(57)【要約】細胞表面レセプター（ＣＳＲ）およびリガンドアイソフォームを産生するための方法が提供される。具体的には、分泌、プロセシング、および細胞内追跡のための前駆体配列であるアイソフォーム融合体が提供される。この融合体をコードする核酸分子が宿主細胞において発現され、コードされ、かつ部分的または完全にプロセシングされたコードされたＣＳＲまたはリガンドアイソフォームが、細胞培地中に産生される。得られたポリペプチドは、必要に応じて、その検出および／または精製のためのエピトープタグを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種前駆体配列またはその十分な部分に、直接的かまたはポリペプチドリンカーを介して間接的に作動可能に連結されたレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）アイソフォームを含むポリペプチドであって、該部分は、該連結されたＲＴＫイントロン融合タンパク質の分泌、プロセシングおよび／または輸送を達成するのに十分である、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ＲＴＫアイソフォームは、内因性シグナル配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ＲＴＫアイソフォームは、内因性シグナル配列を含まない、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記前駆体配列は、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）プレ／プロ配列または分泌を達成するために十分なその部分、ならびにその対立遺伝子改変体および種改変体から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ｔＰＡプレ／プロ配列は、哺乳動物ｔＰＡプレ／プロ配列である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ｔＰＡプレ／プロ配列は、配列番号２に示されるアミノ酸の配列あるいはその対立遺伝子改変体あるいは少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する改変体を含み、そして該ｔＰＡ部分は、前記連結されたＲＴＫアイソフォームの分泌、プロセシングおよび／または輸送を達成する、請求項４または５のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ＲＴＫアイソフォームは、ＶＥＧＦＲ融合タンパク質、ＦＧＦＲ融合タンパク質、ＰＤＧＦＲ融合タンパク質、ＭＥＴ融合タンパク質、ＥＰＨ融合タンパク質、ＴＩＥ融合タンパク質、ＤＤＲ融合タンパク質およびＨＥＲ融合タンパク質から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ＲＴＫアイソフォームは、ＤＤＲ１、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２（ＥｒｂＢ２）、ＥｒｂＢ３、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−４、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＣＳＦ１Ｒ、ＫＩＴ、ＰＤＧＦＲ−Ａ、ＰＤＧＦＲ−Ｂ、ＴＥＫ、Ｔｉｅ−１、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、およびそれらの対立遺伝子改変体または任意のこれらのＲＴＫアイソフォームと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を有するそれらの改変体から選択され、該改変体は、対応するＲＴＫアイソフォームの少なくとも１つの活性を有する、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ＲＴＫアイソフォームは、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１〜１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１９、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２２７、配列番号２２９〜２３１、配列番号２３３、配列番号２４５、配列番号２４７〜２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２５９、配列番号２６１、配列番号２６３〜２７０、配列番号２７４〜２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２８９〜３０３のいずれか１つに示されるアミノ酸の配列またはその活性な部分を含む、請求項８のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ＲＴＫアイソフォームは、ｔＰＡ前駆体配列または分泌を達成するために十分なその部分にリンカーを介して作動可能に連結されている、請求項１〜９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記リンカーは、１種以上の制限酵素によって認識されるヌクレオチドの配列によってコードされる制限酵素リンカーである、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記制限酵素リンカーは、アイソフォームと、ｔＰＡプレ／プロ配列または分泌を達成するために十分なその部分との間に連結されている、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
ポリペプチドの精製および／または検出を容易にするタグを必要に応じて含む、請求項１〜１２のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記タグは、前記制限酵素リンカーと、ｔＰＡ前駆体配列または分泌を達成するために十分なその部分との間に連結されている、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記タグは、ｍｙｃタグである、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ＲＴＫアイソフォームは、ＶＥＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−４、ＴＥＫ、ＲＯＮ、ＭＥＴおよびそれらの対立遺伝子改変体または任意のこれらのＲＴＫアイソフォームと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を有するそれらの改変体から選択され、該改変体は、対応するＲＴＫアイソフォームの少なくとも１つの活性を有する、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４６および配列番号４８のいずれか１つに示されるアミノ酸の配列を含む、請求項１〜１６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１８】
構築物が、制限酵素リンカーを含み、そして前記タグが、該制限酵素リンカーと前記アイソフォームとの間に位置する、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記タグは、ポリＨｉｓタグである、請求項１３または１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記ＲＴＫアイソフォームは、ＨＥＲ−２またはその対立遺伝子改変体である、請求項１〜１９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号３８に示されるアミノ酸の配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
異種前駆体配列またはその十分な部分に直接的かまたはポリペプチドリンカーを介して間接的に作動可能に連結された終末糖化産物レセプター（ＲＡＧＥ）アイソフォームを含むポリペプチドであって、該部分は、該ＲＡＧＥアイソフォームの分泌および／または輸送を達成するのに十分である、ポリペプチド。
【請求項２３】
前記ＲＡＧＥアイソフォームは、内因性シグナル配列を含む、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記ＲＡＧＥアイソフォームタンパク質は、内因性シグナル配列を含まない、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記前駆体配列は、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）プレ／プロ配列、または分泌を達成するために十分なその部分、あるいはその対立遺伝子改変体、あるいは前記ＲＡＧＥアイソフォームの分泌および／またはプロセシングまたは輸送を達成するために該前駆体配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を有するその改変体である、請求項２２〜２４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記ｔＰＡプレ／プロ配列は、哺乳動物ｔＰＡプレ／プロ配列である、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記ｔＰＡプレ／プロ配列は、配列番号２に示されるアミノ酸の配列、またはその対立遺伝子改変体を含む、請求項２５および２６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記ＲＡＧＥアイソフォームは、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３のいずれかに示されるアミノ酸の配列、またはその活性部分あるいはそれらと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するそれらの改変体を含む、請求項２２〜２７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記ＲＡＧＥアイソフォームは、ｔＰＡプレ／プロ配列または分泌を達成するために十分なその部分にリンカーによって作動可能に連結されている、請求項２２〜２８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記リンカーは、１種以上の制限酵素によって認識されるヌクレオチドの配列によってコードされる制限酵素リンカーである、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記制限酵素リンカーは、前記ＲＡＧＥアイソフォームまたはその活性部分と、ｔＰＡプレ／プロ配列または分泌を達成するために十分なその部分との間に連結される、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
ポリペプチドの精製および／または検出を容易にするタグを必要に応じて含む、請求項２２〜３１のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記ポリペプチドは、制限酵素リンカーを含み、そして前記タグは、該制限酵素リンカーと、ｔＰＡプレ／プロ配列または分泌を達成するために十分なその部分との間に連結される、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記タグは、ｍｙｃタグである、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
配列番号４４に示されるアミノ酸の配列を含む、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
異種前駆体配列またはその十分な部分に直接的かまたはリンカーを介して間接的に作動可能に連結された腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）アイソフォームを含むポリペプチドであって、該部分は、該ＴＮＦＲアイソフォームの分泌、プロセシングおよび／または輸送を達成するのに十分である、ポリペプチド。
【請求項３７】
前記ＴＮＦＲアイソフォームは、内因性シグナル配列を含む、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
前記ＴＮＦＲアイソフォームは、内因性シグナル配列を含まない、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
前記前駆体配列は、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）プレ／プロ配列または分泌を達成するために十分なその部分、あるいはそれらの対立遺伝子改変体あるいはそれらと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するそれらの改変体である、請求項３６〜３８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４０】
前記ｔＰＡプレ／プロ配列は、哺乳動物ｔＰＡプレ／プロ配列である、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
前記ｔＰＡプレ／プロ配列は、配列番号２に示されるアミノ酸の配列を含む、請求項３９および４０のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記ＴＮＦＲアイソフォームは、ＴＮＦＲ１またはＴＮＦＲ２である、請求項３６〜４１のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記ＴＮＦＲアイソフォームは、ＴＮＦＲ２アイソフォームである、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
前記ＴＮＦＲアイソフォームは、配列番号２７２に示されるアミノ酸の配列またはその活性部分、あるいはそれらと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するそれらの改変体を含む、請求項４３に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
前記ＴＮＦＲアイソフォームは、ｔＰＡプレ／プロ配列または分泌、プロセシングもしくは輸送を達成するために十分なその部分にリンカーによって作動可能に連結される、請求項３６〜４４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４６】
前記リンカーは、１種以上の制限酵素によって認識されるヌクレオチドの配列によってコードされる制限酵素リンカーである、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
前記制限酵素リンカーは、アイソフォームまたはその活性部分と、ｔＰＡプレ／プロ配列または分泌を達成するために十分なその部分との間に連結される、請求項４６に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
ポリペプチドの精製および／または検出を容易にするタグを必要に応じて含む、請求項３６〜４７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４９】
前記ポリペプチドは、制限酵素リンカーを含み、そして前記タグは、該制限酵素リンカーと、ｔＰＡ前駆体配列または分泌を達成するために十分なその部分との間に連結される、請求項４８に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
前記タグは、ｍｙｃタグである、請求項３６〜４９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５１】
請求項１〜５０または請求項９２〜１０４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含む、核酸分子。
【請求項５２】
配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５および配列番号４７のいずれか１項に示されるヌクレオチドの配列を含む、核酸分子。
【請求項５３】
請求項５１または請求項５２の分子を含む、ベクター。
【請求項５４】
哺乳動物発現ベクターである、請求項５３に記載のベクター。
【請求項５５】
ｐＣＩベクターおよびｐｃＤＮＡ３．１ベクターから選択される、請求項５４に記載のベクター。
【請求項５６】
アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ＥＢＶ、ＳＶ４０、サイトメガロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、または人工染色体から選択される、請求項５３に記載のベクター。
【請求項５７】
請求項５３〜５６のいずれかに記載のベクターであって、該ベクターは、エピソームであるか、または該ベクターが導入される細胞の染色体中に組み込む、ベクター。
【請求項５８】
請求項５３〜５７のいずれかに記載のベクターを含む、細胞。
【請求項５９】
哺乳動物細胞である、請求項５８に記載の細胞。
【請求項６０】
前記哺乳動物細胞は、マウス細胞、ラット細胞、ヒト細胞、サル細胞、ニワトリ細胞、およびハムスター細胞から選択される、請求項５９に記載の細胞。
【請求項６１】
前記細胞は、ＣＨＯ細胞株、Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＭＴ２細胞株、マウスＮＳ０細胞株および他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマ細胞株およびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、２９３Ｔ細胞、２９３Ｓ細胞、２Ｂ８細胞、およびＨＫＢ細胞、およびＥＢＮＡ−１細胞から選択される、請求項５９または６０のいずれかに記載の細胞。
【請求項６２】
請求項５８〜６１のいずれかに記載の細胞を培養する工程を包含する、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームを産生する方法であって、該工程によって、該アイソフォームが、分泌される、方法。
【請求項６３】
前記分泌されたアイソフォームを細胞培養物から精製する工程をさらに包含する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記アイソフォームは、精製を容易にするためにエピトープタグを含み；そして
該エピトープタグは、該タンパク質上に発現される；
請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記精製されたタンパク質は、エキソプロテアーゼによって処理される、請求項６３および６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
前記エキソプロテアーゼは、プラスミン様プロテアーゼである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームを産生する方法であって、該方法は、該アイソフォームとシグナル配列とをコードするＤＮＡ構築物を導入する工程を包含し、該工程によって、該アイソフォームが、細胞から分泌される、方法。
【請求項６８】
前記細胞は、哺乳動物細胞である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記哺乳動物細胞は、マウス細胞、ラット細胞、ヒト細胞、サル細胞、ニワトリ細胞、およびハムスター細胞から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記細胞は、ＣＨＯ細胞株、Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＭＴ２細胞株、マウスＮＳ０細胞株および他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマ細胞株およびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、２９３Ｔ細胞、２９３Ｓ細胞、２Ｂ８細胞、およびＨＫＢ細胞およびＥＢＮＡ−１細胞から選択される、請求項６８および６９のいずれかに記載の方法。
