(57)【要約】  本発明はアルボウイルス感染症治療のための新しい医薬品製品、特に、免疫グロブリンと前記アルボウイルスに特異性を示すＦ（ａｂ）’２及びＦａｂフラグメントの濃縮物とその調製方法に関するものである。濃縮物において、前記アルボウイルスはデング・ウイルス類、黄熱病ウイルス、西ナイル・ウイルス、チクングニヤ・ウイルス、ロス・リバー・ウイルス、オニョンニョン・ウイルス、あるいはマヤロ・ウイルスの１つである。また、濃縮物において、前記免疫グロブリンは免疫グロブリンＡ、Ｇ、及びＭである。
2009531400.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬品製品としての、免疫グロブリンとアルボウイルスに特異性を示すＦ（ａｂ）’２及び／又はＦａｂフラグメントの濃縮物。
【請求項２】
前記アルボウイルスがデング・ウイルス類、黄熱病ウイルス、西ナイル・ウイルス、チクングニヤ・ウイルス、ロス・リバー・ウイルス、オニョンニョン・ウイルス、あるいはマヤロ・ウイルスの１つであることを特徴とする、請求項１に記載の濃縮物。
【請求項３】
前記免疫グロブリンが免疫グロブリンＡ、Ｇ、及びＭであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の濃縮物。
【請求項４】
前記免疫グロブリンが免疫グロブリンＧであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の濃縮物。
【請求項５】
前記免疫グロブリンが免疫グロブリンＭであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の濃縮物。  
【請求項６】
９０−９８％の免疫グロブリン及びＦ（ａｂ）’２及び／又はＦａｂを含んでいることを特徴とする、請求項１−５のいずれか１項に記載の濃縮物。
【請求項７】
５−５０％のＦ（ａｂ）’２及び／又はＦａｂを含んでいることを特徴とする、請求項１−６のいずれか１項に記載の濃縮物。
【請求項８】
前記Ｆ（ａｂ）’２及び／又はＦａｂフラグメントがＩｇＧ及び／又はＩｇＭのＦ（ａｂ）’２及び／又はＦａｂフラグメントであることを特徴とする、請求項１−７のいずれか１項に記載の濃縮物。
【請求項９】
１−１０ｍｍｏｌのマグネシウムが添加されることを特徴とする、請求項１−８のいずれか１項に記載の濃縮物。
【請求項１０】
１−１０ｍｍｏｌの亜鉛が添加されることを特徴とする、請求項１−９のいずれか１項に記載の濃縮物。
【請求項１１】
前記アルボウイルス感染症を治療するための医薬品を製造するための、請求項１−１０のいずれか１項に記載の濃縮物の利用。
【請求項１２】
局所、皮下、経口、筋肉内、あるいは静脈経路で投与される形態の医薬品を製造するための、請求項１１に記載の濃縮物の利用。
【請求項１３】
請求項１−３のいずれか１項に記載の濃縮物を調製するための方法において、
−それぞれ、十分な力価の前記アルボウイルスに対するＩｇを含んでいる少なくとも１０００件の血漿献体のプールを作成するステップと、
−単一の工程で脂質及び蛋白質汚染物質を沈殿させるステップと、
−上澄液（１）内のＩｇ濃縮物を回収するステップと、
−前記の濃縮物の一部を蛋白質分解にかけて、Ｆ（ａｂ）’２及び／又はＦａｂフラグメント（２）を得るステップと、
−画分（１）と（２）を混合するステップ
とで構成されることを特徴とする、濃縮物を調製する方法。
【請求項１４】
請求項１−５のいずれか１項による濃縮物を調製する方法において、
−それぞれ十分な力価の抗チクングニヤＩｇを含んでいる少なくとも１０００件の血漿献体のプールを作成するステップと、
−単一の工程で脂質及び蛋白質汚染物質を沈殿させるステップと、
−アルカリｐＨ領域で陰イオン交換器上で上澄液をクロマトグラフィにかけるステップと、
−ｐＨが４−７のリン酸緩衝液でＩｇＧを溶出させてＩｇＧ濃縮物（１）を得るステップと、
−オプションとして、続けて、１００−１７５ｍｍｏｌ、好ましくは１５０ｍｍｏｌのＮａＣｌを添加した、ｐＨが６−６．３の範囲のリン酸緩衝液でＩｇＡを溶出させるステップと、
−オプションとして、続けて、緩衝液に２５０−３５０ｍＭのＮａＣｌを添加したｐＨが６−７の範囲の同じリン酸緩衝液でＩｇＭを溶出させるステップと、
−オプションとして、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭ濃縮物（１）を混合するステップと、前記の濃縮物の一部を蛋白質分解にかけてＦ（ａｂ）’２及び／又はＦａｂフラグメント（２）を得るステップと、
−画分（１）と画分（２）を混合するステップ
を含むことを特徴とする、濃縮物を調製する方法。
【請求項１５】
前記上澄液のｐＨが８．９−９．１の範囲に調整され、クロマトグラフィを行う前に、クロマトグラフィ・カラムにｐＨ８．９−９．１の緩衝液が装填されることを特徴とする、請求項１４に記載の濃縮物を調製する方法。
【請求項１６】
