(57)【要約】本発明は、潜在的にアレルゲン性または組織刺激性の物質のインビトロ評価方法に関し、その方法では被験細胞が物質の存在下で培養され、G1P2、OASL、IFITl、TRIM22、IFI44L、MXI、RSAD2、IFIT3、IFITMl、IFIT2、SPR、GNB2、XK、IFITM3、C 33.28 HERV-H タンパク質 mRNA、IFITM3、XK、GPR15、MTlG、MT1B;MT1A、ADFP、JL8、MTlE、MTlF、MTlH、SLC30A1、SERPINB2、CD83、TncRNAから選択される上方制御された遺伝子またはそれらからの発現産物の存在が測定される。本発明はまた、アレルギーまたは組織刺激のインビトロ分析のためのそれら遺伝子の１以上からの発現産物の使用にも関する。本発明はまたそれら遺伝子のいずれかに対応するRNAに相補的なRNAから選択される少なくとも３の、好ましくは 3 - 40、特に 5 - 15の核酸を含むプローブならびにそのアレルギーまたは組織刺激のインビトロ分析のための使用にも関する。さらに本発明はそれら遺伝子のいずれかの発現の際に産生される産物を認識する１以上のプローブを含む試薬キットにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
潜在的にアレルゲン性または組織刺激性の物質のインビトロ評価方法であって、被験細胞が該物質の存在下で培養され、G1P2、OASL、IFIT1、TRIM22、IFI44L、MXI、RSAD2、IFIT3、IFITM1、IFIT2、SPR、GNB2、XK、IFITM3、 C 33.28 HERV-H タンパク質 mRNA、IFITM3、XK、GPR15、MT1G、MT1B;MT1A、ADFP、IL8、MT1E、MT1F、MT1H、SLC30A1、SERPINB2、CD83、TncRNAから選択される上方制御された遺伝子またはそれらからの発現産物の存在が測定されることを特徴とする方法。
【請求項２】
G1P2、OASL、IFIT1、TRIM22、IFI44L、MXI、RSAD2、IFIT3、IFITM1、IFIT 2の１以上の発現が I型アレルギーを示し; SPR、GNB2、XK、IFITM3の１以上の発現が非アレルギーを示し; C 33.28 HERV-H タンパク質 mRNA、IFITM3、XK、GPR15の１以上の発現がI/IV型ハプテンを示し、MT1G、MT1B;MT1A、ADFP、IL8、MT1E、MT1F、XK、IFITM3、MT1H、SLC30A1、SERPINB2、GNB2、MTIB、CD83、TncRNA 遺伝子の１以上の発現がIV型アレルギーを示すことを特徴とする請求項 1の方法。
【請求項３】
RNA、DNA、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質が測定されることを特徴とする請求項 1-2のいずれかの方法。
【請求項４】
被験細胞が、一次血液細胞; 全血、末梢血、リンパ球、単球および血液細胞由来のインビトロ培養細胞またはインビトロ培養細胞株から選択されることを特徴とする請求項 1-3のいずれかの方法。
【請求項５】
細胞に対して非毒性の物質の最高濃度が段階希釈されることを特徴とする請求項 1-4のいずれかの方法。
【請求項６】
細胞増殖が測定されることを特徴とする請求項1 - 5のいずれかの方法。
【請求項７】
インターフェロン産生と相関する遺伝子がクラスI免疫応答の指標として選択されることを特徴とする請求項1-6のいずれかの方法。
【請求項８】
G1P2、OASL、IFIT1、TRIM22、IFI44L、MXI、RSAD2、IFIT3、IFITM1 および IFIT2の遺伝子の１以上が測定されることを特徴とする請求項7の方法。
【請求項９】
IL-8を上方制御する遺伝子の存在が測定され、IL-8を上方制御する遺伝子の高レベルの存在がアレルゲン性応答の指標であることを特徴とする請求項 1-6のいずれかの方法。
【請求項１０】
ネオプテリンにより上方制御される遺伝子の存在が測定され、ネオプテリンにより上方制御される遺伝子の高レベルの存在がアレルゲン性応答の指標であることを特徴とする請求項 1-6のいずれかの方法。
【請求項１１】
アスペルギルスにより上方制御される遺伝子がクラスI免疫応答の指標として選択されることを特徴とする請求項1-10のいずれかの方法。
【請求項１２】
以下の１以上の遺伝子からの発現産物の、アレルギーまたは組織刺激のインビトロ分析のための使用：G1P2、OASL、IFIT1、TRIM22、IFI44L、MXI、RSAD2、IFIT3、IFITM1、IFIT2、SPR、GNB2、XK、IFITM3、C 33.28 HERV-H タンパク質 mRNA、IFITM3、XK、GPR15、MT1G、MT1B;MT1A、ADFP、IL8、MT1E、MT1F、MT1H、SLC30A1、SERPINB2、CD83、TncRNA 。
【請求項１３】
以下の遺伝子のいずれかに対応するRNAまたは DNAに相補的なRNAまたはDNAから選択される少なくとも5、好ましくは少なくとも 10、例えば、3-50、5-40または10-30のアミノ酸の、アレルギーまたは組織刺激のインビトロ分析のためのプローブとしての使用： G1P2、OASL、IFIT1、TRIM22、IFI44L、MXI、RSAD2、IFIT3、IFITM1、IFIT2、SPR、GNB2、XK、IFITM3、C 33.28 HERV-H タンパク質 mRNA、IFITM3、XK、GPR15、MT1G、MT1B;MT1A、ADFP、IL8、MT1E、MT1F、MT1H、SLC30A1、SERPINB2、CD83、TncRNA 。
【請求項１４】
プローブが、G1P2、OASL、IFIT1、TRIM22、IFI44L、MXI、RSAD2、IFIT3、IFITM1、IFIT2、SPR、GNB2、XK、IFITM3、C 33.28 HERV-H タンパク質 mRNA、IFITM3、XK、GPR15、MT1G、MT1B;MT1A、ADFP、IL8、MT1E、MT1F、MT1H、SLC30A1、SERPINB2、CD83、TncRNAのいずれかの発現の際に産生される産物を認識することを特徴とする、１以上のプローブを含む試薬キット。
【請求項１５】
さらに被験細胞も含む請求項 14の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、潜在的にアレルゲン性または組織刺激性の物質のインビトロ評価方法に関し、その方法では、被験細胞が物質の存在下で培養され、請求項１に記載の特定の上方制御された遺伝子またはそれらからの発現産物の存在が測定される。この方法は遺伝子活性化プロファイルアッセイ、GAPAと称される。本発明はまた、アレルギーまたは組織刺激のインビトロ分析のためのそれら遺伝子の１以上からの発現産物の使用にも関する。
【０００２】
本発明はまた、それら遺伝子のいずれかに対応するRNAに相補的なRNA から選択される少なくとも３、好ましくは 3 - 40、特に 5 - 15の核酸を含むプローブおよびアレルギーまたは組織刺激のインビトロ分析のためのその使用にも関する。
【０００３】
さらに本発明は、それら遺伝子のいずれかの発現の際に産生される産物を認識する１以上のプローブを含む試薬キットにも関する。
【背景技術】
【０００４】
従来技術
今日、化学物質に対するアレルギー応答を予測するのに利用できる確証された信頼できるインビトロ試験は存在しない。現在使用されている試験はインビボ動物試験であり、倫理的側面を考慮すると、現在用いられている動物試験と取って代わることができるインビトロ方法を見いだすことが非常に求められている。アレルギー反応は罹患したヒトにとって非常に深刻であり得るため、例えば、医薬、化粧品および食品業界から可能な限り早期にそのような物質を同定することができることが非常に要求されている。
【０００５】
以前の研究では、血液細胞により産生されるネオプテリンおよびインターロイキン-8 (IL-8)が、アレルゲン性物質を同定する信頼できるシグナル分子でありうることが示されている1。スウェーデン特許 (No. 506 533、WO 97/16732)となったこの仮説はヒトアレルゲンおよびT-リンパ球抗原の同定のためのインビトロ方法を導いた。この特許に包含される方法はサイトカインプロファイルアッセイ (CPA)と命名された。この試験の概念はアレルゲン性物質は培養ヒト末梢血単核球 (PBMC)の上清中に測定される特定のパターンのネオプテリンおよびIL-8 産生を誘導することが出来るということである。CPAのさらなる確証研究により、ヒト単球細胞株の参照系としての好ましい使用が導かれる。また、この方法はI型アレルギーを誘導することが知られているタンパク質を同定するのにもっとも好適なようである。
【０００６】
アレルゲン
免疫学的機構に媒介される過敏症を刺激することができる抗原はアレルゲンと称される。アレルゲンはその他の抗原と同じように細胞性または体液性応答を誘導し、活性化Ｔ細胞、抗体分泌プラズマ細胞そして記憶細胞を作る。
【０００７】
抗原の共通の化学的性質を同定するための多くの努力がなされたが、免疫系の複雑性のためにそれはすべて失敗している。
【０００８】
アレルゲンの化学的性質
タンパク質
タンパク質は感受性の個体におけるアレルギー応答を誘導する能力を有する。この反応にはタンパク質と免疫系との間の複雑な相互作用が必要であり、それらは残念なことに予測が困難である。既知のアレルゲン性タンパク質は通常、分子量が15000から40000であり2、それらはしばしばI型アレルゲン性反応を与える環境因子、例えば、 動物のフケ、酵素、花粉および食品、に対するアレルギーと関連している。
【０００９】
