(57)【要約】アスパラギン酸由来のアミノ酸（例えば、メチオニン、リシン、スレオニン、イソロイシン、及びＳ−アデノシルメチオニン（Ｓ−ＡＭ））及びシステインを含むアミノ酸、及び関連代謝産物の産生を増大させるように作成される細菌株について開示する。この菌株は、ポリペプチド（例えば、宿主細胞に対して異種または相同であるポリペプチド）をコードする１以上の核酸分子（例えば、組換え核酸分子）を保有するように遺伝子操作して創ることができ、及び／またはそれらは（例えば、内因性核酸配列の突然変異によって）ポリペプチドの発現及び／または活性を増加または減少させるように創ることができる。
2009501512.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸内細菌科またはコリネ型細菌であって、
（ａ）細菌スルフェートＡＢＣ輸送担体ＡＴＰ結合ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂ）細菌スルフェート輸送系パーミアーゼＷポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｃ）細菌スルフェート・チオスルフェート輸送系パーミアーゼＴポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｄ）細菌スルフェートアデニリルトランスフェラーゼサブユニット１ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｅ）細菌スルフェートアデニリルトランスフェラーゼサブユニット２ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｆ）細菌アデニリルスルフェートキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｇ）細菌ホスホアデノシンホスホスルフェートレダクターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｈ）細菌スルファイトレダクターゼαサブユニットポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｉ）細菌スルファイトレダクターゼヘモポリペプチドベータ成分ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｊ）細菌スルファイトレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ）、フラボポリペプチドβサブユニットポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｋ）細菌アデニリル−スルフェートレダクターゼαサブユニットポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｌ）細菌ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｍ）細菌ホスホセリントランスアミナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｎ）細菌ホスホセリンホスファターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｏ）細菌セリンＯ−アセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｐ）細菌システインシンターゼＡポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｑ）細菌システインシンターゼＢポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｒ）細菌ＡＢＣ型ビタミンＢ１２輸送担体パーミアーゼ成分ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｓ）細菌ＡＢＣ型ビタミンＢ１２輸送担体ＡＴＰａｓｅ成分ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｔ）細菌ＡＢＣ型コバラミン／Ｆｅ３＋シデロフォア輸送系ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｕ）細菌アデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｖ）細菌ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｗ）細菌ｐｈｏＡ、ｐｓｉＡ、またはｐｓｉＦ遺伝子産物ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｘ）細菌ジヒドロネオプテリンアルドラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｙ）細菌７，８−ジヒドロ−６−ヒドロキシメチルプテリン−ピロホスホキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｚ）細菌ジヒドロプテロエートシンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａａ）細菌ジヒドロ葉酸シンテターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｂ）細菌ジヒドロ葉酸レダクターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｃ）細菌フォリルポリグルタメートシンテターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｄ）推定細菌メチオニン（ＡＰＣ輸送担体スーパーファミリー）パーミアーゼ（ＹｊｅＨ）ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｅ）ＭｅｔＥ／Ｈポリペプチドの細菌転写アクチベータまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｆ）細菌６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｇ）細菌Ｓ−メチルメチオニンホモシステインメチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｈ）細菌Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｉ）細菌部位特異的ＤＮＡメチラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｊ）細菌メチオニン搬出系タンパク質１ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｋ）細菌メチオニン搬出系タンパク質２ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｌ）細菌ＡＢＣ輸送系ＡＴＰ結合タンパク質（ＭｅｔＮ）ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｍ）細菌ＡＢＣ輸送系パーミアーゼタンパク質（ＭｅｔＰ）ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｎ）細菌ＡＢＣ輸送系基質結合タンパク質（ＭｅｔＱ）ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｏ）細菌アスパルトキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｐ）細菌アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｑ）細菌ホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｒ）細菌Ｏ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｓ）細菌Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｔ）細菌コバラミン依存性メチオニンシンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｕ）細菌コバラミン非依存性メチオニンシンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｖ）細菌ホモセリンキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｗ）細菌メチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｘ）細菌Ｏ−スクシニルホモセリン（チオ）−リアーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｙ）細菌シスタチオニンβ−リアーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｚ）細菌５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂａ）細菌ジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｂ）細菌ピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｃ）細菌グルタミン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｄ）細菌ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｅ）細菌メチオニン及びシステイン生合成レプレッサー（ＭｃｂＲ）ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｆ）細菌リシンエクスポータータンパク質ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｇ）細菌ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｈ）細菌ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｉ）細菌グリシンデヒドロゲナーゼ（脱カルボキシル化）ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｊ）（グリシン切断系に関与する）細菌Ｈポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｋ）細菌アミノメチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｌ）細菌ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｍ）細菌リポエート−タンパク質リガーゼＡポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｎ）細菌リポ酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｏ）細菌リポイル−［アシル−キャリア−タンパク質］−タンパク質−Ｎ−リポイルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｐ）細菌フルクトース１，６ビスホスファターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｑ）細菌グルコース６ホスフェートデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｒ）グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；及び
（ｂｓ）細菌ＮＣｇｌ２６４０ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
よりなる群から選択される少なくとも１つの単離核酸分子を含む細菌。
【請求項２】
前記細菌が核酸分子（ａ）乃至（ｂｓ）の内の少なくとも２つを含む請求項１の細菌。
【請求項３】
前記細菌が核酸分子（ａ）乃至（ｂｓ）の内の少なくとも３つを含む請求項１の細菌。
【請求項４】
前記細菌が核酸分子（ａ）乃至（ｂｓ）の内の少なくとも４つを含む請求項１の細菌。
【請求項５】
前記細菌が核酸分子（ａ）乃至（ｂｓ）の内の少なくとも５つを含む請求項１の細菌。
【請求項６】
前記ポリペプチドの内の少なくとも１つが前記細菌に対して異種である請求項１の細菌。
【請求項７】
前記ポリペプチドの内の少なくとも２つが前記細菌に対して異種である請求項１の細菌。
【請求項８】
前記細菌がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細菌である請求項１の細菌。
【請求項９】
前記細菌が（ａｊ）及び（ａｋ）を含む請求項１の細菌。
【請求項１０】
前記細菌が（ｒ）、（ｓ）及び（ｔ）を含む請求項１の細菌。
【請求項１１】
前記細菌が（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む請求項１の細菌。
【請求項１２】
前記細菌が（ｄ）及び（ｅ）を含む請求項１の細菌。
【請求項１３】
前記細菌が（ｉ）及び（ｊ）を含む請求項１の細菌。
【請求項１４】
前記細菌が（ｌ）及び（ｏ）を含む請求項１の細菌。
【請求項１５】
前記細菌が（ｐ）及び（ｑ）を含む請求項１の細菌。
【請求項１６】
前記細菌が（ｂｉ）、（ｂｊ）及び（ｂｋ）を含む請求項１の細菌。
【請求項１７】
前記細菌が（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）及び（ｂｌ）を含む請求項１の細菌。
【請求項１８】
前記細菌が（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）並びに、
（１）（ｂｍ）または（２）（ｂｎ）と（ｏ）の少なくとも１つ
を含む請求項１の細菌。
【請求項１９】
前記細菌が（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）並びに、
（１）（ｂｍ）または（２）（ｂｎ）と（ｂｏ）の内の少なくとも１つ
を含む請求項１の細菌。
【請求項２０】
アミノ酸または関連代謝産物を産生する方法において、
前記アミノ酸または前記関連代謝産物を産生できるようにした条件下で請求項１の細菌を培養し、次いで、培養物から前記アミノ酸または前記関連代謝産物を含む組成物を収集することを含む、前記方法。
【請求項２１】
前記アミノ酸がメチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン、リシン、スレオニン及びシステインから選択される請求項１の方法。
【請求項２２】
（ａ）乃至（ａｎ）よりなる群から選択される少なくとも１つの単離核酸分子、及び（ａｏ）乃至（ｂｓ）よりなる群から選択される少なくとも１つの単離核酸分子を含む請求項１の細菌。
【請求項２３】
（ａ）乃至（ａｎ）よりなる群から選択される少なくとも１つの単離核酸分子、及び（ａｏ）乃至（ｂｓ）よりなる群から選択される少なくとも２つの単離核酸分子を含む請求項１の細菌。
【請求項２４】
（ａ）乃至（ａｎ）よりなる群から選択される少なくとも２つの単離核酸分子、及び（ａｏ）乃至（ｂｓ）よりなる群から選択される少なくとも１つの単離核酸分子を含む請求項１の細菌。
【請求項２５】
（ａ）乃至（ａｎ）よりなる群から選択される少なくとも２つの単離核酸分子、及び（ａｏ）乃至（ｂｓ）よりなる群から選択される少なくとも２つの単離核酸分子を含む請求項１の細菌。
【請求項２６】
フィードバック阻害が低減された変異アスパルトキナーゼをコードする単離核酸分子、フィードバック阻害が低減された変異ホモセリンデヒドロゲナーゼ、またはフィードバック阻害が低減された変異Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼを含む請求項１の細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は細菌アミノ酸及び代謝産物の生合成、さらに詳しくは、メチオニン及び関連アミノ酸及び代謝産物の生合成に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌の工業的発酵は、アミノ酸、ヌクレオチド、ビタミン、及び抗生物質のような商業的に有用な代謝産物の産生に使用される。これらの発酵過程で用いられる多くの生産用細菌株（産生菌株）の多くは、ランダム突然変異誘発及び突然変異体の選択によって生じさせてきた（非特許文献１）。突然変異を誘発された産生菌株およびこれら菌株の誘導体に二次突然変異が蓄積することにより、増殖特性およびストレス寛容性が変化して代謝産物の産生効率が減少する可能性がある。産生菌株および関連細菌に関するゲノム情報が利用可能であれば、クローニングした核酸を、操作していない未処理の宿主株に導入して新しい産生菌株を構築することにより、有害な突然変異が存在しない状態でアミノ酸を産生させることを可能にする機会が提供される（非特許文献２）。同様に、ゲノム情報により、現存する産生菌株の限界を特定し、克服する機会が提供される。
【非特許文献１】デマイン、エイ  エル（Ｄｅｍａｉｎ，Ａ．Ｌ．）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１８巻：２６〜３１頁，２０００年
【非特許文献２】オオニシ、ジェイ．ら（Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第５８巻：２１７〜２２３頁，２００２年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、アミノ酸産生用の方法および組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、アミノ酸及び関連代謝産物の細菌における産生のための組成物及び方法に関し、アスパラギン酸誘導アミノ酸（例えば、メチオニン、リシン、スレオニン、イソロイシン、及びＳ−アデノシルメチオニン（Ｓ−ＡＭ））及びシステインのようなアミノ酸、及び関連代謝産物の産生を増加させるように作製された細菌株を本明細書で説明する。その菌株はポリペプチド（例えば、宿主細胞に対して異種または相同であるポリペプチド）をコードする１以上の核酸分子（例えば、組換え核酸分子）を保有するように遺伝子操作して創ることができ、及び／またはそれらの細菌株は、（例えば、内因性核酸配列の突然変異によって）ポリペプチドの発現及び／または活性を増加させるか、または減少させるように作製することができる。当業者が精通している種々の方法によって発現させることができる発現されたポリペプチドは、フィードバック阻害が低減された変異ポリペプチドのような変異ポリペプチドを含む。その変異ポリペプチドは、タンパク質の野生型形態に対して、Ｓ−アデノシルメチオニン、リシン、スレオニンまたはメチオニンのような、アミノ酸生合成経路の産物または中間体によるフィードバック阻害の低減を呈することができる。また、変異ポリペプチド、及び前記核酸を含むように遺伝子改変された細菌細胞も本明細書中に記載されている。核酸の組合せ、及び核酸の組合せを保有する細胞もまた本明細書中で提示する。限定されるものではないが、コリネ型細菌や腸内細菌科（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌））の菌株を含む、改良された細菌産生株も記載されている。
【０００５】
メチオニン及び関連アミノ酸及び代謝産物の産生を調節する細菌ポリペプチドには、例えば、メチオニン、アスパラギン酸、ホモセリン、システイン、硫黄、葉酸及びビタミンＢ１２の代謝に関与するポリペプチドが含まれる。このポリペプチドには、アミノ酸生合成経路の中間体の、他の中間体及び／または最終産物への変換を触媒する酵素、前駆体、補因子、中間体または最終産物の移入または搬出（import or export）に必要なポリペプチド、及びそのような酵素及び／または移入／搬出の調節因子（regulator）の発現及び／または機能を調節するポリペプチドが含まれる。以下の表１乃至６は関連ポリペプチドの全てではないがいくつかを示す。図１は、メチオニン生合成経路を模式的に示し、メチオニン生合成経路で用いられる前駆体及び補因子を生じるさらなる経路を示す。これらのさらなる経路は図２乃至４に描かれる。アミノ酸及び代謝産物を産生するのに有用な付加的なポリペプチド及び変異体が以下に記載されている。
【０００６】
様々な実施形態において、宿主細菌は１以上のポリペプチド（例えば、アミノ酸合成に関与するポリペプチド；例えば、対照に対して活性が低下した内因性ポリペプチド）の低下した活性を有する。アミノ酸合成に関与する特定のポリペプチドの活性の低下は、特定のアミノ酸及び関連代謝産物の産生の向上を容易とすることができる。一実施形態において、ジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドの発現は細菌において欠乏している（例えば、細菌における内因性ｄａｐＡ遺伝子は突然変異しているか、または欠失している）。様々な実施形態において、以下のポリペプチドの１以上の発現は低下している：ｍｃｂＲ遺伝子産物、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼポリペプチド、ＡＢＣ輸送系ＡＴＰ結合タンパク質ポリペプチド、ＡＢＣ輸送系パーミアーゼタンパク質ポリペプチド、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼポリペプチド、ＮＣｇｌ２６４０ポリペプチド、及びＡＢＣ輸送系基質結合タンパク質ポリペプチド。一実施形態では、アデノシルトランスフェラーゼ（ｐｄｕＯ）の発現または活性は、低下しているか、または除去されている。
【０００７】
（ａ）細菌アスパルトキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；（ｂ）細菌アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；（ｃ）細菌ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；（ｄ）細菌ピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；（ｅ）細菌ジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；（ｆ）細菌ホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；（ｇ）細菌ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；（ｈ）細菌Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；（ｉ）細菌メチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；（ｊ）細菌ｍｃｂＲ遺伝子産物ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；（ｋ）細菌Ｏ−スクシニルホモセリン／アセチルホモセリン（チオール）−リアーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；（ｌ）細菌シスタチオニンβ−リアーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；（ｍ）細菌５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステインメチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；（ｎ）細菌５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステインメチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；（ｏ）細菌ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；（ｐ）細菌ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；または（ｑ）表６に示されたポリペプチオドをコードする核酸分子より選択される少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４またはそれ以上）の組換え核酸分子を含む宿主細菌（例えば、コリメ型細菌、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細菌のような腸内細菌科の細菌）のような種々の細菌が記載されている。
【０００８】
様々な実施形態において、核酸分子は単離核酸分子である（例えば、核酸分子は、それから核酸分子が由来する生物においては天然では配列に近接するヌクレオチド配列を含まない、すなわち核酸分子は組換え核酸分子である）。組換え核酸分子は、天然で生じないか、または、それが由来する生物において核酸分子に近接しない配列が近接するように核酸分子に挿入される核酸分子である。例えば、発現ベクターに挿入された大腸菌β−ガラクトシダーゼをコードする核酸分子は、その元の位置以外の位置において大腸菌ゲノムに挿入された大腸菌β−ガラクトシダーゼをコードする核酸分子がそうであるように、組換え核酸分子である。組換え核酸分子のもう１つの例は、大腸菌ゲノム以外のゲノムに挿入された大腸菌β−ガラクトシダーゼをコードする核酸分子である。核酸分子のいずれも、ここでは、特に断りのない限り、組換え核酸分子であり得る。
【０００９】
コードされたポリペプチド、すなわち、表１乃至６のいずれかにおけるポリペプチドは宿主細胞に対して相同または異種であり得る。従って、ポリペプチドは、宿主細胞種の細胞において通常見出されるポリペプチドの配列を有することができる（相同）か、あるいはポリペプチドは宿主種以外の種の細胞において天然で生じるポリペプチドの配列を有することができる。従って、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓアスパルトキナーゼポリペプチドは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓにおいて発現された場合には宿主細胞に対して相同であり、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉで発現された場合は宿主細胞に対して異種である。
【００１０】
様々な実施形態において、ポリペプチドはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅポリペプチド、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓポリペプチドまたはその変異体から選択される。様々な実施形態において、ポリペプチドは以下のＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ種：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｆａｒｃｉｎｉｃａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｂｉｔｅｒｒａｎｅｉ及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅのようなコリネ型細菌の内の１つのポリペプチドである。様々な実施形態において、ポリペプチドは以下のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ種：Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｙｓａｎｔｈｅｍｉ、Ｅｒｗｉｎｉａ  Ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの内の１つのポリペプチドである。様々な実施形態において、ポリペプチドは以下のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの内の１つのポリペプチドである。様々な実施形態において、ポリペプチドは以下のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの内の１つのポリペプチドである。
【００１１】
様々な実施形態において、ポリペプチドは、（例えば、ポリペプチドの野生型形態に対する）フィードバック阻害が低減された変異ポリペプチドである。様々な実施形態において、細菌は、さらに、付加的な異種細菌遺伝子産物、またはアミノ酸の産生に関与する組換え相同細菌遺伝子産物を含む。様々な実施形態において、細菌は、さらに、本明細書中に記載された異種細菌ポリペプチドをコードする核酸分子、または本明細書中に記載された相同細菌ポリペプチドをコードする組換え核酸分子（例えば、異種細菌ホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする核酸分子）を含む。様々な実施形態において、細菌は、さらに、本明細書中に記載された細菌ポリペプチドのような、相同細菌ポリペプチド（すなわち、宿主種に対して天然である細菌ポリペプチドまたはその機能的変異体）をコードする核酸分子を含む。相同細菌ポリペプチドは高レベルで発現させることができ及び／または条件付で発現させることができる。例えば、相同細菌ポリペプチドをコードする核酸が、野生型レベルよりも高いレベルでのポリペプチドの発現を可能とするプロモーターに操作可能に連結させることができ、核酸は野生型レベルにおいてタンパク質を発現させることができるが、細胞中の相同ポリペプチドをコードする核酸のコピー数を増加させることによって総じての発現を増加させることができ、及び／または核酸は細菌において複数コピーで存在することができる。様々な実施形態において、異種または相同細菌ポリペプチドをコードする核酸分子は宿主生物内でエピソーム上に存在する。様々な実施形態において、異種または相同細菌ポリペプチドをコードする核酸分子は宿主生物のゲノムに組み込まれる。いくつかの具体例において、宿主生物は、特定の相同または異種細菌ポリペプチドをコードする１以上のエピソーム核酸分子、及び宿主生物のゲノムに組み込まれる特定の相同または異種細菌ポリペプチドをコードする１以上の分子双方を保有する。
【００１２】
様々な実施形態において、細菌アスパルトキナーゼまたはその機能的変異体は（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓアスパルトキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、（ｂ）Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉアスパルトキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、（ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアスパルトキナーゼ、（ｄ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆａｄａ  ｆｕｓｃａアスパルトキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、（ｅ）Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉアスパルトキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、及び（ｆ）Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓアスパルトキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、異種細菌アスパルトキナーゼポリペプチドはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉアスパルトキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。一実施形態では、異種細菌アスパルトキナーゼポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍアスパルトキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。一実施形態では、異種細菌アスパルトキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体はフィードバック阻害が低減されたものである。
【００１３】
様々な実施形態において、細菌アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体は（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、（ｂ）Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、（ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、及び（ｄ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、細菌アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。一実施形態では、細菌アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。
【００１４】
様々な実施形態において、細菌ホスホエノーピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体は（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、（ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、（ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、及び（ｄ）Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、細菌ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。一実施形態では、異種細菌ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。
【００１５】
様々な実施形態において、細菌ピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体は（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、（ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、及び（ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、細菌ピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍピルビン酸カルボキシラーゼまたはその機能的変異体である。
【００１６】
様々な実施形態において、宿主細菌はコリネ型細菌、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細菌のような腸内細菌科の細菌から選択される。コリネ型細菌は、限定されるものではないが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ、及びＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍを含む。
【００１７】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置２７９のアラニンの第１群アミノ酸残基への変異；位置３０１のセリンの第６群アミノ酸残基への変異；位置３１１のスレオニンの第２群アミノ酸残基への変異；及び位置３４５のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異から選択された少なくとも１つのアミノ酸変異を含む；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓアスパルトキナーゼは：位置２７９のアラニンのプロリンへの変異、位置３０１のセリンのチロシンへの変異、位置３１１のスレオニンのイソロイシンへの変異、及び位置３４５のグリシンのアスパラギン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００１８】
様々な実施形態において、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置２７９のアラニンの第１群アミノ酸残基への変異；位置３０１のセリンを第６群のアミノ酸残基への変異；位置３１１のスレオニンを第２群アミノ酸残基への変異及び；位置３４５のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００１９】
様々な実施形態において、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置２７９のアラニンのプロリンへの変異；位置３０１のセリンのチロシンへの変異；位置３１１のスレオニンのイソロイシンへの変異；及び位置３４５のグリシンのアスパラギン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００２０】
様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置２８２のアラニンの第１群アミノ酸残基への変異；位置３０４のセリンの第６群アミノ酸残基への変異；位置３１４のセリンの第２群アミノ酸残基への変異；及び位置３４８のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００２１】
様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置２８２のアラニンのプロリンへの変異；位置３０４のセリンのチロシンへの変異；位置３１４のセリンのイソロイシンへの変異；及び位置３４８のグリシンのアスパラギン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００２２】
様々な実施形態において、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置３２８のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異；位置３３０のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異；位置３５０のセリンの第２群アミノ酸残基への変異；及び位置３５２のバリンをバリン以外の第２群アミノ酸残基へ変異させることから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００２３】
様々な実施形態において、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置３２８のグリシンのアスパラギン酸への変異；位置３３０のロイシンのフェニルアラニンへの変異；位置３５０のセリンのイソロイシンへの変異；及び位置３５２のバリンのメチオニンへの変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００２４】
様々な実施形態において、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置３２３のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異；位置３２５のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異；位置３４５のセリンの第２群アミノ酸残基への変異；および位置３４７のバリンのバリン以外の第２群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００２５】
様々な実施形態において、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置３２３のグリシンのアスパラギン酸への変異、位置３２５のロイシンのフェニルアラニンへの変異、位置３４５のセリンのイソロイシンへの変異および位置３４７のバリンのメチオニンへの変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００２６】
様々な実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置２７９のアラニンのアラニン以外の第１群アミノ酸への変異、位置３０１のセリンの第６群アミノ酸残基への変異、位置３１１のスレオニンの第２群アミノ酸残基への変異および位置３４５のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００２７】
様々な実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置２７９のアラニンのプロリンへの変異、位置３０１のセリンのチロシンへの変異、位置３１１のスレオニンのイソロイシンへの変異および位置３４５のグリシンのアスパラギン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００２８】
様々な実施形態において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置３２３のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異、位置３２５のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異、位置３４５のセリンの第２群アミノ酸残基への変異および位置３４７のバリンのバリン以外の第２群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００２９】
様々な実施形態において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置３２３のグリシンのアスパラギン酸への変異、位置３２５のロイシンのフェニルアラニンへの変異、位置３４５のセリンのイソロイシンへの変異および位置３４７のバリンのメチオニンへの変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００３０】
様々な実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその変異体は、位置４５８のプロリンの第４群アミノ酸残基への変異を含む。様々な実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその変異体は、位置４５８のプロリンのセリンへの変異を含む。
【００３１】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその変異体は、位置４４８のプロリンの第４群アミノ酸残基への変異を含む。様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその変異体は、位置４４８のプロリンのセリンへの変異を含む。
【００３２】
様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその変異体は位置４４９のプロリンの第４群アミノ酸残基への変異を含む。様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその変異体は、位置４４９のプロリンのセリンへの変異を含む。
【００３３】
また、本発明は細菌ジヒドロジピコリン酸シンターゼまたはその機能的変異体をコードする核酸分子を含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。
様々な実施形態において、細菌ジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及びＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、フィードバック阻害が低減された異種細菌ジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。一実施形態では、異種細菌ジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体はフィードバック阻害が低減されたものである。
【００３４】
様々な実施形態において、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドは、位置８０のアスパラギンの第２群アミノ酸残基への変異、位置８８のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異、および位置１１８のヒスチジンの第６群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００３５】
様々な実施形態において、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドは：位置８０のアスパラギンのイソロイシンへの変異、位置８８のロイシンのフェニルアラニンへの変異および位置１１８のヒスチジンのチロシンへの変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００３６】
様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドは：位置８９のアスパラギンの第２群アミノ酸残基への変異、位置９７のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異、位置１２７のヒスチジンの第６群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００３７】
様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドは：位置８９のアスパラギンのイソロイシンへの変異、位置９７のロイシンのフェニルアラニンへの変異および位置１２７のヒスチジンのチロシンへの変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００３８】
様々な実施形態において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドは：位置８０のアスパラギンの第２群アミノ酸残基への変異、位置８１のアラニンの第２群アミノ酸残基への変異、位置８４のグルタミン酸の第５群アミノ酸残基への変異、位置８８のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異、および位置１１８のヒスチジンの第６群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００３９】
様々な実施形態において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドは：位置８０のアスパラギンのイソロイシンへの変異、位置８１のアラニンのバリンへの変異、位置８４のグルタミン酸のリシンへの変異、位置８８のロイシンのフェニルアラニンへの変異および位置１１８のヒスチジンのチロシンへの変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００４０】
様々な実施形態において、細菌ホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体：（ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及び（ｄ）Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、細菌ホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドはコリネ型細菌からのホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体）。一実施形態では、ホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。一実施形態では、異種ホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体はフィードバック阻害が低減されたものである。
【００４１】
一実施形態では、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは：位置２３のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異、位置５９のバリンの第１群アミノ酸残基への変異、位置１０４のバリンの別の第２群アミノ酸残基への変異、位置３７８のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異、およびホモセリン・デヒドロゲナーゼタンパク質を位置４２８リシンアミノ酸残基の後で切断する変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。一実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍホモセリンデヒドロゲナーゼプリペプチドはＷＯ９３／０９２２５に記載されたｈｏｍｄｒ配列（配列番号３）によってコードされる。
【００４２】
