(57)【要約】  サンプル中の細胞、検体、核酸または微生物の存在、非存在、健康状態またはそれらの間の相互作用を決定するための方法が提供される。蛍光を発する化合物およびそれを含有するキットも提供される。
2009501511.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の細胞、検体、核酸または微生物の存在、非存在または健康状態を決定するためのアッセイであって、
サンプルに標識試薬を結合させるステップと、標識された細胞、検体、核酸もしくは微生物を形成するステップであって、前記標識試薬が細胞、検体、核酸または微生物を染色して、染色細胞、検体、核酸または微生物を含む染色されたサンプルを提供する染料を含み、前記染料が式Ｉの化合物であり、
【化１】
2009501511.tif 000011
式Ｉ中、ＮＲ1Ｒ2およびＮＲ3Ｒ4部分は、オルト、メタもしくはパラ位にあり、
Ｘ-はアニオン性塩であり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、またはＲ4は、メチル、エチル、Ｃ1-10アルキル（直鎖もしくは分岐）、アルケン（直鎖もしくは分岐）からなる群より独立して選択され、あるいはＲ1およびＲ2またはＲ3およびＲ4が、それらが結合している窒素原子と一緒にピロリジノまたはピペリジノ環を形成し、
Ｒ5は、メチル、エチル、Ｃ1-10アルキル（直鎖もしくは分岐）、アルケン（直鎖もしくは分岐）、アルキン、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、有機金属化合物、ポリアルキレングリコール部分、置換および非置換アリール部分ならびに置換および非置換ベンジル部分からなる群より選択される、結合させるステップと、
染色された細胞、検体、核酸または微生物の蓄積を観察するステップと
を含むアッセイ。
【請求項２】
前記染料がカプセル化またはペグ化されている、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
Ｒ5が（ＣＨ2）n−ＭＲ6であり、ｎが１〜６の数であり、Ｍが、スズ、ケイ素およびゲルマニウムからなる群より選択される有機金属化合物であり、Ｒ6がプロピル、ブチル、および置換もしくは非置換アルキルからなる群より選択される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項４】
式Ｉの化合物が次の構造：
【化２】
2009501511.tif 000012
を有する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項５】
式Ｉの化合物が次の構造：
【化３】
2009501511.tif 000013
を有する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項６】
式Ｉの化合物が次の構造：
【化４】
2009501511.tif 000014
を有する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項７】
リガンドまたは抗体と、式Ｉの化合物
【化５】
2009501511.tif 000015
（式Ｉ中、ＮＲ1Ｒ2およびＮＲ3Ｒ4部分は、オルト、メタまたはパラ位にあり、
Ｘ-はアニオン性塩であり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、またはＲ4は、メチル、エチル、Ｃ1-10アルキル（直鎖もしくは分岐）、アルケン（直鎖もしくは分岐）からなる群より独立して選択され、あるいはＲ1およびＲ2またはＲ3およびＲ4が、それらが結合している窒素原子と一緒にピロリジノまたはピペリジノ環を形成し、
Ｒ5は、メチル、エチル、Ｃ1-10アルキル（直鎖もしくは分岐）、アルケン（直鎖もしくは分岐）、アルキン、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、有機金属化合物、ポリアルキレングリコール部分、置換および非置換アリール部分ならびに置換および非置換ベンジル部分からなる群より選択される）とを含み、
前記化合物が化学結合によって前記リガンドまたは抗体に連結されるプローブ。
【請求項８】
前記リガンドがオリゴヌクレオチドである、請求項７に記載のプローブ。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡオリゴマーである、請求項８に記載のプローブ。
【請求項１０】
前記ＤＮＡオリゴマー内のリン原子が染料に付着される、請求項９に記載のプローブ
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドが、特定の配列を含有する標的核酸中の特定の配列に対して相補的な配列を有する、請求項８に記載のプローブ。
【請求項１２】
式Ｉ：
【化６】
2009501511.tif 000016
（式Ｉ中、ＮＲ1Ｒ2およびＮＲ3Ｒ4部分は、オルト、メタまたはパラ位にあり、
Ｘ-はアニオン性塩であり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、またはＲ4は、メチル、エチル、Ｃ1-10アルキル（直鎖もしくは分岐）、アルケン（直鎖もしくは分岐）からなる群より独立して選択され、あるいはＲ1およびＲ2またはＲ3およびＲ4が、それらが結合している窒素原子と一緒にピロリジノまたはピペリジノ環を形成し、
Ｒ5は、メチル、エチル、Ｃ1-10アルキル（直鎖もしくは分岐）、アルケン（直鎖もしくは分岐）、アルキン、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、有機金属化合物、ポリアルキレングリコール部分、置換および非置換アリール部分ならびに置換および非置換ベンジル部分からなる群より選択される）の化合物に結合する検体を選択する方法であって、前記結合が前記式Ｉの蛍光強度を上昇させ、前記方法が、
（ａ）検体の集団を提供するステップと、
（ｂ）前記式Ｉに結合する前記検体を選択するステップと、
（ｃ）前記式Ｉに結合する前記検体を接触させるステップと、
（ｄ）前記式Ｉに結合するときに検体の蛍光強度が上昇する前記検体を選択するステップと
を含む方法。
【請求項１３】
前記検体がＤＮＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記検体がＲＮＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記検体が小分子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記検体が微生物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記検体が細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
関心ある核酸が細胞またはインビトロサンプル中の関心あるタンパク質と相互作用するかどうかを決定する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記細胞または前記サンプル中で、第１の式Ｉ：
【化７】
2009501511.tif 000017
（式Ｉ中、ＮＲ1Ｒ2およびＮＲ3Ｒ4部分は、オルト、メタまたはパラ位にあり、
Ｘ-はアニオン性塩であり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、またはＲ4は、メチル、エチル、Ｃ1-10アルキル（直鎖もしくは分岐）、アルケン（直鎖もしくは分岐）からなる群より独立して選択され、あるいはＲ1およびＲ2またはＲ3およびＲ4が、それらが結合している窒素原子と一緒にピロリジノまたはピペリジノ環を形成し、
Ｒ5は、メチル、エチル、Ｃ1-10アルキル（直鎖もしくは分岐）、アルケン（直鎖もしくは分岐）、アルキン、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、有機金属化合物、ポリアルキレングリコール部分、置換および非置換アリール部分ならびに置換および非置換ベンジル部分からなる群より選択される）に結合する核酸アプタマーに共有結合的に結合した前記関心ある核酸を含む融合核酸を発現させるステップと、
（ｂ）前記細胞または前記サンプル中で、第２の式Ｉを結合する検出可能なタンパク質に共有結合的に結合した前記関心あるタンパク質を含む融合タンパク質を発現させるステップであって、前記第１の式Ｉの発光波長が前記第２の式Ｉの発光波長と異なり、前記第１の式Ｉの発光波長が前記第２の式Ｉの蛍光を誘起するか、または前記第２の式Ｉの発光波長が前記第１の式Ｉの蛍光を誘起する、発現させるステップと、
（ｃ）前記細胞または前記サンプルに、ｉ）前記第１の式Ｉおよび前記第２の式Ｉ、ｉｉ）前記第１の式Ｉのみ、またはｉｉｉ）前記第２の式Ｉのみを接触させるステップと、それにより前記核酸アプタマーが前記第１の式Ｉに結合して、その蛍光強度を上昇させ、それにより前記検出可能なタンパク質が前記第２の式Ｉに結合して、その蛍光強度を上昇させるステップと、
（ｄ）前記第２の式Ｉの存在下および非存在下で前記第１の式Ｉの前記蛍光強度を測定して、または前記第１の式Ｉの存在下および非存在下で前記第２の式Ｉの前記蛍光強度を測定するステップと、それにより蛍光共鳴エネルギー移動が前記第１の式Ｉおよび前記第２の式Ｉとの間で発生する場合に前記関心ある核酸が前記関心あるタンパク質と相互作用するかどうかが判定されるステップと
を含む方法。
【請求項１９】
（ａ）前記細胞または前記サンプル中で、内部蛍光を有する検出可能なタンパク質に共有結合的に結合した前記関心あるタンパク質を含む融合タンパク質を発現させるステップであって、前記式Ｉの発光波長が前記検出可能なタンパク質の発光波長と異なり、前記式Ｉの発光波長が前記検出可能なタンパク質の蛍光を誘起するか、または前記検出可能なタンパク質の発光波長が前記式Ｉの蛍光を誘起する、発現させるステップと、
（ｂ）前記細胞または前記サンプルに前記式Ｉを接触させるステップと、それにより前記核酸アプタマーが前記式Ｉに結合して、その蛍光強度を上昇させるステップと、
（ｃ）前記検出可能なタンパク質の存在下および非存在下で前記式Ｉの前記蛍光強度を測定するステップ、または前記式Ｉの存在下または非存在下で前記検出可能なタンパク質の前記蛍光強度を測定するステップと、それにより蛍光共鳴エネルギー移動が前記式Ｉおよび前記検出可能なタンパク質との間で発生する場合に前記関心ある核酸が前記関心あるタンパク質と相互作用するかどうかが判定されるステップと
をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
サンプル中の１つ以上の標的化合物の存在または非存在を決定する方法であって、前記化合物が式Ｉ：
【化８】
2009501511.tif 000018
（式Ｉ中、ＮＲ1Ｒ2およびＮＲ3Ｒ4部分は、オルト、メタまたはパラ位にあり、
Ｘ-はアニオン性塩であり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、またはＲ4は、メチル、エチル、Ｃ1-10アルキル（直鎖もしくは分岐）、アルケン（直鎖もしくは分岐）からなる群より独立して選択され、あるいはＲ1およびＲ2またはＲ3およびＲ4が、それらが結合している窒素原子と一緒にピロリジノまたはピペリジノ環を形成し、
Ｒ5は、メチル、エチル、Ｃ1-10アルキル（直鎖もしくは分岐）、アルケン（直鎖もしくは分岐）、アルキン、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、有機金属化合物、ポリアルキレングリコール部分、置換および非置換アリール部分ならびに置換および非置換ベンジル部分からなる群より選択される）の化合物の蛍光分子であり、
該方法が、
前記１つ以上の標的化合物に対して特異的な複数の電気泳動プローブであって、標的結合部分をそれぞれ有する電気泳動プローブを提供するステップと、
標的化合物の存在下で各標的化合物とそれに対して特異的な１つ以上の電気泳動プローブとの間に複合体が形成されるように、サンプルを複数の電気泳動プローブと結合させるステップと、
前記化合物を分離するステップと識別するステップと、１つ以上の標的化合物の存在または非存在を決定するステップと
を含む方法。
【請求項２１】
サンプル中の細胞、検体、核酸または微生物を染色するためのキットであって、
（ａ）結合された混合物を形成するための、１つ以上の染料を含む染色された混合物であって、少なくとも１つの染料が式Ｉ
【化９】
2009501511.tif 000019
（式Ｉ中、ＮＲ1Ｒ2およびＮＲ3Ｒ4部分は、オルト、メタまたはパラ位にあり、
Ｘ-はアニオン性塩であり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、またはＲ4は、メチル、エチル、Ｃ1-10アルキル（直鎖もしくは分岐）、アルケン（直鎖もしくは分岐）からなる群より独立して選択され、あるいはＲ1およびＲ2またはＲ3およびＲ4が、それらが結合している窒素原子と一緒にピロリジノまたはピペリジノ環を形成し、
Ｒ5は、メチル、エチル、Ｃ1-10アルキル（直鎖もしくは分岐）、アルケン（直鎖もしくは分岐）、アルキン、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、有機金属化合物、ポリアルキレングリコール部分、置換および非置換アリール部分ならびに置換および非置換ベンジル部分からなる群より選択される）を有する、染色された混合物と、
ｂ）前記染料に、細胞、検体、核酸および／または微生物を含むサンプルを結合させるための指示であって、前記指示が、
ｉ）結合された混合物を形成するために、細胞、検体、核酸および／または微生物のサンプルを、前記少なくとも１つまたは複数の染料を結合させるステップと、
ｉｉ）サンプル混合物中の細胞、検体、核酸または微生物と関連させて、照明時に検出可能な光学反応を与える染色された細胞、検体、核酸または微生物複合体を形成するために、染色された混合物中の染料に十分な時間にわたって結合させた混合物をインキュベートするステップと
を含む指示と
を含むキット。
【請求項２２】
前記キットが細胞分化に使用される、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
式Ｉ：
【化１０】
2009501511.tif 000020
（式Ｉ中、ＮＲ1Ｒ2およびＮＲ3Ｒ4部分は、オルト、メタまたはパラ位にあり、
Ｘ-はアニオン性塩であり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、またはＲ4は、メチル、エチル、Ｃ1-10アルキル（直鎖もしくは分岐）、アルケン（直鎖もしくは分岐）からなる群より独立して選択され、あるいはＲ1およびＲ2またはＲ3およびＲ4が、それらが結合している窒素原子と一緒にピロリジノまたはピペリジノ環を形成し、
Ｒ5は、メチル、エチル、Ｃ1-10アルキル（直鎖もしくは分岐）、アルケン（直鎖もしくは分岐）、アルキン、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、有機金属化合物、ポリアルキレングリコール部分、置換および非置換アリール部分ならびに置換および非置換ベンジル部分からなる群より選択される）の化合物であって、カプセル化またはペグ化されている化合物。
【請求項２４】
前記カプセル化またはペグ化された化合物が水溶性である、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
前記化合物が約４００ｎｍから７００ｎｍまでの範囲で蛍光を発する、請求項２３に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願データ
本出願は、２００５年４月８日に出願された米国特許仮出願番号６０／６６９，６１５、２００５年１１月８日に出願された米国特許仮出願番号６０／７３４，５１８および２００６年２月１３日に出願された米国特許仮出願番号６０／７７３，３６６の利益を請求する。その開示は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０００２】
発明の分野
本発明は、アッセイで使用するための組成物、方法、およびキットに関する。さらに詳細には、本発明は、アッセイで使用するための蛍光剤、染色剤またはタグとしての、スチルバジウム化合物およびその類似体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
