(57)【要約】本発明は、単離された初代ヒト細胞に、少なくとも一つの細胞形質転換因子の発現を可能にする配列と、少なくとも一つの組換えポリペプチドの発現を可能にする配列とが、同時にトランスフェクトされる、永久ヒト細胞系統の作出方法に関する。2009515537.tif 000007
2009515537.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
永久ヒト細胞株の作出方法であって、単離された初代ヒト細胞に、一つの核酸分子または少なくとも二つの異なる核酸分子がトランスフェクトされ、一つの核酸分子がトランスフェクトされる場合は、該核酸分子が少なくとも一つの細胞形質転換因子の発現および組換えポリペプチドの発現を可能にする配列を示し、少なくとも二つの異なる核酸分子がトランスフェクトされる場合は、第1の核酸分子が少なくとも一つの細胞形質転換因子の発現を可能にする配列を示し、第2の核酸分子が少なくとも一つの組換えポリペプチドの発現を可能にする配列を示す、方法。
【請求項２】
初代ヒト細胞が羊膜細胞、胎児網膜細胞、およびニューロン由来の胎児細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
細胞形質転換因子がSV40由来のT抗原、HPV由来のE6およびE7、またはヒトアデノウイルス由来のE1AおよびE1Bである、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
ヒトアデノウイルス由来のE1AおよびE1Bの配列がヒトアデノウイルス血清型5のヌクレオチド1〜4344、505〜3522、またはヌクレオチド505〜4079を含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
組換えポリペプチドがホルモン、凝固因子、増殖因子、コクサッキーアデノウイルス受容体（CAR）、抗体、ウイルス抗原、細菌抗原もしくは寄生虫抗原、または組換えウイルス生産用の相補因子である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
細胞形質転換因子がHPV由来のE6およびE7である場合に、E6の配列が一つの核酸分子上に存在し、E7の配列がもう一つの別個の核酸分子上に存在し、細胞形質転換因子がヒトアデノウイルス由来のE1AおよびE1Bである場合に、E1Aの配列が一つの核酸分子上に存在し、E1Bの配列がもう一つの別個の核酸分子上に存在する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
組換えポリペプチドの配列が細胞形質転換因子用の二つの核酸分子の一方の上に存在する、請求項6記載の方法。
【請求項８】
細胞形質転換因子または組換えポリペプチドの発現を可能にする配列が、異種プロモーターおよび/または異種転写終結要素を示す、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
プロモーターが、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、EF-1αプロモーター、CAGプロモーター、ヒトまたはマウスpgkプロモーター、RSVプロモーター、またはSV40プロモーターであり、転写終結要素がSV40ラージT抗原のポリアデニル化配列またはヒトG-CSF遺伝子のポリアデニル化配列である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
組換えポリペプチドの発現を可能にする配列がリコンビナーゼの認識配列を含有し、該認識配列が組換えポリペプチドのコード配列または組換えポリペプチドの完全な発現カセットに隣接する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
認識配列がloxP、attB/attPまたはFrt配列である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
トランスフェクトされた核酸分子が選択マーカーをコードする配列を示さない、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
請求項1〜12のいずれか一項記載の方法に従って得ることができる永久ヒト細胞株。
【請求項１４】
ポリペプチドを生産するための、請求項13記載の細胞株の使用。
【請求項１５】
ウイルス遺伝子導入ベクターを生産するための、請求項13記載の細胞株の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単離された初代ヒト細胞に、少なくとも一つの細胞形質転換因子の発現を可能にする配列と、少なくとも一つの組換えポリペプチドの発現を可能にする配列とが同時にトランスフェクトされる、永久ヒト細胞株の作出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養（インビトロ）における治療用、診断用または工業用組換えポリペプチドの生産は、一般に、前記ポリペプチドをコードする核酸が細胞の染色体DNAに組み込まれている安定な、永続または永久樹立細胞株（いわゆる生産細胞株）で行われる。これらの生産細胞株は、特に、二つの特徴的性質を示す必要がある。すなわち、まず第一に、それらは細胞培養において永続的（永久的）に成長し、増殖可能である必要があり、第二に、それらは所望のポリペプチドをコードする遺伝子を発現させ、次にそのポリペプチドを細胞からまたは培養物の上清から単離することが可能である必要がある。細菌、酵母および植物細胞だけでなく、動物細胞も、特に組換えポリペプチドの生産には使用される。今日では、全ての治療タンパク質の約60〜70％が、哺乳動物細胞で生産されている（Wurm, Nat. Biotechnology 22, 1393-1398, 2004（非特許文献1））。生産細胞の作出は、通常、細胞培養下で永久的に成長し増殖する、既に不死化または形質転換されている細胞株、例えば動物由来のCHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、BHK（乳呑みハムスター腎臓）細胞、NS0（マウス骨髄腫）細胞、またはヒトHEK293（ヒト胎児腎臓）もしくはPER.C6細胞などから出発する。最近では市販されるようになっているこれらの細胞株は、遺伝子操作によって生産細胞を樹立する方法の事実上の第1段階として初代培養細胞から作製されたものであるか、天然の腫瘍から単離されたものである。
【０００３】
実際の生産細胞を作製する場合、一方では、必要な転写調節要素と共に組換えポリペプチドをコードする核酸（いわゆる導入遺伝子）を、これらの既に樹立されている細胞株にトランスフェクションによって導入し、他方では、選択マーカーをコードする遺伝子を持っていてその遺伝子産物が細胞に選択上一定の利点を与えるような第2の発現カセットを導入する。遺伝子導入の数日後（この間、細胞は選択試薬を含まない培養培地中で培養された）に、適切な選択試薬を培地に加える。選択試薬の存在下では、トランスフェクションに使用した、選択マーカーを発現させる核酸を取り込んだ細胞だけが、生き残り、成長する。よく使用される選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）である（Wurm, Nat. Biotechnology 22:1393-1398, 2004（非特許文献1）；WurmおよびJordan, 309-333.Makrides(Eds.)「Gene Transfer and Expression in Mammailian Cells」（Elsevier, Amsterdam, 2003）（非特許文献2））。したがって選択は、抗生物質ネオマイシンまたはハイグロマイシンなどの選択試薬を含む培養培地、および合成グルココルチコイド・メトトレキサートを含む培養培地で、それぞれ行われる。次に、選択マーカーおよび導入遺伝子を有し、選択工程に耐えて増殖する細胞（いわゆる形質転換体）は、通常、培養物中の全ての細胞が遺伝的に同一であることを確実にし、かつ最良の生産速度を有する望ましい生産細胞株をそれほどでもない生産細胞株から分離するために、個別化（クローン化）される。
【０００４】
選択試薬は、生産工程に応じて、生産細胞株の遺伝的安定性を保証するために、選択相だけでなく、その後のクローン化細胞の成長時にも、培地に加える必要があるかもしれない。所望のポリペプチドの遺伝子（導入遺伝子）および選択マーカーの遺伝子は、通常は、細胞ゲノムの同じ部位内に組み込まれる。その後の細胞の拡大時、または生産相中に、選択圧が存在しなければ、細胞が選択マーカーを失い、それと共に所望のポリペプチドの導入遺伝子も失う危険が生じる。これは選択試薬の継続的な添加によって防止される。
