(57)【要約】本発明は、筋芽細胞又は筋繊維から神経細胞への分化を誘導する化合物、これを含む薬学的組成物、神経分化を誘導する方法、及び神経分化を誘導する付加化合物を同定するスクリーニング方法に関するものである。本発明は、神経分化を誘導する化合物、上記化合物を含み、すべての薬学的に許容可能な異性体、塩、水和物、溶媒和物、及びそれらのプロドラッグを含む薬学的組成物、及び筋芽細胞又は筋繊維を上記化合物と共に培養して筋芽細胞又は筋繊維から神経細胞への分化を誘導する方法、そして筋芽細胞又は筋繊維を調査対象化合物共に培養した後、筋芽細胞又は筋繊維の神経細胞への分化を確認する段階を含む、筋芽細胞又は筋繊維から神経分化を誘導する付加化合物を同定するスクリーニング方法を提供する。
2009517379.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式を有する一般式(Ｉ)の化合物。
【化１】
2009517379.tif 000017
ここで、式中、Ｒ１は水素、Ｃ０-４アルキルアリール、Ｃ１-６アルキル、Ｃ３-８シクロアルキル、及び-[(ＣＨ２)２Ｏ]０-３-(ＣＨ２)２ＮＨ２からなる官能基より選択されるいずれか１つであるが、これらに限定されるものではなく、
Ｒ２はアルキル、Ｃ３-８シクロアルキル、Ｃ０-４アルキルアリール、及びアルケニルアリールからなる官能基より選択されるいずれか１つであるが、これらに限定されるものではなく、
Ｒ３はアルキル、Ｃ３-８シクロアルキル、Ｃ０-４アルキルアリール、及びアルケニルアリールからなる官能基より選択されるいずれか１つであるが、これらに限定されるものではなく、
Ｒ４はアルキル、Ｃ３-８シクロアルキル、Ｃ０-４アルキルアリール、及びアルケニルアリールからなる官能基より選択されるいずれか１つであるが、これらに限定されるものではない。
【請求項２】
上記Ｒ１は、下記群より選択されるいずれか１つであることを特徴とする請求項１に記載の化合物。 
【化２】
2009517379.tif 000018
【請求項３】
上記Ｒ２は、下記群より選択されるいずれか１つであることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【化３】
2009517379.tif 000019
【請求項４】
上記Ｒ３及びＲ４は、下記群より選択されるいずれか１つであることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【化４】
2009517379.tif 000020
【請求項５】
上記化合物は、下記群より選択されるいずれか１つであることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【化５】
2009517379.tif 000021
【請求項６】
上記化合物は、下記の化合物であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【化６】
2009517379.tif 000022
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物を含む薬学的組成物。
【請求項８】
筋芽細胞及び筋繊維を請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物で処理して神経細胞への分化を誘導することを特徴とする筋芽細胞及び筋繊維から神経細胞への分化を誘導する方法。
【請求項９】
筋芽細胞及び筋繊維の神経細胞への分化を確認する段階をさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の筋芽細胞及び筋繊維から神経細胞への分化を誘導する方法。
【請求項１０】
上記筋芽細胞及び筋繊維の神経細胞への分化を確認する段階は、神経細胞特異的蛋白質の発現を調べることを特徴とする請求項９に記載の筋芽細胞及び筋繊維から神経細胞への分化を誘導する方法。
【請求項１１】
上記筋芽細胞及び筋繊維の神経細胞への分化を確認する段階は、細胞の形態変化を観察することを特徴とする請求項９に記載の筋芽細胞及び筋繊維から神経細胞への分化を誘導する方法。
【請求項１２】
上記筋芽細胞及び筋繊維の神経細胞への分化を確認する段階は、１００ｍＭ ＫＣｌの存在下でＦＭ１-４３によって処理した後、細胞の蛍光強度を測定することを特徴とする請求項９に記載の筋芽細胞及び筋繊維から神経細胞への分化を誘導する方法。
【請求項１３】
上記筋芽細胞は、マウスから分離することを特徴とする請求項８に記載の筋芽細胞及び筋繊維から神経細胞への分化を誘導する方法。
【請求項１４】
上記筋芽細胞は、霊長類から分離することを特徴とする請求項８に記載の筋芽細胞及び筋繊維から神経細胞への分化を誘導する方法。
【請求項１５】
上記筋芽細胞は、ヒトから分離することを特徴とする請求項８に記載の筋芽細胞及び筋繊維から神経細胞への分化を誘導する方法。
【請求項１６】
筋芽細胞及び筋繊維を請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物と共に培養した後、筋芽細胞及び筋繊維の神経細胞への分化を確認する段階を含むことを特徴とする筋芽細胞及び筋繊維から神経分化を誘導する付加化合物を同定するスクリーニング方法。
【請求項１７】
哺乳類の細胞を請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物と共に培養して神経細胞に分化させる段階と、
分化した神経細胞を患者に投与する段階と、を含むことを特徴とする退行性神経疾患の治療方法。
【請求項１８】
上記分化した神経細胞を患者に投与する段階は外科的注入によることを特徴とする請求項１７に記載の退行性神経疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋芽細胞又は筋繊維から神経細胞への分化を誘導する化合物、これを含む薬学的組成物、神経分化を誘導する方法、及び神経分化を誘導する付加化合物を同定するスクリーニング方法に関するものである。より詳しくは、筋芽細胞又は筋繊維の神経分化に用いられるイミダゾール骨格を含む化合物に関するものである。いくつかの実施形態において、イミダゾール誘導体を含む薬学的組成物を提供する。他の実施形態において、筋芽細胞又は筋繊維を神経細胞に分化させる方法を提供する。その他に、筋芽細胞又は筋繊維から神経分化を誘導する化合物を同定するスクリーニング方法をさらに提供する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物は、神経細胞が損傷すると再生されないが、神経細胞が損傷すると脳卒中、脊髄損傷、パーキンソン病、又はアルツハイマー病（Ｊ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ. ２００５,９３,１４１２ 及び Ｎｅｕｒｏｎ ２００３,３９,８８９）のような退行性神経疾患が発生する。近年、幹細胞研究の発展で心血管疾患、退行性神経疾患、筋骨格疾患、糖尿病、及び癌のような多数の病気を治療できる可能性が高くなった（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００２, ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ, Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ, Ｄ.Ｃ）。しかしながら、幹細胞を利用した治療法は、１）移植可能な機能を有する再生可能な細胞源を同定すること、２）正確に幹細胞から目的とする細胞に分化させることができること、３）分化した細胞は患者の免疫系に反応しないこと、４）未分化幹細胞が癌細胞に転換されないこと、などの問題を解決しなければならない（Ｃｕｒｒ. Ｔｏｐ. Ｍｅｄ. Ｃｈｅｍ. ２００５, ５, ３８３及びＮａｔ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. ２００４,２２,８３３）。
【０００３】
