(57)【要約】本発明は、テンプレートの少なくとも一部分、およびテンプレート相補的配列の少なくとも一部分を配列決定することにより、合成反応による配列決定の正確さを改良する方法を提供する。一つの実施形態において、テンプレート核酸がプライマーにハイブリダイズされ、そしてテンプレート依存の、合成による配列決定が行われ、プライマーの３’末端が伸長される。このテンプレートは、次に、伸長されたプライマーから除去され、そしてこのプライマーが次いで「プライム」され、そして再び配列決定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸配列決定の正確さを増加させる方法であって：
ａ）テンプレートおよびプライマーを含む二重鎖を、ポリメラーゼおよび検出可能な標識を含む１つ以上のヌクレオチドに、該プライマーへのテンプレート−依存ヌクレオチド付加のために十分な条件下で曝し、ここで、該テンプレートが、個々に光学的に解像可能である工程；
ｂ）該プライマー中に取り込まれたヌクレオチドを識別する工程；
ｃ）工程ａ）およびｂ）を繰り返す工程であって、それによってヌクレオチド配列を決定する工程；
ｄ）工程ｃ）のプライマーからテンプレートを除去する工程；
ｅ）工程ｄ）のプライマーの３’末端にポリヌクレオチドを添加し、テンプレートを形成する工程；
ｆ）工程ｅ）のテンプレートを、該添加されたポリヌクレオチドにハイブリダイズし得るプライマーに曝し、テンプレート／プライマー二重鎖を形成する工程、および
該テンプレートの一部分を配列決定するために工程ａ）〜ｃ）を繰り返す工程、
を包含し、ここで、得られる配列の少なくとも一部分が、ｃ）のヌクレオチド配列に相補的であり、それによって、核酸配列決定の正確さが増加する、方法。
【請求項２】
前記工程ｃ）で得られる配列が、前記工程ｆ）で得られる配列の相補物と比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程ｄ）およびｆ）を繰り返す工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標識が、光学的に検出可能な標識である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記光学的に検出可能な標識が、蛍光標識である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記蛍光標識が、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＢＯＤＩＰＹ、アレクサ、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記二重鎖が、表面に付着される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記プライマーが、表面に付着される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、一般に、核酸合成反応における正確さを増加するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
インビトロ核酸合成は、核酸増幅および配列決定のような、多くの基礎的な研究および診断ツールの基礎である。テンプレート依存核酸合成反応において、ヌクレオチドの逐次的添加は、核酸ポリメラーゼによって触媒される。テンプレートおよび反応の性質に依存して、核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素であり得る。
【０００３】
テンプレート依存核酸合成の正確さは、相補的ヌクレオチドと非相補的ヌクレオチドとの間を識別するポリメラーゼの能力に一部依存する。通常、ポリメラーゼ酵素の立体構造は、相補的ヌクレオチドの取り込みを好む。しかしなお、局所的配列および取り込まれる塩基のような因子に依存する誤取り込みの識別可能率が存在している。
【０００４】
標識されたヌクレオチドのような、合成または改変ヌクレオチドおよびアナログは、天然に存在するヌクレオチドより少ない効率でプライマー中に取り込まれる傾向にある。非在来ヌクレオチドがポリメラーゼによって取り込まれる減少された効率は、そのような非在来ヌクレオチドの忠実な取り込みに依存する配列決定技法の性能に有害に作用し得る。
【０００５】
単一分子配列決定技法は、遺伝子機能に影響を与え得る変化および／または差異を識別するために、個々の核酸分子の評価を可能にする。単一分子技法においては、核酸フラグメントが、この核酸フラグメントの少なくとも一部分が個々に光学的に解像可能であるように固体支持体に付着される。配列決定は、上記フラグメントをテンプレートとして用いて実施される。配列決定事象は検出され、そして個々のストランドに関連付けられる。例えば、本明細書中に参考として援用される非特許文献１を参照のこと。単一分子技法は、バルク技法が行うようなアンサンブル平均化に依存しないので、誤取り込みに起因する誤りは、配列決定結果に対し顕著に有害な影響を与え得る。プライマー伸長の間の対応するテンプレートヌクレオチドとの、標準的なＷａｔｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｉｃｋ塩基対合の下で、不正確に対合されているヌクレオチドの取り込みは、配列決定誤りを生じ得る。さらに、配列決定されるテンプレートが、サンプル中に１つまたは２〜３コピーのみで存在する場合（希なテンプレート）、誤取り込みは、得られる配列に大きな衝撃を有し得る。なぜなら、得られる、互いに比較されるか、または参照配列と比較される配列がより少ないからである。
【非特許文献１】Ｂｒａｓｌａｖｓｋｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１００：３９６０−６４（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、当該技術分野には、特に単一分子配列決定における核酸合成反応の正確さを改良するための改良された方法に対する必要性が存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、核酸配列決定反応の正確さを改良する。本発明によれば、テンプレート核酸がプライマーにハイブリダイズされ、そしてテンプレート依存の、合成による配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）が行われ、プライマーの３’末端を伸長する。このテンプレートは、次に、伸長されたプライマーから除去され、そしてこのプライマーが次いで「プライム」され、そして再び配列決定される。本発明の実施は、同じ配列およびその相補物のインサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）での再配列決定を可能にし、そして配列決定の正確さの増加をもたらし得る。
【０００８】
本発明によれば、重合反応は、テンプレート核酸にハイブリダイズしたプライマーを含む核酸二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）上で実施される。この反応は、ポリメラーゼ、および検出可能な標識を含む少なくとも１つのヌクレオチドの存在下で実施される。このヌクレオチドが、テンプレート中の次のヌクレオチドに相補的である場合、それは、ポリメラーゼによってプライマーに付加される。付加されたヌクレオチドは検出され、そして上記反応は、次に少なくとも一度繰り返される。それ故、プライマーは、テンプレートの少なくとも一部分に相補的である配列に対応する１つ以上のヌクレオチドによって伸長される。このテンプレートは、二重鎖から除去され、伸長されたプライマーを残す。
【０００９】
１つの実施形態では、１つ以上のプライマー／テンプレート二重鎖は、二重鎖の少なくともいくつかが個々に光学的に検出可能であるように固体支持体に結合される。これら二重鎖は、ポリメラーゼ、および少なくとも１つの検出可能に標識されたヌクレオチドに、プライマーへのテンプレート依存ヌクレオチド付加のために十分な条件下で曝される。取り込まれなかった標識ヌクレオチドは、必要に応じて洗い流される。標識されたヌクレオチドの取り込みは検出され、それによって、付加されたヌクレオチドおよび相補的テンプレートヌクレオチドを識別する。塩基付加工程、洗浄工程、および識別工程は、その他のヌクレオチド種の各々に対応する検出可能に標識されたヌクレオチドの存在下で連続的に繰り返され得る。結果として、プライマーは、付加されたヌクレオチドによって伸長される。これら付加されたヌクレオチドは、テンプレートの少なくとも一部分に相補的である配列に対応する。
