(57)【要約】  関節の病的状態、例えば、関節症、関節リウマチ、及び軟骨の損傷を処置するための物質の使用。使用は、αケトグルタル酸、グルタミン、又はグルタミン酸、並びに記載した物質の塩、アミド、ジペプチド又はトリペプチドの使用を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨又は他の関節の状態の炎症性又は非炎症性の障害の状態の処置又は予防のための製剤調製物を製造するための、αケトグルタル酸、グルタミン、グルタミン酸、及びこれらの酸の薬学的に許容できる塩、αケトグルタル酸とアミノ酸又はジ若しくはトリペプチドのアミド、グルタミンと別のアミノ酸とのジペプチド、グルタミンと他のアミノ酸とのトリペプチド、グルタミン酸と他のアミノ酸とのジペプチド、グルタミン酸と他のアミノ酸とのトリペプチド、並びに前記ジペプチド及びトリペプチドの薬学的に許容できる塩、αケトグルタル酸又はその薬学的に許容できる塩及び少なくとも１つのアミノ酸の薬学的に許容できる物理的混合物からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む物質の使用。
【請求項２】
前記少なくとも１つのメンバーが、αケトグルタル酸、αケトグルタル酸の塩、及びαケトグルタル酸のアミドからなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記少なくとも１つのメンバーが、αケトグルタル酸、及びαケトグルタル酸の塩からなる群から選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
骨関節炎の処置又は予防のための、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
関節リウマチの処置又は予防のための、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
体重減少及び／又は栄養障害が関与する状態における軟骨の障害の処置又は予防のための、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
胃切除、部分的胃切除、又は胃バンディングが関与する状態における軟骨の障害の処置又は予防のための、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
栄養不良が関与する状態における軟骨の障害の処置又は予防のための、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
請求項１〜８に記載の状態に関連する疼痛を軽減するための、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
患者に投与する投与量が、前記物質１から１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間隔である、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
患者に投与する投与量が、前記物質１０から４００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間隔である、請求項１〜９のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
患者に投与する投与量が、前記物質の１０から１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間隔である、請求項１〜９のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、軟骨障害及びそれに付随する疼痛に関連する状態を処置、軽減、及び予防するための、或いは骨関節炎（ａｒｔｒｏｓｅ）及び関節リウマチ及びそれに関連する疼痛を予防するための医薬組成物、並びに前記組成物の使用に関する。
【０００２】
［背景技術］
産業界においては、成人の約３人に１人が、現在、慢性の関節の症候又は関節炎に罹患していることがある。最も一般的な症候である、持続性の関節疼痛は、股関節痛、膝痛、手の痛み、又は手首痛、及び身体の他の領域における関節痛として出現することがある。症候は苦痛を引き起こし、人々が労働の停止又は労働時間の削減を余儀なくされる場合には、経済学的損失がもたらされる。また、医療に巨大な金額が費やされる。明らかに、関節の症候及び関節炎を軽減又は治療するための、費用効果の高い解決法が必要とされている。
【０００３】
［発明の概要］
本発明の実施形態には、炎症性又は非炎症性の軟骨の障害及び上記に関連する疼痛の状態の処置又は予防のための製剤調製物を製造するための、αケトグルタル酸、グルタミン、グルタミン酸、及びこれらの酸の薬学的に許容できる塩、αケトグルタル酸とアミノ酸又はジ若しくはトリペプチドのアミド、グルタミンと別のアミノ酸とのジペプチド、グルタミンと他のアミノ酸とのトリペプチド、グルタミン酸と他のアミノ酸とのジペプチド、グルタミン酸と他のアミノ酸とのトリペプチド、並びに前記ジペプチド及びトリペプチドの薬学的に許容できる塩、αケトグルタル酸又はその薬学的に許容できる塩及び少なくとも１つのアミノ酸の薬学的に許容できる物理的混合物からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む物質の使用が含まれる。
