(57)【要約】  本発明は、メチオニン生産のための改善された方法および生物を特徴とする。本発明は、ΔmetF生物またはΔmetE AmetH生物、例えば、C. glutamicumまたは大腸菌の突然変異体は、メチオニンの合成のために、メチルキャップスルフィド供給源、例えば、ジメチルジスルフィド(DMDS)を、硫黄とメチル基の両方の供給源として使用することができ、それによりMetH/MetEおよびMetFの活性の必要性と硫酸塩を還元する必要性が回避されることを示している。また、本特許出願には、MetY（MetZとも呼ばれる）がメチルキャップスルフィド供給源（例えば、DMDS）をメチオニンに組み込む酵素として関係しているというデータも記載される。C. glutamicumのΔmetF ΔmetB株は、メチルキャップスルフィド供給源（例えば、DMDS）を、スルフィドとメチル基の両方の供給源として使用することができる。さらに、O-アセチル-ホモセリンを過剰生産する、操作された原栄養性生物によるメチオニン生産は、メチルキャップスルフィド供給源（例えば、DMDS）を添加することによって改善された。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチオニンを生産する方法であって、メチオニンが生産されるように、メチルキャップスルフィド化合物の存在下でメチオニン生産微生物を培養することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記メチルキャップスルフィド化合物が、ジメチルジスルフィド(DMDS)、ジメチルトリスルフィド、ジメチルテトラスルフィド、およびより高分子量のスルフィドポリマーからなる群から選択され、それらの末端はメチル基によりキャッピングされている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
メチオニンを生産する方法であって、メチオニンが生産されるように、ジメチルジスルフィド(DMDS)の存在下でメチオニン生産微生物を培養することを含む、前記方法。
【請求項４】
前記DMDSが培養物中に0.02%以上存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記DMDSが培養物中に0.06%以上存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
メチオニンを生産する方法であって、メチオニンが生産されるように、持続放出性DMDS送達系の存在下でメチオニン生産微生物を培養することを含む、前記方法。
【請求項７】
前記持続放出性DMDS送達系がAmberlite（商標）XAD4である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記持続放出性DMDS送達系がDMDSを培養物中0.1%以上のレベルで放出する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記持続放出性DMDS送達系がDMDSを培養物中0.3%以上のレベルで放出する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記持続放出性DMDS送達系が、水と不混和性であるが、DMDSを溶解する液体を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記持続放出性DMDS送達系が、動物油、鉱油、化学油、植物油、合成油、有機溶媒、クロロカーボン、フルオロカーボン、クロロフルオロカーボン、またはそれらの組合せからなる群から選択される液体を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記持続放出性DMDS送達系が遅延制御MDS供給である、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記持続放出性DMDS送達系が、DMDSに対して透過性を有する膜を通るDMDSの流れまたは拡散である、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記持続放出性DMDS送達系がガス状DMDSを供給することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記ガス状DMDSが、液体DMDSを蒸発または沸騰させることにより生成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ガス状DMDSが、液体DMDS中に空気もしくは酸素をバブリングすることにより生成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記メチオニン生産微生物がコリネバクテリウム属(Corynebacterium)に属する、請求項１、２，３または６に記載の方法。
【請求項１８】
前記メチオニン生産微生物がCorynebacterium glutamicumである、請求項１、２，３または６に記載の方法。
【請求項１９】
前記メチオニン生産微生物が、グラム陰性菌、グラム陽性菌、酵母、および古細菌からなる群から選択される、請求項１、２，３または６に記載の方法。
【請求項２０】
前記メチオニン生産微生物が、調節解除された、少なくとも1つのメチオニン生合成酵素を有する、請求項１、２，３または６に記載の方法。
【請求項２１】
前記微生物が調節解除されたO-アセチル-ホモセリンスルフヒドリラーゼまたはO-スクシニル-ホモセリンスルフヒドリラーゼを有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記メチオニン生産微生物が、調節解除された、少なくとも２つのメチオニン生合成酵素を有する、請求項１、２，３または６に記載の方法。
【請求項２３】
前記微生物が調節解除されたホモセリンアセチルトランスフェラーゼまたはホモセリンスクシニルトランスフェラーゼおよび調節解除されたホモセリンデヒドロゲナーゼを有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記微生物が調節解除されたO-アセチル-ホモセリンスルフヒドリラーゼおよび調節解除されたホモセリンアセチルトランスフェラーゼ、または調節解除されたO-スクシニル-ホモセリンスルフヒドリラーゼおよび調節解除されたホモセリンスクシニルトランスフェラーゼを有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
メチオニンを生産する方法であって、メチオニンが生産されるように、ジメチルジスルフィド(DMDS)の存在下で、調節解除されたメチオニン生合成経路を有する微生物を培養することを含む、前記方法。
【請求項２６】
前記微生物がコリネバクテリウム属に属する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記微生物がCorynebacterium glutamicumである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記微生物が大腸菌属に属する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記微生物が、グラム陰性菌、グラム陽性菌、酵母、および古細菌からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記微生物が調節解除されたO-アセチル-ホモセリンスルフヒドリラーゼまたはO-スクシニル-ホモセリンスルフヒドリラーゼを有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記微生物が調節解除されたホモセリンアセチルトランスフェラーゼまたはホモセリンスクシニルトランスフェラーゼおよび調節解除されたホモセリンデヒドロゲナーゼを有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記微生物が調節解除されたO-アセチル-ホモセリンスルフヒドリラーゼおよび調節解除されたホモセリンアセチルトランスフェラーゼ、または調節解除されたO-スクシニル-ホモセリンスルフヒドリラーゼおよび調節解除されたホモセリンスクシニルトランスフェラーゼを有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記メチオニンを単離する段階をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の単離されたメチオニンを含む組成物。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法に従って合成される、メチオニン含有産物。
【請求項３６】
ジメチルジスルフィド(DMDS)の存在下でのメチオニンの生産のための、調節解除されたメチオニン生合成経路を有する組換え微生物。
【請求項３７】
コリネバクテリウム属に属する、請求項３６に記載の微生物。
【請求項３８】
Corynebacterium glutamicumである、請求項３７に記載の微生物。
【請求項３９】
大腸菌属に属する、請求項３６に記載の微生物。
【請求項４０】
メチオニン生産のためのDMDSの利用を改善するための方法であって、メチオニンを欠いているがDMDSを含有している最少培地においてメチオニン要求性株の増殖またはより早い増殖について選択することを含む、前記方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の選択方法によって得られた微生物、または該微生物由来の派生株。
【請求項４２】
請求項４０に記載の選択方法によって得られた微生物由来の単離された遺伝子。
【請求項４３】
メチオニンによるフィードバック阻害に耐性を示すO-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはO-スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする突然変異対立遺伝子を同定するための方法であって、
a)DMDSに依存している生物、およびメチオニン不含有培地での増殖のためにO-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはO-スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼがコードされたプラスミドを、該生物の増殖を阻害するメチオニン類似体と接触させること、
b)該類似体に耐性を示す、該生物の突然変異体について選択すること、
c)該耐性表現型が該プラスミドによりコードされる該突然変異体を単離すること、および
d)メチオニンによるフィードバック阻害に耐性を示すO-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはO-スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする突然変異対立遺伝子が同定されるように、該O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはO-スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼのコード領域において変化した配列を有する突然変異プラスミドを同定するために、該プラスミドの関連部分のDNA配列を決定すること
を含む、前記方法。
【請求項４４】
前記生物がメチオニンシンターゼ（MetEおよびMetH）またはメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(MetF)を欠損しており、かつ前記メチオニン不含有培地がジメチルジスルフィド(DMDS)を含有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記生物がCorynebacterium glutamicum株である、請求項４３または請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記生物が大腸菌株である、請求項４３または請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
請求項４３に記載の方法により単離された、突然変異O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはO-スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ酵素。
【請求項４８】
請求項４３に記載の方法により単離された突然変異O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはO-スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ酵素を含む、生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、2005年7月18日出願の「Use of Dimethyl Disulfide for Methionine Production in Microrganisms」と題する米国仮特許出願第60/700,698号、および2005年9月1日出願の「Use of Dimethyl Disulfide for Methionine Production in Microrganisms」と題する米国仮特許出願第60/713,907号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本願は、2005年7月18日出願の「Use of a Bacillus MetI Gene to Improve Methionine Production in Microorganisms」と題する米国仮特許出願第60/700,557号、および2005年9月1日出願の「Use of a Bacillus MetI Gene to Improve Methionine Production in Microorganisms」と題する米国仮特許出願第60/60/713,905号に関する。
【０００３】
本願はまた、2005年9月1日出願の「Methionine Producing Recombinant Microorganism」と題する米国仮特許出願第60/714,042号、および2005年7月18日出願の「Methionine Producing Recombinant Microorganism」と題する米国仮特許出願第60/700,699号にも関する。
【０００４】
これらの特許出願の各々の全開示内容は、限定されるものではないが、本明細書、特許請求の範囲、および要約書、ならびに任意の図、表、またはそれらの図面を含め、本明細書によって明示的に、参照により本明細書に組み入れる。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
メチオニンは、現在、毒性、危険性、易燃性、不安定性および有害性のある材料または中間体が関わる十分に確立された化学的方法によりDL-メチオニンラセミ混合物として生産されている。メチオニンの化学生産のための出発原料は、アクロレイン、メチルメルカプタン、およびシアン化水素である。メチオニンの化学合成は、メチルメルカプタンとアクロレインとの反応を含み、中間体である3-メチルメルカプトプロピオンアルデヒド(MMP)を生産する。さらなる処理では、5-(2-メチルチオエチル)ヒダントインを生成するためにMMPをシアン化水素と反応させることを含み、この5-(2-メチルチオエチル)ヒダントインを、その後、NaOHなどの腐食剤をNa2CO3、NH3、およびCO2とともに用いて加水分解する。続いて、DL-メチオニンナトリウムを硫酸およびNa2CO3で中和し、DL-メチオニン、Na2SO4、およびCO2を得る。この方法では、生産されるメチオニンの量と比べて過剰の不使用の化合物が生じ、経済的および生態学的問題をもたらす。
【０００６】
メチオニン生産の発酵法は、一般に、微生物を、炭水化物源、例えば、糖類（グルコース、フルクトース、またはスクロースなど）、窒素源、例えば、アンモニア、および硫黄源、例えば、硫酸塩またはチオ硫酸塩を含む栄養源と、他の必要な培地成分とともに培養することに基づく。この方法では、L-メチオニンと、副産物としてのバイオマスが生じ、それらには、毒性、危険性、易燃性、不安定性および／または有害性である出発原料が含まれない。
【０００７】
しかしながら、生物（例えば、微生物）が硫黄源としての硫酸塩からメチオニンを生産するためには、その硫黄原子が、まず、スルフィドに還元されなければならない。この方法は、硫酸塩よりも還元されやすい硫黄源を微生物に供給することによってこの方法を改善するほどにエネルギー集約的である。このように還元される1つの硫黄源はチオ硫酸塩であり、このチオ硫酸塩の2個の硫黄原子のうちの1個は既に還元されている。還元される硫黄のもう1つの供給源は、完全に還元された硫黄原子を含有するメタンチオールである。
【０００８】
メチオニンの生産のためのメタンチオールの使用には2つの利点がある。第1に、上記のように、硫黄原子は既に還元されている。第2に、メチル基が供給され、このメチル基はメチオニン生合成に通常必要な酵素のうちの2つの酵素、メチルテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(MetF)およびメチオニンシンターゼ（MetEおよび／またはMetH）、の必要性を回避(bypass)する可能性がある。一部の微生物、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)は、メタンチオールをO-アセチルホモセリンと反応させることにより、メタンチオールを直接メチオニンに酵素的に組み込むことができるということを開示する文献報告がある(Yamagata, S. 1971. J. Biochem. (Tokyo) 70:1035)。メチオニンの生産におけるメタンチオールの使用方法もまた、WO 93/17112およびWO 2004/076659に開示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、メチオニンの生産のためのメタンチオールの使用には不利な点もある。メタンチオールは、空気中で容易に酸化する毒性のある爆発性のガスであり、有害である。メチオニンを生産するための化学的方法では、技術者が工業規模での取扱いを学んでいることから、メタンチオールを基質の1つとしても用いる。それでもなお、メタンチオールを用いない、メチオニンの生産のための改善された方法がとても有益であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
