(57)【要約】  本発明は、マウリチアナ亜科に属するマリナー可動遺伝因子の活性かつ安定なトランスポゼースの原核生物宿主細胞による製造方法に関する。この発明は、そのような方法を用いて製造することができる活性かつ安定なトランスポゼース、および、活性かつ安定なトランスポゼースの製造を可能とするかあるいは使用する原核生物宿主細胞、発現ベクターまたはキット等の分子生物学手段にも関する。さらに、本発明は、活性かつ安定なトランスポゼースの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウリチアナ(Mauritiana)亜科に属するマリナー可動性遺伝因子の活性かつ安定なトランスポゼースの原核生物宿主細胞による生産方法であって、
少なくとも下記の
ａ）該活性トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターにクローニングする工程、
ｂ）ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ｐＫａ）の活性触媒サブユニットをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターにクローニングする工程、
ｃ）該宿主細胞を該発現ベクターで形質転換する工程、
ｄ）該宿主細胞により該ヌクレオチド配列を発現させる工程、および
ｅ）ｐＫａのリン酸化により活性かつ安定化されたトランスポゼースを得る工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記活性トランスポゼースが機能亢進突然変異型トランスポゼースである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ｅ）で得られる活性かつ安定なトランスポゼースの精製工程も含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）およびｂ）のクローニングが単一の発現ベクターで行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
活性トランスポゼースをコードする前記ヌクレオチド配列とｐＫａをコードする前記ヌクレオチド配列の発現が同じ調節因子の制御下にある、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記原核生物宿主細胞が細菌細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌が大腸菌(Escherichia coli)である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記マリナー可動性遺伝因子がＭｏｓ１である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法により得ることができる、マウリチアナ亜科に属するマリナー可動性遺伝因子の活性かつ安定なトランスポゼース。
【請求項１０】
少なくとも
ａ）マウリチアナ亜科に属するマリナー可動性遺伝因子の活性トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ｐＫａ）の活性触媒サブユニットをコードするヌクレオチド配列
を含む、原核生物宿主細胞。
【請求項１１】
前記活性トランスポゼースが機能亢進突然変異型トランスポゼースである、請求項１０に記載の原核生物宿主細胞。
【請求項１２】
前記ヌクレオチド配列ａ）とｂ）が複数の発現ベクターにクローニングされている、請求項１０または１１に記載の原核生物宿主細胞。
【請求項１３】
前記ヌクレオチド配列ａ）とｂ）が一つの発現ベクターにクローニングされている、請求項１０または１１に記載の原核生物宿主細胞。
【請求項１４】
細菌細胞である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の原核生物宿主細胞。
【請求項１５】
前記細菌が大腸菌(Escherichia coli)である、請求項１４に記載の原核生物宿主細胞。
【請求項１６】
前記マリナー可動性遺伝因子がＭｏｓ１である、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の原核生物宿主細胞。
【請求項１７】
少なくとも
