(57)【要約】【課題】少なくとも１つの改良された特性を有するｒｔＴＡ及び単鎖ｒｔＴＡ変異体の提供。【解決手段】目的の核酸配列を誘導的に発現させる方法であって、遺伝子誘導発現系に使用可能な状態で連結された目的の前記核酸配列を含んでなる核酸構築物を準備するステップであって、ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列を含んでなり、前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、ｒｔＴＡのアミノ酸位９、及び／又は１９、及び／又は３７、及び／又は５６、及び／又は６７、及び／又は６８、及び／又は１３８、及び／又は１５７、及び／又は１７１、及び／又は１７７、及び／又は１９５においてコドン変異を含んでなるステップと、適切な発現系に前記核酸構築物を導入するステップと、目的の前記核酸配列を誘導発現させるステップを含んでなる方法。【選択図】なし
2009515550.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の核酸配列を誘導発現させる方法であって、
遺伝子誘導発現系に使用可能な状態で連結された目的の前記核酸配列を含んでなる核酸構築物を準備するステップであって、ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列を含んでなり、前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、ｒｔＴＡのアミノ酸位９、及び／又は１９、及び／又は３７、及び／又は５６、及び／又は６７、及び／又は６８、及び／又は１３８、及び／又は１５７、及び／又は１７１、及び／又は１７７、及び／又は１９５においてコドン変異を含んでなるステップと、
適切な発現系に前記核酸構築物を導入するステップと、
目的の前記核酸配列を誘導発現させるステップを含んでなる方法。
【請求項２】
前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、ｒｔＴＡのアミノ酸位１２、及び／又は８６、及び／又は２０９のコドン変異を更に有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、グルタミン酸コドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位１９のコドンと、及び／又はアラニン、リジン又はセリンコドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡ位置３７のコドンと、及び／又はｒｔＴＡのアミノ酸位５６のグルタミン又はリジンコドンを含んでなる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、グルタミン酸コドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位１９のグリシンコドンを含んでなる、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、グルタミン酸コドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位１９のアラニン、システイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンコドンを含んでなる、請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、アラニン、リジン又はセリンコドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位３７のヒスチジン、ロイシン又はアルギニンコドンを含んでなる、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、イソロイシンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位９のコドン、及び／又はアラニン、システイン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１９のコドン、及び／又はシステイン、メチオニン、グルタミン、トレオニン、ヒスチジン、ロイシン又はアルギニンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位３７のコドン、及び／又はリジン又はグルタミンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位５６のコドン、及び／又はセリンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位６７のコドン、及び／又はアルギニンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位６８のコドン、及び／又はチロシンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位８６のコドン、及び／又はアスパラギン酸又はセリンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１３８のコドン、及び／又はリジンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１５７のコドン、及び／又はリジンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１７１のコドン、及び／又はロイシンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１７７のコドン、及び／又はセリンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１９５のコドン、及び／又はトレオニンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位２０９のコドンを含んでなる、請求項１から６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、図１４Ｂ又は図１４Ｃに示す少なくとも１つの変異を含んでなる、請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、図１９に示すｒｔＴＡをコードする核酸配列と比較して少なくとも１つのコドン変異を含んでなる、請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
目的の前記核酸が高等真核生物発現系において発現される、請求項１から９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
目的の前記核酸が哺乳動物細胞において発現される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
目的の前記核酸が複製に必要なウイルス配列を含んでなる、請求項１から１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
目的の前記核酸が複製に必要なＨＩＶゲノムの少なくとも一部を含んでなる、請求項１から１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列を含んでなる、単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列であって、ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、ｒｔＴＡのアミノ酸位９、及び／又は１９、及び／又は３７、及び／又は５６、及び／又は６７、及び／又は６８、及び／又は１３８、及び／又は１５７、及び／又は１７１、及び／又は１７７及び／又は１９５におけるコドン変異を有する、単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列
【請求項１５】
前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、ｒｔＴＡのアミノ酸位１２、及び／又は８６、及び／又は２０９のコドン変異を更に有する、請求項１４記載の単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列。
【請求項１６】
前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、グルタミン酸コドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位１９のコドン、及び／又はアラニン、リジン又はセリンコドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位３７におけるコドン、及び／又はｒｔＴＡのアミノ酸位５６のグルタミン又はリジンコドンを含んでなる、請求項１４又は１５記載の単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列。
【請求項１７】
前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、グルタミン酸コドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位１９のグリシンコドンを含んでなる、請求項１４から１６のいずれか１項記載の単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列。
【請求項１８】
前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、グルタミン酸コドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位１９のアラニン、システイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンコドンを含んでなる、請求項１４から１７のいずれか１項記載の単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列。
【請求項１９】
前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、アラニン、リジン又はセリンコドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位３７のヒスチジン、ロイシン又はアルギニンコドンを含んでなる、請求項１４から１８のいずれか１項記載の単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列。
【請求項２０】
前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、イソロイシンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位９のコドン、及び／又はアラニン、システイン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１９のコドン、及び／又はシステイン、メチオニン、グルタミン、トレオニン、ヒスチジン、ロイシン又はアルギニンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位３７のコドン、及び／又はリジン又はグルタミンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位５６のコドン、及び／又はセリンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位６７のコドン、及び／又はアルギニンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位６８のコドン、及び／又はチロシンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位８６のコドン、及び／又はアスパラギン酸又はセリンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１３８のコドン、及び／又はリジンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１５７のコドン、及び／又はリジンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１７１のコドン、及び／又はロイシンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１７７のコドン、及び／又はセリンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１９５のコドン、及び／又はトレオニンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位２０９のコドンを含んでなる、請求項１４から１９のいずれか１項記載の単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列。
【請求項２１】
前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、図１４Ｂ又は図１４Ｃに示す少なくとも１つの変異を含んでなる、請求項１４から２０のいずれか１項記載の単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列。
【請求項２２】
前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、図１９に示すｒｔＴＡをコードする核酸配列と比較して少なくとも１つの変異を含んでなる、請求項１４から２１のいずれか１項記載の単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列。
【請求項２３】
請求項１４から２２のいずれか１項記載の核酸配列でコードされる、単離された、合成された若しくは組換え型のアミノ酸配列。
【請求項２４】
ｒｔＴＡ配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡ配列を含んでなる、単離された、合成された若しくは組み換え型のアミノ酸配列であって、ｒｔＴＡ配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡ配列が、位置９のイソロイシン、及び／又は位置１９のアラニン、システイン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシン、及び／又は位置３７のシステイン、メチオニン、グルタミン、トレオニン、ヒスチジン、ロイシン又はアルギニン、及び／又は位置５６及び／又は位置６７のセリンのリジン又はグルタミン、及び／又は位置６８のアルギニン、及び／又は位置８６のチロシン、及び／又は位置１３８のアスパラギン酸又はセリン、及び／又は位置１５７のリジン、及び／又は位置１７１のリジン、及び／又は位置１７７のロイシン、及び／又は位置１９５のセリン、及び／又は位置２０９のトレオニンを含んでなる、単離された、合成された若しくは組み換え型のアミノ酸配列。
【請求項２５】
目的の核酸配列の誘導発現のための、請求項１４から２２のいずれか１項記載の単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列の使用。
【請求項２６】
目的の核酸配列の誘導発現のための、請求項１４から２２のいずれか１項記載の核酸配列でコードされるアミノ酸配列、又は請求項２４記載のアミノ酸配列の使用。
【請求項２７】
前記アミノ酸配列が請求項２２に記載のアミノ酸配列を含んでなる、請求項２４記載の使用。
【請求項２８】
ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列を含んでなる、単離されたか組換え核酸配列の使用であって、ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、図１５にて示す変異若しくは変異の組合せ（野生型ｒｔＴＡ及びＦ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ変異体を除く）を含んでなり、目的の核酸のテトラサイクリン誘導及び／又はミノサイクリン誘導発現に用いられる使用。
【請求項２９】
請求項１４から２２のいずれか１項記載の核酸配列を含んでなるベクター。
【請求項３０】
請求項１４から２２のいずれか１項記載の核酸配列と、前記核酸配列の直接的又は間接的な制御下にある複製に必要な少なくとも１つのウイルス配列を含んでなる、誘導性のウイルスレプリコン。
【請求項３１】
前記核酸配列の直接的又は間接的な制御下にある複製に必要な全てのウイルス配列を含んでなる、請求項３０記載の誘導性のウイルスレプリコン。
【請求項３２】
ヒト免疫不全ウイルスに由来する請求項３０又は３１記載のレプリコン。
【請求項３３】
請求項１３から２０のいずれか１項記載の前記核酸配列がｎｅｆ遺伝子に挿入される、請求項３０から３２のいずれか１項記載のレプリコン。
【請求項３４】
少なくとも１つの機能性ＬＴＲ中の少なくとも１つのｔｅｔＯモチーフを含んでなる、請求項３０から３３のいずれか１項記載のレプリコン。
【請求項３５】
少なくとも１つの機能性ＬＴＲ中に、少なくとも２、４、６又は８のかかるエレメントを含んでなる、請求項３４記載のレプリコン。
【請求項３６】
少なくとも１つのＬＴＲが野生型ウイルスへの復帰を回避するために修飾されている、請求項３０から３５のいずれか１項記載のレプリコン。
【請求項３７】
複製誘導物質に依存性のウイルスの調製方法であって、請求項３０から３６のいずれか１項記載のレプリコンを受容細胞に提供するステップと、前記誘導物質の存在下で細胞を培養するステップと、前記培養組織から前記依存性のウイルスを回収することを含んでなる方法。
【請求項３８】
前記依存性のウイルスがヒト免疫不全ウイルスである、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記ウイルスが弱毒化ウイルスである、請求項３７又は３８記載の方法。
【請求項４０】
請求項３７から３９のいずれか１項記載の方法によって得られる、複製誘導物質に依存性のウイルス。
【請求項４１】
ヒト免疫不全ウイルスである、請求項４０記載のウイルス。
【請求項４２】
請求項１４から２２のいずれか１項記載の核酸配列、及び／又は請求項３０から３６のいずれか１項記載のレプリコン、及び／又は請求項４０又は４１記載のウイルス、及び適切なアジュバント及び／又は担体を含んでなる免疫原性組成物。
【請求項４３】
前記レプリコン及び／又は前記ウイルスがヒト免疫不全ウイルスに由来する、請求項４２記載の免疫原性組成物。
【請求項４４】
ウイルス又はウイルスレプリコンの複製制御方法であって、請求項３０から３６のいずれか１項記載のレプリコン、及び／又は請求項４０又は４１記載のウイルスを受容細胞に提供するステップと、前記誘導物質の存在下で前記細胞を培養するステップと、存在させる誘導物質の量を操作するステップと含んでなる方法。
【請求項４５】
エイズの少なくとも部分的な予防及び／又は治療方法であって、患者に請求項４２又は４３記載の免疫原性組成物を投与するステップと、前記誘導物質を提供して一定時間ウイルス複製を行わせることを含んでなる方法。
【請求項４６】
薬剤及び／又はワクチンとしての使用法のための、請求項１４から２２のいずれか１項記載の単離された若しくは組換え型の核酸配列、請求項３０から３６のいずれか１項記載のレプリコン、又は請求項４０又は４１記載のウイルス。
【請求項４７】
エイズを少なくとも部分的に予防及び／又は治療するための薬剤及び／又は免疫原性組成物の調製への、請求項１４から２２のいずれか１項記載の単離された若しくは組換え型の核酸配列、請求項３０から３６のいずれか１項記載のレプリコン、又は請求項４０又は４１記載のウイルスの使用。
【請求項４８】
請求項１４から２２のいずれか１項記載の核酸配列、請求項３０から３６のいずれか１項記載のレプリコン、及び／又は請求項４０又は４１記載のウイルスを含んでなる単離された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子生物学の分野に関し、特に改良された核酸の発現系に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸発現を調節するシステムは、機能ゲノミクス、遺伝子治療、ワクチン接種、ヒトの疾患タンパク質及び生物薬剤タンパク質の産生用の動物モデルをはじめとした、多岐にわたる基礎生物学的及び応用生物学的な研究分野にとって重要である。これらの用途では、目的の核酸の発現は、好ましくは、定量的及び時間的な方法で制御される。現在のところ、用量依存的及び可逆的な様式で無毒性のエフェクター分子によって調整されるいくつかの人工的な遺伝子発現システムが利用可能である。テトラサイクリン（Ｔｃ）又はその誘導体のドキシサイクリン（ｄｏｘ）によって厳密に制御される遺伝子発現であるＴｅｔシステムは、最も広く使用されている調節回路である（Ｂａｒｏｎら、２０００；Ｇｏｓｓｅｎら、２００１；Ｂｅｒｅｎｓら、２００３）。このシステムは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＴｅｔリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）とｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）ＤＮＡ配列との配列特異的かつ高親和性の結合性に基づくものである。Ｔｃ又はｄｏｘは、ＴｅｔＲに結合し、リプレッサータンパク質がｔｅｔＯに結合するのを妨害する構造変化を引き起こす。単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６活性化ドメインとＴｅｔＲとの融合により、転写活性化因子のｔＴＡが生じ、このｔＴＡは、真核細胞においてｔｅｔＯ含有プロモータ（Ｐｔｅｔ）からの核酸発現を誘導する（Ｇｏｓｓｅｎら、１９９２）。Ｔｃ又はｄｏｘが存在することにより、ｔＴＡ−ｔｅｔＯ相互作用ができなくなり、遺伝子発現のスイッチがオフになる（Ｔｅｔ−ｏｆｆシステム）。ＴｅｔＲ部分の中に４つのアミノ酸置換を有するｔＴＡバリアントが同定されており、そのバリアントは、逆の表現型を示す（Ｇｏｓｓｅｎら、１９９５）。この逆のｔＴＡ（ｒｔＴＡと呼ぶ）は、ｄｏｘの存在下ではもっぱらＰｔｅｔと結合するが、ｄｏｘが存在しない場合は結合しない（Ｔｅｔ−ｏｎシステム）。現在、両方のＴｅｔシステムが、哺乳動物、植物及び昆虫をはじめとした真核生物において核酸発現を制御するために広く応用されている（（Ｇｏｓｓｅｎら、２００１）に概説）。エフェクターへの長期間の曝露は、望ましくないことが多いので、長期間にわたってスイッチがオフの状態で核酸発現が持続されるべき用途において、又は、核酸発現の迅速な誘導が求められるときは、Ｔｅｔ−ｏｎシステムが好ましい。
【０００３】
残念ながら、逆の表現型をもたらすｒｔＴＡ中のアミノ酸置換もまた、エフェクターに対する結合親和性に影響する。結果として、ｒｔＴＡは、Ｔｃ及び他のＴｃ様化合物によって活性化される能力を失い、最大限に誘導するために、ｔＴＡ阻害に必要とされるよりも１００倍多いｄｏｘが必要となる。これらの特徴は、Ｔｅｔ−ｏｎシステムのｉｎ  ｖｉｖｏでの使用を大幅に制限する。例えば、ラットの脳においてＴｅｔ−ｏｎで制御される導入遺伝子発現を活性化するために、毒性に近い高用量のｄｏｘを含む餌をその動物に与えなければならない（Ｂａｒｏｎら、１９９７）。従って、Ｔｅｔ−ｏｎシステム、特にそのエフェクター感度を改善しなければならない。
【０００４】
以前に、Ｔｅｔシステムは、合理的に設計された変異の導入（Ｂａｒｏｎら、１９９７；Ｂａｒｏｎら、１９９９）及びＴｅｔシステムの成分のランダム突然変異誘発の後に、細菌又は酵母のアッセイシステムにおいて変異体の機能的なスクリーニングを行う指向進化（Ｇｏｓｓｅｎら、１９９５；Ｕｒｌｉｎｇｅｒら、２０００）によって最適化されている。しかしながら、これらのアプローチは、大きな労働力を要し、また、細菌又は酵母のアッセイシステムにおいて選択される変異は、必ずしも高等核生物において改善とならない。
【０００５】
現在のｒｔＴＡシステムの別の欠点は、複数回複製した後にｄｏｘ依存性が低下する危険性である。この問題は、例えば、病原体の少なくとも一部の複製がｒｔＴＡシステムの制御下であるワクチン接種での用途において生じる。そのようなワクチン接種での用途では、前記病原体からの防御は、好ましくは、限られた時間の間に、病原体の前記少なくとも一部の制御された誘導性の複製によってもたらされる。しかしながら、ｒｔＴＡシステムがそのｄｏｘ依存性を緩めてしまう場合には、病原体の前記少なくとも一部は、恒常的に複製され、その結果、病原性の核酸及び／又はタンパク質が過剰となり、安全性の問題に関わることになる。様々な回数のｒｔＴＡの増幅が関連する他の用途においても同種の問題が生じる。従って、現在のｒｔＴＡシステムの遺伝的安定性の改善が望まれる。
【非特許文献１】Ａｋａｇｉ  Ｋ，Ｋａｎａｉ  Ｍ，Ｓａｙａ  Ｈ，Ｋｏｚｕ  Ｔ，Ｂｅｒｎｓ  Ａ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｗｉｔｈ  Ｅ２Ｆ４  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００１  Ｆｅｂ  １５；２９（４）：Ｅ２３
【非特許文献２】Ａｕｅｒｓｐｅｒｇ，Ｎ．（１９６４）．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｐｏｄｉｐｌｏｉｄ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．３２：１３５−１６３．
【非特許文献３】Ｂａｃｋ，Ｎ．Ｋ．，Ｍ．Ｎｉｊｈｕｉｓ，Ｗ．Ｋｅｕｌｅｎ，Ｃ．Ａ．Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｂ．Ｏ．Ｏｕｄｅ  Ｅｓｓｉｎｋ，Ａ．Ｂ．ｖａｎ  Ｋｕｉｌｅｎｂｕｒｇ，Ａ．Ｈ．ｖａｎ  Ｇｅｎｎｉｐ，ａｎｄ  Ｂ．Ｂｅｒｋｈｏｕｔ．１９９６．Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ３ＴＣ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ＨＩＶ−Ｉ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｅ  ｔｏ  ａ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ  ｄｅｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：４０４０−４０４９．
【非特許文献４】Ｂａｒｏｎ，Ｕ．，Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９７）．Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ：ｎｏｖｅｌ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｇｒａｄｅｄ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２７２３−２７２９．
【非特許文献５】Ｂａｒｏｎ，Ｕ．，Ｓｃｈｎａｐｐｉｎｇｅｒ，Ｄ．，Ｈｅｌｂｌ，Ｖ．，Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．，Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．，ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９９）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｉｎ  ｈｉｇｈｅｒ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ  ｂｙ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｇｅｎｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１０１３−  １０１８．
【非特許文献６】Ｂａｒｏｎ，Ｕ．，ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．（２０００）．Ｔｅｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ−ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｄｖａｎｃｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２７：４０１−４２１．
【非特許文献７】Ｂｅｒｅｎｓ，Ｃ，ａｎｄ  Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．（２００３）．Ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ．Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ  ｏｆ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｈａｐｅ  ＴｅｔＲ  ｆｏｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３１０９−３１２１．
【非特許文献８】Ｂｅｒｋｈｏｕｔ  Ｂ，Ｄａｓ  ＡＴ，Ｂｅｅｒｅｎｓ  Ｎ  （２００１）  ＨＩＶ−１  ＲＮＡ  ｅｄｉｔｉｎｇ，ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：７．
【非特許文献９】Ｂｅｒｋｈｏｕｔ  Ｂ  ａｎｄ  ｄｅ  Ｒｏｎｄｅ  Ａ  （２００４）  ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ  ｖｅｒｓｕｓ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ＡＩＤＳ  １８：１８６１−１８６３．
【非特許文献１０】Ｄａｓ，Ａ．Ｔ．，Ｋｌａｖｅｒ，Ｂ．，Ｋｌａｓｅｎｓ，Ｂ．Ｉ，ｖａｎ  Ｗａｍｅｌ，Ｊ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｋｈｏｕｔ，Ｂ．（１９９７）．Ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｈａｉｒｐｉｎ  ｍｏｔｉｆ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒ−Ｕ５  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ＲＮＡ  ｇｅｎｏｍｅ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２３４６−２３５６
【非特許文献１１】Ｄａｓ，Ａ．Ｔ．，Ｋｌａｖｅｒ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｋｈｏｕｔ，Ｂ．（１９９９）．Ａ  ｈａｉｒｐｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ＲＮＡ  ｇｅｎｏｍｅ  ｉｓ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ  ｉｎ  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：８１−９１
【非特許文献１２】Ｄａｓ，Ａ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４ａ）．Ｖｉｒａｌ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｔｏｏｌ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１８７７６−１８７８２．
