(57)【要約】  本発明の目的は、嫌気性条件下である場合に、飽和又は不飽和、直鎖状又は分枝状脂肪族炭化水素の必要な硫黄、芳香族炭化水素の分解方法を実施するために、好熱性硫酸還元性古細菌を使用することである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
嫌気性条件下における、飽和又は不飽和、直鎖状又は分枝状脂肪族炭化水素、あるいは、当てはまる場合には、硫黄含有の芳香族炭化水素の分解方法の実施のための、好熱性硫酸還元性古細菌の使用。
【請求項２】
前記古細菌が、アルカエオグロバス属に属する種、特に以下の種：
−  アルカエオグロバス・フルギダス、
−  アルカエオグロバス・プロフォンダス、
−  アルカエオグロバス・ベネフィカス、
から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記古細菌が、以下のアルカエオグロバス・フルギダス：
−  アルカエオグロバス・フルギダス  ＤＳＭ４３０４、
−  ２００５年６月２２日に寄託されたアルカエオグロバス・フルギダス  ＣＮＣＭ  Ｉ−３４６５（菌株Ｌ３）、
−  ２００５年６月３０日に寄託されたアルカエオグロバス・フルギダス  ＣＮＣＭ  Ｉ−３４６９（菌株Ｌ４）、
から選択される、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記炭化水素が、
−  アルカン、特に直鎖が炭素原子５〜２０個を含む分枝アルカン、特にヘプタメチルノナン（ＨＭＮ）又はプリスタン、
−  アルケン、特に鎖が炭素原子１〜２０個、特に１〜１６個を含む直鎖状アルケン、
−  芳香族化合物、特にジベンゾチオフェン（ＤＢＴ）、ベンゼン、トルエン、ナフタレン、又はフェナントレン、
から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
スルフェート又はチオスルフェートが、電子受容体として用いられ、（飽和又は不飽和、分枝状又は直鎖状）前記脂肪族及び芳香族炭化水素が電子供与体として用いられ、そして、炭化水素の存在下におけるＨ２Ｓの生成が、約１ｍＭ以上、特に約４ｍＭである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
嫌気性条件下における飽和又は不飽和、直鎖状又は分枝状脂肪族炭化水素、あるいは、当てはまる場合には、硫黄含有の芳香族炭化水素の分解方法であって、前記炭化水素を、前記で定義された好熱性硫酸還元性古細菌の存在下に置く段階であって、当てはまる場合には、電子受容体として用いられたスルフェート又はチオスルフェート、及び電子供与体として用いられた前記炭化水素の反応媒質への添加後である前記段階、を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項７】
前記古細菌が、アルカエオグロバス属に属する種、特に以下の種：
−  アルカエオグロバス・フルギダス、
−  アルカエオグロバス・プロフォンダス、
−  アルカエオグロバス・ベネフィカス、
から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記古細菌が、以下のアルカエオグロバス・フルギダス：
−  アルカエオグロバス・フルギダス  ＤＳＭ４３０４、
−  ２００５年６月２２日に寄託されたアルカエオグロバス・フルギダス  ＣＮＣＭ  Ｉ−３４６５（菌株Ｌ３）、
−  ２００５年６月３０日に寄託されたアルカエオグロバス・フルギダス  ＣＮＣＭ  Ｉ−３４６９（菌株Ｌ４）、
から選択されることを特徴とする、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記炭化水素が、
−  アルカン、特に直鎖が炭素原子５〜２０個を含む分枝アルカン、特にヘプタメチルノナン（ＨＭＮ）又はプリスタン、
−  アルケン、特に鎖が炭素原子１〜２０個、特に１〜１６個を含む直鎖状アルケン、
−  芳香族化合物、特にジベンゾチオフェン（ＤＢＴ）、ベンゼン、トルエン、ナフタレン、又はフェナントレン、
から選択されることを特徴とする、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
炭化水素の存在下におけるＨ２Ｓの生成が、約１ｍＭ以上、特に約４ｍＭであることを特徴とする、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
用いられる古細菌の量が、約２ｍＭの炭化水素に対して約１ｇ／Ｌ（湿潤重量）であることを特徴とする、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
古細菌と炭化水素との接触時間が、約１５日であることを特徴とする、請求項６〜１１の１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞の回収段階、及び、当てはまる場合には、膜脂質の精製段階を含むことを特徴とする、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
アルカエオグロバス属に属する以下の種：
−  ２００５年６月２２日に寄託されたアルカエオグロバス・フルギダス  ＣＮＣＭ  Ｉ−３４６５（菌株Ｌ３）、
−  ２００５年６月３０日に寄託されたアルカエオグロバス・フルギダス  ＣＮＣＭ  Ｉ−３４６９（菌株Ｌ４）、
から選択される古細菌。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、嫌気性条件下における脂肪族又は芳香族炭化水素の分解方法の実施のための、好熱性硫酸還元性古細菌（thermophilic sulphate-reducing archaeobacteria）の使用に関する。
【０００２】
炭化水素は、炭素及び水素から構成された有機化合物であり、これらの主要な貯蔵層の１つは、地球化学的に（ｇｅｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ）高温及び高圧において形成された石油である。炭化水素は、飽和化合物；アルカン及びシクロアルカン、不飽和化合物；アルケン及びシクロアルケン、及び単環式又は多環式であることのできる芳香族化合物を包含する。実際、脂肪族及び芳香族炭化水素は、原油の大部分の７５％超を構成する。有機窒素含有化合物、硫黄含有化合物、又は酸素含有化合物の低濃度における存在、アスファルトフラクション及びポルフィリンの存在に注目することさえ可能である（Ｂｅｒｔｒａｎｄ及びＭｉｌｌｅ、１９８９年）。
【０００３】
石油は、人によって用いられている主要エネルギー源である。その配送のときに、このことから問題が起こる。これらは一方では、輸送及び保存、石油の生分解のリスク、及びその派生生成物による問題である。更に、本質的に海路によって実施される輸送は、環境汚染において主な原因である。国立科学及び環境協会（Ｌ’Ａｃａｄｅｍｉｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｄｅ  ｌ’Ｅｎｖｉｒｏｎｎｅｍｅｎｔ）は、石油の環境への導入が１．７〜８．８百万メートルトンであり、これらの大部分は、人類発生起源のものであると推定している（Ｌｅａｈｙ及びＣｏｗｅｌｌ、１９９０年）。
【０００４】