本発明は、メチオニンの生産のための改善された方法（例えば、微生物合成）に関する。本発明者らは、メチオニンの生産に用いることができる、メタンチオール以外の硫黄および／またはメチル基供給源を見出した。特に、本発明者らは、メチオニンの合成のために、ジメチルジスルフィド(DMDS)（メチルジスルフィドまたはCH3-S-S-CH3とも呼ばれる）を培養培地に添加することができること、かつ微生物によりスルフィドとメチル基の両方の供給源として使用し得ること、それによりMetH/MetEおよびMetFの活性の必要性と硫酸塩を還元する必要性が回避されるということを見出した。
【００１１】
加えて、本発明は、調節解除(deregulated)されたメチオニン生合成経路、例えば、調節解除されたO-アセチル-ホモセリンスルフヒドリラーゼ、および／または調節解除されたホモセリンアセチルトランスフェラーゼ、および／または調節解除されたホモセリンデヒドロゲナーゼを有する微生物は、メチオニンの合成のために、メチルキャップスルフィド化合物(methyl capped sulfide compound)、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、ジメチルジスルフィド(DMDS)を使用することができるということも示す。さらに、本発明者らは、O-アセチル-ホモセリンを蓄積する、工学的に操作された原栄養株(engineered prototrophic strain)によるメチオニン生産は、DMDSを添加することによって改善されるということも見出した。
【００１２】
したがって、1つの態様では、本発明は、メチオニンの生産方法であって、メチオニンが生産されるように、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、ジメチルジスルフィド(DMDS)の存在下で微生物を培養することを含む方法を特徴とする。1つの実施形態では、前記メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSは、培養物中に0.02%以上存在する。もう1つの実施形態では、前記メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSは、培養物中に0.06%以上存在する。他の実施形態では、前記メチルキャップスルフィド化合物、例えば、前記硫黄および／またはメチル基供給源は、ジメチルトリスルフィド(DMTS)、すなわち、CH3-S-S-S-CH3、ジメチルテトラスルフィド(DMTTS)、すなわち、CH3-S-S-S-S-CH3、またはより高分子量のスルフィドポリマーからなる群から選択され、それらの末端はメチル基によりキャッピングされている。
【００１３】
本発明のもう1つの態様は、メチオニンを生産する方法であって、メチオニンが生産されるように、持続放出性メチルキャップスルフィド送達系、例えば、硫黄および／またはメチル基送達系、例えば、ジメチルジスルフィド(DMDS)送達系の存在下でメチオニン生産微生物を培養することを含む方法を特徴とする。1つの実施形態では、前記持続放出性メチルキャップスルフィド送達系、例えば、持続放出性硫黄および／またはメチル基送達系、例えば、DMDSの持続放出性送達系は、Amberlite（商標）XAD4である。1つの実施形態では、前記持続放出性送達系はDMDSを培養培地中合計0.1%以上のレベルで放出する。さらにもう1つの実施形態では、前記持続放出性送達系はDMDSを培養培地中合計0.3%以上のレベルで放出する。1つの実施形態では、前記持続放出性DMDS送達系は、水と不混和性であるが、DMDSを溶解する液体を含む。1つの実施形態では、前記持続放出性メチルキャップスルフィド送達系、例えば、硫黄および／またはメチル基送達系、例えば、DMDSの持続放出性送達系は、動物油、鉱油、化学油、植物油、合成油、有機溶媒、クロロカーボン、フルオロカーボン、クロロフルオロカーボン、またはそれらの組合せからなる群から選択される液体を含む。もう1つの実施形態では、前記持続放出性メチルキャップスルフィド送達系、例えば、前記硫黄および／またはメチル基送達系、例えば、DMDSの持続放出性送達系は、水と不混和性であるが、前記メチルキャップスルフィド化合物、例えば、前記硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSを溶解する液体を含む。さらにもう1つの実施形態では、前記持続放出性メチルキャップスルフィド送達系、例えば、前記硫黄および／またはメチル基送達系、例えば、DMDS持続放出性送達系は、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源の遅延制御供給(slow controlled feed)、例えば、遅延制御DMDS供給である。もう1つの実施形態では、前記持続放出性メチルキャップスルフィド送達系、例えば、前記硫黄および／またはメチル基送達系、例えば、前記DMDS持続放出性送達系は、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSに対して透過性を有する膜である。もう1つの実施形態では、前記DMDS持続放出系は、例えば、液体DMDSを蒸発もしくは沸騰させることにより、または発酵容器に向かう途中で、例えば、液体DMDS中に空気もしくは酸素をバブリングすることによりガス状DMDSを送達する。1つの実施形態では、前記メチオニン生産微生物はコリネバクテリウム属(Corynebacterium)に属する。もう1つの実施形態では、前記メチオニン生産微生物はコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である。さらにもう1つの実施形態では、前記メチオニン生産微生物は、グラム陰性菌（例えば、大腸菌(Escherichia coli)または関連腸内細菌）、グラム陽性菌（例えば、枯草菌(Bacillus subtilis)または関連バチルス属(Bacillus)）、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエまたは関連酵母株）、および古細菌からなる群から選択される。1つの実施形態では、前記メチオニン生産微生物は、調節解除された、少なくとも1つのメチオニン生合成酵素を有する。もう1つの実施形態では、前記微生物は、調節解除されたO-アセチル-ホモセリンスルフヒドリラーゼを有する。さらにもう1つの実施形態では、前記メチオニン生産微生物は、調節解除された、少なくとも2つのメチオニン生合成酵素を有する。1つの実施形態では、前記微生物は、調節解除されたホモセリンアセチルトランスフェラーゼと調節解除されたホモセリンデヒドロゲナーゼを有する。もう1つの実施形態では、前記微生物は、調節解除されたO-アセチル-ホモセリンスルフヒドリラーゼと調節解除されたホモセリンアセチルトランスフェラーゼを有する。
【００１４】
本発明のもう1つの態様は、メチオニンを生産する方法であって、メチオニンが生産されるように、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、ジメチルジスルフィド(DMDS)の存在下で、調節解除されたメチオニン生合成経路を有する微生物を培養することを含む方法を特徴とする。1つの実施形態では、前記微生物はコリネバクテリウム属に属する。もう1つの実施形態では、前記微生物はCorynebacterium glutamicumである。さらにもう1つの実施形態では、前記微生物は、グラム陰性菌（例えば、大腸菌または関連腸内細菌）、グラム陽性菌（例えば、枯草菌または関連バチルス属）、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエまたは関連酵母株）、および古細菌からなる群から選択される。1つの実施形態では、前記微生物は、調節解除されたO-アセチル-ホモセリンスルフヒドリラーゼを有する。もう1つの実施形態では、前記微生物は、調節解除されたホモセリンアセチルトランスフェラーゼと調節解除されたホモセリンデヒドロゲナーゼを有する。さらにもう1つの実施形態では、前記微生物は、調節解除されたO-アセチル-ホモセリンスルフヒドリラーゼと調節解除されたホモセリンアセチルトランスフェラーゼを有する。
【００１５】
本発明のさらにもう1つの態様は、上記方法の任意の方法に従って合成される産物を特徴とする。
【００１６】
本発明のもう1つの態様は、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、ジメチルジスルフィド(DMDS)の存在下でのメチオニンの生産のための、調節解除されたメチオニン生合成経路を有する組換え微生物を特徴とする。1つの実施形態では、前記微生物はコリネバクテリウム属に属する。もう1つの実施形態では、前記微生物はCorynebacterium glutamicumである。さらにもう1つの実施形態では、前記微生物は、グラム陰性菌（例えば、大腸菌または関連腸内細菌）、グラム陽性菌（例えば、枯草菌または関連バチルス属）、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエまたは関連酵母株）、および古細菌からなる群から選択される。1つの実施形態では、前記微生物は、調節解除されたO-アセチル-ホモセリンスルフヒドリラーゼを有する。もう1つの実施形態では、前記微生物は、調節解除されたホモセリンアセチルトランスフェラーゼと調節解除されたホモセリンデヒドロゲナーゼを有する。さらにもう1つの実施形態では、前記微生物は、調節解除されたO-アセチル-ホモセリンスルフヒドリラーゼと調節解除されたホモセリンアセチルトランスフェラーゼを有する。
【００１７】
本発明のさらにもう1つの態様は、メチオニンフィードバック耐性のO-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはO-スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ酵素および／または前記メチオニンフィードバック耐性酵素(methionine feedback-resistant emzymes)をコードする遺伝子（例えば、突然変異遺伝子または対立遺伝子）を同定するための方法を特徴とする。1つの実施形態では、本発明は、メチオニンによるフィードバック阻害に耐性を示すO-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはO-スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする突然変異対立遺伝子を同定するための方法であって、a)DMDSに依存している微生物、およびメチオニン不含有有培地での増殖のためにO-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはO-スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼがコードされたプラスミドを、該微生物の増殖を阻害するメチオニン類似体と接触させること、b)該類似体に耐性を示す、該微生物の突然変異体について選択すること、c)該耐性表現型が該プラスミドによりコードされる該突然変異体を単離すること、およびd)該O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはO-スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼのコード領域において変化した配列を有する突然変異プラスミドを同定するために、該プラスミドの関連部分のDNA配列を決定することを含む方法を特徴とする。本発明はまた、この方法により単離された新規突然変異O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはO-スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ酵素、前記突然変異酵素をコードする遺伝子、ならびに前記突然変異酵素を含む生物をも特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも一部は、メチオニンの生産のための改善された方法（例えば、微生物合成）の発見に基づく。本明細書に記載のとおり、化学的方法によるメチオニンの生産では、硫黄源としてメタンチオールなどの有害で危険な化成品が現在用いられている。メチオニンの生合成生産に、危険性と有害性のより少ない硫黄源を利用することができるということが判明した。特に、本発明者らは、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、ジメチルジスルフィド(DMDS)（メチルジスルフィドとも呼ばれる）を培養培地に添加することができ、微生物により用いられ得るということを発見した。後述の実施例に記載とおり、C. glutamicumのΔmetF株またはΔmetE ΔmetH株は、メチオニンの合成のために、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、ジメチルジスルフィド(DMDS)を、スルフィドとメチル基の両方の供給源として使用することができ、それによりMetH/MetEおよびMetFの活性の必要性と硫酸塩を還元する必要性が回避される。
【００１９】
メチオニンの生産のためのメチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、ジメチルジスルフィドの使用は、メタンチオールの利点の多くをもたらすがその不利な点はほとんど与えない。DMDSは、比較的安価な、石油蒸留産業の副産物であるメタンチオールの酸化ジスルフィドダイマーである。DMDSは、室温で液体であり、沸点は約109℃である。DMDSは水に難溶性であり、増殖培地に0.1%以上の濃度で、特に、0.3%以上の濃度で添加する場合、DMDSの大部分は油として容器の底または側面に残る。
【００２０】
さらに、本発明は、C. glutamicumのΔmetF ΔmetB株が、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSを、スルフィドとメチル基の両方の供給源として使用することができることから、MetY（MetZとも呼ばれる；O-アセチル-ホモセリンスルフヒドリラーゼ）が、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSを、直接または間接的にメチオニンに組み込む酵素であるということを示す。さらに、O-アセチル-ホモセリンを蓄積する、工学的に操作された原栄養株によるメチオニン生産は、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSを添加することによって改善された。
【００２１】
よって、本発明は、メチオニンの生産のための方法および微生物を提供する。
【００２２】
本発明をより理解しやすくするために、最初に特定の用語を本明細書において定義する。
【００２３】
用語「メチオニン生合成経路」とは、メチオニンの形成または合成に利用される、メチオニン生合成酵素（例えば、生合成酵素コード遺伝子によりコードされるポリペプチド）、化合物（例えば、前駆体、基質、中間体、または産物）、補因子などが関与する生合成経路を含む。用語「メチオニン生合成経路」とは、微生物において（例えば、in vivoで）メチオニンの合成をもたらす生合成経路だけでなく、in vitroでメチオニンの合成をもたらす生合成経路も含む。
【００２４】
用語「メチオニン生合成酵素」とは、メチオニン生合成経路の化合物（例えば、中間体または産物）の形成に利用されるいずれもの酵素を含む。「メチオニン生合成酵素」とは、例えば、「トランススルフレーション経路(transsulfuration pathway)」およびメチオニン合成の代替経路である「直接スルフヒドリル化経路(direct sulfhydrylation pathway)」に関与する酵素を含む。例えば、大腸菌はトランススルフレーション経路を利用するが、一方、他の微生物（サッカロミセス・セレビシエ、C. glutamicum、および枯草菌、ならびにこれらの微生物の類縁菌など）は、直接スルフヒドリル化経路を発達させている。多くの微生物は、トランススルフレーション経路または直接スルフヒドリル化経路のいずれかを用い、両方は用いないが、例えば、C. glutamicumなどの一部の微生物はメチオニンの合成に両方の経路を用いる。
【００２５】
「メチオニン生合成酵素」とは、メチオニンの生産に貢献する微生物において一般に見つけられる全ての酵素を包含する。表1では、メチオニン生合成経路における様々な酵素とそれらの酵素をコードするその対応する遺伝子を記載し、図1は、メチオニン生合成経路の模式図である。対応する酵素をコードする遺伝子の名前が、本明細書において記載される名前と異なる微生物もあることは理解される。
【表１】
2009501548.tif 000003
【００２６】
図1によれば、オキサル酢酸(OAA)からのメチオニンの合成は、中間体である、アスパラギン酸、アスパラギン酸ホスフェート、およびアスパラギン酸セミアルデヒドを経て進行する。アスパラギン酸セミアルデヒドは、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（hom遺伝子の産物、他の生物における他の名称の中ではthrA、metL、hdhの別名でも知られる）によりホモセリンに変換される。メチオニン合成におけるその後の段階は、トランススルフレーション経路および／または直接スルフヒドリル化経路を経て進行し得る。
【００２７】
トランススルフレーション経路では、ホモセリンは、ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ（metX遺伝子の産物、metAと呼ばれることもある）およびアセチルCoAの付加によりO-アセチルホモセリンに変換されるか、またはmetA遺伝子の産物（ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ）によるスクシニルCoAの付加によりO-スクシニルホモセリンに変換される。metB遺伝子の産物であるシスタチオニンγ-シンターゼによる、システインからO-アセチルホモセリンまたはO-スクシニルホモセリンのいずれかへの硫黄基の供与によりシスタチオニンが生じる。シスタチオニンは、その後、metC遺伝子（一部の生物ではaecD遺伝子とも呼ばれる）の産物であるシスタチオニンβ-リアーゼによりホモシステインに変換される。
【００２８】
直接スルフヒドリル化経路では、metY遺伝子（metZ遺伝子と呼ばれることもある）の産物であるO-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼは、スルフィドのO-アセチルホモセリンへの直接付加を触媒して、ホモシステインを生成する。ホモシステインは、直接スルフヒドリル化経路において、metZ遺伝子の産物であるO-スクシニルホモセリンスルフヒドララーゼ(O-succinylhomoserine sulfhydralase)によるスルフィド基のO-スクシニルホモセリンへの直接付加によっても生成され得る。
【００２９】
