(57)【要約】Ｏ−結合型グリコシル化量が減少しているタンパク質組成物を生成するための方法が記載されている。本方法は、Ｐｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤の存在下および／または１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼの存在下で培養された細胞中でタンパク質を生成することを含む。
2009515963.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）タンパク質をコードする核酸を準備すること、
（ｂ）該核酸を宿主細胞に導入して、該宿主細胞の培養物を得ること、
（ｃ）該培養物を１つまたは複数のＰｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤と接触させること、および
（ｄ）該１つまたは複数の阻害剤の存在下で該宿主細胞によって生成された糖タンパク質を単離して、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成すること
を含む、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成する方法。
【請求項２】
培養物を、核酸を有する多数の宿主細胞を得るのに十分な時間増殖させてから、培養物を１つまたは複数のＰｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培養物を１つまたは複数のＰｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤の存在下で増殖させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
核酸が、誘導性プロモーターに作動可能に連結している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
培養物を、核酸を有する多数の宿主細胞を得るのに十分な時間増殖させてから、培養物を１つまたは複数のＰｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤およびプロモーターの誘導因子と接触させてタンパク質の発現を誘導し、１つまたは複数の阻害剤および誘導因子の存在下で宿主細胞によって生成されたタンパク質を単離して、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
培養物をプロモーターの誘導因子と接触させてタンパク質の発現をある時間誘導してから、培養物を１つまたは複数のＰｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤と接触させ、１つまたは複数の阻害剤および誘導因子の存在下で宿主細胞によって生成されたタンパク質を単離してＯ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
１つまたは複数の阻害剤が、ベンジリデンチアゾリジンジオンである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
１つまたは複数の阻害剤が、５−［［３，４−ビス（フェニルメトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、５−［［３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、および５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
宿主細胞が真菌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
宿主細胞が酵母細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
宿主細胞が、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、およびハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
宿主細胞がピキア・パストリスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
宿主細胞が、優勢なＮ−グリカングリコフォームを有する糖タンパク質を生成するように遺伝子改変された酵母または糸状菌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
宿主細胞が、Ｎ−グリコシル化パターンがヒト様であるかまたはヒト化されている糖タンパク質を生成するように遺伝子改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
糖タンパク質が、培地１リットル当たり少なくとも１００ｍｇの収率で生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）タンパク質をコードする核酸を準備すること、
（ｂ）該核酸を宿主細胞に導入して、該宿主細胞の培養物を得ること、
（ｃ）該培養物を１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素と接触させること、および
（ｄ）該１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素の存在下で該宿主細胞によって生成されたタンパク質を単離して、Ｏ−結合型グリコシル化が減少している糖タンパク質を生成すること
を含む、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成する方法。
【請求項１７】
培養物を、核酸を有する多数の宿主細胞を得るのに十分な時間増殖させてから、培養物を１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素と接触させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素の存在下で培養物を増殖させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素をコードする第二の核酸が準備され、該第二の核酸が宿主細胞に導入される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
誘導性プロモーターに作動可能に連結された１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素をコードする第二の核酸が準備され、該第二の核酸が宿主細胞に導入される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
培養物を、多数の宿主細胞を得るのに十分な時間増殖させてから、タンパク質および１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素の発現を誘導して、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
タンパク質の発現をある時間誘導してから、１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素の発現を誘導してＯ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素の発現をある時間誘導してから、タンパク質の発現を誘導してＯ−結合型グリコシル化が減少している有するタンパク質を生成する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
α−１，２−マンノシダーゼが、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種由来である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
α−１，２−マンノシダーゼがトリコデルマ・レエセイ由来である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
宿主細胞が真菌細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
宿主細胞が酵母細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
宿主細胞が、Ｋ．ラクチス、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、およびハンゼヌラからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
宿主細胞がピキア・パストリスである、請求項１６に記載の方法。
【請求項３０】
宿主細胞が、優勢なＮ−グリカングリコフォームを有する糖タンパク質を生成するように遺伝子改変された酵母または糸状菌細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
宿主細胞が、Ｎ−グリコシル化パターンがヒト様であるかまたはヒト化されている糖タンパク質を生成するように遺伝子改変されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項３２】
糖タンパク質が、培地１リットル当たり少なくとも１００ｍｇの収率で生成される、請求項１６に記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）誘導性プロモーターに作動可能に連結したタンパク質をコードする核酸を準備すること、
（ｂ）該核酸を宿主細胞に導入し、該核酸を含む該宿主細胞を増殖させて該宿主細胞の培養物を生成すること、
（ｃ）該培養物を１つまたは複数のＰｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤および１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素と接触させること、ならびに
（ｄ）該１つまたは複数の阻害剤および該１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素の存在下で該宿主細胞によって生成された糖タンパク質を単離して、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成すること
を含む、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成する方法。
【請求項３４】
培養物を、核酸を有する多数の宿主細胞を得るのに十分な時間増殖させてから、該培養物を１つまたは複数のＰｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤と接触させる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
培養物を１つまたは複数のＰｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤の存在下で増殖させる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
核酸が、誘導性プロモーターに作動可能に連結している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
培養物を、核酸を有する多数の宿主細胞を得るのに十分な時間増殖させてから、該培養物を１つまたは複数のＰｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤およびプロモーターの誘導因子と接触させてタンパク質の発現を誘導し、該１つまたは複数の阻害剤および該誘導因子の存在下で該宿主細胞によって生成されたタンパク質を単離して、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
培養物をプロモーターの誘導因子と接触させてタンパク質の発現をある時間誘導してから、該培養物を１つまたは複数のＰｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤と接触させ、該１つまたは複数の阻害剤および該誘導因子の存在下で該宿主細胞によって生成されたタンパク質を単離して、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
培養物を、核酸を有する多数の宿主細胞を得るのに十分な時間増殖させてから、該培養物を１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素と接触させる、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
培養物を１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素の存在下で増殖させる、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素をコードする第二の核酸が準備され、該第二の核酸が宿主細胞に導入される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
誘導性プロモーターに作動可能に連結された１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素をコードする第二の核酸が準備され、該第二の核酸が宿主細胞に導入される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
培養物を、多数の宿主細胞を得るのに十分な時間増殖させてから、タンパク質および１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素の発現を誘導してＯ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
タンパク質の発現をある時間誘導してから、１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素の発現を誘導してＯ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成させる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
Ｏ−結合型グリコシル化を阻害することができる１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素の発現をある時間誘導してから、タンパク質の発現を誘導してＯ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
１つまたは複数の阻害剤が、ベンジリデンチアゾリジンジオンである、請求項３３に記載の方法。
【請求項４７】
１つまたは複数の阻害剤が、５−［［３，４−ビス（フェニルメトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、５−［［３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、および５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸からなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４８】
α−１，２−マンノシダーゼが、トリコデルマ・レエセイ、サッカロミセス種、またはアスペルギルス種由来である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４９】
α−１，２−マンノシダーゼが、トリコデルマ・レエセイ由来である、請求項３３に記載の方法。
【請求項５０】
宿主細胞が、誘導性プロモーターに作動可能に連結されたα−１，２−マンノシダーゼをコードする第二の核酸を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項５１】
宿主細胞が真菌細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項５２】
宿主細胞が酵母細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項５３】
宿主細胞が、Ｋ．ラクチス、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、およびハンゼヌラからなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項５４】
宿主細胞がピキア・パストリスである、請求項３３に記載の方法。
【請求項５５】
宿主細胞が、優勢なＮ−グリカングリコフォームを有する糖タンパク質を生成するように遺伝子改変されている、酵母または糸状菌細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項５６】
宿主細胞が、Ｎ−グリコシル化パターンがヒト様であるかまたはヒト化されている糖タンパク質を生成するように遺伝子改変されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項５７】
