(57)【要約】  本発明は、ヘパリンコーティングを有する生体組織を提供するin vitroでの方法を開示し、この方法は以下のステップを含む；ビオチン試薬を生体組織に結合させること、アビジン試薬をビオチン化した生体組織に結合させること、およびヘパリン試薬を生体組織に形成されたアビジンの層に結合させて、ヘパリンコーティングを形成させること。本発明はさらに、生体組織におけるヘパリンコーティング、ヘパリンコーティングの使用、および本方法のヘパリン層でコーティングされた生体組織を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパリンコーティングを有する生体組織を提供するin vitroの方法であって、以下のステップ；
（a）ビオチン試薬を生体組織へ結合させること、
（b）アビジン試薬をビオチン化生体組織へ結合させることにより、生体組織上にアビジン層を形成すること、および
（c）ヘパリン試薬を生体組織上に形成されたアビジン層に結合させて、前記組織にヘパリンコーティングを形成すること
を含む方法。
【請求項２】
ビオチン試薬が、チオール基、1級アミン基またはカルボキシル基等の適切なタンパク質残基と化学結合を形成することができる官能基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヘパリン試薬がアンチトロンビンと相互作用し、アンチトロンビンの阻害作用を促進する能力を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ビオチン、アビジンまたはヘパリンからなる群より選択される試薬の結合が、20〜37℃の温度で実施される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ビオチン化ステップで使用するビオチン試薬の濃度が0.01〜1 mg/mlの範囲内である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
アビジン結合ステップで使用するアビジン試薬の濃度が0.01〜1 mg/mlの範囲内である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ヘパリン結合ステップで使用するヘパリン試薬の濃度が0.01〜1 mg/mlの範囲内である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ステップa）、b）およびc）の１つ以上の後に、過剰な試薬を除去するために洗浄ステップが実施される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ビオチン層、アビジン層およびヘパリン層を含む生体組織上のヘパリンコーティングであって、ここで、ビオチン層が生体組織の表面に共有結合したビオチン試薬を含み、アビジン層が親和性によってビオチン層に結合したアビジン試薬を含み、そしてヘパリン層が親和性によってアビジン層に結合したヘパリン試薬を含むヘパリンコーティング。
【請求項１０】
請求項９に記載のヘパリンでコーティングされた生体組織の移植片としての使用。
【請求項１１】
ヘパリンまたはヘパリン誘導体でコーティングされた生体組織であって、ここで、ヘパリンがビオチンおよびアビジンを介して組織表面に結合した生体組織。
【請求項１２】
ヘパリンまたはヘパリン誘導体でコーティングされた移植片であって、ここで、ヘパリンがビオチンおよびアビジンを介して移植片表面に結合した移植片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヘパリンコーティングを有する生体組織を提供するin vitroにおける方法に関する。
【０００２】
本発明の背景
哺乳動物の先天性免疫系は、内因性構造物と外因性構造物とを区別するように設計される。外因性構造物が露呈されるとすぐに、それらは先天性免疫系によって認識され、そして多くの防御系が誘導、開始され、これらは凝固および炎症の活性化の促進をもたらす。血管は最外層でヘパラン硫酸（ヘパリン様物質）を発現する内皮細胞で覆われている。ヘパリンと同様に、ヘパラン硫酸はアンチトロンビンの阻害作用を促進することができる糖質領域を提示する。例えば、酸素の欠乏（虚血）、機能的損傷等によって開始する病理過程により、病変組織の化学構造および生物学的構造が変化し、その組織が外因性と認識され得る。組織工学の領域において、細胞（例えば、ランゲルハンス島）の単離および処理は、そのような細胞が血液に輸液される場合に外因性構造物の暴露をもたらし、最終的には、即時性血液媒介炎症反応（IBMIR）のために、細胞の生物学的機能の損失および崩壊さえももたらす（Diabetes, vol. 48, 1907-1914, 1999）。
