(57)【要約】マルチチャネルフローセルは、試料注入時の二次汚染を減じることが可能であり、チャネルが注入されると、フローセル内の活性を観察することが可能である。マルチチャネルフローセルは、２つの基板の間に挟まれた複数の独立してアドレス可能なチャネルを含む。各々のチャネルは、検体の支持体結合を容易にする層でコーティングすることができる。各々のチャネルは、入口に一端を、出口に他端を成端する。チャネルの入口に一致する入口ポートを有する注入ブロックは、チャネルの入口に嵌合することができ、出口ブロックは、チャネルの出口に嵌合することができる。検体は、注入ブロックの入口ポートを経てチャネルに導入することができ、毛管現象または真空引きによってチャネルを介して引っ張られる。検体が各々のチャネルに導入されると、注入および出口ブロックを取り除いて、デバイスを回転させることができる。
2009503555.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の試料の単一分子シーケンシングに使用するデバイスであって、
該デバイスは、流体がそれを通って流れることができる個々に分離された複数のチャネルを画定するフローセルを備え、該フローセルは、該チャネルの各々のための入口ポートおよび出口ポートも画定し、該チャネルのうちの少なくとも１つの内側面の少なくとも一部は、該試料のうちの１つによってハイブリダイズすることができる少なくとも１つの化合物の結合を容易にする材料を含む、デバイス。
【請求項２】
注入ブロックをさらに備え、該注入ブロックは、複数のウェルを画定し、前記フローセルに着脱自在に取り付け可能であり、前記入口ポートの各々が該ウェルのうちの１つに対応する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記出口ポートと位置合わせして前記フローセルに着脱自在に取り付け可能である出口ブロックをさらに備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記フローセルの前記出口ポートは、真空源に接続可能である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
前記フローセルは、第一の基板および第二の基板を備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
前記基板のうちの少なくとも１つは、ガラス、溶融シリカ、サファイヤ、またはプラスチックを含む、請求項５に記載のデバイス。
【請求項７】
前記基板のうちの少なくとも１つは、アクリルまたはポリカーボネートを含む、請求項５に記載のデバイス。
【請求項８】
前記化合物は、エポキシドを含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
前記コーティングは、アビジンを含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１０】
１つ以上の試料を分析するためのデバイスであって、
上面および底面を有する第一の基板と、
該第一の基板の該底面に形成された複数の独立してアクセス可能なチャネルであって、各チャネルが、該チャネルの一端には、該底面から該上面へ該第一の基板を通って延在する入口孔を有し、該チャネルの対向端には、該底面から該上面へ該第一の基板を通って延在する出口孔を有するチャネルと、
各チャネルが隣接するチャネルから流体的に分離されるように、該チャネルを封止する該第一の基板の該底面に選択的に固定された第二の基板と、
該試料のうちの１つによってハイブリダイズすることができる少なくとも１つの化合物の結合を容易にするように、少なくとも１つのチャネルの少なくとも一部に配置された材料と
を備え、
流体は、該入口孔から該チャネルに流れて、次いで該出口チャネルに流れることができる、デバイス。
【請求項１１】
注入ブロックをさらに備え、該注入ブロックは、複数のウェルを画定し、前記上面に着脱自在に取り付け可能であり、該ウェルの各々が前記入口孔のうちの１つに対応する、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記出口ポートと位置合わせして前記上面に着脱自在に取り付け可能である排出ブロックをさらに備える、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記第一の基板の前記出口孔は、真空源に接続可能である、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記基板のうちの少なくとも１つは、ガラス、溶融シリカ、サファイヤ、またはプラスチックを含む、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記基板のうちの少なくとも１つは、アクリルまたはポリカーボネートを含む、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記化合物は、エポキシドを含む、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記化合物は、アビジンを含む、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記チャネルは、エッチングによって形成される、請求項１４に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記チャネルは、成形によって形成される、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項２０】
１つ以上の試料を分析するためのデバイスであって、
上面および底面を有する第一の基板と、
該底面から該上面へ該第一の基板を通って延在する少なくとも１つの入口孔、および該底面から該上面へ該第一の基板を通って延在する少なくとも１つの出口孔と、
所定の接着パターンで該第一の基板の該底面上に配置された接着剤層であって、該接着パターンは、該少なくとも１つの入口孔と該少なくとも１つの出口孔との間に延在する空隙を有する接着剤層と、
該空隙を封止することによってチャネルを形成する該接着剤層に固定された第二の基板と、
該試料のうちの１つによってハイブリダイズすることができる少なくとも１つの化合物の結合を容易にするように、少なくとも１つのチャネルの少なくとも一部に配置された材料と
を備え、
流体は、該入口孔から該チャネルに流れて、次いで該出口チャネルに流れることができる、デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体として、マイクロ流体フローセルに関し、また当該のセルを使用した生化学分析の実行に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
流体システムは、生化学分析、医学的診断、分析化学、化学合成、および環境モニタリングを含む様々な技術分野に使用されている。マイクロ流体システムは、化学的および生物学的情報の取得においてある種の利点を提供する。例えば、マイクロ流体システムは、少量の試薬を使用した複雑なプロセスの実行を可能にする。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、全体として、フローセル、特にマルチチャネルフローセルに関するものであり、また、マイクロ流体レベルでの生化学分析の反応および検査（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）のプロセスを簡素化するフローセルを使用するための方法に関するものである。当該のフローセルによって、１つ以上の試料を注入および分析することができる。
【０００４】
一実施態様では、両面マルチチャネルフローセルは、検体試料間の汚染を防ぐような様態で複数の前記試料を受ける。前記フローセルは、複数の独立してアドレス可能な試料チャネルを有し、試料を注入するための着脱可能な注入ブロックを使用する。前記フローセルは、前記複数のフローチャネル内の検体の観察および分析用の屈折率整合流体を収容するためのウェルを形成することができる。各々の前記フローチャネルは、前記注入ブロックおよび出口ブロックとそれぞれ嵌合し、前記注入ブロックおよび出口ブロックが取り除かれた後にも、化学試薬を導入するためにアクセス可能である、入口および出口を有する。
【０００５】
本発明によるフローセルの実施態様によって、試料注入時の二次汚染を減じることが可能であり、チャネルが注入されると、フローセル内の活性を観察することが可能である。また、光学的検出が必要である化学分析にも有用である。
【０００６】
本発明によるフローセルの一実施態様は、ガラス（または他の材料）製の第一の層と、ガラス（または他の材料）製の第二の層との間に挟まれた、複数の独立してアドレス可能なチャネルを備える。各々のチャネルは、検体の支持体結合（ｓｕｐｐｏｒｔ−ｂｏｎｄｉｎｇ）を容易にする層でコーティングすることができる。前記コーティングは、例えばエポキシドとすることができる。各々の前記チャネルは、入口に一端を、出口に他端を成端する。前記チャネルの前記入口に一致する入口ポートを有する注入ブロックは、前記チャネルの前記入口に嵌合することができ、出口ブロックは、前記チャネルの前記出口に嵌合することができる。検体は、前記注入ブロックの前記入口ポートを経て前記チャネルに導入することができ、毛管現象または真空引きによって前記チャネルを通って引っ張られる。検体が各々の前記チャネルに導入されると、前記注入および出口ブロックを取り除いて、前記デバイスを反転させることができる。前記チャネルの観察に使用される前記光学装置の屈折率に一致する屈折率を有する流体は、次いで、前記セルによって画定されたウェルに導入することができる。次いで、フローセル内の化学反応のために、各々の前記チャネルに試薬を導入することができ、余分な試薬は前記チャネル出口を介して除去される。次いで、光学的に検出可能な部分の観察が行われる。当該のフローセル、および本発明のあらゆるフローセルによって、合成によるシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）の反応における組み込みに関連する光ラベルを観察することができる。
【０００７】
前記各々のチャネルにエポキシドコーティングを使用した場合、前記チャネルに導入されたアミノ末端核酸プライマは、前記エポキシドコーティングに共有結合する。あらゆる非結合プライマを、前記チャネルから除去することができる。前記フローセルを反転させることができると、屈折率整合油を前記ウェル内に入れる。前記セルを光学顕微鏡に載置されたチャックに嵌合することによって、前記チャネル入口を介して試料核酸を導入することができる。前記導入された核酸は、プライマにハイブリダイズする。次いで、前記チャネルにおける前記試料（テンプレート）核酸の合成によるシーケンシングのために、試薬を導入することができる。シーケンシングは、光学的に検出可能なラベルとポリメラーゼとを含むヌクレオチド類似体を前記チャネルに導入することによって行う。テンプレート依存のヌクレオチドの添加は、利用可能な相補的塩基を有する支持体結合二重鎖に生じる。非結合ヌクレオチドは、前記チャネルから洗い流され、前記チャネルを洗浄した後に、組み込まれたヌクレオチドに添付されたラベルの光学的同定とともに、更なる塩基添加サイクルが行われる。ラベルは、取り除くか、または例えば光ブリーチングによって消去することができる。シーケンスは、各二本鎖に組み込まれた塩基の線形順序に基づいてコンパイルされる。二本鎖は、個別に光学的に解像できることが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
マルチチャネルフローセルを製作し使用する方法をさらに理解するために、添付図面とともに以下の発明を実施するための最良の形態を参照する。複数の図面を通じて、同様の参照符号は対応する要素を示す。
【０００９】
本発明による流体装置の実施態様は、全体として生化学分析の分析を簡素化するものである。各々の実施態様によって、生化学反応の反応および検査コンポーネントを並行して生じさせることができ、それによって、生化学分析の合計サイクル時間が減じられる。特定の実施態様に関して、生化学分析の合計サイクル時間は、反応生成物を含む区画の検査に必要な時間程度に減じられる。本発明により同じフローセルで生化学分析が１回以上実行された場合、セルを完全に利用したように顕著な時間節約が実現され、生化学分析の反応コンポーネントの実行中の中断時間（本願明細書では反応時間とも称する）がほとんど無い。
