(57)【要約】本発明は、緑藻種および組成物、高脂質含量を生産する藻類、高ＣＯ２に対する耐性を有する藻類、および／または、廃水中で成長することが可能な藻類を特定する方法、ならびに、脂質生産、廃水改善、廃ガス改善、および／またはバイオマス生産のためにそのような藻類を使用するための方法に関する。第１局面において、本発明は、単離Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種組成物であって、その単離Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種ゲノムが、配列番号１（ＩＴＳ−１２４９ｂｐ）、配列番号２（ｒｂｃＬ−１３９３ｂｐ）、配列番号３（ＩＴＳ１−ＩＴＳの５０２−７３９）、配列番号４（ＩＴＳ２−ＩＴＳの８９９−１１３７）、配列番号５（ＩＴＳ−８２７ｂｐ）、および配列番号６（ｒｂｃＬ−１１６０ｂｐ）、またはその相補体から成る群から選ばれる、一つ以上の核酸配列を含む、組成物を提供する。
2009536830.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種組成物であって、前記単離Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種のゲノムが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、またはその相補体から成る群から選ばれる一つ以上の核酸配列を含む、組成物。
【請求項２】
前記単離Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種ゲノムが、配列番号３の核酸配列を含む、請求項１に記載の、単離Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種組成物。
【請求項３】
前記単離Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種ゲノムが、配列番号４の核酸配列を含む、請求項１に記載の、単離Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種組成物。
【請求項４】
前記単離Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種ゲノムが、配列番号５の核酸配列を含む、請求項１に記載の、単離Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種組成物。
【請求項５】
前記単離Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種ゲノムが、配列番号１の核酸配列を含む、請求項１に記載の、単離Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種組成物。
【請求項６】
実質的に純粋な培養物であって：
（ａ）増殖培地；および、
（ｂ）請求項１〜５のいずれか１項の単離Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種組成物
を含む培養物。
【請求項７】
藻類培養システムであって：
（ａ）光バイオリアクター；および、
（ｂ）請求項６の実質的に純粋な培養物
を含むシステム。
【請求項８】
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種を培養することを含む、脂質単離のための方法であって、前記Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種のゲノムが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、またはその相補体から成る群から選ばれる一つ以上の核酸配列を含み、前記培養が、前記Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種の増殖、および前記Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種からの脂質の抽出に好適な条件下で行われる、方法。
【請求項９】
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種を培養することを含む、廃水から栄養素を除去するための方法であって、前記Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種のゲノムが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、またはその相補体から成る群から選ばれる一つ以上の核酸配列を含み、前記培養が、前記Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種の増殖に好適な条件下で行われ、かつ、前記培養が、前記廃水中の栄養素が前記Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種によって除去される条件下で、少なくとも５％の廃水を含む培養培地中で行われる、方法。
【請求項１０】
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種を培養することを含む、廃ガスから栄養素を除去するための方法であって、前記Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種のゲノムが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、またはその相補体から成る群から選ばれる一つ以上の核酸配列を含み、前記培養が、前記Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種の増殖に好適な条件下で行われ、かつ、前記培養が、廃ガス中の栄養素が前記Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種によって除去される条件下で、前記廃ガスを含む培養培地中で行われる、方法。
【請求項１１】
前記培養Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種から藻類タンパクおよび／またはバイオマス成分を収集することをさらに含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種を培養することを含む、バイオマスを生産するための方法であって、前記Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種のゲノムが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６、またはその相補体から成る群から選ばれる一つ以上の核酸配列を含み、前記培養が、前記Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種の増殖、および前記培養Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種からの藻類タンパクおよび／またはバイオマス成分の収集に好適な条件下で行われる、方法。
【請求項１３】
