(57)【要約】  固体支持材に吸着される抗原を検定する方法が提供される。  前記方法は、  ａ）固体支持抗原抗体複合体を形成するために、固体支持材に吸着される抗原の懸濁液を、抗原に対し任意検出可能標識一次抗体の溶液または懸濁液に接触させ、  ｂ）前記一次抗体が検出可能に標識されている場合、検出可能標識を任意に測定して抗原の量を決定し、または  ｃ）固体支持抗原抗体複合体を固体支持抗原抗体複合使用検出可能標識プローブに接触させ、次いで  ｄ）プローブ上の検出可能標識を測定し、抗原量を決定することを含む。  前記抗原は望ましくはサブユニットワクチンの成分であり、もっとも望ましくは炭疽菌防御抗原である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）固体支持抗原抗体複合体を形成するために、固体支持材に吸着された抗原の懸濁液を、抗原に対し任意検出可能標識一次抗体の水溶液または懸濁液に接触させ、
ｂ）前記一次抗体が検出可能に標識されている場合、検出可能標識を任意に測定して抗原の量を決定し、または
ｃ）固体支持抗原抗体複合体を固体支持抗原抗体複合体用の検出可能標識プローブに接触させ、次いで
ｄ）プローブ上の検出可能標識を測定し、抗原の量を決定する、
ことを含むことを特徴とする固体支持材に吸着される抗原を分析する方法。
【請求項２】
前記抗原がサブユニットワクチンの成分であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記抗原が炭疽菌防御抗原であることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記一次抗体が炭疽菌防御抗原のドメイン４の抗体であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記固体支持材がリン酸カルシウム、リン酸アルミニウムまたはオキシ水酸化アルミニウムより成るグループから選択されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記固体支持材に吸着される前記抗原が水性緩衝液に懸濁されることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記緩衝液が７乃至８の範囲のｐＨ、また望ましくは約７．５のｐＨを持つことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記一次抗体が水性緩衝液で溶液として用いられることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記緩衝液が７乃至８の範囲のｐＨ、または望ましくは約７．５のｐＨを持つことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
固体方法抗原抗体複合体用の検出可能標識プローブが用いられることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記固体支持抗原抗体複合体用の検出可能標識プローブが一次抗体／抗原複合体の二次抗体を含むことを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記プローブが水性緩衝液で溶液として用いられることを特徴とする請求項１０または１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記緩衝液が７乃至８の範囲のｐＨ、または望ましくは約７．５のｐＨを持つことを特徴とする請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原、とりわけサブユニットワクチンの成分、また特に炭疽菌防御抗原を分析する方法に関し、またより特異的には、前記抗原の生存能力または潜在能力を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くのワクチン製剤は、固体無機支持材、とりわけアルヒドロゲルなどのコロイド状水酸化アルミニウムなどに吸着された抗原を含む。支持材への吸着は、抗原の従来の多くの分析法、例えばイムノアッセイ法などを受け入れ難くする。イムノアッセイ法はこのような製剤を分析するものとしてこれまで提供されてきたが、しかしこれらの方法は抗原の支持材からの脱着で抗原を損傷するリスクを冒し、または分析の間接法に依存することになり、後者の場合、抗体の既知の量が抗原と接触され、残余の抗体が決定され、その差異で抗原の量が決定されることになる。多くの抗原にとって、とりわけ炭疽菌防御抗原の場合、吸着力は貯蔵と共に増加し、脱着での損傷のリスクはより増大することになる。従って、固体支持材への吸着抗原を分析する代替方法、とりわけ生存能力または潜在能力の信頼できる尺度として役立ち、またｉｎ  ｖｉｔｒｏで適用できる方法を同定することが望まれる。
【発明の開示】
【０００３】
本発明に基づいて、
ａ）固体支持抗原抗体複合体を形成するために、固体支持材に吸着される抗原の懸濁液を、抗原に対し任意検出可能標識一次抗体の水溶液または懸濁液に接触させ、
ｂ）前記一次抗体が検出可能に標識されている場合、検出可能標識を任意に測定して抗原の量を決定し、または
ｃ）固体支持抗原抗体複合体を固体支持抗原抗体複合体用の検定可能標識プローブに接触させ、次いで、
ｄ）プローブ上の検出可能標識を測定し、抗原の量を決定する、
ことを含む固体支持材に吸着される抗原を分析する方法が提供される。
【０００４】