なお、他に、神経細胞を得ることができる潜在力の大きい方法は、小分子を用いて筋芽細胞又は筋繊維のように容易に求められる細胞や組織を神経分化させる化学的方法である（Ｎａｔｕｒｅ２００２, ４１６, ４８５, Ｎａｔｕｒｅ ２００２, ４１８, ４１及びＳｃｉｅｎｃｅ２００４, ３０３, １６６９）。近年、小分子を用いて哺乳動物細胞を特定細胞に分化させるいくつかの研究結果が報告されている。例えば、パーモルファミン（Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）を用いて中胚葉繊維芽細胞を骨芽細胞に分化させることができ(Ｊ. Ａｍ. Ｃｈｅｍ. Ｓｏｃ. ２００２,１２４,１４５２０）、カルディオゲノール及びＴＷＳ-１１９を用いて胚性幹細胞であるＰ１９細胞を各々心筋細胞及び神経細胞に分化させることができる（Ｊ. Ａｍ. Ｃｈｅｍ. Ｓｏｃ. ２００４, １２６, １５９０及びＰｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ２００３, １００, ７６３２）。したがって、神経分化を誘導することができる小分子は、退行性神経疾患の移植治療試験をするための神経細胞を得る際に非常に有用である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そのために、従来技術から容易に求められる細胞や組織を用いて神経細胞に分化させるための組成物及び方法が要求されている。開発された小分子誘導体は、神経分化の分子的作用メカニズムの究明に重要な情報を得る際に利用でき、又、究極的にインビボでの神経再生ができるようにする。本発明はこれのみでなく他の要求を充足させる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、筋芽細胞又は筋繊維を神経細胞に分化させることができる新規な化合物及び方法に関するものである。したがって、上記化合物は、退行性神経疾患治療のために筋芽細胞及び筋繊維から神経細胞を産生する際に用いることができる。
【０００６】
本発明の第１の目的は、筋芽細胞又は筋繊維を神経分化させることができる化合物を提供することである。
本発明の第２の目的は、損傷神経細胞によって誘発された内科的機能障害又は内科的疾患を治療するために筋芽細胞又は筋繊維を神経分化させることができる活性成分として上記化合物を含む有用な薬学的組成物を提供することである。上記化合物は、全ての薬学的に許容可能な異性体、塩、水和物、溶媒和物及びそれらのプロドラッグを含む。
【０００７】
本発明の第３の目的は、筋芽細胞又は筋繊維を神経分化させる方法を提供することである。すなわち、上記化合物を哺乳類の筋芽細胞又は筋繊維と共に培養するとこれらの細胞は神経細胞に分化する。  
【０００８】
本発明の第４の目的は、筋芽細胞又は筋繊維を神経分化させることができる付加化合物を同定するスクリーニング方法を提供することである。
本発明の他の実施形態は次に述べることから明確である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって開発される小分子は、神経細胞分化の分子的作用メカニズムの究明に重要な情報を得る際に利用でき、又、究極的に神経細胞の再生に利用して退行性神経疾患を治療することができるようにする効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、下記一般式（Ｉ）の新規なイミダゾール誘導体を提供する。
【００１１】
【化１】
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上記式中、Ｒ１は水素、Ｃ０-４アルキルアリール、Ｃ１-６アルキル、Ｃ３-８シクロアルキル、及び-[(ＣＨ２)２Ｏ]０-３-(ＣＨ２)２ＮＨ２からなる官能基より選択されるいずれか１つであるが、これらに限定されるものではない。
【００１２】
上記式中、Ｒ２はアルキル、Ｃ３-８シクロアルキル、Ｃ０-４アルキルアリール、及びアルケニルアリールからなる官能基より選択されるいずれか１つであるが、これらに限定されるものではない。
【００１３】
上記式中、Ｒ３はアルキル、Ｃ３-８シクロアルキル、Ｃ０-４アルキルアリール、及びアルケニルアリールからなる官能基より選択されるいずれか１つであるが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
上記式中、Ｒ４はアルキル、Ｃ３-８シクロアルキル、Ｃ０-４アルキルアリール、及びアルケニルアリールからなる官能基より選択されるいずれか１つであるが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
好ましい化合物は、上記Ｒ１が下記より選択される官能基を有している誘導体を含むものであるが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
【化２】
2009517379.tif 000004
好ましい化合物は、上記Ｒ２が下記より選択される官能基を有している誘導体を含むものであるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
【化３】
2009517379.tif 000005
好ましい化合物は、上記Ｒ３とＲ４が下記より選択される官能基を有している誘導体を含むものであるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
【化４】
2009517379.tif 000006
本発明のさらに好ましい化合物は、下記記載の化合物であるが、本発明がこれらに限定されるものではない。
【００１９】
【化５】
2009517379.tif 000007
上記化合物の中で、特に好ましい化合物は次の構造を有している化合物である。
【００２０】
【化６】
2009517379.tif 000008
又、本発明は、全ての薬学的に許容可能な異性体、塩、水和物、溶媒和物、及びそれらのプロドラッグを提供する。
【００２１】
又、本発明は、筋芽細胞又は筋繊維を本発明の化合物で処理し、筋芽細胞又は筋繊維から神経細胞への分化を誘導する方法を提供する。 
又、本発明は、筋芽細胞又は筋繊維を本発明の化合物と共に培養した後、筋芽細胞又は筋繊維の神経細胞への分化を確認する段階を含む筋芽細胞又は筋繊維から神経分化を誘導する付加化合物を同定するスクリーニング方法を提供する。
【００２２】
筋芽細胞又は筋繊維から神経分化を誘導する方法
本発明に係る化合物は、筋芽細胞又は筋繊維を神経分化させる際に用いることができる。筋芽細胞を多様な濃度の一般式（Ｉ）の化合物（或いはその組成物）と共に培養すると、これらの細胞は神経細胞に分化する。又、分離した骨格筋繊維で生成された衛星筋前駆細胞を多様な濃度の一般式（Ｉ）の化合物（或いはその組成物）で処理すると、これらの細胞は神経細胞に分化する。又は、骨格筋から分離した筋繊維を先にミオセベリン（Ｍｙｏｓｅｖｅｒｉｎ）で処理する。ミオセベリンはネズミ科筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）を筋管に分化させる効果と類似し、筋繊維を過収縮させて繊維周囲に現れる分離した繊維破片、衛星細胞及びその他の分離した細胞になるようにする（Ｎａｔ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. ２０００, １８, ３０４）。これらの細胞を再塗抹し、多様な濃度の一般式（Ｉ）の化合物（或いはその組成物）と共に培養すると、これらの細胞は神経細胞に分化する。
【００２３】
上記ニューロダジン（Ｎｅｕｒｏｄａｚｉｎｅ）１〜４のような一般式（Ｉ）の化合物濃度は、筋芽細胞又は筋繊維の神経細胞への分化の誘導を促進するために好適に調節することができる。一般に、ニューロダジン１〜４の濃度は０.５μＭ〜２０μＭの濃度で細胞と共に培養され、１μＭの濃度が最も一般的である。
【００２４】
好ましい筋芽細胞は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、チンパンジー、及びヒトのような任意の哺乳動物から得ることができる。筋芽細胞は、筋肉検体から分離された１次培養セルライン（筋繊維を取り囲む衛星細胞又は筋繊維をミオセベリンで処理して得た筋原細胞）を意味し、又はＣ２Ｃ１２細胞のように商業的に購入可能な形質転換されたセルラインを意味する。筋芽細胞は、細胞培養に適した条件で培養させる。この条件とは、３７℃、５％二酸化炭素が入っている空気中で培養することを含む。細胞は、本発明の方法により細胞培養用プラスチック皿、培養用フラスコ、又はローラーボトルで培養させる。細胞培養に適した容器はマルチウェルプレート、ペトリ皿、組織培養チューブ、培養用フラスコ及びローラーボトルなどを含む。
【００２５】
本発明で用いられる細胞培養液は、あらかじめ混合した粉や滅菌溶液の形態で購入して使用する。一般的に多用されている培養液は、ＭＥＭ-α、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ-１０、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉａ、又はＭｃＣｏｙ’ｓ培養液である。特に、ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭＥＭ及びＨａｍ’ｓ Ｆ-１０培養液が本発明の方法で用いられる。細胞培養液は、一般的に熱により不活性化された血清を５〜２０％添加して用いる。特に、１０％ウシ胎児血清が本発明の方法で用いられる。一般的に細胞培養液は細胞をｐＨ７.２〜７.４に維持させる。通常的に培養液には抗生剤、アミノ酸、糖、成長因子を含む添加剤を用いる。