トランススルフレーション経路または直接スルフヒドリル化経路のどちらの経路を用いるかには関係なく、メチオニンは、その後、ホモシステインから、ビタミンB12依存性メチオニンシンターゼ（metH遺伝子の産物）またはビタミンB12非依存性メチオニンシンターゼ（metE遺伝子の産物）によるメチル基の付加により生成される。メチオニンのメチル基は、メチル-テトラヒドロ葉酸（メチル-THF）より供与され、このメチル-テトラヒドロ葉酸（メチル-THF）はmetF遺伝子産物による触媒反応でのメチレン-THFの還元により生成される。
【００３０】
I. メチオニンが生産されるように、ジメチルジスルフィド(DMDS)の存在下で微生物を培養するための方法、および本発明の方法に用いる組換え微生物
1つの態様では、本発明は、メチオニンを生産する方法であって、L-メチオニンまたはL-メチオニンの塩が生産されるように、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、好ましくはジメチルジスルフィド(DMDS)の存在下で、メチオニン生産微生物を培養することを含む方法を特徴とする。「メチオニン生産微生物」とは、メチオニンを生産することができるいずれかの微生物、例えば、細菌、酵母、菌類、古細菌などである。1つの実施形態では、前記メチオニン生産微生物はコリネバクテリウム属に属する。もう1つの実施形態では、前記メチオニン生産微生物はCorynebacterium glutamicumである。さらにもう1つの実施形態では、前記メチオニン生産微生物は、グラム陰性菌（例えば、大腸菌または関連腸内細菌）、グラム陽性菌（例えば、枯草菌または関連バチルス属）、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエまたは関連酵母株）、および古細菌、例えば、本発明の方法において好適な微生物からなる群から選択される。1つの実施形態では、腸内細菌群に属する前記微生物は大腸菌である。もう1つの実施形態では、バチルス属に属する前記微生物は枯草菌である。さらにもう1つの実施形態では、前記酵母微生物はサッカロミセス・セレビシエまたはその類縁菌である。
【００３１】
本発明の2つ以上の実施形態では、本発明の微生物は、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、好ましくはジメチルジスルフィド(DMDS)を含む培地で培養される。1つの実施形態では、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSは、培養培地中に0.02%以上存在する。もう1つの実施形態では、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSは、培養培地中に0.04%以上存在する。さらにもう1つの実施形態では、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSは、培養培地中に0.06%以上存在する。
【００３２】
本発明の2つ以上の実施形態では、前記メチルキャップスルフィド化合物、例えば、前記硫黄および／またはメチル基供給源は、ジメチルトリスルフィド、ジメチルテトラスルフィド、またはより高分子量のスルフィドポリマーであり、それらの末端はメチル基によりキャッピングされている。メチル基によりキャッピングされたかかるスルフィドポリマーの一例は、H3C-(S)n-CH3（式中、nは2〜50である）である。1つの実施形態では、nは40〜50である。もう1つの実施形態では、nは30〜40である。もう1つの実施形態では、nは20〜30である。もう1つの実施形態では、nは10〜20である。もう1つの実施形態では、nは5〜10である。好ましい実施形態では、nは5、6、7、8、9、または10である。もう1つの好ましい実施形態では、nは2、3、または4である。スルフィド含有ポリマーの他の例は、内部エチレンオキシドオリゴマーとジスルフィド結合で構成されるポリ（エチレンオキシドスルフィド）（例えば、Leeら, Biomacromolecules. 2005 Jan-Feb;6(1):24-6参照）、およびポリ（フェニレンスルフィド）である。
【００３３】
1つの実施形態では、前記メチルキャップスルフィド化合物、例えば、前記硫黄および／またはメチル基供給源、好ましくは、DMDSは、持続放出性メチルキャップスルフィド送達系、例えば、持続放出性硫黄および／またはメチル基送達系、例えば、持続放出性ジメチルジスルフィド(DMDS)送達系を用いて、前記培養物に提供される。本明細書において、表現「持続放出性メチルキャップスルフィド送達系」、「持続放出性硫黄および／またはメチル基送達系」、および「持続放出性ジメチルジスルフィド(DMDS)送達系」とは、疎水性小有機化合物、例えば、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSが水相に放出されて、その結果として、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSの定常状態の濃度が、用いられている生物に対する致死量以下の濃度で維持されるように、培養培地に添加することができるか、あるいは培養培地と適合させることができるいずれかの不活性物質を含む。「持続放出性メチルキャップスルフィド送達系」、例えば、「持続放出性硫黄および／またはメチル基送達系」、例えば、「持続放出性ジメチルジスルフィド(DMDS)送達系」はまた、前記微生物に対して毒性がなく、かつ微生物自体の増殖に悪影響を及ぼさないレベルにおいて、経時的に溶液へのこれらの化合物の長期持続放出も可能にする。1つの実施形態では、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSの前記持続放出性送達系は、水と不混和性であるが、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSを溶解する液体である。好ましい実施形態では、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSの前記持続放出性送達系は、微多孔性ポリスチレン樹脂ビーズ、例えば、Amberlite（商標）XAD4である。Amberlite（商標）XAD4は、塩化ナトリウムおよび炭酸ナトリウムを吸収させた水湿潤製品として供給される不溶性ビーズからなる。メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSを吸収させる前に、Amberlite（商標）XAD4を、製造業者によって推奨されるように、エタノールおよび水で洗浄し、水中懸濁液を得る。Amberlite（商標）XAD4に、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSを吸収させ、この混合物を培養培地に添加した後、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSは、metFまたはmetE、metH栄養要求株の増殖を支えるのに十分な速度でビーズから放出される。1つの実施形態では、前記メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSは、Amberlite（商標）XAD4を含む培養培地中に0.1%以上存在する。もう1つの実施形態では、前記メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSは、Amberlite（商標）XAD4を含む培養培地中に0.2%以上存在する。さらにもう1つの実施形態では、前記メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDS��、Amberlite（商標）XAD4を含む培養培地中に0.3%以上存在する。
【００３４】
もう1つの好ましい実施形態では、前記持続放出性メチルキャップスルフィド送達系、例えば、前記持続放出性硫黄および／またはメチル基送達系、例えば、前記DMDS持続放出性送達系は、遅延制御メチルキャップスルフィド化合物供給(slow controlled methyl capped sulfide compound feed)、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源供給(sulfur and/or methyl group source feed)、例えば、DMDS供給(DMDS feed)である。本明細書において、表現「遅延制御メチルキャップスルフィド化合物供給」、「遅延制御硫黄および／またはメチル基供給源供給」、および「遅延制御DMDS供給」とは、例えば、増加的にまたは連続的に、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSを、前記培養物に、所望の産物、例えば、メチオニンが生産されるが、前記生産微生物に対して毒性があるレベルが回避されるような十分な量で送達する遅延制御供給である。さらにもう1つの好ましい実施形態では、本発明の持続放出性送達系は、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSに対して透過性を有する膜であり、このメチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSは、この膜を通って前記増殖培地に拡散または流入することが可能となる。膜の限定されない例としては、有機溶媒（すなわち、DMDS）および水性培養培地の存在下で構造的および機能的完全性を維持することができるいずれもの膜を含む。かかる膜は、本明細書によって参照によりそのまま組み入れる「1994-1995 Millipore Direct」と題するthe Millipore Corporation Catalog and technical references guide、Millipore Corporation, Bedford, MA, USAに記載されている。好適な膜としては、親水性皮膜を有するまたは有さない、PVDF（ポリフッ化ビニリデン） PTFE（ポリテトラフルロエチレン(polytetrafluroethylene)）、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエーテルスルホン、ナイロン、およびポリカーボネートからなるものが含まれる。持続放出性ジメチルジスルフィド(DMDS)送達系として用いることができる物質のさらなる限定されない例としては、他の疎水性樹脂ビーズ、動物油、鉱油、化学油、植物油、合成油、有機溶媒、クロロカーボン、フルオロカーボン、クロロフルオロカーボン、またはそれらの組合せが含まれる。
【００３５】
本明細書に記載のとおり、例えば、O-アセチルホモセリンを過剰生産するようにメチオニン生合成経路が遺伝子的に改変されている微生物は、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、例えば、DMDSなどを含有する培地において改善されたメチオニン生産をもたらす。よって、本発明はまた、メチオニンを生産する方法であって、メチオニンが生産されるように、メチルキャップスルフィド化合物、例えば、硫黄および／またはメチル基供給源、好ましくはジメチルジスルフィド(DMDS)の存在下で、調節解除されたメチオニン生合成経路を有する微生物を培養することを含む方法も提供する。
【００３６】
本発明の方法は、微生物、例えば、本明細書に記載され、かつ／または所望の産物（例えば、メチオニン）の生産をもたらす方法で培養される、好ましくは、ベクターまたは遺伝子（例えば、野生型および／または突然変異遺伝子）を含む組換え微生物を備えることを特徴とする。用語「組換え」微生物とは、その由来となる天然に存在する微生物と比べて、変更された(altered)、改変された(modified)、または異なる遺伝子型および／または表現型を示すように、遺伝子的に改変、修飾、または工学的に操作されている（例えば、遺伝子操作されている）微生物（例えば、細菌、酵母細胞、菌類細胞など）（例えば、遺伝子改変が微生物のコード核酸配列に影響を及ぼす場合）を含む。
【００３７】
もう1つの好ましい実施形態では、組換え微生物は、少なくとも1つの非天然メチオニン生合成酵素が発現または過剰発現されるように設計または操作される。用語「過剰発現される」または「過剰発現」とは、微生物の操作前に、または操作されていない比較微生物で、発現されるよりも高いレベルでの、適当な増殖培地における遺伝子産物（例えば、生合成酵素）の発現を含む。1つの実施形態では、前記微生物は、操作されていない比較微生物で発現されるよりも高い遺伝子産物レベルを過剰発現するように遺伝子的に設計または操作することができる。好ましくは、生合成酵素コード遺伝子を組換えベクター内に含め、および／または生合成酵素を組換えベクターから発現させる。当業者ならば、遺伝子産物を発現または過剰発現する微生物は、遺伝子産物をコードする核酸配列および／または遺伝子の発現または過剰発現の結果として遺伝子産物を生産または過剰生産するということは分かるであろう。
【００３８】
用語「操作された微生物」とは、微生物が、メチオニン生産が増加するように量または構造において改変された、メチオニン生合成経路の少なくとも1つの酵素を有するように操作されている（例えば、遺伝子操作されている）または改変されている微生物を含む。かかる微生物の改変または操作は、本明細書において記載されるいずれの方法によってもよく、限定されるものではないが、生合成経路の調節解除および／または少なくとも1つの生合成酵素の過剰発現が含まれる。「操作された」酵素（例えば、「操作された」生合成酵素）は、例えば、対応する野生型または天然に存在する酵素と比べて、酵素の少なくとも1つの上流もしくは下流前駆体、基質、または産物が変更または改変される（例えば、前駆体、基質、および／または産物の変更または改変のレベル、割合など）ように、発現、生産、もしくは活性が変更または改変されている酵素を含む。「操作された」酵素はまた、1以上の産物または中間体による阻害、例えば、フィードバック阻害に対する耐性が強化されているものも含む。例えば、（例えば、メチオニンの存在下で）効果的に、酵素的に機能する能力を有する酵素。
【００３９】
用語「過剰発現される」または「過剰発現」とは、微生物の操作前に、または操作されていない比較微生物で、発現されるよりも高いレベルでの遺伝子産物（例えば、メチオニン生合成酵素）の発現を含む。1つの実施形態では、前記微生物は、微生物の操作前に、または操作されていない比較微生物で発現されるよりも高い遺伝子産物レベルを過剰発現するように遺伝子的に操作する（例えば、遺伝子操作する）ことができる。遺伝子操作としては、限定されるものではないが、特定の遺伝子の発現に関連する調節配列もしくは部位を（例えば、強力なプロモーター、誘導プロモーター、もしくは多重プロモーターを付加することにより、または発現が構成的であるように、調節配列を除去することにより）変更もしくは改変すること、特定の遺伝子の染色体上の位置を変更すること、特定の遺伝子に隣接した核酸配列（リボソーム結合部位または転写ターミネーターなど）を改変すること、特定の遺伝子のコピー数を増加させること、特定の遺伝子の転写および／または特定の遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写活性化因子など）を変更すること、または当技術分野ではルーチンの、特定の遺伝子の発現を調節解除するいずれの他の従来の手段（限定されるものではないが、例えば、レプレッサータンパク質の発現をブロックするための、アンチセンス核酸分子の使用、および／または遺伝的変異性を高め、例えば、適応進化を加速するミューテーター対立遺伝子、例えば、細菌対立遺伝子の使用など）も含まれ得る。
【００４０】
もう1つの実施形態では、前記微生物は、微生物の操作前に、または操作されていない比較微生物で発現されるよりも高い遺伝子産物レベルを過剰発現するように、物理的にまたは環境的に操作することができる。例えば、微生物は、転写および／または翻訳が促進または増加されるように、特定の遺伝子の転写および／または特定の遺伝子産物の翻訳を増加させるとして知られているまたは考えられている薬剤で処理することができるし、またはそのような薬剤の存在下で培養することができる。あるいは、微生物は、転写および／または翻訳が促進または増加されるように、特定の遺伝子の転写および／または特定の遺伝子産物の翻訳を増加させるように選択された温度で培養することができる。
【００４１】
本発明の好ましい「組換え」微生物は、調節解除されたメチオニン生合成経路または酵素を有する微生物である。用語「調節解除された(deregulated)」または「調節解除(deregulation)」とは、微生物における生合成酵素のレベルまたは活性が改変または変更されるように、生合成経路における酵素をコードする、微生物における少なくとも1つの遺伝子を改変または変更することを含む。好ましくは、生合成経路における酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子は、その遺伝子産物が促進または増加されるように改変または変更される。表現「調節解除された経路」とは、2つ以上の生合成酵素のレベルまたは活性が改変または変更されるように、生合成経路における酵素をコードする2つ以上の遺伝子が改変または変更された生合成経路も含み得る。微生物における経路を「調節解除する」（例えば、所与の生合成経路における2つ以上、例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つの遺伝子を同時に調節解除する）能力は、2つ以上の酵素（例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つの生合成酵素など）が「オペロン」と呼ばれる遺伝物質の隣接領域に互いに隣接して存在する遺伝子によりコードされるという微生物の特定の現象によって生じる。
【００４２】
用語「オペロン」とは、所望により、少なくとも1つの遺伝子またはORFの5’末端または3’末端のいずれかにおいて配列が重複している、少なくとも2つの隣接する遺伝子またはORFを含む。用語「オペロン」とは、1つ以上の、好ましくは少なくとも2つの、構造遺伝子（例えば、酵素、例えば、生合成酵素をコードする遺伝子）に関連する、プロモーター、場合によっては、調節エレメントを含む遺伝子発現の協調ユニットを含む。構造遺伝子の発現は、例えば、調節エレメントへの調節タンパク質の結合により、または抗転写終結により、協調的に調節することができる。構造遺伝子は、構造タンパク質の全てをコードする単一mRNAを与えるように転写させることができる。オペロンに含まれる遺伝子の協調的調節により、単一プロモーターおよび／または調節エレメントを改変または変更することによってオペロンによりコードされる各遺伝子産物の改変または変更をもたらし得る。調節エレメントの改変または変更としては、限定されるものではないが、内因性プロモーターおよび／または調節エレメントを除去すること、強力なプロモーター、誘導プロモーター、もしくは多重プロモーターを付加すること、または遺伝子産物の発現が改変されるように、調節配列を除去すること、オペロンの染色体上の位置を変更すること、オペロンに隣接したもしくはオペロン内の核酸配列（リボソーム結合部位など）を改変すること、オペロンのコピー数を増加させること、オペロンの転写および／またはオペロンの遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写活性化因子など）を改変すること、または当技術分野ではルーチンの、遺伝子の発現を調節解除するいずれの他の従来の手段（限定されるものではないが、例えば、レプレッサータンパク質の発現をブロックするための、アンチセンス核酸分子の使用など）も含まれ得る。調節解除はまた、例えば、フィードバック耐性である、すなわち、産物または中間体による阻害に耐性を示す、またはより高いまたはより低い特異的活性を有する酵素を得るために、1つ以上の遺伝子のコード領域を改変することも含むことがある。
