(57)【要約】  水性混合物への空気混入工程と、その後に行なわれる空気混入混合物の静止状態での凍結工程を含む凍結空気混入組成物の製造方法であって、上記混合物はハイドロホビンを含むことを特徴とする方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性混合物への空気混入工程と、その後に行なわれる空気混入混合物の静止状態での凍結工程を含む凍結空気混入組成物の製造方法であって、混合物はハイドロホビンを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
混合物は少なくとも0.001重量%のハイドロホビンを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ハイドロホビンは単離した形態である請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
ハイドロホビンは、クラスIIのハイドロホビンである請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
凍結空気混入組成物は少なくとも25％のオーバーランを有する請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
組成物は食品である請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
食品は冷凍菓子製品である請求項6に記載の方法。
【請求項８】
冷凍菓子製品はアイスクリームである請求項7に記載の方法。
【請求項９】
空気混入工程は連続起泡、バッチ起泡、気体注入、気体巻き込み(entrainment)、化学的または生化学的反応による気体生成、および溶液または固体からの閉じ込められた気体の放出からなる群から選択される請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
凍結工程は、水性混合物を含む容器を低温環境に置くこと; 混合物を含む型を低温冷媒浴中に浸すこと; 混合物の一部を極低温液体浴中に直接置くこと;フィルム凍結;および混合物の液滴を冷却環境中に噴霧することからなる群から選択される請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
混合物はさらに降伏応力剤を含む請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
降伏応力剤は、キサンタンおよび／またはゲランである請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
ハイドロホビンを含む、静止状態で凍結された空気混入組成物。
【請求項１４】
請求項1から12のいずれか一項に記載の方法により得られた製品。
【請求項１５】
請求項1から12のいずれか一項に記載の方法によって得ることが可能な製品。
【請求項１６】
静止状態での凍結の際に空気混入組成物を安定化させるためのハイドロホビンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、冷凍空気混入組成物の製造方法、特に、水性混合物に空気混入をして気泡を形成し、その後に上記気泡を静止状態で凍結する工程を含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
冷凍空気混入組成物、例えば、アイスクリーム、シャーベット、及び冷凍ヨーグルトは従来、空気混入と凍結が同時に行なわれる方法により製造されていた。空気混入を達成するために、凍結の際に上記組成物に、剪断または攪拌がされなければならない。このことにより、複雑で高価な加工装置、例えば、キサゲ面付熱交換器が必要となり、その使用は制限される;例えば、これらの装置は一般に、消費者が台所において利用できるものではない。
【０００３】
代替の方法は、上記空気混入と凍結工程を分離することである。つまり、空気混入された混合物（つまり、気泡）を形成し、その後、それに続く工程において、この気泡を凍結する。空気混入は既に達成されているため、この凍結工程は故に、静止状態、つまり、剪断または攪拌のない状態であってよい。米国特許US6187365は冷凍空気混入バーに適した原料混合物を調製し、混合物を約20％と約250％の間のオーバーランを有する空気混入混合物を得るために泡立て、この空気混入混合物を成形空気混入混合物を得るために成形し、かつ上記成形空気混入混合物を冷凍することによる成形空気混入冷凍バーを製造する方法を開示する。
【０００４】
この方法には、２つの問題がある。第一に、未凍結の気泡は、長時間に渡って安定性を維持できない。不均一化、および、癒着が泡の成長につながり（上記空気泡の浮力に起因する）、クリーム化が垂直層分離を誘引し、結果として泡の大部分が上方の表面に存在し、底部においては泡が枯渇することになる。このことは、最終製品におけるこの不安定性の効果を最小限のものとするためには、通常、凍結工程が、空気混入工程のほぼすぐ後に行なわれなければならないことを意味する。第二に、成長する氷結晶が物理的に気体を混合物の外に押し出すため、静止状態での凍結の際に著しい気体の喪失が起こり得る。この効果は、大きな気体泡についてより際立ったものとなる、なぜなら氷結晶は泡の周りには成長しにくいからである。よって、冷凍空気混入冷凍組成物の、単純で、低廉な製造方法へのニーズが存在する。
【特許文献１】国際公開第06/010425号
【非特許文献１】Ice Cream、第4版、Arbuckle(1986)、Van Nostrand Reinhold Company、New York、NY.
【非特許文献２】Sambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版 (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.
【非特許文献３】Ausubel他、Short Protocols in Molecular Biology (1999) 第4版、John Wiley & Sons、Inc.-および「Current Protocols in Molecular Biology」と題する完全版.