【００１０】
１つ以上のプライマー伸長反応の後、テンプレートは二重鎖から除去される。テンプレートは、任意の適切な手段、例えば、表面の温度を高めることによるか、もしくは二重鎖が融解されるようにフローセルによるか、または二重鎖を不安定にする緩衝液条件を変更するか、またはそれらの組み合わせにより除去され得る。テンプレート／プライマー二重鎖を融解するための方法は、当該技術分野で周知であり、そして例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）の第１０章に記載され、その教示は、本明細書中に参考として援用される。テンプレートは、次に、例えば、表面を、適切なリンス溶液でリンスすることにより表面から除去され得る。
【００１１】
テンプレートを除去した後、重合反応中で用いられ伸長されたプライマーは、表面上に残る。プライマーの３’末端は、次いで、短いポリヌクレオチドの付加により改変される。このポリヌクレオチドは、酵素触媒によってプライマーに付加される。好ましい酵素は、リガーゼまたはポリメラーゼである。適切なリガーゼは、例えば、Ｔ４リガーゼおよびＴ４ＲＮＡリガーゼ（このようなリガーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  ＷｅｂのＮＥＢ．ｃｏｍ上）から入手可能であり市販されている）、ならびにプライマーの３’末端にヌクレオチドを付加し得るその他のプライマーを含む。好ましい実施形態では、脱リン酸化ポリヌクレオチドがプライマーに付加される。リガーゼおよび脱リン酸化オリゴヌクレオチドを用いるための方法は、当該技術分野で周知である。
【００１２】
重合が、プライマーの３’末端にポリヌクレオチドを付加するために用いられる場合、任意の適切な酵素が用いられ得る。例えば、ＵＳＢ（Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  ＷｅｂのＵＳＢ．ｃｏｍ上）から市販され入手可能である酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼを含むポリ（Ａ）ポリメラーゼ、末端デオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）などのようなポリメラーゼが有用である。これらポリメラーゼは、製造業者の指示書に従って用いられ得る。
【００１３】
上記に記載のように改変されて、上記プライマーは、次に、上記に概略が説明されたような、テンプレート依存の、合成による配列決定のためのテンプレートとして用いられる。
【００１４】
上記のプライマーに付加されるポリヌクレオチドは、それが新たなプライマー（またはその少なくとも一部分）に相補的であるように選択される。好ましい実施形態では、このポリヌクレオチドは、オリゴ（ｄＡ）のようなホモポリマーであり、そして対応するプライマーはオリゴ（ｄＴ）配列を含む。これら相補的配列は、ハイブリダイゼーションに適切な長さである。付加されたポリヌクレオチドおよびその相補的な新たなプライマーは、長さが約１０〜約１００ヌクレオチド、そして好ましくは長さが約５０ヌクレオチドであり得る。この付加されたポリヌクレオチドおよび新たなプライマーは、同じ長さまたは異なる長さであり得る。ハイブリダイゼーションを最適化するためにプライマー長さおよび／またはオリゴヌクレオチド長さを調節することは、当該技術分野では慣用である。
【００１５】
一旦、ポリヌクレオチドがプライマーの３’末端に付加され、そして新たなプライマー配列がこのポリヌクレオチド（またはその一部分）にハイブリダイズされると、テンプレート依存の合成による配列決定が、プライマー上で当初の配列決定反応の反対方向（すなわち、プライマーが結合される表面に向かって）に実施される。
【００１６】
表面に向かって戻るこの配列決定反応を実施した後、「新たに」伸長されたプライマーは融解して離れ得、３’から５’方向（すなわち、表面に向かう）における任意の再配列決定のための当初のテンプレートと相補的な配列を有するテンプレートを残す。
【００１７】
当初のテンプレートの相補物の少なくとも一部分を配列決定すること、および／または再配列決定することは、例えば、参照配列と比較するために１セット以上の配列情報を提供することにより、所定のテンプレートから得られる配列情報の正確さを増加させる。別の実施形態では、最初に得られた配列は、新たなテンプレートから得られた配列と比較され得る。
【００１８】
本発明の配列決定方法は、好ましくは、表面に付着されたテンプレート／プライマー二重鎖を含む。この表面に付加された個々のヌクレオチドは、検出可能な標識−好ましくは、蛍光標識のような光学的に検出可能な標識を含む。各ヌクレオチド種は異なる標識を含み得るか、または同じ標識を含み得る。好ましい実施形態では、各鎖は単一分子配列識別を容易にするために個々に光学的に解像可能である。二重鎖の付着のための表面の選択は、採用される検出方法に依存する。本発明の方法のための好ましい表面は、Ｂｒａｓｌａｖｓｋｙら、前述、に記載のされる表面のような、エポキシド表面および多価電解質多層表面を含む。表面は、好ましくは、ガラスまたはシリカのような、表面化学の光学的検出を受け易い基体上に堆積される。
【００１９】
本発明で有用なヌクレオチドは、天然に存在するか、または合成の任意のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む。例えば、好ましいヌクレオチドは、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、アデノシン、シチジン、グアノシン、およびウリジンのリン酸エステルを含む。
【００２０】
本発明で有用なポリメラーゼは、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのプライマーへのテンプレート依存付加を触媒し得る任意の核酸ポリメラーゼを含む。標的核酸の特徴に依存して、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、これらの任意の変異体または改変形態が用いられ得る。本発明の１つの局面によれば、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）、９゜ＮＴＭ、ＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒＴＭ、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ、Ｔｌｉ、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント、ＶｅｎｔＴＭおよびＤｅｅｐ  ＶｅｎｔＴＭＤＮＡポリメラーゼのような、好熱性ポリメラーゼが用いられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（詳細な説明）
本発明は、テンプレート核酸の少なくとも一部分を再配列決定することにより、合成反応による核酸配列決定の正確さを改良するための方法および組成物を提供する。バルク配列決定方法に適用可能であるが、本発明は、単一分子配列決定方法と組み合わせて特に有用である。本発明に従って、この方法は、テンプレートおよびプライマーを含む二重鎖を、ポリメラーゼおよび検出可能な標識を含む１つ以上のヌクレオチドに、プライマーへのテンプレート依存ヌクレオチド付加のために十分な条件下で曝す工程を包含する。１つの実施形態では、このテンプレートは、個々に光学的に解像可能である。任意の取り込まれなかった標識ヌクレオチドは、必要に応じて洗い流される。プライマー中に取り込まれた任意のヌクレオチドは、取り込まれたヌクレオチドに付随する標識を検出することにより識別される。二重鎖を、ポリメラーゼおよび検出可能な標識を含む別のヌクレオチドに曝す工程、および重合工程、必要に応じた洗浄工程、および識別工程は繰り返され、それによってヌクレオチド配列が決定される。曝す工程および重合する工程の結果として、プライマーは、テンプレートの対応する位置に相補的である１つ以上のヌクレオチドの付加により伸長される。テンプレートは、次いで二重鎖から除去され、伸長されたプライマーを残す。ポリヌクレオチドがプライマーまたは伸長されたプライマーの３’末端に付加され、それによって、改変されたプライマーを形成する。この改変されたプライマーは、引き続く配列決定反応でテンプレートとして用いられる。
【００２２】