【００２６】
本発明の一態様は、筋芽細胞又は筋繊維を神経細胞に分化させる方法を提供する。一実施形態として、筋芽細胞をニューロダジン１〜４を含む組成物と共に培養するとこれらの細胞は神経細胞に分化する。神経細胞への分化を確認するために、神経細胞特異的蛋白質の発現を調べたり、細胞の形態変化を観察したり、或いは１００ｍＭ ＫＣｌの存在下でＦＭ１-４３によって処理した後、細胞の蛍光強度を測定するなどの従来から知られている任意の方法を用いる。
【００２７】
例えば、神経細胞は、神経特異的エノラーゼ、ニューロフィラメント２００及び神経特異的ベータIII−チューブリンのような神経特異的蛋白質を発現する。これら蛋白質の発現はこれら蛋白質の発現レベルを測定して確認する。細胞特異的標識蛋白質の発現レベルは、標識蛋白質に選択的に結合する抗体を用いて免疫細胞化学的解析、ウエスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡなどのような免疫測定法によって好都合に調べられる。免疫測定法において蛋白質特異的抗体を用いた蛋白質の検出は従来技術に既に公知である（Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ, Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ: Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９８））。
【００２８】
神経突起の形成による細胞の形態変化は、神経細胞分化の兆候であり、従来技術に既に公知の任意の方法を用いて検出することができる。一般的に細胞の形態変化は光学顕微鏡を用いて確認する。
【００２９】
なお、神経細胞の分化は、１００ｍＭ ＫＣｌの存在下でＦＭ１-４３と共に培養した後、細胞の蛍光強度を測定することにより確認することができる。高い濃度のＫ+の存在下で脱分極以後にシナプス小胞が神経細胞に再循環して入り込む時、ＦＭ１-４３は神経細胞内に入り込む。したがって、分化した神経細胞は強い蛍光信号を有する（Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００４, １８, ８８９）。 
【００３０】
筋芽細胞又は筋繊維を神経分化させる化合物のスクリーニング方法
本発明の一実施形態は、筋芽細胞又は筋繊維を神経分化させる付加化合物をスクリーニングする方法を提供する。神経分化を誘導すると見込まれる、調査の対象となる化合物を筋芽細胞と共に培養する。筋芽細胞の神経細胞への分化は、光学顕微鏡を用いて化合物で処理された細胞の形態変化（特に神経突起の形成）を観察し、又は１００ｍＭ ＫＣｌの存在下でＦＭ１-４３によって処理した後、細胞の蛍光強度を測定することにより検出することができる。筋芽細胞が神経細胞に分化されたことを確認するために、筋芽細胞を少なくとも２つの別個の培地で培養した後、それぞれの培地で筋芽細胞が神経細胞に分化するか確認する。筋芽細胞を神経細胞に変えるということが確認された化合物を神経細胞分化誘導化合物（ｈｉｔ）とする。 
【００３１】
好ましい一実施形態において、ハイスループット・スクリーニング法は、多数の薬品候補物質群を含んだ化合物ライブラリーを提供するものである。次に、上記ライブラリーの中で神経分化誘導活性を有する候補を同定するために、１つ以上の分析方法で上記複合化学物質ライブラリーをスクリーニングする。同定された化合物はリード化合物として用いることができ、又は、有力な治療剤として若しくは実際に治療剤として用いることができる。 
【００３２】
治療方法
本発明の他の実施形態は、神経細胞に分化された細胞を患者に投与して疾患又は障害を治療する方法を提供する。この実施形態において、筋芽細胞を一般式（Ｉ）の化合物（例えば、ニューロダジン１〜４、又はそれらの組成物）と共に培養すると、筋芽細胞は神経細胞に分化する。又は分離した筋繊維から生成された衛星筋前駆細胞を一般式（Ｉ）の化合物（例えば、ニューロダジン１〜４、又はそれらの組成物）で処理すれば、前駆細胞は神経細胞に分化する。又は筋繊維をミオセベリンで処理した後、得られた筋前駆細胞を一般式（Ｉ）の化合物（例えば、ニューロダジン１〜４又はそれらの組成物）で処理すると前駆細胞は神経細胞に分化する。分化した神経細胞は、治療が必要な患者に移植する。
【００３３】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。しかし、本発明の範囲はこれら実施例によって限定されるものではない。 
【実施例１】
【００３４】
２-{２-[５-(３-クロロフェニル)]フラニル}-４,５ビス(４-メトキシフェニル)イミダゾール（化合物１すなわちニューロダジン１）の合成
５-(３-クロロフェニル)フルフラール（１０ｍｇ、０.０４８ｍｍｏｌ）、アンモニウムアセテート（ＮＨ４ＯＡｃ）（４４ｍｇ、０.５７ｍｍｏｌ）、４,４’-ジメトキシベンジル（１３ｍｇ、０.０４８ｍｍｏｌ）を、酢酸（ＣＨ３ＣＯ２Ｈ、５００μｌ）に加えた後、上記懸濁液を１００℃に加熱した。６時間振とうした後、上記反応混合液をエチルアセテートで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３及び塩水で洗浄した。有機層を減圧濃縮した。得られた化合物はフラッシュカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。 
【００３５】
【化７】
2009517379.tif 000009
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 12.85 (s, 1 H), 7.96 (s, 1 H), 7.77 (d, 1 H,J = 7.5 Hz), 7.50-7.35 (m, 5 H), 7.28 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.17 (s, 1 H), 7.02 (s, 1 H), 6.98-6.83 (m, 4 H), 3.72 (s, 6 H).
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 158.4, 150.9, 146.0, 137.5, 133.9, 131.9, 130.5, 129.5, 128.5, 127.1, 123.0, 122.1, 113.8, 109.3, 108.9, 55.02.
MALDI-TOF-MS calcd for C27H21ClN2O3 (M+H)+457.12, found 457.12
【実施例２】
【００３６】
２-{２-[５-(３-クロロフェニル)]フラニル}-４,５-ビスフェニルイミダゾール（化合物３）の合成
５-(３-クロロフェニル)フルフラール（１０ｍｇ、０.０４８ｍｍｏｌ）、アンモニウムアセテート（ＮＨ４ＯＡｃ）（４４ｍｇ、０.５７ｍｍｏｌ）、ベンジル（１０ｍｇ、０.０４８ｍｍｏｌ）を、酢酸（ＣＨ３ＣＯ２Ｈ、５００μｌ）に加えた後、上記懸濁液を１００℃に加熱した。６時間振とうした後、上記反応混合液をエチルアセテートで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３及び塩水で洗浄した。有機層を減圧濃縮した。得られた化合物はフラッシュカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。
【００３７】
【化８】
2009517379.tif 000010
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 13.02 (s, 1 H), 8.01 (s, 1 H), 7.85 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.61-7.50 (m, 4 H), 7.49-7.43 (m, 3 H), 7.42-7.20 (m, 6 H), 7.10 (s, 1 H).
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 151.0, 145.7, 138.1, 137.4, 134.7, 133.8, 131.8, 130.8, 130.6, 128.6, 128.1, 127.9, 127.2, 127.0, 126.6, 123.0, 122.2, 109.3.
MALDI-TOF-MS calcd for C25H17ClN2O (M+H)+397.10, found 397.10.
