(57)【要約】  本発明は、調節性Ｔ細胞を同定、定量、及び単離するための方法及びキットと、調節性Ｔ細胞量に基づいた、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患、アレルギー性疾患、それらの素因、感染症、癌の診断又はモニタリング、癌治療及び／又は臓器移植のための方法及びキットと、調節性Ｔ細胞量に基づいた、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患、アレルギー性疾患、それらの素因、感染症、癌のための治療法及び／又は臓器移植に対する反応を予測する方法及びキットと、単離した調節性Ｔ細胞を使用する治療法のための方法及びキットとに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を同定する方法であって、霊長類の生物学的サンプル中の少なくとも１つの細胞を分析し、細胞のＣＤ１２７、ＣＤ４及びＣＤ２５の発現レベルを測定する、分析することを含み、ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋の発現が調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を示す方法。
【請求項２】
前記分析する工程が、少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドについて細胞の発現レベルを測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドが、細胞表面に結合又は細胞内に存在する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドが、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４又はＣＤ９５を含む群から選択される、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記霊長類の生物学的サンプルが、細胞株、体液又は組織を含む群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記体液が血液又はリンパ液を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが、胸腺、リンパ節、脾臓、扁桃腺、少なくとも１つの単離リンパ球又は少なくとも１つのＴ細胞を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）霊長類の生物学的サンプルを得る工程と、
（ｂ）細胞表面のＣＤ１２７、ＣＤ４及びＣＤ２５に対する抗体と前記霊長類の生物学的サンプル中の少なくとも１つの細胞を接触させる工程と、
（ｃ）前記少なくとも１つの細胞をフローサイトメトリーにかける工程と、
（ｄ）ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋の発現の前記フローサイトメトリーのシグナルを分析する工程と
を含み、前記ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋の発現が調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を示す、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を同定する方法であって、霊長類の生物学的サンプル中の少なくとも１つの細胞を分析し、細胞のＣＤ１２７の発現レベルを測定する、分析することを含み、該サンプル中の該少なくとも１つの細胞が、あらかじめＣＤ４及び／又はＣＤ２５の発現について分析されて、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ２５＋であることが明らかにされており、ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋の発現が、調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を示す方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの細胞が、あらかじめＣＤ４の発現について分析されており、前記分析する工程が、細胞のＣＤ２５の発現レベルを測定することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの細胞が、あらかじめＣＤ２５の発現について分析されており、前記分析する工程が、細胞のＣＤ４の発現レベルを測定することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルが、胸腺、リンパ節、脾臓、扁桃腺、少なくとも１つの単離リンパ球、少なくとも１つのＴ細胞、少なくとも１つのＣＤ４＋Ｔ細胞、少なくとも１つのＣＤ２５＋Ｔ細胞又は少なくとも１つのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
霊長類の被験体において、調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を同定するためのキットであって、少なくともＣＤ１２７の細胞の発現レベルの測定ための少なくとも１つの薬剤を含むキット。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの薬剤が、少なくとも１つの抗ＣＤ１２７抗体又はＣＤ１２７に対して特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む群から選択される、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
霊長類の被験体において、少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドの細胞の発現レベルを測定するための少なくとも１つの薬剤をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドが、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４又はＣＤ９５を含む群から選択される、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
調節性Ｔ細胞の集団を定量するためのキットであって、少なくともＣＤ１２７の細胞の発現レベルの測定ための少なくとも１つの薬剤を含むキット。
【請求項１８】
霊長類の生物学的サンプル中の調節性Ｔ細胞の量を定量化する方法であって、細胞のＣＤ１２７、ＣＤ４及びＣＤ２５の発現レベルを測定するために該サンプル中に分析細胞を含み、該サンプル中のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量が該サンプル中の調節性Ｔ細胞の量を示す方法。
【請求項１９】
霊長類の生物学的サンプル中の調節性Ｔ細胞の量を定量化する方法であって、細胞のＣＤ１２７の発現レベルを測定するために該サンプル中に分析細胞を含み、該細胞があらかじめＣＤ４及び／又はＣＤ２５の発現について分析されて、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ２５＋であることが明らかにされており、該サンプル中のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量が該サンプル中の調節性Ｔ細胞の量を示す方法。
【請求項２０】
霊長類の被験体において、調節性Ｔ細胞の過剰生産又は低生産を診断する方法であって、
（ａ）前記被験体から生物学的サンプルを得ること、及び
（ｂ）前記サンプル中の細胞を分析し、細胞のＣＤ１２７、ＣＤ４及びＣＤ２５の発現レベルを測定する、分析すること
を含み、前記サンプル中の少量のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞が前記被験体の調節性Ｔ細胞の低生産を示し、該サンプル中の多量のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞が該被験体の調節性Ｔ細胞の過剰生産を示す方法。
【請求項２１】
調節性Ｔ細胞の低生産が、炎症性腸疾患若しくはその素因、又は臓器移植に関連する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
調節性Ｔ細胞の過剰産生が、原発性シェーグレン症候群、湿疹、喘息、肝細胞癌又はＨＩＶ感染に関連する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つの対照サンプル中のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量と、前記霊長類の被験体から得られたサンプル中のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量を比較することを含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの対照サンプルが、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患、若しくはアレルギー性疾患、肝細胞癌、臓器移植、ＨＩＶ感染、それらの素因、又は調節性Ｔ細胞の量の変化に関連する他の疾患をともなわない霊長類の被験体由来である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
霊長類の被験体において疾患を診断する方法であって、
（ａ）前記被験体から生物学的サンプルを得ること、及び
（ｂ）前記サンプル中の細胞を分析し、細胞のＣＤ１２７、ＣＤ４及びＣＤ２５の発現レベルを測定する、分析すること
を含み、前記サンプル中の少量のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞が前記被験体の疾患を示す方法。
【請求項２６】
前記疾患が、炎症性腸疾患、全身性紅斑性狼瘡、乾癬性関節炎、若年性特発性関節炎、若年性糖尿病、川崎病、肝細胞癌、ＨＩＶ感染又は調節性Ｔ細胞の量の変化に関連する他の疾患を含む群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
病状、感染又は治療の経過の間に霊長類の被験体の調節性Ｔ細胞の量をモニタリングする方法であって、
（ａ）前記被験体から生物学的サンプルを得ること、及び
（ｂ）前記サンプル中の細胞を分析し、細胞のＣＤ１２７、ＣＤ４及びＣＤ２５の発現レベルを測定する、分析すること
を含み、前記サンプル中のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量が該サンプル中の調節性Ｔ細胞の量を示す方法。
【請求項２８】
前記病状又は前記感染が、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患若しくはアレルギー性疾患、又はそれらの素因、感染症又は癌を含む群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記治療が化学療法である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
霊長類の被験体の病状又は感染のための治療に対する反応を、該被験体の調節性Ｔ細胞の量に基づいて予測する方法であって、
（ａ）前記被験体から生物学的サンプルを得ること、及び
（ｂ）前記サンプル中の細胞を分析し、細胞のＣＤ１２７、ＣＤ４及びＣＤ２５の発現レベルを測定する、分析すること
を含み、前記サンプル中のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量が該サンプル中の調節性Ｔ細胞の量を示す方法。
【請求項３１】
（ａ）霊長類の被験体における調節性Ｔ細胞の前記過剰生産又は前記低生産、
（ｂ）霊長類の被験体における自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患若しくはアレルギー性疾患、又はそれらの素因、及び／又は
（ｃ）霊長類の被験体における調節性Ｔ細胞の量の変化に関連する疾患  
の診断で用いられるキットであって、
少なくともＣＤ１２７の細胞の発現レベルの分析のために少なくとも１つの薬剤を含むキット。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの薬剤が、少なくとも１つの抗ＣＤ１２７抗体及び／又はＣＤ１２７に対して特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドから選択される、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドの細胞の発現レベルを測定するための少なくとも１つの薬剤をさらに含む、請求項３１又は３２に記載のキット。
【請求項３４】
病状、感染又は治療の経過の間に、霊長類の被験体における調節性Ｔ細胞の量をモニタリングするのに用いられるキットであって、少なくともＣＤ１２７の細胞の発現レベルを分析するための少なくとも１つの薬剤を含むキット。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの薬剤が、少なくとも１つの抗ＣＤ１２７抗体及び／又はＣＤ１２７に対して特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドから選択される、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記病状又は前記感染が、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患若しくはアレルギー性疾患、又はそれらの素因、感染症又は癌を含む群から選択されてもよい、請求項３４又は３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記治療が化学療法である、請求項３４に記載のキット。
【請求項３８】
少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドの細胞の発現レベルを測定するための少なくとも１つの薬剤をさらに含む、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３９】
霊長類の被験体における病状又は感染のための治療に対する反応を、該被験体における調節性Ｔ細胞の量に基づいて予測するのに用いられるキットであって、少なくともＣＤ１２７の細胞の発現レベルの分析のための少なくとも１つの薬剤を含むキット。
【請求項４０】
調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を単離するための方法であって、
（ａ）霊長類の生物学的サンプル中の少なくとも１つの細胞を分析し、細胞のＣＤ１２７、ＣＤ４及びＣＤ２５の発現レベルを測定する、分析することであって、ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋の発現が調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を示す、分析すること、及び
（ｂ）前記少なくとも１つの細胞を単離することであって、該少なくとも１つの細胞がＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋である、単離すること
を含む方法。
【請求項４１】
前記分析する工程が、少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドについての細胞の発現レベルを測定することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を単離するための方法であって、
（ａ）霊長類の生物学的サンプル中の少なくとも１つの細胞を分析し、細胞のＣＤ１２７の発現レベルを測定する、分析することであって、該サンプル中の該少なくとも１つの細胞があらかじめＣＤ４及び／又はＣＤ２５の発現について分析されて、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ２５＋であることが明らかにされており、ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋の発現が調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を示す、分析すること、及び
（ｂ）前記少なくとも１つの該細胞を単離することであって、該少なくとも１つの細胞がＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋である、単離すること
を含む方法。
【請求項４３】
前記少なくとも１つの細胞があらかじめＣＤ４の発現について分析され、前記分析する工程が細胞のＣＤ２５の発現レベルを測定することをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１つの細胞があらかじめＣＤ２５の発現について分析され、前記分析する工程が細胞のＣＤ４の発現レベルを測定することをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記分析する工程が、少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドについての細胞の発現レベルを測定することをさらに含む、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
請求項４０〜４５のいずれか一項に記載の方法によって単離した場合の少なくとも１つの調節性Ｔ細胞。
【請求項４７】
請求項４０〜４５のいずれか一項に記載の方法によって単離した場合の少なくとも１つの調節性Ｔ細胞を使用する、調節性Ｔ細胞療法についての方法。
【請求項４８】
前記Ｔ細胞療法が、自己免疫性疾患、アレルギー性疾患、免疫炎症性疾患若しくは感染症、癌のための治療法又は臓器移植を含む群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、調節性Ｔ細胞の同定、定量及び医単離のための方法及びキットと、調節性Ｔ細胞量に基づいた、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患、アレルギー性疾患、それらの素因、感染症、癌の診断又はモニタリング、癌治療及び／又は臓器移植のための方法及びキットと、調節性Ｔ細胞量に基づいた、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患、アレルギー性疾患、それらの素因、感染症、癌のための治療法及び／又は臓器移植に対する反応を予測する方法及びキットと、単離した調節性Ｔ細胞を使用する治療法のための方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的サンプル中にある特異的な型の細胞の同定は、科学的、診断的、及び医学的努力についての根本的に重要な局面を含む。そのような同定を達成できる手段は、細胞の表面上で発現される分子の型の確認をしばしば必要とする。そのような細胞表面発現パターンは、当業者に既知の標準方法を使用して、典型的には或る特定の細胞表面分子に対して特異的な抗体への細胞の露出を伴って求めることができる。この目的に使用される抗体は、或る特定の波長の光による励起でシグナルを発する蛍光色素と直接又は間接的に結合することができる。このように、生物学的サンプルにおける特定の細胞集団の存在及び定量化を求めることが可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
細胞表面発現のパターンに基づいて、生物学的サンプルにおける免疫細胞の異なる集団を同定することができる場合には、そのような技術は免疫学分野内で特定の用途があることがわかる。例えば、多くのリンパ球がそれらの表面上でＣＤ４５を発現すること、並びにＴ細胞として既知のリンパ球の特定の集団がＴ細胞の活性化及び発生のレベルによって、ＣＤ４及びＣＤ２５を含む様々な他の細胞表面分子も発現することができることは既知である。
【０００４】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、免疫反応の生成及び自己免疫性疾患の抑制の両方において、根本的に重要なＴ細胞の不均一集団を含む。ＣＤ４＋Ｔ細胞の別個の亜集団は、ＣＤ２５及び転写因子Ｆｏｘｐ３も発現する。調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）として大まかに定義されたこの亜集団は、自己免疫寛容を維持するという点で極めて重要な役割を果たす（１）。Ｔｒｅｇの重要性のための最もよい証拠がマウスのモデルから生じるが、ますます多くの報告は、マスター調節因子のＦｏｘｐ３転写因子自体が欠損している非常に重症のＩＰＥＸ（免疫調節異常、多発性内分泌障害、腸疾患、及びＸ連鎖遺伝）症候群（１２）に加えて、様々な自己免疫性疾患（２〜８）、免疫炎症性疾患（９）及びアレルギー性疾患（１０、１１）のヒト患者におけるＴｒｅｇの数及び／又は機能の障害を概説した。Ｔｒｅｇ数の障害は、肝細胞癌（１３）及び頭頸部癌（１４）のような癌においても報告されている。
【０００５】
したがって、生物学的サンプル内のＴｒｅｇ集団を正確に同定し且つ定量する手段についての明確な必要性がある。しかしながら、特に抗原による感作を受けた（antigen-experienced）ＣＤ４＋Ｔ細胞の最大２０％がさらにＣＤ２５を発現するヒト末梢血中でＴｒｅｇを、ＣＤ２５＋の活性化されたメモリーＴ細胞と正確に区別することは、困難であることが証明された（１５）。Ｔ細胞集団の正確な識別の測定におけるそのような混乱が、曖昧な結果を報告するいくつかの研究をもたらした。例えば、いくつかの研究は、自己免疫の症状（２、３、８、１６）におけるＴｒｅｇ数の明らかな減少を実証したが、他の研究は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の正常数又は数の増加さえ示している（１７〜２０）。
【０００６】
本発明者らは、ＣＤ４５ＲＡ＋／ＲＯ−の発現に基づいて、ＣＤ２５＋の抗原による感作を受けた従来のＴ細胞の多くの集団から、胸腺に由来する成人のヒトナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の亜集団を区別することができることを示した（２１）。このナイーブＴｒｅｇ集団は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の若年患者において減少し、これらの患者におけるＴｒｅｇ産生の一次的欠損の存在と一致している（２２）。しかしながら、３８個の異なるモノクローナル抗体での本発明者らによる検査は、活性化／メモリーＣＤ４５ＲＡ−／ＲＯ＋Ｔ細胞から、ヒトＣＤ４５ＲＡ−／ＲＯ＋Ｔｒｅｇを分離するいかなる手段も提供しなかった（２１）。これらのモノクローナル抗体の多くは、ＣＤ４５ＲＡ−／ＲＯ＋Ｔｒｅｇの同定の正確な手段を提供すると以前に主張されたものである（１５、２３）。したがって、Ｔｒｅｇ集団を同定する改良方法についての必要性があることは明らかである。
【０００７】
抗原による感作を受けたＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔｒｅｇの両方はまたＣＤ２５も発現することができるので、ＣＤ４／ＣＤ２５の状態に基づいてＴｒｅｇを同定する従来の方法は不十分であり、データの誤った解釈、及び特定の病状と特定のＴ細胞集団との不正確な関連性についての可能性がもたらされる。実際は、アレルギー性疾患、自己免疫性疾患及び免疫炎症性疾患の患者が、Ｔｒｅｇの数又は機能に一次的欠損を有するか否かという問題を取り巻く論争の少なくとも一部は、Ｔｒｅｇの正確な同定における困難から生じる。ヒトＴｒｅｇによるＣＤ２５の構成的発現の範囲は、抗原による感作を受けた活性化／メモリーＣＤ４＋細胞の範囲と重なる。
【０００８】
さらにＦｏｘｐ３は、Ｔｒｅｇの発生に対して重要であるが、活性化Ｔ細胞によっても発現され、したがってＴｒｅｇと活性化／メモリーＣＤ４＋細胞との明確な選別を与えない（２４）。したって、正確にＴｒｅｇ集団を同定し且つ定量する改良方法についての必要性が明らかにある。
