(57)【要約】  本発明は高トリプトファン含有ダイズミールを提供する。本発明はさらに、この新規ダイズミールの作成および利用方法を提供する。本発明はさらに、このダイズミールのさらなる加工由来の生産物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
約0.78 wt.%を超える全トリプトファンを含み、外来栄養由来のトリプトファンは添加されていない、ダイズミール。
【請求項２】
約0.8 wt.%を超える全トリプトファンを含む、請求項１記載のダイズミール。
【請求項３】
約0.9 wt.%を超える全トリプトファンを含む、請求項１記載のダイズミール。
【請求項４】
約1.0 wt.%を超える全トリプトファンを含む、請求項１記載のダイズミール。
【請求項５】
約1.3 wt.%を超える全トリプトファンを含む、請求項１記載のダイズミール。
【請求項６】
ダイズはトランスジェニックのものではない、請求項１記載のダイズミール。
【請求項７】
ダイズはトランスジェニックのものである、請求項１記載のダイズミール。
【請求項８】
全トリプトファン含有量が、さらに少なくとも0.10 wt.%濃度の遊離トリプトファンを含む、請求項１記載のダイズミール。
【請求項９】
全トリプトファン含有量が、さらにタンパク質結合トリプトファン含有量を含む、請求項１記載のダイズミール。
【請求項１０】
タンパク質結合トリプトファン含有量が、トランスジェニックタンパク質を含む、請求項９記載のダイズミール。
【請求項１１】
トランスジェニックタンパク質が、少なくとも約20 %のトリプトファン残基を含む、請求項１０記載のダイズミール。
【請求項１２】
トリプトファン生合成経路における酵素をコードする、少なくとも１遺伝子が過剰発現した結果、ダイズが高トリプトファン含有量を有する、請求項１記載のダイズミール。
【請求項１３】
酵素がアントラニル酸シンターゼ、ホスホリボシルアントラニル酸トランスフェラーゼ、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ、インドール-3-リン酸シンターゼおよびトリプトファンシンターゼよりなる群から選択される、請求項１２記載のダイズミール。
【請求項１４】
酵素がアントラニル酸シンターゼである、請求項１３記載のダイズミール。
【請求項１５】
遺伝子が導入遺伝子である、請求項１２記載のダイズミール。
【請求項１６】
導入遺伝子がフィードバック非感受性アントラニル酸シンターゼをコードする、請求項１５記載のダイズミール。
【請求項１７】
導入遺伝子がモノマーアントラニル酸シンターゼをコードする、請求項１５記載のダイズミール。
【請求項１８】
遺伝子がトランスジェニック転写因子によって過剰発現する、請求項１２記載のダイズミール。
【請求項１９】
ダイズが、トリプトファン生合成経路における反応を触媒する酵素をコードする導入遺伝子を発現し、該酵素は同反応を触媒する内因性酵素と比較して、フィードバック抑制に対して、より感受性が小さいか、非感受性である、請求項１記載のダイズミール。
【請求項２０】
導入遺伝子がアントラニル酸シンターゼをコードする、請求項１９記載のダイズミール。
【請求項２１】
アントラニル酸シンターゼがトウモロコシ C28変異体である、請求項２０記載のダイズミール。
【請求項２２】
トリプトファン分解経路における１以上の酵素活性が減少する、請求項１記載のダイズミール。
【請求項２３】
分解経路における酵素がコリスミ酸ムターゼ、トリプトファナーゼ、およびトリプトファンオキシダーゼを含む、請求項２２記載のダイズミール。
【請求項２４】
トリプトファンの分解経路における少なくとも１酵素をコードする遺伝子の遺伝子抑制によって、活性が減少する、請求項２２記載のダイズミール。
【請求項２５】
抑制はアンチセンスまたはセンス共抑制技術を利用することによって達成される、請求項２４記載のダイズミール。
【請求項２６】
請求項１のダイズミールを含む、動物飼料。
【請求項２７】
請求項１のミールを含む、発酵原料。
【請求項２８】
請求項１のダイズミールから生産された、ダイズタンパク質濃縮物。
【請求項２９】
請求項１のダイズミールを含む、水産養殖飼料。
【請求項３０】
a)トリプトファン生合成における酵素をコードする単離核酸分子を含む導入遺伝子を、ダイズ植物体の再生可能細胞に導入し、単離核酸分子は操作可能にダイズ細胞において機能的なプロモーターに連結され、形質転換されたダイズ植物体をもたらし；
b)該形質転換ダイズ植物細胞からダイズ植物体を再生し、該植物細胞は、同様の遺伝的バックグラウンドの非形質転換ダイズ植物体における穀粒のトリプトファン含有量と比較して、植物体の穀粒中のトリプトファン含有量が増加するのに効果的な量の単離核酸分子によってコードされた酵素を発現し；および
c)該形質転換植物体の穀粒からダイズミールを生産する
ことよりなる、少なくとも約0.78 wt.%の全トリプトファン量を有するダイズミールの生産方法。
【請求項３１】
導入遺伝子は、アントラニル酸シンターゼα-ドメインおよびアントラニル酸シンターゼを含むモノマーアントラニル酸シンターゼβ-ドメインをコードする、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
導入遺伝子はフィードバック非感受性トウモロコシアントラニル酸シンターゼα-サブユニットをコードする、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
a)全トリプトファン含有量が約0.65 wt.%ないし1.2 wt.%間であるダイズ穀粒を選択し；および
b)ダイズミールを生産するために該穀粒から油を抽出する
ことよりなる、ダイズミールの生産方法。
【請求項３４】
該穀粒は0.15 wt.%を超える遊離トリプトファンを有する、請求項３３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子工学、植物育種、穀物加工、および動物栄養の分野を含む。本発明は、動物飼養業における原料として利用される新規の高トリプトファンダイズミールに関する。
