(57)【要約】  本発明は人間の脂肪組織由来の脂肪前駆細胞を脂肪細胞に分化させて生分解性骨格と一緒に体内に移植する技術に関するものであり、脂肪組織由来の脂肪前駆細胞から脂肪細胞に分化させて得られる直径２０〜４０μｍの未成熟脂肪細胞を骨格と一緒に自家または同種移植に利用する場合、移植部位から脂肪細胞が成熟するにつれて移植細胞の体積が漸進的に増加されるため、効果的な身体体積代替物に利用されることができ、軟部組織欠損又は美容上の外形的欠陥による障害を治療することができる。
2009500048.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪組織由来の脂肪前駆細胞から脂肪細胞に分化させて得られる直径２０〜４０μｍの未成熟脂肪細胞を含む、身体体積代替のための移植用脂肪細胞組成物。
【請求項２】
哺乳類の自家移植または同種移植に使用される請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記哺乳類がヒトである請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
（ａ）自家または同種脂肪組織から分離された未分化脂肪前駆細胞を脂肪細胞に分化させる段階；
（ｂ）直径２０〜４０μｍの分化した未成熟脂肪細胞を収集する段階；次いで
（ｃ）収集された未成熟脂肪細胞と生分解性骨格をインビトロで一緒に培養する段階
を含む、移植用脂肪細胞組成物の製造方法。
【請求項５】
（ｄ）生分解性骨格内で脂肪細胞の結合及び成熟を測定する段階がさらに含まれる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）  自家または同種脂肪組織から分離された未分化脂肪前駆細胞を脂肪細胞に分化させる段階；
（ｂ）直径２０〜４０μｍの分化した未成熟脂肪細胞を収集する段階；
（ｃ）収集された未成熟脂肪細胞と生分解性骨格をインビトロで一緒に培養する段階；次いで
（ｄ）未成熟脂肪細胞と生分解性骨格を一緒に体内に移植する段階
を含む、脂肪細胞の移植方法。
【請求項７】
脂肪細胞と生分解性骨格を注射で移植する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
脂肪細胞と生分解性骨格を外科的手術で移植する請求項６に記載の方法。
【請求項９】
組織再建または美容整形の目的で移植する請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は人間の脂肪組職由来の脂肪前駆細胞を脂肪細胞に分化させて生分解性骨格と一緒に体内に移植する技術に関するもので、より詳しくは人間の脂肪組職から脂肪前駆細胞を分離し成長因子を含む培地で培養させた後、脂肪細胞に分化させて得られる直径２０〜４０μｍの未成熟脂肪細胞、その培養方法、ならびにそれを生分解性骨格と一緒に体内に移植する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、脂肪細胞の自家移植は広く行われている。自家脂肪細胞移植は１８９０年代から始まり、１９８０年代脂肪吸入術が始まって以来広く使われることでその事例も非常に多くなり自家脂肪移植の安全性は既に立証されている。特に脂肪移植は歳によって老化した肌のしわ改善を始めとして、  唇の線、  あごの線、額の線の矯正、鼻整形などに使われている。また、火傷や傷によって陷沒した肌、癌切除手術で喪失した部分などにも脂肪を移植することで欠陷部位を矯正する手術として良い成果を見せている。
【０００３】
しかし、単純に脂肪吸入から得られた脂肪を移植する場合、  移植後に移植体積の４０〜６０％が吸収されるなど、移植物の生存率と生存期間が期待どおりでなく再移植を要するという問題がある（S Eremia et al.,2000, Dermatol. Sur. 26, 1150-1158; Fulton JE et al.,2001, Dermatol.Clin.19(3), 523-530）。
【０００４】