ａ）マウリチアナ亜科に属するマリナー可動性遺伝因子の活性トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ｐＫａ）の活性触媒サブユニットをコードするヌクレオチド配列
を含む、発現ベクター。
【請求項１８】
前記活性トランスポゼースが機能亢進突然変異型トランスポゼースである、請求項１７に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
前記マリナー可動性遺伝因子がＭｏｓ‐１である、請求項１７または１８に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
請求項９に記載の少なくとも１つの活性かつ安定なトランスポゼースを含む、挿入突然変異誘発および／またはシーケンシングおよび／またはクローニングキット。
【請求項２１】
標的ＤＮＡ配列において対象とする転移可能なＤＮＡ配列のin vitro転移のための、請求項９に記載の少なくとも１つの活性かつ安定なトランスポゼースの使用。
【請求項２２】
標的ＤＮＡ配列において対象とする転移可能なＤＮＡ配列のin vivo転移から生じる薬剤の製造のための、請求項９に記載の少なくとも１つの活性かつ安定なトランスポゼースの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、転移可能因子を扱う分子生物学の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、バイオテクノロジーに用いるために、マリナー可動性遺伝因子の天然トランスポゼースの特性の改良に関する。
【０００２】
本発明はまた、原核生物宿主細胞による、マウリチアナ(mauritiana)亜種に属するマリナー可動性遺伝因子の活性かつ安定なトランスポゼースの生産方法に関する。
【０００３】
本発明はさらに、このような方法によって生産し得る活性かつ安定なトランスポゼース、ならびに活性かつ安定なトランスポゼースの生産および適用に必要な原核生物宿主細胞、発現ベクターおよびキットなどの分子生物学的ツールに関する。
【０００４】
さらに本発明は、活性かつ安定なトランスポゼースの使用を包含する。
【０００５】
転移可能因子（ＴＥ）または可動性遺伝因子（ＭＧＥ）は、ある染色体部位から別の染色体部位へ転移し得る小型のＤＮＡ断片である(Renault et al., 1997)。これらのＤＮＡ断片は、５’末端と３’末端に位置する逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を特徴とする。ＴＥそれ自体にコードされている酵素トランスポゼースは前者の転移プロセスを触媒する。
【０００６】
ＴＥは原核生物と真核生物の双方で確認されている（本分野の参考書を参照：Craig et al., 2002）。
【０００７】
ＴＥはそれらの転移機構によって２つのカテゴリーに分けられる。一方で、カテゴリーＩの因子、すなわちレトロトランスポゾンは、ＲＮＡ中間体の逆転写によって転移する。他方、カテゴリーＩＩの因子は、「切り‐貼り」機構によるＤＮＡ中間体を介してある染色体部位から別の染色体部位へ直接転移する。
【０００８】
これまでに原核生物では、例えば、ＩＳ１などの挿入配列やＴｎ５などのトランスポゾンなど、多数のＴＥが確認されている。
【０００９】
真核生物では、カテゴリーＩＩの因子は、Ｐ、ＰｉｇｇｙＢａｃ、ｈＡＴ、ｈｅｌｉｔｒｏｎおよびＴｃ１−ｍａｒｉｎｅｒの５つのファミリーからなる。
【００１０】
マリナー可動性遺伝因子（またはマリナー様因子としてのＭＬＥ）は、Ｔｃ１−ｍａｒｉｎｅｒスーパーファミリーに属するカテゴリーＩＩのＴＥの大きな群を構成している(Plasterk et al., 1999)。
【００１１】
特に宿主染色体における標的核酸へ、挿入の対象とする配列を含む種々の長さの同種または異種のＤＮＡ断片を転移可能とするＴＥトランスポゼースの能力は、バイオテクノロジーの分野で、主として遺伝子工学の分野で広く使用されて来ており、また、使用され続けるであろう。
【００１２】
ＴＥの中でもＭＬＥは、バイオテクノロジー、すなわち、遺伝子工学および機能的ゲノム工学で用いるのに特に有利な特性を有する。限定されるものではないが、例えば、次のような特性が挙げられる。
【００１３】
ｉ）ＭＬＥは取扱いの容易な小型のトランスポゾンである。
【００１４】
ｉｉ）ＭＬＥ転移の機構は単純である。実際、このトランスポゼースはそれ自体、ＭＬＥ転移の総ての段階を触媒することができる。さらに、このトランスポゼースは、宿主因子の不在下で、ＭＬＥの可動性を確保するのに必要かつ十分である(Lampe et al. 1996)。