アレルゲン性であると規定されるためには、タンパク質は免疫グロブリン EおよびT-細胞によって検出可能なエピトープを含んでいなければならないが、タンパク質のその他の特徴および特性がそれらの全体的なアレルゲン性を与えていると考えられる。食品タンパク質がアレルギー応答を誘導する可能性に寄与している重要な因子は曝露時間と安定性である。例えば、既知の食品アレルゲンは、よりしっかりと消化される非アレルゲン性タンパク質と比較してAstwood et al.3により使用された胃腸管を表す胃モデルにおいてより安定であることが示されている。これについての論拠は安定なタンパク質はそのインタクトな形態にて胃腸管に、免疫応答を誘発するために十分に長い時間持続するということである。
【００１０】
もう一つの特徴的な性質は多くのアレルゲンに対して起こることが観察されている翻訳後グリコシル化であり4、これはグリコシル基がそのアレルゲン性に寄与しているという可能性をもたらす。グリコシル化は、安定性、溶解性、疎水性および電荷の変化を含むタンパク質の物理的性質に影響を及ぼし、したがっておそらくは免疫系によるタンパク質の取り込みの上昇およびその結果としての検出によりそのアレルゲン性を変化させる。酵素活性もまた、アレルゲン性と相関している可能性がある。例えば、酵素の界面活性剤への導入により界面活性剤がアレルギー感作を引き起こすことが出来るようになりうる5。
【００１１】
多くのアレルゲンはいくらか相同性を共有し、タンパク質の一次配列はそれゆえ、少なくとも部分的には、アレルゲン性と関連している可能性がある。一方、実際にアレルゲン性のエピトープが考慮される場合 (およそ 10-15 アミノ酸長)、アレルゲン性アミノ酸配列についての全体的相同性は出現しない。研究により、アレルゲン性タンパク質は卵形の形状である傾向があり、反復モチーフを有し、熱安定性であること、また、タンパク質ジスルフィド結合がアレルゲン性に寄与していることも示された6。
【００１２】
要約すると、多くの因子が独立にまたは協調してタンパク質のアレルゲン性に寄与している可能性がある:
・大きさおよび構造
・免疫応答を誘導することができるT-およびB-細胞エピトープの存在
・熱および分解に対する耐性
・グリコシル化状態
・生物学的機能 (特に酵素活性が存在するか否か)。
【００１３】
ハプテン
低分子量化学物質、例えばイソシアネートもアレルゲンとして振る舞うことが出来、それらはハプテンと称される。かかる分子は一般に分子量が700より小さい。ハプテンは抗原性であるが、免疫原性ではなく、即ち、それら自体で免疫応答を誘導することはできない。しかし、それらがより大きいタンパク質、即ち、可溶性または細胞結合ホストタンパク質、いわゆるキャリアタンパク質と結合すると、それは免疫原性ハプテン-キャリア接合体を形成する。ハプテンアレルゲンの感作能力は、かかるハプテン-タンパク質複合体を形成するその能力に依存する。ハプテンとタンパク質との間の相互作用には、ほとんどの場合、共有、それゆえ不可逆的な結合が伴う。これはハプテンがそのアミノ酸の側鎖との結合の形成を可能とする化学反応特性を有することを意味する。高頻度の標的はハプテンの構造に依存するが、システイン、ヒスチジンおよびリジンである。この感作物質は求電子剤として作用し、タンパク質は求核剤として作用し、ほとんどのかかる反応において、アミノ酸の側鎖基(-NH2、-SH、-S、-N、-NHおよび -OH)における求核性官能基によって反応する。一方、金属はタンパク質と配位結合を形成することが出来る。それとはことなり、ハプテンのなかには容易にフリーラジカルを形成するものもあり、それはフリーラジカル機構を用いてタンパク質に結合する7。
【００１４】
ランドシュタイナーによる古典的モデルによれば、ハプテンは体内に入り、キャリアタンパク質と化学的に結合し、ハプテン決定基、キャリアタンパク質上のエピトープおよび、ハプテンとキャリアとの接合により形成された新しいエピトープに対して特異的な抗体を生成させる。しかし、ハプテンのみで、キャリアタンパク質に結合せずに、T-細胞応答を誘導することができることも示された。ハプテン-特異的T-細胞はハプテン- 修飾MHC-ペプチド複合体を認識し、それによりハプテンが MHC 分子、結合ペプチド、またはその両方の構造を修飾することが示唆され、また、T-細胞によって認識されるのは修飾構造であることも示唆された8。
【００１５】
ハプテンは通常、IV型過敏症反応を誘導し、その結果、皮膚接触アレルギーが起こる; 多くのハプテンの重要な性質はそれゆえ、皮膚バリアを透過する能力である。多様な生体異物、例えば、薬剤、金属、および化学物質だけでなく、ペプチドホルモンおよびステロイドホルモンもハプテンとして機能することができ、IV型過敏症反応を引き起こす。
【００１６】
ハプテンは単純な金属イオンから複雑なアロマート（aromate）まで様々であり得る。ハプテンの共通の性質は以下の通りである:
低分子量 
皮膚バリアを透過する能力
アミノ酸側鎖とのその結合の形成を可能とする化学反応特性またはMHC 分子および/または結合ペプチドの構造を修飾することができる性質。
【００１７】
APCによるアレルゲンの提示-アレルギー応答の生成
抗原提示細胞(APC)はアレルゲン- 特異的免疫応答の生成において重要な役割を果たす。
【００１８】
マクロファージ、B リンパ球および樹状細胞を含むAPCは、２つの特徴を有する:それらはクラスIIMHC分子をその膜上に発現し、そして、T-細胞活性化を刺激することができる。免疫系によって認識されるためには、すべての体内に入る抗原はプロセシングされて提示されなければならない。タンパク質アレルゲンなどの外来抗原は、APCのエンドサイトーシスまたはファゴサイトーシスによって細胞に入り、次いで分解されてペプチド断片とされ、そして細胞表面上のクラスII分子によって抗原構造が提示される、図1。このようにして潜在的な抗原構造はAPC表面上でT-リンパ球に対して提示されるようになる。T リンパ球は特有の抗原結合分子をAPC 表面に有し、それはT-細胞受容体と称される。これらは9-15 アミノ酸のサイズの抗原構造を認識することが出来る。T-細胞はその受容体にマッチするペプチドを提示するAPCを見いだすと、活性化され、B-細胞、T-細胞およびその他の細胞の活性化に寄与するサイトカインを分泌する。同時にB-細胞は同じ抗原を認識する抗体により、抗原と相互作用し、T-細胞により活性化され、抗体分泌プラズマ細胞および記憶細胞へと分化する。抗体、ならびにT-細胞は、アレルギー反応の惹起において中心的な役割を果たす。
【００１９】
アレルギー
免疫学的機構により惹起される過敏症反応であるアレルギーは、例えば、植物、食品または動物に由来する一般的な物質に対する有害な免疫応答の結果である。様々な免疫機構が過敏症反応を引き起こし得、それゆえP.G.H. Gell およびR.R.A、Coombsは1968年に過敏症反応を４群に分ける分類スキームを示唆した。各群は、様々な機構、細胞、およびメディエーター分子を伴い、機構は複雑であって分類間の境界ははっきりしないことを認識することが重要である。４つの型のうち３つは抗体または抗原-抗体複合体により媒介され、その結果、免疫系の体液性部門内で起こり、４つめの型は免疫系の細胞性部門内で起こる。
I型:IgE 抗体媒介
II型: 抗体媒介(IgGまたはIgM 抗体媒介) 
III型: 免疫複合体媒介 (IgGまたはIgM 抗体媒介)
IV型: 遅延型過敏症 (DTH)、細胞媒介。
【００２０】
過敏症反応の特徴は再現性である; TおよびB-細胞はアレルゲンに曝されたらいつでも応答を与えることが出来るアレルゲン特異的記憶細胞を形成する。
【００２１】
I型過敏症
I型過敏症の原理は、抗原に遭遇したときに正常な体液性応答が行うのと同じ機構を用いるアレルゲンに対する抗体産生に基づく。違いは、I型過敏症反応の際にはIgGではなくIgE 抗体がプラズマ細胞により分泌されることである。
【００２２】
I型 アレルゲンに曝されると、B-細胞は活性化され、IgE分泌プラズマ細胞および記憶細胞へと発達する。Ig E がマスト細胞および血液好塩基球に結合すると、これらの細胞は薬理学的に活性のメディエーターを放出し、図 2、平滑筋収縮、血管透過性の上昇および血管拡張をもたらす。
【００２３】
正常の免疫応答においては、IgE 抗体は寄生虫感染に対する防御として産生されるが、アレルゲンに対する応答として産生される場合はそのヒトはアトピーであると言われる。Johansson et al9はアトピーを「低用量のアレルゲン、通常はタンパク質に応答してIgE 抗体を産生し、典型的症候、例えば、 喘息、鼻炎結膜炎、または湿疹/皮膚炎を発症する個人的または家系性傾向」であると定義している。この反応は一般的な環境的抗原、例えばナッツおよびハチ毒に対して曝された後にも起こりうる。
【００２４】
反応は部分的には遺伝性であり、曝露の5-20分後に起こり、処置されなければ死に至ることもある。したがって、I型過敏症はもっとも重篤な過敏症反応であるとみなされている１０。
【００２５】
II型過敏症
これは抗体媒介細胞傷害性過敏症反応であり、それは細胞のIgG/IgM-媒介破壊を伴う。II型過敏症は、標的細胞の膜に孔を開けるよう補体系を活性化する抗体を介して起こりえ、細胞死が導かれる。細胞破壊は抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ADCC)によっても起こりうる。抗体は細胞表面の抗原に対して形成される。それらが表面に結合した後、細胞傷害性細胞が抗体に結合する。これは標的細胞の破壊を促進する、図 3。
【００２６】
輸血反応および胎児赤芽球症はII型過敏症反応の例である。抗原への曝露および臨床反応の間には５−８時間程度かかる10。
【００２７】
III型過敏症
これら反応において抗原に結合したIgG/IgM 抗体は、ともに免疫複合体を生成する。これら免疫複合体は一般に抗原の排除を容易にするが、抗原が過剰であると多くの小さい免疫複合体が生成し、それらは食細胞によって容易に排除されない、図 4。これは炎症反応と称されるIII型過敏性組織傷害をもたらしうる。