【０００９】
本発明は、Ｔｒｅｇ集団は、当該集団の表面上で発現されたＣＤ１２７のレベルを評価することにより正確に定義することができるという、本発明者らによる驚くべきそして思いもよらない発見に基づく。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の態様によれば、調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を同定する方法であって、霊長類の生物学的サンプル中の少なくとも１つの細胞を分析し、細胞のＣＤ１２７、ＣＤ４及びＣＤ２５の発現レベルを測定する、分析することを含み、ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋の発現が調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を示す方法が提供される。
【００１１】
分析する工程は、少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドについて細胞の発現レベルを測定することをさらに含んでもよい。少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、細胞表面に結合又は細胞内に存在してもよい。少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５を含んでもよい。
【００１２】
霊長類の生物学的サンプルは、細胞株又は体液又は組織を含んでもよい。体液又は組織血液、リンパ液、胸腺、リンパ節、脾臓、又は扁桃腺を含んでもよい。霊長類の生物学的サンプルは、少なくとも１つの単離リンパ球を含んでもよい。霊長類の生物学的サンプルは、少なくとも１つのＴ細胞を含んでもよい。
【００１３】
分析する工程は免疫測定法を含んでもよい。免疫測定法は酵素免疫測定法又は放射免疫測定法を含んでもよい。さらに又は或いは、分析する工程はフローサイトメトリーを含んでもよい。さらに又は或いは、フローサイトメトリー分析は蛍光活性化細胞選別を含んでもよい。
【００１４】
さらに又は或いは、細胞の発現レベルはポリメラーゼ連鎖反応によって測定されてもよい。ポリメラーゼ連鎖反応は定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応であってもよい。任意で、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応は蛍光活性化細胞選別後に行なわれてもよい。
【００１５】
一実施形態において、この方法は、
（ａ）ヒトの生物学的サンプルを得る工程と、
（ｂ）細胞表面のＣＤ１２７、ＣＤ４及びＣＤ２５に対する抗体と霊長類の生物学的サンプル中の少なくとも１つの細胞を接触させる工程と、
（ｃ）少なくとも１つの細胞をフローサイトメトリーにかける工程と、
（ｄ）ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋の発現のフローサイトメトリーのシグナルを分析する工程と
を含み、ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋の発現が調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を示す。
【００１６】
この方法は調節性Ｔ細胞を単離するために使用されてもよい。
【００１７】
この方法は、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患、アレルギー性疾患、それらの素因、感染症、癌の診断又はモニタリング、癌治療及び／又は臓器移植のために使用されてもよい。
【００１８】
この方法は、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患、アレルギー性疾患、それらの素因、感染症、癌のための治療及び／又は臓器移植に対する反応の予測のために使用されてもよい。
【００１９】
本発明の第２の態様によれば、調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を同定する方法であって、霊長類の生物学的サンプル中の少なくとも１つの細胞を分析し、細胞のＣＤ１２７の発現レベルを測定する、分析することを含み、サンプル中の少なくとも１つの細胞が、あらかじめＣＤ４及び／又はＣＤ２５の発現について分析されて、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ２５＋であることが明らかにされており、ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋の発現が、調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を示す方法が提供される。
【００２０】
少なくとも１つの細胞が、あらかじめＣＤ４の発現について分析される場合、分析する工程は細胞のＣＤ２５の発現レベルを測定することをさらに含む。
【００２１】
少なくとも１つの細胞が、あらかじめＣＤ２５の発現について分析される場合、分析する工程は細胞のＣＤ４の発現レベルを測定することをさらに含む。
【００２２】
分析する工程は、少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドについての細胞の発現レベルを測定することをさらに含んでもよい。少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、細胞表面に結合又は細胞内に存在してもよい。少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５を含んでもよい。
【００２３】
霊長類の生物学的サンプルは、細胞株又は体液又は組織を含んでもよい。体液又は組織は、血液、リンパ液、胸腺、リンパ節、脾臓又は扁桃腺を含んでもよい。霊長類の生物学的サンプルは、少なくとも１つの単離リンパ球を含んでもよい。霊長類の生物学的サンプルは、少なくとも１つのＴ細胞を含んでもよい。霊長類の生物学的サンプルは、少なくとも１つのＣＤ４＋Ｔ細胞、少なくとも１つのＣＤ２５＋Ｔ細胞又は少なくとも１つのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでもよい。
【００２４】
この方法は調節性Ｔ細胞を単離するために使用されてもよい。
【００２５】
この方法は、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患、アレルギー性疾患、それらの素因、感染症、癌の診断又はモニタリング、癌治療及び／又は臓器移植のために使用されてもよい。
【００２６】
この方法は、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患、アレルギー性疾患、それらの素因、感染症、癌のための治療及び／又は臓器移植に対する反応を予測するために使用されてもよい。
【００２７】
本発明の第３の態様によれば、霊長類の被験体において調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を同定するためのキットであって、少なくともＣＤ１２７の細胞の発現レベルを測定するための少なくとも１つの薬剤を含むキットが提供される。
【００２８】
少なくとも１つの薬剤は、少なくとも１つの抗ＣＤ１２７抗体及び／又はＣＤ１２７に対して特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドから選択されてもよい。
【００２９】
このキットは、霊長類の被験体において少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドの細胞の発現レベルを測定するために少なくとも１つの薬剤をさらに含んでもよい。少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５から成る群から選択されてもよい。
【００３０】
このキットは調節性Ｔ細胞を単離するために使用されてもよい。
【００３１】
このキットは、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患、アレルギー性疾患、それらの素因、感染症、癌の診断又はモニタリング、癌治療及び／又は臓器移植のために使用されてもよい。
【００３２】
このキットは、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患、アレルギー性疾患、それらの素因、感染症、癌のための治療及び／又は臓器移植に対する反応を予測するために使用されてもよい。
【００３３】
本発明の第４の態様によれば、霊長類の被験体において調節性Ｔ細胞の集団を同定するためのキットであって、少なくともＣＤ１２７の細胞の発現レベルを測定するための少なくとも１つの薬剤を含むキットが提供される。
【００３４】
少なくとも１つの薬剤は、少なくとも１つの抗ＣＤ１２７抗体及び／又はＣＤ１２７に対して特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドから選択されてもよい。
【００３５】
このキットは、霊長類の被験体において少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドの細胞の発現レベルを測定するために少なくとも１つの薬剤をさらに含んでもよい。少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５から成る群から選択されてもよい。
【００３６】
本発明の第５の態様によれば、霊長類の生物学的サンプル中の調節性Ｔ細胞の量を定量化する方法であって、サンプル中の細胞を分析し、細胞のＣＤ１２７及びＣＤ４及びＣＤ２５の発現レベルを測定する、分析することを含み、サンプル中のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量がサンプル中の調節性Ｔ細胞の量を示す方法が提供される。
【００３７】
分析する工程は、少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドについての細胞の発現レベルを測定することをさらに含んでもよい。少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、細胞表面に結合又は細胞内に存在してもよい。少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５を含んでもよい。
【００３８】
霊長類の生物学的サンプルは、細胞株又は体液又は組織を含んでもよい。体液又は組織は、血液、リンパ液、胸腺、リンパ節、脾臓又は扁桃腺を含んでもよい。霊長類の生物学的サンプルは、少なくとも１つの単離リンパ球を含んでもよい。霊長類の生物学的サンプルは、少なくとも１つのＴ細胞を含んでもよい。
【００３９】
分析する工程は免疫測定法を含んでもよい。免疫測定法は酵素免疫測定法又は放射免疫測定法を含んでもよい。さらに又は或いは、分析する工程はフローサイトメトリーを含んでもよい。さらに又は或いは、フローサイトメトリー分析は蛍光活性化細胞選別を含んでもよい。
【００４０】
さらに又は或いは、細胞の発現レベルはポリメラーゼ連鎖反応によって測定されてもよい。ポリメラーゼ連鎖反応は定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応であってもよい。任意で、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応は蛍光活性化細胞選別後に行なわれてもよい。
【００４１】
本発明の第６の態様によれば、霊長類の生物学的サンプル中の調節性Ｔ細胞の量を定量化する方法であって、細胞のＣＤ１２７の発現レベルを測定するためのサンプル中の分析細胞を含み、細胞があらかじめＣＤ４及び／又はＣＤ２５の発現について分析されて、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ２５＋であることが明らかにされており、サンプル中のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量がサンプル中の調節性Ｔ細胞の量を示す方法が提供される。
【００４２】
細胞があらかじめＣＤ４の発現について分析される場合、分析する工程は細胞のＣＤ２５の発現レベルを測定することをさらに含む。
【００４３】
細胞があらかじめＣＤ２５の発現について分析される場合、分析する工程は細胞のＣＤ４の発現レベルを測定することをさらに含む。
【００４４】
分析する工程は少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドについての細胞の発現レベルを測定することをさらに含んでもよい。少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、細胞表面に結合又は細胞内に存在してもよい。少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５を含んでもよい。
【００４５】
霊長類の生物学的サンプルは、細胞株又は体液又は組織を含んでもよい。体液又は組織は、血液、リンパ液、胸腺、リンパ節、脾臓又は扁桃腺を含んでもよい。霊長類の生物学的サンプルは、少なくとも１つの単離したリンパ球を含んでもよい。霊長類の生物学的サンプルは、少なくとも１つのＴ細胞を含んでもよい。霊長類の生物学的サンプルは、少なくとも１つのＣＤ４＋Ｔ細胞、少なくとも１つのＣＤ２５＋Ｔ細胞又は少なくとも１つのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでもよい。
【００４６】
本発明の第７の態様によれば、霊長類の被験体において、調節性Ｔ細胞の過剰生産又は低生産を診断する方法であって、
（ａ）上記被験体から生物学的サンプルを得ること、及び
（ｂ）サンプル中の細胞を分析し、細胞のＣＤ１２７、ＣＤ４及びＣＤ２５の発現レベルを測定する、分析すること
を含み、サンプル中の少量のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞が被験体の調節性Ｔ細胞の低生産を示し、サンプル中の多量のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞が被験体の調節性Ｔ細胞の過剰生産を示す方法が提供される。調節性Ｔ細胞の低生産は、炎症性腸疾患、又はその素因に関連してもよい。調節性Ｔ細胞の過剰生産は、癌又はウイルス感染に関連してもよい。癌は幹細胞癌であってもよい。ウイルス感染はＨＩＶであってもよい。
【００４７】
この方法は、少なくとも１つの対照サンプル中のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量と、霊長類の被験体から得られたサンプル中のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量を比較することを含んでもよい。典型的には対照サンプルは、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患、若しくはアレルギー性疾患、それらの素因、又は調節性Ｔ細胞の量の変化に関連する他の疾患をともなわない霊長類の被験体由来のサンプルであってもよい。
【００４８】
本発明の第８の態様によれば、霊長類の被験体において疾患を診断する方法であって、
（ａ）上記被験体から生物学的サンプルを得ること、及び
（ｂ）サンプル中の細胞を分析し、細胞のＣＤ１２７、ＣＤ４及びＣＤ２５の発現レベルを測定する、分析すること
を含み、サンプル中の少量のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞が被験体の疾患を示す方法が提供される。疾患が、炎症性腸疾患、全身性紅斑性狼瘡、乾癬性関節炎、若年性特発性関節炎、若年性糖尿病、川崎病、又は調節性Ｔ細胞の量の変化に関連する他の疾患であってもよい。
【００４９】
この方法は、少なくとも１つの対照サンプル中のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量と、霊長類の被験体から得られたサンプル中のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量を比較することを含んでもよい。典型的には対照サンプルは、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患、若しくはアレルギー性疾患、それらの素因、又は調節性Ｔ細胞の量の変化に関連する他の疾患をともなわない霊長類の被験体由来のサンプルであってもよい。
【００５０】
本発明の第９の態様によれば、病状、感染又は治療の経過の間に霊長類の被験体の調節性Ｔ細胞の量をモニタリングする方法であって、
（ａ）上記被験体から生物学的サンプルを得ること、及び
（ｂ）サンプル中の細胞を分析し、細胞のＣＤ１２７、ＣＤ４及びＣＤ２５の発現レベルを測定する、分析すること
を含み、サンプル中のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量がサンプル中の調節性Ｔ細胞の量を示す方法が提供される。
【００５１】
病状又は感染は、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患若しくはアレルギー性疾患、又はそれらの素因、感染症又は癌を含む群から選択されてもよい。
【００５２】
この治療は化学療法であってもよい。
【００５３】
この方法は、少なくとも１つの対照サンプル中のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量と、霊長類の被験体から得られたサンプル中のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量を比較することを含んでもよい。典型的には対照サンプルは、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患、若しくはアレルギー性疾患、それらの素因、感染症若しくは癌、又は調節性Ｔ細胞の量の変化に関連する他の疾患をともなわない霊長類の被験体由来のサンプルであってもよい。
【００５４】
本発明の第１０の態様によれば、霊長類の被験体の病状又は感染のための治療に対する反応を、被験体の調節性Ｔ細胞の量に基づいて予測する方法であって、
（ａ）上記被験体から生物学的サンプルを得ること、及び
（ｂ）サンプル中の細胞を分析し、細胞のＣＤ１２７、ＣＤ４及びＣＤ２５の発現レベルを測定する、分析すること
を含み、サンプル中のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量がサンプル中の調節性Ｔ細胞の量を示す方法が提供される。
【００５５】
病状又は感染は、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患若しくはアレルギー性疾患、又はそれらの素因、感染症又は癌を含む群から選択されてもよい。
【００５６】
この治療は化学療法であってもよい。
【００５７】
この方法は、少なくとも１つの対照サンプル中のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量と、霊長類の被験体から得られたサンプル中のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量を比較することを含んでもよい。典型的には対照サンプルは、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患、若しくはアレルギー性疾患、又はそれらの素因、感染症若しくは癌又は調節性Ｔ細胞の量の変化に関連する他の疾患をともなわない霊長類の被験体由来のサンプルであってもよい。
【００５８】
本発明の第１１の態様によれば、
（ａ）霊長類の被験体における調節性Ｔ細胞の過剰生産又は低生産、
（ｂ）霊長類の被験体における自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患若しくはアレルギー性疾患、又はそれらの素因、及び／又は
（ｃ）霊長類の被験体における調節性Ｔ細胞の量の変化に関連する疾患  
の診断で用いられるキットであって、
少なくともＣＤ１２７の細胞の発現レベルの分析のために少なくとも１つの薬剤を含むキットが提供される。
【００５９】
少なくとも１つの薬剤は、少なくとも１つの抗ＣＤ１２７抗体及び／又はＣＤ１２７に対して特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドから選択されてもよい。
【００６０】
このキットは、少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドの細胞の発現レベルを測定するために、少なくとも１つの薬剤をさらに含んでもよい。少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５から成る群から選択されてもよい。
【００６１】
本発明の第１２の態様によれば、病状、感染又は治療の経過の間に、霊長類の被験体における調節性Ｔ細胞の量をモニタリングするのに用いられるキットであって、少なくともＣＤ１２７の細胞の発現レベルを分析するための少なくとも１つの薬剤を含むキットが提供される。
【００６２】
少なくとも１つの薬剤は、少なくとも１つの抗ＣＤ１２７抗体及び／又はＣＤ１２７に対して特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドから選択されてもよい。
【００６３】
病状又は感染は、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患若しくはアレルギー性疾患、又はそれらの素因、感染症又は癌を含む群から選択されてもよい。
【００６４】
この治療は化学療法であってもよい。
【００６５】
このキットは、少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドの細胞の発現レベルを測定するために、少なくとも１つの薬剤をさらに含んでもよい。少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５から成る群  から選択されてもよい。
【００６６】
本発明の第１３の態様によれば、霊長類の被験体における病状又は感染のための治療に対する反応を被験体における調節性Ｔ細胞の量に基づいて予測するのに用いられるキットであって、少なくともＣＤ１２７の細胞の発現レベルを分析するための少なくとも１つの薬剤を含むキットが提供される。
【００６７】
少なくとも１つの薬剤は、少なくとも１つの抗ＣＤ１２７抗体及び／又はＣＤ１２７に対して特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドから選択されてもよい。
【００６８】
病状又は感染は、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患若しくはアレルギー性疾患、又はそれらの素因、感染症又は癌を含む群から選択されてもよい。
【００６９】
この治療は化学療法であってもよい。
【００７０】
このキットは、少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドの細胞の発現レベルを測定するために、少なくとも１つの薬剤をさらに含んでもよい。少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５から成る群から選択されてもよい。
【００７１】
本発明の第１４の態様によれば、調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を単離するための方法であって、
（ａ）霊長類の生物学的サンプル中の少なくとも１つの細胞を分析し、細胞のＣＤ１２７、ＣＤ４及びＣＤ２５の発現レベルを測定する、分析することであって、ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋の発現が調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を示す、分析すること、及び