相同な核酸配列を検出するための最も頻繁に使用される分子生物学的技法の１つは、核酸ハイブリダイゼーション、すなわちＤＮＡとＤＮＡ、ＲＮＡとＲＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡのハイブリダイゼーションである。本技法では、プローブとして使用される核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が標識され、そして標識された核酸が検出される核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）にハイブリダイズされる。プローブとして使用される核酸が検出される核酸に対して相同性を有するとき、二本鎖配列を形成するために各一本鎖核酸はその相補的な配列にハイブリダイズして、次に二本鎖配列が標識プローブによって検出される。
【０００４】
血液中の、または他の生体液中の検体、微生物、アミノ酸または核酸配列（たとえば複数の病原体または複数の遺伝子または複数の遺伝的変異体）を単独で識別し、マーキングし、単離し、修飾し、またはそうでなければ決定する必要性があることは、医学の多くの分野でますます明らかになってきている。大半のマルチ検体アッセイ、たとえば複数の核酸配列を検出するアッセイは、多数のステップを含み、不十分な感度、制限されたダイナミックレンジ（通例、約２〜１００倍の相違）を有し、および／または高度な計測設備を利用することが多い。
【０００５】
ヒトゲノムが解明されているので、特定の配列の存在を決定するアッセイを実施するための、ホモ接合体およびヘテロ接合体の対立遺伝子を区別するための、変異の存在を決定するための、細胞発現パターンを評価するためなどの多くの機会がある。これらの場合の多くで、１回の反応で同じサンプルの多数の異なる特徴を決定することが所望される。多くのアッセイでは、ゲノム、合成、またはｃＤＮＡであると、特定の配列の存在を決定することに関心がある。これらの配列は、特に遺伝子、制御配列、反復、多量体領域、発現パターンなどに関連付けることができる。１つ以上の病原体の存在を決定することにも関心がある。ＤＮＡのセンチモルガンに潜在的に分布する多数の塩基または配列を同定および定量する必要性は、大きな課題を与える。理想的には、方法は正確であり、必要な試薬の量を制限することで合理的に経済性であり、および／または高度に多重化されたアッセイを提供して、そのアッセイは複数の遺伝子の区別および定量、および／または一塩基多型（ＳＮＰ）判定、および／またはＲＮＡまたはタンパク質レベルでの遺伝子発現を可能にする。
【０００６】
初期の創薬アッセイでは、放射能が主な読み出し手段であった。しかしながらさらなる情報への必要性、より高いスループットおよび小型化が、蛍光検出へのシフトを引き起こした。蛍光ベース試薬は、スループットおよび情報含有量がより高く、より少ない量の試薬および試験化合物を必要とする、より強力な複数パラメータアッセイを与えることができる。蛍光はまた、放射能ベースの方法よりも安全で費用が安い。
【０００７】
生体化合物を検出するための別の技法は、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）である。Ｓｗｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｏｌ．Ｍｕｔａｇｅｎ．２７：２４５−２５４；Ｒａａｐ（１９９８）Ｍｕｔ．Ｒｅｓ．４００：２８７−２９８；Ｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃ．Ｈｉｓｔｏｌ．７３：６−２２。ＦＩＳＨは、たとえば顕微鏡での可視化によって細胞または組織調製物内の所定の標的オリゴヌクレオチド、たとえばＤＮＡまたはＲＮＡの検出を可能にする。このようにＦＩＳＨは、臨床および研究実験室の両方での、たとえば分子細胞遺伝学、病理学および免疫学の分野において重要なツールである。ＦＩＳＨは、特定の相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ配列を検出するためにオリゴヌクレオチドプローブの蛍光タギングを含む。特にＦＩＳＨは、標的オリゴヌクレオチドの少なくとも一部に対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブを、標的オリゴヌクレオチドを含有する、または含有することが疑われる細胞または組織調製物によってインキュベートすることを含む。検出可能な標識、たとえば蛍光染料分子がオリゴヌクレオチドプローブに結合される。ハイブリダイゼーション部位で産生された蛍光シグナルは通例、ｅｐｉ蛍光顕微鏡を使用して可視化される。代わりの手法は、プローブのそのＤＮＡ標的へのハイブリダイゼーションを可視化するために、ビオチンまたはジゴキシゲニンなどの抗原に結合したオリゴヌクレオチドプローブおよびその抗原に対して作られた蛍光標識された抗体を使用することである。各種のＦＩＳＨフォーマットが当分野で知られている。たとえばＤｅｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １２：１４９−１５４；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５２：８５４−８６５；Ｊａｌａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．７３：１３２−１３７；Ｚａｈｅｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．１２：４８３−４９３；Ｋｉｔａｄａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１：１０９５−１１０２；Ｎｅｕｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌ．３０：８１−８６；Ｈａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，（１９８０）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｓｔｓ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｓｔｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）；Ｂｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２：２３１５−２３２１；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９７６−９７９；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ３１：２６５−２７４；Ｂｏｒｚｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１９３：１６７−１７６；Ｗａｃｈｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．１８：４５５−４６３；Ｂｉａｎｃｈｉ（１９９８）��．Ｐｅｒｉｎａｔ．Ｍｅｄ．２６：１７５−１８５；およびＭｕｎｎｅ（１９９８）Ｍｏｌ．Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．４：８６３−８７０を参照。
【０００８】
このように、より高い感度、大規模なダイナミックレンジ、より優れた蛍光、より高度の多重化および／またはより少なく安定な試薬を有する、１個または複数の遺伝子の区別および／または定量、および／ＳＮＰ判定および／またはＲＮＡまたはタンパク質レベルでの遺伝子発現についてのアッセイは、マルチ検体アッセイの平易さおよび／または信頼性を向上させて、それらのコストを低下させ得る。
【０００９】
アッセイの分野では次の特徴を備えた標識に対する必要性も引き続き存在する。（ｉ）高い蛍光感度（少量での検出のため）、（ｉｉ）吸収周波数および放射周波数との間の十分な分離、（ｉｉｉ）所望の溶解度、（ｉｖ）他の分子と直ちに結合する能力、（ｖ）厳しい条件および高温に対する安定性、（ｖｉ）複数の色のデコンボリューションのための対称なほぼガウス発光線形、および／または（ｖｉｉ）自動化解析との適合性。
【発明の開示】
【００１０】
本発明の実施形態は、細胞、検体、核酸または微生物を含有することが疑われるサンプル中での細胞、検体、核酸または微生物の存在または非存在を決定するためのアッセイを含み、前記アッセイは、標識された細胞、核酸または微生物を作製するためにサンプルに標識試薬を結合させるステップであって、前記標識試薬は、染色した細胞、検体、核酸または微生物を含む染色されたサンプルを提供するために細胞、検体、核酸または微生物を直接染色する染料を含み、前記染料は式Ｉ：
【化１】
2009501511.tif 000003
によって表される化合物であり、
式Ｉ中、ＮＲ1Ｒ2およびＮＲ3Ｒ4部分は、オルト、メタまたはパラ位にあり、Ｘ-はアニオン性塩であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、またはＲ4は、Ｃ1-10アルキル（直鎖もしくは分岐）、アルケン（直鎖もしくは分岐）からなる群より独立して選択され、あるいはＲ1およびＲ2またはＲ3およびＲ4はそれらが結合する窒素原子と一緒にピロリジノまたはピペリジノ環を形成し、Ｒ5は、ポリアルキレングリコール部分、Ｃ1-10アルキル（直鎖もしくは分岐）、アルケン（直鎖もしくは分岐）、アルキン、置換および非置換アリール、置換および非置換ベンジルおよび／または有機金属部分であり、Ｒ5は、有機スズ、有機ケイ素または有機ゲルマニウムなどの有機化合物であり得る。加えてＲ5は（ＣＨ2）n−ＭＲ6でもよく、ｎは１〜６の数であり、Ｍは、スズ、ケイ素またはゲルマニウムなどの有機金属化合物であり、そしてＲ6は、プロピル、ブチル、またはいずれかのアルキル化合物からなる群より選択される、結合させるステップと、染色されたサンプルに接触するステップと、染色された細胞、検体、核酸または微生物の蓄積を観察するステップとを含む。アッセイは、細胞アッセイ、化学アッセイおよび生物アッセイを含み得る。染料は脂質ベシクルまたは適切な生体材料中に取り込むことができる。特に染料は、マイクロカプセル化された調合物、リポソーム調合物、ミセル調合物および／またはバイセル調合物をそれぞれ作製するために、マイクロカプセル、リポソーム、ミセルおよび／またはバイセル中に取り込むことができる。さらに染料をペグ化（ｐｅｇｌａｔｅｄ）できる。
【００１１】
本発明の実施形態は、リガンドまたは抗体および式Ｉの化合物を含むプローブを含み得る。プローブは細胞、検体、核酸および微生物を検出するために使用できる。
【００１２】
本発明の実施形態は、式Ｉの化合物に結合する検体を選択する方法をさらに含む。
【００１３】
本発明の実施形態は、サンプル中の１つ以上の標的化合物の存在または非存在を決定するステップを含み、化合物は式Ｉまたは蛍光分子によって表され、該ステップは、１つ以上の標的化合物に対して特異的な複数の電気泳動プローブであって、標的結合部分をそれぞれ有する電気泳動プローブを提供するステップと、標的化合物の存在下で各標的化合物とそれに対して特異的な１つ以上の電気泳動プローブとの間に複合体が形成されるように、サンプルに複数の電気泳動プローブを結合させるステップと、１つ以上の標的化合物の存在または非存在を決定するために化合物を分離するステップと識別するステップとを含む。
【００１４】
本発明の実施形態は、細胞、検体、核酸および／または微生物を染色するためのキットをさらに含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
ここで本発明の上述および他の態様を、本明細書に記載する他の実施形態に関してさらに詳細に説明する。本発明を各種の形で具現することができ、本明細書で述べる実施形態に限定されると解釈すべきでないことを認識すべきである。むしろこれらの実施形態は、本開示が徹底的および完全となり、当業者に本発明の範囲を十分に伝えるために提供される。
【００１６】
本明細書の発明の記述で使用される用語は、詳細な実施形態を説明するためだけであり、本発明を限定するものではない。本発明および添付の請求項の実施形態の記述で使用するように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上別途明確に指示しない限り、複数形も同様に含むものである。また本明細書で使用するように「および／または」は関連する列挙項目の１つ以上のありとあらゆる考えられる組合せを指して含む。本明細書で使用するように、「Ｘ〜Ｙの間の」および「約Ｘ〜Ｙの間の」などの語句は、ＸおよびＹを含むと解釈すべきである。本明細書で使用するように、「約Ｘ〜Ｙの間の」などの語句は、「約Ｘ〜約Ｙの間の」を意味する。本明細書で使用するように、「約ＸからＹまでの」などの語句は、「約Ｘから約Ｙまでの」を意味する。別途定義しない限り、本記述で使用する技術および科学用語を含むすべての用語は、本発明が属する当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。
【００１７】
本明細書で引用するすべての公報、特許出願、特許および他の参考文献は、参考文献が示される文および／または段落に関連する教示のためにその実体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００１８】
「アルキル」は本明細書で使用するように、単独でまたは他の基の一部として、１から１０個までの炭素原子を含有する直鎖もしくは分岐鎖炭化水素を指す。アルキルの代表的な例は、これに限定されるわけではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、３−メチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、２，３−ジメチルペンチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシルなどを含む。
【００１９】
「低級アルキル」は本明細書で使用するように、アルキルのサブセットであり、１から４個までの炭素原子を含有する直鎖もしくは分岐鎖炭化水素基を指す。低級アルキルの代表的な例はこれに限定されるわけではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチルなどを含む。
【００２０】
アルキルおよび低級アルキル基は非置換であるか、ハロ、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロ、ヘテロシクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロアルコキシ、シクロアルコキシ、シクロアルキルアルキルオキシ、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、ヘテロシクロオキシ、ヘテロシクロアルキルオキシ、メルカプト、アルキル−Ｓ（Ｏ）m、ハロアルキル−Ｓ（Ｏ）m、アルケニル−Ｓ（Ｏ）m、アルキニル−Ｓ（Ｏ）m、シクロアルキル−Ｓ（Ｏ）m、シクロアルキルアルキル−Ｓ（Ｏ）m、アリール−Ｓ（Ｏ）m、アリールアルキル−Ｓ（Ｏ）m、ヘテロシクロ−Ｓ（Ｏ）m、ヘテロシクロアルキル−Ｓ（Ｏ）m、アミノ、アルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、ハロアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、シクロアルキルアルキルアミノ、アリールアミノ、アリールアルキルアミノ、ヘテロシクロアミノ、ヘテロシクロアルキルアミノ、二置換アミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、エステル、アミド、スルホンアミド、尿素、アルコキシアシルアミノ、アミノアシルオキシ、ニトロまたはシアノ（ｍ＝０、１または２）によって１回以上置換され得る。
【００２１】
「アルコキシ」は本明細書で使用するように、単独でまたは他の基の一部として、オキシ基を介して親分子部分に付加された、本明細書で定義するようなアルキル基を指す。アルコキシの代表的な例はこれに限定されるわけではないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２−プロポキシ、ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシなどを含む。
【００２２】
「アシル」または「アルカノイル」は本明細書で使用するように、単独でまたは他の基の一部として、−Ｃ（Ｏ）Ｒラジカルを指し、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリールなどのいずれかの適切な置換基である。
【００２３】
