(57)【要約】  本発明は、液体タンパク質サンプル中のポロキサマーの分析測定に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体タンパク質サンプル中のポロキサマーの定量方法であって、
前記サンプルを：
（ａ）サイズ排除クロマトグラフィーカラムを用いた分離工程；
（ｂ）移動相を用いた溶離工程；及び、
（ｃ）任意による、ポロキサマーの検出工程；
に供する工程を含んでなる方法。
【請求項２】
前記ポロキサマーが、ポロキサマー１８８（Poloxamer 188）である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質が、５〜７０ｋＤａ、好ましくは、２０〜７０ｋＤａの分子量を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質が、ヘテロ２量体のタンパク質である、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が、ＦＳＨ、ＬＨ、ｈＣＧ、ＴＳＨから選択されるゴナドトロピンである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
分析対象のタンパク質が、インターフェロン−β又は成長ホルモン（ＧＨ）である、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが、ＦＳＨ、ＬＨ、ｈＣＧ、ＴＳＨ、ＧＨ又はインターフェロン−βを含有する水性医薬組成物である、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記移動相が、水性溶媒、特に緩衝処理された溶媒である、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルの溶離が、酸性ｐＨの移動相を用いて行なわれる、請求項１〜８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記移動相のｐＨが、３未満に調整されている、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記移動相のｐＨが、約１．９〜２．０に調整されている、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記ポロキサマーの検出工程が、屈折率を分析することを包含する、請求項１〜１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記サイズ排除カラムが、ビーズを含有するポリマー系マトリックスが充填されたＳＥ−ＨＰＬＣカラムである、請求項１〜１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記マトリックスのビーズが、１０又は１７μｍの粒径を有する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記マトリックスのビーズが、約２００Åの孔径を有する、請求項１３又は１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体タンパク質サンプル中におけるポロキサマー類に属する界面活性剤の分析測定の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポロキサマーは、エチレンオキシド（ＥＯ）とプロピレンオキシド（ＰＯ）との非イオン性ブロック共重合体である。これらは界面活性剤、乳化剤、安定剤、及び分散剤として医薬製剤に用いられる。
【０００３】
ポロキサマーを特性付ける周知の分析法として、ポロキサマーとチオシアン酸コバルト（II）との錯体形成に起因する３２０及び６２０ｎｍでのＵＶ吸光度を分析する、熱量測定法がある。
【０００４】
Yun Maoら（Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 35 (2004), 1127）は、ＴＨＦを移動相とするカラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）と屈折率（ＲＩ）検出とを使用したポロキサマーの測定法について記載している。この方法は、医薬製剤のアバプロ（Avapro）、ニューロンチン（Neurontin）及びスダフェド（Sudafed）に適用されたが、かかる有効成分は「低分子」である。低分子は、高分子量のポロキサマーから、ＳＥＣにより簡便に分離される。
【０００５】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、別名ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）は、多孔性粒子を用いて異なるサイズの分子を分離するものである。この方法はポリマー分子の分離、並びにポリマーの分子量及び分子量分布の測定に、一般的に用いられている。孔径よりも小さな分子は、粒子内に進入可能であるために、粒子内に進入不可能な大分子と比べて経路が長くなり、通過時間もよりかかることになる。孔径よりも大きな分子は全て、保持されることなく一緒に溶出してしまう。孔に進入可能な分子の粒子内における平均滞留時間は、分子のサイズ及び形状に依存する。従って、異なる分子であれば、カラムの総通過時間も異なることになる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ポロキサマーと同程度の分子量を有するタンパク質サンプル中における、ポロキサマーの定量を可能にする方法は、未だ提供されていない。
【０００７】
特に、タンパク質が５〜７０ｋＤａ、好ましくは２０〜７０ｋＤａの分子量を有する場合について、タンパク質サンプル中のポロキサマーの定量法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明はタンパク質サンプル、特に液体医薬製剤等の液体タンパク質サンプル中における、ポロキサマーの定量を可能にする方法に関する。特に本発明は、タンパク質サンプル中のポロキサマーの定量方法を提供する。即ち、タンパク質製剤の約２年間の保存寿命の間の何れの時点においても、該製剤中のポロキサマー量を測定することが可能となる。
【０００９】
この液体タンパク質サンプル中のポロキサマーの定量方法は、前記サンプルを：
（ａ）サイズ排除クロマトグラフィーカラムを用いて液体タンパク質サンプル中の成分を分離する工程；及び