【請求項７１】
前記核酸分子は、請求項５１または５２に記載のＤＮＡ構築物である、請求項６７〜７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
前記核酸分子は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、および核マイクロインジェクションから選択される方法によって細胞に導入される、請求項６７〜７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
前記核酸分子は、リン酸カルシウム、カチオン性脂質試薬、またはポリカチオンを使用することによって細胞に導入される、請求項６７〜７２のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
前記カチオン性脂質試薬は、カチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）とジオレオイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）との１：１（ｗ／ｗ）処方物；ポリカチオン性脂質２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）とジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）との３：１（ｗ／ｗ）処方物、ならびにＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥのうちの１つ以上を含む他の組成物から選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記分泌されたアイソフォームを前記細胞培養物から精製する工程をさらに包含する、請求項６７〜７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
前記アイソフォームを精製する工程は、前記タンパク質によって発現されたエピトープタグによって容易にされる、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記精製されたタンパク質は、エキソプロテアーゼによって処理される、請求項７５および７６のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】
前記エキソプロテアーゼは、プラスミン様プロテアーゼである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
細胞表面レセプター（ＣＳＲ）アイソフォームまたはリガンドアイソフォームを含むポリペプチドであって、
該ポリペプチドが、内因性前駆体配列を欠き；そして
該ポリペプチドが、そのＮ末端に１つ以上のさらなるアミノ酸を含む；
ポリペプチド。
【請求項８０】
前記内因性前駆体配列は、シグナル配列を含む、請求項７９に記載のポリペプチド。
【請求項８１】
前記内因性前駆体配列は、シグナル配列および１つのさらなるアミノ酸を含む、請求項７９に記載のポリペプチド。
【請求項８２】
前記ＣＳＲアイソフォームは、ＲＴＫアイソフォーム、ＴＮＦＲアイソフォーム、およびＲＡＧＥアイソフォームから選択されるアイソフォームである、請求項７９〜８１のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８３】
前記リガンドアイソフォームは、ＨＧＦのアイソフォームである、請求項７９〜８１のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８４】
配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１〜１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１９、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２２７、配列番号２２９〜２３１、配列番号２３３、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７〜２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２５９、配列番号２６１、配列番号２６３〜２７０、配列番号２７２、配列番号２７４〜２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２８９〜３０３、配列番号３５０、配列番号３５２および配列番号３５４のいずれか１つに示されるアミノ酸の配列の全てまたは部分、その対立遺伝子改変体または種改変体ならびにそれらと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有し、かつ配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１〜１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１９、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２２７、配列番号２２９〜２３１、配列番号２３３、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７〜２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２５９、配列番号２６１、配列番号２６３〜２７０、配列番号２７２、配列番号２７４〜２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２８９〜３０３、配列番号３５０、配列番号３５２および配列番号３５４のいずれかに示される対応するポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するその改変体を含む、請求項７９〜８３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８５】
前記Ｎ末端における１つ以上のさらなるアミノ酸は、制限酵素リンカー配列またはｔＰＡのプロ配列の部分またはエピトープタグのうちの１つ以上であり、制限酵素リンカーは、１種以上の制限酵素によって認識されるヌクレオチドの配列によってコードされる、請求項７９〜８４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８６】
前記Ｎ末端における１つ以上のさらなるアミノ酸は、ＧＡＲ、ＳＲ、またはＬＥである、請求項７９〜８５のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８７】
前記Ｎ末端における１つ以上のさらなるアミノ酸は、ＧＡＲＳＲまたはＧＡＲＬＥである、請求項７９〜８６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８８】
マルチマー化ドメインを含む、請求項１〜５０および請求項７９〜８７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８９】
請求項１〜５０および請求項７９〜８８のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、薬学的組成物。
【請求項９０】
被験体に請求項８９に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、疾患または状態を処置する方法であって、該疾患または状態は、同族ＣＳＲまたは同族リガンドによって媒介される、方法。
【請求項９１】
前記疾患または状態は、炎症性疾患、癌、新脈管形成媒介性疾患、または過剰増殖性疾患である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記疾患または状態は、眼疾患、アテローム硬化症、糖尿病、関節リウマチ、血管腫、創傷治癒、アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤーコプ病、ハンティングトン病、平滑筋増殖に関連する疾患、多発性硬化症、心臓血管疾患、および腎疾患から選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記癌は、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、リンパ性悪性疾患、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌または消化管癌を含む胃癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎細胞癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、および頭頸部癌から選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
異種前駆体配列またはその十分な部分に直接的かまたは間接的に作動可能に連結された肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）アイソフォームを含むポリペプチドであって、該部分は、該ＨＧＦアイソフォームの分泌および／または輸送を達成するのに十分である、ポリペプチド。
【請求項９５】
前記ＨＧＦアイソフォームは、内因性シグナル配列を含む、請求項９４に記載のポリペプチド。
【請求項９６】
前記ＨＧＦアイソフォームは、内因性シグナル配列を含まない、請求項９５に記載のポリペプチド。
【請求項９７】
前記前駆体配列は、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）プレ／プロ配列または分泌を達成するために十分なその部分、あるいはその対立遺伝子改変体、あるいは少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する改変体であり、該改変体は、前記連結されたアイソフォームの分泌、プロセシングおよび／または輸送を達成する、請求項９４〜９５のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項９８】
前記ｔＰＡプレ／プロ配列は、哺乳動物ｔＰＡプレ／プロ配列である、請求項９７に記載のポリペプチド。
【請求項９９】
前記ｔＰＡプレ／プロ配列は、配列番号２に示されるアミノ酸の配列、またはその対立遺伝子改変体を含む、請求項９７および９８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１００】
前記ＨＧＦアイソフォームは、配列番号３５０、配列番号３５２、および配列番号３５４のいずれか１つに示されるアミノ酸の配列、またはその活性部分を含む、請求項９４〜９９のうちのいずれかの請求項に記載のポリペプチド。
【請求項１０１】
前記ＨＧＦアイソフォームは、ｔＰＡプレ／プロ配列または前記連結されたアイソフォームの分泌、プロセシングおよび／または輸送を達成するために十分なその部分に、リンカーによって作動可能に連結されている、請求項９５〜１００のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１０２】
前記リンカーは、１種以上の制限酵素によって認識されるヌクレオチドの配列によってコードされる制限酵素リンカーである、請求項１０１に記載のポリペプチド。
【請求項１０３】
前記制限酵素リンカーは、アイソフォームまたはその活性部分と、ｔＰＡプレ／プロ配列または分泌を達成するために十分なその部分との間に連結されている、請求項１０２に記載のポリペプチド。
【請求項１０４】
ポリペプチドの精製および／または検出を容易にするタグを必要に応じて含む、請求項９５〜１０３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１０５】
請求項１０４に記載のポリペプチドであって、
該ポリペプチドが、制限酵素リンカーを含み、該リンカーが、１種以上の制限酵素によって認識されるヌクレオチドの配列によってコードされる制限酵素リンカーであり；そして
前記タグが、該制限酵素リンカーと、ｔＰＡ前駆体配列または分泌を達成するために十分なその部分との間に連結されている；
ポリペプチド。
【請求項１０６】
前記タグは、ｍｙｃタグである、請求項９４〜１０４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１０７】
前記アイソフォームは、イントロン融合タンパク質である、請求項１〜５０、請求項７８〜８７および請求項９４〜１０６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１０８】
前記アイソフォームは、イントロン融合タンパク質である、請求項６２〜７８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０９】
請求項５１または５２に記載の核酸分子、あるいは請求項５３〜５７のいずれかに記載のベクター、あるいは請求項５８〜６１のいずれかに記載の細胞を含む、薬学的組成物であって、前記疾患または状態が、ＣＳＲまたはそれらに対するリガンドによって媒介される、薬学的組成物。
【請求項１１０】
被験体に請求項１０９に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、疾患または状態を処置する方法であって、該疾患または状態は、同族ＣＳＲまたは同族リガンドによって媒介される、方法。
【請求項１１１】
前記疾患または状態は、炎症性疾患、癌、新脈管形成媒介性疾患、または過剰増殖性疾患である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記疾患または状態は、眼疾患、アテローム硬化症、糖尿病、関節リウマチ、血管腫、創傷治癒、アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤーコプ病、ハンティングトン病、平滑筋増殖に関連する疾患、多発性硬化症、心臓血管疾患、および腎疾患から選択される、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１３】
前記癌は、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、リンパ性悪性疾患、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌または消化管癌を含む胃癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎細胞癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、および頭頸部癌から選択される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
ＣＳＲまたはそれに対するリガンドによって媒介される疾患または状態を処置するための、請求項５１もしくは５２に記載のＤＮＡ構築物、または請求項５３〜５７のいずれかに記載のベクター、または請求項５８〜６１のいずれかに記載の細胞の、使用。
【請求項１１５】
ＣＳＲまたはそれに対するリガンドによって媒介される疾患または状態を処置するための医薬の処方のための、請求項５１もしくは５２に記載のＤＮＡ構築物、または請求項５３〜５７のいずれかに記載のベクター、または請求項５８〜６１のいずれかに記載の細胞の、使用。
【請求項１１６】
前記疾患または状態は、炎症性疾患、癌、新脈管形成媒介性疾患または過剰増殖性疾患である、請求項１１４または請求項１１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
優先権が、Ｐｅｉ  Ｊｉｎ、Ｈ．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｈｅｐａｒｄ、Ｃｏｒｎｅｌｉａ  ＧｏｒｍａｎおよびＪｕａｎ  Ｚｈａｎｇに対する米国仮特許出願第６０／７３６，１３４号（２００５年１１月１０日出願、発明の名称「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ＡＮＤ  ＬＩＧＡＮＤ  ＩＳＯＦＯＲＭＳ」）に基づいて主張される。
【０００２】
本願は、Ｐｅｉ  Ｊｉｎ、Ｈ．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｈｅｐａｒｄ、Ｃｏｒｎｅｌｉａ  ＧｏｒｍａｎおよびＪｕａｎ  Ｚｈａｎｇに対する米国特許出願番号（代理人整理番号１７１１８−０４１００１／２８２２）（本願と同日に出願、発明の名称「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ＡＮＤ  ＬＩＧＡＮＤ  ＩＳＯＦＯＲＭＳ」、これもまた、米国仮特許出願第６０／７３６，１３４号に基づく優先権を主張する）に関連する。
【０００３】
本願は、米国特許出願第１０／８４６，１１３号（２００４年５月１４日出願）、および対応する国際ＰＣＴ出願第ＷＯ  ０５／０１６９６６号（２００５年２月２４日公開、発明の名称「ＩＮＴＲＯＮ  ＦＵＳＩＯＮ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＩＤＥＮＴＩＦＹＩＮＧ  ＡＮＤ  ＵＳＩＮＧ  ＳＡＭＥ」）に関連する。本願はまた、米国特許出願第１１／１２９，７４０号（２００５年５月１３日出願）、および対応する国際ＰＣＴ出願第ＵＳ２００５／１７０５１号（２００５年５月１３日出願、発明の名称「ＣＥＬＬ  ＳＵＲＦＡＣＥ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ＩＳＯＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＩＤＥＮＴＩＦＹＩＮＧ  ＡＮＤ  ＵＳＩＮＧ  ＴＨＥ  ＳＡＭＥ」）に関連する。その出願はまた、米国仮特許出願第６０／６７８，０７６号（発明の名称「ＩＳＯＦＯＲＭＳ  ＯＦ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ＦＯＲ  ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＧＬＹＣＡＴＩＯＮ  ＥＮＤ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ（ＲＡＧＥ）ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＩＤＥＮＴＩＦＹＩＮＧ  ＡＮＤ  ＵＳＩＮＧ  ＳＡＭＥ」、２００５年５月４日出願）に関連する。本願はまた、米国特許出願番号（代理人整理番号１７１１８−０４５００１／２８２４）および国際出願番号（代理人整理番号１７１１８−０４５Ｗ０１／２８２４ＰＣ）（発明の名称「ＨＥＰＡＴＯＣＹＴＥ  ＧＲＯＷＴＨ  ＦＡＣＴＯＲ  ＩＮＴＲＯＮ  ＦＵＳＩＯＮ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ」、本願と同日に出願、これらの各々は、米国仮特許出願第６０／７３５，６０９号（２００５年１１月１０日出願）に基づく優先権を主張する）に関連する。
【０００４】
許容される場合、上記出願、仮出願および国際出願ならびに本明細書中の開示全体を通して記載される任意の出願の各々の対象は、本明細書中にそれらへの参考として援用される。
【０００５】
（発明の分野）
細胞表面レセプター（ＣＳＲ）アイソフォームおよびリガンドアイソフォームの産生のための方法が、提供される。特に、分泌、プロセシングおよび細胞内輸送のための前駆体配列を含むアイソフォーム融合体が、提供される。上記融合体をコードする核酸分子は、宿主細胞中で発現され、そしてそのコードされ、かつ部分的かまたは完全にプロセシングされたＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームは、細胞培養媒体中に産生される。得られたポリペプチドは、必要に応じて、その検出および／または精製のためのエピトープタグを含む。