【００４３】
本発明の特に好ましい「組換え」微生物は、細菌由来の遺伝子または遺伝子産物を過剰発現するように遺伝子操作されている。用語「細菌由来の」または例えば、細菌、「から誘導された（由来の）」とは、細菌において自然に見つけられる遺伝子、または細菌遺伝子によりコードされる（例えば、metX、hom（hsdなどの別名でも知られる）、およびmetYそれぞれによりコードされる）遺伝子産物（例えば、ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、およびO-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ）を含む。
【００４４】
1つの実施形態では、前記メチオニン生産微生物は、調節解除された、少なくとも1つのメチオニン生合成酵素を有する。好ましい実施形態では、前記調節解除されたメチオニン生合成酵素はO-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼである。もう1つの実施形態では、前記メチオニン生産微生物は、調節解除された、少なくとも2つのメチオニン生合成酵素を有する。1つの好ましい実施形態では、前記調節解除されたメチオニン生合成酵素はホモセリンアセチルトランスフェラーゼとホモセリンデヒドロゲナーゼである。もう1つの好ましい実施形態では、前記調節解除されたメチオニン生合成酵素はO-アセチル-ホモセリンスルフヒドリラーゼとホモセリンアセチルトランスフェラーゼである。
【００４５】
1つの実施形態では、本発明は、メチオニン生合成経路の様々な生合成酵素の改変を特徴とする。特に、本発明は、前記生合成酵素をコードする遺伝子を変更または改変することによって、前記経路に関連する様々な酵素活性を変更することを特徴とする。
【００４６】
本明細書において、用語「遺伝子」とは、生物において、遺伝子間DNA（すなわち、該遺伝子に天然でフランキングし、かつ／または生物の染色体DNAにおける遺伝子を分離する介在またはスペーサーDNA）によりもう1つの遺伝子または他の遺伝子から分離され得る核酸分子（例えば、DNA分子またはそのセグメント）を含む。また、遺伝子は、もう1つの遺伝子と少し重複してよく（例えば、第1の遺伝子の3’末端は第2の遺伝子の5’末端と重複している）、それらの重複遺伝子は、遺伝子間DNAにより他の遺伝子から分離される。遺伝子は、酵素もしくは他のタンパク質分子の合成を指令することがあるし（例えば、コード配列、例えば、タンパク質をコードする隣接するオープンリーディングフレーム(ORF)を含み得る）、またはそれ自体が生物において機能することもある。生物における遺伝子は、オペロンにおいてクラスター化され得、本明細書において定義されるとおり、該オペロンは、遺伝子間DNAにより他の遺伝子および／またはオペロンから分離されている。本明細書において、「単離された遺伝子」とは、該遺伝子が得られた生物の染色体DNAにおいて該遺伝子に天然でフランキングする配列を本質的に含まない（すなわち、第2のまたは別個のタンパク質をコードする隣接するコード配列、隣接する構造配列などを含まない）、所望により、5’および3’調節配列、例えば、プロモーター配列および／またはターミネーター配列を含む遺伝子を含む。1つの実施形態では、単離された遺伝子は、主に、タンパク質についてのコード配列（例えば、コリネバクテリウム属タンパク質をコードする配列）を含む。もう1つの実施形態では、単離された遺伝子は、タンパク質について（例えば、コリネバクテリウム属タンパク質について）のコード配列と、該遺伝子が得られた生物の染色体DNAの隣接する5’および／または3’調節配列（例えば、隣接する5’および／または3’コリネバクテリウム調節配列）とを含む。好ましくは、単離された遺伝子は、該遺伝子が得られた生物の染色体DNAにおいて該遺伝子に天然でフランキングする、約10kb、5kb、2kb、1kb、0.5kb、0.2kb、0.1kb、50bp、25bpまたは10bp以下のヌクレオチド配列を含む。
【００４７】
本明細書において、「突然変異を有する遺伝子」または「突然変異遺伝子」とは、該突然変異体によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質がその野生型核酸分子または遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質とは異なる活性を示すように、少なくとも1つの改変（例えば、置換、挿入、欠失）を含むヌクレオチド配列を有する遺伝子を含む。1つの実施形態では、突然変異または突然変異遺伝子を有する遺伝子は、その野生型遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質と比べて、例えば、同じような条件下でアッセイした（例えば、同じ温度で培養された微生物においてアッセイした）場合には、増加した活性を有するポリペプチドまたはタンパク質をコードする。本明細書において、「増加した活性」または「増加した酵素活性」とは、野生型核酸分子または遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質のものよりも少なくとも5%高いものであり、好ましくは、野生型核酸分子または遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質のものよりも少なくとも5〜10%高い、より好ましくは少なくとも10〜25%高い、さらに好ましくは少なくとも25〜50%、50〜75%、または75〜100%高いものである。中間の値〜上記の値の範囲、例えば、75〜85%、85〜90%、90〜95%もまた、本発明に包含されるものである。また、本明細書において、「増加した活性」または「増加した酵素活性」とは、その野生型遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質の活性よりも少なくとも1.25倍高い活性、好ましくは、その野生型遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質の活性よりも少なくとも1.5倍高い、より好ましくは少なくとも2倍高い、さらに好ましくは少なくとも3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍高い活性も含み得る。
【００４８】
もう1つの実施形態では、突然変異または突然変異遺伝子を有する遺伝子は、その野生型遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質と比べて、例えば、同じような条件下でアッセイした（例えば、同じ温度で培養された微生物においてアッセイした）場合には、低下した活性を有するポリペプチドまたはタンパク質をコードする。突然変異遺伝子はまた、ポリペプチドをコードし得ず、またその野生型ポリペプチドの生産のレベルが低下することもある。本明細書において、「低下した活性」または「低下した酵素活性」とは、野生型核酸分子または遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質のものよりも少なくとも5%低いもの、好ましくは、野生型核酸分子または遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質のものよりも少なくとも5〜10%低い、より好ましくは少なくとも10〜25%低い、さらに好ましくは少なくとも25〜50%、50〜75%、または75〜100%低いものである。中間の値〜上記の値の範囲、例えば、75〜85%、85〜90%、90〜95%もまた、本発明に包含されるものである。本明細書において、「低下した活性」または「低下した酵素活性」とは、欠失または「ノックアウト」されている活性（例えば、野生型核酸分子または遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質のものよりもおよそ100%低い活性）も含み得る。
【００４９】
2つ以上の実施形態では、調節解除された遺伝子の組合せを有する本発明の微生物は、メチオニンを、例えば、調節解除された遺伝子それぞれの存在下で生産されるメチオニンレベルの合計よりも少なくとも1〜2%高い、または少なくとも3〜5%高い、または少なくとも5〜10%高い、または少なくとも10〜20%高い、または少なくとも20〜30%高い、または少なくとも30〜40%高い、または少なくとも40〜50%高い、または少なくとも50〜60%高い、または少なくとも60〜70%高い、または少なくとも70〜80%高い、または少なくとも80〜90%高い、または少なくとも90〜95%高いレベルで生産する。いくつかの実施形態では、調節解除された遺伝子の組合せを含む微生物により生産されるメチオニンのレベルは、調節解除された遺伝子それぞれの存在下で生産されるメチオニンのレベルの合計よりも少なくとも2倍、または少なくとも2.5倍、または少なくとも3倍、または少なくとも3.5倍、または少なくとも4倍、または少なくとも4.5倍、または少なくとも5倍、または少なくとも10倍、または少なくとも15倍、または少なくとも20倍、または少なくとも25倍、または少なくとも30倍、または少なくとも35倍、または少なくとも40倍、または少なくとも45倍、または少なくとも50倍、または少なくとも100倍高い。
【００５０】
さらに他の実施形態では、適した発酵条件で改変された遺伝子の組合せを含む微生物によって生産されるメチオニンの量は、改変された遺伝子それぞれの存在下で、または遺伝子改変の不在下で、微生物によって生産される量の合計に比べて、1リットル当たり少なくとも5g、または少なくとも7g、または少なくとも8g、または少なくとも9g、または少なくとも10g、または少なくとも11g、または少なくとも12g、または少なくとも13g、または少なくとも14g、または少なくとも15g、または少なくとも16g、または少なくとも17g、または少なくとも18g、または少なくとも19g、または少なくとも20g、または少なくとも25g、または少なくとも30g、または少なくとも40g、または少なくとも50g多い。
【００５１】
本明細書に記載の微生物によって生産されるメチオニンのレベルは、本明細書に記載の1以上のアッセイを用いて容易に測定することができる。
【００５２】
活性は、特定の目的タンパク質の活性を測定するための、十分に受け入れられているいずれのアッセイによっても決定することができる。活性は、例えば、細胞または微生物から単離または精製されたタンパク質の活性を測定して、直接測定またはアッセイすることができる。あるいは、細胞もしくは微生物内でまたは細胞外培地において、活性を測定またはアッセイすることもできる。例えば、突然変異遺伝子（すなわち、低下した酵素活性をコードしている前記突然変異体）についてのアッセイは、微生物、例えば、酵素が温度感受性である突然変異微生物において該突然変異遺伝子を発現させ、該突然変異遺伝子を、酵素活性に関する温度感受性(Ts)突然変異体を補完する能力についてアッセイすることにより行うことができる。「増加した酵素活性」をコードする突然変異遺伝子は、例えば、対応する野生型遺伝子より効果的にTs突然変異体を補完（相補）するものであり得る。「低下した酵素活性」をコードする突然変異遺伝子は、例えば、対応する野生型遺伝子より低い効果でTs突然変異体を補完するものである。
【００５３】
当業者ならば、核酸または遺伝子配列中のただ1つの置換（例えば、その対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸変化をコードする塩基置換）でさえも、コードされるポリペプチドまたはタンパク質の活性に、その対応する野生型ポリペプチドまたはタンパク質と比べて劇的な影響を与え得るということは分かるであろう。突然変異遺伝子（例えば、突然変異ポリペプチドまたはタンパク質をコードする突然変異遺伝子）は、本明細書において定義されるとおり、突然変異遺伝子が、所望により、該突然変異遺伝子を発現し、または該突然変異タンパク質またはポリペプチドを生産する微生物（すなわち、突然変異微生物）において、その野生型遺伝子を発現する対応する微生物と比べて異なるまたは別個の表現型として識別可能な、改変された活性を有するタンパク質またはポリペプチドをコードするという点において、タンパク質相同体をコードする核酸または遺伝子と容易に区別できる。一方、タンパク質相同体は、所望により、微生物において生産される場合に、その野生型遺伝子を発現する対応する微生物と比べて表現型では識別できない、同一または実質的に類似の活性を有し得る。よって、相同体と突然変異体を区別するのに役立つのは、例えば、核酸分子間、遺伝子間、タンパク質間、またはポリペプチド間の配列同一性の程度ではなく、むしろ 相同体と突然変異体を区別するのは、コードされたタンパク質またはポリペプチドの活性である。相同体は、例えば、低い配列同一性（例えば、30〜50%配列同一性）を共有し、実質的に等価な機能活性をなお有し、突然変異体は、例えば、99%配列同一性を共有し、劇的に異なるまたは改変された機能活性をなお有する。
【００５４】
1つの実施形態では、本発明の組換え微生物は、グラム陽性生物（例えば、該微生物を取り囲むグラム陽性の壁が存在するために、塩基性色素、例えば、クリスタルバイオレットを保持する微生物）である。好ましい実施形態では、本発明の組換え微生物はコリネバクテリウム属のものである。1つの実施形態では、前記組換え微生物はバチルス属のものである。もう1つの好ましい実施形態では、前記組換え微生物は、Bacillus licheniformis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus halodurans、枯草菌、およびBacillus pumilusからなる群から選択される。
【００５５】
もう1つの実施形態では、前記組換え微生物はグラム陰性（塩基性色素を排除する）生物である。もう1つの実施形態では、本発明の組換え微生物は腸内細菌群に属する微生物である。好ましい実施形態では、前記組換え微生物は、サルモネラ属(Salmonella)、エシェリキア属(Escherichia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、セラチア属(Serratia)、およびプロテウス属(Proteus)からなる群から選択される属に属する微生物である。より好ましい実施形態では、前記組換え微生物はエシェリキア属のものである。さらに好ましい実施形態では、前記組換え微生物は大腸菌である。もう1つの実施形態では、前記組換え微生物はサッカロミセス属(Saccharomyces)の酵母（例えば、S. セレビシエ）、および古細菌である。
【００５６】
本発明の重要な態様は、所望の化合物（例えば、メチオニン）が生産されるように、本発明の微生物を培養することを含む。
【００５７】
用語「培養すること」とは、本発明の生存微生物を維持および／または増殖すること（例えば、培養物または菌株を維持および／または増殖すること）を含む。1つの実施形態では, 本発明の微生物は液体培地で培養される。もう1つの実施形態では、本発明の微生物は固体培地または半固体培地で培養される。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、該微生物の維持および／または増殖に不可欠または有益な栄養源（例えば、炭素源または炭素基質、例えば 炭水化物、炭化水素、油、脂肪、脂肪酸、有機酸、およびアルコール；窒素源、例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉エキス、麦芽エキス、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、およびリン酸アンモニウム；リン源、例えば、リン酸、そのナトリウムおよびカリウム塩；微量元素、例えば、マグネシウム、鉄、マンガン、カルシウム、銅、亜鉛、ホウ素、ニッケル、モリブデン、および／またはコバルト塩；ならびに増殖因子（例えば、アミノ酸、ビタミン、増殖促進物質など））を含む培地（例えば、滅菌液体培地）で培養される。
【００５８】
本発明に従って作り出された微生物は、メチオニンを生産させるために、連続的にもしくはバッチ式で、または供給バッチ(fed batch)法もしくは反復供給バッチ(repeated fed batch)法で培養してよい。既知培養方法の概要は、Chmiel(Bioprozelitechnik 1. Einfiihrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))による教本またはStorhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))による教本に見つけることができる。
【００５９】
好ましくは、本発明の微生物は、制御されたpH下で培養される。用語「制御されたpH」とは、所望の産物（例えば、メチオニン）の生産をもたらす任意のpHを含む。1つの実施形態では、微生物はpH約7で培養される。もう1つの実施形態では、微生物はpH6.0〜8.5間で培養される。望ましいpHは、当業者に公知の様々な方法により維持し得る。
【００６０】
また、好ましくは、本発明の微生物は、制御された通気下で培養される。用語「制御された通気」とは、所望の産物（例えば、メチオニン）の生産をもたらすのに十分な通気（例えば、酸素）を含む。1つの実施形態では、通気は、培養物中の酸素レベルを調節することにより、例えば、培養培地に溶解する酸素の量を調節することにより、制御される。好ましくは、培養物の通気は、培養物を攪拌することにより制御される。攪拌は、プロペラまたは類似の機械攪拌装置によって、培養容器（例えば、試験管またはフラスコ）を回転または振盪することによりまたは様々なポンプ装置により与え得る。通気は、滅菌空気または酸素を培地に（例えば、発酵混合物に）通すことによってもさらに制御し得る。また、好ましくは、本発明の微生物は、（例えば、消泡剤を添加することにより）過剰に起泡することなく培養される。
【００６１】
