(57)【要約】  核酸の融解曲線遺伝子型決定分析のためのシステム及び方法が提供される。融解曲線は、試料の蛍光を温度の関数としてプロットすることにより生成される。例示的な１つの実施例では、指数関数アルゴリズムを用いて、生成した融解曲線からバックグラウンドを除去し、これによって他の融解曲線に対する比較分析を行う。付加的な例示的実施例では、２つ又はそれ以上の融解曲線の間の差分値を測定し、提供された試料核酸の遺伝子型をクラスタリングする。【選択図】図１Ａ
2009508530.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料の融解プロファイルを分析するための方法であって、
核酸と、該核酸を結合して蛍光的に検出可能な複合体を形成する分子とを含む前記核酸試料の蛍光を温度の関数として測定して、バックグラウンド蛍光信号及び核酸試料信号を含む生の融解曲線を生成する段階と、
指数関数アルゴリズムを用いることにより前記核酸試料信号から前記バックグラウンド信号を分離し、前記核酸試料信号を含む補正融解曲線を生成する段階と、
を含む方法。
【請求項２】
試料核酸融解が生じていない前記生の融解曲線上の点から取られた第１及び第２の勾配値を用いて、前記指数関数アルゴリズムを導くことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バックグラウンド蛍光信号が、減少指数関数をバックグラウンド蛍光対温度曲線にフィットすることにより算出され、前記減少指数関数が、前記核酸融解遷移前の点から取られた第１の勾配値と前記核酸融解遷移後の点から取られた第２の勾配値とから導かれる、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記バックグラウンド信号を前記試料信号から分離する段階が、
前記試料融解によって生じたものではない前記生の融解曲線の領域から得られた、前記生の融解曲線又はその微分関数の第１の勾配値及び第２の勾配値を測定する段階と、
前記第１の値及び前記第２の値を用いてバックグラウンド雑音を表す指数関数を求める段階と、
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
差分値機能を実施して、前記補正融解曲線と第２の核酸試料の補正融解曲線との間の差分値を識別する段階を更に含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
複数の付加的な核酸試料の遺伝子型をクラスタ化する段階を更に含み、
前記クラスタ化段階が、別個のクラスタの前記試料融解プロファイル間の最小距離を関連付けることにより動的に行うことを特徴とする、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記指数的バックグラウンド信号が、方程式
ｅa(TR-TL)＝Ｂ’（ＴR）／Ｂ’（ＴL）
（ここで、
2009508530.tif 000005
Ｂ’（ＴL）は第１の勾配値、
Ｂ’（ＴR）は第２の勾配値）
を用いて計算され、
前記減算段階が、方程式
Ｍ（Ｔ）＝Ｆ（Ｔ）−Ｃｅa(T-TL)
（ここで、
Ｍ（Ｔ）は核酸試料信号、
Ｆ（Ｔ）は生の融解曲線、
Ｃ＝Ｂ’（ＴL）／ａ）
を用いる段階を含む、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸試料が、ＰＣＲ反応の２本鎖産物である、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸試料は、既知の配列変異について遺伝子型が決定され、未知の配列変異について走査される、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記融解プロファイルが、ＰＣＲ産物及び非ラベル化プローブの両方に対する融解遷移を含む、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が多重単位複製配列を含む、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
１つ又はそれ以上の配列バリアントが、前記核酸内に存在することができ、前記バリアントは、前記融解曲線又はその微分関数から識別される、
ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料の補正融解曲線及び第２の試料の補正融解曲線に対して、単一のデータ点を必要とする曲線オーバーレイ機能を実施する段階を更に含む、
ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記差分値機能が、方程式：ｆ1（Ｔ）−ｆ2（Ｔ）＝ｍａｘ｛√（１＋ｆ1’（Ｔ）2）、√（１＋ｆ2’（Ｔ）2）｝を用いることにより、前記補正融解曲線と前記第２の試料の補正融解曲線との間の直角距離を近似する、
ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記差分値機能が、前記補正融解曲線及び前記第２の試料の補正融解曲線の融解領域に対する過剰強調を補償する、
ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
前記差分値機能が、前記補正融解曲線及び前記２の試料の補正融解曲線の主要融解領域の過小強調を補償する、
ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＣＲ反応が、非対称で、第２の産物鎖よりも第１の産物鎖を多く生成し、前記ＰＣＲが、前記第１の産物鎖にハイブリダイズするように構成された非ラベル化プローブ存在下で行われる、
ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
前記差分値機能が、前記第１の試料の融解曲線と前記第２の試料の融解曲線との間の配列依存変異を反映する差分メトリックを生成する、
ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記差分値機能が、前記第１の試料に対応する遺伝子型と、前記第２の試料に対応する遺伝子型とを識別する、
ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記バックグラウンド信号が、減少指数関数を生の蛍光対温度曲線の勾配にフィットすることにより算出され、前記減少指数関数が、試料融解が生じていない前記融解曲線プロファイル上に位置する少なくとも２つの勾配値により前記融解曲線プロファイルにフィットされる、
ことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
核酸試料の遺伝子型をクラスタ化する段階を更に含み、
前記クラスタ化段階が、別個のクラスタの試料融解曲線間の最小距離を関連付けることにより動的に行うことを特徴とする、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
核酸試料を分析するためのシステムであって、
試料温度の関数として試料蛍光を決定するため前記試料温度及び試料蛍光を測定及び記録してバックグラウンド蛍光信号及び試料蛍光信号を含む融解プロファイルを生成するように適合された、核酸及び蛍光種を含む蛍光的に検出可能な複合体をその蛍光を監視しながら加熱するための高解像度融解器具と、
コンピュータ実行可能な命令を実施するための中央処理ユニット（ＣＰＵ）と、
前記ＣＰＵによって実行されたときに、配列変異について前記核酸を分析する処理を前記ＣＰＵに行わせるコンピュータ実行可能な命令を記憶するためのメモリ記憶装置と、
を備え、
前記処理が、指数関数アルゴリズムを用いて前記融解プロファイルからバックグラウンド蛍光信号を分離して、試料信号を有する補正融解曲線を生成する段階を含む、
ことを特徴とするシステム。
【請求項２３】
前記ＣＰＵが、２本鎖核酸試料の遺伝子型決定するためのプログラムを実行する、
ことを特徴とする請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
前記バックグラウンド蛍光信号が、減少指数関数をバックグラウンド蛍光対温度曲線の勾配にフィットすることにより算出され、前記減少指数関数が、試料融解が生じていない前記融解プロファイルから取られた少なくとも２つの勾配値から導かれる、
ことを特徴とする請求項２２に記載のシステム。
【請求項２５】
前記試料信号から前記バックグラウンド蛍光信号を分離する段階が、
試料融解によって生じたものではない前記融解プロファイルの領域から各々得られた前記融解プロファイルの第１の勾配値及び第２の勾配値を測定する段階と、
前記融解プロファイルのＴｍよりも高い温度の点から取られた前記第１の勾配値及び前記第２の勾配値を用いてバックグラウンド蛍光を表す指数関数を求める段階と、
を含む、
ことを特徴とする請求項２２に記載のシステム。
【請求項２６】
差分値機能を実施して、前記補正試料融解曲線と第２の補正試料融解曲線との間の差分値を識別する段階を更に含み、
前記バックグラウンド蛍光が、前記第１の補正試料融解曲線及び前記第２の補正試料融解曲線から以前に分離されていたものである、
ことを特徴とする請求項２２に記載のシステム。
【請求項２７】
前記バックグラウンド信号が、減少指数関数をバックグラウンド蛍光対温度曲線にフィットすることにより算出され、前記減少指数関数が、試料融解が生じていない前記融解プロファイル上に位置する少なくとも２つの勾配値により前記融解プロファイルにフィットされる、
ことを特徴とする請求項２２に記載のシステム。
【請求項２８】
前記核酸試料がＰＣＲ反応の２本鎖産物であり、前記複合体が、前記ＰＣＲ反応の産物の第１の鎖と非ラベル化プローブとを含む、
ことを特徴とする請求項２２に記載のシステム。
【請求項２９】
複数の核酸試料の遺伝子型をクラスタ化する段階を更に含み、
前記クラスタ化段階が、別個のクラスタの前記試料融解曲線間の最小距離を関連付けることにより動的に行うことを特徴とする、
請求項２２に記載のシステム。
【請求項３０】
前記システムが、前記試料融解プロファイル及び遺伝子型を単一の閉鎖型反応器において分析するように構成されている、
ことを特徴とする請求項２２に記載のシステム。
【請求項３１】
前記核酸試料が２本鎖核酸である、
ことを特徴とする請求項２２に記載のシステム。
【請求項３２】
前記システムが、既知の突然変異体の遺伝子型を決定し、未知の突然変異体を走査するように構成されている、
ことを特徴とする請求項２２に記載のシステム。
【請求項３３】
前記融解プロファイルが、ＰＣＲ産物及び非ラベル化プローブの両方についての融解遷移を含む、
ことを特徴とする請求項２２に記載のシステム。
【請求項３４】
前記試料が多重単位複製配列を含む、
ことを特徴とする請求項２２に記載のシステム。
【請求項３５】
前記核酸において１つ又はそれ以上の配列バリアントが存在することができ、前記バリアントが、前記第２の融解曲線又はその微分関数から識別される、
ことを特徴とする請求項２３に記載のシステム。
【請求項３６】
前記差分値機能が、方程式：
ｔ，（Ｔ）−ｆ2（Ｔ）／ｍａｘ｛√（１＋ｆ，／（Ｔ）2），√（１＋ｆ2／（Ｔ）2）｝
を用いることにより、前記補正試料融解曲線と前記第２の補正試料融解曲線との間の直角方向距離を近似する、
ことを特徴とする請求項２６に記載のシステム。
【請求項３７】
前記差分値機能が、前記補正試料融解曲線及び前記第２の補正試料融解曲線の融解領域に対する過剰強調を補償する、
ことを特徴とする請求項２６に記載のシステム。
【請求項３８】
前記差分値機能が、前記補正試料融解曲線及び前記第２の補正試料融解曲線の主要融解領域の過小強調を補償する、
ことを特徴とする請求項２６に記載のシステム。
【請求項３９】
前記ＣＰＵが、前記補正試料融解曲線及び前記第２の補正試料融解曲線に対し曲線オーバーレイ機能を実施し、前記曲線オーバーレイ機能が単一のデータ点を必要とし、前記曲線オーバーレイ機能が、試料融解曲線間を識別可能な特徴を生成する、
ことを特徴とする請求項２６に記載のシステム。
【請求項４０】
前記指数的バックグラウンド信号が、方程式
ｅa(TR-TL)＝Ｂ’（ＴR）／Ｂ’（ＴL）
（ここで、
2009508530.tif 000006
Ｂ’（ＴL）は第１の勾配値、
Ｂ’（ＴR）は第２の勾配値）
を用いて計算され、
前記減算段階が、方程式
Ｍ（Ｔ）＝Ｆ（Ｔ）−Ｃｅa(T-TL)
（ここで、
Ｍ（Ｔ）は試料信号、
Ｆ（Ｔ）は融解曲線プロファイル、
Ｃ＝Ｂ’（ＴL）／ａ）
を用いる段階を含む、
ことを特徴とする請求項２５に記載のシステム。
【請求項４１】
前記ＣＰＵが、複数の２本鎖核酸試料の遺伝子型のクラスタ化を実施し、前記クラスタ化が、別個の遺伝子型クラスタの前記試料の融解曲線間の最小距離を関連付けることにより動的に行う、
ことを特徴とする請求項２５に記載のシステム。
【請求項４２】
前記差分値機能が、前記補正試料融解曲線と前記第２の補正試料融解曲線との間の配列依存変異を反映する差分メトリックを生成する、
ことを特徴とする請求項３７に記載のシステム。
【請求項４３】
前記ＰＣＲ反応が非対称であり、第２の鎖よりも前記第１の鎖を多く生成する、
ことを特徴とする請求項２９に記載のシステム。
【請求項４４】
指数的バックグラウンド信号方程式と試料信号との合計である信号関数を有するデータセットを分析する方法であって、
信号の全ての変化が前記指数的バックグラウンド信号に起因する前記信号関数の２つの領域から第１及び第２の勾配値を識別する段階と、
前記勾配値を用いて前記指数的バックグラウンド信号方程式を算出する段階と、
前記信号関数から前記指数的バックグラウンド信号方程式を減算して前記試料信号を識別する段階と、
を含む方法。
【請求項４５】
前記指数的バックグラウンド信号が、方程式
ｅa(TR-TL)＝Ｂ’（ＴR）／Ｂ’（ＴL）
（ここで、
2009508530.tif 000007
Ｂ’（ＴL）は第１の勾配値、
Ｂ’（ＴR）は第２の勾配値）
を用いて計算され、
前記減算段階が、方程式
Ｍ（Ｔ）＝Ｆ（Ｔ）−Ｃｅa(T-TL)
（ここで、
Ｍ（Ｔ）は試料信号、
Ｆ（Ｔ）は信号関数、
Ｃ＝Ｂ’（ＴL）／ａ）
を用いる段階を含む、
ことを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記データセットが核酸融解曲線である、
ことを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記試料が、既知の変異について遺伝子型が決定され、未知の変異について走査される、
ことを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記核酸融解曲線が、非ラベル化プローブの融解を含む、