【００１５】
ｉｉｉ）ＭＬＥは原核生物および真核生物に非常に広く分布していることを特徴とする。最初のＭＬＥ、Ｄｉｍａｒ１（Ｍｏｓ１とも呼ばれる）は、Jacobson and Hartl (1985)によりモリシャス系統のショウジョウバエ(Drosophila mauritiana)で発見された。これに引き続き、特に細菌、原虫、真菌、植物、無脊椎動物、冷血脊椎動物および哺乳類でそのゲノムに多くの関連因子が確認された。
【００１６】
ｉｖ）ＭＬＥの転移活性は極めて特異的であり、メチル化による[MIP; Jeong et al. (2002); Martienssen and Colot (2001)]またはＲＮＡを介した[RNAi; Ketting et al. (1999); Tabara et al. (1999)]干渉現象など、宿主ゲノムの「耐性」機構を生じない。転移事象は温度、特定の二価陽イオンの存在およびｐＨなどの種々の要因によって制御することができる。
【００１７】
その結果、バイオテクノロジーにおける、主として、遺伝子組換え手段としてのＭＬＥの適用の可能性は大きい。典型的には、in vitro挿入突然変異誘発適用では、このトランスポゼースをコードする遺伝子を「標識」ＤＮＡに置き換える。このトランスポゼースはタンパク質形態ではトランス型として供給しなければならない。in vivoまたはin vitro遺伝子導入適用では、このトランスポゼースをコードする遺伝子を移入する外来ＤＮＡに置き換える。このトランスポゼースは発現プラスミド、メッセンジャーＲＮＡまたはタンパク質それ自体を介してトランス型として供給しなければならない。
【００１８】
従って、これらの各適用では、十分な量の活性トランスポゼースが利用可能であることが不可欠である。このトランスポゼースは実際に、転移プロセス全体に必要かつ十分である。しかしながらやはり、その転移媒介能に加え、ＭＬＥトランスポゼースは自己タンパク質分解も可能である。この不可逆的プロセスはおそらくは、細胞内に存在する活性トランスポゼースの最大量を決める役割を果たすための、トランスポゼース自体による自己調節機構によるものである。よって、Lohe et al. (1996)が記載している、トランスポゼースが細胞内で過剰発現される際に、それに従ってＭｏｓ１転移の頻度が低下するＯＰＩ現象（過剰生産阻害）は、過剰発現したトランスポゼースの自己タンパク質分解の結果である。
【００１９】
これは、ＭＬＥトランスポゼースが量と安定性に関して実施上困難な点をいくつか有している理由である。特に、in vitro転移などの適用、またはex vivo転移のためトランスポゼース自体が（すなわちタンパク質形態で）細胞に供給される場合はそうである。
【００２０】
よって、真核生物トランスポゼース（マリナーその他）を使用している世界中の工業実験室および研究実験室双方のチームが、トランスポゼースは原核生物系（一般に細菌系）で生産された場合には不安定であるという頻発する問題に直面している。精製されたトランスポゼースのバッチには一般にタンパク質のタンパク質分解断片が混入している。これらの断片はトランスポゼースごとに特異的である。このトランスポゼースの不安定性の問題は科学文献には報告されないが、工業界および研究者の双方が、必要な転移を行うのに必要な操作数、コストおよび時間を軽減するために、処分時に効率的であり、かつ安定なトランスポゼースを確保する必要があるという限りでは、天然ＭＬＥの実施上の利益に現状で著しい制限があるまでになっている。
【００２１】
これが、特に工業界で、依然として必要量のトランスポゼースを得る最も直接的で最小コストの方法である原核生物系、特に細菌での生産がなぜ大いに利用されないのかという理由である。
【００２２】
従って、原核生物系で生産されるトランスポゼースの安定性を高めることが主として重要である。
【００２３】
本発明はまさにそれ自体、この必要性に、原核生物系、より具体的には細菌で生産されるＭＬＥトランスポゼースを安定化させる手段を供給することにより取り組むものである。
【００２４】
よって、本発明の第一の態様は、マウリチアナ(mauritiana)亜科に属するマリナー可動性遺伝因子の活性かつ安定なトランスポゼースの原核生物宿主細胞による生産方法であって、
少なくとも下記の
ａ）該活性トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターにクローニングする工程、