【００２８】
III型過敏症反応は、自己免疫疾患(例えば、関節リウマチ)、薬剤反応(例えばペニシリンに対するアレルギー)および感染性疾患 (例えば、マラリア)において観察されうる。この反応は曝露の４−８時間後に起こる10。
【００２９】
IV型過敏症
この反応は遅延型過敏症とも称され、低分子量化学物質(ハプテン)への皮膚の曝露の結果として発症し得、アレルギー性接触皮膚炎を導く。IV型過敏症の機構はアレルゲン-特異的T-細胞の形成を特徴とする。この反応には抗体は関与しない。T-細胞が活性化されると、それらはサイトカインを分泌し、非特異的炎症細胞の流入の活性化を導き、これにはマクロファージが主に関与し、その結果局所炎症(湿疹)が起こる、図 5。正常な免疫応答においてこの反応は細胞内病原体に対する宿主防御において重要な役割を果たす。
【００３０】
遅延型過敏症を典型的に引き起こす抗原は、合成または天然由来物質、例えば、薬剤、金属または植物成分であり得る。遅延型過敏症反応は曝露部位の皮膚において炎症反応をもたらすアレルゲンとの接触の24-48時間後に顕著になる10。
【００３１】
刺激反応
アレルギー型以外の過敏症の形態もある。刺激物質への曝露後の反応は非アレルギー性過敏症の一例である。この応答の特徴は、炎症促進性メディエーター、例えば、サイトカインである腫瘍壊死因子α(TNF α)およびインターロイキン 6 (IL6)の放出である11。反応はIV型過敏症反応に類似しているが、主な相違はこのプロセスは感作を必要とせず、それゆえ、IV型反応におけるように記憶T-細胞が発達することはないということである。抗原-特異的抗体も存在しない。刺激反応は;強力な刺激物質、例えば、塩化ベンザルコニウムへの１回の接触、湿潤環境での頻繁な作業、または弱い刺激化学物質との頻繁な接触の後の応答として起こりうる。刺激は接触アレルゲン感作の動力学に顕著な効果を有することが示されており12、アレルギー性接触皮膚炎が刺激物質が抗原とともに存在する場合により頻繁に起こることを意味する。
【００３２】
予測試験方法
長年にわたり、化学物質およびタンパク質のアレルゲン性である能力がある可能性の同定のためのいくつかの予測試験が用いられてきた。ヒトと動物との両方が被験対象として用いられてきた。ヒトを用いる試験方法は主に1944から1980年の間に開発された。これらの試験の大きな欠点は、試験結果を信頼できるものとするために多くのボランティアが必要であることである。ボランティアには、彼らの人生の残りの期間について感作されて被験化学物質にさらに曝露された場合に湿疹を発症するようになるという危険もある。これは大きな倫理的問題であるので、今日ではヒトに対する試験は行われていない。
【００３３】
接触感作物質を同定するための動物試験は長年にわたって利用可能であった。それらはすべてインビボ方法であり、皮膚感作物質の同定にもっとも一般的に用いられているのは、モルモット極大化試験 (GPMT)およびBuehler試験であり、これはアジュバントを用いないモルモットにおける閉塞パッチテストである。皮膚感作物質を同定するために用いられる評価され、受け入れられているもう一つの試験は局所リンパ節アッセイ (LLNA)である。
【００３４】
ガイドライン
新規薬剤およびその他の製品を世界市場で評価するための欧州および全世界について規格化された系を獲得するために、新規方法を評価する様々な組織による系が展開されてきた。
【００３５】
経済協力開発機構 (OECD)は民主政治および市場経済への合意を共有する30のメンバー国からなる組織である。該組織はまた70のその他の国および組織と活動的な関係を有しており、世界的規模に達している。該組織は個々の国がグローバル化経済において進展するために多国間合意が必要である分野における競争の規則を促進するための国際的に合意された方法、決定および推奨を作成している。
【００３６】
OECDの第406 試験ガイドライン (1981年に採択)において、GPMTおよびBuehler試験が、アレルギー性接触皮膚炎化学物質の評価のために推奨された。これら２つの試験は最近まで用いられていた。2002年４月に LLNAが新しい試験ガイドライン(第429; 皮膚感作: 局所リンパ節アッセイ)にOECDにより導入され、同年７月に採択された。並行して、EUが該アッセイについての新規試験ガイドラインを作成した。LLNAはまた免疫毒性についての最も最近の食品医薬品局 (FDA) ガイドラインにおいても推奨されており13、ここでモルモットアッセイよりも有益であることが示唆されている。動物実験代替法機関(ICCVAM)は、LLNAは簡素化と緻密化の両方に関して重要な動物生活福祉を与えると結論している14。
【００３７】
代替方法
現存の動物に基づく試験はやり遂げるのに時間および費用がかかり、動物が用いられるために多くの倫理的側面を含む。このためアレルゲン性を有する物質を同定するために多くの研究がなされており、いくつかの新規な方法が開発された。
【００３８】
インビボ/ インビトロ
Dearman et al.15;16は、リンパ節細胞からの様々なサイトカインレベルを測定することによる化学的アレルゲンの潜在的なアレルゲン性を予測する方法の開発に取り組んだ。呼吸性アレルゲンであるトルエンジイソシアネート (TDI)および皮膚感作物質であるジニトロフルオロベンゼン (DNFB)に局所的に曝されたマウスにおいて、彼らはインターフェロンγ (IFN-γ)、IL-4およびIL- 10のサイトカインレベルにおける変化をモニターした。示されたデータは、マウスの流入領域リンパ節細胞において誘導された相対的サイトカイン分泌パターンは異なるクラスの化学的アレルゲンを特徴づけることができることを示唆したが、この方法はさらに評価する必要がある。
【００３９】
IV型反応は抗原提示細胞 (APC)とT-細胞との両方を伴うので、刺激性 APCと応答性 T-細胞との両方を含む培養系は化学物質のアレルゲン性を予測するインビトロ試験の開発のための最良のアプローチを提供すると考えられる。かかるインビトロ系を確立するための試みがいくつかなされてきたがいまだに成功していない。皮膚における主要なAPCはランゲルハンス細胞 (LC)であると考えられており、それゆえ研究者らは、化学的ハプテンおよび刺激物質への曝露の後にLCにおいて起こる事象に注目してきた。多くの技術がIV型アレルゲンに曝露された際に皮膚において起こる事象の経過を模倣するインビトロ方法の確立を可能とするためにヒトおよびマウス源からLC の集団を単離するために開発された。今日までLC株は樹立されておらず、それゆえ細胞の数がLCに基づくインビトロ方法の開発における律速因子となっていた。
【００４０】
上皮(EpiDerm)モデルは欧州代替法研究評価機関 (ECVAM)によって評価された物質の刺激能力を検出することが出来る方法である。実験手順は正常のヒト由来上皮ケラチノサイトからなり、それはヒト表皮の多層の高度に分化したモデルを形成するよう培養されたものである。組織は培地を含むプレートに移され、物質が組織の上に適用される。細胞生存率が各組織についてネガティブコントロール組織のパーセンテージとして計算される。被験物質は、被験物質への曝露の後の残りの細胞生存率にしたがって分類される。この試験の理論は刺激性化学物質は表皮に対する短期曝露の後に細胞傷害性を示すという知識に基づく17;18。しかしこのモデルは潜在的アレルゲンの分類に用いられてこなかった。
【００４１】
インシリコ
生物学的研究と並行して、もうひとつのアプローチがより重要となってきており、それは即ち構造活性相関 (SAR)の研究である。この方法によると、既知の分子の分子的または物理化学的性質が未知の物質のアレルゲン性能力の予測に用いられる。新規化合物についての構造、物理化学的および電気的データが感作の危険を有することが知られている化学構造についてのデータと比較される。この型の系の最終的使用は以下のような問題に対して回答することである: どの化合物が感作しうるかし得ないか？
【００４２】
DEREK (化学構造と影響の相関に関する知識ベースを活用したエキスパートシステム)はこの原理に基づくデータベースである。このシステムは分子の構造を分析する「コントロール」プログラムと、アレルゲン性と関係していることが知られているサブ構造の形態にある「ルール」からなるデータベースからなる。 DEREKは次いで化合物がアレルゲン性であるかどうかの「リスク」を評価する。このシステムの限界は、プログラムがアレルゲンについて重要である状況である物質の代謝を考慮しないことである。プロセスは被験分子の構造に単に基づくのみであり、かかる構造は、例えば IV型 アレルギーにおいては、皮膚タンパク質と反応するのに必要でない。 
【００４３】
もうひとつのアプローチは実験および症例情報のみを含むデータベースを作成することである。かかるデータベースの例は、サンフランシスコ大学のH.I. MaibachおよびProfessor C. Benzraとの協力によりCCS Associate によってPalo-Alto において開発されたものであり19 、ここで使用されたデータの主なソースは1975年以来 Contact Dermatitisにおいて公表されたアレルギーの症例である。このシステムの限界は参照データが編集された方法に起因する。このデータは歴史的物質に基づいており、より新しい物質は含まれていない。別の問題は、保存されたデータが多数の患者における中程度の反応よりも少数の患者における重篤な反応がよりよく記載されている科学文献に基づくことであり、その結果、中程度であるが一般的な反応が予測され得ないことである。アレルゲン性物質のみに関するその他のデータベースはAllergomeおよびAllermatchである。92,000 のアノテーションされたタンパク質配列を有し、およそ 30のその他のデータベースと相互参照されているデータベース SWISS-PROTを介して配列を比較することも可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００４４】
