(57)【要約】本発明は、の革新的な方法は、全採血されていないか又は一部採血されている分離されたほ乳類の胎盤から、胎盤灌流によって臍帯血幹細胞を回収する革新的な方法について説明する。胎盤灌流は、例えば、脈動ポンプ若しくはペリスタポンプ又はその装置を用い、灌流液の脈動流で分離された胎盤を灌流する工程を備えることができる。前記幹細胞は、その後、前記灌流液から分離される。前記灌流液は、抗凝固剤を含むことができる。前記分離されたほ乳類の胎盤は、灌流の前に抗凝固剤で処理する必要がない。前記分離された胎盤は、灌流の前に抗凝固剤が使用されないようにすることができる。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
全採血されていないか又は一部採血されており、臍帯血幹細胞を含む臍帯血を有する分離されたほ乳類の胎盤を用意する工程と、
該全採血されていないか又は一部採血されている該ほ乳類の胎盤を、灌流液の圧力に依存する流れを形成させて灌流し、該臍帯血幹細胞を含む臍帯血を有する灌流液を作る工程と、
該灌流液を回収する工程と、
該灌流液から該臍帯血幹細胞を分離して、分離された臍帯血幹細胞を得る工程とを備えることを特徴とする臍帯血幹細胞を回収する方法。
【請求項２】
前記分離されたほ乳類の胎盤が、全採血されていないことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
臍帯血幹細胞を含む臍帯血を有し、全採血されていない、分離されたほ乳類の胎盤を用意する工程と、
全採血されていない該分離されたほ乳類の胎盤から一部採血し、一部採血された胎盤と臍帯血幹細胞を含む所定量の臍帯血とを作製する工程と、
該一部採血されたほ乳類の胎盤を、灌流液の圧力に依存する流れを形成させて灌流し、臍帯血幹細胞を含む臍帯血を有する灌流液を作る工程と、
該灌流液を回収する工程と、
該所定量の臍帯血から該臍帯血幹細胞を分離し、分離された臍帯血幹細胞を得る工程とを備えることを特徴とする臍帯血幹細胞を回収する方法。
【請求項４】
分離する前に、前記所定量の臍帯血及び前記灌流液を貯留する工程をさらに備えることとを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記灌流液の圧力に依存する流れが、該灌流液の脈動流であることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記灌流は、臍帯血幹細胞が実質的に存在しないほ乳類の胎盤を作製するために十分な状況下で行われることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記灌流は、ペリスタポンプを用いて行われることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記分離された臍帯血幹細胞は、造血幹細胞を備えることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記分離されたほ乳類の胎盤を用意する工程は、前記分離されたほ乳類の胎盤を冷却し、冷却されたほ乳類の胎盤を作製する工程をさらに備えることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記冷却されたほ乳類の胎盤を０〜１５℃の範囲の温度に維持する工程をさらに備えることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記冷却されたほ乳類の胎盤を０〜１５℃の範囲の温度に維持する工程は、４０時間以上の期間の間行われることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記分離された胎盤は、分離された後、前記灌流する工程の前まで、氷上で冷却又は維持されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記冷却された分離された胎盤は、０〜６℃の範囲の温度に維持されることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記方法は、灌流する工程の前に前記胎盤内に抗凝固剤の投与又は注入をしないことを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記胎盤は、前記灌流する工程の前に抗凝固剤が投与又は注入されていないことを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記灌流液は、抗凝固剤を含む生理学的に適合可能な溶液であることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
前記灌流液は、ヘパリン、クレアチンリン酸ブドウ糖（ＣＰＤＡ）又はこれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される抗凝固剤の１つ以上を含むことを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記分離されたほ乳類の胎盤は、灌流する工程の前に一部採血されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記一部採血する工程は、静脈穿刺又は重力による排出によって臍帯血を回収する工程を備えることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項２０】
前記灌流する工程は、１つ以上の臍動脈及び臍静脈を介して行われることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項２１】
前記灌流する工程は、１つ以上の前記臍動脈及び前記臍静脈にカニューレを挿入し、カニューレが挿入された胎盤を作製する工程と、該カニューレが挿入された胎盤を灌流回路中に配置する工程とをさらに備えることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記灌流する工程は、脈動が１５〜６０拍／分となるように設定されて行われることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記灌流する工程は、脈動が６０拍／分となるように設定されて行われることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
前記灌流する工程は、収縮期圧が３０〜７０ｍｍＨｇの範囲の圧力であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記灌流する工程は、１５〜３５分の範囲の時間行われることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記分離された臍帯血幹細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４−細胞、ＣＤ１１７＋細胞、ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ５９＋細胞、Ｔｈｙ１＋細胞、ＣＸＣＲ４＋細胞、ＡＬＤＨｈｉｇｈ細胞、ｓｉｄｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＳＰ）細胞、ＳＳＥＡ−４＋細胞、ＴＲＡ−１−６０細胞、ＴＲＡ−１−８１細胞、又は、これらの組み合わせの内、１つ以上を含むことを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
前記分離された臍帯血幹細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞又はＣＤ１３３＋／ＣＤ３４−細胞、ＣＤ１１７＋細胞、ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ５９＋細胞、Ｔｈｙ１＋細胞、Ｌｉｎ−細胞、ＣＸＣＲ４＋細胞、ＡＬＤＨｈｉｇｈ細胞、ｓｉｄｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＳＰ）細胞、ＳＳＥＡ３＋細胞、ＳＳＥＡ−４＋細胞、ＴＲＡ−１−６０細胞、又はＴＲＡ−１−８１細胞以外の細胞に分化することが出来る初期幹細胞であることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）請求項８記載の前記分離された造血幹細胞を生体外で培養し、それにより、該造血幹細胞を増殖させる工程と、
（ｂ）医療的に効果的な量の該増殖させた造血幹細胞を備える組成物を、前記ほ乳類に導入し、造血再構成を行わせる工程とを備えることを特徴とする造血再構成を必要とするほ乳類に対する治療方法。
【請求項２９】
医療的に効果的な量の請求項８記載の前記分離された所定量の造血幹細胞を備える組成物を、ほ乳類の静脈内又は骨内に導入し、造血再構成を行わせることを特徴とする造血再構成を必要とするほ乳類に対する治療方法。
【請求項３０】
前記造血再構成を必要とするほ乳類は、再生不良性貧血、造血器悪性腫瘍、自己免疫疾患、遺伝性疾患、免疫不全、悪性固形癌、又は、これらの組み合わせであることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
前記造血再構成を必要とするほ乳類は、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、及び、骨髄異形成症候群から選択される造血器悪性腫瘍であることを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記造血再構成を必要とするほ乳類は、放射線治療、化学療法、病原微生物による感染、又は、これらの組み合わせの結果生じる免疫不全であることを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）請求項１記載の前記分離された臍帯血幹細胞を生体外で培養し、それにより、分化された細胞又は増殖された幹細胞を作製する工程と、
（ｂ）医療的に効果的な量の分化された細胞又は増殖された幹細胞を備える組成物を、対象組織の静脈内投与又は直接投与し、造血再構成を行わせることを特徴とする損傷組織の再構成を必要とするほ乳類における損傷組織を再構成するための方法。
【請求項３４】
医療的に効果的な量の請求項１記載の前記分離された臍帯血幹細胞を備える組成物を、前記ほ乳類の各損傷組織の静脈内投与又は直接投与することを特徴とする損傷組織の再構成を必要とするほ乳類における損傷組織を再構成するための方法。
【請求項３５】