これにより、脂肪吸入術以後に得られた脂肪の固まりから純粋に脂肪細胞を分離しようとする研究が持続して来た。このような努力の一環で一部では脂肪の固まりから纎維質、血液などを除去した後に脂肪移植を行っているが、いまだにその効果は満足できない（G Sattler et al.,2000,Dermatol. Sur. 26, 1140-1144）。
【０００５】
上述のごとく、脂肪組職から単純分離された脂肪細胞を体内に移植した時の移植体積の減少が起こる。このようにして得られた殆どの脂肪細胞が充分に成熟したものであるため圧力に対してもろく、吸入過程中相当な部分が破壊されたり、移植後に生着率が落ちて血管再生または血管新生が円滑に行われないという事に起因する。
【０００６】
この目的のために、脂肪組職に含まれている脂肪前駆細胞を生体移植材料として利用しようとする研究が多様に行われている。脂肪組職由来脂肪前駆細胞は分化条件により骨細胞、脂肪細胞、筋細胞、神経細胞などに分化されるので、脂肪前駆細胞を体内に移植することで移植部位に生着して脂肪細胞に分化されるメカニズムを応用するものである（JM Gimble et al.,2000, Bone 19:421-428）。しかし、脂肪前駆細胞はそれ自体として多様な分化能を持つので安全ではないのみならず、移植部位の生理学的環境により脂肪細胞への分化能及び分化率に大きく影響を受けるので結果の予測が難しいという問題がある。また、脂肪細胞への分化を助けるために成長因子などの補助療法とともに処置を行う場合、安全上の問題を引き起こすこともある。
【０００７】
このような問題点を改善するものとして、米特許第６，１５３，４３２号（２０００年１１月２８日付与）では、脂肪吸入術を通して得た脂肪組織から未分化された脂肪前駆細胞を分離して移植に必要な脂肪細胞に分化する方法及び試薬について記述している。この方法は脂肪吸入により得られた脂肪組織から脂肪前駆細胞を分離して；これを基質培地に懸濁して培養容器に加えた後、３７℃、ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養して脂肪前駆細胞を培養容器の底に付着させ；基質培地を除去し分化培地を入れて３日間培養した後；脂肪細胞培地を入れて脂肪細胞に分化させる過程を含む。この方法によれば、既存の脂肪移植術で使われる老化した脂肪細胞ではない健康な未成熟細胞だけ移植して効果を極大化させることができ、脂肪前駆細胞使用から現われ得る安全性及び有効性の問題を克服できるという長所がある。
【０００８】
しかし、上記特許方法においては、分化された脂肪細胞の形態学的な特徴を具体的に定義せずに、「脂質滴を含んだ分化された脂肪細胞」と表現しており、脂肪前駆細胞から最終的に得られる分化された脂肪細胞の収集時期及び結果で得られる脂肪細胞の品質を規定し難いという問題がある。
【０００９】
脂肪前駆細胞は、分化段階を経ながら分化初期には細胞質内に小さな脂質滴の形成が始まる段階、小さな脂質滴の数が次第に増加する段階、そして小さな脂質滴が次第に合わさり大きな脂質滴を形成する段階を経ながら成熟し、完全に成熟すると一つの脂質滴が細胞質全体を占めることになり、成熟過程の間、細胞の大きさも徐々に増加するようになる。脂肪細胞に十分に分化されない細胞は移植後に脂肪細胞への分化を確信できず、完全に成熟した脂肪細胞が細胞収集過程で損失されたりして移植後に生着率が落ちる。従って、移植に用いる細胞の特徴を具体的に決めて健康な未成熟脂肪細胞を得て移植後効果を極大化することができる方法が要求される。
【００１０】
最近数年にわたってバイオマテリアル分野には目を見張る程の成長があった。すでに多くの物質が臨床に適用されており、代表的なものとしてはコラーゲンがある。その外にも組織工学分野で多様な物質が使われているが、ポリ乳酸、ポリグリゴール酸、コラーゲンタイプＩ誘導体、アルギネートなどがここに含まれる。このようなバイオマテリアルにステロイドや成長ホルモンのような外因性要素を処理して移植することで移植したマトリックス内で細胞の成長を促進することもできる。