糖タンパク質が、培地１リットル当たり少なくとも１００ｍｇの収率で生成される、請求項３３に記載の方法。
【請求項５８】
Ｎ−グリカン構造の優勢種を含みＯ−結合型グリコシル化が減少している、糖タンパク質組成物。
【請求項５９】
Ｎ−グリカン構造が、Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、Ｇａｌ（ＧｌｃＮＡｃ）2Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、（ＧａｌＧｌｃＮＡｃ）2Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＮＡＮＡ2Ｇａｌ2ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、およびＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2からなる群より選択される、請求項５８に記載の糖タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のグリコシル化パターンを有するタンパク質を生成するための、組成物および方法に関する。具体的には、本発明は、Ｏ−結合型グリコシル化を減少しているタンパク質を生成するための、組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質は、触媒作用、シグナル伝達、細胞間コミュニケーション、ならびに分子認識および分子集合を含む、ヒトおよび他の哺乳動物における多くの重要な機能を媒介する。糖タンパク質は、真核生物における非細胞質タンパク質の大部分を占める（ＬｉｓおよびＳｈａｒｏｎ、１９９３年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：１〜２７頁）。多くの糖タンパク質が治療目的で利用されており、この２０年の間、天然に存在する糖タンパク質の組換えバージョンは生命工学産業の主要な部分であった。治療薬として使用される組換え糖化タンパク質の例としては、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＨ）が挙げられる（Ｃｕｍｍｉｎｇら、１９９１年、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １：１１５〜１３０頁）。組換えで生成された糖タンパク質のグリコシル化パターンの変化は、潜在的な予防薬および治療薬として生成される組換えタンパク質が臨床に近づくにつれて、最近、科学界において多くの関心の主題である。
【０００３】
一般に、糖タンパク質オリゴ糖のグリコシル化構造は、それらを生成するために使用される細胞の宿主種によって変化する。非ヒト宿主細胞において生成される治療用タンパク質は、ヒトにおいて免疫原性応答を誘発する場合がある非ヒトグリコシル化、例えば酵母における高マンノシル化（Ｂａｌｌｏｕ、１９９０年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４４０〜４７０頁）、植物におけるα（１，３）−フコースおよびβ（１，２）−キシロース（Ｃａｂａｎｅｓ−Ｍａｃｈｅｔｅａｕら、１９９９年、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、９：３６５〜３７２頁）、チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｏｇｕｃｈｉら、１９９５年、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７：５〜６２頁）、および、マウスにおけるＧａｌα−１，３Ｇａｌグリコシル化（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋら、１９９３年、Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ、１４：４７７〜４７９頁）を含む可能性がある。動物細胞におけるタンパク質に結合している炭水化物鎖としては、タンパク質中のアスパラギン（Ａｐｎ）残基に結合したＮ−グリコシル化結合型炭水化物鎖（Ｎ−グリカン、またはＮ−結合型グリコシル化とも呼ばれる）およびタンパク質中のセリン（Ｓｅｒ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）残基に結合したＯ−グリコシド結合型炭水化物鎖（Ｏ−グリカン、またはＯ−結合型グリコシル化とも呼ばれる）が挙げられる。
【０００４】
非ヒト哺乳動物細胞によって生成される糖タンパク質のオリゴ糖構造は、ヒト糖タンパク質のものと、より密接に関連する傾向があるので、ほとんどの市販の糖タンパク質は、哺乳動物中で生成される。しかしながら、哺乳動物は、タンパク質生成のための宿主細胞として、いくつかの重要な不利な点を有する。高価なことに加えて、哺乳動物中でタンパク質を生成するためのプロセスは、グリコフォームの不均一な集合を生じ、低い体積価（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｔｉｔｅｒｓ）を有し、継続的なウイルス封じ込め、および安定した細胞系を生じるための相当な時間の両方を要する。
【０００５】
タンパク質上の特定のグリコフォームが、タンパク質の、その薬物動態、薬力学、受容体相互作用、および組織特異的標的化特性を含む特性に、大いに影響を及ぼすことができることが、よく認識されている（Ｇｒａｄｄｉｓら、２００２年、Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２８５〜２９７頁）。例えば、Ｉｇの異なるグリコシル化パターンが、異なる生物学的特性と関連することが示されている（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、１９９７年、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６５：１１１〜１２８頁、ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９７年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５：２６〜３２頁）。糖タンパク質のガラクトシル化が、細胞培養条件で異なることがあり、これによって、糖タンパク質上の特定のガラクトースパターンによっていくつかの糖タンパク質組成物が免疫原性になり得ることが、さらに示されている（Ｐａｔｅｌら、１９９２年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８５：８３９〜８４５頁）。しかしながら、どの特定のグリコフォーム（複数可）が所望の生物学的機能に寄与するかは知られていないので、糖タンパク質上の特定のグリコフォームについて濃縮する能力が、大いに望ましい。異なるグリコフォームは異なる生物学的特性と関連するので、特定のグリコフォームを有する糖タンパク質について濃縮する能力を用いて、糖タンパク質の特定のグリコフォームと特定の生物学的機能との間の関係を解明することができる。また、特定のグリコフォームを有する糖タンパク質について濃縮する能力によって、特定の特異性を有する治療用糖タンパク質の生成が可能になる。したがって、特定のグリコフォームについて濃縮された糖タンパク質組成物の生成が、大いに望ましい。
【０００６】
Ｎ−結合型グリコシル化のための経路は多くの分析の対象であったが、Ｏ−結合型グリコシル化のプロセスおよび機能はそれ程よく理解されていない。しかしながら、Ｎ−結合型グリコシル化と対照的に、Ｏ−グリコシル化は翻訳後の事象であり、シスゴルジにおいて起こることが、公知である（Ｖａｒｋｉ、１９９３年、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．、３：９７〜１３０頁）。Ｎ−結合型グリコシル化のものと類似したＯ−結合型グリコシル化についてのコンセンサス受容配列は存在しないようであるが、いくつかの糖タンパク質の多数のＯ−結合型グリコシル化部位の周囲のアミノ酸配列の比較から、グリコシル化残基と比較して、−１および＋３位でのプロリン残基の頻度増大、ならびにセリン、スレオニン、およびアラニン残基の顕著な増大が示される（Ｗｉｌｓｏｎら、１９９１年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、２７５：５２９〜５３４頁）。糖タンパク質中のセリンおよびスレオニン残基の広がりもまた、Ｏ−グリコシル化の潜在的部位であることがある。
【０００７】
Ｏ−結合型グリコシル化において役割を有するある遺伝子ファミリーは、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：タンパク質（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）マンノシルトランスフェラーゼ（Ｐｍｔ）をコードする遺伝子である。これらの高度に保存された遺伝子は、ヒト、げっ歯動物、昆虫等の高等真核生物、および真菌等の下等真核生物の両方において同定されている。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等の酵母は、Ｐｍｔホモログをコードする７つまでのＰＭＴ遺伝子をコードする（Ｗｉｌｌｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２００３年１０月、１３（５）：６２１〜３０頁において概説されている）。酵母において、Ｏ−結合型グリコシル化は、７つのＯ−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子の１つによって、ドリコールリン酸マンノースから小胞体中の新生糖タンパク質のセリンまたはスレオニン残基への、最初のマンノースの付加によって開始する。酵母中に、Ｐｍｔホモログをコードする７つのＰＭＴ遺伝子があるようであるが、酵母における分泌された真菌タンパク質および異種タンパク質のＯ−マンノシル化は、主にＰｍｔ１およびＰｍｔ２をコードする遺伝子に依存し、これはヘテロ二量体として機能するようである。ＰＭＴ１およびＰＭＴ２ならびにそれらのタンパク質生成物、それぞれＰｍｔ１およびＰｍｔ２は、種の間で高度に保存されているようである。
【０００８】
米国特許第５７１４３７７号におけるＴａｎｎｅｒらは、サッカロミセス・セレビシエのＰＭＴ１およびＰＭＴ２遺伝子、ならびに１つまたは複数のＰＭＴ遺伝子が遺伝子改変されてＯ−結合型グリコシル化が減少している組換えタンパク質を生成する真菌細胞を用いた、Ｏ−結合型グリコシル化が減少している組換えタンパク質を作るための方法を記載している。
【０００９】
米国特許出願公開２００２００６８３２５におけるＮｇらは、アンチセンスもしくはコサプレッションの使用またはＯ−結合型グリコシル化と関連する遺伝子、具体的には１つまたは複数のＰＭＴ遺伝子の機能喪失性の突然変異（loss of function mutation）を有する酵母宿主株の操作による、Ｏ−グリコシル化の阻害を開示している。
【００１０】
ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ）は、高等真核生物において見られるムチン型Ｏ−結合型グリコシル化に関与している。これらの酵素は、タンパク質中の特定のセリンおよびスレオニンアミノ酸の、Ｎ−アセチルガラクトサミンをこれらのアミノ酸のヒドロキシル基に付加し、次いでこれに段階的にマンノース残基を付加することができることによる、Ｏ−グリコシル化を開始させる。米国特許第５，８７１，９９０号および米国特許出願公開２００５００２６２６６におけるＣｌａｕｓｅｎらは、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ）をコードする核酸のファミリーを開示している。米国公開特許出願２００３０１８６８５０におけるＣｌａｕｓｅｎは、ポリペプチドＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼのレチンを選択的に阻害し、Ｏ−グリカン生合成に関与する他のグリコシルトランスフェラーゼの基質として機能せず、これによってＯ−グリコシル化を阻害するＧａｌＮＡｃ−β−ベンジルの使用を開示している。
【００１１】
Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤が、記載されている。例えば、米国特許第７，１０５，５５４号におけるＯｒｃｈａｒｄらは、ベンジリデンチアゾリジンジオン、および抗真菌剤性作用物質、例えば抗真菌剤としてのそれらの使用を記載している。これらのベンジリデンチアゾリジンジオンは、Ｐｍｔ１酵素を阻害し、Ｏ−結合型マンノプロテインの形成を妨げ、真菌細胞壁の完全性を傷つけると報告されている。この最終結果は、細胞膨張および最終的には破裂による死である。
【００１２】
米国公開特許出願２００２０１２８２３５におけるＫｏｎｒａｄらは、組織または細胞においてＯ−結合型タンパク質グリコシル化を薬理学的に阻害することによって真性糖尿病を治療または予防する方法を開示している。この方法は、Ｏ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼを結合し、それによってＯ−結合型グリコシル化を阻害する、（Ｚ）−１−［Ｎ−（３−アンモニオプロピル）−Ｎ−（ｎ−プロピル）アミノ］ジアゼン−イウム−１，２−ジオラート（（Ｚ）−１−［Ｎ−（３−Ａｍｍｏｎｉｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ−（ｎ−ｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｄｉａｚｅｎ−ｉｕｍ−１，２−ｄｉｏｌａｔｅ）またはその誘導体で糖尿病の個体を処置することに依存している。
【００１３】
米国特許第５，２６８，３６４号におけるＫｏｊｉｍａらは、Ｏ−α−ＧａｌＮＡｃの蓄積につながるＯ−グリコシル化の伸長を阻害して白血球または腫瘍細胞によるＳＬｅｘまたはＳＬｅａの発現をブロックし、それによって内皮細胞および血小板へのこれらの細胞の接着を阻害するベンジル−α−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ｂｅｎｚｙｌｅ−α−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）等の化合物を用いた、Ｏ−グリコシル化の阻害のための治療用組成物を開示している。
【００１４】
米国特許第６，１０３，５０１号におけるＢｉｏｍｅらは、グリコシル化の部位でアミノ酸配列を改変することによって、Ｏ−結合型グリコシル化が変化したホルモンの変異体を開示している。
【００１５】
本発明者らは、Ｏ−結合型グリコシル化を減少している組換えタンパク質の生成のために、真菌にとって一般に致死性であるＰｍｔタンパク質の阻害剤である特定の化合物を、宿主細胞にとって致死性でないように用いることができることを見出した。これによって、真菌および酵母細胞によって生成されたタンパク質のＯ−結合型グリコシル化を制御することが可能になる。本発明者らがＰＭＴ酵素の非致死性阻害剤であると考える他のクラスの化合物はまた、Ｏ−結合型グリコシル化の減少に関して改良した糖タンパク質の生成において、有用である。本発明者らはさらに、宿主細胞または細胞培養物へのあるクラスの酵素、すなわちα−１，２−マンノシダーゼの添加が、単独で、またはＰｍｔタンパク質の化学阻害剤と組み合わせて、Ｏ−グリコシル化のさらなる減少を生じさせることを見出した。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、特定のグリコシル化パターンを有するタンパク質および糖タンパク質を生成するための方法を提供する。具体的には、本発明は、、宿主細胞でタンパク質のＰｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化の１つまたは複数の阻害剤と宿主細胞とを接触させること、または宿主細胞もしくは組換えタンパク質を１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼと接触させること、またはこれら両方によって、組換えタンパク質のＯ−結合型タンパク質が減少している、組換えタンパク質組成物を宿主細胞において作るための方法を提供する。阻害剤なしで宿主細胞によって生成された組換えタンパク質または糖タンパク質のＯ−結合型グリコシル化の量と比較して、組換えタンパク質または糖タンパク質のＯ−結合型グリコシル化の量が減少する。
【００１７】
Ｐｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化はマンノース残基のＯ−結合型グリコシル化をいい、タンパク質のセリンまたはスレオニン残基へのマンノース残基の転移がＰＭＴ遺伝子またはそのホモログによってコードされるタンパク質−Ｏ−Ｄ−マンノシルトランスフェラーゼ（Ｐｍｔ）またはホモログによって媒介される。Ｐｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤としては、ＰＭＴ遺伝子のホモログのいずれか１つを阻害する阻害剤が挙げられる。現在好ましい態様において、阻害剤は、真菌および酵母の少なくともＰｍｔ１および／もしくはＰｍｔ２活性、または哺乳動物、植物および昆虫を含むがこれらに限定されない他の生物における対応するホモログを阻害する。