ことを特徴とする請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記核酸融解曲線が、短い単位複製配列融解を含む、
ことを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
融解プロットの各々に対し、指数的バックグラウンド減算、曲線オーバーレイ機能、差分値プロット機能、及びクラスタリング機能から成る群から選択されるアルゴリズムを受けさせる段階を含む複数の融解プロットを分析する方法。
【請求項５１】
前記アルゴリズムが前記指数的バックグラウンド減算であり、前記指数的バックグラウンド減算が、
方程式
ｅa(TR-TL)＝Ｂ’（ＴR）／Ｂ’（ＴL）
（ここで、
2009508530.tif 000008
Ｂ’（ＴL）は第１の勾配値、
Ｂ’（ＴR）は第２の勾配値）
を用いて計算され、
前記減算段階が、方程式
Ｍ（Ｔ）＝Ｆ（Ｔ）−Ｃｅa(T-TL)
（ここで、
Ｍ（Ｔ）は試料信号、
Ｆ（Ｔ）は信号関数、
Ｃ＝Ｂ’（ＴL）／ａ）
を用いる段階を含む、
ことを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記アルゴリズムが前記曲線オーバーレイ機能であり、前記複数の融解プロットが、方程式
2009508530.tif 000009
（ここで、ｆ（ｚ）及びｇ（ｚ）は、２つの正規化蛍光値の間の切片を表し、ｃは、平均差分（ｘ1（ｙ）＋ｃ）−ｘ2（ｙ）をゼロに等しくなるようにする定数である）
を用いることによりシフトされる、
ことを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記アルゴリズムが前記差分値プロット機能であり、前記複数の融解プロットの第１の融解プロットと第２の融解プロットとの間の差分が、ｆ1（Ｔ）−ｆ2（Ｔ）＝ｍａｘ｛√（１＋ｆ1’（Ｔ）2），√（１＋ｆ2’（Ｔ）2）｝を用いて近似される、
ことを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記アルゴリズムが前記クラスタリング機能であり、前記クラスタリング機能が、数学的表現
ｍｉｎ＿｛ｆ1εＣ1，ｆ2εＣ2｝
（ここで、｜｜ｆ１−ｆ２｜｜であり、更に、ｆ1は、サブクラスタＣ1に関連する融解曲線を表す）
を有する、
ことを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記アルゴリズムが前記指数的バックグラウンド減算であり、前記方法が、
前記曲線オーバーレイ機能、前記差分値プロット機能、及び前記クラスタリング機能を実施する段階を更に含む、
ことを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００５年９月２０日に出願された名称「Ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｃｕｒｖｅ  ｏｆ  ａ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（２本鎖ヌクレオチドの融解曲線からのバックグラウンドの除去）」の米国特許仮出願番号６０／７１９，２５０号に対する尾根器を主張し、これは引用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、一般に、核酸融解曲線分析に関する。更に詳細には、本発明の種々の実施形態は、バックグラウンド蛍光信号を除去することによる２本鎖核酸の融解プロファイルを分析するための方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡ配列の変異を分析するための方法は、２つの一般的なカテゴリに分けることができ、即ち、１）既知の配列バリアントの遺伝子型を決定すること、及び２）未知のバリアントを走査することである。既知の配列バリアントの遺伝子型を決定するには多くの方法があり、蛍光プローブを用いる単一段階の均質な閉管法が利用可能である（Ｌａｙ  Ｍ  Ｊら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ  １９９７年；第４３巻：２２６２〜７頁）。これと対照的に、未知のバリアントのための殆どの走査技術では、ＰＣＲ後にゲル電気泳動又はカラム分離が必要である。これらには、１本鎖高次構造多型性（Ｏｒｉｔａ  Ｏら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９８９年第８６巻２７６６〜７０頁）、ヘテロ二重鎖移動（Ｎａｔａｒａｊ  Ａ  Ｊら、電気泳動、１９９９年；第２０巻：１１７７〜８５頁）、変性勾配ゲル電気泳動（Ａｂｒａｍｓ  Ｅ  Ｓら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１９９０年；第７巻：４６３〜７５頁）、温度勾配ゲル電気泳動（Ｗａｒｔｅｌｌ  Ｒ  Ｍら、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ、１９９８年；第８０６巻：１６９〜８５頁）、酵素又は化学開裂方法（Ｔａｙｌｏｒ  Ｇ  Ｒら、Ｇｅｎｅｔ  Ａｎａｌ、１９９９年；第１４巻：１８１〜６頁）、並びにＤＮＡ配列決定が含まれる。また、配列決定により新しい変異体を識別する段階には、ＰＣＲ後に複数の段階、即ち繰り返し配列決定及びゲル電気泳動が必要である。変性高速液体クロマトグラフィー（Ｘｉａｏ  Ｗら、Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ、２００１年；第１７巻：４３９〜７４頁）は、ＰＣＲ産物をカラムに注入する段階を含む。
【０００４】
一塩基多型性（ＳＮＰ）は、ヒト及び他の種で観察される極めて一般的な遺伝子変異である。これらの多型性では、単一の塩基のみが個体間で異なっている。この変化により、タンパク中のアミノ酸が変化し、転写速度が変わり、ｍＲＮＡスプライシング（ｓｐｉｃｉｎｇ）に影響を及ぼす可能性があるが、又は細胞プロセスへの作用は明らかではないこともある。場合酔っては、変化がサイレントであるとき（例えば、それがコードするアミノ酸が変化しないとき）に、この変化が、別の遺伝子変化により引き起こされる固有の表現型に関連する（付随する）場合には、ＳＮＰ遺伝子型の決定は、依然として有用とすることができる。
【０００５】
ＳＮＰの遺伝子型を決定するための多くの方法がある。殆どは、ＰＣＲ又は他の増幅技術を用いて、関心のあるテンプレートを増幅する。同時又は連続分析技術を用いることもでき、これには、ゲル電気泳動、質量分析法、及び蛍光法が含まれる。均質であり、増幅開始後に試薬を付加することも分析のために反応の物理的サンプリングも必要ではない蛍光技術が魅力的である。例示的な均質な技術では、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、信号生成のために関心のある領域及び蛍光のラベル又は染料を位置決めする。種々のＰＣＲベースの方法は、完全に閉管されており、ＤＮＡ変性温度まで安定な耐熱酵素を用いて、加熱開始後に、何も添加が必要でないようにされる。
【０００６】
ＳＮＰの遺伝子型を決定するためには、幾つかの閉管された均質な蛍光ＰＣＲ法が利用可能である。これには、２つの相互作用する発色団を備えるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブ（隣接するハイブリダイゼーションプローブ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ）、１つの蛍光体のみを備える単一のオリゴヌクレオチドプローブ（Ｇ−クエンチングプローブ、Ｃｒｏｃｋｅｔｔ，Ａ．Ｏ．及びＣ．Ｔ．Ｗｉｔｔｗｅｒ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１年；第２９０巻：８９〜９７頁、及びＳｉｍｐｌｅ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用する系、並びに共有結合で蛍光ラベルしたオリゴヌクレオチドプローブの代わりにｄｓＤＮＡ染料を用いる技術が含まれる。
【０００７】
ＤＮＡがｄｓＤＮＡ蛍光染料で融解することを監視するＰＣＲ法は、実時間ＰＣＲと併せて普及してきた。ＰＣＲでは、蛍光融解分析に十分なＤＮＡを生成するので、増幅及び分析の両方は、同じ管内で行うことができ、処理又は分離段階を必要としない均質な閉管システムが提供される。ｄｓＤＮＡ染料は、その融解温度、すなわちＴｍにより産物を識別するのに一般に用いられる。
【０００８】
ＤＮＡ融解分析の出力は、その解像度によって決まる。ＵＶ吸収を用いた研究は、確実に平衡状態にするために、０．１〜１．０°Ｃ／分の速度で高解像度データを収集するのに何時間もかかる場合が多い。これとは対照的に、蛍光の融解分析は、０．１〜１．０°Ｃ／秒で取得され、解像度は、２〜４ポイント／°Ｃに制限される。近年の電子工学の進歩により（例えば、２４ビットアナログデジタルコンバータ）、高解像度融解は、プローブ及びＰＣＲ産物融解に対して最近実証されたように、従来の実時間ＰＣＲ機器のデータ密度（５０〜１００ポイント／°Ｃ）の１０〜１００倍で高速に行うことができる。更に、現在では、不適切に組み合わせられた二重鎖（ヘテロ二重鎖）の検出が最大になるＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ（ユタ州ソルトレイクシティＩｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のような飽和ＤＮＡ染料（ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｄｙｅｓ）が利用可能である（例えば、引用により全体が本明細書に組み入れた米国特許公開番号第２００５／０２３３３３５号及び第２００６／００１９２５３号を参照）。これら２つが開発されたことにより、ＰＣＲ産物中の単一ベースの変化をロバストに識別するための蛍光ベースのＤＮＡ融解の出力が劇的に増大する。
【０００９】
遺伝子走査のための高解像度融解分析は、主に、ＰＣＲ産物の融解遷移の形状に依存する。最大１，０００ｂｐまでの産物中のヘテロ接合性の一塩基多型性（ＳＮＰ）をスクリーニングするのに利用可能な方法は、それぞれ９７％及び９９％の感受性及び特異性を有する。多くの場合において、融解遷移が高解像度分析されると、プローブを用いずに遺伝子型決定することも可能になる。非ラベル化プローブを用いることにより、小さな領域にわたるバリアント区別のための更に大きな特異性を得ることができる。特定の遺伝子型は、プローブＴｍの変化に対するプローブ下の相関する配列変化により推測される。近年の染料及び機器の進歩により、非ラベル化プローブで高解像度遺伝子査及び遺伝子型決定を行う段階は、任意選択的に、同じ反応で同時に行うことができる。飽和ＤＮＡ染料が存在する場合には、ＰＣＲ産物及びプローブ融解遷移の両方を観察することができる。ＰＣＲ産物中のプライマー間のあらゆる配列バリアントをスクリーニングすることに加えて、共通の多型性及び変異体の遺伝子型を決定することができる。更に、不偏性の階層的クラスタ化により、融解曲線を遺伝子型に正確に分類することができる。単一のＰＣＲにおいて、１つ、２つ、又は場合によってはそれ以上の非ラベル化プローブを用いることができる。
【００１０】
遺伝子型決定及び走査を同時に行う場合には、産物融解分析により、２つのプライマーの間の何れかの地点の配列バリアントを検出すると共に、プローブ融解分析により、プローブ下のバリアントが識別される。配列バリアントがプライマー間で且つプローブ下に存在する場合には、バリアントが存在することとその遺伝子型の両方が得られる。産物融解でバリアントが示されるが、プローブでは示されない場合には、変異は、プライマー間で起こるが、プローブ下では発生しない可能性が高く、遺伝子型を決定するために更に分析が必要である。プローブは、大抵の場合には、産物走査が陽性であれば、プローブが配列バリアントを識別することになるように、一般的な配列変異の部位に配置され、配列決定の必要性を大幅に低減させることができる。１つのプローブの場合には、ＳＮＰの遺伝子型は、ＰＣＲ産物及びプローブ融解の両方により確立することができる。２つのプローブの場合には、配列の２つの別個の領域に遺伝子型があるかが識別され、ＰＣＲ産物の残りは、稀な配列バリアントを走査することができる。融解温度が違う場合及び各アリルがプローブ及び／又は産物融解の独自のパターンを示す場合には、複数のプローブを用いることができる。
【００１１】
１つの例示的な実施例では、母集団は、嚢胞性線維症変異体をスクリーニングされる。白人の僅か３．８％が嚢胞性線維症保因者であるので、完全に（エクソン及びスプライシング部位）配列決定することにより無作為にスクリーニングされた個体の９６．２％は陰性であることが期待されることになる。２７のエクソンでは、配列決定を実施して陽性であることが期待されるパーセントは、０．１４％未満である。即ち、１０００回配列決定を実施して約１回しか有用であることにならない。これが、嚢胞性線維症のスクリーニングに配列決定が推奨されない理由である。その代わりに、嚢胞性線維症アリルの８３．７％が検出される選択された変異パネルが通常行われる。
【００１２】
或いは、高解像度融解により嚢胞性線維症スクリーニングのために同時に走査及び遺伝子型決定することを考える。単位複製配列の長さが４００ｂｐ未満に維持される場合には、高解像度走査の感受性は、１００．０％に近づく。共通変異体及び多型性が、同じ反応で非ラベル化プローブを用いて分析される場合には、変異体の約８０％はまた、遺伝子型決定されることになる。新規の配列決定によりスクリーニングすることに比べて、配列決定の負担は９９．９７％減少させることができる。
【００１３】
融解分析を用いる閉管遺伝子型決定法は、予期しないバリアントを走査する能力を有する。また、融解方法では、分析する各アリルに対して１つのプローブが必要とされるアリル特異的方法よりも、複雑さが少なくより少ないプローブが用いられる。Ｔｍ又は曲線形状によりアリルを区別することは、蛍光色に対する興味深い選択肢である。一般に、２本鎖ＤＮＡを染色する染料は、簡単で安価であるため魅力的である。単位複製配列融解による遺伝子型決定の信頼性には議論の余地があるが、近年の研究で、試験した２１のヘテロ二重鎖対のうち２１が小さな単位複製配列の高解像度融解により区別可能であることが見出された（Ｇｒａｈａｍ  Ｒ、Ｌｉｅｗ  Ｍ、Ｍｅａｄｏｗｓ  Ｃ、Ｌｙｏｎ  Ｅ、Ｗｉｔｔｗｅｒ  ＣＴ．高解像度融解による異なるＤＮＡヘテロ接合体の区別。Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、２００５年；第５１巻）。
【００１４】