図は、本発明の１つの実施形態の概略表示である。この実施形態では、プライマー２が、固体支持体３に付着される。テンプレート１がこのプライマーにハイブリダイズされ、テンプレート／プライマー二重鎖を形成する。ステップＡでは、テンプレートプライマー／二重鎖が、ポリメラーゼおよび検出可能な標識を含む少なくとも１つのヌクレオチドに、上記プライマーへのテンプレート依存のヌクレオチド付加のために十分な条件下で曝される。このヌクレオチドが、プライマーの直ぐ下流のテンプレートヌクレオチドに相補的である場合、ヌクレオチドがプライマーに付加される。プライマーに取り込まれたヌクレオチドが識別された後、このプロセスは繰り返され、それによって、第２のヌクレオチドが、テンプレート依存様式でこのプライマーに付加される。以下同様。図に示されるように、このプロセスを繰り返す結果として、テンプレート相補的配列４がプライマーに付加される。このプロセスが所望の回数繰り返された後、テンプレートは、ステップＢに示されるように除去され、伸長されたプライマーを残す。ステップＣでは、ポリヌクレオチド６が、伸長されたプライマーにその３’末端（例えば、先に付加されたテンプレート相補的配列の下流）で付加され、反対方向の配列決定のための新たなテンプレートを形成する。ステップＤでは、上記ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得るプライマーが付加され、テンプレート／プライマー二重鎖７が形成される。ヌクレオチドおよびポリメラーゼを付加するプロセス、取り込まれたヌクレオチドを検出する工程、および所望の回数繰り返す工程が、次いで、図Ｅに示されるように、改変され伸長されたプライマーを用いて繰り返され、それによって、テンプレート相補的配列４、８を配列決定する。結果として、プライマー６は、当初のテンプレート１の少なくとも一部分に対応する配列８の付加により伸長される。伸長されたプライマー（６、８）は除去され得、Ｆおよびテンプレートは、上記に記載のように再配列決定される。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態では、直接アミン付着が、プライマーまたはテンプレートをエポキシド表面に付着するために用いられる。このプライマーまたはテンプレートは、この表面上の二重鎖の位置を決定するために光学的に検出可能な標識を含み得る。この二重鎖の少なくとも一部分は、この表面上でその他の二重鎖から光学的に解像可能である。この表面は、好ましくは、不動態化がなければ蛍光を発し得る表面の部分を占める試薬で不動態化される。最適不動態化試薬は、アミン、リン酸塩、水、硫酸塩、洗浄剤、および本来の、または蓄積する表面蛍光を低減するその他の試薬を含む。配列決定は、次いで、プライマー中の相補的塩基取り込みを促進する条件下でポリメラーゼの存在下、１つ以上の標識されたヌクレオチドを呈示されることによって達成される。好ましい実施形態では、一度に（サイクルあたり）１つの塩基が添加され、そしてすべての塩基は同じ標識を有する。各取り込みサイクルの後には洗浄ステップがあり、そして標識は、除去されずに中和されるか、または取り込まれたヌクレオチドから除去される。塩基付加の所定の数のサイクルの終了の後、各々の個々の二重鎖に対する直線配列データは編集される。以下に論議されるように、多くのアルゴリズムが、配列編集およびアラインメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）のために利用可能である。
【００２４】
一般に、エポキシドで被覆されたガラス面が、テンプレート、プライマー、または両方の直接アミン付着のために用いられる。テンプレートおよびプライマー分子の末端へのアミン付着は、ターミナルトランスフェラーゼを用いて達成される。プライマー分子は、二重鎖形成のためにテンプレートにハイブリダイズするよう注文合成され得る。
【００２５】
全サイクルは、所望の長さのテンプレートの配列決定、またはテンプレート相補的配列の所望の長さの再配列決定を終了するために必要な限り多くの回数実施される。一旦、所望の数のサイクルが終了されると、この結果は、コンピューターデータベース中に呈示されるイメージのスタックである。初期の個々の二重鎖を含んだ表面上の各スポットに対して、塩基が任意の所定のサイクルで取り込まれた否かに対応して一連の明画像および暗画像の座標（コーディネート）が存在し得る。例えば、上記テンプレート配列が、ＴＡＣＧＴＡＣＧであり、そしてヌクレオチドが、ＣＡＧＵ（Ｔ）の順で呈示された場合、そのときは、二重鎖は、第１のサイクル（Ｃの呈示）については、「暗い」（すなわち、検出可能な信号はない）が、第２のサイクル（テンプレート配列中で第１のＴに相補的であるＡの呈示）では信号を示す。サンプル二重鎖は、Ｇの呈示に際して信号を生成する。なぜなら、そのヌクレオチドは、テンプレート中の次の利用可能な塩基Ｃに相補的であるからである。次のサイクル（Ｕの呈示）に際し、二重鎖は暗い。なぜなら、テンプレート中の次の塩基はＧであるからである。多くのサイクルの呈示に際し、テンプレートの配列は、画像スタックを通じて構築され得る。配列決定データは、次いで、再配列決定のために以下に記載のようにアライナー（ａｌｉｇｎｅｒ）に供給されか、または、プライマー中に取り込まれたヌクレオチドの直線状配列としてデノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）の配列決定のために編集される。
【００２６】
本発明の実施で用いられるイメージングシステムは、単一の蛍光分子が解像され得るような倍率で配列決定表面の十分な照明を提供する任意のシステムであり得る。
【００２７】
（一般的考察）
（Ａ．核酸テンプレート）
核酸テンプレートは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。核酸テンプレート分子は、タンパク質、脂質および非テンプレート核酸のような種々のその他の成分を含む生物学的サンプルから単離され得る。核酸テンプレート分子は、動物、植物、細菌、真菌、または任意のその他の細胞生物から得られる任意の細胞材料から得られ得る。本発明における使用のための生物学的サンプルはまた、ウイルス粒子またはウイルス材料から調製されたサンプルを含む。核酸テンプレート分子は、生物から直接、または生物から得られる生物学的サンプル（例えば、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、糞便）および組織から得られ得る。任意の組織または体液標本が、本発明における使用のための核酸の供給源として用いられ得る。核酸テンプレート分子はまた、一次細胞培養または細胞株のような培養された細胞から単離され得る。テンプレート核酸が得られる細胞または組織は、ウイルスまたはその他の細胞内病原体で感染され得る。サンプルはまた、生物学的標本、ｃＤＮＡライブラリー、ウイルス、またはゲノムＤＮＡから抽出された総ＲＮＡであり得る。
【００２８】
生物学的サンプルから得られた核酸は、代表的にはフラグメント化され、分析のための適切なフラグメントを生成する。１つの実施形態では、生物学的サンプルからの核酸は、超音波処理によってフラグメント化される。核酸テンプレートは、２００３年１０月９日に公開され、その教示がそれら全体で本明細書中に参考として援用される米国特許出願第２００２／０１９０６６３号に記載のように得られ得る。一般に、核酸は、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、ｐｐ２８０−２８１（１９８２）によって記載されるような種々の技法により生物学的サンプルから抽出され得る。一般に、個々の核酸テンプレート分子は、約５塩基から約２０ｋｂまでであり得る。核酸分子は、一本鎖、二本鎖、または一本鎖領域をもつ二本鎖（例えば、ステム構造およびループ構造）であり得る。
【００２９】