さらに、本発明の微生物は、制御された温度下で培養することができる。用語「制御された温度」とは、所望の産物（例えば、メチオニン）の生産をもたらす任意の温度を含む。1つの実施形態では、制御された温度は15℃〜95℃間の温度を含む。もう1つの実施形態では、制御された温度は15℃〜70℃間の温度を含む。好ましい温度は20℃〜55℃間、より好ましくは30℃〜50℃間である。
【００６２】
微生物は、液体培地で培養（例えば、維持および／または増殖）することができ、好ましくは、従来の培養方法、例えば、静置培養、試験管培養、振盪培養（例えば、回転振盪培養、振盪フラスコ培養など）、通気スピナー培養、または発酵により、連続的にまたは間欠的にいずれかで培養される。好ましい実施形態では、前記微生物は振盪フラスコで培養される。より好ましい実施形態では、前記微生物は発酵槽で培養される（例えば、発酵プロセス）。本発明の発酵プロセスとしては、限定されるものではないが、発酵のバッチ、供給バッチ、および連続処理または方法が含まれる。表現「バッチ処理」または「バッチ発酵」とは、培地の組成、栄養源、補足添加剤などが発酵開始時に設定され、発酵中には変更を行わない系を指すが、培地の過度の酸性化および／または微生物の死滅を防ぐためにpHおよび酸素濃度のような因子を制御しようと試みてもよい。表現「供給バッチ処理」または「供給バッチ」発酵とは、発酵の進行とともに1つ以上の基質または補給物を添加する（例えば、徐々にまたは連続的に添加する）という例外を含む、バッチ発酵を指す。表現「連続処理」または「連続発酵」とは、規定の発酵培地が発酵槽に連続的に添加され、好ましくは、所望の産物（例えば、メチオニン）を回収するために、同量の、使用済みまたは「馴化」培地が同時に除去される系を指す。このような処理は様々なものが開発されており、当技術分野で周知である。
【００６３】
用いる培養培地は、適当な方法により特定の菌株の要求を満たさなければならない。様々な微生物についての培養培地の説明は、the American Society for Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981)のハンドブック「Manual of Methods for General Bacteriology」に記載されている。
【００６４】
培養培地に用いるのに適当な炭素源は、例えば、糖および炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、およびセルロースなど）、油脂（例えば、大豆油、ヒマワリ油、ラッカセイ油、およびココナツ脂など）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、およびリノール酸など）、アルコール（例えば、グリセロールおよびエタノールなど）、ならびに有機酸（例えば、酢酸など）である。これらの物質は個別にまたは混合物として用いることができる。
【００６５】
有機窒素含有化合物（ペプトン、酵母抽出物、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆粉、および尿素など）または無機化合物（硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、および硝酸アンモニウムなど）は、窒素源として用いることができる。窒素源は個別にまたは混合物として用いることができる。
【００６６】
リン酸、リン酸二水素カリウム、またはリン酸水素二カリウム、もしくはその対応するナトリウム含有塩は、リン源として用いることができる。
【００６７】
DMDS、ジメチルトリスルフィド、ジメチルテトラスルフィド、またはより高分子量のスルフィドポリマー（それらの末端はメチル基によりキャッピングされている）の他に、有機および無機硫黄含有化合物（例えば、スルフィド、亜硫酸塩、硫酸塩、およびチオ硫酸塩など）をさらなる硫黄源として用いることができる。
【００６８】
培養培地は、増殖に必要な、例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などの金属塩をさらに含んでよい。最後に、上記物質の他に、アミノ酸およびビタミンなどの必須および非必須増殖物質を使用することができる。さらに、好適な前駆体を培養培地に添加することができる。記述した出発物質は、単一バッチとして培養に添加することができ、また適当な方法により培養の間に供給することができる。
【００６９】
pHを制御するために、塩基性化合物、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、アンモニア、もしくはアンモニア水、または酸性化合物、例えば、リン酸または硫酸を適当な方法により使用することができる。泡の発生を制御するために、消泡剤、例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルなどを使用することができる。プラスミドの安定性を維持するために、選択作用を有する好適な物質、例えば、抗生物質などを培地に添加することができる。好気条件を維持するために、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば、空気などを培養物中に導入する。培養温度は、通常20℃〜45℃、好ましくは25℃〜40℃である。培養は、所望の産物が最大となるまで継続される。この目的は、通常、10時間〜160時間以内に達成される。
【００７０】
表現「所望の化合物が生産されるような条件下で培養すること」とは、所望の化合物の生産を得るのに、または生産されている特定の化合物の望ましい収率を得るのに適当または十分な条件（例えば、温度、圧力、pH、期間など）下で微生物を維持および／または増殖することを含む。例えば、培養は、化合物（例えば、メチオニン）の望ましい量を生産するのに十分な時間の間継続される。好ましくは、培養は、化合物の好適な生産量を実質的に達成するのに十分な時間（例えば、メチオニンの好適な濃度を達成するのに十分な時間）の間継続される。1つの実施形態では、培養は約12〜24時間継続される。もう1つの実施形態では、培養は、約24〜36時間、36〜48時間、48〜72時間、72〜96時間、96〜120時間、120〜144時間、または144時間より長い時間の間継続される。もう1つの実施形態では、培養は、メチオニンの望ましい生産収率を達成するのに十分な時間の間継続され、例えば、微生物は、少なくとも約7〜10g/L、または少なくとも10〜15g/L、または少なくとも約15〜20g/L、または少なくとも約20〜25g/L、または少なくとも約25〜30g/L、または少なくとも約30〜35g/L、または少なくとも約35〜40g/L、または少なくとも約40〜50g/Lのメチオニンが生産されるように培養される。さらに他の実施形態では、微生物は、メチオニンの好ましい収率、例えば、上記範囲内の収率が、約24時間内、約36時間内、約48時間内、約72時間内、または約96時間内にもたらされるような条件下で培養される。
【００７１】
本発明の方法は、所望の化合物（例えば、メチオニン）を回収する段階をさらに含み得る。用語、所望の化合物を「回収すること」とは、培養培地から化合物を濃縮、抽出、採取、単離、または精製することを含む。化合物の回収は、当技術分野で公知の任意の従来の単離または精製方法に従って行うことができ、それらの方法としては、限定されるものではないが、従来の樹脂（例えば、陰イオンもしくは陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂など）を用いた処理、従来の吸着剤を用いた処理（例えば、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナなど）、pHの変更、溶媒抽出（例えば、従来の溶媒、例えば、アルコール、酢酸エチル、ヘキサンなどを用いる）、透析、濾過、濃縮、結晶化、再結晶、pH調整、凍結乾燥、乾燥、蒸発などが含まれる。例えば、メチオニンは、まず、培養物から微生物を除去することにより、培養培地から回収することができる。
【００７２】
好ましくは、本発明の所望の化合物は、結果として得られた調製物が他の培地成分を実質的に含まない（例えば、培地成分および／または発酵副産物を含まない）ように、「抽出される」、「単離される」、または「精製される」。言語「他の培地成分を実質的に含まない」とは、所望の化合物の調製物であって、該化合物が、該化合物が生産される培養物の培地成分または発酵副産物から分離されている調製物を含む。1つの実施形態では、前記調製物は、所望の化合物が（乾燥重量で）約80%を上回っており（例えば、他の培地成分または発酵副産物が約20%未満であり）、より好ましくは、所望の化合物が約90%を上回っており（例えば、他の培地成分または発酵副産物が約10%未満であり）、さらに好ましくは、所望の化合物が約95%を上回っており（例えば、他の培地成分または発酵副産物が約5%未満であり）、最も好ましくは、所望の化合物が約98〜99%を上回っている（例えば、他の培地成分または発酵副産物が約1〜2%未満である）。
【００７３】
本開示は、本明細書に記載の様々な組換え微生物を特徴とする生体内変換プロセスをさらに包含する。用語「生体内変換プロセス」とは、本明細書において「生物変換プロセス」とも呼ばれ、適当な基質および／または中間化合物の所望の産物（例えば、メチオニン）への生産（例えば、形質転換または変換）をもたらす生体内プロセスを含む。
【００７４】
生体内変換反応に用いられる微生物および／または酵素は、それらが、それらの対象とする機能（例えば、所望の化合物の生産）を果たすことを可能にする形態で存在する。かかる微生物は、全細胞であってよく、または望ましい最終結果を得るのに必要な細胞の一部（例えば、遺伝子および／または酵素)のみであってもよい。これらの微生物は、懸濁（例えば、緩衝液または培地などの適当な溶液中へ）、濯ぎ（例えば、微生物の培養物から培地を除くための濯ぎ）、アセトン乾燥、固定化（例えば、ポリアクリルアミドゲルまたはκ-カラギーナンを用いる固定化、または合成支持体、例えば、ビーズ、マトリックスなどの上への固定化）、固定、架橋、または易透化（例えば、膜および／または壁を易透化した結果として、化合物、例えば、基質、中間体、または産物が該膜または壁をより容易に通過できるようになる）することができる。
【００７５】
代替実施形態では、例えば、微生物が生物学的に無害（例えば、安全）であるときには、所望の化合物は微生物から精製されない。例えば、全培養物（または培養上清）を産物（例えば、未精製産物）の供給源として用いることができる。1つの実施形態では、前記培養物（または培養上清）はそのまま用いられる。もう1つの実施形態では、前記培養物（または培養上清）は濃縮される。さらにもう1つの実施形態では、前記培養物（または培養上清）は乾燥または凍結乾燥される。本発明により得られる産物には、メチオニンの他に、発酵培養液の他の成分、例えば、リン酸塩、炭酸塩、残留炭水化物、バイオマス、複合培地成分などが含まれ得る。
【００７６】
II. 組換え核酸分子、ベクター、およびポリペプチド
本発明は、さらに、本明細書に記載の遺伝子（例えば、単離された遺伝子）、好ましくはコリネバクテリウム属遺伝子、より好ましくはCorynebacterium glutamicum遺伝子、さらに好ましくはCorynebacterium glutamicumメチオニン生合成遺伝子を含む組換え核酸分子（例えば、組換えDNA分子）を特徴とする。用語「組換え核酸分子」とは、該組換え核酸分子が（例えば、1つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換により）誘導された非天然または天然核酸分子とヌクレオチド配列が異なるように、改変、変更、または操作されている核酸分子（例えば、DNA分子）を含む。好ましくは、組換え核酸分子（例えば、組換えDNA分子）は、調節配列に機能しうる形で連結された本発明の単離された遺伝子を含む。表現「調節配列に機能しうる形で連結された」とは、目的の遺伝子のヌクレオチド配列が、該遺伝子の発現（例えば、強化された発現、増加された発現、構成的発現、基本的発現、減弱された発現、低減された発現、または抑制された発現）、好ましくは該遺伝子によりコードされる遺伝子産物の発現（例えば、本明細書において定義されるとおりに、組換え核酸分子を組換えベクターに含め、それを微生物に導入する場合）を可能にする方法で調節配列に連結されるということを意味する。
【００７７】
用語「異種核酸」とは、本明細書において、標的生物に一般には存在しない核酸配列を指すために用いられる。それらの核酸配列は、標的生物に存在するが、目的の標的生物の遺伝領域には通常見られない核酸配列も含み得る。同様に、用語「異種遺伝子」とは、宿主生物の野生型分離株には存在しない遺伝子を指す。異種核酸および異種遺伝子は、一般に、組換え核酸分子を含む。異種核酸または異種遺伝子は、（例えば、1つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換による）修飾を含んでいても、含んでいなくてもよい。
【００７８】
また、本明細書に記載の様々な遺伝子およびタンパク質の相同体も本開示に包含される。遺伝子に関連して、「相同体」とは、遺伝子の少なくとも一部に対して、またはその相補鎖もしくはその一部と実質的に同一であるヌクレオチド配列を指す（ただし、該ヌクレオチド配列が、該遺伝子（該相同体は該遺伝子の相同体である）によりコードされるタンパク質と実質的に同じ活性／機能を有するタンパク質をコードする場合）。本明細書に記載の遺伝子の相同体は、推定相同体と、遺伝子またはそれらによりコードされるタンパク質の配列（例えば、Corynebacterium glutamicum遺伝子ask、hom、metX、metY、metB、metH、metE、metF、metC、およびmetKのヌクレオチド配列、またはそれらの相補鎖）についての、アミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性パーセントにより同定することができる。同一性パーセントは、例えば、目視検査によりまたは当技術分野で公知であるか、もしくは本明細書に記載されている様々なコンピュータープログラムを用いることにより決定してもよい。例えば、2つのヌクレオチド配列の同一性パーセントは、Devereuxら(1984)（Nucl. Acids. Res., 12:387、University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG)から入手可能）により記載されているGAPコンピュータープログラムを用いて配列情報を比較することにより決定することができる。また、同一性パーセントは、Tatusovaら(1999)（FEMS Microbiol. Lett., 174:247）により記載されているBasic Local Alignment Search Tool(BLAST.RTM.) プログラム）を用いて2つのヌクレオチド配列をアライメントすることによっても決定することができる。例えば、BLAST（商標）プログラムを用いたヌクレオチド配列アライメントの場合、デフォルト設定は以下のとおりである。マッチに対するリワードは2であり、ミスマッチに対するペナルティーは-2であり、開始ギャップおよび伸長ギャップペナルティーはそれぞれ5および2であり、ギャップ×ドロップオフは50であり、期待値は10であり、ワードサイズは11であり、フィルターはオフである。
【００７９】
本明細書において, 用語「相同性」および「相同の」とは、理論上共通の遺伝的祖先を有するタンパク質を表すために限定されず、遺伝学的に無関係である可能性があるにもかかわらず、類似の機能を果たし、かつ／または類似の構造を有するように進化したタンパク質を含む。本明細書に記載の様々なタンパク質の機能的相同性はまた、相同体である、その対応するタンパク質の活性を有するタンパク質も包含する。機能的相同性を有するタンパク質の場合、それらのタンパク質がそれらのアミノ酸配列において顕著な同一性を有することが必要なのではなく、むしろ、機能的相同性を有するタンパク質は、類似または同一の活性、例えば、酵素活性を有することによってそのように定義される。同様に、構造的相同性を有するタンパク質は、類似の三次（または四次）構造を有するものと定義され、それらをコードする遺伝子についてのアミノ酸相同性または核酸相同性は必ずしも必要ではない。ある特定の状況において、構造的相同体は、タンパク質の活性部位または結合部位においてのみ構造的相同性を維持するタンパク質を含む場合がある。
【００８０】
構造的および機能的相同性に加えて、本発明は、本明細書に記載の様々なタンパク質および酵素と少なくとも部分的なアミノ酸同一性を有するタンパク質をさらに包含する。2つのアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するために、それらの配列を最適に比較できるようにアライメントする（例えば、一方のタンパク質のアミノ酸配列に、もう一方のタンパク質のアミノ酸配列と最適にアライメントするために、ギャップを導入することができる）。その後、対応するアミノ酸位置のアミノ酸残基を比較する。一方の配列におけるある位置に、もう一方の配列におけるその対応する位置と同じアミノ酸残基が存在する場合には、それらの分子はその位置において同一である。その2つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列が共有する同一位置数の関数である（すなわち、%同一性=同一位置数/位置の総数×100）。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の分子の核酸およびアミノ酸配列は、本明細書に記載の核酸またはアミノ酸配列とハイブリダイズするか、あるいは本明細書に記載の核酸またはアミノ酸配列と少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一であるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む。
【００８２】
本発明はまた、改善または変更された特徴を有する酵素を作り出すための、本明細書に記載のタンパク質の遺伝子工学に有用な当技術分野で周知の技術も包含する。例えば、タンパク質が増加または低下した基質結合親和性を有するように、タンパク質を修飾するためには、当技術分野で利用可能な教示で十分対応できる。また、増加または低下した酵素速度を有するタンパク質を設計することもまた有利であり得、当技術分野における教示で対応できる。特に、多機能酵素の場合、タンパク質の様々な活性を、特定の状況下で最適に機能するように、個別に微調整することも有用であり得る。さらに、フィードバック阻害（例えば、メチオニンによる）に対する酵素の感受性をモジュレート（調節）する能力は、負または正のフィードバックに関与する可能性があるメチオニンまたは他の補因子の結合または配位に関わるアミノ酸を選択的に変化させることによって果たし得る。さらに、遺伝子工学には、転写および翻訳の両方のレベルでの発現調節に関連する事象を包含する。例えば、完全または部分的なオペロンをクローニングおよび発現に用いる場合、遺伝子の調節配列、例えば、プロモーター配列またはエンハンサー配列が望ましいレベルの転写を得るように、それらを変更してよい。
