２の増幅組成物は、増幅産物の順方向プライマーと増幅産物の逆方向プライマーとを含む増幅産物プライマー対を含む。特定の実施形態において、少なくとも１つのＭＳＡを含む適切なｄＮＴＰの混合物は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、および（ｉ）ｄＣＴＰの移動度シフトアナログ、（ｉｉ）ｄＧＴＰの移動度シフトアナログ、または（ｉｉｉ）その両方のいずれかを含む。第２の増幅組成物は、少なくとも１つの組み込まれたＭＳＡを含む第２のアンプリコンを産生するために、増幅の少なくとも１つのサイクルに供される。いくつかの方法に従って、増幅の第２のサイクルは、多数の増幅サイクル（例えば、２サイクル〜約４５サイクル（明示的に、
２〜４５の全ての数字を含む）であるが、これに限定されない）を含む。第２の増幅産物の少なくとも一部は、それらの相対的な移動速度または他の測定可能なアンプリコンパラメータを決定するために分析され、そして少なくとも１つの標的領域についてのメチル化の程度が、推測される。いくつかの実施形態において、分析することは、第２のアンプリコンまたは改変された標的領域の配列の少なくとも一部を含む第２のアンプリコンの少なくとも１つの鎖もしくはその相補体に存在する改変型ヌクレオチドまたはその相補体の数を決定することを含む。
【０１１３】
特定の実施形態において、少なくともいくつかの亜硫酸水素改変されたサンプルと、多数の異なるプライマー対と、ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの混合物とを含む第１の増幅組成物が、形成される。標的特異的プライマー対の各々は、（ａ）上流の標的フランキング配列と同じであるかまたは実質的に同じであり、かつ上流の標的フランキング配列と選択的にハイブリダイズするように設計される配列を含む第１の標的特異的部分と、（ｂ）第１の標的特異的部分の上流に位置する第１のプライマー結合部位を含む尾部とを含む（１）順方向標的特異的プライマー；および（ａ）下流の標的フランキング配列と相補的であるかまたは実質的に相補的であり、かつ下流の標的フランキング配列と選択的にハイブリダイズするように設計される配列を含む第２の標的特異的部分と、（ｂ）第２の標的特異的部分の上流に位置する第２のプライマー結合部位を含む尾部とを含む（２）逆方向標的特異的プライマーを含む。異なる標的特異的プライマー対の各々の第１のプライマー結合部位および第２のプライマー結合部位は、他の異なる標的特異的プライマー対の各々の第１のプライマー結合部位および第２のプライマー結合部位と異なる。第１の増幅組成物は、増幅の多数のサイクル（例えば、２０サイクルの増幅、２５サイクルの増幅、３０サイクルの増幅、３５サイクルの増幅、または４０サイクルの増幅であるが、これらに限定されない）に供され、そして多数の異なる第１のアンプリコンが、産生される。特定の実施形態において、多数の異なる第１のアンプリコンは、分離手段および／または分解手段を使用して精製される。
【０１１４】
多数の異なる第２の増幅組成物が形成され、各々は、少なくともいくつかのアンプリコンまたは精製された第１のアンプリコン、増幅産物プライマー対、ＤＮＡポリメラーゼ、および少なくとも１つのＭＳＡを含む適切なｄＮＴＰの混合物を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのＭＳＡを含む適切なｄＮＴＰの混合物は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、および（ｉ）ｄＣＴＰの移動度シフトアナログ、（ｉｉ）ｄＧＴＰの移動度シフトアナログのいずれか、または（ｉｉｉ）両方を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのＭＳＡを含む適切なｄＮＴＰの混合物は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＧＴＰの移動度シフトアナログを含む。上記増幅産物プライマー対は、（１）第１のアンプリコンの第１のプライマー結合部位と同じか、または実質的に同じである配列を含む順方向増幅産物プライマー、および（２）同じ第１のアンプリコンの第２のプライマー結合部位と同じか、または実質的に相補的である配列を含む逆増幅産物プライマーを含む。順方向増幅産物プライマー、逆増幅産物特異的プライマー、または両方は、レポーター基をさらに含む。いくつかの実施形態では、多数の第２の増幅組成物の少なくとも１つは、２、３、４、５、または６の異なる増幅産物プライマー対を含み、各々は、同じ第２の増幅組成物中のその他の増幅産物プライマー対のいずれとも異なるレポーター基を含む。いくつかの実施形態では、多数の第２の増幅組成物の少なくともいくつかは、ユニバーサルプライマーまたはユニバーサルプライマー対を含み、これは、特定の実施形態では、同じレポーター基を含み、そして２、３、４、５、または６の異なるサイズのアンプリコンが生成される。第２の増幅組成物は、多数の増幅のサイクル、例えば、制限されないで、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、８サイクル、１０サイクル、または１５サイクルの増幅を受け、第２の増幅組成物の少なくとも１つのおいてＭＳＡを含む第２のアンプリコンを生成する。第２のアンプリコンまたは第２のアンプリコンの少なくとも一部は、代表的には移動度依存性分析技法を用いて分析され、そして多数の異なる標的領
域についてのメチル化の程度が推論される。
【０１１５】
制限としてではなく、例示目的のために、混合された細胞集団を含む例示の生検標本癌患者から得られ、とりわけ、標的領域Ｂのメチル化の程度を決定する。例示の標的領域Ｂは、９ＣＧ対を含み、そして標本中のｇＤＮＡは、標的領域Ｂの４つのサブ集団；完全にメチル化されている標的領域Ｂのいくつかのコピー（すなわち、すべて９のＣＧ対が５ｍＣを含む）、６のＣＧ対および３つの５ｍＣＧ対を含む（部分的にメチル化されている）いくつかのコピー；３のＣＧ対および６の５ｍＣＧを含むいくつかのコピー（部分的にメチル化されている）、およびメチル化されていないいくつかのコピー（５ｍＣＧはない）を含む。上記ｇＤＮＡは、上記標本から抽出され、そしてこのサンプルは、重亜硫酸塩に曝され、改変されたサンプルを生成する。標的領域Ｂは、標的領域Ｂ特異的プライマー対、ＤＮＡポリメラーゼ、およびｄＮＴＰのミックスを含む第１の増幅組成物中のＰＣＲによって増幅され、そして４つの関連するアンプリコンのファミリーが生成される。第１のアンプリコンは、スピンカラムを用いて精製され、そして精製された第１のアンプリコンのアリコートが、第２のＤＮＡポリメラーゼ、第１のアンプリコンプライマー対、およびｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、およびビオチン−３６−ｄＣＴＰを含むｄＮＴＰのミックス、およびｄＣＴＰの移動度シフトアナログを含む第２の増幅組成物に添加される。この第２の増幅組成物は、増幅の５サイクルを受け、第２のアンプリコンを生成する。完全にメチル化された標的領域Ｂ由来の第２のアンプリコンの順方向ストランドは、９のビオチン−３６−ｄＣＴＰを含み、標的領域Ｂの部分的にメチル化されたコピー由来のアンプリコンの順方向ストランドは、３のビオチン−３６−ｄＣＴＰおよび６のビオチン−３６−ｄＣＴＰをそれぞれ含み、そして標的領域Ｂの非メチル化コピー由来のアンプリコンの順方向ストランドは、任意のビオチン−３６−ｄＣＴＰを含まない（隣接配列中に存在し得る任意のＣｓは除く）。