【非特許文献４】Wessels、1997、Adv. Microb. Physio. 38:1〜45頁
【非特許文献５】Wosten、2001、Annu Rev. Microbiol. 55: 625〜646頁
【非特許文献６】De Vocht他、1998、Biophys. J. 74: 2059〜68頁
【非特許文献７】Wosten 他、1994、 Embo. J. 13: 5848〜54頁
【非特許文献８】MacCabeおよび Van Alfen、1999、App. Environ. Microbiol 65: 5431〜5435頁
【非特許文献９】Collen他、2002、Biochim Biophys Acta. 1569:139〜50頁
【非特許文献１０】Calonje他、2002、Can. J. Microbiol. 48:1030〜4頁
【非特許文献１１】Askolin他、2001、Appl Microbiol Biotechnol. 57:124〜30頁
【非特許文献１２】De Vries他、1999、Eur J Biochem. 262:377〜85頁
【非特許文献１３】Mengual他、Colloids and Surfaces A、1999、152、112〜123頁
【非特許文献１４】Rouimi他、Food Hydrocolloids、2005、19、467〜478頁
【非特許文献１５】Linder 他、2001、 Biomacromolecules 2:511〜517頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らの同時係属中の出願、国際公開第06/010425号において、発明者らは、ハイドロホビンと呼ばれる真菌タンパク質が不均一化と癒着に優れた安定性を有する気泡の製造を許容することを発見した。ハイドロホビンは界面活性を有し、かつ、空気混入剤として作用し、また、空気泡の表面に高度の粘弾性を付与するように見える。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ハイドロホビンが使用されれば、その後に静止状態での凍結工程が続く空気混入工程を含む方法の際に、気体を保持することが可能となることを見出した。ハイドロホビンは、空気混入と凍結工程の間の保存の際と、凍結工程の際の両方において気泡を安定化させる。従って、本発明は、水性混合物への空気混入工程と、その後に行なわれる空気混入混合物の静止状態での凍結工程を含む凍結空気混入組成物の製造方法であって、上記混合物はハイドロホビンを含むことを特徴とする方法を提供する。
【０００７】
好ましくは、ハイドロホビンは少なくとも0.001重量%、より好ましくは少なくとも0.01重量%の量で存在する。
【０００８】
好ましくは、ハイドロホビンは実質的に単離した形態である。
【０００９】
ハイドロホビンは、クラスIIのハイドロホビンであることが好ましい。
【００１０】
好ましくは、凍結空気混入組成物は少なくとも25％のオーバーランを有する。
【００１１】
好ましくは、冷凍空気混入組成物は食品であることが好ましい。より好ましくは食品は冷凍菓子製品である。最も好ましくは、冷凍菓子製品はアイスクリームである。
【００１２】
好ましくは、空気混入工程は連続起泡、バッチ起泡、気体注入、気体巻き込み(entrainment)、化学的または生化学的反応による気体生成、および溶液または固体からの閉じ込められた気体の放出からなる群から選択される。
【００１３】
好ましくは、凍結工程は、水性混合物を含む容器を低温環境に置くこと;低温冷媒浴中に混合物を含む型を浸すこと;極低温液体浴中に混合物の一部を直接置くこと;フィルム凍結;および混合物の液滴を冷却環境中に噴霧することからなる群から選択される。
【００１４】
好ましくは、混合物はさらに降伏応力剤を含む。好ましくは、降伏応力剤はポリサッカリド、より好ましくは細菌性ポリサッカリド、例えば、キサンタンおよび／またはゲランである。
【００１５】
また関連する態様において、本発明は、ハイドロホビンを含む水性混合物を用意する工程、混合物への空気混入工程、その後に行なわれる空気混入混合物の静止状態での凍結工程を含む凍結空気混入組成物の製造方法を提供する。
【００１６】
第二の態様において、本発明は、ハイドロホビンを含む、静止状態で凍結された空気混入組成物を提供する。
【００１７】
別の態様においては、本発明は本発明の方法により得られた製品を提供する。また、本発明の方法によって得ることが可能な製品を提供する。
【００１８】
関連する態様においては、本発明は静止状態での凍結の際に空気混入組成物を安定化させるためのハイドロホビンの使用を提供する。
【００１９】