前記Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種ゲノムが、配列番号３の核酸配列を含む、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種ゲノムが、配列番号４の核酸配列を含む、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種ゲノムが、配列番号５の核酸配列を含む、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種ゲノムが、配列番号１の核酸配列を含む、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００６年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／８０００７７号に対する優先権を主張する。米国仮特許出願第６０／８０００７７号は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、藻類、藻類選択法、および、種々の製品の製造のために藻類を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
大気中のＣＯ２およびその他の温室効果ガス（メタン、クロロフルオロカーボンなど）による地球規模の温暖化、および、栄養素（例えば、窒素およびリン酸塩）およびその他の汚染物質による広範な水質汚染は、特に大きな環境不安とされる。汚染防止およびコントロールのために、多くの従来の技術および方法の利用が可能であるが、これらの方法は、通常、きわめて高価で、高度のエネルギー消費を伴う。これらのシステムから生成される大量の汚泥および／または廃液は、処理が難しく、さらに二次汚染を引き起こす危険性を抱える。石油、天然ガス、石炭、および核エネルギーは、今日使用されるエネルギーの主要供給源であるが、その維持は不可能である。エネルギー消費が増すにつれ、これら再生不能の化石燃料の天然埋蔵量は急激に縮小する。例えば、現在の消費率で行くと、現在特定されている石油埋蔵量は約５０年以下しか続かない。化石燃料の生産および消費はまた、地域的、および地球規模の大気および水質汚染の主要原因でもある。
【０００４】
廃液中の栄養素およびその他の汚染物質を分解し、それらを除去することが可能な遺伝子工学的に加工された細菌システムが設計されているようであるが、廃棄栄養素を再生可能なバイオマスに効果的に転換し、リサイクルすることはできていない。多くの油生産農産物、例えば、大豆、菜種、ひまわり種子、および棕櫚種子は、バイオジーゼル用の飼料供給源であるが、これらの農産物は、廃液処理を十分に実行することはできない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
第１局面において、本発明は、単離Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種組成物であって、その単離Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種ゲノムが、配列番号１（ＩＴＳ−１２４９ｂｐ）、配列番号２（ｒｂｃＬ−１３９３ｂｐ）、配列番号３（ＩＴＳ１−ＩＴＳの５０２−７３９）、配列番号４（ＩＴＳ２−ＩＴＳの８９９−１１３７）、配列番号５（ＩＴＳ−８２７ｂｐ）、および配列番号６（ｒｂｃＬ−１１６０ｂｐ）、またはその相補体から成る群から選ばれる、一つ以上の核酸配列を含む、組成物を提供する。
【０００６】
第２局面では、本発明は、実質的に純粋な培養物であって：
（ａ）増殖培地；および、
（ｂ）本発明の第３局面の単離Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種
を含む培養物を提供する。
【０００７】
第３局面では、本発明は、藻類培養システムであって：
（ａ）光バイオリアクター；および、
（ｂ）本発明の第２局面の実質的に純粋な培養物
を含むシステムを提供する。
【０００８】
第４局面では、本発明は、脂質単離、廃液改善、廃ガス改善、および／またはバイオマス生産のための方法であって、ゲノムが、配列番号１（ＩＴＳ−１２４９ｂｐ）、配列番号２（ｒｂｃＬ−１３９３ｂｐ）、配列番号３（ＩＴＳ１−ＩＴＳの５０２−７３９）、配列番号４（ＩＴＳ２−ＩＴＳの８９９−１１３７）、配列番号５（ＩＴＳ−８２７ｂｐ）、および配列番号６（ｒｂｃＬ−１１６０ｂｐ）、またはその相補体から成る群から選ばれる、一つ以上の核酸配列を含む、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種を、脂質単離、廃液改善、廃ガス改善、および／またはバイオマス生産に好適な条件下で培養することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】３００ｍｌ容量のガラスカラム（６８ｃｍ長で、内径が２．３ｃｍ）中に培養されるＣｈｏｒｅｌｌａ種の成長速度に及ぼす二酸化炭素の作用。培養物には、１％または１５％ＣＯ２を含む圧縮空気で通気した。培養は、２５±１℃、および１７０μｍｏｌｍ−２ｓ−１の光強度で行われた。
【図２】Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種のバイオマス収率に及ぼす二酸化炭素の作用（培養条件は、図１に記載されるものと同じ）。
【図３】Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種の脂質含量（ａ）および脂質収率）（ｂ）に及ぼす二酸化炭素の作用（培養条件は、図１の場合と同じ）。
【図４】３００ｍｌ容量ガラスカラム（６８ｃｍ長、内径２．３ｃｍ）において、２５±１℃、１％ＣＯ２、および１７０μｍｏｌｍ−２ｓ−１の連続照明の下で増殖されたＣｈｌｏｒｅｌｌａ種の成長に及ぼす酪農廃水（ＤＷＷ）の作用。
【図５】ガラスカラムバイオリアクターにおいて増殖した（増殖条件は、図４の場合と同じ）Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種のバイオマス収率に及ぼす酪農廃水の作用。
【図６】ガラスカラムバイオリアクターにおいて増殖した（増殖条件は、図４の場合と同じ）Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種の脂質含量に及ぼす酪農廃水の作用。
【図７】ガラスカラムバイオリアクターにおいて増殖した（増殖条件は、図４の場合と同じ）Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種の脂質生産性に及ぼす酪農廃水の作用。
【図８】Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種から増幅したＰＣＲ産物。Ａ＝ＤＮＡラダー；Ｂ＝ＩＴＳ；およびＣ＝ｒｂｃＬ。
【図９】緑藻門に属する２２ＯＴＵ（操作的分類単位）のＩＴＳ（内部転写スペーサ）領域における８２７塩基の、整列ヌクレオチド配列に基づく近隣結合（ＮＪ）系統樹。分枝の上の数字は、１０００回複製に基づくブートストラップ分析の多数規則合意樹において分解されるブートストラップ値を示す。５０未満の非有意数値は示さなかった。
【図１０】緑藻門に属する２０ＯＴＵのｒｂｃＬ領域における１１２９塩基の、整列ヌクレオチド配列に基づく近隣結合（ＮＪ）系統樹。分枝の上の数字は、１０００回複製に基づくブートストラップ分析の多数規則合意樹において分解されるブートストラップ値を示す。５０未満の非有意数値は示さなかった。
【図１１】Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種（ＣＶ）および、その、系統学的にもっとも近縁の緑藻種Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ＣＢＳ  １５−２０７５（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号：ＡＹ９４８４１９）の、ＩＴＳセグメントの８２７ｂｐ領域の配列整列。ＩＴＳ１（１６８−４０５）およびＩＴＳ２（５６５−８０３）は別々にマークされる。
【図１２】Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種（ｃｖ）および、その、系統学的にもっとも近縁の緑藻種Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ２４０１４５）の、ｒｂｃＬの１１６０ｂｐの配列整列。コドンは第１ヌクレオチドからスタートする。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
