(57)【要約】本発明は、霊長類のサイトカインファミリーに関する。本明細書ではそのポリペプチド類をコードするポリヌクレオチド類、そのコードされるポリペプチド類を宿主ソースで産生させるのに用いる試薬、およびそのコードされるポリペプチド類に結合してその活性を調節する化合物の同定に有用な試薬が提供される。さらに、霊長類において炎症および／または自己免疫に関連した疾患の診断または治療のために有用な試薬を提供する。一つの実施形態では、本発明により、配列番号２のアミノ酸配列を持つシノモルグス・マカークｐ１９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。
2009500021.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号６を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
発現調節配列が機能するように連結されている、請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを含む培養細胞。
【請求項９】
前記ポリペプチドが発現可能な条件下で、請求項８に記載の細胞を培養する工程を含む、前記ポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
前記細胞または前記細胞培地から前記ポリペプチドを精製する工程をさらに含む、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
発現調節配列が機能するように連結されている、請求項３または４に記載のポリヌクレオチオドを含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターを含む培養細胞。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが発現可能な条件下で、請求項１２に記載の細胞を培養する工程を含む、前記ポリペプチドの製造方法。
【請求項１４】
前記細胞または前記細胞培地から前記ポリペプチドを精製する工程をさらに含む、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
発現調節配列が機能するように連結されている、請求項５または６に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターを含む培養細胞。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが発現可能な条件下で、請求項１６に記載の細胞を培養する工程を含む、前記ポリペプチドの製造方法。
【請求項１８】
前記細胞または前記細胞培地から前記ポリペプチドを精製する工程をさらに含む、請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
発現調節配列が機能するように連結されている配列番号３のポリヌクレオチドおよび配列番号３に機能するように連結されている配列番号１のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２０】
配列番号３が配列番号７を介して配列番号１に機能的に連結されている、請求項１９に記載の発現ベクター。
【請求項２１】
請求項１９に記載のベクターを含む培養細胞。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが発現可能な条件下で、請求項２１に記載の細胞を培養する工程を含む前記ポリペプチドの製造方法。
【請求項２３】
発現調節配列が機能するように連結されている配列番号３のポリヌクレオチド、および配列番号３に機能するように連結されている配列番号５のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２４】
配列番号３が配列番号７を介して配列番号５に機能するように連結されている、請求項２３に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２３に記載のベクターを含む培養細胞。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが発現可能な条件下で、請求項２５に記載の細胞を培養する工程を含む、前記ポリペプチドの製造方法。
【請求項２７】
配列番号２を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号４を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２９】
配列番号６を含む単離されたポリペプチド。
【請求項３０】
合成アミノ酸リンカーによって連結されている配列番号２と４とを含むポリペプチド。
【請求項３１】
哺乳類細胞の表面受容体に結合する、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記哺乳類細胞表面受容体がＩＬ−２３受容体である、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記ＩＬ−２３受容体が霊長類のＩＬ−２３受容体である、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記霊長類がシノモルグス・マカークである、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記ヒトおよびシノモルグス・マカークのＩＬ−２３細胞表面受容体の両方に結合する、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
請求項３０に記載のポリペプチドならびに滅菌緩衝液を含有する組成物。
【請求項３７】
合成アミノ酸リンカーで連結されている配列番号４と６とを含むポリペプチド。
【請求項３８】
前記ポリペプチドが哺乳類細胞表面受容体に結合する、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
前記哺乳類細胞表面受容体がＩＬ−１２受容体である、請求項３８に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
前記哺乳類ＩＬ−１２受容体が霊長類のＩＬ−１２受容体である、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
前記霊長類がシノモルグス・マカークである、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記ヒトおよびシノモルグス・マカークのＩＬ−１２細胞表面受容体の両方に結合する、請求項４１に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
請求項３７に記載のポリペプチドならびに滅菌緩衝液を含有する組成物。
【請求項４４】
固形支持体上に固定化されている、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
前記固形支持体が、ニトロセルロースフィルター、ビーズ、マルチウエルプレートおよびチップから成る群から選択される、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
固形支持体上に固定化されている、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
前記固形支持体が、ニトロセルロースフィルター、ビーズ、マルチウエルプレートおよびチップから成る群から選択される、請求項４６に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
請求項３０に記載のポリペプチドに結合して当該活性を調節する結合性化合物。
【請求項４９】
請求項３０に記載のポリペプチドの前記活性を抑制する、請求項４８に記載の結合性化合物。
【請求項５０】
請求項３０に記載のポリペプチドの前記活性を刺激する、請求項４８に記載の結合性化合物。
【請求項５１】
抗体、アプタマーまたは低分子から成る群から選択される、請求項４８に記載の結合性化合物。