【背景技術】
【０００６】
（背景）
細胞シグナル伝達経路は、細胞外シグナル、細胞間シグナルおよび細胞内シグナルを伝達するために相互作用するポリペプチドおよび低分子を含む分子のネットワークを含む。このような経路は、上記経路の１つのメンバーから次のメンバーにシグナルを伝達する中継のように相互作用する。上記経路の１つのメンバーの活性のモジュレーションは、シグナル伝達経路によって伝達され得、表現型、およびシグナルに対する細胞または生物の応答に影響を及ぼすような、他の経路のメンバーの活性のモジュレーションおよびそのようなシグナル伝達の結果のモジュレーションをもたらす。疾患および障害は、シグナル伝達経路の誤調節、またはシグナル伝達経路のモジュレーションの変化を含み得る。薬物開発の目的は、シグナル伝達経路におけるより正常な調節を回復するためにこのような誤制御された経路を標的することである。
【０００７】
レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、とりわけ、多くのシグナル伝達経路に関与するポリペプチドである。ＲＴＫは、種々の細胞プロセス（細胞の分裂、増殖、分化、移動および代謝を含む）において役割を果たす。ＲＴＫは、リガンドによって活性化され得る。このような活性化は立ち代って、自己分泌またはパラ分泌性の細胞シグナル伝達経路、例えば二次メッセンジャーの活性化を始動することなどによって、シグナル伝達経路中の事象を活性化させ、これは特異的な生物学的効果をもたらす。ＲＴＫに対するリガンドは同族レセプターに特異的に結合する。
【０００８】
ＲＴＫは、乳癌および結腸直腸癌、胃癌、神経膠腫ならびに中胚葉性由来の腫瘍などの癌を含めたいくつかの疾患に関連するとされている。ＲＴＫの調節不備がいくつかの癌で注目されている。例えば、乳癌をｐ１８５−ＨＥＲ２の発現の増幅と関連づけることができる。ＲＴＫはまた、糖尿病性網膜症および黄斑変性症を含めた眼の疾患に関連づけられている。ＲＴＫはまた、生理的な脈管形成および腫瘍性脈管形成を含めた新脈管形成に関与する経路の調節にも関連している。ＲＴＫはまた、細胞の増殖、遊走および生存の調節に関連するとされている。
【０００９】
ヒト上皮増殖因子レセプター２遺伝子（ＨＥＲ−２；ＥｒｂＢ２とも呼ばれる）は、癌遺伝子として暗示されているレセプターチロシンキナーゼをコードしている。ＨＥＲ−２は、約１８５ｋＤａのポリペプチド（Ｐ１８５ＨＥＲ２）をコードしている４．５Ｋｂの主要なｍＲＮＡ転写物を有する。Ｐ１８５ＨＥＲ２は、チロシンキナーゼ活性を有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン含む。いくつかのポリペプチド形態がＨＥＲ−２遺伝子から産生され、これには、タンパク質分解性プロセシングによって生じたポリペプチドおよび選択的スプライシングされたＲＮＡから生じた形態が含まれる。ヘルスタチン（ｈｅｒｓｔａｔｉｎ）およびそのフラグメントは、ＨＥＲ−２遺伝子によってコードされているＨＥＲ−２結合タンパク質である。ヘルスタチン（ｐ６８ＨＥＲ−２とも呼ばれる）は、ｐ１８５−ＨＥＲ２レセプターをコードしている遺伝子の選択的スプライシングされた改変体によってコードされている。例えば、１つのヘルスタチンは胎児の腎臓および肝臓で生じ、Ｃ末端に、膜局在レセプターに関連する、７９個のアミノ酸のイントロンにコードされた挿入物を含む（特許文献１および特許文献２を参照のこと）。いくつかのヘルスタチン改変体が同定されている（例えば、特許文献１；特許文献２、特許文献３；特許文献４；特許文献５および特許文献６参照）。ヘルスタチンは上皮増殖因子（ＥＧＦ）相同ドメインを欠いており、ｐ１８５−ＨＥＲ２の細胞外ドメインの一部、代表的には最初の３４０個のアミノ酸を含む。ヘルスタチンは、ヒト上皮増殖因子レセプターのサブドメインＩおよびＩＩ、ＨＥＲ−２細胞外ドメインおよびイントロンによってコードされているＣ末端ドメインを含む。得られるヘルスタチンポリペプチドは、代表的には４１９個のアミノ酸を含む（サブドメインＩおよびＩＩから３４０個のアミノ酸、加えてイントロン８から７９個のアミノ酸）。ヘルスタチンタンパク質は細胞外ドメインＩＶ、ならびに膜貫通ドメインおよびキナーゼドメインを欠く。
【００１０】
対照的に、上皮増殖因子およびトランスフォーミング増殖因子−αなどの正に作用するＥＧＦＲリガンドが、このようなドメインを保有する。さらに、ヘルスタチンの結合によってレセプターは活性化されない。ヘルスタチンは、レセプターチロシンキナーゼのＥＧＦファミリーのメンバー、ならびにインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）レセプターおよび他のレセプターを阻害することができる。ヘルスタチンは、トランスリン酸化およびレセプター活性化に必要である生産的なレセプターダイマー（ホモダイマーおよびヘテロダイマー）の形成を妨げる。あるいは、またはさらに、ヘルスタチンは、レセプター末端への結合に関してリガンドと競合することができる（特許文献１；特許文献２、特許文献３；特許文献４；特許文献５および特許文献６を参照のこと）。
【００１１】
腫瘍壊死因子レセプターファミリー（ＴＮＦＲ）は、シグナル伝達および調節に関与しているレセプターファミリーの別例である。ＴＮＦリガンドおよびレセプターファミリーは、細胞の分化、活性化、および生存度に関与するものを含めた様々なシグナル伝達経路を調節する。ＴＮＦＲは、シグナル伝達に関わる、リガンド結合ドメインを含めた細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。さらに、ＴＮＦＲは代表的には、細胞表面でトリマー化するトリマータンパク質である。ＴＮＦＲは、炎症性疾患、中枢神経系疾患、自己免疫疾患、喘息におけるものなどの気道過敏症状態、関節リウマチおよび炎症性腸疾患において役割を果たす。ＴＮＦＲは、ウイルス感染などの感染症においても役割を果たす。
【００１２】
ＴＮＦレセプターファミリー（ＴＮＦＲ）は細胞外ドメイン間で相同性を示す。これらのレセプターのいくつかはアポトーシスを開始し、いくつかは細胞増殖を開始し、いくつかは両方の活性についても開始する。このファミリーによるシグナル伝達は、トリマーリガンドによるレセプターのクラスタリング、および続くタンパク質とレセプターの細胞質領域との会合を要する。ＴＮＦＲファミリーは、相同的な、８０個のアミノ酸の細胞質ドメインを有するサブファミリーを含む。このドメインは、デスドメイン（ＤＤ）と呼ばれ、このドメインを含むタンパク質がアポトーシスに関与していることから命名された。ＴＮＦＲファミリーのメンバー間の区別は、明確に異なる遺伝子によってコードされた２つのＴＮＦＲによって例示される。ＴＮＦＲ１（５５ｋＤａ）は、アポトーシスの開始および転写因子ＮＦκＢの活性化のシグナルを行う。ＴＮＦＲ２（７５ｋＤａ）の機能はＮＦκＢの活性化のシグナルを行うが、アポトーシスの開始のシグナルを行わない。ＴＮＦＲ１はＤＤを含んでおり、ＴＮＦＲ２はＤＤを含まない。
【００１３】
いくつかの場合において、変化した分子の蓄積は、病理学的な状態および疾患の原因であり得る。他の場合において、疾患または状態は、変化した分子代謝をもたらし得、そして変化した形態および／または量における特定の分子の蓄積をもたらす。１つの例は、糖化された産物としてのタンパク質および脂質の蓄積である。終末糖化産物（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）（ＡＧＥ）と称される産物は、アルドース糖の存在下におけるタンパク質および脂質の非酵素的なグリケーションおよび酸化の結果である。最初の初期産物は、可逆的なシッフ塩基およびアマドリ産物として形成される。分子の再配列は、ＡＧＥを形成する不可逆的な改変をもたらす。ＡＧＥは、ヒトにおける正常な老化プロセスの間に蓄積する。ＡＧＥの蓄積は、特定の疾患および状態において加速され得る
ＡＧＥの蓄積は、細胞結合タンパク質とのそれらの相互作用によって細胞および組織の代謝およびシグナル伝達に影響を及ぼす。１つのこのような結合タンパク質は、終末糖化産物レセプター（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）（ＲＡＧＥ）である。ＲＡＧＥとＡＧＥとの相互作用は、ＲＡＳ−ＭＡＰキナーゼ経路およびＮＦ−κＢの活性化を含む細胞の酸化ストレス応答の誘導に関係する。
【００１４】
ＲＡＧＥはまた、低分子およびタンパク質を含む他の分子に結合する。Ｓ１００Ａ１２（ＥＮ−ＲＡＧＥ、ｐ６およびカルグラニュリンＣとしても公知である）は、ＲＡＧＥに対するリガンドとして作用し得るカルシウム結合タンパク質である。ＲＡＧＥはまた、アミロイドβ−ペプチド、Ａβ、アミリン、血清アミロイドＡおよびプリオン由来ペプチドを含むβ−シート繊維状物質と相互作用し得る。アムホテリン（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｎ）（ヘパリン結合性神経突起伸長促進タンパク質）はまた、ＲＡＧＥに対するリガンドである。これらのリガンド相互作用の各々は、シグナル伝達経路に影響し得る。ＲＡＧＥに対するこれらのリガンドの結合は、レセプター依存性シグナル伝達によって媒介される細胞活性化（それによって、種々の疾患プロセスを媒介するか、またはそれに関与する）をもたらす。これらとしては、糖尿病合併症、アミロイドーシス、炎症性／免疫障害および腫瘍が挙げられる。
【００１５】
種々の疾患および状態におけるそれらの関与に起因して、細胞表面レセプター（ＣＳＲ）（例えば、ＲＴＫ、ＲＡＧＥおよびＴＮＦＲ）およびそれらのリガンドは、治療的介入のための標的である。とりわけ、目的の治療用タンパク質は、種々の疾患および状態（癌、新脈管形成、ならびに望ましくない細胞増殖および炎症性反応を含む他の疾患）に関与するＣＳＲの活性をモジュレートする細胞表面レセプター（ＣＳＲ）のアイソフォームおよびＣＳＲのリガンドのアイソフォームである（例えば、同時係属中の特許文献７および対応する特許文献８；特許文献９および対応する特許文献１０；特許文献１１および対応する特許文献１２および国際出願第ＰＣＴＵＳ２００６／１７７８６号明細書；ならびに特許文献１３および対応する米国特許出願番号（代理人整理番号１７１１８−０４５００１／２８２４）および国際出願番号（代理人整理番号１７１１８−０４５ＷＯ１／２８２４ＰＣ）を参照のこと）。これらの治療用タンパク質は、シグナル伝達経路のモジュレーションの調節不備および／または変化を含む疾患および障害を標的とする。
【特許文献１】米国特許第６，４１４，１３０号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４００２２７８５号明細書
【特許文献３】米国特許出願第０９／２３４，２０８号明細書
【特許文献４】米国特許出願０９／５０６，０７９号明細書
【特許文献５】国際公開第００４４４０３号パンフレット
【特許文献６】国際公開第０１６１３５６号パンフレット
【特許文献７】米国特許出願第１０／８４６，１１３号明細書
【特許文献８】国際公開第０５／０１６９６６号パンフレット
【特許文献９】米国特許出願第１１／１２９，７４０号明細書
【特許文献１０】国際公開第０５／１１３５９６号パンフレット
【特許文献１１】米国仮特許出願第６０／６７８，０７６号明細書
【特許文献１２】米国特許出願第１１／４２９，０９０号明細書
【特許文献１３】米国仮特許出願第６０／７３５，６０９号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
このような治療用分子の有効使用を可能にするために、産生のための方法を最適化することが、重要である。このような分子は、公知であり、かつ利用可能であるが、広範にわたる普及のため、そしてその使用のために多量に産生する必要性が、存在する。したがって、本発明書中の目的に共通して、このような治療用アイソフォームならびに上記治療用分子とその分泌、発現、および／または精製を改善するポリペプチドとの融合体をコードする核酸分子を産生するための方法を提供することが、目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（要旨）
ＣＳＲおよびリガンドの治療用アイソフォームならびに分泌、発現、および／または精製を改善する治療用アイソフォームの融合体をコードする核酸分子の産生のための方法および産物が、提供される。上記アイソフォームは、さらに、Ｆｃドメインを含むさらなる機能的部分（例えば、マルチマー化ドメイン（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ））を含み得る。
【００１８】
レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）アイソフォームの分泌および／または輸送を達成するために十分な異種前駆体配列に作動可能に連結された、イントロン融合タンパク質を含むＲＴＫアイソフォームのポリペプチドが、提供される。作動可能な連結について本明細書中に提供されるＲＴＫアイソフォームは、内因性シグナル配列を含むものおよび内因性シグナル配列を含まないものを含む。
【００１９】
組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）前駆体配列（ｔＰＡプレ／プロ配列）、またはＲＴＫアイソフォームの分泌を達成するためのｔＰＡプレ／プロ配列の十分な部分に作動可能に連結されたＲＴＫアイソフォームポリペプチドが、本明細書中に提供される。配列番号２に示されるアミノ酸の配列を有するｔＰＡプレ／プロ配列、またはその対立遺伝子改変体に作動可能に連結されたＲＴＫアイソフォームポリペプチドが、含まれる。
【００２０】
ｔＰＡプレ／プロ配列に作動可能に連結されたＤＤＲ１、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−４、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＣＳＦ１Ｒ、ＫＩＴ、ＰＤＧＦＲ−Ａ、ＰＤＧＦＲ−Ｂ、ＴＥＫ、Ｔｉｅ−１、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、またはＶＥＧＦＲ−３のアイソフォームを含むＶＥＧＦＲポリペプチド、ＦＧＦＲポリペプチド、ＰＤＧＦＲポリペプチド、ＭＥＴポリペプチド、ＥＰＨポリペプチド、ＴＩＥポリペプチド、ＤＤＲポリペプチド、またはＨＥＲポリペプチドのアイソフォームであるＲＴＫのいずれか１つを含むＲＴＫアイソフォームポリペプチドが、本明細書中に提供される。
【００２１】
ＲＴＫアイソフォームの分泌を達成するために十分なｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは一部に作動可能に連結された配列番号１４０、１４２、１４３、１４５、１４７、１４９、１５０、１５２、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１〜１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８１、１８３、１８５、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９〜２３１、２３３、２４５、２４７〜２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３〜２７０、２７４〜２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２８９〜３０３のいずれか１つに示されるアミノ酸の配列、またはその活性部分を有するＲＴＫアイソフォームが、本明細書中に提供される。
【００２２】
制限酵素リンカーを含むリンカーによってｔＰＡプレ／プロ配列に作動可能に連結されたイントロン融合タンパク質を含むＲＴＫアイソフォームが、本明細書中に提供される。ＲＴＫアイソフォームのポリペプチドが、含まれ、ここで制限酵素リンカーは、上記アイソフォームと、上記アイソフォームの分泌を達成するためのｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分との間に連結される。ポリペプチドの精製および／または検出を容易にするタグを必要に応じて含むＲＴＫアイソフォームのポリペプチドもまた、含まれる。上記タグは、制限酵素リンカーと、上記ポリペプチドの分泌を達成するためのｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分との間に連結され得る。あるいは、上記タグは、上記制限酵素リンカーと上記アイソフォームとの間に連結され得る。上記タグは、ｍｙｃタグまたはポリＨｉｓタグであり得る
制限酵素リンカー、およびまた、必要に応じてｍｙｃタグを含む、ｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分に作動可能に連結されたＶＥＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−４、ＴＥＫ、ＲＯＮ、またはＭＥＴのアイソフォームポリペプチドが、本明細書中に提供される。ｔＰＡ−イントロン融合タンパク質融合体を含むｔＰＡ−アイソフォーム融合体は、配列番号３２、３４、３６、４０、４２、４６、または４８のいずれか１つに示されるアミノ酸の配列を有する。
【００２３】
制限酵素リンカー、およびまた、必要に応じてポリＨｉｓタグを含むｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分に作動可能に連結されたイントロン融合タンパク質を含むＨＥＲ２のアイソフォームポリペプチドが、本明細書中に提供される。ｔＰＡ−ＨＥＲ２アイソフォームは、配列番号３８に示されるアミノ酸の配列を有する。
【００２４】
終末糖化産物レセプター（ＲＡＧＥ）アイソフォームの分泌および／または輸送を達成するするために十分な異種前駆体配列に作動可能に連結されたイントロン融合タンパク質を含むＲＡＧＥアイソフォームのポリペプチドが、本明細書中に提供される。作動可能な連結について本明細書中に提供されるＲＡＧＥアイソフォームは、内因性シグナル配列を含むものおよび内因性シグナル配列を含まないものを含む。
【００２５】
組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）前駆体配列（ｔＰＡプレ／プロ配列）、またはＲＡＧＥアイソフォームの分泌を達成するためのｔＰＡプレ／プロ配列の十分な部分に作動可能に連結されたＲＡＧＥアイソフォームポリペプチドが、本明細書中に提供される。配列番号２に示されるアミノ酸の配列を有するｔＰＡプレ／プロ配列、またはその対立遺伝子改変体に作動可能に連結されたＲＡＧＥアイソフォームポリペプチドが、含まれる。
【００２６】
ＲＡＧＥアイソフォームの分泌を達成するために十分なｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分に作動可能に連結された、配列番号２３５、２３７、２３９、２４１、２４３のいずれか１つに示されるアミノ酸の配列またはその活性部分を有するＲＡＧＥアイソフォームが、本明細書中に提供される。
【００２７】
制限酵素リンカーを含むリンカーによってｔＰＡプレ／プロ配列に作動可能に連結された、イントロン融合タンパク質を含むＲＡＧＥアイソフォームが、本明細書中に提供される提供される。ＲＡＧＥアイソフォームイントロン融合タンパク質のポリペプチドが、含まれ、ここで上記制限酵素リンカーは、上記アイソフォームと、上記アイソフォームの分泌を達成するためのｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分との間に連結される。ポリペプチドの精製および／または検出を容易にするタグを必要に応じて含むＲＴＫアイソフォームのポリペプチドもまた、含まれる。上記タグは、上記制限酵素リンカーと、上記ポリペプチドの分泌を達成するためのｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分との間に連結され得る。上記タグは、ｍｙｃタグであり得る。
【００２８】