「細胞」は本明細書で使用するように、生きた有機体または固定された有機体の基本成分を指し、オルガネラを含む。このようにして細胞の存在を検出すること、細胞をアッセイすること、細胞を染色することなどは、全細胞または細胞の少なくとも１つのオルガネラにおいてであることを指し得る。本発明の実施形態に従って、細胞は植物または動物細胞であり得る。当業者によって認識されるように、「オルガネラ」は本明細書で使用するように、それに境界を与え、そして特殊化された機能を有するものを含めて、細胞質中に浮遊する細胞成分または構造を指す。オルガネラはこれに限定されるわけではないが、核、滑面および／または粗面小胞体、中心体、細胞骨格、細胞壁、細胞膜、鞭毛、繊毛、葉緑体、ミトコンドリア、ゴルジ体、リボソーム、リソソーム、中心小体、アクロソーム、グリオキシソーム、分泌小胞、ペルオキシソーム、空胞、メラノソーム、筋原線維およびパレンテソームを含む。
【００２４】
「染料」は本明細書で使用するように、色および／または蛍光を付与して、及び／または定量可能または識別可能である物質を指す。色および／または蛍光は、一時的、半永久または永久であり得る。
【００２５】
「検体」は本明細書で使用するように、分析を受ける物質または化学構成要素を指す。たとえば検体は、それを評価するための生物、化学または臨床試験の結果として検出可能である分子、タンパク質、化学物質などであり得る。検体はこれに限定されるわけではないが、イオン；グルコースおよび尿素などの代謝産物；ホルモン、薬物、ステロイドホルモンなどの微量代謝産物；呼吸ガス、麻酔ガス、毒ガスおよび可燃性ガスなどのガス；毒性蒸気；タンパク質および核酸；抗原および抗体ならびに微生物を含み得る。
【００２６】
「核酸」は本明細書で使用するように、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを、そしてＤＮＡまたはＲＮＡあるいはそのキメラ、一本鎖または二本鎖を指し、完全に合成された、部分的に合成された、あるいは自然発生のものであり得る。核酸は、修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含み得る。さらに核酸は、植物種またはヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコなどの哺乳類種を含む、いずれの起源種由来でもよい。ある実施形態において、核酸は単離された核酸である。本明細書で使用するように、「単離された」核酸は、天然発生型生物の他の構成要素の少なくとも一部、たとえば核酸と関連して一般に見出される細胞構造構成要素または他のポリペプチドまたは核酸から分離された、または実質的に遊離した核酸を意味する。
【００２７】
「脂質ベシクル」は本明細書で使用するように、内部空隙の存在によって特徴付けられる両親媒性物質、たとえば界面活性剤またはリン脂質を含む構造を指す。内部空隙は、液体、水性溶液、ガス、ゲル、固体物質またはその混合物などのいずれかの適切な物質によって充填できる。脂質ベシクルはこれに限定されるわけではないが、リポソーム、らせん体、円盤、チューブ、円環体、六角形、相構造、ミセル、ゲル相、逆ミセル、バイセル、マイクロエマルジョン、エマルジョンおよびその組合せを含む。
【００２８】
「微生物」は本明細書で使用するように、単細胞または細胞クラスターとして存在できる微視的な生物を指す。
【００２９】
本発明の実施形態は、式Ｉ：
【化２】
2009501511.tif 000004
を含む化合物またはその溶媒和物を含み、式中、Ｘ-はアニオン性塩であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、またはＲ4は、メチル、エチル、Ｃ1-10アルキル（直鎖もしくは分岐）、アルケン（直鎖もしくは分岐）からなる群より独立して選択され、あるいはＲ1およびＲ2またはＲ3およびＲ4が、それらが結合している窒素原子と一緒にピロリジノまたはピペリジノ環を形成する。Ｘ-は、フルオリド、クロリド、ブロミド、ヨージドハライド、メシラート、トシラート、ナフチラート、ノシラート、パラアミノベンゾアート、ベンゼンスルホナート、ベシラート、ラウリルサルフェート、２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン、２−（２−ヒドロキシ−５’−メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、エチル２−シアノ−３，３−ジフェニルアクリレートおよび５−ブチルフェニルサリチラートを含む群より選択できる。Ｒ5は、ポリアルキレングリコール部分、Ｃ1-10アルキル（直鎖もしくは分岐）、アルケン（直鎖もしくは分岐）、アルキン、置換および非置換アリール、置換および非置換ベンジルおよび／または有機金属部分である。Ｒ5は、有機スズ、有機ケイ素、または有機ゲルマニウムなどの有機金属化合物でもあり得る。加えて、Ｒ5は（ＣＨ2）n−ＭＲ6でもよく、ｎは１〜６の数であり、Ｍは、スズ、ケイ素またはゲルマニウムなどの有機金属化合物であり、Ｒ6は、プロピル、ブチル、またはいずれかのアルキル化合物からなる群より選択される。化合物は、スチルバジウム化合物であり得る。
【００３０】
本発明のある実施形態において、化合物は次の構造を有する。
【化３】
2009501511.tif 000005
【００３１】
本発明の他の実施形態において、化合物は次の構造を有する。
【化４】
2009501511.tif 000006
【００３２】
本発明のさらに他の実施形態において、化合物は次の構造を有する。
【化５】
2009501511.tif 000007
【００３３】
スチルバジウムクロライドは他のスチルバジウム塩、その類似体およびホモログと同様に、ＵＶ可視発色団を有し、さらに特徴的な強力な蛍光を示し得る、明赤色から暗赤色または他の色の化合物として存在し得る。
【００３４】
スチルバジウムクロライドは他のスチルバジウム塩、類似体およびホモログと同様に、典型的な染色特性を示し、布、紙、木材プラスチック、ガラス、金属および他の物質に、皮膚および関連生体組織にと同様に結合し、同時にその赤色またはピンクまたは他の呈色を保持する。スチルバジウムクロライドは他のスチルバジウム塩、類似体およびホモログと同様に、ＤＮＡおよびＲＮＡ鎖の求核性基に共有結合することによって、一本鎖または二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）などのバイオポリマーを染色できる。
【００３５】
作用の１つの機構は、求核試薬（Ｎｕ：）およびスチルバジウムクロライド側鎖の１つとの間に形成される強力な共有結合を含み得る。他の側鎖は、下のスキームに示すような発色団およびフルオロフォアを保持する。
【００３６】
【化６】
2009501511.tif 000008
【００３７】
求核試薬は、核酸、微生物、アミノ酸、細胞、または検体であり得る。加えて詳細な実施形態において、核酸、アミノ酸、または検体は、求核試薬がスチルバジウムクロライド、その塩、類似体およびホモログに共有結合される前に、ＯＨ、Ｏ-、ＮＨ2などの求核試薬に結合できる。
【００３８】
本発明の化合物は、幾何異性体として存在することができる。そのような異性体はすべて、個別にそして混合物として、その工業用途のために本発明の範囲内に含まれている。Ｅ，Ｅ異性体は本発明の１つの配置であり、Ｅ，Ｅ−配置のシソイドおよびトランソイド２，６−コンフォメーション両方が可能である。加えて構造のオルトコンフォメーションが、上で示したパラおよびメタ構造に加えて形成できる。オルトコンフォメーション構造は、上で開示されたのと同じ塩および部分を本出願を通じて含み得る。
【００３９】
本発明の化合物は、迅速に作用して、関心ある物体を１０分未満で、そしてある実施形態では数秒で染色することができる。本発明の化合物は、明視野および／または蛍光下で可視であり得る。その上、本発明の化合物は、生存可能な細胞の非毒性染色オプションを提供し、生きている細胞の反復可能な染色を提供できる。加えて、本発明の化合物は同じ培養物の複数のアッセイで使用できる。本発明の実施形態は、生細胞有糸分裂の検出をさらに提供できる。本発明の化合物は、使用者に安全であり、使いやすい。加えて本発明の化合物は、適切なアッセイを実施するのに十分な期間にわたって室温で安定性を示すことができる。
【００４０】
本発明の実施形態は、リポソーム、ミセルおよびバイセルなどの脂質ベシクルでカプセル化、調合され、および／またはペグ化される（ＰＥＧ）、式Ｉによって表される化合物も含み得る。本明細書で使用するように「カプセル化された」は、材料または物体によって封じ込められた本発明による化合物の調合物を指す。物質または物体は、合成または天然起源であり得る。したがって脂質ベシクルは、例示的なカプセル化のための機構を提供する。その上、当業者によって理解されるように、本発明の化合物は、化合物を包囲するコーティングの適用によってさらにカプセル化できる。そのようなコーティングはバイオマテリアルを含み、マイクロカプセルに関連して後述する材料をさらに含むことができる。
【００４１】
脂質ベシクルでカプセル化されたまたは調合された、および／またはペグ化された化合物の量は、化合物が利用される方法に基づいて当業者により決定できる。一般に、化合物は調合物の約１重量パーセントから約５０重量パーセント以上までの範囲の量で存在できる。そのようなカプセル化脂質ベシクル調合物およびペグ化調合物は水溶性であり得る。
【００４２】
１．マイクロカプセル化
ある実施形態に従って、本発明の化合物をマイクロカプセルにカプセル化することができる。本明細書で使用するように、「マイクロカプセル」という用語は、単一分子、カプセル化された離散的な微粒子、マルチ微粒子（ｍｕｌｔｉｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ）、液体マルチコアおよび均質に溶解された活性成分を考慮するものと意図する。カプセル化方法は、水または油溶性物質のどちらかのシェルマトリクスにカプセル化された水溶性のもしくは油溶性の活性成分のどちらかを提供できる。マイクロカプセル化された活性成分は酸化（たとえばＵＶ）および水和から保護でき、包囲するシェルマトリクスを溶融、破壊、生分解、または溶解させることによって、あるいはマトリクスを通じた活性成分の低速拡散によって放出され得る。マイクロカプセルは通常、約１〜２０００ミクロンの間のサイズ範囲に入るが、より小さいまたはより大きいサイズが当分野で公知である。
【００４３】
本発明の化合物は、分散のために使用されるマイクロカプセルまたは中空ファイバタイプ内に配置できる。それらもポリマー材料内に分散させるか、または液体として保持することができる。
【００４４】
マイクロカプセルは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリビニルクロライド、トリスターチアセテート、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリビニリデンクロライドまたはフルオリド、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、ウレタン、ポリカーボネート、およびポリラクトンを含む多種多様の材料から作製できる。マイクロカプセル化についてのさらなる詳細事項は、米国特許第５，５８９，１９４号および米国特許第５，４３３，９５３号に見出されるものである。本発明のベース材料で使用するために適切なマイクロカプセルは、約１．０から２，０００ミクロンまでの直径を有する。
【００４５】
活性成分を保持するための形状には、特定の制限は課されていない。言い換えれば、保持混合物によって活性成分を保持するための各種の形がある。具体的な例として、活性成分の表面が保持混合物によって被覆されたマイクロカプセルと、所望の形状に加工された生成物が挙げられ、それぞれ保持混合物中に活性成分を捏和するか、または保持混合物（ｈｏｌｄｉｎｇ  ｍｉｘｔｕｒｅ）および活性成分の均質溶液を形成して、溶媒などの除去によって活性成分を保持混合物中に分散させて、次に分散物を単一分子、分子鎖、液体、球体、シート、フィルム、ロッド、パイプ、スレッド、テープまたはチップなどの所望の形状に加工することによって得られる。加えて、活性成分の放出を制御するためのバリア層によって被覆された表面を有するこれらの加工された生成物および適用性を改善するために接着剤でコーティングされたものを、例として与えることができる。さらなる例として、加工された保持混合物中の活性成分を毛細管の形に充填して、毛細管の両端を熱融着し、次に活性成分をその中にカプセル化することによって得られたもの、および上述の毛細管を中央で２片に切断し、それにより各端を開口として有することによって得られたものが挙げられる。
【００４６】
容器は保持混合物より形成され、該容器は長い期間にわたって均一な放出能力を確保するために、液層としてその中に封入された活性成分を有する。そのような形状として、チューブ形状、ボトル形状または袋形状の容器が一般に使用される。
【００４７】
混合物が容器へ形成されるとき、持続放出層は望ましくは、安定な持続放出を行うために少なくとも約０．００２ｍｍの厚さを有する。持続放出層が約０．００２ｍｍ以上の厚さを有するときに特定の問題は発生しないが、約０．００５ｍｍから５ｍｍに及ぶ厚さを使用できる。厚さが約５ｍｍを超えるとき、化合物の放出量は小さくなりすぎる傾向がある。
【００４８】
固体では、そのような容器からなる持続放出調製物の放出表面積は望ましくは、０．００１ｃｍ2以上である。０．０１ｃｍ2から１ｃｍ2までの範囲を使用できる。
【００４９】
活性成分が持続放出調製物の容器に封入および保持され、前記容器が保持混合物からなるときに、それはいくつかの分量として封入できる。封入量は約０．５ｍｇから５ｍｇであり、約１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、または４ｍｇであり得る。
【００５０】
保持混合物からなる容器の形状として、チューブ、ボトルおよび袋が使用できる。チューブ形状調製物の場合、約０．４ｍｍから１０ｍｍまでの内径を有するものを使用できる。約０．４ｍｍ未満の内径は、活性成分を容器に充填することを困難にするが、約１０ｍｍより大きい内径は、カプセル化の実施を困難にする。ボトル形状調製物は、ブロー成形または射出成形によって形成され、一般に約０．１から２００ｍｌまでの内部容積を有する。約０．１ｍｌ未満の内部容積を有するボトルは容易には形成できないが、約２００ｍｌを超える内部容積を有するボトルは、その中に充填された活性成分の量と内部容積との間に大きな差があるために経済的ではない。袋形状調製物の場合、袋に充填された活性成分の量は望ましくは約１ｍｇから１００ｇまでである。
【００５１】
ある実施形態において、マイクロカプセル組成物全体は約４０〜９０パーセントの液体充填物および約１０〜４０パーセントのシェル壁を含むことができ、液体充填物は約５〜６０パーセントの化合物、約２５〜５０パーセントの生物共力剤および２０〜４０パーセントの水混和性有機溶媒を含み、シェルはその不可欠な要素として、０．５〜２０パーセントの光安定性紫外光吸収化合物を含む（すべてのパーセンテージは、マイクロカプセル組成物全体の重量に基づいている）。
【００５２】
化合物がマイクロカプセル内に残存するのに対して、組成物は、マイクロカプセルを包囲するピリジニウム塩の部分圧のために包装され、貯蔵され、すなわち密閉容器に入れられる。化合物は、貯蔵中および利用後にカプセル壁に浸透するまで化学的に安定である。
【００５３】
安定な充填安定剤は、約２７０〜３５０ナノメートルの範囲の紫外線放射を吸収し、それを無害な形態に変換する。それらはスペクトルの近紫外部分で高い吸収係数（たとえば約２から５までの対数モル吸光係数）を有するが、スペクトルの可視部分では最小の吸収のみを有する。それらは、マイクロカプセル化プロセス中に化合物を形成する、シェルのイソシアナート基および１級アミン基とのいずれの実質的な化学反応も示さない。充填安定剤として使用される化合物には、置換ベンゾフェノン、たとえば２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−オクチルオキシベンゾフェノンなど；ベンゾトリアゾール、たとえば２−（２−ヒドロキシ−５’−メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、２−（３’，５’−ジアリル−２’−ヒドロキシフェニル）ベンゾトリアゾールなど；置換アクリレート、たとえばエチル２−シアノ−３，３−ジフェニルアクリレート、２−エチルヘキシル−２−シアノ−３，３−ジフェニルアセテートなど；サリチラート、たとえばフェニルサリチラート、５−ブチルフェニルサリチラートなど；およびニッケル有機化合物、たとえばニッケルビス（オクチルフェノール）スルフィドなどがある。充填安定剤のそれらのクラスの追加の例は、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに見出すことができる。充填安定剤は、マイクロカプセル組成物の重量の最大５パーセントを構成し、一般に約０．０１から２パーセントまでである。
【００５４】