第１局面において、本発明は、単離Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種組成物であって、その単離Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種ゲノムが、配列番号１（ＩＴＳ−１２４９ｂｐ）、配列番号２（ｒｂｃＬ−１３９３ｂｐ）、配列番号３（ＩＴＳ１−ＩＴＳの５０２−７３９）、配列番号４（ＩＴＳ２−ＩＴＳの８９９−１１３７）、配列番号５（ＩＴＳ−８２７ｂｐ）、および配列番号６（ｒｂｃＬ−１１６０ｂｐ）、またはその相補体から成る群から選ばれる、一つ以上の核酸配列を含む、組成物を提供する。下記により詳細に論じるように、これらの核酸配列はそれぞれ、本発明の新規Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種のマーカーとして有用であり、このＣｈｌｏｒｅｌｌａを他のＣｈｌｏｒｅｌｌａ株と区別する。
【００１１】
本発明の、この第１局面の藻類は、種々の目的のために、例えば、ただしこれらに限定されないが、脂質生産、廃液改善、廃ガス改善、および、例えば、動物飼料および有機肥料として使用が可能な、他の付加価値バイオマスの生産のために有用である。これらの使用は、下記にさらに詳細に記載される。
【００１２】
本発明の第１局面の藻類は、州都フェニックスの都市圏の水環境から採取された培養物の選択プロセスによって得られた。したがって、得られたＣｈｌｏｒｅｌｌａ種は、天然のもので、あらかじめ単離されたものではないが、選択プロセス中、選択圧によって引き起こされる突然変異によって得られてもよい。本明細書で用いるＣｈｌｏｒｅｌｌａ種は、言明される特定の特徴を備える全ての株を含む。
【００１３】
本明細書で用いる「単離」という用語は、組成物中に存在する藻類の少なくとも９０％が、言明される藻類型を持つことを意味し、さらに別の実施態様では、組成物中に存在する少なくとも９５％、９８％、または９９％が、言明される藻類型を持つことを意味する。単離Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種組成物は、溶液中、凍結、乾燥、または固相寒天プレート上で培養または保存することが可能である。
【００１４】
本発明の第１局面のＣｈｌｏｒｅｌｌａ種は、（ｉ）顕著なアンモニア摂取、（ｉｉ）窒素、燐、および無機炭素から成る群から選ばれる栄養素を大量に同化する能力、および、（ｉｉｉ）大量のバイオマス（例えば、ただしこれらに限定されないが、未精製タンパク、総脂質、総ポリサッカリド、および／または、ルテイン、ゼアキサンチン、およびアスタキサンチン（例えば、家畜または水性培養の飼料添加物として有用）から成る群から選ばれるカロテノイド、または、これらの組み合わせを含む）を蓄積する能力、によって特徴づけられる。
【００１５】
本発明で用いる「増殖する能力」という語句は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種が、言明の条件下で、本発明の方法において使用するのに十分なほど生殖することが可能であることを意味する。本明細書で用いる「大量の栄養素を同化する能力」という語句は下記を意味する：汚染水および廃液からの窒素（硝酸塩またはアンモニア／アンモニウム）除去については、処理１時間当たり、硝酸塩またはアンモニアとして、リットル当たり少なくとも２ｍｇの窒素が、高除去率（すなわち、大量の栄養素の同化）と見なされる。発電所の煙道ガスからのＣＯ２除去の場合は、１時間の培養時間当たり、１リットルの藻類培養物当たり少なくとも２グラムのＣＯ２放出が、高除去率と見なされる。本明細書で用いる「大量のバイオマスを蓄積する能力」という語句は、乾燥重量の２０から６０％を意味する。
【００１６】
第２局面では、本発明は、増殖培地、および、本発明の第１局面の単離Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種を含む、実質的に純粋な培養物を提供する。本明細書で用いる「増殖培地」という用語は、本発明の藻類を培養するための任意の適切な培地を指す。本発明の藻類は、ＣＯ２および日光、プラス、最少量の微量栄養素に依存して光合成的に増殖することが可能である。増殖培地の容量は、例えば、バイオ改善、脂質生産、および／または藻類バイオマス生産に使用するための、標準的実験室培養から大規模培養にいたる、任意の目的のために、藻類を培養するのに適切な任意の容量であることが可能である。適切な藻類増殖培地は、任意の培地、例えば、ただしこれらに限定されないが、ＢＧ−１１増殖培地（例えば、Ｒｉｐｐｋａ，１９７９を参照）などであることが可能であり；１０℃から３８℃の培養温度が使用され；別の実施態様では、１５℃から３０℃の温度範囲が使用される。同様に、２０μｍｏｌｍ−２ｓ−１から１０００μｍｏｌｍ−２ｓ−１の光強度が使用され；各種実施態様では、その範囲は、１００μｍｏｌｍ−２ｓ−１から５００μｍｏｌｍ−２ｓ−１、または１５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１から２５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１であってもよい。さらに、通気も０％から２０％ＣＯ２の間で行われ；各種実施態様では、通気は０．５％から１０％ＣＯ２、０．５％から５％ＣＯ２、または、０．５％から２％ＣＯ２の間で行われる。
【００１７】
維持および保存目的のためには、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種単離株は、通常、標準的人工増殖培地中に維持される。定期的維持目的のためには、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種単離株は、連続照明、または中等範囲の光強度（１０μｍｏｌｍ−２ｓ−１から４０μｍｏｌｍ−２ｓ−１）の照明／暗黒サイクルのいずれか、および、温度（１８℃から２５℃）の下で、液体培養または固相寒天プレートにおいて維持することが可能である。培養ｐＨは、ｐＨ６．５からｐＨ９．５の間を変動してよい。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種単離株の維持には、ＣＯ２濃縮は必要とされない。種々の非限定的例では、増殖タンクの培養培地の温度は、約１０℃から約３８℃に維持されることが好ましく、さらに別の実施態様では、約２０℃から約３０℃に維持されることが好ましい。
【００１８】
各種実施態様では、本発明のＣｈｌｏｒｅｌｌａ種を培養するために有用な増殖培地は、廃液または廃ガスを含む。この増殖培地は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種が廃棄物改善プロセスに使用される場合、特に有用である。ただし、この増殖培地の使用は、廃棄物改善プロセスのみに限定されない。一実施態様では、廃液が培地の調製に使用される場合、廃液は、栄養素汚染された水または廃液（例えば、産業廃水、農業廃水、家庭廃水、汚染地下水、および地表水）、または、天然ガスまたはバイオマスを燃やす発電機から吐き出される廃ガス、または、化石燃料燃焼発電所の煙道ガス放出から得られる。この実施態様では、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種は、先ず、一次増殖培地中で培養し、次いで、それに廃水および／または廃ガスを添加することが可能である。それとは別に、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種は、廃水源のみにおいて培養することも可能である。