一般的な配列バリアントは、通常、同じ反応で１つ又はそれ以上の非ラベル化プローブを用いて遺伝子型決定することができるが、３つ以上のプローブ及び／又は逐次反応を用いることもできる。例えば、複数の重なったプローブにより、予期されない稀なバリアントを１つのプローブによりカバーされる領域内に位置決めすることができる。付加的なプローブは、変異の正確な位置及び配列を識別するように設計することができる。しかしながら、ＤＮＡ配列決定は、特に増幅された領域が高度に可変性である場合には、新しくこれまで未知であった変異を識別するための更に直接的な方法である。それでも、大部分の遺伝子分析では、増幅された野生型配列が既知であり、可能性のある一般的なバリアントは限定される。この場合には、走査及び遺伝子型決定は、単純（ｓｉｍｐｌｅ）オリゴヌクレオチドをＤＮＡ融解することにより１段階で行うことができる。蛍光プローブも分離（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）も必要ではなく、増幅（１５分）及び融解分析（１〜２分）の両方を高速にすることができる。
【００１５】
上に論じたように、同時遺伝子型決定及び走査、並びに融解分析を用いる他の遺伝子型決定技術は、有望な研究領域である。しかしながら、融解曲線分析は、高解像度が可能となる前には、特異性及び正確性に欠けるものであった。高解像度融解曲線分析の出現で、バックグラウンド蛍光雑音により、融解曲線を用いて正確にＳＮＰの遺伝子型を決定し、配列変異を検出し、変異体を検出するのが妨げられる可能性がある。単位複製配列によっては、以前のバックグラウンド蛍光除去技術では、誤った呼び出しに到ることもあった。例えば、基線法では、融解曲線を正規化してバックグラウンド蛍光を除去する方法として線形外挿法を用いる。この技術は、ラベル化プローブで良好に働く。しかしながら、これ及び他の先に示した正規化技術は、非ラベル化プローブ（Ｚｈｏｕ  Ｌ、Ｍｙｅｒｓ  ＡＮ、Ｖａｎｄｅｒｓｔｅｅｎ  ＪＧ、Ｗａｎｇ  Ｌ、Ｗｉｔｔｗｅｒ  ＣＴ。非ラベル化オリゴヌクレオチドプローブ及び飽和ＤＮＡ染料を用いる閉管遺伝子型決定。Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２００４年；第５０巻：１３２８〜３５頁）、多重小単位複製配列融解（Ｌｉｅｗ  Ｍ、Ｎｅｌｓｏｎ  Ｌ、Ｍａｒｇｒａｆ  Ｒ、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｓ、Ｅｒａｌｉ  Ｍ、Ｍａｏ  Ｒ、Ｌｙｏｎ  Ｅ、Ｗｉｔｔｗｅｒ  ＣＴ。高解像度単位複製配列融解及び従来のハイブリダイゼーションプローブによるヒト血小板抗原１〜６及び１５の遺伝子型決定。Ｊ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇ、２００６年；第８巻：９７〜１０４頁）、及び単位複製配列及び非ラベル化プローブ融解の組み合わせ（Ｚｈｏｕ  Ｌ、Ｗａｎｇ  Ｌ、Ｐａｌａｉｓ  Ｒ、Ｐｒｙｏｒ  Ｒ、Ｗｉｔｔｗｅｒ  ＣＴ。溶液中での同時変異体走査及び遺伝子型決定のための高解像度融解分析。Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、２００５年；第５１巻：１７７０〜７頁、引用により本明細書に組み入れられる）では同様には良好に働かず、小単位複製配列でもうまく働かない。少なくとも部分的には、これは、非ラベル化プローブ及び小単位複製配列融解方法では、標準単位複製配列融解に一般的である８０〜９５°Ｃの温度よりも低温（４０〜８０°Ｃ）でのバックグラウンド減算が必要であることが多いためである。これらの低温では、低温基線は直線でなくて曲線であり、低温で蛍光が急速に増大する。線形外挿法を用いる場合には、ラインは、融解遷移が完了する前に交差する可能性があり、これが起こると、従来の技術は、部分的に絶対蛍光に関する数学的信頼性に起因して、融解曲線分析のための最も正確な手段とはならない。
【００１６】
高解像度融解プロファイル技術を用いることにより、２本鎖核酸内で極めて正確にＳＮＰの遺伝子型決定、配列変異検出、及び／又は変異体検出を行うことがシステム及び方法にとって有利となる。バックグラウンド蛍光を２本鎖核酸試料融解プロファイルから自動的且つ正確に分離することができる場合には更に有利となる。システム及び方法が、小及び大単位複製配列に対して、並びに非ラベル化プローブを用いて正確に融解曲線分析を行う場合には更に有利になる。
【００１７】
【特許文献１】米国特許仮出願番号６０／７１９，２５０号公報
【特許文献２】米国特許公開番号第２００５／０２３３３３５号公報
【特許文献３】米国特許公開番号第２００６／００１９２５３号公報
【非特許文献１】Ｌａｙ  Ｍ  Ｊら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ１９９７年第４３巻２２６２〜７頁
【非特許文献２】Ｏｒｉｔａ  Ｏら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９８９年第８６巻２７６６〜７０頁
【非特許文献３】Ｎａｔａｒａｊ  Ａ  Ｊら、電気泳動、１９９９年第２０巻１１７７〜８５頁
【非特許文献４】Ａｂｒａｍｓ  Ｅ  Ｓら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１９９０年第７巻４６３〜７５頁
【非特許文献５】Ｗａｒｔｅｌｌ  Ｒ  Ｍら、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ、１９９８年第８０６巻１６９〜８５頁
【非特許文献６】Ｔａｙｌｏｒ  Ｇ  Ｒら、Ｇｅｎｅｔ  Ａｎａｌ、１９９９年第１４巻１８１〜６頁
【非特許文献７】Ｘｉａｏ  Ｗら、Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ、２００１年第１７巻４３９〜７４頁
【非特許文献８】Ｃｒｏｃｋｅｔｔ，Ａ．Ｏ．とＣ．Ｔ．Ｗｉｔｔｗｅｒ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１年第２９０巻８９〜９７頁
【非特許文献９】Ｇｒａｈａｍ  Ｒ、Ｌｉｅｗ  Ｍ、Ｍｅａｄｏｗｓ  Ｃ、Ｌｙｏｎ  Ｅ、Ｗｉｔｔｗｅｒ  ＣＴ．高解像度融解による異なるＤＮＡヘテロ接合体の区別。Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、２００５年第５１巻
【非特許文献１０】Ｚｈｏｕ  Ｌ、Ｍｙｅｒｓ  ＡＮ、Ｖａｎｄｅｒｓｔｅｅｎ  ＪＧ、Ｗａｎｇ  Ｌ、Ｗｉｔｔｗｅｒ  ＣＴ。非ラベル化オリゴヌクレオチドプローブ及び飽和ＤＮＡ染料を用いる閉管遺伝子型決定。Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２００４年第５０巻１３２８〜３５頁
【非特許文献１１】Ｌｉｅｗ  Ｍ、Ｎｅｌｓｏｎ  Ｌ、Ｍａｒｇｒａｆ  Ｒ、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｓ、Ｅｒａｌｉ  Ｍ、Ｍａｏ  Ｒ、Ｌｙｏｎ  Ｅ、Ｗｉｔｔｗｅｒ  ＣＴ。高解像度単位複製配列融解及び従来のハイブリダイゼーションプローブによるヒト血小板抗原１〜６及び１５の遺伝子型決定。Ｊ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇ、２００６年第８巻９７〜１０４頁
【非特許文献１２】Ｚｈｏｕ  Ｌ、Ｗａｎｇ  Ｌ、Ｐａｌａｉｓ  Ｒ、Ｐｒｙｏｒ  Ｒ、Ｗｉｔｔｗｅｒ  ＣＴ。溶液中での同時変異体走査及び遺伝子型決定のための高解像度融解分析。Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、２００５年第５１巻１７７０〜７頁
【発明の開示】
【００１８】
本発明の１つの態様では、核酸試料の融解プロファイルを分析する方法が提供される。本方法は、温度の関数として試料の蛍光を測定し、生の融解曲線を生成する段階を含み、ここで試料は、核酸と、該核酸を結合して蛍光的に検出可能な複合体を形成する分子とを含む。生の融解曲線は、バックグラウンド蛍光信号及び核酸試料信号を含む。また本方法は、指数関数アルゴリズムを用いることにより核酸試料信号からバックグラウンド信号を分離し、これによって補正融解曲線を生成する段階を含む。補正融解曲線は核酸試料信号を含む。
【００１９】
本発明の別の態様では、核酸試料を分析するためのシステムが提供される。本システムは、蛍光を監視しながら蛍光的に検出可能な複合体を加熱するための高解像度融解器具を含む。複合体は、核酸及び蛍光種を含み、融解器具は、試料温度の関数として試料蛍光を決定するため試料温度及び試料蛍光を測定及び記録して、融解プロファイルを生成するように適合される。融解プロファイルは、バックグラウンド蛍光信号及び試料蛍光信号を含む。また本システムは、コンピュータ実行可能な命令を実施するための中央処理ユニット（ＣＰＵ）と、コンピュータ実行可能な命令を記憶するためのメモリ記憶装置とを含む。ＣＰＵによって命令が実行されたときに、核酸の配列変異を分析する処理を該ＣＰＵに対して行わせる。処理は、指数アルゴリズムを用いて融解プロファイルからバックグラウンド蛍光信号を分離し、補正融解曲線を生成する段階を含む。補正融解曲線は試料信号を含む。
【００２０】
本発明の更に別の態様では、データセットを分析する方法が提供される。当該データセットは、指数的バックグラウンド信号方程式と試料信号との合計である信号関数を含み、本方法は、信号関数の２つの領域から第１及び第２の勾配値を識別する段階を含み、信号の全ての変化は、指数的バックグラウンド信号に起因するものである。また、勾配値を用いて指数的バックグラウンド信号方程式を算出し、信号関数から指数的バックグラウンド信号方程式を減算して試料信号を識別する段階も含まれる。
【００２１】
本発明の更に別の態様では、複数の融解プロットを分析する方法が提供される。本方法は、各融解プロットに対し、指数的バックグラウンド減算、曲線オーバーレイ機能、差分値プロット機能、及びクラスタリング機能から成る群から選択されるアルゴリズムを受けさせる段階を含む。
【００２２】
本発明の付加的な特徴は、現在認識される本発明を実施する最良の形態を例証する好ましい実施形態の以下の詳細な説明を考慮すると、当業者には明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
図１を参照すると、指数的バックグラウンド減算（ＥＢＳ）正規化を行う前（図１Ａ）及び後（図１Ｂ）の融解曲線プロファイルが示されている。ＥＢＳは、生の融解曲線データを正規化するための方法であり、分析及び遺伝子型決定を行うのに良好なデータセットを提供する。微分又は生の融解曲線上でＥＢＳを行うと、詳細分析に良好に適した補正融解曲線が得られる。生の融解曲線（図１Ａ）は、蛍光値を温度の関数としてプロットすることが多い。
【００２４】
１つの実施例では、指数的バックグラウンド減算は、２つの温度ＴL及びＴRで生の融解曲線の勾配をフィットすることにより算出される。生の融解曲線は、以下の方程式セット（１）により表され、式中、Ｆ（Ｔ）は生の融解曲線を表し、Ｍ（Ｔ）は核酸試料信号を表し、Ｂ（Ｔ）はバックグラウンド信号を表す。ＴL及びＴRは、試料信号の融解遷移温度から離れた点から得られ、この点では、融解遷移が勾配に有意な影響を及ぼさず、従って信号（Ｍ（Ｔ））の勾配（Ｍ’（Ｔ））が本質的にゼロであり、指数関数的に有効にゼロになる。これは、方程式セット（２）で表される。
方程式セット（１）      Ｆ（Ｔ）＝Ｍ（Ｔ）＋Ｂ（Ｔ）
方程式セット（２）      Ｆ’（ＴL）＝Ｂ’（ＴL）及びＦ’（ＴR）＝Ｂ’（ＴR）
【００２５】
指数関数モデルは方程式３にフィットされ、ここで、指数関数の形は、これらの２つの値に対しての数値安定性のためＴLにシフトされ、即ち、Ｔ＝ＴR、ＴLで
Ｂ’（Ｔ）＝ａＣｅa(T-TL)。
これは、Ｔ＝ＴLでは、
ａＣ＝Ｂ’（ＴL）
ＴRでは、
ａＣｅa(TR-TL)＝Ｂ’（ＴR）となる。
方程式セット（３）
Ｂ（Ｔ）＝Ｃｅa(T-TL)
Ｔ＝ＴR、ＴLでＢ’（Ｔ）＝ａＣｅa(T-TL)
Ｔ＝ＴLでａＣ＝Ｂ’（ＴL）
Ｔ＝ＴRでａＣｅa(TR-TL)＝Ｂ’（ＴR）
ＴL及びＴRが生の融解曲線を生成するときに測定され、従って、これらの値は、方程式セット（４）に示されるようにパラメータ（ａ）及び（Ｃ）を得るのに用いられることは理解される。
方程式セット（４）
ｅa(TR-TL)＝Ｂ’（ＴR）／Ｂ’（ＴL）、
であるので、
2009508530.tif 000003
Ｃ＝Ｂ’（ＴL）／ａ
Ｍ（Ｔ）＝Ｆ（Ｔ）−Ｃｅa(T-TL)（バックグラウンド除去）
蛍光値ではなくＴL及びＴRの勾配を用いて指数的バックグラウンドを求めるので、バックグラウンド減算は、存在する試料の量又は単に試料間変異に起因して変わる可能性のある存在する信号の量を基準とすることなく算出することができる。
【００２６】
信号Ｍ（Ｔ）は、任意選択的ではあるが、例えば、直線シフトを適用して関心のある区間に関し方程式セット（５）に従って再スケーリングすることにより範囲０〜１００に正規化することができる。
方程式セット（５）      Ｍ（Ｔ）＝１００（Ｍ（Ｔ）−ｍ）／（Ｍ−ｍ）
式中、ｍ＝ｍｉｎ｛Ｍ（Ｔ）｝、Ｍ＝ｍａｘ｛Ｍ（Ｔ）｝
【００２７】
或いは、別の実施例では、指数関数を微分融解曲線のバックグラウンド蛍光にフィットすることができる。バックグラウンドは、数値的に計算された微分曲線の高さを指数関数にフィットして、次にバックグラウンドを生の融解曲線から減算することにより除去される。指数関数の微分は、同じ減衰率を有する指数関数であるので、指数的バックグラウンド減算は、この実施形態では、関心のある温度での値の指数関数フィットを減算することにより微分曲線に使用される。この方法では、集合的微分曲線の２つの温度ＴL及びＴRでの値（高さ）を用い、これらの値をＢ’（Ｔ）＝Ｄｅa(T-TL)（式中、Ｄは上記の微分関数のａＣに相当する）についての対応するモデルにフィットすることができる。この状況では、パラメータＤ及びａは次のように解く。Ｔ＝ＴLでは、これは、Ｄ＝Ｂ’（ＴL）となり、よってパラメータＤについて解く必要はなく、そのまま測定値として見える。ＴRでは、これは、Ｄｅa(TR-TL)＝Ｂ’（ＴR）となる。第２の方程式を第１の方程式で割ると、ｅa(TR-TL)＝Ｂ’（ＴR）／Ｂ’（ＴL）となり、これにより、ａ＝ｌｎ（Ｂ’（ＴR）／Ｂ’（ＴL））／（ＴR−ＴL）は上の方法に一致するが（指数関数及びその微分関数の指数減衰率は同じである）、ここではＢ’の値は、測定データの勾配をフィットする代わりに、測定データの数値的微分関数の高さから求められる。最後に、減算によりバックグラウンド微分関数を除去した信号の微分関数が得られ、Ｍ’（Ｔ）＝Ｆ’（Ｔ）−Ｄｅa(T-TL)、パラメータＤ及びａは上記で求められる。上述のように、微分信号Ｍ’（Ｔ）は、任意選択的ではあるが、例えば、直線シフトを適用して、Ｍ’（Ｔ）＝１００（Ｍ’（Ｔ）−ｍ）／（Ｍ−ｍ）（式中、それぞれ関心のある区間に関しｍ＝ｍｉｎ｛Ｍ’（Ｔ）｝、Ｍ＝ｍａｘ｛Ｍ’（Ｔ）｝）を再スケーリングすることにより範囲０〜１００に正規化することができる。
