(57)【要約】  本発明は少なくともアミノ酸配列ＫＸＫＸ1Ｘ2ＸＫＧＸを含む分子又はそのアナログに関し、ここでＸはいずれかのアミノ酸残基であり、Ｘ1及びＸ2はＫ又はＲであり、及びここで前記分子は約１０〜約１００アミノ酸残基の長さを有する。本発明はまた前記分子を含む組成物及び細菌、ウイルス、酵母を含む真菌、及び寄生虫の如き微生物と闘うための本発明に係る分子及び／又は組成物の使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともアミノ酸配列
ＫＸＫＸ1Ｘ2ＸＫＧＸ
を含む分子又はそのアナログであって、ここで
Ｘはいずれかのアミノ酸残基であり
Ｘ1及びＸ2はＫ又はＲであり
及びここで、前記分子は約１０〜約１００アミノ酸残基の長さを有する、分子又はそのアナログ。
【請求項２】
前記分子は少なくともアミノ酸配列
ＫＸＫＸ1Ｘ2ＸＫＧＸ3Ｘ4Ｘ5ＸＸ6ＣＸ7Ｘ8
を含む、請求項１に記載の分子であって、ここで
Ｘはいずれかのアミノ酸残基であり
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ4及びＸ5はＫ又はＲであり
Ｘ3はいずれかのアミノ酸残基及び２〜１２のアミノ酸残基であり
Ｘ6はＰ又はＬであり
Ｘ7はいずれかのアミノ酸残基である３のアミノ酸残基であり
Ｘ8はＦ又はＹであり
及びここで、前記ペプチドは約２０〜約１００アミノ酸残基の長さを有する、分子。
【請求項３】
上記分子は配列ＩＤ番号：２０中に示されるアミノ酸配列を含む又はここで、前記分子は少なくともアミノ酸残基Ｌ９Ｗが置換されている点で配列ＩＤ番号：２０中に示されるアミノ酸配列とは異なる、請求項１に記載の分子。
【請求項４】
上記分子は配列ＩＤ番号：１２中に示されるアミノ酸配列を含む又はここで、前記分子はＬ９Ｗ、Ｒ１３Ｋ、Ｄ１４Ｗ、Ｄ１４Ｌ及びＹ２０Ｆから成る群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基が置換されている点で配列ＩＤ番号：１２中に示されるアミノ酸配列とは異なる、請求項２に記載の分子。
【請求項５】
前記分子は少なくともアミノ酸残基Ｒ１３Ｋ及びＹ２０Ｆが置換されている（配列ＩＤ番号：１３）点で配列ＩＤ番号：１２中に示されるアミノ酸配列とは異なる、請求項４に記載の分子。
【請求項６】
前記分子は少なくともアミノ酸残基Ｄ１４Ｌが置換されている（配列ＩＤ番号：１４）点で配列ＩＤ番号：１２中に示されるアミノ酸配列とは異なる、請求項４に記載の分子。
【請求項７】
前記分子は少なくともアミノ酸残基Ｌ９Ｗが置換されている（配列ＩＤ番号：１５）点で配列ＩＤ番号：１２中に示されるアミノ酸配列とは異なる、請求項４に記載の分子。
【請求項８】
前記分子は少なくともアミノ酸残基Ｌ９Ｗ及びＤ１４Ｌが置換されている（配列ＩＤ番号：１６）点で配列ＩＤ番号：１２中に示されるアミノ酸配列とは異なる、請求項４に記載の分子。
【請求項９】
前記分子は少なくともアミノ酸残基Ｌ９Ｗ及びＤ１４Ｗが置換されている（配列ＩＤ番号：１７）点で配列ＩＤ番号：１２中に示されるアミノ酸配列とは異なる、請求項４に記載の分子。
【請求項１０】
前記分子は少なくともアミノ酸残基Ｄ１４Ｗが置換されている（配列ＩＤ番号：１８）点で配列ＩＤ番号：１２中に示されるアミノ酸配列とは異なる、請求項４に記載の分子。
【請求項１１】
前記分子は約１０〜約５０アミノ酸残基の長さを有する、請求項１及び３のいずれかに記載の分子。
【請求項１２】
前記分子は約１０〜約３５アミノ酸残基の長さを有する、請求項１及び３のいずれかに記載の分子。
【請求項１３】
前記分子は１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５アミノ酸残基の長さを有する、請求項１及び３のいずれかに記載の分子。
【請求項１４】
前記分子は約２０〜約５０アミノ酸残基の長さを有する、請求項２及び４〜１０のいずれかに記載の分子。
【請求項１５】
前記分子は約２０〜約３５アミノ酸残基の長さを有する、請求項２及び４〜１０のいずれかに記載の分子。
【請求項１６】
前記分子は２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５アミノ酸残基の長さを有する、請求項２及び４〜１０のいずれかに記載の分子。
【請求項１７】
上記分子はアミド化、エステル化、アシル化、アセチル化、ＰＥＧ付加又はアルキル化により改変される、前記請求項のいずれかに記載の分子。
【請求項１８】
前記分子は１、２、３、４、５又は６アミノ酸残基の置換により改変される、前記請求項のいずれかに記載の分子。
【請求項１９】
前記請求項のいずれかに記載の少なくとも１の分子を含む組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１８のいずれかに記載の２〜４の分子を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
医薬として許容される緩衝液、希釈剤、担体、補助剤又は賦形剤を含む請求項１９又は２０に記載の組成物。
【請求項２２】
１以上の抗生物質及び／又は防腐剤（単数又は複数）及び／又は抗炎症剤を含む請求項１９〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１８に記載の分子又は請求項１９〜２２に記載の組成物を含む製品であって、包帯、硬膏、縫合、石鹸、タンポン、ダイヤパー、シャンプー、歯磨き粉、ウェットティッシュ、抗ざ瘡化合物、日焼け止めクリーム、織物、粘着物、傷ドレッシング、クリーニング溶液又はインプラントから成る群から選ばれる、製品。
【請求項２４】
医薬における使用のための請求項１〜１８のいずれかに記載の分子。
【請求項２５】
微生物感染を治療する又は予防するための微生物の減少及び／又は消去のための抗菌組成物の製造のための請求項１〜１８のいずれかに記載の分子又は配列ＩＤ番号：１９に少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド又は請求項１９〜２２に記載の組成物の使用。
【請求項２６】
前記ポリペプチドは配列ＩＤ番号：１９に少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記ポリペプチドは配列ＩＤ番号：１９に少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記ポリペプチドは配列ＩＤ番号：１９に少なくとも９７％の配列同一性を有する、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記ポリペプチドは配列ＩＤ番号：１９に少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記微生物感染は細菌感染及び／又は真菌感染である、請求項２５〜２９のいずれかに記載の使用。
【請求項３１】
前記抗菌組成物は局所組成物である、請求項２５〜３０のいずれかに記載の使用。
【請求項３２】
治療されるべき前記微生物感染はアトピー性皮膚炎、とびひ、慢性皮膚潰瘍、感染された急性の傷及び火傷の傷、ざ瘡、外耳炎、真菌感染、肺炎、脂漏性皮膚炎、カンジダ間擦疹、カンジダ膣炎、中口腔咽頭カンジダ症、眼の感染及び鼻の感染から成る群から選ばれる、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記微生物組成物は火傷の傷における、手術後の又は皮膚外傷後の微生物感染を予防するためである、請求項３１に記載の使用。
【請求項３４】
治療的に有効な量の請求項１〜１８に記載の分子又は請求項１９〜２２に記載の医薬組成物又は請求項２３に記載の製品を哺乳類に投与することを含む、疾患及び／又は障害を治療する及び／又は予防するための微生物を減少させる及び／又は消去する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は少なくともアミノ酸配列ＫＸＫＸ1Ｘ2ＸＫＧＸを含む分子又はそのアナログに関し、ここでＸはいずれかのアミノ酸残基であり、Ｘ1及びＸ2はＫ又はＲであり、及びここで前記分子は約１０〜約１００アミノ酸残基の長さを有する。本発明はまた前記分子を含む組成物及び細菌、ウイルス、酵母を含む真菌、及び寄生虫の如き微生物と闘うための本発明に係る分子及び／又は組成物の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
いくつかの感染はヒトの如き哺乳類の免疫系によりうまく闘われる。しかしながら、いくつかの場合、細菌、真菌又はウイルスは必ずしも除去されるとは限らず、そのことは局在的又は一般的急性感染を引き起こしうる。これは周産期の、火傷の又は集中治療部で、及び免疫無防備状態の個体において重要な関心事である。他の場合、上皮表面での連続した細菌残存は慢性疾患を引き起こし又はさらに悪化させうる。ヒトにおいて、これは慢性皮膚潰瘍、アトピー性皮膚炎及び他の型の湿疹、ざ瘡又は尿生殖器感染により例示される。例えば、グラム陽性細菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓでのコロニー形成又は感染はアトピー性皮膚炎において誘発させる又は悪化させる因子であるというかなりの証拠がいまや存在する。全てのアトピー性皮膚炎患者の約９０％がＳ．  ａｕｒｅｕｓによりコロニー形成され又は感染され、一方で健康な個人の５％のみがその細菌を有する。上記細菌により生成される超抗原はケラチン生成細胞及びＴ−リンパ球を刺激し、及び炎症プロセスを誘発する。炎症は損なわれた皮膚バリア機能を引き起こす。
【０００３】
症状的感染はさまざまな医薬によって処置されうる。いくつかの疾患はまた例えば、ワクチンによって闘われうる。しかしながら、ワクチンは必ずしも最も良い処置選択ではなく、及びいくつかの微生物についてはワクチンが入手可能でない。保護が使用可能でないとき、疾患の処置が遂行される。しばしば、上記処置は微生物を殺す抗生剤の使用により行われる。しかしながら、近年、いくつかの微生物は抗生剤に対して抵抗性になっている。おそらく、抵抗性問題は近い将来において増大するであろう。さらに、何人かの個人は抗生剤に対するアレルギーを発展しており、それによりいくつかの抗生剤を効果的に使用する可能性を減少させる。
【０００４】
さまざまな生物の上皮表面は絶えず細菌に暴露される。最近、抗菌ペプチドに基づいた生来の免疫系は感染しやすい生物学的限界での細菌の初期除去において重要な役割を果たすとされている（Ｌｅｈｒｅｒ，  Ｒ．  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｇａｎｚ，  Ｔ．（１９９９）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１：２３−２７，  Ｂｏｍａｎ，  Ｈ．  Ｇ．（２０００）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  １７３，  ５−１６）。分子は細菌の膜に浸透することにより細菌を殺し、及びしたがって、特定の分子微生物標的がないことは抵抗性発展を最小限にする。