別段の定義がない限り、本発明で使用される全ての技術的および科学的用語は、当技術分野(例えば、チルド菓子/冷凍菓子製造、化学およびバイオ技術)において一般的に理解されているのと同じ意味である。チルド/冷凍菓子製造において使用されるさまざまな用語および技術の定義および説明は、Ice Cream、第4版、Arbuckle(1986)、Van Nostrand Reinhold Company、New York、NY.において見出される。分子およびバイオケミカル方法に関する標準技術は、Sambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.およびAusubel他、Short Protocols in Molecular Biology (1999) 第4版、John Wiley & Sons、Inc.および「Current Protocols in Molecular Biology」と題する完全版において見出される。
【００２０】
ハイドロホビン
ハイドロホビンは、タンパク質の明確な種類であり(Wessels、1997、Adv. Microb. Physio. 38:1〜45頁、Wosten、2001、Annu Rev. Microbiol. 55: 625〜646頁)、疎水性/親水性の界面において自己集合することができ、以下の保存配列を有している。
Xn-C-X5-9-C-C-X11-39-C-X8-23-C-X5-9-C-C-X6-18-C-Xm  (配列番号1)
ここで、Xは任意のアミノ酸を表し、nおよびmは独立に整数を表す。一般的に、ハイドロホビンは125アミノ酸までの長さを有する。保存配列中のシステイン残基(C)は、ジスルフィド架橋の一部である。本発明の文脈では、ハイドロホビンという用語は、より広い意味合いを有しており、疎水性/親水性の界面における自己集合の特性を示し、結果としてタンパク質フィルムとなる、機能的に同等のタンパク質、例えば以下の配列、
Xn-C-X1-50-C-X0--5-C-X1-100-C-X1-100-C-X1-50-C-X0-5-C-X1-50-C-Xm  (配列番号2)
または、疎水性/親水性の界面における自己集合の特性を依然として示し、結果としてタンパク質フィルムとなるこの配列の部分を含むタンパク質を含む。本発明の定義によれば、自己集合はタンパク質をテフロン（登録商標）に吸収させて、円偏光二色性を用いて二次構造(一般的αらせん)の存在を確立することにより検出することができる(De Vocht他、1998、Biophys. J. 74: 2059〜68頁) 。
【００２１】
フィルムの形成は、テフロン（登録商標）シートをタンパク質溶液中でインキュベートし、続いて少なくとも3回水または緩衝溶液で洗浄することによって確立することができる(Wosten 他、1994、 Embo. J. 13: 5848〜54頁)。タンパク質フィルムは、例えば蛍光マーカーを用いたラベリング、蛍光抗体の使用など、当技術分野において十分に確立している任意の適切な方法によって可視化することができる。mおよびnは、一般的に0〜2000におよぶ値を有しているが、より一般的には合計で100または200未満である。本発明に関するハイドロホビンの定義は、ハイドロホビンおよび別のポリペプチドの融合タンパク質、ならびにハイドロホビンおよび多糖類など他の分子の複合体を含んでいる。
【００２２】
今までに確認されたハイドロホビンは、クラスIまたはクラスIIのいずれかに分類される。両方の種類とも、菌類中でハイドロホビン性界面において、両親媒性フィルムへと自己集合する分泌タンパク質として確認された。クラスIハイドロホビンの集合体が比較的不溶性であるのに対して、クラスIIのハイドロホビンの集合体は、さまざまな溶媒に容易に溶解する。
【００２３】
ハイドロホビン様のタンパク質も、例えば、アクチノミセテス属種およびステプトマイセス属種など、糸状菌中で確認されている(国際公開01/74864号)。これら細菌タンパク質は、2つだけのシステイン残基を有しているので、菌類ハイドロホビンと対照的に、1つまでのジスルフィド架橋形成する。かかるタンパク質は、配列番号1および2において示されるコンセンサス配列を有するハイドロホビンと機能的同等物の例であり、本発明の範囲内である。
【００２４】
ハイドロホビンは、糸状菌などの自然源から、任意の適切な方法によって、抽出により得ることができる。例えば、ハイドロホビンは、ハイドロホビンを成長媒体へ分泌する糸状菌の培養または真菌性菌糸体を、60%エタノールを用いて抽出することによって得ることができる。自然においてハイドロホビンを分泌する宿主生物から、ハイドロホビンを単離することが特に好ましい。好ましい宿主生物は、ハイホミセトス(例えば、トリコデルナ)、バシジオマイセトスおよびアセトマイセトスである。特に好ましい宿主は、クリパリンと呼ばれるハイドロホビンを分泌するクリホネクトリア寄生虫などの、食品級の生物である(MacCabeおよびVan Alfen、1999、App. Environ. Microbiol 65: 5431〜5435頁)。
【００２５】