本発明の別の実施形態は、各種の分野へ応用可能な、特に光への耐性において保存安定性を促進する感熱性材料と、中に紫外線吸収剤が封入されたマイクロカプセルとを含み得る。基材中に存在し得る所望の構成要素は、熱を吸収して、基礎となる材料を過熱から保護し得る材料を含む。熱エネルギーは、これらの材料の温度上昇を引き起こすことなく、そのような材料の相転移によって吸収される。適切な相転移は、パラフィン系炭化水素、すなわち式ＣnＨn+2によって表され、ｎが１３から２８に及んでもよい直鎖炭化水素を含む。相転移材料に適切である他の化合物は、ＰＡＢＡ塩、２，２−ジメチル−１，３−プロパンジオール（ＤＭＰ）、２−ヒドロキシメチル−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＨＭＰ）および同様の化合物である。メチルパルミテートなどの脂肪エステルも有用である。使用できる相転移材料は、パラフィン系炭化水素を含む。
【００５５】
無色もしくは淡色塩基性染料と有機または無機の色受容体との間の色形成反応を利用して、２つの発色物質を相互に熱的に接触させることによって記録画像を得る、感熱性記録材料が周知である。そのような感熱性記録材料は比較的安価であり、小型で保守が容易である記録デバイスとの使用に適しており、したがって、ファクシミリシステム、各種のコンピュータなどのための記録媒体として幅広い用途を見出している。感熱性記録材料の耐光性を改善するために、微粉化された紫外線吸収剤またはブロッカを感熱性記録層または保護層に添加できる。
【００５６】
本発明のさらなる実施形態は、紫外線吸収剤を保持し、常圧での破裂耐性を示し、および／または適切な紫外線吸収効率を保有するマイクロカプセルを提供する。
【００５７】
本発明の実施形態は、基材と、基材の上に形成され、無色もしくは淡色塩基性染料および色受容体を含有する記録層と、記録層の上に形成された保護層とを含む感熱性記録材料を含むことができ、該記録材料は、その中に紫外線吸収剤が封入され、色形成能力を実質的に有さないマイクロカプセルが保護層に含有されていることを特徴とする。
【００５８】
さらに本発明は、紫外線吸収剤と、必要に応じてその中に封入された有機溶媒とを有するマイクロカプセルを提供し、それは合成樹脂のカプセル壁フィルムおよび約０．１から３μｍの平均粒径を有する。
【００５９】
以下は、本発明で使用できる紫外線吸収剤の例である。フェニルサリチラート、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルサリチラート、ｐ−オクチルフェニルサリチラートおよび同様のサリチル酸タイプの紫外線吸収剤；２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−オクチルオキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−ドデシルオキシベンゾフェノン、２，２’−ジヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２，２’−ジヒドロキシ−４，４’−ジメトキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシ−５−スルホベンゾフェノンおよび同様のベンゾフェノンタイプの紫外線吸収剤；２−エチルヘキシル２−シアノ−３，３−ｄｉｐｈｅｎｙｔ−アクリレート、エチル２−シアノ−３，３−ジフェニルアクリレートおよび同様のシアノアクリレートタイプ紫外線吸収剤；ビス（２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジル）セバケート、ビス（２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジル）スクシナート、ビス（１，２，２，６，６−ペンタメチル−４−ピペリジル）２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシベンジル）−２−ｎ−ブチルマロナートおよび同様のヒンダードアミンタイプ紫外線吸収剤；２−（２’−ヒドロキシフェニル）ベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−５’−メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−５−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）ベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’，５’−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）ベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’−ｔｅｒｔ−ブチル−５’−メチルフェニル）−５−クロロベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’，５’−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−５−クロロベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’，５’−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−５−ｔｅｒｔ−ブチルベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’，５’−ジ−ｔｅｒｔ−アミルフェニル）ベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’，５’−ジ−ｔｅｒｔ−アミルフェニル）−５−ｔｅｒｔ−アミルベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’，５’−ジ−ｔｅｒｔ−アミルフェニル）−５−メトキシベンゾトリアゾール、２−［２’−ヒドロキシ−３’−（３”，４”，５”，６”−テトラヒドロフタリミド−メチル）−５’−メチルフェニル］ベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−５’−ｔｅｒｔ−オクチルフェニル）ベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’−ｓｅｃ−ブチル−５’−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）ベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’−ｔｅｒｔ−アミル−５’−フェノキシフェニル）−５−メチルベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−５’−ｎ−ドデシルフェニル）ベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−５’−ｓｅｃ−オクチルオキシフェニル）−５−フェニルベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’−ｔｅｒｔ−アミル−５’−フェニルフェニル）−５−メトキシベンゾトリアゾール、２−［２’−ヒドロキシ−３’，５’−ビス（α，α−ジメチルベンジル）フェニル］ベンゾトリア��ールおよび通常の温度で固体である同様のベンゾトリアゾールタイプ紫外線吸収剤；２−（２’−ヒドロキシ−３’−ドデシル−５’−メチルフェニル）−ベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’−ウンデシル−５’−メチルフェニル）−ベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’−トリデシル−５’−メチルフェニル）−ベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’−テトラデシル−５’−メチルフェニル）−ベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’−ペンタデシル−５’−メチルフェニル）−ベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’−ヘキサデシル−５’−メチルフェニル）−ベンゾトリアゾール、２−［２’−ヒドロキシ−４’−（２”−エチルヘキシル）オキシフェニル］−ベンゾトリアゾール、２−［２’−ヒドロキシ−４’−（２”−エチルヘプチル）オキシフェニル］−ベンゾトリアゾール、２−［２’−ヒドロキシ−４’−（２”−エチルオクチル）オキシフェニル］−ベンゾトリアゾール、２−［２’−ヒドロキシ−４’−（２”−プロピルオクチル）オキシフェニル］−ベンゾトリアゾール、２−［２’−ヒドロキシ−４’−（２”−プロピルヘプチル）オキシフェニル］−ベンゾトリアゾール、２−［２’−ヒドロキシ−４’−（２”−プロピルヘキシル）オキシフェニル］−ベンゾトリアゾール、２−［２’−ヒドロキシ−４’−（１”−エチルヘキシル）オキシフェニル］−ベンゾトリアゾール、２−［２’−ヒドロキシ−４’−（１”−エチルヘプチル）オキシフェニル］−ベンゾトリアゾール、２−［２’−ヒドロキシ−４’−（１”−エチルオクチル）オキシフェニル］−ベンゾトリアゾール、２−［２’−ヒドロキシ−４’−（１”−プロピルオクチル）オキシフェニル］−ベンゾトリアゾール、２−［２’−ヒドロキシ−４’−（１”−プロピルヘプチル）オキシフェニル］−ベンゾトリアゾール、２−［２’−ヒドロキシ４’−（１”−プロピルヘキシル）オキシフェニル］−ベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’−ｓｅｃ−ブチル−５’−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル−５−ｎ−ブチルベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’−ｓｅｃ−ブチル−５’−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−５−ｔｅｒｔ−ペンチル−ベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’−ｓｅｃ−ブチル−５’−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−５−ｎ−ペンチル−ベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’−ｓｅｃ−ブチル−５’−ｔｅｒｔ−ペンチルフェニル）−５−ｔｅｒｔ−ブチルベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’−ｓｅｃ−ブチル−５’−ｔｅｒｔ−ペンチルフェニル）−５−ｎ−ブチルベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’，５’−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−５−ｓｅｃ−ブチルベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’，５’−ジ−ｔｅｒｔ−ペンチルフェニル）−５−ｓｅｃ−ブチルベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’−ｔｅｒｔ−ブチル−５’−ｔｅｒｔ−ペンチルフェニル）−５−ｓｅｃ−ブチルベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’，５’−ジ−ｓｅｃ−ブチルフェニル）−５−クロロベンゾトリアゾ��ル、２−（２’−ヒドロキシ−３’，５’−ジ−ｓｅｃ−ブチルフェニル）−５−メトキシベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’，５’−ジ−ｓｅｃ−ブチルフェニル）−５−ｔｅｒｔ−ブチルベンゾトリアゾール、２−（２’−ヒドロキシ−３’，５’−ジ−ｓｅｃ−ブチルフェニル）−５−ｎ−ブチルベンゾトリアゾール、オクチル５−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（５−クロロ−２Ｈ−ベンゾトリアゾール−２−イル）−４−ヒドロキシベンゼン−プロピオナート、メチル３−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（２Ｈ−ベンゾトリアゾール−２−イル）−４−ヒドロキシフェニル］プロピオナートおよびポリエチレングリコール（分子量：約３００）の縮合物および通常の温度で液体である同様のベンゾトリアゾールタイプ紫外線吸収剤。もちろん紫外線吸収剤は上記に限定されず、それらの少なくとも２つの混合物にて必要に応じて使用できる。
【００６０】
使用される紫外線吸収剤の量は特に限定されないが、量は１０から５００重量部まで、一般に２０から２５０重量部までに調整され得る。
【００６１】
本発明での使用のためのマイクロカプセルは、各種の公知の方法によって調製できる。それらは一般に、紫外線吸収剤と必要ならば有機溶媒を含むコア材料（油性液体）を水性溶媒に乳化および分散させることと、高分子量物質の壁膜を生じた油性液滴の周囲に形成することとによって調製される。
【００６２】
マイクロカプセルの壁膜を形成するために有用な高分子量物質の例は、ポリウレタン樹脂、ポリ尿素樹脂、ポリアミド樹脂、ポリエステル樹脂、ポリカーボネート樹脂、アミノアルデヒド樹脂、メラミン樹脂、ポリスチレン樹脂、スチレン−アクリレートコポリマー樹脂、スチレン−メタクリレートコポリマー樹脂、ゼラチン、ポリビニルアルコールなどである。とりわけ合成樹脂、特に他の樹脂の中でもポリ尿素樹脂、ポリウレタン樹脂およびアミノアルデヒド樹脂の壁膜を有するマイクロカプセルは、紫外線吸収剤の優れた保持性および高い耐熱性を有し、したがってサーマルヘッドへの粘着を防止するための保護層に包含される顔料の機能を果たすための顕著な追加の効果を示す。その上、ポリ尿素樹脂またはポリウレタン樹脂の壁膜を有するマイクロカプセルは、他の材料および通常の顔料の壁膜を有するマイクロカプセルよりも屈折率が低く、形状が球状であり、したがって保護層中に大量に存在する場合でも光の不規則な反射による記録画像の密度の低下（いわゆるホワイトニング）を起しにくいので、好都合に使用できる。さらにポリ尿素樹脂およびポリウレタン樹脂はアミノアルデヒド樹脂よりも弾力性があり、したがってポリ尿素樹脂およびポリウレタン樹脂は一般に、高圧力条件下で使用されるマイクロカプセルの壁膜として使用される。これに対して、アミノアルデヒド樹脂から作製された壁膜を有するマイクロカプセルは、コア材料の乳化後に壁形成材料を添加することによってマイクロカプセルを調製できるので、エマルジョンの粒径に依存せずに壁膜の厚さを制御できるというメリットを有する。
【００６３】
本発明は、紫外線吸収剤と共に有機溶媒も含み得る。有機溶媒は特に限定されず、感圧複写用紙の分野で使用される各種の疎水性溶媒が使用され得る。有機溶媒の例は、トリクレジルホスフェート、オクチルジフェニルホスフェートおよび同様のホスフェート、ジブチルフタレート、ジオクチルフタレートおよび同様のフタレート、ブチルオレアートおよび同様のカルボキシラート、各種の脂肪酸アミド、ジエチレングリコールジベンゾアート、モノイソプロピルナフタレン、ジイソプロピルナフタレンおよび同様のアルキル化ナフタレン、１−メチル−１−フェニル−１−トリルメタン、１−メチル−１−フェニル−１−キシリルメタン、１−フェニル−１−トリルメタンおよび同様のアルキル化ベンゼン、イソプロピルビフェニルおよび同様のアルキル化ビフェニル、トリメチロールプロパントリアクリレートおよび同様のアクリレート、ポリオールおよび不飽和カルボン酸のエステル、塩素化パラフィンおよびケロシンである。これらの溶媒は個別に、またはそれらの少なくとも２つの混合物で使用できる。高い沸点を有するこれらの疎水性媒体のうち、トリクレジルホスフェートおよび１−フェニル−１−トリルメタンは、本発明で使用される紫外線吸収剤と関連して高い溶解度を示すために望ましい。一般に、コア材料の粘度が低くなればなるほど、乳化から生じる粒径がより小さくなり、粒径分布がより狭くなるので、低い沸点を有する溶媒はコア材料の粘度を低くするために同時に使用できる。低い沸点を有するそのような溶媒の例は、エチルアセテート、ブチルアセテート、メチレンクロライドなどである。
【００６４】
使用される有機溶媒の量は、使用される紫外線吸収剤の種類および量ならびに有機溶媒の種類に従って適切に調節されるべきであり、特に限定されない。たとえば通常の温度で液体である紫外線吸収剤を使用する場合、有機溶媒は必ずしも使用されない。しかしながら通常の温度で固体である紫外線吸収剤を使用する場合、紫外線吸収剤がマイクロカプセルに完全に溶解した状態であることが望ましいため、有機溶媒の量は、たとえばポリ尿素樹脂またはポリウレタン樹脂のマイクロカプセルの場合、有機溶媒、紫外線吸収剤および壁形成材料の組合せ量に基づいて一般に、通常約１０から６０重量％まで、または約２０から６０重量％までに調整される。さらにアミノアルデヒド樹脂のマイクロカプセルの場合、有機溶媒の量は、紫外線吸収剤の通常約５０から２０００重量％まで、一般に約１００から１０００重量％までに調整される。