（ｂ）屈折率を分析することでポロキサマーを検出する工程；
に供する工程を含んでなる。
【００１０】
好ましくは、本発明は、液体タンパク質サンプル中のポロキサマーの定量方法であって、前記サンプルを：
（ａ）サイズ排除クロマトグラフィーカラムを用いた分離工程；
（ｂ）移動相を用いた溶離工程；及び、
（ｃ）任意による、ポロキサマーの検出工程；
に供する工程を含んでなる方法に関する。
【００１１】
即ち、サイズ排除クロマトグラフィーを、移動相を用いた溶離工程と組み合わせることにより、ポロキサマーを他の成分から分離することが可能になる。
【００１２】
ポロキサマーの検出は更なる工程において、例えばＲＩ（屈折率）検出系を用いて溶離相を分析することにより行なわれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
略語
以下の略語を本発明の説明に使用する。
ＦＳＨ：卵胞刺激ホルモン；
ｒ−ＦＳＨ；ｒ−ＬＨ；ｒ−ｈＣＧ；ｒ−ＧＨ；ｒ−ＩＦＮ−β、ｒ−ＴＳＨ：組み換えＦＳＨ、ＬＨ、ｈＣＧ、ＧＨ、ＩＮＦ−β、ＴＳＨ；
ｈＦＳＨ：ヒトＦＳＨ；
ｒ−ｈＦＳＨ：組み換えヒトＦＳＨ
ＲＩ：屈折率
ＫＤ又はＫｄ又はｋＤａ：キロダルトン
ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィー
ＲＴ：室温
ＷＦＩ：注射用蒸留水
ポロキサマー１８８（Poloxamer 188）：ＢＡＳＦ社のプルロニックＦ６８（Pluronic F68）の別名。
【００１４】
本発明は、タンパク質サンプル中のポロキサマー（界面活性剤である）の定量を可能にする簡便な方法に関する。タンパク質サンプルとしては、液体タンパク質サンプルが好ましい。液体タンパク質サンプルは、如何なる形態の液体製剤であってもよいが、以下に説明する液体医薬製剤であることが好ましい。一実施形態によれば、液体医薬タンパク質サンプルは、単回又は多回投与用バイアルに収められる。
【００１５】
更なる実施形態によれば、分析対象となるタンパク質サンプルは凍結乾燥されてなり、分析の前に適切な水性溶媒に溶解される。
【００１６】
この液体タンパク質サンプル中のポロキサマーの定量方法は、前記サンプルを：
（ａ）サイズ排除クロマトグラフィーカラムを用いて液体タンパク質サンプル中の成分を分離する工程；及び
（ｂ）屈折率を分析することでポロキサマーを検出する工程；
に供する工程を含んでなる。
【００１７】
好ましくは、本発明は、液体タンパク質サンプル中のポロキサマーの定量方法であって、前記サンプルを：
（ａ）サイズ排除クロマトグラフィーカラムを用いた分離工程；
（ｂ）移動相を用いた溶離工程；及び、
（ｃ）任意による、ポロキサマーの検出工程；
に供する工程を含んでなる方法を提供する。
【００１８】
典型的には、サイズ排除カラムはＳＥ−ＨＰＬＣカラムであろう。
【００１９】
一実施形態によれば、ポロキサマーはポロキサマー１８８（Poloxamer 188）である。
【００２０】
好ましい実施形態によれば、液体タンパク質サンプル中のタンパク質の分子質量は、ポロキサマーの質量と同程度である。
【００２１】
好ましい実施形態によれば、前記液体タンパク質サンプル中のタンパク質は、５〜７０ｋＤａ、より好ましくは２０〜７０ｋＤａの分子質量を有する。
【００２２】
各ポロキサマーの質量に対するタンパク質の質量の比率は１：３〜１０：１、好ましくは１：２〜１：７であることが好ましい。
【００２３】
本発明に係るタンパク質の例としては、哺乳動物タンパク質、例えば、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモン等の成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；絨毛性ゴナドトロピン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；因子VIIIＣ、因子IX、組織因子及びフォン・ヴィレブランド因子等の凝固因子；プロテインＣ等の抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；ウロキナーゼ又は組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）等のプラスミノゲンアクチベーター；ボンバジーン；スロンビン；腫瘍壊死因子−α及び−β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（regulated on activation normally T-cell expressed and secreted）；ヒトマクロファージ炎症タンパク（ＭＩＰ−１−α）；ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン；ミュラー阻害物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連タンパク質；ＤＮａｓｅ；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は増殖因子のレセプター；インテグリン；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、又は−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、又はＮＴ−６）等の神経栄養因子、又はＮＧＦ−Ｐ等の神経成長因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ、特にＦＧＦ−１８等の線維芽細胞増殖因子；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−α及び、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、又はＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子Ｉ及び−II（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−II）；デス（１−３）−ＩＧＦ−１（des(1-3)-IGF-1）（脳ＩＧＦ−Ｉ）；インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９及びＣＤ２０等のＣＤタンパク質；