別法として、ハイドロホビンは組換え技術を使用することによって得ることができる。例えば、宿主細胞、典型的に微生物は、ハイドロホビンを発現するように改質してよく、次いでハイドロホビンを分離して本発明に従って使用することもできる。ハイドロホビンをコードする核酸構成物を宿主細胞中に導入する技術は、当技術分野において良く知られている。ハイドロホビンをコードする34を超える遺伝子は、16を超える真菌種からクローン化されている(例えば、アガリカスビスポラスにおいて確認されているハイドロホビンの配列を示している国際公開第96/41882号およびWosten、2001、Annu Rev. Microbiol.55: 625〜646頁を参照されたい)。組換え技術は、ハイドロホビン配列の改変または所望の/改良された性質を有する新規のハイドロホビンの合成にも使用することができる。
【００２６】
一般的に、適切な宿主細胞または生物は、所望のハイドロホビンをコードする核酸構成物によって形質転換される。このポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、適切な条件の下で(例えば、適切な配向および正しい読み取り枠において適切なターゲッティングおよび発現配列で)発現されるように、転写および翻訳のために必要なエレメントをコードする適切な発現ベクター中に挿入することができる。これらの発現ベクターを構築するのに必要な方法は、当業者に良く知られている。
【００２７】
ポリペプチドをコードする配列を発現するのに数多くの発現システムを使用することもできる。これらには、それだけに限定されないが、細菌、菌類(酵母菌を含む)、昆虫細胞システム、植物細胞培養システムおよび適切な発現ベクターを用いて形質転された全ての植物が含まれる。好ましい宿主は、食品級すなわち「一般的に安全である」 (GRAS)」とみなされる宿主である。
【００２８】
適切な真菌種には、例えば、サッカロミセス属、クリュイベロミセス属、ピチア属、ハンゼヌラ属、カンジダ属、スキゾサッカロミセス属などの(ただしこれらに限定されない)酵母菌、および例えばアスペルギルス属、トリコデルマ属、ムコール属、ニューロスポラ属、フザリウム属などの(ただしこれらに限定されない)糸状種が含まれる。
【００２９】
ハイドロホビンをコードする配列は、アミノ酸レベルにおいて、自然において確認されたハイドロホビンに対して少なくとも80%同一であることが好ましく、少なくとも95%または100%同一であることがより好ましい。しかしながら、当業者は同類置換またはハイドロホビンの生物活性を低下させない他のアミノ酸変換を行うこともできる。本発明の目的において、自然に産するハイドロホビンに対して高い同一性を有するこれらのハイドロホビンも、「ハイドロホビン」という用語に包含される。
【００３０】
ハイドロホビンは、培地または細胞抽出体から、例えば、国際公開第01/57076号に記述されている手順によって精製することができる。この手順は、ハイドロホビン含有溶液中に存在するハイドロホビンを表面に吸着し、次いで表面を例えばTween 20などの界面活性剤と接触させてハイドロホビンを表面から溶離することを含んでいる。また、Collen他、2002、Biochim Biophys Acta. 1569:139〜50頁;Calonje他、2002、Can. J. Microbiol.48:1030〜4頁;Askolin他、2001、Appl Microbiol Biotechnol. 57:124〜30頁;およびDe Vries他、1999、Eur J Biochem. 262:377〜85頁も同様に参照されたい。
【００３１】
空気混入
「空気混入」という用語は、気体が機械的手段などで製品に意図的に組み込まれたことを意味する。気体はどんな気体でもよいが、特に食品の関連においては、空気、窒素または二酸化炭素など食品用気体であることが好ましい。空気混入の程度は、一般的に「オーバーラン」という用語で定義される。本発明に関して、%オーバーランは容積で以下のように定義される。
オーバーラン＝（空気混入製品の容積-混合物の容積)/混合物の容積)×100
製品中に存在するオーバーランの程度は、所望の製品特性により変わる。好ましくは、オーバーランの水準は少なくとも10%であり、より好ましくは少なくとも25％または50％である。好ましくは、オーバーランの水準は400％未満、より好ましくは300または200％未満である。
【００３２】
好ましくは、気泡は実質的に均一である。
【００３３】
空気混入工程はあらゆる適切な方法により実施することができ、空気混入方法は以下を含む（が、これらに限定されるものではない。）
−オークス(Oakes) 攪拌機（E.T. Oakes Corp）、メガトロン（Megatron）攪拌機(Kinematica AG)、モンドミックス（Mondomix）攪拌機（Haas-Mondomix BV）等の回転固定子装置における連続起泡;