（ｂ）上記少なくとも１つの細胞を単離することであって、当該少なくとも１つの細胞がＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋である、単離すること
を含む方法が提供される。
【００７２】
分析する工程は少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドについての細胞の発現レベルを測定することをさらに含んでもよい。少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、細胞表面に結合又は細胞内に存在してもよい。少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドはＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５を含んでもよい。
【００７３】
霊長類の生物学的サンプルは、細胞株又は体液又は組織を含んでもよい。体液又は組織は、血液、リンパ液、胸腺、リンパ節、脾臓又は扁桃腺を含んでもよい。霊長類の生物学的サンプルは、少なくとも１つの単離したリンパ球を含んでもよい。霊長類の生物学的サンプルは、少なくとも１つのＴ細胞を含んでもよい。
【００７４】
分析する工程はフローサイトメトリーを含んでもよい。さらに又は或いは、フローサイトメトリー分析は蛍光活性化細胞選別を含んでもよい。
【００７５】
一実施形態において、この方法は、
（ａ）霊長類の生物学的サンプルを得る工程と、
（ｂ）細胞表面のＣＤ１２７、ＣＤ４及びＣＤ２５に対する抗体と霊長類の生物学的サンプル内の少なくとも１つの細胞を接触させる工程と、
（ｃ）少なくとも１つの細胞をフローサイトメトリーにかける工程と、
（ｄ）ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋の発現についてフローサイトメトリーで分析する工程と、
（ｆ）蛍光活性化細胞選別によってＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を単離する工程と
を含み、ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋の発現が調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を示す。
【００７６】
本発明の第１５の態様によれば、調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を単離するための方法であって、
（ａ）霊長類の生物学的サンプル中の少なくとも１つの細胞を分析し、細胞のＣＤ１２７の発現レベルを測定する、分析することであって、サンプル中の少なくとも１つの細胞があらかじめＣＤ４及び／又はＣＤ２５の発現について分析されて、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ２５＋であることが明らかにされており、ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋の発現が調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を示す、分析すること、及び
（ｂ）上記少なくとも１つの細胞を単離することであって、当該少なくとも１つの細胞がＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋である、単離すること
を含む方法が提供される。
【００７７】
少なくとも１つの細胞があらかじめＣＤ４の発現について分析された場合、分析する工程は細胞のＣＤ２５の発現レベルを測定することをさらに含む。
【００７８】
少なくとも１つの細胞があらかじめＣＤ２５の発現について分析された場合、分析する工程は細胞のＣＤ４の発現レベルを測定することをさらに含む。
【００７９】
分析する工程は少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドについての細胞の発現レベルを測定することをさらに含んでもよい。少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、細胞表面に結合又は細胞内に存在してもよい。少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドはＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５を含んでもよい。
【００８０】
霊長類の生物学的サンプルは、細胞株又は体液又は組織を含んでもよい。体液又は組織は、血液、リンパ液、胸腺、リンパ節、脾臓又は扁桃腺を含んでもよい。霊長類の生物学的サンプルは、少なくとも１つの単離したリンパ球を含んでもよい。霊長類の生物学的サンプルは、少なくとも１つのＴ細胞を含んでもよい。霊長類の生物学的サンプルは、少なくとも１つのＣＤ４＋Ｔ細胞、少なくとも１つのＣＤ２５＋Ｔ細胞又は少なくとも１つのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含んでもよい。
【００８１】
本発明の第１６の態様によれば、第１４の態様又は第１５の態様の方法によって単離した場合に、少なくとも１つの調節性Ｔ細胞が提供される。
【００８２】
本発明の第１７の態様によれば、第１４の態様又は第１５の態様の方法によって単離した場合に、少なくとも１つの調節性Ｔ細胞を使用する調節性Ｔ細胞治療法のための方法が提供される。
【００８３】
定義
本明細書の文脈において、用語「含むこと」は、「主に包含するが、必ずしも単独では含まないこと」を意味する。さらに、「含む」及び「含む（三人称単数）」のような、単語「含むこと」の変形は、対応して意味を変える。
【００８４】
本明細書において使用されるような用語「発現」は、コードされたポリペプチド又はタンパク質を含む、遺伝子の発現又は遺伝子産物の発現を同じ意味で指す。遺伝子産物の発現は、ポリペプチドと結合する抗体（複数可）を使用して、例えば免疫測定法によって求められてもよい。或いは遺伝子の発現は、例えばｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）のレベルの測定によって求められてもよい。
【００８５】
本明細書において使用されるように、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって互いに結合したアミノ酸で構成されるポリマーを意味する。したがって用語「ポリペプチド」は、その範囲内に全長タンパク質及びその断片を含んでいる。
【００８６】
本明細書において使用されるように、用語「ポリヌクレオチド」は、ホスホジエステル骨格によって互いに結合したヌクレオチド残基で構成される核酸を意味する。したがってポリヌクレオチドは、その範囲内にＤＮＡ、ＲＮＡ及び特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含んでいる。
【００８７】
本明細書において使用されるように、用語「オリゴヌクレオチド」は、鋳型指示核酸合成の開始点として作用することができる一本鎖核酸を意味する。オリゴヌクレオチドは、典型的には２〜約５００塩基長にわたる一本鎖核酸である。オリゴヌクレオチドの正確な長さは特定の用途に従って変化するが、典型的には１５〜３０ヌクレオチドにわたる。オリゴヌクレオチドは、鋳型の正確な配列を反映する必要がないが、鋳型にハイブリダイズするのに十分に相補的でなくてはならず、それによって標的配列の優先的な増幅を促進する。したがってオリゴヌクレオチドを、ｍＲＮＡのような特定の遺伝子又は遺伝子産物に対して「特異的である」と呼ぶことは、必ずしも標的ポリヌクレオチドの正確な配列を反映せずに、その範囲内に優先的に鋳型にハイブリダイズするのに十分な配列の相補性を含むオリゴヌクレオチドを包含する。
【００８８】
本明細書において使用されるように、用語「Ｔｒｅｇ」は調節性Ｔ細胞（単数又は複数）を指す。
【００８９】
本明細書において使用されるように、用語「ｌｏｗ」又は「ｌｏ」は同じ意味で使用され、分析されているサンプルの全体を含む細胞の集団によるＣＤ１２７、ＣＤ４又はＣＤ２５のような特定の分子又はポリヌクレオチドの発現レベルと比較した場合、サンプル内の特定の細胞又は細胞の集団によるその分子又はポリヌクレオチドの発現レベルが低いことを指す。例えば、用語「ＣＤ１２７ｌｏｗ」は、分析されているサンプルの全体を含む細胞の集団によるＣＤ１２７の発現レベルと比較する場合、サンプル内の特定の細胞又は細胞の集団によるＣＤ１２７の発現レベルが低いことを指す。より詳細には、用語「ｌｏｗ」は、サンプル内の１つ又は複数の他の別個の集団により発現されたレベルよりも低いレベルで特定の分子を発現する別個の細胞の集団を指してもよい。同様に、用語「ｈｉｇｈ」又は「ｂｒｉｇｈｔ」は、同じ意味で使用され、対応する意味を有している。用語「ｉｎｔ」は、サンプル内の２つ以上の他の別個の集団により発現されたレベルの間にあるレベルで、特定の分子を発現する別個の細胞の集団を指してもよい。すなわち、発現レベルは、１つの他の別個の細胞の集団により発現されたレベルよりも低く、他の別個の細胞の集団により発現されるレベルよりも高い。
【００９０】
本明細書において使用されるように、特定の分子又はポリヌクレオチドの発現レベルに関連して使用される場合の用語「＋」は、分析されているサンプルの全体を含む細胞の集団によるＣＤ１２７、ＣＤ４又はＣＤ２５のような特定の分子又はポリヌクレオチドの発現レベルと比較する場合、サンプル内の特定の細胞又は細胞の集団によるその分子又はポリヌクレオチドの発現レベルが高いか又は中間であることを指す。例えば、用語「ＣＤ４＋」は、分析されているサンプルの全体を含む細胞の集団によるＣＤ４の発現レベルと比較する場合、サンプル内の特定の細胞又は細胞の集団によるＣＤ４の発現レベルが比較的高いか又は中間であることを指す。
【００９１】
本明細書において使用されるように、特定の分子又はポリヌクレオチドの発現レベルに関連して使用される場合の用語「−」は、分析されているサンプルの全体を含む細胞の集団によるＣＤ１２７、ＣＤ４又はＣＤ２５のような特定の分子又はポリヌクレオチドの発現レベルと比較する場合、サンプル内の特定の細胞又は細胞の集団によるその分子又はポリヌクレオチドの発現レベルが低いことを指す。例えば、用語「ＣＤ４−」は、分析されているサンプルの全体を含む細胞の集団によるＣＤ４の発現レベルと比較する場合、サンプル内の特定の細胞又は細胞の集団によるＣＤ４の発現レベルが低いことを指す。
【００９２】
本明細書において使用されるように、用語「ｌｏｗ」又は「ｌｏ」が、分析されているサンプルの全体を含む細胞の量と比較される場合、ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞のような生物学的サンプル中の特定の細胞の量が少ないことを指してもよい。さらに又は或いは、用語「ｌｏｗ」は、分析されているサンプルの全体に関して対照サンプルと比較された場合、ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞のようなサンプル中の特定の細胞の量の比率が低いことを指してもよい。典型的には、対照サンプルは、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患若しくははアレルギー性疾患、又はそれらの素因のない被験体由来のサンプルであってもよい。「ｈｉｇｈ」又は「ｂｒｉｇｈｔ」という用語は対応する意味を有する。
【００９３】
これより本発明の実施形態は、添付の図面に関して、例示のみのために記述される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９４】
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞により発現された表面分子に対するモノクローナル抗体の多量のパネルを検査することにより、本発明者らは、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）及びリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を使用して、ＣＤ１２７の発現が、Ｔｒｅｇ及び活性化／メモリー細胞の特質を備えたそれぞれ２つの集団へとヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を分けることを示した。ＣＤ１２７の発現についてのゲート（gating）は、さらにＣＤ４５ＲＯの発現にまだ変換していない従来の活性化Ｔ細胞からのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔｒｅｇの分離において、より明瞭にすることができる。この驚くべきそして思いもよらない発見は、本発明者らによる、他の３８個のマーカーの多くがマウスのサンプルにおいてＴｒｅｇを効果的に分離するが、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＴｒｅｇとＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＯ＋活性化／メモリー細胞との分離を提供しなかったという事前の検査とは対照的であると思われる（図１及び参考文献２０）。さらに、事前の研究はマウス調節性Ｔ細胞の表面上にＣＤ１２７の低レベルの発現を示唆しているが（２５、２６）、典型的にはマーカーはマウスＴ細胞サンプルとヒトＴ細胞サンプルとの間で明確に異なる発現パターンを示し（図１Ｃを参照）、それにより予測不能な種間の推定を与える。さらに認められている考え方に反して、本発明者らは、マウスＣＤ４＋Ｔｒｅｇと非Ｔｒｅｇとの間のＣＤ１２７の発現の発表されている差は、ＣＤ１２７を単独で使用して２つの集団を正確にゲートするのためには、明らかに不十分であること、及びさらにマウスＣＤ４＋Ｔ細胞を共染色するためのＣＤ２５及びＣＤ１２７の使用は、Ｔｒｅｇと非Ｔｒｅｇとを区別する点ではＣＤ２５単独の使用を超える利点はないことを実証した（２５、２６）。
【００９５】
したがって本発明は、一般に霊長類においてＣＤ１２７の発現に基づいて、ＣＤ２５＋の従来のＣＤ４＋Ｔ細胞からＴｒｅｇを単離するための戦略に関する。本明細書において例示されるように、ＣＤ４及びＣＤ２５についてのゲート、又はＣＤ４５アイソフォームについてのゲートの追加と併用して、ＣＤ１２７の発現に対する細胞表面染色を適用することができる。ゲート戦略の有効性は３つの方法により確認された。第１に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの抑制分析は、ＣＤ１２７の発現がＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を抑制活性があるＣＤ１２７ｌｏ細胞の２つの集団に分けるが、ＣＤ１２７ｈｉ細胞は分けないことを示した。第２に、ＦｏｘＰ３に対する抗体による染色は、ヒト末梢リンパ系組織に由来した複数サンプルのＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞とＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞との間で、８５％超の相関性があることを示した。第３に、ＲＴ−ｑＰＣＲは、Ｔｒｅｇ集団を表わすと判断されたサンプルにおける高レベルのＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡ発現を示した。この戦略を使用して、本発明者らは、ＣＤ４５ＲＡ陽性の細胞又はＣＤ４５ＲＡ陰性細胞のいずれかの中のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇが、ＣＤ４５アイソフォームの発現について匹敵するＣＤ１２７ｈｉＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞よりも、少なくとも１０倍超のＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡを発現したことを実証した。
【００９６】
したがって、本発明は、調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を同定するため、調節性Ｔ細胞の量を定量化するため、及びさらなる研究又は治療における使用のために生存可能な調節性Ｔ細胞を分離するための方法を提供する。この方法は、細胞のＣＤ１２７、ＣＤ４及び／又はＣＤ２５の発現レベルについて分析することを含んでもよく、ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋の発現が調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を示す。
【００９７】
この方法は調節性Ｔ細胞を単離するために使用されてもよい。単離した調節性Ｔ細胞は、様々な目的に使用されてもよく、養子Ｔ細胞移入又は自己Ｔ細胞移入のための多くの調節性Ｔ細胞を増幅する細胞培養を含むが、これに限定されず、増幅又は前増幅された細胞培養物からの特定のＴ細胞サブセットを選択することを含んでもよいし、又は含んでなくてもよい。単離した調節性Ｔ細胞は、後日の被験体の治療のために保存されてもよい。
【００９８】
この方法は、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患、アレルギー性疾患、それらの素因、感染症、癌の診断又はモニタリング、癌治療及び／又は臓器移植のために使用されてもよい。
【００９９】
この方法は、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患、アレルギー性疾患、それらの素因、感染症、癌のための治療及び／又は臓器移植に対する反応を予測するために使用されてもよい。
【０１００】
当業者は、分析されている生物学的サンプルの正確な性質を説明するために、本発明の方法が変えられてもよいことを容易に認識するだろう。例えば生物学的サンプルが、任意のタンパク質又はポリヌクレオチドの発現についてあらかじめ分析されていないＴ細胞の集団を含む場合には、この方法は少なくともＣＤ１２７、ＣＤ４及びＣＤ２５の発現について分析することを含んでもよい。しかしながら生物学的サンプルが、ＣＤ４及び／又はＣＤ２５の発現についてあらかじめ分析されているＴ細胞の集団を含む場合には、この方法はＣＤ１２７及びＣＤ２５、又はＣＤ１２７及びＣＤ４についてのみ、それぞれ分析することを含んでもよい。すべての場合において、本発明の方法は、例えばＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５のような、他のタンパク質又はポリヌクレオチドの細胞の発現レベルについて分析することによって、調節性Ｔ細胞の識別又は調節性Ｔ細胞の量をさらに確認する他の方法と併用して使用されてもよい。
【０１０１】
当業者は、本発明の方法がさらに例えばＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５のような、他のタンパク質又はポリヌクレオチドの細胞の発現レベルについて分析することによって、調節性Ｔ細胞の識別又は量をさらに確認する他の方法と併用して使用されてもよいことを容易に認識するだろう。
【０１０２】
さらに本発明者らは、４３人の対照と比較して、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の３８人の患者に対してＣＤ４／ＣＤ２５／ＣＤ４５ＲＡ／ＣＤ１２７ゲート戦略を適用した。従来のようにゲートされたＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ中の高い変動率（免疫炎症性症状を患う患者において特に明らかである）は、特に潰瘍性大腸炎の患者におけるＣＤ１２７ｈｉＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞汚染の同定により減少した。ＩＢＤ患者と正常対照との比較のためのＣＤ４／ＣＤ２５／ＣＤ４５ＲＡ／ＣＤ１２７染色及びゲート戦略の使用は、患者においてＴｒｅｇとして同定された多くの細胞が存在したことを示しただけではなく、一貫してＴｒｅｇのＣＤ４５ＲＡ＋サブセットが減少することを示した。この減少は、ＩＢＤ発症のピーク年齢に対応する１５〜３０歳間での患者において特に明らかであった。ＣＤ１２７細胞表面染色戦略の使用は、これまでに活性化細胞によるＣＤ２５ゲートの汚染に起因した患者間の変動率の多くを取り除き、調節性Ｔ細胞の真の数の正確な推測を直接ｅｘ  ｖｉｖｏで可能にした。
【０１０３】
さらに本発明者らは、臍帯血サンプルと若年者及び高齢者の末梢血との間のＴｒｅｇ数及び機能を比較し、ＣＤ１２７染色を使用して、Ｔｒｅｇの機能的な活性がＣＤ４５ＲＡ発現からＣＤ４５ＲＯ＋ＲＡ−表現型の発現への移行の間、不変のままであることを実証した。
【０１０４】
さらにＴｒｅｇの同定におけるＣＤ１２７の使用のための実験的支持も、アルツハイマー病、重症のアトピー性湿疹、喘息、シェーグレン症候群、ＨｌＶ及び黒色腫を含む、様々な他の疾患モデルを使用して、本発明者らにより実証され、それによって病状範囲の診断におけるＣＤ１２７の使用を実証した。
【０１０５】
重要なことには本発明者らは、ＣＤ１２７を使用したＴｒｅｇの同定に基づいて、透析あり又は透析なしの腎移植患者対慢性腎不全患者における循環Ｔｒｅｇ数をさらに測定し、それによって治療に対する反応性のモニタリングにおけるＣＤ１２７の使用をさらに実証した。
【０１０６】
特に本発明者らは、１８人の原発性シェーグレン症候群の患者及び１７人の年齢及び性別が一致した対照由来の末梢血白血球に対してＣＤ４／ＣＤ２５／ＣＤ４５ＲＡ／ＣＤ１２７ゲート戦略を適用し、年齢とは無関係に原発性シェーグレン症候群の群において、ナイーブＴｒｅｇ数及び全Ｔｒｅｇ数の両方が増加することを実証した。皮膚プリックテスト陽性及びイエダニ抗原による刺激に応じてｉｎ  ｖｉｔｒｏでインターロイキン−５を分泌した９人の喘息患者において、ナイーブＴｒｅｇのパーセンテージは有意に増加した。６人の重症のアトピー性湿疹の患者及び７人の対照におけるＣＤ４／ＣＤ２５／／ＣＤ１２７戦略の使用は、全Ｔｒｅｇ細胞の２．５倍の増加を示した。原発性シェーグレン症候群、アトピー性湿疹及びアトピー性喘息はすべて、特定物質に対する抗体の異常な産生を含む。それゆえ抗体産生に関連した免疫病は、したがって異常に高い数のＴｒｅｇ細胞（特にナイーブＴｒｅｇ細胞）に関連しているかもしれない。
【０１０７】
さらに、本発明者らはＨＩＶに感染した患者からの末梢血白血球に対してＣＤ４／ＣＤ２５／ＣＤ４５ＲＯ／ＣＤ１２７ゲート戦略を適用した。一次感染をともなう患者（セロコンバータ（seroconverters：血清転換者））、及び治療を受けない群と抗レトロウイルスの薬剤による治療を受けた群へさらに分けられた慢性病をともなう患者、及び免疫再構築症候群（ＩＲＤ）を発症し抗レトロウイルスの薬剤で治療された患者の４つの群の患者が検討された。ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔｒｅｇの数はＩＲＤの患者において増加し、これは疾患病理に関連しているかもしれない。さらに、ナイーブＴｒｅｇは急性一次疾患の患者において過剰に存在した。したがって、この方法は感染症のＴｒｅｇ数における異常を定義するために使用することができる。
【０１０８】
免疫抑制療法を受ける腎移植のレシピエントにおいて、ＣＤ４／ＣＤ２５／ＣＤ４５ＲＡ／ＣＤ１２７ゲート戦略は、ＣＤ４５ＲＡ−Ｔｒｅｇの数が有意に減少したが、ＣＤ４５ＲＡ＋の数が有意に減少しなかったことを示した。したがって、この方法は移植及び免疫抑制療法を受ける患者においてＴｒｅｇ数をモニタリングするために使用することができる。
【０１０９】
黒色腫の患者において、ＣＤ４／ＣＤ２５／ＣＤ１２７ゲート戦略は、ワクチン接種治験の経過の全体にわたってＴｒｅｇ数を追跡するために適用された。
【０１１０】
同じ抗体の組み合わせもマカクのようなヒト以外の霊長類においてＴｒｅｇを定量するために使用され、それによってヒトだけでなく他の霊長類に対して本明細書において開示された方法の適用可能性を実証した。
【０１１１】
したがって、本発明は、被験体において調節性Ｔ細胞の過剰生産又は低生産を診断する方法であって、生物学的サンプル中のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋を発現する細胞の量が、被験体の調節性Ｔ細胞の過剰生産又は低生産を示す方法をさらに提供する。