【００１８】
現在、化学阻害剤、例えばベンジリデンチアゾリジンジオンと呼ばれる化学物質のクラスに包含される化学阻害剤の使用によって、Ｏ−結合型グリコシル化の量が減少していることが好ましい。特定の実施形態において、化学阻害剤は、５−［［３，４−ビス（フェニルメトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、５−［［３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、３−ヒドロキシ−４−（２−フェニルエトキシ）ベンズアルデヒド、３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）−ベンズアルデヒド、５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸からなる群より選択される。
【００１９】
さらなる態様において、Ｏ−結合型グリコシル化に関与する１つまたは複数のＰｍｔタンパク質阻害剤および／または１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素を使用してＯ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成する、Ｏ−結合型グリコシル化が減少している組換えタンパク質組成物を生成するための方法が提供される。現在好ましいα−１，２−マンノシダーゼは、哺乳動物および酵母細胞を含む、真核細胞から単離してもよい。現在好ましい態様において、α−１，２−マンノシダーゼは、トリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）、サッカロミセス種、またはアスペルギルス（Aspergillus）種によって生成されるものである。他の現在好ましい実施形態において、α−１，２−マンノシダーゼは、触媒ドメインと通常は会合しない細胞内標的化シグナルペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されたα−１，２−マンノシダーゼの触媒ドメインをコードする核酸配列を含むキメラコンストラクトから生成されてもよい。他の実施形態において、α−１，２−マンノシダーゼは、別々に生成されて細胞培養物に加えられてもよく、またはα−１，２−マンノシダーゼを組換え糖タンパク質とともに同時発現することによって生成されてもよい。
【００２０】
本方法の特定の態様において、組換えタンパク質組成物は、この組換え糖タンパク質が少なくとも１つの優勢なＮ−グリコフォームを含み、かつＯ−結合型グリコシル化が減少している、Ｎ−結合型グリコシル化を有する糖タンパク質を含む。したがって、Ｐｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤または１つより多いマンノース残基をグリカン構造から切り取ることができるα−１，２−マンノシダーゼの存在下でインキュベートされていない宿主細胞において生成された糖タンパク質の組成物と比較して、優勢種のＮ−グリカン構造を含み、かつＯ−結合型グリコシル化が減少している糖タンパク質組成物が、さらに提供される。特定の態様において、糖タンパク質組成物は、Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、Ｇａｌ（ＧｌｃＮＡｃ）2Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、（ＧａｌＧｌｃＮＡｃ）2Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＮＡＮＡ2Ｇａｌ2ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、およびＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2のグリコフォームからなる群より選択される優勢なＮ−グリカン構造を有する糖タンパク質を含む。重要な態様の方法は、ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞培養物から生成された同じ糖タンパク質の組成物と比較して、組換え糖タンパク質が生物学的活性の増大および／または望ましくない免疫原性の減少を示すことが出来る、Ｏ−結合型グリコシル化の減少および優勢に特定のＮ−結合型グリコフォームを含む糖タンパク質組成物を提供することである。Ｏ−結合型グリコシル化の減少および優勢なＮ−結合型グリコフォームを含む糖タンパク質組成物を生成することのさらなる利点は、望ましくない効果を誘導することがある、および／またはより効果的なグリコフォームを希薄化することがある、望ましくないかまたは活性がないグリコフォームおよび不均一な混合物の生成を避けることである。したがって、例えばＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、Ｇａｌ（ＧｌｃＮＡｃ）2Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、（ＧａｌＧｌｃＮＡｃ）2Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＮＡＮＡ2Ｇａｌ2ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、およびＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2のグリコフォームを優勢に含み、Ｏ−結合型グリコシル化が減少している糖タンパク質分子の治療用医薬組成物もまた、より低い用量で効果的な場合があり、したがって、より高い有効性／効力を有し得る。
【００２１】
したがって、タンパク質をコードする核酸を準備すること、この核酸を宿主細胞に導入して、宿主細胞の培養物を提供すること、この培養物を１つまたは複数のＰｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤と接触させること、および阻害剤の存在下で宿主細胞によって生成された糖タンパク質を単離して、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成することを含む、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成する方法が提供される。
【００２２】
本方法の特定の態様において、培養物を、核酸を有する多数の宿主細胞を得るのに十分な時間増殖させてから、この培養物を１つまたは複数のＰｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤と接触させるか、またはこの培養物が確立した時に培養物を１つまたは複数のＰｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤の存在下で増殖させる。
【００２３】
本方法のさらなる態様において、タンパク質をコードする核酸を、誘導性プロモーターに作動可能に連結させる。次いで、この核酸を有する多数の宿主細胞を得るのに十分な時間、培養物を増殖させてから、この培養物を１つまたは複数のＰｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤およびプロモーターの誘導因子と接触させてタンパク質の発現を誘導し、１つまたは複数の阻害剤および誘導因子の存在下で宿主細胞によって生成されたタンパク質を単離して、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成するか、または、培養物をプロモーターの誘導因子と接触させてタンパク質の発現をある時間誘導してから、その培養物を１つまたは複数のＰｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤と接触させ、この阻害剤および誘導因子の存在下で宿主細胞によって生成されたタンパク質を単離して、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成する。
【００２４】
タンパク質をコードする核酸を準備すること、この核酸を宿主細胞に導入して、宿主細胞の培養物を提供すること、この培養物を１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素と接触させること、および１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素の存在下で宿主細胞によって生成されたタンパク質を単離して、Ｏ−結合型グリコシル化が減少している糖タンパク質を生成することを含む、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成する方法が、さらに提供される。
【００２５】
本方法の特定の態様において、核酸を有する多数の宿主細胞を得るのに十分な時間、培養物を増殖させてから、この培養物を１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素と接触させる。他の態様において、培養物を１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素の存在下で増殖させる。
【００２６】
本方法のさらなる態様において、１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素をコードする第二の核酸が準備され、この第二の核酸が宿主細胞に導入される。特定の態様において、誘導性プロモーターに作動可能に連結された１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素をコードする第二の核酸が準備され、この第二の核酸が宿主細胞に導入され、多数の宿主細胞を得るのに十分な時間、培養物を増殖させてから、タンパク質および１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素の発現を誘導して、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成するか、または、タンパク質の発現をある時間誘導してから１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素の発現を誘導して、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成するか、または１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素の発現をある時間誘導してからタンパク質の発現を誘導して、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成する。
【００２７】
誘導性プロモーターに作動可能に連結されたタンパク質をコードする核酸を準備すること、この核酸を宿主細胞に導入し、この核酸を含む宿主細胞を増殖させて、その宿主細胞の培養物を生成すること、この培養物を１つまたは複数のＰｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤および１つまたは複数の１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素と接触させること、ならびに１つまたは複数の阻害剤および１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素の存在下で宿主細胞によって生成された糖タンパク質を単離してＯ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成することを含む、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成する方法がさらに提供される。
【００２８】
本方法の特定の態様において、核酸を有する多数の宿主細胞を提供するのに十分な時間、培養物を増殖させてから、この培養物を、１つまたは複数のＰｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤と接触させるか、または、培養物が樹立された時に、この培養物を、１つまたは複数のＰｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤の存在下で増殖させる。
【００２９】
本方法のさらなる態様において、タンパク質をコードする核酸を、誘導性プロモーターに作動可能に連結させる。次いで、この核酸を有する多数の宿主細胞を得るのに十分な時間、培養物を増殖させてから、この培養物を１つまたは複数のＰｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤およびプロモーター誘導因子と接触させてタンパク質の発現を誘導し、１つまたは複数の阻害剤および誘導因子の存在下で宿主細胞によって生成されたタンパク質を単離して、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成するか、または、培養物をプロモーターの誘導因子と接触させてタンパク質の発現をある時間誘導してから、その培養物を１つまたは複数のＰｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤と接触させ、阻害剤および誘導因子の存在下で宿主細胞によって生成されたタンパク質を単離して、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成する。
【００３０】
本方法の特定の態様において、核酸を有する多数の宿主細胞を得るのに十分な時間、培養物を増殖させてから、この培養物を１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素と接触させる。他の態様において、培養物を１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素の存在下で増殖させる。
【００３１】
本方法のさらなる態様において、１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素をコードする第二の核酸が準備され、この第二の核酸が宿主細胞に導入される。特定の態様において、誘導性プロモーターに作動可能に連結された１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素をコードする第二の核酸が準備され、この第二の核酸が宿主細胞に導入され、多数の宿主細胞を得るのに十分な時間、培養物を増殖させてから、タンパク質および１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素の発現を誘導してＯ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成するか、または、タンパク質の発現をある時間誘導してから、１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素の発現を誘導してＯ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成するか、または１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素の発現をある時間誘導してからタンパク質の発現が誘導されて、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質が生成される。
【００３２】
１つまたは複数のＰｍｔタンパク質阻害剤を使用する上記の方法のさらなる態様において、現在のところ、１つまたは複数の阻害剤が、ベンジリデンチアゾリジンジオンを含む分子のクラスから選択されることが好ましい。現在のところ、１つまたは複数の阻害剤は、５−［［３，４−ビス（フェニルメトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、５−［［３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、および５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸からなる群より選択されることが好ましい。
【００３３】
α−１，２−マンノシダーゼを使用する上述の方法の特定の態様において、現在のところ、α−１，２−マンノシダーゼが、トリコデルマ・レエセイ、サッカロミセス種、およびアスペルギルス種からなる群より選択されることが好ましい。現在のところ、α−１，２−マンノシダーゼが、トリコデルマ・レエセイ由来であることが好ましい。あるいは、宿主細胞は、タンパク質または糖タンパク質をコードする第一の核酸に加えて、誘導性プロモーターに作動可能に連結されたα−１，２−マンノシダーゼをコードする第二の核酸を含んでもよい。α−１，２−マンノシダーゼおよびタンパク質もしくは糖タンパク質の発現は、同時に誘導されてもよく、または、タンパク質もしくは糖タンパク質の発現は、α−１，２−マンノシダーゼの発現の前に誘導されてもよく、またはその逆もまた同様である。
【００３４】