【０００３】
従来技術
特許出願PCT/SE00/00223は、負電荷のヘパリン複合体と膵島表面の正電荷との間のイオン相互作用に基本的に依存した１ステップの手順によって、ヘパリン複合体で表面がコーティングされたランゲルハンス島を提供する方法を開示する。１ステップの手順は魅力的ではあるが、最近の評価は、この比較的単純なアプローチで再現性のある結果を得ることが困難であるだろうことを指摘しており、それはおそらく、単離した膵島の表面特性が調製物によって変化し得るという事実による。従って、再現性が向上し、幅広い生体組織に適用可能であるような性質の手順が非常に望まれている。
【０００４】
特許出願WO 03/000234は、標的組織内または標的組織上における医学的用途のための開孔性マトリクスを開示する。このマトリクスは、孔をマトリクス内に規定するための互いに架橋した粒子を含む。使用される架橋剤は、ビオチンおよびアビジンを含む。細孔の存在により、組織再生（例えば、真性糖尿病における膵臓の再生）に使用するための細胞をマトリクスに播種することができる。このマトリクスは、新規の組織を発達させるための骨格として、または治療剤のための送達システムとして使用することができるが、本明細書に開示されるヘパリンコーティングを有する生体組織を提供する使用目的については教示していない。
【０００５】
米国特許第5,773,224号は、溶出に使用する可溶性リガンドと共に、固定化リガンド／抗リガンド対のメンバーを使用した細胞分離システムを開示する。１つの実施形態において、固定化ヘパリン吸着剤はビオチン化アンチトロンビンIIIでコーティングされ、次にこれらがアビジンで架橋されることにより、アンチトロンビンIIIのヘパリンへの結合親和性が大きく増加する。得られた吸着剤は効果的にビオチン標識化標的細胞を捕らえ、そして可溶性ヘパリンにより免疫選択された細胞を容易に溶出することを可能とする。しかし、この特許は、当業者を本発明に導くであろういかなる教示も含まず、特に先天性免疫系を下方制御する目的で生体組織をヘパリンコーティングする使用法において教示しない。
【０００６】
Kett, W.C.らによる刊行物（Biochim.Biophys.Acta 1620(2003)p.225-234）は、３つの異なる方法によって調べられたアビジンとグリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン）との間の相互作用を記載する。結果は、特定の多糖構造のみがアビジンと強く相互作用することを示唆した。相互作用はpH依存的であり、pHが7.5から5.5に低下すると5倍に増加する一方、pH 9での結合はわずかである。Kett, W.C.らはまた、ポリスチレン板上に固定化したヘパリンおよび細胞表面のヘパラン硫酸（heparin sulphates）の双方に利用することによって、表面のヘパリンおよびヘパラン硫酸を検出するための道具としての蛍光アビジン誘導体の可能性を示す。本特許明細書に記載されるような、生体組織におけるヘパリンコーティングを提供する方法の教示は、Kett, W.C.らに見られない。
【０００７】
Keiser, N.らによる刊行物（Nature Medicine 7(2001)p.123-128）において、特定のタンパク質に結合する、組織由来のヘパリン／ヘパラン硫酸様グルコサミノグルカン（HLGASs）を単離、濃縮および配列決定する方法が開示される。汎用の手順は、直接的なまたはビオチン-アビジン系を介した疎水性表面へのタンパク質の固定化を含み、ここでアビジンは表面に固定される。この方法の目的は、細胞表面のHLGAG組成物と配列のダイナミックな変化が、シグナル伝達分子および解明する多糖−タンパク質相互作用に対する応答を変化させる細胞の能力にどれだけ影響を及ぼすかを調べることである。この方法は、当業者を本発明に導くであろういかなる教示も含まず、生体組織の生体機能を保持するための、前記組織のヘパリンコーティングを含まない。
【０００８】
発明の概要