請求項４及び８の濃縮物を調製する方法において、以下のステップ、つまり
（１）  請求項１４又は１５によるＩｇＧの濃縮物を調製するステップ、
（２）  請求項１４又は１５によるＩｇＭの濃縮物を調製するステップ、
（３）  前記ＩｇＧ濃縮物の一部と前記ＩｇＭ濃縮物の一部を混合して蛋白質分解にかけ、ＩｇＧとＩｇＭのＦ（ａｂ）’２及び／又はＦａｂフラグメントの混合物を得るステップ、そして
（４）  （１）と（３）を混合するステップ
で構成されていることを特徴とする、濃縮物を調製する方法。
【請求項１７】
Ｆ（ａｂ）’２フラグメントを得るための蛋白質分解が蛋白質に対するペプシンの割合が１重量％、ｐＨ４、そして温度が３５℃の条件で行われることを特徴とする、請求項１３−１６のいずれか１項に記載の濃縮物を調製する方法。
【請求項１８】
Ｆａｂフラグメントを得るための前記蛋白質分解がパパイン内で行われることを特徴とする、請求項１３−１７のいずれか１項に記載の濃縮物を調製する方法。
【請求項１９】
前記沈殿がカプリル酸を用いた沈殿であり、そして、上澄液内のカプリル酸の残滓がリン酸カルシウムによって除去されることを特徴とする、請求項１３−１８のいずれか１項に記載の濃縮物を調製する方法。
【請求項２０】
前記沈殿物が、少なくとも１つのろ過添加物を加えた後、ろ過によって分離されることを特徴とする、請求項１３−１９のいずれか１項に記載の濃縮物を調製する方法。
【請求項２１】
前記上澄液が溶液／洗剤で処理されることを特徴とする、請求項１３−２０のいずれか１項に記載の濃縮物を調製する方法。
【請求項２２】
前記溶出される免疫グロブリンが限外ろ過で濃縮され、通常の滅菌ろ過にかけられた後、空隙率が１００−１５ナノメートルに減少するナノメートル・レベルのフィルターを通じてろ過されることを特徴とする、請求項１３−２１のいずれか１項に記載の濃縮物を調製する方法。
【請求項２３】
薬学的に許容される安定剤が濃縮ろ過された免疫グロブリンの溶液に付加され、ついで、滅菌溶液としてパッケージ化され、必要があれば凍結及び凍結乾燥されることを特徴とする、請求項１３−２２のいずれか１項に記載の濃縮物を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアルボウイルスを措置するための新しい医薬品、つまり、アルボウイルスに特異性を示す免疫グロブリン及びＦ（ａｂ）’２及び／又はＦａｂフラグメントの濃縮物、及びその調製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
［はじめに］
そのサイクルに節足動物のベクターを用いるウイルスは一般的にアルボウイルスと呼ばれている。アルボウイルスはＷＨＯによって、基本的には、そしてほとんどの場合、自然の中では、吸血性節足動物によって感染しやすい脊椎動物間での生物感染を通じて存続しているウイルスで、それらは脊椎動物内で増殖しウイルス血症を引き起こし、その節足動物の組織内で増殖して、外部潜伏期間後に、刺咬昆虫によって、別の脊椎動物に伝染されると定義されている。
【０００３】
ウイルス血症を有するホスト（宿主）から成長した雌の蚊へのウイルスの放出は、虫が刺した時に吸い出した血液を介して起きる。このウイルスは蚊の体内で増殖して、動物の胃の障壁をくぐり抜け、唾液腺内で見出される。健康なヒトの汚染は、血管を刺す行為が行われる前に放出される蚊の抗凝血性唾液によって行われる。ヒトが発症する前にウイルス血症ホストである時間はわずか数日である。
【０００４】
今までに知られているアルボウイルスは５つのウイルス科のいずれかに属している。
−トガウイルス科、アルファウイルス属、チクングニヤ・ウイルス、オニョンニョン・ウイルス、ロスリバー・ウイルス、シンドビス・ウイルス及びマヤロ・ウイルスなどを含む２８種類
−フラビウイルス科、フラビウイルス属、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、西ナイル病ウイルス、ユーラシア温暖地域のダニ媒介脳炎ウイルス、そしてキャサヌール森林病やオムスク出血熱などを引き起こすウイルスなど６８種類
−ブンヤウイルス科、ブンヤウイルス属、（ブンヤムウェラ・ウイルスを含む１３８種類）、フレボウイルス属（リフトバレー熱ウイルスを含む４３種類）、ナイロウイルス属（クリミア−コンゴ出血熱ウイルスを含む２４種類）＋４１種類の未分類ウイルス
−レオウイルス科、オルビウイルス属（６９種類）、及びコルチウイルス族（２種類）＋６種類の未分類ウイルス
−ラブドウイルス科、ベシキュロウイルス属（１８種類）、及びリッサウイルス属（１６種類）＋３６種類の未分類ウイルス
【０００５】
熱帯地方に観察される主なウイルスについて、以下に詳述する。
