(57)【要約】イントロンコード部分を含有する肝細胞成長因子（ＨＧＦ）のアイソフォームを包含するリガンドのアイソフォーム、及び、ＨＧＦアイソフォームを含有する医薬組成物を提供する。ＨＧＦリガンドアイソフォーム及びそれを含有する組成物は癌及び他の血管形成性の疾患のような疾患の治療方法において使用できる。本発明のアイソフォームは、ＨＧＦリガンドのＫ４ドメインの全て又は一部分を含有する単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォームである。一部分はＫ４ドメインにより呈される活性を付与するために十分であり、或いは、そこに由来する少なくとも１０、１５、２０、２５、３０以上のアミノ酸を含有する。これ等に包含されるものはイントロン融合蛋白であるＨＧＦアイソフォームポリペプチドである。単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォームはまたＳｅｒＰドメインの全て又は部分を包含できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＧＦリガンドのＫ４ドメインの全て又は一部分を含む単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォームであって、該ＨＧＦポリペプチドがイントロン融合蛋白である、アイソフォーム。
【請求項２】
前記ＨＧＦポリペプチドが同種のＨＧＦ遺伝子のイントロン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６及び１７から選択されるイントロンの全て又は一部分を包含するヌクレオチドの配列によりコードされる請求項１記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項３】
前記同種のＨＧＦ遺伝子の配列が配列番号１に示されるか；又はその対立遺伝子又は種変異体である請求項１又は請求項２記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項４】
前記ＨＧＦポリペプチドが、配列番号１の相当する部分によりコードされるアミノ酸の配列とその完全長にわたって少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する請求項３記載の単離されたＨＧＦポリペプチド。
【請求項５】
前記同種のＨＧＦポリペプチドが、配列番号１によりコードされるアミノ酸の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する請求項３記載の単離されたＨＧＦポリペプチド。
【請求項６】
Ｎ末端ドメインの全て又は部分、Ｋ１ドメインの全て又は部分、Ｋ２ドメインの全て又は部分又はＫ３ドメインの全て又は部分、あるいはその組合せを更に含有する請求項１〜５の何れかに記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項７】
前記イントロンがイントロン１１の全て又は一部分である請求項２〜６の何れかに記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項８】
前記ポリペプチドがイントロン１１によりコードされるアミノ酸少なくとも１つに作動可能に連結している請求項１〜７の何れかに記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項９】
前記ポリペプチドがイントロン１１によりコードされるアミノ酸３つを含む請求項８記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項１０】
前記ＨＧＦポリペプチドが配列番号１０、１２、１８又は２０の何れかに記載のアミノ酸の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する請求項９記載の単離されたＨＧＦポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号１０、１２、１８又は２０の何れかに記載のアミノ酸の配列を含むか、又はその対立遺伝子変異体である請求項９又は１０記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項１２】
前記対立遺伝子変異体が配列番号１６に記載の対立遺伝子変異のアミノ酸１つ以上を含む請求項１１記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが配列番号１０、１２、１８又は２０の何れかに記載のアミノ酸と同数のアミノ酸を含有する請求項９〜１２の何れかに記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項１３】
Ｓｅｐドメインの全てまたは一部をさらに含む、請求項１〜６の何れかに記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項１４】
前記イントロンがイントロン１３の全て又は部分である請求項１３記載の単離されたＨＧＦポリペプチド。
【請求項１５】
前記ＨＧＦポリペプチドが配列番号１４に記載のアミノ酸の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する請求項１４記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項１６】
配列番号１４に記載のアミノ酸の配列を含むか、又はその対立遺伝子又は種変異体である請求項１４又は１５記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項１７】
前記変異体が配列番号１６に記載の対立遺伝子変異のアミノ酸１つ以上を含む請求項１６記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが配列番号１４に記載するアミノ酸と同数のアミノ酸を含有する請求項１５〜１７の何れかに記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが同種のＨＧＦポリペプチドの拮抗剤である請求項１〜１８の何れかに記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項２０】
前記ポリペプチドがＭＥＴ受容体に結合する請求項１９記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが有糸分裂誘発、形態形成及び遊走誘発の１つ以上から選択されるＭＥＴ媒介活性を抑制する請求項２０記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが血管形成を抑制する請求項１〜１８の何れかに記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項２３】
前記ポリペプチドがグリコサミノグリカンに結合する請求項２２記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項２４】
前記グリコサミノグリカンがヘパリンスルフェートである請求項２３記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが血管形成分子に結合する請求項２２記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項２６】
前記血管形成分子がＡＴＰシンターゼ、アンジオモチン、αｖβ３インテグリン、アネキシンＩＩ、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ及びＦＧＦＲから選択される請求項２５記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが同種のＨＧＦ、ＦＧＦ−２又はＶＥＧＦにより誘導される血管形成を抑制する請求項２２〜２６の何れかに記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが拮抗性であり、そして血管形成を抑制する請求項１〜２７の何れかに記載の単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォーム。
【請求項２９】
請求項１〜２８の何れかに記載のＨＧＦポリペプチドアイソフォームを含む医薬組成物。
【請求項３０】
同種のＨＧＦポリペプチドに拮抗するために有効なポリペプチドの量を含む請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
同種のＨＧＦと拮抗することが、有糸分裂誘発、遊走誘発及び形態形成の何れかの１つ以上から選択されるＭＥＴ媒介活性１つ以上を抑制する請求項３０記載の組成物。
【請求項３２】
血管形成を抑制するために有効な前記ポリペプチドの量を含む請求項２９記載の組成物。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが同種のＨＧＦ、ＦＧＦ−２又はＶＥＧＦにより誘導される血管形成を抑制する請求項３２記載の組成物。
【請求項３４】
抗癌剤及び／又は抗血管形成剤を更に含む請求項２９〜３３の何れかに記載の組成物。
【請求項３５】
請求項１〜２８の何れかのＨＧＦポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項３６】
同種のＨＧＦ遺伝子のイントロン１つの少なくともすべて又は部分及びエクソンを含むがイントロン５は含有しない核酸分子。
【請求項３７】
請求項３６記載の核酸分子であって、下記特徴：
前記イントロンが終止コドンを含有し；
前記核酸分子がエクソンイントロン接合部にわたるオープンリーディングフレームをコードし；そして、
該オープンリーディングフレームが該イントロン内の終止コドンにおいて終了する、
核酸分子。
【請求項３８】
前記イントロンが、コードされたポリペプチドのアミノ酸１つ以上をコードする請求項３７記載の核酸分子。
【請求項３９】
前記イントロンがイントロン１１の全て又は一部分である請求項３８記載の核酸分子。
【請求項４０】
配列番号９、１１、１７及び１９の何れか１つに記載のヌクレオチドの配列又はその対立遺伝子又は種変異体を含む請求項３９記載の核酸分子。
【請求項４１】
前記対立遺伝子変異体が配列番号１５に記載の対立遺伝子変異の何れか１つである請求項４０記載の核酸分子。
【請求項４２】
前記終止コドンが前記イントロン中の第１のコドンである請求項３７記載の核酸分子。
【請求項４３】
前記イントロンがイントロン１３の全て又は一部分である請求項４２記載の核酸分子。
【請求項４４】
配列番号１３に記載のヌクレオチドの配列又はその対立遺伝子変異体を含む請求項４３記載の核酸分子。
【請求項４５】
前記対立遺伝子変異体が配列番号１５に記載の対立遺伝子変異の何れか１つである請求項４４記載の核酸分子。
【請求項４６】
核酸分子であって、該核酸分子が以下：
ａ）配列番号９、１１、１３、１７、１９の何れか１つに記載のヌクレオチドの配列およびその対立遺伝子変異体又は種を含む核酸分子；
ｂ）請求項１記載のポリペプチドをコードし、そして、配列番号９、１１、１３、１７又は１９の何れかと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する核酸分子；
ｃ）配列番号９、１１、１３、１７又は１９の何れかに記載のヌクレオチドの配列を含む核酸分子に対して、自身の完全長の少なくとも７０％にわたって中又は高ストリンジェンシーの条件下にハイブリダイズする核酸であって、ここでコードされるポリペプチドはＫ４ドメインを含有し、そして、イントロン由来のコドン少なくとも１つを含有する、核酸；
ｄ）上記ａ）、ｂ）又はｃ）の縮重コドンを含む核酸分子；及び、
ｅ）ＨＧＦ遺伝子のスプライシング変異体である核酸分子であって、該核酸分子がイントロン５以外のイントロンの全て又は一部分を包含する、核酸分子；
から選択される、核酸分子。
【請求項４７】
請求項３５〜４６の何れか１項に記載の核酸分子によりコードされるポリペプチド。
【請求項４８】
請求項３５〜４６の何れか１項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項４９】
哺乳類発現ベクターである請求項４８記載のベクター。
【請求項５０】
アデノウィルスベクター、アデノ関連ウィルスベクター、ＥＢＶ、ＳＶ４０、サイトメガロウィルスベクター、ワクシニアウィルスベクター、ヘルペスウィルスベクター、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター又は人工染色体から選択される請求項４８記載のベクター。
【請求項５１】
エピソーム性であるか、又は、自身が導入される細胞の染色体内に組み込まれる請求項５０記載のベクター。
【請求項５２】
請求項４８〜５１の何れかに記載のベクターを含む細胞。
【請求項５３】
請求項３５〜４６の何れかに記載の核酸分子を対象に投与することを含むＨＧＦ媒介疾患の治療方法。
【請求項５４】
前記核酸分子が投与のためのベクターに導入される請求項５３記載の治療方法。
【請求項５５】
前記ベクターが発現ベクターである請求項５４記載の治療方法。
【請求項５６】
前記ベクターがエピソーム性である請求項５５記載の治療方法。
【請求項５７】
前記発現ベクターがアデノウィルスベクター、アデノ関連ウィルスベクター、ＥＢＶ、ＳＶ４０、サイトメガロウィルスベクター、ワクシニアウィルスベクター、ヘルペスウィルスベクター、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター又は人工染色体から選択される請求項５４〜５６記載の治療方法。
【請求項５８】
前記核酸がインビボ又はエクスビボで投与される請求項５３〜５７の何れかに記載の治療方法。
【請求項５９】
エクスビボの治療がインビトロで細胞内に前記核酸を投与すること、及びその後の前記対象内への該細胞の投与を含む、請求項５８記載の治療方法。
【請求項６０】
前記細胞が適当なドナーに由来するか、又は、治療すべき対象に由来する請求項５９記載の治療方法。
【請求項６１】
前記対象がヒトである請求項５３〜６０に記載の治療方法。
【請求項６２】
請求項３５〜４６の何れかに記載の核酸分子、又は、請求項４８〜５１の何れかに記載のベクターを含む医薬組成物。
【請求項６３】
請求項２９〜３４及び６２の何れかに記載の医薬組成物を投与することを含むＨＧＦ媒介疾患又は状態を治療する方法。
【請求項６４】
前記医薬組成物が、血管形成、細胞増殖、細胞遊走、腫瘍細胞成育又は腫瘍細胞転移を抑制するポリペプチドを含有する請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
前記疾患又は状態が癌、血管形成性の疾患又はマラリアからなる群より選択される請求項６３又は６４記載の方法。
【請求項６６】
前記血管形成性の疾患が眼科疾患、子宮内膜症、関節炎又は他の慢性炎症性疾患から選択される請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
前記血管形成性の疾患が慢性関節リューマチ、変形性関節症、乾癬、オスラー・ウェバー症候群、子宮内膜症、スティル病、心筋の血管形成、末梢血管拡張症、血友病性関節炎、加齢関連の黄斑変性、未熟児網膜症、角膜移植に対する拒絶、全身エリテマトーデス、アテローム性動脈硬化症、血管新生緑内障、脈絡膜血管新生、水晶体後線維増症、腱麻痺、神経線維腫、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫及び糖尿病関連疾患、例えば増殖性糖尿病性網膜症及び血管疾患、炎症性肺疾患、クローン病及び乾癬から選択される請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
前記癌が癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫及び白血病又はリンパ様悪性疾患、扁平上皮細胞癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃及び腹部の癌、胃腸の癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌又は腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌、陰茎癌並びに頭頚部癌からなる群より選択される請求項６６記載の方法。
【請求項６９】
ＨＧＦアイソフォームを含む結合体。
【請求項７０】
前記結合体がＨＧＦアイソフォーム又はそのドメイン又はその機能的部分、及び異なるＨＧＦアイソフォーム由来か、又は別の細胞表面受容体（ＣＳＲ）アイソフォームに由来する第２の一部分を含み；そして、
該部分が直接又はリンカーを介して連結している、請求項６９記載の結合体。
【請求項７１】
細胞表面受容体アイソフォーム由来の前記第２の部分が、該細胞表面受容体アイソフォームの細胞外ドメインの全て又は部分である請求項７０記載の結合体。
【請求項７２】
前記細胞表面受容体アイソフォームが受容体チロシンキナーゼである請求項７０又は７１記載の結合体。
【請求項７３】
前記第２の部分がヘルスタチンポリペプチドの全て又は部分である請求項７０〜７２の何れかに記載の結合体。
【請求項７４】
前記ヘルスタチンポリペプチドが配列番号１８６〜２００の何れか１つに記載のアミノ酸の配列を含む請求項７３記載の結合体。
【請求項７５】
あるＨＧＦアイソフォームの全て又は少なくとも１つのドメイン、及び、異なるＨＧＦアイソフォーム又は他の細胞表面受容体アイソフォームの全て又は少なくとも１つのドメインを含むキメラポリペプチド。
【請求項７６】
前記細胞表面受容体アイソフォームがイントロン融合蛋白である請求項７５記載のポリペプチド。
【請求項７７】
あるＨＧＦアイソフォームの全て又は少なくとも１つのドメイン、及び、細胞表面受容体アイソフォームのイントロンコード部分を含む請求項７６記載のポリペプチド。
【請求項７８】
下記成分：
ＨＧＦアイソフォーム１つ以上；
他の細胞表面受容体アイソフォーム１つ以上；及び／又は、
治療薬；
を含む、組み合わせ。
【請求項７９】
前記アイソフォーム及び／又は薬品が別個の組成物中、又は、単一の組成物中にある請求項７８記載の組み合わせ。
【請求項８０】
前記細胞表面受容体アイソフォームがＶＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＤＤＲ、ＴＮＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＭＥＴ、ＴＩＥ、ＲＡＧＥ、ＥＰＨ又はＨＥＲのアイソフォームである請求項７８又は７９記載の組み合わせ。
【請求項８１】
前記細胞表面受容体アイソフォームがＭＥＴアイソフォームである請求項８０記載の組み合わせ。
【請求項８２】
前記アイソフォームがイントロン融合蛋白である請求項７８〜８１の何れかに記載の組み合わせ。
【請求項８３】
前記ＭＥＴアイソフォームが配列番号８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３及び１１４の何れか１つから選択されるアミノ酸の配列を含む請求項８１又は８２に記載の組み合わせ。
【請求項８４】
請求項７８〜８３の何れかに記載の組み合わせの成分を投与することを含み、各成分は別個、同時、間歇的に、単一の組成物中、又は、その組み合わせにおいて投与される、ＨＧＦ媒介疾患の治療方法。
【請求項８５】
請求項２９〜３４及び６２の何れかに記載の組成物を投与することを含む腫瘍の侵襲又は腫瘍の転移を抑制する方法。
【請求項８６】
請求項２９〜３４及び６２の何れかに記載の組成物を投与することを含む血管形成を抑制する方法。
【請求項８７】
蛋白に直接又はリンカーを介して連結されたＣＤ４５ポリペプチドのフラグメントを含み、ここで該ＣＤ４５のフラグメントは炭水化物又はグリコシル化部位を付加するために選択される、融合蛋白又は結合体。
【請求項８８】
前記蛋白が治療用蛋白である請求項８７記載の融合蛋白。
【請求項８９】
前記融合蛋白が細胞表面受容体（ＣＳＲ）又はリガンドのアイソフォームであるか、又は、サイトカイン又はＣＳＲ又はリガンド又は成長因子又はホルモン又は末端に追加のアミノ酸を含む形態である請求項８７又は８８に記載の融合蛋白。
【請求項９０】
前記ＣＤ４５ポリペプチドがグリコシル化部位又は炭水化物の十分な数を含み、これにより、該蛋白の血清中半減期が１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上増大する請求項８７〜８９の何れかに記載の融合蛋白。
【請求項９１】
前記連結が場合により化学的リンカーを包含する化学的連結である請求項８７〜９０の何れかに記載の融合蛋白又は結合体。
【請求項９２】
前記リンカーがヘテロ２官能性リンカーから製造されるか、及び／又は光切断可能なリンカーである請求項９１記載の融合蛋白又は結合体。
【請求項９３】
場合によりポリペプチド又はペプチド又はアミノ酸のリンカーを包含する融合蛋白である請求項８７〜９０の何れかに記載の融合蛋白又は結合体。
【請求項９４】
前記リンカーが１〜３０、１〜１０、２〜１０又は２〜１５アミノ酸残基を含有する請求項９３記載の融合蛋白又は結合体。
【請求項９５】
前記ＣＤ４５ポリペプチド又はそのフラグメントが配列番号２７２、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３及び２９５の何れかに記載のアミノ酸の配列及びそのフラグメント及びその変異体を含む請求項８７〜９４の何れかに記載の融合蛋白又は結合体。
【請求項９６】
前記蛋白がリガンド又はＣＳＲアイソフォーム又は追加のアミノ酸を含有する形態である請求項８７〜９５の何れかに記載の融合蛋白又は結合体。
【請求項９７】
前記蛋白が
【化１】
2009515520.tif 000018
の何れかに記載のアミノ酸の配列及びその対立遺伝子変異体を含む請求項９６記載の融合蛋白又は結合体。
【請求項９８】
前記蛋白がＨＧＦ又はそのアイソフォームである請求項９７記載の融合蛋白又は結合体。
【請求項９９】
請求項７８記載の組み合わせ；及び、場合により、
該組み合わせの使用のための説明書及びその使用のための説明書の１つ以上；
を含む、キット。
【請求項１００】
ＨＧＦ媒介疾患に関して対象を治療するための医薬の製剤のための請求項３５〜４６の何れかに記載の核酸分子の使用。
【請求項１０１】
ＨＧＦ媒介疾患に関して対象を治療するための請求項３５〜４６の何れかに記載の核酸分子の使用。
【請求項１０２】
ＨＧＦ媒介疾患に関して対象を治療するための医薬の製剤のための請求項２９〜３４の何れかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項１０３】
ＨＧＦ媒介疾患に関して対象を治療するための請求項２９〜３４の何れかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項１０４】
ＨＧＦ媒介疾患に関して対象を治療するための医薬の製剤のための請求項７８〜８３の何れかに記載の組み合わせの使用。
【請求項１０５】
ＨＧＦ媒介疾患に関して対象を治療するための請求項７８〜８３の何れかに記載の組み合わせの使用。
【請求項１０６】
前記ＨＧＦ媒介疾患が、癌ならびに望ましくない細胞増殖の関与する他の疾患、ならびに望ましくない血管形成性および炎症性の反応又は応答の関与する疾患である請求項１００〜１０５の何れかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
優先権の利益は、Ｐｅｉ  Ｊｉｎ，Ｈ．Ｍｉｃｈａｅｌ  ＳｈｅｐａｒｄおよびＩｒｅｎｅ  Ｎｉへの表題「ＨＥＰＡＴＯＣＹＴＥ  ＧＲＯＷＴＨ  ＦＡＣＴＯＲ  ＩＮＴＲＯＮ  ＦＵＳＩＯＮ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ」の２００５年１１月１０日に出願された米国仮出願第６０／７３５，６０９号に対して主張される。
【０００２】
この出願は、Ｐｅｉ  Ｊｉｎ，Ｈ．Ｍｉｃｈａｅｌ、ＳｈｅｐａｒｄおよびＩｒｅｎｅ  Ｎｉへの表題「ＨＥＰＡＴＯＣＹＴＥ  ＧＲＯＷＴＨ  ＦＡＣＴＯＲ  ＩＮＴＲＯＮ  ＦＵＳＩＯＮ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ」の同日に出願された米国出願（代理人管理番号第１７１１８−０４５００１／２８２４号）（これもまた、米国仮出願第６０／７３５，６０９号に対する優先権を主張する）に関する。
【０００３】
この出願はまた、表題「ＩＮＴＲＯＮ  ＦＵＳＩＯＮ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＩＤＥＮＴＩＦＹＩＮＧ  ＡＮＤ  ＵＳＩＮＧ  ＳＡＭＥ」の、２００４年５月１４日に出願された米国出願第１０／８４６，１１３号および対応する国際ＰＣＴ出願第ＷＯ０５／０１６９６６号（２００５年２月２４日公開）にも関する。この出願はまた、表題「ＣＥＬＬ  ＳＵＲＦＡＣＥ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ＩＳＯＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＩＤＥＮＴＩＦＹＩＮＧ  ＡＮＤ  ＵＳＩＮＧ  ＴＨＥ  ＳＡＭＥ」の２００５年５月１３日に出願された米国出願第１１／１２９，７４０号および２００５年５月１３日に出願された対応する国際ＰＣＴ出願第ＵＳ２００５／１７０５１号にも関する。この出願はまた、表題「ＩＳＯＦＯＲＭＳ  ＯＦ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ＦＯＲ  ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＧＬＹＣＡＴＩＯＮ  ＥＮＤ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ  （ＲＡＧＥ）  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＩＤＥＮＴＩＦＹＩＮＧＡＮＤ  ＵＳＩＮＧ  ＳＡＭＥ」の２００５年５月４日に出願された米国仮出願第６０／６７８，０７６号および表題「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ＡＮＤ  ＬＩＧＡＮＤ  ＩＳＯＦＯＲＭＳ」の同日に出願された米国出願（代理人管理番号第１７１１８−０４１Ｐ０１／Ｐ２８２２号）にも関する。
【０００４】
許容される場合は、上記した出願、暫定出願及び国際出願並びに本明細書の開示全体を通して記載される何れかの出願の各々の要件は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００５】
発明の分野
イントロンコード部分を含有する肝細胞成長因子（ＨＧＦ）のアイソフォームを包含するリガンドのアイソフォーム、及び、ＨＧＦアイソフォームを含有する医薬組成物を提供する。ＨＧＦリガンドアイソフォーム及びそれを含有する組成物は癌及び他の血管形成性の疾患のような疾患の治療方法において使用できる。
【背景技術】
【０００６】
発明の背景
成長因子は多くの異なる細胞型により生産され、そして、オートクリン及びパラクリンの機序を介してその作用を発揮する。それらは細胞の分裂、分化及び遊走の刺激剤又は抑制剤として機能し、そして発癌に関与しており、その場合それらは種々の機能、例えば細胞増殖、細胞侵襲、転移形成、血管形成、局所免疫系機能及び細胞外マトリックス合成に影響する。特に腫瘍細胞の侵襲及びその後の転移の樹立は癌の進行及び重症度に関連する壊滅的な事象である。
【０００７】
肝細胞成長因子（ＨＧＦ、別名散乱因子）はｃ−ｍｅｔプロト癌遺伝子に対する成長因子リガンドである（ＭＥＴ受容体）。正常組織においては、ＨＧＦは臓器形成及び組織再生の間の組織の構築及び再構築において、例えば胚組織、例えば肝臓、腎臓、肺、乳腺、歯牙、胎盤及び骨格筋の発生において、役割を果たしている。ＨＧＦは又成熟組織の再生及び保護において役割を果たしている。しかしながら悪性組織においては、腫瘍細胞はその侵襲及び転移の挙動のためにＨＧＦの生物学的作用を利用している。ＨＧＦは細胞−細胞接着、細胞マトリックス会合、細胞外マトリックスの蛋白分解性の崩壊、細胞運動性及び血管形成を調節することにより、腫瘍の侵襲的挙動を促進する。
【０００８】
多くの癌を包含する増殖性及び血管形成性の疾患における関与のため、ＨＧＦは治療介入の標的となっている。ＨＧＦ又はその受容体ＭＥＴをターゲティングする小分子治療薬が設計されている。そのような細胞表面受容体及び／又は他の血管形成受容体又はそのリガンドをターゲティングする治療薬として小分子を設計することは可能であるが、そのような方策には多くの制約が伴う。小分子は無差別的となり、意図する標的以外の受容体にも影響する場合がある。更に又、一部の小分子は不可逆的又は実質的に不可逆的に受容体に結合する（即ちナノモル未満の結合親和性）。このような探求法の利点は確認されていない。受容体及び／又は受容体リガンドに対する抗体を治療薬として使用できる。しかしながら抗体治療は対象において免疫応答をもたらす場合があり、そしてそのため、そのような治療は治療における合併症を回避するためには広範な個人向け調整を必要とする場合が多い。即ち、癌及び望ましくない細胞増殖及び血管形成反応の関与する他の疾患を包含する疾患の治療のための治療薬の要望は満足されないままとなっている。従って、本明細書に記載する目的のうちでも、そのような治療薬及び候補治療薬を識別又は発見するための方法及び治療の方法を提供することを目的とする。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
要旨
本発明により提供されるものは、癌及び望ましくない細胞増殖、血管形成性及び炎症性の反応の関与する他の疾患を包含する疾患の治療のための治療薬である。更に提供されるものは、候補治療薬を識別又は発見するための方法及び治療薬を用いた治療方法である。治療薬はポリペプチド又は修飾ポリペプチド、例えばペプチドミメティック結合を含むポリペプチドである。
【００１０】
ＨＧＦポリペプチドアイソフォームを提供する。アイソフォームに包含されるものはＨＧＦリガンドのＫ４ドメインの全て又は一部分を含有する単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォームである。一部分はＫ４ドメインにより呈される活性を付与するために十分であり、或いは、そこに由来する少なくとも１０、１５、２０、２５、３０以上のアミノ酸を含有する。これ等に包含されるものはイントロン融合蛋白であるＨＧＦアイソフォームポリペプチドである。単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォームはまたＳｅｒＰドメインの全て又は部分を包含できる。
【００１１】
ＨＧＦアイソフォームの例示されるものは、ヒトＨＧＦ遺伝子のような同種のＨＧＦ遺伝子（即ち全てのエクソンを包含するＨＧＦリガンドをコードする遺伝子）のイントロン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６及び１７から選択されるイントロンの全て又は一部分を包含するヌクレオチドの配列によりコードされるものである。その対立遺伝子の配列は配列番号１に記載する通りである。更に提供されるものはその対立遺伝子、種又は他の変異体であるＨＧＦアイソフォーム、例えば自身に対して同種のＨＧＦリガンドが、配列番号１の相当する部分によりコードされるアミノ酸の配列とその完全長にわたって少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するようなアイソフォームである。イントロンによりコードされる部分は１つのコドン、例えば終止コドン、又は、得られるＨＧＦアイソフォームがエクソンの末端において終止するか、又はイントロンによりコードされるアミノ酸１、２、３つ以上を包含するようにより多いコドンであることができる。
【００１２】
同様に提供されるものは、Ｎ末端ドメインの全て又は部分、Ｋ１ドメインの全て又は部分、Ｋ２ドメインの全て又は部分又はＫ３ドメインの全て又は部分又はその何れかの組合せを包含する上記した単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォームである。提供されるアイソフォームに包含されるものは、イントロン１１の全て又は一部分を包含する核酸分子によりコードされるものである。一部分は１つのコドン、例えば終止コドンであることができ、これにより、得られるアイソフォームがエクソンの末端で終止し、そして、他のアミノ酸を包含しないようにすることができ、或いは、一部分は、イントロンによりコードされるアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個〜全てまでをアイソフォームが包含するように１つより多いコドンであることができる。例示される実施形態においては、アイソフォームは、イントロン１１によりコードされるアミノ酸１、２又は３つを包含する。
【００１３】
提供されるものは、配列番号１０、１２、１８又は２０の何れかに記載のアミノ酸の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するか、及び／又はその対立遺伝子又は種変異体であるＨＧＦポリペプチドアイソフォームである。ＨＧＦポリペプチドの例示される対立遺伝子変異体は配列番号１６に記載するアミノ酸の配列を有する。結果として、ＨＧＦアイソフォームは特定のアイソフォームの部分である何れかのエクソン又はイントロン中に存在する変異を包含することになる。本明細書に記載するＨＧＦアイソフォーム変異体に包含されるものは、配列番号１０、１２、１８又は２０の何れかに記載のアミノ酸と同数のアミノ酸を含有するものである。
【００１４】
提供されるアイソフォームに包含されるものは、イントロン１３の全て又は一部分を包含する核酸分子によりコードされるものである。一部分は１つのコドン、例えば終止コドンであることができ、これにより、得られるアイソフォームがエクソンの末端で終止し、そして、他のアミノ酸を包含しないようにすることができ、或いは、一部分は、イントロン１３によりコードされるアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個〜全てまでをアイソフォームが包含するように１つより多いコドンであることができる。例示される実施形態においては、アイソフォームは、イントロン１３１によりコードされるアミノ酸１、２又は３つを包含する。提供されるものは、配列番号１４に記載のアミノ酸の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するＨＧＦポリペプチドアイソフォーム、並びに、その対立遺伝子又は種変異体、例えば自身の配列が配列番号１６に示される対立遺伝子変異体の部分である。これ等には配列番号１４に記載するアミノ酸と同数のアミノ酸を含有する変異体が包含される。
【００１５】
本明細書において提供される単離されたＨＧＦポリペプチドアイソフォームはＨＧＦポリペプチドの拮抗剤として作用するもの、例えば同種のＨＧＦポリペプチド；ＭＥＴ受容体に結合するもの；有糸分裂誘発、形態形成及び遊走誘発（ｍｏｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）から選択されるＭＥＴ媒介活性１つ以上を抑制するもの；血管形成を抑制するもの；グリコサミノグリカン、例えばヘパリンスルフェートに結合するもの；血管形成分子（angiogenic molecule）、例えばＡＴＰシンターゼ、アンジオモチン（ａｎｇｉｏｍｏｔｉｎ）、αｖβ３インテグリン、アネキシンＩＩ、ＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ及びＦＧＦＲの何れかに結合するもの；同種のＨＧＦ、ＦＧＦ−２及び／又はＶＥＧＦにより誘導される血管形成を抑制するもの；及び、ＨＧＦ拮抗剤であり、血管形成を抑制するものを包含する。ＨＧＦアイソフォームはこれ等の活性及び／又は他の活性の何れかの１つ以上を保有することができる。
【００１６】
同様に提供されるものは、製薬上許容しうる担体中にＨＧＦポリペプチドアイソフォーム１つ以上を含有する医薬組成物である。医薬組成物は何れかの適当な経路による投与のために製剤できる。組成物は追加的な活性剤、例えば限定しないが、他の抗癌剤及び／又は抗血管形成剤を包含できる。ＨＧＦアイソフォームの量は、特定の活性、例えば同種のＨＧＦポリペプチドに拮抗すること、例えば、同種のＨＧＦに拮抗することが有糸分裂誘発、遊走誘発及び形態形成の何れかの１つ以上から選択されるＭＥＴ媒介活性１つ以上を抑制する場合；及び／又は同種のＨＧＦ、ＦＧＦ−２及び／又はＶＥＧＦにより誘導された血管形成のような血管形成を抑制することのために有効なものとする。
【００１７】
ＨＧＦポリペプチドの何れかをコードする核酸分子が提供される。提供される核酸分子はエクソンの全て又は部分及びイントロン５以外のイントロンに由来する少なくとも１つのコドンを含有する。イントロンは第１の遺伝子座を包含する何れかの遺伝子座において終止コドンを含有できる。例えば、提供されるものはエクソンイントロン接合部にわたるオープンリーディングフレームをコードする核酸分子であり、この場合オープンリーディングフレームはイントロン１１又は１３のようなイントロン（イントロン５以外）内の終止コドンにおいて終了する。同様に提供されるものは、終止コドンがイントロン１３のようなイントロン内の第１のコドンである核酸分子である。例示的実施形態においては、配列番号９、１１、１３、１７及び１９の何れか１つに記載のヌクレオチドの配列又はその対立遺伝子変異体、例えば配列番号１５における変異１つ以上又は種変異体を含有する核酸分子が提供される。同様に提供されるものは、Ｋ４ドメインの全て又は部分を包含し、そして、配列番号９、１１、１３、１７又は１９の何れかと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するか；又は配列番号９、１１、１３、１７又は１９の何れかに記載のヌクレオチドの配列を含む核酸分子に対して、自身の完全長の少なくとも７０％にわたって中又は高ストリンジェンシーの条件下にハイブリダイズする、上記したアイソフォームをコードする核酸分子であって、ここでコードされるポリペプチドはＫ４ドメインを含有し、そして、イントロン由来のコドン少なくとも１つを含有する。同様に提供されるものは、記載した核酸分子の何れかの縮重コドンを含有する核酸分子である。同様に提供されるものは、ＨＧＦ遺伝子のスプライシング変異体であり、そして、イントロン５以外のイントロンの全て又は一部分を包含する核酸分子である。これ等の核酸分子の何れかによりコードされるポリペプチド、並びに核酸分子の何れかを含有するベクターも提供される。ベクターは真核生物及び原核生物のベクター、発現ベクター、例えば哺乳類発現ベクター、及び遺伝子療法に適するベクターを包含する。例示されるベクターはウィルスベクター、例えば限定しないが、アデノウィルスベクター、アデノ関連ウィルスベクター、ＥＢＶベクター、ＳＶ４０ベクター、サイトメガロウィルスベクター、ワクシニアウィルスベクター、ヘルペスウィルスベクター、レトロウィルスベクター及びレンチウィルスベクターである。同様に包含されるものは人工染色体である。ベクターはエピソーム型又は組み込み型であることができる。
【００１８】
ベクターを含有する細胞が提供される。細胞は真核生物の細胞、例えば哺乳類及び昆虫の細胞、及び原核生物の細胞を包含する。
【００１９】
治療方法が提供される。方法は本明細書に記載されるＨＧＦアイソフォームを含有する医薬組成物を投与することにより、及び／又は、そのようなアイソフォームをコードする核酸分子の導入を介した遺伝子療法により、行うことができる。遺伝子療法方法は対象又は適合する原料から取り出した宿主細胞内への導入を包含するエクスビボの方法、及び、局所的、限局的及び系統的な投与を包含するインビボの方法を包含する。エクスビボ投与はインビトロで細胞内に核酸を投与すること、及びその後の対象内への細胞の投与を包含できる。細胞は適当なドナー由来、又は治療すべき対象、例えばヒト由来であることができる。
【００２０】
アイソフォーム１つ以上を含有する医薬組成物を投与することにより疾患又は状態を治療するための方法が提供される。アイソフォームは血管形成、細胞増殖、細胞遊走、腫瘍細胞成育及び／又は腫瘍細胞転移を抑制するものであることができる。治療される状態は、例えば限定しないが、癌、血管形成性の疾患及びマラリアを包含する。血管形成性の疾患は眼科疾患、子宮内膜症、関節炎又は他の慢性又は急性の炎症性疾患を包含する。例示される疾患は、慢性関節リューマチ、変形性関節症、乾癬、オスラー・ウェバー症候群、子宮内膜症、スティル病、心筋の血管形成、末梢血管拡張症、血友病性関節炎、加齢関連の黄斑変性、未熟児網膜症、角膜移植に対する拒絶、全身エリテマトーデス、アテローム性動脈硬化症、血管新生緑内障、脈絡膜血管新生、水晶体後線維増症、腱麻痺（ｐｅｒｏｓｉｓ）、神経線維腫、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫及び糖尿病関連疾患、例えば増殖性糖尿病性網膜症及び血管疾患、炎症性肺疾患、クローン病及び乾癬である。治療することができる癌は、胃癌、肺癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌及び他の腫瘍及び血液の癌を包含し、そして、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫及び白血病又はリンパ様悪性疾患、扁平上皮細胞癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃及び腹部の癌、胃腸の癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌又は腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌、陰茎癌並びに頭頚部癌を包含する。使用すべき特定のアイソフォームは必要に応じて実験的に決定できる。組成物は腫瘍の侵襲又は腫瘍の転移を抑制するため、及び／又は、血管形成を抑制するために投与できる。
【００２１】
別の部分に直接又はリンカーを介して間接的に連結しているＨＧＦアイソフォームを含有する結合体が提供される。結合体は融合蛋白及びさらには化学結合体も包含する。結合体はＨＧＦアイソフォーム又はそのドメイン又はその機能的部分、及び異なるＨＧＦアイソフォーム由来、又は、細胞表面受容体（ＣＳＲ）アイソフォーム又はリガンドアイソフォーム由来の第２の一部分を含有できる。細胞表面受容体アイソフォームは例えば細胞表面受容体アイソフォームの細胞外ドメインの全て又は部分を包含する。細胞表面受容体アイソフォームは受容体チロシンキナーゼ、例えばヘルスタチンポリペプチドの全て又は部分を包含する。例示されるヘルスタチンポリペプチドは配列番号１８６〜２００の何れか１つに記載のアミノ酸の配列又はその対立遺伝子又は種変異体を包含する。
【００２２】
同様に提供されるものは、あるＨＧＦアイソフォームの全て又は少なくとも１つのドメイン、及び、異なるＨＧＦアイソフォーム又は他の細胞表面受容体アイソフォームの全て又は少なくとも１つのドメインを含有するキメラポリペプチドである結合体、例えばイントロン融合蛋白である。他のキメラポリペプチドはあるＨＧＦアイソフォームの全て又は少なくとも１つのドメイン、及び、細胞表面受容体アイソフォームのイントロンコード部分を包含する。
【００２３】
同様に提供されるものは、ＨＧＦアイソフォーム１つ以上、及び他の細胞表面受容体アイソフォーム１つ以上；及び／又は、治療薬を含有する組み合わせである。そのような組み合わせはアイソフォーム及び／又は薬品が別個の組成物中、又は、単一の組成物中にあるものを包含する。組み合わせは、任意の使用説明書と共に、及び／又は、他の試薬及び組み合わせの成分の投与及び使用のための器具及び成分と共に、キットとして提供できる。組み合わせを投与することによる治療の方法が提供される。各成分は別個、同時、間歇的に、単一の組成物中、又は、その組み合わせにおいて投与できる。
【００２４】
組み合わせ又は結合体内に包含させるための細胞表面受容体アイソフォームは例えば限定しないが、ＶＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＤＤＲ、ＴＮＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＭＥＴ、ＴＩＥ、ＲＡＧＥ、ＥＰＨ又はＨＥＲのアイソフォームを包含する。アイソフォームはイントロン融合蛋白であることができる。例示されるＭｅｔアイソフォームはが配列番号８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３及び１１４の何れか１つから選択されるアミノ酸の配列を含有する。
【００２５】
同様に包含されるものは、蛋白に直接又はリンカーを介して連結されたＣＤ４５ポリペプチドのフラグメントを含有する融合蛋白又は結合体であり、ここでＣＤ４５のフラグメントは炭水化物又はグリコシル化部位を付加するために選択され、従ってそのような部位少なくとも１つ及びポリペプチドのような連結した部分の血清中半減期を延長させるために十分な量を包含する。融合蛋白はポリペプチドに直接又は間接的に連結したＣＤ４５ポリペプチド又はそのフラグメントを含有し；結合体は非ペプチド部分、典型的には治療薬に直接又は間接的に連結したＣＤ４５ポリペプチド又はそのフラグメントを含有する。連結した薬剤は蛋白及び他の薬剤、例えば小分子治療薬を包含する。連結した蛋白は治療用蛋白、例えばＣＳＲ又はリガンドアイソフォーム、又はサイトカイン、ＣＳＲ、リガンド、成長因子、ホルモン又は末端に追加のアミノ酸を包含する形態を包含する。ＣＤ４５ポリペプチド又はフラグメントはグリコシル化部位又は炭水化物の十分な数を含有し、これにより、蛋白の血清中半減期は１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上増大する。連結は直接、又は化学的連結、例えばペプチド連結又は化学的リンカー（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｎｋｅｒ）、例えばヘテロ２官能性リンカーから生じた連結を介したものであることができ、及び／又は、それは光切断可能なリンカー（ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｌｉｎｋｅｒ）であることもできる。融合蛋白の結合体は場合によりポリペプチド又はペプチド又はアミノ酸のリンカーを包含し、これは１〜３０、１〜１０、２〜１０又は２〜１５以上のアミノ酸残基を含有できる。例示されるＣＤ４５ポリペプチド又はそのフラグメントは配列番号２７２、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３及び２９５の何れかに記載のアミノ酸の配列及びそのフラグメント及びその変異体を含有する。
【００２６】
ＣＤ４５蛋白に連結した蛋白はリガンド、例えばＨＧＦ又はそのアイソフォーム、ＣＳＲ又はＣＳＲアイソフォーム又はリガンドの形態、追加のアミノ酸を含有するＣＳＲ又はアイソフォームであることができる。例示される蛋白は限定しないが、
【００２７】
【化２】
2009515520.tif 000002
の何れかに記載のアミノ酸の配列及びその対立遺伝子変異体を含有するものを包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
（詳細な説明）
概略
Ａ．定義
Ｂ．肝細胞成長因子（ＨＧＦ）及びＭＥＴ受容体
１．ＨＧＦ
ａ．ＨＧＦドメイン構造
ｉ．Ｎ末端ドメイン
ｉｉ．クリングルドメイン
ｉｉｉ．β−鎖
２．ＨＧＦ変異体
ａ．ＨＧＦスプライシング変異体
ｂ．ＨＧＦ対立遺伝子変異体
３．ＭＥＴ受容体
Ｃ．ＨＧＦアイソフォーム
１．ＨＧＦアイソフォームのクラス
２．オルタナティブスプライシング及びＨＧＦアイソフォームの形成
ａ．イントロン修飾及びイントロン融合蛋白
ｉ．天然のイントロン融合蛋白
ｉｉ．コンビナトリアルイントロン融合蛋白
ｂ．エクソン修飾により形成されるアイソフォーム
２．ＨＧＦアイソフォームポリペプチド構造
３．ＨＧＦアイソフォーム活性
ａ．細胞表面作用の改変
ｂ．競合的拮抗剤
ｃ．負の作用を示す抑制性のアイソフォーム
Ｄ．ＨＧＦアイソフォームを識別して形成するための方法
１．アイソフォームを識別して単離するための方法
２．アイソフォームの対立遺伝子及びスプライシング変異体の識別
Ｅ．例示されるＨＧＦアイソフォーム
１．ＨＧＦアイソフォーム
２．ＨＧＦイントロン融合蛋白
Ｆ．ＨＧＦアイソフォームポリペプチドをコードする核酸を製造するための方法
１．合成遺伝子及びポリペプチド
２．ＨＧＦアイソフォームのクローニング及び単離の方法
３．発現系
ａ．原核生物発現
ｂ．酵母
ｃ．昆虫細胞
ｄ．哺乳類細胞
ｅ．植物
Ｇ．アイソフォーム結合体
１．アイソフォーム融合
ａ．ＨＧＦアイソフォームポリペプチドの進歩した製造のためのＨＧＦアイソフォーム融合
ｉ．組織プラスミノーゲン活性化物質
ｉｉ．ＴＰＡ−ＨＧＦイントロン融合蛋白融合
ｂ．キメラ及び合成のイントロン融合ポリペプチド
ｃ．  ＨＧＦ多量体及び多量体化ドメイン
ｉ．ペプチドリンカー
ｉｉ．ポリペプチド多量体化ドメイン
（ａ）免疫グロブリンドメイン
（ｉ）ＦＣドメイン
（ｉｉ）キャビティー内への突出（即ちノブ及びホール）
（ｂ）ロイシンジッパー
（ｉ）ＦＯＳ及びＪＵＮ
（ｉｉ）ＧＣＮ４
（ｃ）他の多量体化ドメインＲ／ＰＫＡ−ＡＤ／ＡＫＡＰ
ｄ．ＨＧＦ融合を形成及びクローニングする方法
２．ターゲティング剤／ターゲティング剤結合体
３．ペプチドミメティックアイソフォーム
Ｈ．血清中半減期及び他の治療特性を改変するための方法
１．Ｎ−連結及びＯ−連結グリコシル化
２．グリコシル化の作用
３．グリコシル化のための治療上の使用
４．血清中半減期を改変するためのＣＤ４５の使用
ａ．ＣＤ４５の機能
ｂ．ＣＤ４５の２量体化及びグリコシル化
ｃ．ＣＤ４５の融合蛋白
ｄ．ＣＤ４５融合蛋白の結合体
ｅ．治療用ＣＤ４５融合蛋白
ｆ．グリコシル化を測定するための方法
ｇ．製造及びグリコシル化増大の方法
ｈ．ＨＧＦ−ＣＤ４５融合蛋白及び治療上の使用
Ｉ．ＨＧＦアイソフォーム特異的抗体を製造及び単離する方法
Ｊ．ＨＧＦアイソフォーム活性を評価又はモニターするための試験
１．リガンド結合試験及びＨＧＦ結合試験
２．リガンド２量体化
３．複合体形成
４．ＭＥＴ及びＥＲＫ１／２ホスホリル化試験
５．形態形成／血管形成試験
６．有糸分裂誘発／増殖試験
７．遊走誘発／細胞遊走試験
８．アポトーシス試験
９．動物モデル
ａ．腫瘍抑制試験
ｂ．血管形成性の疾患
Ｋ．ＨＧＦアイソフォーム及びＨＧＦアイソフォーム組成物の製造、製剤化及び投与
Ｌ．ＨＧＦアイソフォームのインビボ発現及び遺伝子療法
１．核酸の送達
ａ．ベクター−エピソーム型及び組み込み型
ｂ．人工染色体及び他の非ウィルス性ベクター送達方法
ｃ．リポソーム及び他のカプセル化形態及び核酸分子を含有する細胞の投与
２．インビトロ及びエクスビボの送達
３．全身、局所及び限局型の送達
Ｍ．ＨＧＦ及び癌及び血管形成
１．腫瘍生育及び転移
ａ．有糸分裂誘発
ｂ．遊走誘発及び形態形成
２．血管形成
ａ．血管形成プロセス
ｂ．血管形成における細胞表面受容体
ｃ．腫瘍血管形成におけるＨＧＦ
ｄ．他の血管疾患におけるＨＧＦ
３．ＨＧＦアイソフォーム及び癌及び血管形成
Ｎ．ＨＧＦアイソフォームを用いた例示される治療
１．癌
２．血管形成性の疾患
ａ．関節炎及び慢性炎症性疾患
ｂ．眼の疾患
ｃ．子宮内膜症
３．マラリア
４．複合療法
５．ＨＧＦアイソフォーム活性の評定
Ｏ．実施例。
【００２９】
Ａ．定義
特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての専門的及び技術的な用語は本発明が属する当該分野の当業者が共通して理解しているものと同様の意味を有する。本明細書の開示全体を通じて言及する全ての特許、特許出願、公開された出願及び公開物、ＧＥＮＢＡＮＫ配列、ウエブサイト及び他の公開された資料は特段の記載が無い限り参照により全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載する用語に関して複数の定義がある場合は本セクションにおけるものが優先するものとする。ＵＲＬ又は他のそのような識別子又はアドレスに言及する場合は、その表な識別子は変更される場合があり、そしてインターネット上の特定の情報は常時変化しているが、等しい情報は知られており、そして例えばインターネット及び／又は適切なデータベースを検索すること等により容易に入手できるものと理解される。それらに関する言及はそのような情報の入手可能性及び公的流布の証拠と見なす。
【００３０】
本明細書においては、リガンドは受容体１つ以上に結合する細胞外の物質、一般的にはポリペプチドである。リガンドは可溶性であることができ、或いは膜貫通蛋白であることができる。本明細書の目的のためには、リガンドは受容体に結合し、そして受容体によるシグナル伝達を誘導する。
【００３１】
本明細書においては、シグナル伝達とは、例えば、転写因子のような最終調節分子がシグナルに応答して修飾されるまで、一連の中間体分子を経由してシグナルを転移させる膜貫通細胞表面受容体によるリガンドの結合の結果としての蛋白ホスホリル化のような一連の逐次的事象を指す。シグナル伝達によりトリガーされる応答は特定の遺伝子の活性化を包含する。遺伝子の活性化は更なる作用に繋がるが、その理由は遺伝子は蛋白として発現され、その大部分は酵素、転写因子、又はリガンド−受容体相互作用の生物学的活性の何れか１つ以上を媒介する他の代謝活性調節物質であるためである。
【００３２】
本明細書においては、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）とは有糸分裂誘発、形態形成及び遊走誘発を誘導するＭＥＴ受容体のリガンドを指す。通常はＨＧＦは発生中及び成熟した組織における臓器形成及び組織再生に関与質得る。悪性組織においては、ＨＧＦは腫瘍細胞の侵襲、遊走及び増殖を促進することで腫瘍形成に寄与することにより、癌の進行に寄与する。ＨＧＦは又癌の生育及び拡張及び他の血管形成性の疾患に寄与する血管形成因子である。一例とし、ヒトＨＧＦは、３１アミノ酸シグナルペプチド、アミノ酸３４〜１２４の間にあるＮ末端ドメインアミノ酸１２８〜２０６の間にあるクリングル１ドメイン、アミノ酸２４１〜２８８の間にあるクリングル２ドメイン、アミノ酸３０５〜３８３の間にあるクリングル３ドメイン、アミノ酸３９１〜４６９の間にあるクリングル４ドメイン、及びアミノ酸４９５〜７２８の間にあるセリンプロテアーゼドメインを有する７２８アミノ酸残基のリガンドをコードしている（例えば図２の配列番号３参照）。前駆体蛋白は切断されて６９ｋＤａのα−鎖及び３４ｋＤａのβ−鎖よりなるジスルフィド結合へテロ２量体を形成する単量体である。ＨＧＦ遺伝子は１７イントロンにより中断された１８エクソンよりなる（例えば図１参照）。ＨＧＦの例示されるゲノム配列は配列番号１に記載する通りである。ＨＧＦのオルタナティブスプライシング変異体が存在する。２つの知られたスプライシング変異体であるＮＫ１及びＮＫ２はＮ末端ドメイン、及びクリングル１ドメイン（ＮＫ１）又はクリングル２及びクリングル２ドメイン（ＮＫ２）を含有するトランケーションされたＨＧＦアイソフォームである。ＮＫ１及びＮＫ２はＭＥＴシグナリングの部分的アゴニストである。ＮＫ４と命名されたＨＧＦの操作された変異体がＨＧＦの酵素的切断により形成されており、そして、ＨＧＦ−ＭＥＴシグナリングの拮抗剤である。ＨＧＦは種変異体及び配列番号１に記載するＨＧＦの対立遺伝子変異の何れか１つを包含するＨＧＦの対立遺伝子変異体を包含する。ＨＧＦは又ヒト以外の異なる種、例えばウシ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウマ又はその他においても識別されている。ＨＧＦの例示される種変異体は配列番号２４６〜２５１の何れか１つに記載の通りである。
【００３３】
本明細書においては、細胞表面受容体（ＣＳＲ）は細胞の表面上に発現される蛋白であり、そして典型的には、膜貫通ドメイン又は細胞の表面に自身をアンカリングする他の一部分を包含する。受容体として、それは、シグナル伝達又はリガンド内在化のような細胞表面受容体の活性を媒介するか、それに関与するリガンドに結合する。細胞表面受容体は限定しないが、単一の膜貫通受容体及びＧ蛋白カップリング受容体を包含する。受容体チロシンキナーゼ、例えば成長因子受容体もまた細胞表面受容体に包含される。
【００３４】
本明細書においては、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）とは、蛋白の成長因子受容体ファミリーのメンバーである蛋白、典型的には糖蛋白を指す。成長因子受容体は典型的には細胞成育、細胞分裂、分化、代謝及び細胞遊走を包含する細胞プロセスに関与している。ＲＴＫはまた細胞増殖、分化及び細胞消長の決定並びに腫瘍生育に関与していることがわかっている。ＲＴＫは細胞外ドメイン、膜スパニング（膜貫通）ドメイン及び細胞内チロシンキナーゼドメインを包含する保存されたドメイン構造を有する。典型的には、細胞外ドメインはポリペプチド成長因子又は細胞膜関連分子又は他のリガンドに結合する。チロシンキナーゼドメインは受容体の正及び負の調節に関与している。例示されるＲＴＫはＭＥＴ受容体である。
【００３５】
ＲＴＫの２量体化は受容体の触媒的チロシンキナーゼドメイン及びチロシンの自己ホスホリル化を活性化する。キナーゼドメインにおける自己ホスホリル化はチロシンキナーゼドメインを活性化された状態に維持する。蛋白の他の領域の自己ホスホリル化は他の細胞蛋白との受容体の相互作用に影響する。一部のＲＴＫにおいては、細胞外ドメインへのリガンドの結合は受容体の２量体化をもたらす。一部のＲＴＫにおいては、受容体はリガンドの非存在下に２量体化できる。２量体化は又受容体の過剰発現によっても増大させることができる。
【００３６】
本明細書においては、アイソフォームとは相当する蛋白と比較した場合にアイソフォームのアミノ酸配列及びコードされるポリペプチドにおける相違のために同種の蛋白の完全長の野生型（優勢な）の形態と比較して改変されたポリペプチド構造を有する蛋白を指す。本明細書の目的のためには、アイソフォームは細胞表面受容体（ＣＳＲ）のアイソフォーム及びＣＳＲのリガンドのアイソフォームを包含する。一般的に本明細書に記載するアイソフォームは蛋白の優勢な形態の酵素活性のような活性又は蛋白の構造を改変するために十分なドメイン又はその一部分を欠いている（か又は挿入を含むか、その両方である）。本明細書で改変された活性を有するアイソフォームに言及する場合は、蛋白の完全長又は優勢な形態と比較した場合のアイソフォームの異なる構造又は配列に起因する活性における改変を指す。アイソフォームに言及する場合、活性の改変とは、特定のアイソフォームと優勢な又は野性型の形態との間の活性の相違を指す。活性の相違は活性の増強又は低減を包含する。１つの実施形態において、活性の改変は活性の低減であり；低減は受容体の野生型及び／又は優勢な形態と比較して少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５又は１０倍であることができる。典型的には、活性は５、１０、２０、５０、１００又は１０００倍以上低減する。例えば、リガンドは受容体に結合でき、そして、シグナル伝達を開始するか、それに関与する。
【００３７】
本明細書においては、リガンドアイソフォームとはリガンドの野生型又は優勢な形態のポリペプチドと比較してドメイン又はドメインの一部分を欠いているか、又は、アミノ酸１つ以上の挿入等によるドメインの崩壊を有するリガンドを指す。典型的には、そのようなアイソフォームは同種の受容体をコードする遺伝子のオルタナティブスプライシング変異体によりコードされる。本明細書に記載するリガンドアイソフォームに包含されるものは、受容体に結合できるがシグナル伝達を開始しないもの、又は低減されたレベルのシグナル伝達を開始するものである。そのようなリガンドアイソフォームはリガンド拮抗剤として作用し、そして野生型リガンドと比較してアゴニストとしては低減された活性を保有している。リガンドアイソフォームは一般的にリガンドの野生型完全長及び／又は優勢な形態の活性を改変するために十分なドメイン又はその一部分を欠いており、及び／又はその受容体の活性をモジュレートし、及び／又はドメインとしての構造的特徴を欠いている。そのようなリガンドアイソフォームはまた挿入及び再配列を包含する。リガンドアイソフォームは相当する野生型リガンドからは改変された活性を示すものを包含し；例えばアイソフォームはそれが受容体の２量体化を誘導することができないようにリガンドのドメインの改変を包含することができる。そのような例において、アイソフォームはその受容体に対して完全長野生型リガンドと結合において競合できるが、受容体によるシグナリングは低減又は抑制できる。一般的に活性はリガンドの野生型及び／又は優勢な形態と比較して少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５又は１０倍、アイソフォームにおいては改変される。典型的には、活性は少なくとも２、５、１０、２０、５０、１００又は１０００倍以上改変される。１つの実施形態において、リガンドアイソフォームによる活性の改変はリガンドの優勢な形態と比較した場合の活性の低減である。
