(57)【要約】  本発明は、インフルエンザウイルスワクチンに、具体的には、非病原性または低病原性のインフルエンザウイルスに由来するその血球凝集素遺伝子を少なくとも有する再集合インフルエンザウイルス、およびドナー株に由来する他の遺伝子に関する。一実施形態において、インフルエンザウイルスは、血球凝集素遺伝子のみが非病原性インフルエンザウイルスに由来する、7：1の再集合体である。ウイルスは、高病原性インフルエンザウイルス株により生じるインフルエンザを含むインフルエンザに対するワクチンの生産に有用である。
2009533477.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）非病原性トリインフルエンザウイルスに由来する血球凝集素遺伝子を少なくとも有する再集合インフルエンザウイルス、および
b）ドナー株に由来する他の遺伝子
を含むインフルエンザウイルスワクチンであって、非病原性または低病原性のインフルエンザウイルスが高病原性インフルエンザウイルスと同一の血球凝集素型を有する、インフルエンザウイルスワクチン。
【請求項２】
再集合インフルエンザウイルスが、血球凝集素遺伝子のみが非病原性インフルエンザウイルスに由来する7：1の再集合体である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
非病原性または低病原性のインフルエンザウイルスがトリウイルスである、請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項４】
非病原性または低病原性のトリインフルエンザウイルスがA/Duck/Potsdam/1042-6/86（H5N2）、A/Vietnam/1194/04（H5N1）、A/Duck/Singapore/97（H5N3）、A/Duck/Hokkaido/67/96（H5N4）、またはA/Mallard/Netherlands/12/00（H7N3）である、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
ドナー株が完全に特徴付けられているワクチン株である、請求項１から４のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項６】
ドナー株が低温適応性または温度感受性の株である、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
ドナー株が低温適応性であり、かつ温度感受性である、請求項５に記載のワクチン。
【請求項８】
ドナー株がPB2遺伝子、PA遺伝子、NA遺伝子、およびM遺伝子に突然変異を有している、請求項６または７に記載のワクチン。
【請求項９】
ドナー株が、A/Leningrad/134/17/57（H2N2）、A/Leningrad/134/47/57（H2N2）、A/Leningrad/134/17/K7/57（H2N2）、A/Moscow/21/65（H2N2）、A/Moscow/21/17/65（H2N2）、A/Ann Arbor/6/60（H2N2）、A/Puerto Rico/8/34（H1N1）、またはA/Puerto Rico/8/59/1（H1N1）である、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
再集合インフルエンザウイルスが古典的な再集合により得られる、請求項１から９のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１１】
再集合インフルエンザウイルスが高病原性インフルエンザウイルスに対する交差防御免疫応答を誘発する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１２】
IgA、IgG、およびT細胞の応答を誘発する、請求項１から１１のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１３】
弱毒生ワクチンまたは不活化ワクチンである、請求項１から１２のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１４】
弱毒生ワクチンである、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
経口投与または経鼻投与用に製剤されている、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
アジュバントも含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１７】
ワクチンを冷蔵庫内の温度で保存することを可能にする1つまたは複数の安定剤も含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１８】
（a）1つまたは複数の追加のインフルエンザウイルス、ならびに/あるいは
（b） 実質的に純粋なインフルエンザノイラミニダーゼタンパク質、および/またはインフルエンザ血球凝集素タンパク質
も含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１９】
高病原性インフルエンザウイルスによる感染に対して対象を免疫感作する方法であって、請求項１から１８のいずれか一項に記載のワクチンを対象に投与するステップを含む方法。
【請求項２０】
高病原性インフルエンザウイルス株がトリ由来のインフルエンザウイルス株である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ワクチンが弱毒生ワクチンである、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
ワクチンが経口投与または経鼻投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
高病原性インフルエンザウイルス株に対する交差防御および/または交差反応性の免疫応答をもたらす、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
高病原性インフルエンザウイルス株に対して対象を免疫感作するためのワクチンの製造における、請求項１から１８のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスの使用。
【請求項２５】
ワクチンが弱毒生ワクチンである、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
ワクチンが経口投与または経鼻投与用に製剤される、請求項２４または２５に記載の使用。
【請求項２７】
非病原性または低病原性のインフルエンザウイルスに由来する血球凝集素遺伝子、およびドナー株に由来する他の遺伝子を含む再集合インフルエンザウイルスであって、非病原性または低病原性のインフルエンザウイルスが高病原性インフルエンザウイルスと同一の血球凝集素型を有する、再集合インフルエンザウイルス。
【請求項２８】
血球凝集素遺伝子のみが非病原性インフルエンザウイルスに由来する7：1の再集合体である、請求項２７に記載のウイルス。
【請求項２９】
非病原性または低病原性のインフルエンザウイルスがトリウイルスである、請求項２７または２８に記載のウイルス。
【請求項３０】
非病原性または低病原性のトリインフルエンザウイルスが、A/Duck/Potsdam/1042-6/86（H5N2）、A/Vietnam/1194/04（H5N1）、A/Duck/Singapore/97（H5N3）、A/Duck/Hokkaido/67/96（H5N4）、またはA/Mallard/Netherlands/12/00（H7N3）である、請求項２９に記載のウイルス。
【請求項３１】
ドナー株が完全に特徴付けられているワクチン株である、請求項２７から３０のいずれか一項に記載のウイルス。
【請求項３２】
ドナー株が低温適応性または温度感受性の株である、請求項２７から３１のいずれか一項に記載のウイルス。
【請求項３３】
ドナー株が低温適応性でもあり、温度感受性でもある、請求項２７から３１のいずれか一項に記載のウイルス。
【請求項３４】
ドナー株がPB2遺伝子、PA遺伝子、NA遺伝子、およびM遺伝子に突然変異を有している、請求項２７から３３のいずれか一項に記載のウイルス。
【請求項３５】
ドナー株が、A/Leningrad/134/17/57（H2N2）、A/Leningrad/134/47/57（H2N2）、A/Leningrad/134/17/K7/57（H2N2）、A/Moscow/21/65（H2N2）、A/Moscow/21/17/65（H2N2）、A/Ann Arbor/6/60（H2N2）、A/Puerto Rico/8/34（H1N1）、またはA/Puerto Rico/8/59/1（H1N1）である、請求項３１に記載のウイルス。
【請求項３６】
古典的な再集合により得られる、請求項２７から３５のいずれか一項に記載のウイルス。
【請求項３７】
再集合インフルエンザウイルスが高病原性インフルエンザウイルスに対する交差防御免疫応答を誘発する、請求項２６から３５のいずれか一項に記載のウイルス。
【請求項３８】
ワクチンが交差防御をもたらす高病原性インフルエンザウイルスが、血球凝集素型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、またはH16のウイルスである、請求項３７に記載のウイルス。
【請求項３９】
ワクチンが交差防御をもたらす高病原性インフルエンザウイルスが、H5N1、H5N2、H5N8、H5N9、H7N3、H7N7、またはH9N2型のウイルスである、請求項３７または３８に記載のウイルス。
【請求項４０】
高病原性インフルエンザウイルス株に対して対象を免疫感作するためのワクチンを調製する方法であって、請求項２６から３８のいずれか一項に記載の再集合インフルエンザウイルスを、担体と、かつ場合によってはアジュバントと混合するステップを含む、方法。
【請求項４１】
ワクチンが、ワクチンを冷蔵庫内の温度で保存することを可能にする1つまたは複数の安定剤も含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ワクチンが、
（a）1つまたは複数の他のインフルエンザウイルス、ならびに/あるいは
（b）実質的に純粋なインフルエンザノイラミニダーゼタンパク質、および/またはインフルエンザ血球凝集素タンパク質
も含む、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
ワクチンが弱毒生ワクチンである、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ワクチンが経口投与または経鼻投与用に製剤される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
a）非病原性トリインフルエンザウイルスに由来する血球凝集素遺伝子、および
b）ドナー株に由来する他の遺伝子
を含む再集合インフルエンザウイルスを作製する方法であって、高病原性インフルエンザウイルスと同一の血球凝集素型を有する非病原性または低病原性のインフルエンザウイルスを、高病原性インフルエンザウイルスと異なる血球凝集素型を有するドナー株との再集合に供するステップを含む、方法。
【請求項４６】
再集合が古典的な再集合である、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本願は、2006年4月19日付のロシア特許出願第2006113251号の優先権を主張するものであり、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、インフルエンザウイルスに対するワクチンに、具体的には、高病原性トリインフルエンザウイルスに対するワクチンに関する。一実施形態において、本発明は、弱毒生経鼻ワクチンまたは不活化インフルエンザ非経口ワクチンの生産に有用なインフルエンザウイルス株を提供する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書において引用される、あらゆる特許または特許出願を含む全ての参考文献は、本発明の完全な理解を可能にするべく、参照により本明細書に組み込まれる。それでもなお、そのような参照は、これらの文献のいずれかが、オーストラリアまたは他のあらゆる国における、当技術分野において広く一般的な知識の一部を形成することの承認を構成するものであると解釈されるものではない。参考文献の補正はそれらの著者の主張を提示するものであり、本出願人は引用文献の正確性や適切性に異議を唱える権利を留保する。
【０００４】
アジアの家禽および野生の鳥において繰り返されている高病原性トリインフルエンザ（HPAI）H5N1ウイルスの発生は、依然として、ヒトの健康に対する汎発的な脅威である。血清型H5N1のHPAIウイルスは、ヒトにおいて呼吸器系の疾患を引き起こすものとして、1997年に香港で最初に確認され、その際、感染した家禽からのウイルスによって18件の確認されたヒトでの事例が生じ、そのうちの6件は死亡であった。2003年、H5N1ウイルスはヒトにおいて再び出現し、香港の2人の家族に感染して、その結果1人が死亡した。2003年後半から、家禽におけるかつてない数のHPAI H5N1の発生が、アジア、ヨーロッパ、およびアフリカの多くの国において生じており、その結果、香港、ベトナム、タイ、カンボジア、およびインドネシアにおいて220件を超えるヒトでの事例が検査で確認され、死亡率は50%を超えた。これまでのところ、感染は鳥または動物からヒトに伝わっている。恐らくは非常に近い血縁者間を除いて、ヒトからヒトへの顕著な伝染の事例は全く確認されていない。しかし、ウイルスがヒトからヒトへ渡る能力を得た場合、汎発が急速に生じ得る。
【０００５】
感染した鳥の屠殺および健康な鳥の予防接種による、多くの国の保健局、地域団体、および農業経営者の、家禽間でのトリインフルエンザの発生を封じ込めるための厳重な試みにも関わらず、発生が蔓延しヒトに伝染する可能性のある国がいくつか存在する。したがって、流行または汎発の危険性が依然として存在する。
【０００６】
流行性または季節性のインフルエンザAに対するワクチン接種に現在用いられている、インフルエンザウイルス亜型H1N1およびH3N2は、ほとんどの個体群が免疫を有していない亜型H5N1のウイルスにより生じる大規模な発生の場合には強い防御反応を生じさせることができない。
【０００７】
現在利用可能な、筋肉内不活化インフルエンザワクチン（IIV）は、比較的株特異的な血清中和抗体の誘導に効果的であるが、鼻の洗浄液における分泌型IgAの誘導にはあまり効果的ではない。逆に、経鼻的に（i.n.）送達された弱毒生インフルエンザワクチン（LAIV）は、全身性および粘膜性の免疫応答、ならびに細胞媒介性免疫を誘発する。粘膜性のIgA応答は異型での交差反応性を有することが示されているため、LAIVは異種の株に対してより広範な防御を示し得る。
【０００８】
1997年から、鳥からのHPAI H5N1ウイルスは急速に遺伝的進化をしている。ヒトから単離されたウイルスはこの遺伝的変異を反映しており、同時に抗原変異も有している。2004年から2005年のH5N1ウイルスは遺伝的に異なる2つのウイルスクレードを含んでいるが、その両方は2003年のヒトからの単離物とは抗原的に異なるものであり、前記単離物はまた、1997年にヒトから単離されたものと抗原的に異なるものであった。ヒトの疾患を引き起こすことが認められたならば、各H5N1抗原変異体に対して新たな候補ワクチン株が作製されなければならない。この抗原的多様性のため、抗原的に異なるH5N1ウイルスに対するより広範な交差防御免疫をもたらすワクチンが強く必要とされる。