上記第２のアンプリコンは、適切なＤＮＡサイズラダーとともにキャピラリー電気泳動によって分析され、そして４つの異なるアンプリコンピークが、少なくとも、４つの第２の標的領域Ｂアンプリコンのうち３つに取り込まれたビオチン−３６−ｄＣＴＰアナログによって与えられる増分移動度シフトに少なくとも一部基き検出される。４つのアンプリコンピークは、標的領域Ｂに対する標準曲線と比較され、サンプル中の標的領域Ｂのメチル化状態が、特定の完全にメチル化された標的領域Ｂ、３つの５ｍＣＧ対をもついくつか、および６つの５ｍＣＧ対をもついくつかを含む中間メチル化をもつ２つの異なるサブ集団、およびいくつかの非メチル化標的領域Ｂを含むことを決定する。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、増幅組成物は、特に、上記増幅が、配列決定反応、例えば、制限されないでサイクル配列決定またはＳＢＥを含むとき、ターミネーターとも呼ばれるヌクレオチドターミネーターを含む。特定の実施形態では、ターミネーターは、ヌクレオチド塩基がプリン、７−デアザ−プリン、ピリミジン、またはヌクレオチドアナログ、そして糖部分が、ジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）のような、さらなる合成をブロックする３’−置換基を含むペントースアナログである。特定の実施形態では、さらなる合成をブロックする置換基は、制限されないで、アミノ、デオキシ、ハロゲン、もアルコキシ、およびアリールオキシ基を含む。ターミネーターのいくつかの非制限的な例は、糖−リン酸エステル部分が３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルリボース−５’−三リン酸；２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルリボース−５’−三リン酸；２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシリボース−５−三リン酸；２’−デオキシ−３’−（Ｃ５−Ｃ１４）アリールオキシリボース−５’−三リン酸；２’−デオキシ−３’−ハロリボース−５’−三リン酸；２’−デオキシ−３’−アミノリボース−５’−三リン酸；２’，３’−ジデオキシリボース−５’−三リン酸；または２’，３’−ジデヒドロリボース−５’−三リン酸であるようなものを含む。ターミネーターはまた、テンプレート中に反対のアデニン、またはアデニンアナログを取り込むｄｄＴＴＰおよびｄＵＴＰを含む「Ｔ」ターミネーター；テンプレート中に反対のチミン、ウラシルまたはチミンも
しくはウラシルのアナログを取り込むｄｄＡＴＰを含む「Ａ」ターミネーター；テンプレート中に反対のグアニン、またはグアニンアナログを取り込むｄｄＣＴＰを含む「Ｃ」ターミネーター；およびテンプレート中に反対のシトシンまたはシトシンアナログを取り込むｄｄＧＴＰおよびｄｄＩＴＰを含む「Ｇ」ターミネーターを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドターミネーターは、レポーター基、例えば、制限されないで蛍光レポーター基を含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、順方向標的−特異的プライマーのテイル部分、逆標的−特異的プライマー、逆方向標的−特異的プライマー、順方向増幅産物プライマー、逆方向増幅産物プライマー、またはそれらの組み合わせは、ユニバーサルプライミング配列および／またはレポータープローブ結合部分を含む。いくつかの実施形態では、このユニバーサルプライミング配列および／またはレポータープローブ結合部分は、平行する手順または次の手順、例えば、制限されないで配列決定または定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）で採用され得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、上記第１のＤＮＡポリメラーゼと第２のＤＮＡポリメラーゼは同じである。いくつかの実施形態では、上記第１のＤＮＡポリメラーゼと第２のＤＮＡポリメラーゼは異なる。特定の実施形態では、第１のＤＮＡポリメラーゼ、第２のＤＮＡポリメラーゼ、または両方は、ＭＳＡを含むヌクレオチドアナログを取り込み得る許容ポリメラーゼを含む。可能な許容ＤＮＡポリメラーゼの非制限的な例は、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼＣＳ、ＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒＴＭＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、バクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼＦＳ、およびＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅを含む。当業者は、適切なＤＮＡポリメラーゼの選択が、少なくと部分的には、アナログ、方法、および反応条件に依存するが、特定の適用のための適切な許容ポリメラーゼが慣用の方法によって決定され得、そして過度の実験を要求しないことを理解する。当業者はまた、所望の許容度をもつＤＮＡポリメラーゼが、過度の実験を要することなく、区画化自己複製（ＣＳＲ）、および特定の変異誘発技法を含む周知の技法を用いて操作され得ることを理解する（例えば、Ｇｈａｄｅｓｓｙら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：７５５〜７９、２００４；およびＳｉｎｇｈら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １３（９）：６３５〜４３、２０００を参照のこと）。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、上記第１のＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、制限されないで、その酵素的に活性な変異体または改変体を含むＴａｑＤＮＡポリメラーゼまたはＴｌｉＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、上記第２のＤＮＡポリメラーゼは、許容ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、上記第１のＤＮＡポリメラーゼおよび第２のＤＮＡポリメラーゼは同じである。特定の実施形態では、上記第１の増幅組成物から十分な残存する第１のＤＮＡポリメラーゼが存在し得、上記第２の増幅産物を合成し、そして上記第２の増幅組成物は、第２のＤＮＡポリメラーゼを含まない。特定の実施形態では、上記第１のＤＮＡポリメラーゼ、第２のＤＮＡポリメラーゼ、または両方は、多数の異なるＤＮＡポリメラーゼを含む。例えば、しかし、制限されないで、プライマー濃度−依存性非対称ＰＣＲを含むいくつかの実施形態では、単一のＤＮＡポリメラーゼが採用される。
【０１２０】
用語「分析する」は、本明細書で広い意味で用いられ、そして測定可能なアンプリコンパラメーターが得られることを可能にする任意の技法または技法の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、分析することは、移動度依存性分析技法を用いて１つ以上のアンプリコンを解像することを包含する。いくつかの実施形態では、関連するアンプリコンのファミリーが分析され、そして関連アンプリコンの群に対応する標的領域のメチル化の程
度が決定される。
【０１２１】