【非特許文献１３】Ｄａｓ，Ａ．Ｔ．，Ｖｅｒｈｏｅｆ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｋｈｏｕｔ，Ｂ．（２００４ｂ）．Ａ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏｗａｒｄ  ａｎ  ＨＩＶ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３８８：３５９−  ３７９．
【非特許文献１４】Ｄｅｕｓｃｈｌｅ，Ｕ．，Ｗ．Ｋ．Ｍｅｙｅｒ，ａｎｄ  Ｈ．Ｊ．Ｔｈｉｅｓｅｎ．１９９５．Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  −ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．ＭｏＩ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５：１９０７−１９１４．
【非特許文献１５】Ｆｏｒｓｔｅｒ，Ｋ．，Ｖ．Ｈｅｌｂｌ，Ｔ．Ｌｅｄｅｒｅｒ，Ｓ．Ｕｒｌｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｗｉｔｔｅｎｂｕｒｇ，ａｎｄ  Ｗ．Ｈｉｌｌｅｎ．１９９９．Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  −ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｂａｓａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：７０８−７１０．
【非特許文献１６】Ｆｒｅｕｎｄｌｉｅｂ，Ｓ．，Ｃ．Ｓｃｈｉｒｒａ−Ｍｕｌｌｅｒ，ａｎｄ  Ｈ．Ｂｕｊａｒｄ．１９９９．Ａ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．１：４−１２．
【非特許文献１７】Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）．Ｔｉｇｈｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１．
【非特許文献１８】Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．，Ｆｒｅｕｎｄｌｉｅｂ，Ｓ．，Ｂｅｎｄｅｒ，Ｇ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｇ．，Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．，ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９５）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１７６６−１７６９．
【非特許文献１９】Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．（２００１）．Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｉｎ  Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （Ｍ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｗ．Ｈｉｌｌｅｎ，ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，Ｅｄｓ．），ｐｐ．１３９−１５７．Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂａｓｅｌ．
【非特許文献２０】Ｈｅｌｂｌ，Ｖ．ａｎｄ  Ｗ．Ｈｉｌｌｅｎ．１９９８．Ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴｅｔＲ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ｔｅｔ  ｏｐｅｒａｔｏｒ  ４Ｃ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２７６：３１３−３１８．
【非特許文献２１】Ｈｅｌｂｌ，Ｖ．，Ｂ．Ｔｉｅｂｅｌ，ａｎｄ  Ｗ．Ｈｉｌｌｅｎ．１９９８．Ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴｅｔＲ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ｔｅｔ  ｏｐｅｒａｔｏｒ  ６Ｃ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２７６：３１９−３２４．
【非特許文献２２】Ｈｅｎｓｓｌｅｒ，Ｅ．Ｍ．，Ｏ．Ｓｃｈｏｌｚ，Ｓ．Ｌｏｃｈｎｅｒ，Ｐ．Ｇｍｅｉｎｅｒ，ａｎｄ  Ｗ．Ｈｉｌｌｅｎ．２００４．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｔｅｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｔｏ  ｏｐｔｉｍｉｚｅ  ａ  ｎｅｗ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：９５１２−９５１８．
【非特許文献２３】Ｈｉｎｒｉｃｈｓ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｅｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ−ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：４１８−４２０．
【非特許文献２４】Ｋａｍｐｅｒ  ＭＲ，Ｇｏｈｌａ  Ｇ，Ｓｃｈｌｕｔｅｒ  Ｇ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ  （ｒｔＴＡ）  ｖａｒｉａｎｔ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ａｃｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００２  Ａｐｒ  ２４；５１７（１−３）：１１５−２０
【非特許文献２５】Ｋｅｕｌｅｎ  Ｗ，Ｂａｃｋ  ＮＫ，ｖａｎ  Ｗｉｊｋ  Ａ，Ｂｏｕｃｈｅｒ  ＣＡ，Ｂｅｒｋｈｏｕｔ  Ｂ  （１９９７）  Ｉｎｉｔｉａｌ  ａｐｐｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  １８４Ｉｌｅ  ｖａｒｉａｎｔ  ｉｎ  ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｂｉａｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７１：３３４６−３３５０．
【非特許文献２６】Ｋｅｕｌｅｎ  Ｗ，Ｂｏｕｃｈｅｒ  Ｃ，Ｂｅｒｋｈｏｕｔ  Ｂ  （１９９６）  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｃａｎ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｔｈｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ  ３１：４５−５７．
【非特許文献２７】Ｋｉｓｋｅｒ，Ｃ，Ｈｉｎｒｉｃｈｓ，Ｗ．，Ｔｏｖａｒ，Ｋ．，Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．，ａｎｄ  Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｗ．（１９９５）．Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｏｒｍｅｄ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｔｅｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ａｎｄ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  −Ｍｇ２＋  ｒｅｖｅａｌｓ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２４７：２６０−２８０
【非特許文献２８】Ｋｒａｕｌｉｓ，Ｐ．Ｊ．（１９９１）．ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ：ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｂｏｔｈ  ｄｅｔａｉｌｅｄ  ａｎｄ  ｓｃｈｅｍａｔｉｃ  ｐｌｏｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２４：９４６−９５０
【非特許文献２９】Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｃ，Ｂｅｒｅｎｓ，Ｃ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ａ．，Ｓｃｈｎａｐｐｉｎｇｅｒ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．（２００３）．Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｔｅｔ  ｔｒａｎｓｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．３１  Ｎｏ．１２：３０５０−  ３０５６．
【非特許文献３０】Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｃ，Ａ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｃ．Ｄａｎｋｅ，Ｗ．Ｈｉｌｌｅｎ，ａｎｄ  Ｃ．Ｂｅｒｅｎｓ．２００４．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｌｌｏｗ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｇｅｎｅ  ３３１：１２５−１３１．
【非特許文献３１】Ｍａｒｚｉｏ，Ｇ．，Ｖｅｒｈｏｅｆ，Ｋ．，Ｖｉｎｋ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｋｈｏｕｔ，Ｂ．（２００１）．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ，ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＨＩＶ  ｆｏｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：６３４２−６３４７．
【非特許文献３２】Ｍａｒｚｉｏ，Ｇ．，Ｍ．Ｖｉｎｋ，Ｋ．Ｖｅｒｈｏｅｆ，Ａ．ｄｅ  Ｒｏｎｄｅ，ａｎｄ  Ｂ．Ｂｅｒｋｈｏｕｔ．２００２．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ａ  ｆｉｎｅ−ｔｕｎｅｄ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：３０８４−３０８８．
【非特許文献３３】Ｍｅｒｒｉｔｔ，Ｅ．Ａ．，ａｎｄ  Ｂａｃｏｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９７）．Ｒａｓｔｅｒ３Ｄ：Ｐｈｏｔｏｒｅａｌｉｓｔｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｐｈｉｃｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７７：５０５−５２４
【非特許文献３４】Ｍｉｋａｅｌｉａｎ，Ｉ，ａｎｄ  Ｓｅｒｇｅａｎｔ，Ａ．（１９９２）．Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  ｆａｓｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：３７６
【非特許文献３５】Ｐｅｄｅｎ，Ｋ．，Ｍ．Ｅｍｅｒｍａｎ，ａｎｄ  Ｌ．Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ．１９９１．Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｎ  ｐａｓｓａｇｅ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｅｓ  ｏｆ  ＨＩＶ−  １ＬＡＩ，ＨＩＶ−１ＭＡＬ，ａｎｄ  ＨＩＶ−１ＥＬＩ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８５：６６１−  ６７２．
【非特許文献３６】Ｓｃｈｏｌｚ，Ｏ．，Ｍ．Ｋｏｓｔｎｅｒ，Ｍ．Ｒｅｉｃｈ，Ｓ．Ｇａｓｔｉｇｅｒ，ａｎｄ  Ｗ．Ｈｉｌｌｅｎ．２００３．Ｔｅａｃｈｉｎｇ  ＴｅｔＲ  ｔｏ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ａ  ｎｅｗ  ｉｎｄｕｃｅｒ．Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．３２９：２１７−２２７．
【非特許文献３７】Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．Ｄ．，Ｓｈａｔｓｋｙ，Ｍ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｐ．Ｓ．，Ｗａｒｎｋｅ，Ｒ．，Ｌｉｎｋ，Ｍ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｇｌａｄｅｒ，Ｂ．Ｅ．（１９８４）．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４４：５６５７−５６６０．
【非特許文献３８】Ｕｒｌｉｎｇｅｒ，Ｓ．，Ｂａｒｏｎ，Ｕ．，Ｔｈｅｌｌｍａｎｎ，Ｍ．，Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｔ．，Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．（２０００）．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐａｃｅ  ｆｏｒ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ：ｎｏｖｅｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｙｉｅｌｄ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｒａｎｇｅ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７（１４）：７９６３−７９６８．
【非特許文献３９】Ｖｅｒｈｏｅｆ，Ｋ．，Ｇ．Ｍａｒｚｉｏ，Ｗ．Ｈｉｌｌｅｎ，Ｈ．Ｂｕｊａｒｄ，ａｎｄ  Ｂ．Ｂｅｒｋｈｏｕｔ．２００１．Ｓｔｒｉｃｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｗｉｔｃｈ：Ｔｅｔ  ｆｏｒ  Ｔａｔ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：９７９−９８７．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ｒｔＴＡ及び単鎖ｒｔＴＡ変異体を提供することである。好ましくは、ｒｔＴＡ及び単鎖ｒｔＴＡ変異体は少なくとも１つの改良された特性を有する態様で提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、目的の核酸配列を誘導的に発現させる方法であって、遺伝子誘導発現系に使用可能な状態で連結された目的の前記核酸配列を含んでなる核酸構築物を準備するステップであって、ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列を含んでなり、前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、ｒｔＴＡのアミノ酸位９、及び／又は１９、及び／又は３７、及び／又は５６、及び／又は６７、及び／又は６８、及び／又は１３８、及び／又は１５７、及び／又は１７１、及び／又は１７７、及び／又は１９５においてコドン変異を含んでなるステップと、
適切な発現系に前記核酸構築物を導入するステップと、
目的の前記核酸配列を誘導発現させるステップを含んでなる方法の提供に関する。
【０００８】
本発明では、ｒｔＴＡ核酸の上述したコドンの少なくとも１つの変異又は単鎖ｒｔＴＡによって、（ｓｃ  ｒｔＴＡ）核酸が現在使用されるＴｅｔ−ｏｎシステム（例えばＧｏｓｓｅｎその他（１９９５）、Ｕｒｌｉｎｇｅｒその他（２０００）、及びＫｒｕｅｇｅｒその他（２００３）と比較して、改良されたｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡ活性化物質が得られる。本発明のｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡ変異体を使用することにより、改良されたｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡシステムが提供され、現在使用されるｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡシステムと比較して、誘導物質の非存在下で高い及び／又は低い転写活性、高いｄｏｘ−感受性、高い遺伝的安定性を有する。誘導物質の非存在下で転写のレベルは、本願明細書ではベース活性と称する。更に、ドキシサイクリン以外の抗生物質によって誘導されるｒｔＴＡ及びｓｃ  ｒｔＴＡシステムが提供される。ゆえに、ｒｔＴＡの使用法及び／又は本発明のｓｃ  ｒｔＴＡは、目的の核酸配列を誘導発現させるのに好適である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
好ましい実施態様は、前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、ｒｔＴＡのアミノ酸位１２、及び／又は８６、及び／又は２０９のコドン変異を更に有する方法の提供に関する。かかる更なる変異により、得られるｒｔＴＡ及びｓｃ  ｒｔＴＡシステムの改良された特徴が得られることが明らかとなった。
【００１０】
単鎖ｒｔＴＡ（ｓｃ  ｒｔＴＡ）とは、ｒｔＴＡ二量体と同様のトランス制御特性（質的な意味、量的な意味ではない）を有するモノマー種のことを指す。前記ｓｃ  ｒｔＴＡは、２つのＴｅｔＲ部分と１つの真核生物由来の調節領域とを有するのが好ましい。前記２つのＴｅｔＲ部分は好ましくはリンカーによって各々に連結し、前記リンカーは好ましくは長く十分な可撓性を有する（ＳＧ４）５リンカーをコードする配列を含み、２つのＴｅｔＲタンパク質の分子内アセンブリを可能にする。単鎖Ｔｅｔトランスレギュレーターの非限定的な例は、Ｋｒｕｅｇｅｒその他（２００３）に記載されている。単鎖ｔＴＡ及び／又は単鎖ｒｔＴＡを生成するための方法は、３０５０ページ（最後のパラグラフ）及び３０５１ページに記載されており、本願明細書に援用する。これらの方法は、ｓｃ  ｒｔＴＡを生成させる非限定的な例である。
【００１１】
本発明によれば、本発明のｒｔＴＡ二量体トランスレギュレーター変異に対応するｓｃ  ｒｔＴＡの変異により、改良されたｓｃ  ｒｔＴＡが得られる。ｓｃ  ｒｔＴＡの変異は、ｓｃ  ｒｔＴＡの変異がｒｔＴＡのアミノ酸位９、１２、１９、３７、５６、６７、６８、８６、１３８、１５７、１７１、１７７、１９５及び／又は２０９の位置のアミノ酸残基をコードするコドンと対応するとき、本発明のｒｔＴＡ二量体の変異に対応する。
【００１２】
目的の核酸配列を誘導発現するとは、本願明細書では、目的の核酸の発現が少なくとも１つの誘導物質によって少なくとも部分的に影響されることを意味する。ゆえに、前記発現系に投与する誘導物質の量を制御することによって、目的の前記核酸配列の発現量を制御できる。前記誘導物質は好ましくは外因の化合物を含み、それは前記化合物が前記発現系の中で天然に存在しないことを意味する。好ましくは、目的の核酸配列の発現は誘導物質の存在に依存する。これは、前記核酸が誘導物質の存在下で発現されることを意味し、その一方で、前記誘導物質の非存在下では有意に少ない程度で発現されることを意味する。好ましくは前記核酸配列は、前記誘導物質が存在しないときは基本的に発現されない。
【００１３】
前記誘導性の核酸発現系が目的の前記核酸配列を発現できるとき、目的の核酸配列は、誘導性の核酸発現系に使用可能な状態で連結されているという。好ましくは前記目的の核酸配列は、ｔｅｔＯ−を含んでなるプロモータの制御下である。目的の前記核酸の発現は誘導物質が不在で少なくとも部分的に阻害されが、なぜなら、ｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡは誘導物質が不在であるとき、ｔｅｔＯ誘導発現を活性化させないからである。ｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡは、誘導物質の存在下で、目的の前記核酸のｔｅｔＯ誘導発現を活性化させることが可能である。
【００１４】
本発明のｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸配列とは、ｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸配列がｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡ配列（Ｕｒｌｉｎｇｅｒその他（２０００）、Ｄａｓその他（２００４）、Ｋｒｕｅｇｅｒその他（２００３））に由来するものと定義され、詳細には、本発明のｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡ配列は少なくとも１つの変異を有する。本発明では好適には、図１９に示す少なくとも１つの変異をｒｔＴＡ配列に導入する。本発明では好ましくは、前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列は、ｒｔＴＡをコードする核酸配列と比較し、図１９に示すような、少なくとも１つの変異又は変異の組合せを有する。
【００１５】
ｒｔＴＡ核酸及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸が様々な方法で本発明の変異により提供される。例えば部位特異的変異導入を介して、本発明に係るｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸に人工的に少なくとも１つの変異を導入することが可能である。人工的に特異的な変異を導入する様々な方法は公知技術で、更なる説明をここで必要としない。一旦変異又は本発明による変異の組合せが導入されると、本発明のｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸は好ましくは更に増幅される。本発明はまた、かかる変異を含んでなる増幅されたｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡの提供にも関する。本発明のｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸配列が利用できるならば、もはや人工的に本発明による変異を導入する必要はないことが明らかである。なぜなら、本発明の変異は増幅の間保持されるからである。
【００１６】
ｒｔＴＡ／ｓｃ  ｒｔＴＡ核酸のコレクションから、本発明に係る少なくとも１つの変異を有するｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡを選択することが可能でもある。例えば、非特異的変異をｒｔＴＡ／ｓｃ  ｒｔＴＡ核酸のコレクションに導入し、本発明による少なくとも１つの変異を含んでなる核酸分子を選抜する（任意に増幅の後）。好ましい実施態様において、本発明のｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸は、進化及び淘汰法を介して増幅されたｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡのコレクションから選択される。本発明の変異によりｒｔＴＡ／ｓｃ  ｒｔＴＡ核酸に少なくとも１つの効果か提供されるため、かかる効果を基礎として本発明の変異を有する核酸を選択することが可能となる。例えば、ｄｏｘの感受性強化に関与する本発明の変異は、ｄｏｘの非常に少ない量を使用して選抜することができる。遺伝子誘導発現系を、ｄｏｘの非常に少ない量によってインキュベートし、感受性が高い発現系を選抜する。別の例としては、低いベース活性に関与する本発明の変異は、誘導物質の非存在下で非常に低い活性を有する誘導性の核酸発現系を選抜することにより得られる。
【００１７】
一実施形態では、本発明の少なくとも１つの変異を有するｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸を作製し選抜するため、強制的進化を用いてもよい。かかる方法では、ｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡの増幅は、変異の導入を含む方法により実施される。これは、ウイルスを含んでなるリボゾームリボ核酸のゲノムを使用して好ましくは実施される。その理由は、それらの複製機構（例えば逆転写酵素（ＲＴ）酵素又はＲＮＡポリメラーゼ酵素による）ではエラーが発生する傾向が見られるため、変異した核酸配列が得られ易くなるからである。それにより、変異ｒｔＴＡ／ｓｃ  ｒｔＴＡ核酸分子を作製できる。かかる変異型の核酸配列が本発明による変異を含む場合、当該核酸は、本発明の変異のない核酸配列より有利である。その結果、本発明による少なくとも１つの変異を含んでなる核酸分子は、本発明の変異のない核酸分子より大きくなる。その結果、本発明による少なくとも１つの変異を含んでなるｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸は容易に選抜される。
【００１８】
好ましい一実施形態では、強制的進化法（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ−１（ＨＩＶ−１）ゲノム（国際公開第０１／２００１３号、２１ページ、５−２８行目）用いる。国際公開第０１／２００１３号の強制的進化法の説明は、本願明細書に援用する。
【００１９】
本発明では、ｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡ変異体は「Ｘ［数］Ｙ」と表記するが、Ｘは現在使用されるｒｔＴＡ活性化物質に存在するアミノ酸残基を表し、［数］は前記ｒｔＴＡの前記アミノ酸残基の位置を表し、Ｙは前記変異体の前記位置に存在するアミノ酸残基を表す。例えば、Ｖ９Ｉは、ｒｔＴＡのアミノ酸位９でバリン残基の代わりにイソロイシン残基を含む変異体を意味する。複数変異を含んでなる変異体は、複数のＸ［数］Ｙにより表される。ゆえに、変異体Ｖ９Ｉ  Ｆ６７Ｓ  Ｒ１７１Ｋ  Ｆ８６Ｙは、ｒｔＴＡの９位置のアミノ酸がバリンの代わりにイソロイシン、ｒｔＴＡのアミノ酸位６７でフェニルアラニンの代わりにセリン、ｒｔＴＡの１７１位置のアミノ酸がアルギニンの代わりにリジン、ｒｔＴＡのアミノ酸位８６でフェニルアラニンの代わりにチロシンを含む変異体を意味する。
【００２０】
本発明のどの変異、又は本発明のどの変異の組合せを具体的なアプリケーションで使用するかは、例えば希望する効果に依存する。例えば、脳への誘導性のインビボ導入遺伝子の場合は、感受性が高いｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸の発現が特に要求されるが、それは少量の誘導物質のみが脳血液関門を通過できるからである。かかるアプリケーションでは、本発明による変異を有するｒｔＴＡ／ｓｃ  ｒｔＴＡ核酸は、少なくとも改良された感受性をもたらすものが望ましい。その場合、変異体Ｖ９Ｉ  Ｆ６７Ｓ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ、Ｖ９Ｉ  Ｆ６７Ｓ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｖ９Ｉ  Ｆ６７Ｓ  Ｅ１５７Ｋ  Ｆ８６Ｙ、Ｖ９Ｉ  Ｆ６７Ｓ  Ｅ１５７Ｋ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｖ９Ｉ  Ｆ６７Ｓ  Ｒ１７１Ｋ  Ｆ８６Ｙ、Ｖ９Ｉ  Ｆ６７Ｓ  Ｒ１７１Ｋ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｅ３７Ｑ  Ｆ６７Ｓ  Ｆ８６Ｙ、Ｅ３７Ｑ  Ｆ６７Ｓ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｖ９Ｉ  Ｃ６８Ｒ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ、Ｖ９Ｉ  Ｃ６８Ｒ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｖ９Ｉ  Ｇ１９Ｍ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ、Ｖ９Ｉ  Ｇ１９Ｍ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｖ９Ｉ  Ｅ３７Ｑ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ、Ｖ９Ｉ  Ｅ３７Ｑ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｖ９Ｉ  Ｇ１９Ｍ  Ｆ６７Ｓ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ、Ｖ９Ｉ  Ｇ１９Ｍ  Ｆ６７Ｓ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｖ９Ｉ  Ｓ１２Ｇ  Ｆ６７Ｓ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ、Ｖ９Ｉ  Ｓ１２Ｇ  Ｆ６７Ｓ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｖ９Ｉ  Ｆ６７Ｓ  Ｃ６８Ｒ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ及び／又はＶ９Ｉ  Ｆ６７Ｓ  Ｃ６８Ｒ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔが好ましい。なぜなら、これらの変異体がｒｔＴＡと比較して、１００倍以上のドキシサイクリン感受性を有し、但し誘導物質の非存在下でごく低いベース活性を有するからである（図１４Ｂに示す）。誘導物質の非存在下での若干のベース活性は問題でなく、Ｖ９Ｉ  Ｇ１９Ｍ  Ｆ６７Ｓ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ及び／又はＶ９Ｉ  Ｇ１９Ｍ  Ｆ６７Ｓ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ  ｒｔＴＡ変異体は特に好ましいが、それはｒｔＴＡと比較して、ドキシサイクリン誘導に対して３００倍以上感受性が高いからである（図１４に示す）。
