(57)【要約】  本発明は、乾燥オリゴヌクレオチド組成物及びその製造方法に関し、より詳しくはオリゴヌクレオチドの製造及び流通の過程で離脱損失を防止するため、オリゴヌクレオチド溶液入りの保管容器に対し粘着性を有する離脱損失防止物質を添加し、選択的には非反応性染料物質をさらに添加して乾燥工程を行なうことにより製造される乾燥オリゴヌクレオチド組成物及びその製造方法に関するものである。本発明の乾燥オリゴヌクレオチド組成物は、製造過程中または製品包装後運送中にオリゴヌクレオチドが離脱損失されることを防止することができるだけでなく、オリゴヌクレオチドが保管容器内に存在するか否かを肉眼で容易に確認することができるので、実験時にオリゴヌクレオチドの離脱により発生し得る人力及び時間の無駄遣いを解消することができる。
2009526544.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質、水溶性高分子、非イオン系界面活性剤、オリゴ糖及び多価アルコールで構成された群から選択される1つ以上の離脱損失防止物質とオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする乾燥オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項２】
前記タンパク質はゼラチン、アルブミン及びアセチル化アルブミンで構成された群から選択される1つ以上であることを特徴とする請求項1に記載の乾燥オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項３】
前記タンパク質は、オリゴヌクレオチド100重量部に対し0.01乃至5重量部の含量で含まれることを特徴とする請求項1または2に記載の乾燥オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項４】
前記アルブミンは、オリゴヌクレオチド100重量部に対し0.01乃至0.5重量部の含量で含まれることを特徴とする請求項2に記載の乾燥オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項５】
前記水溶性高分子はポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルスルホン酸、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレン、ポリビニルアセテート、ポリビニルシアノエチルエーテル、ヒドロキシエチルセルロース、セルローススルフェート、アミロペクチン、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル及びポリエチレングリコールターオクチルフェニルエーテルで構成された群から選択される1つ以上であることを特徴とする請求項1に記載の乾燥オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項６】
前記水溶性高分子は、オリゴヌクレオチド100重量部に対し0.01乃至5重量部の含量で含まれることを特徴とする請求項1または5に記載の乾燥オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項７】
前記ポリエチレングリコールは、オリゴヌクレオチド100重量部に対し0.01乃至0.1重量部の含量で含まれることを特徴とする請求項5に記載の乾燥オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項８】
前記非イオン系界面活性剤はエチレングリコールモノラウレート、プロピレングリコールモノラウレート、トリグリセロールモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、メチルグルコシド、オクチルグルコシド、メチルグルコシドモノラウレート及びソルビトールモノラウレートで構成された群から選択される1つ以上であることを特徴とする請求項1に記載の乾燥オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項９】
前記非イオン系界面活性剤は、オリゴヌクレオチド100重量部に対し0.01乃至5重量部の含量で含まれることを特徴とする請求項1または8に記載の乾燥オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項１０】
前記ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートは、オリゴヌクレオチド100重量部に対し0.01乃至0.1重量部の含量で含まれることを特徴とする請求項8に記載の乾燥オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項１１】
前記オリゴ糖はフラクトオリゴ糖、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖及び大豆オリゴ糖で構成された群から選択される1つ以上であることを特徴とする請求項1に記載の乾燥オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項１２】
前記オリゴ糖は、オリゴヌクレオチド100重量部に対し0.01乃至5重量部の含量で含まれることを特徴とする請求項1または11に記載の乾燥オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項１３】
前記イソマルトオリゴ糖は、オリゴヌクレオチド100重量部に対し0.01乃至0.5重量部の含量で含まれることを特徴とする請求項11に記載の乾燥オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項１４】
前記多価アルコールはエチレングリコール、グリセリン、トレイトール、アラビトール、グルコース、マンニトール、ガラクチトール及びソルビトールで構成された群から選択される1つ以上であることを特徴とする請求項1に記載の乾燥オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項１５】
前記多価アルコールは、オリゴヌクレオチド100重量部に対し0.01乃至5重量部の含量で含まれることを特徴とする請求項1または14に記載の乾燥オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項１６】
前記グリセリンは、オリゴヌクレオチド100重量部に対し0.01乃至0.1重量部の含量で含まれることを特徴とする請求項14に記載の乾燥オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドはDNAオリゴヌクレオチド、RNAオリゴヌクレオチド、SiRNAオリゴヌクレオチド及びこれらの組合せであることを特徴とする請求項1に記載の乾燥オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項１８】
ブロモフェノールブルー、キシレンシアノール、ブロモクレゾールレッド及びクレゾールレッドで構成された群から選択される1つ以上の非反応性染料物質をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の乾燥オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項１９】
