(57)【要約】  本発明は水溶性コンジュゲートならびに診断および検出アッセイにおけるその使用方法を提供する。検出および定量アッセイのための装置も提供する。種々の実施形態において、該コンジュゲートはイムノアッセイおよび側方流動アッセイにおいて有用である。本発明は、より高い収率、および該アッセイにおける、より高い感度をもたらす、該コンジュゲートの製造方法を提供する。本発明はまた、非常に高い感度でアナライトを検出しうる電気化学的シグナル成分を利用する水溶性コンジュゲートを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの担体成分、
少なくとも１つの連結成分、
該連結成分を介して該担体成分に共有結合した少なくとも１つの電気化学的シグナル成分、
検出すべきリガンドに関する少なくとも１つの標的化要素または検出すべき少なくとも１つのリガンド
を含んでなる水溶性コンジュゲート。
【請求項２】
該連結成分を介して該担体成分に結合したスペーサー成分を更に含む、請求項１記載の水溶性コンジュゲート。
【請求項３】
該スペーサーが、タンパク質、ポリペプチド、ウシ血清アルブミン、オボアルブミンまたはグロブリンよりなる群から選ばれる、請求項２記載の水溶性コンジュゲート。
【請求項４】
該担体が、デキストラン、デンプン、グリコーゲン、アガロース、セルロース、天然ゴムおよびこれらの混合物よりなる群から選ばれ、
検出すべきリガンドに関する少なくとも１つの標的化要素または検出すべき少なくとも１つのリガンドが該連結成分を介して該担体に結合している、請求項１記載の水溶性コンジュゲート。
【請求項５】
該担体がデキストランである、請求項４記載の水溶性コンジュゲート。
【請求項６】
該連結成分がジビニルスルホンである、請求項１記載の水溶性コンジュゲート。
【請求項７】
該電気化学的シグナル成分が、基質または反応メディエーターを、電気化学的に検出可能な種に変換する酵素である、請求項１記載の水溶性コンジュゲート。
【請求項８】
該酵素が、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、コリンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼよりなる群から選ばれる、請求項７記載の水溶性コンジュゲート。
【請求項９】
該基質または反応メディエーターが、４−アミノフェニルホスファート、１−ナフチルホスファート、グルコース−６−ホスファート、４−ヒドロキシナフチル−１２−ホスファート、３−インドキシルホスファート、フェニルホスファート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファートエステル、６−（Ｎ−フェロセノイルアミノ）−２，４−ジメチルフェニルホスファート、パラセタモール（ｐａｒａｃｅｔａｍｏｌ）ホスファート、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ヒドロキノン、ＮＡＤ＋およびグルコース−６−ホスファート、アセチルチオコリンヨージド、４−アミノフェニル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＡＰＧ）、グルコースおよびコリンよりなる群から選ばれ、
電気化学的に検出可能な種が、１−ナフトールおよびベンゾキノンよりなる群から選ばれる、請求項８記載の水溶性コンジュゲート。
【請求項１０】
電気化学的シグナル成分が該スペーサーに共有結合しており、
検出すべきリガンドまたは検出すべきリガンドに関する標的化要素が該連結成分を介して該担体に共有結合している、請求項２記載の水溶性コンジュゲート。
【請求項１１】
検出すべきリガンドに関する標的化要素が、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、受容体分子、レクチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびビオチンよりなる群から選ばれる、請求項１記載の水溶性コンジュゲート。
【請求項１２】
該リガンドが、抗原、ハプテン、遺伝子プローブ、オリゴ−またはポリヌクレオチド、単糖、オリゴ糖または多糖、ホルモン、薬理学的物質、ペプチド、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、増殖因子およびタンパク質よりなる群から選ばれる、請求項１記載の水溶性コンジュゲート。
【請求項１３】
該リガンドが、細菌またはウイルス抗原、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ろ胞刺激ホルモン、コルチゾン、Ｔ３、Ｔ４、乱用の薬物、トロポニンＩ、トロポニンＴ、高感受性Ｃ反応性タンパク質（ｈｓＣＲＰ）、ＣＫ−ＭＢ、ミオグロブリン、ＮＴ−プロＢＮＰ、Ｂ型ナトリウム利尿性ペプチド（ＢＮＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびアルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）よりなる群から選ばれる、請求項１記載の水溶性コンジュゲート。
【請求項１４】
少なくとも１つの連結成分を含有する担体成分を少なくとも１つの電気化学的シグナル成分と接触させて、水溶性中間体コンジュゲートを形成させ、
該水溶性中間体コンジュゲートを、リガンドまたは検出すべきリガンドに関する標的化要素と接触させて、水溶性コンジュゲートを形成させることを含んでなる、水溶性コンジュゲートの製造方法。
【請求項１５】
担体成分：電気化学的シグナル成分のモル比が１：１０またはそれ以上である、請求項１４記載の製造方法。
【請求項１６】
該担体成分がデキストランであり、該電気化学的シグナル成分がホースラディッシュペルオキシダーゼである、請求項１４記載の製造方法。
【請求項１７】
該水溶性中間体コンジュゲートを該標的化要素と接触させて該水溶性コンジュゲートを形成させる工程が、沈殿物の形態で形成される水溶性コンジュゲートを与える、請求項１４記載の製造方法。
【請求項１８】
該水溶性コンジュゲートを形成させた後、該沈殿物を音波処理に付すことを更に含む、請求項１７記載の製造方法。
【請求項１９】
該担体が、デキストラン、デンプン、グリコーゲン、アガロース、セルロース、天然ゴムおよびそれらの混合物よりなる群から選ばれる、請求項１４記載の製造方法。
【請求項２０】
該連結成分がジビニルスルホンである、請求項１４記載の製造方法。
【請求項２１】
該電気化学的シグナル成分が、基質または反応メディエーターを、電気化学的に検出可能な種に変換する酵素である、請求項１４記載の製造方法。
【請求項２２】
該酵素が、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、コリンオキシダーゼ、カタラーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼよりなる群から選ばれる、請求項２１記載の製造方法。
【請求項２３】
該基質または反応メディエーターが、４−アミノフェニルホスファート、１−ナフチルホスファート、グルコース−６−ホスファート、４−ヒドロキシナフチル−１２−ホスファート、３−インドキシルホスファート、フェニルホスファート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファートエステル、６−（Ｎ−フェロセノイルアミノ）−２，４−ジメチルフェニルホスファート、パラセタモール（ｐａｒａｃｅｔａｍｏｌ）ホスファート、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ヒドロキノン、ＮＡＤ＋およびグルコース−６−ホスファート、アセチルチオコリンヨージド、４−アミノフェニル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＡＰＧ）、グルコース、コリン、フェロセンおよびフェリシアニドよりなる群から選ばれ、
電気化学的に検出可能な種が、４−アミノフェノール、１−ナフトール、ベンゾキノン、フェリシアニドおよびチオコリンよりなる群から選ばれる、請求項２２記載の製造方法。
【請求項２４】
検出すべきリガンドに関する標的化要素が、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、受容体分子、レクチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびビオチンよりなる群から選ばれる、請求項１４記載の製造方法。
【請求項２５】
該リガンドが、抗原、ハプテン、遺伝子プローブ、オリゴ−またはポリヌクレオチド、単糖、オリゴ糖または多糖、ホルモン、薬理学的物質、ペプチド、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、増殖因子、タンパク質またはそれらの混合物よりなる群から選ばれる、請求項１４記載の製造方法。
【請求項２６】
検出すべきアナライトに対する特異的結合性分子で被覆された表面をサンプルと接触させること、
検出すべきアナライトに対する特異的結合性分子で被覆された表面を、
少なくとも１つの担体成分、
少なくとも１つの連結成分、
該担体成分に共有結合した少なくとも１つの電気化学的シグナル酵素、
検出すべきアナライトに関する少なくとも１つの標的化要素
を含む水溶性コンジュゲートと接触させること、
該表面上に被覆された該特異的結合性分子、該アナライトおよび該水溶性コンジュゲートの結合性複合体を形成させること、
該結合性複合体を、該電気化学的シグナル酵素の基質と接触させて産物溶液を形成させること、
サンプル中のアナライトの存在または非存在を決定すること
を含んでなる、サンプル中のアナライトの存在または量の検出方法。
【請求項２７】
該特異的結合性分子が抗体またはそのフラグメントであり、
該電気化学的シグナル酵素が、アルカリホスファターゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼよりなる群から選ばれ、
該基質が、１−ナフチルホスファートおよびヒドロキノンよりなる群から選ばれる、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
該表面が磁気ビーズである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
該産物溶液を電極と接触させることを更に含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
該表面が電極である、請求項２７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断アッセイにおいて有用な水溶性コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の組成物、該コンジュゲートの製造方法および使用方法、イムノアッセイ、側方流動アッセイならびに試験装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
家庭用妊娠・妊性検査のような免疫化学的アッセイにおいて使用された場合に高い感度および特異性を示すコンジュゲートを製造するための優れた方法が依然として必要とされている。
【０００３】
イムノアッセイの感度および信頼性を改善するための種々の方法がＬ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ（１９９４）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４０，３４７−３５７に概説されている。
【０００４】
ＥＰ  ０  ５９４  ７７２  Ｂ１は、ジビニルスルホンに由来する部分を含む、重合体に基づく水溶性コンジュゲートに関するものである。ＥＰ  ０  ５９４  ７７２  Ｂ１は、いわゆる「塩析」効果を利用することにより、水溶性担体分子への抗体および抗原のような分子種の結合を増強する可能性を記載している。しかし、塩濃度を約１Ｍに増加させることにより、不可逆的な沈殿物が生じることが判明した。
【０００５】
Ｌｉｈｍｅら，米国特許第６，６２７，４６０号は、水溶性架橋コンジュゲートの方法およびその使用方法を提供するものである。該特許は、反応混合物中の塩の濃度を更に増加させる方法を提供するものであり、これは、側方流動装置のような種々の免疫化学的アッセイにおいて有用である水溶性コンジュゲートを含有する可逆的（すなわち、再溶解可能）な沈殿物の生成を引き起こす。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、診断および検出アッセイに使用する水溶性コンジュゲートの組成物ならびにその製造方法および使用方法を提供する。種々の実施形態において、該コンジュゲートはイムノアッセイおよび側方流動アッセイにおいて有用である。本発明は、該コンジュゲートの製造における、より高い収率、および該アッセイにおける、より高い感度をもたらす、該コンジュゲートの製造方法を提供する。本発明はまた、より経済的に製造されうる水溶性コンジュゲートを提供する。本発明はまた、関心のある種々のリガンドの検出および定量アッセイの実施において使用する装置を提供する。本発明はまた、電気化学的検出法を利用し非常に高い感度を有する水溶性コンジュゲートを提供する。
【０００７】
水溶性コンジュゲートの製造方法は米国特許第６，６２７，４６０号（すべての表、図面および特許請求の範囲を含むその全体を参照により本明細書に組み入れることとする）において考察されている。これらの方法は一般に、担体成分、連結成分、スペーサー成分、シグナル成分および検出すべきリガンドに関する標的化要素または検出すべきリガンド（一次標的化成分）を有する水溶性コンジュゲートの製造を含む。該シグナル成分は該スペーサー成分に共有結合しており、該スペーサー成分は該連結成分を介して該担体成分に共有結合している。該方法は、ａ）担体成分、連結成分、スペーサー成分およびシグナル成分（該シグナル成分は該スペーサー成分に共有結合しており、該スペーサー成分は該連結成分を介して該担体成分に共有結合している）を有する水溶性中間体コンジュゲートを少なくとも１つの一次標的化成分（検出すべきリガンドに関する標的化要素または検出すべきリガンド）と反応させることを含む。該反応は、水溶液中、連結成分に由来する未反応の反応性部分で生じる。該条件は、可逆的沈殿物が生成する条件である。該水溶性コンジュゲートを含有する可逆的沈殿物を水性溶媒に再溶解させ、ｃ）場合によっては、該水溶性架橋コンジュゲートを精製工程に付す。反応パラメーターの更なる詳細は米国特許第６，６２７，４６０号（すべての表、図面および特許請求の範囲を含むその全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。種々の実施形態において、該コンジュゲートは、より大きなコンジュゲート分子を形成するよう互いに架橋されうる。