【００１０】
本発明によるフローセルの実施態様は、反応コンポーネントおよび検査コンポーネントを有する生化学分析の並列処理が行えるようにデザインされ、反応および検査コンポーネントは、一般的に、同じフローセル内で（または上で）順番に実行される。全体として、フローセルは、反応が１つの区画で行われ、撮像が別の区画で行われるように、独立した別個の配管を有する２つ以上の区画を有する。フローセル区画（またはサブ区画）は、それらが互いに流体連通しないように、互いに流体的に分離されたものとすることができる。
【００１１】
本発明による第一の例示的な実施態様では、装置は、同じホルダーに取り付けられた２つ以上のマルチチャネルフローセルを備える。取り付けられたそれぞれのフローセルは、他のフローセルの撮像領域に影響を及ぼさずに、生化学分析の反応コンポーネントを１つのフローセル上で実行できるように、１つ以上の撮像領域を備え、別個の流体接続を有する。
【００１２】
全体的に、本発明によるフローセルの実施態様は、本願明細書に記述されるように、あらゆる適切な表面を使用して作製することができる。フローセルの撮像領域のための１つの表面は、ガラスまたは融合シリカスライド上のエポキシド表面、またはカバースリップである。例えば、表面は、約１０ｍｍ〜約１００ｍｍの円形のカバーガラスとすることができる。表面の厚さは、約０．０５ｍｍ〜約０．４５ｍｍとすることができる。一実施態様では、カバーガラスは、４０ｍｍの円形のカバーガラス（Ｅｒｉｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で、厚さは０．１５ｍｍである。カバーガラスの撮像可能領域は、約１０ｍｍ２〜約１０，０００ｍｍ２とすることができる。一実施態様では、カバーガラスの撮像可能な領域は、約６９０ｍｍ２であり、フローセルの撮像領域の間で分割される。フローセルが２つの撮像領域を備えている場合、各撮像領域は、約３４５ｍｍ２となる。図１は、例示的なフローセルの概略図である。
【００１３】
フローセルの各撮像領域は、独立したマイクロ流体配管を有することができる。すなわち、各撮像領域は、それ自体の流体入口ポートおよび／または流体出口ポートを有することができる。加えて、各撮像領域は、熱的および流体的に独立したものとすることができ、それによって、反応コンポーネントが一方の撮像領域上で実行され、同時に、他の撮像領域は検査（例、撮像）されることができる。カバーガラスは、検査デバイス（例、ニコンＰｌａｎ  ＡＰＯ  ＴＩＲＦ対物レンズ６０×／１．４５）が、撮像領域に干渉しないように、約２ｍｍの保護バンドを含めるか、またはカバーガラスの縁が傾斜させられ得る。図２の特定の実施態様を参照すると、目標のＸ−Ｙ傾斜は約１ｎｍ／μｍ（１ミリラジアン）であり、その平坦度は１００μｍにおけるピークツーピーク値が１００ｎｍである。目標のＺ方向の配置再現性（例、フローセル上の載置および取り外し）は、１０μｍ±２の標準偏差である。対物レンズの待避領域は、フローセルから熱的に分離され、対物レンズのための再給油領域がある。
【００１４】
上述のように、撮像領域は、同じホルダーに取り付けられた別個のフローセルの一部とすることができ、ともに検査デバイス（顕微鏡など）に載置することができる。別の実施態様では、撮像領域は、単一のフローセルの一部であり、各撮像領域は、上述のように撮像領域を互いに分離するガスケットによって囲まれる。図３は、２つの撮像領域がそれぞれ３つのスポットを備え、同じホルダーに取り付けられた別個のフローセルである、２つの撮像領域ＡおよびＢの概略図である。図４は、単一のフローセルの表面が、別個の流体接続を有する別個の領域に分割された、２つの撮像領域ＡおよびＢの概略図である。
【００１５】
図５Ａに示されるように、フローセルの一実施態様は、一連の２つ以上の流路（本願明細書では、チャネルとも称する）を備えることができる。各チャネルは、別個の流体入口Ｐ１を有することができる。チャネルは、別個の流体出口を有するか、または共通の流体出口Ｐ２を共有することができる。チャネルは、マスキングによって形成することができる。例えば、図５Ｂに示されるように、並列した疎水性および親水性領域を作り出すことができる。図５Ｃに示されるように、疎水性および親水性領域は、ガラスカバースリップおよびポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）スライドを使用して形成することができる。ＰＤＭＳ表面は、マスキングおよびプラズマへの露出によって選択的に疎水性とすることができる。
【００１６】
生化学分析の反応コンポーネントを実行させるのに必要な試薬は同時に流れ込む。各チャネルにおける流れは、通常、非常に低いレイノルズ数（≪１）を有し、一般的に同じ粘度を有するので、チャネルに一定の圧力を加えることにより、複数の並列する流路がもたらされる。チャネルへの圧力は、チャネル中の好適な流量を得るように、入口に圧力を加えるか、出口に吸引力を加えるか、または両方を組み合わせることによって達成することができる。したがって、生化学分析が核酸を伴う場合は、上述のように、核酸をチャネルに付着させることができる。次いで、１つのステップで、複数の異なるオリゴヌクレオチドをチャネルに添加して、付着させた核酸にハイブリダイズさせることができる。加えて、上述のように、反応時間と比較した撮像時間の比率に基づいて、チャネルの一方の群が生化学分析の反応コンポーネントを受け、他方の群が検査されるように、チャネルを２つ以上の群に分割することができる。
【００１７】
カバーガラスは、約２ｍｍの保護バンドを含めるか、または検査デバイスが撮像領域に干渉しないようにカバーガラスの縁を傾斜させることができる。一実施態様では、検査デバイスは、ニコンＰｌａｎ  ＡＰＯ  ＴＩＲＦ対物レンズ６０×／１．４５である。他の好適な検査または検出デバイスは下述する。図２を参照すると、目標のＸ−Ｙ傾斜は、約０．１〜約１０ミリラジアンとすることができる。一実施態様では、Ｘ−Ｙ傾斜は、約１ｎｍ／μｍ（１ミリラジアン）である。一実施態様では、目標のＺ方向の配置再現性（例、フローセル上の載置および取り外し）は、約１０μｍ＋１−２の標準偏差である。対物レンズの待避領域は、フローセルから熱的に分離することができる。
【００１８】
本願明細書に記述されるように、最小容量を有するフローセルが複数の利点を提供する。例えば、フローセルの容量は、約１〜約１０００μｌとすることができる。さらに、フローセルの内部容積の交換が迅速である。一実施態様では、この交換は、３０００ｋＰａの駆動圧力において１秒未満であり、４℃での最大レイノルズ数は１未満である。カバースリップの湾曲は、一般的に、注入中に、最初のチャネル高さの２０％未満である。図６は、円形環状部におけるスポットの近似を示す図である。
【００１９】
マイクロ流体容量および関連する生物学的材料を処理および分析するための、マルチチャネルフローセルの第二の例示的な実施態様を、図７に１で示す。マルチチャンネルフローセルは、例えば、単一分子シーケンシングの実行などのような、多種多様な用途に使用することができる。
【００２０】
図７を参照すると、フローセル１は、互いに並列に配向された複数のチャネル２を含む。各チャネル２は、流体をチャネル２に注入するための入口４と、流体をチャネル２から取り除くための出口６とを有する。チャネル２は、それぞれ約３マイクロリットル〜約１５マイクロリットルの容量を有する。各々のチャネル２は、入口４のうちの１つから出口６のうちの対応する１つまで、軸３に沿って長手方向に延在する。示されるように、チャネル２は、軸３全体が均一の幅であるが、フローセル１の所望の用途に基づいた幅および／または深さで先細りまたは湾曲させることが可能である。また、複数のチャネル２が示されているが、当然、フローセル１は単にチャネル２のうちの１つだけを有することができる。
【００２１】
図８Ａ〜８Ｃを参照すると、組み立て前のフローセル１０の第一の実施態様の個々のコンポーネントが示されている。このフローセル１０は、上面２０（図８Ａ）と底面２２（図８Ｂ）とを有する第一の基板１８を含む。第一の基板１８は、複数の入口孔１４と複数の出口孔１６とをその中にさらに含み、各々のこれらの孔１４および１６は、第一の基板１８の上面２０からその底面２２まで、基板を通って延在する。入口孔１４は、第一の基板１８の一方の縁２４の近くに列を成し、出口孔１６は、第一の基板１８の対向する縁２６の近くに列を成す。
【００２２】
図８Ｂに最良に示されるように、各入口穴１４は、対応するまたは一致する出口孔１６を有する。複数の凹部２８は、各入口孔１４からその対応する出口孔１６まで延在する軸３３に沿って、第一の基板１８の底面２２にエッチングされ、カービングされ（ｃａｒｖｅｄ）、または成形される。第一の基板１８は、チャネル１２の所望のサイズおよび形状を形成するに必要な、あらゆる所望の深さまたは幅で形成することが可能である。一実施態様での、チャネルのサイズは、所望の流量において層流を確保するように選択される。
【００２３】
フローセル１０は、上面３２（図８Ａ）および底面３４（図８Ｂ）を有する第二の基板３０をさらに含む。第二の基板３０は、第二の基板３０の上面３２が第一の基板１８の底面２０と接触するように、第一の基板１８へ組み立てられる。２つの基板１８および３０を互いに固定すると、凹部２８が密封されてチャネル１２（図８Ｃ）を形成する。別の実施態様では、凹部２８は、第二の基板３０の上面３２にエッチング、カービング、または成形することができる。第一の基板１８は、様々な機械的締結具を用いて、または上面３２および／または底面２２に塗布される様々な接着剤のうちのいずれかを用いて、第二の基板３０に取り付けることができる。
【００２４】
第一の基板１８および第二の基板３０のそれぞれは、基板１８および３０が、それらを通過するマイクロリットル量に適合しており、マイクロリットル量におけるあらゆる物質が固着しないものであれば、様々な材料または材料の組み合わせのいずれかで製造することができる。表面２２および３２は、ＤＮＡのような試料だけが所望の表面に付着するように、不動態化することもできる。不動態化試薬には、例えば、アミン、リン酸塩、水、硫酸塩、洗浄剤、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社が販売するＰＯＰ−６（登録商標）のようなポリマーが挙げられる。
【００２５】
基板１８および３０は、全般的に、適切な波長の光および／またはエネルギーがそれを通過できる材料で形成される。これは、フローセル１０の１つの使用において、１つ以上の波長の光が基板１８および３０を通過して、チャネル１２内の材料を照らすためである。基板１８および３０は、ガラス、融合シリカ、サファイヤ、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、またはアクリルまたはポリカーボネートのような好適な透明プラスチックとすることができる。いくつかの実施態様では、基板１８および３０として使用される材料は、基板１８および３０を互いに固定するために、接着剤および／または機械的締結具が不要であるように、同じまたは異なる材料とすることができる。
【００２６】
フローセル１０は、フレーム３６をさらに含む。フレーム３６は、内側縁部４０と、外側縁部４２を含み、フレーム３６は、矩形の開口部３８を画定する。フレーム３６は、組み立てた基板１８および３０を受けて（例えば接着剤で）これらをフレーム３６に選択的に固定するための、内側縁部４０に沿って形成された凹部４４（図８Ａ）をさらに含む。フレーム３６は、例えばガラス注入ポリカーボネートまたは複合プラスチックのような、２つの基板に類似した熱膨張特性を有するあらゆる材料で構成することができる。別様には、熱的な不整合がある場合、シリコンのような高柔軟性の接着剤を使用することができる。
【００２７】
図９Ａ〜９Ｄを参照すると、本発明によるフローセル１１０の第三の例示的な実施態様は、図８Ａ〜８Ｃを参照して上述したものとは異なる様態で形成されたチャネル１１２を含む。
【００２８】
接着剤は、所望の接着パターンでフィルムに配置することができる。次いで、フィルムを使用して、パターン化した接着剤を接着すべき材料の１つの表面に塗布し、次にそのフィルムを剥がして廃棄すると、所望の位置にだけ所望のパターンで接着剤が残る。次いで、第二の材料を第一の材料と接触して配置させて、２つの材料を接着することができる。Ｍｉｃｒｏｎｉｃｓ社（Ｒｅｄｍｏｎｄ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）は、該技術を供給する一社である。