前記非反応性染料物質は、オリゴヌクレオチドに対し1ppm乃至10,000ppmの含量で含まれることを特徴とする請求項18に記載の乾燥オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項２０】
1) オリゴヌクレオチド及びタンパク質、水溶性高分子、非イオン系界面活性剤、オリゴ糖及び多価アルコールで構成された群から選択される1つ以上の離脱損失防止物質を含むオリゴヌクレオチド溶液を用意するステップ; 及び
2) 前記結果物溶液を乾燥させるステップを含むことを特徴とする請求項1に記載の乾燥オリゴヌクレオチド組成物の製造方法。
【請求項２１】
前記1) 段階は
i) オリゴヌクレオチド溶液を用意するステップ;
ii) 前記オリゴヌクレオチド溶液に離脱損失防止物質を添加するステップ; 及び
iii) これら所定量を合成樹脂容器に分株することにより行なわれることを特徴とする請求項20に記載の製造方法。
【請求項２２】
前記1) 段階は
i) オリゴヌクレオチド溶液を用意するステップ;
ii) 所定量のオリゴヌクレオチド溶液を合成樹脂容器に分株するステップ; 及び
iii) 前記合成樹脂容器に離脱損失防止物質を添加することにより行なわれることを特徴とする請求項20に記載の製造方法。
【請求項２３】
前記合成樹脂容器はプレート、チューブまたは瓶の形態であることを特徴とする請求項20から22の何れか1項に記載の製造方法。
【請求項２４】
前記離脱損失防止物質は、オリゴヌクレオチド100重量部に対し0.01乃至5重量部の含量で含まれることを特徴とする請求項20に記載の製造方法。
【請求項２５】
前記第1) ステップのオリゴヌクレオチド溶液に非反応性染料物質を有効量添加するステップをさらに含むことを特徴とする請求項20に記載の製造方法。
【請求項２６】
前記非反応性染料物質はブロモフェノールブルー、キシレンシアノール、ブロモクレゾールレッド及びクレゾールレッドで構成された群から選択される1つ以上であることを特徴とする請求項25に記載の製造方法。
【請求項２７】
前記非反応性染料物質は、オリゴヌクレオチドに対し1ppm乃至1,000ppmの含量で含まれることを特徴とする請求項25または26に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乾燥オリゴヌクレオチド組成物及びその製造方法に関し、より詳しくは乾燥及び/または運送過程でオリゴヌクレオチドの離脱損失を防止することができる乾燥オリゴヌクレオチド組成物及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近、人間ゲノムプロジェクトが完了して以来、人間遺伝子に対する研究が速やかに進められている。これに伴い、遺伝子機能の研究、遺伝子単一塩基多様性(SNP、Single Nucleotide Polymorphism)の研究、遺伝子チップの研究、遺伝子新薬の研究などに必須に用いられるオリゴヌクレオチドの使用量も大きく増加している傾向である。
【０００３】
オリゴヌクレオチドは、1967年度に化学的合成法が最初に発表されて以来(Khorana,Proceedings of the Seventh International Congress of Biochemistry, Tokyo, 1967, p17)その合成方法が一層改良されてきた。オリゴヌクレオチドの商業的生産の工程は合成、回収、精製、定量、乾燥及び包装の工程からなっているが、最初のオリゴヌクレオチド合成の工程は、固体シリカ支持体を利用して遺伝子を構成する基礎塩基物質のアデノシン(adenosine)、グアノシン(guanosine)、シチジン(cytidine)、チミジン(thymidine)を順次加えながら合成することになる。1つの塩基を順次加える度にデブロッキング(de-blocking)反応、カップリング(coupling)反応、キャッピング(capping)反応及び酸化反応の4段階を経てオリゴヌクレオチドを合成することになる。第二の工程は、合成されたオリゴヌクレオチドを固体支持体(solid support)から取り出す回収反応の工程であるが、このとき90℃で2時間以上アンモニア水と反応させてオリゴヌクレオチドを回収することになる。第三の工程は、合成されたオリゴヌクレオチドを、逆相シリカ樹脂を用いクロマトグラフィ原理を利用して精製することになる。精製工程によりオリゴヌクレオチド以外の不純物等が除去される。次に、定量工程は精製されたオリゴヌクレオチドをUV装備(UV spectrophotometer)を用いて吸光度を測定し、これから合成されたオリゴヌクレオチドのモル数を計算して得る。以後、合成された全体のオリゴヌクレオチドから一定量のモル数に伴う分量をチューブまたはプレート等の保管容器に分株する。分株されたオリゴヌクレオチドは乾燥器を用いて乾燥する工程を経た後、乾燥したオリゴヌクレオチドは包装工程でラベルを貼り包装ボックスに入れて出庫することになり、運送過程を経て使用者に伝えられる。
【０００４】
オリゴヌクレオチドは、例えばPCRに用いられるが、PCRはゲノム上に増幅させようとする部分の両末端の塩基配列をテンプレート(template)にし、化学合成された2種のオリゴヌクレオチド(通常、プライマーという)とDNA重合酵素を用いて所望のDNA配列を増幅させる反応である。このようなPCRには通常、非常に微量のオリゴヌクレオチドだけが用いられるので、微量の単位でオリゴヌクレオチドを包装した後製品で販売されている。したがって、販売されるオリゴヌクレオチドは容器内に少量(ng乃至μg)を入れるためその量が極微量であり、性状も無色透明であるため製造及び販売する過程で肉眼ではその存在有無を確認するのが困難である。
【０００５】
製造過程で微量のオリゴヌクレオチドを保管容器に分株した後乾燥させて製造されたオリゴヌクレオチド製品を流通する場合、微量のオリゴヌクレオチドを乾燥する過程や、またはこのように乾燥したオリゴヌクレオチド製品を運送する過程でオリゴヌクレオチドが容器外または容器の蓋に離脱損失される場合が発生することになっても、その有無を確認する途がない。もし、オリゴヌクレオチドが製品の乾燥、貯蔵または運送の過程中に損失された場合は、実際PCRを行なう時にプライマーとして機能するオリゴヌクレオチドの量が容器内で足りなくなるが、使用者はこのような容器にオリゴヌクレオチドが定量で存在するものと間違えてPCRを行なうことになるので、このような場合は実質的にPCR反応が発生しないか強度が弱くなり、正しい実験結果が出なくなる。これは結果的に時間、費用、人力の無駄遣いをもたらすことになる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記のような従来のオリゴヌクレオチドの乾燥、保管または運送上の問題点を解決するため案出されたものであって、オリゴヌクレオチドの乾燥、保管または運送過程で前記オリゴヌクレオチドが離脱し損失されることを防止するための乾燥オリゴヌクレオチド組成物及びその製造方法を提供することに目的がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記の目的を達成するため、本発明はオリゴヌクレオチド溶液入りの保管容器に対し粘着性を有する離脱損失防止物質と前記オリゴヌクレオチドを含む乾燥オリゴヌクレオチド組成物を提供する。