ある特定の栄養素または元素が培養培地に添加される場合、それは、他の栄養素と同様、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種によって摂取され、同化される。最終的に、廃水含有および添加栄養素は共に除かれ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種バイオマス中に保存される、巨大分子（例えば、脂質、タンパク、または炭水化物）に変換される。通常、廃水は、所望の速度で培養培地に添加される。廃水源から供給されるこの水は、さらに別の栄養素、例えば、リン酸塩、および／または微量元素（例えば、鉄、亜鉛）を含み、これらは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種の成長を補佐する。一実施態様では、もしも、処理される廃水が、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種の増殖を維持するのに十分な栄養素を含むのであれば、より少ない増殖培地を使用することが可能な場合もある。廃水が、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種処理によってより澄明になるにつれて、増殖培地の量を増やすことが可能である。
【００１９】
廃水補給速度に影響を及ぼす主要要因としては：１）Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種の増殖速度、２）光強度、３）培養物温度、５）廃水における栄養素の初期濃度、６）特定のバイオリアクターの設計および性能、および、７）特定の維持プロトコールが挙げられる。
【００２０】
第３局面では、本発明は、藻類培養システムであって：
（ａ）光バイオリアクター；および、
（ｂ）本発明の第２局面の、実質的に純粋な培養物
を含むシステムを提供する。
【００２１】
本明細書に用いられる「光バイオリアクター」とは、その中で藻類が成長し、増殖する、産業規模の培養容器である。本発明のこの局面における使用のためには、任意のタイプの光バイオリアクターの使用が可能であり、例えば、ただしこれらに限定されないが、トラック型開放池（すなわち、水深約１５から３０ｃｍの、複数の浅い池で、それぞれ、１０００から５０００ｍ２以上の面積を持ち、ループ状に構築され、その中を、培養物は、回転パドルによって循環される（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，１９８６））、閉鎖システム、すなわち、透明チューブまたは容器から製造される光バイオリアクターで、その中で、培養物は、ポンプまたは空気バブリングによって混ぜ合わされる（Ｌｅｅ  １９８６；Ｃｈａｕｍｏｎｔ  １９９３；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  １９９０；Ｔｒｅｄｉｃｉ  ２００４）、チューブ状光バイオリアクター（例えば、Ｔａｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．（１９５３）、Ｐｉｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）、Ｇｕｄｉｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｕｍｏｎｔ  １９８３，Ｃｈａｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．１９８８；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）を参照）、および、平板型光バイオリアクターで、例えば、Ｓａｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｅｄｕｙ（１９８５）、Ｒａｍｏｓ  ｄｅ  Ｏｒｔｅｇａ  ａｎｄ  Ｒｏｕｘ（１９８６）、Ｔｒｅｄｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１，１９９７）、およびＨｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６，１９９８ａ，ｂ）に記載されるものなど、が使用される。この第３局面では、本発明は、例えば、本発明のＣｈｌｏｒｅｌｌａ種による栄養素除去（後述）法に使用が可能な、各種設計のシステムを提供する。
【００２２】
閉鎖光バイオリアクターの側面間の距離は、維持可能な藻類濃度、光合成効率、およびバイオマス生産性に影響を及ぼす、「光路」である。各種実施態様において、閉鎖光バイオリアクターの光路は、約５ミリメートルと４０センチメートルの間；１００ミリメートルと３０センチメートルの間；５０ミリメートルと２０センチメートルの間；および、１センチメートルと１５センチメートルの間、もっとも好ましくは２センチメートルと１０センチメートルの間にあることが可能である。ある任意の用途における最適光路は、少なくとも部分的には、例えば、培養される特定の藻類株、および／または、生産される特定の所望産物などの要因に依存する。
【００２３】
第４局面では、本発明は、脂質単離、廃液改善、廃ガス改善、および／またはバイオマス生産のための方法であって、そのゲノムが、配列番号１（ＩＴＳ−１２４９ｂｐ）、配列番号２（ｒｂｃＬ−１３９３ｂｐ）、配列番号３（ＩＴＳ１−ＩＴＳの５０２−７３９）、配列番号４（ＩＴＳ２−ＩＴＳの８９９−１１３７）、配列番号５（ＩＴＳ−８２７ｂｐ）、および配列番号６（ｒｂｃＬ−１１６０ｂｐ）、またはその相補体から成る群から選ばれる、一つ以上の核酸配列を含む、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種を、脂質単離、廃液改善、廃ガス改善、および／またはバイオマス生産に好適な条件下で培養することを含む方法を提供する。これらの方法は、単独で実行することも可能であるし、あるいは、任意の組み合わせで実行することも可能である。一実施態様では、脂質単離のための方法は、単離される脂質が、脂質の単一種、例えば、ただしこれらに限定されないが、脂肪酸、色素（クロロフィル、カロテノイドなど）、ステロール、ビタミンＡおよびＤ、または炭水化物、またはそれらの混合物（例えば、総脂質）となるように、単離が実行される。さらに別の実施態様では、方法は、本発明のＣｈｌｏｒｅｌｌａ種の培養を、乾燥藻類細胞重量の少なくとも４０％の総脂質含量を生産するのに好適な条件下で実行することを含み；各種実施態様では、総脂質含量は、乾燥藻類細胞重量の少なくとも４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％以上である。本明細書で用いる「乾燥細胞重量」とは、培養物の藻類を濃縮し、乾燥した後の、藻類培養物の総重量である。上に論じたように、本発明の第１局面の方法を用いて、乾燥藻類細胞重量の少なくとも４０％の総脂質含量を生産する藻類単離株を選別することが可能である。したがって、当業者であれば、脂質単離のために、従来技術で既知の任意の脂質抽出技術、例えば、ただしこれらに限定されないが、後述の方法を用いて、このような新規藻類を使用することが可能である。この方法によって単離される脂質は、任意の目的のために、例えば、ただしこれらに限定されないが、バイオ燃料生産（例えば、ただしこれに限定されないが、バイオジーゼル）、洗剤、バイオポリマー、およびバイオプラスチックのために使用することが可能である。
【００２４】