【００２９】
フローセル１１０は、上面１２０および底面１２２を有する第一の基板１１８を含む。第一の基板１１８は、複数の入口孔１１４と、複数の出口孔１１６をさらに含む。接着剤のパターンは、所定の接着パターンで、一枚のフィルム１８０に配置される。上述の手法を使用することで、フィルム１８０を使用して、接着パターンを第一の基板１１８の底面１２２（図９Ｃ）に塗布する。
【００３０】
フローセル１１０は、上面１３２と、底面１３４を有する第二の基板１３０をさらに含む。上述のような第一の基板１１８の底面１２２への接着剤の塗布に代えて、接着剤を第二の基板１３０の上面１３２に配置することが可能である。接着剤が表面１２２および１３２の内の１つに塗布されると、２つの基板１１８および１３０は、並置されて互いに接触して配置される。接着剤の硬化後に、２つの基板１１８および１３０は互いに接着され、基板１１８および１３０のいずれにも接着剤が配置されなかった領域にチャネル１１２が形成される。接着剤の層は、所望の寸法および形状のチャネル１１２を作り出すために、任意の所定の厚さおよびパターンを有する。さらに、矢印、ロゴ１８２、または説明書きのような更なるパターンおよび参照物を接着層内に含めて、ユーザーによる更なる適切な操作を確保することもできる。
【００３１】
図９Ａを参照すると、フローセル１１０は、フレーム１３６をさらに含む。フレーム１３６は、内側縁部１４０と、外側縁部１４２とを有し、フレーム１３６は、矩形の開口部１３８を画定する。フレーム１３６は、基板１１８および１３０を受けて（例えば接着剤で）これらをフレーム１３６に選択的に固定するための、内側縁部１４０に沿って形成された凹部１４４をさらに含む。フレーム１３６は、また、外側縁部１４２近くの外側の周辺部に形成される凹部１７２も含む。前記凹部１７２は、状況に応じてガスケットまたは圧縮可能な管を受けて、フローセル１１０に使用されているときの封止を向上させることができる。
【００３２】
図９Ｄは、ユーザーによる注入の準備ができた完全に組み立てたフローセル１１０を示す図である。示されるように、フローセル１１０は、入口孔１１４および出口孔１１６を囲む場所にガスケット１１５および１１７を有する。ガスケット１１５および１１７は、所望の用途に応じて、凹部内に配置するか、または平坦な上面１２０上に配置することができる。フローセル１１０は、凹部１７２内に配置された圧縮可能な管１９０も有する。
【００３３】
図１０Ａ〜１０Ｈを参照する。試料をフローセル１０に注入するプロセスを示して説明する。図１０Ａを参照すると、完全に組み立てたフローセル１０が示される。この特定の図には示されていないが、流体が入口孔１４に注入されたときに、その流体がチャネル１２を通って流れ、次いで出口孔１６を経て取り除かれるように、各入口穴１４は、出口孔１６に連結されたチャネル１２に連結される。状況に応じて、凹状キャナル４６が、位置口穴１４を完全に囲んだ第一の基板１８の上面２０に形成される。更なる凹状キャナル４７は、完全に出口孔１６を囲んだ第一の基板１８の上面２０内に形成される。これらの導管４６および４７は、状況に応じて、チャネル１２の注入または排出中、およびフローセル１０が使用されているときに、入口孔１４および出口孔１６を封止するために、ガスケットまたは圧縮可能な管を受けることができる。
【００３４】
図１０Ｂ〜１０Ｅを参照すると、注入ブロック４８は、分析のために流体をフローセル１０のチャネル１２に注入するために提供される。注入ブロック４８は、上面５０と、底面５２とを有する。注入ブロック４８は、上面５０から底面５２まで注入ブロック４８を通って延在する、複数の注入ウェル５４を含む。示されるように、注入ウェル５４は、基本的に円錐形に形成され、上面５０の近くの直径が最も大きく、底面５２の近くの直径が最も小さい。上面５０において、注入ウェル５４は、３つの千鳥状の列で配列される。注入ウェル５４は、注入ウェル５４が入口孔１４と合わさるように、底面５２において単一の列を形成する注入ブロック４８（図１０Ｃ）の中心に向かって角度をつける。別様には、図１０Ｄに示されるように、中央の列にある注入ウェル５４は、上面５０において円形とすることができ、また２つの外側の列は、上面５０において鍵穴形状とすることができる。注入ウェル５４は、注入ブロック４８の底面５２において単一の列となるように先細りに下る。注入ウェル５４は、十分な量の試料を容易にフローセル１０のチャネル１２に注入するに必要なあらゆる形状またはサイズとすることができる。
【００３５】
注入ブロック４８は、底面５２から突出した嵌合ピン５６として知られる、２つの隆起特徴部をさらに含む。嵌合ピン５６は、第一の基板１８の上面２０内の受け入れ穴５８と合わさり、この孔で受けられる。注入ブロック４８が、図１０Ｂ上のラインＡによって示される方向にフローセル１０上に降ろされたときに、嵌合ピン５６は受け入れ穴５８に挿入される。これにより、流体が注入ウェル５４から入口孔１４に流れ、次いでチャネル１２に流れることができるように、注入ウェル５４と入口孔１４との適切な配列が確保される。ガスケットまたは圧縮可能な管（図示せず）をキャナル４６内に組み込んで、注入プロセス中に、流体が注入ブロック４８およびチャネル１２内に収容され、フローセル１０の他の領域に漏れないように、入口孔１４の周囲に堅固な封止を提供することが可能である。別様には、注入ブロック４８は、注入ブロック４８自体がガスケットなしで堅固な封止を形成するように、各注入ウェル５４の周囲の底面５２に更なる隆起特徴部を有する、比較的柔らかく柔軟な材料（例、シリコンゴム）で作製することができる。注入ブロック４８の更なる隆起特徴部は、注入ウェル５４と上面２０との間の有効な封止を確保する。これらの隆起特徴部は、適切な封止ジオメトリを提供するために、矩形または半円形の断面とすることができる隆起線である。図１０Ｅは、フローセル１０上の適切な位置にある注入ブロック４８を示す。
【００３６】
図１０Ｆ〜１０Ｈを参照すると、排出ブロック６０が、流体をチャネル１２から取り除くために提供される。排出ブロック６０は、上面６２と、底面６４を有する。図１０Ｆに最良に示されるように、排出ブロック６０は、上面６２から底面６４まで排出ブロック６０を通って延在する、単一の開口部６６を含む。図１０Ｆおよび１０Ｇに示されるように、開口部６６は、上面６２の近くでは円筒状であり、底面６４においては溝である。なお、他の形状およびサイズの開口部を、流体をチャネル１２から取り除くための排出ブロック６０内に形成することが可能であることは、当業者には明らかとなろう。実施例は、複数の孔または排出ブロック６０を通って延在する単一のダクトを含む。別の実施態様では、各チャネル１２をその近傍に連結するブロックまたはマニホールドが、フローセルのガラスに直接エッチングされるか、または機械加工されることができる。一実施態様では、排出ブロック６０および／または排出ブロック６０と出口孔１６との間のインターフェースは、チャネル１２の排出中に真空にするときに（または試料を処理している間に）、全ての出口孔１６にわたって圧力分配が均一になるようにデザインされる。均一な圧力分配により、チャネル１２内の試料および試薬の流量が均一になる。流量を制御してチャネル間を移動させないようにするために、任意的な表面処理をチャネルに加えて、それらを疎水性または親水性にすることができる。
【００３７】
排出ブロック６０は、底面６４から突出した嵌合ピン６８として知られる、２つの隆起特徴部をさらに含む。嵌合ピン６８は、第一の基板１８の上面２０内の受け入れ穴７０と合わさり、この孔で受けられる。排出ブロック６０が、図１０Ｆ上のラインＢによって示される方向にフローセル１０上に降ろしたときに、嵌合ピン６８は受け入れ穴７０に挿入される。これにより、流体がチャネル１２から出口孔１６を通って流れ、開口部６６を通ってフローセル１０から取り除くことができるように、開口部６６と出口孔１６との適切な配列が確保される。ガスケットまたは圧縮可能な管（図示せず）をキャナル４７内に組み込んで、排出プロセス中に、流体が排出ブロック６０内に収容され、フローセル１０の他の領域に漏れないように、入口孔１４の周囲に堅固な封止を提供する。注入ブロック４８と同様に、排出ブロック６０は、排出ブロック６０自体がガスケットなしで堅固な封止を形成するように、開口部６６の周囲の更なる隆起特徴部を底面６４に有する、比較的柔らかく柔軟な材料（例、シリコンゴム）で作製することができる。排出ブロック６０の更なる隆起特徴部は、開口部と上面２０との間の有効な封止を確保する。これらの隆起特徴部は、適切な封止ジオメトリを提供するために、矩形または半円形の断面とすることができる隆起線である。図１０Ｈは、注入ブロック４８および排出ブロック６０が適切な位置にあり、マイクロ流体量および関連する生物学的材料を処理する準備のできたフローセル１０を示す図である。
【００３８】
動作に際し、ユーザーは、緩衝液をフローセル１０に予注入してチャネル１２に水分補給する。これは、マイクロ流体量の緩衝液を注入ウェル５４に個別または同時に分配することによって達成される。これは、単一のピペットまたは複数組のピペットを使用して、ロボット制御または手動のいずれかで行うことが可能である。このようなロボット制御による作業は、米国特許出願第１１／１８４，３６０号に記載されており、参照することにより本願明細書に援用される。緩衝液（または他の液体試料）が注入されると、緩衝液は円錐の注入ウェル５４を通って移動し、入口孔１４を通って下がり、次いで毛管現象によってチャネル１２に入る。所定の時間待った後、ユーザーは、排出ブロック６０に真空ポンプを取り付け、緩衝液をフローセル１０から排出する。
【００３９】
次に、ユーザーは、マイクロ流体量の試料を注入ウェル５４に個別または同時に分配する。上述のように、これは、単一のピペットまたは複数組のピペットを使用して、ロボット制御または手動のいずれかで行うことが可能である。試料が注入されると、円錐の注入ウェル５４を通って移動し、入口孔１４を通って下がり、次いで毛管現象によってチャネル１２に入る。ユーザーは、サンプルがハイブリダイズするまで適切な時間待ち、次いで、試料をフローセル１０から排出する。各注入ウェル５４および対応するチャネル１２は、複数の相異なる試料を注入し、交差汚染することなく同時に分析できるように、隣接した注入ウェルおよびチャネルを分離することが可能である。更なる緩衝液または試薬を注入または排出するプロセスは、実行する特定の分析の必要に応じて繰り返すことができる。フローセル１０が最後に排出されたら、ユーザーは、真空ポンプを排出ブロック６０から取り外し、次いで、注入ブロック４８および排出ブロック６０を取り除く。図１０Ｉに示されるように、これでフローセルは、更なる分析プロセスのための装置への注入準備ができる。
【００４０】
種々の実施態様では、第一の基板１８または第二の基板３０は、フローセル１０を通過するマイクロ流体量と反応するように処理されることができる。例えば、複数のＤＮＡのストリングを、基板１８および３０によって形成されたチャネル１２の表面に付着させることができる。
【００４１】
本願明細書に記述したフローセル１０の一つの用途は、単一分子のシーケンシングの実行を含む。前記用途では、フローセル１０は、フローセル１０のチャネル１２に結合された個々のＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖（「テンプレート」）を含む。テンプレートは、例えばビオチン−アビジンの相互作用または他の好適な付着化学反応を使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡを表面に結合させるための様々な手段のうちのいずれかによってチャネル１２に結合させることができる。プライマは、フローセル１０に結合されたＤＮＡまたはＲＮＡの一部にハイブリダイズするように添加される。このような用途は、Ｕｌｍｅｒに対する米国特許出願公開第２００６／００１２７８４号（２００４年１１月１６日出願）に記載されており、参照することにより本願明細書に援用される。
【００４２】
上述のプロセスの実行に使用することができる装置２００の一例を図１１に示す。装置２００は、光学部２１０と、流体処理部２２０と、フィルタ２３０と、電源２４０と、レーザー制御部２５０と、バーコードリーダ２６０と、モーター部２７０と、中央処理ユニット２８０と、フローチャック２９０とを含む。フローセル１０のようなフローセルは、分析の準備をした後に、装置２００のフローチャック２９０に装着することが可能である。