特定の実施形態では、分析することは、器具、すなわち、必ずしも必要ではないがコンピューターアルゴリズムを含み得る自動化または半自動化検出手段を用いて少なくとも１つのアンプリコンまたはアンプリコンの少なくとも一部分を分離すること、および／または検出することを包含する。特定の実施形態では、検出ステップは、分離ステップ、例えば、制限されないで、蛍光スキャナー、およびグラフ化、記録、または読み出しコンポーネントおよびデータ分析ソフトウェアのようなデータ収集モジュールを含むコンピューターを備えるキャピラリー電気泳動器具；質量分析器とカップルされたキャピラリー電気泳動器具；または吸光度モニターもしくは蛍光スキャナーおよびグラフレコーダーと、または質量分析器とカップルされたクロマトグラフィーカラムと組み合わせられるか、またはそれとの連続である。分離ステップを実施するための例示の手段は、キャピラリー電気泳動器具、例えば、制限されないで、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００  Ｇｅｎｔｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００−Ａｖａｎｔ  Ｇｅｎｔｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７３０  ＤＡＮ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７３０ｘ／ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（すべてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから）；ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７３００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ；ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ；質量分析計；を含み、そして必要に応じて関連ソフトウェアを含む。レポーター基検出、データ収集、および分析のための例示のソフトウェアは、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒＴＭＳｏｆｔｗａｒｅ、ＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、およびＧｅｎｏｔｙｐｅｒ（登録商標）ソフトウェア（すべてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから）を含む。
【０１２２】
特定の実施形態では、分析することは；関連アンプリコンのファミリーを含み得る少なくとも１つのアンプリコン、そして代表的には２つ以上のアンプリコンを、キャピラリー電気泳動のような移動度−依存分析技法を用いて分離すること；上記アンプリコン（単数または複数）をそれらが溶出するとき、例えば、制限されずに、蛍光スキャナーを用いて溶離液をモニターすること；および少なくとも１つの標的領域のメチル化の程度を決定するために、代表的には、ＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｗａｒｅを用いるＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（両者ともＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから）のような検出および分析ソフトウェアを用いて上記アンプリコン（単数または複数）の蛍光プロフィールを評価することを包含する。特定の実施形態では、分析することは、プレートリーダーおよび適切な照射源を含む。
【０１２３】
特定の実施形態では、少なくとも２つのアンプリコン（例えば、制限されないで、２つの異なる標的領域由来のアンプリコン、ならびに／または標的領域のメチル化バージョン由来の少なくとも１つのアンプリコンおよびこの同じ標的領域の非メチル化バージョン由来のアンプリコン）ならびに／またはアンプリコンとコントロール配列が、分子篩または非分子篩マトリックス中の電気泳動によって解像および分析される。特定の実施形態では、この電気泳動的分離は、キャピラリー電気泳動によってキャピラリーチューブ中で実施れされる（例えば、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＣｏｌｂｕｒｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９２を参照のこと）。開示される技法における使用のために分子篩するマトリックスの非制限的な例は、ビス−アクリルアミドと共有結合により架橋されたポリアクリルアミドのような共有結合による架橋されたポリマーマトリックス；線状ポリマーで形成されたゲルマトリックスを含む（例えば、米国特許第５，５５２，０２８
号）；およびゲルフリーの分子篩媒体（例えば、米国特許第５，６２４，８００号；ＨｕｂｅｒｔおよびＳｌａｔｅｒ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１６：２１３７〜２１４２；Ｍａｙｅｒら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６６（１０）：１７７７〜１７８０、１９９４を参照のこと）を含む。この電気泳動媒体は、ポリヌクレオチドを一本鎖形態に維持するために、７Ｍホルムアミドのような核酸変性剤を含み得る。適切なキャピラリー電気泳動器械は、市販され入手可能であり、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒシリーズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）がある。
【０１２４】
当業者は、２以上の近接して移動するフラグメント、例えば、制限されないでアンプリコンおよびコントロール配列を解像する能力が、採用される分析技法の解像力を含む種々の変数に依存することを認識する。特定の開示される方法によれば、近接して移動する２つ以上のアンプリコンを解像する能力は、アンプリコンの少なくとも１つにＭＳＡを取り込むことにより増大される。特定の実施形態では、２つの近接して移動するピーク間、例えば、しかし、制限されないで、ＭＳＡを含まない非メチル化標的領域由来のアンプリコンと、少なくとも１つのＭＳＡを含む同じ標的領域のメチル化バージョン由来のアンプリコンとの距離は、この２つ以上のピーク中のＭＳＡの異なる数の存在に起因して増大される。いくつかの実施形態では、ＭＳＡの、非メチル化標的領域由来のアンプリコンまたは異なるレベルのメチル化をもつ複数のサブ手段を有する標的領域由来の関連アンプリコンのファミリー中への取り込みは、その標的領域中のメチル化ヌクレオチドの数が決定されることを可能にし得る。
【０１２５】
電気泳動に基く分析技法で２つ以上の近接して移動するフラグメントの分離に影響し得るその他の変数は、分子篩マトリックスのタイプ、濃度、および組成；緩衝液組成、濃度、およびｐＨ；変性剤または夾雑物の存在；電気泳動が実施される温度；フラグメントが一本鎖または二本鎖であるか否か；印加される電圧；動電学的注入時間；およびキャピラリーまたはスラブゲルの長さを含む。検出手段の感度および分析ソフトウェアもまた、ピーク解像に影響し得る。当業者は、２つの近接して移動するフラグメント間の分離が、これら変数の１つ以上、および／または特定のＭＳＡの移動度シフト性質を含む、分析されるフラグメント中のＭＳＡの存在または不在に基き、増加または減少され得ることを理解する。当業者はまた、適切な解像条件が、代表的には、慣用の試験を用い、かつ過度の実験なくして実験的に得られることを理解する。