【背景技術】
【０００２】
肉用として飼育されている動物種は多数のアミノ酸を作り出す能力がなく、よってそれらのアミノ酸を食餌から得る必要がある。食餌から得られなければならないアミノ酸は必須アミノ酸と言われる。植物は全２０の必須アミノ酸を合成することができ、よって動物において、これらアミノ酸の一次エネルギー源としての機能を果たす。トリプトファンはこれら必須アミノ酸の１つであり、同時に、多くの飼料成分のアミノ酸組成において、代表的に不足している。
【０００３】
経済的なタンパク質源、例えば、トウモロコシ製粉および畜産処理プラントの副産物が、一般的に動物飼料として利用される。これらのタイプの副産物の例としてはトウモロコシグルテンミール、可溶性蒸留かす、肉および骨粉、羽毛粉および家禽ミールが含まれる。残念ながら、これらの副産物のトリプトファン含有量は、多くの動物の要求量に対して不足しており、よってある種の飼料配合によっては利用する量に制限がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ダイズミールは、タンパク質および必須アミノ線を提供する動物用飼料の１つの主要な成分である。ダイズが飼料中に含められた場合、含有率は一般的に最も制限のある必須アミノ酸に基づいて計算される。この制限となる必須アミノ酸は一般的にトリプトファンであり、結果として残りの必須アミノ酸が食餌の要求量を超過した状態となる。超過したアミノ酸は無駄となる。必要なものはよってより高濃度のトリプトファンを有するダイズミールを提供する形で存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ここに記載された本発明は、高全トリプトファン含有量を有する１以上のダイズの加工由来の、高トリプトファン含有ダイズミールに関する。本発明は、動物飼料産業における高トリプトファン含有ダイズミールの利用を含む。
【０００６】
故に、第１の局面として、本発明は乾物ベース（wt.%）で約0.78重量パーセントを超える全トリプトファン含有量を有するダイズミールを目的としており、ここでは外因性のトリプトファンは一切添加されていない。本発明の１具体例として、ダイズミールは少なくとも約0.10 wt.%の遊離トリプトファンを有する。他の具体例においては、ダイズミールは少なくとも約0.43 wt.%の遊離トリプトファンを有する。さらなる具体例においては、ダイズミールは少なくとも約44 wt.%か、それより高いタンパク質含有量を有する。加えてダイズミールは、トランスジェニック的に改変されたタンパク質を含むタンパク質結合トリプトファンをさらに有し、遺伝気組換え的に改変されたタンパク質は少なくとも8 wt.%のトリプトファン残基を含む。
【０００７】
本発明は、ダイズ植物体の再生可能細胞に、トリプトファン生合成経路における酵素をコードする単離核酸分子を含む導入遺伝子を導入し、そこでは単離核酸分子は操作可能にダイズ細胞において機能的なプロモーターに連結され、形質転換されたダイズ植物体をもたらし；および該形質転換ダイズ植物細胞からダイズ植物体を再生し、該植物細胞は、同様の遺伝的バックグラウンドの非形質転換ダイズ植物体における穀粒のトリプトファン含有量と比較して、植物体の穀粒中のトリプトファン含有量が増加するのに効果的な量の単離核酸分子によってコードされた酵素を発現し；および該形質転換植物体の穀粒からダイズミールを生産する、ことを含む、少なくとも約0.78 wt.%の全トリプトファン量を有するダイズミールの生産方法に関する。
【０００８】
本発明の１局面として、該方法はアントラニル酸シンターゼα-ドメインおよびアントラニル酸シンターゼβ-ドメインを含むモノマーアントラニル酸シンターゼをコードする導入遺伝子を含む。該方法はさらに、フィードバック非感受性トウモロコシアントラニル酸シンターゼα-サブユニットをコードする導入遺伝子を含む。該方法はさらに、ホスホリボシルアントラニル酸トランスフエラーゼ、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ、インドール-3-リン酸を含む。
【０００９】
他の局面として、本発明は以下を含む高トリプトファン含有ダイズミールの生産方法を目的としている：a)約0.65 wt.%を超える全トリプトファン含有量を有するダイズ穀粒を選択し；およびb)該穀粒からダイズミールを生産するために油を抽出する。本発明の１具体例として、高トリプトファン含有ダイズミールの生産方法はまた、約0.15 wt.%を超える遊離トリプトファンを有するダイズ穀粒を用いる。
【００１０】
他の局面として、本発明はダイズミールを動物生産業者用の飼料、ペット用の飼料、および水産養殖用の飼料を含む、動物用飼料に取り入れることを目的としている。本発明のダイズミールはまた発酵飼料原料をしても有用である。
【００１１】
他の局面として、本発明は動物用飼料に利用する高トリプトファン含有量で、脂肪分の高いダイズミールを目的とする。高トリプトファン含有量で、脂肪分の高いダイズミールはまた随意に押し出される。
【００１２】
他の局面として、本発明は高トリプトファン含有ダイズまたはダイズタンパク質濃縮を目的とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は新規の飼料成分、高トリプトファン含有ダイズミールについて記載している。本発明のミールは動物飼養業、また水産養殖飼料源として、および発酵培地として有用である。
【００１４】
以下の定義がここで用いられる：
外因性トリプトファン：ダイズミールが生産される元となるダイズ固有のものではないトリプトファン。外因性トリプトファンは食餌または飼料に添加され、その濃度を高める。
【００１５】
遊離トリプトファン：遊離酸性型のトリプトファンであり、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の一部ではないもの。