【００４３】
図１２Ａ〜１２Ｃを参照すると、フローセル１０は、フローチャック２９０に装着されている。フローセル１０は、第一の基板１８の上面２０が、図１２Ａの線Ｃで示される方向に、フローチャック２９０と接触して配置されるように、ユーザーによって反転される。フローセル１０は、状況に応じて、フレーム３６の外周の近くに形成された凹部７２を含み（図１２Ｂ）、ガスケットまたは圧縮可能な管（図示せず）が、フローセル１０がフローチャック２９０内に組み込まれたときに、より堅固な封止を作り出すように、凹部７２内で受容されることが可能である。フローチャック２９０は、状況に応じて、フローセル１０内のスロット７６で受けるポスト２９２を含む。ポスト２９２は、フローセル１０がフローチャック２９０に適切に載置されるようにデザインされた整合特徴部である。図１２Ｃは、フローチャック２９０内に装着されて装置２００による処理の準備ができたフローセル１０を示す図である。
【００４４】
図１３Ａ〜１３Ｃを参照すると、フローセル１１０は、フローチャック４９０の別の実施態様に装着されている。フローセル１１０は、第一の基板１１８の上面１２０が、図１３Ａの線Ｄで示される方向にフローチャック４９０と接触して配置されるように、ユーザーによって反転される。図１３Ｂに示されるように、フローセル１１０は、凹部１７２に配置された圧縮可能な管１９０を有し、フローセル１１０がフローチャック４９０内に組み込まれたときに、より堅固な封止を作り出す。本実施態様では、フローセル１１０はポスト４９２を含み、フローチャック４９０はスロット１７６を含み、フローチャック４９０におけるフローセル１１０の適切な位置決めを確保する。ポスト４９２は、フローチャック４９０上に偶然に落下されたり不適切に配置されたりしても、基板１１８および１３０が壊れないように、フローセル１１０の保護も行う。フローセル１１０の本実施態様の更なる整合特徴部は、矢印１７８と、ロゴ１８２を含む。図１３Ｃは、フローチャック４９０内に装着されて装置２００による処理の準備ができたフローセル１１０を示す図である。フローセルの別の実施態様は、バーコードまたは他の電磁デバイスも含み、適切な装着および分析する試料の同定を確保する。
【００４５】
フローセルは、個別に使用するか、または状況に応じて、２つ以上のフローセルを組み合わせて使用して、同時により多くの試料を分析する。例えば、図１４は、デュアルフローセル３００およびデュアルフローチャック３９０の構成を示す図である。特定の実施態様が記述されたが、当該の記述は単なる例示目的に過ぎない。変更および変形を行うことが可能であり、それらは本開示の範囲内に含まれる。
【００４６】
上述のマイクロ流体デバイスは、様々な生化学分析の実行に有用である。一実施態様では、生化学分析は、合成によるシーケンシングプロセスを含む。好適な一実施態様では、合成によるシーケンシングは、表面に付着させた単一の光学的に分離された核酸の二本鎖に対して行われる。本発明の方法は、高効率かつ高精度で対象となる標的核酸をシーケンシングするために、有効な撮像と同時に合成によるシーケンシングの反応コンポーネントを併用する。
【００４７】
下述の実施態様では、例示的な生化学分析として合成によるシーケンシングを使用する。なお、本発明のフローセルは、反応コンポーネントおよび検査コンポーネントを有するあらゆる生化学分析に使用することができ、反応および検査コンポーネントは、一般的に、同じチャンバ内で（または上で）順番に実行される。
【００４８】
生化学分析に対する反応時間が検査時間とほぼ同じである場合、本発明の方法は、上述のように第一および第二の領域を有するフローセルの使用を含む。生化学分析が合成によるシーケンシングプロセスである場合、テンプレートおよびプライマがハイブリダイズされた１つ以上の核酸の二本鎖は、フローセルの第一の撮像領域の表面に付着される。テンプレートおよびプライマがハイブリダイズされた１つ以上の核酸の二本鎖は、フローセルの第二の撮像領域の表面に付着される。二本鎖は、表面上での個々の二本鎖の位置の特定に使用される、光学的に検出可能なラベルを含む。二本鎖の位置が得られると、反応コンポーネント（例えばシーケンシング反応）がフローセルの第一および第二の撮像領域上で実行される。シーケンシング反応の完了後に、第一の撮像領域が検査（例えば、撮像）される。
【００４９】
合成によるシーケンシングプロセスの１回目の間に、両方の撮像領域は、ポリメラーゼの存在下で標識化ヌクレオチド三リン酸塩に露出される。プライマの３’末端に直接隣接した標識化ヌクレオチドの補足物を含むテンプレート鎖は、添加されたヌクレオチドを組み込む。組み込まれなかったヌクレオチドを取り除く洗浄ステップの後に、本願明細書に記述されているように、第一の撮像領域の表面を検査して、どの二本鎖の位置にラベルが加えられたのかを特定する。それらは、添加されたヌクレオチドを組み込んだ位置にある。第一の撮像領域が検査されている間に、第二の撮像領域の表面を好適な緩衝液、例えばＨＥＰＥＳ緩衝液のような中性緩衝液内に格納して、付着された二本鎖の安定性を保持する。
【００５０】
第一の撮像領域の表面の検査完了後に、第二の撮像領域の表面が同様に検査される。第二の撮像領域の表面は、格納後および検査前に洗浄することができる。第二の撮像領域の表面が検査されている間に、上述のように、第一の撮像領域の表面上でシーケンシング反応が実行される。検査後に、加えられたラベルは取り除くことができる。第一の撮像領域の表面は、上述のように、第一の撮像領域の表面を再び検査する時まで、中性緩衝液内に格納することができる。
【００５１】
第二の撮像領域の表面の検査完了後に、上述のように、第一の撮像領域の表面が検査される。第一の撮像領域の表面は、格納後および検査前に洗浄することができる。第一の撮像領域の表面が検査されている間に、上述のように、第二の撮像領域の表面上でシーケンシング反応が実行される。検査後に、加えられたラベルは取り除くことができる。第二の撮像領域の表面は、上述のように、第二の撮像領域の表面を再び検査する時まで、中性緩衝液内に格納することができる。このように、生化学分析の反応コンポーネントおよび検査コンポーネントは、同じフローセルを用いて並行して実行される。
【００５２】
合成によるシーケンシングおよび検査を実行するサイクルは、繰り返すことができる。十分な回数の反応を行った後に、生成されるデータセットは、生化学分析の反応コンポーネントの線形な結果を示す、各撮像領域の画像データスタックである。例えば、生化学分析が合成によるシーケンシングプロセスである場合、十分な数のヌクレオチド（下述するように、所望の読み取り長さで特定される）を、第一および第二の撮像領域の表面結合したテンプレートに露出した後に、生成されるデータセットは、その画像領域の表面上で同定された個々の二本鎖の位置の線形なシーケンスを示す、各撮像領域の画像データスタックである。
【００５３】
生化学分析に必要な反応時間が検査時間よりも長い場合、フローセルは、少なくとも２つの撮像領域を有し、それぞれが表面を有する。なお、対象となる生物学的分子は、各表面上の複数のスポットに付着される。例えば、生化学分析が合成によるシーケンシングプロセスである場合、上述のように、各表面が二重鎖を付着させた２つ以上のスポットを有するように、各撮像領域の表面に二重鎖が付着される。
【００５４】
撮像領域ごとのスポットの数は、反応時間と検査時間との割合に依存する。例えば、シーケンシング反応が検査の３倍の時間を要する場合、二重鎖を３つのスポットの各表面に付着させることができる。各スポットは、別々に検査される。したがって、撮像領域ごとの合計検査時間は、各スポットの検査に要する時間に撮像領域ごとのスポットの数を乗じた時間である。反応時間は、同じ撮像領域内で同時に処理されるので、１つのスポットに関して反応コンポーネントが要する時間である。したがって、１つの撮像領域内の全てのスポットの検査に要する時間は、他の撮像領域に対してシーケンシング反応を完了する時間の長さにほぼ等しくなる。図１５は、撮像領域内の複数のスポットの概略図を示す図である。
【００５５】
生化学分析の反応時間が検査時間未満である場合、フローセルは、上述のように、３つ以上の撮像領域を含む。３つ以上の撮像領域を含むフローセルを使用する方法は、各々の撮像領域の表面に対する特定の生化学分析に必要な生化学分子を付着させるステップを含む。例えば、生化学分析が合成によるシーケンシングプロセスである場合、上述のように、各撮像領域の表面に二重鎖が付着される。二本鎖の位置が得られると、生化学分析の反応コンポーネントがフローセルの各々の撮像領域で同時に実行される。
【００５６】
一実施態様では、撮像領域の表面は、ポリメラーゼの存在下で標識化ヌクレオチド三リン酸塩に露出される。プライマの３’末端に直接隣接した標識化ヌクレオチドの補足物を含むテンプレート鎖は、添加されたヌクレオチドを組み込む。組み込まれなかったヌクレオチドを取り除く洗浄ステップの後に、第一の撮像領域の表面を検査して、どの二本鎖の位置にラベルが加えられたのかを特定する。それらは、添加されたヌクレオチドを組み込んだ位置にある。第一の撮像領域の表面が検査されている間に、上述のように、他の撮像領域の表面は好適な緩衝液内に保持しておくことができる。第一の撮像領域の表面の検査後に、ラベルを取り除くことができる。
【００５７】
次に、第二の撮像領域の表面が検査され、生化学分析の反応コンポーネント（例えばシーケンシング反応）は、上述のように、第一の撮像領域の表面上で実行される。組み込まれなかったヌクレオチドを取り除く洗浄ステップの後に、第一の撮像領域の表面は、上述のように、第一の撮像領域の表面を再び検査する時まで格納される。したがって、第二の撮像領域の検査（例、撮像）は、第一の撮像領域の反応コンポーネント（例えばシーケンシング）と並行して実行される。第二の撮像領域の表面の検査後に、ラベルを取り除くことができる。
【００５８】
次に、第三の撮像領域の表面が検査され、生化学分析の反応コンポーネント（例えばシーケンシング反応）は、上述のように、第二の撮像領域の表面上で実行される。組み込まれなかったヌクレオチドを取り除く洗浄ステップの後に、第二の撮像領域の表面は、上述のように、第二の撮像領域の表面を再び検査する時まで格納される。したがって、第三の撮像領域の検査（例、撮像）は、第二の撮像領域の反応コンポーネント（例えばシーケンシング）と並行して実行される。第三の撮像領域の表面の検査後に、ラベルを取り除くことができる。
【００５９】
合成によるシーケンシングおよび検査を並行して実行するサイクルは、繰り返すことができる。十分な回数の反応を行った後に、生成されるデータセットは、生化学分析の反応コンポーネントの線形な結果を示す、各撮像領域の画像データスタックである。例えば、生化学分析が合成によるシーケンシングプロセスである場合、十分な数のヌクレオチド（下述するように、所望の読み取り長さで特定される）を、撮像領域の表面結合したテンプレートに露出した後に、生成されるデータセットは、その画像領域の表面上で同定された個々の二本鎖の位置のそれぞれで組み込まれたヌクレオチドの線形シーケンスを示す、各撮像領域の画像データスタックである。
【００６０】
撮像領域の数は、反応時間と検査時間との割合に基づいて増加させることができる。全般的に、撮像領域の数は、反応時間と検査時間との間の倍差と同じにすることができる。したがって、検査の２倍の時間を反応に要した場合、フローセルは２つの撮像領域を含むことができる。反応に３倍の時間を要した場合、フローセルは３つの撮像領域を含むことができ、５倍差に対しては５つの撮像領域、１０倍差に対しては１０の撮像領域、２０倍差に対しては２０の撮像領域などとなる。
【００６１】
本発明による方法は、遺伝子的な癌研究のためのアプリケーションに加えて、デノボシーケンシング、再シーケンシング、ＤＮＡ鑑定、多型同定、例えば一塩基変異多型（ＳＮＰ）の検出を提供する。ＲＮＡシーケンスに適用された、本発明による方法は、代替スプライス部位の同定、コピー数の計数、遺伝子発現の測定、低コピー数で細胞に現れる未知のＲＮＡ分子の同定、どのシーケンスが実際に転写されたのかを特定することによるゲノムへの注釈付け、系統発生関係の特定、細胞分化の解明、および組織工学を容易にすることにも有用である。本発明による方法は、ＲＮＡ翻訳およびタンパク質集合のような他の生体高分子の活性の分析にも有用である。
【００６２】