【０００８】
さらに、本発明はオリゴヌクレオチド溶液に1つ以上の離脱損失防止物質を添加した後乾燥させることにより製造される、前記乾燥オリゴヌクレオチド組成物の製造方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１０】
本発明は、オリゴヌクレオチド溶液入りの保管容器に対し粘着性を有する離脱損失防止物質と前記オリゴヌクレオチドを含む乾燥オリゴヌクレオチド組成物を提供する。
【００１１】
本発明において「オリゴヌクレオチド」とは、1乃至数百の塩基対の長さを有する比較的短い長さの核酸を意味するものであり、DNAオリゴヌクレオチド、RNAオリゴヌクレオチド、siRNAオリゴヌクレオチドなどを含む。さらに、「保管容器」は、前記オリゴヌクレオチドの製造後、市販のためこれが盛られている容器を意味するもので、ポリプロピレンなどの合成樹脂容器であるのが好ましいが、必ずこれに限定されるものではない。
【００１２】
先ず、オリゴヌクレオチド製品の製造時に化学合成されたオリゴヌクレオチド溶液を乾燥する過程で離脱損失される場合を具体的に検討してみれば、次の通りである。オリゴヌクレオチドを化学的に合成した後、適正量をナノモル程度の単位で保管容器、好ましくはポリプロピレン保管容器、例えば2Mlのポリプロピレンチューブまたは96-ウェルポリプロピレンプレートに液体の状態で溶解されているオリゴヌクレオチド溶液を10μl乃至1,000μlの量で分株した後、製造工程の最終の段階であるオリゴヌクレオチド溶液の乾燥工程を経ることになる。乾燥工程では、オリゴヌクレオチド入りの保管容器、好ましくはポリプロピレン保管容器を乾燥器、好ましくは真空乾燥器に取り付けて乾燥させることになるが、真空乾燥器で3時間以上真空乾燥すれば、水分を含むバッファ溶液が除去されることになる。乾燥器内でバッファ溶液が蒸発することになれば乾燥した状態のオリゴヌクレオチドが残留することになるが、この場合乾燥過程中にオリゴヌクレオチドが乾燥器内でポリプロピレン保管容器の外に飛び出てしまう場合が頻繁に発生することになる。オリゴヌクレオチドは無色透明でナノモル単位の少量であるため、その存在を肉眼で確認するのが実質的に不可能であるので、もし乾燥過程で損失された場合これを確認することができる方法が皆無であり、オリゴヌクレオチド製品の存在有無が確認されていない状態で市中に販売されることになる。
【００１３】
さらに、オリゴヌクレオチドは乾燥工程後保管または運送過程でも離脱損失される場合があるが、乾燥したオリゴヌクレオチドを保管容器に入れて製品が出荷された後、運送中に乾燥したオリゴヌクレオチドがポリプロピレン保管容器の底に固定され付着していず、離脱して保管容器の上部蓋に付着してしまうことになる場合がある。この場合、使用者はチューブやプレートの内部にオリゴヌクレオチドがあるものと信じて、バッファ溶液を入れオリゴヌクレオチドを溶解してPCRなどの実験に用いることになり、結局プライマーなくPCRなどの実験を行なうことになるので、所望の実験結果を得ることができない場合が発生することになる。
【００１４】
したがって、本発明者たちは乾燥、保管または運送過程でオリゴヌクレオチドが離脱損失される問題を解決するため研究を重ねた結果、乾燥工程以前に離脱損失防止物質をオリゴヌクレオチド溶液に一定量を添加した後乾燥工程を行なうことにより、オリゴヌクレオチドの乾燥過程中にオリゴヌクレオチドが離脱損失されるのを効果的に防止することができるとのことを発見した。
【００１５】
本発明において、「離脱損失防止物質」とは保管容器、好ましくは合成樹脂容器、より好ましくはポリプロピレン保管容器に粘着性がありながらオリゴヌクレオチドには化学的に反応性がなく、PCR反応にも影響を及ぼさないものでなければならない。本発明者たちはこのような条件を満足させる物質を探すために努力した結果、タンパク質、水溶性高分子、非イオン系界面活性剤、オリゴ糖または多価アルコールを単独にまたは組み合わせて使用するとき前記条件を満足させるとのことを見付けて本発明を完成した。この中でも多価アルコールを用いるのが好ましい。前記離脱損失防止物質は、オリゴヌクレオチド100重量部に対し0.01乃至5重量部の含量で含まれてもよく、0.01乃至0.5重量部の含量で含まれるのが好ましい。もし、5重量部を超過することになればオリゴヌクレオチドの物性に影響を及ぼすとの問題点があり、0.01重量部未満であれば離脱損失防止剤としての機能を果たすことができないとの問題点がある。
【００１６】
前記タンパク質はゼラチン、アルブミン(albumin)またはアセチル化アルブミンを単独に、または組み合わせて用いるのが好ましいが、必ずこれに限定されるものではない。前記タンパク質は、オリゴヌクレオチド100重量部に対し0.01乃至5重量部の含量で含まれてもよく、0.01乃至0.5重量部の含量で含まれるのが好ましい。もし、5重量部を超過することになればオリゴヌクレオチドの物性に影響を及ぼすとの問題点があり、0.01重量部未満であれば離脱損失防止剤としての機能を果たすことができないとの問題点がある。
【００１７】
さらに、前記水溶性高分子はポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール(polyvinyl alcohol)、ポリアクリル酸(polyacrylic acid)、ポリメタクリル酸(polymethacrylic acid)、ポリアクリルアミド(polyacrylamide)、ポリビニルスルホン酸(polyvinyl sulfonic acid)、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド(polydiallydimethyl ammonium chloride)、ポリビニルピロリドン(polyvinyl pyrrolidone)、ポリオキシエチレン(polyoxyethylene)、ポリビニルアセテート(polyvinyl acetate)、ポリビニルシアノエチルエーテル(polyvinylcyanoethyl ether)、ヒドロキシエチルセルロース(hydroxyethyl cellulose)、セルローススルフェート(cellulose sulfate)、アミロペクチン(amylopectin)、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル(polyethylene glycol monomethyl ether)またはポリエチレングリコールターオクチルフェニルエーテル(polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)を単独にまたは組み合わせて用いるのが好ましいが、必ずこれに限定されるものではない。前記水溶性高分子は、オリゴヌクレオチド100重量部に対し0.01乃至5重量部の含量で含まれてもよく、0.01乃至0.1重量部の含量で含まれるのが好ましい。もし、5重量部を超過することになればオリゴヌクレオチドの物性に影響を及ぼすとの問題点があり、0.01重量部未満であれば離脱損失防止剤としての機能を果たすことができないとの問題点がある。
