(57)【要約】  本発明は、バイオアッセイ受容体をコードするベクター、及び、目的の化合物を評価するための、前記バイオアッセイ受容体を用いたインビトロでのバイオアッセイに関する。特に、前記バイオアッセイは、目的の化合物の存在下及び／又は非存在下における、異なるリガンドのそれぞれの受容体又は結合パートナーへの結合の比較のための、汎用基盤を提供する。
2009517014.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）リガンドに結合することができる細胞外リガンド結合領域、
（ｂ）膜貫通領域、
（ｃ）シグナルの伝達が可能な１つ又は複数の細胞内シグナル伝達領域であって、前記細胞外リガンド結合領域と細胞内シグナル伝達領域とが自然の状態では互いに融合していない、細胞内シグナル伝達領域、及び
（ｄ）レポーター領域、
を含むバイオアッセイ受容体をコードするベクターであって、
前記ＤＮＡ配列が、ベクターの発現に適した条件下において選ばれた宿主細胞内で発現している場合に、細胞外リガンド結合領域へのリガンドの結合が、レポーター領域からの検出可能なシグナルの生成をもたらす上記ベクター。
【請求項２】
膜結合型の細胞外リガンド結合領域がサイトカイン受容体、細胞表面受容体、又は可溶性タンパク質に由来する、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
サイトカイン受容体がＩＬ−１７Ｒである、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
細胞表面受容体がＫＤＲである、請求項２に記載のベクター。
【請求項５】
ＤＮＡ配列が２つの細胞内シグナル伝達領域をコードし、前記領域の１つがＣＤ２８に由来する、請求項１から４までのいずれか一項に記載のベクター。
【請求項６】
第２の細胞内シグナル伝達領域がＴＣＲζに由来する、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
第２の細胞内シグナル伝達領域が合成シグナル伝達領域に由来する、請求項５に記載のベクター。
【請求項８】
合成シグナル伝達領域がＩＴＡＭに基づいている、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
膜貫通領域がＣＤ２８に由来する、請求項１から８までのいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１０】
レポーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求項１から９までのいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１】
レポーター領域がＳＥＡＰである、請求項１から９までのいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１から１１までのいずれか一項に記載のベクターを含む哺乳類の宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１から９までのいずれか一項に記載のベクターを含む哺乳類の宿主細胞であって、
（ａ）細胞外リガンド結合領域、
（ｂ）膜貫通領域、
（ｃ）シグナルの伝達が可能な１つ又は複数の細胞内シグナル伝達領域であって、前記細胞外リガンド結合領域と細胞内シグナル伝達領域とが自然の状態では互いに融合していない、細胞内シグナル伝達領域、及び随意に
（ｄ）レポーター領域
を含む第２のバイオアッセイ受容体をコードするベクターであって、
前記ＤＮＡ配列が、ベクターの発現に適した条件下において選ばれた宿主細胞内で発現している場合に、細胞外リガンド結合領域へのリガンドの結合が、細胞内シグナル伝達領域からのシグナルの生成、及び、存在している場合、レポーター領域により生じた検出可能なシグナルをもたらすベクターをさらに含む、上記哺乳類の宿主細胞。
【請求項１４】
ヒトＪｕｒｋａｔ細胞である、請求項１３に記載の哺乳類細胞。
【請求項１５】
（ａ）リガンドに結合することができる細胞外リガンド結合領域、
（ｂ）膜貫通領域、
（ｃ）シグナルの伝達が可能な１つ又は複数の細胞内シグナル伝達領域であって、前記細胞外リガンド結合領域と細胞内シグナル伝達領域とが自然の状態では互いに融合していない、細胞内シグナル伝達領域、及び
（ｄ）レポーター領域
を含むポリペプチドであって、細胞外リガンド結合領域へのリガンドの結合がレポーター領域からの検出可能なシグナルの生成をもたらす上記ポリペプチド。
【請求項１６】
（ａ）請求項１２から１４までのいずれか一項に記載の哺乳類の宿主細胞を提供すること、
（ｂ）リガンドを含む第１のサンプルを提供すること、
（ｃ）目的の化合物を含む第２のサンプルを提供すること、並びに
（ｄ）１つ若しくは複数の細胞内シグナル伝達領域により生じるシグナル、及び／又は１つ若しくは複数のレポーター領域により生じる検出可能なシグナルを測定すること
を含む、目的の化合物を評価するためのインビトロでの方法。
【請求項１７】
（ｃ）の第２のサンプルの提供の前に、１つ若しくは複数の細胞内シグナル伝達領域により生じるシグナル及び／又は１つ若しくは複数のレポーター領域により生じる検出可能なシグナルを測定するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
目的の化合物が抗体である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書で開示される発明は、バイオアッセイ受容体をコードするベクター、及び、目的の化合物を評価するための、前記バイオアッセイ受容体を用いたインビトロでのバイオアッセイに関する。特に、前記バイオアッセイは、目的の化合物の存在下及び／又は非存在下における、異なるリガンドのそれぞれの受容体又は結合パートナーへの結合の比較のための、汎用基盤を提供する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、その抗体−抗原相互作用の高い特異性及び親和性の組合せを活用することを主に視野に入れて、標的の薬物送達を介した治療的介入のための作用物質としての可能性を長い間考えられてきた。抗体の結合は、例えばリガンド又はその受容体などの、抗原に対する抗体の結合についてのバイオアッセイのアウトプットをアッセイすることにより測定することができる。したがって、従来のインビトロでのバイオアッセイは、内因性の細胞表面発現受容体の数に依存し、その数により制限される。実際、選択された受容体を発現する適切な細胞系が同定されなければならない。さらに、受容体の数は、細胞型及び問題にする受容体に依存して大きく変化する。治療抗体として可能性のあるものはバイオアッセイによって評価されなければならない。しかし、典型的には、各生成物については異なるアッセイが開発されている。多くのアッセイが、エラーの大きな誘因となる長い出力情報を有する。