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；骨誘導因子；オステオポンチン；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、−β、及び−γ等のインターフェロン；Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ等のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１〜ＩＬ−１０等のインターロイキン（ＩＬ）；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子（ＤＡＦ）；ＡＩＤＳエンベロープの一部等のウィルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；イムノアドヘシン；抗体；並びに、上に列挙する任意のポリペプチドの生物活性断片又は変異体等が挙げられる。
【００２４】
中でも、本発明に係るタンパク質は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、ＰＥＧ化インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、成長ホルモン（ＧＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、線維芽細胞増殖因子１８（ＦＧＦ−１８）又はオステオポンチンから選択されることが好ましい。
【００２５】
ＦＳＨ、ＣＧ、ＬＨ及びＴＳＨは、ゴナドトロピン類に分類される糖タンパク質である。ゴナドトロピンは、不妊症の治療に用いられる。
【００２６】
ＩＮＦ−βは、インターロイキン類に分類される糖タンパク質である。ＩＦＮ−βは、多発性硬化症の治療に用いられる。
【００２７】
ＰＥＧ−ＩＮＦ−βは、ポリエチレングリコール鎖から誘導されるＩＮＦ−βである。これは安定性を向上させる。
【００２８】
成長ホルモンは、非グリコシル化タンパク質である。子供又は成人の成長ホルモン欠損の治療に用いられる。
【００２９】
ＦＧＦ−１８は、変形性関節症の治療に用いられる。
【００３０】
オステオポンチンは、グリコシル化された１本鎖のポリペプチドである。
【００３１】
好ましい一実施形態によれば、前記タンパク質は、ゴナドトロピン（ＦＳＨ、ＬＨ、ＣＧ、ＴＳＨ及び変異体）等のヘテロ２量体である。更なる実施形態によれば、前記タンパク質は、成長ホルモン（ＧＨ）又はインターフェロン−β（ＩＦＮ−β、又はＰＥＧ化変異体等の変異体）である。別の更なる実施形態によれば、前記タンパク質は、ＦＧＦ−１８又はオステオポンチンである。
【００３２】
好ましい実施形態によれば、液体タンパク質サンプルは、１又は２種類以上の治療用タンパク質を含有する。かかるサンプルは、低分子量化合物等の非タンパク質治療剤を含まないことが好ましい。
【００３３】
本明細書で使用される限り、卵胞刺激ホルモン（即ちＦＳＨ）は、完全長の成熟タンパク質として作製されたＦＳＨを指す。例としてはヒトＦＳＨ（即ち「ｈＦＳＨ」）が挙げられるが、これに限定される訳ではない。これは組み換えによって作製されたか、ヒト由来原料（例えば閉経後の女性の尿等）から単離されたかを問わない。
【００３４】
本方法は天然タンパク質のみならず、組み換えタンパク質にも適用可能である。一実施形態によれば、タンパク質製剤は、ヒト組み換えＦＳＨ、ＬＨ、ＣＧ、ＴＳＨ、ＧＨ又はＩＦＮ−βである。
【００３５】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、ゴナドトロピン類に分類される糖タンパク質である。ＦＳＨは、女性患者及び男性患者の双方について、不妊症及び繁殖障害の治療（例えば、精子減少症を患う男性における精子産生の誘発等）に用いられる。
【００３６】
黄体形成ホルモン（ＬＨ）は、下垂体前葉から分泌されるゴナドトロピンである。ＬＨは、女性患者において、ＦＳＨとの組み合わせで、ＯＩ（排卵誘発）及びＣＯＨ（過排卵誘起）に用いられ、特に、内因性ＬＨレベルが極めて低い患者や、ＬＨに抵抗性を示す患者、例えば下垂体性機能不全性生殖機能不全（ＨＨ、ＷＨＯグループＩ）を患う女性や、高齢（即ち３５歳以上）の患者、並びに、着床又は早期流産が問題となっている患者等に用いられる。
【００３７】
絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）は、胎盤から生成されるゴナドトロピンであり、妊婦の尿から得られる。ＣＧは、ＬＨと同じレセプターに作用し、同じ反応を誘発する。ＣＧは、ＬＨよりも循環半減期が長いことから、通常はＬＨ活性の長期作用源として用いられる。ＣＧをＯＩ及びＣＯＨ療法に用いることにより、自然状態のＬＨピークが模倣され、排卵が誘発される。ＦＳＨによる、或いはＦＳＨとＬＨとの混合物による刺激の最後に、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の注射を用いて排卵を誘発する。また、ＯＩ及びＣＯＨのための刺激期間において、ＣＧをＦＳＨと併用することにより、上述のような、ＬＨ活性が所望される患者の刺激時に、ＬＨ活性を付与してもよい。
【００３８】
ＦＳＨ、ＬＨ及びＣＧは、ヘテロ２量体の糖タンパク質ホルモンファミリーのメンバーである。かかるファミリーには甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）も含まれる。このファミリーのメンバーはヘテロ２量体であり、α−サブユニットとβ−サブユニットとを含んでなる。これらのサブユニットは、非共有結合的相互作用によって、相互に支持されている。ヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）ヘテロ２量体は、（ｉ）他のヒトファミリーのメンバー（即ち、絨毛性ゴナドトロピン（「ＣＧ」）、黄体形成ホルモン（「ＬＨ」）、及び甲状腺刺激ホルモン（「ＴＳＨ」））に共通する、９２個のアミノ酸からなる成熟した糖タンパク質のα−サブユニット；及び（ii）ＦＳＨに特有の、１１１個のアミノ酸からなる成熟したβ−サブユニットから構成される。ヒトＬＨヘテロ２量体は、（ｉ）前述の、９２個のアミノ酸からなる成熟した糖タンパク質のα−サブユニット；及び（ii）ＬＨに特有の、１１２個のアミノ酸からなる成熟したβ−サブユニットから構成される。糖タンパク質のα−サブユニット及びβ−サブユニットは製剤時に、保存剤、界面活性剤及び他の賦形剤との相互作用によって分解され易い傾向がある。サブユニットの分解は、生物学的効力の低下を招く。