【０１１２】
本発明は、被験体における自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患若しくはアレルギー性疾患、又は調節性Ｔ細胞量の変化に関連する疾患、又はそれらの素因を診断するための方法であって、被験体からの生物学的サンプルを分析し、生物学的サンプル中のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋を発現する細胞の量を求める、分析することを含み、サンプル中の少量のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞が、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患若しくはアレルギー性疾患、調節性Ｔ細胞量の変化に関連する疾患、又はそれらの素因を示す方法をさらに提供する。
【０１１３】
本発明は、病状、感染又は治療の経過の間に被験体の調節性Ｔ細胞の量をモニタリングする方法であって、当該被験体から生物学的サンプルを得ること、及びサンプル中の細胞を分析し、細胞のＣＤ１２７、ＣＤ４及びＣＤ２５の発現レベルを測定する、分析することを含み、サンプル中のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量がサンプル中の調節性Ｔ細胞の量を示す方法をさらに提供する。
【０１１４】
本発明は、被験体の病状又は感染のための治療に対する反応を、被験体の調節性Ｔ細胞の量に基づいて予測する方法であって、当該被験体から生物学的サンプルを得ること、及びサンプル中の細胞を分析し、細胞のＣＤ１２７、ＣＤ４及びＣＤ２５の発現レベルを測定する、分析することを含み、サンプル中のＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量が、サンプル中の調節性Ｔ細胞の量を示す方法をさらに提供する。
【０１１５】
本発明は、調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団の同定ためのキットであって、少なくともＣＤ１２７の細胞の発現レベルを測定するために生物学的サンプルの中の少なくとも１つの細胞を分析するための薬剤（複数可）を含むキットをさらに提供する。このキットは、例えばＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５のような、他の細胞タンパク質又はポリヌクレオチドの細胞の発現レベルについて分析することによって、調節性Ｔ細胞をさらに識別するためにさらなる薬剤を含んでもよい。このキットも分析されている生物学的サンプルの正確な性質を説明するために変更されてもよい。例えば生物学的サンプルは、あらかじめＣＤ４及び／又はＣＤ２５の発現について分析されている、又は分析されていないＴ細胞の集団を含んでもよい。
【０１１６】
このキットは、調節性Ｔ細胞を単離するために使用されてもよい。単離した調節性Ｔ細胞は、様々な目的に使用されてもよく、養子Ｔ細胞移入又は自己Ｔ細胞移入のための多くの調節性Ｔ細胞を増幅する細胞培養を含むが、これに限定されず、増幅又は前増幅された細胞培養物からの特定のＴ細胞サブセットを選択することを含んでもよいし、又は含んでなくてもよい。単離した調節性Ｔ細胞は、後日の被験体の治療のために保存されてもよい。
【０１１７】
このキットは、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患、アレルギー性疾患、それらの素因、感染症、癌の診断又はモニタリング、癌治療及び／又は臓器移植のために使用されてもよい。
【０１１８】
このキットは、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患、アレルギー性疾患、それらの素因、感染症、癌のための治療及び／又は臓器移植に対する反応を予測するために使用されてもよい。
【０１１９】
したがって、本発明は、調節性Ｔ細胞の過剰生産若しくは低生産、自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患若しくはアレルギー性疾患、調節性Ｔ細胞量の変化に関連している疾患、或いは自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患若しくはアレルギー性疾患、又は調節性Ｔ細胞量の変化に関連している疾患を診断するのに使用するためのキットであって、生物学的サンプルの中の少なくとも１つの細胞の少なくともＣＤ１２７の発現を分析するための薬剤（複数可）を含むキットも提供する。
【０１２０】
本発明は、病状、感染又は治療の経過の間に被験体の調節性Ｔ細胞の量のモニタリングするのに使用するためのキットであって、少なくともＣＤ１２７の細胞の発現レベルを分析するために少なくとも１つの薬剤を含むキットも提供する。
【０１２１】
本発明は、被験体の病状又は感染のための治療に対する反応を、被験体の調節性Ｔ細胞の量に基づいて予測するのに使用するキットであって、少なくともＣＤ１２７の細胞の発現レベルを分析するのために少なくとも１つの薬剤を含むキットをさらに提供する。
【０１２２】
本発明は、調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を単離するための方法であって、生物学的サンプルの中の少なくとも１つの細胞を分析し、細胞のＣＤ１２７、ＣＤ４及びＣＤ２５の発現レベルを測定する、分析することを含み、ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋の発現が調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団及び単離された当該少なくとも１つの細胞を示し、当該少なくとも１つの細胞がＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋である方法をさらに提供する。
【０１２３】
分析する工程は、少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドについての細胞の発現レベルを測定することをさらに含んでもよい。少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、細胞表面に結合又は細胞内に存在してもよい。少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５を含んでもよい。
【０１２４】
当業者は、単離された調節性Ｔ細胞が、Ｔｒｅｇ数の増大、トランスフェクション及び／又は形質転換のようなｉｎ  ｖｉｔｒｏの操作を含む（これらに限定されない）様々な用途に使用されてもよいことを認識するだろう。単離されたＴｒｅｇについての他の用途は、内因性のＴｒｅｇの低発現又はＴｒｅｇの異常発現を伴う疾患に対する治療のために被験体の中へのＴｒｅｇの注入を含んでもよい。したがって単離されたＴｒｅｇは、そのような治療の一部として、自己Ｔｒｅｇ移入及び／又はＴｒｅｇの養子移入に使用されてもよいことは明らかである。
【０１２５】
単離したＴｒｅｇは、Ｔｒｅｇトランスクリプトームの定義、Ｔｒｅｇ同定のためのｍＲＮＡのプロファイリング又は抗体の調製、及び／又は機能的阻害のためにも使用されてもよいことは、当業者によりさらに認識されるだろう。
【０１２６】
本発明は、調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団を単離する方法であって、生物学的サンプルの中の少なくとも１つの細胞の分析し、細胞のＣＤ１２７の発現レベルを測定する、分析することを含み、サンプルの中の少なくとも１つの細胞があらかじめＣＤ４及び／又はＣＤ２５の発現について分析されて、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ２５＋であることが明らかになっており、ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋の発現が調節性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞の集団及び単離された当該少なくとも１つの細胞を示し、当該少なくとも１つの細胞がＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ２５＋である方法をさらに提供する。少なくとも１つの細胞があらかじめＣＤ４の発現について分析される場合、分析する工程は細胞のＣＤ２５の発現レベルを測定することをさらに含む。少なくとも１つの細胞があらかじめＣＤ２５の発現について分析される場合、分析する工程は細胞のＣＤ４の発現レベルを測定することをさらに含む。
【０１２７】
分析する工程は、少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドについての細胞の発現レベルを測定することをさらに含んでもよい。少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、細胞表面に結合又は細胞内に存在してもよい。少なくとも１つの追加の細胞のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５を含んでもよい。
【０１２８】
本明細書において開示された方法により単離した場合、本発明は少なくとも１つの調節性Ｔ細胞をさらに提供する。
【０１２９】
本発明は、本明細書において開示された方法により単離した場合、少なくとも１つの調節性Ｔ細胞を使用する調節性Ｔ細胞治療法のための方法をさらに提供する。
【０１３０】
当業者は、調節性Ｔ細胞が、血液、リンパ液若しくは胸腺を含む（これらに限定されない）様々な細胞株又は体液又は組織中に同定、定量化及び／又は単離されてもよいことを認識するだろう。
【０１３１】
本発明の特定の実施形態は、ＣＤ１２７、ＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５の発現の検出、並びにＴｒｅｇレベルの測定のために、他の分子なしで又は他の分子と共に、ＣＤ１２７、ＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５に対して作製された１つ又は複数の抗体の使用を提供する。抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってもよく、抗原としてＣＤ１２７、ＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５若しくはその抗原性断片又はその部分の使用により作製されてもよい。抗体結合は、ＣＤ１２７一次抗体、ＣＤ４一次抗体、ＣＤ２５一次抗体、Ｆｏｘｐ３一次抗体、ＣＴＬＡ−４一次抗体及び／又はＣＤ９５一次抗体に対する検出可能な標識によって検出されてもよい。或いは、抗ＣＤ１２７抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗Ｆｏｘｐ３抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体及び／又は抗ＣＤ９５抗体は、検出を可能にするために適切に標識される二次抗体又は試薬による結合によって検出されてもよい。様々な方法は、免疫測定法での結合の検出について当技術分野において既知であり、本発明の範囲内である。例えば、ＣＤ１２７、ＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５レベルの測定は、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチ免疫測定法、免疫放射定量測定法（ＩＲＭＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫電気泳動測定法、ｉｎ  ｓｉｔｕ免疫測定法、免疫拡散測定法、免疫蛍光測定法、ウェスタンブロット、リガンド結合測定法等を含む、当技術分野において既知の多くの技法のうちのいずれか１つにより達成することができる。或いは、ＣＤ１２７、ＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５レベルの測定は、上で記述されるような抗ＣＤ１２７抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗Ｆｏｘｐ３抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体及び／又は抗ＣＤ９５抗体を使用して、フローサイトメトリー（蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含んでいてもよいし、又は含んでいなくてもよい）により達成することができる。
【０１３２】
本発明の方法における使用のために適切な抗体は、当技術分野において既知の技法を使用してＣＤ１２７に対して作製することができる。適切な抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、及びＦａｂ発現ライブラリーを含むが、これらに限定されない。
【０１３３】
適切な抗体は、ＣＤ１２７、ＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５ポリペプチドの不連続部位又は断片から調製されていてもよい。抗原性のＣＤ１２７、ＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５のポリペプチドは、少なくとも約５アミノ酸、及び典型的には少なくとも約１０アミノ酸を含む。
【０１３４】
適切な抗体の生成のための方法は、当業者により容易に認識されるだろう。例えば、典型的にはＦａｂ部分を含む、抗ＣＤ１２７モノクローナル抗体、抗ＣＤ４モノクローナル抗体、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体、抗Ｆｏｘｐ３モノクローナル抗体、抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体及び／又は抗ＣＤ９５モノクローナル抗体は、抗体−実験用マニュアル（Antibodies-A Laboratory Manual）、 Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. （1988）に記述されているハイブリドーマ技術を使用して調製されていてもよい。本質的には、ＨｂＡ１、その断片又はそのアナログに対するモノクローナル抗体の調製において、培養における継続的な細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技法が使用されてもよい。これらは、Kohler et al., Nature, 256:495-497 （1975）によりもとは開発されたハイブリドーマ技法、並びにトリオーマ技法（ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法）［Kozbor et al., Immunology Today, 4:72 （1983）］、及びヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢＶハイブリドーマ技法［Cole et al, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., （1985）］を含む。不死化抗体産生細胞株は、腫瘍形成性のＤＮＡによるＢリンパ球の直接的な形質転換、又はエプスタインバーウイルスによるトランスフェクションのような、融合以外の技法により作製することができる。例えば、M. Schreier et al.著「ハイブリドーマ技法（Hybridoma Techniques）」（1980）、Hammerling et al.著「モノクローナル抗体及びＴ細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas）」（1981）、Kennett et al.著「モノクローナル抗体（Monoclonal Antibodies）」（1980）を参照。
【０１３５】
本発明を実行するのに役立つモノクローナル抗体は、適切な抗原特異性の抗体分子を分泌するハイブリドーマを含む培養液から成るモノクローナルハイブリドーマ培養を開始することによって産生することができる。培養は、ハイブリドーマが培地へ抗体分子を分泌するのに十分な条件下で、且つ十分な期間維持される。次に、抗体含有培地を回収する。次に、抗体分子を周知の技法によりさらに単離してもよい。
【０１３６】
同様に、ポリクローナル抗体、若しくはその断片又はそのアナログの産生のために使用されてもよい当技術分野において既知の様々な手順がある。ポリクローナル抗体の産生のために、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどを含む（これらに限定されない）様々な宿主動物は、ＣＤ１２７ポリペプチド、ＣＤ４ポリペプチド、ＣＤ２５ポリペプチド、Ｆｏｘｐ３ポリペプチド、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド及び／又はＣＤ９５ポリペプチド、若しくはその断片又はそのアナログによる注射により免疫付与することができる。さらに、ＣＤ１２７ポリペプチド、ＣＤ４ポリペプチド、ＣＤ２５ポリペプチド、Ｆｏｘｐ３ポリペプチド、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド及び／又はＣＤ９５ポリペプチド若しくは断片又はそのアナログは、免疫原性キャリア、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）に結合することができる。さらに、免疫反応を増加するためにフロインド（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノール、並びにＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）及びコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）のような潜在的に有用なヒトアジュバントを含む（これらに限定されない）様々なアジュバントが使用されてもよい。
【０１３７】
所望の抗体のためのスクリーニングも当技術分野において既知の様々な技術により達成することができる。抗体の免疫特異的な結合のための測定法は、放射免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、サンドイッチ免疫測定法、免疫放射定量測定法、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散測定法、ｉｎ  ｓｉｔｕ免疫測定法、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集反応測定法、補体結合測定法、免疫蛍光測定法、プロテインＡ測定法、及び免疫電気泳動測定法等を含んでもよいが、これらに限定されない（例えば、Ausubel et al., eds, 1994,著「分子生物学における最新のプロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照）。
【０１３８】
さらに又は或いは、ＣＤ１２７、ＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５のレベルの測定は、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むＰＣＲにより達成することができ、そのようなＰＣＲにおける使用のためのＣＤ１２７、ＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５をコードするポリヌクレオチドに対して特異的なプライマーが当業者によって容易に設計できる。
【０１３９】
典型的には、本発明の方法によれば、ポリヌクレオチド発現の分析はＰＣＲ増幅により行なわれる。増幅産物は、核酸シークエンシングによりさらに分析されてもよい。ＰＣＲ増幅は、細胞から抽出されたポリヌクレオチドで行なわれてもよく、或いは配列は、事前のポリヌクレオチドを精製する工程の必要なく直接増幅されてもよい。
【０１４０】
ＰＣＲ増幅反応、続く断片の解像及び核酸シークエンシングのために用いられる方法及び試薬は、当業者に周知である。各々の場合において、適切なプロトコル及び試薬は主として個々の状況に依存する。指導書は、様々な出典、例えばSambrook et al.著「分子クローニング：実験用マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」, Cold Spring Harbor, New York, 1989、及びAusubel et al.著「分子生物学における最新のプロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」, Greene Publ. Assoc, and Wiley-Intersciences, 1992のようなものから得られてもよい。当業者は、所望の産物を得る能力に影響せずに、これらの手順の様々なパラメーターが変更されてもよいことを容易に認識するだろう。例えば、ＰＣＲ増幅の場合には、塩濃度は変更されてもよく、又は変性工程、アニーリング工程及び伸張工程の１つ又は複数の時間及び／又は温度が変更されてもよい。同様に、鋳型として使用されるポリヌクレオチドの量も、利用可能なポリヌクレオチドの量又は効率的な増幅のために必要な最適量の鋳型に依存して変更されてもよい。
【０１４１】
典型的には本発明の方法及びキットで用いられるためのオリゴヌクレオチドは、一般的には１５〜３０の塩基長のオリゴヌクレオチドである。そのようなオリゴヌクレオチドは、例えば適切な配列の直接化学合成又はクローニング及び制限を含む任意の適切な方法により調製することができる。オリゴヌクレオチド中のすべての塩基が、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする鋳型分子の配列を反映する必要はなく、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが鋳型にハイブリダイズすることを可能にするのに十分な相補的な塩基を含むことだけが必要である。オリゴヌクレオチドは、鋳型中の塩基に相補的ではないが、むしろ塩基の伸張又は増幅に際してポリヌクレオチドへ変化を取り込むように設計されている塩基である、１つ又は複数の位置でのミスマッチ塩基を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、増幅されたポリヌクレオチドのクローニングを促進するために、例えば５'末端での制限酵素認識配列の形で追加の塩基を含んでもよい。
【０１４２】
Ｔｒｅｇレベルを測定する本発明の方法は、対象となる被験体、例えば自己免疫性疾患、免疫炎症性疾患若しくはアレルギー性疾患、又はＴｒｅｇ量の変化に関連する疾患に罹患した疑いのある個体、或いはそれらの素因を有する個体から得られたサンプル中のＴｒｅｇのレベルを、１つ又は複数の対照サンプル由来のＴｒｅｇのレベルと比較する工程を含んでもよい。典型的には、対照サンプルは、正常レベルのＴｒｅｇを有する被験体由来のサンプルであってもよい。
【０１４３】
本発明は、Ｔｒｅｇレベルの測定のためのキットも提供し、キットが本発明の方法の利用を促進する。典型的には、本発明の方法を行なうためのキットは、この方法を行なうために必要な試薬をすべて含んでいる。例えば、一実施形態において、このキットは、ＣＤ１２７、ＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５に対して作製された抗体を含む第１の容器と、検出可能な標識と共に抗体の結合パートナーから成る結合物を含む第２の容器とから成ってもよい。
【０１４４】
典型的には、上で記述されたキットはまた、例えば、洗浄試薬、及び／又は、結合された抗体の存在を定量的に検出することができる他の試薬を含む、１つ又は複数の他の容器から成る。好ましくは、検出試薬は標識された（二次）抗体を含むか、又はＣＤ１２７、ＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＣＤ９５に対して作製された抗体自体が標識された場合には、コンパートメントは、標識された抗体と反応することができる抗体結合試薬から成る。