適切なバイオアッセイの出力情報は、タイプ、時点、及び関与する生物学の理解のレベルによって大きく異なる。したがって、異なる出力情報を有するこのようなアッセイの比較は、通常、無意味である。汎用のバイオアッセイ基盤があれば、治療抗体製品の候補として可能性のあるものの各々について本質的に同様に行うことができる堅牢なアッセイフォーマットの開発が可能となり、それにより、製品の安定性をより深く理解することを容易ならしめ、異なる製品バッチを直接的に意義深く比較することを可能とするであろう。このような汎用のアッセイ基盤は、製品物についての最初のスクリーニング、製品物の有効性についての分析、製品物の安定性及びバッチの再現性の監視に有用である。最も有効なことには、このような汎用のアッセイ基盤によって、同一の抗原に対する異なる抗体の効用性の比較が可能になろう。汎用アッセイによって、報告書の提出及び規制当局の理解も容易になるであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本明細書で開示される発明は、上述した困難性を克服し、目的の組換え受容体を発現する細胞を用いた標準化されたインビトロでのバイオアッセイを提供する。特に、本発明のアッセイは、本発明のバイオアッセイ受容体を用いてリガンドの結合をインビトロで評価するための汎用基盤を提供し、前記結合を拮抗又は活性化する作用物質の評価を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
したがって、提供されるものは、
（ａ）リガンドに結合することができる細胞外リガンド結合領域、
（ｂ）膜貫通領域、
（ｃ）シグナルの伝達が可能な１つ又は複数の細胞内シグナル伝達領域であって、前記細胞外リガンド結合領域と細胞内シグナル伝達領域とが自然の状態では互いに融合していない、細胞内シグナル伝達領域、及び
（ｄ）レポーター領域、
を含むバイオアッセイ受容体をコードするベクターであって、
前記ベクターが、発現に適した条件下において選ばれた宿主細胞内で膜結合型タンパク質を発現している場合に、細胞外リガンド結合領域へのリガンドの結合がレポーター領域からの検出可能なシグナルの生成をもたらすベクターである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
当業者であれば、もしシグナル配列が、細胞外領域を宿主細胞の細胞表面へ標的化するために用いられる場合、前記シグナル配列はバイオアッセイ受容体のＮ末端に存在し、その後、細胞外リガンド結合領域、膜貫通領域、及び１つ又は複数の細胞内シグナル伝達領域が続くことを理解されよう。ＤＮＡコード配列へのスペーサー配列の組み込みにより、１つ又は複数の領域を、隣接する領域から随意に分離することができる。例えば、バイオアッセイ受容体をコードするベクターの構築の間、１つ又は複数の制限酵素切断部位は、領域同士の継ぎ接ぎの際に、１つ又は複数のスペーサーアミノ酸残基を領域の間に残すことができる。一実施形態において、各領域はその隣接する領域からスペーサー配列により分離されている。スペーサー配列は２つのアミノ酸、又は３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、若しくはそれ以上のアミノ酸であり得る。
【０００６】
細胞外リガンド結合領域は、リガンドを結合することができるあらゆるタンパク質（又はこのようなタンパク質をコードする核酸）を含む。最も好ましくは、リガンドは可溶性のリガンドである。本発明のバイオアッセイ受容体の、膜結合型の細胞外リガンド結合領域は、表面膜受容体、例えばキナーゼ受容体、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、成長因子受容体、インターロイキン受容体のようなサイトカイン受容体、例えばＩＬ−１Ｒ（Ｉ型及びＩＩ型）、ＩＬ−２Ｒ（α、β及びγサブユニット）、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ；ｇｐ１３０、ＩＬ−８Ｒ、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−１５Ｒ（α、β及びγサブユニット）、ＩＬ−１７Ｒ；ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−ＲＩ及びＴＮＦ−ＲＩＩ）；ＩＬ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＰ−１０、ＩＴＡＣ、ＭＩＧ及びＶＥＧＦの受容体；ＣＤマーカー、例えばＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ１２２及びＣＤ２４４；並びにＩＣＯＳ−Ｌ、ＯＸ−４０−Ｌ、ＣＤ４０Ｌ及びＣＤ１３７−Ｌの受容体を含む。バイオアッセイ受容体の膜結合型の細胞外のリガンド結合領域はまた、細胞膜上又は細胞膜内で通常見られない、結合領域としての分子、例えば細胞質タンパク質又は可溶性タンパク質、例えば限定はしないが、通常分泌されるタンパク質を含むこともできる。したがって、細胞外リガンド結合領域はまた、ＳＯＳＴ、並びにＬＤＬ関連タンパク質、例えばＬＲＰ５及びＬＲＰ６、ケモカイン、サイトカイン、及び膜貫通領域によって細胞外に存在する成長因子を含むこともできる。当業者であれば、細胞外リガンド結合領域を細胞表面に標的化するシグナル配列が、バイオアッセイ受容体をコードするベクターのＤＮＡ配列に含まれることを理解されよう。このようなシグナル配列は当該技術分野で既知であり、天然で細胞外リガンド結合領域と結び付けられる配列（シグナル配列／リーダー配列）を含む。シグナル配列は通常、細胞外リガンド結合領域の細胞表面への標的化の間に、プロセッシングされ、除去される。
【０００７】
一実施形態において、細胞外リガンド結合領域は、１つ又は複数の他の細胞外リガンド結合領域との相互作用によって、リガンドを認識する（リガンドに結合する）ことができる多重に会合した細胞外リガンド結合領域を得るように、選択することができる。したがって、一実施形態において、本発明のバイオアッセイ受容体は２つ以上の膜結合型の細胞外リガンド結合領域を含む。より好ましくは、リガンドを認識する（リガンドに結合する）ことができる多重に会合した細胞外リガンド結合領域を得るために、異なるリガンド結合領域を含む２つ以上のバイオアッセイ受容体を宿主細胞で発現させてもよい。
【０００８】