前記組織は、心臓組織、筋組織、肝臓、皮膚、神経組織、骨組織、上皮、ストローマ、又は内皮の１つ以上を備えることを特徴とする請求項３３又は請求項３４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臍帯血幹細胞の効率的な回収方法及び該回収した幹細胞を用いるための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
１．技術分野
本発明は、胎盤から幹細胞を回収する、臨床に適した便利で効率のよい新しい方法に関するものである。特に、本発明は、機械による脈動灌流によって回収された残余の胎盤臍帯血細胞が、従来の針／シリンジを用いた回収方法または重力により排出して回収する方法を用いた場合に比較して、初期造血幹細胞表現型をより多く含んでおり、再生医療において臍帯血細胞を用いることができる。本発明の方法を用いることで、１つの胎盤からより多くの数の幹細胞を得ることができるため、同種の造血幹細胞の移植結果を向上させることができ、単一提供者からの移植片では幹細胞の数が不十分な場合を補うため、異なる提供者からの２種又は３種の臍帯血移植片を用いることを避けることができる。
【０００３】
２．背景技術の説明
成人の臍帯血回収方法及び臍帯血移植
臍帯の臍帯血（ＣＢ）細胞は、血液がん及び骨髄（ＢＭ）不全症候群に対する同種の造血幹細胞（ＨＳＣ：hematopoietic stem cell）移植における有望なＨＳＣ源である（例えば、非特許文献１〜４参照）。大きな利点として、国際的な臍帯血バンクに保存されているＣＢへの迅速な接触、及び、ヒト白血球型抗原の適合非血縁提供者の移植片を用いる場合と比較して重度の移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を生じる頻度を低くするための１〜２種のヒト白血球型抗原不適合移植片の受け入れを含む（例えば、非特許文献５参照）。特に、少数民族の患者において、ＣＢ細胞は、血液がんに対する治療の選択肢として、さもなければ適切でない適合提供者が利用できる同種の移植を患者に選択させることができる。上記利点を有するにもかかわらず、ＣＢの利用は、ＣＤ３４＋細胞及びその前駆細胞を含む細胞の数が不十分であるため、成人に限られている。総有核細胞数が低水準であるＣＢ移植は、好中菌及び血小板の移植後移植（post-transplant engraftment）において重大な遅延、又は移植失敗につながる（例えば、非特許文献６及び非特許文献７参照）。ＣＢを回収するための従来の方法によれば、摘出された胎盤から重力により血液を排出し、該血液を採血バッグ又はシリンジに静脈穿刺によって回収することを含む。
【０００４】
ＣＢは、ほんの一回用いるのにかろうじて十分な量だけが供給されるため、また、近年では２人の異なる提供者から供給された２人分のＣＢが供給されるため、成人ＣＢ移植は、一般に適切な非血縁提供者が得られない場合にのみ臨床調査の基礎として行われている。実際問題として、わずか２０〜４０ｍｌしか回収されないことが珍しいわけではなく、そのため、このようなＣＢ細胞は、使用されることも保存されることもない（例えば、非特許文献８及び非特許文献９参照）。このような場合、臍帯中には回収されていないかなりの量のＣＢ細胞が残っており、これらは、初期回収後、補足的に回収することができる確立された補足的方法がないため、破棄されている。将来、ＣＢバンク提供者のプールを拡大するため、従来のＣＢ回収後、残余のＣＢ細胞を回収する方法を含む改良ＣＢ回収方法を検討することが重要である（例えば、非特許文献１０参照）。さらに重要なことに、同一の胎盤から得られるＣＢ細胞の量の増加は、予備又は生体外増殖及び養子免疫療法のような移植片工学を含む複数回の使用のために十分な量のＣＢ細胞を保存することができる。
【０００５】
ＨＳＣ可塑性及び組織再生に関する現在の知見
過去１０年間にわたって、複製能、自己複製能、及び、分化能を有する多くの型の幹細胞がヒトにおいて確認されている。全能性幹細胞は、全ての型の体細胞を形成することができ、これらの全能性幹細胞は、初期胚の範囲に含まれるため、ヒト胚幹（ＥＳ）細胞と呼ばれる。多能性幹細胞は、内胚葉、中胚葉又は外胚葉に分化することができる。組織特異性幹細胞は、ある種の組織のみに分化する能力を有する。例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、他の組織の型には分化できないが、全ての型の血球細胞に分化することができ、成人において、これらのＨＳＣが存在し続けることで、回復能を備える。しかしながら、研究者によると、異なる型の造血始原細胞の産生の原因と考えられている成人ＨＳＣのような細胞は、神経細胞又は筋細胞のような異なる組織又は臓器の細胞さえ生じさせることが発見されている。
【０００６】
成人ＨＳＣの分化転換上の調査研究は、議論の余地があり、研究者達による活発な調査が継続的に行われている。対照的に、多くの臨床の症例においては、ＢＭ移植又は心臓移植のいずれか一方の後に、非造血細胞生産の証拠が報告されている。ＢＭ移植後の脳内にＢＭ分化転移を探し出す後ろ向き研究では、細胞融合を除き、長期設定の中で、神経生成の証拠、アストロサイト及びミクログリアの検出が示された（例えば、非特許文献１１参照）。他の報告によれば、ＢＭ移植後の骨芽細胞、肝細胞、胃腸（ＧＩ）管上皮、ストローマの検出、末梢血幹細胞移植後のケラチン生成細胞／肝細胞／胃腸管／皮膚の上皮の検出、及び、心臓移植後の内皮を含む又は含まない心筋細胞の検出について言及されている（例えば、非特許文献１２〜１７参照）。
【０００７】
成人幹細胞源としての臍帯血細胞
ヒトＥＳ細胞は、生体外で異なる型の前駆細胞に区別し、増殖させることができるにも関わらず、現在、患者への適用は多くの倫理問題によって規制されている。また、ＥＳ細胞から派生した始原細胞の純度の問題を解決しなくてはならない。対照的に、骨髄及び臍帯のＣＢ細胞を含む造血組織に由来する成人幹細胞群を、適切な刺激にさらすことで外胚葉又は内胚葉に分化させることができることが発見された（例えば、非特許文献１８〜２２参照）。特に、ＣＢ由来の幹細胞は、通常破棄される胎盤から回収されるため、該幹細胞を回収する上で、提供者に組織的損傷を与えることがないため、他の細胞源由来のものに比較して、より優れている。ＢＭ細胞と比較して、ＣＢは、無警戒な(naive)免疫状態で初期個体に発生し、比較的短くないテロメア長を有している。
【０００８】
本当に多能な耐性幹細胞が存在するかどうかに関する議論の中で、その焦点は、ＣＢ及び胎盤由来の細胞が、潜在的に臨床に利用できる興味深い特性を有しているかどうかにますます絞られてきた。近年、ＣＢは異種の細胞群を含み、多能な幹細胞源として認められることが示されている（例えば、非特許文献２３〜２７参照）。他の人は、リネージ（lineage）陽性細胞減少後、ＣＢ細胞を１週間懸濁培養することにより分離した接着細胞群が、外胚葉及び内胚葉特性の免疫組織化学的な証拠を表すことが示されたと報告した(例えば、非特許文献２８参照)。神経変性疾患であるクラッベ型大脳白質萎縮症を患う子供において、ＣＢ移植が成功した一連の報告がなされている(例えば、非特許文献２９参照)。
【０００９】
本発明者は、ＣＢ幹細胞に見られる独特の特徴は、妊娠胎盤が胚の発達中における造血ニッチ（niche）であるかもしれないという近年発表された新しい概念によるものであると仮定している（例えば、非特許文献３０及び非特許文献３１参照）。これは単純に、臨月の胎盤もまた、血管ニッチに接着している残りの初期幹細胞を含むかもしれない、又は、「出生」に関する刺激によって、胎児のＢＭ又は肝臓から放出されて胎盤ニッチに移動する循環幹細胞数が増加するかもしれないという仮定である。このように、本発明者は、本発明により得られる胎盤由来のＣＢ細胞は、胚形成から胎盤血管床に位置する余りの幹細胞として残存する、より多くの初期幹細胞（ＥＳ細胞類似細胞）を含むかもしれないと仮定している。
【００１０】
ＥＳ細胞類似細胞及び初期ＨＳＣを含む初期ＣＢ細胞の分離と選択
胚、造血及び神経幹細胞から遺伝子発現パターンの比較解析に用いる共通の幹細胞マーカーを同定するため、一遺伝子を同定した（おそらく、技術的困難性のため）（例えば、非特許文献３２参照）。このように、幹細胞を同定、選択するためには、これらの細胞を分離するためのいくつかのマーカーが必要とされる場合がある。幹細胞を区別するために用いることができる特徴の一つとして、分化によるマーカーの欠如がある。この方法は、治療のために用いられる幹細胞の濃縮を行うために、ＨＳＣ分野で広く用いられている。この「リネージ陰性（Ｌｉｎ−）」特性は、多くの幹細胞群に共通のものである（例えば、非特許文献３３参照）。Ｌｉｎ−ＣＢ細胞からの幹細胞群をさらに濃縮するために、ＣＤ１３３＋マーカーが成長因子刺激による高い増殖能を表すことが報告されている（例えば、非特許文献３４参照）。他の人により、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４−の一部は、メチルセルロース中においてコロニー形成細胞（ＣＦＣ）を生じないが、高い重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）複製細胞頻度を示すことが報告された（例えば、非特許文献３５参照）。時期特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）−３，ＳＳＥＡ−４，ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１のような胚幹細胞マーカーは、（市販の）蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）による解析において、多能性幹細胞及び抗体の特徴付けに広く用いられているＥＳ細胞上でのみ表れる。ごく最近、Ｌｉｎ−／ＣＤ４５−／ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋表現型を運ぶ「非常に小さい胚様（ＶＳＥＬ：very small embryonic-like）幹細胞」について報告された（例えば、非特許文献３６参照）。これらの細胞はまた、胚転写因子Ｏｃｔ−４及びＮａｎｏｇに対して陽性である。
【００１１】