【０００４】
さらなる実施形態には、骨関節炎、及び関節リウマチ、及び上記に関連する疼痛の処置又は予防のための、上記に記載した使用が含まれる。
【０００５】
さらなる実施形態には、体重減少及び／又は栄養障害、又は胃切除、部分的胃切除又は胃バンディングが関与する状態における軟骨の障害の処置又は予防のための、上記に記載した使用が含まれる。
【０００６】
さらなる実施形態には、栄養不良が関与する状態における軟骨の障害の処置又は予防のための、上記に記載した使用が含まれる。
【０００７】
さらなる実施形態には、上記に記載した状態における軟骨障害に関連する疼痛を軽減するための、上記に記載した使用が含まれる。
【０００８】
さらなる実施形態には、胃切除に関連する骨粗しょう症の処置又は予防のための、上記に記載した使用が含まれる。
【０００９】
以下の記載にて、本発明を、好ましい実施形態、実施例の試験、及び添付の図面の助けで、さらに説明する。
【００１０】
［詳細な説明］
したがって、本発明の一態様によれば、骨関節炎、関節リウマチ、及び軟骨の破壊、並びに上記の異常に関連する疼痛の状態の処置又は予防のための製剤調製物を製造するための、αケトグルタル酸、グルタミン、グルタミン酸、及びこれらの酸の薬学的に許容できる塩、αケトグルタル酸とアミノ酸又はジ若しくはトリペプチドのアミド、グルタミンと別のアミノ酸とのジペプチド、グルタミンと他のアミノ酸とのトリペプチド、グルタミン酸と他のアミノ酸とのジペプチド、グルタミン酸と他のアミノ酸とのトリペプチド、並びに前記ジペプチド及びトリペプチドの薬学的に許容できる塩、αケトグルタル酸又はその薬学的に許容できる塩及び少なくとも１つのアミノ酸の薬学的に許容できる物理的混合物からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーの新規な使用を提供する。
【００１１】
本発明の好ましい一実施形態によれば、αケトグルタル酸、又はそのアルカリ塩、若しくはアルカリ土類金属塩、若しくはそれらの組合せが用いられる。好ましくは、αケトグルタル酸ナトリウムが用いられる。
【００１２】
本発明の別の一態様によれば、ヒトを含めた哺乳動物における骨関節炎からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーの疼痛が増大する状態を処置又は予防するための処置方法に対する方法が提供され、この方法は、αケトグルタル酸、グルタミン、グルタミン酸、及びこれらの酸の薬学的に許容できる塩、αケトグルタル酸とアミノ酸又はジ若しくはトリペプチドとのアミド、グルタミンと別のアミノ酸とのジペプチド、グルタミンと他のアミノ酸とのトリペプチド、グルタミン酸と他のアミノ酸とのジペプチド、グルタミン酸と他のアミノ酸とのトリペプチド、並びに前記ジペプチド及びトリペプチドの薬学的に許容できる塩、αケトグルタル酸又はその薬学的に許容できる塩及び少なくとも１つのアミノ酸の薬学的に許容できる物理的混合物からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーの、有効な疼痛量のこのような処置又は予防を必要とする対象に投与することを含む。
【００１３】
これらの態様の好ましい実施形態によれば、αケトグルタル酸、又はそのアルカリ若しくはアルカリ若しくはアルカリ土類金属塩、又はそれらの組合せを投与する。最も好ましくは、αケトグルタル酸ナトリウムを投与する。
【００１４】
本発明にしたがって用いられる、１種又は複数の有効成分の製剤調製物を、哺乳動物及び鳥類を含めた脊椎動物、例えば、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、若しくはウサギ）、鳥類（例えば、シチメンチョウ、雌鳥、若しくはニワトリ、及び他のブロイラー、及び放し飼い動物）、ウシ、ウマ、ブタ若しくは子ブタ、及び他の農場飼育動物、イヌ、ネコ、及び他のペット、特にヒトに投与することができる。
【００１５】
投与は、脊椎動物のどの種を処置するかに応じて、前記方法の必要性のある脊椎動物の状態に応じて、及び処置するための特定の指示に応じて様々な方法で行うことができる。
【００１６】
一実施形態では、投与を、栄養補助食品、並びに／又は固形食品及び／若しくは飲料の形態の成分など、食餌又は餌のサプリメントとして行う。さらなる実施形態は、以下にさらに記載する飲料などの、懸濁液又は溶液の形であってもよい。また、この形態は、チュアブル錠又は可溶性錠剤（例えば、沸騰錠）などのカプセル剤又は錠剤、並びに、粉末剤及び当業者には知られている他の乾燥形態、例えばペレット（例えばマイクロペレット）及び粒子などの形であってよい。
【００１７】
投与は、上記に表す通り、非経口、直腸、又は経口の、食餌又は餌のサプリメントとしてであってよい。非経口のビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、又は不揮発性油が含まれる。