本方法は、Ｏ−結合型グリコシル化を有するタンパク質を生成した任意の宿主細胞を用いて行うことができるが、現在好ましい態様において、宿主細胞は、下等真核細胞、好ましくは真菌細胞または酵母細胞である。現在、宿主細胞が、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、およびハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）由来の細胞からなる群より選択されることが好ましい。組換え糖タンパク質を生成するためのさらなる実施形態において、具体的には、宿主細胞は、優勢に特定のＮ−グリカン構造を有する糖タンパク質を生成するように遺伝子改変された、酵母または糸状菌細胞である。特に好ましい態様において、宿主細胞は、グリコシル化パターンがヒト様であるか、またはヒト化されている、組換え糖タンパク質を発現するように遺伝子改変されている。具体的には、宿主細胞は、特定の所望のＮ−グリカン構造を優勢に有する組換え糖タンパク質を発現するよう、改変されてもよい。グリコシル化プロフィールに関連して本明細書中で使用される場合、下等真核宿主細胞とは、通常高マンノース含有Ｎ−結合型グリカンを生成する任意の真核細胞をいい、したがって、単細胞または多細胞の真菌および藻細胞を含む、最も典型的な下等真核細胞が含まれる。
【００３５】
本明細書中で言及される全ての刊行物、特許、特許出願、および他の参考文献は、それらの全体が、参照によって本明細書中に援用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明は、Ｏ−結合型グリコシル化を特定の宿主細胞内で受容可能（susceptible）であって、その宿主細胞型内でＯ−結合型グリコシル化の量が減少している（Ｏ−結合型グリコシル化がない場合を含む）組換えタンパク質（ポリペプチドおよび糖タンパク質を含む）を発現するための方法を提供する。本方法は、タンパク質の発現が誘導された時に、細胞内でタンパク質のセリン残基もしくはスレオニン残基へのマンノースの転移に関与する１つまたは複数のＤｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：タンパク質（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）マンノシルトランスフェラーゼ（Ｐｍｔ）タンパク質の活性の化学阻害剤、または１つもしくは複数のα−１，２−マンノシダーゼ、またはその両方の存在下で、タンパク質がＯ−結合型グリコシル化受容可能である宿主細胞において目的のタンパク質の発現を誘導することを含む。阻害剤または１つもしくは複数のα１，２−マンノシダーゼの存在下で発現されたタンパク質は、阻害剤または１つもしくは複数のα１，２−マンノシダーゼまたは両方なしで生成されていればタンパク質上に存在していたＯ−結合型グリコシル化の量と比較して、Ｏ−結合型グリコシル化の量が減少している。本方法は、治療上関連性があるタンパク質であって、通常Ｏ−結合型グリカンを有するタンパク質を生成する宿主細胞（例えば、下等真核生物、例えば酵母、および細菌等）の中でタンパク質がＯ−グリコシル化量を減少していることが所望される場合に、Ｏ−結合型グリカン数が減少しているタンパク質を生成するための手段を提供するので、特に有用である。しかしながら、本方法は、下等真核生物においてＯ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を発現するのに特に適しているが、本方法はまた、高等真核生物および細菌においても実施することができる。
【００３７】
本方法は、タンパク質がＯ−結合型グリコシル化を受容可能である宿主細胞においてＯ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成するための、従来技術の方法の改良である。例えば、米国特許第５，７１４，３７７号におけるＴａｎｎｅｒらは、Ｐｍｔタンパク質をコードする１つまたは複数のＰＭＴ遺伝子が、Ｏ−結合型グリコシル化が減少している組換えタンパク質を生成するように遺伝子改変されている、酵母細胞等の真菌細胞を用いた、Ｏ−結合型グリコシル化が減少している組換えタンパク質を作るための方法を記載している。真菌宿主細胞におけるＰＭＴ１またはＰＭＴ２遺伝子のいずれかの欠失によって、真菌宿主細胞中でＯ−結合型グリコシル化が減少している組換えタンパク質の生成が可能になるが、ＰＭＴ１およびＰＭＴ２遺伝子の発現は、宿主細胞増殖にとって重要であり、いずれか単独の欠失のみもまた、真菌宿主細胞の増殖する能力に有害に影響を及ぼし、したがって、十分な量の宿主細胞またはＯ−結合型グリコシル化の量が減少している組換えタンパク質を生成するのが難しくなる。両方の遺伝子の欠失は、真菌宿主細胞にとって致死性であるようである。したがって、宿主細胞中のＰＭＴ１およびＰＭＴ２遺伝子の遺伝子の除去は、Ｏ−結合型グリコシル化が減少している組換えタンパク質を生成するには、望ましくない手段であるようである。
【００３８】
対照的に、本発明の方法において使用される宿主細胞中のＰＭＴ遺伝子は、改変または欠失されておらず、これによって、Ｐｍｔタンパク質の活性が阻害される時まで、宿主細胞が細胞増殖に重要なタンパク質をＯ−グリコシル化をすることができるようになる。一般に、このことによって、ＰＭＴ遺伝子が欠失された場合に取得できるレベルよりも高いレベルまで宿主細胞が増殖することができる。また、特定の実施形態において、宿主細胞における組換えタンパク質の発現が誘導性プロモーターによって制御され、この組換えタンパク質の発現が誘導されるまで、宿主細胞におけるＰｍｔ活性は阻害されないか、または、１つもしくは複数のα１，２−マンノシダーゼが添加されるか、またはその両方である。これによって、組換えタンパク質の発現を誘導し、Ｐｍｔ阻害剤および／または１つまたは複数のα１，２−マンノシダーゼを添加する前に、組換えタンパク質をコードする核酸を含む大量の宿主細胞が、培養物中で生成されることが可能になる。これによって、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているより大量の組換えタンパク質の生成が可能になり、１つまたは複数のＰＭＴ遺伝子が欠失して培養物中で増殖が乏しい宿主細胞について生じるよりも短い期間で培養物中に生成される。
【００３９】
従来技術のこの改良はまた、優勢に特定のＮ−結合型グリカン構造を有する糖タンパク質を生成するが糖タンパク質のＯ−グリコシル化もするように遺伝子改変された宿主細胞における、Ｏ−結合型グリコシル化が減少している糖タンパク質の生成を容易にする。優勢に特定のＮ−結合型グリコフォームを有する種々の糖タンパク質を生成するための方法は、米国特許第７，０２９，８７２号および米国特許出願公開２００５０１７０４５２、２００５０２６０７２９、２００４０２３００４２、２００５０２０８６１７、２００５０２０８６１７、２００４０１７１８２６、２００６０１６０１７９、２００６００４０３５３、および２００６０２１１０８５に開示されている。本明細書中に開示されている方法を用いて、前述の特許および特許出願に記載されている宿主細胞のいずれか１つを用いて、特定のＮ−結合型グリカン構造を有し、Ｏ−結合型グリコシル化が減少している糖タンパク質を、優勢に生成することができる。特定のＮ−グリカン構造を優勢に有する糖タンパク質を生成するように遺伝子改変されているいくつかの宿主細胞は、特定の条件下の培養物中で、改変されている宿主細胞よりも良好に増殖できないことが見出されている。例えば、高マンノシル化に関与する遺伝子が欠失されており、特定の哺乳動物またはヒト様Ｎ−結合型グリカン構造を生成するのに必要な他の遺伝子が付加された特定の真菌および酵母細胞は、遺伝子組換えしていない真菌または酵母細胞よりも良好に増殖することができない。これらの遺伝子組換え真菌または酵母細胞のいくつかにおいて、ＰＭＴ１またはＰＭＴ２遺伝子のいずれかの欠失をさらに導入することは、細胞にとって致死性であるか、またはその細胞が培養物中で十分な量まで増殖する能力に有害に影響を及ぼす。本明細書中の方法は、培養物中で細胞を十分な量増殖させてから、組換え糖タンパク質の発現を誘導し、Ｐｍｔタンパク質の活性の阻害剤、または１つもしくは複数のα１，２−マンノシダーゼ、または両方を添加して、特定のＮ−結合型グリカン構造を優勢に有し、かつＯ−結合型グリコシル化が減少している組換え糖タンパク質を生成することによって、ＰＭＴ１およびＰＭＴ２遺伝子を欠失することの潜在的な有害な効果を避ける。
【００４０】
したがって、本方法の重要な態様は、組換え糖タンパク質が、ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞培養物から生成された同じ糖タンパク質の組成物と比較して、生物学的活性の増大および／または望ましくない免疫原性の低下を示すことができる、Ｏ−結合型グリコシル化の減少および優勢な特定のＮ−結合型グリコフォームを含む糖タンパク質組成物を提供することである。Ｏ−結合型グリコシル化の減少および優勢なＮ−結合型グリコフォームを含む糖タンパク質組成物を生成することのさらなる利点は、望ましくない効果を誘導し得る、および／またはより効果的なグリコフォームを希釈し得る、望ましくない、または不活性なグリコフォームおよび不均一な混合物の生成を避けることである。したがって、例えば、Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、Ｇａｌ（ＧｌｃＮＡｃ）2Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、（ＧａｌＧｌｃＮＡｃ）2Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＮＡＮＡ2Ｇａｌ2ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、およびＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2のグリコフォームを優勢に含み、Ｏ−結合型グリコシル化が減少している糖タンパク分子の治療用医薬組成物はまた、より低い用量で効果的であり得、したがって、より高い有効性／力価を有し得る。
【００４１】
一般に、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成するための方法は、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成することが望ましい組換えまたは異種タンパク質をコードする核酸で宿主細胞を形質転換することを含む。組換えタンパク質をコードする核酸は、組換えタンパク質の発現を可能にする制御配列に作動可能に連結される。かかる制御配列としては、誘導性プロモーター、ならびに場合により、融合タンパク質をコードする核酸の上流または５'側のエンハンサー、および組換えタンパク質をコードする核酸の３'側または下流の転写終結点が挙げられる。核酸はまた、典型的には、リボソーム結合部位を有する５'ＵＴＲ領域および３'非翻訳領域をコードする。核酸は、しばしば、組換えタンパク質が発現される細胞中で複製可能なベクター成分である。ベクターはまた、マーカーを含んで、形質転換細胞の認識を可能にすることができる。しかしながら、いくつかの細胞型、特に酵母は、外来性のベクター配列を欠く核酸で、うまく形質転換することができる。
【００４２】
所望の組換えタンパク質をコードする核酸は、いくつかの供給源から得ることができる。ｃＤＮＡ配列は、保存領域に対するプライマーを用いてタンパク質を発現することが公知である細胞系から増幅することができる（例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５８１〜５９６頁（１９９１年）参照）。核酸はまた、科学文献中の配列に基づいて、デノボ合成することができる。核酸はまた、所望の配列にまたがる、重複するオリゴヌクレオチドの伸長によって合成することができる（例えば、Ｃａｌｄａｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１３、３５３〜３６０頁（２０００年）参照）。
【００４３】
一態様において、タンパク質をコードする核酸は、誘導性プロモーターに作動可能に連結され、そのタンパク質の発現が所望される時に誘導できる。別の態様において、これによって、タンパク質をコードする核酸は、構成的プロモーターに作動可能に連結される。発現されたタンパク質の単離を容易にするために、タンパク質が、細胞培地中に分泌されるようにタンパク質を方向づけるシグナル配列を含み、次いでその培地からタンパク質を単離することができることが、現在好ましい。第１の態様において、形質転換された宿主細胞は、所望の量のタンパク質を生成するのに十分な所望の多数の宿主細胞を生成するのに十分な時間、培養されてから、１つまたは複数のＰｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤が培地に加えられる。誘導因子および阻害剤は同時に培地に加えてもよく、または誘導因子を培地に加えてから１つもしくは複数のＰｍｔ阻害剤を培地に加えてもよく、または１つもしくは複数のＰｍｔ阻害剤を培地に加えてから誘導因子を加えてもよい。誘導されたタンパク質は、Ｏ−グリコシル化が減少して生成され、培地から、またはシグナル配列を有さないタンパク質については溶解によって宿主細胞から、回収することができる。タンパク質をコードする核酸が構成的プロモーターに作動可能に連結している第２の態様において、１つまたは複数のＰｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤は、培養物が確立されるのと同時に培地に加えられ、Ｏ−結合型グリコシル化が減少した生成タンパク質は、培地から、またはシグナル配列を有さないタンパク質については、溶解によって宿主細胞から、回収することができる。誘導性プロモーターを使用する方法を説明する例を実施例２に示し、構成的プロモーターを使用する方法を説明する例を、実施例３に示す。
【００４４】
Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成するために有用な阻害剤は、１つまたは複数のＰｍｔタンパク質の活性を阻害する化学物質または組成物である。宿主細胞が真菌または酵母等の下等真核生物である場合、阻害剤が少なくともＰｍｔ１もしくはＰｍｔ２または両方の活性を阻害することが望ましい。高等真核生物において、阻害剤が、ＰｍｔまたはＰｍｔ２に対応する、高等真核生物におけるホモログの活性を阻害することが望ましい。使用することができる化学阻害剤としては、５−［［３，４−ビス（フェニルメトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、５−［［３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、３−ヒドロキシ−４−（２−フェニルエトキシ）ベンズアルデヒド、３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）−ベンズアルデヒド、および５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸を含む、米国特許第７，１０５，５５４号中で同定されているベンジリデンチアゾリジンジオンが挙げられる。有用な場合がある他の化合物は構造的に類似した化合物であり、糖尿病の遅発効果の予防および治療ならびにアテローム性動脈硬化症および動脈硬化症の予防および治療において有用であると開示されているアリーリデン−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジンカルボン酸を作る方法を開示している国際公開第９４／２９２８７号におけるＶｏｓｓらに開示されるもの、ならびにロダニンカルボン酸（ｒｈｏｄａｎｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄｓ）の誘導体を作る方法および代謝性骨障害の治療のためのそれらの使用を開示している米国特許第６，６７３，８１６号におけるＥｓｓｗｅｉｎらにおいて開示されるものである。
【００４５】
実施例において、５−［［３，４−ビス（フェニルメトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、５−［［３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、および５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸からなる群より選択された化学阻害剤は、インタクトな機能性ＰＭＴ１およびＰＭＴ２遺伝子を有するピキア・パストリス株において、Ｏ−結合型グリコシル化が減少している組換えタンパク質の生成において効果的であることが示されている。実施例２の表１は、組換えタンパク質の発現が誘導された時に、インタクトな機能性ＰＭＴ１およびＰＭＴ２遺伝子を有し、誘導性プロモーターに作動可能に連結された組換え分泌性クリングル１〜３タンパク質をコードする核酸で形質転換された組換えピキア・パストリスの培養物に添加された上述の３つのＰｍｔ化学阻害剤のいずれか１つが、ＰＭＴ１またはＰＭＴ２遺伝子のいずれかの欠失を含むピキア・パストリス細胞について見られるＯ−結合型グリコシル化のレベルに匹敵する、Ｏ−結合型グリコシル化のレベルが減少している組換えタンパク質を生成したことを示す。上述のＰｍｔｉ阻害剤は、約０．０３μＭ〜２０μＭの量で使用されて、Ｐｍｔｉ阻害剤なしで同様の宿主細胞培養物中で増殖した場合のタンパク質上のＯ−結合型グリコシル化の量と比較して、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成する。実施例３に示される結果から、さらに、宿主細胞培養物が、宿主細胞を死滅させることなく、Ｏ−結合型グリコシル化を阻害するのに十分な量で、Ｐｍｔｉ阻害剤の存在下で増殖することができることが示される。