【０００９】
多くの異なる戦略が、HPAI H5N1ウイルスに対するワクチン候補の作製に適用されており、前記戦略は、IIVを生産するための抗原的に関連する非病原性ウイルスの使用、および精製された組換え血球凝集素（HA）タンパク質の使用を含む。これらのアプローチは両方とも臨床的に評価され、次善の結果を示している。より最近では、鳥における病原性と関連する修飾された多塩基性の切断部位を有するHAおよびヒトワクチンドナー株に由来する内在遺伝子を有するワクチン再集合株の作製を可能にするように、逆遺伝学的技術が最適化されている。このアプローチによって、修飾されてはいるものの循環HPAI H5N1ウイルスにおいて見られるものと抗原的に密接な関係を有するHAタンパク質の含有が可能になる。
【００１０】
汎発への備えのためのLAIVの開発は、他のワクチン戦略よりも確実に有利である。LAIVはより広範な変異体に対する効果的な防御を提供し得るため、ワクチン株と循環ウイルスとの間の厳密な適合はさほど重要ではない。例として、アメリカ合衆国でのLAIVの臨床試験において、LAIVが、健康な就学前の子供においてインフルエンザA（H3N2）のドリフト変異体に対する非常に効果的な防御をもたらすことが示された。同様のデータがロシアでも得られている。LAIVの異型での効果は、少なくとも一部分は、IIVにより誘導されたものと比較して、気道において高いIgA抗体応答が誘導されることによるものであり得る。さらに、汎発の際にはワクチンが供給不足になるため、ワクチン生産の多様な選択肢は重要であり得る。
【００１１】
トリインフルエンザに対する多くの異なるワクチンが、臨床前の開発段階にあるかまたはヒトにおける臨床試験の段階にあるが、今までのところ1つのみがアメリカ合衆国において使用を認可されている。しかし、季節性ワクチンを受けた場合は標準的な季節性インフルエンザ株に対して75〜90%の防御があるのに対し、Sanofi-Aventis  SAにより生産されているこのワクチンは、ワクチン接種を受けた成人の54%においてしか防御免疫応答を誘発しない。この結果は、90μgという最も高い用量を2回投与された対象の45%のみが、ウイルスに対して防御的であると考えるのに十分な抗体レベルを生じたということを示した。
【００１２】
現在開発中のトリインフルエンザに対するワクチンのほとんどはHPAI H5N1株から調製されており、したがって、生存している病原性ウイルスをワクチンが含まないことを確実にするために、高レベルの封じ込め施設の使用および厳重な予防措置が必要である。これは実質的に、ワクチン開発の困難性およびコストの要因となっている。
【特許文献１】ロシア特許出願第2006113251号
【特許文献２】ロシア特許第2183672号
【特許文献３】ロシア特許第2248935号
【特許文献４】WO97/37000
【特許文献５】WO97/37001
【特許文献６】WO2005/10779
【特許文献７】米国特許第5989805号
【特許文献８】米国特許第5827738号
【特許文献９】米国特許第5833980号
【特許文献１０】米国特許第5866117号
【特許文献１１】米国特許第5874303号
【特許文献１２】WO91/03552
【特許文献１３】米国特許第5166057号
【特許文献１４】WO00/60050
【特許文献１５】WO01/04333
【特許文献１６】米国特許第6649372号
【特許文献１７】WO00/53786
【特許文献１８】米国特許第6485729号
【特許文献１９】WO90/14387
【特許文献２０】WO2005/10797
【特許文献２１】WO2006/04189
【特許文献２２】米国特許第4338335号
【特許文献２３】WO2006/04819
【特許文献２４】WO2005/014862
【特許文献２５】PCT/US03/12728
【特許文献２６】米国特許出願第20050186563号
【特許文献２７】PCT/US04/05697
【非特許文献１】Remington's Pharmaceutical Sciences、第20版、WilliamsおよびWilkins、ペンシルベニア州、アメリカ合衆国
【非特許文献２】Klimov A.I.、Cox N.J.、J. Viol. Method. 1995年、第55番、445〜446頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、トリインフルエンザに対してより高いレベルの防御を提供し得る別のワクチンが必要とされている。特に、安全で、投与量が少なく、かつ効果的な、H5N1インフルエンザに対するヒトワクチンの開発が、世界の人々の健康のために最も優先すべきことである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
第1の態様において、本発明は、非病原性または低病原性のインフルエンザウイルスに由来する血球凝集素遺伝子、およびドナー株に由来する他の遺伝子を含む再集合インフルエンザウイルスであって、非病原性または低病原性のインフルエンザウイルスが高病原性インフルエンザウイルスと同一の血球凝集素型を有する再集合インフルエンザウイルスを提供する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、非病原性または低病原性のインフルエンザウイルスはトリウイルスである。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ウイルスは、血球凝集素遺伝子のみが非病原性インフルエンザウイルスに由来する7：1の再集合体である。
【００１７】
第2の態様において、本発明は、高病原性インフルエンザウイルスに対するワクチンであって、
a）非病原性トリインフルエンザウイルスに由来する血球凝集素遺伝子を含む再集合インフルエンザウイルス、および
b）ドナー株に由来する他の遺伝子
を含むワクチンを提供する。
【００１８】
第3の態様において、本発明は、トリインフルエンザウイルス株に対して対象を免疫感作するためのワクチンを調製する方法であって、本発明の第1の態様によるインフルエンザウイルスを、担体と、かつ場合によっては1つもしくは複数の追加のインフルエンザウイルスおよび/またはアジュバントと混合するステップを含む方法を提供する。
【００１９】
第4の態様において、本発明は、高病原性インフルエンザウイルスによる感染に対して対象を防御する方法であって、本発明の第2の態様によるワクチンで対象を免疫感作するステップを含む方法を提供する。
【００２０】
第5の態様において、本発明は、高病原性インフルエンザウイルス株に対して対象を免疫感作するためのワクチンの製造における、本発明の第1の態様によるインフルエンザウイルスの使用を提供する。
【００２１】
第4および第5の態様において、ワクチンはLAIVまたはIIVであり得る。ワクチンがLAIVの場合、ワクチンは経口投与または経鼻投与用に製剤され得る。
【００２２】
本発明の第4および第5の態様の一実施形態において、ワクチンは、高病原性インフルエンザウイルス株に対する交差防御および/または交差反応性の免疫応答をもたらす。
【００２３】
本発明者は、古典的な再集合技術を用いて、抗原的に関連する非病原性トリインフルエンザH5N2および低温適応性の（ca）インフルエンザドナー株A/Leningrad134/17/57（H2N2、Len17）から、汎発性の7：1の候補H5再集合ワクチンを調製した。この候補ワクチンは、抗原的に異種のHPAI H5N1株に対する防御効果について評価されている。汎発性のH5ワクチン候補（Len17/H5）は、HAは非病原性A/Duck/Potsdam/1402-6/86（H5N2、Pot/86）ウイルスに、他の全ての遺伝子はLen17に由来する（7：1の再集合体）。Pot/86ウイルスはヒトから単離された1997 H5N1ウイルスに抗原的に類似している。本発明者は、この再集合ウイルスから調製されたLAVおよびIIVにより誘導される、または2003 H5N1ワクチン候補のHAおよびNAのドナーであった、他のH5N1株であるA/Hong Kong/213/2003（HK213）に対して作製されたIIVにより誘導される、H5交差反応性免疫および現存するH5N1株A/Vietnam/1203/2004（VN/1203）に対する防御効果を比較した。
【００２４】
Len17/H5は、インビトロにおいて、Len17 caドナー株と同様のca表現型およびts表現型を示し、孵化卵において高力価まで成長し、かつ1997年にヒトから単離されたH5N1ウイルスと抗原的に類似であった。本発明者は、本明細書において、再集合Len17/H5ウイルスが、LAIVまたはIIVとして用いた場合、マウスにおいて弱毒であり、ニワトリに対して非感染性であり、かつ異種のHPAI H5N1に対してマウスを効果的に防御することを示す。Len17/H5ワクチン候補はまた、IIVの生産に望ましい孵化卵における高成長特性を有していた。
【００２５】
LAIVとしては、Len17/H5の単回投与は気道における優れたH5ウイルス特異的IgA抗体応答を誘導し、一方、Len17/H5 IIVの単回投与は、HK/156ウイルスのHAに対するより良好な交差反応性の血清中和抗体応答およびIgG抗体応答を誘導した。驚くべきことに、LAIVまたはIIVとして単回投与したLen17/H5は、マウスにおいて、関連するH5N1ウイルスおよび抗原的に異なるH5N1ウイルスの両方に対する防御免疫を誘発した。
【００２６】
これらの結果は、ワクチン株の作製のために逆遺伝学的技術、生物学的安全性のための厳重な予防措置、または正確な抗原的適合を必要としない汎発性ワクチン戦略が、それでもなお、汎発の初期段階において異種ウイルスに対する防御を提供し得ることを示唆している。従来の再集合法によりLen17/H5ワクチン株を生成するための非病原性H5ウイルスの使用は、研究所の封じ込め能力またはHPAI H5ウイルスからワクチン株を誘導するために必要な特許された逆遺伝学的技術の利用が制限されている国においては有利であろう。本発明による再集合ウイルスは古典的な方法により生産され得、したがって、逆遺伝学的戦略を用いる必要性を避けることができる。さらに、Len17/H5で予防接種されたニワトリにおけるウイルス複製またはウイルス特異的抗体の誘導の欠如は、非病原性H5再集合ワクチン株の大規模な製造が家禽産業に対していかなる脅威ももたらさないであろうことを示唆している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
ワクチンが交差防御をもたらす高病原性インフルエンザウイルスは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、またはH16を含む、あらゆる血球凝集素型のウイルスであり得る。
【００２８】
高病原性インフルエンザウイルスは、限定はしないがH5N1、H5N2、H5N8、H5N9、H7N3、H7N7、およびH9N2を含む、あらゆる亜型のウイルスであり得る。
【００２９】
あらゆる非病原性または低病原性のインフルエンザウイルスは、それが高病原性インフルエンザウイルスと同一の血球凝集素型を有する場合に使用し得る。いくつかの実施形態において、非病原性または低病原性のインフルエンザウイルスはトリウイルスである。一実施形態において、非病原性または低病原性のトリインフルエンザウイルスは、A/Duck/Potsdam/1042-6/86（H5N2）、A/Vietnam/1194/04（H5N1）、A/Duck/Singapore/97（H5N3）、A/Duck/Hokkaido/67/96（H5N4）、またはA/Mallard/Netherlands/12/00（H7N3）である。
【００３０】
非病原性または低病原性のトリインフルエンザウイルスは、限定はしないがニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ハクチョウ、および他の水鳥を含む、あらゆる野生のまたは飼育された鳥から単離され得る。
【００３１】
ドナー株は、非病原性インフルエンザウイルスとは異なる血球凝集素型の株であるべきであるが、それは、もしそれが同一の血球凝集素型の株であれば、再集合体の同定が非常に困難であるからである。いくつかの実施形態において、ドナー株はH2N2型またはH1N1型の株である。
【００３２】
安全上および制御上の観点から、完全に特徴付けられているワクチン株であるドナー株を用いることが有利であり、いくつかの実施例において、これは低温適応性または温度感受性の株であり得る。いくつかの実施形態において、ドナー株は低温適応性であり、かつ温度感受性である。
【００３３】
適したドナー株は、
A/Leningrad/134/17/57（H2N2）、
A/Leningrad/134/47/57（H2N2）、
A/Leningrad/134/17/K7/57（H2N2）、
A/Moscow/21/65（H2N2）、
A/Moscow/21/17/65（H2N2）、
A/Ann Arbor/6/60（H2N2）、
A/Puerto Rico/8/34（H1N1）、
A/Puerto Rico/8/59/1（H1N1）
を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本発明の第1の態様は、低温適応性の弱毒化ドナーとしてA/Leningrad/134/17/57（H2N2）を用い、かつ表面抗原の源としてトリインフルエンザの非病原性A/Duck/Potsdam/1402-6/86（H5N2）ウイルスを用いる、インフルエンザウイルスワクチン株の新規な抗原変異体を対象とする。弱毒化ドナーA/Leningrad/134/17/57（H2N2）は、ロシアにおいて成人および子供に対する経鼻インフルエンザワクチンの生産を認可された、インフルエンザウイルスの低温適応性かつ温度感受性の株である（Alexandrova、1986年）。
【００３５】
例えば、ワクチン株A/17/New Caledonia/99/145（H1N1）（2002年6月20日に公開されたロシア特許第2183672号）およびA/17/Panama/99/242（H3N2）（2005年3月20日に公開されたロシア特許第2248935号）はまた、弱毒化ドナーとしての使用にも適している。
【００３６】
本発明者は、指定のインフルエンザウイルスA/PR/8/59/1である低温適応性の原ドナー株を調製した。これは、本発明者の他の原ドナー株インフルエンザウイルスA/Len/134/47/57（H2N2）と同様、PB2遺伝子、PA遺伝子、NA遺伝子、およびM遺伝子に突然変異を有しており、本発明者は、LAIVおよび不活化ワクチンにおいて用いるために、この株を、インフルエンザウイルスA/F/2/82（H3N2）およびA/Len/234/84（H1N1）といった再集合体を開発するために用いた（Alexandrova、1989年）。
【００３７】
上述したLeningrad株およびMoscow株は低温適応性および温度感受性であり、ロシアにおいてLAIVの生産に広く用いられている。PR株およびAnn Arbor株はそれぞれ、アメリカ合衆国においてIIVおよびLAIVの生産に用いられている。
【００３８】