制限酵素リンカー、およびまた、必要に応じてｍｙｃタグを含むｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分に作動可能に連結されたＲＡＧＥのアイソフォームポリペプチドが、本明細書中に提供される。ｔＰＡ−ＲＡＧＥアイソフォームは、配列番号４４に示されるアミノ酸の配列を有する。
【００２９】
腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）アイソフォームの分泌および／または輸送を達成するするために十分な異種前駆体配列に作動可能に連結されたイントロン融合タンパク質を含むＴＮＦＲアイソフォームのポリペプチドが、本明細書中に提供される。作動可能な連結について本明細書中に提供されるＴＮＦＲアイソフォームは、内因性シグナル配列を含むものおよび内因性シグナル配列を含まないものを含む。
【００３０】
組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）前駆体配列（ｔＰＡプレ／プロ配列）、またはＴＮＦＲアイソフォームの分泌を達成するためのｔＰＡプレ／プロ配列の十分な部分に作動可能に連結された、ＴＮＦＲアイソフォームポリペプチドが、本明細書中に提供される。配列番号２に示されるアミノ酸の配列を有するｔＰＡプレ／プロ配列、またはその対立遺伝子改変体に作動可能に連結されたＴＮＦＲアイソフォームポリペプチドが、含まれる。
【００３１】
ｔＰＡプレ／プロ配列に作動可能に連結されたＴＮＦＲ１またはＴＮＦＲ２のアイソフォームを含むＴＮＦＲアイソフォームポリペプチドが、本明細書中に提供される。
【００３２】
ＴＮＦＲ２アイソフォームの分泌を達成するために十分なｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分に作動可能に連結された、配列番号２７２のいずれか１つに示されるアミノ酸の配列またはその活性部分を有するＴＮＦＲ２アイソフォームが、本明細書中に提供される。
【００３３】
制限酵素リンカーを含むリンカーによってｔＰＡプレ／プロ配列に作動可能に連結された、イントロン融合タンパク質を含むＴＮＦＲアイソフォームポリペプチドが、本明細書中に提供される提供される。ＴＮＦＲアイソフォームのポリペプチドが、含まれ、ここで上記制限酵素リンカーは、上記アイソフォームと、上記アイソフォームの分泌を達成するためのｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分との間に連結される。ポリペプチドの精製および／または検出を容易にするタグを必要に応じて含むＴＮＦＲアイソフォームのポリペプチドもまた、含まれる。上記タグは、上記制限酵素リンカーと、上記ポリペプチドの分泌を達成するためのｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分との間に連結され得る。上記タグは、ｍｙｃタグであり得る。
【００３４】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）アイソフォームの分泌および／または輸送を達成するするために十分な異種前駆体配列に作動可能に連結された、イントロン融合タンパク質を含むＨＧＦアイソフォームのポリペプチドが、本明細書中に提供される。作動可能な連結について本明細書中に提供されるＨＧＦアイソフォームは、内因性シグナル配列を含むものおよび内因性シグナル配列を含まないものを含む。
【００３５】
組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）前駆体配列（ｔＰＡプレ／プロ配列）、またはＨＧＦアイソフォームの分泌を達成するためのｔＰＡプレ／プロ配列の十分な部分に作動可能に連結された、ＨＧＦアイソフォームポリペプチドが、本明細書中に提供される。配列番号２に示されるアミノ酸の配列を有するｔＰＡプレ／プロ配列、またはその対立遺伝子改変体に作動可能に連結されたＨＧＦアイソフォームポリペプチドが、含まれる。
【００３６】
ＨＧＦアイソフォームの分泌を達成するために十分なｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分に作動可能に連結された、配列番号３５０、３５２、もしくは３５４のいずれか１つに示されるアミノ酸の配列またはその活性部分を有するＨＧＦアイソフォームが、本明細書中に提供される。
【００３７】
制限酵素リンカーを含むリンカーによってｔＰＡプレ／プロ配列に作動可能に連結された、イントロン融合タンパク質を含むＨＧＦアイソフォームポリペプチドが、本明細書中に提供される提供される。ＨＧＦアイソフォームのポリペプチドが、含まれ、ここで上記制限酵素リンカーは、上記アイソフォームと、上記アイソフォームの分泌を達成するためのｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分との間に連結される。ポリペプチドの精製および／または検出を容易にするタグを必要に応じて含むＨＧＦアイソフォームのポリペプチドもまた、含まれる。上記タグは、上記制限酵素リンカーと、上記ポリペプチドの分泌を達成するためのｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分との間に連結され得る。上記タグは、ｍｙｃタグであり得る。
【００３８】
対立遺伝子改変体、種改変体、または本明細書中に提供される任意のポリペプチドアイソフォームと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有し、かつ本明細書中に提供されるポリペプチドのアイソフォームと比較して活性を保持する改変体であるポリペプチドもまた、包含される。
【００３９】
異種前駆体配列に作動可能に連結されたＲＴＫ、ＴＮＦＲ、またはＲＡＧＥのアイソフォームを含むＣＳＲアイソフォームをコードする核酸分子を含むＤＮＡ構築物が、本明細書中に提供される。これらには、ｔＰＡプレ／プロ配列アイソフォームポリペプチド融合体の核酸が、含まれる。配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、または４７に示される核酸の配列を有する核酸分子、およびその対立遺伝子改変体が、本明細書中に提供される。
【００４０】
上記核酸分子を含むベクターが、本明細書中に提供される。ベクターは、哺乳動物ベクターを含む。哺乳動物ベクターには、ｐＤｒｉｖｅベクター、ｐＣＩベクター、またはｐｃＤＮＡ  ３．１ベクターが、含まれる。ベクターはまた、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ＥＢＶ、ＳＶ４０、サイトメガロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、または人工染色体を含み得る。ベクターは、エピソームとして保持するか、またはそれらが導入される細胞の染色体中に組み込むものであり得る。
【００４１】
本明細書中に記載されるようなベクターを含む細胞もまた、提供される。細胞は、哺乳動物細胞を含む。哺乳動物細胞には、ＣＨＯ細胞株、Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＭＴ２細胞株、マウスＮＳ０細胞株および他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマ細胞株およびヘテロハイブリドーマ（ｈｅｔｅｒｏｈｙｂｒｉｄｏｍａ）細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｓ９３Ｓ細胞、２Ｂ８細胞、およびＨＫＢ細胞、およびＥＢＮＡ−１細胞を含む、マウス細胞、ラット細胞、ヒト細胞、サル細胞、ニワトリ細胞、およびハムスター細胞が、含まれる。
【００４２】
アイソフォームの分泌を達成する本明細書中に記載される任意の細胞を培養することによってアイソフォームを産生する方法が、本明細書中に提供される。分泌されたアイソフォームは、細胞培養物からさらに精製され得る。上記分泌されたアイソフォームによって発現されたエピトープタグは、タンパク質精製を容易にし得る。上記分泌されたアイソフォームがプラスミン様エキソプロテアーゼを含むエキソプロテアーゼによって処理される方法もまた、本明細書中に提供される。
【００４３】
細胞と上記細胞からのアイソフォームの分泌を達成するためのＤＮＡ構築物とを導入することによってアイソフォームを産生する方法が、本明細書中に提供される。例示的なＤＮＡ構築物は、ｔＰＡプレ／プロ配列などの異種前駆体配列に作動可能に連結されたアイソフォームのポリペプチドをコードする本明細書中に記載される任意のものを含む。上記ＤＮＡ構築物は、ＣＨＯ細胞株、Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＭＴ２細胞株、マウスＮＳ０細胞株および他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマ細胞株およびヘテロハイブリドーマ（ｈｅｔｅｒｏｈｙｂｒｉｄｏｍａ）細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｓ９３Ｓ細胞、２Ｂ８細胞、およびＨＫＢ細胞、およびＥＢＮＡ−１細胞を含む、マウス細胞、ラット細胞、ヒト細胞、サル細胞、ニワトリ細胞、およびハムスター細胞を含む哺乳動物細胞中に導入され得る。ＤＮＡ構築物の導入は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、または核マイクロインジェクション（ｎｕｃｌｅａｒ  ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によるものであり得る。細胞中にＤＮＡ構築物を導入する例示的な方法は、リン酸カルシウム、カチオン性脂質試薬、またはポリカチオンを使用することを包含する。カチオン性脂質化合物の例としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｏｎｔ．）（カチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）とジオレオイル−ホスファチジル−エタノール−アミン（ＤＯＰＥ）との１：１（ｗ／ｗ）処方物）；ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｏｎｔ、米国特許第５，３３４，７６１号を参照のこと）（ポリカチオン性脂質２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）とジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）との３：１（ｗ／ｗ）処方物）、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｏｎｔ．米国特許第５，３３４，７６１号および同第５，７３６，３９２号を参照のこと；米国特許第６，０５１，４２９号も参照のこと）（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅおよびＰｌｕｓ試薬）、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｏｎｔ．；国際ＰＣＴ出願ＷＯ  ００／２７７９５も参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、細胞培養物から上記アイソフォームを精製する方法が、本明細書中に提供される。精製は、上記アイソフォームによるエピトープタグの発現によって容易にされ得る。上記分泌されたアイソフォームがプラスミン様エキソプロテアーゼを含むエキソプロテアーゼによって処理される方法もまた、本明細書中に提供される。
【００４４】
内因性前駆体配列を欠き、そしてさらに、そのＮ末端にさらなるアミノ酸をさらに含む、イントロン融合タンパク質アイソフォームを含む細胞表面レセプターアイソフォームまたはリガンドアイソフォームのポリペプチドが、本明細書中に提供される。上記ポリペプチドが欠く内因性前駆体配列は、シグナル配列であっても、シグナル配列および１つのさらなるアミノ酸であってもよい。例示的なアイソフォームは、ＲＴＫレセプター、ＴＮＦＲレセプター、またはＲＡＧＥレセプターのアイソフォームを含むＣＳＲのアイソフォームを含む。アイソフォームはまた、ＨＧＦアイソフォームなどのリガンドアイソフォームを含み得る。前駆体配列を欠くポリペプチドとして本明細書中に提供されるアイソフォームは、配列番号１４０、１４２、１４３、１４５、１４７、１４９、１５０、１５２、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１〜１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８１、１８３、１８５、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９〜２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７〜２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３〜２７０、２７２、２７４〜２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２８９〜３０３、３５０、３５２、または３５４のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸の配列、あるいはその活性部分を有する。本明細書中に提供されるアイソフォームのポリペプチドのＮ末端に含まれる１つ以上のさらなるアミノ酸は、制限酵素リンカー配列、ｔＰＡのプロ配列の部分、またはエピトープタグを含み得る。アイソフォームポリペプチドのＮ末端にて含まれ得る配列は、ＧＡＲ、ＳＲ、ＬＥ、またはＧＡＲＳＲもしくはＧＡＲＬＥを含むその組合せを含む。それらのＮ末端に１つ以上のさらなるアミノ酸を含むポリペプチドアイソフォームを含む薬学的組成物もまた、含まれる。
【００４５】
本明細書中に記載される任意の薬学的組成物を投与することによって疾患または状態を処置する方法が、本明細書中に提供される。処置される疾患または状態は、炎症性疾患、癌、新脈管形成媒介性疾患、または過剰増殖性疾患（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）を含む。例示的な疾患としては、眼疾患、アテローム硬化症、糖尿病、関節リウマチ、血管腫、創傷治癒、アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤーコプ病、ハンティングトン病、平滑筋増殖に関連する疾患（ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）、多発性硬化症、心臓血管疾患、および腎疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
例示的な癌は、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、リンパ性悪性疾患（ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ）、消化管癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌／子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）または腎細胞癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌（ｈｅｐａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部癌である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
（詳細な説明）
（アウトライン）
Ａ．定義
Ｂ．細胞表面レセプターアイソフォームおよびリガンドアイソフォーム
１．細胞表面レセプターアイソフォーム
２．リガンドアイソフォーム
３．アイソフォームの対立遺伝子改変体および種改変体ならびに突然変異
Ｃ．アイソフォーム融合タンパク質の産生
１．分泌
２．精製および／または検出
Ｄ．アイソフォーム融合体
１．例示的なｔＰＡ分泌配列
２．ｔＰＡ−イントロン融合タンパク質および他のＣＳＲ融合体
ａ．ＦＧＦＲ−２  ｔＰＡ−イントロン融合タンパク質融合体
ｂ．ＦＧＦＲ−４−ｔＰＡイントロン融合タンパク質融合体
ｃ．ＶＥＧＦＲ−１−ｔＰＡイントロン融合タンパク質融合体
ｄ．ｔＰＡ−ＭＥＴイントロン融合タンパク質融合体
ｅ．ｔＰＡ−ＲＯＮイントロン融合タンパク質融合体
ｆ．ｔＰＡ−ＨＥＲ２イントロン融合タンパク質融合体
ｇ．ｔＰＡ−ＲＡＧＥイントロン融合タンパク質融合体
ｈ．ｔＰＡ−ＴＥＫイントロン融合タンパク質融合体
Ｅ．アイソフォーム融合ポリペプチドをコードする核酸を産生するための方法。
【００４８】
１．合成遺伝子および合成ペプチド
２．アイソフォームおよびアイソフォーム融合体をクローニングおよび単離する方法
３．イントロン融合タンパク質融合体を産生およびクローニングする方法
４．発現系
ａ．原核生物の発現
ｂ．酵母
ｃ．昆虫細胞
ｄ．哺乳動物細胞
ｅ．植物
５．トランスフェクションおよび形質転換の方法
６．産生および精製
７．合成アイソフォーム
８．マルチマーの形成
ａ．ペプチドリンカー
ｂ．ポリペプチドマルチマー化ドメイン
ｉ．免疫グロブリンドメイン
（Ａ）ＦＣドメイン
（Ｂ）窪みへの突出（すなわち、ノブと穴）
ｉｉ．ロイシンジッパー
（Ａ）ＦＯＳおよびＪＵＮ
（Ｂ）ＧＣＮ４
ｉｉｉ．他のマルチマー化ドメイン
Ｒ／ＰＫＡ−ＡＤ／ＡＫＡＰ
Ｆ．アイソフォームの活性を評価するためのアッセイ
１．キナーゼアッセイ
２．複合体化
３．リガンド結合
４．レセプター結合
５．細胞増殖アッセイ
６．運動源性（ｍｏｔｏｇｅｎｉｃ）アッセイ
７．アポトーシスアッセイ
８．細胞疾患モデルアッセイ
９．動物モデル
Ｇ．ＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームならびにＣＳＲアイソフォーム組成物およびリガンドアイソフォーム組成物の調製、処方および投与
Ｈ．  ＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームのインビボ発現ならびに遺伝子治療
１．核酸の送達
ａ．エピソームベクターおよび組込みベクター
ｂ．人工染色体および他の非ウイルスベクターの送達方法
ｃ．リポソームおよび他の封入された形態ならびに核酸を含む細胞の投与
２．インビトロ送達およびエキソビボ送達
３．全身送達、局所送達および表面送達
Ｉ．ＣＳＲアイソフォームを用いた例示的な処置および研究
１．新脈管形成に関連する状態
２．新脈管形成に関連するアテローム硬化症
３．新脈管形成に関連する糖尿病
ａ．血管疾患
ｂ．歯周疾患
４．さらなる新脈管形成に関連する処置
５．癌
６．アルツハイマー病
７．平滑筋増殖に関連する疾患および状態
８．炎症性疾患
９．心臓血管疾患
１０．腎疾患
Ｊ．併用療法
Ｋ．実施例
（Ａ．定義）
別段に定義しない限りは、本明細書中で用いる全ての専門用語および科学用語は、発明が属する分野の当業者に一般に理解される意味と同様の意味を持つ。本明細書の開示の全体にわたって言及する全ての特許、特許出願、公開出願および出版物、ＧＥＮＢＡＮＫの配列、ウェブサイトおよび他の公開された資料は、別段に指摘しない限りは、その全体が参考として援用される。本明細書中の用語に複数の定義が存在する場合は、本セクション中の定義が優勢である。ＵＲＬまたは他のそのような識別子もしくはアドレスを参考としている場合は、そのような識別子は変わる可能性があり、またインターネット上の特定の情報は現れてはすぐ消える可能性があるが、同等の情報が知られており、インターネットおよび／または適切なデータベースを検索することなどによって容易にアクセスすることができることを理解されるべきである。それへの言及が、そのような情報の利用可能性および一般への普及の証拠である。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、細胞表面レセプター（ＣＳＲ）とは、細胞の表面上に発現されるタンパク質であり、代表的にはそれを細胞の表面に固定する膜貫通ドメインまたは他の部分を含む。レセプターとして、これはシグナル伝達もしくはリガンドの内部移行などの細胞表面レセプターの活性を媒介するか、またはそれに関与するリガンドと結合する。細胞表面レセプターとしては、単一膜貫通レセプターおよびＧタンパク質共役型レセプターが挙げられるが、これらに限定されない。とりわけ、増殖因子レセプターなどのレセプターチロシンキナーゼもこのような細胞表面レセプターに含まれる。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）とは、増殖因子レセプターのタンパク質ファミリーのメンバーであるタンパク質、代表的には糖タンパク質をいう。代表的には、増殖因子レセプターは細胞成長、細胞分裂、分化、代謝および細胞遊走を含む細胞プロセスに関与している。ＲＴＫは、細胞増殖、分化および細胞運命の決定、ならびに腫瘍増殖に関与していることも知られている。ＲＴＫは、細胞外ドメイン、膜にまたがる（膜貫通）ドメインおよび細胞内チロシンキナーゼドメインを含む保存されたドメイン構造を有する。代表的には、細胞外ドメインはポリペプチド増殖因子もしくは細胞膜に会合した分子または他のリガンドに結合する。チロシンキナーゼドメインは、レセプターの正の調節および負の調節に関与している。