【実施例３】
【００３８】
２-(２-フルオレニル)-４,５-ビス(４-フルオロフェニル)イミダゾール（化合物５）の合成
２-フルオレンカルボキシアルデヒド（９ｍｇ、０.０４８ｍｍｏｌ）、アンモニウムアセテート（ＮＨ４ＯＡｃ）（４４ｍｇ、０.５７ｍｍｏｌ)、４,４’-ジフルオロベンジル（１２ｍｇ、０.０４８ｍｍｏｌ）を、酢酸（５００μｌ）に加えた後、上記懸濁液を１００℃に加熱した。６時間振とうした後、上記反応混合液をエチルアセテートで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３及び塩水で洗浄した。有機層を減圧濃縮した。得られた化合物はフラッシュカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。
【００３９】
【化９】
2009517379.tif 000011
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 12.74 (s, 1 H), 8.33 (s, 1 H), 8.14 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.98 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.91 (d, 1 H, J = 7.0 Hz), 7.64-7.52 (m, 5 H), 7.39 (dd, 1 H, J = 6.5, 7.5 Hz), 7.37-7.12 (m, 5 H), 4.0 (s, 2 H).
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.3 (d, 243 Hz), 145.9, 143.4, 143.3, 141.2, 140.7, 136.2, 131.5, 130.3, 129.0, 128.7, 126.9, 126.8, 125.1, 124.0, 121.8, 120.1, 115.3, 36.4.
MALDI-TOF-MS calcd for C28H18F2N2 (M+H)+421.14, found 421.14.
【実施例４】
【００４０】
２-(２-フルオレニル)-４,５-ビス(４-メトキシフェニル)イミダゾール（化合物７すなわちニューロダジン３）の合成
２-フルオレンカルボキシアルデヒド（９ｍｇ、０.０４８ｍｍｏｌ）、アンモニウムアセテート（ＮＨ４ＯＡｃ）（４４ｍｇ、０.５７ｍｍｏｌ）、４,４’-ジメトキシベンジル（１３ｍｇ、０.０４８ｍｍｏｌ）を、酢酸（ＣＨ３ＣＯ２Ｈ、５００μｌ）に加えた後、上記懸濁液を１００℃に加熱した。６時間振とうした後、上記反応混合液をエチルアセテートで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３及び塩水で洗浄した。有機層を減圧濃縮した。得られた化合物はフラッシュカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。
【００４１】
【化１０】
2009517379.tif 000012
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 12.53 (s, 1 H), 8.30 (s, 1 H), 8.12 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.93 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.87 (d, 1 H, J = 6.5 Hz), 7.58-7.48 (m, 3 H), 7.47-7.40 (m, 2 H), 7.35 (dd, 1 H, J = 6.1, 6.7 Hz), 7.31-7.24 (m, 2 H), 6.98 (d, 2 H, J = 7 Hz), 6.86 (d, 2 H, J = 7.5 Hz), 3.97 (s, 2 H), 3.76 (s, 3 H), 3.72 (s, 3 H).
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 159.4, 158.6, 145.9, 144.1, 144.0, 141.5, 141.4, 137.2, 130.3, 129.7, 128.9, 128.6, 127.8, 127.5, 125.7, 124.6, 124.2, 122.3, 120.7, 114.7, 114.2, 55.8, 55.6, 37.1.
MALDI-TOF-MS calcd for C30H24N2O2 (M+H)+445.18, found 445.18.
【実施例５】
【００４２】
１-(８-アミノ-３,６-ジオキサオクチル)-２-{２-[５-(３-クロロフェニル)]フラニル}-４,５-ビス(４-メトキシフェニル)イミダゾール（化合物２すなわちニューロダジン２）の合成
ＣＨ２Ｃｌ２に溶かした４-ニトロフェニルクロロフォーメイト（０.８ｇ、４ｍｍｏｌ）を、ワンレジン（Ｗａｎｇ ｒｅｓｉｎ、１ｍｍｏｌ）を含んだＣＨ２Ｃｌ２（９ｍｌ）及びピリジン（３ｍｌ）に添加した。１２時間振とうした後、上記レジンを１０％ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含んだＣＨ２Ｃｌ２溶液で洗浄した。ＤＭＦに溶かした２,２’-(エチレンジオキシ)ビスエチレンジアミン（１.５ｇ、１０ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（０.６ｇ、５ｍｍｏｌ）を上記レジンに添加した。１２時間振とうした後、上記レジンをＤＭＦで洗浄した。上記レジン（７μｍｏｌ）、５-(３-クロロフェニル)フルフラール（１４ｍｇ、０.０７ｍｍｏｌ）、ＮＨ４ＯＡｃ（２２ｍｇ、０.２８ｍｍｏｌ）、及び４,４’-ジメトキシベンジル（１９ｍｇ、０.０７ｍｍｏｌ）を反応バイアルに入れた後、酢酸（３００μｌ）で懸濁した。上記バイアルを振とう器上に置かれた１００℃に加熱したヒートブロックに入れた。上記反応バイアルを５時間振とうした。上記レジンをろ過した後、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２を用いて数回洗浄した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を入れて１.５時間処理し、固体支持体から目的とする化合物を分離した。得られた化合物は、直ちに０.１％ＴＦＡ／水に対して５〜１００％ＣＨ３ＣＮの勾配で、８５分以上、分取逆相ＨＰＬＣで精製した。
【００４３】
【化１１】
2009517379.tif 000013
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.94 (s, 1 H), 7.83 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 7.53 (dd, 1 H, J = 7.5, 8.0 Hz), 7.47-7.39 (m, 5 H), 7.38-7.31 (m, 2 H), 7.12 (d, 2 H, J = 8.0 Hz), 6.89 (d, 2 H, J = 8.5 Hz), 4.38-4.32 (m, 2 H), 3.84 (s, 3 H), 3.72 (s, 3 H), 3.62 (t, 2 H, J = 4.3 Hz), 3.47 (t, 2 H, J = 4.3 Hz), 3.44-3.37 (m, 4 H), 2.92-2.84 (m, 2 H).
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 160.0, 158.9, 153.1, 141.4, 135.7, 133.9, 133.5, 132.8, 131.0, 130.9, 129.8, 128.3, 128.1, 123.4, 122.5, 119.6, 115.2, 114.6, 113.8, 109.5, 69.5, 69.3, 68.5, 66.5, 55.1, 55.0, 45.1, 38.3.
MALDI-TOF-MS calcd for C33H34ClN3O5 (M+H)+588.22, found 588.22.
【実施例６】
【００４４】
１-(８-アミノ-３,６-ジオキサオクチル)-２-{２-[５-(３-クロロフェニル)]フラニル}-４,５-ビスフェニルイミダゾール（化合物４）の合成
ＣＨ２Ｃｌ２に溶かした４-ニトロフェニルクロロフォーメイト（０.８ｇ、４ｍｍｏｌ）をワンレジン（１ｍｍｏｌ）を含んだＣＨ２Ｃｌ２（９ｍｌ）及びピリジン（３ｍｌ）に添加した。１２時間振とうした後、上記レジンを１０％ＤＭＦを含んだＣＨ２Ｃｌ２溶液で洗浄した。ＤＭＦに溶かした２,２’-(エチレンジオキシ)ビスエチレンジアミン（１.５ｇ、１０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０.６ｇ、５ｍｍｏｌ）を上記レジンに添加した。１２時間振とうした後、上記レジンをＤＭＦで洗浄した。上記レジン（７μｍｏｌ）、５-(３-クロロフェニル)フルフラール（１４ｍｇ、０.０７ｍｍｏｌ）、ＮＨ４ＯＡｃ（２２ｍｇ、０.２８ｍｍｏｌ）、及びベンジル（１５ｍｇ、０.０７ｍｍｏｌ）を反応バイアルに入れた後、酢酸（３００μｌ）で懸濁した。上記バイアルを振とう器上に置かれた１００℃に加熱したヒートブロックに入れた。上記反応バイアルを５時間振とうした。上記レジンをろ過した後、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２を用いて数回洗浄した。ＴＦＡを入れて１.５時間処理し、固体支持体から目的とする化合物を分離した。得られた化合物は、直ちに０.１％ＴＦＡ／水に対して５〜１００％ＣＨ３ＣＮの勾配で、８５分以上、分取逆相ＨＰＬＣで精製した。
【００４５】
【化１２】
2009517379.tif 000014
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.92 (s, 1 H), 7.81 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.61-7.55 (m, 3 H), 7.54-7.47 (m, 3 H), 7.45-7.35 (m, 5 H), 7.31-7.20 (m, 3 H), 4.40-4.32 (m, 2 H), 3.61 (t, 2 H, J = 4.9 Hz), 3.46 (t, 2 H, J = 4.3 Hz), 3.43-3.35 (m, 4 H), 2.92-2.83 (m, 2 H). 