炭化水素による自然環境の汚染は、かなり大きい関心事になっている。実際、オイルバンカーは、硫黄含有化合物、（例えば、ジベンゾチオフェン（ＤＢＴ））を含有する。これらの燃焼は、都市汚染及び酸性雨の主な原因である。更に、油井中に存在する微生物は、鋼を腐蝕させ、嫌気生活におけるスルフィドの生成（これは、「堆積層の酸洗い（Ｓｏｕｒｉｎｇ  ｏｆ  ｄｅｐｏｓｉｔｓ）」と呼ばれる）により作業者の安全性を脅かす。同様に科学者たちは、この環境問題を改善するために、バイオテクノロジー的な方法を導入することを目的として、炭化水素の化学的及び生物学的分解メカニズムを理解しようと努力している。実際、生分解処理、すなわち微生物によって加速される自然分解は有利であるが、それは、経済的な視点から物理化学的処理よりも安価であり、より無害であるからである。これは更に、炭化水素の完全無機化に導くことができる。
【０００５】
炭化水素の異化作用は、長い間、厳密に酸素によるプロセスであると考えられてきた。このプロセスの間、最初の段階は、オキシゲナーゼの使用を必要とする（Ｓｐｏｒｍａｎｎ＆Ｗｉｄｄｅｌ、２０００年）。およそわずか２０年間の間に、いくつの細菌が酸素の非存在下に炭化水素を代謝することができることを、予想することができるようになった（Ａｔｌａｓ、１９８１年；Ｂｅｒｔｒａｎｄ＆Ｍｉｌｌｅ、１９８９年；Ｌｅａｈｙ＆Ｃｏｌｗｅｌｌ、１９９０年）。このような代謝が可能な微生物は、酸素の非存在下に炭化水素を分解するために代替物を発見しなければならなかった。それまで、炭化水素を分解することのできる、脱窒性細菌、硫酸還元性細菌（sulphate-reducing bacteria）、及び鉄還元性細菌が、単離されている。
【０００６】
Ｓｔｅｔｔｅｒらが、イタリアのバルカノアイランド（Ｖｕｌｃａｎｏ  Ｉｓｌａｎｄ）の水熱系から、新しい群の硫酸還元性及び超好熱性古細菌を単離したのは１９８７年であった（菌株アルカエオグロバス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）ＶＣ１６（ＤＳＭ４３０４））。
【０００７】
アルカエオグロバス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）属に属する種は、０．４〜１μｍの異なるサイズを有する規則的又は不規則的シェルの形態の細胞を特徴とする。これらはグラム陰性であり、分離しているか、又は対になっている。これらの微生物は、６０℃〜９５℃の成長温度、５．５〜７．５程度のｐＨに耐性である。これは、ホルメート、ホルムアミド、Ｄ−、及びＤ＋ラクテート、グルコース、デンプン、カサミノ酸、ペプトン、ゼラチン、カゼイン、酵母抽出物、肉抽出物、及び真性細菌及び古細菌細胞の抽出物を、電子受容体としてのスルフェート、チオスルフェート、及びスルフィットの存在下に酸化することのできる化学合成有機栄養生物である。更に、これらの微生物は、Ｈ２ＣＯ２の存在下に成長することができる。電子受容体としてのチオスルフェートの存在下、６μモル／ｍＬ超のスルフィドと、０．１μモル／ｍＬ未満のメタンの痕跡との生成がある。
【０００８】
アルカエオグロバス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ・ｆｕｌｇｉｄｕｓ）  ＶＣ−１６は、代表的な種である。前記細胞は、糖タンパク質からなるエンベロープを有する不規則な球の形態である。この菌株は、８３℃の最適成長温度、及び約４時間の世代時間を有する。
【０００９】
この種は、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ−Ｓｔｏｃｋｈｅｉｍのドイツ微生物コレクションに提出され、ＶＣ−１６（４３０４）と呼ばれている。
【００１０】
Ｋｌｅｎｋら（１９９７年）は、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ  ＶＣ−１６のゲノムの配列決定を、古細菌：メタノコッカス・ジャナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）と比較しながら行なった。実際、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓは、そのゲノムが配列決定された最初の硫酸還元性古細菌である。Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓのゲノムは、２，１７８，４００塩基対によって形成された円形染色体であり、このＤＮＡのＧ＋Ｃ組成は４８．５％である。
【００１１】
硫酸還元（Ｓｕｌｐｈａｔｅ−ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）は、無酸素海洋環境における最も豊富な呼吸プロセスである。スルフェート（ＳＯ４−２）はまず、アデニルスルフェート（アデノシン−５’−ホスホスルフェート；ＡＰＳ）を生成するために活性化され、ついでスルフィットが活性化されることになる。異化型硫酸還元プロセスに関与する酵素は、活性化されたスルフェートを還元するアデニルスルフェートレダクターゼである。このように形成されたスルフィットは、デスルホビリジン、スルフィットレダクターゼの作用によってスルフィドへ還元される。
【００１２】
Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓは、アセテート上で成長することができないことが指摘されてきたが、いくつかのアセチル−ＣｏＡシンテターゼ遺伝子が、そのゲノム中に検出されている。これらは、アセテートのアセチル−ＣｏＡへの転化の原因である。β−酸化に関与する５７酵素の存在は、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓが脂肪酸を酸化することができることを示唆している。古細菌におけるβ−酸化経路は、バクテリア及びミトコンドリア中で行なわれるものと同様である。
【００１３】
Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓにおいて、成長中のメタンの痕跡の生成はおそらく、一酸化炭素デヒドロゲナーゼを介したＮ５−メチルテトラヒドロメタノプテリンの還元による。更に、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓは、ロドスピリラム・ルブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ）のものと同様なＣＯデヒドロゲナーゼのタイプを有し、単一エネルギー源として一酸化炭素を用いることによって、これを成長させることができることが示唆されている。
【００１４】
本発明の目的は、嫌気性条件下における、脂肪族又は芳香族炭化水素の新規分解方法、及び、前記方法の実施のための新規細菌株を提供することである。
【００１５】
本発明は、嫌気性条件下における、飽和又は不飽和、直鎖状又は分枝状脂肪族炭化水素、あるいは、当てはまる場合には、硫黄含有の芳香族炭化水素の分解方法の実施のための、好熱性硫酸還元性古細菌の使用に関する。
【００１６】
より詳細には、本発明は、古細菌が、アルカエオグロバス属に属する種、特に以下の種：
−  アルカエオグロバス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、
−  アルカエオグロバス・プロフォンダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｐｒｏｆｏｎｄｕｓ）、