【００２８】
図１では、非ラベル化プローブを用いて第Ｖ因子ライデン遺伝子のモデルシステムの種々の遺伝子型についての例示的な融解曲線が示されている。非ラベル化プローブ及び単位複製配列の両方の融解遷移が見られる。この例示的な実施例では、図１Ａに示すように、直線のペア１（直線１、２）及びペア２（直線３、４）は、それぞれのカーソルのペアを表す。各カーソルのペアは、ＥＢＳ分析のＦ’（ＴL）及びＦ’（ＴR）を求めるのに用いられる生の融解曲線データの温度区間を抽出するための融解遷移外側領域を提供する。２つの領域の各々は、勾配が領域内で有意に変化しないように十分に小さいが、局所勾配の正確な試料を提供するには十分な幅であるように選択される。しかしながら、バックグラウンドが指数関数であるため、勾配は、領域の幅を広げ過ぎると一定ではなくなる。１つの実施例では、ソフトウェアに自動初期位置決めアルゴリズムを備えることができる。例えば、指数微分方程式ｙ’＝Ｃｙ（式中、Ｃは定数）が満足されるバックグラウンド領域を識別することができる。必要であれば、ソフトウェアにより、ユーザがカーソルを調節して結果の改善を図ることができる。或いは、融解遷移領域が既知であれば、ソフトウェアにより、ユーザがカーソルを特定の領域に固定することもできる。領域を設定する他の方法も可能である。
【００２９】
この実施例では、融解曲線は、ＨＲ−１融解器具から取ったデータから生成した。勾配値ＴLは、カーソルペア１から生成され、ＴRはカーソルペア２から生成される。この実施例では、カーソルペアはそれぞれ、ほぼ７６°Ｃ及び８５°Ｃに配置されるが、カーソルペアの位置は、試料中に存在する核酸の融解遷移に応じて変わることになる点は理解される。カーソルペア１及び２は、試料核酸のプローブ融解遷移を囲むが、カーソルペア２は、単位複製配列融解遷移領域の前にも配置される。カーソルペアから生成された勾配で指数関数フィットを行った後、指数的バックグラウンド減算を行う。図１Ｂは、上で論じたＥＢＳ方程式及び正規化を用いてバックグラウンドが減算された後のプローブ融解領域を表す。同じ又は異なるカーソルペアを用いた単位複製配列融解領域についての指数的バックグラウンド減算は、プローブ融解領域に見られる同じ指数関数で行うことができる（図示せず）。
【００３０】
例示的に、カーソルペアは、少なくとも１つの融解遷移の何れかの側に配置されるが、カーソルペアの位置は、本発明を実施するときに変化する可能性があることは理解される。例えば、別の実施形態では、勾配値（ＴL及びＴR）は、両方ともプローブ融解領域前の点から得られる。更に別の実施形態では、勾配値（ＴL及びＴR）は、両方とも、プローブ融解領域後で且つ単位複製配列融解領域前の点から得られる。更に別の実施形態では、勾配値（ＴL及びＴR）は、両方とも単位複製配列融解領域後の点から得られる。更に別の実施形態では、勾配値（ＴL及びＴR）は、プローブ融解領域前で且つ単位複製配列融解領域後の点から得られる。更に別の実施形態では、勾配値（ＴL及びＴR）は、プローブも単位複製配列も融解していない、生の融解曲線上のあらゆる２つの点で得られる。例示的なカーソルペアは、互いに間隔を置いて配置されるが、互いに近接する２つの勾配値（ＴL及びＴR）で指数的バックグラウンド減算を行うことも可能である。これは、限定的な非融解領域を備える極めて混雑した融解曲線に有用な可能性がある。
【００３１】
指数的バックグラウンド除去は、ＴL及びＴRが融解範囲の外側にある限り、ユーザがどこにバックグラウンドをフィットするかを判断するユーザの選択に関係なく、試料融解曲線信号を識別する。一般に、バックグラウンド雑音はバックグラウンド蛍光信号及び交互非核酸融解信号を含み、この両方は、試料データの分析を妨げる。例えば、低温（８０°Ｃ未満）で非ラベル化プローブ及び多重単位複製配列を用いる場合には、低温でのバックグラウンド雑音により、場合によっては試料信号曲線の識別が事前に阻止されている。
【００３２】
バックグラウンド減算のための従来技術の方法は、バックグラウンド信号及び試料信号が等しい振幅に近づくにつれ成立しなくなる可能性がある。試料信号がバックグラウンドよりも有意に高い場合でも、指数的バックグラウンド減算は、一貫性及び正確性により優れていることが見出されている。
【００３３】
一例として、指数的バックグラウンド減算で試料の融解曲線を区別すると正確性及び特異性が向上する。近年の研究で、単位複製配列がほぼ４０塩基ペアの長さである場合の標準野生型試料とホモ接合変異体試料とを区別するのに１００％の正確性が見出された。指数的バックグラウンド減算を用いる前に、特にＧＣ含量が２つの単位複製配列間で同じままである場合には、標準野生型試料及びその相同変異体試料の小さな単位複製配列の一部が同一の曲線を有することになることが理論的に理解される。従って、高解像度融解及び指数的バックグラウンド除去を用いると、２本鎖核酸試料の遺伝子型決定及び変異体走査の正確性が極めて高くなる。
【００３４】
高解像度融解分析は、バックグラウンド除去の効率を識別し、遺伝子型決定を行うために生存可能な結果を得るのに有用である。融解分析は、高解像度融解器具ＨＲ−１（商標）（毛管に基づく融解装置）及びＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ（登録商標）（プレートに基づく融解装置）（両方ともユタ州ソルトレイクシティ所在のＩｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含む種々の融解器具で行うことができる。しかしながら、融解曲線分析は、特に高均質性核酸試料に関しては増幅せずに行うことができる点は理解される。ＨＲ−１を用いる１つの例示的な融解プロトコルでは、試料は、まずＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）（インディアナ州インディアナポリス所在のＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ）（又はＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒ（登録商標）（ユタ州ソルトレイクシティ所在のＩｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））で増幅させ、次に、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ内で瞬間的に９４°Ｃまで加熱して、素早く（プログラム設定−２０°Ｃ／秒）４０°Ｃまで冷却させる。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ毛管は、１度に１つずつ高解像度器具に移送し、例えば０．３°Ｃ／秒で加熱することができる。ＨＲ−１は、アルミニウムシリンダで１つのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ毛管を囲む単一の試料器具である。本システムは、シリンダの外側に巻かれたコイルによりＪｏｕｌｅ加熱で加熱される。ほぼ５０のデータ点が１°Ｃ毎に取得することができる。ＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒは、９６又は３８４ウェルマイクロタイタープレート上で高解像度融解させるプレートベースのシステムである。ＰＣＲは、何らかの適合性のあるプレートベースのサーマルサイクラーで行うことができる。
【００３５】
場合によっては、ＰＣＲ後、融解曲線を取得する前に産物を変性させないことが有利である。例えば、繰り返し配列（例えばＳＴＲ、ＶＮＴＲ）の数をタイピングすることが目的である場合には、増幅は、平坦になる前の反応の対数期の間の伸長段階で停止することができ、その後、融解分析を行う。このようにして、ホモ二重鎖伸長産物を分析することができる。繰り返しタイピングするときには、特に多くの異なるヘテロ二重鎖産物が繰り返しの異なるアライメントを形成する可能性があるので、ホモ二重鎖産物は、ヘテロ二重鎖産物よりも情報的に有用とすることができる。場合によっては、これは、ホモ二重鎖融解曲線（予め変性していない）及びヘテロ二重鎖融解曲線（変性して全ての可能な二重鎖の組み合わせを形成する）の両方を得るための一助とすることができる。これらの２つの融解曲線の間の差は、同じ試料を「ホモ二重鎖対照」として用いて、形成することができるヘテロ二重鎖の伸長の尺度をもたらす。
【００３６】
これまでのバックグラウンド減算技術は、多くの場合、要素として数値微分法を含んでいた。生のデータの数値微分法には、人為的フィット及び平滑が含まれており、これはデータの有効性に影響を及ぼす可能性がある。一般的な数値微分技術は、負の微分曲線及び統合微分曲線を含む。本実施形態は、生のデータを数値的に微分する必要がない。これは、これまでのバックグラウンド減算技術に優る利点である。生のデータから微分曲線への変換には、バックグラウンド雑音の増幅、及び融解データの有意な特徴の人為的平滑化を伴うことが多い。本実施形態は、融解データにおいて微小だが分子的には有意な差を区別することができ、これは、微分曲線分析を伴うこれまでの技術に優る利点である。
【００３７】
上記の指数的バックグラウンド減算法は、核酸融解曲線を参照して用いるが、この方法は、指数的バックグラウンド雑音を有する他の生物学的データセットを含む種々のデータセットに適用することができ、計算に信号の値を用いることなくバックグラウンド減算することが重要である場合に特に適切であることは理解される。
【００３８】
曲線オーバーレイ機能
別の実施形態は、融解曲線分析に用いるための曲線オーバーレイ機能を含む。従来の方法である曲線オーバーレイ、又は温度シフティングは、通常は正規化融解曲線の低蛍光（例えば５〜１５％）で蛍光区間を選択する段階と、２次多項式を各曲線の区間内の全ての点にフィットする段階と、次いで、各曲線をこの区間のプロットに最良にオーバーレイするようにシフトする段階とを含む。曲線オーバーレイでは、あらゆる小さなラン間の温度変異が補正され、ホモ接合体からヘテロ接合体を区別する能力が向上する。しかしながら、従来の方法では、区間内の点が３（３）未満である場合には成功しなかった。３つのデータ点がない場合には、公知の数学的オーバーレイ法を高い正確性で適用することができないので、従来の方法は自動的な正確な曲線オーバーレイの手段を提供することはできなかった。公知の数学的オーバーレイの方法には、最小距離法、絶対距離値の最低平均法、及び最小二乗方法が含まれる。
【００３９】
本実施形態は、正規化融解曲線を低従属変数値（ｙＬ）と高従属変数値（ｙＨ）との間にオーバーレイすることにより分析する。これは、全ての（ｙ）値が減少し続けるか、全ての（ｙ）値が増加し続ける場合に、区間内の全ての数値（ｘ，ｙ）を抽出することにより行われる。（ｙ）を（ｘ）の関数としてフィットしてこのようなフィットの最良のオーバーレイを見つける代わりに、順序対を逆にし、これによって（ｘ）を（ｙ）の関数にする。水平方向にシフトさせた１つの関数の最適最小二乗フィットの実施例は、方程式セット６に示されており、平均差（ｘ1（ｙ）＋ｃ）−ｘ2（ｙ）をゼロに等しくする定数ｃを見つけることにより、ｘ1（ｙ）＋ｃから別のｘ2（ｙ）が得られる。
方程式セット（６）
2009508530.tif 000004
【００４０】
値ｘ2（ｙ）は、定数（ｃ）を見つけることにより得られ、それによって、平均差分（ｘ1（ｙ）＋ｃ）−ｘ2（ｙ）がゼロに等しくなる。値（ｚ）は、積分変数を表す。方程式セット６の値（ｚ）は、値（ｘ）又は値（ｙ）の何れかを表すが、これは、部分的には独立変数が元の（ｙ）であり、蛍光値に等しいことに起因する。関数ｆ（ｚ）及びｇ（ｚ）は、温度が蛍光の関数としてプロットされた２つの正規化融解曲線をオーバーレイさせるように選択される２つの正規化蛍光値（低及び高）間の切片を表す。値（ｄｚ）は、正規化蛍光区間に関する正規化尺度である。
【００４１】
ＰＣＲ産物中のヘテロ接合体を走査するために、絶対温度すなわちＴｍよりも形状がより重要である。ヘテロ接合体は、低温で融解して融解曲線全体の形状を歪ませるヘテロ二重鎖を生成する。形状差は、小さな試料差及び器具のばらつきによって温度変異が引き起こされる可能性があるので、異なる遺伝子型を識別するときに絶対Ｔｍよりも有用である。可能性のある試料差には、限定ではないが、イオン強度の差異、及び処理手順の間の蒸発の発生が含まれる。また、試料プレート上の相対的及び正確なウェル位置に関して器具のばらつきがある可能性もある。
【００４２】
上に論じたように、曲線形状を比較するための従来の方法には、温度軸に沿ってシフトさせることによる曲線のオーバーレイが含まれ、二次多項式を各曲線の小さな蛍光区間にフィットさせることにより実施される。次に、任意の標準曲線を選択し、残りの曲線をシフトしてこの領域に標準曲線をオーバーレイした。しかしながら、データ密度及び蛍光区間が小さい場合には、従来の方法は図２Ｂに示すように失敗する傾向がある。上部パネル（図２Ｂ）は、指数的バックグラウンド減算法により正規化された９６のゲノムＤＮＡ試料からの第Ｖ因子ＬｅｉｄｅｎのＰＣＲフラグメントの融解曲線を含む。図２Ｂでは３つの区別可能な遺伝子型クラスタが見える。また、上部パネルには、蛍光区間マーカＦ１、Ｆ２が示されており、これに対してオーバーレイを試みる。第１の区間のマーカＦ１は、ほぼ１０％蛍光であり、第２の区間のマーカＦ２は、ほぼ１５％蛍光である。中央のパネルには、選択した蛍光区間内の８０〜８２°Ｃの実際のデータ点の拡大プロットを示す。種々の曲線で、３つ未満の点がこの区間に含まれていることが示され、これにより二次フィットが不可能になり、最終的に下部パネルに示すように以前の曲線オーバーレイ法が失敗することになる。
【００４３】
本発明の実施形態は、同じデータセットを有する方程式セット（６）（図２Ａ）のアルゴリズムを用いる。本実施形態では、データが正確に首尾良く分析され、実際に、これを行うためにそれぞれの曲線の各々から１つのデータ点しか必要とせず、従って、新規の改良された分析方法となる。図２Ａの上部パネルでは、生のデータが、指数的バックグラウンドの勾配推定のための領域を定める垂直カーソルと共に示される（図１Ａ及び上の説明を参照）。下部パネル（図２Ａ）には、全ての曲線が１０〜１５％蛍光領域にオーバーレイされるように首尾良く温度をシフトさせた正規化バックグラウンド減算曲線が示される。
【００４４】
本実施形態は、曲線オーバーレイ機能の正当性及び正確性のために１つのデータ点しか必要でないことを含む種々の理由から、従来の方法に優る有利な方法である。本実施形態は、最小二乗フィッティングに厳密最適性を有するので更に有利である。曲線オーバーレイ機能の本実施形態は、本明細書に記載した意外の多くの数学的表現で表すことができることが企図され、方程式セット（６）は、そのような実施例の１つとみなされる。