様々な実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは：位置２３のロイシンのフェニルアラニンへの変異、位置５９のバリンのアラニンへの変異、位置１０４のバリンのイソロイシンへの変異および位置３７８のグリシンのグルタミン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００４３】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは：位置１０のバリンの第６群アミノ酸残基への変異、位置４６のバリンの第１群アミノ酸残基への変異、および位置３６４のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００４４】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは：位置１０のバリンのフェニルアラニンへの変異、位置４６のバリンのアラニンへの変異および位置３７８のグリシンのグルタミン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００４５】
様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは：位置１０のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異、位置４６のバリンの第１群アミノ酸残基への変異、位置３６２のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異、およびホモセリン・デヒドロゲナーゼタンパク質を位置４１２アルギニンアミノ酸残基の後で切断する変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは：位置１０のロイシンのフェニルアラニンへの変異、位置４６のバリンのアラニンへの変異および位置３６２のグリシンのグルタミン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００４６】
様々な実施形態において、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは：位置１９２のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異、位置２２８のバリンの第１群アミノ酸残基への変異、位置５４５のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。様々な実施形態において、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは位置５９５のアルギニンアミノ酸残基の後方で切断される。
【００４７】
様々な実施形態において、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは、位置１９２のロイシンのフェニルアラニンへの変異、位置２２８のバリンのアラニンへの変異および位置５４５のグリシンのグルタミン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００４８】
様々な実施形態において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは：位置３３０のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異、および位置３５２のセリンの第６群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。様々な実施形態において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは：位置３３０のグリシンのアスパラギン酸への変異、および位置３５２のセリンのフェニルアラニンへの変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００４９】
様々な実施形態において、細菌Ｏ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドは：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及びＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、細菌Ｏ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。一実施形態では、異種Ｏ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体はフィードバック阻害が低減されたものである。
【００５０】
様々な実施形態において、細菌Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドは：（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及び（ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、細菌Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。一実施形態では、異種Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体はフィードバック阻害が低減されたものである。
【００５１】
様々な実施形態において、細菌メチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及びＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、細菌メチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。一実施形態では、細菌メチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからのメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。一実施形態では、異種メチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体はフィードバック阻害が低減されたものである。
【００５２】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置１９６のバリンの第３群アミノ酸残基への変異を含む。様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置１９６のバリンのグルタミン酸残基への変異を含む。
【００５３】
様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置１９５のバリンの第３群アミノ酸残基への変異を含む。様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置１９５のバリンのグルタミン酸残基への変異を含む。様々な実施形態において、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置１９５のバリンの第３群アミノ酸残基への変異を含む。様々な実施形態において、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置１９５のバリンのグルタミン酸残基への変異を含む。
【００５４】
様々な実施形態において、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置１８５のバリンの第３群アミノ酸残基への変異を含む。様々な実施形態において、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置１８５のバリンのグルタミン酸残基への変異を含む。
【００５５】
様々な実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置２００のバリンの第３群のアミノ酸残基への変異を含む。様々な実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｅｔａｍｉｃｕｍメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置２００のバリンのグルタミン酸残基への変異を含む。
【００５６】
様々な実施形態において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置１８５のバリンの第３群アミノ酸残基への変異を含む。様々な実施形態において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置１８５のバリンのグルタミン酸残基への変異を含む。
【００５７】
ＭｅｔＫ及び／またはＤａｐＡの低下した活性または発現を有する宿主細胞はメチオニンを産生するのに有用であり得る。従って、宿主細胞はＭｅｔＫをコードする配列、ＤａｐＡをコードする配列、または双方において少なくとも１つの突然変異（例えば、挿入、欠失またはミスセンス突然変異）を有することができる。これらの遺伝子の発現は発現制御配列の突然変異または欠失によって減少させることができる。
【００５８】
様々な実施形態において、細菌は、さらに、（ａ）細菌ホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、組換え核酸分子）またはその機能的変異体；（ｂ）細菌Ｏ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、組換え核酸分子）またはその機能的変異体；（ｃ）細菌Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸分子（例えば、組換え核酸分子）の少なくとも１つを含む。一実施形態では、このポリペプチドまたはその機能的変異体の１以上はフィードバック阻害が低減されたものである。
【００５９】
様々な実施形態において、異種細菌ホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及びＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、異種ホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体はフィードバック阻害が低減されたものである。
【００６０】
様々な実施形態において、異種細菌Ｏ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドは：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、異種Ｏ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体はフィードバック阻害が低減されたものである。
【００６１】
様々な実施形態において、異種細菌Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドは：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはその機能的変異体；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、異種Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体はフィードバック阻害が低減されたものである。
【００６２】
様々な実施形態において、細菌は、さらに、細菌メチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチド（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｃｓメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体）をコードする核酸分子（例えば、組換え核酸分子）を含む。
【００６３】
様々な実施形態において、細菌は、さらに、コバラミン依存性メチオニン合成ポリペプチド（ＭｅｔＨ）（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓコバラミン依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒコバラミン依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａコバラミン依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉコバラミン依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉコバラミン依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍコバラミン依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体）をコードする核酸分子（例えば、組換え核酸分子）を含む。
【００６４】
様々な実施形態において、細菌は、さらに、コバラミン非依存性メチオニン合成ポリペプチド（ＭｅｔＥ）（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓコバラミン非依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒコバラミン非依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａコバラミン非依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉコバラミン非依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉコバラミン非依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍコバラミン非依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体）をコードする核酸分子（例えば、組換え核酸分子）を含む。
【００６５】
「アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸及び関連代謝産物」は、例えば、Ｌ−アスパラギン酸、β−アルパルチルリン酸、Ｌ−アスパラギン酸−β−セミアルデヒド、Ｌ−２，３−ジヒドロジピコリン酸、Ｌ−Δ１−ピペリデイン−２，６−ジカルボン酸、Ｎ−スクシニル−２−アミノ−６−ケト−Ｌ−ピメレート、Ｎ−スクシニル−２，６−Ｌ，Ｌ−ジアミノピメレート、Ｌ，Ｌ−ジアミノピメレート、Ｄ，Ｌ−ジアミノピメレート、Ｌ−リシン、ホモセリン、Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン、Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン、シスタチオニン、Ｌ−ホモシステイン、Ｌ−メチオニン、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（Ｓ−アデノシルメチオニン）、Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリン、スレオニン、２−オキソブタン酸、（Ｓ）−２−アセト−２−ヒドロキシブタン酸、（Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−メチル−３−オキソペンタン酸、（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−３−メチルペンタン酸、（Ｒ）−２−オキソ−３−メチルペンタン酸、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−アスパラギンならびにこれらの化合物の他の立体配座異性体を含む。様々な実施形態において、アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸及び関連代謝産物はアスパラギン酸、アスパラギン、リシン、スレオニン、メチオニン、イソロイシン、及びＳ−アデノシルメチオニンを含む。
【００６６】
「フィードバック阻害が低減された」ポリペプチドまたはその機能的変異体は、野生型のポリペプチドと比較して阻害因子の存在によってあまり阻害されないポリペプチド、または変異体が導入された生物において発現する、変異体に対応する内因性ポリペプチドと比較して、阻害因子の存在によって阻害を受けにくいポリペプチドを含む。例えば、大腸菌またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来の野生型アスパルトキナーゼは、各々ある濃度のリシン、またはリシン＋スレオニンの存在下では１０分の１の低活性を有するであろう。フィードバック阻害が低減された変異体は、例えば、同一濃度のリシンの存在下で５分の１の、２分の１の、または野生型レベルの活性を有し得る。
【００６７】
異種タンパク質は、宿主細菌種以外のいずれの細菌生物の遺伝子によってもコードされ得る。異種遺伝子は以下の細菌の非限定的一覧：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ；Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ；Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ；Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ；Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ；及びＮｏｃａｒｄｉａ  ｆａｒｃｉｎｉｃａからの遺伝子であり得る。
【００６８】
勿論、腸内細菌科からの宿主株についての異種遺伝子もまたコリネ型細菌からの遺伝子を含む。同様に、コリネ型細菌の宿主株についての異種遺伝子もまた腸内細菌科メンバーからの遺伝子を含む。一実施形態では、宿主株はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉであって、異種遺伝子はコリネ型細菌以外の種の遺伝子である。一実施形態では、宿主株はコリネ型細菌であって、異種遺伝子はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ以外の種の遺伝子である。一実施形態では、宿主株はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉであって、異種遺伝子はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ以外の種の遺伝子である。一実施形態では、宿主株はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍであって、異種遺伝子はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ以外の種の遺伝子である。様々な実施形態において、ポリペプチドは放線菌目の生物から得られた遺伝子によってコードされる。様々な実施形態において、核酸分子はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｆａｒｃｉｎｉｃａまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍもしくはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅのようなコリネ型細菌から得られる。様々な実施形態において、核酸分子はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、またはＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａから得られる。様々な実施形態において、タンパク質は腸内細菌科の生物から得られる遺伝子によってコードされる。様々な実施形態において、核酸分子はＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｙｓａｎｔｈｅｍｉ、Ｅｒｗｉｎｉａ  Ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉから得られる。
【００６９】
様々な実施形態において、異種ポリペプチドをコードする核酸分子を保有するのに加えて、宿主細菌（例えば、コリネ型細菌または腸内細菌科の細菌）は、宿主細菌からの、（例えば、コリネ型細菌、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細菌のような腸内細菌科の細菌からの）遺伝子によってコードされるポリペプチドの増大したレベルも有する。様々な実施形態において、宿主細菌からの遺伝子によってコードされるポリペプチドの増大したレベルは以下の：天然で関連するプロモーターによって調節される宿主細菌からの遺伝子のさらなるコピーの導入；プロモーター、例えば、宿主、異種生物、または天然で生じない核酸配列いずれかからの、天然で生じるプロモーターよりもアミノ酸の産生により最適なプロモーターの制御下にある宿主細菌からの遺伝子の更なるコピーの導入；または宿主、異種生物、または天然に生じない核酸配列いずれかからの、アミノ酸の産生により最適なプロモーターでの、宿主細菌からの遺伝子の天然で生じるプロモーターの置換の１以上に由来し得る。相同または異種ポリペプチドをコードする配列（例えば、１以上のポリペプチドをコードするベクター）を含む核酸分子は宿主ゲノムに組み込むことができ、あるいはエピソーム性プラスミドとして存在することができる。
【００７０】
様々な実施形態において、宿主細菌はポリペプチドの低下した発現または活性を有する。アミノ酸合成に関与する特定のポリペプチドの発現または活性の低下は、特定のアミノ酸及び関連代謝産物の産生の向上を容易とすることができる。低下した発現または活性は、コーディング配列または制御配列における改変から生起し得る。一実施形態において、ジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドの発現は細菌において低下している（例えば、細菌における内因性ｄａｐＡ遺伝子は突然変異しているか、または欠失されている）。様々な実施形態において、以下のポリペプチドの１以上の発現は欠乏している：ｍｃｂＲ遺伝子産物、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、アデノシルトランスフェラーゼポリペプチド、ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼポリペプチド、ＡＢＣ輸送系ＡＴＰ結合タンパク質ポリペプチド、ＡＢＣ輸送系パーミアーゼタンパク質ポリペプチド、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼポリペプチド、ＮＣｇｌ２６４０ポリペプチド、及びＡＢＣ輸送系基質結合タンパク質ポリペプチド。様々な実施形態において、核酸分子は、例えば、大腸菌からのｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｃＲＢＳ、ｐｈｏＡ、ｔａｃ、またはλＰＬ／λＰＲプロモーター（またはその誘導体）またはコリネ型細菌からのｐｈｏＡ、ｇｐｄ、ｒｐｌＭ、またはｒｐｓＪプロモーターのようなプロモーターを含む。
【００７１】
様々な実施形態において、ポリペプチドは（例えば、ポリペプチドの野生型形態に対して）フィードバック阻害が低減された変異ポリペプチドである。様々な実施形態において、細菌は、さらに、アミノ酸の産生に関与する更なる細菌遺伝子産物を含む。様々な実施形態において、細菌は、さらに、本明細書中に記載された細菌ポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、細菌ホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする核酸分子）を含む。様々な実施形態において、細菌は、さらに、本明細書中に記載された細菌ポリペプチドのような、相同性菌ポリペプチド（すなわち、宿主の種に対して天然である細菌ポリペプチドまたはその機能的変異体）をコードする核酸分子を含む。相同細菌ポリペプチドは、高いレベルにて発現でき、及び／または条件付で発現することができる。例えば、相同細菌ポリペプチドをコードする核酸は、野生型レベルよりも大きなポリペプチドの発現を可能とするプロモーターに操作可能に連結させることができ、及び／または核酸は細菌中に多数のコピーで存在することができる。
【００７２】
様々な実施形態において、細菌アスパルトキナーゼまたはその機能的変異体は：（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓアスパルトキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｂ）Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉアスパルトキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、（ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアスパルトキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、（ｄ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａアスパルトキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、（ｅ）Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉアスパルトキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、及び（ｆ）Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓアスパルトキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、細菌アスパルトキナーゼポリペプチドはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉアスパルトキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。一実施形態では、細菌アスパルトキナーゼポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍアスパルトキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。一実施形態では、細菌アスパルトキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体はフィードバック阻害が低減されたものである。
【００７３】
様々な実施形態において、細菌アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体は：（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、（ｂ）Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、（ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、及び（ｄ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、細菌アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。一実施形態では、細菌アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。
【００７４】
様々な実施形態において、細菌ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体は：（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、（ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、（ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、及び（ｄ）Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、細菌ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。一実施形態では、細菌ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。
【００７５】
様々な実施形態において、細菌ピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体は（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、（ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、及び（ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、細菌ピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。
【００７６】
様々な実施形態において、細菌はコリネ型細菌、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細菌のような腸内細菌科の細菌から選択される。コリネ型細菌は、限定されるものではないが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ、及びＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍを含む。
【００７７】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置２７９のアラニンの第１群アミノ酸残基への変異；位置３０１のセリンの第６群アミノ酸残基への変異；位置３１１のスレオニンの第２群アミノ酸残基への変異；及び位置３４５のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異から選択された少なくとも１つのアミノ酸変異を含み；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓアスパルトキナーゼは：位置２７９のアラニンのプロリンへの変異、位置３０１のセリンのチロシンへの変異、位置３１１のスレオニンのイソロイシンへの変異、及び位置３４５のグリシンのアスパラギン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００７８】
様々な実施形態において、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置２７９のアラニンの第１群アミノ酸残基への変異；位置３０１のセリンの第６群アミノ酸残基への変異；位置３１１のスレオニンの第２群アミノ酸残基への変異；及び位置３４５のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００７９】
様々な実施形態において、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置２７９のアラニンのプロリンへの変異；位置３０１のセリンのチロシンへの変異；位置３１１のスレオニンのイソロイシンへの変異；及び位置３４５のグリシンのアスパラギン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００８０】
様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置２８２のアラニンの第１群アミノ酸残基への変異；位置３０４のセリンの第６群アミノ酸残基への変異；位置３１４のセリンの第２群アミノ酸残基への変異；及び位置３４８のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００８１】
様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置２８２のアラニンのプロリンへの変異；位置３０４のセリンのチロシンへの変異；位置３１４のセリンのイソロイシンへの変異；及び位置３４８のグリシンのアスパラギン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００８２】
様々な実施形態において、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置３２８のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異；位置３３０のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異；位置３５０のセリンの第２群アミノ酸残基への変異；及び位置３５２のバリンのバリン以外の第２群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００８３】
様々な実施形態において、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置３２８のグリシンのアスパラギン酸への変異；位置３３０のロイシンのフェニルアラニンへの変異；位置３５０のセリンのイソロイシンへの変異；及び位置３５２のバリンのメチオニンへの変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００８４】
様々な実施形態において、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置３２３のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異；位置３２５のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異；位置３４５のセリンの第２群アミノ酸残基への変異；及び位置３４７のバリンのバリン以外の第２群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００８５】
様々な実施形態において、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置３２３のグリシンのアスパラギン酸への変異；位置３２５のロイシンのフェニルアラニンへの変異；位置３４５のセリンのイソロイシンへの変異；及び位置３４７のバリンのメチオニンへの変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００８６】
様々な実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置２７９のアラニンのアラニン以外の第１群アミノ酸への変異；位置３０１のセリンの第６群アミノ酸残基への変異；位置３１１のスレオニンの第２群アミノ酸残基への変異；及び位置３４５のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００８７】
様々な実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置２７９のアラニンのプロリンへの変異；位置３０１のセリンのチロシンへの変異；位置３１１のスレオニンのイソロイシンへの変異；及び位置３４５のグリシンのアスパラギン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００８８】
様々な実施形態において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置３２３のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異；位置３２５のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異；位置３４５のセリンの第２群アミノ酸残基への変異；及び位置３４７のバリンのバリン以外の第２群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００８９】
様々な実施形態において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉアスパルトキナーゼポリペプチドは：位置３２３のグリシンのアスパラギン酸への変異；位置３２５のロイシンのフェニルアラニンへの変異；位置３４５のセリンのイソロイシンへの変異；及び位置３４７のバリンのメチオニンへの変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００９０】
様々な実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその変異体は位置４５８のプロリンの第４群アミノ酸残基への変異を含む。様々な実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその変異体は位置４５８のプロリンのセリンへの変異を含む。
【００９１】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその変異体は位置４４８のプロリンの第４群アミノ酸残基への変異を含む。様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその変異体は位置４４８のプロリンのセリンへの変異を含む。
【００９２】
様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその変異体は位置４４９のプロリンの第４群アミノ酸残基への変異を含む。様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその変異体は位置４４９のプロリンのセリンへの変異を含む。
【００９３】
様々な実施形態において、細菌ジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体は：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及びＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、フィードバック阻害が低減された細菌ジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。一実施形態では、細菌ジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体はフィードバック阻害が低減されたものである。
【００９４】
様々な実施形態において、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドは：位置８０のアスパラギンの第２群アミノ酸残基への変異；位置８８のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異；及び位置１１８のヒスチジンの第６群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００９５】
様々な実施形態において、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドは：位置８０のアスパラギンのイソロイシンへの変異；位置８８のロイシンのフェニルアラニンへの変異；及び位置１１８のヒスチジンのチロシンへの変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００９６】
様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドは：位置８９のアスパラギンの第２群アミノ酸残基への変異；位置９７のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異；及び位置１２７のヒスチジンの第６群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００９７】
様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドは：位置８９のアスパラギンのイソロイシンへの変異；位置９７のロイシンのフェニルアラニンへの変異；及び位置１２７のヒスチジンのチロシンへの変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００９８】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドは：第２群アミノ酸残基へ変異されるチロシン９０に対応するアミノ酸残基；第６群アミノ酸残基へ変異されるロイシン９８に対応するアミノ酸残基；及び第６群アミノ酸残基へ変異されるヒスチジン１２８に対応するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００９９】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドは：イソロイシンへ変異されるチロシン９０に対応するアミノ酸残基；フェニルアラニンへ変異されるロイシン９８に対応するアミノ酸残基；及びヒスチジンへ変異されるヒスチジン１２８に対応するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【０１００】
様々な実施形態において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドは：位置８０のアスパラギンの第２群アミノ酸残基への変異；位置８１のアラニンの第２群アミノ酸残基への変異；位置８４のグルタミン酸の第５群アミノ酸残基への変異；位置８８のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異；及び位置１１８のヒスチジンの第６群アミノ酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【０１０１】
様々な実施形態において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドは：位置８０のアスパラギンのイソロイシンへの変異；位置８１のロイシンのバリンへの変異；位置８４のグルタミン酸のリシンへの変異；位置８８のロイシンのフェニルアラニンへの変異；及び位置１１８のヒスチジンのチロシンへの変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【０１０２】
様々な実施形態において、細菌ホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは：（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及び（ｄ）Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、細菌ホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドはコリネ型細菌からのホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体、またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体）である。一実施形態では、ホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。一実施形態では、ホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体はフィードバック阻害が低減されたものである。
【０１０３】
様々な実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは：位置２３のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異；位置５９のバリンの第１群アミノ酸残基への変異；位置１０４のバリンの他の第２群アミノ酸残基への変異；位置３７８のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異；及びホモセリンデヒドロゲナーゼタンパク質を４２８位リシンアミノ酸残基の後で切断する変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【０１０４】
様々な実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは：位置２３のロイシンのフェニルアラニンへの変異；位置５９のバリンのアラニンへの変異；位置１０４のバリンのイソロイシンへの変異；及び位置３７８のグリシンのグルタミン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【０１０５】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは：位置１０のバリンの第６群アミノ酸残基への変異；位置４６のバリンの第１群アミノ酸残基への変異；及び位置３６４のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【０１０６】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは：位置１０のバリンのフェニルアラニンへの変異；位置４６のバリンのアラニンへの変異；及び位置３７８のグリシンのグルタミン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【０１０７】
様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは：位置１０のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異；位置４６のバリンの第１群アミノ酸残基への変異；位置３６２のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異；ホモセリンデヒドロゲナーゼタンパク質を位置４１２のアルギニンアミノ酸残基の後で切断する変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは：位置１０のロイシンのフェニルアラニンへの変異；位置４６のバリンのアラニンへの変異；及び位置３６２のグリシンのグルタミン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【０１０８】
様々な実施形態において、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは：位置１９２のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異；位置２２８のバリンの第１群アミノ酸残基への変異；位置５４５のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。様々な実施形態において、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは位置５９５のアルギニンアミノ酸残基の後で切断される。
【０１０９】
様々な実施形態において、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは：位置１９２のロイシンのフェニルアラニンへの変異；位置２２８のバリンのアラニンへの変異；及び位置５４５のグリシンのグルタミン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【０１１０】
様々な実施形態において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは、配列番号２１１において、位置３３０のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異；及び位置３５２のセリンの第６群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【０１１１】
様々な実施形態において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは、配列番号２１１において、位置３３０のグリシンのアスパラギン酸への変異；及び位置３５２のセリンのフェニルアラニンへの変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【０１１２】
様々な実施形態において、細菌Ｏ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドは：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及びＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、細菌Ｏ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。一実施形態では、Ｏ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体はフィードバック阻害が低減されたものである。
【０１１３】