別の実施態様では、廃液から栄養素を除去することを含む方法は、廃液中の栄養素が、本発明のＣｈｌｏｒｅｌｌａ種によって除去される条件下で、少なくとも５％の廃液水を含む培養培地において該藻類株を培養することを含む。さらに別の実施態様では、培養培地は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の廃水を含む。このプロセスによって、最大９５％以上の栄養素を、この廃水から除去することが可能であり、これにより、栄養素レベルは、米国環境保護局（ＥＰＡ）によって個別の汚染物質について設定される最大汚染レベル未満に下げられる。このような廃水の一つの非限定的例として、１リットル当たり数十から数百ミリグラムの、硝酸塩として窒素を含む場合のある地下水がある。地下水の中の硝酸塩の初期濃度に応じて、１日または数日以内に、１Ｌ当たり、１０ｍｇ硝酸塩−Ｎ未満となるまで、硝酸塩の量を除去することが可能である。本発明の方法によって浄化することが可能な地下水の量は、除去すべき栄養素の初期濃度、および、使用される光バイオリアクターシステムのサイズに依存する。ある場合、藻類が地下水から硝酸塩を完全に除去することを可能とするように、地下水に、極小量のリン酸塩（リットル当たりマイクログラムからミリグラムの範囲）、または微量元素（例えば、Ｚｎ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｍｇ）を添加してもよい。
【００２５】
別の非限定的実施態様では、廃水は、濃厚動物飼養作業区画（ＣＡＦＯ）、例えば、酪農場からやってくる。この廃水は、高濃度のアンモニア（リットル当たり、アンモニアとして窒素を数百から数千ミリグラム）、およびリン酸塩（リットル当たり、リン酸塩として燐を数十から数百ミリグラム）含む場合がある。完全強度のＣＡＦＯ廃水は、前述の光バイオリアクターにおいて、選ばれた藻類株の急速増殖を維持するための「平衡的増殖培地」として使用することが可能である。ある場合、ＣＡＦＯ廃水は、本発明のＣｈｌｏｒｅｌｌａ種の成長および増殖を加速するためにある程度まで希釈することが可能である。その結果、アンモニアおよびリン酸塩の濃度を、それらの栄養素の初期濃度に応じて、１日または数日以内に除去することが可能である。地下水状況と違って、ＣＡＦＯ廃水には、米国ＥＰＡ基準に合致させるために、アンモニアおよびリン酸塩レベルを低下または除去するために薬品を導入する必要はない。別の実施態様では、廃水は、硝酸塩およびアンモニアとして高濃度（リットル当たり、若干から数十ミリグラムの範囲の）窒素、およびリン酸塩を含む場合のある農業排水である。本発明のＣｈｌｏｒｅｌｌａ種は、これらの栄養素の初期濃度および／または天候条件に応じて、１日または２日以内に、米国ＥＰＡ基準未満となるまでこれらの栄養素を除去することが可能である。窒素対リン酸塩比が１５：１比よりも離れている場合であれば、廃水からそれらの栄養を除去するには、その比の平衡を取るために一薬品（硝酸塩またはリン酸塩）の添加が必要である。
【００２６】
この第４局面の別の実施態様では、本法は、廃棄ガスから栄養素を除去することを含む方法であって、本発明のＣｈｌｏｒｅｌｌａ種を、廃ガスを含む培養培地中で、廃ガス中の栄養素が除去される条件下で培養することを含む。一実施態様では、煙道ガス放出は、藻類光合成および廃棄栄養素除去のための炭素源（二酸化炭素、すなわちＣＯ２の形で）を提供する。煙道ガスは、任意の供給源、例えば、ただしこれに限定されないが、化石燃料燃焼電力工場などからのものであってもよい。光合成機序を通じて、本発明のＣｈｌｏｒｅｌｌａ種細胞は、ＣＯ２を固定し、それを、細胞中に蓄えられる有機巨大分子（例えば、炭水化物、脂質、およびタンパク）に変換する。その結果、上に開示される培養システムに進入する分子ＣＯ２は、除去され、藻類バイオマスに変換され、したがって、この光バイオリアクターから放出されるガスは、ＣＯ２が十分に低減される（少なくとも５０％低下）。
【００２７】
一実施態様では、煙道ガスが、上に開示された光バイオリアクターに輸送される。一方法は、煙道ガスを、光バイオリアクターに直接注入するが、その注入を、活発な光合成ＣＯ２固定を持続させるが、他方では、溶解ＮＯｘおよびＳＯｘによる培養ｐＨの低下、および／または、ある種の有毒分子、例えば、重金属水銀による負の作用を最小に留める流速（１分当たり、１リットルの培養培地当たり、０．１から０．５リットルの煙道ガス）において行うことを含む。それとは別に、煙道ガスは、ある一定の比率で圧縮空気と混ぜ合わされ（煙道ガスの圧縮空気に対する比は、０．１〜０．６容量から１容量の範囲にあってもよい）、通気システムを通じて光バイオリアクターシステムに輸送されてもよい。さらに別の実施態様では、藻類増殖培地における気相からの汚染物質転移および有毒化合物の蓄積を緩和または根絶するために、液体または気体スクラッバーシステムを導入してもよい。さらに別の好ましい実施態様では、発電機から発せられる煙道ガスは、プロトン吸収薬品、例えば、ＮａＯＨで前処理し、実質的に中性のｐＨを維持し、有毒な危険性のあるＮＯｘおよびＳＯｘ化合物を、藻類増殖のために有用な硫黄および窒素源に変えてもよい。例えば、市販の気体スクラッバーシステムを光バイオリアクターシステムに導入し、藻類に前処理煙道ガスを供給するようにすることも可能である。廃液の場合、前処理としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、１）廃水を先ず嫌気性消化プロセス、または、天然または人造の浄水池で処理して有機物質の大部分を除去すること；２）可能な有毒化合物の濃度に応じて、定期的地下水または降水によって廃水を１０％から９０％に希釈すること；３）維持可能な最大栄養素除去および／またはバイオマス生産のために、栄養素組成物をバランスするためにある種の栄養素を添加すること（例えば、燐および／または微量元素）が挙げられる。
【００２８】
本発明の、この第４局面の、さらに別の実施態様では、バイオマスを生産するための方法であって、本発明のＣｈｌｏｒｅｌｌａ種を培養すること、および、培養藻類から、藻類のバイオマス成分を収集することを含む方法が提供される。このようなバイオマスは、例えば、ただしこれらに限定されないが、未精製タンパク、総脂質（例えば、脂肪酸）、総ポリサッカリド、および／または、ルテイン、ゼアキサンチン、およびアスタキサンチン（例えば、家畜または水性培養の飼料添加物として有用）から成る群から選ばれるカロテノイド、または、これらの組み合わせを含む。一実施態様では、多段階維持プロトコールであって、初期段階で廃棄栄養素を除去するが、一方、後期段階で高価値化合物（例えば、脂肪酸、カロテノイド）を誘発し、蓄積するプロトコールが記載される。さらに別の実施態様では、光バイオリアクターによって生産された藻類バイオマスは、バイオジーゼル生産のための原料として使用される。さらに別の好ましい実施態様では、藻類脂肪酸抽出後の、藻類マスの残留物は、動物飼料または有機肥料添加物として使用される。別の実施態様では、前述の光バイオリアクター中で増殖される藻類株による廃液処理の副産物として得られる、カロテノイド富裕藻類バイオマスは、動物飼料添加物、または高価値カロテノイドの天然供給源として使用される。藻類バイオマス生産および／またはタンパク発現のための方法は、当技術分野で周知である。例えば：Ｈｕ，Ｑ．（２００４）Ｃｈａｐｔｅｒ  ５：ｐｐ．８３−９３．Ｉｎ  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  Ａ．（ｅｄ．）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ  ＯＸ２  ０ＥＬ，ＵＫ；Ｈｕ，Ｑ．（２００４）Ｃｈａｐｔｅｒ  １２：Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）ｐｌａｔｅｎｓｉｓ，ｐｐ．２６４−２７２．Ｉｎ  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  Ａ．（ｅｄ．）