これに対して、一般的な代謝マーカーの存在下に用いられる方法が、幹細胞の同定及び分離に用いられている。代謝マーカーの一つは、詳しくは、アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）である（例えば、非特許文献３７参照）。ＡＬＤＨの蛍光基質であるＡｌｄｅｆｌｕｏｒ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ社製）は、神経幹細胞及びＨＳＣにおけるＡＬＤＨ活性増加を示すために用いられている（例えば、非特許文献３８及び非特許文献３９参照）。この無毒であり、生きた標識法は、同様に、他の幹細胞群の同定に用いることができる（例えば、非特許文献４０参照）。この無毒性の生きた標識法は、同様に他の幹細胞群の同定に用いることができる（例えば、非特許文献４１参照）。さらにまた、ローダミン取り込み及びＨｏｅｃｈｓｔ  ｄｙｅ標識は、ＢＭ、ＣＢ、間葉、筋肉及び成体脳由来の幹細胞群を選択するために用いられる例えば、非特許文献４２〜４５参照）。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ｄｙｅ  ３３３４２の低い取り込みを示すｓｉｄｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＳＰ）は、高い自己複製脳及び多分化能を示す。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ｄｙｅの取り込みは、膜輸送体ＡＢＣＧ２によって調節され、ＳＰ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎは、該ＡＢＣＧ２タンパク質の発現として定義される（例えば、非特許文献４６及び非特許文献４７参照）。ＡＢＣＧ２タンパク質はまた、神経幹細胞中で特に発現され、前駆細胞が分化する際に、発現が減少する（例えば、非特許文献４８参照）。
【００１２】
ヒト造血細胞系統由来の外胚葉細胞分化転換の証拠
初期の報告においては、マウスにおいて、筋肉、グリア及び肝細胞に分化すると示されていた、ＢＭストローマ由来の神経細胞に分化する前駆細胞についての報告が増加してきている（例えば、非特許文献４９〜５１参照）。生体外における神経細胞特異的タンパク質誘導の証拠として、例えば、レチノイン酸、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）又は脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）による刺激後に報告されたヒト由来の細胞及び齧歯類のＢＭストローマ細胞における、ネスチン、神経細胞特異的核タンパク質（ＮｅｕＮ）、及びグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）等を挙げることができる（例えば、非特許文献５２参照）。非間葉造血前駆細胞の中で、分離されたＣＤ１３３＋細胞を含むヒトＣＢ単核細胞が、生体外において、β−チューブリンＩＩＩ、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及びｈＥＧＦに曝された後のＧＦＡＰ、及び、レチノイン酸及び神経成長因子（ＮＧＦ）に曝された後のＭｕｓａｓｈｉ−１のようなニューロン及びグリアのマーカーを発現するように誘導することが、いくつかの報告により示されている（例えば、非特許文献５３及び非特許文献５４参照）。
【００１３】
造血細胞系統由来の内胚葉細胞分化転換の証拠
以前、マウスモデルにおいて、幹細胞は注入されたＢＭ細胞が変換されているものだと思われていた（例えば、非特許文献５５参照）が、特定の肝再生モデルにおける細胞融合の結果生じていることが発見された（例えば、非特許文献５６参照）。他の人もまた、ＢＭ  ＨＳＣ源由来の骨髄単核細胞が、幹細胞融合パートナーの主要源であることを発見した（例えば、非特許文献５７参照）。リナージ陽性細胞から分離されたＣＢ細胞は、減少手順に続く１週間の懸濁培養により、接着細胞群を形成し、これは肝細胞増殖培養液によるさらなる培養の後、肝細胞に対するマーカーを発現することが発見された（例えば、非特許文献５８参照）。ＣＢ  ＣＤ３４＋．ＣＤ３８−  ＣＤ７−移植後の免疫不全マウスによる生体内実験において、ＣＣｌ４で処理した肝臓中に肝細胞様細胞発生の証拠が報告され（例えば、非特許文献５９参照）、また、ごく最近、ヒツジ胎児を用いた非損傷モデルにおいて、ヒツジ胎児のＢＭ再構成を通じて、ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−，ＣＤ３４−／Ｌｉｎ−，ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−／ＣＤ３８−，ＣＤ３４−／Ｌｉｎ−／ＣＤ３８−，ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−／ＣＤ１３３＋，ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−・ＣＤ１３３−を含むヒトＨＳＣからヒト肝細胞が生成された（例えば、非特許文献６０参照）。
【非特許文献１】KURTZBERG, J., LAUGHLIN, M., GRAHAM, M.L., SMITH, C., OLSON, J.F., HALPERIN, E.C., CIOCCI, G., CARRIER, C., STEVENS, C.E., and RUBINSTEIN, P. (1996). Placental blood as a source of hematopoietic stem cells for transplantation into unrelated recipients. N Engl J Med 335, 157-166.
【非特許文献２】WAGNER, J.E., ROSENTHAL, J., SWEETMAN, R., SHU, X.O., DAVIES, S.M., RAMSAY, N.K., MCGLAVE, P.B., SENDER, L., and CAIRO, M.S. (1996). Successful transplantation of HLA-matched and HLA-mismatched umbilical cord blood from unrelated donors: analysis of engraftment and acute graft-versus-host disease. Blood 88, 795-802.
【非特許文献３】GLUCKMAN, E., ROCHA, V., BOYER-CHAMMARD, A., LOCATELLI, F., ARCESE, W., PASQUINI, R., ORTEGA, J., SOUILLET, G., FERREIRA, E., LAPORTE, J.P., FERNANDEZ, M., and CHASTANG, C. (1997). Outcome of cord-blood transplantation from related and unrelated donors. Eurocord Transplant Group and the European Blood and Marrow Transplantation Group. N Engl J Med 337, 373-381.
【非特許文献４】RUBINSTEIN, P., CARRIER, C., SCARADAVOU, A., KURTZBERG, J., ADAMSON, J., MIGLIACCIO, A.R., BERKOWITZ, R.L., CABBAD, M., DOBRILA, N.L., TAYLOR, P.E., ROSENFIELD, R.E., and STEVENS, C.E. (1998). Outcomes among 562 recipients of placental-blood transplants from unrelated donors. N Engl J Med 339, 1565-1577.
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【非特許文献６】WAGNER, J.E., BARKER, J.N., DEFOR, T.E., BAKER, K.S., BLAZAR, B.R., EIDE, C., GOLDMAN, A., KERSEY, J., KRIVIT, W., MACMILLAN, M.L., ORCHARD, P.J., PETERS, C., WEISDORF, D.J., RAMSAY, N.K., and DAVIES, S.M. (2002). Transplantation of unrelated donor umbilical cord blood in 102 patients with malignant and nonmalignant diseases: influence of CD34 cell dose and HLA disparity on treatment-related mortality and survival. Blood 100, 1611-1618.
【非特許文献７】LAUGHLIN, M.J., EAPEN, M., RUBINSTEIN, P., WAGNER, J.E., ZHANG, M.J., CHAMPLIN, R.E., STEVENS, C., BARKER, J.N., GALE, R.P., LAZARUS, H.M., MARKS, D.I., VAN ROOD, J.J., SCARADAVOU, A., and HOROWITZ, M.M. (2004). Outcomes after transplantation of cord blood or bone marrow from unrelated donors in adults with leukemia. N Engl J Med 351, 2265-2275.
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【非特許文献９】GEORGE, T.J., SUGRUE, M.W., GEORGE, S.N., and WINGARD, J.R. (2006). Factors associated with parameters of engraftment potential of umbilical cord blood. Transfusion 46, 1803-1812.
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【非特許文献１４】KORBLING, M., KATZ, R.L., KHANNA, A., RUIFROK, A.C., RONDON, G., ALBITAR, M., CHAMPLIN, R.E., and ESTROV, Z. (2002). Hepatocytes and epithelial cells of donor origin in recipients of peripheral-blood stem cells. N Engl J Med 346, 738-746.
