(57)【要約】  本発明は、NOGOに対する抗体、それを含有する医薬製剤に関し、また神経疾患／障害の治療及び／又は予防におけるかかる抗体の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトNOGOに結合するモノクローナル抗体であって、配列番号77のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、12、20、38、40、48、67、68、70、72、74、76、79及び91位のうち１以上においてｎ個の置換をさらに含み；
置換される各アミノ酸残基は、配列番号7中の同等の位置のアミノ酸残基で置換され、ｎは１〜１３の数である、前記モノクローナル抗体。
【請求項２】
前記抗体が79位の置換を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記抗体の配列が48及び68位の置換を含む、請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
40及び／又は67位の置換をさらに含む、請求項２又は請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
38及び／又は72及び／又は70位の置換をさらに含む、請求項４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
12、20、74、76又は91位のうち１以上の置換をさらに含む、請求項５に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
重鎖可変領域が、配列番号11〜18、29〜33及び85〜91で表される配列を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
前記抗体が配列番号11、12、16、18、85、86、87又は91で示されるVH領域を含む、請求項７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の重鎖可変領域を、配列番号20のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と組み合わせて含むモノクローナル抗体であって、場合によっては、4、7、11、19、42、64及び70位のうち１以上において、複数の置換をさらに含み、置換される各アミノ酸残基は、配列番号8中の同等の位置のアミノ酸残基で置換され、置換数は０〜７である、前記モノクローナル抗体。
【請求項１０】
軽鎖可変領域が11及び19位の置換を有する、請求項９に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
軽鎖可変領域が4位の置換を有する、請求項９に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
軽鎖可変領域が42位の置換を有する、請求項１０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】
軽鎖可変領域が7、64又は70位の置換を有する、請求項１０又は１２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１４】
軽鎖可変領域が配列番号20である、請求項９に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１５】
抗体が配列番号23及び25で示されるVL領域を含む、請求項９に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１６】
以下のリスト:H1L13 (配列番号77＋配列番号20)、H5L13 (配列番号11＋配列番号20)、H6L13 (配列番号12＋配列番号20)、H14L13 (配列番号14＋配列番号20)、H15L13 (配列番号15＋配列番号20)、H16L13 (配列番号16＋配列番号20)、H17L13 (配列番号17＋配列番号20)、H18L13 (配列番号18＋配列番号20)、H19L13 (配列番号85＋配列番号20)、H20L13 (配列番号86＋配列番号20)、H21L13 (配列番号87＋配列番号20)、H22L13 (配列番号88＋配列番号20)、H23L13 (配列番号89＋配列番号20)、H24L13 (配列番号90＋配列番号20)、H25L13 (配列番号91＋配列番号20)、H700L13 (配列番号13＋配列番号20)、H1L16 (配列番号77＋配列番号23)、H5L16 (配列番号11＋配列番号23)、H6L16 (配列番号12＋配列番号23)、H14L16 (配列番号14＋配列番号23)、H15L16 (配列番号15＋配列番号23)、H16L16 (配列番号16＋配列番号23)、H17L16 (配列番号17＋配列番号23)、H18L16 (配列番号18＋配列番号23)、H19L16 (配列番号85＋配列番号23)、H20L16 (配列番号86＋配列番号23)、H21L16 (配列番号87＋配列番号23)、H22L16 (配列番号88＋配列番号23)、H23L16 (配列番号89＋配列番号23)、H24L16 (配列番号90＋配列番号23)、H25L16 (配列番号91＋配列番号23)、H700L16 (配列番号13＋配列番号23)、H1L18 (配列番号77＋配列番号25)、H5L18 (配列番号11＋配列番号25)、H6L18 (配列番号12＋配列番号25)、H14L18 (配列番号14＋配列番号25)、H15L18 (配列番号15＋配列番号25)、H16L18 (配列番号16＋配列番号25)、H17L18 (配列番号17＋配列番号25)、H18L18 (配列番号18＋配列番号25)、H19L18 (配列番号85＋配列番号25)、H20L18 (配列番号86＋配列番号25)、H21L18 (配列番号87＋配列番号25)、H22L18 (配列番号88＋配列番号25)、H23L18 (配列番号89＋配列番号25)、H24L18 (配列番号90＋配列番号25)、H25L18 (配列番号91＋配列番号25)、H700L18 (配列番号13＋配列番号25)より選択されるVH及びVL領域を含む、モノクローナル抗体。
【請求項１７】
哺乳動物細胞において、次の完全長の抗体鎖：
2009500363.tif 000047
のうち１以上の発現によって得られる、請求項１６に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗NOGO抗体又はその機能性フラグメントを、製薬上許容される希釈剤又は担体と共に含む、医薬組成物。
【請求項１９】
ヒトにおける脳卒中及びその他の神経疾患／障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とするヒトに、改変された抗体又はその機能性フラグメントを含む請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗NOGO抗体を有効量投与することを含む、前記方法。
【請求項２０】
脳卒中及びその他の神経疾患／障害を治療又は予防する医薬の製造における、改変された抗体又はその機能性フラグメントを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗NOGO抗体の使用。
【請求項２１】
脳卒中又はその他の神経疾患／障害を患う又は発症のリスクがあるヒト患者において神経変性を抑制する及び／又は機能回復を促進する方法であって、それを必要とするヒトに、改変された抗体又はその機能性フラグメントを含む請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗NOGO抗体を有効量投与することを含む、前記方法。
【請求項２２】
脳卒中又はその他の神経疾患／障害に罹患した又は発症のリスクがあるヒト患者において神経変性を抑制する及び／又は機能回復を促進する医薬の製造における、改変された抗体又はその機能性フラグメントを含む請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗NOGO抗体の使用。
【請求項２３】
ヒトにおける脳卒中又はその他の神経疾患／障害を治療又は予防する方法であって、治療上有効量の請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗NOGO抗体を、該ヒトに非経口投与するステップを含む、前記方法。
【請求項２４】
抗NOGO抗体が静脈内投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
その他の神経疾患／障害が、外傷性脳損傷、脊髄損傷、アルツハイマー病、前頭側頭型痴呆症（タウオパシー）、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病及び多発性硬化症からなる群より選択される、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ヒト軸索に請求項１〜１７の抗NOGO抗体を接触させるステップを含む、軸索の発芽を促進する方法。
【請求項２７】
前記方法がin vitroで行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ヒトNOGO-Aに特異的に結合し、ヒトNOGO-Aの活性を中和する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗NOGO抗体を産生する方法であって、該方法が以下のステップ：
（ａ）前記抗体の重鎖をコードする第１のベクターを準備し;
（ｂ）前記抗体の軽鎖をコードする第２のベクターを準備し;
（ｃ）第１及び第２のベクターで哺乳動物の宿主細胞を同時トランスフェクトし;
（ｄ）(好ましくは無血清の)培養培地において、該宿主細胞から該培地に抗体を分泌させることができる条件下で、ステップ（ｃ）の宿主細胞を培養し；
（ｅ）ステップ(ｄ)で分泌された抗体を回収することを含む、前記方法。
【請求項２９】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体が結合するのを競合して阻害する抗NOGO抗体を産生する方法であって、該方法が以下のステップ：
（ａ）前記抗体の重鎖をコードする第１のベクターを準備し;
（ｂ）前記抗体の軽鎖をコードする第２のベクターを準備し;
（ｃ）第１及び第２のベクターで哺乳動物の宿主細胞を同時トランスフェクトし;
（ｄ）(好ましくは無血清の)培養培地において、該宿主細胞から該培地に抗体を分泌させることができる条件下で、ステップ（ｃ）の宿主細胞を培養し；
（ｅ）ステップ(ｄ)で分泌された抗体を回収することを含む、前記方法。
【請求項３０】
宿主細胞が、NS0 Sp2/o、CHO、COS、線維芽細胞、例えば3T3、特にCHOからなる群より選択される、請求項２８又は２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫グロブリン、特にNOGOに結合しその活性を中和する抗体、かかる抗体をコードするポリヌクレオチド、該抗体を含む医薬製剤に関し、また神経疾患の治療及び／又は予防におけるかかる抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
脳卒中は、西欧諸国における死亡及び機能障害の主な原因である。出血を排除するために、コンピューター断層撮影(CT)後、発症から３時間以内に投与する必要がある組織プラスミノーゲン(t-PA)以外に、脳卒中の治療で承認されている治療法はない。現在のところ、急性脳卒中の治療(すなわち、神経保護)を行う治療剤のほとんどは、急性細胞死に関与することが知られているグルタミン酸受容体及びその下流のシグナル伝達経路を標的とすることに主に関わっている。しかしながら、現時点でこれらの方法は、臨床試験での失敗が証明されており、用量制限副作用に結びつくことが多い(Hill & Hachinski, The Lancet, 352 : (suppl III) 10-14 (1998))。従って、血流停止後の細胞死の改善を行う新規のアプローチが必要とされている。神経保護は、発作又は疾病過程に反応して神経細胞損失を予防又は改善する治療となり得る。これは、グリア(乏突起膠細胞を含む)細胞の損失を防止することによって、ニューロンを直接的又は間接的に標的とすることで、おそらくは達成される。
【０００３】
脳卒中の発症後は、ある程度の自然な機能回復が多くの患者で観察される。このことは損傷後に（たとえ限定的であるにしても）脳が修復及び／又は再構築する能力を有することを示唆する。従って、この回復を増進する能力を有する薬剤は、脳虚血の発症後に、干渉をかなり（可能性としては数日）遅延させることができるかもしれない。両急性の神経保護をもたらし、機能回復を増進することができる薬剤は、現在とり得る神経保護の方法よりも、有利な効果を提供できるかもしれない。
【０００４】
