(57)【要約】アルツハイマー病(AD)は、脳におけるアミロイド-βペプチド(Aβ)の蓄積により特徴付けられる。Aβは、β-およびγ-セクレターゼによりアミロイド前駆体タンパク質(APP)に由来する。アポリポタンパク質E受容体2(ApoER2)は、アポリポタンパク質Eの細胞表面受容体である。ApoER2がX11α/βタンパク質と相互作用すること、およびAPPがX11の存在下でApoER2との会合を形成することが、この研究により示される。ApoEはAβの産生を刺激し、かつApoE4がApoE2またはApoE3よりも多くのAβを産生する点が重要であり、これはApoE4多型を有する個体がADをより発症しやすいことを示した以前の研究と相関する。従って、細胞表面上でのApoEのApoER2への結合は、APPからのAβの生成を刺激する。ApoE-ApoER2相互作用に干渉するアンタゴニストが、ADの処置のために提案される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ApoER2受容体を発現する神経細胞内でAβ産生を低下させる方法であって、ApoEのApoER2への結合を阻害する作用物質を該細胞へ供給する段階を含む、方法。
【請求項２】
作用物質が、ApoE4のApoER2への結合の相互作用を優先的に阻害する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
作用物質がApoER2の可溶型またはApoER2ペプチドである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
作用物質がApoEペプチドである、請求項1記載の方法。
【請求項５】
ApoEペプチドがApoE4ペプチドである、請求項4記載の方法。
【請求項６】
ApoE4ペプチドが天然ApoE4タンパク質の112位を含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
作用物質が、ApoER2または抗ApoE4に結合する抗体または抗体断片である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
抗体が一本鎖抗体またはヒト化抗体である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
作用物質が神経細胞内でApoER2の発現を低下させる、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
作用物質が、小分子、ApoER2アンチセンス分子、ApoER2 siRNA、またはApoER2リボザイムである、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
作用物質が、ApoE4を発現する細胞内でApoE4の発現を低下させる、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
作用物質が、ApoER2もしくはApoE同形型への結合親和性を有する小分子、ApoE4アンチセンス分子、ApoE4 siRNA、またはApoE4リボザイムである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
作用物質が脂質媒体で送達される、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
脂質媒体がリポソームである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
供給する段階が、プロモーターの制御下で作用物質をコードする発現構築物を神経細胞またはApoE4を発現する細胞へ送達することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
発現構築物がウイルス発現構築物である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
ウイルス発現構築物が神経栄養性ウイルスである、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
神経栄養性ウイルスがレトロウイルス、レンチウイルス、またはヘルペスウイルスである、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
神経細胞がヒト神経細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
ヒト神経細胞が生きている被験体内にある、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
生きている被験体がアルツハイマー病を患っている、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
生きている被験体がアルツハイマー病を患っていない、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
生きている被験体が先在するAβ斑を有する、請求項20記載の方法。
【請求項２４】
被験体のニューロンにおいてAβ斑形成を阻害する方法であって、ApoEのApoER2への結合を阻害する作用物質を被験体に供給する段階を含む、方法。
【請求項２５】
被験体においてアルツハイマー病の1つまたは複数の症状の進行を阻止する方法であって、ApoEのApoER2への結合を阻害する作用物質を被験体に供給する段階を含む、方法。
【請求項２６】
被験体においてアルツハイマー病の発症を遅延させる方法であって、ApoEのApoER2への結合を阻害する作用物質を被験体に供給する段階を含む、方法。
【請求項２７】
ApoER2受容体を発現する神経細胞内でAβ産生を低下させる方法であって、X11α/βのApoER2への結合を阻害する作用物質を該細胞に供給する段階を含む、方法。
【請求項２８】
作用物質がドミナントネガティブ型のX11α/βである、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
ドミナントネガティブ型のX11α/βがPTBドメインペプチドである、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
PTBドメインペプチドが、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、もしくはSEQ ID NO:12の配列、またはそれらの阻害性断片を含む、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
作用物質が、ApoER2または抗X11α/βに結合する抗体または抗体断片である、請求項27記載の方法。
【請求項３２】
抗体が一本鎖抗体またはヒト化抗体である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
作用物質が脂質媒体で送達される、請求項27記載の方法。
【請求項３４】
脂質媒体がリポソームである、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
神経細胞がヒト神経細胞である、請求項27記載の方法。
【請求項３６】
ヒト神経細胞が生きている被験体内にある、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
生きている被験体がアルツハイマー病を患っている、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
生きている被験体がアルツハイマー病を患っていない、請求項36記載の方法。
【請求項３９】
生きている被験体が先在するAβ斑を有する、請求項36記載の方法。
【請求項４０】
作用物質がX11α/βまたはApoEのペプチド模倣体である、請求項27記載の方法。
【請求項４１】
被験体のニューロンにおいてAβ斑形成を阻害する方法であって、X11α/βのApoER2への結合を阻害する作用物質を該細胞に供給する段階を含む、方法。
【請求項４２】
被験体においてアルツハイマー病の1つまたは複数の症状の進行を阻止する方法であって、X11α/βのApoER2への結合を阻害する作用物質を該細胞に供給する段階を含む、方法。
【請求項４３】
被験体においてアルツハイマー病の発症を遅延させる方法であって、X11α/βのApoER2への結合を阻害する作用物質を該細胞に供給する段階を含む、方法。
【請求項４４】
ドミナントネガティブなX11α/β。
【請求項４５】
PDZドメインを欠く、請求項44記載のドミナントネガティブなX11α/β。
【請求項４６】
X11α/βのホスホチロシン/チロシン結合(PTB)ドメインを含むペプチドであって、10〜50残基長であるペプチド。
【請求項４７】
SEQ ID NO:8の残基413位〜421位を含む、請求項46記載のペプチド。
【請求項４８】
X11α/βのホスホチロシン/チロシン結合(PTB)ドメインに結合する抗体。
【請求項４９】
一本鎖抗体またはヒト化抗体である、請求項48記載の抗体。
【請求項５０】
抗体がX11α/βのホスホチロシン/チロシン結合(PTB)ドメインに結合する、抗血清。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、全内容が参照により本明細書に組み入れられている、2006年2月21日に出願された米国特許仮出願第60/775,477号の優先権の恩典を主張する。
【０００２】
米国政府は、認可番号AG-18933によるNational Institutes of Healthからの財政支援に準じて本発明に権利を有する。
【０００３】
I. 発明の分野
本発明は、一般的に、神経病理学および分子生物学の分野に関する。より具体的には、それは、ApoE受容体（ApoER2など）との、ApoE4を含むApoEの相互作用を阻害する作用物質の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
II. 関連技術の説明
神経変性疾患は、一般的に、中枢神経系の1つまたは複数の領域由来のニューロンの損失により特徴付けられる。それらは、起源および進行の両方において複雑で、処置するべき最も困難な型の疾患の一部であることが証明されている。実際、いくつかの神経変性疾患について、有意な治療的有用性をもたらす、利用可能な薬物はない。治療供給困難は、これらの疾患がそれらの罹患者へ生じる壊滅的効果を考えれば、いっそう悲劇的である。
【０００５】
神経変性疾患の一つの型は、高齢者の間で最も一般的な型の認知症である、アルツハイマー病(AD)である。科学者は、最高4百万人のアメリカ人がADに罹患していると考えている。疾患は通常、年齢60歳後に始まり、年齢と共にリスクは上昇する。若年者もまたADに罹る場合もあるが、それはそれほど一般的ではない。年齢65〜74歳の男女の約3パーセントがADに罹っており、年齢85歳以上の男女のほぼ半分がその疾患に罹患している可能性がある。徹底した研究の対象であるが、ADの正確な原因はまだわかっておらず、治療法がない。
【０００６】
ADは、思考、記憶、および言語を制御する脳の部分を攻撃する。それは、ドイツ人の医者であるAlois Alzheimer博士の名をとって名付けられた。1906年、Alzheimer博士は、異常な精神病で死んだ女性の脳組織における変化に気づいた。彼は、今、アミロイド「斑」と呼ばれる、異常な塊、および今、神経原線維「濃縮体(tangle)」と呼ばれる、もつれた線維束を見出した。今日では、脳におけるこれらの斑および濃縮体がADの顕著な特徴とみなされている。
【０００７】
脳における、アミロイド斑の主要な成分である、アミロイドβ-タンパク質(Aβ)の産生、凝集、および蓄積が、ADの病気の発生における最初の段階である。Aβは、プロテアーゼのβ-セクレターゼ(メマプシン2またはBACE1)およびγ-セクレターゼによりI型膜タンパク質(Kang et al., 1987)であるアミロイドβ前駆タンパク質(APP、図1参照)(Selkoe, 2001)の細胞内プロセシングにより生成される。APPの細胞質ドメイン(APPcyt)は、その細胞質タンパク質との相互作用を通して、APP代謝およびAβ産生の制御において重要な役割を果たす(King and Turner, 2004)。
【０００８】
APPcytと相互作用するタンパク質の中には、X11ファミリータンパク質、X11α/β/γ(X11、X11様(X11L)、およびX11様2(X11L2)としても知られている)がある。図1は、X11タンパク質におけるドメインの図を示す。X11γは異なる組織に遍在性に分布するが、X11αおよびβは脳にのみ発現する(Borg et al., 1999; Hase et al., 2002)。ファミリータンパク質のそれぞれは、細胞内APPを安定化する、および/またはAβ産生を抑制することが報告された(King and Turner, 2004)。
【０００９】
LDL受容体ファミリーのメンバーである、ApoE受容体2(ApoER2)は、主に脳に発現している(Kim et al., 2001)。ApoER2は、アポリポタンパク質E(ApoE)、および脳の発達中にニューロン移動を制御するシグナル伝達タンパク質である、リーリン(Reelin)の受容体である(D'Arcangelo, 1999)。ApoEのApoER2への結合は、結果として、脂質が細胞へ輸送される過程の一部としてのその複合体の細胞への輸送を生じ、ApoEは担体タンパク質の一つである。
【００１０】
ヒトにおいて以下の3つの構造的に異なるApoEがある：ApoE2、ApoE3、およびApoE4。ApoE多型は、ADと結びつけられ、ApoE4を有する人々がその疾患のより高い発生率をもつ(Beffert et al., 2004)。このリスクについての生理学的機構は明らかではない。いくつかの方向の間接的証拠は、ApoER2がADにおいて役割を果たしている可能性があることを示唆している。ApoER2はAD患者のアミロイド斑に存在することが示されており(Motoi, 2004)、斑形成にApoER2が関与している可能性を意味する。ApoER2はまた、効率的なシナプス可塑性の維持に関与している(Petit-Turcotte et al., 2005)。さらに、APPおよびApoER2の両方は、Dab1およびJIP1に結合し(King and Turner, 2004)、関連する細胞機能を示唆する。しかしながら、ADにおけるApoER2およびApoE4によって果たされる正確な役割ははっきりしないままである。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
従って、本発明は、ApoER2受容体を発現する神経細胞内でAβ産生を低下させる方法を提供し、本方法は、ApoEのApoER2への結合を阻害する作用物質を該細胞に供給する段階を含む。もう一つの態様において、被験体のニューロンにおいてAβ斑形成を阻害する方法を提供し、本方法は、ApoEのApoER2への結合を阻害する作用物質を被験体に供給する段階を含む。さらにもう一つの態様において、被験体におけるアルツハイマー病の1つまたは複数の症状の進行をブロックする方法を提供し、本方法は、ApoEのApoER2への結合を阻害する作用物質を被験体に供給する段階を含む。そしてなおもう一つの態様において、被験体におけるアルツハイマー病の発症を遅らせる方法を提供し、本方法は、ApoEのApoER2への結合を阻害する作用物質を被験体に供給する段階を含む。
【００１２】
作用物質は、ApoE4のApoER2への結合の相互作用を優先的に阻害しうる。作用物質は、可溶型のApoER2またはApoER2ペプチド、ApoEペプチド（ApoE4ペプチドなど）、および特に天然のApoE4タンパク質の112位を含むApoE4ペプチドであってよい。作用物質はまた、一本鎖抗体またはヒト化抗体など、ApoER2またはApoE4に結合する抗体または抗体断片であってよい。作用物質は、該神経細胞内でApoER2の発現を低下させる可能性があり、例えば、そのような作用物質は、小分子、ApoER2アンチセンス分子、ApoER2 siRNA、またはApoER2リボザイムを含む。作用物質は、代わりに、ApoE4を発現する細胞内でApoE4の発現を低下させる可能性があり、この場合もやはり、小分子、ApoE4アンチセンス分子、ApoE4 siRNA、またはApoE4リボザイムである。
【００１３】
作用物質は、脂質媒体、例えば、リポソームまたはナノ粒子で送達されうる。送達は、プロモーターの制御下で該作用物質をコードする発現構築物と細胞を接触させる段階を含んでもよい。発現構築物は、レトロウイルス、レンチウイルス、またはヘルペスウイルスを含む神経栄養性ウイルスなどウイルス発現構築物であってよい。神経細胞は、生体におけるものなどヒト神経細胞であってよい。被験体はアルツハイマー病を患っていても患っていなくてもよい、または先在するAβ斑を有していてもよい。
【００１４】
ApoE4のApoER2への結合の相互作用を優先的に阻害する作用物質を含む薬学的組成物もまた提供される。組成物は作用物質を含んでもよく、作用物質は、ApoER2の可溶型、ApoER2ペプチド、ApoEペプチド（ApoE4ペプチドなど、特に天然のApoE4タンパク質の112位を含むApoE4ペプチド）、ApoER2もしくはApoE4に結合する抗体もしくは抗体断片、または一本鎖抗体もしくはヒト化抗体である。組成物はまた、該神経細胞におけるApoER2の発現を低下させる作用物質、例えば、小分子、ApoER2アンチセンス分子、ApoER2 siRNA、またはApoER2リボザイムを含んでもよい。組成物はまた、ApoE4を発現する細胞におけるApoE4の発現を低下させる作用物質（この場合もやはり、小分子、ApoE4アンチセンス分子、ApoE4 siRNA、またはApoE4リボザイム）を含んでもよい。