【０００５】
本明細書中に記述されるペプチドに関連しないいくつかの分子及びタンパク質は本分野において知られる。
米国特許第６，５０３，８８１号は分子として使用されるインドリシヂンアナログである陽イオン性ペプチドを開示する。動物及び植物を含む異なる種に由来する陽イオン性ペプチド。
米国特許第５，９１２，２３０号は抗真菌の及び抗菌のヒスタチンに基づくペプチドを開示する。天然ヒトヒスタチンのアミノ酸配列の定義される部分に基づくペプチド及び真菌及び細菌感染の治療方法。
米国特許第５，７１７，０６４号はメチル化リジンリッチ分解ペプチドを開示する。トリプシン消化抵抗性及び非天然である分解ペプチド。上記分解ペプチドはｉｎ  ｖｉｖｏ投与に好適である。
【０００６】
米国特許第５，６４６，０１４号は分子を開示する。上記ペプチドは蚕血リンパからの抗菌フラクションから単離された。上記ペプチドはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓの如きいくつかの細菌株に対する優れた抗菌活性を示す。
ＷＯ２００４０１６６５３はアズロシヂンの２０〜４４配列に基づくペプチドを開示する。このペプチドはヂスルフィド架橋によりつなげられるループ構造を含む。
米国特許第６４９５５１６号及び関連特許は殺菌５５ｋＤａタンパク質殺菌／浸透性増大タンパク質（ＢＰＩ）に基づいたペプチドを開示する。上記ペプチドは抗菌効果を発揮した、及びＬＰＳ−中和能を有した。
ＷＯ  ０１／８１５７８は、多くの疾患に使用されうるＧ−連結型タンパク質受容体関連ポリペプチドをコードする多くの配列を開示する。
現在、セクロピン、デフェンシン、マガイニン及びカテリシヂンを含む、７００を超える異なる分子配列が知られる（ｗｗｗ．ｂｂｃｍ．ｕｎｉｖ．ｔｒｉｅｓｔｅ．ｉｔ／〜ｔｏｓｓｉ／ｓｅａｒｃｈ．ｈｔｍ）。
【０００７】
今日比較的多数の入手可能な分子があるが、微生物、抗生剤及び／又は他の抗菌剤に対して抵抗性又は耐性である微生物と闘うために使用されうる新規改善分子の増大される要求がまだある。より重要には、ヒトの如き哺乳類に導入されるとき非アレルギー性である新規分子について要求がある。細菌は顕著な抵抗性の誘発なしに進化の間に内因的に生成された分子と対抗してきた。
【発明の開示】
【０００８】
発明の要約
第一の態様にしたがって、本発明は少なくともアミノ酸配列ＫＸＫＸ1Ｘ2ＸＫＧＸを含む分子又はそのアナログに関し、ここでＸはいずれかのアミノ酸残基であり、Ｘ1及びＸ2はＫ又はＲであり、及びここで前記分子は約１０〜約１００アミノ酸残基の長さを有する。
第二の態様にしたがって、本発明は上記に定義される少なくとも１の分子を含む組成物に関する。
第三の態様にしたがって、本発明は前記分子及び／又は前記組成物を含む製品に関する。
第四の態様にしたがって、本発明は医薬における使用のための前記分子の使用に関する。
【０００９】
第五の態様にしたがって、本発明は微生物感染を治療する又は予防するための微生物の減少及び／又は消去のための抗菌組成物の製造のための前記分子又は配列ＩＤ番号：１９に少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド又は前記組成物の使用に関する。
最後に、本発明は、本発明に係る分子（単数）又は分子（複数）を含む治療的に有効な量の医薬組成物を哺乳類に投与することを含む、上記に定義される分子（単数又は複数）又は上記に定義される組成物又は製品の使用により微生物感染を含む疾患及び／又は障害を治療する及び／又は予防するために微生物を減少させる及び／又は消去する方法に関する。
【００１０】
上記分子を提供することにより、分子に対するアレルギー反応についての危険性は、上記分子が内因性タンパク質及び／又はペプチドのポリペプチド配列に由来するという事実のために減少されうる。短いペプチドを使用することにより、より長いペプチド及びタンパク質に比較して、上記ペプチドの安定性は増大され及び生産コストは減少され、それにより本発明は経済的に有利でありうる。さらに、短いペプチドは、より長いポリペプチドとは対照的に、固体相合成の如き本分野において知られる合成方法を用いて容易に調製されうる。容易に変性されるより長いポリペプチドとは対照的に、短いペプチドはより安定である。この事実のために、医薬組成物を製造するための上記短いペプチドの使用は保存される活性の点で前記医薬組成物において使用される他の成分の制限を軽減する。
【００１１】
本発明に係るペプチドは微生物の有効な予防、減少又は消去を促進する組成物を提供する。それにより、現在の抗生剤に対して抵抗性又は耐性である微生物と闘う可能性は増大されうる。さらに、商業的に入手可能な抗菌剤に対してアレルギーである哺乳類は処置されうる、及び上記分子は処置される哺乳類にとって毒性でない。内因性タンパク質に由来する医薬組成物を提供することにより、哺乳類がこれらの特定のペプチドに対してアレルギーを発展するであろう可能性は減少されうる又は消去されうることさえある。このため、上記医薬組成物は、上記医薬組成物が医薬として又は感染を予防するための添加剤として哺乳類と接触されるいくつかの適用のために有用である。
【００１２】
さらに、短いペプチドの使用はバイオアベイラビリティを改善しうる。さらに、グラム陰性及びグラム陽性細菌又は真菌に対して特異的な又は好ましい活性を有する構造的に明らかなペプチドの使用はさまざまな微生物の特異的標的化を可能にし、したがって抵抗性及び生態学的問題の発展を最小限にする。既に哺乳類内に存在するペプチドに類似の補充ペプチドを使用することにより、新規抗生物質による追加の生態学的圧力の危険性はさらに減少される。最後に、これらの分子、ペプチド及び組成物はまた内因性分子の効果をも高めうる。したがって、本発明は改善された特性を有する及びいくつかの問題を解決する新規分子に関する。
【００１３】
さらに、本発明に係る分子は哺乳類内の生理学的環境中で安定である、すなわち、活性であり及び分解しない又はいずれかのプロテアーゼによって分解されないであろう。微生物により引き起こされる感染中、異なるプロテアーゼの如き哺乳類及び微生物におけるいくつかの系は活性化され、１の例は好中球エラスターゼである。さらに、本発明に係る分子は、上記分子がヒトの環境をまねる生理学的塩中に又はヒト血漿の存在下で溶解されるとき、Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの如きグラム陰性細菌の如き異なる微生物に対して活性であるはずである。さらに、問題の分子は、本発明をヘリックス抗菌ペプチドから分ける、低いヘリックス含有量により特徴付けられる。さらに、問題の分子は内因性起源のものであり、アレルギーの発展を最小限にする。
【００１４】
本発明に係る分子は非限定的に、ヒトの如き哺乳類を襲う又は哺乳類に感染するものを含む、全ての種類の適用において微生物を予防する、減少させる又は消去するための選択において助けとなる抗菌剤のリストを増加させる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
定義
本出願及び発明の文脈において、以下の定義が適用する：
用語「ヌクレオチド配列」は２以上のヌクレオチドの配列を意味すると意図される。上記ヌクレオチドはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成又は合成起源又はそれらの混合物のものでありうる。上記用語はＤＮＡ又はＲＮＡの一重鎖及び二重鎖形を含む。
用語「抗菌組成物」は、抗生物質及び他の剤の如き１以上の追加の抗菌剤を含む組成物はもちろん、哺乳類を攻撃する微生物と闘うために有用な医薬組成物の如き、本発明にしたがう発明された分子を含むどんな組成物をも意味すると意図される。
【００１６】
用語「置換される」はアミノ酸残基が他のアミノ酸残基により置き換えられることを意味すると意図される。例えば、Ｓ１５Ｖは配列ＩＤ番号：１中の位置番号１５のセリンアミノ酸残基がバリンにより置換された、すなわち、置き換えられたことを意味する。
用語「そのアナログ」はペプチド配列を含む分子の部分又は全部がアミノイソブチル酸（Ａｉｂ）、ノルバリンガンマ−アミノブチル酸（Ａｂｕ）又はオルニチンの如き、非タンパク質アミノ酸残基に基づくことを意味すると意図される。他の非タンパク質アミノ酸残基の例はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｏｒｔ．ｐｕｒｄｕｅ．ｅｄｕ／ｒｈｏｄｃｖ／ｈｏｒｔ６４０ｃ／ｐｏｌｙａｍ／ｐｏ００００８．ｈｔｍ．で見られうる。
用語「除去される」は少なくとも１のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基により置換されることなく、ポリペプチドから除去された、すなわち、放出されたことを意味すると意図される。
【００１７】
用語「配列同一性」は等しい長さの２のアミノ酸配列の間の又は２の核酸配列の間のホモロジーの程度の定量的計測を示す。比較される２の配列が等しい長さでない場合、それらは、ギャップの挿入又はあるいは、ポリペプチド配列又はヌクレオチド配列の末端での切り取りを許容して、最もよい可能なフィットを与えるよう整列されなければならない。上記配列同一性は
【数１】
2009526045.tif 000002
として計算されることができ、ここでＮdifは整列されるときの２の配列中の非同一残基の総数であり、及びここでＮrefは上記配列の１中の残基の数である。したがって、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣは配列ＡＡＴＣＡＡＴＣと７５％の配列同一性を有するであろう（Ｎdif＝２及びＮref＝８）。ギャップは特定の残基（単数又は複数）の非同一性としてカウントされる、すなわち、ＤＮＡ配列ＡＧＴＧＴＣはＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣと７５％の配列同一性を有するであろう（Ｎdif＝２及びＮref＝８）。アミノ酸配列に関する本発明の全ての態様について、１以上の配列の間の配列同一性の割合はまたデフォルト設定でｃｌｕｓｔａｌＷソフトウェアを用いた整列に基づきうる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌＷ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。
【００１８】
用語「分子」は微生物を予防する、阻害する、減少させる又は破壊するペプチドを意味すると意図される。置換、エステル化の如き化学改変の如き改変を伴う又は伴わないペプチド。抗菌活性は実施例５中の方法の如きどんな方法によっても決定されうる。