【０１２６】
特定の例示の実施形態では、増幅産物を含み、配列決定反応産物、および／または特有に識別可能な分子量の増幅産物を含む風乾増幅産物ペレットが、水、緩衝液、または脱イオン化ホルムアミド、例えば、ＨｉＤｉホルムアミド（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中に懸濁される。特定の実施形態では、これらの再懸濁されたサンプルおよび分子量マーカー（例えば、ＧｅｎｅＳｃａｎ５００−ＬＩＺまたは−ＲＯＸサイズ標準品、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が、キャピラリー電気泳動プラットホーム（例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にロードされ、そして適切なポリマー、例えば、制限されずに、ＰＯＰ−４、ＰＯＰ−６、またはＰＯＰ−７ポリマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で電気泳動される。特定の実施形態では、二本鎖アンプリコン、一本鎖アンプリコン、変性二本鎖アンプリコンの一本鎖または二本鎖を含む電気泳動バンドが検出され、そしてそれらの移動速度および／またはその他のアンプリコンパラメーターが得られ、そして評価される。特定の実施形態では、これらバンドは、標準曲線または１つ以上のコントロール配列に対するそれらの移動速度、ピーク高さ、またはピーク強度に基いて識別され、そして少なくとも１つの対応する標的領域のメチル化の程度が推測される。
【０１２７】
特定の実施形態では、標的領域メチル化の程度は、（ａ）２つ以上の関連アンプリコン
種、例えば、制限されないで、標的領域の完全にメチル化されたコピー由来のアンプリコン種、標的領域の非メチル化コピー由来の第２のアンプリコン種、および／または中間レベルのメチル化をもつ１つ以上の標的領域由来の１つ以上のアンプリコン種の間１つ以上の測定可能なアンプリコンパラメーターを比較すること；（ｂ）１つ以上の測定可能なアンプリコンパラメーターを標的領域に対する１つ以上の標準曲線と比較すること；および／または（ｃ）コントロール配列、例えば、制限されないでサイズラダーと１つ以上の測定可能なアンプリコンパラメーターと比較することによって決定される。
【０１２８】
特定の実施形態では、移動速度またはその他の測定可能なアンプリコンパラメーターが、対応する標的領域に対する標準曲線と比較され、サンプル中のその標的領域のメチル化の程度を決定する。当業者は、同じ標的領域から生成され異なるメチル化の程度をもつ関連アンプリコンの群を比較するために用いられ得る多くの測定可能なアンプリコンパラメーターを認識し、アンプリコン移動速度、アンプリコンピーク高さの高さ、関連アンプリコンの群のアンプリコンに対する曲線の下の積分面積などを含む。標準曲線、コントロール配列、または関連アンプリコン種を用いて１つ以上の測定可能なアンプリコンを評価することにより、代表的には、メチル化の程度または標的領域を決定し得る。
【０１２９】
代表的には、ピーク高さ、アンプリコンピークの下の面積、少なくとも１つのアンプリコンに関する１つ以上の検出されたレポーター基のシグナル強度、またはその他の測定可能なアンプリコンパラメーターが得られ、そして少なくとも１つの標的領域のメチル化の程度が、例えば、しかし、制限なくして、アンプリコンに対応する標的領域のメチル化の程度が推測され得る１つ以上の対応する標準曲線を用いて外挿され得る。
【０１３０】
標準曲線は、サンプル中の特定の標的領域のメチル化の程度を決定するために有用であり得る。標準曲線の生成および使用は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｏｖｅｒｈｏｌｔｚｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００：１１５４７〜５２、２００３）。代表的には、１つ以上の標的領域を含む既知のメチル化状態をもつ合成テンプレートまたはｇＤＮＡ（「コントロールテンプレート」）の予め決定された混合物または系列希釈物が、１つ以上の開示される方法について出発材料として用いられる。この方法は、コントロールテンプレートおよび得られる測定可能なアンプリコンパラメーターのセットを用いて反応条件の確立されたセットの下で実施される。実験的に得られたパラメーターは、Ｘ−Ｙグラフまたはその他の座標系上でプロットされ、そして次に手動で、もしくは１つ以上の数学的公式またはアルゴリズム、例えば、しかし制限されないで、グラフ化および／または線描写ソフトウェア、線形回帰分析および類似の数学的計算、コンピューターアルゴリスムなどを用いて「曲線」が生成される。一旦標準曲線が、所定の標的領域およびプライマーセット（単数または複数）について生成されたなら、同じアッセイ条件の下で同じプライマーセット（単数または複数）を用いて試験（未知）サンプルから得られた実験結果が、この標準曲線およびサンプル中の標的領域メチル化がこの標準から外挿され得る程度を用いて評価され得る。当業者は、「曲線」が実際に真っ直ぐ、または実質的に真っ直ぐな直線であり得るか、またはそれは曲線であり得、そして広範な範囲の形状をとり得ることを認識する。
【０１３１】
（特定の例示のキット）
本教示はまた、特定の開示された方法の実施を促進するように設計されたキットを提供する。キットは、これら方法を実施するために必要な２つ以上の成分をアセンブルすることにより特定の開示された方法の実施を促進するために供され得る。特定の実施形態では、キットは、エンドユーザーによる測定のための必要性を最小にする予め測定されたユニット量で成分を含む。いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の開示された方法を実施するための指示書を含む。好ましくは、これらキット成分は、互いと組み合わせて操作するために最適化される。
【０１３２】
特定の実施形態では、キットは、標的特異的プライマー対、第１のＤＮＡポリメラーゼ、およびＭＳＡを含む。特定の実施形態では、キットは、多数の異なる標的特異的プライマー対を含む。特定の実施形態では、キットは、第２のＤＮＡポリメラーゼおよび増幅プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、増幅プライマー対を含む。いくつかの実施形態では、順方向増幅産物プライマー、逆増幅産物プライマー、またはプライマー対の両方のプライマーは、ユニバーサルプライミング配列またはユニバーサルプライミング配列の相補物を含む。いくつかの実施形態では、キットは、順方向プライマー、逆プライマー、またはレポーター基をさらに含む順方向プライマーおよび逆プライマーを含む。いくつかのこのような実施形態では、プライマー対の順方向プライマーのレポーター基は、このプライマー対の逆プライマーのレポーター基とは異なる。いくつかの実施形態では、キットはさらに：改変剤、レポータープローブ、インターカーレート剤、レポーター基、およびコントロール配列、例えば、制限されないでハウスキーピング遺伝子または分子サイズもしくは重量標準物を含むポリヌクレオチドラダーのような内部標準配列の少なくとも１つをさらに含む。
【０１３３】
上記に記載された現在の教示は、実施例を参照してより良好に理解され得る。以下の実施例は、例示目的のみのために意図され、そしていかなる方法においても本明細書中の教示の範囲を制限するとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１３４】
（実施例１：改変サンプルの調製）