−  アルカエオグロバス・ベネフィカス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｖｅｎｅｆｉｃｕｓ）、
から選択される前記使用に関する。
【００１７】
本発明のより具体的な主題は、古細菌が、以下のアルカエオグロバス・フルギダス：
−  アルカエオグロバス・フルギダス  ＤＳＭ４３０４、
−  ２００５年６月２２日に寄託されたアルカエオグロバス・フルギダス  ＣＮＣＭ  Ｉ−３４６５（菌株Ｌ３）、
−  ２００５年６月３０日に寄託されたアルカエオグロバス・フルギダス  ＣＮＣＭ  Ｉ−３４６９（菌株Ｌ４）、
から選択される前記使用である。
【００１８】
より詳細には、本発明は、炭化水素が、
−  アルカン、特に直鎖が炭素原子５〜２０個を含む分枝アルカン、特にヘプタメチルノナン（ＨＭＮ）又はプリスタン、
−  アルケン、特に鎖が炭素原子１〜２０個、特に１〜１６個を含む直鎖状アルケン、
−  芳香族化合物、特にジベンゾチオフェン（ＤＢＴ）、ベンゼン、トルエン、ナフタレン、又はフェナントレン、
から選択される前記使用に関する。
【００１９】
本発明のより具体的な主題は、スルフェート又はチオスルフェートが、電子受容体として用いられ、（飽和又は不飽和、分枝状又は直鎖状）脂肪族及び芳香族炭化水素が電子供与体として用いられ、炭化水素の存在下におけるＨ２Ｓの生成が、約１ｍＭ以上、特に約４ｍＭである上記使用である。
【００２０】
本発明はまた、嫌気性条件下における飽和又は不飽和、直鎖状又は分枝状脂肪族炭化水素、あるいは、当てはまる場合には、硫黄含有の芳香族炭化水素の分解方法であって、前記炭化水素を、前記で定義された好熱性硫酸還元性古細菌の存在下に置く段階であって、当てはまる場合には、電子受容体として用いられたスルフェート又はチオスルフェート、及び電子供与体として用いられた前記炭化水素の反応媒質への添加後である前記段階、を含むことを特徴とする、前記方法にも関する。
【００２１】
本発明はより詳細には、古細菌が、アルカエオグロバス属に属する種、特に以下の種：
−  アルカエオグロバス・フルギダス、
−  アルカエオグロバス・プロフォンダス、
−  アルカエオグロバス・ベネフィカス、
から選択されることを特徴とする、前記に規定された方法に関する。
【００２２】
本発明のより具体的な主題は、前記古細菌が、以下のアルカエオグロバス・フルギダス：
−  アルカエオグロバス・フルギダス  ＤＳＭ４３０４、
−  ２００５年６月２２日に寄託されたアルカエオグロバス・フルギダス  ＣＮＣＭ  Ｉ−３４６５（菌株Ｌ３）、
−  ２００５年６月３０日に寄託されたアルカエオグロバス・フルギダス  ＣＮＣＭ  Ｉ−３４６９（菌株Ｌ４）
から選択されることを特徴とする、前記に規定された方法である。
【００２３】
本発明はより詳細には、炭化水素が、
−  アルカン、特に直鎖が炭素原子５〜２０個を含む分枝アルカン、特にヘプタメチルノナン（ＨＭＮ）又はプリスタン、
−  アルケン、特に鎖が炭素原子１〜２０個、特に１〜１６個を含む直鎖状アルケン、
−  芳香族化合物、特にジベンゾチオフェン（ＤＢＴ）、ベンゼン、トルエン、ナフタレン、又はフェナントレン
から選択されることを特徴とする、前記に規定された方法に関する。
【００２４】
本発明のより具体的な主題は、炭化水素の存在下におけるＨ２Ｓの生成が、約１ｍＭ以上、特に約４ｍＭであることを特徴とする、前記に規定された方法である。
【００２５】
本発明はより詳細には、用いられる古細菌の量が、約２ｍＭの炭化水素に対して約１ｇ／Ｌ（湿潤重量）であることを特徴とする、前記に規定された方法に関する。
【００２６】
本発明のより具体的な主題は、古細菌と炭化水素との接触時間が、約１５日であることを特徴とする、前記に規定された方法である。
【００２７】
本発明はより詳細には、細胞の回収段階、及び当てはまる場合には、膜脂質の精製段階を含むことを特徴とする、前記に規定された方法に関する。
【００２８】
本発明はまた、アルカエオグロバス属に属する以下の種：
−  ２００５年６月２２日に寄託されたアルカエオグロバス・フルギダス  ＣＮＣＭ  Ｉ−３４６５（菌株Ｌ３）、
−  ２００５年６月３０日に寄託されたアルカエオグロバス・フルギダス  ＣＮＣＭ  Ｉ−３４６９（菌株Ｌ４）
から選択される古細菌にも関する。
【００２９】
炭化水素の分解の枠組み内での古細菌の菌株の使用についての、以下の詳細な説明を用いて、本発明を更に例証する。
【００３０】
《材料及び方法》
Ｉ．用いられた菌株
以下の実験研究を通して、「アルカエオグロバス・フルギダス」とは、菌株ＤＳＭ４３０４を意味し、「菌株Ｌ−３」とは、ＣＮＣＭ（パリ）に２００５年６月２２日に寄託された菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−３４６５を意味する。
菌株Ｌ−３を用いて得られた実験結果はまた、菌株Ｌ−４、すなわちＣＮＣＭ（パリ）に２００５年６月３０日に寄託された菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−３４６９でも得ることができる。
アルカエオグロバス・フルギダス（ＤＳＭ４３０４）は、極度に好熱性で厳格に嫌気性の硫酸還元性古細菌である。これは、ナポリの近くの海洋水熱系（ｍａｒｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌ  ｓｙｓｔｅｍ）（バルカノ・アイランド）から単離された（Ｓｔｅｔｔｅｒ、１９８８年）。前記細胞は、０．４〜１μｍのサイズの球菌形状を有し、分離されているか、又は対になっている。最適な成長を得るためには、温度は８３℃でなければならず、ｐＨは５．５〜７．５の間を含み、最適基質はラクテートである。この菌株のＤＮＡのＧ＋Ｃパーセンテージは、４６％である。
菌株Ｌ−３は、Ｍ．Ｌ．Ｆａｒｄｅａｕによって、メラン（Ｍｅｌｕｎ）（パリ地域）に位置する地熱井から８０℃で採取されたサンプルから単離されたアーキオン（Ａｒｃｈａｅｏｎ）である。前記細胞は、直径１〜１．５μｍのシェルである。この菌株は、５５〜８５℃の範囲の温度で成長可能であり、その最適温度は７５℃である。これは、ｐＨ６．５で成長する。
菌株Ｌ−３は、硫酸還元性菌株であり、その成長は、電子受容体としてスルフェートの代わりのチオスルフェート、及び基質としてのラクテートによって有利になる。その代謝の間に、用いられる基質は、アルカエオグロバス・フルギダス（ＤＳＭ４３０４；その酸化は部分的であり、排出を通して、アセテートの痕跡を通過させる）とは異なって、ＣＯ２の生成を生じるために完全に酸化される。
系統発生的な特徴づけは、菌株Ｌ−３とアルカエオグロバス・フルギダス（ＤＳＭ４３０４）との間のＲＮＡ１６ＳをコードするＤＮＡ配列に、９９％の相似性があることを示した。ゲノムの観点から、菌株Ｌ−３は、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ（ＤＳＭ４３０４）と約９０％ハイブリッドを形成する（ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成）。
【００３１】
ＩＩ．微生物学的方法
ＩＩ．１．嫌気性培地