【００５１】
レセプターチロシンキナーゼは、例えばその細胞外ドメイン内における配列モチーフの構造的配置に基づいてファミリーに分類される。構造モチーフとしては、免疫グロブリン、フィブロネクチン、カドヘリン、上皮増殖因子およびクリングル反復の領域の反復が挙げられるが、これらに限定されない。構造モチーフによる分類から、それぞれが保存されたチロシンキナーゼドメインを有する、１６を超えるＲＴＫファミリーが同定された。ＲＴＫの例としては、エリスロポエチン産生肝細胞（ＥＰＨ）レセプター、上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプター、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）レセプター、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）レセプター、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプター、細胞接着ＲＴＫ（ＣＡＫ）、Ｔｉｅ／Ｔｅｋレセプター、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）レセプター、およびインスリンレセプター関連（ＩＲＲ）レセプターが挙げられるが、これらに限定されない。ＲＴＫをコードしている例示的な遺伝子としては、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ８、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−４、Ｆｌｔ１（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１レセプター；ＶＥＧＦＲ−１としても公知である）、ＦＬＫ１（ＶＥＧＦＲ−２としても公知である）、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、およびＴＥＫ（ＴＩＥ−２としても公知である）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
ＲＴＫのダイマー化は、レセプターの触媒チロシンキナーゼドメインおよびチロシンの自己リン酸化を活性化させる。キナーゼドメインの自己リン酸化は、チロシンキナーゼドメインを活性状態に維持する。タンパク質の他の領域における自己リン酸化は、レセプターと他の細胞タンパク質との相互作用に影響を与える。いくつかのＲＴＫでは、細胞外ドメインに結合するリガンドが、レセプターのダイマー化をもたらす。いくつかのＲＴＫでは、レセプターは、リガンドが存在していなくてもダイマー化することができる。また、ダイマー化はレセプターの過剰発現によっても増大する可能性がある。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）とは、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２中に見出されるものなどの、特徴的な反復性かつ細胞外のシステインが豊富なモチーフを有するレセプターファミリーのメンバーをいう。また、ＴＮＦＲは、ＴＮＦＲファミリーのメンバー間で異なる可変性の細胞内ドメインも有する。ＴＮＦＲレセプターファミリーとしては、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲｒｐ、低親和性の神経増殖因子レセプター、Ｆａｓ抗原、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、およびヘルペスウイルス侵入媒介物質（ＨＶＥＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＴＮＦＲに対するリガンドとしては、ＴＮＦ−α、リンフォトキシン、神経増殖因子、Ｆａｓリガンド、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢリガンド、ＯＸ４０リガンド、ＡＰＯ３リガンド、ＴＲＡＩＬ、ＬＩＧＨＴがおよびＢＴＬＡ挙げられる。ＴＮＦＲとしては、シグナル伝達に関与する、リガンド結合ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインが挙げられる。ＴＮＦＲは、代表的には細胞表面でトリマー化するトリマータンパク質である。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、リガンドは、１種以上のレセプターに結合する細胞外物質（一般に、ポリペプチド）である。リガンドは、可溶性であっても、膜貫通タンパク質であってもよい。本明細書中の目的では、リガンドは、レセプターに結合し、そしてそのレセプターによるシグナル伝達を誘導する。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、シグナル伝達とは、最終的な調節分子（例えば、転写因子）がシグナルに応答して改変されるまで一連の中間分子によってシグナルを伝達する膜貫通レセプターによるリガンドの結合の際に生じる一連の連続的な事象（例えば、タンパク質のリン酸化）をいう。シグナル伝達によって誘発される応答は、特定の遺伝子の活性化を含む。遺伝子の活性化は、さらなる効果をもたらす。なぜならば、遺伝子は、タンパク質として発現され、そのタンパク質の多くは、酵素、転写因子、またはリガンド−レセプター相互作用の任意の１つ以上の生物学的活性を媒介する代謝活性の他の調節因子であるからである。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、アイソフォームとは、対応するタンパク質と比較して核酸配列およびアイソフォームのコードされたポリペプチドにおける違いに起因して、同族タンパク質の完全長野生（優性）型と比較して変更されたポリペプチド構造を有するタンパク質をいう。本明細書中の目的では、アイソフォームは、細胞表面レセプター（ＣＳＲ）のアイソフォームおよびＣＳＲのリガンドのアイソフォームを含む。一般に、本明細書中に提供されるアイソフォームは、タンパク質の活性（例えば、優性型のタンパク質の酵素活性）、または構造を変更するために十分なドメインまたはその部分を欠く（または挿入を含むか、あるいはその両方である）。変更された活性を有するアイソフォームへの本明細書中の言及は、完全長または優性型のタンパク質と比較してアイソフォームの異なる構造または配列による活性の変更を指す。アイソフォームへの言及によって、活性の変更とは、特定のアイソフォームと、優性型または野生型との間の活性における違いをいう。活性の変更は、活性の増強または減少を含む。１つの実施形態において、活性の変更は、活性の減少である；その減少は、野生型および／または優性型のレセプターと比較して、少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、または１０倍であり得る。代表的に、活性は、５、１０、２０、５０、１００または１０００倍またはそれ以上減少する。例えば、リガンドは、レセプターに結合し、そしてシグナル伝達を開始し得るか、またはシグナル伝達に関与し得る。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、リガンドアイソフォームとは、ドメインまたはドメインの部分を欠くリガンド、あるいは野生型または優性型のリガンドのポリペプチドと比較して１つ以上のアミノ酸の挿入などによるドメインの破壊を有するリガンドをいう。代表的に、このようなアイソフォームは、同族リガンドをコードする遺伝子の選択的スプライシングされた改変体によってコードされる。とりわけ、本明細書中に提供されるリガンドアイソフォームは、レセプターに結合し得るが、シグナル伝達を開始しないか、または減少したレベルのシグナル伝達を開始するものである。このようなリガンドアイソフォームが、リガンドアンタゴニストとして作用し、そしてまた、野生型リガンドと比較してアゴニストとして減少した活性を有する。リガンドアイソフォームは、一般に、野生型完全長および／または優性型のリガンドの活性を変更するために十分なドメインまたはその部分を欠き、そして／あるいはそのレセプターの活性をモジュレートするか、または構造的特徴（例えば、ドメイン）を欠く。このようなリガンドアイソフォームはまた、挿入および再配列を含む。リガンドアイソフォームは、対応する野生型リガンドから変更されている活性を示すリガンドアイソフォームを含む；例えば、アイソフォームは、それがレセプターのダイマー化を誘導できないようにリガンドのドメインの変更を含み得る。そのような例において、アイソフォームは、そのレセプターに対する完全長野生型リガンドとの結合について競合し得るが、レセプターによるシグナル伝達を減少させるか、または阻害する。一般に、活性は、野生型および／または優性型のリガンドと比較して、アイソフォームにおいて少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、または１０倍変更される。代表的に、活性は、少なくとも２、５、１０、２０、５０、１００、または１０００倍あるいはそれ以上変更される。１つの実施形態において、リガンドアイソフォームによる活性の変化は、優性型のリガンドと比較された活性の減少である。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、細胞表面レセプター（ＣＳＲ）アイソフォーム（例えば、レセプターチロシンキナーゼのアイソフォーム）とは、野生型および／もしくは優性型のレセプターと比較して活性を変更またはモジュレートするために十分なドメインまたはその部分を欠くか、あるいは構造的特徴（例えば、ドメイン）を欠くレセプターをいう。ＣＳＲアイソフォームは、そのレセプターから変更されている１つ以上の生物学的活性を有するアイソフォームを含み得る；例えば、アイソフォームは、ｐ１８５−ＨＥＲ２の細胞外ドメインの変更を含み得、その変更は、アイソフォームを、正に作用する調節性ポリペプチドのレセプターから、負に作用する調節性ポリペプチドのレセプターへと（例えば、レセプタードメインからリガンドへと）変更する。一般に、活性は、野生型および／または優性型のレセプターと比較して、アイソフォームにおいて少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、または１０倍変更される。代表的に、活性は、少なくとも２、５、１０、２０、５０、１００、または１０００倍あるいはそれ以上変更される。１つの実施形態において、活性の変化は、活性の減少である。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、細胞表面レセプターの活性をモジュレートすることへの言及は、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームがレセプターと何らかの様式で相互作用し、活性（例えば、リガンド結合もしくはダイマー化または他のシグナル伝達に関連する活性であるが、これらに限定されない）が変更されることを意味する。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、場合、変更された活性を有するＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームへの言及は、同族レセプターまたは同族リガンドと比較して異なるＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの構造または配列に基づく、活性の変更をいう。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、イントロン融合タンパク質とは、１つ以上のドメインまたは１つ以上のドメインの一部分を欠くアイソフォームをいう。さらに、イントロン融合タンパク質は、エキソンコドンに作動可能に連結された、（タンパク質の優性型または野生型に関して）１つ以上のコドン（終止コドンを含む）を含む核酸分子によってコードされる。イントロン部分は、エキソンとイントロンとの連結部において終了するイントロン融合タンパク質を生じる終止コドンであり得る。代表的には、イントロン融合タンパク質の活性は、一般に、イントロンアミノ酸残基の切断、欠失および／または挿入に基づくことにより優性型とは異なる。このような活性は、レセプターとの相互作用の変化、あるいは共起刺激性のレセプターもしくはリガンド、レセプターリガンドもしくは補因子またはレセプター活性の他のモジュレーターとの相互作用の違いに基づいて生じる間接的変化を含む。細胞もしくは組織から単離されたイントロン融合タンパク質、または細胞もしくは組織から単離されたそのようなポリペプチドの配列を有するイントロン融合タンパク質は、「天然」である。天然に存在しないが、分子をイントロンに連結することによって合成または調製されるものは、「合成」または「組換え」または「コンビナトリアル」である。イントロン融合タンパク質には、とりわけ、１つ以上のドメインまたは１つ以上のドメインの一部分を欠いており、その結果、イントロン融合タンパク質とそのレセプターもしくはリガンドとの間の相互作用または他の相互作用の変化に基づくことによって同族レセプターまたは同族リガンドの活性の変更をもたらす、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームが含まれる。一般に、このようなアイソフォームは、ＣＳＲ遺伝子またはリガンド遺伝子によってコードされている野生型または優性型と比較して短縮されている。しかし、これらはエキソン部分内に挿入または他の改変を含み得、したがって、優性型と同じ大きさ以上になることができる。しかし、そのそれぞれは、エキソンの末端におけるＣＳＲアイソフォームもしくはリガンドアイソフォームの切断、またはイントロンによってコードされている２、３、４、５、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５個およびそれを超えるアミノ酸の付加のいずれかを生じるイントロンにコードされた部分由来の少なくとも１つのコドン（終止コドンを含む）を含む核酸分子によってコードされる。
【００６２】
イントロン融合タンパク質は、選択的スプライシングされたＲＮＡによってコードされ得、そして／またはインシリコ（これは、潜在的なスプライス部位を同定し、その後組換え方法によってこのような分子を同定することによって行う）で同定されたＲＮＡ分子などから合成的に産生され得る。代表的には、イントロン融合タンパク質は、対応するポリペプチドの野生型または優性型をコードしているＲＮＡの対応する配列中に存在しない、イントロン融合タンパク質をコードしているＲＮＡ中の１つ以上の終止コドンの存在によって短縮されている。イントロンが、エキソン部分とインフレームでオープンリーディングフレームを含む場合、イントロンにコードされた部分は、ポリペプチド中に挿入され得る。アミノ酸および／または終止コドンの付加は、ポリペプチドの野生型または優性型とは大きさおよび配列が異なるイントロン融合タンパク質をもたらす。
【００６３】
本明細書中の目的のためのイントロン融合タンパク質には、天然、コンビナトリアルおよび合成のイントロン融合タンパク質が含まれる。天然のイントロン融合タンパク質とは、遺伝子の１つ以上のエキソンによってコードされているポリペプチドの１つ以上の部分に連結したイントロンによってコードされている、１つ以上のアミノ酸を含む選択的スプライシングされたＲＮＡ分子によってコードされている、ポリペプチドをいう。選択的スプライシングされたｍＲＮＡは、単離するか、または遺伝子内でスプライスドナー部位およびアクセプター部位を連結させることによって合成的に調製することができる。天然のイントロン融合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸を含むか、またはイントロンが第１のコドンとして終止コドンを含むので、エキソンとイントロンとの連結部において切断される。天然のイントロン融合タンパク質は、一般に細胞および／または組織中に存在する。イントロン融合タンパク質は、例えば、スプライスドナー部位およびアクセプター部位を同定すること、ならびに可能なコードされるスプライシング改変体を同定することによって、遺伝子によってコードされた配列に基づいて合成的に産生され得る。コンビナトリアルイントロン融合タンパク質とは、ポリペプチドの野生型または優性型と比較して短縮されているポリペプチドをいう。代表的には、短縮することは、活性が変更されるように１つ以上のドメインもしくはその一部分をポリペプチドから取り除く。コンビナトリアルイントロン融合タンパク質は多くの場合、１つ以上のドメインもしくはその一部分が、同じ遺伝子由来または関連遺伝子ファミリー中の遺伝子由来の天然のイントロン融合タンパク質では欠失しているという点で、天然のイントロン融合タンパク質を模倣する。天然に存在しないが、生じる構築物がＣＳＲの活性をモジュレートするように、分子をイントロンに連結させることによって合成または調製されるものは、「合成」である。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、イントロン融合タンパク質あるいはＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームに関して天然とは、（適切なスプライスアクセプター／ドナー部位の存在によって）動物のゲノム内にコードされており、かつ／または動物内で産生もしくは作製されるか、あるいは遺伝子から産生され得る、任意のタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドまたはそのフラグメントをいう。天然のイントロン融合タンパク質には、対立遺伝子改変体およびスプライシング改変体が含まれる。イントロン融合タンパク質は、翻訳後に改変することができる。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、エキソンとは、ＲＮＡへと転写され、スプライシングおよび他のＲＮＡプロセシングの後にｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）などのＲＮＡの成熟型で表されるヌクレオチドの配列を含む、核酸分子をいう。ｍＲＮＡは、作動可能に連結された１つ以上のエキソンを含む。エキソンは、ポリペプチドまたはポリペプチドの一部分をコードし得る。また、エキソンは、非翻訳配列（例えば、翻訳調節配列）も含み得る。エキソン配列は、多くの場合、保存されており、遺伝子ファミリーメンバー間で相同性を示す。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、イントロンとは、ＲＮＡへと転写され、その後、代表的には、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の成熟型を生じるためにスプライシングによってＲＮＡから取り除かれるヌクレオチドの配列をいう。代表的には、イントロンのヌクレオチド配列は、成熟ＲＮＡ内に取り込まれず、また、イントロン配列またはその一部分は、代表的には翻訳されも、ポリペプチド内に取り込まれもしない。細胞のスプライシング機構によってスプライスドナーおよびアクセプターなどのスプライスシグナル配列が用いられて、ＲＮＡからイントロンが取り除かれる。１つのスプライシング改変体中のイントロンが、別の改変体中ではエキソン（すなわち、スプライシングされた転写物中に存在する）となることができることは、注目すべきである。したがって、イントロン融合タンパク質をコードしているスプライシングされたｍＲＮＡは、エキソンおよびイントロンを含み得る。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、スプライシングとは、ｍＲＮＡ中のイントロンが取り除かれ、そしてエキソンが作動可能に連結されて、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が作製されるＲＮＡ成熟のプロセスをいう。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、選択的スプライシングとは、１つの遺伝子から複数のｍＲＮＡを産生するプロセスをいう。選択的スプライシングは、１つの遺伝子のエキソンの全てではないエキソンを作動可能に連結させること、および／または１つの遺伝子に由来する全ての転写物中には存在しない１つ以上の選択的エキソンを作動可能に連結させることを含み得る。