【００４５】
差分値プロット機能
別の代替的な実施形態は、核酸試料融解曲線間の差を分析するための改良差分値プロット機能を含む。従来の方法は、任意の基準曲線又は基準曲線の平均から全ての曲線を減算するものであった。減算の結果は、純粋に各温度点での曲線間の垂直方向距離であった。これらの差分値プロットは、曲線間の差を視覚的に拡大することで、より容易に見ることができるようにした。しかしながら、曲線間の垂直方向距離は、曲線間の最短距離を正確には表していない。これは、融解曲線の蛍光値が大きな割合又は負の勾配で低下する場合は特に当てはまる。この欠点により、「変異バブル」として知られるアーチファクトが示され、これは、蛍光の減少が最大である場合にはっきりと見える場合が多い。
【００４６】
本発明の差分値プロット機能の新規の改良点は、曲線の勾配に基づいて曲線間の差に重みをつけることである。これにより、曲線間の距離測定が良好になるので、共通及び異なる遺伝子型を正確且つ自動的に識別することができるようになる。重み付けにより、曲線間の差分測定に関する勾配の影響がバランスされる。重み付けを行わない場合には、標準垂直方向差分により、勾配が急な場合に曲線間の差が過度に強調され、同じ遺伝子型内の融解曲線の格差が拡大する。本発明の方法により、融解曲線間の直角方向の距離に対する実際に計算可能な近似値が提供され、従って、これは、曲線間の距離の変異を良好に表している。
【００４７】
本実施形態は、融解曲線データを分析するための新規の方法を提供する。分析した融解曲線は、種々の公知の方法で正規化することができるが、本明細書に記載した新しい指数的バックグラウンド減算が好ましい。各温度での垂直方向距離に代わり、曲線間の直角方向距離が有利である。この実施形態では、曲線間の最小距離が得られ、これは、各点での曲線間の最小距離である。蛍光が急激に低下する場合には、直線間の垂直方向距離を用いる代わりに、曲線の勾配に直角方向のメトリックが、２つの曲線間の差を推定するのにより有用且つ正確である。２つの曲線間の直角方向距離を測定するときには、どの曲線を基準として用いるかによって結果が異なることが多い。この実施形態は、２つの曲線間の直線方向距離を推定する方法を提供する。
【００４８】
比較される２つの融解曲線の融解領域が誇張的に強調されること、及びその結果その主要融解域を囲む領域が強調されないことを補償するために、単純な垂直方向差分ｆ1（Ｔ）−ｆ2（Ｔ）を用いる場合には、曲線間の直角方向距離の近似値は、方程式セット（７）を用いて求めることができる。
方程式セット（７）
ｆ1（Ｔ）−ｆ2（Ｔ）＝ｍａｘ｛√（１＋ｆ1’（Ｔ）2），√（１＋ｆ2’（Ｔ）2）｝
方程式セット７は、両方の融解曲線の融解領域を対称的に考慮するための方法の実施例である。方程式は、更に、起点から直線（ｙ＝ｂ−ｍｘ）までの直角方向距離を一般化しており、ここで、起点からの垂直方向距離は（ｂ）であるが、起点から直角方向距離は、（ｂ／√（１＋ｍ2））である。本実施形態の結果は、融解曲線の配列依存性変異を測定範囲全体にわたり更に高感度で均質に反映する測定値であり、同時に、これは、コンピュータシステムで自動的に動的に用いるのに好適である。差分値機能の実施例は、図１０Ａ〜図１０Ｃに提供されており、ここでは、バックグラウンドを指数的に減算した正規化融解曲線を用いて、以前の垂直（図１０Ｂ）差分値及び新しい直角方向（図１０Ｃ）差分値の両方をプロットしている。垂直差分値プロットは、全ての試料が野生型である場合でも、最急な勾配領域の周りに「変異バブル」を示す。変異バブルは、直角方向差分値を用いると排除される。
【００４９】
重み付けにより、曲線間の差分値測定に関する勾配の影響がバランスされる。重み付けを行わない場合には、標準垂直方向差分値測定は、勾配が急な場合に曲線間の差分を過度に強調し、同じ遺伝子型内の融解曲線の格差が拡大する。本発明は、融解曲線間の直角方向距離に対する実際的に計算可能な近似法を提供し、従って、これは、曲線間の距離の変異を良好に表している。
【００５０】
遺伝子型クラスタリング機能
更に別の代替的な実施形態は、クラスタの数を自動的に決定する遺伝子型クラスタリング機能を含む。具体的には、学習データセット及び任意の切り捨てに基づき遺伝子型をクラスタ化する従来の方法と対照的に、不偏階層クラスタリングを用いた。通常、遺伝子型は分析する前は未知であるので、以前のデータセットは、将来のデータセットの適切なグループ化を十分に予想しない。このような学習データセットの方法は、特に未知の遺伝子型に対してはクラスタリングのための正確で自動的な手段を提供することができないことが多い。これとは対照的に、不偏階層クラスタリングは、予備学習も切り捨てを確立することも必要とせず、利用可能な融解データの品質及び解像度をロバストに調節する。
【００５１】
この新規の不偏階層クラスタリング法は、融解曲線間の距離メトリックに基づく。距離メトリックは、１）曲線間の最大距離、２）全ての温度点での曲線間の距離の絶対値平均、及び３）全ての温度点での曲線間の距離の二乗平均平方根の平均から選択される。好ましくは、距離メトリックは、ＥＢＳ、正規化、任意選択的な曲線オーバーレイの後に導かれ、これは、前節で記載した新しい直角方向距離メトリックである。次いで、当技術分野で標準的な逐次的不偏階層クラスタリングを行う。
【００５２】
最も可能性の高いクラスタの数を自動決定することが、本開示の新規の態様である。具体的には、各レベルのクラスタリングについての尤度（クラスタの数）は、クラスタレベル間の距離比を考慮することにより決定される。階層クラスタリングの間に、各サブクラスタ内の全ての点の重み付き平均（各段階でどのサブクラスタを併合するかを決定するために最小化された量）を考えることにより、２つのサブクラスタＣ1及びＣ2を統合して大きなクラスタにする。重み付き平均を用いて距離比を算出する代わりに、データのクラスタとそのサブクラスタとの間の分離の更に正確な尺度として、別個のクラスタ内の曲線間の最小距離を用いる。これは、最新の統合された重み付き平均間の距離ではなく、各サブクラスタの最近傍曲線間の距離に限定されるサブクラスタに関する距離尺度を維持することにより、凝集型クラスタリング工程の間に形成される階層サブクラスタを表す重み付き平均曲線間の距離が自然に大きくなることを相殺する。本実施形態は、２つの隣接するクラスタレベル距離間の比を評価することにより、どのクラスタレベルが最も可能性が高いかを正確に判断する。この比により、クラスタリングレベルの尤度評価（クラスタの数）がより正確で安定化され、大規模現象から微細規模を正確に分離する。最大比は、クラスタの最も可能性の高い数を定め、次に大きな比は、クラス他の２番目に可能性の高い数を定めるなどである。主遺伝子型の複数の表現に対して十分な曲線が存在する遺伝子型決定用途では、この方法により、本質的に階層クラスタリングにおける遺伝子型決定レベルを識別するためのロバストな判定基準が得られる。
【００５３】
クラスタリング工程の数学的表現は、方程式セット（８）に示されており、ここで、｜｜ｆ1−ｆ2｜｜は、尤度によりクラスタレベル（クラスタの数）を順序付ける比で用いられる距離メトリックを表す。差分測定値（｜｜ｆ１−ｆ２｜｜）は、２つの正規化融解曲線の間の距離の尺度を表し、選択温度での平均絶対分離、平均二乗分離、及び最大分離を含む群から選択される。方程式セット８に関して、２つの融解曲線間の距離を測定するための種々の他の公知の方法を用いることができることも企図される。
方程式セット（８）ｍｉｎ＿｛ｆ1εＣ1，ｆ2εＣ2｝｜｜ｆ１−ｆ２｜｜
サブクラスタＣ1及びＣ2が統合された時点では、値（ｆ1）は、サブクラスタＣ1に関連する融解曲線を表し、値（ｆ2）は、サブクラスタＣ2に関連する融解曲線である。値（ｍｉｎ＿｛ｆ1εＣ1，ｆ2εＣ2｝）は、融解曲線の全てのペア間の距離の最小値を表し、第１の値を第１のサブクラスタから取る場合には、第１のサブクラスタは統合され、第２の値は第２のサブクラスタから取る。
【００５４】
本実施形態は、クラスタレベル間の距離を測定して特定のレベルの尤度（クラスタの数）を決定するための新規の方法である。新しい距離尺度は、各々が異なるクラスタからのものである限りあらゆる２つのメンバ間の最小距離である。あらゆるクラスタレベル（即ち３対４対５クラスタ）の尤度を決定するために、隣のクラスタまでの距離の比を前のクラスタまでの距離で除算する。上記の方法により、カーソル位置のようなパラメータが変化しても遺伝子型の正しい分類が得られる。比を求めるために各サブクラスタの最近傍曲線間の距離ではなく重み付き平均を用いる場合には、最も可能性の高いクラスタの数の選択は、遥かに安定性が劣る。更に、本実施形態は、高い正確性で自動的に行うことができる。
【００５５】
図３Ａ〜図３Ｃは、正しい数の遺伝子型クラスタを多試料融解曲線に割り当てる新規のクラスタリング機能の能力を実証している。９６ウェルプレートに１０μｌの反応容積を用いて、肝リパーゼ遺伝子のヒトゲノムＤＮＡの６つの別個の遺伝子型を増幅した（ＢｉｏＲａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒ）。１Ｘ  ＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ユタ州ソルトレイクシティ所在のＩｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた。試料は、ＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ融解器具に入れ、０．１°Ｃ／秒で７５°Ｃから９４°Ｃまで加熱した。
【００５６】
図３Ａは、肝リパーゼ遺伝子増幅及び融解遷移に対する生の融解曲線のスクリーンショット（上部パネル）を示す。下部パネルは、以前のクラスタリング機能の結果と、該以前のクラスタリング機能が３つの別個の色付き線のクラスタとして表現される３つの別個の遺伝子型クラスタのみが試料中に存在することを示すドロップダウンメニュー表示とを共に図示している。
【００５７】
図３Ｂは、肝リパーゼ遺伝子の増幅及び融解遷移に対する生の融解曲線（上部パネル）のスクリーンショットを示す。下部パネルは、本実施形態のクラスタリング機能の結果と、新規のクラスタリング機能が、６つの色付き線のクラスタとして表現された６つの別個の遺伝子型クラスタが試料中に存在することを示すドロップダウンメニュー表示とを共に図示している。図３Ｃは、ユーザが、図３Ｂの蛍光対温度プロットと並んで図示された９６ウェル反応プレート上に試料を位置付けることにより、遺伝子型により試料を識別することができることを実証している。
【００５８】
融解プロットは、指数的バックグラウンド減算、曲線オーバーレイ機能、差分値プロット機能、及びクラスタリング機能のアルゴリズムの１つ又はそれ以上を用いて分析することができ、これらの方法の各々は、単独で用いても、組み合わせて用いてもよく、融解プロットを分析する他の方法と組み合わせて用いることもできる点は理解される。
【実施例１】
【００５９】
血色素症（ＨＦＥ）突然変異体及び多型性遺伝子型決定
血色素症遺伝子突然変異体及び多型性は、ヒトの正常な鉄代謝を妨げることが知られている。この例示的な実施例では、融解曲線分析による多型性及び変異体遺伝子型の検出及び識別では、基線バックグラウンド減算よりも指数的バックグラウンド減算を用いるとより正確である。分析は、異なるホモ接合体試料間のＴｍ差分を増大させるために、小さな単位複製配列（７８ｂｐ及び４０ｂｐ）で行った。非ラベル化プローブは、他の場合には単位複製配列融解により容易に遺伝子型を決定することができないＳＮＰを遺伝子型決定するのに用いられる。
【００６０】
特徴的な血色素症遺伝子型を表すヒトゲノムＤＮＡは、種々のＰＣＲ器具で増幅することができる。例示的な方法は、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）２．０に１０μｌの反応容積を含む。ＰＣＲ増幅の後、ＨＦＥ試料は、ＨＲ−１（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）融解器具に入れてほぼ１１５秒加熱した。結果として得られる蛍光対温度のプロットを図４Ａとして示す。図４Ｂには、微分融解曲線を示す。この例示的な実施例では、指数的バックグラウンド減算は微分融解曲線に対して行い、正規化微分融解曲線が図４Ｃに示される。指数的バックグラウンド正規化融解曲線（図４Ｃ）に比べると、融解曲線を正規化するための基線技術は明らかに不十分である。図４Ｄ〜図４Ｅに示すように、組み合わせプローブ＋単位複製配列融解曲線（図４Ｄ）に基線技術を適用すると、基線及び指数的バックグラウンド減算技術に同じ融解曲線のデータセット（図４Ｂ、図４Ｄ）を用いても、使用可能なデータが存在しないことになる（図４Ｅ）。Ｃ２８２Ｙホモ接合及びヘテロ接合、Ｈ６３Ｄヘテロ接合及びホモ接合並びに野生型試料についての図４Ｃの遺伝子型識別が図４Ｆに示される。
【実施例２】
【００６１】
第Ｖ因子ライデン（３８４ウェルプレート）微分クラスタリング組み合わせプローブ及び単位複製配列
第Ｖ因子ライデンは、米国で最もよく見られる遺伝性血液凝固障害である。これは、白人の人口のほぼ５％及びアフリカ系アメリカ人の人口のほぼ１．２％に存在する。遺伝子標的としての第Ｖ因子ライデンは、凝固障害素因に関連するＳＮＰを検出する上で重要である。
【００６２】
異なる第Ｖ因子ライデン遺伝子型を表すヒト第Ｖ因子ライデンゲノムＤＮＡ試料は、１０μｌ反応容積及び１２μｌオイルオーバーレイを備えるＡＢＩ  ９７００で増幅した。アッセイは、
５’−ＣＴＧＡＡＡＧＧＴＴＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＡＡＴＡＣＣＴＧＴＡＴＴＣＣＴＣＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＧＧＡＴＣＴＧＣＴＣＴＴＡＣＡＧＡＴＴＡＧＡＡＧＴＡＧＴＣＣＴＡＴＴＡＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＧＡＴＧＴＣ−３’（配列番号（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ）１）の配列を有するほぼ１００ｂｐの第Ｖ因子ライデン単位複製配列を含んでおり、これを順方向プライマー５’−ＣＴＧＡＡＡＧＧＴＴＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣ−‘３（配列番号２）及び逆方向プライマー５’−ＧＡＣＡＴＣＧＣＣＴＣＴＧＧＧ−３’（配列番号３）により増幅した。また、アッセイは、下線で示されるように、単位複製配列の順方向ストランドにハイブリダイズするように構成された非ラベル化プローブ３’−ＴＧＧＡＣＡＴＡＡＧＧＡＧＣＧＧＡＣＡＧＧＴ−５’（配列番号４）も含んだ。得られるＰＣＲ試料は、３８４ウェル反応プレートを用いて、ＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ融解器具に入れて０．１°Ｃ／秒で５８°Ｃ〜８８°Ｃまで加熱した。全融解手順を完了するには、ほぼ５分必要であった。