外因性の生体構造物の投与（つまり、ランゲルハンス島を血流へ）後の先天性免疫系の不要な活性化についての上記の危険性を考慮して、先天性免疫系を活性化することなく生体機能を保持する膵島のコーティングが望ましい。
【０００９】
本発明は、凝固および炎症の活性化を効果的に下方制御するために、密着して機能的なヘパリンの上皮を生体細胞および生体組織上に作製する新規の方法に関する。
【００１０】
ヘパリンとアビジンとの間に特定の親和性があることがたとえ以前から知られているとしても、驚くべきことに、ヘパリン（適切には複合体として）が生物学的機能を維持し、ビオチンのアビジンへの結合と同じように高い親和性またはより高い親和性により、アビジンと結合し得ることが見出された。このことを見出し、ビオチンの基質（生体細胞または生体組織）への結合、これに続くアビジンのビオチンへの結合、および最後のヘパリン複合体のアビジン形成層への結合に基づいて、生体組織を作製する方法が詳述された。
【００１１】
従って、本発明の目的は、生体組織の生物学的機能を保持し、さらには向上させるために、ヘパリンコーティングを有する前記組織を提供することである。
【００１２】
１つの態様において、請求項１に記載される本発明は、ヘパリンコーティングを有する生体組織を提供する方法に関し、ビオチン試薬を生体組織の表面に結合させる第一のステップ、アビジン試薬をビオチン化生体組織に結合させる第二のステップ、およびヘパリン試薬を生体組織のアビジン形成層に結合させることによりヘパリンコーティングを形成する第三のステップを含む。ビオチン試薬は、チオール基、1級アミン基またはカルボキシル基等の、組織表面の適切なタンパク質残基と化学結合を形成することのできる官能基を含む。アビジン試薬は、ビオチンとアビジンとの間の強い親和性によってビオチン化生体組織に結合される。ヘパリン試薬は、アビジンとヘパリン試薬との間の親和性によってアビジン層に結合される。ヘパリン試薬は、アンチトロンビンと相互作用し、アンチトロンビンの阻害作用を促進する能力を保持しなくてはならない。
【００１３】
適切には、本方法はさらに、第一、第二および第三のステップの後に、過剰量の試薬を除去するための洗浄ステップを含む。
【００１４】
本発明の１つの利点は、本方法によって得られる達成された再現性である。他の利点は、ヘパリンまたはヘパリン誘導体のコーティングによる、生体組織の改良された生体適合性および生物学的機能である。これらの特徴は、驚くことに、本発明のヘパリンコーティングが、あらゆる種類の移植片または移植物に使用できる可能性が生じることが見出された。
【００１５】
発明の詳細な説明
本出願の目的のために、以下の定義を定める。生体組織は、単一細胞、細胞の集積、細胞群、臓器の一部および臓器全体を指す。用語「層」は、1分子の厚さである単一の連続した層または膜を含む分子単層と定義する。
【００１６】
用語「ヘパリン試薬」は、ヘパリン、ヘパリン複合体（非ヘパリン分子に結合したヘパリン分子群）もしくはヘパリン誘導体またはそれらの組み合わせに関する。驚くことに、生物学的機能を維持した生体組織上にヘパリンコーティングを得るために、段階的な手順を用いることが可能であることが見出された。第一のステップは、ビオチンを基質（生体組織）に結合することを含む。これは、チオール基、1級アミン基またはカルボキシル基等の組織表面の適切なタンパク質残基と化学結合を形成することのできる官能基が付加されたビオチンを使用することによって達成され得る。一連のこのようなビオチンは市販されている。試薬は好ましくは水性溶液に可溶性であるべきで、また、試薬は最適な効果を得るために伸長した鎖長で提供されることが好ましい。多くの異なる試薬が本発明の範囲内で使用可能であるが、本発明者らは、1級アミン基に対して反応性であって伸長した鎖長を有する水溶性ビオチン試薬（例えば、EZ-Link(商標)Sulfo-NHS-LC-BiotinまたはEZ-Link(商標)Sulfo-NHS-LC-LC-BiotinまたはEZ-Link(商標)TFP-PEO-Biotin、Perbio Science, Europe）が、本発明の目的に最も有用であることを見出した。基質を、10〜60分間、20〜37℃の温度で、バッファーまたは細胞培養液中に0.01〜1 mg/mlの濃度で溶解したビオチン試薬の希釈液中でインキュベーションする。過剰な試薬を除去するために、適切には洗浄ステップが続く。