【００２１】
更に、ｒｔＴＡのアミノ酸位１９でアラニン、システイン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン又はチロシン残基を含んでなるｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡ変異体は、現在公知のｒｔＴＡと比較して、改良された転写活性を有する。前記変異体は、現在公知のｒｔＴＡと比較して、低いドキシサイクリン濃度（１０〜１００ｎｇ／ｍｌ）で増加した転写活性、及び／又は高いドキシサイクリン濃度（１００〜１０００ｎｇ／ｍｌ）で増加した転写活性を示す。本発明の一実施例はゆえに、ｒｔＴＡ配列及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ配列を含んでなる単離されたか、合成であるか、組換えアミノ酸配列の提供に関し、詳細には、ｒｔＴＡ配列及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ配列が、ｒｔＴＡの１９位置のアミノ酸において、アラニン、システイン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン又はチロシンを含んでなる。また、ｒｔＴＡ配列及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ配列をコードする配列を含んでなる単離されたか、合成であるか、組み換え型の核酸配列の提供にも関し、詳細には、ｒｔＴＡ配列及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ配列が、ｒｔＴＡのアミノ酸位１９において、アラニン、システイン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン又はチロシンを含んでなる。並びに、当該核酸配列を使用した目的の核酸配列の誘導発現方法の提供にも関する。
【００２２】
ｒｔＴＡのアミノ酸位３７でシステイン、メチオニン、グルタミン、アルギニン又はトレオニン残基を含んでなるｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡ変異体は、現在公知のｒｔＴＡと比較して、改良された転写活性を有する。前記変異体は、現在公知のｒｔＴＡと比較して、低いドキシサイクリン濃度（１０〜１００ｎｇ／ｍｌ）で増加した転写活性、及び／又は高いドキシサイクリン濃度（１００〜１０００ｎｇ／ｍｌ）で増加した転写活性を示す。本発明の一実施例はゆえに、ｒｔＴＡ配列及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ配列を含んでなる単離されたか、合成であるか、組換えアミノ酸配列の提供に関し、詳細には、ｒｔＴＡ配列及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ配列は、アミノ酸３７位置においてシステイン、メチオニン、グルタミン、アルギニン又はトレオニン残基を有する。ｒｔＴＡ配列及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ配列をコードする配列を含んでなる単離されたか、合成であるか、組み換え型の核酸配列（ｒｔＴＡ配列及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ配列は、ｒｔＴＡのアミノ酸位３７でシステイン、メチオニン、グルタミン、アルギニン又はトレオニン残基を含む）が、本発明の方法への前記核酸配列の使用と同様に、目的の核酸配列の誘導発現に使用できる。
【００２３】
本発明のｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸を、目的の核酸配列（病原から派生）の制御発現を含んでなる予防接種に用いる場合、ベース活性が最小限であることは重要である。目的の前記病原性核酸の連続的な存在に結びつくため、誘導物質の非存在下における目的の病原性核酸の発現は望ましくない。そのような場合、生物体は病原性の核酸で協力に曝露されるため、免疫系の疾患及び／又は目的の前記病原性核酸に対する寛容などを生じさせることとなる。寛容が誘導される場合、前記病原体による次の侵入からの保護が減弱する。生存する病原体の複製がｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡシステムによって誘導的に制御される場合、ベース活性を回避することは少なくとも部分的には重要である。前記病原体の連続複製は多くの病原体の拡散の危険性を増大させ、疾患をもたらす。予防接種目的では、非常に低いベース活性（存在するとしても）を有する本発明のｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ変異体が好適である。このような場合、変異体Ｆ６７Ｓ  Ｆ８６Ｙ、Ｆ６７Ｓ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ、Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｅ１５７Ｋ  Ｆ８６Ｙ、Ｅ１５７Ｋ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｒ１７１Ｋ  Ｆ８６Ｙ、Ｒ１７１Ｋ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ、Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｖ９Ｉ  Ｅ１５７Ｋ  Ｆ８６Ｙ、Ｖ９Ｉ  Ｅ１５７Ｋ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｖ９Ｉ  Ｒ１７１Ｋ  Ｆ８６Ｙ、Ｖ９Ｉ  Ｒ１７１Ｋ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｆ１７７Ｌ  Ｆ８６Ｙ、Ｆ１７７Ｌ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｆ６７Ｓ  Ｆ１７７Ｌ  Ｆ８６Ｙ、Ｆ６７Ｓ  Ｆ１７７Ｌ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｃ１９５Ｓ  Ｆ８６Ｙ、Ｃ１９５Ｓ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｇ１３８Ｓ  Ｆ８６Ｙ、Ｇ１３８Ｓ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｃ６８Ｒ  Ｆ８６Ｙ、Ｃ６８Ｒ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｆ６７Ｓ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ、Ｆ６７Ｓ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｆ６７Ｓ  Ｅ１５７Ｋ  Ｆ８６Ｙ、Ｆ６７Ｓ  Ｅ１５７Ｋ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｆ６７Ｓ  Ｒ１７１Ｋ  Ｆ８６Ｙ、Ｆ６７Ｓ  Ｒ１７１Ｋ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｖ９Ｉ  Ｆ６７Ｓ  Ｒ１７１Ｋ  Ｆ８６Ｙ、Ｖ９Ｉ  Ｆ６７Ｓ  Ｒ１７１Ｋ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｓ１２Ｇ  Ｆ６７Ｓ  Ｆ８６Ｙ、Ｓ１２Ｇ  Ｆ６７Ｓ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｇ１９Ｍ  Ｆ６７Ｓ  Ｆ８６Ｙ及び／又はＧ１９Ｍ  Ｆ６７Ｓ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔが好ましくは用いられる。これらの変異体は、０．１％以下の非常に低いベース活性を有する。最も好ましくはＶ９Ｉ  Ｆ６７Ｓ  Ｒ１７１Ｋ  Ｆ８６Ｙ及び／又はＶ９Ｉ  Ｆ６７Ｓ  Ｒ１７１Ｋ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ  ｒｔＴＡ変異体が用いられる。それらはｒｔＴＡ（図１４に示す）と比較して、１００倍以上のドキシサイクリン感受性を有するため、これらの変異体は非常に低いベース活性を有し、非常に感受性が高い。
【００２４】
本発明は更に、変化した誘導物質特異性を有するｒｔＴＡ及びｓｃ  ｒｔＴＡ変異体の提供に関する。例えばドキシサイクリン以外の抗生物質に誘導性であるｒｔＴＡ及びｓｃ  ｒｔＴＡ変異体の提供に関する。ゆえに、テトラサイクリン（Ｔｃ）及びミノサイクリン（ｍｃ）のようなｄｏｘ以外の化合物は野生型ｒｔＴＡを効果的に活性化させないにもかかわらず、本発明はこれらの抗生物質の少なくとも１つによって誘導されうる変異体が提供される。これは特にテトラサイクリンが誘導物質として適切である場合に効果を提供する。なぜなら、ドキシサイクリンより安価であるからである。更に、ドキシサイクリン以外の抗生物質によって誘導されうる本発明のｒｔＴＡ及びｓｃ  ｒｔＴＡ変異体は、ドキシサイクリンでなく、ドキシサイクリン以外の少なくとも１つの抗生物質によって誘導性されうる、改変された特異性を有するｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ変異体の開発に適している。図１５は、本発明に係る、野生型ｒｔＴＡ及びＦ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ変異体を除く、テトラサイクリン及び／又はミノサイクリンに反応する好ましい変異体示す。
【００２５】
本発明はゆえに、図１５にて図示するように、Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ変異（もちろん野生型変異体を除く）に係る変異又は変異の組合せを含むｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列を含んでなる、単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列の提供に関する。また、目的の核酸配列のテトラサイクリン誘導性及び／又はミノサイクリン誘導性の発現への、少なくとも１つの前記核酸配列の使用も提供される。
【００２６】
好ましくは、変異体Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｃ６８Ｒ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｇ１９Ｍ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｅ３７Ｑ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｇ１９Ｍ  Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｓ１２Ｇ  Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ及び／又はＣ６８Ｒ  Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔが、目的の核酸配列のテトラサイクリン誘導発現のために用いられる。なぜなら、これらの変異体は特にテトラサイクリンに対する感受性が高く、少量のテトラサイクリンで遺伝子発現の誘導に充分なことを意味するからである。最も好ましくは、変異体Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｃ６８Ｒ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ及び／又はＳ１２Ｇ  Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔが目的の核酸配列のテトラサイクリン誘導発現に用いられるが、その理由は、これらの変異体はテトラサイクリンのために非常に感受性が高く、いかなるエフェクタの非存在下でも低いバックグラウンド活性を示すからである。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、変異体Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｅ１５７Ｋ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｒ１７１Ｋ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｆ６７Ｓ  Ｅ３７Ｑ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｃ６８Ｒ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｇ１９Ｍ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｅ３７Ｑ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｇ１９Ｍ  Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｓ１２Ｇ  Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ及び／又はＣ６８Ｒ  Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔが目的の核酸配列のミノサイクリン誘導発現のために用いられるが、これらの変異体は特にミノサイクリンに対する感受性が高いため、少量のミノサイクリンで遺伝子発現の誘導が充分可能となる。最も好ましくは、変異体Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｆ６７Ｓ  Ｅ３７Ｑ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｃ６８Ｒ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ及び／又はＳ１２Ｇ  Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔが目的の核酸配列のミノサイクリン誘導発現のために用いられるが、その理由は、これらの変異体は、ミノサイクリンのために非常に感受性が高く、いかなるエフェクターの非存在下でも低いバックグラウンド活性を示すからである。
【００２８】
本発明は更に、遺伝的に安定であるｒｔＴＡ及びｓｃ  ｒｔＴＡ変異体の提供に関する。現在使用される誘導性のＴｅｔ−ｏｎシステムは、目的の核酸配列を構成的に発現しているシステムに変化する危険性を有する。例えば、病原体の複製がＴｅｔ−ｏｎシステムにより制御させる場合、これは回避するのが好ましい。前記病原体の構成的な複製は多くの病原体の発生を生じさせ、疾患及び／又は寛容の危険性を生じさせる。
【００２９】
本発明によれば、誘導物質依存性の低下が少なくとも部分的に防止されるように、ｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸を含んでなる遺伝子誘導発現系の遺伝的安定性はｒｔＴＡのアミノ酸位１９、３７及び／又は５６（及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡの対応するコドン）でコドンを変えることにより改良される。現在使用されるｒｔＴＡ及びｓｃ  ｒｔＴＡの誘導物質依存性の減少及び／又は損失は、ｒｔＴＡのアミノ酸位１９、３７及び／又は５６における少なくとも１つの変異（例えば例えばＧ１９Ｅ、Ｅ３７Ｋ、Ｅ３７Ａ、Ｅ３７Ｓ及び／又はＰ５６Ｓ変異）から生じる。本発明によれば、グルタミン酸残基によるｒｔＴＡのアミノ酸位１９のグリシン残基の置換は、少なくともｒｔＴＡ／ｓｃ  ｒｔＴＡの誘導物質依存性の部分的な損失をもたらす。更に、リジン、アラニン又はセリン残基によるｒｔＴＡのアミノ酸位３７のグルタミン酸残基の置換は、少なくともｒｔＴＡ／ｓｃ  ｒｔＴＡの誘導物質依存性の部分的な損失をもたらす。更に、セリン、チロシン、システイン、ヒスチジン、アスパラギン、アラニン又はグリシンによるｒｔＴＡのアミノ酸位５６のプロリン残基の置換は、少なくともｒｔＴＡ／ｓｃ  ｒｔＴＡの誘導物質依存性の部分的な損失をもたらす。本発明はゆえに、現在使用されるｒｔＴＡ／ｓｃ  ｒｔＴＡと比較して、少なくとも誘導物質依存性の部分的な損失に結びつく自然変異が生じることが少ない改変ｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸の提供に関する。かかる変異体は、以下のパラグラフにて説明するようにして得られる。
【００３０】
現在使用されるｒｔＴＡでは、Ｇ１９Ｅ変異は、コドン１９の１つのヌクレオチド変化（すなわち、ＧＡＡに対するコドン変化ＧＧＡ）のみを必要とする。ＧからＡへの変異は、リボゾームリボ核酸の逆転写において最も頻繁に生じるエラーである。本発明によれば、ｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡの誘導物質依存性の減少及び／又は損失は、グルタミン酸コドンに変異しにくい位置１９におけるコドン変異を用いて、少なくとも部分的に防止される。これは、グルタミン酸コドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なる位置１９のコドンを用いて好ましくは実施される。かかるコドンが用いられる場合、望まれていないＧ１９Ｅ変異はずっと困難な２部位での変異を必要とすると考えられる。ゆえに、ｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸がグルタミン酸コドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡ位置１９のコドンを用いるとき、望ましくないＧ１９Ｅ変異は現在使用されるＴｅｔ−ｏｎシステムと比較して進化する傾向が少ない。ゆえに誘導物質依存性の減少及び／又は損失は、少なくとも部分的に防止される。ゆえに本発明は、前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列がグルタミン酸コドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位１９のコドンを含む方法の提供に関する。
【００３１】
別の一実施形態では、位置１９で他のグリシンコドンが用いられ、当該グリシンコドンは、グルタミン酸コドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なる。この実施形態では、現在使用されるｒｔＴＡに存在するＧＧＡの代わりに、他のグリシンコドンＧＧＵ又はＧＧＣが用いられる。Ｇ１９Ｅ変異はこの実施形態では非常に困難であるが、その理由は、ＧＧＵ→ＧＡＡ、ＧＧＵ→ＧＡＧ、ＧＧＣ→ＧＡＡ又はＧＧＣ→ＧＡＧの変異が必要だからである。ゆえに、それらの全てのケースで２部位での変異が必要となる。これが発生する確率が低いため、この実施形態では他のグリシンコドンによっては、ｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡはその誘導物質依存性を失うとは考えられない。この実施態様による他のグリシンコドンが用いられるときに、ｒｔＴＡの得られるアミノ酸残基又はｒｔＴＡ位置１９のｓｃ  ｒｔＴＡ活性化物質は現在使用されるｒｔＴＡ及びｓｃ  ｒｔＴＡ核酸でコードされる活性化物質と同様である。ゆえに本発明の好ましい実施態様では、前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列にが、グルタミン酸コドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位１９のグリシンコドンが含まれる方法の提供に関する。
【００３２】
より好ましい態様では、ｒｔＴＡのアミノ酸位１９でアラニン、システイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンコドンを含み、グルタミン酸コドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸が、用いられる。この実施態様による核酸は、遺伝的に安定であるのみならず、Ｇ１９Ｗ変異体を除いて、ドキシサイクリンへの感受性がより高い。ゆえに本発明の１つの実施形態では、前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、グルタミン酸コドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なる、ｒｔＴＡのアミノ酸位１９におけるアラニン、システイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンコドンを含んでなる方法の提供に関する。グルタミン酸コドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位１９の適切なコドンは、コドンＵＵＮ（ＮはＧ、Ａ、Ｕ又はＣ（フェニルアラニン又はロイシンをコード））、ＵＣＮ（セリン）、ＵＡＹ（ＹはＵ又はＣに対応、チロシン）、ＵＧＵ（システイン）、ＵＧＣ（システイン）、ＵＧＧ（トリプトファン）、ＣＵＮ（ロイシン）、ＣＡＹ（ヒスチジン）、ＣＧＮ（アルギニン）、ＡＵＮ（イソロイシン又はメチオニン）、ＡＣＮ（トレオニン）、ＡＡＹ（アスパラギン）、ＡＧＮ（セリン又はアルギニン）、ＧＵＹ（バリン）及びＧＣＹ（アラニン）である。
【００３３】
他の好ましい例として、本発明による方法は提供された前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列は、ｒｔＴＡのアミノ酸位１９でシステイン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、セリン又はトレオニンコドンを含み、グルタミン酸コドンから３つのヌクレオチドにおいて異なる。３つの変異がＧ１９Ｅ変異体を生成するために必要とされるため、かかる変異体は遺伝的に特に安定である。グルタミン酸コドンから少なくとも３つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位１９の適切なコドンは、コドンＵＵＹ（ＹはＵ又はＣに対応、フェニルアラニンをコード）、ＵＣＹ（セリン）、ＵＧＹ（システイン）、ＣＵＹ（ロイシン）、ＣＧＹ（アルギニン）、ＡＵＹ（イソロイシン）、ＡＣＹ（トレオニン）及びＡＧＹ（セリン）である。
【００３４】
また、アラニン、リジン及びセリンコドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位３７でコドンを含んでなるｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸も提供される。かかる変異体を使用する場合、自然発生的なＥ３７Ｋ、Ｅ３７Ａ及びＥ３７Ｓは、非常に稀な２部位変異を必要とするため、現在使用されるｒｔＴＡ／ｓｃ  ｒｔＴＡと比較して変異が発生しにくい。結果として、誘導物質依存性の低下が少なくとも部分的に回避される。ゆえに本発明は、前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列がアラニン、リジン又はセリンコドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位３７でコドンを含む方法の提供に関する。アラニン、リジン又はセリンコドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位３７の適切なコドンは、コドンＣＵＮ（ロイシンをコード、ＮはＵ、Ｃ、Ａ又はＧ）、ＣＡＵ、ＣＡＣ（ＣＡＵ及びＣＡＣはヒスチジンをコード）、ＣＧＡ及びＣＧＧ（ＣＧＡ及びＣＧＧはアルギニンをコード）である。ゆえに、ｒｔＴＡのアミノ酸位３７で核酸配列を含んでなるコドンＣＵＮ、ＣＡＵ、ＣＡＣ、ＣＧＡ又はＣＧＧをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードするｒｔＴＡが好ましくは提供される。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態では、前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、グルタミン酸コドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位１９のコドンと、アラニン、リジン又はセリンコドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位３７のコドンを含んでなる方法の提供に関する。かかる変異体は特に遺伝的に安定であるが、なぜなら、自然発生的なＧ１９Ｅ、Ｅ３７Ｋ、Ｅ３７Ａ及びＥ３７Ｓ変異が少なくとも部分的に防止されるからである。
【００３６】
ｒｔＴＡのアミノ酸位５６におけるコドン変異を含んでなるｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸により、安定性が強化される。ドキシサイクリンの非存在下で、ｒｔＴＡ変異体はｒｔＴＡのアミノ酸位５６でアミノ酸残基変異を有して、ドキシサイクリンにもはや依存しない変異体に進化しうることが明らかとなった。ゆえに本発明は、誘導物質の非存在下で転写活性を媒介するｒｔＴＡのアミノ酸位５６のコドンから少なくとも１つのヌクレオチド（好ましくは塩基転換）において異なるコドンを含む、ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡを含んでなる単離されたか、組換えであるか、合成核酸配列の提供に関する。前記ドキシサイクリンに依存しない大部分のｒｔＴＡ変異体は、セリン、チロシン、システイン、ヒスチジン、アスパラギン、アラニン又はプロリンの代わりに位置５６でグリシン残基を有する。少なくとも部分的にかかる変異体の進化を回避するため、ｒｔＴＡのアミノ酸位５６でグルタミンをコードするＣＡＡ又はＣＡＧコドン、リジンをコードするＡＡＡ又はＡＡＧコドンを含むｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ符号化核酸の提供が好適である。
【００３７】
塩基転換とは、ピリミジンへのプリンの置換、又はプリンへのピリミジンの置換と本願明細書では定義される。塩基転換は、他のプリンのプリンへの置換又は他のピリミジンのピリミジンへの置換と比較して、自然進化の間に発生しにくい。ゆえに、ｒｔＴＡのアミノ酸位５６において、セリン、チロシン、システイン、ヒスチジン、アスパラギン、アラニン又はグリシン残基をコードするコドンから少なくとも１つの塩基転換において異なるコドンを含む、ｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡをコードする核酸配列は、現在のｒｔＴＡ及びｓｃ  ｒｔＴＡと比較して遺伝的に安定である。
【００３８】
本発明では、ｒｔＴＡのアミノ酸位９、１９、３７、５６、６７、６８、１３８、１５７、１７１、１７７及び／又は１９５で少なくとも１つの変異するコドンを有するｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸は、現在利用可能なＴｅｔ−ｏｎシステムと比較し少なくとも１つの改良された特徴を有する。好ましくは、本発明による方法は、前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は、単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、イソロイシンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位９でコドン、及び／又はアラニン、システイン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１９のコドン、及び／又はリジン又はグルタミンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位５６でトレオニン、ヒスチジン、ロイシン、アルギニン、システイン、メチオニン又はグルタミン及び／又はコドンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位３７のコドン、及び／又はセリンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位６７のコドン、及び／又はアルギニンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位６８のコドン、及び／又はチロシンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位８６のコドン、及び／又はアスパラギン酸又はセリンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１３８のコドン、及び／又はリジンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１５７のコドン、及び／又はリジンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１７１のコドン、及び／又はロイシンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１７７のコドン、及び／又はセリンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１９５のコドン、及び／又はトレオニンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位２０９のコドンを含んでなる。特に核酸の誘導発現系の少なくとも１つの特性が改良されるため、これらの変異のいずれか、又はそれらのいかなる組合せも好適である。
【００３９】
ｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡを改良するため、ｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡをコードする核酸配列に、１つの本発明に係る変異を導入すれば十分である。しかしながら好ましくは、本発明による少なくとも２つの変異が導入されが、その理由は、更なる本発明の少なくとも２つの変異の組合せはｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡの少なくとも１つの特性を改良するからである。更に好ましい実施態様において、ｒｔＴＡ核酸及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸は、本発明による最低３つの変異を含んでなる。最も好ましくは、ｒｔＴＡ核酸及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸は、本発明による最低４つの変異を含んでなる。
【００４０】
図１４において、本発明によるｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡの様々な好ましい変異体を示す。これらの変異体は特に遺伝子誘導発現系用に好適である。ゆえに、更なる本発明の態様では、前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列（図１４にて示す少なくとも１つの変異体を含む）を用いる方法の提供に関する。好ましい一実施形態では、目的の核酸配列は、ｒｔＴＡ変異体Ｖ９Ｉ  Ｇ１９Ｍ  Ｆ６７Ｓ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙによって、及び／又は変異体Ｖ９Ｉ  Ｇ１９Ｍ  Ｆ６７Ｓ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔによって誘導発現される。これらの変異体は、現在使用されるｒｔＴＡと比較して、ドキシサイクリンに対する感受性が約３８５倍高い。ゆえにこれらの変異体は、特に誘導物質を少ない量で用いる用途に利用でき及び／又は望ましい（例えば脳における導入遺伝子の発現）。他の好ましい例として、目的の核酸配列は、ｒｔＴＡ変異体Ｖ９Ｉ  Ｆ６７Ｓ  Ｒ１７１Ｋ  Ｆ８６Ｙによって、及び／又は変異体Ｖ９Ｉ  Ｆ６７Ｓ  Ｒ１７１Ｋ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔによって誘導発現される。これらの変異体は、ベース活性が非常に低い（約０．１％）と同時に、現在使用されるｒｔＴＡと比較して、ドキシサイクリンに対する感受性が約１００倍高い。ゆえに、これらの変異体は特にドキシサイクリン感受性が要求され、その一方でベース活性が望ましくないアプリケーション（例えば病原体の誘導発現）に適している。