【００１５】
さらにもう一つの態様において、ApoER2受容体を発現する神経細胞内でAβ産生を低下させる方法を提供し、本方法は、X11α/βのApoER2への結合を阻害する作用物質を該細胞に供給する段階を含む。作用物質は、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、もしくはSEQ ID NO:12を有するもの、またはそれらの阻害性断片を含む、PTBドメインペプチドなどドミナントネガティブ型のX11α/βであってよい。作用物質はまた、ApoER2またはX11α/βに結合する抗体または抗体断片であってもよく、そのような抗体は、一本鎖抗体またはヒト化抗体である。作用物質は、X11α/βまたはApoEのペプチド模倣体であってよい。作用物質は、ApoER2またはApoE(すべての3つの多型を含む)のいずれかの立体構造を模倣する小分子であってもよく、結果として、ApoEのApoER2への結合の干渉を生じる。作用物質は、リポソームなど脂質媒体で送達されうる。神経細胞は、ヒト神経細胞で、生体に位置しうる。生体は、アルツハイマー病を患っていても、患ってなくてもよく、先在するAβ斑を有していても、有しなくてもよい。
【００１６】
他の態様において、以下が提供される：被験体のニューロンにおいてAβ斑形成を阻害する方法であって、X11α/βのApoER2への結合を阻害する作用物質を該細胞へ供給する段階を含む方法；被験体におけるアルツハイマー病の1つまたは複数の症状の進行をブロックする方法であって、X11α/βのApoER2への結合を阻害する作用物質を該細胞へ供給する段階を含む方法；および被験体におけるアルツハイマー病の発症を遅らせる方法であって、X11α/βのApoER2への結合を阻害する作用物質を該細胞へ供給する段階を含む方法。
【００１７】
さらに追加の態様において、以下が提供される：PDZドメインを欠損するものなどドミナントネガティブなX11α/β；X11α/βのホスホチロシン/チロシン結合(PTB)ドメインを含むペプチドであって、該ペプチドはSEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、もしくはSEQ ID NO:12の10〜50残基の連続したセグメント、またはSEQ ID NO:8の残基413位〜421位を含むものなど10〜50残基長である；一本鎖抗体またはヒト化抗体などX11α/βのホスホチロシン/チロシン結合(PTB)ドメインに結合する抗体；または、抗体がX11α/βのホスホチロシン/チロシン結合(PTB)ドメインに結合する、抗血清。
【００１８】
本明細書に記載された任意の方法または組成物は、本明細書に記載された任意の他の方法または組成物に関して実行できることが企図される。
【００１９】
特許請求の範囲および/または明細書において「含む」という用語と共に用いられる場合の「1つの（a）」または「1つの（an）」という言葉の使用は、「1つの」を意味しうるが、それはまた「1つまたは複数の」、「少なくとも1つの」、および「1または1より多い」の意味と一致する。
【００２０】
本明細書で考察された任意の態様は、本発明の任意の方法または組成物に関して実行することができ、逆もまた同様である。さらに、本発明の組成物およびキットは、本発明の方法を達成するために用いてもよい。
【００２１】
本出願を通して、「約」という用語を用いて、値には、その値を測定するために用いられることになっている装置、方法についての固有の誤差変動、または研究対象間に存在する変動が含まれることを示す。
【００２２】
例証的態様の説明
罹患者から徐々に活動能力を奪う点において、神経変性疾患は特に壊滅的である。際立ったことには、ここ数年、大きく進歩したにもかかわらず、神経変性疾患の処置に有用である薬物は相対的にわずかしかないままであり、高い割合で患者に有効であるものはほとんどない。従って、高齢者のヘルスケアに数十億ドルの費用がかかる、認知機能および全体的なメンタルヘルスに壊滅的な効果を生じる状態である、アルツハイマー病を含むこれらの状態に対する治療の、新規かつ改善された薬物および方法の緊急の必要性がある。
【００２３】
I. 本発明
本発明は今、神経細胞内でApoER2がApoE（特にApoE4）によるAβ40産生の増加を媒介することを示す。この関係の説明は以下のとおりである。X11の存在下で、APPはApoER2と会合している。ApoEのApoER2の結合は、結果として、ApoE-ApoER2複合体の細胞表面からエンドソームへのエンドサイトーシスを生じる。X11の存在下で、APPはこの複合体と共にエンドサイトーシスされるようになる。エンドソームは、Aβを形成しうるAPP切断についての主な部位であるため、この過程は、Aβ産生および分泌を増加させることが予想されうる。ApoE4は明らかに、他のApoEよりこの過程を実行するのにより効果的である。
【００２４】
この発見により、ApoER2のApoE（特にApoE4）への結合に干渉する小分子アンタゴニストが、Aβの産生を低下させるだろうことが予測される。これらのアンタゴニスト分子は、アルツハイマー病を処置するために、またはこの疾患が発症するリスクを低下させるために用いてもよい。ApoE4を含むApoEにおける既知の多型部位あたりのペプチド配列は、可能性のあるアゴニストであり、X11α/β/γのPTB結合ドメインの部分も同様である。ApoER2とApoEの相互作用は、BIAcore装置において表面プラズモンを用いるなどの様々な方法でモニターすることができる。または、ApoEの結合に干渉するために、およびAβ産生を低下させるために、ApoER2の抗体を用いてもよい。ApoER2の生合成、分布、または分解に影響を及ぼすことによりニューロンにおけるApoER2の数を低下させるように、他の薬物を設計してもよい。
【００２５】
II. アルツハイマー病
ADは、記憶喪失、言語低下、視空間的技能の障害、弱い判断力、無関心な態度、ただし運動機能の維持により特徴付けられる、進行性神経変性疾患である。ADは通常、65歳以降に始まるが、その発症が早くも40歳に起こる場合があり、最初は記憶力減退として現れ、そして数年かけて、認知、人格、および機能する能力を破壊する。精神錯乱および情動不安もまた起こる場合がある。精神的変化の型、重症度、順序、および進行は大きく異なる。健忘症および集中力の低下を含むADの初期症状は、それらが老化の自然の徴候と似ているため、簡単に見逃される場合がある。類似した症状はまた、疲労、悲しみ、鬱病、病気、視力もしくは聴力の損失、アルコールもしくは特定の薬物の使用、または単に、多すぎる項目を同時に記憶することからの負担に起因しうる。
【００２６】
ADの治療法およびその疾患の進行を遅らせる方法はない。疾患の初期または中期にある一部の人々では、タクリンなどの薬物が一部の認知的症状を緩和する場合がある。アリセプト(Aricept)(ドネペジル)およびエクセロン(Exelon)(リバスチグミン)は、軽度から中等度のアルツハイマー型の認知症の処置に用いられる可逆性アセチルコリンエステラーゼインヒビターである。また、一部の薬物は、不眠、不穏、徘徊、不安、および憂鬱などの行動的症状を制御するのを助ける可能性がある。これらの処置は、患者をより快適にさせることを目的とする。
【００２７】
ADは進行性疾患である。疾患の経過は人によって異なる。生涯の最後の5年間のみ疾患をもつ人もあれば、長くも20年間それをもつ人もいる。AD患者における最も多い死因は感染である。
【００２８】
ADの分子局面は、複雑であり、まだ完全には定義されていない。上記のように、ADは、脳、特に記憶処理の中心である海馬における、アミロイド斑および神経原線維濃縮体の形成により特徴付けられる。以下のいくつかの分子がこれらの構造に寄与する：アミロイドβタンパク質(Aβ)、プレセニリン(PS)、コレステロール、アポリポタンパク質E(ApoE)、およびタウタンパク質。これらのうち、Aβは中心的役割を果たしていると思われる。
【００２９】
Aβは約40アミノ酸残基を含む。42残基型および43残基型が40残基型よりはるかに毒性が強い。Aβはアミロイド前駆体タンパク質(APP)から逐次タンパク質分解により生成される。酵素の1つは配列特異性を欠くため、様々な長さ(39〜43)のAβを生成しうる。Aβの毒性型は、アポトーシス、フリーラジカル形成、凝集、および炎症などの異常な事象を引き起こす。プレセニリンは、APPをAβへ切断することに関与するプロテアーゼをコードする。2つの型、PS1およびPS2がある。Aβ42の生成を引き起こすPS1における変異は、早期発症ADの典型的な原因である。
【００３０】
コレステロール降下剤はAD予防的能力をもつと主張されているが、コレステロール上昇をADのリスクの増加に結びつけている明確な証拠はない。しかしながら、Aβがスフィンゴ脂質を含むという発見は、この理論にさらなる信憑性を与える。同様に、コレステロールの再分布に関与するApoEは、現在、AD発生に寄与すると考えられている。上で考察されているように、ニューロンからの最小程度のコレステロール流出を示すApoE4対立遺伝子を有する個体は、ADを発症する可能性がより高い。
【００３１】
正常な脳において微小管と会合したタウタンパク質は、AD罹患脳内で対になったらせん状フィラメント(PHF)を形成し、これは神経原線維濃縮体の主成分である。最近の証拠により、Aβタンパク質がタウタンパク質の過剰リン酸化を引き起こし、微小管からの解離およびPHFへの凝集をもたらす可能性があることが示唆される。
【００３２】
III. ApoEおよびApoER2
A. ApoE
アポリポタンパク質は担体タンパク質であり、これは中心の疎水性脂質とアミノ酸で作られた親水性側鎖とを有するリポタンパク質粒子を形成するように脂質と結合する。9つの異なるアポリポタンパク質が、ヒトでは見出される。これらのうちの1つ、アポリポタンパク質E(ApoE)は身体において多くの機能をもつ。VLDLの一部として肝臓により合成される場合、それはトリグリセリドを肝臓組織へ輸送する。それは、HDLにおいて細胞中にコレステロールを分配するのを助ける役割を果たす。それはまた、腸で合成されるキロミクロンへ取り込まれ、食事由来のトリグリセリドおよびコレステロールを輸送する。最後に、それは、LDLへの結合を媒介し、細胞内コレステロール代謝におけるリポタンパク質の細胞取り込みの過程を開始する。
【００３３】
ApoEは、約34,000の推定分子量をもつ299アミノ酸のタンパク質である(参照により組み入れられている、アクセッション番号P02649(SEQ ID NO:1))。ApoEの遺伝子は、第19染色体に見出され、長さが3.7kbである。転写産物は1163塩基対長であるが、翻訳後プロセシングを受ける。ApoEは主として肝臓内で合成されるが、脳もまた多量のApoEを産生する。ApoEはまた、脾臓、肺、副腎、卵巣、腎臓、筋肉細胞内で、およびマクロファージで、合成される。ApoEは、通常、血漿中、5mg/dlで存在し、それはキロミクロン、VLDL、およびHDLと会合する。
【００３４】
ApoEの構造は3つの区画に分けることができる。残基165位までのアミノ末端は高度に秩序立っている。次の35残基はランダムな構造を構成する。カルボキシル末端部分もまた高度に秩序立っている。最強の脂質結合をもつタンパク質の領域は、残基202位〜209位に見出される。残基140位と160位の間の5個のアルギニンおよび3個のリジンは、LDL(低密度リポタンパク質)脂質受容体への結合に必須であり、これはApoEの塩基性残基と脂質受容体の酸性残基(アスパラギン酸およびグルタミン酸由来)の間のイオン相互作用に起因すると考えられている。
【００３５】
アポリポタンパク質Eの3つの異なるアイソフォームがある：ApoE2、ApoE3、およびApoE4。ApoE3は、他のものが比較される参照配列である。ApoE2は、残基158位のE2型のアルギニンがシステインで置換されている点で異なる。ApoE2はIII型高タンパク血症と関連している；実際、ApoE2は正常な受容体結合活性の2%未満を示す。ApoE4は、残基112位でシステインに対して置換されたアルギニンを有する。この残基は、最強の脂質結合領域の外側にあり、その置換は脂質結合能力に影響を及ぼさない。ApoE4はなお、正常な受容体結合活性の100%を有する。
【００３６】
B. ApoER2
アポリポタンパク質E受容体2(ApoER2)のcDNAは、LDL-RおよびVLDL受容体と強い相同性を示す。ApoER2のアクセッション番号はQ14114(SEQ ID NO:2)であり、LDL-Rについては、NP-000518(SEQ ID NO:3)である；およびVLDL-Rについては、AAB31735(SEQ ID NO:4)であり、それらのすべては参照により組み入れられている。他のLDL-Rファミリーメンバーと共通して、ApoER2は、クラスリン被覆ピットを介するLDL-Rの内部移行に必要とされる細胞質配列NPxYを含む。しかしながら、このモチーフはまた、シグナル伝達分子のホスホチロシン結合ドメインおよびPDZドメインに対するリガンドでもあり、そのシグナル伝達分子の一部はApoER2に結合できる。細胞内でのapoER2の役割がリポタンパク質取り込みおよび分解に関与する可能性は低く、その結論は、最近、細胞質ApoER2のエンドサイトーシス機能の直接的分析により実証された。Sun & Soutar (1999)。これは、apoER2におけるNPxYモチーフについての代替機能を示唆する。実際、ApoER2がシグナルトランスデューサー分子であり、脳の発達中にニューロン移動を制御し、おそらく脈管構造において血小板凝集を緩和するという証拠が増加している。Trommsdorff et al. (1999); Riddell et al. (1999)。シグナル伝達は、apoER2の細胞質ドメインと、アダプター分子（Dab 1、JIP 1およびJIP 2、ならびにPSD-95など）との間の相互作用を必要とするようである。Trommsdorff et al. (1999); Gotthardt et al. (2000); Stockinger et al. (2000)。
【００３７】
C. X11α/β/γ
X11ファミリータンパク質であるX11α/β/γ(X11、X11様(X11L)、およびX11様2(X11L2)としても知られている)は、ニューロンのアダプタータンパク質である。図1はX11タンパク質におけるドメインの図を示し、これはホスホチロシン結合(PTB)ドメインにより特徴付けられる。X11γは異なる組織に遍在性に分布するが、X11αおよびβは脳にのみ発現する(Borg et al., 1999; Hase et al., 2002)。ファミリータンパク質のそれぞれは、細胞内APPを安定化する、および/またはAβ産生を抑制することが報告された(King and Turner, 2004)。X11αおよびβの配列は、それぞれ、SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:11に提供されており、SEQ ID NO:9、10、および12は様々なPTBドメインを示している。
【００３８】
IV. 治療計画
A. 治療剤
本発明に従って用いるために様々な治療剤が企図される。ApoEおよび/またはApoER2の構造/機能を模倣する小分子(生物製剤または有機医薬品)を設計し、本文書の他の所で示したパラメーターに従って試験してよい。しかしながら、他の作用物質は、本情報に基づいて容易に設計および試験することができる。特に、これらの作用物質は、ApoE(ApoE4を含む)、ApoER2由来のペプチドもしくはポリペプチド、これらの2つの標的に対する抗体(ヒト化、一本鎖、それらの全体または抗原結合断片)、またはこれらの作用物質をコードする核酸である。X11 PTBドメインおよびそれらの断片もまた企図される。
【００３９】
1. ペプチド、ポリペプチド、および模倣体
天然ApoEの結合と競合することが予想されるが、天然ApoEのApoER2への結合により引き起こされる同じ過程を活性化できない、ApoEのペプチドが設計してもよい。特に関心対象となるのは、ApoE4における多型の領域、すなわち残基112位にまたがるペプチドである。X11 PTBドメインおよびそれらの断片もまた企図される。ペプチドは、一般的に、約6〜40アミノ酸長であり、すべての中間サイズが企図される(6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、および40)。これらの残基のうち、少なくとも約6個がApoEドメインまたはX11 PTBドメイン由来の連続した残基を表す。しかしながら、連続した残基の数は、この場合もやはり、すべての中間サイズであってよい(6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、および40)。ペプチドは、安定化ドメインまたはターゲティングドメインなど非ApoEおよび非X11配列を含んでもよい。
【００４０】
同様に、ApoER2由来のペプチドはまた、溶液中でApoEを結合するように働き、それにより、天然の表面結合したApoE2へのその結合を低下させうる。ペプチドは、一般的に、約6〜40アミノ酸長であり、すべての中間サイズが企図される(6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、および40)。これらの残基のうち、少なくとも約6個がApoER2由来の連続した残基を表す。しかしながら、連続した残基の数は、この場合もやはり、すべての中間サイズであってよい(6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、および40)。ペプチドは、安定化ドメインまたはターゲティングドメインなど非ApoER2配列を含んでもよい。または、ApoER2の40残基より多く、外部ドメイン全体まで(外部ドメイン全体を含む)を含む、より大きなポリペプチドが企図される。