用語「両親媒性」は、α−ヘリックス構造、β−鎖、直線、環状又は他の二次コンフォメーションの反対面に沿った及びペプチド一次構造の反対の端に沿った親水性及び疎水性アミノ酸残基の分布を意味すると意図され、それは上記分子の１の面又は端が主に荷電し及び親水性であり、及びもう一方の面又は端が主に疎水性であることをもたらす。ペプチドの両親媒性の程度は、例えば、さまざまなウェブに基づいたアルゴリズム、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ又はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｂｉｏ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ＢｉｏＥｄｉｔ／ｂｉｏｅｄｉｔ．ｈｔｍｌ上に見られるものによりアミノ酸残基の配列をプロットすることにより評価されうる。疎水性残基の分布はヘリックスホイールダイアグラムにより視覚化されうる。ＧＯＲＩＶ及びＡＧＡＤＩＲの如き二次構造予想アルゴリズムはｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｏｍ．で見られうる。
【００１９】
用語「陽イオン性」は約４〜約１０の範囲内の如き、約２〜約１２のｐＨ範囲内で正味正の電荷を有する分子を意味すると意図される。
用語「微生物」はどんな生きている微生物をも意味すると意図される。微生物の例は細菌、真菌、ウイルス、寄生虫及び酵母である。
用語「抗菌剤」は微生物の命を妨げる、阻害する又は破壊するどんな剤をも意味すると意図される。抗菌剤の例はＴｈｅ  Ｓａｎｆｏｒｄ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ（３２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｉｎｃ，  ＵＳ）中に見られうる。
【００２０】
本文脈中で、アミノ酸名称及び原子名称はＩＵＰＡＣ命名法（ＩＵＰＡＣ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｙｍｂｏｌｉｓｍ  ｆｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ｒｅｓｉｄｕｅ  ｎａｍｅｓ，  ａｔｏｍ  ｎａｍｅｓ  ｅｔｃ．），  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８，９−３７（１９８４）及びＥｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １５２，１（１９８５）中のそれらの訂正を伴う）に基づくＰｒｏｔｅｉｎ  ＤａｔａＢａｎｋ（ＰＤＢ）（ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ）により定義されるように使用される。用語「アミノ酸」はアラニン（Ａｌａ又はＡ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチヂン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）及びチロシン（Ｔｙｒ又はＹ）又はそれらの誘導体から成る群からのアミノ酸を示すと意図される。
【００２１】
説明
分子
本発明は、配列ＩＤ番号：２０中に示されるアミノ酸配列を含む分子の如き、少なくともアミノ酸配列
ＫＸＫＸ1Ｘ2ＸＫＧＸ
を含む新規に発明された分子又はそのアナログに関し、
ここで
Ｘはいずれかのアミノ酸残基であり
Ｘ1及びＸ2はＫ又はＲであり
及びここで前記分子は約１０〜約１００アミノ酸残基の長さを有する又はここで前記分子は少なくともアミノ酸残基Ｌ９Ｗが置換されている点で配列ＩＤ番号：２０中に示されるアミノ酸配列とは異なる。用語「アナログ」は上記に定義される。上記新規に発明された分子は細菌、ウイルス、酵母を含む真菌、及び寄生虫の如き微生物と闘うために使用されることができ、及び上記に定義される問題を解決する。上記に定義されるような、上記分子の長さにわたり分布されるいくつかの正に荷電した残基を有するアミノ酸配列は前記分子の抗菌活性に寄与するであろう。上記分子は１０〜約３５アミノ酸残基の如き、約１０〜約５０アミノ酸残基の長さを有しうる。例は１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５アミノ酸残基の長さである。１５アミノ酸残基を含む本発明にしたがう分子の例（ＫＲＫ１５）は表３Ａ（配列ＩＤ番号：２１）中に見られる。
【００２２】
本発明はまた少なくともアミノ酸配列
ＫＸＫＸ1Ｘ2ＸＫＧＸ3Ｘ4Ｘ5ＸＸ6ＣＸ7Ｘ8
を含む分子にも関し
ここで
Ｘはいずれかのアミノ酸残基であり
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ4及びＸ5はＫ又はＲであり
Ｘ3はいずれかのアミノ酸残基及び２〜１２アミノ酸残基であり
Ｘ6はＰ又はＬであり
Ｘ7はいずれかのアミノ酸残基である３のアミノ酸残基であり
Ｘ8はＦ又はＹであり
及びここで前記分子は約２０〜約１００アミノ酸残基の長さを有する。このモチーフは抗菌活性を有するＨＢ−ＥＧＦ及びアムフィレグリン及びそれらの変形に由来する分子を特異的に含む。
したがって、本発明はまた少なくともアミノ酸配列
ＫＸＫＸ1Ｘ2ＸＫＧＸ7Ｘ4Ｘ5ＸＸ6ＣＸ7Ｘ8
を含む分子にも関し
ここで
Ｘはいずれかのアミノ酸残基であり
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ4及びＸ5はＫ又はＲであり
Ｘ6はＰ又はＬであり
Ｘ7はいずれかのアミノ酸残基である３のアミノ酸残基であり
Ｘ8はＦ又はＹであり
及びここで前記分子は約２０〜約１００アミノ酸残基の長さを有する。
【００２３】
したがって、本発明は配列ＩＤ番号：１２中に示されるアミノ酸配列を含む分子に関する又はここで前記分子はＬ９Ｗ、Ｒ１３Ｋ、Ｄ１４Ｗ、Ｄ１４Ｌ及びＹ２０Ｆから成る群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基が置換されている点で配列ＩＤ番号：１２中に示されるアミノ酸配列とは異なる。例は少なくともアミノ酸残基Ｒ１３Ｋ及びＹ２０Ｆが置換されている点で配列ＩＤ番号：１２中に示されるアミノ酸配列とは異なる分子（配列ＩＤ番号：１３）、少なくともアミノ酸残基Ｄ１４Ｌが置換されている点で配列ＩＤ番号：１２中に示されるアミノ酸配列とは異なる分子（配列ＩＤ番号：１４）、少なくともアミノ酸残基Ｌ９Ｗが置換されている点で配列ＩＤ番号：１２中に示されるアミノ酸配列とは異なる分子（配列ＩＤ番号：１５）、少なくともアミノ酸残基Ｌ９Ｗ及びＤ１４Ｌが置換されている点で配列ＩＤ番号：１２中に示されるアミノ酸配列とは異なる分子（配列ＩＤ番号：１６）又は少なくともアミノ酸残基Ｌ９Ｗ及びＤ１４Ｗが置換されている点で配列ＩＤ番号：１２中に示されるアミノ酸配列とは異なる分子（配列ＩＤ番号：１７）、少なくともアミノ酸残基Ｄ１４Ｗが置換されている点で配列ＩＤ番号：１２中に示されるアミノ酸配列とは異なる分子（配列ＩＤ番号：１８）である。第二の局面にしたがう分子は、約２０〜約３５アミノ酸残基の長さの如き、約２０〜約５０アミノ酸残基の長さを有しうる。例は２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５アミノ酸残基の長さである。２５、３０、３５、４０及び５０アミノ酸残基を含む本発明にしたがう分子の例は表３Ａ中に見られる（配列ＩＤ番号：２２−２７）。
【００２４】
したがって、本発明は、微生物の減少及び／又は消去又は微生物感染の予防処置のための抗菌組成物の製造のための、配列ＩＤ番号：１２を含むペプチド又はそのアナログの使用の如き、微生物感染を治療する又は予防するための微生物の減少及び／又は消去のための抗菌組成物の製造のための、配列ＩＤ番号：１２−１８又は２０から成る群から選ばれるペプチド又はそのアナログの使用に関する。
【００２５】
さらに、上記ペプチドは２〜２１アミノ酸残基の如き、１以上のアミノ酸残基において置換されうる。例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９アミノ酸残基は除去され及び／又は置換されうる。
上記ペプチドは合成又は半合成であることはもちろん、内因性ヒトペプチドに由来しうる。
【００２６】
発明されたペプチドの安定性はもちろん、抗菌活性が残る限り、１以上のアミノ酸残基は除去され及び／又は置換されうる。
上記分子は１〜１００アミノ酸残基、５〜５０アミノ酸残基又は６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０アミノ酸残基の如き、１以上のアミノ酸残基により延長されうる。上記追加のアミノ酸は非抗菌タンパク質に由来する分子の配列に隣接する配列を二重にしうる。追加される数はペプチドの安定性、毒性、処置される哺乳類又は上記ペプチドが含まれるべき製品及び上記分子が基づくペプチド構造を含む、闘われる微生物に因る。上記ペプチドに追加されるアミノ酸残基の数はまた生産の選択、例えば、発現ベクター及び発現ホスト及び医薬組成物の製造の選択にも因る。延長は、それが上記ペプチドの抗菌効果を破壊しない限り、上記分子のＮ−若しくはＣ−末端部分で又は両方の部分でありうる。上記分子はまた上記分子が他のペプチドに融合される融合タンパク質でもありうる。
【００２７】
さらに、上記分子は他のペプチド、脂質、タンパク質、オリゴ糖、多糖、他の有機化合物又は無機物質の如き、他の既知の分子又は他の物質に使用可能につなげられうる。例えば、上記分子は、上記分子が微生物の命を阻害する、妨げる又は破壊する前に上記分子が哺乳類内で分解されることから保護する物質にカップリングされうる。
したがって、上記分子はアミド化又はエステル化によりＣ−末端部分で及びアシル化、アセチル化、ＰＥＧ付加、アルキル化等によりＮ−末端部分で改変されうる。
上記分子はヒト細胞、ｃ−ＤＮＡ、ゲノムクローンからの如き天然の源から得られ、化学合成され又は細胞源からの発現生成物として組換えＤＮＡ技術により得られうる。
上記分子は自動化手順による合成を含む、標準の化学方法により合成されうる。一般的に、ペプチドアナログはカップリング剤としてのＨＡＴＵ（Ｎ−［ヂメチルアミノ−１Ｈ−１．２．３．−トリアゾロ［４，５−Ｂ］ピリヂン−１−イルメチル］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロフォスフェートＮ−オキシド）又はＨＯＡｔ−１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールの如き他のカップリング剤を伴って標準の固体相Ｆｍｏｃ保護法に基づいて合成される。上記ペプチドは、側鎖官能基を脱保護する適切なスカヴェンジャーを含むトリフルオロ酢酸で固体相樹脂から切断される。粗ペプチドは調製済み逆相クロマトグラフィーを用いてさらに精製される。分割クロマトグラフィー、ゲルろ過、ゲル電気泳動又はイオン交換クロマトグラフィーの如き他の精製方法が使用されうる。ｔＢｏｃ保護法の如き本分野において知られる他の合成技術又は異なるカップリング試薬の使用等は同等のペプチドを生成するために使用されうる。