【００４１】
本発明による変異は更に、他のｒｔＴＡ、及び／又は、ＴｅｔＲ由来分子（ｒｔＴＡ及びｓｃ  ｒｔＴＡ以外）の少なくとも１つの特徴を改善することに適している。かかる代わりのｒｔＴＡ及び／又はＴｅｔＲから派生した分子は例えば、他の転写活性化領域（例えば［アカギその他２００１］及び［カンパーその他２００２］）、又は活性化領域が転写リプレッサ領域によって置換されている転写サイレンサ（ｔＴＳ、例えば［Ｄｅｕｓｃｈｌｅその他１９９５］）、又はｔＴＡ転写活性化物質（エフェクタの非存在下で活性で、エフェクタによって抑制される）（Ｇｏｓｓｅｎ及びＢｕｊａｒｄ、１９９２）を含んでなる。
【００４２】
本発明によるｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸配列及び／又は代わりの分子を含んでなるいかなる誘導性の核酸発現系も、目的の核酸配列の誘導発現に適している。インビボ並びにｅｘ  ｖｉｖｏにおける使用が可能である。一実施形態では、原核生物の核酸発現系が用いられる。目的の前記核酸は好ましくは真核生物発現系において発現される。なぜなら、単純疱疹ウイルスのＶＰ１６活性化領域を含んでなるｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ配列は特に真核細胞のｔｅｔＯ含有プロモータからの核酸発現の制御に適しているからである。本発明では、ｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸配列及び代わりの分子は、下等真核生物発現系での使用に適している。更に、本発明によるｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸配列及び代わりの分子は、由来したその高等真核生物発現系の使用に適している。一実施形態では、誘導される目的の前記核酸及び／又は代わりの分子は、哺乳動物細胞において発現される。
【００４３】
原則として、目的のいかなる核酸配列も、本発明による核酸発現系によって誘導発現される。例えば、本発明による遺伝子誘導発現系のための適切なアプリケーションは、タンパク質医薬、目的の（病原性の）遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ誘導発現、トランスジェニック動物における治療タンパク質の産生などが挙げられる。一実施形態では、ウイルス又はレプリコンの複製にとって重要な少なくとも１つのウイルス配列が本発明の核酸発現系によって誘導発現される。これは特にウイルス病原体に対する少なくとも部分保護効果を得るための予防接種目的に適している。有効な免疫反応を得るために前記ウイルス又はレプリコンを複製することは重要であるが、前記複製が前記免疫反応のために必要なレベルを越えないことも重要でもある。レプリコンとは、適切な環境（例えば受容細胞）において複製ができる核酸分子として定義されるが、その理由は、かかる環境における複製のための全ての必要な部材を有するからである。我々はレプリコンと称するが、なぜなら第一の病原体のヌクレオチド配列に必ずしも直接由来しないからである。
【００４４】
本発明のｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸配列の制御下のウイルス又はレプリコンの複製にとって重要な少なくとも１つのウイルス配列を配置することによって、前記ウイルス又はレプリコンは複製を制御される。そのレベルを超える複製が見られない良好な免疫反応を誘引するために必要な複製の量は、したがって、本発明の核酸誘導発現系に投与される誘導物質の量を制御することにより制御される。リークを防止するために、かかる制御下の必須遺伝子の組合せを有するのが好ましい。より好ましくは少なくとも２つの異なるリプレッサ／活性化物質の組合せを有することであるが、複製のための複数の必須遺伝子を更に有するのがより好ましい。大部分の（ウイルス性の）病原物質では、多くの遺伝子は複製に必要であるが、それらのほとんどは、「マスター（親）スイッチ」と称される、通常初期遺伝子、通常トランス活性化のための遺伝子のセットを有する。リプレッサ／活性化物質による直接制御中に提供する第１の候補は当然、かかるマスタースイッチであり、それにより間接的に他の必須遺伝子の複製が制御される。しかし、少なくとも１つの他の必須遺伝子を誘導性リプレッサ／活性化物質の制御下に置くのが好適である。
【００４５】
少なくとも一実施形態では、複製にとって重要なＨＩＶゲノムの一部は、本発明のｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸配列の制御下で誘導発現される。これは、現在公知の方法と比較して、例えば改良されたエイズ予防に適している。本一実施形態では、ＨＩＶゲノムが単一の転写単位の制御下であるため、親スイッチは必要とでない。
【００４６】
ｒｔＴＡ核酸配列及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸配列（本発明による少なくとも１つの変異を含んでなる前記ｒｔＴＡ核酸配列及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸配列）を含んでなる核酸配列は、多種多様なアプリケーションにおいて有用である。前記核酸配列は核酸配列の誘導発現系への使用に特に適している。したがって本発明は、ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列を含んでなる単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列を提供に関し、当該ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列は、ｒｔＴＡのアミノ酸位９、及び／又は１９、及び／又は３７、及び／又は５６、及び／又は６７、及び／又は６８、及び／又は１３８、及び／又は１５７、及び／又は１７１、及び／又は１７７、及び／又は１９５においてコドン変異を有する。更なる一実施形態では、前記核酸配列には、ｒｔＴＡのアミノ酸位１２及び／又は８６及び／又は２０９のコドン変異を有する。かかる模倣の組合せを含んでなる核酸配列は、現在公知のｒｔＴＡと比較して改良されている。
【００４７】
好ましい実施態様において、現在使用されるＴｅｔ−ｏｎシステムと比較した改良された遺伝的安定性を有する本発明の核酸配列が提供される。例えばウイルス病原体又はレプリコンの複製制御の間、特に本発明の核酸配列の複数回の増幅を含んでなる用途において好適である。上記したように、グルタミン酸コドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位１９のコドン、アラニン、リジン又はセリンコドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡ位置３７のコドン、及び／又はリジン又はグルタミンをコードするｒｔＴＡ位置５６のコドンを有するｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸配列を設計することにより、遺伝的安定性が改良される。本発明は更に、前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列は、グルタミン酸コドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位１９でコドン、アラニン、リジン又はセリンコドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡ位置３７のコドン、及び／又はリジン又はグルタミンをコードするｒｔＴＡ位置５６のコドンを含む単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列の提供に関する。一実施形態では、前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列には、グルタミン酸コドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位１９のグリシンコドンを含んでなり、それにより、生じるｒｔＴＡ位置１９のｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡ活性化物質のアミノ酸残基は、現在使用されるｒｔＴＡ及びｓｃ  ｒｔＴＡ核酸でコードされる活性化物質と同様である。
【００４８】
好ましくは、グルタミン酸コドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位１９で、アラニン、システイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンコドンを含むｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸が用いられる。この実施態様による核酸は、現在使用されるＴｅｔ−ｏｎシステムと比較して、遺伝的により安定であるのみならず、Ｇ１９Ｗ変異体を除いて、ドキシサイクリンに対する感受性が高い。好ましい一実施形態では、前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が、アラニン、リジン又はセリンコドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なる、ｒｔＴＡのアミノ酸位３７のロイシン、ヒスチジン又はアルギニンコドンを含む、本発明による単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列の提供に関する。
【００４９】
更なる好ましい実施態様は、本発明による単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列の提供に関し、詳細には、前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列は、誘導物質の非存在下で転写活性を媒介するコドンから少なくとも１つのヌクレオチド（好ましくは塩基転換）において、ｒｔＴＡのアミノ酸位５６で異なるコドンを含む。ｒｔＴＡのアミノ酸位５６の前記コドンは、好ましくはグルタミン又はリジン残基をコードする。
【００５０】
本発明は好ましくは、位置１９、３７及び５６からなる群から選択される少なくとも２つのｒｔＴＡのアミノ酸位で本発明に係るコドンを含む、単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列の提供に関する。本発明は好ましくは、グルタミン酸コドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位１９のコドン、並びに、アラニン、リジン又はセリンコドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡ位置３７のコドンを含む、単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列の提供に関する。本発明は更に、グルタミン酸コドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位１９のコドン、並びに、ｒｔＴＡ位置５６でリジン又はグルタミンをコードするコドンを含む、単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列の提供に関する。本発明は更に、アラニン、リジン又はセリンコドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡ位置３７でのコドン、及びリジン又はグルタミンをコードするｒｔＴＡ位置５６でのコドンを含む、単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列の提供に関する。
【００５１】
最も好ましくは本発明による単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列は、ｒｔＴＡのアミノ酸位１９、３７及び５６において本発明のコドンを有する。ゆえに好ましい実施態様は、グルタミン酸コドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡのアミノ酸位１９のコドン、アラニン、リジン又はセリンコドンから少なくとも２つのヌクレオチドにおいて異なるｒｔＴＡ位置３７のコドン、及びリジン又はグルタミンをコードするｒｔＴＡ位置５６のコドンを含む本発明の単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列の提供に関する。
【００５２】
上記のように、本発明に係る核酸配列は、好ましくはｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡをコードする核酸配列であって、前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列は、イソロイシンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位９のコドン、及び／又はアラニン、システイン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１９のコドン、及び／又はトレオニン、ヒスチジン、ロイシン、アルギニン、システイン、メチオニン又はグルタミンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位３７のコドン、及び／又はリジン又はグルタミンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位５６のコドン、及び／又はセリンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位６７のコドン、及び／又はアルギニンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位６８のコドン、及び／又はチロシンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位８６のコドン、及び／又はアスパラギン酸又はセリンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１３８のコドン、及び／又はリジンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１５７のコドン、及び／又はリジンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１７１のコドン、及び／又はロイシンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１７７のコドン、及び／又はセリンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位１９５のコドン、及び／又はトレオニンをコードするｒｔＴＡのアミノ酸位２０９のコドンを含んでなる。これらの各々の変異は、特に核酸の誘導発現系の少なくとも１つの特性を改良するため、好適である。ゆえに、これらの変異の１つ以上の組み合わせが、本発明の核酸配列に存在するのが好適である。
【００５３】
本発明は更に、前記ｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列が図１４に示す少なくとも１つの変異体を含む、単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列の提供に関する。
【００５４】
本発明による核酸配列は、好ましくは公表（ゴッセンその他１９９５、Ｕｒｌｉｎｇｅｒその他２０００、クルーガーその他２００３）されているｒｔＴＡ又はｓｃ  ｒｔＴＡをコードする核酸配列と比較して、少なくとも１つの変異を含むｒｔＴＡをコードする核酸配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡをコードする核酸配列、及び／又は、図１９において示す配列を含んでなる。
【００５５】
本発明は更に、本発明による核酸配列でコードされる単離された、合成された若しくは組換え型のアミノ酸配列の提供に関する。前記アミノ酸配列は好ましくは、ｒｔＴＡ配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡ配列の位置９のイソロイシン、及び／又は位置１９のアラニン、システイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン、トリプトファン又はチロシン、及び／又は位置３７のトレオニン、ヒスチジン、ロイシン、アルギニン、システイン、メチオニン又はグルタミン、及び／又は位置５６のリジン又はグルタミン、及び／又は位置６７のセリン、及び／又は位置６８のアルギニン、及び／又は位置８６のチロシン、及び／又は位置１３８のアスパラギン酸又はセリン、及び／又は位置１５７のリジン、及び／又は位置１７１のリジン、及び／又は位置１７７のロイシン、及び／又は位置１９５のセリン、及び／又は位置２０９のトレオニンを含む、ｒｔＴＡ配列及び／又は単鎖ｒｔＴＡ配列である。これらの各々の変異は、特にｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ活性化物質に少なくとも１つの改良された特性を与える。
【００５６】
上記したように、本発明の核酸配列でコードされる本発明及び／又はアミノ酸配列の核酸配列は、特に目的の核酸配列を誘導発現することに適している。同時に、目的の核酸配列の誘導発現のための、本発明の単離された、合成された若しくは組換え型の核酸配列及び／又はアミノ酸配列の使用も提供される。
【００５７】
好ましくは前記アミノ酸配列には上述した変異の少なくとも１つが含まれる。
【００５８】
更に本発明に係る核酸配列を含んでなるベクターも提供される。かかるベクターは様々なアプリケーションに適している。例えば、治療的に有益な核酸配列を含んでなる本発明のベクターは、治療的なアプリケーションに適している。その必要の個人に対するかかるベクターの投与は、インビボ前記治療的な核酸配列の発現をもたらす。もちろん前記ベクターはまた、目的の核酸配列の生体外発現を含んでなるアプリケーションにおいて有用である。特定の核酸配列を有するベクターを構築する方法は公知技術である。本発明のベクターを生成することに適しているベクターの非限定的な例は、レトロウイルス及びレチノウイルスのベクターである。
【００５９】
本発明はまた、前記核酸配列の直接的又は間接的な制御下での複製に必要な核酸配列及び少なくとも１つのウイルス配列からなる、誘導性のウイルスレプリコンの提供にも関する。上記のようにレプリコンとは、適切な環境（例えば受容細胞）において複製ができる核酸分子として定義されるが、その理由は、かかる環境における複製のための全ての必要な部材を有するからである。我々はレプリコンと称するが、なぜなら、例えば一本鎖ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルスなどの場合、最初の病原体のヌクレオチド配列に必ずしも直接由来しないからである。通常、核酸操作の便宜上、二本鎖ＤＮＡの形態が好適である。ゆえに、好ましいレプリコンは、それらのライフサイクルの少なくとも１つのステージにおいて二本鎖ＤＮＡ核酸である。
【００６０】
レプリコンはまた、実際の病原体又は比較的その弱毒生ワクチンにおいて、核酸以外の物質を含んでもよい。核酸は通常、ウイルス粒子にパッケージングされる。ゆえに、本発明によるレプリコンは好ましくは機能性パッケージングシグナルもコードし、それにより、野生型形態（レトロウイルス、その他の場合ではリボゾームリボ核酸）の核酸がウイルス粒子にパックされることが可能となる。宿主における複製が可能なレプリコンであるためには、前記レプリコンはまた、エンベロープ及び／又はカプシドのタンパク質などの構造遺伝子を有することが好ましい。本発明において、ウイルスレプリコンの誘導物質依存性を強化及び／又は少なくとも一部の誘導物質依存性の損失を防止するために、本発明による誘導性のウイルスレプリコンは好ましくは、前記核酸配列による直接的又は間接的な制御における複製に必要な全てのウイルス配列を含んでなる。
【００６１】
本発明のウイルスレプリコンは、少なくともそのゲノムの一部がＤＮＡ形態で存在するステージを有するいかなるウイルスに由来してもよく、それにより、Ｔｅｔ−ｏｎ機構による目的の核酸の発現制御が可能となる。かかるウイルスとしては、例えばＤＮＡウイルス及びレトロウイルスが挙げられる。一実施形態では、前記誘導性のレプリコンの前記ウイルス配列の少なくとも一部は、リボゾームリボ核酸である。
【００６２】
好ましい一実施形態では、本発明によるレプリコンは、ヒト免疫不全ウイルスに由来する。本発明によるレプリコンは、本発明において、ＨＩＶに由来するレプリコンに関する好ましい実施態様によって更に例証される。しかしながら本発明は、他の病原微生物に由来するレプリコンを適用してもよい。
【００６３】
通常は、ＨＩＶに由来する本発明のレプリコンは、ＨＩＶ系統の伝染性の二本鎖ＤＮＡクローンである。好ましくは前記ＨＩＶ系統は、すでに弱毒化された系統であるか、又は例えば変異導入（例えば官能基欠失）によって弱毒化（本願明細書に記載）して調製してもよい。原則として、誘導性のいかなるリプレッサ／活性化エレメントも本発明に適用できる。二重若しくはそれ以上の誘導性制御の場合、単一のリプレッサ／活性化物質のリークは重要ではないが、基本的にリークは好ましくない。安全のために、自殺遺伝子を有するレプリコンの提供が有利である。それらの遺伝子は、野生型ウイルスなどによる免疫反応又はレスキューにとり必要な範囲を越えて複製されるような、不必要な効果が発生する場合に活性化されうる。かかる自殺遺伝子は例えばＨＳＶ−ｔｋである。それはガンシクロビル又は同様の機能性物質を添加することにより誘発されうる。誘導により、前記自殺遺伝子は感染細胞を殺し、このことにより他の細胞の更なる複製及び感染が阻害される。したがって、本発明の更にもう１つの好ましい実施態様では、自殺遺伝子を更に含む本発明に係るレプリコンの提供に関する。
【００６４】
ＨＩＶレプリコン及び／又は得られるウイルスを減らすため、レプリコンはＴＡＲ−エレメントの機能を欠失させた状態で提供することが好ましい。したがって、本発明の更にもう１つの好ましい実施態様では、不活性ＴＡＲエレメントを更に含んでなる本発明に係るレプリコンの提供に関する。
【００６５】
本発明によるＨＩＶレプリコンを減らすために、機能的にＴａｔエレメントを削除するのが好ましい。したがって、本発明はまた、不活性Ｔａｔエレメントを更に含んでなる本発明に係るレプリコンの提供に関する。好ましくは、上記の両方の部材は機能的に削除される。機能性欠失とは、レプリコンの複製機能が少なくとも部分的に阻害されることを意味する。複製のための必須遺伝子は通常、完全に機能不全であってはならない。
【００６６】
抑制を取り除くか又は活性化因子を活性化するのに必要となるタンパク質は、必須遺伝子の上流に存在し、好ましくは本発明によるレプリコンによってコードされ、好ましくは非必須遺伝子に挿入される。したがって、本発明の好ましい実施態様では、前記誘導性のリプレッサ及び／又は活性化物質の少なくとも１つの機能部分、好ましくはｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡ核酸配列を有するレプリコンを、ｎｅｆ遺伝子に挿入する。機能部分とは、この場合当然ながら、必須遺伝子を制御するエレメントを活性化させることができるいかなるタンパク質性物質をも指す。好ましくは、前記タンパク質性物質をコードする配列のためにスペースを作成する。したがって、本発明はまた、少なくともｎｅｆ遺伝子の一部が挿入の余地をつくるために削除されている、本発明に係るレプリコンの提供に関する。
【００６７】
更なる本発明の態様では、更にレプリコンを減らすため、野生株ウイルスのエレメントを機能的に削除してもよい。したがって、更なる本発明の態様では、少なくとも１つのＮＦ−ｋＢエレメントが削除された、本発明に係るレプリコンの提供に関する。活性化モティーフがｔｅｔＯのモティーフである（好ましくはＬＴＲに存在する）ことが好ましい。したがって、本発明また、少なくとも１つの機能性ＬＴＲの少なくとも１つのｔｅｔＯモティーフを含む、本発明に係るレプリコンの提供に関する。
【００６８】
必須遺伝子の前に複数のエレメントを挿入するのも好ましい。したがって、本発明はまた、少なくとも２、４、６、又は８個のかかる部材を、少なくとも１つの機能性ＬＴＲ内に含むレプリコンの提供に関する。
【００６９】
少なくとも１つのＬＴＲが修飾されるのが好ましく、それにより野生型ウイルスへの復帰が回避される。
【００７０】
更なる本発明の態様は、レプリコンを使用して依存性のウイルスを作製する方法に関し、すなわち、複製を可能にするためにウイルスは誘導物質を必要とすることを意味している。したがって本発明は、複製誘導物質に依存性のウイルスの作製方法の提供に関し、当該方法は詳細には、本発明のレプリコンを有する受容細胞を準備し、前記誘導物質の存在下で前記細胞を培養し、前記培養組織から前記依存性のウイルスを回収することを特徴とする。また、かかる方法は好ましくはＨＩＶに適用される。したがって本発明は、前記依存性のウイルスがヒト免疫不全ウイルス（好ましくは弱毒化ウイルス）である方法の提供に関する。
【００７１】
一実施形態では、当該誘導物質はドキシサイクリン又はその機能性類似体である。他の実施形態ではしかしながら、当該誘導物質は、ドキシサイクリン以外の抗生物質（好ましくはテトラサイクリン及び／又はミノサイクリン）である。上記したように、テトラサイクリン及び／又はミノマイシン依存性が要求される場合、本発明のレプリコンは好ましくは、野生型ｒｔＴＡ及びＦ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ変異体を除いて、図１５にて図示する変異又は変異の組合せを含んでなる核酸配列をコードするｒｔＴＡ及び／又はｓｃ  ｒｔＴＡを含んでなる。
【００７２】
好ましくは、これらのレプリコンが特にテトラサイクリン感受性が高いため、変異Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｃ６８Ｒ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｇ１９Ｍ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｅ３７Ｑ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｇ１９Ｍ  Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｓ１２Ｇ  Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ及び／又はＣ６８Ｒ  Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔを含んでなる本発明のレプリコンが、目的の核酸配列のテトラサイクリン誘導発現のために用いられ、少量のテトラサイクリンが遺伝子発現の誘導に充分なことを意味する。最も好ましくは、変異Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｃ６８Ｒ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ及び／又はＳ１２Ｇ  Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔを含んでなる本発明のレプリコンが目的の核酸配列のテトラサイクリン誘導発現のために用いられる。なぜなら、これらのレプリコンはテトラサイクリンに非常に感受性が高く、エフェクタの非存在下で低いバックグラウンド活性を示すからである。
【００７３】
別の好ましい実施例では、変異Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｅ１５７Ｋ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｒ１７１Ｋ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｆ６７Ｓ  Ｅ３７Ｑ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｃ６８Ｒ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｇ１９Ｍ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｅ３７Ｑ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｇ１９Ｍ  Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｓ１２Ｇ  Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ及び／又はＣ６８Ｒ  Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔを含んでなる本発明によるレプリコンが、目的の核酸配列のミノサイクリン誘導発現のために用いられる。なぜなら、これらのレプリコンは特にミノサイクリンに対する感受性が高く、少量のミノサイクリンが遺伝子発現の誘導に充分であることを意味する。最も好ましくは、変異Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｆ６７Ｓ  Ｅ３７Ｑ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ、Ｃ６８Ｒ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ及び／又はＳ１２Ｇ  Ｆ６７Ｓ  Ｖ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄ  Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔを含んでなる本発明のレプリコンが目的の核酸配列のミノサイクリン誘導発現において用いられるが、その理由は、これらのレプリコンがミノサイクリンに対して非常に感受性が高く、エフェクタの非存在下で低いバックグラウンド活性を示すからである。
【００７４】
また本発明は、前記方法により製作されるウイルスの提供に関する。したがって、本発明はまた、入手できる複製誘導物質に依存性のウイルス（好ましくは弱毒化ヒト免疫不全ウイルス）の提供に関する。本発明によるレプリコン及び／又はウイルスを製作する方法は公知技術である。例えば、ＨＩＶに由来し、ｒｔＴＡ配列及びＴｅｔＯエレメントを含んでなる誘導性のウイルスレプリコン及びその作製方法の非限定的な例としては、に国際公開第０１／２００１３号（９ページ、第１３行〜１８ページ、第２７行）に記載されている。これらの方法及び使用は本発明に援用する。
【００７５】