【００６３】
ＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ融解器具は、温度の関数として蛍光を測定して記録した。この手順の生の融解曲線の結果は図５Ａに示す。図５Ａの融解曲線の負の微分関数を計算し、これを図５Ｂに示す。図５Ｂには、遺伝子型のクラスタリングと共に３８４ウェルプレートの代表的な図を示す。バックグラウンド除去は実施しておらず、実施したクラスタリングは、試験した試料の幾つかを正しく遺伝子型決定しなかった（図５Ｄの３８４ウェルプレートに比較）。
【００６４】
図５Ｂの微分関数プロットに線形補正機能を実施し、これを図５Ｃに示す。３８４ウェルプレートの代表的な図は、遺伝子型のクラスタリングと共に図５Ｃに示す。線形補正の後に行ったクラスタリングは、試験した試料の幾つかを正しく遺伝子型決定しなかったことは、３８４ウェルプレートから明らかである。微分融解曲線データに行った線形補正は、線形関数を減算することにより、末端間勾配を削除する段階を含む。
【００６５】
図５Ｄは、データセットに対し指数的バックグラウンド減算を行った後の図５Ｂの微分融解曲線データを表す。指数的バックグラウンド減算の後でのみ、遺伝子型の正当なクラスタリングが得られる。遺伝子型クラスタリングの正確性は、３８４ウェルプレート内に見ることができ（図５Ｄ）、プレート位置により遺伝子型を示す文字「Ｓ−Ｎ−Ｐ」のつづりが示され、第Ｖ因子ライデン遺伝子標的の単位複製配列及びプローブ領域の両方に対する適切な識別情報を見ることができる。
【実施例３】
【００６６】
プローブのみの第Ｖ因子ライデン（９６ウェルプレート）微分クラスタリング
異なる第Ｖ因子ライデン遺伝子型を表すヒト第Ｖ因子ライデンゲノムＤＮＡ試料は、１０μｌ反応容積及び１２μｌオイルオーバーレイを備えるＡＢＩ  ９７００で増幅した。アッセイは、上記の実施例２に記載するように、１Ｘ  ＬＣＧｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ（登録商標）の存在下で、第Ｖ因子ライデン単位複製配列及び非ラベル化プローブを含んでいた。得られるＰＣＲ試料は、９６ウェル反応プレートを用いてＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ融解器具に入れて０．１°Ｃ／秒で５８°Ｃ〜８８°Ｃまで加熱した。全融解手順を完了するのにはほぼ５分必要であった。
【００６７】
ＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ融解器具は、温度の関数として蛍光を測定し記録した。図６Ａに、手順の生の融解曲線の結果を示す。図６Ａの融解曲線データから温度の関数としての負の微分関数プロットを行い、図６Ｂに示す。垂直カーソルの線の２つのセットは、それぞれ、ほぼ５９°Ｃ及び６０°Ｃ、及び７１°Ｃ及び７２°Ｃで存在する。指数的バックグラウンド減算技術の勾配は、これらのカーソル線を用いて生成した。自動計算及びフィットに続き、指数的バックグラウンドは、生の負の微分関数プロットから減算される。プローブ領域に特異的な指数的バックグラウンド減算の結果を図６Ｃに示す。垂直勾配カーソルはプローブ領域の何れかの側に配置されるが、プローブ領域に用いられる指数関数は、単位複製配列領域にも用いることができる。実際、勾配が得られる絶対的位置は、勾配が試料の融解が起こらない位置で見出される限り、指数関数を決定するものではない。プローブ領域データ（図６Ｃ）は、遺伝子型クラスタリング機能により自動的にクラスタ化される。９６ウェルプレートからの核酸試料は、３つの遺伝子型にクラスタ化され、図６Ｄに示す。
【００６８】
実施例４及び実施例５に関して、以下の手順及び器具を用いた。分析には、ヒトゲノムＤＮＡの既知の第Ｖ因子ライデン遺伝子型試料及び選択した嚢胞性線維症変異体を備えるヘテロ接合性ゲノムＤＮＡ試料を用いた。
【００６９】
予想プローブＴｍは、恐らくは染料安定化のため、観察Ｔｍよりも低かった。異なるプローブ／アリル二重鎖の融解温度は、プローブ長さ、不整合位置、及びプローブｄＵ対ｄＴ含量により調節した。ＰＣＲの間の非ラベル化プローブの伸長は、合成中に３’−リン酸塩を組み入れることにより防止した。或いは、例示的に、付加的な２塩基不整合をプローブの３’−端部に与えることにより他の３’−ブロック化機構を用いることもできる。５’−エキソヌクレアーゼ陰性ポリメラーゼを用いる場合には、プローブは、ＰＣＲ伸長温度よりも低い温度で融解するように設計する必要がある。
【００７０】
例示的に１：５〜１：１０の比率で示されるプライマー非対称を用いて、単位複製配列融解に十分な２本鎖産物及びプローブアニーリングに十分な１本鎖産物を生成することができる。第Ｖ因子のＰＣＲは、５μｌ容積を用いて３８４ウェル形式で行い、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、各々０．２ｍＭのｄＮＴＰ、５００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１Ｘ  ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）ＰＬＵＳ（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、０．２Ｕ  ＫｌｅｎＴａｑｌ（商標）（ＡＢペプチド）、及び７０ｎｇ  ＴａｑＳｔａｒｔＴＭ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を加えた５０ｍＭトリス、ｐＨ８．３に２０ｎｇのゲノムＤＮＡを含んだ。ＰＣＲは、９７００サーマルサイクラー（ＡＢＩ）で、９４°Ｃで１０秒の初期変性、その後、９４°Ｃで５秒間、５７°Ｃで２秒間、及び７２°Ｃで２秒間を５０サイクル行った。ＰＣＲ後、試料は、９４°Ｃまで１秒間加熱し、その後、融解する前に１０°Ｃまで冷却した。
【００７１】
ＣＦＴＲエクソン１０及び１１の増幅用のＰＣＲは、１０μｌ容積で行い、２ｍＭ  ＭｇＣ１2、各々０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、５００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１Ｘ  ＬＣＧｒｅｅｎＩ（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ及び０．４Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を含む５０ｍＭトリス、ｐＨ８．３に５０ｎｇのゲノムＤＮＡを含んだ。ＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）の毛管で、９４°Ｃで１０秒の初期変性に続いて、９５°Ｃで１秒間、５４°Ｃで０秒間、及び７２°Ｃで１０秒間を４５サイクル行った。増殖後、試料は、９５°Ｃまで０秒間加熱し、融解する前に４０°Ｃまで急速に冷却した。
【００７２】
核酸試料は、３８４ウェルプレートで増殖し、試作版のＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ（登録商標）（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で融解取得を行った。標準４７０ｎｍ発光ダイオードを４５０ｎｍ発光ダイオード（Ｂｒｉｇｈｔ−ＬＥＤ  Ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）と置き換えた。また、光学フィルタを４２５〜４７５ｎｍ励起及び４８５ｎｍロングパス放出フィルタ（Ｏｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ）に変えた。プレートは、３００ｍｓフレーム区間、１５ｍｓ露出及び１００％ＬＥＤ出力を用い、０．１°Ｃ／秒で５５〜８８°Ｃに加熱し、約２５ポイント／°Ｃとなった。
【００７３】
ＣＦＴＲエクソンの融解は、温度及び蛍光を２４ビットで取得し、ＨＲ−１高解像度融解器具（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で行った。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒでＰＣＲを行った後、各毛管をＨＲ−１に移し、０．３°Ｃ／秒の勾配で５０°Ｃから９０°Ｃまで融解し、６５ポイント／°Ｃとなった。
【００７４】
融解曲線は、当技術分野で公知のあらゆる適切なソフトウェアで分析することができる。本発明の種々の実施形態の融解分析法を実施する例示的なソフトウェアパッケージは、ＬａｂＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）である。最初に、関心のある融解遷移を囲むバックグラウンドに指数関数をフィットすることにより正規化及びバックグラウンド減算を行った。プローブ融解遷移の微分関数プロットは、Ｓａｌｖｉｔｓｋｙ−Ｇｏｌａｙ多項式推定により得た。ＰＣＲ産物の融解曲線は、温度オーバーレイ正規化融解曲線の異なるプロットに対して比較した。正規化融解曲線は、蛍光の範囲（例示的に、低蛍光／高温、典型的には５〜１０％蛍光）を選択し、各曲線をＸ軸に沿ってシフトさせ、標準試料をこの範囲内に最も良好にオーバーレイさせることにより、（ウェル又はラン間の僅かな温度誤差を排除するために）温度オーバーレイした。温度オーバーレイ正規化曲線の異なるプロットは、全ての温度点で平均野生型曲線から各曲線の蛍光差分値をとることにより得た。これらの分析方法は、以前に変異体走査及びＨＬＡ一致を行うのに適用した。
【００７５】
融解曲線データの凝集型不偏階層クラスタリングは、ＬａｂＶＩＥＷにおいてカスタムプログラムされた従来の方法で行った。曲線間の距離は、全ての温度の取得点にわたって曲線間の蛍光差分の平均絶対値として取った。群の数は、連続するクラスタレベル間の距離の最大比を選択することにより自動的に識別した。クラスタリング法は、本明細書に記載する新しいクラスタリング法よりも、遺伝子型をクラスタリングするのに正確性で劣る手段であることが示される（図９Ａ〜図９Ｄ）。
【実施例４】
【００７６】
ＣＦＴＲ走査及び遺伝子型決定
嚢胞性線維症相互コンダクタンス調節剤（ＣＦＴＲ）遺伝子の種々のエクソンは、複数のバリアントの走査及び遺伝子型決定を同時に行うように選択している。ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１１の２つの領域の３つのＳＮＰを配列が、部分的にＴＣＴＴＧＧＡＧＡＡ（配列番号５）及びＡＧＧＴＣＡＡＣＧＡ（配列番号６）である２つの非ラベル化プローブで分析した。変異体の２つは、６塩基しか離れておらず、プローブの１つが両方の変異体をカバーすることができる（図７Ａ）。各遺伝子型の５つの複製を増幅して分析した。ＥＢＳ後の正規化融解曲線（図７Ｂ）は、プローブ融解（５６〜７４°Ｃ）及びＰＣＲ産物融解（８０〜８３°Ｃ）の領域を示す。略式の観察では、正規化融解曲線からどの情報を抽出することができるかは明らかでない。しかしながら、プローブ領域が微分関数プロット（図７Ｃ）として表示される場合には、両方のプローブ下の全ての共通アリルの融解遷移は明らかである。非ラベル化プローブの両方は野生型配列に一致するが、プローブの１つは短く作られており、ｄＴの代わりにｄＵを含んでその融解温度を低下させた。より安定なプローブは、単一のＳＮＰをカバーし、２つのアリルがＴｍにより分離され、あまり安定でないプローブの全てのアリルよりも、両方とも安定性に優れている。安定性の低いプローブは、２つのＳＮＰをカバーし、共通遺伝子型に対して３つのピークが生じることになる。プローブ内の特定の不整合及びその位置は、二重鎖安定性に影響を及ぼし、複数のアリルを区別するプローブ設計が可能になる。ＰＣＲ産物融解遷移の鎖分値プロットが図７Ｄに示される。ヘテロ接合性の野生型及びホモ接合変異体試料は明らかに異なる。しかしながら、ＰＣＲ産物融解単独で異なるヘテロ接合体間を区別することは困難である。不偏階層的クラスタリングは、全てのヘテロ接合体を共に分類した（データは示さず）。３つのヘテロ接合体は、全て同じＳＮＰ階級（１２）に属し、同じヘテロ二重鎖不整合（Ｃ：Ａ及びＴ：Ｇ）及びホモ二重鎖一致（Ｃ：Ｇ及びＡ：Ｔ）となる。最近傍熱力学（１３、１４）を用いると全ての３つのヘテロ接合体の予想安定性は同一というわけではないが、最終的な遺伝子型決定にはプローブを利用することが必要である。産物融解の強度により、ヘテロ接合体が存在することは容易に識別されるが、非ラベル化プローブは、ヘテロ接合体間を更に容易に区別し、ホモ接合バリアントを更に容易に識別する。この実施例で示したように、遺伝子型決定及び走査の両方を組み合わせると、単位複製配列（ＰＣＲ産物）及び非ラベル化プローブ融解遷移の両方が表示されることになる。
【実施例５】
【００７７】
ＣＦＴＲ遺伝子型決定
また、２つの非ラベル化プローブでＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１０内の３つのＳＮＰ及び２つの欠失も分析した。配列が部分的にＴＴＣＴＣＡＧＴＴＴ（配列番号７）であるＴｍが高いプローブは、単一のＳＮＰをカバーするが、配列が部分的にＴＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧ（配列番号８）であるＴｍが低いプローブは、２つのＳＮＰ及び２つの欠失をカバーする（図８Ａ）。ＥＢＳ後の正規化融解曲線（図８Ｂ）は、低温プローブ（５６〜６７°Ｃ）、高温プローブ（６７〜７５°Ｃ）、及びＰＣＲ産物（８０〜８３°Ｃ）融解の領域を示す。プローブ領域が微分関数プロット（図８Ｃ）として表示される場合には、５つ全てのヘテロ接合性の遺伝子型が独自の経路を辿り、これにより野生型から及び互いから区別される。ヘテロ接合体の４つは、分解ピークを示し、１つは、比較的安定な不整合（プローブの一端の近くの高ＡＴ領域のＡ：Ｇ不整合）により幅の広いピークにより識別される。アリルの区別には、各アリルに独自のＴｍを必要とせず、曲線が融解遷移のある領域で異なることのみを必要とする。図８Ｄには、ＰＣＲ産物融解遷移の差分値プロットを示す。二重ヘテロ接合体は、ＰＣＲ産物内に２つの不整合が存在するため、野生型から最も大きな偏移を示す。４つの単一ヘテロ接合体は、全て、野生型から容易に区別される。エクソン１１と対照的に、全てのヘテロ接合体は、ＰＣＲ産物又はプローブ融解の何れかにより遺伝子型決定することができた。両方の領域を考慮すると、多くの場合、遺伝子型が独立に確認される。