最近発表された論文では、ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）とマトリゲル（Matrigel）（basement membrane collagen）を一緒にマウスに注射して新しい脂肪組職が生成されることを確認している（K Toriyama et al., 2002,Tissue Engineering, vol.8, 157-165）。すなわち、マトリゲル部位には内皮細胞が集まって新しい血管が形成され、集まった纎維芽細胞−類似細胞（fibroblast-like cell）内に脂肪滴が形成されることを確認した。また、ＰＬＧＡ（poly lactic-co-glycolic acid）で作った骨格（scaffold）に脂肪前駆細胞を導入してラットに移植した時、脂肪前駆細胞が脂肪細胞に分化されて脂肪組職を形成することを確認した（CW Patrick et al.,2002,Tissue Engineering, vol.8,283-293）。
【００１１】
このようなバイオマテリアル分野の発展にもかかわらず、人に移植して効果的に脂肪組職を再生できる方法はまだ開発されていない。その理由のうち最も重要なものは、人の同種または異種脂肪細胞を効果的に増殖させ分化させることのできる適切な条件、移植に用いた時しっかりと生着し持続的に維持され得る適切な形態の分化された脂肪細胞を得る条件が開発されなかったためである。結果として、軟部組職の欠損または欠陥などを效果的に治療するためには細胞生産技術と適切なバイオマテリアルの緊密な調和を要する。
【非特許文献１】S Eremia et al.,2000, Dermatol. Sur. 26, 1150-1158
【非特許文献２】Fulton JE et al.,2001, Dermatol.Clin.19(3), 523-530
【非特許文献３】G Sattler et al.,2000,Dermatol. Sur. 26, 1140-1144
【非特許文献４】JM Gimble et al.,2000, Bone 19:421-428
【非特許文献５】K Toriyama et al., 2002,Tissue Engineering, vol.8, 157-165
【非特許文献６】CW Patrick et al.,2002,Tissue Engineering, vol.8,283-293
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
それゆえ、上記課題に鑑みて、本発明の１の目的は、ヒト脂肪組織から単離された未分化脂肪前駆細胞を用いて移植可能な分化した未成熟脂肪細胞を得るための方法を確立することにより、生分解性骨格とともにインビボにおいて移植された場合に本来的に存在する脂肪細胞と同様の脂肪組織を形成することにより、そして単離された脂肪前駆細胞と生分解性骨格との共培養の後に生分解性骨格内の脂肪細胞の成熟を確認することにより、標的部位の身体体積を効果的に置換しうる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記目的を果たすために本発明は１の態様において、脂肪組職由来の脂肪前駆細胞から脂肪細胞に分化させて得られる直径２０〜４０μｍの未成熟脂肪細胞を含む、身体体積代替のための移植用脂肪細胞組成物を提供する。
【００１４】
本発明は他の態様において、
（ａ）自家または同種脂肪組職から分離した未分化脂肪前駆細胞を脂肪細胞に分化させる段階；
（ｂ）直径２０〜４０μｍの分化した未成熟脂肪細胞を収集する段階；次いで
（ｃ）収集された未成熟脂肪細胞と生分解性骨格をインビトロで一緒に培養する段階
を含む、移植用脂肪細胞組成物の製造方法を提供する。
【００１５】
また、本発明はさらなる態様において、
（ａ）自家または同種脂肪組職から分離した未分化脂肪前駆細胞を脂肪細胞に分化させる段階；
（ｂ）直径２０〜４０μｍの分化した未成熟脂肪細胞を収集する段階；
（ｃ）収集された未成熟脂肪細胞と生分解性骨格をインビトロで一緒に培養する段階；次いで
（ｄ）未成熟脂肪細胞と生分解性骨格を一緒に体内に移植する段階
を含む、脂肪細胞移植方法を提供する。
【００１６】