【００１８】
食餌又は餌のサプリメントは、乳化したものであってもよい。次いで、有効な治療成分又は複数の成分を、薬学的に許容でき、有効成分と適合性である賦形剤と混合してもよい。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組合せである。さらに、所望により、組成物は、有効成分の有効性を増強する少量の補助剤、例えば、湿潤剤若しくは乳化剤、ｐＨ、緩衝剤を含むことができる。
【００１９】
固形食品、液体、又は凍結乾燥若しくは他の方法で乾燥した製剤など、非経口の、食餌又は餌のサプリメントの様々な形態を供給してもよい。これには様々なバッファー（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、リン酸）の希釈剤、ｐＨ及びイオン強度、表面への吸収を防ぐためのアルブミン又はゼラチンなどの添加剤、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、胆汁酸塩）、可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜流酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、増量剤、又は張度調節剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、ポリエチレングリコールなどのポリマーの組成物に対する共有結合、金属イオンとの錯体形成、又はポリ乳酸などのポリマー性化合物の粒子性の調製物中、若しくは調製物上への材料の組込み、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなど、又はリポソーム上へ、マイクロエマルジョン、ミセル、単層若しくは多層の小胞、赤血球ゴースト、又はスフェロプラストが含まれ得る。
【００２０】
一実施形態では、食餌又は餌のサプリメントを、本発明によるあらゆる方法で、飲料、又はその乾燥組成物の形態で投与する。
【００２１】
飲料は、有効量の有効成分又はその複数の成分を、栄養学的に許容できる水溶性の担体、例えば、ミネラル、ビタミン、炭水化物、脂肪、及びタンパク質とともに含む。飲料を乾燥形態で提供する場合は、これらの成分は全て、乾燥形態で供給される。摂取可能な状態で提供される飲料は、水をさらに含む。最終の飲料溶液の張性及び酸度は、先の段落における一般的な提案にしたがって、バッファー溶液などとして、やはりコントロールされていることがある。
【００２２】
ｐＨの範囲は、細菌及び真菌の増殖を防ぐために、約２〜５が好ましく、特に約２〜４である。ｐＨ約６〜８の、滅菌した飲料も用いることがある。
【００２３】
飲料を、単独で供給してもよく、或いは１つ又は複数の治療上有効な組成物と組み合わせてもよい。
【００２４】
さらなる実施形態によれば、経口及び直腸で使用するための薬物としての製剤調製物は、薬学的に許容できる担体及び／若しくは添加剤、例えば、希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、補助剤、並びに／又は本発明に開示する方法及び使用で有用な担体と組み合わせた、有効成分又は複数の成分を含む、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、粉末剤、水性又は油性の懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤、水溶液剤などの形態であってよい。
【００２５】
さらに、本明細書で用いられる「薬学的に許容できる担体」は、当業者にはよく知られており、それだけには限定されないが、０．０１〜０．０５Ｍのリン酸バッファー又は０．８％食塩水を含むことができる。さらに、このような薬学的に許容できる担体は、水性又は非水性の溶液、懸濁液、及び乳液であってよい。非水性の溶媒の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルがある。水性の担体には、食塩水及び緩衝性の媒体を含めた、水、アルコール性／水性の溶液、乳液又は懸濁液が含まれる。非経口のビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、又は不揮発性油が含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガスなどの、保存剤及び他の添加剤も存在してもよい。
【００２６】
αケトグルタル酸とアミドの部分を、又はグルタミン若しくはグルタミン酸とジペプチドの部分を、又はグルタミン及び／若しくはグルタミン酸とトリペプチドの部分を形成するアミノ酸は、天然でペプチドにおける成分として存在するあらゆるアミノ酸であってよい。同じことが、αケトグルタル酸又はその塩と、少なくとも１つのアミノ酸との、薬学的に許容できる物理的混合物に当てはまる。アミノ酸又は複数のアミノ酸が、アルギニン、オルニチン、ロイシン、イソロイシン、及びリジンからなる群から選択されるのが好ましい。