【００６９】
本明細書中で使用される場合、エキソン欠失とは、ポリペプチドの野生型または優性型をコードしているＲＮＡ分子と比較して、少なくとも１つのエキソンを欠く核酸分子を産生する選択的ＲＮＡスプライシングの事象をいう。欠失したエキソンを有するＲＮＡ分子は、このような選択的スプライシングによってか、またはエキソンを欠失させるためのインビトロ方法などの任意の他の方法によって、産生され得る。
【００７０】
本明細書中で使用される場合、エキソン挿入とは、ポリペプチドの野生型または優性型をコードしているＲＮＡ分子中に代表的には存在しない少なくとも１つのエキソンを含む核酸分子を産生する、選択的ＲＮＡスプライシングの事象をいう。挿入されたエキソンを有するＲＮＡ分子は、このような選択的スプライシングによってか、またはエキソンを付加もしくは挿入するためのインビトロ方法などの任意の他の方法によって産生され得る。
【００７１】
本明細書中で使用される場合、エキソン伸長とは、ポリペプチドの野生型または優性型をコードしているＲＮＡ中の対応するエキソンよりも長い（エキソン中に含まれるヌクレオチド数が多い）少なくとも１つのエキソンを含む核酸を産生する、選択的ＲＮＡスプライシングの事象をいう。伸長されたエキソンを有するＲＮＡ分子は、このような選択的スプライシングによってか、またはエキソンを伸長させるインビトロ方法などの任意の他の方法によって産生され得る。いくつかの場合において、本明細書中に記載されるように、エキソン伸長によって産生されたｍＲＮＡはイントロン融合タンパク質をコードしている。
【００７２】
本明細書中で使用される場合、エキソン切断とは、１つ以上のエキソンがポリペプチドの野生型または優性型をコードしているＲＮＡ分子中の対応するエキソンよりも短い（ヌクレオチド数が少ない）ように、１つ以上のエキソンの切断または短縮を含む核酸分子を産生する、選択的ＲＮＡスプライシングの事象をいう。切断されたエキソンを有するＲＮＡ分子は、このような選択的スプライシングによってか、またはエキソンを切断するためのインビトロ方法などの任意の他の方法によって産生され得る。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、イントロン保持とは、１つ以上のエキソンに作動可能に連結されたイントロンまたはその一部分を含む核酸分子を産生する、選択的ＲＮＡスプライシングの事象をいう。イントロンまたはその一部分を保持しているＲＮＡ分子は、このような選択的スプライシングによってか、または、保持されたエキソンを有するＲＮＡ分子を産生するためのインビトロ方法などの任意の他の方法によって産生され得る。いくつかの場合において、本明細書中に記載されるように、イントロン保持によって産生されたｍＲＮＡ分子は、イントロン融合タンパク質をコードしている。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、遺伝子配列とも称される遺伝子とは、少なくとも１つのポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡ（イントロンおよびエキソン）へと転写されるヌクレオチドの配列をいう。遺伝子は、ＲＮＡの転写およびプロセシングを調節するヌクレオチドの配列を含む。遺伝子はまた、プロモーターおよびエンハンサーなどのヌクレオチドの調節配列、ならびに翻訳調節配列を含む。
【００７５】
本明細書中で使用される場合、スプライス部位とは、イントロンの除去および／またはエキソンの結合に関与する、遺伝子内の１つ以上のヌクレオチドをいう。スプライス部位は、スプライスアクセプター部位およびスプライスドナー部位を含む。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、オープンリーディングフレームとは、機能的ポリペプチドまたはその一部分、代表的には少なくとも約５０個のアミノ酸をコードしているヌクレオチドの配列をいう。オープンリーディングフレームは、完全長のポリペプチドまたはその一部分をコードし得る。オープンリーディングフレームは、終止コドンがイントロン中にあり、そしてイントロンの全てまたは一部分が転写されたｍＲＮＡ中に存在する場合に、１つ以上のエキソンまたはエキソンとイントロンとを作動可能に連結させることによって作製され得る。
【００７７】
本明細書中で使用される場合、ポリペプチドとは、共有結合した２つ以上のアミノ酸をいう。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中で、交換可能に使用される。
【００７８】
本明細書中で使用される場合、核酸分子またはタンパク質の短縮に関して切断もしくは短縮とは、タンパク質または核酸分子の野生型または優性型と比較して、完全長よりも短いヌクレオチドまたはアミノ酸の配列をいう。
【００７９】
本明細書中で使用される場合、参照遺伝子とは、遺伝子内のイントロンおよびエキソンのマッピングに用いることができる遺伝子をいう。参照遺伝子は、遺伝子中のイントロンおよびエキソンのマッピングを行うために、例えば、発現された遺伝子配列と比較することができる、ゲノムＤＮＡまたはその一部分であり得る。また、参照遺伝子はポリペプチドの野生型または優性型をコードしている遺伝子であり得る。
【００８０】
本明細書中で使用される場合、タンパク質または遺伝子のファミリーもしくは関連ファミリーとは、それぞれ、互いに相同性ならびに／または構造的類似性および／もしくは機能的類似性を有する、タンパク質または遺伝子の群をいう。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、早期終止コドンとは、ポリペプチドの野生型もしくは優性型などのタンパク質の完全長形態を産生または作製するために使用される終止コドンの前に、配列のオープンリーディングフレーム中に生じる終止コドンである。早期終止コドンの発生は、例えば、選択的スプライシングおよび突然変異の結果であり得る。
【００８２】
本明細書中で使用される場合、発現された遺伝子配列とは、遺伝子から転写されたか、または転写されると予測された任意のヌクレオチドの配列をいう。発現された遺伝子配列としては、ｃＤＮＡ、ＥＳＴ、ならびに、例えば、スプライス部位の予測およびスプライシングされた配列のインシリコ作製に基づいた発現された配列のインシリコ予測が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
本明細書中で使用される場合、発現された配列タグ（ＥＳＴ）とは、発現された遺伝子配列から作製したヌクレオチドの配列をいう。ＥＳＴは、ｃＤＮＡを産生するためにｍＲＮＡの集団を用いて作製される。ｃＤＮＡ分子は、例えばｍＲＮＡ上に存在するポリＡテイルから開始することによって産生され得る。また、ｃＤＮＡ分子は、ｍＲＮＡ内でｃＤＮＡの内部合成を開始する１つ以上のオリゴヌクレオチドを用いて、ランダムプライミングによっても産生され得る。作製されたｃＤＮＡ分子の配列決定を行い、配列を代表的にはデータベースに記憶する。ＥＳＴデータベースの例は、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｂＥＳＴにオンラインで見出されるｄｂＥＳＴである。それぞれのＥＳＴ配列には、代表的に、固有の識別子が割り当てられており、ヌクレオチドの配列、長さ、発現された場所の組織型、および他の関連するデータなどの情報が、識別子と関連付けられている。
【００８４】
本明細書中で使用される場合、本明細書中に提供されるアイソフォームに関して同族レセプターとは、特定のアイソフォームと同じ遺伝子によってコードされているレセプターをいう。一般に、同族レセプターは特定の細胞または組織内の優性型でもある。例えば、ヘルスタチンは、ｐ１８５−ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２レセプター）をコードしているプレｍＲＮＡのスプライシング改変体によってコードされている。したがって、ｐ１８５−ＨＥＲ２はヘルスタチンの同族レセプターである。
【００８５】
本明細書中で使用される場合、本明細書中に提供されるアイソフォームに関して同族リガンドとは、特定のアイソフォームと同じ遺伝子によってコードされているリガンドをいう。一般に、同族リガンドは特定の細胞または組織内の優性型でもある。
【００８６】
本明細書中で使用される場合、野生型（例えば、ポリペプチドの野生型）とは、遺伝子によってコードされているポリペプチドをいう。代表的に、野生型とは、機能または構造を変更する変異または他の改変を伴わない遺伝子（またはＲＮＡまたはそれらに由来するタンパク質）をいう；野生型は、種の間で対立遺伝子変異を含む。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、優性型（例えば、ポリペプチドの優性型）とは、遺伝子から産生される主要なポリペプチドであるポリペプチドをいう。「優性型」は、その供給源に応じて異なる。例えば、異なる細胞または組織の型は、例えば選択的スプライシングおよび／または選択的タンパク質プロセシングによって、異なる形態のポリペプチドを産生し得る。それぞれの細胞型または組織型において、異なるポリペプチドは、「優性型」であり得る。
【００８８】
本明細書中で使用される場合、ドメインとは、１つ以上の構造モチーフ（例えばループ領域によって結合されたαへリックスおよび／もしくはβ鎖の組合せ）からなり、そして／あるいはキナーゼ活性などの機能的活性によって認識される、タンパク質内に独立して折畳み構造を形成することができるポリペプチド鎖の一部分（代表的には、３アミノ酸以上、一般には５アミノ酸または７アミノ酸以上の配列）をいう。タンパク質は１つ以上の明確に異なるドメインを有することができる。例えば、ドメインは、細胞外ドメインを規定するモチーフの相同性などの、関連するファミリーメンバーに対するドメイン内の配列の相同性によって同定、規定または識別され得る。別の例では、ドメインは、酵素活性（例えば、キナーゼ活性）などのその機能によってか、またはＤＮＡ結合、リガンド結合、およびダイマー化などの生体分子と相互作用する能力によって、識別され得る。ドメインは、ドメインが独立かまたは別の分子と融合して、例えば、タンパク質分解活性などの活性もしくはリガンド結合を行うことができるように、独立して生物学的機能または生物学的活性を示し得る。ドメインは、ポリペプチド由来のアミノ酸の直鎖状配列またはアミノ酸の非直鎖状配列であり得る。多くのポリペプチドは、複数のドメインを含む。例えば、レセプターチロシンキナーゼは、代表的には細胞外ドメイン、膜にまたがる（膜貫通）ドメインおよび細胞内チロシンキナーゼドメインを含む。
【００８９】
本明細書中で使用される場合、ドメインの全てまたは一部分を欠くポリペプチドとは、同族ポリペプチドと比較して、ドメインの１つ以上のアミノ酸または全てのアミノ酸が欠失しているポリペプチドをいう。ドメインの全体または一部を欠くポリペプチドにおいて欠失しているアミノ酸は、同族ポリペプチドのドメイン内の連続したアミノ酸である必要はない。ドメインの全てまたは一部を欠くポリペプチドは、同族ポリペプチドの活性と比較したポリペプチドの活性の損失もしくは低下、またはポリペプチド中の構造の損失を示し得る。
【００９０】
例えば、同族レセプターが膜貫通ドメインを有する場合、膜貫通ドメインの全てまたは一部を欠くアイソフォームポリペプチドは、同族ポリペプチド中の同じアミノ酸位置に対応するアミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上のアミノ酸の欠失を有し得る。
【００９１】
本明細書中で使用される場合、ドメインを含むポリペプチドとは、同族タンパク質の対応するドメインに関して完全なドメインを含むポリペプチドをいう。完全なドメインは、同族ポリペプチド内のその特定のドメインの定義に関連して決定される。例えば、ドメインを含むアイソフォームとは、同族タンパク質中で見出される完全なドメインに対応するドメインを含むアイソフォームをいう。同族レセプターが、例えば、４００位〜４２０位の間に２１アミノ酸の膜貫通ドメインを含む場合、このような膜貫通ドメインを含むレセプターアイソフォームは、同族タンパク質の２１アミノ酸のドメインと実質的な同一性を有する２１アミノ酸のドメインを含む。実質的な同一性とは、同族タンパク質のドメインと比較して、対立遺伝子変異および保存的置換を含み得るドメインをいう。実質的に同一であるドメインは、同族タンパク質のドメインと比較して、アミノ酸の欠失、非保存的置換または挿入を有さない。
【００９２】
このようなドメインは、それらを同定し得る分野の当業者に公知である。ドメイン（すなわちフューリン（ｆｕｒｉｎ）ドメイン、Ｉｇ様ドメイン）は多くの場合、ドメイン、特に、タンパク質に対する構造的および／または配列相同性によって同定される。本明細書中で例示のために、定義が、提供されるが、名前で特定のドメインを認識することは当業者の範囲内で良好であることが、理解される。必要とされる場合、適切なソフトウェアが、ドメインを同定するために使用され得る。さらに、本明細書中のドメインのアミノ酸位置への言及は、例示のみを目的とする。相互作用は動的であるので、記載されたアミノ酸位置は、参考および例示のためのものである。記載された位置は、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸またはそれ以上のアミノ酸で変動する位置（ｌｏｃｉ）の範囲を反映する。変異はまた、とりわけ、対立遺伝子改変体および種改変体を示す。当業者は、目視による比較または容易に利用可能なアルゴリズムおよびソフトウェアを含む他の比較によって対応する配列を同定し得る。
【００９３】
本明細書中で使用される場合、細胞外ドメインは、レセプターの表面に生じる細胞表面レセプターの部分であり、リガンド結合部位を含む。１つの例において、例えば、ＨＥＲ２などのレセプターＬドメイン（ＲＬＤ）（ＥＧＦＲ様ドメインとも称される）が、リガンド結合部位を含むドメインの例である。各Ｌドメインは、第２のＬドメインと結合して、リガンド分子を収容するために十分な大きさの中心の窪みを取り囲む三次元の２つに裂けた（ｂｉｌｏｂａｌ）構造を形成し得る一本鎖の右巻きβ−ヘリックスを含む。
【００９４】
本明細書中で使用される場合、フューリンドメインは、当業者によってそのように認識されるドメインであり、システインが豊富な領域である。フューリンは、１型膜貫通セリンプロテアーゼである。フューリンドメインはフューリンプロテアーゼの切断部位として機能し得る。
【００９５】
本明細書中で使用される場合、Ｓｅｍａドメインは、当業者によってそのように認識されるドメインであり、レセプターの認識および結合モジュールである。Ｓｅｍａドメインは、４つのジスルフィド結合を形成して構造を安定化させる保存された一組のシステイン残基によって特徴付けられている。Ｓｅｍａドメインの折畳みはβプロペラトポロジーの変形であり、７つのブレード（ｂｌａｄｅ）が中心軸の周りに放射状に配置されている。それぞれのブレードは４本鎖の逆平行のβシートを含む。Ｓｅｍａドメインは最初と最後のブレードの間の円を閉じるために「ループ−フック」システムを用いている。ブレードは、第７の（Ｃ末端の）ブレードの最も外側の鎖を提供することによってＮ末端のβ鎖が円を閉じることで、逐次的に構成される。βプロペラは、ブレード６の外側の端にＮ末端を伸長して追加の第５のβ鎖を提供することによって、さらに安定化される。
【００９６】
本明細書中で使用される場合、プレキシン（ｐｌｅｘｉｎ）ドメインは、当業者によってそのように認識されるドメインであり、システインが豊富な反復を含む。プレキシンは、複合体として膜結合したセマフォリンと相互作用するレセプターである。プレキシンは、散乱係数に誘導される運動性のレセプターであるｃ−ｍｅｔに対して相同性を有する３つのドメインを含むが、ｃ−ｍｅｔの本来のチロシンキナーゼ活性を欠く。細胞内では、不変のアルギニンにより、グアノシントリホスファターゼ活性化タンパク質に対して相同性を有するプレキシンドメインが同定される。タンパク質は１つ以上のプレキシンドメインを含み得る。本明細書中に記載されるように、ＭＥＴレセプターは、単一のプレキシンドメインを含む。
【００９７】
本明細書中で使用される場合、Ｉｇ様ドメインは、当業者によってそのように認識されるドメインであり、疎水性相互作用によって安定化され、かつ鎖間のジスルフィド結合によって一緒になって挟まれている（ｓａｎｄｗｉｃｈｅｄ）、２つのβシートの緻密な折畳み構造を形成するβ鎖の折畳みを含むドメインである。Ｉｇドメインは、βシート中の鎖の数において異なり、そして代表的に、４つの型（Ｉｇ様Ｖ型、Ｉｇ様Ｃ１型、Ｉｇ様Ｃ２型、およびＩ−ｓｅｔ）に分類される。１つの例において、Ｉｇ様Ｃ型ドメインは、４つのβ鎖が１つのβシートを形成し、３つのβ鎖が第２のβシートを形成するように、４本の鎖および３本の鎖として配置されている７つのβ鎖を含む。別の例では、Ｉｇ様Ｖ型ドメインは、４つのβ鎖および５つのβ鎖として配置されている９つのβ鎖を含む（Ｊａｎｅｗａｙ  Ｃ．Ａ．ら（編）：Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ−ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ、第５版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２００１）。さらに、いくつかのＩｇ様ドメインは、上記の群のうちの１つに分類することができず、そしてときとして、単にＩｇ様と称される。
【００９８】
本明細書中で使用される場合、免疫グロブリンスーパーファミリーは、免疫グロブリン様ドメインを含むタンパク質の異種遺伝子型の群である。免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質は、免疫系に関与するタンパク質（例えば、免疫グロブリンおよびＴ細胞レセプター、神経系および他の組織における細胞間認識に関与するタンパク質、ならびに他のタンパク質）を含む。
【００９９】
本明細書中で使用される場合、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインは、当業者によってそのように認識されるドメインであり、一方のβシートが４本の鎖を含み、他方のシートが３本の鎖を含む、保存されたβサンドイッチ折畳みを含む。ＦＮ３ドメインおよびＩｇ様ドメインの折畳み構造は、ＦＮ３ドメインが保存されたジスルフィド結合を欠く以外は位相幾何学的に非常に類似している。ＦＮ３ドメインをコードしているポリペプチド部分はまた、血栓症、炎症、および腫瘍転移をモジュレートする細胞接着分子との相互作用を媒介する、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）を含むアミノ酸の短いストレッチによって特徴付けられる。
【０１００】