【０００８】
該水溶性コンジュゲートの配置の具体例を本明細書に記載するが、他の配置も可能である。例えば、後記のとおり、該標的化要素は該リンカーを介して該担体に結合されることが可能であり、あるいは該スペーサーまたは非特異的タンパク質に結合されることが可能である。また、該シグナル成分は該担体または該スペーサー、あるいは更には該標的化要素に結合されうる。成分の厳密な配置は、試薬として機能する水溶性コンジュゲートを与えるよう、ならびに該アッセイが行われ有用な結果をもたらすよう任意の様態で変更されうる。
【０００９】
第１の態様において、本発明は、ａ）少なくとも１つの担体、少なくとも１つのリンカー、少なくとも１つのシグナル成分および検出すべきリガンドに関する少なくとも１つの標的化要素または検出すべきリガンドを有する水溶性コンジュゲートを懸濁液中の可逆的沈殿物として製造することを含む、水溶性コンジュゲートの製造方法を提供する。該懸濁液を音波処理に付して音波処理調製物を得、該水溶性コンジュゲートを含有する該調製物から上清を分離する。場合によっては、該水溶性コンジュゲートを該上清から精製することが可能である。１つの実施形態においては、該水溶性コンジュゲートをゲル濾過（またはサイズ排除）クロマトグラフィーにより精製する。１つの実施形態においては、３００ｋＤの平均サイズ排除を有する媒体を使用して、該ゲル濾過クロマトグラフィーを行う。
【００１０】
本明細書に記載されている本発明の種々の実施形態においては、該水溶性コンジュゲートはスペーサー成分をも含有しうる。１つの実施形態においては、該担体は該リンカーに共有結合しており、該シグナル成分は該スペーサーに共有結合している。該水溶性コンジュゲートは、水溶性中間体コンジュゲートを、少なくとも約１．２５Ｍの濃度のリオトロピック塩の存在下、検出すべきリガンドまたはリガンドに関する標的化要素と接触させることにより製造されうる。他の実施形態においては、該リオトロピック塩の濃度は少なくとも約１．５Ｍまたは少なくとも約１．７５Ｍまたは少なくとも約２．０Ｍまたは少なくとも約２．５Ｍでありうる。「水溶性コンジュゲート」は、担体、リンカー、検出すべきリガンドに関する標的化要素または検出すべきリガンド、シグナル成分を含有し、場合によっては、スペーサー成分をも含有しうる。「水溶性中間体コンジュゲート」は、担体、リンカーおよびシグナル成分を含有する分子を意味する。水溶性中間体コンジュゲートはスペーサー成分をも含有しうる。「水溶性中間体前駆体」は、水溶性コンジュゲートの成分の任意の２以上を有し水溶性コンジュゲートでも中間体コンジュゲートでもない分子を意味する。１つの実施形態においては、該水溶性中間体前駆体は担体およびリンカーを含有する。もう１つの実施形態においては、該前駆体は該担体、リンカーおよびスペーサーを含有する。１つの実施形態においては、該水溶性中間体コンジュゲートは該担体、リンカー、シグナル成分およびスペーサー成分を含有する。「音波処理」は、高周波音エネルギーにさらす、化学および生物学において用いられる公知技術を意味する。これは超音波処理を意味することもある。音波処理は、任意の適当な出力、例えば少なくとも約３００ワットまたは少なくとも約５００ワットまたは少なくとも約７００ワットまたは少なくとも約９００ワットまたは少なくとも約１０００ワットまたは１０００ワット超で行われうる。任意の望ましい周波数、例えば２０〜２４ｋＨｚが用いられうる。本明細書中で用いる「約」なる語はプラスまたはマイナス１０％を意味する。「可逆的沈殿物」なる語は、生じた沈殿物を２５℃の水溶液に溶解させると、それが再溶解しうることを示すものである。
【００１１】
リオトロピック塩は、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびアンモニウムの硫酸塩、リン酸塩、クエン酸塩および酒石酸塩のような成分を含有することが可能であり、約２．５Ｍの濃度で存在しうる。１つの実施形態においては、該塩はリン酸カリウムまたはリン酸ナトリウムである。
【００１２】
本文脈において、該コンジュゲートに関して用いる「水溶性」なる語は、得られたコンジュゲートが水のような水性媒体に室温で可溶性であるべきであること、すなわち、本明細書に開示されている方法により得られた架橋コンジュゲートが、サンプルの目視検査による判断で実質的に透明で均一である溶液を与えるべきであることを意味する。
【００１３】
種々の実施形態において、得られたコンジュゲートは、２５℃の水１ｍｌ当たり少なくとも０．１、または少なくとも０．２、または少なくとも０．５、または少なくとも１、または少なくとも３、または少なくとも５、または少なくとも７、または５〜１０、または４〜１１、または少なくとも１０、または少なくとも２０、または少なくとも３０、または少なくとも４０、または少なくとも５０、または少なくとも１００、および特に少なくとも２００ｍｇの乾燥コンジュゲートの、水への溶解度を有する。本発明はまた、本発明の任意の方法に従い製造された水溶性コンジュゲートを提供する。
【００１４】
もう１つの態様において、本発明は、本明細書に記載の水溶性コンジュゲートを懸濁液中の沈殿物として製造することを含む、水溶性コンジュゲートの製造方法を提供する。該水溶性コンジュゲートを含有するペレットを該懸濁液から分離し、該ペレットを水溶液で洗浄して、第２の懸濁液を得る。該水溶性コンジュゲートを含有する第２の懸濁液からペレットを分離する。これらの方法に従い製造された水溶性コンジュゲートは、本明細書に記載のコンジュゲートと同じ構造を有しうる。例えば、該コンジュゲートは更にスペーサーを含有することが可能であり、該スペーサーは該リンカーに共有結合していることが可能であり、該シグナル成分は該スペーサーに共有結合していることが可能である。
【００１５】
１つの実施形態においては、該水溶性コンジュゲートは、該沈殿物を上清から分離し水溶液中の該沈殿物の懸濁液を形成させ該沈殿物を上清から分離する方法により精製される。該コンジュゲートは、リンカーを介して該担体に結合した非特異的タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン、免疫グロブリン）を含有しうる。１つの実施形態においては、該標的化要素は、還元剤で処理された抗体である。「還元剤」は、電子を供与することにより他の物質を化学的に還元する物質を意味する。還元剤の具体例には、ベータ−メルカプトエタノール、ジチオトレイトールおよび２−イミノチオランが含まれる。「ペレットの洗浄」は、ペレットを水溶液と接触させて配置し攪拌することを意味する。攪拌は、任意の方法により、例えば容器をボルテックスまたは攪拌または振とうすることにより行われうる。該ペレットの一部が攪拌中に最初のペレットから破断することがあり、それは遠心分離または他の方法により再ペレット化されうる。もう１つの実施形態においては、水溶液で洗浄した後、該水溶性コンジュゲートに対して、更なる精製工程を行わない。
【００１６】
１つの実施形態においては、該水溶性コンジュゲートを遠心分離により上清から分離するが、遠心分離は、該方法を実施するために必要なわけではない。また、該コンジュゲートはゲル濾過のような任意の簡便な技術により上清から精製されうる。「上清」はサンプルの液体部分を意味する。
【００１７】
もう１つの態様において、本発明は、担体、該担体に共有結合したリンカー、シグナル成分、検出すべきリガンドに関する標的化要素または検出すべきリガンドおよび非特異的タンパク質を含有する水溶性コンジュゲートを提供する。１つの実施形態においては、該非特異的タンパク質は該リンカーを介して該担体に共有結合している。もう１つの実施形態においては、該非特異的タンパク質は該リンカーを介して該担体に結合しており、該コンジュゲートの（該リンカー以外の）他のいずれの成分にも結合していない。他の実施形態においては、該非特異的タンパク質の少なくとも２％または少なくとも３％または少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％が該リンカーを介して該担体に結合しており、該コンジュゲートの（該リンカー以外の）他のいずれの成分にも結合していない。他の実施形態においては、該非特異的タンパク質の少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも７０％または少なくとも７５％または少なくとも８０％または少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％が該リンカーを介して該担体に結合しており、該コンジュゲートの（該リンカー以外）の他のいずれの成分にも結合していない。関連実施形態においては、前記で挙げられているのと同じ比率（％）のリンカーの全てが非特異的タンパク質に結合しており、該非特異的タンパク質は該リンカーに結合しており、該水溶性コンジュゲートの他のいずれの成分にも結合していない。任意の該水溶性コンジュゲートはスペーサー成分をも含有しうる。
【００１８】
「非特異的タンパク質」は、それが用いられる状況において結合特異性または標的を有さないタンパク質である。該非特異的タンパク質は、典型的には、連結化学法により、該水溶性コンジュゲートに連結される。ウシ血清アルブミン、免疫グロブリン、キーホールリンペットヘモシアニンおよび他のタンパク質は非特異的タンパク質の具体例である。１つの実施形態においては、該非特異的タンパク質は、（スペーサーが存在する場合に）スペーサーとして使用されるタンパク質以外のタンパク質であるが、該スペーサーおよび非特異的タンパク質は、異なる機能を達成するために使用される同じタンパク質であることも可能である。該非特異的タンパク質は、該非特異的タンパク質を該コンジュゲートに共有結合させるために用いられるアミノ基を含有しうるが、他の適当な連結化学法も用いられうる。もう１つの実施形態においては、該スペーサーおよび該非特異的タンパク質は、独立して、該リンカーを介して該担体に共有結合しており、該シグナル成分は該スペーサーに共有結合しており、検出すべきリガンドまたは検出すべきリガンドに関する標的化要素は該担体に共有結合している。
【００１９】
他の実施形態においては、該シグナル成分は該スペーサーおよび／または該非特異的タンパク質の一方または両方に結合している。該非特異的タンパク質およびスペーサーを該リンカーを介して該担体に結合させ、該標的化要素またはリガンドおよびシグナル成分を該非特異的タンパク質およびスペーサーの一方または両方に結合させることも可能である。
【００２０】
もう１つの態様においては、本発明は、ａ）担体、リンカー、スペーサーおよびシグナル成分を有する水溶性中間体コンジュゲートをｉ）検出すべきリガンドに関する標的化要素またはｉｉ）検出すべきリガンドと接触させて、水溶性コンジュゲートを含む沈殿物を含有する懸濁液を形成させることを含む、水溶性コンジュゲートの製造方法を提供する。該方法は、該懸濁液から該水溶性コンジュゲートを抽出することをも含む。検出すべきリガンドに関する標的化要素または検出すべきリガンドは、該水溶性中間体コンジュゲートとの接触の前に、還元剤で前処理される。該抽出は任意の適当な方法により行われうる。１つの実施形態においては、該水溶性コンジュゲートを遠心分離により抽出する。「前処理」は、該組成物を該還元剤と接触させ又は該還元剤と共に温置することを意味する。１つの実施形態においては、該還元剤は、任意の適当な濃度で使用されうるジチオトレイトールである。例えば、該前処理は、ジチオトレイトール少なくとも約１５ｍｇ／１００μｌまたは少なくとも約１０ｍｇ／１００μｌまたは少なくとも約５ｍｇ／１００μｌまたは少なくとも約２０ｍｇ／１００μｌでの前処理でありうる。同等量の他の還元剤も使用されうる。該前処理は、任意の適当な時間、例えば５分間または１０分間または１５分間または２０分間、または２０分間より長時間にわたって行われうる。
【００２１】
もう１つの態様においては、本発明は、少なくとも１つの担体および少なくとも１つのリンカーを有する水溶性中間体前駆体を、検出すべきリガンドに関する少なくとも１つの標的化要素または検出すべきリガンドおよび非特異的タンパク質と接触させて、水溶性中間体コンジュゲートを形成させることを含む、水溶性コンジュゲートの製造方法を提供する。該水溶性中間体コンジュゲートにシグナル成分を結合させて、該水溶性コンジュゲートを形成させる。該水溶性コンジュゲートの沈殿物を含有する懸濁液を形成させ、該懸濁液から該水溶性コンジュゲートを抽出する。種々の実施形態において、該非特異的タンパク質はウシ血清アルブミン、免疫グロブリンまたはキーホールリンペットヘモシアニンでありうる。該標的化要素またはリガンドおよび非特異的タンパク質の付加の前に、該担体およびリンカーがシグナル成分を含有することも可能であり、あるいは該標的化要素またはリガンドおよび非特異的タンパク質を結合させた後、該シグナル成分を付加することが可能である。１つの実施形態においては、該標的化要素またはリガンド、および非特異的タンパク質を、同時に、該水溶性中間体前駆体と接触させ、または該前駆体に付加し、または該前駆体に結合させ、または該前駆体と共に温置する。１つの実施形態においては、該標的化要素またはリガンドの付加の前に、該水溶性中間体コンジュゲート前駆体は該担体および該リンカーよりなる。該標的化要素またはリガンドおよび非特異的タンパク質は、少なくとも１．６Ｍまたは少なくとも１．７Ｍまたは少なくとも１．８Ｍまたは少なくとも１．９Ｍまたは少なくとも２．０Ｍまたは少なくとも２．２Ｍまたは約２．５の塩濃度で、該中間体前駆体に結合されうる。該非特異的タンパク質は、該前駆体と、１：１もしくはそれ以上（前駆体：非特異的タンパク質）、または１：５もしくはそれ以上、または１：７もしくはそれ以上、または１：１０もしくはそれ以上、または１：１２もしくはそれ以上、または１：１５もしくはそれ以上、または１：２０もしくはそれ以上の比で、反応させることが可能である。該方法は、本明細書に記載されているとおりの水溶性コンジュゲートを与える。
【００２２】
もう１つの実施形態においては、該コンジュゲートは、すべてのリンカーが遮蔽されるよう該非特異的タンパク質を該リンカーを介して該担体に結合させることにより製造されうる。ついで該標的化要素またはリガンドを該非特異的タンパク質を介して該前駆体に結合させることが可能である。該シグナル成分を該標的化要素またはリガンドおよび非特異的タンパク質に結合させ、あるいは後の工程で結合させて、最終コンジュゲートを形成させることが可能である。
【００２３】