【００４６】
本方法は、１つまたは複数のＰｍｔ阻害剤を含む培地に１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼ酵素を加えて、Ｏ−結合型グリコシル化が減少している組換えタンパク質を生成することを含んでもよい。α−１，２−マンノシダーゼは、酵母においてＭａｎ9ＧｌｃＮＡｃ2からＭａｎ8ＧｌｃＮＡｃ2へ切り取ることができるＮ−グリカンの成熟のための真核生物の酵素の、保存されたファミリーである（Ｖａｌｌｅｅら、２０００年、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９：５８１〜５８８頁）。α−１，２−マンノシダーゼはまた、クラスＩα−マンノシダーゼとしても公知であり、哺乳動物、下等真核生物種、および昆虫細胞において同定されている（Ｋａｗａｒら、２０００年、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０：３４７〜３５５頁）。哺乳動物細胞は、いくつかのクラスＩα−マンノシダーゼを有することが公知であり、そのいくつかは、複数のマンノース残基を切り取ることができるが（Ｍｏｒｅｍｅｎら、１９９４年、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４：１１３〜１２５頁）、酵母は、より少ない、より特定化したα−１，２−マンノシダーゼを有するようである。例えば、サッカロミセスは、１つの特定のマンノース残基を除去する（例えば、Ｍａｎ9ＧｌｃＮＡｃ2からＭａｎ8ＧｌｃＮＡｃ2へ）、ＭＮＮ１によってコードされる単一のα−１，２−マンノシダーゼを有することが開示されている（Ｈｅｒｓｃｏｖｉｃｓ、１９９９年、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．、１４７３：９６〜１０７頁）。したがって、真菌および酵母等の多くの下等真核生物中に存在し、グリカン構造から複数のマンノース残基を除去することができない内在性α−１，２−マンノシダーゼは、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質の生成を可能にすることができない。したがって、本明細書中の方法は、Ｏ−結合型グリカンから複数のマンノース残基を切り取ることができるα−１，２−マンノシダーゼの、宿主細胞を含む培地への導入、またはＯ−結合型グリカンから複数のマンノース残基を切り取ることができるα−１，２−マンノシダーゼをコードする核酸の宿主細胞への導入を必要とする。本明細書中のα−１，２−マンノシダーゼとしては、インタクトな天然のα−１，２−マンノシダーゼ、α−１，２−マンノシダーゼ活性を増強するよう改変されたα−１，２−マンノシダーゼ、α−１，２−マンノシダーゼ活性を減少させるよう改変されたα−１，２−マンノシダーゼ、および、α−１，２−マンノシダーゼ活性を有する少なくとも触媒ドメインを含む組換えα−１，２−マンノシダーゼ（例えば、異種のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに融合した、α−１，２−マンノシダーゼ活性を有する触媒ドメインを含む融合タンパク質）が挙げられる。
【００４７】
特定の実施形態において、Ｏ−結合型グリカンから複数のマンノース残基を切り取ることができ、細胞培養物に添加されるα−１，２−マンノシダーゼは、トリコデルマ（trichoderma）種、サッカロミセス（Saccharomyces）種、またはアスペルギルス（Aspergillus）種によって生成される。現在、好ましいα−１，２−マンノシダーゼは、トリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）、黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）、またはコウジカビ（Aspergillus oryzae）から得られる。Ｔ．レエセイはまた、ヒポクレア・ジェコリナ（Hypocrea jecorina）としても公知である。実施例３において、サッカロミセス・セレビシエαＭＡＴプレシグナル（pre signal）配列に融合したトリコデルマ・レエセイα−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインを含む組換えα−１，２−マンノシダーゼを発現する、発現カセットを含む、形質転換された酵母を用いて、Ｏ−結合型グリコシル化が減少している組換えタンパク質を生成した。Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成するために、本明細書中の方法において使用することができる組換えα−１，２−マンノシダーゼの別の例は、Ｍａｒａｓら、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７：２５５〜２６３頁に開示されている組換えトリコデルマ・レエセイα−１，２−マンノシダーゼであり、ここでトリコデルマ・レエセイα−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインは、サッカロミセス・セレビシエα−ＭＡＴプレプロシグナル（ｐｒｅｐｒｏ−ｓｉｇｎａｌ）ペプチドに融合した。
【００４８】
α−１，２−マンノシダーゼはまた、通常触媒ドメインと関連しない細胞内標的化シグナルペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結された、Ｏ−結合型グリカンから複数のマンノース残基を切り取ることができるα−１，２−マンノシダーゼの少なくとも触媒ドメインをコードする核酸配列を含む、キメラ核酸から生成することができる。キメラ核酸は、構成的または誘導性プロモーターに、作動可能に連結させることができる。キメラ核酸を宿主細胞に形質転換して、α−１，２−マンノシダーゼを生成し、次いでこれを単離し、次いで、タンパク質の発現が誘導される時に、異種タンパク質をコードする核酸で形質転換された細胞を含む細胞培地に添加する。あるいは、宿主細胞を、α−１，２−マンノシダーゼをコードするキメラ核酸および組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換し、α−１，２−マンノシダーゼおよび組換えタンパク質を、同じ時点に同時発現する。特定の実施形態において、α−１，２−マンノシダーゼをコードするキメラ核酸および組換えタンパク質をコードする核酸の両方はともに誘導性プロモーターに作動可能に連結している。他の実施形態において、プロモーターの一方または両方が構成的である。実施例３は、α−マンノシダーゼおよび組換えタンパク質の両方をコードする核酸が構成的プロモーターに作動可能に連結され、宿主細胞に導入され、次いで宿主細胞の培養物が１つまたは複数のＰｍｔ阻害剤の存在下でインキュベートされて、Ｏ−結合型グリコシル化が減少している組換えタンパク質を生成する方法を説明している。実施例３は、Ｐｍｔｉ阻害剤およびα−１，２−マンノシダーゼが、いずれか単独の存在下でのＯ−結合型グリコシル化の量と比較して、Ｏ−結合型グリコシル化の量を相乗的に減少させるようであるようであることをさらに示す。
【００４９】
特定の態様において、Ｏ−結合型グリコシル化の減少は、１つまたは複数のＰｍｔ阻害剤でなく、１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼのみを培地に添加することによって生じることができる。一態様において、組換えタンパク質をコードする核酸は、組換えタンパク質の発現が所望される時に誘導できるようになる誘導性プロモーターに作動可能に連結される。別の態様において、タンパク質をコードする核酸は、構成的プロモーターに作動可能に連結される。発現されたタンパク質の単離を容易にするために、そのタンパク質が、細胞培地中に分泌されるように組換えタンパク質を方向づけるシグナル配列を含み、次いでこれを単離することができることが現時点で好ましい。
【００５０】
第１の態様において、形質転換された宿主細胞が、所望の量の組換えタンパク質を生成するのに十分な所望の多数の宿主細胞を生成するのに十分な時間培養されてから１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼが培地に添加される。誘導因子および１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼを同時に培養物に加えるか、または培養物に誘導因子を加えてから１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼを加えるか、または１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼを培養物に加えてから誘導因子を加える。誘導された組換えタンパク質は、Ｏ−結合型グリコシル化を減少して生成され、培地から、またはシグナル配列を有さないタンパク質については溶解によって宿主細胞から、回収することができる。
【００５１】
組換えタンパク質をコードする核酸が構成的プロモーターに作動可能に連結される、第２の態様において、培養物が確立されるのと同時に、１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼが培地に添加され、Ｏ−結合型グリコシル化が減少して生成された組換えタンパク質は、培地から、または、シグナル配列を有さない組換えタンパク質については、溶解によって宿主細胞から、回収することができる。
【００５２】
Ｐｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤を用いることなくＯ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質を生成するためのさらなる態様において、宿主細胞は、α−１，２−マンノシダーゼをコードするキメラ核酸および組換えタンパク質をコードする核酸で形質転換され、α−１，２−マンノシダーゼおよび組換えタンパク質が同時発現されて、Ｏ−結合型グリコシル化が減少している組換えタンパク質が生成される。特定の実施形態において、α−１，２−マンノシダーゼをコードするキメラ核酸および組換えタンパク質をコードする核酸の両方はともに誘導性プロモーターに作動可能に連結している。他の実施形態において、プロモーターの一方または両方が構成的である。誘導性プロモーターの場合、宿主細胞を増殖させて、所望の多数の宿主細胞を生成してから、α−１，２−マンノシダーゼおよび／または組換えタンパク質の発現を誘導する。実施例３は、α−１，２−マンノシダーゼおよび組換えタンパク質の両方をコードする核酸が構成的プロモーターに作動可能に連結している方法が、宿主細胞に導入され、次いで、宿主細胞の培養物が、α−１，２−マンノシダーゼなしで細胞において生成された組換えタンパク質と比較してＯ−結合型グリコシル化が減少している組換えタンパク質を生成するのに十分な時間インキュベートされる方法を説明する。
【００５３】
ＩＩ．宿主細胞
本明細書中の方法のための宿主細胞としては、高等真核細胞および下等真核細胞の両方が挙げられるが、下等真核細胞、例えば糸状菌または酵母細胞が、経済的に培養することができ、高収量のタンパク質を生じることができ、適切に改変された場合、適切なグリコシル化パターンを有するタンパク質を生成することができるので、タンパク質の生成のために現時点で好ましい。下等真核生物としては、酵母、真菌、襟鞭毛虫、微胞子虫、アルベオラータ（alveolates）（例えば、渦鞭毛藻類）、黄色植物（stramenopiles）（例えば、褐藻、原生動物）、紅藻類（例えば、紅藻）、植物（例えば、緑藻、植物細胞、藻類）および他の原生生物が挙げられる。酵母および真菌としては、ピキア種（例えば、ピキア・パストリス、ピキア・フィンランディカ（Pichia finlandica）、ピキア・トレハロフィラ（Pichia trehalophila）、ピキア・コクラマエ（Pichia koclamae）、ピキア・メンブラナファシエンス（Pichia membranaefaciens）、ピキア・ミヌタ（Pichia minuta）（オガタエア・ミヌタ（Ogataea minuta）、ピキア・リンドネリ（Pichia lindneri））、ピキア・オプンティアエ（Pichia opuntiae）、ピキア・サーモトレランス（Pichia thermotolerans）、ピキア・サリクタリア（Pichia salictaria）、ピキア・グエルクウム（Pichia guercuum）、ピキア・ピペリ（Pichia pijperi）、ピキア・スティプティス（Picha stiptis）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica））、サッカロミセス種（例えば、サッカロミセス・セレビシエ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）種（例えば、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis））、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、アスペルギルス種（例えば、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、黒色アスペルギルス、コウジカビ）、トリコデルマ・レエセイ、クリソスポリウム・ルクノウエンス（Chrysosporium lucknowense）、フザリウム（Fusarium）種（例えば、フザリウム・グラミネウム（Fusarium gramineum）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum））、ニセツリガネゴケ（Phycomitrella patens）およびアカパンカビ（Neurospora crassa）が挙げられるが、これらに限定されない。特に、酵母は迅速な形質転換、試験済みのタンパク質局在化戦略、および容易な遺伝子ノックアウト技術を可能にする確立された遺伝学を提供するので、酵母が現在好ましい。適したベクターは、所望により、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素を含むプロモーター等の発現制御配列、複製開始点、終止配列等を有する。
【００５４】
Ｋ．ラクチス、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、およびハンゼヌラ・ポリモルファ等の種々の酵母は、高い細胞密度に増殖することができ、大量の組換えタンパク質を分泌するので、現在、細胞培養のために好ましい。同様に、黒色アスペルギルス、フザリウム種、アカパンカビ、および他のもの等の糸状菌を用いて、産業規模で組換えタンパク質を生成することができる。
【００５５】
下等真核生物、具体的には糸状菌および酵母は、グリコシル化パターンがヒト様であるか、またはヒト化されているタンパク質または糖タンパク質を発現するように遺伝子改変されてもよい。これは、米国特許第７０２９８７２号におけるＧｅｒｎｇｒｏｓｓら、ならびに米国公開特許出願２００４００１８５９０、２００５０１７０４５２、２００５０２６０７２９、２００４０２３００４２、２００５０２０８６１７、２００４０１７１８２６、２００５０２０８６１７、２００６０１６０１７９、２００６００４０３５３、および２００６０２１１０８５によって記載されているように、選択された内在性グリコシル化酵素を排除すること、および／または外来性酵素を供給することによって、達成することができる。したがって、宿主細胞は、さらに、または代替的に、１つまたは複数の酵素または酵素活性を発現するよう操作して、これによって特定のＮ−グリカン構造の高収率での生成を可能にすることができる。例えば、通常酵素と関連しないシグナルペプチドによって、かかる酵素を、その酵素が最適な活性を有する宿主細胞内小器官に標的化することができる。宿主細胞はまた、糖ヌクレオチドトランスポーターおよび／またはヌクレオチドジフォスファターゼ酵素を発現するよう改変することができる。トランスポーターおよびジフォスファターゼは、適切な区画においてグリコシル化酵素に適切な基質を提供すること、競合的生成物阻害を減少させること、およびヌクレオシド二リン酸の除去を促進させることによって、操作されたグリコシル化工程の効率を向上させる。例えば、米国公開特許出願２００４００１８５９０におけるＧｅｒｎｇｒｏｓｓらおよびＨａｍｉｌｔｏｎ、２００３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：１２４４〜４６頁ならびに前述の米国特許および特許出願を参照のこと。
【００５６】