【００１８】
前記非イオン系界面活性剤はエチレングリコールモノラウレート(ethylene glycol monolaurate)、プロピレングリコールモノラウレート(propylene glycol monolaurate)、トリグリセロールモノステアレート(triglycerol monostearate)、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート(polyoxyethylene sorbitan monopalmitate)、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート(polyoxyethylene sorbitan monostearate)、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(polyoxyethylene sorbitan monooleate)、メチルグルコシド(methyl glucoside)、オクチルグルコシド(octyl glucoside)、メチルグルコシドモノラウレート(methyl glucoside monolaurate)またはソルビトールモノラウレート(sorbitol monolaurate)を単独にまたは組み合わせて用いるのが好ましいが、必ずこれに限定されるものではない。前記非イオン系界面活性剤は、オリゴヌクレオチド100重量部に対し0.01乃至5重量部の含量で含まれてもよく、0.01乃至0.1重量部の含量で含まれるのが好ましい。もし、5重量部を超過することになればオリゴヌクレオチドの物性に影響を及ぼすとの問題点があり、0.01重量部未満であれば離脱損失防止剤としての機能を果たすことができないとの問題点がある。
【００１９】
前記オリゴ糖はフラクトオリゴ糖(fructo oligosaccharide)、マルトオリゴ糖(malto oligosaccharide)、イソマルトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖(galacto oligosaccharide)または大豆オリゴ糖(soybean oligosaccharide)を単独にまたは組み合わせて用いるのが好ましいが、必ずこれに限定されるものではない。前記オリゴ糖は、オリゴヌクレオチド100重量部に対し0.01乃至5重量部の含量で含まれてもよく、0.01乃至0.5重量部の含量で含まれるのが好ましい。もし、5重量部を超過することになればオリゴヌクレオチドの物性に影響を及ぼすとの問題点があり、0.01重量部未満であれば離脱損失防止剤としての機能を果たすことができないとの問題点がある。
【００２０】
前記多価アルコールはエチレングリコール、グリセリン、トレイトール(threitol)、アラビトール(arabitol)、グルコース(glucose)、マンニトール(mannitol)、ガラクチトール(galactitol)、ソルビトール(sorbitol)を単独にまたは組み合わせて用いるのが好ましいが、必ずこれに限定されるものではない。前記多価アルコールは、オリゴヌクレオチド100重量部に対し0.01乃至5重量部の含量で含まれてもよく、0.01乃至0.1重量部の含量で含まれるのが好ましい。もし、5重量部を超過することになればオリゴヌクレオチドの物性に影響を及ぼすとの問題点があり、0.01重量部未満であれば離脱損失防止剤としての機能を果たすことができないとの問題点がある。
【００２１】
一方、本発明は乾燥オリゴヌクレオチドに色を与えるため、オリゴヌクレオチドに対し反応性のない染料物質をさらに添加することもできる。
【００２２】
前記で説明したように、オリゴヌクレオチドは無色透明なので、ポリプロピレン保管容器内に存在するか否かを肉眼で確認することができない。したがって、本発明ではこのような乾燥オリゴヌクレオチドがポリプロピレン容器に存在するか否かを肉眼で容易に確認することができるようにするため、前記オリゴヌクレオチド及び離脱損失防止物質に対し非反応性の染料物質を乾燥工程以前にオリゴヌクレオチド溶液に一定量をさらに添加して乾燥することにより、オリゴヌクレオチドがポリプロピレン保管容器にあるか否かを容易に識別することができる。
【００２３】
前記で、「非反応性染料物質」はオリゴヌクレオチド及び離脱損失防止物質と化学的反応性がなくPCR反応にも影響を及ぼさない物質から選択されなければならず、このような条件を満足させる物質にはブロモフェノールブルー(bromophenol blue)、キシレンシアノール(xylene cyanole)、ブロモクレゾールレッド(bromocresol red)、クレゾールレッド(cresol red)などの水溶性染料を挙げることができ、この中でもキシレンシアノールを用いるのが好ましい。前記非反応性染料物質は、オリゴヌクレオチドに対し1ppm乃至10,000ppmの含量で含まれてもよく、1ppm乃至1,000ppmの含量で含まれるのが好ましい。もし、非反応性染料物質が10,000ppmを超過することになればオリゴヌクレオチドの物性に影響を及ぼすとの問題点があり、1ppm未満であれば保管容器に存在するのかの識別ができないとの問題点がある。
【００２４】
さらに、本発明は
1) オリゴヌクレオチドにタンパク質、水溶性高分子、非イオン系界面活性剤、オリゴ糖及び多価アルコールで構成された群から選択される1つ以上の離脱損失防止物質を含むオリゴヌクレオチド溶液を用意するステップ; 及び
2) 前記結果物溶液を乾燥させるステップを含むことを特徴とする前記乾燥オリゴヌクレオチド組成物の製造方法を提供する。
【００２５】
前記で、離脱損失防止物質は前記したように、タンパク質、水溶性高分子、非イオン系界面活性剤、オリゴ糖及び多価アルコールで構成された群から選択される1つ以上の物質が単独にまたは組み合わせて用いられ得る。この中でも多価アルコールを用いるのが好ましい。
【００２６】
本発明において、乾燥オリゴヌクレオチド組成物は前記1)ステップ後または前記 2)ステップ後に保管容器に分株され得る。即ち、1)ステップ後に保管容器に分株する場合は、前記オリゴヌクレオチド溶液を合成樹脂容器、好ましくはポリプロピレン容器に所定量に分株したあと各容器に離脱損失防止物質を添加し、続いて各容器を乾燥させるステップを経る。さらに、2)ステップ後に保管容器に分株する場合は、オリゴヌクレオチド溶液に1つ以上の離脱損失防止物質を添加した混合溶液を先ず製造したあと、これを合成樹脂容器に分株してから乾燥させるステップを経る。前記で、合成樹脂容器はプレート、チューブまたは瓶のような多様な形態であってもよく、特別な形態に限定されるのではない。
【００２７】
さらに、本発明に係る乾燥オリゴヌクレオチド組成物は前記オリゴヌクレオチド溶液に非反応性染料物質を有効量添加したあと乾燥させて製造することもできる。前記で、非反応性染料物質はブロモフェノールブルー、キシレンシアノール、ブロモクレゾールレッド、クレゾールレッドなどの水溶性染料が用いられ得るが、この中でもキシレンシアノールを用いるのが好ましい。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例に基づき詳しく説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するためのものであるだけで、本発明の内容が下記の実施例により限定されるものではない。