デング熱は世界の熱帯及び亜熱帯地域全域に広がっており、アルボウイルスが投げかける最も重大な公衆衛生上の問題となっている。『デング１、２、３、及び４』と呼ばれる４つの抗原型があり、これらは交差防御はつくりださない。臨床的に、デング熱のいくつかの形態が確認されており、それは無症候性デング熱、古典的デング熱（ＣＤ）、そして、特に子供たちを死に至らしめることもある重篤形態、特に出血性形態の出血性デング熱（ＨＤ）及びデング・ショック症候群（ＤＳＳ）などである。これら４つのデング熱ウイルスはすべてＣＤ及びＨＤに関与している。ＨＤ発生に関与している病態生理学的メカニズムは分かっていない。最も一般的に用いられている理論は、『免疫学的促進』の現象について触れている。前記の４つの抗原型の１つに感染した人は他の３つの抗原型に対して防御されないので、二次的な異種感染がＨＤにつながるのではないか、というのである。ベクターはアエデス（シマカ）属の蚊で、アエデス・アエジプティ（ネッタイシマカ）主要なベクターであり、アエデス・アルボピクタス（ヒトスジシマカ）は地方や都市圏周辺で重要な役割を演じており、温暖な気候によく順応する。
【０００６】
西ナイル・ウイルスは、現在、デング・ウイルスに続いて最もひろく分布しているフラビウイルスであると考えられており、散発的あるいは伝染形態でヒトに影響を及ぼしている。このウイルスは１９９９年にニューヨークで発生した伝染病で、アメリカ大陸で始めて登場したと言われている（６２症例、７名死亡）。以後アメリカ合衆国ではかなり広がっており、２００３年には４４の州で９０００人に影響を及ぼし、そのうち２８６６件が脳炎で、２６４名の人が死亡している。このウイルスはアフリカ、中近東、インド、及びヨーロッパなど世界各地で見られている。蚊、特にイエカ属のものが西ナイル・ウイルス主要なベクターである。このウイルスの主なホスト（宿主）は野生のもの及び家で飼われているもの（例えばアヒルや鳩など）を含め鳥類である。鳥類がこのウイルスの広がりに重要な役割を果たしている。西ナイル・ウイルスは主にベクターである蚊を介してヒトに感染する。この感染はヒトの体内に入ってから３−６日後に突然高熱が始まることが特徴である。熱と共に、頭痛や背中の痛み、筋肉痛、咳、首リンパ節の腫れと頻繁な皮膚発疹、吐き気、胃痛、下痢、及び呼吸器症状などが起きる。１５％以下の症例で、髄膜炎、脳炎、たまにではあるが肝炎、膵炎、あるいは心筋炎などの合併症が起きる。一般的に、患者は自然に回復するが、続発症が起きることも時々ある。しかしながら、この病気は高齢者や時には若い子供達においては死につながることがある。
【０００７】
黄熱病（ＹＦ）はサハラ以南のアフリカ及び熱アメリカで依然として続いている恐るべき伝染病であり、持続的な脅威である。この病気はアマリル・ウイルスによるものである。この病気は出血性肝腎炎、アマリル・チフスなどの症状で発現し、開始あるいは『赤色』フェーズがあって三日目に沈静化し、その後、黄疸、吐き気、出血（主に胃腸管）、そして腎症状を伴ううっ滞あるいは『黄色』フェーズが続く。この伝染病は、自然界では、アマリル・ウイルスが、野生のサルを嗜好する蚊をベクターとしてサルの個体群の間を絶えず循環している点で複雑である。最初にヒトにこの病気が発生したのは、ヒトがそうしたジャングル・サイクルに入り込んだ時で、偶然の事情だった。
【０００８】
チクングニヤ（以下ＣＨＩＫと短縮して表現）はアエデス属の蚊によって媒介される。この名称はバンツー語から来ており、かがむ者、あるいは身をよじらせる者、あるいはかがむ者の病気といった意味で、それは、この病気が硬直を伴う非常に激しい関節痛をもたらし、感染した者が非常に特徴的な身を曲げた様子を示すからである。
【０００９】
９５０以上にのぼる蚊の種類のなかで、いくつかの種類の蚊がチクングニヤを媒介することができるが、現在までのところ伝染性のベクターとして確認されているのはアエデス・アエジプティとアエデス・アルボピクタスだけで、それはこれらの蚊がヒトの住む環境に順応しているからである。これらの同じ種類が、デング熱、出血性デング熱（ＨＤＦ）、高熱病などを引き起こす他のアルボウイルスも媒介している。  
【００１０】
臨床的な特徴は、デング熱の場合と同様の高熱が主たるもので（デング熱がチクングニヤと誤って判断されたり、その逆の場合もしばしばある）、身体の自由を奪うような関節痛を伴い、皮膚発疹も時々見られる。しかしながら、これまで無視されてきたような重度の症状もあり、それは激症肝炎、心臓発作、脳髄膜炎などである。ロス・リバー・ウイルス、オニョンニョン・ウイルス、及びマヤゴ・ウイルスなどのアルファウイルス属の他のいくつかのアルボウイルス（およそ３０−ＫＤのカプシドお呼び３’末端でポリアデニル化されたＲＮＡをもつ）も同様の症状をもたらすことが確認されている。
【００１１】
これらの病気の潜伏期間は、平均で４日間から７日間である。ウイルス血症、つまり血液中でのウイルスの存在と、従って伝染の可能性は５日間程度である。その後、抗体が発生する。それらの抗体は血液中に留まる。従って、免疫性は通常は一生続く。
【００１２】
黄熱病の予防にはワクチンを用いることができる。ワクチン接種はこのウイルスに曝されている個体群の間で組織的に行われる。しかしながら、この伝染病を防ぐためには、人口の６０−８０％は（自然にか、あるいはワクチン接種によって）免疫化されなければならない。抗体は接種からほぼ１０日経つと発生する。ワクチン接種は妊婦及び生後６ヶ月以前の幼児に対して行ってはならない。  