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、胎盤から臍帯血（ＣＢ）由来の肝細胞を回収する革新的な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第１の態様は、胎盤灌流を胎盤灌流機械灌流（ＰＭＰＰ）によって行うことができる。ＰＭＰＰは、通常、静脈穿刺（針とシリンジとを用い臍帯血管から吸引する方法）若しくは重力による排出などの従来の方法のいずれかと組み合わせて、又は事前の回収を行わずに行うことができる。ＰＭＰＰは、抗凝固剤を含む組織灌流液を用い、臍帯細胞を洗浄し、次に、生じた幹細胞を含む灌流液を回収するようにして行うことができる。このような方法は、凝固を防ぐために分娩後の胎盤中に抗凝固剤を調整又は投与する必要がない。分離された前記胎盤を、灌流の前に、例えば、氷上に配置されて冷却することができる。もし、胎盤の分離後１時間以内に灌流が行われるのであれば、該胎盤は灌流前に冷却する必要がない。本発明の方法は、前記胎盤が灌流の開始前に抗凝固剤が調整又は投与されているとしても、まだ行うことができる。もし、臍帯血細胞が先ず従来の方法を用いて回収されている場合、ＰＭＰＰで得られる残余の臍帯血細胞を、始めに回収した細胞に加えることができる。前記ＰＭＰＰで得た臍帯血細胞は、予備の細胞として保存することもでき、また、将来の細胞移植片工学及び再生医療のために保存するようにしてもよい。前記胎盤から臍帯血幹細胞を直ちに取り除く必要がないという便益、及び、中央施設までにさらなる準備をする必要なく、氷上に直接送るだけでよいという能力により、本発明の方法は現在確立している臍帯血細胞バンクシステムに組み込むために魅力的な可能性を有している。
【００１６】
本発明の１つの態様は、全採血されていないか又は一部採血されている該分離されたほ乳類の胎盤から臍帯血幹細胞を回収する方法を含む。他の態様として、例えば、少なくとも最初の１容の灌流液をほ乳類の胎盤に灌流して、臍帯血幹細胞を含む灌流液を作製する工程と、臍帯血幹細胞を含む該灌流液を回収する工程と、該灌流液から臍帯血幹細胞を分離し、分離された臍帯血幹細胞を作製する工程とを備えることができる。灌流は、灌流液を最初の１容以上、例えば、１〜３容分、灌流する工程を備えることができる。
【００１７】
本発明の方法のいくつかの態様において、前記灌流する工程は、前記全採血されていないか又は一部採血されているほ乳類の胎盤を灌流液の圧力に依存する流れを形成させて行われる。本発明の方法のある態様において、前記灌流液の圧力に依存する流れは、該灌流液の脈動流である。いくつかの態様において、前記灌流液の圧力に依存する流れは、１つ以上が該灌流液の陽圧又は陰圧に依存する流れである。
【００１８】
本発明の方法は、いくつかの態様において、前記全採血されていないか又は一部採血されているほ乳類の胎盤を、臍帯血幹細胞が実質的に存在しないほ乳類の胎盤を作製するのに十分な条件下で、例えば、脈動灌流となるように、前記灌流液の圧力に依存する流れを形成させて灌流する工程を備えている。さらなる態様として、前記胎盤灌流は、ペリスタポンプを用いて行われる。
【００１９】
一般に、本発明の方法は、分離された胎盤の臍帯血に存在する幹細胞を分離する工程を含む。前記分離された幹細胞は、胚幹細胞（ＥＳ細胞）様幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞又はこれらの組合せを含んでいることがある。本発明の方法によって得ることができる他の臍帯血細胞は、Ｔ細胞、単球、樹状細胞及びＢ細胞を含む。
【００２０】
本発明の方法では、他の態様として、灌流する工程の前に、ほ乳類の提供者からの胎盤を分離し、分離されたほ乳類の胎盤を作製する工程と、分離されたほ乳類の胎盤を冷却し、冷却したほ乳類の胎盤を作製する工程とをさらに備えることができる。
【００２１】
本発明の方法におけるいくつかの態様として、前記分離された胎盤は、該胎盤の分離から灌流の開始までの間、冷却又は氷上に維持される。いくつかの態様において、前記冷却され分離された胎盤は、前記灌流が行われる前、冷凍しないよう、０〜６℃の範囲の温度、又は１〜４℃の範囲の温度に維持される。他の態様では、前記灌流を行う前に、前記胎盤は、４〜１０℃の範囲の温度に４時間の間維持される。１態様として、前記胎盤は、前記灌流が行われる前、４℃に維持される。ある種の態様では、前記分離され冷却された胎盤は、該胎盤の分離から灌流の開始までの間、４０時間以上の範囲の時間維持される。
【００２２】
本発明の方法では、いくつかの態様において、灌流前の前記胎盤内に抗凝固剤を投与又は注入する必要がない。ある態様では、前記胎盤は、灌流の前に抗凝固剤が投与又は注入されない。
【００２３】
本発明の方法において、いくつかの態様では、前記灌流液は、生理学的に適合可能な溶液ベルザー（非ヒトにはＩＭＤＭのＲＰＭＩを用いる）である。他の態様では、前記灌流液は抗凝固剤である。ある態様では、前記灌流液は、ヘパリン、クレアチンリン酸ブドウ糖（ＣＰＤＡ）、又はこれらの２つ以上の組合せから選択される抗凝固剤である。
【００２４】
本発明の方法において、いくつかの態様では、前記胎盤は、胎盤灌流を受ける前に一部採血されている。一般に、前記臍帯血は、例えば、静脈穿刺（例えば、針とシリンジとによる）又は重力により排出する（例えば、針と袋とによる）ような標準的な方法によって前記胎盤から採血されていてもよい。一般に、幹細胞は、このような標準的な方法により前記胎盤から採血された前記臍帯血から分離されてもよい。いくつかの態様では、標準的な方法を用いて採血された胎盤から分離された幹細胞は、本発明の灌流方法を用いて分離された幹細胞と統合することができる。いくつかの態様では、前記統合された両方法由来の幹細胞をさらに幹細胞の個体発生を導くために用いてもよい。
【００２５】
本発明の方法の１態様において、前記胎盤は、臍動脈及び臍静脈を介して灌流が行われる。いくつかの態様では、前記胎盤を灌流し、生存可能な分娩後最高４０時間の幹細胞を含む臍帯血を取り除いた。ある態様では、前記胎盤を灌流し、生存可能な分娩後最高６〜４０時間の範囲内である幹細胞を含む臍帯血を取り除いた。
【００２６】
本発明の方法において、いくつかの態様では、前記胎盤に対するＰＭＰＰが、脈動設定を１５〜６０拍／分として行われた。ある態様では、前記胎盤に対するＰＭＰＰが、収縮期圧を１５〜７０ｍｍＨｇの範囲となるようにして行われた。また、さらなる態様では、前記胎盤に対するＰＭＰＰが、５〜９０分の範囲の時間行われ、その間に、臍帯血が該胎盤から取り除かれた。いくつかの態様では、前記胎盤に対するＰＭＰＰが１５〜３５分の範囲の時間行われた。他の態様では、前記胎盤に対するＰＭＰＰが２０〜３０分の範囲の時間行われた。さらなる態様として、前記胎盤に対するＰＭＰＰが、少なくとも１０分、少なくとも１５分、少なくとも２０分、少なくとも２５分、少なくとも３０分、少なくとも４０分、少なくとも５０分、及び少なくとも６０分から選択される最小限の時間行われ、最大灌流時間は、前記選択された最小限の時間に対して９０分より大きくない時間であった。
【００２７】
本発明の方法において、ある態様では、前記分離された初期造血幹細胞表現型は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３８−細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４−細胞、ＣＤ１１７＋細胞、ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ５９＋細胞、Ｔｈｙ１＋細胞、Ｌｉｎ−細胞、ＣＸＣＲ４細胞、ＡＬＤＨｈｉｇｈ細胞、ｓｉｄｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＳＰ）細胞、ＳＳＥＡ−３＋細胞、ＳＳＥＡ−４＋細胞、ＴＲＡ−１−６０細胞、ＴＲＡ−１−８１細胞又はこれらの組合せの一つ以上を含んでいる。さらなる態様として、前記分離された幹細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞、又はＣＤ１３３＋／ＣＤ３４−細胞以外に分化することができる初期造血幹細胞表現型を備える。
【００２８】
本発明の方法の１態様として、臍帯血幹細胞を回収する方法は、臍帯血幹細胞を含む臍帯血を有する、全採血されていないか又は一部採血されている分離されたほ乳類の胎盤を用意する工程と、該全採血されていないか又は一部採血されている分離されたほ乳類の胎盤を、灌流液の圧力に依存する流れを形成させて灌流し、臍帯血幹細胞を含む臍帯血を有する灌流液を得る工程と、該灌流液を回収する工程と、該灌流液から該臍帯血幹細胞を分離し、分離された臍帯血幹細胞を得る工程とを備えることを特徴とする。前記分離された臍帯血幹細胞は、低温保存することができる。
【００２９】
本発明の方法のもう１つの態様として、臍帯血幹細胞を回収する方法は、臍帯血幹細胞を含む臍帯血を有する、全採血されていない分離されたほ乳類の胎盤を用意する工程と、該全採血されていない分離されたほ乳類の胎盤から一部採血し、一部採血された胎盤と臍帯血幹細胞を含む所定量の臍帯血とを作製する工程と、該一部採血されたほ乳類の胎盤を、灌流液の圧力に依存する流れを形成させて灌流し、臍帯血幹細胞を含む臍帯血を有する灌流液を作る工程と、該灌流液を回収する工程と、該所定量の臍帯血から該臍帯血幹細胞を分離し、分離された臍帯血幹細胞を得る工程とを備えることを特徴とする。