【００２９】
離脱損失防止物質が乾燥DNAオリゴヌクレオチドに及ぼす影響
多価アルコールが及ぼす影響
＜実施例1＞グリセリン
配列番号1に記載される塩基配列を有する正方向(forward)オリゴヌクレオチドプライマー(5'-AAT ATG AGC CAG CGG GGA TT-3')、及び配列番号2に記載される塩基配列を有する逆方向(reverse)オリゴヌクレオチドプライマー(5'-CAT CCA GAA AAC GGG CGT AA-3')を化学的に合成したあと、UV-分光計(spectrophotometer)を使ってOD(Optical Density)値が2になるようそれぞれ5個ずつ2セット合計10個を定量したあと、ポリプロピレン保管容器に200μlずつ分株した。ここに離脱損失防止物質としてグリセリン0.25%(v/v)の希釈液10μlを添加し、真空遠心分離機に取り付けたあとハロゲンランプを使用して加熱し、1トル以下の真空状態で4時間以上乾燥工程を行なって乾燥オリゴヌクレオチドを製造した。オリゴヌクレオチドの存在有無を確認するため、前記乾燥オリゴヌクレオチド10個を再度200μlの超純水を用いて溶解し、UV-分光計を使って定量した結果、乾燥工程を経た後にもオリゴヌクレオチドの損失なく、大凡2のOD値を示していることを確認した(表1)。
【００３０】
【表１】
2009526544.tif 000003
【００３１】
＜実施例2＞〜＜実施例5＞グリセリン以外の多価アルコール
グリセリン以外の他の多価アルコールであるエチレングリコール0.25%(v/v)の希釈液10μl、グルコース0.1%(w/v)の希釈液10μl、ソルビトール0.1%(w/v)の希釈液10μl、マンニトール0.1%(w/v)の希釈液10μlを用いて前記実施例1と同じ方法で実験を行なった結果、グリセリンを用いた場合と同様に乾燥工程を経た後にもオリゴヌクレオチドの損失なく、大凡2のOD値を示していることを確認した(表2乃至表5)。
【００３２】
【表２】
2009526544.tif 000004
【００３３】
【表３】
2009526544.tif 000005
【００３４】
【表４】
2009526544.tif 000006
【００３５】
【表５】
2009526544.tif 000007
【００３６】
オリゴ糖が及ぼす影響
＜実施例6＞イソマルトオリゴ糖
離脱損失防止物質としてイソマルトオリゴ糖0.25%(v/v)の希釈液10μlを用いたことを除いては、前記実施例1と同じ方法で実験を行なった結果、乾燥工程を経た後にもオリゴヌクレオチドの損失なく、大凡2のOD値を示していることを確認した(表6)。
【００３７】
【表６】
2009526544.tif 000008
【００３８】
＜実施例7＞イソマルトオリゴ糖以外のオリゴ糖
イソマルトオリゴ糖以外の他のオリゴ糖であるマルトオリゴ糖0.05%(w/v)の希釈液10μlを用いて前記と同じ方法で実験を行なった結果、イソマルトオリゴ糖を用いた場合と同様に乾燥工程を経た後にもオリゴヌクレオチドの損失なく、大凡2のOD値を示していることを確認した(表7)。
【００３９】
【表７】
2009526544.tif 000009
【００４０】
非イオン系界面活性剤が及ぼす影響
＜実施例8＞ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート
離脱損失防止物質としてポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート0.25%(v/v)の希釈液10μlを用いたことを除いては、前記実施例1と同じ方法で実験を行なった結果、乾燥工程を経た後にもオリゴヌクレオチドの損失なく、大凡2のOD値を示していることを確認した(表8)。
【００４１】
【表８】
2009526544.tif 000010
【００４２】
＜実施例9〜11＞ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート以外の非イオン系界面活性剤
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート以外の他の非イオン系界面活性剤であるソルビタンモノラウレート0.25%(v/v)の希釈液10μl、メチルグルコシド0.1%(w/v)の希釈液10μl、オクチルグルコシド0.1%(w/v)の希釈液10μlを用いて前記と同じ方法で実験を行なった結果、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを用いた場合と同様に乾燥工程を経た後にもオリゴヌクレオチドの損失なく、大凡2のOD値を示していることを確認した(表9乃至表11)。
【００４３】
【表９】
2009526544.tif 000011
【００４４】
【表１０】
2009526544.tif 000012
【００４５】
【表１１】
2009526544.tif 000013
【００４６】
水溶性高分子が及ぼす影響
＜実施例12＞ポリエチレングリコール
離脱損失防止物質としてポリエチレングリコール(MW: 8,000) 0.1%(w/v)の希釈液10μlを用いたことを除いては、前記実施例1と同じ方法で実験を行なった結果、乾燥工程を経た後にもオリゴヌクレオチドの損失なく、大凡2のOD値を示していることを確認した(表12)。
【００４７】
【表１２】
2009526544.tif 000014
【００４８】
＜実施例13〜15＞ポリエチレングリコール以外の水溶性高分子
ポリエチレングリコール以外の他の水溶性高分子であるポリビニルアルコール0.01%(w/v)の希釈液10μl、ポリアクリル酸0.25%(v/v)の希釈液10μl、ポリメタクリル酸0.25%(v/v)の希釈液10μlを用いて前記と同じ方法で実験を行なった結果、ポリエチレングリコールを用いた場合と同様に乾燥工程を経た後にもオリゴヌクレオチドの損失なく、大凡2のOD値を示していることを確認した(表13乃至表15)。
【００４９】
【表１３】
2009526544.tif 000015
【００５０】
【表１４】
2009526544.tif 000016
【００５１】
【表１５】
2009526544.tif 000017
【００５２】
タンパク質が及ぼす影響
＜実施例16＞ウシ血清アルブミン
離脱損失防止物質としてウシ血清アルブミン(BSA)0.05%(w/v)の希釈液10μlを用いたことを除いては、前記実施例1と同じ方法で実験を行なった結果、乾燥工程を経た後にもオリゴヌクレオチドの損失なく、大凡2のOD値を示していることを確認した(表16)。
【００５３】
【表１６】
2009526544.tif 000018
【００５４】
＜実施例17＞ウシ血清アルブミン以外のタンパク質
ウシ血清アルブミン以外の他のタンパク質であるゼラチン0.01%(w/v)の希釈液10μlを用いて前記と同じ方法で実験を行なった結果、ウシ血清アルブミンを用いた場合と同様に乾燥工程を経た後にもオリゴヌクレオチドの損失なく、大凡2のOD値を示していることを確認した(表17)。
【００５５】
【表１７】
2009526544.tif 000019
【００５６】
比較例1