様々な実施形態において、細菌Ｏ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドはＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体であり；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドは配列番号２４またはその変異配列を含み；細菌Ｏ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体であり；Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドは配列番号２１２またはその変異配列を含み；または細菌Ｏ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体であり；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドは配列番号２１３またはその変異配列を含む。
【０１１４】
様々な実施形態において、細菌Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドは（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及び（ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、細菌Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。一実施形態では、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体はフィードバック阻害が低減されたものである。
【０１１５】
様々な実施形態において、細菌メチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及びＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、細菌メチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。一実施形態では、細菌メチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからのメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。一実施形態では、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体はフィードバック阻害が低減されたものである。
【０１１６】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置１９６のバリンの第３群アミノ酸残基への変異を含む。様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置１９６のバリンのグルタミン酸残基への変異を含む。
【０１１７】
様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置１９５のバリンの第３群アミノ酸残基への変異を含む。様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置１９５のバリンのグルタミン酸への変異を含む。様々な実施形態において、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置１９５のバリンの第３群アミノ酸残基への変異を含む。様々な実施形態において、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置１９５のバリンのグルタミン酸残基への変異を含む。
【０１１８】
様々な実施形態において、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置１８５を第３群アミノ酸残基へのバリンの変異を含む。様々な実施形態において、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置１８５のバリンのグルタミン酸残基への変異を含む。
【０１１９】
様々な実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置２００のバリンの第３群アミノ酸残基への変異を含む。様々な実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置２００のバリンのグルタミン酸残基への変異を含む。
【０１２０】
様々な実施形態において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置１８５のバリンの第３群アミノ酸残基への変異を含む。様々な実施形態において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドは位置１８５のバリンのグルタミン酸残基への変異を含む。
【０１２１】
様々な実施形態において、コバラミン―依存性メチオニン合成ポリペプチド（ＭｅｔＨ）はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓコバラミン―依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒコバラミン―依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａコバラミン―依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉコバラミン―依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉコバラミン―依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍコバラミン―依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体である。
【０１２２】
様々な実施形態において、コバラミン―非依存性メチオニン合成ポリペプチド（ＭｅｔＥ）はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓコバラミン―非依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒコバラミン―非依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａコバラミン―非依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉコバラミン―非依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉコバラミン―非依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍコバラミン―非依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体である。
【０１２３】
様々な実施形態において、細菌は、さらに、細菌ジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸分子を含む。
様々な実施形態において、細菌ジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体は；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、ジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体はフィードバック阻害が低減されたものである。
【０１２４】
様々な実施形態において、細菌は、さらに（ａ）細菌ホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸分子（例えば、組換え核酸分子）；（ｂ）細菌Ｏ−ホモセリンアセチルトランスフェナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸分子（例えば、組換え核酸分子）；（ｃ）Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸分子（例えば、組換え核酸分子）の内の少なくとも１つを含む。一実施形態では、前記ポリペプチドまたはその機能的変異体の１以上はフィードバック阻害が低減されたものである。
【０１２５】
様々な実施形態において、細菌ホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドは：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及びＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、前記ホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体はフィードバック阻害が低減されたものである。
【０１２６】
様々な実施形態において、細菌Ｏ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドは：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＯ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、前記Ｏ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体はフィードバック阻害が低減されたものである。
【０１２７】
様々な実施形態において、細菌Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドは：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、前記Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体はフィードバック阻害が低減されたものである。
【０１２８】
様々な実施形態において、細菌は、さらに、細菌メチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチド（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍメチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体）をコードする核酸分子（例えば、組換え核酸分子）を含む。
【０１２９】
様々な実施形態において、細菌は、さらに、コバラミン―依存性メチオニン合成ポリペプチド（ＭｅｔＨ）（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓコバラミン―依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒコバラミン―依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａコバラミン―依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉコバラミン―依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉメチオニンコバラミン―依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍコバラミン―依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体）をコードする核酸分子（例えば、組換え核酸分子）を含む。
【０１３０】
様々な実施形態において、細菌は、さらに、コバラミン―依存性メチオニン合成ポリペプチド（ＮｅｔＥ）（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓコバラミン―非依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒコバラミン―非依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａコバラミン―非依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉコバラミン―非依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉコバラミン―非依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体；またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍコバラミン―非依存性メチオニン合成ポリペプチドまたはその機能的変異体）をコードする核酸分子（例えば、組み換え核酸分子）を含む。
【０１３１】
様々な実施形態において、細菌グリシンデヒドロゲナーゼ（脱カルボキシル化）ポリペプチドは：（ａ）大腸菌グリシンデヒドロゲナーゼ（脱カルボキシル化）ポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｂ）Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓグリシンデヒドロゲナーゼ（脱カルボキシル化）ポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｃ）Ｔ．ｆｕｓｃａグリシンデヒドロゲナーゼ（脱カルボキシル化）ポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｄ）Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａグリシンデヒドロゲナーゼ（脱カルボキシル化）ポリペプチドまたはその機能的変異体；及び（ｅ）Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒグリシンデヒドロゲナーゼ（脱カルボキシル化）ポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。
【０１３２】
様々な実施形態において、（グリシン切断系に関与する）細菌Ｈポリペプチドは（ａ）グリシン切断系に関与する大腸菌Ｈポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｂ）グリシン切断系に関与するＢ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓＨポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｃ）グリシン切断系に関与するＴ．ｆｕｓｃａＨポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｄ）Ｅ．グリシン切断系に関与するｃａｒｏｔｏｖｏｒａＨポリペプチドまたはその機能的変異体；及び（ｅ）グリシン切断系に関与するＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＨポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。
【０１３３】
様々な実施形態において、細菌アミノメチルトランスフェラーゼポリペプチドは（ａ）大腸菌アミノメチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｂ）Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓアミノメチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｃ）Ｔ．ｆｕｓｃａアミノメチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｄ）Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａアミノメチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及び（ｅ）Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアミノメチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、前記細菌アミノメチルトランスフェラーゼポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのアミノメチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。
【０１３４】
様々な実施形態において、細菌ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼポリペプチドは（ａ）大腸菌ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｂ）Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｃ）Ｔ．ｆｕｓｃａジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｄ）Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及び（ｅ）Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、細菌ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。
【０１３５】
様々な実施形態において、細菌リポ酸シンターゼポリペプチドは（ａ）大腸菌リポ酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｂ）Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓリポ酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｃ）Ｔ．ｆｕｓｃａリポ酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｄ）Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａリポ酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及び（ｅ）Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒリポ酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、前記細菌リポ酸シンターゼポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのリポ酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。
【０１３６】
様々な実施形態において、細菌リポイル―［アシル−キャリア−タンパク質］−タンパク質−Ｎ−リポイルトランスフェラーゼポリペプチドは：（ａ）大腸菌リポイル―［アシル−キャリア−タンパク質］−タンパク質−Ｎ−リポイルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｂ）Ｔ．ｆｕｓｃａリポイル―［アシル−キャリア−タンパク質］−タンパク質−Ｎ−リポイルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｃ）Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａリポイル―［アシル−キャリア−タンパク質］−タンパク質−Ｎ−リポイルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及び（ｄ）Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒリポイル―［アシル−キャリア−タンパク質］−タンパク質−Ｎ−リポイルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、前記細菌リポイル―［アシル−キャリア−タンパク質］−タンパク質−Ｎ−リポイルトランスフェラーゼポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのリポイル―［アシル−キャリア−タンパク質］−タンパク質−Ｎ−リポイルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。
【０１３７】
様々な実施形態において、細菌リポエート−タンパク質リガーゼＡポリペプチドは：（ａ）大腸菌リポエート−タンパク質リガーゼＡポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｂ）Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓリポエート−タンパク質リガーゼＡポリペプチドまたはその機能的変異体；及び（ｃ）Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒリポエート−タンパク質リガーゼＡポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、細菌リポエート−タンパク質リガーゼＡポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのリポエート−タンパク質リガーゼＡポリペプチドまたはその機能的変異体である。
【０１３８】
様々な実施形態において、細菌フルクトース１，６ビスホスファターゼポリペプチドは（ａ）大腸菌フルクトース１，６ビスホスファターゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｂ）Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓフルクトース１，６ビスホスファターゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｃ）Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒフルクトース１，６ビスホスファターゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｄ）Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍフルクトース１，６ビスホスファターゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｅ）Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａフルクトース１，６ビスホスファターゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｆ）Ｍ．Ｓｍｅｇｍａｔｉｓフルクトース１，６ビスホスファターゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及び（ｇ）Ｔ．ｆｕｓｃａフルクトース１，６ビスホスファターゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、前記細菌フルクトース１，６ビスホスファターゼポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのフルクトース１，６ビスホスファターゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。
【０１３９】
様々な実施形態において、グルコース６ホスフェートデヒドロゲナーゼポリペプチドは（ａ）大腸菌グルコース６ホスフェートデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｂ）Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒグルコース６ホスフェートデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｃ）Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａグルコース６ホスフェートデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｄ）Ｍ．Ｓｍｅｇｍａｔｉｓグルコース６ホスフェートデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及び（ｅ）Ｔ．ｆｕｓｃａグルコース６ホスフェートデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、前記細菌グルコース６ホスフェートデヒドロゲナーゼポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのグルコース６ホスフェートデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。
【０１４０】
様々な実施形態において、細菌グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼポリペプチドは（ａ）大腸菌グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｂ）Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓグルコース−６−ホスフェートイソメラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｃ）Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒグルコース−６−ホスフェートイソメラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｄ）Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍグルコース−６−ホスフェートイソメラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｅ）Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａグルコース−６−ホスフェートイソメラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｆ）Ｍ．Ｓｍｅｇｍａｔｉｓグルコース−６−ホスフェートイソメラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体；及び（ｇ）Ｔ．ｆｕｓｃａグルコース−６−ホスフェートイソメラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。一実施形態では、細菌グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのグルコース−６−ホスフェートイソメラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体である。
【０１４１】
様々な実施形態において、細菌ＮＣｇｌ２６４０ポリペプチドは（ａ）大腸菌  ＮＣｇｌ２６４０ポリペプチドまたはその機能的変異体；（ｂ）Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ＮＣｇｌ２６４０ポリペプチドまたはその機能的変異体；及び（ｃ）Ｔ．ｆｕｓｃａ  ＮＣｇｌ２６４０ポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。ある具体例において細菌ＮＣｇｌ２６４０ポリペプチドはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのＮＣｇｌ２６４０ポリペプチドまたはその機能的変異体である。
【０１４２】
特徴は（ａ）細菌ホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸分子；（ｂ）細菌Ｏ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸分子；及び（ｃ）細菌Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸分子、の内の少なくとも２つを含む、コリネ型細菌、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細菌のような腸内細菌科の細菌である。一実施形態では、前記細菌ポリペプチドまたはその機能的変異体の１以上はフィードバック阻害が低減されたものである。
【０１４３】
様々な実施形態において、細菌は対照に対して、以下のポリペプチド：（ａ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼポリペプチド；及び（ｂ）ｍｃｂＲ遺伝子産物ポリペプチドの１以上の低下した活性を有し、例えば、前記細菌は内因性ｐｃｋ遺伝子または内因性ｍｃｂＲ遺伝子において突然変異を含み、例えば、前記細菌は内因性ｐｃｋ遺伝子及び内因性ｍｃｂＲ遺伝子において突然変異を有する。
【０１４４】
また、アミノ酸または関連代謝産物を産生する方法が記載され、前記方法は、前記アミノ酸または前記関連代謝産物を産生できるようにした条件下で細菌（例えば、本明細書中に記載された細菌）を培養し（すなわち、培養地における培養）、前記アミノ酸または関連代謝産物を含む組成物を培養物から収集することを含む（前記組成物は実質的に無細胞培養地であり得、ここに、前記細胞は培養されており、あるいは細胞を含むことができ、あるいは細胞デブリス、例えば、溶解された細胞を含むことができ、または実質的に細胞であり得る）。前記方法は、さらに、収集された組成物（または培養）の少なくとも一部を分画して、前記アミノ酸または代謝産物が豊富化された画分を得ることができる。
【０１４５】
前記画分をさらに処理して、前記アミノ酸または関連代謝産物の少なくとも１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、９８重量％または９９重量％である組成物を得ることができる。
【０１４６】
また、アミノ酸（例えば、メチオニン、リシン、スレオニン、イソロイシン、Ｓ−アデノシルメチオニン）を産生する方法が記載され、前記方法は、アミノ酸が生じるのを可能とする条件下で本明細書中に記載されて細菌を培養し、培養を収集することを含む。培養は、（例えば、細胞を除去し、及び／またはアミノ酸が豊富化された画分を得るために分画する）ことができる。
【０１４７】
さらなる特徴は、アミノ酸または代謝産物、またはアミノ酸または代謝産物を含む産物の調製方法であり、前記方法は以下の工程：
（ａ）アミノ酸または代謝産物が生じるのを可能とする条件下で細菌（例えば、本明細書中に記載された細菌）を培養し；
（ｂ）前記アミノ酸または代謝産物の少なくとも一部を含む組成物を収集し、
（ｃ）収集された組成物を濃縮して、アミノ酸または代謝産物を豊富化し；次いで、
（ｄ）所望により、１以上の物質を加えて、所望の産物を得る；
の２以上を含む。
【０１４８】
アミノ酸または代謝産物を含む動物飼料製品の場合には、加えることができる物質は、限定されるものではないが、例えば、ゼラチン、セルロース誘導体（例えば、セルロースエーテル）、シリカ、シリケート、ステアレート、小砂、ふすま、ミール、澱粉、ガム、アルギネート糖その他のような慣用的な有機または無機の補助的物質または担体を含み、及び／または、これは慣用的な増粘剤またはバインダーと混合し、安定化される。
【０１４９】
様々な実施形態において、収集される組成物は細菌の細胞を欠如する。様々な実施形態において、収集される組成物は、細菌の培養に由来する細菌細胞の１０％、５％、１％、０．５％未満を含む。様々な実施形態において、組成物は、細菌の培養に由来する細菌細胞の少なくとも１％（例えば、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、４０％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、または１００％まで）を含む。
【０１５０】
本明細書中に記載されているのは：
（ａ）細菌スルフェートＡＢＣ輸送担体ＡＴＰ結合ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂ）細菌スルフェート輸送系パーミアーゼＷポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｃ）細菌スルフェート・チオスルフェート輸送系パーミアーゼＴポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｄ）細菌スルフェートアデニリルトランスフェラーゼサブユニット１ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｅ）細菌スルフェートアデニリルトランスフェラーゼサブユニット２ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｆ）細菌アデニリルスルフェートキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｇ）細菌ホスホアデノシンホスホスルフェートレダクターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｈ）細菌スルファイトレダクターゼαサブユニットポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｉ）細菌スルファイトレダクターゼヘモポリペプチドベータ成分ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｊ）細菌スルファイトレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ）、フラボポリペプチドβサブユニットポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｋ）細菌アデニリル−スルフェートレダクターゼαサブユニットポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｌ）細菌ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｍ）細菌ホスホセリントランスアミナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｎ）細菌ホスホセリンホスファターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｏ）細菌セリンＯ−アセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｐ）細菌システインシンターゼＡポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｑ）細菌システインシンターゼＢポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｒ）細菌ＡＢＣ型ビタミンＢ１２輸送担体パーミアーゼ成分ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｓ）細菌ＡＢＣ型ビタミンＢ１２輸送担体ＡＴＰａｓｅ化合物ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｔ）細菌ＡＢＣ型コバラミン／Ｆｅ３＋シデロフォア輸送系ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｕ）細菌アデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｖ）細菌ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｗ）細菌ｐｈｏＡ、ｐｓｉＡ、またはｐｓｉＦ遺伝子産物ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｘ）細菌ジヒドロネオプテリンアルドラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｙ）細菌７，８−ジヒドロ−６−ヒドロキシメチルプテリン−ピロホスホキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｚ）細菌デヒドロプテロエートシンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａａ）細菌ジヒドロ葉酸シンテターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｂ）細菌ジヒドロ葉酸レダクターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｃ）細菌フォリルポリグルタメートシンテターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｄ）推定細菌メチオニン（ＡＰＣ輸送担体スーパーファミリー）パーミアーゼ（ＹｊｅＨ）ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｅ）ＭｅｔＥ／Ｈポリペプチドの細菌転写アクチベータまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｆ）細菌６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｇ）細菌Ｓ−メチルメチオニンホモシステインメチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｈ）細菌Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｉ）細菌部位特異的ＤＮＡメチラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｊ）細菌メチオニン搬出系タンパク質１ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｋ）細菌メチオニン搬出系タンパク質２ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｌ）細菌ＡＢＣ輸送系ＡＴＰ結合タンパク質（ＭｅｔＮ）ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｍ）細菌ＡＢＣ輸送系パーミアーゼタンパク質（ＭｅｔＰ）ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｎ）細菌ＡＢＣ輸送系基質結合タンパク質（ＭｅｔＱ）ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｏ）細菌アスパルトキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｐ）細菌アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｑ）細菌ホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｒ）細菌Ｏ−ホモセリンアセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｓ）細菌Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｔ）細菌コバラミン依存性メチオニンシンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｕ）細菌コバラミン非依存性メチオニンシンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｖ）細菌ホモセリンキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｗ）細菌メチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｘ）細菌Ｏ−スクシニルホモセリン（チオ）−リアーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｙ）細菌シスタチオニンβ−リアーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ａｚ）細菌５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂａ）細菌ジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｂ）細菌ピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｃ）細菌グルタミン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｄ）細菌ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｅ）細菌メチオニン及びシステイン生合成レプレッサー（ＭｃｂＲ）ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｆ）細菌リシンエクスポータータンパク質ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｇ）細菌ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｈ）細菌ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｉ）細菌グリシンデヒドロゲナーゼ（脱カルボキシル化）ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｊ）（グリシン切断系に関与する）細菌Ｈポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｋ）細菌アミノメチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｌ）細菌ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｍ）細菌リポエート−タンパク質リガーゼＡポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｎ）細菌リポ酸シンターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｏ）細菌リポイル−［アシル−キャリア−タンパク質］−タンパク質−Ｎ−リポイルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｐ）細菌フルクトース１，６ビスホスファターゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｑ）細菌グルコース６ホスフェートデヒドロゲナーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；
（ｂｒ）グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；及び
（ｂｓ）細菌ＮＣｇｌ２６４０ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列を含む核酸分子；及び
（ａ）乃至（ｂｓ）の全ての組合せ及びサブコンビネーション
よりなる群から選択される少なくとも１つの単離核酸分子を含む腸内細菌科またはコリネ型細菌である。
【０１５１】
また、本明細書中に記載されているのは以下の細菌である。すなわち、その細菌は核酸分子（ａ）乃至（ｂｓ）の内の少なくとも２つを含み；その細菌は核酸分子（ａ）乃至（ｂｓ）の内の少なくとも３つを含み；その細菌は核酸分子（ａ）乃至（ｂｓ）の内の少なくとも４つを含み；その細菌は核酸分子（ａ）乃至（ｂｓ）の内の少なくとも５つを含み；ポリペプチドの内の少なくとも１つは細菌に対して異種であり；ポリペプチドの内の少なくとも２つは細菌に対して異種であり；その細菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細菌であり；その細菌はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細菌であり；ポリペプチド（すなわち、（ａ）乃至（ｂｓ）のいずれかのポリペプチド）は腸内細菌科ポリペプチド、放線菌属ポリペプチド、またはその変異体から選択され；ポリペプチド（すなわち、（ａ）乃至（ｂｓ）のいずれかのポリペプチド）は以下の放線菌属の種：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅのような、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｆａｒｃｉｎｉｃａ、及びコリネ型細菌のうちの１つのポリペプチドであり；ポリペプチド（すなわち、（ａ）乃至（ｂｓ）のいずれかのポリペプチド）はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ及びＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａの１以上からのものであり；核酸分子を含む腸内細菌科またはコリネ型細菌（宿主株）はＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍであり；核酸分子を含む腸内細菌科またはコリネ型細菌（宿主株）はＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｙｓａｎｔｈｅｍｉまたはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。
【０１５２】
また、記載されているのは前記したあらゆる細菌であり、その細菌はいずれかの遺伝子操作に先立っての細菌に対する以下のポリペプチドの１以上の低下した活性または発現を有する：ジヒドロジピコリン酸シンターゼポリペプチド；ｍｃｂＲ遺伝子産物ポリペプチド；ホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチド、ホモセリンキナーゼポリペプチド、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼポリペプチド、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼポリペプチド、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼポリペプチド、アデノシルトランスフェラーゼポリペプチド、ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼポリペプチド、ＡＢＣ輸送系ＡＴＰ結合タンパク質ポリペプチド、ＡＢＣ輸送系パーミアーゼタンパク質ポリペプチド、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、ＮＣｇｌ２６４０ポリペプチド、及びＡＢＣ輸送系基質結合タンパク質ポリペプチド。その細菌はこれらのポリペプチドの種々の組合せ及びサブ−組合せのいずれかの低下した活性を有することができる。
【０１５３】
また、記載されているのは前記したあらゆる細菌である。すなわち、その細菌は（ａ）ならびに：（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｂ）ならびに（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；前記細菌は（ｃ）ならびに（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｄ）ならびに（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｅ）ならびに（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｆ）ならびに（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｇ）ならびに（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｈ）ならびに（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｉ）ならびに（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｊ）ならびに（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｋ）ならびに（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｌ）ならびに（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｍ）ならびに（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｎ）ならびに（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｏ）ならびに（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｐ）ならびに（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（
ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｑ）ならびに（ｒ）、（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｒ）ならびに（ｓ）、（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｓ）ならびに（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｔ）ならびに（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｕ）ならびに（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｖ）ならびに（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｗ）ならびに（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｘ）ならびに（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は、（ｙ）ならびに（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｚ）ならびに（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａａ）ならびに（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｂ）ならびに（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は、（ａｃ）ならびに（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｄ）ならびに（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｅ）ならびに（ａｆ）、（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｆ）ならびに（ａｇ）、（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｇ）ならびに（ａｈ）、（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｈ）ならびに（ａｉ）、（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｉ）ならびに（ａｊ）、（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｊ）ならびに（ａｋ）、（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｋ）ならびに（ａｌ）、（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂ
ｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｌ）ならびに（ａｍ）、（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｍ）ならびに（ａｎ）、（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｎ）ならびに（ａｏ）、（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｏ）ならびに（ａｐ）、（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｐ）ならびに（ａｑ）、（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｑ）ならびに（ａｒ）、（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｒ）ならびに（ａｓ）、（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｓ）ならびに（ａｔ）、（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｔ）ならびに（ａｕ）、（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｕ）ならびに（ａｖ）、（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｖ）ならびに（ａｗ）、（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｗ）ならびに（ａｘ）、（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｘ）ならびに（ａｙ）、（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｙ）ならびに（ａｚ）、（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ａｚ）ならびに（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｂａ）ならびに（ｂｂ）、（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｂｂ）ならびに（ｂｃ）、（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｂｃ）ならびに（ｂｄ）、（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｂｄ）ならびに（ｂｅ）、（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｂｅ）ならびに（ｂｆ）、（ｂｇ）、（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｂｆ）ならびに（ｂｇ）（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｂｇ）ならびに（ｂｈ）、（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｂｈ）ならびに（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｂｉ）ならびに（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｂｊ）ならびに（ｂｋ）、（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｂｋ）ならびに（ｂｌ）、（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｂｌ）ならびに（ｂｍ）、（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｂｍ）ならびに（ｂｎ）、（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｂｎ）ならびに（ｂｏ）、（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｂｏ）ならびに（ｂｐ）、（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｂｐ）ならびに（ｂｑ）、（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｂｑ）ならびに（ｂｒ）、及び（ｂｓ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｂｒ）及び（ｂｓ）を含み；その細菌は（ａｊ）及び（ａｋ）を含む。
【０１５４】
また、記載されているのは細菌である。すなわち、その細菌は（ｒ）、（ｓ）及び（ｔ）を含み、細菌は（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含み；その細菌は（ｄ）及び（ｅ）を含み；その細菌は（ｉ）及び（ｊ）を含み；その細菌は（ｌ）及び（ｏ）を含み；その細菌は（ｐ）及び（ｑ）を含み；その細菌は（ｂｉ）、（ｂｊ）及び（ｂｋ）を含み；その細菌は（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）及び（ｂｌ）を含み；その細菌は（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）ならびに：（１）（ｂｍ）または（２）（ｂｎ）と（ｏ）の内の少なくとも１つを含み；その細菌は（ｂｉ）、（ｂｊ）、（ｂｋ）、（ｂｌ）ならびに：（１）（ｂｍ）または（２）（ｂｎ）と（ｂｏ）の内の少なくとも１つを含む。
【０１５５】
また、（ａ）乃至（ａｎ）よりなる群から選択される少なくとも１つの単離核酸分子及び（ａｏ）乃至（ｂｓ）よりなる群から選択される少なくとも１つの単離核酸分子を含む細菌；（ａ）乃至（ａｎ）よりなる群から選択される少なくとも１つの単離核酸分子及び（ａｏ）乃至（ｂｓ）よりなる群から選択される少なくとも２つの単離核酸分子を含む細菌；（ａ）乃至（ａｎ）よりなる群から選択される少なくとも２つの単離核酸分子及び（ａｏ）乃至（ｂｓ）よりなる群から選択される少なくとも１つの単離核酸分子を含む細菌；（ａ）乃至（ａｎ）よりなる群から選択される少なくとも２つの単離核酸分子及び（ａｏ）乃至（ｂｓ）よりなる群から選択される少なくとも２つの単離核酸分子を含む細菌；及びフィードバック阻害が低減された変異アスパルトキナーゼ、フィードバック阻害が低減された変異ホモセリンデヒドロゲナーゼ、及び／またはフィードバック阻害が低減された変異Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする単離核酸分子を含む細菌も記載されている。
【０１５６】
また、アミノ酸または関連代謝産物が産生されるのを可能とする条件下で前記した細菌のいずれかを栽培（培養）し、次いで、培養物からアミノ酸または関連代謝産物を含む組成物（培養地、細胞、または細胞及び培養地の組合せ）を収集することを含む、アミノ酸または関連代謝産物を産生する方法も記載されている。前記方法は、さらに：培養物の少なくとも一部を分画して、分画されていない培養と比較してアミノ酸または代謝産物が豊富化された画分を得ることを含むことができる。
【０１５７】
また、Ｓ−アデノシルメチオニンを産生する方法も記載され、前記方法は、Ｓ−アデノシルメチオニンが産生されるのを可能とする条件下で本明細書中に記載された細菌を培養し、次いで、培養物からＳ−アデノシルメチオニンを含む組成物を収集することを含む。前記方法は：培養物の少なくとも一部を分画して、Ｓ−アデノシルメチオニンが豊富化された画分を得ることを含むことができる。
【０１５８】
また、メチオニンを産生する方法が記載され、前記方法はメチオニンが産生されるのを可能とする条件下で本明細書中に記載された細菌を培養し、次いで、培養物からメチオニンを含む組成物を収集することを含む。前記方法は：培養物の少なくとも一部を分画して、メチオニンが豊富化された画分を得ることを含むことができる。
【０１５９】
また、システインを産生する方法が記載され、前記方法はシステインが産生されるのを可能とする条件下で本明細書中に記載された細菌を培養し、次いで、培養物からシステインを含む組成物を収集することを含む。前記方法は：培養物の少なくとも一部を分画して、システインが豊富化された画分を得ることを含むことができる。
【０１６０】
また、リシンを産生する方法が記載され、前記方法はリシンが産生されるのを可能とする条件下で本明細書中に記載された細菌を培養し、次いで、培養物からリシンを含む組成物を収集することを含む。前記方法は：培養物の少なくとも一部を分画して、リシンが豊富化された画分を得ることを含むことができる。
【０１６１】
また、スレオニンまたは関連代謝産物を産生する方法が記載され、前記方法は：スレオニンまたは関連代謝産物が産生されるのを可能とする条件下で本明細書中に記載された細菌を培養し、次いで、培養物からスレオニンまたは関連代謝産物を含む組成物を収集することを含む。前記方法は培養物の少なくとも一部を分画して、スレオニンまたは関連代謝産物が豊富化された画分を得ることを含むことができる。
【０１６２】
また、イソロイシンまたは関連代謝産物を産生する方法が記載され、前記方法は：イソロイシンまたは関連代謝産物が産生されるのを可能とする条件下で本明細書中に記載された細菌を培養し、次いで、培養物からイソロイシンまたは関連代謝産物を含む組成物を収集することを含む。前記方法は培養物の少なくとも一部を分画して、イソロイシンまたは関連代謝産物が豊富化された画分を得ることを含むことができる。
【０１６３】
また、（ａ）選択されたアミノ酸が産生されるのを可能とする条件下で本明細書中に記載された細菌を培養し；（ｂ）細菌を培養することに由来する選択されたアミノ酸の少なくとも一部を含む組成物を収集し；（ｃ）収集された組成物を濃縮して、選択されたアミノ酸を豊富化し；次いで、（ｄ）所望により、１以上の物質を加えて、所望の飼料（例えば、動物飼料）添加物を得ることを含む、メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン、システイン、リシン、スレオニン及びイソロイシンよりなる群から選択される１以上のアミノ酸を含む動物飼料添加剤の調製方法が記載されている。種々の状況において：細菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはコリネ型細菌であり；その細菌はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍであり；選択されたアミノ酸はメチオニンである。
【０１６４】
また、（ａ）乃至（ａｎ）よりなる群から選択される少なくとも１つの単離核酸分子及び（ａｏ）乃至（ｂｓ）よりなる群から選択される少なくとも１つの単離核酸分子を含む；（ａ）乃至（ａｎ）よりなる群から選択される少なくとも１つの単離核酸分子及び（ａｏ）乃至（ｂｓ）よりなる群から選択される少なくとも２つの単離核酸分子を含む；（ａ）乃至（ａｎ）よりなる群から選択される少なくとも２つの単離核酸分子及び（ａｏ）乃至（ｂｓ）よりなる群から選択される少なくとも１つの単離核酸分子を含む；（ａ）乃至（ａｎ）よりなる群から選択される少なくとも２つの単離核酸分子及び（ａｏ）乃至（ｂｓ）よりなる群から選択される少なくとも２つの単離核酸分子を含む腸内細菌科またはコリネ型細菌も開示される。
【０１６５】
また、フィードバック阻害が低減された変異アスパルトキナーゼ、フィードバック阻害が低減された変異デヒドロゲナーゼ、またはフィードバック阻害が低減された変異Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする単離核酸分子を含む細菌（例えば、フィードバック阻害が低減された変異アスパルトキナーゼ、フィードバック阻害が低減された変異ホモセリンデヒドロゲナーゼ、またはフィードバック阻害が低減された変異Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼが宿主細胞に対して異種である細菌）も記載されている。他の例はその発現または活性を低下させまたは除去するホモセリンキナーゼにおいて突然変異を有する細菌；その発現または活性を低下させまたは除去するメチオニン／システイン生合成抑制において突然変異を有する細菌（例えば、メチオニン及びシステイン生合成リプレッサー（ＭｃｂＲ）において突然変異を有する細菌；その発現または活性を低下させるメチオニンアデノシルトランスフェラーゼにおいて突然変異を有する細菌；（ａｊ）及び（ａｋ）を含む細菌；（ｒ）、（ｓ）及び（ｔ）を含む細菌；及び（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む細菌）を含む。
【０１６６】
「機能的変異体（functional variant）」タンパク質は、該タンパク質が酵素である場合は野生型タンパク質によって触媒される生合成反応を触媒しうるタンパク質であり、該タンパク質が触媒作用を持たない場合は野生型タンパク質と同様の生物学的機能を提供しうるタンパク質である。例えば、正常時に１または複数の遺伝子の転写を制御するタンパク質の機能的変異体は、細菌に形質転換されたとき、やはり同じ１または複数の遺伝子の転写を制御することになる。機能的変異体は野生型タンパク質と同一レベルの活性を有することができ、あるいはそれは増大したまたは減少した活性を有することができる。一実施形態では、機能的変異体タンパク質は、アミノ酸生合成経路の産物または中間体によるフィードバック阻害に対して少なくとも部分的にまたは全く耐性である。一実施形態では、変異体は野生型タンパク質と比較して２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３または２未満のアミノ酸変異を有する。一実施形態では、アミノ酸変異は保存的変異である。変異配列とは、変異体ポリペプチド（例えば機能的変異体ポリペプチド）に対応するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列である。
【０１６７】
基準の配列のアミノ酸に「対応する」アミノ酸は、基準の配列における部位に相同な部位を占める。対応するアミノ酸は、関連の配列の整列により同定することが可能である。アミノ酸配列は、当業者によく知られたＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣｌｕｓｔａｌＷのようなアルゴリズムを用いて公のデータベ−スで入手可能なタンパク質配列と比較することができる。
【０１６８】
本明細書では、「異種の」核酸またはタンパク質とは、アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸および関連代謝産物の生産に使用される宿主生物（種）以外の生物（種）に由来する核酸もしくはタンパク質、または核酸もしくはタンパク質の機能的変異体を含むことが意図されている。特定の実施形態において、宿主生物がコリネ型細菌である場合、異種遺伝子は大腸菌からは得られない。他の特定の実施形態において、宿主生物が大腸菌である場合、異種遺伝子はコリネ型細菌からは得られない。
【０１６９】
本明細書では、「遺伝子」は、コード配列、プロモーター配列、オペレーター配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、共転写配列（例えば、オペロン由来の配列）および特定のコード配列に関連するその他の制御配列を含む。
【０１７０】
本明細書では、「相同(homologous)」核酸またはタンパク質とは、アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸および関連代謝産物の生産に使用される宿主生物と同じ種である生物に由来する核酸もしくはタンパク質、または核酸もしくはタンパク質の機能的変異体を含むことが意図されている。
【０１７１】
「組換え核酸分子」は、自然状態では存在しない核酸分子である。例えば、大腸菌ポリペプチドを正確にコードする核酸分子は、それが、ポリペプチドをコードする遺伝子についての野生型位置以外の位置における大腸菌ゲノムに挿入された場合に組換えである。組換え核酸分子は、非野生型プロモーター、及びポリペプチドをコードする遺伝子の野生型位置いずれかにおける、またはいくつかの他の位置における細菌のゲノムに挿入された野生型ポリペプチドコーディング配列よりなる核酸分子も含む。
【０１７２】
当業者には周知のことであるが、野生型酵素の活性または機能をなくすことなく、該酵素の１つ以上のアミノ酸残基について、アミノ酸を別のアミノ酸で置換する特定の置換が許容可能である。本明細書では、「保存的置換」という用語は、タンパク質配列において、あるアミノ酸を同じ保存的置換グループの別のアミノ酸と交換することを指す。保存的アミノ酸置換は当技術分野で公知であり、通常、アミノ酸側鎖の置換基の相対的類似性、例えば疎水性、親水性、電荷、大きさなどを基にしている。１実施形態において、保存的置換とは、一般的に、次のグループ、すなわち、第１群：グリシン、アラニンおよびプロリン、第２群：バリン、イソロイシン、ロイシンおよびメチオニン、第３群：アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、第４群：セリン、スレオニンおよびシステイン、第５群：リシン、アルギニンおよびヒスチジン、第６群：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの群内での置換が挙げられる。各群には、タンパク質配列において、その特定の群内の他のアミノ酸のうちのいずれかと置換することが可能なアミノ酸が列挙されている。
【０１７３】
保存的置換のためのアミノ酸のグループ化を設定するためにはいくつかの基準が使用されている。例えば、タンパク質に対して相互作用的な生物学的機能を与える場合のアミノ酸の親水性・疎水性指標の重要性が、一般に当技術分野で知られている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２））。あるアミノ酸は、同等の親水性・疎水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸と置換することが可能であり、かつなおも同等の生物学的活性を保持しうることが知られている。また、アミノ酸の親水性も、保存的アミノ酸のグループ化の設定基準として使用される（米国特許第４，５５４，１０１参照）。
【０１７４】
あるアミノ酸と別のアミノ酸との置換に関する情報は、一般に当技術分野で公知である（例えば、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ：Ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０１９８５０４７４８；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｒａｎｄｅｎ，Ｃ．−Ｉ．，Ｔｏｏｚｅ，Ｊ．，Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ（Ｊａｎｕａｒｙ  １５，１９９９）；及びＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｄｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｄ．Ｍ．（Ｅｄｉｔｏｒ），Ａｕｇｕｓｔ  ２０００，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ：０８９６０３６３７５参照）。
【０１７５】
一部の実施形態において、異種配列および／または宿主株の遺伝子の核酸配列および／またはタンパク質配列を比較して、相同性を測定することが可能である。相同性の比較は、例えば、対応するアミノ酸を同定するために使用することが可能である。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適な整列のために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮しつつ、該２つの配列によって共有される同一部位の数に応じて変わる。配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の測定は、数学的アルゴリズムを使用して行うことができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２マトリックス及び１２のギャップ重み、４のギャップ延長ペナルティ、及び５のフレームシフトギャップペナルティのいずれかを用い、ＧＣＧソフトウエアパッケージ中のＧＡＰプログラムに取り込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（（１９７０）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）アルゴリズムのアルゴリズムを用いて決定することができる。
【０１７６】
通常、２つの核酸配列またはタンパク質配列の同一性（％）を測定するためには、最適の比較のために配列をアラインする（例えば、最適のアラインメントを実施するために、第１および第２の核酸配列またはアミノ酸配列のうち一方または両方にギャップを導入することが可能であり、また非相同配列を比較対象から除外することが可能である）。比較のためにアラインされるテスト配列の長さは、基準の配列の長さの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％であることが可能である。次に、対応するヌクレオチド部位またはアミノ酸部位のヌクレオチドまたはアミノ酸を比較する。第１の配列のある部位が、第２の配列の対応する位置と同一のヌクレオチドまたはアミノ酸であるならば、該分子はその部位について同一である（本明細書中で用いるように、「同一性」は「相同性」と同義である）。
【０１７７】
本明細書に記載のタンパク質配列を「検索配列」として使用して、例えば重複のない（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）配列データベースに対する検索を実施することが可能である。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＢＬＡＳＴＰ及びＴＢＬＡＳＴＮプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。タンパク質のＢＬＡＳＴ検索は、例えば、Ｂｌｏｓｕｍ６２行列、ワード長３、ギャップ存在コスト１１およびギャップ伸長ペナルティー１を使用して、ＢＬＡＳＴＰプログラムで実施することが可能である。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、米国生命工学情報センターを通して公的に利用可能であり、デフォルト・パラメータを使用することが可能である。また、本明細書に記載の配列を、特定のパラメータまたはデフォルト・パラメータを使用して、ＴＢＬＡＳＴＮ検索の検索配列として使用することも可能である。
【０１７８】
本明細書に記載の核酸配列を「検索配列」として使用して、例えば重複のない配列データベースに対する検索を実施することが可能である。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＢＬＡＳＴＮプログラムおよびＢＬＡＳＴＸプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することが可能である。ヌクレオチドのＢＬＡＳＴ検索は、核酸レベルでの同一性を評価するために、ＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて、スコア＝１００、ワード長＝１１として実施することが可能である。タンパク質のＢＬＡＳＴ検索は、タンパク質レベルでの同一性を評価するために、ＢＬＡＳＴＸプログラムを用いて、スコア＝５０、ワード長＝３として実施することが可能である。比較するためにギャップのあるアラインメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載のようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが利用可能である。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＸおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルト・パラメータを使用することが可能である。また、比較のためのヌクレオチド配列のアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメント・アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法により、これらアルゴリズムのコンピュータによる実施（米国ウィスコンシン州マディソンサイエンスドライブ５７５所在のＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）のウィスコンシン遺伝学ソフトウェアパッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ）、またはマニュアルでのアラインメントおよび目視検査（例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、１９９５年補足を参照）によって実施することが可能である。
【０１７９】
核酸配列は、ハイブリダイゼーション特性について解析することも可能である。本明細書では、「低ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、高ストリンジェンシーまたは非常に高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイゼーションする」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を説明している。ハイブリダイゼーション反応を実施するための指針は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、ニューヨーク所在のＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８９），６．３．１−６．３．６に記載されている。該参照文献には水性および非水性の方法が記載されており、いずれも使用することが可能である。本明細書に示す特定のハイブリダイゼーション条件は、１）低ストリンジェンシー条件として、約４５℃、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）でハイブリダイゼーションした後、５０℃以上、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回洗浄（洗浄温度は、低ストリンジェンシー条件については５５℃まで上げることができる）、２）中程度のストリンジェンシー条件として、約４５℃、６×ＳＳＣでハイブリダイゼーションした後、６０℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回または複数回洗浄、３）高ストリンジェンシー条件として、約４５℃、６×ＳＳＣでハイブリダイゼーションした後、６５℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１、２、３または４回以上の洗浄、非常に高いストリンジェンシー条件は、６５℃、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳでハイブリダイゼーションした後、６５℃、０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで１回または複数回洗浄、である。非常に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（少なくとも４回以上洗浄）が好ましい条件であり、特に明記しない限りこの条件を使用するべきである。
【０１８０】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細が、添付の図面および詳細な説明に記載されている。本発明のその他の特徴、目的および利点は、詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１８１】
詳細な説明
以下に、メチオニン及びメチオニン関連中間体化合物、ならびに他のアミノ酸及び代謝産物の発酵産生を改良するタンパク質をコードする核酸配列を保有する遺伝子改変された細菌について説明する。特に、メチオニン、Ｓ−アデノシル−メチオニン、ホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、ホモシステイ、ならびにシスタチオニン及び他の化合物の産生に関連する核酸分子、ポリペプチド、及び細菌について説明する。該核酸はこれらのアミノ酸、中間体、及び関連代謝産物の生合成を直接的に（例えば、中間体の酵素変換を介して）または間接的に（例えば、酵素発現の転写調節、アミノ酸搬出の調節、または代謝産物の取り込みの調節を介して）調節する代謝経路のタンパク質をコードする。タンパク質をコードする核酸配列は宿主生物以外の細菌種由来であることが可能であり、そのような配列及びタンパク質を宿主に対して異種という。他の核酸及びコードされたタンパク質は宿主生物と同一種由来であることが可能であり、そのような配列及びタンパク質は宿主に対して相同という。いくつかの状況では、宿主生物は、相同及び異種核酸配列の双方を含むように遺伝子操作される。動物飼料添加物で用いられるアミノ酸の産生方法を含めた、アミノ酸及び代謝産物を産生する方法のように、遺伝子改変された細菌を産生するための方法についても説明する。異種または相同ポリペプチドをコードする核酸配列の導入は、１以上のアミノ酸及び／または中間体の増大した収率に導くことができる。加えて、アミノ酸産生に関与するある種の細菌タンパク質の配列の組換えは、アミノ酸及び／または中間体の増大した収率に導くことができる。例えば、ポリペプチドについてのコーディング配列における突然変異は、ポリペプチドの減少したまたは増大した活性（例えば、減少したまたは増大した酵素活性）に導くことができる。組換えられたまたは組換えられていない（例えば、野生型の）細菌タンパク質の調節された（例えば、低下したまたは増大した）発現は、同様に、アミノ酸の産生を増大させることができる。本明細書中で説明する方法及び組成物は、アミノ酸及び関連代謝産物の産生を調節する細菌タンパク質（例えば、メチオニン、セリン、ホモセリン、システイン、シスタチオニン、葉酸、ビタミンＢ１２、ホモシステイン及び硫黄の代謝または搬出に関与するタンパク質）、及びこれらのタンパク質をコードする核酸分子に適応される。これらのタンパク質は、アミノ酸生合成経路の中間体の他の中間体、及び／または最終産物、酵素の発現及び／または機能を直接的に調節するタンパク質、及び生合成経路で利用される代謝産物の取込を調節するタンパク質への変換を触媒する酵素を含む。操作のための標的タンパク質は、抑制、減衰、またはフィードバック阻害のような種々のタイプの調節に従う酵素を含む。細菌種におけるアミノ酸生合成経路、これらの経路に関与するタンパク質、これらのタンパク質の配列へのリンク、及び本明細書中に記載された操作及び／または発現についてのタンパク質を同定するための他の関連源に関する情報は、Ｂｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８：２０３−２１０，１９９８に記載されている。商業的産生用のアミノ酸生合成の効率を操作するための戦略は、限定されるものではないが、（例えば、増大した遺伝子量、発現制御配列（の置換を含む） 組換え、または調節タンパク質の改変による）過剰発現、（例えば、遺伝子の破壊または置換、またはアンチセンス技術の使用による）過少発現、及び特異的遺伝子の条件付発現、ならびにタンパク質の活性を最適化するための遺伝子操作を含む。選択されたポリペプチドの過少発現または低下した活性は、選択されたポリペプチドをコードするｍＲＮＡの少ない産生（低下した転写）、ｍＲＮＡの産生が低下していない場合でさえのより少ないポリペプチドの産生（例えば、低下した翻訳）、または不活性なまたは活性が低いポリペプチドが産生されるようなポリペプチドをコードする配列の改変から生起することができる。
【０１８２】
阻害性刺激、例えば、生合成経路の最終産物及び中間体の存在によるフィードバック阻害に対するポリペプチドの感受性を低下させることが可能である。例えば、コリネ形態細菌またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉいずれかから由来するリシンの商業的産生で用いられる菌株は、典型的には、リシンによるフィードバック阻害に対して相対的非感受性を呈する。有用なコリネ型細菌株もまたスレオニンによる阻害に対して比較的耐性である。本明細書中に記載された新規な方法及び組成物の結果、増大したアミノ酸の産生がもたらされる。
【０１８３】
メチオニン生合成
アスパラギン酸の変換から出発するメチオニン及び他のアスパラギン酸ファミリーアミノ酸（及び中間体）の生合成を図１に模式的に示す。メチオニン生合成経路に関与する酵素の群を表１に示す。これらの酵素それぞれの過剰発現および／または脱制御により、メチオニンの産生を増大させることが可能である。生合成酵素の過剰発現は、例えば、目的の遺伝子のコピー数を増加させ、及び／または発現に最適のプロモーター、例えば、強力なまたは条件付のプロモーターに遺伝子を操作可能に連結することによって達成することができる。
【０１８４】
【表１】
2009501512.tif 000003
【０１８５】
メチオニン生合成の前駆体及び補因子
図１に示すように、メチオニン経路で用いられる前駆体及び補因子を生じる生化学的経路もまた、メチオニン産生のレベルを決定するのに重要である。前駆体経路には、例えば、セリン及びシステインの生合成（図２）、スルフェート同化（図３）、葉酸の生合成（図４）、及びビタミンＢ１２の取り込みが含まれる。
【０１８６】
セリン及びシステインの生合成
システインは、図１に示すように、シスタチオニンγ−シンターゼ（ＭｅｔＢ）によるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンのシスタチオニンへの変換における補因子である。Ｄ−３−ホスホグリセリン酸がシステインに変換される経路、及びそれらが触媒する反応において作用するタンパク質を表２に示す（図２参照）。
【０１８７】
【表２】
2009501512.tif 000004
【０１８８】
ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ
ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＳｅｒＡ）は３−ホスホグリセリン酸を、セリン生合成経路における前駆体である３−ホスホヒドロキシピルビン酸へ変換する。システインは、メチオニンに対する前駆体であるシスタチオニンに変換されることができる。従って、増大したＳｅｒＡの発現または活性はメチオニンまたはＳ−アデノシルＬ−メチオニンの産生を増加させることができる。加えて、ホスホヒドロキシピルビン酸は、セリンの前駆体であり、これはホモシステイをメチオニンに変換するのに必要とされるメチルテトラヒドロ葉酸を再生するのに必要とされる。従って、増大したＳｅｒＡの発現または活性はメチルテトラヒドロ葉酸を生じさせることによってメチオニンの産生を増加させることができる。
【０１８９】
ホスホセリントランスアミナーゼ
ホスホセリントランスアミナーゼ（ＳｅｒＣ）はホスホヒドロキシピルビン酸を、システイン生合成経路における前駆体である３−ホスホセリンに変換する。システインは、メチオニンへの前駆体であるシスタチオニンに変換されることができる。従って、増大したＳｅｒＣの発現または活性はメチオニンまたはＳ−アデノシルＬ−メチオニン産生を増大させることができる。加えて、ホスホヒドロキシピルビン酸はセリンの前駆体であり、これはホモシステインをメチオニンに変換するのに必要とされるメチルテトラヒドロ葉酸を再生するのに必要である。従って、増大したＳｅｒＣの発現または活性は、メチルテトラヒドロ葉酸を生じさせることによってメチオニンまたはＳ−アデノシルＬ−メチオニンの産生を増大させることができる。
【０１９０】
ホスホセリンホスファターゼ
ホスホセリンホスファターゼ（ＳｅｒＢ）はホスホセリンを、システイン生合成経路における前駆体であるアミノ酸セリンに変換する。システインは、メチオニンへの前駆体であるシスタチオニンに変換されることができる。従って、増大したＳｅｒＢの発現または活性はメチオニンまたはＳ−アデノシルＬ−メチオニンの産生を増大させることができる。加えて、ホスホヒドロキシピルビン酸はセリンの前駆体であり、これはホモシステインをメチオニンに変換するのに必要とされるメチルテトラヒドロ葉酸を再生するのに必要とされる。従って、増大したＳｅｒＢの発現または活性は、メチルテトラヒドロ葉酸を生じさせることによってメチオニンまたはＳ−アデノシルＬ−メチオニンの産生を増加させることができる。
【０１９１】
セリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ
セリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ＣｙｓＥ）はセリンの、システイン生合成経路における前駆体であるＯ−アセチルセリンへの変換を触媒する。システインは、メチオニンへの前駆体であるシスタチオニンに変換されることができる。従って、増大したＣｙｓＥの発現または活性はメチオニンまたはＳ−アデノシルＬ−メチオニンの産生を増加させることができる。
【０１９２】
システインシンターゼＡ及びシステインシンターゼＢ
システインシンターゼＡ（ＣｙｓＫ）及びシステインシンターゼＢ（ＣｙｓＭ）はＯ−アセチルセリンのシステインへの変換を触媒する。システインは、メチオニンへの前駆体であるシスタチオニンに変換することができる。従って、増大したＣｙｓＫ及び／またはＣｙｓＭの発現または活性はメチオニンまたはＳ−アデノシルＬ−メチオニンの産生を増加させることができる。
【０１９３】
スルフェートの同化
スルフェート（ＳＯ４）の同化は、Ｏ−アセチルホモセリンのホモシステインへの変換において酸化剤として作用するスルフィド（Ｓ２−）の産生で重要である（図１参照）。ＳＯ４の同化、及びスルフィドへの変換工程において機能するタンパク質を表３に示す（図３参照）。
【０１９４】
【表３】
2009501512.tif 000005
【０１９５】
スルフェートＡＢＣ輸送担体ＡＴＰ結合タンパク質（ＣｙｓＡ）、スルフェート輸送系パーミアーゼＷタンパク質（ＣｙｓＷ）、及びスルフェート・チオスルフェート輸送系パーミアーゼＴタンパク質（ＣｙｓＴ）は細胞外ＳＯ４の細胞への輸送で機能する。ＳＯ４はＳ２−への前駆体であり、これはＭｅｔＹによるＯ−アセチルホモセリンのホモシステインへの変換のための酸化剤として働く。ホモシステインの産生の増大は、メチオニンの増大した産生に導くことができる。従って、増大したＣｙｓＡ、ＣｙｓＷ、及び／またはＣｙｓＴの発現または活性はメチオニンまたはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの産生を増加させることができる。
【０１９６】
スルフェートアデニリルトランスフェラーゼサブユニット１及び２
スルフェートアデニリルトランスフェラーゼサブユニット１（ＣｙｓＮ）及びスルフェートアデニリルトランスフェラーゼサブユニット２（ＣｙｓＤ）はＳO４をアデニリルスルフェートに変換するが、これはＳ２−の産生における前駆体として働く。Ｓ２−はＭｅｔＹによるＯ−アセチルホモセリンのホモシステインへの変換のための酸化剤として働く。ホモシステインの産生の増加は、メチオニンの増大した産生に導くことができる。従って、増大したＣｙｓＮ及び／またはＣｙｓＤの発現または活性はメチオニンまたはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの産生を増加させることができる。
【０１９７】
アデニリルスルフェートキナーゼ
アデニリルスルフェートキナーゼ（ＣｙｓＣ）はアデニリルスルフェートをリン酸化して、それを３’−ホスホアデニリル−スルフェートに変換するが、これはＭｅｔＹによるＯ−アセチルホモセリンのホモシステインへの変換用の酸化剤として働くＳ２−の産生への前駆体として働く。従って、増大したＣｙｓＣの発現または活性はメチオニンまたはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの産生を増加させることができる。
【０１９８】
アデニリルスルフェートレダクターゼ（同化型）
アデニリルスルフェートレダクターゼ（ＣｙｓＨ）はアデニリルスルフェートの還元からＳＯ３２−を産生するのに働く。ＳＯ３２−はＳ２−形成についての前駆体として働き、Ｓ２−は、ＭｅｔＹによるＯ−アセチルホモセリンのホモシステインへの変換用の酸化剤として働く。従って、増大したＣｙｓＨの発現または活性はメチオニンまたはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの産生を増加させることができる。
【０１９９】
ホスホアデノシンホスホスルフェートレダクターゼ
ホスホアデノシンホスホスルフェートレダクターゼ（ＣｙｓＨ）の活性は、ＮＡＤＰＨによる３’−ホスホアデニリル−スルフェートの還元からＳＯ３２−を産生するように働く。ＳＯ３２−はＳ２−形成のための前駆体として働き、Ｓ２−は、ＭｅｔＹによるＯ−アセチルホモセリンのホモシステインへの変換のための酸化剤である。従って、増大したＣｙｓＨの発現または活性はメチオニンまたはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの産生を増加させることができる。
【０２００】
スルファイトレダクターゼ（αサブユニットまたはホモプロテインベータ成分、ＣｙｓＩ）及びスルファイトレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ）、フラボタンパク質βサブユニット、ＣｙｓＪ）
スルファイトレダクターゼＣｙｓＩ及びＣｙｓＪはＳＯ３２−をＳ２−に変換するが、これは、ＭｅｔＹによるＯ−アセチルホモセリンのホモシステインへの変異用の酸化剤として働く。従って、増大したＣｙｓＩ及び／またはＣｙｓＪの発現または活性はメチオニンまたはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの産生を増加させることができる。
【０２０１】
葉酸の生合成
腸内細菌では、葉酸生合成経路で産生される５−メチルテトラヒドロ葉酸は、ホモシステインへのメチル基ドナーとして働いて、それをメチオニンに変換する（図１参照）。表４は、葉酸生合成経路において機能するタンパク質を示す（図４参照）。
【０２０２】
【表４】
2009501512.tif 000006
【０２０３】
ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ
ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ（ＦｏｌＥ）はＧＴＰの、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）及びテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸（ＴＨＦＰＧ３）の生合成における前駆体であるジヒドロネオプテリントリホスフェートへの変換を触媒する。ＴＨＦ及びＴＨＦＰＧ３は、各々、ＭｅｔＨまたはＭｅｔＥによるホモシステインのメチオニンへの変換における必須補因子である。従って、増大したＦｏｌＥの発現または活性はメチオニンまたはＳ−アデノシルＬ−メチオニンの産生を増加させることができる。
【０２０４】
ホスファターゼ（ＰｈｏＡ、ＰｓｉＡ、ＰｓｉＦ）
ホスファターゼ（ＰｈｏＡ、ＰｓｉＡ、ＰｓｉＦ）はジヒドロネオプテリントリホスフェートを、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）及びテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸（ＴＨＦＰＧ３）の生合成における前駆体であるジヒドロネオプテリンへ変換する。ＴＨＦ及びＴＨＦＰＧ３は、各々、ＭｅｔＨまたはＭｅｔＥによるホモシステインのメチオニンへの変換における必須の補因子である。従って、増大したＰｈｏＡ、ＰｓｉＡ、及び／またはＰｓｉＦの発現または活性はメチオニンまたはＳ−アデノシルＬ−メチオニンの産生を増大させることができる。
【０２０５】
ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ
ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ（ＦｏｌＢ）はジヒドロネオプテリンの、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）及びテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸（ＴＨＦＰＧ３）の生合成における前駆体である６−ヒドロキシメチル−ジヒドロプテリンへの変換を触媒する。ＴＨＦ及びＴＨＦＰＧ３は、各々、ＭｅｔＨまたはＭｅｔＥによるホモシステインのメチオニンへの変換における必須の補因子である。従って、増大したＦｏｌＢの発現または活性はメチオニンまたはＳ−アデノシルＬ−メチオニンの産生を増加させることができる。
【０２０６】
７，８−ジヒドロ−６−ヒドロキシメチルプテリン−ピロホスホキナーゼ
７，８−ジヒドロ−６−ヒドロキシメチルプテリン−ピロホスホキナーゼ（ＦｏｌＫ）は、６−ヒドロキシメチル−ジヒドロプテリンの、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）及びテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸（ＴＨＦＰＧ３）の生合成における前駆体である６−ヒドロキシメチル−ジヒドロプテリンピロホスフェートへの変換を触媒する。ＴＨＦ及びＴＨＦＰＧ３は、各々、ＭｅｔＨまたはＭｅｔＥによるホモシステインのメチオニンへの変換における必須の補因子である。従って、増大したＦｏｌＫの発現または活性はメチオニンまたはＳ−アデノシルＬ−メチオニンの産生を増加させることができる。
【０２０７】
ジヒドロプテロエートシンターゼ
ジヒドロプテロエートシンターゼ（ＦｏｌＰ）は、６−ヒドロキシメチル−ジヒドロプテリンピロホスフェートを、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）及びテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸（ＴＨＦＰＧ３）の生合成における前駆体であるジヒドロプテロエートに変換する。ＴＨＦ及びＴＨＦＰＧ３は、各々、ＭｅｔＨまたはＭｅｔＥによるホモシステインのメチオニンへの変換における必須の補因子である。従って、増大したＦｏｌＰの発現または活性はメチオニンまたはＳ−アデノシルＬ−メチオニンの産生を増加させることができる。
【０２０８】
ジヒドロ葉酸シンターゼ
ジヒドロ葉酸シンターゼ（ＦｏｌＣ）はジヒドロプテロエートの、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）及びテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸（ＴＦＨＰＧ３）の生合成における前駆体であるジヒドロ葉酸への変換を触媒する。ＴＨＦ及びＴＦＨＰＧ３は、各々、ＭｅｔＨまたはＭｅｔＥによるホモシステインのメチオニンへの変換において必須の補因子である。従って、増大したＦｏｌＣの発現または活性はメチオニンまたはＳ−アデノシルＬ−メチオニンの産生を増加させることができる。