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 152.8, 142.7, 136.8, 134.8, 134.0, 131.4, 130.9, 130.8, 129.6, 129.2, 128.6, 128.3, 128.0, 127.5, 126.8, 123.4, 122.4, 114.4, 109.5, 69.6, 69.4, 68.7, 66.6, 45.0, 38.4.
MALDI-TOF-MS calcd for C31H30ClN3O3 (M+H)+528.20, found 528.20.
【実施例７】
【００４６】
１-(８-アミノ-３,６-ジオキサオクチル)-２-(２-フルオレニル)-４,５-ビス(４-フルオロフェニル)イミダゾール（化合物６）の合成
ＣＨ２Ｃｌ２に溶かした４-ニトロフェニルクロロフォーメイト（０.８ｇ、４ｍｍｏｌ）をワンレジン（１ｍｍｏｌ）を含んだＣＨ２Ｃｌ２（９ｍｌ）及びピリジン（３ｍｌ）に添加した。１２時間振とうした後、上記レジンを１０％ＤＭＦを含んだＣＨ２Ｃｌ２溶液で洗浄した。ＤＭＦに溶かした２,２’-(エチレンジオキシ)ビスエチレンジアミン（１.５ｇ、１０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０.６ｇ、５ｍｍｏｌ）を上記レジンに添加した。１２時間振とうした後、上記レジンをＤＭＦで洗浄した。上記レジン（７μｍｏｌ）、２-フルオレンカルボキシアルデヒド（１３ｍｇ、０.０７ｍｍｏｌ）、ＮＨ４ＯＡｃ（２２ｍｇ、０.２８ｍｍｏｌ）、及び４,４’-ジフルオロベンジル（１７ｍｇ、０.０７ｍｍｏｌ）を反応バイアルに入れた後、酢酸（３００μｌ）で懸濁した。上記バイアルを振とう器上に置かれた１００℃に加熱したヒートブロックに入れた。上記反応バイアルを５時間振とうした。上記レジンをろ過した後、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２を用いて数回洗浄した。ＴＦＡを入れて１.５時間処理し、固体支持体から目的とする化合物を分離した。得られた化合物は、直ちに０.１％ＴＦＡ／水に対して５〜１００％ＣＨ３ＣＮの勾配で、８５分以上、分取逆相ＨＰＬＣで精製した。
【００４７】
【化１３】
2009517379.tif 000015
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.07-7.93 (m, 3 H), 7.81 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.62 (d, 1 H, J = 6.5 Hz), 7.59-7.52 (m, 2 H), 7.48-7.32 (m, 5 H), 7.11-7.03 (m, 2 H), 4.18-4.10 (m, 2 H), 4.02 (s, 2 H), 3.33-3.17 (m, 8 H), 2.55 (t, 2 H, J = 4.3 Hz).
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 162.5 (d, 195 Hz), 160.6 (d, 193 Hz), 147.6, 143.4, 143.2, 141.5, 140.5, 135.9, 133.4, 131.0, 129.3, 128.5, 127.8, 127.6, 127.1, 126.8, 125.8, 125.2, 120.3, 119.9, 116.3, 116.1, 115.0, 114.8, 72.5, 69.7, 69.2, 68.5, 44.2, 41.0, 36.4. 
MALDI-TOF-MS calcd for C34H31F2N3O2(M+H)+ 552.24, found 552.24.
【実施例８】
【００４８】
１-(８-アミノ-３,６-ジオキサオクチル)-２-(２-フルオレニル)-４,５-ビス(４-メトキシフェニル)イミダゾール（化合物８すなわちニューロダジン４）の合成
ＣＨ２Ｃｌ２に溶かした４-ニトロフェニルクロロフォーメイト（０.８ｇ、４ｍｍｏｌ）をワンレジン（１ｍｍｏｌ）を含んだＣＨ２Ｃｌ２（９ｍｌ）及びピリジン（３ｍｌ）に添加した。１２時間振とうした後、上記レジンを１０％ＤＭＦを含んだＣＨ２Ｃｌ２溶液で洗浄した。ＤＭＦに溶かした２,２’-(エチレンジオキシ)ビスエチレンジアミン（１.５ｇ、１０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０.６ｇ、５ｍｍｏｌ）を上記レジンに添加した。１２時間振とうした後、上記レジンをＤＭＦで洗浄した。上記レジン（７μｍｏｌ）、２-フルオレンカルボキシアルデヒド（１３ｍｇ、０.０７ｍｍｏｌ）、ＮＨ４ＯＡｃ（２２ｍｇ、０.２８ｍｍｏｌ）、及び４,４’-ジメトキシベンジル（１９ｍｇ、０.０７ｍｍｏｌ）を反応バイアルに入れた後、酢酸（３００μｌ）で懸濁した。上記バイアルを振とう器上に置かれた１００℃に加熱したヒートブロックに入れた。上記反応バイアルを５時間振とうした。上記レジンをろ過した後、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２を用いて数回洗浄した。ＴＦＡを入れて１.５時間処理し、固体支持体から目的とする化合物を分離した。得られた化合物は、直ちに０.１％ＴＦＡ／水に対して５〜１００％ＣＨ３ＣＮの勾配で、８５分以上、分取逆相ＨＰＬＣで精製した。
【００４９】
【化１４】
2009517379.tif 000016
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.04-7.93 (m, 3 H), 7.80 (d, 1 H, J = 7.0 Hz), 7.62 (d, 1 H, J = 6.5 Hz), 7.45-7.32 (m, 5 H), 7.09 (d, 2 H, J = 7.5 Hz), 6.79 (d, 2 H, J = 8.0 Hz), 4.14-4.07 (m, 2 H), 4.02 (s, 2 H), 3.83 (s, 3 H), 3.69 (s, 3 H), 3.32-3.18 (m, 8 H), 2.58-2.52 (m, 2 H).
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 160.0, 158.3, 147.7, 144.0, 143.8, 141.9, 141.2, 137.1, 133.0, 130.4, 129.2, 128.2, 128.1, 127.8, 127.5, 126.4, 125.8, 123.6, 120.9, 120.5, 115.2, 114.1, 73.1, 70.3, 69.9, 69.2, 55.7, 55.5, 44.7, 41.6, 37.1.
MALDI-TOF-MS calcd for C36H37N3O4 (M+H)+576.28, found 576.28.