【請求項５２】
請求項３７に記載のポリペプチドを認識して当該活性を調節する結合性化合物。
【請求項５３】
請求項３７に記載のポリペプチドの前記活性を抑制する、請求項５２に記載の結合性化合物。
【請求項５４】
請求項３７に記載のポリペプチドの前記活性を刺激する、請求項５２に記載の結合性化合物。
【請求項５５】
抗体、アプタマーまたは低分子から成る群から選択される、請求項５２に記載の結合性化合物。
【請求項５６】
ａ）請求項２７、２８、２９、３０または３７のいずれか一つに記載されるシノモルグス・マルケスのポリペプチドと、結合性化合物とを接触させる工程；
ｂ）前記シノモルグス・マカークのポリペプチドに結合する前記結合性化合物を選択して結合性候補化合物を得る工程；
ｃ）ｐ１９、ｐ４０、ｐ３５、ＩＬ−２３またはＩＬ−１２から成る群から選択されるヒトのポリペプチドと、前記結合性候補化合物とを接触させる工程；および
ｄ）前記シノモルグス・マカークのポリペプチドおよび当該ヒト相同体の両方に結合する前記結合性候補化合物を同定する工程を含む、
結合性化合物の同定方法。
【請求項５７】
ａ）請求項２７、２８、２９、３０または３７のいずれか一つによるシノモルグス・マルケスのポリペプチドと、結合性化合物とを接触させる工程；
ｂ）前記シノモルグス・マカークのポリペプチドの機能を調節する前記結合性化合物を選択して結合性候補化合物を得る工程；
ｃ）ｐ１９、ｐ４０、ｐ３５、ＩＬ−２３またはＩＬ−１２から成る群から選択されるヒトのポリペプチドと、前記結合性候補化合物とを接触させる工程；および
ｄ）前記シノモルグス・マカークのポリペプチドおよび当該ヒト相同体の両方の機能を調節する前記結合性候補化合物を同定する工程を含む、
結合性化合物の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本非仮特許出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、次の仮特許出願：２００５年６月３０日に出願された米国仮特許出願第６０／６９６，４４９号の利益を請求し、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般的にはポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関し、さらに特定するとサイトカインのうちのＩＬ−１２ファミリーのメンバーをコードする核酸、ならびにそれらから導かれる精製ポリペプチド類に関する。さらに、本発明はＩＬ−１２サイトカインファミリー精製蛋白質を生成する試薬、ならびにそれらの蛋白質に対する拮抗性化合物も提供し、それらは研究、診断および医療に用いられる。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
哺乳類における免疫応答は、「免疫ネットワーク」と呼ばれる一連の複合的な細胞相互作用に基づいている。リンパ球、マクロファージ、顆粒球、およびそのほかのネットワーク様の細胞相互作用に加えて、リンホカイン、サイトカインまたはモノカインとして知られている可溶性蛋白質も、前述の細胞相互作用の調節に重要な役割を果たしている。免疫系細胞によって発現するサイトカインは、免疫応答の調節に重要な役割を果たす。サイトカインのほとんどは多面発現性を有し、多様な生物活性を持つ。その生物活性には抗原提示；ＣＤ４＋細胞サブセットの活性化、増殖および分化；Ｂ細胞による抗体反応；ならびに過敏感反応の表出が含まれる。サイトカインについては、免疫系および／または増血細胞に直接または間接的に関与する広範囲の変性または異常状態に関わっている。重要なサイトカインファミリーにはＩＬ−１２ファミリーが存在し、それはたとえばＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７およびｐ４０モノマーおよびｐ４０ダイマーが含まれる。ＩＬ−２３は、互いに別々の遺伝子でコードされるｐ１９とｐ４０とのサブユニットから構成される共有結合化ヘテロダイマー分子である。ＩＬ−１２も共有結合化ヘテロダイマー分子であり、互いに別々の遺伝子でコードされているｐ３５とｐ４０とのサブユニットから成る。したがってＩＬ−２３およびＩＬ−１２はともにｐ４０サブユニットを共通に持つ。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ｐ４０、ｐ３５およびｐ１９遺伝子については、すでにマウス、ラット、イヌ、ブタおよびヒトを含む多細胞生物から単離され、精製されている。本発明は、ヒト以外の霊長類のｐ４０、ｐ１９およびｐ３５サブユニットをコードする単離核酸を提供し、それらの用途としては、たとえばＩＬ−１２サイトカインファミリーの精製蛋白質の発現用試薬、ならびに霊長類、特にシノモルグス・マカーク（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ・ｍａｃａｑｕｅｓ）における免疫ネットワークの種々の細胞型の調節用試薬が挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、哺乳類のＩＬ−１２サイトカインファミリーを対象とするものである。本発明は特にシノモルグス・マカークのＩＬ−１２サイトカイン類を対象とするものである。
【０００６】
一つの実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列を持つシノモルグス・マカークｐ１９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態では、シノモルグスｐ１９をコードする単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１またはその相補配列を含む核酸が提供される。ほかの実施形態では、配列番号４のアミノ酸配列を持つシノモルグス・マカークｐ４０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態では、シノモルゲスのｐ４０をコードする単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。一つの実施形態では、配列番号３またはその相補配列を含む核酸が提供される。ほかの実施形態では、配列番号６のアミノ酸配列を持つシノモルグス・マカークｐ３５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態では、シノモルグスｐ３５をコードする単離されたポリヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。一つの実施形態では、配列番号５またはその相補配列を含む核酸が提供される。
【０００７】
別の実施形態では、発現調節配列が機能するように連結した本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。一つの実施形態では、発現調節配列が機能するように連結した配列番号２によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、たとえば配列番号１によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。別の実施形態では、発現調節配列が機能するように連結した配列番号４によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、たとえば配列番号３によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。別の実施形態では、発現調節配列が機能するように連結した配列番号６によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、たとえば配列番号５によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。
【０００８】
一つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは機能するように連結した配列番号１および３によるポリヌクレオチド配列を含み、その連結にはたとえばエラスチリンカー（ｅｌａｓｔｉ  ｌｉｎｋｅｒ）配列（ｇｔｔｃｃｔｇｇａｇｔａｇｇｇｇｔａｃｃｔｇｇｇｇｔｇｇｇｃ）（配列番号７）が加えられる。一つの実施形態では、エラスチリンカーによって配列番号１によるポリヌクレオチド配列の５’末端に、配列番号３の３’末端が連結する。別の実施形態では、エラスチリンカーによって配列番号３によるポリヌクレオチド配列の５’末端が、配列番号１の３’末端に連結する。特定の実施形態では、発現調節配列が機能するように連結した配列番号１と３との連結体を含む発現ベクターが提供される。
【０００９】
一つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、機能するように連結した配列番号３および５によるポリヌクレオチド配列を含み、その連結にはたとえばエラスチリンカー配列（ｇｔｔｃｃｔｇｇａｇｔａｇｇｇｇｔａｃｃｔｇｇｇｇｔｇｇｇｃ）（配列番号７）が加えられる。一つの実施形態では、エラスチリンカーによって配列番号５によるポリヌクレオチド配列の５’末端に、配列番号３の３’末端が連結する。別の実施形態では、エラスチリンカーによって配列番号３によるポリヌクレオチド配列の５’末端が、配列番号５の３’末端に連結する。特定の実施形態では、発現調節配列が機能するように連結した配列番号３と５との連結体を含む発現ベクターが提供される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本発明には本発明の発現ベクターを含む細胞、たとえば培養細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、培養細胞としては原核細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、真核細胞、哺乳類細胞、マウス細胞、霊長類細胞またはヒト細胞を挙げることができるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、培養細胞内に含まれる発現ベクターには、配列番号１，３または５、あるいはそれらの組合せによるポリヌクレオチド配列が含まれる。特定の実施形態では、培養細胞内に含有する発現ベクターには、ポリヌクレオチド１および３、あるいはポリヌクレオチド３および５が含まれる。ほかの実施形態では、本発明は配列番号１，３または５によるポリヌクレオチドを含むシノモルグス以外の組織または臓器を提供する。ほかの実施形態では、本発明は配列番号１および３によるポリヌクレオチド、あるいは配列番号３および５によるポリヌクレオチドを含むシノモルグス以外の組織または臓器を提供する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本発明は本発明の発現ベクターを含む本発明の細胞をポリペプチドの発現を可能にする諸条件下で培養する工程を含むポリペプチドの製造方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法には細胞および／または細胞培地からポリペプチドを精製する工程もさらに含まれる。いくつかの実施形態では、培養細胞内に含有される発現ベクターには、配列番号１，３または５によるポリヌクレオチド配列、あるいはそれらいずれかの組合わせが含まれる。特定の実施形態では、培養細胞内に含有される発現ベクターには、ポリヌクレオチド１および３、あるいはポリヌクレオチド３および５が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの製造方法は、本発明の発現ベクターを含有する組織または臓器からポリペプチドを精製する工程を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは固形支持体に固定化されており、その固形支持体としてはニトロセルロースフィルター、ビーズ、マルチウエルプレートまたはチップが挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の固定化ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３および／または配列番号５によるヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
さらに本発明は、配列番号２，４または６のいずれか一つによるアミノ酸配列を含む単離または組換え産生ポリペプチドも提供する。
【００１４】
特定の実施形態では、本発明はエラスチリンカーによってアミノ酸配列ＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧ（配列番号８）が加えられた配列番号２および４を含むポリペプチドを提供する。一つの実施形態では、ポリペプチドの立体配置には配列番号２−エラスチリンカー−配列番号４が含まれるが、別の実施形態では、ポリペプチドの立体配置には配列番号４−エラスチリンカー−配列番号２が含まれる。別の実施形態では、配列番号２および４による連結型ポリペプチドは、哺乳類の細胞表面受容体に結合する。好ましい実施形態では、連結型ポリペプチドが結合する細胞表面受容体は、ＩＬ−２３受容体である。別の好ましい実施形態では、哺乳類は霊長類である。特定の実施形態では、霊長類はシノモルグス・マカークである。さらなる実施形態では、配列番号２および４による連結型ポリペプチドは、ヒトおよびシノモルグスの両方のＩＬ−２３受容体に結合する。一つの実施形態では、本発明は配列番号２および４による連結型ポリペプチド、ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む組成物を提供する。
【００１５】
別の実施形態では、本発明はエラスチリンカーによってＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧアミノ酸配列（配列番号８）が加えられた配列番号４および６を含むポリペプチドを提供する。一つの実施形態では、ポリペプチドの立体配置には配列番号４−エラスチリンカー−配列番号６が含まれるが、別の実施形態では、ポリペプチドの立体配置には配列番号６−エラスチリンカー−配列番号４が含まれる。一つの実施形態では、配列番号４および６による連結型ポリペプチドは、哺乳類の細胞表面受容体に結合する。好ましい実施形態では、連結型ポリペプチドが結合する細胞表面受容体は、ＩＬ−１２受容体である。別の好ましい実施形態では、哺乳類は霊長類である。特定の実施形態では、霊長類はシノモルグス・マカークである。さらなる実施形態では、配列番号４および６による連結型ポリペプチドは、ヒトおよびシノモルグスの両方のＩＬ−２３受容体に結合する。一つの実施形態では、本発明は配列番号４および６のアミノ酸配列を含む連結型ポリペプチド、ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む組成物を提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、配列番号２，４および６のいずれか一つ、あるいはそれらのいずれかの組合わせによるペプチドは、固形支持体に固定化されており、その固形支持体にはニトロセルロースフィルター、ビーズ、マルチウエルプレートまたはチップが挙げられるが、それらに限定されない。
【００１７】