本発明においては自家または同種脂肪組職から分離した未分化脂肪前駆細胞を脂肪細胞に分化させるにあたって、基質培地、増殖培地、分化培地及び分化維持培地を適切に使用して培養することで一定の大きさに成熟した未成熟脂肪細胞を収集することにより分化率が極大化された脂肪細胞を得ることを特徴とする。
【００１７】
本発明で移植に用いる脂肪細胞は直径２０〜４０μｍの分化した未成熟脂肪細胞で、移植部位で成熟するので漸進的に体積が増加する。この段階の未成熟脂肪細胞は脂肪前駆細胞と異なり分化誘発因子を必要とせず、既に成熟した脂肪細胞や他の方法で得られた脂肪細胞に比べて生存率と生着率が優れており移植部位で漸進的に体積が増加する長所がある。
【００１８】
本発明で得られた未成熟脂肪細胞を骨格（scaffold）と共に移植に利用する場合、移植初期の体積代替は骨格がその役割をし、脂肪細胞が生着して成長する間に骨格は生分解されて吸収されるので最終的には本来的に存在する脂肪組職と同一の形態の脂肪組職に取り替えられる。それゆえ、本発明の移植用脂肪細胞組成物は移植部位で脂肪細胞の成熟と共に漸進的に体積が増加されるので効果的な身体体積代替物として利用することができ、軟部組職欠損または美容上の外形的欠陷による障害を治療することができる。
（発明の実施するための最良の形態）
【００１９】
以下、本発明について詳細に説明する。
本明細書において、「脂肪前駆細胞（preadipocyte）」は脂肪組職から分離された細胞で、特に脂肪細胞に分化され得る可能性を有する細胞を意味する。
【００２０】
「脂肪細胞（adipocyte）」は脂肪前駆細胞に分化誘導因子を処理して脂質滴を形成しレプチンを分泌する細胞で、本発明では未分化脂肪前駆細胞から分化された脂肪細胞を意味する。
【００２１】
「分化した未成熟脂肪細胞（differentiated immature adipocyte）」は脂肪前駆細胞を分化誘導因子で処理することにより脂質滴を形成しレプチンを分泌する細胞で、本発明では未分化脂肪前駆細胞から分化された脂肪細胞であって細胞直径が２０〜４０μｍの細胞を意味する。
【００２２】
本発明において「脂肪前駆細胞分化因子（preadipocyte-differentiation factor）」は脂肪前駆細胞を脂肪細胞に分化させることに必要な物質で、ビオチン、インスリン、パントテナート（pantothenate）、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、インドメタシンなどを含む。
【００２３】
本発明において、「臨床適用のための移植（transplantation for clinical application）」は老化によるしわ改善、顔輪郭矯正など身体の輪郭を正すために、または癌切除手術による欠損、創傷によって陥没された部位の再生、奇形による陥没部位など身体全般にわたって陥没された部位の再生のために脂肪前駆細胞から分化した未成熟脂肪細胞を移植することを意味する。
【００２４】
「同種移植（allogeneic transplantation）」は他人または同じ種の他の動物から特定組職や臓器または細胞移植受けるもので、自分の組職や臓器、細胞を用いることができない場合、他人や他の動物から組職や臓器または細胞の移植を受けることを意味する。
【００２５】
本発明は自家または同種脂肪組職から分離した未分化脂肪前駆細胞を脂肪細胞に分化させる段階を含むが、これと関連する脂肪前駆細胞の分化方法はすでに多くの文献に多様な方法で発表されている。本発明においては前記の米特許第６，１５３，４３２号（２０００年１１月２８日付与）で提示した方法を改善することで、移植後に漸進的な体積増加が可能な細胞生産方法を提示する。
【００２６】
本発明において、脂肪前駆細胞は主に人間の皮下脂肪組職から脂肪吸入方法で得られるが、これに限定されない。
【００２７】
本発明において移植に用いるための同種または異種の分化された脂肪細胞は次の過程によって得られる：
（１）脂肪吸入で得られた脂肪組職から脂肪前駆細胞の分離