【００２８】
ペプチドはあるいは組換え生産により合成されうる（例えば、米国特許第５，５９３，８６６号を参照のこと）。Ｅ．  ｃｏｌｉの如き細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はｐｉｃｈｉａの如き酵母、Ｓｆ９の如き昆虫、及びＣＨＯ又はＣＯＳ−７の如き哺乳類細胞を含む、さまざまなホスト系はペプチドアナログの生産のために好適である。上記ホストのそれぞれに使用されるために入手可能な多くの発現ベクターがあり、及び本発明は、上記ベクター及びホストが上記分子を生産することができる限りそれらのいずれかに限定されない。ベクター及びＥ．  ｃｏｌｉにおけるクローニング及び発現のための手順は例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８７）及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  １９９５）中に見られうる。
【００２９】
最後に、上記ペプチドは血漿、血液、さまざまな組織等から精製されうる。上記ペプチドは内因性であり又は精製されたタンパク質の酵素的又は化学的消化後に生成されうる。例えば、タンパク質はトリプシンにより消化され、及び生ずる抗菌ペプチドはさらにより大きなスケールで単離されうる。
上記分子をコードするＤＮＡ配列はホストに適切な好適な発現ベクターに導入される。好ましい態様において、上記遺伝子は融合タンパク質を作出するためにベクターにクローニングされる。上記ペプチド配列の単離を促進するために、化学的切断（例えば、ＣＮＢｒ）又は酵素的切断（例えば、Ｖ８プロテアーゼ、トリプシン）にかかりやすいアミノ酸が上記ペプチド及び融合パートナーを架橋するために使用される。Ｅ．  ｃｏｌｉにおける発現のために、上記融合パートナーは好ましくは発現を封入体形成に向かわせる通常の細胞内タンパク質である。上記の場合、最終生成物を放出するための切断後、上記ペプチドの巻き戻りのための必要性がない。本発明において、融合パートナー及びペプチド遺伝子を含むＤＮＡカセットは発現ベクターに挿入されうる。好ましくは、上記発現ベクターはホスト内で挿入されたＤＮＡ配列の効率的な転写を促進するための誘導可能又は構成的プロモーターを含むプラスミドである。
【００３０】
上記発現ベクターはカルシウム仲介技術、エレクトロポーレーション又は当業者に周知の他の方法によるように、慣用の形質転換技術によりホストに導入されうる。
上記分子をコードする配列は哺乳類細胞、存在するｃＤＮＡ又はゲノムクローンの如き天然源に由来し又は合成されうる。使用されうる１の方法は、抗菌ＤＮＡテンプレートの５’及び３’末端に由来し、及び典型的に上記ベクターのクローニング部位について選択される制限酵素部位を組み込む増幅プライマーを用いるＰＣＲの助けによる上記分子の増幅である。必要な場合、翻訳開始及び停止コドンは上記プライマー配列中に作出されうる。上記分子をコードする配列は、上記コドンの選択が処置される最終的な哺乳類を考慮して作出される限り、特定のホスト内での発現を促進するためにコドン最適化されうる。したがって、例えば、上記分子が細菌内で発現される場合、上記コドンは細菌について最適化される。
【００３１】
上記発現ベクターは導入された分子の発現を促進するためのプロモーター配列を含みうる。必要な場合、１以上のエンハンサー、リボソーム結合部位、転写停止シグナル配列、分泌シグナル配列、複製起源、選択可能マーカー等の如き、調節配列もまた含まれうる。上記調節配列は転写及び続く翻訳を許容するよう互いに使用可能につなげられる。上記分子が細菌内で発現される場合、上記調節配列は細菌内で使用されるよう設計されるものであり、及びそのようなものは当業者に周知である。構成的及び誘発可能プロモーターの如き好適なプロモーターは広く入手可能であり、及びＴ５、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６ファージからのプロモーター、及びｔｒｐ、ｌｐｐ、及びｌａｃオペロンを含む。
【００３２】
上記分子を含むベクターが細菌内で発現される場合、起源の例は高いコピー数を生ずるもの又は低いコピーを生ずるもののいずれか、例えば、ｆ１−ｏｒｉ及びｃｏｌ  Ｅ１  ｏｒｉである。
好ましくは、上記プラスミドは、形質転換された細胞が同定される及び／又は選択的に生育されることを許容する、ホスト内で機能的である少なくとも１の選択可能マーカーを含む。細菌ホストに好適な選択可能マーカー遺伝子はアンピシリン抵抗性遺伝子、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子、テトラサイクリン抵抗性遺伝子、カナマイシン抵抗性遺伝子及び本分野において知られる他のものを含む。
【００３３】
細菌内での発現のためのプラスミドの例はｐＥＴ発現ベクターｐＥＴ３ａ、ｐＥＴ１１ａ、ｐＥＴ１２ａ−ｃ、及びｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．から入手可能）を含む。低コピー数ベクター（例えば、ｐＰＤ１００）はＥ．  ｃｏｌｉホストに有害なペプチドの効率的な過剰生産のために使用されうる（Ｄｅｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  １２３：１９，１９９４）。
【００３４】
好適なホストの例は細菌、酵母、昆虫及び哺乳類細胞である。しかしながら、しばしばＥ．  ｃｏｌｉの如きいずれかの細菌が使用される。
発現される分子はアフィニティ、サイズ除外又はイオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等の如き慣用の単離技術により単離される。異なる精製技術はＡ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ｅｄｓ．  Ｗｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｉｎｇ，  Ｅｄｗａｒｄ  Ａｒｎｏｌｄ，  Ｌｏｎｄｏｎ）中に又はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ）中に見られうる。
【００３５】
したがって、上記分子はさまざまなグラム陰性細菌からのリポ多糖に結合し及びそれらを不活性化することができ、したがって、リポ多糖誘発炎症の阻害剤としてはたらく。上記分子はまた真核細胞の成長をも調節しうる。
さらに、本発明は前記分子を含む組成物又は上記に示される分子及び医薬として許容される緩衝液、希釈剤、担体、補助剤又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。他の分子の如き追加の化合物は上記組成物中に含まれうる。他の分子の例はＷＯ  ２００５／０６１５３５及びＷＯ  ２００５／００１７３７中に開示される。他の例はＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ又はグルタチオンの如きキレート化剤を含む。上記医薬組成物は十分に貯蔵安定で及びヒト及び動物への投与のために好適である本分野において知られる様式で調製されうる。上記医薬組成物は例えば、凍結乾燥、スプレイ乾燥又はスプレイ冷却をとおして凍結乾燥されうる。
【００３６】
「医薬として許容される」は上記活性成分、すなわち、上記分子（単数又は複数）の生物学的活性の有効性を減少させない非毒性物質を意味する。そのような医薬として許容される緩衝液、担体又は賦形剤は本分野において周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）及びｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａ．  Ｋｉｂｂｅ，  Ｅｄ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）を参照のこと）。
【００３７】
用語「緩衝液」はｐＨを安定化する目的で酸−塩基混合物を含む水溶液を意味すると意図される。緩衝液の例はＴｒｉｚｍａ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓ、ＨＥＰＢＳ、ＭＥＳ、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ホウ酸塩、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、酒石酸塩、ＡＭＰ、ＡＭＰＤ、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＣＡＢＳ、カコヂル酸塩、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、エタノールアミン、グリシン、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、イミダゾール乳酸、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＳＳＰＥ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＢＳ、ＴＡＰＳＯ及びＴＥＳである。
【００３８】
用語「希釈剤」は上記医薬調製物中に上記ペプチドを希釈する目的を有する水性又は非水性溶液を意味すると意図される。希釈剤は１以上の塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール又は（ベニバナ油、トウモロコシ油、ピーナッツ油、綿実油又はセサミ油の如き）油でありうる。
用語「補助剤」は上記ペプチドの生物学的効果を増大させるために調合物に添加されるどんな化合物をも意味すると意図される。補助剤は異なる陰イオン、例えば、非限定的に、異なるアシル組成物のフッ化物、塩化物、臭化物、ヨー化物、チオシアネート、亜硫酸塩、水酸化物、リン酸塩、炭酸塩、乳酸塩、グリコール酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、及び酢酸塩を伴う１以上の亜鉛、銅又は銀塩でありうる。
【００３９】