【００２７】
前記アミノ酸は、そのＬ立体配置で用いるのが好ましい。
【００２８】
αケトグルタル酸の、アミノ酸又はジペプチド若しくはトリペプチドとのアミドの例には、それだけには限定されないが、αケトグルタル酸の、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、オルニチン、リジン、プロリン、イソロイシン、及びロイシンからなる群から選択されるアミノ酸とのアミド；並びにαケトグルタル酸の、グルタミンとグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、リジン、プロリン、イソロイシン、及びロイシンのいずれかとのジペプチド、並びに、グルタミン酸とアルギニン、オルニチン、リジン、プロリン、イソロイシン、及びロイシンのいずれかとのジペプチドとのアミドが含まれる。
【００２９】
グルタミン及びグルタミン酸の、他のアミノ酸とのジペプチド及びペプチドの例には、αケトグルタル酸のジペプチド若しくはトリペプチドとのアミドに関連した上記に記載したものが含まれる。
【００３０】
αケトグルタル酸若しくはその塩の、少なくとも１つのアミノ酸との物理的混合物の例には、それだけには限定されないが、αケトグルタル酸並びにそのナトリウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウム塩からなる群から選択される少なくとも１メンバーと、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、オルニチン、ロイシン、イソロイシン、リジン、及びプロリンのいずれか、並びに前記アミノ酸のあらゆる組合せとの物理的混合物が含まれる。
【００３１】
前記物理的混合物の、αケトグルタル酸又はその塩の、アミノ酸又は複数のアミノ酸に対するモル比は、一般的に、１：０．０１から１：２、好ましくは１：０．１から１：１．５、最も好ましくは１：０．２から１：１．０の限度内にある。
【００３２】
投与すべき投与量は、用いる有効成分又は複数の成分、処置する状態、処置する患者の年齢、性別、体重などに応じて変化するが、一般的には、１から１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、又は１０から４００ｍｇ／ｋｇ体重及び日、好ましくは１０から１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲内である。
【００３３】
本発明を、次に、実施例によりさらに説明するが、これを本発明の範囲を制限するものと解釈してはならない。
【００３４】
［実施例］
背景
胃を外科的に除去する（胃切除、Ｇｘ）と、動物及びヒトでは骨粗しょう症がもたらされる。胃切除は、主に、海綿骨の構造に影響を及ぼす。Ｇｘが、骨端軟骨板にも悪影響を及ぼすか否かは不明である。食餌性のαケトグルタル酸（ＡＫＧ）は、骨及び軟骨のプロコラーゲンにおける最も豊富なアミノ酸である、ヒドロキシプロリンの前駆物質である。この試験の目的は、ＡＫＧの、胃切除に依存する骨／軟骨の喪失に対する影響を強調することであった。
方法
【００３５】
メスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット４０匹を用いた。ラット２０匹を胃切除し、２群、すなわちＧｘ＋ＡＫＧ及びＧｘ＋プラセボに分けた。別のラット２０匹には偽手術をし、別の２群、すなわち偽手術＋ＡＫＧ及び偽手術＋プラセボに分けた。８週間後、動物を屠殺し、頭蓋冠、大腿、及び脛骨を回収した。右足大腿及び脛骨の骨密度（ＢＭＤ）及び骨ミネラル濃度（ＢＭＣ）を概算し、左足骨からの組織形態計測を概算した。頭蓋冠の徹照法の測定も行った。
結果
【００３６】
食餌性のαケトグルタル酸は、胃切除したラットの頭蓋冠の骨の喪失に対して強力な保護効果を呈した。ＡＫＧは、胃切除したラットの、骨端軟板細胞、海綿骨体積、及び骨梁の形状に対して、強力な抗破壊性の効果を示した。
【００３７】
結論
ＡＫＧにより、ラットにおいて胃を切除した後に発症する、骨及び軟骨の破壊は最小になる。
【００３８】
胃を外科的に除去すると、ヒト、ラット、及び他の実験動物で、骨減少症及び関節炎がもたらされる。胃切除は、ヒトでは骨減少症に関連している。胃の機能障害は、高齢者における骨粗しょう症の発症の一因ともなり得る。したがって、骨の疾患に関する研究の殆どは、胃を切除した後の患者を扱うものである。
【００３９】
胃切除は、主に、海綿骨、及び時には皮質骨にも影響を及ぼし、頭蓋冠骨の破壊という顕著な影響を引き起こす。胃切除後の皮質骨及び海綿骨の量の減少が、ヒトでは男女ともに報告されている。脛骨及び大腿骨における海綿骨の体積は、胃切除後１６週間後に６０％低下する。骨の喪失により、胃切除患者間で、股関節、椎骨、及び他の部位の骨折の危険性は増大し、これは、今日、深刻な問題である。
【００４０】