脂肪組職をＫＲＢ溶液で洗浄し脂肪組職をコラゲナーゼで処理した後遠心分離して上層の脂肪階を除去し、下層に基質培地（stromal medium）を入れて懸濁させた後に遠心分離して下層の脂肪前駆細胞を回収する。
（２）脂肪前駆細胞を基質培地で培養
脂肪前駆細胞を基質培地に懸濁させて培養容器に加えた後、培養して底に付ける。基質培地は１０％ウシ胎児血清が含まれているＤＭＥＭ／Ｆ１２（Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F12 Nutrient Broth）培地で、２４時間培養する。
（３）増殖培地（expansion media）で培養
基質培地を除去した後、増殖培地で培養して十分な量の脂肪前駆細胞で増殖させる。増殖培地は１０％ウシ胎児血清、ＥＧＦ（epidermal growth factor）、ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）、ＴＧＦ−ｂｅｔａ １（transforming growth factor beta 1）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２で、脂肪前駆細胞を迅速に増殖させて細胞量を大量に増加させる作用をする。
【００２８】
（４）基質培地で培養
細胞が培養容器の底に単一層で満杯になると増殖培地を除去し基質培地を入れて１〜３日間追加培養する。
【００２９】
（５）分化培地（differentiation media）で培養
基質培地を除去し分化培地で培養する。分化培地は３％ウシ胎児血清、  ビオチン、パントテナート（pantothenate）、インスリン、デキサメダゾン、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、インドメタシンなどが含まれたＤＭＥＭ／Ｆ１２であって、脂肪前駆細胞が脂肪細胞に分化されるよう誘導し、この時細胞質に小さな脂質滴が形成され始める。
【００３０】
（６）分化維持培地（maintenance media）で培養
分化培地を除去し分化維持培地で培養する。分化維持培養は分化培地で細胞分化を誘導するイソブチルメチルキサンチンとインドメタシンを除外したもので、２〜３日毎に新しく取り替える。細胞は維持培地で脂質滴の数がより増えて大きさが次第に大きくなり脂肪細胞に成熟する。
特に、初期脂肪組織から脂肪前駆細胞を分離して培養容器に分株するとき、細胞濃度は、脂肪吸入によって得られた脂肪の場合、約０．０４ｍｌ／ｃｍ３の脂質濃度とし、６〜８日培養して十分に増殖させる。継代培養なしにパッセージ０（Ｐ０）から増殖過程を終えて分化させることにより分化率が極大化された脂肪細胞を得ることができる。
【００３１】
前記方法によって分化させた脂肪細胞を収集する時期は次のように決定する。すなわち、脂肪前駆細胞は分化培地から脂質滴が形成され始めて、分化維持培地で培養時間が増えるほど脂質滴の数と大きさが増加して十分成熟すると脂質滴が一つに合わさり細胞質全体を占めるようになり、培養過程においては細胞が培養容器の底から離れて浮遊することになる。また、脂肪前駆細胞は分化段階を経ながら細胞の大きさが次第に増加するようになるが、分化初期の脂肪細胞の直径は約１０〜２０μｍで完全に成熟した脂肪細胞の大きさは約７０〜１２０μｍである。本発明によると、分化された脂肪細胞の直径が２０〜４０μｍに成長した時、細胞収集を実施することが望ましい。
【００３２】
本発明により、分化した未成熟脂肪細胞と生分解性骨格をインビトロで一緒に培養して生分解性骨格内での脂肪細胞の結合及び成熟を測定する段階は次のように実施される。
（１）分化した未成熟脂肪細胞の収集
分化維持培地で培養される脂肪細胞は２〜３日間隔で新しい培地に交換しながら維持する。６〜９日間培養された脂肪細胞をトリプシン／ＥＤＴＡを利用して収集し細胞の大きさを測定する。特に、収集された細胞を人に適用する場合、細胞収集２〜４日前の培養液からはウシ胎児血清を含まないことが望ましい。
（２）生分解性骨格