本発明の方法で分析される抗原は、通常の組換えタンパク質ベースのサブユニットワクチンであるサブユニットワクチンの成分を含む。このような抗原の例は、Ｂ型肝炎防御抗原、単純ヘルペスウイルス抗原、インフルエンザ抗原、先天性サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、結核菌抗原、ＨＩＶ抗原、ジフテリア抗原、破傷風菌抗原、百日咳抗原およびイェルシニア・ペスト菌防御抗原、１個、２個またはそれ以上の抗原タンパク質を含むような抗原を含む。もっとも望ましくは、前記抗原は炭疽菌抗原である。
【０００５】
本発明に基づく方法で分析できる炭疽菌防御抗原は、従来の技術で公知である。望ましくは、炭疽菌防御抗原は、図２（配列識別番号１）で与えられる配列を持つ抗原のように、本出願で引用例として組み込まれたＷＯ０２／０４６４６に記載の組換え防御抗原である。
【０００６】
抗原が吸着される固体支持材の例は、望ましくは薬理許容アジュバント、とりわけリン酸カルシウムなどのコロイド系アジュバント、「アジュホス」（ＡｄｊｕＰｈｏｓ）の商標で知られるコロイド系リン酸アルミニウムなどのリン酸アルミニウム、「アルヒドロゲル」の名前で一般にもっとも知られるもっとも望ましいオキシ水酸化アルミニウムなどがある。オキシ水酸化アルミニウムは、また水酸化アルミニウムすなわちアラムでも知られる。
【０００７】
固体支持材に吸着される抗原は、液体、その殆どが水溶液の懸濁液として分析される。もっとも普通には液体は緩衝食塩水、とりわけリン酸緩衝食塩水またはトリス緩衝食塩水などの水溶液である。緩衝液が用いられると、前記緩衝液は望ましくは７．５のｐＨを持つ。固体支持材に吸着された抗原が懸濁液の形でない場合には、そのような懸濁液は従来の技術を用いて容易に調製される。
【０００８】
本発明の方法で一次抗体またはプローブとして用いることのできる抗体は、望ましくはモノクローナル抗体である。多くの実施例で一次抗体は、抗原の活性を提示する炭疽菌防御抗原の領域に対す抗体として選別され、望ましくは抗体は炭疽菌防御抗原のドメイン４の抗体である。とりわけ望ましい抗体は、配列識別番号１を持つ抗原の（ＩＲＫＩＬＳＧＹＩＶＥＩＥＤＴＥＧＬ、配列識別番号２）を含むアミノ酸６３６乃至６５３、（ＲＹＤＭＬＮＩＳＳＬＲＱＤＧＫＴＦＩ、配列識別番号３）を含むアミノ酸６６０乃至６７７、または（ＦＩＤＦＫＫＹＮＤＫＬＰＬＹＩ、配列識別番号４）を含むアミノ酸６７６乃至６９０により定義される領域と結合する抗体である。もっとも望ましい抗体は、配列識別番号１を持つ抗原の６８４の位置でアスパラギン酸残基を含む領域に対する抗体である。適切な抗体を同定する方法は、従来の技術で周知である。適切な一次抗体の例は、ユナイテッド・ステーツ・バイオロジカルで商業的に利用できる抗防御抗原モノクローナル抗体クローン２Ｂ１８（マウス）、ＲＤＩ−フィッツジェラルドで商業的に利用できる抗防御抗原モノクローナル抗体クローンＲＤＩ−ＴＲＫ３ＢＡ１６−Ｃ３（クローンＣ３；マウス）、および同ＲＤＩ−フィッツジェラルドで商業的に利用できる抗防御抗原モノクローナル抗体クローンＲＤＩ−ＴＲＫ３ＢＡ１６−１０６マウスｍＡｂを含む。
【０００９】
一次抗体は懸濁液として用いることができる。望ましくは、一次抗体は溶液、もっとも多くは水溶液、またもっとも一般的には緩衝食塩水、例えばリン酸緩衝食塩水またはトリス緩衝食塩水などの水性緩衝液として用いられる。ある実施例では、用いられる緩衝液はブロッキング緩衝液を含む。水性緩衝液が用いられる場合、それは７乃至８の範囲ｐＨ、もっとも望ましくは約７．５のｐＨを持つ。多くの実施例で、一次抗体は２１００倍まで過剰、一般には５００倍まで過剰の予測抗原量までのモル過剰濃度で用いられる。
【００１０】
用いられる一次抗体／抗原複合体のプローブは、一次抗体／抗原複合体に対する二次抗体、およびタンパク質Ａおよびタンパク質Ｇなどの免疫グロブリン結合タンパク質を含む。
【００１１】
一次抗体／抗原複合体に対する二次抗体が用いられる場合は、二次抗体は望ましくは複合体の一次抗体部分に対する抗体である。この場合、二次抗体の選別は、一次抗体の性質に依存し、とりわけ一次抗体が産生される場合にはそうである。二次抗体と一次抗体との組合わせの例は従来の技術で周知である。多くの場合、一次抗体がモノクローナルの場合はマウスでしばしば産生され、またポリクローナルの場合にはヤギおよびラビットで産生される。望ましい二次抗体はＩｇＧ抗マウス抗体、およびＩｇＧ抗ラビット抗体を含む。
【００１２】
二次抗体は懸濁液として用いることができる。望ましくは二次抗体は溶液、もっとも多くは水溶液、またもっとも一般的には緩衝食塩水、例えばリン酸緩衝食塩水またはトリス緩衝食塩水などの水性緩衝液として用いられる。ある実施例では、用いられる緩衝液はブロッキング緩衝液を含む。水性緩衝液が用いられる場合、それは７乃至８の範囲のｐＨ、もっとも望ましくは約７．５のｐＨを持つ。多くの実施例で、二次抗体は１００倍まで過剰、一般には２０倍まで過剰、例えば１．５乃至１０倍など過剰の範囲で一次抗体／抗原複合体の予測量までのモル過剰濃度で用いられる。
【００１３】
検出可能標識およびそれらの検出方法は、従来の技術で周知であり、それらは１２５Ｉ標識などの放射線標識；フルオレセインおよびＦＩＴＣ標識などの蛍光標識；アビジンまたはストレプトアビジンでのビチオン化標識；およびホースラディッシュ−ペルオキシグーゼおよびアルカリホスファターゼ標識などの酵素標識を含む標識は従来周知の方法で添付することができる。
【００１４】