再集合のためのウイルスはあらゆる適切な宿主において成長させ得る。ニワトリの孵化卵における成長は非常に広く用いられている。あるいは、ウイルスは細胞培養物において成長し得る。イヌのMadin-Darby腎細胞（MDCK細胞）、ベロ細胞（アフリカミドリザル腎細胞）、BHK（ハムスターの新生児の腎臓）細胞、初期の幼鶏の腎（PCK）細胞、ウシのMadin-Darby腎（MDBK）細胞、293細胞（例えば293T細胞）、およびCOS細胞（例えばCOS1細胞またはCOS7細胞）といった哺乳動物細胞系を含む多種多様な宿主細胞が適している。例えば、WO97/37000、WO97/37001、およびWO2005/10779を参照。PBS-1細胞（HepaLIfe Technologies, Inc）によりトリインフルエンザウイルスが優れた収量で得られることが報告されている。米国特許第5989805号（「Immortal Avian Cell Line To Grow Avian and Animal Viruses To Produce Vaccines」）、米国特許第5827738号、米国特許第5833980号、米国特許第5866117号、および米国特許第5874303号を参照。EBx（商標）細胞（Vivalis、ナント、フランス）などのトリ細胞系、またはニワトリの線維芽細胞もまた使用可能である。
【００３９】
再集合体は、Ghendonら（1984年）によるものなどの従来の方法によって調製し得るか、または、WO91/03552および米国特許第5166057号で開示されている逆遺伝学的方法により調製し得る。プラスミドに基づいた逆遺伝学的技術は、WO00/60050、WO01/04333、および米国特許第6649372号で開示されており、アンチセンス法はWO00/53786で開示されている。
【００４０】
ワクチンは、限定はしないが、弱毒生ワクチン（LAIV）、不活化ワクチン（IIV、死滅ウイルスワクチン）、サブユニット（スプリットワクチン、サブビリオンワクチン）、精製タンパク質ワクチン、またはDNAワクチンを含む、あらゆる種類のワクチンであり得る。これらのタイプのワクチンの全ての生産方法は、当技術分野において非常によく知られている。
【００４１】
いくつかの実施形態において、ワクチンは弱毒生ワクチン（LAIV）であり、経鼻投与に適した製剤となり得る。
【００４２】
ワクチンはまた、
（a）1つまたは複数の追加のインフルエンザウイルス、ならびに/あるいは
（b）実質的に純粋なインフルエンザノイラミニダーゼタンパク質、および/またはインフルエンザ血球凝集素タンパク質
も含み得る。
【００４３】
他のインフルエンザウイルスは、従来のインフルエンザワクチンに用いられている類の現在の季節性株であり得る。例えば、2つのA型株および1つのB型株を、本発明のウイルスに加えて使用し得る。一実施形態において、ノイラミニダーゼタンパク質および血球凝集素タンパク質はグリコシル化した成熟タンパク質であり、例えば米国特許第6485729号に記載されているように、インフルエンザビリオンから単離され得るかまたは組換え法により生産され得る。
【００４４】
ワクチンはまた、場合によってアジュバントを含む。ヒトに対するこれまでのインフルエンザワクチンにおいて用いられている適切なアジュバントには、ミョウバン、MF59（5%スクアレン、0.5%Tween80、0.5%Span85、WO90/14387を参照）などの油乳剤組成物、ISCOMなどのサポニン、またはCRL1005（Katzら、2000年）などのブロック共重合体、およびAmpligen（登録商標）（Hemisperx Biopharma, Inc）などの二本鎖RNAが含まれる。インフルエンザワクチンと共に用いるためのアジュバントはまた、WO2005/10797およびWO2006/04189において論じられている。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、IgG応答、IgA応答、および/またはT細胞応答を誘発する。他の実施形態において、ワクチンは、IgA、IgG、およびT細胞の応答を誘発する。
【００４６】
適切な担体は当技術分野で周知である。本発明によるLAIVのいくつかの実施形態において、担体はワクチンを冷蔵庫内の温度で保存することを可能にするものであるため、ワクチンの凍結乾燥は必要ない。このような製剤はインフルエンザを含む様々なウイルスについて知られており、典型的には、糖、アミノ酸、および緩衝液を含み、また、ゼラチンもしくはカゼインといったタンパク質またはその誘導体も含み得る。例えば、米国特許第4338335号、Yannarellら（2002年）、IkizlerおよびWright（2002年）、WO2006/04819、およびWO2005/014862を参照。
【００４７】
いくつかの実施形態において、ワクチンが交差防御をもたらす高病原性インフルエンザウイルスは、血球凝集素型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、またはH16のウイルスである。いくつかの実施形態において、ワクチンが交差防御をもたらす高病原性インフルエンザウイルスはH5N1、H5N2、H5N8、H5N9、H7N3、H7N7、またはH9N2型のウイルスである。
【００４８】
本発明のワクチンはヒトの医療的処置における使用に適していると特に考えられる一方で、それらはまた、ヒト以外の霊長類またはサルの治療を含む動物の治療にも適用可能である。
【００４９】
ワクチンの調製のための方法および薬学的担体は当技術分野で周知であり、Remington's Pharmaceutical Sciences、第20版、WilliamsおよびWilkins、ペンシルベニア州、アメリカ合衆国などのテキストに記載されている。
【００５０】
本発明の化合物および組成物はあらゆる適切な経路により投与し得、当業者は、治療する状態に最も適した経路および用量を容易に決定し得よう。免疫感作に用いる用量はとりわけ、個々のワクチン、免疫感作の経路、およびレシピエントの年齢に依存し、通常の臨床試験の過程において容易に決定し得る。季節性インフルエンザワクチンで用いる用量を指針として用い得る。
【００５１】
担体または希釈剤および他の賦形剤は投与経路に依存し、ここでも、当業者は、それぞれの事例に最も適した製剤を容易に決定し得よう。
【００５２】
現在用いられている最も一般的なインフルエンザワクチンは、全ウイルス粒子（ビリオン）、脂質を溶解する物質での処理に供したビリオン（「スプリット」ワクチン）、または精製されたウイルス糖タンパク質（「サブユニットワクチン」）を含み得る、不活化ワクチンである。これらの不活化ワクチンは、主に、血球凝集素に対する抗体の生産を誘発することにより防御を行う。突然変異によるインフルエンザウイルスの抗原進化により、HAおよびNAが変化する。結果として、これらの不活化ワクチンのみが、同一のまたは交差反応性のエピトープを含む表面糖タンパク質を有する株に対して防御を行う。
【００５３】
抗原性の十分な範囲をもたらすために、従来のワクチンはいくつかのウイルス株からの構成要素を含む。それらは通常、2つのA型株および1つのB型株を含む。ワクチンにおいて用いるための株の選択は、それぞれの年について毎年再調査されており、世界保健機関およびアメリカ合衆国の食品医薬品局（FDA）により提供される推奨を前提としている。これらの推奨は国際的な疫学的見解を反映している。ウイルス株は、イギリスのロンドンにある国立生物学的製剤研究所、イギリスのロンドンにある国際インフルエンザセンター、アメリカ合衆国のアトランタにある疾患対策センター、およびアメリカ合衆国のワシントンにある生物製剤評価研究センターといった供給源から入手し得る。
【００５４】
インフルエンザのビリオンは、一本鎖RNAゲノムを含む内部のリボ核タンパク質核心（らせん状のヌクレオカプシド）、および内側が基質タンパク質（M）で覆われている外部のリポタンパク質エンベロープで構成される。インフルエンザAの断片化ゲノムは、線状で、マイナス極性で、一本鎖の、8分子のRNAで構成され、前記RNAは、ヌクレオカプシドを形成する、RNA依存性RNAポリメラーゼタンパク質（PB2、PB1、およびPA）および核タンパク質（NP）と、基質タンパク質（M1、M2）と、リポタンパク質エンベロープから突出している2つの表面糖タンパク質である血球凝集素（HA）およびノイラミニダーゼ（NA）と、機能が未知の非構造タンパク質（NS1およびNS2）とを含む、10個のポリペプチドをコードする。ゲノムの転写および複製は核内で起こり、組み立ては原形質膜上での発芽を経て生じる。エンベロープの糖タンパク質である血球凝集素は感染の際の細胞の付着および侵入に関与する。エンベロープの糖タンパク質であるノイラミニダーゼは、宿主細胞からの娘ウイルスの粒子の放出に必要である。2つ以上の異なる株のウイルスが単一の宿主細胞または宿主生物に感染する場合、インフルエンザウイルスは遺伝子を再集合し得る。
【００５５】
2つの主要な表面糖タンパク質であるHAおよびNAは高免疫原性であり、免疫を有するまたは部分的に免疫を有する個体群において持続的かつ連続的な進化を受けている。NAがワクチン内または無傷のビリオン上において免疫原性の形態で存在する場合、NAは少数の構成要素であり、したがって、免疫優勢なHAとの継続的な抗原競合では補助的である。HAにより誘導される抗体はウイルスの感染性を直接中和する。NAに対する抗体は、中和はしないが、複数サイクルの感染におけるウイルス複製を制限し、かつ、病原性の閾値未満にウイルス複製を減少させ得る。しかし、NAが十分量で存在する場合、NAはHAを相乗的に増強し得る。従来の不活化インフルエンザウイルスを含むワクチンにおいてHAおよびNAが個別の精製タンパク質として存在することにより、HAとNAとの間の抗原競合が完全にまたは実質的に消え得るということが、米国特許第6485729号において報告されている。
【００５６】
生インフルエンザワクチン（LIV）の調製に現在用いられているワクチン株は、現存する流行インフルエンザウイルスを低温適応性の（ca）インフルエンザウイルスドナー株と再集合させて、混合した遺伝子を有する再集合体を作製するという方法により得ることができる。血球凝集素（HA）およびノイラミニダーゼ（NA）をコードする遺伝子は流行株から受け継がれ、一方、内部タンパク質および非構造タンパク質（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）をコードする6つの遺伝子は、無害のHA弱毒化ドナーに由来する。したがって、これらの従来のワクチン株は6：2の再集合体である。
【００５７】
定義
インフルエンザは、インフルエンザウイルスにより生じる急性の高感染性疾患である。感染は気道を介して生じ、季節性株の再生は通常は非常に急速である。しかし、特に高齢者または衰弱した患者においては、二次感染により重篤な合併症が生じ得る。自然免疫がほとんどまたは全く存在しない流行性または汎発性の株により、若い個体および健康な個体においてさえも劇症型の感染が生じ得る。唯一の利用可能な治療薬は、ノイラミニダーゼ阻害剤であるザナミビル（リレンザ（登録商標）、SmithKline Glaxo）およびオセルタミビル（タミフル（登録商標）、Roche）、効果が低いアンダマンタジンである。その結果、疾患の制御は免疫感作に頼ることになる。
【００５８】
インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルスであり、3つの既知の型が存在する。インフルエンザAは、ヒトにおいて季節性、流行性、または汎発性のインフルエンザを生じさせ、また、鳥、ブタ、およびウマにおいて家畜伝染病を生じさせ得る。インフルエンザBおよびCは、通常は子供および若年成人の間における散発性の発生と関連する。インフルエンザウイルスは、HA抗原およびNA抗原における抗原性の差異に基づいて複数の株または亜型に分けられる。各ウイルスはその型（A、B、またはC）、株が最初に単離された動物（ヒトではない場合にのみ指定される）、最初に単離された場所、株の番号、単離された年、ならびに特定のHA抗原およびNA抗原（同定のための数字と共に、それぞれHおよびNにより指定される）により指定される。
【００５９】
「トリインフルエンザ」（AI）は、アヒル、ガチョウ、およびハクチョウといった野生の鳥の間で自然に生じるインフルエンザAウイルスによるものである。1983年から1984年のペンシルベニアでの家畜伝染病までは、AIは悪性の疾患であるとは考えられていなかった。
【００６０】
「低病原性トリインフルエンザ」（LPAI）は鳥において一般的なものであり、ほとんど問題は生じない。野生の鳥、主に水鳥および海岸に棲息する鳥は、ウイルスの低病原性株（LPAI）の自然な保有宿主である。保有宿主である鳥は典型的にはLPAIウイルスによる臨床的徴候を全く示さないが、ウイルスは、飼育されているニワトリ、シチメンチョウ、およびアヒルにおける疾患の発生を生じさせ得る。
【００６１】
「非病原性トリインフルエンザ」は、感受性の鳥に感染し得るトリインフルエンザウイルス株により生じるが、疾患の症状または疾患の発生は生じさせない。
【００６２】
「高病原性トリインフルエンザ」（HPAI）は、感染した鳥の突然の発病、重篤な疾病、および短時間での死亡に特徴を有し、100%に達する死亡率を有する。HPAIは、家禽および他の鳥において生じる、悪性で高伝染性のウイルス性疾患である。それは、1900年代の初めにイタリアで最初に同定された。まれに、高病原性トリインフルエンザは、通常は感染した鳥との直接の接触によって、ヒトおよび他の動物に広がり得る。トリインフルエンザのLPAI株およびHPAI株は、それらの相対的な複製率、感染性、および死亡率により容易に区別し得る。HPAIは顕著に高い複製率を有し、ニワトリなどの感受性の鳥に一定に感染し、感染した感受性の鳥を、感染後およそ6日以内に死亡させる。例えば、Van der Goot、Kochら（2003年）、Van der Goot、de Jongら（2003年）を参照。
【００６３】
H5亜型またはH7亜型であるウイルスのみが高病原性トリインフルエンザウイルスであると知られている。それらは、飼育されている鳥にとって、およびヒトに感染する能力について最も懸念されている2つの株である。HPAIウイルスは、自由棲息の鳥から広がった後にニワトリおよびシチメンチョウに感染するLPAI H5またはLPAI H7ウイルスから生じると考えられている。現在のところ、全てのH5ウイルスおよびH7ウイルスがこの能力を有していること、および悪性への突然変異が無作為に生じることが推定されている。
【００６４】
例えば、インフルエンザウイルス株H5N1は高病原性であり、飼育されている家禽にとって致命的であり、鳥からヒトへ伝染し得る。HPAIに対するヒトの免疫は存在せず、利用可能なワクチンはない。
【００６５】
汎発性インフルエンザは、重篤な疾病の世界的な発生または汎発を生じさせる、悪性のヒトインフルエンザである。インフルエンザAウイルスは、血球凝集素およびノイラミニダーゼの両方の抗原性に大きな変化を与える遺伝的変化を受け得る。これは抗原シフトとして知られている。抗原シフトは、インフルエンザAが動物およびヒトに感染し得るという事実により生じるものであると考えられる。異なる種の株が単一の宿主に感染する混合感染により再集合が行われ得、その結果、ヒトの個体群が完全に感受性である新たなインフルエンザウイルスが生じ、インフルエンザの汎発が起こり得る。自然免疫がほとんどないため、疾患は容易に人から人へ広がり得る。最も深刻なインフルエンザの汎発は、1918年（「スペイン風邪」）、1957年（「アジア風邪」）、および1968年（「香港風邪」）に生じた。1918年のインフルエンザの汎発により世界中の人々のおよそ5000万人から1億人が死亡し、1957年の汎発では200万人が死亡し、1968年の発生ではおよそ100万人が死亡した。
【００６６】