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ  ＯＸ２  ０ＥＬ，ＵＫ；Ｈｕ，Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：１３３−１３９；Ｈｕ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４１２：２５０−２６１；Ｈｕ，Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１３３１９−１３３２３；Ｈｕ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａ．Ｉｎ：Ｇａｒａｂ  Ｇ．（ｅｄ．）Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｃｈａｎｓｉｍｓ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔｓ，Ｖｏｌ．Ｉ．４３７−４４０，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；Ｈｕ，Ｑ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８５：２３０−２３６；Ｈｕ，Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．３３：１６５−１７１；Ｈｕ，Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：６５５−６６２；Ｉｗａｓａｋｉ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｂ：Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４４：１８４−１９０；Ｈｕ，Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．３２：８１−８６；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ａ．ａｎｄ  Ｈｕ，Ｑ（１９９７）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６３−６５：６４９−６５８；Ｈｕ，Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．５１：５１−６０；Ｈｕ，Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．３２：１０６６−１０７３；Ｈｕ，Ｑ．ａｎｄ  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ａ．（１９９６）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｃｏｌ．８：１３９−１４５；Ｇｉｔｅｌｓｏｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：１５７０−１５７３；Ｈｕ，Ｑ．ａｎｄ  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ａ．（１９９５）Ｉｎ：Ｍａｔｈｉｓ  Ｐ．（ｅｄ．）Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｆｒｏｍ  Ｌｉｇｈｔ  ｔｏ  Ｂｉｏｓｐｈｅｒｅ，Ｖｏｌ．ＩＶ，１０３７−１０４０，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；ａｎｄ  Ｈｕ，Ｑ．ａｎｄ  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ａ．（１９９４）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｃｏｌ．６：３９１−３９６を参照されたい。
【００２９】
本発明は、環境汚染防止に向き合いながら、その一方、新規藻類試薬および方法を通じて再生可能エネルギーを生産する。本発明のＣｈｌｏｒｅｌｌａ種は、バイオ燃料（例えば、バイオジーゼル）を生産し、および／または、廃水および／または廃ガス（例えば、ただしこれらに限定されないが、廃水および発電所煙道ガスなど）から栄養素を速やかに取り出し、それらを、藻類バイオマスに保存される付加価値化合物に変換するために使用することが可能である。次に、このバイオマスは、例えば、液体バイオ燃料および／または精密化学薬品生産のための材料として、かつ、動物飼料または有機肥料として使用することが可能である。本発明の試薬および方法が、従来の細菌使用システムに優る大きな利点は、本発明の試薬および方法は、廃水または廃ガスから栄養素を除去するばかりでなく、それらを、再生可能なバイオマスおよび精密化学品としてリサイクルするのに対し、一方、細菌システムは、硝化および脱硝化プロセスを通じて、貴重なものとなる可能性のある硝酸塩および／またはアンモニアを大気中に逃がすことである。さらに、細菌システムは、通常、適切な処理を必要とする汚泥を大量に生成する。天然および構築された浄水池システムに比べると、本発明の藻類使用試薬および方法は、栄養素除去およびバイオマス生産の点でより効率的である。エネルギー生産の側から見ると、本発明の試薬および方法は、従来の脂質還元生産よりも効率的で、年間、土地の単位面積当たり最大２０から４０倍の原料を生産する。本発明の試薬および方法は、非農業環境、例えば、乾燥および半乾燥環境（砂漠を含む）においても適用が可能である。したがって、本発明技術は、有限の農業用土地を求めて油性種子（またはその他の）植物と競合しない。
【実施例】
【００３０】
材料および方法
生物および増殖条件：
開始の藻類培養物は、フェニックス都市圏の水環境から得、ＢＧ−１１増殖培地において２５℃で維持した（Ｒｉｐｐｋａ，１９７９）。
【００３１】
光学的密度および乾燥重量測定：
藻類細胞集団の密度は、毎日、マイクロプレート分光光度計（ＳＰＥＣＴＲＡ  ｍａｘ  ３４０ＰＣ）によって測定し、６６０ｎｍ波長における光学的密度として記録した。藻類マスの乾燥重量は、あらかじめ重量測定したＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｃフィルターによる１０〜２０ｍｌの培養物のろ過によって定量した。藻類を登載するフィルターは、１０５℃で一晩乾燥し、デシケータで室温に冷却し、重量測定した。
【００３２】
クロロフィル測定：
高温メタノール抽出法を用いた（Ａｚｏｖ（１９８２））。濃度は、Ｔａｌｌｉｎｇ係数を用いて計算した。
【００３３】
クロロフィルａ（ｍｇ／Ｌ）＝１３．９（ＤＯ６６５−ＤＯ７５０）Ｖ／Ｕ
上式において、ＤＯ６６５＝６６５ｎｍ波長において測定した光学的密度、ＤＯ７５０＝７５０ｎｍ波長において測定した光学的密度、Ｖ＝メタノールの全体体積（ｍｌ）、および、Ｕ＝藻類縣濁液の体積（ｍｌ）である。
【００３４】
脂質抽出：
脂質抽出手順は、Ｂｉｇｏｇｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）にしたがって改変した。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ細胞バイオマス（１００ｍｇ凍結乾燥）を、小型のガラスバイアルに加え、Ｔｅｆｌｏｎねじ込みキャップで密封し、１時間磁力攪拌しながら４０℃に温めることによって、１０％ＤＭＳＯ含有メタノールで抽出した。この混合物を、３，５００ｒｐｍで１０分遠心した。得られた上清を、別の清潔なバイアルに移動し、ペレットを、ヘキサンおよびエーテル（１：１，ｖ／ｖ）の混合物で３０分再抽出した。この抽出手順を、ペレット中に残留するクロロフィルの量が無視できるほどになるまで数回繰り返した。ジエチルエーテル、ヘキサン、および水を、合わせた上清に、１：１：１：１（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）比となるように加えた。この混合物を、手で振とうし、次いで、３，５００ｒｐｍで５分遠心した。上部相を収集した。下部の水相は、ジエチルエーテル：ヘキサン（１：１，ｖ／ｖ）の混合液で２度再抽出した。これらの有機相を合わせ、窒素ガスを、残留する油状抽出物の重量が一定となるまで、バブリングすることによって油状抽出物中の溶媒を完全に除去した。