固体支持抗原と抗体／抗原複合体との接触は遠心分離管でたやすく達成することができる。遠心分離管の使用は、遠心分離による固体支持抗原と固体支持抗体／抗原複合体の溶液および懸濁液からの分離を容易にする。他の実施例において、個体支持抗原と抗体／抗原の間の接触は、ウエル平板、通常は９６ウエル平板で容易に達成される。ウエル平板の面積は適切に選択され、固体支持抗原と固体支持抗体／抗原複合体の溶液または懸濁液からの分離は平板を回転させることで達成され、かくして固定支持抗原または固定支持抗体／抗原複合体は平板上に残り、一方、溶液または懸濁液は上澄み注ぎまたはピペレット移しなどで除去される。望ましくは従来公知の他の方法、例えば分離が濾過で行われるフィルター平板（ウエル基盤がフィルター膜のウエル平板）を用いて行われるようなものも用いられる。ある実施例では、とりわけピペット、もっとも望ましくは多チャンネルピペットを用いて固定量の上澄みを除去することで好結果を達成することができる。
【００１５】
本発明に基づく方法は、免疫学的検定法の従来の慣行に基づいて洗浄液とブロッキング剤を一般に使用する。
【００１６】
使用できるブロッキング剤は従来の技術で公知である。望ましいブロッキング剤は、例えばトウィーン２０ＴＭなどのポリアルコキシル化アルカノール酸ソルビタン（ｐｏｌｙａｌｋｙｌａｔｅｄ  ｓｏｒｂｉｔａｎ  ａｌｋａｎｏａｔｅｓ）非イオン系界面活性剤、また粉ミルクタンパク質（カゼイン）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのような非特異的タンパク質を含む。望ましいブロッキング剤は、ポリアルコキシル化アルカノール酸ソルビンタン、およびカゼインならびに随意にＢＳＡとの混合物を含む。多くの実施例において、インバイトロゲンでウエスターンブリーズＴＭキットの部分として商業的に利用できるブロッキング緩衝液を用いてより成果をあげることができた。
【００１７】
本発明は下記の実施例により限定することなく説明することができる。
【００１８】
実施例１
試薬
試料−０．２ｍｇ／ｍＬの炭疽菌防御抗原濃度を持つ製剤が以下の通り準備された。０．４ｍｇ／ｍＬ炭疽菌防御抗原を持つ溶液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）での０．５ｍＬの炭疽菌防御抗原溶液を更に１．１２５ｍＬのＰＢＳで希釈して用意された。アルヒドロゲル懸濁液（シグマ、Ａ−８２２２）０．２６ｍＬが１．２２％の食塩水０．７４ｍＬと混合された。これに対し０．４ｍｇ／ｍＬ炭疽菌防御抗原液１ｍＬが加えられ、次いで室温で１時間ゆるやかに混合された製剤が作られた。
【００１９】
一次抗体−下記表１にて詳細説明
二次抗体−シグマＦ０２５７抗マウスＩｇＧ（全分子）−ヤギに産生されたＦＩＴＣ抗体（２０μｇ／ｍＬ、すなわち１０ｍＬの抗体希釈液での濃抗体１００μＬ）
ブロッキング抗体洗浄および抗体希釈液−インバイトロジェンのウエターンブリーズキットからのものでＰＶＤＦ膜用ウエスターンブリーズキット使用説明書に基づき準備される。
【００２０】
ファルコン９６−ウエル組織培養処置平板（透明ポリスチレン）でウエル量が３５０μＬのものが使用された。ブロッキング液２５０μＬプラス十分混合された試料５μＬが無作為にウエル内に負荷された。ギルソン型通常単一チャンネルピペットが平板への試料追加に使用された。他の溶液の追加は多チャンネルピペットが平板への試料追加に使用された。他の溶液の追加は多チャンネルピペットを使用して行われた。
【００２１】
混合はしぶきを避けるために５００ｒｐｍの振動速度でマイクロ平板攪拌機プラットフォームで行われた。遠沈はマイクロ平板ロータを用いてセンチュリオン遠心分離機で行われた。
【００２２】
上澄みは、ふたをとり、平板を水平面から約２０°の角で転倒し、１秒間約１回の速度でそれをゆっくり振動させて除去された。固形物は下部にゆるやかに置かれているので、平板を激しく振動させてはならない。平板の激しい振動は固形物のあるものを移動させ、分析の精度を減じる。
【００２３】
用いられたシークエンスは以下の通りである。
【００２４】
免疫学的検査手順
（１）各ウエルに２５０μＬのブロッキング液を追加
（２）各ウエルに５μＬの試料を追加
（３）攪拌プラットフォームで５００ｒｐｍ、３０分混合
（４）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（５）上澄みを除去
（６）一次抗体溶液２００μＬを追加
（７）攪拌プラットフォームで５００ｒｐｍ、１時間混合
（８）３ｋｒｐｍで５分回転
（９）上澄みを除去
（１０）抗体洗浄液２５０μＬを追加
（１１）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（１２）上澄みを除去
（１３）抗体洗浄液２５０μＬを追加
（１４）攪拌プラットフォームで５００ｒｐｍ、３０分混合
（１５）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（１６）上澄みを除去
（１７）水２５０μＬを追加
（１８）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（１９）上澄みを除去
（２０）二次抗体溶液２００μＬを追加
（２１）攪拌プラットフォームで５００ｒｐｍ、１時間混合
（２２）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（２３）上澄みを除去
（２４）抗体洗浄液２５０μＬを追加
（２５）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（２６）上澄みを除去
（２７）抗体洗浄液２５０μＬを追加
（２８）攪拌プラットフォームで５００ｒｐｍ、３０分混合
（２９）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（３０）上澄みを除去