もう１つの態様においては、本発明は水溶性コンジュゲートの製造方法を提供する。該方法は、担体、該担体に共有結合したリンカーおよびシグナル成分を含有する水溶性コンジュゲート前駆体を、検出すべきリガンドまたは検出すべきリガンドに関する標的化要素および非特異的タンパク質と共に温置することを含む。このようにして、該リンカーを介して該担体に共有結合した非特異的タンパク質を有する水溶性コンジュゲートが製造される。１つの実施形態においては、該非特異的タンパク質を該リンカーを介して該担体に結合させ、該水溶性コンジュゲートの他の成分には結合させない。検出すべきリガンドに関する標的化要素（または検出すべきリガンド）および該非特異的タンパク質を、同時に、該前駆体と共に温置する。
【００２４】
もう１つの態様においては、本発明は、本発明の水溶性コンジュゲートを含有する装置を提供する。該コンジュゲートは試験ストリップ（試験用細片）上に位置し、これは、サンプル域と検出域とを有する多孔性担体物質である。該サンプル域に適用された液体サンプルは該検出域へ流動する。該試験ストリップは、該試験ストリップの検出域に適用された、該液体サンプル中に存在すると疑われるリガンドに関して、またはリガンドに結合した標的化要素に関して選択的な第２の標的化要素をも有する。「多孔性担体」は、毛管力により流体を移動させうる吸収性物質を意味する。そのような物質の一例として、ニトロセルロースが挙げられるが、本発明において同様に機能する他の吸収性物質、例えばポリアミドおよび前処理紙が当業者により特定されるであろう。「サンプル域」は、試験すべきサンプルが適用される、該試験ストリップの領域である。「試薬域」は、該試験ストリップ上で試薬が含有される領域である。該試薬は乾燥形態で存在することが可能であり、移動可能な様態で該ストリップ上に存在しうる。「検出域」は、サンプル中に存在すると疑われるリガンドの存在、非存在または量を決定するための測定が行われる該試験ストリップの領域である。該装置は、移動可能な様態で標識が該試験ストリップ上に適用される「標識域」をも有しうる。「毛管力」は、毛管または多孔性媒体における液体間で作用し該毛管または多孔性媒体を介して液体を移動させる界面力を意味する。「移動可能（な様態）」は、該試薬または他の組成物が、１つの領域から別の領域まで、該試験ストリップを通る液体の流動により、該装置に沿って移動しうることを意味する。
【００２５】
該装置の種々の実施形態が提供されうる。１つの実施形態においては、該水溶性コンジュゲートは該試験ストリップ上の検出域の上流かつサンプル域の下流に乾燥形態で存在する。該試験ストリップは制御域を有することも可能であり、これは検出域の下流に位置しうる。「制御域」は標的化要素を含有し、制御域における結合は、該アッセイが、意図されたとおりに機能していることを示す。もう１つの実施形態においては、該装置は外包（ケーシング）をも有し、これは該試験ストリップを包囲し、サンプル域の範囲を定める。該多孔性担体は、該外包の内側に接触して配置される水分不浸透性物質で裏打ちされうる。１つの実施形態においては、該装置は、該外包の一端上に選択的に収容され該装置のサンプル域を覆う蓋（キャップ）をも有する。該外包はプラスチックまたは他の適当な物質から構成されうる。１つの実施形態においては、該試験ストリップは、検出域の上流に位置し該多孔性担体物質の一部でありうるフィルターをも含有する。該フィルターは、適用されたサンプル中に存在しうる混入物質を除去するよう機能する。該試験ストリップは、それが、ブロッキング（遮蔽）タンパク質またはポリビニルアルコールでブロッキングされた該試験ストリップの結合部位の部分を有するよう製造されうる。例えば、該ブロッキングタンパク質はウシ血清アルブミン、乳タンパク質、または該アッセイに対して同等の効果をもたらす他の物質でありうる。該サンプルは、試験すべき尿、血清、血漿、血液、精液、喀痰、または他の体液または生物由来の他の流体でありうる。もう１つの実施形態においては、該装置は試験ストリップ、外包、および該外包から突出した該試験ストリップの一部を有する。例えば、該試験ストリップの１ｃｍまたはそれ未満の部分が、サンプルを受容するために該外包から突出している。
【００２６】
もう１つの実施形態において、本発明は、ａ）担体、リンカー、スペーサーおよび検出すべきリガンドに関する標的化要素または検出すべきリガンドを含有する水溶性中間体前駆体をシグナル成分と接触させて、水溶性コンジュゲートを含有する沈殿物を含有する懸濁液を形成させることを含む、水溶性コンジュゲートの製造方法を提供する。ついで該懸濁液から水溶性コンジュゲートを抽出する。
【００２７】
もう１つの態様において、本発明は、少なくとも１つの担体成分、少なくとも１つの連結成分、該連結成分を介して該担体成分に共有結合した少なくとも１つの電気化学的シグナル成分、および検出すべきリガンドに関する少なくとも１つの標的化要素または検出すべき少なくとも１つのリガンドを含有する水溶性コンジュゲートを提供する。該コンジュゲートは、該連結成分を介して該担体成分に結合されうるスペーサー成分をも含有しうる。該連結成分を「介して」結合している電気的シグナル成分は、それが介在分子の非存在下に該連結成分に直接的に結合していること、またはそれ自体が該連結成分に結合している成分に該シグナル成分が結合していることを意味する。１つの例においては、該シグナル成分は、該連結成分に結合したスペーサー成分に結合していることが可能である。
【００２８】
１つの実施形態においては、該電気化学的シグナル成分は、基質または反応メディエーターを、電気化学的に検出可能な種に変換する酵素である。例えば、該電気化学的シグナル成分はアルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたは他の酵素であり、該基質は、該酵素に適した任意のもの、例えば１−ナフチルホスファートまたはヒドロキノンまたは該酵素の他の適当な基質でありうる。したがって、電気的に検出可能な種は１−ナフトールまたはベンゾキノン、あるいは使用基質に対する酵素の作用により生じる他の種でありうる。
【００２９】
１つの実施形態においては、該電気化学的シグナル成分は該スペーサーに共有結合しており、検出すべきリガンドまたは検出すべきリガンドに関する標的化要素は該連結成分を介して該担体に共有結合している。
【００３０】
もう１つの態様において、本発明は水溶性コンジュゲートの製造方法を提供する。該方法は、少なくとも１つの連結成分を含有する担体成分を少なくとも１つの電気学的シグナル成分と接触させて水溶性中間体コンジュゲートを形成させ、該水溶性中間体コンジュゲートを、検出すべきリガンドまたはリガンドに関する標的化要素と接触させて、水溶性コンジュゲートを形成させることを含む。
【００３１】
種々の実施形態において、担体成分と電気化学的シグナル成分とのモル比は、１：１０もしくはそれ以上、または１：１５もしくはそれ以上、または約１：２０、または１：２０もしくはそれ以上である。もう１つの実施形態においては、該水溶性前駆体を該標的化要素と接触させて該水溶性コンジュゲートを形成させる工程は、沈殿物として形成される水溶性コンジュゲートを与える。該方法は、該水溶性コンジュゲートの形成後に該沈殿物を音波処理に付す工程をも含みうる。
【００３２】
もう１つの態様において、本発明は、サンプル中のアナライトの存在または量の検出方法を提供する。該方法は、検出すべきアナライトに対する特異的結合性分子で被覆された表面をサンプルと接触させ、検出すべきアナライトに対する特異的結合性分子で被覆された表面を本明細書に記載の水溶性コンジュゲートと接触させ、該表面上に被覆された該特異的結合性分子、該アナライトおよび該水溶性コンジュゲートの結合性複合体を形成させ、該結合性複合体を、該電気化学的シグナル酵素の基質と接触させて産物溶液を形成させ、該サンプル中のアナライトの存在または非存在を決定することを含む。
【００３３】
１つの実施形態においては、該特異的結合性分子は抗体またはそのフラグメントである。該結合性複合体は、該表面に結合した抗体、該アナライトおよび該コンジュゲートの複合体である。種々の実施形態において、該表面は電極、磁性ビーズまたは他の表面でありうる。該表面が磁性ビーズである場合、該方法は更に、該産物溶液を電極と接触させて該サンプル中のアナライトの存在または量を決定することを含みうる。
【００３４】
前記の本発明の概要は限定的なものではなく、本発明の他の特徴および利点が以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００３５】
詳細な説明
本発明の方法は、架橋後の水溶性コンジュゲートの適当な音波処理により従来から入手可能であったものより高い産物収量を可能にする。該音波処理法は透明溶液を与え、このことは、それが、肉眼で視認しうる非液体物質を含有しないこと又は最低限度の非液体物質を含有することを意味する。通常、この方法を用いた後は、更なる遠心分離は不要である。
【００３６】
本発明の１つの態様は、反応産物中に沈殿物として存在する形成した水溶性コンジュゲートの遠心分離により得られたペレットの洗浄を含む。該ペレットから上清を分離し、該ペレットを水溶液またはバッファーで洗浄して第２の懸濁液を得る。第２のペレットを分離し、必要に応じて洗浄工程を更に１〜２回繰返すことが可能である。いずれの特定の理論にも束縛されるものではないが、該ペレットの洗浄工程は、上清中に見出される遊離（未反応）標的化要素（例えば、抗体）を可溶化したと考えられる。したがって、未反応標的化要素は後に容易に除去されうる。該洗浄工程は、産物の更なる精製を行う必要性を無くさせることも判明した。したがって、例えばゲル濾過（Ｓ−３００）カラム上の該産物の、高い経費を要する精製工程が省かれた。
【００３７】
もう１つの態様において、本発明は、担体、リンカー、場合によってはスペーサー成分、シグナル成分、検出すべきリガンドに関する標的化要素または検出すべきリガンド、および該リンカーを介して該担体に共有結合している非特異的タンパク質を含有する水溶性コンジュゲート（およびその製造方法）を提供する。従来は、水溶性コンジュゲートを得るのに十分なカップリングおよび架橋を確保するために、大量の標的化要素（またはリガンド）分子が使用された。本発明によれは、十分な架橋を確保するために、該担体上の全ての利用可能な部位への結合により用いられるものより実質的に少量の標的化要素またはリガンドしか必要としない。該反応混合物中に非特異的タンパク質を含めることにより、（該リンカーを介して利用可能な）該担体上の多数の部位が該非特異的タンパク質により占拠されることとなる。それでもなお、有用な産物を与える、標的化要素またはリガンドの十分な結合が生じるであろう。したがって、本明細書中に教示されている方法を使用することにより、使用者は、該製造方法において使用する標的化要素（またはリガンド）の量を減少させ、したがって、該産物の製造コストを実質的に削減することが可能である。
【００３８】
もう１つの態様において、本発明は、水溶性中間体コンジュゲートを標的化要素またはリガンドと接触させて、水溶性コンジュゲートを含有する沈殿物を含有する懸濁液を形成させ、該懸濁液から該水溶性コンジュゲートを抽出する（該水溶性中間体コンジュゲートとの接触の前に該標的化要素またはリガンドが還元剤で前処理されている場合）ことによる、水溶性コンジュゲートの製造方法を提供する。還元剤での該標的化要素の前処理は、該担体への該標的化要素の、より高い結合率を可能にして、該アッセイの感度の増加をもたらす。実施例５は本発明のこの態様の実用的応用を示す。任意の還元剤、例えばジチオトレイトール、ベータ−メルカプトエタノール、トラウト試薬（Ｔｒａｕｔ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（２−イミノチオラン）または他の還元剤が使用されうる。
【００３９】
もう１つの態様において、本発明は、液体サンプル中のアナライトの存在を決定するための方法を提供する。該方法は、液体サンプルを本発明の試験装置の一部分（該部分は検出域の上流に位置する）と接触させ、該液体サンプルを該検出域へ流動させ、該検出域を観察することにより該液体サンプル中のアナライトの存在、非存在または量を決定することを含む。該検出工程は、該検出域におけるシグナルを視覚的に観察しうる。
【００４０】
担体
本発明における「担体」なる語は、該コンジュゲートの「バックボーン（骨格）」を示すために用いられる。すなわち、担体成分は、種々の成分が結合しうるバックボーンとして機能する。コンジュゲートの製造方法において担体成分として機能する水溶性重合体は、天然および合成多糖ならびにそれらの誘導体、例えばデキストランおよびデキストラン誘導体、デンプンおよびデンプン誘導体、セルロース誘導体、アミロースおよびペクチン、ならびに或る天然ガムおよびその誘導体、例えばアラビアゴムおよびアルギン酸の塩；適当な反応性官能基を有するホモポリ（アミノ酸）、例えばポリリシン、ポリヒスチジンまたはポリオルニチン；天然および合成ポリペプチドおよびタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および他の哺乳類アルブミン；および求核性官能基を有する合成重合体、例えばポリビニルアルコール、ポリアリルアルコール、ポリエチレングリコールおよび置換ポリアクリラートを含む多種多様なタイプの重合体から選ばれうる。
【００４１】
本発明の目的に非常に適した重合体としては、多糖およびその誘導体、例えばデキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ヒドロキシエチル−およびヒドロキシプロピル−デンプン、グリコーゲン、アガロース誘導体ならびにヒドロキシエチル−およびヒドロキシプロピル−セルロースが挙げられる。本明細書中の実施例（後記）から明らかなとおり、注目すべきことに、デキストランは本発明に特に好適な重合体であることが判明している。
【００４２】
該コンジュゲートは実効電荷を有さない又は実質的に有さないことが、多くの場合、特に、該コンジュゲートの免疫化学的適用の多くの場合において望ましい。なぜなら、そのような場合の実効正または負電荷の存在は、とりわけ、関心のある物質および／または材料以外の物質および／または材料への該コンジュゲートの望ましくない非特異的結合を招きうるからである。多くの場合、この条件は、荷電種が導入されない限り、単に重合性担体成分自体が実効電荷を有さないことを確保することにより満たされるであろう。したがって、本発明の方法において使用する適当な重合性担体成分は、その遊離状態において、実質的に直鎖状であり、約４〜約１０の範囲のｐＨにおいて実質的に無荷電であり、後者のｐＨ範囲は、免疫化学法、ハイブリダイゼーション法およびコンジュゲートの他の応用の大多数に実用的に妥当な範囲である。この基準を満たす種々の重合体として、例えば、多数の多糖および多糖誘導体、例えばデキストランおよびヒドロキシエチル−およびヒドロキシプロピルセルロースが挙げられる。
【００４３】