例として、宿主細胞（例えば、酵母または真菌）を選択または操作して、他の状態では糖タンパク質のＮ−グリカンにマンノース残基を付加させる１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を、枯渇させることができ、さらに、α−１，２−マンノシダーゼ活性の異所性発現のための核酸を含むことができ、これによって、３０モルパーセントより大きいＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2Ｎ−グリカンを有する組換え糖タンパク質の生成が可能になる。本明細書中に記載されている方法に従って宿主細胞中で糖タンパク質が生成される場合、宿主細胞は、他の状態で細胞中で生成された糖タンパク質と比較して、優勢にＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2Ｎ−グリカン構造を有しかつＯ−グリコシル化が減少している糖タンパク質を生成する。さらなる態様において、宿主細胞はＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性の異所性発現のための核酸をさらに含むよう操作され、これによって優勢にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質の生成が可能になる。本明細書中に記載されている方法に従って宿主細胞中で糖タンパク質が生成される場合、宿主細胞は、他の状態で細胞中で生成される糖タンパク質と比較して、優勢にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2Ｎ−グリカン構造を有し、かつＯ−グリコシル化が減少している糖タンパク質を生成する。さらなる態様において、宿主細胞は、マンノシダーゼＩＩ活性の異所性発現のための核酸をさらに含むように操作され、これによって、優勢にＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質の生成が可能になる。本明細書中に記載されている方法に従って宿主細胞中で糖タンパク質が生成される場合、宿主細胞は、他の状態で細胞中で生成される糖タンパク質と比較して、優勢にＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2Ｎ−グリカン構造を有しかつＯ−グリコシル化が減少している糖タンパク質を生成できる。さらなる態様において、宿主細胞はＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性の異所性発現のための核酸をさらに含むように操作され、これによって優勢にＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質の生成が可能になる。本明細書中に記載されている方法に従って宿主細胞中で糖タンパク質が生成される場合、宿主細胞は、他の状態で細胞中で生成される糖タンパク質と比較して、優勢にＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2Ｎ−グリカン構造を有しかつＯ−グリコシル化が減少している糖タンパク質を生成する。さらなる態様において、上述の宿主細胞はさらに操作されて、任意の組み合わせで、例えばシアル酸転移酵素活性、クラスＩＩおよびＩＩＩマンノシダーゼ活性、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ活性、ならびにガラクトーストランスフェラーゼ活性をコードするＮ−結合型グリコシル化に関与する１つまたは複数の高等真核生物遺伝子をさらに含むことによって、特定のハイブリッドまたは複合体Ｎ−グリカン構造またはヒト様Ｎ−グリカン構造を生成できる。細胞がＵＤＰ特異的ジフォスファターゼ活性、ＧＤＰ特異的ジフォスファターゼ活性、およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター活性をコードする１つまたは複数の核酸をさらに含むことが、現時点で好まし���。
【００５７】
本明細書中で教示されるような、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質および糖タンパク質の発現のために、植物細胞培養物および植物細胞培養物を用いてもよい（例えば、ＬａｒｒｉｃｋおよびＦｒｙ、１９９１年、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ２：１７２〜８９頁参照）、Ｂｅｎｖｅｎｕｔｏら、１９９１年、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７：８６５〜７４頁）、Ｄｕｒｉｎら、１９９０年、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：２８１〜９３頁）、Ｈｉａｔｔら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：７６〜８頁）。好ましい植物宿主としては、例えば、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum）、ニコチアナ・ルスチカ（Nicotiana rustica）、およびバレイショ（Solanum tuberosum）が挙げられる。
【００５８】
昆虫細胞培養物もまた、本明細書中で教示されている例えばバキュロウイルスベースの発現系のように、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質および糖タンパク質を生成するために使用することができる（例えば、Ｐｕｔｌｉｔｚら、１９９０年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：６５１〜６５４頁参照）。
【００５９】
現在、下等真核生物および原生生物ほど培養するのが経済的ではないが、哺乳動物組織細胞培養物もまた、本明細書中で教示されるような、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質および糖タンパク質を発現および生成するのに使用することができる（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ニューヨーク、１９８７年参照）。適した宿主としては、ＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、好ましくは骨髄腫細胞株等、または形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマが挙げられる。これらの細胞のための発現ベクターとしては、複製開始点、プロモーター、エンハンサー等の発現制御配列（Ｑｕｅｅｎら、１９８６年Ｉ，ｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９〜６８頁）、ならびに、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列等の必要なプロセシング情報部位を挙げることができる。転写制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス等に由来するプロモーターである。一般に、ｎｅｏＲ発現カセット等の選択可能なマーカーが、発現ベクターに含まれる。
【００６０】
細胞宿主の型によって異なる従来の方法によって、発現されるタンパク質をコードする核酸を、宿主細胞に転移させることができる。例えば、リン酸カルシウム処理、プロトプラスト融合、天然の育種、リポフェクション、微粒子銃、ウイルスベースの形質導入またはエレクトロポレーションを、細胞宿主のために使用することができる。タングステン粒子を撃ち込むことによる遺伝子導入が、植物細胞および組織のために好ましい。（一般に、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８２年）参照）。
【００６１】
一旦発現されると、Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質または糖タンパク質は、硫安沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法等を含む、当該分野の標準的な手順に従って精製することができる（一般に、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、１９８２年）参照）。製薬学的用途のためには、少なくとも約９０〜９５％の均一性の実質的に純粋な糖タンパク質が好ましく、９８〜９９％の均一性が最も好ましい。所望により部分的に、または均一になるまで、一旦精製されると、次いで、タンパク質は、治療上（体外を含む）またはアッセイ手順、免疫蛍光染色等の開発および実施に、使用することができる。（一般に、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第ＩおよびＩＩ巻（ＬｅｆｋｏｖｉｔｓおよびＰｅｒｎｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９７９年および１９８１年参照）。
【００６２】
したがって、Ｐｍｔ媒介性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤、もしくはグリカン構造から１つより多いマンノース残基を切り取ることができるα−１，２−マンノシダーゼ、または両方の存在下でインキュベートされていない宿主細胞中で生成された糖タンパク質の組成物と比較して、Ｎ−グリカン構造の優勢な種を含み、Ｏ−結合型グリコシル化が減少している糖タンパク質組成物がさらに提供される。特定の態様において、糖タンパク質組成物は、Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、Ｇａｌ（ＧｌｃＮＡｃ）2Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、（ＧａｌＧｌｃＮＡｃ）2Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＮＡＮＡ2Ｇａｌ2ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、およびＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2のグリコフォームからなる群より選択される、優勢なＮ−グリカン構造を有する糖タンパク質を含む。
【００６３】
ＩＩＩ．医薬組成物
Ｏ−結合型グリコシル化が減少しているタンパク質および糖タンパク質を、活性治療剤としての糖タンパク質および種々の他の薬学的に許容され得る成分を含む医薬組成物中に組み込むことができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルバニア州イーストン、１９８０年参照）。好ましい形態は、意図される投与の様式および治療用途による。組成物はまた、所望される製剤によって、動物またはヒト投与のための医薬組成物を製剤化するのに一般に使用される賦形剤（vehicle）として定義される、薬学的に許容され得る非毒性の支持体または希釈剤を含んでもよい。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響を及ぼさないよう選択される。かかる希釈剤の例は、蒸留水、生理学的リン酸緩衝食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、およびハンクス液である。また、医薬組成物または製剤はまた、他の支持体、アジュバント、または非毒性で非治療的な非免疫原性の安定剤等を含むことができる。
【００６４】
非経口投与のための医薬組成物は、無菌で、実質的に等張であり、発熱物質を含まず、ＦＤＡのＧＭＰまたは同様の主文に従って調製される。糖タンパク質は、注射可能な投与量の、水、油、生理食塩水、グリセリンもしくはエタノール等の無菌の液体であってもよい薬学的支持体を含む、生理学的に許容され得る希釈剤中の物質の溶液または懸濁液として、投与することができる。また、湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質等の補助剤が、組成物中に存在してもよい。医薬組成物の他の成分は、石油、動物、野菜、または合成の起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、およびミネラルオイルの成分である。一般に、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等のグリコールが、特に注射可能な溶液のために、好ましい液体支持体である。糖タンパク質は、活性成分の徐放を可能にするように製剤化することができるデポー注射またはインプラント調製物の形態で投与することができる。典型的には、組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとしての注射剤として調製され、注射の前に液体媒介物中の溶液または懸濁液に適した固体形態を調製してもよい。調製物はまた、上述のように、ポリ乳酸、ポリグリコリド等のリポソームもしくは微小粒子、または増強されたアジュバント効果のための共重合体中に乳化またはカプセル化してもよい（Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９、１５２７頁（１９９０年）およびＨａｎｅｓ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２８、９７〜１１９頁（１９９７年）参照）。
【００６５】
本明細書中で別途定義されない限り、本発明に関連して使用される科学的および技術的用語および語句は、当業者に一般に理解されている意味を有する。さらに、別途文脈によって必要とされない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含む。一般に、本明細書中に記載されている、関連して使用される命名法、ならびに生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質核酸化学ならびにハイブリダイゼーションの技術は、周知で、当該分野で一般に使用されているものである。本発明の方法および技術は、一般に、別途指示しない限り、本明細書全体で引用および議論されている種々の一般的な、およびより詳しい参考文献に記載されているような、当該分野で周知の従来の方法に従って行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９年）、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２年、および２００２年までの補遺）、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９９０年）、ＴａｙｌｏｒおよびＤｒｉｃｋａｍｅｒ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３年）、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍａｎｕａｌ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、ニュージャージー州フリーホルド、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第Ｉ巻、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６年）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第ＩＩ巻、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６年）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９年）を参照のこと。
【００６６】
以下の実施例は、本発明のさらなる理解を促進するよう意図される。
【実施例１】
【００６７】
この実施例は、種々のＰｍｔ阻害剤を調製するための方法を提供する。別途明記しない限り、全ての材料は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（ミズーリ州セントルイス）から得て、受け取ったままで使用した。全ての中間体および最終生成物の1Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、公開されたデータと一致する。
【００６８】
Ｐｍｔｉ−１、（５−［［３，４−ビス（フェニルメトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸）の調製は、以下の通りである。
【化１】
2009515963.tif 000003
【００６９】
手順は、米国特許第７，１０５，５５４号におけるＯｒｃｈａｒｄらから翻案した。酢酸（３０ｍＬ）中のロダニン−３−酢酸（１ｇ、５．２０ｍｍｏｌ、１当量）、３，４−ジベンジルオキシベンズアルデヒド（２．０４ｇ、６．２５ｍｍｏｌ、１．２当量）、および酢酸ナトリウム（１．３ｇ、１５．６ｍｍｏｌ、３当量）の溶液を加熱還流し、一晩撹拌する。反応混合物を室温まで冷却すると、生成物を沈殿させ、ろ過し、酢酸で、次いで石油エーテルで洗浄する。残渣を熱いＤＭＳＯに溶解させ、ろ過し、水の添加によって沈殿させる。冷却する際に、沈殿をろ過し、酢酸エチルおよび石油エーテルから再結晶化して、水に懸濁した生成物を得て、真空中で一晩凍結乾燥して、綿毛状の黄色の粉末として、最終生成物を得る。