核酸テンプレートの単一分子シーケンシングのための好適な方法は、得られるシーケンスの精度が参照シーケンスの少なくとも７０％であるように、複数の標識化ヌクレオチドが連続的にプライマに組み込まれるテンプレート依存のシーケンシング反応を行うステップを含む。プライマは、プライマがハイブリダイズされた核酸テンプレートを含む、光学的に分離された基板結合された二本鎖の一部である。二本鎖は、二本鎖が基板上に個々に光学的に解像できるように基板に結合される。
【００６３】
本願明細書に記述されるように、複数の標識化ヌクレオチドは、連続的に１つ以上の個々のプライマ分子に組み込まれる。いくつかの実施態様では、それぞれが光学的に検出可能なラベルを含む、少なくとも３つの連続するヌクレオチドが個々のプライマ分子に組み込まれる。他の実施態様では、それぞれが光学的に検出可能なラベルを含む、少なくとも５個、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または少なくとも１００００の連続するヌクレオチドが個々のプライマ分子に組み込まれる。
【００６４】
得られるシーケンスの精度は、参照シーケンスに対して少なくとも約７０％、参照シーケンスに対して約７５％〜９０％、参照シーケンスに対して約９０〜９９％である。得られるシーケンスの精度は、参照シーケンスに対して９９％を超えられることが好ましい。参照シーケンスは、例えば、分かっている場合はテンプレート核酸分子のシーケンスとするか、または他のシーケンシング方法によって得られるテンプレートのシーケンスとするか、あるいは、異なる源（例えば同じ種の異なる個体または異なる種からの同じ遺伝子）からの対応する核酸のシーケンスとすることができる。
【００６５】
単一分子核酸シーケンシングのための方法は、それぞれが光学的に検出可能なラベルを含む、少なくとも３つの連続するヌクレオチドをプライマに組み込むステップも含む。プライマは、テンプレート／プライマ二本鎖の一部である。テンプレート、プライマまたはその両方は、二本鎖を個別に光学的に解像できるように、固体基板に取り付けられる。
【００６６】
本発明の特定の一実施態様では、４つ全てのヌクレオチドは、各サイクルの生化学コンポーネントの間に添加され、各ヌクレオチドは検出可能なラベルを含む。本発明の非常に好適な一実施態様では、添加されたヌクレオチドに取り付けられるラベルは蛍光標識である。蛍光標識には、これに限定されないが、以下が挙げられる。４−アセトアミド−４’−イソチオシアネートスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアン酸塩；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタリン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホン酸；Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアントイエロー；クマリンおよび誘導体；クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマラン  １５１）；シアニン染料；シアノシン；４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５”−ジブロモピロガロール−スルホナフタレン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’−ジイソチオシアネートジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアネートスチルベン−２，２’−ジスルホン酸）；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアン酸塩（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体；エオシン、エオシンイソチオシアン酸塩、エリトロシンおよび誘導体；エリトロシンＢ、エリトロシン、イソチオシアン酸塩；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体；５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ４’５’−クロロ−６−カルボキシフルオレスセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ，（ＸＲＩＴＣ）；フルオレサミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアン酸塩；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローズアニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体：ピレン、ピレン酪酸塩、スクシンイミジル  １−ピレン；酪酸塩量子ドット；リアクティブレッド４（ＣｉｂａｃｒｏｎＴＭブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）ローダミンおよび誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢ  スルホニルクロリド  ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸ  イソチオシアン酸塩、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアン酸塩（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤ  ７００；ＩＲＤ  ８００；Ｌａ  Ｊｏｌｔａブルー；フタロシアニン；およびナフタロシアニン。好適な蛍光標識は、シアニン−３およびシアニン−５である。蛍光標識以外のラベルは、本発明によって考慮され、他の光学的に検出可能なラベルを含む。
【００６７】
本発明のフローセルの撮像領域のための好適な表面は、ガラスまたは融合シリカスライド上のエポキシド表面、あるいはカバースリップである。なお、低固有蛍光を有するあらゆる表面が本発明に有用である。他の表面には、これに限定されないが、テフロン（登録商標）、高分子電解質多層、その他が挙げられる。本発明に使用する表面の唯一の要件は、低固有蛍光を有し、直接または間接的に核酸を結合する能力を有することである。
【００６８】
好適な一実施態様では、核酸テンプレート分子は基板（本願明細書では表面とも称する）に付着され、本願明細書に教示するように、単一分子シーケンシングによって分析される。核酸テンプレート分子は、テンプレート／プライマ二本鎖が個々に光学的に解像できるように、表面に付着される。本発明に使用する基板は、二次元または三次元とすることができ、平坦面（例えばガラススライド）を備えているか、または形成することができる。基板には、ガラス（例、細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ：ＣＰＧ）、石英、プラスチック（例、ポリスチレン（低架橋および高架橋ポリスチレン））、ポリカーボネート、ポリプロピレンおよびポリ（メチメタクリレート））、アクリルコポリマー、ポリアミド、シリコン、金属（例、アルカンチオレート誘導体化金）、セルロース、ナイロン、ラテックス、デキストラン、ゲルマトリクス（例、シリカゲル）、ポリアクロレイン、または複合物が挙げられる。
【００６９】
好適な三次元基板には、例えば、球、微粒子、ビード、膜、スライド、プレート、微小チップ、管（例えば毛管）、マイクロウェル、マイクロ流体デバイス、チャネル、フィルタ、または核酸の定着に好適な他の構造が挙げられる。基板には、テンプレート核酸またはプライマの集団を含む領域を有することができる、平面のアレイまたはマトリクスが挙げられる。実施例には、ヌクレオシド誘導体化ＣＰＧおよびポリスチレンスライド、誘導体化磁気スライド、ポリエチレングリコールと融合したポリスチレンなどが挙げられる。
【００７０】
一実施態様では、基板は、最適な光学処理および核酸の付着を可能にするようにコーティングされる。本発明に使用する基板は、バックグラウンドを減じるように処理されることもできる。例示的なコーティングには、エポキシド、および（例えば、ストレプトアビジンのような結合分子による）誘導体化エポキシドが挙げられる。表面は、分析のために付着させる核酸（例、核酸テンプレート分子、プライマ、またはテンプレート分子／プライマ二本鎖）の位置決めを向上させるように処理されることもできる。このように、本発明による表面は、１つ以上の荷電層（例、負荷電）で処理して、荷電分子（例、負に荷電した標識化ヌクレオチド）をはね返すようにすることができる。例えば、本発明による基板は、ポリアクリル酸に続けてポリアリルアミンで処理して、高分子電解質多層を形成することができる。ポリアクリル酸層のカルボキシル基は、負に荷電するので、負に荷電した標識化ヌクレオチドをはね返し、検出のためのラベルの位置決めを向上させる。基板に適用されるコーティングまたはフィルムは、実質的に劣化または基板から分離せずに、以降の処理ステップ（例、フォト露光、沸騰、焼成、暖洗浄剤を含む液体への浸漬）に耐えることができなければならない。
【００７１】
基板コーティングの例には、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によるガラススライド製品に適用されるような、３−アミノプロピルトリメトキシシランの蒸気相コーティングが挙げられる。加えて、全般的に、疎水性基板コーティングおよびフィルムは、基板表面上の親水性分子の一様分布を補助する。このような基板コーティングまたはフィルムを用いる本発明の実施態様では、実質的にプライマの伸張ステップおよび検出ステップを妨げないコーティングまたはフィルムが好適であることが重要である。加えて、基板に適用されるあらゆるコーティングまたはフィルムが、テンプレート分子の基板への結合を増加させるか、または少なくとも実質的にテンプレートの結合を損なわないことが好ましい。
【００７２】
様々な方法を使用して、核酸テンプレート分子を基板の表面に定着または固定させることができる。固定化は、表面への直接的または間接的な接着を通じて達成することができる。接着は、共有結合リンケージによるものとすることができる。Ｊｏｏｓ他、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４７：９６−１０１、１９９７；Ｏｒｏｓｋａｒ他、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２：１５４７−１５５５、１９９６；およびＫｈａｎｄｊｉａｎ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｒｅｐ．１１：１０７−１１５、１９８６を参照のこと。好適な付着は、表面上に集積させたエポキシドへの、テンプレートまたはプライマの末端ヌクレオチドの直接的なアミン結合である。この結合は、非共有結合リンケージを通じたものとすることもできる。例えば、ビオチン−ストレプトアビジン（Ｔａｙｌｏｒ他、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｄ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．２４：１４４３、１９９１）、および抗ジゴキシゲニンを有するジゴキシゲニン（Ｓｍｉｔｈ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１１２２、１９９２）は、核酸を表面または類似物に定着させるための一般的なツールである。別様には、付着は、疎水性チェーンを脂質単層または二重層に定着させることによって達成することができる。核酸分子を基板に付着させるための従来技術の他の方法も使用することができる。
【００７３】