機能回復の基礎をなす機構は、現在も知られていない。損傷した又は損傷していない軸索の発芽が、可能性のある機構の１つとして提案されている。ところが、in vivo試験では、神経栄養性因子による脊髄損傷又は脳卒中の治療が、機能回復及び軸索発芽の程度を増強することが証明されているにも関わらず、これらは軸索発芽の程度と機能回復内容との間の直接的な関連性を証明していない(Jakeman, et al. 1998, Exp. Neurol. 154: 170-184, Kawamata et al. 1997, Proc Natl Acad. Sci. USA., 94:8179-8184, Ribotta, et al. 2000, J Neurosci. 20: 5144-5152)。そのうえ、軸索発芽には生きているニューロンが必要である。従って、広範囲の細胞死が関係する脳卒中のような疾患では、脳卒中後に投与される薬剤によってもたらされる機能回復の増進には、軸索発芽以外の機構、例えば内因性幹細胞の分化、重複する経路の活性化、受容体分布又はニューロン若しくはグリアの興奮性の変化が介在するかもしれない(Fawcett & Asher, 1999, Brain Res. Bulletin, 49: 377-391, Horner & Gage, 2000, Nature 407 963-970)。
【０００５】
損傷後に修復するという中枢神経系(CNS)の能力が制限されているのは、軸索発芽(神経突起の成長)に対して阻害作用を有するCNS環境中の分子、例えばかかるミエリンタンパク質NOGOのせいもしれない(Sato S. et al (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm.163,1473-1480; McKerracher L et al (1994) Neuron 13, 805-811; Mukhopadhyay G et al (1994) Neuron 13, 757-767; Torigoe K and Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262; Schafer et al (1996) Neuron 16, 1107-1113; WO9522344; WO9701352; Prinjha R et al (2000) Nature 403, 383-384; Chen MS et al (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre T et al (2000) Nature 403, 439-444; US005250414A; WO200005364A1; WO0031235)。
【０００６】
３つの形態のヒトNOGOが同定されている：1192アミノ酸残基を有するNOGO-A(GenBank受託番号AJ251383)；推定上の細胞外ドメイン中の186〜1004残基を欠くスプライス変異体NOGO-B(GenBank受託番号AJ251384)；及び186〜1004残基も欠き、代わりにより短いアミノ末端ドメインも有する、より短いスプライス変異体NOGO-C(GenBank受託番号AJ251385) (Prinjha et al (2000) 前掲)。
【０００７】
NOGOのようなCNS阻害タンパク質の阻害は、ニューロン損傷を改善し、ニューロン修復及び成長を促進することにより、ニューロン損傷、例えば脳卒中で持続する損傷からの回復を補助し得る治療手段をもたらすかもしれない。かかるNOGO阻害剤の例には、小分子、ペプチド及び抗体が含まれる。
【０００８】
抗体は、典型的には、ジスルフィド結合により互いに連結された２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む。それぞれの軽鎖は、ジスルフィド結合によりそれぞれの重鎖と連結されている。それぞれの重鎖は、片側末端に可変ドメイン、これに続いて複数の定常ドメインを有する。それぞれの軽鎖は、片側末端に可変ドメインを有し、他方の片側末端に定常ドメインを有する。軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列している。軽鎖定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列している。軽鎖及び重鎖の定常ドメインは、抗体が抗原に結合するのに直接関与しない。
【０００９】
軽鎖及重鎖のそれぞれのペアの可変ドメインは、抗原結合部位を形成する。軽鎖及び重鎖上の可変ドメインは同一の一般構造を有し、それぞれのドメインは４つのフレームワーク領域を含み、その配列は比較的保存的であって、超可変領域と称されることも多い３つの相補性決定領域(CDR)で連結されている。４つのフレームワーク領域は、大部分がβシートコンホメーションをとり、CDRはループ連結を形成しており、またβシート構造の一部を形成する場合もある。CDRは、近接しあってフレームワーク領域によって保持されており、他のドメインのCDRと一緒になって抗原結合部位の形成に寄与している。抗体のCDR及びフレームワーク領域は、Kabat et al (「Sequences of proteins of immunological interest」 US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987)の参照によって、特定することができる。
【００１０】
マウスモノクローナル抗体IN-1は、NI-220/250、すなわち軸索成長を阻害し得(またNOGO-Aのフラグメントであることが実質的に示されている)ミエリンタンパク質に対し作製されたものであり、該抗体は軸索再生を促進することが報告されている(Caroni, P and Schwab, ME (1988) Neuron 1 85-96; Schnell, L and Schwab, ME (1990) Nature 343 269-272; Bregman, BS et al (1995) Nature 378 498-501及びThallmair, M et al (1998) Nature Neuroscience 1 124-131)。NOGO-AがIN-1の標的であることも報告されている(Chen et al (2000) Nature 403 434-439)。脊髄断裂されたラットにIN-1 Fabフラグメント又はヒト化IN-1を投与したところ、回復を増進した(Fiedler, M et al (2002) Protein Eng 15 931-941; Brosamle, C et al (2000) J. Neuroscience 20 8061-8068)。
【００１１】
NOGOに結合するモノクローナル抗体は、WO 04/052932及びWO2005028508に記載されている。WO 04/052932は、特定の形態のヒトNOGOに高親和性で結合するマウス抗体11C7を開示している。
【００１２】
ヒトNOGOに結合し、その活性を阻害する治療上さらに有用なモノクローナル抗体を単離及び開発することが望まれる。神経変性の過程は、多くの神経疾患／障害の基礎をなし、当該神経疾患／障害には急性疾患、例えば脳卒中(虚血性又は出血性)、外傷性脳損傷及び脊髄損傷だけでなく、アルツハイマー病、前頭側頭型痴呆症（タウオパシー）、末梢神経障害、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、統合失調症（精神分裂病）、筋萎縮側索硬化症(ALS)、多発性硬化症、ハンチントン病、多発性硬化症、及び封入体筋炎を含む慢性疾患が含まれるが、これに限定されない。このため、抗NOGOモノクローナル抗体は、これらの疾患/障害の治療に有用であろう。上記の疾患/障害の治療のためのかかる抗体は、本発明によって提供され、下記のとおり説明される。
【００１３】
WO 2005/061544は、高親和性のモノクローナル抗体を開示しており、これにはマウスモノクローナル抗体2A10及びそのヒト化変異体H1L11が含まれる。
【特許文献１】WO9522344
【特許文献２】WO9701352
【特許文献３】US005250414A
【特許文献４】WO200005364A1
【特許文献５】WO0031235
【特許文献６】WO04/052932
【特許文献７】WO2005028508
【特許文献８】WO2005/061544
【非特許文献１】Hill & Hachinski, The Lancet, 352:(suppl III) 10-14 (1998)
【非特許文献２】Jakeman, et al. 1998, Exp. Neurol. 154: 170-184
【非特許文献３】Kawamata et al. 1997, Proc Natl Acad. Sci. USA., 94:8179-8184
【非特許文献４】Ribottaet al. 2000, J Neurosci. 20: 5144-5152
【非特許文献５】Fawcett & Asher, 1999, Brain Res. Bulletin, 49: 377-391
【非特許文献６】Horner & Gage, 2000, Nature 407 963-970
【非特許文献７】Sato S. et al (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm.163,1473-1480
【非特許文献８】McKerracher L et al (1994) Neuron 13, 805-811
【非特許文献９】Mukhopadhyay G et al (1994) Neuron 13, 757-767
【非特許文献１０】Torigoe K and Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262
【非特許文献１１】Schafer et al (1996) Neuron 16, 1107-1113
【非特許文献１２】PRlnjha R et al (2000) Nature 403, 383-384
【非特許文献１３】Chen MS et al (2000) Nature 403, 434-439
【非特許文献１４】GrandPre T et al (2000) Nature 403, 439-444
【非特許文献１５】Kabat et al 「Sequences of proteins of immunological interest」 US Dept. of Health and Human Services, US Government PRlnting Office, 1987
【非特許文献１６】Caroni, P and Schwab, ME (1988) Neuron 1 85-96
【非特許文献１７】Schnell, L and Schwab, ME (1990) Nature 343 269-272
【非特許文献１８】Bregman, BS et al (1995) Nature 378 498-501
【非特許文献１９】Thallmair, M et al (1998) Nature Neuroscience 1 124-131
【非特許文献２０】Chen et al (2000) Nature 403 434-439
【非特許文献２１】Fiedler, M et al (2002) Protein Eng 15 931-941
【非特許文献２２】Brosamle, C et al (2000) J. Neuroscience 20 8061-8068
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の概要
本発明は、ヒトNOGOに結合するモノクローナル抗体を数多く提供する。本出願は、表１２にまとめた多くの配列番号を参照するものであり、実際の配列は、本明細書の最後にある該表の後ろにある。
【００１５】
マウス抗体2A10は、ヒトNOGOに高親和性で結合し、ヒト細胞株で発現されるNOGOの形態に高親和性で結合する。既に、2A10はヒト化に成功している（重鎖可変領域H1(配列番号77)及び軽鎖可変領域L11(配列番号78)を含むH1L11)。本発明は、ヒトNOGOに対するドナー抗体(2A10)の親和性を高い割合で保持するか、又は該抗体と同等の親和性を有する更なるヒト化モノクローナル抗体を提供する。特に、細菌細胞(例えば、E.Coli)で発現される組換え型、及びヒト神経芽細胞腫細胞株(例えば、ヒト神経芽細胞腫細胞株IMR32)により発現される形態の両方の本発明の抗体は、ヒトNOGOに対し高い度合いで結合する。
【００１６】
2A10のヒト化変異体を提供する目的で、本発明者らは、ヒトNOGOに対する結合親和性の最適な保持のために重要であると考えられる2A10可変領域のフレームワーク配列中で、複数の鍵となるアミノ酸残基を同定した。2A10重鎖可変領域(VH)は、配列番号7で表され；2A10軽鎖可変領域(VL)は、配列番号8で表される。マウス可変領域及びヒト定常領域を含むキメラの重鎖及び軽鎖は、それぞれ配列番号9及び10で表される(２つのキメラ鎖の組み合わせをHcLcと称する)。熟練した読者であれば、シグナル配列を除去するための任意のプロセシング(例えば、宿主細胞が仲介するプロセシング)の前には、配列番号9及び10が重鎖又は軽鎖を表していることがわかる。典型的には、抗体鎖のプロセシングされた形態は、配列番号9の20位(シグナル配列の除去後)で始まり；また配列番号10の21位で始まる。本発明では、あらゆる完全長の重鎖及び軽鎖配列が、包含されるシグナル配列と共に提供される（配列番号9及び10ではないその他の完全長の配列は全て、配列番号75に対応する)。これらの完全長の重鎖及び軽鎖のいずれかをコードする遺伝子でトランスフェクトした細胞株により産生される抗体が、このシグナル配列を含むべきでないことは当業者には明らかである。