季節性のまたは通常のインフルエンザ（流行間期のインフルエンザ） は、人から人に容易に伝染し得る呼吸器系の疾病である。ほとんどの人はいくらかの免疫を有しており、ワクチンが利用可能である。これらは、生の、弱毒化ワクチン、死滅ウイルス（不活化ワクチン）、またはサブユニット（「スプリットウイルス」）ワクチンであり得る。他のタイプのワクチンは臨床試験の段階にある。抗原ドリフトとして知られている、血球凝集素またはノイラミニダーゼの抗原性におけるわずかな変化は頻繁に生じる。個体群はウイルスに対してもはや完全に免疫ではなくなり、インフルエンザの季節性の発生が生じる。これらの抗原性の変化により、インフルエンザワクチンの毎年の再製剤も必要となる。
【００６７】
「再集合」インフルエンザウイルスは、2つ以上のインフルエンザウイルス株に由来する遺伝子を有するものである。通常は、2つのインフルエンザウイルス株、すなわち、原ドナーウイルス（MDV）（原株、MSとしても知られている）と、免疫感作の標的である株とを用いる。通常は、再集合ウイルスは、孵化卵または組織培養物である宿主細胞の混合ウイルス感染からウイルス粒子をスクリーニングすることにより得られる。より最近では、逆遺伝学による再集合の方法が開発されている。
【００６８】
再集合体は従来、各ドナーおよび標的ウイルスに由来する遺伝子の数に準拠して記載される。標的遺伝子に由来する遺伝子は通常、HAおよびNAとなる。したがって、6：2の再集合体は、標的ウイルスからのHA遺伝子およびNA遺伝子という2つの遺伝子と、MSからの他の全ての遺伝子を有する。本発明の第1の態様の一実施形態による7：1の再集合体は、標的の高病原性ウイルスと同じ型の1つのHA遺伝子と、MSからの他の全ての遺伝子とを有する。
【００６９】
再集合、すなわち再集合体の生産は通常、通常は卵または細胞培養物において、異なるウイルスからの遺伝子断片を混合することを含む。したがって、従来の、特定の年の推奨ワクチン株を反映している毎年の三価ワクチンは、6：2の遺伝的再集合のプロセスにより調製される。例えば、6：2のワクチン株は、関連するA株またはB株の原ドナーウイルス（MDV）と目的の循環インフルエンザ株とのインビトロでの重複感染、および適切な再集合体の抗体媒介性の選択により生産される。6：2の標的再集合体は循環株からのHA遺伝子およびNA遺伝子と、卵における良好な成長について通常は選択されるMDVからの残りの遺伝子とを含む。再集合体は原ドナーウイルスの表現型特性を維持している。したがって、2つのウイルス型の間の再集合は、とりわけ、一方の断片では野生型エピトープ株を含み、他方の断片では低温適応性の弱毒株を含むウイルスを生産するために用い得る。
【００７０】
インフルエンザウイルス株の再集合のための方法は当業者に周知である。例えば、低温適応性のMDVおよび野生型ウイルスの希釈物、例えば、各溶液の濃度は問わないがそれぞれの1：5の希釈物を混合し、次に25℃および33℃で24時間および48時間インキュベートする。インフルエンザAウイルスおよびインフルエンザBウイルスの両方の再集合は、細胞培養物および卵の両方において再集合ウイルス株を生産するために用いられている。Wareingら、2002年を参照。インフルエンザ株の再集合はまた、プラスミド構築物によっても行われている。2003年4月25日に出願されたPCT/US03/12728、2005年5月20日に出願された米国特許出願第20050186563号を参照。
【００７１】
残念ながら、所望の再集合体を調製するために数多くの再集合を実施する必要がある場合がある。再集合の後、所望の再集合体を見出すためにウイルスを選択し得る。次に、所望の再集合体をクローニングしてそれらの数を増やすことができる。あるいは、典型的には細胞培養物内への株の重複感染の後に、ここでもまた典型的には細胞培養物において、選択およびクローニングを同時に行い得る。再集合のプロセスは、必要な再集合の数を減らすために、ひいてはワクチン生産プロセスの処理量または安定性を向上させるなどのために、最適化することができる。このような最適化技術は、典型的には細胞培養物、例えばCEK細胞内において実施される。例えば、2004年2月25日に出願された国際特許出願PCT/US04/05697を参照。卵における再集合体の収量が少ない場合、例えばRudnevaら（2007年）に記載されているように、卵における連続継代により、この環境において成長するよう容易に再集合体を適応させることができる。
【００７２】
「交差防御免疫応答」は、応答を誘発するために用いるものと同一ではないインフルエンザウイルス株による感染を防御するものである。
【００７３】
「アジュバント」は、細胞または体液のレベルで免疫応答を増大させ、刺激し、活性化し、増強し、または調節する物質である。
【００７４】
アジュバントは、免疫応答を向上させるために、ワクチンに添加され得るかまたは抗原を投与する前に投与され得、その結果、免疫応答を生じさせるために必要なワクチンが少なくなる。広く用いられているアジュバントには、ミョウバン、Quil Aなどのサポニンを含むISCOM、リポソーム、および、カルメット・ゲラン菌（BCG）、コリネバクテリウムパルバム（Corynebacterium parvum）、または細菌抗原を含むマイコバクテリアのペプチドといった物質が含まれる。他のアジュバントには、限定はしないが、アルミニウム塩およびモノホスホリル脂質Aで構成されている専売アジュバントAS04（GlaxoSmithKline）と、例えば血球凝集素、オクタデシルアミン、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド、N,N-ジオクタデシル-n'-N-ビス（2-ヒドロキシエチルプロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびpluronicポリオールといった界面活性剤と、例えばピラン、硫酸デキストラン、ポリイノシンシトシン、ポリアクリル酸、およびカルボポールといったポリアニオンと、例えばムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、およびタフトシンといったペプチドと、油乳剤と、それらの混合物とが含まれる。これらのうちのいくつかは現在、ヒトまたは動物での使用を認可されている。他は臨床試験の段階にある。
【００７５】
本発明の明細書および後の特許請求の範囲において、文言または必要な含意により文脈上別段の解釈を必要とする場合を除き、「含む（comprise）」という語、または「含む（comprises）」もしくは「含んでいる（comprising）」といった変形は包含的な意味で用いられ、すなわち、言及されている特徴の存在を特定するが、本発明の様々な実施形態におけるさらなる特徴の存在または追加を排除するものではない。
【００７６】
本明細書において用いる場合、文脈上明確に別段の指定がない限り、単数形「1つの（a、an）」および「その（the）」は対応する複数形への言及を含む。したがって、例えば、「1つの酵素」という言及は複数のそのような酵素を含み、「1つのアミノ酸」という言及は1つまたは複数のアミノ酸についての言及である。
【００７７】
値の範囲が表されている場合、この範囲が範囲の上限および下限ならびにこれらの限界の間の全ての値を包含することは明確に理解されよう。
【００７８】
略語
本明細書において用いられる略語は以下の通りである。
CA  低温適応性
EID50  卵50%感染量
ELISA  酵素結合免疫吸着アッセイ
HA  血球凝集素
HAI  血球凝集素阻害
HAU  血球凝集素単位
HPAI  高病原性トリインフルエンザA
HK/156  インフルエンザウイルスA/Hong Kong/156/97
HK/213   インフルエンザウイルスA/Hong Kong/213/03
HK/483   インフルエンザウイルスA/Hong Kong/483/97
IIV  筋肉内不活化インフルエンザワクチン
i.n.  経鼻
i.m.  筋肉内
i.v.  静脈内
LAIV  弱毒生インフルエンザワクチン
LD50  50%致死量
LIV  生インフルエンザワクチン
LPAI  低病原性トリインフルエンザA
Len17  インフルエンザウイルスA/Leningrad/134/17/57
MID50  マウス50%感染量
MS  原株
MDV  原ドナーウイルス
NA  ノイラミニダーゼ
PBS  リン酸緩衝生理食塩水
Pot/86  インフルエンザウイルスA/Duck/Potsdam/1402-6/86
PCR  ポリメラーゼ連鎖反応
p.i.  感染後
ts  温度感受性
【００７９】
本明細書に記載されている特定の材料および方法は変化し得るものであるため、本発明がそれらに限定されないということは明確に理解される。また、本明細書において用いられる専門用語は特定の実施形態のみを記載する目的のものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定する目的のものではないということも理解される。
【００８０】
別段の定義がない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されているものと同様の意味を有する。本明細書において記載されているものと類似または同等のあらゆる材料および方法が本発明の実施または試験に用いられ得るが、好ましい材料および方法を記載する。
【００８１】
本研究において用いられた野生型H5N1ウイルスは、A/Hong Kong/156/97（HK/156）、A/Hong Kong/483/97（HK483）、およびA/Hong Kong/213/03（HK213）である。
【００８２】
ウイルスは、10日齢の鶏の孵化卵の尿膜腔において、34℃で2日間（Len17/H5、Len17、およびPot/86）または37℃で26〜28時間（HK/156、HK/1483、およびHK/213）増殖させた。尿膜腔液を予防接種の26時間後（H5N1ウイルス）または48時間後（Len17/H5およびLen17）に回収した。ウイルスストックをアリコートに分け、使用するまで-70℃で保存した。卵50%感染量（EID50）の力価を卵における連続的なウイルス力価測定により決定し、ReedおよびMuench（1938年）の方法により計算した。
【００８３】
これから、以下の非限定的な実施例および図面のみを参照して本発明を詳細に記載する。
【実施例１】
【００８４】
再集合株の調製
弱毒化ドナーA/Leningrad/134/17/57（H2N2）と現存する流行ウイルスH1N1およびH3N2とに由来する再集合株の生産に用いるものと類似の戦略を用いて、トリインフルエンザウイルス亜型H5N2の表面抗原を含むワクチン株を開発した。
【００８５】
発育段階の幼鶏の胚における非病原性トリウイルスA/17/Duck/Potsdam/1402-6/86（H5N2）と低温適応性かつ温度感受性の原ドナー株A/Leningrad/134/17/57（H2N2）との古典的な遺伝的再集合方法によりA/17/Duck/Potsdam/86/92（H5N2）を得、その後、弱毒化ドナー株に対する抗血清の存在下でA/Leningrad/134/17/57（H2N2）弱毒化ドナー株を選択した。
【００８６】
再集合株のゲノムをPCR制限分析（Klimov A.I.、Cox N.J.： J. Virol. Method. 1995年、第55番、445〜446頁）により分析し、個別の遺伝子の部分的または完全なDNAの配列決定を実施した。これにより、再集合A/17/Duck/Potsdam/86/92（H5N2）がそのHA遺伝子を亜型H5N2の親トリウイルスから受け継いでいる一方、NA遺伝子および非グリコシル化タンパク質をコードする6つの遺伝子はA/Leningrad/134/17/57（H2N2）弱毒化ドナーから受け継いでいることが明らかになった。したがって、これは、6：2の再集合体である従来のワクチン株とは異なり、7：1の再集合体である。この再集合体はLen17/H5と指定された。
【００８７】
血球凝集素阻害反応（HAI）を用いて、再集合体の血球凝集素型が、親株である野生型A/Duck/Potsdam/1402-6/86（H5N2）と同一であるということを確認した。株は温度感受性であり（力価の差は33℃および40℃で6.8logEID50/ml）、低温適応性である（力価の差は33℃および25℃で3.1logEID50/ml）。
【００８８】
したがって、本発明によるA/17/Duck/Potsdam/86/92（H5N2）ワクチン株は、
（a）野生型A/Duck/Potsdam/1402-6/86（H5N2）ウイルスの血球凝集素の抗原特異性、
（b）再集合ワクチン株に必要なゲノム構造、
（c）原ドナー株に典型的な弱毒化に関連する温度感受性および低温適応性
という、ワクチン株に必要な有用な特性の組み合わせを有する。
【００８９】
再集合株のサンプルは、2006年2月10日に登録番号2389でロシア国立ウイルス収集機関（Russian State Collection of Viruses）に寄託されている。株の形態は、インフルエンザウイルスに典型的であるように、多様である。
【実施例２】
【００９０】
再集合株の評価
33℃で48時間インキュベートした発育段階のニワトリの胚における複製によって評価した感染活性は、9.3logEID50/mlであった。血球凝集素の力価は1：512であった。株の生物学的特性の遺伝的安定性を、フェレットに経鼻継代接種した後に明らかにした。再集合株A/17/Duck/Potsdam/86/92（H5N2）の特徴は以下のようにまとめられる。
【００９１】
1.株名： A/17/Duck/Potsdam/86/92（H5N2）
2.シリーズ：シリーズ1
3.生産方法：再集合、
親ウイルス： 
A/Duck/Potsdam/1402-6/86（H5N2）流行ウイルス
A/Leningrad/134/17/57（H2N2）弱毒化ドナー
4.組換えプロセスにおける継代の数：7
5.凍結乾燥前の株の特徴：
生産のための最適なインキュベーション条件：33℃、48時間、
血球凝集素活性1：512、
感染活性8.5±0.3logEID50/0.2ml、
血清阻害剤に対する感受性：33℃および40℃での感染活性における阻害剤耐性の差：6.8logEID50/ml、
33℃および25℃での感染活性における差：3.1logEID50/ml、
再構築物のゲノム構造：
非病原性トリインフルエンザからの遺伝子：HA
弱毒化ドナーからの遺伝子：PA、PB1、PB2、NP、M、NS、NA
6.凍結乾燥後の株の特徴：
凍結乾燥の日付：2005年11月24日、
フラスコ当たりの材料の量：1ml、
連続投与回数：4
感染活性：7.5logEID50/0.2ml、
血球凝集素の力価：1：256、
7.ワクチン接種での推奨される希釈1：2
8.抗原特異性：
血球凝集素：ラット抗血清を用いてHAIにより評価したところA/17/Duck/Potsdam/86/92（H5N2）ウイルスと同一
ノイラミニダーゼ：配列決定により評価したところA/Leningrad/134/17/57（H2N2）ウイルスと同一
9.皮下投与または経鼻投与後のマウスに対する安全性：無害
10.凍結乾燥した材料の細菌学的制御：2005年11月30日に殺菌
11.外来ウイルスの制御：外来ウイルスはない。
【実施例３】
【００９２】
ニワトリにおける候補ワクチン株の病原性
ニワトリへのA/17/Duck/Potsdam/86/92（H5N2）株の経鼻投与および静脈内投与の効果を評価した。0.2mlのワクチンウイルスの静脈内投与は無害であり、試験した8羽の鳥のいずれにおいても疾患の症状は見られなかった。0.5mlのワクチンウイルスの経鼻投与では、疾患の症状は見られなかった。表１に示すように、ウイルスは口腔咽頭および排泄腔のぬぐい液からは分泌されておらず、試験した5羽の鳥のいずれにおいてもセロコンバージョン（血清転換）を誘導しなかった。
【００９３】