【００７０】
Ｐｍｔｉ−２、２（５−［［３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸）、の調製は、以下の通りである。
【化２】
2009515963.tif 000004
【００７１】
この生成物を、米国特許第７，１０５，５５４号におけるＯｒｃｈａｒｄらの指示に従って合成する。ロダニン−３−酢酸（３７５ｍｇ、１．９６ｍｍｏｌ、１当量）、３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）ベンズアルデヒド（６８０ｍｇ、１．９６ｍｍｏｌ、１当量）および酢酸アンモニウム（４５３ｍｇ、３当量）の溶液を１０分間、７０℃まで加熱し、次いで室温まで冷却し、酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈する。有機溶液を１Ｍ  ＨＣｌ（２×２００ｍＬ）およびブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、次いで硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させる。３５〜７５μｍのＣ１８を充填した１０×２．５ｃｍガラスカラム（Ａｌｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、イリノイ州ディアフィールド）を用いた液体クロマトグラフィーによって、生成物を精製する。グラジエント溶出を採用する。バッファーＡは０．１％酢酸であり、バッファーＢは８０％アセトニトリルである。グラジエントは、３分間２０％Ｂで構成され、４０分間にわたって７５％Ｂに増大する。流速は８ｍＬ／分である。検出は２８０ｎｍである。適切な画分を貯蔵し、濃縮し、真空中で凍結乾燥して、綿毛状の黄色の粉末として、生成物を得る。
【００７２】
Ｐｍｔｉ−３、（５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸）、（米国特許第７，１０５，５５４号におけるＯｒｃｈａｒｄら）、の調製を、以下のように、３段階で合成する。
【化３】
2009515963.tif 000005
【００７３】
工程１：（＋）−（Ｓ）−２−アセトキシ−１−ブロモ−１−フェニルエタンの生成。約５分間の間、冷たいＨＢｒ−酢酸（１２．４ｇ、５２．２ｍｍｏｌ）を、（−）−（Ｒ）−１−フェニルエタン−１，２−ジオール（２．４ｇ、１７．４ｍｍｏｌ）に滴下し、混合物を室温で４０分間撹拌する。水（２５ｍＬ）を加え、溶液を炭酸ナトリウムで中和し、エーテルで抽出する（３×３０ｍＬ）。合わせた抽出物を乾燥させ、蒸発させて、（＋）−（Ｓ）−２−アセトキシ−１−ブロモ−１−フェニルエタン（３．９３ｇ、９３％）、ｄ２５  １．４１５ｇ／ｍＬ、［ｘ］0２４＋９３．５°（ＣＣｌ4中ｃ５．６３）２．７２（５Ｈ，ｓ）、４．９８（ａＨ，ｄｄ，６．７および７．０Ｈｚ）および５．５６（２Ｈ，ｄ）を得る。この生成物は希釈しない。異性体の均一性は、ｎｍｒスペクトル（ＰｈＣＨ*ＯＡｃ共鳴なし）の、１，２−ジアセトキシ−１−フェニルエタンのものとの比較によって確立する。（ラセミ試薬を、列挙した光学異性体の代用とすることに留意されたい）。
【００７４】
工程２：３−［（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ］−４−（２−フェニルエトキシ）−ベンズアルデヒドの生成。（２−アセトキシ−１−ブロモエチル）ベンゼン（３．３２ｇ、１３．６７ｍｍｏｌ、１．２当量）（工程１の生成物）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）中の３−ヒドロキシ−４−（２−フェニルエトキシ）−ベンズアルデヒド（２．６ｇ、１１．３９ｍｍｏｌ、１当量）および炭酸セシウム（２．９７ｇ、９．１１ｍｍｏｌ、０．８当量）の、撹拌されている溶液に加える。溶液を室温で１９時間、次いで、８０℃で２１時間撹拌する。酢酸エチルと水の間で分割することによって、反応を後処理する（ブラインを加えて、形成された乳濁液を崩壊させるのを助ける）。有機層を水、ブラインでさらに２回洗浄し、次いで硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させて、濃い色の油（ｄａｒｋ  ｏｉｌ）を得る。シリカゲル上でのクロマトグラフィーによって残渣を精製し、ジエチルエーテルでの溶出によって橙色の油を得る。この油をメタノール（１００ｍＬ）に溶解させ、溶液に、水酸化ナトリウムの水溶液（７ｍＬ、１Ｍ）を加える。３０分後、混合物を蒸発させ（メタノールを除去する）、ジクロロメタンと水の間で残渣を分割する。硫酸ナトリウム上で有機層を乾燥させ、蒸発させる。シリカゲル上でのクロマトグラフィーによって残渣を精製し、石油エーテル：ジエチルエーテル（１：２）での溶出によって、淡黄色の粉末として生成物を得る。
【００７５】
工程３：Ｐｍｔｉ−３の生成。トルエン（１０ｍＬ）中のロダニン−３−酢酸（１５８ｍｇ、０．８２８ｍｍｏｌ、１当量）、３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）ベンズアルデヒド（３００ｍｇ、０．８２８ｍｍｏｌ、１当量）（工程２の生成物）、および酢酸アンモニウム（１９１ｍｇ、３当量）の溶液を３．５時間加熱還流し、室温まで冷却し、酢酸エチル（５０ｍＬ）で希釈する。有機溶液を１Ｍ  ＨＣｌ（２×２００ｍＬ）およびブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、次いで硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させる。後処理の後、シリカゲル上でのクロマトグラフィーによって残渣を精製する。酢酸エチルでの溶出によって、黄色のゴム質を得、これをジエチルエーテルおよび石油エーテルから再結晶化して、黄色の粉末として生成物を得る。
【実施例２】
【００７６】
この実施例は、クリングル１〜３マーカー糖タンパク質をコードする発現ベクターで形質転換され、Ｐｍｔ阻害剤で処理されたピキア・パストリスが、Ｏ−グリコシル化が減少している糖タンパク質を生成したことを示す。
【００７７】
ピキア・パストリスのアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーターの制御下でヒトプラスミノーゲンドメインＫ１、Ｋ２、およびＫ３（クリングル１〜３タンパク質）からなるＨｉｓタグレポーター糖タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡを、野生型ピキア・パストリスに形質転換して、ｙＪＣ５３株を生成した。ドメインＫ１、Ｋ２、Ｋ３、およびＫ４からなるクリングルレポータータンパク質は、Ｄｕｍａｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８年）、第２８巻、３９〜４５頁中、およびドメインＫ３のみＣｈｏｉら、２００３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（９）：５０２２〜５０２７頁で、考察されている。実施例中で使用されるクリングル１〜３タンパク質のアミノ酸配列は、
【化４】
2009515963.tif 000006
である。クリングル１〜３タンパク質は、−１および＋３で意味されるコンセンサス配列Ｐに適合する少なくとも２つの潜在的な哺乳動物Ｏ−グリコシル化部位を含む。Ｏ−グリコシル化されたセリン残基がアミノ酸配列「ｐｐｐＳｓｇｐ」中で大文字で記されており、Ｏ−グリコシル化されたスレオニン残基が、アミノ酸配列「ｌａｐＴａｐｐ」中で大文字で記されている。Ｏ−グリコシル化部位は、上記のアミノ酸配列中で下線が引かれている。潜在的な哺乳動物Ｏ−グリコシル化部位は、Ｋ１およびＫ２のドメイン間ならびにＫ２およびＫ３のドメイン間に位置している。しかしながら、表１に示されるように、酵母において、タンパク質は、約２０個のＯ−結合型グリコシル化部位を有する。したがって、Ｏ−結合型グリコシル化は、本明細書中の方法によって示されるようにＯ−結合型グリコシル化を阻害することなく酵母中でタンパク質を生成するのに、相当に不利な点である場合がある。Ｎ−グリコシル化部位は、配列番号１の２０８位のアスパラギンをセリンで置換することによって除去されたＫ３ドメイン中にある。したがって、クリングル１〜３タンパク質上の唯一のグリカン類は、Ｏ−グリコシル化の結果であろう。
【００７８】
フォワードプライマーＫ１〜３／ＵＰ５'−ＣＧＧＡＡ  ＴＴＣＴＣ  ＡＧＡＧＴ  ＧＣＡＡＧ  ＡＣＴＧＧ  ＧＡＡＴＡ  ＧＡＡ−３'（配列番号２）およびリバースプライマーＫ１〜３／ＬＰ１（リバースプライマー、３Ｇｌｙ＋２Ｈｉｓ、Ｋ１〜３／ＵＰと対になっている）５'−ＡＴＧＡＴ  ＧＡＴＧＡ  ＣＣＡＣＣ  ＡＣＣＧＴ  ＣＣＴＧＧ  ＡＣＣＡＣ  ＡＧＧＧＧ  ＴＴＡＧ−３'（配列番号３）を用いて、クリングル１〜３タンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドを調製して、ＰＣＲ産物を生成し、次いでこれを、リバースプライマーＫ１〜３／ＬＰ２（リバースプライマー、３Ｇｌｙ＋９Ｈｉｓ＋終止コドン、Ｋ１〜３／ＵＰと対になっている）５'−ＴＴＡＡＴ  ＧＡＴＧＡ  ＴＧＡＴＧ  ＡＴＧＡＴ  ＧＡＴＧＡ  ＴＧＡＴＧ  ＡＣＣＡＣ  ＣＡＣＣ−３'（配列番号４）を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件は、以下の通りであった。変性工程としての９５℃で２分間の１サイクルの後、ＰＣＲ反応を、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で１分間の３０サイクル、次いで７２℃で１０分間の１サイクルに供した。ＰＣＲ反応およびＰＣＲ産物のカラム精製の後、ＥｘＴａｑを用いて、ＰＣＲ産物のヌクレオチドＡオーバーハングを生成した（７２℃で１５分間の１サイクル）。得られたＰＣＲ産物を、ＰＣＲ鋳型として、第二のＰＣＲ反応に用い、ここでプライマー、Ｋ１〜３／ＵＰおよびＫ１〜３／ＬＰ２を用いて、野生型クリングル１〜３＋３Ｇｌｙ＋９Ｈｉｓを増幅し、これをｐＣＲ２．１プラスミドベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、ｐＢＫ１０５を生成した。次いで、以下のＰＣＲプライマーを用いて、クリングル１〜３タンパク質中の２０８位のＡｓｎからＳｅｒの変異を生じて、アミノ酸配列ＳＲＴＰからアミノ酸配列ＮＲＴＰを生成した。フォワードプライマーＫ３ｆ（ＡｓｎからＳｅｒ）５'−ＡＣＣＣＣＴＣＡＣＡＣＡＣＡＴＴＣＴＡＧＧＡＣＡＣＣＡＧＡＡＡＡＣＴＴＣ−３'（配列番号５）およびリバースプライマーＫ３ｒ５'−ＣＴＧＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧＧＴＧＴＧ−３'（配列番号６）。次いで、逆ＰＣＲによって、ｐＢＫ１０５中にＡｓｎからＳｅｒの変異を形成する。ＰＣＲ条件は以下の通りであった。変性工程としての９５℃で２分間の１サイクルの後、ＰＣＲ反応を、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で５分間の３５サイクル、次いで７２℃で１０分間の１サイクルに供した。得られたＰＣＲ産物をライゲートして、プラスミドｐＢＫ１１８を生成し、これを配列決定して、変異を確認した。
【００７９】
プラスミドｐＢＫ１１８をＥｃｏＲＩで消化し、ＤＮＡ断片をゲル精製し、ｐＰＩＣＺａＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州ラホーヤ）のＥｃｏＲＩ部位にクローニングして、ｐＢＫ１１９（ピキア発現プラスミド）を生成した。プラスミドｐＰＩＣＺａＡは、ピキア・パストリス由来のほとんどのタンパク質の効率的な分泌を可能にするα因子分泌シグナル、ピキア・パストリス中でメタノール誘導性で高レベルの発現を可能にするＡＯＸ１プロモーターを含む９４２ｂｐの断片である５'−ＡＯＸ、および、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびピキア・パストリス中のポジティブ選択のためのゼオシン（ZEOCIN）耐性遺伝子を含む。プラスミドｐＢＫ１１９をＰｍｅＩで直鎖化してから、ピキア・パストリス株に形質転換した。プラスミドｐＢＫをピキア・パストリス株ｙＪＣ５３、野生型株、および種々のＰＭＴノックアウト株に形質転換した。
【００８０】
ＧｅｎｔｚｓｃｈおよびＴａｎｎｅｒ、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９６年１１月１日、１５（２１）：２５７５２〜５７５９頁）中でサッカロミセス・セレビシエについて概説されている手順に従って、ＰＭＴノックアウト酵母株をピキア・パストリス中で作製した。サッカロミセス・セレビシエＰＭＴ遺伝子についてのヌクレオチド配列を用いたホモロジー検索によって、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、イリノイ州シカゴから得られたピキア・パストリスゲノムのヌクレオチド配列中で、ピキア・パストリスＰＭＴ遺伝子を同定した。ピキア・パストリスＰＭＴ（ＰｐＰＭＴ）遺伝子の欠失は以下の通りであった。ＰＣＲオーバーラップ法によって、ＰｐＰＭＴ欠失対立遺伝子を生じた（例えば、Ｄａｖｉｄｓｏｎら、２００４年、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４：３９９〜４０７頁、Ｈｏら、１９８９年、Ｇｅｎｅ  ７７：５１〜９頁、Ｈｏｒｔｏｎら、１９８９年、Ｇｅｎｅ  ７７：６１〜８頁参照）。第一のＰＣＲ反応において、ＰＭＴ遺伝子の５'および３'隣接領域についてのヌクレオチド配列ならびにＮＡＴまたはＨＹＧ耐性マーカーを含むＤＮＡ（ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＭｃＣｕｓｋｅｒ、１９９９年、Ｙｅａｓｔ  １４：１５４１〜１５５３頁、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、１９９９年、Ｙｅａｓｔ  １５：５０７〜１１０頁）をＰＣＲ増幅した。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、イリノイ州シカゴから得られたピキア・パストリスゲノムヌクレオチド配列を用いてＰＭＴに隣接する領域についてのプライマー配列を、ガイドとして設計した。ピキア・パストリスゲノムＤＮＡを、ＰｐＰＭＴ隣接領域ＰＣＲ増幅のための鋳型として用いる一方、（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ．およびＭｃＣｕｓｋｅｒ、１９９９年、同書、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、１９９９年、同書）に記載されているようなプラスミドを鋳型として用いて、ＮＡＴおよびＨＹＧ断片をＰＣＲ増幅した。次いで、第二のＰＣＲ反応において、最初の３回全てのＰＣＲ産物を鋳型として用いて、３つ全ての断片を単一の直鎖状の対立遺伝子として含む重複産物を生じた。次いで、最終的なＰＣＲ産物を、形質転換に直接採用した。形質転換体を、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンまたは１００μｇ／ｍＬのヌルセオスリシン（nourseothricin）を含むＹＰＤ培地上で選択した。各場合において、変異対立遺伝子の適切な組込みを、ＰＣＲによって確認した。作製したＰＭＴノックアウト株はｙＪＣ５１（ｐｍｔ３Δ、ｐｍｔ５Δ、ｐｍｔ６Δ）、ｙＪＣ５５（ｐｍｔ１Δ）、ｙＪＣ６６（ｐｍｔ２Δ）、およびｙＪＣ６５（ｐｍｔ４Δ）であった。ＰＭＴノックアウト株を、上述のクリングル１〜３タンパク質をコードするプラスミドｐＢＫ１１９で、それぞれ形質転換した。
【００８１】
１％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ６．０、１．３４％酵母窒素塩基、４×１０−５％ビオチン、および１％グリセリンからなる緩衝化グリセリン複合培地（buffered glycerol-complex medium）（ＢＭＧＹ）とともに、振とうフラスコ中、２４℃で、形質転換された酵母株についてのクリングル１〜３タンパク質発現を行った。タンパク質発現のための誘導培地は、ＢＭＧＹ中のグリセリンの代わりに１％メタノールからなる緩衝化メタノール複合培地（buffered methanol-complex medium）（ＢＭＭＹ）であった。誘導培地を加えた時に、メタノール中のＰｍｔ阻害剤Ｐｍｔｉ−１、Ｐｍｔｉ−２、またはＰｍｔｉ−３を、０．２μＭ、２μＭ、または２０μＭの終濃度まで、増殖培地に加えた。細胞を収集し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。Ｐｍｔ阻害剤Ｐｍｔｉ−１、Ｐｍｔｉ−２、およびＰｍｔｉ−３は、本質的に互換的であり、使用の容易さにおける差異が小さい。例えば、記載されている細胞培養条件において、Ｐｍｔｉ−３の溶解度はＰｍｔｉ−１およびＰｍｔｉ−２のものより大きく、したがって、３つのうち最も望ましい。
【００８２】
Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０年）Ｎａｔｕｒｅ  ２２７、６８０〜６８５頁に従って、Ｐｍｔｉ−１で処理したｙＪＣ５３培養物またはｙＪＣ５５培養物由来の７μＬの上清を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、次いで、ニトロセルロース膜上に電気ブロッティングした（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ（現在Ｗｈａｔｍａｎ社、ニュージャージー州フローハムパーク）。Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（カリフォルニア州サンタクルス）からの抗Ｈｉｓ抗体（Ｈ−１５）を用いて、クリングル１〜３タンパク質をウエスタンブロット上で検出し、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｍｅｔａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＤＡＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、イリノイ州ロックフォード）を用いて発色させた。図１に示されるウエスタンブロットのレーン１に示されるように、未処理のピキア・パストリス由来のクリングル１〜３タンパク質は、Ｏ−グリコシル化の存在のために、スメアなものとして移動した。しかしながら、対照的に、ｙＪＣ５３由来のクリングル１〜３タンパク質（２μＭまたは２０μＭのＰｍｔｉ−１で処置したピキア・パストリス、それぞれレーン２および３）は、ｙＪＣ５５から発現されるクリングル１〜３タンパク質（ピキア・パストリスのｐｍｔ１Δノックアウト変異体）と同様に、Ｏ−グリコシル化がないために、明確なバンドを示す（レーン４および５）。図１は、Ｐｍｔｉ−１によってＯ−グリコシル化が、Ｐｍｔ１を欠く株で見られるのと同様なレベルまで減少したことをさらに示す。
【００８３】
Ｐｍｔ阻害剤によるＯ−グリコシル化減少を測定するために、ニッケルキレート化クロマトグラフィー（Ｃｈｏｉら、２００３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（９）：５０２２〜５０２７頁）を用いて、クリングル１〜３タンパク質を増殖培地から精製し、アルカリ脱離（β脱離）（Ｈａｒｖｅｙ、１９９９年Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １８、３４９〜４５１頁）によってクリングル１〜３タンパク質からＯ−グリカンを放出および分離させた。このプロセスはまた、放出されたＯ−グリカン（オリゴマンノースまたはマンノースのいずれか）の新しく形成された還元性末端をマンニトールへと還元させる。このようにして、マンニトール基は、各Ｏ−グリカンの独特な指標として機能する。１００μＬの体積のＰＢＳバッファー内に含まれる０．５ｎｍｏｌｅ以上のクリングル１〜３タンパク質が、β脱離のために必要である。試料を、２５μＬのアルカリ水素化ホウ素試薬で処理し、５０℃で１６時間インキュベートした。約２０μＬのアラビトール内部標準を加え、次いで１０μＬの氷酢酸を加えた。次いで、ＳＥＰＡＢＥＡＤＳおよびＡＧ  ５０Ｗ−Ｘ８樹脂の両方を含めた試料をＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターを通して遠心分離し、水で洗浄した。洗浄液を含む試料を、プラスチック製オートサンプラーバイアルに移し、遠心エバポレーター中で乾燥するまで蒸発させた。１５０μｌの１％ＡｃＯＨ／ＭｅＯＨを試料に加え、試料を遠心エバポレーター中で乾燥するまで蒸発させた。この最後の工程をさらに５回繰り返した。２００μＬの水を加え、１００μＬの試料を、パルス電気化学検出−Ｄｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣと組み合わせた高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）によって分析した。Ｏ−グリカン平均占有率を、回収されたマンニトールの量に基づいて測定した。結果を表１に要約し、これは、Ｐｍｔ化学阻害剤のいずれか１つが、インタクトなＰＭＴ１およびＰＭＴ２遺伝子を含むピキア・パストリス株において分泌されたクリングル１〜３タンパク質のＯ−グリコシル化を、ＰＭＴ１またはＰＭＴ２遺伝子のいずれかの欠失を含む細胞について見られるＯ−結合型グリコシル化のレベルに匹敵するレベルまで減少させたことを示す。表１はまた、タンパク質が２つの潜在的な哺乳動物のＯ−結合型グリコシル化部位を有するが、酵母においては、タンパク質が約２０個のＯ−結合型グリコシル化部位を有することを示す。
【表１】
2009515963.tif 000007
【実施例３】
【００８４】
この実施例において、Ｔ．レエセイα−マンノシダーゼをコードするＤＮＡで形質転換された酵母細胞が、Ｏ−グリコシル化が減少し、またＰｍｔ阻害剤の存在下で細胞をインキュベートした場合にＯ−グリコシル化がさらに減少したタンパク質の生成をもたらす。
【００８５】
抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体のＨ＋Ｌ鎖を、ピキア・パストリス株ＧＳ１１５（ＷＴ）、およびＴ．レエセイα−マンノシダーゼを同時発現するように遺伝子操作されたＧＳ１１５（＋Ｔｒｍａｎ）中で発現させた。ＧＳ１１５は、ｈｉｓ４選択を可能にするＨＩＳ４変異を例外として、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールズバッド）から入手可能であり、本質的に野生型表現型を有する。Ｈ＋Ｌ鎖を、２つの別々の遺伝子として、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎプラスミドｐＡＯ８１５に由来するプラスミドｐＪＣ２８４から発現させた。
【００８６】
ＧｅｎＢａｎｋから得られた抗Ｈｅｒ２抗体配列を用いて、Ｈ＋Ｌ遺伝子を生成した。Ｌ鎖についてのＧｅｎＢａｎｋ受入番号は１Ｎ８Ｚ＿Ａであり、Ｈ鎖可変領域＋ＣＨ１ドメインのＧｅｎＢａｎｋ受入番号は１Ｎ８Ｚ＿Ｂである。Ｈ鎖Ｆｃ領域についてのＧｅｎＢａｎｋ受入番号はＢＣ０９２５１８である。ＨおよびＬ鎖ＤＮＡ配列の両方を、ピキア・パストリスコドン使用頻度に従ってコドン最適化して、ピキア・パストリス中での翻訳を増強した。ピキア種における使用のためのコドンの最適化は、当該分野で周知であり、例えば、Ｏｕｔｃｈｋｏｕｒｏｖら、２００２年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２４：１８〜２４頁、ＳｈａｒｐおよびＬｉ、１９８７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：１２８１〜９５頁、Ｗｏｏ  ＪＨ，Ｌｉｕら、２００２年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２５：２７０〜２８２頁、ならびにＮａｋａｍｕｒａら、２０００年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２頁に記載されている。Ｈ鎖（ヒトＩｇＧ１）およびＬ鎖（ヒトκ）の定常領域を、ＧｅｎｅＡｒｔ社、ドイツレーゲンスブルグによって合成した。オーバーラップＰＣＲ法において、ＩＤＴ社（アイオワ州コーラルビル）から購入したオリゴヌクレオチドを用いて、可変領域を組織内で作製した。オーバーラップＰＣＲによってＨおよびＬ鎖全長を構築し、得られたＨおよびＬ鎖をｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州ラホーヤ）にクローニングして、それぞれｐＤＸ３４４およびｐＤＸ３４９を生成した。ｐＤＸ３４４およびｐＤＸ３４９由来のＨ＋Ｌ鎖を、ベクターｐＤＸ５８０（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎベクターｐＧＡＰＺＡ由来のバックボーン）中で、ＧＡＰＤＨプロモーターおよびＡＯＸ１ターミネーター配列と合わせた。最後に、Ｈ＋Ｌ鎖発現カセットを、ｐＤＸ５８０からベクターｐＪＣ２８４にサブクローニングした。軽鎖をコードするコドン最適化ＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号７に示し、重鎖をコードするコドン最適化ＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号８に示す。プラスミドｐＪＣ２８４は、Ｈ＋Ｌ遺伝子ならびにＧＳ１１５およびＧＳ１１５（＋Ｔｒｍａｎ）株における形質転換体の選択のためのインタクトなｈｉｓ４遺伝子を発現するためのＧＡＰＤＨプロモーターを有する。酵母株ＧＳ１１５およびＧＳ１１５（＋Ｔｒｍａｎ）をｐＪＣ２８５で形質転換し、ｈｉｓ４遺伝子座でプラスミドがゲノムに組み込まれている形質転換体を単離して、抗Ｈｅｒ２抗体を生成する株を生成した。
【００８７】
ＧＳ１１５（＋Ｔｒｍａｎ）株の構築は以下の通りであった。トリコデルマ・レエセイα−１，２−マンノシダーゼを、プラスミドｐＪＣ２８５中の発現カセットから発現させた。プラスミドｐＪＣ２８５は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎベクターｐＧＡＰＺＡに由来し、これは、選択マーカーとしてのゼオシン耐性遺伝子を有し、最初の８４塩基対がサッカロミセス・セレビシエαＭＡＴプレシグナル配列（配列番号１０）をコードするＤＮＡで置換されたそのシグナル配列をコードするＴ．レエセイα−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメイン（配列番号９）をコードするＤＮＡを含む発現カセットを含み、これはちょうど、５'末端のピキア・パストリスＧＡＰＨプロモーター（配列番号１１）を含むＤＮＡおよび３'末端のピキア・パストリスＡＯＸ１転写終結配列（配列番号１２）を含むＤＮＡに作動可能に連結されたＥＲ標的化アミノ酸をコードする。完全な発現カセットのヌクレオチド配列を、配列番号１３に示す。酵母株ＧＳ１１５をｐＪＣ２８５で形質転換し、ＧＡＰＤＨ遺伝子座でゲノムに組み込まれたプラスミドを有する形質転換体を単離して、ＧＳ１１５株（＋Ｔｒｍａｎ）を生成した。
【００８８】
二つ組の株の培養物を、１％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．０、１．３４％酵母窒素塩基、０．００００４％ビオチン、２％デキストロース、および０．３もしくは０．０３μＭのＰｍｔｉ−２ありまたはなしからなる２００ｍＬの緩衝化デキストロース複合培地（ＢＭＤＹ）中で培養した。７２時間の増殖の後、培養物上清を回収し、遠心分離して、酵母細胞を除去した。残った上清画分（約２００ｍＬ）中の抗体をプロテインＡカラムで精製し、実施例２に記載されているようなＯ−グリカン分析に供した。マンニトールアッセイに加えて、加水分解のないクロマトグラフィー分析によって、Ｏ−結合型マンノース鎖の平均長を測定した。結果を表２に要約する。
【００８９】
抗体上に、１４の酵母Ｏ−グリカン部位がある。野生型ＧＳ１１５株において抗体を生成した場合、１４全てのＯ−グリカン部位は、８％の部位がただ１つのマンノースを有し、３９％が２つのマンノース鎖を有し、４３％が３つのマンノース鎖を有し、９％が４つのマンノース鎖を有するグリカン構造を有する（表２参照）。しかしながら、化学阻害剤Ｐｍｔｉ−２で処理した野生型細胞において抗体を生成した場合、１４のＯ−グリカン部位のうち２つだけが占有され、２つの部位の７６％については、マンノース鎖はただ１つのマンノース残基を有した。２つの部位のいずれも、３つまたは４つのマンノース残基を有するマンノース鎖を有さなかった。分析によって、１４の部位のうちどの２つが占有されていたかは判定されなかったことに留意されたい。抗体分子あたりの２つのＯ−グリカン部位のいずれかの組み合わせが占有されるか、または、特定のＯ−グリカン部位が、選択的に占有される。後者の場合において、Ｏ−グリカンが完全にない抗体（または他のタンパク質）を提供するために、好ましいＯ−グリカン部位を含むアミノ酸配列を、その部位のＯ−結合型グリコシル化を排除するアミノ酸配列に改変することができる。
【００９０】
表２は、トリコデルマ・レエセイα−１，２−マンノシダーゼをコードするＤＮＡを含む細胞（ＧＳ１１５（＋Ｔｒｍａｎ）株）中で抗体を生成した場合に、１４のＯ−グリカン部位のうち４つだけが占有され、その４つの部位の９５％については、マンノース鎖がただ１つのマンノース残基を有したことをさらに示す。４つの部位のうち、マンノース鎖が３つまたは４つのマンノース残基を有するものはなかった。特定の部位が優先的にＯ−グリコシル化されている場合、Ｏ−グリカンが完全にない抗体（または他のタンパク質）を提供するために、好ましいＯ−グリカン部位を含むアミノ酸配列を、その部位のＯ−グリコシル化を排除するアミノ酸配列に改変することができる。
【００９１】
最後に、表２は、トリコデルマ・レエセイα−１，２−マンノシダーゼをコードするＤＮＡを含む細胞中およびＰｍｔｉ−２の存在下で抗体を生成した場合に、１４のＯ−グリカン部位のうちただ１つが占有され、その部位の９１％については、マンノース鎖がただ１つのマンノース残基を有することを示す。３つまたは４つのマンノース残基を有するマンノース鎖はなかった。ただ１つ、または少数の部位が選択的にＯ−グリコシル化されている場合、Ｏ−グリカンが完全にない抗体（または他のタンパク質）を提供するために、好ましいＯ−グリカン部位を含むアミノ酸配列を、その部位のＯ−グリコシル化を排除するアミノ酸配列に改変することができる。
【００９２】
表２は、培養物を増殖させる間に、０．３ｕＭのＰｍｔｉ阻害剤が、占有率を約８６％減少させるのに十分であり、かつ分子の７６％についての鎖長を１つのマンノースに減少させるのに十分であることをさらに示す。トリコデルマ・レエセイα−１，２−マンノシダーゼを含むことによって、Ｐｍｔｉ阻害剤の量が１０倍減少できるようになり、占有率が９３％に減少することができるようになり、分子の８７％については鎖長が１つのマンノースまで減少することができるようになる。これらの結果から、細胞を死滅させない量のＰｍｔｉ阻害剤を用いることが、Ｏ−結合型グリコシル化が減少している糖タンパク質を生成するのに十分であることが示される。これらの結果から、Ｐｍｔｉ阻害剤およびα−マンノシダーゼが、Ｏ−結合型グリコシル化の量を相乗的に減少させるようであることがさらに示される。
【表２】
2009515963.tif 000008
【００９３】
上述のもののそれぞれについて、７μＬの上清を還元し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ（ＨおよびＬ）を用いたウエスタンブロッティングに供して、ＨおよびＬ鎖を検出した。結果を図２に示す。高Ｏ−グリコシル化Ｈ鎖は、図２中のレーンの第一の対で目に見える、最も遅く移動するバンドである。図２は、抗体をトリコデルマ・レエセイα−１，２−マンノシダーゼとともに同時発現した場合、または抗体を発現している細胞をＰｍｔｉ−２阻害剤の存在下でインキュベートした場合、または抗体をトリコデルマ・レエセイα−１，２−マンノシダーゼとともに同時発現し、両方のタンパク質を発現している細胞をＰｍｔｉ−２阻害剤の存在下でインキュベートした場合に、Ｏ−グリコシル化重鎖の量の減少があることを示す。
【００９４】
説明された実施形態を参照して、本明細書中で本発明を記載しているが、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。当業者および本明細書中の教示の入手手段を有する者は、さらなる改変、およびその範囲内の実施形態を認識するであろう。したがって、本発明は、本明細書に添付された特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、ピキア・パストリスにおける、分泌された組換えレポータータンパク質のＯ−グリコシル化に対するＰｍｔ阻害剤の効果を示す図である。Ｐｍｔの化学阻害剤によって、Ｏ−グリコシル化が、ＰＭＴ１を欠失した株において観察されるものと同様のレベルまで減少した。抗ポリヒスチジン抗体を用いたウエスタンブロッティングを用いて、野生型（レーン１〜３）およびｐｍｔ１（レーン４〜５）株の増殖培地中のヒトプラスミノーゲンのＨｉｓタグヒトクリングル１〜３ドメイン（Ｋ１〜３）を検出した。より遅く移動している方のバンド（レーン１のＫ１〜３について、より高い分子量のスメアとして見える）から、Ｏ−グリコシル化タンパク質が示される。Ｐｍｔ−１、ＰＭＴ阻害剤１。
【図２】図２は、免疫グロブリン軽鎖および重鎖ポリペプチドのＯ−グリコシル化に対するＴ．レエセイα−マンノシダーゼおよび化学阻害剤Ｐｍｔｉ−２の効果を示す、ウエスタンブロットを示す図である。Ｔ．レエセイα−マンノシダーゼおよび化学的Ｐｍｔ阻害剤はともに、Ｏ−グリコシル化のレベルを減少させた。
【図１】
2009515963.tif 000009
【図２】
2009515963.tif 000010
【配列表】
2009515963000001.app
【国際調査報告】
2009515963.tif 000011
2009515963.tif 000012
2009515963.tif 000013
2009515963.tif 000014