あらゆる重合酵素を本発明に使用することが可能である。好適なポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を減じたクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）である。全般的に本発明に有用な核酸ポリメラーゼには、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、および前述したもののうちのいずれかの突然変異型または改変型が挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼおよびそれらの特性は、とりわけ、ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、ＫｏｍｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９１）に詳述されている。本発明に有用な既知の従来のＤＮＡポリメラーゼには、これに限定されないが、ピロコッカス  フリオサス（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ他、１９９１、Ｇｅｎｅ、１０８：１、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ピロコッカス  ウォエセイ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈｉｎｎｉｓｄａｅｌｓ他、１９９６、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０：１８６−８、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、サーマス  サーモフィルス（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＭｙｅｒｓおよびＧｅｌｆａｎｄ、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：７６６１）、バチルス  ステアロサーモフィラスＤＮＡポリメラーゼ（ＳｔｅｎｅｓｈおよびＭｃＧｏｗａｎ、１９７７、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ４７５：３２）、サーモコッカス  リトラリス（ＴＩｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＶｅｎｔＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼとも称される、Ｃａｒｉｅｌｌｏ他、１９９１、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓ、１９：４１９３、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、９°ＮｍＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ストッフェルフラグメント、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社  ＵＫ）、ＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒＴＭ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、サーモトーガ  マリティマ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｉａｚおよびＳａｂｉｎｏ、１９９８  Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｍｅｄ．Ｒｅｓ、３１：１２３９）、サーマス  アクアチクス（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎ他、１９７６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ、１２７：１５５０）、ＤＮＡポリメラーゼ、ピロコッカス  コダカラエンシスＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｇｉ他、１９９７、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５０４）、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ（サーモコッカスｓｐ．ＪＤＦ−３由来、特許出願ＷＯ０１３２８８７）、ピロコッカスＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼとも称される、Ｊｕｎｃｏｓａ−Ｇｉｎｅｓｔａ他、１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１６：８２０、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ＵｌＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ（好熱性サーモトーガ  マリティマ由来；ＤｉａｚおよびＳａｂｉｎｏ、１９９８  Ｂｒａｚ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ、３１：１２３９；ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（サーモコッカスゴルゴナリアス由来、Ｒｏｓｈｅ  Ｍ���ｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＬｅｃｏｍｔｅおよびＤｏｕｂｌｅｄａｙ、１９８３、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓ．１１：７５０５）、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ他、１９８１、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１１２）、および古細菌ＤＰ１Ｉ／ＤＰ２  ＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｃａｎｎ他、１９９８、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９５：１４２５０−−＞５）が挙げられる。
【００７４】
他のＤＮＡポリメラーゼには、これに限定されないが、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）、９°ＮｍＴＭ、ＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒＴＭ、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ、Ｔｌｉ、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント、ＶｅｎｔＴＭおよびＤｅｅｐ  ＶｅｎｔＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ、ＪＤＦ−３、およびそれらの突然変異体、変種、および誘導体が挙げられる。本発明に有用な逆転写酵素には、これに限定されないが、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＦｅＬＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＡＭＶ、ＭＭＴＶ、ＭｏＭｕＬＶ、および他のレトロウイルス由来の逆転写酵素が挙げられる（Ｌｅｖｉｎ、Ｃｅｌｌ  ８８：５−８（１９９７）；Ｖｅｒｍａ、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．４７３：１−３８（１９７７）；Ｗｕ他、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３：２８９−３４７（１９７５）を参照のこと）。
【００７５】
本発明の好適な一実施態様では、アミンの直接付着は、二本鎖としてプライマ、テンプレート、またはその両方をエポキシド表面に付着させるために使用される。プライマまたはテンプレートは、表面上の二本鎖の部位を特定するために、光学的に検出可能なラベルを備える。二本鎖の少なくとも一部は、表面上の他の二本鎖から光学的に解像できなければならない。表面は、不動態化がない限り蛍光を発する可能性がある表面の一部を占有する試薬によって不動態化されることが好ましい。最適な不動態化試薬には、アミン、リン酸塩、水、硫酸塩、洗浄剤、および元来のまたは蓄積する表面の蛍光を減じる他の試薬が挙げられる。次いで、シーケンシングは、プライマへの相補的塩基組み込みを促進する条件下で、ポリメラーゼの存在下で１つ以上の標識化ヌクレオチドを提供することによって達成される。好適な一実施態様では、（サイクルごとに）１度に１つの塩基が添加され、全ての塩基が同じラベルを有する。各組み込みサイクルの後には洗浄ステップがあり、ラベルは、取り除かれずに中和されるか、または組み込まれたヌクレオチドから取り除かれる。塩基添加の所定のサイクル数の完了後に、個々の二本鎖に対して線形シーケンスデータがコンパイルされる。後述するシーケンスコンパイルおよびアラインメントには、多数のアルゴリズムが利用可能である。
【００７６】
再シーケンシングにおいて、シーケンスアラインメントのための好適な実施態様では、得られたシーケンスと、ルックアップテーブルフォーマットの標的からの、同じ長さの参照シーケンスまたは同じ長さの１または２塩基内のデータベースと比較する。好適な一実施態様では、ルックアップテーブルは、参照シーケンスおよび１つまたは２つのエラーを有する所定の長さのシーケンス（例えば、総当りで１塩基または２塩基のエラーを有する９量体）に関する完全一致を含む。得られたシーケンスは、次いで、ルックアップテーブル上のシーケンスと照合され、テーブル内のシーケンスへの一致の一意性を反映するスコアが提供される。得られたシーケンスは、次いで、得られたシーケンスが参照テーブルの一部に最も一致する位置に基づいて、参照シーケンスに合わせられる。アラインメントプロセスに関する詳細を下記の実施例に記述する。
【００７７】
本発明の別の実施例では、蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）を使用して、本発明の単一分子シーケンシングにおいて、組み込まれたヌクレオチドから信号を生成する。ＦＲＥＴは、Ｂｒａｓｌａｙｓｋｙ他、１００  ＰＮＡＳ：３９６０−６４（２００３）に記述されているように行うことができ、参照することにより本願明細書に援用される。一実施態様では、ドナーのフルオロフォアが二本鎖のプライマの一部に付着され、アクセプタのフルオロフォアが、組み込まれるべきヌクレオチドに付着される。他の実施態様では、ドナーは、テンプレート、ポリメラーゼ、または二本鎖に近接して基板に付着される。いずれにせよ、組み込んだときに、ドナーの励起がアクセプタにおいて検出可能な信号を生成して組み込みを示す。
【００７８】
本発明の別の実施態様では、表面結合した二本鎖への組み込みのために表面に提供されるヌクレオチドが、可逆性ブロッカを含む。好適なブロッカは、ヌクレオチドの糖成分上の３’ヒドロキシ基に付着される。例えば、試料へのヒドロキシル添加によって取り除かれるエチルシアニン（−ＯＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）ブロッカは、有用な除去可能なブロッカである。他の有用なブロッカには、３’ヒドロキシルの位置に配置されたフルオロフォア、および除去可能で、次のヌクレオチドの添加のために完全なヒドロキシルを残すが、取り除く前に更なる重合を阻止する化学的に不安定な基が挙げられる。
【００７９】
別の実施態様では、ポリメラーゼおよび標的核酸を含む個々に光学的に解像可能な複合体が、ゼロモード導波管における相補的塩基添加のために、互いに対して配向される。一実施態様では、金属膜内にサブ波長孔を備えたゼロモード導波管のアレイを使用して、単一分子レベルでＤＮＡまたはＲＮＡをシーケンスする。ゼロモード導波管は波長遮断を有する導波管であり、波長遮断より上のいかなる伝播モードも導波管内に存在しない。照明は、導波管の入口への入射を急速に衰えさせるので、ごくわずかな観察量しか提供しない。一実施態様では、導波管は、顕微鏡スライドまたはカバースリップ上の薄い金属膜内の小さな孔で構成されている。ポリメラーゼは、ゼロモード導波管のアレイ内に固定される。導波管はテンプレート／プライマの二本鎖に露出され、該二本鎖は、酵素活性部位によって捕獲される。次いで、蛍光標識化ヌクレオチドの種を含む溶液が導波管に提供され、蛍光のバーストとして洗浄ステップの後に組み込みが観察される。
【００８０】