したがって、再集合体A/17/Duck/Potsdam/86/92（H5N2）は、ニワトリに対して高いレベルの弱毒化を示し、このことは、この株が卵におけるワクチンの製造およびニワトリにおける使用に安全であることを示している。
【００９４】
【表１】
2009533477.tif 000003
【実施例４】
【００９５】
マウスにおける候補ワクチン株の病原性および防御効果
株A/17/Duck/Potsdam/86/92（H5N2）は安全であり、免疫原性であり、かつ、マウスに経鼻投与するとその後の亜型H5N1の高病原性ウイルスの感染に対して効果的である。
【００９６】
再集合株A/17/Duck/Potsdam/86/92（H5N2）の安全性および免疫原性を、6〜7logEID50の経鼻投与を用いてBALB/cマウスにおいて研究した。表２に示すように、再集合体はマウスに弱毒であり、肺組織（1.8logEID50/ml）よりも鼻腔（3.5logEID50/ml）においてより効果的に複製した。
【００９７】
【表２】
2009533477.tif 000004
【００９８】
実験動物の血清における液性免疫応答を、調製物を投与した28日後に評価した。免疫酵素アッセイを用いて、亜型H5N1のウイルスに対する、HK/213の全ウイルスに対する、およびHK/483ウイルスの精製組換えHAに対する特異的IgGおよびIgAの存在を検出した。これらの結果は表３にまとめられている。
【００９９】
【表３】
2009533477.tif 000005
【０１００】
A/17/Duck/Potsdam/86/92（H5N2）株から調製された300MID50のLIVを単回投与して免疫感作したマウスは、50LD50用量のHK/483ウイルスによる致死的感染から100%防御され、一方、対照群の動物においては100%の致死量が見られた。LIVを経鼻で単回免疫感作することにより、100MID50のHK/213ウイルスでのその後の投与誘発に対して100%の防御が得られ、5匹の試験動物のいずれの肺からも感染性のウイルスは抽出されなかった。これらの結果は表４にまとめられている。
【０１０１】
【表４】
2009533477.tif 000006
【０１０２】
したがって、本発明者は、非病原性トリウイルスH5N2からのHAを含む再集合ワクチン株からのLIVが安全でかつ免疫原性であること、および、ワクチンの単回投与が、免疫感作株とは顕著に異なる抗原特性を有するウイルスを含む亜型H5N1の高病原性ウイルスでのその後の投与誘発に対して防御免疫応答を誘発することを示した。
【実施例５】
【０１０３】
マウスにおける、A/17/Duck/Potsdam/86/92（H5N2）からのLAIVおよびIIVの免疫原性特性の比較
17/H5株と追加の水酸化アルミニウムアジュバントとを用いて調製した全ビリオンワクチンの感染特性の試験により、アジュバントを有さないワクチンの単回投与が、2005年にベトナムにおいて発見された高病原性H5N1ウイルスでのその後の感染を防御するには十分ではないということが明らかになった。このウイルスの感染に対して100%の防御をもたらすためには、アジュバントを有するワクチンを2回投与することが必要であった。これらの結果は実施例１１および１３でより詳細に論じられており、表９および１１にまとめられている。
【実施例６】
【０１０４】
トリインフルエンザウイルスH7N1の免疫原性再集合体の生産
2003年の間にオランダにおいて出現した高病原性トリインフルエンザH7N1の発生により、80件を超えるヒトでの、結膜炎および軽度の呼吸器系の疾病の事例、ならびに1件の死亡事例が生じた。潜在的な今後の汎発を防御するための候補生インフルエンザワクチンを調製するために、本発明者は非病原性トリウイルスと低温適応性のH2N2原株 A/Leningrad/134/17/57（Len/17）との遺伝的再集合を用いた。Len/17は、成人および子供のための認可された弱毒生ワクチンを調製するためにロシアで現在用いられている。本発明者は、実施例３および４において、Len/17と非病原性H5インフルエンザウイルスとの間の再集合体がニワトリおよびマウスで弱毒であることを示した。
【０１０５】
本発明者は、インフルエンザウイルスLen/17とインフルエンザウイルスA/Mallard/Netherlands/12/00（H7N3）との間の6：2の再集合体を評価した。再集合体A/17/Mallard/Netherlands/00/84（H7N3）（Len17/H7）は、Len/17と同様の、低温適応性（ca）および温度感受性（ts）の表現型を示した。Len17/H7のHAの遺伝子配列は親H7N3野生型ウイルスのものと同一であった。異なるトリおよびヒトH7ウイルスに対するフェレットの抗血清のパネルを用いた血球凝集阻害（HI）試験の結果は、再集合体の抗原プロフィールが、H7N3野生型親株のものと、および、死亡事例で単離されたウイルスを含む、オランダからのヒトH7単離体のものと類似していることを示した。
【０１０６】
再集合体は、最適温度（34℃）で、ニワトリの孵化卵において、親Len/17 MSに匹敵する高い成長能力を示した。さらに、Len17/H7は、親Len/17と同様、ニワトリに弱毒であることが示され、一方、H7N3野生型ウイルスは60%の死亡率を生じさせた。Len/17原株と同様、Len17/H7はマウスで完全に弱毒であった。
【０１０７】
105〜106EID50での経鼻予防接種の後、Len17/H7はマウスの鼻腔において良好に複製したが、マウスの肺においては複製しなかった。マウスの肺における複製の欠如にも関わらず、Len17/H7は、血清の、3.7±0.8 log10という高いウイルス特異的IgGの力価を誘導した。
【実施例７】
【０１０８】
免疫原性の評価
本発明者は、H5N2再集合体から調製したLAIVと、ロシアにおいて用いられている2つのタイプの不活化サブユニットワクチンとの、免疫原性および防御効果を比較した。両方のサブユニットワクチンは、逆遺伝学的方法を用いてH5N1株から調製した。一方のサブユニットワクチンはまた、ポリマーアジュバントであるポリオキシドニウム（N-酸化1,4-エチレンピペラジンと（N-カルボキシエチル）1,4-エチレンピペラジンブロマイドとの共重合体、分子量100kDa、Petrovax Pharm、モスクワ、ロシア）を含み、一方、他はミョウバンアジュバントを含んでいた。
【０１０９】
表５は、高病原性H5N1ウイルスでの投与誘発で得られた結果を示す。LAIVが非常に高いレベルの交差防御を引き起こすことは明白であり、これは第1および第2の投与後に57%〜87%であった。
【０１１０】
【表５】
2009533477.tif 000007
【実施例８】
【０１１１】
ニワトリにおける病原性および感染性
病原性の決定のために、各群につき8羽のニワトリを、各ウイルスの10-1希釈物0.2mlで静脈内（i.v.）予防接種し、14日間にわたって臨床的徴候および死亡について毎日観察した。感染性の決定のために、5羽のニワトリを、0.1mlにおける106EID50の各ウイルスで経鼻（i.n.）予防接種した。予防接種後（p.i.）3日目に、口腔咽頭および排泄腔のぬぐい液を各ニワトリから回収し、ウイルスの複製をニワトリの孵化卵において評価した。ニワトリは21日間にわたり疾患の臨床的徴候および死亡について観察し、その際、血清サンプルを採取し、寒天ゲル免疫拡散（AGID）試験により抗体の存在について試験した。
【０１１２】
2つの親および再集合体Len17/H5ウイルスを、特定病原体を含まない（SPF）ニワトリに投与し、家畜生産に対するそれらの潜在的なリスクを決定した。これには、i.v.予防接種後の罹患率および死亡率をもたらす能力の評価（病原性）、ならびに模擬自然暴露（i.n.予防接種）の後の組織特異的な複製のレベルの評価が含まれる。表６に示すように、i.v.予防接種またはi.n.予防接種では、それぞれ14または21日間の観察期間にわたり、3つのウイルスのいずれでもニワトリにおいて臨床的な疾患の徴候または死亡は認められなかった。低病原性トリインフルエンザウイルスの複製のピーク時であるp.i.3日目にi.n.予防接種した群では、ウイルスは気道（口腔咽頭のぬぐい液）または腸管（排泄腔のぬぐい液）からは単離されなかったが、トリインフルエンザウイルスタンパク質に対する抗体が、トリPot/86親ウイルスで予防接種したニワトリにおいて検出された。
【０１１３】
【表６】
2009533477.tif 000008
【０１１４】
2つの実験のデータの組み合わせにより、2つの親および再集合体Len17/H5ウイルスがニワトリに対して高病原性ではないということが示唆される。模擬自然暴露の後、Pot/86親ウイルスは一見したところ、ニワトリにおいてあまり複製しなかった。感染の証拠は抗体の存在においてのみ検出され、気道または腸管におけるウイルスの実際の検出によっては検出されなかった。野生の水鳥から単離されたウイルスによるニワトリの予防接種による、感染に対する同様の耐性が報告されている（JonesおよびSwayne、2004年）。さらに、再集合体Len17/H5は、i.n.予防接種による模擬自然暴露によってはニワトリにおいて複製しなかった。これらの所見は、ヒトワクチンの製造における再集合体Len17/H5の使用が家禽産業に対して脅威をもたらさないであろうことを示唆している。
【実施例９】
【０１１５】
マウスにおけるワクチンの病原性および感染性
10週齢のメスのBALB/cマウス（Jackson Laboratories、Bar Harbor、メイン州、アメリカ合衆国）をCO2で軽く麻酔し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に希釈した101から107EID50のLen17/H5、Len17、またはPot/86を50μl、i.n.予防接種した。Luら（1999年）に記載されているように、マウス50%感染量（MID50）を用いて感染性を決定し、50%致死量（LD50）を用いて病原性を決定した。Len17/H5および2つの親ウイルスの複製を評価するために、106EID50のこれらのウイルスでマウスをi.n.感染させた。器官のサンプルをp.i.3日目（肺および鼻）ならびに6日目（脳）に回収し、卵における感染性ウイルスの力価測定を行った。
【０１１６】
表７に示すように、再集合体Len17/H5および2つの親ウイルスは全て、マウスに対して致死的ではなかった（LD50>107EID50）。Len17 Ca H2N2ドナー株のように、Len17/H5ウイルスは親Pot/86ウイルスと比較して10倍高いMID50を有していた。マウスの上気道および下気道における再集合体Len17/H5ウイルスの複製を、弱毒化の測定として評価した。マウスを106EID50の親ウイルスおよび再集合ウイルスでi.n.感染させ、鼻および肺に存在するウイルスの力価をp.i.3日目に決定した。
【０１１７】
【表７】
2009533477.tif 000009
【０１１８】
親Pot/86ウイルスはマウスの肺において効果的に複製したが、鼻においてはあまり複製しなかった。逆に、Len17/H5再集合体は、3匹のマウスの肺の1つのみからウイルスが回収されたLen17 ca株がそうであったように、鼻においては良好に複製したが肺においてはあまり複製しなかった（力価=103.3EID50/ml）。いずれの感染したマウスの脳においても、p.i.6日目にウイルスは検出されなかった（データは示していない）。これらの結果は、再集合体Len17/H5ウイルスが上気道において主に複製し、マウスにおいて弱毒であったということを示している。
【実施例１０】
【０１１９】
マウスにおける免疫原性および交差反応性の抗体応答
次に、本発明者は、300MID50の単回投与でLAIVとしてi.n.予防接種した、または、IIVとしてi.m.予防接種した（10μgの全ウイルスの単回投与）Len17/H5の免疫原性をマウスにおいて評価した。
【０１２０】
高成長Len17/H5ウイルスを尿膜腔液から濃縮し、Coxら（1984年）の方法を用いてショ糖勾配で精製し、精製ウイルスを4℃で3日間、0.025%ホルマリンで処理することでIIVとして調製した。マウス群を、体積が0.1mlの10μgのIIVで単回、筋肉内投与（i.m.）した（約3μgのHAタンパク質）。
【０１２１】
マウスを、ミョウバンアジュバントの存在下または不存在下で（Liら、1999年）、300MID50（-107EID50）のLAIVの単回投与でi.n.予防接種するか、または、10μg（約3μgのHAタンパク質）のIIVを単回もしくは2回、筋肉内投与（i.m.）した。何匹かのマウスには4週の間隔をあけて2回予防接種した。
【０１２２】
8週齢のメスのBALD/cマウスの群を300MID50のLen17/H5（=107EID50）またはLen17（=107.3EID50）のLAIVの単回投与でi.n.で免疫感作した。マウスに300MID50のPot/86（=105.7EID50）または100MID50のHK/213ウイルス（=103.8EID50）を陽性対照としてi.n.感染させ、陰性対照としてはPBSを投与した。
【０１２３】
i.n.またはi.m.での免疫感作の6週間後、以前に記載されているように（Katzら、1997年）、血液、肺、および鼻の洗浄液サンプルを各群につき5匹から回収した。コレラ菌（Vibrio Cholerae）に由来する受容体破壊酵素（ノイラミニダーゼ）（デンカ生研株式会社、東京、日本）で血清を処理し、その後H5特異的抗体の存在について試験した（Kendalら、1982年）。以前に記載されているように（Roweら、1999年）マイクロ中和アッセイを用いて中和抗体の力価を決定した。中和抗体の力価は、Madin-Darbyイヌ腎細胞において100TCID50のウイルスを50%中和する、血清の最も高い希釈の逆数として表されている。
【０１２４】
2μg/mlの、精製された、バキュロウイルスが発現するH5（HK/156）組換えHAタンパク質（Protein Sciences Corporation、メリデン、コネティカット州、アメリカ合衆国）をプレートの被覆に用いたことを除いて、インフルエンザH5特異的IgGおよびIgA抗体を、以前に記載されているようにして（Katzら、1997年）酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）により検出した。終点のELISA力価を、同様に希釈した対照サンプルの光学密度（CD）の平均+標準偏差（S.D.）の2倍を超えるCDを示す最も高い希釈として表した。
【０１２５】
免疫感作の6週間後、血清、肺、および鼻の洗浄液を回収し、マイクロ中和アッセイまたはELISAによってH5ウイルス特異的抗体について試験した（Katzら（1997年）、Roweら（1999年））。表８に示すように、同種のPot/86ウイルスに対する中和抗体が、LAIV Len17/H5を投与したマウスの血清において検出されたが、HPAI H5N1 HK/156またはHK/213ウイルスに対する交差反応性の中和抗体は検出されなかった。
【０１２６】
【表８】
2009533477.tif 000010
【０１２７】
しかし、図１に示すように、H5N1ウイルス特異的な血清IgGおよび気道のIgAの実質的なレベルがELISAにより検出された。予想した通り、Len17 ca H2N2親ウイルスは、H5ウイルスに対する検出可能な交差反応性の中和抗体を全く誘導しなかったが、それぞれ生ワクチンまたは死滅ワクチンとしてのLen17/H5により誘導される亜型特異的なIgG応答よりも20〜100倍低い（p<0.01）、H5 HAとの血清IgGの低レベルの交差反応性が検出された。
【０１２８】