胃切除患者における骨の喪失は、食餌の欠乏（例えば、カルシウム）、又は胃酸若しくはビタミンＤの喪失の結果ではないと仮定されている。胃切除が誘発する骨粗しょう症の背後にあるメカニズムは、まだ知られていない。しかし、骨粗しょう症の主な原因は、破骨細胞によるコラーゲンの大量の破壊後、骨のコラーゲンの再合成が非効率であることであると仮定されている。骨のプロコラーゲンの主な成分はプロリンであり、消化管においてＡＫＧからグルタミン酸及びプロリンを経てアミノ酸が合成し、プロリンは次に骨のプロコラーゲンにおいて、ＡＫＧ、ビタミンＣ、及びＦｅ２＋の存在下でヒドロキシプロリンに変換される。最近、ＡＫＧは、卵巣切除したラット、及びシチメンチョウにおける除神経した骨において骨の喪失を防ぐのに有効であったことが示された。上記を全て考慮すると、研究の主な目的は、食餌性のＡＫＧは、胃切除したラットにおける骨及び軟骨の喪失を防ぐことができるか否かを調査することであった。
【００４１】
動物及び手術手順
１０週齢（２２０〜２３０ｇ）のメスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット４０匹を、Ｍａｃｒｏｌｏｎ（登録商標）ケージに収容し（各ケージにラット２匹）、ラット標準食ペレット（Ｌａｃｔａｍｉｎ、Ｖａｄｓｔｅｎａ、スウェーデン）、及びビヒクル又はＡＫＧを適宜、水に溶解した食餌を与えた（表１）。研究は８週間継続した。毎週、ラットの体重を測定した。
【００４２】
ラットは、毎日２５と５０ミリリットルの間を飲用した。原則として、ラットは体重の１０と２０％の間を飲用していると考えることができる。
【００４３】
ＡＫＧ群のラットは、１日あたり約２５ｍｌのＡＫＧ飲料を飲用した。２５ｍｌの飲料に、ＡＫＧは０．３６ｇ存在し、これにより１日あたり、ラット体重１ｋｇあたり約１から１．４ｇのＡＫＧを投与している。プラセボ（対照）群のラットは、１日あたり約５０ｍｌのプラセボ飲料を飲用した。
【００４４】
外科手術
ラット２０匹を胃切除し、２群、すなわちＧｘ＋ＡＫＧ及びＧｘ＋プラセボ（各群、ラット１０匹）に分けた。胃の腺性の部分（すなわち、胃酸生成部分、胃底、及び幽門洞）を切除し、その後、非腺性部分（前胃）を十二指腸と、端同士で連結した。ラット２０匹を偽手術し、２群間、すなわち偽手術＋ＡＫＧ、及び偽手術＋プラセボ（各群、ラット１０匹）に分けた。偽手術は、腹部正中線切開、胃の処置、及び切開の閉鎖を含むものであった。麻酔は、Ｋｅｔａｌａｒ（登録商標）（５０ｍｇ／ｋｇ、Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ、Ｍｏｒｒｉｓ  Ｐｌａｉｍｓ、ニュージャージー州、米国）、及びＳｔｅｓｎｉｌ（登録商標）（４０ｍｇ／ｋｇ、Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ  Ｐｈａｒｍａ、ウィーン、オーストリア）の皮下注射によって達成した。無痛化は、Ｔｅｍｇｅｓｉｃ（登録商標）（０．１８ｍｇ／ｋｇ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ニュージャージー州、米国）の皮下注射によって達成した。ビヒクルで偽手術＋プラセボ及びＧｘ＋プラセボ群の処置を開始し、ＡＫＧで偽手術＋ＡＫＧ及びＧｘ＋ＡＫＧ群を処置した。
【００４５】
Ｇｘラットに、２週毎に１回（手術後第１週に開始して）、ビタミンＢ１２の吸収に不可欠である内因性因子の喪失を補償するためのビタミンＢ１２（Ｂｅｔｏｌｖｅｘ（登録商標）１ｍｇ／ｍｌ、Ｄｕｍｅｘ、コペンハーゲン、デンマーク）０．４ｍｇ／ｋｇ、及び胃酸の喪失による、予想される鉄の吸収不良を補充するものとして水酸化鉄ポリマルトース複合体（Ｆｅｒｒｕｍ（登録商標）５０ｍｇＦｅ３＋ｍｇ／ｍｌ、Ｖｉｆｏｒ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｇａｌｌｅｎ／スイス）の２０ｍｇＦｅ３＋／ｋｇを、筋肉内の経路によって注射した。これらの補充は、外科的手順を行わなかったラットの体重の発達には影響なかった。
【００４６】
実験中に、８匹の動物が死亡した。最終の動物数（ｎ）は、偽手術＋プラセボでは７匹、偽手術＋ＡＫＧでは１０匹、Ｇｘ＋プラセボでは８匹、Ｇｘ＋ＡＫＧ群では７匹であった。
【００４７】
ラットを、上記に記載した麻酔下で、腹部大動脈からの失血により全て屠殺した。
【００４８】
研究は、地方のＡｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、Ｌｕｎｄ、スウェーデンによって認可された。
【００４９】
組織の回収及び分析
各ラットから頭蓋冠を解剖して取り出し、骨膜を注意深く除去することによって、軟組織を取り除いた。食塩水を浸したガーゼで各頭蓋冠を覆うことによって乾燥を防ぎ、それらを実験まで＋４℃の気密容器に貯蔵した。各頭蓋冠を、一定の強度で光を放出する光源（市販の蛍光管）の上のガラス板上に配置した。得られた徹照法の画像を、×１６の倍率の手術用顕微鏡に接続したカメラを使用することによって写真撮影した。画像を、ＩｍａｇｅＪ  ｖ．１．３３ａによって行う、組織形態計測のコンピュータ分析にかけた。骨喪失のパーセント値（間隙の観察された面積として）を概算した。
【００５０】