生分解性骨格の材料としてはフィブリン、アルギネート（alginate）、ＰＬＧＡ（poly lactic-co-glycolic acid）、ＰＴＦＴ（polytetrafluoroethylene）などが含まれるが、これに限定されない。その形態もまた注射として注入可能なものと、構造物として外科的手術を通して移植可能なものの全てを含む。
（３）分化した未成熟脂肪細胞を生分解性骨格に移植
直径２０〜４０μｍの未成熟脂肪細胞を生分解性骨格に移植し培養培地で培養する。
（４）生分解性骨格内脂肪細胞の結合及び成熟を測定
生分解性骨格内で脂肪細胞の生着と脂肪細胞の成熟は、
（ｉ）オイルレッドＯ染色を実施して脂肪細胞を同定し、脂肪細胞の成熟及び大きさを測定する方法；または
（ｉｉ）細胞培養上清液のレプチンを定量して脂肪細胞の機能を確認する方法で行われる。
【００３３】
以上の方法によって得られた未成熟脂肪細胞を生分解性骨格に移植したとき、移植部位にしっかりと生着し脂肪滴の大きさが増加しながら細胞の大きさが増加し完全に成熟することが確認された。また、脂肪細胞の特徴的な機能であるレプチンの分泌量も持続的に上昇した。
【００３４】
また、本発明においては分化した未成熟脂肪細胞と生分解性骨格を一緒に体内に移植する段階を含む。すなわち、本発明の方法によって得られた自家または同種の脂肪細胞を生分解性骨格と一緒に臨床適用のための移植に利用することができる。
【００３５】
以下、実施例を通して本発明をより詳細に説明する。ただし、これらの実施例は本発明の例示であるだけで、本発明の範囲がこれらだけに限定されるものではない。
【実施例】
【００３６】
実施例１：未成熟脂肪細胞の製造
まず脂肪吸入によって得られた脂肪組織から次のように脂肪前駆細胞を分離した。：血液を除去するために脂肪組織を同じ体積のＫＲＢ溶液に３〜４回洗浄した。脂肪組織と同じ体積のコラゲナーゼ溶液を入れて３７℃の水浴で反応させた。これを遠心分離用チューブに移し入れて２０℃、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上層液のリピッドと脂肪層を除去し、下層のコラーゲン溶液を揺らさないように注意して分離した。基質培地を入れて懸濁させた後、２０℃、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この時、下に沈むものが脂肪前駆細胞であり、上層液を除去した。
【００３７】
得られた脂肪前駆細胞を基質培地に懸濁させて培養容器に加え、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーターーで２４時間培養し底に付着させた。基質培地は１０％ウシ胎児血清が含まれているＤＭＥＭ／Ｆ１２（Dulbecco's Modigied Eagle Medium/Ham's F-12Nutrient Broth）培地である。
【００３８】
次に、培養容器の底に単一層で満杯になるまで増殖培地に取り替えて培養した。増殖培地の組成は次の通りである：ＤＭＥＭ／Ｆ１２，１０％ＦＢＳ，５ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ，０．２５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ，０．２５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−ｂ１。
【００３９】
細胞が培養容器の底に単一層で満たされたら、増殖培地を除去し基質培地を入れて３日間培養した。
【００４０】
基質培地を除去し分化培地を入れて３日間培養した。分化培地の組成は次の通りである：ＤＭＥＭ／Ｆ１２，３％  ＦＢＳ，３３μＭ  ビオチン、１７μＭ  パントテナート、１μＭ  インスリン、１μＭ  デキザメタゾン、２５０μＭ  ＩＢＭＸ，１００μＭ  インドメタシン。
【００４１】
次に、分化培地を除去した後、脂肪細胞培地（分化維持培地）に取替え脂質滴が大きくなり収集した細胞の直径が２０〜４０μｍになるまで培養した。脂肪細胞培地の組成は次の通りである。：ＤＭＥＭ／Ｆ１２，３％  ＦＢＳ，３３μＭ  ビオチン、１７μＭ  パントテナート、１００ｎＭ  インスリン、１μＭ  デキサメタゾン。