【００８３】
本明細書に記載のあらゆる遺伝子の「相同体」も、該相同体によってコードされるタンパク質の活性により同定することができる。例えば、かかる相同体は、遺伝子（該相同体は該遺伝子の相同体である）の突然変異を補完（相補）することができる。
【００８４】
本明細書において、用語「調節配列」とは、他の核酸配列（すなわち、遺伝子）の発現に影響を及ぼす（例えば、モジュレートまたは調節する）核酸配列を含む。1つの実施形態では、調節配列は、該調節配列および目的遺伝子で観察されるように、自然界で、例えば、本来の位置および／または配向で見られるとおりに、特定の目的遺伝子に対して類似もしくは同一の位置および／または配向で組換え核酸分子に含まれる。例えば、目的遺伝子は、天然生物において該目的の遺伝子に付随または隣接する調節配列に機能しうる形で連結された（例えば、「天然の(native)」調節配列（例えば、「天然の」プロモーター）に機能しうる形で連結された）組換え核酸分子に含めることができる。また、目的遺伝子を、天然生物における別の（例えば、異なる）遺伝子に付随または隣接する調節配列に機能しうる形で連結された組換え核酸分子に含めてもよい。あるいは、目的遺伝子を、別の生物由来の調節配列に機能しうる形で連結された組換え核酸分子に含めてもよい。例えば、他の微生物由来の調節配列（例えば、他の細菌調節配列、バクテリオファージ調節配列など）は、特定の目的遺伝子に機能しうる形で連結することができる。
【００８５】
1つの実施形態では、調節配列は、天然または非天然配列（例えば、改変、突然変異、置換、誘導体化、欠失されている配列（化学合成された配列を含む））である。好ましい調節配列は、プロモーター、エンハンサー、終結シグナル、抗終結シグナル、および他の発現制御エレメント（例えば、レプレッサーもしくはインデューサーが結合する配列、および／または、例えば、転写されたmRNAにおける転写および／または翻訳調節タンパク質の結合部位）を含む。そのような調節配列は、例えば、Sambrook, J., Fritsh, E. F., およびManiatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989、ならびにPatek, M.ら, (2003) Journal of Biotechnology 104:311-323に記載されている。調節配列には、微生物におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの（例えば、構成的プロモーターおよび強力な構成的プロモーター）、微生物におけるヌクレオチド配列の誘導性発現を指令するもの（例えば、誘導プロモーター、例えば、キシロース誘導プロモーター）、および微生物におけるヌクレオチド配列の発現を減弱または抑制するもの（例えば、減弱シグナルまたはレプレッサー 配列）が含まれる。調節配列を除去または欠失させることにより目的遺伝子の発現を調節することも本発明の範囲に含まれる。例えば、目的遺伝子の発現が強化されるように、転写の負の調節に関与する配列を除去することができる。
【００８６】
1つの実施形態では、本発明の組換え核酸分子は、プロモーターまたはプロモーター配列に機能しうる形で連結された少なくとも1つの細菌遺伝子産物（例えば、メチオニン生合成酵素）をコードする核酸配列または遺伝子を含む。本発明の好ましいプロモーターとしては、コリネバクテリウム属プロモーターおよび／またはバクテリオファージプロモーター（例えば、コリネバクテリウム属を感染させるバクテリオファージ）が含まれる。1つの実施形態では、プロモーターは、コリネバクテリウム属プロモーター、好ましくは強力なコリネバクテリウム属プロモーター（例えば、コリネバクテリウム属における生化学的ハウスキーピング遺伝子に関連するプロモーター）である。もう1つの実施形態では、プロモーターは、バクテリオファージプロモーターである。さらなる好ましいプロモーター（例えば、グラム陽性微生物に用いる場合）としては、限定されるものではないが、スーパーオキシドジスムターゼ、groEL、延長因子 Tu、amy、およびSPO1プロモーターが含まれる。さらなる好ましいプロモーター（例えば、グラム陰性微生物に用いる場合）としては、限定されるものではないが、cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIQ、T1、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR、またはλ-PLが含まれる。
【００８７】
もう1つの実施形態では、本発明の組換え核酸分子は、1つのターミネーター配列または複数のターミネーター配列（例えば、転写ターミネーター配列）を含む。用語「ターミネーター配列」とは、mRNAの転写を終結させる働きをする調節配列を含む。ターミネーター配列（またはタンデム転写ターミネーター）は、さらに、mRNAを（例えば、mRNAに構造を加えることにより）、例えば、ヌクレアーゼから、安定させる働きをする。
【００８８】
さらにもう1つの実施形態では、本発明の組換え核酸分子は、前記配列を含有するベクターの検出を可能にする配列（すなわち、検出および／または選択マーカー）、例えば、抗生物質耐性配列をコードする、または栄養要求性突然変異を克服する遺伝子、例えば、trpC、薬剤マーカー、蛍光マーカー、および／または比色マーカー（例えば、lacZ/β-ガラクトシダーゼ）を含む。さらにもう1つの実施形態では、本発明の組換え核酸分子は、人工リボソーム結合部位(RBS)または人工RBSに転写される配列を含む。用語「人工リボソーム結合部位(RBS)」とは、リボソームが（例えば、翻訳を開始するために）結合する、本来のRBS（例えば、天然に存在する遺伝子において見られるRBS）とは少なくとも1つのヌクレオチドが異なっている、mRNA分子内の（例えば、DNA内でコードされる）部位を含む。好ましい人工RBSとしては、その本来のRBS（例えば、目的遺伝子の本来のRBSと、約1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12、13-15、またはそれ以上のヌクレオチドが異なっている約5-6、7-8、9-10、11-12、13-14、15-16、17-18、19-20、21-22、23-24、25-26、27-28、29-30、またはそれ以上のヌクレオチドが含まれる。
【００８９】
本発明は、さらに、本明細書に記載の核酸分子（例えば、遺伝子、または該遺伝子を含む組換え核酸分子）を含むベクター（例えば、組換えベクター）を特徴とする。用語「組換えベクター」とは、該組換えベクターが、該組換えベクターが誘導された非天然または天然核酸分子に含まれているものよりも、より多い、より少ない、または異なる核酸配列を含むように、改変、変更、または操作されているベクター（例えば、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウイルス、コスミド、または他の精製核酸ベクター）を含む。好ましくは、前記組換えベクターは、本明細書において定義されるとおり、調節配列、例えば、プロモーター配列、ターミネーター配列、および／または人工リボソーム結合部位(RBS)に機能しうる形で連結された、生合成酵素コード遺伝子、または該遺伝子を含む組換え核酸分子を含む。もう1つの実施形態では、本発明の組換えベクターは、細菌における複製を促進する配列（例えば、複製増強配列）を含む。1つの実施形態では、複製増強配列は、大腸菌またはC. glutamicumで機能する。もう1つの実施形態では、複製増強配列は、pBR322由来である。
【００９０】
さらにもう1つの実施形態では、本発明の組換えベクターは抗生物質耐性配列を含む。用語「抗生物質耐性配列」とは、宿主生物（例えば、コリネバクテリウム属）において抗生物質耐性を促進または付与する配列を含む。1つの実施形態では、前記抗生物質耐性配列は、cat（クロラムフェニコール耐性）配列、tet（テトラサイクリン耐性）配列、erm（エリスロマイシン耐性）配列、neo（ネオマイシン耐性）配列、kan（カナマイシン耐性）配列、およびspec（スペクチノマイシン耐性）配列からなる群から選択される。本発明の組換えベクターは、相同組換え配列（例えば、目的の遺伝子の宿主生物染色体への組換えを可能にするように設計された配列）をさらに含み得る。当業者ならば、遺伝子操作する微生物の選択、所望の遺伝子産物の発現レベルなどの因子に応じて、ベクターの設計を調整することができることはさらに分かるであろう。
【００９１】
当業者ならば、遺伝子操作する微生物の選択、所望の遺伝子産物の発現レベルなどの因子に応じて、ベクターの設計を調整することができることはさらに分かるであろう。本明細書において、「キャンベルイン（Campbell in）」とは、完全環状二本鎖DNA分子（例えば、プラスミド）が単一相同組換え事象（クロスイン事象）により染色体に組み込まれている、該環状DNA分子の第1DNA配列と相同である染色体の第1DNA配列への、該環状DNA分子の線形型の挿入を効果的にもたらす、原形宿主細胞の形質転換体を指す。「キャンベルインされた」とは、「キャンベルイン」形質転換体の染色体に組み込まれている線形DNA配列を指す。「キャンベルイン」は、第1相同DNA配列の重複を含み、その各コピーは相同組換え交差点のコピーを含み、それを包囲している。この名前は、この種の組換えを最初に提示したProfessor Alan Campbellから来ている。本明細書において、「キャンベルアウト（Campbell out）」とは、第2相同組換え事象（クロスアウト事象）が、「キャンベルインされた」DNAの挿入された線形DNAに含まれる第2DNA配列と、該線形インサートの該第2DNA配列と相同である、染色体起源の第2DNA配列との間に起こった「キャンベルイン」形質転換体に由来する細胞を指し、該第2組換え事象は、組み込まれたDNA配列の一部の欠失（廃棄）をもたらすが、重要なことには、原形宿主細胞と比べて、「キャンベルアウト」細胞が染色体において1以上の意図的変化（例えば、一塩基置換、多塩基置換、異種遺伝子もしくはDNA配列の挿入、相同遺伝子もしくは修飾相同遺伝子の1または複数のさらなるコピーの挿入、またはこれらの前記例の2以上を含むDNA配列の挿入）を含むように、染色体に、該組み込まれたキャンベルインされたDNAの一部（これはわずか単一の塩基であり得る）を残しもする。
【００９２】
「キャンベルアウト」細胞または菌株は、必ずではないが、通常、「キャンベルインされた」DNA配列の一部（廃棄することが望まれる部分）に含まれる遺伝子（例えば、約5%〜10%スクロースの存在下で増殖させている細胞で発現させると死をもたらす枯草菌sacB遺伝子）に対する対抗選択により得られる。対抗選択を用いても用いなくとも、所望の「キャンベルアウト」細胞は、任意のスクリーニング可能な表現型、例えば、限定されるものではないが、コロニーの形態、コロニーの色、抗生物質耐性の有無、ポリメラーゼ連鎖反応による特定のDNA配列の有無、栄養要求性の有無、酵素の有無、コロニーの核酸ハイブリダイゼーション、抗体スクリーニングなどを用いる、所望の細胞についてのスクリーニングにより得ることができ、または同定することができる。用語「キャンベルイン」および「キャンベルアウト」は、上記の方法または工程を指して、様々な時制において動詞としても用いることができる。
【００９３】
「キャンベルイン」または「キャンベルアウト」をもたらす相同組換え事象は、相同DNA配列内のDNA塩基の範囲にわたって起こる可能性があり、該相同配列はこの範囲の少なくとも一部では互いに同一であると思われることから、通常、乗り換え事象が起こった場所を厳密に特定することはできないということは理解される。言い換えれば、どの配列がもともと、挿入されたDNAのものであって、どれがもともと、染色体DNAのものであったかは正確に特定することはできない。さらに、第1相同DNA配列と第2相同DNA配列は、通常、部分的非相同性の領域により分離され、この非相同性領域は「キャンベルアウト」細胞の染色体に付着したままである。
【００９４】
実際的には、C. glutamicumにおいて、典型的な第1および第2相同DNA配列は少なくとも約200塩基対長であり、最大数千塩基対長であり得るが、より短いまたはより長い配列を用いて進めることもできる。例えば、第1および第2相同配列の長さは約500〜2000塩基に及んでよく、「キャンベルイン」からの「キャンベルアウト」の 獲得は、第1および第2相同配列がほぼ同じ長さであるように、好ましくは、差が200塩基対未満であるように、最も好ましくは、塩基対において2つの配列のうちの短い方が長い方の長さの少なくとも70% であるように、計画することによって容易になる。
【００９５】
本発明を次の実施例によりさらに例示的に説明するが、その実施例を限定と解釈してはならない。本願を通じて引用された全ての参照文献、特許、および公開特許出願の内容は、参照により本明細書に組み入れる。
【実施例】
【００９６】
実施例1: M2014株の創出
C. glutamicum株 ATCC 13032を、DNA A（pH273とも呼ばれる）（配列番号1）で形質転換し、「キャンベルインし」て、「キャンベルイン」株を得た。図2は、プラスミド pH273の概略図を示す。この「キャンベルイン」株を、次いで、「キャンベルアウトし」て、フィードバック耐性ホモセリンデヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子(homfbr)を含む「キャンベルアウト」株、M440を得た。この結果として生じるホモセリンデヒドロゲナーゼタンパク質は、S393がF393に変化したアミノ酸変化を含んだ（Hsdh S393Fと呼ばれる）。
【００９７】
この株M440を、続いて、DNA B（pH373とも呼ばれる）（配列番号2）で形質転換して、「キャンベルイン」株を得た。図3は、プラスミド pH373の概略図を示す。この「キャンベルイン」株を、さらに、「キャンベルアウトし」て、フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼ酵素をコードする遺伝子(Askfbr)（lysCによりコードされる）を含む「キャンベルアウト」株、M603を得た。この結果として生じるアスパラギン酸キナーゼタンパク質では、T311がI311に変化していた（LysC T311Iと呼ばれる）。
【００９８】
株M603は約17.4mMリジンを生産するが、一方、ATCC13032株では測定可能な量のリジンが生産されないということが分かった。加えて、表2に要約されるように、ATCC13032株では測定可能な量が生産されないのに対して、M603株は約0.5mMホモセリンを生産した。
【表２】
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【００９９】
株M603 を、DNA C（pH304とも呼ばれ、この概略図は図4に示される）（配列番号3）で形質転換して、「キャンベルイン」株を得た。この「キャンベルイン」株を、次いで、「キャンベルアウトし」て、「キャンベルアウト」株M690を得た。このM690株は、metH遺伝子の上流にPgroESプロモーターを含んだ（P497 metHと呼ばれる）（P497の核酸配列は配列番号12に示される）。以下で表3に示されるように、このM690株は約77.2mMリジンおよび約41.6mMホモセリンを生産した。
【表３】
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【０１００】
M690株は、続いて、以下のとおりに突然変異を起こさせた。BHI培地(BECTON DICKINSON)で増殖させたM603の一晩培養物を、50mMクエン酸バッファー pH5.5で洗浄し、N-メチル-N-ニトロソグアニジン（50mMクエン酸塩 pH5.5中10mg/ml）を用いて30℃で20分間処理した。処理後、それらの細胞を、再度、50mMクエン酸バッファー pH5.5で洗浄し、以下の成分を含有する培地にプレーティングした：（記載した量は全て、500ml培地に対して算出したものである）10g (NH4)2SO4; 0.5g KH2PO4; 0.5g K2HPO4; 0.125g MgSO4*7H2O; 21g MOPS; 50mg CaCl2; 15mg プロトカテク酸; 0.5mg ビオチン; 1mg チアミン; および5g/l D,L-エチオニン(SIGMA CHEMICALS, CATALOG #E5139)（KOHを用いてpH7.0に調整した）。加えて、この培地には、10g/l FeSO4*7H2O; 1g/l MnSO4*H2O; 0.1g/l ZnSO4*7H2O; 0.02g/l CuSO4; および0.002g/l NiCl2*6H2O（全てを0.1M HClに溶かした）からなる微量金属溶液0.5mlを含めた。最終培地を濾過滅菌し、その培地に、40mlの滅菌50%グルコース溶液(40ml)および滅菌寒天を、終濃度1.5%まで添加した。この最終寒天含有培地を寒天プレートに注ぎ、最少エチオニン培地と表示を付けた。突然変異を起こさせた菌株をそのプレート（最少エチオニン）に撒いて、30℃で3〜7日間インキュベートした。その培地で増殖させたクローンを単離し、同じ最少エチオニン培地に再ストリークした。いくつかのクローンをメチオニン生産解析用に選択した。
【０１０１】
メチオニン生産は、以下のとおり解析した。菌株をCM-寒天培地において30℃で2日間増殖させた。この培地は、10g/l D-グルコース、2.5g/l NaCl; 2g/l 尿素; 10g/l Bacto Peptone(DIFCO); 5g/l 酵母抽出物(DIFCO); 5g/l Beef Extract(DIFCO); 22g/l Agar(DIFCO)を含有し、約121℃で20分間オートクレーブ処理したものとした。
【０１０２】
菌株を増殖させた後、細胞を擦り取り、0.15M NaClに再懸濁した。本培養では、擦り取った細胞の懸濁液を開始OD 600nmにおいて、0.5g 固体およびオートクレーブ処理したCaCO3(RIEDEL DE HAEN)とともに、約1.5〜10mlの培地II（下記参照）に添加し、それらの細胞を、30℃で約200rpmにてオービタルシェイキングプラットフォームにおいて100mlバッフルなし振盪フラスコ中で72時間インキュベートした 。培地IIは、40g/l スクロース; 60g/l 糖蜜の全糖（糖含量について算出）; 10g/l (NH4)2SO4; 0.4g/l MgSO4*7H2O; 0.6g/l KH2PO4; 0.3mg/l チアミン*HCl; 1mg/l ビオチン; 2mg/l FeSO4; および2mg/l MnSO4：を含有した。この培地は、NH4OHを用いてpH7.8に調整し、約121℃で約20分間オートクレーブ処理した）。オートクレーブ処理し、冷却した後に、ビタミンB12（シアノコバラミン）(SIGMA CHEMICALS)を濾過滅菌ストック溶液(200μg/ml)で、終濃度100μg/lまで添加した。