一つの実施形態では、本発明は配列番号２，４または６のいずれか一つによるポリペプチドを認識する結合性化合物を提供する。一つの実施形態では、結合性化合物は配列番号２，４または６のいずれか一つによるポリペプチドの活性を調節する。いくつかの実施形態では、結合性化合物は配列番号２，４または６のいずれか一つによるポリペプチドの活性を抑制するが、ほかの実施形態では、結合性化合物は配列番号２，４または６のいずれか一つによるポリペプチドの活性を刺激する。いくつかの実施形態では、配列番号２，４または６のいずれか一つによるポリペプチドを認識する結合性化合物は抗体である。別の実施形態では、結合性化合物は低分子である。好ましい実施形態では、結合性化合物はアプタマーである。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は配列番号２および４のアミノ酸配列を含む連結型ポリペプチドを認識する結合性化合物を提供する。一つの実施形態では、結合性化合物は配列番号２および４のアミノ酸配列を含む連結型ポリペプチドの活性を調節する。いくつかの実施形態では、結合性化合物は配列番号２および４による連結型ポリペプチドの活性を抑制するが、ほかの実施形態では、結合性化合物は配列番号２および４による連結型ポリペプチドの活性を刺激する。いくつかの実施形態では、配列番号２および４による連結型ポリペプチドを認識する結合性化合物は抗体である。別の実施形態では、結合性化合物は低分子である。好ましい実施形態では、結合性化合物はアプタマーである。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は配列番号４および６による連結型ポリペプチドを認識する結合性化合物を提供する。一つの実施形態では、結合性化合物は配列番号４および６による連結型ポリペプチドの活性を調節する。いくつかの実施形態では、結合性化合物は配列番号４および６による連結型ポリペプチドの活性を抑制するが、ほかの実施形態では、結合性化合物は配列番号４および６による連結型ポリペプチドの活性を刺激する。いくつかの実施形態では、配列番号４および６による連結型ポリペプチドを認識する結合性化合物は抗体である。別の実施形態では、結合性化合物は低分子である。好ましい実施形態では、結合性化合物はアプタマーである。
【００２０】
一つの実施形態では、本発明は配列番号１，２または３によるポリヌクレオチドのいずれか一つから派生する核酸を認識する結合性化合物を提供する。一つの実施形態では、結合性化合物は配列番号１，３または５のいずれか一つの発現を調節する。一つの実施形態では、結合性化合物は配列番号１，３または５のいずれか一つの発現を抑制する。いくつかの実施形態では、配列番号１，３または５によるポリヌクレオチドのいずれか一つを認識する結合性化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ（小型干渉ＲＮＡ）から成る群から選択される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、結合性化合物の同定方法が提供される。一つの実施形態では、同定方法には以下の工程が含まれる。ａ）配列番号２，４，６、配列番号４に連結した配列番号２、あるいは配列番号６に連結した配列番号４のいずれか一つによるシノモルグス・マカークのポリペプチドに、結合性化合物を接触させる工程；ｂ）シノモルグス・マカークのポリペプチドに結合する結合性化合物を選択して結合性候補化合物を得る工程；ｃ）ｐ１９、ｐ４０、ｐ３５、ＩＬ−２３またはＩＬ−１２からなる群から選択されるヒトのポリペプチドに、結合性候補化合物を接触させる工程；およびｄ）シノモルグス・マルケスのポリペプチドおよびヒトのその相同体の両方に結合する結合性候補化合物を同定する工程。別の実施形態では、同定方法には以下の工程が含まれる。ａ）配列番号２，４，６、配列番号４に連結した配列番号２、あるいは配列番号６に連結した配列番号４のいずれか一つによるシノモルグス・マカークのポリペプチドに結合性化合物を接触させる工程；ｂ）シノモルグス・マカークのポリペプチドの機能を調節する結合性化合物を選択して結合性候補化合物を得る工程；ｃ）ｐ１９、ｐ４０、ｐ３５、ＩＬ−２３またはＩＬ−１２からなる群から選択されるヒトのポリペプチドに、結合性候補化合物を接触させる工程；およびｄ）シノモルグス・マルケスのポリペプチドおよびヒトのその相同体の両方の機能を調節する結合性候補化合物を同定する工程。いくつかの実施形態では、同定方法には本発明のポリペプチドを用いて本発明のポリペプチドに対するアプタマーを得る工程が含まれ、その例としては配列番号２，４，６、配列番号４に連結した配列番号２、あるいは配列番号６に連結した配列番号４のいずれか一つによるポリペプチドをＳＥＬＥＸ（商標）中で用いる工程があげられる。ＳＥＬＥＸ（商標）工程とは、標的分子に対して結合特異性が高い核酸分子をインビトロで評価する方法の一つであって、たとえば１９９０年、１月１１日に出願され、現在は取下げられた米国特許出願第０７／５３６４２８号、発明の名称が「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ（核酸リガンド）」である米国特許第５４７５０９６号、および発明の名称が「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ（核酸リガンド）」である米国特許第５２７０１６３号（国際公開第９１／１９８１３号も参照のこと）に記載されている。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本発明の同定方法には本発明のポリペプチドを動物に投与する工程が含まれ、その例としては配列番号２，４，６、配列番号４に連結した配列番号２、あるいは配列番号６に連結した配列番号４のいずれか一つによるポリペプチドを投与して本発明のポリペプチドに対する抗体を得る工程が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明の一つまたは複数の実施形態の詳細については、以下の説明で示される。本明細書の記載と同じまたは同等の方法および素材のいずれも、本発明の実施または試験に用いることができ、それに好適な方法および素材をここで述べる。本発明のほかの特徴、目的および利点については、この記載で明らかになる。本明細書においては特に明示されていなくとも、単一の形態は複数の形態も含むものとする。別に規定されていなくとも、本明細書で用いられる技術用語および科学用語のすべては、本発明に属する当業者が一般に理解するのと同じ意味を有するものとする。矛盾する場合は、本明細書を優先することとする。本明細書で挙げられた参考文献のすべては、その全体が組入れられるものとする。
【００２４】
本発明は、ｐ４０、ｐ１９およびｐ３５を含めたシノモルグス・マカークＩＬ−１２サイトカインファミリーの遺伝子メンバーでコードされるポリペプチド類を提供する。本明細書で用いられる「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合で連結したアミノ酸鎖のいずれかを指し、「蛋白質」（たとえばサイトカイン類）という用語と同義であるが、本明細書で用いられるポリペプチドという用語は、生物によって産生されるものと同じ構造のものに限定されない。一つの実施形態では、本発明のポリペプチドは成熟型ペプチドである。本明細書で用いられる場合、翻訳後の修飾を受けた成熟型または最終のペプチドまたは蛋白質産物についてのコーディング配列を指す。さらに本発明は、シノモルグスのＩＬ−２３およびＩＬ−１２に関するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド類も提供する。本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、ホスホジエステル結合によって互いが結合したヌクレオチドポリマーを指し、それらにはＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸が含まれる。本発明で提供されるポリヌクレオチド類については、標準的な方法で合成することができる。
【００２５】
また本発明では前述の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供され、それらは蛋白質であるシノモルグスＩＬ−２３およびＩＬ−１２サイトカインの発現および精製用の試薬として有用である。本明細書で用いられる発現ベクターという用語は、プラスミド内にドナー由来の単離ｃＤＮＡを組入れたものであって、ｃＤＮＡでコードされる蛋白質を合成させることが可能なものを指す。本明細書で用いられる宿主という用語は、インビトロでの細胞培養物を指し、それらには原核細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、真核細胞、哺乳類細胞、マウス細胞、霊長類細胞、およびヒト細胞が含まれるが、それらに限定されない。本明細書で用いられる精製ポリペプチドという用語は、ドナー由来のほかの汚染性の蛋白質、核酸またはそれ以外の生物学的物質をほとんど含まない蛋白質のことを意味する。ポリペプチドの純度については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲル分析で測定でき、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで測定した場合、一般的には少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％である。これらの精製サイトカインについては、その機能を調節できる結合性化合物の同定またはスクリーニングに用いることができる。