上記賦形剤は１以上の炭水化物、重合体、脂質及び鉱物でありうる。炭水化物の例は、例えば、凍結乾燥を促進するために上記組成物に添加されるラクトース、スクロース、マンニトール、及びサイクロデキストリンを含む。重合体の例は、例えば、粘性制御のために、生物接着を達成するために又は化学及びタンパク質分解から脂質を保護するために、上記組成物に添加される、全ての異なる分子量の、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸塩、カラゲーニン、ヒアルロン酸及びその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルフォネート、ポリエチレングリコール／酸化ポリエチレン、酸化ポリエチレン／酸化ポリプロピレン共重合体、異なる程度の加水分解のポリビニルアルコール／ポリビニル酢酸塩、及びポリビニルピローリドンである。脂質の例は、重合体についてのものと同様の理由のために上記組成物に添加される、異なるアシル鎖長及び飽和の全ての、脂肪酸、リン脂質、モノ−、ヂ−、及びトリグリセリド、セラミド、スフィンゴリピド及び糖脂質、卵レシチン、大豆レシチン、水素化卵及び大豆レシチンである。鉱物の例は液体蓄積の減少又は有利な色素特性の如き利点を得るために上記組成物に添加される、タルク、酸化マグネシウム、酸化亜鉛及び酸化チタンである。
【００４０】
発明された調合物はまたキシリトール、ソルビトール、マンニトール、ラクチチオール、イソマルト、マルチトール又はキシロシド、及び／又はモノラウリンの如きモノアシルグリセロールの如き１以上の単糖又は二糖をも含みうる。上記担体の特徴は投与経路に因る。１の投与経路は局所投与である。例えば、局所投与のために、好ましい担体は上記活性ペプチドを含む乳化クリームであるが、重合体ゲル、液体結晶相及びマイクロエマルジョンはもちろん、あるワセリン／鉱物に基づいた及び植物に基づいた軟膏の如き他の通常の担体は使用されうる。
【００４１】
上記組成物は上記医薬組成物中に１、２、３又は４の異なる分子の如き、１以上の分子を含みうる。１の例において、本発明はＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａの如き、グラム陽性及びグラム陰性細菌の両方の細菌、ウイルス、寄生虫、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ及びＣａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉ並びにＭａｌａｓｓｅｚｉａ種の如き真菌及び酵母を阻害する、予防する又は破壊するために使用されうる抗菌組成物に関する。異なる分子の組み合わせを用いることにより、効果は増大されうる及び／又は上記微生物が上記抗菌剤に対して抵抗性及び／又は耐性でありうる可能性。しかしながら、ほとんどの場合、１の分子／ペプチドは調節プロセスのためにより好適である。
【００４２】
塩としての上記分子／ペプチドは塩酸、硫酸、硝酸、臭化水素酸、リン酸、過塩素酸、チオシアン酸、ホウ酸等の如き、無機酸を伴う又は蟻酸、酢酸、ハロ酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、クエン酸、酒石酸、琥珀酸、グルコン酸、乳酸、マロン酸、フマル酸、アントラニル酸、安息香酸、桂皮酸、ｐ−トルエンスルフォン酸、ナフタレンスルフォン酸、スルファニル酸等の如き有機酸を伴う酸付加物でありうる。全て対応する陰イオンを伴う、一価のナトリウム、カリウム又は二価の亜鉛、マグネシウム、銅カルシウムの如き無機塩は上記抗菌組成物の生物学的活性を改善するために添加されうる。
【００４３】
本発明に係る医薬組成物はまたミセル、不溶性単層及び脂質結晶として凝集された形態で存在する脂質の如き両親媒性の剤を伴う、他の医薬として許容される担体に加えて、上記ペプチドが混合されるリポソームの形態でも存在しうる。リポソーム調合物のために好適な脂質は、非限定的に、モノグリセリド、ヂグリセリド、スルファチド、リソレシチン、フォスフォリピド、サポニン、胆汁酸等を含む。上記リポソーム調合物の調製は例えば、米国特許第４，２３５，８７１号中に見られうる。
【００４４】
本発明に係る医薬組成物はまた生分解性微小球の形態でも存在しうる。ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ＰＬＡ及びＰＧＡの共重合体（ＰＬＧＡ）又はポリ（カルプロラクトン）（ＰＣＬ）の如き脂肪族ポリエステル、及びポリ無水物は微小球の生産において生分解性重合体として広く使用されている。上記微小球の調製は米国特許第５，８５１，４５１号中に及びＥＰ０２１３３０３中に見られうる。
【００４５】
本発明に係る医薬組成物はまたデンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸塩、カラゲーニン、ヒアルロン酸及びその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルフォン酸塩、ポリエチレングリコール／酸化ポリエチレン、酸化ポリエチレン／酸化ポリプロピレン共重合体、異なる程度の加水分解のポリビニルアルコール／ポリビニル酢酸塩、及びポリビニルピローリドンの如き重合体が上記ペプチドを含む溶液の濃化のために使用される、重合体ゲルの形態でも存在しうる。
本発明に係る医薬組成物はテルペン、セキテルペン及びファルネソールの如き１以上の精油を含みうる。
【００４６】
あるいは、上記分子は塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール又は（ベニバナ油、トウモロコシ油、ピーナッツ油、綿実油又はゴマ油の如き）油、トラガカントゴム、及び／又はさまざまな緩衝液中に溶解されうる。上記医薬組成物はまた分子の活性の強化のためにイオン及び定義されたｐＨをも含みうる。
上記医薬組成物は滅菌の如き慣用の医薬操作にかけられうる、及び／又は例えば、本明細書中のどこかに開示されるような、保存剤、安定化剤、浸潤剤、乳化剤、緩衝液、充填剤等の如き慣用の補助剤を含みうる。
【００４７】
本発明にしたがう医薬組成物は局所的に又は体系的に投与されうる。投与経路は局所、眼、鼻、肺、頬、非経口（静脈内、皮下、及び筋内等）、耳、口、膣、点滴（例えば、泌尿器腔等）及び直腸を含む。インプラントからの投与もまた可能である。好適な抗菌調製形態は例えば、顆粒、粉末、錠剤、コーティングされた錠剤、（微小）カプセル、坐剤、シロップ、ヴァジトリー、エマルジョン、長い範囲の秩序により特徴付けられるが短い範囲の無秩序によっては特徴付けられない系として定義される、水、油及び界面活性剤、液体結晶相から成る光学的に等方性の熱力学的に安定な系として定義されるマイクロエマルジョン（例は水−又は油連続的な、層状の、六方晶系の及び立方晶系の相を含む）又はそれらの分散された対照物、ゲル、軟膏、分散物、懸濁物、クリーム、スプレイ、うがい薬、エーロゾル、アンプル形態中の小滴又は注入可能溶液及びまたその調製物中で賦形剤、希釈剤、補助剤又は担体は上記に示されるように慣例上使用される、活性化合物の延長された放出を伴う調製物である。上記医薬組成物はまた包帯、硬膏において又は縫合等においても提供されうる。
【００４８】
上記医薬組成物は医薬として有効な用量で患者に投与されるであろう。「医薬として有効な用量」によりそれが投与される状態に関連して所望の効果を作出するのに十分な用量が意味される。正確な用量は上記化合物の活性、投与の様式、障害の性質及び重篤さ、患者の年齢及び体重に因り、異なる用量が必要とされうる。上記用量の投与は個々の用量単位又は他のいくつかのより小さい用量単位の形態で単一の投与により及びまた特定の間隔で分けられた用量の複数の投与により実行されうる。
【００４９】
本発明に係る医薬組成物は単独で又は抗生物質、抗炎症又は抗細菌剤の如き防腐剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、及び抗寄生虫剤の如き他の治療用剤と共に投与されうる。例はペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、セファミシン、カルバペネム、モノバクタム、アミノグリコシド、グリコペプチド、キノロン、テトラサイクリン、マクロリド、及びフルオロキノロンである。防腐剤はヨーヂン、銀、スペルミン、スペルミヂン、銅、クロルヘキシヂン、ポリヘキサニド及び他のビグアニド、キトサン、酢酸、及び過酸化水素を含む。これらの剤は同じ医薬組成物の部分として組み込まれうる又は別々に投与されうる。上記医薬組成物はまたステロイド及びマクロラクタム誘導体の如き抗炎症薬をも含みうる。
【００５０】
本発明はヒト及び数ある中でウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ラクダの如き他の哺乳類の両方に関する。したがって、上記方法はヒト治療及び獣医学的適用の両方に適用可能である。そのような処置のために好適な対象は熱、脈、生物の培養等の如き感染の十分に確立された証明により同定されうる。上記分子で処置されうる感染は微生物により又は微生物のために引き起こされるものを含む。微生物の例は細菌（例えば、グラム陽性、グラム陰性）、真菌（例えば、酵母及びカビ）、寄生虫（例えば、原生動物、線虫、条虫及び吸虫）、ウイルス、及びプリオンを含む。これらのクラスの特定の生物は周知である（例えば、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ３．ｓｕｐ．ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｈａｒｐｅｒ  ＆  Ｒｏｗ，  １９８０を参照のこと）。感染は、非限定的に、慢性皮膚潰瘍、感染された急性の傷及び火傷の傷、感染された皮膚湿疹、とびひ、アトピー性皮膚炎、ざ瘡、外耳炎、膣感染、脂漏性皮膚炎、経口感染及び歯周炎、カンジダ間擦疹、結膜炎及び他の眼の感染、及び肺炎を含む。
【００５１】
したがって、上記医薬組成物は火傷の傷、手術後及び皮膚外傷後の予防処置のために使用されうる。上記医薬組成物はまたコンタクトレンズ、整形外科用インプラント、及びカテーテルの如き、ヒトの体と接触する外部材料の貯蔵及び処置のために意図される溶液中に含まれうる。
さらに、上記医薬組成物はアトピー性皮膚炎、とびひ、慢性皮膚潰瘍、感染された急性の傷及び火傷の傷、ざ瘡、外耳炎、真菌感染、肺炎、脂漏性皮膚炎、カンジダ間擦疹、カンジダ膣炎、中口腔咽頭カンジダ症、眼の感染（細菌性結膜炎）、及び（ＭＲＳＡ輸送を含む）鼻の感染の処置のために使用されうる。
上記医薬組成物はまたレンズ消毒薬の如き清浄溶液及び貯蔵溶液において使用され又は泌尿器系カテーテル使用又は中枢静脈カテーテルの使用に関連して細菌感染を予防するために使用されうる。
【００５２】
さらに、上記抗菌組成物は硬膏、ばんそうこう、縫合において手術後感染の予防のために使用され又は傷ドレッシング中に組み込まれうる。
上記分子はまた抗菌表面又は化粧品を作出するために重合体、織物等において使用されることができ、及び個人的ケア製品（石鹸、シャンプー、歯磨き粉、ウェットティッシュ、抗ざ瘡、日焼け止めクリーム、タンポン、ダイヤパー等）は上記医薬組成物で補充されうる。