培地は、Ｈｕｎｇａｔｅ（１９６９年）によって考え出され、Ｍｉｌｌｅｒ及びＷｏｌｌｉｎ（１９７４）によって開発された技術に従って調製された。合成培地は、１リットルの蒸留水あたり、ＮＨ４Ｃｌ、１ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、０．３ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４、０．３ｇ；ＫＣｌ、０．１ｇ；ＣａＣｌ２、２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ；ＮａＣｌ、２０ｇ；ＮｉＳＯ４．６Ｈ２Ｏ、１．６ｍｇ；Ｎａ２ＷＯ４．２Ｈ２Ｏ、３８μｇ；Ｎａ２ＳｅＯ３．５Ｈ２Ｏ、３μｇ；酵母抽出物、０．１ｇ；実験によるチオスルフェート又はスルフェート、２０ｍＭ；Ｌ−システイン、ＨＣｌ塩酸塩、０．５ｇ；レサズリン、１ｍＬの０．１％溶液；０．０５ｍＬのビタミン溶液（Ｗｏｌｌｉｎら、１９６３年）；痕跡成分（ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）１ｍＬからなる。痕跡成分のこの溶液は、１リットルの蒸留水あたり、１０ｍＬの２５％ＨＣｌ、１．５ｇのＦｅＣｌ２、４Ｈ２Ｏ、１９０ｍｇのＣｏＣｌ２、６Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＭｎＣｌ２、４Ｈ２Ｏ、７０ｍｇのＺｎＣｌ２、６２ｍｇのＨ３ＢＯ３、３６ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４、２Ｈ２Ｏ、２４ｍｇのＮｉＣｌ２、６Ｈ２Ｏ、１７ｍｇのＣｕＣｌ２、２Ｈ２Ｏを含有し、そのｐＨは、７．２に調節される。
この培地のｐＨは、７に調節され、ついで培地は、培地を脱ガスし、溶解酸素を窒素と代えるために窒素流下に沸騰させられる。無酸素培地は、使用法に従って、培養フラスコ又は嫌気性培養管のどちらかに分配される。
１２１．１℃での４５分間のオートクレーブ中での培地の滅菌後、培地は、還元剤としてのＮａ２Ｓ、９Ｈ２Ｏ、２％（５ｍＬに対して０．１ｍＬ）、緩衝剤としてのＮａＨＣＯ３、１０％（５ｍＬに対して０．１ｍＬ）、及びＭｇＣｌ２、６Ｈ２Ｏ（３ｇ／Ｌ）の添加によって完成される。培地は、ＮａＣｌの存在に関連したその沈殿を避けるために、滅菌後に添加される。
最後に、基質は、実験条件に従って添加される。これがラクテートである場合、ラクテートは、滅菌１Ｍ溶液から２０ｍＭで導入される。
【００３２】
ＩＩＩ．臨床的及び生化学的分析
ＩＩＩ．１．スルフィドアッセイ
スルフィドアッセイは、２つの方法、すなわちＣｏｒｄ−Ｒｕｗｉｓｈの方法（１９８５年）及びＣｌｉｎｅの方法（１９６９年）に従って実施された。
【００３３】
ＩＩＩ．１．１．Ｃｏｒｄ−Ｒｕｗｉｓｈによるスルフィドアッセイ
Ｃｏｒｄ−Ｒｕｗｉｓｈによるスルフィドアッセイは、比濁アッセイである。
実験では、５０ミリモル／ｌのＨＣｌ及び５ミリモル／ｌのＣｕＳＯ４を含んでいる４ｍＬのＣｏｒｄ−Ｒｕｗｉｓｈ試薬が、０．１ｍＬのサンプルへ添加される。硫酸銅（ＣｕＳＯ４）は、硫化水素（Ｈ２Ｓ）との反応によって、反応：
ＣｕＳＯ４＋Ｈ２Ｓ→ＣｕＳ＋Ｈ２ＳＯ４
後、硫化銅沈殿物（ＣｕＳ）を生成する。
この方法によれば、ＣｕＳは、４８０ｎｍにおける分光測定法によってアッセイされる。読み取りは、４ｍＬのＣｏｒｄ−Ｒｕｗｉｓｈ試薬によって構成されたブランクに対して実施される。
スルフィドの量は、硫化ナトリウムを用いて生成された標準化曲線に対して計算される。
【００３４】
ＩＩＩ．１．２．Ｃｌｉｎｅによるスルフィドアッセイ
Ｃｌｉｎｅの方法によるスルフィドアッセイは、比色アッセイである。このアッセイは、スルフィド架橋による、塩化第二鉄の存在下における２分子のジメチルｐ−フェニレンジアミン（ＤＭＰＤ）の組み合わせ後のメチレンブルーの生成に基づく。マイクロ方法が用いられ、２％酢酸亜鉛中に入れられた１〜２０μＬのサンプルの１フラクションに対して実施された。これは、スルフィドを不溶性硫化亜鉛（ｑｓｆ５００μＬ）の形態で固定するであろう。
２００μＬの０．２％ＤＭＰＤ（２ｇのジメチルアニリンスルフェート、２００ｍＬの濃硫酸、蒸留水ｑｓｆ１１）、１０μＬの１０％塩化鉄、及び２００μＬの蒸留水が、ついで添加される。着色の強度は、サンプルの代わりに水を含有するブランクに対して、６７０ｎｍにおける分光光度計で測定される。スルフィド濃度は、硫化ナトリウム溶液から生成された標準化曲線との比較によって決定される。
【００３５】
ＩＩＩ．２．代謝産物の分析及び定量化
ＩＩＩ．２．１．説明
代謝体の分析及び定量化は、基質の消失及び様々な代謝産物の出現を測定することによって、ＨＰＬＣで実施される。
用いられた装置は、以下のものから構成される：
・アミネックス（Ａｍｉｎｅｘ）ＨＰＸ−８７Ｈ３００Ｘ７カラム、３５℃にされた８ｍｍ（ビオラッド（Ｂｉｏｒａｄ））；
・スペクトラ（Ｓｐｅｃｔｒａ）シリーズＡＳ１００型自動サンプラープロセッサー；
・スペクトラシステムＲＩ１５０型示差屈折計検出器；
・インジェクターと組み合わされたスペクトラシステムＳＣＭ１０００自動脱ガス器；
・結果がアズール・データリス（Ａｚｕｒ  Ｄａｔａｌｙｓ）ソフトウエアによって記録され、積算され、かつ分析されるコンピュータ。
対照標準化曲線は、ソフトウエアがその保持時間によって化合物を同定し、その濃度をこれから推論することを可能にする、公知濃度の溶液を用いて確立される。同定されたピークは、自動的に処理され、各化合物の濃度は、ピークのサイズから推論される。
【００３６】
ＩＩ．２．２．操作方法
液体溶離液が濾過され、３５℃で硫酸（０．００２５Ｍ）を脱ガスする。溶離液の流量は、１，２００Ｐｓｉの圧力で０．６ｍＬ／分である。注入シリンジを濯ぎ洗いするための液体は、水である。
サンプルが採取され、ＨＰＬＣを通過する前に冷凍される。解凍後、サンプルは１３，０００ｒｐｍで２０℃において６分間遠心分離される。
６００μＬの上澄み液が、適切な小さいフラスコに導入され、これらはついで、自動サンプラープロセッサーに入れられる。注入容積は２０μＬである。各分析シリーズの最後に、カラムは、測定値を歪めることがあるカラムの任意の細菌汚染を避けるために、１５％アセトニトリル溶液で濯ぎ洗いされる。
【００３７】
ＩＩＩ．３．チオスルフェート及びスルフェートアッセイ
ＩＩ．３．１．説明
チオスルフェート及びスルフェートアッセイが、イオンクロマトグラフィーによって実施される。
イオンクロマトグラフィー（ＩＣ）は、最も古いクロマトグラフィー技術の１つである。逆説的に言えば、自動イオンクロマトグラフィー装置は、わずか２０年ちょっと前（１９７５年）に開発されたばかりであった。
イオンクロマトグラフィーの原理は、樹脂上のイオン交換に基づく。イオンは、移動相によって取り込まれ（ｅｎｔｒａｉｎｅｄ）、固定相の作用によって分離される。カラム中の樹脂と、分離されるイオンとの間の静電的相互作用が、多少なりとも強いかどうかに応じて、分離は、多少なりとも容易に実施されるであろう。
分析は、以下のものを備えたクロマトグラフ（Ｃｏｍｐａｃｔ  ＩＣ７６１、Ｍｅｔｒｏｈｍ）を用いて実施される：
・カチオン性イオン交換カラム（Ｍｅｔｒｏｓｅｐ  Ａ  ＳＵＰＰ  １−２５０（６．１００５．３００））、サイズ４．６*２５０ｍｍ；
・用いられる溶離液は、３ミリモル／ｌの濃度、１〜２．５ｍＬ／分の流量でのＮａ２ＣＯ３である；（（→流量は分析の間に変わる））
・サンプルプロセッサー（メトローム８３８）；
・導電計測器（ｃｏｎｄｕｃｔｉｍｅｔｅｒ）；
・結果が、ソフトウエア（７６１コンパクトＩＣ、メトローム）によって記録され、積算され、かつ分析されるコンピュータ。