新規試験についての現在の要求 
既に確証されて受け入れられている試験の主な限界は、それらが接触アレルギーを含むIV型 アレルゲンしか検出することができないことである。したがって、現在、経過が速く、しばしば暗い前兆を有する反応であるI型アレルギー反応を引き起こす未知の物質を同定することが出来る確証され受け入れられている試験は存在しない10。インビトロでアレルギー反応を検出する代替試験を開発する機会は社会からの要求の高まりにより大きく、多くの努力がこの分野に注がれてきた。出現しつつある新しい技術、または既に入手可能な技術が代替アプローチの設計の現実的機会を提供するというのは楽観的である。アレルギー反応の化学的および生物学的側面をますます理解することおよびゲノミクス/プロテオミクスをこの分野に適用することにより将来、動物方法と取って代わることが可能となりうる。
【課題を解決するための手段】
【００４５】
新規試験方法- 受入の基準
新規インビトロ試験が受入られ、上市できるようにするためには、妥当性および信頼性を確立するための手順がEMEA(The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products)の欧州医薬品委員会(CPMP)により要求される。
【００４６】
フェーズI: 試験開発および定義
試験は定義される目的を有さねばならず、プロジェクトを行う研究室は他の研究室がその試験を再現できるように作業手順を徹底的に記載しなければならない。試験の特異性、感受性および再現性は、得られるデータと関連していなければならない。ポジティブおよびネガティブコントロールを含む十分な数の参照物質を、試験の一貫性を確立するために試験しなければならない。
【００４７】
フェーズII: 試験の最適化
様々な国からの研究室を伴う多施設研究を試験の評価のために行わなければならない。試験の有用性、信頼性、確実性および実施可能性を従来の方法と比較した試験の技術的改良を強調して記載しなければならない。この研究において、参加する研究室はポジティブおよびネガティブコントロールを含む、限定された十分な数の参照物質を規定し評価しなければならない。多施設研究は国際的な査読された科学文献に公表されることが必須である。
【００４８】
フェーズIII: 確証
フェーズIおよびIIの後に試験はその最終形態となり、多数の異なる国からの研究室による多施設研究を行わなければならない。提案された試験の妥当性と受け入れられている標準的インビボ方法との比較が目的である。より多数の適当に選択された関連物質が試験される。この研究もまた公表しなければならない。
【００４９】
フェーズIV: 設定または国際的データバンクへの参加
国際的データバンクを作ることが、特に試験がルーチン的に行われるべき場合は試験の性能の知識を改善するために必要である。
【００５０】
GAPA試験の開発の際に、試験結果の間の変動は最初は大きかった。というのは、細胞源が様々な個体から採取されていたからである。試験をより安定な、再現性のある、そして商業的に実施可能なものとするためにより標準化された細胞源が探索された。
【００５１】
13の単球/マクロファージ細胞株のスクリーニングが行われた。アレルゲン性および刺激性が知られている３つの物質を用いた。スクリーニングの結果は細胞株 MonoMac-6 が GAPA試験に好適であるということであった。
【００５２】
Mono Mac 6
親細胞株、Mono Macは骨髄化生の後の再発性急性単芽球性白血病(AML FAB M5)と1985年に診断された64-歳の男性患者の末梢血から樹立された。親細胞株が樹立されたもととなる血液サンプルは、患者の死の１ヶ月前に採取された。これから２つのサブクローン、Mono Mac 1とMono Mac 6が生じ、それらはともに形態学的、細胞化学的および免疫学的基準に基づいて単球細胞系であると確認された。Mono Mac 6は成熟単球の表現型および機能的特徴を構成的に発現しているようである20。
【００５３】
Mono Mac 6は単一丸形(single round)/多形(multiformed）細胞または小さいクラスターとして懸濁物として増殖し、ゆるく接着性であることもある。37℃で 5% CO2でインキュベートした場合のその倍加時間は約 60 時間であり、最大密度は約 1.0 x 106 細胞/mlである。細胞の直径はおよそ 16μであり、１または２の核小体が光学顕微鏡により確認されることもある丸形または所望の（intended）核を有する。4.8 ±1.9%の細胞においては、2-4の核が観察される。細胞質は多くのミトコンドリア、多数の粗面小胞体嚢、顕著なゴルジ体、リソソーム、被覆小胞、細胞内小胞および多胞体を含む。Mono Mac 6 は抗体に被覆された赤血球を容易に貪食する能力を有し、Mono Mac 6は成熟単球の代表であることが明らかである21。
【００５４】
本発明者らは、アレルゲン性または組織刺激性の物質が存在する場合、特定の遺伝子が上方制御されることを見いだした。それらの発現産物は、かかる物質の指標として測定されうる。
【００５５】
発明の概要
本発明は、潜在的にアレルゲン性または組織刺激性の物質のインビトロ評価 のための方法に関し、この方法では被験細胞が物質の存在下で培養され、請求項１に記載の特定の上方制御された遺伝子またはそれらからの発現産物の存在が測定される。本発明はまた、アレルギーまたは組織刺激のインビトロ分析のための１以上の遺伝子からの発現産物の使用にも関する。
【００５６】
本発明はまた、かかる遺伝子のいずれかに対応するRNAに相補的なRNAから選択された少なくとも３の、好ましくは 3 - 40の、特に 5 - 15の核酸を含むプローブおよびそのアレルギーまたは組織刺激のインビトロ分析のための使用にも関する。
【００５７】
さらに本発明は、それら遺伝子のいずれかの発現の際に産生される産物を認識する１以上のプローブを含む試薬キットにも関する。
【００５８】
本発明を以下の図によってさらに説明する:
図 1は、エンドサイトーシスプロセッシング経路である。
図 2は、I型過敏症である。
図 3は、II型過敏症である。
図 4は、III型過敏症である。
図 5は、IV型過敏症である。
図 6は、cGTP シクロヒドロラーゼの指数関数的発現を獲得するのに必要な細胞周期数である。
図 7は、IL-8の指数関数的発現を獲得するのに必要な細胞周期数である。
【００５９】
以下の略語を本明細書において用いる。
略語：
ADCC 抗体依存性細胞媒介細胞傷害性
APC 抗原提示細胞
Asp アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)
CPA サイトカインプロファイルアッセイ
CPMP 欧州医薬品委員会
DTH 遅延型過敏症
Fc 倍変化
GAPA 遺伝子活性化プロファイルアッセイ
GPMT モルモット極大化試験
GTP グアノシン三リン酸
ICCVAM 動物実験代替法機関
IFN-γ インターフェロンガンマ
IL インターロイキン
LC ランゲルハンス細胞
LLNA 局所リンパ節アッセイ
LPS リポ多糖
MHC 主要組織適合抗原
OECD 経済協力開発機構
PBMC 末梢血単核球
RT-PCR 逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
TDI トルエンジイソシアネート
TNF 腫瘍壊死因子 
【００６０】
発明の詳細な説明
本発明は、潜在的にアレルゲン性または組織刺激性の物質のインビトロ評価の方法に関し、この方法では、被験細胞が物質の存在下で培養され、G1P2, OASL, IFIT1, TRIM22, IFI44L, MXI, RSAD2, IFIT3, IFITM1, IFIT2, SPR, GNB2, XK, IFITM3, C 33.28 HERV-Hタンパク質 mRNA, IFITM3, XK, GPR15, MT1G, MT1B;MT1A, ADFP, IL8, MT1E, MT1F, MT1H, SLC30A1, SERPINB2, CD83, TncRNAから選択される上方制御された遺伝子またはそれらからの発現産物の存在が測定される。
【００６１】
特に、G1P2, OASL, IFIT1, TRIM22, IFI44L, MXI, RSAD2, IFIT3, IFITM1, IFIT 2遺伝子の１以上の発現は、I型アレルギーを示し; SPR, GNB2, XK, IFITM3遺伝子の、１以上の発現は、非アレルギーを示し; C 33.28 HERV-H タンパク質mRNA, IFITM3, XK, GPR15遺伝子の、１以上の発現は、I/IV型ハプテンを示し、MT1G, MT1B;MT1A, ADFP, IL8, MT1E, MT1F, XK, IFITM3, MT1H, SLC30A1, SERPINB2, GNB2, MTIB, CD83, TncRNA遺伝子の１以上の発現は、IV型 アレルギーを示す。
【００６２】
測定される発現産物は、RNA、DNA、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、およびそれらの誘導体、例えば、cDNA、またはcRNAであってよい。
【００６３】
上記のタンパク質に対応する遺伝子の遺伝子配列およびアミノ酸配列はすべて公知であり、GenBank (NIH 遺伝子配列データベース)に見いだすことが出来る。
【００６４】
本発明の一つの態様によると、インターフェロン産生と相関する遺伝子がクラスI免疫応答の指標として選択される。かかる遺伝子は、G1P2, OASL, IFIT1, TRIM22, IFI44L, MXI, RSAD2, IFIT3, IFITM1および IFIT2の１以上の遺伝子から選択することが出来、測定される。