【０００５】
生物または組織から取り出された後、細胞培養に取り込まれた初代動物細胞および初代ヒト細胞は、通常は短期間、数継代しか成長することができない。ヒト細胞は、他の哺乳動物細胞または動物細胞とは対照的に、真正な翻訳後修飾パターンを有する複雑なポリペプチドを発現させるので、ヒトバイオ治療薬の生産には特に適している。複雑な組換えタンパク質の糖鎖付加パターン、すなわち分子内の糖残基の構造および配置は、非ヒト生産系で生産した場合よりも、ヒト細胞において生産した場合の方が、真正なヒトポリペプチドのパターンを、かなり良く再現するだろう。この糖鎖付加パターンは、生物学的活性、安定性、溶解性および免疫原性などのポリペプチドの重要な性質にとって、しばしば決定的な重要性を有する。
【０００６】
組換えポリペプチドの発現に使用することができる永続樹立ヒト細胞株（永久ヒト細胞株）が患者の腫瘍組織から単離された（例えばHeLa細胞）。しかしそのような細胞は、安全面の懸念およびその遺伝的不安定性により、ヒトに応用される治療ポリペプチドの工業生産には適していない。極めて数少ない例外（例えばいわゆるHaCaT細胞）を除けば、自発的に不死化したヒト細胞株は実用上、利用不可能である。これに対し、一定のウイルス遺伝子産物による初代組織の形質転換によって作製された永久ヒト細胞株は、生物工学的生産目的に適している。DNAウイルスの形質転換ポリペプチドの発現により、初代細胞を永久的に成長する細胞へと移行させることができる。形質転換の機序は、ウイルスがコードする遺伝子産物の、細胞分裂の調節に関与する細胞タンパク質（いわゆる腫瘍抑制遺伝子産物）との相互作用を必要とする。その結果、細胞周期の停止（G0/G1期）が中断されて、細胞はS期に進入し、それが細胞の無制御な増殖につながる（HeltおよびFalloway, Carcinogenesis 24:159-169, 2003）。そのような形質転換性の、ウイルスがコードする遺伝子産物の例は、シミアンウイルス40（SV40）のT抗原、ヒトパピローマウイルス（HPV）のE6/E7、またはアデノウイルスのE1A/E1Bである。これらのウイルスタンパク質は、その形質転換機序が類似している。すなわち、T抗原、E6およびE1Aは細胞性網膜芽細胞腫タンパク質ファミリーの遺伝子産物（pRb）を不活化し、T抗原、E7およびE1Bは細胞性腫瘍抑制因子p53を不活化する（zur Hausen, J. Natl. Cancer Inst, 92, 690-698, 2000（非特許文献3）；Ludlow, FASEB J. 7: 866-871, 1993（非特許文献4）；Moran, FASEB J. 7, 880-885, 1993（非特許文献5）に概説されている）。そのようにして形質転換された細胞株は、永久的に培養可能となり、生物工学的生産目的に特に適している。
【０００７】
今までにアデノウイルスE1遺伝子領域によって形質転換されたヒト細胞タイプは極めてわずかしかない。それらの中には、ヒト胎児腎臓組織のニューロン細胞（HEK293）（Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-74, 1977（非特許文献6））、ヒト胎児網膜細胞（EP 833 934 B1（特許文献1））およびヒト羊膜細胞（EP 1 230 354 B1（特許文献2））がある。
【０００８】
利用可能な不死化細胞株および形質転換細胞株にそれぞれ基づく生産細胞株の上記作出方法では、さまざまな点で欠点が生じる。生産に先だって、選択相で、また場合によっては拡大相でも、抗生物質、化学療法剤または他の選択試薬を培養培地に添加すると、その生産方法のコストが増加する。それだけでなく、生産工程中に労力を要する分析を行い、かつ最終製品の分析も行うことによって、精製され調合された最終製品がいかなる残留選択試薬も保持しないことを確保し、確認しなければならない。これは、治療調製物の安全を保証するために、品質管理の要件が追加されることを意味する。さらにまた、適用される選択試薬の一部は、生産細胞の品質およびクローン安定性に対して、それぞれ影響を発揮する。例えば一部の生産細胞株では、培養物にメトトレキサートを選択試薬として継続的に添加することによって、その生産性に関する細胞の「安定な」表現型の効果が維持される。しかし、この試薬の存在は（特に認可過程の規制要件に関して）望ましくない細胞の細胞遺伝学的不均一性を増進することが、遺伝子解析によって示されている（Wurm et al., Dev. Biol. Stand. 76:69-82, 1992（非特許文献7）；KimおよびLee, Biotechnol. Bioeng. 64:741-749, 1999（非特許文献8））。古典的な生産細胞株作製方法のさらにもう一つの欠点は、該作出方法の基礎となる利用可能な永久出発細胞株（例えばCHO、BHK、HEK293）の選択肢が極めて限られているという事実に見出すことができる。これらの細胞はいずれも、それらを生産細胞株へと発展させる前に、何年間も、数え切れない継代数にわたって培養され、貯蔵されたものである。これらの操作は常に、最初の不死化に必要な遺伝子変化に加えて、それらをそれぞれ「天然」の動物およびヒト出発細胞とはますます異なるものにするさらなる染色体異常および遺伝子突然変異を蓄積する危険を内包している。組換えタンパク質の遺伝子操作の安全関連局面および/または生産技術的局面に関して、これらの変化の考え得る帰結は、まだ詳細には解析されていない。
【０００９】
【特許文献１】EP 833 934 B1
【特許文献２】EP 1 230 354 B1
【非特許文献１】Wurm, Nat. Biotechnology 22, 1393-1398, 2004
【非特許文献２】WurmおよびJordan, 309-333.Makrides(Eds.)「Gene Transfer and Expression in Mammailian Cells」（Elsevier, Amsterdam, 2003）
【非特許文献３】zur Hausen, J. Natl. Cancer Inst, 92, 690-698, 2000
【非特許文献４】Ludlow, FASEB J. 7: 866-871, 1993
【非特許文献５】Moran, FASEB J. 7, 880-885, 1993
【非特許文献６】Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-74, 1977
【非特許文献７】Wurm et al., Dev. Biol. Stand. 76:69-82, 1992
【非特許文献８】KimおよびLee, Biotechnol. Bioeng. 64:741-749, 1999
【発明の開示】
【００１０】
したがって、本発明の基礎にある課題は、組換えポリペプチド生産用の永久ヒト細胞株を作出するための、より簡便で、より対費用効果が高く、かつ毒性局面では、より安全な方法を提供することである。
【００１１】
この課題は、本特許請求の範囲に定義する対象によって解決される。
【００１２】
本明細書において使用する用語「羊膜細胞」は、最も広い意味において、羊水液中に存在する全ての細胞に関し、羊水穿刺によって取得することができる。それらは羊膜に由来するか、羊水と接触している胎児組織に由来する。形態学的基準に基づいて識別することができる羊膜細胞が大きく分けて三種類記載されている。すなわち、線維芽細胞様細胞（F細胞）、上皮様細胞（E細胞）および羊水液細胞（AF細胞）である（Hohn et al., Pediat. Res. 8:746-754, 1974）。AF細胞が最も優勢な細胞タイプである。例えば細胞遺伝学的診断などのために行われた羊水穿刺によって得られる細胞は羊膜細胞の供給源として役立ち得る。さらにまた、羊水液の量が平均を上回る場合（羊水過多症、羊水過多）に妊娠期間中に採取された羊水穿刺の細胞も、羊膜細胞の供給源として役立ち得る。
【００１３】
用語「発現カセット」は、特に、コード領域の前に位置する調節要素またはプロモーター、コード領域およびオープンリーディングフレームをそれぞれ含有すると共に、コード領域の後ろに置かれた転写終結要素を含有する、核酸分子および核酸分子の領域をそれぞれ指す。コード領域の前に存在する調節要素およびプロモーターは、それぞれ、構成的プロモーター、すなわち転写を永久的に活性化するプロモーター（例えばCMVプロモーター）であるか、調節可能なプロモーター、すなわちスイッチをオンおよび/またはオフすることができるプロモーター（例えばテトラサイクリン調節可能プロモーター）であることができる。発現カセットのコード領域は、5'末端に開始コドンを有しかつ3'末端に停止コドンを有するcDNAの場合のように、連続したオープンリーディングフレームであることができる。コード領域は、コーディングエクソンと点在する非コーディングイントロンとのゲノム編成または新たな組み合わせの編成から構成され得る。しかし、発現カセットのコード領域は、いわゆるIRE（内部リボソームエントリー部位）によって分離された数個のオープンリーディングフレームから構成されていてもよい。