大腿骨及び脛骨を回収し、さらなる分析まで７０％エタノールに貯蔵した。
【００５１】
右足大腿骨及び脛骨を、ＰＩＸＩＭＵＳ（登録商標）分析にかけ、これによりＢＭＤがｇ／ｃｍ２で、ＢＭＣがｇ／ｃｍ３で得られた。
【００５２】
エタノール固定した左足の大腿骨及び脛骨を、４８時間、７％硝酸（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ａｃｉｄ）で脱灰した。遠位の大腿骨及び近位の脛骨の標本（骨幹端の８ｍｍ部分の骨端からなる）を、さらなる組織学的手順に用いた。標本をパラフィンに浸漬した。大腿骨及び脛骨の標本の縦方向の切片（厚さ６μｍ）を、自動ミクロトームＭｉｃｒｏｍＨＭ３６０によって切断した。１個体から骨１個あたりスライス２０個（各５個の後２０μｍの間隔で）を切断した。スライスを、標準の条件下、ヘマトキシリン／エオシンで染色した。染色した各スライスから、顕微鏡画像を撮った。海綿骨を評価するのに用いる写真を、Ｎｉｃｏｎ  ＥｃｌｉｐｓｅＥ８００−光学顕微鏡、倍率×４０、及びＮｉｋｏｎＤ７０−デジタルカメラを用いて撮った。大腿骨及び脛骨の切片の顕微鏡画像を、組織形態学計測のコンピュータ分析にかけた。骨梁を、ＩｍａｇｅＪ  ｖ．１．３３ａを用いて分析した。骨端軟骨板を評価するために用いた写真を、ノマルスキーのコントラスト技術によって作成し、×１００倍率、波長５１４ｎｍのアルゴンレーザーのＺｅｉｓｓ、ＬＳＭ５Ｐａｓｃａｌレーザースキャニングヘッドを装着したＡＸＩＯＶＥＲＴ  ２００Ｍによって収集した。骨端軟骨板を、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｖ．３．０を用いて分析した。倍率×１００、波長５１４ｎｍのアルゴンレーザーで、Ｚｅｉｓｓ、ＬＳＭ５Ｐａｓｃａｌレーザースキャニングヘッドを装着したＡＸＩＯＶＥＲＴ  ２００Ｍの蛍光モードを用いて、関節軟骨の画像を捕えた。関節軟骨の写真を、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  Ｉｍａｇｅ  Ｅｘａｍｉｎｅｒ  ｖ．３．１．０．９９によって評価した。骨端軟骨板下の骨梁に関して考慮されるパラメータは、海綿質骨の特徴を得るために測定した海綿骨体積（ＢＶ／ＴＶ％）、及び骨梁のフラクタル次元（Ｂｏｘ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ）であった。骨端軟骨板に関するパラメータは、休止状態のゾーン、増殖性のゾーン、及び肥厚性の軟骨のゾーンからなるＲＯＩ（対象の領域）内の軟骨細胞数であった。関節軟骨の相対的なコラーゲン含量の概算は、ＬＳＭ５Ｐａｓｃａｌレーザースキャニングヘッド検出器１２ビットグレイレベルを測定のスケールとして無作為選択のＲＯＩ（全てのスライスに対して同じ面積−関節軟骨に沿って各々直径８３μｍの円６個）における、エオシン染色したコラーゲンの蛍光強度測定によって行った。測定は、全てのスライスに対して正確に同じ標準状態で行った。
【００５３】
統計
データを、片側分散分析（ＡＮＯＶＡ）、スチューデントのｔ検定で比較し、ｐ＜０．０５を統計学的有意性とみなした。
【００５４】
結果
実験終了時に、外科手術処置した動物の体重は、偽手術よりも８％少なかった。群間に、統計学的有意差はなかった（図１）。
【００５５】
頭蓋冠の徹照法
頭蓋冠の徹照法により、偽手術＋プラセボ及び偽手術＋ＡＫＧのラットに比べて、Ｇｘ＋プラセボ及びＧｘ＋ＡＫＧのラットにおける骨間隙のパーセント値に、著しい増殖が示された（図２）。Ｇｘ＋ＡＫＧラットは、また、Ｇｘ＋プラセボ群（＊Ｐ＝０．０３１）に比べて、有意に低いパーセント値の間隙を表した（図３）。偽手術＋プラセボと、偽手術＋ＡＫＧとの間の相違は、統計学的に有意ではなかった。
【００５６】
大腿骨及び脛骨の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）及び骨ミネラル含量（ＢＭＣ）
Ｇｘ＋プラセボ及びＧｘ＋ＡＫＧのラットにおけるＢＭＤ及びＢＭＣは、偽手術＋プラセボ及び偽手術＋ＡＫＧのラットに比べて低かった（データは示さず）。しかし、Ｇｘ＋ＡＫＧにおけるＢＭＤは、Ｇｘ＋プラセボ群におけるよりも大きい傾向があった（ｐ＝０．１９）。
【００５７】
組織形態計測
関節軟骨分析
Ｇｘ＋ＡＫＧ群における軟骨コラーゲンの量は、対照（偽手術）群におけるものと類似しており、Ｇｘ＋プラセボ群に比べて有意に高かった（表２）。
【００５８】
骨端軟骨板分析
骨端軟骨増殖板細胞の定量的評価により、Ｇｘ＋プラセボに比べてＧｘ＋ＡＫＧ群における細胞数（大腿骨及び脛骨の両方）に増大が示された。さらに、Ｇｘ＋ＡＫＧ群における軟骨細胞の数は、偽手術の両群におけるよりも有意に大きかった（表３、４）。
【００５９】
海綿骨体積
海綿骨体積は、偽手術＋プラセボ及び偽手術＋ＡＫＧのラットに比べてＧｘ＋プラセボ及びＧｘ＋ＡＫＧのラットで低下した。しかし、Ｇｘ＋ＡＫにおける骨梁の面積の低減は、Ｇｘ＋プラセボ群におけるよりも低かった（表５、６）。
【００６０】
骨梁のフラクタル次元
Ｇｘ＋ＡＫＧにおけるフラクタル次元は、対照群に類似しており、Ｇｘ＋プラセボにおけるよりも高かった（表７、８）。