【００６５】
本発明の別の態様によると、IL-8およびネオプテリンをそれぞれ上方制御する遺伝子の存在が測定され、IL- 8 を上方制御する遺伝子がネオプテリンを上方制御する遺伝子と比較して高いレベルで存在することは、クラスIV 細胞媒介T-細胞免疫および遅延型過敏症、例えば、細胞性免疫、遅延型アレルギーおよび接触湿疹の指標である。
【００６６】
アスペルギルス(Aspergillus)により上方制御される遺伝子はクラスI免疫応答の指標であることが判明した。
【００６７】
本発明の別の態様によると、ネオプテリンを上方制御する遺伝子およびIL- 8を上方制御する遺伝子の高いレベルでの存在は、T および B リンパ球および炎症細胞からのクラスI型免疫応答および即時型過敏症、例えば、喘息、枯草熱、蕁麻疹および鼻炎の指標である。
【００６８】
本発明による方法は、一次血液細胞; 全血、末梢血、リンパ球、単球および血液細胞由来のインビトロ培養細胞またはインビトロ培養細胞株から選択されうる被験細胞に対して行うことが出来る。細胞に対して非毒性の非常に高濃度の物質は段階希釈するとよい。
【００６９】
本発明によると、発現した遺伝子を測定する前に、細胞からより多くの発現産物を得るために細胞増殖を確立または阻害および/または測定してもよい。増殖はWO 97/16732 、特にその実施例に記載のように行うことが出来る。
【００７０】
本発明はまた、アレルギーまたは組織刺激のインビトロ分析のための１以上の遺伝子からの発現産物の使用にも関する。
【００７１】
発現産物、例えば、 RNA、DNAおよびそれら配列に相補的な核酸を分析するために、cRNAおよびcDNAを、ハイブリダイゼーション試験においてプローブとして使用することもできる。少なくとも3、例えば、少なくとも 5、少なくとも 10、少なくとも 15の核酸をプローブとして用いることが出来、例えば、 3-50、5-40、10-30の核酸を用いることが出来る。全長遺伝子のDNA 配列はGenBankにおいて見いだすことが出来る。有用なプローブを下記の材料および方法に列挙する。
【００７２】
本発明はまた、上記の遺伝子のいずれかの発現の際に産生される産物を認識するプローブを含む１以上のコンパートメントを含む試薬キットにも関する。被験細胞または使用説明書を含むコンパートメントが存在していてもよい。
【００７３】
本発明を特定の開示した態様に関して記載してきたが、当業者であれば具体的には言及していないが請求の範囲に含まれるその他の態様、改変または組合せを予測できるであろう。
【００７４】
本明細書において引用するすべての文献を、引用によりその内容全体を本明細書に含める。
【００７５】
本明細書において用いる「を含む」という表現は、記載された事項を包含するが、それに限定されるものではないものと理解すべきである。
【００７６】
本発明を以下の非限定的な実施例によりさらに説明する。
【実施例】
【００７７】
材料および方法
細胞培養
細胞株 Mono Mac 6 (AstraZeneca Cell Storage and Retrieval, Alderley Park, UK) を、10 mM HEPES バッファー (Gibco, UK)、2 mM L-グルタミン、9 μg/mL ヒトインスリン、1.0 mM ピルビン酸ナトリウム、10% 胎児ウシ血清、5.6 μl/mL グルコース、100 U/mL ペニシリンおよび100μg/mL ストレプトマイシンを含むRPMI 1640 培地で培養した。培養用の新しい培地を頻繁に添加するか交換し (２−３日毎)、細胞密度 （生細胞/mL）を0.5 x 106〜1.0 x 106に維持した。細胞株は懸濁されているかゆるく接着性であり、継代培養は必要な場合スクレーピングにより調製した。プレートはGalaxy R (Lab Rum Klimat Ab、Sweden) インキュベーター中で傾斜位で37℃で5% CO2にて培養した。
【００７８】
生存率測定 
細胞懸濁液の残りの部分を用いて生存率を計算した。041029の実験において、細胞をトリパンブルーで染色し、光学顕微鏡を用いてBurker チャンバ中で計数した。041115および041213の実験においてはNucleoCounter（商標）(Chemometec、Denmark)を用いた。
【００７９】
被験物質
マイクロアレイ分析のための時間応答研究
細胞培養物を表1に示す物質に、1、3、6、24および96時間曝した。コントロール細胞培養物は曝さなかった。
表1：動力学実験における被験物質
【表１】
2009508484.tif 000002
1) 物質 A、AstraZeneca、Sweden。蒸留水に溶解。
【００８０】
トータルRNAの調製はRNeasy（登録商標） Mini Handbook (Qiagen/VWR、Sweden)にしたがって行った。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)は7700 Sequence Detector System (Applied Biosystems、Sweden)でGene Expression Assay kitを用いて製造業者(Applied Biosystems、USA)の指示に従って行った。用いたプローブおよびプライマーは、ネオプテリン作成の出発物質、GTP シクロヒドラーゼ I (アッセイ番号: Hs00609198_m、Applied Biosystems)およびIL-8 (アッセイ番号: Hs00174103_m1、Applied Biosystems)であった。これら遺伝子をアレルギー反応についてのポジティブコントロールとした。TaqMan 分析を標準的操作手順 (“Real Time PCR med TaqMan Probe eller SYBR Green Primers”、SAS 755-1、AstraZeneca、Sweden)にしたがって行った。
【００８１】
マイクロアレイ分析
細胞を表2に示す４種のアレルゲンで、２連の培養にて処理した。被験物質はすべて２回蒸留水で希釈した。２連の培養を異なる曝露日数にて処理した。全ての処理は6 時間行い、コントロール細胞には曝露しなかった。
表2 ：041221および041222の実験に用いた物質
【表２】
2009508484.tif 000003
【００８２】
ベンジルペニシリンナトリウム塩 (ペニシリンG)は、13752、Sigma Aldrich、Germany; アルブミンヒトは、A9511、Sigma Aldrich、Germanyおよびアスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)はALK15142、Apoteket、Sweden であり、関連するアレルゲンの他に、グリセロール、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウムおよび注射用水を含んでいた 33。
【００８３】
培養物当たり500 000 細胞を含む20の個々の培養物をそれぞれの物質について同じように処理した。6時間の曝露後、同じ処理をされた細胞を回収し、 50 ml ファルコンチューブにプールし、7℃で540gで5 分間ペレットとした。上清を捨て、細胞をリン酸緩衝食塩水 (0,5% ウシ血清アルブミン含有)で洗浄し、エッペンドルフチューブに移し150gで2 分間室温で遠心分離した。上清を除き、細胞を液体窒素で凍結乾燥し、その後-152℃の冷凍庫にさらなる調製を行うまで入れておいた。
【００８４】
実験手順は Gene Chip（登録商標）Expression Analysis Technical Manual (rev1、2001)にしたがい、記載するようにわずかに改変を施して行った。トータルRNAをQiagen Rneasy Mini kit (Qiagen/WVR、Sweden)によって凍結細胞から調製した。30 μgのトータルRNA をcDNA 合成に用い、ビオチンによるインビトロ 転写産物標識をEnzo BioArray RNA Transcription Labeling Kit (Enzo、U.S.A)によって行った。cRNAの質はAgilent Bioanalyser 2001 (Agilent Technologies、U.S.A) で分析し、濃度はNano Droop (Saveen Werner、Sweden)で測定した。15 μgの断片化した cRNA をハイブリダイゼーション混合液 に添加し、HG_U95Av2 チップ(Affymetrix、U.S.A)に16時間45℃でハイブリダイズさせた。アレイを洗浄し、EukGE_W2v4 プロトコール (Affymetrix、U.S.A)にしたがって液体ステーション(Affymetrix、U.S.A)中でビオチン化抗ストレプトアビジン抗体により染色した。
【００８５】
得られたデータをMAS 5.0 モデルベースを用いて分析した。発呼検出(detection call)をすべてのプローブセットについて計算し、特定の遺伝子の転写産物が存在または非存在の場合に、すべての非存在遺伝子を分析から除くこととした。
【００８６】
データにおける異常値と傾向を確証するために、探索分析を主成分分析 (PCA)により行った。 統計分析はスチューデントのt検定を用いて行った。それは個々の群における分散をすべての群における分散により重み付けする。コントロールと比較しての統計的有意性を試験するためにスチューデントのt検定を用いた。得られたp-値は擬陽性プローブセットが見いだされる統計的確立を記載する。倍変化 (fc)は２つの比較されるチップ間の商を表す。
【００８７】
すべての処理群からの平均シグナル値をコントロールシグナルと比較した。
【００８８】