膜貫通領域は通常、バイオアッセイ受容体を細胞膜に固定する役目を果たし（このため、細胞外リガンド結合領域は膜結合型である）、あらゆるタンパク質（又はこのようなタンパク質をコードする核酸）を含む。このような領域は多岐にわたる源、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα鎖、β鎖、又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ３ε、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ６４、ＣＤ９、ＣＤ３７、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７若しくはＣＤ１５４、サイトカイン受容体、例えばインターロイキン受容体、ＴＮＦ−Ｒ、チロシンキナーゼ受容体若しくはインターフェロン受容体、又はコロニー刺激因子受容体、の全て又は一部に由来することができる。或いは、膜貫通領域は合成されたものであってよい。適した合成膜貫通領域は、主にロイシン及びバリンといった疎水性のアミノ酸を含む。
【０００９】
細胞内シグナル伝達領域は、細胞内メッセンジャーシステムの直接的又は間接的な産生をもたらすシグナルの生成に関与することができる、あらゆるタンパク質（又はこのようなタンパク質をコードする核酸）を含む。特定の細胞内メッセンジャーシステムは、１つ若しくは複数のキナーゼ経路、例えばチロシンキナーゼ経路、ＭＡＰキナーゼ経路、若しくはプロテインキナーゼＣ経路；Ｇタンパク質若しくはホスホリパーゼ介在性の経路；カルシウム介在性の経路；ｃＡＭＰ若しくはｃＧＭＰ介在性の経路；又は、１つ若しくは複数のインターロイキン等のサイトカイン、例えばＩＬ−２やＮＦκＢ、ＮＦＡＴ若しくはＡＰ−１などの転写因子、の合成を伴う１つ若しくは複数の経路、を含む。各細胞内シグナル伝達領域は、最も好ましくは、相互に協働して作用するように選択される。
【００１０】
細胞内シグナル伝達領域は、１つ又は複数の天然に生じるタンパク質シグナル伝達配列に由来してもよい。適した例には、非制限的に、ＴＣＲに由来する配列、例えばζ、エータ又はイプシロン鎖の一部を含み、また、ＴＣＲζ鎖の第１（ＴＣＲζ１）、第２（ＴＣＲζ２）及び第三（ＴＣＲζ３）免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、例えばＦｃＲＩＩＩγ又はＦｃＲＩγのようなＦｃＲγ、例えばＦｃＲＩβのようなＦｃＲβ；ＣＤ３γ；ＣＤ３δ；ＣＤ３ε；並びにＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ又はＣＤ６６ｄを含む。特に好ましいＩＴＡＭは、ＴＣＲζ１、ＴＣＲζ２、ＴＣＲζ３及びＦｃεＲＩγに由来するもの；ＣＤ４；ＣＤ８；並びにＦｃ受容体のガンマ鎖を含む。さらに含まれるものは、ＳＢ２８（ＧＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＧＳ、配列番号１）及びＳＢ２９（ＧＳＭＩＥＴＹＮＱＴＳＰＲＳＡＡＴＧＬＰＩＳＭＫＧＳ、配列番号２）であり、各配列の両端のＧＳリンカーの一方又は両方は削除されていてもよい。細胞内シグナル伝達領域は特に、合成シグナル伝達領域、例えば、上記のあらゆる細胞内シグナル伝達領域の配列に基づいた合成領域を含むことが意図されている。合成ＩＴＡＭ及び合成シグナル伝達領域、並びにこれらを作成するための方法は、ＷＯ００／６３３７２及びＷＯ００／１３２８６７に記載されたものを含み、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる（例えば表１参照）。ＷＯ００／６３３７２及びＷＯ００／１３２８６７に記載されているように、これらのシグナル伝達モチーフの組合せを用いることができる。
【００１１】
また、シグナル伝達要素としては例えばＩＬ−１β、ＴＮＦ−ＲＩ及びＴＮＦＲＩＩのようなサイトカイン受容体、並びにインターフェロン受容体；ＴＬＲ４のようなＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）；ＧＭＣＳＦのようなコロニー刺激因子；チロシンキナーゼ、例えばＺＡＰ−７０、ｆｙｎ、ｌｙｋ、ｌｔｋ、ｓｙｋ、及びそれらの結合要素、例えばＶａｖ、Ｃｒｋ、ＬＡＴ及びＧｒｂ−２；ホスホリパーゼＣ及びホスホイノシチド−３キナーゼ；接着分子、例えばＬＦＡ−１及びＬＦＡ−２、Ｂ２９、ＭＢ−１、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ５、ＣＤ２及びＣＤ１５４、並びに例えばＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ１３４及びＣＤ１３７のような共刺激分子、からも含まれる。また、免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）も含まれる。ＩＴＩＭの特定の例には、ＦｃｙＲ（ＦｃｙＲＩＩＢなど）、ＣＤ２２、ＥＰＯＲ、ＩＬ−２ｓｓＲ及びＩＬ−３ｐＲが含まれる。
【００１２】
【表１】
2009517014.tif 000003
【００１３】
当業者なら理解されようが、バイオアッセイ受容体から要求されるものに応じて、領域の元来の性質を改変するために、アミノ酸の欠失、挿入及び／又は突然変異を天然の配列から生じさせることができる。
【００１４】
当業者には自明であろうが、複数の細胞内シグナル伝達領域を組み合わせたものは、別々のバイオアッセイ受容体内で利用することができるし、又は単一のバイオアッセイ受容体内でも、連続的に利用することができる。最も好ましくは、連続的に組み合わせたものである。
【００１５】
一実施形態において、バイオアッセイ受容体の細胞内シグナル伝達領域は、ＣＤ２８に由来する第１の細胞内シグナル伝達領域と、ＴＣＲの要素、例えばＴＣＲζに由来する、又は前記シグナル伝達領域と関連するシグナル伝達カスケードの要素に由来する、第２の細胞内シグナル伝達領域とを含む。別の実施形態において、第１の細胞内シグナル伝達領域はＣＤ２８に由来しており、第２の細胞内シグナル伝達領域はメッセンジャーの直接的又は間接的な生成をもたらす。
【００１６】
細胞内シグナル伝達領域の最も好ましい組合せは、ＣＤＲ２８とＴＣＲζ、ＩＣＯＳとＴＣＲζ、ＣＤ１３４とＴＣＲζ、及びＣＤ２８と上述したような１つ又は複数のＩＴＡＭに由来する合成シグナル伝達領域を含む。
【００１７】
レポーター領域は、測定可能な（検出可能な）シグナルを生成することができる化合物、例えば非限定的に、ルシフェラーゼ、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、緑色蛍光タンパク質又は赤色蛍光タンパク質を含む。したがって、レポーター領域のシグナルの測定は、発光、蛍光、又はアルカリフォスファターゼの産生の測定を含む。最も好ましくは、測定されるシグナルはルシフェラーゼの産生又はＳＥＡＰの産生である。目的の化合物を評価するために用いるシグナルは、細胞内シグナル伝達領域により生じるシグナルに依存する、当業者に既知の手段を用いて測定してもよい。好ましいシグナルには、サイトカインの産生（例えばＩＬ−２の産生）、細胞増殖又はアポトーシスの測定が含まれる。
【００１８】