【００３８】
本明細書においては、細胞表面受容体（ＣＳＲ）アイソフォーム、例えば受容体チロシンキナーゼのアイソフォームは、受容体の野生型及び／又は優勢な形態と比較して活性を改変又はモジュレートするために十分なドメイン又はその一部分を欠いているか、又はドメインのような構造的特徴を欠いている。ＣＳＲアイソフォームは受容体からは改変された生物学的活性１つ以上を有するアイソフォームを包含することができ；例えばアイソフォームは受容体の正の作用を示す調節ポリペプチドから受容体の負の作用を示す調節ポリペプチドに、例えば受容体ドメインをリガンドとするように、アイソフォームを改変するｐ１８５−ＨＥＲ２の細胞外ドメインの改変を包含できる。一般的に、活性は受容体の野生型及び／又は優勢な形態と比較して少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５又は１０倍、アイソフォームにおいては改変される。典型的には、活性は少なくとも２、５、１０、２０、５０、１００又は１０００倍以上改変される。１つの実施形態において、活性の改変は活性の低減である。
【００３９】
本明細書においては、イントロン融合蛋白はドメイン１つ以上又はドメイン１つ以上の一部分を欠いているアイソフォームを指す。更に又、イントロン融合蛋白はエクソンコドンに作動可能に連結した終止コドンを包含するコドン（蛋白の優勢な、又は野性型の形態を参照）１つ以上を含有する核酸分子によりコードされる。イントロン部分は終止コドンであることができ、これによりエクソンイントロン接合部において終止するイントロン融合蛋白をもたらす。イントロン融合蛋白の活性は典型的には、一般的にイントロンアミノ酸残基のトランケーション、欠失及び／又は挿入のために、優勢な形態とは異なっている。このような活性は受容体との相互作用の変化、又は同時刺激性の受容体又はリガンド、受容体リガンド又はコファクター又は受容体活性の他のモジュレーターとの相互作用における相違のために生じる間接的変化を包含する。細胞又は組織から単離された、又は細胞又は組織から単離されたそのようなポリペプチドの配列を有するイントロン融合蛋白は、「天然」である。天然に存在しないがイントロンへの分子の連結により合成又は製造されるものは、「合成」又は「組み換え」又は「コンビナトリアル」と称される。イントロン融合蛋白に包含されるものは、ドメイン１つ以上又はドメイン１つ以上の一部分を欠いていることにより、同種の受容体又はリガンドの活性の改変が、イントロン融合蛋白とその受容体又はリガンドとの間の相互作用又は他の相互作用を介してもたらされているＣＳＲアイソフォーム又はリガンドアイソフォームである。一般的にそのようなアイソフォームはＣＳＲ又はリガンド遺伝子によりコードされる野生型又は優勢な形態と比較して短鎖化されている。しかしながらそれらはエクソン部分において挿入又は他の修飾を包含でき、そしてそのため、優勢な形態と同じ大きさ又はより大型のものとなることができる。しかしながら各々は、エクソンの末端におけるＣＳＲ又はリガンドアイソフォームのトランケーション、又は、イントロンによりコードされるアミノ酸１、２、３、４、５、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５以上の付加のいずれかをもたらす、イントロンコード部分に由来する少なくとも１つのコドン（終止コドンを包含する）を包含する核酸分子によりコードされる。
【００４０】
イントロン融合蛋白は、オルタナティブスプライシングされたＲＮＡによりコードされるか、及び／又は、例えばインシリコで識別されたＲＮＡ分子から、潜在的スプライシング部位を識別すること、そして次に組み換え法によりそのような分子を製造することにより、合成により製造することができる。典型的には、イントロン融合蛋白は、相当するポリペプチドの野生型又は優勢な形態をコードするＲＮＡの相当する配列中に存在しないイントロン融合蛋白コードＲＮＡにおける終止コドン１つ以上の存在により、短鎖化される。イントロンがエクソン部分とインフレームにオープンリーディングフレームを包含する場合は、イントロンコード部分はポリペプチドに挿入できる。アミノ酸及び／又は終止コドンの付加は、ポリペプチドの野生型又は優勢な形態とは大きさ及び配列において異なっているイントロン融合蛋白をもたらす。
【００４１】
本明細書の目的のためのイントロン融合蛋白は、天然、コンビナトリアル及び合成のイントロン融合蛋白を包含する。天然のイントロン融合蛋白とは、遺伝子のエクソン１つ以上によりコードされるポリペプチドの部分１つ以上に連結したイントロンによりコードされるアミノ酸１つ以上を含有するオルタナティブスプライシングされたＲＮＡ分子によりコードされるポリペプチドを指す。オルタナティブスプライシングされたｍＲＮＡは単離されるか、又は、遺伝子内でスプライシングドナーとアクセプター部位を連結することにより、合成により製造できる。天然のイントロン融合蛋白はアミノ酸１つ以上を含有するか、又はイントロンが第１のコドンとして終止コドンを含有するためにエクソン−イントロン接合部においてトランケーションされる。天然のイントロン融合蛋白は一般的に細胞及び／又は組織中に存在する。イントロン融合蛋白は、例えば、スプライシングドナー及びアクセプター部位を識別すること及び可能なコードされたスプライシング変異体を識別することにより、遺伝子によりコードされる配列に基づいて、合成により製造することができる。コンビナトリアルなイントロン融合蛋白とはポリペプチドの野生型又は優勢な形態と比較して短鎖化されているポリペプチドを指す。典型的には、短鎖化により、活性が改変されるように、ポリペプチドから１つ以上のドメイン又はその一部分が除去される。コンビナトリアルなイントロン融合蛋白は同じ遺伝子から誘導された、又は、関連する遺伝子ファミリーにおける遺伝子から誘導された、天然のイントロン融合蛋白中で欠失している１つ以上のドメイン又はその一部分において、天然のイントロン融合蛋白を模倣している場合が多い。天然に存在しないが、結果として生じるコンストラクトがＣＳＲの活性をモジュレートするようにイントロンに分子を連結することにより合成又は製造されるものは、「合成」とされる。
【００４２】
本明細書においては、イントロン融合蛋白又はＣＳＲ又はリガンドアイソフォームに言及する場合の天然とは、動物のゲノム内においてコードされている、及び／又は、動物において生産又は形成されるか、又は、遺伝子から生産できる何れかの蛋白、ポリペプチド又はペプチド又はそのフラグメント（適切なスプライシングアクセプター／ドナー部位の存在による）を指す。天然のイントロン融合蛋白は対立遺伝子変異体及び種変異体を包含する。イントロン融合蛋白は翻訳後修飾できる。
【００４３】
本明細書においては、エクソンとはＲＮＡに転写され、そしてスプライシング及び他のＲＮＡプロセシングの後にｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）のようなＲＮＡの成熟した形態となるヌクレオチドの配列を含有する核酸分子を指す。ｍＲＮＡは作動可能に連結したエクソン１つ以上を含有する。エクソンはポリペプチド又はポリペプチドの一部分をコードできる。エクソンは又翻訳されていない配列、例えば翻訳調節配列を含有できる。エクソン配列は遺伝子ファミリーメンバーの間で保存されており、相同性を呈する場合が多い。
【００４４】
本明細書においては、イントロンとは、ＲＮＡ内に転写され、そして次に典型的にはスプライシングによりＲＮＡから取り外されてＲＮＡの成熟した形態、例えばｍＲＮＡを生じさせるヌクレオチドの配列を指す。典型的には、イントロンのヌクレオチド配列は成熟したＲＮＡ内へは取り込まれず、又、典型的にはイントロンの配列又はその一部分が翻訳又はポリペプチドに取り込まれたりもしない。スプライシングシグナル配列、例えばスプライシングドナー及びアクセプターはＲＮＡからイントロンを除去するために細胞のスプライシング機序により使用される。１つのスプライシング変異体中のイントロンは別の変異体におけるエクソンとなりえる（即ちスプライシングされた転写物内に存在する）ことに留意しなければならない。従って、イントロン融合蛋白をコードするスプライシングされたｍＲＮＡはエクソン及びイントロンを包含できる。
【００４５】
本明細書においては、スプライシングとはｍＲＮＡ中のイントロンが除去されエクソンが作動可能に連結することによりメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が生じるような、ＲＮＡ成熟化のプロセスを指す。
【００４６】
本明細書においては、オルタナティブスプライシングとは遺伝子から複数のｍＲＮＡを形成するプロセスを指す。オルタナティブスプライシングは遺伝子の全量未満のエクソンを作動可能に連結すること、及び／又は遺伝子から誘導された全ての転写物中には存在しない１つ以上の交互のエクソン又はイントロンを作動可能に連結することを包含できる。
【００４７】
本明細書においては、エクソンの欠失とはポリペプチドの野生型又は優勢な形態をコードするＲＮＡ分子と比較して少なくとも１つのエクソンを欠いている核酸分子を生産するオルタナティブＲＮＡスプライシングの事象を指す。欠失したエクソンを有するＲＮＡ分子はそのようなオルタナティブスプライシングにより、又は、何れかの他の方法、例えばエクソンを欠失させるインビトロの方法により生産できる。
【００４８】
本明細書においては、エクソン挿入とは、ポリペプチドの野生型又は優勢な形態をコードするＲＮＡ分子中に典型的には存在しないエクソン少なくとも１つを含有する核酸分子を生産するオルタナティブＲＮＡスプライシングの事象を指す。挿入されたエクソンを有するＲＮＡ分子はそのようなオルタナティブスプライシングにより、又は、何れかの他の方法、例えばエクソンを付加又は挿入させるインビトロの方法により生産できる。
【００４９】
本明細書においては、エクソン伸長とは、ポリペプチドの野生型又は優勢な形態をコードするＲＮＡ中の相当するエクソンよりも長さ（エクソン中に含有されるヌクレオチドの数）において高値であるエクソン少なくとも１つを含有する核酸分子を生産するオルタナティブＲＮＡスプライシングの事象を指す。伸長されたエクソンを有するＲＮＡ分子はそのようなオルタナティブスプライシングにより、又は、何れかの他の方法、例えばエクソンを伸長させるインビトロの方法により生産できる。一部の場合においては、本明細書に記載する通り、エクソン伸長により生産されたｍＲＮＡはイントロン融合蛋白をコードする。
【００５０】
本明細書においては、エクソントランケーションとはポリペプチドの野生型又は優勢な形態をコードするＲＮＡ分子中の相当するエクソンと比較してエクソン１つ以上が長さ（ヌクレオチドの数）において低値となるようにエクソン１つ以上のトランケーション又は短鎖化を含有する核酸分子を生産するオルタナティブＲＮＡスプライシングの事象を指す。トランケーションされたエクソンを有するＲＮＡ分子はそのようなオルタナティブスプライシングにより、又は、何れかの他の方法、例えばエクソンをトランケーションするインビトロの方法により生産できる。
【００５１】
本明細書においては、イントロン保持とはエクソン１つ以上に作動可能に連結したイントロン又はその一部分を含有する核酸分子を生産するオルタナティブＲＮＡスプライシングの事象を指す。イントロン又はその一部分（一般的に終止コドンのみを包含する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のコドンをコードするイントロン部分）を保持するＲＮＡ分子はそのようなオルタナティブスプライシングにより、又は、何れかの他の方法、例えば保持されたエクソンを有するＲＮＡ分子を製造するインビトロの方法により生産できる。一部の場合においては、本明細書に記載する通り、イントロン保持により生産されたｍＲＮＡはイントロン融合蛋白をコードする。
【００５２】
本明細書においては、遺伝子配列とも称する遺伝子とは少なくとも１つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含するＲＮＡ内に転写されるヌクレオチドの配列（イントロン及びエクソン）を指す。遺伝子はＲＮＡの転写及びプロセシングを調節するヌクレオチドの配列を包含する。遺伝子は又、プロモーター及びエンハンサーのようなヌクレオチドの調節配列、及び、翻訳調節配列を包含する。
【００５３】
本明細書においては、本明細書に記載するコードされたポリペプチドを参照する場合の同種の遺伝子とは、優勢なポリペプチドをコードし、そして特定のアイソフォームと同じ遺伝子である遺伝子配列を指す。本明細書の目的のためには、同種の遺伝子は天然の遺伝子又は組み換えＤＮＡ手法の使用等により合成される遺伝子を包含できる。一般的に、同種の遺伝子はまた特定の細胞又は組織の優勢な形態である。
【００５４】
本明細書においては、スプライシング部位はイントロンの除去及び／又はエクソンの連結に関与する遺伝子内のヌクレオチド１つ以上を指す。スループット部位はスプライシングアクセプター部位及びスプライシングドナー部位を包含する。
【００５５】
本明細書においては、オープンリーディングフレームとは機能的ポリペプチド又はその一部分、典型的には少なくとも約５０アミノ酸をコードするヌクレオチドの配列を指す。オープンリーディングフレームは完全長のポリペプチド又はその一部分をコードできる。オープンリーディングフレームは、終止コドンがイントロンにあり、そしてイントロンの全て又は一部分が転写されたｍＲＮＡにある場合に、１つ以上のエクソン又はエクソンとイントロンを作動可能に連結することにより形成できる。
【００５６】
本明細書においては、ポリペプチドとは共有結合したアミノ酸２つ以上を指す。「ポリペプチド」及び「蛋白」という用語は本明細書においては互換的に使用する。
【００５７】
本明細書においては、核酸分子又は蛋白の短鎖化を参照する場合のトランケーション又は短鎖化とは、蛋白又は核酸分子の野生型又は優勢な形態と比較して完全長未満であるヌクレオチド又はアミノ酸の配列を指す。
【００５８】
本明細書においては、レファレンス遺伝子とは遺伝子内のイントロン及びエクソンをマッピングするために使用できる遺伝子を指す。レファレンス遺伝子は遺伝子内のイントロン及びエクソンをマッピングするために例えば発現された遺伝子配列と比較することができるゲノムＤＮＡ又はその一部分であることができる。レファレンス遺伝子は又、ポリペプチドの野生型又は優勢な形態をコードする遺伝子であることができる。
【００５９】
本明細書においては、未成熟終止コドンはポリペプチドの野生型又は優勢な形態のような蛋白の完全長の形態を生成又は発生させるために使用される終止コドンよりも前の配列のオープンリーディングフレーム内に生じた終止コドンである。未成熟終止コドンの出現は例えばオルタナティブスプライシング及び突然変異の結果である場合がある。
【００６０】
本明細書においては、発現された遺伝子配列とは、遺伝子から転写された、又は転写されたと予測されるヌクレオチドの何れかの配列を指す。発現された遺伝子配列は、限定しないが、ｃＤＮＡ、ＥＳＴ、及び、例えばスプライシング部位の推定及びスプライシングされた配列のインシリコの形成に基づいた発現配列のインシリコの推定を包含する。
【００６１】
本明細書においては、発現された配列タグ（ＥＳＴ）は発現された遺伝子配列から形成されたヌクレオチドの配列である。ＥＳＴはｍＲＮＡの集団を用いてｃＤＮＡを製造することにより形成される。ｃＤＮＡ分子は例えばｍＲＮＡ上に存在するポリＡテールからプライミングすることにより製造できる。ｃＤＮＡ分子は又、ｍＲＮＡにおいて内在的にｃＤＮＡ合成をプライミングするオリゴヌクレオチド１つ以上を用いたランダムプライミングにより製造できる。形成されたｃＤＮＡ分子を配列決定し、そして配列は典型的にはデータベース中に格納される。ＥＳＴデータベースの例はｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｂＥＳＴにおいてオンラインで知ることができるｄｂＥＳＴである。各ＥＳＴ配列は典型的には独特の識別子を割り付けられ、そして情報、例えばヌクレオチドの配列、長さ、発現される組織型、及び他の関連データが識別子に関連付けられる。
【００６２】
本明細書においては、本明細書に記載するアイソフォームを参照する場合の同種のリガンドとは特定のアイソフォームと同じ遺伝子によりコードされるリガンドを指す。一般的に、同種のリガンドは又、特定の細胞又は組織における優勢な形態である。
【００６３】
本明細書においては、野生型の形態、例えばポリペプチドの野生型の形態とは、遺伝子によりコードされるポリペプチドを指す。典型的には、野生型の形態とは、機能又は構造を改変する突然変異又は他の修飾を伴わない遺伝子（又はそれから誘導されたＲＮＡ又は蛋白）を指し；野生型の形態には種内及び種間の対立遺伝子変異が包含される。
【００６４】
本明細書においては、優勢な形態、例えばポリペプチドの優勢な形態とは、遺伝子から生産された主要なポリペプチドであるポリペプチドを指す。「優勢な形態」とは原料毎に変動する。例えば、異なる細胞又は組織の型は、例えばオルタナティブスプライシングにより、及び／又はオルタナティブ蛋白プロセシングにより、ポリペプチドの異なる形態を製造できる。各細胞又は組織の型において、異なるポリペプチドが「優勢な形態」であることができる。
【００６５】
本明細書においては、ドメインとは、構造モチーフ１つ以上よりなる蛋白内で独立して折畳構造（例えばアルファヘリックス及び／又はベータ鎖がループ領域により連結されたものの組み合わせ）を形成できる、及び／又はキナーゼ活性のような機能的活性により認識される、ペプチド鎖の一部分（典型的には３以上、一般的に５又は７以上のアミノ酸の配列）を指す。蛋白は１つ又は１つより多い、区別されたドメインを有することができる。例えば、ドメインはその中の配列の関連ファミリーメンバーに対する相同性、例えば細胞外ドメインを定義するモチーフとの相同性により、識別、定義又は区別されることができる。別の例においては、ドメインはその機能により、例えば酵素活性、例えばキナーゼ活性、又は生体分子と相互作用する能力、例えばＤＮＡ結合、リガンド結合及び２量体化により、区別することができる。ドメインが独立して、又は他の分子と融合した状態で、活性、例えば蛋白分解活性又はリガンド結合を発揮することができるように、ドメインは独立して生物学的機能又は活性を示すことができる。ドメインはポリペプチド由来のアミノ酸の直鎖配列又はアミノ酸の非直鎖配列であることができる。多くのポリペプチドが複数のドメインを含有する。例えば受容体チロシンキナーゼは典型的には細胞外ドメイン、膜スパニング（膜貫通）ドメイン及び細胞内チロシンキナーゼドメインを包含する。
【００６６】
本明細書においては、ドメインの全て又は一部分を欠いているポリペプチドとは、同種のポリペプチドと比較してドメインの１つ以上のアミノ酸又は全てのアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを指す。ドメインの全て又は一部分を欠いているポリペプチドにおいて欠失しているアミノ酸は同種のポリペプチドのドメイン内において隣接しているアミノ酸であることができるが、必ずしも隣接している必要はない。ドメインの全て又は一部分を欠いているポリペプチドは変化、例えば同種のポリペプチドの活性と比較した場合のポリペプチドの活性の消失又は低下、又は同種のポリペプチドと比較した場合のポリペプチド内の構造の消失又は付加を呈することができる。
【００６７】
本明細書においては、ドメインの一部分、例えばクリングルドメイン、即ちＫ４又はセリンプロテアーゼ、即ちＳｅｒＰは、ドメインの少なくとも１つのアミノ酸、典型的には２、３、４、５、６、８、１０、１５以上のアミノ酸、ただしドメインを構成するアミノ酸の全てよりは少数を包含する。例えば、同種のリガンドがクリングルドメインを有する場合は、クリングルドメインの全て又は部分を書いているリガンドアイソフォームポリペプチドは同種のリガンドにおける同じアミノ酸の位置に相当するアミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のアミノ酸の欠失を有することができる。そのような部分を含有する本明細書に記載する何れかのアイソフォームは所望の活性、例えば細胞表面受容体の活性のモジュレーションを示す。
【００６８】
本明細書においては、ドメインを含有するポリペプチドとは同種のリガンドの相当するドメインを参照する場合に完全なドメインを含有するポリペプチドを指す。完全なドメインは同種のポリペプチド内のその特定のドメインの定義を参照しながら決定される。例えば、ドメインを含むリガンドアイソフォームとは同種のリガンドに存在るような完全なドメインに相当するドメインを含有するアイソフォームを指す。同種のリガンドが例えばアミノ酸位置２４１〜２８８に４７アミノ酸のクリングルドメインを含有する場合、そのようなクリングルドメインを含むリガンドアイソフォームは同種のリガンドの４７アミノ酸ドメインと実質的な同一性を有する４７アミノ酸ドメインを含有する。実質的な同一性とは同種のリガンドのドメインと比較した場合に対立遺伝子変異及び保存的置換を含有できるドメインを指す。実質的に同一であるドメインは同種のリガンドのドメインと比較した場合にアミノ酸の欠失、非保存的置換又は挿入を有さない。ドメイン（即ちクリングルドメイン、セリンプロテアーゼドメイン）は頻繁には特定の蛋白におけるドメインとの構造及び／又は配列の相同性により識別される。
【００６９】
そのようなドメインはそれを識別することができる当業者の知る通りである。本明細書における例示のためには、定義を示すが、名称により特定のドメインを認識することは当業者のよく知る通りであると理解される。必要に応じて適切なソフトウエアを使用してドメインを識別することができる。
【００７０】
本明細書においては、Ｎ末端ドメインはドメインのＰＡＮモジュールスーパーファミリーに属し、これはまた血漿中プレカリクレイン／凝固因子ＸＩファミリーのアップルドメイン及び種々の線虫蛋白のドメインを包含する。ＰＡＮドメインモジュールは３つのジスルフィド架橋の保存されたコアを含有する。ファミリーの一部のメンバーにおいては、ドメインのＮ及びＣ末端を連結する追加的な第４のジスルフィド架橋が存在する。ドメインは多様な蛋白に存在する。一部においては、ドメインは蛋白−蛋白相互作用を媒介し、他のものにおいては蛋白−炭水化物相互作用を媒介する。ＨＧＦはＭＥＴ受容体及びヘパリン分子に結合するＮ末端ドメインを含有する。ＨＧＦのＮ末端ドメインの構造は２つのジスルフィド架橋により安定化される特徴的なヘアピンループ構造を含有する。
【００７１】
本明細書においては、クリングルドメインは約８０アミノ酸を含有し、そして、３つの内在ジスルフィド結合及び追加的な保存された残基により定義される特徴的な折畳パターンを有する。一般的に、クリングルドメインは蛋白−蛋白相互作用に関与している。配列番号３に記載するものとして本明細書に記載する例示ＨＧＦは４つのクリングルドメインを含有する。
【００７２】
本明細書においては、セリンプロテアーゼドメインとは一般的に共通の閉鎖型ベータバレル構造を共有するペプチダーゼの大きな群を指す。典型的には、プロテアーゼドメインはプロテアーゼの触媒活性部分である。蛋白のプロテアーゼドメインは、例えばその触媒中心のような、その蛋白分解活性のために必要なその蛋白の不可欠特性の全てを含有する。セリンプロテアーゼの触媒中心は３つのアミノ酸、即ちアスパラギン酸、ヒスチジン及びセリンの触媒３要素である。本明細書に記載する例示ＨＧＦにおいては、触媒３要素における残基は、蛋白が蛋白分解活性を有さないように突然変異している。
【００７３】
本明細書においては、対立遺伝子変異体又は対立遺伝子変異とは、集団内の遺伝子のレファレンス形態とは異なる遺伝子によりコードされるポリペプチドを指す（即ち対立遺伝子によりコードされる）。典型的には、遺伝子のレファレンス形態は種のある集団又は単一のレファレンスメンバー由来のポリペプチドの野生型の形態及び／又は優勢な形態をコードする。典型的には、対立遺伝子変異体は同じ種由来の野生型及び／又は優勢な形態と少なくとも８０％、９０％、９５％以上のアミノ酸同一性を有する。
【００７４】
本明細書においては、種変異体とは種間及び種内における同じポリペプチドの変異体を指す。一般的に、種間対立遺伝子変異体は他の種の野生型及び／又は優勢な形態と少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の同一性、例えばポリペプチドの野生型及び／又は優勢な形態と９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有する。
【００７５】
本明細書においては、修飾とはポリペプチドのアミノ酸の配列又は核酸分子のヌクレオチドの配列の修飾を指し、そして、それぞれアミノ酸及びヌクレオチドの欠失、挿入及び交換を包含する。
【００７６】
本明細書においては、指定された（ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ）とは、レファレンス又は比較の点としてン分子又はその部分の選択を指す。例えばドメインは選択されたドメイン内において修飾されるポリペプチドを構築する目的のために指定されたドメインとして選択できる。他の例においては、あるイントロンは、選択されたイントロンを包含又は排除するＲＮＡ転写物を識別する目的のために指定されたイントロンとして、選択することができる。
【００７７】
本明細書においては、アゴニストとは受容体による最大の応答を誘発する分子を指す。
【００７８】
本明細書においては、部分的アゴニストとは受容体による応答を誘発するが、得られる最大応答はアゴニストのものよりも低値である分子を指す（例えば生理学的リガンド）。
【００７９】
本明細書においては、拮抗剤又は競合的拮抗剤とは、自身が受容体の活性化をもたらすことなく受容体結合に関して野生型又は優勢なリガンドと競合する分子を指す。
【００８０】
本明細書においては、リガンド拮抗剤とはＣＳＲとのリガンドの相互作用から生じる活性に拮抗するアイソフォームの活性を指す。
【００８１】
本明細書においては、抑制する及び抑制とは、未抑制の活性と相対比較して生物学的活性のような活性の低下を指す。
【００８２】
本明細書においては、活性とはポリペプチドのような生物学的分子の機能又は機能呈示又は変化又は相互作用を指す。限定することなく例示すれば、そのような活性は、複合体形成、２量体化、多量体化、受容体関連キナーゼ活性又は他の酵素又は触媒活性、ホスホリル化、脱ホスホリル化、自己ホスホリル化、他の分子と複合体を形成する能力、リガンド結合、触媒又は酵素活性、活性化、例えば自己活性化及び他のポリペプチドの活性化、他の分子の機能の抑制又はモジュレーション、シグナル伝達及び／又は細胞応答の刺激又は抑制、例えば細胞増殖（有糸分裂誘発）、遊走（遊走誘発）、分化（形態形成）、血管形成、生育、分解、膜局在、膜結合及び腫瘍形成性に関わるものである。活性は本明細書に記載する試験により、そして、当該分野で知られた何れかの適当な試験、例えば限定しないが、インビトロ試験、例えば細胞系試験、インビボ試験、例えば特定の疾患に関する動物モデルにおける試験により評価することができる。生物学的活性とはインビボで示される活性を指す。本明細書の目的のためには、生物学的活性とは本明細書に記載するポリペプチドにより示される活性の何れかを指す。
【００８３】
本明細書においては、複合体形成とは蛋白２分子のような分子２個以上の相互作用により複合体が形成されることを指す。相互作用は非共有結合及び／又は共有結合によるものであることができ、そして限定しないが、疎水性及び静電性の相互作用、ファンデルワールス力及び水素結合を包含する。一般的に、蛋白−蛋白相互作用は疎水性相互作用及び水素結合が関与するものである。複合体形成は環境条件、例えば温度、ｐＨ、イオン強度及び圧力、並びに蛋白濃度により影響される場合がある。
【００８４】
本明細書においては、２量体化とは受容体の２分子のような同じ型の２分子の相互作用を指す。２量体化は２つの同一の分子が相互作用するホモ２量体化を包含する。２量体化は又、２つの異なる分子、例えばある受容体の２つのサブユニットのヘテロ２量体化、及び、２つの異なる受容体分子の２量体化を包含する。典型的には、２量体化には各分子内に含有される２量体化ドメインの相互作用を介して各々互いに相互作用する２分子が関与している。
【００８５】
本明細書においては、有糸分裂誘発とはある薬剤が有糸分裂及び細胞増殖を誘導するプロセスを指す。
【００８６】
本明細書においては、遊走誘発とは細胞の移動又は遊走を調節するプロセスを指し、そして一般的に一箇所から他の場所への細胞の集団の移動が調節されることを意味する。
【００８７】
本明細書においては、形態形成とは細胞、組織又は臓器の分化及び成長を指す。分化は臓器形成の場合のように、臓器又は部分の構造の形成の間に起こる場合がある。分化は又、細胞がより特殊化された形態又は機能に向けて変化を起こしている場合のように、細胞レベルにおいて起こる場合もある。
【００８８】
本明細書においては、血管形成とは新しい血管の形成を指す。
【００８９】
本明細書においては、「抗血管形成」又は「血管抑制性」の分子とは血管形成を抑制する分子を指す。
【００９０】
本明細書においては、モジュレート又はモジュレーションとは蛋白のような分子の活性の変化を指す。例示される活性は限定しないが、シグナル伝達及び蛋白ホスホリル化のような活性を包含する。モジュレーションは活性の増大（即ちアゴニスト活性のアップレギュレーション）、活性の低減（即ちダウンレギュレーション又は抑制）又は活性における何れかの他の改変（例えば周期性、頻度、持続時間及び動態）を包含する。モジュレーションは状況に応じたものであることができ、そして典型的にはモジュレーションは指定された状態、例えば野生型の蛋白、構成的状態の蛋白、指定された細胞型又は状態において発現される蛋白等と比較される。
【００９１】
本明細書においては、細胞表面受容体の活性をモジュレートすることに言及する場合は、それはＣＳＲ又はリガンドアイソフォームが受容体とある態様において相互作用し、これにより、活性、例えば限定しないがリガンド結合、２量体化及び／又は他のシグナル伝達関連活性が改変されることを意味する。
【００９２】
本明細書においては、改変された活性を有するリガンドアイソフォーム、例えばＨＧＦアイソフォームに言及する場合、これは、ＣＳＲ又はリガンドアイソフォームの同種の受容体又はリガンドと比較した場合の異なる構造又は配列による活性の改変を指す。
【００９３】
本明細書においては、組成物とは何れかの混合物を指す。それは溶液、懸濁液、液体、粉末、ペーストの水性、非水性のもの、又はその何れかの組み合わせであることができる。
【００９４】
本明細書においては、組み合わせとは２つ以上の品目の間又は品目内における何れかの会合を指す。組み合わせは２つ以上の別個の品目、例えば２つの組成物又は２つの収集物であることができ、その混合物、例えば２つ以上の品目の単一の混合物又は何れかのその変形例であることができる。組み合わせの要素は一般的に機能的に関連するか関係付けられる。キットは組み合わせ又はその要素の使用のための説明書を場合により包含する、及び／又は、キットが意図する方法において使用される他の試薬及び容器及び道具及び装置を場合により包含スル、パッケージされた組み合わせである。
【００９５】
本明細書においては、薬学的作用とは疾患又は障害の治療のため、又はその症状の緩解のために意図される薬剤の投与により観察される作用を指す。
【００９６】
本明細書においては、治療とは状態、障害又は疾患又は他の適応症の症状が緩解又は別様に有益に改変される何れかの態様を意味する。
【００９７】
本明細書においては、ＨＧＦの関与する疾患又はＨＧＦ媒介疾患とは、ＨＧＦが役割を果たしており、そのためその活性のモジュレーションが疾患又は疾患の症状の治療に影響するような何れかの疾患を指す。ＨＧＦ媒介疾患に包含されるものは、ＨＧＦ−ＭＥＴシグナリングが関与するＭＥＴ媒介疾患、並びに他のＣＳＲ、例えばＦＧＦＲ又はＶＥＧＦＲによるシグナリングが関与する他の血管形成性の疾患である。そのような疾患の例は、癌及び望ましくない細胞増殖、血管形成及び炎症反応又は応答が関与している他の疾患を包含する。
【００９８】
本明細書においては、治療効果とは疾患又は状態の症状を改変、典型的には改善又は緩解するか、又は、疾患又は状態を治癒させる、対象の治療から得られる効果を意味する。治療有効量とは対象に投与後の治療効果をもたらす組成物、分子又は化合物の量を指す。
【００９９】
本明細書においては、「対象」という用語は人間のような哺乳類を包含する動物を指す。
【０１００】
本明細書においては、患者とはヒト対象を指す。
【０１０１】
本明細書においては、血管形成性の疾患（又は血管形成関連疾患）は血管形成の均衡が改変されるかその時期が改変される疾患である。血管形成性の疾患は血管形成の改変、例えば望ましくない脈管形成が起こるものを包含する。そのような疾患は限定しないが、細胞増殖性の障害、例えば癌、糖尿病性網膜症及び他の糖尿病合併症、炎症性疾患、子宮内膜症及び過剰な脈管形成が疾患プロセスの部分となっている他の疾患、例えば上記したものを包含する。
【０１０２】
本明細書においては、インシリコとはコンピューターを用いて実施される研究及び実験を指す。インシリコの方法は、限定しないが、分子モデリング試験、生体分子ドッキング実験及び分子構造及び／又はプロセス、例えば分子相互作用の仮想的標示を包含する。
【０１０３】
本明細書においては、生物学的試料とは生体又はウィルスの原料又は巨大分子及び生物学的分子の他の原料から得られる何れかの試料を指し、そして核酸又は蛋白又は他の巨大分子の入手元となり得る対象の何れかの細胞型又は組織を包含する。生物学的試料は生物学的原料から直接得られた試料又は処理された試料であることができる。例えば、増幅される単離された核酸は生物学的試料を構成する。生物学的試料は限定しないが、体液、例えば血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿及び汗、動物及び植物由来の組織及び臓器の試料、及び、それらから誘導された処理済試料を包含する。同様に包含されるものは土壌及び水の試料及び他の環境試料、ウィルス、細菌、カビ、藻類、原生動物及びそれらの成分である。
【０１０４】
本明細書においては、巨大分子は数百〜数百万の分子量を有する何れかの分子を指す。巨大分子はペプチド、蛋白、ヌクレオチド、核酸、及び、一般的には生物により合成されるが合成により、又は、組み換え分子生物学の方法を用いても製造できる他のこのような分子を包含する。
【０１０５】
本明細書においては、生物学的分子は天然に存在する何れかの化合物又はその誘導体である。例示される生物学的分子は限定しないが、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、蛋白、ペプチド、アミノ酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、オリゴ糖類及び単糖類を包含する。
【０１０６】
本明細書においては、「核酸」という用語は１本鎖及び／又は２本鎖のポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）並びにＲＮＡ又はＤＮＡの何れかの類縁体又は誘導体を指す。同様に「核酸」という用語に包含されるものは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ及び他のこのような類縁体及び誘導体又はそれらの組み合わせのような核酸の類縁体である。核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドを指すことができる。用語は更に、等価物として、ヌクレオチド類縁体、１本鎖（センス又はアンチセンス）及び２本鎖ポリヌクレオチドから作成したＲＮＡ又はＤＮＡの誘導体、変異体及び類縁体を包含する。デオキシリボヌクレオチドはデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン及びデオキシチミジンを包含する。ＲＮＡについては、ウラシル塩基はウリジンである。
【０１０７】
本明細書においては、「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）及び例えばヌクレオチド類縁体又はホスホジエステル結合以外の「骨格」結合、例えばホスホトリエステル結合、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合、チオエステル結合又はペプチド結合（ペプチド核酸）を含有するＤＮＡ又はＲＮＡの誘導体を包含する、少なくとも２つの連結されたヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体を含有するオリゴマー又は重合体を指す。「オリヌクレオチド」という用語はもまた本明細書においては「ポリヌクレオチド」と本質的に同義に使用されるが、当業者の知る通り、オリヌクレオチド、例えばＰＣＲプライマーは一般的に約５０〜１００ヌクレオチド長より短い。
【０１０８】
ポリヌクレオチドはヌクレオチド類縁体、例えばポリヌクレオチドの質量の差異をもたらす質量修飾ヌクレオチド；ポリヌクレオチドの検出を可能にする蛍光、放射性、ルミネセント又はケミルミネセントの標識のような検出可能な標識を含有するヌクレオチド；又は固体支持体へのポリヌクレオチドの固定化を容易にするビオチン又はチオール基のような反応性の基を含有するヌクレオチドを包含することができる。ポリヌクレオチドは又、例えば化学的、酵素的又は光分解により選択的に切断できる骨格１つ以上を含有できる。例えばポリヌクレオチドは１つ以上のデオキシリボヌクレオチド、それに後続する１つ以上のリボヌクレオチド、それに後続できる１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを包含でき、そのような配列は塩基加水分解によりリボヌクレオチド配列において切断可能である。ポリヌクレオチドは又切断に対して比較的抵抗性である結合１つ以上を含有することができ、例えばキメラオリゴヌクレオチドプライマーが挙げられ、これに含まれることができるものはペプチド核酸結合により連結されたヌクレオチド及び３’末端の少なくとも１つのヌクレオチドであり、これはホスホジエステル結合又は他の適当な結合により連結され、そしてポリメラーゼにより伸長することができる。ペプチド核酸配列は当該分野で良く知られている方法を用いて製造できる（例えばＷｅｉｌｅｒ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２７９２−２７９９（１９９７）参照）。
【０１０９】
本明細書においては、合成とは、合成の配列及び合成の遺伝子に関する場合、組み換え法により、及び／又は、化学合成法により製造された核酸分子を指す。
【０１１０】
本明細書においては、オリゴヌクレオチドとはＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸類縁体、例えばＰＮＡ及びこれ等の組み合わせを包含する重合体を指す。本明細書の目的のためには、プライマー及びプローブは１本鎖オリゴヌクレオチドであるか、又は部分的に１本鎖のオリゴヌクレオチドである。
【０１１１】
本明細書においては、プライマーとは、プライマー伸長産物の合成を開始できる原料となる２つ以上、一般的には３つより多いデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを指す。合成に適する実験条件はヌクレオシドトリホスフェート及び重合と伸長のための物質、例えばＤＮＡポリメラーゼ、及び適当な緩衝液、温度及びｐＨの存在を包含する。
【０１１２】
本明細書においては、組み換えＤＮＡ法を用いることによる組み換え手段による製造とは、クローニングされたＤＮＡによりコードされる蛋白を発現するための分子生物学のよく知られた方法の使用を指す。
【０１１３】
本明細書においては、分子、例えば核酸分子、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド又は抗体に言及する場合の「単離された」とは、分子がその自然環境において存在する状態から人為的に改変されていることを示す。例えば、組み換え宿主細胞により製造され、及び／又はその内部に含有されている分子は、「単離された」と見なされる。同様に、ネイティブの原料又は組み換え宿主細胞から部分的又は実質的に精製されているか、又は、合成法により製造されている分子は、「単離された」と見なされる。意図する用途に応じて、単離された分子は何れかの形態、例えば動物、細胞又はその抽出液中；脱水され、蒸気、溶液又は懸濁液中に、又は固体支持体上に固定化されて存在することができる。
【０１１４】
本明細書においては、「ベクター」という用語は、自身が連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子である。ベクターの１つの型はエピソーム、即ち余剰な染色体の複製が可能な核酸である。ベクターは自己複製及び／又は自身が連結されている核酸の発現が可能なものを包含する。自身が作動可能に連結している遺伝子の発現を指向できるベクターは本明細書においては「発現ベクター」ト称する。一般的に、発現ベクターは「プラスミド」の形態である場合が多く、これは、そのベクター形態において染色体には結合しない一般的には環状の２本鎖ＤＮＡループである。プラスミドがベクターの最も一般的に使用されている形態であるため、「プラスミド」及び「ベクター」は互換的に使用される。発現ベクターの他の形態は等価な機能を発揮し、そして後に当該分野で知られる用になるものを包含する。
【０１１５】
本明細書においては、「トランスジェニック動物」とは、動物の細胞の１つ以上が人的介入により、例えば当該分野で良く知られているトランスジーン手法により導入された異種の核酸を含有する、何れかの動物、一般的に非ヒト動物、例えば哺乳類、鳥類又は両生類を指す。核酸は直接、又は間接的に細胞の前駆体内への導入により、意図的な遺伝子操作により、例えばマイクロインジェクションによるか、又は組み換えウィルスによる乾癬により、細胞内に導入される。この分子は染色体内に安定に組み込まれることができ、即ち、染色体の部分として複製できるか、又は、それは染色体外で複製するＤＮＡであることができる。典型的なトランスジーン動物においては、トランスジーンは細胞に蛋白の組み換え型を発現させる。
【０１１６】
本明細書においては、レポーター遺伝子コンストラクトは転写制御配列に作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を包含する核酸分子である。レポーター遺伝子の転写はこれ等の配列により制御される。これ等の制御配列の少なくとも１つ以上の活性は、直接、又は間接的に、他の分子、例えば細胞表面蛋白、細胞内のシグナル伝達に関与する蛋白又は小分子により調節される。転写制御配列はプロモーター及びプロモーターの活性をモジュレートする他の調節領域、例えばエンハンサー配列、又はＲＮＡポリメラーゼの活性又は効率をモジュレートする制御配列を包含する。このような配列は本明細書においては創傷して転写制御エレメント又は配列と称する。更に又、コンストラクトは形成されるｍＲＮＡの翻訳を改変するヌクレオチドの配列を包含し、これによりレポーター遺伝子産物の量を改変することができる。
【０１１７】
本明細書においては、「レポーター」又は「レポーター部分」とは、目的の分子、例えば細胞により発現される蛋白、又は生物学的粒子の検出を可能にする何れかの一部分を指す。典型的なレポーター部分は、例えば、蛍光蛋白、例えば赤色、青色及び緑色蛍光蛋白（例えばＲｅｎｉｌｌａ種及び他の種由来のＧＦＰを提供する米国特許６，２３２，１０７参照）、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｌａｃＺ遺伝子、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）及び他のこのようなよく知られた遺伝子を包含する。細胞内での発現のためには、本明細書において「レポーター遺伝子」と称するレポーター部分をコードする核酸は目的の蛋白との融合蛋白として、又は目的のプロモーターの制御下に、発現することができる。
【０１１８】
本明細書においては、核酸の配列に言及する場合の「作動可能に連結」という表現は、１本鎖又は２本鎖の形態に関わらずＤＮＡ又はＲＮＡのような核酸の１片内に核酸分子又はそのセグメントが共有結合的に連結されていることを意味する。セグメントは必ずしも隣接しておらず、むしろ２つ以上の要素は、要素がそれらの意図する態様に置いてそれらが機能できるようにする関係にあるように並列している。例えば、ＲＮＡのセグメント（エクソン）はスプライシング等により共有結合的に連結することにより単一のＲＮＡ分子を形成することができる。別の例においては、ＤＮＡセグメントは共有結合的に連結することができ、これにより一方のセグメント上の調節配列の制御がもう一方のセグメントの発現又は複製又は別のそのような制御を制御することができる。即ち、レポーター又は何れかの他のポリヌクレオチドに作動可能に連結した調節領域、又は、調節領域に作動可能に連結したレポーター又は何れかのポリヌクレオチドの場合は、ポリヌクレオチド／レポーターの発現は調節領域により影響又は制御（例えばモジュレート又は改変、例えば増大又は低減）される。遺伝子発現については、ヌクレオチドの配列及び調節配列は適切な分子シグナル、例えば転写活性化蛋白が調節配列に結合した場合に遺伝子発現を制御又は可能にするような態様において連結される。異種核酸、例えばＤＮＡの、ヌクレオチドの調節及びエフェクター配列、例えばプロモーター、エンハンサー、転写及び翻訳の終止部位及び他のシグナル配列への作動可能な連結は、そのようなＤＮＡとそのようなヌクレオチド配列の間の関係を指す。例えば、プロモーターへの異種ＤＮＡの作動可能な連結は、そのようなＤＮＡの転写が、読み枠においてＤＮＡを特異的に認識し、結合し、そして転写するＲＮＡポリメラーゼによりプロモーターから開始されるような、ＤＮＡとプロモーターの間の物理的関係を指す。
【０１１９】
本明細書においては、ポリペプチドのアミノ酸に言及する場合の「作動可能に連結」という用語はアミノ酸の共有結合（直接又は間接）を指す。例えばリガンドをコードする遺伝子のイントロンによりコードされる少なくとも１つのアミノ酸に作動可能に連結したＨＧＦのようなリガンドの少なくとも１つのドメインはリガンド由来のドメインのアミノ酸がリガンド遺伝子由来のイントロンによりコードされるアミノ酸に共有結合的に連結されていることを意味する。典型的にはペプチド結合を介した直接のそのような連結は、例えばリンカーを介するか、又は非ペプチド連結を介して間接的に行うこともできる。従って、細胞表面受容体をコードする遺伝子のイントロンによりコードされる少なくとも１つのアミノ酸に作動可能に連結したリガンドの少なくとも１つのドメインを含有するポリペプチドはイントロン融合蛋白であることができる。そのようなポリペプチドをコードする核酸は、イントロン配列がスプライシングされるか、又は別様に、細胞表面受容体のドメインをコードするエクソン配列にインフレームに共有結合する場合に、製造できる。核酸分子の翻訳は、イントロン配列によりコードされる終止コドンを最小限含有するアミノ酸のイントロンコード部分がリガンドのドメインに共有結合しているポリペプチドを生成する。それらは又、イントロンを含有する部分にエクソンを含有する部分を連結することによる合成による生成が可能であり、その例としては、エクソンがイントロン部分とは異なる、又はその逆であるアイソフォーム、例えば異なるリガンドアイソフォーム又は細胞表面受容体アイソフォームによりコードされているキメライントロン融合蛋白が挙げられる。
【０１２０】
本明細書においては、アイソフォーム及びイントロン融合蛋白のようなポリペプチドの形成に言及する場合の「核酸から形成された」という表現は、ポリペプチド分子の記号通りの形成、及び、アミノ酸の配列への核酸配列の翻訳に由来するポリペプチドのアミノ酸配列の形成を包含する。
【０１２１】
本明細書においては、結合体とは核酸又はポリペプチドが共に連結していることを指す。コンジュゲーションは直接又は間接的に行うことができる。一部の例においては、ペプチドリンカー、制限酵素リンカー、又は他のリンカーのようなリンカーを使用できる。コンジュゲーションはまた化学的に、例えばへテロ二官能性交差結合試薬を用いることにより行うこともできる。
【０１２２】
本明細書においては、交差結合とは共有結合により２つ以上の分子を化学結合させるプロセスを指す。交差結合試薬は蛋白又は他の分子上の特定の官能基（第１アミン、スルヒドリル等）に対する反応性の末端を含有する。交差結合剤はホモ又はへテロ二官能性交差結合剤を包含する。ホモ２官能性交差結合剤は２つの同一の反応性の基を有し、そして頻繁には、蛋白を相互に交差結合するか、又は、第４構造を安定化させるために１工程反応操作法において使用される。ヘテロ二官能性交差結合剤は望ましくない重合又は自己コンジュゲーションを最小限にするために役立つ、逐次的（２段階）コンジュゲーションを可能にする２つの異なる反応性の基を保有する。
【０１２３】
本明細書においては、融合蛋白とは組み換えＤＮＡ手法を介して作成される蛋白を指し、そして、１つの遺伝子の核酸配列の全て又は部分を、他の遺伝子の核酸配列の全て又は部分と作動可能に連結することにより得られる。一部の場合においては、融合は２つ以上の蛋白又はペプチドを含有するキメラ蛋白をコードできる。
【０１２４】
本明細書においては、ポリペプチドに言及する場合の製造とは、発現された蛋白（又は回収可能又は単離可能な発現された蛋白）の発現及び回収を指す。蛋白の製造に影響することができる要因は選択された発現系及び宿主細胞、細胞培養条件、宿主細胞による蛋白の分泌、及び、精製目的のために蛋白を検出する能力を包含する。蛋白の製造は例えば細胞培養培地内への蛋白の分泌を評価することによりモニタリングできる。
【０１２５】
本明細書においては、「進歩した製造」とは対照ポリペプチドの製造と比較してポリペプチドの製造の増大を指す。例えばアイソフォーム融合蛋白の製造を融合蛋白ではない、又は、異なる融合を含有する相当するアイソフォームと比較する。例えばｔＰＡプレ／プロ配列を含有するアイソフォームの製造を、自身の内因性シグナル配列を含有するアイソフォームと比較できる。一般的に、蛋白の製造は、概ね、又は少なくとも、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍又はそれ以上、向上させることができる。典型的には、蛋白の製造は、アイソフォーム融合ではない、又は同じ融合を含有しない相当するアイソフォームと比較して、５、１０、２０、３０、４０、５０倍又はそれ以上向上させることができる。
【０１２６】
本明細書においては、分泌とは外部の細胞環境内に、又は、グラム陰性細菌の場合はペリプラズムの空間内に蛋白が輸送されるプロセスを指す。一般的に分泌は細胞内における分泌経路を介して生じ、例えば真核生物の細胞においては、これには小胞体及びゴルジ体が関与する。
【０１２７】
本明細書においては、「前駆体配列」又は「前駆体ペプチド」又は「前駆体ポリペプチド」とは、プロセシングされ、そして、プロセシング又は切断の前にはポリペプチドの末端、典型的にはアミノ末端に存在する、アミノ酸の配列を指す。前駆体配列は連結されたポリペプチドの分泌及び／又はトラフィッキングを起こすアミノ酸の配列を包含する。前駆体配列は機能的部分１つ以上を包含できる。例えば、プレ配列（シグナルポリペプチド）及び／又はプロ配列を包含できる。ポリペプチドから成熟ポリペプチドへのプロセシングによりポリペプチドからの前駆体配列の切断が起こる。前駆体配列は、それがプレ配列及びプロ配列を包含している場合は、プレ／プロ配列とも称することができる。
【０１２８】
本明細書においては、「プレ配列」、「シグナル配列」、「シグナルペプチド」、「リーダー配列」又は「リーダーペプチド」とは、分泌経路に蛋白をターゲティングし、そして、小胞体膜に転座した後は発生中の鎖から切断される発生中のポリペプチドのアミノ末端における配列を指す。
【０１２９】
本明細書においては、プロ配列とはポリペプチドに連結された場合に、例えば限定しないが、正しい折畳み及び成熟ポリペプチドのジスルフィド結合の形成に寄与すること、プロペプチドの切断時のポリペプチドの活性化に寄与すること、及び／又は認識部位としての寄与等の多様な調節機能を示すことができるプロペプチドをコードする配列を指す。一般的に、プロ配列は分泌の前に細胞内で分解されるが、エキソプロテアーゼにより細胞外で分解される場合もある。一部の例においては、プロ配列は自己触媒的に分解されるが、別の例においては他のポリペプチドプロテアーゼがプロ配列を分解する。
【０１３０】
本明細書においては、相同とは相互に相当し、そして相互に同一であるか、極めて同様である（即ち相同体である）異なる種に由来する核酸分子又はポリペプチドのような分子を指す。
【０１３１】
本明細書においては、異種とは活性又は配列においてユニークである核酸又はポリペプチドのような分子を指す。異種分子は別個の遺伝子原料又は種から誘導できる。本明細書の目的のためには、異種分子は、起源に関わらず、ＣＳＲ又はリガンドアイソフォーム又はその対立遺伝子変異体以外の、蛋白又はポリペプチドである。即ち、ＣＳＲ又はリガンドアイソフォームに異種である分子は、ＣＳＲ又はリガンドアイソフォームから誘導されておらず、それに内因性のものではなく、そしてその配列と相同でもない配列を含有する何れかの分子を包含する。本明細書の目的の異種分子の例は同じか又は異なる種の異なるポリペプチドに由来する分泌シグナル、タグ、例えば融合タグ又は標識、又はＣＳＲアイソフォーム又はリガンドと相同ではなく、自身の配列がこのものと同じではない何れかの他の分子の全て又は部分を包含する。異種分子は融合又はキメラ分子の形成のための目的の核酸又はポリペプチドの配列に融合させることができる。
【０１３２】
本明細書においては、異種分泌シグナルとは、ＣＳＲ又はリガンドアイソフォームのシグナル配列とは配列が異なる同じか又は異なる種に由来するポリペプチドに由来するシグナル配列を指す。異種分泌シグナルはそれの誘導元である宿主細胞において使用でき、或いは、それはシグナル配列の誘導元である細胞とは異なる宿主細胞で使用できる。
【０１３３】
本明細書においては、内因性前駆体配列又は内因性シグナル配列とは、ポリペプチドの全て又は部分に会合している天然に存在するシグナル配列を指す。ＣＳＲ及びリガンドアイソフォームのシグナル配列の大まかな位置は、その相当する同種の受容体又はリガンドシグナル配列に基づけば、当業者の知る通りである。しかしながらシグナルペプチドのＣ末端境界は、典型的にはシグナルペプチドＣ末端境界の何れかの側の約５アミノ酸以下において、変動してよい。シグナル配列を発見し、そしてその切断部位を予測するためのアルゴリズムを入手することができ、そしてそれは当該分野で知られているものである（例えばＣｈｏｕ等、（２００１）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ４２：１３６；ＭｃＧｅｏｃｈ等、（１９８５）Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．３：２７１；ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ等、（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：４６８７を参照できる）。
【０１３４】
本明細書においては、組織プラスミノーゲン活性化物質（ｔＰＡ）とはフィブリン溶解活性を有し、そして典型的には５ドメイン（フィンガー、成長因子、クリングル−１、クリングル−２、及びプロテアーゼドメイン）を有する構造を有する外因性（組織型）プラスミノーゲン活性化物質を指す。哺乳類ｔ−ＰＡはヒトを包含する何れかの動物に由来するｔ−ＰＡを包含する。他の種は、限定しないが、ウサギ、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、ウマ、ネズミ、イヌ、ネコ、ウシ及びヒツジのｔＰＡを包含する。ヒト及び非ヒト種由来の前駆体ポリペプチドを包含するｔＰＡをコードする核酸は当該分野で知られている。
【０１３５】
本明細書においては、ｔＰＡ前駆体とはｔＰＡ由来のプレ配列及びプロ配列を包含するアミノ酸残基の配列を指す（即ちプレ／プロ配列、例えば米国特許６，６９３，１８１及び米国特許４，７６６，０７５参照）。このポリペプチドは天然にｔＰＡと会合しており、そして細胞由来のｔＰＡの分泌を指向するように作用する。ｔＰＡに関わる例示される前駆体配列は配列番号２５３に記載する通りであり、そして配列番号２５２に記載する核酸配列によりコードされている。前駆体配列はシグナル配列（アミノ酸１〜２３）及びプロ配列（アミノ酸２４〜３５）を包含する。プロ配列は２つのプロテアーゼ切断部位を有し、うち１つは残基３２の後方、もう１つは残基３５の後方にある。前駆体配列の例示される種変異体は配列番号２５８〜２６５の何れか１つに記載の通りであり；例示されるヌクレオチド及びアミノ酸の対立遺伝子変異体は配列番号２５６又は２５７に記載する通りである。
【０１３６】
本明細書においては、ｔＰＡ全基体配列の全て又は一部分とは、細胞由来のｔＰＡのプロセシング及び／又は分泌を指向するために十分なｔＰＡ前駆体配列のアミノ酸の何れかの隣接する部分を指す。前駆体配列の全て又は一部分は配列番号２５３に示され、そして配列番号２５２によりコードされる野生型又は優勢なｔＰＡ前駆体配列、配列番号２５７に示されるその対立遺伝子変異体、又は、配列番号２５６〜２６５に示される種変異体の全て又は一部分を包含できる。例えば、配列番号２５３に記載する例示されるｔＰＡ前駆体配列については、ｔＰＡ前駆体配列の一部分はアミノ酸１〜２３、又はアミノ酸２４〜３５、２４〜３２又はアミノ酸３３〜３５、又は配列番号２５３に記載するアミノ酸１〜３５の何れかの他の隣接する配列を包含できる。
【０１３７】
本明細書においては、例えばアイソフォームの活性な部分に言及する場合のポリペプチドの活性な部分とは、活性を有するポリペプチドの一部分を指す。
【０１３８】
本明細書においては、蛋白の精製とは、例えばＤＮＡ、細胞膜及び他の蛋白を包含する細胞及び組織の成分を含有できるホモジネート等から蛋白を単離するプロセスを指す。蛋白は当該分野で知られた種々の方法の何れか、例えばその等電点に応じて段階的ｐＨを有するゲル又はイオン交換カラムを通過させて泳動させることにより、それらのサイズ又は分子量に応じてサイズエクスクルージョンクロマトグラフィーを介するか又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルクロマトグラフィー）分析によるか、又はそれらの疎水性に応じて、精製することができる。他の精製手法は、例えば限定しないが、沈殿又はアフィニティークロマトグラフィー、例えばイムノアフィニティークロマトグラフィー及びこれ等の方法の何れかの組合せを包含する他の手法及び方法を包含する。更に又、精製は分子上のタグ、例えばアフィニティー精製用のｈｉｓタグ又は識別用の検出可能なマーカーを使用することにより容易にすることができる。
【０１３９】
本明細書においては、検出とは蛋白の可視化（眼によるか、装置による）を可能にする方法を包含する。蛋白は蛋白に特異的な抗体を用いて可視化できる。蛋白の検出は又、エピトープタグ又は標識を包含するタグに蛋白を融合させることにより、容易にすることができる。
【０１４０】
本明細書においては、「タグ」とは典型的にはポリペプチドのＮ又はＣ末端に吹かされるアミノ酸の配列を指す。ポリペプチドに融合したタグを包含させることは、ポリペプチドの精製及び／又は検出を容易にすることができる。
【０１４１】
本明細書においては、エピトープタグは、抗体形成の対象となり得るエピトープを与えるには十分であるが、それが融合するポリペプチドの活性を妨害しない程度に十分短い残基を有するアミノ酸の配列を包含する。適当なタグポリペプチドは一般的に少なくとも６アミノ酸残基、通常は約８〜５０アミノ酸残基を有する。
【０１４２】
本明細書においては、標識は標識されたアイソフォームを形成するように、アイソフォームに直接又は間接的に結合体化される検出可能な化合物又は組成物を指す。標識はそれ自体検出可能であるか（例えば放射性同位体方式又は蛍光標識）、又は、酵素標識の場合は、基質化合物の組成物の化学的改変を触媒することができ、それを次に検出する。標識の非限定的な例は蛍光発生部分、緑色蛍光蛋白又はルシフェラーゼを包含する。
【０１４３】
本明細書においては、融合タグポリペプチドはタグポリペプチドに融合されたアイソフォームポリペプチドを含有するキメラポリペプチドを指す。
【０１４４】
本明細書においては、発現とは遺伝子のコードされた情報を細胞内に存在して作動している構造に変換するプロセスを指す。発現された遺伝子はｍＲＮＡに転写させ、その後蛋白に翻訳されるもの、及び、ＲＮＡに転写されるが蛋白に翻訳されないもの（例えば転移及びリボソームＲＮＡ）を包含する。本明細書の目的のためには、発現される蛋白は細胞内部、例えば細胞質内に保持されることができ、又は、細胞から分泌されることができる。蛋白の全発現も挙げられる。
【０１４５】
本明細書においては、融合コンストラクトとは、ある核酸分子に由来するあるコーディング配列及び別の核酸分子由来のコーディング配列を含有する核酸配列を指し、ここで、融合コンストラクトが宿主細胞内で転写及び翻訳される場合に２つの蛋白を含有する蛋白が製造されるようにコーディング配列は同じ読み枠にある。２つの分子はコンストラクト中隣接するか、又は１、２、３以上、ただし典型的には１０、９、８、７、６アミノ酸より少数を含有するリンカーポリペプチドにより分離されていることができる。融合コンストラクトによりコードされる蛋白産物は融合ポリペプチドと称される。