【００１４】
本明細書において使用する用語「永久細胞株」は、適切な培養条件下に細胞培養で永久的に成長し続けるように遺伝子改変された細胞に関する。そのような細胞は不死化細胞とも呼ばれる。
【００１５】
本明細書において使用する用語「ポリペプチド」または「組換えポリペプチド」は、少なくとも二つのアミノ酸からなるペプチドに関する。ポリペプチドは、翻訳と同時におよび/または翻訳後に、例えば糖残基の取付けによって、またはアミノ酸残基の修飾によって、修飾され得る。ポリペプチドは線状、環状または分枝状であることができる。さらにまた、ポリペプチドは1より多いアミノ酸鎖からなることもでき、該鎖は、分子内および/または分子間結合により、多かれ少なかれ複雑な三次元構造（例えば二次構造、三次構造、四次構造）をとり得る。ポリペプチドが1本のアミノ酸鎖からなる場合、それは、やはり分子内結合によって、多かれ少なかれ複雑な三次元構造をとることができる。ポリペプチドは薬理学的もしくは免疫学的に活性なポリペプチド、または診断目的に使用されるポリペプチドであることができる。
【００１６】
本明細書において使用する用語「初代細胞」は、生物または組織から直接取り出すことによって取得され、培養下に置かれた細胞に関する。初代細胞は、極めて限られた寿命しか示さない。初代細胞は例えば羊膜細胞、ニューロン細胞または網膜細胞であることができる。
【００１７】
本明細書において使用する用語「生産細胞株」は、生産すべき所望のポリペプチドをコードする導入遺伝子の導入によって遺伝子改変された永久細胞株に関する。
【００１８】
本明細書において使用する用語「選択マーカー」は、選択条件下で成長する上での利点を細胞に与える遺伝子マーカーに関する。そのような選択条件は、例えば培地における化学療法剤もしくは抗生物質または他の細胞毒性物質もしくは成長妨害物質の存在であることができる。よく使用される選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子およびジヒドロ葉酸レダクターゼである。
【００１９】
本明細書において使用する用語「トランスフェクション」は、言及した核酸を細胞中に導入するのに適した任意の方法に関する。例として、古典的なリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション、あらゆる種類のリポソーム系、およびこれらの方法の組み合わせが挙げられる。
【００２０】
本明細書において使用する用語「導入遺伝子」は、組換えポリペプチドをコードする核酸配列に関する。
【００２１】
本発明の一局面は、永久ヒト細胞株の作出方法であって、単離された初代ヒト細胞に、一つの核酸分子または少なくとも二つの異なる核酸分子がトランスフェクトされ、一つの核酸分子がトランスフェクトされる場合は、該核酸分子が少なくとも一つの細胞形質転換因子の発現および組換えポリペプチドの発現を可能にする配列を示し、少なくとも二つの異なる核酸分子がトランスフェクトされる場合は、第1の核酸分子が少なくとも一つの細胞形質転換因子の発現を可能にする配列を示し、第2の核酸分子が少なくとも一つの組換えポリペプチドの発現を可能にする配列を示す方法に関する。
【００２２】
本発明の方法で使用される初代ヒト細胞は、生物から直接取り出すことによって取得されるか、または生物から取り出された組織から直接取り出すことによって取得され、培養下に置かれる。好ましいのは、細胞形質転換因子の発現によって永久ヒト細胞株にうまく変化させることができる初代ヒト細胞、特に羊膜細胞、胎児網膜細胞ならびにニューロン由来の胎児細胞である。
【００２３】
細胞形質転換因子は、SV40のT抗原（GeneBankアクセッション番号J02400）、HPVのE6およびE7遺伝子産物（例えばHPV16、GeneBankアクセッション番号K02718）ならびにヒトアデノウイルスのE1AおよびE1B遺伝子産物（例えばヒトアデノウイルス血清型5、GeneBankアクセッション番号X02996）であることができる。E6および E7遺伝子産物の核酸配列を本発明の方法に使用する場合は、両方の遺伝子産物の配列を初代ヒト細胞にトランスフェクトする必要がある。E1AおよびE1B遺伝子産物の核酸配列を本発明の方法に使用する場合は、両方の遺伝子産物の配列を初代ヒト細胞にトランスフェクトする必要がある。天然HPVによる発現の場合、E6およびE7はRNA転写物から発現させることができる。天然であるアデノウイルスのE1AよびE1Bの発現にも同じことが言える。アデノウイルスE1遺伝子機能などの細胞形質転換因子は、細胞の不死化または形質転換をもたらし、それゆえに、それらを永続的に培養することが可能になる。非トランスフェクト初代ヒト細胞が少なくとも数週間後には培養物内で自然に死ぬのに対して、トランスフェクト細胞は、例えばE1遺伝子産物の不死化活性ゆえに増殖して、表現型的に認識できる細胞コロニーを形成する。このように、細胞の不死化にとって不可欠な細胞形質転換因子の導入は、本発明の方法においては、選択マーカーの機能に取って代わるものであり、この選択マーカーはいかなる外因的化学選択圧も追加せずに細胞株を単離することを可能にし、該細胞株は一つまたは複数の異なる組換えポリペプチドを発現する。このように本発明は、特に、選択マーカーのトランスフェクションを行わずに永久ヒト細胞株を作出する方法に関する。
【００２４】
細胞形質転換因子を発現させるための核酸配列は発現カセットの形で存在する。
【００２５】
発現カセットは、同種のプロモーターおよび転写終結配列、例えばアデノウイルスE1A遺伝子機能の発現には天然E1Aプロモーターおよび天然E1Aポリアデニル化部位を、それぞれ含有し得る。これは、トランスフェクションに使用する核酸分子が、各ウイルスゲノムの（例えば、E1A、E1Bなどの前記遺伝子機能を示すアデノウイルスゲノムの）フラグメントを含有する場合に、達成することができる。細胞形質転換因子用の発現カセットは、自然界では、使用するコード領域または転写終結配列と一緒に存在しない異種プロモーターも含有することができる。異種プロモーターとしては、例えばCMV（サイトメガロウイルス）プロモーター（Makrides, 9-26 Makrides(Eds.)「Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells」（Elsevier, Amsterdam, 2003））、EF-1αプロモーター（Kim et al., Gene 91:217-223, 1990）、CAGプロモーター（第1イントロンを有する、ヒトサイトメガロウイルスの最初期エンハンサーと改変ニワトリβアクチンプロモーターとに由来するハイブリッドプロモーター）（Niwa et al., Gene 108:193-199, 1991）、ヒトまたはマウスpgk（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター（Adra et al., Gene 60:65-74, 1987）、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター（Makrides, 9-26 Makrides(Eds.)「Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells」（Elsevier, Amsterdam, 2003））またはSV40（シミアンウイルス40）プロモーター（Makrides, 9-26 Makrides(Eds.)「Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells」（Elsevier, Amsterdam, 2003））などが役立ち得る。ポリアデニル化部位としては、例えばSV40ラージT抗原（GeneBankアクセッション番号J02400）またはヒトG-CSF（顆粒球コロニー刺激因子）遺伝子（MizushimaおよびNagata, Nucl. Acids Res. 18:5322, 1990)のポリアデニル化配列などが役立ち得る。さらにまた、一部の発現カセットは、形質転換因子用の同種調節要素および他の異種調節要素を含有し得る。すなわち、E1A発現カセットは、例えば異種プロモーターを示し、かつE1B発現カセットは同種プロモーターを示すか、もしくはその逆であることができ、または両発現カセットが異種プロモーターを示す。
【００２６】