コンジュゲートが使用される用途に応じて、該コンジュゲートは、ある範囲の分子量を有する水溶性重合性担体成分に基づくものでありうる。本発明の１つの実施形態においては、該重合性担体成分は、約４，０００〜約４０，０００，０００（該水溶性重合性担体成分をＤＶＳ（ジビニルスルホン）またはＥＰＣＨ（エピクロルヒドリン）のようなリンカー試薬と反応させる前、あるいは架橋コンジュゲートおよび架橋コンジュゲート複合体の最終的な形成のために、得られた水溶性中間体前駆体をスペーサーまたはシグナル成分と反応させる前）の範囲のピーク分子量を有しうる。特に関心のあるピーク分子量としては、１００，０００〜１０，０００，０００の範囲、例えば、５００，０００〜８，０００，０００の範囲、または５００，０００〜４，０００，０００の範囲、例えば、５００，０００〜２，０００，０００の範囲のピーク分子量が挙げられる。とりわけ重合性担体成分としてのデキストランの場合に特に関心のあるピーク分子量としては、約５００，０００、約１，０００，０００、約１，５００，０００、約２，０００，０００、２，５００，０００、約３，０００，０００、約３，５００，０００および約４，０００，０００が挙げられる。
【００４４】
より詳しくは、出発担体成分としては、２０，０００〜２，０００，０００の分子量範囲のデキストランが適している。最も詳しくは、一次または二次標的としてストレプトアビジンを使用するコンジュゲートおよび／または複合体には（これらに限定されるものではない）、２０，０００Ｄａのデキストランが適している。さらに、ある色素、酵素を使用し及び或る特異的結合分子（一次または二次標的として）を伴うコンジュゲートおよび／または複合体には（これらに限定されるものではない）、５００，０００Ｄａのデキストランが適している。さらに、ある他の色素には（これに限定されるものではない）、２，０００，０００Ｄａのデキストランが適している。種々の実施形態において、該担体は任意の適当な担体分子、例えばデキストラン、デンプン、グリコーゲン、アガロース、セルロース、天然ゴムまたはそれらの混合物でありうる。
【００４５】
該担体成分に関して本明細書および特許請求の範囲において用いる「ピーク分子量」なる語は、最大存在量の分子量、すなわち、分子量の分布のなかで、該重合体の或る与えられたサンプルまたはバッチにおける最大数の分子により所有される分子量を示す。非常に狭い分子量分布の重合体画分を入手または調製することは（最高分子量に関しては特に）困難であるため、多数のタイプの重合体をこのようにして特徴づけることはごく一般的なことである。本発明において関心のある多数の商業的に入手可能な担体成分、例えばデキストランの場合、その製造業者または販売業者が、該重合性担体成分の適切な画分の選択のための基礎をもたらしうる信頼しうるピーク分子量データ（例えばゲル浸透クロマトグラフィーにより測定されるもの）を提供しうるであろう。本明細書および特許請求の範囲において引用されているピーク分子量の値（担体成分に関して用いられる場合）は、問題の遊離重合体のピーク分子量を意味し、例えば、コンジュゲートの製造方法におけるＤＶＳまたはＥＰＣＨのような連結成分との反応による２以上の重合体分子の架橋の結果としての架橋重合体単位の考えられうる形成を考慮しておらず、そのような架橋単位は、平均として、それらの形成のもととなる個々の遊離重合体分子より高い分子量を有することを、ここで触れておくべきである。
【００４６】
連結成分
本発明における「リンカー」または「連結成分」なる語は、他の（典型的にはより大きな）分子間で共有結合を確立しうる二官能性分子を包含する意である。本発明の方法に適した連結成分の具体例としては、例えば、二官能性反応性を含む分子、例えばグルタルアルデヒド、カルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−フェニレンジマレイミド、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオナート、ｐ−ベンゾキノン、ビス−オキシラン、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）およびエポキシド誘導体、例えば一般式Ｉ：
【化１】
2009530639.tif 000002
（式中、Ｒ１は水素またはＣ１−４−アルキル、ｎは１〜４の範囲の整数、すなわち、１、２、３または４であり、Ｘは脱離基、トシル、メシルまたはハロゲン、例えばフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素である。）のエポキシドが挙げられる。この場合、「Ｃ１−４−アルキル」なる語は、１〜４個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状飽和炭化水素基、例えばメチル  エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、イソプロピル、イソブチルなどを示す。本明細書に記載の実施例から明らかなとおり、非常に有望なエポキシド由来連結成分はエピクロロヒドリン（ＥＰＣＨ）、すなわち、Ｒ１が水素であり、ｎが１であり、脱離基Ｘが塩素である、前記一般式Ｉの化合物である。
【００４７】
該連結成分は水性環境中で安定であるはずであり、したがって、連結成分ＥＰＣＨは、連結成分ＤＶＳと一緒になって、本発明の方法において使用するための非常に有用な連結成分となる。
【００４８】
スペーサー成分
スペーサー成分は、連結成分との反応を介して、水溶性中間体前駆体と共有結合し、それにより、第２の水溶性中間体前駆体を形成する。前記のとおり、「スペーサー成分」は、連結基を介して、担体成分に共有結合する。したがって、本文脈において用いられた場合の「スペーサー成分」なる語は、色素（後記）のようなシグナル成分の共有結合に利用可能な複数の部位を有するタンパク質またはポリペプチドを示す。スペーサー成分は、本発明において使用される水溶性コンジュゲートのいずれにおいても、および水溶性コンジュゲートの製造方法のいずれにおいても有用であるが、該コンジュゲートはスペーサー成分無しでも機能することが可能である。
【００４９】
スペーサー成分、特に、シグナル成分の共有結合に利用可能な複数の部位を有するスペーサー成分の組み込みの目的の１つは、この方法が、該コンジュゲートに結合しうるシグナル成分の数（すなわち、該水溶性中間体コンジュゲート（前記）中のシグナル成分の「負荷（ｌｏａｄ）」）を増加させ、それにより、種々のアッセイ、例えば免疫化学的アッセイ、および本明細書に記載の側方流動装置（後記）において使用された場合にそのようなコンジュゲートの感度を増加させる適当な手段となることである。ある実施形態において、シグナル成分（例えば、色素分子）のカップリングが連結成分に対して（スペーサー成分を介さないで）直接的に行われることは、該コンジュゲート中に存在する連結成分の１分子当たり（少なくとも原則として）ただ１つのシグナル分子のみが結合することを示唆すると理解されるべきである。
【００５０】
第２の水溶性前駆体の製造のいくつかの実施形態においては、出発デキストランの１モル当たりのスペーサーのモル数（スペーサーの「負荷」）は１〜５００、特に、２〜１００、最も頻繁には、５〜７５の範囲である。また、第２の水溶性中間体は、例えば、担体成分の１モル当たりに結合したスペーサー成分の（モル）数により特徴づけられうる。
【００５１】
前記のとおり、該水溶性中間体の連結成分の反応性部分の一部のみがスペーサー成分と反応する。スペーサー成分およびリンカー成分に応じて、スペーサー成分を反応させた後、リンカー成分の未反応の反応性部分の１〜９９％、または２０〜９９％、特に３０〜９９％、例えば４０〜９９％、特に５０〜９９％が未反応のまま残存する。例えば、１つの実施形態においては、ある条件下では、未反応リンカー部分の１〜４９％がスペーサー成分と反応した。
【００５２】
該スペーサー成分はタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、グロブリンなど、またはポリペプチド、例えばホモポリペプチド、例えばポリリシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチンなどでありうる。しかし、スペーサー成分の選択は、使用するシグナル成分（例えば、個々のコンジュゲートにおいて使用する実際の色素）および使用する連結成分に左右されるであろう。
【００５３】
該スペーサー成分、例えばタンパク質の分子量は、少なくとも２，５０００Ｄａ、または少なくとも５，０００Ｄａ、または少なくとも１０，０００Ｄａ、または１０，０００〜２，０００，０００の範囲、例えば、２０，０００〜５００，０００の範囲でありうる。導入されるスペーサー成分の特徴の１つは、シグナル成分の導入に利用可能な位置の数を増加させることにあるため、シグナル成分の結合に利用可能な官能基の数はスペーサー成分の分子１個当たり少なくとも５、例えば１０〜１，０００、特に１０〜５００であることが更に望ましい。
【００５４】
あるいは、該スペーサー成分は多糖またはポリ核酸でありうる。該水溶性中間体コンジュゲートの製造の前に、これらの重合体の化学修飾が必要であり得る。
【００５５】
該スペーサー成分上の（第２の水溶性中間体前駆体の形成におけるリンカー成分への、または後の、該水溶性中間体コンジュゲート（後記）の形成におけるシグナル成分への）カップリング化学の性質のため、該スペーサー成分上には反応性官能性、例えば求核性官能性が存在する。したがって、適当なスペーサー成分は、例えば、求核性官能基、例えば−Ｏ−（例えば、脱プロトン化フェノール性ヒドロキシ基、例えば、ポリペプチドまたはタンパク質のチロシン残基における脱プロトン化芳香族ヒドロキシ基）、−Ｓ−（例えば、芳香環または脂肪族基上の脱プロトン化チオール基、例えば、ポリペプチドまたはタンパク質のシステイン残基における脱プロトン化チオール基）、−ＯＨ（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質の或るアミノ酸残基、例えばセリンまたはトレオニン残基中に存在する脂肪族ヒドロキシ基）、−ＳＨ（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質のシステイン残基におけるチオール基）、第１級アミノ基（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質のリシンまたはオルニチン残基におけるもの）または第２級アミノ基（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質のヒスチジン残基におけるもの）を有するものであろう。当業者に理解されるとおり、前記の官能基がプロトン化状態であるか又は脱プロトン化状態であるのかの問題は、もちろん、選択された反応条件、例えば、反応混合物のｐＨに左右されるであろう。
【００５６】
１つの実施形態においては、該水溶性中間体のリンカー成分の未反応の反応性部分の一部のみが該スペーサー成分と反応する。すなわち、第２の水溶性中間体は有意な量の未反応の反応性部分を尚も有する。
【００５７】
得られた第２の水溶性中間体前駆体は、精製工程に関して、すなわち、該水溶性中間体前駆体の精製に関して前記で説明した方法により精製されうる。本明細書に記載の実施例から明らかなとおり、得られた第２の水溶性中間体前駆体を精製するための適当な方法はゲル濾過である。
【００５８】
シグナル成分
いくつかの実施形態においては、該シグナル成分は該スペーサー成分との反応により第２の水溶性中間体前駆体に共有結合し、それにより、水溶性中間対コンジュゲートを形成する。
【００５９】
本明細書中で用いる「シグナル成分」なる語は、直接的に物理的に検出可能な部分、またはそのような物理的に検出可能な部分の前駆体である若しくは該部分を生成する部分を意味する。１つの実施形態においては、該シグナル成分は、当技術分野で公知の幾つかの物理的技術により、例えば、光学的方法、例えば分光光度法、蛍光、発光、りん光または例えば“Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”Ｇ．Ｗ．Ｅｗｉｎｇ，５ｔｈ  Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８に記載されている方法のような他の方法により容易に測定されうる標識またはマーカーとして機能する。該シグナル成分は肉眼での視覚的観察によっても検出されうる。あるいは、該シグナル成分は、前記のとおり、そのような物理的に検出可能な成分の前駆体でありうる。そのような前駆体の典型例としては、適当な基質と作用すると、前記の物理的方法の１以上により検出されうる例えば着色種のような種を生成しうる酵素が挙げられる。
【００６０】
該シグナル成分は、色素のような物質；蛍光、発光、りん光および他の光を放出する物質；金属器レート化物質、例えばイミノ二酢酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびデスフェリオキサミンＢ；放射性同位体で標識された物質；重金属で標識された物質；ならびにそれらの混合物から選ばれうる。
【００６１】
いくつかの他の具体例を挙げると、蛍光物質は、例えば、フルオレセイン（適切にはフルオレセインイソチオシアナート，ＦＩＴＣとしてのもの）、フルオレセインアミン、１−ナフトール、２−ナフトール、エオシン、エリトロシン、モリン、ｏ−フェニレンジアミン、ローダミンおよび８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸から選ばれうる。適当な放射性同位体は、例えば、水素の同位体（すなわち、トリチウム，３Ｈ）、炭素の同位体（例えば、１４Ｃ）、リンの同位体（例えば、３２Ｐ）、硫黄の同位体（例えば、３５Ｓ）、ヨウ素の同位体（例えば、１３１Ｉ）、ビスマスの同位体（例えば、２１２Ｂｉ）、イットリウムの同位体（例えば、９０Ｙ）、テクネチウムの同位体（例えば、９９ｍＴｃ）、パラジウムの同位体（例えば、１０９Ｐｄ）およびサマリウムの同位体（例えば、１５３Ｓｍ）から選ばれうる。適当な重金属は、例えば、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｉｎ、Ａｇ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｉ、Ｂｉ、Ｙ、Ｌａ、Ｃｅ、ＥｕおよびＧｄから選ばれうる。金（Ａｕ）は多くの場合に特に有用な重金属である。
【００６２】