【００１３】
ダニが媒介する脳炎に対しては、ヨーロッパでもワクチンが用いられており、ＴＩＣＯＶＡ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  ＳＡ）の名称で販売されている。
【００１４】
チクングニヤ・ワクチンに関しては米国陸軍感染症医学研究所が、フェーズＩ及びフェーズＩＩの研究を行っている。
【非特許文献１】Ｅｄｅｌｍａｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，  “Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｌｉｖｅ  ｃｈｉｋｕｎｎｇｕｎｙａ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ”  ＴＳＩ−ＧＳＤ−２１８．  Ｊｕｉｎ  ２０００；  Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ．  ６２：６８１−５
【００１５】
アルボウイルスに対しては現在のところ、殺ウイルス措置は行われていない。
措置は純粋に対症的に行われており、熱を下げ、痛みを緩和することを目的としている。
【００１６】
［先行技術］
このウイルスに犯される危険のある人々に対して、Ａ型肝炎ワクチンが開発される前に、抗Ａ型肝炎抗体を含む免疫グロブリン注射を行うことの有効性が、いくつかの研究で示されている。
【非特許文献２】Ｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｐｎ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，  １９８６  Ｏｃｔ；  ５６（５）：  ２２９−３３；  Ｃｏｎｒａｄ  ＭＥ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，  １９８７  Ｊｕｌ；  １５６（１）；  ５６−６３
【００１７】
汚染された品物で切り傷を受ける可能性のあるワクチン接種を受けていない人、ＨＢ抗原ポジティブな母親の新生児（この場合は出生直後に注射を行い、ワクチン接種を開始しなければならない）、移植臓器による再感染を防ぐ必要がある肝移植を受けた患者、そして、ワクチン接種の効果が現れるのを待っているＨＢ抗原ポジティブな人の性的パートナーを護るために、Ｂ型肝炎のための特別な免疫グロブリン、あるいは抗ＨＢが広く使われている。これらの免疫グロブリンはその感染の危険がある人、あるいは感染した人と最初に接触（偶発的な接触）してから２４時間以内の人のいずれに対しても有効である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、アルボウイルス感染症を治療する、あるいは予防するための医薬品を実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、医薬品製品としての、免疫グロブリンとアルボウイルスに特異性を示すＦ（ａｂ）’２及び／又はＦａｂフラグメントの濃縮物である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の濃縮物は、アルボウイルス感染症を治療する、あるいはアルボウイルス感染症を予防することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
［発明の要約］
確立された殺ウイルス治療が存在せず、市販が認められているワクチンがたった１つであるという上に述べたような状況の下で、本出願人は罹病の危険にさらされている人々を迅速に免疫化することができる特殊な免疫グロブリンに基づいて、アルボウイルス感染症を治療する、あるいは予防するための医薬品の開発に努力してきた。
【００２２】
本出願人は、こうした治療が有効に行われるためには、免疫グロブリンとアルボウイルスに特異性を示すＦ（ａｂ）’２及び／又はＦａｂフラグメントの組み合わせが必要であることを、驚くべき方法で実証した。
【００２３】
［定義］
『濃縮物』という用語は一定の成分を取り除いて得られる製品を意味する。免疫グロブリンの濃縮物は免疫グロブリンの含有量を高めた血漿画分（ｐｌａｓｍａ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）を得るために、その血漿の一定の成分を除去することで得られる。
【００２４】
『免疫グロブリン』（Ｉｇ）とは、治癒的あるいは予防的治療に用いることができる抗体機能を有する主に血漿内に存在する天然のグロブリンを意味する。
【００２５】