【０１４５】
本発明の文脈において、コンパートメント化された（compartmentalised：区画化）キットは、試薬が別々の容器に含まれており、小さなガラス容器、プラスチックの容器、又はプラスチック若しくは紙のストリップを含んでもよい任意のキットを含む。そのような容器は、サンプル及び試薬の二次汚染（cross-contamination）を回避しながら１つのコンパートメントから他のコンパートメントへの試薬の効率的な移行、及び定量的様式で１つのコンパートメントから他のコンパートメントへの各々の容器の薬剤又は溶液の追加を可能にし得る。そのようなキットはまた、試験サンプルを受け入れる容器と、分析で使用する抗体（複数可）を含む容器と、洗浄試薬（リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝液等のような）含む容器と、検出試薬を含む容器とを含んでもよい。
【０１４６】
典型的には本発明のキットは、適切な方法を行うようにキット構成要素を使用するための取扱説明書も含む。
【０１４７】
本発明の方法及びキットは、ヒト及び、例えばヒト以外の霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、トリ、ネコ及びイヌの種を含む他の動物を含む任意の動物に、等しく適用可能である。したがって、異なる種への応用については、本発明の単一のキットが適用可能であってもよく、又は或いは、例えば各々の個々の種に対して特異的な試薬を含む異なるキットが必要であってもよい。
【０１４８】
本発明の方法及びキットは、Ｔｒｅｇレベルを測定することが望ましい任意の状況における適用を見出す。本発明は、Ｔｒｅｇの低発現又は過剰発現の診断、及びアレルギー性疾患、自己免疫性疾患、免疫不全に関連した自己免疫性疾患、環境抗原に対する不適当な免疫反応により引き起こされた疾患、炎症性腸疾患、免疫の関与をともなう炎症性疾患、免疫反応自体が疾患を引き起こす感染症、移植病、癌及びウイルス感染のような、Ｔｒｅｇの低発現若しくは過剰発現の症状又はそれらの素因の診断においても適用を見出す。
【０１４９】
同様に、本発明の方法及びキットは、霊長類、及び本明細書において検討された他の種を含む（これらに限定されない）動物の検査及びスクリーニングにもまた適用されてよい。
【０１５０】
本発明は、これより、以下の具体的な実施例に対する参照によりさらに詳しく記述され、本発明の範囲を限定する任意の方法で解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１５１】
一般的な方法
サンプル
末梢血は、健康な成人のドナー及び炎症性腸疾患を有する患者から得られた（Centenary Institute）及びRoyal Prince Alfred Hospital, Camperdown, NSW, Australia）。軟膜は、オーストラリアの赤十字血液サービス（Australian Red Cross Blood Service）（Sydney, NSW, Australia）から得られた。Nepean Hospital, Penrith, NSW, Australiaからの臍帯血サンプルは胎盤娩出直後に臍帯静脈から得られた。新生児は、満期であり、血液学的異常や感染合併症を有していなかった。正常な胸腺標本は、Children's Hospital, Westmead, NSW, Australiaで矯正心臓外科手術を受ける１〜７ヶ月齢の子供由来のものであった。研究は、児童倫理委員会（Children Ethics Committee）のためのシドニー中部及び西部領域の保健サービス（Central and Western Sydney Area Health Services）及びRoyal Alexandra Hospitalの承認により行なわれた。
【０１５２】
他のすべてのヒト末梢血サンプルは、患者の完全な同意及び適切な倫理委員会の承認により得られた。マカクの研究は、メルボルン大学及びＣＳＩＲＯ畜産業動物実験（Livestock Industries Animal Experimentation）及び倫理委員会の承認により実行された。
【０１５３】
標本からのＣＤ４  Ｔ細胞の単離
末梢血、軟膜及び臍帯血単核細胞はフィコールパック勾配（Lymphoprep, Nycomed, Oslo, Norway）における遠心分離により調製された。
【０１５４】
胸腺の新鮮な手術標本は、８０ゲージのステンレス鋼メッシュを通して引き裂くこと及びゆっくりしたピペッティングにより塊を分散させることによって分離された。リンパ節は腸の手術標本中に同定され、腸壁から切り取られ、８０ゲージのステンレス鋼メッシュを通して引き裂くこと及びゆっくりしたピペッティングにより塊を分散させることによって分離された。単一細胞懸濁液はすべて液体窒素中で凍結保存され、フローサイトメトリーによる分析のためにバッチで染色された。
【０１５５】
抗体及びフローサイトメトリー
抗ＣＤ４モノクローナル抗体、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体及び抗ＣＤ４５ＲＯモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（それぞれ、クローンＯＫＴ４、７ＧＢ６及びＵＣＨＴＬ−１）は、標準的なプロトコルによるＡｌｅｘａ４８８（Molecular Probes, Oregon, USA）及びＦＩＴＣ（Sigma）で標識された。ヒト分子に対する特異性を有する以下のマウスｍＡｂが、この研究で使用された：ビオチン−、Ａｌｅｘａ４８８−、ＦＩＴＣ−、ＰＥ−、ＰｅｒＣｐ又はＰＥＣｙ５結合した抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ５、抗ＣＤ８、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ４５ＲＡ、抗ＣＤ４５ＲＯ、抗ＣＤ５４、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ５７、抗ＣＤ５８、抗ＣＤ６２Ｌ、抗ＣＤ６９、抗ＣＤ７１、抗ＣＤ７４、抗ＣＤ８４、抗ＣＤ９５、抗ＣＤ９５Ｌ、抗ＣＤ１０３、抗ＣＤ１２２、抗ＣＤ１３４、抗ＣＤ１５２、抗ＨＬＡ−ＤＲ、抗ＣＸＣＲ４、抗ＣＸＣＲ５（PharMingen, SanDiego, CA）、抗ＣＤ２１、抗ＣＤ２３、抗ＣＤ２５、抗ＧＩＴＲ（BD Biosciences, San Jose, CA）、抗ＣＤ２７（Ancell, Bayport, MN）、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ３０（Miltenyi Biotec GmbH, Gladbach, Germany）、抗ＣＤ７０、抗ＣＤ１２７、抗ＣＤ２４４（Immunotech, Marseille, France）、抗ＣＤ１４８、抗ＣＤ１５０（DNAX Research Institute, Palo Alto, CA）、抗ＣＤ１１ａ（Caltag, Burlingame, CA）及びＦｏｘ  Ｐ３（eBioscience又はBiolegend）。ビオチン複合体は、Ａｌｅｘａ５９４（Molecular Probes）又はＰｅｒＣｐ（PharMingen）と結合したストレプトアビジンにより生じた。ＰＥ−及びＦＩＴＣ結合した抗マウスｍＡｂ（Southern Biotechnology, Birmingham, AL）を使用して、非結合抗ＣＣＲ７（PharMingen）を検出した。
【０１５６】
単細胞懸濁液を５％ＦＣＳと５ｍＭのアジ化ナトリウムとを含むＰＢＳで洗浄した（ＦＡＣＳ洗浄）。ＦＡＣＳ洗浄において、５×１０５個の細胞のアリコートを９６ウェルの丸底ＰＶＣマイクロタイタープレート（ICN, Costa Mesa, CA）で染色した。細胞を洗浄し、必要に応じて、１％ホルムアルデヒドで固定した。２％パラホルムアルデヒドにおける固定の後に細胞内染色を行ない、その後浸透させ、０．１％サポニンを含む緩衝液で染色した。製造業者の取扱説明書に従って、ＦｏｘＰ３に対する染色を行った。前方散乱プロファイルと側方散乱プロファイルとに基づいてリンパ球についてゲートされた全量１×１０５個の染色した細胞（events）をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（Becton Dickinson, Mountain View, CA）又はＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（商標）（BD Biosciences）を使用して回収した。ＦｌｏｗＪｏプログラム（Treestar, San Carlos, CA）を使用して分析を行った。
【０１５７】
蛍光活性化細胞選別
軟膜単核細胞（５×１０８）は、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ５９４又はストレプトアビジン−ＰｅｒＣＰで生じたＣＤ４−ＦＩＴＣモノクローナル抗体、ＣＤ２５−ＡＰＣモノクローナル抗体、ＣＤ１２７−ＰＥモノクローナル抗体及びＣＤ４５ＲＡ−ビオチンモノクローナル抗体の組み合わせによって染色された。選別前にＡｕｔｏＭａｃｓ（商標）（Miltenyi Biotech）を使用して、抗ＦＩＴＣビーズ（Miltenyi Biotech GmbH）による正の選択が行われた。胸腺細胞（５×１０８）は、ＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙ５．５、ＣＤ３−ＰＥ、ＣＤ８−ＡＰＣ  ＣＤ２５−Ａｌｅｘａ４８８、及びＣＤ４５ＲＡ−ビオチンｍＡｂの組み合わせで染色された。ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（商標）又はＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）細胞分別装置を使用して、分別を行った。
【０１５８】
リアルタイムｑＰＣＲ
ＲＮＡ抽出のために、全ＲＮＡは、トリゾール（Invitrogen, Life Technologies）での溶解後に１〜５×１０５個の分別細胞から抽出された。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩリバーストランスクリプターゼ及びオリゴ（ｄＴ）２−１８プライマー（Invitrogen）を最終容量２０μｌで使用して、サンプル全体を逆転写させた。リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ  ｑＰＣＲ）のために、反応混合物（１８μｌ）は、２μｌのｃＤＮＡと、１０μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  ＵＤＧ（Invitrogen）と、０．２５ｐｍｏｌのフォワードプライマー及びリバースプライマーとを含んでいた。ｑＰＣＲは、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ３０００システム（Corbett research）で行った。アンプリコンがイントロン／エキソン境界にかかり、ゲノムＤＮＡの増幅が最小限になるように、プライマーを設計した。プライマー配列は以下のようなものであった：Ｆｏｘｐ３センス、ＧＧＣＡＡＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＣＡＡＧＴＧ（配列番号１）及びアンチセンス、ＧＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＡＡＧＣ（配列番号２）。他の遺伝子に対するプライマー配列は、ＧＡＴＡ３センス  ＡＡＣＴＧＴＣＡＧＡＣＣＡＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＡＣ（配列番号３）、ＧＡＴＡ３アンチセンス  ＧＧＡＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＣＡＴＡＧＴＣＡＧＧ（配列番号４）、Ｔ−ｂｅｔセンス  ＣＡＣＴＡＣＡＧＧＡＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＣＧＴＧ（配列番号５）、Ｔ−ｂｅｔアンチセンス  ＣＣＣＣＴＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＧＡＧＣＴＴＴＡＧ（配列番号６）であった。プライマーは、Invitrogenにより供給された。β−アクチンに対するプライマーは、以下のようなものであった：センス  ＴＣＧＡＣＡＡＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＴＧＴＧＣＡＡＧ（配列番号７）及びアンチセンス  ＡＧＣＣＡＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＧ（配列番号８）（Sigma Genosys, Australia）。
【０１５９】
Ｆｏｘｐ３、Ｔ−ｂｅｔ及びＧＡＴＡ−３に対するＲＴ−ｑＰＣＲを以下の条件下で行った：段階１：９４℃で５分間；段階２：９４℃で２０秒間、５８℃で２０秒間及び７２℃で２０秒間。７５℃で１５秒間のさらなる工程を加えて、プライマー二量体バックグラウンドを低減させた。４５サイクルの増幅を行った。β−アクチンに対して正規化することによって、Ｆｏｘｐ３、Ｔ−ｂｅｔ及びＧＡＴＡ−３の相対発現を求めた。
【０１６０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの抑制の分析
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの抑制分析は、９６ウェルの丸底ウェルプレート中の、５％熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを追加したＲＰＭＩ  １６４０から成る培地中で実行された。すべてのウェルは、５×１０４個のＡＰＣ、２×１０４個のレスポンダー細胞（responder cells：キラー細胞）（選別されたＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＡ＋細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞）及び０．２５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ−１又はＨｉｔ３ａ、PharMingen）を含んでいた。各々のウェルに加えられたサプレッサー細胞の推測上の数は、２×１０４、０．５×１０４、２×１０３又は０のいずれかであり、それぞれ１：１、０．２５：１、０．１：１又は０：１のサプレッサー細胞対レスポンダー細胞の最終的な比率を与えた。対照培養では、レスポンダー細胞がサプレッサー細胞の代わりに加えられた。ＣＦＳＥ分析については、レスポンダー細胞はＣＦＳＥにより標識され、細胞分裂はフローサイトメトリーを使用して７２時間後に測定された。増殖のパーセントは、レスポンダー細胞のみを含む対照ウェル中で分裂した細胞の平均の数に対して計算された。チミジン分析については、３日間、４日間又は５日間の培養後に培養物がパルスされた予備実験は、抑制の程度がその期間にわたって安定していることを示し、したがって、続く培養物はすべて７２時間での３ＨＴｄＲによりパルスされ、１６時間後に採取されて、ＣＦＳＥ及びチミジンの分析の直接的な比較を可能にした。
【０１６１】
サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０）は、製造業者の取扱説明書に従ってＯｐｔＥＩＡキット（BD）を使用して測定された。これまでに記述されたように、トランスウェル分析は２４ウェルプレートにおいて実行された（１５）。
[実施例１]
【０１６２】
ヒト及びマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞によるＣＤ２５の発現、及びそれらの同定及び単離のための代替戦略
図１Ａ及び図１Ｂは、マウス及びヒトのＣＤ４＋Ｔ細胞によるＣＤ２５の発現における差を示す。マウス末梢血において、６％のＣＤ２５を発現する細胞の別個の集団は、陰性の集団とは明らかに識別可能である（図１Ａ）。１０％のＣＤ４＋Ｔ細胞による発現の同じようなプロファイルは、ヒト臍帯血中に見られる。しかしながら、成人血のＣＤ４＋Ｔ細胞についてのプロファイルは、分離した亜集団として識別可能なＣＤ２５を最も高いレベルで発現する細胞はわずか１〜２％であるが、９８％の他の細胞における発現レベルは中間から真の陰性に及んでいるというように、全く異なる。臍帯血プロファイル（点線、図１Ｂ）により示されたレベルでのゲートの設定は、成人の末梢血中でＣＤ４＋Ｔ細胞の大多数の集団を横断する。同じようなゲートジレンマはヒトのリンパ節により提起されるが、マウスのリンパ節では提起されない。種間差に対する主要原因は、ヒト末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞の大部分における中間レベルの発現であり、それは抗原による感作を受けた「従来の」ＣＤ４＋細胞に対応する。ＣＤ４＋Ｔ細胞の多量の画分が活発に分裂している（図１Ａ「刺激された」、これはＲＡＧ−／−動物を再構成する恒常性を保って分裂する集団を示す）マウスにおいてでさえ、従来の活性化Ｔ細胞におけるＣＤ２５の発現の平均のレベルは、ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの同定を著しく妨害しない。ヒト抗原による感作を受けた「従来の」ＣＤ４＋Ｔ細胞の大多数に対する高親和性ＩＬ−２受容体の発現の生理的な意義は、不明瞭なままである。
【０１６３】
図１Ａ及び図１Ｂにおいて実証された染色パターンの１つのさらなる態様は、ヒト成人血中でＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔ細胞の別個の集団が、ＣＤ４の発現のわずかな減少を示すということである。この減少は、マウスにおけるＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの全集団中でも明らかである。残念なことにこの減少は、Ｔｒｅｇを、抗原による感作を受けた従来のＴ細胞から識別するためのゲート戦略での使用を可能にするほどは多量ではない。しかしながら、マウスのモデルにおける本発明者らの研究は、ＣＤ２５の構成的発現のように、ＣＤ４の減少した発現がＴｒｅｇの非常に安定した表現型のマーカーを表わすことを示した。これとは対照的に、従来のＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける活性化に際してＣＤ４の発現を上方調節する。
【０１６４】
３９個のマーカーの検査が、ＣＤ２５を中間レベルから高レベルで発現するＣＤ４＋細胞中の亜集団を同定する能力を測定するために試みられた（ＣＤ２５ｉｎｔ−ｈｉ、図１において点線により同定される）。マウスで有用なマーカーがヒトにおいて正確にＴｒｅｇを区別できるか否かを検査するために、マウス及びヒトの染色パターンが比較された（図１Ｃ）。このデータは、マウスのデータに基づいたヒトのパターンの予測は可能ではないことを示す。さらなるヒトマーカーを成人血に対して検査した。ＣＤ４５ＲＡの発現は、胸腺、臍帯血、成人血、リンパ節及び胸腺に存在する「ナイーブ」Ｔｒｅｇの集団を同定した。しかしながらＣＤ４５ＲＡ−ＲＯ＋集団内で、マーカーのどれも、ＣＤ１２７（図２）以外に、Ｔｒｅｇ及び抗原による感作を受けた細胞（図１Ｄ）により差異的に発現されなかった。ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５８及びＣＤ９５と異なり、ＴｒｅｇにおけるＣＤ１２７の発現レベルはナイーブＴ細胞よりも低かったが、抗原による感作を受けた細胞における発現はより高かった。したがって、ＣＤ１２７細胞対ＣＤ２５細胞のプロファイルは、ＣＤ４対ＣＤ２５のプロファイルに類似していたが、ＣＤ１２７の発現の範囲はより大きく、フローサイトメトリー選別によるヒト成人血Ｔｒｅｇの分離を可能にした。特に興味深いのは臍帯血プロファイルであり、図１において単一集団に見えたものはＣＤ１２７の発現についての染色後に２つの集団に明らかに分離されたことだった。
[実施例２]
【０１６５】
ＣＤ１２７の発現は、ヒトＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の２つの集団を区別する
様々なリンパ組織におけるＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の２つの集団を区別するＣＤ１２７の発現の能力は、ＣＤ４、ＣＤ２５及びＣＤ１２７に対するｍＡｂによって、正常成人血、リンパ節、臍帯血及び胸腺の染色サンプルで検査された。
【０１６６】
成人血は、ＣＤ１２７ｈｉ細胞の大多数の集団とは異なるＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞の集団を含んでいた（図２ａ）。ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ集団に加えて、リンパ節はかなりの数のＣＤ２５−ＣＤ１２７ｌｏＴ細胞も含んでおり、それは少数の正常成人由来の血液において顕著であった（図示せず）。臍帯血では、抗ＣＤ１２７による染色は、これまでに主張されたように、ＣＤ２５＋集団が均質ではなく（２７）、むしろＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞及びＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｈｉ細胞の混合物から成ることを明らかにした。胸腺において、ＣＤ２５を発現する抗原による感作を受けた細胞が存在しない場合には、最も高いレベルのＣＤ２５を有する細胞はＣＤ１２７の中間の発現を保持した（図２ａ）。
[実施例３]
【０１６７】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞におけるＦｏｘＰ３とＣＤ１２７との発現の間の逆相関性
ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ集団中のＦｏｘｐ３タンパク質の発現を測定するために、成人血及び臍帯血、リンパ節及び胸腺由来の細胞は、Ｆｏｘｐ３及びＣＤ１２７に対するｍＡｂにより共染色された（図２ｂ）。血液及びリンパ節では、ＦｏｘＰ３＋細胞の集団はＣＤ１２７ｌｏであり、図２ａにおけるＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞の集団の大きさに類似していた。これとは対照的に、胸腺のＦｏｘＰ３＋集団は、ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ集団よりもかなり多かった。末梢血では、ＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞（図２ｃ、左上パネル中のようにゲートされた）の８７％は、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ゲート内にあり（図２ｃ、左下パネル）、反対に、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の８４％は、ＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏゲート内に検出された（図２ｃ、右側のパネル）。しかしながら、胸腺のＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞において、Ｆｏｘｐ３＋細胞の４５％はＣＤ２５−であり（図２ｄ、右下パネル）、それゆえにＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞はＦｏｘｐ３＋細胞よりも有意に小さな集団から成っていた。それにもかかわらず、胸腺のＣＤ４＋ＣＤ８−Ｆｏｘｐ３＋細胞はすべてＣＤ１２７ｌｏであった。したがって、ＣＤ２５、ＣＤ１２７及びＦｏｘＰ３の発現は、胸腺と末梢血との間で異なっていた。
[実施例４]
【０１６８】