本発明によるレプリコン及び／又はウイルスは免疫化及び予防接種に特に適している。本発明によるレプリコン及び／又はウイルスを患者に投与し、当該患者体内で前記レプリコン及び／又はウイルスが複製制御され、前記患者における免疫反応がもたらされる。前記レプリコン又はウイルスの複製及び、その結果誘導される免疫反応は、誘導物質の存在及び／又は量を制御することにより制御される。一実施形態では、免疫反応が患者において誘導され、それにより本発明の前記レプリコン又はウイルスが由来する種類のウイルスによる感染に対する少なくとも部分的が前記患者の防御がなされる。他の実施態様では、結合化合物（例えば例えば抗体及び／又はＴ細胞）及び／又はかかる結合化合物を製作できる細胞（例えばＢ細胞）を産生させるために、ヒト以外の動物において免疫反応を誘導してもよい。前記抗体、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞（又は機能部分及び／又はその核酸）は、例えばモノクローナル抗体の産生のために回収し、更に使用してもよい。
【００７６】
免疫化及び／又は予防接種を含んでなる様々な代替的な方法及びアプリケーションが公知である。かかる方法及びアプリケーションにおける、本発明によるレプリコン及び／又はウイルスの使用もまた、本発明の範囲内である。
【００７７】
したがって本発明は、本発明のレプリコン及び／又は本発明のウイルスを含んでなる免疫原性組成物の提供に関する。また本発明による核酸配列を含んでなる免疫原性組成物の提供にも関する。本発明の免疫原性組成物は、好ましくは適切なアジュバント及び／又は担体を含んでなる。アジュバント及び担体は公知である。例えば、アルミン酸ナトリウム及び／又は生理食塩水溶液が用いられる。
【００７８】
更なる一実施形態では、前記免疫原性組成物には、一定量の誘導物質が含有される。しかしながらこれは必須ではない（誘導物質はいつでも投与できるため）。好ましい一実施形態では、前記免疫原性組成物は、本発明による前記レプリコン又はウイルスが由来するウイルスに対する完全な防御機構を誘導できるワクチンを含んでなる。これは、本発明による前記レプリコン又はウイルスが由来するウイルスによる次の感染症が、疾患に基本的に結びつかないことを意味する。
【００７９】
免疫原性組成物又はワクチンは単回投与形態であってもよいが、少なくとも１つの誘導物質を別に含んでなってもよく、又は、任意にアジュバント及び／又は誘導物質と共に、食塩水などの液体賦形剤中に再調製したレプリコン及び／又はウイルスから即座に調製してもよい。ウイルスワクチンは公知である。公知のワクチンに適用できる一般の経験則は、本発明の免疫原性組成物及びワクチンにも適用できる。投与量は通常、前臨床試験における、例えば誘導物質としてのドキシサイクリン量の単純な滴定によって決定できる。免疫原性組成物又はワクチンは単独で充分である場合もあるが、他の治療用及び／又は予防用化合物との組合せで用いてもよい。誘導物質を長期間にわたって投与してもよく、また断続的に投与してもよい。
【００８０】
また、本発明の好ましい免疫原性組成物及び／又はワクチンは、少なくともヒト免疫不全ウイルスへの感染の部分的な予防に用いられる。
【００８１】
エイズの少なくとも部分的な予防及び／又は治療方法を提供するという点で、本発明はまた、前記免疫原性組成物及び／又はワクチンの使用法の提供に関する。当該方法は、患者に本発明の免疫原性組成物及び／又はワクチンを投与し、前記誘導物質を提供することによって、ウイルス複製を一定時間内に生じさせることを含んでなる。好ましくはその後、上記の誘導物質の単純な再添加によってブースター免疫を行ってもよい。
【００８２】
本発明はまた、ウイルス又はウイルスレプリコンの複製制御方法の提供に関し、当該方法は、レプリコン又はウイルスによる受容細胞を準備し、前記誘導物質の存在下で前記細胞を培養し、所定用の誘導物質を添加することを含んでなる。
【００８３】
上記で説明したように、本発明のレプリコン、ウイルス及び／又は核酸配列は、目的のウイルスに対する免疫反応を誘導することに適している。前記免疫反応により、目的の前記ウイルスによる次の感染、複製及び／又は拡散を少なくとも部分的に防止できる。更に、目的の前記ウイルスによる感染症に既に罹患する患者の免疫反応を、本発明のレプリコン、ウイルス及び／又は核酸配列により強化することにより、疾患を良好な方向に好転させることができる。
【００８４】
本発明のレプリコン、ウイルス及び核酸配列はしたがって、薬剤及び／又はワクチンとしての使用に適している。ゆえに薬剤及び／又はワクチンとしての使用のための本発明によるレプリコン又はウイルスは、本発明の単離された若しくは組換型の核酸配列と同様に、薬剤及び／又はワクチンとしての使用に供される。ｒｔＴＡ及び／又は本発明のｓｃ  ｒｔＴＡ核酸の直接的又は間接的な制御下に、複製にとって必要となる少なくとも１つのＨＩＶ配列を配置することも可能である。このようにして、ＨＩＶの複製制御により、エイズの少なくとも部分的な予防及び／又は治療が可能となる。更に、本発明の単離された若しくは組換え型のレプリコン、ウイルス及び／又は核酸配列の、少なくとも部分的にエイズを予防及び／又は治療するための薬剤若しくは免疫原性組成物の調製のための使用の提供にも関する。
【００８５】
１つの更なる実施態様は、本発明の核酸配列、レプリコン及び／又はウイルスを含んでなる単離された細胞の提供に関する。
【００８６】
以下の実施例で本発明を更に詳細に説明する。これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではなく、単に本発明を例示するものに過ぎないことに留意すべきである。
【実施例】
【００８７】
＜実施例１＞
本発明者らは、以前に、複製についてｄｏｘに決定的に依存している感染性のＨＩＶ−ｒｔＴＡウイルスの構築について報告している（Ｖｅｒｈｏｅｆら、２００１；Ｄａｓら、２００４ｂ；Ｍａｒｚｉｏら、２００１）。このウイルスにおいて、天然の転写活性化因子Ｔａｔ及びそのＴＡＲ結合部位を変異により不活性化し、Ｔｅｔ−ｏｎシステムの成分で機能的に置換した（図１Ａ）。ｎｅｆ遺伝子の代わりに、転写活性化因子ｒｔＴＡをコードする遺伝子を挿入し、ｔｅｔＯ  ＤＮＡ結合部位をウイルスのＬＴＲプロモータ内に導入した。このウイルスは、ｄｏｘの非存在下で複製しない。ｄｏｘを投与すると、ｒｔＴＡは、ＬＴＲ−ｔｅｔＯプロモータからの転写を活性化し、ウイルスタンパク質の発現及びウイルスの複製が起きる。その後、ｒｔＴＡタンパク質において２つのアミノ酸が変更されたバリアントが提供された：８６位のフェニルアラニンがチロシンで置換され（Ｆ８６Ｙ）、２０９位のアラニンが、トレオニンで置換された（Ａ２０９Ｔ）（Ｄａｓら、２００４ａ）。
【００８８】
本発明者らは、最適化されたＬＴＲ−ｔｅｔＯプロモータ構造と改善されたｒｔＴＡ遺伝子の両方を含むＨＩＶ−ｒｔＴＡＦ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔバリアントの複数の独立したウイルス培養を開始した。最高２００日間、ｄｏｘ有りでウイルスを培養した後、ｒｔＴＡ遺伝子を配列決定した。解析した全ての培養物において、Ｆ８６Ｙ及びＡ２０９Ｔ変異は、安定的に維持されていた。独立した培養物由来のいくつかのウイルスは、ｒｔＴＡ遺伝子内にさらなる変異を獲得していた。ウイルスバリアントは、ウイルス集団において優勢な配列になるような複製の利点を有するはずである。ｒｔＴＡ内の変異により、ｒｔＴＡ機能が改善されうるので、ウイルスの複製が増強されうる。そのような有益な変異を同定する確率を上げるために、本発明者らは、複数の培養物において観察されるｒｔＴＡ変異に焦点を合わせた（図１Ａ及び表１）。これらの全てのアミノ酸置換は、ｒｔＴＡのＴｅｔＲ部分に存在する：Ｖ９Ｉは、ＤＮＡ結合ドメイン内のα１ヘリックス中に存在し、Ｆ６７Ｓは、α４の後のループ中に存在し、Ｇ１３８Ｄ、Ｅ１５７Ｋ及びＲ１７１Ｋは、調節コアドメインのα８−α９領域内に存在する（図１Ｂ）。Ｖ９Ｉは、個別の変異として、かつ、Ｇ１３８Ｄ、Ｅ１５７Ｋ又はＲ１７１Ｋとの組み合わせとして、見出された。Ｆ６７ＳとＲ１７１Ｋとの組み合わせも観察された。ＴｅｔＲには、７つの天然バリアント（Ａ−Ｅ、Ｇ、Ｈ）が存在し、ｒｔＴＡは、クラスＢ（ＴｅｔＲＢ）に基づくものである。興味深いことに、ＴｅｔＲＢのみが、６７位にＰｈｅを有するのに対し、ほとんどのＴｅｔＲがこの位置にＳｅｒを有する（表１）。進化したｒｔＴＡ中に観察された他のアミノ酸置換は、天然にはＴｅｔＲバリアント中に存在しなかった。
【００８９】
進化したｒｔＴＡバリアントの特徴付け：
進化したｒｔＴＡが、転写活性の改善を示すか否かを試験するために、本発明者らは、標準のＴｅｔシステムにおいてｒｔＴＡ活性をアッセイした。もとのｒｔＴＡタンパク質（野生型、これは、Ｕｒｌｉｎｇｅｒら、２０００に記載されているｒｔＴＡ２Ｓ−Ｓ２バリアントである）及び変異ｒｔＴＡタンパク質（Ｖ１−Ｖ１０、表１）をコードする発現プラスミドを構築し、ウイルスのＬＴＲ−２ΔｔｅｔＯプロモータの制御下でルシフェラーゼレポーターを発現するプラスミドを含むＣ３３Ａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に測定したルシフェラーゼレベルは、ｒｔＴＡ活性を反映する（図２Ａ）。野生型及び全ての変異ｒｔＴＡは、ｄｏｘの非存在下では活性を示さない。野生型ｒｔＴＡ活性は、５００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘで初めて検出可能となり、１０００ｎｇ／ｍｌで更に増加する。ｒｔＴＡ  Ｖ１（Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ）活性は、すでに５０ｎｇ／ｍｌのｄｏｘで検出可能であり、ｄｏｘの濃度が上がるにつれて徐々に増加する。１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘでは、Ｖ１バリアントは、野生型よりも２．５倍活性が高い。全ての変異体が、ｒｔＴＡ  Ｖ１から進化したものであるので、その活性は、このバリアントと比較されるべきである。ｒｔＴＡ  Ｖ２は、試験した最低のｄｏｘ濃度ではＶ１よりも活性が高いが、高ｄｏｘレベルではＶ１よりも活性が低い。単一のアミノ酸置換を有する他のｒｔＴＡ（Ｖ３−Ｖ６）は、低ｄｏｘレベルと高ｄｏｘレベルの両方においてＶ１よりも活性が高い。バリアントＶ７、Ｖ８及びＶ９は、Ｖ２変異と、それぞれＶ４、Ｖ５及びＶ６変異とを組み合わせたものである。これらの組み合わせは、低ｄｏｘレベルと高ｄｏｘレベルの両方においてｒｔＴＡ活性を更に改善する。Ｖ３変異とＶ６変異とを組み合わせたＶ１０バリアントは、自然に進化したバリアントの中で最も活性が高いｒｔＴＡである。従って、ウイルスの進化ストラテジーにより、野生型ｒｔＴＡ及び進化実験を開始するために使用したＶ１バリアントと比較して、転写活性及びｄｏｘ感度が増加したいくつかの新規ｒｔＴＡバリアントがもたらされた。
【００９０】
このｒｔＴＡ最適化が、ウイルスのＬＴＲ−２ΔｔｅｔＯプロモータへの特異的な適応を反映しているか否かを試験するために、本発明者らは、ルシフェラーゼ発現が７つのｔｅｔＯエレメントのアレイに結合した最小ＣＭＶプロモータの制御下であるレポーター遺伝子構築物を用いて、ｒｔＴＡ活性をアッセイした［４］。進化した全てのｒｔＴＡバリアントが、このプロモータ構築物によって活性の改善を示し（図２Ｂ）、これは、ＬＴＲ−２ΔｔｅｔＯ構築物による結果（図２Ａ）によく似たものである。従って、ｒｔＴＡ中に観察された変異は、ウイルス特異的適応ではないが、全般的なＴｅｔ−ｏｎシステムの改善である。本発明者らはまた、染色体に組み込まれたＣＭＶ−７ｔｅｔＯルシフェラーゼレポーター構築物のコピーを含むＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞［９］においてｒｔＴＡ活性をアッセイした（図２Ｃ）。これらの細胞において、進化したｒｔＴＡは、Ｃ３３Ａ細胞におけるエピソームのレポーター遺伝子構築物による活性と同様のパターンを示す。従って、これらの変異は、プロモータのタイプ及び標的遺伝子のエピソーム又は染色体の状態から独立してｒｔＴＡ活性を改善する。
【００９１】
別の方法でｒｔＴＡバリアントのｄｏｘ感度を比較するために、本発明者らは、各ｒｔＴＡバリアントが、野生型ｒｔＴＡの１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘでの活性と同様の活性に達するのに必要なｄｏｘ濃度を計算した（図３）。Ｖ１０バリアントは、この活性レベルに達するためにたった４４ｎｇ／ｍｌのｄｏｘを必要とするだけであり、これは、野生型ｒｔＴＡよりも２３倍高いｄｏｘ感度を反映する。このことから、Ｖ１０バリアントが、自然に進化したバリアントの中で最もｄｏｘ感度が高く、最もｒｔＴＡ活性が高くなる（野生型よりも活性が６．６倍高い、図３）。
【００９２】
有益な変異の組み合わせによる、ｒｔＴＡ活性の更なる改善：
進化したｒｔＴＡバリアントの解析により、二重変異体が、単一変異体よりも高い活性及びｄｏｘ感度を示すことが明らかになった。例えば、Ｖ６（Ｒ１７１Ｋ）は、野生型ｒｔＴＡよりも感度が４．４倍高く、二重変異体Ｖ９（Ｖ９ＩＲ１７１Ｋ）は、ｄｏｘ感度が１４．９倍高い。それゆえ、本発明者らは、観察された変異を組み合わせたさらなるｒｔＴＡバリアントを構築し（Ｖ１１−Ｖ１８、表１）、そしてその活性をアッセイした（図２Ｄ）。図３に示されるように、全ての組み合わせのバリアントが、自然に進化したバリアントよりも高い転写活性及びｄｏｘ感度を示す。三重変異体Ｖ１４、Ｖ１５及びＶ１６は、最も活性が高く、かつ、最もｄｏｘ感度が高いｒｔＴＡである。野生型ｒｔＴＡと比較して、これらの三重変異体は、高ｄｏｘレベルにおいて活性が７倍高く、ｄｏｘに対する感度が１００倍高い。Ｖ１５及びＶ１６バリアントは、ｄｏｘ無しでいかなる基礎活性も示さないのに対し、本発明者らは、Ｖ１４バリアントにおいて、低いが特徴的な基礎活性を頻繁に観察した（誘導したレベルの０．１％未満）。ＨＩＶ−ｒｔＴＡ進化において観察された変異を有し、転写活性及びｄｏｘ感度の改善を示す新規ｒｔＴＡバリアントのより広範なリストを図１４Ｂに示す。
【００９３】
変異ｒｔＴＡに対して、活性の増大が高いタンパク質レベルに起因して観察される可能性を排除するために、本発明者らは、ｒｔＴＡタンパク質の細胞内の定常状態レベルを決定した。ｒｔＴＡ発現プラスミドでトランスフェクトされたＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞の溶解産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ポリクローナル抗ＴｅｔＲ抗体を用いてウエスタンブロット解析を行った。自然に進化したバリアント及び構築したバリアントの全てについて、等量のｒｔＴＡタンパク質を検出した（図４及びデータ示さず）。これらの結果は、活性及びｄｏｘ感度の増大が、変異ｒｔＴＡタンパク質の内因性の特性であり、発現又はタンパク質安定性の増大に起因しないことを示唆する。
【００９４】
ｄｏｘ様化合物による、新規ｒｔＴＡバリアントの活性化：
Ｄｏｘは、Ｔｅｔ−ｏｎシステムを制御する最も有効なエフェクターである。他のｄｏｘ様化合物（例えば、テトラサイクリン（Ｔｃ）及びミノサイクリン（Ｍｃ））は、野生型ｒｔＴＡ及びもとのＨＩＶ−ｒｔＴＡウイルスを効果的に活性化しない。活性及びｄｏｘ感度が改善された新規ｒｔＴＡバリアントが、より広いエフェクター特異性を有するか否かを試験するために、本発明者らは、様々なＴｃ及びＭｃ濃度においてこれらのｒｔＴＡバリアントのサブセットの活性をアッセイした（図５）。野生型ｒｔＴＡ及びＶ１バリアントが、Ｔｃ及びＭｃによって活性化されないのに対し、変異体Ｖ３は、高濃度のＴｃ又はＭｃ（１００００ｎｇ／ｍｌ）において低レベルの活性を示す。Ｖ７の活性は、１０００ｎｇ／ｍｌのＴｃ又はＭｃにおいてすでに検出可能であり、この活性は、エフェクターレベルが高くなるにつれて増加する。Ｖ３変異とＶ７変異との組み合わせであるＶ１４は、Ｔｃ及びＭｃによって最も高い活性を示す。１００００ｎｇ／ｍｌのＴｃでの活性は、野生型ｒｔＴＡの１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘでの活性と類似している。Ｖ１４は、１０００ｎｇ／ｍｌのＭｃにおいても、１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘにおける野生型ｒｔＴＡよりも活性である。このように、本発明者らは、広範なエフェクター特異性を有するｒｔＴＡバリアントを作製した。Ｔｃ及び／又はＭｃに対して応答性である新規ｒｔＴＡバリアントのより広範なリストを図１５に示す。
【００９５】
ｒｔＴＡバリアントにおける、ＨＩＶ−ｒｔＴＡ複製の改善：
活性及びｄｏｘ感度が増大したｒｔＴＡバリアントが、ＨＩＶ−ｒｔＴＡ複製も改善することができるか否かを試験するために、本発明者らは、変異体Ｖ７又はＶ１４のいずれかをコードするｒｔＴＡ遺伝子を含むウイルスバリアントを構築し、そして様々なｄｏｘ濃度においてＳｕｐＴ１細胞におけるその複製をアッセイした（図６）。もとのＨＩＶ−ｒｔＴＡ−Ｖ１（ＨＩＶ−ｒｔＴＡ−Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ）をコントロールとして含めた。このコントロールＨＩＶ−ｒｔＴＡ−Ｖ１は、ｄｏｘの非存在下又は低ｄｏｘレベルでは複製せず、１００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘで効率的な複製が観察され、複製の速度は、１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘで更に上昇した。ＨＩＶ−ｒｔＴＡ−Ｖ７及びＨＩＶ−ｒｔＴＡ−Ｖ１４の複製もまた、完全にｄｏｘに依存していた。ＨＩＶ−ｒｔＴＡ−Ｖ７は、１ｎｇ／ｍｌのｄｏｘで低レベルの複製を示し、１０ｎｇ／ｍｌで効率的な複製を示した。ＨＩＶ−ｒｔＴＡ−Ｖ１４については、すでに１ｎｇ／ｍｌのｄｏｘにおいて高レベルの複製が明らかであった。これらの結果から、バリアントＶ７及びＶ１４が低ｄｏｘ濃度においてＨＩＶ−ｒｔＴＡの複製を著しく改善することが証明される。重要なことには、もとのＨＩＶ−ｒｔＴＡと同様に、これらのウイルスは、ｄｏｘの非存在下で複製しない。ｄｏｘの非存在下においてＶ１４バリアントで観察された低い基礎ｒｔＴＡ活性は、明らかにウイルスの複製を支持するのに十分ではない。本発明者らはまた、Ｔｃ及びＭｃの存在下でこれらの新規ＨＩＶ−ｒｔＴＡバリアントの複製をアッセイした（図７）。コントロールのＨＩＶ−ｒｔＴＡ−Ｖ１が５００ｎｇ／ｍｌのＴｃ又はＭｃの存在下で複製しなかったのに対し、ＨＩＶ−ｒｔＴＡ−Ｖ７とＨＩＶ−ｒｔＴＡ−Ｖ１４の両方ともがこれらのエフェクターによって効率的な複製を示す。これらの結果から、ｒｔＴＡバリアントのＶ７及びＶ１４が、Ｔｃ及びＭｃによって効率的に活性されうることが確かめられる。
【００９６】
結論：
ＨＩＶ−ｒｔＴＡウイルスの進化の間に観察される、ｒｔＴＡ中の９、１９、３７、６７、６８、８６、１３８、１５７、１７１、１７７、１９５及び／又は２０９位におけるアミノ酸置換によって、ｒｔＴＡの転写活性及び／又はインデューサー感度が増大する。更に、これらの変異は、ｒｔＴＡのインデューサー特異性を広げる。最適なｒｔＴＡバリアント（Ｖ１５及びＶ１６）は、もとのｒｔＴＡよりも高ｄｏｘレベルにおいて活性が７倍高く、ｄｏｘに対する感度が１００倍高い。重要なことには、これらのｒｔＴＡバリアントは、ｄｏｘの非存在下ではいかなる基礎活性も示さない。これらの新規ｒｔＴＡの高い活性及びｄｏｘ感度は、Ｔｅｔ−ｏｎシステムの性能を著しく改善する。
【００９７】
材料及び方法：
細胞培養：
ヒトＴリンパ球細胞株ＳｕｐＴ１（Ｓｍｉｔｈら、１９８４）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。ＨｅＬａ  Ｘ１／６（Ｂａｒｏｎら、１９９７）は、染色体に組み込まれたＣＭＶ−７ｔｅｔＯプロモータ／ルシフェラーゼレポーター構築物ｐＵＨＣ１３−３のコピーを含んでいる、ＨｅＬａ由来の子宮頸癌細胞株である（Ｇｏｓｓｅｎら、１９９２）。ＨｅＬａ  Ｘ１／６及びＣ３３Ａ子宮頸癌細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ３１）（Ａｕｅｒｓｐｅｒｇ，１９６４）を、１０％ＦＣＳ、基礎培地可欠アミノ酸、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地中で生育した。全ての細胞培養物を３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。
【００９８】
ウイルス複製：
ＨＩＶ−ｒｔＴＡ分子クローンの構築は、以前に報告されている（Ｖｅｒｈｏｅｆら、２００１；Ｄａｓら、２００４ｂ）。本研究で使用したＨＩＶ−ｒｔＴＡバリアントは、５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの両方に２ΔｔｅｔＯ構造を含む（Ｍａｒｚｉｏら、２００１；Ｍａｒｚｉｏら、２００２）。ＳｕｐＴ１細胞（５×１０６）を、エレクトロポレーション（２５０Ｖ及び９７５μＦ）によって５μｇのＨＩＶ−ｒｔＴＡ分子クローンでトランスフェクトした。ウイルスの複製を、ドキシサイクリン（ｄｏｘ，Ｄ−９８９１，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、テトラサイクリン（Ｔｃ，Ｓｉｇｍａ  Ｔ−３３８３）又はミノサイクリン（Ｍｃ，Ｓｉｇｍａ  Ｍ−９５１１）を用いて誘導した。無細胞培養上清中のＣＡ−ｐ２４レベルを抗原捕捉酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した（Ｂａｃｋら、１９９６）。
【００９９】
進化したウイルスを選択するために、ＳｕｐＴ１細胞をＨＩＶ−ｒｔＴＡ−Ｆ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ分子クローン（Ｄａｓら、２００４ａ）でトランスフェクトし、１μｇ／ｍｌのｄｏｘの存在下で最大２００日間培養した。ウイルスを含む培養上清を、感染のピーク（シンシチウムの塊が出現したことにより判定する）で新しいＳｕｐＴ１細胞に継代した。一定間隔で、細胞及び上清サンプルを培養物から採取し、その後の解析のために−８０℃で保存した。
【０１００】
プロウイルスのＤＮＡ解析及び進化した配列のクローニング：
感染した細胞由来の全細胞ＤＮＡを、以前に報告されているように（Ｄａｓら、１９９７）単離した。プロウイルスのｒｔＴＡ遺伝子を、センスプライマーｔＴＡ１（５’−ＡＣＡＧＣＣＡＴＡＧＣＡＧＴＡＧＣＴＧＡＧ−３’）及びアンチセンスプライマーｔＴＡ−ｒｅｖ２（５’−ＧＡＴＣＡＡＧＧＡＴＡＴＣＴＴＧＴＣＴＴＣＧＴ−３’）を用いてＰＣＲ増幅し、そしてｂｉｇｄｙｅターミネーターサイクルシークエンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて配列決定した。そのＰＣＲ産物をＸｂａＩ及びＳｍａＩで消化し、そしてそれを使用して、ｐＣＭＶ−ｒｔＴＡ中の対応するフラグメントを置換した。ここで、野生型ｒｔＴＡ（ｒｔＴＡ２Ｓ−Ｓ２，（Ｕｒｌｉｎｇｅｒら、２０００））の発現は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモータによって制御される。ＸｃｍＩ及びＮｄｅＩ部位を用いて、変異ｒｔＴＡ遺伝子をｐＣＭＶ−ｒｔＴＡからシャトルベクターｐＢｌｕｅ３’ＬＴＲｅｘｔ−デルタＵ３−ｒｔＴＡＦ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ−２ΔｔｅｔＯ（Ｄａｓら、２００４ａ）にクローニングし、続いて、ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩフラグメントとしてＨＩＶ−ｒｔＴＡ分子クローンにクローニングし戻した。進化したｒｔＴＡバリアントにＦ６７Ｓ及びＧ１３８Ｄ変異を導入するために、対応するｐＣＭＶ−ｒｔＴＡプラスミド及び突然変異誘発性プライマー
（プライマーＭ）ｔＴＡ−Ｆ６７Ｓ（５’−ＣＡＴＡＣＣＣＡＣＴＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡ−３’、ミスマッチのヌクレオチドに下線を引いた）
又はｔＴＡ−Ｇｌ３８Ｄ（５’−ＧＴＣＣＧＣＣＧＴＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＡＣＡＣＴＧＧＧＣＴ−３’）
及び通常のプライマー
５’−ＴＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴ−３’（プライマー１）、
５’−ＴＧＡＡＡＴＣＧＡＧＴＴＴＣＴＣＣＡＧＧＣＣＡＣＡＴＡＴＧＡ−３’（プライマー２）及び
５’−ＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴ−３’（プライマー３）
を用いて、突然変異誘発ＰＣＲ（Ｍｉｋａｅｌｉａｎら、１９９２）を行った。簡潔には、プライマーＭ＋プライマー３及びプライマー１＋プライマー２を用いてＰＣＲ反応を行った。そのＰＣＲ産物を精製し、混合し、そしてプライマー１及び３を用いてＰＣＲ増幅した（詳細については参考文献（Ｍｉｋａｅｌｉａｎら、１９９２）を参照のこと）。得られた変異型ｒｔＴＡ遺伝子をＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＣＭＶ−ｒｔＴＡにクローニングした。全ての構築物を配列解析によって確認した。
【０１０１】
ｒｔＴＡ活性アッセイ：
異なるプロモータ構造を有する２つのホタルルシフェラーゼレポーター構築物を使用した。ｐＬＴＲ−２ΔｔｅｔＯ−ｌｕｃは、ＨＩＶ−ｒｔＴＡ分子クローン由来のＬＴＲ−２ΔｔｅｔＯプロモータを含む（Ｍａｒｚｉｏら、２００１；Ｍａｒｚｉｏら、２００２）。以前にｐＵＨＣ１３−３と命名された（Ｇｏｓｓｅｎら、１９９２）ｐＣＭＶ−７ｔｅｔＯ−ｌｕｃは、最小ＣＭＶプロモータの上流に位置する７つのｔｅｔＯエレメントを含む。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの発現をＣＭＶプロモータによって制御するプラスミドｐＲＬ−ＣＭＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を、トランスフェクション効率の差についての補正を可能にするための内部コントロールとして使用した。
【０１０２】
Ｃ３３Ａ及びＨｅＬａＸ１／６細胞を、６０％コンフルエントになるまで２ｃｍ２ウェル内で生育し、リン酸カルシウム沈殿法によってトランスフェクトした（Ｄａｓら、１９９９）。０．４ｎｇのｐＣＭＶ−ｒｔＴＡ（野生型又は変異体）、２０ｎｇのｐＬＴＲ−２ΔｔｅｔＯ−ｌｕｃ又はｐＣＭＶ−７ｔｅｔＯ−ｌｕｃ、０．５ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶ及びキャリアＤＮＡとして９８０ｎｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを用いて、Ｃ３３Ａ細胞をトランスフェクトした。８ｎｇのｐＣＭＶ−ｒｔＴＡ、２．５ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶ及び９９０ｎｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを用いて、ＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞をトランスフェクトした。そのＤＮＡ構築物の量は、線形の範囲内でｒｔＴＡ媒介性トランス活性化を維持するように、及び転写因子の抑制を回避するように各細胞タイプについて最適されたものであった。様々な濃度のｄｏｘ、Ｔｃ又はＭｃの存在下で、細胞を４８時間培養し、Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に溶解した。ホタル及びＲｅｎｉｌｌａのルシフェラーゼ活性を、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。ｒｔＴＡバリアントの活性は、ホタルとＲｅｎｉｌｌａのルシフェラーゼ活性の比として計算され、そしてセッション間の変分について補正された。
【０１０３】
ウエスタンブロット解析：
２ｃｍ２ウェル内で１μｇの野生型又は変異体ｐＣＭＶ−ｒｔＴＡ及び２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて９０％コンフルエントにおいてＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞をトランスフェクトした。細胞を４８時間培養し、そして１００μｌのＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ中に溶解した。１０μｌの溶解産物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分離に供し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）に転写した。ｒｔＴＡバリアントの免疫化学的検出のために、ポリクローナル抗ＴｅｔＲ抗体を含むウサギ血清とともに膜をインキュベートした（Ｋｒｕｅｇｅｒら、２００３）。結合した抗体を、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ及びＥＣＬ＋キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて可視化し、そしてＳｔｏｒｍ  ８６０  Ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。
【０１０４】
＜実施例２＞
弱毒生ウイルスに基づくＨＩＶ−１ワクチンは、ＳＩＶ−マカクモデルでは確かめられているが、一般にヒトにおける使用は安全ではないと考えられている。主な安全性に対する懸念としては、弱毒ウイルスが長期にわたって低レベルで複製されることによって、より適応し、かつ病原性のあるウイルスバリアントの淘汰が最終的にはもたらされうるという点である。理想的には、ワクチンウイルスの複製を、防御的免疫応答を誘発するのに必要な時間枠に制限することが望まれる。本発明者らは、以前に、条件つきの生ＨＩＶ−１ウイルスを使用する新規のワクチンアプローチを発表した。このＨＩＶ−ｒｔＴＡウイルスでは、ウイルスの転写活性化因子Ｔａｔ及びそのＴＡＲ結合部位を変異により不活性化し、そしてＴｅｔ−ｏｎシステムの成分で機能的に置換した。このシステムでは、無毒性のエフェクターのドキシサイクリン（ｄｏｘ）によって遺伝子発現が厳密に制御され、このシステムは、真核生物において遺伝子発現を調整するために広く応用されている。上記転写活性化因子をコードするｒｔＴＡ遺伝子をｎｅｆ遺伝子の代わりに挿入し、そしてｔｅｔ−オペレーター（ｔｅｔＯ）ＤＮＡ結合部位をウイルスのＬＴＲプロモータ内に配置する。このＨＩＶ−ｒｔＴＡウイルスは、ｄｏｘの非存在下では複製しない。ｄｏｘがｒｔＴＡに結合することにより、そのタンパク質とｔｅｔＯ  ＤＮＡとの結合を可能にする構造変化が生じ、その結果、転写の活性化及びそれに続くウイルスの複製がもたらされる。このウイルスによるワクチン接種において、複製は、一過性のｄｏｘ投与による免疫システムの誘導に必要な程度に一時的に活性化及び制御され得る。
【０１０５】
このｄｏｘ依存性ＨＩＶ−ｒｔＴＡウイルスをワクチンとして将来的に使用しようとすることで、導入されたＴｅｔ−ｏｎシステムの遺伝的安定性に関する新しい安全性の問題が生じる。恒常的に複製するウイルスになるまでにはいくつかの仮説的な進化経路が存在する。第１に、野生型配列への単純な復帰変異を回避するように複数の不活性化変異が両方のエレメントに導入されたにもかかわらず、ウイルスは、Ｔａｔ−ＴＡＲシステムの機能を回復しうる。このシナリオでは、ｄｏｘに制御されるｒｔＴＡ−ｔｅｔＯシステムは、過剰になり、変異又は欠失によって時間とともに不活性化されうる。第２に、ウイルスのＬＴＲプロモータは、例えば、恒常的に発現される細胞の転写因子に対する結合部位を獲得することによって構成的な転写エレメントになりうる。そのようなウイルスの複製は、ウイルスにコードされるトランス活性化因子（ＴａｔとｒｔＴＡの両方）に依存しない。第３に、導入されたｒｔＴＡ−ｔｅｔＯ軸が、ｄｏｘ依存性を喪失することにより、制御されないＴｅｔシステムを作り出しうる。このシナリオは、例えば、ｄｏｘの非存在下でさえもｒｔＴＡタンパク質の構造をＤＮＡ結合様式に変化させる、獲得したｒｔＴＡタンパク質の変異によって生じうる。