【００６５】
加えて、吸収剤を利用することができる。マイクロカプセルが暴露されるはずであるスペクトル感度範囲（その活性範囲）の部分でマイクロカプセルの感度を過度に低下させることなく、他の波長でのマイクロカプセルの暴露を妨害するそのスペクトル感度範囲（その不活性範囲）の部分においてマイクロカプセルの感度を低下させる吸収剤を選択すべきである。ある例において、最適な暴露特徴を達成するために活性範囲および不活性範囲における吸収剤の吸収特徴を平衡させることが必要であり得る。一般にマイクロカプセルの不活性範囲で約１００／Ｍｃｍを超え、活性範囲で約１００，０００／Ｍｃｍ未満の吸光係数を有する吸収剤が使用される。吸収剤が感光性組成物に直接包含されるとき、理想的にはそれがフリーラジカル重合を阻害すべきでなく、そして暴露時にフリーラジカルを発生すべきではない。
【００６６】
本発明で使用される吸収剤は、写真分野で公知のそれらの吸収剤の中から選択できる。そのような化合物の例として、カラー写真において銀塩増感色素として従来使用された染料（たとえばシアニン、メロシアニン、ヘミシアニンおよびスチリル染料）および紫外線吸収剤が挙げられる。マイクロカプセルの所望の感度範囲外を吸収し、範囲内を激しく吸収しない多数の有色色素も、本発明で吸収剤として使用することができる。それらの中でＳｕｄａｎ  Ｉ、Ｓｕｄａｎ  ＩＩ、Ｓｕｄａｎ  ＩＩＩ、Ｓｕｄａｎ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｇ、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ、Ｏｉｌ  Ｂｌｕｅ  Ｎ、およびＦａｓｔ  Ｇａｒｎｅｔ  ＧＢＣは、潜在的に有用な化合物の例である。
【００６７】
加えて、望ましい紫外線吸収剤は、ヒドロキシベンゾフェノン、ヒドロキシフェニルベンゾ−トリアゾールおよびホルムアミジンから選択されるものを含む。吸収剤は所望のスペクトル感度特徴を達成するために、単独でまたは組合せて使用され得る。
【００６８】
有用なヒドロキシベンゾフェノンの代表的な例は、２−ヒドロキシ−４−ｎ−オクチルベンゾフェノン（Ｆｅｒｒｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＤｉｖｉｓｉｏｎからのＵＶ−ＣＨＥＫ  ＡＭ−３００、Ａｒｇｕｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｗｉｔｃｏ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏｒｐ．からのＭａｒｋ  １４１３およびＡｍｅｒｉｃａｎ  ＣｙａｎａｍｉｄからのＣｙａｓｏｒｂ  ＵＶ−５３１  Ｌｉｇｈｔ  Ａｂｓｏｒｂｅｒ）、４−ドデシル−２−ヒドロキシベンゾフェノン（Ｅａｓｔｍａｎ  ＫｏｄａｋからのＥａｓｔｍａｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＤＯＢＰ）、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ＣｙａｎａｍｉｄからのＣｙａｓｏｒｂ  ＵＶ−９  Ｌｉｇｈｔ  Ａｂｓｏｒｂｅｒ）および２，２’−ジヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ＣｙａｎａｍｉｄからのＣｙａｓｏｒｂ  ＵＶ−２４  Ｌｉｇｈｔ  Ａｂｓｏｒｂｅｒ）である。有用なヒドロキシベンゾフェニルベンゾトリアゾールの代表的な例は、２−（２’−ヒドロキシ−５’−メチルフェニル）ベンゾトリアゾール（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  Ｄｅｐｔ．からのＴｉｎｕｖｉｎ  Ｐ）、２−（３’，５’−ジｔｅｒｔ−ブチル−２’ヒドロキシフェニル）−５−クロロベンゾトリアゾール（Ｃｉｂａ−ＧｅｉｇｙからのＴｉｎｕｖｉｎ  ３２７）、および２−（２−ヒドロキシ−５−ｔ−オクチルフェニル）ベンゾトリアゾール（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ＣｙａｎａｍｉｄからのＣｙａｓｏｒｂ  ＵＶ−５４１１  Ｌｉｇｈｔ  Ａｂｓｏｒｂｅｒ）である。有用なホルムアミジンの代表的な例は、米国特許第４，０２１，４７１号に記載されており、Ｎ−（ｐ−エトキシ−カルボニルフェニル）−Ｎ’−エチル−Ｎ’−フェニルホルムアミジン（Ｇｉｖａｕｄａｎ  Ｃｏｒｐ．からのＧｉｖｓｏｒｂ  ＵＶ−２）を含む。特定の用途のための最適な吸収剤および吸収剤の濃度は、吸収剤候補の吸収極大および吸光係数ならびに関連する光開始剤のスペクトル感度特徴の両者に依存する。
【００６９】
加えて、マイクロカプセル、感光性組成物、画像形成剤、現像剤、および現像技法は、米国特許第４，３９９，２０９号および米国特許第４，４４０，８４６号に記載されている。
【００７０】
特に、水分散性濃縮物または水和粉末などのスプレー形で利用される調合物は、湿潤剤および分散剤などの界面活性剤、たとえばホルムアルデヒドとナフタレンスルホナート、アルキルアリールスルホナート、リグニンスルホナート、脂肪アルキルサルフェート、ならびにエトキシ化アルキルフェノールおよびエトキシ化脂肪アルコールとの縮合生成物を含有し得る。
【００７１】
２．リポソーム調合物
本明細書で使用するように、「リポソーム」という用語は、少なくとも１つの水性コンパートメントを包囲する脂質二分子層を含む構造を指す。壁は、二分子層を形成すると共に、その表面積を最小化する傾向を有する脂質分子から調製される。リポソームを含む脂質分子は、親水性部分および親油性部分を有する。水への暴露時に脂質分子は二分子層膜を形成し、そこで各層の分子の脂質端が膜の中心を向き、対向する極性端が二分子層膜の内面および外面をそれぞれ形成する。したがって膜の各側面が親水性表面に相当するのに対して、膜の内側は親油性媒体を含む。
【００７２】
リポソームは、その全体のサイズおよびラメラ構造の性質に基づいて複数の種類に分類できる。分類として、小型単層ベシクル（ＳＵＶ）、多層ベシクル（ＭＬＶ）、大型単層ベシクル（ＬＵＶ）およびオリゴ層ベシクルが挙げられる。ＳＵＶは、直径が約２０から５０ナノメートルまでの範囲であり、水性コンパートメントを包囲する１つの脂質二分子層を含み得る。ＳＵＶの特徴は、全脂質のうち大量、約７０％が二分子層の外層に位置することである。ＳＵＶがかなり均一なサイズの単一コンパートメントベシクルである場合、ＭＬＶは直径が最大約３０，０００ナノメートルまで大幅に変化し、その構造が多コンパートメント式であり、そこでリポソーム二分子層は通例、閉じた同心薄膜として組織され、水層は各薄膜を次の薄膜から分離している。大型単層ベシクルは、約６００ナノメートルから３０ミクロンまでの範囲に及ぶ、その大きな直径のためにそのように命名される。オリゴ層ベシクルは、ＭＬＶより大きい水性スペースおよびＬＵＶよりも小さい水性スペースを有する中間のリポソームである。オリゴ層ベシクルは、１個より多い内部コンパートメントおよびおそらく数個の同心薄膜を有するが、一般にＭＬＶよりも少ない薄膜を有する。
【００７３】
リポソームを調製する各種の方法が当分野で公知であり、そのいくつかはＬｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．，ｅｄｉｔｏｒ，ｔｈｒｅｅ  ｖｏｌｕｍｅｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  １９８４）に記載されているか、またはＬｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇおよびＢａｒｅｎｈｏｌｚによってＭｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ３３，３３７−４６２（１９８８）に記載されている。リポソーム調合物を調製するさらなる方法は、米国特許第７，０２２，３３６号；米国特許第６，９８９，１５３号；米国特許第６，７２６，９２４号；米国特許第６，３５５，２６７号；米国特許第６，１１０，４９１号；米国特許第６，００７，８３８号；米国特許第５，０９４，７８５号および米国特許第４，５１５，７３６号に見出すことができる。リポソームはまた、生物活性物質をカプセル化するために有用であると十分に認識されている。リポソームによるＤＮＡのカプセル化を特に含む調製方法、およびリポソーム仲介形質移入への直接利用を有する方法は、Ｈｕｇ  ａｎｄ  ＳｌｅｉｇｈｔによってＢｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１０９７，１−１７（１９９１）に記載されている。
【００７４】
本発明のリポソームはリン脂質から調製できるが、疎水性部分および親水性部分の両方を有する同様の分子形状および寸法の他の分子も使用できる。本発明の目的では、そのようなすべての適切なリポソーム形成分子は、本明細書では脂質と呼ばれる。１つ以上の自然発生の脂質化合物および／または合成脂質化合物が、リポソームの調製で使用され得る。
【００７５】
本発明で有用な初期リポソームを形成するための代表的な適切なリン脂質または脂質化合物としては、これに限定されるわけではないが、リン脂質関連物質、たとえばホスホファスチジルコリン（レシチン）、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノール−アミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ホスファチジルコリン、およびジパルミトイル−ホスファチジルグリセロールが挙げられる。さらなるリン非含有脂質としては、これに限定されるわけではないが、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミテート、グリセロールリシンオレアート、ヘキサデシルステアレート、イソプロピルミリステート、両性アクリルポリマー、脂肪酸、脂肪酸アミド、コレステロール、コレステロールエステル、ジアシルグリセロール、ジアシルグリセロールスクシナートなどが挙げられる。
【００７６】
当業者によって理解されるように、異なる特性、カチオン性、アニオン性または中性を備えた異なる脂質を使用できるが、調製方法は、どの脂質の組合せを使用するかにかかわらず同じままであり得る。さらに詳細には、リポソームでの使用のために脂質を選択したら、それらは完全な混合を確実にするために有機溶媒に溶解させることができる。有機溶媒は蒸発によって、それに続く乾燥によって除去することができ、均質な脂質混合物の脂質膜が残る。脂質混合物はケーキ状に凍結させて、乾燥させることができる。脂質ケーキは水和するまで凍結して保管できる。
【００７７】
水性媒体の添加および容器の撹拌は、脂質ケーキを水和させる。得られた生成物は大型の多層ベシクルである。この構造物は、水によって隔離された脂質二分子層の同心円を含み得る。この大型の多層ベシクルは、押出プロセスにおける機械エネルギーの形で、または超音波処理での音響エネルギーのどちらかによるエネルギーの印加によって小型化できる。水和された脂質は、先細孔を有するポリカーボネートフィルタを強制的に通過させて、孔と同様のサイズの直径を有する粒子を生成することができる。最終孔径を使用する前に、脂質懸濁物に数回の凍結−解凍サイクルを受けさせて、最終粒径のサイズが均一となるようにする。最終粒径は、使用した脂質の組合せに一部依存する。平均粒径は、バッチ間で再現可能である。このプロセスは、超音波処理器からの音響エネルギーの印加によって小型の単層ベシクルへ縮小できる大型の単層ベシクルを生成できる。超音波処理されている試験管内の粒子は、遠心分離によって取り出すことができる。得られたベシクルの平均サイズは、脂質混合物の組成、濃度、体積および温度ならびに超音波処理器の持続期間、出力および調整によって影響され得る。Ｉ
【００７８】
具体的なリポソーム調製方法としては、これに限定されるわけではないが、ハンドシェイク法、超音波処理法、逆相蒸発法、フリーズドライ再水和法、およびデタージェントデプリーション法が挙げられる。ハンドシェイク法に従って、リポソームを生成するために、脂質分子を水性環境中に導入する。乾燥脂質膜を水和させるときに、薄膜が膨潤して、ミエリン形へ成長する。機械的撹拌、たとえばボルテックス処理、振とう、回旋またはピペット操作は、ミエリン形（薄い脂質細管）を破裂させ、暴露された疎水性エッジを再密封させて、リポソームの形成を引き起こす。
【００７９】
超音波処理法は、小型単層ベシクルを調製するために使用できる。２つの例示的な超音波処理技法として、プローブ超音波処理およびバス超音波処理が挙げられる。プローブ超音波処理の間、超音波処理器の先端はリポソーム分散物中に直接浸漬される。先端でのエネルギー散逸は、局所的過熱を引き起こすことがあり、したがって容器は氷／水浴中に浸漬できる。溶液超音波処理（ｂａｔｈ  ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）の間、管内のリポソーム分散物はバス超音波処理器内に配置される。超音波処理される物質はプローブユニットとは異なり、滅菌容器内に、または不活性雰囲気中で保持することができる。
【００８０】
逆相蒸発法は、逆ミセルの生成に基づいている。さらに詳細には逆ミセルは、リポソーム中にカプセル化される水溶性分子を含む緩衝化された水相と、両性分子が溶解されている有機相との混合物の超音波処理時に生成される。有機溶媒の低速での除去は、これらの逆ミセルのゲル様および粘性状態への変換を引き起こす。この手順でのある時点の間に、ゲル状態が崩壊して、逆ミセルの一部が分解する。この環境での過剰なリン脂質は、残存するミセルの周囲での完全な二分子層の形成に寄与し、このことはリポソームの形成を引き起こす。逆相蒸発法によって作製されたリポソームは、各種の脂質調合物から作製可能であり、多層リポソームまたはハンドシェイクリポソームよりも４倍大きい水性体積（ａｑｕｅｏｕｓ  ｖｏｌｕｍｅ）対脂質比を有する傾向を有する。
【００８１】
フリーズドライ再水和法の間、フリーズドライリポソームは、予備形成されたリポソームから形成される。脱水の間、脂質二分子層とリポソーム内にカプセル化される物質とは密接に接触させられる。再膨潤時に付着した分子のカプセル化の可能性は向上する。水相は一般に乾燥物質に少量に分けて添加される。原則として、再水和に使用される全体積はリポソーム分散物の開始体積よりも少ない。
【００８２】
デタージェントデプリーション法は、各種のリポソームおよびタンパクリポソーム調合物の調製に使用できる。デタージェントは、均質なリポソームの形成につながる各種の技法によって混合されたデタージェント−脂質ミセルから減少させることができる。実際にその相転位温度以下の脂質は、この作製方法によって使用できる。しかしながらすべてのデタージェントがこの方法に適しているわけではない。例示的なデタージェントとしては、これに限定されるわけではないが、ナトリウムコレート、アルキル（チオ）グルコシド、およびアルキルオキシポリエチレンが挙げられる。混合ミセルは、濃縮されたデタージェント溶液を多層リポソームに添加することによって調製できる（デタージェントの最終濃度は、デタージェントの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）よりも十分に高くするべきである）。各種のデタージェントの使用は、形成されたベシクルの各種のサイズ分布を引き起こし得る。より大きい消耗速度は、より小さいサイズのリポソームを生成できる。各種のデタージェントの使用も、大型の単層ベシクル／オリゴ層ベシクル／多層ベシクルの各種の比を生じ得る。
【００８３】
３．ミセルおよびバイセル
本明細書で使用するように、「ミセル」は液体コロイド中に分散された界面活性剤分子の凝集体を指す。ミセルは形状が球体であり得るが、これに限定されるわけではないが楕円体、円筒体、二分子層、およびベシクルを含む他の形状で存在し得る。ミセルの形状は、その界面活性剤分子の分子形態によって大きく制御され得る；しかしながら形状は条件（たとえば温度またはｐＨ、ならびにいずれかの添加塩の種類および濃度）にも依存する。ミセルにおいて、複数の界面活性剤分子の疎水性尾部が、水とより少ない接触を有する油様コアへと集合する。対照的に、界面活性剤モノマーは、水素結合によって連結された分子の「かご」を作成する水分子によって包囲される。非極性溶媒中では、親水性基がミセルのコアを形成して、疎水性基はミセルの表面に残存する（いわゆる逆ミセル）。
【００８４】