比較のため、離脱損失防止物質を含まないオリゴヌクレオチドをOD値が2になるよう10個の保管容器に200μlずつ分株したあと、乾燥器で4時間の乾燥過程を経て製品を製造した。このように製造された製品10個を再度200μlの超純水を用いて溶解し、UV-分光計を使用して定量した結果、オリゴヌクレオチドが部分的に損失したことを確認した(表18)。
【００５７】
【表１８】
2009526544.tif 000020
【００５８】
離脱損失防止物質が乾燥RNAオリゴヌクレオチドに及ぼす影響
＜実施例18＞多価アルコールが及ぼす影響
配列番号3に記載される塩基配列を有するセンス(sense)方向のsiRNAオリゴヌクレオチド(5'-CCA AGU AAC UCU CCU CAA AUA dTdT-3')、及び配列番号4に記載される塩基配列を有するアンチセンス(antisense)方向のsiRNAオリゴヌクレオチド(5'-UAU UUG AGG AGA GUU ACU UGG dTdT-3')を化学的に合成したことを除いては、前記実施例1と同じ方法でグリセリン0.25%(v/v)の希釈液10μlを添加して実験を行なった結果、乾燥工程を経た後にもsiRNAオリゴヌクレオチドの損失なく、大凡2のOD値を示していることを確認した(表19)。さらに、グリセリンの代わりに他の多価アルコールであるエチレングリコール、グルコース、ソルビトールまたはマンニトールを用いた場合もこれと近似の結果が現われた。
【００５９】
【表１９】
2009526544.tif 000021
【００６０】
＜実施例19＞オリゴ糖が及ぼす影響
離脱損失防止物質としてイソマルトオリゴ糖0.25%(v/v)の希釈液10μlを用いたことを除いては、前記実施例18と同じ方法で実験を行なった結果、乾燥工程を経た後にもsiRNAオリゴヌクレオチドの損失なく、大凡2のOD値を示していることを確認した(表20)。さらに、イソマルトオリゴ糖の代わりに他のオリゴ糖であるマルトオリゴ糖を用いた場合もこれと近似の結果が現われた。
【００６１】
【表２０】
2009526544.tif 000022
【００６２】
＜実施例20＞非イオン系界面活性剤が及ぼす影響
離脱損失防止物質としてポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート0.25%(v/v)の希釈液10μlを用いたことを除いては、前記実施例18と同じ方法で実験を行なった結果、乾燥工程を経た後にもsiRNAオリゴヌクレオチドの損失なく、大凡2のOD値を示していることを確認した(表21)。さらに、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの代わりに他の非イオン系界面活性剤であるソルビタンモノラウレート、メチルグルコシドまたはオクチルグルコシドを用いた場合もこれと近似の結果が現われた。
【００６３】
【表２１】
2009526544.tif 000023
【００６４】
＜実施例21＞水溶性高分子が及ぼす影響
離脱損失防止物質としてポリエチレングリコール(MW: 8,000) 0.1%(w/v)の希釈液10μlを用いたことを除いては、前記実施例18と同じ方法で実験を行なった結果、乾燥工程を経た後にもsiRNAオリゴヌクレオチドの損失なく、大凡2のOD値を示していることを確認した(表22)。さらに、ポリエチレングリコールの代わりに他の水溶性高分子であるポリビニルアルコール、ポリアクリル酸またはポリメタクリル酸を用いた場合もこれと近似の結果が現われた。
【００６５】
【表２２】
2009526544.tif 000024
【００６６】
＜実施例22＞タンパク質が及ぼす影響
離脱損失防止物質としてウシ血清アルブミン(BSA)0.05%(w/v)の希釈液10μlを用いたことを除いては、前記実施例18と同じ方法で実験を行なった結果、乾燥工程を経た後にもsiRNAオリゴヌクレオチドの損失なく、大凡2のOD値を示していることを確認した(表23)。さらに、ウシ血清アルブミンの代わりに他のタンパク質であるゼラチンを用いた場合もこれと近似の結果が現われた。
【００６７】
【表２３】
2009526544.tif 000025
【００６８】
離脱損失防止物質及び非反応性染料物質がPCRに及ぼす影響の測定
＜実施例23＞多価アルコールが及ぼす影響の測定
離脱損失防止物質がPCR過程に影響を及ぼすのか否かを確認するため、ラムダ(lambda)DNAをテンプレートにして1kbサイズの反応産物を得ることができる、配列番号1に記載される塩基配列を有する正方向オリゴヌクレオチドプライマー、及び配列番号2に記載される塩基配列を有する逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを化学的に合成してそれぞれ10pmolを混合し、これに離脱損失防止物質として0.25%(v/v)のグリセリン10μlを添加し、非反応性染料物質としてキシレンシアノール0.01%希釈液2μlを添加したあとこれを乾燥して乾燥オリゴヌクレオチド組成物を製造した。このとき、離脱損失防止物質及び非反応性染料物質を含まない場合を対照群として用いた。これに10mMトリス-HCl(pH 8.3)、40mM KCl、1.5mM MgCl2、1mM DTT、50mg/Ml BSA、それぞれ250μMである4種類のdNTP及び1ngラムダDNAテンプレート(ロシアSIB社から購入)とPCR用DNA重合酵素(Taq DNA polymerase) 1 unitを混合したあとPCRを行なった。このとき、構成成分の濃度及び量は反応液0.05Mlに含まれた各構成成分の最終濃度及び量を表わす。PCRは変性(94℃で1分)、結合(54℃で1分)及び伸張(72℃で1分)の各サイクルを30回進めさせてDNAを増幅した。
【００６９】
このように増幅されたPCR反応産物を3セットに分けて1%(w/v)のアガロースゲルでそれぞれ電気泳動した結果、離脱損失防止物質及び非反応性染料物質が添加されていない第1、2、3レーンと、0.25%(v/v)のグリセリン希釈液を添加した第4、5、6レーンが全て1kbサイズのDNAだけが正確に増幅された(図1)。したがって、離脱損失防止物質としてグリセリンと、非反応性染料物質のキシレンシアノールが添加された組成物の場合、PCRに全く影響を及ぼさないことを確認した。さらに、グリセリンの代わりに他の多価アルコールであるエチレングリコール、グルコース、ソルビトールまたはマンニトールと、非反応性染料物質であるキシレンシアノールが添加された場合も、前記グリセリンの場合と似てPCRに全く影響を及ぼさなかった。
【００７０】
＜実施例24＞非イオン系界面活性剤が及ぼす影響の測定
離脱損失防止物質としてグリセリンの代わりにポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを10μl添加したことを除いては、前記実施例23と同じ条件でPCRを行なった。このようにして製造されたPCR産物を電気泳動した結果、離脱損失防止物質及び非反応性染料物質が添加されていない第7、8、9レーンと、0.25%(v/v)のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート希釈液と非反応性染料物質のキシレンシアノールとを添加した第10、11、12レーンが全て1kbサイズのDNAだけが正確に増幅された(図1)。したがって、離脱損失防止物質としてポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートと非反応性染料物質のキシレンシアノールとが添加された組成物の場合、PCRに全く影響を及ぼさないことを確認した。さらに、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの代わりに他の非イオン系界面活性剤であるソルビタンモノラウレート、メチルグルコシドまたはオクチルグルコシドと、非反応性染料物質のキシレンシアノールとが添加された場合も、前記ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの場合と似てPCRに全く影響を及ぼさなかった。