免疫グロブリンはジスルフィド結合で架橋された２つの重鎖と２つの軽鎖で構成されたヘテロダイマーである。各鎖は、その抗体が向けられる抗原に対して特異性を示す（軽鎖に関しては転位Ｖ−Ｊ遺伝子でコードされ、重鎖に関してはＶ−Ｄ−Ｊでコードされる）可変ドメインあるいは領域のＮ末端と、軽鎖の場合単一のＣＬドメイン、あるいは重鎖の場合は３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）で構成される不変領域のＣ末端に組み込まれている。重鎖及び軽鎖の可変ドメインとＣＨ１及びＣＬドメインの組み合わせがＦａｂ部分を形成しており、このＦａｂ部分が各Ｆａｂがその抗原標的に結合できるようにしている非常にフレキシブルなヒンジ領域によってＦｃ領域に接続されており、一方、抗体のエフェクターとしての性質を媒介するＦｃ領域は、ＦｃγＲレセプタ及びＣｌｑなどのエフェクター分子がアクセスできる状態のままである。
【００２６】
ＩｇＧは最も一般的に使われている免疫グロブリンである（市場に出回っている抗体のうちの７５−８０％）。これは血液やリンパ液を介して体内を循環するバクテリア、ウイルス及び毒素から体を護るものである。さらに、ＩｇＧはその相補体（免疫システムの成分の１つ）とすばやく結合する。さらにＩｇＧはワクチン化のメカニズムの基礎となる免疫の中心である記憶応答にも関与している。最後に、免疫グロブリンＧは胎盤関門をくぐり抜けて、胎児に受動免疫をつくりだす。
【００２７】
ＩｇＡは主に、唾液、腸液、汗及び母乳などの分泌物内に見出される。免疫グロブリンＡの主な役割は病原性作用因子が細胞、特に、粘膜及び表皮を構成する保護細胞に結合するのを防ぐことである。
【００２８】
ＩｇＭは身体が１つの抗原に最初に接触すると分泌される免疫グロブリンである。それらは形質細胞によって放出される最初のタイプの免疫グロブリンである。血液内にＩｇＭが存在していると、それは感染していることを示す。
【００２９】
パパインによる免疫グロブリンの酵素蛋白質分解はＦａｂフラグメント（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ）として知られている２つの同じフラグメントと、１つのＦｃ（結晶化可能画分）フラグメントをつくりだす。このＦｃフラグメントは免疫グロブリンのエフェクター機能を支えている。
【００３０】
ペプシンによる蛋白質分解によって、２つのＦａｂフラグメントが２つのジスルフィド結合で架橋されたままのＦ（ａｂ’）２フラグメンが生成され、Ｆｃフラグメントはいくつかのペプチドに分割される。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントはＦ（ａｂ’）２を形成するための垂直方向ジスルフィド結合によって２つのＦａｂ’フラグメント（１つのＦａｂ’フラグメントは１つのＦａｂと１つのヒンジ領域で構成される）から形成される。
【００３１】
『クロマトグラフィ』という用語は、適切な媒体を用いてそれぞれの選択的保持力に基づいて混合物の成分を分離する方法である。
【００３２】
［発明の詳細な説明］
先ず第１に、本発明は医薬品としての、免疫グロブリン及び アルボウイルスに特異性を示すＦ（ａｂ）’２及び／又はＦａｂフラグメントの濃縮物に関連している。
【００３３】
Ｃｏｈｎによってエタノール沈殿法が開発されて以後、種々の感染症や先天的不全を治療するための免疫グロブリンを多量に含むヒト血漿画分を使用することが知られている（Ｃｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９４６，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．．  Ｓｏｃ．  ６８，  ４５９；  Ｏｎｃｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９４９，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ７１，  ５４１）。
【００３４】
抗体結合サイトを含んでいるＦ（ａｂ）’２あるいはＦａｂフラグメントは、それらが誘導される元の抗体の属性のうち、例えば、Ｆｃガンマ・レセプタに結合する能力など、一部の属性を失っている場合がある。
【００３５】
本発明で述べられているような濃縮物を使って治療できる問題のアルボウイルスは、例えば、デング・ウイルス類、黄熱病ウイルス、西ナイル・ウイルス、チクングニヤ・ウイルス、オニョンニョン・ウイルスあるいはマヤロ・ウイルスなどである。
【００３６】
本発明による濃縮物においては、免疫グロブリンＡ、Ｇ及び／又はＭの混合物と、アルボウイルスに対して特異性を示す免疫グロブリンＡ、Ｇ及び／又はＭ  のＦ（ａｂ）’２及び／又はＦａｂフラグメントの間のすべての組み合わせが可能である。
【００３７】
特に、本発明による濃縮物は、免疫グロブリンＡ、Ｇ、及びＭと、アルボウイルスに特異性を示すＦ（ａｂ）’２及び／又はＦａｂフラグメントの濃縮物である。
【００３８】