興味深いことに、図１はまた、Len17 ca親ウイルスが、Len17/H5 LAIVにより誘導されるものと有意差のないH5交差反応性の鼻IgAの力価を誘導したことを示し、このことは、局所的なIgA応答が、通常、血清IgG抗体応答よりもより亜型交差反応性であったということを示唆している。ホルマリン不活化ワクチンとして用いた場合、Len17/H5は、同種のPot/86ウイルスおよび抗原的に関連するHK/156ウイルスと同様の中和抗体力価（それぞれ160および80）を誘発したが、HK/213ウイルスと交差反応した中和抗体は検出されなかった（表８）。
【０１２９】
図１に示すように、不活化Len17/H5ワクチンはまた、血清、肺、および鼻の洗浄液において有意なレベルのHK/156 HA特異的IgGを誘導した。血清、肺、および鼻の洗浄液におけるHK/213ウイルスと交差反応したIgAおよび/またはIgG抗体はまた、Len17/H5 LAIVまたはLen17/H5 IIVを投与したマウスにおいても見られた。
【０１３０】
要約すると、i.m.経由で予防接種されたIIVは、LAIV Len17/H5と比較して良好な、HK/156ウイルスのHAに対する交差反応性の血清中和抗体応答およびIgG抗体応答（0<0.05）を誘導し、一方、LAIV Len17/H5は、気道の洗浄液において優れたH5 HA特異的IgA抗体応答を誘導した。
【実施例１１】
【０１３１】
マウスにおける再集合体Len17/H5ワクチンの交差防御効果
LAIVまたはIIVとしてのLen17/H5の防御効果を、1997年（HK/483）および2003年（HK/213）に香港においてヒトから単離されたH5N1ウイルスで投与誘発したマウスにおいて評価した。HK/483はナイーブBALB/cマウスに対して非常に致死的であるということが示されているため（Luら、1999年）、HK/483を1997 H5N1ウイルスの代表として選択した。抗原的に異なるH5N1ウイルスであるHK/213はマウスに対して致死的ではなかったが、マウスの肺において高力価まで複製した。
【０１３２】
i.n.またはi.m.での免疫感作の6週間後、ワクチン接種したマウスを50μlの100MID50のHK/213または50LD50のHK/483でi.n.投与誘発した。投与誘発の3日または6日後、各群につき5匹のマウスを安楽死させ、組織を回収し、-70℃で保存した。解凍した組織を1mlの冷たいPBS内にホモジナイズし、以前に記載されているように（Luら、1999年）、10日齢の孵化卵においてウイルスの感染性について力価測定した。ウイルスの終点力価はlog10EID50/mlの平均±S.D.で表した。高病原性HK/483ウイルスでi.n.投与誘発した各群につき8匹のマウスを、投与誘発後の14日間、疾患の徴候、体重減少、および死亡について毎日観察した。結果の統計的有意性は、スチューデントの両側t検定を用いて決定した。
【０１３３】
第1の実験において、ワクチン接種したマウス群（n=13）を、50LD50のHP HK/483でi.n.感染させた。各群につき8匹のマウスを体重減少および死亡について14日間毎日観察した。各群の残りのマウスをp.i.6日目に安楽死させ、下気道（肺）および上気道（鼻）、脳、ならびに胸腺におけるウイルス複製のレベルを決定した。交差防御の評価には6日目を選択したが、それは、ナイーブマウスが肺および鼻においてHK/483ウイルスの実質的な力価を有していること、ならびにこの時点で脳および胸腺におけるウイルス複製のピークを有していることを、本発明者が見出したためである。結果は表９にまとめられている。
【０１３４】
【表９】
2009533477.tif 000011
【０１３５】
PBSを投与したワクチン接種していない対照マウスは全て、HK/483での投与誘発の5〜9日後に死亡し、最大体重減少の平均は22%であり、p.i.6日目に肺、鼻、脳、および胸腺において高いウイルス力価を有していた。逆に、野生型親Pot/86ウイルスでi.n.予防接種したマウスは、全実験期間にわたって疾患の徴候を全く示さず、p.i.6日目にいずれの器官においてもウイルスは検出されなかった。ca親Len17（H2N2）ウイルスを投与したマウスは重篤な疾患を示し、最大体重減少の平均は19%であったが、ワクチン接種しなかった群と比較して生存がわずかに増加していた。この所見と一致する点は、わずかではあるが有意ではない、これらのマウスにおけるHK/483の肺のウイルス力価の減少であった。一方、上気道、脳、および胸腺におけるウイルス力価は、PBSのみを投与したマウスと比較して、親Len17（H2N2）ウイルスを投与したマウスにおいて有意に低かった。同様の、H5N1ウイルスに対する異亜型での防御（heterosubtypic protection）が以前に観察されている（Tumpeyら、2001年）。
【０１３６】
逆に、Len17/H5 LAIVを投与した全てのマウスはHP HK/483ウイルスでの致死的投与誘発で生存したが、p.i.3日目と5日目との間で見られるわずかな体重減少により測定されるように、軽度の疾患を呈した（データは示していない）。Len17/H5 LAIVでワクチン接種したマウスの5匹のうち2匹の肺において、p.i.6日目に低いウイルス力価のみが検出され（102.3 EID50/mlおよび102.5EID50/ml）、試験した他のいずれの器官においてもウイルスは検出されず、このことは、これらのマウスがHP HK/483の投与誘発から効果的に防御されたことを示している。マウスはわずかな体重減少を経験したものの、Len17/H5はIIVとして送達された場合、8匹のうち7匹のマウスを致死的なHK/483ウイルス疾患から防御した。Len17/H5でワクチン接種したマウスの肺または胸腺においてウイルスは検出されなかったが、p.i.6日目に、5匹のうち1匹のマウスの鼻（101.6EID50/ml）ならびに5匹のうち2匹のマウスの脳（101.6 EID50/mlおよび101.8EID50/ml）から低い力価のウイルスが単離された。
【０１３７】
第2の実験において、各ワクチン群で5匹のマウスを100MID50のHK/213 2003ウイルスでi.n.で投与誘発し、p.i.3日目の肺のウイルス力価を決定した。PBSのみを投与したマウスはp.i.3日目に肺において高いウイルス力価を有していた。Len17で免疫感作したマウスにおける肺のウイルス力価は、ワクチン接種していないPBSマウスよりもわずかに低かったが、差は有意ではなかった。HK/483での投与誘発で観察されたように、野生型親Pot/86 H5N2ウイルスで予防接種したいずれのマウスの肺においても、HK/213ウイルスでの投与誘発の3日後にウイルスは検出されなかった。Len17/H5 LAIVを投与した10匹のマウスのうち9匹およびLen17/H5 IIVを投与した全てのマウスは、p.i.3日目に、検出可能なHK/213ウイルスを肺に有しておらず、PBSのみを投与したマウスと比較して少なくとも3000倍の力価の減少を示した。
【０１３８】
これらの結果により、LAIVまたはIIVとしてのLen17/H5の単回投与により、HP HK/483ウイルスでの投与誘発による感染、重篤な疾病、および死亡からの実質的な防御が得られることが明らかになった。加えて、両方のワクチンは、抗原的に異なるHK/213ウイルスの複製に対してマウスを防御した。
【実施例１２】
【０１３９】
H5のLAIVおよびIIVにより誘導される免疫原性および交差反応性抗体の細胞応答
不活化した全ウイルスワクチンを、以前に記載されているように（Subbaraoら、2003年）Len17/H5およびHK/213から調製した。ミョウバンの2%懸濁液を免疫感作の前にPBS内において等容量のワクチンと混合した。
【０１４０】
8週齢のメスのBALB/cマウス（Jackson Laboratories、Bar Harbor、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）をこれらの実験において用いた。マウスは、ミョウバンアジュバントの存在下または不存在下で投与した、Len17/H5または対照としてのLen17（H2N2）でのi.n.予防接種で1回免疫感作したか、またはLen17/H5またはHK/213ウイルスから調製したIIVでのi.m.予防接種により免疫感作した。
【０１４１】
免疫血清および鼻の洗浄液を、以前に記載されているように（Katzら、1999年）回収した。コレラ菌に由来する受容体破壊酵素（デンカ生研株式会社、東京、日本）で血清を処理し、その後、H5特異的抗体の存在について試験した（Kendalら、1982年）。以前に記載されているように（Roweら、1999年）中和抗体の力価を決定した。
【０１４２】
1μg/mlの、精製された、バキュロウイルスが発現する組換えH5血球凝集素（rHA、Protein Sciences Corporation、メリデン、コネティカット州、アメリカ合衆国）タンパク質をプレートの被覆に用いたことを除いて、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて、血清および/または鼻の洗浄液におけるIgG、IgG1、IgG2a、およびIgA抗体を検出した（Katzら、1999年）。終点のELISA力価を、同様に希釈した陰性対照サンプルの光学密度（CD）の平均+S.D.の2倍を超えるCDを示す最も高い希釈として表した。単一の脾臓細胞懸濁液を調製し、ホルマリンで不活化した5血球凝集単位（HAU）の全H5（HK/213）ウイルスまたは5×106細胞/mlの濃度の組換えHA（HK/156） 250ngで刺激した（Luら、2002年）。培養物の上清を培養の5日後に採取した。インターロイキン（IL）-2、インターフェロン（IFN）-γ、IL-4、およびIL-10を、Bio-Plexアッセイ（BioRad Laboratories、Hercules、カナダ）を製造者の指示に従って用いて、培養物の上清において検出した。データの統計的有意性はスチューデントのt検定を用いて決定した。
【０１４３】
ワクチン接種の1月後にマウスから回収した血清を、1997年から2004年にヒトから単離された代表的なH5N1ウイルスに対する交差反応性の中和抗体の存在について試験した。表１０に示すように、同種のウイルスに対する中和抗体は、i.n.経路でLen17/H5 LAIVを予防接種したマウスの血清において検出されたが、異種ウイルスHK/156、HK/213、およびVN/1203に対する交差反応性の中和抗体は検出されなかった。
【０１４４】
【表１０】
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【０１４５】
予想した通り、Len17 ca H2N2ウイルスは、いずれのH5ウイルスに対しても検出可能な交差反応性の中和抗体を誘導しなかった。H5 LAIVと比較すると、Len17/H5またはHK/213 IIVは少なくとも2倍高い、同種のウイルスに対する血清中和抗体を誘導したが、異種ヒト1997 H5N1および2004 H5N1ウイルスを中和し得る交差反応性抗体は存在してもほんのわずかであった。しかし、Len17/H5またはHK/213の IIVにミョウバンを加えると、同種抗体力価が4〜16倍増大し、その結果、異種H5N1ウイルスに対する交差反応性の中和抗体応答も増強された。
【０１４６】
抗H5血清IgGならびに鼻の洗浄液のIgGおよびIgAのレベルをELISAにより決定し、その結果を図２に示した。VN/1203ウイルスに対する中和抗体は検出されなかったものの、VN/1203 HAと交差反応するIgG1およびIgG2aの実質的なレベルがLen17/H5 のLAIVおよびIIVの両方によって誘導された。i.n.経路で投与したLAIVワクチンのみが鼻のIgA応答を誘導した。興味深いことに、Len17/H5およびLen17（H2N2）の LAIVの両方が、同様の力価までH5 HAと反応する鼻のIgA応答を誘導した。逆に、Len17/H5 LAIVのみが、H5特異的な鼻の洗浄液のIgGを、Len17/H5 IIVによって誘発されるものよりわずかに高いレベルで誘導した。
【０１４７】
サイトカインの生産を、H5組換えHAまたは不活化全H5N1ウイルスによってインビトロで再刺激した、LAIVまたはIIVで免疫感作したマウスから単離した脾臓細胞において評価し、結果を図３に示す。陽性対照として含まれる、野生型HK/213 H5N1ウイルスでi.n.感染させたマウスの脾臓細胞は、Th1様サイトカイン（IFN-γ）またはTh2様サイトカイン（IL-4およびIL-10）を生産した。全ての事例において、不活化全H5N1ウイルスでの免疫脾臓細胞の刺激により、精製されたH5組換えHAでの刺激よりも強いサイトカイン応答が誘導された。不活化全H5N1ウイルスで刺激した場合、LAIVと比較して、IIVはより強いIL-4およびIL-10の生産を誘導した。逆に、差はよりわずかではあったが、LAIVは全ウイルスで再刺激した脾臓細胞において、より高いレベルのIFN-γを誘発した。LAIVまたはIIVは同様のレベルのIL-2を誘発した。しかし、Len17（H2N2）LAIVを投与したマウスは主にIFN-γを生産し、かつそれは全H5N1ウイルスで再刺激した場合のみであり、このことは、この亜型での交差反応性の細胞応答が、内在インフルエンザAウイルスタンパク質上の保存されたエピトープに対するものであったことを示唆している。逆に、H5のLAIVまたはIIVの応答はH5 HAに存在するエピトープおよび他のウイルスタンパク質に対するものであった。
【実施例１３】
【０１４８】
マウスにおけるH5のLAIVおよびIIVの交差防御効果
本発明者は次に、ワクチン株から抗原的および遺伝的に区別される、2004年代の初めのヒトでの死亡事例で単離されたHPAI H5N1ウイルスである、200LD50のVN/1203ウイルスでの致死的な投与誘発からマウスを防御する、Len17/H5のLAIVまたはIIV、およびHK213 IIVの能力を評価した。
【０１４９】
致死的な投与誘発からの防御の程度を評価するために、ワクチン接種したマウスを200LD50のVN/1203ウイルスでi.n.感染させた。マウスをCO2で軽く麻酔し、PBS内に希釈した50μlの感染性ウイルスをi.n.予防接種した。マウス50%感染量（MID50）および50%致死量（LD50）の力価を以前に記載されているように（Luら、1999年）決定した。各群5匹のマウスを感染の6日後（p.i.）に安楽死させた。肺、鼻、および脳の組織を回収し、以前に記載されているように（Luら、1999年）ウイルスの感染性について力価測定した。ウイルス力価はlog10EID50/mlの平均±標準偏差（S.D.）で表した。各群の残りのマウスは14日間にわたって体重減少および生存について毎日観察した。
【０１５０】
H5のLAIVまたはIIVを単回および/または2回投与したマウスの群を、最初のワクチン接種の3.5か月後または2度目のワクチン接種の2.5か月後に投与誘発した。ウイルス複製のレベルの評価には6日目を選択したが、それは、VN/1203で感染させたナイーブマウスが肺、鼻、および脳においてこの時点で実質的なウイルス力価を有していることを本発明者が見出したためである。表１１に示すように、PBSのみを投与した全ての対照マウスはVN/1203ウイルスでの投与誘発の6〜9日後に死亡し、最大体重減少の平均は19%であり、p.i.6日目に肺、鼻、および脳において高いウイルス力価を有していた。
【０１５１】
【表１１】
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【０１５２】