【００７１】
＜実施例25＞オリゴ糖が及ぼす影響の測定
離脱損失防止物質としてグリセリンの代わりにイソマルトオリゴ糖を10μl添加したことを除いては、実施例23と同じ条件でPCRを行なった。このようにして製造されたPCR産物を電気泳動した結果、離脱損失防止物質及び非反応性染料物質が添加されていない第1、2、3レーンと、0.25%(v/v)のイソマルトオリゴ糖希釈液と非反応性染料物質のキシレンシアノールとを添加した第4、5、6レーンが全て1kbサイズのDNAだけが正確に増幅された(図2)。したがって、離脱損失防止物質としてイソマルトオリゴ糖と非反応性染料物質のキシレンシアノールとが添加された組成物の場合、PCRに全く影響を及ぼさないことを確認した。さらに、イソマルトオリゴ糖の代わりに他のオリゴ糖であるマルトオリゴ糖と、非反応性染料物質のキシレンシアノールとが添加された場合も、前記イソマルトオリゴ糖の場合と似てPCRに全く影響を及ぼさなかった。
【００７２】
＜実施例26＞水溶性高分子が及ぼす影響の測定
離脱損失防止物質としてグリセリンの代わりに0.1%(w/v)のポリエチレングリコールを10μl添加したことを除いては、前記実施例23と同じ条件でPCRを行なった。このようにして製造されたPCR産物を電気泳動した結果、離脱損失防止物質及び非反応性染料物質が添加されていない第7、8、9レーンと、0.1%(w/v)のポリエチレングリコール希釈液と非反応性染料物質のキシレンシアノールとを添加した第10、11、12レーンが全て1kbサイズのDNAだけが正確に増幅された(図2)。したがって、離脱損失防止物質としてポリエチレングリコールと非反応性染料物質のキシレンシアノールとが添加された組成物の場合、PCRに全く影響を及ぼさないことを確認した。さらに、ポリエチレングリコールの代わりに他の水溶性高分子であるポリビニルアルコール、ポリアクリル酸またはポリメタクリル酸と、非反応性染料物質のキシレンシアノールとが添加された場合も、前記ポリエチレングリコールの場合と似てPCRに全く影響を及ぼさなかった。
【００７３】
＜実施例27＞タンパク質が及ぼす影響の測定
離脱損失防止物質としてグリセリンの代わりに0.05%(w/v)のウシ血清アルブミン(BSA)を10μl添加したことを除いては、前記実施例23と同じ条件でPCRを行なった。このようにして製造されたPCR産物を電気泳動した結果、離脱損失防止物質及び非反応性染料物質が添加されていない第1、2、3レーンと、0.1%(w/v)のウシ血清アルブミン(BSA)希釈液と非反応性染料物質のキシレンシアノールとを添加した第4、5、6レーンが全て1kbサイズのDNAだけが正確に増幅された(図3)。したがって、離脱損失防止物質としてウシ血清アルブミン(BSA)と非反応性染料物質のキシレンシアノールとが添加された組成物の場合、PCRに全く影響を及ぼさないことを確認した。さらに、ウシ血清アルブミンの代わりに他のタンパク質であるゼラチンと、非反応性染料物質のキシレンシアノールとが添加された場合も、前記ウシ血清アルブミンの場合と似てPCRに全く影響を及ぼさなかった。
【００７４】
離脱損失防止物質の含量が及ぼす影響の測定
多価アルコールが及ぼす影響の測定
＜実施例28＞グリセリン
離脱損失防止物質であるグリセリンの添加量がPCRに及ぼす影響を調べるため、実施例1の組成物でプライマーにグリセリンを添加しない場合と、所定量を添加した場合及び過量を添加した場合に対する比較実験を行なった。具体的に、6つの実験容器を準備したあと、グリセリンを2つの容器には添加せず、2つの容器には0.25%(v/v)のグリセリン希釈液10μlを添加し、残りの2つの容器には1.0%(v/v)のグリセリン希釈液10μlをそれぞれ添加したあと、実施例23と同じ条件でPCR反応を行なった。このようにして製造されたPCR産物6セットを電気泳動した結果、グリセリンが過量に添加された場合(1.0%(v/v)のグリセリン希釈液10μlを添加)は、1kbサイズ以外の他のバンドが表われてDNA重合酵素連鎖反応に影響を及ぼすことが分かった(図4)。さらに、グリセリンの代わりに他の多価アルコールであるエチレングリコール、グルコース、ソルビトールまたはマンニトールを用いた場合もこれと近似の結果が現われた。
【００７５】
非イオン系界面活性剤が及ぼす影響の測定
＜実施例29＞ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート
離脱損失防止物質であるポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの添加量がPCRに及ぼす影響を調べるため、実施例1の組成物でプライマーにポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを所定量に添加した場合及び過量に添加した場合に対する比較実験を行なった。具体的に、6つの実験容器を準備したあと、グリセリンを3つの容器には0.25%(v/v)のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート希釈液10μlを添加し、残りの3つの容器には1.0%(v/v)のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート希釈液10μlをそれぞれ添加したあと、実施例23と同じ条件でPCR反応を行なった。このようにして製造されたPCR産物6セットを電気泳動した結果、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートが過量に添加された場合(1.0%(v/v)のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート希釈液10μlを添加)は、1kbサイズ以外の他のバンドが表われメインバンドのサイズも小さく表われてDNA重合酵素連鎖反応に影響を及ぼすことが分かった(図5)。さらに、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの代わりに他の非イオン系界面活性剤であるソルビタンモノラウレート、メチルグルコシドまたはオクチルグルコシドを用いた場合もこれと近似の結果が現われた。
【００７６】
水溶性高分子が及ぼす影響
＜実施例30＞ポリエチレングリコール