【実施例９】
【００５０】
細胞培養及び小分子のスクリーニング
ネズミ科筋芽細胞のＣ２Ｃ１２細胞は、通常１０％ ＦＢＳ、５０ｕｎｉｔｓ/ｍｌのペニシリン、そして５０μｇ/ｍＬのストレプトマイシンが添加されたＲＰＭＩ １６４０、もしくはＤＭＥＭの培地で培養され、この時、５％二酸化炭素が提供される３７℃培養機で培養される。 
【００５１】
小分子のスクリーニングのために、培養されたＣ２Ｃ１２細胞を９６-マイクロウェルプレートの培地にウェル当たり約１０００個ずつ入れる。２４時間培養後、培地を分化用培地（１％ＦＢＳ、５０ｕｎｉｔｓ/ｍｌのペニシリン、５０μｇ/ｍｌのストレプトマイシンが含まれたＲＰＭＩ １６４０もしくはＤＭＥＭ）に取り替える。調査対象の化合物を細胞が入っている９６-マイクロウェルに５〜１０μＭの最終濃度で入れる。９６時間後、神経細胞に特徴的な神経突起を確認するために光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００）で細胞の形態変化を観察する。神経細胞への分化を検証するために細胞をＰＢＳバッファで洗浄した後、１００ｍＭ ＫＣｌを含むリンガーバッファに溶けたＦＭ１-４３（最終濃度２μＭ、モレキュラープローブ社）を入れる。常温で５分間処理した後、残っているＦＭ１-４３を除去するため細胞をリンガーバッファで３回洗浄する。蛍光マイクロプレート検出機（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ＧｅｍｉｎｉＥＭ、モレキュラーデバイス社）を用いて処理された細胞の蛍光強度（励起波長:４７０ｎｍ、発光波長:５４０ｎｍ）を測定する。
【００５２】
神経突起を引き起こし、又は１００ｍＭ ＫＣｌの存在下でＦＭ１-４３によって処理した後、強い蛍光強度を示す化合物を神経分化誘導活性が推定される標的化合物（ｈｉｔ）として選択する。免疫検索法（ウエスタンブロット解析又は免疫細胞化学的解析）を用いて化合物で処理された細胞の神経特異的蛋白質の発現を調べて選択された標的化合物（ｈｉｔ）をさらに確認する。
【００５３】
ウエスタンブロット解析:９６時間化合物で処理した細胞を細胞溶解バッファ（１ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７.４）、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００、１ｍＭ ＰＭＳＦ、バッファ２０ｍｌにつき１錠の蛋白質分解酵素阻害剤カクテル）を用いて粉砕する。細胞粉砕後、蛋白質を７.５％又は１０％ＳＤＳ-ＰＡＧＥを用いて分離し、分離した蛋白質をニトロセルロースメンブレンに移す。蛋白質が吸着したメンブレンを神経特異的抗体で処理し、これをＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識二次抗体で処理する。抗体処理されたメンブレンは、増感化学発光キット（アマシャム社）を用いて神経特異的蛋白質の存在有無を確認する。用いた抗体希釈比率: 抗神経特異的ベータIII−チューブリンマウスモノクローナル抗体（１:１０００）、抗神経特異的エノラーゼニワトリモノクローナル抗体（１:５００）、抗ニューロフィラメント２００（リン酸化型及び非リン酸化型）クローンＣ５２マウスモノクローナル抗体（１:５００）、抗骨格筋ミオシン（速筋型）クローンＭＹ−３２マウスモノクローナル抗体（１：５００）、抗ｓ−１００（Ｂ３２．１）マウスモノクローナル抗体（１:１０００）、及び抗コリンアセチルトランスフェラーゼヒツジポリクローナル抗体（１:１０００）。ウエスタンブロット解析に用いる二次抗体は、ＨＲＰ標識ヤギ抗−マウスＩｇＧ（１:２０００）、ウサギ抗ニワトリＩｇＹ（１:２０００）、及びウサギ抗ヒツジＩｇＧ（１:２０００）である。
【００５４】
免疫細胞化学的解析:９６時間化合物で処理した細胞を４％パラホルムアルデヒドと０.１％トリトンＸ-１００が入っているＰＢＳバッファを１０分間処理して固定させる。固定された細胞を１％血清が含まれたＰＢＳバッファで希釈した一次抗体と共に１時間培養する。細胞をＰＢＳバッファで５分間３回洗浄した後、１％血清が含まれたＰＢＳバッファで希釈した適切な二次抗体と共に１時間培養する。細胞をＰＢＳで５分間３回洗浄した後、Ｃｙ−３標識ストレプトアビジン：ＰＢＳ＝１：１００の希釈溶液と共に０．５時間培養する。細胞をＰＢＳバッファで５分間５回洗浄した後、水溶性マウンティング溶液とともにマウントする。用いた抗体希釈比率: 抗神経特異的ベータIII−チューブリンマウスモノクローナル抗体（１:５００）、抗神経特異的エノラーゼニワトリモノクローナル抗体（１:２００）、抗ニューロフィラメント２００（リン酸化型及び非リン酸化型）クローンＣ５２マウスモノクローナル抗体（１:４００）。二次抗体としては、ビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（１:５００）及びウサギ抗ニワトリＩｇＹ（１:２００）を用いた。細胞は顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて観察した。
【実施例１０】
【００５５】
神経分化を誘導するニューロダジンの同定
約３００のイミダゾールライブラリーの中の１のイミダゾール（最終濃度:５〜１０μＭ）を筋芽細胞が入っている９６-マイクロウェルプレートに入れる。９６時間培養後、神経突起の形成を光学顕微鏡で調べる。調査後、化合物で処理された筋芽細胞をＰＢＳバッファで洗浄した後、ＦＭ１-４３（最終濃度、２μＭ）をＫＣｌ（１００ｍＭ）が溶けているリンガーバッファに溶解して加える。常温で５分後、過剰なＦＭ１-４３を除去するため細胞をリンガーバッファで３回洗浄する。蛍光マイクロプレート検出機（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ ＧｅｍｉｎｉＥＭ、モレキュラーデバイス社）を用いて蛍光強度（励起波長:４７０ｎｍ、発光波長:５４０ｎｍ）を測定する。
【００５６】
筋芽細胞をニューロダジンで処理すると、ニューロダジン処理細胞と非処理細胞間に顕著な差のある神経突起が観察される。対照細胞群（単にＤＭＳＯで処理された細胞群）において変化しない筋芽細胞が観察される。反面、１μＭのニューロダジンの処理時に神経突起が観察される。又、ニューロダジンで処理された細胞は１００ｍＭ ＫＣｌによって引き起こされた脱分極の存在下でＦＭ１-４３を処理すると強い蛍光強度を示す。しかしながら、ＤＭＳＯのみで処理された細胞は非常に低い蛍光強度を示す。イミダゾールライブラリーにおいて、ニューロダジン１〜４は、ウエスタンブロット解析によると、神経特異的標識蛋白質を最も良好に発現させ、ＦＭ１-４３染色による測定によると、分極に対するシナプス小胞の再循環特性を最も良好に示す。
【００５７】
しかしながら、ニューロダジン１〜４で処理された細胞にはＭｙｏＤ又はミオシンのような筋原細胞特異的蛋白質が発現しなかった。又、ｓ-１００のような星状細胞特異的蛋白質も発現しなかった。これは分化した神経細胞には筋肉細胞及び星状細胞のどちらの特性も含んでいないということを示す。
【実施例１１】
【００５８】
ニューロダジンによるヒト筋繊維の神経細胞への分化
単一の筋繊維は人間の骨格筋から報告された方法により得る（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ａｎｉｍ. ２００２, ３８, ６６）。骨格筋検体は母趾外転筋から切り取られる。上記検体を収集し、単一繊維培養培地（１０％ＦＢＳ、２％ニワトリ胚抽出物と１.５μｇ/ｍｌアンフォテリシンＢが入っているＨａｍ’ｓ Ｆ-１０）に入れる。上記筋肉検体を３７℃で１時間、５０ｍｌ ＦａｌｃｏｎＴＭ（ファルコン、登録商標）チューブ内の０.１％コラゲナーゼが含まれた１０ｍｌ単一繊維培養培地で培養する。筋繊維束を外科用メスで注意しながら切断する。上記筋繊維束を０.１％コラゲナーゼが含まれた１０ｍｌ培養培地を含むペトリ皿に入れ、３７℃で５時間培養する。広口にしたパスツールピペットを用いて処理された筋繊維束を繰り返し粉砕した後、単一筋肉繊維を得る。過収縮を進行しない分離した筋肉繊維を、マトリゲルでコーティングされた６-ウェルプレートにウェル当たり３本ずつ入れる。筋繊維を一滴の単一筋繊維培養培地に塗抹し、６時間後、プレートに固着される。その後、１ｍｌの培養液を培地に入れる。２４時間後、培地をアンフォテリシンＢのない単一繊維培養培地に取り替える。