１つの実施形態においては、シグナル成分は、非微粒子標識、例えば非微粒子色素でありうる。この場合、「色素」なる語は、任意の分光光度的に検出可能な色素分子またはその誘導体を意味すると意図される。本発明の方法により製造されるコンジュゲート内への組み込みに有用な色素には、可視色素、りん光色素、蛍光色素、レーザー色素、赤外色素およびランタニドキレートから誘導されるものが含まれる。特に興味深い色素としては、可視色素、例えば可溶性可視色素、例えば顔料、建染め染料、硫化染料、媒染染料、ロイコ建染め染料、ならびにフルオレセイン、ローダミンおよびそれらの誘導体（例えば、スルホローダミン、ローダミン−ヒドリドおよびローダミンヒドラジド）のような種、ならびにオキサジン色素、シアニン色素およびアゾール色素が挙げられる。適当な色素の具体例としては、例えば、テキサス・レッド・ヒドラジン（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  ｈｙｄｒａｚｉｎｅ）、コンゴ・レッド（Ｃｏｎｇｏ  Ｒｅｄ）、トリパン・ブルー（Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ）、リサミン・ブルー（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ  Ｂｌｕｅ）、レマゾール・ブラック（Ｒｅｍａｚｏｌ  Ｂｌａｃｋ）、レマゾール・ブリリアント・レッド（Ｒｅｍａｚｏｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ）、ローダミンＢイソチオシアナート（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ  Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、Ｃｙ５−Ｏｓｕ単官能性反応性色素、反応性オレンジ（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｒａｎｇｅ）１６、ユニブルー（Ｕｎｉｂｌｕｅ）Ａなどが挙げられる。微粒子色素でない色素も本発明において有用である。「非微粒子」標識は、該標識の検出の基礎が固体の検出以外にあるものであり、これは、該固体がシグナル成分（例えば、ラテックスまたは他の粒子）であるか又は検出のための基礎となる固体粒子が生じるかには無関係である。
【００６３】
前記の色素は本発明の目的のためのシグナル成分として有用であり、当技術分野でよく知られており、本発明の目的のためのシグナル成分として他の色素も使用されうることが当業者に明らかであろう。シグナル成分として使用される色素の他の具体例としては、例えば、“Ｄｙｅｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｅｘｔｉｌｅ  Ｆｉｂｅｒｓ”，Ｔｒｏｔｍａｎ，３４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｌｏｎｄｏｎおよび“Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｄｙｅｓ”，Ｖａｎｋａｔａｒａｍｏｎ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする。）に記載されているような色素が挙げられる。
【００６４】
該シグナル成分は、ＢＳＡのようなタンパク質と反応可能、および／または、後記の代替実施形態に関しては、リンカー成分の未反応の反応性部分と反応可能でありうる。さらに、該シグナル成分は、該スペーサーとの反応または結合に際して、生じる水溶性中間体コンジュゲートの望ましくない特性を何らもたらすべきではない。すなわち、該シグナル成分は、制御不可能な非特異的結合を促進すべきではなく、また、該コンジュゲートに結合する標的化成分（例えば、抗体）の活性を抑制すべきではない。さらに、該シグナル成分は該コンジュゲートの水溶性を有意に減少させるべきではない。
【００６５】
１つの実施形態においては、第２の水溶性中間体の連結成分の反応性部分の僅かの部分のみが該水溶性中間体コンジュゲートの形成においてシグナル成分と反応する。シグナル成分、スペーサー成分およびリンカー成分に応じて、該シグナル成分と反応した後、第２の水溶性中間体前駆体において利用可能な未反応の反応性連結成分の量に応じて、該リンカー成分の未反応の反応性部分の５０〜１００％、例えば、６０〜１００％、特に、７０〜１００％、例えば、８０〜１００％、特に、９０〜１００％が未反応のままとなる（第２の水溶性中間体前駆体と比較した場合のものであることに注意されたい。）。
【００６６】
個々の色素に応じて、本発明の方法により製造されたコンジュゲートは、可視領域、ＵＶ領域または近赤外領域の光子を反射、散乱または放出する。ローダミンのような可視色素の使用は本発明のコンジュゲートに可視領域（例えば、青）の光子を反射または散乱させて、観察者にとっての、色の補色主波長（例えば、赤）の透過をもたらす。あるいは、蛍光色素の使用は、（照射されると）基底状態への電子の戻りにより本発明のコンジュゲートに特定の波長の光子を放射させる。「可視色素」は、可視領域の光を反射または散乱する色素である。
【００６７】
１つの実施形態においては、該シグナル成分は供与／受容色素ペアである。供与／受容色素ペアは化学分野において公知である。共鳴エネルギー転移において、供与分子は光子を吸収し、受容体へのエネルギー転移を開始させる。該受容体はエネルギー転移を受容し、光子を放出する。該供与色素および受容色素は、励起されると、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）をもたらしうる。適当な供与体／受容体ペアの幾つかの具体例として、６−カルボキシフルオレセイン／６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＦＡＭ−ＲＯＸ）、３−（イプシロン−カルボキシペンチル）−３’−エチル−５，５’−ジメチルオキサカルボシアニン／６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＣＹＡ−ＲＯＸ）および４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３アルファ、４アルファ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ）誘導体、５，７−ジメチル−ＢＯＤＩＰＹ／５−（４−フェニル−１，３−ブタジエニル）ＢＯＤＩＰＹ（ＢＯＤＩＰＹ５０３／５１２−ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１）が挙げられる。これらの供与体／受容体ペアは例示として記載されており、本開示に関する当業者は、ＦＲＥＴを示し本発明での使用に適した他の供与／受容色素ペアを特定しうるであろう。ＦＲＥＴは蛍光共鳴エネルギー転移であり、これは供与体から受容体への励起状態のエネルギーの転移である。
【００６８】
１つの実施形態においては、該スペーサーはリンカーを介して担体に共有結合しており、シグナル成分は、該スペーサーに共有結合した色素（例えば、供与体／受容体ペアのメンバー）であり、リガンドまたはリガンドに関する標的化要素は該担体に共有結合している。該担体はデキストランであり、該リンカーはジビニルスルホンであり、該スペーサーはウシ血清アルブミンである。
【００６９】
該方法はまた、シグナル成分が連結成分に共有結合しており該連結成分が担体成分に結合している（すなわち、タンパク質またはポリペプチドスペーサー成分は該コンジュゲート内に組み込まれていない）水溶性コンジュゲートの製造に適している（後記）。更なる詳細は、とりわけ、米国特許第６，６２７，４６０号第１２欄に記載されている。
【００７０】
もう１つの実施形態においては、該シグナル成分は、リンカーを介して担体に共有結合しうる電気化学的シグナル成分である。１つの実施形態においては、これらのコンジュゲート中にはスペーサー成分が含まれるが、該コンジュゲートは、担体分子、連結成分、および該連結成分に結合した電気化学的シグナル成分よりなる。該電気化学的シグナル成分は、基質と反応して電気化学的に検出可能な種を生成する酵素でありうる。電気化学的に検出可能な種は該基質から変換されうるか、あるいは該反応の副生成物（例えば、反応メディエーター）でありうる。本発明において使用されうる酵素の具体例には、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼおよびコリンオキシダーゼが含まれる。酵素の組合せを用いることが可能であり、この場合、組合される酵素は、独立して作用するか、あるいは二酵素系または多酵素系で作用するかには無関係である。二酵素系の一例として、ＮＡＤＨオキシダーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼが挙げられる。本発明において機能しうるもう１つの二酵素系はチロシナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼである。二酵素系は検出のために酸素センサーを利用しうる。電気化学的シグナル成分が酵素（または酵素の組合せ）である場合、それは電気化学的シグナル酵素と称される。
【００７１】
電気化学的シグナルを生成するために使用されうる基質または反応メディエーターには、電気化学的に検出可能な産物または種を与える、選択した酵素に適した任意の基質または反応メディエーターが含まれる。基質の具体例には、４−アミノフェニルホスファート、１−ナフチルホスファート、グルコース−６−ホスファート、４−ヒドロキシナフチル−１−ホスファート、３−インドキシルホスファート、フェニルホスファート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファートエステル、６−（Ｎ−フェロセノイルアミノ）−２，４−ジメチルフェニルホスファート、パラセタモール（ｐａｒａｃｅｔａｍｏｌ）ホスファート、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ヒドロキノン、レドックスＯｓ＋２に基づく重合体、ＮＡＤ＋およびグルコース−６−ホスファート、アセチルチオコリンヨージド、４−アミノフェニル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＡＰＧ）、グルコースおよびメディエーター、およびコリンが含まれる。反応メディエーターの具体例には、フェリシアニド、フェロセンおよびフェロセン誘導体が含まれる。これらの一覧は単に例示として示されているに過ぎず、多数の他の基質および反応メディエーターも使用されうる。「反応メディエーター」は、酵素反応において利用される、基質とは異なる物質である。反応メディエーターは、酵素反応中に、電気化学的に検出可能な種に変換されうる。
【００７２】
「電気化学的に検出可能な種」は、ボルタンメトリー、電位差測定または電気伝導度測定の電気分析技術の少なくとも１つにより検出可能な物質である。電気化学的に検出可能な種の具体例には、４−アミノフェノール、１−ナフトール、グルコース、ジヒドロキシナフタレン、インジゴブルー、フェノール、Ｈ２Ｏ２、６−（Ｎ−フェロセノイルアミノ）−２，４−ジメチルフェノール、４−アセトアミドフェノール（ＴＭＢ  ｏｘ）、ベンゾキノン、フェリシアニド、酸化型フェロセンおよびフェロセン誘導体、Ｏｓ＋３、ＮＡＤＨ、チオコリン、４−アミノフェノール（ＰＡＰ）、グルコノラクトンおよび還元型メディエーター、ならびにベタインが含まれる。本開示に関して、当業者は、本発明において使用されうる多数の他の酵素、基質および電気化学的に検出可能な種を認識するであろう。
【００７３】
ボルタンメトリーは、電気化学的分析のために又は電極反応の速度論およびメカニズムの決定のために用いられる電気化学的測定技術である。ボルタンメトリーにおいては、作用電極の電位を（典型的にはポテンショスタットで）制御し、電極を通って流れる電流を測定する。電位差測定は、無電流の条件下で電位を測定する電気分析化学の分野である。ついで、測定した電位を用いて、関心のある分析量、一般にはアナライト溶液の何らかの成分の濃度を決定することが可能である。電気化学セルにおいて発生する電位は、平衡条件が満たされるまで化学現象が進行するために生じる遊離エネルギー変化の結果である。電気伝導度測定は溶液コンダクタンスの科学測定の分野である。
【００７４】
検出すべきリガンドおよびリガンドに関する標的化要素
「標的化要素」なる語は、相補的分子または生物由来の物質の相補的構造領域に結合または反応しうる分子、特に生物由来の分子を意味する。標的化要素が、検出すべきリガンドに関する標的化要素である場合、該標的化要素は、検出すべきリガンドと結合または反応する。
【００７５】
検出すべきリガンドに関する妥当な標的化要素の具体例としては、例えば、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、遺伝子プローブ、天然および合成オリゴおよびポリヌクレオチド、天然および合成単糖、オリゴ糖および多糖、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、増殖因子、ホルモン、受容体分子、プロテインＡおよびプロテインＧ，ならびにそれらの混合物が挙げられる。個々の具体例には、抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（抗ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ウサギ抗ヒトＣＲＰ、ストレプトアビジン、アビジン、抗ＨＩＶ、抗Ｃ型肝炎、抗クラミジア、抗ヘルペス、抗甲状腺刺激ホルモン（抗ＴＳＨ）、抗リステリア、抗サルモネラ、抗単核症、抗ＨＢｅＡｂ、抗ＨＢｓＡｂおよび抗ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）が含まれる。
【００７６】
検出すべきリガンド