【００６１】
考察
実験の目的は、胃切除によって引き起こされる骨の喪失に対する食餌性のαケトグルタル酸の効果を評価することであった。得られたデータは、仮説を裏付けるものである。実際に、食餌性のＡＫＧは、胃切除したラットにおける骨及び軟骨の喪失を防止した。我々の結果は、ＡＫＧは、卵巣切除したラット及び閉経後の女性における骨粗しょう症の発症を防ぐことを示す、最近の実験と一致している。
【００６２】
胃切除により、Ｇｘ＋プラセボにおける軟骨のコラーゲン及び軟骨細胞の喪失が引き起こされたが、Ｇｘ＋ＡＫＧラットでは引き起こされなかった。Ｇｘ＋ＡＫＧでは、Ｇｘ＋プラセボ群におけるよりも、２２％多い軟骨細胞が確認された。これは、ＡＫＧが、胃切除したラットにおける軟骨細胞の喪失を防ぐのに有効であったことを指摘している。分析により、骨及び軟骨のコラーゲンに対するＡＫＧの保護的効果が明らかになった。Ｇｘ＋ＡＫＧ群におけるコラーゲンの量は、実験に対する対照群の範囲内にあり、Ｇｘ＋プラセボラットにおけるよりも約１８％高かった。
【００６３】
胃切除したラットにおいて、頭蓋冠骨に対するＡＫＧの保護的効果が観察された。Ｇｘ＋ＡＫＧラットからの頭蓋冠は、Ｇｘ＋プラセボラットからのものよりも、２０％低い傷害を示していた。ＢＭＤ及びＢＭＣの値は、胃切除は、Ｇｘ＋プラセボ、及びＧｘ＋ＡＫＧラットにおいて骨減少症を引き起こすことを実証しており、これは他の実験と一致する。しかし、より感度の高い組織形態計測方法を用いて、我々は、ＡＫＧが、ＧＸラットにおける骨減少症を防ぐのにおそらく効果的であることを示した。
【００６４】
さらに、試験した海綿骨体積は、Ｇｘ＋プラセボ動物に比べて、Ｇｘ＋ＡＫＧラットで３８％少ない低減を示した。さらに、Ｇｘ＋ＡＫＧ群における骨梁のフラクタル次元は、偽手術群におけるものと殆ど同レベルを示した。このように、αケトグルタル酸は、実際に、骨の骨梁の構造の再構成に、強力な影響がある。
【００６５】
胃切除は、骨格に対して強力な破壊効果があり、骨減少症及び関節症を引き起こす。ＡＫＧは、これらの傷害を完全に止めることはできないが、骨及び関節における胃切除に関連する深刻な破壊的な変化を明らかに制限し、骨格系の再構成をおそらく改善するものであった。これらの観察は、例えば、部分的な胃切除を肥満の患者における体重減少に推薦する場合、ヒトにおける臨床上の考慮にとって重要であり得ることをほのめかすものである。これらの患者は全て骨粗しょう症及び関節症を発症する。したがって、このような患者に対する食餌性のＡＫＧは、これらの破壊的な骨の変化を停止又は制限することができると推測することができる。
【００６６】
【表１】
2009515953.tif 000002
【００６７】
各溶液において同レベルのｐＨを達成するために、プラセボ飲料を、０．１ＭＨＣｌで、ｐＨ４．６（ＡＫＧ飲料のｐＨレベル）に滴定した。
【００６８】
【表２】
2009515953.tif 000003
【００６９】
カラムにおける結果に添えられている様々な文字は、ｐ＜０．０５の場合の有意差を示すものである。
【００７０】
Ｇｘ＋ＡＫＧにおけるｎ＝７、Ｇｘ＋プラセボにおけるｎ＝８、偽手術＋ＡＫＧにおけるｎ＝１０、偽手術＋プラセボにおけるｎ＝７
【００７１】
【表３】
2009515953.tif 000004
【００７２】
カラムにおける結果に添えられている様々な文字は、ｐ＜０．０５の場合の有意差を示すものである。
【００７３】
Ｇｘ＋ＡＫＧにおけるｎ＝７、Ｇｘ＋プラセボにおけるｎ＝８、偽手術＋ＡＫＧにおけるｎ＝１０、偽手術＋プラセボにおけるｎ＝７
【００７４】
【表４】
2009515953.tif 000005
【００７５】
カラムにおける結果に添えられている様々な文字は、ｐ＜０．０５の場合の有意差を示すものである。
【００７６】
Ｇｘ＋ＡＫＧにおけるｎ＝７、Ｇｘ＋プラセボにおけるｎ＝８、偽手術＋ＡＫＧにおけるｎ＝１０、偽手術＋プラセボにおけるｎ＝７
【００７７】
【表５】
2009515953.tif 000006
【００７８】
カラムにおける結果に添えられている様々な文字は、ｐ＜０．０５の場合の有意差を示すものである。
【００７９】
Ｇｘ＋ＡＫＧにおけるｎ＝７、Ｇｘ＋プラセボにおけるｎ＝８、偽手術＋ＡＫＧにおけるｎ＝１０、偽手術＋プラセボにおけるｎ＝７
【００８０】
【表６】
2009515953.tif 000007
【００８１】
カラムにおける結果に添えられている様々な文字は、ｐ＜０．０５の場合の有意差を示すものである。
【００８２】
Ｇｘ＋ＡＫＧにおけるｎ＝７、Ｇｘ＋プラセボにおけるｎ＝８、偽手術＋ＡＫＧにおけるｎ＝１０、偽手術＋プラセボにおけるｎ＝７
【００８３】
【表７】
2009515953.tif 000008
【００８４】
カラムにおける結果に添えられている様々な文字は、ｐ＜０．０５の場合の有意差を示すものである。
【００８５】
Ｇｘ＋ＡＫＧにおけるｎ＝７、Ｇｘ＋プラセボにおけるｎ＝８、偽手術＋ＡＫＧにおけるｎ＝１０、偽手術＋プラセボにおけるｎ＝７
【００８６】
【表８】
2009515953.tif 000009
【００８７】