【００１６】
高脂肪分ダイズミール：油抽出段階を省略することを除いて、ダイズミールと同様に生産されるダイズ製品。
【００１７】
タンパク質量：ダイズ種子またはダイズミール中に含まれるタンパク質の重量パーセント。
【００１８】
ダイズミール：ダイズ穀粒の産物である飼料成分。「ダイズミール」という言いまわしは、ここで使用する場合、脱脂し、非溶解性とし、トーストしおよび粉砕したダイズについて言及している。
【００１９】
ダイズタンパク質アイソレート：大部分の非タンパク質成分を除去し、および絶対乾燥のもと90 %以上のタンパク質を含むことで作成したダイズ穀粒由来の調製物。
【００２０】
ダイズタンパク質濃縮物：ほとんどの油および水溶性非タンパク質成分を除去し、および絶対乾燥のもと約65 %以上のタンパク質を含むことで作成したダイズ穀粒由来の生成物。
【００２１】
導入遺伝子：少なくともプロモーター配列、コーディング領域、および転写終結配列を含み、遺伝子スプライシング技術を通して細胞遺伝子中に挿入された、核酸分子。
【００２２】
全トリプトファン含有量：遊離トリプトファンおよびタンパク質結合トリプトファン含有物の合計。
【００２３】
遊離トリプトファン含有量：ダイズ穀粒またはダイズミールの遊離トリプトファンの質量パーセント。
【００２４】
タンパク質結合トリプトファン含有量：ダイズ種子またはダイズミール中のタンパク質またはペプチドに取り込まれたトリプトファンの質量パーセント。「タンパク質結合トリプトファン」および「ペプチド結合トリプトファン」という言いまわしは、ここでは同様の意味で使用する。
【００２５】
高トリプトファンダイズ品種
本発明の高トリプトファン含有ダイズミールは、高トリプトファンダイズの品種の利用を含む。高トリプトファンダイズの品種の生産方法には様々なものがある。
【００２６】
ダイズ穀粒中のトリプトファンは、２つの異なる形によって存在する：タンパク質結合および遊離という形である。穀粒中の遊離トリプトファン濃度を増加する技術的アプローチは以下を含む：１）合成量の増大、２）分解の減少、または３）合成部位から貯蔵部位への輸送量の増大。加えて、上記アプローチのいずれかまたは全ての組合せが、最善の結果を達成するために利用し得る。
【００２７】
ダイズ植物体中のトリプトファン合成量の増大は、１）生合成経路における鍵酵素または酵素の過剰発現、または２）内因性酵素の反応と比較して、フィードバック抑制に対して、より感受性が小さいか、非感受性である、生合成経路における少なくとも１つの鍵酵素の発現、によって達成され得る。これらの方法の実施例は米国特許第2003/0097677号および第2003/0213010号に記載されており、参照することにより本明細書中に含まれる。
【００２８】
トリプトファン分解の減少は、１）分解に反応する酵素量の減少、または２）酵素阻害剤の発現による分解酵素の効果の減少、または３）元来の酵素の活性を競合的に阻害し得る分解酵素の変異型の発現によって達成される。酵素量はアンチセンス抑制、センス共抑制、RNA干渉、または当技術分野で周知の他の技術等の、遺伝子抑制技術によって減少され得る。
【００２９】
植物体は多くの形でもって、個々のアミノ酸に対するそれらの特異性、または親和性によって特徴づけられるアミノ酸トランスポーターを保有する。トリプトファントランスポーターの過剰発現または、より効果的なトリプトファントランスポーターの発現は、プラスチドから細胞質空間、余分な細胞空間、または小胞等の他の区分へのトリプトファンの輸送を容易にする。実施例として、米国特許第2003/0188332号を参照されたい。
【００３０】
タンパク質結合トリプトファンは、高レベルのトリプトファンを含む貯蔵タンパク質の過剰発現によって増大し得る。高トリプトファンタンパク質は天然タンパク質または天然タンパク質の修飾形態であり得る。これらの方法の実施例は国際特許出願第WO 98/45458号、第WO 98/20133号、および第WO 99/29882号に開示されている。
【００３１】
加えて、タンパク質結合トリプトファンは、ダイズ穀粒中のタンパク質の全濃度が、炭水化物および脂質などの他の成分と比較して、増加することによって重量パーセンテージベースで増加し得る。高タンパク質ダイズは、ダイズまたはダイズの変異集団の元来の遺伝資源をスクリーニングすることによって得られる。
【００３２】
他のタンパク質結合トリプトファンの増大方法は、トリプトファンが本質的に低い元来の貯蔵タンパク質の発現を抑制することである。この方法においては、ダイズ穀粒のアミノ酸組成が、非抑制の親系統と比較して、トリプトファンがより高レベルとなる方向に変化する。この方法の実施例としては、特にトウモロコシへの適用においては、しかしダイズにも適用可能であるが、米国特許第6,326,527号に記載されている。
【００３３】
ダイズにおけるタンパク質結合トリプトファンのさらなる増大方法は、トリプトファンコドンを他のアミノ酸をコードしているものと置き換えることによって、主要な貯蔵タンパク質をコードしている核酸配列を設計することである。結果として生じた発現タンパク質は、ゆえにより高レベルなトリプトファンを有し、それによって植物体における全トリプトファンレベルが増大する。この方法の実施例は米国特許第2003/0200558号に記載されている。
【００３４】
さらに他の方法において、遊離トリプトファンレベルは標的組織において増加し得、同時に、相補的タンパク質シンクが形成され、これがタンパク質結合トリプトファンの増加という結果をもたらす。この方法の実施例は米国特許第6,080,913号に記載されている。
【００３５】
当該技術分野における通常の技術の１つは、高トリプトファン含有量を有するダイズ穀粒の他の生産方法が存在することを認識し、および本発明における高トリプトファン含有ダイズミールを生み出すのに用いられ得る。
【００３６】
ダイズ加工および生成物