本明細書中で使用される場合、ＩＰＴ／ＴＩＧドメインは、当業者によってそのように認識されるドメインであり、免疫グロブリンの折畳み様のドメインを有する。タンパク質は、１つ以上のＩＰＴ／ＴＩＧドメインを含む。ＩＰＴ／ＴＩＧドメインは、プレキシン、転写因子、ならびに例えば細胞増殖および細胞接着を調節すると考えられている本明細書中に記載の細胞表面レセプターＭＥＴおよびＲＯＮなどのレセプタータンパク質の細胞外領域中に見出される（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＣＡら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、４０：３１１〜３１９、（２００３））。
【０１０１】
本明細書中で使用される場合、ＥＧＦドメインは、当業者によってそのように認識されるドメインであり、タンパク質の三次元構造に重要であり、したがってレセプターおよび他の分子によるその認識に重要であるいくつかの保存されたシステイン残基を含む、反復パターンを含む。本明細書中に記載されるようなＥＧＦドメインは、ジスルフィド結合の形成に関与している６つのシステイン残基を含む。ＥＧＦドメインは２本鎖のβシート、次いでループを形成して、Ｃ末端の短い２本鎖のシートを形成する。保存されたシステイン間のサブドメインは長さが異なる。ＥＧＦドメインの反復は、代表的には、例えば、本明細書中に記載されるようなＴＥＫなどのように膜結合タンパク質の細胞外ドメイン中に見出される。ＥＧＦドメインの変形は、本明細書中に記載されるように、６個ではなく８個の保存されたシステインを有し、したがって平均的なＥＧＦモジュールよりも長く、かつＥＧＦ様領域のさらなるジスルフィド結合Ｃ末端を含む、ラミニン（Ｌａｍ）ＥＧＦドメインである。
【０１０２】
本明細書中で使用される場合、膜貫通ドメインは、レセプターを固定している形質膜にまたがり、そして一般に、疎水性残基を含む。
【０１０３】
本明細書中で使用される場合、細胞質ドメインは、シグナル伝達に関与し、かつ膜貫通細胞表面レセプターの細胞質部分中に生じるドメインである。１つの例において、細胞質ドメインはプロテインキナーゼ（ＰＫ）ドメインを含み得る。ＰＫドメインとは、当業者によってそのように認識され、かつ保存された触媒核（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｃｏｒｅ）を含むドメインである。保存された触媒核は、ＡＴＰ結合に関与することが示されているドメインのＮ末端の端にあるリジン残基の近傍、および酵素の触媒活性に重要である触媒ドメインの中心部分にあるアスパラギン酸残基の近傍に、グリシンが豊富な残基のストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）を有すると認識されている。代表的には、ＰＫドメインは、例えばチロシンキナーゼドメインを含むタンパク質がチロシン残基上の基質タンパク質をリン酸化し、一方で、例えばセリン／スレオニンプロテインキナーゼドメインを含むタンパク質がセリンまたはスレオニン残基上の基質タンパク質をリン酸化するなどのように、レセプタードメインの基質特異性に依存する、セリン／スレオニンプロテインキナーゼまたはチロシンプロテインキナーゼドメインであり得る。
【０１０４】
本明細書中で使用される場合、キナーゼとは、高分子および低分子を含む分子、代表的には生体分子をリン酸化する能力を有し得るタンパク質である。例えば、分子は低分子またはタンパク質であり得る。リン酸化は、自己リン酸化を含まれる。いくつかのキナーゼは構成的キナーゼ活性を有する。他のキナーゼは、活性化を必要とする。例えば、シグナル伝達に関与する多くのキナーゼは、リン酸化される。リン酸化により、経路中の別の生体分子に対するそのキナーゼ活性が活性化される。いくつかのキナーゼは、タンパク質構造の変化および／または別の分子との相互作用によってモジュレートされる。例えば、タンパク質の複合体化または分子のキナーゼへの結合は、キナーゼ活性を活性化または阻害し得る。
【０１０５】
本明細書中で使用される場合、指定とは、参照または比較の点としての分子の選択もしくはその一部分をいう。例えば、選択されたドメイン内で改変されたポリペプチドを構築するための指定ドメインとして、ドメインが、選択され得る。別の例では、選択されたイントロンを含むかまたは排除するＲＮＡ転写物を同定するために、イントロンが、指定イントロンとして選択され得る。
【０１０６】
本明細書中で使用される場合、ポリペプチドに関して産生とは、発現および発現されたタンパク質（または回収可能もしくは単離可能な発現されたタンパク質）の回収をいう。タンパク質の産生に影響し得る因子としては、選択された発現系および宿主細胞、細胞培養条件、宿主細胞によるタンパク質の分泌、および精製目的のためにタンパク質を検出する能力が挙げられる。タンパク質の産生は、例えば、細胞培養培地中などへのタンパク質の分泌を評価することによってモニタリングされ得る。
【０１０７】
本明細書中で使用される場合、「改善された産生」とは、コントロールポリペプチドの産生と比較して、ポリペプチドの産生の増加をいう。例えば、アイソフォーム融合タンパク質の産生は、融合タンパク質ではない対応するアイソフォームまたは異なる融合体を含む対応するアイソフォームと比較される。例えば、ｔＰＡプレ／プロ配列を含むアイソフォームの産生は、その内因性シグナル配列を含むアイソフォームと比較され得る。一般に、タンパク質の産生は、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、およびそれ以上より大きくか、約１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、およびそれ以上か、または少なくとも１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、およびそれ以上改善され得る。代表的に、タンパク質の産生は、アイソフォーム融合体ではない対応するアイソフォーム、または同じ融合体を含まない対応するアイソフォームと比較して、５、１０、２０、３０、４０、５０倍またはそれ以上改善され得る。
【０１０８】
本明細書中で使用される場合、分泌とは、タンパク質が細胞環境の外部、またはグラム陰性菌の場合においては、ペリプラズム空間中に輸送されるプロセスをいう。一般に、分泌は、細胞中の分泌経路（例えば、真核細胞において、これは、小胞体およびゴルジ装置を含む）によって生じる。
【０１０９】
本明細書中で使用される場合、「前駆体配列」または「前駆体ペプチド」または「前駆体ポリペプチド」とは、プロセシングされ、かつプロセシングまたは切断の前にポリペプチドの末端（代表的に、アミノ末端）にて生じるアミノ酸の配列をいう。前駆体配列は、上記連結されたポリペプチドの分泌および／または輸送を達成するアミノ酸の配列を含む。前駆体配列は、１つ以上の機能部分を含み得る。例えば、前駆体配列は、プレ配列（シグナルポリペプチド）および／またはプロ配列を含み得る。ポリペプチドの成熟ポリペプチドへのプロセシングは、ポリペプチドからの前駆体配列の切断を生じる。前駆体配列はまた、それがプレ配列およびプロ配列を含む場合、プレ／プロ配列と称され得る。
【０１１０】
本明細書中で使用される場合、「プレ配列」、「シグナル配列」、「シグナルペプチド」、「リーダー配列」または「リーダーペプチド」とは、タンパク質を分泌経路へと標的させ、そして小胞体膜中に一旦トランスロケーションされると、発生期の鎖から切断される、発生期のポリペプチドのアミノ末端におけるアミノ酸の配列をいう。
【０１１１】
本明細書中で使用される場合、プロ配列とは、プロペプチドがポリペプチドに連結される場合に種々の調節機能を示す、プロペプチドをコードする配列をいい、その調節機能としては、成熟ポリペプチドの正しい折畳みおよびジスルフィド結合の形成に寄与すること、プロペプチドの切断の際のポリペプチドの活性化に寄与すること、および／または認識部位として寄与することが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、プロ配列は、分泌前に細胞内で切り取られるが、それはまた、エキソプロテアーゼによって細胞外で切断され得る。いくつかの例において、プロ配列は、自触反応によって切断される一方で、他の例では、別のポリペプチドプロテアーゼが、プロ配列を切断する。
【０１１２】
本明細書中で使用される場合、同種とは、互いに対応する異なる種に由来し、かつ互いに同一であるか、または非常に類似する（すなわち、ホモログである）、核酸分子またはポリペプチドなどの分子をいう。
【０１１３】
本明細書中で使用される場合、異種とは、活性または配列において特有である、核酸分子またはポリペプチドなどの分子をいう。異種分子は、別個の遺伝的な供給源または種に由来し得る。本明細書中の目的では、異種分子は、起源にかかわらず、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォーム、またはその対立遺伝子改変体以外のタンパク質またはポリペプチドである。したがって、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームに関して異種の分子は、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの配列に関して内因性であるか、または同種の分子に由来しない配列を含む任意の分子を含む。本明細書中で目的とする異種分子の例は、同一の種または異なる種の異なるポリペプチド由来の分泌シグナル、タグ（例えば、融合タグまたは標識）、または任意の他の分子の全てもしくは部分を含み、それらは、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドに関して同種ではなく、そしてそれらの配列は、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドのものと同じではない。異種分子は、融合分子またはキメラ分子の産生のために、目的の核酸配列またはポリペプチド配列に融合され得る。
【０１１４】
本明細書中で使用される場合、異種分泌シグナルとは、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームのシグナル配列とは配列が異なる同一の種または異なる種由来のポリペプチドに由来するシグナル配列をいう。異種分泌シグナルは、それが由来する宿主細胞において使用され得るか、または異種分泌シグナルは、そのシグナル配列が由来する細胞とは異なる宿主細胞において使用され得る。
【０１１５】
本明細書中で使用される場合、内因性前駆体配列または内因性シグナル配列とは、ポリペプチドの全てもしくは部分に結合した天然に存在するシグナル配列をいう。種々のＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームの例示的なシグナル配列の隣接する位置（それらの対応する同族レセプターまたはリガンドシグナル配列に基づく）は、例えば、表３および４に提供される。シグナルペプチドのＣ末端の境界は、変動し得るが、代表的に、シグナルペプチドのＣ末端の境界のいずれかの側において約５アミノ酸以下で変動し得る。アルゴリズムは、利用可能であり、かつシグナル配列を同定し、そしてそれらの切断部位を予測する分野の当業者に公知である（例えば、Ｃｈｏｕら．、（２００１）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ４２：１３６；  ＭｃＧｅｏｃｈら、（１９８５）Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．３：２７１；ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅら、（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：４６８３を参照のこと）
本明細書中で使用される場合、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）とは、フィブリン溶解活性を有し、そして代表的に、５個のドメイン（フィンガードメイン、増殖因子ドメイン、クリングル−１ドメイン、クリングル−２ドメイン、およびプロテアーゼドメイン）を含む構造を有する外因性（組織型）プラスミノーゲンアクチベータをいう。哺乳動物ｔ−ＰＡは、ヒトを含む任意の動物由来のｔ−ＰＡを含む。他の種としては、ウサギ、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、ウマ、マウス、イヌ、ネコ、ウシおよびヒツジのｔＰＡが挙げられるが、これらに限定されない。ヒト由来の前駆体ポリペプチドを含むｔＰＡをコードする核酸およびヒトではない種由来の前駆体ポリペプチドを含むｔＰＡをコードする核酸は、当該分野で公知である。
【０１１６】
本明細書中で使用される場合、ｔＰＡ前駆体配列とは、ｔＰＡ由来のプレ配列およびプロ配列を含むアミノ酸残基の配列（すなわち、プレ／プロ配列である、例えば、米国特許第６，６９３，１８１号および米国特許第４，７６６，０７５号を参照のこと）。このポリペプチドは、もちろんｔＰＡに結合し、そして細胞由来のｔＰＡの分泌を誘導するように作用する。ｔＰＡについての例示的な前駆体配列は、配列番号２に示され、そして配列番号１に示される核酸配列によってコードされる。上記前駆体配列は、シグナル配列（アミノ酸１〜２３）およびプロ配列（アミノ酸２４〜３５）を含む。上記プロ配列は、２つのプロテアーゼ切断部位を含む：一方は、残基３２の後であり、そして他方は、残基３５の後である。前駆体配列の例示的な種改変体は、配列番号５２〜５９のいずれか１つに示される；例示的なヌクレオチド対立遺伝子改変体およびアミノ酸対立遺伝子改変体は、配列番号５および６に示される。
【０１１７】
本明細書中で使用される場合、ｔＰＡ前駆体配列の全てまたは部分とは、細胞由来のｔＰＡのプロセシングおよび／または分泌を誘導するために十分なｔＰＡ前駆体配列のアミノ酸のうちの連続した部分をいう。前駆体配列の全てまたは部分は、配列番号２に示され、かつ配列番号１によってコードされるような野生型または優性型のｔＰＡ前駆体配列の全てまたは部分、配列番号６に示されるその対立遺伝子改変体、または配列番号５２〜５９に示される種改変体を含み得る。例えば、配列番号２に示される例示的なｔＰＡ前駆体配列について、ｔＰＡ前駆体配列の部分は、アミノ酸１〜２３、またはアミノ酸２４〜３５、アミノ酸２４〜３２、またはアミノ酸３３〜３５、あるいは配列番号２に示されるアミノ酸１〜３５の任意の他の連続した配列を含み得る。
【０１１８】
本明細書中で使用される場合、ポリペプチドの活性部分（例えば、アイソフォームの活性部分に関して）、活性を有するポリペプチドの部分をいう。
【０１１９】
本明細書中で使用される場合、タンパク質の精製とは、細胞成分および組織成分（ＤＮＡ、細胞膜および他のタンパク質を含む）を含み得るホモジネートなどからタンパク質を単離するプロセスをいう。タンパク質は、例えば、それらをｐＨ勾配ゲルまたはイオン交換カラムに流す（ｒｕｎ）ことによりそれらの等電点に従ってか、サイズ排除クロマトグラフィーまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）分析によりそれらの大きさまたは分子量に従ってか、それらの疎水性に従って、当業者に公知である任意の種々の方法で精製され得る。他の精製技術としては、析出またはアフィニティクロマトグラフィー（免疫親和性クロマトグラフィーを含む）、ならびに任意のこれらの方法の組合せを含む他の技術および方法が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、精製は、分子上にタグ（例えば、アフィニティー精製のためのヒスタグまたは同定のための検出可能なマーカー）を含むことによって容易にされ得る。
【０１２０】
本明細書中で使用される場合、検出は、タンパク質の（眼または装置による）可視化を可能にする方法を含む。タンパク質は、そのタンパク質に特異的な抗体を使用して可視化され得る。タンパク質の検出はまた、タンパク質とタグ（エピトープタグまたは標識を含む）との融合によって容易にされ得る。
【０１２１】
本明細書中で使用される場合、「タグ」とは、代表的にはポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加されるアミノ酸の配列をいう。ポリペプチドに融合させたタグを含むことは、ポリペプチドの精製および／または検出を容易にし得る。
【０１２２】
本明細書中で使用される場合、エピトープタグは、抗体が作製され得るエピトープを提供するために十分であるが、そのエピトープが融合されるタグポリペプチドの活性を妨げない程度に短い残基を有するアミノ酸の配列を含む。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６アミノ酸残基を有し、そして通常、約８アミノ酸残基と５０アミノ酸残基との間である。
【０１２３】
本明細書中で使用される場合、標識とは、標識されたアイソフォームを産生するためにアイソフォームに直接的かまたは間接的に結合体化される、検出可能な化合物または組成物をいう。標識は、単独で検出可能（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）であり得るか、または酵素標識の場合において、基質化合物組成物の化学的変化を触媒して、その基質化合物組成物を検出可能にし得る。標識の非限定的な例としては、蛍光発生部分、緑色蛍光タンパク質、またはルシフェラーゼが挙げられる。
【０１２４】
本明細書中で使用される場合、融合タグ化ポリペプチドとは、タグポリペプチドに融合されたアイソフォームポリペプチドを含むキメラポリペプチドをいう。
【０１２５】
本明細書中で使用される場合、発現とは、遺伝子のコードされた情報が細胞中に存在しかつ細胞中で作動する構造へと変換されるプロセスをいう。発現された遺伝子は、ｍＲＮＡへと転写され、次いでタンパク質へと翻訳されるもの、およびＲＮＡへと転写されるが、タンパク質へと翻訳されないもの（例えば、トランスファーＲＮＡおよびリボソームＲＮＡ）を含む。本明細書中の目的では、発現されるタンパク質は、その細胞の内側（例えば、細胞質）に保持されても、その細胞から分泌されてもよい。
【０１２６】
本明細書中で使用される場合、融合構築物とは、１つの核酸分子由来のコード配列、および融合構築物が宿主中で転写および翻訳される場合にタンパク質が２つのタンパク質を含んで産生されるように上記コード配列が同じ読み枠中にある別の核酸分子由来のコード配列を含む核酸配列をいう。上記２つの分子は、その構築物中で隣接していても、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、またはそれ以上であるが、代表的には１０アミノ酸、９アミノ酸、８アミノ酸、７アミノ酸、６アミノ酸よりも少ないアミノ酸を含むリンカーポリペプチドによって隔てられてもよい。融合構築物によってコードされるタンパク質産物は、融合ポリペプチドと称される。
【０１２７】
本明細書中で使用される場合、制限酵素リンカーは、１種以上の制限酵素によって認識されるヌクレオチドの配列によってコードされるリンカーである。
【０１２８】
本明細書中で使用される場合、アイソフォーム融合タンパク質またはアイソフォーム融合ポリペプチドとは、イントロン配列を伴うかまたはイントロン配列を伴わないアイソフォーム由来のコード配列と、別のポリペプチド（例えば、前駆体配列またはエピトープタグ）をコードするコード配列とを含む核酸分子によってコードされるポリペプチド。上記核酸は、作動可能に連結されて、アイソフォーム融合構築物が転写および翻訳される場合に、アイソフォームポリペプチドが別のペプチドに対して直接かまたはリンカーを介して連結される、アイソフォーム融合ポリペプチドが産生される。アイソフォームポリペプチドは、代表的に、１つ以上の他のペプチドに対して、Ｎ末端またはＣ末端、あるいはその両方にて連結される。
【０１２９】
本明細書中で使用される場合、対立遺伝子改変体または対立遺伝子変異とは、集団の間の遺伝子の基準型とは異なる遺伝子によってコードされているポリペプチド（すなわち対立遺伝子によってコードされている）を指す。代表的には、遺伝子の基準型は、種の集団または単一の基準メンバー由来のポリペプチドの野生型および／もしくは優性型をコードしている。代表的には、種間および種にわたる改変体を含む対立遺伝子改変体は、代表的には、同一種由来の野生型および／もしくは優性型と少なくとも８０％、９０％、９５％またはそれ以上のアミノ酸の同一性を有する。
【０１３０】