【００３９】
ＦＳＨは、筋肉内（ＩＭ）注射用又は皮下（ＳＣ）注射用に製剤される。一実施形態によれば、ＦＳＨは凍結乾燥（固体）形態として、バイアル又はアンプル中、７５ＩＵ／バイアル及び１５０ＩＵ／バイアルで供給され、２〜２５℃での保存時に１年半〜２年間の保存寿命を有する。注射用溶液は、前記凍結乾燥物を注射用蒸留水（ＷＦＩ）に再溶解させて作製する。更に、２２μｇ／０．５ｍｌ、３３μｇ／０７５ｍｌ又は６６μｇ／１．５ｍｌのＦＳＨと、ポロキサマー１８８、ショ糖、緩衝剤、メチオニン及びｍ−クレゾールとを含んでなる液体ＦＳＨ製剤が利用可能である（Gonal-F pen）。
【００４０】
よって、ＦＳＨはバイアル又はアンプル中、単回投与及び多回投与の両形式で、液剤として製剤されてきた。単回投与形式は、使用に先立つ保存の際に、安定性及び効力を維持しなければならない。多回投与形式は、使用に先立つ保存の際に安定性及び効力を維持するのみならず、アンプルの開封後、多回投与計画の全投与期間を通じて、安定性及び効力を維持するとともに、細菌が比較的少ない状態で維持しなければならない。かかる理由から、多回投与形式は通常、ベンジルアルコールやｍ−クレゾール等の静菌剤を含有する。
【００４１】
ＬＨは、筋肉内（ＩＭ）注射用又は皮下（ＳＣ）注射用に製剤される。一実施形態によれば、ＬＨはは凍結乾燥（固体）形態として、バイアル又はアンプル中、７５ＩＵ／バイアルで供給され、２〜２５℃での保存時に１年半〜２年間の保存寿命を有する。注射用溶液は、前記凍結乾燥物を注射用蒸留水（ＷＦＩ）に再溶解させて作製する。Luveris(商標)にはＬＨの他に、賦形剤としてショ糖、緩衝剤、ポリソルベート２０、メチオニンが含まれている。最近、ポロキサマー１８８を含有するＬＨ製剤が報告されている（国際公開公報ＷＯ２００４／０８７２１３）。
【００４２】
ｈＣＧを含有する液体医薬組成物も市販されている。例えば、ｐＨ７のリン酸バッファー中にマンニトール、メチオニン、ポロキサマー１８８を含有する、Ovitrelle(商標)が挙げられる。
【００４３】
「変異体」という表現は、ヒトＦＳＨ、ＬＨ、ＣＧ、ＴＳＨ、ＩＦＮ−β又はＧＨとはアミノ酸配列、グリコシル化のパターン、又はサブユニット間の結合が異なるものの、ＦＳＨ、ＬＨ、ＣＧ、ＴＳＨ、ＩＦＮ−β又はＧＨに相当する生物活性を示す分子を包含する意である。例としては、ＣＴＰ−ＦＳＨが挙げられる。これは、野生型のα−サブユニットと、ｈＣＧのカルボキシ末端ペプチドがＦＳＨのβ−サブユニットのＣ末端に融合した、ハイブリッド型β−サブユニットとからなる、長時間作用型修飾組み換えＦＳＨであって、LaPolt et al.; Endocrinology;1992, 131, 2514-2520、又は、Klein et al.; Development and characterization of a long-acting r-hFSH agonist; Human Reprod. 2003, 18, 50-56 等に記載されている。また、単鎖ＣＴＰ−ＦＳＨも挙げられる。これは以下の配列（Ｎ末端からＣ末端へ）からなる１本鎖分子である。
【００４４】
【化１】
2009508132.tif 000002
【００４５】
ここで、Klein ら（Pharmacokinetics and pharmacodynamics of single-chain recombinant human follicle-stimulating hormone containing the human chorionic gonadotrophin carboxyterminal peptide in the rhesus monkey; Fertility & Sterility; 2002, 77, 1248-1255）に記載の通り、βＦＳＨは、ＦＳＨのβ−サブユニットを表わし、βｈＣＧ ＣＴＰ（１１３−１４５）は、ｈＣＧのカルボキシ末端ペプチドを表わし、αＦＳＨは、ＦＳＨのα−サブユニットを表わす。ＦＳＨ変異体の他の例としては、国際公開公報ＷＯ０１／５８４９３（Maxygen）に開示の（特に国際公開公報ＷＯ０１／５８４９３の請求項１０及び１１に開示の）、α−サブユニット及び／又はβ−サブユニット内に更なるグリコシル化部位が組み込まれてなるＦＳＨ分子、並びに、国際公開公報ＷＯ９８／５８９５７に記載の、サブユニット間にＳ−Ｓ結合を有するＦＳＨ分子が挙げられる。
【００４６】
本明細書で言及するＦＳＨ変異体には、完全長の成熟ＦＳＨタンパク質よりも短い、β−サブユニットのカルボキシ末端欠失体も含まれる。ＦＳＨヘテロ２量体又はＦＳＨ変異体ヘテロ２量体は、任意の適切な方法により作製することができる。かかる方法としては、組み換え技術、（適切な場合には）天然材料からの単離又は抽出、又は化学合成、或いはこれらの任意の組合せ等が挙げられる。
【００４７】
「変異体」には、タンパク質のＰＥＧ化型も含まれる。
【００４８】
「組み換え」という語は、組み換えＤＮＡ技術の使用を通じて作製される、ＦＳＨ、ＬＨ、ＣＧ、ＴＳＨ、ＧＨ、ＩＦＮ−β又は変異体の調製を表わすのに用いられる（例えば、国際公開公報ＷＯ８５／０１９５８を参照）。組み換え技術によりＦＳＨ又はＬＨを発現させる方法の一例として、欧州特許ＥＰ ０ ２１１ ８９４及び同ＥＰ ０ ４８７ ５１２に記載のように、ＦＳＨ又はＬＨのα−及びβ−サブユニットをコード化するＤＮＡ配列を、単一のベクターにより、或いは２つのベクターにより（各サブユニットに個別にプロモーターを付与して）、真核細胞にトランスフェクトさせる方法が挙げられる。組み換え技術によってＦＳＨ又はＬＨを作製する別の例としては、欧州特許第ＥＰ ０ ５０５ ５００号（Applied Research Systems ARS Holding NV）に記載されるように、ＦＳＨ又はＬＨのサブユニットをコード化する内在配列と作動式に連結されるように、異種の調節セグメントを相同性組み換えによって挿入する方法が挙げられる。
【００４９】