（３１）蛍光標識を可溶化するため８Ｍ尿素２００μＬを追加
（３２）攪拌プラットフォームで５００ｒｐｍ、３０分混合
（３３）平板リーダーを用いてウエルの蛍光を読み取る
【００２５】
蛍光はバイオ−ＴＥＫシナジーＨＴを持ちいて４８５ｎｍの励起波長と５２８２ｎｍの発光波長で読み取られた。
【００２６】
生存能力の尺度としての本発明の効用を説明する目的で、免疫学的検定手順が炭疽菌防御抗原製剤の３個の試料を検定するために用いられた。２個の試料は保存安定試験用製品で活性を失ったものとして知られており、また１個の試料は保存許容活性を持つ保存安定試験用試料であった。標準品として、炭疽菌防御抗原製剤の最近のバッチから希釈系列が製剤の希釈物であるが、炭疽菌防御抗原を含まないブランク品と共に用意された。３個の検定試料と標準品はすべて同一組成であった。
【００２７】
３個の異なる一次抗体が表２で示されるように用いられ、そのそれぞれは炭疽菌防御抗原のドメイン４と結合することを示していた。
【００２８】
表３は試験された試料を示す。
【００２９】
各資料の６個のウエル、すなわち３個の一次抗体それぞれの２個が検定された。
【００３０】
蛍光測定のために、バイオ−ＴＥＫシナジーＨＴ平板リーダーが用いられた。
【００３１】
【表１】
2009533668.tif 000002
【００３２】
【表２】
2009533668.tif 000003
【００３３】
結果
３個の溶液およびブランク品に対する平均蛍光結果（下記表３で示される）が各抗体の標準曲線を示すようにプロットされた。標準曲線は下記図１に示される。
【００３４】
【表３】
2009533668.tif 000004
【００３５】
［図１］
2009533668.tif 000005
【００３６】
試料１乃至３それぞれから得られた平均蛍光値を用いて各試料の相対活性を決定することができた。平均蛍光値および活性パーセントは下記表４で示される。
【００３７】
【表４】
2009533668.tif 000006
【００３８】
前記結果から許容活性を持つものとして知られた試料１は、活性標準と比較して非常に良好な応答を示したのに対し、効力を喪失したものとして知られる試料はきわめて劣った成果を示した。この結果は、本発明に基づく方法が炭疽菌防御抗原のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生存能力／効用検定に使用できることを示している。
【００３９】
実施例２
４０℃保存安定性試験からの製剤試料および２−８℃で保存された対照が前記実施例１で示された方法のバリエーションで分析された。標準曲線は、２−８℃で７日間保存された同一方法で準備された既知の生存能力を持つ標準物質からの希釈系列を用いて作られた。
【００４０】
すべての製剤およびアルヒドロゲル懸濁液は強制排出ピペットを用いて操作された。
【００４１】
使用された一次抗体は、０．０１ｍｇ／ｍｌ濃度のＲＤＩ−ＴＲＫ３ＢＡ１６−Ｃ３（クローンＣ３；マウス−ＲＤＩ−フィッツジェラルドで商業的利用可能）であった。使用された二次抗体は、６．２４６ｍｇ／ｍｌ（希釈剤１ｍｌあたり供給濃縮物１５μｌ）のヤギで産生されたシグマＦ０５７抗マウスＩｇＧ（全分子）−ＦＩＴＣ抗体であった。
【００４２】
使用されたブロッキング緩衝液および抗体洗剤は、インバイトロゲンから供給されたウェスターン・ブリーズキットから得られた。
【００４３】
各試料はＰＢＳで０．２６％アルヒドロゲルで１：２で希釈され、ブロッキング緩衝液１２５μｌの溶液で１：２４で更に希釈された本溶液は、約３５０Ｌのウエル容量を持つファルコン９６．ウエル組織培養処置平板（透明ポリスチレン）のウエルに加えられた。
【００４４】
検定は、次いで下記の手順で続けられた。
【００４５】
（１）１２５μｌブロッキング緩衝液でウエルを満たす
（２）５００ｒｐｍで３０分攪拌プラットフォーム上で混合
（３）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（４）多チャンネルピペットを用いて１５０μｌの上澄みを除去
（５）一次抗体溶液２００μＬを追加
（６）５００ｒｐｍで１時間攪拌プラットフォーム上で混合
（７）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（８）多チャンネルピペットを用いて２００μｌ上澄みを除去
（９）抗体洗剤２００μＬを追加
（１０）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（１１）多チャンネルピペットを用いて上澄み２００μｌを除去
（１２）抗体洗剤２００μＬを追加
（１３）５００ｒｐｍで５分攪拌プラットフォーム上で混合
（１４）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（１５）多チャンネルピペットを用いて上澄み２００μｌを除去
（１６）ブロッキング緩衝液２００μＬを追加
（１７）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（１８）多チャンネルピペットを用いて上澄み２００μｌを除去
（１９）ブロッキング緩衝液２００μＬを追加
（２０）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（２１）多チャンネルピペットを用いて上澄み２００μｌを除去
（２２）二次抗体溶液２００μＬを追加
（２３）５００ｒｐｍで１時間攪拌プラットフォーム上で混合