好ましくは、本発明による前記濃縮物は、免疫グロブリンＧだけの濃縮物、免疫グロブリンＭだけの濃縮物、及びアルボウイルスに特異性を示すＦ（ａｂ）’２及び／又はＦａｂフラグメントの濃縮物である。
【００３９】
特に好ましくは、本発明による濃縮物は、免疫グロブリンＧだけの濃縮物と、アルボウイルスに特異性を示すＩｇＧ及びＩｇＭのＦ（ａｂ）’２及び／又はＦａｂフラグメントの濃縮物で構成されている。
【００４０】
好ましくは、本発明による濃縮物は、少なくとも５０％のＩｇＧ免疫グロブリンと、９０−９８％の特にヒト免疫グロブリンに向けられた抗体と反応する蛋白質、特に５−５０％のＦ（ａｂ）’２及び／又はＦａｂフラグメント、そして特に少なくとも５−６０ｇ／ＬのＩｇと医薬品製剤のフラグメントを含んでいる。
【００４１】
本発明によれば、１−１０ｍｍｏｌのマグネシウム及び／又は亜鉛をその濃縮物に加えてもよい。
【００４２】
本発明の別の主題は、前記アルボウイルス感染症の治療のための医薬製品の製造のための本発明の濃縮物の使用である。
【００４３】
この治療は予防的及び／又は治癒的である。この治療は、伝染病の広がっている地域で未だ感染してない人々に対して受動的免疫性を付与するためにも、あるいは、すでにウイルスに感染した患者を治療するためにも用いることができる。
【００４４】
問題の医薬品は、局所的、経口、筋肉内あるいは静脈注射などのルートで投与される。
効果は数週間、ほぼ２１日間持続し、その伝染病あるいはその症状が続くのであれば、投与を繰り返す必要がある。
【００４５】
本発明は、本発明による濃縮物を調製する方法にも関係している。
この方法はアルボウイルスに特異性を示す免疫グロブリンの濃縮物と、同じアルボウイルスに対して特異性を示す蛋白質分解を受けた免疫グロブリンの濃複物を混合してこのアルボウイルスに特異性を示すＦ（ａｂ）’２及びＦａｂフラグメントを得るステップを含んでいる。従って、この方法においては、少なくとも１つの免疫グロブリンの濃縮物を調製するステップを必要としている。
【００４６】
この方法は、それぞれ前記アルボウイルスに対して向けられた十分な力価のＩｇを含む少なくとも１０００件の血漿献体のプールをつくることから始まる。十分な力価の血清とは、例えば、力価をイライザ法になどの方法で測定した時に、１／１０００に希釈した後で、抗チクングニヤ抗体の検出に対して依然としてポジティブであるような血清に対応している。
【００４７】
これらの献体はその病気に接触した人々、あるいはその病気を発症している患者から来るものである。
【００４８】
滴定は、Ｃ．Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗａｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １６６（１９９３），  １５７−１６４に述べられている方法に従って行うことができる。
【００４９】
この血漿プールの免疫グロブリンの含有量を増大させるために、『脂質及び蛋白質汚染物質』として知られているものを単一のステップで沈殿させる。この単一ステップでの沈殿による精製は、シュタインブーフによる沈殿条件（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈ  Ｍ．  Ａｒｃｈｉｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，  １３４，  ２７９−２８４）の下で、カプリル酸を加えてプラズマを希釈することで行われる。また、例えば、リバノール、塩化アルミニウム、塩化セチルピリジニウム、オクタン酸、ポリリン酸塩などの沈殿剤とを加え、そして、例えば、リン酸三カルシウム及びベントナイトなどの吸着剤の存在下でも行うことができる。
【００５０】
沈殿によって生じた上澄液は免疫グロブリンの濃縮物内に含まれていてもよい。従って、それはＩｇＧ、Ａ、及びＭの混合物を含んでいる。この上澄液は、例えば、オプションとして少なくとも１つのろ過添加剤を加えてろ過を行うことによって回収される。
【００５１】
遠心分離あるいはろ過によって得られるこの上澄液を、例えば、溶剤／洗浄剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）を用いた従来のウイルス非活性化処理などのウイルス非活性化処理にかけてもよい。
【００５２】
行われた沈殿が上に述べたような『カプリル酸を用いる』タイプの沈殿であるならば、上澄液内の残基はＰＯ４カルシウム（これはＣａＰＯ４：つまりリン酸カルシウム）によって取り除かれる。
【００５３】