【００４２】
実施例２：未成熟脂肪細胞を骨格中に生着させて共培養すること
（１）分化した未成熟脂肪細胞の収集
実施例１で生産された未成熟脂肪細胞を含んでいるプラスチックにトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を添加し１〜１５分間インキュベーターで反応させた後ＤＭＥＭ／Ｆ１２を入れてトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を不活性化させた。
【００４３】
溶液を収集した後、２０℃、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上層液を除去し運搬培地（フェノールレッドが含まれないＤＭＥＭ）を添加し細胞を懸濁させた後、再度上記の条件で遠心分離した。上層液を除去して適定量の運搬培地を添加した後、細胞数を測定した。最終的に添加する運搬培地（shipping medium）の量を計算した後、再度遠心分離を実施した。
【００４４】
図１は分解された未成熟脂肪細胞と成熟した脂肪細胞をオイルレッドＯで染色して大きさを測定した顕微鏡写真（４００倍）である。Ａは分化した未成熟脂肪細胞を収集した後大きさを測定したものでいくつかの脂質滴を含んでおり、直径が２０〜４０μｍである。Ｂは収集した未成熟脂肪細胞をインビトロで三次元的に培養した後オイルレッドＯで染色した成熟した脂肪細胞の写真で、いくつかの脂肪滴が一つに合わさり直径が６０〜１００μｍである。
【００４５】
（２）分化した未成熟脂肪細胞とフィブリンとの共培養
フィブリノーゲン溶液とトロビン溶液は使用１０分前に次の通り準備した。：アプロチニン溶液を凍結乾燥されたフィブリノーゲンが入っているバイアルに入れ１〜２分放置した後、軽く振って完全に溶かした。トロンビン溶液は塩化カルシウム溶液をトロビンが入っているバイアルに入れて内容物が完全に溶けるまで振って作った。
【００４６】
上の（１）で最終遠心分離後上層液を除去して得られた未成熟脂肪細胞にトロビン溶液を入れて１〜５ｘ１０７個／ｍｌになるように懸濁させた。トロビン−細胞懸濁液１００μｌとフィブリノーゲン１００μｌをよく混合し１〜２分後に未成熟脂肪細胞が導入されたフィブリンゲルが形成されると脂肪細胞培地を添加し３日に１回ずつ培地を交換しながら共培養を実施した。
【００４７】
図２は分化した未成熟脂肪細胞をフィブリンに導入し１ヶ月間共培養した後成熟した脂肪細胞をオイルレッドＯで染色した顕微鏡写真（Ａ、Ｃ〜Ｆ  ４００倍）である。Ａは分化した未成熟脂肪細胞を収集した後の顕微鏡写真で、細胞内脂質滴をいくつか含んでいる。Ｂは収集された未成熟脂肪細胞をフィブリンに導入した後１ヶ月間共培養したフィブリン−細胞で、ＣとＤは各々フィブリンゲル内で成熟した脂肪細胞と  オイルレッドＯで染色した顕微鏡写真で、人体に存在する脂肪組織を  オイルレッドＯで染色したＥ、Ｆと大きさと形態が類似していることを示している。
【００４８】
図３は分化した未成熟脂肪細胞をフィブリンに導入して共培養を実施しながら培養上清液に分泌されたレプチンの量を測定するグラフである。ここでは、フィブリン−細胞共培養時、共培養１日から１４日までレプチン分泌量が増加し続け、１４日以後から飽和状態を現すことが分かる。
【００４９】
図２と３からわかるように、分化した未成熟脂肪細胞はフィブリンゲル内での３次元的な培養を通して完全に成熟し、身体で自然に形成された脂肪組織と細胞生物学的に類似していることが分かる。フィブリンは未成熟脂肪細胞に対し毒性を有しておらず、未成熟脂肪細胞が成熟する間分解されて脂肪細胞が大きくなリ得る空間を提供することで未成熟脂肪細胞の移植効果を極大化させることができる。
【００５０】
（３）分化した未成熟脂肪細胞とアルギネートビーズとの共培養
アルギネートはＰＢＳに溶かして２％溶液に作った後、滅菌し室温保管した。塩化カルシウムと塩化ナトリウム溶液は各々１０２ｍＭ、１５０ｍＭに作り滅菌した後室温保管した。
【００５１】