本発明の１局面において、高トリプトファンダイズは高トリプトファン含有ダイズミールへ加工される。未加工のダイズをダイズミールに加工する多くの方法が知られている。本発明の高トリプトファン含有ダイズミールは、これらの方法を、高トリプトファンダイズ穀粒に加工するのに用いることで調達される。
【００３７】
ダイズミールの調達の実例となる工程は、米国特許第4,922,294;5,225,230;5,773,051;および5,866,192号内で記載されているものも含む。一般的に、市販のダイズ加工過程はどれか従来の輸送方法による田畑からのダイズを入手する段階から始まる。ダイズは一般的に汚れた状態および、度々湿った状態で入手され、振動ふるいによって消毒され得る。この段階において、ダイズは非ダイズ-物質、例えば石、枝、葉、茎、汚れ、雑草種子、およびダイズの望ましくない断片から分離される。消毒されたダイズは、振動古いによっては除去されない緩んださやと共に、ほとんどの残留している緩んださやが空気中へ除去されるアスピレーター内に移動される。ダイズはそれから倉庫に移動され、および除去された緩んださやはさらなる加工における副産物として回収される。
【００３８】
加工過程のこの時点において、ダイズは一般的に約12 %の水分を含んでいるが、ダイズの実際の水分含有量は多くの異なる因子によって変化し得る。もしダイズの水分含有量が約12 %を超過していた場合、ダイズは倉庫に置かれるのに先立ち、水分量を約12 %より少なくするため、乾燥段階にさらされる。水分量の制御は、貯蔵の間のカビおよび細菌の混入を防止するのに不可欠なものである。
【００３９】
この時点から先の加工過程は、望まれる最終生産物によって変わり得る。例として、ダイズは最初に、クラッキンロールまたはハンマーミル等の従来からの装置を、従来の吸引システムと共に用いることで、さやが剥かれる。その代わりに、さやはさらなる加工の前までは除去されない。例として、米国特許第5,225,230号を参照されたい。トリプシン阻害剤等の、非栄養因子を非活性化するために、ダイズはクラッキング、粉砕、またはクラッシングに先だって一定期間加熱状態にさらされる。
【００４０】
クラッキング工程において、消毒され、乾燥した、全ダイズが粗い波形のローラーミルまたは「クラッカー」に与えられる。これらのクラッカーは１つ以上のローラーセットをもち得る。ダイズ断片、それは「クラック」と呼ばれる、が形成される。クラッキング段階の目標は、出発段階のダイズのサイズの４分の１ないし８分の１を断片の最大サイズとし、および直径1 mm未満の断片として、良好な形を最小化することである。
【００４１】
クラッキングミルから、全ダイズの穀粒（クラック）、それは一般的に１ないし３段階を採用している、を多段階吸引さや剥きシステムへ搬送する。各段階はアスピレーターおよびサイズ振るい分けシステムからなる。各段階において、食物繊維を多く含むさやが最初に逆流空気冷却装置およびサイクロンによって除去される。より重く、繊維の少ない、身の部分が、サイズによる少なくとも１つの付加的な画分を除去する振るい分けシステムに運ばれ、さらなる吸引の流れを生み出す。あるいは、スクリーニングは吸引に先立って行われる。「さや」の流れは、一般的に他のダイズ副産物と一緒に運ばれ、動物飼料成分として利用される。いったんさやが剥かれた身の部分はそれから、２段階商用前-抽出工程を用いて二回目のさや剥きを行い、粗繊維が約3 %未満(脱脂、乾燥状態では4.28 %粗繊維量である)であるようにする。しかしながら、単一段階システムもまた、身の部分を生み出すために採用され得る。
【００４２】
結果として生じた身は、それからロータリーまたはスタック  クッカー（stack cooker）等によって加熱条件下におかれる。亀裂の滞留時間は一般的に、約20および40分間である。吐き出し温度は一般的に約120ないし180oFの範囲である。より低い条件温度は、フレーカー内のより大きな微穀粒生産物が、耐え得る場合に用いられる。
【００４３】
調整された身の部分は、それからフレーカーと呼ばれるスムースローラーミルに与えられる。約500 kPa-ゲージ（72.5 psig）を超える力が一般的にローラーに適用される。約0.75 mm(0.030'')未満のフレークの厚さが、続く油抽出段階において最大の油回収を得るために、好ましくは生産される。任意的に、クラッキングおよびさや剥き段階は削除され、または調整段階に続いて行われる。付加的な選択は、フレーク化したダイズの割合を増大させ、油抽出に先立って「コレット」を形成し得る。他の工程のバリエーションは、クラッキング段階に先立つ調整、および油抽出に先立つさや剥き段階の削除を含む。さや剥き段階の削除というバリエーションを有する工程における本発明のダイズミールは、高トリプトファンおよび高繊維ダイズミールであると考えられ得る。この生産物はブタ生産業における特別な飼料成分となり得る。
【００４４】
ダイズミールを生産する工程における次の段階は、油抽出である。この抽出段階は一般に親油性溶媒を用いて行われるが、機械的抽出によっても行われ得る。この工程において、ダイズミールを適切な溶媒（例として、ヘキサン）と接触させ、一般的に重量にして約1 %未満の量まで油を除去する。従来の溶媒抽出手順の１実施例は、米国特許第3,721,569号に記載されている。
【００４５】
しかしながら、もし「脂肪分の高い」ダイズミールが必要とされる場合、含油ミールは油（脂肪または脂質とも知られる）抽出にはさらされない。本発明のこの具体例においては、結果として得られた産物は高トリプトファン含有量となり得るので、脂肪分の高いダイズミールであり得る。
【００４６】
この段階において、抽出された溶媒、脱脂ダイズミールは一般的に重量にして約30 %の溶媒を含んでいる。動物飼料として利用されるのに先立ち、ミールは一般的にジソルベンティザー(desolventizer)-トースター（DT）を通した工程を経て残留溶媒を除去し、およびタンパク質画分をトリプシン阻害剤および他の元来の毒性物質（接触阻害剤）が不活性化するまで、十分に加熱される。一般的に、スチームはダイズミールと接触し、および凝縮蒸気から放出された蒸気の熱が溶媒を蒸発させ、これは続いて再生および再利用される。