【００３５】
脂肪酸分析：
脂肪酸は、メタノール液中の硫酸による直接的メチル基移転の後（Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，２００３）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分析した。この脂肪酸メタノールエステル（ＦＡＭＥ）を、０．８％ＢＨＴ含有ヘキサンで抽出し、ＨＰ７６７３インジェクター、および、ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸ（商標）毛細管カラム（ＨＰ１９０９１Ｎ−１３３、３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）を備えたＨＰ−６８９０ガスクロマトグラフィー（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）によって分析した。２μＬのサンプルを、非分割性（ｓｐｌｉｔ−ｌｅｓｓ）注入方式で注入した。入力および検出器温度は、それぞれ、２５０℃および２７０℃に維持し、オーブン温度は、１７０℃から２２０℃まで１℃／分で上昇するようにプログラムした。キャリヤーガスとして高純度の窒素ガスを用いた。ＦＡＭＥは、その保持時間を、真性標準（Ｓｉｇｍａ）と比較することによって特定し、そのピーク面積を、内部標準（Ｃ１７：０）のものと比較することによって定量した。
【００３６】
酪農場廃水の収集：
酪農場廃水は、Ｍｅｓａ、Ａｒｉｚｏｎａの酪農場（北緯Ｎ３３．３５０３０、西経Ｗ１１１．６５８３７）において、飼養区画送管廃棄物および地表水から成る、浅い廃水池から収集した。廃水複合サンプルを、浅い廃水池の土手にそった、少なくとも３ヶ所の接近地点から収集した。廃水は、プラスチック容器（５ガロン以上）に納めて４℃で保存した。
【００３７】
生の状態の廃水は、赤褐色で、未消化の穀粒、草葉、土壌、および不特定固形物を含んでいた。実験のために使用する前に、この酪農場廃水を５，０００ｒｐｍで遠心し、顆粒および藻類の地元品種を取り除いた。透明褐色の酪農場廃水を、指定の実験のために収集した。この廃水を、種々の実験的要求を満たすために、２５％廃水（１：３酪農場廃水・対・脱イオン水）、５０％廃水（１：１廃水・対・脱イオン水）、７５％廃水（３：１廃水・対・脱イオン水）、および１００％廃水（未希釈水）に希釈した。
【００３８】
実験設計：
この藻類を増殖するために、３００ｍｌ容量のガラスカラム（６８ｃｍ長、内径２．３ｃｍ）であって、通気を行うためにカラムの中心より下にガラス毛細管を設置したカラムを用いた。カラムの最頂部は、カラム間の汚染を防止するため、ゆるい結合性のアルミニウムフォイルで囲まれたゴム製ストッパーで覆った。別様に指示しない限り、実験を通じて、２５℃の培養温度、１７０μｍｏｌｍ−２ｓ−１の光強度、および、１％ＣＯ２の圧縮空気をガラスカラムに与えた。
【００３９】
実験のために、対数相培養物を収集、遠心し、培養培地を除去し、小容量の滅菌蒸留水に再縣濁し、接種に備えた。各処理は三重に行った。蒸発による水分損失を補うために、脱イオン水を毎日カラムに加えた。
【００４０】
栄養素除去実験のために、１０ｍｌの培養縣濁液を、毎日、カラムから収集し、３，５００ｒｐｍで１０分遠心した。この上清を、小型バイアルにプールし、−２０℃のフリーザーにて凍結し、栄養素分析に備えた。このペレットは蒸留水に再縣濁し、乾燥重量測定に備えた。
【００４１】
高二酸化炭素処理
ＣＯ２処理実験のために、１％ＣＯ２添加空気、または１５％ＣＯ２添加空気でバブルさせたＢＧ−１１増殖培地において、藻類細胞を増殖した。
【００４２】
ＤＮＡ抽出、増幅、および配列決定：
５０ｍｌの細胞培養物を収集し、遠心し（３０００ｒｐｍ×５分）、次いで、ホモジェナイズし、液体窒素において粉末とした。ゲノムＤＮＡを抽出し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ  Ｉｎｃ．）によって精製した。リボソームＤＮＡ内部転写スペーサ（ＩＴＳ）（配列番号１）、および、Ｒｕｂｉｓｃｏ遺伝子の大型サブユニット（ｒｂｃＬ）（配列番号２）を、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種名特定のための分子マーカーとして用いた。ＰＣＲ反応は、１２．５μｌのＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、２００ｎｇの鋳型ＤＮＡ、および０．５μＭのプライマー（表参照）およびＨ２Ｏを、２５μｌの最終容量の中に含んでいた。領域ＩＴＳ増幅のためのＰＣＲサイクルは、下記の通りであった：９４℃、５分が１サイクル、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で１分３０秒が３５サイクル、７２℃、１０分が１サイクル。ｒｂｃＬ増幅のためのＰＣＲサイクルは、下記の通りであった：９４℃、５分が１サイクル、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒が３５サイクル、７２℃、１０分が１サイクル。ＰＣＲ産物は、１．５％アガロース上で調べた。２μｌのＰＣＲ産物を、ｐＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローンした。ＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｑｕｉｃｋ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、陽性クローンから配列決定用プラスミドを抽出した。配列決定のためにプライマーＭ１３ＲおよびＭ１３Ｆを用いた。
【００４３】
【表１】
2009536830.tif 000003
系統発生分析法
ＤＮＡ配列を、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ  １．８３と整列させ、Ｓｅａｖｉｅｗによる手動で確認した。系統樹は、Ｍｅｇａ３に登載される隣接接合（ＮＪ）アルゴリスムによって再構築した。系統樹を再構築するための置換率を計算するために、Ｋｉｍｕｒａの２−パラメータモデルを用いた。
【００４４】
結果および考察
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種の単離および形態学的記述
開始藻類培養物は、Ｔｅｍｐｅ市（アリゾナ）の公共水源池から収集し、藻類単離株は、標準的寒天プレート法によって水サンプルから単離した。次に、個々の緑色コロニーを、１０ｍｌのＢＧ−１１増殖培地を含む、ねじ込みキャップ付き試験管に移した。培養物を、２０〜４０μｍｏｌフォトンｍ−２ｓ−１の光強度の下に２０〜２５℃に維持した。培養物は、毎週、顕微鏡観察および分光光度計測によってその成長を調べた。急速な成長および生殖を示す、単一藻類株（我々の培養条件（例えば、ＢＧ−１１増殖培地、２５℃、１７０μｍｏｌｍ−２ｓ−１の光強度、および１〜２％ＣＯ２による通気）下において、１日当たり１から３倍増加を示す全ての単離株）に対し、脂肪酸含量分析を行った。高い脂肪酸含量を処理する藻類株のみを選び、その後、高ＣＯ２濃度、温度範囲、および／または各種廃水に対する耐性に関して選別を行った。この選択プロセスから得られた藻類株の一つが、形態学的特徴に基づいてＣｈｌｏｒｅｌｌａ種と特定され、その後の分析に使用された。
【００４５】
ＣＯ２濃度の成長およびバイオマス生産性に及ぼす作用