好ましい一実施形態において、本発明のバイオアッセイ受容体を発現させるためのベクターは、ＩＬ−１７Ｒの細胞外領域、ＣＤ２８の膜貫通領域、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達領域及びＴＣＲζのシグナル伝達領域をコードするＤＮＡ配列、並びにルシフェラーゼをコードするレポーター領域を含む。別の好ましい実施形態においては、バイオアッセイ受容体をコードするベクターは、ＫＤＲ（ＶＥＧＦ受容体）の細胞外結合領域、ＣＤ２８の膜貫通領域、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達領域、及びＴＣＲζのシグナル伝達領域をコードするＤＮＡ配列、並びに随意に、ルシフェラーゼをコードするレポーター領域を含む。
【００１９】
最も好ましい実施形態において、本発明の方法のベクターは、ＣＤ２８に由来する膜貫通領域（配列番号２８）、ＣＤ２８に由来する細胞内シグナル伝達領域（配列番号２９）、及びＴＣＲのζ鎖（配列番号３０）、並びにＴＮＦ−α、ＩＬ−１７受容体又はＫＤＲに由来する細胞外リガンド結合領域をコードするＤＮＡを含む。ＣＤ２８の膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達領域並びにＴＣＲのζ鎖は、配列番号３１で示されるようにスペーサー配列で連結していてもよい。好ましくは、レポーター領域はルシフェラーゼ又はＳＥＡＰである。最も好ましくは、ＤＮＡは、配列番号２４若しくは２５のＩＬ−１７受容体の配列を含むか若しくはそれにより構成される、又は配列番号２６若しくは２７のＫＤＲ配列を含むか若しくはそれにより構成される、細胞外リガンド結合領域のアミノ酸配列をコードする。
【００２０】
本発明はさらに、本発明のバイオアッセイ受容体をコードする少なくとも１つのベクター（すなわち第１のベクター）を含む哺乳類の宿主細胞を提供する。宿主細胞は、トランスフェクション又は形質転換をすることが可能なあらゆる細胞又は細胞系であることができ、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＳ０、Ｃｏｓ−７、Ｈｅｌａ、ＭＣＦ−７、ＨＬ−６０、ＥＬ４、Ａ５４９、及びＫ５６２細胞が含まれる。最も好ましくは、Ｊｕｒｋａｔ細胞が用いられる。
【００２１】
好ましい実施形態において、哺乳類の宿主細胞は、
（ｅ）細胞外リガンド結合領域、
（ｆ）膜貫通領域、
（ｇ）シグナルの伝達が可能な１つ又は複数の細胞内シグナル伝達領域であって、前記細胞外リガンド結合領域と細胞内シグナル伝達領域とが自然の状態では互いに融合していない、細胞内シグナル伝達領域、及び随意に
（ｈ）レポーター領域
を含むバイオアッセイ受容体をコードするさらなるベクター（すなわち、本発明の第１のベクターとは異なるベクター）であって、
前記ＤＮＡ配列が、ベクターの発現に適した条件下において選ばれた宿主細胞内で発現している場合に、細胞外リガンド結合領域へのリガンドの結合が、細胞内シグナル伝達領域からのシグナルの生成、及び、存在している場合、レポーター領域からの検出可能なシグナルの生成をもたらすベクターを含む。一実施形態において、（ｈ）のレポーター領域は第１のベクター内に存在しているものと同一である。或いは、レポーター領域は異なっている。したがって、例えば、１つのレポーター領域がルシフェラーゼでありもう一方がＳＥＡＰであることが可能である。
【００２２】
最も好ましくは、宿主細胞が２つの本発明のバイオアッセイ受容体を含んでおり、共にレポーター領域を含んでいるとき、当該領域は同一ではない。例えば、１つ目がルシフェラーゼ受容体領域であり２つ目がＳＥＡＰレポーター領域であってよい。或いは、それらは同一のレポーター領域であってもよい。
【００２３】
哺乳類の宿主細胞は、あらゆる都合の良い技術、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在性のトランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質介在性のトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、弾道的な導入又は感染を用いて、本発明のベクターでトランスフェクトすることができる（例えば、Ｄａｖｉｓら、分子生物学における基本的方法（Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１９８６、及びＳａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ、ＮＹ、１９８９参照）。宿主細胞内でベクターの発現を誘発するための適当な条件は当該技術分野でよく知られている。トランスフェクションは一過性であってよいが、あるいはその代わりに、バイオアッセイ受容体を安定して発現する細胞系を、当該技術分野で知られているようにして生成させてもよい。特に、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７．Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編、１９９１を参照。
【００２４】
したがって、本発明はさらに、
（ｉ）リガンドを結合することができる細胞外リガンド結合領域、
（ｊ）膜貫通領域、
（ｋ）シグナルの伝達が可能な１つ又は複数の細胞内シグナル伝達領域であって、前記細胞外リガンド結合領域と細胞内シグナル伝達領域とが自然の状態では互いに融合していない、細胞内シグナル伝達領域、及び
（ｌ）レポーター領域
を含むポリペプチドであって、細胞外リガンド結合領域へのリガンドの結合がレポーター領域からの検出可能なシグナルの生成をもたらすポリペプチドを提供する。一実施形態において、細胞外リガンド結合領域はサイトカイン受容体、細胞表面受容体、又は可溶性タンパク質に由来する。好ましい実施形態において、サイトカイン受容体はＩＬ−１７Ｒである。別の好ましい実施形態において、細胞表面受容体はＫＤＲである。
【００２５】
本発明はまた、上記の（ａ）から（ｄ）で定義したようなバイオアッセイ受容体をコードする少なくとも１つのベクターを含む哺乳類細胞を提供する。さらに提供されるものは、表面膜タンパク質として上記の（ｉ）から（ｌ）に記載されたようなポリペプチドを含む哺乳類細胞である。好ましくは、哺乳類細胞はヒト細胞であり、最も好ましくはＪｕｒｋａｔ細胞である。
【００２６】
本発明はまた、本発明のあらゆる１つ又は複数のベクターの使用を含む、目的の化合物を評価するための方法も提供する。したがって、
（ｉ）上記の（ａ）から（ｄ）及び随意に上記の（ｅ）から（ｈ）で定義したようなバイオアッセイ受容体をコードする本発明のベクターを含む哺乳類細胞を提供すること、
（ｉｉ）リガンドを含む第１のサンプルを提供すること、
（ｉｉｉ）目的の化合物を含む第２のサンプルを提供すること、並びに
（ｉｖ）１つ若しくは複数の細胞内シグナル伝達領域により生じるシグナル、及び／又は１つ若しくは複数のレポーター領域により生じる検出可能なシグナルを測定すること
を含む、目的の化合物を評価するための方法が提供される。