【実施例６】
【００７８】
βグロブリンの全単位複製配列遺伝子型決定
βグロブリンは、異常ヘモグロビン症（ｈｅｍｏｇｌｏｂｒｉｎｐａｔｈｉｅｓ）の分析に重要な既知のＳＮＰを備える遺伝子標的となり、最も注目すべきものは、ＨｂＣ及びＨｂＳ突然変異体である。異なるβグロブリン遺伝子型のヒトゲノムＤＮＡ試料は、１０μｌ反応容積を用いてＲｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅで増幅した。ＰＣＲには、Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの１Ｘ  ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）を用い、４５ｂｐ単位複製配列：５’−ＣＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣＣＧＴＴＡＣＴＧＣＣＣ−３’（配列番号９）を増幅した。ＰＣＲ産物試料をＨＲ−１融解器具に入れ、０．３°Ｃ／秒で約７２°Ｃ〜約８８°Ｃに加熱した。融解に必要な時間は、約６０秒である。
【００７９】
ＨＲ−１融解器具は、温度の関数として試料の蛍光を測定して記録した。図９Ａに、全βグロブリン単位複製配列のための生の融解曲線を示す。次に、本明細書に記載する指数的バックグラウンド減算法により、全βグロブリン単位複製配列のための生の融解曲線を正規化し、これは、図９Ｂの温度の関数として試料の相対蛍光である融解曲線となる。遺伝子型クラスタリング機能を図９Ｂの正規化融解曲線に行う。図９Ｃは、図９Ｂの正規化融解曲線のクラスタ化遺伝子型を示す。
【実施例７】
【００８０】
第Ｖ因子ライデン野生型差分値プロット分析
６０の異なる第Ｖ因子ライデン野生型を表すヒト第Ｖ因子ライデンゲノムＤＮＡ試料を１０μｌ反応容積及び１２μｌオイルオーバーレイのＡＢＩ  ９７００に入れて増殖した。アッセイは、上の実施例２に記載したように、１Ｘ  ＬＣＧｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ（登録商標）の存在下で第Ｖ因子ライデン単位複製配列及び非ラベル化プローブを含んだ。得られるＰＣＲ試料は、９６ウェル反応プレートを用い、ＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ融解器具に入れて０．１°Ｃ／秒で５８°Ｃ〜８８°Ｃに加熱した。総融解手順を完了するのに、ほぼ５分必要であった。
【００８１】
ＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ融解器具は、画分温度として（ａｓ  ａ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）蛍光を測定して記録した。種々の差分値プロット機能を実行すると、温度の関数として蛍光差分値が与えられる。図１０Ａには、指数的バックグラウンド減算機能を実行した後の６０の第Ｖ因子ライデン野生型の融解曲線を示す。正規化融解曲線は、１つの太い黒い曲線として現れ、これは、６０の野生型試料が実質的に同様であるという特徴である。
【００８２】
図１０Ｂは、温度の関数として６０の野生型試料間の垂直蛍光差分値としてプロットした以前の垂直差分値プロット技術の結果のグラフを表す。この以前の垂直差分値プロット技術は、融解曲線が十分に急な勾配である場合に興味深いアーチファクトを示す。アーチファクトは、ほぼ８０．２５°Ｃと８１．５°Ｃとの間の「バブル」として現れ（図１０Ｂ）、これは生のデータ融解曲線勾配の最も急な部分である。
【００８３】
垂直差分値プロットのアーチファクトは、６０野生型試料の間の小さな差分の人工的増幅を表す。図１０Ｃは、直角差分値プロット機能の結果を表す。差分値プロット機能は、試料間の差分を正確に測定するように設計されるので、温度の関数としてプロットされた蛍光差分値の近接近は、６０野生型試料のうちで有意な類似性を示す（図１０Ｃ）。６０野生型の差分蛍光対温度プロットは、ほぼゼロ蛍光差分に中心を置く単一の太い線として現れる。
【００８４】
図１１を参照すると、本発明の実施形態は、コンピュータシステム１００上で実施することができることが企図される。コンピュータシステム１００は、核酸融解器具１０２、メモリ記憶装置１０４、及び中央処理ユニット（ＣＰＵ）１０６を含む。メモリ記憶装置１０４及びＣＰＵ１０６は、融解器具１０２のハウジング内に一体化することもでき（図示せず）、例示的にはラップトップ又はデスクトップコンピュータとして外部に設けることもできる（図１１）。或いは、システム１００は、高解像度融解曲線を観察、操作及び分析するためのグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）１０８を含むことができる。ユーザ１１０は、融解器具、ＧＵＩ、又はシステム１００のあらゆる他の態様と直接インタフェース接続することができる。メモリ記憶装置１０４は、本明細書に記載した本発明の実施形態そのもの又は本発明の実施形態の均等物であるコンピュータ読み取り可能コードを含む。コンピュータ読み取り可能コードは、本明細書に記載した方法を実行するための命令を含み、当技術分野で公知のあらゆる適切な中央処理装置により実行される。ソフトウェアは、殆どの融解器具が利用可能であり、多くの場合、通常各点の勾配をＳａｌｖｉｔｓｋｙ−Ｇｏｌａｙ多項式推定することにより、プローブ及び産物融解遷移を微分関数のピークとして視覚化することができる。種々の中央処理装置は、異なるコード化言語を実行し、コード化言語は、その構造及び実行で区別されることが多いため、本明細書に記載する方法及び方程式における変形形態も本発明の精神及び範囲に含まれることが企図される。種々の実施形態は、例証として挙げたものであり、本発明の範囲は、本明細書に提供された実施例及び方程式により限定されないことが意図される。本発明は、好ましい実施形態を参照して詳細に記載されたが、請求項で定義した本発明の精神及び範囲に含まれる変形形態及び変更形態がある。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１Ａ】非ラベル化プローブで識別された第Ｖ因子ライデン遺伝子標的の高解像度融解曲線であり、元の融解曲線を示す図である。
【図１Ｂ】非ラベル化プローブで識別された第Ｖ因子ライデン遺伝子標的の高解像度融解曲線であり、指数的バックグラウンド減算の後の遺伝子型決定を示す図である。
【図２Ａ】第Ｖ因子ライデン遺伝子標的の元の融解曲線（上部）及び指数的バックグラウンド減算後の融解曲線及び改良曲線オーバーレイ機能（下部）を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ａの元の融解曲線に試みた以前の曲線オーバーレイ機能の失敗を示す図である。
【図３Ａ】肝リパーゼ遺伝子の分析した融解曲線を示す図であり、生の融解曲線（上部パネル）及び以前の遺伝子型決定関数により試料に遺伝子型決定を試みて失敗したこと（下部パネル）を示す図である。
【図３Ｂ】肝リパーゼ遺伝子の分析した融解曲線を示す図であり、生の融解曲線（上部パネル）及び新しいクラスタリング機能により試料に遺伝子型決定を行って成功した結果（下部パネル）を示す図である。
【図３Ｃ】肝リパーゼ遺伝子の分析した融解曲線を示す図であり、９６ウェル反応プレートと共に図３Ｂの融解曲線（下部パネル）を示す図である。
【図４Ａ】血色素症（ｈｅｍｏｃｈｏｍａｔｏｓｉｓ）遺伝子標的の非ラベル化プローブ及び全単位複製配列遺伝子型決定を示す図であり、高解像度の元の融解曲線の図である。
【図４Ｂ】血色素症（ｈｅｍｏｃｈｏｍａｔｏｓｉｓ）遺伝子標的の非ラベル化プローブ及び全単位複製配列遺伝子型決定を示す図であり、図４Ａの融解曲線の負の微分関数プロットである。
【図４Ｃ】血色素症（ｈｅｍｏｃｈｏｍａｔｏｓｉｓ）遺伝子標的の非ラベル化プローブ及び全単位複製配列遺伝子型決定を示す図であり、図４Ｂの融解曲線の指数的バックグラウンド減算の結果の図である。
【図４Ｄ】血色素症（ｈｅｍｏｃｈｏｍａｔｏｓｉｓ）遺伝子標的の非ラベル化プローブ及び全単位複製配列遺伝子型決定を示す図であり、元の融解曲線を示す図である。
【図４Ｅ】血色素症（ｈｅｍｏｃｈｏｍａｔｏｓｉｓ）遺伝子標的の非ラベル化プローブ及び全単位複製配列遺伝子型決定を示す図であり、図４Ｄのデータの線形基線正規化が失敗したことを示す図である。
【図４Ｆ】血色素症（ｈｅｍｏｃｈｏｍａｔｏｓｉｓ）遺伝子標的の非ラベル化プローブ及び全単位複製配列遺伝子型決定を示す図であり、指数的バックグラウンド減算後の血色素症（ｈｅｍｏｃｈｏｍａｔｏｓｉｓ）遺伝子の遺伝子型決定を示す図である。
【図５Ａ】第Ｖ因子ライデン座及び種々の関数を行った後の不偏階層クラスタリングの高解像度融解曲線を示す図であり、元の融解曲線データを示す図である。
【図５Ｂ】第Ｖ因子ライデン座及び種々の関数を行った後の不偏階層クラスタリングの高解像度融解曲線を示す図であり、元の融解データの負の微分関数を示す図である。
【図５Ｃ】第Ｖ因子ライデン座及び種々の関数を行った後の不偏階層クラスタリングの高解像度融解曲線を示す図であり、図５Ｂのデータに行った線形基線減算を示す図である。
【図５Ｄ】第Ｖ因子ライデン座及び種々の関数を行った後の不偏階層クラスタリングの高解像度融解曲線を示す図であり、図５Ａのデータに指数的バックグラウンド減算関数を行い、その後、正規化して負の微分関数としてプロットしたものを示す図である。
【図６Ａ】非ラベル化プローブ遺伝子型決定と共に第Ｖ因子ライデン座の高解像度融解曲線を示す図であり、元の融解曲線データを示す図である。
【図６Ｂ】非ラベル化プローブ遺伝子型決定と共に第Ｖ因子ライデン座の高解像度融解曲線を示す図であり、図６Ａのデータに行った負の微分関数プロットの結果を示す図である。
【図６Ｃ】非ラベル化プローブ遺伝子型決定と共に第Ｖ因子ライデン座の高解像度融解曲線を示す図であり、図６Ｂのデータに示される領域の勾配を用いて指数的バックグラウンド減算した後のプローブ領域の負の微分関数プロットを示す図である。
【図６Ｄ】非ラベル化プローブ遺伝子型決定と共に第Ｖ因子ライデン座の高解像度融解曲線を示す図であり、図６Ｃのデータにクラスタリング機能により行われた３つの遺伝子型のクラスタリングを示す図である。
【図７Ａ】嚢胞性線維症相互コンダクタンス調節（ＣＦＴＲ）遺伝子のエクソン１１の走査及び遺伝子型決定データを示す図であり、非ラベル化プローブ下で分析されたバリアント配列を示す図である。
【図７Ｂ】嚢胞性線維症相互コンダクタンス調節（ＣＦＴＲ）遺伝子のエクソン１１の走査及び遺伝子型決定データを示す図であり、指数的バックグラウンド減算後の正規化融解曲線を示す図である。
【図７Ｃ】嚢胞性線維症相互コンダクタンス調節（ＣＦＴＲ）遺伝子のエクソン１１の走査及び遺伝子型決定データを示す図であり、プローブ領域の負の微分関数プロットを示す図である。
【図７Ｄ】嚢胞性線維症相互コンダクタンス調節（ＣＦＴＲ）遺伝子のエクソン１１の走査及び遺伝子型決定データを示す図であり、ＰＣＲ産物融解遷移の差分値プロットを示す図である。
【図８Ａ】ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１０の高解像度融解曲線を示す図であり、プローブ下のバリアント配列を示す図である。
【図８Ｂ】ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１０の高解像度融解曲線を示す図であり、指数的バックグラウンド減算後の正規化融解曲線を示す図である。
【図８Ｃ】ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１０の高解像度融解曲線を示す図であり、図８Ｂのデータに行った負の微分関数プロットを示す図である。
【図８Ｄ】ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１０の高解像度融解曲線を示す図であり、ＰＣＲ産物融解遷移の差分値プロットを示す図である。
【図９Ａ】ＨｂＳ及びＨｂＣ  ＳＮＰ座を含むβグロブリン単位複製配列に対する元の融解曲線を示す図である。
【図９Ｂ】指数的バックグラウンド減算後の融解曲線データを示す図である。
【図９Ｃ】図９Ｂの正規化融解曲線のクラスタ化した遺伝子型を示す図である。
【図１０Ａ】第Ｖ因子ライデン座の６０の試料野生型の高解像度融解曲線を示す図であり、指数的バックグラウンド減算後の正規化融解曲線の図である。
【図１０Ｂ】第Ｖ因子ライデン座の６０の試料野生型の高解像度融解曲線を示す図であり、以前の垂直差分値プロット技術後の差分値プロットを示す図である。
【図１０Ｃ】第Ｖ因子ライデン座の６０の試料野生型の高解像度融解曲線を示す図であり、直角差分値プロット技術後の差分値プロットを示す図である。
【図１１】核分析システムの例示的な実施例のブロック図である。
【図１Ａ】
2009508530.tif 000010
【図１Ｂ】
2009508530.tif 000011
【図２Ａ】
2009508530.tif 000012
【図２Ｂ】
2009508530.tif 000013
【図３Ａ】
2009508530.tif 000014
【図３Ｂ】
2009508530.tif 000015
【図３Ｃ】
2009508530.tif 000016
【図４Ａ】
2009508530.tif 000017
【図４Ｂ】
2009508530.tif 000018
【図４Ｃ】
2009508530.tif 000019
【図４Ｄ】
2009508530.tif 000020
【図４Ｅ】
2009508530.tif 000021
【図４Ｆ】
2009508530.tif 000022
【図５Ａ】
2009508530.tif 000023
【図５Ｂ】
2009508530.tif 000024
【図５Ｃ】
2009508530.tif 000025
【図５Ｄ】
2009508530.tif 000026
【図６Ａ】
2009508530.tif 000027
【図６Ｂ】
2009508530.tif 000028
【図６Ｃ】
2009508530.tif 000029
【図６Ｄ】
2009508530.tif 000030
【図７Ａ】
2009508530.tif 000031
【図７Ｂ】
2009508530.tif 000032
【図７Ｃ】
2009508530.tif 000033
【図７Ｄ】
2009508530.tif 000034
【図８Ａ】
2009508530.tif 000035
【図８Ｂ】
2009508530.tif 000036
【図８Ｃ】
2009508530.tif 000037