本発明はまた医薬における上記に定義される分子（単数又は複数）及び医薬組成物の使用にも関する。
【００５３】
本発明はまた細菌感染を治療する又は予防するための微生物の減少及び／又は消去のための抗菌組成物の製造のための、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％配列同一性の如き、配列ＩＤ番号：１９に少なくとも８０％の配列同一性を有する上記に定義される分子又はポリペプチド又は上記に定義される組成物の使用にも関する。
【００５４】
上記分子、組成物及び／又はポリペプチドはまた異なる細菌、異なるウイルス等の混合物又はウイルス、細菌、真菌、酵母及び原生動物等の混合物の如き、１以上の異なる微生物の混合物により引き起こされる障害又は疾患を予防する／軽減する又は治療するためにも使用されうる。
最後に、本発明は治療的に有効な量の上記に定義される医薬組成物を患者に投与することを含む、上記に定義される医薬組成物を用いる、微生物感染を有する又はアレルギーを患う哺乳類の如き哺乳類の治療方法に関する。
【実施例】
【００５５】
実施例
配列の定義
示される抗菌ペプチドのアナログを見つけるために、配列パターンを特定の領域について定義した。Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔタンパク質データベース中のヒトタンパク質（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｐｒｏｔ／）をＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅサーチツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｓｃａｎｐｒｏｓｉｔｅ／）を用いて検索した。
【００５６】
ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅツールはＰＲＯＳＩＴＥデータベース中に貯蔵されるパターン、プロファイル及び規則性（モチーフ）の存在について（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ）又はＰＤＢからの又はユーザーにより提供される）タンパク質配列（単数又は複数）をスキャンすること又は特定のモチーフ（単数又は複数）によるヒットについてタンパク質データベース（単数又は複数）を検索することを許容する。
【００５７】
保存領域についてのパターンを以下のシンタックスにしたがって構築した：
ＰＲＯＳＩＴＥデータベースにおいて使用されるパターンシンタックス：
１．アミノ酸についての標準のＩＵＰＡＣ一文字コドンが使用される。
２．シンボル「ｘ」はどんなアミノ酸でも許容される位置について使用される。
３．あいまいさは角括弧「［］」の間に、ある位置について許容可能なアミノ酸を列挙することにより示される。例えば：［ＡＬＴ］はＡｌａ又はＬｅｕ又はＴｈｒを示す。
４．あいまいさはまた、ある位置で許容されないアミノ酸を一対の曲り括弧「｛｝」の間に列挙することにより示される。例えば：｛ＡＭ｝はＡｌａ及びＭｅｔ以外のアミノ酸を示す。
５．パターンにおけるそれぞれのエレメントは「−」によりその近隣から分離される。
６．パターンのエレメントの繰返しは数値でそのエレメントに続けることにより又はそれがギャップ（「ｘ」）である場合、括弧内の数字範囲により示されうる。
【００５８】
例：
ｘ（３）はｘ−ｘ−ｘに対応する。
ｘ（２，４）はｘ−ｘ又はｘ−ｘ−ｘ又はｘ−ｘ−ｘ−ｘに対応する。
Ａ（３）はＡ−Ａ−Ａに対応する。
注意：範囲は「ｘ」でのみ使用しうる、すなわち、Ａ（２，４）は確実なパターンエレメントではない。
７．パターンがＮ−又はＣ−末端のいずれかの配列に限定されるとき、そのパターンは「＜」のシンボルで開始する又は「＞」のシンボルでそれぞれ終了する。いくつかの珍しい場合には（例えば、ＰＳ００２６７又はＰＳ００５３９）、「＞」はまたＣ−末端エレメントについての角括弧内にも起こりうる。「Ｆ−［ＧＳＴＶ］−Ｐ−Ｒ−Ｌ−［Ｇ＞］」は「Ｆ−［ＧＳＴＶ］−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｇ」又は「Ｆ−［ＧＳＴＶ］−Ｐ−Ｒ−Ｌ＞」のいずれかが考えられることを意味する。
【００５９】
実施例１
ヒトヘパリン結合成長因子（ＦＧＦｓ）に由来する分子のペプチド構造の同定
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦｓ）はへパリンプロテオグリカンの存在下で細胞表面ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲｓ）に結合することによりさまざまな細胞機能を刺激する。受容体活性化は遺伝子活性化及び多様な生物学的応答を引き起こすシグナル伝達カスケードを生ずる。ＦＧＦｓ及びＦＧＦＲｓの両方は定義された空間及び時間パターンで発現され、及びそれらは上皮及び神経細胞の両方の分化に関連する。ＦＧＦｓは多くの細胞型にとって強い有糸分裂促進物質である。ＦＧＦｓは線維芽細胞に対するそれらの有糸分裂促進性に基づいてもともと同定された分泌因子である。それらはいくつかのＦＧＦ結晶構造が決定されている小タンパク質である；全てはβ−三つ葉フォールド中に１２β鎖を有する（Ｓｚｅｂｅｎｙｉ  Ｇ．  ａｎｄ  Ｆａｌｌｏｎ  Ｊ  Ｆ．，  Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｃｙｔｏｌ．，  １９９９，１８５，４５−１０６）。
へパリンに結合するへパリン−結合成長因子１（ＦＧＦ１、アクセッションコードＰ０５２３０）の領域に由来するペプチドは抗菌性である。Ｌｅｕ１２６−Ｌｅｕ１４６に対応するペプチド、ＬＫＫ２１はｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗菌活性を示す。
【００６０】
以下のＰＲＯＳＩＴＥモチーフはＬＫＫ２１分子に対応するベータ−三つ葉スーパーファミリー一族に属する１９のヒトヘパリン結合成長因子を発見する（図１、表１）。
【化１】
2009526045.tif 000003
（最後のフェニルアラニンは試験されたペプチド中に含まれないが、それは全てのＦＧＦｓの間で保存されており、及び上記群を定義するために必要とされる）
表１．上記に定義されるＰＲＯＳＩＴＥパターンで検索するときＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔデータベース中で発見されるヒト配列
【化２】
2009526045.tif 000004
【００６１】
実施例２
ヒトヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）及びアムフィレグリンに由来する分子のペプチド構造の同定
ヒトヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ、アクセッションコードＱ９９０７５）はマクロファージ仲介細胞増殖に関連しうる。それは線維芽細胞及び平滑筋にとって有糸分裂促進性であるが、内皮細胞にとってはそうではない。それはＥＧＦそれ自体より高いアフィニティでＥＧＦ受容体に結合することができ、及びＥＧＦより平滑筋細胞にとってはるかにより強い有糸分裂促進物質である（Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５１，  ９３６−９３９）。それはまたヂフテリア毒素受容体としてもはたらく。ＨＢ−ＥＧＦのＧｌｙ９２−Ｌｙｓ１１３に対応するペプチド、ＧＫＲ２２はｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗菌活性を示す。
ヒトアムフィレグリン又は結腸直腸細胞由来成長因子（ＡＲ、アクセッションコードＰ１５５１４）は二機能性成長調節糖タンパク質である。それは培養中のいくつかのヒト癌細胞の成長を阻害し、及びヒト線維芽細胞及びいくつかの他の腫瘍細胞の増殖を刺激する（Ｓｈｏｙａｂ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４３，  １０７４−１０７６）。アムフィレグリンのＰｒｏ１２４−Ａｓｎ１４４に対応するペプチド、ＰＫＲ２１はｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗菌活性を示す。
【００６２】
以下のＰＲＯＳＩＴＥモチーフはＧＫＲ２２分子に対応する２の成長因子タンパク質における領域を発見する（表２）。
【化３】
2009526045.tif 000005
表２．上記に定義されるＰＲＯＳＩＴＥパターンで検索するときＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔデータベース中に発見されるヒト配列。アムフィレグリン由来分子ＰＫＲ２１は示される領域内に含まれるが、より短い。
【００６３】
【化４】
2009526045.tif 000006
ＨＢ−ＥＧＦ及びアムフィレグリンは非常に似たアミノ酸配列を有し、及び両方のタンパク質は１のＥＧＦ様ドメインを含む。抗菌ペプチド、ＧＫＲ２２及びＰＫＲ２１は両方ともこのＥＧＦ様ドメインのアミノ末端に対応する領域に由来する（図２）。
【００６４】
実施例３
ヒト血小板由来成長因子に由来する分子のペプチド構造の同定
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は平滑筋細胞及びグリア細胞を含む、間充織起源の細胞にとって強い有糸分裂促進物質である。マウス及びヒトの両方において、ＰＤＧＦ伝達ネットワークは４のリガンド、ＰＤＧＦ  Ａ−Ｄ、及び２の受容体、ＰＤＧＦＲアルファ及びＰＤＧＦＲベータから成る。全てのＰＤＧＦは分泌されたヂスルフィド結合ホモダイマーとして機能するが、ＰＤＧＦ  Ａ及びＢのみは機能的なヘテロダイマーを形成しうる。ＰＤＧＦＲもまたホモ−及びヘテロダイマーとして機能する。全ての既知のＰＤＧＦは分子間及び分子内結合に関連する８の保存されたシステインを含む特徴的な「ＰＤＧＦドメイン」を有する。Ａ鎖転写産物の代替のスプライシングはそれらのＣ−末端においてのみ異なる２の異なる形態を生じうる。それらはＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ成長因子ファミリーに属する（Ｈａｎｎｉｎｋ  Ｍ  ａｎｄ  Ｄｏｎｏｇｈｕｅ  ＤＪ．，  １９８９，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，  ９８９，  １−１０）。