【０１４６】
本明細書においては、アイソフォーム融合蛋白又はアイソフォーム融合ポリペプチドとは、イントロン配列を有するか有さないアイソフォーム由来のコーディング配列、及び、前駆体配列又はエピトープタグのような別のポリペプチドをコードするコーディング配列を含有する核酸分子によりコードされるポリペプチドを指す。核酸は、アイソフォーム融合コンストラクトが転写及び翻訳される場合に、アイソフォームポリペプチドが別のペプチドに直接又はリンカーを介して連結されているアイソフォーム融合ポリペプチドが製造されるように作動可能に連結している。アイソフォームポリペプチドは典型的にはＮ又はＣ末端又は両方において、他のポリペプチド１つ以上に連結している。
【０１４７】
本明細書においては、プロモーター領域とは、それが作動可能に連結しているＤＮＡの転写を制御する遺伝子のＤＮＡの一部分を指す。プロモーター領域はＲＮＡポリメラーゼの認識、結合及び転写の開始のために十分であるＤＮＡの特異的な配列を包含する。プロモーター領域のこの一部分をプロモーターと称する。更に又、プロモーター領域はＲＮＡポリメラーゼのこの認識、結合及び転写開始活性をモジュレートする配列を包含する。これ等の配列はシス作用することができ、或いは、トランス作用因子に応答することができる。プロモーターは調節の性質に応じて構成的であるか、又は調節されることができる。
【０１４８】
本明細書においては、調節領域は作動可能に連結された遺伝子の発現に正又は負の方向に影響するシス作用ヌクレオチド配列を意味する。調節領域は遺伝子の誘導（即ち増大した転写のためには物質又は刺激を必要とする）発現をもたらすヌクレオチドの配列を包含する。インデューサーが存在するか又は増大した濃度にある場合、遺伝子発現を増大させることができる。調節領域は又、遺伝子発現の抑制をもたらす配列を包含する（即ち物質又は刺激が転写を低減する）。リプレッサーが存在するか又は増大した濃度にある場合、遺伝子発現を低減させることができる。調節領域は多くのインビボの生物学的活性、例えば細胞増殖、細胞成育及び死滅、細胞分化及び免疫モジュレーションに対して、影響、モジュレート又は制御することが知られている。調節領域は典型的にはトランス作用性の蛋白１つ以上に結合し、これにより遺伝子の転写の増大又は低減の何れかが生じる。
【０１４９】
遺伝子調節領域の特定の例はプロモーター及びエンハンサーである。プロモーターは転写又は翻訳の開始部位の周囲に位置する、典型的には翻訳開始部位の５’側に位置する配列である。プロモーターは通常は翻訳開始部位の１Ｋｂ以内に位置するが、更に遠位に、例えば２Ｋｂ、３Ｋｂ、４Ｋｂ、５Ｋｂ以上〜１０Ｋｂまでに位置することもできる。エンハンサーは遺伝子の５’又は３’側に位置する場合、又はエクソン又はイントロン又はその一部に位置する場合は、遺伝子発現に影響することがわかっている。エンハンサーは又遺伝子からかなりの距離で、例えば約３Ｋｂ、５Ｋｂ、７Ｋｂ、１０Ｋｂ、１５Ｋｂ以上の距離で機能できる。
【０１５０】
調節領域は又、プロモーター領域に加えて、翻訳、イントロンのシグナルのスプライシング、ｍＲＮＡのインフレームの翻訳を可能にする遺伝子の正しい読み枠の維持を促進する配列、及び、終止コドン、リーダー配列及び融合相手の配列、多重遺伝子又はポリシストロン性のメッセージの形成のための内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）エレメント、目的の遺伝子の転写の適切なポリアデニル化を与えるポリアデニル化のシグナル及び終止コドンを包含し、そして、場合により発現ベクター内に包含されることができる。
【０１５１】
本明細書においては、本明細書において出現する種々のアミノ酸配列内に存在する「アミノ酸」は、そのよく知られた３文字又は１文字の略記法に従って識別される（表１参照）。種々のＤＮＡフラグメント中に存在するヌクレオチドは当該分野で日常的に使用されている標準的な１文字の表記で表記される。
【０１５２】
本明細書においては、「アミノ酸残基」とは、自身のペプチド連結部におけるポリペプチドの化学分解（加水分解）により形成されるアミノ酸を指す。本明細書に記載するアミノ酸残基は一般的に「Ｌ」異性体の形態にある。「Ｄ」異性体形態の残基は、所望の機能的特性がポリペプチドにより保持されれば、何れかのＬ−アミノ酸残基と置換してよい。ＮＨ２はポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離のアミノ基を指す。ＣＯＯＨはポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離のカルボキシ基を指す。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２−５９（１９６９）に記載され、そして３７ＣＦＲ§§１．８２１〜１．８２２において採択されている標準的なポリペプチド命名法に沿って、アミノ酸残基に関する略記を表１に示す。
【０１５３】
【表１】
2009515520.tif 000003
式により本明細書において示すアミノ酸残基の全ての配列はアミノ末端からカルボキシル末端への従来の方向において左から右の向きを有している。更に、「アミノ酸残基」という表現は改変した対応表に記載されるアミノ酸、非天然及び非通常のアミノ酸を包含するものとして定義される。更に又、アミノ酸残基配列の初めと終わりの波線はアミノ酸残基１つ以上の別の配列への、又は、ＮＨ２のようなアミノ末端基への、又はＣＯＯＨのようなカルボキシル末端基へのペプチド結合を示すことに留意しなければならない。
【０１５４】
ペプチド又は蛋白において、アミノ酸の適当な保存された置換は当業者の知る通りであり、そして、一般的に、結果として生じる分子の生物学的活性を改変せずに行うことができる。当業者の知る通り、一般的に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸の置換は生物学的活性を実質的に改変しない（例えばＷａｔｓｏｎ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．ｃｏ．，ｐ．２２４参照）。
【０１５５】
そのような置換は以下の表２に記載するものに従って行ってよい。
【０１５６】
【表２】
2009515520.tif 000004
他の置換もまた、可能であり、そして実験的に、又は、他の知られた保存的又は非保存的置換に従って、決定することができる。
【０１５７】
本明細書においては、ペプチドミメティックとは特定のペプチドの生物学的に活性な形態のコンホーメーション及び特定の立体化学的特徴を模倣している化合物である。一般的に、ペプチドミメティックは、化合物の所望の特性は模倣するが、生物学的に活性なコンホーメーションの消失及び結合の崩壊をもたらす柔軟性のような望ましくない特性は模倣しないように設計される。ペプチドミメティックは生物学的に活性な化合物から、バイオアイソスターの望ましくない特性に寄与する特定の基又は結合を置き換えることにより製造できる。バイオアイソスターは当業者の知る通りである。例えばメチレンバイオアイソスターＣＨ２Ｓはエンケファリン類縁体におけるアミド代替物として使用されている（例えばＳｐａｔｏｌａ（１９８３）ｐｐ．２６７−３５７、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｅｄ．ｖｏｌｕｍｅ７，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。経口投与できるモルヒネはペプチドエンドルフィンのペプチドミメティックである化合物である。本明細書の目的のためには、ポリペプチドの骨格を形成する１つ以上のペプチド結合がバイオアイソスターと置き換えられているポリペプチドがペプチドミメティックである。
【０１５８】
本明細書においては、２つの蛋白又は核酸の間の「同様性」とは、蛋白のアミノ酸の配列又は核酸のヌクレオチド配列の間の関連性を指す。同様性は残基の配列及びそこに含有される残基の同一性及び／又は相同性の程度に基づくことができる。蛋白又は核酸の間の同様性の程度を評価するための方法は当該分野で知られている。例えば配列同一性を評価する１つの方法においては、２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列を、配列の間の同一性が最高レベルとなるような態様においてアラインする。「同一性」はアミノ酸又はヌクレオチド配列が不変である程度を指す。アミノ酸配列、そしてある程度まではヌクレオチド配列のアライメントは又、アミノ酸（又はヌクレオチド）における保存的な相違及び／又は頻繁な置換を考慮することができる。保存的な相違は関与する残基の物理化学的な特性が温存されるものである。アライメントは全般的（配列の全長にわたる、そして全残基を包含する比較配列のアライメント）又は限局的（最も同様な領域のみを包含する配列の一部分のアライメント）であることができる。
【０１５９】
「同一性」とはそれ自体、当該分野でよく知られた意味を有し、そして公開されている手法を用いて計算できる（例えばＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｒｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１参照）。２つのポリヌクレオチド又はポリペプチドの間の同一性を計測するために多くの方法が存在するが、「同一性」という用語は当該分野で良く知られている（Ｃａｒｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＬＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３（１９８８））。
【０１６０】
本明細書においては、他のポリペプチドと比較した場合のあるポリペプチドの完全長に沿って比較される配列の同一性は、ポリペプチド中のその完全長に沿ったアミノ酸の同一性のパーセンテージを指す。例えば、ポリペプチドＡが１００アミノ酸を有し、そしてポリペプチドＢがポリペプチドＡのアミノ酸１〜９５と同一である９５アミノ酸を有する場合、配列同一性をポリペプチドＢの完全長と比較しながらポリペプチドＡの完全長に沿って比較すれば、ポリペプチドＢは９５％の同一性を有する。後に考察する通り、そして当該分野で知られる通り、同一性を評価するための種々のプログラム及び方法が当該分野で知られている。高レベルの同一性、例えば９０％又は９５％の同一性はソフトウエアを用いることなく容易に測定できる。
【０１６１】
本明細書においては、相同（核酸及び／又はアミノ酸配列に関する）とは、約２５％以上の配列相同性、典型的には約２５％、４０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％以上の配列相同性を意味し；厳密なパーセンテージは必要に応じて特定できる。本明細書の目的のためには「相同性」及び「同一性」」という用語は頻繁には、特段の記載が無い限り互換的に使用される。一般的に、パーセンテージ相同性又は同一性を求めるためには、最高等級のマッチが得られるように配列をアラインする（例えばＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．等、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｇｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；Ｃａｒｒｉｌｌｏ等（１９８８）ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３参照）。配列相同性により、保存されたアミノ酸の数は標準的なアライメントアルゴリズムプログラムにより求められ、そして各供給元により確立されたデフォルトギャップペナルティーと共に使用できる。実質的に相同の核酸分子は典型的には中等度のストリンジェンシー又は高ストリンジェンシーにおいて目的の核酸の完全長にわたりハイブリダイズする。同様に意図されるものはハイブリダイズしている核酸分子においてコドンの代わりに縮重したコドンを含有する核酸分子である。
【０１６２】
何れかの２つの核酸分子が少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％「同一」又は「相同」であるヌクレオチド配列を有するかどうかは例えばＰｅａｒｓｏｎ等（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４に記載のデフォルトパラメーターを用いる「ＦＥＳＴＡ」のような知られたコンピューターアルゴリズム（他のプログラムはＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（Ｉ）：３８７（１９８４）を包含する）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．等、Ｊ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３（１９９０）；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９４及びＣａｒｒｉｌｌｏ等（１９８８）ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３）を用いて調べることができる。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｄａｔａｂａｓｅのＢＬＡＳＴ関数を用いて同一性を求めることができる。他の市販又は公的に入手できるプログラムにはＤＮＡＳｔａｒの「ＭａｇＡｌｉｇｎ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧ）の「Ｇａｐ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が包含される。蛋白及び／又は核酸分子のパーセント相同性又は同一性は例えばＧＡＰコンピュータープログラムを用いながら配列情報を比較することにより求めることができる（例えばＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２再検討によるＮｅｅｄｌｅｍａｎｒ等（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３参照）。慨すれば、ＧＡＰプログラムは、同様であるアラインされた記号（即ちヌクレオチド又はアミノ酸）の数を２配列のより短いほうにおける記号の総数で割ったものとして同様性を定義する。ＧＡＰプログラムに関するデフォルトパラメーターは（１）一要素の比較マトリックス（同一性に対する１及び非同一性に対する０の値を含有）及びＳｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆｆ編のＡＴＬＡＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８（１９７９）に記載のＧｒｉｂｓｋｏｖ等（１９８６）のＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５の加重比較マトリックス；（２）各ギャップにつき３．０のペナルティー及び各ギャップにおける各記号に付き追加の０．１０ペナルティー；及び（３）末端ギャップにペナルティー無しとすることができる。
【０１６３】
従って、本明細書においては、「同一性」又は「相同性」という用語は被験及びレファレンスのポリペプチド又はポリヌクレオチドの間の比較を表す。本明細書においては、少なくとも「９０％同一」という用語はレファレンスの核酸又はポリペプチドのアミノ酸と相対比較して９０〜９９．９９のパーセント同一性を指す。９０％以上のレベルの同一性は、例示目的と推定した場合に、１００アミノ酸の被験及びレファレンスポリペプチド長を比較したという事実を示している。被験ポリペプチド中のアミノ酸の１０％（即ち１００のうち１０）以下がレファレンスポリペプチドのものと異なる。同様の比較は被験及びレファレンスポリヌクレオチドの間で行うこともできる。そのような相違はポリペプチドの全長にわたって無作為に分布した点突然変異として示すことができ、或いは、それらは最大許容可能、例えば１０／１００アミノ酸相違（約９０％同一性）までの可変長の１つ以上の位置においてクラスター化していることができる。相違は核酸又はアミノ酸の置換、挿入又は欠失として定義される。約８５〜９０％超の相同性又は同一性のレベルにおいて、結果はプログラム及びギャップペナルティー設定とは独立していなければならず；そのような高いレベルの同一性は頻繁にはソフトウエアに依存することなく手作業のアライメントにより容易に評価することができる。
【０１６４】
本明細書においては、アラインされた配列はヌクレオチド又はアミノ酸の配列における相当する位置をアラインするための相同性（同様性及び／又は同一性）の使用を指す。典型的には、５０％以上の同一性で関連付けられている２つ以上の配列をアラインする。配列のアラインされたセットは、相当する位置においてアラインされた２つ以上の配列と称し、そしてゲノムＤＮＡ配列とアラインしたＲＮＡ、例えばＥＳＴ及び他のｃＤＮＡから誘導された配列をアラインすることを包含できる。
【０１６５】
本明細書においては、「プライマー」とは、適切な緩衝液中において、そして適当な温度において、適切な条件下（例えば４種のヌクレオチドトリホスフェート及び重合剤、例えばＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素の存在下）鋳型指向ＤＮＡ合成の開始点として作用することができる核酸分子を指す。当然ながら、特定の核酸分子は「プローブ」として、そして「プライマー」として作用することができる。しかしながら、プライマーは伸長のための３’ヒドロキシル基を有する。プライマーは種々の方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ、ＲＮＡ  ＰＣＲ、ＬＣＲ、多重ＰＣＲ、パンハンドルＰＣＲ、キャプチャーＰＣＲ、伸長ＰＣＲ、３’及び５’ＲＡＣＥ、インサイチュＰＣＲ、ライゲーション媒介ＰＣＲ及び他の増幅プロトコルにおいて使用できる。
【０１６６】
本明細書においては、「プライマー対」とは、増幅すべき（例えばＰＣＲによる）配列の５’末端とハイブリダイズする５’（上流）プライマー、及び、増幅すべき配列の３’末端の相補体とハイブリダイズする３’（下流）プライマーを包含するプライマーのセットを指す。
【０１６７】
本明細書においては、「特異的にハイブリダイズする」とは標的核酸分子への核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）の相補塩基対形成によるアニーリングを指す。特異的ハイブリダイゼーションに影響するインビトロ及びインビボのパラメーター、例えば特定の分子の長さ及び組成については、当該分野で良く知られている。インビトロハイブリダイゼーションに特に関連するパラメーターは更に、アニーリング及び洗浄の温度、緩衝液の組成及び塩の濃度を包含する。高ストリンジェンシーで非特異的結合核酸分子を除去するための例示される洗浄条件は、０．１ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、そして中ストリンジェンシーでは０．２ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃である。等価なストリンジェンシー条件は当該分野で知られている。等業者であれば、特定の用途のために適切である標的核酸分子への核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションを達成するためにこれ等のパラメーターを容易に調節できる。
【０１６８】
本明細書においては、有効量は疾患又は障害の症状を防止、治癒、緩解、停止又は部分的に停止するために必要な治療薬の量である。
【０１６９】
本明細書においては、単位剤型とは当該分野で知られる通り、ヒト及び動物対象に適し、そして個別にパッケージされている物理的に個別の単位を指す。
【０１７０】
本明細書においては、単数表記は特段の記載が無い限り複数表記も包含する。即ち、「細胞外ドメイン」を含む化合物は、１つ又は複数の細胞外ドメインを有する化合物を包含する。
【０１７１】
本明細書においては、範囲及び量は「約」を付した特定の値又は範囲として表現できる。約は又厳密な量も包含する。従って「約５塩基」とは「約５塩基」及び、さらには「５塩基」を意味する。
【０１７２】
本明細書においては、「任意の」又は「場合により」とはその後に記載される事象又は状況が実際に起こるか、実際には起こらないこと、そして、記載がそのような事象又は状況が起こる場合、及びそれが起こらない場合を包含することを意味している。例えば場合により置換された基とはその基が未置換又は置換されていることを意味している。
【０１７３】
本明細書においては、何れかの保護基、アミノ酸及び他の化合物に関する略記法は、特段の記載が無い限りその一般的な用法に従い、認知された略記法、又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅとする（（１９７２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：１７２６参照）。
【０１７４】
Ｂ．肝細胞成長因子（ＨＧＦ）及びＭＥＴ受容体
本明細書に提供するものとして肝細胞成長因子（ＨＧＦ）のアイソフォームがある。ＨＧＦアイソフォームは挿入及び／又は欠失があるため生じるＨＧＦアイソフォームが１つ以上の活性又は機能において、又は構造においてＨＧＦと比較して相違を呈する点において、同種のリガンドとは異なっている。活性又は機能は、限定しないが、受容体２量体化、細胞シグナリング、細胞遊走、細胞成育及び増殖、及び血管形成を包含する。ＨＧＦアイソフォームは複数の活性、例えばＨＧＦ受容体、ＭＥＴのモジュレーターとしての活性、及び、血管形成抑制活性を有している。本明細書に記載するＨＧＦアイソフォームには、ＶＥＧＦＲリガンド又はＦＧＦＲリガンドのモジュレーションによりＶＥＧＦＲ又はＦＧＦＲのような他の成長因子受容体の活性をモジュレーションするものが包含され、そして更に一般的な血管形成抑制活性を有するＨＧＦアイソフォームも包含される。本明細書に記載するＨＧＦアルカリホスファターゼに包含されるものは、ＭＥＴ受容体拮抗剤活性を示し、そして更に抗血管形成活性を呈するものである。
【０１７５】
１．ＨＧＦ
肝細胞成長因子（ＨＧＦ、別名スキャッター因子、ＳＦ及びヘパトポエチンＡ）は種々の上皮及び内皮細胞をターゲティングする多面性因子である。ＨＧＦは臓器再成、臓器形成、胚発生及び発癌において役割を果たしている。有糸分裂誘発、遊走誘発（細胞の運動性の増強）及び形態形成の活性を有している。ＨＧＦの特定の生理学的機能は、上皮−間葉相互作用を媒介することによる種々の臓器の臓器形成の支援、及び、腫瘍−間質相互作用を媒介することによる腫瘍における血管新生の促進を包含する。ＨＧＦは例えばプラスミノーゲン、ｔＰＡ、ｕＰＡ、及び第ＸＩＩ因子のような他のセリンプロテアーゼの触媒ドメインに相同であるプロテアーゼドメインを含有する。しかしながらＨＧＦは触媒３要素を構成する３アミノ酸のうちの２つの改変（即ちＨ５３４Ｑ及びＳ６７３Ｙ）のために、プロテアーゼ活性を示さない。
【０１７６】
例示されるヒトＨＧＦはＮ末端アミノ酸１〜３１においてシグナル配列を含有する７２８アミノ酸の単一のオープンリーディングフレーム前駆体によりコードされている。成熟ＨＧＦ蛋白は蛋白分解的にプロセシングすることにより、配列番号３に記載する例示ＨＧＦのアミノ酸３２〜４９４に伸長する６９ｋＤａのアルファ鎖（２量体の重鎖とも称する）及び配列番号３に記載する例示ＨＧＦのアミノ酸４９５〜７２８に伸長する３４ｋＤａのベータ鎖（２量体の軽鎖とも称する）よりなるジスルフィド連結したヘテロ２量体分子となる。ＨＧＦ分子のアルファ鎖は蛋白結合モジュールとして機能する４クリングル構造を含有し、そしてベータ鎖はセリンプロテアーゼ（ＳｅｒＰ）様ドメインを含有する（例えば図２参照）。例えば、配列番号３として本明細書に記載し、配列番号２によりコードされている例示完全長ＨＧＦポリペプチドにおいては、シグナルペプチドはアミノ酸１〜３１に位置し、Ｎ末端ドメインはアミノ酸３４〜１２４に位置し、クリングル１ドメインはアミノ酸１２８〜２０６に位置し、クリングル２ドメインはアミノ酸２１１〜２８８に位置し、クリングル３ドメインはアミノ酸３０５〜３８３に位置し、クリングル４ドメインはアミノ酸３９１〜４６９に位置し、アルファ及びベータ鎖の間の中間鎖はアミノ酸４８７〜６０４に位置し、そしてセリンプロテアーゼ（ＳｅｒＰ、ペプチダーゼＳ１）ドメインはアミノ酸４９５〜７２８に位置する。
【０１７７】
ＨＧＦ遺伝子（配列番号１）は１７イントロンにより中断された１８エクソンよりなる（例えば図１参照）。ＨＧＦのエクソン１は５’未翻訳領域及び分泌に関わるシグナルペプチドを含有し、エクソン２及びエクソン３は２つのジスルフィド結合により安定化されるヘアピンループ領域であるＮドメインをコードし、エクソン４〜１１は４つのクリングルをコードし、各グリングルは２つのエクソンによりコードされ、エクソン１２はアルファ及びベータ鎖の間にスペーサーを含有し、そして残余の６エクソンはＳｅｒＰ様ドメインをコードする（例えばＳｅｋｉ等（１９９１）Ｇｅｎｅ  １０２：２３１参照）。配列番号１として本明細書に示すＨＧＦの例示されるゲノム配列においては、エクソン１はヌクレオチド１〜２５３を包含し、これはヌクレオチド位置１６６で始まる開始コドンを有し；イントロン１はヌクレオチド２５４〜７２６４を包含し；エクソン２はヌクレオチド７２６５〜７４３１を包含し；イントロン２はヌクレオチド７４３２〜１１３３３を包含し；エクソン３はヌクレオチド１１３３４〜１１４４５を包含し；イントロン３はヌクレオチド１１４４６〜１２８３３を包含し；エクソン４はヌクレオチド１２８３４〜１２９４８を包含し；イントロン４はヌクレオチド１２９４９〜１７８７４を包含し；エクソン５はヌクレオチド１７８７５〜１８１１７を包含し；イントロン５はヌクレオチド１８１１８〜２５０１６を包含し；エクソン６はヌクレオチド２５０１７〜２５１３７を包含し；イントロン６はヌクレオチド２５１３８〜２６６６５を包含し；エクソン７はヌクレオチド２６６６６〜２６７８４を包含し；イントロン７はヌクレオチド２６７８５〜４０３５７を包含し；エクソン８はヌクレオチド４０３５８〜４０５３２を包含し；イントロン８はヌクレオチド４０５３３〜４４１１９を包含し；エクソン９はヌクレオチド４４１２０〜４４２４７を包含し；イントロン９はヌクレオチド４４２４８〜４９２８９を包含し；エクソン１０はヌクレオチド４９２９０〜４９３９２を包含し；イントロン１０はヌクレオチド４９３９３〜５２７７１を包含し；エクソン１１はヌクレオチド５２７７２〜５２９０５を包含し；イントロン１１はヌクレオチド５２９０６〜５８６１７を包含し；エクソン１２はヌクレオチド５８６１８〜５８６５６を包含し；イントロン１２はヌクレオチド５８６５７〜５９８９３を包含し；エクソン１３はヌクレオチド５９８９４〜５９９９１を包含し；イントロン１３はヌクレオチド５９９９２〜６２７７２を包含し；エクソン１４はヌクレオチド６２７７３〜６２８４７を包含し；イントロン１４はヌクレオチド６２８４８〜６３７０９を包含し；エクソン１５はヌクレオチド６３７１０〜６３８５０を包含し；イントロン１５はヌクレオチド６３８５１〜６４３８３を包含し；エクソン１６はヌクレオチド６４３８４〜６４４９０を包含し；イントロン１６はヌクレオチド６４４９１〜６４６０１を包含し；エクソン１７はヌクレオチド６４６０２〜６４７４７を包含し；イントロン１７はヌクレオチド６４７４８〜６７３７９を包含し；そしてエクソン１８はヌクレオチド６７３８０〜６８００９を包含する。
【０１７８】
ＨＧＦはＭＥＴと標記される受容体のモジュレーションを介してその活性の種々のものに関与している。これ等の活性は細胞、例えば癌細胞の運動性、有糸分裂誘発及び形態形成、並びに血管形成の促進に関与するものを包含する。例えば、ＨＧＦは肝細胞（Ｎａｋａｍｕｒａ等（１９９１）、Ｐｒｏｇ．ｉｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｓ．３：６７）、上皮細胞（Ｄｉｇｎａｓｓ等（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２０２：７０１）、内皮細胞（Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏ等（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１９：６２９）、皮膚線維芽細胞（Ｋａｔａｏｋａ等（１９９３）Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔ．１７：６５）、メラノサイト（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ等（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７６：４５）及び造血前駆細胞（Ｋｍｉｅｃｉｋ等（１９９２）Ｂｌｏｏｄ  ８０：２４５４）に対する有糸分裂誘発因子として機能する。更に又、ＨＧＦは内皮細胞及び多くの上皮細胞、例えば肝細胞に対する、そして細胞侵襲性を増強する数種の腫瘍細胞に対する有糸分裂誘発因子として機能する（Ｓｔｏｋｅｒ等（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：２３９；Ｗｅｉｄｎｅｒ等（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：７００１）。ＨＧＦは又腎上皮細胞による細管形成（Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ等（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６７：９０１）、乳房上皮細胞による小管形成（Ｔｓａｆａｒｔｙ等（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１２５８）及び肝細胞による索形成（Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ等（１９９３）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５６：４４３）を誘導する形態形成因子として機能する。ＨＧＦの他の特性は例えば腫瘍細胞における細胞毒性又は細胞増殖抑制性の因子（Ｓｈｉｏｔａ等（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：３７３）として、及び、血管形成因子（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ等（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：１９９）としての活性を包含する。更に又、ＨＧＦは樹状細胞機能を抑制する等の免疫調節活性も示す（Ｏｋｕｎｉｓｈｉ等（２００５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：４７４５）。
【０１７９】
一部のＨＧＦ媒介活性はその受容体ＭＥＴの結合及びチロシン−自己ホスホリル化により誘導され、それに後続してＭＥＴの細胞質ドメインへのシグナリング分子及び／又はアダプター蛋白の群のリクルートメントが起こり、これにより多重シグナリングカスケードの活性化が起こり、これが細胞内及び細胞外応答の完全なネットワークを形成する。ＨＧＦ結合によりＭＥＴは多くのＳＨ２含有シグナルトランスデューサー、例えばホスホチジルイノシトール３−キナーゼ、ホスホリパーゼＣ−γ、Ｓｔａｔ３、Ｇｒｂ２及びＧｒｂ２関連ドッキング蛋白Ｇａｂ１と契合し、そしてＲａｓ−有糸分裂誘発物質活性化蛋白キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を間接的に活性化する。シグナリング経路及びシグナリング分子の異なる組み合わせ、及び／又は、応答の規模の相違が、ＨＧＦ／ＭＥＴの多様な活性に寄与している。更に又、ＨＧＦの活性は細胞の型並びに異なる細胞の環境により影響される。
【０１８０】
ＨＧＦによるＭＥＴ活性化の機序は単鎖ＨＧＦから２鎖の形態への切断を必要とする。ＨＧＦの単鎖形態は受容体結合を保持しているが、ＨＧＦの２鎖形態の生物学的活性を欠いており、このため、ＨＧＦ活性の拮抗剤として機能する。２鎖形態への切断はコンホーメーションの変化をもたらし、恐らくはドメインの再配列をもたらすと考えられる（Ｃｈｉｒｇａｄｚｅ等（１９９８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４３０：１２６）。典型的には受容体チロシンキナーゼ、例えばＭＥＴの活性化は、その同種のリガンドの結合時の単量体から２量体の状態への遷移を必要とする。その結果、リガンドは２つの結合部位を保有するか、又は自体が２量体であることの何れかを要する。２鎖形態へのＨＧＦのコンホーメーション変化は受容体活性化の前のＨＧＦの２量体化を可能にすると考えられる。ＳｅｒＰドメインの間の相互作用は、ＳｅｒＰドメインはＨＧＦの生物学的活性には重要であるが受容体結合には重要ではないことから、２量体の相互作用を安定化させることができる。ヘパリン及びヘパリンスルフェートは完全長２量体を更に安定化させることができ、そして天然のＨＧＦアイソフォーム単量体、ＮＫ１及びＮＫ２にとって、アゴニスト活性のために重要である（Ｃｈｉｒｇａｄｚｅ等（１９９８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ４３０：１２６）。
【０１８１】
ａ．ＨＧＦドメイン構造
構造−機能試験はＨＧＦドメインの機能を解明している。Ｎ末端ドメインのヘアピンループ、クリングル１又は２、又はＳｅｒＰドメインの何れかの欠失はＨＧＦの生物学的活性を根絶させる。一方、クリングル３又はクリングル４の欠失を有する分子は低減されているが計測可能な活性を示す（Ｃｈｉｒｇａｄｚｅ等（１９９８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４３０：１２６）。ＨＧＦのα鎖はＭＥＴ受容体への結合を担っており、この相互作用はＮ末端ドメイン及び第１クリングル（Ｋ１）ドメインにより主に媒介されている。
【０１８２】
ｉ．Ｎ末端ドメイン
配列番号３に記載する例示ＨＧＦのアミノ酸３４〜１２４を含有するＮ末端ドメインは自身の受容体ＭＥＴとの高親和性の相互作用のために必要な細胞表面上のヘパリンスルフェートグリコサミノグリカン（ＨＳＧＡＧ）への結合に関与するとされている。典型的には、リガンドのＨＵＳＧＡＧ又は可溶性ヘパリンへの結合は、豊富ではないシグナル伝達に関与する高親和性チロシンキナーゼ受容体によるリガンドの安定化及び／又は局在化を促進する。ヘパリン結合はチロシンキナーゼ受容体の２量体化を刺激することによりシグナリングを増強できるリガンドオリゴマー化を促進する。種々の成長因子、例えばＨＧＦ、ＦＧＦ１及びＦＧＦ２が特定の受容体の相互作用を補填し、接着力を強化している二次結合部位をもたらすためにヘパリン含有共受容体２依存している。例えば、細胞表面からＨＳＧＡＧを切断するヘパリナーゼによる細胞の処理は、ＨＧＦ−ＭＥＴ交差結合を減衰させ、そして細胞への可溶性ヘパリンの投与はＨＧＦ媒介機能を改変する（Ｓａｋａｔａ等（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７２：９４５７）。ＨＧＦのヘパリン結合部位はＨＧＦのＮ末端ドメインにおける塩基性及び／又は極性の残基より構成され（Ｚｈｏｕ等（１９９８）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，６：１０９）、そして、研究によれば、ドメインのオリゴマー化を誘導するためには、ヘパリンは、組み換えＫ１ドメインに対してではなく、組み換えＮ末端ドメインに添加するだけで十分であることがわかっている（Ｓａｋａｔａ等（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７２：９４５７）。結果的に、ＨＧＦのＮ末端ドメインはリガンドのオリゴマー化、受容体結合及び受容体の活性化及びシグナリングのために必要なヘパリン又は内因性ＨＳＧＡＧ結合能力を保持している。自身の受容体ＭＥＴの結合のためのＨＧＦのＮ末端ドメインの必要性は、操作されたＨＧＦアイソフォームＮＫ４の拮抗活性の厳密な決定要因としてＮ末端ドメインを示唆している（後述のＫｕｂａ等（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７９：８４６参照）。
【０１８３】
ヘパリンとの相互作用を介して受容体の２量体化を促進することの外に、ヘパリンスルフェートとのＮ末端ドメインの相互作用はまた受容体非依存性血管形成抑制においても役割を果たしている。ＨＧＦＮ末端ドメインの組み換えペプチドは、ＨＧＦ／ＭＥＴ相互作用を途絶させることによるのではなく、むしろ、ＨＳＧＡＧを包含する内皮ＧＡＧへのＨＧＦの結合に干渉することにより、血管形成を抑制する。更に又、ＨＧＦ  Ｎ末端ドメインの抗血管形成の役割は、Ｎ末端ドメインが複数のＧＡＧ依存性成長因子、例えばＨＧＦ、ＦＧＦ２及びＶＥＧＦに対してそれらが細胞表面上のＧＡＧと相互作用する能力をブロックすることにより拮抗作用を示すことができるため、ＨＧＦに限定されない（Ｍｅｒｋｕｌｏｖａ−Ｒａｉｎｏｎ等（２００３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７８：３７４００）。
【０１８４】
ｉｉ．クリングルドメイン
ＨＧＦはＫ１、Ｋ２、Ｋ３及びＫ４と標記されるクリングルドメイン４つを含有する。配列番号３に記載するＨＧＦの例示アミノ酸配列に基づけば、Ｋ１ドメインはアミノ酸１２８〜２０６を包含し、Ｋ２ドメインはアミノ酸２１１〜２８８を包含し、Ｋ３ドメインはアミノ酸３０５〜３８３を包含し、そして、Ｋ４ドメインはアミノ酸３９１〜４６９を包含する。クリングルドメインの蛋白−蛋白相互作用への参加はＨＧＦの受容体結合部位がそのクリングルドメイン１つ以上の内部に局在することを示唆している。ＨＧＦのＫ１ドメインの突然変異誘発によるＨＧＦ活性の低下はＭＥＴ結合におけるＫ１の役割を間接的に裏付けている。Ｋ１ドメインがＨＧＦ活性を模倣することができることを示す他の研究は、機能的Ｋ１／ＭＥＴ相互作用を直接明らかにしている。例えば、Ｎ末端ドメインではなくＫ１ドメイン単独でＭＥＴ受容体に結合して活性化するために十分であり、それは例えば受容体チロシンキナーゼの活性化、ＭＡＰキナーゼ活性化、細胞運動性及び細胞増殖の誘導により行える。Ｋ１媒介機能はヘパリン依存性及びヘパリン非依存性であり；例えば有糸分裂誘発シグナリングのＫ１刺激はヘパリン依存性であるが、細胞運動性のＫ１刺激はヘパリン非依存性である（Ｒｕｂｉｎ等（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６：３２９７７）。Ｋ１ドメイン自身はヘパリンに結合せず、ヘパリンスルフェートは、ＭＥＴ受容体とのヘパリンスルフェートの直接の相互作用のようなＨＧＦ−ヘパリンスルフェート結合ではない機序を介してＫ１シグナリングを促進していることが示唆される。実際、他の成長因子リガンド／受容体は機能のためにはヘパリン結合を必要とする。例えば、ＦＧＦＲを介したＦＧＦシグナリングはＦＧＦヘパリンスルフェート結合のみならず、ＦＧＦＲとヘパリンスルフェートの間の相互作用も必要とする。これを裏付けるものとして、ＭＥＴの細胞外ドメインはヘパリン結合部位を含有している。即ち、Ｋ１誘導の遊走誘発及び有糸分裂誘発応答を媒介することに関するヘパリンスルフェートの矛盾した必要性は、異なる細胞応答を媒介する細胞内エフェクターをＭＥＴ−ヘパリンスルフェート相互作用がリクルートメントしていることを示唆している。完全長ＨＧＦ又はＨＧＦのアイソフォーム（ＮＫ１、後述参照）と比較した場合にＤＮＡ合成及び細胞運動性の刺激において組み換えＫ１の力価が低減されていることは、ヘパリンスルフェートに結合できるＮ末端ドメインを含有するＨＧＦはリガンドの自己会合をモジュレートすることによりＨＧＦシグナリングを強化していることを示唆している。
【０１８５】
一般的にクリングルドメインはまた、クリングルドメインを含有する多くの蛋白により明らかな通り、その蛋白結合能力のために血管形成の抑制に関わっている。例えば、アンジオスタチン（プラスミノーゲンのＫ１−Ｋ４ドメインを含有する分子）は内皮細胞の増殖及び遊走を抑制し、そしてアポトーシスを誘導する。同様に、プロトロンビンのＫ２ドメイン、ｔＰＡのＫ１−Ｋ２ドメイン及びｕＰＡのＫ１ドメインは全て、抗血管形成特性を示す。クリングルドメインによる血管形成の抑制の機序は内皮細胞に対する推定上の血管形成性の結合分子との相互作用、例えばＡＴＰシンターゼ、アンジオモチン、αｖβ３
インテグリン、アネキシンＩＩ、又は何れかの１つ以上の成長因子受容体、例えばＭＥＴへの結合が関与していると推定される（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ等（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３３３：３１６；Ｋｕｂａ等（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７９：８４６）。即ち、Ｋ１−Ｋ４ドメインは、ＨＧＦのＮ末端ドメイン又はβ鎖の非存在下において、ＨＧＦの血管形成抑制活性を媒介するために十分である（Ｋｕｂａ等（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７９：８４６）。Ｋ１ドメインはまた成長因子誘導血管形成機能、例えばＦＧＦ２により刺激された内皮細胞増殖を抑制するために独立して機能する（Ｘｉｎ等（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７７：１８６）。最初の２つのクリングルドメインと組み合わせたＫ３及びＫ４は上記した通り抗血管形成特性を示し、そして又受容体活性化に必要なβ鎖との相互作用を促進する場合に重要となる（後述参照）。
【０１８６】
ｉｉｉ．β鎖
配列番号３に記載する例示ＨＧＦのアミノ酸４９５〜７２８を含有するＨＧＦのβ鎖は構造的にはセリンプロテアーゼに似ており、そしてセリンプロテアーゼ（ＳｅｒＰ）ドメインを含有するが、触媒３要素内の非保存的置換２つにより蛋白分解活性を欠いている。ＨＧＦのβ鎖はＭＥＴ受容体に結合できず、そして単独ではＨＧＦの活性の何れも示さない。しかしながら、β鎖の欠失はＨＧＦの生物学的活性の消失をもたらすものの、α鎖単独でＨＧＦ受容体に結合できる（Ｄａｔｅ等（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４２０：１−６）。本質的にＨＧＦの全４クリングルドメインを含有するα鎖（ＮＫ４アイソフォーム、後述）及びＨＧＦのβ鎖を共に含有する組み換え分子を用いた細胞の同時刺激はＨＧＦ応答を誘導する（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ等（１９９８）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．３６：２２９１３）。Ｎ末端ドメイン及び２つのクリングルドメインのみを含有するＨＧＦアイソフォームのβ鎖への投与はβ鎖による受容体結合又は受容体活性化を支援しない。これ等の結果はβ鎖との相互作用のためにＨＧＦのＫ３及びＫ４ドメインの存在に依存しているα及びβ鎖の間の協同的相互作用を示唆している。即ち、ＨＧＦのβ鎖は、最適な活性化及びその後のＨＧＦ媒介有糸分裂誘発、形態形成及び遊走誘発の応答をもたらす細胞内シグナル伝達経路の活性化のために必要である。
【０１８７】
２．ＨＧＦ変異体
ａ．ＨＧＦスプライシング変異体
ＨＧＦの完全長アイソフォームに加えて、ＨＧＦの少なくとも３つの追加的スプライシング変異体がインビボで発見されている。欠失ＨＧＦ（ｄｅｌＨＧＦ、配列番号２４）と称される１つのものは最初のクリングルドメインに５アミノ酸欠失を含有する。ｄｅｌＨＧＦは完全長ＨＧＦと同様の活性を示す。ＮＫ１（配列番号３０）及びＮＫ２（配列番号２２）と称される他の２つのＨＧＦ天然変異体はＮ末端Ｎドメインとそれに後続する第１のクリングルドメイン（ＮＫ１）又は最初の２つのクリングルドメイン（ＮＫ２）を含有する。ＮＫ１及びＮＫ２は完全長ＨＧＦの機能の多くを示すが、実験研究によればこれ等のＨＧＦアイソフォームに関して拮抗剤及びアゴニストの役割が提案されている。ＮＫ４と称される操作されたＨＧＦ変異体はＮ末端Ｎドメイン及び全ての４つのクリングルドメインを含有し、そして、それはＭＥＴへの結合に関して完全長ＨＧＦと競合できるため拮抗剤として機能するが、受容体の検出可能なホスホリル化を刺激することはできない。ＨＧＦの別の提案されるアイソフォームは配列番号２６又は２８に記載するものを包含する。
【０１８８】
ＮＫ１及びＮＫ２のアゴニスト又は拮抗剤活性は状況によるものであり、そして、細胞の型及び／又は実験条件に依存している。特に、これ等のＨＧＦアイソフォームのアゴニスト機能はヘパリン結合能力と相関している。その理由はＨＧＦ及びトランケーションされたＨＧＦの形態であるＮＫ１及びＮＫ２の受容体結合及び活性化の機序には重要な相違があることである。成熟したＨＧＦは２量体リガンドの形成及び／又は受容体チロシンキナーゼのコンホーメーション変化の誘導によりＭＥＴ受容体２量体化を誘導するが、これはＮＫ１及びＮＫ２単独ではそれらが単量体として存在するため不可能である。ヘパリン又はＧＡＧの存在は一部の成長因子のリガンドのリガンド２量体化及び／又はリガンド−受容体オリゴマー化を促進することができる。これにより単量体の成長因子は受容体活性化に必要な受容体２量体化を誘導できるようになる。ＮＫ１の結晶構造は、ヘパリンスルフェートの反復単位は２つのＮＫ１分子とそれぞれのＮ末端ドメインとの相互作用を介して結合し、これによりリガンド２量体化及び関連する受容体キナーゼの交差活性化を促進するというモデルを予測させる（Ｒｕｂｉｎ等（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７６：３２９７７）。即ち、ＨＧＦはヘパリンスルフェートを欠いた細胞において完全に活性であるのに対し、ＮＫ１及びＮＫ２はヘパリン存在下又はヘパリンスルフェートをディスプレイする細胞においてのみ活性である。ＮＫ１及びＮＫ２は共に、細胞表面上のヘパリン又は緊密に関連するヘパリンスルフェートグリコサミノグリカン（ＨＳＧＡＧ）への結合を媒介するＮ末端ドメインを保持している。例えば、ヘパリンを欠いている細胞（即ちヘパリンスルフェート（ＨＳ）−欠損ＣＨＯ細胞）においてはＮＫ１はＭＥＴに結合できない。これとは対照的に、ヘパリン発現細胞又はヘパリン欠損細胞へのヘパリンの添加は、ＨＧＦアイソフォームのリガンド結合及びＭＥＴのリガンド依存性活性化の増大を呈する（Ｓａｋａｔａ等（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７２：９４５７）。更に又、ＮＫ１及びＮＫ２はヘパリンの存在下では増殖活性を保持しているが非存在下では保持していない（Ｓｃｈｗａｌｌ等（１９９６）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３３：７０９−７１８）。即ち、ヘパリンの存在下、又はヘパリン発現細胞の存在下では、ＮＫ１及びＮＫ２はＨＧＦの極めて同様の特性を有するアゴニストとして機能できるが、ヘパリンの非存在下では拮抗剤として機能できる。重要な点は使用する細胞の型及びヘパリンの存在に応じて、ＮＫ１及びＮＫ２はアゴニスト又は拮抗剤の何れかとして機能できることである。
【０１８９】
トランスジェニックマウスを用いたＮＫ１及びＮＫ２の活性化のインビボの試験はＮＫ１とＮＫ２の機能が区別されることを示している。ＮＫ１トランスジェニックマウスはＨＧＦトランスジェニックマウスと同様の表現型を示し、ＮＫ１が実際に部分的アゴニストであり、インビボで受容体に結合して活性化する能力を保持していることを示唆している（Ｊａｋｕｂｃｚａｋ等（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１２７５）。これとは対照的に、ＮＫ２に関してトランスジェニックであるマウスは解離したアゴニスト及び拮抗剤の表現型を示す。ＮＫ２トランスジェニックマウスはＭＥＴ駆動転移性播種の遊走誘発特性に関してアゴニスト活性を示すが、ＨＧＦ及びＮＫ１トランスジェニックマウスにおいて観察される調節不全の細胞成育と比較した場合に拮抗剤の有糸分裂誘発活性を示す（Ｏｔｓｕｋａ等（２０００）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０：２０５５）。
【０１９０】
ＨＧＦの操作された変異体であるＮＫ４（配列番号３２）はＨＧＦの真の拮抗剤である。ＮＫ４はＨＧＦの有糸分裂誘発、遊走誘発、形態形成及び腫瘍抑制活性に拮抗する。ＮＫ４はエラスターゼを用いて高度に精製された組み換えＨＧＦを酵素的に消化することにより製造される。エラスターゼによるＨＧＦの消化は２つのフラグメント、即ちＮ末端ヘパリンドメイン及び４つのクリングルドメインを包含するα鎖のＮ末端４７７アミノ酸よりなるフラグメント（ＮＫ４と称する）、及び、β鎖及びβ鎖とジスルフィド架橋を形成する４８７Ｃｙｓを含有するαの一部分を含有する第２のフラグメントを生じさせる。ＨＧＦと比較して親和性は低値であるもののＮＫ４はＭＥＴと結合するが、ただしβ鎖の非存在のために受容体を活性化することはできない。例えばＮＫ１又はＮＫ２を包含する他のＨＧＦアイソフォームとは異なり、ＮＫ４におけるＫ４の存在はＨＧＦにおけるコンホーメーション変化を誘導し、これにより、β鎖が存在しない限り、受容体の２量体化及び活性化を抑制する（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ等（１９９８）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，３６：２２９１３）。即ち、ＮＫ４はＭＥＴ受容体へのＨＧＦの結合に関して競合的に競合し、そしてこれにより、ＨＧＦの生物学的機能に拮抗する。例えばＮＫ４は癌細胞、例えば乳癌、膀胱癌、結腸直腸癌の細胞、前立腺、神経膠腫、膵臓、胃、胚及び卵巣の癌細胞を包含する癌細胞のＨＧＦ誘導細胞遊走、侵襲及び接着を抑制する（Ｊｉａｎｇ等（２００５）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃ．Ｈｅｍａ．５３：３５）。ＮＫ４はまた内皮細胞からのＨＧＦ誘導血管細管形成（Ｊｉａｎｇ等（１９９９）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５：３６９５）及びＨＧＦシグナリングにより媒介される細胞接着及び堅固な接合の崩壊（Ｍａｔｒｉｎ等（２００４）Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ  ２８：３６１）を包含するＨＧＦの他の機能も抑制する。ＮＫ４由来のＮ末端ドメインの欠失はＮＫ４媒介ＨＧＦ拮抗活性を消失させ、Ｎ末端ドメインがＭＥＴへのＮＫ４の結合のために重要であることを明らかにしている（Ｋｕｂａ等（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７９：８４６）。
【０１９１】
ＨＧＦの拮抗剤として作用する外に、ＮＫ４は又一般的な抗血管形成特性も示す。ＮＫ４の抗血管形成特性、例えば内皮細胞の増殖及び遊走の抑制は、ＮＫ４がＨＧＦ−媒介機能のみならず、ＦＧＦ−２及びＶＥＧＦ−媒介機能も拮抗するため、ＭＥＴ受容体とは独立している。ＨＧＦのクリングルドメインは血管形成の抑制に関連しており（Ｋｕｂａ等（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７９：８４６）、そして実際に、ＨＧＦのＫ１ドメインは、第１のクリングルドメイン単独でＦＧＦ−２により刺激される細胞増殖を抑制し、そしてウシ大動脈内皮細胞のアポトーシスを増強するために十分であることから、ＮＫ４の血管形成抑制活性に関与していると示唆されている（Ｘｉｎ等（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７７：１８６）。Ｎ末端ドメインは又、それがヘパリンへの結合に関して成長因子、例えばＨＧＦ、ＦＧＦ−２及びＶＥＧＦと競合することから、ある程度の抗血管形成機能を示す（Ｍｅｒｋｕｌｏｖａ−Ｒａｉｎｏｎ等（２００３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７８：３７４００）。即ち、クリングルドメイン、特にＫ１はＮＫ４の血管形成抑制活性を担っているのに対し、ＨＧＦのＮ末端ドメインは内皮細胞への血管形成性成長因子の結合の競合的抑制を介して抗血管形成活性を増強する（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ等（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３３３：３１６）。ＮＫ４は、腫瘍転移の抑制、侵襲の抑制、細胞外マトリックス分解の抑制及び腫瘍血管形成の抑制のような多様な抗腫瘍活性を媒介する、ＨＧＦ拮抗剤及び一般的な血管形成抑制剤としてのその２重機能により、広範な抗癌治療薬候補として受け入れられている（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ等（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３３：３１６）。
【０１９２】
ｂ．ＨＧＦ変異体
変異は集団又は種のメンバー内（対立遺伝子変異）で、そして、種間（種変異）においても起こる。ＨＧＦの対立遺伝子変異体は配列番号１又は２と比較して１つ以上のヌクレオチド変化、又は、配列番号３と比較して１つ以上のアミノ酸変化を含有することができる。対立遺伝子変異はＨＧＦ遺伝子のエクソン又はイントロンの配列の何れか１つ以上において起こりえる。ＨＧＦ蛋白をコードする核酸及びコードされたＨＧＦポリペプチドはＨＧＦの対立遺伝子変異体を包含できる。ＨＧＦの例示される対立遺伝子変異体は表３に記載する。例示されるＨＧＦ対立遺伝子変異体は配列番号１５に記載する何れかの１つ以上のヌクレオチド変化又は配列番号１６に記載の何れかの１つ以上のアミノ酸変化を包含できる。
【０１９３】
１つの実施形態において、ＨＧＦにおける対立遺伝子変異体は配列番号３に記載する同種のＨＧＦと比較して何れかの１つ以上のアミノ酸変化を包含できる。例えば、１つ以上のアミノ酸の変異はＨＧＦのＮ末端ドメインにおいて起こることができる。対立遺伝子変異体は、例えばＫがＮにより置き換えられることができる７８位におけるアミノ酸変化、又は例えばＦがＬにより置き換えられることができる８２位におけるアミノ酸変化を包含できる。ＨＧＦの対立遺伝子変異体はまたＨＧＦのクリングルドメインの何れか１つにおいて生じることもできる。例えば、対立遺伝子変異体は例えばＳがＩにより置き換えられることができる１５３位における、又は例えばＰがＴにより置き換えられることができる１８０位におけるアミノ酸変化のようなＫ１ドメインにおけるアミノ酸変化を包含できる。追加のアミノ酸変化はＫ３ドメインにおいて起こることができる。対立遺伝子変異体は例えばＭがＶにより置き換えられることができる２９３位における、又は例えばＬがＭにより置き換えられることができる３００位における、又は、例えばＥがＫにより置き換えられることができる３０４位における、又は、例えばＶがＡにより置き換えられることができる３１７位における、又は、例えばＰがＳにより置き換えられることができる３２５位における、又は、例えばＹがＤにより置き換えられることができる３３０位における、又は、例えばＥがＫにより置き換えられることができる３３６位におけるアミノ酸変化を包含できる。対立遺伝子変異体は又、例えばＨがＮにより置き換えられることができる３８７位における、又はＤがＮにより置き換えられることができる４１６位におけるアミノ酸変化のようなＫ４ドメインにおいて生じることができる。他の対立遺伝子変異はＨＧＦのセリンプロテアーゼドメインにおいて生じることができる。対立遺伝子変異体は例えばＲがＱにより置き換えられることができる４９４位における、又は、例えばＩがＶにより置き換えられることができる５０５位における、又は、例えばＶがＩにより置き換えられることができる５０９位における、又は、例えばＤがＥにより置き換えられることができる５５８位における、又は、例えばＣがＲにより置き換えられることができる５６１位における、又は、例えばＤがＮにより置き換えられることができる５９２位における、又は、例えばＳがＮにより置き換えられることができる５９５位におけるアミノ酸変化を包含できる。
【０１９４】
一部の場合において、ヌクレオチド又はアミノ酸の相違は、生物学的活性に対して検出可能な作用を有さない、又は実質的に有さない「サイレント」なものであることができる。他の例においては、対立遺伝子変異体はトランケーションされた、又は短鎖化されたポリペプチドをもたらすことができる。例えば、例えばＧがＮにより置き換えられることができるヌクレオチド位１２５６における対立遺伝子変異は、短鎖化された翻訳蛋白をもたらす終止コドンに対する変化をもたらす。他の例においては、対立遺伝子変異体は、例えばリガンドの野生型又は優勢な形態に関する場合、疾患、状態又は生物学的活性における変化に関連することができる。
【０１９５】
【表３】
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ＨＧＦの変異体は又、種変異体を包含する。ＨＧＦはヒト以外の多数の種、例えば限定しないが、ウシ、イヌ、ネコ、マウス、ラット及びニワトリにおいて存在する。ＨＧＦの種変異体に関する例示される配列は配列番号２４６〜２５１の何れか１つに記載のものである。
【０１９６】
３．ＭＥＴ受容体
ＭＥＴ受容体（別名ｃ−ＭＥＴ、肝細胞成長因子受容体、ＨＧＦＲ）は膜貫通１４５ｋＤａβ鎖にジスルフィド結合した細胞外５０ｋＤａα鎖よりなるヘテロ２量体分子に蛋白分解的に切断される前駆体蛋白として生産される受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。完全にプロセシングされたＭＥＴ蛋白においては、αサブユニットは蛋白−蛋白相互作用に関与するＳｅｍａドメイン及びＭＥＴ関連配列と称されるシステインリッチのモチーフを含有する。膜を横断し、そして細胞外及び細胞内にあるβサブユニットは膜近傍ドメイン、触媒ドメイン及びＣ末端テール部を包含する３つの機能的ドメインを含有する。ＨＧＦはＭＥＴに対するリガンドである。ＭＥＴへのＨＧＦの結合は、受容体の２量体化及び膜近傍、触媒及び細胞質テールドメイン内の多数の残基上のホスホリル化をトリガーし、これにより、受容体の内在化、触媒活性及び多重基質ドッキングを調節する。例えば、膜近傍ドメインはセリンのホスホリル化によりＭＥＴのキナーゼ活性を阻害するＳｅｒ９８５残基を含有し；Ｓｅｒ９８５の脱ホスホリル化によりＨＧＦ依存性ＭＥＴ活性化が可能となる。膜近傍ドメインは又ユビキチン化のためにＭＥＴをターゲティングすることによるＭＥＴの負の調節及びプロテオソーム経路による分解に関与するＴｙｒ１００３を含有する。ＭＥＴの触媒ドメイン内のホスホリル化部位は、Ｔｙｒ１２３０、Ｔｙｒ１２３４及びＴｙｒ１２３５を包含し、そして細胞質テール部内のホスホリル化部位はＴｙｒ１３４９及びＴｙｒ１３５６を包含する。ＭＥＴのホスホリル化及び活性化は多重アダプター蛋白（例えばＧｒｂ２、Ｓｈｃ、Ｃｂｌ、Ｃｒｋ、コルテクチン、パキシリン及びＧＡＢ１）を包含する多くの細胞内シグナリング蛋白及び種々の他のシグナルトランスデューサー（例えばＰＩ３−キナーゼ、ＦＡＫ、Ｓｒｃ、ＥＲＫ  １／２、ＪＮＫ  １／２、ＰＬＣ−ガンマ及びＳＴＡＴ−３）の結合及び／又はホスホリル化をもたらす。
【０１９７】
ＭＥＴは上皮細胞及び肝細胞において高度に発現されるが、胚中心Ｂ細胞及び終末分化形質細胞を包含する造血系起源の他の細胞上でも発現される。ＭＥＴは又多くの癌組織中及び固形腫瘍上で発現される。通常は、ＨＧＦ−ＭＥＴシグナリングは胚の発生に関与しているが、ＭＥＴシグナリングは又、癌細胞の成育、侵襲、運動性及び転移を媒介し、並びに、腫瘍における血管形成を促進する。癌における役割に加えて、ＭＥＴは又、宿主細胞アクチン細胞骨格を再配列すること、及び、感染細胞のアポトーシスを抑制することによる等ホストを感染に対して感受性とするシグナルのメディエーターとしてマラリア感染の発症において重要な要因となっている（Ｃａｒｒｏｌｏ等（２００３）Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，９：１３１６；Ｌｅｉｒｉａｏ等（２００５）Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７：６０３）。
【０１９８】