【００４７】
溶媒抽出の代替として、ダイズミールは、例えば、ねじプレスを用いて機械的に脱脂される。この機械的に抽出されまたは「連続圧縮」されたダイズミールは、一般的に約4および8 %の残留油を含む。もし、ミールの使用目的が反芻動物の飼料補助としてであったならば、ミールは米国特許第5,225,230号に記載されているような特定の方法によって、油が機械的に抽出される前にまず加熱されそれから乾燥される。脱脂ダイズミールはそれから乾燥され、および一般的に粉砕またはペレットされ、および食品補助としてまたは動物飼料として適切な物理的状態にまで粉砕される。
【００４８】
さらなるダイズまたはミールの加工は随意に行われ、結果として生じた飼料を動物においてより味がよく、利用可能で、および/または消化し易いものとなるようにする。これらの加工は酵素または栄養物の添加、およびミールの熱処理を含む。加えて、ペレット成形等の、さらなる加工がミールに対して行われ、ミールが分配においてより緻密および濃厚になるようにする。
【００４９】
ダイズミールのさらなる加工は、食料、飼料および産業的な利用を有するダイズ粉、ダイズタンパク質濃縮物、およびダイズタンパク質アイソレートを生産し得る。
【００５０】
ダイズ粉は脱脂ダイズミールを粉砕およびスクリーニングすることによって、単純に生産される。ダイズタンパク質濃縮物、少なくとも約65 wt.%タンパク質を有するものは、脱脂タンパク質ミールから溶解性炭水化物物質を除去することによって生成される。含水アルコール抽出物（水分の60ないし80 %はエタノール）またはタンパク質の等電点がpH 4.5に達することは、溶解性炭水化物画分を除去する最も一般的な方法である。無数の適用例が、それらのいずれも本発明における高トリプトファン含有ダイズミールを利用し得る、加工食品、肉、家禽類、魚、穀草類、および酪農システムにおいて、ダイズミール濃縮物および植物性タンパク質濃縮物について開発されてきた。
【００５１】
ダイズタンパク質アイソレートは、好ましくは標準的な化学的分離を通して生産されるのがよく、可溶化させた（pH 7ないし10におけるアルカリ処理）脱脂ダイズフレークからタンパク質を抽出し、および等電沈殿に続く分離を行う。結果として、アイソレートは少なくとも約90 wt. %のタンパク質となる。これらは時々ナトリウムおよびミネラル（灰分量）が高く、その応用性を限定し得る特性を有する。これらの主要な適用例は、特殊調製粉乳および代用乳等の、乳製品代用品である。
【００５２】
ダイズ粉はしばしば肉増強剤および類似品、ペットフード、製パン用原料、および他の食品の生産において利用される。ダイズ粉およびアイソレートから作成される食品は離乳食、砂糖菓子製品、シリアル、食品飲料、麺類、イースト、ビール、エール等を含む。
【００５３】
当該技術分野に周知の者は、上記生産者におけるバリエーションが本発明の精神を離れることなく行われ得ることに気がつくであろう。本発明の高トリプトファン含有ダイズミールは、上記生産物のいずれにもさらに加工することができる。
【００５４】
飼料配合
本発明における高トリプトファン含有ダイズミールは、様々な飼料配合に利用される。好ましい具体例において、本発明における高トリプトファン含有ダイズミールは、ブタおよび家禽等の胃簡易動物の飼料配合において利用される。本発明における高トリプトファン含有ダイズミールによって、含有率は一般的に、商品としてのダイズミールと比較して減少する。飼料配合における本発明のダイズミールの利用は、トリプトファンの外来源の添加の必要性を減少または取り除き得る。本発明におけるダイズミールのこれらの特徴は、飼料配合においてより多くの選択肢を有する動物生産業者および考案者に利益を提供する。
【００５５】
本発明における高トリプトファン含有ダイズミールは、考案者が動物飼料においてより安価な成分を利用することを可能にし、これは動物生産業者の飼料コストを下げることにつながる。以下の表に示されることは、本発明における高トリプトファン含有ダイズミール（C）、動物副産物を含まない配合（A）、および動物副産物を含む配合（B）を用いたブロイラー育成飼料の比較である。表に示すように、肉および骨粉（MBM）および本発明の高トリプトファン含有ダイズミール(HT)を有するトウモロコシグルテンミールが利用可能となることで、飼料1トンあたりのコストが4ないし6ドル減少する。
2009500039.tif 000002
【００５６】
以下の表に挙げるものは、選択された飼料成分および飼料配合であり、および粗タンパク質（CP）、リシン（Lys）、およびトリプトファン（Trp）含有量である。低いトリプトファン含有量であるが高タンパク質を含む一定の成分は、本発明における高トリプトファン含有ダイズミールと調合するのに利用され得ることが読み取れる。
2009500039.tif 000003
【実施例】
【００５７】
本発明は、さらに以下の実施例において詳述し、それらは実例として提供されおよびいかなる方法においても本発明を制限するものではない。
【００５８】
この実施例は、本発明の高トリプトファン含有ダイズミールを調製するのに用いられるトランスジェニック高トリプトファンダイズの生産について記載する。
【００５９】
GM_A15238:0015と設計された高トリプトファンダイズは、Weaver等（米国特許第2003/0213010号、既に参照することにより本明細書中に含まれる）によって記載されたようにして生産した。簡潔には、ダイズ植物体はベクターpMON39325を用いて形質転換をし、75α'プロモーターによって発現が誘導されるフィードバック非感受性トウモロコシアントラニル酸シンターゼ（AS）α-サブユニットをコードする配列を含む。高トリプトファンレベルを含む事象を選択し、GM_A15238と番号を振った。この事象由来のR1種子は、R1植物体を生産する温室条件下で育成した。インベーダー  アッセイ（Invader(登録商標) Assay）を用いて、（Third Wave Technologies, Inc., Madison, W1）ホモおよびヘテロ植物体の同定を行った。１遺伝子陽性ホモ植物体（GM_A15238:0015）および１遺伝子陰性ホモ植物体（GM_A15238:0017）が選択され、さらなる世代に応用した。高トリプトファン含有ダイズミール調製のためのダイズ穀粒の生産は、規制されたトランスジェニック材料のUSDA規則のガイダンスの下で行った(例として、7CFR 340を参照されたい)。