【００４１】
本発明のペプチドまたはポリペプチドを精製することが望ましい場合がある。タンパク質精製技術は当業者に周知である。これらの技術は、ポリペプチド画分および非ポリペプチド画分への細胞環境の粗分画を一つのレベルで含む。他のタンパク質からそのポリペプチドを分離した後に、部分的または完全精製(または均一性までの精製)を達成するために、対象となるポリペプチドを、クロマトグラフィーおよび電気泳動技術を用いてさらに精製してもよい。純粋なペプチドの調製に特に適した分析的方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィーまたは同等のHPLCである。
【００４２】
本発明の特定の局面は、コードされたタンパク質またはペプチドの精製に関し、かつ特定の態様では、実質的な精製に関する。本明細書に用いられる場合、「精製タンパク質またはペプチド」という用語は、他の成分から単離可能な組成物を指すことが意図され、タンパク質またはペプチドは、その天然で得られる状態に対して任意の程度まで精製されている。したがって、精製タンパク質またはペプチドはまた、それが天然で存在しうる環境から解放されたタンパク質またはペプチドを指す。
【００４３】
タンパク質精製に用いるのに適した様々な技術は当業者に周知であろう。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、PEG、抗体などによる、または熱変性による沈殿、続いて遠心分離；HPLC、イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイト、およびアフィニティークロマトグラフィーなどクロマトグラフィー段階；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびにそのようなものを始めとする技術の組み合わせが挙げられる。当技術分野において一般的に公知であるように、様々な精製段階を行う順序を変化させてもよく、または特定の段階を省略してもよく、それでもなお、実質的に精製したタンパク質もしくはペプチドの調製の適切な方法となると考えられている。
【００４４】
遺伝子法(下で考察する)に加えて、ペプチドを、本発明の様々な態様に用いるために合成的に作製してもよい。それらは比較的サイズが小さいため、本発明のペプチドは、通常の技術に従って、溶液中または固体支持体上で合成してもよい。様々な自動合成機は市販されており、公知のプロトコールに従って用いてもよい。例えば、Stewart & Young, (1984); Tam et al., (1983); Merrifield, (1986); Barany and Merrifield (1979)参照（それぞれは参照により本明細書に組み入れられている）。本明細書に記載の選択された領域に対応する、通常約6個から約35〜50個までのアミノ酸の、短いペプチド配列または重複ペプチドのライブラリーが、容易に合成され、その後、反応性ペプチドを同定するように設計したスクリーニングアッセイにおいてスクリーニングされうる。または、組換えDNAテクノロジーを用いることができ、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターへ挿入し、適切な宿主細胞へ形質転換またはトランスフェクションし、発現に適した条件下で培養する。
【００４５】
加えて、本発明者らはまた、構造的に類似した化合物を、本発明のペプチドまたはポリペプチドの重要な部分を模倣するように構築できることを企図する。そのような化合物は、ペプチド模倣体と呼ばれることもあり、本発明のペプチドと同じ様式で用いてもよく、そのため機能的等価物でもある。
【００４６】
タンパク質二次および三次構造の要素を模倣する特定の模倣体は、Johnson et al. (1993)に記載されている。ペプチド模倣体の使用の背後にある根本的な論拠は、タンパク質のペプチドバックボーンが、主として、抗体および/または抗原の相互作用などの分子相互作用を促進するような様式でアミノ酸側鎖を配向するように存在することである。ペプチド模倣体は、従って、天然分子と類似した分子相互作用を可能にするように設計される。
【００４７】
いくつかの成功したペプチド模倣概念の適用は、タンパク質内のβターンの模倣体に集中しており、それらは高抗原性であることが知られている。おそらく、ポリペプチド内のβターン構造は、本明細書に考察されているように、コンピューターに基づいたアルゴリズムにより予測することができる。いったんターンの構成要素アミノ酸が決定したら、模倣体を、そのアミノ酸側鎖の必須要素の類似した空間的配向を達成するように構築してもよい。
【００４８】
他のアプローチは、大きなタンパク質の結合部位を模倣する生物活性のある立体構造を生じるために魅力的な構造的鋳型として、小さな多ジスルフィド含有タンパク質を使用することに焦点を合わせている(Vita et al., 1998)。特定の毒素に進化的に保存されていると思われる構造的モチーフは、小さく(30〜40アミノ酸)、安定で、かつ変異に高許容的である。このモチーフは、3個のジスルフィドにより内部コアで架橋されたβシートおよびαヘリックスで構成される。
【００４９】
βIIターンは、環状L-ペンタペプチドおよびD-アミノ酸を含むそれらを用いて成功裡に模倣されている(Weisshoff et al., 1999)。また、Johannesson et al. (1999)は、逆ターン誘導性質をもつ二環式トリペプチドについて報告している。
【００５０】
特定の構造を作製するための方法が、当技術分野において開示されている。例えば、αヘリックス模倣体は、米国特許第5,446,128号；第5,710,245号；第5,840,833号；および第5,859,184号に開示されている。これらの構造は、ペプチドまたはタンパク質をより熱的に安定にし、タンパク分解性分解に対する抵抗性も増加させる。6員環、7員環、11員環、12員環、13員環、および14員環構造が開示されている。
【００５１】
配座固定されたβターンおよびβバルジを作製するための方法が、例えば、米国特許第5,440,013号；第5,618,914号；および第5,670,155号に記載されている。βターンは、対応するバックボーン立体構造を変化させることなく、側鎖置換基の変化を可能にし、標準合成手順によるペプチドへの組み入れのための適切な末端を有する。模倣ターンの他の型には、逆ターンおよびγターンが挙げられる。逆ターン模倣体は米国特許第5,475,085号および第5,929,237号に開示され、γターン模倣体は米国特許第5,672,681号および第5,674,976号に記載されている。
【００５２】
2. 抗体
「抗体」という用語は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を指すために用いられ、Fab'、Fab、F(ab')2、単一ドメイン抗体(DAB)、Fv、scFv(一本鎖Fv)などを含む。様々な抗体ならびに抗体に基づいた構築物および断片を調製および使用するための技術が、当技術分野において周知である(例えば、それぞれは参照により本明細書に組み入れられるHarlow et al., 1988;および米国特許第4,196,265号を参照)。抗体またはその断片は、所望の生物活性、すなわちApoE-ApoER2相互作用の阻害性を示すべきである。モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)も企図される。
【００５３】
本明細書に用いられる場合の「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一の抗体の集団（すなわち、集団を構成する個々の抗体が、微量で存在する可能性のある自然発生の変異を除いて同一である集団）から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原性エピトープに対して方向づけられている。対照的に、通常の(ポリクローナル)抗体調製物は、典型的には、異なるエピトープに対して方向づけられた(または、特異的な)多数の抗体を含む。「モノクローナル」という修飾成句は、実質的に均一の抗体の集団から得られているという抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って用いることができるモノクローナル抗体を、Kohler et al. (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ方法により作製してもよく、または組換えDNA方法により作製してもよい(例えば、米国特許第4,816,567号参照)。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clackson et al. (1991)およびMarks et al. (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。
【００５４】
本明細書で用いる場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体由来の配列だけでなく、非ヒト(例えば、マウスの)抗体由来の配列も含む抗体の型を指す。そのような抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含むキメラ抗体である。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの、可変ドメインの実質的に全部を含み、超可変ループの全部または実質的全部が非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、FR領域の全部または実質的全部がヒト免疫グロブリン配列のFR領域である。ヒト化抗体はまた、任意で、免疫グロブリン定常領域(Fc)（典型的にはヒト免疫グロブリンのFc）の少なくとも一部を含む。
【００５５】
本発明の特定の態様において、本明細書に示した薬学的組成物および手段の核酸は、一本鎖抗体をコードする。一本鎖抗体は米国特許第4,946,778号および第5,888,773号に記載されており、それらの特許のそれぞれは参照により本明細書に組み入れられている。
【００５６】
3. アンチセンス
アンチセンス方法は、核酸が「相補的な」配列と対形成する傾向にあるという事実をうまく利用する。相補的とは、ポリヌクレオチドが、標準ワトソン-クリック相補性ルールに従って塩基対形成の能力があるものであることを意味する。すなわち、比較的大きなプリンが比較的小さなピリミジンと塩基対を形成し、シトシンとグアニンの対(G:C)、およびDNAの場合はチミンとアデニンの対(A:T)またはRNAの場合はウラシルとアデニンの対(A:U)のいずれかの組み合わせを形成する。ハイブリダイズする配列内のイノシン、5-メチルシトシン、6-メチルアデニン、ヒポキサンチンなど、あまり一般的ではない塩基の包含は対形成に干渉しない。
【００５７】
ポリヌクレオチドによる二本鎖(ds)DNAのターゲティングは、三重らせん形成へ導く；RNAのターゲティングは二重らせん形成へ導く。アンチセンスポリヌクレオチオドは、標的細胞に導入された場合、それらの標的ポリヌクレオチドへ特異的に結合し、転写、RNAプロセシング、輸送、翻訳、および/または安定性に干渉する。アンチセンスRNA構築物、またはそのようなアンチセンスRNAをコードするDNAは、インビトロか、またはヒト被験体を含む宿主動物内などのインビボかのいずれかで、宿主細胞内で遺伝子転写もしくは翻訳または両方を阻害するために用いてもよい。
【００５８】
遺伝子のプロモーターおよび他の制御領域、エクソン、イントロン、またはエクソン-イントロン境界までも結合するように、アンチセンス構築物を設計してもよい。最も効果的なアンチセンス構築物は、イントロン-エクソンのスプライス部位に相補的な領域を含むことが企図される。従って、好ましい態様にはイントロン-エクソンのスプライス部位の50〜200塩基内の領域に相補性を有するアンチセンス構築物を含まれることが、提案される。いくつかのエクソン配列が、それらの標的選択性に深刻な影響を及ぼすことなく、構築物に含まれうることが観察されている。含まれるエクソン性材料の量は、用いる特定のエクソンおよびイントロン配列に依存して異なる。単にインビトロで構築物を試験して、正常な細胞機能が影響を受けるかどうか、または相補的配列を有する関連遺伝子の発現が影響を受けるかどうかを判定することにより、多すぎるエクソンDNAが含まれるかどうかを容易に試験することができる。
【００５９】
上記のように、「相補的な」または「アンチセンス」は、全長に渡って実質的に相補的であり、かつ塩基ミスマッチをほとんど有しないポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、15塩基長の配列は、13箇所または14箇所で相補的なヌクレオチドを有する場合、相補的と呼んでよい。当然ながら、完全に相補的である配列は、それらの全長を通して全体的に相補的であり、かつ塩基ミスマッチを有しない配列である。相同性の程度がより低い他の配列もまた企図される。例えば、限られた領域で高相同性を有するが、非相同性領域も含むアンチセンス構築物(例えば、リボザイム；下記参照)を設計してもよい。これらの分子は、相同性が50%未満であるが、適切な条件下で標的配列に結合すると考えられる。
【００６０】
特異的構築物を作製するために、ゲノムDNAの部分とcDNAまたは合成配列とを組み合わせることが有利である場合がある。例えば、最終構築物でイントロンが望まれる場合、ゲノムクローンを用いる必要がある。cDNAまたは合成ポリヌクレオチドは、構築物の残りの部分のより便利な制限部位を供給することができ、したがって、配列の残りのために用いられる。
【００６１】
4. リボザイム
タンパク質は伝統的に、核酸の触媒作用に用いられているが、高分子のもう一つのクラスがこの試みにおいて有用なものとして現れた。リボザイムは、核酸を部位特異的様式で切断するRNA-タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特異的触媒ドメインを有する(Kim and Cook, 1987; Gerlach et al., 1987; Forster and Symons, 1987)。例えば、多数のリボザイムは、高程度の特異性を以てリン酸エステル転移反応を促進し、しばしば、オリゴヌクレオチド基質において数個のリン酸エステルのうちの1個のみを切断する(Cook et al., 1981; Michel and Westhof, 1990; Reinhold-Hurek and Shub, 1992)。この特異性は、基質が化学反応の前に、特異的塩基対形成相互作用を介してリボザイムの内部ガイド配列(「IGS」)に結合する必要性に起因している。
【００６２】
リボザイム触媒作用は、主として、核酸に関与する配列特異的切断/ライゲーション反応の一部として観察されていた(Joyce, 1989; Cook et al., 1981)。例えば、米国特許第5,354,855号は、特定のリボザイムが、エンドヌクレアーゼとして、既知のリボヌクレアーゼのものより高く、かつDNA制限酵素のものに匹敵する配列特異性で作用することができると報告している。従って、遺伝子発現の配列特異的リボザイム媒介性阻害は、特に、治療的適用に適している可能性がある(Scanlon et al., 1991; Sarver et al., 1990)。リボザイムが、それらを適用したいくつかの細胞系において遺伝子変化を誘発すること；変化した遺伝子は、発癌遺伝子H-ras、c-fos、およびHIVの遺伝子を含むこと；が最近報告された。この研究の大部分は、特定のリボザイムにより切断される特定の変異体コドンに基づいた、標的mRNAの改変に関係した。
【００６３】
5. RNAi
RNA干渉(「RNA媒介性干渉」またはRNAiとも呼ばれる)は、遺伝子発現が低下しうるまたは排除されうる機構である。二本鎖RNA(dsRNA)は、多段階過程であるその低下を媒介することが観察されている。dsRNAは、細胞をウイルス感染およびトランスポゾン活性から防御するために機能するようである転写後遺伝子発現監視機構を活性化する(Fire et al., 1998; Grishok et al., 2000; Ketting et al., 1999; Lin and Avery et al., 1999; Montgomery et al., 1998; Sharp and Zamore, 2000; Tabara et al., 1999)。これらの機構の活性化は、破壊のために成熟したdsRNA相補的mRNAを標的とする。RNAiは、遺伝子機能の研究のために重要な実験的利点を与える。これらの利点には、非常に高い特異性、細胞膜を横断する移動の容易さ、および標的とされた遺伝子の長期間の下方制御が挙げられる(Fire et al., 1998; Grishock et al., 2000; Ketting et al., 1999; Lin and Avery et al., 1999; Montgomery et al., 1998; Sharp et al., 1999; Sharp and Zamore, 2000; Tabara et al., 1999)。さらに、dsRNAは、植物、原生動物、真菌、線虫(C. elegans)、トリパノソーマ属(Trypanasoma)、ショウジョウバエ(Drosophila)、および哺乳動物を含む、幅広い範囲の系において、遺伝子をサイレンシングすることが示されている（Grishock et al., 2000; Sharp et al., 1999; Sharp and Zamore, 2000; Elbashir et al., 2000）。RNAiは、分解のために、転写後、RNA転写産物を標的とするように働くことが、一般的に認められている。核RNAおよび細胞質RNAの両方が標的とされうるようである(Bosher and Labouesse, 2000)。