ＦｏｘＰ３の発現とＣＤ１２７ｌｏ表現型との間の相関性
制御活性を有するナイーブＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋細胞のサブセットがＦｏｘＰ３＋ＣＤ１２７ｌｏ表現型も有するか否かを検査するために、本発明者らは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２５、ＣＤ１２７及びＦｏｘＰ３に対するｍＡｂにより成人血、リンパ節及び臍帯血細胞を染色した（図３ａ）。ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞はＣＤ４５ＲＡ−サブセット及びＣＤ４５ＲＡ＋サブセットへ分離され、Ｆｏｘｐ３＋ゲート内のＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞のパーセンテージが計算された。すべての組織において、全Ｆｏｘｐ３＋細胞の９０％超はＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏであったが、残りの細胞はＣＤ２５ｉｎｔＣＤ１２７ｈｉであった。さらに、ＣＤ１２７ｈｉ細胞の比率はＣＤ４５ＲＡ−Ｆｏｘｐ３＋サブセット及びＣＤ４５ＲＡ＋Ｆｏｘｐ３＋サブセット内で同様であった。
【０１６９】
ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ集団及びＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋集団中の細胞のパーセンテージ間の相関性の強さを求めるために、９人の健康なボランティア由来の末梢血サンプルを分析した（図３ｂ）。ＣＤ４５ＲＡ−サブセット及びＣＤ４５ＲＡ＋サブセットの両方において、２つのゲート内の細胞数は非常に類似しており、末梢血におけるＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞の数とＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞の数が強く相関することを示した。
[実施例５]
【０１７０】
健康なボランティアの末梢血におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞の数
正常なレベルの循環しているＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞を定義するために、４３人の健康なボランティアの集団由来の末梢血サンプルを調べた（図４）。ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージとしてのＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞の平均数（±ＳＥＭ）は、４．２９±０．２４％であったが、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞のパーセンテージは２．０５±０．１４％であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞は合計で６．３５±０．２６％であった（図４ｂ）。これは、本発明者らによりこれまでに観察されたマウス血液におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の６．４２±０．５０％の図と一致しており（Tan and Fazekas de St Groth、未発表データ）、ヒト末梢血における１〜２％の従来の推測とは対照的であった（１９）。さらに、エフェクター／メモリーＴｒｅｇ対ナイーブＴｒｅｇの比率は（図４ａ）、マウスについてこれまでに本発明者らが求めたエフェクターＴｒｅｇ対ナイーブＴｒｅｇの２：１比率の類似していた（Higgins and Fazekas de St Groth、未発表データ）。
【０１７１】
次に本発明者らは、ＣＤ４／ＣＤ２５／ＣＤ４５ＲＡ染色を使用して、末梢血におけるナイーブＴｒｅｇの数が年齢に応じて減少することを実証し、胸腺退縮の効果が示唆された（図４Ｃ）。この減少は、これまでに記述された、年齢にともなうＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞の消失に部分的にのみ起因した。これとは対照的に、ＣＤ４５ＲＡ−Ｔｒｅｇのパーセンテージは、末梢血白血球内のＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージと同様に、一生を通じて比較的安定していた。
[実施例６] 
【０１７２】
ＣＤ１２７及びＣＤ２５の発現に基づいて選別されたＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットにおける転写因子についてのｍＲＮＡの測定
本発明者らは、末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞の選別されたサブセット内のＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡのレベルを測定した（図５ａ）。ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１２７ｌｏ細胞（集団１）はＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１２７ｈｉ細胞（集団４、図５ｂ）よりも１００倍多くのＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡを発現した。中間レベルのＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡは、ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１２７ｈｉ細胞（集団３）及びＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１２７ｌｏ細胞（集団２）で存在した。他方では、集団２はＴ−ｂｅｔ（Ｔｈ１エフェクター機能のマスター調節因子）について最も高いレベルでｍＲＮＡを発現したが、ＧＡＴＡ３（Ｔｈ２機能のマスター調節因子）は等しくすべての集団で発現された（図５ｃ）。これらの結果は、集団２がＣＤ１２７ｌｏエフェクター細胞を含むことを示す。ＣＤ４５ＲＡ＋画分内で、ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞は、ナイーブＣＤ２５−ＣＤ１２７ｈｉ細胞よりも１００倍多いＦｏｘｐ３を発現した（図５ｂ）。
【０１７３】
臍帯血において、ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞は対応するナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞よりも５００倍多いＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡを発現した（図５ｂ、右側のパネル）。対応する成人集団（集団３、図５ｂ）について実証されるように、抗原による感作を受けたＴ細胞のＣＤ２５ｉｎｔＣＤ１２７ｈｉ集団（集団８）は、中間レベルのＦｏｘｐ３を発現した。
[実施例７] 
【０１７４】
ＣＤ１２７染色に基づいて選別されたサブセットによるｉｎ  ｖｉｔｒｏの抑制
ＣＤ４５ＲＡ＋サブセット及びＣＤ４５ＲＡ−サブセットへ分割された成人血のＣＤ４＋Ｔ細胞は、図６ａ（左パネル）において図示されたゲートに従って選別された。選別されたＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−自己細胞（集団５）を、抑制活性を測定するために、共培養においてレスポンダー細胞として使用した。細胞増殖の指標としてチミジン（図６ｂ）又はＣＦＳＥ（図示せず）のいずれかを使用する分析は、各々のＣＤ４５サブセット（集団１及び集団３、図６ｂ）内のＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏＴ細胞のみがｉｎ  ｖｉｔｒｏの抑制を媒介したことを示した。ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔｒｅｇは、それらのＣＤ４５ＲＡ−相当物と同じくらい有力であった。臍帯血分析については、臍帯血細胞の大部分がある程度までＣＤ４５ＲＡを発現するので、ＣＤ４５アイソフォーム発現は細胞をさらに分けるためには使用されなかった。図６ａ（右側パネル）におけるゲートに従って選別されたＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏサブセット及びＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｈｉサブセットは、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７ｈｉ自己レスポンダー細胞（集団８）と共培養された。前と同じように、チミジン（図６ｂ）及びＣＦＳＥ分析（図示せず）の両方は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の抑制活性が、ＣＤ１２７ｌｏサブセット（集団６、図６ｂ）に限定されることを示した。
【０１７５】
これまでの報告は、ＣＤ２５ｉｎｔ細胞ではなくＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔ細胞が抑制活性を有していることを示した（１９）。しかしながら、それらの研究において、ＣＤ２５ｉｎｔゲートにおける大多数の細胞は、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１２７ｈｉの従来のＴ細胞（集団２、図６ａ、図６ｂ）であり、それによって分析における抑制の効率が損なわれる。異なるレベルのＣＤ２５を発現するＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１２７ｌｏ細胞の抑制活性を比較するために、ＣＤ４５ＲＡ＋サブセット及びＣＤ４５ＲＡ−サブセットへ分割された成人血ＣＤ４＋Ｔ細胞は、図６ｃにおいて図示されたゲートに従って選別された。すべての３つのＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ集団（集団９〜集団１１）は、抑制活性を示し（図６ｄ、左下のパネル）、高レベルのＦｏｘＰ３の発現と一致している（図２）。さらに、３つの集団はすべて、レスポンダー細胞によるＩＦＮγ産生を抑制し、集団１０及び集団１１は少量のＩＬ−１０を分泌した。ＩＬ−４又はＩＬ−５の分泌はいかなる培養においても全く検出されなかった（データ図示せず）。興味深いことには、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５−ＣＤ１２７ｌｏ細胞（集団１２）は、増殖及びＩＦＮγ産生のある程度の抑制を示し、それらはＦｏｘＰ３タンパク質を発現しなかったが、検出可能なレベルのＩＬ−１０を分泌した（図２及び図３）。
【０１７６】
Ｔｒｅｇとレスポンダー細胞との間の細胞表面相互作用がＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞による抑制に必要か否かを検査するために、トランスウェル培養が実行された（図６ｅ）。サプレッサー細胞とレスポンダー細胞との間の細胞間接触が阻害された場合、抑制は見られず、ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞による抑制におけるＩＬ−１０のような可溶性因子についての役割は除外された。実際はトランスウェル培養において、サプレッサー細胞を欠く対照培養と比較した場合、レスポンダー細胞の増殖は増大した（図６ｅ）。
【０１７７】
総合して考えると、これらの結果は、臍帯血及び成人血の両方において抑制活性がＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞に限定されたことを示す。これとは対照的に、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を２つの集団へ分割するＨＬＡ−ＤＲのようなマーカーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの活性の異なる範囲によりＴｒｅｇサブセットを区別する（２８）。少ない割合のＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞（１０％未満）は、ＣＤ１２７の高い発現を保持した（図３）。ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｈｉ細胞の集団は全体として、標準のｉｎ  ｖｉｔｒｏの分析において抑制活性を示さない（図６）。したがって、これらのデータは、ＦｏｘＰ３の発現がヒトＴ細胞で必須の抑制機能を常に与えるとは限らないことを示す。
[実施例８] 
【０１７８】
ＩＢＤ患者及び対照被験体におけるＴｒｅｇ数の比較
活性化Ｔ細胞からのＴｒｅｇの区別において、ＣＤ４／ＣＤ２５／ＣＤ１２７／ＣＤ４５ＲＡ染色戦略がさらなる明瞭さを与えたことを示したので、本発明者らは、４３人の対照及び３８人のＩＢＤ患者の集団由来の末梢血サンプルにこの方法を適用した（表１）。
【０１７９】
【表１】
2009508089.tif 000002
【０１８０】
フローサイトメトリーのデータは、多くのゲート戦略を使用して、ＣＤ１２７依存的方法の使用の利点を明らかにするために分析された（図７）。従来の「ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔ」及び「ＣＤ２５ｉｎｔ」戦略（図７ａにおいてそれぞれゲートＡ及びゲートＢと標識された）の両方は、対照と比較して、ＣＤ患者における統計的に有意な増加と共に、ＩＢＤ患者において広範囲の値を示した。本発明者らは、ＣＤ４５ＲＯゲート（ゲートＣ、図７ｂ）がＣＤ２５ｂｉｇｈｔゲートに類似したＣＤ４５スプライス変異の差異的な発現に基づいた戦略をこれまでに使用したが、ＣＤ４５ＲＡゲートはナイーブＴｒｅｇの新規サブセットを定義した（ゲートＤ、図７ｂ）。ゲートＥ及びゲートＦ（図７ｃ）によって示されるように、本明細書において記述される新しいＣＤ４／ＣＤ２５／ＣＤ４５ＲＡ／ＣＤ１２７染色戦略が適用された。前と同じように、ＣＤ患者は、ＣＤ４５ＲＡ−Ｔｒｅｇ数の有意な増加を示した。ナイーブＴｒｅｇのパーセンテージの有意な減少は、ＣＤ患者及びＵＣ患者の両方において見られた。
【０１８１】
図７のゲート戦略の適用の結果として、個々のサンプルについてＴｒｅｇのパーセンテージの異なる推測を示すために、本発明者らは、８１人の患者及び対照の組み合わせ群についての様々なゲートの間の相関性を図示した（図８）。最も高い相関性（ｒ＞０．８５）が、ＣＤ４／ＣＤ２５／ＣＤ４５ＲＡ戦略（ゲートＣ及びゲートＤ）に由来したデータと、それぞれ新しいゲートＥ及びゲートＦに由来したデータとの間であった。ゲートＢ以外のゲートはすべて従来のＴ細胞による汚染を減少させるように試みて、ＣＤ２５の発現が最も低いＴｒｅｇを排除したためにＣＤ１２７ｌｏＴｒｅｇ数が過小評価された。ゲートＢは、ＣＤ１２７ｈｉＣＤ２５＋Ｔ細胞による汚染のために過大評価を与えた。したがって、新しい戦略に由来したデータは、他のゲート戦略からのデータと相関するが、数値は有意に異なる。
[実施例９] 
【０１８２】
ＩＢＤ患者におけるＣＤ１２７ｌｏＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの加齢に関連した変化
末梢血においてナイーブＴｒｅｇの数が年齢に応じて減少すると主張するこれまでの報告とは対照的に、本発明者らは、ナイーブＴｒｅｇのパーセンテージがＩＢＤ患者にとって本質的に一定であったことを示し、それゆえに若年患者でのナイーブＴｒｅｇ欠損は、高齢患者においては明白ではなかった（図９ａ）。より若い患者における欠損の一部は、対照と比較して、患者におけるＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞のパーセンテージの減少のためであったが（図９ｂ）、ＣＤ４＋細胞のパーセンテージ全体では差はなかった（図９ｅ）。
【０１８３】
ナイーブＴｒｅｇとは対照的に、ＣＤ４５ＲＡ−（ＲＯ＋）Ｔｒｅｇの数は、患者及び対照の両方において成人期を通じて安定していた（図９ｃ）。ＣＤ４５ＲＡ−Ｔｒｅｇは全Ｔｒｅｇの大多数を成すので、全Ｔｒｅｇの多くも一生を通じて安定していた。患者における全体的な免疫活性のより高い程度を反映して、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の相互増加が、対照と比較して患者において見られ（図９ｄ）、ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞のパーセンテージは患者及び対照の両方において年齢と共に増加した。
【０１８４】
図１０は、３つの年齢集団へ分割された対照、ＣＤ患者及びＵＣ患者におけるＴｒｅｇのパーセンテージの比較を与え、ナイーブＴｒｅｇにおける欠損が、１５歳〜４５歳のＣＤ患者、及び１５歳〜３０歳のＵＣ患者において統計的有意差に達したことを示した。対照的に、３つの集団のうちのいずれかの中にも、患者と対照との間で活性化されたＴｒｅｇ数及び全Ｔｒｅｇ数において有意差はなかった。
【０１８５】
図１１において示されるように、ナイーブＴｒｅｇにおける欠損は疾患活性と無関係であり、治療によって影響されなかった。これは疾患発生率の若年ピークと相関性があったので、疾患を発症しやすい可能性がある原発性の異常を表わしているかもしれない。
[実施例１０] 
【０１８６】
ＩＢＤ患者及び対照の腸粘膜及び腸間膜リンパ節におけるＣＤ１２７ｌｏＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ
血液の研究に加えて、本発明者らは、ＩＢＤの患者、又は憩室症若しくは失調症のために結腸を切除した患者から切除された新鮮な結腸の標本由来の粘膜及びリンパ節を得た。
【０１８７】
図１２において示されるように、有意差は、ＣＤ患者及びＵＣ患者の腸粘膜及び排水リンパ節におけるＣＤ４＋Ｔ細胞中のＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏＴｒｅｇのパーセンテージの間で観察されなかった。このデータは、粘膜及びリンパ節におけるＴｒｅｇのパーセンテージが、末梢血よりも一般に高いことを示す（図４において示されたように）。
[実施例１１] 
【０１８８】
臍帯血、若年者及び高齢者の末梢血におけるＴｒｅｇ数及び機能の比較
この研究は、乳児期から後期成人期への調節性Ｔ細胞の数の変化を評価するために、細胞内のＦｏｘＰ３染色対ＣＤ４／ＣＤ２５／ＣＤ１２７の組み合わせを比較した。このデータは、図１３〜図１７において示されるように、ＣＤ４５ＲＡコンパートメントとＣＤ４５ＲＯコンパートメントとの間の分布は著しく移行するが、Ｔｒｅｇ細胞のプールが一生を通じて狭い範囲内で維持されることを示す。この移行は、従来のＴ細胞の移行に匹敵する。
【０１８９】
健康な成人ドナー（年齢群２０歳〜２５歳及び６０歳超）由来の末梢血は、静脈穿刺によって得られ、リチウム−ヘパリンチューブへ回収された。健康な満期新生児由来の臍帯血サンプルは、Nepean Hospitalにおいてクランプで留めた臍帯から出産直後に得られた。単核細胞はフィコール−ハイパック（Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ）勾配遠心分離によって単離した。西部シドニー領域保健サービス（Western Sydney Area Health Services）の倫理委員会は研究を承認した。
【０１９０】
図１３において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞についての従来のゲートは、若年（２０歳〜２５歳）の健康なドナー及び高齢（６０歳超）の健康なドナー由来の、臍帯血及び末梢血のサンプルに対して適用された。この分析は、一生を通じてＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の有意な増加を示す。新しいマーカーの組み合わせを使用して、図１４（上部のパネル）において示されように、この増加ははるかに少なく（図１５、右側のパネル）、ＣＤ４及びＦｏｘＰ３についての染色で見られた増加に匹敵していた（図１５、左側のパネル）。図１４の下部のパネルにおいて示されるように、ＣＤ４５ＲＡが分析に含まれていた場合、ＣＤ４５ＲＡ＋ＴｒｅｇとＣＤ４５ＲＡ−Ｔｒｅｇとの数の間で相互関係は、３つの年齢集団の数における統計的に高い有意差により明らかだった（図１６）。
【０１９１】
Ｔｒｅｇの抑制機能が一生を通じて変化するか否か検査するために、抑制の分析は、図１７の上部のパネルにおいて示されるように、ＣＤ４／ＣＤ２５及びＣＤ１２７による染色に基づいて選別された細胞を使用して実行された。これらの分析は、各々の３つの年齢集団のドナーから選別された細胞について同等の抑制機能を示した。したがって、ＣＤ４５ＲＡ発現からＣＤ４５ＲＯ＋ＲＡ−表現型の発現への移行は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける機能的な活性に影響しない。
[実施例１２] 
【０１９２】
健康な高齢の患者対アルツハイマー病の高齢の患者における循環Ｔｒｅｇ数の比較
７５歳を超えた４人の健常な個体由来の末梢血Ｔｒｅｇは、アルツハイマー病を患う年齢の一致した５人の個体と比較された。この研究は、ラッシュ施設内倫理委員会（Rush Institutional Review Board）の承認によりラッシュ大学メディカルスクール（Rush University Medical School）で実行された。この研究の被験体の詳細は表２に示される。
【０１９３】
【表２】
2009508089.tif 000003
【０１９４】
図１８に示されたように、ナイーブＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ１２７ｌｏＣＤ２５＋）中のＴ細胞の数、及び７５歳を超えた個体における活性化／メモリーＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７ｌｏＣＤ２５＋）のコンパートメントは、非常に可変的であった。２つの被験者群の間で、差は見い出されなかった。
[実施例１３]
【０１９５】
重症のアトピー性湿疹の患者対健康な対照における循環Ｔｒｅｇ数の増加
Westmead hospitalに通院する重症のアトピー性湿疹の患者（２０，０００Ｉ．Ｕ．の平均のＩｇＥレベル）由来の末梢血は、ＣＤ４／ＣＤ２５／ＣＤ１２７／ＦｏｘＰ３で染色された。患者のうちの１人についてのＣＤ１２７対ＦｏｘＰ３による染色の比較は、図１９に示される。健康な対照に関しては、ＦｏｘＰ３の発現とＣＤ１２７ｌｏＣＤ２５＋表現型との間で明確な相関性があった。図２０は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の従来のゲート対ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏゲートに由来したＴｒｅｇ数の比較を示す。前者は健康な被験体と湿疹患者との間で差を示さないが、新しいゲートは湿疹患者におけるＴｒｅｇ細胞の有意に高い増加を示す。
[実施例１４]
【０１９６】
喘息のアトピー患者対健康な対照における循環Ｔｒｅｇ数の比較
末梢血サンプルは、表３に示されるような個体から得られた。
【０１９７】
【表３】
2009508089.tif 000004
【０１９８】
図２１に示されるように、３つの被験体群で全Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ）のパーセンテージ、又はナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏＣＤ４５ＲＡ＋Ｔｒｅｇのパーセンテージに有意差はなかった。
【０１９９】