【００１７】
2A10重鎖のCDRは表１のとおりである。
【表１】
2009500363.tif 000002
【００１８】
2A10軽鎖のCDRは表２のとおりである。
【表２】
2009500363.tif 000003
【００１９】
カバット(Kabat et al. (1991) 「Sequences of Proteins of immunological interest」; 第５版; US Department of Health and Human Services; NIH publication No 91-3242)に従い、CDRを同定した。CDRは、好ましくはカバットにより特性付けられるが、Chothia及びLesk(Chothia et al., (1989) 「Conformations of Immunoglobrin hypervariable regions」; Nature 342, p877-883)により定義されたタンパク質構造及び折り畳みの原理に従う。付加残基は、抗原結合領域の一部とみなされることもあるので、本発明に包含されることが理解されよう。
【００２０】
VH及びVLドメインH1及びL11は、WO 2005/061544で既に報告されており、これは表１及び２に記載のCDRを、2A10ドナー抗体に対して高い相同性を有するヒト可変領域にグラフトさせた結果生じたものであり、それぞれのグラフトした構築物は、(H1 VHでは)カバット位置93及び94位又は(L11 VLでは)4、45及び46位に復帰突然変異を更に含む。
【００２１】
2A10抗体は、ヒトNOGOに結合することができ、マーモセット及びラットのNOGOにも結合する。そして、本発明の新規のヒト化抗体は、その特性を保持すると考えられる。例えば、H20及びL16可変領域を含むモノクローナル抗体(詳細については、下記参照)は、マーモセットのNOGOだけでなく、ラット、カニクイザル及びリスザルのNOGOにも結合する。マーモセットNOGO-Aフラグメントの配列は、配列番号113に示す。
【００２２】
表１及び２のCDRを含む抗体が、本発明では提供される。本発明には、これらのCDRの類似体(analog)を含めた抗体も包含される。
【００２３】
重鎖可変領域(VH)
本発明の１態様では、本発明の抗体は、配列番号77のアミノ酸配列(H1可変領域)を有する重鎖可変領域を含み、12、20、38、40、48、67、68、70、72、74、76、79及び91位のうち１以上で複数の置換をさらに含み；置換される各アミノ酸残基は、配列番号7(ドナー抗体2A10の重鎖可変領域)中の同等の位置のアミノ酸残基で置換され、置換数は１〜１３である。他の実施形態では、置換数は、1、又は2、又は3、又は4、又は5、又は6、又は7、又は8、又は9、又は10、又は11、又は12、又は13である。他の実施形態では、置換数は2〜13、又は3〜13、又は4〜13、又は5〜13、又は6〜13、又は7〜13、又は8〜13、又は9〜13、又は10〜13、又は11〜13、又は12〜13である。他の実施形態では、置換数は1若しくは2、又は1〜3の置換、又は1〜4、又は1〜5、又は1〜6、又は1〜7、又は1〜8、又は1〜9、又は1〜10、又は1〜11、又は1〜12置換である。
【００２４】
本明細書において、H1配列中の特定の位置のヒトフレームワークアミノ酸残基を、2A10ドナー抗体配列中の同じの位置のアミノ酸残基に復帰突然変異させる場合には、本明細書に記載の置換は、「復帰突然変異」という概念に等しい。
【００２５】
他に特別な記載がない限り、特定の配列内で認められるアミノ酸残基の位置番号（例えば「12位」）が本明細書で言及されている場合には、配列中１番めのアミノ酸を「１」位に割りあてて、１位から数えて所望の位置にあるアミノ酸を熟練した読者が同定することを意図される。よって、上記の例では、配列中の12番目のアミノ酸を同定することが意図される。熟練した読者であれば、この番号づけシステムは、抗体配列中のアミノ酸の位置について頻繁に使用されるカバット番号づけシステムとは対応しないことがわかるだろう。次表(表３)は、本発明の置換/復帰突然変異を示しており、それらの位置番号及びその位置番号に対応するカバット番号を付与する。
【表３】
2009500363.tif 000004
【００２６】
表３を参照しながら、１実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、「クラスＡ」の抗体を形成するために、位置番号79の置換/復帰突然変異を含む。
【００２７】
最適な結合親和性のためには、48及び68位のアミノ酸残基のペアは、(2A10中に存在する場合は)それぞれＩ及びＡ、又は(H1中に存在する場合は)それぞれＭ及びＶでなければならないことがわかった。よって、表３を再び参照すると、別の実施形態では、「クラスＢ」モノクローナル抗体は、79、48及び68位の置換を含む。
【００２８】
別の実施形態(「クラスＣ」)では、「クラスＡ」又は「クラスＢ」のモノクローナル抗体は、40及び／又は67位の置換をさらに含む。
【００２９】
別の実施形態では、本発明の「クラスＣ」モノクローナル抗体は、「クラスＤ」抗体を形成するために、38、72又は70位の置換をさらに含む。
【００３０】
別の実施形態では、「クラスＤ」モノクローナル抗体は、12、20、74、76又は91位のうち１以上において置換をさらに含む(「クラスＥ」)。
【００３１】
下記の表は、本発明の抗体の一部を形成し得る20個の異なる重鎖可変(VH)領域の詳細を含んでいる。開示されたVHはそれぞれ、H1 VH (配列番号77)に基づいており、表(表４)に記した置換をさらに含み、H1残基は適当な位置で、その位置にある2A10残基で置換されている(表中、「-」はその位置では置換がないことを表す。従って、その残基はH1の配列におけるのと同じままである）：
【表４】
2009500363.tif 000005
【００３２】
よって、配列番号11〜18若しくは85〜91のいずれか１つで表される配列を有する重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体、又はCDRの類似体を含むその変異体が提供される。別の実施形態では、配列番号26〜33又は92〜98のいずれか１つで表される配列を有する重鎖を含むモノクローナル抗体、又はCDRの類似体を含むその変異体が提供される。
【００３３】
特別な実施形態において、本発明の抗体には、配列番号11、12、16、18、85、86、87若しくは91で表されるVH領域、又はCDRの類似体を含むその変異体が含まれ；あるいは配列番号26、27、31、33、92、93、94若しくは98で表される重鎖、又はCDRの類似体を含むその変異体が含まれる。
【００３４】
軽鎖可変領域
本発明の１態様では、抗体は、配列番号20のアミノ酸配列(L13可変領域)を有する軽鎖可変領域を含み、場合によっては4、7、11、19、42、64及び70位のうち１以上において複数の置換をさらに含み；置換される各アミノ酸残基は、配列番号8(ドナー抗体2A10の軽鎖可変領域)中の同等の位置のアミノ酸残基で置換され、置換数は0〜7である。他の実施形態では、置換数は、1、又は2、又は3、又は4、又は5、又は6、又は7である。他の実施形態では、置換数は2〜7、又は3〜7、又は4〜7、又は5〜7、又は6〜7である。他の実施形態では、置換数は、1又は2、又は1〜3置換、又は1〜4、又は1〜5、又は1〜6である。
【００３５】
次表(表５)は、本発明の置換/復帰突然変異を示しており、それらの位置番号及びその位置番号に対応するカバット番号を付与する。
【表５】
2009500363.tif 000006
【００３６】
表５を参照しながら、別の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体「クラスＸ」は、11及び19位に置換/復帰突然変異を有するVL領域を含む。別の実施形態、「クラスＹ」、では、「クラスＸ」のモノクローナル抗体は、42位の置換をさらに含む。さらなる実施形態では、「クラスＸ」又は「クラスＹ」のモノクローナル抗体は、「クラスＺ」を形成するために、7、64又は70位に復帰突然変異をさらに含む。
【００３７】
表５を再び参照すると、別の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、４位に置換を有するVL領域(L11(配列番号78)に対応する）を含む。
【００３８】
次表(表６)は、本発明の抗体の一部を形成し得る７個の異なる軽鎖可変(VL)領域、又はCDRの類似体を含むその変異体の詳細を含む。開示されたVLはそれぞれ、L13 VL(配列番号20)であるか、又はL13 VL(配列番号20)に基づいており、場合によってはこの表に記した置換をさらに含んでおり、L13残基は適当な位置でその位置にある2A10残基で置換されている(表中、「-」はその位置での置換がないことを意味する。従って、その残基はL13の配列におけるものと同じままである）：
【表６】
2009500363.tif 000007
【００３９】
よって、配列番号20〜25のいずれか１つで表される配列を有する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体、又はCDRの類似体を含むその変異体が提供される。別の実施形態では、配列番号35〜40のいずれか１つで表される配列を有する軽鎖を含むモノクローナル抗体又はCDRの類似体を含むその変異体が提供される。
【００４０】
あるいは、配列番号19で表される配列を有する軽鎖可変領域、又は配列番号34で表される配列を有する軽鎖、を含むモノクローナル抗体が提供される。
【００４１】
特別な実施形態では、本発明の抗体は、配列番号20、23及び25で表されるVL領域又はCDRの類似体を含むその変異体、あるいは配列番号35、38及び40で表される軽鎖、又はCDRの類似体を含むその変異体を含む。
【００４２】
重鎖及び軽鎖可変領域の特定の組み合わせ
本発明は、上記の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域で取り得る全ての組み合わせを含む抗体等を提供する。それらの組み合わせ及び下に列挙される組み合わせにおいて想定されるものはまた、言及する特定の配列、又は天然のCDRの類似体を含むその変異体である。
【００４３】
本発明の抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
【００４４】
１つの実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号77のアミノ酸配列(H1可変領域)を有し、12、20、38、40、48、67、68、70、72、74、76、79及び91位のうち１以上において複数の置換をさらに含む重鎖可変領域（ここで、置換される各アミノ酸残基は、配列番号7(ドナー抗体2A10の重鎖可変領域)中の同等の位置のアミノ酸残基で置換され、置換数は１〜１３であり、他の実施形態では、置換数は1、又は2、又は3、又は4、又は5、又は6、又は7、又は8、又は9、又は10、又は11、又は12、又は13である）、及び
（ｂ）配列番号20〜25又は78より選択される軽鎖可変領域
を含む。
【００４５】
特定の実施形態は、重鎖及び軽鎖可変領域の以下の組み合わせ：H1L13 (配列番号77＋配列番号20)、H5L13 (配列番号11＋配列番号20)、H6L13 (配列番号12＋配列番号20)、H14L13 (配列番号14＋配列番号20)、H15L13 (配列番号15＋配列番号20)、H16L13 (配列番号16＋配列番号20)、H17L13 (配列番号17＋配列番号20)、H18L13 (配列番号18＋配列番号20)、H19L13 (配列番号85＋配列番号20)、H20L13 (配列番号86＋配列番号20)、H21L13 (配列番号87＋配列番号20)、H22L13 (配列番号88＋配列番号20)、H23L13 (配列番号89＋配列番号20)、H24L13 (配列番号90＋配列番号20)、H25L13 (配列番号91＋配列番号20)、H700L13 (配列番号13＋配列番号20)、H1L16 (配列番号77＋配列番号23)、H5L16 (配列番号11＋配列番号23)、H6L16 (配列番号12＋配列番号23)、H14L16 (配列番号14＋配列番号23)、H15L16 (配列番号15＋配列番号23)、H16L16 (配列番号16＋配列番号23)、H17L16 (配列番号17＋配列番号23)、H18L16 (配列番号18＋配列番号23)、H19L16 (配列番号85＋配列番号23)、H20L16 (配列番号86＋配列番号23)、H21L16 (配列番号87＋配列番号23)、H22L16 (配列番号88＋配列番号23)、H23L16 (配列番号89＋配列番号23)、H24L16 (配列番号90＋配列番号23)、H25L16 (配列番号91＋配列番号23)、H700L16 (配列番号13＋配列番号23)、H1L18 (配列番号77＋配列番号25)、H5L18 (配列番号11＋配列番号25)、H6L18 (配列番号12＋配列番号25)、H14L18 (配列番号14＋配列番号25)、H15L18 (配列番号15＋配列番号25)、H16L18 (配列番号16＋配列番号25)、H17L18 (配列番号17＋配列番号25)、H18L18 (配列番号18＋配列番号25)、H19L18 (配列番号85＋配列番号25)、H20L18 (配列番号86＋配列番号25)、H21L18 (配列番号87＋配列番号25)、H22L18 (配列番号88＋配列番号25)、H23L18 (配列番号89＋配列番号25)、H24L18 (配列番号90＋配列番号25)、H25L18 (配列番号91＋配列番号25)、H700L18 (配列番号13＋配列番号25)を含む抗体である。