例示されるＭＥＴ受容体（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００２３６、配列番号３４記載）はアミノ酸１〜３０７にα鎖及びアミノ酸３０８〜１３９０にβ鎖を含有し、残基９５６〜１３９０にβ鎖の細胞内ドメインを有する。ＭＥＴはアミノ酸５５〜５００のＳｅｍａドメインを特徴としている。ＭＥＴにおいては、Ｓｅｍａドメインはリガンド結合の外に受容体２量体化に関与している。ＭＥＴ蛋白は又アミノ酸５１９〜５６２のプレキシンシステインリッチリピート及びアミノ酸５６３〜６５５、アミノ酸６５７〜７３９及びアミノ酸７４２〜８３６の３つのＩＰＴ／ＴＩＧドメインを特徴とする。ＩＰＴとはプレキシン（Ｐ）と転写因子（Ｔ）により共有されている免疫グロブリン（Ｉ）様折り畳みを意味する。ＴＩＧは転写因子における免疫グロブリン様ドメイン（転写因子（Ｔ）ＩＧ）を意味する。ＭＥＴにおけるＴＩＧドメインは細胞外マトリックスと受容体シグナリングの間の相互作用の一部を媒介する際に役割を果たしていると考えられる。ＭＥＴ蛋白は又、アミノ酸９３３〜９５５の膜貫通ドメイン、それに後続するアミノ酸９５６で始まる膜近傍ドメイン、アミノ酸１０７８〜１３３７の細胞質蛋白キナーゼドメイン、及び細胞質テールを特徴とする。
【０１９９】
Ｃ．ＨＧＦアイソフォーム
本明細書において提供されるものは、ＨＧＦアイソフォーム、及び、ＭＥＴ受容体活性を介する場合を包含する有糸分裂誘発、形態形成及び血管形成をモジュレートするためにＨＧＦアイソフォームを使用する方法である。１つの実施形態において、本明細書に記載するＨＧＦアイソフォームはアイソフォームをコードする核酸が１７イントロンの何れかの１つ以上の部分又は全体を保持している点において、完全長ＨＧＦ同種のリガンドとは異なっている。結果として生じるＨＧＦアイソフォーポリペプチドは、ＨＧＦ蛋白が同種のＨＧＦの１つ以上のドメイン全て又は一部分の崩壊又は排除を包含し、これにより同種のリガンドト比較して１つ以上の活性又は機能における相違を呈するように、挿入及び／又は欠失を含有する。例えば、ＨＧＦアイソフォームがＨＧＦと比較した場合に呈する変化としては、限定しないが、シグナルペプチド、Ｎ末端ドメイン、１つ以上のクリングルドメイン及び／又はＳｅｒＰドメインの全て又は部分の排除及び／又は崩壊を包含することができる。本明細書に記載するＨＧＦアイソフォームは細胞表面受容体、例えばＭＥＴ受容体、ＶＥＧＦＲ又はＦＧＦＲの活性をモジュレートするために使用できる。それらは又、インビボ又はインビトロのターゲティングされた細胞又は組織に対する薬品又は毒素又は核酸のような分子の送達のためのターゲティング剤としても使用できる。
【０２００】
１つ以上のＨＧＦアイソフォーム、典型的には１つ以上の異なるアイソフォームを含有する医薬組成物が提供される。医薬組成物は癌、又は異常な血管形成が顕在化する他の疾患、マラリア及びＭＥＴ又は血管形成性受容体、例えばＶＥＧＦＲ又はＦＧＦＲの関与が疑われるか、関与しているか、又はそれらが参加している当該分野で知られた他の疾患を包含する疾患を治療するために使用できる。癌には、乳癌、肺癌、結腸癌、胆嚢癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌及び前立腺癌、神経膠芽腫、リンパ腫、悪性黒色腫及びその他が包含される。
【０２０１】
同様に提供されるものは、医薬組成物を投与することによる、又はＨＧＦアイソフォームを送達することによる、例えばアイソフォームをコードするベクターを投与することによる、疾患及び状態の治療の方法である。投与はインビボ又はエクスビボで行える。
【０２０２】
本明細書においては、ＨＧＦアイソフォーム及びＨＧＦアイソフォームをコードする核酸分子を製造することを包含する、ＨＧＦアイソフォームを製造、単離及び製剤するための方法が提供される。更に又、ＭＥＴシグナリングの他のモジュレーターとのＨＧＦアイソフォームの組み合わせも提供される。
【０２０３】
１．ＨＧＦアイソフォームのクラス
記載した通り、ＨＧＦアイソフォームは、同種のリガンドと比較した場合に活性を除去又は低減又は別様に改変するため、例えばこれに対して正又は負の作用を有するために十分な程度、ＨＧＦの野生型又は優勢な形態と比較した場合に、ドメイン又はドメインの一部分を欠失するか、又はドメインの崩壊を有するポリペプチドである。ＨＧＦアイソフォームはオルタナティブスプライシングによるか、又は組み換え又は合成の方法により形成できる、ＨＧＦ遺伝子のスプライシング変異体（又は組み換え短鎖化変異体）を呈する。ＨＧＦアイソフォームはオルタナティブスプライシングされたＲＮＡによりコードされることができる。ＨＧＦアイソフォームは又、組み換え法により、そして、インシリコ又は合成の方法を用いることにより形成することもできる。
【０２０４】
典型的には、オルタナティブスプライシングされたＲＮＡから生成したＨＧＦアイソフォームは遺伝子によりコードされるポリペプチドの優勢な形態ではない。一部の例においては、ＨＧＦアイソフォームは組織特異的又は発生段階特異的なポリペプチドであることができ、又は、疾患特異的であることができる（即ち、組織毎に、又は非疾患状態と比較して疾患状態において異なるレベルで発現されることができ、又は、疾患のプロセス又は進行の段階において、又はその間に、組織において発現されるのみであってよい）。ＨＧＦアイソフォームをコードすることができるオルタナティブスプライシングされたＲＮＡの形態は、限定しないが、エクソン欠失、エクソン保持、エクソン伸長、エクソントランケーション及びイントロン保持オルタナティブスプライシングＲＮＡを包含する。ＨＧＦアイソフォームに包含されるものはイントロン融合蛋白である。
【０２０５】
２．ＨＧＦアイソフォームのオルタナティブスプライシング及び形成
真核生物における遺伝子は、一般的にプレｍＲＮＡと称されるＲＮＡ産物にＲＮＡポリメラーゼにより転写されるイントロン及びエクソンを包含する。プレｍＲＮＡは典型的には中間産物であり、これは更にＲＮＡスプライシング及びプロセシングによりプロセシングされることにより最終的なメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を形成する。典型的には、最終ｍＲＮＡはエクソン配列を含有し、そしてイントロンをスプライシングアウトすることにより得られる。イントロン及びエクソンの境界は、イントロンを除去しエクソン配列を共に連結するためのシグナル及び基質として細胞のスプライシング機序により使用されるヌクレオチドの配列である、スプライシング接合部により表される。エクソンは共に作動可能に連結することにより成熟したＲＮＡ分子を形成する。典型的には、ｍＲＮＡ中の１つ以上のエクソンがポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含有する。多くの場合において、オープンリーディングフレームは２つ以上のエクソンを作動可能に連結することにより形成でき；例えばコーディング配列はエクソン接合部に及んでおり、そしてオープンリーディングフレームは接合部を跨いで維持される。
【０２０６】
ＲＮＡは又単一の遺伝子から種々の異なるｍＲＮＡ転写物を生成するようにオルタナティブスプライシングを起こすことができる。オルタナティブスプライシングされたｍＲＮＡは異なる数及び／又は配置のエクソンを含有できる。例えば、１０エクソンを有する遺伝子は種々のオルタナティブスプライシングｍＲＮＡを形成できる。一部のｍＲＮＡは全１０エクソンを含有し、一部は僅か９、８、７、６、５等を有する。更に又、例えば１０エクソン中９つを有する産物が種々のｍＲＮＡに包含され、その各々は異なるエクソンを消失していることができる。オルタナティブスプライシングｍＲＮＡは優勢な又は野生型の形態をコードするＲＮＡには典型的には存在しない追加的なエクソンを含有できる。エクソンの付加及び欠失はＲＮＡの５’エクソン、３’エクソン及び内部のエクソンのそれぞれ付加及び欠失を包含する。オルタナティブスプライシングされたＲＮＡ分子はまた、ＲＮＡに作動可能に連結した、又はその内部にあるイントロン又はイントロンの一部分の付加を包含する。例えば、野生型又は優勢なの形態をコードするＲＮＡ内のスプライシングにより通常除去されるイントロンはオルタナティブスプライシングされたＲＮＡ内に存在することができる。イントロン及びイントロンの一部分は例えば２エクソン間において、ＲＮＡ内で作動可能に連結できる。イントロン又はイントロンの一部分はＲＮＡの一端において、例えば転写物の３’末端において、作動可能に連結することができる。一部の例においては、ＲＮＡ内のイントロン配列の存在は、イントロン内のポリアデニル化配列に基づいて転写を終止させる。
【０２０７】
オルタナティブＲＮＡスプライシングパターンは細胞及び組織の型に応じて変動できる。オルタナティブＲＮＡスプライシングはまた生物、細胞又は組織型の発生段階により調節できる。例えば、ＲＮＡスプライシング酵素及びＲＮＡスプライシングを調節するポリペプチドは特定の細胞及び組織の型において異なる濃度で、そして、特定の発生段階において存在することができる。一部の場合において、特定の酵素又は調節ポリペプチドは特定の細胞又は組織の型において、そして特定の発生段階において非存在であることができる。これ等の相違は細胞又は組織の型又は段階内でのＲＮＡの異なったスプライシングパターンをもたらすことができ、これによりｍＲＮＡの異なる集団を与える。そのような複雑性は特定の細胞方又は発生段階に対して適切である蛋白産物を多く形成することができる。
【０２０８】
オルタナティブスプライシングされたｍＲＮＡは本明細書においてはアイソフォームとも称する種々の異なるポリペプチドを形成することができる。そのようなアイソフォームは欠失、付加及び短鎖化を有するポリペプチドを包含できる。例えば、エクソンにより通常コードされているオープンリーディングフレームの一部分をオルタナティブスプライシングされたｍＲＮＡにおいて除去することにより、より短鎖のポリペプチドを得ることができる。アイソフォームはＮ末端又はＣ末端において除去されたアミノ酸を有することができ、或いは、欠失は内部であることができる。アイソフォームはエクソン欠失の結果としてドメイン又はドメインの一部分を欠いていることができる。オルタナティブスプライシングされたｍＲＮＡは又追加的配列を有するポリペプチドを形成できる。例えば終止コドンをエクソン内に含有でき；このエクソンがｍＲＮＡに包含されない場合は、終止コドンは存在せず、そしてオープンリーディングフレームは下流のエクソンに含有される配列内に引き継がれる。そのような例においては、追加的なオープンリーディングフレーム配列が追加的なアミノ酸残基をポリペプチドに付加し、そして新しいドメイン又はその一部分の付加をもたらすことができる。
【０２０９】
ａ．イントロン修飾及びイントロン融合蛋白
オルタナティブＲＮＡスプライシングパターンにより形成できるＨＧＦアイソフォームに包含されるものは融合蛋白とも称されるイントロン修飾を介して形成されるアイソフォームである。１つの例において、ＨＧＦアイソフォームはＨＧＦの野生型又は優勢な形態をコードするｍＲＮＡ転写物と比較して１つ以上のイントロンが保持されているようにオルタナティブスプライシングにより形成される。取り込まれたイントロン配列は１つ以上のイントロン又はその一部分を包含できる。そのようなｍＲＮＡはイントロン保持の機序により生じさせることができる。例えばスプライシング機序がイントロン１つ以上を除去してしまうよりも前に、プレｍＲＮＡを核から細胞の細胞質に移出する。一部の場合においては、スプライシング部位を例えば細胞蛋白により能動的にブロックすることによりイントロン１つ以上のスプライシングを防止することができる。
【０２１０】
１つ以上のイントロン配列の保持はＨＧＦの野生型又は優勢なの形態と比較して短鎖化されているＨＧＦアイソフォームをコードする転写物を形成できる。保持されたイントロン配列は転写物中に終止コドンを導入しこれによりコードされたポリペプチドを早期に終止させることができる。保持されたイントロン配列はまた、１つ以上のアミノ酸がＨＧＦのドメインに挿入されるように転写物内へのコドン１つ以上を挿入する等、ＨＧＦポリペプチド内に追加的なアミノ酸を導入できる。イントロンの保持はＨＧＦアイソフォームをコードする転写物内への完全又は部分的なイントロン配列の封入を包含する。保持されたイントロン配列は、包囲するエクソンに対してコドンがインフレームとなるようにヌクレオチドに導入することができ、或いは、それは転写物にフレームシフトを導入することができる。イントロン保持転写物の例示されるヌクレオチド配列は配列番号９，１１又は１３を包含する。
【０２１１】
一般的にイントロン融合蛋白は、何れかの１つ以上のイントロン配列の保持のために、同種のリガンドト比較して生物学的活性を改変するために十分な程度に、ドメイン又はドメインの一部分を欠いているか、又は、追加的なドメイン又はドメインの一部分を含有している。更に又、イントロン融合蛋白はエクソンコードアミノ酸に作動可能に連結したエクソンによりコードされないアミノ酸１つ以上を含有することができ、これにより、ＨＧＦによりコードされる野生型又は優勢な形態と比較して長鎖化又は短鎖かされたアイソフォームをもたらすことができる。典型的には、イントロン融合蛋白はＨＧＦポリペプチドの野生型又は優勢な形態をコードするＲＮＡの相当する配列内には存在しないイントロン融合蛋白コードＲＮＡ内の終止コドン１つ以上の存在により短鎖化される。アミノ酸及び／又は終止コドンの付加は、重合体の野生型又は優勢な形態とは大きさ及び配列において異なるイントロン融合蛋白をもたらすことができる。
【０２１２】
イントロン融合蛋白は生物学的活性１つ以上において修飾されることができる。例えば、イントロン融合蛋白におけるアミノ酸の付加は、ポリペプチドの野生型又は優勢な形態と比較して生物学的活性を追加、拡張又は修飾することができる。例えばイントロンコードアミノ酸配列の蛋白への融合は新しい官能性を有するドメインの付加をもたらす。イントロンコードポリペプチドの蛋白への融合もまた、例えば生物学的活性を抑制することにより、例えば受容体２量体化の抑制及び／又は受容体シグナリングの抑制により、蛋白の既存の生物学的活性をモジュレートできる。
【０２１３】
イントロン融合蛋白は天然及びコンビナトリアルなイントロン融合蛋白を包含する。天然のイントロン融合蛋白は遺伝子のエクソン１つ以上に作動可能に連結した１つ以上のイントロン又はその一部分を含有するオルタナティブスプライシングされたＲＮＡによりコードされる。コンビナトリアルなイントロン融合蛋白は組み換え又は合成手段により形成され、そして頻繁には、イントロンコード配列がエクソン配列に作動可能に連結していることにより、同じ遺伝子配列から誘導された、又は、関連する遺伝子ファミリーにおける遺伝子配列から誘導された天然のイントロン融合蛋白の場合のように１つ以上のドメイン又はその一部分が欠失又は付加されているポリペプチドをコードすることができるという点において天然のイントロン融合蛋白を模倣している。
【０２１４】
ｉ．天然のイントロン融合蛋白
天然のイントロン融合蛋白は、イントロン保持ＲＮＡ分子及び一部のエクソン伸長ＲＮＡのような、イントロン配列並びにエクソン配列を含有するｍＲＮＡを包含するオルタナティブスプライシングされたｍＲＮＡのクラスから形成される。それらは、存在し、細胞又は組織から単離できるか、又はデータベース中で識別できる全てのそのような変異体を包含する。可能であり、そしてイントロン由来の１つ以上のコドン（終止コドンのみも包含）を包含する如何なるスプライシング変異体も天然のイントロン融合蛋白と見なす。
【０２１５】
１つ以上のイントロン又はその一部分の保持は、本明細書においては天然のイントロン融合蛋白と称するアイソフォームの形成をもたらすことができる。例えば、イントロン配列はＲＮＡスプライシングによりエクソン配列に作動可能に連結されるオープンリーディングフレームを含有できる。イントロンコード配列は例えばポリペプチドのＮ又はＣ末端の何れかにおいて、又はポリペプチドの内部において、ポリペプチドにアミノ酸を付加させることができる。一部の例においては、イントロン配列は又終止コドン１つ以上を含有できる。エクソンの１つ以上においてオープンリーディングフレームと作動可能に連結しているイントロンコード終止コドンはコードされたポリペプチドを終止させることができる。即ち、終止コドンの結果として短鎖かされたアイソフォームを製造できる。一部の例において、ｍＲＮＡ内に保持されているイントロンはオープンリーディングフレームにアミノ酸１つ以上及び終止コドンの付加をもたらし、これによりイントロンコード配列で終止するアイソフォームが生成する。
【０２１６】
本明細書において提供されるものは、イントロン保持により形成される天然のイントロン融合蛋白、例えばイントロンによりコードされるドメイン又はドメインの部分の付加を有するイントロン融合蛋白、及び欠失した１つ以上のドメイン又はドメインの一部分を有するイントロン融合蛋白である。例えば、典型的には遺伝子のｍＲＮＡ内にあるエクソン配列の代わりにイントロン配列を作動可能に連結できる。即ちエクソンによりコードされるドメイン又はその一部分を欠失させ、そしてイントロンコードアミノ酸をコードされたポリペプチド内に包含させる。
【０２１７】
別の例においては、ｍＲＮＡ内に典型的に存在するエクソンに加えてイントロン配列を作動可能に連結させる。１つの例においては、作動可能に連結させたイントロン配列はポリペプチドをコードするエクソン配列に対してインフレームに終止コドンを導入できる。別の例においては、作動可能に連結したイントロン配列はポリペプチド内にアミノ酸１つ以上を導入できる。１つの実施形態において、インフレームの終止コドンは又、ポリペプチドをコードするエクソン配列に作動可能に連結することにより、Ｃ末端においてイントロンコードアミノ酸を有するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを形成する。
【０２１８】
天然のイントロン融合蛋白の１つの例において、イントロン配列によりコードされるアミノ酸１つ以上はポリペプチドのＣ末端において作動可能に連結される。例えば、イントロン融合蛋白は、ＲＮＡの５’末端のエクソン配列１つ以上とそれに後続するＲＮＡの３’末端の１つ以上のイントロン配列又はイントロン配列の一部分を含有する核酸配列から形成される。このような核酸から生成されたイントロン融合蛋白はＮ末端におけるエクソンコードアミノ酸及びＣ末端におけるイントロン配列によりコードされる１つ以上アミノ酸を含有する。別の例においては、イントロン融合蛋白は、エクソン配列１つ以上にイントロン配列内にコードされる終止コドンを作動可能に連結し、これにより短鎖化されたポリペプチドをコードする核酸配列を形成することにより、核酸から形成される。
【０２１９】
ｉｉ．コンビナトリアルなイントロン融合蛋白
イントロン融合蛋白は又、ポリペプチドの野生型又は優勢な形態と比較して修飾されているポリペプチドを製造するための組み換え法及び／又はインシリコ及び合成の方法により形成できる。典型的には、そのようなＨＧＦアイソフォームは遺伝子のエクソン配列に作動可能に連結したイントロン配列の存在のために野生型又は優勢な形態と比較して修飾された配列を有する。例えば、本明細書において更に記載する通り、使用可能なソフトウエアプログラム、イントロン及びエクソンを使用することにより、配列及びコードされる蛋白のドメインをＨＧＦ遺伝子のような核酸中で識別することができる。エクソン１つ以上及びイントロン配列又はその一部分を含有するポリペプチドをコードする組み換え核酸分子を合成できる。そのような組み換え分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のアミノ酸及び／又はエクソンに作動可能に連結したイントロンによりコードされる終止コドンを含有することができ、これによりイントロン融合蛋白を生成する。
【０２２０】
組み換え手段により形成されるイントロン融合蛋白はコードされたイントロン配列の存在のために野生型又は優勢な形態と比較して、より長鎖又は短鎖であるポリペプチドを包含できる。典型的には、コンビナトリアルなイントロン融合蛋白は野生型又は優勢な形態と比較して短鎖化されたポリペプチドである。例えば、組み換え分子はアミノ酸１つ以上及び／又はエクソンに作動可能に連結したイントロンによりコードされる終止コドンを含有することができ、これによりＨＧＦの野生型又は優勢な形態より短鎖であるアイソフォームを製造する。短鎖化は１つ以上のドメイン又はその一部分を除去できる。これ等のトランケーションされた形態は内部、Ｎ末端、Ｃ末端又はその組み合わせにおいて、欠失を有することができる。別の例において、イントロン配列は、イントロンコードアミノ酸配列がＨＧＦポリペプチド内への追加のアミノ酸の導入、例えばＨＧＦのドメイン内にアミノ酸１つ以上が挿入されるような転写物内へのコドン１つ以上の挿入をもたらすか、又はドメインの付加をもたらす場合には、長鎖化された蛋白を生じさせるこができる。或いは、コードされるイントロン配列は、終止コドンが下流のエクソン内で読まれないために長鎖化された転写物をもたらすように、ＨＧＦ転写物のフレームシフトをもたらすことができる。この方法の部分として、潜在的な免疫原性エピトープは、モチーフスキャニングを用いて認識し、そして保存的なアミノ酸置換を用いるか、又はＰＥＧ化のような当該分野で良く知られている他の修飾により、修飾できる。一般的に、何れの治療用イントロン融合蛋白も、最適化された薬物動態を達成、又は免疫原性を回避するために、この同じ方法で修飾することができる。
【０２２１】
ｂ．エクソン修飾により形成されるアイソフォーム
ＨＧＦアイソフォームはまた、ＨＧＦポリペプチドの野生型又は優勢な形態をコードするＲＮＡの相当するエクソンと相対比較した場合のエクソンの修飾により形成できる。エクソンの修飾はエクソントランケーション、エクソン伸長、エクソン欠失及びエクソン挿入のようなオルタナティブスプライシングされたＲＮＡの形態を包含する。これ等のオルタナティブスプライシングされたＲＮＡ分子は、追加のアミノ酸を包含することにより、及び／又は、ＨＧＦポリペプチドの野生型又は優勢な形態に存在するアミノ酸残基を欠くことにより、ＨＧＦポリペプチドの野生型又は優勢な形態とは異なるＨＧＦアイソフォームをコードすることができる。
【０２２２】
挿入されたエクソンは、挿入されたエクソンによりコードされる追加のアミノ酸を、ＲＮＡ内に存在する他のエクソンに作動可能に連結することができる。挿入されたエクソンは又、１つ以上の終止コドンを含有することができ、これによりＲＮＡコードポリペプチドはそのような終止コドンの結果として終始する。そのような終止コドンを含有するエクソンがポリペプチドの野生型又は優勢な形態のポリペプチド終止のために使用される終止コドンを含有するエクソンの上流に挿入される場合、短鎖化されたポリペプチドを製造できる。
【０２２３】
挿入されたエクソンは、エクソンが挿入された場合に、挿入されたエクソンによりコードされる追加のアミノ酸を有するポリペプチドの野生型又は優勢な形態のアミノ酸配列を含有するアイソフォームをＲＮＡがコードするように、オープンリーディングフレームを維持することができる。挿入されたエクソンによりコードされる追加のアミノ酸がアイソフォームにおいてそれぞれＮ末端、Ｃ末端又は内分において連結されるように、挿入されるエクソンはＲＮＡの５’側、３’側又は内部に挿入されることができる。挿入されるエクソンは又、ポリペプチドの野生型又は優勢な形態におけるアミノ酸の配列の一部分のみを含有するアイソフォームが形成されるように、自身が挿入されるＲＮＡの読み枠を変化させることができる。そのようなアイソフォームは挿入されたエクソンによりコードされるアミノ酸配列を追加的に含有することができ、そして又、挿入されたエクソン内に含有される終止コドンの結果として終止することができる。
【０２２４】
ＨＧＦアイソフォームはまた、エクソン欠失事象から製造できる。エクソンの欠失は、例えばアミノ酸をコードする配列を除去することにより、並びに、ポリペプチドをコードするＲＮＡの読み枠の変化により、代替サイズのポリペプチドを製造できる。エクソン欠失はコードされるポリペプチドからアミノ酸１つ以上を除去することができ；そのようなアミノ酸はＲＮＡ配列内のエクソンの位置に応じて、ポリペプチドに対してＮ末端、Ｃ末端又は内部であることができる。ＲＮＡ内のエクソンの欠失は又、ポリペプチドの野生型又は優勢な形態には存在しないアミノ酸１つ以上を含有するアイソフォームが製造されるように読み枠のシフトを誘発することができる。読み枠のシフトは又、ポリペプチドの野生型又は優勢な形態の場合とは異なる配列において終止するアイソフォームを製造する読み枠中の終止コドンをもたらすことができる。１つの例において、読み枠のシフトはポリペプチドの野生型又は優勢な形態と比較して短鎖化されたアイソフォームを製造する。そのような短鎖化されたアイソフォームは又ポリペプチドの野生型又は優勢な形態には存在しないアミノ酸の配列を含有できる。
【０２２５】
ＨＧＦアイソフォームは又ＲＮＡにおけるエクソン伸長により製造できる。エクソン伸長内に含有される追加的配列は追加のアミノ酸をコードすることができ、及び／又は、ポリペプチドを終止させる終止コドンを含有することができる。インフレームの終止コドンを含有するエクソン挿入はエクソン伸長の配列において終止する短鎖化アイソフォームを製造できる。エクソン挿入は又、ＲＮＡの読み枠をシフトさせることができ、これによりポリペプチドの野生型又は優勢な形態には存在しないアミノ酸１つ以上を含有するアイソフォーム、及び／又は、ポリペプチドの野生型又は優勢な形態の場合とは異なる配列において終止するアイソフォームをもたらすことができる。エクソン伸長はポリペプチドの野生型又は優勢な形態をコードするＲＮＡのイントロン内に含有される配列を包含でき、そしてこれによりイントロン融合蛋白を製造する。
【０２２６】
ＨＧＦアイソフォームは又エクソントランケーションにより製造できる。エクソントランケーションを有するＲＮＡ分子はポリペプチドの野生型又は優勢な形態と比較して短鎖化されたポリペプチドを製造できる。エクソントランケーションは又、ポリペプチドの野生型又は優勢な形態には存在しないアミノ酸１つ以上を含有するアイソフォームが製造されるように読み枠のシフトをもたらすことができる。読み枠のシフトは又、ポリペプチドの野生型又は優勢な形態の場合とは異なる配列において終止するアイソフォームを製造する読み枠中の終止コドンをもたらすことができる。
【０２２７】
エクソン修飾を包含するオルタナティブスプライシングＲＮＡ分子は生物学的活性を低減又は除去するために十分な程度ドメイン又はその一部分を欠いているＨＧＦアイソフォームを製造できる。例えば、エクソン修飾ＲＮＡ分子はドメイン又はその一部分を欠いた短鎖化ＨＧＦポリペプチドをコードできる。エクソン修飾ＲＮＡ分子は又、挿入されたアミノ酸により、及び／又は、ポリペプチドの野生型又は優勢な形態には存在しないアミノ酸１つ以上でドメインを中断する読み枠のシフトにより、ドメインが中断されているポリペプチドをコードできる。
【０２２８】
２．ＨＧＦアイソフォームポリペプチドの構造
例示されるＨＧＦ遺伝子（例えば配列番号１、図１参照）は１７イントロンで中断された蛋白コーディング配列を含有する１８エクソンを包含する。配列が配列番号２に記載される核酸分子によりコードされることができる配列番号３に記載するポリペプチドのようなＨＧＦポリペプチドの野生型又は優勢な形態において、１８エクソンはＲＮＡスプライシングにより連結されることにより、シグナル配列、Ｎ末端ドメイン、４クリングルドメイン（Ｋ１−Ｋ４）及びＳｅｒＰを包含する７２８アミノ酸ポリペプチドをコードする転写物を形成する（例えば図２参照）。本明細書に記載するもののようなＨＧＦアイソフォームは、ＨＧＦのスプライシングパターンがＨＧＦの野生型又は優勢な形態をコードする転写物と比較して改変されるように、オルタナティブスプライシングにより形成できる。
【０２２９】
エクソン欠失、エクソン保持、エクソン伸長、エクソントランケーション又はイントロン保持による等、オルタナティブスプライシングにより形成されるＨＧＦアイソフォームは、一般的に、リガンドの野生型又は優勢な形態のＨＧＦポリペプチドと比較して、ドメイン又はドメインの一部分を欠いているか、又はアミノ酸１つ以上の挿入等によりドメインにおける崩壊を有するリガンドをもたらす。ＨＧＦアイソフォームは又、リガンドの野生型及び／又は優勢な形態と比較して新しいドメイン及び／又は機能を含有できる。ＨＧＦアイソフォームのポリペプチド配列における欠失、崩壊又は挿入は、例えばドメイン１つ以上の排除によるか、ＨＧＦ遺伝子のイントロンによりコードされるもののようなドメイン又はその一部分の付加により、ＨＧＦの場合と比較して活性を改変するか、又はＨＧＦと比較して構造を変化させるために十分なものである。本明細書において提供されるものは、ＨＧＦポリペプチドのドメイン全て又は部分を欠いているイントロン保持により形成されるＨＧＦアイソフォームである。本明細書において提供されるＨＧＦアイソフォームはまた同種のリガンドト比較してコードされるアイソフォームの内部、又はＮ又はＣ末端に挿入されたイントロンコードアミノ酸を包含できる。
【０２３０】
ＨＧＦアイソフォームはリガンドの野生型又は優勢な形態のポリペプチド配列と比較してドメイン１つ以上又はドメイン１つ以上の一部分を欠いていることができる。例えば、ＨＧＦアイソフォームはＳｅｒＰドメイン又はＳｅｒＰドメインの一部分を欠いていることができる。そのようなアイソフォームはＨＧＦアイソフォームは配列番号３のアミノ酸４９５〜７２８に記載するアミノ酸の一部又は全てを欠いていることができる。ＳｅｒＰドメインを欠いているＨＧＦアイソフォームの例は、配列番号１０、１２、１８又は２０を包含し、そしてＳｅｒＰドメインの一部を欠いているＨＧＦアイソフォームの例は配列番号１４を包含する。ＨＧＦアイソフォームはクリングルドメインの全て又は一部分を欠いていることができる。そのようなアイソフォームはＫ１、Ｋ２、Ｋ３又はＫ４ドメインを包含する４クリングルドメインの何れかの１つ以上又は何れかの１つ以上の一部分を欠いているアイソフォームを包含する。ＨＧＦアイソフォームは第１のクリングルドメインの一部分、第１のクリングルドメインの全て、第２のクリングルドメインの一部分、第２のクリングルドメインの全て、第３のクリングルドメインの一部分、第３のクリングルドメインの全て、第４１のクリングルドメインの一部分及び／又は第４のクリングルドメインの全て、又はこれ等の組み合わせを欠いていることができる。そのようなアイソフォームは配列番号３のアミノ酸１２８〜２０６（Ｋ１）、２１１〜２８８（Ｋ２）、３０５〜３８３（Ｋ３）及び／又は３９１〜４６９（Ｋ４）として記載されるアミノ酸の一部又は全てを欠いていることができる。Ｋ１ドメインの一部分を欠いているＨＧＦアイソフォームの例は配列番号１０及び１８を包含する。ＨＧＦアイソフォームはまたＮ末端ドメインの全て又は一部分を欠いていることができる。
【０２３１】
ＨＧＦアイソフォームは、ＨＧＦの野生型又は優勢な形態のポリペプチド配列と比較した場合のアミノ酸１つ以上の挿入等によるドメインの崩壊を包含できる。例えばＨＧＦアイソフォームはシグナルペプチド中、Ｎ末端ドメイン中、クリングルドメイン１つ以上中、及び／又はＳｅｒＰドメイン中のアミノ酸１つ以上の挿入を包含できる。
【０２３２】
ＨＧＦアイソフォームは又配列内へのドメイン又は部分的ドメインの付加を包含するＨＧＦポリペプチド配列を包含できる。例えばＨＧＦアイソフォームは蛋白のＣ末端におけるアミノ酸の付加を包含でき、この場合、そのようなアミノ酸はＨＧＦの野生型及び／又は優勢な形態において観察されない。ポリペプチド配列のＣ末端における追加のアミノ酸配列を包含するＨＧＦアイソフォームの例は配列番号１０、１２、１８又は２０を包含する。
【０２３３】
ＨＧＦアイソフォームポリペプチドは又、正式にはドメインの一部分ではないが、指定されたドメインの間（本明細書においては連結領域と称する）に観察されるアミノ酸を含有できる。ＨＧＦアイソフォームは又、連結領域１つ以上における挿入、欠失及び／又は崩壊を包含できる。連結領域における崩壊を含むＨＧＦアイソフォームの例は配列番号１０、１２、１８又は２０を包含する。
【０２３４】
３．ＨＧＦアイソフォームの活性
本明細書において提供されるＨＧＦアイソフォームはＨＧＦの野生型又は優勢な形態と比較した場合に、異なる、又は改変された活性を保有することができる。ＨＧＦアイソフォームはＭＥＴシグナリングのアゴニスト、部分アゴニスト又は拮抗剤であることができる。ＨＧＦアイソフォームは又ＨＧＦ−ＭＥＴシグナリングとは無関係の他の活性を示すことができる。一般的に、本明細書において提供されるＨＧＦアイソフォームは例えばリガンド拮抗剤として作用することによりその受容体であるＭＥＴの活性を抑制する。本明細書において提供されるＨＧＦアイソフォームはＶＥＧＦ及びＦＧＦ−２を包含する他の成長因子リガンドによる血管形成活性を抑制できる。改変された活性は、例えば、改変されたシグナル伝達及び／又は細胞表面分子１つ以上との改変された相互作用を包含する。
【０２３５】
一般的に、活性は、リガンドの野生型及び／又は優勢な形態と比較して少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５又は１０倍、アイソフォームにより改変される。典型的には、活性は１０、２０、５０、１００又は１０００以上改変される。例えばアイソフォームはリガンドの野生型及び／又は優勢な形態と比較して活性において低減されることができる。アイソフォームは又リガンドの野生型及び／又は優勢な形態と比較して活性において増大されることができる。ＨＧＦアイソフォームの活性を評価する場合、アイソフォームはＨＧＦの野生型及び／又は優勢な形態と比較することができる。例えば、ＨＧＦアイソフォームは配列番号３に記載するＨＧＦポリペプチドと比較して活性において改変されることができる。アイソフォームは又、ＨＧＦの野生型及び／又は優勢な形態の存在下、又はＶＥＧＦ又はＦＧＦ−２のような他の成長因子の野生型及び／又は優勢な形態の存在下においてＨＧＦアイソフォームの活性を評価することにより、拮抗剤又は阻害剤としての活性について試験できる。
【０２３６】
ａ．細胞表面作用の改変
１つの例において、ＨＧＦアイソフォームは受容体相互作用を包含する細胞表面相互作用において改変されている。例えばアイソフォームは例えばＭＥＴ受容体のような受容体１つ以上に対する結合親和性において低減される。別の例においては、アイソフォームは受容体１つ以上に対する親和性において増強される。ＨＧＦアイソフォームは又他の細胞表面分子へのその結合において改変されることができる。１つの例において、アイソフォームはヘパリン又はヘパリンスルフェートのようなＧＡＧへの結合において改変されることができる。別の例においては、アイソフォームは血管形成に関与する他の細胞表面蛋白、例えば、内皮ＡＴＰシンターゼ、アンジオモチン、αｖβ３インテグリン、アネキシンＩＩ、何れかの１つ以上の成長因子受容体、例えばＭＥＴ、ＦＧＦＲ又はＶＥＧＦＲ、又は成長因子受容体と協調して血管形成応答を誘導することが知られている何れかの他の細胞表面分子への結合において改変されることができる。アイソフォームは又受容体又は他の細胞表面結合分子に対する特異性において改変されることができる。例えば、アイソフォームは１つの受容体又は他の細胞表面蛋白と、他の受容体又は細胞表面蛋白よりも優先して結合することができ、その場合、そのような優先的な結合はＨＧＦの野生型又は優勢な形態の受容体特異性との比較におけるものである。受容体又は細胞表面相互作用において改変されるアイソフォームはＮ末端ドメインの全て又は一部分を欠いているか、又は、Ｎ末端ドメインの崩壊を有しているアイソフォームを包含できる。改変された受容体又は細胞表面結合を有するＨＧＦアイソフォームは又、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３又はＫ４ドメインの何れかの１つ以上の全て又は一部分を欠いているアイソフォームを包含できる。受容体相互作用において改変されているＨＧＦアイソフォームは又、単量体アイソフォームを包含するＨＧＦの野生型又は優勢な形態と比較した場合にコンホーメーション変化を有するアイソフォームを包含することができる。
【０２３７】
自身の受容体であるＭＥＴを包含する細胞表面分子との相互作用において改変されているＨＧＦアイソフォームはシグナル伝達の側面１つ以上において改変されることができる。アイソフォームは、ＨＧＦの野生型又は優勢な形態と比較して、受容体又は他の細胞表面蛋白、例えば血管形成応答に関与する蛋白に由来する細胞応答の誘導、増強、抑制又は防止を包含する細胞応答の１つ以上のモジュレーションにおいて改変されることができる。ＨＧＦアイソフォームにより改変できる細胞応答の例は、限定しないが、有糸分裂誘発、遊走誘発、形態形成及び／又は血管形成性の応答の誘導を包含する。
【０２３８】
ｂ．競合的拮抗剤
ＨＧＦアイソフォームは受容体結合に関して同種のＨＧＦの野生型又は優勢な形態のような他のＨＧＦ形態と競合することができる。即ちそのようなアイソフォームはＭＥＴ受容体に結合でき、そして他のＨＧＦポリペプチドに結合するために使用できる受容体の量を低減する。ＨＧＦの受容体１つ以上に対して結合及び競合するＨＧＦアイソフォームは、シグナル伝達に参加しないか、同種のＨＧＦと比較してシグナル伝達に参加する自身の能力が低減しているＨＧＦアイソフォームを包含する。
【０２３９】
ＭＥＴ細胞表面受容体に結合することにより優勢なリガンドト競合するＨＧＦアイソフォーム拮抗剤は同種のＨＧＦリガンドのＮ末端ドメイン及びクリングルドメインの何れかの１つ以上の全て又は部分を包含できる。拮抗剤ＨＧＦアイソフォームは、アイソフォームはその受容体に結合していてもシグナル伝達をモジュレートしないようにドメイン１つ以上を欠いていることができる。例えばそのようなアイソフォームはＳｅｒＰドメインの全て又は一部分を包含するβ鎖の全て又は一部分を欠いていることができる。１つの例において、ＨＧＦアイソフォームはＳｅｒＰドメインのアミノ酸１つ以上を欠いており、例えば配列番号３に記載するＨＧＦポリペプチドのアミノ酸４９５〜７２８に相当するアミノ酸１つ以上を欠いている。ＨＧＦアイソフォーム拮抗剤は又４クリングルドメインの何れか１つの全て又は一部分を欠いていることができる。１つの例において、ＨＧＦアイソフォームは配列番号３に記載する同種のリガンドのクリングルドメインの何れか１つに相当するアミノ酸１つ以上、例えば配列番号３のアミノ酸１２８〜２０６（Ｋ１）、２１１〜２８８（Ｋ２）、３０５〜３８３（Ｋ３）及び／又は３９１〜４６９（Ｋ４）の間にあるアミノ酸１つ以上を欠いている。
【０２４０】
ｃ．負の作用を示す抑制性のアイソフォーム
ＨＧＦアイソフォームは又他のポリペプチドの活性をモジュレートできる。モジュレートされるポリペプチドはＨＧＦの野生型又は優勢な形態であることができ、又は、別の成長因子、例えば限定しないが、ＦＧＦ−２又はＶＥＧＦの野生型又は優勢な形態であることができる。ＨＧＦアイソフォームは又別のＨＧＦ、ＦＧＦ−２又はＶＥＧＦのアイソフォーム、例えば疾患又は状態において発現されるアイソフォームをモジュレートできる。そのようなＨＧＦアイソフォームは成長因子リガンド／受容体対の野生型又は優勢な形態の生物学的活性１つ以上を防止又は抑制することにより負の作用を示すリガンドとして作用することができる。ＨＧＦアイソフォームはＨＧＦ又は他の成長因子ポリペプチドの活性をモジュレートするために直接又は間接的に相互作用できる。負の作用を示すリガンドは受容体のリガンド結合ドメインに結合又は影響する必要はなく、又、受容体へのリガンドの結合に影響する必要もない。
【０２４１】
１つの例において、ＨＧＦアイソフォームは受容体の２量体化及び／又は成長因子の血管形成応答を媒介するために必要な細胞表面蛋白への結合に関して別の成長因子リガンドト競合することができる。例えば、ＨＧＦアイソフォームはヘパリン又はＧＡＧへの結合に関して別の成長因子リガンドト競合することができ、これにより、同種の受容体のリガンド媒介シグナリングのために必要な２量体リガンドの形成を防止する。そのようなＨＧＦアイソフォームはＧＡＧへの結合のために十分なＨＧＦのＮ末端ドメインの全て又は一部分を包含する。ＨＧＦアイソフォームは更に、ＨＧＦアイソフォームがＧＡＧに結合するが、それ自体受容体の２量体化及び活性化を誘導しない限り、同種のＨＧＦの何れか１つ以上のＫ１、Ｋ２、Ｋ３又はＫ４ドメイン又はＳｅｒＰドメインの全て又は一部分を欠くことができる。
【０２４２】
別の例においては、ＨＧＦアイソフォームは別のリガンド受容体対により誘導されたシグナリングをモジュレートするか、それと協調する細胞表面分子に結合できる。例えば、ＨＧＦアイソフォームは血管形成応答に関与する蛋白、例えば内皮ＡＴＰシンターゼ、アンジオモチン、αｖβ３インテグリン、アネキシンＩＩ、ＭＥＴ、ＦＧＦＲ又はＶＥＧＦＲのような成長因子受容体、又は、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２又は他の成長因子のその受容体への結合により誘導される血管形成シグナリングをモジュレート及び／又はこれと協調する何れかの他の細胞表面分子に結合することができる。そのようなＨＧＦアイソフォームはＫ１ドメインの全て又は一部分を包含する。ＨＧＦアイソフォームは更に、ＨＧＦアイソフォームが血管形成分子に結合して成長因子により誘導される血管形成応答をモジュレートするが、それ自体ＭＥＴ受容体活性化を誘導しない限り、Ｎ末端ドメイン、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４又はＳｅｒＰドメインの何れかの１つ以上の全て又は一部分を欠いていることができる。
【０２４３】
Ｄ．ＨＧＦアイソフォームを識別して形成するための方法
アイソフォームは種々の方法のいずれかにより識別子、生成することができる。例えば、それらは、配列アライメント及びドメインマッピング及び選択のようなバイオインフォマティクスの方法と組み合わせたクローニング法を用いる遺伝子及び発現産物（ＲＮＡ分子）の分析及び同定により識別できる。
【０２４４】
１．アイソフォームを識別して単離するための方法
ＨＧＦアイソフォームを識別して単離するための例示される方法は発現された遺伝子配列のクローニング及びゲノムＤＮＡ配列のような遺伝子配列とのアライメントを包含する。発現された配列、例えばｃＤＮＡ分子又はｃＤＮＡ分子の領域を単離する。プライマーはｃＤＮＡ又はｃＤＮＡの領域を増幅するように設計できる。１つの例においては、ＨＧＦ遺伝子のオープンリーディングフレームの開始コドンにオーバーラップ又はフランキングするプライマーを設計し、そして、オープンリーディングフレームの終止コドンにオーバーラップ又はフランキングするプライマーを設計する。プライマーはオープンリーディングフレームをコードする核酸分子を増幅するためにｍＲＮＡを使用した逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）のようなＰＣＲにおいて使用できる。そのような核酸分子はアイソフォームをコードするものを識別するために配列決定できる。１つの例においては、予測される大きさ（例えばコードされる野生型又は優勢な形態に関して予測される大きさ）とは異なる大きさ（例えば分子質量）の核酸分子を候補アイソフォームとして選択する。次にそのような核酸分子を例えば本明細書に記載した方法により分析することにより、更に特定の特性を有する位ホスフェートコード分子を選択することができる。
【０２４５】
得られた核酸配列を用いてコンピューター分析を実施することにより更に候補アイソフォームを選択する。例えばｃＤＮＡ配列を選択された候補遺伝子のゲノム配列とアラインする。そのようなアライメントは手作業により、又は、スプライシング変異体の分析のためのコンピュータープログラムであるＳＩＭ４のようなバイオインフォマティクスプログラムを用いることにより、実施できる。カノニカルなドナー−アクセプタースプライシング部位（例えばＧＴ−ＡＧ）を有する配列を選択する。エクソン欠失、エクソン保持、エクソン伸長及びイントロン保持のようなオルタナティブスプライシングされた産物を呈する分子を選択できる。
【０２４６】
単離された核酸分子の配列分析は又、野生型又は優勢な形態と比較した場合にドメイン及び／又は機能を保持しているか欠いているアイソフォームを更に選択するために使用できる。例えば、単離された核酸分子によりコードされるアイソフォームは蛋白ドメインを識別するために本明細書に記載したもののようなバイオインフォマティクスプログラムを用いて分析できる。次にドメイン又はその一部分を保持又は欠いているアイソフォームを選択することができる。
【０２４７】
１つの実施形態において、活性を低減するために十分な程度、ＳｅｒＰドメイン又はその一部分を欠いているアイソフォームを選択する。例えば、ＳｅｒＰドメインのアミノ酸１つ以上を欠いているか、又は、アミノ酸１つ以上の挿入のようなＳｅｒＰドメインの崩壊を有するアイソフォームを選択する。ＳｅｒＰドメイン又はその一部分を欠いており、そして、失われたドメイン又はドメインの一部分の代わりに作動可能に連結しているアミノ酸１つ以上を有するアイソフォームを選択できる。そのようなアイソフォームはエクソン伸長、イントロン保持、エクソン欠失及びエクソン挿入のようなオルタナティブスプライシング事象の結果であることができる。一部の場合においてはそのようなオルタナティブスプライシングされたＲＮＡ分子は、ＲＮＡの読み枠を改変、及び／又は、野生型又は優勢な形態をコードするＲＮＡ中には観察されない配列を作動可能に連結する。
【０２４８】
別の実施形態においては、少なくとも１つのクリングルドメイン又はクリングルドメインの一部分を欠いているアイソフォームを選択する。例えば、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３又はＫ４ドメインの何れかの１つ以上及び／又は何れかの１つ以上の一部分を欠いているアイソフォームを選択する。そのようなアイソフォームはＫ１ドメインのアミノ酸１つ以上を欠いているものを包含できる。例えば、ＨＧＦアイソフォームは配列番号３のアミノ酸１２８〜２０６に相当するアミノ酸の１つ以上を欠いていることができる。そのようなアイソフォームはＳｅｒＰドメインを欠いていることができる。アイソフォームはエクソン伸長、イントロン保持、エクソン欠失及びエクソン挿入のようなオルタナティブスプライシング事象の結果であることができる。一部の場合においてはそのようなオルタナティブスプライシングされたＲＮＡ分子は、ＲＮＡの読み枠を改変、及び／又は、野生型又は優勢な形態をコードするＲＮＡ中には観察されない配列を作動可能に連結する。そのようなアイソフォームはＨＧＦの野生型又は優勢な形態には観察されない追加のアミノ酸配列を包含できる。１つの例においては、追加のアミノ酸配列はＨＧＦアイソフォームのＣ末端に含有される。
【０２４９】
ＨＧＦアイソフォームをコードし、そしてＨＧＦの野生型又は優勢な形態とは異なる活性を有する核酸分子を選択できる。１つの例においては、アイソフォームがＭＥＴによるシグナル伝達を刺激しないようにＳｅｒＰドメインを欠いたＨＧＦアイソフォームを選択する。別の例においては、少なくとも１つのクリングルドメインの全て又は一部分を欠いているがＭＥＴ及び／又は他の細胞表面相互作用相手、例えばヘパリンへの結合を維持しており、そして、リガンド相互作用及びシグナル伝達を包含する、自身の成長因子リガンドにより刺激される成長因子受容体の生物学的活性１つ以上を改変するＨＧＦアイソフォームを選択する。
【０２５０】
２．アイソフォームの対立遺伝子及びスプライシング変異体の識別
ＨＧＦアイソフォームのようなリガンドアイソフォームの対立遺伝子変異体及び種変異体を形成又は識別することができる。そのような変異体は、特定のＨＧＦアイソフォーム又は同種のＨＧＦとはアミノ酸１つ以上において異なっている。対立遺伝子変異は集団のメンバー内に起こり、そして種変異は種間に起こる。例えば、アイソフォームは遺伝子の異なる対立遺伝子から誘導でき；核対立遺伝子は他のものとはアミノ酸相違１つ以上を有することができる。そのような対立遺伝子は保存的及び／又は非保存的なアミノ酸の相違を有することができる。対立遺伝子変異体は又個々の対象又は動物モデル又は他の動物のような異なる対象から生成又は識別されるアイソフォームを包含する。アミノ酸変化はアイソフォームの生物学的活性のモジュレーションをもたらすことができる。一部の場合において、アミノ酸の相違は生物学的活性に対する検出可能な影響を有さないか、実質的に有さない「サイレント」なものであることができる。アイソフォームの対立遺伝子変異体はまた突然変異誘発により形成することができる。このような突然変異誘発はランダム又は指向性のものであることができる。例えば、アミノ酸配列を改変するか、又は潜在的グリコシル化部位を改変することによりアイソフォームのグリコシル化における変化、例えばアイソフォームのある部位における代替グリコシル化、グリコシル化の増大又は抑制をもたらす対立遺伝子変異体アイソフォームを形成できる。対立遺伝子変異体アイソフォームはアイソフォームに対し配列において少なくとも９０％同一であることができる。一般的に、同じ種に由来する対立遺伝子変異体アイソフォームはアイソフォームに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であり、典型的には対立遺伝子変異体はアイソフォームに対して９８％、９９％、９９．５％同一である。
【０２５１】
例えばＨＧＦアイソフォーム、例えば本明細書に記載するＨＧＦアイソフォームはＨＧＦポリペプチドにおける対立遺伝子変異を包含できる。例えば、ＨＧＦアイソフォームは同種のＨＧＦの対立遺伝子変異体中に存在する１つ以上のアミノ酸相違を包含できる。１つの例において、ＨＧＦアイソフォームは配列番号１６に記載する対立遺伝子変異１つ以上を包含する。対立遺伝子変異の例はＮ末端ドメイン、クリングルドメイン又はＳｅｒＰドメインにおける変異体、例えば限定しないが、配列番号１６に記載するアミノ酸７８、８２、１５３、１８０、２９３、３００、３０４、３１７、３２５、３３０、３３６、３８７、４１６、４９４、５０５又は５０９に相当する位置におけるアミノ酸の変異を包含する。ＨＧＦアイソフォームは又同種のＨＧＦの種変異体を包含する。
【０２５２】
Ｅ．例示されるＨＧＦアイソフォーム
１．ＨＧＦアイソフォーム
ＨＧＦのアイソフォームが提供される。特に、トランケーションされているがＫ４領域の少なくとも全て又は一部分を包含し、ただしＮ末端ドメイン、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３又はＳｅｒＰドメインの全て又は一部分の１つ以上を欠いているＨＧＦのアイソフォームが提供される。
【０２５３】
２．ＨＧＦイントロン融合蛋白
本明細書において提供されるものはＨＧＦアイソフォームをコードする核酸分子におけるイントロンコード配列の保持のために同種のＨＧＦと比較して改変されたドメイン機構を有する例示的ＨＧＦアイソフォームである。
【０２５４】
本明細書において提供されるＨＧＦアイソフォームはエクソンに作動可能に連結したイントロン５を除くＨＧＦの何れかのイントロンの全て又は一部分を包含する核酸分子によりコードされる。イントロン部分は、エクソンの末端において終止するＨＧＦアイソフォームをもたらす終止コドンを包含する１つのコドンを包含でき、又は、ＨＧＦアイソフォームがイントロンコード残基を包含するようにより多くのコドンを包含できる。
【０２５５】
例示されるＨＧＦアイソフォームのイントロン／エクソン構造を図１に示す。その配列は配列番号１に記載する通りである。配列番号１に記載するＨＧＦの例示されるゲノム配列においては、本明細書で提供されるＨＧＦアイソフォームはＨＧＦの何れかのイントロンの全て又は一部分、例えば、ヌクレオチド２５４〜７２６４を包含するイントロン１、ヌクレオチド７４３２〜１１３３３を包含するイントロン２、ヌクレオチド１１４４６〜１２８３３を包含するイントロン３、ヌクレオチド１２９４９〜１７８７４を包含するイントロン４、ヌクレオチド２５１３８〜２６６６５を包含するイントロン６、ヌクレオチド２６７８５〜４０３５７を包含するイントロン７、ヌクレオチド４０５３３〜４４１１９を包含するイントロン８、ヌクレオチド４４２４８〜４９２８９を包含するイントロン９、ヌクレオチド４９３９３〜５２７７１を包含するイントロン１０、ヌクレオチド５２９０６〜５８６１７を包含するイントロン１１、ヌクレオチド５８６５７〜５９８９３を包含するイントロン１２、ヌクレオチド５９９９２〜６２７７２を包含するイントロン１３、ヌクレオチド６２８４８〜６３７０９を包含するイントロン１４、ヌクレオチド６３８５１〜６４３８３を包含するイントロン１５、ヌクレオチド６４４９１〜６４６０１を包含するイントロン１６及びヌクレオチド６４７４８〜６７３７９を包含するイントロン１７の全て又は一部分を包含できる。例示されるＨＧＦアイソフォームはＨＧＦ遺伝子のイントロン１１又はイントロン１３の全て又は一部分を保持している。アイソフォームのイントロンコード部分はイントロンに作動可能に連結したエクソン配列に対してＮ末端側、Ｃ末端側又は内部に存在できる。
【０２５６】
１つの実施形態において、本明細書において提供されるＨＧＦのイントロン融合蛋白又はその対立遺伝子変異体は、ＨＧＦアイソフォームが拮抗性及び／又は抗血管形成性の活性を示すように完全長同種のＨＧＦのドメインの全て又は一部分を欠いている。本明細書において提供されるアイソフォームは同種のＨＧＦのＮ末端ドメインの一部分、Ｋ１ドメインの一部分、Ｋ２ドメインの一部分、Ｋ３ドメインの一部分、Ｋ４ドメインの一部分、及び、ＳｅｒＰドメインの全て又は一部分又はこれ等の組み合わせの１つ以上を欠いている。トランケーション及び欠失は、選択されれば、上記活性を有するアイソフォームを生成する。
【０２５７】
アイソフォームはアイソフォーム内において内部にあるか、Ｎ又はＣ末端にあるイントロン１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７の何れかの１つ以上に由来するイントロンコードアミノ酸を包含し、或いは、アイソフォームはエクソンの末端でトランケーションされている。本明細書において提供されるＨＧＦアイソフォーム及びその対立遺伝子変異体は抗血管形成活性を示すことができる。例えば、アイソフォームはＮ末端ドメインの全て又は一部分、Ｋ１ドメインの一部分、Ｋ２ドメインの全て又は一部分、Ｋ３ドメインの全て又は一部分、Ｋ４ドメインの全て又は一部分、又は、ＳｅｒＰドメインの全て又は一部分又はこれ等の組み合わせを欠いていることができる。アイソフォームはアイソフォーム内において内部にあるか、Ｎ又はＣ末端にあるイントロン１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７の何れかの１つ以上に由来するイントロンコードアミノ酸を包含できる。一部の例においては、抗血管形成性であるアイソフォームも又拮抗活性を示すことができる。
【０２５８】
本明細書において提供されるＨＧＦアイソフォームに包含されるものは、自身のコード核酸分子がＳＲ０２３Ａ０２と標記されるものである。それに関する核酸及びアミノ酸配列は配列番号９又は１７に記載する。クローンＳＲ０２３Ａ０２は１４７１塩基を含有し、Ｃ末端コード末端においてイントロン部分を包含する。イントロン部分はイントロン１１の最初の３４ヌクレオチドを含有する。イントロン１１の部分は終止コドンが後続する３アミノ酸をコードする。クローンにおいてこの部分はエクソン１〜１１のオープンリーディングフレームに作動可能に連結している。コードされたＨＧＦアイソフォームは同種のＨＧＦと比較してトランケーションされており、そしてＣ末端における３イントロンコードアミノ酸を包含する。ＳＲ０２３Ａ０２は、各々がＳＲ０２３Ａ０２アイソフォームをコードするが、２アミノ酸において異なっている、自身の配列が配列番号１０又は１８に示される４６７アミノ酸ＨＧＦアイソフォームポリペプチドをコードする。配列番号１０は８２位にＬｅｕ及び３２０位にＳｅｒを含有する。配列番号１８はこれ等の位置にそれぞれＰｈｅ及びＰｒｏを有し、これ等は配列番号３に記載する同種のＨＧＦのアミノ酸に相当する。これはアミノ酸１〜３１におけるＮ末端のシグナル配列、及び、及びアミノ酸３４〜１２４におけるシグナル配列の後のＮ末端ドメインを含有する。配列番号３に記載する同種の受容体と比較して、ＳＲ０２３Ａ０２コードＨＧＦアイソフォームはＫ１ドメインにおけるアミノ酸１６１〜１６５の欠失を含有している（例えば図２参照）。更に又、このアイソフォームは配列番号３のアミノ酸２１１〜２８８、３０５〜３８３及び３９１〜４６９に相当するＫ２、Ｋ３及びＫ４ドメインを包含し、そしてＳｅｒＰドメインを欠いている。ＳＲ０２３Ａ０２にコードされるアイソフォームは又、配列番号３に記載する同種のＨＧＦには存在しないＫ４ドメインの後の追加的３アミノ酸（アミノ酸４６５〜４６７）を包含する。同様に提供されるものは、ＳＲ０２３Ａ０２の対立遺伝子及び種変異体である。これ等は、別の原料からそれらを単離するか、又は、同種の受容体の既知配列に基づいてそれらを合成することにより製造される。これ等は、コードする核酸が配列番号２とは異なる残基において相違している。例示されるＨＧＦ対立遺伝子変異体は配列番号１５及び１６に記載する。
【０２５９】
本明細書において提供されるものは、ＳＲ０２３Ａ０８と標記される核酸分子によりコードされる別の例示的ＨＧＦアイソフォームであり、その配列は配列番号１１又は１９に記載する。ＳＲ０２３Ａ０８はイントロン１１の最初の３４ヌクレオチドを含有するＣ末端におけるイントロン部分を包含する１４９５塩基を含有する。イントロン１１の部分はコードされるポリペプチドのエクソン１〜１１のオープンリーディングフレームに作動可能に連結した終止コドンが後続する３アミノ酸をコードしており、これにより、同種のＨＧＦと比較してトランケーションされたＨＧＦアイソフォームをもたらす。ＳＲ０２３Ａ０８によりコードされるＨＧＦアイソフォームは、ＳＲ０２３Ａ０８アイソフォームを各々がコードするが１つのアミノ酸において異なっている配列番号１２又は２０に記載する４７２アミノ酸を含有する。配列番号１２は３０４位にＬｙｓを含有するが、配列番号２０はこの位置にＧｌｕを含有し、これは配列番号３に記載する同種のＨＧＦのアミノ酸に相当する。このアイソフォームはアミノ酸１〜３１のＮ末端にシグナルペプチド、アミノ酸３４〜１２４にＮ末端ドメイン、アミノ酸１２８〜２０６にＫ１ドメイン、アミノ酸２１１〜２８８にＫ２ドメイン、アミノ酸３０５〜３８３にＫ３ドメイン、及びアミノ酸３９１〜４６９にＫ４ドメインを包含する（例えば図２参照）。ＳＲ０２３Ａ０８によりコードされるＨＧＦアイソフォームはＳｅｒＰドメインを欠いているが、配列番号３に記載する同種のＨＧＦには存在しないＫ４ドメインの後の追加的３アミノ酸（アミノ酸４７０〜４７２）を含有する。ＳＲ０２３Ａ０８変異体、例えば対立遺伝子及び種変異体を提供する。これ等はコードする核酸が配列番号２とは異なる残基において相違している。例示されるＨＧＦ対立遺伝子変異体は配列番号１６に記載されており、そして配列番号１５においてコードされている。
【０２６０】
クローンＳＲ０２３Ａ０９によりコードされる別の例示されるＨＧＦアイソフォームが提供される。コードされる核酸配列は配列番号１３に記載する。このクローンはイントロン１３の最初の６６ヌクレオチドを含有するＣ末端におけるイントロン部分を包含する１６１３塩基を含有する。イントロン１３の部分はコードされるポリペプチドのエクソン１〜１３のオープンリーディングフレームに作動可能に連結した終止コドンをコードしており、これにより、同種のＨＧＦと比較してトランケーションされたＨＧＦアイソフォームをもたらす。ＳＲ０２３Ａ０９コードアイソフォームはシグナル配列を包含する５１４アミノ酸長である。アイソフォームのアミノ酸配列は配列番号１４に記載する通りである。アイソフォームはアミノ酸１〜３１にＮ末端シグナル配列、アミノ酸３４〜１２４にＮ末端ドメイン、アミノ酸１２８〜２０６にＫ１ドメイン、アミノ酸２１１〜２８８にＫ２ドメイン、アミノ酸３０５〜３８３にＫ３ドメイン、及びアミノ酸３９１〜４６９にＫ４ドメインを含有する（例えば図２参照）。このアイソフォームはアミノ酸５１４においてトランケーションされており、従って、配列番号３に記載する同種のＨＧＦのアミノ酸５１５〜７２８に相当するＳｅｒＰドメインの部分を欠いている。ＳＲ０２３Ａ０８コードＨＧＦアイソフォームの対立遺伝子及び種変異体を包含する変異体を提供する。これ等はそれぞれ同種ののＨＧＦ又はポリペプチドの配列番号１５又は１６に記載する対立遺伝子変異の何れか１つのような対立遺伝子変異を包含する。
【０２６１】
Ｆ．ＨＧＦアイソフォームポリペプチドをコードする核酸を製造するための方法
ＨＧＦアイソフォーム核酸分子及びポリペプチドを形成するための例示される方法は当該分野で知られた分子生物学の手法を包含する。そのような方法はＰＣＲ、合成遺伝子構築、及び、単離及び／又は合成された核酸フラグメントのインビトロのライゲーションのような核酸分子に関するインビトロの合成方法を包含する。ＨＧＦアイソフォーム核酸分子は又、クローニング方法、例えば細胞から単離されたＲＮＡ及びＤＮＡのＰＣＲ、及び、ハイブリダイゼーション及び／又は発現スクリーニング法による核酸分子ライブラリのスクリーニングにより単離できる。
【０２６２】
ＨＧＦアイソフォームポリペプチドはインビトロ及びインビボの合成方法を用いながらＨＧＦアイソフォーム核酸分子から形成できる。ＨＧＦアイソフォームは投与及び治療のために要するアイソフォームの必要量及び形態を製造するために適する何れかの生物中で発現させることができる。発現宿主は原核生物及び真核生物、例えばＥ．ｃｏｌｉ、酵母、植物、昆虫細胞、哺乳類細胞、例えばヒト細胞系統及びトランスジェニック動物を包含する。ＨＧＦアイソフォームは又、それらが発現される細胞及び生物、例えばアイソフォームが組み換え生産される細胞及び生物、及び、オルタナティブスプライシング事象により生産されるゲノム的にコードされたアイソフォームのような組み換え手段によらずにアイソフォームが合成されるものから単離できる。
【０２６３】
１．合成遺伝子及びポリペプチド