本明細書中に記載されるような生物学的サンプルは、洗浄剤または界面活性剤の存在下でホモゲナイズまたは分画され得る。緩衝液中の洗浄剤の濃度は、約０．０５％〜約１０．０％であり得る。この洗浄剤の濃度は、洗浄剤が溶液中で可溶性のままである量までであり得る。好ましい実施形態では、洗浄剤の濃度は、０．１％〜約２％であり得る。この洗浄剤、特に非変性性の刺激性の少ないものは、サンプルを可溶化するように作用し得る。洗浄剤は、イオン性または非イオン性であり得る。非イオン性の洗浄剤は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘシリーズ（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００  ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｘＯＨ、ｘ＝９−１０、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００Ｒ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４  ｘ＝７−８）のようなトリトン、オクチルグルコシド、ポリオキシエチレン（９）ドデシルエーテル、ジギトニン、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ６３０オクチルフェニルポリエチレングリコール、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（βＯＧ）、ｎ−ドデシルβ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート、ポリドカノール、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）、ＮＰ−４０ノニルフェニルポリエチレングリコール、Ｃ１２Ｅ８（オクタエチレングリコールｎ−ドデシルモノエーテル）、ヘキサエチレングリコールモノ−ｎ−テトラデシルエーテル（Ｃ１４ＥＯ６）、オクチル−β−チオグルコピラノシド（オクチルチオグルコシド、ＯＴＧ）、Ｅｍｕｌｇｅｎ、およびポリオキシエチレン１０ラウリルエーテル（Ｃ１２Ｅ１０）を含む。イオン性洗浄剤（アニオン性またはカチオン性）の例は、デオキシコレート、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ−ラウロイルサルコシン、およびセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を含む。Ｃｈａｐｓ、両性イオン３−１４、および３−［（３−コルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネートのような両性イオン試薬がまた、本発明の精製スキームで用いられ得る。尿素が、別の洗浄剤または界面活性剤とともに、またはそれらなしで添加され得ることがまた企図される。
【００３０】
溶解または均質化溶液は、還元剤のようなその他の試薬をさらに含み得る。このような還元剤の例は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール、ＤＴＥ、ＧＳＨ、システイン、システアミン、トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）、または亜硫酸の塩を含む。
【００３１】
（Ｂ．ヌクレオチド）
本発明で有用なヌクレオチドは、天然に存在するか、または合成のいずれかの任意のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む。例えば、好ましいヌクレオチドは、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、アデノシン、シチジン、グアノシン、およびウリジンのリン酸エステルを含む。本発明で有用なその他のヌクレオチドは、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン塩基、キサンチンまたはヒポキサンチン；５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、デオキシイノシン、またはメチル化シトシン、例えば、５−メチルシトシン、およびＮ４−メトキシデオキシシトシンを含む。また、メチル化核酸、例えば２’−Ｏ−ｍｅｔｈＲＮＡのようなポリヌクレオチド模倣物の塩基、ペプチド核酸、改変ペプチド核酸、ロックされた核酸および、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡにある１つ以上の塩基と塩基相補性を示すことにより、そして／または塩基相補性取り込みを行い得ることにより、実質的にヌクレオチドまたは塩基のように作用し得る任意のその他の構造成分が含まれ、そして鎖を終結するアナログが含まれる。ヌクレオチドは、それらが少なくとも１つの塩基について塩基相補性を共有する場合、特定のヌクレオチド種に対応する。
【００３２】
本発明による核酸配列決定のためのヌクレオチドは、好ましくは、直接または間接的に検出可能である検出可能標識を含む。好ましい標識は、蛍光標識のような光学的に検出可能な標識を含む。蛍光標識の例は、制限されないで、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体；アクリジン、アクリジンイソチオシアナート；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート；Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアントイエロー；クマリンおよび誘導体；クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、Ｃｏｕｍａｒｉｎ  １２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（Ｃｏｕｍａｒａｎ  １５１）；シアニン色素；シアノシン；４’，６−ジアニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４−４’−ジイソシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロライド（ＤＮＳ、ダンシルクロライド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体；エオシン、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンおよび誘導体；エリスロシンＢ、エリスロシン、イソチオシアネート；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体；５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マカライトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウムベリフェロネオルトクレソルフタレイン；ニトロチロシン；パラロサニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリスリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体；ピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピレン；ブチレート量子ドット（ｂｕｔｙｒａｔｅｄ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ）；Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ４（ＣｉｂａｃｒｏｎＴＭ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ３Ｂ−Ａ）ローダミンおよび誘導体；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リスアミンローダミンＢスルホニルクロライドローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロライド誘導体（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルロ��ダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；Ｌａ  Ｊｏｌｔａ  Ｂｌｕｅ；フタロシアニン；およびナフタロシアニンを含む。好ましい蛍光標識は、シアニン−３およびシアニン−５である。蛍光標識以外の標識が本発明によって企図され、その他の検出可能な標識を含む。
【００３３】
（Ｃ．核酸ポリメラーゼ）