少なくとも一つの組換えポリペプチドを発現させるための核酸配列も、少なくとも一つの発現カセット中に存在し、プロモーターおよび転写終結配列の種類および選択は、細胞形質転換因子について言及したものに対応する。
【００２７】
それぞれの調節要素を含む細胞形質転換因子および組換えポリペプチドの核酸配列は、一つの核酸分子上またはいくつかの異なる核酸分子上に存在し得る。本発明の好ましい実施形態では、それぞれの調節要素を含む細胞形質転換因子、例えばE6およびE7遺伝子機能またはE1AおよびE1B遺伝子機能の配列、またはSV40のT抗原などの細胞形質転換因子の配列が、一つの核酸分子上に存在し、調節要素を含む組換えポリペプチドの配列が、第1の核酸分子とは別個の第2核酸分子上に存在する。さらにもう一つの好ましい実施形態では、それぞれの調節要素を含む形質転換因子E6およびE7ならびにE1AおよびE1Bの配列が、それぞれ異なる核酸配列分子上に存在する。この場合、調節要素を含む組換えポリペプチドの配列は、第1および第2の核酸分子とは別個の第3核酸分子上に存在するか、一方の細胞形質転換因子の配列を含む第1または第2の分子上に存在することができる。ある好ましい実施形態では、初代ヒト細胞が、E1AおよびE1B遺伝子機能の発現カセットを含有する第1核酸分子と、組換えペプチドの発現カセットを示す第2核酸分子とによってトランスフェクトされ、第2核酸分子は第1核酸分子とは別個である。この実施形態では、第1核酸分子が、異種プロモーターおよび同種転写終結要素を含有するE1A発現カセットを含有し、E1B転写単位は、同種プロモーターおよび同種転写終結要素を含有する。特に好ましい実施形態では、第1核酸分子が、アデノウイルス血清型5ヌクレオチド配列のヌクレオチド505からヌクレオチド4079までを含有する。さらにもう一つの特に好ましい実施形態では、第1核酸分子が、アデノウイルス血清型5ヌクレオチド配列のヌクレオチド505からヌクレオチド3522までを含有する。さらにもう一つの特に好ましい実施形態では、第1核酸分子が、HEK293細胞中のアデノウイルスDNAに相当するアデノウイルス血清型5ヌクレオチド配列のヌクレオチド1からヌクレオチド4344までを含有する（Louis et al., Virology 233:423-429, 1997）。
【００２８】
この実施形態の場合、E1BプロモーターおよびE1Bポリアデニル化部位（ヌクレオチド4037〜4070）の存在は、E1Bの最適な転写および発現につながるはずである。さらにもう一つの利点は、E1Bの停止コドンとE1Bのポリアデニル化部位の間の配列領域がアデノウイルスpIX遺伝子機能を含有するという事実にある。ウイルス構造タンパク質であるpIXポリペプチドは、チミジンキナーゼプロモーターおよびベータグロビンプロモーターなどの異なるウイルスプロモーターおよび細胞プロモーターに対して、転写活性化因子として作用する。組換えポリペプチドのコード配列が上述したプロモーターの一つの制御を受けるのであれば、細胞内で追加発現されるpIXポリペプチドの転写活性化効果は、本発明の生産細胞株内における組換えポリペプチドの発現率の増加をもたらすことができる。
【００２９】
組換えポリペプチドは、ヒトアルファ1アンチトリプシンなどの治療タンパク質またはエリスロポエチンもしくはインターロイキン-2などの増殖因子であることができる。ヒトアルファ1-アンチトリプシン（hAAT）は、エラスターゼおよび他のプロテイナーゼを阻害するプロテイナーゼ阻害剤であり、肺および肝臓の重篤な損傷につながる遺伝性hAAT欠損症において治療的に活性である。エリスロポエチンは、貧血の場合および移植患者においては、血液形成活性を有するエリスロサイト（赤血球）の重要な増殖因子である。インターロイキン-2（Il-2）は免疫系の細胞伝達物質であり、例えば腫瘍疾患などの場合に、細胞性免疫応答の活性化において、極めて重要である。血液凝固障害を有する血友病患者において使用される第VIII因子および第IX因子などの血液凝固因子も、治療活性ポリペプチドに属する。本発明の方法による組換えポリペプチドはホルモンであることができる。生物工学的に操作されたホルモンは、ホルモン障害を有する患者における補充療法に使用される。真性糖尿病を有する多くの患者が依存している血糖低下ホルモン・インスリン、小人症を処置するためのソマトトロピン（成長ホルモン）、および妊孕性障害を処置するための卵胞刺激ホルモン（FSH）または黄体形成ホルモン（LH）などの性腺刺激因子が、その例である。
【００３０】
組換えポリペプチドは、治療目的または診断目的に使用し得る組換え抗体であることができる。腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）に対する抗体は、慢性関節リウマチを有する患者に使用され、上皮成長因子の細胞受容体（EGFR）に対する抗体は、がん患者に使用される。診断目的に使用される抗体は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）または放射性免疫吸着アッセイ（RIA）などの方法に基づく市販診断キットの成分であることができる。これらの検査アッセイでは、抗体が、ヒトB型肝炎ウイルスなどの感染性物質の抗原の検出に役立つ。
【００３１】
抗体または免疫グロブリン（Ig）は、それぞれが可変領域または可変ドメインおよび定常領域または定常ドメインからなっている重鎖および軽鎖からなる。抗体を発現させるためにトランスフェクトされる核酸分子の核酸配列は、一方が免疫グロブリン分子の軽鎖をコードし、他方が重鎖をコードする二つの分離した発現カセットを含有し得る。本発明の細胞内で両鎖が発現すると、これらの鎖は集合して活性な抗体分子を形成する。二本の鎖の発現カセットは、別々の核酸分子上に存在することも、同じ核酸分子上に存在することもできる。しかし、重鎖および軽鎖のコード配列は、同じ発現カセット内に存在していて、重鎖と軽鎖の両方の発現に備えてIRES配列（内部リボソームエントリー部位）で分離されていてもよい。軽鎖および重鎖のコード配列は、原理上、同じ発現カセット内に存在していて、該細胞内で同時に発現されるプロテイナーゼであって軽鎖および重鎖の配列からなる前駆体ポリペプチドを活性な軽鎖および重鎖へと切断するプロテイナーゼ（例えばトロンビン）の酵素切断部位をコードする配列によって分離されていてもよい。
【００３２】
本発明による細胞の核酸配列によってコードされる組換え抗体は、完全な軽鎖および重鎖の代りに抗体のフラグメントからなることもできる。いわゆる単鎖抗体（scFv、単鎖可変フラグメント）は、重鎖および軽鎖の可変ドメインからなり、それらが、両ドメインの自由な運動に備えたアミノ酸配列（いわゆるリンカー）によって連結されている。抗原結合構造は、両ドメインの分子内集合によって形成され、その構造は免疫グロブリン分子の可変領域に相当する。二重特異性単鎖抗体（ビスscFv）は、重鎖および軽鎖の可変ドメインから構成される二つの前記単鎖アセンブリからなり、それらのアセンブリは連結配列によって連結されて、互いに対して運動し得る。そのような分子は、二つの抗原結合部位（エピトープ）に同時に結合し、その結果として、二つの分子構造を非共有結合的に連結することができる。二重特異性ダイアボディは、別々に発現される二本の単鎖からなり、そのそれぞれは、極めて短いリンカーで分離されているに過ぎない軽鎖および重鎖それぞれの可変ドメインからなるか、または軽鎖および重鎖それぞれの可変ドメインはリンカーを全く伴わない。短いリンカーまたはリンカーの欠如は分子内集合を阻害し、可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインの分子内集合により、二つの結合価を有する活性分子がもう一度形成される。
【００３３】
本方法においてトランスフェクトされる核酸がコードする組換えポリペプチドは、予防用ワクチンまたは治療用ワクチンとして使用するために生産されるウイルスタンパク質、細菌タンパク質または寄生虫タンパク質であることができる。これらのタンパク質は、ウイルス、細菌または寄生虫に由来する構造ポリペプチドおよび調節または酵素活性ポリペプチドのどちらでもよい。ウイルスタンパク質は、例えばB型肝炎ウイルス表面抗原（HBV表面抗原）またはヒトパピローマウイルス由来の構造タンパク質L1であることができる。生産細胞株における発現後にワクチンの生産に使用することが考えられる細菌タンパク質は、例えば腸管毒原性大腸菌（Escherichia coli）（ETEC）由来のエンテロトキシンサブユニットまたは淋菌（Neisseria gonorrhoeae）由来のトランスフェリン結合タンパク質（Tbp AおよびB）である。本方法においてトランスフェクトされる核酸分子がコードし得る寄生虫由来のポリペプチドは、例えばマラリアの原因微生物（熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum））のメロゾイト表面タンパク質（MSP）または日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）のグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）である。