ｂ）ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ｐＫａ）の活性触媒サブユニットをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターにクローニングする工程、
ｃ）該宿主細胞を該発現ベクターで形質転換する工程、
ｄ）該宿主細胞により該ヌクレオチド配列を発現させる工程、および
ｅ）ｐＫａのリン酸化により活性かつ安定化されたトランスポゼースを得る工程
を含む方法に関する。
【００２５】
本明細書において「原核生物宿主細胞」とは、当技術分野で受け入れられている意味に従って定義される。好ましくは、それは細菌細胞に関する。例えば、当業者ならば、有利には大腸菌(Escherichia coli)細胞を選択することができる。
【００２６】
「活性」、「機能」、「生物活性」および「生物機能」は等価であり、本発明の技術分野において受け入れられている意味に相当する。本発明の厳密な文脈では、対象とする活性はトランスポゼースの酵素活性（「トランスポゼース活性」または「トランスポゼース機能」）である。
【００２７】
本発明の範囲内で対象とするトランスポゼースは「活性なトランスポゼース」であり、言い換えれば、ＭＬＥの転移を媒介し得るトランスポゼースである。有利には、それらは、もし転移活性が指定された突然変異誘発により向上していたならば機能亢進であり得る。この場合、用いる用語は「機能亢進突然変異トランスポゼース」となる。このようなトランスポゼースはフランス特許出願第ＦＲ２８５０３９５号（２００３年１月２８日出願）に記載されている。
【００２８】
「安定なトランスポゼース」とは、その自己タンパク質分解が有意に低下されている、有利には妨げられているトランスポゼースを意味する。より一般には、これは「阻害」を意味する。好ましくは、「安定な」トランスポゼースは、各部位におけるタンパク質分解の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、いっそうより好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、最も好ましくは９５％〜９８％の間またはそれ以上（理想的には１００％）が妨げられているものである。トランスポゼースの自己タンパク質分解（本明細書では「タンパク質分解」とも呼ぶ）は活性部位、言い換えれば、タンパク質分解活性を有する配列（Ｍｏｓ１トランスポゼースでは、図２のアミノ酸１〜１１６番）と、１〜３の間の「切断部位」、言い換えれば、１〜３の間の、タンパク質分解切断の標的部位を含む。Ｍｏｓ１トランスポゼースでは、２つの主要な切断部位が確認されている。それらはアミノ酸８０／８１およびアミノ酸１０１／１０２の間に位置する。アミノ酸１６９／１７０の間にマイナーな切断部位がある（図２参照）。
【００２９】
「マウリチアナ亜科」とは、そのトランスポゼースが、それらの全長にわたって、または特異的にそのＮ末端もしくはＣ末端ドメインをコードする領域に関して、１０００種のサブサンプルのデータセットに対して、節約・近隣接合法を用いて行った系統発生学的研究の過程で上記の４配列と同じ系統に含めるために十分なレベル、言い換えれば、少なくとも７５％の相同性を示す配列によりコードされているＭＬＥを含む[Felsenstein (1993) and Auge-Gouillou et al., (2000)参照]：
・Ｍｏｓ１トランスポゼース（図２、ＥＭＢＬアクセス番号：Ｘ７８９０６）
・ヘシアンバエ(Mayetiola destructor）由来Ｍｄｍａｒ−１トランスポゼース（ＥＭＢＬアクセス番号：Ｕ２４４３６）
・セイヨウオオマルハナバチ(Bombus terrestris)由来Ｂｔｍａｒ−１トランスポゼース(Bonnin et al., 2005)、および
・メタセウイリウス・オシデンタリス(Metaseuilius occidentalis)由来Ｍｏｍａｒ−１トランスポゼース（ＥＭＢＬアクセス番号：Ｕ１２２７９）。
【００３０】
好ましくは、本明細書で考慮する可動性遺伝因子はＭｏｓ１である。
【００３１】