本発明に従って用いられるＦＳＨ又はＦＳＨ変異体は、組み換え手段により（例えば哺乳動物細胞等から）作製されるのみならず、他の生物源（例えば尿等）から抽出することもできる。好ましい方法としては、Hakola, K. Molecular and Cellular Endocrinology, 127:59-69, 1997、Keene et al., J. Biol. Chem., 264 :4769-4775, 1989、Cerpa-Poljak et al., Endocrinology, 132:351-356, 1993、Dias et al., J. Biol. Chem., 269:25289-25294, 1994、Flack et al., J. Biol. Chem., 269:14015-14020, 1994、Valove et al., Endocrinology, 135:2657-2661, 1994、米国特許第３，１１９，７４０号、及び米国特許第５，７６７，０６７号に記載される方法が挙げられる。
【００５０】
本明細書で用いられる黄体形成ホルモン（又はＬＨ）は、完全長の成熟タンパク質として作製されたＦＳＨを表わす。例えばヒトＬＨが挙げられるが、これに限定される訳ではない。これは組み換えにより作製されたか、ヒト由来材料（例えば閉経後の女性の尿等）から単離されたかを問わない。ヒト糖タンパク質のα−サブユニットのタンパク質配列を配列番号１に示し、ヒトＬＨのβ−サブユニットのタンパク質配列を配列番号６に示す。好ましい実施形態によれば、ＬＨは組み換え体である。
【００５１】
「ＬＨ変異体」という表現は、ヒトＬＨとはアミノ酸配列、グリコシル化のパターン、又はサブユニット間の結合が異なるが、ＬＨ活性を示す分子を包含する意である。
【００５２】
ＬＨヘテロ２量体又はＬＨ変異体ヘテロ２量体は、任意の適切な方法により作製することができる。かかる方法としては、組み換え技術、（適切な場合には）天然材料からの単離又は抽出、又は化学合成、或いはこれらの任意の組合せ等が挙げられる。
【００５３】
本発明の液体タンパク質サンプルには、ＦＳＨ／ＬＨ及び変異体の混合物も含まれ（国際公開公報第ＷＯ２００４／０８７２１３号）、更にはＦＳＨ、及びｈＣＧ、及び変異体（国際公開公報第ＷＯ２００４／１０５７８８号）も含まれる。
【００５４】
「水性希釈剤」という語は、水を含有する液体溶媒を指す。水性溶媒系は、水のみからなるものでも、水と１種又は２種以上の水混和性の溶媒とからなるものでもよい。また、糖、緩衝剤、塩又は他の賦形剤等の溶質が溶解されていてもよい。より一般的に用いられる非水性溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール等の短鎖有機アルコール、アセトン等の短鎖ケトン、及びグリセロール等の多価アルコールである。
【００５５】
「静菌」又は「静菌剤」という語は、製剤に添加され、抗菌剤として作用する化合物又は組成物を指す。ＦＳＨ又はＦＳＨ変異体、又はＦＳＨ及びＬＨを含有する、本発明に係る保存用製剤は、（好ましくはヒト用の）商業的に実現可能な多回使用品として、防腐効果に関する法定又は規制指針に合致することが好ましい。静菌剤の例としては、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチル等）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム及びチメロサールが挙げられる。
【００５６】
「緩衝剤」又は「生理学的に許容可能な緩衝剤」という語は、医薬又は獣医薬用途において製剤中安全であることが知られており、製剤に所望されるｐＨの範囲内に製剤のｐＨを維持又は調節する効果を有する化合物の溶液を指す。ｐＨを適度な酸性ｐＨ〜適度な塩基性ｐＨに調節する許容可能な緩衝剤としては、リン酸、酢酸、クエン酸、アルギニン、ＴＲＩＳ、及びヒスチジン等の化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。「ＴＲＩＳ」は、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３，−プロパンジオール、及びその薬理学的に許容可能なあらゆる塩を指す。好ましい緩衝剤は、生理食塩水又は許容可能な塩を用いたリン酸緩衝剤である。
【００５７】
「リン酸緩衝剤」という語は、リン酸又はその塩を含有し、所望のｐＨに調整された溶液を指す。リン酸緩衝剤は一般的に、リン酸又はリン酸塩から調製される。リン酸塩としては、これに限定されるものではないが、ナトリウム及びカリウム塩が挙げられる。本技術分野では数種のリン酸塩が公知であり、第一、第二及び第三リン酸のナトリウム塩及びカリウム塩などが挙げられる。また、リン酸塩は、既存の塩の水和物として生じることも知られている。リン酸緩衝剤はある範囲のｐＨをカバーしていてもよい。この範囲は例えば約ｐＨ４〜約ｐＨ１０であるが、好ましい範囲は約ｐＨ５〜約ｐＨ９であり、最も好ましい範囲は約６．０〜約８．０であり、最も好ましくは約ｐＨ７．０である。
【００５８】
「バイアル」は、固体又は液体の状態にあるＦＳＨを、滅菌状態のまま保持するのに適した容器を広く指す語である。本明細書で用いられるバイアルの例としては、アンプル、カートリッジ、ブリスターパッケージ、又は、シリンジ、ポンプ（浸透ポンプを含む）、カテーテル、経皮貼布、肺又は経粘膜スプレーを介してＦＳＨを患者に送達するのに適切なその他の容器が挙げられる。非経口、経肺、経粘膜、又は経皮投与用の製品をパッケージングするのに適したバイアルは、本技術分野では周知であり、認知されている。
【００５９】
「多回投与使用」という表現は、ＦＳＨ製剤又はタンパク質製剤の単一のバイアル、アンプル又はカートリッジを、複数回の注射に、例えば２回、３回、４回、５回、６回又はこれ以上の注射に使用することを含む意である。注射は、好ましくは少なくとも約１２時間、約２４時間等の期間に亘って、好ましくは最長約１２日間の期間に亘って行なう。注射の間には時間間隔として、例えば６、１２、２４、４８又は７２時間等の期間を設けてもよい。
【００６０】
「安定性」という語は、本発明の製剤中における所与のタンパク質の物理的、化学的、及び高次構造的安定性を指す（生物学的効力の維持も含む）。タンパク質製剤の不安定化の原因としては、タンパク質分子の化学分解又は凝集による高次ポリマーの形成、ヘテロ２量体の単量体への分解、脱グリコシル化、グリコシル化修飾、酸化（特にα−サブユニットのヘテロ２量体中の酸化）、或いは、本発明に含まれるポリペプチドの少なくとも１種の生物活性を減退させる、その他の任意の構造修飾が挙げられる。
【００６１】
「安定な」溶液又は製剤とは、その中に含まれるタンパク質の分解、修飾、凝集、生物活性の喪失等の程度が、許容し得る程度に調節されており、且つ、許容し得ない程度にまで経時的に増大しないような溶液又は製剤である。製剤は、表示されたタンパク質活性の少なくとも約８０％を、最長２年の期間に亘って維持することが好ましい。