用いられるラベルのタイプに好適なあらゆる検出方法を使用することが可能である。したがって、例示的な検出方法には、放射能検出、光学的吸収検出（例、紫外可視吸収度検出）、光学的放射検出（例、蛍光または化学ルミネセンス）が挙げられる。例えば、伸張プライマは、使用される方法に基づいて、各基板の全てまたは一部を同時または連続的に走査することによって、基板上で検出することができる。蛍光ラベリングの場合、基板上の選択領域は、Ｆｏｄｏｒ（米国特許第５，４４５，９３４号）およびＭａｔｈｉｅｓ他（米国特許第５，０９１，６５２号）が記述しているような蛍光顕微鏡装置を使用して、１つずつまたは行ごとに連続的に走査することができる。単一分子から蛍光を検出することができるデバイスには、走査トンネル顕微鏡（ｓｉＭ）および原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）が挙げられる。ハイブリッド化パターンは、Ｙｅｒｓｈｏｖ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．９３：４９１３（１９９６）に記述されるような、好適な光学部品（Ｐｌｏｅｍ、ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｎｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍａｓｏｎ、Ｔ．Ｇ．Ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、ｐｐ．１−１１（１９９３））を備えたＣＣＤカメラ（例、モデルＴＥ／ＣＣＤ５１２ＳＦ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｔｒｅｎｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）を使用して走査するか、またはＴＶ観察によって撮像することも可能である。放射線信号の場合、蛍光体撮像装置（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ他、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１３：５６６、１９９０；Ｄｒｍａｎａｃ他、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１３：５６６、１９９２；１９９３）を使用することが可能である。撮像機器の他の販売会社には、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、Ｍａｓｓ．、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｇｅｎｓｃａｎ．ｃｏｍ）、Ｇｅｎｉｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗａｔｅｒｌｏｏ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ；Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｃｏｎｆｏｃａｌ．ｃｏｍ）、およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．が挙げられる。このような検出方法は、複数の付着させたテンプレート核酸の同時走査の達成に特に有用である。
【００８１】
複数の手法を使用して、単一の核酸分子への蛍光標識化ヌクレオチドの組み込みを検出することができる。光学装置には、ニアフィールド走査顕微鏡検査、ファーフィールド共焦点顕微鏡検査、広視野落射照明、光散乱、暗視野顕微鏡法、フォトコンバージョン、単一および／または多光子励起、スペクトル波長識別、フルオロフォア識別、エバネセント波照明、および全反射蛍光（ｔｏｔａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：ＴＩＲＦ）顕微鏡法が挙げられる。全体的に、特定の方法は、カメラを備えた顕微鏡を使用してのレーザー活性化蛍光の検出を伴う。好適な光子検出システムには、これに限定されないが、光ダイオードおよび高感度ＣＣＤカメラが挙げられる。例えば、高感度電荷結合素子（ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｄ  ｃｈａｒｇｅ  ｃｏｕｐｌｅ  ｄｅｖｉｃｅ：ＩＣＣＤ）カメラを使用することができる。表面付近の流体における個々の蛍光色素分子の撮像にＩＣＣＤカメラを使用することにより、多数の利点が提供される。例えば、ＩＣＣＤ光学装置によって、フルオロフォアの一連の画像（動画）を得ることが可能である。
【００８２】
本発明のいくつかの実施態様は、二次元撮像にＴＩＲＦ顕微鏡法を使用する。ＴＩＲＦ顕微鏡法は、全反射励起光を使用し、これは既知の技術である。Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｎｉｋｏｎ−ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ．ｊｐ／ｅｎｇ／ｐａｇｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｔｉｒｆ．ａｓｐｘを参照のこと。特定の実施態様では、検出は、エバネセント波照明および全反射蛍光顕微鏡法を使用して行われる。エバネセント明視野は、表面に設定して、例えば蛍光標識化核酸分子を撮像することができる。レーザー光線が、液体と固体基板（例、ガラス）との間のインターフェースで全反射されるときに、励起光線はほんの短い距離だけ液体を貫通する。光電場は、反射インターフェースにおいて突然に途切れることはないが、その強度は、距離によって指数的に低下する。この表面電磁場（「エバネセント波」と呼ばれる）は、インターフェース付近の液体において蛍光分子を選択的に励起することができる。インターフェースでの薄いエバネセント光電場は、低バックグラウンドを提供し、可視波長において、高信号対雑音比での単一分子の検出を容易にする。
【００８３】
エバネセント場は、ポリメラーゼの存在下で、付着されるテンプレート／プライマに蛍光標識化ヌクレオチドを組み込んだときに、それらを撮像することもできる。次いで、全反射蛍光顕微鏡法を使用して、付着されたテンプレート／プライマ二本鎖および／または組み込まれたヌクレオチドを単分子解像度で視覚化する。
【００８４】
核酸テンプレート分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。核酸テンプレート分子は、タンパク質、脂質、および非テンプレート核酸のような、様々な他のコンポーネントを含む生物学的試料から分離することができる。核酸テンプレート分子は、動物、植物、バクテリア、真菌、または他の細胞生物から得られる、あらゆる細胞物質から得ることができる。本発明の生物学的試料は、ウイルス粒子または調合剤を含む。核酸テンプレート分子は、有機体から、または有機体から得た生物学的試料、例えば血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、便、および組織から直接得ることが可能である。あらゆる組織または体液の標本は、本発明で使用する核酸のための源として使用することが可能である。核酸テンプレート分子は、一次細胞培養または細胞株のような培養細胞から分離することも可能である。テンプレート核酸が得られる細胞または組織は、ウイルスまたは他の細胞内の病原体で汚染される可能性がある。試料は、生物学的標本、ｃＤＮＡライブラリ、またはゲノムＤＮＡから抽出された全ＲＮＡとすることもできる。
【００８５】
一般的に、生物学的試料から得られた核酸は断片化されて、分析に好適な断片を生成する。一実施態様では、生物学的試料からの核酸は、超音波処理によって断片化される。核酸テンプレート分子は、米国特許出願公開第２００２／０１９０６６３（Ａ１）号（２００３年１０月９日発行）に記述されているように得ることができ、その教示するところは全体が本願明細書に援用される。全般的に、核酸は、Ｍａｎｉａｔｉｓ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、ｐｐ．２８０−２８１（１９８２）のような様々な手法によって、生物学的試料から抽出することができる。全般的に、個々の核酸テンプレート分子は、約５塩基〜約２０キロ塩基となりうる。核酸分子は、単鎖、二本鎖、または、単鎖領域を有する二本鎖（例、ステムおよびループ構造）であり得る。
【００８６】
生物学的試料は、本願明細書に記述されるように、洗浄剤または界面活性剤の存在下で均質化または分画することが可能である。緩衝液内の洗浄剤の濃度は、約０．０５％〜約１０．０％とすることが可能である。洗浄剤の濃度は、洗浄剤が溶液に可溶な状態を保つ最高濃度とすることができる。好適な一実施態様では、洗浄剤の濃度は０．１％〜約２％である。特に、変性していないマイルドな洗浄剤は、試料を可溶化するように作用することができる。洗浄剤は、イオン性または非イオン性とすることが可能である。非イオン洗剤の例には、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘシリーズ（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００  ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ＸＯＨ，ｘ＝９−１０、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００Ｒ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４  ｘ＝７−８）、オクチルグルコシド、ポリオキシエチレン（９）ドデシルエーテル、ジギトニン、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ６３０  オクチルフェニルポリエチレングリコール、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（βＯＧ）、ｎ−ドデシル−β、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０  ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０  ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート、ポリドカノール、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）、ＮＰ−４０  ノニルフェニルポリエチレングリコール、Ｃ１２Ｅ８（オクタエチレングリコール  ｎ−ドデシルモノエーテル）、ヘキサエチレングリコール  モノ−ｎ−テトラデシルエーテル（Ｃ１４ＥＯ６）、オクチル−β−チオグルコピラノシド（オクチルチオグルコシド、ＯＴＧ）、エマルゲン（Ｅｍｕｌｇｅｎ）、およびポリオキシエチレン１０ラウリルエーテル（Ｃ１２Ｅ１０）、のようなトリトンが挙げられる。イオン洗浄剤（アニオン性またはカチオン性）の例には、デオキシコール酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウロイルサルコシン、および臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）が挙げられる。双性イオン性試薬は、Ｃｈａｐｓ、双性イオン３−１４、および３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナートのような、本発明の浄化スキームに使用することも可能である。また、別の洗浄剤または界面活性剤の有無に関わらず、尿素を添加することが可能であることも考慮される。
【００８７】
溶解または均質化溶液は、還元剤のような他の薬剤をさらに含むことができる。このような還元剤の例には、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール、ＤＴＥ、ＧＳＨ、システイン、システアミン、トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）、または亜硫酸の塩が挙げられる。
【００８８】
当業者には、本発明の他の側面および利点は、添付図面、本発明の詳細な説明、および実施例を考慮すれば明らかとなろう。