ＨＧＦアイソフォーム核酸分子及びポリペプチドは合成的な遺伝子合成を用いながら当業者の知る方法により合成できる。そのような方法において、ＨＧＦアイソフォームのポリペプチド配列は「逆翻訳」されることにより、アイソフォームをコードする核酸分子１つ以上を形成する。次に逆翻訳された核酸分子を例えば自動化ＤＮＡ合成技術を用いることによりＤＮＡフラグメント１つ以上として合成する。次にフラグメントを作動可能に連結することによりアイソフォームをコードする核酸分子を形成する。核酸分子は又、追加的な核酸分子、例えば、ベクター、転写及び翻訳を調節するための調節配列、及び他のポリペプチドコード核酸分子と連結することもできる。アイソフォームコード核酸分子はまた例えばトラッキングのための標識、例えば放射標識及び蛍光部分に連結することもできる。
【０２６４】
逆翻訳のプロセスはＨＧＦアイソフォームのような目的の何れかのポリペプチドに関するヌクレオチド遺伝子配列を得るために遺伝子コードを使用する。遺伝子コードは縮重しており、６４のコドンが２０アミノ酸及び３終止コドンを特定する。このような縮重により、核酸の設計及び形成において柔軟性が得られ、そしてこれにより例えば制限部位を付加することにより核酸フラグメントの連結及び各合成フラグメント内のユニークな識別子配列の設置を容易にすることができる。遺伝子コードの縮重は又、望ましくないヌクレオチド配列、例えば望ましくない制限部位、スプライシングドナー又はアクセプター部位、又は、効率的な翻訳のためには潜在的に有害である他のヌクレオチド配列を回避するための核酸分子の設計を可能にする。更に又、生物は場合により特定のコドンの使用及び／又はＧＣ対ＡＴヌクレオチドの所定の比を優先する場合がある。即ち、遺伝子コードの縮重により特定の生物又は生物の群における発現のために専用化した核酸分子の設計が可能となる。更に又、核酸分子は配列の最適化（又は非最適化）に基づいた発現の異なるレベルのために設計できる。逆翻訳は、ポリペプチドをコードするコドンを選択することにより実施する。そのようなプロセスは遺伝子コードとポリペプチド配列の表を用いながら手作業で実施できる。或いは、コンピュータープログラム、例えば公的に入手可能なソフトウエアを使用することにより逆翻訳された核酸配列を発生させることができる。
【０２６５】
逆翻訳された核酸分子を合成するためには、核酸合成の分野で使用可能な何れかの方法を使用できる。例えば、ヌクレオチドのＨＧＦアイソフォームをコードする配列のフラグメントに相当する個々のオリゴヌクレオチドを標準的な自動化方法により合成し、そしてアニーリング又はハイブリダイゼーション反応において共に混合する。そのようなオリゴヌクレオチドは、一般的には約１００ヌクレオチド長の相補配列のデュプレックス形成時に形成されるオーバーラップ１本鎖オーバーハングを用いながらオリゴヌクレオチドから遺伝子を自己組立させることができるように、合成される。デュプレックスＤＮＡ内の単一のヌクレオチド「ニック」を例えばバクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼによるライゲーションを用いてシールする。次に例えば制限エンドヌクレアーゼリンカー配列を使用することにより蛋白発現に適する種々の組み換えＤＮＡベクターの何れか１つに合成遺伝子を挿入することができる。別の同様の方法においては、オーバーラップオリゴヌクレオチドのシリーズを化学的オリゴヌクレオチド合成法により製造する。これ等のオリゴヌクレオチドのアニーリングにより、ギャップを有するＤＮＡ構造がもたらされる。ＤＮＡポリメラーゼＩのような酵素により触媒されるＤＮＡ合成を用いてこれ等のギャップを充填することができ、そしてライゲーションを用いてデュプレックス構造における全てのニックをシールする。形成された線状ＤＮＡデュプレックスを増幅するためにはＰＣＲ及び／又は他のＤＮＡ増幅の手法を適用できる。
【０２６６】
ベクター、例えば蛋白発現ベクター又はコア蛋白コーディングＤＮＡ配列の増幅のために設計されたベクター内に合成された遺伝子をクローニングする目的のための制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するリンカー配列を包含する追加的なヌクレオチド配列を、ＨＧＦアイソフォームをコードする核酸分子に連結することができる。更に又、機能的ＤＮＡエレメントを特定する追加的ヌクレオチド配列を、アイソフォームをコードする核酸分子に作動可能に連結することができる。そのような配列の例は、限定しないが、細胞内蛋白発現を促進するように設計されたプロモーター配列、及び、蛋白の分泌を促進するように設計された分泌配列を包含する。追加的な核酸配列、例えば蛋白結合領域を特定する配列もまたアイソフォームをコードする核酸分子に連結できる。そのような領域は限定しないが、特定の標的細胞内へのアイソフォームの取り込みを促進する、又は別様に合成遺伝子の薬物動態を増強する配列を包含する。
【０２６７】
ＨＧＦアイソフォームは又、自動化された合成ポリペプチド合成を用いて合成できる。クローニング及び／又はインシリコで発生したポリペプチド配列をフラグメントとして合成し、次に化学的に連結することができる。或いは、アイソフォームを単一のポリペプチドとして合成できる。次にそのようなポリペプチドを本明細書に記載する試験及び治療投与において使用できる。
【０２６８】
２．ＨＧＦアイソフォームのクローニング及び単離の方法
ＨＧＦアイソフォームは核酸分子をクローニング及び単離するための当該分野で知られた何れかの使用可能な方法を用いてクローニング及び単離を行える。そのような方法は核酸のＰＣＲ増幅及びライブラリのスクリーニング、例えば核酸のハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体系のスクリーニング及び活性系のスクリーニングを包含する。
【０２６９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を包含する核酸の増幅のための方法を用いることによりアイソフォームをコードする核酸分子を単離できる。核酸含有材料を出発物質とし、これより、アイソフォームコード核酸分子を単離で切る。例えば、ＤＮＡ及びｍＲＮＡ調製物、細胞抽出液、組織抽出液、体液資料（例えば血液、血清、唾液）及び健常者及び／又は罹患した対象に由来する試料を増幅法において使用できる。核酸ライブラリもまた出発物質の原料として使用できる。プライマーはアイソフォームを増幅するために設計できる。例えばプライマーは、アイソフォームの形成元となった発現配列に基づいて設計できる。プライマーはアイソフォームアミノ酸配列の逆翻訳に基づいて設計できる。増幅により形成された核酸分子を配列決定し、そしてアイソフォームをコードすることを確認することができる。
【０２７０】
アイソフォームをコードする核酸分子は又、ライブラリスクリーニングを用いて単離できる。例えば、ｃＤＮＡ分子のような発現されたＲＮＡ転写物を提示する核酸ライブラリは、ＨＧＦアイソフォーム又はその部分をコードする核酸分子とのハイブリダイゼーションによりスクリーニングできる。例えば、ＨＧＦ遺伝子由来のイントロン配列又はその一部分を用いながら、相同配列へのハイブリダイゼーションに基づいてイントロン保持含有分子を得るべくスクリーニングすることができる。発現ライブラリのスクリーニングを用いてＨＧＦアイソフォームをコードする核酸分子を単離できる。例えば、発現ライブラリは特定のアイソフォーム又はアイソフォームの一部分を認識する抗体を用いてスクリーニングできる。ＨＧＦアイソフォーム又はアイソフォームに含有される領域又はペプチドに特異的に結合する抗体を得ることができ、及び／又は製造できる。アイソフォームに特異的に結合する抗体を用いてアイソフォームをコードする核酸分子を含有する発現ライブラリをスクリーニングできる。アイソフォーム特異的抗体を製造するための例示される方法は後に記載する。
【０２７１】
３．発現系
天然及びコンビナトリアルなイントロン融合蛋白を包含するＨＧＦアイソフォームはインビボ及びインビトロの方法を包含する当該分野で知られた何れかの方法により製造できる。ＨＧＦアイソフォームは投与及び治療のために要するＨＧＦアイソフォームの必要量及び形態を製造するために適する何れかの生物中で発現させることができる。発現宿主は原核生物及び真核生物、例えばＥ．ｃｏｌｉ、酵母、植物、昆虫細胞、哺乳類細胞、例えばヒト細胞系統及びトランスジェニック動物を包含する。発現宿主はその蛋白生産レベルにおいて、並びに発現された蛋白上に存在する翻訳後修飾の型において異なることができる。発現宿主の選択は、これ等及び他の要因、例えば調節及び安全性の問題、製造コスト及び精製の必要性及び方法に基づいて行うことができる。
【０２７２】
多くの発現ベクターが入手可能であり、当該分野で知られており、そしてＨＧＦアイソフォームの発現のために使用できる。発現ベクターの選択は宿主発現系の選択により影響される。一般的に、発現ベクターは転写プロモーター及び任意のエンハンサー、翻訳シグナル及び転写及び翻訳の終止シグナルを包含できる。安定な形質転換のために使用される発現ベクターは典型的には形質転換された細胞の選択及び維持を可能にする選択可能なマーカーを有する。一部の場合において、複製起点を用いてベクターのコピー数を増幅させることができる。
【０２７３】
ＨＧＦアイソフォームは又融合蛋白として利用又は発現させることができる。例えばアイソフォーム融合はアイソフォームに追加的機能を付加させるために形成できる。アイソフォーム融合蛋白の例は、限定しないが、シグナル配列、例えば局在化用のタグ、例えばＨｉｓ６タグ又はｍｙｃタグ、又は精製用タグ、例えばＧＳＴ融合、及び蛋白分泌及び／又は膜会合を指向するための配列の融合を包含する。
【０２７４】
ａ．原核生物発現
原核生物、特にＥ．ｃｏｌｉがＨＧＦアイソフォームのような蛋白の大量を生産するための系を提供する。Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換は当該分野で良く知られている簡素で迅速な手法である。Ｅ．ｃｏｌｉのための発現ベクターは誘導プロモーターを含有でき、そのようなプロモーターは高レベルの蛋白発現の誘導のため、及び、宿主細胞に対して何らかの毒性を呈する蛋白の発現のために有用である。誘導プロモーターの例はｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７及びＳＰ６ＲＮＡプロモーター及び温度調節λＰＬプロモーターを包含する。
【０２７５】
アイソフォームはＥ．ｃｏｌｉの細胞質環境において発現できる。細胞質は還元性の環境であり、そして一部の分子に対しては、これは不溶性の封入体の形成をもたらす場合がある。ジチオスレイトール及びβ−メルカプトエタノールのような還元剤及び塩酸グアニジン及び尿素のような変性剤を用いることにより蛋白を再可溶化することができる。代替の方策は酸化性の環境及びシャペロニン様及びジスルフィドのイソメラーゼを与え、そして可溶性蛋白の生産をもたらすことができる細菌のペリプラズムの空間におけるＨＧＦアイソフォームの発現である。典型的にはペリプラズムに蛋白を指向させる発現すべき蛋白にリーダー配列を融合させる。次にリーダーをペリプラズム内部のシグナルペプチダーゼにより除去する。ペリプラズムターゲティングリーダー配列の例はペクテートリアーゼ遺伝子由来のｐｅｌＢリーダー及びアルカリホスファターゼ遺伝子から誘導されたリーダーを包含する。一部の場合において、ペリプラズム発現は発現された蛋白の培地中への漏出を可能にする。蛋白の分泌は培地上澄みからの迅速で簡素な精製を可能にする。分泌されない蛋白は、浸透圧溶解によりペリプラズムから得ることができる。細胞質発現と同様に、一部の場合において蛋白は不溶性となり、変性剤及び還元剤を用いて可溶化及び再折り畳みを促進することができる。誘導及び生育の温度もまた発現レベル及び溶解しえに影響する場合があり、典型的には２５℃〜３７℃の温度を使用する。典型的には、細菌はアグリコシル化蛋白を生成する。即ち、蛋白が機能のためにグリコシル化を要する場合は、宿主細胞からの精製の後にインビトロでグリコシル化を付加することができる。
【０２７６】
ｂ．酵母
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓはＨＧＦアイソフォームの製造のために使用できるよく知られた酵母発現宿主である。酵母はエピソーム複製ベクターを用いるか、又は、相同組み換えによる安定な染色体組み込みにより、形質転換できる。典型的には、誘導プロモーターを使用して遺伝子発現を調節する。そのようなプロモーターの例はＧＡＬ１、ＧＡＬ７及びＧＡＬ５、及び、メタロチオネインプロモーター、例えばＣＵＰ１、ＡＯＸ１又は他のＰｉｃｈｉａ又は他の酵母のプロモーターを包含する。発現ベクターは頻繁には形質転換されたＤＮＡの選択及び維持のためにＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３及びＵＲＡ３のような選択可能なマーカーを包含する。酵母において発現された蛋白は頻繁には可溶性である。シャペロニン、例えばＢｉｐ及び蛋白ジスルフィドイソメラーゼを用いた同時発現により発現レベルと溶解性を向上させることができる。更に又、酵母において発現された蛋白は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ由来の酵母交配型アルファ因子分泌シグナルのような分泌シグナルペプチド融合、及び、酵母細胞表面蛋白、例えばＡｇａ２ｐ交配接着受容体又はＡｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓのグルコアミラーゼとの融合を用いた分泌を指向することができる。Ｋｅｘ−２プロテアーゼのようなプロテアーゼ切断部位は、融合した配列がそれらの分泌経路退出時に発現ポリペプチドから除去されるように操作することができる。酵母は又、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフのグリコシル化も可能である。
【０２７７】
ｃ．昆虫細胞
特にバキュロウィルス発現を用いた昆虫細胞はＨＧＦアイソフォームのようなポリペプチドを発現するために有用である。昆虫細胞は高レベルの蛋白を発現氏、そしてより高等な真核生物により使用される翻訳後の修飾の大部分が可能である。バキュロウィルスは真核生物発現の安全性を向上させ、調節の問題を低減する限定的な宿主の範囲を有する。典型的な発現ベクターはバキュロウィルスのポリヘドリンプロモーターのような高レベルの発現のためのプロモーターを使用する。一般的に使用されるバキュロウィルス系は、バキュロウィルス類、例えばＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核ポリヘドローシスウィルス（ＡｃＮＰＶ）及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ核ポリヘドローシスウィルス（ＢｍＮＰＶ）及び昆虫細胞系統、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａから誘導されたＳｆ９、Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ（Ａ７Ｓ）及びＤａｎａｕｓ  ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ（ＤｐＮ１）を包含する。高レベルの発現のためには、発現すべき分子のヌクレオチド配列をウィルスのポリヘドリン開始コドンの直ぐ下流に融合する。哺乳類分泌シグナルは昆虫細胞中で正確にプロセシングされ、そして発現された蛋白を培地中に分泌するために使用できる。更に又、細胞系統Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ（Ａ７５）及びＤａｎａｕｓ  ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ（ＤｐＮ１）は哺乳類細胞系と同様のグリコシル化パターンで蛋白を生産する。
【０２７８】
昆虫細胞における代替発現系は安定に形質転換される細胞の使用である。細胞系統、例えばＳｃｈｎｉｅｄｅｒ２（Ｓ２）及びＫｃ細胞（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）及びＣ７細胞（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）を発現のために使用できる。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのメタロチオネインプロモーターを用いることによりカドミウム又は銅による重金属誘導の存在下に高レベル発現を誘導することができる。発現ベクターは典型的には、ネオマイシン及びハイグロマイシンのような選択可能なマーカーの使用により維持される。
【０２７９】
ｄ．哺乳類細胞
哺乳類発現系を用いてＨＧＦアイソフォームを発現することができる。発現コンストラクトはウィルス感染、例えばアデノウィルスにより、又は直接ＤＮＡ転移、例えばリポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランにより、及び、物理的手段、例えばエレクトロポレーション及びマイクロインジェクションにより、哺乳類細胞に転移させることができる。哺乳類細胞のための発現ベクターは典型的には、ｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）及びポリアデニル化エレメントを包含する。そのようなベクターは頻繁には高レベル発現のための転写プロモーターエンハンサー、例えばＳＶ４０プロモーターエンハンサー、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター及びラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）の長鎖末端リピートを包含する。これ等のプロモーターエンハンサーは多くの細胞型において活性である。組織及び細胞型のプロモーター及びエンハンサー領域もまた発現のために使用できる。例示されるプロモーター／エンハンサー領域は、限定しないが、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳腫瘍ウィルス、アルブミン、アルファフィトプロテイン、アルファ−１−抗トリプシン、ベータグロビン、ミエリン塩基性蛋白、ミオシン軽鎖２及びゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御のような遺伝子に由来するものを包含する。選択可能なマーカーを用いて発現コンストラクトを有する細胞を選択及び維持することができる。選択可能なマーカーの例は、限定しないが、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロホレート還元酵素及びチミジンキナーゼを包含する。ＴＣＲ−ζ及びＦｃεＲＩ−γのような細胞表面シグナリング分子との融合は細胞表面上の活性上体の蛋白の発現を指向できる。
【０２８０】
多くの細胞系統、例えばマウス、ラット、ヒト、サル、ニワトリ及びハムスター細胞を哺乳類発現のために使用できる。例示される細胞系統は、限定しないが、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０（非分泌）及び他の骨髄腫細胞系統、ハイブリドーマ及びヘテロハイブリドーマ細胞系統、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｓ、２Ｂ８及びＨＫＢ細胞を包含する。細胞系統は又、細胞培養培地由来の分泌蛋白の精製を容易にする血清非含有の培地に適合される。そのような例の１つは血清非含有ＥＢＮＡ−１細胞系統である（Ｐｈａｍ等、（２００３）Ｂｉｏｔｇｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８４：３３２−４２）。
【０２８１】
ｅ．植物
トランスジェニック植物細胞及び植物を使用してＨＧＦアイソフォームを発現させることができる。発現コンストラクトは典型的には直接のＤＮＡ転移、例えばプロトプラストへのマイクロプロジェクタイルボンバードメント及びＰＥＧ媒介転移を用いながら、そしてアグロバクテリウム媒介形質転換により、植物内に転移される。発現ベクターはプロモーター及びエンハンサーの配列、転写終止エレメント及び翻訳制御エレメントを包含できる。発現ベクター及び形質転換の手法は通常はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ及びタバコのような双子葉植物宿主とトウモロコシ及びコメのような単子葉植物宿主との間で区別される。発現のために使用される植物の例は、カリフラワーモザイクウィルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボースビスホスフェートカルボキシラーゼプロモーター及びユビキチン及びＵＢＱ３プロモーターを包含する。選択可能なマーカー、例えばハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼ及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼが形質転換細胞の選択及び維持を容易にするために頻繁に使用されている。形質転換された植物細胞は細胞、凝集塊（カルス組織）として培養物中で維持するか、又は、完全体植物に再生することができる。トランスジェニック植物細胞は又ＣＳＲアイソフォームを生産するように操作された藻類を包含できる（例えばＭａｙｆｉｅｌｄ等（２００３）ＰＮＡＳ１００：４３８−４４２参照）。植物は哺乳類細胞とは異なるグリコシル化パターンを有しているため、これ等の宿主において生産されるＣＳＲアイソフォームの選択に影響する場合がある。
【０２８２】
Ｇ．アイソフォーム結合体
種々のＨＧＦアイソフォームの合成結合体が提供される。１つの例において、ＨＧＦアイソフォームはアイソフォームの分泌を誘発するポリペプチドのような別のポリペプチドをコードする核酸分子に直接又は間接的に連結した融合蛋白として提供される。一部の例においては、融合蛋白はキメラポリペプチドをもたらすことができる。例えば、キメラは細胞外ドメイン及びＣ末端部分、例えばイントロンコード蛋白が異なるアイソフォームに由来するポリペプチドを包含できる。同様に合成形態に包含されるものは、アイソフォーム又はそのイントロンコード部分が、別の薬剤、例えばターゲティング剤又は標的物質に、又は、ＭＥＴのような細胞表面受容体（ＣＳＲ）に対してＣＳＲの活性がモジュレートされるようにＨＧＦアイソフォーム又はＨＧＦアイソフォームのイントロンコード部分を提示する何れかの他の分子に、直接又はリンカーを介して連結されている結合体である。同様に提供されるものは、形成されるポリペプチドペプチドミメティックが未修飾形態と比較してプロテアーゼに対する耐性のような向上した特性を有するように、ペプチド骨格中の１つ以上の結合がバイオアイソスター又は他の結合により置き換えられている「ペプチドミメティック」アイソフォームである。
【０２８３】
修飾された特性１つ以上を有するＨＧＦアイソフォーム結合体を設計して生成することができる。これ等の特性は限定しないが、増大した分泌又は発現を包含する増大した生産を包含する。例えば、ＨＧＦアイソフォームは未修飾のＨＧＦアイソフォームと比較して向上した分泌を示すように修飾できる。他の特性は増大した蛋白の安定性、例えば増大した蛋白の半減期、増大した熱耐容性、及び／又は、１つ以上のプロテアーゼに対する耐性を包含する。例えば、ＨＧＦアイソフォームはインビトロ及び／又はインビボの蛋白安定性を増大するように修飾できる。インビボの安定性は特定の投与条件下における蛋白の安定性、例えば血液、唾液及び／又は消化液中の安定性を包含できる。
【０２８４】
ＨＧＦアイソフォームは又、蛋白の修飾の分野で知られた何れかの方法を用いて結合体化されたポリペプチドを生成することなく修飾された特性を示すように修飾できる。そのような方法は部位指向性及びランダムな突然変異誘発を包含できる。非天然アミノ酸及び／又はポリペプチドのアミノ酸間の非天然共有結合をＨＧＦアイソフォームに導入することにより蛋白の安定性を向上させることができる。そのような修飾されたＨＧＦアイソフォームにおいて、アイソフォームの生物学的機能は未修飾アイソフォームと比較して不変のままとすることができる。一部の例においては、修飾されたＨＧＦアイソフォームは又、結合体、例えば融合蛋白、キメラ蛋白又は本明細書に記載する他の結合体として提供できる。本明細書に記載し、そして当該分野で知られている生物学的機能に関する試験のような試験を用いることにより、修飾されたＨＧＦアイソフォームの生物学的機能を評価することができる。
【０２８５】
融合蛋白又は合成結合体としての合成ＨＧＦアイソフォームの連結は直接又は間接であることができる。一部の例においては、連結は核酸リンカー、例えば制限酵素リンカー又はコードされたポリペプチドの折り畳み又は安定性を誘起する他のペプチドリンカーにより促進することができる。ポリペプチド結合体の連結は又、化学連結によるものであるか、又は、当該分野で知られた、又は本明細書に記載するようなヘテロ二官能性リンカーにより促進することができる。例示されるペプチドリンカー及びヘテロ二官能性交差結合試薬は以下に記載する通りである。例えば、例示されるペプチドリンカーは、限定しないが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、（Ｓｅｒ４Ｇｌｙ）ｎ及び（ＡｌａＡｌａＰｒｏＡｌａ）ｎ（例えば配列番号２７０参照）、ただしｎは１〜４、例えば１、２、３又は４であるもの、例えば：
（１）Ｇｌｙ４Ｓｅｒ＋ＮｃｏＩ末端、配列番号２６６
【０２８６】
【化３】
2009515520.tif 000006
（２）（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２＋ＮｃｏＩ末端、配列番号２６７
【０２８７】
【化４】
2009515520.tif 000007
（３）（Ｓｅｒ４Ｇｌｙ）４＋ＮｃｏＩ末端、配列番号２６８
【０２８８】
【化５】
2009515520.tif 000008
（４）（Ｓｅｒ４Ｇｌｙ）２＋ＮｃｏＩ末端、配列番号２６９
【０２８９】
【化６】
2009515520.tif 000009
（５）（ＡｌａＡｌａＰｒｏＡｌａ）ｎ、式中ｎは１〜４、例えば２又は３（例えば配列番号２７０参照）
を包含する。
【０２９０】
アミノ基とチオール基の間に共有結合を形成するため、及び、蛋白にチオール基を導入するために使用される多数のヘテロ二官能性交差結合試薬が当該分野で知られている（例えばそのような試薬の調製及び使用を記載し、そのような試薬の市販元を提示しているＰＩＥＲＣＥ  ＣＡＴＡＬＯＧ，  ＩｍｍｕｎｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＆  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９２−１９９３を参照でき；更に又例えばＣｕｍｂｅｒ等（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：３９７−４０１；Ｔｈｏｒｐ等（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：５９２４−５９３１；Ｇｏｒｄｏｎ等（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：３０８−３１２；Ｗａｌｄｅｎ等（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１９１−１９７；Ｃａｒｌｓｓｏｎ等（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７；Ｍａｒａｎ等（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１６３−１７０；Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ等（１９９２）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６６：３６１−３６６；Ｆａｔｔｏｍ等（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ＆  Ｉｍｍｕｎ．６０：５８４−５８９参照）。これ等の試薬は、Ｎ末端部分とＣ末端イントロンコード部分との間、又は、これ等の部分の各々とリンカーの間に共有結合を結合するために使用してよい。これ等の試薬は限定しないが、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ；ジスルフィドリンカー）；スルホスクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン−アミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）；スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチルベンジルチオスルフェート（ＳＭＢＴ、ヒンダードジスルフィドリンカー）；スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）；スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）；スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ；ヒンダードジスルフィド結合リンカー）；スルホスクシンイミジル２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ＳＡＥＤ）；スルホスクシンイミジル７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセテート（ＳＡＭＣＡ）；スルホスクシンイミジル６−［アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）；１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン（ＤＰＤＰＢ）；４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルチオ）トルエン（ＳＭＰＴ、ヒンダードジスルフェートリンカー）；スルホスクシンイミジル６−［α−メチル−α−（２−ピリミジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）；Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（���ＩＡＢ；チオエーテルリンカー）；スルホスクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）；スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドゲニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）；スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）；アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）を包含する。これ等のリンカーは、例えば、柔軟性又は溶解性を増大させるか、又は立体障害を与えるか排除するもののようなペプチドリンカーと組み合わせて使用できる。ポリペプチド分子を他の分子に連結させるための当該分野で知られた何れかの他のリンカーも使用できる。一般的な特性は、得られる分子が生体適合性であること（ヒトを包含する動物への投与のため）及び得られる分子が細胞表面分子、例えばＭＥＴ受容体、血管形成分子又は他の細胞表面分子又は受容体の活性をモジュレートすることである。
【０２９１】
ＨＧＦアイソフォーム結合体を含有する医薬組成物を製造することができ、そして例えば生理学的に許容される賦形剤中で結合体の治療有効量を投与することにより治療を行う。ＨＧＦアイソフォーム結合体は又融合蛋白としてのＨＧＦアイソフォーム結合体をコードする核酸を含有するベクターを送達することによる等、インビボの治療方法において使用できる。
【０２９２】
１．アイソフォーム融合
ＨＧＦアイソフォーム融合はＨＧＦの核酸配列の別の核酸配列との作動可能な連結を包含する。ＨＧＦアイソフォームに接続できる核酸分子は限定しないが、細胞内蛋白発現を促進するように設計されたプロモーター配列、蛋白分泌を促進するように設計された分泌配列、転写及び翻訳を調節する調節配列、ＣＤ４５の部分又は免疫グロブリンのＦｃ部分のようなコードされたポリペプチドの血清中安定性を調節する分子、及び、他のポリペプチドコード核酸分子、例えばターゲティングされた物質又はターゲティング薬剤をコードするもの、又は他のリガンド又は細胞表面受容体イントロン融合蛋白の全て又は一部をコードするものを包含する。融合配列は発現ベクターの成分であることができ、或いは、発現ベクター内に挿入されるアイソフォーム核酸配列の一部であることができる。融合は２つ以上の遺伝子によりコードされるキメラ蛋白をもたらすことができるか、又は、融合した配列が分泌経路へのポリペプチドの分泌の後に切断されるシグナル配列である場合のように融合はＨＧＦアイソフォームポリペプチドのみをコードする蛋白配列をもたらすことができる。１つの例においては、ＨＧＦアイソフォームの全て又は一部分に融合した核酸はプロモーター配列、エピトープ又は融合タグ又は分泌シグナルのようなアイソフォームの生産を向上させる何れかの核酸配列を包含することができる。別の例においては、ＨＧＦアイソフォーム融合は後に記載するもののようなＨＧＦアイソフォーム結合体を生産するためのターゲティングされた物質又はターゲティング剤との融合を包含できる。更に又、ＨＧＦアイソフォームの全て又は一部分をコードする核酸を他のリガンド又は細胞表面受容体イントロン融合アイソフォーム又はそのイントロン部分をコードする核酸に接続することによりキメライントロン融合蛋白を形成することができる。例示されるＨＧＦキメラは後に記載する。
【０２９３】
コードされたＨＧＦアイソフォーム融合蛋白は精製されたアイソフォーム蛋白の活性に悪影響を与えない追加のアミノ酸を含有できる。例えば追加のアミノ酸は、融合蛋白において例えば好ましい立体配置をもたらすために、コードされた融合配列からコードされたアイソフォーム蛋白を分離するリンカー配列として融合蛋白中に包含させることができる。分離体として使用してよいそのような追加のアミノ酸の数は変動してよく、そして一般的には６０アミノ酸を超えない。例示されるリンカー配列は後に記載する。別の例においては、融合蛋白は制限酵素リンカー配列によりコードされるアミノ酸残基を含有できる。追加的な例においては、アイソフォーム融合蛋白はＨＧＦアイソフォームの他の分子との融合の接合部において選択的切断部位を含有できる。例えば、そのような選択的切断部位は選択的な酵素的、蛋白分解的、化学的又は他の切断に対して感受性な部位をもたらすアミノ酸残基１つ以上を含んでよい。１つの例においては、追加のアミノ酸は部位特異的プロテアーゼによる切断のための認識部位であることができる。融合蛋白は更にプロセシングすることにより自身から融合ポリペプチドを切断することができ；例えばアイソフォーム蛋白がエピトープタグに融合しているが治療目的等のため追加のアミノ酸を有さない状態が望まれる場合等である。
【０２９４】
ａ．ＨＧＦアイソフォームポリペプチドの進歩した製造のためのＨＧＦアイソフォーム融合
本明細書において提供されるものはＨＧＦアイソフォームの向上した生産のためのＨＧＦ融合ポリペプチドをコードする核酸配列である。配列番号９、１１、１３、１７又は１９の何れか１つに記載のもののようなＨＧＦアイソフォームの核酸を、機能的分泌配列を代替及び／又は提供する相同又は異種の前駆体配列に融合させることができる。他の例示されるＨＧＦアイソフォームは、配列番号２１、２３、２５、２７、２９及び３１の何れか１つに記載され、そして配列番号２２、２４、２６、２８、３０又は３２の何れか１つに記載されるポリペプチドをコードする同種のＨＧＦの他の天然及び操作されたアイソフォームの変異体を包含できる。１つの例においては、同種のＨＧＦリガンドのネイティブの内因性前駆体シグナル配列を含有するイントロン融合蛋白アイソフォームのようなアイソフォームは、その前駆体配列を、異種又は相同の前駆体配列、例えば組織プラスミノーゲン活性化物質の前駆体配列又は当業者の知る何れかの他のシグナル配列で置き換えることにより、ＨＧＦアイソフォームポリペプチドの分泌及び生産を向上させることができる。前駆体配列は宿主細胞から分泌されるべき組み換え蛋白のＮ末端に自身を位置させることにより、最も効果的に利用される。核酸前駆体配列は、前駆体配列コーディング領域がアイソフォームコーディング領域の上流（即ち５’側）にあり、それと同じ読み枠内にあることによりアイソフォーム融合をもたらすような態様において、ＨＧＦアイソフォームのコーディング領域を含有する核酸に作動可能に接続することができる。アイソフォーム融合を宿主細胞内で発現させることにより、ＨＧＦアイソフォームのアミノ末端に自身のカルボキシ末端が接続された前駆体配列を含む融合ポリペプチドを提供することができる。融合ポリペプチドは宿主細胞から分泌される。典型的には、前駆体配列を融合ポリペプチドから分泌プロセス中に切断し、分泌されたアイソフォームを外部細胞環境中、又は、一部の場合においてはペリプラズム空間に蓄積させる。
【０２９５】
場合により、融合核酸であるイントロン融合蛋白を包含するＨＧＦアイソフォームは、アイソフォームポリペプチドの精製及び／又は検出を促進する融合タグをコードする配列のような別の核酸配列との作動可能な連結を包含できる。融合タグの非限定的な例はｍｙｘタグ、Ｐｏｌｙ−Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、Ｆｌａｇタグ、蛍光又はルミネセント部分、例えばＧＦＰ又はルシフェラーゼ、又は当業者の知る何れかの他のエピトープ又は融合タグを包含する。別の実施形態においては、ＨＧＦアイソフォームの核酸配列は内因性のシグナル配列を含有でき、そして、融合タグをコードする核酸配列との融合を包含できる。多くの前駆体配列、例えばシグナル配列及びプロ配列及び／又は融合タグ配列が識別されており、そして当該分野で知られており、例えば限定しないが、本明細書において提供され説明されているものが挙げられ、そして、アイソフォーム核酸分子と組み合わせて使用されることを意図している。前駆体配列はアイソフォームの遺伝子又はｃＤＮＡに対して相同又は異種であってよく、或いは、前駆体配列は化学合成できる。大部分の例においては、シグナルペプチド及び／又はプロペプチドの存在を介した宿主細胞からのアイソフォームポリペプチドの分泌は分泌されたイントロン融合蛋白ポリペプチドからのシグナルペプチド又はプロペプチドの除去をもたらすことになる。
【０２９６】
ｉ．組織プラスミノーゲン活性化物質
組織プラスミノーゲン活性化物質（ｔＰＡ）はチモーゲンであるプラスミノーゲンをその活性型プラスミンに変換することにより止血を調節するセリンプロテアーゼである。他のセリンプロテアーゼと同様、ｔＰＡは蛋白分解性のプロセシングにより活性化される不活性なチモーゲンとして合成され、分泌される。特定すれば、ｔＰＡ由来の成熟部分活性単一鎖チモーゲン形態は、プラスミン、組織カリクレイン又は第Ｘａ因子により触媒される配列番号２５５のＡｒｇ−３１０の後の切断により更にプロセシングされて２鎖の完全に活性な形態になることができる。ｔＰＡはフィブリンに富む領域である血塊の直ぐ周囲の領域において内皮細胞により血中に分泌される。ｔＰＡはフィブリン凝固の調節物質であるプラスミンへのプラスミノーゲンの変換に関する自身の高い触媒活性のためにフィブリン溶解を調節する。プラスミンは又、自身のチモーゲン形態のｔＰＡによる分解時に触媒活性２鎖形態に変換されるセリンプロテアーゼである。プラスミンは種々の場所においてフィブリンメッシュを切断することにより血塊のフィブリンネットワークを分解させる機能を有し、これにより他のプロテイナーゼにより、又は腎又は肝により消去される循環フラグメントの生産をもたらす。
【０２９７】
ｔＰＡの前駆体ポリペプチドは配列番号２５５に記載され、そして配列番号２５３において例示される完全長ｔＰＡ配列の残基１〜３５によりコードされるプレ配列及びプロ配列を包含する。ｔＰＡの前駆体配列はアミノ酸１〜２３を包含するシグナル配列を含有し、そして更に、配列番号２５３又は２５５に記載する例示ｔＰＡ配列のアミノ酸２４〜３２及び３３〜３５を包含する２プロ配列を含有する。ｔＰＡのシグナル配列はＥＲにおいて同時翻訳的に切断され、そしてプロ配列は配列番号２５３又は２５５に記載する例示配列のアミノ酸２９〜３２に存在する配列ＲＦＲＲの後のフリンプロセシング部位における切断によりゴルジ体内で除去される。ｔＰＡのプロ配列のフリン切断は、３アミノ酸プロ配列そして成熟ポリペプチドｔＰＡ配列内において配列番号２５３又は２５５に記載する例示ｔＰＡ配列のアミノ酸３３〜３５に記載するエキソペプチダーゼ切断部位であるＧＡＲを保持している。保持されたプロ配列部位の切断はプラスミン様細胞外プロテアーゼにより媒介され、配列番号２５３又は２５５に記載するＳｅｒ３６で始まる成熟ｔＰＡポリペプチドが得られる。プロテアーゼ阻害剤、例えばアプロチニンを培地中に包含させることにより、エキソペプチダーゼ切断が防止でき、そしてこれによりｔＰＡの成熟ポリペプチド中にＧＡＲプロ配列を保持できる（Ｂｅｒｇ等（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ，１７９：１２８９）。
【０２９８】
典型的にはｔＰＡは構成的分泌経路により分泌されるが、一部の細胞においてはｔＰＡは調節された態様に置いて分泌される。例えば内皮細胞においては、ｔＰＡの調節された分泌は例えばヒスタミン、血小板活性化因子又はプリンヌクレオチドによる内皮細胞の活性化の後に誘導され、そして内皮細胞内Ｃａ２＋及びｃＡＭＰシグナリングを必要とする（Ｋｎｏｐ等（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １６００：１６２）。別の細胞、例えば神経細胞においては、ｔＰＡの分泌を誘導できる特定の刺激は、運動、精神的ストレス、電気痙攣療法及び手術を包含する（Ｐａｒｍｅｒ等（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：１９７６）。ｔＰＡの調節された分泌を媒介する機序はｔＰＡポリペプチド自身上のシグナルを必要とするのに対し、ｔＰＡのシグナル配列にのみ作動可能に連結したＧＦＰ分子がカルバコール刺激非存在下に構成的に分泌されるためｔＰＡのシグナル配列はｔＰＡの構成的分泌を効率的に媒介する（Ｌｏｃｈｎｅｒ等（１９９８）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ，９：２４６３）。ｔＰＡシグナル配列の非存在下においてはｔＰＡ／ＧＦＰハイブリッド蛋白は細胞から分泌されない。
【０２９９】
ｔＰＡのプレ／プロ配列を包含する例示されるｔＰＡ前駆体配列は配列番号２５３に記載するとおりであり、そして配列番号２５２に記載する核酸配列によりコードされている。ｔＰＡのシグナル配列は配列番号２５５のアミノ酸１〜２３を包含し、プロ配列は配列番号２５５のアミノ酸２４〜３５を包含し、これによりフリン切断プロ配列はアミノ酸２４〜３２を包含し、そして、プラスミン様エキソプロテアーゼ切断プロ配列はアミノ酸３３〜３５を包含する。ｔＰＡプレ／プロ配列の対立遺伝子変異体もまた本明細書において提供され、例えば配列番号２５６又は２５７に記載するものが挙げられる。更に又、哺乳類及び非哺乳類の起源のｔＰＡのプレ／プロ配列のアイソフォーム蛋白融合も意図され、例示される配列は配列番号２５８〜２６５に記載する通りである。
【０３００】
ｉｉ．ｔＰＡ−ＨＧＦイントロン融合蛋白融合
本明細書において提供されるものはＨＧＦイントロン融合蛋白アイソフォームの向上した生産のためのｔＰＡ−ＨＧＦアイソフォームポリペプチドをコードする核酸配列である。ｔＰＡプレ／プロ配列に作動可能に連結した配列番号１０、１２、１４、１８又は２０に記載したアミノ酸をコードする配列番号９、１１又は１３の何れか１つのような、ＨＧＦのイントロン融合蛋白アイソフォーム又はその対立遺伝子変異体を包含するＨＧＦアイソフォームをコードする核酸配列が提供される。ｔＰＡプレ／プロ配列は配列番号２５３の１〜３５に記載するアミノ酸をコードする配列番号２５２に記載するｔＰＡプレ／プロ配列を包含できる。一部の例においては、ｔＰＡプレ／プロ配列はＨＧＦの内因性前駆体シグナル配列の置き換え及び／又はイントロン融合蛋白ポリペプチドの分泌のための最適な前駆体配列の提供が可能である。
【０３０１】
別の実施形態において、配列番号１０、１２、１４、１８又は２０に記載したアミノ酸をコードする配列番号９、１１又は１３の何れか１つに記載したＨＧＦアイソフォーム又はその対立遺伝子変異体は、ｔＰＡのプレ／プロ配列のフリン切断部位までの核酸配列を包含するｔＰＡのプレ／プロ配列の一部に作動可能に連結することができ（配列番号２５３に記載する例示ｔＰＡプレ−プロ配列のコードされたアミノ酸１〜３２）、これにより、アミノ酸ＧＡＲをコードする核酸を排除することができる（配列番号２５３に記載する例示ｔＰＡプレ−プロ配列のコードされたアミノ酸３３〜３５）。更に又、配列番号１０、１２、１４、１８又は２０に記載したアミノ酸をコードする配列番号９、１１又は１３の何れか１つに記載したもののようなＨＧＦアイソフォーム又はその対立遺伝子変異体の核酸配列は、配列番号２５２又は２５３に記載するようなｔＰＡのプレ／プロ配列の全て又は一部分の対立遺伝子変異体との作動可能な連結を包含でき、或いは、配列番号２５８〜２６５の何れか１つに記載のような哺乳類及び非哺乳類起源の他のｔＰＡのプレ／プロ配列の全て又は一部分との作動可能な連結を包含できる。本明細書において提供するＨＧＦイントロン融合蛋白−ｔＰＡプレ／プロ融合配列は向上した生産のためのＨＧＦアイソフォームポリペプチドの増強された細胞における発現及び分泌を示すことができる。
【０３０２】
別の実施形態において、配列番号１０、１２、１４、１８又は２０に記載したアミノ酸をコードする配列番号９、１１又は１３の何れか１つのようなＨＧＦアイソフォーム又はその対立遺伝子変異体をコードする核酸配列は配列番号２５３に記載する例示ｔＰＡプレ／プロ配列のアミノ酸１〜２３をコードする例示シグナル配列のようなｔＰＡプレ／プロ配列のみのプレ配列（シグナル配列）との作動可能な連結を包含できる。本明細書において提供されるＨＧＦイントロン融合蛋白−ｔＰＡプレ配列融合は向上した生産のためのＨＧＦアイソフォームポリペプチドの増強された細胞における発現及び分泌を示すことができる。
【０３０３】
別の実施形態において、同種のＨＧＦリガンドの内因性シグナル配列を含有する配列番号１０、１２、１４、１８又は２０に記載したアミノ酸をコードする配列番号９、１１又は１３の何れか１つのようなＨＧＦアイソフォーム又はその対立遺伝子変異体をコードする核酸配列はＨＧＦアイソフォーム内因性シグナル配列とＨＧＦアイソフォームコーディング配列の間にｔＰＡプロ配列の挿入があるｔＰＡプロ配列との融合を包含できる。１つの例において、ｔＰＡプロ配列は配列番号２５３に記載する例示ｔＰＡプレ／プロ配列のアミノ酸２４〜３２をコードする核酸配列を包含する。別の例においては、ｔＰＡプロ配列は配列番号２５３に記載する例示ｔＰＡプレ／プロ配列のアミノ酸３３〜３５をコードする核酸配列を包含する。追加的な例において、ｔＰＡプロ配列は配列番号２５３に記載する例示ｔＰＡプレ／プロ配列のアミノ酸２４〜３５をコードする核酸配列を包含する。他のｔＰＡプロ配列は配列番号２５６又は２５７に記載するようなｔＰＡプレ／プロ配列の対立遺伝子変異体のアミノ酸２４〜３２、３３〜３５又は２４〜３５を包含できる。本明細書において提供されるＨＧＦイントロン融合蛋白−ｔＰＡプロ配列融合は向上した生産のためのＨＧＦアイソフォームポリペプチドの増強された細胞における発現及び分泌を示すことができる。
【０３０４】
更に又、イントロン融合蛋白ポリペプチドの向上した分泌のためのＨＧＦアイソフォーム、ＨＧＦイントロン融合蛋白−ｔＰＡプレ／プロ配列融合、ＨＧＦイントロン融合蛋白−ｔＰＡプレ配列融合、及び／又は、ＨＧＦイントロン融合蛋白−ｔＰＡプロ配列融合は場合により更にＨＧＦアイソフォームポリペプチドの精製及び／又は検出を容易にする融合タグ１、２、３つ以上を包含することができる。一般的に、特定のタグに関するコーディング配列は、アミノ又はカルボキシ末端上において、リンカー領域の存在下又は非存在下、ＨＧＦアイソフォームポリペプチドをコードする核酸分子のコーディング配列とインフレームにスプライシングされることができる。融合が配列のアミノ末端上にある場合は、融合タグは内因性又は異種の前駆体配列の間に置かれることができる。１つの実施形態において、融合タグ、例えばｃ−ｍｙｃタグ、８ＸＨｉｓタグ、又は当該分野で知られた何れかの他の融合タグはＨＧＦアイソフォーム内因性シグナル配列とＨＧＦコーディング配列の間に置かれることができる。別の実施形態においては、融合タグは異種前駆体配列、例えば配列番号２５２に記載のｔＰＡのプレ／プロ配列、プレ配列又はプロ配列とＨＧＦアイソフォームコーディング配列の間に置かれることができる。別の実施形態においては融合タグはＨＧＦアイソフォーム融合ポリペプチド配列をコードする核酸のカルボキシ末端上に直接置かれることができる。一部の場合において、ＨＧＦアイソフォーム融合は内因性又は異種の前駆体配列と融合タグとの間にリンカーを含有できる。本明細書において提供される融合タグ１つ以上を含有するＨＧＦアイソフォーム、例えばＨＧＦイントロン融合蛋白−ｔＰＡ融合は向上した生産のためのＨＧＦアイソフォームポリペプチドのより容易な検出及び／又は精製を容易にすることができる。
【０３０５】
ｂ．キメラ及び合成のイントロン融合ポリペプチド
同様に提供されるものは、キメラＨＧＦ融合ポリペプチドである。キメラＨＧＦアイソフォームは遺伝子の２つ以上の全て又は一部分によりコードされる蛋白であり、別のポリペプチドに作動可能に連結したコードされるＨＧＦ配列の全て又は一部分を含有するポリペプチドをもたらす。一般的に、キメラＨＧＦアイソフォームは別のポリペプチド又は他の分子にＮ末端において作動可能に連結下ＨＧＦイントロン融合ポリペプチドに由来するイントロンを包含するＨＧＦアイソフォームの全て又は一部分を含有し、これにより、結果として生じる分子は細胞表面分子、特にＲＴＫ受容体又は他の血管形成性の分子、例えば炎症応答、血管形成、血管新生及び／又は細胞増殖に参加する経路に関与する何れかの活性をモジュレートする。これ等の合成「ポリペプチド」に包含されるものはＨＧＦアイソフォームの全て又は一部分がイントロン融合蛋白の全て又は一部分、例えば配列番号３６〜２４５に記載する配列及びコードされたアミノ酸の何れか１つの全て又は一部分に連結しているキメライントロン融合ポリペプチドである。例示されるキメライントロン融合ポリペプチドはヘルスタチンのイントロン８部分に連結したＨＧＦアイソフォームの全て又は一部分を包含する（例えば配列番号２３１〜２４５及び配列番号２１６〜２３０に記載するコードされるアミノ酸を参照）。例示されるヘルスタチン又はそのイントロン８部分は配列番号２０１〜２４５に記載する通りである。以下に示す表４は配列番号１８６に記載するプロミネントなヘルスタチン分子のアミノ酸３４１〜４１９の間に包含されるプロミネントなイントロン８（配列番号２１６）と比較してヘルスタチンのイントロン８コード部分における変異を識別している。例示されるイントロン８及びヘルスタチン分子、例えばイントロン８又はヘルスタチンの変異体の配列識別子（配列番号）はカッコ内に記載する。他のヘルスタチン変異体は対立遺伝子変異体、特に細胞外ドメイン部分における変異を有するものを包含する。
【０３０６】
【表４】
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ＨＧＦアイソフォームのＮ末端部分は直接、又はポリペプチドリンカーのようなリンカーを介して、合成イントロン融合蛋白のＣ末端（イントロンコード部分）に連結できる。例えば、連結はＨＧＦアイソフォームをコードする核酸の全て又は一部分が別のイントロン融合蛋白をコードする核酸の全て又は一部分に５’末端において作動可能に連結している融合蛋白の組み換え発現により行うことができる。連結はコードされたペプチドリンカー、例えば本明細書に記載するか当該分野で知られた何れかのリンカーの存在下、又は、制限酵素リンカーの存在下に行える。ＨＧＦアイソフォームコードポリペプチドは又、例えばへテロ二官能性交差結合剤を用いることによる化学的連結、又は、アイソフォーム結合体に関して上記したもののような化学的に行うことができる何れかの他の連結により、別のポリペプチドの全て又は一部分に連結又は結合体化することができる。
【０３０７】
何れの適当なリンカーも、得られるＨＧＦキメラ分子が細胞表面受容体、例えばＭＥＴ受容体又は他の細胞表面分子、例えば血管形成性の分子と相互作用し、そして細胞表面分子の活性をモジュレート、典型的には抑制する限りにおいて、選択することができる。リンカーは所望の特性を付加させるため、例えば血清中安定性、溶解性及び／又は細胞内濃度を増大させるため、又はリンカー１つ以上がＮ末端部分とイントロンコード部分の間に挿入されている近接部により誘発される立体障害を低減するために、選択することができる。得られる分子は細胞表面分子、特にＲＴＫ又は他の血管形成性の分子、例えば炎症応答、血管新生、血管形成及び細胞増殖及び腫瘍の進行に関与する経路に関与する何れかのものの活性をモジュレートする能力を保持するように選択される。
【０３０８】
ｃ．ＨＧＦ多量体及び多量体化ドメイン
アイソフォーム多量体、例えばＨＧＦ多量体は、アイソフォームの２量体、３量体又はより高次の多量体が形成されるように１つ又は１つより多いポリペプチドが共有結合的に連結、非共有結合的に連結、又は、化学的に連結した多量体であることができる。多量体のポリペプチド成分は同じかまたは異なっていることができる。典型的には本明細書において提供される多量体は本明細書において提供されるＨＧＦアイソフォームの何れか１つ以上、例えば配列番号１０、１２、１８又は２０に記載の何れかの間で形成される。一部の例においては、多量体はＨＧＦアイソフォームと別のＣＳＲ又はリガンドアイソフォームの間に形成されることができる。例示されるＣＳＲアイソフォームは限定しないが、ペプチド及び配列番号３６〜２４５に記載するポリペプチドをコードする核酸分子及びその変異体を包含する。
【０３０９】
ポリペプチドの多量体は例えばＦｃドメインの間の相互作用を介した２量体化により形成でき、又は、それらは共有結合的に接続することができる。２つのアイソフォームポリペプチドの間の多量体化は自発的であるか、又は、ポリペプチド２つ以上の強制的な連結により起こることができる。１つの例において、多量体はアイソフォームポリペプチド上のシステイン残基の間に形成されるジスルフィド結合により連結できる。別の例においては、多量体は例えばへテロ二官能性リンカーを使用することによるなど、化学的な連結を介して２ポリペプチド間に形成できる。
【０３１０】
ｉ．ペプチドリンカー
ペプチドリンカーはポリペプチド多量体を製造するために使用できる。１つの例においては、ペプチドリンカーは第１のポリペプチドのＣ末端と第２のポリペプチドＮ末端に融合させることができる。この構造は、少なくとも１つ、好ましくは２、３、４つ以上の可溶性ポリペプチドがそれらのそれぞれの末端においてペプチドリンカーを介して相互に連結するように多数回反復できる。例えば、多量体ポリペプチドは配列Ｚ１−Ｘ−Ｚ２を有することができ、ここでＺ１及びＺ２は各々ＣＳＲ又はリガンドアイソフォームの全て又は一部分の配列であり、そしてＸはペプチドリンカーの配列である。一部の例においては、Ｚ１及び／又はＺ２はアイソフォームポリペプチドの全て又は一部分である。別の例においては、Ｚ１及びＺ２は同じであり、或いはそれらは異なっている。別の例においては、ポリペプチドはＺ１−Ｘ−Ｚ２（−Ｘ−Ｚ）ｎの配列を有し、ここで「ｎ」は何れかの整数、即ち一般的には１又は２である。典型的には、ペプチドリンカーは最終的に形成されるポリペプチドが可溶性となるために十分な長さのものである。ペプチドリンカーの例は、グリシンセリンポリペプチド、例えば−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、ＧＧＧＧＧ（配列番号３１３）、ＧＧＧＧＳ（配列番号３１１）又は（ＧＧＧＧＳ）ｎ、ＳＳＳＳＧ（配列番号３１２）又は（ＳＳＳＳＧ）ｎを包含する。
【０３１１】
連結部分は例えばＨｕｓｔｏｎ等（１９８８）ＰＮＡ  Ｓ８５：５８７９−５８８８、Ｗｈｉｔｌｏｗ等（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６：９８９−９９５及びＮｅｗｔｏｎ等（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：５４５−５５３に記載されている。他の適当なペプチドリンカーは参照により本明細書に組み込まれる米国特許４，７５１，１８０又は４，９３５，２３３に記載されているものの何れかを包含する。所望のペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドは、アイソフォーム中の何処か、又はＮ又はＣ末端において、又は例えばｔＰＡプレプロ配列のような前駆体配列番号の間に、インフレームに、何れかの適当な従来の手法を用いながら挿入することができる。
【０３１２】
ｉｉ．ポリペプチド多量体化ドメイン
２つ以上のポリペプチドの相互作用は、自身等が相互作用して安定な構造を形成することができる何れかの部分又は他のポリペプチドへの、直接又は間接的な自身の連結により促進できる。例えば、別個のコードされるポリペプチド鎖を多量体化により接続することにより、ポリペプチドの多量体化を多量体化ドメインにより媒介させることができる。典型的には、多量体化ドメインは第１のキメラポリペプチドと第２のキメラポリペプチドの間の安定な蛋白−蛋白相互作用の形成をもたらす。キメラポリペプチドは例えば、多量体化ドメインをコードする核酸とのアイソフォームポリペプチドをコードする核酸の連結（直接又は間接）を包含する。ホモ又はヘテロ多量体ポリペプチドは、別個のキメラポリペプチドの同時発現から形成できる。第１及び第２のキメラポリペプチドは同じかまたは異なっていることができる。
【０３１３】
一般的に、多量体化ドメインは安定な蛋白−蛋白相互作用の形成ガ可能である何れのものも包含する。多量体化ドメインは免疫グロブリン配列、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、又は、ホモ又はヘテロ多量体のキメラ分子間の分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを介して相互作用できる。更に又、多量体化ドメインは例えば米国特許出願０８／３９９，１０６に記載されているような陥没部を含むアミノ酸配列に相補な隆起部を含むアミノ酸配列を包含できる。そのような多量体化領域は、立体的相互作用が安定な相互作用を促進するのみならず、更にキメラ単量体の混合物からのホモ２量体を超えたヘテロ２量体の形成を促進するように操作することができる。一般的に、隆起部は、第１のポリペプチドの界面に由来する小型のアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起部と同一又は同様のサイズの代償キャビティーは、場合により、大型のアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより第２のポリペプチドの界面上に形成される。
【０３１４】
キメラアイソフォームポリペプチド、例えば本明細書において提供されるＨＧＦアイソフォームポリペプチドは、何れかの箇所において、ただし典型的にはそのＮ又はＣ末端を介して、多量体化ドメインのＮ又はＣ末端に接続させることにより、究極的には発現時においてキメラポリペプチドを形成することができる。
【０３１５】
得られるキメラポリペプチド及びそれから形成される多量体は何れかの適当な方法により、例えばプロテインＡ又はプロテインＧのカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製できる。異なるキメラポリペプチドをコードする２つの核酸分子を細胞に形質転換する場合は、ホモ及びヘテロ２量体の形成が起こることになる。発現のための条件は、ヘテロ２量体の形成がホモ２量体の形成より優先されるように調節できる。
【０３１６】
（ａ）免疫グロブリンドメイン
多量体化ドメインは、別のアミノ酸配列の多量体化ドメインと分子間ジスルフィド結合を形成するために反応できる遊離チオール部分を含むものを包含する。例えば、多量体化ドメインはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭおよびＩｇＥに由来するような、免疫グロブリン分子の一部分を包含できる。一般的に、そのような一部分は免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）である。抗体誘導ポリペプチドの種々の部分（Ｆｃドメインを包含）に融合した融合蛋白の製造は、例えばＡｓｈｋｅｎａｚｉ等（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：１０５３５；Ｂｙｒｎ等（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４４：６７７；及びＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ  ａｎｄ  Ａｒｕｆｆｏ（１９９２）、“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐｐ．１０．１９．１−１０．１９．１１に記載されている。