本発明において「ヌクレオチド配列」または「核酸」とは、生物学分野で受け入れられている意味に従う。これらの２つの用語は互換的にＤＮＡおよびＲＮＡを包含し、前者としては例えばゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、組換えＤＮＡまたは相補的（ｃＤＮＡ）があり、後者としてはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）およびトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）がある。好ましくは、本発明のヌクレオチド配列および核酸はＤＮＡである。
【００３２】
「ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ｐＫａ）の活性触媒サブユニットをコードするヌクレオチド配列」とは、Strausberg et al. (2002)が記載したものである。特に、これはアクセス番号ＡＡＨ５４８３４としてＮＢＲＦ−ＰＩＲデータベースから得ることができる。
【００３３】
本発明の方法の範囲内で実施される一連の工程は、当業者に公知の従来技術をさす（例えば、Sambrook and Russel, 2001またはAusubel et al., 1994参照）。特に、この場合、「形質転換」とは、厳密な意味の形質転換の他、当業者に十分知られている分子生物学的技術であるウイルスベクターによる遺伝子導入およびトランスフェクションも包含するという一般的な意味を有する。
【００３４】
特定の実施形態によれば、本発明の方法はまた、工程ｅ）で得られる活性かつ安定なトランスポゼースの精製工程も含む。一般に、この精製工程は、当業者に公知の一般法を用いて、必ずしも酵素それ自体ではなく、望ましい酵素活性を有するタンパク質画分の精製からなる。従って、「純粋な酵素」または「純粋なトランスポゼース」とは、精製された活性タンパク質画分または適切であれば精製された酵素を表すために互換的に使用することができる。精製工程の終了時に、他のタンパク質を含め、少量の夾雑物質の存在は、対象とするトランスポゼースの活性が完全であり、この活性だけが検出される限り必ずしも排除する必要はない。対象とする酵素活性の検出は、当業者に公知の常法を用いて行うことができる(Ausubel et al., 1994)。
【００３５】
別の実施形態によれば、工程ａ）およびｂ）のクローニングは単一の発現ベクターで行われる。これは活性トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とｐＫａをコードするヌクレオチド配列の「同時クローニング」と呼ぶことができる。この場合、この２つのヌクレオチド配列の発現は同じ調節因子の制御下にあるのが有利である。
【００３６】
本発明の第二の実施形態は、上記のものなどの方法により得られるマウリチアナ亜科に属するマリナー可動性遺伝因子の活性かつ安定なトランスポゼースに関する。
【００３７】
第三の実施形態では、本発明は、少なくとも
ａ）マウリチアナ亜科に属するマリナー可動性遺伝因子の活性トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）ｐＫａをコードするヌクレオチド配列
を含む、上記で定義されたような原核生物宿主細胞を対象とする。
【００３８】
有利には、活性トランスポゼースは、上記のような機能亢進突然変異トランスポゼースであり得る。
【００３９】
特定の実施形態では、ヌクレオチド配列ａ）とｂ）は複数の発現ベクターにクローニングされる。あるいは、これらの配列は単一の発現ベクターにクローニングされる。
【００４０】
本発明の第四の態様は、少なくとも
ａ）マウリチアナ亜科に属するマリナー可動性遺伝因子の活性トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）ｐＫａをコードするヌクレオチド配列
を含む発現ベクターに関する。
【００４１】
ここでもまた、有利には、この活性トランスポゼースは上記のような機能亢進突然変異トランスポゼースであり得る。
【００４２】
第五の実施形態では、本発明は、本発明の少なくとも１つの活性かつ安定なトランスポゼースを含むキットに関する。
【００４３】
例えば、このようなキットは、マリナーＭｏｓ１偽トランスポゾン（ＤＮＡ）、そのトランスポゼースに適合するバッファー、転移反応を停止させるための停止バッファー、１以上の対照ＤＮＡ（反応対照）、反応後のシーケンシングに用いるオリゴヌクレオチド、活性な細菌などから選択される１以上の要素をさらに含み得る。
【００４４】
本発明の他の態様は、上記のツールの使用に関する。
【００４５】
よって、本発明は、標的ＤＮＡ配列において対象とする転移可能なＤＮＡ配列のin vitro転移のための、前記に従う少なくとも１つの活性かつ安定なトランスポゼースの使用に関する。