ＩｇＧ、ＩｇＡ、あるいはＩｇＭの濃縮物を得るためには、特許ＥＰ１３８５８８６に述べられている教示、特に、ｐＨ調整、先行付加カラム上での吸着、免疫グロブリンとそれに伴う蛋白質を含む上澄液のカラム上での吸着、カラム洗浄及びそれに続く種々の免疫グロブリン類、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、あるいはＩｇＭの溶出などに関する方法を適用することができる。ウイルス非活性化ステップの後、この上澄液はさらにｐＨをアルカリ領域にした状態で行われる陰イオン交換体を用いたクロマトグラフィによる精製ための追加ステップにかけられる。具体的には、上澄液のｐＨを予め８．９から９．１の範囲に調整して、そのカラムにｐＨが８．９から９．１の範囲の緩衝液を充填する。このクロマトグラフィ・ステップで免疫グロブリンの前記カラムへの吸着と捕捉されない蛋白質の溶出液内への放出が行われる。クロマトグラフィは、例えば、ＤＥＡＥ、ＴＭＡＥ、あるいはＱＡＥグループとグラフト結合した網目状多糖類あるいはビニル・ポリマー・ゲル上で行うことが出来る。
【００５４】
捕捉されない蛋白質を除去するために加えた緩衝液と同じ緩衝液でカラムを洗浄した後、リン酸緩衝液で免疫グロブリンＧが溶出され、そのｐＨは４−７の範囲、好ましくは６．２である。
【００５５】
次に、ＩｇＡを集めるために１００―１７５ｍ、好ましくは１５０ｍＭのＮａＣｌで補強したｐＨが６−６．３の範囲の同じリン酸緩衝液で溶出を行うことができるが、この操作はオプション可能である。
【００５６】
さらにオプション可能な溶出ステップとして、ｐＨを６−７の範囲に調整した２５０−３５０ｍＭ、好ましくは３００ｍＭのＮａＣｌで補強した同じ緩衝液を用いて、ＩｇＭを収集することができる。
【００５７】
上に述べたような濃縮物を混合することで、ＩｇＡ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの間のどのようなタイプの混合物でも可能である。
【００５８】
このようにして溶出、回収された免疫グロブリンは限外ろ過により、さらに、通常の滅菌ろ過にかけ、次に空隙率が１００−１５ナノメートルに減少するナノメートル・レベルのフィルターを通じてろ過することで濃縮することができる。
【００５９】
濃縮され、ろ過された免疫グロブリンの溶液に対して、特許出願ＷＯ２００４／０９１６５６に述べられているような薬学的に許容できる安定剤を加え、次にその溶液を滅菌溶液としてパッケージ化し、さらに必要であれば凍結及び／又は凍結乾燥される。
【００６０】
ナノ・レベルでろ過することによって、ウイルス非活性化溶液／洗剤処理に対しても抵抗性を示すウイルスを除去することが可能になる。
【００６１】
上に述べたようにして得られた免疫グロブリン、あるいは上に述べたような方法で得られた別の免疫グロブリンの濃縮物の一部は、Ｆ（ａｂ）’２及び／又はＦａｂフラグメントを得るために蛋白質分解にかけられる。そして、Ｉｇの濃縮物と蛋白質分解で生じる混合物を混ぜ合わせる。
【００６２】
従って、ＩｇＧとＩｇＧ及びＩｇＭのＦ（ａｂ）’２及び／又はＦａｂフラグメントの濃縮物は、以下のようにして得られる。
（１）  ＩｇＧの濃縮物を上に述べた手順で調製する。
（２）  ＩｇＭの濃縮物を上に述べた手順で調製する。
（３）  ＩｇＧ濃縮物の一部とＩｇＭ濃縮物の一部を混合、消化して、ＩｇＧとＩｇＭのＦ（ａｂ）’２及び／又はＦａｂフラグメントを得る。
（４）  （１）と（３）を混合する。
【００６３】
Ｆ（ａｂ）’２フラグメントを得るためには、１％ペプシンを用いて蛋白質分解をｐＨ４．０、温度３５℃の条件で行う。このペプシンの比率は、ペプシンの重量と前記濃縮物の蛋白質の総重量との割合を示している（ＩＧＬＯＯプロトコール）。
【００６４】
Ｆａｂフラグメントを得るためには、１％パパインを用いて蛋白質分解を行う。この比率はパパインの重量と前記濃縮物の蛋白質の総重量との比率である。
【００６５】
免疫グロブリンＧ、Ａ、及び／又はＭの蛋白質分解もプラスミン及び／又はトリプシンを用いて行うことができ、これらの蛋白質分解酵素の用い方は当業者には良く知られている。
【実施例】
【００６６】
以下に示す実施例は、本発明の具体的な実施の形態を示しているが、これは本発明の範囲の限定を意図するものではない。
【００６７】
抗チクングニヤ免疫グロブリン濃縮物の調製
【００６８】
１−１．  血漿プールの作成
最近チクングニヤ・ウイルスに感染しその症状が治癒したボランティア・ドナーから抗チクングニヤ抗体を多量に含んだ血漿１リットルを集めた。抗体の力価はイライザ（Ｅｌｉｓａ）法で測定し、ウイルス抗原を微少滴定プレート上に固定し、免疫グロブリンに対する試薬でラベルしたホースラディッシュ・ペルオキシダーゼを介して特定の抗体の存在を視認できるようにした。血漿プールを作成するために、『特殊な』イライザ法を用いて少なくとも１／１０００の希釈率でポジティブと評価されたサンプルを確保した。
【００６９】
１−２．  免疫グロブリンの調製
ステップ１−１で得られた血漿プールを−３℃に冷却して、冷却中に、最終エタノール濃度が８％になるのに十分な量のエタノールを加える。それによって生じた沈殿物は廃棄しる。この上澄液のｐＨを、例えば−５℃に冷却した酢酸緩衝液を加えて５．９に調節して、さらに、最終的なエタノール濃度が１９％になるようにエタノールを加える。それによって生じた沈殿物を遠心分離で回収して、例えば、酢酸緩衝液に再懸濁し、最終的なｐＨを４．７から４．９の範囲に調整する。