【００２７】
この方法は、治療抗体製品の候補として可能性のあるものの各々について本質的に同様に行うことのできる堅牢なアッセイフォーマットの開発が可能であり、それにより、製品の安定性をより深く理解することを容易ならしめ、異なる製品バッチを直接的に意義深く比較することを可能とするため、特に有利である。これまでは、組換え受容体は細胞活性化プロセスを容易にするための手段として開示されてきており、その活性化された細胞は投与を必要とする患者に投与することで治療物として用いることができるとされている。例えばＷＯ９７／２３６１３、ＷＯ９９／５７２６８、ＥＰ０５１７８９５、ＷＯ９６／２３８１４及びＷＯ０１３２７０９参照。しかし、これらに開示されている受容体を、堅牢かつ再現性のあるバイオアッセイ法に用いることができるという示唆はされていない。
【００２８】
最も好ましい実施形態において、本発明の方法のベクターは、ＣＤ２８に由来する膜貫通領域（配列番号２８）、ＣＤ２８に由来する細胞内シグナル伝達領域（配列番号２９）、及びＴＣＲのζ鎖（配列番号３０）のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、並びにＴＮＦ−α、ＩＬ−１７受容体又はＫＤＲに由来する細胞内リガンド結合領域を含む。ＣＤ２８の膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達領域並びにＴＣＲのζ鎖は、配列番号３１で示されようにスペーサー配列で連結していてもよい。好ましくは、レポーター領域はルシフェラーゼ又はＳＥＡＰである。最も好ましくは、ＤＮＡは、配列番号２４若しくは２５のＩＬ−１７受容体の配列を含むか若しくはそれにより構成される、又は配列番号２６若しくは２７のＫＤＲ配列を含むか若しくはそれにより構成される、細胞外リガンド結合領域のアミノ酸配列をコードする。
【００２９】
一実施形態において、本発明の方法はさらに、上記の（ｉｉｉ）の第２のサンプルの提供の前に、１つ若しくは複数の細胞内シグナル伝達領域により生じるシグナル及び／又は１つ若しくは複数のレポーター領域により生じる検出可能なシグナルを測定するステップを含む。
【００３０】
リガンドは、目的のあらゆる核酸、タンパク質又は抗原、例えば、限定はしないが、ＣＤマーカーのリガンド、例えばＣＤ４８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、サイトカイン及びケモカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＴＮＲ−α、ＩＬ−β、ＩＬ−１０、ＩＰ−１０、ＩＴＡＣ、ＭＩＧ、ＶＥＧＦ、共刺激リガンド、例えばＩＣＯＳ−Ｌ、ＯＸ−４０−Ｌ、ＣＤ１３７−Ｌ、シグナル伝達経路の構成要素、並びに実際には、あらゆる目的の抗原を含む。リガンドはまた抗体も含む。本発明の方法において、リガンドは最も好ましくは可溶性のリガンドである。本方法はまた、哺乳類細胞、細菌、ウイルス、酵母細胞、又は合成粒子のようなその他の粒子、例えばアガロースビーズ若しくは磁気ビーズの表面に存在するリガンドにも用いることができる。このようなリガンドが少なくとも１つの結合パートナーを有する見込みがあり、それが、本発明の目的では、宿主細胞の表面に発現しているバイオアッセイ受容体の細胞外リガンド結合領域であることは、当業者には自明であろう。
【００３１】
第２のサンプルは、細胞外リガンド結合領域への結合に対してリガンドと競合するか、或いはリガンドに結合する目的の化合物を含む、あるいはその目的の化合物で構成される。したがって、「目的の化合物」は、抗体、小分子（例えばＮＣＥ）及びその他の薬物、タンパク質、ポリペプチド及びペプチド、ペプチド模倣物、脂質、炭水化物、並びに核酸を含む。最も好ましくは、第２のサンプル内に存在する目的の化合物は、抗体である。したがって、好ましい一実施形態において、第２のサンプルは、バイオアッセイ受容体の細胞外リガンド結合領域と特異的に相互作用する抗体を含み、第２の好ましい実施形態において、第２のサンプルは、リガンドに特異的に結合する抗体を含む。特異的に相互作用する（例えば認識する、又は結合する）とは、最も好ましくは抗体である目的の化合物が、選択された細胞外リガンド結合領域又はリガンドに対して、その他の領域又はリガンドに対してよりもより良好な親和性を有することを意味する。抗体は、バイオアッセイ受容体の細胞外リガンド結合領域と直接的又は間接的に相互作用することができる。第２のサンプルをまた、コントロール、標準、又は比較用サンプルとして用いてもよいことは理解されよう。したがって、本発明の方法は二回以上行うことができ、サンプルの比較を可能にする。
【００３２】
本明細書で用いる「抗体」という用語は、完全抗体及び機能的に活性な断片又はそれらの誘導体を含み、限定はしないが、一本鎖抗体、二価抗体、三価抗体又は四価抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、単一ドメイン抗体、修飾されたＦａｂ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片、並びにあらゆる上記のもののエピトープ結合断片であってよい（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２３（９）、１１２６−１１３６参照）。一実施形態において、抗体は、天然の又は修飾されたヒンジ領域を有するＦａｂ’断片である。多数の修飾されたヒンジ領域が、例えばＵＳ５６７７４２５、ＷＯ９９／１５５４９、及びＷＯ９８／２５９７１に既に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。別の実施例では、抗体は、ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１に記載されているものを含む。
【００３３】
抗体は、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、特異的に抗原を結合する抗原結合部位を含む分子を含む。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のあらゆるクラス（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ若しくはＩｇＡ）又はサブクラスであってよい。抗体の定常領域ドメインは、もし存在する場合、抗体分子の提案されている機能、及び特に、必要とされる可能性のあるエフェクター機能を考慮して選択することができる。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであってよい。特に、抗体分子が治療用途を意図しており、かつ抗体のエフェクター機能が必要とされている場合［例えば、抗体依存性細胞介在性毒性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣＣ）］、ヒトＩｇＧの定常領域ドメイン、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプのものを用いることができる。或いは、抗体分子が治療目的を意図しており、かつ抗体のエフェクター機能が必要とされてない場合は、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを用いることができる。