【００３４】
本方法においてトランスフェクトされる核酸分子がコードする組換えポリペプチドは、複製因子として活性であって、ヒト細胞株内で、トランスフェクションにより、細胞株中に引き続いて導入される核酸分子の、エピソーム（すなわち染色体非依存的）複製を可能にする、一つまたは複数のウイルスポリペプチドであることができる。トランスフェクションにより細胞株中に引き続いて導入される核酸分子は、「複製起点」（ori）と呼ばれる遺伝要素を含有し、ポリペプチドはその要素に複製因子として結合し、そうすることにより、エピソーム核酸分子の複製を開始させる。細胞における核酸分子（特にプラスミドDNA）のエピソーム複製は、導入された核酸分子のコピー数を著しく増加させ、その結果として、この分子がコードする組換えポリペプチドの発現を増加させると共に、何回もの細胞分裂の間、その保全を増進する。そのようなウイルス複製因子は、例えば、核酸分子（例えばプラスミドDNA）上のSV40複製近点（SV40 ori）と呼ばれる配列に結合するとその複製を開始するシミアンウイルス40（SV40）のT抗原である。エプシュタイン・バーウイルスタンパク質EBNA-1（エプシュタイン・バーウイルス核抗原-1）は、ori-Pと呼ばれる複製起点を認識し、ori-P保有核酸分子の染色体外複製を触媒する。
【００３５】
本方法においてトランスフェクトされる核酸分子がコードする組換えポリペプチドは、細胞株内での組換えウイルス遺伝子導入ベクターの生産を可能にするウイルスタンパク質であることもできる。相補因子とも呼ばれるこれらのウイルスタンパク質は細胞株内で発現され、遺伝子導入ベクターの生産に必要な、遺伝子導入ベクターの核酸分子上にはコードされていない酵素成分または構造成分である。そのような遺伝子導入ベクターでは、安全を考慮して、一定のウイルス遺伝子機能が通常は削除されている。遺伝子導入ベクターであって、その相補因子が本明細書に記載の方法によって導入される導入遺伝子によってコードされ得るものは、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）またはヘルペスウイルスに基づくベクターである。細胞株内で発現される相補因子は、導入されるべき遺伝子を含有せず、したがって遺伝子導入ベクターとしては作用しないが、例えばワクチンとして使用される欠失または組換えウイルスを、その生産時に相補することもできる。
【００３６】
アデノウイルス系遺伝子導入ベクターの場合、例えば遺伝子機能pIX、E2、E3および/またはE4を、本発明の細胞内で発現させることができる。ベクターのゲノムから各遺伝子機能を欠失させると、ベクターの安全性が増加し、無関係な核酸配列の取り込み関するその容量が増加する。遺伝子機能pIXはアデノウイルス構造タンパク質、すなわちウイルスキャプシドの成分である。ウイルス遺伝子機能E2、E3およびE4は、ウイルス複製の初期に発現される調節ポリペプチドをコードする。第一世代のアデノウイルスベクターはE1および/またはE3を欠失させただけである。第二世代のアデノウイルスベクターは、さらに遺伝子機能E2および/またはE4を欠く。全てのウイルス遺伝子機能を相補する細胞株は、原理上、逆方向末端反復（ITR）と呼ばれるベクター核酸複製用の配列を有する他は、いかなるコード遺伝子機能も含有しない、「ガットレス」ベクターまたは高容量アデノウイルスベクターと呼ばれる世代のアデノウイルス遺伝子導入ベクターを相補することができるだろう。
【００３７】
本方法で初代ヒト細胞にトランスフェクトされる核酸は、さらに、受容体ポリペプチド（特に細胞の表面に局在し、ウイルスによる細胞の感染およびウイルス遺伝子導入ベクターによる細胞の形質導入をそれぞれ担っているもの）をコードすることもできる。最も一般的なアデノウイルスベクターの由来源であるアデノウイルス血清型2または5に細胞が感染する際の第1段階のためのウイルス受容体として、いわゆるコクサッキーアデノウイルス受容体CARが同定された（Bergelson et al., Science 275:1320-1323, 1997）。表面におけるCARの十分な発現は、細胞が、アデノウイルス遺伝子導入ベクター用の生産細胞として適していることの必要条件である。好ましい実施形態では、組換えポリペプチドがコクサッキーアデノウイルス受容体（CAR）である。受容体ポリペプチドの過剰発現は、感染性を著しく改善することができ、それにゆえにアデノウイルスベクターに関して、これらの細胞の生産効率を著しく改善することができる。さらにまた、核酸分子はCARの他に、例えば、それぞれウイルスおよび遺伝子導入ベクターの細胞への取り込みを媒介し、その追加発現がアデノウイルスベクター用生産細胞の作出に有利である一定のインテグリンなど、二次受容体または内在化受容体をコードすることもできる。
【００３８】
本方法において初代ヒト細胞のトランスフェクションに使用される、少なくとも一つの組換えポリペプチドをコードする核酸分子、または細胞形質転換因子をコードする核酸分子は、「マトリックス付着領域」（MAR）を含有してもよい。「足場付着領域」（SAR）とも呼ばれるこれらの遺伝要素は、遺伝子発現の調節に役割を果たす。というのも、それらはゲノム内の転写単位および調節要素と会合するからである。MARは、細胞に組み込まれた外来遺伝子を、トランスフェクト細胞内での転写サイレンシングまたは転写の停止から保護することができ、そうすることにより、それらの発現を強化する（GirodおよびMermod .p.359-379, S.C. Makrides(Eds.)「Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells」（2003. Elsevier, Amsterdam））。
【００３９】
細胞形質転換因子および二つの機能的に関連する因子それぞれの発現可能な核酸配列ならびに少なくとも一つの組換えポリペプチドの発現可能な核酸配列を含有する核酸分子を初代ヒト細胞に同時にトランスフェクトすることにより、選択試薬を添加することなく、組換えポリペプチド生産用の永久ヒト細胞株を生成させることに、本発明者らは成功した。したがって本発明はさらに、少なくとも一つの所望のポリペプチドを発現させるための永久ヒト細胞株を、好ましくは選択マーカーのトランスフェクションを行わずに、作出する方法に関する。これらの細胞は、なかんずく、治療ポリペプチド、血液凝固因子、増殖因子、ホルモンおよび抗体、ならびにワクチンとして使用するためのウイルスポリペプチド、細菌ポリペプチドまたは寄生虫ポリペプチドの生産に使用することができる。さらにまた、本発明の細胞は、ウイルス抗原、細菌抗原もしくは寄生虫抗原またはそれぞれの特異的抗体などの、診断関連タンパク質の生産にも使用することができる。さらにまた、本発明の細胞は、例えば技術的合成プロセスを触媒するための酵素または有害物質を分解するための酵素などの、技術関連または工業関連タンパク質の生産にも使用することができる。本発明の細胞は、一つの組換えポリペプチド、さらには複数の異なる組換えポリペプチドを発現させることができる。発現可能なポリペプチドの数は、組換えポリペプチドをコードする異なる核酸配列を、本発明の方法で、細胞中にいくつトランスフェクトするかに依存する。
【００４０】
生産細胞における導入遺伝子の発現の強さは、導入遺伝子が細胞へのその導入後に組み込まれるゲノム領域に決定的に依存する。細胞ゲノムのある部位では比較的短い期間後に導入遺伝子の発現が停止されるのに対して、他の部位、いわゆる転写の「ホットスポット」では、発現カセットが長期間にわたって高い効率で転写活性を保ち続ける。本発明に従って作出された永久細胞において、形質転換された表現型を維持するには、細胞形質転換因子の継続的発現が必要である。したがって永久ヒト細胞では、各発現カセットの組み込み部位が、細胞ゲノム内の転写の「ホットスポット」にある。したがって本発明のさらにもう一つの局面は、永久ヒト細胞の作出方法であって、細胞形質転換因子の配列を示す核酸配列が配列特異的組換え酵素の認識配列をさらに含む方法に関する。後続の段階では、各組換えリコンビナーゼが同時に発現される一方で、導入遺伝子用のさらにもう一つの発現カセットを永久ヒト細胞株に組み込むことができ、その発現カセットは一つまたは複数の各リコンビナーゼ認識配列も含有する。これは、特異的「ホットスポット」における発現カセットの組み込みにつながり、したがって導入遺伝子の高い、長期間持続する発現につながる。上述の方法で作製された生産細胞株であって、生産効率が高いと決定されたものは、別の導入遺伝子用の効率の良い生産細胞株を迅速に作製するために使用することができるだろう。本発明のさらにもう一つの局面は、組み込み部位の配列解析によるこれら特異的「ホットスポット」の単離および発現ベクターにおけるその使用に関する。これは、今まで未知であったホットスポット配列をヒト細胞から単離することを可能にする。特異的発現カセットは、相同組換えによって、これらの配列に組み込まれ得る。