チップの読み取りプロセスの際に、ペニシリン G処理細胞からの物質を表すチップの１つにエラーが生じた。このチップのさらなる分析は不適切であり、 このチップは除外した。２つのチップ、バックグラウンドおよびアスペルギルス（aspergillus）は、非常に質が悪く、除外した。これらのチップは同じ洗浄ステーションで洗浄されたものであり、装置に何か不都合があったことを示す。
【００８９】
フィルター基準 
すべての群におけるシグナル値<50であるすべてのプローブセットを分析から除外した。コントロールと比較して統計的に有意な上方制御 (p<0.05)を示したプローブセットのみを分析に含めた。残りのプローブセットはfcより後であるとランクづけした。
【００９０】
細胞培養
本研究において、より多量のグルコースが細胞の増殖を維持するのに必要であった。その他は、２つの研究における培養条件は同一であった。
【００９１】
アレルゲンのバッチ
本研究に用いたアレルゲンは標準化されているが、試験に用いるバッチの間で組成に差がある可能性がある。これらは２つの研究の間で異なるものであった。
【００９２】
細胞株の安定性
２つの研究において用いた細胞株は同じ供給者から採取し、また同じ継代からのものであった。しかし、研究は1.5年隔てて行われ、細胞株の安定性に相違がある可能性がある。
【００９３】
HG-U95AV2 Affymetrix プローブ配列
プローブ- 配列の情報は NETAFFXTM ANALYSIS CENTER (https://www.affymetrix.com/analysis/netaffx)から得られる。
元の配列源: GenBank
以下の遺伝子についてのプローブを列挙する:
【表３】
2009508484.tif 000004
【００９４】
GIP2 (ISG15)
プローブセット: HG-U95AV2:1107_S_AT
【表４】
2009508484.tif 000005
【００９５】
プローブセット: HG-U95Av2:38432_AT
【表５】
2009508484.tif 000006
【００９６】
OASL
プローブセット: HG-U95AV2:269_AT
【表６】
2009508484.tif 000007
【００９７】
プローブセット: HG-U95Av2:34491_AT
【表７】
2009508484.tif 000008
【００９８】
IFIT1
プローブセット: HG-U95AV2:32814_AT
【表８】
2009508484.tif 000009
【００９９】
プローブセット: HG-U95AV2:915_AT
【表９】
2009508484.tif 000010
【０１００】
TRIM22
プローブセット: HG-U95AV2:36825_AT
【表１０】
2009508484.tif 000011
【０１０１】
IFI44L
プローブセット: HG-U95AV2:36927_AT
【表１１】
2009508484.tif 000012
【０１０２】
MXI
プローブセット: HG-U95AV2:39072_AT
【表１２】
2009508484.tif 000013
【０１０３】
プローブセット: HG-U95AV2:654_AT
【表１３】
2009508484.tif 000014
【０１０４】
プローブセット: HG-U95AV2:748_S_AT
【表１４】
2009508484.tif 000015
【０１０５】
RSAD2
プローブセット: HG-U95AV2:38549_AT
【表１５】
2009508484.tif 000016
【０１０６】
IFIT3
プローブセット: HG-U95AV2:38584_AT
【表１６】
2009508484.tif 000017
【０１０７】
IFITM1
プローブセット: HG-U95AV2:675_AT
【表１７】
2009508484.tif 000018
【表１８】
2009508484.tif 000019
【０１０８】
プローブセット: HG-U95AV2:676_G_AT
【表１９】
2009508484.tif 000020
【表２０】
2009508484.tif 000021
【０１０９】
IFIT2
プローブセット: HG-U95AV2:908_AT
【表２１】
2009508484.tif 000022
【０１１０】
プローブセット: HG-U95AV2:909_G_AT
【表２２】
2009508484.tif 000023
【表２３】
2009508484.tif 000024
【０１１１】
SPR
プローブセット: HG-U95AV2:32108_AT
【表２４】
2009508484.tif 000025
【０１１２】
GNB2
プローブセット: HG-U95AV2:38831_F_AT
【表２５】
2009508484.tif 000026
【０１１３】
プローブセット: HG-U95AV2:38832_R_AT
【表２６】
2009508484.tif 000027
【０１１４】
XK
プローブセット: HG-U95AV2:40647_AT
【表２７】
2009508484.tif 000028
【表２８】
2009508484.tif 000029
【０１１５】
IFITM3
プローブセット: HG-U95AV2:41745_AT
【表２９】
2009508484.tif 000030
【０１１６】
GPR15
プローブセット: HG-U95AV2:31426_AT
【表３０】
2009508484.tif 000031
【０１１７】
MT1G
プローブセット: HG-U95AV2:926_AT
【表３１】
2009508484.tif 000032
【０１１８】
MT1B
プローブセット: HG-U95AV2:609_F_AT
【表３２】
2009508484.tif 000033
【表３３】
2009508484.tif 000034
【０１１９】
MT1A
プローブセット: HG-U95AV2:31623_F_AT
【表３４】
2009508484.tif 000035
【表３５】
2009508484.tif 000036
【０１２０】
ADFP
プローブセット: HG-U95AV2:34378_AT
【表３６】
2009508484.tif 000037
【０１２１】
IL-8
プローブセット: HG-U95AV2:1369_S_AT
【表３７】
2009508484.tif 000038
【０１２２】
プローブセット:  HG-U95AV2:35372_R_AT
【表３８】
2009508484.tif 000039
【０１２３】
MT1E
プローブセット: HG-U95AV2:36130_F_AT
【表３９】
2009508484.tif 000040
【０１２４】
MT1F
プローブセット:  HG-U95AV2:31622_F_AT
【表４０】
2009508484.tif 000041
【０１２５】
MT1H
プローブセット: HG-U95AV2:39594_F_AT
【表４１】
2009508484.tif 000042
【０１２６】
SLC30A1
プローブセット: HG-U95AV2:34759_AT
【表４２】
2009508484.tif 000043
【０１２７】
SERPINB2
プローブセット: HG-U95AV2:37185_AT
【表４３】
2009508484.tif 000044
【０１２８】
SERPINB2
プローブセット: HG-U95AV2:37536_AT
【表４４】
2009508484.tif 000045
【０１２９】
実施例 1.アレルゲン処理後のMonoMac 6 細胞の遺伝子発現プロファイリング
アレルゲンで刺激された細胞の活性化がどの程度速く起こるのかを解明するために、細胞中のmRNAレベルの時間応答研究を行った。最適曝露時間を決定し、細胞を３種類のアレルゲン、１つの非アレルゲン性タンパク質に曝露し、その後、遺伝子発現分析を行った。
【０１３０】
結果 
アレルゲン処理の後のMonoMac 6 細胞の遺伝子発現プロファイリング
アレルゲンがどれほど速く細胞に影響を与え、アレルゲン-関連遺伝子の発現が起こるかを評価するために時間応答実験を行った。
【０１３１】
cGTP シクロヒドラーゼおよびIL-8の指数関数的発現に達するのに必要な細胞周期数をそれぞれ図 22および23に示す。遺伝子の指数関数的発現に達するのに必要な細胞周期数が少ないほどより多くのRNAが細胞中に存在する。1 時間の曝露時間は細胞システムが安定化されるのには短すぎるようであり、ネオプテリン (ここではcGTP シクロヒドラーゼによって示す)はIL-8よりもより興味深いバイオマーカーであることが示され、6 時間を最適曝露時間に選択した。
【０１３２】
表3は、材料および方法に記載のフィルターがけの後の各物質についての倍変化 (fc)の様々な値における制御されたプローブセットの数を示す。
表3. fcについての様々なカットオフ値(cut of value)における上方制御された遺伝子の数
【表４５】
2009508484.tif 000046
【０１３３】
アスペルギルス(Aspergillus)に曝された細胞は、その他の物質に曝された細胞と比べてより多数の制御された遺伝子を示すことが明らかである。上方制御はまた、その他と比較してアスペルギルス(Aspergillus)処理培養物においてより強い。
【０１３４】
アスペルギルス(Aspergillus)において10倍以上上方制御された14のプローブセットを評価し、その遺伝子産物の機能を調べた。これら14のプローブセットは10種類の遺伝子をコードする。これらおよびアルブミン、物質 Aおよびペニシリン Gにおいて2倍以上上方制御されたプローブセットを調べた。プローブセットに関連づけた遺伝子、遺伝子産物が関与していることが知られている生物プロセスおよびその分子機能をアスペルギルス(Aspergillus)、アルブミン、物質 A およびペニシリン G 処理細胞について表4、5、6および7にてそれぞれみることができる。