【００８９】
本発明は、テンプレート依存の合成によるシーケンシング反応に関して記述される。全般的に、反応は、上述のように、テンプレート／プライマ二本鎖を２つ以上の撮像領域のエポキシド表面への付着を含む。平行した合成によるシーケンシング反応は、第二の撮像領域の組み込まれたヌクレオチドの光学的検出を使用して、１つの撮像領域の表面上で実行され、次いで、両方の撮像領域のシーケンスコンパイルが行われる。本発明の方法を使用して、参照シーケンスのデノボシーケンシングまたは再シーケンシングのいずれかが可能である。本願明細書の開示を考慮すれば当業者には明らかなように、本発明の方法を使用して、部分的なシーケンシングを行うこともできる。好適な一実施態様では、単一の二本鎖分子は、それらをエポキシド表面に配置してそれらの位置を検査することによって並行してシーケンシングされる。前記実施態様では、他の二本鎖から光学的に分離された二本鎖だけをシーケンシングに使用する。単一の二本鎖シーケンシングは、テンプレート核酸の増幅を必要としない。増幅されたバルクシーケンシングも本発明の方法に使用することができる。
【００９０】
全体的に、エポキシドコーティングされたガラス表面は、テンプレート、プライマ、またはその両方にアミンを直接付着させるために使用される。テンプレートおよびプライマ分子の末端へのアミンの付着は、下述するような末端転移酵素を使用して達成される。プライマ分子は、二本鎖を形成するためにテンプレートにハイブリダイズするように特別に合成することができる。好適な一実施態様では、下述するように、テンプレート断片はポリアデニル化され、相補的ポリ（ｄＴ）オリゴがプライマとして使用される。このように、予め結合された汎用プライマを有する表面を、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡから得た異種断片のシーケンシングのために調整した。
【００９１】
本発明によるシーケンシングは、高スループットのシーケンス情報を達成するために、試料調製、表面調製およびオリゴ付着、検査、および分析を併用する。一実施態様では、光学的に検出可能なラベルは、エポキシド表面に直接付着させたテンプレートに付着させた。個々のテンプレート分子を、それらの表面上の位置を定めるために撮像した。次いで、プライマを添加して表面上に二本鎖を形成し、添加されたヌクレオチドが、プライマの３’末端の近くの（テンプレート上の）５’末端のテンプレート上の次に利用可能なヌクレオチドに対して相補的である位置における光ラベルを含む個々のヌクレオチドを、プライマの３’端部へ組み込むためにポリメラーゼの存在下で添加した。非結合ヌクレオチドが洗い流され、捕捉剤が添加されて、表面が撮像される。単一の二本鎖（またはプライマ）を含む先に述べた位置における光信号は、組み込みイベントとして数えられる。ラベルが取り除かれ、残りのリンカーがキャップされてシステムが再び洗浄される。サイクルは、残りのヌクレオチドに関して繰り返される。所望の長さのテンプレートのシーケンシングを完了するに必要な回数だけ全サイクルを行う。所望の回数のサイクルが完了すると、その結果は、図１６に示されるように、コンピュータデータベースで表される画像スタックである。初期の個々の二本鎖を含んだ表面の各スポットに関しては、塩基が任意の所与のサイクルで組み込まれたかどうかに対応して、一連の明暗の画像座標が現れる。例えば、テンプレートのシーケンスが、ＴＡＣＧＴＡＣＧであり、ヌクレオチドがＣＡＧＵ（Ｔ）の順で表された場合、二本鎖は、第一のサイクル（Ｃの提示）に対して「暗」（すなわち、検出可能な信号がない）となるが、第二のサイクルでは信号を示す（Ａの提示。これは、テンプレートのシーケンス内の第一のＴに相補的である）。同じ二本鎖は、ヌクレオチドが、テンプレート内の次に利用可能な塩基Ｃに相補的であるので、Ｇの提示があれば信号を生成する。次のサイクル（Ｕの提示）のときには、テンプレート内の次の塩基がＧであるので二本鎖は暗となる。多数のサイクルを提示したときに、テンプレートのシーケンスは、画像スタックを通じて構築される。シーケンシングデータは、次いで、下述するように再シーケンシングのためにアライナに送られるか、またはプライマに組み込まれたヌクレオチドの線形順序としてデノボシーケンシングするためにコンパイルされる。
【００９２】
本発明を実行するための多数の代替がある。例えば、発明者らは、アミンを直接付着させてプライマをエポキシド表面に付着させているが、テンプレートを最初に付着させて二本鎖を付着させてもいる（すなわち、二本鎖を最初に形成し、次いで表面に付着させている）。また、発明者らは、結合対の１つの部分を有するエポキシド表面を官能化し、結合対の他の部分を、表面への付着のためにテンプレート、プライマ、またはその両方に付着させている。例えば、表面をストレプタビジンによって官能化し、ビオチンをテンプレート、プライマのいずれか、またはその両方の末端に付着させた。
【００９３】
本発明に使用すべき撮像システムは、単一の蛍光分子を解像することができるように、ある倍率でのシーケンシング表面の十分な照明を提供するあらゆるシステムとすることができる。下述する実施例に使用される撮像システムを図１７に示す。全体的に、システムは３つレーザーを備え、１つは「緑色」光を発し、１つは「赤色」光を発し、赤外線レーザーが焦点合わせを補助する。ビームは、図１７に示されるように、一連の対物レンズおよびミラーを通して透過され、画像に焦点が合わせられる。撮像は、全反射対物レンズ（ニコン製）を備えたニコンＴＥ−２０００顕微鏡を反転させて達成される。
【００９４】
概ね上述したように生成された画像スタックから得られた、シーケンスの結果のアラインメントおよび／またはコンパイルは、（例えば、エラー、突然変異など）可能なシーケンスの変化を考慮したルックアップテーブルを用いる。基本的に、本願明細書に記述されるように得られたシーケンシング結果は、１つまたは２つの塩基エラーを加えた全ての可能な参照シーケンスを含むルックアップ型テーブルと比較される。
【００９５】
開示された実施態様は、例示的なものである。本発明は、開示された例示的実施態様によって、またはこれらに限定されるものではない。また、開示された実施態様の様々な変更および組み合わせが可能であり、本開示の範囲内に含まれる。当業者は、ルーチンの実験法以上のものを用いなくても、本願明細書に記載された本発明の特定の態様には多くの同等物があることを認識するであろうし、または検査することが可能であろう。当該の同等物は、以下の請求項に包含することを意図するものである。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、本発明のフローセルの概略図である。
【図２】図２は、フローセルの座標系の概略図である。
【図３】図３は、２つの撮像領域がそれぞれ３つのスポットを備え、同じホルダーに取り付けられた別個のフローセルである、２つの撮像領域ＡおよびＢの概略図である。
【図４】図４は、単一のフローセルの表面が、別個の流体接続を有する別個の領域に分割された、２つの撮像領域ＡおよびＢの概略図である。
【図５Ａ】図５Ａは、複数のチャネルを有するフローセルの一実施態様の概略図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、並列する疎水性チャネル（斜線部）および親水性チャネル（無線部）の概略図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、疎水および親水領域によって作り出されるチャネルを有するフォローセルの概略図である。
【図６】図６は、円形環状部におけるスポットの近似を示す図である。
【図７】図７は、フローセルの例示的な一実施態様の略上面図である。
【図８Ａ】図８Ａは、フローセルの第一の実施態様を構成するコンポーネントの上面および側面を示す、図７のフローセルの第一の実施態様の分解斜視図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、コンポーネントの底面および側面を示す、図８Ａのフローセルの分解斜視図である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、２つの基板を組み立てた、図８Ｂと同様の斜視図である。
【図９Ａ】図９Ａは、フローセルの第二の実施態様を構成するコンポーネントの上面および側面を示す、図７のフローセルの第二の実施態様の分解斜視図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、コンポーネントの底面および側面を示す、図９Ａのフローセルの分解斜視図である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、第一の基板に配置された接着フィルムを備えた、図９Ｂと同様の斜視図である。
【図９Ｄ】図９Ｄは、図９Ａ〜９Ｃの完全に組み立てたフローセルの斜視図である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、完全に組み立てた例示的な実施態様による斜視図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、注入ブロックが配置されている、図１０Ａのフローセルの斜視図である。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、図１０Ｂのフローセルの底面斜視図である。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、注入ブロックの例示的な実施態様による斜視図である。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、注入ブロックが配置された後の、図１０Ｂのフローセルの斜視図である。
【図１０Ｆ】図１０Ｆは、排出ブロックが配置されている、図１０Ｅのフローセルの斜視図である。
【図１０Ｇ】図１０Ｇは、図１０Ｆのフローセルの底面斜視図である。
【図１０Ｈ】図１０Ｈは、排出ブロックが配置された後の、図１０Ｆに示されるフローセルの例示的な実施態様による斜視図である。
【図１０Ｉ】図１０Ｉは、注入後に注入ブロックおよび排出ブロックを取り除いた、図１０Ｈのフローセルの斜視図である。
【図１１】図１１は、図１０Ｈに示されるフローセルの例示的な実施態様による分析実験の実行に使用することができる装置の概略図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、フローチャックに配置されている、反転されたフローセルの斜視図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、図１２Ａに示されるフローセルの底面斜視図である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、フローチャックに配置された後の、図１２Ａに示されるフローセルの斜視図である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、フローチャックに配置されている、反転されたフローセルの斜視図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、図１３Ａに示されるフローセルの底面斜視図である
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、フローチャックに配置された後の、図１３Ａに示されるフローセルの斜視図である。
【図１４】図１４は、デュアルフローセルアセンブリの斜視図である
【図１５】図１５は、生化学分子を付着させる複数のスポットを有する撮像領域の概略図である。
【図１６】図１６は、画像スタックと見なされる分子を示す例示的な概略図である。
【図１７】図１７は、本発明の例示的な撮像システムを示す図である。
【図１８Ａ】図１８Ａは、フローセルごとの標的数に対する、対象となる標的核酸のシーケンス長さとの評価を示すチャートの図である。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、スポット直径に対する、対象となる標的核酸のキロ塩基との評価を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【国際調査報告】
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