異なるＰＤＧＦにおけるカルボキシル末端残基に対応するペプチドはｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗菌活性を示す。ペプチドＧＲＰ１９はヒトＰＤＧＦ  Ａ（アクセッションコードＰ０４０８５）のＧｌｙ１９４−Ｔｈｒ２１１に対応し、及びペプチドＬＲＰ２４はヒトＰＤＧＦ  Ｂ（アクセッションコードＰ０１１２７）のＬｅｕ１４８−Ｔｈｒ１７１に対応し、ペプチドＱＲＡ２１はＧｌｎ１９９−Ｐｒｏ２１９に対応し、及びペプチドＲＶＲ２１はＡｒｇ２１４−Ａｌａ２３４に対応する（図３）。
【００６５】
実施例４
分子
上記ペプチドをＩｎｎｏｖａｇｅｎ  ＡＢ，  Ｉｄｅｏｎ，  ＳＥ−２２３７０，Ｌｕｎｄ，  Ｓｗｅｄｅｎにより合成した。これらのペプチドの純度（＞９５％）及び分子量をマススペクトル分析により確認した（ＭＡＬＤＩ．ＴＯＦ  Ｖｏｙａｇｅｒ）（表１を参照のこと）。
表３
研究において使用される分子
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔエントリー中のプロセスされていない前駆体にしたがう名称及び番号（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｐｒｏｔ／）。
【表１】
2009526045.tif 000007
【００６６】
分子ＬＬ−３７は実施例３−６における比較として含まれた。ＬＬ−３７はさまざまなグラム陽性及びグラム陰性細菌、真菌、及びウイルス病原体に対して広いスペクトルの抗菌活性を有する（Ｎｉｙｏｎｓａｂａ，  Ｆ．  ａｎｄ  Ｏｇａｗａ，  Ｈ．，  ２００５，  Ｊ．  Ｄｅｒｍ．  Ｓｃｉ．，  ４０，  １５７−１６８）。それはカテリシヂンファミリーに属する１８ｋＤａのヒト陽イオン性抗菌タンパク質（ｈＣＡＰ１８）に由来する。成熟抗菌ペプチドＬＬ−３７はエラスターゼ及びプロテイナーゼ３による切断をとおして遊離される（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  Ｏ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｂｌｏｏｄ  ９７，  ３９５１−３９５９）。
【００６７】
ＧＫＲ２２（配列ＩＤ番号：１）をさらなる研究のために選択した。ＧＫＲ２２の配列に基づいて、７の新規ペプチド（配列ＩＤ番号：１２−１８）を上記に示されるように合成した。Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ評価は、配列ＩＤ番号：１２の１０のはじめのアミノ酸（配列ＩＤ番号：２０）及び関連ペプチド（配列ＩＤ番号：１３−１８）は活性に重要であることを示すように見える。これらのペプチドは表３Ａ中に示される。
表３Ａ．ＧＫＲ２２に由来するペプチド
【表２】
2009526045.tif 000008
【００６８】
微生物
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ２７８５３、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２９２１３、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ６６３３細菌単離物、及び真菌単離物Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＡＴＣＣ９００２８はＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｕｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから得られた。
【００６９】
実施例５
ラジアル拡散分析
ラジアル拡散分析（ＲＤＡ）を本質的に以前に示されるように（Ｌｅｈｒｅｒ，  Ｒ．  Ｉ．，  Ｒｏｓｅｎｍａｎ，  Ｍ．，  Ｈａｒｗｉｇ，  Ｓ．  Ｓ．，  Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｒ．  ＆  Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ，  Ｐ．（１９９１）  Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １３７，  １６７−７３）行った。結果は図４ａ−ｅ及び表６中に示される。
簡単に述べると、細菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ、Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ、Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又は真菌（Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓ）を１０ｍｌの完全な強度（３％ｗ／ｖ）のトリプチカーゼソイブロス（ＴＳＢ）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）中で中間−対数相まで生育させた。上記微生物を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，  ｐＨ７．４で一回洗浄した。４×１０6細菌ｃｆｕ又は１×１０5真菌ｃｆｕを０．０３％（ｗ／ｖ）ＴＳＢ、１％（ｗ／ｖ）ｌｏｗ−ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｄｏｏｓｍｏｓｉｓｔｙｐｅ（Ｌｏｗ−ＥＥＯ）アガロース（Ｓｉｇｍａ，  ＳｔＬｏｕｉｓｅ  ＭＯ）及び０．０２％（ｖ／ｖ）の最終濃度のＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）から成る、５ｍｌの下敷きアガロースゲルに添加した。上記下敷きを直径８５ｍｍのペトリ皿に注いだ。アガロースが凝固した後、４ｍｍ−直径ウェルに穴を開け、及び６μｌの試験サンプルをそれぞれのウェルに添加した。プレートを３７℃で３時間インキュベートし、上記ペプチドの拡散を許容した。上記下敷きゲルをその後５ｍｌの融解した上張り（ｄＨ2Ｏ中の６％ＴＳＢ及び１％Ｌｏｗ−ＥＥＯアガロース）で覆った。ペプチドの抗菌活性は細菌については３７℃での及びＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓについては２８℃での１８〜２４時間のインキュベーション後それぞれのウェルの周りの透明な領域として視覚化される。
【００７０】
実施例６
溶血分析
ＥＤＴＡ−血液を８００ｇで１０分間遠心分離し、その後血漿及び軟膜を除去した。赤血球を３回洗浄し、及び５％ＰＢＳ、ｐＨ７．４中に再懸濁した。上記細胞をその後ペプチド（３〜６０μＭ）の存在下でエンド−オーバー−エンド回転で３７℃で１時間インキュベートした。２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を陽性コントロールとした。上記サンプルをその後８００ｇで１０分間遠心分離した。ヘモグロビン放出の吸収をλ５４０ｎｍで計測し、及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００誘発溶血の％として表されるプロットにする（図５及び表６）。
【００７１】
実施例７
リポソーム調製及び漏れ分析
乾燥脂質フィルムをクロロフォルム中にヂオールオイルフォスファチヂルコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，  Ａｌａｂａｓｔｅｒ，  ＡＬ）（６０ｍｏｌ％）及びコレステロール（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓｅ，  ＭＯ）（４０ｍｏｌ％）又はヂオールオイルフォスファチヂルコリン（３０ｍｏｌ％）、ヂオールオイルフォスファチヂン酸（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，  Ａｌａｂａｓｔｅｒ，  ＡＬ）（３０ｍｏｌ％）及びコレステロール（４０ｍｏｌ％）のいずれかを溶解し、及びその後上記溶媒を真空下で一晩蒸発させることにより除去することにより調製した。続いて、追加の１５０ｍＭ  ＮａＣｌを伴う又は伴わない１０ｍＭ  Ｔｒｉｓを含む緩衝溶液、ｐＨ７．４を０．１Ｍカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）と共に添加した。水和後、上記脂質混合物を液体窒素中での凍結及び６０℃までの加熱から成る８の凍結−融解周期にかけた。（ｃｒｙｏ−ＴＥＭで見つけられるように；結果は示されていない）約１３０ｎｍの直径を有する単層リポソームをＬｉｐｏＦａｓｔミニエクストルーダー（Ａｖｅｓｔｉｎ，  Ｏｔｔａｗａ，  Ｃａｎａｄａ）中にのせられたポリカーボネートフィルター（ポアサイズ１００ｎｍ）をとおる複数回の押し出しにより作出した。捕えられなかったカルボキシフルオレセインをその後関連するＴｒｉｓ緩衝液を溶離液として２の連続したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０カラムをとおるろ過により除去した。押し出し及びろ過両方ともに２２℃で行った。リポソーム漏れ分析において、ＣＦの周知の自己消滅を使用した。したがって、１００ｍＭでＣＦは自己消滅し、及び捕えられたＣＦを含むリポソームからの記録された蛍光強度は低い。リポソームからの漏れに際して、放出されたＣＦは消滅されない、及びそれゆえ蛍光を発する。ＣＦ放出をリポソーム分散物（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４中の１０ｍＭ脂質）から５２０ｎｍで放出される蛍光をモニターすることにより決定した。絶対漏れスケールを０．８ｍＭ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）の添加をとおして実験の終わりにリポソームを破壊し、それにより１００％放出及びＣＦの脱消滅を引き起こすことにより得る。ＳＰＥＸ−ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ  １６５０  ０．２２ｍダブルスペクトロメーター（ＳＰＥＸ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｅｄｉｓｏｎ，  ＮＪ）をリポソーム漏れ分析のために使用した（表４を参照のこと）。
表４
【表３】
2009526045.tif 000009
【００７２】
実施例８
ＣＤ−スペクトロスコピー