ミセルは、界面活性剤の濃度が臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）より大きいときに形成され、系の温度は臨界ミセル温度、すなわちＫｒａｆｆｔ温度よりも高い。水中では、集合する界面活性剤分子が共にそのエントロピーを低下させるという事実にもかかわらず、疎水性効果はミセル形成の駆動力である。一般にＣＭＣより上では、界面活性剤分子を集合させるエントロピー的な不利益は、水分子をかごに入れるエントロピー的な不利益よりも小さい。
【００８５】
本明細書で使用するように、「バイセル」という用語は、二分子層状混合ミセルを指す。バイセルは、リン脂質を形成する長鎖二分子層およびデタージェントの脂質を形成する短鎖ミセルの混合物として特徴付けられる。
【００８６】
ミセルおよびバイセルの調製は当分野で周知である。これらの構造の調製に関するさらなる詳細事項は、米国特許第６，８９７，２９７号；米国特許第６，６９６，０８１号；米国特許第６，５８６，５５９号；米国特許第６，４４４，７９３号；および米国特許第５，５３４，２５９号に見出され得る。
【００８７】
４．ペグ化
本明細書で述べるようにポリアルキレン部分を付着させることを利用して、水溶性または水溶液への溶解性を向上させる、および／または本明細書で議論する未変性化合物の半減期を延長させることができる。ペグ化剤が所望の活性を保持するという条件で、いずれの従来のペグ化方法も利用できる。Ｓｃｈａｃｈｔ，Ｅ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ  ２９７−３１５（１９９７）も参照。
【００８８】
ポリアルキレングリコールは生体適合性ポリマーであり、本明細書で使用するように、ポリアルキレングリコールは直鎖もしくは分岐ポリアルキレングリコールポリマー、たとえばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリブチレングリコールを指し、さらにポリアルキレングリコールのモノアルキルエーテルを含む。本発明のある実施形態において、ポリアルキレングリコールポリマーは低級アルキルポリアルキレングリコール部分、たとえばポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール部分、またはポリブチレングリコール部分である。ＰＥＧは、式−Ｈ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨを有し、式中、ｎは約１から約４０００以上までの範囲に及び得る。ある実施形態において、ｎは１から１００までであり、他の実施形態において、ｎは５から３０までである。ＰＥＧは平均分子量約１から約２２，０００までの範囲に及び得る。たとえば約３００の平均分子量はｎが５に相当し、約２，３００の平均分子量はｎが５０に相当し、約１３，３００の平均分子量はｎが３００に相当し、約２２，０００の平均分子量はｎが５００に相当し得る。ある実施形態において、ＰＥＧ部分は直鎖もしくは分岐であり得る。さらなる実施形態において、ＰＥＧはヒドロキシル、アルキル、アリール、アシルまたはエステルなどの基に結合できる。ある実施形態において、ＰＥＧはアルコキシＰＥＧ、たとえばメトキシＰＥＧ（すなわちｍＰＥＧ）であってもよく、一方の末端は比較的不活性なアルコキシ基であるのに対して、他方の末端はヒドロキシル基である。ＰＥＧは合成できるか、または直ちに入手できる市販の製品である。
【００８９】
本発明のある実施形態により、本発明のペグ化化合物は水溶性、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、エタノール（ＥＴＯＨ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびメタノール（ＭＴＯＨ）に溶解性であり、ペグ化されていない対応物よりもＵＶ光への感受性が低く、および／または合成するのに経済的であり得る。
【００９０】
本発明の化合物は、少なくとも４個の部位でペグ化でき、および／または多くの異なるＰＥＧ長および分子量でペグ化できる。ある実施形態において、ＰＥＧ部分はＰＥＧ200からＰＥＧ5000までである。本発明のペグ化化合物は、改善された溶解性、改善された安定性、より低い毒性、低下した分解および化学物質感受性および／または同様の分子および他の分子、たとえば公知の薬物、生物タグ、標識、蛍光剤、放射性同位体などに対する向上した結合ポテンシャルをさらに示し得る。
【００９１】
本発明の実施形態は、サンプルが標識試薬と結合されるアッセイも含む。「標識試薬」としては、これに限定されるわけではないが、蛍光タンパク質類似体およびバイオセンサを含む発光標識された巨大分子、緑色蛍光タンパク質およびその変異体によって形成されたものを含む発光巨大分子キメラ、生理学的反応に関与する細胞抗原と反応する発光標識された一次抗原もしくは二次抗原、発光染色剤、染料、および他の小分子が挙げられる。
【００９２】
「バイオセンサ」は、内部的にまたはその表面のどちらかで発生する環境の変化を報告する、生物機能ドメインおよび発光プローブからなる巨大分子を指す。これらの変化を検知および報告するように設計された発光標識された巨大分子のクラスは、「蛍光タンパク質バイオセンサ」と呼ばれている。バイオセンサのタンパク質成分は、放出された分子認識部分を提供する。活性部位に近接したタンパク質部分に結合する蛍光分子は環境変化を蛍光信号に変換し、蛍光信号は適切な時間および空間分解能を備えたシステムを使用して検出できる。生細胞内の未変性タンパク質活性の調節は可逆的であり、蛍光−タンパク質バイオセンサはタンパク質活性の可逆的変化を検知するように設計できるので、これらのバイオセンサは本質的に再使用できる。
【００９３】
「ハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＨＣＳ）」は、複雑な分子事象、たとえばシグナル伝達経路はもちろんのこと、これに限定されるわけではないがアポトーシス、細胞分裂、細胞接着、移動、エキソサイトーシス、細胞成長および代謝、タンパク質合成、酵素機構、細胞間連絡および健常および／または罹患細胞の検出を含む細胞機能に対する薬物の効果を測定するために使用できる。マルチカラー蛍光は、多数の標的および細胞プロセスが１回のスクリーニングでアッセイできるようにする。細胞反応の相互相関は、標的検証に必要な情報を豊富に与え、最適化を導く。
【００９４】
染料および蛍光試薬によって処理した細胞のスクリーニング方法は、当分野で周知である。蛍光タンパク質、たとえば修飾された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をレポーター分子として産生するための細胞の遺伝子組換えに関連して、かなり多数の文献がある。野生種ＧＦＰのある特性は、Ｍｏｒｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３（１９７４），ｐ．２６５６−２６６２）、およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．３１（１９８０），ｐ．６１１−６１５）によって開示されている。クラゲのオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  Ｖｉｃｔｏｒｉａ）のＧＦＰは、３９５ｎｍに励起極大、５１０ｎｍに発光極大を有し、蛍光活性のための外来性因子を必要としない。文献に開示されたＧＦＰの使用は広範囲にわたり、遺伝子発現およびタンパク質局在化の研究（Ｃｈａｌｆｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３（１９９４），ｐ．１２５０１−１２５０４））を、細胞内オルガネラの可視化（Ｒｉｚｚｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５（１９９５），ｐ．６３５−６４２））、二次経路に沿ったタンパク質運搬の可視化（Ｋａｅｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｇｅｒｄｅｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３６９（１９９５），ｐ．２６７−２７１））、植物細胞（Ｈｕ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎｇ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３６９（１９９５），ｐ．３３１−３３４））ならびにショウジョウバエ胚（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７０（１９９５），ｐ．７２６−７２９））での発現のためのツールとして、そして関心ある別のタンパク質へ融合されたレポーター分子として含む。同様にＷＯ９６／２３８９８は、タンパク質キナーゼ活性化部位を有するＧＦＰ構築物を利用することによって細胞内プロセスに影響する生物活性物質を検出する方法に関する。この特許、および本出願で参照した他のすべての特許は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００９５】
多数の参考文献が生物系におけるＧＦＰタンパク質に関連している。たとえばＷＯ  ９６／０９５９８は、ＧＦＰ様タンパク質の発現を利用して関心ある細胞を単離するシステムについて記載している。ＷＯ  ９６／２７６７５は、植物におけるＧＦＰの発現について記載している。ＷＯ  ９５／２１１９１は、突然変異誘発を検出するための形質転換生物において発現した修飾されたＧＦＰタンパク質について記載している。米国特許第５，４０１，６２９号および米国特許第５，４３６，１２８号は、細胞表面受容体を発現して、細胞表面受容体の活性に反応する転写制御要素を含むレポーター遺伝子構築物を含有する組換え細胞を使用して、細胞外シグナルの細胞内伝達を検出および評価するためのアッセイおよび組成物について記載している。ＧＦＰタンパク質の使用について議論した多数の学術誌がある。
【００９６】
何千もの化合物にスクリーニングを実施することは、多くの化合物およびアッセイ成分試薬の並行操作および処理を必要とする。標準的なハイスループットスクリーン（ＨＴＳ）は、化合物および生物試薬を、９６または３８４ウェルの標準マイクロタイタープレートのウェルの配列に取り込まれたあるインジケータ化合物と共に使用する。各ウェルから測定したシグナルである蛍光放射、光学密度、または放射能のいずれかは、ウェル内の物質すべてからのシグナルを積分して、ウェル内の分子すべての全集合平均を与える。
【００９７】
別のシステムである蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）は、細胞単層を撮影するときにバックグラウンドを低減させるために標準９６ウェルプレートのウェルの底の約２００ミクロン以内で蛍光を選択的に励起させる、低角度レーザ走査照明およびマスクを使用する。このシステムは、プレート底の全面積を撮影するために電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラを使用する。このシステムはウェル底の細胞単層から発するシグナルを測定するが、測定されたシグナルはウェルの面積で平均され、したがってなお細胞の集合の平均反応の測定値と見なされる。画像は、細胞ベースアッセイでウェルごとの総蛍光を計算するために解析される。流体送達デバイスも、反応を開始させ、次にマクロ撮像システムを使用して全細胞集合平均反応として観察するために、細胞ベーススクリーニングシステム、たとえばＦＬＩＰＲシステムに組み入れられている。
【００９８】
ハイスループットスクリーンとは対照的に、細胞構成要素およびプロセスの時間−空間力学に関するさらに詳細な情報への要求に対処するために、各種のハイコンテントスクリーン（ＨＣＳ）が開発されている。ハイコンテントスクリーンは、細胞内へ包含された特定の蛍光ベース試薬に由来するマルチカラー蛍光情報の抽出を自動化する（Ｇｉｕｌｉａｎｏ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ（１９９５），Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：４；Ｇｉｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２４：４０５）。細胞は、空間的動態はもちろんのこと、時間的動態も測定できる光学系を使用して解析される。（Ｆａｒｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５５：７８５；Ｇｉｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｉｎ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｂ．Ｈｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｋ．Ｊａｃｏｂｓｏｎ（ｅｄｓ．），ｐｐ．５４３−５５７．Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：７３６；Ｗａｇｇｏｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２７：４９４）。概念は、各細胞を、標識構成要素の活性に関する時間的および空間的情報を有する「ウェル」として処理することである。
【００９９】
細胞に利用される蛍光ベース試薬を通じて現在入手できる生物化学および分子情報の種類としては、イオン濃度、膜電位、特異的な転座、酵素活性、遺伝子発現はもちろんのこと、代謝産物、タンパク質、脂質、炭水化物、および核酸配列の存在、量およびパターンも挙げられる（ＤｅＢｉａｓｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．  ７：１２５９；Ｇｉｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２４：４０５；Ｈｅｉｍ  ａｎｄ  Ｔｓｉｅｎ，  （１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８）。
【０１００】
ハイコンテントスクリーンは、蛍光標識された抗体、生物リガンド、および／または核酸ハイブリダイゼーションプローブを使用して固定細胞、あるいはマルチカラー蛍光インジケータおよび「バイオセンサ」を使用して生細胞のどちらかに対して実施できる。固定または生細胞スクリーンの選択は、要求される特異的な細胞ベースアッセイに依存している。
【０１０１】
当業者によって理解されるように、上述した方法およびスクリーンのいずれも本発明の化合物によって利用できる。
【０１０２】
一般に固定化細胞アッセイ（ｆｉｘｅｄ  ｃｅｌｌ  ａｓｓａｙ）は、マイクロタイタープレート形式の最初の生細胞のアレイを各種の化合物および用量で処理することができ、次に細胞を固定して、特定の試薬によって標識し、定量することができるため、最も容易である。固定後には細胞の環境制御は不要である。空間情報は得られるが、１回の時点のみである。細胞に利用できる数千の抗体、リガンドおよび核酸ハイブリダイゼーションプローブの入手可能性は、これを多くの種類の細胞ベースのスクリーンにとって魅力的な手法としている。固定および標識ステップは自動化でき、アッセイの効率的な処理を可能にする。
【０１０３】
生細胞アッセイは、所望の試薬を含有する生細胞のアレイが空間と同様に時間に対してスクリーンできるため、さらに高度で強力である。細胞の環境制御（温度、湿度、および二酸化炭素）は、細胞の生理学的健康を時間に対して多数の蛍光測定にわたって維持すべきであるため、測定中に維持すべきである。細胞内での生化学および分子活性の変化を報告し得る蛍光生理学的インジケータおよび「バイオセンサ」の増加しつつあるリストがある（Ｇｉｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２４：４０５；Ｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｎｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｗ．Ｔ．Ｍａｓｏｎ，（ｅｄ．），ｐｐ．３４９−３５９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。
【０１０４】