【００１７】
次のステップは、アビジンをビオチン化基質に添加することである。アビジンは、0.01〜1 mg/mlの濃度でバッファーまたは細胞培養液に溶解し、ビオチン化基質に添加し、そしてビオチン化基質を10〜60分間、20〜37℃の温度でインキュベーションする。ビオチンとアビジンとの間の強い親和性のため、基質表面は十分な量のアビジンを結合する。過剰なアビジンを除去するために、適切には洗浄ステップが続く。
【００１８】
第三のステップは、今アビジンでコーティングされた基質表面を、好ましくはEP 0658112に開示されるCorline（Sweden）のヘパリン複合体等の高分子複合体の形状であるヘパリンの希釈液中でインキュベーションすることを含む。ヘパリン試薬は、0.01〜1 mg/mlの濃度でバッファーまたは培養液に溶解する。インキュベーションは、20〜37℃の温度で10〜60分間実施する。過剰な試薬を除去するために、適切には洗浄ステップが続く。記載される反応ステップは、好ましくは生理的pHで行われるが、pH5〜8の範囲内のpHを使用することができる。リアルタイムでのヘパリンコーティングの形成の記録は、QCM（Quartz Crystal Microbalance）を用いて実施され得る。QCM機器を使用して、有機分子の特定の基質表面への吸着または結合を、所定の頻度で振動する結晶からの周波数の変化を継続的に測定することにより、リアルタイムで知ることができる。周波数の変化は質量の変化に比例する。
【００１９】
表面は、金の薄層からなる。第一のステップで、生体表面上のタンパク質層を再現するために、ヒトアルブミンを金表面に吸着させた。次のステップで、EZ-Link（商標）NHS-LC-Biotinをアルブミンの層に結合させた。ビオチン分子のサイズが小さいため、結合はQCM記録の基準曲線と差がなかった（図１を参照せよ）。図１に示すように、アビジンを添加した場合に周波数が急速かつ明白に変化し、このことは、アビジンのビオチン化アルブミンへの強い結合を示す。ヘパリン複合体を添加した場合、同様の急速かつ明白な周波数の変化があった。表面に結合し、アンチトロンビンと相互作用する能力を保持したヘパリンの存在は、アンチトロンビンの添加によって確認され、急速かつ明白な周波数の変化が記録された。
【実施例】
【００２０】
実施例１：ヘパリンコーティングの形成におけるアビジンによる効果の実証
以下の実施例は、コーティングプロトコルにおいてアビジンを含むことの重要性を説明するために計画された。PVC管によって例示される人工表面を、生体基質を再現するためにアルブミンでコーティングした。
【００２１】
PVC管は、2％アルブミンを含む生理食塩水を30分間室温で循環させることにより、受動的な吸着によって、アルブミンでコーティングした。次に、4つの群の管を3つの異なる濃度のSPDP（N-スクシンイミジル 3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート、Perbio Europe)を用いてインキュベーションした。表面に結合したSPDPを遊離のスルフヒドリル基に変換するために、DTT（ジチオスレイトール）を含む水溶液を用いてインキュベーションすることにより、表面に結合したSPDPを還元した。遊離のスルフヒドリル基の相対的な発生は、340 nmでの吸光度の変化を記録することによって測定した。表１のとおり、SPDPの濃度上昇に伴う遊離のスルフヒドリル基の比例的な増加を確認することができた。次のステップで、チオール反応性末端基を有するビオチン（EZ-link(商標)PEO-Iodoacetyl Biotin, Perbio Europe）を用いて、ビオチンを利用可能なチオール基に結合した。このステップの次に、ビオチン化表面を、アビジン（1μg/ml）を含む生理食塩水に30分間室温で暴露した。最後に、アビジンでコーティングした表面を、Corline（Sweden）のヘパリン複合体（0.1 mg/ml）を含む生理食塩水に30分間室温で暴露した。
【００２２】
HRP（ホースラディッシュ ペルオキシダーゼ；horse radish peroxidase）標識化ストレプトアビジンの結合は、遊離のスルフヒドリル基の表面濃度の増加に伴ったビオチンの比例的な結合を裏付けた。ヘパリン複合体のアビジンの層への結合は、アビジン非存在下でのビオチンの層と比較して4〜8倍に増加し、そしてビオチン結合の程度に比較的影響を受けないことが分かった。