【００６４】
siRNAは、それらが対象となる遺伝子の発現を抑制する際に特異的かつ効果的であるように、設計されなければならない。標的配列（すなわち、siRNAが分解機構をガイドする対象となる遺伝子に存在する配列）を選択する方法は、遺伝子に特異的である配列を含むと同時に、siRNAのガイド機能に干渉する可能性がある配列を避けるように向けられる。典型的には、約21〜23ヌクレオチド長のsiRNA標的配列が最も効果的である。この長さは、上記のように、よりずっと長いRNAのプロセシングに起因する消化産物の長さを反映する(Montgomery et al., 1998)。
【００６５】
主に、直接的化学合成を通して；ショウジョウバエ胚溶解物への曝露による比較的長い二本鎖RNAのプロセシングを通して；またはS2細胞由来のインビトロ系を通して；siRNAは作製される。細胞溶解物またはインビトロプロセシングの使用には、その後溶解物から短い21〜23ヌクレオチドsiRNAの単離などがさらに含まれる場合があり、その方法を幾分か、煩雑で費用のかかるものにさせている。2つの一本鎖RNAオリゴマーを作製し、続いて、その2つの一本鎖オリゴマーを二本鎖RNAへアニーリングすることにより、化学合成が進む。化学合成の方法は多様である。非限定的例は、参照により本明細書に明確に組み入れられている米国特許第5,889,136号、第4,415,723号、および第4,458,066号に、ならびにWincott et al. (1995)に提供されている。
【００６６】
siRNA配列へのいくつかのさらなる改変が、それらの安定性を変更するかまたはそれらの効果を向上させるために、示唆されている。ジヌクレオチドオーバーハングを有する合成相補的21-mer RNA(すなわち、19個の相補的ヌクレオチド＋3'非相補的ダイマー)が、最高レベルの抑制を与える可能性があることが示唆されている。これらのプロトコールは主に、ジヌクレオチドオーバーハングとして2個(2'-デオキシ)のチミジンヌクレオチドの配列を用いる。これらのジヌクレオチドオーバーハングは、しばしば、RNAへ取り込まれる典型的なヌクレオチドとそれらを区別するためにdTdTと書かれる。dTオーバーハングの使用は、主に、化学合成されるRNAの費用を低減する必要性が動機となっていることが、文献で指摘されている。dTdTオーバーハングはUUオーバーハングより安定である可能性があることもまた示唆されているが、入手できるデータでは、UUオーバーハングを含むsiRNAと比較してdTdTオーバーハングのほんのわずかな(<20%)向上のみが示されている。
【００６７】
化学合成されたsiRNAは、それらが細胞培養中に25〜100nMの濃度である場合、最適に働くことが見出されているが、約100nMの濃度は、哺乳動物細胞内で発現の効果的な抑制を達成している。siRNAは、哺乳動物細胞培養において、約100nMで最も効果的であった。しかしながら、いくつかの例では、より低い濃度の化学合成siRNAが用いられている(Caplen et al., 2000; Elbashir et al., 2001)。
【００６８】
WO 99/32619およびWO 01/68836は、siRNAに用いるRNAを化学的または酵素的に合成してもよいことを示唆している。これらの本文は両方、その全体が参照により本明細書に組み入れられている。これらの参考文献に企図された酵素的合成は、当技術分野において公知であるように、発現構築物の使用および作製を介して、細胞RNAポリメラーゼまたはバクテリオファージRNAポリメラーゼ(例えば、T3、T7、SP6)によって行われる。例えば、米国特許第5,795,715号参照。企図された構築物は、標的遺伝子の一部と同一のヌクレオチド配列を含むRNAを生成する鋳型を供給する。これらの参考文献により提供された同一配列の長さは、少なくとも25塩基であり、400塩基長もの数またはそれ以上であってもよい。この参考文献の重要な局面は、著者らが、インビボで長いdsRNAをsiRNAへ変換する内因性ヌクレアーゼ複合体により、長いdsRNAを21〜25-merの長さへ消化することを企図していることである。インビトロで転写された21〜25mer dsRNAを合成および使用することについてのデータは、記載または提示されていない。RNA干渉での使用において、化学的または酵素的に合成したdsRNAの予想される性質の間に区別をつけていない。
【００６９】
同様に、参照により本明細書に組み入れられているWO 00/44914は、酵素的にまたは部分/全部の有機合成により、一本鎖のRNAを作製できることを示唆している。好ましくは、一本鎖RNAは、DNA鋳型（好ましくはクローニングされたcDNA鋳型）のPCR産物から酵素的に合成され、RNA産物は、数百個のヌクレオチドを含みうるcDNAの完全な転写産物である。参照により本明細書に組み入れられているWO 01/36646は、siRNAが合成される方法に制限を設けず、これは手作業および/または自動化手順を用いて、RNAをインビトロまたはインビボで合成してもよいことを提供する。この参考文献はまた、インビトロ合成が、化学的であってよい、または、例えば、内因性DNA(またはcDNA)鋳型の転写のためにクローニングされたRNAポリメラーゼ(例えば、T3、T7、SP6)を用いる酵素的であってよい、または両方の混合物であってよいことを提供する。この場合もやはり、化学的または酵素的に合成したsiRNAの間に、RNA干渉に用いる望ましい性質に区別をつけていない。
【００７０】
米国特許第5,795,715号は、単一の反応混合物における2つの相補的DNA配列鎖の同時転写を報告しており、その2つの転写産物はすぐにハイブリダイズする。用いる鋳型は、好ましくは、40塩基対と100塩基対の間であり、各末端にプロモーター配列を備えている。鋳型は、好ましくは、固体表面に付着している。RNAポリメラーゼによる転写後、結果として生じたdsRNA断片を、核酸標的配列を検出および/またはアッセイするために用いてもよい。
【００７１】
6. 発現構築物
特定の態様内では、発現ベクターが、ペプチドまたはポリペプチド産物を発現するために用いられる。発現には、適切なシグナルがベクターに供給されることが必要であり、それらのベクターは、宿主細胞内で対象となる遺伝子の発現を作動させるウイルス源および哺乳動物源の両方に由来するエンハンサー/プロモーターなど様々な制御エレメントを含む。宿主細胞内でメッセンジャーRNAの安定性および翻訳可能性を最適化するように設計したエレメントもまた規定される。産物を発現する安定な永久細胞クローンを確立するためのいくつかの優性の薬物選択マーカーの使用のための条件もまた提供され、薬物選択マーカーの発現をポリペプチドの発現に結びつけるエレメントもまた同様である。
【００７２】
「発現構築物」という用語は、核酸コード配列の部分または全部が転写可能な遺伝子産物をコードする核酸を含む、遺伝的構築物のいかなる型も含むことが意図される。転写産物は、タンパク質へ翻訳されることもあるが、そうである必要はない。特定の態様において、発現は、遺伝子の転写およびmRNAの遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の態様において、発現は、対象となる遺伝子をコードする核酸の転写を含むのみである。
【００７３】
特定の態様において、遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は、特定の遺伝子の転写を開始するのに必要とされる、細胞の合成機構または導入された合成機構により認識されるDNA配列を指す。「転写制御下」という句は、プロモーターが、RNAポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を制御するように、核酸に関して正しい位置および配向にあることを意味する。
【００７４】
プロモーターという用語は、RNAポリメラーゼIIの開始部位の周囲に群がる一群の転写制御分子を指すために、本明細書で用いる。どのようなプロモーターが組織化されるかについて多くの考えは、HSVチミジンキナーゼ(tk)およびSV40初期転写ユニットに対するものを含むいくつかのウイルスプロモーターの分析から引き出される。プロモーターが、それぞれが約7〜20bpのDNAからなる別々の機能的モジュールで構成され、かつ転写アクチベーターまたはリプレッサータンパク質の1つまたは複数の認識部位を含むことが、より最近の研究によって増加したこれらの研究により示されている。
【００７５】
各プロモーター内の少なくとも1つのモジュールは、RNA合成の開始部位を位置づけるように機能する。これの最良の公知の例はTATAボックスであるが、哺乳動物のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子についてのプロモーターおよびSV40後期遺伝子についてのプロモーターなど、TATAボックスを欠くいくつかのプロモーターでは、開始部位の上に横たわる個別エレメント自身が開始の場所を固定するのに寄与する。
【００７６】
追加のプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を制御する。典型的には、これらは開始部位の30〜110bp上流の領域に位置するが、いくつかのプロモーターは最近、開始部位の下流にも機能性エレメントを含むことが示されている。エレメントがお互いに対して逆転するかまたは移動する場合もプロモーター機能が保存されるように、プロモーターとエレメント間の間隔は、高い頻度で可動性である。tkプロモーターにおいて、プロモーターエレメント間の間隔を、活性が下降し始める前に、50bp離れるまで増加することができる。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、転写を活性化するために、協同的または独立的のいずれかで機能できると思われる。
【００７７】
7. ウイルス送達
特定のウイルスが、受容体媒介性エンドサイトーシスを介して細胞に侵入し、宿主細胞ゲノムへ統合され、ウイルス遺伝子を安定にかつ効率的に発現する能力により、それらは、外来遺伝子の哺乳動物細胞への移入のための魅力的な候補であった(Ridgeway, 1988; Nicolas and Rubenstein, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Temin, 1986)。遺伝子ベクターとして用いられた最初のウイルスは、パポバウイルス(シミアン・ウイルス40、ウシパピローマウイルス、およびポリオーマ)(Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986)およびアデノウイルス(Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986)を含むDNAウイルスであった。これらは、外来DNA配列の収容力が比較的低く、宿主範囲が制限されている。さらに、許容細胞内でのそれらの発癌の可能性および細胞変性効果から、安全性が懸念される。それらは、最大で8kBのみの外来遺伝物質を収容することができるが、様々な細胞系および実験動物に容易に導入できる(Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986)。
【００７８】
本発明において特に関心対象となるのは、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスなど神経栄養性ウイルスである。米国特許第6,344,445号、第5,626,850号、第5,223,424号、第6,319,703号は、ヘルペスウイルスベクターを考察している；米国特許第6,924,144号、第6,521,457号、第6,428,953号、第6,277,633号、第6,165,782号、および第5,994,136号は、レンチウイルスベクターを考察している。
【００７９】
8. 非ウイルス送達
本発明のさらなる態様において、発現構築物は、リポソームに捕捉されうる。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部水性媒質により特徴付けられる小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒質によって分離された多数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液中に懸濁された時、自発的に生じる。脂質成分は、閉鎖型構造の形成前に自己再編成を起こし、脂質二重層の間に水および溶解した溶質を捕捉する(Ghosh and Bachhawat, 1991)。リポフェクタミン-DNA複合体もまた企図される。
【００８０】
インビトロでの外来DNAのリポソーム媒介性核酸送達および発現は、非常に成功している。Wong et al., (1980)は、培養したニワトリ胚細胞、HeLa細胞、およびヘパトーマ細胞における外来DNAのリポソーム媒介性送達および発現の可能性を実証した。Nicolau et al., (1987)は、静脈注射後のラットにおいて、リポソーム媒介性遺伝子移入を成功させた。
【００８１】
脂質製剤における最近の進歩は、インビボでの遺伝子移入の効率を向上させている(Smyth-Templeton et al., 1997, WO 98/07408)。等モル比の1,2-ビス(オレオイルオキシ)-3-(トリメチルアンモニウム)プロパン(DOTAP)とコレステロールで構成された脂質製剤は、全身性インビボ遺伝子移入を約150倍、有意に増強する。DOTAP：コレステロール脂質製剤は、「サンドイッチリポソーム」と呼ばれる独特の構造を形成すると言われている。この製剤は、陥入した二重層または「花瓶」構造の間にDNAを「サンドイッチする」と報告されている。これらの脂質構造の有益な特徴には、コレステロールによる正コロイド安定化、2次元DNAパッキング、および血清安定性の増加が挙げられる。
【００８２】
さらなる態様において、リポソームはさらに、ナノ粒子として定義される。「ナノ粒子」は、μm未満の粒子を指すように本明細書で定義される。μm未満の粒子は任意のサイズであってよい。例えば、ナノ粒子は、約0.1、1、10、100、300、500、700、1000ナノメートル、またはそれ以上からの直径を有してもよい。被験体に投与されるナノ粒子は、複数のサイズであってもよい。
【００８３】
ナノ粒子を作製するために、当業者に公知の任意の方法を用いてもよい。いくつかの態様において、ナノ粒子は、製造過程で押し出される。ナノ粒子の作製に関連する例示的な情報は、米国特許出願公開第20050143336号、米国特許出願公開第20030223938号、米国特許出願公開第20030147966号、および米国特許仮出願第60/661,680号に見出すことができる（それぞれは本明細書で参照によりこのセクションへ具体的に組み入れられている）。
【００８４】
B. 併用療法
もう一つの態様において、いずれかの治療効果を向上させる、または増強するために他の作用物質と組み合わせて、本発明のApoE/ApoER2インヒビターを用いてもよい。この方法は、両方の作用物質を含む単一の組成物もしくは薬理学的製剤として、または一方の組成物がApoE/ApoER2インヒビターを含み他方が第二の作用物質を含む2つの別々の組成物もしくは製剤を投与することによるかのいずれかで、同時に両方の作用物質を患者に投与する段階を含んでもよい。
【００８５】
ApoE/ApoER2治療はまた、数分間から数週間の範囲の間隔で他の作用物質処置に先行するか、または後に続いてもよい。他方の作用物質およびApoE/ApoER2インヒビターが別々に投与される態様において、作用物質およびApoEインヒビターがなお有利な複合効果を発揮するように、各送達の時間の間に有効な時間を過ぎなかったことが好ましい。そのような場合、互いに約12〜24時間内に、およびより好ましくは互いに約6〜12時間内に、両方のモダリティーを施してもよいことが企図される。場合によっては、処置の期間を有意に延ばすことが望ましい場合があるが、それぞれの投与の間に、数日間(2、3、4、5、6、または7)〜数週間(1、2、3、4、5、6、7、または8)が経過する。他の態様において、被験体が寛容化されないように組成物を交替することが望ましい場合がある。
【００８６】
以下の様々な追加の組み合わせを用いることができる。ApoE/ApoER2インヒビター治療が「A」であり、第二作用物質が「B」である：
A/B/A  B/A/B  B/B/A  A/A/B  A/B/B  B/A/A  A/B/B/B  B/A/B/B  B/B/B/A  B/B/A/B  A/A/B/B  A/B/A/B  A/B/B/A  B/B/A/A  B/A/B/A  B/A/A/B  A/A/A/B  B/A/A/A  A/B/A/A  A/A/B/A。
処置サイクルは必要に応じて繰り返されるだろうことが予想される。
【００８７】