【００５９】
５日後、衛星筋前駆細胞が筋繊維から遊走し、分裂し始める。筋繊維をパスツールピペットで除去した後、その後の研究のために、細胞を０.２５％トリプシンと０.０２％ＥＤＴＡが入っているＰＢＳバッファを用いてトリプシン処理する。化合物の神経分化の効果を確認するために、脱離された細胞をウェル当たり１００個の細胞が入り込むように、単独で又はニューロダジン１〜４（最終濃度:１μＭ、５μＭ又は２０μＭ）と共に６−ウェルプレートに再塗抹する。９６時間後、免疫細胞化学的解析を用いて化合物で処理された細胞の神経細胞特異的蛋白質の発現を調べるか、又は上記の方法によりＦＭ１-４３を用いて、化合物で処理された細胞の神経生理学的研究を行う。
【００６０】
ミオセベリン及びニューロダジンを用いた２段階の培養によってヒトの単一筋肉繊維を神経細胞に分化させることができる。先ず、プレートに塗抹した筋繊維をミオセベリン（最終濃度:１０μＭ）で２０時間処理して筋繊維周囲に筋繊維断片と細胞を生成させる。上記繊維を広口ピペットで繰り返し粉砕し、筋繊維断片と細胞を収集する。その次に、上記繊維を、マトリゲルでコーティングされた６-ウェルプレートにウェル当たり１００個の単核筋芽細胞及び筋管断片の密度で再塗抹し、神経分化を誘導するためにニューロダジン１又は２（最終濃度:１μＭ）で処理する。９６時間後、神経細胞の分化を、光学顕微鏡を用いた神経突起の成長、１００ｍＭ ＫＣｌ存在下でＦＭ１-４３を処理した後の蛍光強度の増加、又は発現された神経特異的標識蛋白質の免疫細胞化学的解析によって確認する。 
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ニューロダジン１〜４の構造。
【図２】ニューロダジン１によって筋芽細胞から分化した神経細胞。
【図３】ニューロダジン１によって筋繊維から分化した神経細胞。
【図１】
2009517379.tif 000023
【図２】
2009517379.tif 000024
【図３】
2009517379.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成20年7月2日(2008.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項８】
筋芽細胞又は筋繊維を請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物で処理して神経細胞への分化を誘導することを特徴とする筋芽細胞又は筋繊維から神経細胞への分化を誘導する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項９】
筋芽細胞又は筋繊維の神経細胞への分化を確認する段階をさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の筋芽細胞又は筋繊維から神経細胞への分化を誘導する方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０】
上記筋芽細胞又は筋繊維の神経細胞への分化を確認する段階は、神経細胞特異的蛋白質の発現を調べることを特徴とする請求項９に記載の筋芽細胞又は筋繊維から神経細胞への分化を誘導する方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１１】
上記筋芽細胞又は筋繊維の神経細胞への分化を確認する段階は、細胞の形態変化を観察することを特徴とする請求項９に記載の筋芽細胞又は筋繊維から神経細胞への分化を誘導する方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１２】
上記筋芽細胞又は筋繊維の神経細胞への分化を確認する段階は、１００ｍＭ ＫＣｌの存在下でＦＭ１-４３によって処理した後、細胞の蛍光強度を測定することを特徴とする請求項９に記載の筋芽細胞又は筋繊維から神経細胞への分化を誘導する方法。
【手続補正６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１３】
上記筋芽細胞は、マウスから分離することを特徴とする請求項８に記載の筋芽細胞又は筋繊維から神経細胞への分化を誘導する方法。
【手続補正７】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１４】
上記筋芽細胞は、霊長類から分離することを特徴とする請求項８に記載の筋芽細胞又は筋繊維から神経細胞への分化を誘導する方法。
【手続補正８】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１５】
上記筋芽細胞は、ヒトから分離することを特徴とする請求項８に記載の筋芽細胞又は筋繊維から神経細胞への分化を誘導する方法。
【手続補正９】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１６】
筋芽細胞又は筋繊維を請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物と共に培養した後、筋芽細胞又は筋繊維の神経細胞への分化を確認する段階を含むことを特徴とする筋芽細胞又は筋繊維から神経細胞への分化を誘導する化合物を同定するスクリーニング方法。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、筋芽細胞又は筋繊維から神経細胞への分化を誘導する化合物、これを含む薬学的組成物、神経細胞への分化を誘導する方法、及び神経細胞への分化を誘導する化合物を同定するスクリーニング方法に関するものである。より詳しくは、筋芽細胞又は筋繊維の神経細胞への分化に用いられるイミダゾール骨格を含む化合物に関するものである。いくつかの実施形態において、イミダゾール誘導体を含む薬学的組成物を提供する。他の実施形態において、筋芽細胞又は筋繊維を神経細胞に分化させる方法を提供する。その他に、筋芽細胞又は筋繊維から神経細胞への分化を誘導する化合物を同定するスクリーニング方法をさらに提供する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
なお、他に、神経細胞を得ることができる潜在力の大きい方法は、小分子を用いて筋芽細胞又は筋繊維のように容易に求められる細胞や組織を神経細胞に分化させる化学的方法である（Ｎａｔｕｒｅ２００２, ４１６, ４８５, Ｎａｔｕｒｅ ２００２, ４１８, ４１及びＳｃｉｅｎｃｅ２００４, ３０３, １６６９）。近年、小分子を用いて哺乳動物細胞を特定細胞に分化させるいくつかの研究結果が報告されている。例えば、パーモルファミン（Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）を用いて中胚葉繊維芽細胞を骨芽細胞に分化させることができ(Ｊ. Ａｍ. Ｃｈｅｍ. Ｓｏｃ. ２００２,１２４,１４５２０）、カルディオゲノール及びＴＷＳ-１１９を用いて胚性幹細胞であるＰ１９細胞を各々心筋細胞及び神経細胞に分化させることができる（Ｊ. Ａｍ. Ｃｈｅｍ. Ｓｏｃ. ２００４, １２６, １５９０及びＰｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ２００３, １００, ７６３２）。したがって、神経細胞への分化を誘導することができる小分子は、退行性神経疾患の移植治療試験をするための神経細胞を得る際に非常に有用である。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
そのために、従来技術から容易に求められる細胞や組織を用いて神経細胞に分化させるための組成物及び方法が要求されている。開発された小分子誘導体は、神経細胞への分化の分子的作用メカニズムの究明に重要な情報を得る際に利用でき、又、究極的にインビボでの神経再生ができるようにする。本発明はこれのみでなく他の要求を充足させる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