【００２６】
シノモルグスおよびヒトのＩＬ−２３およびＩＬ−１２サイトカインに結合する化合物
本発明で提供される精製シノモルグスＩＬ−２３およびＩＬ−１２サイトカインは、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２を認識して結合する化合物の同定、スクリーニングまたは生成に用いることができる。本発明には、シノモルグスＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２サイトカインを認識して結合し、それらの活性を調節する化合物が含まれる。本発明にはシノモルグスＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２を認識して結合し、ヒトＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２サイトカインと交差反応し、シノモルグスおよびヒトの両方のサイトカイン活性を調節する化合物も含まれる。さらに本発明には、ヒトＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２を認識して結合し、シノモルグスＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２と交差反応し、ヒトおよびシノモルグスのサイトカインの両方の活性を調節する化合物も含まれる。いくつかの実施形態では、結合性化合物はサイトカイン活性を刺激するが、ほかの実施形態ではサイトカイン活性を抑制する。シノモルグスおよび／またはヒトのＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２サイトカインに結合してその活性を調節することが可能であって本発明に含まれる化合物にはアプタマー、抗体および低分子が含まれるが、それらに限定されない。
【００２７】
さらに本発明にはアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡを含めた核酸結合性化合物も含まれる。そのような結合性化合物については、医療、研究および／または診断用のツールとして有用といえる。
【００２８】
さらに本発明には、本発明に含まれる結合性化合物または核酸結合性化合物、ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含有する組成物も含まれる。またそれらの組成物については薬学的に有効な量で霊長類に投与すると、異常な炎症性または自己免疫性の症状の治療薬として有用であり得る。そのような化合物は、霊長類に単独、またはほかの既知治療薬と併用して投与できる。
【実施例】
【００２９】
（実施例１：シノモルグス・マカークＩＬ−１２サイトカインファミリーのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）
前述のように、ＩＬ−１２サイトカインファミリーは、一般にｐ４０サブユニットを持つ種々のヘテロダイマー分子を含有し、ＩＬ−２３およびＩＬ−１２が挙げられる。ＩＬ−２３についてはｐ４０およびｐ１９サブユニットから構成される一方、ＩＬ−１２はｐ４０およびｐ３５サブユニットから構成される。それら三種のサブユニットのすべての、ヒト以外の霊長類のｃＤＮＡについては、シノモルグス・マカークの正常な脾臓ｃＤＮＡ（米国、カリフォルニア州、ヘイワード市、バイオチェインリサーチ社製）から、二段階ＰＣＲ法を用いて単離された。本明細書で用いられるｃＤＮＡという用語は、細胞内で蛋白質を発現させ産生させる遺伝子部位を示し得られたｍＲＮＡ鎖内の塩基に相補させるように実験室内で合成された１本鎖ＤＮＡを指す。ｐ４０サブユニットの単離には、シノモルグスの正常な脾臓のｃＤＮＡテンプレートとともに以下のオリゴを用い、９５℃、３０秒；５０℃、３０秒；および７２℃、６０秒の３５サイクルの温度条件下で第一ＰＣＲ増幅工程を行った。
【００３０】
【化１】
2009500021.tif 000003
第一ラウンドのＰＣＲでは１０４２ｂｐの断片が増幅され、それを第二ＰＣＲ工程用のテンプレートとして用いた。第二ＰＣＲ工程は、以下のオリゴを用い、９５℃、３０秒；５７．５℃、３０秒；および７２℃、６０秒の２５サイクルの温度条件下で行った。
【００３１】
【化２】
2009500021.tif 000004
この工程よって９４４ｂｐの断片が増幅され、それをＴＡクローニングベクター（ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ，大腸菌株Ｔｏｐ１０、米国、カリフォルニア州、カールスバッド市、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内でクローニングした。尚、操作はメーカーのプロトコールに従った。プラスミドＤＮＡについては、ＱＩＡｐｒｅｐキット（ドイツ、ヒルデン市、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて細菌培地１．５ｍｌから調製し、その配列を決定した。シノモルグスの正常な脾臓のｃＤＮＡから単離して得られたＤＮＡ配列（配列番号３）、およびそれに対応する成熟型ペプチド配列（配列番号４）を以下の表１に挙げる。シノモルグスｐ４０の単離核酸配列でコードされる成熟型ペプチド配列（配列番号４）、およびヒトのｐ４０との配列比較を図１に示す。
【００３２】
ｐ１９サブユニットの単離には、シノモルグスの正常な脾臓ｃＤＮＡテンプレートとともに以下のオリゴを用い、９５℃、３０秒；５０℃、３０秒；および７２℃、６０秒の３５サイクルの温度条件下で第一ＰＣＲ増幅工程を行った。
【００３３】
【化３】
2009500021.tif 000005
第一ラウンドのＰＣＲでは６２４ｂｐの断片が増幅され、それを第二ＰＣＲ工程用のテンプレートとして用いた。第二ＰＣＲ工程は、以下のオリゴを用い、９５℃、３０秒；５７．５℃、３０秒；および７２℃、６０秒の２５サイクルの温度条件下で行った。
【００３４】
【化４】
2009500021.tif 000006
この工程よって５６６ｂｐの断片が増幅され、それをＴＡクローニングベクター（ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ，大腸菌株Ｔｏｐ１０、米国、カリフォルニア州、カールスバッド市、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内でクローニングした。尚、操作はメーカーのプロトコールに従った。プラスミドＤＮＡについては、ＱＩＡｐｒｅｐキット（ドイツ、ヒルデン市、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて細菌培地１．５ｍｌから調製し、その配列を決定した。シノモルグスの正常な脾臓のｃＤＮＡから単離して得られたＤＮＡ配列（配列番号１）、およびそれに対応する成熟型ペプチド配列（配列番号２）を以下の表１に挙げる。シノモルグスｐ１９の単離核酸配列でコードされる成熟型ペプチド配列（配列番号２）、およびヒトｐ１９との配列比較を図１に示す。
【００３５】
ｐ３５サブユニットの単離には、シノモルグスの正常な脾臓ｃＤＮＡテンプレートとともに以下のオリゴを用い、９５℃、３０秒；５０℃、３０秒；および７２℃、６０秒の３５サイクルの温度条件下で第一ＰＣＲ増幅工程を行った。
【００３６】
【化５】
2009500021.tif 000007
第一ラウンドのＰＣＲでは７８８ｂｐの断片が増幅され、それを第二ＰＣＲ工程用のテンプレートとして用いた。第二ＰＣＲ工程は、以下のオリゴを用い、９５℃、３０秒；５７．５℃、３０秒；および７２℃、６０秒の２５サイクルの温度条件下で行った。