【０２０９】
ジヒドロ葉酸レダクターゼ
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＦｏｌＡ）はジヒドロ葉酸の、ＴＨＦＰＧ３への前駆体であるテトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）への変換を触媒する。ＴＨＦ及びＴＨＦＰＧ３は、各々、ＭｅｔＨまたはＭｅｔＥによるホモシステインのメチオニンへの変換における必須の補因子である。従って、増大したＦｏｌＡの発現または活性はメチオニンまたはＳ−アデノシルＬ−メチオニンの産生を増加させることができる。
【０２１０】
フォリルポリグルタメートシンテターゼ
フォリルポリグルタメートシンテターゼ（ＦｏｌＣ）は、（前記したように）ジヒドロ葉酸シンターゼでもあり、テトラヒドロ葉酸の、ＭｅｔＥによるホモシステインのメチオニンへの変換における必須の補因子であるテトラヒドロ葉酸のテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸（ＴＨＦＰＧ３）への変換を触媒する。従って、増大したＦｏｌＣの発現または活性はメチオニンまたはＳ−アデノシルＬ−メチオニンの産生を増加させることができる。
【０２１１】
Ｂ１２の取り込み及び代謝
ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）は、ホモシステインのメチオニンへの変換についてＭｅｔＨによって要求される補因子であるメチルコバラミンへの前駆体として働く。Ｂ１２取り込み経路におけるタンパク質は表５ａに示されたｂｔｕ遺伝子を含む。ＰｄｕＯは、ＭｅｔＨではなく、いくらかの他のビタミンＢ１２依存性酵素によって必要とされるアデノシルコバラミンを生じるアデノシルトランスフェラーゼ反応を触媒する。低下したＰｄｕＯのレベルまたは活性は細胞内メチルコバラミンのレベル、よって、過剰発現されたＭｅｔＨへのメチルコバラミンの利用性、よって、メチオニンの産生を増大することができる。ＢｔｕＣ、ＢｔｕＤ及びＢｔｕＦの１以上の増大した発現（例えば、ＢｔｕＣ、ＢｔｕＤ及びＢｔｕＦの増大した産生）はメチオニンの産生を増加させることができる。
【０２１２】
【表５】
2009501512.tif 000007
【０２１３】
ビタミンＢ１２の取り込み
ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）は、メチオニンを生じさせるためのホモシステインのＭｅｔＨ触媒メチル化における必須の補因子であるメチルコバラミンへの前駆体として働く。以下の酵素は、細菌環境からのビタミンＢ１２及び関連化合物の取り込みにおいて機能する。
ＡＢＣ型のビタミンＢ１２輸送担体、パーミアーゼ成分（ＢｔｕＣ）
ＡＢＣ型のビタミンＢ１２輸送担体、ＡＴＰａｓｅ成分（ＢｔｕＤ）
ＡＢＣ型のコバラミン／Ｆｅ３＋シデロフォア輸送系（ＢｔｕＦ）
ＢｔｕＣ、ＢｔｕＤ、及びＢｔｕＦは、Ｂ１２及び関連化合物の細胞内の移入において機能する。ビタミンＢ１２は、メチルコバラミンへの前駆体として働き、これはメチオニンを生じさせるためのホモシステインのＭｅｔＨ触媒メチル化における補因子である。従って、増大したＢｔｕＣ、ＢｔｕＤ、及び／またはＢｔｕＦの発現または活性はメチオニンまたはＳ−アデノシルＬ−メチオニンの産生を増加させることができる。
【０２１４】
コバラミンアデノシルトランスフェラーゼ
ＰｄｕＯは、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）からアデノシルコバラミンを生じさせるのに必要なアデノシルトランスフェラーゼ反応を触媒する。アデノシルコバラミンは、（メチルコバラミンを必要とする）ＭｅｔＨによってではなく、いくつかのビタミンＢ１２依存性酵素によって必要とされる。ＰｄｕＯの低下したレベルまたは活性は、その前駆体ビタミンＢ１２の増大した利用可能性のため、メチルコバラミンのレベルを増大させることができる。メチルコバラミンはホモシステインのメチオニンへのＭｅｔＨ触媒変換で必須であるので、増大したレベルのメチルコバラミンはメチオニンまたはＳ−アデノシルＬ−メチオニンの産生を増大することができる。
【０２１５】
グリシン切断系
メチルテトラヒドロ葉酸は、ＭｅｔＨまたはＭｅｔＥによって触媒されるホモシステインのメチオニンへの変換のためのメチル基を提供する。メチルテトラヒドロ葉酸の再生は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＧｌｙＡ）、テトラヒドロ葉酸及びセリンを必要とし、メチレンテトラヒドロ葉酸及びグリシンを与える。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの発酵ではグリシンはメチオニンとほぼ等モルのレベルで蓄積する。しかしながら、大腸菌及び多くの他の細菌（及び植物及び動物）において、グリシンは、マルチ酵素のグリシン切断系を介するメチルテトラヒドロ葉酸のさらなる再生のための基質として働くことができる。従って、グリシン切断系に必要とされる遺伝子の１以上を発現／過剰発現させるのは、メチルテトラヒドロ葉酸を再生させるための過剰なグリシンの使用を容易とすることができ、従って、メチオニンの産生を増大することができる。グリシン切断系におけるタンパク質は、表５ｂに示すタンパク質を含む。
【０２１６】
【表６】
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【０２１７】
グリシン切断（ＧＣＶ）系は、グリシンの可逆的酸化を触媒するマルチ酵素複合体であり、二酸化炭素、メチレンテトラヒドロ葉酸、アンモニア及び低下したピリジンヌクレオチドを生じる。この系はＰ−（ｇｃｖＰ）、Ｈ−（ｇｃｖＨ）、Ｔ−（ｇｃｖＴ）及びＬ−（ｌｐｄＡ）タンパク質から構成される。Ｈ−タンパク質は、グリシン由来のアミノメチル基のキャリアとして機能する、共有結合しているリポイル補因子を含む。ＧｃｖＨへのリポイル補因子の生成及び付着は、表５Ｂに示したＬｐｌＡまたはＬｉｐＡ及びＬｉｐＢいずれかによって促進される。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍはｇｃｖＰ、ｇｃｖＨ及びｇｃｖＴホモログを欠如するが、それは、リポイル補因子のＧｃｖＨへの再酸化、生成、付着において機能できるタンパク質のホモログを保有する。
【０２１８】
付加的なポリペプチド
前記したものと組み合わせて用いることができる付加的な生合性調節及び輸送ポリペプチドを以下に説明する。種々のポリペプチドをコードする核酸分子の組合せを含む遺伝子工学により作成された菌株は、１以上のアミノ酸または中間体の改良された産生を呈することができる。
【０２１９】
前記したように、メチオニン生合成で用いられる前駆体及び補因子についての経路は、メチオニン産生のレベルを決定するのに重要であり、従って、メチオニン経路の前駆体及び補因子の供給に影響するポリペプチドのいずれかの発現及び／または活性の増加は、メチオニン及び関連するアミノ酸及び代謝産物の産生増大へと導くことができる。
【０２２０】
メチオニン、他のアスパラギン酸ファミリーのアミノ酸及び代謝産物の産生を増大するのに用いることができる例示的なポリペプチド及びそれらの対応する配列番号を表６に掲げる。宿主株において発現させることができる配列は、表６に示した配列番号に対応するものに限定されない。従って、他の種からの同一活性を有するタンパク質（すなわち、ホモログ）は、表に示したポリペプチド及びそれらのホモログの変異体が用いることができるように用いることができる。
【０２２１】
【表７】
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【０２２２】
2009501512.tif 000010
【０２２３】
2009501512.tif 000011
【０２２４】
メチオニン生合成経路
以下に、メチオニン生合成経路における酵素及びそれらが触媒する工程を説明する（図１も参照）。これらの酵素の活性または発現の増加は、メチオニンの産生増大へと導くことができる。後述するように、この経路における酵素のいくつかは、突然変異によるフィードバック阻害の低下により、それらの活性が増加する。
【０２２５】
ホモセリンデヒドロゲナーゼ
ホモセリンデヒドロゲナーゼ（Ｈｏｍ）は、アスパラギン酸セミアルデヒドのホモセリンへの転換を触媒する。コリネ型細菌中では、Ｈｏｍはスレオニンによってフィードバック阻害され、メチオニンによって抑制される。この酵素はリシンブランチで競合するジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＤａｐＡ）反応よりも、アスパラギン酸セミアルデヒドに関する親和性が高いが、下流のスレオニン経路へのわずかな炭素の「流出」がＨｏｍ活性をさらに阻害する可能性があると考えられる。Ｈｏｍのフィードバック耐性変異体、ｈｏｍの過剰発現、および／またはｈｏｍ転写の脱制御転写、あるいはこれらの手法のいずれかの組合せによって、メチオニン、スレオニン、イソロイシン、またはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン産生を増大させることが可能である。Ｈｏｍ活性の低下によって、リシン産生が増大する可能性もある。大腸菌のｍｅｔＬ（アスパルトキナーゼＩＩ−ホモセリン・デヒドロゲナーゼＩＩ）およびｔｈｒＡ（アスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩ）によってコードされる酵素などの、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を有する二機能酵素を使用して、アミノ酸産生を増大させることも可能である。
【０２２６】
ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ
ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＡ）は、メチオニン生合成の最初に行われる工程で作用する（Ｐａｒｋ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ  ８：２８６−２９４，１９９８）。ＭｅｔＡ酵素は、ホモセリンからＯ−アセチル−ホモセリンへの転換を触媒する。ＭｅｔＡはメチオニン生合成経路の最終産物によって強く制御される。大腸菌では、おそらく２つの別個のアロステリック部位で、Ｓ−ＡＭとメチオニンの両方によるアロステリック制御が起こる。さらにＭｅｔＪおよびＳ−ＡＭは、ｍｅｔＡの転写抑制を引き起こす。コリネ型細菌では、ＭｅｔＡは、大腸菌と同様にメチオニンおよびＳ−ＡＭによってアロステリック阻害を受ける可能性がある。ＭｅｔＡ合成はメチオニン単独によって抑制され得る。さらに、初期の研究により、トリフルオロメチオニン耐性はｍｅｔＡと関係付けられている。Ｓ−ＡＭおよびメチオニンによる負の制御の低下は、メチオニンまたはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン産生を増大させ得る。ＭｅｔＡ活性の増大は、メチオニンおよびＳ−ＡＭなどのアスパラギン酸由来のアミノ酸の産生を増大させる可能性があり、一方ＭｅｔＡ活性の低下は、スレオニンおよびイソロイシンなどのアミノ酸の形成を促進する可能性がある。
【０２２７】
Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ
Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ（ＭｅｔＹ）は、Ｏ−アセチルホモセリンからホモシステインへの転換を触媒する。コリネ型細菌ではメチオニンによってＭｅｔＹが抑制されている可能性があり、０．５ｍＭのメチオニンの存在下では酵素活性は９９％低下する。この阻害はアロステリック制御と遺伝子発現の抑制の複合効果であると考えられる。さらに酵素活性は、メチオニン、ホモセリン、およびＯ−アセチルセリンによって阻害される。Ｓ−ＡＭもＭｅｔＹ活性を調節すると考えられる。脱制御型ＭｅｔＹは、メチオニンまたはＳ−ＡＭ産生を増大させることが可能である。
【０２２８】
ホモセリンキナーゼ
ホモセリンキナーゼは、ｈｏｍ−ｔｈｒＢオペロンの一部であるｔｈｒＢ遺伝子によってコードされる。ＴｈｒＢはホモセリンをリン酸化する。ホモセリンキナーゼのスレオニン阻害が幾つかの種で観察されている。幾つかの研究は、ホモセリンキナーゼによるホモセリンのリン酸化が、ある条件下でスレオニン生合成を制限する可能性を示唆している。ＴｈｒＢ活性の増大は、イソロイシンおよびスレオニンなどのアスパラギン酸由来のアミノ酸の産生を増大させる可能性があり、一方ＴｈｒＢ活性の低下は、リシンおよびメチオニンなど（これらに限定はされない）を含めたアミノ酸の形成を促進する可能性がある。
【０２２９】
メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ
メチオニンアデノシルトランスフェラーゼは、メチオニンをＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（Ｓ−ＡＭ）に転換する。メチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＫ）をダウンレギュレーションすることによって、Ｓ−ＡＭへの転換の阻害によりメチオニンの産生を増大させることが可能である。ｍｅｔＫの発現またはＭｅｔＫの活性を増大させることによって、Ｓ−ＡＭの産生を最大にすることが可能である。
【０２３０】
Ｏ−スクシニルホモセリン（チオ）−リアーゼ／Ｏ−アセチルホモセリン（チオ）−リアーゼ
Ｏ−スクシニルホモセリン（チオ）−リアーゼ（ＭｅｔＢ；シスタチオニンγ−シンターゼとしても知られる）は、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンからシスタチオニンへの転換を触媒する。ＭｅｔＢの発現または活性を増大させることによって、メチオニンまたはＳ−ＡＭの産生を増大させることが可能である。
【０２３１】
シスタチオニンβ−リアーゼ
シスタチオニンβ−リアーゼ（ＭｅｔＣ）は、シスタチオニンをホモシステインに転換することができる。ホモシステイン産生の増大は、メチオニンの産生を増大させ得る。したがって、ＭｅｔＣの発現または活性の増大は、メチオニンまたはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの産生を増大させ得る。
【０２３２】
５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステインメチルトランスフェラーゼ
５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＨ）は、ホモシステインのメチオニンへの転換を触媒する。この反応はコバラミン（ビタミンＢ１２）に依存する。ＭｅｔＨの発現または活性を増大させることによって、メチオニンまたはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの産生を増大させることが可能である。
【０２３３】
５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステインメチルトランスフェラーゼ
５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＥ）も、ホモシステインのメチオニンへの転換を触媒する。ＭｅｔＥの発現または活性を増大させることによって、メチオニンまたはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの産生を増大させることが可能である。
【０２３４】
５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ
５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭｅｔＦ）はメチレンテトラヒドロ葉酸からメチルテトラヒドロ葉酸（ホモシステインをメチル化してメチオニンとするための補助因子）への還元を触媒する。ＭｅｔＦの発現または活性を増大させることによって、メチオニンまたはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの産生を増大させることが可能である。
【０２３５】
Ｓ−メチルメチオニン：ホモシステインメチルトランスフェラーゼ
Ｓ−メチルメチオニン：ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（Ｍｍｕｍ）は、Ｓ−メチルメチオニンによるホモシステインのトランスメチル化を触媒して、メチオニンを生じる。Ｍｍｕｍの活性及び／または発現を増大させることによって、メチオニンまたはＳ−アデノシルＬ−メチオニンの生合成を増加させることができる。
【０２３６】
Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ
Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（ＳａｈＨ）は、ＳＡＭの媒介したメチル化反応の副産物であるＳ−アデノシルホモシステインの、メチオニンへの前駆体であるアデノシン及びホモシステインへの可逆的切断を触媒する。ＳａｈＨの活性及び／または発現を増大させることにより、メチオニンの産生を増加させることができる。ＳａｈＨの過剰発現させることにより、リシンのような他のアスパラギン酸由来のアミノ酸の蓄積へと導くことができる。
【０２３７】
部位特異的ＤＮＡメチラーゼ
部位特異的ＤＮＡメチラーゼ（ＣｇｌＭ）はメチル基をＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンからＤＮＡに移し、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインを与える。遺伝学的状況に応じて、部位特異的ＤＮＡメチラーゼの発現の増大または減少により、メチオニンまたはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの産生を増加させることができる。
【０２３８】
代謝前駆体の供給、及びアスパラギン酸由来のアミノ酸の生合成に必要とされる同等体の還元に関与するタンパク質
アスパルトキナーゼ及びアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ
アスパルトキナーゼ（アスパラギン酸キナーゼとも呼ばれる）は、アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸の生合成において最初に行われる工程を触媒する酵素である。アスパルトキナーゼのレベルおよび活性は、一般に、生合成経路の１つまたは複数の最終産物（細菌種に応じて、リシンまたはリシン＋スレオニン）によって、いずれもフィードバック阻害（アロステリック制御とも呼ばれる）および転写制御（抑制とも呼ばれる）を介して制御される。コリネ型細菌および大腸菌のアスパルトキナーゼの細菌ホモログを使用して、アミノ酸の産生を増大させることが可能である。コリネ型細菌および大腸菌のアスパルトキナーゼを異種生物中で発現させて、アミノ酸の産生を増大させることが可能である。コリネ型細菌では、アスパルトキナーゼはｌｙｓＣ遺伝子座によってコードされる。ｌｙｓＣ遺伝子座は重複する２つの遺伝子、ｌｙｓＣαおよびｌｙｓＣβを含む。ｌｙｓＣαおよびｌｙｓＣβは、それぞれアスパルトキナーゼの４７ｋＤおよび１８ｋＤのサブユニットをコードする。第３のオープンリーディングフレームはｌｙｓＣ遺伝子座と隣接しており、アスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）をコードする。ａｓｄ開始コドンはｌｙｓＣオープンリーディングフレームの終端から２４塩基対下流で始まり、ｌｙｓＣオペロンの一部分として発現される。
【０２３９】
アスパルトキナーゼタンパク質の一次配列およびｌｙｓＣ遺伝子座の構造は、放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）の幾つかの生物種にわたって保存されている。コリネ型細菌由来のタンパク質との関連の高いアスパルトキナーゼおよびアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼをいずれもコードする生物の例には、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）、及びＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａがある。幾つかの場合、これらの生物は、コリネ型細菌と同様に配置されたｌｙｓＣおよびａｓｄ遺伝子を含む。表７は、これらの放線菌由来のタンパク質の、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのアスパルトキナーゼおよびアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼタンパク質との同一性（％）を示す。
【０２４０】
【表８】
2009501512.tif 000012
【０２４１】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ及びＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのような供給源の菌株の単離体が利用可能である。
それぞれの供給源菌株から調製したゲノムＤＮＡから、ｌｙｓＣオペロンを増幅することが可能であり、得られたＰＣＲ産物を大腸菌／Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍシャトルベクター中に連結させることが可能である。次いで、供給源菌株由来のアスパルトキナーゼ酵素のホモログを宿主株中に導入し発現させることが可能である。
【０２４２】
コリネ型細菌では、リシンおよびスレオニンによって協調的に行われるアスパルトキナーゼのフィードバック阻害が存在する。対照的に、大腸菌には、リシン、スレオニンまたはメチオニンによって独立にアロステリック制御される３つの異なるアスパルトキナーゼが存在する。大腸菌のアスパルトキナーゼＩＩＩ（および他のイソ酵素）のホモログを、脱制御型アスパルトキナーゼタンパク質の他の供給源として使用することが可能である。コリネ型細菌中でこれらの酵素が発現することによって、経路制御の複雑性を低下させることが可能である。例えば、アスパルトキナーゼＩＩＩの遺伝子はリシンとスレオニンではなくリシンによってのみフィードバック阻害を受ける。したがって、アスパルトキナーゼＩＩＩ対立遺伝子のうちフィードバック耐性の対立遺伝子を発現させる利点には、（１）完全な脱制御の可能性の増大、および（２）ｈｏｍの「漏出（ｌｅａｋｙ）」突然変異体または栄養補給する必要があるスレオニン要求株を構築する必要性がなくなる可能性があること、が挙げられる。これらの特徴は、リシンによるフィードバック阻害の低減をもたらす可能性がある。
【０２４３】
アスパルトキナーゼＩＩＩのイソ酵素をコードする遺伝子は、前に記載した放線菌よりもコリネ型細菌と遠縁の細菌から単離することが可能である。例えば、Ｅ．ｃｈｙｓａｎｔｈｅｍｉおよびＳ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓの遺伝子産物は、大腸菌のｌｙｓＣタンパク質とそれぞれ７７％および６０％同一である（かつＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＬｙｓＣと２６％および３５％同一である）。非Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ細菌、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉおよびＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ由来の、アスパルトキナーゼＩＩＩまたはその機能的変異体をコードする遺伝子を増幅させて、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中で発現するための適切なシャトルベクターに連結させることが可能である。
【０２４４】
ジヒドロジピコリン酸シンターゼ
ｄａｐＡによってコードされるジヒドロジピコリン酸シンターゼは、炭素をスレオニン／メチオニン産生ではなくリシンへの生合成へと送る分岐点で作用する酵素である。ＤａｐＡはアスパラギン酸−β−セミアルデヒドを２，３−ジヒドロジピコリン酸に転換する。ＤａｐＡの過剰発現は、大腸菌およびコリネ型細菌のいずれにおいてもリシン産生を増大させることが示されている。大腸菌では、ＤａｐＡはリシンによってアロステリック制御されており、一方で既存の証拠から、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍでの制御は遺伝子発現のレベルで起こることが示唆されている。ジヒドロジピコリン酸シンターゼ・タンパク質は、放線菌においてＬｙｓＣタンパク質ほどは高くは保存されていない。
【０２４５】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのタンパク質または大腸菌のＤａｐＡタンパク質との相同性を有する、野生型および脱制御型ＤａｐＡタンパク質を発現させて、リシン産生を増大させることが可能である。ｄａｐＡ遺伝子の供給源となり得る候補生物を表８に示す。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓまたはＭ．ｌｅｐｒａｅ由来の公知の配列を使用して、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ由来の相同遺伝子を同定することが可能である。
【０２４６】
【表９】
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【０２４７】
リシンによる大腸菌ＤａｐＡのフィードバック阻害を軽減するアミノ酸置換が報告されている。このような置換の例を表５に列挙する。フィードバック阻害を軽減するために改変することが可能な残基の幾つかは、全てのＤａｐＡタンパク質候補において保存されている（例えばＬｅｕ８８、Ｈｉｓ１１８）。この配列保存性から、放線菌由来のタンパク質に同様の置換を行うことによりタンパク質の機能がさらに高まる可能性があることが示唆される。部位特異的突然変異誘発法を使用して、脱制御型ＤａｐＡ変異体を作出することが可能である。
【０２４８】
前述の方法を使用して、ＤａｐＡ単離物をリシン産生の増大について試験することが可能である。例えば、リシン要求性細菌の培養物を、リシンを含まない増殖培地上に播くことが可能であると思われる。部位特異的突然変異誘発法によって得た一群のｄａｐＡ突然変異体を、次いで（形質転換または接合によって）野生型のコリネ型菌株中に導入し、その後リシン要求株を播いた寒天プレート上に広げることが可能であると思われる。フィードバック耐性ｄａｐＡ突然変異体はリシンを過剰生産すると思われるが、過剰生産されたリシンが増殖培地中に排出され、予め寒天プレート上に播かれた栄養要求株の増殖要件を満たすことになると思われる。したがって、ｄａｐＡ突然変異を含むコロニー周辺で輪状に増殖したリシン要求株は、所望のフィードバック耐性突然変異体の存在を示すことになる。
【０２４９】
生合成中間体としてホモセリンを用いるアスパラギン酸由来のアミノ酸の産生を増大させるためには、ＤａｐＡ活性を減少させるのが有用であろう。ジアミノピメレートは、コリネ細菌のようないくつかの細菌における生存で必須である。従って、菌株構築は「漏出」ｄａｐＡ対立遺伝子の導入を必要とし、リシン生合成経路へのいずれかの過剰な炭素の流れを可能とすることなく成長を可能とする対立遺伝子を意味する。
【０２５０】
【表１０】
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【０２５１】
ピルビン酸カルボキシラーゼ及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
ピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｙｃ）およびホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｐｃ）は、リシン生合成の直接的供給源であるクエン酸サイクルの中間体であるオキサロ酢酸（ＯＡＡ）の合成を触媒する。これらの補充反応は、リシンを含めた幾つかのアミノ酸の収率の向上と関係しており、ＯＡＡ形成を最大にするために重要であることは明らかである。さらに、Ｐ４５８Ｓ置換を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの変異体Ｐｙｃタンパク質は、リシン産生の向上によって実証されたように、高い活性を有することが示されている。プロリン４５８は、放線菌Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（アミノ酸残基４４９）およびＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（アミノ酸残基４４８）由来のタンパク質を含めた、広範囲のピルビン酸カルボキシラーゼにおいて高度に保存されたアミノ酸部位である。これらのタンパク質における同様のアミノ酸置換によって、補充反応の活性が増大する可能性がある。第３の遺伝子、ＰＥＰカルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）は、（糖新生用の）ＯＡＡからのホスホエノールピルビン酸の形成を触媒する酵素を発現し、したがってｐｙｃおよびｐｐｃと機能的に競合する。ｐｙｃおよびｐｐｃの発現を増大させることによって、ＯＡＡ形成を最大にすることが可能である。ｐｃｋ活性の低減または除去によっても、ＯＡＡ形成を改善することが可能である。
【０２５２】
６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）
６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼは６−ホスホグルコネートのＤ−リブロース−５−ホスフェートの酸化及び脱カルボキシル化を触媒する。この反応はＮＡＤＰＨも生じ、これは、アスパラギン酸由来のアミノ酸の形成を含む種々の還元的生合成で必要である。ｇｎｄの発現またはＧｎｄの活性を増大させることにより、メチオニンのようなアスパラギン酸由来のアミノ酸の産生を改良することができる。
【０２５３】
フルクトース１，６ビスホファターゼ（ｆｂｐ）
フルクトース１，６ビスホファターゼは、Ｄ−フルクトース１，６−ビスホスフェート＋Ｈ２Ｏ→Ｄ−フルクトース６−ホスフェート＋ホスフェートの反応を触媒する加水分解酵素である。フルクトース１，６ビスホファターゼの活動は、ＮＡＤＰＨ産生の主な代謝経路であるペントースホスフェート経路を通るフラックスを増大させることができる。前記したように、ＮＡＤＰＨはアスパラギン酸由来のアミノ酸の形成といった種々の還元的生合成で必要である。ｆｂｐ過剰発現の結果、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるリシンの産生増大をもたらすと報告されている（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｂｉｏｌ．２００５  ７１：８５８７−９６）。従って、ｆｂｐの発現またはフルクトース１，６ビスホファターゼの活性を増大させることにより、メチオニンのようなアスパラギン酸由来のアミノ酸の産生を改良することができる。
【０２５４】
グルコース６ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｇ６ｐｄ）
グルコース６ホスフェートデヒドロゲナーゼはペントースホスフェート経路の一部として機能し、Ｄ−グルコース６−ホスフェート＋ＮＡＤＰ＋→Ｄ−グルコース−１，５−ラクトン６−ホスフェート＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋の反応を触媒する。従って、ｇ６ｐｄの発現またはグルコース６ホスフェートデヒドロゲナーゼの活性を増大させることにより、ＮＡＤＰＨレベルを増大させ、メチオニンのようなアスパラギン酸由来のアミノ酸の産生を改良することができる。
【０２５５】
グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ（ｐｇｉ）
グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼは解糖の間に機能し、Ｄ−グルコース−６−ホスフェートをＤ−フルクトース６−ホスフェートに変換する。従って、ｐｇｉ活性の低下または除去は、エムデン−マイヤーホフ経路（解糖）を介するグルコースの異化を阻害することになる。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるｐｇｉ欠失突然変異体は、代替グルコース異化経路（ペントースリン酸経路）を通じるフラックスの増大、ＮＡＤＰＨ産生の増大及びリシン産生の増大をもたらす（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０４，１８５−９７）。従って、ｐｇｉの発現またはグルコース−６−ホスフェートイソメラーゼの活性の低下または除去により、ＮＡＤＰＨのレベルを増大させ、メチオニンのようなアスパラギン酸由来のアミノ酸の産生を改良することができる。
【０２５６】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
ｇｄｈ遺伝子によってコードされる酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、α−ケトグルタル酸の還元的アミノ化を触媒してグルタミン酸を産生させる。コリネ型細菌において、この反応はＮＡＤＰＨを必要とする。いくつかの場合において、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの発現または活性を増大させることによって、リシン、スレオニン、イソロイシン、バリン、プロリン、またはトリプトファンの産生を増大させることが可能である。他の場合において、ＮＡＤＰＨ還元同等体の入手可能性の向上またはトリカルボン酸経路中間体の炭素ドレインの減少のいずれかのため、アスパラギン酸由来のアミノ酸の産生を増大させることができる。
【０２５７】
ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ
コリネ型細菌のｄｄｈ遺伝子によってコードされているジアミノピメレートデヒドロゲナーゼは、アンモニアおよびＬ−２−アミノ−６−オキソピメレートのＮＡＤＰＨ依存的還元を触媒して、メソ−２，６−ジアミノピメレート、すなわちリシン生合成の代替経路におけるＬ−リシンの直接の前駆体を形成する。ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼの過剰発現は、リシン産生を増大させる可能性がある。
【０２５８】
調節タンパク質
ＭｃｂＲ遺伝子産物
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｍｃｂＲ遺伝子産物は、ＴｅｔＲ−ファミリーの推定上の転写抑制因子として同定されており、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるメチオニン合成を誘導する代謝系の制御に関与する可能性がある（Ｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｔｈｃｈｎｏｌ．１０３（１）：５１−６５，２００３）。ｍｃｂＲ遺伝子産物は、ｍｅｔＹ、ｍｅｔＫ、ｃｙｓＫ、ｃｙｓｌ、ｈｏｍ、ｐｙｋ、ｓｓｕＤ、およびおそらく他の遺伝子の発現をも抑制する。ＭｃｂＲはＳ−アデノシルホモシステイン、Ｓ−ＡＭまたはメチオニンなどの小分子と協働して発現を抑制すると考えられる。今日までに、Ｓ−アデノシルホモシステイン、Ｓ−ＡＭまたはメチオニンのいずれかの結合を妨げるような特定のＭｃｂＲ対立遺伝子は同定されていない。ＭｃｂＲの発現を低下させること、および／またはＳ−アデノシルホモシステイン、Ｓ−ＡＭまたはメチオニンによるＭｃｂＲの制御を妨げることによって、アミノ酸産生を増大させることが可能である。
【０２５９】
ＭｃｂＲは、硫黄含有アミノ酸（例えばシステイン、メチオニン）の制御と関係がある。ＭｃｂＲの発現または活性の低下により、ホモセリンに由来する任意のアスパラギン酸ファミリーのアミノ酸（例えばホモセリン、Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン、Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン、シスタチオニン、Ｌ−ホモシステイン、Ｌ−メチオニン、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（Ｓ−ＡＭ）、Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリン、スレオニン、２−オキソブタン酸、（Ｓ）−２−アセト−２−ヒドロキシブタン酸、（Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−メチル−３−オキソペンタン酸、（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−３−メチルペンタン酸、（Ｒ）−２−オキソ−３−メチルペンタン酸、およびＬ−イソロイシン）の産生が増大する可能性もある。
【０２６０】
ＭｅｔＲ遺伝子産物
ＭｅｔＲ遺伝子産物は大腸菌におけるＭｅｔＥ及びＭｅｔＨ遺伝子の転写アクチベータである。ＭｅｔＲ遺伝子産物の発現の増大は、ＭｅｔＥ及びＭｅｔＨ遺伝子産物の発現を増大させることができて、メチオニンの生合成を増加させることができる。
【０２６１】
Ｎｃｇ１２６４０遺伝子産物
Ｎｃｇｌ２６４０遺伝子産物とグルタメート−システインリガーゼファミリー２との間には相同性がある。このファミリーの原型酵素はｄｅ  ｎｏｖｏグルタチオン生合成における最初の工程を触媒する。Ｍａｍｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５６８：２２８−３６）は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＮＣｇｌ２６４０のトランスポゾン挿入不活化が、増大したメチオニンの産生、及びシステインシンターゼ、ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドロラーゼ（ｍｅｔＹ）及びスルファイトレダクターゼのＬ−メチオニン抑制の救助に相関することを観察した。従って、Ｎｃｇｌ２６４０の発現またはＮｃｇｌ２６４遺伝子産物の活性を減少または除去することにより、メチオニンのようなアスパラギン酸由来のアミノ酸の産生を改良することができる。
【０２６２】
排出因子（ｅｆｆｌｕｘ）タンパク質
相当数の細菌遺伝子が膜輸送タンパク質をコードしている。これらの膜輸送タンパク質の１サブセットが、細胞からのアミノ酸の排出を仲介する。例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍは、スレオニン排出因子タンパク質を発現する。このタンパク質の活性の消失は、スレオニンの多量の細胞内蓄積をもたらす（Ｓｉｍｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３（１８）：５３１７−５３２４，２００１）。排出因子タンパク質の発現または活性を制御することによって、さまざまなアミノ酸の産生を増大させることが可能である。有用な排出因子タンパク質は、薬剤／代謝産物輸送担体ファミリーのタンパク質を含む。
【０２６３】
洗剤感受性レスキュアー
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのαサブユニットと関係があるタンパク質をコードする、洗剤感受性レスキュアー（ｄｔｓＲ１）は、界面活性剤耐性遺伝子である。ＤｔｓＲ１の発現または活性を増大させることによって、リシンの産生を増大させることが可能である。発現を増大させることによっても、他のアスパラギン酸由来のアミノ酸の産生を増大させることができる。
【０２６４】
リシンエクスポータータンパク質
リシンエクスポータータンパク質（ＬｙｓＥ）は、細胞からのリシンの流出を仲介する特異的なリシンの輸送体である。ｌｙｓＥ遺伝子に欠失があるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍでは、Ｌ−リシンが１Ｍを超える細胞内濃度に達する可能性がある（Ｅｒｄｍａｎｎ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：３１１５−３１２２，１９９３）。このエクスポータータンパク質の過剰発現または活性の増大は、リシン産生を増大させる可能性がある。ＬｙｓＥの活性の減少は、非リシン、アスパラギン酸由来のアミノ酸の産生を増大させることができる。
【０２６５】
ＹｊｅＨ
ｙｊｅＨはメチオニンの輸送に関与する大腸菌タンパク質をコードする。ＹｊｅＨの発現の増大は、メチオニンの産生を増大させることができる。ＹｊｅＨの発現の増大はメチオニン経路の中間体の産生を増大させることができる。
【０２６６】
ＢｒｎＦＥ
ＢｒｎＦＥはＢｒｎＦ（ＡｚｌＣ）及びＢｒｎＥ（ＡｚｌＤ）ポリペプチドよりなる群から選択される２成分搬出系である。ＢｒｎＦＥの過剰発現（すなわち、ＢｒｎＦ及びＢｒｎＥの過剰発現）は、イソロイシンのような分岐鎖アミノ酸の搬出を増大させることができる。ＢｒｎＦＥの増大した発現はメチオニン産生を増大させることもできる。
【０２６７】
ＭｅｔＤ
ＭｅｔＤはＡＢＣ型の輸送担体ファミリーの高親和性メチオニン取込系であり、ＭｅｔＮＰＱから構成される。ＭｅｔＮはＡＴＰ結合タンパク質であり、ＭｅｔＰはパーミアーゼタンパク質であり（ｍｅｔＩは機能的同等体であると見込まれる）、ＭｅｔＱは基質結合タンパク質である。ＭｅｔＤ取込系の発現を低下または不活性化させることにより、メチオニンの取込を低下させることができ、これはメチオニンの産生を増大させることができる。
【０２６８】
細菌宿主株
アミノ酸の生産に適した宿主の種類には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどの腸内細菌科の細菌、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の菌株がある。以下に列挙するのは、異種及び／または相同遺伝子の発現用の、及びアミノ酸及び関連する中間体及び代謝産物の産生用の宿主株として用いることができる種及び菌株の例である。
Escherichia coli W3110F- IN(rrnD-rrnE)1 λ-(大腸菌遺伝子ストックセンター)
Corynebacterium glutamicum ATCC(米国微生物系統保存機関)13032
Corynebacterium glutamicum ATCC 21526
Corynebacterium glutamicum ATCC 21543
Corynebacterium glutamicum ATCC 21608
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 21491
Corynebacterium acetoglutamicum NRRL B-11473
Corynebacterium acetoglutamicum NRRL B-11475
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium lactis
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
Brevibacterium lactofermentum NRRL B-11470
Brevibacterium lactofermentum NRRL B-11471
Brevibacterium lactofermentum ATCC 21799
Brevibacterium lactofermentum ATCC 31269
Brevibacterium flavum ATCC 14067
Brevibacterium flavum ATCC 21269
Brevibacterium flavum NRRL B-11472
Brevibacterium flavum NRRL B-11474
Brevibacterium flavum ATCC 21475
Brevibacterium bivaricatum ATCC 14020
遺伝子の供給源として用いられる細菌株
核酸配列を得るための適当な種及び菌株は、限定されるものではないが、以下に列挙したものを含む。
Amycolatopsis mediterranei
Bacillus halodurans
Bacillus sphaericus
Clostridium acetobutylicum
Corynebacterium diptheriae
Corynebacterium glutamicum
Escherichia coli
Erwinia chrysanthemi(例えば、ATCC 11663)
Erwinia Carotovora
Lactobacillus plantarum(例えば、ATCC 8014)
Mycobacterium avium
Mycobacterium bovis
Mycobacterium leprae
Mycobacterium smegmatis(例えば、ATCC 700084)
Mycobacterium tuberculosis(例えば、Mycobacterium tuberculosis H37Rv)
Nocardia farcinica
Shewanella oneidensis
Streptomyces coelicolor(例えば、Streptomyces coelicolor A3(2))
Thermobifida fusca(例えば、ATCC 27730)
細菌遺伝子の単離
宿主株中で発現させるための細菌遺伝子を、当分野で知られている方法によって単離することが可能である。例えば、組換え核酸の構築の方法については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，２００１）を参照。供給源の菌株由来のゲノムＤＮＡは、周知の方法を使用して調製することが可能であり（例えば、Ｓａｉｔｏ，  Ｈ．及びＭｉｕｒａ，Ｋ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．７２：６１９−６２９，１９６３参照）、ＰＣＲ法を使用してゲノムＤＮＡから遺伝子を増幅することが可能である（米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号、サイキら（Ｓａｉｋｉ、ｅｔ  ａｌ．）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：３５０〜１３５４、１９８５）。
【０２６９】
増幅反応用に使用されるＤＮＡプライマーは、目的の遺伝子の領域全体または部分領域を含む二本鎖ＤＮＡの両方の３’末端と相補的なプライマーである。遺伝子の部分領域のみが増幅される場合は、このようなＤＮＡ断片をプライマーとして使用して、染色体ＤＮＡライブラリーから領域全体を含むＤＮＡ断片のスクリーニングを行うことが必要である。遺伝子の領域全体が増幅される場合は、増幅された遺伝子を含むＤＮＡ断片を含んだＰＣＲ反応溶液をアガロース・ゲル電気泳動に供し、次いでＤＮＡ断片を抽出し、細菌系中での発現に適したベクターにクローニングする。
【０２７０】
ＰＣＲ用のＤＮＡプライマーは、例えば供給源の菌株中の既知配列に基づいて、適切に調製することが可能である（Ｒｉｃｈａｕｄ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２９７，１９８６）。例えば、目的の異種遺伝子をコードするヌクレオチド塩基を含む領域を増幅させることが可能であるプライマーを使用すればよい。プライマーの合成は、市販のＤＮＡ合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．製のＤＮＡ合成装置モデル３８０Ｂ）を使用することによって、ホスホアミダイト法（Ｔｅｔｒａｈｅｄ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９、１９８１を参照）などの通常の方法によって行うことが可能である。さらにＰＣＲ法は、市販のＰＣＲ装置およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、またはより高品質の他のポリメラーゼを使用することによって、供給業者によって指定された方法に従い行うことが可能である。
【０２７１】
変異型対立遺伝子の構築
アミノ酸産生を制御する多くの酵素は、生合成経路の中間体または最終産物によるアロステリックフィードバック阻害を受ける。フィードバック阻害に関与する残基の置換によって、これらの酵素の有用な変異体を作製することが可能である。
【０２７２】
標準的な部位特異的突然変異誘発技法を使用して、アロステリック制御に対する感受性が低下した変異体を構築することが可能である。ＰＣＲ増幅させた遺伝子（１または複数）を適切なシャトルベクターにクローニングした後、オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的突然変異誘発を使用して、特異的なアミノ酸置換をコードする改変型対立遺伝子を得る。野生型遺伝子または組換え型対立遺伝子を含むベクターを、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、または他の適切な宿主株に、対照ベクターと並行して形質転換することが可能である。得られた形質転換体を、例えばアミノ酸生産性、フィードバック阻害に対する耐性の向上、目的の酵素の活性、または最も興味深い変異対立遺伝子を同定するための当業者に知られている他の方法に関して、スクリーニングすることが可能である。アミノ酸生産性および／または酵素活性を測定するためのアッセイを使用してスクリーニング結果を確認し、有用な変異対立遺伝子を選択することが可能である。メチオニン及び関連代謝産物のレベルを定量するための、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびＨＰＬＣ−質量分析法（ＭＳ）アッセイなどの技法は当業者には周知である。