上記（１）において最終遠心分離後、上層液を除去して得られた未成熟脂肪細胞にアルギネート溶液を入れて１〜５×１０７個／ｍｌになるよう懸濁させた。アルギネート−細胞懸濁液を注射器に入れて塩化カルシウム溶液に落とし穏やかに振盪した後、１０分間放置した。未成熟脂肪細胞を含むアルギネートビーズ（直径約１ｍｍ）が形成されたら塩化カルシウム溶液を除去して塩化ナトリウム溶液で４回洗浄した。塩化ナトリウム溶液を除去した後、脂肪細胞培地を添加し３日に１度ずつ培地を交換しながら共培養を実施した。
【００５２】
図４は分化した未成熟脂肪細胞をアルギネートビーズに導入して共培養した後、脂肪細胞をオイルレッドＯで染色した顕微鏡写真（Ａ：４０倍、Ｂ〜Ｄ：４００倍）である。Ａは細胞を含むアルギネートビーズで、Ｂは４００倍率で撮った顕微鏡写真である。Ｃは２週間共培養を実施した後の脂肪細胞で、Ｄは１ヶ月間共培養を実施した後  オイルレッドＯで染色した成熟脂肪細胞の顕微鏡写真である。
【００５３】
実施例３：未成熟脂肪細胞と骨格との共移植
フィブリノーゲン溶液とトロビン溶液は使用する１０分前に次のように準備した。アプロチニン溶液を凍結乾燥したフィブリノーゲンが入っているバイアルに入れ１〜２分放置し軽く振って完全に溶かした後、注射器に充填させた。トロビン溶液は塩化カルシウム溶液をトロビンが入っているバイアルに入れて内容物が完全に溶けるまで振って作った。
【００５４】
実施例１の（１）において最終遠心分離した後、上層液を除去し細胞にトロビン溶液を入れて細胞が１〜５×１０７個／ｍｌ濃度になるように懸濁させた後、別の注射器に充填させた。フィブリノーゲン溶液が充填された注射器とトロビン−細胞懸濁液が充填された注射器をデュアルシリンジキット（dual syinge kit）の各々の部位に連結し、スプレーチップの先に１８号注射針を嵌めた。噴霧調節装置を利用してフィブリノーゲン溶液とトロビン−細胞懸濁液を混合させながら同時にヌードマウス（Crl:Nu/Nu-nuBR）胸骨の上の皮下に２００μｌずつ移植した。移植後１日から１２ヶ月間飼育した後、移植部位組織を生検によって分離した。移植物の分布位置、大きさ、生着率と生存率を測定し、免疫拒否反応発生可否確認するために免疫染色反応、生化学的検査、分子生物学的検査を実施した。分化された人間の未成熟脂肪細胞の検出は人間特異抗体を利用した免疫染色反応とヒト特異的ＤＮＡ遺伝子標識であるａｌｕ配列を利用してＰＣＲ法で確認した。
【００５５】
移植部位の組織検査の結果、移植された未成熟脂肪細胞がマウスの皮下にしっかりと生着し成熟した脂肪細胞に成長していることを確認した。
（産業上の利用分野）
【００５６】
本明細書に開示のごとく、脂肪組織由来の脂肪前駆細胞から脂肪細胞に分化させて得られる直径２０〜４０μｍの未成熟脂肪細胞を骨格と一緒に自家または同種移植に利用する場合、移植部位から脂肪細胞が成熟するにつれて移植細胞の体積が漸進的に増加されるため、効果的な身体体積代替物に利用されることができ、軟部組織欠損又は美容上の外形的欠陥による障害を治療することができる。
【００５７】
本発明の好ましい具体例を説明の目的で開示したが、当業者は、特許請求の範囲に開示された本発明の精神から逸脱することなく、種々の修飾、付加および置換が可能であることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】分化した未成熟脂肪細胞と成熟脂肪細胞をオイルレッドＯで染色して大きさを測定した顕微鏡写真（４００倍）。
【図２】分化した未成熟脂肪細胞をフィブリンに導入して１ヶ月間共培養した後成熟した脂肪細胞をオイルレッドＯで染色した顕微鏡写真（Ａ、Ｃ〜Ｆ  ４００倍）。
【図３】分化した未成熟脂肪細胞をフィブリンに導入して共培養を実施しながら培養上清液に分泌されたレプチン量を測定したグラフ。
【図４】分化した未成熟脂肪細胞をアルギネートビーズに導入して共培養した後脂肪細胞をオイルレッドＯで染色した顕微鏡写真（Ａ  ４０倍、Ｂ〜Ｄ  ４００倍）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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