【００３４】
本発明で使用するための抗体は、当該技術分野で既知のあらゆる適当な方法を用いて産生することができる。このような抗体は、限定はしないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ファージディスプレイに由来する抗体、又はキメラ抗体を含む。
【００３５】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、１９７５、２５６、４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、１９８３、４、７２）、及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”、ｐｐ．７７−９６、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８５）のような、当該技術分野で既知のあらゆる方法を用いて調製することができる。
【００３６】
本発明において使用するための抗体はまた、例えばＢａｂｃｏｏｋ，Ｊら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３（１５）、７８４３−７８４８、ＷＯ９２／０２５５１、ＷＯ２００４／０５１２６８、及びＷＯ２００４／１０６３７７に記載されている方法により、特異的な抗体の産生のために選択された単一のリンパ球から生成された、免疫グロブリンの可変領域のｃＤＮＡをクローニングし、発現させることによる、単一リンパ球抗体法を用いて生成することもできる。
【００３７】
キメラ抗体は、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントにより軽鎖及び重鎖の遺伝子が構成されるように遺伝的に操作されている、免疫グロブリン遺伝子によりコードされている抗体である。
【００３８】
ヒト化抗体は、ヒト以外の種から得た１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子から得たフレームワーク領域を有する抗体分子である（例えばＵＳ５５８５０８９参照）。
【００３９】
組換え抗体を生み出し製造するための方法は、当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｂｏｓｓら、ＵＳ４８１６３９７；Ｃａｂｉｌｌｙら、ＵＳ６３３１４１５；Ｓｉｍｍｏｎｓら、２００２、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２６３、１３３−１４７；Ｓｈｒａｄｅｒら、ＷＯ９２／０２５５１；Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、３８３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３２２、３２３；Ｑｕｅｅｎら、ＵＳ５５８５０８９；Ａｄａｉｒ、ＷＯ９１／０９９６７；Ｍｏｕｎｔａｉｎ及びＡｄａｉｒ、１９２２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ、１０、１−１４２；Ｖｅｒｍａら、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５−１８１；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２３（９）、１１２６−１１３６参照）。
【００４０】
本発明で使用するための抗体はまた、当該技術分野で既知の様々なファージディスプレイ法を用いて生成することもでき、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８２、４１−５０；Ａｍｅｓら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８４、１７７−１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４、９５２−９５８；Ｐｅｒｓｉｃら、１９９７、Ｇｅｎｅ、１８７、９−１８；及びＢｕｒｔｏｎら、１９９４、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５７、１９１−２８０；ＷＯ９０／０２８０９、ＷＯ９１／１０７３７、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９５／１５９８２、及びＷＯ９５／２０４０１、並びにＵＳ５６９８４２６、５２２３４０９、５４０３４８４、５５８０７１７、５４２７９０８、５７５０７５３、５８２１０４７、５５７１６９８、５４２７９０８、５５１６６３７、５７８０２２５、５６５８７２７、５７３３７４３、及び５９６９１０８により開示されているものを含む。
【００４１】
また、トランスジェニックマウス、又はその他の哺乳類を含むその他の生物を、抗体を産生するために用いることができる（例えば、ＵＳ６３００１２９参照）。
【００４２】
本発明のベクターは、宿主細胞における本発明のバイオアッセイ受容体の発現に必要な、全ての必要なモチーフ及びシグナルを含む。したがって、ベクターは、転写開始領域、プロモーター領域、及び終結領域を含む。プロモーター領域は、バイオアッセイ受容体を含むコード領域に機能可能に連結され、誘導可能又は構成的に活性であることができる。非コード領域を、所望により、例えばｍＲＮＡを安定化させるために提供してもよい。本発明のバイオアッセイ受容体の構成要素をコードする核酸は、発現配列タグ（ＥＳＴ）分析を用いた、ヒト細胞のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡライブラリーからの標準的なクローニング技術及びスクリーニング技術を用いて得ることができる（Ａｄａｍｓ，Ｍら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２、１６５１−１６５６；Ａｄａｍｓ，Ｍら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ、３５５、６３２−６３４；Ａｄａｍｓ，Ｍら、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ、３７７、追補、３−１７４）。本発明のバイオアッセイ受容体の構成要素をコードする核酸はまた、ゲノムＤＮＡライブラリーなどの天然の源から得ることもできるか、又は既知で市販されている技術を用いて合成することもできる。