【０２７３】
突然変異誘発ＰＣＲなどの方法によって、コード配列内にランダムなアミノ酸置換を生じさせる方法を使用することが可能である（例えば、フィードバック阻害の低下をスクリーニングするため、あるいは変異をさらに導入して強化型の変異配列とするための変異体を産生させるため）。例えば、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（登録商標）ＰＣＲ突然変異誘発キット（ストラタジーン，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して、製造者の指示書に従ってＰＣＲ法を行い、中程度および高頻度の突然変異を得ることが可能である。他の方法も当分野では知られている。
【０２７４】
宿主株に内在する他の酵素の存在下において、酵素の評価を行うことが可能である。幾つかの場合、該生物に内在しない生合成タンパク質（例えばエピソームにより発現されるタンパク質）の機能性を詳細に評価するための試薬を使用することが有用であろう。フィードバック阻害に関する表現型アッセイまたは酵素アッセイを使用して、野生型および変異型の生合成酵素の機能を確認することが可能である。クローニングした遺伝子の機能は、宿主生物（例えば、宿主大腸菌またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の遺伝学的に解析されている突然変異体に対する補完性によって確認することが可能である。多くの大腸菌株が、大腸菌遺伝子ストックセンターから公的に入手可能であり、利用可能な菌株のリストがワールドワイドウェブサイトにある。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ突然変異体もまた記載されている。
【０２７５】
遺伝子の発現
当分野で知られている方法を使用して、宿主細菌株中で細菌遺伝子を発現させることが可能である。幾つかの場合、細菌遺伝子（例えば、異種遺伝子および／または変異体遺伝子）の過剰発現が、宿主株によるアミノ酸産生を増大させるであろう。遺伝子の過剰発現は、さまざまな方法によって達成することが可能である。例えば、多数の遺伝子コピーを発現させてもよいし、あるいは遺伝子（例えば、遺伝子の変異体対立遺伝子、または内在性遺伝子）上流のプロモーター、制御要素、および／またはリボソーム結合部位を、宿主株で最適に発現するように改変してもよい。さらに、宿主株が該宿主生物に固有な遺伝子のコピーを既に１つまたは複数有している場合でも、対応する遺伝子がさらに１コピー存在するだけで産生が増大する可能性がある。遺伝子を強力な構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えばｔｒｃ、ｌａｃ）と作動可能なように連結させ、最大のアミノ酸産生を容易にする条件下で誘導することも可能である。ｍＲＮＡの安定性を高めるための方法は当業者に知られており、これを使用してタンパク質が絶えず高レベルで発現されるのを確実にすることが可能である。例えば、Ｋｅａｓｌｉｎｇ，Ｊ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：４５２−４６０，１９９９を参照。培地および培養条件の最適化によって、遺伝子の発現を増大させることも可能である。
【０２７６】
細菌における遺伝子の発見を容易とする方法が報告されている。例えば、Ｇｕｅｒｒｅｒｏ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １３８（１−２）：３５−４１，１９９４；Ｅｉｋｍａｎｎｓ，Ｂ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０２（１）：９３−８，１９９１；Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ，Ａ．，及び  Ｐｕｈｌｅｒ，Ａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（１）８４−７，１９９１；Ｌａｂａｒｒｅ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５（４）：１００１−７，１９９３；Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １３４（１）:１５−２４，１９９３；Ｊｅｎｓｅｎ，Ｐ．Ｒ．及び  Ｈａｍｍｅｒ，Ｋ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．１５８（２−３）：１９１−５，１９９８；Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．６０（３）：５１２−３８，１９９６；Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４２８−４３１，１９８８；米国特許第５，９６５，９３１号；米国特許第４，６０１，８９３号；及び米国特許第５，１７５，１０８号参照。
【０２７７】
目的の遺伝子（例えば異種遺伝子または変異体遺伝子）は、適切なプロモーター、例えば該遺伝子本来のプロモーターまたは宿主株由来のプロモーター、ファージのプロモーター、充分に解析されている大腸菌プロモーターの１つ（例えばｔａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、ａｒａＢＡＤ、またはこれらの変異体など）などと作動可能なように連結されなければならない。他の適切なプロモーターも利用可能である。一実施形態では、異種遺伝子は、宿主株の内在性ホモログのレベルより少なくとも２倍、５倍、または１０倍高いレベルでの該異種遺伝子の発現を可能にするプロモーターと作動可能なように連結される。染色体へ組み込まれることによって遺伝子増幅の過程を助長するプラスミド・ベクターを使用することも可能である。例えば、Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：１２６−１３２，１９９４）参照。この方法では、宿主（通常は大腸菌）内では複製し得るがＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍでは複製し得ないプラスミド・ベクターに、完全長の遺伝子をクローニングする。これらのベクターには、例えばｐＳＵＰ３０１（Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１，７８４−７９，１９８３）、ｐＫｌ８ｍｏｂまたはｐＫｌ９ｍｏｂ（Ｓｃｈｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １４５：６９−７３，１９９４）、ＰＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ．，ＵＳＡ）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｓｈｕｍａｎ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９：３２６７８−８４，１９９４；米国特許第５，４８７，９９３号）、ｐＣＲ．ＲＴＭ．Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｈｏｌｌａｎｄ；Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２３４：５３４−５４１，１９９３）、ｐＥＭ１（Ｓｃｈｒｕｍｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：４５１０−４５１６，１９９１）またはｐＢＧＳ８（Ｓｐｒａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ４１：３３７−３４２，１９９６）がある。次いで、増幅させる遺伝子を含んだプラスミド・ベクターを、接合または形質転換によってＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの所望の菌株内に入れる。接合の方法は、例えばＳｃｈｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：７５６−７５９，１９９４）によって報告されている。形質転換の方法は、例えばＴｈｉｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：３５６−３６２，１９８８）、Ｄｕｎｉｃａｎ  及びＳｈｉｖｎａｎ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ７：１０６７−１０７０，１９８９）及びＴａｕｃｈ  ｅｔ  ａｏｌ．（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１２３：３４３−３４７，１９９４）によって報告されている。遺伝的交差事象による相同的組換えの後では、得られた菌株は、宿主ゲノム中に所望の遺伝子が組み込まれている。
【０２７８】
適切な発現プラスミドは、少なくとも１つの選択可能なマーカーも含み得る。選択可能なマーカーは、宿主細胞において抗生物質耐性を与えるヌクレオチド配列であってよい。これらの選択可能なマーカーには、アンピシリン、セファゾリン、アウグメンチン、セホキシチン、セフタジジム、セフチオファー、セファロチン、エンロフロキシン、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、チカルシリン、チルミコシン、またはクロラムフェニコール耐性遺伝子がある。他の選択可能なマーカーには、特定の宿主株中に存在する栄養要求性（例えばロイシン、アラニン、またはホモセリン要求性）を補完することが可能な遺伝子がある。
【０２７９】
１実施形態では、異種遺伝子を発現させるために複製型ベクターが使用される。例示的な複製型ベクターには、以下のもの、すなわちａ）選択可能なマーカー、例えば抗生物質マーカー、ｋａｎＲ（ｐＡＣＹＣ１８４由来）など；ｂ）大腸菌の複製起点、Ｐ１５ａ  ｏｒｉ（ｐＡＣＹＣ１８４由来）など；ｃ）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの複製起点、ｐＢＬ１中で見られる複製起点など；ｄ）プロモーター・セグメント、付随する抑制遺伝子を含んでも含まなくてもよい；およびｅ）ターミネーター・セグメントが含まれうる。プロモーター・セグメントはｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｃＲＢＳ、ｔａｃ、またはλＰＬ／λＰＲ（大腸菌由来）、またはｐｈｏＡ、ｇｐｄ、ｒｐｌＭ、ｒｐｓＪ（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来）であってよい。抑制遺伝子は、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｃＲＢＳ、ｔａｃ及びλＰＬ／λＰＲについてそれぞれｌａｃＩまたはｃＩ８５７であってよい。ターミネーター・セグメントは大腸菌のｒｒｎＢ（ｐｔｒｃ９９ａ由来）、Ｔ７ターミネーター（ｐＥＴ２６由来）、またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のターミネーター・セグメントであってよい。
【０２８０】
他の実施形態では、異種遺伝子を発現させるために組込み型ベクター（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｖｅｃｔｏｒ）が使用される。例示的な組込み型ベクターは：選択可能なマーカー、例えば抗生物質マーカー、ｋａｎＲ（ｐＡＣＹＣ１８４由来）など；ｂ）大腸菌の複製起点、Ｐ１５ａ  ｏｒｉ（ｐＡＣＹＣ１８４由来）など；ｃ）およびｄ）置換されるセグメント（ｐｃｋまたはｈｏｍ遺伝子など）に隣接するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノムの２つのセグメント；ｅ）Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓａｃＢ遺伝子；ｆ）異種遺伝子の発現を調節するためのプロモーター・セグメント、付随する抑制遺伝子を含んでも含まなくてもよい；およびｇ）ターミネーター・セグメントを含むことが可能である。プロモーター・セグメントはｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｃＲＢＳ、ｔａｃ、またはλＰＬ／λＰＲ（大腸菌由来）、またはｐｈｏＡ、ｇｐｄ、ｒｐｌＭ、ｒｐｓＪ（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃ
ｕｍ由来）であってよい。抑制遺伝子は、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｃＲＢＳ、ｔａｃに対してはｌａｃＩ、λＰＬ／λＰＲに対してはｃＩであってよい。ターミネーター・セグメントは大腸菌のｒｒｎＢ（ｐｔｒｃ９９ａ由来）、Ｔ７ターミネーター（ｐＥＴ２６由来）、またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のターミネーター・セグメントであってよい。考えられる組込み型または複製型のプラスミド、またはこれらのプラスミドを構築するために使用される試薬は、本明細書に記載するものだけには限られない。他のプラスミドは当業者によく知られている。
【０２８１】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のターミネーター・セグメントを使用するために、該ターミネーター配列および隣接する配列を１つの遺伝子セグメントによって供給することが可能である。この場合、前述の要素はプラスミド上で以下の順序、すなわちマーカー；複製起点；置換すべきセグメントに隣接するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノムのセグメント；プロモーター；Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのターミネーター；ｓａｃＢ遺伝子として配置されるであろう。ｓａｃＢ遺伝子は、複製起点とＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの隣接セグメントとの間に位置してもよい。組込みおよび切り出しによって、プロモーター、ターミネーター、および目的の遺伝子のみが挿入される。
【０２８２】
前述のプラスミド要素の間の幾つかの可能な位置のうち１つにマルチクローニング部位を配置して、目的の特定の遺伝子（例えばｌｙｓＣなど）のプラスミド中への挿入を容易にすることが可能である。複製型および組込み型ベクターのいずれについても、ＲＰ４ｍｏｂなどの接合移入の起点を加えることによって、大腸菌とＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍとの間の遺伝子の移動を容易にすることが可能である。
【０２８３】
一実施形態では、エピソーム性プラスミドを用いて宿主株中で細菌遺伝子を発現させる。適切なプラスミドには、コリネ型細菌などの選択された宿主株中で複製するプラスミドがある。例えば、ｐＺ１（Ｍｅｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：５４９−５５４，１９８９）、ｐＥＫＥｘ１（Ｅｉｋｍａｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０２：９３−９８，１９９１）またはｐＨＳ２−１（Ｓｏｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０７：６９−７４，１９９１）のような多くの既知のプラスミドベクターは、潜在性（ｃｒｙｐｔｉｃ）プラスミドｐＨＭ１５１９、ｐＢＬ１またはｐＧＡ１を基とするものである。使用可能な他のプラスミド・ベクターには、ｐＣＧ４（米国特許第４，４８９，１６０号）、またはｐＮＧ２（Ｓｅｒｗｏｌｄ−Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．６６：１１９−１２４，１９９０）、またはｐＡＧ１（米国特許第５，１５８，８９１号）に基づくベクターがある。別例として、１つまたは複数の遺伝子を、形質導入、トランスポゾン（Ｂｅｒｇ，Ｄ．Ｅ．及びＢｅｒｇ，Ｃ．Ｍ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１：４１７，１９８３）、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５号）あるいは相同的組換えまたは非相同的組換え（「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．、１９７２）を使用する方法によって宿主微生物の染色体中に組み込むことが可能である。
【０２８４】
さらに、１又はそれ以上の遺伝子を使用するか、あるいは遺伝子を他の生合成経路の遺伝子と組み合わせて使用して、特定の生合成経路、解糖、補充、またはアミノ酸輸送の１つまたは複数の酵素を増強することが、アミノ酸の生産に有利である可能性がある。
【０２８５】
特定の遺伝子産物の発現を同時に弱化させて特定のアミノ酸の産生を最大にすることも有利である可能性がある。例えば、ｍｅｔＫの発現またはＭｅｔＫの活性を弱めることで、メチオニンからＳ−ＡＭへの転換を妨げることによってメチオニン産生を増大させる可能性がある。
【０２８６】
核酸を宿主細胞に導入する方法は当該分野で公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，及びＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１参照。適当な方法は塩化カルシウム（Ｍａｎｂｅｌ，Ｍ．及びＨｉｇａ，Ａ．Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．５３：１５９，１９７０）及びエレクトロポレーション（Ｒｅｓｔ，Ｍ．Ｅ．ｖａｎ  ｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５２：５４１−５４５，１９９９）、または接合を用いる形質転換を含む。
【０２８７】
細菌の培養
目的の遺伝子（例えば、異種遺伝子、フィードバック阻害が低減された酵素をコードする変異体遺伝子）を含む細菌を、連続培養してもよいし、あるいはバッチ発酵工程（バッチ培養）によって培養してもよい。当業者に知られている他の工業的に使用されている変形工程には、供給バッチ（供給工程）または反復供給バッチ工程（反復供給工程）がある。周知の培養法の概要は、Ｃｈｍｉｅｌのテキストブック（Ｂｉｏｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ  １．Ｅｉｎｆｕｈｒｕｎｇ  ｉｎ  ｄｉｅ  Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ（Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９９１））またはＳｔｏｒｈａｓのテキストブック（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ  ｕｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ  Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ（Ｖｉｅｖｅｇ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，１９９４））に記載されている。
【０２８８】
使用する培養培地は、特定の宿主株の要件を満たすものである。さまざまな微生物に適した培養培地についての一般的説明は、米国細菌学協会の書籍「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（米国ワシントン市、１９８１）に見出すことが可能であるが、培養培地の組成は、生成物の形成を最大にするために単純な増殖要件以外にも変更が加えられることが多いことは、当業者であれば理解しているであろう
例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、澱粉及びセルロースのような糖及び炭水化物；例えば、大豆油、ヒマワリ油、アメリカホドイモ油及びヤシ油のような油脂；例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノレン酸のような脂肪酸；例えば、グリセロール及びエタノールのようなアルコール；及び例えば、酢酸のような有機酸を炭素の供給源として個別に、あるいは混合物として使用することが可能である。
【０２８９】
ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリッカー、大豆タンパク質加水分解物、大豆粉及び尿素のような有機窒素含有化合物または硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機化合物を、窒素の供給源として使用することが可能である。窒素の供給源は個別に、あるいは混合物として使用することが可能である。
【０２９０】
リン酸、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩を、リン供給源として使用することが可能である。
例えば、スルフェート、チオスルフェート、スルファイトのような有機及び無機硫黄含有化合物、Ｈ２Ｓ、スルフィド、スルフィドの誘導体、メチルメルカプタン、チオグリコライト、チオシアネート、及びチオ尿素のような還元された源を、硫黄含有アミノ酸の調製用の硫黄供給源として使用することが可能である。
【０２９１】
培養培地は、増殖に必要な金属塩、例えば硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄を含むことも可能である。アミノ酸およびビタミン（例えばコバラミン）などの必須の増殖物質を、前述の物質に加えて使用することが可能である。さらに適切な前駆物質を培養培地に加えてもよい。言及した出発物質は１つのバッチとして培養物に加えてもよいし、あるいは培養中に複数回供給されてもよい。
【０２９２】
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カルシウム、アンモニアまたはアンモニア水のような塩基性化合物、またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切に使用してｐＨを調節することができる。例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して、泡の発生を制御することができる。例えば、抗生物質のような選択的活性を有する適当な物質を培地に加えて、プラスミドの安定性を維持することができる。好気性条件を維持するために、酸素、または例えば、空気のような酸素含有ガス混合物を培養地に導入する。培養温度は、典型的には２０乃至４５℃、好ましくは２５乃至４０℃である。培養は、最大の所望の産物が形成されるまで通常は、１０時間乃至１６０時間内継続させる。
【０２９３】
このようにして得た発酵ブロスは、乾燥重量で２．５〜２５重量％の目的のアミノ酸を含み得る。生産用微生物の増殖および代謝が、発酵サイクルのある時期、好ましくは発酵期間の少なくとも３０％の間の炭水化物添加速度によって制限されるように発酵が行われると好都合である可能性もある。例えば、発酵培地中で使用可能な糖の濃度を、この期間中は≦３ｇ／ｌに維持する。
【０２９４】
次いで発酵ブロスをさらに処理することが可能である。バイオマス全部または一部分を、任意の固体−液体分離法、例えば遠心分離、濾過、デカント、またはこれらの組合せなどによって発酵ブロスから取り出してもよいし、あるいはバイオマスが完全にブロス中に含まれたままでもよい。次いで、周知の方法によって、例えば多重効用蒸発器、薄膜蒸発器、流下液膜式蒸発器によって、あるいは逆浸透によって、ブロスから水を除去する。濃縮された発酵ブロスを、次いで凍結乾燥、スプレー乾燥、流動床乾燥などの方法によって、あるいは他の方法によって後処理して、好ましくは自由流動性の微粉末を得ることが可能である。
【０２９５】
この自由流動性の微粉末は、次いで適切な圧縮処理または造粒処理によって、粗粒子状で、容易に自由流動する、保存可能かつほとんど無塵の産物へと転換可能である。造粒または圧縮においては、従来の有機または無機の補助物質または担体、例えばデンプン、ゼラチン、セルロース誘導体、または類似の物質（食品加工において結合剤、ゲル化剤または増粘剤として従来使用されている物質など）、あるいは他の物質、例えばシリカ、ケイ酸（塩）またはステアリン酸（塩）などを使用することが有利である可能性がある。
【０２９６】
しかしながら、別例として、食品加工において周知の従来の有機または無機担体物質、例えば、シリカ、シリケート、小砂、ふすま、ミール、澱粉、糖その他に産物を吸着させ、及び／または慣用的な増粘剤またはバインダーと混合し、安定化することができる。
【０２９７】
最後に、ＤＥ−Ｃ−４１００９２０に記載されているように、産物を、例えば、金属炭酸塩、シリカ、シリケート、アルギネート、ステアレート、澱粉、ガム及びセルロースエーテルのようなフィルム形成剤を用いるコーティングプロセスによって、動物の胃、特に反芻動物の胃による消化に対してそれが安定である状態とすることができる。
【０２９８】
バイオマスが処理中に分離除去される場合、他の無機固体、例えば発酵中に添加される固体は一般に除去される。
本発明の１態様では、バイオマスは７０％まで、好ましくは８０％まで、好ましくは９０％まで、好ましくは９５％まで、および特に好ましくは１００％までの程度まで分離除去することが可能である。本発明の他の態様では、バイオマスの２０％まで、好ましくは１５％まで、好ましくは１０％まで、好ましくは５％までのバイオマスを分離除去し、バイオマスを分離除去しないことが特に好ましい。
【０２９９】
発酵ブロスの溶液中に形成または添加され、該溶液中に存在する有機物質を、適切な処理によって保持または分離することが可能である。これらの有機物質は、所望のアミノ酸または代謝産物に加えて所望により生じ、発酵で使用される微生物によって所望により放出される有機副産物を含む。これらはＬ−リシン、Ｌ−バリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、またはＬ−トリプトファンよりなる群から選択されるＬ−アミノ酸を含む。それらはビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）、ニコチン酸／ニコチンアミド及びビタミンＥ（トコフェロール）よりなる群から選択されるビタミンを含む。それらはまた、酢酸、乳酸、クエン酸、マレイン酸またはフマル酸のような１乃至３のカルボキシル基を担う有機酸を含む。最後に、それらは糖、例えば、トリハロースも含む。これらの化合物は、もしそれらが産物の栄養価を改良すれば所望により望まれる。
【０３００】
Ｌ−及び／またはＤ−アミノ酸及び／またはラセミ混合物Ｄ，Ｌ−アミノ酸を含むこれらの有機物質は、要件に応じて加えることもできる。というのは、固体または液体中の濃縮物または純粋な物質が適当なプロセス工程の間に形成されるからである。前記したこれらの有機物質は、個々に、または混合物として、得られたまたは濃縮された発酵ブロスに加えることができ、また乾燥または造粒プロセスの間に加えることができる。同様に、有機物質またはいくつかの有機物質の混合物を発酵ブロスに加え、さらなる有機物質またはいくつかの有機物質の混合物を後のプロセス工程、例えば、造粒の間に加えることが可能である。前記した産物は飼料添加物すなわち、動物の栄養のための飼料添加物として用いることができる。試料添加物として用いるためのアミノ酸を調製する方法については、例えば、その内容をここに引用して援用するＷＯ０２／１８６１３参照。
【０３０１】
変異ポリペプチド
後により詳細に説明するように、変異ポリペプチド、例えば、フィードバック阻害を低下あるいは除去させ、１以上のアミノ酸改変を有するポリペプチドはアミノ酸及び他の代謝産物の産生に有用である。変異ポリペプチドの例を以下に説明する。
【０３０２】
６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ（ｇｎｄ）
６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼは６−ホスホグルコネートのＤ−リブロース−５−ホスフェートへの酸化及び脱カルボキシル化を触媒する。この反応は、アスパラギン酸由来のアミノ酸の形成を含む種々の還元的生合成で必要な、ＮＡＤＰＨを再生させる。ＧｎｄはＡＴＰのような細胞内代謝産物によってアロステリック的に阻害されることによってフィードバック阻害される。フィードバックを減少させるのに有効なＧｎｄ点突然変異の例を表１０において多数の細菌種について示す。
【０３０３】
【表１１】
2009501512.tif 000015
【０３０４】
ホモセリンデヒドロゲナーゼ（Ｈｏｍ）
標的化されたアミノ酸置換は、Ｈｏｍ活性を除去せずに減少させるか、あるいはスレオニンによるフィードバック阻害からＨｏｍを軽減するために生成されることができる。Ｈｏｍ活性の減少をもたらす突然変異は「漏出」Ｈｏｍ突然変異と呼ぶ。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍホモセリンデヒドロゲナーゼにおいて、Ｈｏｍ活性を増大しまたは減少させるように突然変異されることのできるアミノ酸残基が同定されている。これらの特異的なアミノ酸のいくつかは他のＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓにおいてＨｏｍタンパク質でよく保存されている（表１１参照）。
【０３０５】
【表１２】
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【０３０６】
ｈｏｍ  ｄｒ遺伝子のカルボキシル末端におけるこの単一塩基欠失は、酵素のカルボキシル末端のタンパク質配列を根本的に改変し、スレオニンと結合部位との相互作用が妨げられるようにその立体配座を変化させる。
【０３０７】
アスパルトキナーゼ（ｌｙｓＣ）
リシン類似体（例えば、Ｓ−（２−アミノエチル）システイン（ＡＥＣ））または高濃度のリシン（及び／またはスレオニン）を用いて、リシンの産生の向上を伴う菌株を同定することができる。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ及び大腸菌双方からの公知のリシン耐性菌株のかなりの部分はｌｙｓＣ遺伝子座において突然変異を含む。重要なことには、ＡＥＣに増大した耐性を付与する特異的アミノ酸置換が同定されており、これらの置換はよく保存された残基にマッピングされる。少なくとも野生型菌株における増大したリシンの生産性をもたらす特異的アミノ酸置換は、限定されるものではないが、表１２に列挙したものを含む。多くの場合において、いくつかの有用な置換が特定の残基において同定されている。さらに、種々の例において、１を超えるｌｙｓＣ突然変異を含む菌株が同定されている。配列整列により、フィードバック耐性（すなわち、ＡＥＣ耐性）に従前関連付けられていた残基は、距離を置いて関連する細菌からの種々のアスパルトキナーゼタンパク質で保存されていることが確認される。
【０３０８】
【表１３】
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【０３０９】
標準的な部位特異的突然変異誘発技法を使用して、アロステリック制御を受けないアスパルトキナーゼ変異体を構築することが可能である。ＰＣＲで増幅したｌｙｓＣまたはアスパルトキナーゼＩＩＩ遺伝子を適切なシャトルベクターにクローニングした後、オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的突然変異誘発を使用して、置換体をコードする改変型対立遺伝子を得る。野生型遺伝子または改変型対立遺伝子のいずれかを含むベクターで、対照ベクターと並行してＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを形質転換することが可能である。得られた形質転換体を、例えばリシン生産性、ＡＥＣへの耐性向上、リシン要求株との相対的な栄養共生、または最も興味深い突然変異対立遺伝子を同定するための当業者に知られているその他の方法に関してスクリーニングすることが可能である。リシン生産性および／または酵素活性を測定するためのアッセイを使用してスクリーニング結果を確認し、有用な突然変異対立遺伝子を選択することが可能である。アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸および関連代謝産物のレベルを定量するための、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびＨＰＬＣ−質量分析法（ＭＳ）などのアッセイ技法は当業者に周知である。
【０３１０】
突然変異誘発ＰＣＲなどの方法によって、ｌｙｓＣコード配列内にランダムにアミノ酸置換を導入するための方法を使用することが可能である。これらの方法は当業者にはよく知られており、例えばＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（Ｒ）ＰＣＲ突然変異誘発キット（ストラタジーン、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して製造者の教示書に従いＰＣＲ法を行って、中程度および高頻度の突然変異を得ることが可能である。
【０３１１】
異種酵素の評価は、宿主株に対して内因性であるタンパク質の存在下で行うことができる。幾つかの場合、異種の生合成タンパク質の機能性を詳細に評価するための試薬を用いることが有用であろう。ＡＥＣ耐性に関する表現型アッセイまたは酵素アッセイを使用して、異種アスパルトキナーゼの野生型および改変型変異体の機能を確認することが可能である。クローニングした異種遺伝子の機能は、大腸菌またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの遺伝学的に解析されている突然変異体に対する補完性によって確認することが可能である。多くの大腸菌株が大腸菌遺伝子ストックセンターから公に入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｃｇｓｃ．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／ｔｏｐ．ｈｔｍｌ）。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ突然変異体もまた記載されている。
【０３１２】
メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ
標的のアミノ酸置換を、ＭｅｔＫの活性を除去せずに減少させることができるように生成することができる。減少したＭｅｔＫ活性をもたらす突然変異を「漏出」ＭｅｔＫ突然変異という。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ及び大腸菌  ＭｅｔＫポリペプチドにおいて、突然変異させて、ＭｅｔＫ活性を減少させることができるアミノ酸残基が同定されている。これらの特異的アミノ酸は、他のＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ及びＥ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉにおけるＭｅｔＫタンパク質でよく保存されている（表１３参照）。
【０３１３】
【表１４】
2009501512.tif 000018
【０３１４】
本明細書中に記載されたポリペプチドを発現するためのベクターを構築する方法ならびに変異ポリペプチドを構築する方法を以下に説明する。
【実施例１】
【０３１５】
アスパラギン酸由来のアミノ酸の産生を増大するための遺伝子発現用ベクターの構築
アスパラギン酸由来のアミノ酸の産生と関係がある遺伝子を発現させるための、プラスミドを作製した。多くの標的遺伝子を図１に示す。これらのプラスミドは、自律的に複製するものでも宿主Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの染色体中に組み込まれるものでもよいが、該プラスミドを報告されているようにエレクトロポレーションによってコリネバクテリウムの菌株中に導入した（Ｆｏｌｌｅｔｔｉｅ，Ｍ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６７：６９５−７０２，１９９３参照）。全てのプラスミドは、抗生物質カナマイシンに対する耐性を与えるｋａｎＲ遺伝子を含む。形質転換体を、カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を含む培地上で選択した。
【０３１６】
エピソーム性プラスミドからの発現のために、潜在Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの低コピーｐＢＬ１プラスミドの誘導体を用いてベクターを構築した（Ｓａｎｐａｍａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３０：２２３７−２２４６，１９８４参照）。エピソーム性プラスミドは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中でのプラスミドの複製を可能にするレプリカーゼをコードする配列を含み；したがって、これらのプラスミドは、染色体中へ組み込まれずに増幅可能である。プラスミドＭＢ３９６１およびＭＢ４０９４を、本明細書で説明するエピソーム性発現プラスミドを構築するために使用したベクターの骨格とした（図５及び６参照）。プラスミドＭＢ４０９４が含む複製起点は、ＭＢ３９６１と比較してコリネバクテリウム中での使用に関して改善されており；したがって、この骨格を多くの試験用に使用した。ＭＢ３９６１及びＭＢ４０９４は共にｐＴｒｃ９９Ａからの制御配列を含む（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５，１９８８参照）。ｌａｃＩｑ−ｔｒｃ  ＩＰＴＧ誘導性プロモーターカセットの３’部分は、目的の遺伝子が、該遺伝子の開始部位と隣接するＮｃｏＩ部位を備えたＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ適合性の突出部を含む断片として挿入されうるように、ポリリンカー内に存在する（ＫｐｎＩなどの他のポリリンカー部位をＮｏｔＩ部位の代わりに使用することも可能である）。さらに、改変型ｔｒｃプロモーター（ｔｒｃＲＢＳ）およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｇｐｄ、ｒｐｌＭ、およびｒｐｓＪプロモーターなどの有用なプロモーターを、ＭＢ３９６１およびＭＢ４０９４骨格のＮｈｅＩ−ＮｃｏＩ断片などの好都合な制限断片に挿入することが可能である。ｔｒｃＲＢＳプロモーターは、発現されたタンパク質のレベルを増大することが示された改変されたリボソーム結合部位を含む。遺伝子の発現に関するこれらの実験に使用したプロモーターの配列を表１４に示す。
【０３１７】
【表１５】
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【０３１８】
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【０３１９】
遺伝子欠失によって本来のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの遺伝子を不活性化させるためのプラスミドも設計した。幾つかの場合、これらの構築物では本来の遺伝子が欠失し、かつ宿主染色体の欠失の生じた遺伝子座に異種遺伝子が挿入される。表１４に、欠失させた内在性遺伝子、および導入された場合には異種遺伝子を列挙する。欠失プラスミドは、欠失事象の標的遺伝子の上流および下流の領域と相同なヌクレオチド配列を含み；場合よっては、これらの配列は不活性化される遺伝子のコード配列の一部を含む。これらの隣接する配列を使用して相同的組換えを容易にする。１回の交差事象により、プラスミドは宿主染色体上の欠失させる遺伝子の上流および下流の部位に送られる。欠失プラスミドは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のレバンスクラーゼ遺伝子をコードするｓａｃＢ遺伝子も含む。組込み型プラスミドを含む形質転換体を、カナマイシンを欠くＢＨＩ培地で画線培養した。１日後、１０％スクロースを含むＢＨＩ培地上でコロニーを画線培養した。この手順によって、ｓａｃＢ遺伝子が切除されている菌株が選択されるが、これは、ｓａｃＢ遺伝子がスクロースを重合させてＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに対して有毒なレバンを形成するからである（Ｊａｇｅｒ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：５４６２−５４６５，１９９２参照）。スクロースを含む培地で形質転換体を増殖させる間に、ｓａｃＢにより組換え事象に関する陽性選択が可能となり、その結果、完全な欠失を生じるか、または、組込み型プラスミドの特定の目的遺伝子の誘導的発現を制御するカセット以外の部分全ての除去がもたらされる（Ｊａｇｅｒ，Ｗ．，ａｌ．  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：５４６２−５４６５，１９９２参照）。ＰＣＲ、および診断用培地上での増殖を使用して、期待される組換え事象がスクロース耐性コロニー中で起こったことを確認した。図７乃至１４Ａに、本明細書で説明する欠失プラスミドを示す。
【０３２０】
【表１６】
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【実施例２】
【０３２１】
アスパラギン酸由来アミノ酸の産生を増大するための遺伝子の単離
アスパルトキナーゼα（ｌｙｓＣ−α）およびβ（ｌｙｓＣ−β）、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ由来のアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるｌｙｓＣ／ａｓｄのホモログ）の野生型対立遺伝子；アスパルトキナーゼ−ａｓｄ（ｌｙｓＣ−ａｓｄ）、ｄａｐＡ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来のｈｏｍ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ由来のｍｅｔＡおよびｍｅｔＹＡ、ならびにＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のｄａｐＡおよびｐｐｃをコードする遺伝子を、それぞれの生物から単離したゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲ増幅によって得た。さらに、場合によっては、それぞれの遺伝子に対応する野生型対立遺伝子を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍから単離した。続いてアンプリコンを配列確認用にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩにクローニングし；特定の場合、活性型の対立遺伝子を産生するためにこれらのベクターにおいて部位特異的突然変異誘発も行った。ゲノムＤＮＡは、３７℃で７２時間ＢＨＩ培地において増殖させたＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓから、ＱＩＡＧＥＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ（商品名）を使用して製造者のキット（米国カリフォルニア州ヴァレンシアのＱｉａｇｅｎ）の推奨に従って単離した。Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来のゲノムＤＮＡを単離するためには、「塩析法」（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｐｐ．１６９−１７０，Ｋｉｅｓｅｒ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，Ｅｎｇｌａｎｄ  ２０００に記載されているような）を、ＴＹＥ培地（ＡＴＣＣ培地１８７７ＩＳＰ培地１）中で２５℃において７日間増殖させた細胞に使用した。
【０３２２】
Ｔ．ｆｕｓｃａからゲノムＤＮＡを単離すべく、５０℃で５日間ＴＹＧ培地（ＡＴＣＣ培地７４１）中において細胞を増殖させた。１００ｍｌの培養物を遠心分離にかけ（５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間）、４０ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０で２回洗浄した。細胞ペレットを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０に懸濁して最終体積４０ｍｌとした。この懸濁液を、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｒ）（米国マサチューセッツ州ニュートン所在のＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に１０サイクル通し回収した。この装置を別のバッファー２０ｍｌで洗浄し回収した。溶解した細胞の最終体積は６０ｍｌであった。溶解した細胞の懸濁液からイソプロパノール沈殿によってＤＮＡを沈殿させ、ペレットを２ｍｌのＴＥ  ｐＨ８．０に再懸濁した。サンプルをフェノール／クロロホルムで抽出し、ＤＮＡをイソプロパノールでもう１度沈殿させた。Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉからＤＮＡを単離すべく、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔｉｐ  ５００／Ｇを使用して、大腸菌に関して説明したのと同様に（Ｑｉａｇｅｎのゲノム・プロトコル）ゲノムＤＮＡを調製した。
【０３２３】
Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ｌｙｓＣ−ａｓｄオペロンのＰＣＲ増幅用に、プライマーを、ｌｙｓＣ遺伝子の上流の配列及びａｓｄの停止近くの配列に従って設計した。上流プライマーは５’−ＣＣＧＴＧＡＧＣＴＧＣＴＣＧＧＡＴＧＴＧＡＣＧ−３’（配列番号：    ）であり、下流プライマーは５’−ＴＣＡＧＡＧＧＴＣＧＧＣＧＧＣＣＡＡＣＡＧＴＴＣＴＧＣ−３’（配列番号：    ）である。遺伝子は、１０μｌの１０×クローニングしたＰｆｕ緩衝液、８μｌのｄＮＴＰミックス（各々２．５ｍＭ）、２μｌの各プライマー（２０ｕＭ）、１μｌのＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ、１０ｎｇのゲノムＤＮＡ及び水を１００μｌの最終反応容量中に含有する反応混合物中のＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて増幅した。反応条件は、９４℃で２分間、次に９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で９分間のサイクルを２８サイクルとした。４分間７２℃の最終的な伸長反応で反応を終了させ、次いで反応混合物を４℃まで冷却した。得られた産物をＱｉａｇｅｎゲル抽出プロトコルによって精製し、続いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  ＩＩ−のＳｍａＩ部位へ平滑末端連結した。連結体を大腸菌  ＤＨ５αに形質転換し、青色／白色スクリーニングによって選択した。陽性形質転換体を処理して、Ｑｉａｇｅｎ方法によってプラスミドＤＮＡを単離し、配列決定した。ＭＢ３９０２が得られたプラスミドであり、期待通りの挿入物を含んでいた。
【０３２４】
Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ遺伝子を増幅するためのプライマー対は：５’−ＡＣＣＧＣＡＣＴＴＴＣＣＣＧＡＧＴＧＡＣ−３’（配列番号：    ）及び５’−ＴＣＡＴＣＧＴＣＣＧＣＴＣＴＴＣＣＣＣＴ−３’（ｌｙｓＣ−ａｓｄ）（配列番号：    ）；５’−ＡＴＧＧＣＴＣＣＧＡＣＣＴＣＣＡＣＴＣＣ−３’（配列番号：    ）及び５’−ＣＧＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧＴＴＧＴＣＧＴ−３’（ｄａｐＡ）（配列番号：    ）；及び５’−ＴＧＡＧＧＴＣＣＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＡＡ−３’（配列番号：    ）及び５’−ＴＴＡＣＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡＣＣＣＧＣＡ−３’（ｈｏｍ）（配列番号：    ）である。Ｔ．ｆｕｓｃａからのｍｅｔＹＡオペロンを増幅するためのプライマー対は５’−ＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＣＧＴＧＴＧＡ−３’（配列番号：    ）及び５’−ＴＧＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＡＣＣＧＣＡＣＣ−３’（配列番号：    ）である。Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ遺伝子を増幅するためのプライマー対は：５’−ＴＴＧＡＣＣＴＧＡＣＧＣＴＴＡＴＡＧＣＧ−３’（配列番号：    ）及び５’−ＣＣＴＧＴＡＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧＧＧＡＧ−３’（ｄａｐＡ）（配列番号：    ）；及び５’−ＡＴＧＡＡＴＧＡＡＣＡＡＴＡＴＴＣＣＧＣＣＡ−３’（配列番号：    ）及び５’−ＴＴＡＧＣＣＧＧＴＡＴＴＧＣＧＣＡＴＣＣ−３’（ｐｐｃ）（配列番号：    ）である。