（２４）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（２５）多チャンネルピペットを用いて上澄み２００μｌを除去
（２６）抗体洗剤２００μＬを追加
（２７）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（２８）多チャンネルピペットを用いて上澄み２００μｌを除去
（２９）抗体洗剤２００μＬを追加
（３０）５００ｒｐｍで５分攪拌プラットフォーム上で混合
（３１）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（３２）多チャンネルピペットを用いて上澄み２００μｌを除去
（３３）ブロッキング緩衝液２００μＬを追加
（３４）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（３５）多チャンネルピペットを用いて上澄み２００μｌを除去
（３６）ブロッキング緩衝液２００μＬを追加
（３７）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（３８）多チャンネルピペットを用いて上澄み２００μｌを除去
蛍光はバイオ−ＴＥＫシナジーＨＴを用いて４８５ｎｍの励起波長と５２８ｎｍの発光波長で読み取られた。
【００４６】
検定の結果、２−８℃で保存された対照試料は製剤の４５８．８μｌ抗原ｒＰＡ／ｍｌに等しい活性を持っていたのに対し、４０℃で保存された試料は残量抗原ｒＰＡがゼロであったことを示した。
【００４７】
［図２］
2009533668.tif 000007
【配列表】
2009533668000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年5月18日(2009.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原、とりわけサブユニットワクチンの成分、また特に炭疽菌防御抗原を分析する方法に関し、またより特異的には、前記抗原の生存能力または潜在能力を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くのワクチン製剤は、固体無機支持材、とりわけアルヒドロゲルなどのコロイド状水酸化アルミニウムなどに吸着された抗原を含む。支持材への吸着は、抗原の従来の多くの分析法、例えばイムノアッセイ法などを受け入れ難くする。イムノアッセイ法はこのような製剤を分析するものとしてこれまで提供されてきたが、しかしこれらの方法は抗原の支持材からの脱着で抗原を損傷するリスクを冒し、または分析の間接法に依存することになり、後者の場合、抗体の既知の量が抗原と接触され、残余の抗体が決定され、その差異で抗原の量が決定されることになる。多くの抗原にとって、とりわけ炭疽菌防御抗原の場合、吸着力は貯蔵と共に増加し、脱着での損傷のリスクはより増大することになる。従って、固体支持材への吸着抗原を分析する代替方法、とりわけ生存能力または潜在能力の信頼できる尺度として役立ち、またｉｎ  ｖｉｔｒｏで適用できる方法を同定することが望まれる。
【発明の開示】
【０００３】
本発明に基づいて、
ａ）固体支持抗原抗体複合体を形成するために、固体支持材に吸着される抗原の懸濁液を、抗原に対し任意検出可能標識一次抗体の水溶液または懸濁液に接触させ、
ｂ）前記一次抗体が検出可能に標識されている場合、検出可能標識を任意に測定して抗原の量を決定し、または
ｃ）固体支持抗原抗体複合体を固体支持抗原抗体複合体用の検定可能標識プローブに接触させ、次いで、
ｄ）プローブ上の検出可能標識を測定し、抗原の量を決定する、
ことを含む固体支持材に吸着される抗原を分析する方法が提供される。
【０００４】
本発明の方法で分析される抗原は、通常の組換えタンパク質ベースのサブユニットワクチンであるサブユニットワクチンの成分を含む。このような抗原の例は、Ｂ型肝炎防御抗原、単純ヘルペスウイルス抗原、インフルエンザ抗原、先天性サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、結核菌抗原、ＨＩＶ抗原、ジフテリア抗原、破傷風菌抗原、百日咳抗原およびイェルシニア・ペスト菌防御抗原、１個、２個またはそれ以上の抗原タンパク質を含むような抗原を含む。もっとも望ましくは、前記抗原は炭疽菌抗原である。
【０００５】
本発明に基づく方法で分析できる炭疽菌防御抗原は、従来の技術で公知である。望ましくは、炭疽菌防御抗原は、図２（配列識別番号１）で与えられる配列を持つ抗原のように、本出願で引用例として組み込まれたＷＯ０２／０４６４６に記載の組換え防御抗原である。
【０００６】
抗原が吸着される固体支持材の例は、望ましくは薬理許容アジュバント、とりわけリン酸カルシウムなどのコロイド系アジュバント、「アジュホス」（ＡｄｊｕＰｈｏｓ）の商標で知られるコロイド系リン酸アルミニウムなどのリン酸アルミニウム、「アルヒドロゲル」の名前で一般にもっとも知られるもっとも望ましいオキシ水酸化アルミニウムなどがある。オキシ水酸化アルミニウムは、また水酸化アルミニウムすなわちアラムでも知られる。
【０００７】
固体支持材に吸着される抗原は、液体、その殆どが水溶液の懸濁液として分析される。もっとも普通には液体は緩衝食塩水、とりわけリン酸緩衝食塩水またはトリス緩衝食塩水などの水溶液である。緩衝液が用いられると、前記緩衝液は望ましくは７．５のｐＨを持つ。固体支持材に吸着された抗原が懸濁液の形でない場合には、そのような懸濁液は従来の技術を用いて容易に調製される。
【０００８】