【図８Ｄ】
2009508530.tif 000038
【図９Ａ】
2009508530.tif 000039
【図９Ｂ】
2009508530.tif 000040
【図９Ｃ】
2009508530.tif 000041
【図１０Ａ】
2009508530.tif 000042
【図１０Ｂ】
2009508530.tif 000043
【図１０Ｃ】
2009508530.tif 000044
【図１１】
2009508530.tif 000045
【配列表】
2009508530000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年5月22日(2008.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料の融解プロファイルを分析するための方法であって、
核酸と、該核酸を結合して蛍光的に検出可能な複合体を形成する分子とを含む前記核酸試料の蛍光を温度の関数として測定して、バックグラウンド蛍光信号及び核酸試料信号を含む生の融解曲線を生成する段階と、
指数関数アルゴリズムを用いることにより前記核酸試料信号から前記バックグラウンド信号を分離し、前記核酸試料信号を含む補正融解曲線を生成する段階と、
を含む方法。
【請求項２】
試料核酸融解が生じていない前記生の融解曲線上の点から取られた第１及び第２の勾配値を用いて、前記指数関数アルゴリズムを導くことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バックグラウンド蛍光信号が、減少指数関数をバックグラウンド蛍光対温度曲線にフィットすることにより算出され、前記減少指数関数が、前記核酸融解遷移前の点から取られた第１の勾配値と前記核酸融解遷移後の点から取られた第２の勾配値とから導かれる、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記バックグラウンド信号を前記試料信号から分離する段階が、
前記試料融解によって生じたものではない前記生の融解曲線の領域から得られた、前記生の融解曲線又はその微分関数の第１の勾配値及び第２の勾配値を測定する段階と、
前記第１の値及び前記第２の値を用いてバックグラウンド雑音を表す指数関数を求める段階と、
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
差分値機能を実施して、前記補正融解曲線と第２の核酸試料の補正融解曲線との間の差分値を識別する段階を更に含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
複数の付加的な核酸試料の遺伝子型をクラスタ化する段階を更に含み、
前記クラスタ化段階が、別個のクラスタの前記試料融解プロファイル間の最小距離を関連付けることにより動的に行うことを特徴とする、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記指数的バックグラウンド信号が、方程式
ｅa(TR-TL)＝Ｂ’（ＴR）／Ｂ’（ＴL）
（ここで、
2009508530.tif 000046
Ｂ’（ＴL）は第１の勾配値、
Ｂ’（ＴR）は第２の勾配値）
を用いて計算され、
前記減算段階が、方程式
Ｍ（Ｔ）＝Ｆ（Ｔ）−Ｃｅa(T-TL)
（ここで、
Ｍ（Ｔ）は核酸試料信号、
Ｆ（Ｔ）は生の融解曲線、
Ｃ＝Ｂ’（ＴL）／ａ）
を用いる段階を含む、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸試料が、ＰＣＲ反応の２本鎖産物である、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸試料は、既知の配列変異について遺伝子型が決定され、未知の配列変異について走査される、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記融解プロファイルが、ＰＣＲ産物及び非ラベル化プローブの両方に対する融解遷移を含む、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が多重単位複製配列を含む、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
１つ又はそれ以上の配列バリアントが、前記核酸内に存在することができ、前記バリアントは、前記融解曲線又はその微分関数から識別される、
ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料の補正融解曲線及び第２の試料の補正融解曲線に対して、単一のデータ点を必要とする曲線オーバーレイ機能を実施する段階を更に含む、
ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記差分値機能が、方程式：ｆ1（Ｔ）−ｆ2（Ｔ）＝ｍａｘ｛√（１＋ｆ1’（Ｔ）2）、√（１＋ｆ2’（Ｔ）2）｝を用いることにより、前記補正融解曲線と前記第２の試料の補正融解曲線との間の直角距離を近似する、
ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記差分値機能が、前記補正融解曲線及び前記第２の試料の補正融解曲線の融解領域に対する過剰強調を補償する、
ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
前記差分値機能が、前記補正融解曲線及び前記２の試料の補正融解曲線の主要融解領域の過小強調を補償する、
ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＣＲ反応が、非対称で、第２の産物鎖よりも第１の産物鎖を多く生成し、前記ＰＣＲが、前記第１の産物鎖にハイブリダイズするように構成された非ラベル化プローブ存在下で行われる、
ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
前記差分値機能が、前記第１の試料の融解曲線と前記第２の試料の融解曲線との間の配列依存変異を反映する差分メトリックを生成する、
ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記差分値機能が、前記第１の試料に対応する遺伝子型と、前記第２の試料に対応する遺伝子型とを識別する、
ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記バックグラウンド信号が、減少指数関数を生の蛍光対温度曲線の勾配にフィットすることにより算出され、前記減少指数関数が、試料融解が生じていない前記融解曲線プロファイル上に位置する少なくとも２つの勾配値により前記融解曲線プロファイルにフィットされる、
ことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
核酸試料の遺伝子型をクラスタ化する段階を更に含み、
前記クラスタ化段階が、別個のクラスタの試料融解曲線間の最小距離を関連付けることにより動的に行うことを特徴とする、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
核酸試料を分析するためのシステムであって、
試料温度の関数として試料蛍光を決定するため前記試料温度及び試料蛍光を測定及び記録してバックグラウンド蛍光信号及び試料蛍光信号を含む融解プロファイルを生成するように適合された、核酸及び蛍光種を含む蛍光的に検出可能な複合体をその蛍光を監視しながら加熱するための高解像度融解器具と、
コンピュータ実行可能な命令を実施するための中央処理ユニット（ＣＰＵ）と、
前記ＣＰＵによって実行されたときに、配列変異について前記核酸を分析する処理を前記ＣＰＵに行わせるコンピュータ実行可能な命令を記憶するためのメモリ記憶装置と、
を備え、
前記処理が、指数関数アルゴリズムを用いて前記融解プロファイルからバックグラウンド蛍光信号を分離して、試料信号を有する補正融解曲線を生成する段階を含む、
ことを特徴とするシステム。
【請求項２３】
前記試料信号から前記バックグラウンド蛍光信号を分離する段階が、
試料融解によって生じたものではない前記融解プロファイルの領域から各々得られた前記融解プロファイルの第１の勾配値及び第２の勾配値を測定する段階と、
前記融解プロファイルのＴｍよりも高い温度の点から取られた前記第１の勾配値及び前記第２の勾配値を用いてバックグラウンド蛍光を表す指数関数を求める段階と、
を含む、
ことを特徴とする請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
差分値機能を実施して、前記補正試料融解曲線と第２の補正試料融解曲線との間の差分値を識別する段階を更に含み、
前記バックグラウンド蛍光が、前記第１の補正試料融解曲線及び前記第２の補正試料融解曲線から以前に分離されていたものである、
ことを特徴とする請求項２２に記載のシステム。
【請求項２５】
前記バックグラウンド信号が、減少指数関数をバックグラウンド蛍光対温度曲線にフィットすることにより算出され、前記減少指数関数が、試料融解が生じていない前記融解プロファイル上に位置する少なくとも２つの勾配値により前記融解プロファイルにフィットされる、
ことを特徴とする請求項２２に記載のシステム。
【請求項２６】
複数の核酸試料の遺伝子型をクラスタ化する段階を更に含み、
前記クラスタ化段階が、別個のクラスタの前記試料融解曲線間の最小距離を関連付けることにより動的に行うことを特徴とする、
請求項２２に記載のシステム。
【請求項２７】
前記システムが、既知の突然変異体の遺伝子型を決定し、未知の突然変異体を走査するように構成されている、
ことを特徴とする請求項２２に記載のシステム。
【請求項２８】
前記差分値機能が、前記補正試料融解曲線及び前記第２の補正試料融解曲線の融解領域に対する過剰強調を補償する、
ことを特徴とする請求項２４に記載のシステム。
【請求項２９】
前記差分値機能が、前記補正試料融解曲線及び前記第２の補正試料融解曲線の主要融解領域の過小強調を補償する、
ことを特徴とする請求項２４に記載のシステム。
【請求項３０】
前記ＣＰＵが、前記補正試料融解曲線及び前記第２の補正試料融解曲線に対し曲線オーバーレイ機能を実施し、前記曲線オーバーレイ機能が単一のデータ点を必要とし、前記曲線オーバーレイ機能が、試料融解曲線間を識別可能な特徴を生成する、
ことを特徴とする請求項２４に記載のシステム。
【請求項３１】
前記指数的バックグラウンド信号が、方程式
ｅa(TR-TL)＝Ｂ’（ＴR）／Ｂ’（ＴL）
（ここで、
2009508530.tif 000047
Ｂ’（ＴL）は第１の勾配値、
Ｂ’（ＴR）は第２の勾配値）
を用いて計算され、
前記減算段階が、方程式
Ｍ（Ｔ）＝Ｆ（Ｔ）−Ｃｅa(T-TL)
（ここで、
Ｍ（Ｔ）は試料信号、
Ｆ（Ｔ）は融解曲線プロファイル、
Ｃ＝Ｂ’（ＴL）／ａ）
を用いる段階を含む、
ことを特徴とする請求項２３に記載のシステム。
【請求項３２】
前記ＣＰＵが、複数の２本鎖核酸試料の遺伝子型のクラスタ化を実施し、前記クラスタ化が、別個の遺伝子型クラスタの前記試料の融解曲線間の最小距離を関連付けることにより動的に行う、
ことを特徴とする請求項２３に記載のシステム。
【請求項３３】
指数的バックグラウンド信号方程式と試料信号との合計である信号関数を有するデータセットを分析する方法であって、
信号の全ての変化が前記指数的バックグラウンド信号に起因する前記信号関数の２つの領域から第１及び第２の勾配値を識別する段階と、
前記勾配値を用いて前記指数的バックグラウンド信号方程式を算出する段階と、
前記信号関数から前記指数的バックグラウンド信号方程式を減算して前記試料信号を識別する段階と、
を含む方法。
【請求項３４】
前記指数的バックグラウンド信号が、方程式
ｅa(TR-TL)＝Ｂ’（ＴR）／Ｂ’（ＴL）
（ここで、
2009508530.tif 000048
Ｂ’（ＴL）は第１の勾配値、
Ｂ’（ＴR）は第２の勾配値）
を用いて計算され、
前記減算段階が、方程式
Ｍ（Ｔ）＝Ｆ（Ｔ）−Ｃｅa(T-TL)
（ここで、
Ｍ（Ｔ）は試料信号、
Ｆ（Ｔ）は信号関数、
Ｃ＝Ｂ’（ＴL）／ａ）
を用いる段階を含む、
ことを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
融解プロットの各々に対し、指数的バックグラウンド減算、曲線オーバーレイ機能、差分値プロット機能、及びクラスタリング機能から成る群から選択されるアルゴリズムを受けさせる段階を含む複数の融解プロットを分析する方法。
【請求項３６】
前記アルゴリズムが前記指数的バックグラウンド減算であり、前記指数的バックグラウンド減算が、
方程式
ｅa(TR-TL)＝Ｂ’（ＴR）／Ｂ’（ＴL）
（ここで、
2009508530.tif 000049
Ｂ’（ＴL）は第１の勾配値、
Ｂ’（ＴR）は第２の勾配値）
を用いて計算され、
前記減算段階が、方程式
Ｍ（Ｔ）＝Ｆ（Ｔ）−Ｃｅa(T-TL)
（ここで、
Ｍ（Ｔ）は試料信号、
Ｆ（Ｔ）は信号関数、
Ｃ＝Ｂ’（ＴL）／ａ）
を用いる段階を含む、
ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記アルゴリズムが前記曲線オーバーレイ機能であり、前記複数の融解プロットが、方程式
2009508530.tif 000050
（ここで、ｆ（ｚ）及びｇ（ｚ）は、２つの正規化蛍光値の間の切片を表し、ｃは、平均差分（ｘ1（ｙ）＋ｃ）−ｘ2（ｙ）をゼロに等しくなるようにする定数である）
を用いることによりシフトされる、
ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記アルゴリズムが前記差分値プロット機能であり、前記複数の融解プロットの第１の融解プロットと第２の融解プロットとの間の差分が、ｆ1（Ｔ）−ｆ2（Ｔ）＝ｍａｘ｛√（１＋ｆ1’（Ｔ）2），√（１＋ｆ2’（Ｔ）2）｝を用いて近似される、
ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記アルゴリズムが前記クラスタリング機能であり、前記クラスタリング機能が、数学的表現
ｍｉｎ＿｛ｆ1εＣ1，ｆ2εＣ2｝
（ここで、｜｜ｆ１−ｆ２｜｜であり、更に、ｆ1は、サブクラスタＣ1に関連する融解曲線を表す）
を有する、
ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記アルゴリズムが前記指数的バックグラウンド減算であり、前記方法が、
前記曲線オーバーレイ機能、前記差分値プロット機能、及び前記クラスタリング機能を実施する段階を更に含む、
ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【国際調査報告】
2009508530.tif 000051
2009508530.tif 000052