【０３１７】
抗体は特異的抗原に結合し、そして、ジスルフィド結合により共有結合的に連結された２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖を含有する。重鎖及び軽鎖は抗原に結合する可変領域及び定常（Ｃ）領域を含有する。欠く鎖において、１つのドメイン（Ｖ）は分子の抗体特異性に応じて可変のアミノ酸配列を有する。他のドメイン（Ｃ）は同じクラスの分子の間で共通したむしろ一定の配列を有している。ドメインはアミノ末端から順次番号付けされる。例えば、ＩｇＧ軽鎖はそれぞれ軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインと称される順序ＶＬ−ＣＬでＮ末端からＣ末端に連結した２つの免疫グロブリンドメインよりなる。ＩｇＧ重鎖は可変重鎖ドメイン、定常重鎖ドメイン１、定常重鎖ドメイン２及び定常重鎖ドメイン３と称される順序ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３でＮ末端からＣ末端に連結した４つの免疫グロブリンドメインよりなる。得られる抗体分子は４鎖分子であり、ここで各重鎖はジスルフィド結合により軽鎖に連結され、そして２つの重鎖はジスルフィド結合により相互に連結される。重鎖の連結はヒンジ領域として知られている重鎖の柔軟性領域により媒介される。抗体分子のフラグメントは例えば酵素的切断により形成できる。例えばパパインによるプロテアーゼ切断により、重鎖定常領域の２量体Ｆｃドメインが２つのＦａｂ領域切断される（即ち可変領域を含有する部分）から切断される。
【０３１８】
ヒトにおいては、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、ミュウ（μ）及びアルファ（α）及びイプシロン（ε）と標記される自身の重鎖に基づいて分類される５つの抗体アイソタイプが存在し、それぞれ抗体のＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ及びＩｇＥクラスを生じさせる。ＩｇＡ及びＩｇＧクラスはサブクラスＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含有する。免疫グロブリン重鎖の間の配列の相違は、種々のアイソタイプを、例えばＣドメインの数、ヒンジ領域の存在及び鎖間のジスルフィド結合の数及び位置において異なるものとする。例えば、ＩｇＭ及びＩｇＥ重鎖はヒンジ領域を置き換える余剰のＣ度目（Ｃ４）を含有する。ＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＡのＦｃ領域はそのＣγ３、Ｃδ３及びＣα３ドメインを介して相互に対形成するが、ＩｇＭ及びＩｇＥのＦｃ領域はそのＣμ４及びＣイプシロン４ドメインを介して２量体化する。ＩｇＭ及びＩｇＡはそれぞれ１０及び４の抗原結合部位を有する多量体構造を形成する。
【０３１９】
本明細書において提供される免疫グロブリンキメラポリペプチドは完全長の免疫グロブリンポリペプチドを包含する。或いは、免疫グロブリンポリペプチドは完全長未満であり、即ち重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆｖ又はＦｃを含有している。１つの例において、免疫グロブリンキメラポリペプチドは単量体、又はヘテロ又はホモ多量体として、そして特に２量体又は４量体として組み立てられる。鎖又は種々の構造の基本単位を利用することにより単量体及びヘテロ及びホモ多量体を組み立てることができる。例えばアイソフォームポリペプチドは免疫グロブリン分子のＣＨ、ＣＬ、ＶＨ又はＶＬドメインの全て又は一部分を包含する免疫グロブリン分子の全て又は一部分に融合させることができる（例えば米国特許出願５，１１６，９６４参照）。キメラアイソフォームポリペプチドは適切な核酸分子で形質転換された哺乳類細胞により容易に生産及び分泌させることができる。分泌された形態は、アイソフォームポリペプチドが重鎖２量体中にあるもの；軽鎖単量体又は２量体；及びアイソフォームポリペプチドが１つ以上の軽鎖又は重鎖に融合した重鎖及び軽鎖のヘテロ４量体、例えば４つ全てまでの可変領域類縁体が置換されているヘテロ４量体を包含する。一部の例においては、１つ又は１つより多い核酸融合分子を宿主細胞に形質転換することにより、多量体のアイソフォーム部分が同じか又は異なる多量体を製造できる。一部の例においては、非アイソフォームポリペプチド軽鎖−重鎖可変様ドメインが存在することにより、ヘテロ二官能性の抗体を生成する。別の例においては、キメラポリペプチドは、２ポリペプチドの非共有結合又は共有結合性の相互作用が分子を会合させてホモ又はヘテロ２量体とする、ヒンジジスルフィドを欠いた免疫グロブリン分子の部分に融合させることができる。
【０３２０】
（ｉ）Ｆｃドメイン
典型的には、免疫グロブリンキメラポリペプチド融合、例えばＨＧＦアイソフォームとの融合の免疫グロブリン部分は免疫グロブリンポリペプチドの重鎖、最も常用的には重鎖の定常ドメインを包含する。ヒトＩｇＧサブタイプに関する重鎖定常領域の例示配列が知られている。例えば、配列番号２９６に記載する例示重鎖定常領域については、ＣＨ１ドメインはアミノ酸１〜９８に相当し、ヒンジ領域はアミノ酸９９〜１１０に相当し、ＣＨ２ドメインはアミノ酸１１１〜２２３に相当し、そして、ＣＨ３ドメインはアミノ酸２２４〜３３０に相当する。
【０３２１】
１つの例において、免疫グロブリンポリペプチドキメラ蛋白は免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域を包含できる。典型的には、このような融合は免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保持している。例えば、ＩｇＧ１の完全長Ｆｃ配列は配列番号２９６に記載する配列のアミノ酸９９〜３３０を包含する。多くのＦｃドメイン、例えば自身のＴ細胞活性が低減又は排除されている変異体Ｆｃドメインが知られている。連結を行う厳密な部位は重要ではなく：特定の部位はよく知られており、そしてアイソフォームポリペプチドの生物学的活性、分泌又は結合特性を最適化するために選択できる。Ｆｃドメインの例示される配列は配列番号２９７又は配列番号２９８に記載する。
【０３２２】
ｈＩｇＧ１Ｆｃに加えて、他のＦｃ領域もまた本明細書において提供されるアイソフォームポリペプチド内に包含させることができる。例えば、Ｆｃ／ＦｃγＲ相互作用により媒介されるエフェクター機能を最小限としたい場合は、補体又はエフェクターの細胞のリクルートメントが乏しいＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ２又はＩｇＧ４のＦｃとの融合が意図される。更に又、Ｆｃ融合は、抗体クラス、例えば限定しないが、抗体のＩｇＧ（ヒトサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４を包含）、ＩｇＡ（ヒトサブクラスＩｇＡ１及びＩｇＡ２を包含）、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭクラスの何れかに属する免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされる免疫グロブリン配列を含有することができる。更に又、リンカーを用いることによりＦｃを別のポリペプチドに共有結合することによりＦｃキメラを形成できる。
【０３２３】
修飾されたＦｃドメインもまた知られている（例示される修飾に関しては例えば米国特許公開２００６／００２４２９８；及び国際特許公開ＷＯ２００５／０６３８１６参照）。ある例においては、Ｆｃ領域は野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域のエフェクター機能から改変（即ち増減）されたエフェクター機能を有するものである。抗体のＦｃ領域は多くのＦｃ受容体及びリガンドト相互作用し、エフェクター機能と称される重要な機能的能力のアレイを付与する。Ｆｃエフェクター機能は例えばＦｃ受容体結合、補体固定及びＴ細胞枯渇活性を包含する、例えば米国特許６，１３６，３１０参照）。Ｔ細胞枯渇活性、Ｆｃエフェクター機能及び抗体安定性を試験する方法は当該分野で知られている。例えばＩｇＧ分子のＦｃ領域はＦｃγＲと相互作用する。これ等の受容体は種々の免疫細胞、例えば単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びγδＴ細胞において発現される。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成はこれ等のエフェクター細胞を結合抗原の部位にリクルートし、典型的には、細胞内におけるシグナリング事象及び重要なその後の免疫応答、例えば炎症メディエーターの放出、Ｂ細胞活性化、エンドサイトーシス、貪食作用及び細胞毒性攻撃をもたらす。細胞毒性及び貪食作用のエフェクター機能を媒介する能力は、抗体がターゲティングされた細胞を破壊する潜在的な機序である。ＦｃγＲを発現する細胞毒性細胞による標的細胞上の結合抗体の認識及び溶解は抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）と称される。種々の抗体アイソタイプに関する他のＦｃ受容体はＦｃεＲ（ＩｇＥ）、ＦｃαＲ（ＩｇＡ）及びＦｃμＲ（ＩｇＭ）を包含する。
【０３２４】
即ち、修飾されたＦｃドメインはＦｃ受容体に対して改変された親和性を有することができ、例えば限定しないが、親和性は増大又は低値又は非存在となっている。例えば、異なるＩｇＧサブクラスはＦｃγＲに対して異なる親和性を有し、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３は典型的にはＩｇＧ２及びＩｇＧ４よりも受容体に実質的により良好に結合する。更に又、異なるＦｃγＲは異なるエフェクター機能を媒介する。ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ／ｃ及びＦｃγＲＩＩＩａは、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞内ドメインを有することを特徴とする免疫複合体トリガー活性化の正の調節物質である。しかしながらＦｃγＲＩＩｂは免疫受容体チロシン系抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、そしてしたがって抑制性である。即ち、受容体に対するＦｃ領域の親和性を改変することは、Ｆｃドメインにより誘導されるエフェクター機能をモジュレートできる。
【０３２５】
１つの例において、例えばＡＤＣＣのようなエフェクター機能をより良好に媒介するために特定のＦｃγＲへの最適化結合のために修飾されているＦｃ領域を使用する。そのような修飾されたＦｃ領域は配列番号２９７に記載する例示Ｆｃ配列の
【０３２６】
【化７】
2009515520.tif 000011
の何れかの１つ以上に相当する修飾又はその組み合わせを含有できる。これ等の突然変異を含有する修飾されたＦｃは例えば活性化受容体ＦｃγＩＩＩａのようなＦｃＲへの増強された結合を有することができ、及び／又は、抑制受容体ＦｃγＲＩＩｂへの低減された結合を有することができる（例えばＵＳ２００６／００２４２９８参照）。ＦｃＲへの増大した結合を有するように修飾されたＦｃ領域はアイソフォームポリペプチドと連結した場合であっても患者における癌細胞の破壊の促進においてより有効であることができる。抗体が腫瘍細胞を破壊するための可能な機序は多く存在し、例えば必要な生育経路の遮断、アポトーシスをもたらす細胞内シグナリング、受容体の増強されたダウンレギュレーション及び／又はターンオーバー、ＡＤＣＣを介した、そして、養子免疫応答の促進を介した、抗増殖が挙げられる。
【０３２７】
別の例においては、ＦｃγＲとの結合を低減又は除去する置換を有する種々のＦｃ突然変異体が知られている。そのようなムテインはＦｃにより媒介されるエフェクター機能の低減又は排除が必要である場合に有用である。標的抗原を担持する細胞の殺傷ではなく拮抗性が望ましい場合が頻繁である。そのようなＦｃの例は米国特許５，４５７，０３５に記載されているＦｃムテインである。例示されるＦｃムテインは配列番号２９９に記載する。
【０３２８】
別の例においては、ＦｃＲｎへの自身の結合において修飾されているＦｃ領域を利用することによりＦｃキメラポリペプチドの薬物動態を向上させることができる。ＦｃＲｎは新生仔ＦｃＲであり、その結合はエンドソームからのエンドサイトーシスを起こした抗体を血流中に戻して再使用させる。このプロセスが完全長分子の大型性による腎濾過の妨害と組み合わせられて、１〜３週間の範囲という望ましい抗体血清中半減期が得られる。ＦｃからＦｃＲｎへの結合は又、抗体輸送における役割を果たしている。
【０３２９】
典型的には、ポリペプチド多量体はＦｃポリペプチドに同じかまたは異なるアイソフォームポリペプチド２つを直接又は肝説的に連結することにより形成されたキメラ蛋白２つの２量体である。一部の例においては、ＨＧＦアイソフォーム−Ｆｃキメラ蛋白をコードする遺伝子融合を適切な発現ベクター内に挿入する。得られるＦｃキメラ蛋白は組み換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞内で発現させることができ、多くの同様の抗体分子を組み立てることが可能となり、その場合、鎖間ジスルフィド結合がＦｃ部分の間に形成し、２価のポリペプチドを生じさせる。典型的には、宿主細胞及び発現系を哺乳類発現系とすることによりＦｃ蛋白の安定化のためのグリコシル化が可能となる。この位置におけるグリコシル化が考慮されない場合は他の宿主細胞も使用できる。
【０３３０】
結果として得られるＦｃ部分を含有するキメラポリペプチド及びそれから形成される多量体はプロテインＡ又はプロテインＧカラム上のアフィニティークロマトグラフィーにより容易に精製できる。異なるキメラポリペプチドをコードする２核酸分子を細胞に形質転換する場合は、Ｆｃドメインを担持するキメラ分子も同様にジスルフィド連結ホモ２量体として発現されることになるため、ヘテロ２量体の形成が生化学的に達成されるはずである。即ち、ホモ２量体は、細胞内ジスルフィドに作用するのではなく細胞間ジスルフィドの破壊を優先する条件下において低減できる。典型的には、異なる細胞外部分を有するキメラ単量体を等モル量で混合し、そして酸化することにより、ホモ及びヘテロ２量体の混合物を形成する。この混合物の成分はクロマトグラフィー手法により分離される。或いは、この型のヘテロ２量体の形成は、アイソフォームポリペプチド、次いでｈＩｇＧのＦｃドメイン、次いでｃ−ｊｕｎ又はｃ−ｆｏｓロイシンジッパーの何れかを含有する融合分子を遺伝子的操作して発現させることにより偏向させることができる（後述参照）。ロイシンジッパーはヘテロ２量体を優先的に形成するため、それらはヘテロ２量体の形成を駆動するために所望により使用できる。Ｆｃ領域を含有するキメラポリペプチドはまた金属キレーター又は他のエピトープによるタグを包含させるために操作することもできる。タグ付けされたドメインは金属キレートクロマトグラフィーによる、及び／又は、抗体による迅速精製のために使用することができ、これにより、バイオアッセイにおけるウエスタンブロット、免疫沈降、又は活性枯渇／ブロッキングの検出を可能にする。
【０３３１】
（ｉｉ）キャビティー内への突出（即ちノブアンドホール）
多量体はホモオリゴマー化よりもヘテロオリゴマー化を促進するように第１のキメラポリペプチド及び第２のキメラポリペプチドの間の界面を含有するように操作できる。典型的には第１及び第２のキメラポリペプチドの一方又は両方の多量体化ドメインは、ヘテロ２量化を促進及び／又は誘発するように抗体分子界面が修飾されているような、修飾された抗体フラグメントである。一部の場合において、抗体分子は修飾されたＦｃ領域である。即ち修飾は、第１のＦｃポリペプチド内への隆起部及び第２のＦｃポリペプチド内へのキャビティーの導入を包含し、この場合、隆起部はキャビティー中に位置付け可能であり、これにより第１及び第２のＦｃ含有キメラポリペプチドの複合体形成が誘発されるようにする。
【０３３２】
典型的には第１のキメラポリペプチド及び第２のキメラポリペプチドの安定な相互作用は免疫グロブリン定常ドメインのＣＨ３ドメインの十分な一部分を含有する同じかまたは異なる多量体化ドメインの界面相互作用を介する。種々の構造的及び機能的データによれば、抗体重鎖会合がＣＨ３ドメインにより指向されていることが示唆されている。例えば、Ｘ線結晶分析によれば、Ｆｃ領域におけるヒトＩｇＧ１重鎖間の分子間会合は、ＣＨ３ドメイン間の広範な蛋白／蛋白相互作用を包含しているのに対し、グリコシル化されたＣＨ２ドメインはその炭水化物を介して相互作用することが明らかにされている（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ等（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０：２３６１）。更に又、重鎖がトランケーションされてＣＨ２及びＣＨ３ドメインが除去されない限り、哺乳類細胞内で抗体発現の間に効率的に形成される２つの重鎖間ジスルフィド結合が存在する（Ｋｉｎｇ等（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８１：３１７）。即ち、重鎖の組立がジスルフィド結合形成を誘発するのであって、その逆ではないと考えられる。ＣＨ３ドメインの界面の操作は異なる重鎖のヘテロ多量体の形成を誘発し、そして、相当するホモ多量体の組立を妨害する（例えば米国特許５，７３１，１６８；国際特許出願ＷＯ９８／５０４３１及びＷＯ２００５／０６３８１６；Ｒｉｄｇｗａｙ等（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９：６１７−６２１）。
【０３３３】
即ち、本明細書において提供される多量体は第１及び第２のキメラアイソフォームポリペプチド（第１及び第２のポリペプチドは同じかまたは異なる）の界面の間に形成することができ、この場合、第１のポリペプチドの多量体化ドメインは隆起部を含有するように修飾されているＦｃドメインのＣＨ３界面の十分な一部分を少なくとも含有し、そして、第２のポリペプチドの多量体化ドメインはキャビティーを含有するように修飾されているＦｃドメインのＣＨ３界面の十分な一部分を少なくとも含有する。修飾されたＣＨ３界面の全て又は十分な一部分はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ免疫グロブリン由来であることができる。種々の免疫グロブリン分子のＣＨ３ドメインにおける修飾をターゲティングした界面残基は米国特許５，７３１，１６８に記載されている。一般的に多量体化ドメインは例えばＩｇＧ１のようなＩｇＧ抗体から誘導したＣＨ３ドメインの全て又は十分な一部分である。
【０３３４】
ポリペプチド中の隆起部又はキャビティーを形成するための置き換え及び／又は修飾のためにターゲティングされるアミノ酸は典型的には第２のポリペプチドの界面におけるアミノ酸１つ以上と相互作用又は接触する界面アミノ酸である。隆起部アミノ酸を含有するように修飾された第１のポリペプチドは、第１のポリペプチドの界面から突出し、そしてこれにより第２のポリペプチドの鱗屑界面における代償キャビティー内に位置付けることができる側鎖少なくとも１つを有するアミノ酸によるネイティブ又は元のアミノ酸の置き換えを包含する。より頻繁には、置き換えアミノ酸は元のアミノ酸残基よりも大きな側鎖体積を有するものである。隆起部を形成するために理想的な置き換えアミノ酸となるものを識別するためにアミノ酸残基の特性を測定及び／又は評価することは当業者の知る通りである。一般的に、隆起部の形成のための置き換え残基は天然に存在するアミノ酸残基であり、そして例えばアルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）を包含する。一部の例においては、置き換えのために識別される元の残基は、小さい側鎖を有するアミノ酸残基、例えばアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、スレオニン又はバリンである。
【０３３５】
キャビティーを含有するように修飾される第２のポリペプチドは、第２のポリペプチドの界面から陥没し、そしてこれにより第１のポリペプチドの界面からの相当する隆起部を収容することができる側鎖少なくとも１つを有するアミノ酸によるネイティブ又は元のアミノ酸の置き換えを包含するものである。頻繁には、置き換えアミノ酸は元のアミノ酸残基よりも小さな側鎖体積を有するものである。キャビティーを形成するために理想的な置き換え残基となるものを識別するためにアミノ酸残基の特性を測定及び／又は評価することは当業者の知る通りである。一般的に、キャビティーの形成のための置き換え残基は天然に存在するアミノ酸残基であり、そして例えばアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）を包含する。一部の例においては、置き換えのために識別された元のアミノ酸はより大きな側鎖を有するアミノ酸、例えばチロシン、アルギニン、フェニルアラニン又はトリプトファンである。
【０３３６】
例えばヒトＩｇＧ１のＣＨ３界面には、各面から１０９０Å２陥入する反平行β鎖４つの上に位置する各ドメイン上の１６残基が関与している（例えばＤｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ等（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０：２３６１−２３７０；Ｍｉｌｌｅｒ等（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１６，９６５−９７３；Ｒｉｄｇｗａｙ等（１９９６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎ．，９：６１７−６２１；米国特許５，７３１，１６８参照）。隆起部又はキャビティーを形成するためのＣＨ３ドメインの修飾は、例えば米国特許５，７３１，１６８；国際特許出願ＷＯ９８／５０４３１及びＷＯ２００５／０６３８１６；及びＲｉｄｇｗａｙ等（１９９６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎ．，９：６１７−６２１に記載されている。例えば、隆起部又はキャビティーを形成するためのＣＨ３ドメインの修飾は配列番号２９６に記載する配列の界面アミノ酸
【０３３７】
【化８】
2009515520.tif 000012
に相当する何れかのアミノ酸の置き換えであることができる。一部の例においては、隆起部又はキャビティーを形成するためのＣＨ３ドメインの修飾は典型的には２つの中央反平行β鎖上に位置する残基にターゲティングされる。目的は、形成された隆起部が、相手となるＣＨ３ドメインにおける代償キャビティーにより収容されるのではなく包囲する溶媒内に突出することにより収容され得る危険性を最小限にすることである。そのような修飾の例は、界面アミノ酸Ｔ２４９、Ｌ２５１、Ｐ２７８、Ｆ２８８、Ｙ２９０及びＫ２９２に相当する何れかのアミノ酸の置き換えを包含する。隆起部／キャビティー相互作用を起こすためのＣＨ３ドメイン界面における修飾のためのアミノ酸対の例はＴ２４９及びＹ２９０；及びＦ２８８及びＴ２７７の修飾を包含する。例えば、修飾はＴ２４９Ｙ及びＹ２９０Ｔ；Ｔ２４９Ｗ及びＹ２９０Ａ；Ｆ２８８Ａ及びＴ２７７Ｗ；Ｆ２８８ＷおよびＴ２７７Ｓ；及びＹ２９０Ｔ及びＴ２４９Ｙを包含できる。
【０３３８】
一部の例においては、１つより多い界面相互作用を起こすことができる。例えば修飾はまた隆起部を形成するための第１のポリペプチドにおける２つ以上の修飾、及び、キャビティーを形成するための第２のポリペプチドにおける２つ以上の修飾を包含する。そのような修飾の例は、第１のポリペプチドにおけるＴ２４９Ｙ及びＦ２８８Ａの修飾及び第２のポリペプチドにおけるＴ２７７Ｗ及びＹ２９０Ｔの修飾；第１のポリペプチドにおけるＴ２７７Ｗ及びＦ２８８Ｗの修飾及び第２のポリペプチドにおけるＴ２７７Ｓ及びＹ２９０Ａの修飾；又は第１のポリペプチドにおけるＦ２８８Ａ及びＹ２９０Ａ及び第２のポリペプチドにおけるＴ２４９Ｗ及びＴ２７７Ｓの修飾を包含する
Ｆｃドメイン又はその変異体のような何れかの免疫グロブリン分子又はその変異体の全て又は一部分を包含する本明細書に記載した別の多量体化ドメインの場合と同様、ＣＨ３隆起部／キャビティー修飾を含有するＦｃ変異体は、何れかの箇所においてアイソフォームポリペプチドに、ただし典型的には自身のＮ又はＣ末端を介して第１及び／又は第２のアイソフォームポリペプチドのＮ又はＣ末端に接続されることにより、キメラポリペプチドを形成できる。連結はリンカーを介して直接又は間接的であることができる。更に又、キメラポリペプチドは融合蛋白であることができるか、又は、例えば共有結合又は非共有結合性の相互作用を介した化学的連結により形成できる。典型的には、ノブアンドホールの分子はＣＨ３隆起部修飾を含有するＦｃ変異体に連結した第１のアイソフォームポリペプチドのＣＨ３キャビティー修飾を含有するＦｃ変異体に連結した第２のアイソフォームポリペプチドとの同時発現により形成される。
【０３３９】
（ｂ）ロイシンジッパー
多量体を製造するための別の方法ではロイシンジッパードメインの使用を行う。ロイシンジッパーはそれらが観察される蛋白の多量体化を誘発するペプチドである。典型的には、ロイシンジッパーは数種の蛋白の保存されたドメインとして存在する４〜５ロイシン残基を含有する反復７価モチーフを指すために使用される用語である。ロイシンジッパーは短鎖平行コイルドコイルとして折り畳まれ、そして、自身がドメインを形成している蛋白のオリゴマー化を担うことができる。ロイシンジッパーは当初は数種のＤＮＡ結合蛋白中で同定され（例えばＬａｎｄｓｃｈｕｌｚ等（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１７５９参照）、そしてその後種々の蛋白中で発見されるようになった。知られたロイシンジッパーに包含されるものは、天然に存在するペプチド及びその誘導体で２量体化又は３量体化するものである。ロイシンジッパーペプチドに直接又は間接的に連結したアイソフォームポリペプチドを含有する組み換えキメラ蛋白は適当な宿主細胞中で発現させることができ、そして形成したポリペプチド多量体を培地上澄みから回収できる。
【０３４０】
ロイシンジッパードメインは短鎖平行コイルドコイルとして折り畳まれる（Ｏ’Ｓｈｅａ等（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：５３９）。平行コイルドコイルの一般的な構成は１９５３年にＣｒｉｃｋにより最初に提唱された「ノブイントゥーホール」充填により特徴付けられている（Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６：６８９）。ロイシンジッパードメインにより形成される２量体は（ａｂｃｄｅｆｇ）ｎと標記される７価のリピートにより安定化され（例えばＭｃＬａｃｈｌａｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ（１９７８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：２９３参照）、この場合、残基ａ及びｄが一般的には疎水性の残基であり、ｄがロイシンであり、これはヘリックスの同じ面上に並べられる。反対に荷電した残基はｇ及びｅの位置に共通して生じる。即ち、２つのヘリックス型のロイシンジッパードメインから形成された平行コイルドコイルにおいて、第１のヘリックスの疎水性側鎖により形成された「ノブ」が第２のヘリックスの側鎖の間に形成された「ホール」内に充填される。
【０３４１】
ｄの位置にあるロイシン残基は大きな疎水性安定化エネルギーを与え、そして２量体形成のために重要である（Ｋｒｙｓｔｅｋ等（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．３８：２２９）。疎水性安定化エネルギーは螺旋型の単量体からのコイルドコイルの形成のための主な駆動力を与える。静電気的相互作用もまたコイルドコイルの化学量論及び幾何学に寄与している。
【０３４２】
（ｉ）ｆｏｓ及びｊｕｎ
２つの核形質転換蛋白、ｆｏｓ及びｊｕｎはネズミプロトオンコジーンｃ−ｍｙｃの遺伝子産物と同様にロイシンジッパードメインを示す。ロイシンジッパードメインはこれ等の蛋白における生物学的活性（ＤＮＡ結合）のために必要である。核オンコジーンｆｏｓ及びｊｕｎの産物はヘテロ２量体を優先的に形成するロイシンジッパードメインを含有する（Ｏ’Ｓｈｅａ等（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：６４６；Ｔｕｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｔｉｊｉａｎ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：１６８９）。例えば、ヒト転写因子ｃ−ｊｕｎ及びｃ−ｆｏｓのロイシンジッパードメインは１：１の化学量論において安定なへテロ２量体を形成することがわかっている（例えばＢｕｓｃｈ  ａｎｄ  Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６：３６−４０；Ｇｅｎｔｚ等（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：１６９５−１６９９参照）。ｊｕｎ−ｊｕｎホモ２量体もまた形成することがわかっているが、それらはｊｕｎ−ｆｏｓへテロ２量体よりも約１０００倍低安定性である。
【０３４３】
即ち、典型的には、本明細書において提供されるアイソフォームポリペプチド多量体はｊｕｎ−ｆｏｓ組み合わせを用いて形成される。一般的にｃ−ｊｕｎ又はｃ−ｆｏｓのロイシンジッパードメインは融合遺伝子を遺伝子操作することによりポリペプチドのアイソフォームのＣ末端においてインフレームに融合する。ｃ−ｊｕｎ又はｃ−ｆｏｓのロイシンジッパードメインの例示される配列はそれぞれ配列番号３００及び３０１に記載する。一部の場合において、ロイシンジッパーの配列は、例えばシステイン残基を付加させてジスルフィド結合の形成を可能とすること、又は、Ｃ末端にチロシン残基を付加させてペプチド濃度の測定を容易にすることにより、修飾できる。修飾されたｃ−ｊｕｎ又はｃ−ｆｏｓのロイシンジッパードメインの例示される配列はそれぞれ配列番号３０２及び３０３に記載する。更に又、ロイシンジッパーとのアイソフォームポリペプチドの連結は、柔軟性リンカードメイン、例えばＩｇＧのヒンジ領域、又は、種々の長さ及び組み合わせにおけるグリシン、セリン、スレオニン又はアラニンのような小型アミノ酸の他のポリペプチドリンカーを指向するか、又は使用することができる。一部の場合において、コードされるポリペプチドのＣ末端からのロイシンジッパーの分離は例えばトロンビン切断部位のようなプロテアーゼ切断部位をコードする配列との融合により行うことができる。更に又、キメラ蛋白は、例えば金属キレートクロマトグラフィーによる迅速な精製を可能にする６ＸＨｉｓタグによるか、及び／又は、ウエスタンブロット上の検出、免疫沈降又は活性枯渇／ブロッキングバイオアッセイを可能にする例えばｍｙｃタグのような対応する抗体が入手可能であるエピトープによりタグ付けすることができる。
【０３４４】
（ｉｉ）ＧＣＮ４
ロイシンジッパードメインは又、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの窒素代謝の全般的制御に関与する遺伝子のファミリーの転写活性化物質（ＧＣＮ４）として機能する核蛋白中にも存在する。ＧＣＮ４ロイシンジッパードメインの例示される配列を配列番号３０４に示す。蛋白は２量化してＧＣＮ４の認識配列を含有するプロモーター配列に結合することができ、これにより窒素枯渇時に転写を活性化することができる。ＧＣＮ４ロイシンジッパードメインを提示する合成ペプチドのａ及びｄ残基におけるアミノ酸置換はロイシンジッパードメインのオリゴマー化特性を変化させる。例えば、ａの位置の全ての残基がイソロイシンに変化すれば、ロイシンジッパーはなお平行２量体を形成する。この変化に加えてｄの位置の全てのロイシン残基もまたイソロイシンに変化すれば、結果として生じるペプチドは自発的に３量体平行コイルドコイルを溶液中に形成する。ＧＣＮ４ロイシンジッパードメインの３量体及び４量体の形態の例示される配列はそれぞれ配列番号３０５及び３０６に示す。
【０３４５】
（ｃ）他の多量体化ドメイン
他の多量体化ドメインは当該分野で知られており、そして別個に形成され、発現されるポリペプチド２つ以上の蛋白−蛋白相互作用を促進するものである。ポリペプチドの間又は内部で蛋白−蛋白相互作用をもたらすために使用できる他の多量体化ドメインの例は、限定しないが、バルナーゼ−バルスターモジュール（例えばＤｅｙｅｖ等（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：１４８６−１４９２参照）；特定の蛋白ドメインの選択（例えばＴｅｒｋｉｋｈ等（１９９７）ＰＮＡＳ  ９４：１６６３−１６６８及びＭｕｌｌｅｒ等（１９９８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４２２：２５９−２６４参照）；特定のペプチドモチーフの選択（例えばｄｅ  Ｋｒｕｉｆ等（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７６３０−７６３４及びＭｕｌｌｅｒ等（１９９８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４３２：４５−４９）；及び増強された安定性のためのジスルフィド架橋の使用（ｄｅ  Ｋｒｕｉｆ等（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７６３０−７６３４及びＳｃｈｍｉｅｄｌ等（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１３：７２５−７３４）を包含する。多量体化ドメインの別の型の例は例えばＰＫＡ／ＡＫＡＰ相互作用に関して後述するような、異なるサブユニットポリペプチドの間の蛋白−蛋白相互作用により多量体化が促進されるものである。
【０３４６】
（ｉ）Ｒ／ＰＫＡ−ＡＤ／ＡＫＡＰ
多量体ポリペプチドは又ｃＡＭＰ依存性蛋白キナーゼ（ＰＫＡ）の調節（Ｒ）サブユニット（例えば配列番号３０７又は配列番号３０９参照）とＡキナーゼアンカー蛋白（ＡＫＡＰ、例えばＲｏｓｓｉ等（２００６）ＰＮＡＳ  １０３：６８４１−６８４６参照）のアンカリングドメイン（ＡＤ）（例えば配列番号３０８又は配列番号３１０参照）の間の蛋白−蛋白相互作用を利用して形成することができる。Ｒサブユニットの２つの型（ＲＩ及びＲＩＩ）がＰＫＡに存在し、各々がα及びβアイソフォームを有する。Ｒサブユニットは２量体として存在し、そして全てのＲＩＩに関して、２量体化ドメインは４４アミノ末端残基内に存在する。ＡＫＡＰはそのＡＤドメインとの相互作用を介して、ＰＫＡのＲサブユニットと相互作用することによりその活性を調節する。ＡＫＡＰは２量体Ｒサブユニットにのみ結合する。例えば、ヒトＲＩＩαについては、ＡＤは２３アミノ末端残基から形成される疎水性表面に結合する。
【０３４７】
ｄ．ＨＧＦ融合の形成及びクローニングの方法
ＤＮＡ配列が得られ、そして連結することにより融合蛋白をコードするＤＮＡ配列が得られる方法は組み換えＤＮＡ技術の分野においてよく知られている。ＨＧＦアイソフォームに融合するべき配列に関するＤＮＡ、例えば限定しないが、ＨＧＦアイソフォームの配列、前駆体シグナル配列、融合タグ、別のアイソフォーム又はそのイントロンコード蛋白、又は何れかの他の所望の配列を種々の方法、例えばオリゴヌクレオチド合成装置を用いた合成；適切な制限酵素消化による配列を含有する生物、細胞又はベクター等からの標的ＤＮＡの単離により形成することができ；或いは、適切なプライマーを用いたゲノムＤＮＡのＰＣＲにより標的入手元から得ることができる。ＰＣＲ法においては、全ＰＣＲ配列がＰＣＲ増幅時に標的核酸配列内に取り込まれるように、小型エピトープタグ、例えばｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ又は他の小型エピトープタグに関する配列、及び／又は、何れかの他の追加的ＤＮＡ配列、例えば制限酵素リンカー配列又はプロテアーゼ切断部位配列を含有する、ＨＧＦアイソフォーム配列のような標的配列に対して指向されたプライマーを操作することができる。例示される実施形態においては、プライマーはベクター内への配列のクローニングを促進するためにＨＧＦアイソフォーム配列又は他の標的配列内に制限酵素部位を導入できる。
【０３４８】
１つの例において、ＨＧＦアイソフォーム融合配列は、操作された組み換え部位におけるベクターへのＰＣＲ増幅されたＤＮＡ標的配列のライゲーションの連続ラウンドにより形成できる。例えば、ＨＧＦアイソフォーム、融合タグ、相同又は異種の前駆体配列の核酸配列、又は、他の所望の核酸配列を、対向する鎖にハイブリダイズし、そして標的ＤＮＡ内の目的の領域にフランキングするプライマーを用いながらＰＣＲ増幅できる。標的ＤＮＡ分子を発現することがわかっている細胞又は組織又は他の入手元、又は標的ＤＮＡ分子に関する配列を含有するベクターをＰＣＲ増幅事象の出発産物として使用できる。ＰＣＲ増幅産物は、配列を更に組み換え操作するため、例えばベクター内に既に含有される別の核酸配列との融合を形成するため、又は標的分子の発現のために、ベクター内にサブクローニングできる。
【０３４９】
ＰＣＲ増幅に使用するＰＣＲプライマーはまた核酸配列の作動可能な連結を促進するために操作できる。例えば、非鋳型相補５’伸長をプライマーに付加することにより増幅そのものに大きな影響を与えることなくＰＣＲ産物の種々の増幅後調整が可能となる。例えばこれ等の５’伸長は制限部位、プロモーター配列、エピトープタグ配列等を包含できる。１つの例において、融合配列を形成する目的のためには、プライマー内に取り込むことができる配列は、例えば、増幅されたＰＣＲ産物がエピトープタグとの目的の核酸配列の融合を効果的に含有するように、ｍｙｃエピトープタグ又は他の小型エピトープタグをコードする配列を包含する。
【０３５０】
別の例においては、プライマーへの制限酵素部位の取り込みは、例えば核酸配列のライゲーションのための粘性末端を与えることにより、適合する制限部位を含有するベクター内への増幅産物のサブクローニングを容易にすることができる。多数のＰＣＲ増幅産物の単一のベクターへのサブクローニングは、種々の核酸配列を作動可能に連結又は融合するための方策として用いることができる。プライマー配列に導入できる制限酵素部位の例は、限定しないが、Ｘｈｏ  Ｉ制限部位、Ｎｈｅ  Ｉ制限部位、Ｎｏｔ  Ｉ制限部位、ＥｃｏＲＩ制限部位又はＸｂａ  Ｉ制限部位を包含できる。ベクター内にＰＣＲ産物をサブクローニングするための別の方法は平滑末端クローニング、ＴＡクローニング、ライゲーション非依存性クローニング及びインビボクローニングを包含する。
【０３５１】
プライマー内への効果的な制限酵素部位の形成は、粘性末端を、或いは一部の制限酵素の場合は平滑末端を、後のサブクローニングのために露出させるための適合する制限酵素によるＰＣＲフラグメントの消化を促進する。制限酵素に対する自身の適合性を保持するようにプライマー内に制限酵素部位を操作する場合には、考慮すべき数種の要因が存在する。第１に、ＰＣＲプライマーにおける操作された制限部位の上流への２〜６余剰塩基の付加は増幅産物の消化の効率を大きく増大させる。制限酵素による制限酵素部位の消化を向上させるために使用できる他の方法は、ＤＮＡをブロックできる熱安定性ポリメラーゼがある場合はそれを除去するためのプロテイナーゼＫ処理、Ｋｌｅｎｏｗ又はＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いた末端ポリッシング、及び／又は、スペルミジンの付加を包含する。ＰＣＲ産物の消化効率を向上させるための代替方法はまた、増幅後のフラグメントのコンカタマー化を包含できる。これを達成するためには、先ず、浄化済みＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理する（プライマーがまだホスホリル化されていない場合）。Ｐｆｕのようなプルーフリーディング熱安定性ポリメラーゼを使用した場合は末端は既に平滑となっていてよく、或いは、Ｔａｑのような非プルーフリーディング酵素を使用する場合は増幅されたＰＣＲ産物をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより末端をポリッシュすることができる。ＰＣＲ産物はＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションできる。これにより制限酵素部位をフラグメント末端から効率的に離脱させ、そして効率的な消化が可能となる。
【０３５２】
例えば目的の配列との融合を形成するためのベクター内への曝露制限酵素部位を含有するＰＣＲ産物のサブクローニングの前に、未切断で残存しているものから消化されたＰＣＲ産物を分割することが必要な場合がある。そのような例においては、プライマーの５’末端における蛍光タグの付加はＰＣＲ前に付加することができる。これにより、良好に消化されているものは消化時に蛍光標識を消失してしまうことになるため、消化産物の識別を可能にする。
【０３５３】
一部の例においては、融合配列の形成のためのベクター内への後のサブクローニングのための制限部位を含有する増幅されたＰＣＲ産物の使用は、融合蛋白産物中への制限酵素リンカー配列の取り込みをもたらすことができる。一般的に、このようなリンカー配列は短鎖であり、そして配列が作動可能に連結している限り、ポリペプチドの機能を減損しない。
【０３５４】
アイソフォーム融合蛋白をコードする核酸分子は核酸分子を含むベクターの形態で提供できる。そのようなベクターの１つの例はプラスミドである。多くの発現ベクターが使用可能であり、当該分野で知られており、そして、アイソフォーム融合を包含するＨＧＦアイソフォームの発現のために使用できる。発現ベクターの選択は宿主発現系の選択により影響される場合がある。一般的に、発現ベクターは転写プロモーター及び場合によりエンハンサー、翻訳シグナル及び転写及び翻訳の終止シグナルを包含できる。安定な形質転換のために使用される発現ベクターは典型的には、形質転換細胞の選択及び維持を可能にする選択可能なマーカーを有する。一部の場合においては、ベクターのコピー数を増幅するために複製起点を使用できる。
【０３５５】
２．ターゲティング剤／ターゲティング剤結合体
ＨＧＦポリペプチドアイソフォームはまたアイソフォームと他の薬剤の間の結合体として提供できる。結合体はアイソフォームが相互作用する相手の受容体に対し、及び／又は、アイソフォームの送達のための別のターゲティングされた受容体に対し、ターゲティングするために使用できる。そのような結合体はターゲティングされた物質及び／又はターゲティング剤とのＨＧＦアイソフォームの連結を包含する。結合体は、例えばターゲティングされた物質又はターゲティング剤をコードするＤＮＡが、リンカー領域を有するか有することなく、ＨＧＦアイソフォームをコードするＤＮＡに作動可能に連結している融合蛋白の発現によるものを包含する何れかの適当な方法により生産できる。蛋白結合体は又、ＨＧＦアイソフォームポリペプチドの化学的カップリングにより、典型的には成分中に存在するかそれに付加されたシステイン残基間のジスルフィド結合を介して、又はアミド結合又は他の適当な結合を介して、例えば本明細書において提供されるか当該分野で知られているヘテロ二官能性交差結合試薬を用いることにより、製造することができる。イオン性又は他の連結もまた意図される。
【０３５６】
結合体は、直接、又はリンカーを介して、１つ以上のターゲティングされた物質：（ＨＧＦアイソフォーム）ｎ、（Ｌ）ｑ及び（ターゲティングされた物質）ｍに連結されたＨＧＦアイソフォーム１つ以上を含有でき、ここで少なくとも１つのＨＧＦアイソフォームは直接又はリンカー（Ｌ）１つ以上を介して、ターゲティングされた物質少なくとも１つに連結されている。そのような結合体はまた、標的、例えば治療のための標的細胞型に結合するために十分なＨＧＦアイソフォームの何れかの部分を用いて製造できる。結合体のエレメント間の何れの適当な会合、及び、ｎ及びｍが１より大きい整数でありｑがゼロ又は１より大きい何れかの整数であるエレメントの何れの数も、得られる結合体がＭＥＴのようなターゲティングされる細胞表面受容体又はターゲティングされた細胞型に相互作用する限り、意図されるものとする。
【０３５７】
例示されるターゲティングされた物質は、細胞表面において、又はそれを介して作用する薬剤及び毒素のような他の細胞毒性分子、及び、細胞内で作用するものを包含する。そのような部分の例は、ＨＧＦアイソフォームとカップリングされた場合にターゲティングされることができる、崩壊して例えばイオン化アルファ粒子又はベータ粒子を送達する放射性核種、放射性原子、又は、Ｘ線又はガンマ線を包含する。他の例はアイソフォームとカップリングすることによりターゲティングされる化学療法剤を包含する。例えば、ゲルダナマイシはプロテオソームをターゲティングする。アイソフォーム−ゲルダナマイシン分子は細胞内プロテオソームに対して指向させることができ、ターゲティングされたアイソフォームを分解し、そしてプロテオソームにおいてゲルダナマイシンを放出する。他の毒性分子は毒素、例えばリシン、サポリン及びホラガイ又は軟体動物門の他のメンバーに由来する天然物を包含する。ターゲティングされた物質との結合体の他の例は、抗体又は抗体フラグメントと、例えば蛋白融合として、カップリングしたＨＧＦアイソフォームである。例えば、アイソフォームは特定の細胞表面マーカーに結合して好中球、ナチュラルキラー細胞及びマクロファージにおいてキラーＴ細胞活性を誘導する抗体のＦｃフラグメントにカップリングできる。種々の毒素は当該分野で良く知られている。
【０３５８】
結合体は、直接、又はリンカーを介して、１つ以上のターゲティングされた物質：（ＨＧＦアイソフォーム）ｎ、（Ｌ）ｑ及び（ターゲティング剤）ｍに連結されたＨＧＦアイソフォーム１つ以上を含有でき、ここで少なくとも１つのＨＧＦアイソフォームは直接又はリンカー（Ｌ）１つ以上を介して、ターゲティングされた物質少なくとも１つに連結されている。結合体のエレメント間の何れの適当な会合、及び、ｎ及びｍが１より大きい整数でありｑがゼロ又は１より大きい何れかの整数であるエレメントの何れの数も、得られる結合体がターゲティングされた細胞型のような標的と相互作用する限り、意図されるものとする。
【０３５９】
ターゲティング剤は特定の組織又は細胞の型又は臓器のような標的にＨＧＦアイソフォームをターゲティングする如何なる分子も包含する。ターゲティング剤の例は細胞表面抗原、細胞表面受容体、細胞表面上又は細胞膜内部の蛋白、脂質及び炭水化物の部分、細胞表面上に突出しているか分泌されている分子、及び、他の細胞外分子を包含する。ターゲティング剤として有用な分子は、限定しないが、有機化合物；無機化合物；金属複合体；受容体；酵素；抗体；蛋白；核酸；ペプチド核酸；ＤＮＡ；ＲＮＡ；ポリヌクレオチド；オリゴヌクレオチド；オリゴ糖；脂質；リポ蛋白；アミノ酸；ペプチド；ポリペプチド；ペプチドミメティック；炭水化物；コファクター；薬品；プロドラッグ；レクチン；糖類；糖蛋白；生物学的分子；巨大分子；生物重合体；重合体；及び他のこのような生物学的材料を包含する。ターゲティング剤として有用な例示される分子は受容体に対するリガンド、例えば蛋白性及び小分子のリガンド、及び抗体及び結合蛋白、例えば抗原結合蛋白を包含する。
【０３６０】
或いは、特定の受容体又は他の分子と特異的に相互作用するＨＧＦアイソフォームはターゲティング剤であり、そして毒素、薬品又は核酸分子のようなターゲティングされた物質に連結される。核酸分子はターゲティングされた細胞において転写及び／又は翻訳されることができ、或いは、それは調節核酸分子であることができる。
【０３６１】
ＨＧＦアイソフォームは直接ターゲティングされた物質（又はターゲティング剤）に連結するか、リンカーを介してよい。リンカーはペプチド及び非ペプチドリンカーを包含し、そして、ターゲティングされた物質又はＨＧＦアイソフォームに対するターゲティング剤の近接部により誘発される立体障害を緩和又は低減するため、及び／又は、結合体の他の特性、例えば特異性、毒性、溶解性、血清中安定性及び／又は細胞内利用性を増大又は改変するため、及び／又は、ＨＧＦアイソフォームとターゲティングされた物質又はターゲティング剤との間の連結の柔軟性を増大するため等、機能性に関して選択することができる。連結は化学的交差結合により、例えば本明細書に記載するヘテロ二官能性交差結合剤を使用することにより、行うこともできる。連結及びコンジュゲーションの方法の例は当該分野で知られている（例えばＷＯ００／０４９２６参照）。ＨＧＦアイソフォームは又、リポソーム及びカプセル化又は捕獲された分子の送達を指向する他のそのような分子を用いてターゲティングされることもできる。
【０３６２】
３．ペプチドミメティックアイソフォーム
同様に提供されるものは、結果として形成されるポリペプチドペプチドミメティックが未修飾形態と比較して進歩した特性、例えばプロテアーゼに対する耐性を有するように、ペプチド骨格中の結合（又は他の結合）１つ以上がバイオアイソスター又は他の結合により置き換えられている「ペプチドミメティック」アイソフォームである。
【０３６３】
Ｈ．血清中半減期及び他の治療特性を改変するための方法
血清中半減期、安定性、溶解性の増大、及び／又は、ポリペプチドの免疫原性の低減のための方法が本明細書において提供される。蛋白の炭水化物含有量を増大させることはこれ等の特性に影響する場合がある。炭水化物含有量を増大させるための方法は標的蛋白内へのグリコシル化のためのコンセンサス部位１つ以上の導入を包含する。炭水化物含有量は又標的部分内の既存のグリコシル化部位のパターン又はスペーシングを改変することにより増大することもできる。コンセンサスグリコシル化部位の導入又はコンセンサスグリコシル化部位の改変は、アミノ酸置換により、又は、グリコシル化のためのコンセンサス部位を含有するポリペプチド配列の付加により、行うことができる。グリコシル化のためのコンセンサス部位を含有するポリペプチド配列は、標的蛋白のアミノ又はカルボキシ末端のいずれかに融合させることができ、或いは、標的蛋白内に生じるように操作することによりその炭水化物含有量を増大させることができる。
【０３６４】
本明細書において提供されるものは、ポリペプチドの炭水化物含有量を増大させるための方法、及び、増大した炭水化物含有量を有するポリペプチド産物である。特に、ＣＤ４５蛋白の全て又は一部分を含有する融合蛋白が提供される。ＣＤ４５の一部分は１つ以上、一般的には、２，３、４つ以上のグリコシル化部位を包含するように選択する。この一部分を蛋白のＮ末端、Ｃ末端又は内部に融合させる。挿入のための部位は、蛋白が活性、特に治療活性を保持するように選択する。ＣＤ４５フラグメントの挿入はそのような活性を実質的に改変してはならず、そして活性の少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上が保持されるように選択する。保持される活性の特定の量は、炭水化物含有量を増大させるべき蛋白及びその意図される用途に応じたものである。必要に応じて、量は実験的に決定できる。一部の蛋白、例えばプロテアーゼは活性が高値であるため、活性の僅か１％の保持が多くの目的のためになお十分である。他の蛋白はその目的の妥協以前に活性の１０％損失を忍容するのみであってよい。活性を評価するための試験は、全てとはいえなくとも大部分の治療用蛋白及び他の活性蛋白について使用可能であり、或いは、開発することもできる。
【０３６５】
１．Ｎ−連結及びＯ−連結グリコシル化
蛋白はグリコシル化を増大させる何れかの態様において修飾することができる。例えば、それらはＮ−連結又はＯ−連結グリコシル化部位を付加することにより修飾することができる。Ｏ−連結グリコシル化は標的蛋白におけるＳｅｒ又はＴｈｒ残基のヒドロキシル基へのＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮａｃ）のような単糖類の添加により生じる。コラーゲンにおいては、ヒドロキシリジンのヒドロキシル基にガラクトースを付加する。グリコシルトランスフェラーゼはその後、修飾された残基に別の炭水化物部分を付加させることにより、成熟したＯ−グリカンを形成する。Ｏ−連結オリゴ糖は典型的には１〜４糖残基を含有する。Ｏ−連結グリコシル化は伸長したベータターン部のような蛋白の二次構造により定義される部位において生じる。Ｎ−連結グリコシル化はコンセンサスモチーフＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅ／Ｔｈｒを有するＡｓｎ残基のアミド窒素への１４残基オリゴ糖Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の付加により生じ、ここでＸはＰｒｏ以外の何れかのアミノ酸である。グリコシルトランスフェラーゼはその後、付加されたオリゴ糖を改変して成熟したＮ−グリカンを形成する。Ｎ−連結オリゴ糖はマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミンを含有し、そして典型的には負荷電のシアル酸残基において各々が終止する、炭水化物の分枝数個を有する。蛋白の二次構造はグリコシル化のための標的としてのコンセンサス部位の利用性に影響する場合がある。
【０３６６】
グリコシル化反応は小胞体（ＥＲ）及びシス、メジアル及びトランスゴルジ槽を包含する分泌経路に関与する細胞内小器官の管腔内において生じる。シグナル配列はＥＲに対して発生中のポリペプチドをターゲティングすることができる。シグナル配列は野生型の蛋白中に存在でき、或いは、標的蛋白をコードするヌクレオチド配列へのシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列の融合による組み換えＤＮＡ手法を介して操作することができる。
【０３６７】
２．グリコシル化の作用
グリコシル化は蛋白の安定性及び溶解性を増大させ、そして免疫原性を低減することによりポリペプチドの血清中半減期を増大することができる。グリコシル化は蛋白の蛋白分解を低減することにより蛋白の安定性を増大することができる。グリコシル化は熱分解、変性剤への曝露、酸素フリーラジカルによる損傷、及び、ｐＨ変化から蛋白を保護することができる。グリコシル化は又細胞表面受容体を包含する他の蛋白への結合が関与する場合があるクリアランスの機序を標的蛋白が回避できるようにすることができる。シアル酸を含有する炭水化物部分は蛋白の溶解性に影響する場合がある。シアル酸部分は高度に親水性であり、標的蛋白の疎水性の残基を遮蔽できる。これにより標的蛋白の凝集及び沈殿が低減する。低減した凝集はまた標的蛋白に対する免疫応答の防止を支援する。炭水化物は更に、免疫系由来の免疫原性配列を遮蔽できる。炭水化物部分により占有された空間の容量は免疫系の対象となりえる使用可能な表面積を低減することができる。これ等の特性は標的蛋白の免疫原性の低減をもたらす。
【０３６８】
３．グリコシル化のための治療上の使用
蛋白の血清中半減期を増大させることはそれらが治療薬として使用される潜在性を向上させることができる。身体による治療用蛋白の急速なクリアランスは治療の効力を低減し、そして、患者により必要とされる注射の回数を増大させる。治療用蛋白のグリコシル化を増強することのような方法を介して血清中半減期を増大させることは、頻繁な注射の必要性を緩解できる。グリコシル化の他の作用、例えば標的蛋白の溶解性及び免疫原性低下は治療用蛋白にとって望ましい特性である。増大した溶解性は治療用蛋白の送達のための適当な組成物の選択肢を増大させることができ、そして、身体内に入った後に標的組織に到達する治療用蛋白の能力を増強することができる。蛋白の免疫原性を低下させることは、有害免疫応答の可能性を低減できる。
【０３６９】
自身のグリコシル化を増大させるために操作できる治療用蛋白の例は限定しないが、成長因子、抗体、サイトカイン、例えば腫瘍壊死因子及びインターロイキン、及び、細胞毒性剤及び本明細書に開示する、そして当該分野で知られた他の薬剤を包含する。そのような薬剤は限定しないが、腫瘍壊死因子、α−インターロイキン、β−インターロイキン、神経成長因子、血小板誘導成長因子、組織プラスミノーゲン活性化物質；又は生物学的応答のモディファイアー、例えばリンホカイン、インターロイキン−Ｉ（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、プロ凝固剤、例えば組織因子及び組織因子変異体、プロアポトーシス剤、例えばＦＡＳリガンド、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、神経成長因子及び他の成長因子を包含する。
【０３７０】
４．血清中半減期を改変するためのＣＤ４５の使用
ＣＤ４５は重度にグリコシル化された単一の膜貫通ドメインである細胞外ドメイン及び直列に２連となったホスファターゼドメインを含有する細胞内ドメインを含有する膜貫通蛋白チロシンホスファターゼである。ＣＤ４５の細胞外ドメイン又はそのフラグメントへの標的蛋白の融合は、組み換え蛋白の全体的炭水化物含有量を増大させることにより標的蛋白の血清中半減期を改変、特に増大するために操作することができる。ＣＤ４５融合蛋白の製造のためのＣＤ４５細胞外ドメイン又はそのフラグメントの使用のための方法が本明細書において提供される。
【０３７１】
例示される完全長ＣＤ４５ポリペプチドは配列番号２７１に記載する核酸配列によりコードされる配列番号２７２として本明細書において提供される。ＣＤ４５の対立遺伝子変異体は配列番号２７１と比較してヌクレオチド変化１つ以上、又は、配列番号２７２と比較してアミノ酸変化１つ以上を含有できる。対立遺伝子変異はＣＤ４５遺伝子のエクソン又はイントロン配列の何れか１つ以上において生じることができる。ＣＤ４５蛋白をコードする核酸及びコードされたＣＤ４５ポリペプチドはＣＤ４５の対立遺伝子変異体を包含できる。例示されるＣＤ４５対立遺伝子変異体は配列番号２７３に記載する通り何れかの１つ以上のヌクレオチド変化、又は、配列番号２７４に記載する通り何れかの１つ以上のアミノ酸変化を包含できる。更に又、炭水化物含有量を増大させるためにＣＤ４５を添加する場合は、グリコシル化部位に影響する、及び／又は、追加的グリコシル化部位を付加させる変異及び修飾を導入できる。従って本明細書に開示する、そして当該分野で知られたＣＤ４５ポリペプチドの変異体を使用できる。そのような変異体は本明細書に開示するＣＤ４５ポリペプチドに対し、又は、その対立遺伝子及び種変異体に対して、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有することができる。
【０３７２】
ａ．ＣＤ４５の機能
ＣＤ４５は造血起源の全有核細胞上で発現され、そしてリンパ球受容体の活性化及び発生において機能を果たしている。ＣＤ４５の細胞内ホスファターゼドメインは、基質結合をブロックすることによりキナーゼ活性を阻害するペプチド活性化ループ上の抑制性のホスフェートの除去により、Ｓｒｃファミリーの蛋白チロシンキナーゼ、例えばＬｃｋ及びＦｙｎの活性をモジュレートする。これ等のキナーゼの活性化はＴ細胞活性化、Ｔ細胞発生およびＢ細胞発生に対し、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）活性化を介して寄与している。
【０３７３】
ｂ．ＣＤ４５の２量体化及びグリコシル化
ＣＤ４５の活性は受容体の２量体化により制御できる。細胞外領域の２量体化は細胞内ホスファターゼ活性の不活性化をもたらすことができる。阻害はあるＣＤ４５蛋白の抑制性構造の別のＣＤ４５蛋白のホスファターゼドメインとの相反的相互作用を介して起こる。ＣＤ４５の２量体は受容体の不活性の形態を示すのに対し、ＣＤ４５の単量体型は受容体の活性な又は「プライミングされた」状態を示し、ここで、活性のホスファターゼはリンパ球活性化に応答するための準備状態にある。受容体２量体化の相違はＣＤ４５細胞外領域の炭水化物含有量の変化を介して達成できる。増大したグリコシル化はＣＤ４５の単量体形態の増大を誘発し、増大したホスファターゼ活性をもたらす。細胞外例示のグリコシル化は又、細胞表面へのＣＤ２２及びガレクチン−１のようなレクチンの結合を増進するが、これ等の蛋白は一般的にＴ細胞糖蛋白に結合し、そしてＣＤ４５ホスファターゼドメインを介したシグナリングには関与していないと考えられる。
【０３７４】