本発明の方法で一次抗体またはプローブとして用いることのできる抗体は、望ましくはモノクローナル抗体である。多くの実施例で一次抗体は、抗原の活性を提示する炭疽菌防御抗原の領域に対す抗体として選別され、望ましくは抗体は炭疽菌防御抗原のドメイン４の抗体である。とりわけ望ましい抗体は、配列識別番号１を持つ抗原の（ＩＲＫＩＬＳＧＹＩＶＥＩＥＤＴＥＧＬ、配列識別番号２）を含むアミノ酸６３６乃至６５３、（ＲＹＤＭＬＮＩＳＳＬＲＱＤＧＫＴＦＩ、配列識別番号３）を含むアミノ酸６６０乃至６７７、または（ＦＩＤＦＫＫＹＮＤＫＬＰＬＹＩ、配列識別番号４）を含むアミノ酸６７６乃至６９０により定義される領域と結合する抗体である。もっとも望ましい抗体は、配列識別番号１を持つ抗原の６８４の位置でアスパラギン酸残基を含む領域に対する抗体である。適切な抗体を同定する方法は、従来の技術で周知である。適切な一次抗体の例は、ユナイテッド・ステーツ・バイオロジカルで商業的に利用できる抗防御抗原モノクローナル抗体クローン２Ｂ１８（マウス）、ＲＤＩ−フィッツジェラルドで商業的に利用できる抗防御抗原モノクローナル抗体クローンＲＤＩ−ＴＲＫ３ＢＡ１６−Ｃ３（クローンＣ３；マウス）、および同ＲＤＩ−フィッツジェラルドで商業的に利用できる抗防御抗原モノクローナル抗体クローンＲＤＩ−ＴＲＫ３ＢＡ１６−１０６マウスｍＡｂを含む。
【０００９】
一次抗体は懸濁液として用いることができる。望ましくは、一次抗体は溶液、もっとも多くは水溶液、またもっとも一般的には緩衝食塩水、例えばリン酸緩衝食塩水またはトリス緩衝食塩水などの水性緩衝液として用いられる。ある実施例では、用いられる緩衝液はブロッキング緩衝液を含む。水性緩衝液が用いられる場合、それは７乃至８の範囲ｐＨ、もっとも望ましくは約７．５のｐＨを持つ。多くの実施例で、一次抗体は２１００倍まで過剰、一般には５００倍まで過剰の予測抗原量までのモル過剰濃度で用いられる。
【００１０】
用いられる一次抗体／抗原複合体のプローブは、一次抗体／抗原複合体に対する二次抗体、およびタンパク質Ａおよびタンパク質Ｇなどの免疫グロブリン結合タンパク質を含む。
【００１１】
一次抗体／抗原複合体に対する二次抗体が用いられる場合は、二次抗体は望ましくは複合体の一次抗体部分に対する抗体である。この場合、二次抗体の選別は、一次抗体の性質に依存し、とりわけ一次抗体が産生される場合にはそうである。二次抗体と一次抗体との組合わせの例は従来の技術で周知である。多くの場合、一次抗体がモノクローナルの場合はマウスでしばしば産生され、またポリクローナルの場合にはヤギおよびラビットで産生される。望ましい二次抗体はＩｇＧ抗マウス抗体、およびＩｇＧ抗ラビット抗体を含む。
【００１２】
二次抗体は懸濁液として用いることができる。望ましくは二次抗体は溶液、もっとも多くは水溶液、またもっとも一般的には緩衝食塩水、例えばリン酸緩衝食塩水またはトリス緩衝食塩水などの水性緩衝液として用いられる。ある実施例では、用いられる緩衝液はブロッキング緩衝液を含む。水性緩衝液が用いられる場合、それは７乃至８の範囲のｐＨ、もっとも望ましくは約７．５のｐＨを持つ。多くの実施例で、二次抗体は１００倍まで過剰、一般には２０倍まで過剰、例えば１．５乃至１０倍など過剰の範囲で一次抗体／抗原複合体の予測量までのモル過剰濃度で用いられる。
【００１３】
検出可能標識およびそれらの検出方法は、従来の技術で周知であり、それらは１２５Ｉ標識などの放射線標識；フルオレセインおよびＦＩＴＣ標識などの蛍光標識；アビジンまたはストレプトアビジンでのビチオン化標識；およびホースラディッシュ−ペルオキシグーゼおよびアルカリホスファターゼ標識などの酵素標識を含む標識は従来周知の方法で添付することができる。
【００１４】
固体支持抗原と抗体／抗原複合体との接触は遠心分離管でたやすく達成することができる。遠心分離管の使用は、遠心分離による固体支持抗原と固体支持抗体／抗原複合体の溶液および懸濁液からの分離を容易にする。他の実施例において、個体支持抗原と抗体／抗原の間の接触は、ウエル平板、通常は９６ウエル平板で容易に達成される。ウエル平板の面積は適切に選択され、固体支持抗原と固体支持抗体／抗原複合体の溶液または懸濁液からの分離は平板を回転させることで達成され、かくして固定支持抗原または固定支持抗体／抗原複合体は平板上に残り、一方、溶液または懸濁液は上澄み注ぎまたはピペレット移しなどで除去される。望ましくは従来公知の他の方法、例えば分離が濾過で行われるフィルター平板（ウエル基盤がフィルター膜のウエル平板）を用いて行われるようなものも用いられる。ある実施例では、とりわけピペット、もっとも望ましくは多チャンネルピペットを用いて固定量の上澄みを除去することで好結果を達成することができる。
【００１５】
本発明に基づく方法は、免疫学的検定法の従来の慣行に基づいて洗浄液とブロッキング剤を一般に使用する。
【００１６】
使用できるブロッキング剤は従来の技術で公知である。望ましいブロッキング剤は、例えばトウィーン２０ＴＭなどのポリアルコキシル化アルカノール酸ソルビタン（ｐｏｌｙａｌｋｙｌａｔｅｄ  ｓｏｒｂｉｔａｎ  ａｌｋａｎｏａｔｅｓ）非イオン系界面活性剤、また粉ミルクタンパク質（カゼイン）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのような非特異的タンパク質を含む。望ましいブロッキング剤は、ポリアルコキシル化アルカノール酸ソルビンタン、およびカゼインならびに随意にＢＳＡとの混合物を含む。多くの実施例において、インバイトロゲンでウエスターンブリーズＴＭキットの部分として商業的に利用できるブロッキング緩衝液を用いてより成果をあげることができた。
【００１７】
本発明は下記の実施例により限定することなく説明することができる。
【００１８】
実施例１
試薬