【００６２】
本発明の根底にある目的は、タンパク質サンプル中のポロキサマー量を測定するための簡便で迅速な方法を提供することにある。ポロキサマーは界面活性剤として使用可能であり、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとのブロック共重合体から選択される。好ましくはプルロニック（Pluronic）（登録商標）Ｆ７７、プルロニックＦ８７、プルロニックＦ８８及びプルロニック（登録商標）Ｆ６８であり、特に好ましくはプルロニックＦ６８である（ＢＡＳＦ、プルロニックＦ６８は、ポロキサマー１８８（Poloxamer 188）としても知られている）。
【００６３】
上述したように、医薬製剤は２〜２５℃の保存温度において、最長２年間の保存寿命を有することが求められる。これは、製剤が前記期間に亘って、安定に維持されるとの見込みを示唆するものである。液体製剤が含有する種々の賦形剤は、タンパク質製剤の安定性に直接影響するか、又は分解を介して間接的に影響することから、製剤の安定性を評価する分析ツールが必要となる。
【００６４】
より具体的には、ポロキサマー界面活性剤は、エチレンオキシド（ＥＯ）とプロピレンオキシド（ＰＯ）とのブロック共重合体である。プロピレンオキシドのブロック（ＰＯ）は、２つのエチレンオキシド（ＥＯ）ブロックに挟まれている。
【００６５】
【化２】
2009508132.tif 000003
【００６６】
ポロキサマーの合成は：
・プロピレングリコールの２つのヒドロキシル基に、プロピレンオキシドを制御下で付加することにより、所望の分子量の疎水性物質を作製し；
・エチレンオキシドを付加して、前記の疎水性物質を親水性基間に挟み込む
という、二段階のプロセスで行なわれる。
【００６７】
ポロキサマー界面活性剤は、プルロニックとしても知られている。
【００６８】
プルロニック（登録商標）Ｆ７７では、ポリオキシエチレン（親水性物質）の割合は７０％であり、疎水性物質（ポリオキシプロピレン）の分子量は約２，３０６Ｄａである。
【００６９】
プルロニックＦ８７では、ポリオキシエチレン（親水性物質）の割合は７０％であり、疎水性物質（ポリオキシプロピレン）の分子量は約２，６４４Ｄａである。
【００７０】
プルロニックＦ８８では、ポリオキシエチレン（親水性物質）の割合は８０％であり、疎水性物質（ポリオキシプロピレン）の分子量は、約２，６４４Ｄａである。
【００７１】
プルロニックＦ６８では、ポリオキシエチレン（親水性物質）の割合は８０％であり、疎水性物質（ポリオキシプロピレン）の分子量は、約１，９６７Ｄａである。
【００７２】
プルロニックＦ７７の代表的な特性を以下に列挙する：
平均分子量：６６００；
融点／流動点：４８℃；
２０℃における物理的形態：固体
粘性（ブルックフィールド）ｃｐｓ：４８０［２５℃で液体、６０℃でペースト、７７℃で固体］；
表面張力、２５℃でのｄｙｎｅ／ｃｍ；
濃度０．１％：４７．０
濃度０．０１％：４９．３
濃度０．００１％：５２．８
界面張力、２５℃でのｄｙｎｅ／ｃｍ、対ヌジョール；
濃度０．１％：１７．７
濃度０．０１％：２０．８
濃度０．０１％：２５．５
ドレーヴス・ウェッティング（Draves Wetting）、秒  ２５℃
濃度１．０％：＞３６０
濃度０．１％：＞３６０
泡高
ロス・マイルス（Ross Miles）、０．１％、５０℃でのｍｍ：１００
ロス・マイルス（Ross Miles）、０．１％、２６℃でのｍｍ：４７
動的（Dynamic）、０．１％、４００ｍｌ／分でのｍｍ：＞６００
水溶液中での曇り点、℃
濃度１％：＞１００
濃度１０％：＞１００
ＨＬＢ（親水性−油性バランス）：２５
【００７３】
プルロニックＦ８７の代表的な特性を以下に列挙する：
平均分子量：７７００；
融点／流動点：４９℃；
２０℃における物理的形態：固体
粘性（ブルックフィールド）ｃｐｓ：７００［２５℃で液体、６０℃でペースト、７７℃で固体］；
表面張力、２５℃でのｄｙｎｅ／ｃｍ；
濃度０．１％：４４．０
濃度０．０１％：４７．０
濃度０．００１％：５０．２
界面張力、２５℃でのｄｙｎｅ／ｃｍ、対ヌジョール；
濃度０．１％：１７．４
濃度０．０１％：２０．３
濃度０．０１％：２３．３
ドレーヴス・ウェッティング（Draves Wetting）、秒  ２５℃
濃度１．０％：＞３６０
濃度０．１％：＞３６０
泡高
ロス・マイルス（Ross Miles）、０．１％、５０℃でのｍｍ：８０
ロス・マイルス（Ross Miles）、０．１％、２６℃でのｍｍ：３７
動的（Dynamic）、０．１％、４００ｍｌ／分でのｍｍ：＞６００
水溶液中での曇り点、℃
濃度１％：＞１００
濃度１０％：＞１００
ＨＬＢ（親水性−油性バランス）：２４
【００７４】
プルロニックＦ８８の代表的な特性を以下に列挙する：
平均分子量：１１４００；
融点／流動点：５４℃；
２０℃における物理的形態：固体
粘性（ブルックフィールド）ｃｐｓ：２３００［２５℃で液体、６０℃でペースト、７７℃で固体］；
表面張力、２５℃でのｄｙｎｅ／ｃｍ；
濃度０．１％：４８．５
濃度０．０１％：５２．６
濃度０．００１％：５５．７
界面張力、２５℃でのｄｙｎｅ／ｃｍ、対ヌジョール；
濃度０．１％：２０．５
濃度０．０１％：２３．３
濃度０．０１％：２７．０
ドレーヴス・ウェッティング（Draves Wetting）、秒  ２５℃
濃度１．０％：＞３６０
濃度０．１％：＞３６０
泡高
ロス・マイルス（Ross Miles）、０．１％、５０℃でのｍｍ：８０
ロス・マイルス（Ross Miles）、０．１％、２６℃でのｍｍ：３７
動的（Dynamic）、０．１％、４００ｍｌ／分でのｍｍ：＞６００
水溶液中での曇り点、℃
濃度１％：＞１００
濃度１０％：＞１００
ＨＬＢ（親水性−油性バランス）：２８
【００７５】
プルロニックＦ６８の代表的な特性を以下に列挙する：
平均分子量：８４００；
融点／流動点：５２℃；
２０℃における物理的形態：固体
粘性（ブルックフィールド）ｃｐｓ：１０００［２５℃で液体、６０℃でペースト、７７℃で固体］；
表面張力、２５℃でのｄｙｎｅ／ｃｍ；
濃度０．１％：５０．３
濃度０．０１％：５１．２
濃度０．００１％：５３．６
界面張力、２５℃でのｄｙｎｅ／ｃｍ、対ヌジョール；
濃度０．１％：１９．８
濃度０．０１％：２４．０
濃度０．０１％：２６．０
ドレーヴス・ウェッティング（Draves Wetting）、秒  ２５℃
濃度１．０％：＞３６０
濃度０．１％：＞３６０
泡高