−気体の表面巻き込みを伴う装置、例えば、Hobart whick攪拌機(Kinematica AG)または攪拌型タンクによるバッチ起泡;
−気体注入、例えば、スパージャー、ジェットミキサー、またはミクロ流体化装置によるもの;
−キサゲ面付熱交換器、静的ミキサーまたはポンプ等の連続流通装置における混合および分散が後に行なわれる気体注入;
−昇圧気体注入、ここで、気体は圧力下において可溶化され、その後減圧により分散ガス層を形成する。これは噴霧容器からの分散により生じうる;
−気体引き込み、例えば、ベンチュリーバルブを経由するもの;
−化学的または生化学的反応による気体生成、例えば、酸と炭酸塩の間の反応によるもの、
−溶液または固体、例えば、ガラス状物質（例えばEP1206193に記載されるもの）または包接水和物に封入された気体の放出
【００３４】
空気混入と凍結工程の間の期間
本発明は空気混入と凍結工程の分離を許容する。よって、凍結空気混入組成物はいくつかの異なる方法によって製造されうる。例えば、空気混入と凍結工程は、両者とも工場内で行なうことができ、その結果、凍結空気混入組成物は工場で生産することができ、消費者は最終形態の凍結空気混入組成物を購入する。代替的には、空気混入工程のみが工場において行なわれ、その結果、消費者は未凍結の予め空気混入された混合物を購入し、その後家庭でそれらを凍結することとなる。第三の可能性は消費者は、未空気混入、かつ、未凍結混合物を購入し、家庭で空気混入かつ凍結を行なう。
【００３５】
特に、これらの事例の２つ目（潜在的には他の事例においても同様であるが）においては、空気混入と凍結の工程の間には、有意の期間が存在する。空気混入組成物が凍結前に保存される場合の事例、または、凍結工程が長時間かかる場合の事例においてすら、気泡が不均一化と癒着の両者、並びに、この時間におけるクリーム化に対しても安定である必要がある。ハイドロホビン類は不均一化および癒着に対して良好な安定性を有する気泡を与える。(空気泡の浮力による)クリーム化は、垂直な相分離を引き起こすことがあり、結果として泡の大部分は上部表面に接近し、底部の泡が減少する。クリーム化により、気泡における個々の泡がより密に詰められることとなり、それに起因する気泡の崩壊による結果としての空気の喪失が生じ得る。クリーム化は、気泡の連続相が、見掛けの降伏応力などのあるレオロジー特性を有している場合に阻害される。
【００３６】
それ故一実施形態において、組成物は連続相に適切なレオロジー特性を付与し、これにより空気泡のクリーム化を阻止する降伏応力剤(複数可)をさらに含む。ここにおいて、降伏応力剤は連続相に見掛けの降伏応力を提供する成分(分子または粒子)であると定義される。
【００３７】
降伏応力剤として、特に食品系において使用することのできる適切な成分には、ゲル化剤、以下に要約される一部の限定されない例が含まれる:
−ゼラチン、ι-およびκ-カラゲナン、および寒天などの熱可逆性ゲル化バイオポリマー。-多糖類とCa2+などの適切なイオンとの間の相互作用から、それらのゲル構造を導き出す化学的にセットされたゲル化バイオポリマー。例には、アルギン酸ナトリウムおよびペクチンが含まれる。
−弱いゲル様の行動を形成でき、剪断によって分裂するキサンタンまたはゲランなどの細菌性多糖類。かかる多糖類は、空気混入混合物中で少なくとも0.2重量%の最終量となるように加えることが好ましい。空気混入混合物を、冷凍する前に、1日またはそれ以上、長時間貯蔵する場合は、もっと多い量、好ましくは少なくとも0.4重量%を加える。
−シゾフィランなどの真菌性多糖類。
−2つ以上のバイオポリマーを含み、これらは個別には非ゲル化であることもできるが、混合するとゲルまたはより高い係数のゲルを形成する相乗作用ゲル。例には、ペクチンとのアルギン酸ナトリウム、ローカストビーンガムとのキサンタン、ローカストビーンガムとの寒天およびローカストビーンガムとのκ-カラゲナンが含まれる。
【００３８】
上で説明したいくつかの降伏応力剤が、従来ゲル製品に対してセットの様に使用されている。ゲル化多糖類が、本発明の状況において降伏応力剤として使用できる唯一の成分ではない。連続相の見掛けの降伏応力をもたらす任意の成分(分子または粒子)を使用することができる。降伏応力剤の他の例には以下が含まれる。
-リポゲル。これらには、これらだけに限定するものではないが、飽和脂肪酸のポリグリセロールエステル、および脂肪酸のモノグリセリドと飽和脂肪酸のクエン酸エステル、飽和脂肪酸の乳酸エステル、または飽和脂肪酸のジアセチル酒石酸エステルとのブレンドが含まれる。一般的に、リポゲル成分の量は、前もって空気混入した混合品中約2〜5重量%未満であろう。リポゲルの作製方法の例は、Heertje他、Food Science and Technology、1998、31、387-396頁において見出すことができる。
−(熱的または化学的な)ゲル化タンパク質、例えば、乳漿タンパク質。
−ゲル状の性質を有する連続相を提供するよう、分散したオイル粒子が互いに相互作用する水中油のエマルジョン。