【００６０】
実施例２
この実施例は、ダイズ種子およびミールにおける遊離および全トリプトファン、および全タンパク質の分析方法について説明する。
【００６１】
遊離トリプトファン
ダイズミールにおけるアミノ酸は、o-フタルアルデヒド(OPA)と共にプレカラム１級アミン誘導体化を用いて同定される。結果として生じたアミノ酸付加化合物である、アイソレートは疎水性でありおよび優れた蛍光特性を保有し、このことが蛍光検出器において同定されることを可能とする。逆相クロマトグラフィーを用いて、各アミノ酸に位置するR基の疎水性を通して分離が達成される。蛍光色素分子を安定化するのを補助するために、2-メルカプトエタノール、3-メルカプトプロピオン酸等のチオールが添加される。
【００６２】
種子およびミールサンプルは1 mmの振るいの細かさ、またはそれより細かい大きさにまで粉砕される。粉砕したサンプルは分析に先立ち5 ℃で貯蔵される。分析のために、サンプルは室温状態にされ、それから円錐型遠心分離管（2.0 ml容量）中で直接重さを測った。サンプルの抽出溶媒に対する比率は同等であるかまたは30 mg/ml未満である。5 %トリクロロ酢酸(TCA)溶液(part no. VW3372-1, VWR Scientific, West Chester, PA)を各サンプルに添加し、ボルテックスによって約30分間混合した。サンプルは一晩寝かし(16時間)抽出の完了を確実に行う。サンプルはそれからボルテックスによって約30分混合し、30分間、3000 rpmで遠心分離をし、上澄みを分析に先だって-80 ℃にて保存、貯蔵をする。
【００６３】
アミノ酸は、蛍光検出器(FLD)およびZorbax Eclipse-AAA、XDB C-18カラム、Zorbax Eclipse-AAA保護カラムと共に、HPLC(model 1100, Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA)によって分析をし、パラメーターは以下の通りである：
方法を実行するまでの分析時間：14.0 分
実行毎の全経過時間：約17 分
標準および最小サンプル量：    標準：50 mg
最小：30 mg
標準分析範囲: 7.8ないし800 pmol/μL.
【００６４】
移動相は（A）0.001 %アジ化ナトリウムとpH=7.8の40 mM Na2HPO4 バッファーおよび、（B）アセトニトリル：MeOH:H2O(45:45:10 v/v)である。全試薬はHPLCグレードであり、および全溶媒はHoneywell, Burdick and Jackson(Muskegon, Michigan)由来の高純度なものである。以下は使用した移動相の勾配およびHLPC設定を示す表である。
時間（分） % B
0.00            5.0 
1.00            5.0
9.80            35.0
12.00           100.0
12.50           5.0
14.00           5.0
温度：40 ℃
カラムフロー：2.00 mL/分
FLD  セッティング:励起: 340 nm
発光: 450 nm
ピーク幅: ＞0.2分
PMT ゲイン: 10
蛍光スキャン:励起範囲: 220ないし380 nm、ステップ 5 nm
発光範囲: 300ないし500 nm、ステップ5 nm
AOAC(登録商標) 正式手法990.03、(2000)、(AOAC(登録商標) International, Gaithersburg, MD)によって行われる粗タンパク質分析；AOAC(登録商標)正式手法982.30E(a,b,c)、CHP.45.3.05, (2000)によるおよびアミノ酸特性。
【００６５】
実施例３
この実施例はパイロットプラント規模でのダイズミールの製造について説明する。
【００６６】
本発明のダイズミール、ここに記載された飼育試験に使用されるものは、溶媒抽出過程によって、パイロットプラント規模で調製した。
【００６７】
高トリプトファンダイズであるGM_A15238:0015（実施例１に記載）は、親系統であるA4922(Asgrow Seed Company, Des Monis, IA)同様、またネガティブトランスジェニックアイソライン(isoline)であるGM_A15238:0017は、消毒し10および10.5 %の湿度中でベフラン  ウィックス  ドライヤー(behlan wicks drier)(Behlen Manufacturing Company, Columbus, NE)によって乾燥した。消毒し乾燥させたダイズはそれから蓋付きの、持ち運び可能なビン中で1ないし3日貯蔵され、さやから身がほぐれやすくなるようにした。マメはそれから一本鎖フェレール-ロス（Ferrell-Ross）(A. T. Ferrell Company Inc., Bluffton, IN) クラッキングミル中に送った。クラッキンロールは大気温度下、ギャップを8、これは1.9 mmに相当するもとで操作を行った。ローラーは、速度の遅いローラーを700 ppmで走らせながら、スピードの違いの比率が1.5:1となるように操作を行った。
【００６８】
クラッキンミル由来で作成されたクラックは、多段空力さや剥きシステム(Kice Zigzag Aspirator, Kice Industries, Wichita, KS)に搬送し、さやが身から除去されるようにした。アスピレーターは1ないし2.4インチの絶対水圧下で行った。結果として得られたさやは回収し、ハンマーミルに送った。ハンマーミル由来の生産物は比重差選別装置に送り、そこでは身の豊富な画分がさやから分離されそして回収された。この方法で回収した身は、フレーキングに先立って吸引したクラック画分と混合した（混合身画分）。