試料−０．２ｍｇ／ｍＬの炭疽菌防御抗原濃度を持つ製剤が以下の通り準備された。０．４ｍｇ／ｍＬ炭疽菌防御抗原を持つ溶液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）での０．５ｍＬの炭疽菌防御抗原溶液を更に１．１２５ｍＬのＰＢＳで希釈して用意された。アルヒドロゲル懸濁液（シグマ、Ａ−８２２２）０．２６ｍＬが１．２２％の食塩水０．７４ｍＬと混合された。これに対し０．４ｍｇ／ｍＬ炭疽菌防御抗原液１ｍＬが加えられ、次いで室温で１時間ゆるやかに混合された製剤が作られた。
【００１９】
一次抗体−下記表１にて詳細説明
二次抗体−シグマＦ０２５７抗マウスＩｇＧ（全分子）−ヤギに産生されたＦＩＴＣ抗体（２０μｇ／ｍＬ、すなわち１０ｍＬの抗体希釈液での濃抗体１００μＬ）
ブロッキング抗体洗浄および抗体希釈液−インバイトロジェンのウエターンブリーズキットからのものでＰＶＤＦ膜用ウエスターンブリーズキット使用説明書に基づき準備される。
【００２０】
ファルコン９６−ウエル組織培養処置平板（透明ポリスチレン）でウエル量が３５０μＬのものが使用された。ブロッキング液２５０μＬプラス十分混合された試料５μＬが無作為にウエル内に負荷された。ギルソン型通常単一チャンネルピペットが平板への試料追加に使用された。他の溶液の追加は多チャンネルピペットが平板への試料追加に使用された。他の溶液の追加は多チャンネルピペットを使用して行われた。
【００２１】
混合はしぶきを避けるために５００ｒｐｍの振動速度でマイクロ平板攪拌機プラットフォームで行われた。遠沈はマイクロ平板ロータを用いてセンチュリオン遠心分離機で行われた。
【００２２】
上澄みは、ふたをとり、平板を水平面から約２０°の角で転倒し、１秒間約１回の速度でそれをゆっくり振動させて除去された。固形物は下部にゆるやかに置かれているので、平板を激しく振動させてはならない。平板の激しい振動は固形物のあるものを移動させ、分析の精度を減じる。
【００２３】
用いられたシークエンスは以下の通りである。
【００２４】
免疫学的検査手順
（１）各ウエルに２５０μＬのブロッキング液を追加
（２）各ウエルに５μＬの試料を追加
（３）攪拌プラットフォームで５００ｒｐｍ、３０分混合
（４）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（５）上澄みを除去
（６）一次抗体溶液２００μＬを追加
（７）攪拌プラットフォームで５００ｒｐｍ、１時間混合
（８）３ｋｒｐｍで５分回転
（９）上澄みを除去
（１０）抗体洗浄液２５０μＬを追加
（１１）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（１２）上澄みを除去
（１３）抗体洗浄液２５０μＬを追加
（１４）攪拌プラットフォームで５００ｒｐｍ、３０分混合
（１５）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（１６）上澄みを除去
（１７）水２５０μＬを追加
（１８）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（１９）上澄みを除去
（２０）二次抗体溶液２００μＬを追加
（２１）攪拌プラットフォームで５００ｒｐｍ、１時間混合
（２２）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（２３）上澄みを除去
（２４）抗体洗浄液２５０μＬを追加
（２５）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（２６）上澄みを除去
（２７）抗体洗浄液２５０μＬを追加
（２８）攪拌プラットフォームで５００ｒｐｍ、３０分混合
（２９）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（３０）上澄みを除去
（３１）蛍光標識を可溶化するため８Ｍ尿素２００μＬを追加
（３２）攪拌プラットフォームで５００ｒｐｍ、３０分混合
（３３）平板リーダーを用いてウエルの蛍光を読み取る
【００２５】
蛍光はバイオ−ＴＥＫシナジーＨＴを持ちいて４８５ｎｍの励起波長と５２８２ｎｍの発光波長で読み取られた。
【００２６】
生存能力の尺度としての本発明の効用を説明する目的で、免疫学的検定手順が炭疽菌防御抗原製剤の３個の試料を検定するために用いられた。２個の試料は保存安定試験用製品で活性を失ったものとして知られており、また１個の試料は保存許容活性を持つ保存安定試験用試料であった。標準品として、炭疽菌防御抗原製剤の最近のバッチから希釈系列が製剤の希釈物であるが、炭疽菌防御抗原を含まないブランク品と共に用意された。３個の検定試料と標準品はすべて同一組成であった。
【００２７】
３個の異なる一次抗体が表２で示されるように用いられ、そのそれぞれは炭疽菌防御抗原のドメイン４と結合することを示していた。
【００２８】
表３は試験された試料を示す。
【００２９】
各資料の６個のウエル、すなわち３個の一次抗体それぞれの２個が検定された。
【００３０】
蛍光測定のために、バイオ−ＴＥＫシナジーＨＴ平板リーダーが用いられた。
【００３１】
【表１】
2009533668.tif 000008
【００３２】
【表２】
2009533668.tif 000009
【００３３】
結果
３個の溶液およびブランク品に対する平均蛍光結果（下記表３で示される）が各抗体の標準曲線を示すようにプロットされた。標準曲線は下記図１に示される。
【００３４】
【表３】
2009533668.tif 000010
【００３５】
試料１乃至３それぞれから得られた平均蛍光値を用いて各試料の相対活性を決定することができた。平均蛍光値および活性パーセントは下記表４で示される。