メチル化ヒトｇＤＮＡを含むサンプル（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｐ／Ｎ  Ｓ７８２１“ＣｐＧｅｎｏｍｅＴＭ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＤＮＡ、ヒト男性、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ．）または非メチル化ヒトｇＤＮＡ（Ｃｏｒｉｅｌｌ＃ＮＡ１７１４３、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）を、市販供給元から得た。これら２つのサンプルの各々のアリコートを改変剤でパラレルに処理した。１つのＭｉｃｒｏＡｍｐ反応チューブ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐ／Ｎ  Ｎ８０１−０５８０）中に、３３０ｎｇの非メチル化ｇＤＮＡ（１μＬのＣｏｒｉｅｌｌ  ｇＤＮＡ）を、４４μＬの水（合計でＤＮＡサンプルからの水を含む）および５μＬのＭ−希釈緩衝液（Ｚｙｍｏ  Ｐ／Ｎ  Ｄ５００１−２、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ）と合わせた。第２のＭｉｃｒｏＡｍｐ反応チューブは、３３０ｎｇのメチル化ｇＤＮＡ（３．３μＬのＳｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓメチル化ｇＤＮＡ）、４１．７μＬの水（合計でＤＮＡサンプルからの水を含む）、および５μＬのＭ−希釈緩衝液（Ｚｙｍｏ  Ｐ／Ｎ  Ｄ５００１−２）を含んだ。これらチューブを、３７℃で１５分間インキュベートした。ｇＤＮＡサンプルがインキュベートされていた間、Ｚｙｍｏ  ＣＴ転換試薬Ｐ／Ｎ  Ｄ５００１−１を２１０μＬのＭ−希釈緩衝液および７５０μＬの分子生物学グレードのヌクレアーゼフリーの水（ＳｉｇｍａＷ４５０２）と混合し、そしてこの混合物を使用の前に１０分間に亘り定期的にボルテックスした。１００μＬの新鮮に調製された改変試薬のアリコートを各々のＭｉｃｒｏＡｍｐチューブ（総容量１５０μＬ）に添加し、そしてこれらチューブを５０℃で約１２〜１６時間の間サーモサイクラー中でインキュベートした。
【０１３５】
改変されたサンプルを２００〜３００μＬの水で希釈し、そして各溶液をアセンブルされたＭｉｃｒｏｎ  １００デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐ／Ｎ  ＹＭ−１００）に移し、そしてＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４１５遠心分離機中で１８分間２８００ｒｍｐで遠心分離した。濾液を除去し、３５０μＬのさらなる水を上部チャンバーに添加し、そしてこれらアセンブリを２８００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。この洗浄ステップをさらに１回繰り返し、次いで、３５０μＬの０．１Ｍ  ＮａＯＨを上部チャンバーに添加し、そしてこれらアセンブリを２８００ｒｍｐで１５分間遠心分離した。濾液を除去し、３５０μ
Ｌの水を上部チャンバーに添加し、そしてこれらアセンブリを２８００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。５０μＬのＴＥ緩衝液を上部チャンバーに添加し、そして上下に数回ピペッティングすることにより混合した。これらアセンブリを約５分室温で静置させ、次いで、これらアセンブリを転置し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中のＴＥ緩衝液中に改変サンプルを収集した。
【０１３６】
（実施例２：ｐ１５標的領域のメチル化の程度を評価すること）
ｐ１５腫瘍−サプレッサー遺伝子（ＩＮＫ４Ｂ）のプロモーター領域中の標的領域のメチル化の程度を評価するために、公開された配列（ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｓ７５７５６）のセクションを、「ＭｅｔｈＰｒｉｍｅｒ」ソフトウェア（インターネット上：ｕｒｏｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒで見出される）を用いて分析し、可能な順方向および逆標的特異的プライマー配列を識別した。いくつかのＤＮＡポリメラーゼは、ホモポリマーストレッチを非効率的に増幅するので、この標的領域は、好ましくは、例えば、制限されないで９ＴまたはＡより大きいホモポリマーストレッチを含まない。ホモポリマーストレッチなしの２８９塩基対標的領域が同定された。重亜硫酸塩で転換された完全にメチル化された標的領域は以下の配列：
【０１３７】
【化１】
2009508475.tif 000005
を含んだ。３０のＣＧ部位が下線で示され、そして上流および下流の標的隣接領域はイタリックで示される。重亜硫酸塩転換に起因して、すべての下線ＣＧ部位は、非メチル化ｇＤＮＡ出発物質から得られた改変サンプルの標的領域中ではＴＧに変換されたはずである。例示のｐ１５標的特異的プライマー対は以下の配列：
【０１３８】
【化２】
2009508475.tif 000006
み、そしてその５’−末端上に蛍光レポーター基６−ＦＡＭ（「ＦＡＭ」として示される）を含み；第１の標的特異的部分は下線で示される。例示のプライマー対の逆標的特異的プライマーは以下の配列：
【０１３９】
【化３】
2009508475.tif 000007
を含み；第２の標的特異的部分は下線で示され、そしてこの例ではＭ１３ユニバーサルプライミング配列である、上流のプライマー結合部位はイタリックで示される。
【０１４０】
実施例１からの２つの改変サンプルの各々の一部分を、２つの別個の第１の増幅組成物中で標的特異的プライマー対と組み合わせた。この第１の増幅組成物の各々は、１μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  １０×緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．８μＬのヌクレオチドミックス（２．５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）、０．８μＬのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）、０．２μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ
Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．２５μＬの順方向標的特異的プライマー（５μＭ）、０．２５μＬの逆標的特異的プライマー（５μＭ）、０．５μＬの改変サンプルの１つ（１０ｎｇ／μＬ）、および６．２μＬの水（Ｓｉｇｍａ）を含んだ。第１のアンプリコンを生成するために、第１の増幅反応は、９５℃１１分間、（９７℃５秒間、５７℃２分間、および７２℃４５秒間）の４０サイクルの熱サイクリングを受け、そして４℃に冷却した。
【０１４１】