本発明で一般に有用な核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、および前述の任意の変異体または改変体を含む。ＤＮＡポリメラーゼおよびそれらの性質は、とりわけ、ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ第２版、ＫｏｍｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）に詳細に記載されている。本発明で有用な公知の従来のＤＮＡポリメラーゼは、制限されないで、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、１９９１、Ｇｅｎｅ、１０８：１、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈｉｎｎｉｓｄａｅｌら、１９９６、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０；１８６−８、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＭｙｅｒｓおよびＧｅｌｆａｎｄ  １９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：７６６１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＳｔｅｎｅｓｈおよびＭｃＧｏｗａｎ、１９７７、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ４７５：３２）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＶｅｎｔＴＭＤＮＡポリメラーゼとも呼ばれる、Ｃａｒｉｅｌｌｏら、１９９１、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓ、１９：４１９３、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、９０ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＵＫ）、ＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒＴＭ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｉａｚおよびＳａｂｉｎｏ、１９９８  Ｂｒａｚ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ、３１：１２３９）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎら、１９７６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ、１２７：１５５０）、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｇｉら、１９９７、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５０５）、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ（ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＪＤＦ−３由来、特許出願ＷＯ０１３２８８７）、ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＴＭＤＮＡポリメラーゼとも呼ばれる、Ｊｕｎｃｏｓａ−Ｇｉｎｅｓｔａら、１９９４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１６：８２０、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＵＩＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（好熱性Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ由来；ＤｉａｚおよびＳａｂｉｎｏ、１９９８  Ｂｒａｚ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ、３１：１２３９；ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ由来、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）��Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＬｅｃｏｍｔｅおよびＤｏｕｂｌｅｄａｙ、１９８３、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓ．１１：７５０５）、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｒｄｓｔｏｒｍら、１９８１、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１１２）、および古細菌ＤＰＩＩ／ＤＰ２ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃａｎｎら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１４２５０−−＞５）を含む。
【００３４】
中温性ポリメラーゼが本発明によって企図されるが、好ましいポリメラーゼは好熱性である。好熱性ＤＮＡポリメラーゼは、制限されないで、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）、９０ＮｍＴＭ、ＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒＴＭ、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ、Ｔｌｉ、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメンクト、ＶｅｎｔＴＭおよびＤｅｅｐ  ＶｅｎｔＴＭＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ、ＪＤＦ−３、およびそれらの変異体、改変体および誘導体を含む。
【００３５】
本発明で有用な逆転写酵素は、制限されないで、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＦｅＬＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＡＭＶ、ＭＭＴＶ、ＭｏＭｕＬＶおよびその他のレトロウイルス（Ｌｅｖｉｎ、Ｃｅｌｌ  ８８：５−８（１９９７）；Ｖｅｒｍａ、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．４７３：１−３８（１９７７）；Ｗｕら、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３：２８９−３４７（１９７５）を参照のこと）由来の逆転写酵素を含む。
【００３６】
（Ｄ．表面）
好ましい実施形態では、核酸テンプレート分子は、基体（本明細書では表面とも呼ばれる）に付着され、そして本明細書中で教示されるように配列決定による分析に供される。核酸テンプレート分子は、この表面に、テンプレート／プライマー二重鎖が個々に光学的に解像可能であるように付着される。本発明における使用のための基体は、二次元または三次元であり得、そして平坦な表面（例えば、ガラススライド）を含み得るか、または形成され得る。基体は、ガラス（例えば、制御されたポアガラス（ＣＰＧ））、石英、プラスチック（例えば、ポリスチレン（低架橋および高架橋ポリスチレン）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、およびポリ（メチルメタクリレート））、アクリルコポリマー、ポリアミド、シリコン、金属（例えば、アルカンチオレート−誘導体化金）、セルロース、ナイロン、ラテックス、デキストラン、ゲルマトリックス（例えば、シリカゲル）、ポリアクロレイン、またはコンポジットを含み得る。
【００３７】
適切な三次元基体は、例えば、球、微粒子、ビーズ、膜、スライド、プレート、マイクロ機械加工されたチップ、チューブ（例えば、キャピラリーチューブ）、マイクロウェル、マイクロ流体デバイス、チャンネル、フィルター、または核酸を係留するために適切な任意のその他の構造を含む。基体は、テンプレート核酸またはプライマーの集団を含む領域を有し得る平坦なアレイまたはマトリックスを含み得る。例は、ヌクレオシド−誘導体化ＣＰＧおよびポリスチレンスライド；誘導体化磁性スライド；ポリエチレングリコールでグラフトされたポリスチレンなどを含む。
【００３８】