蛍光ベース試薬の入手可能性および使用は、固定された細胞および生きた細胞のハイコンテントスクリーンの両方の開発を進めるのに役立った。マルチカラーハイコンテント情報を自動的に抽出するための計測手段の進歩は、ＨＣＳを自動化ツールに発展させることを可能にした。Ｔａｙｌｏｒらによる論文（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ８０（１９９２），ｐ．３２２−３３５）は、これらの方法およびその用途の多くを記載している。たとえばＰｒｏｆｆｉｔｔら（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ２４：２０４−２１３（１９９６））は、各種の組織培養プレート形式、特に９６ウェルマイクロタイタープレートにおいてインサイチューで相対細胞数を定量するための半自動蛍光デジタルイメージングシステムについて記載している。該システムは、電動ステージを備えた落射蛍光倒立顕微鏡、ビデオカメラ、画像増強管、およびＰＣ−Ｖｉｓｉｏｎデジタイザを備えたマイクロコンピュータからなる。Ｔｕｒｂｏ  Ｐａｓｃａｌソフトウェアは、ステージを制御して、ウェルごとに多数の画像を得るプレートを操作する。該ソフトウェアはウェル当たりの総蛍光を計算し、日々の校正を提供して、各種の組織培養プレート形式のために容易に設定する。デジタル画像の閾値化および生細胞に摂取されたときのみに蛍光を発生する試薬を使用して、過剰な蛍光試薬を除去せずにバックグラウンド蛍光を低減させる。
【０１０５】
走査型共焦点顕微鏡イメージング（Ｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４７：２１０−２１５；Ｇｏｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２１：３１１−３１９）および多光子顕微鏡イメージング（Ｄｅｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：７３；Ｇｒａｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，ｐｐ．１５４−１５５）も、顕微鏡サンプルの高分解能画像を取り込むための十分に確立された方法である。これらの光学系の主な利点は焦点深度が浅いことであり、これは制限された軸方向の範囲の特徴がバックグラウンドに対して分解されるようにできる。たとえば細胞表面の特徴から接着細胞の内部細胞質特徴を分解することが可能である。走査型多光子イメージングは要求された高い光子束を達成するために短期パルスレーザシステムを利用するので、蛍光寿命もこれらのシステムで測定でき（Ｌａｋｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０２：３１６−３３０；Ｇｅｒｒｉｔｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｊ．ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ７：１１−１５））、異なる検出モードのための追加の機能を提供する。小型で信頼性が高く、比較的安価なレーザシステム、たとえばレーザダイオード励起レーザは現在利用可能であり、多光子共焦点顕微鏡がかなり日常的な方式で利用できるようにしている。
【０１０６】
新たな創薬パラダイムの主な構成要素は、細胞内イオン、代謝産物、巨大分子、およびオルガネラの時間および空間分布、含有量、および活性を測定するために使用される蛍光および発光試薬の引き続き成長しつつあるファミリである。これらの試薬のクラスとしては、生細胞および固定細胞内の分子の分布および量を測定する標識試薬、時間および空間でのシグナル伝達事象を報告するための環境インジケータ、および生細胞内での標的分子活性を測定するための蛍光タンパク質バイオセンサが挙げられる。１個の細胞内で複数の試薬を組合せるマルチパラメータ手法は、創薬のための強力なツールであり得る。
【０１０７】
本発明の方法は、蛍光または発光スチルバジウム分子および類似体の特定の細胞成分に対する高い親和性を含む。特異性構成要素に対する親和性は、イオン性相互作用、共有結合（タンパク質ベース発色団、フルオロフォア、および発光団とのキメラ融合を含む）などの力によってはもちろんのこと、疎水性相互作用、電位、そしてある場合には細胞構成要素内への単純な捕捉によっても支配される。当業者は、これに限定されるわけではないが、蛍光標識された生体分子、たとえばタンパク質、リン脂質、細胞オルガネラおよびＤＮＡハイブリダイズプローブを含む、本発明の化合物に加えて多重化に使用できる多岐にわたる蛍光レポーター分子を認識する。
【０１０８】
発光プローブは生細胞内で合成できるか、または拡散、促進または能動輸送、シグナル配列仲介輸送、およびエンドサイトーシスまたはピノサイトーシス摂取を含む複数の非機械的モードによって、細胞内に輸送できる。当分野で周知の機械的バルクローディング方法も、蛍光プローブを生細胞内に取り込むために使用できる（Ｂａｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０７：１７−２０；Ｂｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ２４：２２６−２３３；ＭｃＮｅｉｌ（１９８９）ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９，Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ（ｅｄｓ．），ｐｐ．１５３−１７３）。これらの方法は、エレクトロポレーションおよび他の機械的方法、たとえばスクレープローディング、ビーズローディング、インパクトローディング、注射器ローディング、高張および低張ローディングを含む。加えて細胞は、上述したように関心あるタンパク質に結合されたＧＦＰなどのリポーター分子を発現するために遺伝子組換えできる（Ｃｈａｌｆｉｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｓｈｅｒ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，４９１，０８４；Ｃｕｂｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０：４４８−４５５）。
【０１０９】
さらに、生物内のある細胞タイプは他の細胞タイプでは発生し得ないスチルバジウムまたはその類似体によって特異的に標識できる構成要素を含有し得る。たとえば上皮細胞は極性膜構成要素を含有することが多い。すなわちこれらの細胞はその原形質膜に沿って巨大分子を非対称的に分散させる。結合または支持組織細胞は、その細胞タイプに対して特異的な分子（たとえばヘパリン、ヒスタミン、セロトニンなど）が捕捉されている顆粒を含有することが多い。大半の筋肉組織細胞は、その機能が細胞の細胞質内でカルシウムイオンの濃度を調節することである特殊細胞オルガネラである、筋小胞体を含有する。多くの神経組織細胞は、神経ホルモンまたは神経伝達物質が捕捉される分泌顆粒およびベシクルを含有する。したがって蛍光分子は、特定の細胞内の特定の構成要素だけでなく、混合された細胞タイプの集合内の特定の細胞も標識するように設計され得る。
【０１１０】
当業者は、蛍光を測定するための多岐にわたる方法を認識する。たとえばある蛍光レポーター分子は、励起または発光スペクトルの変化を示し、ある蛍光レポーター分子は１つの蛍光レポーターが蛍光を失って、これに対して第２の蛍光レポーターの蛍光が向上する場合に共鳴エネルギー移動を示し、ある蛍光レポーターは蛍光の消失（消光）または出現を示し、これに対してある蛍光レポーターは回転移動を知らせている（Ｇｉｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２４：４０５−４３４；Ｇｉｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２７：１−１６）。
【０１１１】
生化学診断、分子生物学診断および医療診断において、タンパク質を容易に追跡および定量できるように、タンパク質に蛍光標識を添加することがしばしば望ましい。標識の通常の手順は、タンパク質をインビトロで蛍光染料と共有結合的に反応させて、次に過剰な染料およびいずれの損傷したタンパク質を除去するために再精製することを必要とする。標識タンパク質が細胞内で使用される場合、それは通常、微量注入される。しかしながらこれは、多数の細胞に対しては現実的には実施され得ない困難なおよび／または時間のかかる操作であり得る。
【０１１２】
本発明の化合物は、その単離された状態のＤＮＡ／ＲＮＡに、または単離細胞およびオルガネラに染色剤として利用され得る。また該化合物は、細胞ベースアッセイで核染色剤として利用され得る。さらなる用途としては、動物全体の組織および／または臓器はもちろんのこと、胚、幼生、線虫、昆虫および他の寄生虫を染色するために本発明の化合物を使用することが挙げられる。ある実施形態において、本発明の化合物は、動物全体モデル系での特定の臓器組織の撮像のために特定の抗体と複合体形成させることができる。「抗体」または「抗体分子」という用語は本明細書で使用するように各種の文法形で、免疫グロブリン分子（ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤを含む）および／または免疫グロブリン分子、すなわち抗体結合部位すなわちパラトープを含有して、抗体に結合できる分子の免疫活性部分を指す。「抗体結合部位」または「抗原結合部位」は、抗原を特異的に結合する重鎖および軽鎖可変および超可変（ＣＤＲ）領域からなる抗体分子のその構造部分である。当分野で公知のように、抗体の特定の特性は、免疫グロブリンアイソタイプに関連している。代表的な実施形態において、抗体または抗原結合断片は、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｂアイソタイプ分子である。抗体または断片はさらに、鳥類（たとえばニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、ウズラなど）および哺乳類（たとえばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコなど）種を含む、いずれの起源種由来でもよい。
【０１１３】
本発明は、少なくとも多くの細胞スクリーニング形式を蛍光ベースの分子試薬およびコンピュータベースの特徴抽出、データ解析、ならびに自動化と組合せることによって標的検証および候補の最適化を改善し得る、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）およびハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）を組合せるシステム、方法、およびスクリーンを提供することが可能であり、データ収集の品質および速度向上、サイクル時間の短縮、そして最終的により迅速な評価をもたらす。
【０１１４】
したがってある実施形態において、本発明は、細胞の存在、位置、または量、そしてしたがって細胞オルガネラ、たとえば核、滑面および／または粗面小胞体、中心体、細胞骨格、細胞壁、細胞膜、鞭毛、繊毛、葉緑体、ミトコンドリア、ゴルジ体、リボソーム、リソソーム、中心小体、アクロソーム、グリオキシソーム、分泌小胞、ペルオキシソーム、液胞、メラノソーム、筋源線維およびパレンテソームを決定するための技法を特徴とする。他の実施形態において、本発明は検体および微生物の存在、位置、量および／または健康を決定するための技法を特徴とする。
【０１１５】
他の実施形態において、本発明は、細胞またはインビトロサンプルにおける関心あるＲＮＡ分子の存在、位置、または量を決定するための技法を特徴とする。本方法は、（ａ）細胞またはサンプルにおいて、ＲＮＡアプタマーに共有結合的に結合した関心あるＲＮＡ分子を含む融合ＲＮＡ分子を発現させるステップと、（ｂ）ＲＮＡアプタマーがフルオロフォアと結合してそれによりその蛍光を増加または減少させる条件下で、細胞またはサンプルをフルオロフォアと接触させるステップと、（ｃ）フルオロフォアの蛍光を可視化するステップとを含む。
【０１１６】
なお他の実施形態において、本発明は、細胞またはインビトロサンプルにおける関心あるＤＮＡ分子の存在、位置、または量を決定するための方法を提供する。本方法は、（ａ）細胞またはサンプルにおいて、ＤＮＡアプタマーに共有結合的に結合した関心あるＤＮＡ分子を含む融合ＤＮＡ分子を発現させるステップと、（ｂ）ＤＮＡアプタマーがフルオロフォアと結合してそれによりその蛍光を増加または減少させる条件下で、細胞またはサンプルをフルオロフォアと接触させるステップと、（ｃ）フルオロフォアの蛍光を可視化するステップとを含む。
【０１１７】
本発明の実施形態は、微生物を含有することが疑われるサンプル、たとえば液体または水性サンプル中の細胞、検体、核酸または微生物の存在または非存在を決定するためのアッセイも含み、該アッセイは、標識細胞、核酸または微生物を作製するためにサンプルを標識試薬と結合させるステップであって、前記標識試薬は、染色された細胞、検体、核酸または微生物を含む染色されたサンプルを提供するために細胞、検体、核酸または微生物を直接染色する染料を含み、前記染料は式Ｉ：
【化７】
2009501511.tif 000009
によって表される化合物であり、式Ｉ中、ＮＲ1Ｒ2およびＮＲ3Ｒ4部分は、オルト、メタまたはパラ位にあり、Ｘ-はアニオン性塩であり、Ｘ-は、フルオリド、クロライド、ブロミド、ヨージドハライド、メシラート、トシラート、ナフチラート、ノシラート、パラアミノベンゾアート、ベンゼンスルホナート、ベシラート、ラウリルサルフェート、２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン、２−（２−ヒドロキシ−５’−メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、エチル２−シアノ−３，３−ジフェニルアクリレートおよび５−ブチルフェニルサリチラートを含む群より選択することができ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、またはＲ4は、メチル、エチル、Ｃ1-10アルキル（直鎖もしくは分岐）、アルケン（直鎖もしくは分岐）からなる群より独立して選択され、あるいはＲ1およびＲ2またはＲ3およびＲ4はそれらが結合する窒素原子と一緒にピロリジノまたはピペリジノ環を形成し、Ｒ5は、ポリアルキレングリコール部分、Ｃ1-10アルキル（直鎖もしくは分岐）、アルケン（直鎖もしくは分岐）、アルキン、置換および非置換アリール、置換および非置換ベンジルおよび／または有機金属部分である。Ｒ5は、有機スズ、有機ケイ素、または有機ゲルマニウムなどの有機金属化合物でもあり得る。加えて、Ｒ5は（ＣＨ2）n−ＭＲ6でもよく、ｎは１〜６の数であり、Ｍは、スズ、ケイ素またはゲルマニウムなどの有機金属化合物であり、Ｒ6は、プロピル、ブチル、またはいずれかのアルキル化合物からなる群より選択される、結合させるステップと、染色されたサンプルに接触するステップと、染色された細胞、検体、核酸または微生物の蓄積を観察するステップとを含む。染料をカプセル化することができる。ある実施形態において、染料は、マイクロカプセル化調合物または脂質ベシクル調合物をそれぞれ作製するために、マイクロカプセルまたは脂質ベシクル、たとえばリポソーム、ミセルおよび／またはバイセル内に染料を取り込むことができる。染料はペグ化することもできる。
【０１１８】
本発明の各種の実施形態において、細胞は式Ｉによる化合物の１つによって結合され得る。ある実施形態において、細胞は原核細胞、たとえばグラム陰性またはグラム陽性細菌細胞である。他の実施形態において、細胞は真核細胞である。たとえば細胞は酵母、線虫類、ツメガエル、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、イカ、植物、哺乳類、胚性またはヒト細胞であり得る。なお他の実施形態において、細胞またはサンプルを、細胞またはサンプルをフルオロフォアによってインキュベートすることによってフルオロフォアに接触させる。まだ他の実施形態では、フルオロフォアは細胞内に注入されるか、または細胞を含む植物、胚、哺乳類、トランスジェニックアニマル、またはヒトに投与される。
【０１１９】
他の実施形態において、核酸の集合は１個より多いＤＮＡ分子または１個より多いＲＮＡ分子を含有する。核酸は、自然発生のまたは非自然発生のポリヌクレオチド配列を有し得る。核酸における領域、たとえばループ、テトラループ、またはらせんのすべてまたは一部は、集合のメンバの一部または全部の間で異なるランダム配列を含有する。他の実施形態において、ループ、テトラループ、またはらせんの配列は、集合のメンバのすべてで同じである。ループまたはらせんのいずれかの長さは、集合のメンバ間で同じであり得るか、または異なり得る。核酸の集合は、いずれかの数の独自の分子を含有し得る。たとえば集合は、約１０、１０2、１０9、または１０11もの少ない独自の分子、あるいは約１０13、１０15、１０20以上もの多くの独自の分子を含有し得る。ある実施形態において、ポリヌクレオチド配列の少なくとも１つは、非自然発生の配列である。核酸は、すべて同じ長さを有し得るか、または分子の一部の長さが異なり得るかのどちらかである。