【００４６】
その他の実施形態は、重鎖及び軽鎖可変領域の以下の組み合わせ：H1L14 (配列番号77＋配列番号21)、H5L14 (配列番号11＋配列番号21)、H6L14 (配列番号12＋配列番号21)、H14L14 (配列番号14＋配列番号21)、H15L14 (配列番号15＋配列番号21)、H16L14 (配列番号16＋配列番号21)、H17L14 (配列番号17＋配列番号21)、H18L14 (配列番号18＋配列番号21)、 H19L14 (配列番号85＋配列番号21)、H20L14 (配列番号86＋配列番号21)、H21L14 (配列番号87＋配列番号21)、H22L14 (配列番号88＋配列番号21)、H23L14 (配列番号89＋配列番号21)、H24L14 (配列番号90＋配列番号21)、H25L14 (配列番号91＋配列番号21)、H700L14 (配列番号13＋配列番号21)、H1L15 (配列番号77＋配列番号22)、H5L15 (配列番号11＋配列番号22)、H6L15 (配列番号12＋配列番号22)、H14L15 (配列番号14＋配列番号22)、H15L15 (配列番号15＋配列番号 22)、H16L15 (配列番号16＋配列番号22)、H17L15 (配列番号17＋配列番号22)、H18L15 (配列番号18＋配列番号22)、H19L15 (配列番号85＋配列番号22)、H20L15 (配列番号86＋配列番号22)、H21L15 (配列番号87＋配列番号22)、H22L15 (配列番号88＋配列番号22)、H23L15 (配列番号89＋配列番号22)、H24L15 (配列番号90＋配列番号22)、H25L15 (配列番号91＋配列番号22)、H700L15 (配列番号13＋配列番号22)、H1L17 (配列番号77＋配列番号24)、H5L17 (配列番号11＋配列番号24)、H6L17 (配列番号12＋配列番号24)、H14L17 (配列番号14＋配列番号24)、H15L17 (配列番号15＋配列番号24)、H16L17 (配列番号16＋配列番号24)、H17L17 (配列番号17＋配列番号24)、H18L17 (配列番号18＋配列番号24)、H19L17 (配列番号85＋配列番号24)、H20L17 (配列番号86＋配列番号24)、H21L17 (配列番号87＋配列番号24)、H22L17 (配列番号88＋配列番号24)、H23L17 (配列番号89＋配列番号24)、H24L17 (配列番号90＋配列番号24)、H25L17 (配列番号91＋配列番号24)、H700L17 (配列番号13＋配列番号24)を含む抗体である。
【００４７】
さらなる実施形態は、重鎖及び軽鎖可変領域の以下の組み合わせ：H1L6 (配列番号77＋配列番号19)、H5L6 (配列番号11＋配列番号19)、H6L6 (配列番号12＋配列番号19)、H14L6 (配列番号14＋配列番号19)、H15L6 (配列番号15＋配列番号19)、H16L6 (配列番号16＋配列番号19)、H17L6 (配列番号17＋配列番号19)、H18L6 (配列番号18＋配列番号19)、H19L6 (配列番号85＋配列番号19)、H20L6 (配列番号86＋配列番号19)、H21L6 (配列番号87＋配列番号19)、H22L6 (配列番号88＋配列番号19)、H23L6 (配列番号89＋配列番号19)、H24L6 (配列番号90＋配列番号19)、H25L6 (配列番号91＋配列番号19)、H700L6 (配列番号13＋配列番号19)、H5L11 (配列番号11＋配列番号78)、H6L11 (配列番号12＋配列番号78)、H14L11 (配列番号14＋配列番号78)、H15L11 (配列番号15＋配列番号78)、H16L11 (配列番号16＋配列番号78)、H17L11 (配列番号17＋配列番号78)、H18L11 (配列番号18＋配列番号78)、H19L11 (配列番号85＋配列番号78)、H20L11 (配列番号86＋配列番号78)、H21L11 (配列番号87＋配列番号78)、H22L11 (配列番号88＋配列番号78)、H23L11 (配列番号89＋配列番号78)、H24L11 (配列番号90＋配列番号78)、H25L11 (配列番号91＋配列番号78)、H700L11 (配列番号13＋配列番号78)を含む抗体である。
【００４８】
１つの実施形態では、本発明の抗体は、以下の重鎖及び軽鎖可変領域H6L13、H16L16、H20L13若しくはH20L16、又は天然のCDRの類似体を含むその変異体を含む。１実施形態では、本発明の抗体はH20L16、又は天然のCDRの類似体を含むその変異体を含む。
【００４９】
完全抗体(whole antibody)
さらに、本発明はNOGO、好ましくはヒトNOGO、より好ましくはヒトNOGO-Aに結合し、それを中和するヒト化抗体も提供する。より具体的には、本明細書に記載の重鎖可変領域及び本明細書に記載の軽可変領域を含むヒト化抗体が提供される。
【００５０】
本発明のヒト化抗体は、マウスドナー抗体2A10又はそのキメラ型(HcLc)の親和性に匹敵する親和性で、ヒトNOGOに結合する。１実施形態では、本発明の抗体とNOGOの結合は、2A10の10倍以内の親和定数(Biacore法で測定されるKD)を有し、別の実施形態では、該親和定数は2A10の３又は２倍以内であり、別の実施形態では、該親和定数は2A10(又は2A10HcLc)と差がない。別の実施形態では、該親和定数は2A10の親和定数の３又は２倍以内で、かつ解離速度(kd)は2A10の１０倍以内、又は３倍以内、又は２倍以内であり、別の実施形態では、解離速度は2A10(又は2A10HcLc)と差がない。抗体の親和定数及び解離速度を測定する方法は、熟練した読者には明らかであるが、これに関しては、本明細書の実施例５に記載の動力学的解析Biacore法を例示する。例えば、Biacore動力学的解析法で測定した2A10の親和定数及び解離速度は、一般に、それぞれ1 nM及び1.84×10-3 (kd 1/s)の範囲であり；同じアッセイにおいて、本発明の１実施形態の抗体の親和定数は8〜10 nM及び1.84×10-2未満である。同様の方法において、2A10キメラ抗体HcLcの解析では、親和定数がそれぞれ約1〜2 nM及び2×10-3〜4×10-3 (kd 1/s）である。
【００５１】
典型的な実施形態において、本発明の抗体はIgGクラスであり、より典型的にはヒトIgG1又はIgG4であり、κ型ヒト軽鎖を有する。
【００５２】
本発明のさらなる態様は、本発明の抗NOGO抗体又はその機能性フラグメントを、製薬上許容される希釈剤又は担体と共に含む医薬組成物を提供する。
【００５３】
さらなる態様では、本発明は、ヒトにおける脳卒中(特に、虚血性脳卒中)及びその他の神経疾患、特にアルツハイマー病又は多発性硬化症を治療又は予防する方法であって、有効量の本発明の抗NOGO抗体又はその機能性フラグメントを、それを必要とするヒトに投与することを含む、前記方法を提供する。
【００５４】
別の態様では、脳卒中(特に、虚血性脳卒中)及びその他の神経疾患、特にアルツハイマー病又は多発性硬化症を治療又は予防する医薬の製造における、本発明の抗NOGO抗体又はその機能性フラグメントの使用を提供する。
【００５５】
さらなる態様では、本発明は、脳卒中(特に、虚血性脳卒中)又はその他の神経疾患、特にアルツハイマー病又は多発性硬化症を患う又は発症のリスクのあるヒト患者において、神経変性を抑制する及び／又は機能回復を促進する方法であって、それを必要とするヒトに、有効量の本発明の抗NOGO抗体又はその機能性フラグメントを投与することを含む、前記方法を提供する。
【００５６】
他のさらなる態様では、本発明は、脳卒中及びその他の神経疾患、特にアルツハイマー病又は多発性硬化症を患う又は発症のリスクのあるヒト患者において、神経変性を抑制する及び／又は機能回復を促進する医薬の製造における、本発明の抗NOGO抗体又はその機能性フラグメントの使用を提供する。
【００５７】
本発明の他の態様では、外傷性神経損傷、例えば脊髄損傷、又は神経系に対するその他の外傷性損傷の治療方法、又はこれらを治療する医薬の製造における、本発明の抗NOGO抗体の使用が提供される。
【００５８】
本発明のその他の態様及び有利な点は、発明の詳細な説明及びその好ましい実施形態においてさらに説明されている。
【００５９】
１つの実施形態では、完全長の抗体は配列番号34〜40の軽鎖及び配列番号92〜98の重鎖；特に、配列番号35、38又は40の軽鎖及び配列番号92、93、94又は98の重鎖を含むものである。熟練した読者には、シグナル配列の除去のための任意のプロセシング(例えば、宿主細胞が仲介するプロセシング)の前は、表７及び１２の完全長の抗体鎖を表す配列(及び付加配列)は全て、重鎖又は軽鎖で表されることが明らかであろう。典型的には、抗体鎖のプロセシングされた形態は、20位から始まる(シグナル配列（残基1〜19）の除去後には）配列番号75に対応する)。本発明は、(シグナル配列の始めの19アミノ酸の除去後の)リストに挙げたポリペプチド配列を有する抗体を提供し、重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドを発現する宿主細胞から産生及び精製される形態の抗体も提供する。
【表７】
2009500363.tif 000008
【００６０】
１実施形態では、抗体はH6L13FL、H16L16 FL、H20L13 FL又はH20L16 FLである。１実施形態では、抗体はH20L16 FL又はCDR類似体を含むその変異体である。
【００６１】
あるいは、ドナー2A10マウス配列中の同等の位置に認められる正確なアミノ酸残基への復帰突然変異である上記の置換は、ドナー2A10マウス配列中の同等の位置に認められる正確な残基の保存的置換であるアミノ酸への任意の置換であってもよい。熟練した読者には明らかであろうが、用語「保存的置換」には、例えば、同様の物理的特性、化学的特性又は構造的特性、例えばpH、電荷、疎水性、芳香族性等を有する別のアミノ酸残基によるアミノ酸の置換が含まれる。
【００６２】
本発明の１実施形態では、定常領域が補体に結合できず、かつ／又はADCC(抗体依存性細胞傷害活性)を媒介できないという点で、抗体は、溶解性(lytic)ではない。したがって、完全長の抗体の定常領域は、天然の非溶解性の定常ドメインに基づくか（例えば、ヒトIgG4)、又はヒトIgG1定常領域中の235及び237位の置換を不活化することを含む(詳細については、EP0307434を参照されたい）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
発明の詳細な説明
本発明の抗体は、典型的には、天然の抗体又はその機能性フラグメントの構造を有する。従って、抗体には、完全長の抗体、(Fab')2フラグメント、Fabフラグメント、軽鎖ダイマー又は重鎖ダイマーが含まれる。抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、若しくはIgG4；又はIgM；IgA、IgE若しくはIgD又はそれらの改変された変異体であってもよい。よって、抗体重鎖の定常ドメインは選択することができる。軽鎖定常ドメインは、κ又はλ定常ドメインである。さらに、抗体には、全てのクラスの改変体、例えばIgGダイマー、もはやFc受容体に結合せず、Clq結合を介さないFc変異体が含まれる。本発明の抗体は、WO86/01533に記載されたタイプのキメラ抗体であってもよく、該キメラ抗体は、抗原結合領域及び非免疫グロブリン領域を含む。抗原結合領域は、抗体軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインである。典型的には、抗原結合領域には、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方が含まれる。非免疫グロブリン領域は、そのC末端で抗原結合領域と融合する。非免疫グロブリン領域は、典型的には非免疫グロブリンタンパク質であり、公知の結合特異性を有する酵素、毒素又はタンパク質であってもよい。このタイプのキメラ抗体の２つの領域は、切断可能なリンカー配列を介して連結できる。前記のCDRを有する免疫性接着因子も、本発明では意図される。
【００６４】