【０１０３】
この培地からサンプルを採取し、アミノ酸含量についてアッセイした。生産された、メチオニンなどのアミノ酸を、Agilent社のアミノ酸法を用いて、Agilent 1100シリーズLCシステムHPLC.(AGILENT)において決定した。サンプルをオルト−フタルアルデヒドでプレカラム誘導体化することで、Hypersil AA-カラム(AGILENT)での分離後に生産されたアミノ酸の定量が可能となった。
【０１０４】
M690において少なくとも2倍のメチオニン力価を示したクローンを単離した。そのような1つのクローンをさらなる試験に用い、そのクローンをMl179と名付け、2005年5月18日にDSMZ strain collectionに菌株番号DSM 17322として寄託した。以下で表4に要約されるように、この菌株によるアミノ酸生産を、株M690によるものと比較した。
【表４】
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【０１０５】
株M1179を、DNA F（pH399とも呼ばれ、この概略図は図5に示される）（配列番号4）で形質転換して、「キャンベルイン」株を得た。この「キャンベルイン」株を、続いて、「キャンベルアウトし」て、株M1494を得た。この菌株は、ホモセリンキナーゼの遺伝子に突然変異を含み、この突然変異は、この結果として生じるホモセリンキナーゼ酵素におけるT190からA190へのアミノ酸変化をもたらす（HskT190Aと呼ばれる）。以下で表5に要約されるように、株M1494によるアミノ酸生産を、株M1197による生産と比較した。
【表５】
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【０１０６】
株M1494を、DNA D（pH484とも呼ばれ、この概略図は図6に示される）（配列番号5）で形質転換して、「キャンベルイン」株を得た。この「キャンベルイン」株を、続いて、「キャンベルアウトし」て、M1990株を得た。このM1990株は、groES-プロモーターとEFTU（伸長因子 Tu）-プロモーターの両方を用いてmetY対立遺伝子を過剰発現する（P497 P1284 metYと呼ばれる）（P497 P1284 の配列は配列番号6に示される）。以下で表6に要約されるように、株M1494によるアミノ酸生産を、株M1990による生産と比較した。
【表６】
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【０１０７】
株M1990を、DNA E（pH491とも呼ばれ、この概略図は図7に示される）（配列番号7）で形質転換して、「キャンベルイン」株を得た。この「キャンベルイン」株を、次いで、「キャンベルアウトし」て、「キャンベルアウト」株M2014を得た。このM2014株は、スーパーオキシドジスムターゼプロモーターを用いてmetA対立遺伝子を過剰発現する（P3119 metAと呼ばれる）。以下で表7に要約されるように、株M2014によるアミノ酸生産を、株M2014による生産と比較した。
【表７】
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【０１０８】
実施例2. C. glutamicumメチオニン要求性株はジメチルジスルフィドをメチオニンに組み込む
C. glutamicumがDMDSをメチオニンに組み込む能力を有するかどうかを確認するために、株M2014（実施例1に記載されている）においてmetFの欠失を構築した。M2014を、プラスミド pOM86（図9）（配列番号8）で形質転換して、「キャンベルイン」株を得た。この「キャンベルイン」株を、次いで、「キャンベルアウトし」て、「キャンベルアウト」株を得、OM63と名付けた。このメチオニン要求性株、OM63が、メチオニンを合成するためにDMDSを利用することができるかどうかを確認するために、OM63の試験管培養物とその親M2014を、ODを600nmで測定することにより、増殖についてアッセイした。培養物は、メチオニン不含有培地（処方については下記参照）、メチオニンを補給したメチオニン不含有培地、または様々な異なる量のDMDS(Aldrich Catalog No. 32,041-2)を補給したメチオニン不含有培地で増殖させた。この試験は、DMDSが細菌の膜を通過し、細胞質内で一度メタンチオールに還元され、その後、基質として、MetYまたはMetB、あるいは別の酵素、例えば、MetCによってO-アセチル-ホモセリンとともに利用されて、直接L-メチオニンが形成し得るかどうかを確認するように設計された。この試験はまた、細胞増殖に対して、もしあるとすれば、DMDSの毒性を確認するようにも設計された。
【０１０９】
表8に示されるように、C. glutamicum metF要求性株は、DMDSを増殖のため、それゆえメチオニン生産のための基質として利用することができる。加えて、光学密度は、0.02%、0.04%、または0.06%DMDSを補給したメチオニン不含有培地5mlを入れた試験管中の全ての菌株で類似していた。0.08%DMDSまたは0.1%DMDSのいずれかを補給したメチオニン不含有培地5mlを入れた試験管では、恐らく、これらの濃度でのDMDSの毒性のために、増殖はほとんどまたは全く起こらなかった。最後に、予想されるように、DMDSを含まないメチオニン不含有培地は、M2014の増殖を支援したが、OM63の増殖は支援しなかった。
【表８】
2009501548.tif 000010
【０１１０】
この試験の結果は、DMDSは取り込まれ、C. glutamicumにより還元的にメタンチオールに切断され、メチオニン経路に入って、メチオニン要求性株の増殖を支援することができるということを示す。また、DMDSは、O-アセチル-ホモセリンスルフヒドリラーゼまたはO-O-スクシニル-ホモセリンスルフヒドリラーゼ（O-O-succinyl-homoserine sulfhydrylase）、あるいは別の酵素の直接基質である。言い換えれば、単一酵素が還元的開裂とDMDSのメチオニンへの組込みを触媒する可能性がある。
【０１１１】
メチオニン不含有培地-1リットル(l)
100mlのDifco（商標）Methionine Assay Medium(105g/l)
100mlの10x Spizizen塩類*
6mlグルコース(50%)
4mlの「4B」溶液**
100mgトレオニン
40mgシステイン
785ml dH2O
5ml 2%CaCl2
**4B溶液
チアミン(B1)-0.25mg/ml
シアノコルバラミン(cyanocolbalamin)(B12)-50μg/ml
ビオチン-50mM KPO4 pH=7.0中28μg/ml
ピリドキシンHCl-1.25mg/ml
*10x Spizizen塩類
20g/l 硫酸アンモニウム
174g/l 二塩基性リン酸カリウム（三水和物）
60g/l 一塩基性リン酸カリウム（無水）
10g/l クエン酸ナトリウム
2g/l 硫酸マグネシウム（七水和物）
オートクレーブ処理後、3.5ml 0.4%FeCl3・6H20および1ml 微量栄養素溶液1を添加する
1微量栄養素溶液-1リットル(l)
0.15g Na2MoO4・2H2O
2.5g H3BO3
0.7g CuSO4・5H2O
1.6g MnCl2・4H2O
0.3g ZnSO4・7H2O
約15〜20g/Lの寒天を含めることにより、この培地の固体型を作製することができる。これは標準手順により行われる。例えば、20g寒天を約750ml水に加え、オートクレーブ処理し、溶かしながら、上記の成分を滅菌ストック溶液として加える。
【０１１２】
実施例3. メチオニンに組み込むためのC. glutamicumへのDMDSの送達系の開発
上記のとおり、DMDSは、約0.06%より多い量で液体培養物に直接添加される場合には毒性がある。この問題を克服するために、経時的に溶液へのDMDSの持続放出を可能にすると思われる送達系が求められた。Amberlite（商標）XAD4、微多孔性ポリスチレン樹脂ビーズ（以後「XAD4」と呼ぶ）は、不活性であり、疎水性小有機化合物を吸着することができ、水により湿潤させることができ、高表面積および小孔径を有することから、送達系として選択された。
【０１１３】
XAD4により吸着され、なお増殖を可能にし得る最大量のDMDSを決定するために、試験管試験を実施した。この目的のために、OM63およびM2014において5mlの培地を用いた試験管試験を実施した。各試験管には、XAD4の50%(v/v)懸濁液100μlと、メチオニン不含有培地、メチオニンを補給したメチオニン不含有培地、または様々な量のDMDSを補給したメチオニン不含有培地のいずれかを入れた。
【０１１４】
試験管アッセイを、5mlのメチオニン不含有培地を、ゆるい金属キャップで蓋がなされた滅菌20mMx20mMxl50mM試験管に入れることにより準備した。各試験管に、XAD4の水中滅菌懸濁液(50%v/v)100μlを加えた。それらの試験管にBHI培地(Bacto（商標）Brain Heart Infusion(Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD)を入れた試験管で一晩増殖させた細胞を接種した後、回転させ、メチオニン不含有培地で2回濯いだ。細胞をメチオニン不含有培地の開始量の50%に再懸濁した。各試験管に対してその細胞懸濁液(5μl)を接種材料として用いた。細胞接種後、各試験管にDMDSを指示濃度(v/v)で添加した。これらの試験管を、プラットフォームシェーカーにおいて24〜48時間、30℃で200rpmにてインキュベートした。細胞増殖は、Genesys（商標）2 分光光度計を使用し、600nmでの光学密度により測定した。
【０１１５】
表9に示されるように、光学密度は、0.1%、0.2%、0.3%、または0.4%DMDSを補給したメチオニン不含有培地を入れた試験管中の全ての菌株でかなり類似していた。0.5%DMDSを補給した試験管は、OM63増殖への負の影響を示したが、このレベルのDMDSはM2014では許容されるように思われた。結論として、DMDSをXAD4ビーズに吸着させることによって、C. glutamicumの液体試験管培養物により多くのDMDSを添加することが可能になる。メチオニン要求性株の十分な増殖を可能にするのに十分なDMDSがビーズから放出される。
【表９】
2009501548.tif 000011
【０１１６】
さらに、XAD4単独では、細胞増殖への明確な悪影響はない。DMDSを含まないメチオニン不含有培地を入れた試験管では、予想どおり、M2014の増殖を支援したが、OM63の増殖は支援しなかった。40mg/lメチオニンを補給した、DMDSを含まないメチオニン不含有培地を入れた試験管では、M2014では類似の最終光学密度となったが、OM63では予想されるよりもやや低い光学密度となった。これは、恐らく、XAD4が、補給されたメチオニンの一部を吸着して、OM63細胞増殖を制限していることによる。
【０１１７】
実施例4. ガス状DMDSは、OM101(ΔmetB, ΔmetF)のメチオニン合成および増殖を支援することができる
DMDSの類似体である、ジメチルジセレニド(DMDSe)は、気体状態で微生物に対して毒性があるが、O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼを欠失した突然変異体について選択するのに用いることができるということは、これまでに分かっている(Brzywczy, J., およびPaszewski, A. (1994) Yeast 9:1335-1342、およびTreichler, H. J.,ら (1978) in FEMS Symposium No. 5, pp 177-199, R. Hutterら編, Academic Press, New York)。DMDSeの供給物全てを寒天に拡散および溶解する場合には、DMDSeを液滴として、ペトリプレートの蓋裏面に入れて、終濃度約5μMとした。しかしながら、本化合物DMDSについては、記載されておらず、気体状態で拡散することにより、（類似体阻害とは対照的に）増殖に十分なレベルのDMDSを供給することができるかは明らかでなかった。比較のため、上記実施例1〜3の液体増殖試験では、DMDSの濃度は、約10mM（例えば、0.1%の場合）、または上記参照文献のDMDSeよりも約2000倍高かった。しかしながら、ガス状DMDSを送達することで、液体DMDSで見られた毒性が回避される可能性があった。
【０１１８】
この可能性を検証するために、約108細胞のOM101(ΔmetB, ΔmetF)を含むローンを、メチオニンが比較的含まれないように洗い流し、約25mlの寒天培地を入れたメチオニン不含有寒天プレートにプレーティングした。DMDSは、プレートの中央に50μlをスポッティングすることによるか、またはプレート中央で寒天にくぼみを作り、そのくぼみに50μlのDMDSを入れることにより送達した。DMDSがそのプレート全体に拡散した場合には、終濃度は約25mMとなるであろう。対照プレートには、細胞のローンを与えたが、DMDSは与えなかった。それらのプレートを、プレートのスタックよりも少し大きい、密閉されたポリプロピレンプラスチックボックスに一緒に入れ、30℃で48〜60時間インキュベートした。ローン上に直接DMDSをスポッティングしたプレートでは、液体DMDSをスポッティングした場所からおよそ30mmの死滅ゾーンがあったが、プレートの残りの部分は、増殖のローンで一様に覆われていた。くぼみに入れられた液体DMDSを含むプレートでは、死滅ゾーンはなかったが、逆に、プレート全体（プレートの周辺部と中央のくぼみに至るまでを含む）を一様に覆う増殖のローンがあった。通常、必要な栄養源を、その栄養源に対して栄養要求性のローンの中央に置くと、増殖勾配が見られ、最も早い増殖はその栄養源に最も近くに起こる。最後に、DMDSを添加していないが、同じ、密閉されたプラスチックボックスに、DMDSを与えたプレートとともに入れた対照プレートでは、OM101の増殖の完全なローンが見られた。これらの観察により、C. glutamicum要求性株の増殖は、ガス状DMDSの拡散により支援され得ることが示唆された。
【０１１９】
ガス移動を証明するために、試験を実施し、その試験ではOM101のローンがすでに広がっているメチオニンフリープレートの寒天の中央から丸い(25x25x5mm)穴を開けた。これらの穴に、50μlの液体DMDSのカップとしての役割を果たす滅菌赤色ポリプロピレンスクリューキャップ（(20x20x5mm) Sarstedt（登録商標）(No. 62.554.002)のもの）円錐型試験管を入れた。この方法では、DMDSがポリプロピレンを通して迅速に拡散しないことから、液体DMDSが細胞と直接接触せず、気体状態での拡散によってしか細胞に届かないことを確実にした。プレートを30℃でインキュベートし、気密プラスチックボックスに密閉した。この試験の対照プレートを、OM101のローンが広がっているメチオニンフリープレートとし、DMDSの不在下で別の密閉プラスチックボックスで30℃でインキュベートした。2日後、液体DMDSを入れた滅菌キャップを有するプレートは完全な細菌のローンで覆われ、別の容器のDMDSを欠いた対照プレートは増殖を示さないことが観察された。これらの試験は、総合すれば、OM101への毒性には液体DMDSが直接接触することが必要であること、および対照的に、ガス状DMDSに毒性はなく、増殖のため、それゆえメチオニン合成のためにも、OM101により利用され得ることを示す。よって、発酵タンクでは、液体状態での細胞に対するDMDSの毒性を回避するために、DMDSは気体状態で細胞に送達され得る。これは、DMDSを蒸発または沸騰させ、DMDSの蒸気を発酵容器に供給することにより、または発酵容器に向かう途中で、液体DMDS中に空気もしくは酸素をバブリングすることにより行うことができる。
【０１２０】
実施例5. ΔmetE ΔmetH株の構築
MetEとmetHの両方を欠失させたC. glutamicum株を構築した。M2014を、プラスミド pH469（図10）（配列番号9）で形質転換して、「キャンベルイン」株を得た。この「キャンベルイン」株を、次いで、「キャンベルアウトし」て、metE欠失を含む「キャンベルアウト」株、OM228C-2を得た。さらに、OM228C-2を、プラスミド pH300（図11）（配列番号10）で形質転換して、「キャンベルイン」株を得た。この「キャンベルイン」株を、次いで、「キャンベルアウトし」て、ΔmetEとΔmetHの両方を含む「キャンベルアウト」株、OM246Cを得た。予想されるように、二重欠失株の2つの分離株、OM246C-1およびOM246C-2は、メチオニン要求性株であり、糖蜜培地での試験管培養ではメチオニンを生産しない。
【０１２１】
実施例6. MetYは、メチオニンの生産のための、O-アセチル-ホモセリンとメタンチオールとの反応を触媒する酵素活性の大部分に関与する
文献報告では、MetB(Flavin, M.およびS. Slaughter 1967. Biochim. Biophys. Acta, 132:400-405; Kanzaki, H.ら 1987. Eur. J. Biochem. 163:105-112; Kiene, R.P.ら 1999. Appl. Environ. Microbiol. 65:4549-4558)またはMetZ(Yamagata, S. 1971. J. Biochem. (Tokyo) 70:1035)のいずれかがメタンチオールの組込みに関与する可能性があることが示唆されているため、C. glutamicumにおけるメタンチオールの組込みに関与する酵素を同定するために、ΔmetB対立遺伝子を含有するOM63誘導体を用いて試験を実施した。上記に示されるように、C. glutamicumは、ジメチルジスルフィド(DMDS)を、メタンチオールを介して直接メチオニンに組み込むことができる。実施例3では、DMDSは、約0.06%より少ない量で液体培養物に直接添加されるならば、細胞により許容されるが、吸着剤であるAmberlite（商標）XAD4などの送達系の存在下で添加されるならば、毒性が認められないように、液体培養物に添加されるDMDSの量は5倍増加し得ることが確認された。
【０１２２】
C. glutamicumがΔmetFメチオニン要求性株の増殖を支援するのにDMDSを利用することができるということを示す「概念実証」試験には、メチオニン要求性株OM63(ΔmetF)を用いた。C. glutamicumにおいてどのような酵素がメタンチオールのメチオニンへの組込みに関与しているかをさらに定義するために、metBの欠失を含む菌株を、DMDSの存在下で増殖するそれらの能力について検証した。
【０１２３】