【０１３５】
表4. アスペルギルス(Aspergillus)処理培養物においてfcが10以上である非常に上方制御された遺伝子
【表４６】
2009508484.tif 000047
【表４７】
2009508484.tif 000048
【０１３６】
表5. アルブミン処理培養物においてfcが2以上である上方制御された遺伝子
【表４８】
2009508484.tif 000049
【０１３７】
表6. ペニシリン G 処理培養物においてfcが2以上である上方制御された遺伝子
【表４９】
2009508484.tif 000050
【０１３８】
表7：物質 A 処理培養物においてfcが2以上である上方制御された遺伝子
【表５０】
2009508484.tif 000051
【表５１】
2009508484.tif 000052
【０１３９】
注目すべきは、アスペルギルス(Aspergillus) 処理培養物において非常によく上方制御されていた10の遺伝子のすべてが、インターフェロンに誘導されることが示されている遺伝子であることである 23;24;25;26;27。
【０１４０】
インターフェロンの制御は表 7に示すとおりであり、そのほとんどは下方制御される。
【０１４１】
注目すべきことに、物質 Aで処理した細胞培養物において2倍以上上方制御された16の遺伝子のうち5つはメタロチオネイン28;29である。
【０１４２】
アスペルギルス(Aspergillus) 処理培養物において10倍以上上方制御された10の遺伝子産物はいずれも、アルブミン、物質 Aまたはペニシリン Gで処理された細胞培養物では2倍以上上方制御されていない。IFITM3およびXKは、物質 A、ペニシリン Gおよびアルブミンで処理された細胞培養物では共に2倍以上上方制御されるが、アスペルギルス(Aspergillus) で処理された細胞培養物ではそうではない。
【０１４３】
表 8.様々なインターフェロンの制御
【表５２】
2009508484.tif 000053
【０１４４】
遺伝子発現
アルブミン、ペニシリン Gおよび物質 Aで処理された培養物と比較してアスペルギルス(Aspergillus) に曝された細胞培養物においては特定の遺伝子がかなり大幅に上方制御された。アスペルギルス(Aspergillus)処理培養物でみられたfcが14から257の10のもっとも上方制御された遺伝子のいずれもその他の培養物においてはfcが2未満であった。
【０１４５】
アスペルギルス(Aspergillus)で処理された細胞培養物における上方制御された遺伝子はすべてインターフェロンに誘導される遺伝子に分類された。問題はどのようにこの応答が誘導され得たかである。インターフェロンの産生が起こったのであろうか、それともインターフェロンに誘導される遺伝子がインターフェロン産生なしに上方制御されたのであろうか。これはすべてのアレルゲンに普遍的に起こるのか、またはアスペルギルス(Aspergillus)に特異的なことなのかも疑問である。
【０１４６】
単球は高レベルの IFN-α、そして程度は低いがその他の形態のタイプI IFNを分泌することが示されている。IFN-αは病原体に対する自然および獲得応答において多数の重要な役割を有している。ウイルス感染の初期相におけるIFN-α、βの分泌の上昇は周知であるが、いくつかのその他の刺激、例えば細菌およびサイトカインによっても起こりうる30 。
【０１４７】
１つの可能性のあるシナリオは、アスペルギルス(Aspergillus)とウイルスキャプシド構造との間の類似性に起因するインターフェロン産生の誘導であり得る。そうであれば、これは、ウイルス感染の場合と同様に、アスペルギルス(Aspergillus)を提示する単球に隣接する細胞によるインターフェロン産生の開始を引きおこすであろう。もうひとつの可能性のある機構として、分解され細胞から分泌されたアスペルギルス(Aspergillus)の配列が、細胞上のIFN-受容体に結合し、IFNに制御された遺伝子産物を誘導することが出来るIFN-様構造を有している可能性がある。これは非分解アスペルギルス(Aspergillus) タンパク質にも当てはまりうる。これらすべての反応および応答が、曝露時間であった６時間の間に起こることが可能であるかが疑問であろう。
【０１４８】
アスペルギルス(Aspergillus)は真菌であるが、よく特徴決定されていない真菌抽出物からの調製物は、いくらかのウイルス性成分を含有する可能性がある。インターフェロンの活性化はアスペルギルス(Aspergillus)調製物のウイルス性の影響に起因する応答である可能性がある31。
【０１４９】
薬物過敏症の頻度がウイルス感染の存在下で増加するいくつかの例があり、例えば、ヒト免疫不全ウイルス (HIV)に感染した患者を治療する医者にしばしば観察される過敏症反応が挙げられる31;32。この相関は、アレルゲン性化合物とウイルス感染とがいくつかの経路を共有していることを示している可能性があり、さらに解明することに興味がもたれる。この理論の支持は、アスペルギルス(Aspergillus)への曝露により誘導された10の遺伝子のうち4つが抗ウイルス機能を有していることである。 
【０１５０】
この議論と矛盾することは、アスペルギルス(Aspergillus)処理培養物において高度に発現している遺伝子であるMxA がタイプI IFN産生の信頼できる指標であることである33。しかし、MxAはウイルス感染などの外部刺激になんら依存しておらず、したがってインターフェロン産生がおそらくは起こっているのであろう。「インターフェロンの産生」理論を唱えるもう一つの因子は、アスペルギルス(Aspergillus) に曝された細胞培養物において大多数の遺伝子が下方制御されるのにもかかわらず、いくつかのインターフェロン遺伝子が上方制御されることである。しかし、上方制御されたインターフェロン産生遺伝子はインターフェロンに誘導される遺伝子を誘導することが出来る。
【０１５１】
ネオプテリン産生の第一工程は、ほどんどはIFN-γであるが高濃度のIFN-αまたはIFN-βであることもあるインターフェロンによって誘導されるシクロヒドラーゼ Iの活性化である。ネオプテリンがアレルゲン性タンパク質の有用なバイオマーカーであれば、インターフェロン産生と相関しているその他の物質も、アレルゲン性タンパク質とも相関するバイオマーカーでありうる。
【０１５２】
インターフェロン誘導性遺伝子のこの活性化はアスペルギルス(Aspergillus) タンパク質に対する応答にすぎないのであろうか、あるいはすべてまたはほとんどのアレルゲン性タンパク質に共通の機構なのであろうか。さらなる研究がかかる関連を確認するために必要である。
【０１５３】
物質 Aに曝された細胞培養物においてfc >2である16の上方制御された遺伝子のうち5つはいくつかの種類のメタロチオネインをコードしている。ヒトにおいて、メタロチオネインは約 30%のシステインアミノ酸を含む約 10-12のメンバーからなる多重遺伝子族を構成している28。メタロチオネインは約半世紀にわたって知られているが、その正確な生理機能はいまだに議論されている最中である。以前にメタロチオネインは有毒金属に結合し、フリーラジカルおよび酸化ストレスの攻撃を阻害することが示されている。これらの遺伝子の合成は、それらが結合する金属イオン、即ち、Cd++、Zn++、Hg++、Cu++、Ag+およびAu+ または糖質コルチコイド処理によって誘導される29。より最近には、Maret and Callee34は、メタロチオネインの役割は、細胞のエネルギー状態の関数として、細胞内亜鉛分布を調節することにあると結論した。物質 Aは金属イオンを含まないので、これら遺伝子の誘導は金属イオンに起因するはずはない。物質 Aがなぜメタロチオネインの上方制御を誘導するのかという質問はさらに解明しなければならない。それはIV型アレルゲンに普遍的な機構なのか、あるいは単に物質 Aによる効果なのであろうか。 
【０１５４】
アスペルギルス(Aspergillus) 処理培養物において上方制御された遺伝子についてのバックグラウンド値のなかには非常に低いものもある。正確に評価するには低すぎる値からの上方制御は信頼できず、100-倍の上方制御はリアルタイム PCR によると4倍の上方制御であることもあり得る。 
【０１５５】
スチューデントt検定による２群間の比較によると、5% レベル未満のp-値を有するプローブセットが偶然に存在するであろう。受け入れられる有意性レベルを低下させると、擬陽性の回答数を減らすことができる。擬陽性の回答のいくつかはfc の基準が設定されfcと p-値とが密接に相関していると排除される。残りのリストにおいても擬陽性プローブセットは存在するであろうことから、結果はリアルタイム PCRなどのより特異的な方法により確認する必要がある。
【０１５６】
結論
遺伝子の一般的な上方制御は非アレルゲン性タンパク質またはハプテンよりもアレルゲン性タンパク質に曝された培養物においてより顕著であった。 
【０１５７】
アレルゲン性タンパク質に曝された培養物において非常に上方制御された遺伝子はすべてインターフェロンに誘導される遺伝子に分類された。
【０１５８】
アレルゲン性 (IV型) ハプテンに曝された細胞において非常に上方制御された遺伝子の多くはメタロチオネインをコードするものであった。
【０１５９】
参考文献
1.  Johansson L and Andersson B. Development of a Predictive In Vitro Test for identification of Allergens: Evaluation of 15 Well Documented Allergenic or Skin Irritating Compounds. Biovator-Biologicla Innovations Inc. Sweden. (1995).