「リガンド」は、該リガンドに関する標的化要素が結合する分子である。本発明において有用なリガンドの具体例としては、抗原およびハプテンが挙げられるが、該具体例には、該検出における関心のある任意のリガンドが含まれうる。リガンドとしてのホルモンの具体例としては、ホルモン（例えば、エストロゲン、エストラジオール、プロゲステロン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（抗ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン、ろ胞刺激ホルモン、コルチゾン、Ｔ３、Ｔ４）、アミノ酸ホルモン（例えば、チロキシン）ならびにペプチドおよびタンパク質ホルモン（例えば、バソプレッシン、ボンベシン、ガストリンまたはインスリン）、および乱用の薬物が挙げられる。他のリガンドには、心臓マーカー、例えばトロポニンＩ、トロポニンＴ、高感受性Ｃ反応性タンパク質（ｈｓＣＲＰ）、ＣＫ−ＭＢ、ミオグロブリン、ＮＴ−プロＢＮＰ、Ｂ型ナトリウム利尿性ペプチド（ＢＮＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）およびミエロペルオキシダーゼ；ならびに癌マーカー、例えば前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびアルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）が含まれる。「乱用の薬物」は、非医学的な理由で（通常は精神改変効果のために）摂取される薬物である。そのような薬物の乱用は身体的および精神的損傷ならびに（いくつかの物質では）依存および中毒を招きうる。乱用の薬物の具体例には、コカイン、アンフェタミン（例えば、ブラックビューティー、ホワイトベニー、デクストロアンフェタミン（デキシー、ビーン）、メタンフェタミン（クランク、メス、クリスタル、スピード）、バルビツレート、リゼルギン酸ジエチルアミド（ＬＳＤ）、抑制薬、鎮静薬（例えば、選択的セロトニン再取り込みインヒビター）、フェンシクリジン（ＰＣＰ）、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）およびオピエート（例えば、モルヒネ、アヘン、コデインおよびヘロイン）が含まれる。
【００７７】
本方法および組成物は種々のアッセイ形態において有用である。例えば、いくつかの形態は、サンプル中に存在する疑いのあるリガンドに特異的な抗体を使用する。これらの形態においては、試薬は、試験ストリップ上に、移動可能な様態で位置することが可能であり、サンプルはサンプル域に適用される。ついでサンプルは、サンプル中に存在する疑いのあるリガンドに試薬が結合しうる試薬域を通過して泳動し、検出域に達し、ここで、標的化要素が該域に適用され、存在する疑いのあるリガンドに結合し、あるいは該リガンドに結合した標的化要素に結合し、または更には該コンジュゲートの別の成分に結合する。「選択的結合」は、意図されたとおりにアッセイが機能するよう、該標的化要素が、関心のあるリガンドを、サンプル中に存在する他のあらゆるリガンドから識別することを意味する。選択的に結合する標的化要素は２以上のリガンドに尚も結合しうる。「特異的結合」は、標的化要素がその標的リガンドに結合し、サンプル中に存在しうる他のリガンドには結合しないことを意味する。
【００７８】
もう１つのアッセイ形態においては、関心のあるリガンドに対する、より低い選択性を有し、したがって、関心のあるリガンドだけでなく、サンプル中に存在する第２の分子にも結合しうる２つの抗体を使用することが可能である。この形態においては、その第２の分子上の結合部位に結合して、これらの部位を遮断し、これらの２つの抗体を、関心のあるリガンドのみに結合させる捕捉（ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）抗体を使用する。他の形態においては、２以上の捕捉抗体を使用することが可能であり、３以上の抗体を使用することが可能である。本開示に関して、当業者は、同様に本発明に含まれる追加的なアッセイ形態を案出しうるであろう。本明細書中に挙げられている個々の形態は例示として記載されている。
【００７９】
本発明は直接サンドイッチアッセイ形態にも適用されうる。この形態においては、サンプルはサンプル域に適用され、標識（例えば、デキストラン−ＢＳＡ−抗ｈＣＧ抗体−ローダミン）を含有する標識域を通過して流動し、検出すべきリガンドが存在する場合、該標識は該リガンドに結合する。ついでサンプルは検出域（例えば、試験ストリップに固定された抗ｈＣＧ抗体を含有する）へ流動し続ける。検出域において、標識リガンドが検出域に結合し、検出域の観察はアッセイの結果をもたらす。
【００８０】
もう１つのアッセイ形態（「間接」形態と称されることもある）においては、サンプルはサンプル域に適用され、移動可能な様態で試薬域内に存在する、検出すべきリガンドに特異的な標的化要素（例えば、ビオチン−ｈＣＧ  Ａｂ）を含有する試薬域を通過して泳動する。ついでサンプルは、リガンド（例えば、ｈＣＧのベータ部分）またはリガンドに結合した標的化要素に特異的に結合する本発明のコンジュゲートを含有する標識域を通過して泳動し続ける。したがって、シグナル成分が、検出すべきリガンドに結合する。ついでサンプルは検出域へと泳動し続け、ここで、サンプルに対する標的化要素（ストレプトアビジン−ＩｇＧまたはストレプトアビジン−ＢＳＡ）の結合が生じる。検出域の目視観察は、存在するリガンドの存在、非存在または量を示す。
【００８１】
本開示に関して、当業者は、同様に本発明に含まれる本発明の適用のための他の形態を認識するであろう。例えば、本発明は、以下の参考文献に記載されている形態において適用されうる：５，６０２，０４０、５，６２２，８７１、５，６５６，５０３、６，１８７，５９８、６，２２８，６６０、６，３５２，８６２、２００１／０，００８，７７４、２００１／０，０４１，３６８、５，７１４，３８９、５，９８９，９２１、６，４８５，９８２、５，２５２，４９６、５，５５９，０４１、５，７２８，５８７、６，０２７，９４３、６，５０６，６１２、６，５４１，２７７、２００２／０，１６０，５２５、５，０７３，４８４、５，６５４，１６２、６，０２０，１４７、５，１２０，６４３、５，５７８，５７７、６，５３４，３２０、４，７０３，０１７、４，７４３，５６０、５，５９１，６４５、３，０１１，８７４、３，６４１，２３５、４，０９４，６４７、４，１６８，１４６、４，３７３，９３２、４，４７７，５７５、４，７２２，８８９、４，８６１，７１１、４，９４３，５２２、４，９７８，５０３、５，５７１，７２６、ＥＰ  ０，１４９，１６８、ＥＰ  ０，１７０，３７５、ＥＰ  ０，１９２，３２０、ＥＰ  ０，２５０，１３７、ＥＰ  ０，２８７，７３１、ＥＰ  ０，２９１，１９４、ＥＰ  ０，３４９，２１５、ＧＢ  ２，０６２，２２４、ＧＢ  ８，７０９，８７３。以下の実施例は本発明の更なる例示のために記載されている。
【００８２】
酵素電気化学イムノアッセイ
酵素電気化学イムノアッセイ（ＥＣＩ）においては、アナライトまたは第２の抗体を、電気化学的に検出可能な産物の産生を触媒する酵素で標識し、産物生成の速度を用いてアナライトの量を定量する。したがって、酵素ＥＣＩは、化学的増幅により、特異性のために抗体を、そして感度のために酵素標識を使用する。
【００８３】
イムノアッセイにおける電気化学的検出技術の大多数は、ボルタンメトリー（これは、電気化学セルに電位を加え、電極における酸化または還元から生じた電流を測定することを含む電気分析の一法である）に基づくものである。ボルタンメトリーの多数の技術のうち、電流測定法がＥＣＩには最も一般的である。電流測定法においては、電極を一定電位で保持し、電極表面において酸化還元事象から生じた電流を測定する。電流測定法は、流体力学電気化学検出器に適用されると、ナノモルレベルの検出限界をもたらす。検出は非常に小さなサンプル容量（１０μＬ未満）で行われうるため、サンプルにおいて検出される酸化還元（レッドクス）活性種の絶対量は僅か１０−１４モル以下となりうる。
【００８４】
電流測定法においては、検出のための最適電極電位は、加えられた電位の関数としての、アナライトにより生じた電流応答を得ることにより選択される。溶液中の電気活性種に関するこの電流応答は通常、３つの異なる挙動領域を有する。第１は、化合物が電気活性ではなく電流が無視されうる電位領域である。第２は、ネルンスト式により定義される電流応答を上昇させる領域である。第３は、電位に非依存的な限界電流プラトーである。検出のための最良の電位はこの限界電流プラトーに沿ったものであり、この場合、アナライトは電極への物質輸送の限界において電気分解されており、適用電位における小さな変化は電流測定に有意な影響を及ぼさない。限界プラトーにおける電流応答はアナライト濃度に正比例し、式：Ｉ＝ｎＦＡＤＣ°／ｄ（式中、Ｉは電流であり、ｎは、酸化還元反応に関与する電子の数であり、Ｆはファラデー定数であり、Ａは電極表面積であり、Ｄは拡散係数であり、Ｃ°はバルクアナライト濃度であり、ｄは拡散層の厚さである）により与えられる。
【００８５】
酵素−基質−産物（Ｅ−Ｓ−Ｐ）系
Ｅ−Ｓ−Ｐ系の選択は、酵素ＥＣＩにおける重要な要因である。酵素反応は迅速であること、および産物Ｐが活性である何らかの電位領域にわたって、基質Ｓは酸化還元に対して不活性であることが重要である。また、電位の上昇と共に増加するバックグラウンドノイズが低いまま維持されるよう、産物Ｐは低電位において電気活性であることが好ましい。一般に使用される酵素標識であるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）は、４−アミノフェニルホスファート（ＰＡＰＰ）を基質とする。その酵素産物である４−アミノフェノール（ＰＡＰ）は、低い酸化電位（すなわち、ｐＨ７のバッファー中のガラス状炭素電極におけるＡｇ／ＡｇＣｌに対して０．１８Ｖ）を有し、電極毒を引き起こさない。より安価で、より安定なＡＬＰ基質である１−ナフチルホスファートも使用されている。このＥ−Ｓペアは、スクリーンプリント電極に基づくイムノセンサーの場合に特に良好であることが示されている。ＥＣＩにおいて使用される他の酵素は本明細書に記載されている。
【００８６】
単一のＥ−Ｓペアの使用が酵素イムノアッセイにおける最も一般的な実施であるが、二酵素または多酵素系も使用されうる。１つの検出法は、フェノールを、まずはカテコールへ、ついでＯ−キノンに酸化するために、チロシナーゼを使用することを含む。Ｏ−キノンはグルコースの酵素的脱水素におけるメディエーターとなり、カテコールへ再変換される。ＡＬＰの定量は、フェノールの酸化におけるＯ２の喪失を測定することにより間接的に行われる。
【００８７】
スクリーンプリント電極（ＳＰＥ）は、ポリスチレン表面上に電極をプリントするために黒鉛粉末に基づくインクを使用する厚膜技術で製造され、主として電極表面への抗体の受動吸着によりイムノセンサーに適合化される。ＳＰＥに基づくイムノセンサーは、本明細書に記載されているアッセイのための多数の用途に使用されうる。
【００８８】
本発明の組成物および方法は任意の簡便なアッセイ形態で使用されうる。しかし、２つの形態が電気化学的検出試薬に好適である。１つの形態においては、磁性ビーズを、検出すべきアナライトに対する特異的結合分子（例えば、抗体）で処理し、容器内に配置する。分析すべきサンプルを該ビーズに接触させる。サンプル中にアナライトが存在すれば、それは該ビーズ上の特異的結合性分子に結合するであろう。電気化学的シグナル成分を有する本発明の組成物を加え、該混合物を反応させる。適当な洗浄の後、該電気化学的シグナル成分に対する基質を該ビーズと接触させる。この混合物を、非常に小さな容量で、毛細管内で反応させることが可能である。非常に小さな容量は酵素産物の希釈を低下させて、電気化学的シグナルの増強をもたらす。なぜなら、該シグナルは該濃度に直線的に比例するからである。適当な混合および洗浄の後、産物溶液を電極上に配置し、サンプル中のアナライトの存在または量を決定する。
【００８９】
もう１つの実施形態においては、アナライトに対する特異的結合性分子を電極に吸着させる。このタイプのアッセイにおいては、サンプル溶液を電極に接触させる。サンプル中にアナライトが存在すれば、それは該特異的結合性分子に結合するであろう。本発明の組成物を該電極と接触させて、アナライトに対する抗体、アナライトおよび本発明のコンジュゲートの複合体を形成させる。適当な洗浄の後、電気化学的シグナル成分に対する基質を電極と接触させる。反応後、例えばボルタンメトリー、電位差測定法または電気伝導度測定法を用いて測定を行い、サンプル中のアナライトの存在または量を決定する。
【００９０】
「特異的結合性分子」は、化学的または物理的手段により、サンプル中に存在する検出可能な物質に選択的に結合する分子を意味する。「選択的に結合」は、該分子が、関心のある標的に優先的に結合し、または標的に、他の分子に結合する場合より大きなアフィニティーで結合することを意味する。１つの実施形態においては、特異的結合性分子は抗体または抗体のフラグメントである。「抗体」は免疫グロブリンを意味し、天然物であるか又は部分的もしくは完全に合成的に産生されるかどうかには無関係である。該用語は、特異的結合能を維持するその誘導体を含む。該用語は、免疫グロブリン結合ドメインと相同またはほとんど相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質をも包含する。これらのタンパク質は天然由来であることが可能であり、あるいは部分的または完全に合成的に産生されうる。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであることが可能であり、ヒトクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧおよびＩｇＥのいずれかを含む任意の免疫グロブリンクラス（またはクラスの組合せ）のメンバーでありうる。「抗体フラグメント」は、完全長未満である、抗体の任意の誘導体である。抗体フラグメントは完全長抗体の特異的結合能の少なくとも有意な部分を保有しうる。抗体フラグメントの具体例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖジアボディおよびＦｄフラグメントが含まれるが、これらに限定されるものではない。「誘導体」は、親化合物と同じ基本構造を有する任意の分子である。
【００９１】
抗体フラグメントは任意の手段により製造されうる。例えば、抗体フラグメントは無傷抗体の断片化により酵素的または化学的に製造されることが可能であり、あるいはそれは、部分抗体配列をコードする遺伝子から組換え製造されうる。あるいは、抗体フラグメントは全体的または部分的に合成的に製造されうる。抗体フラグメントは、場合によっては、一本鎖抗体フラグメントでありうる。あるいは、該フラグメントは、例えばジスルフィド結合により互いに連結された複数の鎖を含みうる。該フラグメントはまた、場合によっては、多分子複合体でありうる。機能性抗体フラグメントは、典型的には少なくとも約５０アミノ酸、より典型的には少なくとも約２００アミノ酸を含む。
【００９２】
一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、ポリペプチドリンカーにより互いに共有結合した可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）のみよりなる組換え抗体フラグメントである。ＶＬまたはＶＨのいずれかがＮＨ２末端ドメインでありうる。それらの２つの可変ドメインが、重大な立体的干渉を伴わずに架橋されている限り、該ポリペプチドリンカーは様々な長さ及び組成のものでありうる。典型的には、該リンカーは、主として、グリシンおよびセリン残基の伸長から構成され、可溶性のために幾つかのグルタミン酸またはリシン残基が介在する。「ジアボディ」は二量体ｓｃＦｖである。ジアボディの成分は、典型的には、ほとんどのｓｃＦｖより短いペプチドリンカーを有し、これらは、二量体として会合し易い傾向を示す。