−例えば果物または野菜オリジンの繊維、改質セルロースなど。
【００３９】
本発明の空気混入組成物は、その元の空気相容積の好ましくは少なくとも50%を、より好ましくは75%を、少なくとも3週間(一般的に冷温 (約5℃)における保管後に測定して)保持する。オーバーランは、製品を通して均一に分散している必要はない。
【００４０】
静止状態での凍結工程
静止状態（または静的状態）での凍結は、水性液体（例えば、溶液または懸濁液）が凝固点より低温に冷却され、剪断力を課された場の存在なしに、氷結晶形成を通じて部分的または全体の凝固が生ずるあらゆる工程に関する。よって、液体は故意に激しく攪拌されることなく、凍結の際、混合または震盪される。静止状態での凍結工程は以下を含む（がこれらに限定されることのない）数多くの方法により達成してもよい。
−凍結する液体を含む容器を液体凍結点より低い温度である低温環境（家庭用冷凍庫、商業的冷蔵倉庫または急速冷凍庫、または小売りされる冷凍保管庫等）に、所望の程度の凝固が生ずるまで置くこと;
−冷凍する液体で型を満たし、低温冷媒（食塩水、グリコールまたは液体窒素）浴中に上記型を、所望の程度の凝固が生ずるまで浸すこと;
−凍結する液体の一部を極低温液体（液体窒素等）浴中に、除去前に、凝固するのに十分な時間に亘り直接載置または滴下すること;
−フィルム凍結、すなわち、低温表面上に液体を層として展開し、上記層を剪断力なしに凍結させた後、凍結層を低温表面から削ぎ落とす。フィルム凍結の例は、ドラム冷凍機、および、回転冷却板を含む。
−密閉された室内の冷却環境中において、重力下で液体の液滴が室内の床に落下する時迄に、要求される程度の凝固が起こる様に、液滴を噴霧すること。この場合、液滴は移動しているが、液滴中の液体に剪断場は課されない。
【００４１】
組成物
製品に存在するハイドロホビンの量は、一般的に製品の配合および空気相の容積により変わる。一般的に、製品はハイドロホビンを少なくとも0.001重量%、より好ましくは少なくとも0.005重量%または0.01重量%含んでいる。一般的に製品は1重量%未満のハイドロホビンを含んでいる。ハイドロホビンは、単一源からまたは複数源から得ることができ、例えばハイドロホビンは2つ以上の異なるハイドロホビンポリペプチドの混合物であることができる。
【００４２】
ハイドロホビンは、空気相を安定化するのに利用可能な形態および量で加えられる。「加える」という用語によって、本発明者らはハイドロホビンがその泡安定特性を利用する目的で製品に意図的に導入されることを意味する。したがって、ハイドロホビンポリペプチドを含む可能性がある真菌汚染を含む成分が存在するかまたは加えられた場合には、本発明の文脈におけるハイドロホビンを加えるには含まれない。
【００４３】
一般的に、ハイドロホビンは本発明の製品または組成物に、一般的に固体の重量に対して少なくとも10%純度など、少なくとも部分的に精製された単離した形態で加えられる。「単離した形態で加えられる」という用語によって、本発明者らはハイドロホビンが、例えば天然にハイドロホビンを発現するマッシュルームなど、天然産の生物の一部として加えられるものではないことを意味している。そうではなくて、ハイドロホビンは天然産原料から抽出されたものかまたは宿主生物中の組換え発現で得たものかのいずれかである。
【００４４】
一実施形態において、ハイドロホビンは単量体、二量体および/またはオリゴマー(すなわち、10単量体単位以下より成る)の形態で製品に加えられる。加えられるハイドロホビンの好ましくは少なくとも50重量%が、より好ましくは少なくとも75、80、85または90重量%が、これら形態の少なくとも1つである。ハイドロホビンは、いったん加えられると通常は空気/液体界面で集合するので、単量体、二量体およびオリゴマーの量は減少すると予想される。
【００４５】
凍結空気混入食品は、場合によっては、乳タンパク質などの他のタンパク質、純粋な成分または液体成分のどちらかの、例えばミルクまたはクリームなど;特に乳化相形態のオイルまたは脂肪;砂糖;塩;着色剤および芳香剤;モノグリセリドなどの化学的乳化剤、茶またはコーヒー;果物または野菜のピューレ/エキス/ジュース;ポリサッカリドなどの安定剤または増粘剤;保存剤;ナッツ、果実、トッフィーなどの内包物などの、1つまたは複数の他の成分を含むこともできる。
【００４６】
次に、本発明を、例示的であって制限するものではない以下の実施例を参照にしてさらに説明する。
【００４７】
［実施例］
静止状態での凍結の際の空気混入混合物における気体の保持の比較のための実験を行なった。
【実施例１】
【００４８】
混合物調製
凍結空気混入組成物の製造に適した混合物をハイドロホビンHFBIIを含有させることにより調製した(実施例１)。ハイドロホビンの代わりに脱脂粉乳を使用した比較例もまた、調製した。比較例は、乳タンパク質が高レベルで含まれることから、良好な気泡安定性を示すことが予期される混合物の代表例である。上記混合物は表１に記載され、原料の取得源は表２に記載される。