溶液中の上記ペプチドのＣＤスペクトルをＪａｓｃｏ  Ｊ−８１０  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ（Ｊａｓｃｏ，  Ｕ．Ｋ．）上で計測した。計測を３７℃で１０ｍｍ石英キュベット中で撹拌下で行い、及びペプチド濃度は１０μＭであった。１００μＭの脂質濃度でのリポソームのペプチド二次構造に対する効果を２００−２５０ｎｍの範囲内でモニターした。調査された状態下で観察された唯一のペプチドコンフォメーションはα−ヘリックス及びランダムコイルであった。α−ヘリックスコンフォメーション中のペプチドの断片、Ｘαは
【数２】
2009526045.tif 000010
【００７３】
から計算され、ここでＡは２２５ｎｍで記録されたＣＤシグナルであり、及びＡα及びＡCはそれぞれ、１００％α−ヘリックス及び１００％ランダムコイルコンフォメーション中のリファレンスペプチドについての２２５ｎｍでのＣＤシグナルである。１００％α−ヘリックス及び１００％ランダムコイルリファレンスをそれぞれ、０．１Ｍ  ＮａＯＨ及び０．１Ｍ  ＨＣｌ中の０．１３３ｍＭ（単量体濃度）ポリ−Ｌ−リジンから得た。計測間の器械的差を説明するために（ペプチドシグナルが存在しない２５０ｎｍで検出される）バックグラウンド値を引いた。大量の溶液からのシグナルもまた訂正した（表５を参照のこと）。
表５．成長因子に由来するペプチドの、緩衝液中及びリポソーム分散物中のヘリックス含有量（％、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中）。分子ＬＬ−３７は比較のために含まれる。
【表４】
2009526045.tif 000011
【００７４】
実施例８
表３Ａ中のペプチド（配列ＩＤ番号：１２−１８）を上記に示されるように評価した。データは表６中に示される。
表６
【表５】
2009526045.tif 000012
【００７５】
実施例９
ＨＢ−ＥＧＦ（Ｑ９９０７５、配列ＩＤ番号：１９）の抗菌効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。２×１０6ｃｆｕ／ｍｌのＥ．  ｃｏｌｉ細菌を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４緩衝液（Ｔｒｉｓ）中にＨＢ−ＥＧＦを６μＭで含む５０μｌ中でインキュベートした。細菌生存における差はＨＢ−ＥＧＦ処理材料対コントロール（ＨＢ−ＥＧＦが存在しない）について顕著であった、すなわち、ＨＢ−ＥＧＦは、それに由来するペプチドほど表明されないが、それ自体に抗菌効果を有する。
【００７６】
実施例１０
表６中に示されるペプチドを２の異なるクリームに有効な量で添加した。
クリーム１；１ｇクリームは以下のものを含む：グリセロール２００ｍｇ、水素化菜種油、コレステロール、モノステアリン酸グリセロール、ステアリン酸マクロゴル、セトステアリールアルコール、ヂメチコン、液体パラフィン、固体パラフィン、ワセリン、プロピル−及びメチルパラヒドロキシ安息香酸塩及び精製水。
クリーム２；１ｇクリームは以下のものを含む：プロピレングリコール２００ｍｇ、乳酸４５ｍｇ、セトステアリールアルコール、マクロゴル２５セトステアリールエーテル、液体パラフィン、白色ワセリン、水なしクエン酸、水なしクエン酸ナトリウム、保存剤（メチルパラヒドロキシ安息香酸塩Ｅ２１８）及び精製水。
上記クリームをアトピー性皮膚炎に類似の状態を患う哺乳類に適用し、及び効果を有することを発見した。
【００７７】
実施例１１
表６中に示されるペプチドを水中に溶解し、及び硬膏上に噴霧した。上記硬膏を風乾させた。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１−１】ヒトＦＧＦメンバーの複数の配列整列。ＬＫＫ２１に対応する領域は囲み中に示される。
【図１−２】ヒトＦＧＦメンバーの複数の配列整列。ＬＫＫ２１に対応する領域は囲み中に示される。
【図１−３】ヒトＦＧＦメンバーの複数の配列整列。ＬＫＫ２１に対応する領域は囲み中に示される。
【図２】ヒトＨＢ−ＥＧＦ及びアムフィレグリンの対様式の配列整列。ペプチド、ＧＫＲ２２及びＰＫＲ２１は太字で示される。
【図３−１】ヒトＰＤＧＦ及びＶＥＧＦメンバーの複数の配列整列。ＧＲＰ１９、ＬＲＰ２４、ＱＲＡ２１及びＲＶＲ２１に対応する領域は囲み中に示される。
【図３−２】ヒトＰＤＧＦ及びＶＥＧＦメンバーの複数の配列整列。ＧＲＰ１９、ＬＲＰ２４、ＱＲＡ２１及びＲＶＲ２１に対応する領域は囲み中に示される。
【図４ａ】成長因子のペプチドの抗菌活性。上記ペプチドの阻害効果はＲＤＡ中の細菌クリアランスの区域として視覚化され、及び（ｍｍで）ｙ−軸上に示される。
【図４ｂ】成長因子のペプチドの抗菌活性。上記ペプチドの阻害効果はＲＤＡ中の細菌クリアランスの区域として視覚化され、及び（ｍｍで）ｙ−軸上に示される。
【図４ｃ】成長因子のペプチドの抗菌活性。上記ペプチドの阻害効果はＲＤＡ中の細菌クリアランスの区域として視覚化され、及び（ｍｍで）ｙ−軸上に示される。
【図４ｄ】成長因子のペプチドの抗菌活性。上記ペプチドの阻害効果はＲＤＡ中の細菌クリアランスの区域として視覚化され、及び（ｍｍで）ｙ−軸上に示される。
【図４ｅ】成長因子のペプチドの抗菌活性。上記ペプチドの阻害効果はＲＤＡ中の細菌クリアランスの区域として視覚化され、及び（ｍｍで）ｙ−軸上に示される。
【図５】成長因子由来ペプチドの溶血効果の分析。比較のために、またヒト分子ＬＬ−３７も含まれた。
【図１−１】
2009526045.tif 000013
【図１−２】
2009526045.tif 000014
【図１−３】
2009526045.tif 000015
【図２】
2009526045.tif 000016
【図３−１】
2009526045.tif 000017
【図３−２】
2009526045.tif 000018
【図４ａ】
2009526045.tif 000019
【図４ｂ】
2009526045.tif 000020
【図４ｃ】
2009526045.tif 000021
【図４ｄ】
2009526045.tif 000022
【図４ｅ】
2009526045.tif 000023
【図５】
2009526045.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月10日(2007.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも配列ＩＤ番号：２０中に示されるアミノ酸配列を含む分子であって、ここで配列ＩＤ番号：２０中に示される前記アミノ酸配列は少なくともアミノ酸残基Ｌ９Ｗが置換されている点で異なり、及び前記分子は１０〜５０アミノ酸残基の長さを有する、分子。
【請求項２】
前記分子は少なくとも配列ＩＤ番号：１２中に示されるアミノ酸配列（ＫＲＫ２０）を含む、請求項１に記載の分子であって、ここで配列ＩＤ番号：１２中に示される前記アミノ酸配列はＬ９Ｗ、Ｒ１３Ｋ、Ｄ１４Ｗ、Ｄ１４Ｌ及びＹ２０Ｆから成る群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基が置換されている点で異なり、及び前記分子は２０〜５０アミノ酸残基の長さを有する、分子。
【請求項３】
前記分子は少なくともアミノ酸残基Ｒ１３Ｋ及びＹ２０Ｆが置換されている（配列ＩＤ番号：１３）点で異なる、請求項２に記載の分子。
【請求項４】
前記分子は少なくともアミノ酸残基Ｄ１４Ｌが置換されている（配列ＩＤ番号：１４）点で配列ＩＤ番号：１２とは異なる、請求項２に記載の分子。
【請求項５】
前記分子は少なくともアミノ酸残基Ｌ９Ｗが置換されている（配列ＩＤ番号：１５）点で配列ＩＤ番号：１２とは異なる、請求項２に記載の分子。
【請求項６】
前記分子は少なくともアミノ酸残基Ｌ９Ｗ及びＤ１４Ｌが置換されている（配列ＩＤ番号：１６）点で配列ＩＤ番号：１２とは異なる、請求項２に記載の分子。
【請求項７】
前記分子は少なくともアミノ酸残基Ｌ９Ｗ及びＤ１４Ｗが置換されている（配列ＩＤ番号：１７）点で配列ＩＤ番号：１２とは異なる、請求項２に記載の分子。
【請求項８】
前記分子は少なくともアミノ酸残基Ｄ１４Ｗが置換されている（配列ＩＤ番号：１８）点で配列ＩＤ番号：１２とは異なる、請求項２に記載の分子。
【請求項９】
前記分子は１０〜３５アミノ酸残基の長さを有する、請求項１に記載の分子。
【請求項１０】
前記分子は１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５アミノ酸残基の長さを有する、請求項１に記載の分子。
【請求項１１】
前記分子は２０〜３５アミノ酸残基の長さを有する、請求項２〜８に記載の分子。
【請求項１２】
前記分子は２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５アミノ酸残基の長さを有する、請求項２〜８に記載の分子。
【請求項１３】
前記分子は１、２、３、４、５又は６アミノ酸残基の置換により改変される、前記請求項のいずれかに記載の分子。
【請求項１４】
上記分子はアミド化、エステル化、アシル化、アセチル化、ＰＥＧ付加又はアルキル化により改変される、前記請求項のいずれかに記載の分子。
【請求項１５】
前記請求項のいずれかに記載の分子及び許容される緩衝液、希釈剤、担体、補助剤又は賦形剤を含む組成物。
【請求項１６】
１以上の抗生物質及び／又は防腐剤（単数又は複数）及び／又は抗炎症剤を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１４に記載の分子又は請求項１５〜１６に記載の組成物を含む製品であって、包帯、硬膏、縫合、石鹸、タンポン、ダイヤパー、シャンプー、歯磨き粉、ウェットティッシュ、抗ざ瘡化合物、日焼け止めクリーム、織物、粘着物、クリーニング溶液又はインプラントから成る群から選ばれる、製品。
【請求項１８】
医薬における使用のための請求項１〜１４に記載の分子。
【請求項１９】
微生物感染を治療する又は予防するための微生物の減少及び／又は消去のための抗菌組成物の製造のための請求項１〜１４のいずれかに記載の分子又は請求項１５〜１６に記載の組成物の使用。
【請求項２０】
前記微生物感染は細菌及び／又は真菌感染である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記抗菌組成物は局所組成物である、請求項１９〜２０のいずれかに記載の使用。
【請求項２２】
治療されるべき前記微生物感染はアトピー性皮膚炎、とびひ、慢性皮膚潰瘍、感染された急性の傷及び火傷の傷、ざ瘡、外耳炎、真菌感染、肺炎、脂漏性皮膚炎、カンジダ間擦疹、カンジダ膣炎、中口腔咽頭カンジダ症、眼の感染、鼻の感染、手術後又は皮膚外傷後から成る群から選ばれる、請求項１９〜２１に記載の使用。
【請求項２３】
治療的に有効な量の請求項１〜１４のいずれかに記載の分子又は請求項１５〜１６のいずれかに記載の組成物を哺乳類に投与することを含む、疾患及び／又は障害を治療する及び／又は予防するための微生物を減少させる及び／又は消去する方法。
【国際調査報告】
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