定常領域は、必要とされる官能性に応じて選択される。通常、IgG1は、補体との結合を介して溶解能力を示し、及び／又はADCC(抗体依存性細胞傷害活性)を媒介する。非細胞毒性の遮断抗体が必要な場合には、IgG4が好ましい。しかしながら、IgG4抗体の産生は不安定な場合があるので、通常は、より安定性の高いIgG1を改変することが、一層好ましい。提案される改変体はEP0307434に記載されており、好ましい改変体は、235及び237位の改変を含む。従って、本発明は、溶解性又は非溶解形態の本発明の抗体を提供する。
【００６５】
１実施形態では、本発明の抗体は、完全長(すなわち、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含むテトラマー)の非溶解性IgG1抗体であって、前記のVH又はVL配列を有するものである。別の実施形態では、本発明者らは、配列番号11、12、16、18又は85、86、87又は91のVH；及び配列番号20、23又は25のVLを有する完全長の非溶解性IgG1抗体を提供する。
【００６６】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に開示の重鎖若しくは軽鎖又は可変領域をコードするポリヌクレオチドを提供する。例えば、本発明は、配列番号45〜52、99〜105に含まれる配列を有するVH及び配列番号53〜59に含まれる配列を有するVL領域をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００６７】
「NOGO」は任意のNOGOポリペプチドを指し、変異体の形態を含む。これには、1192アミノ酸残基を有するNOGO-A(GenBank受託番号AJ251383)；推定上の細胞外ドメイン中の186〜1004残基を欠くスプライス変異体NOGO-B(GenBank受託番号AJ251384)及び186〜1004残基も欠き、代わりに短いアミノ末端ドメインも有する、より短いスプライス変異体NOGO-C(GenBank受託番号AJ251385) (Prinjha et al (2000) 前掲)が含まれるが、これに限定されない。本明細書で「NOGO」を引用している場合は全て、特別な形態を示さない限り、任意かつ全ての変異体形態のNOGO、例えば本明細書に記載のNOGO-A及びスプライス変異体を含むと理解される。
【００６８】
「中和する」及びその文法的に変形した用語は、ニューロンとの結合を含めたNOGO機能の全て又は一部の阻害、及び軸索の成長の阻害を意味する。
【００６９】
用語Fv、Fc、Fd、Fab、又はF(ab)2は、それらの標準的な意味で使用される(例えば、Harlow et al.,Antibody A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)を参照されたい)。
【００７０】
「キメラ抗体」は、アクセプター抗体由来の軽鎖及び重鎖定常領域と結合してドナー抗体由来の天然の可変領域(軽鎖及び重鎖)を含むあるタイプの改変抗体を意味する。
【００７１】
「ヒト化抗体」は、非ヒトドナーの免疫グロブリン由来のCDRを有し、その分子の残りの免疫グロブリン由来の部分は、１(又２以上の)ヒト免疫グロブリンに由来する、あるタイプの改変抗体を意味する。さらに、フレームワーク支持残基を改変することにより、結合親和性を保持することができる(例えば、Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)を参照されたい)。好適なヒトアクセプター抗体は、ドナー抗体のヌクレオチド及びアミノ酸配列との相同性によって、従来のデータベース、例えばKABAT(登録商標）データベース、Los Alamosデータベース、及びSwiss Proteinデータベースから選択したものであり得る。ドナー抗体のフレームワーク領域に対する相同性によって（アミノ酸ベースで）特性付けられるヒト抗体は、ドナーCDRを挿入するために、重鎖定常領域及び／又は重鎖可変フレームワーク領域を提供するために好適である。軽鎖定常領域又は可変フレームワーク領域を付与することができる好適なアクセプター抗体は、同様の方法で選択できる。アクセプター抗体の重鎖及び軽鎖は、同一のアクセプター抗体に由来しなくてもよいことに留意されたい。先行技術は、かかるヒト化抗体を産生する方法をいくつか報告している。例えば、EP-A-0239400及びEP-A-054951を参照されたい。
【００７２】
用語「ドナー抗体」は、その可変領域、CDR、又はそれらの他の機能性フラグメント若しくは類似体のアミノ酸配列を、第１の免疫グロブリンパートナーに付与し、それによって改変された免疫グロブリンコード領域を提供する抗体(モノクローナル及び／又は組換え抗体)を指し、その結果得られた、発現された改変抗体は、抗原特異性と、ドナー抗体の中和活性特性とを有する。
【００７３】
用語「アクセプター抗体」は、ドナー抗体とは異種の抗体(モノクローナル及び／又は組換え抗体)を指し、その重鎖及び／若しくは軽鎖フレームワーク領域並びに／又はその重鎖及び／又は軽鎖定常領域をコードするアミノ酸配列の全て（又は任意の一部であるが、好ましくは全て）を、第１の免疫グロブリンパートナーに付与する。好ましくは、ヒト抗体はアクセプター抗体である。
【００７４】
「CDR」は、抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列として定義される、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の超可変領域である。例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第4版, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)を参照されたい。免疫グロブリンの可変部分には、３つの重鎖CDR(又はCDR領域)及び３つの軽鎖CDR(又はCDR領域)が存在する。そのため、本明細書で使用される場合「CDR」は、３つの重鎖CDR全て又は３つの軽鎖CDR全て(又は、適切な場合には全ての重鎖及び全ての軽鎖CDRの両方)を意味する。抗体の構造及びタンパク質フォールディングは、その他の残基が抗原結合領域の一部とみなされることを意味し、当業者はそのように理解するだろう。例えば、Chothia et al., (1989)免疫グロブリン超可変領域のコンホメーション; Nature 342, p877-883を参照されたい。
【００７５】
CDRは、抗原又はエピトープに抗体が結合するための接触残基の大部分を提供する。本発明の目的のCDRは、ドナー抗体の可変重鎖及び軽鎖配列に由来し、天然のCDRの類似体を含む。そして、該類似体は、それらが由来するドナー抗体と同一の抗原結合特異性及び／又は中和能力も、共有又は保持する。
【００７６】
「機能性フラグメント」は、重鎖又は軽鎖可変配列の一部（例えば、免疫グロブリン可変領域のアミノ末端又はカルボキシ末端のわずかな欠失)であり、そのフラグメントが由来する抗体と同一の抗原結合特異性及び同一又は同等の中和能力を保持する。
【００７７】
「類似体(analog)」は、少なくとも１つのアミノ酸によって改変されたアミノ酸配列であって、該改変は、数個の(すなわち、１０以下)のアミノ酸の化学修飾又は置換又は転位であり得、該改変により、前記アミノ酸配列は、生物学的な特性、例えば改変されてない配列の抗原特異性及び高親和性を保持することができる。
【００７８】
本発明は、NOGOに対する本発明のmAb由来のFabフラグメント又はF(ab')2フラグメントの使用も含む。Fabフラグメントは、軽鎖全体及び重鎖のアミノ末端部分を含み；F(ab')2フラグメントは、ジスルフィド結合で結合した２つのFabフラグメントにより形成されたフラグメントである。Fabフラグメント及びF(ab')2フラグメントは、従来の手段、例えば適切なタンパク質分解酵素、パパイン及び／又はペプシンによるmAbの切断により、又は組換え技術により入手することができる。Fab及びF(ab')2フラグメントは、治療剤若しくは予防剤として、並びに本明細書に記載の組換え抗体又はヒト化抗体の形成に有用な可変領域及びCDR配列を含む配列のドナーとして、それ自体が有用である。
【００７９】
本発明のさらなる態様では、本発明者らは、前記のCDRの１以上を有し、NOGO機能に結合し中和するダイアボディ（diabody）(二価抗体又は二特異的抗体）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）及びその他の多価性のscFVタンパク質種を提供する。
【００８０】
さらに他の実施形態では、本発明の抗体は、更なる薬剤に結合していてもよい。例えば、組換えDNA技術の手法を利用して、完全長の抗体分子のFcフラグメント又はCH2-CH3ドメインが、酵素又はその他の検出可能な分子(すなわち、ポリペプチドエフェクター又はレポーター分子)で置換されている本発明の改変抗体を作製することができる。
【００８１】
本発明の抗体は、該抗体のこれらのコード配列を、宿主細胞における複製及び発現並びに／又は宿主細胞からの分泌を制御できる従来の制御調節配列と機能し得るように結合して配置することによって、従来の発現ベクター又は組換えプラスミドを作製して、産生することができる。調節配列には、プロモーター配列、例えばCMVプロモーター、及び他の公知の抗体に由来し得るシグナル配列が含まれる。同様に、相補的な抗体の軽鎖又は重鎖をコードするDNA配列を有するように、第２の発現ベクターを作製することができる。好ましくは、この第２の発現ベクターは、上記コード配列及び選択マーカーが関わる限りそれらを除いては第１の発現ベクターと同一であるが、それぞれのポリペプチド鎖が機能的に発現することを、かなり可能な限り保証されている。あるいは、改変された抗体の重鎖及び軽鎖コード配列を、単一のベクター上に存在させることができる
選択した宿主細胞を、従来技術を用いて第１及び第２のベクターの両方で同時トランスフェクトすることで(又は単に、単一のベクターでトランスフェクトすることで)、組換え又は合成の軽鎖及び重鎖の両方を包含する本発明のトランスフェクトした宿主細胞を作製する。その後、トランスフェクトした細胞を従来の方法で培養し、本発明の改変抗体を作製する。組換えした重鎖及び／又は軽鎖両方の会合を含む抗体を、適切なアッセイ、例えばELISA又はRIAにより培養物からスクリーニングする。同様の従来技術を使用して、その他の改変抗体及び分子を構築することができる。
【００８２】
上記方法で使用されるクローニング及びサブクローニングステップに好適なベクター及び本発明の組成物の構築は、当業者によって選択されうる。例えば、従来のpUCシリーズのクローニングベクターを使用できる。ベクターの１つであるpUC19は、供給業者、例えばAmersham (Buckinghamshire, United Kingdom)又はPharmacia (Uppsala, Sweden)から商業的に入手可能である。さらに、容易に複製することができ、多くのクローニング部位及び選択遺伝子(例えば、抗生物質耐性)を有し、容易に遺伝子操作できる任意のベクターを、クローニングのために使用することができる。
【００８３】
同様に、当業者は、抗体の発現のために使用するベクターを、従来のベクターから選択することができる。ベクターは、選択された宿主細胞中で異種DNA配列の複製及び発現を指令する選択された調節配列(例えば、CMV又はRSVプロモーター)も包含する。これらのベクターは、本発明の抗体をコードする上記DNA配列又は改変された免疫グロブリンのコード領域を含む。さらに、迅速な操作のためには、所望の制限部位の挿入によって改変した、選択した免疫グロブリン配列を該ベクターに取り込むことができる。
【００８４】
発現ベクターは、異種DNA配列の発現を増幅させるのに好適な遺伝子、例えば哺乳動物のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（DHFR）によって、特性付けることもできる。他の好ましいベクター配列には、例えばウシ成長ホルモン(BGH)由来のポリＡシグナル配列及びβグロブリンプロモーター配列(betaglopro)が含まれる。本発明の有用な発現ベクターは、当業者に周知の技術により合成することができる。
【００８５】
かかるベクターの構成要素、例えばレプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列等は、商業的な供給源若しくは天然源より入手することができ、又は選択された宿主中での組換えDNA産物の発現及び／又は分泌を指令するのに使用される公知の手法によって合成することができる。その他の適切な発現ベクターは、哺乳動物、細菌、昆虫、酵母、及び菌類の発現に関する技術分野で数多くのタイプが知られており、当該目的で選択することもできる。
【００８６】
本発明は、抗体又はその改変された免疫グロブリン分子のコード配列を含有する組換えプラスミドでトランスフェクトした細胞株も包含する。クローニングに有用な宿主細胞及びこれらのクローニングベクターの他の操作も、知られている。しかしながら、最も望ましいのは、E. coliの様々な株由来の細胞を、クローニングベクターの複製及び本発明の改変抗体の構築における他のステップで、使用することである。
【００８７】