【００９３】
「Ｆｖ」フラグメントは、非共有結合相互作用により互いに保持された１つのＶＨおよび１つのＶＬドメインよりなる。「ｄｓＦｖ」なる語は、本明細書においては、ＶＨ−ＶＬペアを安定化するための操作された分子間ジスルフィド結合を有するＦｖを意味するものとして用いられる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ｐＨ４．０〜４．５で酵素ペプシンでの消化により免疫グロブリン（典型的にはＩｇＧ）から得られるものと実質的に同等の抗体フラグメントである。該フラグメントは組換え製造されうる。Ｆａｂ’フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントにおける２つの重鎖片を連結するジスルフィド架橋の還元により得られるものと実質的に同等の抗体フラグメントである。Ｆａｂ’フラグメントは組換え製造されうる。「Ｆａｂ」フラグメントは、酵素パパインでの免疫グロブリン（典型的にはＩｇＧ）の消化により得られるものと実質的に同等の抗体フラグメントである。Ｆａｂフラグメントは組換え製造されうる。Ｆａｂフラグメントの重鎖セグメントがＦｄ片である。
【００９４】
抗体の活性フラグメントは、好ましくは、抗体のＦｖ領域を含む。抗体の活性フラグメントは、抗体を含むサンプルのタンパク質分解消化のような当技術分野で公知の方法を用いて製造されうる。特に示さない限り、抗体はポリクローナルまたはモノクローナルでありうる。抗体の調製物は全血または血清または血漿のような粗製物であることが可能であり、あるいは例えば分子量精製または硫酸アンモニウム沈殿のような粗分離法により部分的に精製されることが可能であり、あるいは例えば抗体のクラス、抗体のサブクラスに関するアフィニティークロマトグラフィーにより、または個々の抗原もしくはエピトープへの結合により、実質的に精製されうる。そのような精製のための方法は当技術分野で公知であり、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）に記載されている。
【実施例１】
【００９５】
水溶性コンジュゲートの製造
製造方法のこの実施形態は以下の４つの工程を含む：ジビニルスルホンでのデキストランの活性化、活性化デキストランのＢＳＡの結合、デキストラン−ＢＳＡ骨格のＢＳＡ部分へのローダミン色素の取り込み、およびデキストラン−ＢＳＡ−ローダミン骨格への抗体の架橋。
【００９６】
活性化デキストラン：
以下の溶液を活性化のために調製した：蒸留水中の２５ｍｇ／ｍｌ  デキストラン（５００，０００ＭＷ）、０．５Ｍ  リン酸カリウム（ｐＨ  １１．４）および蒸留水中の２５ｍｇ／ｍｌ  水素化ホウ素ナトリウム（使用直前に調製）。
【００９７】
活性化条件は、１０ｍｇ／ｍｌ  デキストラン最終濃度、０．２５Ｍ  リン酸カリウムバッファー、０．２５ｍｇ／ｍｌ  水素化ホウ素ナトリウム最終濃度および５％  ＤＶＳであった。全操作は換気フード内で行った。最初に該デキストラン、蒸留水およびリン酸カリウムバッファーを一緒にし、１０〜１５分間混合した。該水素化ホウ素ナトリウムを加え、ついで直ちにＤＶＳを加えた。ＤＶＳの添加の最初の一滴からタイマーを開始し、ＤＶＳを２分以内に滴下した。ＤＶＳの全量を加えた後、該溶液を３０〜３５分間まで継続的に攪拌した。その３０〜３５分間の温置の後、２５％  ＨＣｌでｐＨを７に調節することにより該活性化を停止させた。活性化デキストランを蒸留水に対して十分に透析し、この場合、該水を４日間にわたり１日２回交換した。透析物を集め、クロロブタノールを０．０１％の最終濃度で加えた。
【００９８】
活性化デキストランへのＢＳＡの結合：
該結合のために調製した溶液は、０．１Ｍ  塩化ナトリウム中の５０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、０．４Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ  １０．４）および０．１Ｍ  塩化ナトリウムであった。
【００９９】
結合条件は、１：２５の活性化デキストラン：ＢＳＡ（モル比）、０．０１０Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ  １０．４、３０℃および２２時間であった。該活性化デキストラン、ＢＳＡ溶液およびリン酸カリウムバッファーを一緒に加えた。該混合物のｐＨを１Ｍ  ＨＣｌで１０．４に調節した。該混合物を３０℃のオーブン中に２２時間配置した。その２２時間の温置の後、該混合物のｐＨを１Ｍ  ＨＣｌで６．５に低下させた。ついで、ランニングバッファーとしての０．１Ｍ  塩化ナトリウムと共にＳ３００サイズ排除カラムを使用して、該混合物を精製した。最初のピークを集め、次工程で使用した。
【０１００】
デキストラン−ＢＳＡのＢＳＡ部分へのローダミン色素の取り込み：
以下の溶液を調製した：１Ｍ  炭酸水素ナトリウム（ｐＨ  ８．６）、ＤＭＳＯ中の１０ｍｇ／ｍｌ  ローダミンイソチオシアナート、０．５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ  ７．２）。
【０１０１】
結合条件は、１００〜２００μｇ色素／ｍｇ  ＢＳＡ、０．１Ｍ  炭酸水素ナトリウム、ｐＨ  ８．０、３０℃および１時間であった。該デキストラン−ＢＳＡ、ローダミン溶液および炭酸水素ナトリウムバッファーを一緒に加えた。ｐＨを１Ｍ  ＨＣｌで８．０に調節した。該混合物を３０℃のオーブン中で１時間温置した。該温置の後、該混合物を１０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ  ７．２）に対して十分に透析した（４日間にわたり１日２回の交換）。透析物を集め、ブロニドクス（Ｂｒｏｎｉｄｏｘ）を０．０５％の最終濃度で加えた。
【０１０２】
デキストラン−ＢＳＡ−ローダミンへの抗体の架橋：
架橋に必要な成分は以下のとおりであった：抗体溶液、３．５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ  ９〜１０）、デキストラン−ＢＳＡ−ローダミン、蒸留水中の０．１Ｍ  システイン（使用直前に調製）、蒸留水および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．２）／０．１Ｍ  ＮａＣｌ／０．０２％  アジ化ナトリウム。
【０１０３】
架橋条件は、１：２．５〜１：５のデキストラン−ＢＳＡ−ローダミン：抗体（モル比）、３０℃、１８〜２２時間および２．５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４塩モル濃度であった。該デキストラン−ＢＳＡ−ローダミンを４０００ｇで遠心分離して粒子を除去した。該抗体溶液、デキストラン−ＢＳＡ−ローダミンおよびＫ２ＨＰＯ４を一緒にした。該混合物を３０℃のオーブン中で１８〜２２時間温置した。該温置の後、システインを全容量の１／１０加えた。蒸留水を加えることにより、該塩濃度を２．５Ｍ〜１．７５Ｍに調節した。ついで該混合物を９，３３３ｇで遠心分離して該水溶性コンジュゲートをペレット化した。該ペレットを、該架橋に使用したデキストラン−ＢＳＡ−ローダミンの元の容量の１／２の容量の蒸留水に再懸濁させた。該再懸濁ペレットを３２７ｇで５分間遠心分離した。ランニングバッファーとして５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／０．１Ｍ  ＮａＣｌ／０．０２％  アジ化ナトリウムを使用して、Ｓ３００ゲル濾過カラム内で上清を精製した。最初のピークを集め、標識コンジュゲートとして使用した。
【実施例２】
【０１０４】
デキストラン−ＢＳＡ−ローダミンに抗体を架橋した後の音波処理の利用
この実施例は該方法における音波処理の利用を例示する。架橋条件は１：２．５のデキストラン−ＢＳＡ−ローダミン：抗体（モル比）、３０℃、１８〜２２時間および２．５Ｍ  塩モル濃度であった。該デキストラン−ＢＳＡ−ローダミンを４０００ｇで遠心分離して粒子を除去した。該抗体溶液、デキストラン−ＢＳＡ−ローダミンおよびＫ２ＨＰＯ４を一緒にした。該混合物を３０℃のオーブン中で１８〜２２時間温置した。該温置の後、システインを全容量の１／１０加えた。蒸留水を加えることにより、該塩濃度を２．５Ｍ〜１．７５Ｍに調節した。ついで該混合物を９，３３３ｇで遠心分離して該水溶性コンジュゲートをペレット化した。該ペレットを、該架橋に使用したデキストラン−ＢＳＡ−ローダミンの元の容量の１／２の容量の蒸留水に再懸濁させた。該再懸濁ペレットを音波処理（出力設定７００ワット、５秒／サイクル、１０サイクル、サイクル間に１０秒間の休止）し、ついで３２７ｇで５分間遠心分離した。ランニングバッファーとして５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／０．１Ｍ  ＮａＣｌ／０．０２％  アジ化ナトリウムを使用して、Ｓ３００ゲル濾過カラム内で上清を精製した。最初のピークを集め、標識コンジュゲートとして使用した。
【０１０５】
標識パッドの調製のために、ＯＤ  １．５を２７−μｌ／試験で使用した。結果は、リガンドが存在しない場合には陰性結果を、そして２５ｍＩＵ／ｍｌおよび５０ｍＩＵ／ｍｌのリガンドが存在する場合には陽性結果を示した。
【実施例３】
【０１０６】
洗浄法の利用はゲル濾過カラムの使用を省略させる
以下の方法は、沈殿後の該ペレットの洗浄がゲル濾過または他の工程による該水溶性コンジュゲートの精製の必要性を無くすことを例示するものである。
【０１０７】
抗体および「Ｄｅｘ−ＢＳＡ−ローダミン」を含有する以下の溶液を調製した：０．００２５８μモルの抗体および０．００５３５μモルのデキストラン（「ｄｅｘ−ＢＳＡ−ローダミン」として）を３．５Ｍ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ  １１．５）と混合して以下の最終濃度を得た：２．５Ｍ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ  １１．０）。該溶液におけるモル比：「ｄｅｘ−ＢＳＡ−ローダミン」／抗体は１／２．５であった。
【０１０８】
混合後、沈殿物を溶液中で観察した。カップリング（結合）を３０℃で３時間継続させた。カップリング後、システインを該サンプルに、０．０１Ｍ  システインの最終濃度となるまで加えた。溶液中のリン酸バッファーの濃度を、該溶液への脱イオン水の添加により、１．７５Ｍに調節した。ついで溶液を１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、透明でほとんど無色の上清をピペットで注意深く吸引した。
【０１０９】
遊離抗体および結合抗体を含有する沈殿物（ペレット）を３ｍｌの脱イオン水に溶解した。該再溶解沈殿物を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心し、遊離抗体を含有する上清を排出させた。前記工程を１回繰返した。ついで該沈殿物（ペレット）を１ｍｌの脱イオン（ＤＩ）水に溶解した。「Ｄｅｘ−ＢＳＡ−ローダミン−抗体」コンジュゲートのＯＤ５５８を測定し、それは２０を上回った。結果を以下に要約する。
【０１１０】
【表１】
2009530639.tif 000003
【実施例４】
【０１１１】
非特異的タンパク質を使用する水溶性コンジュゲートの製造
この実施例は、非特異的タンパク質（この場合はＢＳＡおよび免疫グロブリン）を使用する水溶性コンジュゲートの製造を例示する。
【０１１２】
方法：
（１）以下の物質をこの順序で加えた：
Ｍｅｄｉｘのモノクローナル抗ベータＨＣＧ，クローン５００８  １０ｍｇ。
デキストラン−ＢＳＡ−色素  ６ｍｌ（デキストラン濃度０．００４３μｍ／ｍｌ）、（Ｄｅｘ：Ａｂ＝１：２．５）。
Ａｃｏｎ  ＢｉｏのマウスＩｇＧ，Ｒ１０３００８、５ｍｇ（Ｄｅｘ：マウスＩｇＧ＝１：１．２５）またはマウスＩｇＧ無し。
３．５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ  ９．５）２０．２ｍｌ（最終２．５Ｍ）。
３０Ｃ、Ｏ／Ｎ。
０．１Ｍ  システイン  ２ｍｌ。
ＤＩ水  ６．６７ｍｌ。
８０００ｒｐｍ、１０分間。
Ｓ−３００精製。
精製Ａｂコンジュゲートを標識パッドにＯＤ５５８＝０．６８６（５９μｌ／試験）で適用。
【０１１３】
試験結果：
【０１１４】
【表２】
2009530639.tif 000004
【０１１５】
２）第２の実施例において、以下の物質をこの順序で加えた。
【０１１６】
【表３】
2009530639.tif 000005
【０１１７】
精製Ａｂコンジュゲートを標識パッドにＯＤ５５８＝０．６８６（５９μｌ／試験）で適用。
【０１１８】
【表４】
2009530639.tif 000006
【実施例５】
【０１１９】
ジチオトレイトールでの前処理による水溶性コンジュゲートの製造
この実施例は、ジチオトレイトールでの抗体（標的化要素）の前処理を用いる水溶性コンジュゲートの製造を例示する。
【０１２０】
Ｄｅｘ−ＢＳＡ−ローダミン、ｄｅｘ濃度  ０．００４６４μＭ／ｍｌ、Ａｂ：モノクローナル抗ベータｈＣＧ，クローン５００８、４．８ｍｇ／ｍｌ。
【０１２１】
２．方法
【０１２２】
【表５】
2009530639.tif 000007
【０１２３】
結果
モノクローナル抗アルファｈＣＧ（Ａｃｏｎ  Ｂｉｏ）で除去（ｓｔｒｉｐ）されたＮＣ：ＦＨＣ１０２。
【０１２４】
【表６】
2009530639.tif 000008
【実施例６】
【０１２５】
代替逐次的コンジュゲート
この実施例は、水溶性コンジュゲートを製造するための１つの代替方法を例示する。この方法においては、水溶性コンジュゲートを形成させるために、水溶性中間体コンジュゲートと組合わせる前に、シグナル成分を標的化要素に連結する。
【０１２６】
ウシ血清アルブミンを活性化デキストランにコンジュゲート化した。該組成物を精製して遊離ＢＳＡを分離した。ついでｈＣＧ抗体をデキストラン−ＢＳＡに、５：１のモル比で、０．１Ｍ  リン酸カリウム（ｐＨ９．６）中、３０℃で１８時間コンジュゲート化した。該組成物を再び精製して遊離抗体を分離した。ローダミン色素を該デキストラン−ＢＳＡ−抗体に、１５０μｇ色素／ｍｇタンパク質の比で、０．１Ｍ  炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８．０）中、３０℃で３時間コンジュゲート化した。該反応をシステインで停止させ、再び１０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ  ７．２）に対して十分に透析した。最後に、該抗体を該デキストラン−ＢＳＡ−抗体−色素に、２．５：１の比で、２．５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ  １０．６）中、３０℃で１８時間架橋した。ついで該コンジュゲートを精製して遊離抗体を分離した。