【００４６】
本発明はまた、標的ＤＮＡ配列において対象とする転移可能なＤＮＡ配列のin vivo転移のための、上記で定義されたような少なくとも１つの活性かつ安定なトランスポゼースの使用に関する。
【００４７】
本発明はさらに、標的ＤＮＡ配列において対象とする転移可能なＤＮＡ配列のin vivo転移をもたらす薬剤の製造のための、本発明の少なくとも１つの活性かつ安定なトランスポゼースの使用に関する。
【００４８】
例えば、本発明は、標的ＤＮＡ配列において対象とする転移可能なＤＮＡ配列の、少なくとも１回の転移工程（この転移は本発明による少なくとも１つの活性かつ安定な安定なトランスポゼースにより媒介される）を含む、薬剤の製造のための方法を提案する。よって、この薬剤は、転移がin vitroで行われる場合にはex vivoで製造することができ、あるいは転移がin vivoで起こる場合にはそれをin situで行うことができる。
【００４９】
これらの適用は一般に、本発明の分野の熟練者に公知の方法であるin vitroまたはin vivo転移(Ausubel et al., 1994; Craig et al., 2002)の使用を含む。より詳しくは、in vivo転移に関して、標的ＤＮＡ配列は一般に宿主ゲノムであり、これは生物、真核生物もしくは原核生物、生物由来の組織または生物もしくは組織由来の細胞であってもよい。
【００５０】
本発明に関する別の適用は、挿入突然変異誘発および／またはシーケンシングおよび／またはクローニングのための、本発明のキットの使用に関する。これは、本発明の方法が大きな利益となることが見出される当業者に公知の従来の分子生物学的技術を含む。
【００５１】
以下の実験のセクションは実施例および図面により裏付けられ、何ら限定されることなく、本発明の実施形態および利点を示す。
【実施例】
【００５２】
Ａ−材料および方法
Ｉ．ベクター
１．１  説明
ベクターｐＭａｌＣ２ｘ−Ｔｎｐ(Auge-Gouillou et al., 2005)はｐＭａｌＣ２ｘ(New England Biolabs, Ozyme, Saint Quentin en Yvelines, France)に由来する。このベクターにより、細菌において、ＩＰＴＧによるｐＬａｃの誘導後に、Ｎ末端でＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）と融合させたトランスポゼースを発現させることができる。このプラスミドはアンピシリン耐性遺伝子を有する。
【００５３】
ベクターＰＥＴ−ｐＫａはベクターｐＥＴ２６ｂ＋(Novagen)に由来する。これにより、細菌において、プロモーターｐｏｌ７の制御下でｐＫａを発現させることができる。従って、この発現は、大腸菌ＢＬ２１またはＥＲ２５６６株など、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼを発現する細菌に限定される。ＰＥＴ−ｐＫａはカナマイシン耐性遺伝子を有する。
【００５４】
ｐＢＣ  ３Ｔｅｔ３は、偽マリナーＭｏｓ１のドナープラスミドである(Auge-Gouillou et al., 2001)。これは２つの３’ＩＴＲにより挟まれたテトラサイクリン耐性遺伝子「オフ」（言い換えれば、プロモーター無し）を含む。転移は、プロモーターの手前に偽トランスポゾンを置くプロモータータッグ付けにより、テトラサイクリンに対する耐性を活性化することで検出される。このベクターはまたクロラムフェニコール耐性遺伝子も有する。
【００５５】
Ｉ．２  構築
１．２．１  ベクターＤＮＡの作製
種々の構築物について、アガロースゲルからの全ＤＮＡ溶出物をWizard SV Gel and    PCR Clean-Up system kit (Promega, France)を用いて行った。細菌培養物からの全プラスミドのミニプレパレーションを、Wizard Plus minipreps kit (Promega)を用いて行った。
【００５６】
１．２．２  ＰＥＴ−ｐＫａ
ｐＫａをコードする断片を、Dr Susan Taylor [Harward Hughes Medical Institute- USCD- La Jolla CA 92093-United States of America]から供給されたＣＡＴ／ｐＲＥＳＴＢプラスミドから、Ｎｄｅｌ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化により調製し、０．８％アガロースゲル（ＴＡＥ１Ｘ：０．０４Ｍトリス塩酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８）で溶離した。