【００３８】
ＩＩＩ．３．２．操作方法
操作条件は、温度が２０℃で、圧力が５ＭＰａであるようなものである。分析されるサンプルが濾過される。注入容積は２０μＬである。検出は、溶離勾配を可能にする化学的抑制を有する導電計測電気化学型のものである。
【００３９】
ＩＩＩ．４．ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による分析
ガスクロマトグラフィーは、移動液相がガスによって置換されている液体クロマトグラフィーの転位（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）である。
ガスクロマトグラフィーは、以下のものを含む：
・サーモスタット制御されたオブン中に配列されたカラム；
・サンプル注入装置；
・検出器。
【００４０】
ＩＩＩ．４．１．ＣＯ２アッセイ
ＩＩＩ．４．１．１．説明
カサロメーターを備えたＧＣが、水素、酸素、及びＣＯ２消費レベルを定性化及び定量化するために用いられる。異なる気体溶質が、固定相に沿った示差移行によって分離されるであろう。ガスのカラム中の保持時間は異なり、このことは、分子量の程度を増加させることによってこれらを分離すること、及びこれらを同定することを可能にする。Ｈ２が最初に溶離され、ついでＯ２、最後にＣＯ２が溶離される。
分析は、以下のものを備えたシマズ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）ＧＣ−８Ａクロマトグラフを用いて実施される：
・１５０℃に維持されたカルボスフィア（ｃａｒｂｏｓｐｈｅｒｅ）担体で満たされたカラム；
・２００℃の温度に維持されたインジェクター及び検出器（カサロメーター）；
・キャリヤーガスＮ２のみが通過する対照セル；
・キャリヤーガス及びサンプルが通過する測定セル；これは、溶離液を定量化することを可能にする、抵抗の変動によって２つのセル間に生じた潜在的な差である。
この装置によって生じた結果は、ピークの形態で出現する。純粋ガスの公知濃度での予め確立された標準化曲線によれば、各ピークは、対応化合物へ割り当てられる。
【００４１】
ＩＩＩ．４．１．２．操作方法
ＣＯ２アッセイは、液相中に存在するＣＯ２の気相の方への変位後に実施される。ＣＯ２の気相中への放出は、培養物の溶液の１％に等しい容積の１Ｍリン酸の容積の添加、ついで激しい撹拌による。０．１ｍＬの気相が、クロマトグラフ中に注入される。
【００４２】
ＩＩＩ．４．２．重質炭化水素のアッセイ
ＩＩＩ．４．２．１．説明
重質炭化水素のアッセイが、抽出炭化水素のガスクロマトグラフ中への注入によって実施される。用いられたクロマトグラフは、以下のものを備えたクロムパック（Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ）ＣＰ９０００型のものである：
・ＣＰ−Ｓｉｌ  ５ＣＢ型の固定相（１μｍ厚さ）を含有する溶融シリカを有する半毛管カラム（１０ｍ×０．５３ｍｍ）（クロムパック）；その温度は８０℃であり、２℃／分の率で１８０℃まで増加する；
・流量１０ｍＬ／分でのキャリヤーガス、窒素；
・３００℃に維持された水素炎イオン化検出器；
・３００℃に維持されたインジェクター。
【００４３】
ＩＩＩ．４．２．２．原理
重質炭化水素が、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって、半容積のヘプタンでの培養物から抽出後、内部標準が添加されてアッセイされる。１サンプルあたり１μＬの３つの注入が実施される。標準化曲線は、漸増［アッセイされる炭化水素］／［内部標準］比を用いて生成される。
【００４４】
ＩＩＩ．４．２．３．炭化水素の分解の研究の操作方法
培地は、パラグラフ１．２に示されているように、基質をともなわずに完成され、ベルコ（Ｂｅｌｌｃｏ）管中に分配される。検体は、１０％で接種される。脂肪族炭化水素（アルカン及びアルケン）は、約２ｍＭの率で管中に直接導入される。アッセイされるほかの炭化水素（ジベンゾチオフェン（ＤＢＴ））が、ヘプタメチルノナン（ＨＭＮ）及びＨＭＮ中に単独で溶解される。前記炭化水素は、ブルーストッパーを取り除いて、管を窒素流下に置いた後、クロマトグラフィーシリンジ（ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ））を用いて導入される。この操作はその後、ブルーストッパー（ベルコ）を、テフロンコーティングされたブルーストッパーに代えることを可能にする。最後に、逆さまに配置された管は、７５℃でインキュベーションされる。
基質として導入されたＨＭＮの当初濃度は、１ｍＭであり（ＨＭＮ、ＭＭ＝２２６．４５；ｄ＝０．７９３）、ＤＢＴの当初濃度は、５．４ｍＭである（計算のために１０ｍｇ／１０ｍＬ管を利用する；ＭＷ＝１８４．２６）。
２つのタイプの対照が準備される；第一のタイプにおいて、炭化水素が導入されているが、接種材料は導入されておらず、一方、第二のタイプは接種されているが、炭化水素は導入されていない。
炭化水素の分解の定量分析が、検体に対して実施され、対照は、実験の最初と最後に犠牲にされた。
炭化水素の抽出が、内部標準を含有するヘプタンの半分の容積によって実施された。内部標準が選択された：ＤＢＴの分解の定量的研究の場合、プリスタンが選択され（４５μＬ／２５ｍＬのヘプタン）、他方で、ＨＭＮの場合、内部標準はテトラデカンである（２０μＬ／２５ｍＬのヘプタン）。
【００４５】
ＩＩＩ．５．細胞計数
細胞計数は、液体培地の正確な容積中に含有された細胞数の決定である。この計数の結果は、細胞濃度として、すなわち１リットルあたりの細胞数で表示される。
実験の間に採用された細胞計数は、特別な計数スライド（又は計数チャンバ）を用い、顕微鏡で直接計数することによって、又は間接的に５８０ｎｍにおける吸光度の測定のどちらかによって実施される。
【００４６】
ＩＩＩ．５．１．細胞計数の原理
計数チャンバは、公知容積の計数チャンバが空洞にされているオブジェクトスライドである。これは、溝及びグリッドを含んでいる厚いガラススライドである。計数容積が、スライド上に彫り込まれたグリッドの面積及びチャンバの深さによって決定されることが指摘されるべきである。
【００４７】
ＩＩＩ．５．２．トーマ（Ｔｈｏｍａ）セル：説明及び原理
トーマセルは、４００平方のグリッドを有する、境界が画定された区域を含むガラススライドであり、これは、平らなスライドで覆われて、公知容積の微生物縣濁液を捕捉している。
細胞計数を実施するために、以下の手順にしたがう。この細胞の２つのサイドプレートは、スライドがサイドプレートへ完全に接着するように湿される。ついで計数チャンバが、毛管現象によって均質細胞縣濁液で満たされ、気泡が生じるのを避ける。この計数は、数分後、細胞がグリッド上に付着される時に実施することができる。
計数は、×４０レンズを用いて、３〜４個の大きい正方形に対して実施される。研究された縣濁液の細胞濃度は、以下のとおりである：
Ｎ＝ｎ／ｖであり、
ｎは、計数された細胞数であり、
ｖは、各々の大きい正方形が、４．１０−６ｍＬの容積を有することを知った上での計数容積であり、
Ｎは、１リットルあたりの細胞数である。
【００４８】
《結果》
Ｉ．菌株Ｌ−３及びアルカエオグロバス・フルギダスの生理学的特徴決定
Ｉ．１．酵母抽出物に対する菌株Ｌ−３の必要条件