【表１】
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【００２３】
実施例２：共焦点顕微鏡を使用したランゲルハンス島におけるヘパリンコーティングの検討
ヒトランゲルハンス島を、標準的な手順に従って単離し、そして培養液中に保持した。まず、膵島の一部分をビオチン（EZ-Link(商標)Sulfo-NHS-LC-Biotin, Perbio, 1 mg/ml）により60分間室温でインキュベーションし、そして次に、3倍容の新規の培地で洗浄した。次に、膵島をアビジン（1 mg/ml）中で30分間室温でインキュベーションし、次いで再び3倍容の培地で洗浄した。最後のインキュベーションは、Corline（Sweden）のヘパリン複合体（1 mg/ml）を用いて、60分間室温で実施し、そして3倍容の培地で最後の洗浄を行った。蛍光標識化アンチトロンビンで染色した後、共焦点顕微鏡を用いてヘパリン修飾化膵島を非修飾化膵島と比較した。蛍光標識化アンチトロンビンの密着した層が、図２に示すように、ヘパリン修飾化膵島において観察された。
【００２４】
実施例３：ヘパリン修飾化および非修飾化ヒトランゲルハンス島によるIBMIR（即時性血液媒介炎症反応）に対する効果
ヒトランゲルハンス島は、標準的な手順に従って単離し、そして培養液中に保持し、先に実施例２に記載したようにして、3つの異なるタイプのビオチン試薬（EZ-Link(商標)Sulfo-NHS-LC-BiotinまたはEZ-Link(商標)Sulfo-NHS-LC-LC-BiotinまたはEZ-Link(商標)TFP-PEO-Biotin）を用い、Corline（Sweden）のヘパリン複合体を用いて修飾した。ヘパリン修飾化膵島を、別に記載される（Diabetes, 48, 1907-1914, 1999）Chandlerループモデルを用いて非修飾化膵島と比較した。つまり、抗凝血剤の非存在下ではあるが非修飾化膵島またはヘパリン修飾化膵島を添加したヒト血液を、37℃で最長1時間、ヘパリンでコーティングした管ループ内で振動させた。非修飾化膵島は肉眼で見える凝固を引き起こし、そして血小板数はChandlerループモデルのベースラインレベルの5％未満に減少した。使用したビオチン試薬に関係なく、へパリン修飾化膵島による肉眼で見える凝固は無く、IBMIRの程度を測定するためのパラメーターとして用いた血小板数およびトロンビン-アンチトロンビン複合体（TAT）の生成は、顕著に上昇した。
【００２５】
実施例４：ヘパリン修飾化および非修飾化ブタランゲルハンス島によるIBMIRに対する効果
成体ブタ膵島を、標準的な手順に従って単離し、そして培養液中に保持し、先に実施例３に記載したように、Corline（Sweden）のヘパリン複合体を用いて修飾した。
【００２６】
実施例３に記載するようにChandlerループモデルを用いて、ヘパリン修飾化ブタ膵島を非修飾化ブタ膵島と比較した。結果は実施例３で得られた結果と一致した。
【００２７】
実施例５：血管のヘパリンコーティング
提供された膵臓からヒト血管を切開して、生理食塩水中に保持した。血管を小さな内腔管に接続して、血管のかん流を促進した。これらをまずビオチン（EZ-Link(商標)Sulfo-NHS-LC-Biotin; 1 mg/ml）で30分間室温でインキュベーションし、次に3倍容の生理食塩水で洗浄した。次に血管をアビジン（1 mg/ml）で60分間室温でインキュベーションし、次に再び3倍容の生理食塩水で洗浄した。最後のインキュベーションは、Corline（Sweden）のヘパリン複合体（0.1 mg/ml）を用いて60分間室温で行い、3倍容の生理食塩水で最後の洗浄を行った。トルイジンブルーによる染色および共焦点顕微鏡による検査は、血管内腔表面におけるヘパリンの存在を確認した。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、QCM（Quartz Crystal Microbalance）を用いたリアルタイム（秒）でのヘパリンコーティングの形成を示す。
【図２】図２は、共焦点顕微鏡で得られた、ヘパリンでコーティングされたランゲルハンス島を示す。
【国際調査報告】
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