【００３６】
【表４】
2009533668.tif 000011
【００３７】
前記結果から許容活性を持つものとして知られた試料１は、活性標準と比較して非常に良好な応答を示したのに対し、効力を喪失したものとして知られる試料はきわめて劣った成果を示した。この結果は、本発明に基づく方法が炭疽菌防御抗原のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生存能力／効用検定に使用できることを示している。
【００３８】
実施例２
４０℃保存安定性試験からの製剤試料および２−８℃で保存された対照が前記実施例１で示された方法のバリエーションで分析された。標準曲線は、２−８℃で７日間保存された同一方法で準備された既知の生存能力を持つ標準物質からの希釈系列を用いて作られた。
【００３９】
すべての製剤およびアルヒドロゲル懸濁液は強制排出ピペットを用いて操作された。
【００４０】
使用された一次抗体は、０．０１ｍｇ／ｍｌ濃度のＲＤＩ−ＴＲＫ３ＢＡ１６−Ｃ３（クローンＣ３；マウス−ＲＤＩ−フィッツジェラルドで商業的利用可能）であった。使用された二次抗体は、６．２４６ｍｇ／ｍｌ（希釈剤１ｍｌあたり供給濃縮物１５μｌ）のヤギで産生されたシグマＦ０５７抗マウスＩｇＧ（全分子）−ＦＩＴＣ抗体であった。
【００４１】
使用されたブロッキング緩衝液および抗体洗剤は、インバイトロゲンから供給されたウェスターン・ブリーズキットから得られた。
【００４２】
各試料はＰＢＳで０．２６％アルヒドロゲルで１：２で希釈され、ブロッキング緩衝液１２５μｌの溶液で１：２４で更に希釈された本溶液は、約３５０Ｌのウエル容量を持つファルコン９６．ウエル組織培養処置平板（透明ポリスチレン）のウエルに加えられた。
【００４３】
検定は、次いで下記の手順で続けられた。
【００４４】
（１）１２５μｌブロッキング緩衝液でウエルを満たす
（２）５００ｒｐｍで３０分攪拌プラットフォーム上で混合
（３）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（４）多チャンネルピペットを用いて１５０μｌの上澄みを除去
（５）一次抗体溶液２００μＬを追加
（６）５００ｒｐｍで１時間攪拌プラットフォーム上で混合
（７）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（８）多チャンネルピペットを用いて２００μｌ上澄みを除去
（９）抗体洗剤２００μＬを追加
（１０）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（１１）多チャンネルピペットを用いて上澄み２００μｌを除去
（１２）抗体洗剤２００μＬを追加
（１３）５００ｒｐｍで５分攪拌プラットフォーム上で混合
（１４）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（１５）多チャンネルピペットを用いて上澄み２００μｌを除去
（１６）ブロッキング緩衝液２００μＬを追加
（１７）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（１８）多チャンネルピペットを用いて上澄み２００μｌを除去
（１９）ブロッキング緩衝液２００μＬを追加
（２０）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（２１）多チャンネルピペットを用いて上澄み２００μｌを除去
（２２）二次抗体溶液２００μＬを追加
（２３）５００ｒｐｍで１時間攪拌プラットフォーム上で混合
（２４）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（２５）多チャンネルピペットを用いて上澄み２００μｌを除去
（２６）抗体洗剤２００μＬを追加
（２７）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（２８）多チャンネルピペットを用いて上澄み２００μｌを除去
（２９）抗体洗剤２００μＬを追加
（３０）５００ｒｐｍで５分攪拌プラットフォーム上で混合
（３１）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（３２）多チャンネルピペットを用いて上澄み２００μｌを除去
（３３）ブロッキング緩衝液２００μＬを追加
（３４）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（３５）多チャンネルピペットを用いて上澄み２００μｌを除去
（３６）ブロッキング緩衝液２００μＬを追加
（３７）３ｋｒｐｍで５分遠沈
（３８）多チャンネルピペットを用いて上澄み２００μｌを除去
【００４５】
蛍光はバイオ−ＴＥＫシナジーＨＴを用いて４８５ｎｍの励起波長と５２８ｎｍの発光波長で読み取られた。
【００４６】
検定の結果、２−８℃で保存された対照試料は製剤の４５８．８μｌ抗原ｒＰＡ／ｍｌに等しい活性を持っていたのに対し、４０℃で保存された試料は残量抗原ｒＰＡがゼロであったことを示した。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】表３に基づき３種の標準溶液の平均蛍光結果をプロットして作成された試料内の製剤％を示す図
【図２】炭疽菌防御抗原の配列（配列識別番号１）を示す図
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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