酵母抽出物に対する菌株Ｌ−３の必要条件を研究するために、検体及び対照を、全く同一に２つ（ｉｎ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）調製した。ラクテート基質を含有する検体において、可変量の酵母抽出物が添加され、他方で、対照は２ｇ／Ｌの酵母抽出物を含み、基質は含まない。これを表１に示す。
微生物成長のモニターを、５８０ｎｍにおけるＯＤの測定によって実施し、微生物活性を、Ｃｏｒｄ−Ｒｕｗｉｓｈ方法に従って、スルフィドの生成によってモニターした。
次の培地、すなわち１リットルの蒸留水について、ＮＨ４Ｃｌ、１ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、０．３ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４、０．３ｇ；ＫＣｌ、０．１ｇ；ＣａＣｌ２、２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ；ＮａＣｌ、２０ｇ；ＮｉＳＯ４．６Ｈ２Ｏ、１．６ｍｇ；Ｎａ２ＷＯ４．２Ｈ２Ｏ、３８μｇ；Ｎａ２ＳｅＯ３、５Ｈ２Ｏ、３μｇから構成された培地上で酵母抽出物をともなわずに菌株Ｌ−３を成長させることも可能である。
基質がなく、かつ２ｇ／Ｌの酵母抽出物を含有する対照に関しては、細胞生物量又はスルフィド生成における増加は、インキュベーション期間全体において観察されない。このことは、菌株Ｌ−３が、炭素及びエネルギーの単一源としての２ｇ／Ｌの酵母抽出物上で増殖できないことを証明している。
０ｇ／Ｌの酵母抽出物を有する検体において、細胞成長は起こらない。この結果は、０．５ｍＭを超えないスルフィド価によって確認される。このようにして、菌株Ｌ−３は、成長するためには酵母抽出物を必要とする。
可変量の酵母抽出物（０．１、０．５、１、及び２ｇ／Ｌ）を有する検体において、生成された細胞生物量の価の増加が、スルフィド生成をともなって認められる。しかしながらこの細胞成長は、添加された酵母抽出物の量の関数として様々である。実際、２ｇ／Ｌを有する検体は、ほかの検体に対して、最高の細胞生物量及びスルフィド生成価を特徴とし、これらはそれぞれ、平均して、５８０ｎｍにおけるＯＤについては０．１９６８、２．８ｍＭのスルフィドである。
このようにして、連続した実験が、２ｇ／Ｌの酵母抽出物を含む培地を用いて実施される。
【表１】
2009500008.tif 000002
【００４９】
Ｉ．２．電子受容体（チオスルフェート、スルフェート）に応じての基質の分解
菌株Ｌ−３の様々な基質の分解能力の研究は、コレクション菌株アルカエオグロバス・フルギダス（ＤＳＭ４３０４）との比較に基づいていた。５８０ｎｍにおける細胞生物量の測定、Ｃｏｒｄ−Ｒｕｗｉｓｈ方法に従って生成されたスルフィドアッセイ、ＧＰＣ−カサロメーターでのＣＯ２アッセイにより完成されたＨＰＬＣによる分解代謝物の検査によって、２つの菌株による基質の分解をモニターした。結果を、表２及び３に示す。
２つの一連の検体、すなわち電子受容体として１つがチオスルフェートを有するもの、他方がスルフェートを有するものが調製された。
基質がラクテートであり、電子受容体がチオスルフェート又はスルフェートである検体において、微生物成長の増加及びスルフィドの生成が観察された。ＨＰＬＣによって、ラクテートの分解が、アセテートの痕跡の生成をともなって確認された。
電子受容体の関数としてラクテートを含む２つの一連の検体を比較することによって、及びＨＰＬＣ結果に基づいて、チオスルフェートを用いた場合、スルフェートを用いた場合よりもはるかに大きいアセテートの痕跡の生成がある。
フマレートを含有する検体については、ＨＰＬＣを用いて、分解の場合、アセテートピークの位置決定をすることは不可能であるが、それは、これら２つのピーク（アセテート及びフマレート）が、同じレベルに現われるからである。それにもかかわらず、基質の分解は、スルフィドの生成をともなって見られる。これは、チオスルフェートの場合、６．５ｍＭに達し、スルフェートの場合、３．１ｍＭを超えない。このようにして、フマレートの無機物化は、アルカエオグロバス・フルギダスについては、電子受容体としてスルフェートよりもチオスルフェートを用いた場合、はるかに大きい利点がある。
ピルベート及びホルメートに関して、化学的に、これらの分解はアセテートの生成を導かない。ＨＰＬＣを用いて、これらの基質の消失が観察される。前記基質の分解は、ＣＯ２の生成によって確認される。ピルベートの酸化は、チオスルフェートの存在下、より効果的である。ホルメートの酸化は、２つの電子受容体について同等である。
菌株Ｌ−３については、ラクテートは２つの電子受容体で代謝されたが、ＨＰＬＣによって確認されたこの無機物化は、スルフェートよりもチオスルフェートを用いる方がはるかに大きい。更に、ＨＰＬＣ分析の結果は、この分解の間、代謝物は生成されないことを示している。従って、基質の無機物化は、直接ＣＯ２の生成に導くと想定することができる。
ピルベート及びホルメートを含有する検体に関して、ＨＰＬＣ分析は、ＣＯ２の生成によって確認される基質の分解を示した。
アルカエオグロバス・フルギダスとは異なって、菌株Ｌ−３は、ホルメートを含有する検体上では発育しない；このことは、ＨＰＬＣによって証明された。
結論として、アルカエオグロバス・フルギダスは、ラクテート、フマレート、ピルベート、及びホルメートを酸化することができ、電子受容体として、スルフェートよりもチオスルフェートの方が好ましい；その異化作用は、アセテートの痕跡の生成を特徴とする。他方で、菌株Ｌ−３は、ラクテート、ピルベート、Ｈ２／ＣＯ２、及びフマレートを分解することができる；この無機物化は、スルフェートの存在下よりもチオスルフェートの存在下の方がはるかに大きい（ＨＰＬＣによって証明された）。この無機物化は更に完全であり、すなわち、これはＣＯ２を導く。
【表２】
2009500008.tif 000003
【表３】
2009500008.tif 000004
【００５０】
Ｉ．３．菌株Ｌ−３によって用いられる炭素及びエネルギー源
様々な炭素及びエネルギー源の存在下における菌株Ｌ−３の成長の研究は、電子受容体としてチオスルフェートを用いて実施した。モニターを、細胞生物量（ＯＤ５８０ｎｍ）の評価、スルフィド生成のアッセイ（Ｃｏｒｄ−Ｒｕｗｉｓｈ）によって実施した。結果を、ＨＰＬＣ分析によって確認し、あるいくつかの場合には、ＣＯ２アッセイによって行なった。これらの結果のすべてを、表４に示す。基質を含有しない対照をおいた。菌株Ｌ−３は、この対照において発育しなかった。すなわち、これは、炭素及びエネルギーの単一源として２ｇ／Ｌの酵母抽出物上で発育しなかった。
対照（接種又は非接種）と比較して、ラクテート、ピルベート、及びＨ２／ＣＯ２を含有する検体は、スルフィドの生成をともなう細胞成長を示す。これは、ラクテート、ピルベート、及びＨ２／ＣＯ２についてそれぞれ、５．７ｍＭ、５．２ｍＭ、及び３．４ｍＭに達する。これらの基質の分解に関する仮説は、ＨＰＬＣ分析によって確認された。
あるケースにおいては、ＨＰＬＣ分析は、グルコース、フルクトース、マンノース、及びリボースを含有する検体の場合のように、基質の当初量の減少を示すことを指摘すべきである。しかしながら、このことは、細胞生物量の増加及びスルフィドの生成がないという程度まで、基質の無機物化があることを意味するわけではない。実際、基質の減少は、ＨＰＬＣによれば、高い操作温度によって引起こされた異性化の現象によって説明することができる。
【表４】
2009500008.tif 000005
【００５１】
Ｉ．４．より長鎖の脂肪酸を用いる能力