2.Goldsby R.A, K.T.J.O.B.A. Kuby Immunology. W.H.Freeman and company, New York (2000).
3.  Astwood J.D, L.J.N.a.F.R.L. Stability of food allergens to digestion in vitro. Nature Biotechnology 14, 1269-73 (1996).
4.  Marshall R.D . Glycoproteins. Annual Reviw of Biochemistry 41, 673-702 (1972).
5.  Merget R, S.J.W.R.F.H.K.U.e.al. Diagnostic tests in enzyme allergy. Journal of Allergy & Clinical Immunology 92, 264-277 (1993).
6.  Huby R.D.J, D.R.J.K.I. Why are some proteins allergens? Toxicological sciences 55, 235-246 (2000).
7.  Lepoittevin J-P, B.D.G.A.K.A.-T. Allergic Contact Dermatitis. The Molecular Basis . Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York (1998).
8.  Sinigaglia F. The Molecular Basis of Metal Recognition by T Cells. Journal of Investigative Dermatology 102, 398-401 (1994).
9.  S.G.O. Johansson, J.O.B.H.J.B.B.W.e.al. A revised nomenclature for allergy 
An EAACI position statement from the EAACI nomenclature task force. Allergy 56, 813-824 (2001).
10.  Goldsby R.A, K.T.J.O.B.A.K.J. Immunology. W.H. Freeman and Company, (2003).
11.  Holliday MR, C.E.S.S.B.D.D.R.K.I. Differential induction of cutaneous TNF-alpha and IL-6 by topically applied chemicals.  American Journal of Contact Dermatitis 8, 158-164 (1997).
12.  Smith H.R, B.D.A.a.M.J.P. Irritant dermatitis, irritancy and its role in allergic contact derma. Clinical and Experimental Dermatology 27, 138-146 (2001).
13.  U.S. Department of Health and Human Services , Food and Drug Administration, and Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Guidance for Industry
Immunotoxicology Evaluation of Investigational New Drugs.  2002.
14.  Dean JH, T.L.E.T.R.R.S.D.M.H.D.G.a.S.W.S. ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay. II. Conclusions and recommendations of an indetendent scientific peer review panel.  Regulatory Toxicology and Pharmacology 34, 258-273 (2001).
15.  Dearman R.J, B.D.A.a.K.I. Characterization of Chemical Allergens as a Function of Divergent Cytokine Secretion Profiles Induced in Mice. Toxicology and applied pharmacology  138, 308-316 (1996).
16.  Dearman RJ, W.E.S.R.K.I. Cytokine fingerprinting of chemical allergens: species comparisons and statistical analyses. Food & Chemical Toxicology 40, 1881-92 (2002).
17.  Botham P.A. The validation of in vitro methods for skin irritation. Toxicology LEtters  149, 387-90 (2004).
18.  NOTOX  Safety and Environmental Research. Acceptance of in vitro data.  2005.
19.  Benezra C, S.C.C.P.L.R.H.T.M.H.I. A Systematic Search for Structure-Activity Relationships of Skin Contact Sensitizers. The Journal of Investigative Dermatology  85, 351-356 (1985).
20.  Ziegler-Heitbrock HW, T.E.F.A.H.V.W.A.R.G. Establishment of a human cell line (Mono Mac &) with characteristics of mature monocytes. Int J Cancer 41 (3), 456-61 (1988).
21.  Ziegler-Heitbrock H.W et. al.  Establishment of a human cell line (Mono Mac 6) with characteristic of mature monocytes. International Journal of cancer 41, 456-461 (1988).
22.  Lakemedelsindustriforeningen, LIF.  2005.
23.  Chin K-C and Cresswell P. Viperin (cig5), an IFN-inducible antiviral protein directly induced by human cytomegalovirus. PNAS  98, 15125-130 (2001).
24.  de Veer M.J, S.H.e.al. IFI60/ISG60/IFIT4, a new member of the human IFI54/IFIT2 family of interferon-stimulated genes. Genomics  54, 267-277 (1998).
25.  Deblandre G.A, M.O.P.et.al. Expression cloning of an interferon-inducible 17-kDa membrane protein implicated in the control of cell growth. The Journal of Biological Chemistry 270, 23860-66 (1995).
26.  Haller O and Kochs G. Interferon-induced Mx proteins: Dynamin-like GTPases with antiviral activity. Traffic 3, 710-717 (2002).
27.  Tissot C and Mechti N. Molecular cloning of an new interferon-induced factor that represses human immunodeficiency virus type 1 long terminal repeat expression. The Journal of Biological Chemistry 270, 14891-898 (1995).
28.  Henkel G and Krebs B. Metallothioneins: Zinc, Cadmium, Mercury, and Copper Thiolates and Selenolates Mimicking Protein Acrive Site Features - Structural Aspects and Biological Implications. Chem. Rev. 104, 801-824 (2004).
29.  Richards R, H.A.a.K.M. Structural and functional analysis of the human metallothionein-IA gene: Differential induction by metal ions and glucocortioids. Cell 37, 263-272 (1984).
30.  Lewis C.E, M.J.O.D. The Macrophage. Oxford University Press, Oxford University, United States (1992).
31.  Bayard PJ, B.T.J.M. Drug hypersensitivity reactions and human immunodeficiency virus desease. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes 5, 1237-57 (1992).
32.  Pirmohamed M, D.J.et.al. The danger hypothesis - potential role in idiosyncratic drug reactions. Toxicology  181-182, 55-63 (2002).
33.  Facchetti F, V.W.M.D.C.M. The plasmacytoid monocyte/interferon producing cells. Virchows Arch 443, 703-717 (2003).
34.  Maret W and Vallee B.L. ´Thiolate ligands in metallothioneins confer redox activity on zinc clusters. Preceedings in the National Academy of Sciences of the United States of America  95, 3478-82 (1998).
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】図 1は、エンドサイトーシスプロセッシング経路である。
【図２】図 2は、I型過敏症である。
【図３】図 3は、II型過敏症である。
【図４】図 4は、III型過敏症である。
【図５】図 5は、IV型過敏症である。
【図６】図 6は、cGTP シクロヒドロラーゼの指数関数的発現を獲得するのに必要な細胞周期数である。
【図７】図 7は、IL-8の指数関数的発現を獲得するのに必要な細胞周期数である。
【図１】
2009508484.tif 000054
【図２】
2009508484.tif 000055
【図３】
2009508484.tif 000056
【図４】
2009508484.tif 000057
【図５】
2009508484.tif 000058
【図６】
2009508484.tif 000059
【図７】
2009508484.tif 000060
【国際調査報告】
2009508484.tif 000061
2009508484.tif 000062
2009508484.tif 000063
2009508484.tif 000064
2009508484.tif 000065
2009508484.tif 000066
2009508484.tif 000067