【００３０】
本発明の方法では、いくつかの態様として、前記ＰＭＰＰにより得た灌流液に、例えば、針とシリンジのような従来の採血方法により臍血管から吸引した臍帯血を加えることで、１つの胎盤から得られる総単核細胞数を、針とシリンジとだけで臍血管から臍帯血を吸引した場合に比較して、約１．５倍に増加させることができる。もし本発明の灌流方法を行う前に採血を行わなかった場合でも、それに相当する全ての細胞を回収することが可能である。
【００３１】
本発明の方法の１態様として、前記ＰＭＰＰにより得た灌流液に、例えば、針とシリンジのような従来の採血方法により臍血管から吸引した臍帯血を加えることで、得られるＣＤ３４＋細胞の割合を、針とシリンジとだけで臍血管から臍帯血を吸引した場合に比較して、約５．５倍に増加させることができる。もし本発明の灌流方法を行う前に採血を行わなかった場合でも、それに相当する全ての細胞を回収することが可能である。
【００３２】
本発明の方法のもう一つの態様として、前記ＰＭＰＰにより得た灌流液に、例えば、針とシリンジのような従来の採血方法により臍血管から吸引した臍帯血を加えることで、得られる総ＣＤ３４＋細胞を、針とシリンジとだけで臍血管から臍帯血を吸引した場合に比較して、約４．９倍に増加させることができる。もし本発明の灌流方法を行う前に採血を行わなかった場合でも、それに相当する全ての細胞を回収することが可能である。
【００３３】
本発明の方法のさらに別の態様として、前記ＰＭＰＰにより得た灌流液に、例えば、針とシリンジのような従来の採血方法により臍血管から吸引した臍帯血を加えることで、得られるＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞群の割合を、針とシリンジとだけで臍血管から臍帯血を吸引した場合に比較して、約１４．８倍に増加させることができる。もし本発明の灌流方法を行う前に採血を行わなかった場合でも、それに相当する全ての細胞を回収することが可能である。
【００３４】
本発明の方法のさらに別の態様として、前記ＰＭＰＰにより得た灌流液に、例えば、針とシリンジのような従来の採血方法により臍血管から吸引した臍帯血を加えることで、回収されるＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞を、針とシリンジとだけで臍血管から臍帯血を吸引した場合に比較して、約１１倍以上にすることができる。もし本発明の灌流方法を行う前に採血を行わなかった場合でも、それに相当する全ての細胞を回収することが可能である。
【００３５】
本発明の方法のさらなる態様として、前記ＰＭＰＰにより得た灌流液に、例えば、針とシリンジのような従来の採血方法により臍血管から吸引した臍帯血を加えることで、得られる濃縮ＣＤ１３３＋細胞の割合を、針とシリンジとだけで臍血管から臍帯血を吸引した場合に比較して、約５倍にすることができる。もし本発明の灌流方法を行う前に採血を行わなかった場合でも、それに相当する全ての細胞を回収することが可能である。
【００３６】
本発明の方法のさらなる態様として、前記ＰＭＰＰにより得た灌流液に、例えば、針とシリンジのような従来の採血方法により臍血管から吸引した臍帯血を加えることで、得られるＣＤ１３３＋細胞群の数を、針とシリンジとだけで臍血管から臍帯血を吸引した場合に比較して、約７倍に高くすることができる。もし本発明の灌流方法を行う前に採血を行わなかった場合でも、それに相当する全ての細胞を回収することが可能である。
【００３７】
本発明の方法では、他の態様として、前記臍帯血幹細胞を低温保存することができる。
【００３８】
他の態様として、本発明の造血再構成を必要とするほ乳類の治療方法は、（ａ）ここで説明された方法に従い、胎盤臍帯血に由来する造血幹細胞を分離する工程と、（ｂ）ここで説明した方法に従って分離された造血幹細胞を生体外で培養し、子孫幹細胞（progeny stem cell）を得る工程とを備えることを特徴とする。ある態様では、これらの子孫幹細胞は、直ちに用いられてもよく、また、例えば、低温保存によって、該子孫幹細胞を必要とする患者に移送するためのユニット等として、将来用いるために保存されてもよい。さらなる態様として、前記方法は、さらに（ｃ）医療的に効果的な量の前記子孫幹細胞を備える組成物をほ乳類に導入する工程を備えてもよい。いくつかの態様において、前記ほ乳類は、例えば、ヒヒ又は他の霊長類のような、ヒト又は霊長類から選択される。
【００３９】
他の態様として、本発明の造血再構成を必要とするほ乳類の治療方法は、（ａ）ここで説明された方法に従い、胎盤臍帯血に由来する造血幹細胞を分離する工程と、（ｂ）医療的に効果的な量の該分離された造血幹細胞を備える組成物を前記ほ乳類に導入する工程とを備えることを特徴とする。いくつかの態様において、前記ほ乳類は、例えば、ヒヒ又は他の霊長類のような、ヒト又は霊長類から選択される。
【００４０】
また、本発明の方法の他の態様によれば、造血再構成を必要とするほ乳類に対する治療方法は、さらに、前記分離された幹細胞又はその子孫細胞を、これらの細胞を必要とするほ乳類に導入する前に、該分離された幹細胞を低温保存する工程を備えていてもよい。さらなる態様として、前記分離された幹細胞又はその子孫細胞を必要とするほ乳類に導入された該分離された幹細胞又はその子孫細胞は、該細胞を受け取るほ乳類にとって同種又は自己由来のものであることが好ましい。ある態様では、１つ以上の胎盤由来の前記分離された幹細胞は、これらの細胞を必要とするほ乳類の治療に用いるために、一緒に貯蔵することができる。さらなる態様として、１つの分離された胎盤から分離された幹細胞の子孫細胞は、これらの細胞を必要とするほ乳類の治療に用いるために、１つ以上のさらに分離された胎盤から得られた子孫細胞と一緒に貯蔵することができる。
【００４１】
本発明の方法のいくつかの態様によれば、造血再構成を必要とするほ乳類を治療するための方法は、再生不良性貧血、造血器悪性腫瘍、自己免疫疾患、遺伝性疾患、免疫不全、悪性固形癌又はこれらの組合せであるほ乳類に対するものを含む。
【００４２】
本発明の方法のある態様によれば、造血再構成を必要とする前記ほ乳類は、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群から選択される造血器悪性腫瘍であることを特徴とする。さらなる態様として、造血再構成を必要とする前記ほ乳類は、放射線治療、化学療法、病原微生物による感染、又は、これらの組み合わせの結果生じる免疫不全であることを特徴とする。
【００４３】
本発明の方法の他の態様によれば、損傷組織の再構成を必要とするほ乳類における損傷組織を再構成するための方法は、（ａ）請求項１記載の前記分離された臍帯血幹細胞を生体外で培養し、それにより、分化された細胞又は増殖された幹細胞を作製する工程と、
（ｂ）医療的に効果的な量の分化された細胞又は増殖された幹細胞を備える組成物を、対象組織の静脈内投与又は直接投与し、造血再構成を行わせることを特徴とする。さらなる態様として、損傷組織の再構成を必要とするほ乳類における損傷組織を再構成するための方法は、医療的に効果的な量の請求項１記載の前記分離された臍帯血幹細胞を備える組成物を、前記ほ乳類の各損傷組織の静脈内投与又は直接投与することを特徴とする。
【００４４】
本発明の方法の他の態様によれば、損傷組織の再構成を必要とするほ乳類における損傷組織を再構成するための方法において、前記組織は、心臓組織、筋組織、肝臓、皮膚、神経組織、骨組織、上皮、ストローマ、又は内皮の１つ以上を含むことを特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
以下に本発明を詳しく説明するが、本発明の方法は、様々な変形が可能であり、本発明の範囲から逸脱することなく、他の実施形態として利用することができ、論理的な変更を加えることができると解される。従って、以下の詳細な説明は、それに限定するためのものではなく、本発明の範囲は、添付された特許請求の範囲により定まるものである。
【００４６】
多くの別の実施形態が以下に説明されるが、これは単に例として示すものであり、これに限定するためのものではない。また、本発明の所与の実施形態は、一つの実施形態の特徴のいくつかを備えていてもよく、また、他の実施形態の特徴のいくつかの特徴を備えていてもよい。
【００４７】
臍帯血幹細胞を回収する方法は、全採血されていないか又は一部採血されている分離された胎盤を、灌流液で灌流（例えば、脈動灌流）し、臍帯血幹細胞を含む灌流液を得る工程と、該臍帯血を含む灌流液を回収する工程と、該灌流液から臍帯血幹細胞を分離し、臍帯血幹細胞を得る工程とを備える。
【００４８】
また、本発明は、従来の全採血法により臍血管から吸引した臍帯血に加えて、例えば、脈動灌流により得た灌流液を回収することにより、針及びシリンジだけで臍血管から吸引した臍帯血を回収する場合に比較して、１つの胎盤から得られる総単核細胞数を、少なくとも１．５倍に上昇させることができる。
【００４９】