metBを検出するためにpSH315(Hwang BJ,ら J Bacteriol. 2002 Mar; 184(5): 1277-86)と同じmetB欠失対立遺伝子を含む、H216で形質転換したOM63から誘導されたOM101C(ΔmetF, ΔmetB)、実施例4に記載されている、OM246c(ΔmetH, ΔmetE)、OM63(ΔmetF)、およびM2014を、Amberlite XAD4の50%懸濁液100μlと、メチオニン不含有培地、または様々な量のDMDSを補給したメチオニン不含有培地のいずれかを入れた試験管で増殖させた。表10に示されるように、光学密度は、0.1%または0.2%DMDSを補給したメチオニン不含有培地を入れた試験管中の全ての菌株で類似していた。0.3%DMDSで増殖阻害を示したOM101Cを除いて、全ての菌株は、0.4%DMDSを補給したメチオニン不含有培地で増殖することができた。0.5%DMDSの存在下では、株OM246Cだけが増殖することができた。総合すれば、これらの結果は、メタンチオールのメチオニンへの組込みにはMetB、MetH/MetE、およびMetFは必要ではないということを示す。よって、MetYは、DMDSのメチオニンへの組込みを可能にする酵素活性に十分なものである。
【表１０】
2009501548.tif 000012
【０１２４】
実施例7. O-アセチルホモセリンメタンチオールスルフヒドリラーゼ活性を有する酵素としてのMetYの同定
ここで、本発明者らは、MetBではなくMetYがO-アセチルホモセリンメタンチオールスルフヒドリラーゼ活性に必要かつ十分な酵素であることを直接示す。metY、metB、およびmetFの欠失の異なる組合せを含むM2014派生株を用いて、試験管試験を実施した。それらの菌株を、Amberlite（商標）XAD4ビーズを含み、200mg/lのDMDSまたは100mg/lのメチオニンを含むまたは含まないメチオニン不含有培地で増殖させた。接種材料は、1試験管当たりおよそ5x103細胞とした。細胞をプラットフォームシェーカーで30℃で60時間増殖させ、細胞密度をOD600で測定した。
【０１２５】
表11に示されるように、DMDSは、メチオニン要求性株OM63(ΔmetF)およびOM101(ΔmetF, ΔmetB)の増殖を支援することができるが、metY欠失を有するいずれのメチオニン要求性株（OM158またはOM174など）の増殖も支援しない。0M158は、OM63をプラスミド pH215（配列番号11）で形質転換することにより構築し、「キャンベルイン」株を得た。配列番号11に示される核酸配列は、metYの開始コドン（残基1〜3）からmetAの停止コドン（残基912〜914）までに及ぶ、欠失したmetY遺伝子のpH215における領域である。その欠失を囲む2つの塩基は、残基609〜610に存在する。その「キャンベルイン」株を、次いで、「キャンベルアウトし」て、ΔmetF、ΔmetYを含む「キャンベルアウト」株、OM158を得た。OM174は、OM101をプラスミド pH215で形質転換することにより構築し、「キャンベルイン」株を得た。この「キャンベルイン」株を、次いで、「キャンベルアウトし」て、ΔmetF、ΔmetB、ΔmetYを含む「キャンベルアウト」株、OM174を得た。図8は、プラスミドpH215を用いたmetYの一部の欠失前(8A)および後(8B)のmetY領域におけるC. glutamicum染色体の構造を示す。
【０１２６】
このデータは、MetYがO-アセチルホモセリンメタンチオールスルフヒドリラーゼ活性に関与する唯一の酵素であり、MetBもMetCもこれらの条件下での増殖に十分なレベルのこの酵素活性を有さないということを示す。
【表１１】
2009501548.tif 000013
【０１２７】
実施例8. C. glutamicumの栄養要求性株におけるメチオニン生産効率
ΔmetFまたはΔmetE ΔmetH C. glutamicum栄養要求株がメチオニンの合成のためにDMDSを利用できるということが一度立証されたら、メチオニン生産効率を確認することも関心事となった。振盪フラスコ試験を実施し、その試験ではOM246CをM2014と比較した。各振盪フラスコには、20ml糖蜜培地と、0.4%DMDSを含むまたは含まないAmberlite（商標）XAD4の50%懸濁液800μlを入れた。表12に示されるように、DMDSを含めなかったOM246Cは、ほとんどメチオニンを蓄積しなかった。対照的に、DMDSを添加したOM246Cは、約0.3g/lのメチオニンを蓄積した。このように、メチオニンの生産は、ホモシステインを迂回して、O-アセチル-ホモセリンを直接メチオニンに変換することによって生じる。最も重要なことには、DMDSの存在下で増殖させたOM246Cにおけるメチオニン力価の正味の増加は、DMDSが存在する場合には、メチオニン合成の最終段階に欠陥があるC. glutamicum突然変異体によってもメチオニンが生産され得るということを確証する。対照株M2014は、DMDSの存在下で増殖させるか否かに関わらず、類似プロフィールのアミノ酸を蓄積した。興味深いことに、DMDSは、M2014におけるメチオニン生産を約0.5g/lから約0.7g/lまでに少し促進（刺激）した。これは、DMDSの組込みと従来のメチオニン生合成経路によるメチオニンの生産との相加効果により説明が付く。
【表１２】
2009501548.tif 000014
【０１２８】
実施例9. メチオニンに組み込むためのC. glutamicumへのDMDS送達系のさらなる開発
DMDSの可能性ある送達系（Amberlite（商標）XAD4の他）をさらに探るために、重質白色鉱油(Sigma cat. no. 400-5)と植物油であるカノーラ油の両方を調べた。油は疎水性であるため、油は、DMDSを溶解し、水性培地へのDMDSの持続放出を潜在的に可能にするはずである。様々な量の溶解されたDMDSを含有する油(0.5ml)を、100mg/lメチオニンを含むまたは含まないメチオニン不含有培地5mlを入れた試験管に添加した。プラットフォームシェーカーでの30℃で24時間のインキュベーション後に、終濃度0%、0.2%、0.4%、0.8%、および1.2%のDMDSを含む細胞培養物の光学密度を測定した。表13に示されるように、OM246Cの増殖は、0.4%までのDMDSを含む試験管において起こったが、一方、M2014の増殖は、0.8%までの、鉱油に溶解されたDMDSを含む試験管において起こった。しかしながら、光学密度は、鉱油を含まないメチオニン不含有培地を含む試験管培養物のものの半値に満たなかった。鉱油中のDMDSの最大値は、細胞増殖に許容されるAmberlite（商標）XAD4に対し、M2014の場合では少し高い（0.8%対0.4%）が、OM63の場合では同じであった（0.4%対0.4%）。カノーラ油を送達系として検証した場合でも同じような結果が認められたが、カノーラ油単独では、鉱油ほど細胞増殖に大きな負の影響を与えない（表14）。これらの油の存在下での低下した増殖は、1つには、試験管培養物の通気が不十分であること、細胞膜が破壊されること、またはそれらの2つのことの組合せが原因であるかもしれない。それでもなお、発酵において油をDMDSのための送達系として用いることができることは明らかである。動物源、無機源、化学源、または植物源、もしくはそれらの組合せから得られた油は、細胞へのDMDSの送達に用いることができる。他の可能性ある送達系としては、合成油、有機溶媒、クロロカーボン、フルオロカーボン、またはクロロフルオロカーボンが含まれる。さらなるアプローチは、毒性レベルより低い定常状態レベルで細胞に供給する遅延制御DMDS供給であろう。DMDSの毒性問題もDMDS耐性C. glutamicum株を選択することによって多少とも解決するであろう。最後に、DMDS
の毒性に対して本質的により耐性のある宿主種を利用することによってこの問題も多少とも解決するであろう。
【表１３】
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【表１４】
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【０１２９】
実施例10. 菌株の改良
大腸菌metB遺伝子を、メタンチオールを利用するように、突然変異または進化させた(WO 2004/076659 A2)。例えば、MetEおよびMetHまたはMetFを欠失しているが、選択培地においてメタンチオールではなくDMDSを用いるメチオニン要求性株を用いて、同様の選択手法を適用することができる。よって、例えば、O-アセチルホモセリンまたはO-スクシニルホモセリンを生産することができるが、ホモシステインを用いることができないメチオニン要求性株から始め、メチオニンを欠いているが、DMDSを含有する最少培地において、化学物質、照射、またはミューテーター対立遺伝子による突然変異誘発を行いまたは行わずに、増殖またはより早い増殖について選択することにより、DMDSをメチオニンに組み込むより強い能力を有するということについて微生物を選択することができる。この種の選択は、特定の遺伝子、例えば、metB遺伝子、metY遺伝子、metC遺伝子、またはmetI遺伝子に着目してよく(Augerら, 2002 Microbiology 148: 507-518)、その遺伝子をプラスミドに配置し、そのプラスミドを、（欠失または突然変異により）DMDSを組み込む内因的能力を欠く菌株に導入し、上記のように選択を実施することによる。そのように選択された微生物由来の派生株、またはそのように選択された微生物から単離された遺伝子もまた、メチオニン生産株を構築または誘導するのに有用である。
【０１３０】
実施例11. 大腸菌は、O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはO-スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼの供給を受けたならば、DMDSをメチオニンに代謝することができる
大腸菌メチオニン要求性株CGSC 3592(metF64)およびRY714B、metE::Tn10、MM294のΔmetH派生株（ATCC 33625の別名でも知られる）、ならびにCGSC 6315(endA1、thi-1、supE44、hsdR17)を、pH357（配列番号13；C. glutamicum metYおよびmetXを発現するプラスミド）、pH309（配列番号14；C. glutamicum metYを発現するプラスミド）、または大腸菌およびC. glutamicumで複製するpH357およびpH309に関連する空ベクターであるpCLIK（配列番号15）で形質転換した。選択は、富栄養培地（L培地寒天）における25mg/Lの硫酸カナマイシンに対する耐性についてとした。6つの形質転換体をメチオニンフリー寒天培地にプレーティングし、寒天の中央にくぼみを作り、そのくぼみに、50μlのDMDSを入れ、実施例4に記載のとおり、それらのプレートを30℃でインキュベートした。pH309またはpH357のいずれかで形質転換した両菌株はプレートで増殖したが、エンプティーベクターpCLIKで形質転換したどちらの菌株も増殖せず、このことにより、metYは、大腸菌がメチオニンを合成するためにDMDSを利用するのに必要かつ十分であるものであるということが示された。これらの結果は、RY714B/pH309が、例えば、O-スクシニルホモセリンを主として生産することが分かっている大腸菌MetA酵素に依存していることから、MetYはO-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼとO-スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼの両方の活性を有するという主張も裏付ける。
【０１３１】
よって、大腸菌は、本明細書に記載のように操作されたならば、DMDSを取り込み、それを還元し、それをメチオニンに組み込む能力を有する。大腸菌およびC. glutamicumは、近縁生物ではないが、どちらもこの能力を有することから、本発明者らは、幅広い種類の生物がこの能力を有し、そして、供給される化合物の1つとしてDMDSを用いてメチオニンを生産するように、幅広い種類の生物を操作することができると予想する。
【０１３２】
実施例12. フィードバック耐性O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはO-スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ酵素についての選択
生合成によりメチオニンを作るためには、フィードバック耐性O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはO-スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ酵素を用いることが望ましい。多くの生物では、これらの酵素は、メチオニンによりフィードバック阻害される。例えば、Corynebacterium glutamicumのMetY（O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ）はメチオニンによりフィードバック阻害され、これはメチオニン合成に対して逆効果である。メチオニンによる阻害に耐性を示すといわれている突然変異型MetYが報告されている(WO 2004/108894 A2)が、これらの型は、メチオニン生合成を改善するのに最適な型ではないかもしれない。そのため、好適なフィードバック耐性型のMetYがなお必要である。本明細書において、MetYがDMDSによる増殖を与え得る酵素であることが証明されたため、有用なmetY対立遺伝子を選択するための新規スキームを以下のとおり開発した。MetFまたはMetEおよびMetHを欠失しており、所望により、MetY、MetBおよび／またはMetCも欠失している、比較的高率のO-アセチルホモセリン合成を得るために操作されたC. glutamicum株（例えば、OM174(ΔmetF, ΔmetB, ΔmetY)またはOM246C(ΔmetE, ΔmetH)（2005年7月18日出願の「Methionine Producing Recombinant Microorganism」と題する米国仮特許出願第60/700,699号）を、MetYを発現するプラスミド、pH357またはpH309などで形質転換する。結果として生じる菌株は、プラスミドpH357またはpH309によりもたらされるMetYによって、DMDSを含むメチオニン不含有培地において増殖することができる。その菌株の増殖を阻害するものについて、メチオニン類似体、例えば、α-メチルメチオニン、セレノメチオニン、ノルロイシン、トリフルオロメチオニン、メチオニンヒドロキサマート、エチオニン、S-メチルシステインなどをスクリーニングする。その菌株の増殖を阻害する類似体は、場合によっては、MetYの偽フィードバック阻害によりそれを遂行する。言い換えれば、その類似体は、MetYのメチオニン結合部位と結合し、その酵素の活性を阻害する。前記類似体に耐性を示す突然変異体について選択する（突然変異誘発を行うまたは行わない）ことで、その類似体の結合と、メチオニンとに耐性を示すMetYの変異体をもたらす。そのような突然変異体候補からプラスミドDNAを単離し、それを純粋な(naive)非突然変異宿主株に再び形質転換し、その類似体耐性表現型が導入されたプラスミドによりコードされるかどうかを確認する。このスクリーニングに合格するプラスミドは、1以上の突然変異を含み、それらの突然変異のうちのいくつかはメチオニンに対する望ましいフィードバック耐性を与えるものである。
【０１３３】
フィードバック耐性O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ変異体を創出し、同定するための上記スキームは、フィードバック耐性O-スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ酵素変異体の単離にも適当である。その方法は似ているが、開始生物は中間体としてO-アセチルホモセリンの代わりにO-スクシニルホモセリンを生産し、プラスミドは、O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼの代わりにO-スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ酵素をコードする。言い換えれば、そのプラスミドは、metY遺伝子の代わりにmetZ遺伝子を含む。
【０１３４】
フィードバック耐性MetYまたはMetZについての上記の選択は、C. glutamicum以外の生物でも行うことができる。例えば、上記、実施例11に示されるように、大腸菌RY714B/pH309または大腸菌CGSC 3592/pH357などもDMDSを含むメチオニン不含有培地で増殖することができるため、そのような菌株もまた、DMDSを含むメチオニン不含有培地で増殖させ、メチオニン類似体に対する耐性について選択することによって、MetYの所望の変異体について選択するのに用いることができる。大腸菌MetAはまた、メチオニンによる阻害に対する感受性、およびα-メチルメチオニンなどの一部の類似体に対する感受性も有することから(Usuda Y, Kurahashi O., Appl. Environ. Microbiol., 2005 June;71(6):3228-34)、大腸菌metA-変異体を用い、例えば、pH357を用いてフィードバック耐性MetAもしくはMetXを与えることによって、または類似体に対する耐性について選択されたmetA対立遺伝子を用いることによって、所望のmetY対立遺伝子についての選択を促すことができる。一般に、この方法は幅広い種類の細菌、酵母、菌類、古細菌、および植物において生かされるはずである。
【０１３５】
均等物：
当業者ならば、ルーチン実験を用いる程度で、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態の多くの均等物を理解し、または確認することができるであろう。かかる均等物は特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】メチオニン生合成経路の模式図である。メチオニン生合成酵素をボールド体（太字）で示し、それらの対応する遺伝子をイタリック体（斜字）で示す。
【図２】pH273ベクターの概略図である。
【図３】pH373ベクターの概略図である。
【図４】pH304ベクターの概略図である。
【図５】pH399ベクターの概略図である。
【図６】pH484ベクターの概略図である。
【図７】pH491ベクターの概略図である。
【図８Ａ−Ｂ】プラスミドH215を用いたmetYの一部の欠失前(8A)および後(8B)のmetY領域におけるC. glutamicum染色体の構造の概略図である。
【図９】スペクチノマイシン耐性カセットを有するC. glutamicum metF遺伝子を破壊するように設計されたプラスミドであるベクターpOM86の概略図である。
【図１０】pH469ベクターの概略図である。
【図１１】pH300ベクターの概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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