ADの処置のための様々な薬物が、現在入手可能であり、加えて、研究および法的考察もされている。薬物は一般的に、コリンエステラーゼインヒビター、ムスカリン性アゴニスト、抗酸化剤、または抗炎症剤の広義のカテゴリーに入る。ガランタミン(レミニル)、タクリン(コグネックス)、セレギリン、フィゾスチグミン、レビスチグミン、ドネペジル、(アリセプト)、リバスチグミン(エキセロン)、メトリホナート、ミラメリン、キサノメリン、サエルゾーレ、アセチル-L-カルニチン、イデベノン、ENA-713、メムリック、クエチアピン、ノイレストロール、およびノイロミダルは、ADの治療剤として提案された薬物のほんの一部である。
【００８８】
V. 薬学的製剤および投与経路
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体に溶解または分散した有効量のApoE/ApoER2インヒビターおよび/または追加の作用物質を含む。「薬学的に、または薬理学的に許容される」という句は、例えば、ヒトなどの動物それぞれに見合って投与される場合、逆の反応、アレルギー反応、または他の有害な反応を生じない分子的実体および組成物を指す。少なくとも1つのApoE/ApoER2インヒビターまたは追加の活性成分を含む薬学的組成物の調製は、参照により本明細書に組み入れられているRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990により例示されているように、本開示に照らせば当業者にわかるであろう。さらに、動物(例えば、ヒト)投与について、調製物は、FDA Office of Biological Standardsにより要求される無菌、発熱性、一般的安全性、および純度標準を満たすべきであることは理解されるだろう。
【００８９】
本明細書に用いられる場合、「薬学的に許容される担体」は、当業者に公知であるように、ありとあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤(例えば、抗細菌剤、抗真菌剤)、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、このような物質、およびそれらの組み合わせを含む(例えば、参照により本明細書組み入れられているRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329参照)。任意の通常の担体が活性成分と適合しない場合を除き、治療用または薬学的組成物におけるその使用が企図される。
【００９０】
本発明の化合物は、固体、液体、またはエアゾール形状のいずれで投与されるのか、および注射のような投与経路のために滅菌する必要があるのかに応じて、異なる担体の型を含んでもよい。本発明は、当業者に公知であるように、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、腟内に、直腸内に、局所に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下に、膀胱内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、眼内に、経口で、局所的に、局部的に、吸入(例えば、エアゾール吸入)、注射、注入、持続注入、直接的に、カテーテルを介して、洗浄により標的細胞を浸す局部的灌流、クリームで、液体組成物(例えば、リポソーム)で、または他の方法もしくは前記の任意の組み合わせにより、投与できる(例えば、参照により本明細書に組み入れられているRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990参照)。
【００９１】
患者に投与する本発明の組成物の実際の投薬量は、患者の体重、状態の重症度、処置すべき疾患の型、過去のまたは併用の治療的介入、特発性疾患などの身体的および生理学的因子によって、ならびに投与経路に関して、決定することができる。投与の責任を負う医師は、いずれにしても、個々の被験体について組成物における活性成分の濃度および適切な用量を決定する。
【００９２】
いかなる場合においても、組成物は、1つまたは複数の成分の酸化を遅らせる様々な抗酸化剤を含んでよい。さらに、限定されるわけではないが、パラベン(例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン)、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはそれらの組み合わせを含む様々な抗細菌剤および抗真菌剤などの保存剤によって、微生物の活動を防止することができる。
【００９３】
本発明の化合物を、遊離塩基型、中性型、または塩型の組成物へ製剤化してもよい。薬学的に許容される塩には、酸付加塩、例えば、タンパク性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、または、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸または酢酸、蓚酸、酒石酸、もしくはマンデル酸などの有機酸で形成されたものが挙げられる。遊離カルボキシル基で形成された塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシム、もしくは水酸化第二鉄などの無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、もしくはプロカインなどの有機塩基に由来してもよい。
【００９４】
組成物が液体形状である態様において、担体は、限定されるわけではないが、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレン、グリコール、液体ポリエチレングリコールなど)、脂質(例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム)、およびそれらの組み合わせを含む溶媒または分散媒であってよい。例えば、レシチンなどの被覆剤の使用により；例えば、液体ポリオールもしくは脂質などの担体における分散により必要とされる粒子サイズの維持により；例えば、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤の使用により；またはそのような方法の組み合わせにより、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、例えば、糖、塩化ナトリウム、またはそれらの組み合わせなどの等張剤を含むことが好ましい。
【００９５】
他の態様では、本発明において、点眼剤、点鼻液、スプレー式点鼻薬、エアゾール、または吸入薬を用いてもよい。そのような組成物は一般的に、標的組織型と適合するように設計される。非限定的例において、点鼻液は、通常、滴剤またはスプレーで鼻道へ投与されるように設計された水溶液である。点鼻液は、それらが鼻汁と多くの点で類似しているように、正常な絨毛作用が維持されるように、調製される。従って、好ましい態様において、水性点鼻液は、通常、等張であるか、または約5.5〜約6.5のpHを維持するように少し緩衝化されている。加えて、必要に応じて、点眼薬に用いられるものと類似した抗菌性保存剤、薬物、または適切な薬物安定剤が製剤に含まれてもよい。例えば、様々な市販の点鼻剤が知られており、それらは抗生物質または抗ヒスタミン剤などの薬物を含んでいる。
【００９６】
特定の態様において、本発明の化合物は、経口摂取などの経路による投与のために調製される。これらの態様において、固体組成物は、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸薬、カプセル(例えば、殻の硬いまたは軟らかいゼラチンカプセル)、徐放性製剤、バッカル組成物、トローチ、エリキシル、懸濁液、シロップ、カシェ剤、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。経口組成物は、食事の食物と直接混合してもよい。経口投与のための好ましい担体は、不活性希釈剤、同化可食性担体、またはそれらの組み合わせを含む。本発明の他の局面において、経口組成物を、シロップまたはエリキシルとして調製してもよい。シロップまたはエリキシルは、例えば、少なくとも1つの活性物質、甘味剤、保存剤、香味剤、色素、保存剤、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
【００９７】
特定の好ましい態様において、経口組成物は、1つまたは複数の結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、香味剤、およびそれらの組み合わせを含んでもよい。特定の態様において、組成物は、以下の1つまたは複数を含んでもよい：例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、ゼラチン、もしくはそれらの組み合わせなどの結合剤；例えば、リン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、もしくはそれらの組み合わせなどの賦形剤；例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、もしくはそれらの組み合わせなどの崩壊剤；例えば、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；例えば、スクロース、ラクトース、サッカリン、もしくはそれらの組み合わせなどの甘味剤；例えば、ペパーミント、ウィンターグリーンの油、サクランボ香味、オレンジ香味などの香味剤；または前記の組み合わせ。用量単位形態がカプセルである場合、それは、上記の型の材料に加えて、液体担体などの担体を含んでもよい。被覆剤として、または多の方法で用量単位の物理的形態を改変するために、様々な他の材料が存在してもよい。例えば、錠剤、丸薬、またはカプセルを、セラック、糖、またはその両方で被覆してもよい。
【００９８】
他の投与様式に適している追加の製剤には、坐剤が挙げられる。坐剤は、直腸、膣、または尿道への挿入のための、通常、薬の入った、様々な重量および形の固体剤形である。挿入後、坐剤は、腔液中で柔らかになる、融解する、または溶解する。一般的に、坐剤に対する伝統的な担体には、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリド、またはそれらの組み合わせが含まれてもよい。特定の態様において、例えば、約0.5%〜約10%、および好ましくは約1%〜約2%の範囲での活性成分を含む混合物から、坐剤を形成してもよい。
【００９９】
必要に応じて上記に列挙した様々な他の成分と共に、適切な溶媒に必要量の活性化合物を組み入れ、続いて濾過滅菌を行うことにより、滅菌注射用溶液を調製する。一般的に、基本的な分散媒および/または他の成分を含む滅菌媒質へ、様々な滅菌活性成分を組み入れることにより、分散液を調製する。滅菌注射用溶液、懸濁液、または乳濁液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥または凍結乾燥技術であり、活性成分に加え任意の追加の望ましい成分の粉末を、それらのあらかじめ滅菌濾過された液体媒質から得る。液体媒質は、必要に応じて適切に緩衝化され、液体希釈剤は、最初に、十分な食塩水またはグルコースで注射前に等張にされるべきである。直接的注射のための高濃縮組成物の調製もまた企図され、極めて迅速な透過をもたらすことで高濃度の活性物質を小領域へ送達するために、溶媒としてのDMSOの使用が構想される。
【０１００】
組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定で、かつ細菌および真菌などの微生物の汚染活動から保護されなければならない。内毒素汚染は、安全レベル（例えば、0.5ng/mgタンパク質未満）で最小限に保持されるべきであることは理解されるだろう。
【０１０１】
特定の態様において、注射用組成物の持続的吸収は、組成物内に、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、またはそれらの組み合わせなど吸収を遅らせる作用物質を使用することでもたらされる。
【０１０２】
VI. スクリーニング方法
本発明はさらに、ApoE-ApoER2相互作用のインヒビターを同定するための方法を含む。これらのアッセイは、候補物質の大きなライブラリーのランダムなスクリーニングを含んでもよい；または、ApoE-ApoER2と相互作用し、そのためApoE-ApoER2の相互作用を調節する可能性をより高くさせると考えられる構造特性を考慮して選択された特定のクラスの化合物に焦点を合わせるように、アッセイを用いてもよい。
【０１０３】
本明細書に用いられる場合、「候補物質」という用語は、ApoE-ApoER2結合またはその後の下流シグナル伝達事象を阻害する可能性がある任意の分子を指す。候補物質は、ペプチド、ポリペプチド、小分子、または核酸分子でもよい。上記で考察されているように、最も有用な薬理学的化合物は、ApoEおよびApoER2、またはそれらをコードする核酸と構造的に関連している化合物であることが事実であると証明される可能性がある。
【０１０４】
改善された化合物の開発を助けるためにリード化合物を用いることは、「合理的薬物設計」として知られている。合理的薬物設計の目標は、化合物の構造的類似体を作製し、系統的にこれらを試験して、所望の性質をもつ適切な化合物に到達することである。一つのアプローチにおいて、標的分子またはその断片についての3次元構造を作成する。これは、X線結晶学、コンピューターモデリングにより、または両方のアプローチの組み合わせにより、達成できる。もう一つのアプローチにおいて、構造類似体は、タンパク質もしくはペプチドの推定一次、二次、または三次構造にならってモデリングすることができる。
【０１０５】
標的化合物アクチベーターまたはインヒビターの構造を確認するために抗体を用いることが可能であり、それにより、全体として抗イディオタイプ抗体を作製することで、タンパク質結晶学を迂回する。鏡像の鏡像として、抗イディオタイプの結合部位は、最初の抗原の類似体であることが予想される。その後、化学物質または生物学的に産生されたペプチドのバンクから化合物を同定および単離するために、抗イディオタイプを用いてもよい。その後、選択されたペプチドは、ファーマコアとして働く。抗原として抗体を用いて抗体を産生するための本明細書に記載した方法を用いて、抗イディオタイプを作製してもよい。ApoEまたはApoER2のいずれかに対する抗体および抗イディオタイプそれ自身を、インヒビターとして用いてもよい。
【０１０６】
他方、有用な化合物の同定を「力ずくで押し進め」ようと努力して、単に、有用な薬物の基本的基準を満たすと考えられる小分子ライブラリーである様々な商業的供給源から、得られる場合がある。コンビナトリアル法で作製されたライブラリー(例えば、ペプチドライブラリー)を含むそのようなライブラリーのスクリーニングは、多数の関連(および非関連)化合物を活性についてスクリーニングする迅速かつ効率的な方法である。コンビナトリアルアプローチはまた、活性があるが、他の点では望ましくない化合物の設計された第二、第三、および第四世代化合物の創出によって、可能性のある薬物の迅速な進化に役立つ。
【０１０７】
候補化合物は、天然化合物の断片もしくは部分を含んでもよく、または、さもなければ不活性である既知の化合物の活性な組み合わせとして見出されることもある。動物、細菌、真菌、葉および樹皮を含む植物源、ならびに海水試料など天然源から単離した化合物を、可能性のある有用な薬学的作用物質の存在の候補として、アッセイしてもよいことが提案される。スクリーニングするべき薬学的作用物質はまた、化学合成品または人工化合物から導かれるか、または合成されてもよいことは理解されるだろう。従って、本発明により同定される候補物質は、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、小分子インヒビター、または既知のインヒビターもしくは刺激因子から出発する合理的薬物設計を通してデザインしてもよい任意の他の化合物であってよいことは理解されている。
【０１０８】
他の適切なモジュレーターは、ApoEおよびApoER2の発現を標的とすると考えられ、アンチセンス分子、リボザイム、および抗体（一本鎖抗体を含む）を含み、それぞれは、標的分子に特異的であり、ApoEまたはApoER2を発現する細胞に発現する。ApoER2の翻訳もしくは転写開始部位、またはスプライス部位に結合する特定のアンチセンス分子が、特に企図される。
【０１０９】
本発明のスクリーニング方法のすべては、有効な候補が見出されない場合があるという事実にもかかわらず、それ自体、有用であることは当然、理解されるだろう。本発明は、それらを見出す方法だけでなく、そのような候補についてスクリーニングするための方法を提供する。
【０１１０】
A. インビトロアッセイ
ApoE-ApoER2のインヒビターを同定するために、一般的には、候補物質の存在下および非存在下でApoEとApoER2の相互作用を測定し、インヒビターは、この相互作用を低下させる任意の物質として定義される。例えば、方法は一般的に、
(a)候補モジュレーターを供給する段階；
(b)候補モジュレーターを、ApoEおよびApoER2分子またはApoER2を発現する細胞と混合する段階；
(c)ApoEのApoER2への結合を測定する段階；ならびに
(d)段階(c)で測定された結合を、該候補モジュレーターの非存在下におけるApoEのApoER2への結合と比較する段階
を含み、ApoEのApoER2への結合における低下により、該候補モジュレーターが、真に、ApoE-ApoER2相互作用のインヒビターであることが示される。
【０１１１】