【００３７】
【化６】
2009500021.tif 000008
この工程よって７６７ｂｐの断片が増幅され、それをＴＡクローニングベクター（ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ，大腸菌株Ｔｏｐ１０、米国、カリフォルニア州、カールスバッド市、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内でクローニングした。尚、操作はメーカーのプロトコールに従った。プラスミドＤＮＡについては、ＱＩＡｐｒｅｐキット（ドイツ、ヒルデン市、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて細菌培地１．５ｍＬから調製し、その配列を決定した。シノモルグスの正常な脾臓のｃＤＮＡから単離して得られたＤＮＡ配列（配列番号５）、およびそれに対応する成熟型ペプチド配列（配列番号６）を以下の表１に挙げる。シノモルグスｐ３５の単離核酸配列でコードされる成熟型ペプチド配列（配列番号６）、およびヒトｐ３５との配列比較を図１に示す。
【００３８】
【化７】
2009500021.tif 000009
（実施例２：シノモルグスＩＬ−２３およびＩＬ−１２サイトカインの発現および精製）
さらに本発明では、表１中のポリヌクレオチド配列を含む発現構造体も提供され、それらは宿主内でｃＤＮＡを発現させ、ｃＤＮＡでコードされる精製蛋白質の単離用試薬として有用である。前述のように、ＩＬ−２３はそれぞれ二つの別々の遺伝子でコードされるｐ１９およびｐ４０サブユニットから構成されるヘテロダイマーである。シノモルグスＩＬ−２３発現構造体については、シノモルグスの正常な脾臓から単離されたｐ４０のｃＤＮＡ（配列番号３）およびｐ１９のｃＤＮＡ（配列番号１）の両方を、２個のウシ・エラスチンモチーフ（ｇｔｔｃｃｔｇｇａｇｔａｇｇｇｇｔａｃｃｔｇｇｇｇｔｇｇｇｃ；配列番号７；２個のエラスチモチーフ包含）で一本鎖に連結合して調製し、その連結順は配列番号３−配列番号７−配列番号１とした。この一本鎖を、以下に示す一般的な分子クローニング手法を用い、ｐＯＲＦプラスミド（米国、カリフォルニア州、サンディエゴ市、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内に組入れた。シノモルグスｐ４０の断片についてはＰＣＲ増幅し、ｐＯＲＦ−ｈＩＬ２３ベクター（米国、カリフォルニア州、サンディエゴ市、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内のＢｓｐｅＩおよびＡｐａＩ制限サイトを用いてヒトｐ４０と置換え、シノモルグスｐ１９の断片についてはＰＣＲ増幅し、同ベクター内のＡｃｃ６５ＩおよびＮｈｅＩ制限サイトを用いてヒトｐ１９と置換えた。尚、ｐＯＲＦ−ｈＩＬ２３ベクターは、ヒトｐ４０およびヒトｐ１９の両方が２個のウシ・エラスチンモチーフで一本鎖に連結して含有する発現ベクターである。得られたプラスミドには、シノモルグスｐ４０およびシノモルグスｐ１９の両方が２個のウシ・エラスチンモチーフで一本鎖となって含有する。
【００３９】
シノモルグスＩＬ−２３発現構造体については、標準的なトランスフェクション法を用いてヒト・フリースタイル２９３Ｆ細胞（米国、カリフォルニア州、カールスバッド市、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内にトランスフェクトさせた。トランスフェクト３日後に、細胞を１０００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、上清を収集した。ミニ−コンプリート・プロテアーゼ阻害剤タブレット（ドイツ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を一錠加えた後、その上清を３０分間、氷冷し、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸、ｐＨ８．０、２０ｍＭのＮａＣｌ含有）に対して４時間、透析した。尚、透析の中間時点で緩衝液Ａを一回交換した。透析後、上清３０ｍｌについて、ＡＫＴＡ  Ｅｋｐｌｏｒｅシステム（米国、ニュージャージー州、ピスカタウエイ市、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、ＭｏｎｏＱ５／５イオン交換カラム（米国、ニュージャージー州、ピスカタウエイ市、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に装填入した。カラムを０．０５ＭのＮａＣｌ含有緩衝液Ａ８ｍＬで洗浄した。結合した蛋白質を、ＮａＣｌ濃度が０．０５Ｍから１Ｍの緩衝液Ａのグラジエント２０ｍＬで溶離させた。
【００４０】
ＩＬ−１２はそれぞれ二つの別々の遺伝子でコードされるｐ３５およびｐ４０サブユニットから構成されるヘテロダイマーである。シノモルグスＩＬ−１２発現構造体については、シノモルグスの正常な脾臓から単離されたｐ４０のｃＤＮＡ（配列番号３）およびｐ３５のｃＤＮＡ（配列番号５）の両方を、２個のウシ・エラスチンモチーフ（ｇｔｔｃｃｔｇｇａｇｔａｇｇｇｇｔａｃｃｔｇｇｇｇｔｇｇｇｃ；配列番号７；２個のエラスチモチーフ包含）で一本鎖に連結合して調製し、その連結順は配列番号３−配列番号７−配列番号５とした。この一本鎖を、以下に示す一般的な分子クローニング手法を用い、ｐＯＲＦプラスミド（米国、カリフォルニア州、サンディエゴ市、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内に組入れた。シノモルグスｐ４０の断片についてはＰＣＲ増幅し、ｐＯＲＦ−ｈＩＬ２３ベクター（米国、カリフォルニア州、サンディエゴ市、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内のＢｓｐｅＩおよびＡｐａＩ制限サイトを用いてヒトｐ４０と置換え、シノモルグスｐ３５の断片についてはＰＣＲ増幅し、同ベクター内のＡｃｃ６５ＩおよびＮｈｅＩ制限サイトを用いてヒトｐ１９と置換えた。得られたプラスミドには、シノモルグスｐ４０およびシノモルグスｐ３５の両方が２個のウシ・エラスチンモチーフで一本鎖となって含有する。
【００４１】
シノモルグスＩＬ−１２発現構造体については、ヒト・フリースタイル２９３Ｆ細胞（米国、カリフォルニア州、カールスバッド市、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内にトランスフェクトさせた。トランスフェクト３日後に、細胞を１０００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、上清を収集した。ミニ−コンプリート・プロテアーゼ阻害剤タブレット（ドイツ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を一錠加えた後、その上清を３０分間、氷冷し、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭのＮａＣｌ含有）に対して４時間、透析した。尚、透析の中間時点で緩衝液Ａを一回交換した。透析後、上清３０ｍｌについて、ＡＫＴＡ  Ｅｋｐｌｏｒｅシステム（米国、ニュージャージー州、ピスカタウエイ市、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、ＭｏｎｏＱ５／５イオン交換カラム（米国、ニュージャージー州、ピスカタウエイ市、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に装填入した。カラムを０．０５ＭのＮａＣｌ含有緩衝液Ａ８ｍＬで洗浄した。結合した蛋白質を、ＮａＣｌ濃度が０．０５Ｍから１Ｍの緩衝液Ａのグラジエント２０ｍＬで溶離させた。
【００４２】
シノモルグスＩＬ−２３およびＩＬ−１２の両方の精製蛋白質については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。シノモルグスＩＬ−２３は、およそ６９ｋＤの位置に泳動し、純度はおよそ８０％であり、一方のシノモルグスＩＬ−１２は、６６−８０ｋＤの位置に泳動し、純度はおよそ９５％であった。それら精製ＩＬ−２３およびＩＬ−１２は各々、集めて分注し、−８０℃で保存した。