【実施例】
【００４３】
（実施例１）
バイオアッセイ受容体発現クローニングカセット及びシャトルベクターの構築。
異なるバイオアッセイ受容体の構築を容易にするために、中間シャトルベクターを設計した。このシャトルベクターは、バイオアッセイ受容体の発現に必要な発現カセットの全体を含む。このベクターは、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４、１７２、１０４に既に記載されているｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内に作られたクローニングカセットを含む。このクローニングカセットの５’はＨＣＭＶプロモーターであり、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルがこのクローニングカセットの３’である。クローニングカセットは、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合要素（細胞外リガンド結合領域）、膜貫通要素、及びシグナル伝達領域要素から成り、各別個の構成要素の簡単な交換を容易にする。
【００４４】
以下のＤＮＡ断片の組合せによりシャトルベクターが生じた。
（ａ）ＮｏｔＩからＸｈｏＩの断片上のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のベクターバックボーン、
（ｂ）ＨｉｎｄＩＩＩからＥｃｏＲＩの断片上の、上記記載の、及び図１に示したクローニングカセット、
（ｃ）ＮｏｔＩからＨｉｎｄＩＩＩの断片上のＨＣＭＶプロモーター、並びに
（ｄ）ＥｃｏＲＩからＸｈｏＩの断片上のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル。
【００４５】
このシャトルベクターを、実施例２に記載する結合要素断片、膜貫通要素断片及びシグナル伝達要素断片から様々な異なるバイオアッセイ受容体を生成するために用いた。バイオアッセイ受容体発現カセットの全体を次に、実施例３に記載するように、レポーター遺伝子ベクター内にサブクローニングした。
【００４６】
（実施例２）
結合領域断片、膜貫通領域断片、及びシグナル伝達領域断片の構築
Ａ）ＨｉｎｄＩＩＩからＮａｒＩの断片としてのヒトＩＬ−１７受容体の細胞外リガンド結合領域
ヒトＩＬ−１７受容体のリーダー配列及び細胞外領域の１から３２０番残基を含む断片（ＧｅｎＢａｎｋ参照番号：ＮＭ０１４３３９）を、全長ヒトＩＬ−１７受容体遺伝子を含むプラスミドから、オリゴ５’−ｃｇｇｇａａｇｃｔｔｃｃａｃｃａｔｇｇｇｇｇｃｃｇｃａｃｇｃａｇｃｃｃｇｃｃｇｔｃｃｇｃｔｇｔｃｃｃｇｇｇｇｃｃｃｃｔｇｃｔｇｇｇｇｃｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔｇｃｔｃｃｔｇｇｇｃｇｔｇｃｔｇｇｃｃｃｃｇｇｇｔｇｇｔｇｃｃｔｃｃｃｔｇｃｇａｃｔｃｃｔｇｇａｃｃａｃ−３’（配列番号２２）及び５’−ｃｃｃｇｇｃｇｃｃｃｃａｃａｇｇｇｇｃａｔｇｔａｇｔｃｃｇｇａａｔｔｇｇ−３’（配列番号２３）でＰＣＲクローニングした。配列番号２２のオリゴは５’ＨｉｎｄＩＩＩ部位及びＫｏｓａｋ配列を導入し、ＮａｒＩ制限酵素切断部位を除去する。配列番号２３のオリゴは３’ＮａｒＩ部位を導入する。ＰＣＲ産物を次に、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮａｒＩで切断した。用いたＩＬ−１７受容体のアミノ酸配列を図６に示す。当業者であれば、通常は発現の際に切断される異なるリーダー配列を使用してもよいことを理解し、広く知られている技術を用いてそのようなリーダー配列をコードするＤＮＡを組み込むことが可能であろう。
【００４７】
（Ｂ）ＨｉｎｄＩＩＩからＭｌｕＩの断片としてのヒトＫＤＲの細胞外リガンド結合領域及び膜貫通領域
ヒトキナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）のリーダー配列、細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインの１から７８９番残基を含む断片（ＧｅｎＢａｎｋ参照番号：ＮＭ００００２２５３）を、あらゆる天然の内在的なＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｌｕＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、ＮａｒＩ、ＮｏｔＩ及びＳｐｅＩ部位を除去して、合成的に（ＧＥＮＥＡＲＴ）生成した。断片を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＭｌｕＩを用いて、供給されたプラスミド（０４２０１６ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ）から切断した。用いたＫＤＲのアミノ酸配列を図７に示す。当業者であれば、通常は発現の際に切断される異なるリーダー配列を使用してもよいことを理解し、広く知られている技術を用いてそのようなリーダー配列をコードするＤＮＡを組み込むことが可能であろう。
【００４８】
（Ｃ）ＮａｒＩからＥｃｏＲＩの断片としてのヒトＣＤ２８の膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達領域並びにヒトＴＣＲζの細胞内シグナル伝達領域
ヒトＣＤ２８の膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達領域の１３５から２０２番残基、並びにＴＣＲζの細胞内シグナル伝達領域の３１から１４２番残基を含む断片を、制限酵素ＮａｒＩ及びＥｃｏＲＩを用いて、既に記載されているプラスミド（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４、１７２、１０４）から切断した。用いたＣＤ２８の膜貫通領域、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達領域、及びＴＣＲζの細胞内シグナル伝達領域のアミノ酸配列を図８に示す。スペーサー配列を含む、用いた、連結された全ての三つの領域のアミノ酸配列を図９に示す。
【００４９】
（Ｄ）ＭｌｕＩからＥｃｏＲＩの断片としてのヒトＣＤ２８のシグナル伝達領域及びヒトＴＣＲζの細胞内シグナル伝達領域
ヒトＣＤ２８の細胞内シグナル伝達領域の１６２から２０２番残基及びヒトＴＣＲζの細胞内シグナル伝達領域の３１から１４２番残基を含む断片を、制限酵素ＮａｒＩ及びＥｃｏＲＩを用いて、既に記載されているプラスミド（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４、１７２、１０４）から消化した。用いたＣＤ２８の細胞内シグナル伝達領域及びＴＣＲζの細胞内シグナル伝達領域のアミノ酸配列を図８に示す。