Len17 H2N2 LAIVで免疫感作したマウスの80%は生存したが、そのマウスは、ワクチン接種していない対照マウスにおいて見られるものと同様の実質的な体重減少および肺の平均ウイルス力価を示した。一方、上気道および脳におけるウイルス力価は、親Len17（H2N2）ウイルスを投与したマウスにおいて、PBSを投与したものと比較して有意に低かった（p<0.05）。Len17/H5 LAIVの単回投与で免疫感作した全てのマウスは致死的な投与誘発で生存し、わずかな体重減少のみを示した。p.i.6日目の、Len17/H5 LAIVで免疫感作したマウスの肺のウイルス力価は、Len17 LAIVまたはPBSで免疫感作したマウスにおいて検出されたものよりも1万倍超低かった。マウスの上気道または脳においてウイルスは検出されなかった。
【０１５３】
ミョウバンアジュバントの不存在下で、Len17/H5 IIVの単回もしくは2回の投与またはHK/213 IIVの2回の投与で免疫感作した全てのマウスは、VN/1203ウイルスでの致死的な投与誘発で生存したが、わずかな体重減少を示した。低レベルのウイルスが、Len17/H5 IIVを単回投与したマウスの肺、鼻、および脳、ならびにHK213 IIVを2回投与したマウスの肺において検出された。ミョウバンアジュバントと共にLen17/H5またはHK213のIIVを2回投与したマウスは疾患の徴候を示さず、p.i.6日目にいずれの器官からもウイルスは単離されなかった。
【０１５４】
これらの結果により、LAIVまたはIIVとして投与されたLen17/H5、およびIIVとして投与されたHK/213により、非常に致死的な異種ヒトH5N1 2004ウイルスでの投与誘発による感染、重篤な疾病、および死亡からの実質的な交差防御が得られるが、ミョウバンで製剤したHK/213 IIVのみが、VN/1203ウイルスに対する検出可能な交差反応性の中和抗体応答を誘導するということが明らかになった。
【０１５５】
本発明者はまた、本発明によるワクチンが、H5N1インフルエンザウイルスの感染に対するサルにおける交差防御免疫を誘導することを明らかにした。
【０１５６】
考察
汎発性のインフルエンザを制御するための最適な戦略は、実際の汎発性の株から生産された、または少なくとも抗原的に密接に適合している関連した株から生産されたワクチンでの早期の処置である。2003年および2004年に、野生型HPAI H5N1ウイルスから多塩基性の切断部位モチーフを除去するよう修飾されたNA遺伝子およびHA遺伝子、ならびに孵化卵におけるワクチン生産のための高成長ドナー株であるA/PR/8/34に由来する内在遺伝子を用いて、不活化ワクチン株が逆遺伝子学により作製された。このアプローチには、研究所における高レベルの封じ込め、ニワトリおよび哺乳類種に対する適切な弱毒化を確実にするための再生したワクチン株の安全性の試験、特許された高度な逆遺伝学的技術、およびワクチンに適した細胞系の使用が必要である。さらに、最良のケースにおいてさえ、抗原的に良く適合した流行ワクチンを生産するために少なくとも6か月を要するであろう。
【０１５７】
この概念的研究の裏づけにおいて、本発明者は、1997 H5N1ウイルスに抗原的に類似した非病原性H5N2株とロシアのca原ドナー株Len17とから作製された、7：1の再集合体H5 LAIV候補の免疫原性および効果を評価した。Len17/H5ワクチン候補はまた、IIVの生産に望ましい、孵化卵における高成長特性を有するため、本発明者はIIVとしてのその有用性も評価した。
【０１５８】
LAIVとしては、Len17/H5の単回投与は気道における優れたH5ウイルス特異的IgA抗体応答を誘導し、一方、Len17/H5 IIVの単回投与は、HK/156ウイルスのHAに対するより良好な交差反応性の血清中和抗体応答およびIgG抗体応答を誘導した。驚くべきことに、LAIVまたはIIVとして単回投与したLen17/H5は、マウスにおいて、関連するH5N1ウイルスおよび抗原的に異なるH5N1ウイルスの両方に対して防御免疫を誘発した。
【０１５９】
H5N1ウイルスに対するLAIVは最初に、1997年に香港においてヒトから単離されたHP H5N1株からHAを修飾するための逆遺伝学的技術を用いて開発された。2つの6：2の再集合体が作製された。これらは修飾されたHA遺伝子を含み、HK/156およびHK/483の野生型ノイラミニダーゼ（NA）遺伝子、弱毒ca A/Ann Arbor/6/60ドナー株の6つの内在遺伝子断片、ならびにニワトリにおけるウイルス性に関連する多塩基性のアミノ酸切断部位を有していなかった。得られたH5 LAIVはニワトリに対して高病原性ではなかったが、静脈内予防接種により、ニワトリにおける様々な免疫および防御を投与した。しかし、これらのH5N1 LAIVの効果は哺乳類またはヒトにおいて評価されなかった（Liら、1999年）。
【０１６０】
他のアプローチを用いて、1997 H5N1株に抗原的に関連する、非病原性H5N3ウイルスに由来する表面抗原ワクチンを開発した。MF-59アジュバントの存在下または非存在下でH5N3 IIVを2回投与したヒトにおいて評価したところ、アジュバントを伴わないIIVは、最大30μgのHAを2回投与した後でさえも免疫原性が低く、一方、アジュバントを伴ったH5N3ワクチンは、一元放射溶血アッセイ（Nicholsonら、2001年）により測定したところ、防御レベルに達する抗体力価を誘導した。
【０１６１】
HA1サブユニットのアミノ酸配列の比較により、Len17/1〜15ワクチン株と、現在の研究において用いられている1997 H5N1および2003 H5N1ウイルスとの間で、91〜92%のアミノ酸同一性が明らかにされた。それにも関わらず、Len17/H5ワクチンは、H5N1ウイルス誘導性の死亡、重篤な疾患、およびウイルス複製に対する効果的な防御を提供した。LAIVとして、Len17/H5再集合体は、HK/483ウイルスでの致死的な投与誘発および体重減少により測定される重篤な疾病に対するマウスの効果的な防御を誘導し、ワクチン接種していない対照マウスが致死的な感染で死亡した時点で肺のウイルス力価を5log低下させた。
【０１６２】
この重篤な時点で、Len17/H5 LAIVを投与したマウスの上気道または全身組織においてウイルスは検出されなかった。鼻におけるウイルスの不存在は、鼻の洗浄液におけるH5特異的IgAの顕著な力価と関連していた。実際、Len17/145 LAIVは、野生型Pot/86またはHPAI HK/213ウイルスの感染により誘導されたものに匹敵する、鼻および肺の洗浄液のIgA力価を誘導したが、一方、Len17/H5 IIVは気道のIgA応答を誘導しなかった。逆に、HK/156に対する血清中和抗体およびIgG抗体は、Len17/H5 IIVを投与したマウスにおいて、LAIVを投与したマウスと比較して4倍高かった。
【０１６３】
これらの結果は、p.i.6日目にIIVを投与したマウスの肺において検出可能なウイルスが全く存在しなかったことを説明し得る。したがって、Len17/H5のLAIVまたはIIVは、異なる抗体領域における最適な応答を誘導したが、両方のワクチンは、1997および2003ヒトH5N1ウイルスでの投与誘発の後の実質的な交差防御をもたらした。実施例１３において、本発明者は、Len17/145再集合体により、最近の高病原性A/Vietnam/1203/2004（H5N1）ウイルスでの致死的な投与誘発からの防御が得られることを示している。Len17/H5再集合体はフェレットにおいて免疫原性であるが、それがどの程度ヒトにおいて複製し得、ヒトに対して免疫原性であり得るかはいまだ試験されていない。
【０１６４】
Len17/145の調製に用いた両方の親のNA遺伝子はN2亜型のものであった。野生型親株からNA遺伝子を有する6：2の再集合体を選択するためには、さらなる多大な努力が必要であろう。汎発性の再集合体の緊急な調製が必要とされる場合は時間が限られているため、本発明者は、ca Len17親からNA遺伝子を受け継ぐ7：1の再集合体ワクチンを研究した。
【０１６５】
本発明者による結果により、抗原的に関連するNAは、マウスにおけるウイルス性のH5N1ウイルスに対する防御効果には必須ではないということが示されている。しかし、他の研究により、ヒトにおける疾患の重篤性を低下させる、またはマウスに適合したヒトインフルエンザウイルスでの致死的な投与誘発からマウスを防御する、NA特異的抗体の役割が明らかになっている。
【０１６６】
汎発性の循環株に関連するHAおよびNAの両方を有するLAIV再集合体が望ましいが、それはN1 NA亜型には適していない可能性があり、それは、いくつかのN1遺伝子産物が、HA分子のトリプシン非依存性の切断を増強し、それにより生ワクチンの弱毒化を潜在的に低下させ得ることが示されているためである。
【０１６７】
汎発の状況におけるLAIVの使用はこれまでに考慮されている。従来の再集合技術を用いた低温適応性のインフルエンザA H9N2再集合体ワクチン株の作製が記載されており、このような候補の臨床的評価が現在行われている。汎発の場合における弱毒生ワクチンの使用において重視すべきことは、新規なHAを有する循環株とのワクチン株の再構成の可能性である。したがって、LAIVは、個体群が新規な汎発性の野生型株による急迫の蔓延性の疾患に直面している場合にのみ、汎発状況において最良に使用され得る。
【０１６８】
本発明者による結果は、汎発性の株を迅速に配備し得るIIVの備蓄を可能にするであろう新規な汎発性ワクチン戦略が特定されていることを示唆している。これは恐らくはウイルスの蔓延性の循環の前のものであり、確かに、厳密な抗原的適合に基づくワクチンが利用可能である前のものである。汎発性の株が個体群において確立された場合、同一のシードストックから作製されたLAIVの使用はワクチンの利用可能性を広げるであろう。LAIVは、高感受性で免疫学的にナイーブな個体群における伝染を減少させるために重要であり得る、上気道からのウイルスの出芽を減少させるというさらなる利点を有し得る。本発明者による結果は、汎発の可能性を有する複数のトリインフルエンザA亜型に対する弱毒生ワクチンおよび不活化ワクチンの調製のための、高成長ca H2N2株と、抗原的に関連する非病原性トリウイルスとの間の、古典的な遺伝的再集合を使用する一般的な戦略を示唆する。他の由来源からの非病原性インフルエンザウイルスを用いる同様の戦略を、対応する種からの、汎発の可能性を有するインフルエンザA亜型に適用し得る。
【０１６９】
本発明者はまた、従来の再集合方法を用いる、H5 HA遺伝子のドナーとしての非病原性株の使用、およびca原ドナー株からの他の遺伝子との弱毒再集合ウイルスの作製に基づく、別の戦略を評価した。本発明者による結果は、ワクチンと投与誘発株との間のHA1サブユニットのアミノ酸同一性が91%にすぎないにも関わらず、Len17/H5 LAIVの単回投与またはLen17/H5 IIVの2回投与が、重篤な疾患、死亡、およびウイルス複製からの高レベルの交差防御を誘導するということを明らかにした。驚くべきことに、この交差防御効果は、投与誘発ウイルスに対する低いまたは検出不可能なレベルの中和抗体を有するマウスにおいて見られた（表１０および１１）。しかし、VN/1203のHAと交差反応する鼻の洗浄液のIgAおよび/または血清IgGが、それぞれLAIVおよびIIVを投与したマウスにおいて検出された（図１および２）。これらの結果は、血清中和アッセイによっては検出されなかった抗体の防御的役割を示唆する。
【０１７０】
いずれかのワクチンによる、サイトカイン生産ウイルスに特異的なT細胞の誘導はまた、より広範な交差防御効果に寄与し得る。興味深いことに、Len17（H2N2）LAIVを投与したマウスにおける交差反応性の鼻の洗浄液のIgA抗体およびT細胞応答の誘導は、ウイルスの全身性の拡散および死亡からの防御と関連していたが、肺のウイルス力価および体重減少により測定される罹患率の減少とは関連していなかった。
【０１７１】
それにも関わらず、H5ワクチンのいずれかにより誘導されるH5亜型特異性応答は、肺におけるウイルス負荷の減少に必要であり、罹患率を減少させた。
【０１７２】
低レベルのウイルス複製および/または体重減少が、免疫感作の6日後にほとんどのマウスにおいて検出されたため、アジュバントを有さないLen17/H5のLAIVもIIVも、感染および疾病からの完全な交差防御を誘導しなかった。アジュバントと製剤したIIVで免疫感作したマウスのみが、免疫感作の6日後に試験したいずれの組織においても検出可能なウイルスを有しておらず、基本的に罹患はなかった。これらの結果が気道における感染からの完全な交差防御を実際に反映しているかどうかについては、免疫感作後の早い時期にウイルス力価を決定することによる確立はまだなされていない。
【０１７３】
また、IIVと共にアジュバントを用いると、Len17/H5 IIVおよびHK/213 IIVの両方により誘導されるH5防御反応性の中和抗体応答が増大した。したがって、汎発性ワクチンの製剤におけるアジュバントの使用は、利用可能なIIVワクチン株が汎発性の循環株との最適な抗原的適合を有していない場合、またはワクチン生産のための再集合ウイルスストックが限定されている場合に、特に有用であり得る。
【０１７４】
本発明者は、異種H5株に基づくLAIVまたはアジュバントを伴うIIVが、現存するHPAI H5N1ウイルスでの投与誘発後のマウスにおける疾患の重篤性を有意に制限し、死亡率を減少させ得るということを明らかにした。これらの結果は、異種LAIVまたはアジュバントを伴うIIVが、株特異的ワクチンが利用可能になる前に汎発の初期の段階における疾患の重篤性を制限するための、公衆の健康の制御対策を提供し得るということを示唆している。
【０１７５】
優先出願の出願の後に、A/Duck/Primorie/2621/2001（H1N1）とA/PuertoRico/8/34との間の6：2、7：1、および5：3のインフルエンザウイルス再集合体が報告されている（Rudnevaら、2007年）。3つの全ての再集合体がマウスに対して病原性であった。卵における7：1の再集合体の収量は少なかったが、卵における連続継代により生産された変異体により、6：2の再集合体に匹敵する収量が得られた。6：2の再集合体を親株で戻し交配することによって生産される5：3の再集合体により、6：2または7：1の再集合体よりも多くの収量が得られた。6：2の再集合体のみを免疫原性について試験した。これは、高病原性H5N1株に対する効果的な防御応答を誘発した。著者は、高成長変異体の戻し交配および選択が、高病原性株もしくはこのような株の再集合体の生産において有用であるか、または、逆遺伝学を用いて生産された再集合体に対して有用であり得るということを示唆している。逆遺伝学の使用の必要性を避けるために、低病原性株の使用が示唆される。6：2の再集合体の、H5N1株に対する防御免疫を誘発する能力により、このアプローチが「バリケード」ワクチンの調製に用い得ることが期待されると言える。
【０１７６】
本発明は明瞭性および理解のためにある程度詳細に記載されているが、本明細書において記載されている実施形態および方法に対する様々な修飾および改変が、本明細書において開示されている発明の概念の範囲から逸脱することなくなされ得るということは、当業者には明らかであろう。
【０１７７】
本明細書において引用されている参考文献は以下の頁に列挙されており、この参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７８】
（参考文献）
2009533477.tif 000014
2009533477.tif 000015
2009533477.tif 000016
2009533477.tif 000017