本発明の抗体の発現に好適な宿主細胞又は細胞株は、好ましくは哺乳動物細胞、例えばNS0、Sp2/0、CHO(例えばDG44)、COS、線維芽細胞(例えば、3T3)、及び骨髄腫細胞であり、より好ましくはCHO又は骨髄腫細胞である。従って、分子をヒトグリコシル化パターンで修飾させるために、ヒト細胞を用いてもよい。他には、その他の真核細胞株を用いてもよい。好適な哺乳動物の宿主細胞の選択及び形質転換、培養、増幅、スクリーニング及び産物の産生及び精製のための方法は、当技術分野では知られている。例えば、上記のSambrook et al.を参照されたい。
【００８８】
細菌細胞は、本発明の組換えFabの発現に好適な宿主細胞として、有用かもしれない(例えば、Pleckthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188 (1992)を参照されたい)。しかしながら、細菌細胞中で発現されたタンパク質は、折り畳まれていない若しくは不適切に折り畳まれた形態又はグリコシル化されていない形態となる傾向があるので、細菌細胞中で産生された任意の組換えFabは、抗原結合能力の保持について、スクリーニングする必要があるだろう。細菌細胞により発現された分子が、適切に折り畳まれた形態で産生されるとしたら、その細菌細胞は望ましい宿主であるといえよう。例えば、発現のために使用されるE. coliの様々な株は、バイロテクノロジーの分野では宿主細胞として周知である。Ｂ．サブチリス（B. subtilis）、ストレプトミセス属（Streptomyces）、他の桿菌等の様々な株を、この方法で使用してもよい。
【００８９】
望ましくは、当業者に公知の酵母細胞株も、宿主細胞として利用できる。同様に、昆虫細胞、例えばショウジョウバエ（Drosophila）及び鱗翅類（Lepidoptera）及びウイルス発現系も利用できる。例えば、Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986)及びその引用文献を参照されたい。
【００９０】
ベクターを構築するための一般的な方法、本発明の宿主細胞を産生するのに必要なトランスフェクション法、及びかかる宿主細胞で本発明の抗体を産生させるのに必要な培養方法は、全てが従来から存在する技術である。典型的には、本発明の培養方法は、通常は懸濁液中で、血清を加えずに細胞を培養することによる無血清培養方法である。また、いったん産生されたら、当技術分野の標準的手順により、細胞培養の内容物から本発明の抗体を単離でき、該手順には硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等が含まれる。かかる技術は当該技術分野の範囲にあるが、本発明を制限するものではない。例えば、改変抗体の調製法は、WO 99/58679及びWO 96/16990に記載されている。
【００９１】
本発明の抗体の発現のさらに別の方法では、米国特許第4,873,316号に記載されたようなトランスジェニック動物中での発現を利用できる。この特許はトランスジェニック的に哺乳動物に組み込まれた場合に雌がミルク中に所望の組換えタンパク質を産生させるような動物のカゼインプロモーターを用いる発現系に関するものである。
【００９２】
本発明のさらなる態様では、本発明の抗体の軽鎖及び／又は重鎖をコードするベクターで形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞を培養するステップ及びそれにより産生される抗体を回収するステップを含む、本発明の抗体の作製方法が提供される。
【００９３】
本発明では、ヒトNOGO-Aに特異的に結合し、ヒトNOGO-Aの活性を中和する本発明の抗NOGO抗体を作製する方法であって、該方法は以下のステップ：
（ａ）該抗体の重鎖をコードする第１のベクターを準備し;
（ｂ）該抗体の軽鎖をコードする第２のベクターを準備し;
（ｃ）第１及び第２のベクターで哺乳動物の宿主細胞（例えば、CHO)を形質転換し;
（ｄ）該宿主細胞から該培地に抗体を分泌させることができる条件下で、ステップ（ｃ）の宿主細胞を培養し；
（ｅ）ステップ(ｄ)で分泌された抗体を回収すること
を含む前記方法が提供される。
【００９４】
所望の方法によりいったん発現させたら、その後適切なアッセイの使用により、抗体のin vitro活性を調べる。現在では、従来のELISAアッセイ形式を利用して、NOGOに対する抗体の結合を定性的に及び定量的に評価することができる。加えて、その後にヒト臨床試験を行う前に、他のin vitroアッセイを用いて中和効能を明確にし、通常のクリアランス機構にもかかわらず、体内における抗体の永続性を評価することができる。
【００９５】
本発明の治療剤を、予防薬として、又は脳卒中事象/臨床症状の発症後に、又はその他必要時に投与してもよい。治療用量及び期間は、ヒト循環中での本発明の分子の相対持続時間と関係しており、治療される状態及び患者の一般的健康状態に応じて、当業者は調整することができる。最大の治療効果を得るためには、長期間(例えば４〜６ヶ月)にわたる反復投与(例えば、週に１回又は２週毎に１回)が必要であると予想される。
【００９６】
本発明の治療剤の投与形態は、ホストに薬剤を送達するのに好適な任意の経路である。アンタゴニスト及び抗体、並びに本発明の医薬組成物は、特に非経口投与、すなわち皮下投与、髄腔内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与、又は鼻腔内投与に有用であり、なかでも静脈内投与が特に好ましい。
【００９７】
本発明の治療剤は、製薬上許容される担体中で、有効量のアンタゴニスト又は本発明の抗体を有効成分として含有する医薬組成物として調製してもよい。本発明の予防剤は、改変した抗体を含有し、好ましくは注射できる形態に生理的pHで緩衝した水性懸濁液又は溶液が好ましい。非経口投与用の組成物には、通常、製薬上許容される担体、好ましくは水性担体で溶解した本発明のアンタゴニスト又は抗体又はそれらの混合物の溶液が含まれる。多様な水性担体が利用できるが、例えば0.9％生理食塩水、0.3％グリシン等がある。これらの溶液は滅菌されており、通常は粒子状物質を含まない。これらの溶液は、従来のよく知られた滅菌方法(例えば、濾過)により滅菌することができる。この組成物は、生理学的状態に近づけるために必要な医薬的に許容される補助物質、例えばpH調整剤及び緩衝剤等を含んでもよい。かかる医薬製剤中での本発明のアンタゴニスト又は抗体の濃度は、広範囲に、すなわち約0.5重量％未満、通常は約１重量％又は少なくとも約１重量％〜多くても15又は20重量％に変更することができ、選択した特定の投与形態での液体体積及び粘度等に主に基づいて、選択する。
【００９８】
そのため、筋肉内投与用の本発明の医薬組成物は、1 mLの滅菌緩衝水と、約1 ng〜約100 mg、例えば約50 ng〜約30 mg、又はより好ましくは約5 mg〜約25 mgの本発明のアンタゴニスト又は抗体を含むように調製し得る。同様に、静脈内注入用の本発明の医薬組成物は、約250 mlの滅菌リンゲル溶液と、約1 mg〜約30 mg、好ましくは5 mg〜約25 mgの本発明の改変抗体を含むように作製し得る。非経口投与用の組成物を調製するための実際の方法は、当業者には公知又は明らかであり、その詳細は、例えばRemington's Pharmaceutical Science, 第15版, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaに記載されている。本発明の静脈内投与可能な抗体製剤の調製については、Lasmar U and Parkins D 「The formulation of Biopharmaceutical products」, Pharma. Sci.Tech.today, 129-137頁, 3 巻(2000年4月3日), Wang, W 「Instability, stabilisation and formulation of liquid Protein pharmaceuticals」, Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188, Stability of Protein Pharmaceuticals Part A 及び B ed Ahern T.J., Manning M.C., New York, NY: Plenum Press (1992), Akers,M.J. 「Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations」, J.Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300, Imamura, K et al 「Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state」, J Pharm Sci 92 (2003) 266-274,Izutsu, Kkojima, S. 「Excipient crystalinity 及び its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying」, J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039, Johnson, R, 「Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for タンパク質 lyophilization」, J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922. Ha,E Wang W, Wang Y.j. 「Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability」, J. Pharm Sci, 91, 2252-2264,(2002)を参照されたく、これらの文献の全ての内容は、引用により本明細書に組み込まれ、読者は明確に参照できる。
【００９９】
医薬の調製では、本発明の治療剤を単位投与剤型とするのが好ましい。適切な治療上有効な用量を、当業者は容易に決定できる。ヒトにおける脳卒中及びその他の神経疾患を効果的に治療するためには、１回量が体重70 kgあたり最大700 mgの本発明のアンタゴニスト又は抗体を、非経口投与、好ましくはi.v.又はi.m.（筋肉内投与）すべきである。かかる投与は、必要に応じて、医師により適切であるとして選択された適切な期間、繰り返してもよい。実施例に記載のとおり、本発明者らは、本発明の抗体を静脈内投与した場合に、そこに記載のラットモデルにおいて有効(positive)な機能回復効果を実証することができた。
【０１００】
本明細書に記載の抗体は、保管のために凍結乾燥させて、使用前に好適な担体中で再構成することができる。この技術は、従来の免疫グロブリンに対して有効であることが証明されており、当技術分野で公知の凍結乾燥及び再構成方法を利用することができる。
【０１０１】
本発明の抗体は、神経成長因子(NGF)のような神経栄養因子、例えば脳由来の神経栄養因子(BDNF)、コルチコステロイドのような抗炎症剤及び／又はtPAと組み合わせて(すなわち、同時に、順次、又は別個に)、使用してもよい。本発明のNOGO抗体及び例えばtPAの組み合わせは、下記の実施例に記載のMCAOモデルで評価することができる。
【０１０２】
別の態様では、本発明は、脳卒中及びその他の神経疾患の治療又は予防のための、本発明の抗NOGO抗体又はその機能性フラグメント及び製薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【０１０３】
他のさらなる態様では、本発明は、脳卒中又はその他の神経疾患を患う又は発症のリスクのあるヒト患者において、神経変性を抑制する及び／又は機能回復を促進するための、本発明の抗NOGO抗体又はその機能性フラグメント及び製薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【０１０４】
本発明は、ヒトにおける脳卒中(特に、虚血性脳卒中)及びその他の神経疾患／障害、特にアルツハイマー病を治療又は予防する方法であって、それを必要とするヒトに、本発明の抗NOGO抗体又はその機能性フラグメントを有効量投与することを含む、前記方法をさらに提供する。本発明の抗体は、アルツハイマー病の進行及び／又は発症を遅延又は停止させる、加えて（又は代わりに）ヒト患者中に存在する疾患を治療する治療方法で使用できる。
【０１０５】
さらに、本発明は、脳卒中及びその他の神経疾患／障害、特にアルツハイマー病を治療又は予防する医薬の製造における、抗NOGO抗体又はその機能性フラグメントの使用を提供する。
【０１０６】
本発明は、脳卒中又はその他の神経疾患／障害、特にアルツハイマー病を患う又は発症のリスクがあるヒト患者において、神経変性を抑制する及び／又は機能回復を促進する方法であって、それを必要とするヒトに、抗NOGO抗体又はその機能性フラグメントを有効量投与することを含む、前記方法も提供する。
【０１０７】
さらに、本発明は、脳卒中又はその他の神経疾患／障害、特にアルツハイマー病に罹患した又は発症のリスクがあるヒト患者において、神経変性を抑制する及び／又は機能回復を促進する医薬の製造における、抗NOGO抗体又はその機能性フラグメントの使用を提供する。