炭素及びエネルギー源としての脂肪酸の使用の研究が、（Ｃ１ＦＡホルメート、Ｃ２ＦＡアセテート、Ｃ３ＦＡプロピオネートよりも）更に長い鎖を有する脂肪酸（ＦＡ）をともなわずに、２つの菌株、すなわち菌株Ｌ−３、及びアルカエオグロバス・フルギダス  ＤＳＭ４３０４の菌株について行なわれた。
《Ａ.ｆｕｌｇｉｄｕｓ及びＬ−３による脂肪酸の分解中のチオスルフェートのモニター》
2009500008.tif 000006
テストされたＣ４−Ｃ１８脂肪酸の使用は、コレクション菌株の成長を可能にする。実際には、電子受容体濃度（チオスルフェート）が減少する。
【００５２】
Ｉ．４．菌株Ｌ−３及びアルカエオグロバス・フルギダスの成長カイネティクス
Ｉ．４．１．５８０ｎｍにおけるＯＤのモニター
系統学的な観点から、菌株Ｌ−３及びアルカエオグロバス・フルギダス（ＤＳＭ４３０４）は、対応する１６Ｓ  ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の間で、９９％の相似性を示すことが、既に示されている。ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成は、９０％近い相同性を示した。従って、菌株Ｌ−３は、アルカエオグロバス属に属し、種Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓに近い。
アルカエオグロバス・フルギダス及び菌株Ｌ−３の成長のモニターは、短い潜伏期、ついで指数的成長相及び定常期を示す。
成長曲線によれば、短い潜伏期は、これら２つの菌株の生理学的機能の回復、及び培地の条件への適応に対応することが注目される。アルカエオグロバス・フルギダス及び菌株Ｌ−３について、潜伏期は、１〜２日間続く。指数的成長相に関して、これは、アルカエオグロバス・フルギダスについてはほぼ１１日続き、一方、菌株Ｌ−３について、この相はわずか１週間続くだけである。
これら２つの古細菌を比較し、細胞成長（５８０ｎｍにおけるＯＤで表示された）に基づき、アルカエオグロバス・フルギダスは、菌株Ｌ−３よりもはるかに大きい細胞成長を示す。アルカエオグロバス・フルギダスは、ほとんど０．２６ＯＤ単位に達しない菌株Ｌ−３に対して、０．８９ＯＤ単位に達する。このことは、アルカエオグロバス・フルギダスが、その成長のために最適な条件において見られるという事実、すなわち培地が、この古細菌の栄養的必要条件に対応するのであって、Ｌ−３の栄養的必要条件に対応するのではないという事実によって説明することができる。
結論として、アルカエオグロバス・フルギダスは、菌株Ｌ−３よりもはるかに高い細胞生物量の値を示す。
【００５３】
Ｉ．４．２．菌株Ｌ−３及びアルカエオグロバス・フルギダスについてのラクテートの分解カイネティクス
先の操作において、本発明者らは、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓを用いたラクテートの分解の代謝が、アセテートの痕跡の生成を特徴とすることを証明した。他方で、菌株Ｌ−３については、無機物化はＣＯ２に導かれる。
これら２つの菌株についてのラクテート濃度の発生を、約３ヶ月間にわたってモニターした。ラクテート濃度は、指数的成長相の間、ラクテートの効果的な消費によって、最初の１５日間急速に低下する。その後、ラクテート濃度は低下し続けるが、よりゆっくりと低下する。菌株Ｌ−３とは対照的に、アルカエオグロバス・フルギダスについては、３ヶ月の終りにおいて、ラクテートのすべてが分解された。このことは、菌株Ｌ−３が、アルカエオグロバス・フルギダスとは異なる基質分解代謝を有することができるという事実から説明することが可能である。
【００５４】
ＩＩ．重質炭化水素
炭素及びエネルギーの単一源としての炭化水素の存在下における、アルカエオグロバス・フルギダス及び菌株Ｌ−３の挙動を研究した。
この研究は、２つの主要な部分、すなわち２つの古細菌の炭化水素分解能力の定性的研究、及び炭化水素の任意の分解の定量的研究を含んでいる。
【００５５】
ＩＩ．１．定性的研究
ＩＩ．１．１．炭化水素分解のためのスクリーニング
炭化水素分解能力の研究は、特に長いインキュベーションを必要とする実験である。従って、それは密なゴム栓で密閉されたベルコ管で実施された。
これらの実験のために、基質を含まない１０ｍＬの培地を収容している管が、１０％接種され、ついで炭化水素が、この栓を通る注入によって導入される。
選択された炭化水素は、様々な種類の炭化水素に属するモデル分子である。すなわち、
−  ヘキサデカン（ＣＨ３（ＣＨ２）１４ＣＨ３、Ｃ１６）、すなわち飽和直鎖状脂肪族炭化水素；
−  ヘキサデセン（ＣＨ３（ＣＨ２）１３ＣＨＣＨ２、Ｃ１６：１）、すなわち生物起源の不飽和直鎖状脂肪族炭化水素；
−  ジベンゾチオフェン（ＤＢＴ、Ｃ１２Ｈ８Ｓ）、すなわち硫黄含有芳香族炭化水素。
脂肪族炭化水素（Ｃ１６；Ｃ１６：１）を、対応する管へ、培地に０．０４ｍＬ／１０ｍＬの率で添加した。芳香族炭化水素（ＤＢＴ）が、２，２，４，４，６，８，８−ヘプタメチルノナン（ＨＭＮ、Ｃ１６Ｈ３４）中に、ＨＭＮに２０ｍｇ／１ｍＬの率で溶解され、０．７５ｍＬのこの溶液を、１０ｍＬの培地中に注入した。
芳香族炭化水素は、これらの芳香族炭化水素の毒性により、ヘプタメチルノナン（ＨＭＮ）、すなわち分枝状飽和脂肪族炭化水素中に溶解された（Ｒａｂｕｓら、１９９３年）。
各検体及び対照のために３つの管を作成した。菌株の成長を、スルフィドの生成によって間接的にモニターした。表１は、スルフィドの発生の結果を示す。
２つの菌株について、スルフィドの生成は、基質がラクテートである正の対照については急速である。実際、９日間以内に、スルフィド濃度は少なくとも３倍になった。得られた値は、時間の関数として不安定なことがあり、このことは、一方で、サンプリングの間、Ｏ２の不本意な導入後に生成されたスルフィドの酸化によって、他方で、濁度測定スルフィドアッセイ方法の限定された精度によって説明することができる。
基質が添加されなかった検体によって構成された一連の負の対照（基質を含まない対照）については、スルフィド生成は、これら２つの菌株について、この実験の期間全体で０．８ｍＭを超えない。基質を含まないこれらの対照は、接種材料に由来するラクテートの痕跡の分解によって、及び／又は培地に含有された酵母抽出物の可能性のある無機物化によって生成されたスルフィドを定量化することを可能にする。
第二系列の対照、すなわち検体中に芳香族炭化水素の溶媒、すなわちＨＭＮのみが導入された対照（ＨＭＮ対照）について、先行対照（基質を含まない対照）のものよりも大きいスルフィド生成が、一般に得られた。
脂肪族炭化水素（テストＣ１６；テストＣ１６：１）の存在下に実施されたテストに関して、スルフィド生成は、アルカンについては非常に低いことが証明されている。実際、アルカンは、これら２つの菌株について０．８ｍＭを超えない。これに対して、アルケン（Ｃ１６：１）について、約３ｍＭのスルフィドが生成される。
多環式芳香族炭化水素、特にフェナントレンを有する検体に関して、スルフィド生成は非常に低く、０．５ｍＭを超えず、基質を含まない対照のものよりも低いことさえある。これに対して、ナフタレンの場合、スルフィド生成は、フェナントレン及びヘキサデカン（Ｃ１６）を含有する検体において、基質を含まない対照において生成されたものよりも大きい。他方で、一般にこれは、溶媒ＨＭＮを含有する対照のものに達しない。