これら第１のアンプリコンを含む第１の増幅組成物の各々の１．２μＬのアリコートを、５〜１０％のＧｅｎｅＳｃａｎＴＭ−５００ＲＯＸＴＭサイズ標準（Ｐ／Ｎ  ４０１７３４）を含む１２μＬのＨｉＤｉＴＭホルムアミド（Ｐ／Ｎ４３１１３２０）と混合した。このホルムアミド混合物を、キャピラリー電気泳動による分析の前に９５℃で５分間９５℃で加熱した。これらアンプリコンの各々を、ＰＯＰ−４ポリマーを含む３６ｃｍ×５０ミクロンのキャピラリー中ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０  Ｇｅｎｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｅｒ上で分析し、そして泳動モジュールは、ＧＳ  ＰＯＰ４（１ｍＬ）Ａであった。メチル化および非メチル化サンプル由来の個々のアンプリコンに関するフラグメント分析データを得た後、等容量の２つの第１のアンプリコン−ホルムアミド溶液を合わせ、そしてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中に同時注入し、これら２つのアンプリコンの移動における差異を分析した。図２に示されるように、メチル化ｇＤＮＡ由来のアンプリコンピーク（「１」）は、非メチル化ｇＤＮＡ由来のアンプリコンピーク（「２」）より遅く移動した。これら２つのアンプリコンピークの移動速度を、ＧｅｎｅＳｃａｎＴＭ−５００  ＲＯＸＴＭコントロール配列と比較することにより（示されてはいない）、メチル化ｇＤＮＡ由来のアンプリコンピークは、予想されたサイズにより近く移動したことが決定された。従って、少なくともこれらの電気泳動条件下では、メチル化および非メチル化ｐ１５標的領域は区別され得、そしてこれらの対応するメチル化の程度（この例示の実施形態では、メチル化  対  非メチル化）が決定され得る。当業者は、例えば、しかし、制限されないで、電気泳動温度、ポリマー処方、緩衝液タイプ、緩衝液濃度、緩衝液ｐＨ、キャピラリー長さ、変性剤の存在または不在、電圧などの特定の泳動条件を改変することにより、メチル化および非メチル化アンプリコンピークの解像度をさらに増加または低減することが可能であり得ることを認識する。
【０１４２】
（実施例３：合わせたメチル化および非メチル化サンプルの評価）
改変されたメチル化および非メチル化ｇＤＮＡサンプルを、異なる非メチル化ｇＤＮＡサンプル、Ｃｏｒｉｅｌｌ＃ＮＡ１７１３６（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）を用いたことを除いて、本質的に実施例１に記載のように得た。同じｐ１５標的領域を、今回は、第１の標的特異的部分（下線部）、ならびにプライマーの５’−末端のＦＡＭ蛍光レポーター基およびこの実施例ではＭ１３ユニバーサル順方向プライミング部位である第１のプライマー結合部位を含む上流テイル部分を含む以下の配列をもつ順方向標的特異的プライマー：
【０１４３】
【化４】
2009508475.tif 000008
および、第２の標的特異的部分（下線部）、ならびにこの実施例ではＭ１３ユニバーサル逆プライミング配列である第２のプライマー結合部位、およびその５’−末端に例示の「ＰＩＧｔａｉｌ」配列（イタリックで示される）（Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０（６）：１００４〜１０、１９９６）を含む上流テイルを含む以下の配列をもつ逆標的特異的プライマー
【０１４４】
【化５】
2009508475.tif 000009
を含んだ異なるｐ１５標的特異的プライマー対を用いることにより増幅し、そして分析した。
【０１４５】
改変されたメチル化サンプルおよび改変された非メチル化サンプルの混合物を表１に示されるように調製した。改変されたメチル化サンプルおよび改変された非メチル化サンプルは定量されず、それ故、示される％は、等しい％の改変されたメチル化サンプルおよび改変された非メチル化サンプルの収率が、重亜硫酸塩転換の後に得られ、そして各々の最終ＤＮＡ濃度がほぼ１０ｎｇ／μＬであったとの仮定に基づく、推定の比率であった。
【０１４６】
【表１】
2009508475.tif 000010
一連の第１の増幅組成物を、各々が１μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  １０×緩衝液、０．８μＬのｄＮＴＰミックス（２．５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰを含む）、０．８μＬのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）、０．２μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．２５μＬの順方向標的特異的プライマー（５μＭ）、０．２５μＬの逆標的特異的プライマー（５μＭ）、０．５μＬの表１に示される改変サンプルのミックスの１つ、および６．２μＬの水（Ｓｉｇｍａ）を含む、７のＭｉｃｒｏＡｍｐチューブ中に形成した。第１のアンプリコンは、第１の増幅組成物を９５℃に５分間、（９５℃３０秒間、６０℃２分間、および７２℃４５秒間）の３１の増幅サイクル、（９５℃３０秒間、６０℃２分間、および７２℃１０分間）の４サイクル、そして次に４℃まで冷却することに供することにより生成した。第２のセットのサイクリング条件を、しばしば「Ｃｌａｒｋ反応」と呼ばれる（例えば、Ｃｌａｒｋ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６（２０）：９６７７、１９８８；およびＢｒｏｗｎｓｔｅｉｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０（６）：１００４〜１０、１９９６を参照のこと）、Ａヌクレオチドの非テンプレート付加を
増大するために設計した。
【０１４７】
透明のＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６ウェル反応プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐ／Ｎ  Ｎ８０１−０５６０）の各ウェルに、１．２μＬの第１のアンプリコンを含む第１の増幅組成物の１つを、５〜１０％のＧｅｎｅＳｃａｎＴＭ−５００ＲＯＸＴＭサイズ標準（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐ／Ｎ  ４０１７３４）を含む、１２μＬのＨｉＤｉＴＭホルムアミド（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐ／Ｎ  ４３１１３２０）と混合した。この反応プレートを、９６ウェルの３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒプレート隔壁（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐ／Ｎ  ４３１５９３３）でカバーした。この第１のアンプリコン−ホルムアミド混合物を含むプレートを、分析の前に９５℃で５分間加熱し、ＤＮＡを変性した。これら混合物の各々を、ＰＯＰ−４ポリマーを用いるＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＧｅｎｅＳｃａｎ３６＿ＰＯＰ４ＤｅｆａｕｌｔＭｏｄｕｌｅのランモジュールセッティング、およびＧＳ５００ＦｒａｇＡｎａｌ．ｇｓｐの分析モジュールセッティングを用い、３６ｃｍ×５０ミクロンのキャピラリーを含む１６のキャピラリーアレイを用いて分析した。結果は、図３Ａおよび表２に示される。
【０１４８】
【表２−１】
2009508475.tif 000011
【０１４９】
【表２−２】
2009508475.tif 000012
ｐ１９腫瘍サプレッサー遺伝子（ＩＮＫ４Ａ）中の標的領域のメチル化の程度を評価するために、公開されたｐ１６配列のセクション（ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｘ９４１５４）をＭｅｔｈＰｒｉｍｅｒを用いて分析した。２８のＣＧ対を含む２６１塩基対の標的領域が同定された。ｐ１６標的特異的プライマー対は、第１の標的特異的部分（下線部）、ならびにプライマーの５’−末端にＦＡＭ蛍光レポーター基（「６−ＦＡＭ」として示される）およびこの実施例ではＭ１３ユニバーサル順方向プライミング部位である第１のプライマー