ＣＤ４５のグリコシル化の変化は受容体のグリコシル化ドメインをコードするエクソンのオルタナティブスプライシングを介して達成できる。エクソン４、５及び６（それぞれＡ、Ｂ及びＣと命名）は可変のシアル酸修飾により重度にＯ−グリコシル化される蛋白のＮ末端近傍のポリペプチド領域をコードする。４、５及び６エクソンのオルタナティブスプライシングによりＣＤ４５の異なるアイソフォームが生成する。アイソフォームの細胞外領域は、大部分は炭水化物含有量の相違のために、大きさ、形状及び電荷において変動する。全３ドメインを欠いているＣＤ４５アイソフォームＲＯは約１８０ｋＤａの大きさであるのに対し、Ａ、Ｂ及びＣドメインを包含するＣＤ４５アイソフォームＲＡＢＣは約２２０〜２４０ｋＤａである。ＣＤ４５のＲＯ及びＲＡＢＣアイソフォームは細胞型、発生段階及び細胞活性化状態に応じて、示差的に発現される。例えば、活性化されたＴ細胞は刺激の初日には高レベルのＲＡＢＣアイソフォームを発現し、その後活性化が低減するに従って発現をＲＯアイソフォームに徐々に切り替える。別の例においては、活性化のためにプライミングされるナイーブのＴ細胞は高レベルのＲＡＢＣアイソフォームを発現するのに対し、より低値のチロシンキナーゼ活性化を有するメモリーＴ細胞はＲＯアイソフォームを発現する。他のオルタナティブスプライシングＣＤ４５変異体はＡ、Ｂ及びＣドメインの種々の組み合わせを包含するアイソフォームをコードする。例えば２１０ｋＤａアイソフォームはＡ及びＢ又はＢ及びＣドメインを含有し、そして２００ｋＤａアイソフォームはＢドメインを含有する。
【０３７５】
細胞外ドメインの残余もまた重度にグリコシル化される。この領域はシステインリッチドメイン（ｄ１）とそれに後続する３種のフィブロネクチンＩＩＩ型リピートドメイン（ｄ２、ｄ３及びｄ４）を含有する。この領域におけるグリコシル化は主にＮ−連結グリコシル化である。Ｎ−連結結合体はポリ（Ｎ−アセチルラクトサミン）基及びα−２，６シアル酸残基を含有するテトラ及びトリアンテナ状の複合体型炭水化物鎖である。これ等のドメインのＮ−連結グリコシル化はＢ細胞のＣＤ２２、血清マンナン結合蛋白及び小胞体中に観察されるグリコシダーゼＩＩレクチンの結合に寄与する。ＣＤ４５のこれ等の蛋白の結合は、それぞれ、細胞接着、胸腺細胞成熟化及び炭水化物含有量の改変に寄与する。
【０３７６】
【表５】
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ｃ．ＣＤ４５の融合蛋白
ＣＤ４５の融合蛋白はポリペプチド及びＣＤ４５の蛋白フラグメント及びそのフラグメントの組み合わせを含有する。ＣＤ４５フラグメントは上記表５において概説し、そして配列番号２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５に記載するＣＤ４５の細胞外領域及びその変異体から誘導する。本明細書において提供されるものは、細胞表面受容体（ＣＳＲ）アイソフォーム及びＣＤ４５の細胞外ドメインから誘導されたＣＤ４５蛋白フラグメント及びそのフラグメントの組み合わせを含有するＣＤ４５融合蛋白である。別の実施形態においては、ＣＤ４５融合蛋白はＣＳＲアイソフォーム及びグリコシル化部位１つ以上を含有するＣＤ４５蛋白フラグメント又はそのフラグメントの組み合わせを含有する。例示されるＣＤ４５蛋白フラグメントは限定しないが、配列番号２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５に記載するペプチド、及びその変異体、例えば対立遺伝子及び種変異体、及びこれ等のＣＤ４５蛋白に対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有する何れかを包含する。例示されるＣＤ４５蛋白フラグメントは配列番号２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４に記載するヌクレオチド及びその種及び対立遺伝子変異体を包含する変異体の配列を含有する核酸分子によりコードされる。例示されるＣＳＲアイソフォームは限定しないが、配列番号３６〜２４５に記載するポリペプチド及びその変異体をコードするペプチド及び核酸分子を包含する。別の実施形態においては、ＣＤ４５融合蛋白をコードする核酸分子はＣＳＲアイソフォーム及びＣＤ４５蛋白又はそのフラグメントを含有し、そして本明細書において提供される。配列番号２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３及び２９５に記載するペプチド配列及び配列番号２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２及び２９４に記載する核酸配列の変異体は、それぞれ配列番号２７３及び２７４に記載する通り提供される。
【０３７７】
本明細書において提供されるものはリガンドアイソフォーム及びＣＤ４５蛋白又はそのフラグメントを含有するＣＤ４５融合蛋白である。本明細書において提供されるものは、リガンドアイソフォーム及びＣＤ４５の細胞外ドメインから誘導されたＣＤ４５蛋白フラグメント又はそのフラグメントの組み合わせを含有するＣＤ４５融合蛋白である。別の実施形態においては、リガンドアイソフォーム及び１つ以上の推定グリコシル化部位を含有するＣＤ４５蛋白フラグメント又はそのフラグメントの組合せを含有するＣＤ４５融合蛋白である。例示される蛋白フラグメントは限定しないが、配列番号２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５に記載するペプチド及びその変異体を包含する。例示されるＣＤ４５蛋白フラグメントは配列番号２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４に記載する核酸及びその変異体によりコードされる。例示されるリガンドアイソフォームは限定しないが、配列番号１０〜１４、１８、２０に記載するポリペプチド又はその変異体をコードするペプチド及び核酸分子を包含する。別の実施形態においては、ＣＤ４５融合蛋白をコードする核酸分子はリガンドアイソフォーム及びＣＤ４５蛋白又はそのフラグメントを含有し、そして本明細書において提供される。
【０３７８】
ＣＤ４５融合蛋白は配列番号２８０〜２９５に記載するペプチド及びその変異体の全ＣＤ４５蛋白のフラグメント又はその部分の組み合わせを含有できる。ＣＤ４５の対立遺伝子変異体は又種変異体を包含する。ＣＤ４５はヒト意外にも多数の種、例えば限定しないが、他の哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類、両生類及び昆虫類に存在する。ＣＤ４５の種変異体の例示される配列は限定しないが、配列番号２７５〜２７９に記載されるチンパンジー、マウス、ラット、イヌ及びニワトリを包含する。
【０３７９】
他の実施形態においては、ＣＤ４５融合蛋白はＣＳＲアイソフォームの生物学的活性及び／又は治療活性な変異体、及びＣＤ４５蛋白又はそのフラグメントを含有する。他の実施形態においては、ＣＤ４５融合蛋白はリガンドアイソフォームの生物学的活性及び／又は治療活性な変異体、及びＣＤ４５蛋白又はそのフラグメントを含有する。
【０３８０】
ＣＤ４５−ＣＳＲアイソフォーム又はＣＤ４５−リガンドアイソフォーム融合蛋白をコードする核酸分子を含有するベクターも、ベクター又は核酸分子を含有する細胞と同様、提供される。提供される核酸分子に包含されるものは、イントロン及びエクソンを含有するものであり、ここでイントロンは終止コドンを含有し；核酸分子はエクソンイントロン接合部に及んでいるオープンリーディングフレームをコードし；そしてオープンリーディングフレームはイントロン内の終止コドンにおいて終了する。イントロンはコードされるポリペプチドのアミノ酸１つ以上をコードすることができ、或いは、コドンはイントロン中の最初のコドン（及び恐らくは唯一のコドン）であることができる。
【０３８１】
ＣＤ４５又はそのフラグメントと融合することができる蛋白アイソフォームの網羅的ではないリストは、例えば限定しないが、配列番号１０〜１４、１８、２０及び３６〜２４５に記載するポリペプチド及びポリペプチドをコードする核酸、そのフラグメント及び変異体を含有するＣＳＲアイソフォーム及びリガンドアイソフォームを包含する。
【０３８２】
ｄ．ＣＤ４５融合蛋白の結合体
ＣＤ４５融合蛋白に接続できる核酸分子は、限定しないが、例えば細胞内蛋白発現を促進するように設計されたプロモーター配列、蛋白分泌を促進するように設計された分泌配列、転写及び翻訳を調節するための調節配列、免疫グロブリンのＦｃ部分のようなコードされたポリペプチドの血清中安定性を調節する分子、及び、ターゲティングされた物質又はターゲティング剤をコードするもの又は別のリガンド又は細胞表面受容体イントロン融合蛋白の全て又は一部分をコードするもののような他のポリペプチドコード核酸分子を包含する。融合配列は発現ベクターの成分であることができ、又は、それは発現ベクターに挿入された核酸配列の部分であることができる。１つの実施形態において、ＣＤ４５融合蛋白は、例えばウエスタンブロット、蛍光顕微鏡、免疫組織化学分析、免疫沈降及びカラム精製によるなど、当該分野で知られた手法による融合蛋白の検出及び／又は単離のために使用されるペプチド配列タグを含有できる。例示される配列タグは限定しないが、ｍｙｃタグ、ポリＨｉｓタグ、ＧＳＴタグ、Ｆｌａｇタグ、蛍光又はルミネセント部分、例えばＧＦＰ又はルシフェラーゼ、又は当該分野で知られた何れかの他のエピトープ又は融合タグを包含する。別の実施形態においては、ＣＤ４５融合蛋白は追加的に融合蛋白の分泌を可能及び／又は増強するために使用されるシグナル配列ペプチドを含有する。例示されるシグナル配列ペプチドは限定しないが、本明細書に開示するｔＰＡプレ／プロシグナル配列（例えば配列番号２５６〜２６５参照）を包含する。追加的な結合体、例えばターゲティング剤結合体、交差結合剤、ポリペプチドリンカー及び別のポリペプチドの全て又は一部分に対する融合を、セクションＧに記載した通り、ＣＤ４５融合蛋白に適用できる。
【０３８３】
ｅ．治療用ＣＤ４５融合蛋白
ＣＤ４５−ＣＳＲ融合蛋白及び／又はクリングルドメイン−リガンド融合蛋白は炎症性疾患、免疫疾患、癌、及び、異常な血管形成又は血管新生又は細胞増殖が顕在化している他の疾患を包含する疾患を治療するために使用できる。癌は、乳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌及び他のものを包含する。炎症性疾患は例えば、糖尿病性網膜症及び／又は神経障害及び糖尿病の他の炎症性血管合併症、自己免疫疾患、例えば自己免疫性糖尿病、アテローム性動脈硬化症、クローン病、糖尿病性腎臓病、嚢胞性線維症、子宮内膜症、糖尿病誘導血管傷害、炎症性腸疾患、アルツハイマー病及び他の神経変性疾患、及び、増殖性応答、免疫応答及び炎症応答が関与する当該分野で知られた他の疾患、及び、ＣＳＲの関与が示唆されるか、関与している、又は、役割を果たしている他のものを包含する。
【０３８４】
ｆ．グリコシル化を測定するための方法
グリコシル化の程度及びパターンを評価するための方法が本明細書において提供される。アミノ酸残基の修飾は当該分野で知られた方法により評価することができ、そしてトリプシンマッピング、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アニオン交換クロマトグラフィー、円偏光二色性、蛍光団標識、質量スペクトル分析、結晶学的分析、ゲル電気泳動及びＰＶＤＦ膜からのオリゴ糖遊離の酵素的分解を包含できる。変動する特異性を示しビオチン又はジゴキシゲニンと結合体化されたレクチンのパネルを用いたウエスタンブロットは糖蛋白上に観察される所定の糖エピトープの広範な範囲を識別できる。ウエスタンブロットは又ＣＤ４５細胞外ドメインのグリコシル化を特異的に測定するために使用できる。ＣＤ４５の細胞外ドメインを検出し、そしてＣＤ４５のグリコシル化変異体を区別できる抗体が入手可能である。
【０３８５】
ｇ．製造及びグリコシル化増大の方法
ＣＤ４５融合蛋白の製造のための方法が本明細書において提供される。哺乳類発現系をセクションＦ３ｄに記載する通りＣＤ４５融合蛋白を発現させるために使用できる。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系は、この細胞型が組み換え蛋白の高発現を示し、そして蛋白のグリコシル化が可能であることから、糖蛋白の製造のために頻繁に選択される。内因性野生型ヒト蛋白と同様のグリコシル化パターンで糖蛋白を生産することができるＧｌｙｃｏＥｘｐｒｅｓｓＴＭ細胞系統（Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ）のような操作されたヒト細胞系統も使用される。操作されたヒト細胞系統は、それらが治療用糖蛋白の血清中半減期及び免疫原性に影響するグリコシル化蛋白を適切にシアリレートする能力を保有しているため、治療用蛋白の製造のために好ましい。
【０３８６】
ｈ．ＨＧＦ−ＣＤ４５融合蛋白及び治療上の使用
ＨＧＦアイソフォームをＣＤ４５又はそのフラグメントに融合することによりＣＤ４５−ＨＧＦ融合蛋白を形成できる。ＨＧＦアイソフォームは、ＣＤ４５の細胞外ドメインから誘導したＣＤ４５蛋白フラグメント又はそのフラグメントの組合せに融合できる。例示されるＣＤ４５蛋白フラグメントは限定しないが、配列番号２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５に記載するペプチド及びその変異体を包含する。例示されるＣＤ４５蛋白フラグメントは配列番号２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４に記載する核酸及びその変異体によりコードされる。ＣＤ４５フラグメントに融合できる例示されるＨＧＦアイソフォーム及びその対立遺伝子変異体は限定しないが、配列番号１０、１２、１４、１８又は２０を包含する。ＣＤ４５フラグメントに融合できる追加的なＨＧＦポリペプチドは限定しないが、配列番号３、２２、２４、２６、２８、３０、３２及び２４６〜２５１に記載するポリペプチドを包含する。
【０３８７】
ＣＤ４５−ＨＧＦ融合蛋白はＨＧＦの活性、例えば血管形成、細胞成育、形態形成、遊走誘発又は腫瘍転移を抑制、又は反対に増強することができる。
【０３８８】
ＣＤ４５−ＨＧＦ融合蛋白は異常な血管形成の関与する疾患を治療、防止又は緩解するために使用できる。ＣＤ４５−ＨＧＦ融合蛋白は血管形成関連疾患、例えば限定しないが、慢性関節リューマチ、変形性関節症、乾癬、オスラー・ウェバー症候群、子宮内膜症、スティル病、心筋の血管形成、末梢血管拡張症、血友病性関節炎、加齢関連の黄斑変性、未熟児網膜症、角膜移植に対する拒絶、全身エリテマトーデス、アテローム性動脈硬化症、血管新生緑内障、脈絡膜血管新生、水晶体後線維増症、腱麻痺、神経線維腫、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫及び糖尿病関連疾患、例えば増殖性糖尿病性網膜症及び血管疾患を治療するために使用できる。
【０３８９】
ＣＤ４５−ＨＧＦ融合蛋白は癌、例えば限定しないが、扁平細胞癌（例えば扁平上皮細胞癌）、肺癌、例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃及び腹部の癌、例えば胃腸の癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌又は腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌、陰茎癌並びに頭頚部癌の転移の治療及び防止において使用できる。
【０３９０】
Ｉ．ＨＧＦアイソフォーム特異的抗体を製造及び単離する方法
抗体、例えばポリクローナル及びモノクローナル抗体及びそのフラグメントを製造し、単離する方法は当該分野で良く知られている。組み換え及び合成の抗体を製造し、単離する方法も当該分野で良く知られている。例えば、そのような抗体は固相ペプチド合成を用いて構築するか、又は、組み換えにより製造することができ、その際には、候補ポリペプチドに特異的に結合する抗体の抗原結合部位のヌクレオチド及びアミノ酸の配列の情報を使用する。抗体はまた可変重鎖及び過編軽鎖又はその抗原結合部分を含有するコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることにより得ることもできる。ポリクローナル、モノクローナル及び非天然の抗体を製造、単離及び使用する方法は、例えばＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ編（２００１）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ；Ｈｏｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｂｅｔｈｅｌｌ編（２００１）「Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ」ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；及びＯ’Ｂｒｉｅｎ  ａｎｄ  Ａｉｔｋｉｎ編（２００１）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ」Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓにおいて検討されている。そのような抗体はまた、例えば細胞、組織又は抽出液中のＨＧＦアイソフォームの発現を検出するために、アイソフォームポリペプチドの存在を調べるスクリーニングにおいて使用できる。
【０３９１】
Ｊ．ＨＧＦアイソフォーム活性を評価又はモニターするための試験
一般的に、本明細書において提供されるＨＧＦアイソフォームはリガンドの野生型又は優勢な形態と比較して構造及び１つ以上の活性において改変を示す。特にアイソフォームはＨＧＦ拮抗活性及び／又は抗血管形成活性を示す。そのため、アイソフォームは治療薬候補となる。必要に応じて、識別されたアイソフォームをインビトロ及びインビボの試験を用いてスクリーニングすることにより、ＨＧＦアイソフォームの活性をモニタリング又は識別することができ、そしてそのような活性又は活性の改変を示す、及び／又は、受容体結合を示す、又はＨＧＦ媒介ＭＥＴ活性化をモジュレート、及び／又は、成長因子血管形成活性をモジュレートするＨＧＦアイソフォームを選択することができる。
【０３９２】
本明細書に例示する試験を含む何れかの適当な試験を用いることができる。ＨＧＦの活性に関する多くの試験が当該分野で知られている。試験はＨＧＦアイソフォームの活性のＨＧＦリガンドの野生型又は優勢な形態の活性との比較を可能にし、これにより、活性を欠いているアイソフォームを識別することができる。更に又、試験はＭＥＴ受容体又はＦＧＦＲ又はＶＥＧＦＲを包含する血管形成に関与するもののような他の成長因子受容体の活性をモジュレートするアイソフォームの識別を可能にする。ＨＧＦ及びＨＧＦアイソフォームに関する試験は限定しないが、リガンド結合試験、受容体２量体化／オリゴマー化試験、ＭＥＴ及びＥＲＫホスホリル化試験、増殖及び有糸分裂誘発試験、遊走誘発試験、形態形成試験及びアポトーシス試験を包含する。
【０３９３】
或いは、又は追加的に、ＨＧＦアイソフォームはＭＥＴの活性をモジュレート、及び／又は他の細胞表面蛋白、例えばＧＡＧ、例えばヘパリン、又は血管形成に関与する他の細胞表面蛋白、例えば成長因子受容体及び他の血管形成誘導分子、例えばαｖβ３インテグリン又はアンジオモチンと結合又は相互作用する。識別されたアイソフォームはそのような活性があるものを得るためにスクリーニングできる。活性及びＭＥＴ及び／又は他の細胞表面蛋白との機能的相互作用を識別するためにアイソフォームをスクリーニングする試験は当該分野で知られている。当業者は特定のアイソフォームをＭＥＴ又は他の細胞表面蛋白との相互作用に関して試験することができ、及び／又は、ＨＧＦと比較した場合の活性の変化があるかどうか試験することができる。一部を本明細書において例示する。
【０３９４】
１．リガンド結合試験及びＨＧＦ結合試験
ＨＧＦアイソフォーム結合は細胞へのＨＧＦの結合と比較した場合のＨＧＦアイソフォームの結合を評価することにより直接評価できる。一部の例においては、内皮細胞、又はＨＧＦと結合することが知られている他の細胞へのＨＧＦアイソフォームの結合を評価することにより、ＨＧＦと比較した場合のＨＧＦアイソフォームの結合の改変、即ち増強又は抑制の何れかが起こっているかを調べることができる。他の例においては、ＭＥＴを発現することがわかっている細胞への結合に関して、ＨＧＦ又は他の知られたリガンドを用いながら競合的試験を使用することができる。
【０３９５】
ＭＥＴ受容体との結合に関してＨＧＦアイソフォームがＨＧＦと競合する能力を評価することができる。ＨＧＦ及びＨＧＦアイソフォームをクロラミンＴ法（Ｎａｋａｍｕｒａ等、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７，３３０５−３３１３参照）により放射性ヨウ素化し、そして１２５Ｉ−ＨＧＦ及び１２５Ｉ−ＨＧＦアイソフォームの比放射能を測定する。ＭＥＴ受容体を通常発現する細胞を結合試験用のマルチウェルプレート中で培養する。細胞を氷冷結合緩衝液中で平衡化し、そして過剰モル比の未標識のＨＧＦ又はＨＧＦアイソフォームの存在下又は非存在下、種々の濃度の１２５Ｉ−ＨＧＦ及び１２５Ｉ−ＨＧＦアイソフォームと共にインキュベートする。競合的結合試験のためには、固定された濃度の１２５Ｉ−ＨＧＦ及び種々の濃度の未標識ＨＧＦ又はＨＧＦアイソフォームを細胞と共にインキュベートする。インキュベーション期間の後、細胞を洗浄し、可溶化し、そして結合標識蛋白をガンマカウンターを用いて計測する。
【０３９６】
ＭＥＴ又はヘパリンを包含する細胞表面分子へのＨＧＦの結合は直接又は間接的に、１つ又は１つより多い細胞表面分子に関して計測できる。例えばヘパリンに結合するＨＧＦアイソフォームの能力を計測できる。別の試験においては、免疫沈降を用いて細胞表面分子結合を評価する。細胞溶解物をＨＧＦアイソフォームと共にインキュベートする。αｖβ３、ヘパリン又は成長因子受容体のような細胞表面分子に対する抗体を用いて複合体を免疫沈降する。複合体中のＨＧＦアイソフォームの量は、抗ＨＧＦ抗体による免疫沈降物のウエスタンブロットを用いて定量及び／又は検出する。細胞表面分子結合試験は又、他の分子の存在下のリガンドへの結合を包含できる。例えば、ＨＧＦアイソフォームによる細胞表面分子結合は可溶性ヘパリンの存在下で評価できる。
【０３９７】
２．リガンド２量体化
ＨＧＦアイソフォームを包含するＨＧＦリガンドの２量体化はアイソフォームが２量体を形成するかどうかを調べるために試験できる。例えばアイソフォームをビス（スルホスクシンイミジル）スベレートのような交差結合剤の存在下又は非存在下においてインキュベートすることができる。一部の例においては、ヘパリンを試料に添加できる。クエンチングの後、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分割することができ、そしてクーマシーブルー蛋白染色による染色によるか、又は抗ＨＧＦ抗体又は抗ＨＧＦアイソフォーム抗体を用いることにより、蛋白を検出できる。蛋白のバンドを分析することにより、交差結合試薬と共にインキュベートしなかった蛋白、又はヘパリンの非存在下でインキュベートした蛋白と比較した場合のより高値の分子量を、試料内の単量体、２量体又は他の複合体化形態の存在を評価することによるなどして、評価することができる。
【０３９８】
３．複合体形成
複合体形成、例えばＨＧＦリガンド又はＨＧＦアイソフォームによるＭＥＴ  ＲＴＫの２量体化を検出及び／又は計測することができる。一般的に、ＲＴＫの受容体２量体化が活性化のために必要である。ＭＥＴシグナリングの拮抗剤はＭＥＴに結合するが、２量体化又は活性化を誘導することはできない。例えば、単離されたポリペプチドを共に混合し、ゲル電気泳動及びウエスタンブロットに付すことができる。ＨＧＦ及び／又はＨＧＦアイソフォームもまた細胞及び細胞抽出液、例えば全細胞又は分画された抽出物に添加し、そしてゲル電気泳動及びウエスタンブロットに付すことができる。ポリペプチドを認識する抗体を用いて単量体、２量体及び他の複合体化形態の存在を検出できる。一部の例においては、ヘパリンを添加するか、又は細胞をヘパリナーゼで処理した後に、複合体形成実験を行うことができる。
【０３９９】
４．ＭＥＴ及びＥＲＫ１／２ホスホリル化試験
ＨＧＦアイソフォームは、ＭＥＴ受容体の活性化に影響する、又は、ＭＥＴのＨＧＦ誘導を妨害するその能力について、ＭＥＴのホスホリル化状態を計測することにより評価することができる。通常はＭＥＴ受容体を発現する内皮細胞、例えばヒト皮膚微小血管内皮細胞を一夜血清飢餓状態とする。次に細胞を１０分間種々の濃度のＨＧＦアイソフォームで前処理した後、ＨＧＦ又は血清非含有培地の何れかを添加する。細胞を陽性対照としてナトリウムオルトバナデート（Ｎａ３ＶＯ４）単独で処理することができる。インキュベーション時間の後、細胞を洗浄し、可溶化する。細胞抽出液の等蛋白量を抗ＭＥＴ抗体、例えば抗ＭＥＴ  Ｃ−１２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）で免疫沈降させる。免疫沈降物を洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離に付し、そして膜に移行させる。ＭＥＴ受容体のチロシンホスホリル化の量をＰＹ９９又はＰＹ２０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ及びＣｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）のような抗ホスホチロシン抗体との免疫反応性により評価する。
【０４００】
ＭＥＴ受容体誘導の別の指標はＭＥＴ経路における下流のキナーゼの活性化である。ＥＲＫ１／２のようなキナーゼはＨＧＦ誘導ＭＥＴ受容体活性化に続くホスホリル化を介して活性化される。ＨＧＦアイソフォームは、単独又はＨＧＦの存在下において、ＥＲＫ１／２ホスホリル化に影響するその能力について評価できる。上記した通りＨＧＦアイソフォーム及び／又はＨＧＦによる処理の後、全細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、膜に移行させる。ホスホリル化されたＥＲＫ１／２の量を抗ホスホＥＲＫ１／２抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）との免疫反応性により評価する。
【０４０１】
ＥＲＫ１／２ホスホリル化に関する試験は又、ｂＦＧＦ受容体及びＶＥＧＦ受容体のような他の血管形成性の受容体の活性化を抑制するＨＧＦアイソフォームの能力を評価するためにも使用できる。ＨＧＦアイソフォームによる前処理の後、細胞をｂＦＧＦ又はＶＥＧＦと共に所定時間インキュベートする。全細胞抽出液を上記した通りＥＲＫ１／２のホスホリル化について試験する。
【０４０２】
５．形態形成／血管形成試験
インビトロでＨＧＦ誘導血管形成に影響するＨＧＦアイソフォームの能力は細管形成の計測により評価できる。内皮細胞、例えばヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣＳ）をＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でコーティングしたマルチウェルプレートにプレーティングし、一夜インキュベートする。次に培地を吸引し、血清非含有培地、ＨＧＦ、ＨＧＦアイソフォーム又はＨＧＦとＨＧＦアイソフォームの組み合わせの何れかを含有する追加のＭａｔｒｉｇｅｌＴＭを細胞に積相する。一夜インキュベートした後、細胞を位相差顕微鏡下に観察する。細胞のランダムな視野を撮影し、細管の長さを計測する。ＨＧＦの代わりにＨＧＦアイソフォームも細管形成を促進する他の血管形成因子、例えばｂＦＧＦ及びＶＥＧＦと共に同時インキュベートすることにより、血管形成を促進する他の因子の作用に対してＨＧＦアイソフォームが有する作用を評価することができる。
【０４０３】
この試験の別のバージョンではＨＧＦの原料としてのＭＲＣ５細胞のようなＨＧＦ生産線維芽細胞を用いる。内皮細胞、例えばＨＵＶＥＣＳをＭａｔｒｉｇｅｌＴＭでコーティングしたＴｒａｎｓｗｅｌｌチャンバー（６．５ｍｍ直径のポリカーボネート膜、０．４５μｍ孔径、Ｃｏｓｔａｒ）の下部チャンバー内に入れる。一夜インキュベートした後、培地を吸引し、血清非含有培地又はＨＧＦアイソフォームの何れかを含有する追加のＭａｔｒｉｇｅｌＴＭを細胞に積相する。ＨＧＦ発現ＭＲＣ５細胞をＴｒａｎｓｗｅｌｌプレートの上部チャンバー内の血清非含有培地に入れる。一夜インキュベートした後、細管の長さを計測する。ＥＬＩＳＡによりＨＧＦの存在を確認するために下部チャンバーの培地を分析する。上部チャンバーのＭＲＣ５細胞から単離したＲＮＡもまたＨＧＦの生産を評価するためにＲＴ−ＰＣＲにより分析することができる。
【０４０４】
コラーゲンゲル中の３次元培養もまた、ＭＤＣＫ細胞のような細胞中の細管形成を観察するために使用できる。細胞の所定量を０．２％氷冷コラーゲン溶液に懸濁する。溶液がゲル化した後、種々の濃度のＨＧＦアイソフォーム及び／又はＨＧＦを含有する培地を添加し、そして細胞を６時間培養する。ＨＧＦ処理をしない対照ＭＤＣＫ細胞は球状の嚢胞として生育することになるのに対し、ＨＧＦによる処理は分枝化する細管形成を誘発することになる。ＨＧＦアイソフォーム存在下の細管形成の抑制は細管の数及び細管の長さの計測により評価できる。ＨＧＦの代わりに、他の血管形成因子、例えばＦＧＦ−２及びＶＥＧＦを用いてコラーゲンゲル内の細管形成を促進することができ、そしてＨＧＦアイソフォームのそれらの形態形成活性に対する作用を評価できる。
【０４０５】
６．有糸分裂誘発／増殖試験
内皮細胞のＨＧＦ、ＦＧＦ−２及びＶＥＧＦ誘導有糸分裂誘発活性に対するＨＧＦアイソフォームの作用は細胞増殖を計測することにより評価できる。所定の密度の内皮細胞をゼラチン処理したマルチウェル組織培養プレート上にプレーティングし、一夜インキュベートする。培地を、ＨＧＦ、ＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ又はその組み合わせと共にＨＧＦアイソフォームを種々の濃度で含有する新しい培地と交換する。７２時間後、細胞をトリプシンで分散させ、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターを用いて計数する。細胞増殖の定量は又、３−（４，５−ジメチルチサゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）法を用いて実施することもできる（例えばＹｏｎｅｋｕｒａ等、２００３  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３７０：１０９７−１１０９参照）。
【０４０６】
７．遊走誘発／細胞遊走試験
ＨＧＦアイソフォームはＨＧＦ誘導細胞運動性を妨害するその能力に関して評価できる。内皮細胞をマルチウェルプレート中で培養ディッシュ表面に堅固に接着するまで培養する。次に新しい培地を添加し、軽質鉱物油を積層することにより蒸発を防止する。ＨＧＦ、ＨＧＦアイソフォーム又はその組み合わせを含有する培地を添加し、画像をデジタルカメラ及び維持露出レコーダーで記録する。移動距離を各フレーム由来の細胞の所定数から計算する。
【０４０７】
ＨＧＦ誘導細胞遊走に対するＨＧＦアイソフォームの作用はまた内皮細胞創傷試験により評価できる。内皮細胞をプレート上で培養し、コンフルエントに達するまで生育させる。細胞を８２ゲージ針で傷害し、約２００μｍの創傷を作成する。次に細胞を洗浄し、ＨＧＦアイソフォーム、ＨＧＦ又はそれらの組合せを含有する新しい培地を添加する。細胞遊走の画像を上記した通り記録し、創傷前線にわたる遊走距離を計算する。
【０４０８】
細胞の遊走は又、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー試験の変法を用いて評価することもできる。内皮細胞、例えばヒト皮膚微小血管内皮細胞を血清飢餓状態とし、次に１３．４μｇ／ｍｌのフィブロネクチンでコーティングしたＴｒａｎｓｗｅｌｌプレート（６．５ｍｍ直径のポリカーボネート膜、５μｍ孔径、Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）の内部上に置く。ＨＧＦアイソフォームの存在下又は非存在下でＨＧＦ、ＦＧＦ−２又はＶＥＧＦを含有する培地を外部チャンバーに添加し、所定時間インキュベートする。フィルターの下面まで膜を経由して遊走する細胞の数は、各ウェルにおいて無作為に選択した顕微鏡視野中の細胞を計数することにより定量する。
【０４０９】
ＨＧＦ処理に応答した細胞の解離に関連する細胞の通行は細胞散乱試験により分析できる。ＨＧＦ誘導細胞分散に対してＨＧＦアイソフォームが有している作用を計測できる。細胞、例えばＭＤＣＫ腎上皮細胞をＨＧＦアイソフォーム、ＨＧＦ又はそれらの組み合わせの存在下にマルチウェルプレート中で培養する。一夜インキュベートした後、細胞をヘモトキシリンで染色し、写真撮影する。ＨＧＦ非存在下の対照細胞は堅固なコロニーを形成することになるのに対し、ＨＧＦ処理は細胞の散乱を誘導する。
【０４１０】
８．アポトーシス試験
ＨＧＦは細胞毒性剤、例えば放射線照射及び特定の癌治療薬、例えばシスプラチン、カントテシン、アドリアマイシン及びタキソールで処理された細胞に対して抗アポトーシス作用を示す。ＨＧＦ処理の抗アポトーシス作用を改変するＨＧＦアイソフォームの能力を計測できる。細胞を種々の濃度のＨＧＦアイソフォーム及び／又はＨＧＦを含有する培地と共に細胞を培養する。次に細胞をインキュベーション期間中細胞毒性剤に曝露し、そして細胞の生存性を３−（４，５−ジメチルチサゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ、Ｓｉｇｍａ）試験を用いて計測する。
【０４１１】
アポトーシス細胞は核染色により可視化できる特徴的な核フラグメント化を示す。ＨＧＦで処理した細胞は細胞毒性剤に応答した核フラグメント化の低減を示す。ＨＧＦのこの作用を拮抗するＨＧＦアイソフォームの能力を評価することができる。細胞をスライドガラスにプレーティングし、細胞毒性剤、次いでＨＧＦ及び／又はＨＧＦアイソフォームで上記した通り処理する。細胞の核をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２染色剤及び蛍光顕微鏡を用いながら励起光波長３５０ｎｍ及び発光光波長４５０ｎｍにおいて可視化する。
【０４１２】
核フラグメント化はアポトーシスの間のゲノムＤＮＡの切断の結果であり、そして２本鎖及び１本鎖切断（ニック）をもたらし、これが染色体ＤＮＡのラダリングをもたらし、そしてこれはＨＧＦ処理により抑制される。ＤＮＡフラグメント化試験を用いることにより、ＨＧＦアイソフォーム及び／又はＨＧＦの存在下の細胞毒性剤に応答した染色体ＤＮＡラダリングの程度を計測することができる。処理の後、細胞を可溶化し、そして、それぞれＲＮａｓｅ  Ａ及びプロテイナーゼＫで処理することにより、ＲＮＡ及び蛋白を試料から除去する。染色体ＤＮＡを沈殿させ、アポトーシス細胞中に存在するＤＮＡラダーを可視化するための衆寡エチジウムと共にアガロースゲル上で電気泳動する。
【０４１３】
ＤＮＡフィルター溶出試験もまたアポトーシス細胞におけるＤＮＡ切断の程度を計測するために使用できる。細胞を［３Ｈ］チミジンと共に３２時間インキュベートした後に、同位体非含有培地中で２時間インキュベートする。次に細胞を種々の濃度のＨＧＦアイソフォーム及び／又はＨＧＦで前処理し、次に細胞毒性剤で処理する。一夜インキュベートした後、細胞をトリプシン中に再懸濁し、ポリカーボネート膜に適用する。細胞を膜上で溶解させ、アルカリ溶出することにより１本鎖ＤＮＡ切断を検出する。試料をシンチレーションカウンターで計数し、ｄｐｍ溶出／（ｄｐｍフィルター結合＋ｄｐｍ総溶解物）として計測する。より大型の未フラグメント化ＤＮＡ片はより緩徐に溶出され；従って、時間の関数としての溶出したＤＮＡの量はＤＮＡ損傷に比例する。
【０４１４】
ＤＮＡ切断を計測する別の方法はＴＵＮＥＬ染色であり、これは酵素反応において修飾されたヌクレオチドで遊離の３’−ＯＨ末端を標識することによりＤＮＡ切断を識別する。このプロトコルは単細胞レベルにおいてアポトーシスを検出し、定量することができる。Ａｐｏｔａｇインサイチュアポトーシス検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のような市販のキットをＴＵＮＥＬ染色に使用することができる。上記した通りＨＧＦアイソフォーム及び／又はＨＧＦによる処理の後、細胞をトリプシン処理し、そしてサイトスピン遠心分離によりスライドガラスに移行させる。細胞を透過性とし、その後、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ、抗ジゴキシゲニンＨＲＰ及びジアミノベンジジンを添加する免疫細胞化学操作に付す。細胞をメチルグリーンで逆染色し、スライド当たり細胞の所定数のうちＴＵＮＥＬ陽性細胞数を計数することにより定量する。標識細胞の割合をアポトーシス指数として表示する。この実験に関する陽性対照では標識操作の前にＤＮＡ鎖切断を誘導するためにＤＮａｓｅ  ＩＩと共に細胞をインキュベートする。
【０４１５】
カスパーゼ−３活性の測定はアポトーシスプログラムの誘導の別の計測法である。上記した通りＨＧＦアイソフォーム及び／又はＨＧＦで処理した後、細胞を可溶化し、蛍光原性の基質Ａｃ−ＤＥＶＯ−ＡＦＣと共にインキュベートする。カスパーゼ−３の阻害剤であるＺ−ＤＥＶＤ−ＣＭＫ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を対照として使用できる。基質の切断は励起光波長４００ｎｍ及び発光光波長５２０ｎｍにおいてスペクトル蛍光計で測定する。活性は対照阻害剤の存在下のピーク値を差し引くことにより求める。
【０４１６】
ＨＧＦの抗アポトーシス作用はホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路を介したＡＫＴの活性化により媒介されると考えられている。インビトロのキナーゼ試験を実施することによりＡＫＴ活性のＨＧＦ誘導を抑制するＨＧＦアイソフォームの能力を評価することができる。ＭＥＴ受容体を過剰発現するＳＫ−ＬＭＳ−１細胞をＨＡ−ＡＫＴ１又はＨＡ−ＡＫＴ２をコードするプラスミドでトランスフェクトし、一夜血清枯渇させる。次に細胞を種々の濃度のＨＧＦアイソフォーム及び／又はＨＧＦで処理する。ＨＧＦの添加の前のＰＩ３Ｋ阻害剤、例えばウオルトマニン又はＬＹ２９４００２により処理を、ＡＫＴ阻害に関する陽性対照として使用することができる。細胞を溶解し、ＡＫＴ蛋白を抗ＨＡ抗体及び／又は抗ＡＫＴ抗体を用いて免疫沈降させる。試料の半量をＡＫＴ蛋白量の規格化のために使用する。試料の残り半量は、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及び基質としてのヒストン２Ｂと共にＡＫＴ蛋白をインキュベートするキナーゼ試験のために使用する。試料をＳＤＳ／ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーに付す。
【０４１７】
９．動物モデル
ａ．腫瘍抑制試験
腫瘍の生育及び転移に対するＨＧＦアイソフォームの作用を評価するための多くの試験が当該分野で知られている。ＨＧＦ−ＭＥＴ経路により影響される種々の癌のモデルは、標的組織内への細胞又は細胞系統、例えば癌性細胞又は種々の成長因子で形質転換された細胞の注射を包含できる。例えば、ヒトＨＧＦ及びマウスＭＥＴで形質転換したＣ−１２７細胞を無胸腺ヌードマウスに皮下注射することにより２〜３週間以内にマウスに転移腫瘍が形成される。組み換えＨＧＦアイソフォームを一定期間にわたり定期的に注射し、腫瘍サイズを計測する。更に又、放射線又は化学療法剤を包含する複合療法をＨＧＦアイソフォーム処理に加えて送達することにより、抗腫瘍療法の相加的、又は相乗的な作用を調べることができる。
【０４１８】
特定の癌におけるＨＧＦアイソフォーム治療を試験するために有用な癌の動物モデルの一部の例は以下のものを包含する。
【０４１９】
神経膠腫。悪性神経膠腫は中枢神経系の最も一般的な癌であり、そして放射線及び化学療法に対して生得に抵抗性であることから予後不良となる。悪性神経膠腫は高レベルのＨＧＦを発現する。ＨＧＦシグナリングを抑制することはインビトロ及びインビボで悪性表現型を逆行させることがわかっている。神経膠腫のマウスモデルではＨＧＦで形質転換した９Ｌ細胞をラットの尾状核−被殻に注射することにより脳腫瘍を形成する。これ等の腫瘍の大きさ及び転移を分析するためにＨＧＦアイソフォームの注射を行うことができる。
【０４２０】
神経膠腫の他のモデルは内因性ＨＧＦ／ＭＥＴシグナリングに関するオートクラインであるＵ−１１８ヒト神経膠腫細胞系統（ＧＢＭ）のような細胞系統の異種移植片を包含する。ＧＢＭ細胞を無胸腺ヌードマウスに皮下注射して腫瘍を形成し、腫瘍生育に対するＨＧＦアイソフォームの作用を評価できる。ＨＧＦアイソフォームの注射は異種移植片注射時に開始することができ、或いは、ＨＧＦアイソフォームは腫瘍が確立した時点で腫瘍内に注射できる。
【０４２１】
結腸癌。結腸癌はヒトにおいて最も一般的な癌の１つである。その特徴は高比率での肝臓転移に起因する転移疾患による高い死亡率である。結腸癌転移のマウスモデルではマウスの脾臓へのＭＣ−３８結腸癌細胞の注射を行う。転移結節を接種後約２１日に観察する。ＨＧＦアイソフォーム投与後、腫瘍結節の数と大きさ、結節中の血管密度、結節中のアポトーシス細胞数、及び、ＭＥＴ活性化の程度を評価できる。」
膵臓癌。膵臓癌は極めて予後不良な癌の高度に悪性の形態である。膵臓癌のマウスモデルではヌードマウスの膵臓内への膵臓癌細胞系統ＳＵＩＴ−２細胞の同所注射を行う。４週間以内にマウスは腹腔に播種する大型の塊を形成することになる。生存及び腫瘍生育を評価するために、腫瘍生育の間の種々の時期にＨＧＦアイソフォームの投与を開始することができる。
【０４２２】
当該分野で使用できる癌進行におけるＨＧＦの試験のための別のマウスモデルは、限定しないが、胃癌、胆嚢癌、肺癌、リンパ腫、肝細胞癌、悪性黒色腫、乳癌及び卵巣癌を包含する。
【０４２３】
ｂ．血管形成性の疾患
過剰な血管新生に関連する疾患の動物モデルは当業者の知る通りである。動物癌モデルに置ける腫瘍の血管形成の試験の外に、増殖性糖尿病性網膜症のような疾患の研究のために動物モデルを使用できる。そのようなモデルの１つにおいては、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）を眼において過剰発現するトランスジェニックマウスを使用する。これ等のマウスは網膜血管の血管閉塞、静脈の弛緩及び数珠状化、拡張された毛細管の非灌流区域、網膜内微小血管異常（ＩＲＭＡ）及び網膜内及びガラス体の内部の血管新生を呈する。ＨＧＦアイソフォームの投与により血管形成に対するＨＧＦシグナリング抑制の作用を観察できる。ＶＥＧＦ及び／又はＦＧＦ−２のような血管形成因子の存在下のＨＧＦアイソフォームの作用もまた研究できる。
【０４２４】
血管増殖を研究するための別のモデルはウサギの角膜内に移植したＦＧＦ−２又はＶＥＧＦ含有ペレットにより角膜血管新生を誘導する角膜マイクロポケット試験である。角膜における血管新生の程度は血管の長さ、数、分枝化の項目において計測できる。ＨＧＦアイソフォームの作用は移植、注射又は当該分野で知られた他の送達法により評価できる。
【０４２５】
Ｋ．ＨＧＦアイソフォーム及びＨＧＦアイソフォーム組成物の製造、製剤化及び投与
ＨＧＦアイソフォーム及びＨＧＦアイソフォーム組成物を当業者の知る何れかの経路、例えば筋肉内、静脈内、皮内、腹腔内、皮下、硬膜外、経鼻、経口、直腸内、局所、吸入、口内（例えば舌下）及び経皮投与又は他の経路により投与するために製剤することができる。ＨＧＦアイソフォームは何れかの好都合な経路により、例えば注入又は瞬時注射により、上皮又は粘膜皮膚ライニング（例えば口腔粘膜、直腸及び腸の粘膜等）を介した吸収により投与でき、そして、他の生物学的活性剤と共に、逐次的、完結的又は同じ組成物内で投与することができる。投与は治療患部に応じて限局的、局所又は全身投与であることができる。治療を要する区域への限局的投与は、例えば限定しないが、手術中の限局的注入、局所適用、例えば手術後の創傷包帯との組み合わせ、注射により、カテーテル使用により、座薬使用により、又はインプラント使用により達成できる。投与は又、制御放出システム、例えば制御放出製剤及び装置制御放出、例えばポンプ使用等を包含できる。所定の症例において最も適当である経路は種々の要因、例えば疾患の性質、疾患の進行、疾患の重症度及び使用される特定の組成物に応じたものである。
【０４２６】
種々の送達系が知られており、ＨＧＦアイソフォームを投与するために使用でき、その例は限定しないが、リポソーム中のカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現できる組み換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス、及び、レトロウィルス送達系のようなＨＧＦアイソフォームをコードする核酸分子の送達を包含する。
【０４２７】
ＨＧＦアイソフォームを含有する医薬組成物を製造できる。一般的に、製薬上許容しうる組成物は当局の認可の観点から製造するか、又は、別様に、動物及びヒトにおける使用に関する一般的に認知された薬局方に従って製造される。医薬組成物はアイソフォームを共に投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤又はベヒクルのような担体を包含できる。そのような製薬用の担体は滅菌された液体、例えば水又は油脂、例えば石油、動物、植物又は合成起源のもの、例えばピーナツ油、大豆油、鉱物油及びゴマ油であることができる。医薬組成物が静脈内投与される場合は水が典型的な担体である。食塩水及び水性デキストロース及びグリセロール溶液もまた特に注射溶液用の液体担体として使用できる。組成物は活性成分と共に、希釈剤、例えば乳糖、スクロース、リン酸２カルシウム又はカルボキシメチルセルロース；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム及びタルク；及びバインダー、例えば澱粉、天然ゴム、例えばアカシアゼラチンガム、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリドン、セルロース及びその誘導体、ポビドン、クロスポビドン及び当該分野で知られた他のそのようなバインダーを含有できる。適当な製薬用賦形剤は澱粉、グルコース、乳糖、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、コムギ、白墨、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水及びエタノールを包含する。組成物は所望により更に、少量の水和又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンナトリウムアセテート、トリエタノールアミンオレエート及び他のこのような物質を含有できる。これ等の組成物は溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末及び除放性製剤の形態を取ることができる。組成物は伝統的なバインダー及び担体、例えばトリグリセリドを用いながら座薬として製剤することができる。経口製剤は標準的な担体、例えば医薬品用等級のマンニトール、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム及び他のこのような物質を包含できる。適当な製薬用担体の例はＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎの「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。そのような組成物は、患者への適切な投与のための形態が与えられるように、治療有効量の化合物を一般的には精製された形態において適当な量の担体と共に含有することになる。製剤は投与様式に適合していなければならない。
【０４２８】
製剤は、化合物又は製薬上許容しうるその誘導体の適当な量を含有する錠剤、カプセル、丸薬、粉末、顆粒、滅菌非経腸溶液又は懸濁液、及び経口用の溶液又は懸濁液、及び油／水の乳液のような単位用量剤型においてヒト及び動物への投与のために提供される。薬学的に治療上活性の化合物及びその誘導体は典型的には単位用量剤型又は多用量剤型において製剤され、投与される。単位用量各々は必要な薬学的担体、ベヒクル又は希釈剤と組み合わせて所望の治療効果をもたらすために十分な所定量の治療活性化合物を含有する。単位用量剤型の例はアンプル及びシリンジ及び個包装の錠剤又はカプセルを包含する。単位用量剤型はその分割量又は倍加量において投与できる。多用量剤型は分離された単位用量剤型において投与されるべき単一の容器内に包装された同一の単位用量剤型の複数である。多用量剤型の例はバイアル、錠剤又はカプセルのビン、又は、パイント又はガロンのビンを包含する。従って、多用量剤型は包装において分離されない単位用量の多数の分量である。
【０４２９】
０．００５％〜１００％の範囲で活性成分を含有し残余は非毒性の担体からなる剤型又は組成物を製造できる。経口投与のためには、医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば予備ゼラチン化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば乳糖、微結晶セルロース又はリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；錠剤崩壊剤（例えばバレイショ澱粉又はナトリウム澱粉グリコレート）；又は水和剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）のような製薬上許容しうる賦形剤と共に従来の手段により製造された錠剤又はカプセルの形態をとることができる。錠剤は当該分野で良く知られている方法によりコーティングできる。
【０４３０】
薬学的調製品はまた液体形態、例えば溶液、シロップ又は懸濁液であることができ、又は、使用前に水又は他の適当なベヒクルで再形成する薬品として提示することができる。そのような液体調製物は懸濁剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水添食用脂肪）；乳化剤（例えばレシチン又はアカシア）；非水性のベヒクル（例えばアーモンド油、油性エステル又は分画植物油）；及び保存料（例えばメチル又はプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）のような製薬上許容しうる添加剤と共に従来の手段により製造できる。
【０４３１】
直腸投与に適する製剤は、単位用量の座薬として提供できる。これ等は、活性成分を例えばカカオ脂のような従来の固体担体１つ以上に添加混合し、次に得られた混合物を成形することにより製造できる。
【０４３２】
皮膚又は眼への局所適用に適する製剤は軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル及びオイルを包含する。例示される担体はワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール及びこれ等の２種以上の組み合わせを包含する。局所用製剤は又、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ／ヒドロキシアルキル、（メタ）アクリレート又はポリ（メタ）アクリルアミドから選択される濃厚化剤０．０５〜１５、２０、２５重量％を含有できる。局所用製剤は頻繁には点眼により、又は、結膜嚢内に軟膏として適用される。更に又、眼、顔面洞部及び外耳道の灌注又は潤滑化のために使用できる。更に又、前眼房及び他の箇所に注射することもできる。液体状態の局所用製剤もまた活性成分が放出される元となるストリップ又はコンタクトレンズの形態の親水性３次元重合体マトリックスとして存在できる。
【０４３３】
吸入による投与のためには、本明細書において使用するための化合物は適当な圧縮不活性ガス、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適当なガスと共に、加圧パック又はネブライザーからエアロゾルスプレー商品の形態において送達できる。加圧エアロゾルの場合、投与単位は計量された量を送達するための弁を設けることにより設定できる。例えば吸入器又は注入器において使用するためのゼラチンのカプセル及びカートリッジは、化合物及び適当な粉末基剤、例えば乳糖又は澱粉の粉末混合物を含有するように製剤できる。
【０４３４】
口内（舌下）投与に適する製剤は例えばフレーバー添加基剤、通常はスクロース及びアカシア又はトラガカント中に活性化合物を含有するドロップ剤；及び不活性基剤、例えばゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシア中に化合物を含有するトローチ剤を包含する。
【０４３５】
ＨＧＦアイソフォームの医薬組成物は注射による、例えば瞬時注射又は連続注入による非経腸投与のために製剤できる。注射用製剤は添加した保存料と共に単位剤型として、例えばアンプル中、又は多用量容器中に提示することができる。組成物は油性又は水性ベヒクル中の懸濁液、溶液又は乳液であることができ、そして、製剤用物質、例えば懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤を含有できる。或いは、活性成分は使用前に適当なベヒクル、例えば滅菌発熱物質非含有の水又は他の溶媒で再形成するための粉末形態であることができる。
【０４３６】
経皮投与に適する製剤を提供する。それらは何れかの適当なフォーマット、例えば長時間レシピエントの皮膚に緊密に接触した状態で残存させるために適合された別個のパッチ剤として提供できる。そのようなパッチ剤は活性化合物に対して例えば０．１〜０．２Ｍの濃度の場合により緩衝された水溶液中に活性化合物を含有する。経皮投与に適する製剤はまたイオントフォレシス（例えばＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３（６），３１８（１９８６））により送達することができ、そして典型的には活性化合物の場合により緩衝された水溶液の形態をとる。
【０４３７】
医薬組成物は又、制御放出製剤及び／又は送達装置により投与できる（例えば米国特許
【０４３８】
【化９】
2009515520.tif 000014
参照）。
【０４３９】
特定の実施形態においては、リポソーム及び／又はナノ粒子もまたＨＧＦアイソフォーム投与と共に使用できる。リポソームは水性媒体中に分散され、そして、マルチラメラベシクル（ＭＬＶ）とも称されるマルチラメラの同心円の二層ベシクルを自発的に形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶは一般的に２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理により、コア中に水溶液を含有する２００〜５００オングストロームの範囲の直径を有する小型ユニラメラベシクル（ＳＵＶ）が形成される。
【０４４０】
リン脂質は、水中に分散する場合に、脂質の水に対するモル比に応じてリポソーム以外の種々の構造を形成することができる。低い比の場合は、リポソームが形成される。リポソームの物理的特性はｐＨ、イオン強度及び２価カチオンの存在により変動する。リポソームはイオン性及び極性の物質に対しては低い透過性を示すことができるが、高温では相転移を起こし、これがその透過性を顕著に改変する。相転移では、ゲル状態として知られている緊密に充填された秩序のある構造から、流体状態として知られている緩慢に充填された低秩序の構造に変化する。これは特徴的な相転移温度において発生し、そしてイオン、糖類及び薬品に対する透過性を増大させる。
【０４４１】
リポソームは種々の機序、即ち：マクロファージ及び好中球のような細網内皮系の貪食細胞によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水性又は静電性の力によるか、又は、細胞表面成分との特異的相互作用による、細胞表面への吸着；原形質膜内へのリポソームの脂質二層の挿入による原形質細胞膜の融合と、それに伴って同時に起こる細胞質内へのリポソーム内容物の放出；及びリポソーム脂質の細胞又はサブ細胞膜への移行かその逆の事象によるものでリポソーム内容物を伴わないもの；を介して細胞と相互作用する。リポソーム製剤を変動することによりどの機序を作動させるかを改変できるが、１つより多くを同時に作動させてもよい。
【０４４２】
ナノカプセルは一般的に安定で再現性のある態様において化合物を捕獲する。細胞内重合体過剰付加による副作用を回避するため、そのような超精密粒子（約０．１μｍの大きさ）はインビボで分解できる重合体を用いて設計しなければならない。これ等の要件に合致する生体分解性のポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子が本明細書における使用を意図しており、そしてそのような粒子は容易に作成できる。
【０４４３】
投与方法は、蛋白分解性の分解及び抗原及び免疫原性の応答を介した免疫学的介入のような分解性のプロセスへのＨＧＦアイソフォームの曝露を低減するようなものを使用できる。そのような方法の例は治療部位への限局的投与を包含する。治療薬のＰＥＧ化は蛋白分解に対する抵抗性を増大し、血漿中半減期を増大し、そして抗原性及び免疫原性を低減することが報告されている。ＰＥＧ化方法の例は当該分野で知られている（例えばＬｕ  ａｎｄ  Ｆｅｌｉｘ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，４３：１２７−１３８，１９９４；Ｌｕ  ａｎｄ  Ｆｅｌｉｘ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．，６：１４２−６，１９９３；Ｆｅｌｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．，４６：２５３−６４，１９９５；Ｂｅｎｈａｒ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１３３９８−４０４，１９９４；Ｂｒｕｍｅａｎｕ等、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４：３０８８−９５，１９９５を参照でき；更に又、Ｃａｌｉｃｅｔｉ等（２００３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５（１０）：１２６１−７７及びＭｏｌｉｎｅｕｘ（２００３）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  ２３（８Ｐｔ２）：３Ｓ−８Ｓも参照できる）。ＰＥＧ化は又、インビボの核酸分子の送達において使用できる。例えば、アデノウィルスのＰＥＧ化は安定性及び遺伝子転移を増大できる（例えばＣｈｅｎｇ等（２００３）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０（９）：１４４４−５１参照）。
【０４４４】
望ましい血中レベルは血漿中レベルにより確認される通り活性剤の連続注入により維持することができる。当然ながら、毒性又は骨髄、肝又は腎の機能不全により治療を終止、中断又は低用量への調節を行う方法及び時期は担当医師の知る通りである。逆に臨床応答が十分ではない（毒性副作用を除く）場合に、より高用量への調節を行う方法及び時期も同様に担当医師の知る通りである。活性剤は例えば経口、肺、非経腸（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）又は皮下注射）、吸入（微細粉末製剤を使用）、経皮、鼻内、膣内、直腸内又は舌下の投与経路により投与され、そして、各投与経路に対して適切な剤型において製剤できる（例えば国際ＰＣＴ出願ＷＯ９３／２５２２１及びＷＯ９４／１７７８４；及び欧州特許出願６１３，６８３参照）。
【０４４５】
ＨＧＦアイソフォームは治療される患者に対して望ましくない副作用を与えることなく治療上有用な作用を呈するために十分な量において製薬上許容しうる中に包含される。治療有効濃度は本明細書に記載する試験のような知られたインビトロ及びインビボの経において化合物を試験することにより実験的に決定できる。
【０４４６】
組成物中のＨＧＦアイソフォームの濃度は複合体の吸収、不活性化及び排出の速度、複合体の物理化学的特性、投薬日程、及び洞よされる量並びに当該分野で知られた他の要因に応じたものである。疾患又は状態の治療、例えば癌又は血管形成の治療のために投与されるべきＨＧＦアイソフォームの量は標準的な臨床手法により決定できる。更に又、インビトロ試験及び動物モデルを最適な用量範囲を識別する際の手立てとしてよい。厳密な用量は実験的に決定できるが、投与経路及び疾患の重篤性に応じたものとなる。投与のための適当な用量範囲は約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重、より典型的には０．０５ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇＨＧＦアイソフォーム：患者体重の範囲となり得る。
【０４４７】