【００７０】
次に、２０℃の温度で激しく攪拌しながらオクタン酸を加えて、オクタン酸の最終濃度を２０ｇ／ｌとする。
【００７１】
これによって得られる沈殿物を遠心分離あるいは粒状材料を用いたろ過で分離して、廃棄する。リン酸三カルシウムあるいは活性炭素をその上澄液に加えて、その混合物を深床ろ過で清澄にする。
【００７２】
上の清澄化ステップで得られた上澄液を含む免疫グロブリンのｐＨを、例えば、ＮａＯＨ／グリシン緩衝液を加えてｐＨ９に調節し、その上澄液をグリシン／ＮａＣｌ緩衝液をｐＨ９で充填した陰イオン交換カラム（例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ）に入れる。
【００７３】
２８０ｎｍでのカラム出口ＯＤが、基線確立後のＯＤ２８０に近づくまで、充填緩衝液で洗浄を行う。
【００７４】
その後、ｐＨ６．２の第１のリン酸ナトリウム緩衝液でＩｇＧ溶出を行う。そして、第２の溶出を３００ｍＭのＮａＣｌで補強したリン酸緩衝液で行う。それによる溶出物はＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＧ４の一部を含んでいる。この精製のための詳細な操作方法はＥＰ１３８５８８６に記載されている。
【００７５】
１−３．  チクングニヤに対する活性濃縮物の調製
ＩｇＧを含んでいる最初の溶出液の２５％を取り出して、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＭを含んでいる溶出液に加える。この免疫グロブリン混合物を膜上で限外ろ過して５０ｇ／ｌまで濃縮し、そのカットオフ閾値を３０ＫＤ以下とする。
【００７６】
この濃縮された混合物のｐＨをｐＨ３．８−４．２のクエン酸緩衝液で膜分離精製することによって調整し、この領域の酸性ｐＨとする。この溶液をペプシン（１０００  ＦＩＰ／ｍｇ）で補強して、ペプシンの量がその濃縮された混合物の中に含まれている蛋白質の総量の１％となるようにする。次に、この溶液を０．２μｍで滅菌状態でろ過して、３７℃の温度で２０時間培養する。
【００７７】
培養後、例えば、ｐＨ６．２±０．２の水酸化ナトリウムを加えて蛋白質加水分解物で中和する。中和された蛋白質加水分解物をＯＤ２８０が０．００５程度になるまで、ｐＨ６．２±０．２でグリシン緩衝液で膜分離精製する。この場合、ＯＤ２８０は３０ＫＤカットオフ閾値膜のろ過物線上で測定したものである。
【００７８】
ペプシン蛋白質分解で得られたペプチドのうち、そのサイズが３０ＫＤ以下のものは前記のカットオフ閾値膜を通して廃棄する。従って、得られた蛋白質加水分解物はＦａｂフラグメントとＦ（ａｂ）’２フラグメントは含んでいるが、Ｆｃフラグメントは含んでいない。
【００７９】
次に、この得られた蛋白質加水分解物をＩｇＧを含んでいる最初の溶出液の残りの７５％と混合する。この混合物を次に限外ろ過で濃縮して、最終濃度が選択された投与経路に応じて５０−１６０ｇ／ｌの範囲となるようにする。この濃縮物の力価をＥｄｅｌｍａｎ，  Ｒら（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｙｇｉｅｎｃｅ，  ６２（６），  ２０００，  ｐ．  ６８１−６８５）に述べられている方法に従って測定する。この濃縮物の抗チクングニアに特異性を示す抗体において上に述べた方法で得られた力価は最初の血漿のそれと比較して、少なくとも３−１０倍高い。
【００８０】
１−４．  製剤の利用
ステップ１．３で得られた濃縮物を薬学的に許容される賦形剤、例えば、最終濃度が０．２２Ｍであるようなグリシンなどを含む製剤、あるいは、特許出願ＷＯ２００４／０９１，６５６に述べられているものと混合して安定化させる。この濃縮物に付加される製剤のｐＨは液体混合物を得るのに適したものとし、そのｐＨ値は４．２から５．６の範囲である。
【００８１】
得られた液体混合物は、例えば、受け入れ側の静脈学的状態に応じて、静脈、皮下、あるいは筋肉内注射などで投与することができる。
【００８２】
投与される量は０．２−０．８ｍｌ／ｋｇの範囲で、伝染病の場合は、特に感染の危険のある人々、例えば高齢者、妊婦、あるいは新生児に対して、３週間毎に予防的措置として投与することができる。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明の濃縮物は、アルボウイルス感染症治療のための新しい医薬品であり、アルボウイルス感染症の治療、あるいはアルボウイルス感染症の予防に利用することができる。
【国際調査報告】
2009531400.tif 000003
2009531400.tif 000004
2009531400.tif 000005
2009531400.tif 000006
2009531400.tif 000007
2009531400.tif 000008