１つの実施形態では、基体は被覆され、最適の光学的処理および核酸付着を可能にする。本発明における使用のための基体はまた、バックグラウンドを低減するために処理され得る。例示的な被覆は、（例えば、ストレプトアビジンのような結合分子とともに）エポキシド、および誘導体化されたエポキシドを含む。上記表面はまた、分析のために付着された核酸（例えば、核酸テンプレート分子、プライマー、またはテンプレート／プライマー二重鎖）の位置決めを改良するために処理され得る。従って、本発明による表面は、１つ以上の荷電層（例えば、負電荷）で処理され得、荷電された分子（例えば、負に荷電された標識ヌクレオチド）をはねつける。例えば、本発明による基体は、ポリアリルアミン、次いでポリアクリル酸で処理され得、多電解質の複数層を形成する。ポリアクリル酸の層のカルボキシル基は負に荷電され、そしてそれ故、負に荷電された標識ヌクレオチドをはねつけ、検出のための標識の位置決めを改善する。この基体に付与される被覆またはフィルムは、次の処理ステップ（例えば、光曝露、煮沸、ベーキング、暖かい洗浄剤含有液体に中の浸漬など）に、実質的な分解または基体からの解離なくして耐え得るべきである。
【００３９】
基体被覆の例は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａからのガラススライド製品に付与されるような、３−アミノプロピルトリメトキシシランの蒸気層被覆を含む。さらに、一般に、疎水性基体被覆およびフィルムは、基体表面上の親水性分子の均一分布を支援する。重要なことに、基体被覆またはフィルムを採用する本発明のこれらの実施形態では、プライマー伸長ステップおよび検出ステップを実質的に妨害しない被覆またはフィルムが好ましい。さらに、基体へのテンプレート分子結合を増加させるか、または、少なくともテンプレート結合を実質的に損なわない任意の被覆またはフィルムが基体に付与されることが好ましい。
【００４０】
種々の方法が、プライマーを基体の表面に係留または固定化するために用いられ得る。この固定化は、基体への直接的または間接的結合を通じて達成され得る。この結合は、共有結合であり得る。Ｊｏｏｓら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４７：９６−１０１、１９９７；Ｏｒｏｓｋａｒら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２：１５４７−１５５５、１９９６；およびＫｈａｎｄｊｉａｎ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｒｅｐ．１１：１０７−１１５、１９８６を参照のこと。好ましい付着は、テンプレートまたはプライマーの末端ヌクレオチドの、表面上に一体化されたエポキシドへの直接アミン結合である。この結合はまた、非共有結合を介した結合であり得る。例えば、ビオチン−ストレプトアビジン（Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｄ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．２４：１４４３、１９９１）および抗−ジゴキシゲニンとのジゴキシゲニン（Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１１２２、１９９２）は、核酸を表面および対等物に係留するための従来ツールである。あるいは、この付着は、疎水性鎖を脂質単層または脂質二層中に係留することにより達成され得る。核酸分子を基体に付着するための当該技術分野で公知のその他の方法がまた用いられ得る。
【００４１】
（Ｅ．検出）
採用される標識のタイプに適切である任意の検出方法が用いられ得る。それ故、例示的な検出方法は、放射活性検出、光学的吸光度検出、例えば、ＵＶ−可視吸光度検出、光学的放射検出、例えば、蛍光または化学ルミネセンスを含む。例えば、伸長されたプライマーは、各基体の全てまたは一部分を、用いられる走査方法に依存して同時または連続的に走査することにより基体上で検出され得る。蛍光標識化のために、基体上の選択された領域は、Ｆｏｄｏｒ（米国特許第５，４４５，９３４号）およびＭａｔｈｉｅｓら（米国特許第５，０９１，６５２号）に記載されるように蛍光顕微鏡装置を用いて１つ１つまたは列毎に連続的に走査され得る。単一分子から蛍光を感知し得るデバイスは、走査トンネル顕微鏡（ｓｉＭ）および原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を含む。ハイブリダイゼーションパターンはまた、Ｙｅｒｓｈｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．９３：４９１３（１９９６）に記載されるような、適切な光学性（Ｐｌｏｅｍ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｎｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍａｓｏｎ、Ｔ．Ｇ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌａｎｄｏｎ、１−１１（１９９３））を有するＣＣＤカメラ（例えば、Ｍｏｄｅｌ  ＴＥ／ＣＣＤ５１２ＳＦ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｔｒｅｎｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）を用いて走査され得るか、またはＴＶモニタリングにより画像化され得る。放射性信号には、蛍光体画像化デバイスが用いられ得る（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１３：５６６、１９９０；Ｄｒｍａｎａｃら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１３：５６６、１９９２；１９９３）。その他の画像化機器の商業的供給元は、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、Ｍａｓｓ．Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｇｅｎｓｃａｎ．ｃｏｍ上）、Ｇｅｎｉｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗａｔｅｒｌｏｏ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ；Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｃｏｎｆｏｃａｌ．ｃｏｍ上）、およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．を含む。このような検出方法は、複数の付着されたテンプレート核酸の同時走査を達成するために特に有用である。
【００４２】
多くのアプローチが、単一の核酸分子中への蛍光標識されたヌクレオチドの取り込みを検出するために用いられ得る。光学的セットアップは、近接場走査顕微鏡、遠距離場共焦点顕微鏡、広視野エピ−イルミネーション、光散乱、暗視野顕微鏡、単一および／または多光子励起、スペクトル波長識別、発蛍光団識別、エバネッセント波照射、および全反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡を含む。適切な光子検出システムは、制限されないで、光ダイオードおよび強化ＣＣＤカメラを含む。例えば、強化荷電カップルデバイス（ＩＣＣＤ）カメラが用いられ得る。表面近傍の流体中の個々の蛍光色素分子を画像化するためのＩＣＣＤカメラの使用は、多くの利点を提供する。例えば、ＩＣＣＤ光学的セットアップとともに、発蛍光団の画像のシークエンス（ムービー）を獲得することが可能である。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態は、二次元画像のためにＴＩＲＦ顕微鏡を用いる。ＴＩＲＦ顕微鏡は、全反射励起光を用い、そして当該技術分野では周知である。例えば、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｎｉｋｏｎ−ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ．ｊｐ／ｅｎｄ／ｐａｇｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｔｉｒｆ．ａｓｐｘを参照のこと。特定の実施形態では、検出は、エバネッセント波照射および全反射蛍光顕微鏡を用いて実施される。エバネッセント光場は、表面でセットアップされ得、例えば、蛍光標識された核酸分子を画像化する。レーザービームが液体と固体基体（例えば、ガラス）との間の界面で全反射されるとき、励起光ビームは、短い距離だけ液体中を貫通する。この光学的場は、反射界面で突然に終わらず、その強度は、距離とともに指数関数的に落ちる。この表面電磁場は、「エバネッセント波」と呼ばれ、界面近傍の液体中の蛍光分子を選択的に励起する。この界面にある薄いエバネッセント場は、低バックグラウンドを提供し、そして可視波長で高い信号−対−ノイズ比とともに単一分子の検出を容易にする。