さらなる比較は、図２１中の集団に由来した患者に対して実行された（すなわち、非アトピーの対照群は両方のデータのセットにおいて同じである）。表４に示されるように、イエダニ（ＨＤＭ）による４８時間のｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養に際して産生されたＩＬ５の量に関するデータは、アトピーのサブセット（ＩＬ５−群中の５人の喘息患者及びＩＬ５＋群中の４人の喘息患者）に対して利用可能であった。
【０２００】
【表４】
2009508089.tif 000005
【０２０１】
図２２に示されたように、喘息性群を培養においてＨＤＭへの露出後に検出可能なＩＬ−５を分泌した群及び分泌しなかった群へさらに分けることは、３つの群の間での全Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ）のパーセンテージに有意な差をもたらさなかった。しかしながら、ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージとしてのナイーブＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏＣＤ４５ＲＡ＋Ｔｒｅｇ、及びＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏＣＤ４５ＲＡ＋Ｔｒｅｇ対ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏＣＤ４５ＲＡ−Ｔｒｅｇの比率の両方は、他の２つの群と比較して、ＩＬ５＋群において有意に増加した。したがって、ＨＤＭ反応性喘息患者は、循環ナイーブＴｒｅｇ細胞の有意な増加、及び末梢血におけるナイーブＴｒｅｇと活性化／メモリーＴｒｅｇとの比率の増加を示す。
[実施例１５] 
【０２０２】
シェーグレン症候群の患者対健康な対照中の循環Ｔｒｅｇ数の比較
１８人の原発性のシェーグレン症候群患者（すべて女性）及び１７人の年齢の一致した健康な女性の対照由来の末梢血を、ＣＤ４／ＣＤ２５／ＣＤ１２７／ＣＤ４５ＲＡ  ｍＡｂの組み合わせで染色した。原発性シェーグレン症候群はヨーロッパの基準に従って診断された（２９）。図２３に示されるように、ナイーブＴｒｅｇ細胞と全（しかし活性化されていない）Ｔｒｅｇ細胞とのパーセンテージは、シェーグレン症候群患者においてより高かった。この増加は年齢分布全体にわたって見られた。
[実施例１６] 
【０２０３】
ＨＩＶ感染の異なるステージの患者における循環Ｔｒｅｇ数の比較
末梢血は、２８人の進行性疾患のＨＩＶ＋患者（Rush University Medical Center, Chicago, IL）、１０人の一次感染をともなう患者（セロコンバータ、St Vincents Hospital, Darlinghurst, NSW, Australia）、及び７人の免疫再構築症候群（ＩＲＤ）を発症したＨＩＶ＋患者（St Vincent Hospital）から得られた。一次感染をともなう患者及び２８人中の３人の後期疾患の患者以外のすべて患者は、抗レトロウイルスの薬剤による治療を受けていた。この研究は、中央領域保健サービス（Central Area Health Services）及びラッシュ施設内倫理委員会の承認で行なわれた。
【０２０４】
代表的なフロープロファイルは図２４に示される。ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞の大量の増加があった場合には、ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＣＤ２５及びＣＤ１２７の発現パターンは、ＩＲＤの患者とは別に、ＨｌＶの患者において変わらなかった。ＣＤ４５ＲＯ発現に基づいた細別は、ＩＲＤ患者のＴｒｅｇ増加が主にＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＯ＋サブセット内であることを示した。
【０２０５】
ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ集団内のＦｏｘｐ３の発現を測定するために、ＩＲＤの患者由来の細胞は、ＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３及びＣＤ１２７に対するモノクローナル抗体の組み合わせにより染色された。ＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏＣＤ２５＋細胞の９６．７％及び９７．８％（図２５、左側のパネル）は、それぞれＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ゲート及びＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏＦｏｘｐ３＋ゲートの９７．８％内であった（図２５、右側のパネル）。したがって、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞内でのＣＤ１２７ｌｏ表現型とＦｏｘｐ３タンパク質の発現との間で高い一致率があった。
【０２０６】
図２６に示されるように、ＣＤ４５ＲＯ＋ＴｒｅｇはＩＲＤのＨＩＶ＋患者において有意に増加した。セロコンバータと比較して、一般に慢性ＨＩＶ患者はより少数のナイーブＴｒｅｇを有しており、この差はＡＲＴにより治療されている進行性疾患の群において統計的有意差に達した。
[実施例１７] 
【０２０７】
黒色腫の患者における循環Ｔｒｅｇ数の測定
メルボルンのオースティン病院のルードウィヒ癌研究所（Ludwig Institute For Cancer Research at the Austin Hospital）で行なわれた研究において、黒色腫の患者由来の末梢血においてＴｒｅｇが列挙された。表５に示される６人の患者は、ワクチン治験に登録されなかったが、個体中のＴｒｅｇ数の日々の変動を評価するために多くの週にわたって１週当たり３回採血された。
【０２０８】
【表５】
2009508089.tif 000006
【０２０９】
図２７に示されるように、ＣＤ４／ＣＤ１２７／ＣＤ２５による染色に由来したＴｒｅｇ数とＣＤ４／ＦｏｘＰ３分析に由来したＴｒｅｇ数との間で高い相関性があった（右側のパネル）。Ｔｒｅｇ数は、Ｔｒｅｇ数が一般により高い患者で、一般に１ヶ月を超える期間にわたって安定しており、より縦方向の変化を示した（左側パネルと中心のパネル）。
【０２１０】
表６に示される患者は、ＬＵＤ２００２−０１３治験（ＮＹ−ＥＳＯ−１＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸによるワクチン接種）に登録された。１２人の患者はすべて進行性の転移性黒色腫であった。
【０２１１】
【表６】
2009508089.tif 000007
【０２１２】
図２８に示されるように、ワクチン接種後のＴｒｅｇ数における変化は、図２７に示される縦断的研究において明らかであったにすぎなかった。この変化は、幾人かの患者において上昇した値（例えば１０７）であり、他の患者において低下した値（例えば１０６）であり、本質的に無作為であった。
[実施例１８]
【０２１３】
腎移植患者対透析をともなうか、又は透析をともなわない慢性腎不全患者における循環Ｔｒｅｇ数の測定
６０人の慢性腎不全（ＣＲＦ）の患者群がPrince of Wales Hospital（Sydney）で登録された。患者の詳細は表７において示される。
【０２１４】
【表７】
2009508089.tif 000008
【０２１５】
各々の群における２０人の患者由来の末梢血白血球はＣＤ４／ＣＤ２５／ＣＤ１２７／ＣＤ４５ＲＡにより染色され、図４Ａにおいて示されるようにゲートされた。
【０２１６】
図２９において示されるように、活性化／メモリーＴｒｅｇの数は、透析群において最も高く、移植群において最低であり、この差は統計的に有意であった。数の減少は恐らく移植片拒絶を防ぐために使用される免疫抑制療法の結果であった。ナイーブＴｒｅｇ数は、３つの群内で有意に変化しなかった。
[実施例１９]
【０２１７】
マカクのＴｒｅｇを検出するための抗ヒトＣＤ４／ＣＤ２５／ＣＤ１２７／ＣＤ４５ＲＯ  ｍＡｂ反応混液の使用
末梢血は、メルボルン大学及びＣＳＩＲＯ畜産業動物実験及び倫理委員会の承認により行なわれたワクチン接種研究の一部として３２匹のマカクから得られた。対照（１１匹の被験体）、Ｇａｇタンパク質により治療された群（１０匹の被験体）、並びにＧａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ及びＲＴＮＶＶＶにより治療された群（１０匹の被験体）の異なる３群があった。
【０２１８】
ヒト分子について一次的特異性を有するマウスｍＡｂがこの研究において使用された：抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ４５ＲＯ（PharMingen, San Diego, CA）、抗ＣＤ２５（BD Biosciences, San Jose, CA）、抗ＣＤ１２７（Immunotech, Marseille, France）。
【０２１９】
図３０において示されるように、マカクの末梢血白血球中のＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ１２７の発現は、ヒトにおける発現に類似していた。それゆえに、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞を同定するために同じゲート戦略を利用することができるかもしれない。図３１は、マカクの末梢血中のＴｒｅｇのパーセンテージが本質的にヒトにおけるものと同じで、ワクチン接種が数に影響しなかったことを示す。
【０２２０】
参照文献（References）
1. Sakaguchi, S, 2004. Naturally arising CD4+ regulatory T cells for immunologic self-tolerance and negative control of immune responses. Annu, Rev. Immunol, 22:531-562.
2. Kriegel, M. A., T. Lohmann, C. Gabler, N. Blank, J. R. Kalden, and H. M. Lorenz. 2004.
Defective suppressor function of human CD4+ CD25+ regulatory T cells in autoimmune polyglandular syndrome type II. J. Exp. Med. 199:1285-1291. 
3. Crispin, J. C1 A. Martinez, and J. Alcocer-Varela. 2003. Quantification of regulatory T cells in patients with systemic lupus erythematosus. J. Autoimmun. 21 :273-276.
4. Cao, D., R. van Vollenhoven, L. Klareskog, C. Trollmo, and V. Malmstrom. 2004.
CD25brightCD4+ regulatory T cells are enriched in inflamed joints of patients with chronic rheumatic disease. Arthritis Res. Ther. 6:R335-346.
5. Ehrenstein, M. R., J. G. Evans, A. Singh, S. Moore, G. Warnes, D. A. Isenberg, and C. Mauri. 2004. Compromised function of regulatory T cells in rheumatoid arthritis and reversal by anti- i5 TNFalpha therapy. J. Exp. Med. 200:277-285.
6. Sugiyama, H., R. Gyulai, E. Toichi, E. Garaczi, S. Shimada, S. R. Stevens, T. S. McCormick, and K. D. Cooper. 2005. Dysfunctional blood and target tissue CD4+CD25high regulatory T cells in psoriasis: mechanism underlying unrestrained pathogenic effector T cell proliferation. J. Immunol. 174:164-173.
7. Viglietta, V., C. Baecher-Allan, H. L. Weiner, and D. A. Hafler. 2004. Loss of functional suppression by CD4+CD25+ regulatory T cells in patients with multiple sclerosis. J. Exp. Med. 199:971-979.
8. Furuno, K., T. Yuge, K. Kusuhara, H. Takada, H. Nishio, V. Khajoee, T. Ohno, and T. Hara. 2004. CD25+CD4+ regulatory T cells in patients with Kawasaki disease. J. Pediatr. 145:385- 390.
9. Maul, J., C. Loddenkemper, P. Mundt, E. Berg, T. Giese, A. Stallmach, M. Zeitz, and R. Duchmann. 2005. Peripheral and intestinal regulatory CD4+CD25high T cells in inflammatory bowel disease. Gastroenterology 128:1868-1878.
10. Karlsson, M. R., J. Rugtveit, and P. Brandtzaeg. 2004. Allergen-responsive CD4+CD25+ regulatory T cells in children who have outgrown cow's milk allergy. J. Exp. Med. 199:1679-1688.
11. Ling, E. M., T. Smith, X. D. Nguyen, C. Pridgeon, M. Dallman, J. Arbery, V. A. Carr, and D. S. Robinson. 2004. Relation of CD4+CD25+ regulatory T-cell suppression of allergen-driven T-cell activation to atopic status and expression of allergic disease. Lancet 363:608-615.
12. Bennett, C. L., J. Christie, F. Ramsdell, M. E. Brunkow, P. J. Ferguson, L. Whitesell, T. E. Kelly, F. T. Saulsbury, P. F. Chance, and H. D. Ochs. 2001. The immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome (IPEX) is caused by mutations of FOXP3. Nat. Genet. 27:20-21.
13. Ormandy, L, A., T. Hillemann, H. Wedemeyer, M. P. Manns, T. F. Greten, and F. Korangy. 2005. Increased populations of regulatory T cells in peripheral blood of patients with hepatocellular carcinoma. Cancer Res. 65:2457-2464.
14. Schaefer, C, G. G. Kim, A. Albers, K. Hoermann, E. N. Myers, and T. L. Whiteside. 2005. Characteristics of CD4+CD25+ regulatory T cells in the peripheral circulation of patients with head and neck cancer. SrJ Cancer 92:913-20.
15. Baecher-Allan, C1 J. A. Brown, G. J. Freeman, and D. A. Hafler. 2001. CD4+CD25hight regulatory cells in human peripheral blood. J. Immunol. 167:1245-1253.
16. Kukreja, A., G. Cost, J. Marker, C. Zhang, Z. Sun, K. Lin-Su, S. Ten, M. Sanz, M. Exley, B. Wilson, S. Porcelli, and N, Maclaren. 2002. Multiple immuno-regulatory defects in type-1 diabetes. J. Clin. Invest 109:131-140.
17. Cao, D., V. Malmstrom, C. Baecher-Allan, D. Hafler, L. Klareskog, and C. Trollmo. 2003. Isolation and functional characterization of regulatory CD25brightCD4+ T cells from the target organ of patients with rheumatoid arthritis. Eur. J. Immunol, 33:215-223. 
18. Huang, Y. M., R. Pirskanen, R. Giscombe, H. Link, and A. K. Lefvert. 2004. Circulating CD4+CD25+ and CD4+CD25- T cells in myasthenia gravis and in relation to thymectomy. Scancl. J. Immunol. 59:408-414.
19. Putheti, P., A. Pettersson, M. Soderstrom, H. Link, and Y. M. Huang. 2004. Circulating CD4+CD25+ T regulatory cells are not altered in multiple sclerosis and unaffected by disease- modulating drugs. J. Clin. Immunol. 24:155-61.
20. van Ameisfort, J. M., K. M. Jacobs, J. W. Bijlsma, F. P. Lafeber, and L. S. Taams. 2004. CD4+CD25+ regulatory T cells in rheumatoid arthritis: differences in the presence, phenotype, and function between peripheral blood and synovial fluid. Arthritis Rheum. 50:2775-2785.
21. Seddiki, N., B. Santner-Nanan, S. G. Tangye, S. I. Alexander, M. Solomon, S. Lee, R. Nanan, and B. Fazekas de St Groth. 2006. Persistence of naive CD45RA+ regulatory T cells in adult life. Blood 107:2830-2838.
22. Seddiki, N., W. Selby, M. Solomon, S. Lee, P. McKenzie, and B. Fazekas de St Groth. 2006. Young patients with inflammatory bowel disease display primary defects in regulatory T cells. submitted for publication.
23. Ruprecht, C. R., M. Gattomo, F. Ferlito, A, Gregorio, A. Martini, AntonioLanzavecchia, and F. Sallusto. 2005. Coexpression of CD25 and CD27 identifies FoxP3+ regulatory T cells in inflamed synovia. J. Exp. Med. 201:1793-1803.
24. Morgan, M. E., J. H. van Bilsen, A. M. Bakker, B. Heemskerk, M. W. Schilham, F. C. Hartgers, B. G. Elferink, L. van der Zanden, R. R. de Vries, T. W. Huizinga, T. H. Ottenhoff, and R. E. Toes. 2005. Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+ T regulatory cells in humans. Hum. Immunol. 66:13-20.
25. Cozzo, C, J. Larkin, 3rd, and A. J. Caton. 2003. Self-peptides drive the peripheral expansion of CD4+CD25+ regulatory T cells. J. Immunol. 171:5678-5682. 
26. Gavin, M. A., S. R. Clarke, E. Negrou, A. Gallegos, and A. Rudensky. 2002. Homeostasis and anergy of CD4+CD25+ suppressor T cells in vivo. Nat Immunol. 3:33-41.
27. Godfrey, W. R., D. J. Spoden, Y. G. Ge1 S. R. Baker, B. Liu, B. L. Levine, C. H. June, B. R. Blazar, and S. B. Porter. 2005, Cord blood CD4+CD25+-derived T regulatory cell lines express FoxP3 protein and manifest potent suppressor function. blood 105:750-758.
28. Baecher-Allan, C, E. Wolf, and D. A. Hafler. 2006. MHC class Il expression identifies functionally distinct human regulatory T cells. J. Immunol. 176:4622-4631.
29. Vitali, C, S. Bombardieri, R. Jonsson, H. M. Moutsopoulos, E. L. Alexander, S. E. Carsons, T. E. Daniels, P. C. Fox, R. I. Fox, S. S. Kassan, S. R. Pillemer, N. TaIaI, and M. H. Weisman. 2002. Classification criteria for Sjogren's syndrome: a revised version of the European criteria proposed by the American-European Consensus Group. Ann. Rheum. Dis. 61:554-8. 