本発明の選択法によって得られたＣｈｌｏｒｅｌｌａ種は、高いＣＯ２濃度（すなわち、１５％ＣＯ２以上）でも、一般に藻類培養物に適用される１％ＣＯ２で見られるものと同じ成長率で成長する能力を有する（図１）。このＣＯ２レベルは、化石燃料発電所から吐き出される煙道ガスに通常見られるものと等価である。１５％ＣＯ２において増殖されるＣｈｌｏｒｅｌｌａ種培養物のバイオマスの生産性は、４２０±５０ｍｇｌ−１ｄ−１であり、これは、１％ＣＯ２において増殖される培養物から得られる３５０±４０ｍｇｌ−１ｄ−１と近似するか、やや高かった（図２）。
【００４６】
細胞の脂質含量および脂質生産に及ぼすＣＯ２濃度の作用
細胞の脂質（脂肪酸）含量、または脂質生産に対し、ＣＯ２の作用はほとんど無かった。本明細書で用いる「含量」とは、ある一時点における、細胞の脂質含量を指し；脂質の「生産率」または脂質の「生産性」または「収率」とは、時間（日）当たり、培養物単位容量またはリアクター照明面積当たりに生産される、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種の脂質の量を指す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種培養物が、前記培養条件下において、１％または１５％ＣＯ２を補給されるガラスカラムバイオリアクター中に維持される場合、細胞の脂質含量は、乾燥重量の４０．５＋４％であった（図３ａ）。同様に、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種培養物は、いずれのレベルのＣＯ２を補給されても、体積当たり脂質の生産は、約１５０±１２ｍｇｌ−１ｄ−１であった（図３ｂ）。
【００４７】
成長およびバイオマス生産性に及ぼす廃水濃度の作用
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種は、様々な供給源からの廃水、例えば、栄養素汚染地下水、農業排水、および動物飼養作業場廃水の中でも繁殖する能力を有する。培養物に対し添加性栄養薬品はまったく加えなかった。これは、酪農場廃水は、藻類成長および生殖に必要な栄養素を含むことを示唆する。図４は、種々の濃度の酪農廃水（すなわち、２５％、５０％、７５％、および１００％廃水）に維持したＣｈｌｏｒｅｌｌａ種の成長を示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種細胞は、１００％酪農廃水に接種されると、最初の６日間ほとんど成長は起こらなかった。その後、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種細胞は、急速に成長を開始し、さらに５日の培養後、４．２±０．３ｇｌ−１の最大細胞密度に達した。酪農廃水を、１００％から７５％、次いで５０％に希釈すると、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種培養物の遅延相は次第に短縮した。しかしながら、廃水をさらに２５％に希釈すると、最大細胞密度の低下がもたらされた。しかしながら、ＢＧ−１１増殖培地と比較すると、酪農廃水は、僅かな成長低下しかもたらさなかった。各種希釈度の内、５０％廃水で、体積当たりもっとも高いバイオマス生産性が得られた。５０％よりも低い廃水濃度も、高い廃水濃度も、いずれもバイオマス収率の低下をもたらした（図５）。
【００４８】
脂質含量および脂質生産に及ぼす廃水濃度の作用
酪農廃水の濃度は、成長ばかりでなく、細胞の脂質含量にも影響を及ぼした。最高脂質含量は、２５％廃水において増殖した培養物において測定された。廃水濃度が、５０％および７５％に増加するにつれて、細胞の脂質含量は徐々に減少した（図６）。体積あたりのバイオマス生産性において観察された傾向同様、５０％廃水が、油について最高の生産性を維持したが、それよりも高い（例えば、７５％ＤＷＷ）、または低い（例えば、２５％ＤＷＷ）希釈率では、脂質生産は低下した（図７）。
【００４９】
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種の脂肪酸組成物
表２は、ＢＧ−１１増殖培地において増殖したＣｈｌｏｒｅｌｌａ種の脂肪酸組成を示す。Ｃ１６およびＣ１８が、細胞中の総脂質の９６％を超える割合を構成する主要脂肪酸である。
【００５０】
【表２】
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Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種特定のためのＤＮＡマーカー
１２４９−ｂｐ  ＩＴＳセグメントを、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種から増幅した（配列番号１）。これは、１８Ｓ  ｒＤＮＡ（１−５０１）の３’末端（配列番号１１）、ＩＴＳ１（５０２−７３９）（配列番号３）、５．８Ｓ  ｒＤＮＡ（７４０−８９８）（配列番号１２）、ＩＴＳ２（８９９−１１３７）（配列番号４）、および２８Ｓ  ｒＤＮＡの５’末端（１１３８−１２４９）（配列番号１３）から成る。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）データベースにおいて、ＢＬＡＳＴ検索によって同一ヌクレオチド配列は見出せなかった。２２種の藻類門分類群が、ＩＴＳ領域の８２７塩基対（配列番号５）に基づいて推定された。図９に示すように、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種は、他の８種のクロレラ株と共に単系統群に配置された。この系統樹において、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ＣＢＳ１５−２０７５の姉妹種であり、８０％の配列同一性を有していた。ＮＣＢＩにおけるＢＬＡＳＴ配列検索に基づき、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種において、系統的にもっとも近縁の種によるＩＴＳ１共有の最大同一性は７１％であり、ＩＴＳ２の最大同一性は８５％である（図１１の配列整列を参照）。したがって、この新規単離クロレラ株に対する近縁種は、この急速に進化するＤＮＡ領域において識別することが可能である。
【００５１】
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種から増幅したｒｂｃＬセグメントの長さは、１３９３ｂｐ（配列番号２）であり、この配列は、ＮＣＢＩにおけるＢＬＡＳＴ検索に基づき、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａと分類される株と９６％の同一性を示す（図１２）。この近縁種の間で、もっとも多くの突然変異はコドンの第３位置に見られた。２０種の藻類門分類群のｒｂｃＬの１１６０塩基対に基づいて再構築された系統樹において、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種（配列番号６）は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ単系統群に配置される。これは、ブーストストラップ分析によっても支持され、かつ、ＩＴＳ領域の配列に基づく系統関係とも一致する。したがって、ｒｂｃＬ領域も、本発明のＣｈｌｏｒｅｌｌａ種を、近縁生物から区別するために使用することが可能である。
【００５２】
（参考文献）
【００５３】
【表３】
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【００５４】
【表４】
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【００５５】
【表５】
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【００５６】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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