【０３２５】
遺伝子の増幅は、上記と同様の方法によって、あるいはエッペンドルフ（ドイツ国ハンブルグ、エッペンドルフ所在）のＴｒｉｐｌｅＭａｓｔｅｒ（Ｒ）ＰＣＲシステムを使用することによって行った。平滑末端ライゲーションを行って、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  ＩＩ−のＳｍａＩ部位にアンプリコンをクローニングした。得られたプラスミドはＭＢ３９４７（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ｌｙｓＣ−ａｓｄ）、ＭＢ３９５０（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ｄａｐＡ）、ＭＢ４０６６（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ｈｏｍ）、ＭＢ４０６２（Ｔ．ｆｕｓｃａ  ｍｅｔＹＡ）、ＭＢ３９９５（Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ  ｄａｐＡ）、およびＭＢ４０７７（Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ  ｐｐｃ）であった。これらのプラスミドを用いて、挿入物の配列確認、続いて発現ベクターへのクローニングを実施した。これらのベクターのサブセットにも部位特異的突然変異誘発を施して、特定の遺伝子の脱制御型対立遺伝子を産生させた。
【実施例３】
【０３２６】
アスパラギン酸由来のアミノ酸の産生に関与する遺伝子の活性を増大させるための標的化置換
部位特異的突然変異誘発を、実施例２に記載した異種遺伝子を含む幾つかのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  ＩＩ−プラスミドに対して行った。部位特異的突然変異誘発は、ストラタジーンのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｒ）部位特異的突然変異誘発キットを使用して行った。異種アスパルトキナーゼ（ｌｙｓＣ／ａｓｋ）遺伝子用には、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍタンパク質においてＴ３１１Ｉ、Ｓ３０１Ｙ、Ａ２７９Ｐ、およびＧ３４５Ｄアミノ酸置換に対応する置換突然変異体を構築した。これらの置換は、リシンとスレオニンの組合せによるフィードバック阻害を低下させ得る。いずれの場合も、突然変異型のｌｙｓＣ／ａｓｋ対立遺伝子は、異種ａｓｄ遺伝子を有するオペロン中で発現した。Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓフィードバック耐性ｌｙｓＣ対立遺伝子を構築するのに使用したオリゴヌクレオチドは：５’−ＧＧＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＡＴＣＡＴＡＴＴＣＡＣＧＴＧＴＧＣＧＣＧＴＧ−３’（配列番号：    ）及び５’−ＣＡＣＧＣＧＣＡＣＡＣＧＴＧＡＡＴＡＴＧＡＴＧＴＣＧＧＴＣＴＴＧＣＣ−３’（Ｔ３１１Ｉ）（配列番号：    ）；５’−ＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＡＣＡＴＣＴＡＣＡＡＧＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡ−３’（配列番号：    ）及び５’−ＴＴＧＣＣＧＴＣＣＴＣＧＡＴＣＴＴＧＴＡＧＡＴＧＴＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣ−３’（Ｓ３０１Ｙ）（配列番号：    ）；５’−ＧＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＣＴＡＣＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＴＧＴＴＣＣＧＣ−３’（配列番号：    ）及び５’−ＧＣＧＧＡＡＣＡＣＣＴＴＧＧＣＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＴＣ−３’（Ａ２７９Ｐ）（配列番号：    ）；及び５’−ＧＴＡＣＧＡＣＧＡＣＣＡＣＡＴＣＧＡＣＡＡＧＧＴＧＴＣＧＣＴＧＡＴＣＧ−３’及び５’−ＣＧＡＴＣＡＧＣＧＡＣＡＣＣＴＴＧＴＣＧＡＴＧＴＧＧＴＣＧＴＣＧＴＡＣ−３’（Ｇ３４５Ｄ）（配列番号：    ）であった。Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒフィードバック耐性ｌｙｓＣ対立遺伝子を構築するのに使用したオリゴヌクレオチドは：５’−ＣＧＧＧＣＣＴＧＡＣＧＧＡＣＡＴＣＲＴＣＴＴＣＡＣＧＣＴＣＣＣＣＡＡＧ−３’（配列番号：    ）及び５’−ＣＴＴＧＧＧＧＡＧＣＧＴＧＡＡＧＡＹＧＡＴＧＴＣＣＧＴＣＡＧＧＣＣＣＧ−３’（Ｓ３１４Ｉ／Ｓ３１４Ｖ）（配列番号：    ）；及び５’−ＧＴＣＧＴＧＣＡＧＡＡＣＧＴＧＴＡＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＧＧＧＣ−３’（配列番号：    ）及び５’−ＧＣＣＣＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＴＡＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＡＣＧＡＣ−３’（Ｓ３０４Ｙ）（配列番号：    ）であった。
【０３２７】
部位特異的突然変異誘発を行って、アスパラギン酸由来のアミノ酸の産生と関係がある他のタンパク質の脱制御型対立遺伝子を作製することが可能である。例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｈｏｍ遺伝子のＶ５９Ａ、Ｇ３７８Ｅ、またはカルボキシ末端の短縮に対応する、突然変異体を作製することが可能である。Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（ＴＭ）部位特異的突然変異誘発キット（ビーディーバイオサイエンシズクロンテック（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用して、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのｈｏｍ置換体（Ｇ３６２Ｅ）を作製した。オリゴヌクレオチド５’−ＧＴＣＧＡＣＧＣＧＴＣＴＴＡＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣ−３’（配列番号：    ）及び５’−ＣＧＡＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧＴＧＣＴＣＧＣＣＣ−３’（配列番号：    ）を使用して、突然変異体を構築した。部位特異的突然変異誘発を使用して、Ｔ．ｆｕｓｃａおよびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｍｅｔＡおよびｍｅｔＹ遺伝子の特定の対立遺伝子も作製した（本明細書の実施例５及び６参照）。類似の戦略を使用して、経路の他のタンパク質の脱制御型対立遺伝子を構築することも可能である。例えば、オリゴヌクレオチド５’−ＴＴＣＡＴＣＧＡＡＣＡＧＣＧＣＴＣＧＣＡＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣ−３’（配列番号：    ）及び５’−ＧＧＣＧＧＴＣＡＧＣＡＧＧＴＧＣＧＡＧＣＧＣＴＧＴＴＣＧＡＴＧＡＡ−３’（配列番号：    ）を使用して、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｐｙｃ突然変異体（Ｐ４５８Ｓ）に対応する、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのｐｙｃ遺伝子の置換体を作製することが可能である。部位特異的突然変異誘発を使用して、前述の脱制御型ｄａｐＡ対立遺伝子に対応する置換を導入することも可能である。
【０３２８】
次いで、異種遺伝子（およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ遺伝子）の野生型および脱制御型対立遺伝子を、発現に適したベクターにクローニングした。概略的には、オリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲを実施し、遺伝子をＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ断片としてクローニングしやすくした。ＤＮＡ配列の分析を行って、増幅期間中に突然変異が導入されなかったことを確認した。場合によっては、同じプロモーターから２つ以上の異種または内在性の遺伝子を発現させるために合成オペロンを構築した。一例として、ｔｒｃＲＢＳプロモーターからＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｍｅｔＡ、ｍｅｔＹ、およびｍｅｔＨ遺伝子を発現させるようにプラスミドＭＢ４２７８を作製した。図１４Ｂは、ｔｒｃＲＢＳプロモーターからｍｅｔＨ遺伝子の停止コドンにわたる、ＭＢ４２７８中のＤＮＡ配列を示す。この構築物中の遺伝子の順序はｍｅｔＡＹＨである。図１４Ｂ中、オープンリーディングフレームを大文字で示す。この構築物が、それぞれのオープンリーディングフレームの前に同一のＤＮＡ伸長部分が先行するように作出されていることに留意されたい。この保存的配列は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍタンパク質が効率良く翻訳されやすくするリボソーム結合配列として働く。類似の遺伝子間配列を使用して、他の合成オペロンを構築した。
【実施例４】
【０３２９】
ホモセリンデヒドロゲナーゼの他のスレオニン非感受性突然変異体の単離
実施例２でＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒからクローニングしたｈｏｍ遺伝子を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手したＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（登録商標）ランダム突然変異誘発キットを使用するエラープローンＰＣＲに供した。このキットに指定の条件下で、オリゴヌクレオチドプライマー５’−ＣＡＣＡＣＧＡＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＡＴＧＣＧＴＡＣＧＣＧＴＣＣＧＣＴ−３’（ＢｂｓＩ部位及び切断を含んで、ＮｃｏＩ適合性の突出を生じる）（配列番号：    ）及び５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡＣＣＣＧＣＡ−３’（ＮｏｔＩ部位を含有）（配列番号：    ）を用いて、プラスミドＭＢ４０６２からｍｅｔＡ遺伝子を増幅させた。得られた突然変異体の集団をＢｂｓＩ及びＮｏｔＩで消化し、ＭＢ４０９４プラスミド骨格中にｔｒｃＲＢＳプロモーターを含むＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ消化エピソーム性プラスミドに連結し、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２に形質転換した。形質転換された細胞を、カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）、２０ｍｇ／ＬのＡＨＶ（α−アミノ、β−ヒドロキシ吉草酸、スレオニン類似体）及び０．０１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むコリネバクテリア用に規定された培地を含む寒天培地上で平板培養した（Ｇｕｉｌｌｏｕｅｔ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３１００−３１０７，１９９９参照）。３０℃にて７２時間後、〜１０６細胞のインジケーターＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−３３１（ｈｏｍ−ｔｈｒＢΔ）を予め広げた、スレオニンを補足した規定された培地の寒天プレートにレプリカ平板培養することによって、得られた形質転換体を引き続いてホモセリン分泌についてスクリーニングする。推定フィードバック耐性突然変異体は、レプリカ平板培養した形質転換体の周りのインジケーター菌株の輪状の増殖によって同定した。これらのコロニーの各々から、前記したプライマー対を用いてｈｏｍ遺伝子をＰＣＲ増幅し、アンプリコンを前記したように消化し、前記したエピソーム性プラスミドに連結する。これらの推定ｈｏｍ突然変異体の各々を、引き続いて、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２に再度形質転換し、２５ｍｇ／Ｌカナマイシン及び０．０１ｍＭ  ＩＰＴＧを含む最小培地寒天プレート上で平板培養する。各形質転換からの１つのコロニーを、１０、２０、５０、及び１００ｍｇ／ＬのＡＨＶを含むコリネバクテリアのための規定された培地にレプリカ平板培養し、スレオニン類似体に対する最高レベルの耐性に基づいて分類する。各群からの代表を２．０のＯＤまで最小培地中で増殖させ、細胞を遠心によって回収し、Ｃｈａｓｓａｇｎｏｌｅ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５６：４１５−４２３，２００１に参照された２０ｍＭスレオニンの存在下または不在下においてホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を分析する。ｈｏｍ遺伝子を、フィードバック耐性を示す培養物からＰＣＲ増幅し、配列決定する。得られたプラスミドを用いて、発現プラスミドを生じさせ、アミノ酸の産生を増大させる。
【実施例５】
【０３３０】
ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＡ）及びＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ（ｍｅｔＹ）のフィードバック耐性突然変異体の単離
Ｔ．ｆｕｓｃａからクローニングした異種ｍｅｔＡ遺伝子を、ストラタジーンから入手したＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（登録商標）ランダム突然変異誘発キットを使用するエラープローンＰＣＲに供する。このキット指定の条件下で、オリゴヌクレオチドプライマー５’−ＣＡＣＡＣＡＣＣＴＧＣＣＡＣＡＣＡＴＧＡＧＴＣＡＣＧＡＣＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣ−３’（ＢｓｐＭＩ部位を含み、切断によりＮｃｏＩに適合する突出部を生じる）（配列番号：    ）及び５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴ−３’（ＮｏｔＩ部位を含有）（配列番号：    ）を使用して、プラスミドＭＢ４０６２からｍｅｔＡ遺伝子を増幅させる。得られた突然変異アンプリコンを消化し、実施例４に記載のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化したエピソーム性プラスミドにライゲーションし、次いでＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−４２８を形質転換する。ＭＡ−４２８は、組込み型プラスミドＭＢ４１９２で形質転換されているＡＴＣＣ１３０３２の誘導体である。組換え事象に関する選択の後、得られる菌株ＭＡ−４２８は、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの脱制御型ｈｏｍ遺伝子が挿入される形でｈｏｍ−ｔｈｒＢが欠失する。上記の形質転換されたＭＡ−４２８細胞を、カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）、０．０１ｍＭのＩＰＴＧ、および１００μｇ／ｍｌまたは５００μｇ／ｍｌのトリフルオロメチオニン（ＴＦＭ；メチオニン類似体）を含む最小培地寒天プレート上で平板培養する。３０℃で７２時間の後、得られた形質転換体を、予めＡＴＣＣ（＃２０４５２４）から入手した指標菌株Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｂ−７５８８（ＭＡＴａ  ｕｒａ３−５２、ｕｒａ３−５８、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｔｒｐ１−２８９、ｍｅｔ２、ＨＩＳ３＋）の細胞を約１０６個塗り広げた最小寒天プレートでレプリカ平板培養し、Ｏ−アセチルホモセリンの放出に関してスクリーニングする。フィードバック耐性を推定される突然変異体は、Ｏ−アセチルホモセリン（ＯＡＨ）の放出によって同定されるが、これはＯＡＨの放出によりレプリカ平板培養した形質転換体の周囲に指標菌株が輪状に増殖することができるからである。
【０３３１】
これらの栄養共生コロニーの各々から、前記したプライマー対を用いてｍｅｔＡ遺伝子をＰＣＲ増幅し、ＢｓｐＭＩ及びＮｏｔＩで消化し、実施例４に記載されたＮｏｔＩ／ＮｃｏＩ消化エピソーム性プラスミドに連結する。これらの推定ｍｅｔＡ突然変異体対立遺伝子の各々を、引き続いて、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２に再度形質転換し、２５ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む最小培地寒天プレート上で平板培養する。各形質転換からの１つのコロニーを、１００、２００、５００、及び１０００μｇ／ｍｌのＴＦＭ＋０．０１ｍＭ  ＩＰＴＧを含む最小培地にレプリカ平板培養し、該メチオニン類似体に対する最高レベルの耐性に基づいて分類する。各群からの代表を２．０のＯＤまで最小培地中で増殖させ、遠心によって細胞を回収し、２０ｍＭメチオニンまたはＳ−ＡＭの存在下及び不在下でＫｒｅｄｉｃｈ  ａｎｄ  Ｔｏｍｋｉｎｓ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１：４９５５−４９６５，１９６６）によって、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性を測定する。ｍｅｔＡ遺伝子を、フィードバック耐性を示す培養物からＰＣＲ増幅し、配列決定する。得られたプラスミドを用いて、発現プラスミドを生じさせ、アミノ酸の産生を増大させる。
【０３３２】
同様にして、Ｔ．ｆｕｓｃａからのｍｅｔＹ遺伝子を突然変異誘発ＰＣＲに供する。オリゴヌクレオチドプライマー５’−ＣＡＣＡＧＧＴＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＡＣＴＧＣＧＴＣＣＴＧＡＣＡＧＧＡＧ−３’（ＢｓａＩ部位を含有し、切断はＮｃｏＩ適合性突出を生じる）（配列番号：    ）及び５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＧＴＡＴＧＣＣＴＴＧＧＣＴＧ−３’（ＮｏｔＩ部位を含有）（配列番号：    ）を、前記したように、エピソーム性プラスミドへのクローニングのために、及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅから得られたＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（登録商標）ランダム突然変異誘発キットの仕様についての突然変異誘発反応を行うために用いる。主な差は、突然変異したｍｅｔＹ集団を、高レベルのＯ−アセチルホモセリンを既に生じるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株に形質転換することである。この菌株ＭＩＣｍｅｔ２は、ｔｒｃＲＢＳプロモーターの制御下で前記した脱制御Ｔ．ｆｕｓｃａ  ｍｅｔＡ対立遺伝子を含むプラスミドＭＢ４２８６の改変版でＭＡ−４２８を形質転換することによって構築する。形質転換後、ｓａｃＢ選択系は内因性ｍｃｂＲ遺伝子座の欠失、及び脱制御異種ｍｅｔＡ対立遺伝子での置換を可能とする。
【０３３３】
Ｔ．ｆｕｓｃａ  ｍｅｔＹ変異形質転換ＭＩＣｍｅｔ２菌株を、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン、０．２５ｍＭ  ＩＰＴＧ、及び阻害濃度の毒性メチオニン類似体（例えば、エチオニン、セレノメチオニン、ＴＦＭ）を含む最小寒天プレート上に広げ、形質転換体を、これらの３つの異なるメチオニン類似体の個別、二重または三重の組合せの存在下で増殖させることができる。ｍｅｔＹ遺伝子を、選択プレート上で増殖するこれらのコロニーから増幅し、アンプリコンを消化し、実施例４に記載されたエピソーム性プラスミドに連結し、得られたプラスミドをＭＩＣｍｅｔ２に形質転換する。形質転換体を、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む最小培地寒天プレートで増殖させる。得られたコロニーを、１０倍範囲の毒性メチオニン類似体エチオニン、ＴＦＭ、及びセレノメチオニン（＋０．０１ｍＭ  ＩＰＴＧ）を含む寒天プレートにレプリカ−平板培養し、類似体の感度に基づいて分類する。各群からの代表を２．０のＯＤまで最小培地中で増殖させ、遠心によって細胞を回収し、２０ｍＭメチオニンの存在下及び不在下で、Ｋｒｅｔｉｃｈ  ａｎｄ  Ｔｏｍｋｉｎｓの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１：４９５５−４９６５，１９６６）（実施例９参照）の改変版によって、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ酵素活性を測定する。ｍｅｔＹ遺伝子を、フィードバック耐性を示す培養物からＰＣＲ増幅し、配列決定する。得られたプラスミドを用いて、発現プラスミドを生じさせ、アミノ酸の産生を増大させる。Ｔ．ｆｕｓｃａからのフィードバック耐性ｍｅｔＹ及びｍｅｔＡ変異体を含む発現プラスミドを以下のように構築する。オリゴヌクレオチド５’−ＣＡＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＡＣＴＧＣＧＴＣＣＴＧＡＣＡＧＧＡＧＣ−３’（ＰｃｉＩ部位を含み、切断でＮｃｏＩ適合性の突出が生じる（また、Ａｌａ＞Ｓｅｒからの第二のコドンを変化させる））（配列番号：    ）及び５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴ−３’（ＮｏｔＩ部位を含有）（配列番号：    ）を用いてＴ．ｆｕｓｃａ  ｍｅｔＹＡオペロンを増幅する。アンプリコンをＰｃｉＩ及びＮｏｔＩで消化し、断片を、ＮｏｔＩ、ＨａｅＩＩＩメチラーゼ、及びＮｃｏＩで順次処理した前記エピソーム性プラスミドに連結する。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キットを用いて行った部位特異的突然変異誘発を用いて、Ｔ．ｆｕｓｃａ  ｍｅｔＡ及びｍｅｔＹにおける記載された置換突然変異を、オペロンとして脱制御対立遺伝子を発現する単一プラスミドに取り込む。得られたプラスミドを用いて、アミノ酸の産生を増大させる。
【０３３４】
最小培地：脱イオン水（ｐＨ７．２）１リットル当たり１０ｇのグルコース、１ｇのＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、０．２ｇのＫＣｌ、０．２ｇのＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、３０μｇのビオチン、及び１ｍｌのＴＥ。微量元素溶液（ＴＥ）は：脱イオン水１リットル当たり８８ｍｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７−１０Ｈ２Ｏ、３７ｍｇの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２７−４Ｈ２Ｏ、８．８ｍｇのＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、２７０ｍｇのＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ、７．２ｍｇのＭｎＣｌ２−４Ｈ２Ｏ、及び９７０ｍｇのＦｅＣｌ３−６Ｈ２Ｏを含む。（栄養要求性突然変異体の要件を支持するのに必要な場合、アミノ酸及びプリンを３０ｍｇ／Ｌの最終濃度まで補充する）。
【実施例６】
【０３３５】
細菌アミノ酸配列におけるＳ−ＡＭ結合残基の同定
アミノ酸産生を調節する多くの酵素はＳ−ＡＭによるアロステリックフィードバック阻害を受ける。我々は、（例えば、Ｓ−ＡＭ結合に対する、またはＳ−ＡＭ誘導アロステリック効果に対する耐性を介する）Ｓ−ＡＭ調節に対する耐性を持つこれらの酵素の変異体はフィードバック阻害に対して耐性を示すであろうと仮定した。Ｓ−ＡＭ結合モチーフは細菌ＤＮＡメチルトランスフェラーゼにおいて同定されている（Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：１７３３３−１７３４２，１９９８）。Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．は、この酵素によるＳ−ＡＭ結合に対して重要であると思われるＥｃｏＲＶα−アデニン−Ｎ６−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼにおいて高度に保存されたアミノ酸モチーフを同定した。我々は、Ｃ．ｇｕｌｔａｍｉｃｕｍの以下のタンパク質のアミノ酸配列において関連するモチーフを調査した：ＭｅｔＡ、ＭｅｔＹ、ＭｃｂＲ、ＬｙｓＣ、ＭｅｔＢ、ＭｅｔＣ、ＭｅｔＥ、ＭｅｔＨ、及びＭｅｔＫ。推定Ｓ−ＡＭ結合モチーフは、ＭｅｔＡ、ＭｅｔＹ、ＭｃｂＲ、ＬｙｓＣ、ＭｅｔＢ、ＭｅｔＣ、ＭｅｔＨ、及びＭｅｔＫで同定された。また、我々は、酵母タンパク質中のＳ−ＡＭ結合モチーフに対して類似のｍｅｔＹにおいてさらなる残基を同定した（Ｐｉｎｔａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２０（４）：１３７０−１３８１，２０００）。Ｓ−ＡＭ結合に関与する可能性のある各タンパク質の残基を表１６に示す。
【０３３６】
【表１７】
2009501512.tif 000022
【０３３７】
2009501512.tif 000023
【０３３８】
他の種由来のＭｅｔＡ及びＭｅｔＹ配列の整列を用いて、推定される別のＳ−ＡＭ結合残基を同定した。これらの残基を表１７に示す。
【０３３９】
【表１８】
2009501512.tif 000024
【０３４０】
ＭｅｔＡ及びＭｅｔＹ遺伝子は、実施例２に記載したように、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ及びＴ．ｆｕｓｃａからクローニングした。表１１は、ＭｅｔＡ及びＭｅｔＹ遺伝子の野生型及び突然変異した対立遺伝子の発現で用いられるプラスミド及び菌株を示す。表１８及び１９は、ＭｅｔＡ及びＭｅｔＹ変異体を生じさせるための、発現で用いられるプラスミド、及び部位特異的突然変異誘発で使用されるオリゴヌクレオチドを示す。
【実施例７】
【０３４１】
ＭｅｔＡ及びＭｅｔＹアッセイのためのタンパク質抽出物の調製
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのシングルコロニーを種培養地（以下の実施例１０参照）に接種し、３３℃にて撹拌しつつ２４時間増殖させた。この種培養物を産生大豆培地（４０ｍＬ）（実施例１０）中で１：２０希釈し、８時間増殖させた。遠心による回収に続き、ペレットを１容量の水中で１回洗浄した。ペレットを２５０μｌの溶解緩衝液（１ｍｌ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５、０．５ｍｌ  １Ｍ  ＫＯＨ、１０μｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ水で５ｍｌとする）、３０μｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル、及び１容量の０．１ｍｍ酸洗浄ガラスビーズに再懸濁させた。この混合物を、８回の反復の間に各々１５秒間、交互に渦巻かせ、及び氷上に保持した。４，０００ｒｐｍにおける５分間の遠心の後、上清を除去し、１０，０００ｒｐｍにおいて２０分間再度回転させた。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて、清澄化された上清中のタンパク質濃度を測定した。
【実施例８】
【０３４２】
エピソーム性プラスミドを含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株におけるＭｅｔＡ活性の定量
内因性及びエピソームｍｅｔＡ遺伝子を発現するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＭｅｔＡ活性を測定した。ＭｅｔＡ活性は、Ｋｒｅｄｉｃｈ及びＴｏｍｋｉｎｓによって記載されたプロトコル（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１（２１）：４９５５−４９６５，１９６６）を用いて粗製タンパク質抽出物においてアッセイした。タンパク質抽出物の調製は実施例７に記載されている。簡単に述べると１μｇのタンパク質抽出物をマイクロタイタープレートに加えた。反応ミックス（２５０μＬ；１００ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，２ｍＭ  ５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮ），２ｍＭナトリウムＥＴＤＴＡ、２ｍＭアセチルＣｏＡ、２ｍＭホモセリン）をマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。反応の間に、ＭｅｔＡ活性はアセチル−ＣｏＡからＣｏＡを遊離させる。ジスルフィド交換がＣｏＡ及びＤＴＮの間で起こって、チオニトロ安息香酸を生じる。チオニチトロ安息香酸の産生を分光分析で追跡する。４１２ｎｍにおける吸光度を３０分間に渡って５分毎に測定した。タンパク質抽出物を含まないウェルを対照として含めた。ＭｅｔＡ活性の阻害は、Ｓ−アデノシルメチオニン（Ｓ−ＡＭ；０．０２ｍＭ、０．２ｍＭ、２ｍＭ）及びメチオニン（０．５ｍＭ、５ｍＭ、５０ｍＭ）の添加によって測定した。阻害剤を反応ミックスに直接的に加えて、その後、それをタンパク質抽出物に加えた。
【０３４３】
イン・ビトロＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性を、内在性ならびにエピソーム性のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＭｅｔＡおよびＭｅｔＹ遺伝子を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−４４２およびＭＡ−４４９由来の粗製タンパク質抽出物中で測定した。エピソーム性のｍｅｔＡおよびｍｅｔＹ遺伝子は合成オペロンとして発現された；ｍｅｔＡＹオペロンの核酸配列は図１２Ｂ〜１２ＣのｍｅｔＡＹＨオペロンに示す通りであるが、ｍｅｔＨ配列のみを欠いている。ｔｒｃＲＢＳプロモーターを、これらのエピソーム性プラスミド中で使用した。ＭＡ−４４２は、ｍｅｔＡ−ｍｅｔＹの順でエピソーム性遺伝子を発現する。ＭＡ−４４９は、ｍｅｔＹ−ｍｅｔＡの順でエピソーム性遺伝子を発現する。プラスミド上に存在するＭｅｔＡおよびＭｅｔＹ遺伝子の発現を誘導するＩＰＴＧの存在下および不在下で、実験を行った。図１３は、ＭｅｔＡ活性の経時変化を示す。８時間および２０時間培養物由来のサンプルでは、遺伝子がＭｅｔＡ−ＭｅｔＹ（ＭＡ−４４２）の配置であったときのみ、ＭｅｔＡ活性が観察された。対照的に、菌株ＭＡ−４４９（ＭｅｔＹ−ＭｅｔＡ）由来の抽出物中のＭｅｔＡ活性は、誘導の有無に関わらず、８時間および２０時間の時点において、タンパク質を含まない対照サンプルに対して有意に増大することはなかった。このデータは、これら２つの遺伝子がｍｅｔＹ−ｍｅｔＡの配置である場合ｍｅｔＡの発現が低いことを示したノーザン・ブロット分析と一致する。
【０３４４】
次に、菌株ＭＡ−４４２由来の抽出物のフィードバック阻害に対する感度を試験した。ＭＡ−４４２抽出物を、５ｍＭのメチオニン、０．２ｍＭのＳ−ＡＭの存在下、あるいはメチオニンまたはＳ−ＡＭを付加せずにアッセイし、ＭｅｔＡ活性は前に記載したのと同様にアッセイした。図１４中に示したように、５ｍＭのメチオニンおよび０．２ｍＭのＳ−ＡＭの存在下でＭｅｔＡ活性が低下した。したがって、ＭｅｔＡのアロステリック抑制を低減することによりＭｅｔＡ活性が増大し、より高レベルのメチオニンの産生が可能になりうる。アロステリック抑制は一層低レベルのメチオニンまたはＳ−ＡＭでも観察されると考えられる。それにもかかわらず、試験したレベルは、メチオニンなどのアミノ酸を産生するために作出した菌株中で生理学的に適切なレベルである。Ｔ．ｆｕｓｃａのエピソーム性ＭｅｔＡを発現するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株（菌株ＭＡ−５７８およびＭＡ−５７９）、またはＴ．ｆｕｓｃａのエピソーム性ＭｅｔＡとＭｅｔＹの両方を発現する菌株（菌株ＭＡ−４５６およびＭＡ−５７０）を構築し、これらの菌株から抽出物を調製し、ＭｅｔＡ活性に関してアッセイした。それぞれのエピソーム性遺伝子と関係がある制御要素を表１８に列挙する。各菌株の抽出物におけるＭｅｔＡ活性の変化率は、ＯＤ４１２における変化をタンパク質ｎｇ当たりの時間で割って計算することによって測定した。これらのアッセイの結果を図１７に示し、これは、誘導条件下で菌株ＭＡ−５７８が約２．７５単位の変化率（ＯＤ４１２／時間／ｎｇタンパク質の変化）を呈し、他方、非誘導条件下の変化率は約１であったことを示す。菌株ＭＡ−５７９は誘導条件下で約２．５の変化率、及び非誘導条件下で約０．４の変化率を呈した。構成的プロモーターの制御下でｍｅｔＡ及びｍｅｔＹを発現する菌株ＭＡ−４５６は約２．２の変化率を呈した。菌株ＭＡ−５７０は誘導条件下で約１の変化率、及び非誘導条件下で０．３の変化率を呈した。陰性対照試料（タンパク質なし）は約０．１の変化率を呈した。これらのデータは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＴ．ｆｕｓｃａ  ｍｅｔＡのエピソーム発現がＭｅｔＡ活性の変化率を増大させることを示す。この増大は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＭｅｔＡのエピソーム発現で観察される増大と同様であった。
【実施例９】
【０３４５】
エピソーム性プラスミドを含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株におけるＭｅｔＹ活性の定量
数種類のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株における、Ｔ．ｆｕｓｃａのエピソーム性ＭｅｔＹのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を測定した。Ｋｒｅｄｉｃｈ及びＴｏｍｋｉｎｓの改変版プロトコル（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４１（２１）：４９５５−４９６５，１９６６）を使用して、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの粗製タンパク質抽出物中のＭｅｔＹ活性をアッセイした。粗製タンパク質抽出物は記載したように調製した。簡潔に述べると、９００μｌの反応混合物（５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭの硫化ナトリウム９水和物（Ｎａ２Ｓ）、０．２ｍＭのピリドキサール−５−リン酸（ＰＬＰ））を、４５μｇのタンパク質抽出物と混合した。ゼロ時点で、Ｏ−アセチルホモセリン（ＯＡＨ；Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）を、０．６２５ｍＭの終濃度となるように加えた。ゼロ時点における反応混合物をすぐに２００μｌ採取した。反応混合物の残りは３０℃でインキュベートした。３つの２００μｌの試料を１０分間隔で採取した。３０℃から取り出した直後に、１２５μｌの１ｍＭ亜硝酸を加えることによってホモシステインのチオール基をニトロソ化してＳ−ニトロソチオールを形成させて、反応を停止させた。５分後、（過剰の亜硝酸を除去する）３０μｌの０．５％スルファミン酸アンモニウムを加え、サンプルを攪拌した。２分後、４００μｌの検出溶液（０．４Ｎ  ＨＣｌ中の１％ＨｇＣｌ２を１部、０．４Ｎ  ＨＣｌ中の３．４４％スルファニルアミドを４部、０．４Ｎ  ＨＣｌ中の０．１％１−ナフチルエチレンジアミン２塩酸塩を２部）を加え、溶液を攪拌した。水銀イオンの存在下において、Ｓ−ニトロソチオールが迅速に分解して亜硝酸を生じ、スルファニルアミドをジアゾ化し、これがナフチルエチレンジアミンと結合して発色団として安定したアゾ染料を生じる。５分後、溶液をマイクロタイター皿に移し、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。タンパク質抽出物を含まない反応物を対照として含めた。
【０３４６】
アッセイの結果を図１８に示す。構成的プロモーターの制御下においてエピソーム性のＴ．ｆｕｓｃａの野生型ｍｅｔＡおよびｍｅｔＹ対立遺伝子を発現する菌株ＭＡ−４５６は、０．０４の変化率を示した。誘導型プロモーターの制御下においてエピソーム性のＴ．ｆｕｓｃａの野生型ｍｅｔＡおよびｍｅｔＹ対立遺伝子を発現する菌株ＭＡ−５７０は、誘導条件下で約０．０３８の変化率、非誘導条件下では０．０１未満の変化率を示した。したがって、異種ＭｅｔＹの発現は、内在性ＭｅｔＹの酵素活性より有意に高い酵素活性をもたらす。
【０３４７】
【表１９】
2009501512.tif 000025
【０３４８】
【表２０】
2009501512.tif 000026
【０３４９】
【表２１】
2009501512.tif 000027
【実施例１０】
【０３５０】
アスパラギン酸由来のアミノ酸を産生し検出する方法
アスパラギン酸由来のアミノ酸を震盪フラスコで産生するために、各菌株を寒天プレートから１２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中の１０ｍｌの種培養地に接種した。種培養地を３１℃にて１６時間、シェーカー上で２５０ｒｐｍにおいてインキュベートした。アミノ酸の産生を調べるための培養物は、１２５ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中の１０ｍｌのバッチ産生培地で種培養地を１：２０に希釈することによって調製した。適切であれば、ＩＰＴＧを培養の組に加えて、ＩＰＴＧ調節遺伝子の発現を誘導した（最終濃度０．２５ｍＭ）。メチオニン発酵を撹拌（２５０ｒｐｍ）しつつ３１℃にて６０乃至６６時間行った。本明細書中で報告する実験では、ほとんどの全ての場合、複数形質転換体を平行して発酵させ、各形質転換体はしばしば二連で増殖させた。ほとんどの報告されたデータ点は、同時に増殖させた対照菌株と共に、代表的な形質転換体での少なくとも２回の発酵の平均を反映する。
【０３５１】
培養の後、得られたブロス中のアミノ酸レベルを、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）を用いて測定した。約１ｍｌの培養物を回収し、遠心して細胞をペレット化し、デブリスを粒状化した。得られた上清の画分を０．１％ギ酸水溶液に１：５０００希釈し、１０μＬずつ逆相ＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｃ１８，２．１×１５０ｍｍ）に注射した。化合物は、アセトニトリル中の０．１％ギ酸（「Ｂ」）及び水中の０．１％ギ酸（「Ａ」）のグラジエント混合物（４分間にわたって１％Ｂ→５０％Ｂ、０．２分間５０％Ｂに保持、１分間にわたって５０％Ｂ→１％、１．８分間１％に保持）を用い、０．３５０ｍＬ分−１の流速で流出させた。流出化合物は、陽性電子スプレイイオン化を用いるトリプル−四極マススペクトロメーターで検出した。機器はＭＲＭモードで操作して、アミノ酸を検出した（リシン：１４７→８４（１５ｅＶ）；メチオニン：１５０→１０４（１２ｅＶ）；スレオニン／ホモセリン：１２０→７４（１０ｅＶ）；アスパラギン酸：１３４→８８（１５ｅＶ）；グルタミン酸：１４８→８４（１５ｅＶ）；Ｏ−アセチルホモセリン：１６２→１０２（１２ｅＶ）；及びホモシステイン：１３６→９０（１５ｅｖ））。場合によっては、同様な方法を用いてさらなるアミノ酸を定量した（例えば、ホモシスチン、グリシン、Ｓ−アデノシルメチオニン）。個々のアミノ酸は、同一条件下で注入したアミノ酸標準との比較によって定量した。この質量分析方法を用い、ホモセリン及びスレオニンの間を区別することができない。従って、必要であれば、試料を蛍光標識で誘導体化し、液体クロマトグラフィーに付し、続いて蛍光を検出する。この方法を用いて、ホモセリン及びスレオニンを分解し、ならびにＬＣＭＳ方法を用いて決定された濃度を確認した。
【０３５２】
【表２２】
2009501512.tif 000028
【０３５３】
【表２３】
2009501512.tif 000029
【実施例１１】
【０３５４】
異種野生型及び突然変異体ｌｙｓＣ変異体は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ及びＢ．ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍにおいてリシンの産生を増加させる。
【０３５５】
アスパルトキナーゼは、コリネバクテリウム中でのリシン産生の律速活性であることが多い。アスパルトキナーゼ活性を制御するための主な機構は、リシンとスレオニンの組合せによるアロステリック制御である。アスパルトキナーゼおよびアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼをコードする異種オペロンを、実施例２に記載したのと同様にＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓおよびＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒからクローニングした。部位特異的突然変異誘発を使用して、脱制御型の対立遺伝子を作製し（実施例３参照）、これらの改変型遺伝子をコリネバクテリウム中での発現に適したベクター中に挿入した（実施例１）。得られたプラスミドおよび野生型の対応物を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ野生型菌株ＡＴＣＣ１３０３２およびＢ．ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ野生型菌株ＡＴＣＣ１３８６９を含めた菌株に形質転換し、これらをリシン産生に関して分析した（図１９）。
【０３５６】
菌株ＭＡ−００１４、ＭＡ−００２５、ＭＡ−００２２、ＭＡ−００１６、ＭＡ−０００８およびＭＡ−００１９は、ＭＢ３９６１骨格を有するプラスミドを含む（実施例１参照）。生産用培地にＩＰＴＧを加えて、野生型または脱制御型の異種ｌｙｓＣ−ａｓｄオペロンの発現を増大させると、リシンの産生が促進された。菌株ＡＴＣＣ１３８６９は、これらの菌株の形質転換していない対照株である。Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＳ３０１Ｙ、Ｔ３１１Ｉ、およびＧ３４５Ｄ対立遺伝子を含むプラスミドは、リシン産生の増大において最も有効であり、これらの対立遺伝子を改良型ベクターによる発現用に選択した。脱制御型のＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの対立遺伝子を含む改良型ベクターで、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ１３０３２）を形質転換して、菌株ＭＡ−０３３３、ＭＡ−０３３４、ＭＡ−０３３６、ＭＡ−０３６１、およびＭＡ−０３６２を作製した（プラスミドはｔｒｃＲＢＳプロモーターまたはｇｐｄプロモーターのいずれかと、ＭＢ４０４９骨格を含む；実施例１）。菌株ＡＴＣＣ１３０３２（Ａ）は、形質転換されていない、菌株ＭＡ−０３３３、ＭＡ−０３３４およびＭＡ−０３３６の対照株である。菌株ＡＴＣＣ１３０３２（Ｂ）は、形質転換されていない、菌株ＭＡ−０３６１およびＭＡ−０３６２の対照株である。菌株ＭＡ−０３３３、ＭＡ−０３３４、ＭＡ−０３３６、ＭＡ−０３６１、およびＭＡ−０３６２はいずれも、リシン産生の改善を示した。例えば菌株ＭＡ−０３３４は、５０ｇ／Ｌグルコースから２０ｇ／Ｌを超えるリシンを産生した。さらに、Ｔ３１１ＩおよびＧ３４５Ｄ対立遺伝子は、ｔｒｃＲＢＳプロモーターまたはｇｐｄプロモーターから発現されると有効であることが示された。
【実施例１２】
【０３５７】
Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ｈｏｍ  Ｇ３６２Ｅ変異体は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−０３３１においてホモセリンへの炭素の流れを増大させる。
実施例１１に示すように、アスパルトキナーゼの脱制御は、アスパラギン酸由来のアミノ酸への炭素の流れを増大させた。原理的には、アスパルトキナーゼ活性は、脱制御ｌｙｓＣ対立遺伝子の使用によって、及び／またはアロステリック制御を媒介する小分子（リシンまたはスレオニン）の排除によって増大可能であると思われる。図２０（菌株ＭＡ−０３３１）は、ｈｏｍ−ｔｈｒＢ遺伝子座を不活化した場合に、高レベルのリシンがブロスに蓄積したことを示す。ｈｏｍ及びｔｈｒＢは、スレオニンの産生に必要とされる２つのタンパク質、ホモセリン・デヒドロゲナーゼおよびホモセリン・キナーゼをそれぞれコードする。ｔｈｒＢ遺伝子のみが欠失された場合、リシンの蓄積も観察された（図２３における菌株ＭＡ−０９３３を参照（ＭＡ−０９３３は１例であるが、ＭＡ−０９３３とＭＡ−０３３１を直接比較することは適切ではない。何故ならこれらの菌株の遺伝的背景は異なるからである）。
【０３５８】
メチオニン経路の中間体への炭素の流れを増大させるために、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのｈｏｍ遺伝子の脱制御型と推定される変異体で、ＭＡ−０３３１を形質転換した。同様の戦略を使用して、ｔｈｒＢ欠失のみを含む菌株を作出した。菌株ＭＡ−０３８４、ＭＡ−０３８６、およびＭＡ−０３８９は、それぞれｒｐｌＭ、ｇｐｄ、およびｔｒｃＲＢＳプロモーターの制御下にあるＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのｈｏｍＧ３６２Ｅ変異体を含む。これらのプラスミドは、部位特異的突然変異誘発法の一部として導入した他の置換（Ｇ４３Ｓ）も含むが、その後の実験から、Ｇ４３Ｓ置換はＨｏｍ活性を増大させないことが示唆された。図１８は、菌株ＭＡ−０３３１、ＭＡ−０３８４、ＭＡ−０３８６、およびＭＡ−０３８９を使用して行った振とうフラスコの実験の結果を示すが、該実験では、リシンおよびホモセリンなどのアスパラギン酸由来のアミノ酸に関してブロスを分析した。Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのｈｏｍＧ３６２Ｅ遺伝子を発現する菌株は、リシン産生の劇的な低下、およびホモセリンのレベルの有意な増大を示す。ブロスのホモセリンのレベルは、ＭＡ−０３８９などの菌株中では５ｇ／Ｌを超えていた。ホモセリンの有意なレベルは細胞内で依然として保たれており、一部のホモセリンは他の産物に転換されたと考えられる。ｈｏｍならびにｈｏｍ下流の脱制御型ｌｙｓＣおよび他の遺伝子の過剰発現は、メチオニンを含めたホモセリン系アミノ酸の産生を増大させる可能性がある（以下参照）。
【実施例１３】
【０３５９】
異種ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｐｃ）酵素は、アスパラギン酸由来のアミノ酸への炭素の流れを増大させる。
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｐｃ）は、ピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｙｃ）と共に、アスパラギン酸由来のアミノ酸の産生に直接的に供給されるクエン酸回路中間体であるオキサロ酢酸（ＯＡＡ）の合成を触媒する。Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉの野生型ｐｐｃ遺伝子を、ＩＰＴＧ誘導性ｔｒｃＲＢＳプロモーターの制御下で発現ベクターにクローニングした。このプラスミドで、リシン高産生菌株ＭＡ−０３３１およびＭＡ−０４６３を形質転換した（図２１）。菌株をＩＰＴＧの不在下または存在下で増殖させ、アスパラギン酸を含めたアスパラギン酸由来のアミノ酸の産生に関して分析した。菌株ＭＡ−０３３１はｈｏｍ−ｔｈｒＢΔ突然変異を含み、一方ＭＡ−０４６３は、欠失したｈｏｍ−ｔｈｒＢ遺伝子座にＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓのｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）−ａｓｄオペロンが組み込まれている。このｌｙｓＣ−ａｓｄオペロンはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｇｐｄプロモーターの制御下にある。図２１は、Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのｐｐｃ遺伝子が、アスパラギン酸の蓄積を増大させたことを示す。この違いは、利用可能なアスパラギン酸の大部分をリシンに転換した菌株中でも検出可能であった。
【実施例１４】
【０３６０】
異種ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ｄａｐＡ）酵素はリシンの産生を増加させる。