【００４３】
また本発明は、シノモルグスＩＬ−２３およびＩＬ−１２の精製蛋白質、ならびに薬学的に許容される担体液または希釈剤を含有する組成物も提供する。そのような組成物は商業的に流通させることができ、診断、医療および研究目的で使用されると考えられる。それらの組成物については、理論的に直結するものではないが、霊長類における免疫系の調節に有用といえる。本発明で提供される組成物は、霊長類における炎症および自己免疫に関連する疾患の診断または治療に特に有用といえる。
【００４４】
（実施例３：シノモルグスＩＬ−２３およびＩＬ−１２の種交差反応性）
シノモルグスＩＬ−２３がヒトＩＬ−２３受容体（「ＩＬ２３Ｒ」）に結合するかどうかの試験、およびシノモルグスＩＬ−１２がヒトＩＬ−１２受容体（「ＩＬ１２ＲＢ１」）に結合するかどうかの試験を行うために、ヒトＩＬ２３ＲのＦｃとヒトＩＬ１２Ｂ１のＦｃとの融合蛋白（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社製）を、ＥＬＩＳＡアッセイ用に購入した。ＩＬ２３ＲのＦｃ融合蛋白を捕捉するために、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１００μｌ中に５００ｎｇのＩＬ２３Ｒ−Ｆｃ蛋白質を溶解した溶液を、９６穴Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（米国、ニューヨーク州、ロチェスター市、ＮＵＮＣ社製）に入れ、４℃で一晩、温置した。同様に、ＩＬ１２ＲＢ１のＦｃ融合蛋白を捕捉するために、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１００μｌ中に５００ｎｇのＩＬ２３Ｒ−Ｆｃ蛋白質を溶解した溶液を、９６穴Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（米国、ニューヨーク州、ロチェスター市、ＮＵＮＣ社製）に入れ、４℃で一晩、温置した。一晩温置後に各々について捕捉溶液をプレート内から除去し、プレートのウエルごとをＴＢＳＴ（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．０１％のＴｗｅｅｎ２０含有）２００μｌで３回ずつ洗浄した。そのプレートのウエルごとを５％脱脂粉乳含有のＴＢＳＴ２００μｌで３０分間、室温でブロッキングした。ブロッキング後、プレートのウエルごとを室温でＴＢＳＴ２００μｌで３回洗浄し、ＰＢＳに溶解したシノモルグスＩＬ−２３またはシノモルグスＩＬ−１２希釈列をプレートに加え、室温で１時間温置した。次にプレートのウエルごとをＴＢＳＴ２００μｌで３回洗浄し、ウエルごとをＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製の抗ヒトｐ４０モノクローナル抗体液１００μｌを２回（各々、１０００倍希釈液）加え、室温で１時間温置した。ウエルごとをＴＢＳＴ２００μｌで３回洗浄後、各ウエルにＨＲＰ結合型ヤギ抗マウス抗体（米国、マサシューセッツ州、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）１００μｌを加え、室温で０．５時間温置した。次にプレートのウエルごとをＴＢＳＴ２００μｌで３回洗浄し、ウエルごとにＴＭＰ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ社製）１００μｌを加え、暗所、室温で５分間温置した。２Ｎ−Ｈ２ＳＯ４含有溶液１００μｌを加えて反応を停止させ、プレートを９６穴ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘプレートリーダー上、波長４５０ｎｍで読取らせた。図２は、ヒトＩＬ−２３およびヒト１２ＲＢ１受容体サブユニットへの、本発明のシノモルグスＩＬ−２３およびＩＬ−１２の結合曲線を示し、それによってシノモルグスＩＬ−１２およびＩＬ−２３が交差反応し、対応するヒト受容体に結合性を有することが分かる。
【００４５】
（実施例４：ＩＬ−２３およびＩＬ−１２への結合性化合物の種交差反応性）
ＳＥＬＥＸ（商標）工程の際にすでに述べたのと同じ二種のアプタマーＡＲＣ１６２３およびＡＲＣ１６２６については、ともにヒトＩＬ−２３に高親和的に結合する（ドットブロット分析で測定された親和定数は各々、約０．２ｎＭおよび約０．１ｎＭ）が、シノモルグスＩＬ−２３を認識して結合するそれらの活性についての試験を行った。さらに、ＩＬ−２３およびＩＬ−１２が一般にｐ４０サブユニットを持つため、両方のヒトＩＬ−２３アプタマーについて、シノモルグスＩＬ−１２を認識して結合するそれらの活性の試験も行った。ＡＲＣ１６２３およびＡＲＣ１６２６の配列については、以下の表２に挙げ（５’から３’の方向で記載）、表中の「ｄ」はデオキシヌクレオチドを示し、「ｍ」は２’−ＯＭｅヌクレオチドを示し、「ｓ」はホスホロチオエートヌクレオチド間の連結部分を示し、３Ｔは３’反転型デオキシチミジンを示す。
【００４６】
【化８】
2009500021.tif 000010
アプタマー結合親和性の測定。微量の５’−３２Ｐ標識化アプタマーを、種々の濃度で蛋白質（ＩＬ−２３またはＩＬ−１２）に配合し、ＢＳＡ０．１ｍｇ／ｍｌ添加のＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰＢＳ（ＰＢＳ＋Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋）中、室温で３０分間温置した。各々の滴定曲線については、デュプリケートで試験した。次にそれらの反応液を、ドットブロット装置（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ−１  Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔ，Ａｃｒｙｌｉｃ、米国、ニューハンプシャー州、キーン市、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）に加えた。尚、その装置に組込まれた構成体は、（頂部から底部にかけて）Ｐｒｏｔｒａｎニトロセルロース（米国、ニューハンプシャー州、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐナイロン（米国、ニュージャージー州、ピスカタウエイ市、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、およびＧＢ００２ゲルブロット用紙（米国、ニューハンプシャー州、キーン市、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）とした。蛋白質に結合したアプタマーは、ニトロセルロースフィルター上に保持されるが、蛋白質が結合していないＲＮＡはナイロンフィルター上に捕捉される。各々のフィルター上に捕捉されるアプタマーの程度については、Ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）を用いて定量した。平衡解離定数（ＫＤ）については、以下の計算式を用いて計算した。
（（Ａ＋Ｐ＋Ｋ）−ｓｑｒｔ（（Ａ＋Ｐ＋Ｋ）＾２−４＊Ａ＊Ｐ））／２Ａ＋Ｂ
式中、Ａはアプタマーの全濃度であり、Ｐは蛋白質の全濃度であり、Ｂはバックグランドシグナルである。
【００４７】
図３および４は、シノモルグスＩＬ−２３、シノモルグスＩＬ−１２およびヒトＩＬ−２３への、アプタマーの結合曲線（デュプリケート）の比較を示す。表３は、その結合曲線についての平均ＫＤ計算値を示す。図３および４、ならびに表３に挙げられたＫＤ計算値から分かるように、ヒトＩＬ−２３アプタマーは両方とも、シノモルグスＩＬ−２３と交差反応し、比較的高い親和性を持ってシノモルグスＩＬ−２３に結合する。また両方のヒトアプタマーは、シノモルグスＩＬ−１２とも交差反応するが、その親和性はヒトまたはシノモルグスＩＬ−２３に対する親和性よりも明らかに弱い。
【００４８】
【化９】
2009500021.tif 000011