【０１０６】
これらの安全性の問題に対処するために、本発明者らは、複数の独立したウイルス培養物においてＨＩＶ−ｒｔＴＡの進化を追跡した。本発明者らは、いくつかの培養物においてｄｏｘ制御が喪失されていることを観察し、その全ての場合において、そのｄｏｘ制御の喪失は、ｒｔＴＡタンパク質の１９位又は３７位のいずれかにおける代表的なアミノ酸置換に起因した。本発明者らは、これらの位置に代替のアミノ酸を有する新規のｒｔＴＡバリアントを開発し、対応するＨＩＶ−ｒｔＴＡバリアントが、長期間培養した培養物においてｄｏｘ制御を喪失していないことを証明した。従って、本発明者らは、望まれない進化経路を抑制することによって、Ｔｅｔ−ｏｎシステムの遺伝的安定性及びＨＩＶ−ｒｔＴＡワクチン候補を改善した。
【０１０７】
材料及び方法
ウイルス培養
ＨＩＶ−ｒｔＴＡ感染性分子クローンは、ＨＩＶ−１  ＬＡＩプロウイルスプラスミドの誘導体であり（Ｐｅｄｅｎら、１９９１）、以前に報告されている（Ｄａｓら、２００４ｂ；Ｖｅｒｈｏｅｆら、２００１）。本研究において使用されるＨＩＶ−ｒｔＴＡは、ＫＹＫバージョンであり、Ｔａｔ遺伝子内に不活性化するＹ２６Ａ変異を含み、また、ＴＡＲヘアピンモチーフ内に５つのヌクレオチド置換を含む。このウイルスは、ｎｅｆ遺伝子の代わりにｒｔＴＡ２Ｓ−Ｓ２遺伝子（Ｕｒｌｉｎｇｅｒら、２０００）を含み、ＬＴＲプロモータ領域内に８つのｔｅｔＯ配列を含む。ＨＩＶ−ｒｔＴＡ２ΔｔｅｔＯクローンは、ＨＩＶ−ｒｔＴＡと同一であるが、最適化された２ΔｔｅｔＯプロモータ構造を有する（Ｍａｒｚｉｏら、２００１；Ｍａｒｚｉｏら、２００２）。ＨＩＶ−ｒｔＴＡＦ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔは、ＬＴＲ−２ΔｔｅｔＯプロモータ及び最近報告されたｒｔＴＡＦ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ遺伝子（Ｄａｓら、２００４ａ）を含む。
【０１０８】
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃及び５％ＣＯ２においてＳｕｐＴ１  Ｔ細胞を生育した。エレクトロポレーションによりＨＩＶ−ｒｔＴＡ分子クローンを用いてＳｕｐＴ１  Ｔ細胞をトランスフェクトした。簡潔には、５×１０６細胞を、２０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０で洗浄し、２０％ＦＢＳを含む２５０μｌのＲＰＭＩ１６４０中の５μｇのＤＮＡと混合した。細胞を０．４ｃｍキュベット中において２５０Ｖ及び９７５μＦでエレクトロポレーションに供し、続いて１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中に再懸濁した。無細胞培養上清中のＣＡ−ｐ２４レベルを抗原捕捉酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した（Ｂａｃｋら、１９９６）。
【０１０９】
２４ウェルでの進化実験を、４０μｇのＨＩＶ−ｒｔＴＡプロウイルスプラスミドを２×１０７個のＳｕｐＴ１  Ｔ細胞にトランスフェクションすることにより開始した。細胞を２４個の独立した培養物に分割し、１μｇ／ｍｌのｄｏｘ（Ｓｉｇｍａ  Ｄ−９８９１）の存在下で最高２００日間維持した。ウイルスを含む培養上清を、感染のピーク（シンシチウムの塊が出現したことにより判定する）で新しいＳｕｐＴ１  Ｔ細胞に継代した。一定間隔で、上清サンプルを培養物から採取し、ｄｏｘ有り及びｄｏｘ無しで並行して感染を試験した。細胞サンプルをその後の解析のために−８０℃で保存した。
【０１１０】
プロウイルスのＤＮＡ解析及び進化した配列のクローニング：
ＨＩＶ−ｒｔＴＡ感染細胞を遠心分離により沈殿させ、リン酸緩衝食塩水で洗浄した。その細胞を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）−１ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．５％Ｔｗｅｅｎ２０中に再懸濁することにより、ＤＮＡを可溶化し、その後、２００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫとともに５６℃で６０分間、そして９５℃で１０分間インキュベートした。プロウイルスのＤＮＡ配列を全細胞ＤＮＡからＰＣＲ増幅した。Ｔａｔ遺伝子の第１のエキソンを、
プライマーＫＶ１（５’−ＣＣＡＴＣＧＡＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＴＡＧＧ−３’）
及び３’ＴＡＴ（５’−ＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＧＣＴＴＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＣ−３’）
を用いて増幅した。ＬＴＲ−ｔｅｔＯ領域を、
プライマーｔＴＡ−ｔｅｔＯ１（５’−ＣＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＡＣＴＡＡＧＴＡＡＧＧＡＴ−３’）及び
Ｃ（Ｎ１）（５’−ＧＧＴＣＴＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＴＡＧＴＴＡＣＣＡＧＡＧＴＣ−３’）
を用いて増幅した。ｒｔＴＡ遺伝子を、
プライマーｔＴＡ１（５’−ＡＣＡＧＣＣＡＴＡＧＣＡＧＴＡＧＣＴＧＡＧ−３’）及び
ｔＴＡ−ｒｅｖ２（５’−ＧＡＴＣＡＡＧＧＡＴＡＴＣＴＴＧＴＣＴＴＣＧＴ−３’）を用いて増幅した。全てのＰＣＲフラグメントを、ｂｉｇｄｙｅターミネーターサイクルシークエンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定した。ＨＩＶ−ｒｔＴＡプロウイルスへのＧ１９Ｅ又はＥ３７Ｋ変異型ｒｔＴＡ配列のクローニングに向けて、ｒｔＴＡ  ＰＣＲフラグメントをＸｃｍＩ及びＳｍａＩで消化し、シャトルベクターｐＢｌｕｅ３’ＬＴＲｅｘｔ−デルタＵ３−ｒｔＴＡ−２ΔｔｅｔＯの対応する部位にクローニングした（１６）。そのシャトルベクターのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩフラグメントを使用して、ＨＩＶ−ｒｔＴＡ２ΔｔｅｔＯにおける対応する配列を置換した。
【０１１１】
新規ＨＩＶ−ｒｔＴＡバリアント及びｒｔＴＡ発現プラスミドの構築：
ｒｔＴＡの１９位に代替のＧコドン（ＧＧＡの代わりにＧＧＵ）及び３７位に野生型のアミノ酸（Ｅ）又は代替のアミノ酸（Ｄ、Ｆ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ）を有するＨＩＶ−ｒｔＴＡバリアントを、オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発によって構築した。
オリゴヌクレオチドＧ１９（５’−ＡＴＡＡＣＣＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＧＴＣＡＴＡＡＡＣＴＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＴＣＡＡＴＧＧＴＧＴＣＧＧＴＡＴＣＧＡＡＧＧＣＣＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＣＴＣＧＣＴ−３’、変異させたヌクレオチドに下線を引いた）を、
オリゴヌクレオチドｒｅｖ−３７（５’−ＡＧＣＡＧＧＧＣＣＣＧＣＴＴＧＴＴＣＴＴＣＡＣＧＴＧＣＣＡＧＴＡＣＡＧＧＧＴＡＧＧＣＴＧＸＸＸＡＡＣＴＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＡＧＣＧＡＧＴＴＴＣＣＴＴＧＴＣＧＴＣＡＧＧＣＣＴＴＣＧＡ−３’、ＸＸＸがアミノ酸３７に対応する；このトリプレットは、ＣＴＣのときＥ、ＡＴＣのときＤ、ＧＡＡのときＦ、ＡＡＧのときＬ、ＡＴＴのときＮ、ＣＴＧのときＱ、ＧＣＧのときＲ、そしてＡＧＡのときＳとなる）
にアニーリングさせ、ここで、両方の鎖を、ｄＮＴＰの存在下でＫｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて完成させ、ＸｃｍＩ及びＡｐａＩで消化し、そして同様に消化したシャトルベクターｐＢｌｕｅ３’ＬＴＲｅｘｔ−デルタＵ３−ｒｔＴＡＦ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ−２ΔｔｅｔＯ（Ｄａｓら、２００４ａ）に連結した。シャトルベクターのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩフラグメントを使用してＨＩＶ−ｒｔＴＡ２ΔｔｅｔＯにおいて対応する配列を置換した。
【０１１２】
プラスミドｐＣＭＶ−ｒｔＴＡは、発現ベクターｐＵＨＤ１４１−１／Ｘ内にｒｔＴＡ２Ｓ−Ｓ２遺伝子を含む（Ｕｒｌｉｎｇｅｒら、２０００）。１９位又は３７位に様々なアミノ酸を有するｒｔＴＡバリアントを作製するために、
センスプライマーランダム−ｒｔＴＡ−１９（５’−ＴＴＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＧＴＣＡＴＡＡＡＣＴＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＴＣＡＡＴＮＮＫＧＴＣＧＧＴＡＴＣＧＡＡＧＧＣＣＴＧＡＣＧＡ−３’、変異させたヌクレオチドに下線を引き、ここで、Ｋは、Ｔ又はＧに対応し、Ｎは、Ｔ、Ｃ、Ａ又はＧに対応する）
＋アンチセンスプライマーＣＭＶ２（５’−ＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴ−３’）
又はセンスプライマーＣＭＶ１（５’−ＴＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴ−３’）
＋アンチセンスプライマーランダム−ｒｔＴＡ−３７（５’−ＡＧＣＡＧＧＧＣＣＣＧＣＴＴＧＴＴＣＴＴＣＡＣＧＴＧＣＣＡＧＴＡＣＡＧＧＧＴＡＧＧＣＴＧＭＮＮＡＡＣＴＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＡＧＣＧＡ−３’、変異させたヌクレオチドに下線を引き、ここで、Ｍは、Ａ又はＣに対応し、Ｎは、Ｔ、Ｃ、Ａ又はＧに対応する）
をそれぞれ用いてｐＣＭＶ−ｒｔＴＡにおいてＰＣＲを行った。変異型のｒｔＴＡ配列をＸｂａＩ−ＡｐａＩフラグメントとしてｐＣＭＶ−ｒｔＴＡＦ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ（Ｄａｓら、２００４ａ）にクローニングした。全ての構築物を配列解析により確認した。Ｇ１９Ｆ（ＵＵＵコドン）変異とＥ３７Ｌ（ＣＵＵコドン）変異を組み合わせるために、ｐＣＭＶ−ｒｔＴＡＥ３７ＬのＥ３７Ｌ含有ＳｔｕＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを使用して、ｐＣＭＶ−ｒｔＴＡＧ１９Ｆにおける対応する配列を置換し、ｐＣＭＶ−ｒｔＴＡＧ１９Ｆ  Ｅ３７Ｌが得られた。そのｒｔＴＡＧ１９Ｆ  Ｅ３７Ｌ配列を、ＸｃｍＩ及びＮｄｅＩ部位を用いてシャトルベクターｐＢｌｕｅ３’ＬＴＲｅｘｔ−デルタＵ３−ｒｔＴＡＦ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ−２ΔｔｅｔＯ（Ｄａｓら、２００４ａ）にクローニングし、続いてＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩフラグメントとしてＨＩＶ−ｒｔＴＡ２ΔｔｅｔＯ分子クローンにクローニングした。
【０１１３】
ｒｔＴＡ活性アッセイ：
ＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞（Ｂａｒｏｎら、１９９７）は、ＨｅＬａ子宮頸癌細胞株に由来し、染色体に組み込まれたＣＭＶ−７ｔｅｔＯホタルルシフェラーゼレポーター構築物ｐＵＨＣ１３−３（Ｇｏｓｓｅｎら、１９９２）のコピーを内部に有する。細胞を、１０％ＦＢＳ、基礎培地可欠アミノ酸、１００単位／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地中で単層として３７℃及び５％ＣＯ２で生育した。
【０１１４】
ＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞を６０％コンフルエントまで２ｃｍ２ウェル内で生育し、リン酸カルシウム沈殿法によりトランスフェクトした。１５μｌの水中の１μｇのＤＮＡ混合物を２５μｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）−２５０ｍＭ  ＮａＣｌ−１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４及び１０μｌの０．６Ｍ  ＣａＣｌ２と混合し、室温で２０分間インキュベートし、培養液に加えた。そのＤＮＡ混合物は、８ｎｇのｐＣＭＶ−ｒｔＴＡ、２．５ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶ及びキャリアＤＮＡとして９９０ｎｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔからなるものであった。そのプラスミドｐＲＬ−ＣＭＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ）では、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの発現はＣＭＶプロモータによって制御され、そのプラスミドを、トランスフェクション効率の差についての補正を可能にする内部コントロールとして使用した。トランスフェクションの後、細胞を様々なｄｏｘ濃度で４８時間培養し、次いで、Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に溶解した。ホタル及びＲｅｎｉｌｌａのルシフェラーゼ活性を二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。ホタル及びＲｅｎｉｌｌａのルシフェラーゼの発現は、線形の範囲内であり、抑制作用は観察されなかった。ｒｔＴＡバリアントの活性を、ホタルとＲｅｎｉｌｌａのルシフェラーゼ活性の比として計算し、セッション間の変分について補正した（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ，提出）。
【０１１５】
結果：
ｄｏｘ依存性が低下したＨＩＶ−ｒｔＴＡバリアントの出現：
本発明者らは、条件つきの生ＨＩＶ−１バリアントの構築について以前に報告しており（Ｄａｓら、２００４ｂ；Ｖｅｒｈｏｅｆら、２００１）、その報告では、ウイルスの遺伝子発現及び複製を制御する天然のＴａｔ−ＴＡＲエレメントを、変異によって不活性化し、誘導性の遺伝子発現のためのＴｅｔ−ｏｎシステムのｒｔＴＡ−ｔｅｔＯエレメントで機能的に置換した（図８Ａ）。このＨＩＶ−ｒｔＴＡウイルスは、恒常的に複製しないが、ｄｏｘの存在下で広く複製する。本発明者らは、このウイルスが長期間複製することにより、ｄｏｘ制御を喪失することなくウイルスの複製を著しく改善する、ｒｔＴＡタンパク質におけるｔｅｔＯエレメントの再構成及びアミノ酸置換が生じることを最近報告した。本発明者らは、ＨＩＶ−ｒｔＴＡウイルスが、様々な方向に（緒言を参照のこと）進化しうると予測し、それゆえ、本研究では、複製についてｄｏｘに依存しないウイルスバリアントの出現に注目した。本発明者らは、長期間にわたる複数のウイルス培養を開始し、その後、ｄｏｘ独立性の発生を追跡した。進化アプローチ及びその後の解析のフローチャートを図８Ｂに図示する。ＨＩＶ−ｒｔＴＡウイルスを、２４個の独立した培養物においてｄｏｘの存在下で大規模に継代した。いくつかの時点で、上清サンプルをその培養物から採取し、ｄｏｘ無しで並行して感染を試験することにより、進化したウイルスのｄｏｘ依存性を判定した。２４個全ての培養物についての結果を図８Ｃにまとめる（黒四角）。本発明者らは、培養の５０日以内にｄｏｘ依存性ウイルスの数が著しく減少し、３つの培養物だけが、１２５日後にｄｏｘ依存性を保持していたことを観察した。
【０１１６】
もとのＨＩＶ−ｒｔＴＡウイルス及び２つの代表的なｄｏｘ独立性ウイルス培養物の複製曲線を図９に示す。ウイルスサンプルＣ５は、ｄｏｘ無しでは複製しなかったが、ｄｏｘによってなおもある程度活性化されうるのに対し、ウイルスサンプルＣ６は、ｄｏｘ有りと無しで同様の効率で複製した。組み込まれたプロウイルスを含む全細胞ＤＮＡを８つのｄｏｘ独立性ＨＩＶ−ｒｔＴＡ培養物から単離した。「古い」Ｔａｔ−ＴＡＲモチーフと「新しい」ｒｔＴＡ−ｔｅｔＯモチーフの両方の配列がウイルス集団中に存在するとき、本発明者らは、その両方の配列を解析した。全ての培養物において、Ｔａｔ及びＴＡＲ配列は、もとの変異を含んでおり、このことから、転写性の活性化のＴａｔ−ＴＡＲ軸が修復されていないことが示唆される。対照的に、本発明者らは、全ての培養物において、以前にｄｏｘ依存性のＨＩＶ−ｒｔＴＡ複製を改善すると示されていたｔｅｔＯエレメントの特徴的な再構成を観察した（Ｍａｒｚｉｏら、２００１；Ｍａｒｚｉｏら、２００２）。更に、全てのｄｏｘ独立性培養物由来のウイルスは、ｒｔＴＡ遺伝子内にＧ１９Ｅ変異又はＥ３７Ｋ変異のいずれかを獲得していた（図８Ｄ）。それら培養物のうちの２つ（Ｂ６及びＣ６）は、さらなるアミノ酸置換を含んでいた。残りの３つの培養物において存在しなかったものと組み合わせて、複数の培養物中でＧ１９Ｅ又はＥ３７Ｋが繰り返し選択されることから（データ示さず）、獲得したｄｏｘ独立性表現型との関連が強く示唆される。
【０１１７】
ｒｔＴＡにおけるアミノ酸置換による、ｄｏｘ制御の喪失：
これらのｒｔＴＡ変異が、ｄｏｘ無しで観察されたウイルスの複製に関与していることを証明するために、本発明者らは、ｒｔＴＡ遺伝子内にＧ１９Ｅ変異又はＥ３７Ｋ変異を含むＨＩＶ−ｒｔＴＡ分子クローンを構築し、様々なｄｏｘ濃度でそれらの複製をアッセイした（図１０）。野生型ｒｔＴＡを有するＨＩＶ−ｒｔＴＡは、ｄｏｘ無しでは複製せず、ｄｏｘ濃度が上がるにつれてウイルスの複製が徐々に増加した。ＨＩＶ−ｒｔＴＡＧ１９Ｅは、ｄｏｘ有りと無しの両方で効率的に複製した。ＨＩＶ−ｒｔＴＡＥ３７Ｋも、ｄｏｘ無しで複製したが、ｄｏｘ有りの場合は、複製がより効率的である。これらの結果から、Ｇ１９Ｅ変異又はＥ３７Ｋ変異が、ＨＩＶ−ｒｔＴＡウイルスのｄｏｘ依存性を低減させるのに十分であることが証明される。
【０１１８】
上に記載した結果は、もとのＨＩＶ−ｒｔＴＡウイルスとともに得られ、もとのＨＩＶ−ｒｔＴＡウイルスは、比較的不良な複製を示す。本発明者らは、同様の２４ウェルでの長期間の培養アッセイにおいて、２つの改善されたＨＩＶ−ｒｔＴＡバリアントの遺伝的安定性も試験した。ＨＩＶ−ｒｔＴＡ２ΔｔｅｔＯは、ＨＩＶ−ｒｔＴＡと同一であるが、ＬＴＲ−２ΔｔｅｔＯプロモータが改善されており（Ｍａｒｚｉｏら、２００１；Ｍａｒｚｉｏら、２００２）、ＨＩＶ−ｒｔＴＡＦ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔは、改善されたｒｔＴＡＦ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ遺伝子（Ｄａｓら、２００４ａ）を更に含む。両方のウイルスにおいて、本発明者らは、もとのＨＩＶ−ｒｔＴＡと比較して著しく遅い速度ではあるがｄｏｘ無しで複製するバリアントの出現を再度観察した（図８Ｃ）。もとのＨＩＶ−ｒｔＴＡは、５０日以内に培養物の５０％においてｄｏｘ制御を喪失したのに対し、ＨＩＶ−ｒｔＴＡ  ２ΔｔｅｔＯ培養物の５０％は、約７５日でｄｏｘ依存性を喪失し、ＨＩＶ−ｒｔＴＡＦ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ培養物の５０％超は、１２０日後でも完全にｄｏｘ依存性であった。明らかに、これらの新規ＨＩＶ−ｒｔＴＡバリアントは、複製能力が改善されているだけでなく、ｄｏｘ制御を喪失する傾向が低くなっている。２つのｄｏｘ独立性のＨＩＶ−ｒｔＴＡＦ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ培養物の配列解析により、両方の場合においてＧ１９Ｅ変異が明らかになった。
【０１１９】
ｒｔＴＡの１９位及び３７位に代替のコドンを有するＨＩＶ−ｒｔＴＡバリアント
進化実験において、本発明者らは、たった２つのｒｔＴＡ位置において（Ｇ１９Ｅ及びＥ３７Ｋ）ｄｏｘ依存性を低下させる非常に特異的なアミノ酸置換を観察した。代替のｒｔＴＡコドンを導入することにより、そのような特異的なアミノ酸置換がこれらの望まれない進化経路がより困難になりうるか、又は妨害さえされうる。例えば、Ｇ１９Ｅ変異は、ＧＧＡからＧＡＡへのコドン変更に関与し、このＧからＡへの移行は、ＨＩＶ−１の逆転写中に最も頻繁に起きる誤りである。代替のＧｌｙコドン（ＧＧＵ又はＧＧＣ）の導入により、Ｇｌｕコドン（ＧＡＡ又はＧＡＧ）を創り出すためには１つのトランスバージョンを含む一層困難なツーヒット（ｔｗｏ−ｈｉｔ）変異が必要となりうる。そのような突然変異の頻度の差は、ＨＩＶ−１進化の過程に強く影響する。
【０１２０】
可能性のある全てのＧｌｕコドン（ＧＡＡ及びＧＡＧ）が、Ｌｙｓコドン（ＡＡＡ又はＡＡＧ）に変化するためには、たった１つのＧからＡへの変異を必要とするだけであるので、同様のストラテジーは、Ｅ３７Ｋにとっては可能性がない。代替の阻止ストラテジーとして、本発明者らは、Ｌｙｓコドンに変更することがより困難でありうる非ＧｌｕコドンでＥ３７コドンを置換することもできた。しかしながら、そのようなアミノ酸置換は、理想的には、ｒｔＴＡタンパク質の活性又はｄｏｘ依存性に影響を及ぼすべきでない。本発明者らは、まず、Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）のこの位置における天然のバリエーションを調べた。ｒｔＴＡタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉのクラスＢ  ＴｅｔＲ（ＴｅｔＲＢ）に基づくが、更に６つのＴｅｔＲクラス（Ａ、Ｃ−Ｅ、Ｇ、Ｈ）が存在する。クラスＤ、Ｅ及びＨ由来のＴｅｔＲも、３７位にＧｌｕを有するが、クラスＡ、Ｃ及びＧ由来のＴｅｔＲは、その代わりにＧｌｎを有する。Ｇｌｎコドン（ＣＡＡ又はＣＡＧ）からＬｙｓコドン（ＡＡＡ又はＡＡＧ）への進化は、たった１つのＣからＡへの変異を必要とするが、このトランスバージョンは、ＨＩＶ−１進化においてそれほど頻繁には観察されない。それゆえ、本発明者らは、３７位にＧｌｎコドン（ＣＡＧ）を有するＨＩＶ−ｒｔＴＡバリアント（Ｅ３７Ｑ）を構築した。更に、本発明者らは、Ａｓｐ（ＧＡＵ；Ｅ３７Ｄ）、Ａｓｎ（ＡＡＵ；Ｅ３７Ｎ）、Ｓｅｒ（ＵＣＵ；Ｅ３７Ｓ）、Ａｒｇ（ＣＧＣ；Ｅ３７Ｒ）、Ｐｈｅ（ＵＵＣ；Ｅ３７Ｆ）又はＬｅｕコドン（ＣＵＵ；Ｅ３７Ｌ）のいずれかを有するバリアントを構築した。Ｅ３７Ｄ置換では、インタクトな残基の酸性の性質が残る。Ｅ３７Ｎ及びＥ３７Ｓ変異では、天然のバリアントＥ３７Ｑのように、極性で、無電荷の残基がもたらされる。Ｅ３７Ｆ及びＥ３７Ｌ変異では、疎水性の残基がもたらされる。Ｅ３７Ｒ置換では、ウイルスの進化から選択されるＥ３７Ｋ変異と同様の塩基性の残基が生成される。遺伝コドンの縮重により可能であるとき、本発明者らは、Ｌｙｓコドンに変換するために変異を最も多く必要とするコドンを選択する。例えば、Ｅ３７Ｒバリアントに対しては、ＡＧＡコドンではなくＣＧＣを選択した。更に、全ての新しいＨＩＶ−ｒｔＴＡバリアントは、１９位に代替のＧｌｙコドン（ＧＧＵ）を含む。本発明者らは、ｄｏｘ有り及び無しでＳｕｐＴ１  Ｔ細胞におけるこれらの新規ＨＩＶ−ｒｔＴＡバリアントの複製を試験した（図１１）。予想されるとおり、１９位においてサイレントコドン変化を有するウイルス（Ｅ３７）は、ｄｏｘ依存的に複製した。Ｅ３７Ｌ、Ｅ３７Ｎ、Ｅ３７Ｆ、Ｅ３７Ｑ及びＥ３７Ｒバリアントも、効率的かつｄｏｘ依存性の複製を示した。Ｅ３７Ｄバリアントは、ｄｏｘ有り又は無しで複製しなかった。
【０１２１】
興味深いことに、Ｅ３７Ｓバリアントは、ｄｏｘ有りと無しの両方において効率的に複製し、これは、Ｅ３７Ｋバリアントと類似の表現型である。この最初の調査から、ＨＩＶ−ｒｔＴＡ表現型は、その残基の化学的性質から予測することが困難であること、例えば、Ｅ３７Ｒは、Ｅ３７Ｋと似ているが、ｄｏｘ依存性は低下しないことが証明される。それゆえ、より安定なｄｏｘ依存性のウイルスを構築するために、３７位において可能性のある全てのアミノ酸置換の影響を把握する必要があるとみられる。
【０１２２】
ｒｔＴＡの３７位において可能性のある全てのバリアントの試験：
本発明者らは、３７位において可能性のある全てのアミノ酸を含むｒｔＴＡ発現プラスミドを構築した。これらのバリアントの活性を、安定的に組み込まれたＣＭＶ−７ｔｅｔＯルシフェラーゼレポーター構築物（Ｇｏｓｓｅｎら、１９９２）のコピーを含むＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞（Ｂａｒｏｎら、１９９７）にトランスフェクションすることによってアッセイした。トランスフェクトされた細胞を、０〜１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘの存在下で２日間培養した。続いて、本発明者らは、ｒｔＴＡ活性を反映する細胞内のルシフェラーゼレベルを測定した。図１２Ａに示されるように、これらの２０個のｒｔＴＡバリアントの活性は、かなり多様なものである。ほとんどのバリアントが、ｄｏｘの非存在下で活性を示さないか又は非常に低い活性を示し、その活性は、ｄｏｘレベルが上がるにつれて増加した。
【０１２３】
ｒｔＴＡ活性データ（図１２Ａ）と選択されたＨＩＶ−ｒｔＴＡバリアントのセットの複製能力（図１１）との比較により、ウイルスの複製に必要なｒｔＴＡ活性のレベルの決定が可能になる。３７Ｆ、３７Ｌ、３７Ｎ、３７Ｑ及び３７Ｒバリアントは、ｄｏｘがゼロにおいて活性を示さないか、又は非常に低い活性（１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘにおける野生型ｒｔＴＡ活性の０．０６％以下）を示し、これらのｒｔＴＡバリアントを有するウイルスは、ｄｏｘ無しで複製しない。１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘにおける３７Ｄバリアントの低活性（０．０９％）は、いずれのウイルスの複製に対しても十分でない。３７Ｋ及び３７Ｓバリアントは、ｄｏｘ無しでそれぞれ０．１９％及び１％の活性を示す。この活性のレベルは、低レベルのウイルスの複製を引き起こすのに明らかに十分である。それゆえ、ＨＩＶ−ｒｔＴＡ複製にとって十分なｒｔＴＡ活性の閾値を０．１％に設定した。これは、ＨＩＶ−ｒｔＴＡＥ３７Ｋ及びＨＩＶ−ｒｔＴＡＥ３７Ｓだけでなく、ＨＩＶ−ｒｔＴＡＥ３７Ａもｄｏｘの非存在下で複製することを意味しうる。よって、これらのアミノ酸に対応するコドンは、コドン表（図１２Ｃ）中の濃い灰色であり（黒色ではない）、これらのコドンへの進化は、妨げられるべきである。不活性な３７Ｄ変異体を除く他の全てのバリアントは、野生型ｒｔＴＡと同様の表現型、すなわち、ゼロのｄｏｘにおいて０．１％未満の活性、かつ、１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘにおいて０．１％よりも高い活性を示す。従って、これらのバリアントを含むＨＩＶ−ｒｔＴＡウイルスは、ｄｏｘ依存性の様式で複製すると予想される。これらのアミノ酸は、コドン表における薄い灰色であり、それらへの進化は、ｄｏｘ依存性の喪失をもたらさないだろう。対応するウイルスが複製能力を有しないので、Ｄ及び終止コドンは、黒色で表示している。
【０１２４】
コドン表において、横列又は縦列における全ての変更は、単一のヌクレオチド置換を表す。従って、この色が付けられたコドン表（図１２Ｃ）により、３７位における、ｄｏｘ依存性を保存するコドン（薄い灰色）及びｄｏｘの非存在下における複製を可能にするコドンに変換するために複数のヌクレオチド変異を必要とするコドン（黒い灰色）の同定が容易になる。ＬｅｕコドンＣＵＮは、これらの安全性の必要条件を満たす。
【０１２５】
ｒｔＴＡの１９位において可能性のある全てのバリアントの試験：
Ｅ３７Ｋ変異のように、Ｇ１９Ｅ変異は、ｄｏｘの非存在下においてウイルスの複製を引き起こす。この位置における他のアミノ酸置換が、同様にｄｏｘ依存性の喪失をもたらしうるか否かを明らかにするために、本発明者らは、１９位において可能性のある全てのアミノ酸を含むｒｔＴＡ発現プラスミドを構築した。３７位のバリアントについて上で記載したように、これらのｒｔＴＡバリアントの活性を解析した。図１２Ｂに示されるように、ほとんどのバリアントが、ｄｏｘ無しで活性を示さないか、又は非常に低い活性（０．１％未満）を示し、それらの活性は、ｄｏｘレベルが上がるにつれて増加する。対照的に、１９Ｐバリアントは、不活性であり、１９Ｅバリアントは、ｄｏｘ無しで３％の活性を示す。１９Ｅのこの比較的高い基礎活性は、対応するＨＩＶ−ｒｔＴＡウイルスのｄｏｘ無しでの効率的な複製と一致する。１９位において、ｄｏｘ依存性を保存する、可能性のあるコドン（図１２Ｄ中の薄い灰色の部分）及びｄｏｘの非存在下における複製を可能にするコドンに変換するために複数のヌクレオチド変異が必要な、可能性のあるコドン（濃い灰色に塗られた部分）が複数存在する。例えば、ＰｈｅコドンＵＵＵは、Ｇｌｕコドンに変更されるために３つのトランスバージョンを必要とするので、これらの安全性の必要条件をかなり十分に満たす。
【０１２６】
安全な変異を有するｒｔＴＡによる、ｄｏｘ制御の喪失の抑制：
本発明者らは、２つの安全な変異：１９位におけるＰｈｅ（ＵＵＵ）（Ｇ１９Ｆ）及び３７位におけるＬｅｕ（ＣＵＵ）（Ｅ３７Ｌ）を組み合わせたｒｔＴＡバリアントを構築した。このｒｔＴＡバリアントは、非常に低い基礎活性（０．１％未満）を示し、ｄｏｘレベルが上げるにつれて徐々にその活性が増加する（図１３Ａ）。ｒｔＴＡＧ１９Ｆ  Ｅ３７Ｌは、低ｄｏｘ濃度において野生型ｒｔＴＡよりも活性が低いが、高ｄｏｘレベルにおいて非常に活性である。従って、ＨＩＶ−ｒｔＴＡＧ１９Ｆ  Ｅ３７Ｌは、ｄｏｘの非存在下又は低ｄｏｘレベルにおいて複製しないが、高ｄｏｘレベルにおいて効率的に複製する（図１３Ｃ）。本発明者らは、ｄｏｘ有りで長期間培養した２４個の培養物におけるこのウイルスの遺伝的安定性を試験した（図８Ｃ）。最大２００日間培養しても、ＨＩＶ−ｒｔＴＡＧ１９Ｆ  Ｅ３７Ｌウイルスはｄｏｘ制御を喪失しなかった。この結果から、新規ＨＩＶ−ｒｔＴＡバリアントの遺伝的安定性の増大及びそれによる安全性の改善が証明される。
【０１２７】
１９位又は３７位に代替のアミノ酸を有するｒｔＴＡバリアントによる、転写活性及びｄｏｘ感受性の改善：
１９位に代替のアミノ酸（アラニン、システイン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン又はチロシン）を有するｒｔＴＡバリアントのほとんど及び３７位に代替のアミノ酸（システイン、メチオニン、グルタミン、アルギニン又はトレオニン）を有するｒｔＴＡバリアントのいくつかは、もとの（野生型）ｒｔＴＡと比較して、低いｄｏｘ濃度で転写活性の増大及び／又は高いｄｏｘ濃度で転写活性の増大を示す（図１２Ａ及びＢ）。これらの結果から、１９位及び３７位におけるこれらのアミノ酸置換が、ｒｔＴＡの活性及び／又はｄｏｘ感度を増大させることが証明される。
【０１２８】
結論
現在公知のｒｔＴＡを複製システムに組み込むとき（例えば、レプリコン内に）、ｒｔＴＡは、そのシステムの進化の間に獲得される１９位及び／又は３７位のｒｔＴＡアミノ酸における変異に起因してｄｏｘ制御を喪失する危険性がある。そのような望ましくない進化を、これらのアミノ酸位置に代替のコドンを導入することによって阻止する。好ましい代替のコドンは、ｒｔＴＡのｄｏｘ制御の喪失を媒介しうるアミノ酸をコードするコドンに変更されるために複数のヌクレオチド置換を必要とするものである。例として、本発明者らは、ｒｔＴＡアミノ酸の１９位のフェニルアラニンコドン（ＵＵＵ）及び３７位のロイシンコドン（ＣＵＵ）が、ｒｔＴＡの遺伝的安定性を改善し、ｄｏｘ制御の喪失を少なくとも部分的に阻止することを証明した。本発明者らの結果は、１９位における他のアミノ酸コドン（アラニン、システイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンをコードするコドン）及び３７位における他のアミノ酸コドン（ヒスチジン、ロイシン又はアルギニンをコードするコドン）が、同様にｒｔＴＡの遺伝的安定性を改善することを証明する。