本発明は、筋芽細胞又は筋繊維を神経細胞に分化させることができる新規な化合物及び方法に関するものである。したがって、上記化合物は、退行性神経疾患治療のために筋芽細胞又は筋繊維から神経細胞を産生する際に用いることができる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本発明の第１の目的は、筋芽細胞又は筋繊維を神経細胞に分化させることができる化合物を提供することである。
本発明の第２の目的は、損傷神経細胞によって誘発された内科的機能障害又は内科的疾患を治療するために筋芽細胞又は筋繊維を神経細胞に分化させることができる活性成分として上記化合物を含む有用な薬学的組成物を提供することである。上記化合物は、全ての薬学的に許容可能な異性体、塩、水和物、溶媒和物及びそれらのプロドラッグを含む。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明の第３の目的は、筋芽細胞又は筋繊維を神経細胞に分化させる方法を提供することである。すなわち、上記化合物を哺乳類の筋芽細胞又は筋繊維と共に培養するとこれらの細胞は神経細胞に分化する。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明の第４の目的は、筋芽細胞又は筋繊維を神経細胞に分化させることができる化合物を同定するスクリーニング方法を提供することである。
本発明の他の実施形態は次に述べることから明確である。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
又、本発明は、筋芽細胞又は筋繊維を本発明の化合物で処理し、筋芽細胞又は筋繊維から神経細胞への分化を誘導する方法を提供する。 
又、本発明は、筋芽細胞又は筋繊維を本発明の化合物と共に培養した後、筋芽細胞又は筋繊維の神経細胞への分化を確認する段階を含む筋芽細胞又は筋繊維から神経細胞への分化を誘導する化合物を同定するスクリーニング方法を提供する。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
筋芽細胞又は筋繊維から神経細胞への分化を誘導する方法
本発明に係る化合物は、筋芽細胞又は筋繊維を神経細胞に分化させる際に用いることができる。筋芽細胞を多様な濃度の一般式（Ｉ）の化合物（或いはその組成物）と共に培養すると、これらの細胞は神経細胞に分化する。又、分離した骨格筋繊維で生成された衛星筋前駆細胞を多様な濃度の一般式（Ｉ）の化合物（或いはその組成物）で処理すると、これらの細胞は神経細胞に分化する。又は、骨格筋から分離した筋繊維を先にミオセベリン（Ｍｙｏｓｅｖｅｒｉｎ）で処理する。ミオセベリンはネズミ科筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）を筋管に分化させる効果と類似し、筋繊維を過収縮させて繊維周囲に現れる分離した繊維破片、衛星細胞及びその他の分離した細胞になるようにする（Ｎａｔ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. ２０００, １８, ３０４）。これらの細胞を再塗抹し、多様な濃度の一般式（Ｉ）の化合物（或いはその組成物）と共に培養すると、これらの細胞は神経細胞に分化する。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
筋芽細胞又は筋繊維を神経細胞に分化させる化合物のスクリーニング方法
本発明の一実施形態は、筋芽細胞又は筋繊維を神経細胞に分化させる化合物をスクリーニングする方法を提供する。神経細胞への分化を誘導すると見込まれる、調査の対象となる化合物を筋芽細胞と共に培養する。筋芽細胞の神経細胞への分化は、光学顕微鏡を用いて化合物で処理された細胞の形態変化（特に神経突起の形成）を観察し、又は１００ｍＭ ＫＣｌの存在下でＦＭ１-４３によって処理した後、細胞の蛍光強度を測定することにより検出することができる。筋芽細胞が神経細胞に分化されたことを確認するために、筋芽細胞を少なくとも２つの別個の培地で培養した後、それぞれの培地で筋芽細胞が神経細胞に分化するか確認する。筋芽細胞を神経細胞に変えるということが確認された化合物を神経細胞分化誘導化合物（ｈｉｔ）とする。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
好ましい一実施形態において、ハイスループット・スクリーニング法は、多数の薬品候補物質群を含んだ化合物ライブラリーを提供するものである。次に、上記ライブラリーの中で神経細胞への分化誘導活性を有する候補を同定するために、１つ以上の分析方法で上記複合化学物質ライブラリーをスクリーニングする。同定された化合物はリード化合物として用いることができ、又は、有力な治療剤として若しくは実際に治療剤として用いることができる。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
神経突起を引き起こし、又は１００ｍＭ ＫＣｌの存在下でＦＭ１-４３によって処理した後、強い蛍光強度を示す化合物を神経細胞への分化誘導活性が推定される標的化合物（ｈｉｔ）として選択する。免疫検索法（ウエスタンブロット解析又は免疫細胞化学的解析）を用いて化合物で処理された細胞の神経特異的蛋白質の発現を調べて選択された標的化合物（ｈｉｔ）をさらに確認する。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
神経細胞への分化を誘導するニューロダジンの同定
約３００のイミダゾールライブラリーの中の１のイミダゾール（最終濃度:５〜１０μＭ）を筋芽細胞が入っている９６-マイクロウェルプレートに入れる。９６時間培養後、神経突起の形成を光学顕微鏡で調べる。調査後、化合物で処理された筋芽細胞をＰＢＳバッファで洗浄した後、ＦＭ１-４３（最終濃度、２μＭ）をＫＣｌ（１００ｍＭ）が溶けているリンガーバッファに溶解して加える。常温で５分後、過剰なＦＭ１-４３を除去するため細胞をリンガーバッファで３回洗浄する。蛍光マイクロプレート検出機（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ ＧｅｍｉｎｉＥＭ、モレキュラーデバイス社）を用いて蛍光強度（励起波長:４７０ｎｍ、発光波長:５４０ｎｍ）を測定する。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
５日後、衛星筋前駆細胞が筋繊維から遊走し、分裂し始める。筋繊維をパスツールピペットで除去した後、その後の研究のために、細胞を０.２５％トリプシンと０.０２％ＥＤＴＡが入っているＰＢＳバッファを用いてトリプシン処理する。化合物の神経細胞への分化の効果を確認するために、脱離された細胞をウェル当たり１００個の細胞が入り込むように、単独で又はニューロダジン１〜４（最終濃度:１μＭ、５μＭ又は２０μＭ）と共に６−ウェルプレートに再塗抹する。９６時間後、免疫細胞化学的解析を用いて化合物で処理された細胞の神経細胞特異的蛋白質の発現を調べるか、又は上記の方法によりＦＭ１-４３を用いて、化合物で処理された細胞の神経生理学的研究を行う。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
ミオセベリン及びニューロダジンを用いた２段階の培養によってヒトの単一筋肉繊維を神経細胞に分化させることができる。先ず、プレートに塗抹した筋繊維をミオセベリン（最終濃度:１０μＭ）で２０時間処理して筋繊維周囲に筋繊維断片と細胞を生成させる。上記繊維を広口ピペットで繰り返し粉砕し、筋繊維断片と細胞を収集する。その次に、上記繊維を、マトリゲルでコーティングされた６-ウェルプレートにウェル当たり１００個の単核筋芽細胞及び筋管断片の密度で再塗抹し、神経細胞への分化を誘導するためにニューロダジン１又は２（最終濃度:１μＭ）で処理する。９６時間後、神経細胞の分化を、光学顕微鏡を用いた神経突起の成長、１００ｍＭ ＫＣｌ存在下でＦＭ１-４３を処理した後の蛍光強度の増加、又は発現された神経特異的標識蛋白質の免疫細胞化学的解析によって確認する。
【国際調査報告】
2009517379.tif 000026
2009517379.tif 000027