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】H5ワクチンで免疫感作したマウスにおける抗HK/156HA特異的抗体応答を示す図である。マウスを、300MID50のLen17/H5 LAIVの単回投与でi.n.感染させるか、または10μgのLen17/H5 IIVを単回、i.m.投与した。2群のマウスに、300MID50のPot/86野生型ウイルスまたは100MID50のHK/213ウイルスを陽性対照としてi.n.感染させた。マウスに陰性対照としてPBSを投与した。血清（A）、肺（B）、および鼻の洗浄液（C）をワクチン接種または感染の6週間後に回収し、精製されたHK/156組換えHAタンパク質を抗原として用いて、IgG抗体およびIgA抗体の存在についてELISAで試験した。値は、各群につき5匹のマウスの終点力価の逆数の（log10）の平均±S.D.である。*p<0.05はLen17/H5 IIV群との比較、または†p<0.05はLen17/H5 LAIV群との比較である。
【図２】H5ワクチン接種したマウスにおける抗VN/1203HA特異的抗体応答を示す図である。各群につき5匹のマウスをLen17/H5もしくはLen17（H2N2）のLAIVもしくはIIVで一度免疫感作するか、または、生HK/213ウイルスもしくはPBSでi.n.予防接種した。血清（A）および鼻の洗浄液（B）をワクチン接種または感染の6週間後に回収し、精製されたVN/1203rHAタンパク質を抗原として用いて、（A）IgG1抗体、IgG2a抗体、または（B）IgG抗体およびIgA抗体の存在についてELISAで試験した。値は、各群につき5匹のマウスの終点力価の逆数の（log10）の平均±S.D.である。*p<0.05はPBS群との比較である。
【図３】LAIVまたはIIVによるインフルエンザH5N1ウイルス特異的サイトカインの誘導を示す図である。各群につき5匹のマウスをLen17/H5もしくはLen17（H2N2）のLAIVもしくはIIVで一度免疫感作するか、あるいは、生HK/213ウイルスまたはPBSでi.n.予防接種した。6週間後、脾臓の単一の細胞懸濁液を、5HAUの不活化H5N1全ウイルスまたは250ngのH5rHAで刺激した。培養物の上清を5日後に採取し、Bio-Plexアッセイを用いてサイトカインを検出した。
【図１】
2009533477.tif 000018
【図２】
2009533477.tif 000019
【図３】
2009533477.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成20年1月25日(2008.1.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
弱毒生インフルエンザウイルスワクチンであって、
a）少なくとも、非病原性または低病原性のインフルエンザウイルスが高病原性インフルエンザウイルスと同一の血球凝集素型を有する、非病原性トリインフルエンザウイルスに由来する血球凝集素遺伝子、および
b）高病原性インフルエンザウイルスと異なる血球凝集素型を有する、ドナー株に由来する他の遺伝子
を有する再集合インフルエンザウイルスを含む、弱毒生インフルエンザウイルスワクチン。
【請求項２】
再集合インフルエンザウイルスが7：1の再集合体であり、血球凝集素遺伝子のみが非病原性インフルエンザウイルスに由来する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
非病原性または低病原性のインフルエンザウイルスがトリウイルスである、請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項４】
非病原性または低病原性のトリインフルエンザウイルスがA/Duck/Potsdam/1042-6/86（H5N2）、A/Vietnam/1194/04（H5N1）、A/Duck/Singapore/97（H5N3）、A/Duck/Hokkaido/67/96（H5N4）、またはA/Mallard/Netherlands/12/00（H7N3）である、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
ドナー株が完全に特徴付けられているワクチン株である、請求項１から４のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項６】
ドナー株が低温適応性または温度感受性の株である、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
ドナー株が低温適応性であり、かつ温度感受性である、請求項５に記載のワクチン。
【請求項８】
ドナー株がPB2遺伝子、PA遺伝子、NA遺伝子、およびM遺伝子に突然変異を有している、請求項６または７に記載のワクチン。
【請求項９】
ドナー株が、A/Leningrad/134/17/57（H2N2）、A/Leningrad/134/47/57（H2N2）、A/Leningrad/134/17/K7/57（H2N2）、A/Moscow/21/65（H2N2）、A/Moscow/21/17/65（H2N2）、A/Ann Arbor/6/60（H2N2）、A/Puerto Rico/8/34（H1N1）、またはA/Puerto Rico/8/59/1（H1N1）である、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
再集合インフルエンザウイルスが古典的な再集合により得られる、請求項１から９のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１１】
再集合インフルエンザウイルスが高病原性インフルエンザウイルスに対する交差防御免疫応答を誘発する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１２】
IgA、IgG、およびT細胞の応答を誘発する、請求項１から１１のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１３】
経口投与または経鼻投与用に製剤されている、請求項１から１２のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１４】
アジュバントも含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１５】
ワクチンを冷蔵庫内の温度で保存することを可能にする1つまたは複数の安定剤も含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１６】
（a）1つまたは複数の追加のインフルエンザウイルス、ならびに/あるいは
（b） 実質的に純粋なインフルエンザノイラミニダーゼタンパク質、および/またはインフルエンザ血球凝集素タンパク質
も含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１７】
高病原性インフルエンザウイルスによる感染に対して対象を免疫感作する方法であって、請求項１から１６のいずれか一項に記載のワクチンを対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１８】
高病原性インフルエンザウイルス株がトリ由来のインフルエンザウイルス株である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ワクチンが経口投与または経鼻投与される、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
高病原性インフルエンザウイルス株に対する交差防御および/または交差反応性の免疫応答をもたらす、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
高病原性インフルエンザウイルス株に対して対象を免疫感作するためのワクチンの製造における、請求項１から１６のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスの使用。
【請求項２２】
ワクチンが経口投与または経鼻投与用に製剤される、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
再集合インフルエンザウイルスであって、
a）非病原性または低病原性のインフルエンザウイルスが高病原性インフルエンザウイルスと同一の血球凝集素型を有する、非病原性または低病原性のトリインフルエンザウイルスに由来する血球凝集素遺伝子、および
b）高病原性インフルエンザウイルスと異なる血球凝集素型を有する、ドナー株に由来する他の遺伝子
を含む、再集合インフルエンザウイルス。
【請求項２４】
7：1の再集合体であり、血球凝集素遺伝子のみが非病原性インフルエンザウイルスに由来する、請求項２３に記載のウイルス。
【請求項２５】
非病原性または低病原性のインフルエンザウイルスがトリウイルスである、請求項２３または２４に記載のウイルス。
【請求項２６】
非病原性または低病原性のトリインフルエンザウイルスが、A/Duck/Potsdam/1042-6/86（H5N2）、A/Vietnam/1194/04（H5N1）、A/Duck/Singapore/97（H5N3）、A/Duck/Hokkaido/67/96（H5N4）、またはA/Mallard/Netherlands/12/00（H7N3）である、請求項２５に記載のウイルス。
【請求項２７】
ドナー株が完全に特徴付けられているワクチン株である、請求項２３から２６のいずれか一項に記載のウイルス。
【請求項２８】
ドナー株が低温適応性または温度感受性の株である、請求項２３から２７のいずれか一項に記載のウイルス。
【請求項２９】
ドナー株が低温適応性でもあり、温度感受性でもある、請求項２３から２８のいずれか一項に記載のウイルス。
【請求項３０】
ドナー株がPB2遺伝子、PA遺伝子、NA遺伝子、およびM遺伝子に突然変異を有している、請求項２３から２９のいずれか一項に記載のウイルス。
【請求項３１】
ドナー株が、A/Leningrad/134/17/57（H2N2）、A/Leningrad/134/47/57（H2N2）、A/Leningrad/134/17/K7/57（H2N2）、A/Moscow/21/65（H2N2）、A/Moscow/21/17/65（H2N2）、A/Ann Arbor/6/60（H2N2）、A/Puerto Rico/8/34（H1N1）、またはA/Puerto Rico/8/59/1（H1N1）である、請求項３０に記載のウイルス。
【請求項３２】
古典的な再集合により得られる、請求項２３から３１のいずれか一項に記載のウイルス。
【請求項３３】
再集合インフルエンザウイルスが高病原性インフルエンザウイルスに対する交差防御免疫応答を誘発する、請求項２３から３２のいずれか一項に記載のウイルス。
【請求項３４】
ワクチンが交差防御をもたらす高病原性インフルエンザウイルスが、血球凝集素型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、またはH16のウイルスである、請求項３３に記載のウイルス。
【請求項３５】
ワクチンが交差防御をもたらす高病原性インフルエンザウイルスが、H5N1、H5N2、H5N8、H5N9、H7N3、H7N7、またはH9N2型のウイルスである、請求項３３または３４に記載のウイルス。
【請求項３６】
高病原性インフルエンザウイルス株に対して対象を免疫感作するためのワクチンを調製する方法であって、請求項２３から３５のいずれか一項に記載の再集合インフルエンザウイルスを、担体と、かつ場合によってはアジュバントと混合するステップを含む、方法。
【請求項３７】
ワクチンが、ワクチンを冷蔵庫内の温度で保存することを可能にする1つまたは複数の安定剤も含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ワクチンが、
（a）1つまたは複数の他のインフルエンザウイルス、ならびに/あるいは
（b）実質的に純粋なインフルエンザノイラミニダーゼタンパク質、および/またはインフルエンザ血球凝集素タンパク質
も含む、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
ワクチンが経口投与または経鼻投与用に製剤される、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
a）非病原性トリインフルエンザウイルスに由来する血球凝集素遺伝子、および
b）ドナー株に由来する他の遺伝子
を含む再集合インフルエンザウイルスを作製する方法であって、高病原性インフルエンザウイルスと同一の血球凝集素型を有する非病原性または低病原性のインフルエンザウイルスを、高病原性インフルエンザウイルスと異なる血球凝集素型を有するドナー株との再集合に供するステップを含む、方法。
【請求項４１】
再集合が古典的な再集合である、請求項４０に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
第1の態様において、本発明は、a）少なくとも、非病原性または低病原性のインフルエンザウイルスが高病原性インフルエンザウイルスと同一の血球凝集素型を有する、非病原性トリインフルエンザウイルスに由来する血球凝集素遺伝子；およびb）高病原性インフルエンザウイルスと異なる血球凝集素型を有する、ドナー株に由来する他の遺伝子；を有する再集合インフルエンザウイルスを含む、弱毒生インフルエンザウイルスワクチンを提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
第2の態様において、本発明は、a）非病原性または低病原性のインフルエンザウイルスが高病原性インフルエンザウイルスと同一の血球凝集素型を有する、非病原性または低病原性のインフルエンザウイルスに由来する血球凝集素遺伝子；およびb）高病原性インフルエンザウイルスと異なる血球凝集素型を有する、ドナー株に由来する他の遺伝子；を含む再集合インフルエンザウイルスを提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
第3の態様において、本発明は、a）非病原性トリインフルエンザウイルスに由来する血球凝集素遺伝子、およびb）ドナー株に由来する他の遺伝子を含む再集合インフルエンザウイルスを作製する方法であって、高病原性インフルエンザウイルスと同一の血球凝集素型を有する非病原性または低病原性のインフルエンザウイルスを、高病原性インフルエンザウイルスと異なる血球凝集素型を有するドナー株との再集合に供するステップを含む方法を提供する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
いくつかの実施形態において、ワクチンは経鼻投与に適した製剤となり得る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
現在用いられている最も一般的なインフルエンザワクチンは、全ウイルス粒子（ビリオン）、脂質を溶解する物質での処理に供されたビリオン（「スプリット」ワクチン）、または精製されたウイルス糖タンパク質（「サブユニットワクチン」）を含み得る、不活化ワクチンである。これらの不活化ワクチンは、主に、血球凝集素に対する抗体の生産を誘発することにより防御を行う。突然変異によるインフルエンザウイルスの抗原進化により、HAおよびNAが変化する。結果として、これらの不活化ワクチンのみが、同一のまたは交差反応性のエピトープを含む表面糖タンパク質を有する株に対して防御を行う。
【国際調査報告】
2009533477.tif 000021
2009533477.tif 000022