ＨＧＦアイソフォームは１回で投与でき、或いは、時間間隔を置いて投与されるべきより低用量の多数回に分割することができる。ＨＧＦアイソフォームは例えば数時間、数日間、数週間又は数ヶ月にわたる治療時間の過程に野生型って１投薬以上において投与できる。一部の場合においては、連続投与が有用である。厳密な用量及び治療持続時間は治療すべき疾患の関数であり、そして既知試験プロトコルを用いながら実験的に、又はインビボ又はインビトロの試験データからの推定により、決定できる。濃度及び用量の値もまた軽減すべき状態の重症度に応じて変動できる。更に又、何れかの特定の対象に対して、特定の投薬用法は、個体の必要性及び組成物を投与しているか投与を監督している人間の専門的判断に従って、経時的に調節すべきであり、そして、本明細書に記載した濃度範囲は例示に過ぎず、そして組成物及びそれを含有する組み合わせの範囲又は使用を限定する意図はないと理解すべきである。組成物は毎時、毎日、毎週、毎月、毎年又は１回投与できる。遺伝子療法のためのポリペプチドを含有する組成物並びに核酸を含有する組成物の投与様式は、限定しないが、患部内、腹腔内、筋肉内及び静脈内投与を包含する。同様に包含されるものは注入、髄腔内、皮下、リポソーム媒介及び貯蔵媒介の投与である。同様に包含されるものは経鼻、眼内、局所、限局的及び耳内の送達である。用量は実験的に決定でき、そして適応症上、投与様式及び対象に応じたものである。例示される用量は０．１、１、１０、１００、２００ｍｇ／日／ｋｇ対象体重以上を包含する。
【０４４８】
Ｌ．ＨＧＦアイソフォームのインビボ発現及び遺伝子療法
ＨＧＦアイソフォームは核酸分子の発現により細胞及び組織に送達できる。ＨＧＦアイソフォームはエクスビボの手法及び直接のインビボ発現を包含するＨＧＦアイソフォームをコードする核酸分子として投与できる。
【０４４９】
１．ＨＧＦの送達
核酸は当該分野で知られた何れかの方法により細胞及び組織に送達できる。
【０４５０】
ａ．ベクター−エピソーム型及び組み込み型
コードする核酸分子の発現によりＨＧＦアイソフォームを投与するための方法は組み換えベクターの投与を包含する。ベクターは例えば複製起点を包含することよりエピソーム型であり続けるように設計することができ、或いは、細胞内の染色体に組み込まれるように設計することもできる。組み換えベクターはウィルスベクター及び非ウィルス性ベクターを包含できる。非限定的なウィルスベクターは例えばアデノウィルスベクター、ヘルペスウィルスベクター、レトロウィルスベクター及び当該分野で知られた何れかの他のウィルスベクターを包含する。非限定的な非ウィルス性ベクターは人工の染色体又はリポソーム又は他の非ウィルス性ベクターを包含する。ＨＧＦアイソフォームはまたウィルス及び非ウィルス性ベクターを使用したエクスビボの遺伝子発現において使用されることもできる。例えば、調節配列に作動可能に連結しているゲノム位置に、又は、ゲノム位置内の調節配列に作動可能に連結するように位置付けられるように、ＨＧＦアイソフォームコード核酸を組み込むことによる等、ＨＧＦアイソフォームを発現するように細胞を操作できる。次にそのような細胞を、治療を要する対象のような対象に対して限局的又は全身に投与することができる。
【０４５１】
ＨＧＦアイソフォームは、治療を要する対象に対して投与されるウィルスにより発現させることができる。遺伝子療法に適するウィルスベクターはアデノウィルス、アデノ関連ウィルス、レトロウィルス、レンチウィルス及び上記した他のものを包含する。例えば、アデノウィルス発現技術は当該分野で良く知られており、そしてアデノウィルスの生産及び投与の方法も当該分野で良く知られている。アデノウィルスの血清型は例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より入手可能である。アデノウィルスはエクスビボで使用することができ、例えば、治療を要する患者から細胞を単離し、そしてＨＧＦアイソフォーム発現アデノウィルスベクターで形質導入する。適当な培養期間の後、形質導入された細胞を限局的及び／又は全身に対象に投与する。或いは、ＨＧＦアイソフォーム発現アデノウィルス粒子を単離し、対象の疾患又は状態を防止、治療又は緩解するための治療有効量の送達のための製薬上許容しうる担体中に製剤する。典型的には、アデノウィルス粒子は対象体重キログラム当たり１粒子〜１０１４粒子、一般的には対象体重キログラム当たり１０６又は１０８粒子〜１０１２粒子の範囲の用量で送達する。一部の状況においては、核酸原料には細胞をターゲティングする物質、例えば細胞表面膜蛋白又は標的細胞に特異的な抗体、又は、標的細胞上の受容体に対するリガンドを与えることが望ましい。
【０４５２】
ｂ．人工染色体及び他の非ウィルス性ベクター送達方法
核酸分子は人工染色体及び他の非ウィルス性ベクター内に導入することができる。人工染色体（例えば米国特許６，０７７，６９７及びＰＣＴ国際ＰＣＴ出願ＷＯ０２／０９７０５９参照）を操作してアイソフォームをコードし、発現するようにできる。
【０４５３】
ｃ．リポソーム及び他のカプセル化形態及び核酸分子を含有する細胞の投与
核酸はベヒクル、例えばリポソーム内にカプセル化するか、又は、細胞、例えば細菌細胞、特に弱毒化細菌に導入するか、又は、ウィルスベクターに導入することができる。例えば、リポソームを使用する場合は、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜蛋白に結合する蛋白をターゲティングのため、及び／又は、取り込みを促進するために使用することができ、例えば特定の細胞方に対して向性のカプシド蛋白又はそのフラグメント、サイクリングにおいて内在化を起こす蛋白に対する抗体、及び細胞内局在化をターゲティングし、細胞内半減期を増大させる蛋白が挙げられる。
【０４５４】
２．インビトロ及びエクスビボの送達
エクスビボ及びインビボの方法に関しては、ＨＧＦアイソフォームをコードする核酸分子は、適当なドナー又は治療すべき対象から得られた細胞内に導入される。治療の目的のために核酸を導入することができる細胞は、例えば、治療すべき疾患又は状態に対して適切である何れかの所望の入手可能な細胞型、例えば限定しないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞、血球、例えばＴリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球；種々の幹細胞又は先祖細胞、特に造血系の幹細胞又は先祖細胞、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓及びそれらの他の原料から得た幹細胞を包含する。
【０４５５】
エクスビボの投与のためには、治療すべき対象と適合するドナー由来の細胞、又は、治療すべき対象由来の細胞を取り出し、これ等の単離された細胞内に核酸を導入し、そして修飾された細胞を対象に投与する。治療は直接の投与、例えば多孔性の膜内へのカプセル化を行い、これを患者に移植する（例えば米国特許４，８９２，５３８及び５，２８３，１８７を参照）。インビトロで哺乳類細胞に核酸を転移させるために適する手法はリポソーム及びカチオン性脂質（例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ−Ｃｈｏｌ）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン及びリン酸カルシウム沈降法を包含する。ＤＮＡ送達の方法を用いてインビボでＨＧＦアイソフォームを発現させることができる。そのような方法は核酸のリポソーム送達及びネイキッドＤＮＡ送達、例えばエレクトロポレーション、超音波及びリン酸カルシウム送達を用いた限局的及び全身への送達を包含する。他の手法にはマイクロインジェクション、細胞融合、染色体媒介遺伝子転移、マイクロ細胞媒介遺伝子転移及びスフェロプラスト融合を包含する。
【０４５６】
ＨＧＦアイソフォームのインビボの発現は別の分子の発現に関連付けることができる。例えば、ＨＧＦアイソフォームの発現は、例えば操作されたウィルスにおける、又は細胞毒性ウィルス中で発現された、細胞毒性産物の発現に関連付けることができる。そのようなウィルスは治療効果の標的である特定の細胞型にターゲティングすることができる。発現されたＨＧＦアイソフォームはウィルスの細胞毒性を増強するために使用できる。
【０４５７】
ＨＧＦアイソフォームのインビボの発現は細胞特異性又は組織特異性のプロモーターのような特異的調節配列にＨＧＦアイソフォームコード核酸分子を作動可能に連結することを包含できる。ＨＧＦアイソフォームは又、標的の細胞型及び／又は組織に対して特異的に感染及び／又は内部で複製するベクターから発現させることができる。誘導プロモーターはＨＧＦアイソフォーム発現を選択的に調節するために使用できる。
【０４５８】
３．全身、局所及び限局型の送達
ネイキッドの核酸として、又はベクター、人工染色体、リポソーム及び他のベヒクル内の核酸分子は、全身投与、局所、限局的及び他の投与経路で対象に投与できる。全身及びインビボの場合は、核酸分子又は核酸分子を含有するベヒクルを細胞にターゲティングできる。
【０４５９】
投与は又、直接行うことができ、例えば細胞又は組織を典型的にターゲティングするベクター又は細胞の投与による。例えば、腫瘍細胞及び増殖中の細胞をＨＧＦアイソフォームのインビボの発現のために細胞にターゲティングすることができる。アイソフォームのインビボ発現のために使用される細胞はまた患者の自己由来の細胞を包含する。そのような細胞を患者から取り出し、ＨＧＦアイソフォームの発現のための核酸を導入し、そして次に例えば注射又はエングラフトメントにより患者に投与する。
【０４６０】
Ｍ．ＨＧＦ及び癌及び血管形成
ＨＧＦはその受容体ＭＥＴを介して有糸分裂誘発、形態形成、遊走誘発及び血管形成の媒介において重要な役割を果たす。癌においては、これ等の活性は腫瘍の生育、血管新生及び転移に関与している（例えば図１参照）。原発腫瘍の転移は頻繁にはがん患者における高い死亡率に関連しており、そして腫瘍生育の転移性のプロセス、例えば腫瘍誘導血管形成を低減する治療は悪性の癌における予後を向上させると考えられる。癌の外に、ＨＧＦの血管形成特性は種々の血管疾患、例えば慢性関節リューマチ及び増殖性糖尿病性網膜症の進行に寄与する。ＨＧＦアイソフォーム、例えば本明細書において提供されるＨＧＦアイソフォームを癌の生育及び拡張を抑制するためのＭＥＴの拮抗剤として使用することができ、そして更に、癌の進行又は他の血管疾患に関連する血管形成を抑制するための一般的な血管形成抑制分子としても使用できる。
【０４６１】
１．腫瘍生育及び転移
ＨＧＦは癌における悪性の挙動に関連する侵襲性、血管形成性及び転移性の応答に寄与する増殖、アポトーシス、遊走及び形態形成を包含する細胞プロセスを調節する。ＨＧＦに対する受容体であるＭＥＴは当初は、構成性のリガンド非依存性のチロシンキナーゼ活性及び細胞を形質転換する能力を有するｔｐｒ−ｍｅｔによりコードされるオンコジーン融合蛋白として単離された。ＭＥＴの過剰な活性化は腫瘍の生育、腫瘍細胞の運動性、細胞外マトリックスの侵襲及び血管形成を誘導することができる。多数の癌、例えば膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、食道癌、胃癌、頭頚部癌、腎臓癌、肝癌、肺癌、咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌及び甲状腺癌、骨格菌の肉腫、軟組織肉腫、造血細胞悪性疾患、神経膠芽腫、黒色氏、中皮腫及びウイルムス腫瘍は、ＨＧＦシグナリングのオートクリンアップレギュレーションに寄与するＨＧＦ及び／又はＭＥＴ発現の上昇したレベルを示す。ｃ−ｍｅｔ遺伝子の突然変異もまた、胃、頭部及び頚部、腎、肝、肺、卵巣及び甲状腺の癌において識別されている。高レベルのＨＧＦを発現するように操作されたトランスジェニックマウスは間葉及び上皮の起源の組織学的に異なる腫瘍の広範なアレイを形成する。上昇したＭＥＴ及び／又はＨＧＦの発現を有する癌の動物モデルにおいて、ＭＥＴ受容体の活性化をブロックする抑制剤を用いた治療は腫瘍生育及び転移に良好な影響を与えている
形質転換から悪性及び転移にいたる癌の進行は増強された細胞の増殖、細胞死の回避、細胞−細胞摂食の崩壊、細胞外マトリックスの分解、及び増強された細胞のうんどうせい及び形態形成の関与する多工程のプロセスである。ＨＧＦは原発腫瘍の確立及び侵襲性、及び、細胞が原発腫瘍から脱着して循環系を移動して遠位の部位に至り二次腫瘍を形成する転移カスケードに関連するこれ等のプロセスの各々の調節に関与が示唆されている。
【０４６２】
ａ．有糸分裂誘発
ＨＧＦの刺激は細胞増殖を誘導する。ＨＧＦの有糸分裂誘発の潜在能力は癌の型に応じて変動するが、ＨＧＦは明らかに数種の細胞周期増進活性を示す。ＨＧＦ治療はＭＥＫ／ＥＲＫ経路のような有糸分裂誘発シグナリング経路を誘導できる。ＨＧＦはまた細胞周期開始を早める高ホスホリル化Ｒｂ蛋白の蓄積をもたらすｐ２７ｋｉｐ１をダウンレギュレートすることもできる。更に又、ＨＧＦシグナリングはオンコジーン形成に関与する細胞周期調節物質をアップレギュレートするＬＥＦ／ＴＣＦ転写因子複合体の形成を増進するβ−カテニンの蓄積をもたらすことができる。
【０４６３】
ＨＧＦの有糸分裂誘発特性はまたアポトーシスの抑制にも関連する。細胞生存因子のアップレギュレーションは癌細胞の重要な特徴であり、それらがアポトーシス性の細胞死を免れる能力に寄与している。ＨＧＦ処理は血清飢餓、ＵＶ照射及び他の細胞毒性剤により誘導されるアポトーシスに対抗して細胞を保護することがわかっている。肝細胞などのような細胞における活性化ＭＥＴの構成的発現もまたアポトーシスを抑制できる。ＨＧＦの抗アポトーシス作用はホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路を介したＡｋｔキナーゼの活性化により部分的に媒介される。これを裏付けるものとして、ＨＧＦの抗アポトーシス作用はＬＹ２９４００２のようなＰＩ３Ｋ阻害剤による処理によりブロックできることが研究により示されている。更に又、ＨＧＦは抗アポトーシス蛋白、例えばＢＣＬ−ｘＬ、ＭＡＰＫ及びＧＡＴＡ−４の発現及び／又は活性化を誘導することができる。ＨＧＦシグナリングはまた、アポトーシスプログラムにために重要である特定のカスパーゼの活性化を妨害することができる。ＭＥＴ受容体は又Ｆａｓに直接結合し、Ｆａｓ誘導アポトーシスを防止する能力も有している。
【０４６４】
ＨＧＦ処理は癌の治療において用いられる細胞毒性剤を包含するＤＮＡ損傷剤により誘導されたアポトーシス作用を抑制することができる。研究によれば、ＨＧＦ処理は肺癌、神経膠芽腫細胞、結腸癌細胞、乳癌細胞、頭部頚部の扁平上皮癌、骨髄腫細胞において、そして、上皮細胞系統において、細胞生存を増進している。一例としてＭＤＡ−ＭＢ−４５３ヒト乳癌細胞、ＥＭＴ６マウス乳房腫瘍細胞、Ｕ３７３神経膠芽腫細胞又はＭＤＣＫ腎上皮細胞のＨＧＦ処理はアドリアマイシン（ＡＤＲ）、シスプラチン、カントテシン、タキソール、Ｘ線、ガンマ線照射又は紫外線照射のような細胞毒性剤により誘導されたアポトーシスに対向して細胞を保護する。アポトーシスの抑制に対するＨＧＦの作用がある場合は、癌性の細胞におけるＨＧＦの蓄積は癌の治療において観察されている放射線及び化学療法に抵抗性の表現型に寄与していると考えられる。即ちＨＧＦシグナリングの抑制剤は癌の治療のための従来の細胞毒性剤との複合療法において使用される潜在性を有している。
【０４６５】
ｂ．遊走誘発及び形態形成
癌細胞が周囲の組織を侵襲氏、そして遠位の部位に遊走する能力は細胞の運動性の刺激に依存しており、そして、上皮及び内皮の細胞型の形態形成が関与している。これ等のプロセスは又、正常な臓器の発生及び創傷治癒のために重要である。しかしながら癌においては、細胞の運動性及び形態形成の調節不全が癌の進行及び転移に寄与している。それは更に又後述する通り腫瘍の血管形成にも重要である。ＨＧＦによる癌細胞の処理は多くのマトリックスにわたる細胞の急速な遊走を増進する。ＨＧＦはｒｈｏ／ｒａｃ経路の成分の活性化を介して細胞の移動及び形態形成を促進することができる。この経路は細胞骨格の再配列及び細胞−基盤接着のために重要である。ｒｈｏファミリーの数種のメンバーは癌において異常に発現される。ＨＧＦ刺激により、ＭＥＴ受容体はｃ−ＣｂＩ、ＰＩ３Ｋ、Ｇｒｂ２、Ｓｈｃ、Ｃｒｋ及びＧａｂ−１を包含するシグナリング分子に対するドッキング部位として機能する多数のチロシン残基上においてホスホリル化される。これ等の蛋白が次に、細胞骨格機序に連絡している下流のシグナリング経路を活性化し、接着結合部の分解、膜撹乱の刺激、及び指向性の細胞移動をもたらす。
【０４６６】
腫瘍の転移における細胞遊走の別の重要な要因は、細胞のアンカリング位置からのその解離及び散乱を増進する細胞の接触性の崩壊である。ＨＧＦシグナリングはβ−カテニン支援経路を介した細胞の散乱を増進し、細胞−細胞接触を維持するために重要であるＥ−カドヘリンのようなカドヘリンの漏出及び再分布をもたらす。
【０４６７】
癌細胞の周囲組織への侵襲はまた細胞外マトリックスの分解を必要とする。ＨＧＦは蛋白分解性の酵素、例えばマトリックスメタロプロテイナーゼ、例えばＭＭｐ２、ＭＭＰ７及びＭＭｐ９及びセリンプロテアーゼ、例えばプラスミノーゲン活性化物質ｕＰＡの分泌の刺激を介して癌細胞の侵襲性に寄与する。細胞外マトリックスのこの分解は原発腫瘍部位からの転移細胞の遊走、及び、遠位のドッキング部位における細胞の侵襲能力に寄与する。ＨＧＦは又腫瘍組織における細胞外マトリックス内に貯蔵される場合が多い。蛋白分解性酵素の分泌の後、この便利なＨＧＦ源が放出され、癌細胞の遊走及び侵襲に更に寄与することになる。細胞外マトリックスのヘパリンスルフェートグリコサミノグリカンもまたＨＧＦとは独立してＭＥＴに結合し、運動性を調節する場合がある。
【０４６８】
二次腫瘍生育の遠位の位置において、ＣＤ４４及びインテグリンのような細胞表面分子は侵襲の遠位の部位への転移細胞のアンカリングにおいて役割を果たしている。ＨＧＦ発現はＣＤ４４の発現を誘導できる。更に又、ＭＥＴはα６β４インテグリンのようなインテグリンとの相互作用を介したドッキングにおいて重要な役割を果たしている。
【０４６９】
２．血管形成
血管形成因子（正及び負）に関する細胞受容体は多数の疾患のプロセスにおいて、例えば血管形成性の成長因子のバランスが改変されているか、及び／又は、血管形成の量又はタイミングが改変されている疾患及び状態において、介入点として機能できる。例えば、一部の状況において、腫瘍病巣に血液を供給する、そして、炎症応答及び他の異常な血管形成関連状態における血管形成のような、「不用な」血管形成は有害である場合がある。腫瘍の生育、又は慢性炎症における増殖の部位は、一般的に、その代謝上の必要性を支援するためには、近隣血管及び血管内皮細胞のリクルートメントを必要とする。その理由は組織内の酸素に対して拡散が限定されているためである。血管形成を要する状態の例は限定しないが、固形腫瘍及び血液学的悪性疾患、例えばリンパ腫、急性白血病及び多発性骨髄腫を包含し、これ等の場合、増大した数量の血管が病理学的な骨髄に観察される。血管形成のための刺激は、低酸素、炎症及びオンコジーンにおける遺伝子的罹患部又は疾患細胞遺伝子発現を改変する腫瘍抑制剤を包含する。
【０４７０】
ａ．血管形成プロセス
血管形成は循環内皮細胞前駆体（ＣＥＰ）のリクルートメント、成長因子による新規内皮細胞（ＥＣ）生育の刺激、プロテアーゼによるＥＣＭの分解、ＥＣの増殖、及び、腫瘍部位又は炎症により生じた他の増殖部位である標的への遊走を包含する幾つかの工程を包含する。これにより新しい毛細管が最終的に形成される。そのような血管は構造において正常である必要はない。それらは混沌とした構成及び血流を有する場合がある。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及びアンジオポエチンのような血管形成調節物質の不均衡のために、腫瘍又は炎症部位に供する新しい血管は屈曲して拡張し、直径は不均一であり、過剰な分枝部及び短絡部を伴っている。血流は変動し、低酸素誘導アポトーシス（頻繁にはｐ５３発現の消失による）に対して耐性である変異体の選択の原因となる低酸素及びアシドーシスの領域を伴い；そしてプロ血管形成シグナルの生成が増強されている。疾患関連の血管壁は多くの開口部、拡張した内皮間の接合部、及び不連続又は欠落した基底膜を有し；これがこれ等の血管の高い血管透過性に寄与し、そして機能的なリンパ管／ドレナージの欠如と組み合わせられると、間質性高血圧をもたらす。疾患関連の血管は周皮細胞のような血管周囲の細胞及び組織の代謝的必要性に応答して血管作用性制御を通常は調節する平滑筋を欠いている場合がある。正常な血管とは異なり、腫瘍血管の血管ライニングはＥＣの均質な層ではなく、頻繁にはＥＣと腫瘍細胞のモザイクを含んでおり；腫瘍細胞により分泌されたＥＣＭをライニングとした癌細胞誘導血管チャンネルの概念は血管模倣物と称される。
【０４７１】
血管が急速に急性炎症の部位を侵襲する場合に同様の状況が起こる。血管形成性の血管のＥＣは、ＥＣの僅か０．０１％のみが分裂している成人血管において観察される静態のＥＣとは異なる。腫瘍血管形成の間、ＥＣは高度に増殖性であり、成長因子受容体及び接着分子、例えばインテグリンを包含する活性化された内皮に特徴的な原形質膜蛋白を多数発現する。腫瘍は多くの機序を利用してその血管形成を増進し、そして各々の場合において、それらはこの目的のために正常な血管形成プロセスを転覆させる。この理由のため、内皮及び構造（血管新生の増大した分枝化を可能にする）に関して増殖性である血管形成因子の増大した生産が癌又は慢性炎症疾患のような患部において生じる可能性がある。
【０４７２】
ｂ．血管形成における細胞表面受容体
細胞表面受容体、例えば受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）及びそれらのリガンドは血管形成の調節において役割を果たしている。血管形成性の内皮は休止期の内皮では観察されない多くの受容体を発現する。これ等には、ＲＴＫ（即ちＦＧＦ、ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦ受容体）及び細胞外マトリックスに結合して内皮細胞の接着、遊走及び侵襲を媒介するインテグリンが包含される。活性化されたＲＴＫにより媒介される機能は、内皮細胞の増殖、遊走及び増強された生存、並びに、血管周囲細胞及び血流運搬による循環内皮前駆体及び造血幹細胞の腫瘍へのリクルートメントの調節を包含する。
【０４７３】
別のシグナリング経路も血管形成に関与する。間質細胞により生産されるアンジオポエチンＡｎｇ１はＲＴＫ  Ｔｉｅ−２に結合し、そして内皮細胞の細胞外マトリックス及び血管周囲細胞、例えば周皮細胞及び平滑筋との相互作用を増進することにより堅固で非漏出製の血管を形成する。ＰＤＧＨ及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、別名ＦＧＦ−２）はこれ等の血管周囲細胞のリクルートメントを支援する。Ａｎｇ１は成熟血管の静態性及び安定性を維持するために必要とされ、そして、ＶＥＧＦ及び炎症性サイトカインにより通常は誘導される血管透過性を防止する。
【０４７４】
間質細胞又は炎症性の細胞から分泌されるプロ血管形成サイトカイン、ケモカイン及び成長因子は血管新生に重要な寄与をもたらしており、それらにはｂＦＧＦ、形質転換成長因子−α、ＴＮＦ−アルファ及びＩＬ−８が包含される。正常な内皮とは対照的に、血管形成内皮は内皮細胞の接着、遊走及び生存を媒介する細胞外マトリックス結合蛋白のインテグリンファミリーの特定数を過剰発現する。インテグリンは内皮細胞の拡張及び遊走を媒介し、そして内皮細胞のインテグリン発現をアップレギュレートすることができるＨＧＦ、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦにより誘導される血管形成のために必要とされる。ＶＥＧＦは循環内皮細胞前駆体（ＣＥＰ）及び造血幹細胞（ＨＳＣ）の腫瘍への移動及びリクルートメントを増進し、そこでそれらは定着し、そして新血管の形成に協力すると考えられる。ＣＥＰはＶＥＧＦＲ２を発現するのに対し、ＨＳＣはＶＥＧＦＲ１、即ち受容体、又はＶＥＧＦ及びＰ１ＧＦを発現する。ＣＥＰ及びＨＳＣは両方とも共通の前駆体である血管芽細胞から誘導される。ＣＥＰは内皮細胞に分化すると考えられているのに対し、ＨＳＣ誘導細胞（例えば腫瘍関連マクロファージ）の役割は内皮細胞の発芽及び安定化に必要な血管形成因子（ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アンジオポエチン）を分泌し、そして、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を活性化させることにより細胞外マトリックスのリモデリング及び成長因子の放出をもたらすことであると考えられる。マウス腫瘍モデルにおいて、そしてヒト癌において、増大した数のＣＥＰ及びＶＥＧＦＲ１のサブセット又はＶＥＧＦＲ発現ＨＳＣが循環系中に検出され、これは血清中ＶＥＧＦの上昇したレベルに相関していると考えられる。ＨＧＦはまた胚の発生、創傷治癒及び組織再生の間に生じる正常な生理学的血管形成にも寄与している。
【０４７５】
ｃ．腫瘍血管形成におけるＨＧＦ
血管新生は腫瘍生育において重要なプロセスである。原発腫瘍の生育及び転移部位の形成における重要な要素は、以前より存在している宿主血管からの新しい毛細管の形成を増進する腫瘍の能力である。腫瘍関連血管形成は微小環境からのシグナルに応答して増殖、遊走、侵襲及び分化する多くの異なる細胞型が関与する複雑なプロセスである。内皮細胞はＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、Ａｎｇ２及び他のプロ血管形成刺激に応答して宿主血管から発芽する。発芽はＨＧＦ／ＭＥＴ、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ２、Ａｎｇ２／Ｔｉｅ−２及びインテグリン／細胞外マトリックスの相互作用により刺激される。骨髄誘導循環内皮前駆体はＶＥＧＦに応答して腫瘍に遊走し、内皮細胞に分化するのに対し、造血幹細胞は白血球に分化し、これには腫瘍関連マクロファージが包含され、これは血管形成性の成長因子を分泌し、そしてマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を生産し、これが細胞外マトリックスをリモデリングし、そして結合成長因子を放出させる。
【０４７６】
ＨＧＦは血管内皮細胞における血管形成を増進する形態形成性変化の刺激により血管形成に寄与する。ＨＧＦシグナリングは内皮細胞において分枝化細管形成を刺激し、内皮細胞の運動性を改変する。ＨＧＦは又ＶＥＧＦ及びＩＬ−８を包含する血管形成因子の発現をアップレギュレートすることができ、そして内皮細胞増殖を抑制して内皮細胞のアポトーシスを誘導するトロンボスポンジン−１（ＴＰＳ−１）のような血管形成抑制因子のダウンレギュレーションをもたらす。ＨＧＦは又、上皮から間葉への転移及び血管形成に必要な細管及び管腔の形成の媒介に参加している。ＭＥＴ受容体を介したＨＧＦシグナリングは血管形成に関連する形態形成性変化において重要な役割を果たしているが、ＨＧＦ拮抗剤を用いた試験によれば、ＨＧＦの血管形成活性は部分的にはＦＧＦ及び／又はＶＥＧＦの受容体の活性化を介して機能していると考えられることが明らかになった。
【０４７７】
腫瘍細胞が非血管区域に生じるか、そこに転移する場合、それらは低酸素及び栄養の欠乏により限定された大きさまでの生育を示す。この状態は他の限局的な増殖性疾患においても生じる可能性が高く、血管形成因子を生産する細胞の選択が可能となる。低酸素は腫瘍の血管形成の重要な調節要因となるが、転写因子低酸素誘導因子（ＨＩＦ）１の安定化が関与するプロセスによるＶＥＧＦ及びＨＧＦの転写誘導を誘発する。正常酸素条件下では、ＥＣ  ＨＩＦ−１のレベルはＶＨＬ腫瘍サプレッサ遺伝子座によりコードされるユビキチンＥ３−リガーゼにより調節されるプロテオソーム媒介破壊により低レベルに維持される。低酸素条件下では、ＨＩＦ−１蛋白はヒドロキシル化されず、そしてＶＨＬとの会合は起こらず；従って、ＨＩＦ−１レベルは上昇し、そしてＨＧＦ、ＶＥＧＦ、酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）及びＡｎｇ２を包含する標的遺伝子が誘導される。家族性の散発性腎細胞癌で起こるようなＶＨＬ遺伝子の消失もまた、ＨＩＦ−１安定化及びＶＥＧＦの誘導をもたらす。大部分の腫瘍は貧弱な血流のために低酸素領域を有し、このような区域の腫瘍細胞はＨＩＦ−１発現に関しては陽性染色される。
【０４７８】
ｄ．他の血管疾患におけるＨＧＦ
血管形成は炎症性疾患において役割を果たしている。これ等の疾患は腫瘍の病巣と同様に増殖性の要素を有する。慢性関節リューマチにおいて、この１つの要素はパンヌスの形成をもたらす滑膜線維芽細胞の異常増殖を特徴とする。パンヌスは形質転換された細胞と共に一部の表現型の特徴を有する滑膜線維芽細胞よりなる。関節内でパンヌスが成長するに従い、それは多くのプロ血管形成シグナルを発現し、そして腫瘍と同様の新血管形成の要件の多くを経験する。追加的血液供給、新規血管形成の必要性は重大である。同様に、多くの慢性炎症状態が増殖性の要素を有し、それにおいては、それを構成する細胞の一部が形質転換された細胞に通常帰属する特徴を有する。
【０４７９】
過剰な血管形成が関与する状態の別の例は、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）である（Ｌｉｐ等、Ｂｒ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ８８：１５４３，２００４）。ＰＤＲは血管形成性、炎症性及び増殖性の要素を有する。網膜の血管新生及びガラス体腔部への血管の陥入を特徴とし、増殖チャンネル周囲の出血及び瘢痕形成を伴う。ＨＧＦ、ＶＥＧＦ及びアンジオポエチン−２の上昇した発現がＰＤＲ患者のガラス体液中に共通して検出される。この過剰発現は同様に疾患関連の血管のリモデリングと分枝化のために必要であり、これ等が次に疾患の増殖性の要素を支援する。ＶＥＧＦは血管の透過性を増大させるために早期の段階において重要であるのに対し、ＨＧＦは血管新生における内皮細胞の生育において後期の段階で機能する。
【０４８０】
３．ＨＧＦアイソフォーム及び癌及び血管形成
ＨＧＦ／ＭＥＴシグナリングに拮抗する、及び／又は血管形成を抑制するＨＧＦアイソフォームは、癌及び血管形成尾関連血管疾患の治療において使用できる。一般的に、血管形成阻害剤は、腫瘍に酸素を供給する血管の密度を低減することにより、腫瘍生育及び転移の強力な抑制剤となる。しかしながら、腫瘍の転移はまた血管の生育がない腫瘍の低酸素領域によっても寄与される。そのような低酸素は癌細胞内のＭＥＴのアップレギュレーションをもたらし、次にこれが、ＨＧＦ／ＭＥＴシグナリング経路のアップレギュレーションを介して腫瘍の侵襲性生育能力をもたらす。即ちＨＧＦ／ＭＥＴシグナリングの抑制は抗血管形成療法と組み合わせて転移性生育を抑制することの追加的利点をもたらす。
【０４８１】
本明細書において提供されるものは、腫瘍形成及び／又は血管形成のプロセスにおける工程１つ以上をモジュレートできるＨＧＦアイソフォームである。ＨＧＦアイソフォームの標的となる腫瘍生育及び血管形成の経路における例示される工程は図３に示す。ＨＧＦアイソフォームは単独で、間歇的に、単一又は２種以上の組成物中、又は、それらの他の組み合わせ中において投与できる。提供されるアイソフォームに属するものは、ＭＥＴ及び／又は他の受容体への結合に関してＨＧＦと競合し、これにより循環ＨＧＦの相互作用を低減するものである。循環ＨＧＦの低減は癌発生における循環ＨＧＦの作用を減衰、例えば腫瘍の生育、侵襲及び腫瘍細胞の転移及び血管形成におけるその役割を抑制することができる。ＨＧＦアイソフォームは又、原発及び二次腫瘍の転移及び生育に寄与するものとしての血管形成並びに他の血管形成性の疾患を抑制することができる。
【０４８２】
Ｎ．ＨＧＦアイソフォームを用いた例示される治療
本明細書において提供されるものは血管形成及び／又はＭＥＴの異常な活性化に関連する疾患及び状態に対するＨＧＦアイソフォームを用いた治療の方法である。ＨＧＦアイソフォームは本明細書に記載したものを包含する種々の疾患及び状態の治療において使用できる。治療はポリペプチドとしての組成物として提供することができ、そしてターゲティング送達のためのターゲティング剤と連結又はリポソームのような送達ベヒクル中にカプセル化することができる、ポリペプチドの製剤を、適当な経路により投与することにより行うことができる。或いは、ポリペプチドをコードする核酸をネイキッドの核酸として、又は、ベクター、特に遺伝子療法ベクター中において、投与することができる。そのような遺伝子療法は対象から細胞を取り出すこと、ベクター又は核酸を細胞に導入すること、そして次に修飾した細胞を再導入することにより、エクスビボで行うことができる。遺伝子療法は又核酸又はベクターを直接投与することによりインビボで行うこともできる。
【０４８３】
本明細書において提供されるＨＧＦアイソフォームを用いた治療は、限定しないが、細胞増殖及び血管新生に関連する疾患及び状態、例えば癌及び血管形成性の疾患、例えば慢性関節リューマチ、糖尿病性網膜症及び血管腫の治療を包含する。例示される治療及び前臨床試験を、ＨＧＦアイソフォームを用いた治療及び療法に関して説明する。そのような説明は例示を目的とするのみであり、特定のＨＧＦアイソフォームに限定するものではない。当業者は、治療すべき疾患の型、疾患の重症度及び経過、分枝を予防又は治療目的の何れとして投与するのか、以前の療法、患者の臨床経過及び療法に対する応答、及び、担当医の判断に基づいて、投与すべき分子の適切な用量を決定できる。
【０４８４】
１．癌
本明細書において提供されるものを包含するＨＧＦアイソフォーム、例えば限定しないが、配列番号９〜１４に記載するＨＧＦアイソフォーム（及びコードする核酸）は癌を包含する細胞増殖性疾患の治療において使用できる。ＨＧＦシグナリングは、腫瘍の増殖及び侵襲に関連する細胞の成育、アポトーシスの抑制、細胞の形態形成、細胞接着及び細胞の運動性のような細胞プロセスに影響することにより癌の進行に寄与している。治療される癌の例は限定しないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫及び白血病又はリンパ様悪性疾患を包含する。そのような癌の他の例は、扁平細胞癌（例えば扁平上皮細胞癌）、肺癌、例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃及び腹部の癌、例えば胃腸の癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌又は腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌、陰茎癌並びに頭頚部癌を包含する。ＨＧＦアイソフォームにより治療可能な癌は一般的にＭＥＴ受容体を発現する癌である。そのような癌はＭＥＴの発現を検出するための当該分野で知られた何れかの手段により、例えばＲＴ−ＰＣＲにより、又は免疫組織化学的検討により、識別することができる。
【０４８５】
ＨＧＦアイソフォームを用いた癌の治療は腫瘍の生育及び転移を抑制できる。例えば、腫瘍細胞形成の動物モデルは、免疫無防備状態の無胸腺ヌードマウスにＣ６神経膠腫細胞を注射することにより作成できる。免疫無防備状態のマウスへの例えば１日１回のＨＧＦアイソフォームの投与は、腫瘍の体積を低減し、そして腫瘍部位における細胞増殖を低減することができる。原発腫瘍の摘出により遠位の転移が頻発するルイス肺癌モデルと称される別のモデルにおいては、野生型ルイスは胃癌細胞の接種により生じた原発癌の切除の直前及び直後のＨＧＦアイソフォームの投与により、肺表面の転移の数が減少する。
【０４８６】
ＨＧＦアイソフォームは固形腫瘍の血管新生を呈する癌の治療のために使用できる。腫瘍の血管形成は腫瘍の生育及び転移にとって重要である。高血管性の腫瘍は転移を生じる危険性が増大している。ＨＧＦアイソフォームはＨＧＦに加えてＦＧＦ及びＶＥＧＦのようなプロ血管形成因子の作用を抑制することにより血管の生育を抑制できる。ＨＧＦアイソフォームによる癌の治療のための療法は、腫瘍の血管発生及び生育を制御するために所定期間にわたってＨＧＦアイソフォームの所定用量を投与することを包含する。ＨＧＦアイソフォームを腫瘍血管形成抑制のために使用できる例示される癌は限定しないが、乳房、結腸、膀胱、胃、肺、卵巣、膵臓及び前立腺の癌、リンパ腫及び悪性黒色腫を包含する。
【０４８７】
２．血管形成性の疾患
本明細書において提供されるものを包含するＨＧＦアイソフォーム、例えば限定しないが、配列番号９〜１４に記載するＨＧＦアイソフォーム（及びコードする核酸）は、異常な血管形成に関連する疾患、例えば慢性関節リューマチ、変形性関節症、乾癬、オスラー・ウェバー症候群、子宮内膜症、スティル病、心筋の血管形成、末梢血管拡張症、血友病性関節炎、加齢関連の黄斑変性、未熟児網膜症、角膜移植に対する拒絶、全身エリテマトーデス、アテローム性動脈硬化症、血管新生緑内障、脈絡膜血管新生、水晶体後線維増症、腱麻痺、神経線維腫、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫及び糖尿病関連疾患、例えば増殖性糖尿病性網膜症及び血管疾患の治療において使用できる。ＨＧＦアイソフォームを用いた治療のための疾患標的として意図される非限定的な血管形成性の疾患の例を以下に説明する。
【０４８８】
ａ．関節炎及び慢性炎症性疾患
ＨＧＦアイソフォーム、例えば限定しないが、本明細書に記載したＨＧＦアイソフォーム、例えば配列番号１０、１２、１４、１８又は２０に記載したアミノ酸の配列を含有するポリペプチドは、炎症性の疾患及び状態、例えば関節炎、炎症性肺疾患、クローン病及び乾癬の治療において使用できる。炎症性応答は脈管の拡張及び透過性亢進及び内皮細胞の活性化とその後の毛細管及び細静脈の血管形成性リモデリングを特徴とする。血管形成因子の刺激は正常な炎症応答の部分であり得るが、慢性炎症は頻繁には毛細管密度の顕著な増大及び血管の過剰な拡張を特徴とする。炎症組織は頻繁にはＶＥＧＦ、ＦＧＦ及びＨＧＦのようなプロ血管形成因子のアップレギュレーションを誘発する低酸素である。血管形成の抑制は炎症組織への栄養の供給を低減し、組織への炎症細胞の進入をブロックし、そして、内皮細胞活性化及びサイトカイン及び細胞外マトリックスプロテイナーゼの分泌を防止する。
【０４８９】
慢性関節リューマチ及び変形性関節症の患者の滑液中には、上昇したレベルのＶＥＧＦ、ＦＧＦ及びＨＧＦ及び他のプロ血管形成因子が観察される。慢性関節リューマチにおいては、滑膜パンヌスが過形成となり、関節軟骨及び周囲の骨を侵襲する。侵襲されたパンヌスへの必要な酸素及び栄養を提供するための滑膜中の増大した血管密度をもたらす血管の再組織化が起こる。増大した血管の透過性はまた浮腫及び関節の膨潤を増大させる場合がある。変形性関節症においては、やはり滑膜中の血管の再組織化が起こるが；侵襲パンヌスによる骨及び軟骨の分解の代わりに、軟骨の直接の血管侵襲及び骨軟骨接合部における増大した血管化による軟骨細胞の肥大及び軟骨内骨化が起こる。ＨＧＦアイソフォーム、例えば配列番号１０、１２、１４、１８又は２０に記載したアイソフォームの１つ以上を用いた慢性関節リューマチ及び変形性関節症の治療は関節の損傷をもたらす血管新生プロセスを抑制することによりこれ等の疾患に関連する症状を緩解することができる。
【０４９０】
慢性線維増殖性の障害、例えば炎症性肺線維症は調節不全の血管形成を呈し、そして線維増殖症及び細胞外マトリックスの付着に寄与すると考えられる。血管形成の刺激は肺の炎症の間にアップレギュレートされるプロ血管形成因子の不均衡に起因して生じる。旺盛な血管新生が広範な間質性線維症を有する患者の肺において観察される。血管の再分布もまた、必要な気腔から更に離れるように血流を迂回させる炎症組織近傍の血管の形成に好都合な肺胞壁における低減した血管密度を介してガス交換の障害となる場合がある。ＨＧＦアイソフォーム、例えば配列番号１０、１２、１４、１８又は２０に記載したアイソフォームの１つ以上を用いた肺の炎症の治療は、血管のネットワークの望ましくない再分布及の防止及び組織炎症の低減において役立つものとなる。
【０４９１】
血管の拡張及び膨大もまた乾癬及びクローン病のような他の炎症性疾患の進行において役割を果たしている。乾癬性の皮膚は異常に増殖する上皮細胞及び血管、毛細管漏出及びＶＥＧＦ及びＩＬ−８を包含するプロ血管形成因子の過剰生産を特徴とする。乾癬患部の下方の血管は豊富であり、延長されている。ＶＥＧＦの発現増大を示す皮膚疾患もまた伏在する内皮細胞における豊富なＶＥＧＦ受容体発現を示す。同様に、ＶＥＧＦの上昇したレベルがクローン病のような炎症性腸疾患の患者の血清中に観察される。増大した血管透過性はマクロファージ浸潤のリクルートメント及び傷害を有する組織に対抗する免疫応答の刺激に寄与していると考えられる。ＨＧＦアイソフォーム、例えば配列番号１０、１２、１４、１８又は２０に記載したアイソフォームの１つ以上を用いた乾癬及びクローン病のような炎症性障害の治療は慢性の炎症に関連する症状を緩解することができる。
【０４９２】
ＨＧＦアイソフォームは又アテローム性動脈硬化症のような血管疾患を治療するために使用できる。血管形成の刺激は、増大した血管の弛緩及び血管患部へのマクロファージのリクルートメントを介してアテローム性動脈硬化性のプラークの形成及び成長に寄与することができる。アテローム性動脈硬化性プラークの部位における増大した炎症応答が炎症の拡大をもたらす。ＨＧＦアイソフォーム、例えば配列番号１０、１２、１４、１８又は２０に記載したアイソフォームの１つ以上を用いた治療はアテローム性動脈硬化性の疾患におけるプラークの成長を防止するために使用できる。
【０４９３】
ｂ．眼の疾患
ＨＧＦアイソフォーム、例えば限定しないが、配列番号１０、１２、１４、１８又は２０の何れかに記載のアミノ酸の配列を含有するポリペプチドのような本明細書に記載したＨＧＦアイソフォームは、加齢関連黄斑変性及び増殖性糖尿病性網膜症を包含する眼の疾患及び状態の治療において使用できる。加齢関連黄斑変性は蓄積した黄斑ドルーゼの蓄積、Ｂｒｕｓｃｈ膜における細胞外付着、及び、網膜色素上皮（ＲＰＥ）機能不全が黄斑ドルーゼに積層するＲＰＥ及び光受容体における細胞及び分子の変性により起こること、を原因とする視力喪失を伴う。ＲＰＥにおいて生じる細胞及び分子の変化は、一部は加齢眼における酸化的ストレスを原因とし、サイトカイン、マトリックス組織化、細胞接着及びアポトーシスに関する遺伝子の発現の改変を包含し、これにより、ＲＰＥ−Ｂｒｕｃｈ膜の境界において局所的な炎症応答が誘導される化膿性がある。例えば、酸化的ストレスは早期の加齢関連黄斑変性におけるＲＰＥ及び光受容体層中の血管形成因子、例えばＨＧＦの蓄積を誘導し、そしてＮＦκＢ核局在及びアポトーシスを包含する種々の炎症事象を誘導する。ＨＧＦはＲＰＥ及び血管内皮細胞の分割及び遊走を刺激する。ＨＧＦは又、新しい血管の形成を増進する他の成長因子の生産を刺激し、そして、細胞外マトリックスへの血管細胞の侵襲により直接的に血管新生を支援する。ＨＧＦアイソフォーム、例えば配列番号１０、１２、１４、１８又は２０に記載したアイソフォームの１つ以上を用いた早期の段階の加齢関連黄斑変性の治療は疾患の症状１つ以上を緩解することができる。
【０４９４】
増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）は網膜の血管新生及びガラス体腔部への血管の陥入を特徴とし、これは増殖チャンネル周囲の出血及び瘢痕形成をもたらす。ＨＧＦの発現はＰＤＲを有する患者の眼のガラス体液中で顕著に上昇している。ＶＥＧＦの発現はＰＤＲにおいてやはりアップレギュレートされ、そして血管の透過性を増大させるためにその早期の段階において重要であるのに対し、ＨＧＦは血管新生のために必要な内皮細胞の生育及び活性化のより後の段階において機能する。ＨＧＦアイソフォーム、例えば配列番号１０、１２、１４、１８又は２０に記載したアイソフォームの１つ以上を用いたＰＤＲの治療はＨＧＦ及びＶＥＧＦ経路による網膜血管生育刺激の抑制において役立つものとなる。
【０４９５】
ｃ．子宮内膜症
ＨＧＦアイソフォーム、例えば限定しないが、配列番号１０、１２、１４、１８又は２０の何れかに記載のアミノ酸の配列を含有するポリペプチドのような本明細書に記載したＨＧＦアイソフォームは、子宮内膜症の治療において使用できる。調節された血管形成は女性の月経周期において生じる正常なプロセスであるが；子宮内膜症においては、子宮内膜は増強された内皮細胞増殖を特徴とする過剰な血管形成を示す。これ等の内皮細胞はプロ血管形成性のαｖβ３インテグリンの高発現を有する。増大した生育は、卵巣、ファロピアン管、子宮を支持している靭帯、膣と直腸の間の区域、子宮の外表面及び骨盤腔のライニングを包含する腹腔の区域に移植して生育する結節又は患部の形成による腫瘍生育の特徴の一部を模倣している。生育は又、腸又は直腸、膀胱、膣、子宮頚部及び外陰部における腹部手術瘢痕においても観察される。ＨＧＦアイソフォーム、例えば配列番号１０、１２、１４、１８又は２０に記載したアイソフォームの１つ以上を用いた子宮内膜症の治療は過剰な子宮内膜の血管形成及び結節の成長の抑制において役立つものとなる。
【０４９６】
３．マラリア
ＨＧＦアイソフォーム、例えば限定しないが、配列番号１０、１２、１４、１８又は２０の何れかに記載のアミノ酸の配列を含有するポリペプチドのような本明細書に記載したＨＧＦアイソフォームは、マラリアの治療において使用できる。マラリアの起因生物はＰｌａｓｍｏｄｉｕｍであり、これは肝細胞に感染して哺乳類の感染を開始する。ＨＧＦはＨＧＦのその受容体ＭＥＴを介したシグナリングに依存している感染に対して肝細胞を感受性とする。ＨＧＦにより誘導されたＭＥＴシグナリングは肝細胞内の寄生虫の早期の発生のために必要な宿主細胞細胞骨格の形態形成性の再配列を誘導する。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍによる肝細胞の感染はまたＨＧＦ−ＭＥＴシグナリングにより誘導される抗アポトーシスシグナルによっても寄与されている。ＨＧＦアイソフォーム、例えば配列番号１０、１２、１４、１８又は２０に記載したアイソフォームの１つ以上を用いたマラリアの治療はマラリアの感染を防止できる。
【０４９７】
４．複合療法
本明細書において提供されるものを包含するＨＧＦアイソフォーム、例えば限定しないが、配列番号１０、１２、１４、１８又は２０に記載するＨＧＦアイソフォーム（及びコードする核酸）は相互に組み合わせて、及び／又は他の薬剤、分子又は既存の薬剤及び治療薬と組み合わせて、本明細書に記載した、又は当該分野で知られた疾患及び状態、特に癌及び他の増殖性障害及び／又は異常な血管形成の関与するものの治療において使用できる。例えば、ＨＧＦアイソフォームは扁平細胞癌（例えば扁平上皮細胞癌）、肺癌、例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃及び腹部の癌、例えば胃腸の癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌又は腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌、陰茎癌並びに頭頚部癌及び異常なＭＥＴ活性化が関与する他の癌を包含する癌を治療する抗腫瘍剤と共に投与できる。
【０４９８】
抗腫瘍剤の例は、血管形成抑制剤、抗増殖剤、骨再吸収抑制剤、ＤＮＡ修飾／修復剤、ＤＮＡ合成抑制剤、ＤＮＡ−ＲＮＡ転写調節物質、酵素活性化剤、酵素阻害剤、ＨＳＰ−９０阻害剤、微小管抑制剤及び他の治療用補助物質を包含する。ＨＧＦアイソフォームと組み合わせて使用できる抗腫瘍剤の例は、限定しないが、アンジオスタチン、塩酸ＤＬ−α−ジフルオロメチルオルニチン固体、エンドスタチン、ゲニステイン、スタウロスポリン、サリドマイド、Ｎ−アセチル−Ｄ−スフィンゴシン、アロエ−エモジン、アピゲニン、ベルベリンクロリド型、ジクロロメチレンジホスホン酸２ナトリウム塩、エモジン、Ｎ−ヘキサノイル−Ｄ−スフィンゴシン、７β−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、ハイパーフォリン、パルテノリド、ラパマイシン、アレンドロネートナトリウム３水和物、エチロロネート２ナトリウム固体、パミドロネート２ナトリウム塩、アフィジコリン、硫酸ブレオマイシン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド１水和物、ダカルバジン、シス−ジアミン白金（ＩＩ）２塩化物結晶、６，７−ジヒドロキシクマリン、メルファラン粉末、塩酸メトキシアミン、マイトマイシンＣ、２塩酸ミトキサントロン、オキサリプラチン固体、アメトプテリン、シトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド、５−フルオロ−５’−デオキシウリジン、ガンシクロビル、ヒドロキシ尿素、６−メルカプトプリン１水和物、塩酸ダウノルビシン、（−）−デグエリン、ホルメスタン、ホストリエシン、インドメタシン、オキサムフラチン、トリホスチンＡＧ、尿トリプシン阻害剤、コレカルシフェロール、メラトニン、塩酸ラロキシフェン、タモキシフェン、トログリタゾン及び／又はゲルタナマイシンを包含する。
【０４９９】
ＨＧＦアイソフォームはＭＥＴ活性化を抑制する他の薬剤と組み合わせて投与できる。例えば、ＨＧＦアイソフォームはＭＥＴ受容体の他の拮抗剤又は中和剤、例えば抗ＨＧＦ抗体、切断不可能なプロＨＧＦ、ＭＥＴの組み換えＳｅｍａドメイン及び／又は可溶性ＭＥＴアイソフォームと共に投与できる。例示される可溶性ＭＥＴアイソフォームは配列番号８４〜１１４に記載するＭＥＴアイソフォームの何れか１つを包含できる。ＨＧＦアイソフォームはまた、ＭＥＴの２量体化及びシグナリングを防止する薬剤、例えば優性阻害受容体、抗ＭＥＴ  Ｓｅｍａ抗体、ＡＴＰ競合物質、ＳＨ２競合物質、ＰｔｄＩｎｓ３Ｋ、ＭＡＰＫ又はＳＴＡＴ３阻害剤のような特異的トランスデューサーの阻害剤、及び／又は、アンチセンス、リボザイム、ＲＮＡｉ又はＭＥＴ発現をサイレント化する他の分子と組み合わせて投与できる。
【０５００】
イントロン融合蛋白及び癌及び異常な血管形成の関与する他の疾患を治療するための細胞表面受容体（ＣＳＲ）ポリペプチドアイソフォームを包含する他の物質とのＨＧＦアイソフォームの組み合わせが意図される（例えば本明細書及び同時係争中及び公開された米国特許出願０９／９４２，９５９、０９／２３４，２０８、０９／５０６，０７９；米国特許暫定出願６０／５７１，２８９、６０／５８０，９９０及び６０／６６６，８２５；及び米国特許６，４１４，１３０、公開国際ＰＣＴ出願ＷＯ００／４４４０３、ＷＯ０１／６１３５６、ＷＯ２００５／０１６９６６に記載するものを参照）。細胞表面受容体アイソフォームはＭＥＴアイソフォーム又は他の細胞表面受容体アイソフォーム、例えば受容体チロシンキナーゼ又は腫瘍壊死因子受容体、例えばＶＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＭＥＴ、ＴＩＥ、Ｅｐｈ、ＲＡＧＥ及びＴＮＦＲファミリーのメンバーのアイソフォームを包含できる。これ等は
【０５０１】
【化１０】
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を包含するＣＳＲのアイソフォームを包含できる。そのようなアイソフォームの例はヘルスタチン（配列番号１８６〜２００参照）及びヘルスタチンのイントロン部分を包含するポリペプチド（配列番号２１６〜２３０参照）並びに配列番号３６〜１８５のいずれかに記載のアイソフォーム及びコードヌクレオチド配列である。選択されるアイソフォーム及び／又は薬品及びＨＧＦアイソフォームの組み合わせは治療すべき疾患の関数であり、そして、標的組織及び細胞及びそこに発現される受容の体の検討に基づく。
【０５０２】
組み合わせは、２種以上の細胞表面受容体又は癌細胞の増殖、生育、侵襲及び転移に関与する工程、及び／又は、血管形成及び／又は内皮細胞の維持の経路に関与する工程をターゲティングすることができ、或いは、２種以上の細胞表面受容体又は疾患過程、例えばこれ等の経路の一方又は両方の関与が示唆されている何れか、例えば血管形成性の疾患、例えば糖尿病、癌及び本明細書に記載し当該分野で知られた他の全てにおける工程をターゲティングすることができる。２種以上の薬剤は単一の組成物として投与することができ、或いは、同時、間歇的又は逐次的に２種以上の組成物（２種より多い薬剤がある場合）として投与できる。それらは別個に２種以上の組成物を含有するキットとして、又は、組み合わせられた組成物として、そして場合により投与に関する説明書及び／又はシリンジのような投与のための装置と共に、パッケージ化することができる。
【０５０３】
５．ＨＧＦアイソフォーム活性の評定
必要に応じて、動物モデルを用いることにより候補治療薬であるＨＧＦアイソフォームを評定することができる。評価することができるパラメーターは限定しないが、薬効及び濃度応答性、安全性、薬物動態、種間の換算及び組織分布を包含する。モデル動物試験は本明細書に記載並びに当該分野で知られた試験を包含する。動物モデルを用いることにより得られたデータから次に臨床治験の設計及びＨＧＦアイソフォームを用いた治療のためのヒトの用量を推定することができ、例えば、薬効及び濃度応答性は動物モデルの結果から推定することができる。
【実施例】
【０５０４】
以下の実施例は説明を目的とするのみであり、本発明の範囲を限定する意図はない。
【０５０５】
ＨＧＦアイソフォームのクローニング
Ａ．メッセンジャーＲＮＡの製造
健常又は罹患した組織又は細胞系統に由来する主要ヒト組織型から単離したｍＲＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入した。等量のｍＲＮＡをプールし、逆転写系ＰＣＲ増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）のための鋳型として使用した。
【０５０６】
Ｂ．ｃＤＮＡ合成
ｍＲＮＡを１０分間４０％ＤＭＳＯの存在下７０°Ｃで変性し、氷上でクエンチングした。第１鎖ｃＤＮＡは、１０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、７５ｍＭＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ各ｄＮＴＰ、５μｇ  ｍＲＮＡ及び２００単位のＳｔｒａｔａｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を含有する２０μｌ反応液中において２００ｎｇオリゴ（ｄＴ）又は２０ｎｇランダム６量体の何れかを用いて合成した。１時間３７°Ｃでインキュベートした後、両方の反応液のｃＤＮＡをプールし、１０単位のＲＮａｓｅ  Ｈ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で処理した。
【０５０７】
Ｃ．ＰＣＲ増幅
ＲＴ−ＰＣＲクローニングのためのフォワード及びリバースプライマーはＨＧＦのスプライシング変異体をクローニングするように設計した。Ｈｉｌｌｅｒ等（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００５．６：Ｒ５８）の記載した方法を用いながら、フォワードプライマー（Ｆ１、Ｆ２）は開始コドンにフランキングするように選択し、そしてリバースプライマー（イントロン１１Ｒ１、イントロン１１Ｒ２又はイントロン１３Ｒ１）はＨＧＦゲノム配列（表６）のイントロン配列から選択した（表７参照）。各ＰＣＲ反応は１０ｎｇの逆転写ｃＤＮＡ、０．２μＭのＦ１／Ｒ１プライマー混合物、１ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、０．２ｍＭｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、１Ｘ  ＸＬ−Ｂｕｆｆｅｒ及び０．０４Ｕ／μｌｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を総量７０μｌ中に含有するものとした。ＰＣＲ条件は９４℃４５秒、６０℃１分及び６８℃２分を３６サイクルとした。反応は６８℃２０分の伸長により終止した。ネステッドＰＣＲは１μｌの上記ＲＴ−ＰＣＲ産物、Ｆ２／Ｒ２プライマー混合物、１ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１Ｘ  ＸＬ−Ｂｕｆｆｅｒ及び０．０４Ｕ／μｌ  ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を総量７０μｌで実施した。ＰＣＲ条件は９４℃４５秒、６０℃１分及び６８℃２分を３３サイクルとした。反応は６８℃２０分の伸長により終止した。
【０５０８】
【表６】
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Ｄ．ＰＣＲ産物のクローニング及び配列決定
ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、検出可能なバンドから得たＤＮＡをＧｅｌｓｔａｒ（ＢｉｏＷｈｉｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で染色した。ＤＮＡバンドはＱｉａＱｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で抽出し、ｐＤｒｉｖｅ  ＵＡ−クローニングベクター（Ｑｉａｇｅｎ）にライゲーションし、そしてＤＨ１０Ｂ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。組み換えプラスミドは２５μｇ／ｍｌカナマイシン、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ及び６０μｇ／ｍｌＸ−ｇａｌを含有するＬＢ寒天プレート上で選択した。各トランスフェクションに付き、１２コロニーを無作為に釣菌し、そのｃＤＮＡインサートの大きさは、ＵＡベクタープライマーを用いながらＰＣＲにより測定した。クローンはＭ１３フォワード及びリバースベクタープライマーを用いて両方向から配列決定した。全てのクローンはギャップ領域を横切って指定された配列決定終了までカスタムプライマーを用いて完全に配列決定した。
【０５０９】
Ｅ．配列分析
ＳＩＭ４（スプライシング変異体の分析のためのコンピュータープログラム）を用いた各ｃＤＮＡ配列をその対応するゲノム配列に対するアライメントによりオルタナティブスプライシングのコンピューター分析を実施した。カノニカル（例えばＧＴ−ＡＧ）なドナー−アクセプタースプライシング部位を有する転写物のみを分析の対象とした。ＨＧＦアイソフォームをコードするクローンを更に検討した（下記表８参照）。
【０５１０】
Ｇ．例示されるＨＧＦアイソフォーム
本明細書に記載した方法を用いて製造したＨＧＦアイソフォームをコードする核酸分子の例を表８に記載する。ＨＧＦアイソフォームをコードする核酸分子が提供され、そしてその配列は配列番号９、１１、１３、１７又は１９に記載する。例示されるＨＧＦアイソフォームのポリペプチドの配列を配列番号１０、１２、１４、１８又は２０に記載する。
【０５１１】
【表７】
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本分野の当業者には変更例は自明であるため、本発明は添付請求項の範囲によってのみ制限されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０５１２】
【図１】図１は例示されるＨＧＦ遺伝子のゲノム構成を示す（その配列については配列番号１参照）。ＨＧＦ遺伝子は１７イントロン（波線）により中断された１８エクソン（実線）を含有する。ＨＧＦの優勢なスプライシング型は１８エクソンによりコードされるポリペプチドを含有する。本明細書に記載するＨＧＦアイソフォームはＨＧＦ遺伝子のオルタナティブスプライシング変異体によりコードされ、そしてエクソン及びイントロン部分由来コドン少なくとも１つによりコードされる。例示されるＨＧＦアイソフォームＳＲ０２３Ａ０１、ＳＲ０２３Ａ０８及びＳＲ０２３Ｅ０９をコードする核酸のエクソン−イントロン構成を示す。アスタリスクは遺伝子のイントロン部分内の終止コドンを示しており、これによりトランケーションされたアイソフォームが生じる。ＳＲ０２３Ａ０２アイソフォームのエクソン５内の□はエクソン５の欠失した部分を示す。ＨＧＦアイソフォームはＨＧＦのエクソンに作動可能に連結したＨＧＦ遺伝子のイントロンの何れか１つ以上の全て又は部分を包含し、これにより、ＨＧＦのイントロン融合蛋白が生じる。
【図２】図２はＨＧＦのドメイン構成を示す。図はＳＲ０２３Ａ０２、ＳＲ０２３Ａ０８及びＳＲ０２３Ｅ０９を包含するＨＧＦアイソフォームのドメイン構成を示す。
【図３】図３は腫瘍生育及び血管形成を包含する癌の進行におけるＨＧＦの寄与の概観を示す。ＨＧＦは（Ａ）癌細胞の散乱及び遊走、侵襲及び転移を促進する形態形成及び有糸分裂誘発性の因子として、（Ｂ）癌細胞の増殖を刺激することにより腫瘍生育を促進する有糸分裂誘発性の因子として、そして、（Ｃ）転移及び原発及び二次腫瘍の生育に寄与する血管形成及び血管生育を促進する血管形成性の因子として作用する。ＨＧＦアイソフォームによるこれ等の経路のモジュレーションのための標的点を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
2009515520000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月15日(2008.8.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009515520000001.app
【国際調査報告】
2009515520.tif 000370
2009515520.tif 000371
2009515520.tif 000372
2009515520.tif 000373
2009515520.tif 000374
2009515520.tif 000375