【表１】
2009508503.tif 000002
【表２】
2009508503.tif 000003
【００４９】
ハイドロホビンHFBIIは、基本的に国際公開第00/58342号およびLinder他、2001、Biomacromolecules 2:511〜517頁に記載されているようにトリコデルマレーセイから精製したものである。キサンタンは保存の際の気泡のクリーム化の防止の為に含まれる。
【００５０】
混合物は100gバッチに調製した。スクロース、キサンタンガム、および脱脂粉乳粉末（使用される場合）は、乾燥混合され、室温において、攪拌された水にゆっくりと添加される。混合物は、55℃に加熱され、キサンタンとミルクタンパク質（使用される場合）が完全に水和される迄、約30分間攪拌される。その後、混合物を室温まで冷却する。HFBII（使用される場合）を5mg/mlのアリコートとして、混合物に要求される要求される最終濃度となるまで添加した。その後、溶液を、もう少しの間にわたってゆっくりと攪拌した。
【００５１】
空気混入工程
それぞれの混合物の100mlを、HFBII（使用される場合）を完全に拡散させるため、音響浴中で30秒静かに超音波処理し、攪拌ポット装置中に置いた後、5℃に冷却した。
【００５２】
この装置は、内寸法が高さ105mm、直径72mmである、シリンダー状の、垂直に設置されている、ジャケット付きステンレス鋼容器で構成されており、攪拌機を含んでいる。
攪拌機は、回転したときに容器の内部表面をこすり取るための正確な割合の長方形インペラー(寸法72mmx41.5mm)で構成されている。またローターに、長方形付属品に対して45°角度に位置する半円形(直径60mm)の高剪断ブレードが取り付けられている。100％のオーバーランを達成する迄、攪拌機を1200rpmで回転することにより混合物を空気混入した。（実施例１については60秒、比較例については120秒）
【００５３】
空気混入混合物のオーバーランを調製後すぐに以下に要約した技術を用いて測定した。空気混入組成物は5℃の冷蔵庫でビーカーに入れて7日間保存し、オーバーランを再測定した。
【００５４】
静止状態での凍結工程
７日間の保存の後、それぞれの空気混入混合物を長方形ゴム製型に満たし、24時間、-25℃において、冷凍庫に置いた。その後、サンプルは-80℃の冷凍庫棚に30分間置き、オーバーランの測定前に、硬度を増加させた。それぞれの混合物について3つのサンプルを測定した。微細構造の調査のための走査型電子顕微鏡(SEM)による調査の前に、4つめのサンプルを-80℃で保存した。
【００５５】
オーバーランの測定
［空気混入サンプル］
空気混入未凍結サンプルについて以下の通りオーバーランを決定した。まず、既知の体積(30.7ml)のプラスチック容器を注意深く空気未混入混合物で満たし、実験室秤で重さを量った(M空気未混入)。その後、同じ手順を同体積の空気混入組成物について繰り返した(M空気混入)。オーバーランを以下の式により決定した。
オーバーラン＝（（M空気未混入−M空気混入)/M空気混入）×100％
（これは一定の質量のサンプルの代わりに一定の体積のサンプルを使用した時の上述のオーバーランの定義に等しい。）
【００５６】
［凍結空気混入サンプル］
凍結空気混入サンプルについて、以下の通りオーバーランを決定した。空気混入混合物を型に量り入れ、既知の質量(約5g)のサンプルを得た。サンプルを上述の通り、その後凍結した。凍結後、サンプルを型より取り出し、それぞれをすぐに予め冷却したプラスチック製容器に入れた。2つの小さな穴を含むねじ蓋を上記容器上に嵌めた。容器中の密閉された空間の体積は予め61.95mlと決定しておいた。1つの小さな穴より、目盛り付シリンジを用いて、上記容器を注意深く-10℃の60重量％のスクロース溶液で満たした。蓋の2つ目の穴は、置換された空気が外に逃れるのを可能とした。容器を完全に満たすために注入したスクロース溶液の体積をシリンジの目盛りによって決定した。凍結した気泡(V空気混入)の体積は、容器の既知の体積と、注入した溶液の測定された体積の差により与えられた。試験は凍結した気泡の溶解を防ぐため1分以内で完了させた。同じ手順を同質量の凍結空気未混入混合物について繰り返した（V空気未混入)。オーバーランを以下の式により決定した。(つまり、質量固定のサンプルについて)
オーバーラン＝（（V空気混入−V空気未混入)/V空気未混入）×100％
【００５７】
走査型電子顕微鏡