【０１２９】
１９位及び／又は３７位のｒｔＴＡアミノ酸における代替のアミノ酸の導入により、ｒｔＴＡの転写活性及び／又はインデューサー感度が改善される。特に、１９位のｒｔＴＡアミノ酸におけるアラニン、システイン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリンもしくはチロシンの導入、及び／又は、３７位のｒｔＴＡアミノ酸におけるシステイン、メチオニン、グルタミン、アルギニンもしくはトレオニンの導入により、ｒｔＴＡの転写活性及び／又はｄｏｘ感度の増大がもたらされる。
【０１３０】
＜実施例３：ｓｃ  ｒｔＴＡバリアントの改善＞
ペプチドリンカーによって２つのＴｅｔＲドメインが連結されており、１つのＶＰ１６活性化ドメイン又はＫＲＡＢリプレッサードメインがＣ末端に位置する、一本鎖Ｔｅｔトランス調節因子（ｔｒａｎｓｒｅｇｕｌａｔｏｒ）が、最近開発された（Ｋｒｕｅｇｅｒら、２００３）。これらのトランス調節因子は、分子内で折り畳まれており、互いに二量体化しない。残念なことに、ｒｔＴＡの一本鎖バージョン（ｓｃ  ｒｔＴＡ）は、通常のｒｔＴＡと比較して、低い活性を示し、この低い活性は、活性なＴｅｔ−ｏｎシステムを必要とする用途での使用を妨げうる。
【０１３１】
本発明者らは、ウイルス複製を制御するためにｒｔＴＡ遺伝子及びｔｅｔＯエレメントをＨＩＶ−１ゲノムに組み込んだ。このｄｏｘ依存性ウイルスの培養の間に、自然発生的なウイルスの進化により、改善されたウイルスバリアントが選択され、ここで、導入されたＴｅｔ−ｏｎシステムは、最適化されている。本発明者らは、ｒｔＴＡ遺伝子において、トランス活性化因子の転写活性及びｄｏｘ感度を大きく増大させるいくつかのアミノ酸置換を同定した。これらの変異が、他のＴｅｔＲベースのトランス活性化因子を同様に改善するか否かを試験するために、本発明者らは、それらの変異をｓｃ  ｒｔＴＡに導入した。全ての変異が、ｓｃ  ｒｔＴＡ活性を増大した。最も活性なｓｃ  ｒｔＴＡバリアントは、もとのｓｃ  ｒｔＴＡよりも活性が約３０倍高く、通常のｒｔＴＡとほぼ同程度に活性である。
【０１３２】
材料及び方法
ｓｃ  ｒｔＴＡバリアントの構築：
プラスミドｐＣＭＶ−ｒｔＴＡ及びｐＣＭＶ−ｓｃｒｔＴＡは、発現ベクターｐＵＨＤ１４１−１／Ｘ内にクローニングされている、ｒｔＴＡ２Ｓ−Ｓ２遺伝子及びｓｃ  ｒｔＴＡ２−Ｓ２遺伝子をそれぞれ含む（Ｋｒｕｅｇｅｒら、２００３；Ｕｒｌｉｎｇｅｒら、２０００）。ｓｃ  ｒｔＴＡ遺伝子は、２つのＴｅｔＲドメイン及び１つの活性化ドメインを含む。変異をＮ末端のＴｅｔＲドメインに導入するために、ｐＣＭＶ−ｓｃｒｔＴＡのＥｃｏＲＩ−ＢｆｕＡＩフラグメントを適切なｐＣＭＶ−ｒｔＴＡプラスミドの対応するフラグメントで置換した。ｐＣＭＶ−ｓｃｒｔＴＡにおいて、
突然変異誘発性プライマー（プライマーＭ）ｓｃｒｔＴＡ−Ｖ９Ｉ（５’−ＧＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＴＣＧＴＴＴＡＧＡＴＡＡＡＡＧＴＡＡＡＡＴＣＡＴＴＡＡＣＡＧＣＧＣＡ−３’）、
ｓｃｒｔＴＡ−Ｆ６７Ｓ（５’−ＡＧＧＣＡＣＣＡＴＡＣＴＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＣＴＴＴＡ−３’）、
ｓｃｒｔＴＡ−Ｆ８６Ｙ（５’−ＡＡＣＧＣＴＡＡＡＡＧＴＴＡＴＡＧＡＴＧＴＧＣＴ−３’）
又はｓｃｒｔＴＡ−Ｇ１３８Ｄ（５’−ＣＡＧＣＧＣＴＧＴＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＡＣＴＴＴＡ−３’）
及びｔＴＡ変異について上に記載したようなプライマー
５’−ＴＡＡＴＣＡＴＡＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＡＡ−３’（プライマー１）、
５’−ＡＧＧＣＧＴＡＴＴＧＡＴＣＡＡＴＴＣＡＡＧＧＣＣＧＡＡＴＡＡＧ−３’（プライマー２）及び
５’−ＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴ−３’（プライマー３）を用いた突然変異誘発ＰＣＲ（Ｍｉｋａｅｌｉａｎら、１９９２）によって変異をｓｃ  ｒｔＴＡのＣ末端のＴｅｔＲドメインに導入した。最終的なＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩ及びＳｍａＩで消化し、それを使用して、ｐＣＭＶ−ｓｃｒｔＴＡの対応するフラグメントを置換した。全ての構築物を配列解析によって確認した。
【０１３３】
細胞培養及びｒｔＴＡ活性アッセイ：
ｒｔＴＡ及びｓｃ  ｒｔＴＡの活性を、染色体に組み込まれたＣＭＶ−７ｔｅｔＯルシフェラーゼレポーター構築物ｐＵＨＣ１３−３（Ｇｏｓｓｅｎら、１９９２）のコピーを含むＨｅＬａ由来の細胞であるＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞（Ｂａｒｏｎら、１９９７）においてアッセイした。１０％ウシ胎仔血清、基礎培地可欠アミノ酸、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地中、３７℃及び５％ＣＯ２で細胞を培養した。細胞を２ｃｍ２ウェル内で６０％コンフルエントまで生育し、ｐＣＭＶ−ｒｔＴＡ又はｐＣＭＶ−ｓｃｒｔＴＡ発現プラスミド及びプラスミドｐＲＬ−ＣＭＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてリン酸カルシウム沈殿法によりトランスフェクトした。ｐＲＬ−ＣＭＶは、ＣＭＶプロモータからＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを発現し、それをトランスフェクション効率の差についての補正を可能にする内部コントロールとして使用した。１５μｌの水中の１μｇのＤＮＡ混合物を、２５μｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）−２５０ｍＭ  ＮａＣｌ−１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４及び１０μｌの０．６Ｍ  ＣａＣｌ２と混合し、室温で２０分間インキュベートし、そして培養液に加えた。そのＤＮＡ混合物は、ｓｃ  ｒｔＴＡ又はｒｔＴＡ活性アッセイのための、２０ｎｇのｐＣＭＶ−ｓｃｒｔＴＡ又はｐＣＭＶ−ｒｔＴＡ、２ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶ及び９７８ｎｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔからなるものであった。トランスフェクションの後、様々なｄｏｘ（Ｄ−９８９１，Ｓｉｇｍａ）濃度で細胞を４８時間培養し、次いで、Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に溶解した。二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ホタル及びＲｅｎｉｌｌａのルシフェラーゼ活性を測定した。ホタル及びＲｅｎｉｌｌａのルシフェラーゼの発現は、線形の範囲内であり、抑制作用は観察されなかった。トランス活性化因子の活性を、ホタルとＲｅｎｉｌｌａのルシフェラーゼ活性の比として計算し、セッション間の変分について補正した。
【０１３４】
結果：
ｒｔＴＡにおいて観察された変異による、ｓｃ  ｒｔＴＡ活性の改善：
ｓｃ  ｒｔＴＡにおいて、２つのＴｅｔＲドメインは、ペプチドリンカーによって先頭部分と末端部分が連結され、単一の活性化ドメインは、Ｃ末端のＴｅｔＲドメインに融合されている。ｒｔＴＡ活性を改善した変異は、全て、そのタンパク質のＴｅｔＲドメイン内に位置するものである（図１６）。ｒｔＴＡのこれらの有益な変異が、ｓｃ  ｒｔＴＡの活性及びｄｏｘ感度も改善するか否かを試験するために、本発明者らは、それらの変異をｓｃ  ｒｔＴＡのＴｅｔＲドメインの一方又は両方に導入した。これらのバリアントの活性をＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞において解析し、ｒｔＴＡ及びもとの（野生型）ｓｃ  ｒｔＴＡの活性と比較した（図１８）。ｒｔＴＡと野生型ｓｃ  ｒｔＴＡの両方が、ｄｏｘ無しでバックグラウンド活性を示さず、その活性は、ｄｏｘレベルが上がるにつれて徐々に増加する。しかしながら、ｓｃ  ｒｔＴＡの誘導された活性は、試験された全てのｄｏｘ濃度におけるｒｔＴＡの活性よりも一層低いものである。例えば、ｓｃ  ｒｔＴＡは、１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘにおけるｒｔＴＡよりも活性が約４０倍低い（図１８Ａ）。Ｎ末端のＴｅｔＲドメイン中へのＦ８６Ｙ変異の導入により、全てのｄｏｘレベルにおいてｓｃ  ｒｔＴＡ活性が約１０倍増大したが、バックグラウンド活性に影響しなかった。Ｆ８６ＹバリアントへのＶ９Ｉ変異の更なる導入により、ｓｃ  ｒｔＴＡ活性も改善された（わずかではあるが）のに対し、Ｆ６７Ｓ、Ｇ１３８Ｄ又はＶ９Ｉ変異＋Ｇ１３８Ｄ変異の追加により、更に、全てのｄｏｘレベルにおいてｓｃ  ｒｔＴＡ活性が約２倍改善された。これらのバリアントのバックグラウンド活性は、増大しなかった。
【０１３５】
ｓｃ  ｒｔＴＡのＣ末端のＴｅｔＲドメインに変異を導入した際に、同様の結果が得られた（図１８Ｂ）。しかしながら、これらのバリアントのいずれもが、Ｎ末端のＴｅｔＲドメインにおける変異を有するそれらの対応物と同程度に活性でなかった。Ｆ８６Ｙ変異は、ｓｃ  ｒｔＴＡ活性を約３倍増大し、Ｆ６７Ｓ、Ｇ１３８Ｄ又はＶ９Ｉ変異＋Ｇ１３８Ｄ変異の付加により、活性が更に約２倍増大した。これらの結果から、ｓｃ  ｒｔＴＡの活性が、いずれかのＴｅｔＲドメインにおける変異によって改善されることが証明される。Ｎ末端のＴｅｔＲドメインに導入される変異は、ｓｃ  ｒｔＴＡ活性に対して、Ｃ末端のドメインにおける同じ変異よりも大きい影響を及ぼす。
【０１３６】
両方のＴｅｔＲドメインにおける変異の導入により、最も活性なｓｃ  ｒｔＴＡバリアントがもたらされた（図１８Ｃ）。高ｄｏｘレベル（５００−１０００ｎｇ／ｍｌ）において、これら全てのバリアントは、２つのＴｅｔＲドメインのうちの１つだけに変異を有する対応バリアントよりも高い転写活性を示す（図１８Ａ及び１８Ｂ）。例えば、両方のＴｅｔＲドメインにＦ８６Ｙ変異を有するｓｃ  ｒｔＴＡは、１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘにおいて野生型ｓｃ  ｒｔＴＡよりも約１３倍活性が高いのに対し、Ｎ末端又はＣ末端のＴｅｔＲドメインにおける同じ変異は、ｓｃ  ｒｔＴＡ活性をそれぞれ約１０倍及び約３倍増加させた。両方のＴｅｔＲドメインにおけるＦ８６Ｙ変異に加えて、Ｆ６７Ｓ、Ｇ１３８Ｄ又はＶ９Ｉ変異＋Ｇ１３８Ｄ変異を有するバリアントは、高ｄｏｘレベルにおいてより活性であるだけでなく、低ｄｏｘレベル（１０−１００ｎｇ／ｍｌ）においてもより活性である。実際のところ、これらのバリアントは、ｒｔＴＡと同様の転写活性及びｄｏｘ感度を示す。
【０１３７】
考察：
本発明者らは、トランス活性化因子の転写活性及びｄｏｘ感度を大きく改善する、ｒｔＴＡにおけるアミノ酸置換を同定した。この実施例では、本発明者らは、これらの変異が、同様にｓｃ  ｒｔＴＡに影響するか否かを試験した。本発明者らの結果は、全ての変異が、ｓｃ  ｒｔＴＡ活性を著しく増加させたことを証明する。トランス活性化因子ｒｔＴＡとｓｃ  ｒｔＴＡの両方が、ドキシサイクリンによって活性化される。本発明者らの結果から、ｒｔＴＡ活性を増大させる少なくとも１つの変異の導入によってｓｃ  ｒｔＴＡ活性が、著しく改善されることが証明される。両方のＴｅｔＲドメインに有益な変異を導入することによって、本研究において最も活性なｓｃ  ｒｔＴＡバリアントが得られた。しかしながら、ｓｃ  ｒｔＴＡは、ＴｅｔＲドメインのうちの１つだけにおける少なくとも１つの変異によっても改善される。Ｎ末端のＴｅｔＲドメイン内に有益な変異を有するｓｃ  ｒｔＴＡバリアントは、Ｃ末端のＴｅｔＲドメイン内に同じ変異を有するバリアントよりも活性であるとみられる。
【０１３８】
両方のＴｅｔＲドメイン内にＦ６７Ｓ変異及びＦ８６Ｙ変異を有するｓｃ  ｒｔＴＡバリアントは、高ｄｏｘレベルにおいてもとのｓｃ  ｒｔＴＡよりも約３０倍活性が高く、ｄｏｘの非存在下ではいかなるバックグラウンド活性も示さない。この新規ｓｃ  ｒｔＴＡは、ｒｔＴＡとほぼ同程度に活性であり、同程度のｄｏｘ感度を示すので、複数のＴｅｔＲベースの制御システムが同じ細胞又は生物体において使用される用途において、通常のｒｔＴＡに代わるものとして適している。
【０１３９】
結論：
一本鎖ｒｔＴＡ活性の転写活性及びインデューサー感度は、本発明者らがｒｔＴＡの転写活性及びインデューサー感度を改善することを見出したアミノ酸置換の導入によって著しく改善される。このように、本発明者らは、例えば、もとのｓｃ  ｒｔＴＡにＦ８６Ｙ、Ｖ９Ｉ、Ｆ６７Ｓ及び／又はＧ１３８Ｄアミノ酸置換を導入することによって、転写活性及びｄｏｘ感度が最大約３０倍増大したｓｃ  ｒｔＴＡバリアントを得た。
【０１４０】
＜実施例４：遺伝的安定性が改善された新規ｒｔＴＡバリアントの開発；ｒｔＴＡの１９、３７及び５６位における代替のアミノ酸の導入＞
本発明者らは、複製のためにｄｏｘに依存しないウイルスバリアントが、ＨＩＶ−ｒｔＴＡの長期間の複製の結果もたらされることを証明した。この低いｄｏｘ依存性は、ｒｔＴＡタンパク質の１９位（グリシンからグルタミン酸へ；Ｇ１９Ｅ）又は３７位（グルタミン酸からリシンへ；Ｅ３７Ｋ）のいずれかにおけるアミノ酸置換と関連した。本発明者らは、ｒｔＴＡ遺伝子内に、これらの望ましくない進化経路を阻止する安全な変異（Ｇ１９Ｆ及びＥ３７Ｌ）を有するＨＩＶ−ｒｔＴＡバリアントを開発した。この新規バリアントは、遺伝的安定性の改善を示し、ｄｏｘ有りで長期間培養した培養物においてｄｏｘ制御を喪失しなかった（実施例２を参照のこと）。
【０１４１】
ワクチンとして、ＨＩＶ−ｒｔＴＡの複製は、抗ウイルスの免疫応答を誘導するためにスイッチが一時的にオンにされうる。その後のｄｏｘ中止により、ｄｏｘ有りで長期間培養したものよりも、ウイルスに対して代替の進化の圧力が課される。特に、ｄｏｘ無しで活性であり、ｄｏｘによって阻害される、ｔＴＡ様表現型を有するｒｔＴＡバリアント（ｄｏｘ洗浄実験において明らかになる）の危険性があるのに対し、そのようなバリアントは、ｄｏｘの存在下で対抗選択される。それゆえ、本発明者らは、ｄｏｘによって一時的に活性化される、複数の独立したウイルス培養物においてＨＩＶ−ｒｔＴＡの進化を追跡した。そのウイルスは、ｄｏｘを中止した後のかなりの数の培養物中において、実際にｄｏｘ制御を喪失していた。本発明者らは、ｒｔＴＡタンパク質の５６位における典型的なアミノ酸置換を同定し、それは、ｄｏｘから独立した複製に関与することが見出された。この変異は、ｄｏｘ有りで長期間培養した培養物中には観察されなかった。本発明者らは、この望ましくない進化経路を阻止し、それにより、遺伝的安定性及びＨＩＶ−ｒｔＴＡの安全性を改善する新規ｒｔＴＡバリアントを開発した。
【０１４２】
材料及び方法
ウイルス培養：
ＨＩＶ−ｒｔＴＡ感染性分子クローンは、ＨＩＶ−１  ＬＡＩプロウイルスプラスミドの誘導体であり（Ｐｅｄｅｎら、１９９１）、以前に報告されたものである（Ｄａｓら、２００４ｂ；Ｖｅｒｈｏｅｆら、２００１）。本研究に使用されるＨＩＶ−ｒｔＴＡは、Ｔａｔ遺伝子内に不活性化するＹ２６Ａ変異、ＴＡＲヘアピンモチーフ内に５つのヌクレオチド置換、ｎｅｆ遺伝子の代わりにｒｔＴＡＦ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ遺伝子（Ｄａｓら、２００４ａ）及びＬＴＲ−２ΔｔｅｔＯプロモータ構造（Ｍａｒｚｉｏら、２００１；Ｍａｒｚｉｏら、２００２）を含む。
【０１４３】
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃及び５％ＣＯ２でＳｕｐＴ１  Ｔ細胞を培養した。エレクトロポレーションによりＨＩＶ−ｒｔＴＡ分子クローンでＳｕｐＴ１  Ｔ細胞をトランスフェクトした。簡潔には、５×１０６細胞を２０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０で洗浄し、２０％ＦＢＳを含む２５０μｌのＲＰＭＩ１６４０中の５μｇのＤＮＡと混合した。０．４ｃｍキュベット内において２５０Ｖ及び９７５μＦで細胞をエレクトロポレートし、続いて、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中に再懸濁した。無細胞培養上清中のＣＡ−ｐ２４レベルを抗原捕捉酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した（Ｂａｃｋら、１９９６）。
【０１４４】
進化実験を、１．５×１０７個のＳｕｐＴ１  Ｔ細胞への１５μｇのＨＩＶ−ｒｔＴＡプロウイルスプラスミドのトランスフェクションから開始した。細胞を１２個の独立した培養物に分割し、ｄｏｘ（Ｓｉｇｍａ  Ｄ−９８９１）を加えることにより、ウイルスの複製を開始した。トランスフェクションの３日後に、細胞を培地で２回洗浄することによってｄｏｘを培養物から除去し、その後、各々を３７℃及び５％ＣＯ２で３０分間インキュベートすることにより、細胞からｄｏｘを放出させた。続いて、細胞を培地中に再懸濁し、ｄｏｘ無しで培養した。ウイルス複製が、シンシチウムの形成によって示されるほど明らかである場合、ウイルスを含む培養上清を新しいＳｕｐＴ１  Ｔ細胞に継代した。感染細胞サンプルを使用して、プロウイルスのｒｔＴＡ配列を解析した。
【０１４５】
進化した配列のプロウイルスのＤＮＡ解析：
ＨＩＶ−ｒｔＴＡ感染細胞を遠心分離により沈殿させ、リン酸緩衝食塩水で洗浄した。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）−１ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．５％Ｔｗｅｅｎ２０中に細胞を再懸濁することにより全細胞ＤＮＡを可溶化し、その後、５６℃で６０分間、そして９５℃で１０分間、２００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫとともにインキュベートした。プロウイルスのｒｔＴＡ遺伝子を、プライマーｔＴＡ１（５’−ＡＣＡＧＣＣＡＴＡＧＣＡＧＴＡＧＣＴＧＡＧ−３’）及びｔＴＡ−ｒｅｖ２（５’−ＧＡＴＣＡＡＧＧＡＴＡＴＣＴＴＧＴＣＴＴＣＧＴ−３’）を用いてＰＣＲ増幅し、ｂｉｇｄｙｅターミネーターサイクルシークエンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定した。
【０１４６】
新規ｒｔＴＡ発現プラスミド及びＨＩＶ−ｒｔＴＡバリアントの構築
プラスミドｐＣＭＶ−ｒｔＴＡは、発現ベクターｐＵＨＤ１４１−１／Ｘ内にｒｔＴＡ２Ｓ−Ｓ２遺伝子を含む（Ｕｒｌｉｎｇｅｒら、２０００）。Ｐ５６Ｓ変異を導入するために、この変異を含むプロウイルスのＰＣＲ産物をＸｂａＩ及びＳｍａＩで消化し、それを用いて、ｐＣＭＶ−ｒｔＴＡ内の対応するフラグメントを置換した。Ｇ１９Ｆ変異及びＥ３７Ｌ変異ならびに５６位に様々なアミノ酸を有するｒｔＴＡバリアントを作製するために、センスプライマーランダム−ｒｔＴＡ−５６（５’−ＡＡＧＣＧＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＧＡＴＧＣＣＣＴＧＮＮＫＡＴＣＧＡＧＡＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣ−３’、ここで、Ｋは、Ｇ又はＴに対応し、Ｎは、Ｇ、Ａ、Ｔ又はＣに対応する）＋アンチセンスプライマーＣＭＶ２（５’−ＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴ−３’）を用いて、ｐＣＭＶ−ｒｔＴＡＧ１９Ｆ  Ｅ３７Ｌ（実施例２）に対して突然変異誘発ＰＣＲを行った。変異ｒｔＴＡ配列を、ＡｐａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＣＭＶ−ｒｔＴＡＧ１９Ｆ  Ｅ３７Ｌにクローニングした。ＸｃｍＩ及びＮｄｅＩ部位を使用してシャトルベクターｐＢｌｕｅ３’ＬＴＲｅｘｔ−デルタＵ３−ｒｔＴＡＦ８６Ｙ  Ａ２０９Ｔ−２ΔｔｅｔＯ（Ｄａｓら、２００４ａ）に新規ｒｔＴＡ配列をクローニングし、続いて、ＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ１フラグメントとしてＨＩＶ−ｒｔＴＡ分子クローンにクローニングした。全ての構築物を配列解析により確認した。
【０１４７】
ｒｔＴＡ活性アッセイ：
ｐＬＴＲ−２ΔｔｅｔＯ−ｌｕｃは、ＨＩＶ−ｒｔＴＡ分子クローン（Ｍａｒｚｉｏら、２００１；Ｍａｒｚｉｏら、２００２）由来のＬＴＲ−２ΔｔｅｔＯプロモータからホタルルシフェラーゼを発現する。以前にｐＵＨＣ１３−３と命名された（Ｇｏｓｓｅｎ＆Ｂｕｊａｒｄ，１９９２）ｐＣＭＶ−７ｔｅｔＯ−ｌｕｃは、最小ＣＭＶプロモータの上流に位置する７つのｔｅｔＯエレメント及びホタルルシフェラーゼ遺伝子を含む。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの発現がＣＭＶプロモータによって制御されるプラスミドｐＲＬ−ＣＭＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、トランスフェクション効率の差についての補正を可能にする内部コントロールとして使用した。ＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞は、ＨｅＬａ子宮頸癌細胞株に由来し、染色体に組み込まれたＣＭＶ−７ｔｅｔＯホタルルシフェラーゼレポーター構築物（Ｂａｒｏｎら、１９９７）のコピーを内部に有する。ＨｅＬａ  Ｘ１／６及びＣ３３Ａ子宮頸癌細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ３１）（Ａｕｅｒｓｐｅｒｇ，１９６４）を、１０％ＦＢＳ、基礎培地可欠アミノ酸、１００単位／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。
【０１４８】
Ｃ３３Ａ及びＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞を、６０％コンフルエントまで２ｃｍ２ウェル内で生育し、リン酸カルシウム沈殿法によってトランスフェクトした。１５μｌの水中の１μｇのＤＮＡ混合物を、２５μｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）−２５０ｍＭ  ＮａＣｌ−１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４及び１０μｌの０．６Ｍ  ＣａＣｌ２と混合し、室温で２０分間インキュベートし、そして培養液に加えた。そのＤＮＡ混合物は、Ｃ３３Ａ細胞に対しては、０．４ｎｇのｐＣＭＶ−ｒｔＴＡ、２０ｎｇのｐＬＴＲ−２ΔｔｅｔＯ−ｌｕｃもしくはｐＣＭＶ−７ｔｅｔＯ−ｌｕｃ、０．５ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶ及びキャリアＤＮＡとして９８０ｎｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、又はＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞に対しては、８ｎｇのｐＣＭＶ−ｒｔＴＡ、２．５ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶ及び９９０ｎｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔからなるものであった。様々なｄｏｘ濃度で２０時間、トランスフェクトされた細胞を培養し、ＤＭＥＭで洗浄し、続いて、ｄｏｘ（洗浄工程の前の濃度と同じ濃度）を含む新鮮培地とともに２４時間培養した。次いで、細胞をＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に溶解し、ホタル及びＲｅｎｉｌｌａのルシフェラーゼ活性を、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、ＧｌｏＭａｘマイクロプレートルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。ホタル及びＲｅｎｉｌｌａのルシフェラーゼの発現は、線形の範囲内であり、抑制作用は観察されなかった。ｒｔＴＡバリアントの活性を、ホタルとＲｅｎｉｌｌａのルシフェラーゼ活性の比として計算し、セッション間の変分について補正した。
【０１４９】
結果
一過性のｄｏｘ投与後のＨＩＶ−ｒｔＴＡの進化：
エフェクターのｄｏｘの除去時のＨＩＶ−ｒｔＴＡの遺伝的安定性を試験するために、本発明者らは、ＳｕｐＴ１  Ｔ細胞においてｄｏｘ有りで１２個の独立したウイルス培養を開始した（図２０Ｂ）。ウイルスの複製は、全ての培養物においてＣＡ−ｐ２４の産生及びシンシチウムの出現をもたらした。本発明者らは、３日目にｄｏｘを除去するために培養物を洗浄し、その結果、全ての培養物におけるＣＡ−ｐ２４レベルの低下及びシンシチウムの消失から明らかであるようにウイルスの複製のサイレンシングがもたらされた。しかしながら、ＣＡ−ｐ２４レベルは、１０−２０日目に再度増加し始め、培養を続けた結果、高いＣＡ−ｐ２４レベル及び大きなシンシチウムの形成がもたらされた。感染のピークでウイルスを新しいＳｕｐＴ１  Ｔ細胞に継代し、ｄｏｘ無しで培養した。全てのウイルスが、伝播性の感染を開始することができたことから、それらのウイルスが、ｄｏｘ制御を喪失していたことが示唆される。組み込まれたプロウイルスを含む全細胞ＤＮＡを培養物から単離し、ｒｔＴＡ遺伝子をＰＣＲ増幅して配列決定した。全ての培養物において、ウイルスは、ｒｔＴＡ遺伝子の５６位においてプロリンからセリンへの置換（Ｐ５６Ｓ）をもたらす点変異（ＣＣＡからＵＣＡへ）を獲得していた。
【０１５０】
同様の結果が、２つのｒｔＴＡ変異（Ｖ９Ｉ及びＧ１３８Ｄ）を有する改善されたＨＩＶ−ｒｔＴＡバリアントであるＨＩＶ−ｒｔＴＡＶ９Ｉ  Ｇ１３８Ｄでも得られた（実施例１）。進化したウイルスは、１２個の培養物のうち１０個においてｄｏｘ無しで複製し始めた（図２０Ｃ）。９つのウイルス培養物が、Ｐ５６Ｓ変異を獲得していたのに対し、１つの培養物は、先に記載したＧ１９Ｅ変異（実施例２）を獲得していた。残りの２つの培養物では、ＣＡ−ｐ２４レベルは、ｄｏｘ除去後に安定的に低下し、長期間培養してもウイルスの複製は、観察されなかった。６４日目に、これらの培養物を分割し、ｄｏｘ有り及び無しで培養を継続した。ｄｏｘ無しの培養物は、ＣＡ−ｐ２４陰性を保持したが、ｄｏｘ有りの培養物では伝播性の感染が明らかであった（図２０Ｃ）。従って、これらの２つの培養物中のウイルスは、ｄｏｘ依存性を保持し、また、容易に再活性化されうる。
【０１５１】
Ｐ５６Ｓ変異による、ｔＴＡ様の表現型の出現：
複数の独立した培養物においてＰ５６Ｓ変異が繰り返し選択されることから、観察されたｄｏｘ制御の喪失との関連が強く示唆される。このアミノ酸置換が、本当にｒｔＴＡ表現型の変更に関連することを証明するために、本発明者らは、Ｐ５６Ｓ変異型ｒｔＴＡ遺伝子を発現プラスミドｐＣＭＶ−ｒｔＴＡにクローニングし、そして通常のＴｅｔ−ｏｎシステムにおいてその活性をアッセイした。ルシフェラーゼ発現がウイルスのＬＴＲ−２ΔｔｅｔＯプロモータ（Ｍａｒｚｉｏら、２００１；Ｍａｒｚｉｏら、２００２）によって制御されるレポータープラスミドとともに、ｒｔＴＡ発現プラスミドをＣ３３Ａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、２日間、様々なｄｏｘ濃度で培養した。続いて、本発明者らは、ｒｔＴＡ活性を反映する細胞内のルシフェラーゼレベルを測定した（図２１Ａ）。野生型ｒｔＴＡは、ｄｏｘ無し又は低ｄｏｘレベル（１０ｎｇ／ｍｌ）で活性を示さず、また、その活性は、ｄｏｘ濃度が上げるにつれて徐々に増加した。対照的に、Ｐ５６Ｓバリアントは、ｄｏｘ無しで非常に高い活性を示し、その活性は、ｄｏｘ濃度を上げることによって活性化されるのではなく阻害された。この表現型は、５６位のプロリンの代わりのアラニンを含む４つのアミノ酸が異なるｒｔＴＡと転写活性化因子ｔＴＡの表現型と似ている（Ｕｒｌｉｎｇｅｒら、２０００）。ｄｏｘの非存在下でＰ５６Ｓバリアントが高活性であることは、ｄｏｘ洗浄実験におけるその状況を説明するのに対し、ｄｏｘ有りで低活性であることは、本発明者らが、ｄｏｘの存在下でＨＩＶ−ｒｔＴＡを長期間培養したものにおいてこの変異を観察しなかった理由を説明するものである。
【０１５２】
本発明者らはまた、７つのｔｅｔＯエレメントのアレイに連結された最小ＣＭＶプロモータの制御下のルシフェラーゼレポーター（Ｇｏｓｓｅｎ＆Ｂｕｊａｒｄ，１９９２）を用いてトランスフェクトされたＣ３３Ａ細胞において、安定的に組み込まれたこのＣＭＶ−７ｔｅｔＯルシフェラーゼ構築物（Ｂａｒｏｎら、１９９７）のコピーを含むＨｅＬａ  Ｘ１／６  細胞において、ｒｔＴＡ活性を解析した。両方のアッセイにおいて、ウイルスのＬＴＲ−２ΔｔｅｔＯプロモータ構築物での結果と同様の結果を本発明者らは観察し（図２１Ｂ及び２１Ｃ）、このことから、ｒｔＴＡＰ５６ＳのｔＴＡ様表現型が、プロモータのタイプとレポーター遺伝子のエピソーム又は染色体の状態の両方に依存しないことが証明される。
【０１５３】
ＨＩＶ−ｒｔＴＡＧ１９Ｆ  Ｅ３７Ｌの、Ｐ５６Ｓ変異によるｄｏｘ制御の喪失：
本発明者らは、以前に、ｄｏｘ有りで長期間培養している間にウイルスがｄｏｘ制御を喪失することを阻止する安全な変異Ｇ１９Ｆ及びＥ３７Ｌを含むＨＩＶ−ｒｔＴＡバリアントを構築した（実施例２）。ここで、本発明者らは、ｄｏｘ洗浄実験においてＨＩＶ−ｒｔＴＡＧ１９Ｆ  Ｅ３７Ｌの安定性を試験した。このウイルスは、１２個の培養物のうち、１個だけがｄｏｘ制御を喪失し、他の全ての培養物は、ｄｏｘの非存在下でいかなる複製もしなかった（図２０Ｄ）。配列解析により、そのエスケープバリアントが、Ｐ５６Ｓ変異を獲得していたことが明らかになった。この結果は、ＨＩＶ−ｒｔＴＡＧ１９Ｆ  Ｅ３７Ｌが、安全な変異を有しないもとのウイルスよりもｄｏｘ制御を喪失する傾向が低いことを示したが（図２０Ｂ）、５６位におけるエスケープ経路は、好ましくは、ウイルスの遺伝的安定性を更に改善するために阻止されることを証明している。
【０１５４】
５６位における安全な変異：
Ｐ５６Ｓ変異は、単一のヌクレオチド置換（ＣＣＡからＵＣＡへ）によって引き起こされる。そのような単一のヌクレオチド変化（ピリミジン−ピリミジン又はプリン−プリン置換）は、ＨＩＶ−１逆転写中の単一のヌクレオチドトランスバージョン（ピリミジン−プリン置換）又は複数のヌクレオチド変化よりも一層高い頻度で起きる（Ｂｅｒｋｈｏｕｔら、２００１；Ｂｅｒｋｈｏｕｔ＆ｄｅ  Ｒｏｎｄｅ，２００４）。この変異の偏りは、ウイルス進化の過程に大きく影響する（Ｋｅｕｌｅｎら、１９９６；Ｋｅｕｌｅｎら、１９９７）。従って、ＨＩＶ−ｒｔＴＡがｄｏｘ制御を喪失するために複数のヌクレオチド変化を必要とする代替のアミノ酸コドンを導入することによって５６位における望ましくない進化経路が阻止される。実際に、本発明者らは、そのような安全な変異によって１９位及び３７位におけるエスケープ経路を首尾よく阻止し、このことから、このストラテジーの有効性が証明される（実施例２）。ＨＩＶ−ｒｔＴＡの観察された３つ全てのエスケープ経路を同時に阻止するために、理想的には、５６位の安全な変異を１９位及び３７位の変異と組み合わせる。適当なアミノ酸置換を同定するために、本発明者らは、Ｇ１９Ｆ変異及びＥ３７Ｌ変異と組み合わせて、５６位において可能性のある全てのアミノ酸を有するｒｔＴＡ発現プラスミドを作製し、その活性をＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞においてアッセイした。
【０１５５】
これらの２０個のｒｔＴＡバリアントの活性は、かなり多様なものである（図２２Ａ）。ｄｏｘの非存在下で活性が比較的高く、また、その活性は、ｄｏｘレベルが上がるにつれて低下するので、Ｓバリアントのように、Ａ、Ｃ及びＨバリアントは、ｔＴＡ様表現型を示す。完全に不活性であるＦ及びＭバリアントを除いて、その他のバリアントは、ｄｏｘレベルが上がるにつれて活性が増加するので、ｒｔＴＡ表現型を示す。しかしながら、これらのバリアントの基礎活性及び誘導活性（それぞれ０及び１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘ）は、かなり異なるものである。Ｌバリアントが、非常に低い基礎活性でｒｔＴＡ表現型を示すので、本発明者らは、このバリアントをＨＩＶ−ｒｔＴＡに導入し、ＳｕｐＴ１  Ｔ細胞においてウイルスの複製を試験した。このウイルスは、ｄｏｘ無しでは複製しなかったが、ｄｏｘ有りでも複製しなかった（データ示さず）ことから、Ｌバリアントの誘導活性（１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘにおける野生型ｒｔＴＡ活性の約０．３％）が、ＨＩＶ−ｒｔＴＡ複製にとって不十分であることが示唆される。このことは、野生型ｒｔＴＡが１０ｎｇ／ｍｌのｄｏｘにおいてウイルスの複製を支持せず（約０．４％のｒｔＴＡ活性；図２２Ａにおけるｗｔ）、ｒｔＴＡＧ１９Ｆ  Ｅ３７Ｌは、１００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘにおいて複製を支持しない（約０．４％のｒｔＴＡ活性；図２２ＡにおけるＰバリアント）という本発明者らの観察結果と一致する。これらの全ての結果は、基礎活性と誘導活性の両方が０．４％より低いＥ、Ｆ、Ｌ及びＭバリアントが、ウイルスの複製を支持しないことを示唆する。それゆえ、本発明者らは、これらのアミノ酸に対応するコドン及び終止コドンを黒色とした（図２２Ｂ）。Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｓ及びＹバリアントの基礎活性は、０．４％より高い。対応するＨＩＶ−ｒｔＴＡウイルスが、ｄｏｘ無しで複製する危険性があるので、それらのコドンは、濃い灰色である（完全に黒色ではない）。低い基礎活性（＜０．４％）及び高い誘導活性（＞０．４％）を示すその他のバリアントは、ｄｏｘ依存性ウイルスをもたらし、また、それらのコドンは、薄い灰色である。
【０１５６】
コドン表において、横列又は縦列における全ての変更は、単一のヌクレオチド置換を表す。明らかに、５６位におけるただ１つの、ｄｏｘ依存性を保存するコドン（薄い灰色）及びｄｏｘ無しで複製を可能にするコドンに変更するために１つより多いヌクレオチド変異が必要であるコドン（濃い灰色）は、イソロイシンをコードするＡＵＡコドンである。しかしながら、１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘにおけるＩバリアントの活性は、野生型レベルのたった１％であり（図２２Ａ）、複製が不良なウイルスがもたらされうる。Ｐバリアント（ｒｔＴＡＧ１９Ｆ  Ｅ３７Ｌ）と同様のｄｏｘ依存性の活性を示すＫ及びＱバリアントは、ｄｏｘ独立性バリアントに変換されるために少なくとも１つのヌクレオチドトランスバージョンを必要とする。ＨＩＶ−１逆転写中の変化よりも低頻度でトランスバージョンが起きることが示されている（Ｂｅｒｋｈｏｕｔら、２００１；Ｂｅｒｋｈｏｕｔ＆ｄｅ  Ｒｏｎｄｅ，２００４）。例えば、本発明者らは、頻繁にＰ５６Ｓ変異（ＣＣＡからＵＣＡへの変化に起因する）を観察したが、ｄｏｘ洗浄実験においてＰ５６Ａ変異（ＣＣＡからＧＣＡへのトランスバージョンを必要とする）を観察しなかったにもかかわらず、両方の変異は、ｄｏｘの非存在下で同程度に高い活性を引き起こしうる（図２２Ａ）。従って、ｒｔＴＡの５６位にＡＡＧ（Ｋ）又はＣＡＧ（Ｑ）コドンを導入することにより、ｄｏｘ中断時にｄｏｘ独立性のウイルスバリアントの出現が阻止される。
【０１５７】
三重の安全なｒｔＴＡバリアントによるｄｏｘ制御喪失の阻止：
本発明者らは、三重の安全な変異Ｇ１９Ｆ、Ｅ３７Ｌ及びＰ５６Ｋ又はＰ５６Ｑを有するＨＩＶ−ｒｔＴＡ分子クローンを構築し、ＳｕｐＴ１  Ｔ細胞においてｄｏｘ有り及び無しでそれらの複製を試験した（図２３）。両方のウイルスが、ｄｏｘ依存性の様式で複製した。しかしながら、ＨＩＶ−ｒｔＴＡＧ１９Ｆ  Ｅ３７Ｌ  Ｐ５６Ｋの複製が、二重の安全なバリアントＨＩＶ−ｒｔＴＡＧ１９Ｆ  Ｅ３７Ｌと同程度に効率的であったのに対し、ＨＩＶ−ｒｔＴＡＧ１９Ｆ  Ｅ３７Ｌ  Ｐ５６Ｑは、それほど効率的に複製しなかった。それゆえ、本発明者らは、本発明者らの研究においてＨＩＶ−ｒｔＴＡＧ１９Ｆ  Ｅ３７Ｌ  Ｐ５６Ｋバリアントに注目し、ｄｏｘ有りで長期間培養した培養物及びｄｏｘ洗浄実験において、このウイルスの遺伝的安定性を試験した。本発明者らは、ｄｏｘ有りで２４個の長期間培養を開始し、いくつかの時点においてｄｏｘの存在下及び非存在下でウイルス複製を試験した（先の実施例２に記載したように）。全てのウイルス培養物が、１００日間の培養中において、完全にｄｏｘ依存性のままであり、配列解析から、その安全な変異が、全ての培養物において安定的に維持されていたことが明らかになった（データ示さず）。一過性のｄｏｘ投与後に、ＨＩＶ−ｒｔＴＡＧ１９Ｆ  Ｅ３７Ｌ  Ｐ５６Ｋの遺伝的安定性を試験するために、本発明者らは、ｄｏｘ有りで２４個のウイルス培養を開始した（図２４）。全ての培養物において、ウイルス複製により、検出可能な量のＣＡ−ｐ２４の産生及びシンシチウムの出現がもたらされた。３日目にｄｏｘを中断したとき、翌月には２４個の培養物のうちいずれにおいても、ＣＡ−ｐ２４レベルは低下し、シンシチウムが消失し、そしてウイルスの複製の徴候が検出できなくなった。６０日目に全ての培養物を分割し、ｄｏｘ有り及び無しで培養を継続した。ｄｏｘ無しの培養物ではウイルスの複製はなかったが、ｄｏｘ投与の結果、伝播性の感染がもたらされたことから、全ての培養物中のウイルスが、ｄｏｘ依存性のままであり、また、無ｄｏｘ培養物中の検出不可能なＣＡ−ｐ２４レベルは、プロウイルスのゲノムの喪失又はウイルスのプロモータの完全なサイレンシングに起因しなかったことが示唆される。従って、ＨＩＶ−ｒｔＴＡＧ１９Ｆ  Ｅ３７Ｌ  Ｐ５６Ｋの複製は、ｄｏｘ有りの長期間培養と一時的に活性化される培養の両方においてｄｏｘ依存性のままであることから、ｒｔＴＡの１９、３７及び５６位における三重の安全な変異によって、ｄｏｘの喪失が完全に阻止されることが証明される。
【０１５８】
結論：
本発明者らのウイルス進化実験から、ＨＩＶ−ｒｔＴＡが、ｒｔＴＡの１９、３７又は５６位におけるアミノ酸置換によってｄｏｘ制御を逸出する危険性があることが証明される。安全なＨＩＶ−ｒｔＴＡウイルスを作製するために、好ましくは３つ全ての進化経路を阻止する。本発明者らは、以前に、ｄｏｘ制御を喪失するために複数のヌクレオチドの変化を必要とする安全な変異（例えば、Ｇ１９Ｆ及びＥ３７Ｌ）によって１９位及び３７位における経路を阻止した（実施例２）。本発明者らは、ｒｔＴＡをｄｏｘ独立性のバリアントに変換するために少なくとも１つのヌクレオチドトランスバージョンを必要とする代替のアミノ酸を５６位に導入すること（例えば、Ｐ５６Ｋ又はＰ５６Ｑ）によって、５６位におけるエスケープ経路が効率的に阻止されることを証明した。
【０１５９】
表１：自然に進化したｒｔＴＡバリアント及び構築したｒｔＴＡバリアント
【表１】
2009515550.tif 000003
ａ野生型ｒｔＴＡは、以前にｒｔＴＡ２Ｓ−Ｓ２として報告されたものである（Ｕｒｌｉｎｇｅｒら、２０００）。
ｂ全てのバリアント（Ｖ１−Ｖ１８）が、Ｆ８６Ｙ（ＴｅｔＲドメイン中）及びＡ２０９Ｔ（ＶＰ１６活性化ドメイン中）の変異を含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】ウイルス進化によるｒｔＴＡ遺伝子の変異。（Ａ）：ＨＩＶ−ｒｔＴＡウイルスにおいて、転写制御のＴａｔ−ＴＡＲ軸は、Ｔａｔ及びＴＡＲ（クロスの四角）の変異によって、不活性にされた。ウイルスの転写及び複製は、ＬＴＲプロモータ域のＴｅｔＯエレメントの導入によってｄｏｘ依存性となり、ｒｔＴＡ遺伝子によってｎｅｆ遺伝子が置換された。この２４８アミノ酸タンパク質は、大腸菌Ｔｅｔリプレッサ（ＴｅｔＲ）及び単純疱疹ウイルスのＶＰ１６活性化領域（ＡＤ）との融合型である。ＴｅｔＲパートは、ＤＮＡ結合領域（ＢＤ）（α−螺旋１−３）及び二量体化面（α−螺旋７−１０）を有する調節性の中核領域（α−螺旋５−１０）で再分割されうる。Ｆ８６Ｙ（暗い灰色の三角形）及びＡ２０９Ｔ（黒い三角形）変異は、開始ウイルスに存在し、全ての期間において培養を維持した。軽灰色の三角形は、ＨＩＶ−ｒｔＴＡ−Ｆ８６Ｙ−Ａ２０９Ｔの多くの独立の培養組織において観察されたｒｔＴＡの付加的なアミノ酸置換を示す。（Ｂ）：Ｔｃ（軽灰色）及びＭｇ２＋（灰色のボール）（Ｈｉｎｒｉｃｈｓら、１９９４；Ｋｉｓｋｅｒら、１９９５）と複合体を形成したＴｅｔＲホモダイマ（１つは濃い灰色、その他は軽灰色）ののモノマー）の結晶構造を示す。残基８６を濃い灰色で示す。更なる変異アミノ酸（位置９、６７、１３８、及び１７１）を軽灰色で示す。残基１５７は示さない。なぜなら、部分１５６〜１６４は可撓性で、ＴｅｔＲ結晶構造中で決定できなかったからである。Ｔｃ−結合領域のクローズアップを右に示す。高度に保存された配列を有するＴｅｔＲタンパク質（ＡからＥ、Ｇ、Ｈ）の７つの種類が存在する。示される高分解能結晶構造はクラスＤ（ＴｅｔＲＤ）に基づくものである。ｒｔＴＡはクラスＢ（ＴｅｔＲＢ）に基づき、６３％の配列同一性をＴｅｔＲＤと共有する。中程度の解像度のＴｅｔＲＢの結晶構造では、同一のポリペプチドのフォールド（ヒンリクスその他、１９９４）がみられた。ゆえに、Ｔｃ及びＭｇ２＋とのＴｅｔＲの相互作用が、両方のクラスでほとんど同一であると考えられる。図は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａバンク及びＭＯＬＳＣＲＩＰＴ（Ｋｒａｕｌｉｓ、１９９１）及びＲＡＳＴＥＲ３Ｄ（メリットその他、１９９７）プログラムから２ＴＣＴ座標を使用して描画した。
【図２】Ｎｏｖｅｌ  ｒｔＴＡ変異体が、異なるＴｅｔシステムにおいて増加した活性及びｄｏｘ感受性を示すことを示す。ｒｔＴＡ変異体の転写活性は、ウイルスＬＴＲ−２ΔｔｅｔＯプロモータ（ＬＴＲ−２ΔｔｅｔＯ、Ａ）の制御下のホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するプラスミドによってトランスフェクションするか、又は７つのＴｅｔＯエレメント（ＣＭＶ−７ｔｅｔＯ、Ｂ）に連結する最小のＣＭＶ由来プロモータの制御下のＣ３３Ａ細胞において、測定された。更にｒｔＴＡ活性を、ＣＭＶ−７ｔｅｔＯリポータ構築物（ＣＭＶ−７ｔｅｔＯインテグレート、Ｃ及びＤ）の染色体的にインテグレートされた（組み込まれた）コピーを含むＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞（Ｂａｒｏｎその他、１９９７）において測定した。変異体Ｖ１からＶ１０、及び変異体Ｖ１１からＶ１８を、細胞中で、全３つのＴｅｔシステム（パネルＡからＣ）に関して、インテグレートされたリポータ（パネルＤ）と比較した。示されたｒｔＴＡ発現プラスミド又は陰性対照としてのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、並びにトランスフェクション効率の違いを較正するＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを構成的に発現するプラスミドによって細胞をトランスフェクションした。細胞を、異なるｄｏｘ濃度（０〜１０００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。トランスフェクション後２日におけるホタル及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性の比率を測定した結果は、ｒｔＴＡ活性を反映するものであった。全ての値は１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘでの野生型（ｗｔ）ｒｔＴＡ活性を１００％とした任意単位として示した。Ｃ及びＤでは、３つのトランスフェクションの平均値を、標準偏差を示すエラーバー付きで示した。
【図３】天然に出現した、及び構築されたｒｔＴＡ変異体の転写活性及びｄｏｘ−感受性を示す。トランスフェクションアッセイをＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞において実施した（詳細は図２を参照）。１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘで観察される転写活性を、標準偏差を示すエラーバーを有する３つのトランスフェクションの平均値として示す。野生型ｒｔＴＡ活性を１００％とした。Ｄｏｘ−感受性は、野生型ｒｔＴＡの感受性（１）との比較で示す。ｒｔＴＡ変異体ごとに、１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘによる野生型ｒｔＴＡの活性と同様の活性を得るｄｏｘ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を、ブラケット間に示される（ｎｄ、測定せず）。
【図４】変異が細胞内のｒｔＴＡタンパク質レベルに影響を及ぼさないことを示す。ＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞は、ｒｔＴＡ発現プラスミド（レーン３〜６）又は陰性対照（レーン２）としてのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔでトランスフェクションした。全細胞抽出物をトランスフェクションの後２日において調製し、抗ＴｅｔＲウサギポリクローナル血清（Ｋｒｕｅｇｅｒその他、２００３）でウエスタンブロット分析した。精製されたＴｅｔＲタンパク質（２ｎｇ）の検出をレーン１に示す。ｒｔＴＡ及びＴｅｔＲタンパク質の位置及び分子量（のｋＤａ）を示す。
【図５】新規なｒｔＴＡ変異体が、ｄｏｘなどの化合物により活性化されうることを示す。ｒｔＴＡ活性はＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞において測定された（図２を参照）。Ｔｃ又はＭｃ（０〜１００００ｎｇ／ｍｌ）の異なる濃度の存在下で細胞を培養した。１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘ（図示せず）による野生型（ｗｔ）ｒｔＴＡ活性を１００％とした。３つのトランスフェクションの平均値を、標準偏差を示すエラーバーでプロットした。
【図６】ｒｔＴＡ変異体によるＨＩＶ−ｒｔＴＡ複製の改良。ｒｔＴＡ変異体Ｖ７及びＶ１４を、ＨＩＶ−ｒｔＴＡプロウイルスのゲノムにクローニングした。ＳｕｐＴ１細胞を分子クローンの５μｇによってトランスフェクションし、異なるｄｏｘ濃度（０−１０００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。ウイルス複製を、培養液上清サンプル上のＣＡ−ｐ２４  ＥＬＩＳＡによってモニターした。
【図７】ｄｏｘなどの化合物により誘発されるＨＩＶ−ｒｔＴＡ複製を示す。ＳｕｐＴ１細胞をＨＩＶ−ｒｔＴＡクローン５μｇによってトランスフェクションし、５００ｎｇ／ｍｌのＴｃ又はＭｃの存在下で培養した。ウイルス複製を、培養液上清サンプル上のＣＡ−ｐ２４  ＥＬＩＳＡによってモニターした。
【図８】ＨＩＶ−ｒｔＴＡの進化は、ｄｏｘ−制御の損失につながりうることを示す。（Ａ）ＨＩＶ−ｒｔＴＡゲノムのスキーム。不活性Ｔａｔ−ＴＡＲ部材（交差した箱）及び導入されたｒｔＴＡ−ＴｅｔＯエレメントを示す。ｒｔＴＡは、大腸菌Ｔｅｔリプレッサ（ＴｅｔＲ）及び単純疱疹ウイルスのＶＰ  １６活性化領域（ＡＤ）の融合タンパク質である。ＴｅｔＲは、ＤＮＡ−結合領域（ＤＮＡ  ＢＤ）（残基１−４４）及び二量体化面を有する調節性のコア領域（残基７５−２０７）を含む。（Ｂ）２４穴進化実験のフロー図。詳細は本文中に記載する。（Ｃ）ＨＩＶ−ｒｔＴＡの、ＨＩＶ−ｒｔＴＡ  ２ΔｔｅｔＯ（改良された２ΔｔｅｔＯプロモータ構成（Ｍａｒｚｉｏその他（２００１）、Ｍａｒｚｉｏその他（２００２）を有する）、及びＨＩＶ−ｒｔＴＡＦ５６Ｙ−Ａ２０９Ｔ（ＬＴＲ−２ΔｔｅｔＯプロモータ及び改良されたｒｔＴＡＦ８６Ｙ−Ａ２０９Ｔ遺伝子（Ｄａｓその他（２００４）を有する）によるｄｏｘ制御の連続的な損失。この試験において進化するＨＩＶ−ｒｔＴＡＧ１９Ｆ−Ｅ３７Ｌ変異体は、ｄｏｘ制御からエスケープしない。培養時間に対するｄｏｘ依存性の培養細胞の数をプロットした。各実験は、２４の独立培養組織で実施した。（Ｄ）ｄｏｘ制御を喪失したＨＩＶ−ｒｔＴＡ培養組織において観察されるアミノ酸置換。全てのケースにおいて、Ｇ１９Ｅ置換はＧＡＧ→ＡＡＧ変異であり、Ｅ３７Ｋ置換はＧＧＡ→ＧＡＡ変異であった。
【図９】進化したＨＩＶ−ｒｔＴＡ変異体の複製を示す。最初のＨＩＶ−ｒｔＴＡウイルス（培養Ｃ６又はＣ５に由来（両方とも培養の５０日後に回収））を、ｄｏｘ（１μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で、ＳｕｐＴ１  Ｔ細胞に対して、等量のウイルス（５ｎｇ／ｍｌのＣＡ−ｐ２４）で感染させて複製の程度を比較した。配列分析の結果、Ｃ６ウイルスがｒｔＴＡ遺伝子のＧ１９Ｅ及びＥ１５６Ｋ変異を、Ｃ５ウイルスがＥ３７Ｋ変異（図１Ｄ）を有することが分かった。
【図１０】ｒｔＴＡ位置１９又は３７のアミノ酸置換により、ｄｏｘ制御の損失が生じることを示す。Ｇ１９Ｅ及びＥ３７Ｋ変異するｒｔＴＡ配列は、ＨＩＶ−ｒｔＴＡ  ２ΔｔｅｔＯ  ｐｒｏｖｉｒａｌなゲノム（Ｍａｒｚｉｏその他、２００１、Ｍａｒｚｉｏその他、２００２）にクローニングされた。ＳｕｐＴ１細胞は、分子クローンの２．５μｇによって、トランスフェクションして、０−１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘの存在下で培養した。ウイルス複製は、培養液上清サンプル上のＣＡ−ｐ２４  ＥＬＩＳＡによってモニターした。
【図１１】位置３７で代わりのアミノ酸を有するＨＩＶ−ｒｔＴＡ変異体の複製。ＳｕｐＴ１細胞は、ｒｔＴＡ位置３７に野生型（Ｅ）又は代わりのアミノ酸（Ｋ、Ｄ、Ｌ、Ｎ、Ｆ、Ｑ、Ｒ、Ｓ）を有するＨＩＶ−ｒｔＴＡ  ２ΔｔｅｔＯプロウイルスのプラスミド（２．５μｇ）でトランスフェクションし、１μｇ／ｍｌ  ｄｏｘの有無において培養した。全てのウイルスは、Ｅ３７Ｋ変異体を除いて、ｒｔＴＡ位置１９で他のＧコドン（ＧＧＡの代わりにＧＧＵ）を有し（ウイルス複製に影響を及ぼさない（示されないデータ））、またＦ８６Ｙ及びＡ２０９Ｔ変異（Ｄａｓその他２００４ａ）を有していた。
【図１２】位置１９又は３７で代わりのアミノ酸を有するｒｔＴＡ変異体の転写活性。（Ａ及びＢ）ｒｔＴＡ活性は、ＣＭＶ−７ｔｅｔＯホタルルシフェラーゼリポータ構築物（Ｇｏｓｓｅｎその他１９９２）が安定に導入されたコピーを含むＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞（Ｂａｒｏｎその他１９９７）において測定した。細胞は、ｒｔＴＡ発現プラスミド（全てのｒｔＴＡ変異体は、ｒｔＴＡ活性（Ｄａｓその他２００４ａ）を高めるＦ８６Ｙ及びＡ２０９Ｔ変異を含む）又は陰性対照としてのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、並びにトランスフェクション効率の違いを較正するＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを構成的に発現するプラスミドによってトランスフェクションした。細胞は、異なるｄｏｘ濃度（０−１０００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。ホタル及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性の比率をトランスフェクションの２日後に測定し、ｒｔＴＡ活性とした。全ての値は、１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘによる野生型（Ａの３７Ｅ及びＢの１９Ｇ）ｒｔＴＡ活性を１００％として測定した。２つのトランスフェクションの平均値を、標準偏差を示しているエラーバーでプロットした。（Ｃ及びＤ）位置１９又は３７の全ての可能なアミノ酸を有するｒｔＴＡ変異体のコドン表。ｄｏｘに依存する表現型を軽灰色でマークし、ｄｏｘの非存在下で活性の変異体を暗い灰色でマークし、不活性な変異体を黒でマークした。詳細はテキストを参照。
【図１３】安全変異を有する新規なｒｔＴＡ変異体の活性。（Ａ）野生型及び安全錠ｒｔＴＡ（Ｇ１９Ｆ  Ｅ３７Ｌ）の活性を、ＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞において測定した（図５を参照）。異なるｄｏｘ濃度（０−１０００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で細胞を培養した。全ての値は、１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘによる野生型ｒｔＴＡ活性を１００％として測定した。２つのトランスフェクションの平均値を、標準偏差を示しているエラーバーでプロットした。（Ｂ及びＣ）ＨＩＶ−ｒｔＴＡＦ８６Ｙ−Ａ２０９Ｔ及びＨＩＶ−ｒｔＴＡＧ１９Ｆ−Ｅ３７Ｌの複製（Ｆ８６Ｙ及びＡ２０９Ｔ変異（Ｄａｓその他２００４ａ）を有する）。ＳｕｐＴ１細胞を、５μｇの分子クローンでトランスフェクションし、１μｇ／ｍｌのｄｏｘの有無において培養した。ウイルス産生を、培養液上清サンプル上のＣＡ−ｐ２４  ＥＬＩＳＡによってモニターした。
【図１４Ａ】野生型、自然進化及び構築されたｒｔＴＡ変異体における転写活性及びｄｏｘ感受性を示す。トランスフェクションアッセイはＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞において実施した（図２を参照）。１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘで観察される転写活性は、標準偏差を示しているエラーバーを有する３つのトランスフェクションの平均値として示す。野生型ｒｔＴＡ活性を１００％でセットした。Ｄｏｘ−感受性は、野生型ｒｔＴＡの感受性（１）との比較で示す。ｒｔＴＡ変異体ごとに、１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘによる野生型ｒｔＴＡの活性と同様の活性を得るｄｏｘ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を、ブラケット間に示される（ｎｄ、測定せず）。
【図１４Ｂ】同上。
【図１４Ｃ】本発明によるｒｔＴＡ変異体。各カラム列は適切なｒｔＴＡ変異体を表す。
【図１５】新規なｒｔＴＡ変異体の、ｄｏｘなどの化合物による活性化。ｒｔＴＡ活性をＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞において測定した（図２参照）。Ｔｃ又はＭｃ（０−１００００ｎｇ／ｍｌ）の異なる濃度の存在下で細胞を培養した。１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘ（図示せず）による、野生型ｒｔＴＡ活性を１００％とした。
【図１６】ＴｅｔＲに基づくトランス活性化因子。（Ａ及びＢ）ホモ二量体ｒｔＴＡにおいて、各モノマーは、Ｎ末端において、大腸菌由来のＴｅｔＲ領域、及びＣ末端において、単純疱疹ウイルスＶＰ１６由来の活性化領域を有する。ｒｔＴＡ活性を強化するＶ９Ｉ、Ｆ６７Ｓ、Ｆ８６Ｙ及びＧ１３８Ｄ変異は、ＴｅｔＲ領域に全て位置していた（ｓｃ  ｒｔＴＡとは、単鎖のｒｔＴＡである）。それは、ペプチドリンカーによるヘッド−テール接続した２つのＴｅｔＲ領域、及びＣ末端における単一の活性化領域を含む。
【図１７】ｒｔＴＡ活性を強化する変異は、ｔＴＡ活性を強化しない。ｔＴＡ変異体の転写活性は、ＣＭＶ−７ｔｅｔＯルシフェラーゼリポータ構築物が染色体的に取り込まれたコピーを含んでなるＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞（Ｂａｒｏｎその他１９９７）を用いて測定した。細胞は、ｒｔＴＡ発現プラスミド又は陰性対照としてのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、並びにトランスフェクション効率の違いを較正するＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを構成的に発現するプラスミドによってトランスフェクションした。異なるｄｏｘ濃度（０−２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で細胞を培養した。ホタル及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性の比率をトランスフェクションの２日後に測定し、ｒｔＴＡ活性とした。全ての値は、ｄｏｘの非存在下での最初（野生型）のｔＴＡ活性を１００％として測定した。２つのトランスフェクションの平均値を、標準偏差を示しているエラーバーでプロットした。
【図１８】ｒｔＴＡにおいて観察される変異による、ｓｃ  ｒｔＴＡ活性の上昇。ｒｔＴＡ及びｓｃ  ｒｔＴＡの転写活性はＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞において測定された（図１７参照）。異なるｄｏｘ濃度（０−１０００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で細胞を培養した。全ての値は、１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘによる野生型ｒｔＴＡ活性を１００％として測定した。２つのトランスフェクションの平均値を、標準偏差を示しているエラーバーでプロットした。
【図１９】ｒｔＴＡのヌクレオチド及びアミノ酸配列。ｒｔＴＡ２Ｓ−Ｓ２変異体（Ｕｒｌｉｎｇｅｒその他、２０００）のヌクレオチド配列（上）及びアミノ酸配列（下）を示す。
【図２０】トランジェントなｄｏｘ投与の後のＨＩＶ−ｒｔＴＡの進化。（Ａ）ＨＩＶ−ｒｔＴＡゲノムのスキーム。不活性Ｔａｔ−ＴＡＲ部材（クロスの四角）及び導入されたｒｔＴＡ−ＴｅｔＯエレメントを示す。ｒｔＴＡは、大腸菌Ｔｅｔリプレッサ（ＴｅｔＲ）及び単純疱疹ウイルスのＶＰ１６活性化領域（ＡＤ）の融合タンパク質である。ＴｅｔＲは、ＤＮＡ−結合領域（ＤＮＡ  ＢＤ）（アミノ酸１−４４）及び二量体化面を有する調節性のコア領域（アミノ酸７５−２０７）を含んでなる。（ＢからＤ）トランジェントな活性化の後の、ＨＩＶ−ｒｔＴＡの培養組織のｄｏｘ制御の喪失。ＳｕｐＴ１細胞を、ＨＩＶ−ｒｔＴＡによってトランスフェクションし、１００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘで培養（Ｂ）、ＨＩＶ−ｒｔＴＡＶ９Ｉ−Ｇ１３８Ｄでトランスフェクションし、１０ｎｇ／ｍｌのｄｏｘで培養（Ｃ）、又はＨＩＶ−ｒｔＴＡＧ１９Ｆ−Ｅ３７Ｌでトランスフェクションし、１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘで培養（Ｄ）した。各実験は、１２の独立培養組織（異なるシンボルは、異なる培養組織を表す）で実施した３日目においてｄｏｘを洗浄除去し、培養組織をｄｏｘフリーの媒体に添加した。ウイルスがｄｏｘ制御を失わせなかった培養細胞を、６４日（Ｃ）又は６６日（Ｄ）に２つの部分に分割し、１つのサンプルにｄｏｘを添加した。ウイルス生成を、培養液上清サンプル上のＣＡ−ｐ２４  ＥＬＩＳＡによってモニターした。
【図２１】Ｐ５６Ｓ変異によってｔＴＡ様の表現型が生じることを示す。野生型及びＰ５６Ｓを変異するｒｔＴＡの活性は、ウイルスＬＴＲ−２ΔｔｅｔＯプロモータ（ＬＴＲ−２ΔｔｅｔＯ、Ａ）の制御下又は７つのＴｅｔＯエレメント（ＣＭＶ−７ｔｅｔＯ、Ｂ）の列に連結するＣＭＶ最小プロモータの制御下で、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するリポータプラスミドによってトランスフェクションしたＣ３３Ａ細胞において測定された。更に、ｒｔＴＡ活性は、染色体的に統合されたＣＭＶ−７ｔｅｔＯルシフェラーゼ構築物（ＣＭＶ−７ｔｅｔＯを統合された、Ｃ）のコピーを含むＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞（Ｂａｒｏｎその他、１９９７）において測定された。細胞は、ｒｔＴＡ発現プラスミド（全てのｒｔＴＡ変異体は、ｒｔＴＡ活性（Ｄａｓその他２００４ａ）を高めるＦ８６Ｙ及びＡ２０９Ｔ変異を含む）又は陰性対照（−）としてのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、並びにトランスフェクション効率の違いを較正するＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを構成的に発現するプラスミドによってトランスフェクションした。異なるｄｏｘ濃度（０−１０００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で細胞を培養した。ホタル及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性の比率をトランスフェクションの２日後に測定し、ｒｔＴＡ活性とした。全ての値は、１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘでの野生型ｒｔＴＡ活性を１００％として測定した。
【図２２】位置５６の全ての可能なアミノ酸を有するｒｔＴＡＧ１９Ｆ−Ｅ３７Ｌ変異体の活性。（Ａ）ｒｔＴＡの活性を、ＨｅＬａ  Ｘ１／６細胞において測定した（図２１を参照）。全ての変異体は、位置５６でのアミノ酸変異との組合せで、Ｇ１９Ｆ、Ｅ３７Ｌ、Ｆ８６Ｙ及びＡ２０９Ｔ変異を有する。Ｆ８６Ｙ及びＡ２０９Ｔ変異のみを有する野生型ｒｔＴＡをコントロールとして用い、１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘによる活性を１００％とした。２つのトランスフェクションの平均値を、標準偏差を示しているエラーバーでプロットした。（Ｂ）位置５６の全ての可能なアミノ酸を有するｒｔＴＡＧｉ９Ｐ  Ｅ３７Ｌ変異体のコドン表。不活性な変異体に対応するコドンを黒でマークし、ｄｏｘに依存する変異体を軽灰色でマークし、ｄｏｘなしで活性を有する変異体を濃い灰色でマークする。詳細はテキストを参照。
【図２３】位置５６の異なるアミノ酸を有する、ＨＩＶ−ｒｔＴＡＧ１９Ｆ−Ｅ３７Ｌ変異体の複製を示す。ＳｕｐＴ１細胞を、異なるｒｔＴＡアレルをコードする５μｇのＨＩＶ−ｒｔＴＡ分子クローンでトランスフェクションし、１μｇ／ｍｌ  ｄｏｘの有無において培養した。全てのｒｔＴＡ変異体はＦ８６Ｙ及びＡ２０９Ｔ変異を含む。ウイルス産生を、培養液上清サンプル上のＣＡ−ｐ２４  ＥＬＩＳＡによってモニターした。
【図２４】３回の安全変異による、ｄｏｘ制御の損失のブロッキング。ＳｕｐＴ１細胞を、１０００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘで３回の安全変異（ＨＩＶ−ｒｔＴＡＧ１９Ｆ−Ｅ３７Ｌ−Ｐ５６Ｋ）を含んでなるＨＩＶ−ｒｔＴＡによってトランスフェクションし、２４の独立培養（異なるシンボルは異なる培養を表す）に分割した。３日目にｄｏｘを洗浄除去し、培養細胞をｄｏｘフリーの培地に添加した。６０日目に全ての培養組織を２つに分割し、ｄｏｘ（１０００ｎｇ／ｍｌ）を１つのサンプルに添加した。ウイルス産生を、培養液上清サンプル上のＣＡ−ｐ２４  ＥＬＩＳＡによってモニターした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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