本発明は、さらに、従来の全採血法により臍血管から吸引した臍帯血に加えて、例えば、脈動灌流により得た灌流液を回収することにより、針及びシリンジだけで臍血管から吸引した臍帯血を回収する場合に比較して、得られるＣＤ３４＋細胞の割合を、少なくとも２倍に上昇させ、好ましくは２〜１０倍に上昇させ、さらに好ましくは４〜６倍に上昇させ、最も好ましくは５．５倍に上昇させることができる。
【００５０】
本発明は、従来の全採血法により臍血管から吸引した臍帯血に加えて、例えば、脈動灌流により得た灌流液を回収することにより、針及びシリンジだけで臍血管から吸引した臍帯血を回収する場合に比較して、得られる総ＣＤ３４＋細胞を、４．９倍に増加させることができる。
【００５１】
また、本発明は、従来の全採血法により臍血管から吸引した臍帯血に加えて、例えば、脈動灌流により得た灌流液を回収することにより、針及びシリンジだけで臍血管から吸引した臍帯血を回収する場合に比較して、得られるＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞群の割合を、少なくとも５倍に上昇させ、好ましくは５〜２０倍に上昇させ、さらに好ましくは１２〜１８倍に上昇させ、最も好ましくは１４．８倍に上昇させることができる。
【００５２】
本発明は、従来の全採血法により臍血管から吸引した臍帯血に加えて、例えば、脈動灌流により得た灌流液を回収することにより、針及びシリンジだけで臍血管から吸引した臍帯血を回収する場合に比較して、回収されるＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞を、少なくとも５倍以上、好ましくは５〜１０倍以上、さらに好ましくは１０〜１５倍以上、最も好ましくは１１倍以上にすることができる。
【００５３】
本発明はさらに、従来の全採血法により臍血管から吸引した臍帯血に加えて、例えば、脈動灌流により得た灌流液を回収することにより、針及びシリンジだけで臍血管から吸引した臍帯血を回収する場合に比較して、得られた濃縮ＣＤ１３３＋細胞の割合を、少なくとも２倍、好ましくは２〜１０倍、さらに好ましくは４〜８倍、最も好ましくは５倍とすることができる。
【００５４】
本発明は、従来の全採血法により臍血管から吸引した臍帯血に加えて、例えば、脈動灌流により得た灌流液を回収することにより、針及びシリンジだけで臍血管から吸引した臍帯血を回収する場合に比較して、得られるＣＤ１３３＋細胞数を、少なくとも３倍、好ましくは３〜１５倍、さらに好ましくは５〜１９倍、最も好ましくは７倍高くすることができる。
【００５５】
１．定義
以下に、本明細書及び特許請求の範囲における明確かつ一貫した理解を提供するために、用語の定義をする。
【００５６】
灌流…「灌流」とは、全採血されていないか又は一部採血されている胎盤の上又は中に流体を流すこと、好ましくは、あらゆる残余の細胞、例えば、臓器や組織に吸着していない細胞を取り除くために、十分な力又は圧力で全採血されていないか又は一部採血されている胎盤の中に流体を通過させることを指す。ここで使用される「灌流液」という用語は、臓器又は組織の中に通過させた後に回収される流体を指す。好ましい実施形態として、前記灌流液は、一つ以上の抗凝固剤を含んでいる。灌流液の流れは、灌流液の圧力に依存する流れを備えることができる。灌流液の圧力に依存する流れは、灌流液の陽圧又は陰圧に依存する流れとすることができる。灌流液の圧力に依存する流れは、脈流とすることができる。
【００５７】
灌流は、少なくとも灌流液の最初の１容を、１０分から１時間の範囲、１５〜４５分の範囲又は２０〜３０分の範囲の時間行われるようにすることができる。
【００５８】
灌流は、開状態又は閉状態の固形又は変形自在の容器内で、全採血されていないか又は一部採血されている胎盤に対して行うことができる。前記容器は、全採血されていないか又は一部採血されている胎盤を灌流時に該容器に収容された灌流液中に浸漬できる量の灌流液を収容することができ、それにより、該量の灌流液と該容器に収容される灌流液とを、臍帯血幹細胞をそこから分離する前に統合することができる。前記浸漬されている分離された胎盤及びその周囲の灌流液は、その圧力を周囲圧力又は陽圧若しくは陰圧にすることができる。
【００５９】
灌流は、全採血されていないか又は一部採血されている胎盤を、脈動ポンプ又はペリスタポンプを用いた灌流液の、例えば、１５〜９０拍／分で収縮気圧が１５〜９０ｍｍＨＧ、又は６０拍／分で収縮気圧が３０〜７０ｍｍＨｇである脈流にさらす様にすることができる。
【００６０】
前記ほ乳類の胎盤中に灌流液を通過させるための陽圧又は陰圧を形成するための圧力源として、例えば、ペリスタポンプ若しくはペリスタ装置、又は脈動ポンプ若しくは脈動装置のような加圧システムを用いることで、十分な灌流液の流れを生成することができる。ペリスタポンプ系を用いることで、前記胎盤中を流れる灌流液を容易に無菌に維持することができる。実際の圧力水準又はポンプ流量は、全採血されていないか又は一部採血されている胎盤由来の臍帯血を取り除くために最適に調整される。
【００６１】
灌流液…「灌流液」という用語は、幹細胞を含む臍帯血細胞の生存率を維持するために十分な抗凝固剤を含み生理的に適合するあらゆる溶液又は培地を意味する。適切な灌流液は、ＲＰＭＩ（Roswell Park Memorial Institute）培地（任意に、グルコン酸塩と、ヘパリン、例えば、総体積１リットルに対して１０００Ｕのヘパリンとを含む）、及び、ベルザー（Belzer）ＭＰＳ（任意に、ヘパリン、例えば、総体積６００〜７５０ｍｌに対して２０００Ｕのヘパリンを含む）からなるものを用いることができる。他の適切な灌流液は、公知であり、当業者により容易に選択され、用いられることができる。灌流は、灌流液が少なくても最初の１容分流されて行われる。灌流は、４〜２７℃の範囲の温度で、例えば、室温で行われることができる。
【００６２】
最初の１容…「最初の１容」という用語は、ほ乳類から分離された、全採血されていないか又は一部採血されている胎盤を灌流するために用いられる灌流液の体積を意味する。前記灌流液の最初の１容は、２５０ｍｌ〜２リットル、好ましくは４００ｍｌ〜１．５リットル、より好ましくは５００ｍｌ〜１．２リットル、さらに好ましくは６００ｍｌ〜１リットル、最も好ましくは６００〜７５０ｍｌである。
【００６３】
圧力に依存する流れ…「圧力に依存する流れ」という用語は、陽圧又は陰圧によって引き起こされる灌流液の流れを意味する。
【００６４】
陰圧…「陰圧」という用語は、大気圧より下の圧力、即ち、１気圧より低いことを意味する。
【００６５】
陽圧…「陽圧」という用語は、ある気圧以上の圧力、即ち、１気圧と同じ又はそれより高いことを意味する。
【００６６】
全採血された胎盤…「全採血された胎盤」という用語は、全ての循環血液が取り除かれた又は回収されている、即ち、分離された無血の胎盤を意味する。
【００６７】
全採血されていない…「全採血されていない胎盤」という用語は、循環血液が取り除かれていない又は回収されていない分離された胎盤を意味する。
【００６８】
一部採血された…「一部採血された胎盤」という用語は、循環血液の一部が取り除かれている又は回収されている分離された胎盤を意味する。
【００６９】
幹細胞…ここで使用する「幹細胞」という用語は、無期限に複製し、組織及び臓器の特殊化した細胞に分化することができる万能細胞を指す。幹細胞は、発生的に多能であるか、又は、多能性細胞である。幹細胞は、分割して２つの娘幹細胞を形成することができ、又、１つの娘幹細胞と１つの前駆（「移行期」）細胞とを形成することができ、その後、該前駆細胞は組織の成熟した十分に形成された細胞に増殖する。ここで、前記「幹細胞」は、特に明記しない限り、「前駆細胞」を含むものとする。
【００７０】
造血幹細胞は、新生細胞の連続的な供給源を維持するため、自己複製能を有する希少な初期血球細胞前駆体であり、血球細胞系統の様々な形態学的に認識される前駆細胞に分化する。このような前駆細胞は、未成熟な血球細胞であり、自己複製能が無く、赤血球、リンパ球及び骨髄性細胞を含む成熟血球細胞に分化することになる。骨髄微小環境の中で、前記幹細胞は、一生を通じて、自己複製すると共に、全ての成熟した血球細胞系統の継続的な産生を活発に維持する。
【００７１】
ＣＤ３４＋細胞は、骨髄、末梢血又は新生児の臍帯血の中で、定義しうる最も初期の造血幹細胞として定義される。本発明の補助剤及び培地は、ＣＤ３４＋細胞、及び、例えば、ＢＦＵ−Ｅ細胞、赤血球、ＣＦＵ−ＭＥＧ細胞、巨核球、ＣＦＵ−ＧＭ細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球及び好塩基球を含む骨髄性系統細胞の増殖を維持するのに特に適したものである。発生の初期段階において、骨髄性系統細胞は、ＣＤ３４＋マーカータンパク質を発現する。発生段階の後期段階において、骨髄性系統細胞は、ＣＤ３４＋マーカータンパク質を検出可能水準では発現しない。
【００７２】
臍帯血幹細胞が前記ＣＤ３４＋マーカータンパク質を発現するかどうかは、当業者であれば蛍光活性化細胞分類のような公知の技術を用いて判別することができる。
【００７３】
「ＣＤ３４＋造血細胞」又は「ＣＤ３４＋細胞」は、ＣＤ３４＋表面マーカータンパク質を発現する造血細胞である。このような細胞は、造血幹細胞、骨髄性前駆体又は骨髄性前駆細胞、赤血球前駆体又は赤血球前駆細胞、及びリンパ球前駆体又はリンパ球前駆細胞を挙げることができるが，これらに限るものではない。