【００４４】
このエバネッセント場はまた、ポリメラーゼの存在下で付着されたテンプレート／プライマー複合体中への蛍光標識されたヌクレオチドの取り込みに際し、それらを画像化し得る。全反射蛍光顕微鏡が、次いで、付着されたテンプレート／プライマー複合体および／または取り込まれたヌクレオチドを、単一分子解像で可視化するために用いられる。
【００４５】
（Ｆ．分析）
一般に上記に記載のように生成された画像スタックから得られた配列結果のアラインメントおよび／または編集は、（例えば、誤り、変異などに起因する）可能な配列変化を考慮する参照テーブルを利用する。本質的に、本明細書中に記載した通りに得られた配列決定結果は、すべての可能な参照配列プラス１または２の誤りを含む参照タイプテーブルと比較される。
【００４６】
再配列決定において、配列アラインメントのための好ましい実施形態は、得られた配列を、同じ長さ、または同じ長さの１または２の塩基内の参照配列のデータベースと、最初に得られた配列または参照テーブルフォーマット中に含まれる標的配列から比較する。好ましい実施形態では、この参照テーブルは、１つまたは２つの誤りを有する参照配列および規定された長さの配列（例えば、すべての可能な１塩基または２塩基誤りをもつ９マー）に対して正確な一致を含む。得られた配列は、次に、参照テーブル上の配列に一致され、そしてこのテーブル中の配列（単数または複数）に対する一致の唯一性を反映するスコアを与えられる。これらの得られた配列は、次に、上記得られた配列が参照配列の一部分に最良に一致する位置を基に参照配列に配列される。このアラインメントプロセスに関するさらなる詳細は、以下の実施例に提供される。
【実施例】
【００４７】
バクテリオファージＭ１３ｍｐ１８の７２４９ヌクレオチドゲノムを、本発明の単一分子方法を用いて配列決定した。精製された一本鎖ウイルスＭ１３ｍｐ１８ゲノムＤＮＡを、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから得た。約２５ｕｇのＭ１３ＤＮＡを、０．１Ｕ  ＤｎａｓｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で１０分間３７℃で４０ｂｐの平均フラグメントサイズまで消化した。消化されたＤＮＡフラグメントサイズは、プレキャスト変性（ＴＢＥ−尿素）１０％ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖａｇｅｎ）上で消化混合物のアリコートを泳動すること、およびＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色することにより推定された。このＤＮａｓｅＩで消化されたゲノムＤＮＡは、ＹＭ１０限外濾過スピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通じて濾過し、約３０ｎｔ未満の消化小産物を除いた。約２０ｐｍｏｌの濾過されたＤＮａｓｅＩ消化物を、次いで、公知の方法に従ってターミナルトランスフェラーゼでポリアデニル化した（Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙ、ＲおよびＷｕ、Ｒ．１９８０、Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ３’ｔｅｒｍｉｎｉ  ｏｆ  ＤＮＡ.Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５（１）：４３−６２）。平均のｄＡテイル長さは、５０＋／−５ヌクレオチドであった。ターミナルトランスフェラーゼは、次いで、Ｃｙ３−ｄＵＴＰでフラグメンクトを標識するために用いられた。フラグメントは、次いで、ジデオキシＴＴＰで終結された（さらにターミナルトランスフェラーゼを用いて付加された）。得られたフラグメントは、再び、ＹＭ１０限外濾過スピンカラムで濾過し、遊離のヌクレオチドを除去し、そしてｄｄＨ２Ｏ中−２０℃で貯蔵した。
【００４８】
エポキシド被覆ガラススライドを、オリゴヌクレオチド付着のために調製した。エポキシド官能性付与された４０ｍｍ直径の＃１．５ガラスカバースリップ（スライド）は、Ｅｒｉｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓａｌｅｍ、ＮＨ）から得た。これらスライドは、３×ＳＳＣ中に１５分間３７℃で浸すことにより予備調製された。次に、５’アミネート化ｐｏｌｙｄＴ（５０）プライマー（５’末端アミンを有する長さが５０ヌクレオチドのポリチミジン）の５００ｐＭのアリコートを、８０ｍｌの容量で各スライドと３０分間室温でインキュベートする。得られたスライドは、エポキシドへの直接アミン結合により付着されたプライマーを有する。これらスライドは、次いで、表面を不動態化するために室温で４時間リン酸（１Ｍ）で処理される。スライドは、次いで、ポリメラーゼリンス緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｉｒｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ８．０）中に、それらが配列決定のために用いられるまで貯蔵された。
【００４９】
配列決定のために、スライドは、５０ｕｍの厚いガスケットを用いて改変ＦＣＳ２フローセル（Ｂｉｏｐｔｅｃｈｓ、Ｂｕｔｌｅｒ、ＰＡ）中に置かれる。このフローセルは、全反射（ＴＩＲ）対物レンズを装備したＮｉｋｏｎ  ＴＥ−２００倒立顕微鏡の周りに構築された高効率蛍光画像化システムの一部である移動可能ステージ上に配置される。スライドを、次に、１００ｍＭ  ＮａＣｌを有するＨＥＰＥＳ緩衝液でリンスし、そして５０℃の温度に平衡化した。ポリ（ｄＴ５０）のアリコートをフローセル中に置き、そしてスライド上で１５分間インキュベートする。インキュベーションの後、このフローセルを１×ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／０．１％ＳＤＳ、次いでＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌでリンスする。受動的減圧装置を、フローセルを横切って流体を引くために用いる。得られたスライドは、Ｍ１３／テンプレート／プライマー二重鎖を含む。このフローセルの温度を、次いで、配列決定のために３７℃まで低くし、そして対物レンズをフローセルと接触させる。
【００５０】
配列決定のために、各々がシアニン−５標識を有する（ＡＴＰおよびＧＴＰについては７−デアザ位置に、そしてＣＴＰおよびＵＴＰについてはＣ５位置に（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））シトシン三リン酸、グアニジン三リン酸、アデニン三リン酸、およびウラシル三リン酸を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ  ＨＣｌ、および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および１００Ｕ  Ｋｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ−  ポリメラーゼ（ＮＥＮ）を含む緩衝液中で別個に貯蔵する。配列決定は、以下のように進行する。
【００５１】