ロス・マイルス（Ross Miles）、０．１％、５０℃でのｍｍ：３５
ロス・マイルス（Ross Miles）、０．１％、２６℃でのｍｍ：４０
動的（Dynamic）、０．１％、４００ｍｌ／分でのｍｍ：＞６００
水溶液中での曇り点、℃
濃度１％：＞１００
濃度１０％：＞１００
ＨＬＢ（親水性−油性バランス）：２９
【００７６】
上に挙げたポロキサマーと同様の特性を持つ他のポロキサマーポリマーも、本発明の製剤に用いることができる。本方法の分析対象となるタンパク質製剤中に存在する好ましいポロキサマー界面活性剤としては、プルロニックＦ６８（＝ポロキサマー１８８（Poloxamer 188））が挙げられる。
【００７７】
液体タンパク質製剤中のプルロニックの濃度、特にプルロニックＦ６８の濃度は、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約０．５ｍｇ／ｍｌであり、特に好ましくは約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約０．４ｍｇ／ｍｌであり、最も好ましくは約０．１ｍｇ／ｍｌである。
【００７８】
本発明の方法に従って分析されるタンパク質製剤のｐＨは、約６．０〜約８．０、より好ましくは約６．８〜約７．８、例えば約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．２、及び約７．４である。好ましい緩衝剤としてはリン酸が、好ましい対イオンとしてはナトリウムイオン又はカリウムイオンが挙げられる。リン酸生理食塩緩衝剤は、本技術分野では周知であり、ダルベッコリン酸緩衝食塩水等が挙げられる。全溶液中の緩衝剤濃度は、約５Ｍｍ、約９．５Ｍｍ、約１０Ｍｍ、約５０Ｍｍ、約１００Ｍｍ、約１５０Ｍｍ、約２００Ｍｍ、約２５０Ｍｍ、及び約５００Ｍｍの間で選択し得る。中でも、緩衝剤濃度は約１０Ｍｍである音が好ましい。リン酸イオン１０Ｍｍ、ｐＨ７．０のバッファーが特に好ましい。
【００７９】
本発明の方法に従って分析されるＦＳＨ製剤のｐＨは、好ましくは約６．０〜約８．０、より好ましくは約６．８〜約７．８、例えば約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．２、及び約７．４である。好ましい緩衝剤としてはリン酸が、好ましい対イオンとしてはナトリウムイオン又はカリウムイオンが挙げられる。
【００８０】
本発明の方法に従って分析されるＦＳＨ及びＬＨの混合製剤のｐＨは、約６．０〜約９．０、より好ましくは約６．８〜約８．５、例えば約ｐＨ７．０、約ｐＨ８．０、及び約８．２、最も好ましくは約ｐＨ８．０である。
【００８１】
本発明の方法に従って分析されるｈＣＧ製剤のｐＨは、好ましくは約６．０〜約８．０であり、より好ましくは約６．８〜約７．８、例えば約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．２、及び約７．４である。
【００８２】
タンパク質サンプルとしては、単回投与用又は多回投与用の液体製剤が好ましい。本発明に係る、多回投与での使用が意図される液体製剤は、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチル等）、チモール、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム及びチメロサール等の静菌剤を含んでなることが好ましい。特に好ましいものは、フェノール、ベンジルアルコール及びｍ−クレゾールであり、より好ましいものは、フェノール及びｍ−クレゾールであり、最も好ましいものは、ｍ−クレゾールである。これらの静菌剤は、多回投与注射の期間に亘って、製剤を実質的に無菌（注射に適切な）で維持するのに有効な濃度を生じる量で使用される。かかる期間は、例えば、約１２時間又は約２４時間〜約１２日間又は約１４日間、好ましくは約６日間〜約１２日間である。静菌剤の存在量は、好ましくは約０．１％（静菌剤の量／溶媒の量）〜約２．０％、より好ましくは約０．２％〜約１．０％の濃度とする。ベンジルアルコールの場合、特に好ましい濃度は０．９％である。フェノールの場合、特に好ましい濃度は約０．５％である。ｍ−クレゾールの場合、特に好ましい濃度は約０．３％（例えば、ＷＦＩ中に約３ｍｇ／ｍｌ）である。
【００８３】
サイズ排除カラムは当業者に周知であり、サンプル中の各タンパク質及びポロキサマーに応じて選択される。カラムのゲルとしては、ポリマー系マトリックスを用いるべきである。好ましいカラムとしては、トーソーハース（Toso Haas）社のＳＥ−ＨＰＬＣカラム、商品名TSK G3000PWが挙げられる。このマトリックスのビーズは、粒径１０又は１７μｍ、孔経約２００Åである。このカラムは市販されている。
【００８４】
検出工程は、当業者に公知の任意のＲＩ検出系により行なうことができる。
【００８５】
条件をより酸性にすると、タンパク質からのポロキサマーの分離も、一層容易になることが分かっている。
【００８６】
従って、本発明に係る方法において使用される移動相は、水又は緩衝溶液等の水性溶媒である。
【００８７】
特定の実施形態によれば、移動相のｐＨは７未満、好ましくは３未満、より好ましくは約１．６〜２．０の間、最も好ましくは１．９〜２．０の間に調整される。一実施形態によれば、タンパク質はＦＳＨ、ＣＧ、ＬＨ又はＴＳＨ等のヘテロ２量体である。酸性条件下では、ヘテロ２量体タンパク質はサブユニットに分解し、移動が容易となるため、分離及び検出工程（分解能）が改善される。ｐＨの調整に適した酸性剤は、当業者であれば選択可能である。最も好ましい酸は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）である。
【００８８】
一般的には、評価対象のサンプルを調製し、カラムに注入する。本方法の検出工程で屈折率を考慮することにより、得られるクロマトグラムには、ポロキサマーのピーク面積に加えて、タンパク質及び賦形剤に関する少なくとも１つの更なるピークが含まれる。ピーク面積を評価することにより、分析サンプル中に存在するポロキサマーを定量することができる。定量に必要なポロキサマーの検量線は作成済みである（実施例参照）。
【実施例】
【００８９】
続いて、本発明を実施例により例示する。
【００９０】
実施例１（図１参照）