【００７４】
ＣＤ３４＋細胞は、当業者によく知られた方法を用いて分離される臍帯血幹細胞を生成するために、回収された臍帯血又は灌流液から分離されたものである。様々なシステムは当業者により利用可能である。例えば、ＭｉｃｒｏＣＥＬＬｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＭｉｎｉＭａｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｖｉ  Ｖｉｏｔｅｃ社製）を、ＣＤ３４＋細胞を分離するために用いることができる。大規模にＣＤ３４＋細胞の細胞濃縮調整物を製造するために、Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、及び、ＣｅｌｌＰｒｏ社により販売されているシステムが当業者により利用されうる。「造血幹細胞」及び「多能性造血幹細胞」という単語は、骨髄性前駆体又は骨髄性前駆細胞、赤血球前駆体又は赤血球前駆細胞、及び、リンパ球前駆体又はリンパ球前駆細胞を含むあらゆる型の造血前駆体又は造血前駆細胞を生じさせる細胞を指す。造血幹細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３３−／ＣＤ３８−表現型、又は、ＣＤ３４＋／ＨＬＤ−ＤＲ．−ＣＤ３８表現型を示す（例えば、非特許文献６１及び非特許文献６２参照）。
【００７５】
１．従来のＣＢ回収方法を用いる又は用いない胎盤ＣＢ細胞の回収方法
腎臓保存に広く用いられているＷａｔｅｒ’ｓ  ＲＭ３  脈動灌流装置（Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ロチェスター、ミネソタ州、米国）を用いる脈導管流技術を用いてのＣＢ回収方法の概念パイロットテストの証明に成功した。前記装置は、移植に用いる前に保存されている腎臓の即時機能を向上させることを目的に設計されたものである。前記灌流液は、グルコン酸及び総計１リットル当たり１０００Ｕのヘパリンを有するＲＰＭＩ培地と、１０００〜２０００Ｕのヘパリンが添加されたＢｅｌｚｅｒ  ＭＰＳ（２０００Ｕのヘパリン塩が添加された６００〜７５０ｍｌのＢｅｌｚｅｒ  ＭＰＳ）から成る。前記パイロット試験では、ヒヒの胎盤を用い、前記方法の実現可能性及び残存胎盤ＣＢの全てを灌流により取り除くことを示している。単球細胞の絶対総数、ＣＦＣ数、ＣＤ３４＋とＣＤ３４＋／ＣＤ３８−との割合及び数は、従来の静脈穿刺方法のみの場合に比較して、静脈穿刺方法に加えて機械灌流を行った場合は約２倍高い値となった。
【００７６】
脈動機械灌流による有望なヒヒＣＢ回収に基づき、この方法をヒト胎盤について試験した。ＣＢ回収は、メリーランド大学施設内倫理委員会によって承認された臨床試験計画書に基づき、７つの通常の経膣分娩による胎盤及び１つの帝王切開による胎盤であり、各胎盤が妊娠３６〜４１週の計８つの胎盤に対して行われた。一部のＣＢ回収は、胎盤がまだ子宮内にある状態で新生児が分娩された後、前記臍帯をクランプし、針／シリンジを用いる静脈穿刺を先ず行い、できる限り最大量吸引して行った。この方法は、経膣分娩及び帝王切開の両方に対して用いられる最大の収率でＣＢを回収するものであり、常用のＣＢ回収のために広く用いられている方法の一つである。１８ゲージの針を３０ｍｌまたは６０ｍｌの容量のシリンジに装着し、該針／シリンジにより吸引されたＣＢ物質を、直ちに５０００Ｕのヘパリン溶液を含む５０ｍｌ円錐管に移した。回収されたＣＢを、直ちに、凝固を防ぐためにヘパリンと混合し、氷冷して保存した。この手順で回収されたＣＢの平均体積は、５９±１８ｍｌ（平均値±Ｓ．Ｄ．）(４０〜９０ｍｌの範囲)であった。次に、通常、前記胎盤が分娩され、該胎盤を滅菌分離バッグ（３Ｍヘルスケア株式会社製、セントポール、ミネソタ州、米国）に直接入れた。前記胎盤が、外観試験を必要とする場合には、滅菌トレイに置いた後、該試験が終了してから滅菌分離バッグ内に移した。同様に、前記胎盤の重量を滅菌バッグ内で測定した。前記滅菌分離バッグをしっかりと閉じ、３重にバッグに入れて分離し、前記胎盤の灌流が始まるまで、いかなる処置もせず、氷冷して維持した。前記胎盤に対して、分娩後６．２５〜３９時間の間灌流を行った。胎盤は、分離後、−３〜１５℃の範囲の温度、−８〜１０℃の範囲の温度、−２〜６℃の範囲の温度、又は提供された胎盤を冷凍することができないのであれば０〜６℃の範囲の温度に冷却することができる。前記冷却された胎盤は、灌流する前に、氷点より高く、例えば、０〜１５℃、好ましくは０〜１０℃、さらに好ましくは２〜６℃の範囲の温度に、３０〜６０分の範囲の時間、好ましくは１〜５０時間の範囲の時間、より好ましくは６〜４０時間の範囲の時間、さらに好ましくは１０〜４０時間の範囲の時間、さらに好ましくは１５〜４０時間の範囲の時間、最も好ましくは２０〜４０時間の範囲の時間維持することができる。
【００７７】
胎盤脈動機械灌流（pulsatile machine placental perfusion：ＰＭＰＰ）を行うために、前記胎盤を滅菌野に配置し、胎盤内に裂傷や裂け目がないかどうかを確認するための検査を行った。その後、前記臍帯における２つの臍動脈と１つの臍静脈を見つけるために検査した。前記２つの臍動脈と１つの臍静脈との内、１つ以上に対して灌流を促進するためにカニューレを挿入した。まず、６ｍｍ長のまっすぐなカニューレを臍静脈中に挿入し、O−シルクタイ（o-silk tie）でその位置を固定し、その後、２つの臍動脈中に２ｍｍ長のまっすぐなカニューレをそれぞれ挿入し、ｏ−シルクタイでその挿入位置を固定した。前記胎盤を、１０００〜２０００Ｕのヘパリン（２０００Ｕのヘパリン塩が添加された６００〜７５０ｍｌのベルザーＭＰＳ）が添加されたベルザーＭＰＳを備える灌流回路（Ｗａｔｅｒｓ  ＲＭ３腎臓灌流ポンプ）上に配置した。ベルザーＭＰＳは、ＦＤＡで承認された死体から提供された移植用臓器の保存のために用いられる臓器灌流液である。脈動器官灌流は、６０拍／分に設定され、収縮期圧は３０〜７０ｍｍＨｇの間の圧力であった。灌流は、完了までの時間が平均で２６分間(２０〜３０分の範囲)であった。前記灌流の完了を確認するために、前記胎盤の血管の内容物の全排出を示す指標として、該胎盤組織が暗い青色から鮮明な白色に変化することを利用した。
【００７８】
８つのＣＢサンプルを、同じ対象物から静脈穿刺及び胎盤機械灌流法により回収した。その定量結果を表１に示す。静脈穿刺により回収した前記ＣＢの体積の平均は上述した通りである。前記胎盤脈動機械灌流法で回収した前記ＣＢの体積の平均は、前記灌流液とＣＢとが混合しているため測定しなかった。用いた胎盤は、平均して妊娠３８．６週（３６〜４１週の範囲）であり、該胎盤の平均の大きさは、直径２０ｃｍ×厚さ１ｃｍ（直径１７〜２２ｃｍ×１ｃｍ）であった。前記胎盤は、１つが帝王切開によるものであり(サンプル１)、７つが経膣分娩であった（サンプル２〜８）。胎盤の分娩から灌流の開始までの平均時間は、１７時間（６．２５〜３９時間）であり、胎盤灌流手順の継続時間は、３０分未満（平均２６分、２０〜３０分の範囲）であった（表１）。３つの胎盤（サンプル３，５，６）には全胎盤領域の内のそれぞれ５％、１０％、７％の範囲に血栓症が見られたが、その他のサンプルには見られなかった。前記胎盤は、熱的に分離されたボックス内で、灌流の開始まで１９〜３９時間の範囲の時間、４℃の温度に氷冷された。結局、試験を行った血栓症のものを含む全ての胎盤において、機械灌流を行うことに対する困難はなく、脈動機械灌流による圧力障害は観察されなかった。
【００７９】
【表１】
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【００８０】
２．ＰＭＰＰで回収した溶液の従来の臍帯血回収方法と比較による分析
ＣＢ単核細胞分離
胎盤の血管系への静脈穿刺により得られたＣＢ細胞は、先ず、Ｉｓｏｃｏｖｅ‘ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ培地（ＩＭＤＭ）で１：５に希釈し、単核細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社製、セントルイス、ミズーリ州、米国）を用いた従来の密度勾配遠心法により分離した（例えば、非特許文献６３参照）。前記単核細胞を含む層を、静かに吸引し、前記細胞をＰＢＳ溶液で２回洗浄し、血球計算機により細胞数を計算した。細胞生存度をトリパンブルー除去法によって確認した。ＰＭＰＰによって得たＣＢ細胞は、静脈穿刺により得たＣＢ細胞と同様の手順で処理した。しかしながら、これらの細胞は、灌流液のかなりの量と混合されていた（合計体積６５０〜８００ｍｌ）。この灌流液を、数１０又は５０ｍｌ程の円錐管に分注し、１８００ｒｐｍで２０分間一緒に遠心分離を行い、軟膜層を得た。その後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心法により、さらに単核細胞を分離した。ＣＢ細胞を、上述したように洗浄し、細胞数を計算した。
【００８１】
フローサイコメトリー分析