離脱損失防止物質としてポリエチレングリコールを用いたことを除いては、前記実施例28と同じ方法で実験を行なった結果、ポリエチレングリコールが過量に添加された場合(1.0%(w/v)のポリエチレングリコール希釈液10μlを添加)は、1kbサイズ以外の他のバンドがメインバンド上に表われてDNA重合酵素連鎖反応に影響を及ぼすことが分かった(図6)。さらに、ポリエチレングリコールの代わりに他の水溶性高分子であるポリビニルアルコール、ポリアクリル酸またはポリメタクリル酸を用いた場合もこれと近似の結果が現われた。
【００７７】
オリゴ糖が及ぼす影響
＜実施例31＞イソマルトオリゴ糖
離脱損失防止物質としてイソマルトオリゴ糖を用いたことを除いては、前記実施例28と同じ方法で実験を行なった結果、イソマルトオリゴ糖が過量に添加された場合(1.0%(v/v)のイソマルトオリゴ糖希釈液10μlを添加)は、1kbサイズ以外の他のバンドが表われてDNA重合酵素連鎖反応に影響を及ぼすことが分かった。さらに、イソマルトオリゴ糖の代わりに他のオリゴ糖であるマルトオリゴ糖を用いた場合もこれと近似の結果が現われた。
【００７８】
タンパク質が及ぼす影響
＜実施例32＞ウシ血清アルブミン
離脱損失防止物質としてウシ血清アルブミンを用いたことを除いては、前記実施例28と同じ方法で実験を行なった結果、ウシ血清アルブミンが過量に添加された場合(1.0%(w/v)のウシ血清アルブミン希釈液10μlを添加)は1kbサイズ以外の他のバンドが表われ、DNA重合酵素連鎖反応に影響を及ぼすことが分かった。さらに、ウシ血清アルブミンの代わりに他のタンパク質であるゼラチンを用いた場合もこれと近似の結果が現われた。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
前記で検討してみたように、本発明によればオリゴヌクレオチドの乾燥工程でオリゴヌクレオチドが離脱損失することを低減させることができ、もしオリゴヌクレオチドが離脱損失する場合もその可否を肉眼で容易に判別することができるので、製品生産時の不良率を画期的に改良することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図1は、オリゴヌクレオチドに離脱損失防止物質を添加しない場合と、グリセリンまたはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(polyoxyethylene sorbitan monolaurate)を添加した場合に対し、PCR(polymerase chain reaction)により増幅された反応産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。Mレーン; 1kbラダー(ladder)の標準分子量、第1、2、3レーン; 離脱損失防止物質が添加されていない対照群(control)組成物、第4、5、6レーン; 0.25%(v/v)のグリセリン希釈液を添加した組成物、第7、8、9レーン; 離脱損失防止物質が添加されていない対照群組成物、第10、11、12レーン; 0.25%(v/v)のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート希釈液を添加した組成物
【図２】図2は、オリゴヌクレオチドに離脱損失防止物質を添加しない場合と、イソマルトオリゴ糖(isomalto oligosaccharide)またはポリエチレングリコール(polyethylene glycol、PEG)を添加した場合に対し、PCRにより増幅された反応産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。Mレーン; 1kbラダーの標準分子量、第1、2、3レーン; 離脱損失防止物質が添加されていない対照群(control)組成物、第4、5、6レーン; 0.25%(v/v)のイソマルトオリゴ糖の希釈液を添加した組成物、第7、8、9レーン; 離脱損失防止物質が添加されていない対照群組成物、第10、11、12レーン; 0.1%(w/v)のポリエチレングリコール希釈液を添加した組成物
【図３】図3は、オリゴヌクレオチドに離脱損失防止物質のウシ血清アルブミン(BSA)に対し離脱損失防止物質を添加しない場合と添加した場合に対し、PCRにより増幅された反応産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。Mレーン; 1kbラダーの標準分子量、第1、2、3レーン; 離脱損失防止物質が添加されていない対照群組成物、第4、5、6レーン; 0.05%(w/v)のウシ血清アルブミン(BSA)希釈液を添加した組成物
【図４】図4は、オリゴヌクレオチドに離脱損失防止物質のグリセリンを添加しないか添加量を異ならせた場合に対し、PCRにより増幅された反応産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。Mレーン; 1kbラダーの標準分子量、第1、2レーン; 離脱損失防止物質が添加されていない対照群組成物、第3、4レーン; 1.0%(v/v)のグリセリン希釈液を添加した組成物、第5、6レーン; 0.25%(w/v)のグリセリン希釈液を添加した組成物
【図５】図5は、オリゴヌクレオチドに離脱損失防止物質のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(polyoxyethylene sorbitan monolaurate)に対し添加量を異ならせた場合に対し、PCRにより増幅された反応産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。Mレーン; 1kbラダーの標準分子量、第1、2、3レーン; 0.25%(v/v)のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(polyoxyethylene sorbitan monolaurate)希釈液を添加した組成物、  第4、5、6レーン; 1.0%(v/v)のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(polyoxyethylene sorbitan monolaurate)希釈液を添加した組成物
【図６】図6は、オリゴヌクレオチドに離脱損失防止物質のポリエチレングリコール(polyethylene glycol、PEG)に対し添加量を異ならせた場合に対し、PCRにより増幅された反応産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。Mレーン; 1kbラダーの標準分子量、第1、2、3レーン; 0.1%(w/v)のポリエチレングリコール(polyethylene glycol、PEG)希釈液を添加した組成物、第4、5、6レーン; 1.0%(w/v)のポリエチレングリコール(polyethylene glycol、PEG)希釈液を添加した組成物
【図１】
2009526544.tif 000026
【図２】
2009526544.tif 000027
【図３】
2009526544.tif 000028
【図４】
2009526544.tif 000029
【図５】
2009526544.tif 000030
【図６】
2009526544.tif 000031
【配列表】
2009526544000001.app
【国際調査報告】
2009526544.tif 000032
2009526544.tif 000033
2009526544.tif 000034