【図面の簡単な説明】
【０２２１】
【図１】フローサイトメトリーによる、ヒト及びマウスの末梢血白血球及びリンパ節細胞中のＣＤ４対ＣＤ２５の細胞表面の発現の比較を示した図である。末梢血白血球及びリンパ節（ＬＮ）細胞はＣＤ４及びＣＤ２５に対するモノクローナル抗体を使用して、染色され、ＣＤ４を発現する生細胞についてはゲートした。（ａ）  マウスにおいて、多くのＣＤ４＋Ｔ細胞が活発に増殖している（「刺激された」プロット）ときにおいても、ＣＤ２５を発現する従来の活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の数が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性細胞の数に比べて低い。（ｂ）  成人のヒト末梢血において、ＣＤ４＋Ｔ細胞の最大２０％〜３０％はＣＤ２５を発現し、これらの細胞の多くは、異種抗原との遭遇から生じるエフェクター細胞及びメモリー細胞であるように思われる。対照的に、ヒト臍帯血プロファイルは、マウスのプロファイルと類似している。成人ヒトリンパ節プロファイルは、成人ヒト末梢血のプロファイルに類似している。（ｃ）  マウス末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞とヒト末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞との間での、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＯＸ４０及びＣＴＬＡ−４の発現の比較。細胞は、ＣＤ４を発現する生細胞についてゲートする。ヒト細胞についての発現パターンは、マウスのデータに基づいて正確に予測することはできない。（ｄ）  ８つのマーカーについての染色は、活性化／メモリーＴ細胞からヒト末梢血ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＴ細胞を区別できなかった。末梢血白血球を、ＣＤ４、ＣＤ２５、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７１、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２７、ＣＤ５８、ＣＤ９５又はＣＤ４５ＲＯのいずれかの発現について染色した。プロファイルは、ＣＤ４を発現する生細胞についてゲートされる。ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５８及びＣＤ９５はすべて、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の第２の集団を示したが、これらの抗体の各々は、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇと従来のＣＤ２５を発現する活性化／メモリーＴ細胞を区別できなかった。
【図２】成人血、リンパ節、臍帯血及び胸腺におけるＣＤ１２７及びＦｏｘＰ３の発現を示した図である。（ａ）  プロットは、ＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞についてゲートされる。ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞はボックスで囲まれ、ボックス中の細胞の％が示される。リンパ節サンプルでは、ＣＤ２５−ＣＤ１２７ｌｏ細胞もボックスで囲まれる。（ｂ）  プロットはＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞についてゲートされる。ＦｏｘＰ３＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞はボックスで囲まれ、ボックス中の細胞の％が示される。（ｃ）  末梢血中のＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋表現型とＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ表現型との間の相関性。各々のサブセットについてのＣＤ４＋細胞のゲートが示され、相互サブセットに従ってゲートされた細胞が分布される。（ｄ）  胸腺におけるＦｏｘＰ３＋表現型とＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ表現型との間の相関性。
【図３】ＦｏｘＰ３表現型とＣＤ１２７ｌｏ表現型との発現の間の相関性を示した図である。（ａ）  成人の血液、リンパ節及び臍帯血由来の白血球は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋集団及びＣＤ４５ＲＡ−集団の中へゲートされた。ＦｏｘＰ３＋細胞はボックスで囲まれ、ボックスにおける細胞の％は、ＦｏｘＰ３＋ゲート内のＣＤ２５対ＣＤ１２７の発現と共に示される。（ｂ）  健康なボランティア由来の９つの末梢血サンプルにおける、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋集団及びＣＤ４５ＲＡ−集団中のＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞及びＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞のパーセンテージの間の相関性。
【図４】４３人の健康なボランティア由来の末梢血におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞のパーセンテージを示した図である。（ａ）  ＣＤ４５ＲＡ−亜集団及びＣＤ４５ＲＡ＋亜集団にさらに分けられたＣＤ４＋細胞についてのゲートの戦略。ボックスは、各々の細胞集団についての分析ゲートの配置を示す。（ｂ）  全ＣＤ４＋Ｔ細胞中でのパーセンテージとして表されたＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞及びＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞。全Ｔｒｅｇのパーセンテージは、ＣＤ４５ＲＡ−Ｔｒｅｇサブセット及びＣＤ４５ＲＡ＋Ｔｒｅｇサブセットの値を共に加えることにより導き出された。水平バーは群の平均値を意味する。（ｃ）  様々なＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団と年齢との関係。
【図５】ＣＤ４＋Ｔ細胞の選別された集団におけるＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡ発現の定量分析を示した図である。（ａ）  成人血及び臍帯血由来のＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットの単離のための選別戦略。ドットのプロットは、成人血の場合にはＣＤ４５ＲＡと共にＣＤ４を発現するリンパ球についてゲートされる。番号が付けられたボックスは、各々の細胞集団についてのフロー選別ゲートの配置を示す。（ｂ）  Ｆｏｘｐ３のためのＲＴ  ｑＰＣＲを、選別された細胞集団から調製されたＲＮＡを使用して、二重で実行した。選別された４人のドナー由来のＣＤ４５ＲＡ−細胞は比較された。しかし、十分なＣＤ４５ＲＡ＋細胞は２人のドナーのみに利用可能であった。（ｃ）  ２人の成人のドナーから選別された細胞集団から調製されたＲＮＡを使用するＴ−ｂｅｔ及びＧＡＴＡ３のためのＲＴ  ｑＰＣＲ。
【図６】成人血及び臍帯血由来のＴｒｅｇによるｉｎ  ｖｉｔｒｏの増殖の抑制を示した図である。（ａ）  ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットの単離のための選別戦略。ドットのプロットは、成人血の場合にはＣＤ４５ＲＡと共にＣＤ４を発現するリンパ球についてゲートされる。番号が付けられたボックスは、各々の細胞集団についてのフロー選別ゲートの配置を示す。（ｂ）  成人血からフロー選別された集団（１〜５）及び臍帯血からフロー選別された集団（６〜８）による抑制。レスポンダー細胞は、成人血についてＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＧＤ２５−自己細胞（集団５）、及び臍帯血についてＣＤ４＋ＣＤ２５−自己細胞（集団８）として選別された。サプレッサー細胞とレスポンダー細胞との比率は図の上に示される。バーは、３〜４つの重複した培養の平均±ＳＥＭを表わす。成人血の分析は２つの独立した実験の典型であり、臍帯血データは１回の実験に由来する。（ｃ）  ＣＤ２５の発現に基づいて選別された成人血由来のＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏＴ細胞のサブセットの単離のための戦略。（ｄ）  成人血からフロー選別された集団（９〜１４）による抑制及びサイトカイン産生。レスポンダー細胞は選別されたＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−自己細胞（集団１４）であった。サイトカイン分析における検出限界は点線により示される。ｎｄ：検出されない。（ｅ）  フロー選別された集団（９、１３〜１４及び０）の１：１の比率でのトランスウェル培養。
【図７】様々なゲート戦略を使用する対照及びＩＢＤ患者のＴｒｅｇ数の比較を示した図である。４３人の対照及び３８人のＩＢＤ患者（１９人のクローン病（ＣＤ）患者及び１９人の潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者を含む）由来のＰＢＭＣを血液から精製し、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７及びＣＤ４５ＲＡに対するｍＡｂにより染色した。（ａ、ｂ）  ＣＤ４を発現するリンパ球をゲートＡからゲートＤに従って分析し、個々のデータ点はＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージとしてプロットした。（ｃ）  ＣＤ４を発現するリンパ球を、ＣＤ４５ＲＡ＋集団及びＣＤ４５ＲＡ−集団にさらに分け、ゲートＥ及びゲートＦに従って分析し、個々のデータ点はＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージとしてプロットした。離れている右側のボックスの値は、ゲートＥ及びゲートＦに由来した個々の値の追加により導き出された。水平バーは群の平均値を表わす。ゲートＥ、ゲートＦ及びゲートＥ＋ＦについてのＣＤ４＋Ｔ細胞の％としての平均±ＳＥＭは、ナイーブＴｒｅｇ（ゲートＥ）、対照  ２．０５±０．１４、ＣＤ  １．３４±０．１４、ＵＣ  １．１６±０．１３；エフェクター／メモリーＴｒｅｇ（ゲートＦ）、対照  ４．２９±０．２４、ＣＤ  ６．０５±０．６９、ＵＣ  ４．１９±０．３２；全Ｔｒｅｇ（ゲートＥ＋Ｆ）、対照  ６．３５±０．２６、ＣＤ  ７．３９±０．７２、ＵＣ  ５．３４±０．３８であった。群間の差の統計分析は、ＣＤ及びＵＣの中央値を対照群と比較して、ノンパラメトリックのクラスカル・ワリス及びダンの多重比較検定を使用した。Ｐ値＜０．０５は有意であると考えられた。
【図８】８１人の患者及び対照からプールされたデータを使用して、図７に示されるゲートに従ったＴｒｅｇのための異なるゲートの戦略の相関性を示した図である。（ａ）  ゲートＡ対ゲートＥ。（ｂ）  ゲートＢ対ゲートＥ。（ｃ）  ゲートＣ対ゲートＥ。（ｄ）  ゲートＤ対ゲートＦ。線形回帰式は各々のボックスの中に示される。相関係数の有意性は、ノンパラメトリックのスピアマン検定を使用して推測された。
【図９】ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ及び他の亜集団、並びに対照及びＩＢＤの患者における年齢の関係を示した図である。データは図７ｃに示された分析に由来する。線形回帰を、対照（Ｎ＝４３）群及び患者（Ｎ＝３８）群について実行した。相関係数の有意性はノンパラメトリックのスピアマン検定を使用して推測された。
【図１０】３つの年齢集団に分けられた対照、ＣＤ患者及びＵＣ患者のＴｒｅｇパーセンテージの比較を示した図である。データは図７ｃに示された分析に由来する。（ａ）  全ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージとしてのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞（ゲートＦ、図７ｃ）。（ｂ）  全ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージとしてのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１２７ｌｏ細胞（ゲートＥ、図７ｃ）。（ｃ）  全ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージとしての全ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞（ゲートＥ及びゲートＦ（図７ｃ）由来の個々のデータを加えることにより導き出されたデータ）。ノンパラメトリックのクラスカル・ワリス及びダンの多重比較検定を、ＣＤ及びＵＣの中央値を対照群と比較するために適用した。Ｐ値＜０．０５は、有意であると考えられた。
【図１１】１５歳〜３０歳の患者集団におけるナイーブＴｒｅｇ数に対して、疾患活性又は治療法の効果がないことを示した図である。データは図７において示される実験に由来する。患者サンプルは、病理組織検査と共に、結腸内視鏡検査又は手術の時における肉眼的外観に基づいて、活動期の疾患対非活動期の疾患を示すものに分けられた。治療法は、コルチコステロイド、ＤＮＡアナログ、アミノサリチル酸塩及び／又は抗生物質による治療を含んだ。「治療なし」の患者は、治療を全く受けていなかった。
【図１２】ＣＤ患者及びＵＣ患者において、腸粘膜及び排出リンパ節のＣＤ４＋Ｔ細胞中のＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ  Ｔｒｅｇのパーセンテージの間に有意な差はないことを示した図である。このデータは、粘膜及びリンパ節のＴｒｅｇのパーセンテージが末梢血のＴｒｅｇよりも一般に高いことを示す（図４と比較して）。
【図１３】異なる年齢の正常な対照のＴｒｅｇの区別ための従来のゲート戦略を示した図である。上部のパネル：ＣＤ４及びＣＤ２５による染色の例。下部のパネル：従来のＣＤ４染色及びＣＤ２５染色を使用して評価されるように、一生を通じてＴｒｅｇ数は増加する。＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＣＢ＝臍帯血；２０−２５ａ＝２０歳〜２５歳の対照；＞６０ａ＝６０歳を超える対照。
【図１４】ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７及びＣＤ４５ＲＡによる染色を使用して、異なる年齢の正常な対照のＴｒｅｇを区別するための新規のゲート戦略を示した図である。上部のパネル：ＣＤ４＋細胞をゲートした。下部のパネル：ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞又はＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞をゲートした。
【図１５】ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞と比べて、ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞についてゲートすることを使用するＴｒｅｇ数の比較を示した図である。２０歳〜２５歳、及び６０歳を越える年齢集団における成人の臍帯血及び末梢血の細胞のパーセンテージは表示されたゲートを使用して計算された。＊Ｐ＜０．０５；ｎｓ、統計的に有意ではない。
【図１６】ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔｒｅｇ数及びＣＤ４５ＲＡ−Ｔｒｅｇ数における年齢による変化を示した図である。血液白血球サンプルは、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ１２７に対する抗体により染色され、図１４の下部のパネルのようにゲートされた。年齢により反対にＣＤ４５ＲＡ＋Ｔｒｅｇは減少し、ＣＤ４５ＲＡ−Ｔｒｅｇが増加することは明らかである。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図１７】抑制は、すべての年齢のドナーから選別されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞に限定されることを示した図である。Ａ）  ＣＤ４、ＣＤ２５及びＣＤ１２７による染色を使用して、異なる年齢の正常な対照のＴｒｅｇを区別するためのゲート戦略。Ｂ）  成人血及び臍帯血からフロー選別された集団による抑制。レスポンダー細胞は選別されたＣＤ４＋ＣＤ１２７ｈｉＣＤ２５−自己細胞であった。サプレッサー細胞とレスポンダー細胞との比率は図の下に示される。培養を７２時間チミジンによりパルス標識し、１６時間後に採取した。バーは、３〜４つの重複した培養の１分当たりの平均±ＳＥＭの計測数を表わす。Ｃ）  選別された同じ集団からの重複培養は、ＣＦＳＥ標識されたレスポンダー細胞を使用して設定し、増殖の％は、レスポンダー細胞のみを含んでいる培養物中の分割された細胞の平均の数に関連すると計算された。バーは、３〜４つの重複した培養物の１分当たりの平均±ＳＥＭの計測数を表わす。
【図１８】アルツハイマー病患者対健康な高齢対照における循環Ｔｒｅｇ数の比較を示した図である。血液白血球サンプルを、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ１２７に対する抗体により染色し、図１４の下部のパネルのようにゲートした。４人の対照患者は７５歳〜９０歳で、正常な認知機能を有していた。５人のアルツハイマー病の患者は８３歳〜９２歳の間の年齢であった。ナイーブＴｒｅｇはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏＣＤ４５ＲＯ−でゲートされ、活性化／メモリーＴｒｅｇはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏＣＤ４５ＲＯ＋としてゲートされた。有意な差は２つの群の間で見られなかった。
【図１９】ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７及びＦｏｘＰ３により染色された湿疹患者由来のＰＢＬにおけるＴｒｅｇのゲート例を示した図である。ドットのプロットはＣＤ４＋細胞についてゲートされる。ＦｏｘＰ３及びＣＤ１２７の発現パターンは、対照（例えば図３において）における発現パターンに類似する。したがって、ＦｏｘＰ３＋細胞はＣＤ２５＋であり、ＣＤ１２７ｌｏＣＤ２５＋集団に対応する。
【図２０】異なるゲート戦略を使用する湿疹患者及び健康な対照の間のＴｒｅｇ数の比較を示した図である。（Ａ）  従来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ゲート。差は統計的に有意ではない。（Ｂ）  図１９において説明されるような、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏゲート。（Ｂ）における結果は、ＦｏｘＰ３染色を使用して確認された。湿疹患者は年齢が一致した対照よりも有意に多くのＴｒｅｇを有する（Ｐ＜０．００１）。
【図２１】非アトピーの被験体、喘息をともなわないアトピーの被験体、及び喘息のアトピーの被験体の血液中の全Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ）、及びナイーブＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ）の頻度を示した図である。データは中央値及び範囲によりボックスプロット（２５％〜７５％）として表示される。３つの群の間で有意差はなかった。
【図２２】培養中のイエダニ（ＨＤＭ）に対するＩＬ５反応に従って分けられた、非アトピーの被験体（皮膚プリックテスト陰性（ＳＰＴ−ｖｅ））及びアトピーの被験体の血液中のＴｒｅｇの頻度を示した図である。上部のパネル：全Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ）及びＣＤ４５ＲＡ＋Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ）。下部のパネル：ナイーブＣＤ４５ＲＡ＋Ｔｒｅｇと活性化／メモリーＣＤ４５ＲＡ−Ｔｒｅｇとの比率。ナイーブＴｒｅｇのパーセンテージ、及びナイーブＴｒｅｇとエフェクター／メモリーＴｒｅｇとの比率の両方は、培養中のＨＤＭに反応して検出可能なＩＬ−５を産生する患者においてＣＤ４＋Ｔ細胞の比率として有意に増加したが、この群における全Ｔｒｅｇ細胞において全体的な増加はなかった。
【図２３】原発性のシェーグレン症候群の患者の血液中のナイーブＴｒｅｇ、活性化Ｔｒｅｇ及び全Ｔｒｅｇの頻度を示した図である。血液白血球サンプルはＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ１２７に対する抗体により染色され、図１４の下部のパネルのようにゲートされた。対照は年齢及び性別を一致させた。年齢を一致させた対照と比較して、患者群におけるＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージとして、ナイーブＴｒｅｇ及び全Ｔｒｅｇの両方における有意な増加があった。
【図２４】ＨＩＶの患者の３つの異なる群におけるＣＤ１２７の発現例を示した図である。（ａ）  プロットはＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞についてゲートされる。ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞はボックスで囲まれ、ボックス中の細胞の％が示される。（ｂ）  プロットは、ＣＤ４＋ＣＤ８−ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ８−ＣＤ４５ＲＯ−Ｔ細胞についてゲートされる。ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞がボックスで囲まれる。ＩＲＤ＝免疫再構築症候群。
【図２５】ＩＲＤのＨＩＶ＋患者におけるＦｏｘＰ３の発現とＣＤ１２７ｌｏ表現型との間の相関性を示した図である。ＨＩＶ＋ＩＲＤ＋患者由来のＰＢＭＣは、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞についてゲートされた。ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞はボックスで囲まれ、同じゲート内のＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞及びＣＤ１２７ｌｏＦｏｘＰ３＋細胞のパーセンテージの間の相関性が示される。
【図２６】セロコンバータ、進行性疾患の患者（±抗レトロウイルス療法）、並びに進行性疾患、抗レトロウイルス療法及び免疫再構築症候群の患者へ分けられたＨＩＶ＋患者におけるＴｒｅｇ数を示した図である。セロコンバータ中の全Ｔｒｅｇの平均数は、８．６８±０．８３％（平均±標準誤差）であり、抗レトロウイルス療法あり又はなしの進行性疾患の患者中のＴｒｅｇの平均数は、それぞれ６．６８±０．６８％及び８．７８±２．３％であり、ＩＲＤの患者中のＴｒｅｇの平均数は、１６．６４±２．６６％であった。ＩＲＤ患者は、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔｒｅｇ細胞及び全Ｔｒｅｇ細胞の有意により高いパーセンテージを示したが、セロコンバータにおいては、ＡＲＴにより治療された慢性ＨＩＶと比較して、ナイーブＴｒｅｇ数は有意に増加した。
【図２７】メラノーマ患者における、一週間に３度の採血についての、ＣＤ１２７／ＣＤ２５／ＣＤ４染色をＦｏｘＰ３／ＣＤ２５／ＣＤ４染色と比較するＴｒｅｇ数の縦断的研究を示した図である。いずれかの技法を使用して、Ｔｒｅｇの数は、２つの方法間の高い相関性があり、一般に安定していた（右側のパネル）。
【図２８】メラノーマ患者におけるワクチン接種研究を示した図である。患者は、最初のワクチン接種の前に、及び次に続く各々のワクチン接種後に採血された。ワクチン接種によるＴｒｅｇ数の有意な変化はなかった。
【図２９】慢性腎不全（ＣＲＦ）、透析を行なうＣＲＦ、及び腎移植をともなう患者における、活性化循環Ｔｒｅｇ対ナイーブＴｒｅｇの比較を示した図である。臓器移植患者は、免疫抑制剤を用いた治療の結果として、ＣＤ４５ＲＡ−Ｔｒｅｇ数が有意に減少した。
【図３０】マカク抗原と交差反応する抗ヒト抗体を使用して、マカクにおけるＴｒｅｇゲートの例を示した図である。上部のパネル：ＣＤ２５対ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ１２７の発現についてのゲートを示すＣＤ４＋Ｔ細胞のドットプロット。ゲート内の細胞のパーセンテージが表示される。下部のパネル：示されるようにＣＤ４５ＲＯ−細胞及びＣＤ４５ＲＯ＋細胞中のＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞についてのゲート。ボックスはゲートを表わし、パーセンテージはゲート中に示される。さらに、Ｔｒｅｇのパーセンテージは、全ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージとして計算される（太字で示された）。
【図３１】図３０のようにゲートされたマカクの末梢血中のＴｒｅｇサブセットを示した図である。全Ｔｒｅｇの範囲は、４．３９％〜１１．４２％であり、免疫付与後に有意な変化はなかった。
【０２２２】
「配列表」
SEQUENCE LISTING
<110>  Centenary Institute of Cancer Medicine and Cell Biology
<120>  Method for Identifying Regulatory T Cells
<130>  715732
<160>   8
<170>  PatentIn version 3.2
<210>   1
<211>  21
<212 >  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic sequence
<400>  1
ggcaaatggt gtctgcaagt g
<210>  2
<211>  21
<212 >  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic sequence
<400>   2
ggatgatgcc acagatgaag c
<210>  3
<211>   25
<212 >  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic sequence
<400>  3
aactgtcaga ccaccacaac cacac
<210>  4
<211>  26
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic sequence
<400>  4
ggatgccttc cttcttcata gtcagg
<210>   5
<211>   24
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic sequence
<400>  5
cactacagga tgtttgtgga cgtg
<210>  6
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic sequence
<400>  6
ccccttgttg tttgtgagct ttag
<210>  7
<211>  26
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic sequence
<400>  7
tcgacaacgg ctccggcatg tgcaag
<210>   8
<211>  25
<212 >  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic sequence
<400>   8
agccacacgc agctcattgt agaag
【図１】
2009508089.tif 000009
【図２】
2009508089.tif 000010
【図３】
2009508089.tif 000011
【図４】
2009508089.tif 000012
【図５】
2009508089.tif 000013
【図６】
2009508089.tif 000014
【図７】
2009508089.tif 000015
【図８】
2009508089.tif 000016
【図９】
2009508089.tif 000017
【図１０】
2009508089.tif 000018
【図１１】
2009508089.tif 000019
【図１２】
2009508089.tif 000020
【図１３】
2009508089.tif 000021
【図１４】
2009508089.tif 000022
【図１５】
2009508089.tif 000023
【図１６】
2009508089.tif 000024
【図１７】
2009508089.tif 000025
【図１８】
2009508089.tif 000026
【図１９】
2009508089.tif 000027
【図２０】
2009508089.tif 000028
【図２１】
2009508089.tif 000029
【図２２】
2009508089.tif 000030
【図２３】
2009508089.tif 000031
【図２４】
2009508089.tif 000032
【図２５】
2009508089.tif 000033
【図２６】
2009508089.tif 000034
【図２７】
2009508089.tif 000035
【図２８】
2009508089.tif 000036
【図２９】
2009508089.tif 000037
【図３０】
2009508089.tif 000038
【図３１】
2009508089.tif 000039
【配列表】
2009508089000001.xml
【国際調査報告】
2009508089.tif 000042
2009508089.tif 000043