本実施例の目的は、市販の液体ｈＣＧ製剤、Ovitrelle(商標)のサンプルを室温で１８カ月保存した後、該サンプル中のポロキサマー１８８（Poloxamer 188）濃度を分析することである。即ち、ポロキサマー１８８に関する液体製剤の安定性を評価した。調製時点でのポロキサマー１８８の濃度は約１００μｇ／ｍｌであった。Ovitrelle(商標)中のポロキサマー１８８の定量プロトコルは、以下の通りとした。
【００９１】
注射用液体Ovitrelle(商標)の含有成分は、絨毛性ゴナドトロピン−α、マンニトール、Ｌ−メチオニン、ポロキサマー１８８、リン酸、ＮａＯＨ及び水であった。
【００９２】
【表１】
2009508132.tif 000004
【００９３】
２．方法
２．１  溶離液Ａ（Ｈ2Ｏ／ＴＦＡ０．５％）
１リットルメスシリンダー中の９５０ｍｌの精製水に、５ｍＬのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加え、攪拌しながら１０００ｍｌに調節した。該溶離液のｐＨは１．７〜１．９であった。
【００９４】
２．２  溶離液Ｂ（２０％エタノール）
１リットルのメスシリンダー中の７５０ｍｌの精製水に、２００ｍＬのエタノールを加え、攪拌しながら１０００ｍｌに調節した。
【００９５】
２．３  オートサンプラー用の洗浄溶液（１０％メタノール）
１リットルのメスシリンダー中の８５０ｍｌの精製水に、１００ｍＬのメタノールを加え、攪拌しながら１０００ｍｌに調節した。
【００９６】
２．４  密封洗浄溶媒（５％メタノール）
１リットルのメスシリンダー中の９００ｍｌの精製水に、５０ｍＬのメタノールを加え、攪拌しながら１０００ｍｌに調節した。
【００９７】
２．５  検量線用の希釈溶液（ポロキサマー１８８無しの液体製剤）
１リットルのメスシリンダー中の８５０ｍｌの精製水に、５４．６ｇのＤ（−）マンニトール、０．９８ｇのオルト−リン酸８５％、２００μｇのＬ−メチオニンを加えた。５０％の水酸化ナトリウムを滴下により加えて溶液をｐＨ７．０に調整し、体積を１ｍｌに調節した。この溶液を０．４５μｍフィルターにより濾過した。
【００９８】
上記に代わり、検量線用の希釈溶液として水を用いてもよい。
【００９９】
２．６  検量線用の濃縮溶液
１００ｍｌのメスシリンダー中の８０ｍｌの精製水に、２００ｍｇのポロキサマー１８８を溶解させ、体積を１００ｍｌに調節した。分析対象サンプル中の予想濃度に基づいて検量線を作成した。本実施例では、前記注射用液体のOvitrelle(商標)中の予測ポロキサマー１８８濃度は約１００μｇ／ｍｌであったので、検量線は５０〜１６０μｇ／ｍｌの範囲とした。
【０１００】
３  サンプル調製
ブランク
０．０５ｍｌの検量線用希釈溶液を注入した。
【０１０１】
サンプル
何れのサンプルも、何らの前処理を行なうことなく試験に供し、０．０５ｍｌを注入した。
【０１０２】
４．  操作条件
４．１．  機器の設定
以下の溶液をＨＰＬＣの管に接続した。
管Ａ：溶離液Ａ（Ｈ2Ｏ／ＴＦＡ０．５％）
管Ｂ：溶離液Ｂ（２０％エタノール）
【０１０３】
管Ａ及びＢを充填して装置をパージし、２ｍＬ／分の流速で３分間リンスした。管上に脱気装置がある場合は、スイッチをオンにした。管Ａについては、分析前に、流液のＲＩ検出器の電磁弁を、少なくとも３０分間パージモードに切り替えた。フローセルのパージングを行なって、該セルの基準側面に新鮮な移動相を流し込んだ。
【０１０４】
【表２】
2009508132.tif 000005
【０１０５】
４．２．  カラムの平衡
カラムに溶離液Ａを流して、カラムを平衡化させた。平衡化は、ベースラインが安定した時点で完了とした。
【０１０６】
４．３．  保存カラム
分析の完了後、カラムを少なくとも３０ｍｌの精製水でリンスし、次いで３０ｍｌの２０％エタノールでリンスした。
【０１０７】
４．４．  オビトレルサンプル中のポロキサマー１８８濃度の測定
オビトレルサンプル中のポロキサマー１８８濃度の計算には、モデルとして線形回帰法を用いた。
【０１０８】
Ｙ＝ａ＋ｂｘ
ここで、
Ｙ＝  ポロキサマー１８８の総面積
ａ＝  切片
ｂ＝  傾き
ｘ＝  注入量１ｍｌ当たりμｇ単位のポロキサマー１８８濃度。
【０１０９】
図１に示すようにサンプルを積分した。
検量線の切片（ａ）と傾き（ｂ）を計算し、スタットグラフィックスプラス（Statgraphics plus）というソフトウェアで線形回帰を計算した。
下記の式を適用してポロキサマー１８８の濃度を計算した。
【０１１０】
【数１】
2009508132.tif 000006
【０１１１】
等式１の解は、各オビトレルサンプル中のポロキサマー１８８濃度を表わす。単位はμｇ／ｍｌである。
【０１１２】
本実施例のサンプル中のポロキサマー濃度（図１参照）は約９４μｇ／ｍｌであった。
【０１１３】
実施例２
本実施例の目的は、市販の液体ｈＦＳＨ製剤、Gonal-F RFF Pen(商標)のサンプルを室温で１８カ月保存した後、該サンプル中のポロキサマー１８８濃度を分析することである。即ち、ポロキサマー１８８に関する液体製剤の安定性を評価した。調製時のポロキサマー１８８濃度は約１００μｇ／ｍｌであった。Gonal-F RFF Pen(商標)中のポロキサマー１８８定量のプロトコルは、カラム流速を０．７５ｍｌ／分とした点を除いて、実施例１でオビトレルについて示したプロトコルと同一とした。
ポロキサマーをｈＦＳＨから首尾よく分離し、個別に定量した。
【０１１４】
実施例３
本実施例の目的は、市販の液体ｈＧＨ製剤、Serostim(商標)のサンプル中のポロキサマー１８８濃度を分析することである。プロトコルは実施例２と同一とした。
ポロキサマーをｈＧＨから首尾よく分離し、個別に定量した。
【０１１５】
実施例４
本実施例の目的は、市販の液体ｈＩＦＮ−β製剤のサンプル中のポロキサマー１８８濃度を分析することである。プロトコルは、実施例２のものと同一であった。
ポロキサマーをｈＩＦＮ−βから首尾よく分離し、個別に定量した。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】図１は、ｈＣＧ製剤中におけるポロキサマー１８８（Poloxamer 188）の定量用のクロマトグラムを示す。本実施例におけるポロキサマー１８８のピーク領域は、溶離時間約１４〜１６分に存在する（保持時間は流速の関数であり、変動し得る）。曲線下面積に基づいて、ｈＣＧサンプル中のポロキサマー１８８を定量することができる。
【図１】
2009508132.tif 000007
【国際調査報告】
2009508132.tif 000008
2009508132.tif 000009
2009508132.tif 000010