第一に、初期画像化を用いて、エポキシド表面上の二重鎖の位置を決定する。Ｍ１３テンプレートに付着されたＣｙ３標識は、二重鎖位置を確立するために、５３２ｎｍ照射に調整されたレーザー（Ｖｅｒｄｉ  Ｖ−２レーザー、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いる励起により画像化される。各スライドについて、この工程で画像化された単一の蛍光分子のみがカウントされる。以下に記載されるように取り込まれたヌクレオチドの画像化は、６３５ｎｍ照射レーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）を用いるシアニン−５色素の励起によって達成される。５ｕＭのＣｙ５ＣＴＰをフローセル中に置き、そしてスライドに２分間暴露する。インキュベーションの後、スライドを、１×ＳＳＣ／１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／０．１％ＳＤＳ／ｐＨ７．０（「ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／ＳＤＳ」）中（各々６０ｕｌ容量中で１５回）、次いで、１５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／ｐＨ７．０（「ＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ」）（６０ｕｌ容量で１０回）中でリンスした。３０％アセトニトリルおよびスカベンジャー緩衝液（１３４ｕｌ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ、ＭＥＳ、ｐＨ６．１中の２４ｕｌ  １００ｍＭ  Ｔｒｏｌｏｘ、ＭＥＳ、ｐＨ６．１中の１０ｕｌ  ＤＡＢＣＯ、８ｕｌ  ２Ｍグルコース、２０ｕｌのＮａＩ（水中の５０ｍＭストック）、および４ｕｌグルコースオキシダーゼ）を含む酸素スカベンジャーが次に添加される。スライドを、次いで、Ｉｎｏｖａ３０１Ｋレーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）を用い６４７ｎｍで０．２秒間（５００フレーム）、次いで、Ｖｅｒｄｉ  Ｖ−２レーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）を用い５３２ｎｍで２秒間緑画像化し、二重鎖位置を確認する。検出可能な蛍光を有する位置が記録される。画像化の後、フローセルを５回、各々ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／ＳＤＳ（６０ｕｌ）およびＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ（６０ｕｌ）でリンスする。次に、シアニン−５’標識を５分間５０ｍＭ  ＴＣＥＰのフローセル中への導入により取り込まれたＣＴＰから切断し、その後、フローセルを５回、各々ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／ＳＤＳ（６０ｕｌ）およびＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ（６０ｕｌ）でリンスする。残りのヌクレオチドを５０ｍＭヨードアセトアミドで５分間キャップし、次いで５回、各々ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／ＳＤＳ（６０ｕｌ）およびＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ（６０ｕｌ）でリンスする。上記スカベンジャーを上記に記載のように再び付与し、そしてスライドを再び、切断／キャップステップの有効性を決定し、そして非取り込み蛍光目的物を識別するために画像化する。
【００５２】
上記に記載された手順は、次いで、１００ｎＭ  Ｃｙ５ＡＴＰ、次いで１００ｎＭ  Ｃｙ５ｄＧＴＰ、そして最後に５００ｎＭ  Ｃｙ５ｄＵＴＰで実施される。この手順（ヌクレオチドへの曝露、ポリメラーゼ、リンス、スカベンジャー、画像化、リンス、切断、リンス、キャップ、リンス、スカベンジャー、最終画像化）が、Ｃｙ５ｄＵＴＰが２分ではなく５分間インキュベートされることを除いて、ＡＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰについて正確に繰り返される。Ｃｙ５標識がチミジン三リン酸中のメチル基によって通常占められている位置で取り込まれという事実に起因して、ウリジンがチミジンの代わりに用いられそれ故ｄＴＴＰはｄＵＴＰに変えられる。すべての６４のサイクル（Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｕ）が、この段落および先行する段落に記載のように実施される。
【００５３】
一旦、所望の数のサイクルが終了されると、画像スタックデータ（すなわち、種々の表面−結合二重鎖から得られた単一分子配列）は、Ｍ１３参照配列に配列される。得られた画像データは、ホモポリマー領域を折り畳むために圧縮され得る。それ故、配列「ＴＣＡＡＡＧＣ」は、アラインメントのために用いられるデータタグにおいては「ＴＣＡＧＣ」として表される。同様に、参照配列中のホモポリマー領域は、アラインメントのために折り畳まれる。
【００５４】
アラインメントアルゴリズムは、上で記載の通りに得られた配列を、実際のＭ１３直線状配列に一致させる。Ｍ１３上の得られた配列の配置は、０、１、または２の可能な誤りを考慮して、得られた配列と同じ長さのＭ１３の一部分との間の最良の一致に基づく。誤りが０のすべての得られた９マー（それらはＭ１３参照配列中の９マーに正確に一致することを意味する）は、最初、Ｍ１３で配列される。次に、誤りが０または１の１０−、１１−、および１２マーが配列される。最後に、０、１、または２の誤りのすべての１３−マーまたはより大きいマーが配列される。
【００５５】
テンプレートフラグメントは、二重鎖の融解温度を超えてフローセルの温度を高めることによって除去され、それによってテンプレートフラグメントを二重鎖から放出する。遊離のテンプレートは、フローセルを洗浄することによりフローセルから除去され、例えば、このフローセルは、５回、各々、ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／ＳＤＳ（６０ｕｌ）およびＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ（６０ｕｌ）でリンスされ得る。
【００５６】
プライマーは、次いで、ポリヌクレオチド配列をプライマーの３’末端に付加することによって改変される。このオリゴヌクレオチド改変プライマーは、次いで、引き続く重合反応でテンプレートとして用いられる。付加されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る遊離のプライマーがフローセルに添加され、そしてテンプレートの付加されたオリゴヌクレオチド部分と遊離のプライマーとの間のハイブリダイゼーションを可能にするに十分な条件下でインキュベートされる。インキュベーション後、フローセルは、１×ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／０．１％ＳＤＳ、次いでＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌでリンスされる。得られたスライドは、テンプレート／プライマー二重鎖を含み、ここで、このテンプレートは、それに付加され、オリゴヌクレオチドで改変されたＭ１３テンプレート相補的配列を有する当初のプライマーを含む。フローセルの温度を、次いで配列決定のために３７℃まで低下させ、そして対物レンズをフローセルと接触させる。上記手順（ヌクレオチドへの曝露、ポリメラーゼ、リンス、スカベンジャー、画像化、リンス、切断、リンス、キャップ、リンス、スカベンジャー、最終画像化）が上記に記載のように繰り返される。
【００５７】
一旦、所望の数のサイクルが終了すると、画像スタックデータ（すなわち、種々の表面結合二重鎖から得られた単一分子配列）がＭ１３参照配列に配列され、そして／または上記のように最初に得られたデータ配列に配列される。得られた画像データは、上記にように圧縮され得、ホモポリマー領域を折り畳む。
【００５８】
本発明は、その思想または本質的特徴を逸脱することなく、その他の特定の形態で具現化され得る。前述の実施形態は、従って、本明細書中に記載される本発明を制限するよりむしろすべての点で例示的であると考慮されるべきである。本発明の範囲は、それ故、前述の説明によるより、むしろ添付の請求項によって示され、そしてこれら請求項の意味および等価な範囲内にあるすべての変更は、従って、その中に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図面は、本発明の１つの実施形態の概略図を示す。
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【国際調査報告】
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