【００６９】
混合身画分はそれから、66ないし188 kg/時間でスコット  テンダーブレンド  コンディショナー(Scott Tenderblend conditioner)（model number SJC2, Scott Equipment Company, New Prague, MN）に搬送し、出口温度が55ないし67 ℃となるよう加熱し、および湿度が9.5 %となるようにした。調整した混合身画分はロスカンプ  フレーキング  ロールモデル(Roskamp flaking roll model)2862 (28'' 直径X62''幅、CRM Roskamp Champion, Waterloo, IA)に送り、そこでは画分は、厚さが0.23ないし0.36 mmにまで、60 ℃で、ギャップを0.100インチに設定したものを用いて薄片化した。
【００７０】
フレークはそれからクラウン  アイロン  ウォークス  モデル(Crown Iron Works model)2ろ過抽出機（Crown Iron Works Co., Roseville, MN）へ、油抽出のために送った。抽出機は滞留時間を約37分、ミールの重量に対するヘキサンの割合を1:1、そして処理能力が約140 kg/時間であることを利用して操作した。ミールを抽出した溶媒は、それからクラウン  スネッケン  プレ-ジソルベンティザー（Crown Schnecken pre-desolventizer）を介して２段式クラウン  ジソルベンティザー(Crown desolventizer)トースター(DT)へ運ばれた。プレ-ジソルベンティザー（pre-desolventizer）は0.2インチの水圧下で操作し、50 ℃の吐き出し温度が与えられるようにした。DTは以下の条件下で操作した：上段の温度は91ないし104 ℃；下段の温度は101ないし103 ℃；およびDTの蒸気温度が75±5 ℃。結果として生じたミールは、出口湿度のレベルが16ないし19 %であり、およびpHの値が0.15±0.5上昇するのに対応するウレアーゼレベルを有した。
【００７１】
脱溶媒和（desolventized）したミールを、それから湿度レベルが8.5ないし9.5 %にまで乾燥し、12/64インチの振るいを通過するまで十分に小さな穀粒サイズになるようハンマーミルにかけた。
【００７２】
結果として生じたダイズミールは、以下に示す安定性試験およびブロイラー飼料試験において利用した。
【００７３】
実施例４
この実施例は、商用および高トリプトファン含有ダイズミールと、ミール生産用に対応するダイズ穀粒の、タンパク質およびトリプトファンの含有量を記載および比較する。本発明の高トリプトファン含有ダイズミール（HT SBM）、商用ダイズミール、商用ダイズ、およびコントロールミールの分析結果を、以下の表２において示す。コントロールおよび高トリプトファンダイズミールは、実施例３に記載するようにパイロット規模で加工した。さらに表２には、比較として含むダイズアイソレートおよびダイズ濃縮物の値を含めた。
2009500039.tif 000004
【００７４】
表２を作成するのに用いた分析方法は、実施例２に記載している。
【００７５】
実施例５
この実施例は、加工および貯蔵中における、本発明の高トリプトファン含有ダイズミースにおける遊離トリプトファンの安定性の測定を記載する。
【００７６】
上記実施例３および４において記載した、高トリプトファン含有ダイズミールは、個々に記載する安定性の測定に利用した。工程サンプルを様々な段階において取り、実施例２に記載したように遊離トリプトファンについて分析をした。これらのサンプルによる解析結果を以下の表３にまとめている。結果は、高トリプトファン含有ダイズミールの生産中に際だった遊離トリプトファン濃度の喪失は見られないということを示している。完成したダイズミールは、脱脂し、さやを剥き、および湿気のない基準に戻した場合、約98 %の初期遊離トリプトファンをダイズ穀粒中に保持した。比較として、90分のDT段階において追加の加熱時間にさらしたダイズミール（過度に煮たダイズミール）は、かなり低トリプトファン濃度を有し、これはより厳しい加熱条件下では分解が可能であることを示している。
2009500039.tif 000005
【００７７】
安定化試験は、ミールの貯蔵中に遊離および全トリプトファンの安定性を決定するために行った。高トリプトファン含有ダイズミールのサンプルは、上記実施例３および４で記載したように、4 ℃、22 ℃、および38 ℃で６分間環境室内に保存した（Enconair Model GC8-2H, Enconair Ecological Chambers Inc., Winnipeg, Mannitoba, Canada）。38 ℃で貯蔵したサンプルはまた60 %の湿度で制御した。約600グラムの高トリプトファン含有ダイズミールのサンプルをナルゲン瓶に収容した。副サンプルは以下の表４および５で特定する時点において分析し、各時点における分析は重複して行われた。
【００７８】
結果は表４および５に示す。結果は、６ヶ月を過ぎ、高温（38 ℃）であっても、遊離およびタンパク質結合トリプトファン両者共に、本発明の高トリプトファン含有ダイズミールにおいては安定していることを示す。
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表４および５において、各データーポイントは２つの複製の平均を示す。
【００７９】
実施例６
この実施例は、実施例３において記載した方法で生産した高トリプトファン含有ダイズミールを用いたブロイラー飼養研究について記載する。
【００８０】