【００５７】
ｐＥＴ２６ｂ＋プラスミドをＮｄｅｌ／ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、アガロースゲルに付着させ、溶離した後、１６℃で一晩、ｐＫａをコードする断片と連結させた。プラスミドをそれ自体で再環化するという対照実験を、ｐＫａをコードする断片の不在下でプラスミドを連結することにより行った。
【００５８】
この連結産物を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、次にこれらをＬＢ−カナマイシンディッシュ（１００μｇ／ｍｌ）上で選択した。４つのアンピシリン耐性クローンをプラスミド抽出のために培養した。これらのプラスミドがｐＫａをコードする遺伝子に確実に組み込まれているように、Ｎｄｅｌ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化とその後の０．８％アガロースゲル（ＴＡＥ  １×）上での電気泳動によりＤＮＡミニプレパレーションを管理した。
【００５９】
ＩＩ．  細菌株の準備
ｐＫａの不在下でのＭｏｓ１トランスポゼース（従って非リン酸化型）の産生のためのもの（Ｔｎｐ株と呼ぶ）と、Ｍｏｓ１トランスポゼースとｐＫａの同時産生のためのもの（Ｔｎｐ／ｐＫａ株と呼ぶ）の、２つのＥＲ２５６６細菌株(New England Biolabs)を用いた。この株では、産生されたトランスポゼースは細菌内でｐＫａによりリン酸化される。
【００６０】
細菌株を作製するためにＥＲ２５６６細菌を下記のもので形質転換した。
・１００ｎｇのプラスミドｐＭａｌＣ２Ｘ−Ｔｎｐ（Ｔｎｐ株）（形質転換した細菌は寒天＋アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）上で選択した）
・１００ｎｇのプラスミドｐＭａｌＣ２Ｘ−Ｔｎｐ＋１００ｎｇのプラスミドＰＥＴ−ｐＫａ（Ｔｎｐ／ｐＫａ株）（形質転換した細菌は寒天＋アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）＋カナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）上で選択した）
ＩＩＩ．  ＥＲ２５６６細胞（Ｔｎｐ）および（Ｔｎｐ／ｐＫａ）におけるＭｏｓ１トランスポゼースの産生および精製
【００６１】
ＩＩＩ．１  産生
５０ｍｌのＢＢＣ培地（ブレイン・ハート・インフュージョン培地−ＡＥＳ）に、形質転換ディッシュから直接採取した５〜１０（Ｔｎｐ）クローンまたは５〜１０（Ｔｎｐ／ｐＫａ）クローンを接種した。培地に、（Ｔｎｐ）株にはアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を、または（Ｔｎｐ／ｐＫａ）株にはアンピシリン、（Ｔｎｐ／ｐＫａ）株には＋カナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した。これらの細菌をすぐにＩＰＴＧ（最終１ｍＭ）で誘導し、飽和培養物が得られるまで２５℃で攪拌した。培養時間は（Ｔｎｐ）株では通常１６〜２０時間であり、（Ｔｎｐ／ｐＫａ）株では３０〜３６時間であった。
【００６２】
ＩＩＩ．２  精製
細菌培養物を遠心分離し（５０００ｒｐｍ、１０分、４℃）、残渣を５ｍｌのバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ）に採った。細菌を２０ｍｇ／ｍｌ濃度のリソチーム８００μｌにより４℃で３０分間溶解させた。この細菌溶解物を遠心分離し（１０，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）、上清を回収した。これが粗抽出物となった。
【００６３】
２種類の抽出物（ＴｎｐおよびＴｎｐ／ｐＫａ）中に含まれる融合タンパク質ＭＢＰ−Ｔｎｐを、供給者の使用説明書に従い(New England Biolabs)、マルトース樹脂で精製した。溶離した画分をブラドフォード法に従ってアッセイした。
ＩＶ．  （Ｔｎｐ）および（Ｔｎｐ／ｐＫａ）株から生じる純粋なＭｏｓ１トランスポゼースの分析
【００６４】
ＩＶ．１  安定性