そのようなアッセイにおいて、標的は、それがApoEであろうとApoER2であろうと、溶液中に遊離している、支持体に固定されている、細胞に発現している、またはApoER2の場合、細胞の表面に配置されているかのいずれかであってよい。競合的結合形式を実施することができ、ここでは作用物質の1つを標識し、結合への効果を測定するために標識無しに対する結合した標識の量を測定してもよい。
【０１１２】
結合についての様々な読み出しを利用することができ、例えば、ゲル上での移動パターンの変化、FRET、表面プラズモン共鳴、または多数の他のテクノロジーがある。
【０１１３】
B. インサイト(in cyto)アッセイ
本発明はまた、無傷の細胞内でのApoEとApoER2の相互作用を阻害する能力について、化合物をスクリーニングすることを企図する。そのようなスクリーニングアッセイのために様々な細胞系が利用可能であり、例えば神経細胞、およびこの目的のために特に操作した(例えば、ApoER2を発現もしくは過剰発現するように、またはApoER2リガンド結合の生化学的読み出しを提供するように)ものがある。
【０１１４】
アッセイに依存して、培養が必要とされる場合がある。いくつかの異なるアッセイのいずれか、しかし、特に、候補物質の細胞におけるAβ発現への効果についてのアッセイを用いて、細胞を試験してもよい。または、細胞内のApoER2発現もしくは転位置、またはApoER2 mRNA発現、安定性、もしくは分解を見てもよい。
【０１１５】
C. インビボアッセイ
本発明により、ADの処置における効力について作用物質または作用物質組み合わせをスクリーニングする方法もまた提供される。例示的なアッセイでは、実験動物へ適切な経路を介して、ApoE/ApoER2インヒビターを供給する。その後、ADの1つまたは複数の症状を評価し、そのインヒビターを受けていない類似の動物（例えば、そのインヒビターを受ける前の同じ動物）に見られる症状と比較する。そのような症状には、限定しないが、自発運動の減少、握力の減少、水迷路もしくはT迷路検査における遂行不能、文脈的恐怖条件付け応答能の低下が挙げられる。陽性の結果は、症状の減少、以前に見られた症状の出現の遅延もしくは防止、または既存の症状の進行の遅延もしくは防止として解釈してもよい。
【０１１６】
方法はまた、別の作用物質と組み合わせてApoE-ApoER2インヒビターをスクリーニングする段階を含んでもよい。従って、試験に関してより関心があったのが、インヒビターか、他の作用物質か、または組み合わせかに応じて、適切な対照は、インヒビター、他の作用物質、または両方で、それぞれ処置されていない動物となる。アッセイはまた、投与のタイミング、用量の変化、毒性の評価を含む様々な他のパラメーターを含んでもよい。
【０１１７】
ADを示唆する臨床的特徴をもつマウスモデルが作製されている。アミロイドβ(A4)前駆体タンパク質(APP)を標的とした変異マウスは、David Borchelt博士により作製され、The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine)から購入できる。このマウスモデルは、前肢握力および自発運動の減少を発症する。加えて、反応性星状細胞増加症を、週齢14週までに組織病理学法により示しうる。David Borchelt博士により同様に作製された二重トランスジェニックAPP(マウス/ヒトのキメラ)-プレセニリン1(ヒト)もまた、The Jackson Laboratoryから入手できる。後者のマウスは、ヒトAD脳に見出されるのと類似して、月齢9ヶ月までに脳にアミロイド沈着物を蓄積し始める。これらの沈着物は、月齢12ヶ月までに劇的に増加する。ADマウスモデルは、水迷路、T迷路、または文脈的恐怖条件付け検査を含む様々な検査を用いて評価できる行動変化を生じる。従って、ヒトにおけるADを寛解させるために提案された薬物を、AD動物モデルにおいて評価および確証することができる。斑形成前に疾患またはシナプス毒性の徴候を発症する動物を含む、APPの様々な発現レベルをもつ他のADマウスが作製されている(Mucke et al., 2000)。AD様病態へ導く様々な変異を有するモデルは、Price and Sisodia (1998)に概説されている。このモデルは、ADおよびその症状に対する活性についての本発明による化合物のスクリーニングで使用される。
【０１１８】
VII. ADに罹患している被験体の同定
本発明の様々な局面において、ADに罹患している被験体を同定することが望ましい。診断のための一般的なアプローチを下記に示す。ADのリスクが増加している個体を同定することもまた望ましい。現在、真に予後判定できる検査はない。しかしながら、以下の診断手順はいずれも、有るか無しかの明らかなADの症状しかもたない個体に適用することができ、このようにより臨床的に有意な段階に関連した神経病理学的損傷および/または疾患の進行を予防する可能性のある早期処置を供給する。
【０１１９】
本発明の様々な局面において、ADに罹患している被験体を同定することが望ましい。これらの疾患の診断についての一般的なアプローチは下記に示されている。ADのリスクが増加している個体を同定することもまた望ましい。現在、真に予後判定できる検査はない。しかしながら、以下の診断手順のいずれかは、有るか無しかのADの明らかな症状しかもたない個体に適用されることができ、このようにして、より臨床的に有意な段階に関連した神経病理学的損傷および/または疾患の進行を予防しうる早期処置を供給する。
【０１２０】
初期(軽度)認知障害およびADの両方の診断は、主に臨床上の判断に基づく。しかしながら、臨床医が診断を下すのに、様々な神経心理学的検査が役立つ。記憶障害のみの初期検出は、他の認知症が記憶障害および他の徴候を示す可能性がある、ADの初期徴候を示唆するのに役立つだろう。初期のグローバル認知機能障害を評価する認知能力検査、加えて、ワーキング記憶、エピソード記憶、意味記憶、認知速度、および視空間能力の測定も有用である。これらの検査は単独で、または組み合わせて、臨床的に施すことができる。認知ドメインによる認知力検査の例は、例として示されており、「数字の逆唱」および「記号数字」(注意)、「言葉リスト想起」および「言葉リスト認識」(記憶)、「ボストンネーミング」および「カテゴリー流暢性」(言語)、「MMSE 1-10」(見当識)、および「線方位」(視空間)を含む。従って、神経心理学的検査および教育調整評価は、努力、教育、職業、ならびに運動および感覚障害に関するデータと組み合わせて評価される。軽度認知障害を臨床的に診断する合意の基準はないため、上記に加えて経験豊富な神経心理学者または神経学者による臨床検査の様々な組み合わせが、正しい診断の鍵である。疾患がより明らかになると（すなわち軽度認知障害よりむしろ認知症になると）、臨床医は、the National Institute of Neurologic and Communicative Disorders and Stroke/AD and Related Disorders Association (NINCDS/ADRDA)の共同作業部会により設定された認知症およびADについての基準を用いてもよい。時々、臨床医は、葉性萎縮の程度を評価するために頭部コンピューター断層撮影(CT)または頭部磁気共鳴映像法(MRI)を必要とする場合があるが、これは臨床診断の必要条件ではない。
【０１２１】
VIII. 実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。以下の実施例に開示した技術は、本発明の実施において良く機能しうる本発明者らによって発見された技術を代表し、それに従って、その実施についての好ましい様式を構成すると考えられうることは、当業者により認識されているはずである。しかしながら、当業者は、本開示に照らせば、多くの変化を開示した特定の態様において加えることができ、かつなお、本発明の真意および範囲から逸脱することなく、同様または類似した結果を得ることができることを、認識しているはずである。
【０１２２】
実施例1 - 材料および方法
cDNAベクター
APP cDNAのスウェーデン型変異体は以前に記載された(Lin et al., 2000)。ヒトX11α、X11β、およびマウスのApoER2のベクターは、Chistopher C.J. Miller博士(Kings College London, UK)、Ben Margolis博士(University of Michigan)、およびJohannes Nimpf博士(University of Vienna, Austria)から提供された。PCRは、マウスのApoER2遺伝子を、検出のためのC末端におけるV5-Hisタグと共に、pcDNA6.1へ移入するために用いられた。
【０１２３】
抗体および精製アポリポタンパク質
マウスモノクローナル抗APP MAB5228およびマウスIgGは、CHEMICON(Temecula, CA)から購入した。X11αについてのマウスモノクローナル抗体は、BD Biosciencesから購入した。モノクローナルV5抗体は、Invitrogenから購入した。精製ApoEおよびApoE4は、Biodesign Companyから購入した。
【０１２４】
免疫共沈降およびウェスタンブロットアッセイ
ヒト胚腎臓293細胞(HEK293)に、以前に記載されているように(He et al., 2005)、ApoER2/X11α、ApoER2/X11β、またはApoER2/X11α/APPについての示された組み合わせのプラスミドをLipofectamine2000(Invitrogen)を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションから36時間後、細胞を収集し、溶解緩衝液(プロテアーゼインヒビターカクテル(Roche)と共に1%NP-40および1%サポニンを含む、PBS、pH7.4)に氷上で溶解した。細胞溶解物を、遠心分離により清澄にし、示した抗体を用いて4℃で4時間、免疫沈降した。免疫複合体を、プロテインG-アガロースビーズ(Sigma)を用いて単離し、SDS-PAGEおよび特異的抗体を用いるウェスタンブロッティングに供した。
【０１２５】
β-アミロイド40の定量化
APPsw695を安定に過剰発現するNeuro-2a細胞を、β-アミロイド40の検出のために用いた。N2a-APPsw細胞を、80μg/mLG418と共に10%ウシ胎児血清、100U/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシンを含むダルベッコの改変イーグル培地(DMED)(GibcoBUR)において増殖させた。細胞を、処置の1日前に24ウェルプレートで培養した。一過性トランスフェクションを、FeGENE6 (Roche)を用いて行い、新鮮な最適(Optimum)培地(Invitrogen)をトランスフェクションから5時間後に供給した。同濃度の精製アポリポタンパク質を新鮮培地へ加えた。条件培地を24時間後に収集した。Aβ40を、Aβ40 ELISA Kit (Biosource)を用いることによりサンドイッチELISAで定量化した。少なくとも3回のアッセイを各条件について行った。
【０１２６】
実施例2 - 結果
ApoER2のX11α/βとの結合
本発明者らは、ApoER2がX11のα型またはβ型のいずれかを結合することを実証している。これらの実験において、ApoER2を一過性に発現する293細胞の溶解物を、抗X11α/X11βについて抗mycのいずれかでの免疫沈降に供した。図2A〜Bは、抗V5抗体(V5はApoER2融合構築物の一部である)を用いるApoER2についてのSDS-PAGEおよびウェスタンブロットにより、ApoER2の二重線バンドが明らかにされたことを示している。これらの結果は、X11αまたはX11βがApoER2に結合することを実証している。X11タンパク質は細胞内に位置しているため、X11と相互作用するApoER2の領域は、細胞内ドメインである可能性が高い。APPがその細胞内ドメインを通してX11を結合することが実証されていることは、ここに言及しておく。
【０１２７】
APP、ApoER2、X11α/βの間での複合体形成
本発明者らは、ApoER2がX11αまたはX11βのいずれかの存在下でAPPとの複合体を形成することを見出した。これらの実験において、ヒト胚腎臓293細胞を、ApoER2と共にAPP、またはX11α/βと共にAPP、ApoER2を発現するようにトランスフェクションした。各群からの細胞溶解物を、抗APP抗体5228で沈降させた。ペレットを、SDS-PAGEにより分離し、抗V5抗体を用いるウェスタンブロットによりApoER2について検出した。図3におけるウェスタンブロットパターンは、APP、ApoER2、およびX11αかまたはX11βのいずれかの共発現が、結果として、ApoER2のAPPとの免疫共沈降を生じた。抗APP抗体5228が非特異的IgG画分と置き換えられている対照は、ウェスタンブロットにおいてApoER2バンドを現さず、ApoER2の免疫共沈降がAPPとの特異的会合であることを示している。APPおよびApoER2のみを発現するが、X11αまたはX11βのいずれも含まなかった細胞は、結果として、ApoER2の免疫共沈降を生じなかった。これらの観察は、X11αまたはX11βが、APPとApoER2の複合体形成を媒介することを示した。
【０１２８】
ApoER2により媒介されたAβ分泌を増加させるApoE
本発明者らは、アポリポタンパク質Eまたはアポリポタンパク質E4の培養神経細胞系への添加が、Aβ40の培地への分泌を刺激することを見出している。これらの研究において、マウス神経芽腫細胞N2aに、APPswを安定にトランスフェクションした。ApoEまたはApoE4を、OPTIM培地へ5μg/mLの濃度で加え、培地におけるAβ40のレベルを測定した。図4は、ApoEまたはApoE4の添加が、ApoER2をトランスフェクションされた細胞内で、空のベクターをトランスフェクションされた細胞より高い程度でAβ40の増加を引き起こしたことを示す。ApoER2トランスフェクション有りおよび無しの細胞におけるAβ40レベル間の差は、統計学的に有意であった(p<0.05)。これらの結果は、ApoER2が、ApoE、特にApoE4の存在下でAβ40の増加を媒介することを実証している。図4はまた、Aβ40レベルが、空のベクターをトランスフェクションされた細胞へのApoEまたはApoE4の添加による対照細胞におけるレベルを超えて増加したことを示す。内因性ApoER2もまたこの増加を媒介しうる。
【０１２９】
実施例3 - 材料および方法
cDNAベクター
ヒトβ-セクレターゼおよびAPPのスウェーデン型変異体のベクターは以前に記載された(Lin et al., 2000)。ヒトX11α、X11β、ヒトLRP、およびマウスのApoER2のベクターは、それぞれ、Chistopher CJ Miller博士(Kings College London, UK)、Ben Margolis博士(University of Michigan)、Guojun Bu博士(Washington University)、およびJohannes Nimpf博士(University of Vienna, Austria)から好意により提供された。PCRは、マウスのApoER2遺伝子をC末端におけるV5-Hisタグと共にpcDNA6へ移入するために、およびマウスのApoER2の変異体をpcDNA6において産生するために、用いられた。X11αのPTBドメイン(残基457〜751位)をPCRにより増幅し、pcDNA6へ挿入した。X11αのGST-PTB(457〜751)、GST-PDZ(650〜837)のGST構築物、およびApoER2細胞質ゾルドメインGST-ApoC1(881〜996)、GST-ApoC2(881〜925)、GST-ApoC3(926〜996)のGST構築物、およびGST-APPc(650〜695)をPCRにより増幅し、プラスミドpGEX6.1(Pharmacia)へ挿入した。すべての構築物をシーケンシングにより検証した。GST融合タンパク質を、以前に記載されているように(He et al., 2003)、大腸菌BL21株において産生させ、精製した。
【０１３０】
抗体
組換えプロ-β-セクレターゼに対するヤギポリクローナル抗体を、Affigel(Bio-Rad)固定化組換えβ-セクレターゼを用いて親和性精製した。ウサギポリクローナルAPP抗体AB5228およびマウスIgGは、Chemiconから入手した。X11αについてのマウスモノクローナル抗体は、BD Biosciencesから購入した。LRPについてのマウスモノクローナル抗体は、Calbiochemから購入した。ApoER2についてのモノクローナルV5抗体、Myc抗体、およびポリクローナル抗体は、Invitrogenから購入した。ウサギポリクローナル抗β-アクチンは、Novus Biologicalsから購入した。モノクローナルapoEおよびapoE4抗体は、MBLから購入した。
【０１３１】
リポタンパク質
ApoEおよびApoE4は、Biodesignからであった；ApoE、ApoE2、ApoE3、およびApoE4は、Alpha Diagnosticからであった。ヒト血漿リポタンパク質画分は以下のとおり調製した：期限を経過した血漿を、Oklahoma Blood Bankから入手し、酸化的およびタンパク分解性損傷を防止するために抗生物質、保存剤、およびフッ化フェニルメチルスルホニルを補充した(Manchekar et al., 2004)。超低密度リポタンパク質(VLDL、d<1.006g/ml)、低密度リポタンパク質(LDL、d 1.006〜1.063)、および高密度リポタンパク質(HDL、d 1.063〜1.21g/mL)を、連続超遠心分離により調製し、PBSに対して透析した。ApoE4および総ApoEの含有量を、モノクローナル抗体でのウェスタンブロットを用いて個々のVLDL試料について分析した。バンド量を、STORM Scanner(Amersham Biosciences)およびImageQuant(Molecular Dynamics)を用いる光学式走査により測定した。