製品の微細構造を、低温型走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて可視化した。顕微鏡用試験片を調製するために、サンプルをドライアイス上で-80℃に冷却し、部分を切断した。この寸法が約6mmx6mmx10mmの部分を、TissueTek:OCT(商標)コンパウンド(PVA11%、カーボワックス5% および85%の非反応性成分)を用いて、冷凍点上のサンプルホルダーに乗せた。ホルダーに含まれたサンプルを、液体窒素の中にさっとくぐらせ、約10-4ミリバールの真空に保持されている低温調製チャンバー(Oxford Instrument CT1500HF)に移した。サンプルを、チャンバー内部で手術用メスの刃を用いて破砕した。次いで氷がゆっくりと昇華して表面細部が現れるように、サンプルを約60〜90秒間-90℃まで温めた。次いでサンプルを、-110℃に冷却して昇華を終わらせた。次にサンプルを、アルゴンプラズマを用いて金で被覆した。この工程も適用圧力10-1mbarの真空下、6ミリアンペア電流で45秒間実施した。次いでサンプルを、通常の走査型電子顕微鏡(JSM 5600)に移し、Oxford Instrument冷却段を-150℃の温度で取り付けた。サンプルを画像化し、該当する区域をデジタル画像取込みソフトウェアを介して捕捉した。
【００５８】
結果
空気混入後、保存後、および凍結後のオーバーランを表３に示す。脱脂粉乳粉末を高レベルで含む比較列においては、保存の際、および、凍結の結果、オーバーランの有意な減少が存在する。しかし、ハイドロホビンを含む実施例１は保存の際のオーバーランの損失が全くなく、そして凍結の際の減少もずっと小さなものだった。（事実、この減少の原因の少なくとも一部は温度の低下による気体の体積の変化によるものと説明することができ、サンプルからの気体の喪失に起因するものではない。）結果は、乳タンパク質の代わりにハイドロホビンを使用することにより、泡立てた組成物の保存および凍結の両時の空気の保持を大きく向上させる。
【表３】
2009508503.tif 000004
【００５９】
凍結サンプルのSEM像は、実施例１は空気泡の均一な分布を有することを示した。ハイドロホビンを含まない比較例はより不均一な気体泡を有するように見えた。そして、オーバーランの測定結果と一致して、空気の存在量は少ないように見えた。さらに、比較例の氷結晶は実施例１のものより、より細長く、かつ、幾分大きく見えた。
【００６０】
実施例２および３
実施例１と同じ配合および同じ手順により、2つのさらなる混合物を調製した。混合物は、電動Brevilleハンディーブレンダーを用いて、泡立て刃(beater blade)により、約1分間空気混入をした。空気混入混合物のオーバーランを測定した。その後、空気混入混合物を4日間、5℃で保存し、オーバーランを再測定した。その後、空気混入サンプルを静止状態で凍結し、以下の2つの異なる方法による最終凍結空気混入製品を得た。
【００６１】
実施例２：型に空気混入混合物を入れ、その後、-25℃に設定された食塩水浴において15分間凍結した。約30秒〜1分間の凍結時間の後、製品に棒を挿入した。型を温水浴に簡単に浸すことにより、凍結空気混入製品を型から取り出しした。その後、製品をワックスを塗った紙包みに置いた。
【００６２】
実施例３：空気混入混合物を容器に入れ、その後、-18℃に設定された家庭用冷凍庫において、約6時間凍結した。
【００６３】
いずれの場合においても、その後、さらに凍結空気混入製品を-35℃の急速冷凍庫において2時間凍結し、その後オーバーランを測定した。
【００６４】
保存後および凍結後のオーバーランを表４に示す。静止状態での凍結の際には、少しの量のオーバーランしか測定されなかった。すなわち、実施例２および３それぞれについて5％および7％(±1％)である。このデータもまた、ハイドロホビンが凍結の際の気泡の安定化に効果的であることを示している。
【表４】
2009508503.tif 000005
【００６５】
上記の個々のセクションで言及した本発明のさまざまな特徴および実施形態は、必要に応じて、必要な変更を加えて他のセクションに適用される。したがって、1つのセクションに特定の特徴は、必要に応じて、他のセクションに特定の特徴と結合されてよい。
【００６６】
上記明細書で説明した全ての出版物は、参照により本明細書に組み込まれている。本発明の説明した方法および製品のさまざまな修正形態および変形形態が、本発明の精神から逸脱することなく、当業者にとって明らかであろう。本発明を、特定の好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の請求は、かかる特定の実施形態に不当に制限されるものではないことが理解されなければならない。実際には、本発明を実施するために説明した方法の、関連する分野の当業者には明らかなさまざまな修正形態は、以下の特許請求範囲内であることを意図している。
【国際調査報告】
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2009508503.tif 000007
2009508503.tif 000008
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