【０１２７】
２７μｌ／試験で０．８のＯＤを用いて、標識パッドを調製した。結果は、リガンドが存在しない場合には陰性結果を、そして１００ｍＩＵ／ｍｌのリガンドが存在する場合には陽性結果を示した。
【実施例７】
【０１２８】
間接アッセイ形態
この実施例は間接アッセイ形態における本発明の使用を例示する。最初の遠心分離の後でペレットを蒸留水中で３回洗浄すること以外は前記の方法に従い、水溶性コンジュゲートを製造した。ついで最終ペレットを蒸留水に再懸濁させた。５秒間のサイクルを１０サイクル（サイクル間に１０秒間の休止）にわたって用いて、該溶液を音波処理した。標識パッドをＯＤ５５０  ４５で調製した。
【０１２９】
該標識パッドをこの形態に従い評価した：サンプル域、試薬域内のビオチン化アルファｈＣＧ抗体、標識パッド、ならびに検出域内のニトロセルロースおよび吸着剤上にストライプ処理（Ｓｓｔｒｉｐｅｄ  ｄｏｗｎ）されたストレプトアビジン−ＩｇＧを含有する試験ストリップ。該試験ストリップをプラスチックハウジング内に配置した。該試験装置を種々のレベルのｈＣＧ濃度、陰性尿および蒸留水で試験した。
【０１３０】
３分の時点で得られた結果は、ｈＣＧの非存在下の蒸留水および尿に関しては陰性であった。そして、１  ＩＵ／ｍｌ、５００ｍＩＵ／ｍｌ、１００ｍＩＵ／ｍｌおよび５０ｍＩＵ／ｍｌを含有するサンプルに関しては、陽性結果が得られた。
【実施例８】
【０１３１】
活性化デキストランへのＨＲＰのコンジュゲート化
この実施例は、分子量５００，０００のＤＶＳ活性化デキストランへのＨＲＰのコンジュゲート化を例示する。２６％の活性化度を有する５００，０００の分子量を有する活性化デキストランをＨＲＰ溶液に、１：２０（デキストラン：ＨＲＰ）のモル比で加えた。カップリングバッファーは１０ｍＭ  ホスファート（ｐＨ１０．４）であった。４０ｍｇ／ｍｌでＨＲＰを使用してカップリングを３０℃で２２時間継続した。３０℃の温置からボトルを取り出した後、ｐＨを１Ｍ  ＨＣｌで６．５に滴定した。該溶液をＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）Ｓ−２００ゲル濾過カラム上で分離した。使用前に脱気した０．１Ｍ  ＮａＣｌ中で該カラムを平衡化した。溶離液として０．１Ｍ  ＮａＣｌを使用する無勾配溶出により、精製を行った。ＨＲＰ溶出を４０３ｎｍで検出した。
【実施例９】
【０１３２】
電気化学的イムノアッセイのための抗ｈＣＧコンジュゲートの製造
この実施例は、高塩バッファー中の沈殿を用いるジビニルスルホン活性化デキストラン−ＨＲＰへの抗ｈＣＧ抗体のコンジュゲート化による抗ｈＣＧコンジュゲートの合成を例示する。
【０１３３】
抗ベータｈＣＧ（Ｒ００６００３、ＰＢＳ中、６．５ｍｇ／ｍｌ）を、活性化デキストラン−ＨＲＰ−コンジュゲートに、該デキストラン上の遊離ジビニルスルホン（ＤＶＳ）基を介してコンジュゲート化する。カップリングおよび沈殿の後、遊離未反応ＶＳ基をシステインの添加により遮蔽する。沈殿物を遠心分離によりペレット化し、脱イオン水中の音波処理により再懸濁させる。デキストラン−ＨＲＰ／抗ｈＣＧコンジュゲートをＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）Ｓ−３００上のゲル濾過により未結合抗体から分離する。精製されたコンジュゲートを２８０ｎｍで測定する。
【０１３４】
デキストラン−ＨＲＰ  １モル当たり抗体２モルのモル比を用いた。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０．９５ｍｌの抗ベータｈＣＧ（６．５ｍｇ／ｍｌ）と共に０．４６ｍｌのデキストラン−ＨＲＰ。１５ｍｌの円錐チューブ内で回転させながら、１．９ｍｌのＫ２ＨＰＯ４（３Ｍ，ｐＨ  ９．０）を滴下して該ホスファート濃度を２Ｍとした。全容量は３．３１ｍｌであった。該チューブを、１２５ｒｐｍで穏やかに振とうしながら、３０℃で１８時間温置した。１８時間後、溶液表面付近に該沈殿物が蓄積する。０．４６ｍｌの脱イオン水を加え、該溶液を混合してホスファート濃度を１．７５Ｍに調節した。０．３７７ｍｌの０．１Ｍ  システインを加えて、残留ビニル基を覆った（ｃａｐ）。ついで該溶液を穏やかに混合し、室温で１５分間放置した。該混合物を２ｍｌのミクロフュージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）チューブに移し、１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心した。透明な上清を除去し、ペレットを再懸濁させ、約１．５ｍｌの容量の脱イオン水中に一緒にした。
【０１３５】
該チューブを、カップホルン（ｃｕｐｈｏｒｎ）浴内に氷を維持したカップホルンソニケーター内で音波処理した。該ソニケーターの制御器を５秒パルス、９０％最大出力に設定した。音波処理中、ポリプロピレンプラスチックチューブを音波プローブに押し付けて、４℃で最大エネルギー転移を得た。音波処理を３分間隔で行った。該チューブを氷上で維持し、該ソニケーターに３分間隔で４回押し付けた。この方法は、サンプルの微小加熱（ｍｉｃｒｏ−ｈｅａｔｉｎｇ）を妨げ、サンプルの再可溶化を最大にすることが判明した。
【０１３６】
該ペレットを再び遠心沈殿させ、上清を取っておいた。該ペレットを０．３５ｍｌのＤＩ水に再懸濁させ、該音波処理操作を繰返した。該ペレットの少なくとも９０％が溶解するまで、音波処理および遠心のサイクルを繰返した。ついでそれらの溶液を一緒にした。
【０１３７】
３０，０００の分子量カットオフを有する遠心濃縮器を使用して、溶解したコンジュゲートを約１ｍｌの容量まで濃縮した。ついで、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ７．２）で予め平衡化されたＳ−３００カラム（少なくとも３１ｍｌのベッド容量）に該コンジュゲートを適用した。溶出をＴｒｉｓ緩衝食塩水で１ｍｌ／分の流速で行い、最初のピークを１個または２個の画分内に集めた。該コンジュゲートは最初のピークに溶出し、ピーク画分を一緒にした。
【実施例１０】
【０１３８】
電気化学的検出のための抗体での電極の被覆
この実施例は、ｈＣＧの電気化学的検出のためのアフィニティーセンサーとして使用する、抗体で被覆された炭素電極の製造を例示する。
【０１３９】
Ｍｅｌｉｎｅｘ（登録商標）ＳＴ３２８ポリエステルフィルム基質を有するスクリーンプリンント（ｓｃｒｅｅｎ−ｐｒｉｎｔｅｄ）炭素電極を使用した。黒鉛インクおよび塩化銀インクを使用して、該電極をプリントした。該スクリーンプリンターはＳＭＴ  Ｏｐｔｉｐｒｉｎｔ，モデル１６１６，ＰＤ−Ｆであった。
【０１４０】
該電極を、１００μｇ／ｍｌの抗αｈＣＧ抗体を含有する被覆バッファーに室温で２時間浸け、ついでブロッキングバッファーに室温で１時間浸けた。洗浄および乾燥の後、該電極を乾燥状態で保存した。
【０１４１】
その被覆された電極を、既知濃度のｈＣＧ（例えば、０、２、５または５０ｍＩＵ／ｍｌ  ｈＣＧ）を含有するＰＢＳバッファーまたはサンプルマトリックス中で室温で３０分間温置した。洗浄後、該電極を標識コンジュゲートバッファー中の抗βｈＣＧ標識コンジュゲート（３μｇ／ｍｌ）に室温で３０分間浸けた。洗浄後、２０μｌの基質を該電極に適用し（ＡＬＰコンジュゲートの場合、２０ｍＭ  リン酸ナフトール、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  ジエタノールアミン，ｐＨ  ９．６）、室温で１０分間温置した。ついで、示差パルスボルタンメトリーを用いて、シグナルを記録した。
【実施例１１】
【０１４２】
通常のＨＲＰ−Ａｂ検出とＨＲＰ−デキストラン−Ａｂとの比較
５０μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジンおよび１３３μｌの１００μｇ／ｍｌ  ビオチン化６００２  ｈＣＧ捕捉抗体を容器内に混合し、５０分間混合することにより、捕捉表面を調製した。該ビーズを洗浄バッファー（０．５％  ＢＳＡおよび０．５％  Ｔｗｅｅｎを含有する８０μｌのリン酸バッファー（ｐＨ７．２））で洗浄した。８０μｌの１％  カゼインを加え、該混合物を２時間温置した。ついで該混合物を１％  カゼインで洗浄し、１６６μｌの１％  カゼインに再懸濁させ、４℃の冷蔵庫内に配置した。
【０１４３】
２つのチューブをＡおよびＢと表示した。チューブＡに１０μｌの該ビーズを加えた。適当な洗浄の後、本明細書に記載されているとおりに調製した５μｌのＨＲＰ−６００３コンジュゲートをパッド化（ｐａｄ）し、該混合物を振とう器上に配置した。５０μｌのｈＣＧ標準を、混合しながらチューブＡに加えた。該混合物を７．５分間温置し、洗浄バッファー（前記）で２回洗浄し、５０μｌの洗浄バッファーに再懸濁させた。
【０１４４】
チューブＡ内のビーズをチューブＢに移し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。ついで該ビーズを磁石で分離し、上清を取り出した。１５μｌの酵素基質混合物（１０ｍＭの最終濃度となるよう新たに混合されたＨ２Ｏ２を含有する１０ｍＭ  ヒドロキノン）を洗浄した後、２０分間の混合を行った。該ビーズを分離し、５μｌのビーズを電極上にピペッティングして示差パルスボルタンメトリーを実施した。
【０１４５】
比較のために、独立した実験において、３０μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジンを８０μｌの１００μｇ／ｍｌ  ｂｉｏｔ−６００２抗体と混合することにより、該捕捉表面を調製した。該混合物を４５分間混合し、０．５％  ＢＳＡおよび０．５％  Ｔｗｅｅｎを含有する８０μｌのリン酸バッファー（ｐＨ７．２）で１回洗浄した。８０μｌの１％  カゼインを加え、２時間温置した。該混合物を８０μｌのカゼインで洗浄し、１００μｌの１％  カゼインに再懸濁させた。標識抗体は、本明細書に記載されているとおりに調製したアルカリホスファターゼ−６００３コンジュゲート抗体であった。ｈＣＧ標準は以下のとおりに調製した。
ウェル４００−１２０μｌの１％  カゼイン＋８０μｌのｈＣＧを加える。
ウェル２００−１００μｌの１％  カゼイン＋前記チューブからの１００μｌを加える。
ウェル１００−１００μｌの１％  カゼイン＋前記チューブからの１００μｌを加える。
ウェル５０−１００μｌの１％  カゼイン＋前記チューブからの１００μｌを加える。
ウェル２５−１００μｌの１％  カゼイン＋前記チューブからの１００μｌを加える。
ウェル１２．５−１００μｌの１％  カゼイン＋前記チューブからの１００μｌを加える。
ウェル０−１００μｌの１％  カゼインを加える。
【０１４６】
マイクロタイタープレートの１つの列に沿ってｈＣＧ標準を調製し、ウェル当たり５μｌの標識抗体を加えた。２分の時点で、５０μｌのｈＣＧ標準を第１２列から第１列へ素早く移し、混合し、２分間プレ温置した。ウェル当たり１０μｌのビーズを、プレート振とう器上で混合しながら加え、８分間温置した。該ビーズを磁石で分離し、上清を各ウェルから除去した。該ビーズを、０．５％  ＢＳＡおよび０．５％  Ｔｗｅｅｎを含有する７０μｌのリン酸バッファー（ｐＨ７．２）で２回洗浄した。ついで７０μｌの該リン酸バッファーを各ウェルに加え、該ビーズを第２列内の隣接ウェルに移した。該ビーズを再び７０μｌのリン酸バッファーで洗浄した。１５μｌの基質（１００ｍＭ  ジエタノールアミン（ｐＨ９．６）中の２０ｍＭ  １−ナフチルホスファート）を加え、該混合物を２５分間温置した。該ビーズを保持し、示差パルスボルタンメトリーのために８μｌの基質をスクリーンプリント電極上に直接移した。
【０１４７】
図２は、本発明に従い電気化学的検出を利用した場合、通常の電気化学的方法と比べて数倍高い感度が得られたことを示している。通常の方法で用いた約２倍も長い温置時間（２０分間）（一方、本発明方法では１１分間）に関して補正したところ、該相違はより一層劇的である。
【０１４８】
本明細書中に例示として記載されている本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素、限定の非存在下で実施されうる。用いられている用語および表現は、限定ではなく説明のための用語として用いられおり、そのような用語および表現の使用においては、示されており記載されている特徴またはその一部のいずれの均等物をも除外することを意図するものではなく、特許請求されている本発明の範囲内で種々の変更が可能であると認識される。したがって、本発明は種々の実施形態および随意的な特徴により具体的に開示されているが、開示されている本発明における概念の修飾および変更が当業者により施されることが可能であり、そのような修飾および変更も、添付の特許請求の範囲により定められる本発明の範囲内であるとみなされると理解されるべきである。
【０１４９】
本明細書中に挙げられている又は引用されている文献、特許および特許出願ならびに全ての他の文書および電子的に入手可能な情報の内容の全体を、それぞれの個々の刊行物が参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別的に示されているのと同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。本出願人は、任意のそのような文献、特許、特許出願または他の文書からのあらゆる資料および情報を本出願に物理的に組み入れる権利を保有する。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１Ａ】図１は水溶性コンジュゲートおよびその製造における一般技術の概要図であり、読者が該コンジュゲートを視覚化し本明細書に記載の方法を理解するのを助けるものである。
【図１Ｂ】図１は水溶性コンジュゲートおよびその製造における一般技術の概要図であり、読者が該コンジュゲートを視覚化し本明細書に記載の方法を理解するのを助けるものである。
【図２】図２は通常のＨＲＰ−デキストランコンジュゲート検出方法と本発明方法との応答の比較を示す。
【図１Ａ】
2009530639.tif 000009
【図１Ｂ】
2009530639.tif 000010
【図２】
2009530639.tif 000011
【国際調査報告】
2009530639.tif 000012
2009530639.tif 000013