（実施例５：シノモルグスＩＬ−２３のＳＴＡＴ−３リン酸化活性）
ＩＬ−２３は、ＪＡＫ（ジェイナス・キナーゼ）／ＳＴＡＴ（転写時シグナルトランスデューサー・アクチベーター）シグナル伝達における役割を果たし、ＳＴＡＴ１，３，４および５をリン酸化する。シノモルグスＩＬ−２３が細胞ベースでの活性を有するかどうかを試験するために、ＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）含有培地、またはＰＨＡ  ブラスト中で増殖させた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の溶解物中でシグナル伝達のアッセイを行った。さらに特記すると、ＰＨＡブラスト中でＳＴＡＴ−３のリン酸化を計測する細胞ベースのアッセイを、シノモルグスＩＬ−２３の活性の測定に用いた。
【００４９】
本質論として、ＩＬ−２３で処理した細胞の溶解物は、休止状態の細胞よりもＳＴＡＴ３が活性化されていると考えられる。ＳＴＡＴ３リン酸化の刺激については、ＰａｔｈＳｃａｎ（登録商標）Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ３（Ｔｙｒ７０５）Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（米国、マサチューセッツ州、ビバリー市、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）によって計測した。Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＰａｔｈｓｃａｎ（登録商標）Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ３（Ｔｙｒ７０５）Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔは、固相サンドイッチ型エライザ（ＥＬＩＳＡ）であり、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ３（Ｔｙｒ７０５）蛋白質（Ｔｙｒ７０５がリン酸化されたＳＴＡＴ３蛋白質）の内在レベルを検出する。尚、マイクロウエル表面にはすでにＳＴＡＴ３ウサギモノクローナル抗体（#７３００）が被覆されている。細胞溶解物とともに温置した後、非リン酸化およびリン酸化したＳＴＡＴ３蛋白質は両方とも、被覆化抗体に捕捉される。充分に洗浄後、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３マウスモノクローナル抗体#９１３８を加え、捕捉された状態のＰｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３蛋白質を検出した。次にＨＲＰ結合型抗マウス抗体番号７０７６を用いて結合型検出抗体を認識させた。さらにＨＲＰの基質であるＴＭＢを加えて発色させた。この発色に関する吸光度の大きさは、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３蛋白質の量に比例する。
【００５０】
細胞ベースのアッセイについては、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（商品名）グラジエント（米国、ミズーリー州、セントルイス市、Ｓｉｇｍａ社製）を用いてヒト全血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離して実施した。ＰＢＭＣを、ＩＬ−２（米国、ミネソタ州、ミネアポリス市、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）（５μｇ／ｍＬ）添加のＰＨＡ含有のＰｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｅｄｉｕｍ（米国、ミズーリー州、セントルイス市、Ｓｉｇｍａ社製）中、３７℃／５％ＣＯ２で５−６日間培養し、ＰＨＡブラストを生成させた。ＰＨＡブラストを１×ＰＢＳで２回洗浄し、次に０．２０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ中で４時間、低血清状態で処理した。低血清処理後に、適当に標識されたエッペンドルフチューブ内に、約２．５×１０５個の細胞を分注した。その分注した細胞に、種々の濃度のシノモルグスＩＬ−２３を加え、最終液量を１００μｌとして３７℃で１５分間温置した。陽性対照としてヒトＩＬ−２３（米国、ミネソタ州、ミネアポリス市、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）の６ｎｇ／ｍｌ溶液もアッセイに用いた。温置反応は、１．５ｍＭのＮａ３ＶＯ４含有の氷冷ＰＢＳ０．８ｍＬを加えて停止させた。細胞溶解物については、ＥＬＩＳＡアッセイ（米国、マサチューセッツ州、ビバリー市、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で提供されるライシス緩衝液を用いて調製し、その手順は前述のメーカーマニュアルに従った。得られた結果（図５）から、組換え型精製シノモルグスＩＬ−２３が用量依存的にＳＴＡＴ３のリン酸化を刺激することが示された。またＳＴＡＴ３リン酸化の刺激におけるシノモルグスＩＬ−２３の特異的な活性についても、ヒトＩＬ−２３の活性に匹敵している。
【００５１】
本明細書で引用される出版物および特許文献のすべては、本明細書において参照によって組込まれ、それらの各々は特定的かつ個別に本明細書において参照によって取込まれるものとする。出版物および特許文献の引用については、先行技術の容認を目的とするためのものではなく、その内容または日付の容認とみなすものでもない。本発明については本明細書のこれまでの記述で説明がなされ、当業者であるならば、本発明が種々の実施形態で実施できることが分かり、前述の説明および実施例が以下の請求項の説明に役立ち、同時にそれらを限定しないことも分かるであろう。
【００５２】
本発明については、本明細書のこれまでの記述および実施例によって説明がなされ、当業者であるならば、本発明が種々の実施形態で実施できることが分かり、前述の説明および実施例が以下の請求項の説明に役立ち、同時にそれらを限定しないことも分かるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１−１】図１Ａは、本発明のシノモルグスｐ４０の成熟型ペプチド配列の、ヒトｐ４０に対する配列比較を示し、図１Ｂは、本発明のシノモルグスｐ１９の成熟型ペプチド配列の、ヒトｐ１９に対する配列比較を示し、図１Ｃは、本発明のシノモルグスｐ３５の成熟型ペプチド配列の、ヒトｐ３５に対する配列比較を示す。
【図１−２】図１Ａは、本発明のシノモルグスｐ４０の成熟型ペプチド配列の、ヒトｐ４０に対する配列比較を示し、図１Ｂは、本発明のシノモルグスｐ１９の成熟型ペプチド配列の、ヒトｐ１９に対する配列比較を示し、図１Ｃは、本発明のシノモルグスｐ３５の成熟型ペプチド配列の、ヒトｐ３５に対する配列比較を示す。
【図２】図２Ａは、ＥＬＩＳＡによって測定されたヒトＩＬ−２３Ｒ受容体への本発明のシノモルグスＩＬ−２３の結合を示し、図２Ｂは、ＥＬＩＳＡによって測定されたヒトＩＬ−１２ＲＢ１受容体への本発明のシノモルグスＩＬ−１２の結合を示す。
【図３】図３は、ヒトＩＬ−２３、シノモルグスＩＬ−２３およびシノモルグスＩＬ−１２への、ヒトＩＬ−２３アプタマーＡＲＣ１６２３のドットブロット結合曲線（デュプリケート）の比較を示す。
【図４】図４は、ヒトＩＬ−２３、シノモルグスＩＬ−２３およびシノモルグスＩＬ−１２への、ＩＬ−２３アプタマーＡＲＣ１６２６のドットブロット結合曲線（デュプリケート）の比較を示す。
【図５】図５は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるシノモルグスＩＬ−２３およびヒトＩＬ−２３の、濃度減少に伴う吸光度（縦軸）を示すグラフである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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