精製トランスポゼースをＳＤＳ−ｐａｇｅゲル（重層：４％アクリルアミドｐＨ６．８‐分離：１１％アクリルアミドｐＨ８．８）で分析した。１〜２μｇの純粋なタンパク質を分子量マーカー(Promega)とともにゲルに付着させた。１時間の電気泳動後、ゲルをクーマシーブルーで染色した。
【００６５】
ＩＶ．２  活性
精製したトランスポゼースを、in vitro転移試験を用いて転移を媒介するそれらの能力に関して試験した。
【００６６】
（Ｔｎｐ）系統または（Ｔｎｐ／ｐＫａ）系統のいずれかに由来する８０ｎＭのトランスポゼースを、バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＥＤＴ、１０％グリセロール）中、１００ｎｇのＢＳＡの存在下、３０℃で０〜６０分の範囲の時間、６００ｎｇのプラスミドｐＢＣ３Ｔｅｔ３とともにインキュベートした。４μｇのプロテイナーゼＫおよび０．１５％のＳＤＳ、６５℃で５分間、その後、３７℃で３０分間により反応を停止させた。ＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出の後、アルコール中、１μｇのｔＲＮＡの存在下での沈殿により精製した。ＤＮＡ残渣を２０μｌの水に採った。２μｌを用いてＪＭ１０９細菌（活性大腸菌）を形質転換した。形質転換後、得られた培養物をＬＢ−クロラムフェニコールディッシュ（１５０μｇ／ｍｌ）（１／１０００希釈液４０μｌ）上、およびＬＢ−テトラサイクリンディッシュ（１２．５μｇ／ｍｌ）（全培地（１ｍｌ）は無希釈）で滴定した。ディッシュを３７℃で２４時間インキュベートした。翌日、ＬＢ−クロラムフェニコールおよびＬＢ−テトラサイクリンのコロニーを計数した後、全細菌数（クロラム＋テトラ）に対するテトラサイクリン耐性細菌数から、転移頻度を算出した。
Ｂ−結果
【００６７】
図３は、Ｍｏｓ１トランスポゼースは、ｐＫａの存在下で産生される場合には安定性が高いことを示す。この安定化はタンパク質分解の大幅な低下によるものであることがわかる。このことは図３で、系統４と５では自己タンパク質分解の産物が見られないが、系統２（ｐＫａの不在下で産生されたトランスポゼース）では明瞭であることにより示される。
【００６８】
ｐＫａの存在下で産生されたトランスポゼースがなお転移において活性であることを確認するために、in vitro転移試験を行った。結果を図４に示す。それらは、ｐＫａの存在下で産生されたトランスポゼース（点線）は、ｐＫａの不在下で産生されたトランスポゼース（実線）よりも、それほど高くはなくとも効果的であることを示す。ｐＫａの存在下で産生されたトランスポゼースのこの有効性の上昇は、試験過程で分解されないこのタンパク質の安定化と直接関連があり得る。
【００６９】
［参照文献］
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【図面の簡単な説明】
【００７０】
次の図面は単に例示のために示すものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【図１】ＭＬＥ転移の概略図。ＴＭＰ：トランスポゼース、ｇＤＮＡ：ゲノムＤＮＡ
【図２】Ｍｏｓ１トランスポゼースのタンパク質配列。配列間で切断が行われるアミノ酸（切断部位）を薄いグレーで強調している。ｐＫａによる可能性のあるリン酸化部位を下線で示し、濃いグレーで示している。タンパク質分解活性を有すると思われる領域（活性部位）は白地に影を付けた。
【図３】クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ｐａｇｅゲル。  ＭＷ：分子量マーカー(Promega)  １：ＥＲ２５６６株の粗タンパク質抽出物（Ｔｎｐ）  ２：ＥＲ２５６６株由来の精製ＭＢＰ−Ｔｎｐ（Ｔｎｐ）。このＴｎｐ分解の産物はＭＷ約６０ｋＤａの二量体形態であると思われる。  ３：ＥＲ２５６６株の粗タンパク質抽出物（Ｔｎｐ／ｐＫａ）  ４および５：ＥＲ２５６６株由来の精製ＭＢＰ−Ｔｎｐ（Ｔｎｐ／ｐＫａ）の２つの異なる調製物
【図４】in vitro転移試験  点線：ＥＲ２５６６株から精製した純粋なＭＢＰ−Ｔｎｐ（Ｔｎｐ／ｐＫａ）で行った試験。  実線：ＥＲ２５６６株から産生された純粋なＭＢＰ−Ｔｎｐ（Ｔｎｐ）で行った試験。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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