【０１３２】
免疫沈降およびウェスタンブロット
HEK293細胞に、以前に記載されているように(He et al., 2005)、以下のプラスミドの組み合わせをトランスフェクションした：ApoER2/X11α、ApoER2/X11β、またはApoER2/X11α/APPsw695。細胞をトランスフェクションから36時間後収集し、溶解物緩衝液(プロテアーゼインヒビターカクテル(Roche)と共に1%NP-40および1%サポニンを含む、PBS、pH7.4)に氷上で溶解した。細胞溶解物を、遠心分離により清澄にし、示した抗体を用いて4℃で4時間、インキュベートした。免疫複合体を、プロテインG-アガロースビーズ(Sigma)を用いて単離し、SDS-PAGEおよび示した特異的抗体を用いるウェスタンブロッティングに供した。
【０１３３】
プルダウンアッセイ
GSTプルダウンについて、GST融合タンパク質を、以前に記載されているように(He et al., 2003)、回収した。グルタチオンビーズで回収したタンパク質量を、Bio-Rad Protein Assayを用いて測定し、ビーズの1mgタンパク質/mLの濃度を生じるように希釈した。X11αまたはX11βをトランスフェクションされたHEK293細胞由来の細胞溶解物を、遠心分離により清澄にし、上清のアリコートを、グルタチオンビーズに結合したGST融合タンパク質の同量とPBS緩衝液中、4℃で4時間、インキュベートした。NI-NTA(ニッケル-ニトリロ三酢酸)プルダウン実験について、HEK293細胞により過剰発現したX11α、X11α/ApoER2、X11β、またはX11β/ApoER2由来の溶解物を、同量のNI-NTAビーズ(Qiagen)とPBS中、4℃で4時間、個々にインキュベートした。両方の型のプルダウンビーズ上の結合したタンパク質を、沸点でSDS試料緩衝液で回収し、ウェスタンブロットに供した。
【０１３４】
細胞のAβ40産生
神経芽腫N2a-APPsw細胞(Riqiang Yan博士, Lerner Research Institute, Cleveland, OHから)を、使用の1日前、80μg/mL G418と共に10%ウシ胎児血清、100U/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシンを含むダルベッコの改変イーグル培地(DMED)(GibcoBUR)において24ウェルプレートで培養した。一過性トランスフェクションを、FeGENE6 (Roche)を用いて行い、新鮮な最適(Optimum)培地(Invitrogen)をトランスフェクションから5時間後に供給した。アポリポタンパク質を新鮮培地へ10μg/mLで加えた。条件培地を24時間後に収集した。Aβ40を、Aβ40 ELISA Kit (Biosource)を用いて、三連で測定した。PTBドメインのAβ産生への効果を研究するために、N2a-APPsw細胞に、上記の手順に供する前に、24ウェルプレートについてウェルあたり0.4μgのPTB含有ベクターをトランスフェクションした。
【０１３５】
細胞表面タンパク質の内部移行
N2a-APPsw細胞に、ApoER2およびβ-セクレターゼをLipfectamine 2000を用いて一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションから24時間後、10μg/mLApoEまたはApoE4を、培地へ加え、2時間、インキュベートした。その後、細胞を氷上に置き、冷PBS中ですすぎ、1.5mg/mLスルホ-NHS-LC-ビオチンを含むPBS(Pierce)において4℃で20分間、インキュベートした。細胞をPBS中で2回、すすぎ、0.1%SDS、1%NP40、および完全プロテアーゼインヒビターカクテルを含む800μl PBS中に溶解した。総タンパク質濃度を、50μl細胞溶解物のアリコートからの免疫ブロッティングにより測定した。ビオチン化タンパク質を、NeutrAvidinアガロース(50μl；Pierce)で回収し、3回、すすぎ、沸点で20μl SDS-試料緩衝液中に溶出し、ウェスタンブロットに用いた。バンド量を、上で特定した光学式走査装置により測定した。内部移行したタンパク質の測定について、細胞を上記のように調製し、PBS中ですすぎ、その後、冷たいPBS中の1.5mg/mL開裂可能ビオチン試薬(EZ-Link Sulfo-NHS-SSビオチン, Pierce)と、20分間4℃でインキュベートした。その後、細胞を室温の培地でずばやくすすぎ、対照培地において、または10μg/mLApoEもしくはApoE4を含む培地において、37℃で15分間、インキュベートし、氷上に置き、冷たいストリッピング緩衝液(50mMグルタチオン、75mM NaCl、75mM NaOH、10%FBS、pH8.5〜9.0)中ですすいだ。その後、細胞を、0.1%SDS、1%NP40、および完全プロテアーゼインヒビターカクテルを含む800μl PBS中に溶解した。遠心分離後、ビオチン化タンパク質をNeutrAvidinアガロース(50μl；Pierce)とのインキュベーションにより回収した。単離したタンパク質を緩衝液中で3回、すすぎ、ウェスタンブロットのために20μl試料緩衝液中で沸騰させた。
【０１３６】
細胞タンパク質の免疫蛍光研究
HeLa細胞は、ガラスカバースリップを有する6ウェルプレート上に播種され、トランスフェクション後36時間、ApoER2/X11α、ApoER2/X11β、またはApoER2/APP構築物を発現した。細胞を、リン酸緩衝食塩水、pH7.4中の4%パラホルムアルデヒドにおいて室温で15分間、穏やかに固定した。その後、カバースリップをPBS中、2回、各10分間、洗浄し、PBS中0.1%BSA、0.1%サポニン、0.02%アジ化ナトリウム(免疫蛍光緩衝液)に希釈した一次抗体の示した組み合わせと室温で1時間、インキュベートした。この時間の終わりに、カバースリップをPBSで2回、洗浄し、免疫蛍光緩衝液に希釈した二次抗体の示した組み合わせと30分間、インキュベートした。カバースリップを、再び、PBSで2回、洗浄し、Vector-shield(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)を用いてスライド上に載せた。APPを、ウサギポリクローナル抗体5352(CHEMICON)で、続いて、Cy3連結型ヒツジ抗ウサギ二次抗体(Sigma)で免疫標識した。X11αおよびX11βは、それらに対するモノクローナル抗体(BD Biosciences)によりブロットされ、その後、アレクサ-488連結型ロバ抗マウス二次抗体(Invitrogen)により認識された。ApoER2は、Hisタグ(X11と共局在化した)に対するウサギポリクローナル抗体かまたはV5(APPと共局在化した)に対するモノクローナル抗体のいずれかにより標識し、その後、Cy3かまたはアレクサ-488のいずれかを連結した二次抗体で標識した。画像を、倒立共焦点レーザー走査顕微鏡(LSM 510, Carl Zeiss Inc.)において得た。
【０１３７】
ApoER2のsiRNA干渉
マウスApoER2に特異的な二本鎖siRNA(ON-TARGETplus SMARTpool, カタログ番号L-046407-00)を、Dharmaconにより化学合成した。24時間、24ウェルプレートで増殖したN2a-APPsw細胞に、Oligofectamine(Invitrogen)を用いてApoER2 siRNAかまたは対照siRNA(No-Target siRNA, Dharmacon)のいずれかをトランスフェクションした。培地、Opti-MEMと4時間後、交換し、ApoEまたはApoE4を加え、24時間、培養した。培地試料におけるAβ40を、上記のようにアッセイした。
【０１３８】
リーリンおよびリーリン効果に関する研究
T25フラスコで増殖したN2a-APPsw細胞に、マウスのリーリン遺伝子全体を含む発現ベクターpCrlの5μgをLipofectamine2000を用いてトランスフェクションした。対照細胞に、空のベクターをトランスフェクションした。細胞を、OPTI-MEMにおいて36時間、条件付けし、培地を収集し、濃縮した。ウェスタンブロットを、濃縮培地および細胞溶解物について抗リーリン抗体MAB5364(CHEMICON)を用いて行った。リーリン抗体のAβ産生への効果を測定するために、N2a-APPsw細胞を10μg/mLApoEと共に、抗体MAB5364有りかまたは無しかのいずれかで、24時間、培養した。培地におけるAβ40を、ELISAにより測定した。
【０１３９】
実施例4 - 結果
N2a細胞内でAβを増加させるApoE
本発明者は、ヒトAPPswedishを安定にトランスフェクションされたNeuro-2a細胞(N2a-APPsw)におけるAβ産生が、精製ヒトVLDLの存在下で最高2倍まで増加したが(p<0.01)、LDLおよびHDLは効果を生じなかったことを観察した(図5A)。VLDLはApoEを含む主要なリポタンパク質画分であるため(図1A、挿入図)、本発明者は、同一構造のApoE型のそれぞれの効果を試験し、組換えApoE2、ApoE3、およびApoE4の細胞培養物への10μg/mlでの添加がAβ産生を増加させ(図5B)、最高応答はApoE4によることを見出した。これらのApoE試料は脂質を含まなかったため、示差的応答は、それらの非天然の物理的性質により影響されている可能性がある。したがって、本発明者は、天然ヒトVLDL由来のApoE4がApoE2またはApoE3のどちらよりもAβ産生を刺激するかどうかを調べた。VLDLを個々のヒト血漿から調製し、総ApoEおよびApoE4の含有量を測定した。N2a-APPsw細胞におけるAβ40およびAβ42の産生を測定するために異なるレベルのApoEを含むVLDL試料を選択した。本発明者は、ApoE4含有量と両方のAβ種の産生の、類似した相関係数をもつ線形相関を観察した(図5C)。これらの結果は、天然リポタンパク質粒子におけるApoE4もまた、ApoE2およびApoE3についてのものより高い、N2a細胞におけるAβ産生を刺激することを示す。
【０１４０】
ApoEによるAβ増加を媒介するApoER2
ApoER2はApoEの脳特異的受容体であるため、本発明者らは、ApoEのAβへの効果がApoER2により媒介されるかどうかを問うた。第一セットの実験において、ApoEおよびVLDLのAβ産生への影響を、ApoER2のトランスフェクション有りまたは無しのN2a-APPsw細胞について比較した。ApoER2をトランスフェクションされた細胞は、ApoE、組換えApoE4、または精製VLDLに応答してより多いAβを産生した(図5D)。これらの結果は、ApoER2が、ApoEに応答したAβ産生の増加を媒介したことを示唆する。ApoEはまた、空のベクターによりトランスフェクションされた細胞内でAβを増加させたが(図5D)、その増加が内因性ApoER2により媒介されたかどうか研究する機会を提供した。第二シリーズの実験において、本発明者は、siRNAを用いてApoER2をノックダウンし、様々なApoEシリーズに応答したAβ産生を試験した。図5Eは、内因性ApoER2の残存発現のみがノックダウン細胞に残ったことを示し、そのノックダウン細胞はそれらのAβ産生の約4分の1を失い、それはApoEまたはApoE4の培地への添加によって増加しなかった(図5D)。これらの観察は、ApoER2が、N2a-APPswedish細胞におけるApoEに刺激されるAβ産生を媒介することを示す。
【０１４１】
ApoER2、APP、およびβ-セクレターゼのエンドサイトーシスを誘発するApoE
Aβ産生のApoE刺激についての考えられる解釈は、ApoEがApoER2だけでなく、APPおよびβ-セクレターゼの細胞表面からエンドソームへの内部移行を誘発することである。本発明者は、ApoEの添加が細胞表面からのこれらのタンパク質の低下を引き起こすかどうかを試験した。N2a-APPswedish細胞を、ApoEまたはApoE4で2時間、処理し、その後、細胞表面タンパク質を標識するためにビオチン化した。ビオチン化ApoER2、APP、およびβ-セクレターゼを回収し、ウェスタンブロットにおいて現した。対照と比較して、残っている細胞表面ApoER2、APP、およびβ-セクレターゼは、ApoEが加えられた場合、それぞれ、約25%、25%、および7%、減少し、ApoE4が存在した場合、それぞれ、50%、50%、および35%、減少した(図6A)。細胞溶解物における3つのタンパク質の総量はほぼ同じままであった。その後、本発明者は、ApoEが細胞内でこれらの3つのタンパク質を増加させるかどうかを測定した。細胞表面タンパク質を、ビオチン化によりパルス標識し、15分間、内部移行するようにさせておいた。細胞表面に残存するビオチニル基を取り除き、細胞内部のビオチン化ApoER2、APP、およびβ-セクレターゼを回収し、ウェスタンブロットにおいて可視化した。本発明者は、ApoEおよびApoE4に応答してApoER2およびβ-セクレターゼの少しの増加を観察したが(図6B)、APPの増加ははるかに大きく、ApoEおよびApoE4に応答して、それぞれ、約2.5倍および4倍であった(図6B)。合わせると、ApoEの添加に応答しての、細胞表面ApoER2、APP、およびβ-セクレターゼの減少と、これらのタンパク質の細胞内プールの増加は、ApoEのApoER2への結合がすべての3つのタンパク質のエンドサイトーシスを誘発したという機構と一致している。エンドサイトーシスしたAPPがβ-セクレターゼによるタンパク分解に曝されたことをさらに実証するために、本発明者はまた、上記実験において、β-セクレターゼ切断に起因するAPP C末端断片(C99)を測定した。本発明者は、C99が、対照に対してApoEおよびApoE4の存在下で有意に増加したことを観察した(図6C)。この場合もやはり、ApoE4は、ApoEが生じるより多くのC99を生じた。ApoEにより刺激されたエンドサイトーシスの増加および細胞表面APPの減少は、∝-セクレターゼによるAPPプロセシングの減少を伴うはずである。∝-セクレターゼにより生成されるAPP外部ドメイン、s∝-APPのウェスタンブロットは、ApoEおよびApoE4によるs∝-APPの低下を確認した(図6D)。
【０１４２】
ApoEおよびAβ関係におけるX11α/βの役割
ApoEに誘発されるApoER2およびAPPのエンドサイトーシスを説明しうる仮説は、それらの細胞質ゾルドメインが、細胞輸送を制御する同じアダプタータンパク質と相互作用することである。APPの細胞質ゾルドメインは、脳特異的アダプタータンパク質X11αまたはX11βを結合することが知られているYENPTYモチーフを含む(図7A)。本発明者は、X11α/βがまたApoER2と相互作用するかどうかの決定を求める。ApoER2およびX11αまたはX11βのいずれかを一過性に発現するHEK293細胞の溶解物からApoER2を免疫沈降した時、アダプタータンパク質が沈降物のウェスタンブロットに見られた(図7B)。ApoER2のLRPとの置換は、X11α、またはX11αのApoER2結合PTBドメインとの免疫共沈降を生じず(下記参照)(図7C)、X11のApoER2への結合が、LDL受容体ファミリーでの一般的な現象よりむしろ特異的であることを示している。X11αおよびX11βは本質的に同一の結果を与えた。X11γは、それが脳に発現していないため、試験されなかった。逆プルダウンにおいて、Niアフィニティーゲルで収集した溶解物におけるHis6タグを含むApoER2もまたX11α/βを回収した(図7D)。これらの結果は、X11α/βがApoER2を高親和性で結合することを示唆する。X11α/βがApoER2およびAPPの両方を結合するため、本発明者は、ApoER2およびAPPが、対象となるこれらの内因性タンパク質を欠く非ニューロンのHEK293細胞内で複合体を形成するかどうかを試験した。ApoER2、APP、およびX11α/βを発現する細胞の溶解物を、抗APP抗体5228で免疫沈降した時、APPおよびX11の両方が沈降物のウェスタンブロットに見出された(図7E)。この場合もやはり、X11αおよびX11βの両方が共沈降を支持した。ApoER2およびAPPを、ただし、X11無しで、トランスフェクションされた細胞は、事実上、ApoER2とAPPの共沈降を生じなかった(図7E)。これらの結果は、X11α/βが、ApoER2、APP、およびX11α/βを含む複合体形成に必要とされることを示す。
【０１４３】
ApoER2とX11α/βの間のドメイン相互作用
PDZドメインではなかったが、X11αのPTBドメインは細胞溶解物からApoER2をプルダウンすることが示され(図8A)、それがApoER2結合に関与することを示している。ApoER2における結合モチーフを同定するために、ApoER2細胞質ゾルドメインの異なる領域からの様々なGST融合物を、X11α/βプルダウンについて試験した。59残基挿入部を含む構築物はX11を結合することができたが(図8B)、この領域がX11結合モチーフを含むことを示している。様々な欠失または変異を、ApoER2の細胞質ゾルドメインにおける可能性のあるモチーフ部位に生じさせた。NPXYモチーフの欠失(変異体1および2、図8C)または2つのPXXPモチーフの変異(変異体3および4、図8C)は、X11-PTBドメインのApoER2への結合に影響を及ぼさなかった。59残基挿入部内の残基YDRPLW(残基899位〜904位)の欠失は、X11-PTBプルダウンを無効にした(変異体5、図8C)。この同じ欠失はまた、単独で発現している、X11αのPTBドメインのプルダウンも無効にした(図8D)。これらの結果は、モチーフYDRPLWが、ApoER2の、X11α/βのPTBドメインへの結合を媒介することを示す。