【０１０８】
本発明は、ヒトにおける脳卒中又はその他の神経疾患／障害、特にアルツハイマー病を治療又は予防する方法であって、治療上有効量の抗NOGO抗体を非経口投与するステップを含む前記方法をさらに提供する。好ましくは、抗NOGO抗体は静脈内投与される。
【０１０９】
上記で使用される神経疾患又は障害には、外傷性脳損傷、脊髄損傷、前頭側頭型痴呆症（タウオパシー）、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、及び特にアルツハイマー病が含まれるが、これに限定されない。
【０１１０】
本発明は、ヒト軸索に抗NOGO抗体を接触させるステップを含む軸索の発芽を促進する方法も提供する。この方法は、in-vitro又はin-vivoで行うことができ、好ましくは該方法はin-vivoで行われる。
【０１１１】
従って、さらなる態様では、ヒト患者における脳卒中(特に虚血性脳卒中)、脳損傷、脊髄損傷、前頭側頭型痴呆症（タウオパシー）、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、及び特にアルツハイマー病を治療する医薬の製造のための、静脈内投与可能な形態での本発明の抗NOGO抗体の使用が提供される。
【０１１２】
さらなる態様では、従って、ヒト患者における脳卒中(特に虚血性脳卒中)、脳損傷、脊髄損傷、前頭側頭型痴呆症（タウオパシー）、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、及び特にアルツハイマー病を治療する方法であって、該方法は治療上有効量の本発明の抗NOGO抗体の静脈内投与を含む、前記方法が提供される。
【０１１３】
本発明のさらなる態様では、ヒト被験体(例えば、患者)の中枢神経系におけるニューロンの軸索発芽を促進する方法であって、該方法は治療上有効量の抗NOGO抗体(例えば、本明細書に規定のCDRを含む抗NOGO抗体)を、投与（例えば、静脈内投与）することを含む、前記方法が提供される。
【０１１４】
本発明のさらなる態様では、ヒト患者における脳卒中(特に虚血性脳卒中)、脳損傷、脊髄損傷、前頭側頭型痴呆症（タウオパシー）、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、及び特にアルツハイマー病を治療する静脈内投与可能な医薬の製造における、抗NOGO抗体(例えば、本明細書に規定のCDRを含む抗NOGO抗体)の使用が提供される。
【０１１５】
本発明のさらなる態様では、脳卒中(特に虚血性脳卒中)、脳損傷、脊髄損傷、前頭側頭型痴呆症（タウオパシー）、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、及び特にアルツハイマー病に罹患した（又は罹患した疑いのある）ヒト患者において、中枢神経系のニューロン中の軸索突起を再生する方法であって、該方法は治療上有効量の本発明の抗NOGO抗体を投与（例えば、静脈内投与）するステップを含む、前記方法が提供される。
【０１１６】
本発明のさらなる態様では、脳卒中(特に虚血性脳卒中)、脳損傷、脊髄損傷、前頭側頭型痴呆症（タウオパシー）、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、及び特にアルツハイマー病に罹患した（又は罹患した疑いのある）ヒト患者において、中枢神経系のニューロン中の軸索突起を再生する静脈内投与可能な医薬組成物の製造における、本発明の抗NOGO抗体の使用が提供される。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、用語「機能回復」は、例えば、虚血性事象若しくは損傷又は臨床症候の発症後の、被験体中の運動及び／又は感覚又は行動の改善を意味する。ヒトにおける機能回復は、基本的な神経機能、例えば、運動強度、感覚及び協調運動、認識機能、例えば、記憶、言語、及び指示に従う能力、例えば日常生活の基本活動又は機械的活動を測定するために設計された装置により評価することができる。基本的神経機能の回復は、NIH脳卒中スケール(NIHSS)のような計測法で測定することができ、協調運動の機能の回復は、神経心理学的検査、例えばBoston Naming Test、Trail-making Tests、及びCalifornia Verbal Learning Testで測定でき、また日常生活の活動は、ADCS/ADL(アルツハイマー病の臨床試験/日常生活の活動)スケール、又はBristol Activities of Daily Living Scale、当技術分野で公知の全ての検査及びスケールのような計測法により測定できる。
【実施例】
【０１１８】
実施例１：ヒト化抗NOGO抗体の構築及び発現
Rld及びRln哺乳動物発現ベクターにクローニングするための制限部位に加え、ヒトシグナル配列を含む重複オリゴヌクレオチドの形成により、マウス及びヒト化VH及びVL構築物を新たに作製した。ヒトγ1が変異した定常領域を含むRldにクローニングするために、Hind III及びSpe I制限部位を導入して、CAMPATH-1Hシグナル配列を含有するVHドメインをフレーム化した。ヒトκ定常領域を含むRlnにクローニングするために、Hind III及びBsiWI 制限部位を導入して、CAMPATH-1H シグナル配列を含有するVLドメインをフレーム化した。
【０１１９】
CAMPATH-1H シグナル配列: MGWSCIILFLVATATGVHS (配列番号82)
並行して、11C7のキメラ型を作製した(WO04/052932参照)。可変重鎖ドメイン配列(WO04/052932で得た配列：配列番号43)及び可変軽鎖ドメイン配列 (WO04/052932で得た配列：配列番号44)を、重複オリゴヌクレオチドの形成により新たに作製した。ヒトγ1が変異した定常領域を含むRldにクローニングするために、Hind III及びSpeI制限部位を導入して、VHドメインをフレーム化した。ヒトκ定常領域を含むRlnにクローニングするために、Hind III及びBsiWI制限部位を導入して、VLドメインをフレーム化した。
【０１２０】
実施例２：CHO細胞における抗体発現
重鎖及び軽鎖をそれぞれコードするRld及びRlnプラスミドを、CHO細胞に一過性に同時トランスフェクトさせ、小規模又は大規模で発現させて抗体を産生させた。他には、エレクトロポーレーションにより、同一のプラスミドをCHO細胞に同時トランスフェクトさせた。そして、適切な抗体を発現する細胞の安定なポリクローナル集団を、無ヌクレオシド培地を用いて選択した。場合によっては、上清中に含有される抗体をアッセイし、他の場合には、プロテインＡセファロース上でアフィニティークロマトグラフィーにより、組換え抗体を回収し、精製した。
【０１２１】
実施例３：NOGOに結合するヒト化抗NOGO抗体
PBSで溶解した1μg/mlのGST-ヒトNOGO-A56 (配列番号76)により、Nunc Immunosorpプレート(100μl／ウェル)上を４℃で一晩被覆した。ウェルをTBS＋0.05％Tween (TBST)で１回すすいだ後、TBST中2％BSAでインキュベートして、室温で１時間、非特異的な結合部位をブロックした。抗体をTBST＋2％BSA中で希釈して10μg/mlとし、これにより1/2希釈液を調製した。抗体を二連でウェルに加えて、室温で１時間インキュベートした。ウェルをTBSTで３回洗浄した後、抗-ヒトκペルオキシダーゼコンジュゲート(1:2000)で１時間インキュベートした。ウェルをTBSTで３回洗浄した後、100μlのOPDペルオキシダーゼ基質(Sigma)／ウェルで10分間インキュベートした。25μlの濃H2SO4を加えて、発色反応を停止させた。プレートリーダーを用いて、光学密度を490nmで測定した。抗体を加えていないウェルから読み取ったバックグラウンド値を、引き算した。
【０１２２】
図１〜５は、EILSAアッセイにおいて、ヒト化抗体が、キメラ抗体(2A10のキメラ(2A10マウスVH(配列番号7)及びVL(配列番号8)及びヒトIgG定常領域を含み、HcLcと称されるもの）と比べ、ヒトNOGO-A56(詳細については、実施例６参照)に対し用量依存的に結合することを示す。Y-軸は、490nmで測定された吸光度(OD)を示し、ウェル中で捕捉された抗体の定量的測定を行った。X-軸は、各データポイントでの、使用したウェルあたりの抗体の濃度（mcg/ml)を示す。
【０１２３】
図１、３、４、及び５で使用した抗体物質は、小規模の一過性トランスフェクションにより作製した。上清中のヒトIgGレベルはELISAで定量する(実施例４)。図２において、使用した物質は、ポリクローナル発現系又は大規模な一過性トランスフェクションのいずれかで作製した精製した抗体(実施例２参照)であった。これらの場合には、IgGレベルをELISA及び光学密度により定量した。
【０１２４】
別の実験では、以下のヒト化抗体: H16L16、H17L16、H18L16、H16L18及びキメラ抗体HcLcのために、抗体物質(CHO細胞培養上清の形態)を小規模な一過性トランスフェクション(三連)により作製した。この実験で得た結果は、図１Ａ及び図２に示したH17L16に関してよい結果が得られなかったことを除いては、図１〜５に示したデータと一致していた。この観察結果については説明できないが、当該結果は上清材料で行った別の実験（図１Ａ参照)及び精製したH17L16物質(図２)を用いた実験と矛盾していることに注目されたい。この両実験は、H17L16が他の最適化した変異体に対しては、同等の結合を示すことを表す。
【０１２５】
実施例４：抗体定量プロトコール
Nunc Immunosorpプレートを重炭酸緩衝液(Sigma #C3041)中2μg/mlの捕捉抗体H19(ヤギ抗ヒトIgG鎖, Sigma #I3382)で被覆し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを0.05％Tween20 (TBST)を含有するTBSで２回洗浄し、2％BSAを含有するTBST(ブロック緩衝液) 200μlでブロックした。プレートをTBSTで２回洗浄した。ブロック緩衝液中への２倍希釈ステップでプレートを横断するようにして、抗体を含有する組織培養上清を滴定し、室温で１時間インキュベートした。プレートをTBSTで３回洗浄した。HRPとコンジュゲートした抗体H23(ヤギ抗ヒトκ鎖, Sigma #A7164)をTBST中で1:2000に希釈し、それぞれのウェルに100μlを加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートをTBSTで３回洗浄し、100μlのFast-OPD基質(Sigma #P9187)で発色した。25μlの3M H2SO4でEILSAを停止させた後5〜10分間、発色させた。プレート上、490 nMで吸光度を読み取り、標準曲線を参照して抗体濃度を決定した。
【０１２６】
実施例５：抗体競合ELISAプロトコール
PBSで溶解した0.1〜1.0μg/mlのGST-ヒトNOGO-A56(配列番号76)により、Nunc Immunosorpプレート(100μl／ウェル)上を４℃で一晩又は37℃で１時間被覆した。ウェルをPBSで３回すすいだ後、PBS中１％BSA（ブロック緩衝液）でインキュベートして、室温で２時間、非特異的な結合部位をブロックした。並行して、50：50混合の抗体を作製した。マウス抗体2A10を、ブロック緩衝液中0.5又は1.0 mcg/mlのいずれかの最終濃度になるように、加えた。キメラ抗体(ヒトIgG1 Fc変異定常領域上にクローニングしたマウス可変領域)を、ブロック緩衝液に溶解して最終濃度0〜25 mcg/mlになるまで加えた。ブロック緩衝液をプレートから除去し、100μｌの50:50混合抗体を室温で１時間加えた。ウェルをPBSで３回洗浄した後、100μlのウサギポリクローナル抗マウス免疫グロブリン・ペルオキシダーゼコンジュゲート(ブロック緩衝液中1:2000希釈, DakoCytomation #P0260)で、室温で１時間インキュベートした。ウェルをPBSで３回洗浄した後、100μlのOPDペルオキシダーゼ基質(Sigma #P9187)又はTMB基質(Sigma #T8665)／ウェルで、10〜30分間インキュベートした。25μlの濃H2SO4を加えて、発色反応を停止させた。プレートリーダーを用いて、吸光度を490 nm (OPD)又は450nm(TMB)で測定した。
【０１２７】
第１の実験（図７Ａ）では、PBS中0.5μl/mlのGST-ヒトNOGOA56で、４℃で一晩プレートを被覆し、プレートをTMB基質を用いて発色させた。次の実験では、マウス抗体2A10をHcLc(2A10のキメラ形態)、11C7、アイソタイプ対照キメラ抗体及びブランク対照と組み合わせて評価した。第２の実験(図７Ｂ)では、PBS中0.5μg/mlのGST-ヒトNOGO-A56を用いて、37℃で１時間プレートを被覆し、プレートをOPD基質を用いて発色させた。この実験では、マウス抗体2A10を、HcLc、11C7、アイソタイプ対照及び精製したH16L18抗体と組み合わせて、評価した。
【０１２８】