カラムにおける結果に添えられている様々な文字は、ｐ＜０．０５の場合の有意差を示すものである。
【００８８】
Ｇｘ＋ＡＫＧにおけるｎ＝７、Ｇｘ＋プラセボにおけるｎ＝８、偽手術＋ＡＫＧにおけるｎ＝１０、偽手術＋プラセボにおけるｎ＝７
【００８９】
図に対する凡例
図１
ラットの体重に対する、食餌性のαケトグルタル酸及び胃切除の効果。対照群：ＳＨＡＭ＋ＰＬＡＣ、ＧＸ＋ＰＬＡＣ実験群：ＳＨＡＭ＋ＡＫＧ、ＧＸ＋ＡＫＧ（ＳＨＡＭ−偽手術ラット、ＧＸ−胃切除ラット）。
【００９０】
図２
試験動物の頭蓋冠の選択された写真。対照群：ＳＨＡＭ＋ＰＬＡＣ、ＧＸ＋ＰＬＡＣ実験群：ＳＨＡＭ＋ＡＫＧ、ＧＸ＋ＡＫＧ（ＳＨＡＭ−偽手術ラット、ＧＸ−胃切除ラット）。
【００９１】
図３
頭蓋冠の徹照法写真に対する、食餌性のαケトグルタル酸及び胃切除の効果。対照群：ＳＨＡＭ＋ＰＬＡＣ、ＧＸ＋ＰＬＡＣ実験群：ＳＨＡＭ＋ＡＫＧ、ＧＸ＋ＡＫＧ（ＳＨＡＭ−偽手術ラット、ＧＸ−胃切除ラット）。
ｐ＝０．０２８８
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】ラットの体重に対する、食餌性のαケトグルタル酸及び胃切除の効果を示す図である。
【図２】実験用ラットの頭蓋（頭蓋冠）の上部の、４枚の徹照法写真を示す図である。
【図３】実験用ラットの頭蓋冠の徹照法写真上に見られる間隙の面積を示す図である。
【図１】
2009515953.tif 000010
【図２】
2009515953.tif 000011
【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年12月28日(2007.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体重減少及び／又は栄養障害；栄養不良；胃切除、部分的胃切除又は胃バンディングが関与する状態における軟骨の障害の処置又は予防のための製剤調製物を製造するための、αケトグルタル酸又はαケトグルタル酸の薬学的に許容できる塩の使用。
【請求項２】
αケトグルタル酸又はαケトグルタル酸の薬学的に許容できる塩が、少なくとも１つのアミノ酸との薬学的に許容できる物理的混合物の形である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
アミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、オルニチン、ロイシン、イソロイシン、リジン、プロリン、及びこれらの組合せから選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
αケトグルタル酸の薬学的に許容できる塩が、アルカリ塩、若しくはアルカリ土類金属塩、又はそれらの組合せである、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
αケトグルタル酸の薬学的に許容できる塩がαケトグルタル酸ナトリウムである、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
体重減少及び／又は栄養障害；栄養不良；胃切除、部分的胃切除又は胃バンディングが関与する状態における軟骨の障害の処置又は予防のための製剤調製物を製造するための、αケトグルタル酸、及びアミノ酸、ジペプチド、又はトリペプチドのアミドの使用。
【請求項７】
αケトグルタル酸とともにアミドを形成するアミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、オルニチン、リジン、プロリン、イソロイシン、及びロイシンから選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
αケトグルタル酸とともにアミドを形成するジペプチドが、グルタミンと、グルタミン酸、アルギニン、オルニチン、リジン、プロリン、イソロイシン、及びロイシンのうちの任意のものとのジペプチドである、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
患者に投与する投与量が、前記物質１から１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間隔である、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
患者に投与する投与量が、前記物質１０から４００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間隔である、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
患者に投与する投与量が、前記物質の１０から１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間隔である、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【国際調査報告】
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