【０１４４】
ApoE刺激性Aβ産生に関与するX11α/β
X11α/βはApoER2およびAPPの両方に結合し、かつ3つを含む複合体の形成に必要とされるため(図7A〜Eおよび8A〜D)、本発明者は、ApoE誘導性Aβ産生へ導く、これらのタンパク質のエンドサイトーシスを促進することに、それが関与するという仮説を立てる。この仮説は、APPのApoER2との(図9A〜C)、およびApoER2のX11α/βとの(図9D〜I)、特に、エンドソームと一致した細胞内区画における、細胞内共局在化により支持される(図9A〜I矢印)。しかしながら、それはまた公知であり(Borg et al., 1998; Sastre et al., 1998)、本発明者は、X11α/βの発現がAβ産生を阻害することを確認している(結果未呈示)。そのような応答は、仮説に矛盾するように思われる。したがって、本発明者は、N2a細胞からのApoE誘導性Aβ増加への内因性X11α/βの関与に関する証拠を捜した。第一に、トランスフェクションされたX11α由来のPTBドメインを、内因性X11α/βの機能のドミナントネガティブなインヒビターとして用いた。本発明者は、ApoE4誘導性Aβ増加(図9B、比較列1および3)がPTB発現によって大きく消失したことを観察した(図9B、列4)。第二に、X11α/β結合モチーフの欠失をもつ変異体ApoER2(図4Cにおける変異体5)の発現もまた、ApoE4またはVLDLのいずれかにより誘導されるAβ増加を大きく低下させた(図9C)。これらの観察は、X11α/βの少なくともApoER2への結合が、Aβの産生へ導くApoE誘導性エンドサイトーシスにおいて役割を果たすことを示唆する。
【０１４５】
リーリンに依存しないApoEによるApoER2媒介性Aβ増加
ApoER2はまた、ニューロンのシグナル伝達タンパク質リーリンの受容体であり(D'Arcangelo et al., 1999; Hiesberger et al., 1999)、リーリンは細胞のAβ産生を低下させることが知られている(Hoe et al., 2006)。そこで、ApoEによるApoER2媒介性Aβ増加がリーリン-ApoER2相互作用に依存していないかどうかを測定することは、興味深い。T25フラスコにおける細胞培養から濃縮したN2a-APPsw培地または細胞溶解物のウェスタンブロットは、リーリンの存在を検出しなかったが(図10A、2つの左レーン)、リーリンのバンドは、リーリン発現ベクターをトランスフェクションされた細胞において明らかに目に見えた(図10A、2つの右レーン)。さらに、抗リーリン抗体の培地への添加は、N2a-APPsw細胞におけるApoE刺激性Aβ増加を有意に変化させなかった(図10B)。これらの観察は、ApoEによるApoER2媒介性Aβ増加がリーリン-ApoER2相互作用に依存しないことを示す。
【０１４６】
本明細書で開示し特許請求する組成物ならびに方法のすべては、本開示に照らせば、過度の実験無しに作製および実行することができる。本発明の組成物および方法は好ましい態様に関して記載しているが、本発明の概念、真意、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された組成物および方法に、ならびに方法の段階において、または段階の順序において、バリエーションが適用されうることは当業者にとって明らかであろう。より具体的には、化学的および物理的の両方に関連している特定の作用物質は、本明細書に記載された作用物質の代わりに用いてもよいが、同じまたは類似した結果が達成されるだろうことは明らかであろう。当業者にとって明らかな、そのような類似した置換および改変のすべては、添付された特許請求の範囲により定義される本発明の真意、範囲、および概念内にあると考えられる。
【０１４７】
IX. 参考文献
本明細書に示されたものの補充的な、例示的手順または他の詳細を提供する範囲内での以下の参考文献は、参照により本明細書に明確に組み入れられている。
米国特許第4,196,265号
米国特許第4,415,723号
米国特許第4,458,066号
米国特許第4,816,567号
米国特許第4,946,778号
米国特許第5,223,424号
米国特許第5,354,855号
米国特許第5,440,013号
米国特許第5,446,128号
米国特許第5,475,085号
米国特許第5,618,914号
米国特許第5,626,850号
米国特許第5,670,155号
米国特許第5,672,681号
米国特許第5,674,976号
米国特許第5,710,245号
米国特許第5,795,715号
米国特許第5,840,833号
米国特許第5,859,184号
米国特許第5,888,773号
米国特許第5,889,136号
米国特許第5,929,237号
米国特許第5,994,136号
米国特許第6,165,782号
米国特許第6,277,633号
米国特許第6,319,703号
米国特許第6,344,445号
米国特許第6,428,953号
米国特許第6,521,457号
米国特許第6,924,144号
米国特許公開第20030147966号
米国特許公開第20030223938号
米国特許公開第20050143336号
米国特許仮出願第60/661,680号
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【図面の簡単な説明】
【０１４８】
以下の図面は本明細書の部分を形成し、本発明の特定の局面をさらに実証するために含まれる。
【０１４９】
【図１】(図1A)ヒトスウェーデン型APP695構造およびAβの細胞内プロセシングの図を示す。(図1B)ヒトX11α/β哺乳動物構造のドメイン構造の表示。(図1C)細胞内ドメインに59アミノ酸挿入を含むマウス野生型ApoER2構築物の構成の図。
【図２】図2A〜Bは、ApoER2のX11α/βの免疫共沈降を示す。ApoER2およびX11α/βを一過性に過剰発現するHEK293細胞の細胞溶解物を、抗X11α/X11βについての抗myc、または対照マウスIgGで沈降させた。免疫沈降したタンパク質をSDS-PAGE上で分離した。ペレットを、ストリッピング後、ApoER2を検出するために抗V5でブロットし、X11α/βについて対応する抗体でブロットした。ApoER2は、抗X11α/βで免疫共沈降できるが、対照IgGではできないことが見出された。
【図３】X11α/βと共のApoER2でのAPP免疫共沈降を示す。ApoER2と共にAPPsw、またはX11α/βと共にAPP、ApoER2を発現するHEK293細胞溶解物を、抗APP 5228または対照マウスIgGで免疫沈降させた。ペレットをSDS-PAGEにより分離し、ApoER2について抗V5を用いてウェスタンブロッティングにより検出した。APPおよびApoER2のみが細胞に発現している場合のレーン1および2にはApoER2は検出されなかった。ApoER2は、X11α(レーン3、4)またはX11β(レーン5、6)と共発現している場合、APPで免疫共沈降できることが見出された。
【図４】ApoER2との相互作用に依存するAβ40分泌へのApoE刺激効果を示す。N2a APPsw細胞において、apoE、apoE4(5μg/mL)を、OPTIM培地へ加えた。実験群に、マウスApoER2プラスミド、対照として用いられる同量のpcDNA6.1プラスミドをトランスフェクションした。一晩の処理後、同量の条件培地を、Aβ40を検出するためのELISAについて収集した。各実験を少なくとも3回、繰り返した。実験群と対照の間のP値は<0.05である。対照と比較してのApoER2の過剰発現は、Aβ40分泌への刺激の明らかな増加を示した。
【図５】図5A〜Eにおいて、神経芽腫N2a-APPsw細胞内でApoEはAβ産生を増加させる。(図5A)ヒトVLDL(10μg/mL)は、N2aAPPsw細胞内でAβ産生を増加させた。HDLおよびLDL(同濃度)は効果を生じなかった。培地におけるAβを、培養の24時間後に分析した。挿入図：3つのリポタンパク質画分におけるApoEのウェスタンブロット。(図5B)精製ヒトApoE、組換えApoE2、ApoE3、およびApoE4(それぞれ、5μg/mL)は、N2a-APPsw細胞内でAβ産生を増加させた。実験条件は(a)と同じである。＊、p<0.05；＊＊、p<0.01。(図5C)ヒトVLDLのApoE4含有量のN2a-APPsw細胞におけるAβ40およびAβ42との相関。個体から精製されたVLDL試料を、ApoE4および総ApoE含有量について分析し、N2a-APPsw細胞におけるAβ40およびAβ42産生へのそれらの効果についてELISAで測定した。(図5D)ApoER2のN2a-APPsw細胞へのトランスフェクションは、空のベクターをトランスフェクションされた細胞に対して(灰色列)、Aβ産生のApoEまたはVLDL誘導性増加を増加させた(黒色列)。実験条件は上と同じであった。(図5E)ApoER2 siRNAノックダウンは、Aβ産生のApoEまたはApoE4誘導性増加を無効にした(左パネル)。ウェスタンブロット(右パネル)は、内因性ApoER2バンドがApoER2 siRNAノックダウンにおいて大きく減少したが、対照β-アクチンバンドが有意には変化しなかったことを示す。
【図６】図6A〜Dにおいて、ApoEまたはApoE4はApoER2、APP、およびβ-セクレターゼの細胞表面からの内部移行を誘導した。(図6A)ApoEは、細胞表面ApoER2、APP、およびβ-セクレターゼを低減した。ApoER2およびβ-セクレターゼをトランスフェクションされたN2a-APPsw細胞を、ApoEまたはApoE4と2時間、インキュベートした。細胞表面タンパク質をビオチン化し、アビジン-アガロースゲルで回収し、ApoER2、APP、およびβ-セクレターゼについてウェスタンブロットに供した(上部パネル、右)。バンドの定量化を、走査濃度計により行い、1.0として設定された対照(白色列)に対する相対強度としてここに示した(下部パネル、2回の実験の平均)。並行実験をビオチン化無しで行い、それからの溶解物を、細胞における3つのタンパク質の総量を推定するためにウェスタンブロットに供した(下部パネル)。(図6B)ApoEは細胞内ApoER2、APP、およびβ-セクレターゼを増加させた。図6Aにおいてのように細胞を調製し、その後、細胞表面タンパク質を、4℃において、開裂可能ビオチン化試薬で標識した。内部移行は、37℃で15分間、もたらされた。細胞表面上のビオチニル基を除去した後、細胞を溶解し、ビオチン化タンパク質を上記のようにウェスタンブロットのために回収した。示されたパネルは、下部パネルにおいてApoEの量(黒色列)が1.0として設定されている点を除いて、図6Aと同じである。(図6C)ApoEの非存在下および存在下における、N2a-APPsw細胞由来の細胞内APP断片C99のウェスタンブロット。試料は図6Bに記載されたものであり、抗体MAB1560でブロットされた。(図6D)ApoEの非存在下および存在下におけるN2a-APPsw細胞由来の∝-セクレターゼ、s∝-APPにより生成された可溶性APP外部ドメインのウェスタンブロット。図6Bからの条件培地をMAB1560で免疫沈降させ、同じ抗体でウェスタンブロットした。
【図７】図7A〜Eは、X11α/βのApoER2との結合を示す。(図7A)APP、ApoER2、およびX11のいくつかの機能性ドメインの図。APPにおいて、点は、X11α/βを含むいくつかのアダプタータンパク質の結合に関与するYENPTYモチーフの位置を示す。KPIは、クニッツ(Kunitz)型プロテアーゼインヒビタードメインである。ApoER2において、選択的スプライスされた59残基挿入は、青色で示されている。(図7B)ApoER2はX11α/βの免疫沈降において回収される。ApoER2(V5タグを有する)およびX11αまたはX11β(mycタグを有する)を一過性に発現するHEK293細胞の溶解物を、抗X11α、抗myc(X11βについて)、または対照IgGで別々に免疫沈降させ、抗V5、抗X11α、または抗mycでのウェスタンブロットにおいて可視化した。ApoER2バンドは、X11αおよびX11βについての両方の免疫沈降において存在した。(図7C)LRP(LDL受容体関連タンパク質)は、X11αで免疫共沈降しなかった。実験条件は図7Aにおいてと同じである。(図7D)ApoER2プルダウン実験におけるX11α/βの存在。ApoER2(V5およびヘキサヒスチジンタグの両方を有する)およびX11α/βを発現する細胞の溶解物を、ApoER2を回収するためにNiアフィニティーゲルによる結合に供した。ウェスタンブロットは、X11α(上部パネル)およびX11β(下部パネル)の両方が回収されたことを示した。(図7E)ApoER2およびX11α/βはAPPで免疫沈降された。APP、ApoER2、およびX11αまたはX11βを一過性に発現するHEK293細胞の溶解物を、抗APP抗体5228で免疫沈降させ、ウェスタンブロットにより可視化した。ApoER2は、X11α/βが発現している場合、存在するが(レーン3および5)、X11が発現していない場合、存在しなかった(レーン1)。
【図８】図8A〜Dは、ApoER2/X11α/β相互作用に関与するドメインおよびモチーフを示す。(図8A)X11αのPTBドメインはApoER2を結合する。ApoER2、およびX11αのPTBまたはPDZドメインのGST(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)融合物を発現する細胞由来の溶解物を、グルタチオンアフィニティーカラムを用いるGSTプルダウンに供した。ウェスタンブロットは、ApoER2がPTBドメインと会合するが(第3レーン)、PDZドメインと会合しない(第2レーン)ことを示した。(図8B)ApoER2細胞内領域(灰色棒)の異なる領域を含むGST(白色棒)融合構築物によるX11αプルダウン。APP細胞質ゾルドメイン(斜線棒)へのGST融合物は陽性対照であった。GST-ApoC1およびGST-ApoC3における59残基挿入(チェック棒)を含む構築物は、ウェスタンブロットに示されているように、細胞溶解物においてX11αをプルダウンできた。(図8C)ウェスタンブロットに示されたApoER2変異体のGST-PTB(X11α)プルダウン(上部パネル)。下部パネルは、変異位置の図を示す。NPTY(SEQ ID NO:5)モチーフの欠失(変異体1および2)またはPXXP(SEQ ID NO:6)モチーフの変異(変異体3および4)はプルダウンに影響しなかった。YDRPLW(SEQ ID NO:7)モチーフの欠失のみがプルダウンを無効にした。GSTはプルダウンおよびウェスタンブロットにおける陰性対照であった。(図8D)野生型ApoER2はX11αをプルダウンしたが(レーン2)、変異体5(ApoER2 M5)はプルダウンしなかった(レーン4)、(h)からの逆プルダウン。
【図９】図9A〜Cは、APPおよびApoER2内部移行ならびにApoE誘導性Aβ産生におけるX11α/βの関与を示す。(図9A)ApoER2とのAPP(図9A〜C)、およびX11α/βとのApoER2(図9D〜I)の細胞内局在性。併合画像における細胞内区画への矢印は、エンドソームと一致する。スケールバーは、10μmを示す。(図9B)X11α/βのPTBドメインの発現はApoE誘導性Aβ産生を消失させた。(図9C)ApoER2におけるX11α/β結合モチーフYDRPLW(SEQ ID NO:7)の欠失(Mut4、図8Cにおける変異体4)は、ApoE誘導性Aβ産生を消失させた。
【図１０】図10A〜Bは、N2a-APPsw細胞におけるリーリンの非存在およびApoE誘発性Aβ増加におけるリーリン効果を示す。(図10A)N2a-APPsw細胞(左の2つのレーン)、およびリーリン発現ベクターをトランスフェクションされたN2a-APPsw細胞の細胞溶解物ならびに培地におけるリーリンについてのウェスタンブロット。(図10B)抗リーリン抗体の存在下(右列)および非存在下(左および中央列)でのN2a-APPsw細胞におけるAβ40産生。値は3つの測定から平均された。
【図１１】ApoE誘発性Aβ産生の概略表示を示す。細胞表面において、ApoER2(青色)およびAPP(赤色)は、それぞれ、X11α/β(緑色)の分子を結合して、エンドサイトーシス小胞動員およびパッケージング中に他の細胞質ゾルのタンパク質(ベージュ色の楕円形によって表された)の含有の可能性のある複合体を形成する。β-セクレターゼは、そのAPPの認識によってこの複合体と会合し、そのプロテアーゼはpH7において不活性である。ApoE含有脂質粒子の存在下で、ApoEはApoER2を結合し、β-セクレターゼとの複合体の細胞内区画へのエンドサイトーシスを誘発し、pH4.5において、APPはβ-セクレターゼおよびγ-セクレターゼにより切断され、Aβを生成する。この機構において、ApoEはAβの産生を誘発し、ApoE4は、ApoE2およびApoE3が生成するよりも多くのAβを生成するが、おそらくApoER2とのより強い会合の結果としてであろう。この機構はまた、ニューロンの活動と関連する可能性がある脂質取り込みにAβ産生を結びつける。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年12月4日(2008.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009531299000001.app
【国際調査報告】
2009531299.tif 000016
2009531299.tif 000017
2009531299.tif 000018
2009531299.tif 000019