ＨＭＮ中に溶解された硫黄含有芳香族炭化水素、ＤＢＴを含有する検体に関して、これら２つの菌株について、様々な多環式直鎖状又は芳香族脂肪族炭化水素を含有するほかの検体と比較して、スルフィドの有意な生成がある。更に、ＤＢＴを含む検体におけるスルフィド生成は、ＨＭＮのみを含有する対照のものよりも一般にはるかに大きい。
これらの２つの菌株によるスルフィド生成に基づく実験のこの段階において、飽和直鎖状脂肪族炭化水素（Ｃ１６）の可能性のある分解、及び多環式芳香族炭化水素、フェナントレンの可能性のある分解の仮説は、退けられる。これに対して、アルケン、ＨＭＮ、用いられた溶媒、ＤＢＴ、及びナフタレンの場合、得られた結果は、これらの炭化水素の酸化の仮説を提案することを可能にする。スルフィドアッセイに基づくこの仮説は、まず、これらの同じ炭化水素における、これらの検体の継代培養によって、確認することが残されている。
《表１》
2009500008.tif 000007
【００５６】
ＩＩ．１．２．継代培養による結果の確認
研究された２つの菌株について、ナフタレン、事前にＨＭＮ中に溶解されたＤＢＴ、及びＨＭＮ単独における先行の実験から出発して、継代培養を実施した。接種材料を構成する管を、以下の基準に基づいて先行実験の３つの管から選択した：すなわちＣｏｒｄ−Ｒｕｗｉｓｈによるスルフィドアッセイ、細胞計数によって確認された５８０ｎｍにおける細胞生物量の決定、及び細胞の状態を明らかにする顕微鏡観察である（表２）。
《表２》
2009500008.tif 000008
最高の硫化水素価を有する管は、多数でかつ良好な状態の細菌細胞をも有するので、前記管が選択された（表中の反転表示された細胞は、継代培養のために選択された管に対応する）。
表３及び４は、継代培養後のスルフィド生成の発展の結果を示す。
この継代培養のために、炭化水素（ＤＢＴ、ナフタレン（Ｎａｐｈ）、ＨＭＮ）を含有し、以前に選択された接種材料が播種された検体とは別に、基質（炭化水素）を含有するが、接種されていない嫌気性対照（負の対照）が、培地の様々な成分間の化学反応によるものであろうスルフィド生成を定量化する目的で作られた。これらの対照において、２０日間にわたってスルフィド濃度の発展はなかった（表４）。
《表３》
2009500008.tif 000009
《表４》
2009500008.tif 000010
アルカエオグロバス・フルギダスについて、テストされた様々な炭化水素における成長が確認される。実際、スルフィド生成率は、炭化水素、ＤＢＴ、ナフタレン、及びＨＭＮを含有する検体について有意である。４５日以内に、基質がＤＢＴである検体において測定されたスルフィド価は、３ｍＭを超える（表３）が、一方、炭化水素スクリーニング段階において、これらの同じ検体について、同じ期間にわたるスルフィド価は、１ｍＭを超えなかった（ΔＳ４５ｄ、表１）。従って、スルフィド生成は、同じ期間（４５日）にわたって３倍になった。
スクリーニング段階の間、対照として用いられたＨＭＮに関して、継代培養の間のスルフィド生成は、平均して１．８ｍＭに達した。このようにして、第一実験と比較して、スルフィド生成は平均して、３倍又はそれ以上になり、より急速でもあった。一般にスルフィド生成は、第一実験と比較して、継代培養の間、より急速である。このようにして、この菌株は、炭素及びエネルギー源としての炭化水素に適応しているように見える。
溶媒ＨＭＮのみを含有する検体に対して、基質がＨＭＮ中に溶解されたＤＢＴである検体を比較すると、ＤＢＴの存在下のスルフィド生成は、ＤＢＴの非存在下に得られたものよりも大きい（表３）。
従って、これらの実験において、スルフィド生成は、ＨＭＮの分解と関連しているように見える。更に、検体の２つの先行型（ＨＭＮを含む検体、ＨＭＮ中に溶解されたＤＢＴを含む検体）間のスルフィド生成の差は、ＤＢＴの分解を認識することを可能にする。
飽和及び分枝状脂肪族炭化水素は、長い間、酸素の非存在下において分解に抵抗性である分子として考えられていた。実際、文献によれば、２つの研究のみが、脱窒（Ｂｒｅｇｎａｒｄら、１９９７年）又はメタン生成（Ｇｒｏｓｓｉら、２０００年）の条件下、ＨＭＮのように、飽和及び分枝直鎖脂肪族炭化水素であるプリスタンの嫌気性分解を証明している。
ＨＭＮ中に溶解されたナフタレンの存在下のスルフィド生成は、ＨＭＮ単独を用いて得られたものよりも低く、ナフタレンの分解は、ありそうもないように見える。この研究の残りの部分は、ＤＢＴ及びＨＭＮに集中して行なった。
菌株Ｌ−３について、ＤＢＴ、ナフタレン、及びＨＭＮ上のスルフィド生成も得ることができる。しかしながらこの菌株について、この現象は、継代培養後は、加速されなかった（表１及び表３）。
【００５７】
ＩＩ．２．炭化水素（ＤＢＴ、ＨＭＮ）の分解の定量的研究
コレクション菌株の場合にのみ、炭化水素の分解の化学量論的方程式を確立するために、実験を実施した。従って、チオスルフェート濃と同じように、炭化水素濃度を最初及び最後にアッセイした。更に、生物量の増加は、最確数（ＭＰＮ）方法に基づく微生物集団の増加によって続いた。
炭化水素を正確に定量化することができるために、密なゴム栓を、吸収又は吸着による炭化水素の任意の喪失を避ける不活性物質であるテフロンフィルムで覆った。
炭化水素は、以下の率で添加された：
−  ＤＢＴについて：０．５ｍＬのＨＭＮ中に溶解された１０ｍｇのＤＢＴ、０．５ｍＬのこの溶液が検体に添加される。
−  ＨＭＮについて：６μＬのＨＭＮ／１０ｍＬの培地。
調製された検体は、先行継代培養を接種される。
得られた結果を、表に示す。
いくつかの結果：
７週間のインキュベーション後：
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酵母抽出物上の成長の欠如を示す実験の部分。スルフィドの生成としての生物量の生成は、炭化水素の存在に関連している。
この実験後：スルフィドアッセイについて、以下のものが、最終的に７５日の終わりに得られた。
Ｔ：０．５ｍＭ（検体１．３）
ＨＭＮ：約６ｍＭ（検体２）
ＤＢＴ：約９．５ｍＭ（検体４）
【００５８】
ＩＩ．３．補足的炭化水素（ＤＢＴ、ＨＭＮ）分解実験
補足的炭化水素分解実験を、この分解の特徴づけの目的で実施した。
第一実験を、以前に用いられたチオスルフェートの代わりに電子受容体としてスルフェートの効果を研究する目的で、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓを用いて実施した。実施されたテストにおいて、炭化水素（ＤＢＴ、ＨＭＮ）及びスルフェートの存在下、微生物成長はなかった。このことは、少数派であるチオスルフェートに対してスルフェートが豊富な海洋の海底において、ＤＢＴ又はＨＭＮ分解の現象が、自然には発生することができないことを説明している。
もう１つの実験を、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓの非分枝状及び飽和直鎖状脂肪族炭化水素分解能力の欠如を確認する目的で実施した。このようにして、チオスルフェート、及びウンデカン（Ｃ１１）及びテトラデカン（Ｃ１４）直鎖状脂肪族炭化水素の混合物を含有し、かつ基質がＨＭＮである継代培養に由来する接種材料が接種された検体を調製した。脂肪族炭化水素の混合物を、１０ｍＬの培地中の４μＬのＣ１１及び４μＬのＣ１４の率でこれらの検体へ添加した。チオスルフェートアッセイは、最初と最後に実施した。
【国際調査報告】
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