【０１２０】
「フルオロフォア」とは、蛍光シグナルを発することができる化合物を意味する。本明細書に記載するように、本発明で有用なフルオロフォアは、溶液中で結合されていないときよりも、核酸またはタンパク質に結合されているときにより高い蛍光強度を有する。結合フルオロフォアの蛍光強度は、水溶液中の未結合フルオロフォアの蛍光強度の少なくとも約１、５、１０、５０、１００、５００、または１０００倍であり得る。結合フルオロフォアの蛍光を向上させ得る条件の例としては、硬直化、コンフォメーション制限、および溶媒からの封鎖が挙げられる。１つの実施形態において、フルオロフォアはアプタマーを共有結合的に結合しない。
【０１２１】
他のフルオロフォアは、溶液中で未結合のときよりも核酸またはタンパク質に結合したときに低い蛍光強度を有する。結合フルオロフォアの蛍光強度は、水溶液中の未結合フルオロフォアの蛍光強度の少なくとも約２、５、１０、５０、１００、５００、または１０００未満であり得る。結合フルオロフォアの蛍光を低下させ得る条件の例は、その蛍光強度を低下させるフルオロフォアの配座の変化である。１つの実施形態において、フルオロフォアはアプタマーを共有結合的に結合しない。
【０１２２】
多重化に使用するための他のフルオロフォア、たとえばカルシウム検知染料は、異なる蛍光強度を生じる少なくとも２つの異なる配座状態を採用し得る。本発明のアプタマーは、蛍光が上昇または低下した特定の配座状態にあるフルオロフォアのパーセンテージを増加させることによって、フルオロフォアの蛍光を調節し得る。
【０１２３】
フルオロフォアは、約０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、および５０μＭの濃度で水溶液に溶解性である。細胞をフルオロフォアのこれらの濃度でインキュベートすることは、細胞の生存能に影響し得ない。別の実施形態において、細胞をこれらの濃度のフルオロフォアでわずか約１〜２時間から約８、１２、２４、３６時間以上もインキュベートすることは、フルオロフォアの毒性効果、たとえば細胞内のタンパク質の不活性化；複製、転写または翻訳の阻害；あるいは細胞死の誘発を防止する別の化合物の存在を必要としない。「細胞浸透性」とは、能動または受動拡散により細胞膜または細胞壁を通じて細胞の細胞質または周辺質内へ移動し得ることを意味する。フルオロフォアは、グラム陰性細菌の外膜および内膜の両方、または植物細胞の細胞壁および原形質膜の両方を通じて移動し得る。加えてフルオロフォアは、インビトロサンプル中の細胞、検体および／または核酸を可視化するために使用され得る。
【０１２４】
本発明の実施形態は、一本鎖オリゴヌクレオチドおよび式Ｉ：
【化８】
2009501511.tif 000010
によって表される化合物を含む核酸プローブを含むことができ、式Ｉ中、ＮＲ1Ｒ2およびＮＲ3Ｒ4部分は、オルト、メタまたはパラ位にあり、
Ｘ-はアニオン性塩であり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、またはＲ4は、メチル、エチル、Ｃ1-10アルキル（直鎖もしくは分岐）、アルケン（直鎖もしくは分岐）からなる群より独立して選択され、あるいはＲ1およびＲ2またはＲ3およびＲ4はそれらが結合する窒素原子と一緒にピロリジノまたはピペリジノ環を形成し、
Ｒ5は、ポリアルキレングリコール部分、Ｃ1-10アルキル（直鎖もしくは分岐）、アルケン（直鎖もしくは分岐）、アルキン、置換および非置換アリール、置換および非置換ベンジルおよび／または有機金属部分である。Ｒ5は、有機スズ、有機ケイ素、または有機ゲルマニウムなどの有機金属化合物でもあり得る。加えて、Ｒ5は（ＣＨ2）n−ＭＲ6でもよく、ｎは１〜６の数であり、Ｍは、スズ、ケイ素またはゲルマニウムなどの有機金属化合物であり、Ｒ6は、プロピル、ブチル、またはいずれかのアルキル化合物からなる群より選択される。
【０１２５】
一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡオリゴマーであり得る。ＤＮＡオリゴマー中のリン原子は、リンカーを介した化学結合によって連結され得る。一本鎖オリゴヌクレオチドは、特定の配列を含有する標的核酸中の特異性配列に対して相補性である配列を有し得る。
【０１２６】
本発明の実施形態は、式Ｉに結合する核酸分子を選択する方法を含んでもよく、前記結合は前記式Ｉの蛍光強度を上昇させ、該方法は、
（ａ）候補核酸分子の集団を提供するステップと、
（ｂ）前記式Ｉに結合する前記候補核酸分子を選択するステップと、
（ｃ）前記式Ｉに結合する前記候補核酸分子に前記式Ｉを接触させるステップと、
（ｄ）前記式Ｉに結合したときにその蛍光強度が上昇する前記核酸分子を選択するステップと
を含む。
【０１２７】
核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【０１２８】
本発明の別の実施形態は、細胞中またはインビトロサンプル中での関心ある核酸の存在、位置、または量を決定する方法を含み、該方法は、（ａ）前記細胞または前記サンプル中で関心ある核酸を発現させるステップと、（ｂ）前記細胞または前記サンプルに式Ｉを接触させ、それにより前記化合物を前記式Ｉに結合させて、その蛍光強度を上昇させるステップと、（ｃ）前記式Ｉの蛍光を可視化または測定して、それにより前記細胞または前記インビトロサンプル中での関心ある前記核酸の存在、位置、または量を決定するステップとを含む。
【０１２９】
本発明の実施形態は、式Ｉが関心ある核酸の転写を調節できるかどうかを決定する方法を含み、該方法はさらに、（ａ）細胞またはインビトロサンプル中で関心ある核酸を発現させるステップと、（ｂ）前記細胞または前記サンプルに前記式Ｉを、または前記式Ｉのみを接触させ、それにより前記化合物を前記式Ｉに結合させて、その蛍光強度を上昇させるステップと、（ｃ）前記化合物の存在下および非存在下で前記蛍光強度を測定して、それにより前記化合物が前記蛍光強度の変化を生じる場合に、前記化合物が前記転写を調節すると判定されるステップとを含む。
【０１３０】
他の実施形態は、サンプル中の核酸またはアミノ酸を染色するためのキットであって、（ａ）結合された混合物を生成するために、１つ以上の染料であって、それぞれ独立して式Ｉを有する染料を含有する染色された混合物と、ｂ）前記染料に、核酸またはアミノ酸を含有する、または含有すると考えられるサンプルを結合させるための指示であって、前記指示が、ｉ）結合された混合物を生成するために、核酸またはアミノ酸を含有すると考えられるサンプルを、前記染料を含有する染色された混合物と結合させるステップと、ｉｉ）サンプル混合物中の核酸またはアミノ酸と結合させて、照明時に検出可能な光学反応を与える染料−アミノ酸または染料−核酸複合体を生成するために、染色された混合物中の染料に十分な時間にわたって結合された混合物をインキュベートするステップとを含む指示とを含むキットを含む。
【０１３１】
追加の実施形態は、１つ以上の検体を含有する、または含有することが疑われるサンプル中で標的検体を検出する方法であって、（ａ）検体が核酸分子である固体支持体上にサンプルを供給するステップと、（ｂ）前記サンプルに、特異的な結合分子を結合させるステップであって、（ｉ）前記特異的な結合分子がビオチンを検出可能な標識として含むポリメラーゼ連鎖反応増幅産物であり、（ｉｉ）前記結合が、前記特異的な結合分子と、存在するときに前記検体とを含む第１の複合体の生成を可能にする条件下で実施される、結合させるステップと、（ｃ）いずれの未結合の特異的な結合分子も除去するステップと、（ｄ）式Ｉを有する化合物を提供するステップと、（ｅ）化合物の結合に基づいて光学反応を検出するステップとを含む方法を含む。
【０１３２】
本発明の実施形態は、細胞を解析する方法であって、１つ以上の蛍光レポーター分子を含有する複数の細胞を含有する位置のアレイを提供するステップと、細胞中の蛍光レポーター分子から蛍光シグナルを得るために、細胞を含有する位置それぞれにて複数の細胞をスキャンするステップと、蛍光シグナルをデジタルデータに変換するステップと、デジタルデータを利用して、細胞内での蛍光レポーター分子の分布、環境または活性を決定するステップとを含む方法を含む。
【０１３３】
本発明の実施形態は、細胞アレイ内でも利用され得る。細胞アレイは、特定の生物機能に関する活性について多数の化合物をスクリーニングするために使用され、細胞および試薬の並行処理のために細胞のアレイを作製することを含む。８６ｍｍ×１２９ｍｍであり、９ｎｍピッチで直径６ｍｍのウェルを備えた標準９６ウェルマイクロタイタープレートが、現在の自動ローディングおよびロボット処理システムとの適合性のために使用される。マイクロプレートは通例２０ｍｍ×３０ｍｍであり、約５００ミクロンのピッチに寸法１００〜２００ミクロンの細胞位置を備えている。マイクロプレートを作製する方法は、米国特許第６，１０３，４７９号に記載されている。マイクロプレートは、細胞が付着しない材料を用いてパターン形成された、細胞が付着する材料の同一平面層、または同様にパターン形成された材料のエッチング三次元表面からなり得る。「ウェル」および「マイクロウェル」という用語は、細胞が付着する、および中に細胞が撮像されるいずれかの構造のアレイ内の位置を指す。マイクロプレートは、ウェル間のスペースに流体送達チャネルも含み得る。マイクロプレートのより小型の形式は、試薬の量、調製中の保管および処理、ならびにスキャン操作に必要な動作全体を最小限にすることによって、システムの効率全体を向上させる。加えてマイクロプレートの全範囲はさらに効率的に撮像され、本文書で後述するようにマイクロプレートリーダーのための第２操作モードを可能にする。
【０１３４】
上述したように、本発明により、核酸の検出に使用される場合、二本鎖核酸へのインターカレート時に大幅な蛍光の増強を示し得るよく知られていない蛍光染料であり、励起波長と発光波長との間の著しい差を示す（すなわち大きなストークスシフトを有する）新規な化合物を提供することが可能である。該化合物は核酸プローブを作るために、それに二本鎖核酸を接触させることによって、またはそれを二本鎖オリゴヌクレオチドと連結することによって従来の核酸アッセイに使用される。
【０１３５】
本発明の化合物は、その蛍光スペクトルがいずれの公知の蛍光インターカレート染料の蛍光スペクトルと重複しないことをさらに特徴とし得る。したがって本発明の化合物および従来公知の蛍光インターカレート染料を使用する少なくとも２つの核酸プローブの組合せ使用は、標的核酸を増幅しながら分離せずに閉鎖容器内のサンプル中の少なくとも２つの標的核酸からの増幅産物を測定することを、すなわち少なくとも標的核酸を同時に測定することを可能にする。
【０１３６】
本発明は、以下に続く実施例でより詳細に説明される。本実施例は、本発明を例示するものであり、それを制限するとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１３７】
スペクトルは、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ−６４０分光計（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ）で１ｃｍパス長のメタクリレートキュベット内で周囲温度（２２℃）の溶液で得た。スキャン速度は、８００ｎｍから２５０ｎｍまでで１０ｎｍ／分であった。ブランクスキャンは、検体に使用したのと同じ希釈液で実施し、化合物スペクトルから差し引いた。
【０１３８】
スチルバジウムクロライド（赤色粉末として）およびスチルバジウムを含有するリポソーム調合物（濁った着色溶液）の両方が提供された。エチジウムブロミド、ＤＭＳＯおよびエタノールは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）より購入した。メタクリレート１．５ｍＬキュベットは、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより購入した。モル吸収（ε）は、観測した光学密度を検体のモル数（［モル］＊体積）で割ることによって計算され、試験物質１．０モルの理論吸収を示す。
【０１３９】
スチルバジウムクロライドは無水エタノールに溶解させたときに、深紅色の溶液を生じた。分析を実施する前に、無水または７０％（ａｑ．）エタノールのどちらかによる第２の希釈を行った。どちらの場合でも、単一の幅広い吸収ピークが極大吸収５０９〜５１１ｎｍで、単一の幅広いピークがモル吸光係数ε＝６６３８４００で観察された。
【０１４０】
分子は同様に、４．１ｍｇ／ｍＬの初期濃度で深紅の呈色を伴って、ＤＭＳＯに溶解性であった。スペクトルは最終濃度５０μＭまでの同じ溶媒での二次希釈後に得られ、５０７ｎｍにてε＝４４０１５７４の単一の幅広いピークを与えた。
【０１４１】
スチルバジウムクロライドは、水にほとんど不溶性であることが見出された。したがってスペクトルはエタノールおよびＤＭＳＯの溶液中で実施した。２つの溶媒の間で、ＤＭＳＯに溶解させた化合物よりも大きい吸収がエタノール性溶液で観察された（ε＝６６３８４００対４４０１５７４）。７０％エタノール水溶液への二次希釈は、無水アルコールによる結果と同じであった。
【０１４２】
黄色からピンク着色溶液として与えられたリポソーム調合物を水を含有するキュベットに直接添加すると（１．０ｍＬ中５０μＬ）、見かけの光散乱濁度を生じた。得られたスペクトルは、５８５ｎｍにおいてε＝３０２４００の極大を有していた。水溶性リポソーム複合体として調合したときに、調合物は水に１：２０希釈で添加するとやや濁っていた。得られたスペクトルは、波長の移動を５８５ｎｍでの最大光学密度およびε＝３０２４００と共に示した。低下したモル吸収は、検体がリポソーム懸濁物に含有されているので驚くべきではない。リポソームの表面で散乱する光は、化合物との相互作用を妨害しやすかった。
【０１４３】
比較のために、水に溶解させたＤＮＡ結合染料のエチジウムブロミドは、２８４ｎｍにおいてその最大光学密度、ε＝６６０２４００および４７８ｎｍにおいてより小さいピーク、ε＝７００４６０を有していた。
【０１４４】
本発明の化合物は、約４００ｎｍから７００ｎｍまでの範囲で蛍光を発し得る。
【０１４５】
細胞染色
マウス乳癌４Ｔ１細胞集合を本発明による３つの化合物を用いて約３０分間、個別にインキュベートして、次にＨＯＥＣＨＳＴ（青色）およびＭｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ（緑色）によって同時染色した。共焦点画像はＺｅｉｓｓ  Ｍｅｔａ  ５１０  ＬＳＭによって得た。染料は波長５４０ｎｍ（赤色）のレーザによって励起させた。
【０１４６】
図１Ａ〜１Ｌは、本発明のある実施形態による化合物によってインキュベートして（図１Ｂ、１Ｆおよび１Ｊ）、核を染色するためにＨｏｅｃｈｓｔ（図１Ａ、１Ｅおよび１Ｉ、青色）で、そしてミトコンドリアを染色するためにＭｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ（図１Ｃ、１Ｇおよび１Ｋ、画像では緑色に見える）で同時染色した共焦点画像を示す。図１Ｄは、図１Ａ〜１Ｃに示した画像のオーバーレイ画像を示す。図１Ｈは、図１Ｅ〜１Ｇに示した画像のオーバーレイ画像を示す。図１Ｌは、図１Ｉ〜１Ｋに示した画像のオーバーレイ画像を示す。オーバーレイ画像は、本発明の化合物が生細胞または固定細胞集合内の細胞、特にミトコンドリアを染色し得ることを示している。
【０１４７】
上記は本発明を例示しており、それを限定するとして解釈すべきではない。本発明の例示的実施形態が記載されているが、当業者は、本発明の新規な教示および利点から実質的に逸脱することなく、例示的な実施形態で多くの変更形態が可能であることを直ちに認識する。したがってそのようなすべての変更形態は、請求項で定義するように本発明の範囲内に含まれるものである。本発明は、請求項によって定義され、請求項の等価物もそこに含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１Ａ−１Ｌ】本発明のある実施形態による化合物によってインキュベートして、核を染色するためのＨｏｅｃｈｓｔ（図１Ａ、１Ｅおよび１Ｉ、青色）およびミトコンドリアを染色するためのＭｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ（図１Ｃ、１Ｇおよび１Ｋ、画像では緑色に見える）によって同時染色した、マウス乳癌４Ｔ１細胞の共焦点画像を示す。
【図１Ｄ】図１Ａ〜図１Ｃに示した画像のオーバーレイ画像を示す。
【図１Ｈ】図１Ｅ〜図１Ｇに示した画像のオーバーレイ画像を示す。
【図１Ｌ】図１Ｉ〜図１Ｋに示した画像のオーバーレイ画像を示す。
【図１Ａ−Ｄ】
2009501511.tif 000021
【図１Ｅ−Ｈ】
2009501511.tif 000022
【図１Ｉ−Ｌ】
2009501511.tif 000023
【図１Ｍ−Ｐ】
2009501511.tif 000024