実施例６：NOGO-Aフラグメント(NOGO-A56；配列番号76)の作製
ヒトNOGO-Aのアミノ酸586-785をコードするcDNA配列(MQESLYPAAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASVIQPSSSPLEASSVNYESIKHEPENPPPYEEAMSVSLKKVSGIKEEIKEPENINAALQETEAPYISIACDLIKETKLSAEPAPDFSDYSEMAKVEQPVPDHSELVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDETVMLVKESLTETSFESMIEYENKE （配列番号76）)を、pGEX-6P1のBamHI-XhoI部位にクローニングし、GSTでタグ付けされた融合タンパク質（NOGO-A56）を作製した。IPTGを0.5mMまで添加して37℃で3時間誘導した後、100μg/mlアンピシリンを含む2XTY培地中、BL21細胞内でプラスミドを発現させた。超音波処理により細胞ペレットを溶解し、製造業者の指示書に従い、グルタチオン-セファロース(Amersham Pharmacia)を用いて融合タンパク質を精製した。精製したタンパク質は、還元グルタチオンを用いて溶出させ、PBSに対して十分に透析し、BSA標準品及びBioRadクーマシーベースのタンパク質アッセイを用いて定量し、その後、-80℃でアリコートを保存した。
【０１２９】
実施例７：ヒト化抗NOGOモノクローナル抗体のBiacore解析
組換えした発現させたヒトNOGO-A(GST-ヒトNOGO-A56)に対する精製した抗NOGOモノクローナル抗体(mAb)の結合反応速度を、Biacore3000バイオセンサーを用いて分析した。hNOGO-Aチップを以下のとおり準備した:
方法
目的とする固定レベル用に設計されたBiacore Wizardプログラムを使用して、hNOGO(GST-ヒトNOGO-A56)を第１級アミンのカップリングにより、CM5チップに固定した。50mM N-ヒドロキシ-スクシンイミド(NHS)及び200mM N-エチル-N’-ジメチルアミノプロピルカルボニド(EDC)の溶液を通過させて、CM5センサー表面を活性化させた。その後、酢酸ナトリウム緩衝液で溶解したhNOGO（pH5.0又はpH 4.5）をチップ上に通過させて、固定した。固定化の完了後も活性化しているエステルを、１M エタノールアミンハイドロクロライド（pH8.5）の注入によりブロックした。
【０１３０】
抗NOGOmAbをHBS-EP (10mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 及び0.005％P-20サーファクタント)中で希釈し、規定の抗体濃度の範囲で、結合試験を行った。全ての試行では、ブランクのセンサー表面（活性化しているが、前記のとおりブロックされており、リガンドは加えられていないもの）を参照した。結合の解析は、BIAevaluation動力学解析ソフトウェアバージョン4.1を用いて行った。他の本発明の抗体のBiacore解析は、本明細書に記載のものと同じプロトコールに本質的に従って、実施した。
【表８】
2009500363.tif 000009
【表９】
2009500363.tif 000010
【表１０】
2009500363.tif 000011
【０１３１】
実施例８：解離速度(off-rate)ランキングを利用するヒト化抗NOGOモノクローナル抗体のBiaCore解析
動力学解析のために、hNOGOチップを準備した。細胞の上清を、CHO-K1細胞の一過性トランスフェクションから直接入手した。これらをセンサー表面上に直接通過させ、相互作用を測定した。擬似トランスフェクトした細胞上清を二重参照のために用いて、組織培養培地からの人為的物質はいずれも排除した。全ての実施(run)において、ブランクのセンサー表面を参照としている。このセンサー表面は、前記のとおり活性化されかつブロックされているが、リガンドは加えられていないものである。結合の解析は、BIAevaluation動力学解析ソフトウェアバージョン4.1を用いて行った。
【表１１】
2009500363.tif 000012
【０１３２】
実施例９：ヒト化抗NOGOモノクローナル抗体のFACS解析
IMR32ヒト神経芽細胞腫細胞を、106 細胞／mlの密度で、FACS染色緩衝液(PBS＋4％熱不活化FCS)中に再懸濁させた。100μlの当該懸濁液を、96ウェル丸底マイクロプレートのウェルに移した。100μlの「Fix＆Perm」媒体Ａ(Caltag Laboratories, GAS001S-100)をそれぞれのウェルに加えて、プレートを室温で15分間インキュベートした。細胞ペレットを、FACS染色緩衝液中で２回洗浄した。洗浄後に、50μlの精製した抗NOGO抗体又はアイソタイプ適合対照抗体の溶液中で、2×最終濃度(FACS染色緩衝液中0〜200μg/ml)で、細胞を再懸濁させた。50μlの「Fix＆Perm」媒体Ｂ(Caltag Laboratories GAS002S-100)を加え、プレートを氷上で１時間インキュベートした。PE-コンジュゲートした抗ヒトγ1特異ヤギ F(ab’)2 (Sigma P-8047)の1/50又は1/100希釈溶液100μl中に再懸濁させる前に、FACS染色緩衝液中で２回、細胞を洗浄した。細胞は、氷上で１時間インキュベートした。細胞をペレット化し、FACS染色緩衝液中で３回洗浄し、そして該細胞を100μlの同一緩衝液中に再懸濁させた。図６及び１３に示した実験で細胞を固定するために、100μlの「Fix＆Perm」媒体Ｂを加えた。図４に示した実験で細胞を固定するために、100μlのBD CellFIXを加えた。染色の程度は、Becton Dickinson FACScanフローサイトメーターを用いて、フローサイトメトリーにより測定した。参照物として、アイソタイプ適合対照を使用した。
【０１３３】
結果を図６Ａ〜Ｆに示す。記載のデータは全体として、このFACSアッセイでは(2A10)HcLc抗体が強いシグナルを与えることを実証しており、該シグナルはヒト細胞が発現したNOGOとの強い結合を示す。このデータは、このキメラのヒト化型が当該特性を維持できることも示している。このアッセイでは、H20L16抗体は11C7よりも一貫して性能が優れている。一方、2A10キメラ抗体及び他のそのヒト化型は一貫して、このアッセイでは、11C7よりも性能が優れているか又はそれに匹敵する。
【０１３４】
実施例１０：さらなるヒト化抗NOGOモノクローナル抗体
実施例１及び２に記載の手法により、多くの更なるモノクローナル抗体を作製した。これらの抗体の結合活性は、BIAcore、ELISA及びFACSでアッセイした。
【０１３５】
10.1  BIAcore
実施例７に記載の手順に基づいて、更なる抗NOGO抗体に関するデータを下記の表１３、１４、１５及び１７(精製した抗体物質)及び表１６(上清材料)に示した。
【０１３６】
2009500363.tif 000013
【０１３７】
2009500363.tif 000014
【０１３８】
2009500363.tif 000015
【０１３９】
2009500363.tif 000016
【０１４０】
2009500363.tif 000017
【０１４１】
10.2  ELISA
実施例３に記載の手順に基づいて、NOGO抗体に関する追加データを図８〜１１に示した。これらの実験のいくつかでは、異なる濃度の被覆抗原を使用した(0.1〜1.0 mcg/ml)。
【０１４２】
結果−図８：NOGO抗原1.0 mcg/mlで被覆した場合
結果−図９：NOGO5＋6抗原0.1 mcg/mlで被覆した場合
結果−図１０：NOGO抗原0.5 mcg/mlで被覆した場合
結果−図１１：NOGO抗原1.0 mcg/mlで被覆した場合
結果−図１２Ａ及びＢ：GST-ヒトNOGOA56抗原1.0mcg/mlで被覆した場合。小規模な一過性トランスフェクションから得た上清材料の結合EILSA。
【０１４３】
10.3  細胞内FACS
実施例９に記載の手順に基づいて、追加のFACSデータを図１３に示した。追加データを図１４Ａ〜Ｃに示す。図１４Ａは、それぞれのサンプルに関する単一のデータポイントを示す。図１４Ａ及び１４Ｂは、２回のサンプルの平均値を示す。
【０１４４】
実施例１１：ヒト化抗NOGOモノクローナル抗体の逆方式BiaCore解析
組換えして発現されたヒトNOGO-A(GST-ヒトNOGO-A56)に対する、精製した抗NOGOモノクローナル抗体(mAb)の結合反応速度を、BiacoreT100を用いて解析した。チップは以下のとおり準備した：
方法
候補抗体のプロテインＡ捕捉を用いて、ヒト化NOGO抗体のBiacoreTM動力学解析を実施した。簡単にいうと、標準的なカップリング手順を用いて、第１級アミンのカップリングにより、CM5チップ上にプロテインＡを固定し、マシンのソフトウェアの制御下で固有の固定ウィザードを用いて、強度は約3000〜4000共鳴単位(RU)範囲とした。その後、プロテインＡ表面上にヒト化抗体を通過させ、安定化期間後に、約200〜400 RUのレベルに捕捉した。規定した濃度で、捕捉した抗体表面上にヒトNOGO5＋6GSTを通過させ、結合センサーグラムを得た。酸性(100mM H3PO4 又は10mMグリシン pH 1.5)で再構成すると、プロテインＡ表面から捕捉された抗体全てを除去することができ、表面結合能が著しく減少することはなかった。全ての曲線では、ヒトNOGO 5＋6 GSTの代わりに、緩衝液を注入したものを二重参照した。データは、Biacore評価ソフトウェアT100 バージョン1.1のグローバルフィットパラメーターを用いて、１：１結合モデルにデータをフィットさせた。全ての実験は、T100装置を用いて実施した。
【０１４５】
2009500363.tif 000018
【０１４６】
2009500363.tif 000019
2009500363.tif 000020
【０１４７】
配列
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【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】組換えヒトNOGOに結合するモノクローナル抗体上清のEILSAデータ(A, B)。
【図２】組換えヒトNOGOに結合する精製されたモノクローナル抗体のEILSAデータ(A, B)。
【図３】組換えヒトNOGOに結合するモノクローナル抗体上清のEILSAデータ(A, B)。
【図４】組換えヒトNOGOに結合するモノクローナル抗体上清のEILSAデータ(A, B)。
【図５】組換えヒトNOGOに結合するモノクローナル抗体上清のEILSAデータ(A, B)。
【図６Ａ−Ｂ】ヒト神経芽細胞腫細胞で発現されたヒトNOGOに結合する精製された抗体のFACSデータ。
【図６Ｃ−Ｄ】ヒト神経芽細胞腫細胞で発現されたヒトNOGOに結合する精製された抗体のFACSデータ。
【図６Ｅ−Ｆ】ヒト神経芽細胞腫細胞で発現されたヒトNOGOに結合する精製された抗体のFACSデータ。
【図７】競合ELISAの結果。
【図８】組換えヒトNOGOに結合するモノクローナル抗体のELISAデータ。
【図９】組換えヒトNOGOに結合するモノクローナル抗体のELISAデータ。
【図１０】組換えヒトNOGOに結合するモノクローナル抗体のELISAデータ。
【図１１】組換えヒトNOGOに結合するモノクローナル抗体のELISAデータ。
【図１２】組換えヒトNOGOに結合するモノクローナル抗体のELISAデータ(A, B)。
【図１３】ヒト神経芽細胞腫細胞で発現されたヒトNOGOに結合する精製された抗体のFACSデータ。
【図１４Ａ−Ｂ】ヒト神経芽細胞腫細胞で発現されたヒトNOGOに結合する精製された抗体のFACSデータ。
【図１４Ｃ】ヒト神経芽細胞腫細胞で発現されたヒトNOGOに結合する精製された抗体のFACSデータ。
【図１】
2009500363.tif 000048
【図２】
2009500363.tif 000049
【図３】
2009500363.tif 000050
【図４】
2009500363.tif 000051
【図５】
2009500363.tif 000052
【図６Ａ−Ｂ】
2009500363.tif 000053
【図６Ｃ−Ｄ】
2009500363.tif 000054
【図６Ｅ−Ｆ】
2009500363.tif 000055
【図７】
2009500363.tif 000056
【図８】
2009500363.tif 000057
【図９】
2009500363.tif 000058
【図１０】
2009500363.tif 000059
【図１１】
2009500363.tif 000060
【図１２】
2009500363.tif 000061
【図１３】
2009500363.tif 000062
【図１４Ａ−Ｂ】
2009500363.tif 000063
【図１４Ｃ】
2009500363.tif 000064
【配列表】
2009500363000001.app
【国際調査報告】
2009500363.tif 000065
2009500363.tif 000066
2009500363.tif 000067
2009500363.tif 000068