【００４１】
本発明のさらにもう一つの局面は、永久ヒト細胞株の作出方法であって、組換えポリペプチドの発現を可能にする配列を示す核酸分子が、組換えポリペプチドの発現カセットに加えて、または組換えポリペプチドのコード配列に加えて、一つまたは複数のリコンビナーゼ認識配列を示す方法に関する。例えばリコンビナーゼ認識配列は、各配列の5'末端および3'末端に存在し得る。この場合、組換えポリペプチドはレポーター遺伝子（すなわちその遺伝子産物を容易に検出し定量的に決定することができる遺伝子）であることができる。レポータータンパク質（すなわちレポーター遺伝子によってコードされる遺伝子産物）を強く発現させる安定細胞株を選択した後、第2段階として、他の組換えポリペプチド用の発現カセットを含む核酸分子を、該細胞に組み込むことができる。該発現カセットも、同じ組換え酵素の認識配列を含有する。リコンビナーゼを短期間発現させた後、元の組換えポリペプチドの切り出しと、細胞に新たにトランスフェクトされた組換えポリペプチドの組み込みとによって、同様に高い生産効率を有する新しい生産細胞株が生成するだろう。この方法により、よく発現させる生産細胞株を選択するという時間のかかる工程が減る。リコンビナーゼおよびそれぞれの認識配列の例は、バクテリオファージP1由来のCreリコンビナーゼおよびloxP認識配列、バクテリオファージφC31由来のインテグラーゼおよびattB/attP認識配列、または酵母由来のFlpリコンビナーゼおよびfrt認識配列である（Groth et al., PNAS 97: 5995-6000, 2000；Araki et al., Nucl. Acids Res. 25:868-872, 1997；O'Gorman et al., Science 251:1351-1355, 1991）。多くの場合、効率のよい組み込みには、実際の認識配列ではなく、「擬似（pseudo）」lox（Araki et al., Nucl. Acids Res. 25: 868-872, 1997）または「擬似」att（Thyagarajan et al., Mol. Cell Biol. 21: 3926-3934, 2001）が有利である。
【００４２】
以下に実施例を挙げて本発明を例示するが、以下の実施例を限定であるとみなしてはならない。別段の表示がない限り、例えばSambrookら（1989）「Molecular cloning: A Laboratory Manual」第2版（Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）に記載されているような、分子生物学の標準的方法を使用した。
【００４３】
1．クローニング手法
a）プラスミドpSTK146
プラスミドpSTK146はEP 1 230 354 B1に詳細に記載されており、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ（pgk）プロモーター、アデノウイルス血清型5（Ad5）配列ヌクレオチド（nt.）505-3522ならびにSV40のスプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含む。
【００４４】
b）プラスミドpGS119（図1）
プラスミドpGS119は、マウスpgkプロモーター、全E1領域を含有するAd5配列nt.505-3522、SV40の3'スプライシングおよびポリアデニル化シグナルならびにAd5のpIX領域（nt.3485-4079）を含有する。Ad5 pIX遺伝子配列は、Ad5配列nt.22-5790を含有するプラスミドpXC1（Microbix Biosystems Inc、カタログ番号PD-01-03）に由来する。このプラスミドならびにプライマー
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および
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を使用し、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって、Ad5遺伝子配列nt.3485-4079を増幅し、XhoI（各プライマーは一つのXhoI制限部位を含有する）で切断し、pSTK146のXhoI制限部位に導入した。
【００４５】
c）プラスミドpGS122
プラスミドpGS122はAd5配列bp1-4344を含有する。第1段階では、Ad5配列nt.356-3826をpXC1（Microbix Biosystems Inc、カタログ番号PD-01-03）からSacII消化を使って単離し、pSTK31（pBluescript中に、PmeI制限部位と、それに続くAd5配列bp1-400を含有する）のSacII制限部位に導入した。そのようにして作製したプラスミドpGS120をBstEIIで線状化し、Ad5配列bp1914-5185を含有するpXC1のBstEIIフラグメントを導入した（pGS121）。二つのオリゴヌクレオチド
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および
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をハイブリダイズして、二本鎖を形成させた。プラスミドpGS121をAfeIおよびXhoIで消化し、上述のオリゴヌクレオチドを導入した。オリゴヌクレオチドの配列は、pGS121に導入した時に、5'末端でAfeI制限部位が保たれ、3'末端ではPmeI制限部位の後に再生されたXhoI制限部位が続くように選択した。したがって、pGS122中のAd5配列にはPmeI制限部位が直接隣接している。
【００４６】
d）プラスミドpGS124
プラスミドpGS124はSV40プロモーターおよびSV40 T抗原の遺伝子配列を含有する。SV40 DNAをBamHIおよびKpnIで消化することにより、3kbフラグメントをSV40ゲノムから切り出し、BamHIおよびKpnIで消化したpBluescriptに導入した。したがってプラスミドpGS124はSV40 T抗原を発現させる。
【００４７】
e）プラスミドpGS116（図2）、pGS129、pGS131、pGS132、pGS133
プラスミドpGS116、pGS129、pGS131、pGS132およびpGS133は、異なるプロモーターの制御下でヒトアルファ1-アンチトリプシン（hAAT）を発現させる。
【００４８】
プラスミドpGS116（図2）はヒトサイトメガロウイルス（CMV）の初期プロモーターを含有し、その後ろにSV40スプライスドナー/スプライスアクセプター部位、hAAT-cDNAおよびSV40ポリアデニル化部位（ポリA）が続いている。CMV配列およびSV40配列は、プラスミドpCMVβ（BD Clontech、カタログ番号6177-1）に由来する。NotIによる消化と、それに続く5'オーバーハングのフィルイン反応とによって、pCMVβ中のβガラクトシダーゼ遺伝子を欠失させ、プラスミドAd/PGK-hAATのEcoRI消化によって単離したhAAT cDNAで置き換えた（Kay et al., Hepatology 21:815-819, 1995）。
【００４９】
プラスミドpGS129は、伸長因子EF-1αのためのヒトプロモーターの制御下にある上述のhAAT cDNAを含有する。XhoIおよびEcoRIによるpGS116の消化と、それに続く5'オーバーハングのフィルイン反応とによって、CMVプロモーターをpGS116から欠失させ、EF-1αプロモーターを含有する1.3kbフラグメントで置き換えた。
【００５０】
プラスミドpGS131は、CMVエンハンサーとニワトリβアクチンプロモーターとからなるハイブリッドプロモーター（CAGプロモーター）の制御下にあるhAAT cDNAを含有する。XhoIおよびEcoRIによるpGS116の消化と、それに続く5'オーバーハングのフィルイン反応とによって、CMVプロモーターを1.1kb CAGプロモーターで置き換えた。
【００５１】
プラスミドpGS132は、ラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーターの制御下にあるhAAT cDNAを含有する。pGS116中のCAGプロモーターを、XhoIおよびEcoRIによる制限消化と、それに続く5'オーバーハングのフィルイン反応とによって欠失させ、0.58kb RSVプロモーターで置き換えた。