【００５０】
（実施例３）
バイオアッセイ受容体レポーター遺伝子ベクターの構築
実施例１で記載したシャトルベクター内において実施例２で記載した構成要素を組み合わせることにより生成された各バイオアッセイ受容体についての全長発現カセットを、次に、レポーター遺伝子ベクターｐＮｉｆｔｙ２−Ｌｕｃ又はｐＮｉｆｔｙ２−ＳＥＡＰ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）内にサブクローニングした。後者のベクターは、ＮＦ−κＢの誘導可能なプロモーターの制御下にある、ルシフェラーゼレポーター遺伝子（ｐＮｉｔｆｙ２−Ｌｕｃ）又は分泌型アルカリフォスファターゼレポーター遺伝子（ｐＮｉｆｔｙ２−ＳＥＡＰ）のいずれかを含む。これに加え、該ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と哺乳類細胞の両方における選択のための選択マーカーＺｅｏｃｉｎ（商標）も含む。バイオアッセイ受容体発現カセットを、ＮｏｔＩからＮｏｔＩの断片においてシャトルベクター（実施例１）から除去し、ｐＮｉｆｔｙ２−Ｌｕｃ又はｐＮｉｆｔｙ２−ＳＥＡＰのＮｏｔＩ部位にクローニングした。発現カセットはいずれの方向でもクローニングすることができ、両者の例を選択し、分析した。
【００５１】
（実施例４）
安定的なバイオアッセイ受容体レポーター遺伝子細胞系の生成
実施例３に記載したように生成されたベクターのプラスミドＤＮＡを、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置を製造業者の取扱説明書に従って用いて（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒトＴ細胞白血病細胞系、Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１内にトランスフェクトした。安定的な細胞系を次に、２００、３００又は４００μｇ／ｍｌの濃度のＺｅｏｃｉｎ（商標）における培養により生成した。
【００５２】
（実施例５）
ＩＬ−１７Ｒ／ＣＤ２８−ＴＣＲζバイオアッセイ受容体を用いた抗ヒトＩＬ−１７抗体の分析。
ヒトＩＬ−１７受容体の細胞外リガンド結合領域要素、ヒトＣＤ２８の膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達領域、並びにヒトＴＣＲζの細胞内シグナル伝達領域要素を含むバイオアッセイ受容体を発現する安定的な細胞系を生成した。これらの細胞に対し、ヒトＩＬ−１７の力価測定を追加し、４時間後に、ＬｕｃＬｉｔｅアッセイキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を供給業者の使用説明書に従って用いて、産生されたルシフェラーゼの量を決定した（図２参照）。ＩＬ−１７Ｒ／ＣＤ２８−ＴＣＲζバイオアッセイ受容体を発現する様々な細胞系の分析により、レポーター遺伝子カセットと逆の方向のバイオアッセイ受容体発現カセットを含むベクターがより効果的であることが実証された。ＩＬ−１７の濃度をこの力価測定から選択し（図２）、抗ＩＬ−１７抗体の、ＩＬ−１７Ｒ／ＣＤ２８−ＴＣＲζバイオアッセイ受容体を介したルシフェラーゼ産生の遮断能力を評価するために用いた（図３参照）。
【００５３】
（実施例６）
ＫＤＲ／ＣＤ２８−ＴＣＲζバイオアッセイ受容体を用いた抗ヒトＫＤＲ抗体の分析。
ヒトＫＤＲ（ＶＥＧＦ受容体）の細胞外リガンド結合領域要素及び膜貫通領域、ヒトＣＤ２８の細胞内シグナル伝達領域、並びにヒトＴＣＲζの細胞内シグナル伝達領域要素を含むバイオアッセイ受容体を発現する安定的な細胞系を生成した。これらの細胞に対し、ヒトＶＥＧＦ−Ａ（ｈＶＥＧＦ）の力価測定を追加し、４時間後に、ＬｕｃＬｉｔｅアッセイキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を供給業者の使用説明書に従って用いて、産生されたルシフェラーゼの量を決定した（図４参照）。ＫＤＲ／ＣＤ２８−ＴＣＲζバイオアッセイ受容体を発現する様々な細胞系の分析により、レポーター遺伝子カセットと逆の方向のバイオアッセイ受容体発現カセットを含むベクターがより効果的であることが実証された。ｈＶＥＧＦの濃度をこの力価測定から選択し（図４）、抗ＫＤＲ抗体の、ＫＤＲ／ＣＤ２８−ＴＣＲζバイオアッセイ受容体を介したルシフェラーゼ産生の遮断能力を評価するために用いた（図５参照）。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】バイオアッセイ受容体のシャトルベクターを生成するためにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ  ＳＫ（＋）のＮｏｔＩとＸｈｏＩとの大きな制限断片内にクローニングされた発現カセットを示す図である。
【図２】ＩＬ−１７Ｒ／ＣＤ２８−ＴＣＲζバイオアッセイ受容体からの、ＩＬ−１７に誘発されたルシフェラーゼ応答を示す図である。
【図３】５００ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ−１７で処理した細胞におけるルシフェラーゼ産生の、抗ＩＬ−１７抗体による遮断を示す図である。
【図４】ＫＤＲ／ＣＤ２８−ＴＣＲζバイオアッセイ受容体からの、ＶＥＧＦに誘発されたルシフェラーゼ応答を示す図である。（■）はｈＶＥＧＦの非存在下で処理した細胞を示す。
【図５】２００ｎｇ／ｍｌの濃度のｈＶＥＧＦで処理した（◆）及びｈＶＥＧＦで処理していない（■）細胞におけるルシフェラーゼ産生の、抗ＫＤＲ抗体による遮断を示す図である。抗体の非存在下で、すなわちｈＶＥＧＦのみで処理した細胞、及び培地のみで処理した細胞もまた、それぞれ（▲）及び（●）で示されている。
【図６】パネル（ａ）では、リーダー配列を有する（配列番号２４）、パネル（ｂ）では、リーダー配列を有さない（配列番号２５）、ＩＬ−１７の細胞外領域のアミノ酸配列を示す図である。
【図７】パネル（ａ）では、リーダー配列を有する（配列番号２６）、パネル（ｂ）では、リーダー配列を有さない（配列番号２７）、ＫＤＲの細胞外領域及び膜貫通領域のアミノ酸配列を示す図である。
【図８】パネル（ａ）では、用いたものの（配列番号２８）、パネル（ｂ）では、ＣＤ２８の細胞内領域（配列番号２９）の、及びパネル（ｃ）では、ＴＣＲζの細胞内領域（配列番号３０）のアミノ酸配列を示す図である。
【図９】太字で示されたスペーサー配列により連結された、ＣＤ２８の膜貫通領域、ＣＤ２８の細胞内領域、及びＴＣＲζの細胞内領域のアミノ酸配列（配列番号３１）を示す図である。
【図１】
2009517014.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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