飼養研究は、処理ごとに７食餌療法および１０複製を含む、乱獲法計画を用いて行った。本研究で用いた処理、２ダイズミールの分析、および飼料配合は表６から８において記載した。３つのバッテリーを内蔵したセブンティ  ペタースミン(Petersime)（Zulte, Belgium）ケージを10ブロックに分割した（複製）。ブロックは、各バッテリー内におけるケージの位置およびレベルがブロッキング因子となるような方法で区分した。ロス(Ross) 308(Welp Hatchery, Bancroft, IA)株の全560雄ブロイラー（ヒナ）を、この２１日間の試験に用いた。
【００８１】
ヒナが生後７日目の時、体重を測定し、ランダムにケージに割り当て、試験を開始した。ヒナは成長過程を通して、随意に水および飼料に接触した。全年齢時においてすりつぶした飼料を利用した。
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【００８２】
体重および飼料接種測定は、試験の約７日、１４日、２１日、および２８日に記録し、平均の１日当たりの増加量、飼料摂取量、および７ないし１４日、１４ないし２１日、２１ないし２８日、ならびに試験時期全体における増加に対する飼料の比率を計算した。死亡率もまた、試験を通して記録した。
【００８３】
室温は１日目は90±2 Foで制御し、試験終了日まで各日ごとに1 Foずつ低下し、日ごとの最高気温および最低気温も記録した。実験全体を通して23時間を照明持続時間帯とし、午前０時から午前１時までの１時間を暗期時間帯とした。各ケージは、試験開始時点で１匹当たり0.58平方フィートの成長密度として、６匹のヒナを収容した。
【００８４】
表９は、処理２ないし７を用いたブロイラーのパフォーマンスデーターの要因分析を示す。比較の目的のために、コントロールの平均パフォーマンスも挙げている。平均的傾向は試験期間を通して非常に類似している。７ないし２８日齢の結果は、飼料：ダイズミールレベルの主要効果間での増加率、において明らかな差異があることを示している（P値＜0.0001）。なぜなら食餌はトリプトファンを第１の制限栄養素として有するよう調整されるので、SBMレベルの増加によるパフォーマンスのポジティブ反応は、トリプトファン含有量の増加に起因し得る。トリプトファン源の主な効果間の平均パフォーマンスはこの結論を裏付ける。親SBMに遊離トリプトファンを添加したもの（P＋T、処理４および５）およびポジティブトリプトファンアイソライン(isoline)SBM(HT、処理６および７)は同量の食餌トリプトファンを有し、それらパフォーマンスは非常に類似していた（0ないし28日：増加率はP＋TおよびHT、各々、1.611および1.624）。しかしながら、親SBM飼料、これは低レベルのトリプトファンを含む、を与えたヒナ（処理２および３）は、非常に貧弱なパフォーマンスを示した（0ないし28日：増加率は1.801）。試験結果はさらに、トランスジェニック高トリプトファンミール（HT）中のトリプトファンは、外因的に供給された合成トリプトファン（P＋T）と全く一致していることを、ヒナのパフォーマンスで持って示している。
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【００８５】
実施例７
この実施例は、本発明の高トリプトファン含有ダイズミールの調製に有用な高トリプトファン、高タンパク質ダイズ品種の産出を記載する。
【００８６】
ダイズは、トウモロコシアントラニル酸シンターゼ α遺伝子（米国特許第2003/0213010号に記載されている）と同型であるR3世代において、高タンパク質ダイズ品種EXP3103REN（PCT出願第PCT/US05/002503号に記載されている）と交配し、F1種子を産出した。結果として得られたF1種子を植え付け、F2種子を産出するまで成熟させた。結果として得られたF2種子を植え付け、得られた植物体はグリホサート耐性およびトリプトファン含有に関する遺伝子型となった。グリホサート耐性および高トリプトファン遺伝子と異型であると同定された植物体は間引きした。結果として得られたF2:3種子は単一植物の収穫時に回収し、当業技術分野で周知の手法を用いて、遊離トリプトファン（上記実施例２に記載している）、全タンパク質および全油含有量について分析した。F2:3抽出の結果は、高トリプトファン表現型は高タンパク質遺伝資源において、一方で許容し得る油レベルを維持しながら、約期待度数まで発現することを示している（表10）。
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【００８７】
表１０に記載された各事象由来の単一系統は種子の組成、グリホサート除草剤への耐性および一般作物栽培学としての品質を評価するために、野外実験をさらに行った。野外実験は、以下に続く３グリホサート処理；グリホサート無し、V3およびR1における1.5 lbs グリホサート酸当量(ae)/A、およびV3における1.5 lbs グリホサートae/AおよびR1ステージにおける3.0 lbs グリホサートae/Aの複製と共に乱分割法設計を用いた。全スポットは成熟時に収穫し、および副サンプルについては、トリプトファン、石油タンパク質、萎黄病、壊死、草丈、成熟度および収穫高を分析した。F2：4試験の結果は、高トリプトファン形質は、高タンパク質遺伝資源において発現するという早期の結果を確信付けた。加えて、この結果は、高トリプトファン形質の存在はグリホサート耐性に影響を及ぼさないことを示唆する。この実施例は、本発明の高トリプトファン含有ダイズミールの産出に利用するための付加的なダイズ源を提供する。これらのダイズは実施例３において上記のように、高トリプトファン含有ダイズミールに加工される。
【００８８】
本発明が本特許出願において、本発明の好ましい実施形態の詳細を参照することにより開示される一方で、変更は当業者に対して、本発明の精神および添付した請求の範囲内で、簡単に起こり得ることを熟考するのと同様、開示は制限というよりも説明ということを意図していることは理解されなければならない。
【国際調査報告】
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