【００５２】
プラスミドpGS133では、hAAT cDNAの発現が、シミアンウイルス40（SV40）の初期プロモーターによって制御される。XhoIおよびEcoRIによる消化と、それに続く5'オーバーハングのフィルイン反応とによって、CMVプロモーターをpGS116から欠失させ、0.23kb SV40プロモーターで置き換えた。
【００５３】
f）プラスミドpGS126
プラスミドpGS126は以下の要素を含有する：pkgプロモーター、Ad5配列nt.505-3522、SV40ポリAからなるE1発現カセット、Ad5配列nt.3485-4079からなるpIX発現カセット、およびCMVプロモーター、hAAT cDNA、SV40ポリAからなるhAAT発現カセット。EcoRIおよびHindIIIによるpGS116（1e参照）の消化と、それに続くフィルイン反応とによってhAAT発現カセットを単離し、BamHIによる消化および5'オーバーハングのフィルイン反応後に、プラスミドpGS119（1b参照）に導入した。したがってプラスミドpGS126はAd5 E1タンパク質およびpIXタンパク質ならびにhAATを発現させる。
【００５４】
g）プラスミドpGS123
プラスミドpGS123は、hAAT発現カセットに加えて、マトリックス付随領域（MAR）を含有する。このMARは、ヒトAAT（GenBankアクセッションK02212）の遺伝子座のイントロン領域から得られる2085bpのEcoRI/SpeIフラグメント内に局在する。このフラグメントをpBluescript（pGS58）にクローニングし、pGS116（1e参照）の5'オーバーハングのフィルイン反応後に、EcoRI制限部位に導入した。
【００５５】
h）プラスミドpGS127
プラスミドpGS127は、CMVプロモーター、ヒトエリスロポエチン（Epo）のcDNAおよびSV40ポリA配列を含有する。NotI消化を利用してβガラクトシダーゼ遺伝子をpCMVβから除去し、Epo cDNAで置き換えた。
【００５６】
2．コンストラクトの検証
a）配列解析
上記した全てのプラスミドの完全性を制限消化によって調べた。さらにまた、pGS119、pGS122およびpGS126中のアデノウイルスフラグメントの正しい配列を、配列解析によって確認した。Ad5野生型配列と比較して、配列の変化は見出されなかった。
【００５７】
b）発現
プラスミドpGS116、pGS129、pGS131、pGS132、pGS133、pGS123およびpGS126をHEK293細胞にトランスフェクトし、ヒトアルファ1アンチトリプシン（hAAT）の発現と培養上清への分泌を、ELISAを使って検出した（6b章参照）。プラスミドpGS119およびpGS122をHeLa細胞にトランスフェクトし、モノクローナル抗体を用いるウェスタンブロット法で、E1Aタンパク質の発現を解析した（6a章参照）。プラスミドpGS124をHeLa細胞およびHEK293細胞にトランスフェクトし、ウェスタンブロット法およびモノクローナル抗体（Abcam、英国ケンブリッジ）を使って、T抗原の発現を検出した。
【００５８】
3．細胞の培養
a）細胞株
細胞培養試薬は、別段の表示がない限り、Invitrogen GmbH社から入手した。HEK293細胞およびHeLa細胞は、10％ウシ胎仔血清（FCS）、1×ペニシリン/ストレプトマイシンを含む変法イーグル培地（MEM）中、37℃、湿度95％および5％CO2で培養した。
【００５９】
b）初代羊膜細胞
常法に従って、羊水穿刺時に、初代羊膜細胞を得た。この羊水穿刺物1〜2mlを、6cm Primaria細胞培養ディッシュ（Falcon）中、5mlのハムF10培地、10％FCS、2％Ultroser G（CytoGen GmbH）、1×抗生物質/抗真菌剤と共に、37℃、湿度95％および5％CO2で培養した。4〜6日後に、羊膜細胞が付着し始め、3mlの新鮮培地＋添加物（上記参照）を加えた。細胞が完全に付着したら直ちに培地を取り除き、5mlの新鮮培地＋添加物で置き換えた。さらなる継代のために、コンフルエント細胞をPBSで洗浄し、トリプシン（TrypleSelect、Invitrogen）で剥離し、それぞれ10mlおよび25mlの新鮮培地＋添加物に入れて、それぞれ10cmディッシュおよび15cmディッシュに移した。
【００６０】
4．初代羊膜細胞のトランスフェクションおよび形質転換
初代羊膜細胞を、上述したプラスミドの異なる組み合わせのトランスフェクションによってトランスフェクトし、形質転換細胞株を単離し、導入遺伝子の発現について解析した。以下に、プラスミドpGS116およびpGS119を使ったhAAT発現細胞株の作製を詳しく説明する。他の細胞株も、以下に挙げる核酸の組み合わせを使って、同じ方法で作製した：
・pSTK146（Ad5配列nt.505-3522を含有する）およびpGS116（CMV-hAAT発現カセットを含有する）
・pGS119（Ad5配列nt.505-4079を含有する）およびpGS129（EF-1αhAAT発現カセットを含有する）
・pGS119およびpGS131（CAG hAAT発現カセットを含有する）
・pGS119およびpGS32（RSV hAAT発現カセットを含有する）
・pGS119およびpGS133（SV40 hAAT発現カセットを含有する）
・pGS119およびpGS123（CMV hAAT発現カセットおよびMAR配列を含有する）
・pGS122（Ad5配列nt.1-4344を含有する）およびpGS116（CMV hAAT発現カセット）
・pGS126（Ad5配列nt.505-4079およびCMV hAAT発現カセットを含有する）
・pGS119およびpGS127（CMV-Epo発現カセットを含有する）
・pGS124（T-Agを発現させる）およびpGS116。
【００６１】
トランスフェクションのために、pGS122を除く全てのプラスミドを、適切な制限エンドヌクレアーゼを使った消化により、トランスフェクション前に線状化した。pGS122中のアデノウイルス配列にはそれぞれ一つのPmeI制限部位が隣接しているので、プラスミドpGS122はトランスフェクション前にPmeIで消化した。二つのプラスミドをトランスフェクトする場合は、1μgの各プラスミドを使用し、プラスミドを一つだけトランスフェクトする場合（pGS126）は、2μgを使用した。全ての核酸の組み合わせで形質転換細胞クローンを取得することができ、単一クローンを単離し、試験することができた。形質転換細胞クローンの数は、細胞形質転換因子をコードする核酸分子としてどれを使用したかに依存した。したがって、驚くべきことに、また予想外なことに、pSTK146を使用するよりも、プラスミドpGS119を使用した場合の方が、有意に多くの形質転換細胞クローンが得られた。さらにまた、E1を細胞形質転換因子として有する核酸分子によるトランスフェクションは、SV40 T抗原を発現させる核酸分子（pGS124）によるトランスフェクションよりも有意に多くの形質転換細胞クローンをもたらした。そしてまた、組換えポリペプチドの発現は、使用したプロモーターに依存し、pGS133中のSV40プロモーターの使用が、最も低い発現率をもたらした。
【００６２】
以下、プラスミドpGS116およびpGS119を使ったhAAT発現細胞株の作製を、詳細に説明する。
【００６３】
トランスフェクションに先だって、羊膜細胞を、2％Ultroserを含むOpti-Pro培地に適応させた。この目的のために、新鮮なハムF10培地（添加物を含む）＋Opti-Pro培地（2％Ultroserを含む）を、75：25％、50：50％、25：75％および0：100％の比率で、2〜3日ごとに、細胞にスパイクした。
【００６４】
トランスフェクションのために、約80％コンフルエントの15cmディッシュの細胞を、5〜7×105細胞/ディッシュの細胞数に相当する6cmディッシュに分配した。翌日、5枚のディッシュ上の細胞に、1μgのpGS116およびpGS119（どちらもScaIで線状化したもの）を、トランスフェクション試薬Effectene（Qiagen）を製造者のプロトコールに従って使用することにより、トランスフェクトした。1枚のディッシュはトランスフェクションを行わず、対照として培養した。翌日、細胞をPBSで洗浄し、TrypleSelectで剥離し、15cmディッシュに移した。3〜4日ごとに培地を新鮮培地に交換しながら、細胞をさらに10〜15日間培養した。この期間中にUltroserを1％まで低下させた。約10〜15日後の時点で、細胞はコンフルエントであり、これを上述のように15cmディッシュに移した。
【００６５】
5．形質転換細胞クローンの単離