単核細胞を抗ヒトＣＤ３８−ＦＩＴＣ、ＣＤ３４−ＡＰＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）、ＡＣ１３３−ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、オーバーン、カリフォルニア州、米国）を含むモノクローナル抗体で染色し、Ｆａｃｓｔａｒ−ｐｌｕｓ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）によって製造業者の指示に従って分析した。イソタイプ制御を各サンプルに対して平行に適切な抗体を用いることで行った。
【００８２】
ＣＤ３４＋細胞回収
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心法により得たＣＢ単核細胞のサンプルを、製造業者の指示に従ってＣＤ３４前駆細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）による磁気細胞分離法でさらに分離して、ＣＤ３４＋細胞群を濃縮した。精製細胞数及び生存率を、血球計算機及びトリパンブルー除去試験によって決定した。ＣＤ３４＋細胞の濃縮率を、フローサイコメトリー分析によって確認し、そして、各分離群は、トリパンブルー除去法により確認された９５％以上の生存率を備え、ＣＤ３４＋細胞が９０％以上に精製されていることが示された。
【００８３】
メチルセルロースコロニー形成ユニット分析
精製ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞（３×１０３／プレート）を、３５ｍｍ培養皿に前述のようにまいた（例えば、非特許文献６４参照）。細胞を市販の培地、１ｍｌ  ＩＭＤＭ、１％メチルセルロース、ＢＳＡ、２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、インスリン、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ及びエリトロポエチンからなるＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、バンクーバー、カナダ）を用い、製造業者の指示に従って培養した。１４日目に、前記コロニー（５０細胞以上）を２重に培養した培養皿において列挙した。
【００８４】
【表２】
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【００８５】
【表３】
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【００８６】
【表４】
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【００８７】
本発明は、詳細な説明及びその実施形態を参照することで、添付の請求項において定められる本発明の範囲から逸脱することなく、再構成、組合せ、又は１つ以上の構成要素の追加等の修正変更が行われ得ることが明らかである。従って、本発明は、これらの実施形態に限定するものではなく、ここで開示する原理及び新規特性を備える最も広い範囲に解される。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】胎盤脈動機械灌流（ＰＭＰＰ）は、静脈穿刺だけの場合に比較して、回収できる胎盤当たりの総単核細胞数（静脈穿刺法に加えてＰＭＰＰ法を行った場合）を１．５倍に増加させることができる。図１は、静脈穿刺法（黒塗り）に続いて胎盤機械灌流法（縞模様）によって得た８つの胎盤由来のＣＢサンプルの分析結果を示す。各バーの下の数字は、表１に示すサンプルナンバーを表す。（図１）生データを表３に示す。
【図２】ＰＭＰＰ法によって得たＣＤ３４＋細胞の割合は、静脈穿刺法による場合に比較して、４．９倍に増加した。
【図３】静脈穿刺法を用いて得たＣＤ３４＋細胞数は、７．４×１０６±５．９×１０６個（平均値±Ｓ．Ｄ．）（８サンプルの範囲は、１．１〜１８．２×１０６）であり、ＰＭＰＰ法を用いて得たＣＤ３４＋細胞数は、２８．８×１０６±３７×１０６個（平均値±Ｓ．Ｄ．）（１．６〜１１６×１０６の範囲）である。これは、ＰＭＰＰ法を用いて得た総ＣＤ３４＋細胞が、３．９倍に増加していることを示す。
【図４】静脈穿刺法を用いて得たＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の平均割合は、０．３２±０．１７％（平均値±Ｓ．Ｄ．）（０．０４〜０．６６の範囲）であり、ＰＭＰＰ法を用いて得たＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の平均割合は、４．４±４．１％（平均値±Ｓ．Ｄ．）（１．３〜１４の範囲）である。これは、ＰＭＰＰを用いて得た総ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞群の割合が、静脈穿刺法を用いた場合に比較して、１３〜１４倍に増加していることを示す。
【図５】静脈穿刺法を用いて得たＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の絶対数は、１．７±１．５×１０６個（平均値±Ｓ．Ｄ．）（０．１２〜５．２の範囲）であり、ＰＭＰＰ法を用いて得たＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の絶対数は、１７±２２×１０６個（平均値±Ｓ．Ｄ．）（０．８６〜６５の範囲）である。これは、ＰＭＰＰ法を用いて得たＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞が、１０倍以上に増加していることを示す。
【図６】静脈穿刺法を用いて得たＣＤ１３３＋細胞の割合は、０．５５±０．８％（平均値±Ｓ．Ｄ．）（０〜２．５の範囲）であり、ＰＭＰＰ法を用いて得たＣＤ１３３＋細胞の割合は、２．４±２．０％（平均値±Ｓ．Ｄ．）（０．５〜６．８の範囲）である。これは、ＰＭＰＰ法を用いることでＣＤ１３３＋細胞の割合が４倍に濃縮されたことを示す。
【図７】静脈穿刺法を用いて得たＣＤ１３３＋細胞数は、０．９８±０．８×１０６個（平均値±Ｓ．Ｄ．）（０〜２．３の範囲）であり、ＰＭＰＰ法を用いて得たＣＤ１３３＋細胞数は、６．３±０．８×１０６個（平均値±Ｓ．Ｄ．）（０．５５〜１１．２の範囲）である。これは、ＰＭＰＰ法を用いて得たＣＤ１３３＋細胞数が、６．３倍高い水準に著しく濃縮されたことを示す。
【図８】静脈穿刺法を用いて得たＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋細胞の平均割合及び絶対数は、それぞれ、１．３４±０．６％（平均値±Ｓ．Ｄ．）（０．２６〜２の範囲）、６．１±５．１×１０６個（平均値±Ｓ．Ｄ．）（１．０〜１６．２の範囲）であり、ＰＭＰＰ法を用いて得たＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋細胞の平均割合及び絶対数は、それぞれ、３．５±１．６％（平均値±Ｓ．Ｄ．）（０．８２〜６の範囲）、１１．９±１５×１０６個（平均値±Ｓ．Ｄ．）（０．７８〜５０の範囲）である。これは、ＰＭＰＰ法を用いて得たＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋細胞の割合が、２．６倍に増加しており、その絶対数が１．９５倍に増加したことを示す。
【図９】静脈穿刺法を用いて得たＣＤ１３３＋／ＣＤ３４−細胞の平均割合及び絶対数は、それぞれ、０．３７±０．７％（平均値±Ｓ．Ｄ．）（０〜２の範囲）、０．３６±０．７×１０６個（平均値±Ｓ．Ｄ．）（０〜１．９の範囲）であり、ＰＭＰＰ法を用いて得たＣＤ１３３＋／ＣＤ３４−細胞の平均割合及び絶対数は、それぞれ、１．１６±１．５％（平均値±Ｓ．Ｄ．）（０〜５の範囲）、２．４±３．３×１０６個（平均値±Ｓ．Ｄ．）（０．７８〜５０の範囲）である。これは、ＰＭＰＰ法を用いて得たＣＤ１３３＋／ＣＤ３４−細胞の割合が、３倍に濃縮されており、その絶対数が６．５倍以上に増加したことを示す。
【図１０】静脈穿刺法を用いて得たＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞の平均割合及び絶対数は、それぞれ、０．６２±０．５％（平均値±Ｓ．Ｄ．）（０〜０．６の範囲）、０．６８±０．６×１０６個（平均値±Ｓ．Ｄ．）（０〜１．８９の範囲）であり、ＰＭＰＰ法を用いて得たＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞の平均割合及び絶対数は、それぞれ、１．２６±０．８％（平均値±Ｓ．Ｄ．）（０．３５〜２．９の範囲）、４．０±５．６×１０６個（平均値±Ｓ．Ｄ．）（０．３５〜１６．５の範囲）である。これは、ＰＭＰＰ法を用いて得たＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞の割合が、２倍に濃縮されており、絶対数が５．９倍以上に増加したことを示す。
【符号の説明】
【００８９】
なし
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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