ジヒドロジピコリン酸シンターゼは、炭素をホモセリン系アミノ酸の産生ではなくリシンの生合成へと向かわせる分岐点の酵素である。ＤａｐＡはアスパラギン酸−Ｂ−セミアルデヒドを、２，３−ジヒドロジピコリン酸に転換する。Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉおよびＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの野生型ｄａｐＡ遺伝子を、ｔｒｃＲＢＳおよびｇｐｄプロモーターの制御下の発現ベクターにクローニングした。得られたプラスミドで、高レベルのリシンを産生するように作出された２つの菌株、菌株ＭＡ−０３３１およびＭＡ−０４６３を形質転換した（実施例１３参照）。Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓのｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）−ａｓｄオペロンの発現を増大させるために、ＭＡ−０４６３を作出した。この操作により、ＤａｐＡ触媒反応の基質であるアスパラギン酸−Ｂ−セミアルデヒドの産生が進むと予想される。菌株ＭＡ−０４８１、ＭＡ−０４８２、ＭＡ−０４７２、ＭＡ−０５０１、ＭＡ−０５０２、ＭＡ−０４９２、ＭＡ−０４９７を振とうフラスコ中で増殖させ、リシンを含めたアスパラギン酸由来のアミノ酸に関してブロスを分析した。図２２に示すように、Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉまたはＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのｄａｐＡ遺伝子の発現増大によって、ＭＡ−０３３１およびＭＡ−０４６３をバックグランドとしたうえでのリシン産生が増大する。菌株ＭＡ−０５０２は、５０ｇ／Ｌグルコースの工程でほぼ３５ｇ／Ｌのリシンを産生した。これらの異種ｄａｐＡ遺伝子の脱制御型変異体を構築することによって、さらなるリシン改良体を作出することが可能であろう。
【実施例１５】
【０３６１】
高レベルのホモセリンを産生する菌株の構築
高レベルのホモセリン系アミノ酸を産生する菌株は、遺伝子工学的手法と突然変異誘発法の組合せによって作製することが可能である。１例として、５つの異なる遺伝的操作を行って、＞１０ｇ／Ｌのホモセリンを産生するＭＡ−１３７８菌株を構築した（図２３）。ＭＡ−１３７８を作製するために、野生型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを、最初にニトロソグアニジン（ＮＴＧ）による突然変異誘発（「Ａ  ｓｈｏｒｔ  ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃ」  Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．１９９２，１４３ページに記載された手順に基づく）、次に高レベルのエチオニン（毒性のメチオニン類似体）を含む最小プレート上で増殖したコロニーの選択を実施して突然変異させた。
【０３６２】
次いで、プラスミドＭＢ４１５４を使用して得られたエチオニン耐性菌株の１つ（ＭＡ−０４２２）において内在性のｍｃｂＲ遺伝子座を欠失させ、菌株ＭＡ−０６２２を作製した。ＭｃｂＲは、メチオニンなどのイオウ含有アミノ酸の産生に必要とされる幾つかの遺伝子の発現を制御する転写抑制因子である（Ｒｅｙ，Ｄ．Ａ．，Ｐｕｈｌｅｒ，Ａ．，及びＫａｌｉｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０３：５１−６５，２００３参照）。我々は、幾つかの場合、ＭｃｂＲの不活性化によってホモセリン系アミノ酸のレベルが上昇した菌株が作製されたことを観察した。プラスミドＭＢ４０８４を使用してＭＡ−０６２２のｔｈｒＢ遺伝子座を欠失させるとリシンおよびホモセリンの蓄積を引き起こしたが、メチオニンおよびメチオニン経路の中間体もそれより低い程度で蓄積した。この操作によりＭＡ−０９３３が得られた。前に記載したように、リシンおよびホモセリンの蓄積は、スレオニン産生の欠如によるｌｙｓＣの脱制御の結果であったと考えられる。アスパラギン酸−Ｂ−セミアルデヒドおよび下流のアミノ酸への炭素の流れをさらに最適化するために、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓのｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）−ａｓｄオペロンを発現するエピソーム性プラスミドでＭＡ−０９３３を形質転換した（菌株ＭＡ−１１６２）。次いで、ホモセリン高産生菌株ＭＡ−１１６２を、ＮＴＧを用いて突然変異誘発し、通常増殖を阻害するレベルの塩化メチオニンメチルスルホニウム（ＭＭＳＣ）を含む最小培地プレート上でコロニーを選択した。ＭＡ−１３７８は、このようなＭＭＳＣ耐性菌株の１つであった。
【実施例１６】
【０３６３】
異種ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＡ）酵素はホモセリン系のアミノ酸への炭素の流れを増加させる。
ＭｅｔＡは、メチオニン生合成を行う工程の酵素である。Ｔ．ｆｕｓｃａの野生型ｍｅｔＡ遺伝子を、発現ベクターのｔｒｃＲＢＳプロモーター制御下でクローニングした。このプラスミドで、ホモセリン高産生菌株を形質転換して、ＭｅｔＡ活性の増大を試験した（図２４および２５）。ＭＡ−０４２８、ＭＡ−０９３３、およびＭＡ−１５１４は、ホモセリン高産生菌株の例であった。ＭＡ−０４２８は、プラスミドＭＢ４１９２（実施例１参照）で処理してｈｏｍ−ｔｈｒＢ遺伝子座を欠失させｇｐｄ−Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのｈｏｍ（Ｇ３６２Ｅ）発現カセットを組み込んだ、野生型ＡＴＣＣ１３０３２の誘導体である。ノボビオシンを使用して菌株ＭＡ−１３７８からＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓのｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）−ａｓｄオペロン・プラスミドを脱落させることによって、ＭＡ−１５１４を構築した。この操作を行って、Ｔ．ｆｕｓｃａのｍｅｔＡ遺伝子および選択可能なｋａｎＲマーカーを含むエピソーム性プラスミドによる形質転換を可能にした。菌株ＭＡ−１５５９は、ｔｒｃＲＢＳプロモーターの制御下にあるＴ．ｆｕｓｃａのｍｅｔＡ遺伝子を用いた菌株ＭＡ−１５１４の形質転換から得られた。ＭＡ−０９３３は実施例１５に記載されている。これらのホモセリン高産生菌株のそれぞれにおいてＴ．ｆｕｓｃａのｍｅｔＡ発現を誘導することにより、培養ブロス中にＯ−アセチルホモセリンが蓄積した。例えば菌株ＭＡ−１５５９は、９ｇ／Ｌを超えるＯＡＨレベルを示した。他の操作を加えて、メチオニンを含めた他の産物へのＯＡＨの転換を誘導することも可能である。
【実施例１７】
【０３６４】
［実施例１７Ａ］Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるメチオニン産生に対するｍｅｔＡの変異の影響
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＡ）変異体を、ＭｅｔＡをコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発によって作製した（実施例６）。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−０６２２およびＭＡ−０６９９を、２３３位のリシンがアラニンに変異しているＭｅｔＡ（ＭｅｔＡ（Ｋ２３３Ａ））をコードする高コピー数プラスミドＭＢ４２３６を用いて形質転換した。このプラスミドは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｍｅｔＹ遺伝子の野生型コピーも含んでいる。菌株ＭＡ−０６９９は、プラスミドＭＢ４１９２を用いてＭＡ−０６２２を形質転換して、ｈｏｍ−ｔｈｒＢ遺伝子座を欠失させ、かつｇｐｄ−Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのｈｏｍ（Ｇ３６２Ｅ）発現カセットを組み込むことによって構築した。ｍｅｔＡおよびｍｅｔＹは、改変型のｔｒｃプロモーターの制御下において合成ｍｅｔＡＹオペロンで発現される。この菌株をＩＰＴＧ誘導の存在下または不在下で培養し、メチオニンの生産性をアッセイした。それぞれの菌株からのメチオニン産生を図２６にプロットする。示されるように、ＭＡ−６２２およびＭＡ−６９９の個々の形質転換体は、誘導条件下で培養すると、それぞれ３０００μＭを超えるメチオニンを産生した。構成的プロモーターの制御下でＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのｈｏｍＧ３６２Ｅ変異体を発現するＭＡ−６９９菌株は、ＩＰＴＧの不在下で３０００μＭを超えるメチオニンを産生した。ＩＰＴＧ誘導の結果、１０００〜２５００μＭ高いメチオニン産生がもたらされた。これらのデータは、ＭｅｔＡ（Ｋ２３３Ａ）の発現がメチオニン産生を増大させることを示している。メチオニン生合成の複数のポイントについて操作を加えることによって、産生をさらに増大させることが可能である。
【０３６５】
［実施例１７Ｂ］Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるメチオニン産生に対するｍｅｔＹ変異体の効果
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ（ＭｅｔＹ）変異体を、ＭｅｔＹをコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発によって作製した（実施例６）。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−６２２および菌株ＭＡ−６９９を、２３１位のアスパラギン酸がアラニンに変異しているＭｅｔＹ（ＭｅｔＹ（Ｄ２３１Ａ））をコードする高コピー数プラスミドＭＢ４２３８を用いて形質転換した。このプラスミドはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｍｅｔＡ遺伝子の野生型コピーも含み、このｍｅｔＡ遺伝子は実施例１６に記載したように発現される。この菌株をＩＰＴＧ誘導の存在下または不在下で培養し、メチオニン生産性をアッセイした。それぞれの菌株からのメチオニン産生を図２７にプロットする。図示されるように、ＭＡ−６２２の個々の形質転換体は、ＭｅｔＹ（Ｄ２３１Ａ）の発現を誘導する条件下で培養すると、それぞれ１８００μＭを超えるメチオニンを産生した。ＭＡ−６２２菌株は、個々の形質転換体によって産生されるメチオニンのレベルに変動がみられた（すなわち、形質転換体１および２は誘導条件下で約１８００μＭのメチオニンを産生し、一方形質転換体３および４は誘導条件下で４０００μＭを超えるメチオニンを産生した）。Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＨｏｍ変異体を発現するＭＡ−６９９菌株は、ＩＰＴＧの不在下で約３０００μＭのメチオニンを産生した。ＩＰＴＧ誘導により、メチオニン産生が１５００〜２０００μＭ増大した。これらのデータは、ＭｅｔＹ（Ｄ２３１Ａ）の発現によりメチオニン産生が増大することを示している。菌株ＭＡ−６９９は、ＭＡ−６２２と比べてもメチオニン産生が高かった。菌株ＭＡ−６９９でＭｅｔＹ（Ｄ２３１Ａ）を発現させると、該菌株中のメチオニン産生がさらに増大した。
【０３６６】
ｍｅｔＹの第２の変異体対立遺伝子をＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中で発現させ、メチオニン産生に対するその影響をアッセイした。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＭＡ−６２２株およびＭＡ−６９９株を、２３２位のグリシンがアラニン変異しているＭｅｔＹ（ＭｅｔＹ（Ｇ２３２Ａ））をコードする高コピー数プラスミドＭＢ４２３９を用いて形質転換した。この菌株をＩＰＴＧ誘導の存在下または不在下で培養し、メチオニン生産性をアッセイした。それぞれの菌株からのメチオニン産生を図２６にプロットする。図示されるように、ＭＡ−６２２の個々の形質転換体は、ＭｅｔＹ（Ｇ２３２Ａ）の発現を誘導する条件下で培養すると、それぞれ１７００μＭを超えるメチオニンを産生した。ＭＡ−６９９菌株は、ＩＰＴＧの不在下で約３０００μＭのメチオニンを産生した。ＩＰＴＧ誘導により、メチオニン産生は２０００〜３０００μＭ増大した。これらのデータは、ＭｅｔＹ（Ｇ２３２Ａ）の発現がメチオニン産生を増大させることを示している。菌株ＭＡ−６９９は、ＭＡ−６２２と比べてもメチオニン産生が高かった。菌株ＭＡ−６９９でＭｅｔＹ（Ｇ２３２Ａ）を発現させると、該菌株中のメチオニン産生がさらに増大した。
【実施例１８】
【０３６７】
ｍｅｔＡ及びｍｅｔＹ野生型及び突然変異体対立遺伝子を発現するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株におけるメチオニンの産生
５つの異なるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株においてメチオニン産生をアッセイした。これらの菌株のうち４つは、表１４に列挙するように、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのエピソーム性のｍｅｔＡ対立遺伝子およびｍｅｔＹ対立遺伝子の固有の組合せを発現する。第５の菌株ＭＡ−６２２は、エピソーム性のｍｅｔＡまたはｍｅｔＹ対立遺伝子を含まない。それぞれの菌株によって産生されたメチオニンの量（ｇ／Ｌ）を表２１に列挙する。
【０３６８】
最高レベルのメチオニン産生は、野生型ｍｅｔＡと変異体ｍｅｔＹの組合せ、または野生型ｍｅｔＹと変異体ｍｅｔＡの組合せのいずれかを発現する菌株で観察された。
【０３６９】
【表２４】
2009501512.tif 000030
【実施例１９】
【０３７０】
異種及び天然遺伝子双方を用いる遺伝子操作の組合せにより、アスパラギン酸由来のアミノ酸の産生が誘導される。
【０３７１】
前述のように、遺伝子の組合せによって、コリネバクテリウムをアスパラギン酸由来のアミノ酸産生用に最適化することが可能である。以下は、多重操作がどのようにしてメチオニンの産生を増大させうるかを示す例である。図２９は、菌株ＭＡ−２０２８およびＭＡ−２０２５による幾つかのアスパラギン酸由来のアミノ酸の産生を、それぞれの親菌株ＭＡ−１９０６およびＭＡ−１９０７の能力とともに示す。ＭＡ−１９０６は、プラスミドＭＢ４２７６を使用してＭＡ−０６２２の本来のｐｃｋ遺伝子座を欠失させて、ｐｃｋをＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓのｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）−ａｓｄオペロンの構成的発現用カセットで置換することによって構築した。ＭＡ−１９０７は、ＭＢ４２７６でＭＡ−０９３３を同様に形質転換して作製した。ＭＡ−２０２８およびＭＡ−２０２５は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの合成ｍｅｔＡＹＨオペロン（実施例３参照）の誘導的発現用エピソーム性プラスミドであるＭＢ４２７８を用いて、それぞれの親株を形質転換することによって構築した。親菌株ＭＡ−１９０６およびＭＡ−１９０７は、リシンまたはリシンおよびホモセリンをそれぞれ産生し；メチオニンおよびメチオニン経路の中間体も、これらの菌株によって産生される。リシンおよびホモセリンについての目盛りは左側のｙ軸上にあり；メチオニンおよびＯ−アセチルホモセリンについての目盛りは右側のｙ軸上にある。ＩＰＴＧ誘導によって、ＭＡ−２０２８はリシンのレベルの低下、およびメチオニンのレベルの増大を示した。ＭＡ−２０２５も、ＩＰＴＧ依存的にリシン産生が低下し、かつメチオニンおよびＯ−アセチルホモセリンの産生が増大したことを示した。
【０３７２】
菌株ＭＡ−１７４３は、遺伝子操作の組合せを使用してどのようにメチオニン産生株を作製することが可能であるかを示す別例である。菌株ＭＡ−１７４３は、ｍｅｔＡＹＨ発現プラスミドＭＢ４２７８を用いたＭＡ−１６６７の形質転換によって作製された。ＭＡ−１６６７は、最初に菌株ＭＡ−０４２２（実施例１５参照）をプラスミドＭＢ４０８４で処理してｔｈｒＢを欠失させ、次にプラスミドＭＢ４２８６を使用してｍｃｂＲ遺伝子座を欠失させ、かつｔｒｃＲＢＳ−Ｔ．ｆｕｓｃａのｍｅｔＡを含む発現カセットでｍｃｂＲを置換することによって構築した。この例において、およびｔｒｃＲＢＳが単一コピーにて組み込まれた他の例では、（アミノ酸産生による判断では）エピソーム性プラスミドに関して見られたほど、発現は強く制御されないようである。これは、阻害剤タンパク質ｌａｃＩｑのレベルの低下によるものである可能性がある。菌株ＭＡ−１７４３のＩＰＴＧ誘導により、Ｏ−アセチルホモセリンを含めたメチオニンおよび経路の中間体の産生が誘導される（図３０；リシンおよびホモセリンに関する目盛りは左側のｙ軸上にあり；メチオニンおよびＯ−アセチルホモセリンに関する目盛りは右側のｙ軸上にある）。
【０３７３】
菌株ＭＡ−１６８８およびＭＡ−１７９０は、ｍｅｔＡＹＨ発現プラスミドＭＢ４２７８を含めた複数の遺伝子を用いて作出した、別の２菌株である（図３１参照；リシンおよびホモセリンに関する目盛りは左側のｙ軸上にあり；メチオニンおよびＯ−アセチルホモセリンに関する目盛りは右側のｙ軸上にある）。ＭＡ−０５６９をＭＢ４２７８で形質転換することによってＭＡ−１６８８を作製した。ＭＡ−０５６９は、ＭＢ４１９２およびＭＢ４１６５を順次使用して、最初にｈｏｍ−ｔｈｒＢ遺伝子座を欠失させてｇｐｄ−Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのｈｏｍ（Ｇ３６２Ｅ）発現カセットを組み込み、次いでｍｃｂＲを欠失させることによって構築した。ＭＡ−１７９０の構築には、幾つかの工程を必要とした。最初に、ＭＡ−０４２８のＮＴＧ突然変異誘導体を、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａのｍｅｔＥ突然変異体の増殖を可能にする能力に基づいて同定した。簡潔に述べると、突然変異を誘発したＭＡ−０４２８細胞の集団を、スレオニンおよびローン（lawn）（１０６個を超える数のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｅｔＥ突然変異体の細胞）を含む最小培地で平板培養した。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｅｔＥ突然変異体は、増殖するためにメチオニンを必要とする。肉眼での観察後、輪状に増殖したＳａｌｍｏｎｅｌｌａに囲まれたコリネバクテリウムのコロニー（例えばＭＡ−０６００）を単離し、振とうフラスコ分析に供した。次に菌株ＭＡ−６００を前述と同様に突然変異誘発してエチオニン耐性とし、得られた１菌株をＭＡ−０９９３と名付けた。次いでプラスミドＭＢ４１６５を使用してＭＡ−０９９３からｍｃｂＲ遺伝子座を欠失させ、この操作により得られたのがＭＡ−１４２１であった。ＭＡ−１４２１をＭＢ４２７８で形質転換することによってＭＡ−１７９０を作製した。図３１は、ＩＰＴＧ誘導によりＭＡ−１６８８とＭＡ−１７９０のいずれにおいてもメチオニン産生が刺激され、リシンおよびホモセリンの力価が低下することを示している。
【０３７４】
図３２は、菌株ＭＡ−１６８８およびその親菌株の代謝産物レベルを示す。リシンおよびホモセリンに関する目盛りは左側のｙ軸上にあり；メチオニンおよびＯ−アセチルホモセリンに関する目盛りは右側のｙ軸上にある。菌株ＭＡ−１６６８は、プラスミドＭＢ４２８７を用いたＭＡ−０９９３の形質転換によって作製された。ＭＢ４２８７を用いた操作の結果、ｍｃｂＲ遺伝子座の欠失、およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｍｅｔＡ（Ｋ２３３Ａ）−ｍｅｔＢでの置換がもたらされる。菌株ＭＡ−１６６８は約２ｇ／Ｌのメチオニンを産生し、かつ元の菌株に対して低レベルのリシンおよびホモセリンを産生する。菌株ＭＡ−１６６８は、さらなる分子操作を加えて改良する余地がある。
【０３７５】
表２２は以上の試験で使用した菌株を列挙する。表中の「：：」は、「：：」の後の発現構築物が、「：：」の前に記載された遺伝子座に組み込まれることを示す。ＥｔｈＲ６およびＥｔｈＲ１０は、独立に単離したエチオニン耐性突然変異を表す。Ｍｃｆ３突然変異は、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａのｍｅｔＥ突然変異体の増殖を可能にする能力を与える（実施例１９参照）。Ｍｍｓ１３突然変異は、塩化メチオニンメチルスルホニウム耐性を与える（実施例１５参照）。
【０３７６】
【表２５】
2009501512.tif 000031
【０３７７】
2009501512.tif 000032
【０３７８】
2009501512.tif 000033
【０３７９】
本発明の多数の具体例を記載してきたが、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく種々の変更ができるのは理解されるであろう。従って、他の具体例は特許請求の範囲内のものである。
【図面の簡単な説明】
【０３８０】
【図１】細菌のメチオニン生合成経路のダイアグラムである。
【図２】細菌のシステイン及びセリン生合成経路のダイアグラムである。
【図３】細菌のスルフェート同化経路のダイアグラムである。
【図４Ａ】細菌の葉酸生合成経路のダイアグラムである。
【図４Ｂ】細菌のグリシン切断系のダイアグラムである。
【図５】プラスミドＭＢ３９６１（ベクター骨格プラスミド）の制限地図である。
【図６】プラスミドＭＢ４０９４（ベクター骨格プラスミド）の制限地図である。
【図７】プラスミドＭＢ４０８３（ｈｏｍ−ｔｈｒＢ欠失構築物）の制限地図である。
【図８】プラスミドＭＢ４０８４（ｔｈｒＢ欠失構築物）の制限地図である。
【図９】プラスミドＭＢ４１６５（ｍｃｂＲ欠失構築物）の制限地図である。
【図１０】プラスミドＭＢ４１６９（ｈｏｍ−ｔｈｒＢ欠失／ｇｐｄ−Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）−ａｓｄ置換構築物）の制限地図である。
【図１１】プラスミドＭＢ４１９２（ｈｏｍ−ｔｈｒＢ欠失／ｇｐｄ−Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ｈｏｍ（Ｇ３６２Ｅ）置換構築物）の制限地図である。
【図１２】プラスミドＭＢ４２７６（ｐｃｋ欠失／ｇｐｄ−Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）−ａｓｄ置換構築物）の制限地図である。
【図１３】プラスミドＭＢ４２８６（ｍｃｂＲ欠失／ｔｒｃＲＢＳ−Ｔ．ｆｕｓｃａ  ｍｅｔＡ置換構築物）の制限地図である。
【図１４Ａ】プラスミドＭＢ４２８７（ｍｃｂＲ欠失／ｔｒｃＲＢＳ−Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｍｅｔＡ（Ｋ２３３Ａ）−ｍｅｔＢ置換構築物）の制限地図である。
【図１４Ｂ】ｔｒｃＲＢＳプロモーターからｍｅｔＨ遺伝子の停止までにわたるＭＢ４２７８におけるＤＮＡ配列のヌクレオチド配列の図である（ｔｒｃＲＢＳ−Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｍｅｔＡＹＨ）。
【図１５】ＩＰＴＧの存在下及び不在下における、２つのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株であるＭＡ−４４２及びＭＡ−４４９からのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＭｅｔＡのイン・ビトロＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性を測定するためのアッセイの結果を示すグラフである。
【図１６】メチオニン及びＳ−ＡＭによる阻害に対するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−４４２におけるＭｅｔＡの感度を測定するためのアッセイの結果を示すグラフである。
【図１７】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−４５６、ＭＡ−５７０、ＭＡ−５７８、及びＭＡ−４７９において発現されたＴ．ｆｕｓｃａ  ＭｅｔＡのイン・ビトロＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性を測定するためのアッセイの結果を示すグラフである。尚、変化率は、タンパク質ナノグラム当たりの時間で割ったＯＤ４１２の変化の尺度である。
【図１８】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−４５６及びＭＡ−５７０において発現されたＴ．ｆｕｓｃａ  ＭｅｔＹのイン・ビトロＭｅｔＹ活性を測定するためのアッセイの結果を示すグラフである。尚、変化率は、タンパク質ナノグラム当たりの時間で割ったＯＤ４１２の変化として定義される。
【図１９】異種野生型及び突然変異体ｌｙｓＣ変異体を発現するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ及びＢ．ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ菌株においてリシンの産生を測定するためのアッセイの結果を示すグラフである。
【図２０】Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ｈｏｍ  Ｇ３６２Ｅ変異体の存在下及び不在下における、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−０３３１におけるリシン及びホモセリン産生を測定するためのアッセイからの結果を示すグラフである。
【図２１】Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ  ｐｐｃの存在下及び不在下において、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−０３３１及びＭＡ−０４６３におけるアスパラギン酸濃度を測定するためのいずれかのアッセイからの結果を示すグラフである。
【図２２】異種野生型ｄａｐＡ遺伝子で形質転換されたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−０３３１及びＭＡ−０４６３におけるリシンの産生を測定するためのアッセイからの結果を示すグラフである。
【図２３】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−１３７８及びその親菌株における代謝産物のレベルを測定するためのアッセイからの結果を示すグラフである。
【図２４】ＩＰＴＧの存在下または不在下で増殖したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−０４２８、ＭＡ−０５７９、ＭＡ−１３５１、ＭＡ−１５５９におけるホモセリン及びＯ−アセチルホモセリンレベルを測定するためのアッセイからの結果を示すグラフである。尚、ＩＰＴＧは、エピソーム性プラスミドで生じたＴ．ｆｕｓｃａ  ｍｅｔＡ遺伝子の発現を誘導する。
【図２５】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−１５５９及びその親菌株における代謝産物レベルを特定するためのアッセイからの結果を示すグラフである。
【図２６】ＭｅｔＡ  Ｋ２３３Ａ突然変異体ポリペプチドを発現する、２つのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−６２２及びＭＡ−６９９の発酵ブロス中のメチオニン濃度を示すグラフである。尚、ＩＰＴＧの存在下及び不在下で培養した細胞による産生を示す。
【図２７】ＭｅｔＹ  Ｄ２３１Ａ突然変異体ポリペプチドを発現する、２つのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−６２２及びＭＡ−６９９の発酵ブロス中のメチオニン濃度を示すグラフである。尚、ＩＰＴＧの存在下及び不在下において培養した細胞による産生を示す。
【図２８】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＭｅｔＹ  Ｇ２３２Ａ突然変異体ポリペプチドを発現する、２つのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−６２２及びＭＡ−６９９の発酵ブロス中のメチオニン濃度を示すグラフである。
【図２９】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−１９０６、ＭＡ−２０２８、ＭＡ−１９０７、及びＭＡ−２０２５における代謝産物レベルを測定するためのアッセイからの結果を示すグラフである。尚、菌株はＩＰＴＧの存在下及び不在下で増殖させた。
【図３０】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−１６６７及びＭＡ−１７４３における代謝産物レベルを測定するためのアッセイからの結果を示すグラフである。尚、菌株はＩＰＴＧの存在下及び不在下において増殖させた。
【図３１】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−０５６９、ＭＡ−１６８８、ＭＡ−１４２１、及びＭＡ−１７９０における代謝産物レベルを測定するためのアッセイからの結果を示すグラフである。尚、菌株はＩＰＴＧの不在下及び／または存在下で増殖させた。
【図３２】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−１６６８及びその親菌株における代謝産物レベルを測定するためのアッセイからの結果を示すグラフである。
【図３３】ある有用なポリペプチド及び核酸分子の配列を示す。
【図３４】あるさらなる有用なポリペプチド及び核酸分子の配列を示す。
【図１】
2009501512.tif 000034
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ−１】
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【図１４Ｂ−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３３−３】
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【図３３−４】
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【図３３−５】
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【図３３−６】
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【図３３−７】
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【図３３−８】
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【図３３−９】
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【図３３−１０】
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【図３３−１１】
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【図３３−１２】
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【図３３−１３】
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【図３３−１４】
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【図３３−１５】
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【図３３−１６】
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【図３３−１７】
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【図３３−１８】
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【図３３−１９】
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【図３３−２０】
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【図３３−２１】
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【図３３−２２】
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【図３３−２３】
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【図３３−２４】
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【図３３−２５】
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【図３３−２６】
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【図３３−２７】
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【図３３−２８】
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【図３３−２９】
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【図３３−３０】
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【図３３−３１】
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【図３３−３２】
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【図３３−３３】
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【図３３−３４】
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【図３３−３５】
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【図３３−３６】
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【図３３−３７】
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【図３３−３８】
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【図３３−３９】
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【図３３−４０】
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【図３３−４１】
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【図３３−４２】
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【図３３−４３】
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【図３３−４４】
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【図３３−４５】
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【図３３−４６】
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【図３３−４７】
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【図３３−４８】
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【図３３−４９】
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【図３３−５０】
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【図３３−５１】
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【図３３−５２】
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【図３３−５３】
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【図３３−５４】
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【図３３−５５】
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【図３３−５６】
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【図３３−５７】
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【図３３−５８】
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【図３３−５９】
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【図３３−６０】
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【図３３−６１】
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【図３３−６２】
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【図３３−６３】
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【図３３−６４】
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【図３３−６５】
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【図３３−６６】
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【図３３−６７】
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【図３３−６８】
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【図３３−６９】
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【図３３−７０】
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【図３３−７１】
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【図３３−７２】
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【図３３−７３】
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【図３３−７４】
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【図３３−７５】
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【図３３−７６】
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【図３３−７７】
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【図３３−７８】
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【図３３−７９】
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【図３３−８０】
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【図３３−８１】
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【図３３−８２】
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【図３３−８３】
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【図３３−８４】
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【図３３−８５】
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【図３３−８６】
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【図３３−８７】
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【図３３−８８】
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【図３３−８９】
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【図３３−９０】
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【図３３−９１】
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【図３３−９２】
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【図３３−９３】
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【図３３−９４】
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【図３３−９６】
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【図３３−９７】
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【図３３−９９】
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【図３３−１００】
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【図３３−１０１】
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【図３３−１０２】
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【図３３−１０３】
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【図３３−１０４】
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【図３３−１０５】
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【図３３−１０６】
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【図３３−１０７】
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【図３３−１０８】
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【図３３−１０９】
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【図３３−１１０】
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【図３３−１１１】
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【図３３−１１２】
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【図３３−１１３】
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【図３３−１１４】
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【図３３−１１５】
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【図３３−１１６】
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【図３３−１１７】
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【図３３−１１８】
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【図３３−１１９】
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【図３３−１２０】
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【図３３−１２１】
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【図３３−１２２】
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【図３３−１２３】
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【図３３−１２４】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３４−３】
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【図３４−４】
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【図３４−５】
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【図３４−６】
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【図３４−７】
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【図３４−８】
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【図３４−９】
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【図３４−１０】
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【図３４−１１】
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【図３４−１２】
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【図３４−１３】
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【図３４−１４】
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【図３４−１５】
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【図３４−１６】
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【図３４−１７】
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【図３４−１８】
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【図３４−１９】
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【図３４−２０】
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【図３４−２１】
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【図３４−２２】
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【図３４−２３】
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【図３４−２４】
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