結合部位を含む上流テイル部分を含む以下の配列：
【０１５０】
【化６】
2009508475.tif 000013
をもつ順方向プライマー；および、第２の標的特異的部分（下線部）、ならびにこの実施例ではＭ１３ユニバーサル逆プライミング配列である第２のプライマー結合部位、およびその５’−末端に例示の「ＰＩＧｔａｉｌ」配列（イタリックで示される）を含む上流テイルを含む以下の配列をもつ逆標的特異的プライマー
【０１５１】
【化７】
2009508475.tif 000014
を含む異なるｐ１６標的特異的プライマー対が評価された。これらの結果は、図３Ｂおよび表３に示される。
【０１５２】
【表３−１】
2009508475.tif 000015
【０１５３】
【表３−２】
2009508475.tif 000016
当業者は、このような混合されたサンプルのアンプリコンデータを用いて標準曲線を生成し得、そして、とりわけ、例えば、混合された細胞集団を含む試験（「未知」）サンプル中の対応する標的領域のメチル化の程度がこの曲線からの外挿により決定され得ることを認識する。
【０１５４】
（実施例４：ＭＳＡ取り込みを用いるＳＲＢＣアンプリコンの評価）
標的領域メチル化を決定することにおけるＭＳＡ取り込みの使用を評価するために、ヒトＳＲＢＣ遺伝子（ｃ−キナーゼに結合する血清剥奪応答因子（ｓｄｒ）−関連遺伝子産
物、「ＳＲＢＣ」）中の標的領域を分析した。報告されたＳＲＢＣは、乳癌感受性遺伝子ＢＲＣＡ１の産物と結合する（Ｘｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：７９４３〜４９、２００１）。このＳＲＢＣ標的領域の配列は：
【０１５５】
【化８】
2009508475.tif 000017
であり、ここで、ＣｐＧ部位は下線で示され、そして標的隣接配列はイタリックで示される。この実施例で用いられたＳＲＢＣ特異的プライマー対は、第１の標的特異的部分（下線部）および第１のプライマー結合部位を含む第１のテイル部分を含む以下の配列：
【０１５６】
【化９】
2009508475.tif 000018
含む、順方向ＳＲＢＣ特異的プライマー；および第２の標的特異的部分（下線部）、ならびに第２のプライマー結合部位および逆プライマーの５’−末端に位置する例示のＰＩＧテイル配列（イタリックで示される）を含む第２のテイル部分を含む以下の配列：
【０１５７】
【化１０】
2009508475.tif 000019
を含む逆ＳＲＢＣ−特異的プライマーを含んだ。
【０１５８】
各々が、２．５μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  １０×緩衝液、２μＬの適切なＮＴＰミックス（２．５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰを含む）、２μＬのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）、０．５μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．６２５μＬのＳＲＢＣ特異的順方向プライマー（５μＭ）、０．６２５μＬのＳＲＢＣ−特異的逆プライマー（５μＭ）、１５．５μＬの水および（ａ）１．２５μＬの改変された混合サンプル（５０：５０の改変メチル化および改変非メチル化サンプルの混合物を含む）、または（ｂ）１．２５μＬの改変非メチル化サンプルのいずれかを含む、２つの異なる第１の増幅組成物が、２つのＭｉｃｒｏＡｍｐ反応チューブ中に形成された（総容量は２５μＬであった）。この第１の増幅組成物を９５℃に５分間加熱し、次いで、各々が（９７℃５秒間、６０℃２分間、および７２℃７２秒間）を含む３１の増幅サイクル、各々が（９７℃５秒間、６０℃２分間、および７２℃１０分間）を含む４の増幅サイクルを受け、次いで、この第１の増幅組成物を４℃に冷却した。第１のアンプリコンを、ＱＩＡＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｋｉｔ（Ｐ／Ｎ  ２８１０４、Ｑｉａｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＭＤ）を製造業者のプロトコールに従って用いて精製し、そしてこの精製されたアンプリコンを、最終容量３０μＬのＥＢ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）中に回収した。このＥＢ緩衝液中の精製された第１のアンプリコンの各々のアリコートを、１μＬの小エビアルカリホスファターゼ（ＵＳＢ
Ｃｏｒｐ．、Ｐ／Ｎ  ７００９２Ｘ、１単位／μＬ）とＥＢ中の１つの第１のアンプリコンの１０μＬを混合することによりさらに精製し（二重に精製）、そして次に３７℃で１時間、そして次に７２℃で１５分間パラレルにインキュベートした。
【０１５９】
４つの異なる第２の増幅組成物を調製した。異なる第２の増幅組成物の３つは、０．５μＬの１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂ
ｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、０．５μＬのＤＭＳＯ、０．０５μＬのＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、０．２５μＬのその５’−末端に蛍光レポーター基ＦＡＭを含む増産物特異的順方向プライマー（５μＭ、以下の配列：
【０１６０】
【化１１】
2009508475.tif 000020
を有する）、１μＬの二重に精製された混合された第１のアンプリコン、および（ａ）０．７μＬの水、１μＬのα−チオ−ｄＣＴＰ（１ｍＭ、Ｐ／Ｎ  Ｎ−８００２  ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；ｄＣＴＰの例示の移動度シフトアナログ）およびｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ（各々１ｍＭ）を含むｄＮＴＰミックスの１μＬ、（ｂ）０．７μＬの水、１μＬのビオチン−ａｈａ−ｄＣＴＰ（１ｍＭ、Ｐ／Ｎ  Ｂ３２７７２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；ｄＣＴＰの例示の移動度シフトアナログ）およびｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ（各々１ｍＭ）を含むｄＮＴＰミックスの１μＬ、または（ｃ）１．７μＬの水、およびｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ（各々１ｍＭ）を含むｄＮＴＰミックスの１μＬのいずれかを含んだ。第４の第２の増幅組成物は、０．５μＬの１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液、０．５μＬのＤＭＳＯ、０．０５μＬのＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、０．２５μＬのその５’−末端に蛍光レポーター基ＦＡＭを含む増産物特異的順方向プライマー（５μＭ、以下の配列：
【０１６１】
【化１２】
2009508475.tif 000021