トランスフェクションの数週間後に、非形質転換羊膜細胞とは形態学的に著しく異なるクローン細胞島を観察することができた。これらの細胞島を拾い上げて、24ウェルディッシュに移した（第1継代に相当）。細胞をさらに増殖させ、最初は6cmディッシュに移し、その後は15cmディッシュに移した。
【００６６】
まず、約40個のクローンを単離した。それらの一部は、さらなる培養中に、互いに形態学的に著しく異なった。これらのクローンの一部は、長期間培養した場合には、顕著な「クライシス」を示した。すなわちそれらはその成長が極めて不安定だった。さらなる実験は、形態学的に安定な七つの細胞クローンのさらなる培養および解析に限定された。これらを次のように名付けた：2AI.2、2AI.3、2AI.6、2AI.12、2AI.15、2AI.17、2AI.18。
【００６７】
6．細胞株の特徴づけ
a）E1遺伝子の発現（ウェスタンブロット）
E1Aタンパク質およびE1B 21kDタンパク質の発現を、ウェスタンブロット解析により、モノクローナル抗体を使って、七つのクローン細胞株で検出した。
【００６８】
この目的のために、個々の細胞クローン7×105細胞を、それぞれ6ウェルディッシュに播種した。72時間後に細胞をTris-食塩水/4mM EDTAで剥離し、ペレット化し、100μlのTris-食塩水に再懸濁し、30μlの4×SDSローディング緩衝液（40％グリセロール、1.4Mメルカプトエタノール、8％SDS、250mM Tris/HCl pH7）を加えることによって溶解した。陰性対照として、同じ数の初代羊膜細胞から調製した溶解物を使用した。HEK293細胞の溶解物を陽性対照とした。これらのタンパク質混合物各10μlを、10％SDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動的に分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンに結合しているタンパク質は、化学発光（ECL、Amersham）により、それぞれ抗E1A抗体および抗E1B 21kD抗体（Oncogene Research）ならびにそれぞれHRPコンジュゲート抗マウス（E1A、Jackson ImmunoResearch Laboratories）および抗ラット（E1B 21kD、Oncogene Research）抗体と共にインキュベートしてからインキュベーションを行うことによって、可視化した。E1AおよびE1Bに関するウェスタンブロットの結果を図3に示す。この結果は、調べた細胞株の全てがE1Aタンパク質（30〜50kDにある3本のバンド）およびE1B 21kDタンパク質を発現させることを示した。
【００６９】
b）hAAT発現（ウェスタンブロット）
hAATの発現を、細胞内（クローン細胞株内）で、および分泌後（培地内）に、それぞれ、やはりウェスタンブロット解析により、モノクローナルhAAT特異抗体を使って検出した。この目的のために、単一細胞クローンの細胞7×105個をそれぞれ6ウェルディッシュに播種した。陰性対照として、初代羊膜細胞にpGS119だけをトランスフェクトすることによって作製した同じ細胞数の細胞クローンを使用した。以後のアッセイでは、ヒト血漿由来の精製hAAT 50ngを、陽性対照とした。
【００７０】
72時間後に細胞培養上清を取り除き、細胞をTris-食塩水/4mM EDTAで剥離し、ペレット化し、100μlのTris-食塩水に再懸濁し、30μlの4×SDSローディング緩衝液を加えることによって溶解した。細胞内hAATを検出するために、溶解した細胞のタンパク質混合物10μlを電気泳動的に分離し、モノクローナルhAAT抗体（ICN Biomedicals）およびHRPコンジュゲート抗ヤギ抗体（Pierce）を使用し、次に化学発光染色を行うことによって、可視化した。分泌されたhAATを検出するために、10μlの細胞培養培地に2×SDSローディング緩衝液をスパイクし、電気泳動的に分離し、上述のように検出した。
【００７１】
図4Aは細胞から培養上清に分泌されたhAATを示し、hAATの細胞内発現は図4Bに示されている。hAATの細胞内検出用の溶解物は、細胞培養上清とは異なり、約20倍濃縮されている。これは、hAATが細胞によって非常に効率よく分泌されることを意味する。
【００７２】
c）数継代にわたるhAAT発現の量および安定性（ELISA）
培地中に分泌されるhAATの量を、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）法を使って定量的に決定した。この目的のために、異なる細胞株の細胞7×105個をそれぞれ6ウェルディッシュに播種し、細胞培養上清を72時間後に取り出した。hAATの量をELISAにより、ポリクローナル抗hAAT抗体（非コンジュゲートまたはHRPコンジュゲート；ICN Biomedicals）を使って決定した。対照として、ヒト血漿（ICN Biomedicals）から精製したhAATを使用した。図5Aは、個々の細胞クローンの第5継代において発現された1細胞あたりのhAATの量を示す。選択した細胞クローンにおける発現の安定性を図5Bに示す。調べた細胞株は、約20継代の試験期間にわたって、常に、1細胞あたり0.2〜4pgのhAATを発現させる。
【００７３】
d）hAATの糖解析
hAATは糖タンパク質なので、個々の細胞クローンにおけるhATTの糖鎖付加の程度を調べた。この目的のために、細胞クローンを、前もって、Ultroserを含まないOpti-Pro培地に段階的に適応させた。これにより、細胞はもはや付着せず、懸濁状態で成長するようになる。培養上清に分泌されたhAATが糖鎖付加されているかどうかを調べるために、酵素ペプチド-N-グリコシダーゼF（PNGアーゼF）による消化を行った。この酵素は、アスパラギン残基に結合している（N結合型）糖残基を切り離して、タンパク質の分子量を減少させる。個々の細胞クローンの細胞培養上清22.5μlに2.5μlの変性緩衝液（10倍：5％SDS、10％β-メルカプトエタノール）をスパイクし、タンパク質を100℃で10分間変性させた。次に、3.5μlのG7反応緩衝液（10倍：500mMリン酸Na pH7.5）、3.5μlの10％NP-40および3μlのPNGアーゼF（New England Biolabs；500単位/μl）をタンパク質に加え、37℃で60分間インキュベートした。対照として、いずれの場合にも、ヒト血漿由来の精製hAAT 45ngを25μlのOpti-Pro培地中で上述のように変性させ、PNGアーゼFおよびH2Oをそれぞれスパイクした。次に、hAATの分子量の変化を、ウェスタンブロット解析により、モノクローナルhAAT特異抗体を使って、6b）で述べたように検出した。図6に、四つの異なる細胞クローン中で発現させたhAATおよびヒト血漿から精製したhAATをそれぞれPNGアーゼFで消化した後の分子量の変化を示す。これらの実験は、単一細胞クローン中で合成されたhAATが糖鎖付加されることを、明確に示している。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
後述の図面は本発明を図解するものである。
【００７５】
【図１】アデノウイルス血清型5のE1遺伝子機能およびウイルス構造タンパク質pIXを発現させるためのプラスミドpGS119の構築を模式的に示す図である。
【図２】サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの制御下でヒトアルファ1-アンチトリプシン（hAAT）のcDNAを発現させるためのプラスミドpGS116の構築を模式的に示す図である。
【図３】七つの異なるヒトアルファ1-アンチトリプシン用永久羊膜細胞系生産細胞株におけるAd5のE1AおよびE1Bタンパク質の発現に関するウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図４】七つの異なる永久羊膜細胞系生産細胞株におけるヒトアルファ1-アンチトリプシン（hAAT）の発現に関するウェスタンブロットの結果を示す図である。A、細胞から培養上清中に分泌されたhAAT；B、細胞内hAAT。
【図５】選ばれた生産細胞株により培養上清中に発現されたヒトアルファ1-アンチトリプシン（hAAT）の量を模式的に示す図である（ELISA、酵素結合免疫吸着アッセイ）。A、個々の細胞クローンの第5継代におけるhAATの量；B、選ばれた細胞クローンの数継代にわたる発現の安定性。
【図６】羊膜細胞系生産細胞株から得られるヒトアルファ1-アンチトリプシン（hAAT）の糖鎖付加に関するウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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