を有する）、１μＬの二重に精製された非メチル化された第１のアンプリコン、１μＬのビオチン−ａｈａ−ｄＣＴＰ（１ｍＭ）およびｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ（各々１ｍＭ）を含むｄＮＴＰミックスの１μＬ、または（ｃ）１．７μＬの水、およびｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ（各々１ｍＭ）を含むｄＮＴＰミックスの１μＬを含んだ。各々の第２の増幅組成物の最終容量は、５．０μＬであった。ＦＡＭ標識された第２のアンプリコンは、上記第２の増幅組成物を、パラレルで、９６℃に１分間、および（９６℃１０秒間、５０℃５秒間、および６０℃で４分間）を含む５の増幅サイクルに供することにより生成され、次いで、この第２のアンプリコンを含む第２の増幅組成物は、４℃に冷却された。
【０１６２】
１．２μＬの各々の４つの熱サイクルされた第２の増幅組成物を、ＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６ウェル反応プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐ／Ｎ  Ｎ８０１−０５６０）の別個のウェルに添加し、１つのウェルは第２のアンプリコンの各々のためであり、そして各々は、５〜１０％のＧｅｎｅＳｃａｎＴＭ−５００  ＲＯＸＴＭサイズ標準品を含む１２μＬのＨｉＤｉＴＭホルムアミドと混合された。この反応プレートを、９６ウェルの３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒプレート隔壁で覆った。ＤＮＡを変性するために、この第２のアンプリコン−ホルムアミド混合物、分析の前に９５℃で５分間加熱た。これら混合物の各々を、３６ｃｍ×５０ミクロンのキャピラリーおよびＰＯＰ−４ポリマーを含む、１６のキャピラリーアレイを用いるＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ上で分析した。ランモジュールは、ＧｅｎｅＳｃａｎ３６＿ＰＯＰ４ＤｅｆａｕｌｔＭｏｄｕｌｅであり、そして分析モジュールは、ＧＳ５００ＦｒａｇＡｎａｌ．ｇｓｐであった。
【０１６３】
図４の上のパネルは、メチル化アンプリコンピーク（１）が非メチル化アンプリコンピーク（２）と実質的に重複する、従来のＮＴＰミックスを用いて得た結果を示す。図４の
下のパネルは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、およびα−チオ−ｄＣＴＰを含むＮＴＰミックスを用いて得た結果を示す。このメチル化アンプリコンピーク（１）と非メチル化アンプリコンピーク（２）との間の距離は、（テイル部分中の任意のアナログは除く）非メチル化アンプリコン中にはなく、メチル化アンプリコン中の移動度シフトｄＣＴＰアナログの存在に起因して増加される。α−チオ−ｄＣＴＰは、標的領域が５ｍＣを含む場合はいつもメチル化アンプリコン中に取り込まれ、メチル化アンプリコンの移動度のシフトを生じる。
【０１６４】
図５の上のパネルは、混合された改変サンプル（５０％の改変メチル化サンプルおよひ５０％の改変非メチル化サンプル）、およびビオチン−ａｈａ−ｄＣＴＰを含むｄＮＴＰミックスを用いて得た結果を示す。この上のパネルに示されるように、一連のアンプリコンピークが観察され、非メチル化アンプリコンピーク（１）はメチル化アンプリコンピーク（２）よりゆっくりと移動した。図５の下のパネルは、改変メチル化サンプル、およびｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、およびビオチン−ａｈａ−ｄＣＴＰを含むｄＮＴＰミックスを用いて得た結果を示す。従って、この下のパネルに見られるアンプリコンピークは、完全にメチル化されたＳＲＢＣ標的領域からのみ派生する第２のアンプリコンに対応する。このメチル化されたアンプリコンピークは、標的領域中の１３のＣＧ対、およびプライマー中の４のＣに起因して、１７のビオチン−ａｈａ−ｄＣＴＰを含むはずである順方向の第２のアンプリコンを含んだ。特定の理論によつて制限されることは意図されないが、混合されたメチル化アンプリコンおよび非メチル化アンプリコン（上のパネル）およびメチル化アンプリコン単独（下のパネル）について観察された複数のピークは、第２の増幅反応の間にＭＳＡで終了する、ビオチン−ａｈａ−ｄＣＴＰ調製物中の夾雑物としてｄＣＴＰの存在に起因するようであり得る。しかし、図５の下のパネルで見られるように、メチル化されたＳＲＢＣ標的領域由来の関連アンプリコンファミリーのピーク（文字「ａ」〜「ｏ」によって指定される１５の比較的均一に間隔を置いたピーク）が、これらの例示の反応条件およわび分析する技法を用いて検出された。
【０１６５】
現在の教示の組成物、方法、およびキットは、本明細書で広くかつ一般的に（属として）記載されてきた。この一般的な開示内に入るより狭い種（ｓｐｅｃｉｅｓ）および亜−属（ｓｕｂ−ｇｅｎｅｒｉｃ）グループ分けの各々はまた、現在の教示の一部を形成する。これは、この属から任意の主題を除去する条件または負の限定が、切除される事項が
本明細書に詳細に記載されているか否かにかかわらず、現在の教示の包括的な説明を含む。
【０１６６】
開示された教示が、種々の適用、方法、およびキットを参照して説明されたが、種々の変更および改変が本明細書中の教示から逸脱することなくなされ得ることが認識される。前述の実施例は、本教示をより良好に説明するために提供され、そして本明細書中の教示の範囲を制限することは意図されない。現在の教示の特定の局面は、添付の請求項を考慮してさらに理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】図１は、特定の開示された方法の種々の実施形態の概略図を提供する。
【図２】図２は、実施例２に記載されるような、開示された方法を使用して得られた例示的な結果を示す。１：メチル化されているアンプリコンのピーク；２：メチル化されていないアンプリコンのピーク。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、実施例３に記載されるような、開示された方法を使用して得られた例示的な結果を示す。１：メチル化されているアンプリコンのピーク；２：メチル化されていないアンプリコンのピーク；１０％、２５％、５０％、７５％および１００％は、サンプル中のメチル化されていない標的領域の％を示す。
【図４】図４は、実施例４に記載されるような、例示のＭＳＡ（α−チオ−ｄＣＴＰ）を含む開示された実施形態を使用して得られた例示の結果を示す。１：メチル化されているアンプリコンのピーク；２：メチル化されていないアンプリコンのピーク。
【図５】図５は、実施例４に記載されるような、ＭＳＡ（ビオチン−ａｈａ−ｄＣＴＰ）を含む開示された実施形態を使用して得られた例示の結果を示す。１：メチル化されていないアンプリコンのピーク；２：メチル化されているアンプリコンのピーク；下のパネル：ピーク「ａ」〜「ｏ」は、例示のメチル化されている標的領域に由来するアンプリコンのピークを示す。
【図１】
2009508475.tif 000022
【図２】
2009508475.tif 000023
【図３Ａ】
2009508475.tif 000024
【図３Ｂ】
2009508475.tif 000025
【図４】
2009508475.tif 000026
【図５】
2009508475.tif 000027
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月24日(2008.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009508475000001.app