本明細書中で使用される場合、種改変体とは、種の間における同じポリペプチドの改変体をいう。一般に、種間の対立遺伝子改変体は、ポリペプチドの野生型および／または優性型との９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を含む、別の種の野生型および／または優性型と少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％またはそれ以上の同一性を有する。
【０１３１】
本明細書中で使用される場合、改変とは、ポリペプチドのアミノ酸の配列または核酸分子中のヌクレオチドの配列の改変をいい、そしてそれぞれ、アミノ酸およびヌクレオチドの欠失、挿入、および置換を含む。
【０１３２】
本明細書中で使用される場合、モジュレートするおよびモジュレーションとは、タンパク質などの分子の活性の変化をいう。例示的な活性としては、シグナル伝達およびタンパク質リン酸化などの生物学的活性が挙げられるが、これらに限定されない。モジュレーションは、活性の増大（すなわちアップレギュレーション活性）、活性の低減（すなわちダウンレギュレーションもしくは阻害）または活性の任意の他の変更（周期性、頻度、期間、および速度など）を含み得る。モジュレーションは、状況に依存する可能性があり、代表的には、モジュレーションは指定の状態、例えば、野生型タンパク質、構成的状態のタンパク質、または指定の細胞型もしくは細胞状態において発現されたタンパク質と比較される。
【０１３３】
本明細書中で使用される場合、、阻害するおよび阻害とは、阻害されていない活性に対する生物学的活性などの活性の低下をいう。
【０１３４】
本明細書中で使用される場合、治療用タンパク質とは、状態、疾患、または障害の処置のために称されるタンパク質をいう。
【０１３５】
本明細書中で使用される場合、処置は、状態、障害もしくは疾患の症状または他の徴候が寛解されるか、または他の様式で有益に変更された、任意の様式を意味する。
【０１３６】
本明細書中で使用される場合、同族レセプター（例えば、ＣＳＲ）、またはそのリガンドによって媒介される疾患または障害とは、同族レセプターまたはリガンドが役割を果たし、その活性のモジュレーションが疾患または疾患の症状の処置を達成する任意の疾患をいう。例示的なリガンドの同族レセプターは、本明細書中に提供され、それらとしては、ＲＴＫ、ＲＡＧＥ、またはＴＮＦレセプターなどの任意のＣＳＲあるいはＨＧＦなどのリガンドが挙げられる。同族レセプターまたはリガンド（例えば、本明細書中に提供される任意のアイソフォームに対する同族レセプターまたはリガンド）は役割を果たす例示的な疾患または障害としては、眼疾患、アテローム硬化症、癌および血管傷害を含む新脈管形成に関連する疾患および状態；アルツハイマー病を含む神経変性疾患；アテローム硬化症および関節リウマチを含む炎症性疾患および炎症性状態；癌および平滑筋関連状態を含む細胞増殖に関連する疾患および状態；ならびに種々の自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
本明細書中で使用される場合、治療効果は、疾患もしくは状態の症状を変化させる（代表的には改善または寛解させる）か、あるいは疾患または状態を治癒する、被験体の処置によって生じる効果を意味する。治療的に有効な量とは、被験体に投与した後に治療効果をもたらす、組成物、分子または化合物の量をいう。
【０１３８】
本明細書中で使用される場合、用語「被験体」とは、ヒトなどの哺乳動物を含む動物をいう。
【０１３９】
本明細書中で使用される場合、患者とは、ヒト被験体をいう。
【０１４０】
本明細書中で使用される場合、活性とは、ポリペプチドなどの生体分子の機能または機能性もしくは変化または相互作用をいう。このような活性の例は、以下であるが、これらに限定されない：複合体化、ダイマー化、マルチマー化、レセプター関連キナーゼの活性または他の酵素活性もしくは触媒活性、レセプター関連プロテアーゼの活性、リン酸化、脱リン酸化、自己リン酸化、他の分子と複合体形成する能力、リガンド結合、触媒活性もしくは酵素活性、自己活性化および他のポリペプチドの活性化を含む活性化、別の分子の機能の阻害もしくはモジュレーション、細胞増殖、遊走、分化、および増殖などのシグナル伝達ならびに／または細胞応答の刺激または阻害、分解、膜局在化、膜結合、腫瘍形成である。活性は、本明細書中に記載されるようなアッセイおよび当業者に公知である任意の適切なアッセイによって評価され得、それらのアッセイとしては、細胞系アッセイを含むインビトロアッセイ、特定の疾患の動物モデルにおけるアッセイを含むインビボアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。生物学的活性とは、インビボで示された活性をいう。本明細書中の目的では、生物学的活性とは、本明細書中に提供されるポリペプチドによって示された活性のうちの任意のものをいう。
【０１４１】
本明細書中で使用される場合、脈管形成疾患（もしくは新脈管形成に関連する疾患）は、新脈管形成のバランスが変更されているかまたはそのタイミングが変更されている疾患をいう。脈管形成疾患は、望ましくない血管化などの新脈管形成の変更が起こるものを含む。このような疾患としては、癌、糖尿病性網膜症および他の糖尿病性合併症を含む細胞増殖性障害、炎症性疾患、子宮内膜症ならびに上述のものを含む過剰の血管化が疾患プロセスの一部である他の疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
本明細書中で使用される場合、複合体化とは、複合体を形成する、２つのタンパク質分子などの２つ以上の分子の相互作用をいう。相互作用は、非共有結合および／または共有結合によるものであり得、それらとしては、疎水性相互作用および静電気的な相互作用、ファンデルワールス力ならびに水素結合が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、タンパク質−タンパク質相互作用には、疎水性相互作用および水素結合が関与する。複合体化は、温度、ｐＨ、イオン強度および圧力、ならびにタンパク質濃度などの環境条件によって影響を受け得る。
【０１４３】
本明細書中で使用される場合、ダイマー化とは、２つのレセプター分子などの２つの同型の分子の相互作用をいう。ダイマー化としては、２つの同一の分子が相互作用するホモダイマー化挙げられる。ダイマー化としてはまた、レセプターの２つのサブユニットなどの２つの異なる分子のヘテロダイマー化、および２つの異なるレセプター分子のダイマー化が挙げられる。代表的には、ダイマー化は、それぞれの分子に含まれるダイマー化ドメインの相互作用によって互いに相互作用する２つの分子が関与する。
【０１４４】
本明細書中で使用される場合、リガンドアンタゴニストとは、リガンドとＣＳＲとの相互作用によって生じる活性を拮抗する、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの活性をいう。
【０１４５】
本明細書中で使用される場合、インシリコとは、コンピュータを用いて行った研究および実験をいう。インシリコ方法としては、分子モデリング研究、生体分子結合実験、ならびに分子構造および／または分子の相互作用などのプロセスの仮想表示が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４６】
本明細書中で使用される場合、生物学的サンプルとは、生きている供給源もしくはウイルス性供給源または高分子および生体分子の他の供給源から得た任意のサンプルをいい、核酸もしくはタンパク質または他の高分子を得ることができる被験体の任意の細胞型あるいは組織を含む。生物学的サンプルは、生物学的供給源から直接得られたサンプル、または加工されたサンプルであり得る。例えば、増幅された単離された核酸は生物学的サンプルを構成する。生物学的サンプルとしては、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿および汗などの体液、動物および植物由来の組織および器官のサンプルならびにそれらに由来する加工されたサンプルが挙げられるが、これらに限定されない。また、これには、土壌および水のサンプルならびに他の環境サンプル、ウイルス、細菌、真菌、藻類、原虫およびそれらの成分も含まれる。
【０１４７】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）やリボ核酸（ＲＮＡ）などの一本鎖および／または二本鎖のポリヌクレオチド、ならびにＲＮＡまたはＤＮＡのどちらかのアナログまたは誘導体をいう。また、用語「核酸」には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ、ならびに他のこのようなアナログおよび誘導体などの核酸のアナログまたはそれらの組合せも含まれる。核酸とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドをいうことができる。また、この用語には、均等物として、ヌクレオチドアナログ、一本鎖（センスもしくはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドから作製された、ＲＮＡまたはＤＮＡのどちらかの誘導体、改変体ならびにアナログも含まれる。デオキシリボヌクレオチドには、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンが含まれる。ＲＮＡでは、ウラシル塩基はウリジンである。
【０１４８】
本明細書中で使用される場合、「をコードしている核酸分子」とは、特定のタンパク質またはペプチドの発現を導く核酸分子をいう。核酸配列は、ＲＮＡへと転写されるＤＮＡ鎖配列およびタンパク質またはペプチドへと翻訳されるＲＮＡ配列の両方を含む。核酸分子は、完全長核酸配列および完全長の成熟ポリペプチドに由来する非完全長配列（例えば、前駆体配列を欠く完全長ポリペプチド）の両方を含む。本明細書中の目的では、核酸配列はまた、ネイティブな配列または特定の宿主においてコドン選択を提供するために導入され得る配列の縮重コドンを含む。
【０１４９】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」とは、少なくとも２つの連結したヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体を含むオリゴマーまたはポリマーをいい、それらは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、および、例えばヌクレオチドアナログまたはホスホジエステル結合以外の「骨格」結合、例えばリン酸トリエステル結合、ホスホラミデート結合、ホスホロチオエート結合、チオエステル結合、もしくはペプチド結合（ペプチド核酸）を含むＤＮＡ誘導体あるいはＲＮＡ誘導体を含む。また、用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中では本質的に「ポリヌクレオチド」と同義で用いられるが、当業者は、オリゴヌクレオチド、例えばＰＣＲプライマーは、一般に約５０〜１００個未満のヌクレオチド長であることを認識する。
【０１５０】
ポリヌクレオチドには、ヌクレオチドアナログ、例えばポリヌクレオチドの質量の識別を可能にする質量を改変したヌクレオチド；ポリヌクレオチドの検出を可能にする蛍光、放射性、発光もしくは化学発光標識などの検出可能な標識を含むヌクレオチド；またはポリヌクレオチドを固体支持体に固定することを容易にするビオチン基もしくはチオール基などの反応基を含むヌクレオチドが含まれていることができる。また、ポリヌクレオチドは、例えば、化学的か、酵素的か、または光分解によって選択的に切断可能な１つ以上の骨格結合を含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、１つ以上のデオキシリボヌクレオチド、次いで１つ以上のリボヌクレオチドを含み得、これは次いで１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含み得、このような配列は塩基の加水分解によってリボヌクレオチド配列で切断可能である。また、ポリヌクレオチドは、切断に対して比較的耐性のある１つ以上の結合、例えばキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含み得、これは、ペプチド核酸結合によって連結されているヌクレオチド、および３’末端にホスホジエステル結合または他の適切な結合によって連結されている少なくとも１つのヌクレオチドを含み得、かつポリメラーゼによって伸長可能である。ペプチドの核酸配列は周知の方法を用いて調製することができる（例えば、Ｗｅｉｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２７９２〜２７９９（１９９７）参照）。
【０１５１】
本明細書中で使用される場合、合成配列および合成遺伝子の文脈において、合成とは、組換え方法および／または化学合成方法によって産生される核酸分子をいう。
【０１５２】
本明細書中で使用される場合、オリゴヌクレオチドとは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどの核酸アナログ、およびそれらの組合せを含むポリマーをいう。本明細書中の目的では、プライマーおよびプローブは一本鎖オリゴヌクレオチドであるか、部分的に一本鎖のオリゴヌクレオチドである。
【０１５３】
本明細書中で使用される場合、プライマーとは、２つ以上、一般には３つを超えるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであって、そこからプライマー伸長産物の合成を開始することができるオリゴヌクレオチドをいう。合成を助ける実験条件には、ヌクレオシド三リン酸およびＤＮＡポリメラーゼなどの重合剤や伸長剤の存在、適切な緩衝液、温度、ならびにｐＨが含まれる。
【０１５４】
本明細書中で使用される場合、組換えＤＮＡ方法を用いた組換え手段による産生とは、クローニングされたＤＮＡによってコードされているタンパク質を発現させるための、分子生物学の周知の方法の使用をいう。
【０１５５】
本明細書中で使用される場合、核酸分子、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体などの分子に関して「単離された」とは、その天然の環境中で見出されるものから人工的に変更されている分子を示す。例えば、組換え宿主細胞によって産生され、そして／または組換え宿主細胞内に含まれる分子は、「単離された」とみなされる。同様に、ネイティブの供給源または組換え宿主細胞から部分的にもしくは実質的に精製された、あるいは合成方法によって産生された分子は、「単離された」と見なされる。意図する用途に応じて、単離された分子は、動物、細胞もしくはその抽出物中；脱水した形、蒸気、溶液もしくは懸濁液の形；または固体支持体上に固定した形などの任意の形態で存在することができる。
【０１５６】
本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」とは、核酸分子であって、それに連結している別の核酸を輸送する能力を有する核酸分子をいう。例えば、ベクターとは、ウイルス発現系、自律的な自己複製性の環状ＤＮＡ（プラスミド）をいい、そしてそれらは、発現プラスミドおよび非発現プラスミドを含む。また、ベクターの１つの型は、エピソーム、すなわち染色体外複製が可能な核酸であり得る。ベクターは、それが連結している核酸の自律複製および／または発現が可能なものを含む。それに作動可能に連結された遺伝子の発現を指揮する能力を有するベクターは、本明細書中では「発現ベクター」と呼ぶ。一般に、発現ベクターは多くの場合、そのベクターの形態では染色体に結合していない、一般に環状の二本鎖ＤＮＡループである「プラスミド」の形態にある。ベクターの最も一般的な形態がプラスミドであるので、「プラスミド」および「ベクター」は、交換可能に使用される。発現ベクターの他の形態は、等価な機能を果たすものおよび今後当該分野において公知になるものを含む。組換え微生物または組換え細胞が「発現ベクター」を受け入れると記載される場合、これは、宿主染色体中に組み込まれた染色体外の環状ＤＮＡおよびＤＮＡの両方を含む。ベクターが宿主細胞によって保持されている場合、そのベクターは、自律構造として有糸分裂の間にその細胞によって安定して複製され得るか、またはそのベクターは、宿主のゲノム内に組み込まれ得るかのいずれかである。
【０１５７】
本明細書中で使用される場合、レポーター遺伝子構築物は、転写制御配列に作動可能に連結されたレポーターをコードしている核酸を含む核酸分子である。レポーター遺伝子の転写はこれらの配列によって制御されている。これらの制御配列のうちの少なくとも１つ以上の活性は、細胞表面タンパク質、細胞内のシグナル伝達に関与しているタンパク質もしくは低分子などの別の分子によって直接または間接的に調節されている。転写制御配列は、プロモーター、およびプロモーターの活性をモジュレートするエンハンサー配列またはＲＮＡポリメラーゼの活性もしくは効率をモジュレートする制御配列などの他の調節領域を含む。このような配列は、本明細書中で転写制御要素または転写制御配列と総称される。さらに、構築物は、結果的に生じるｍＲＮＡの翻訳を変更し、したがってレポーター遺伝子産物の量を変更するヌクレオチドの配列を含み得る。
【０１５８】
本明細書中で使用される場合、「レポーター」または「レポーター部分」とは、細胞によって発現されたタンパク質または生物粒子などの目的分子の検出を可能にする任意の部分をいう。代表的なレポーター部分としては、例えば、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質および緑色蛍光タンパク質（例えば、ウミシイタケ種および他の種由来のＧＦＰを提供する米国特許第６，２３２，１０７号を参照のこと）などの蛍光タンパク質、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｌａｃＺ、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）および他のこのような周知の遺伝子が挙げられる。細胞内での発現には、本明細書中で「レポーター遺伝子」と称される、レポーター部分をコードしている核酸を、目的タンパク質との融合タンパク質としてか、または目的プロモーターの制御下で、発現させることができる。
【０１５９】
本明細書中で使用される場合、核酸の配列に関して語句「作動可能に連結された」とは、核酸分子またはそのセグメントが、一本鎖または二本鎖の形態のどちらであろうとＤＮＡもしくはＲＮＡなどの一片の核酸へと共有結合されていることを意味する。セグメントは必ずしも連続している必要はなく、むしろ、２つ以上の成分は、成分がその意図される様式で機能することを可能にする関係にあるように並列されている。例えば、ＲＮＡのセグメント（エキソン）は、スプライシングなどによって作動可能に連結され単一のＲＮＡ分子を形成することができる。別の例では、ＤＮＡセグメントは作動可能に連結されていることができ、ここで、１つのセグメントの制御体上の制御配列あるいは調節配列が、他のセグメントの発現もしくは複製または他のそのような制御を可能にする。したがって、レポーターもしくは任意の他のポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節領域、または調節領域に作動可能に連結されたレポーターもしくは任意のポリヌクレオチドの場合、ポリヌクレオチド／レポーターの発現は調節領域によって影響を受けるかまたは制御される（例えば、増大もしくは減少など、モジュレートまたは変更される）。遺伝子発現には、ヌクレオチド配列および調節配列は、転写活性化タンパク質などの適切な分子シグナルが調節配列に結合した場合に遺伝子発現が制御されるまたは可能になるように結合されている。ＤＮＡなどの異種核酸と、プロモーター、エンハンサー、転写終結部位や翻訳終結部位、および他のシグナル配列などのヌクレオチドの調節配列ならびにエフェクター配列との作動可能な連結とは、このようなＤＮＡとこのようなヌクレオチドの配列との関係性をいう。例えば、異種ＤＮＡのプロモーターへの作動可能な連結とは、このようなＤＮＡの転写が、読み枠中のＤＮＡを特異的に認識、結合および転写するＲＮＡポリメラーゼによってプロモーターから開始されるような、ＤＮＡとプロモーターとの物理的な関係性をいう。
【０１６０】
本明細書中で使用される場合、ポリペプチド中のアミノ酸に関して用語「作動可能に連結された」とは、アミノ酸の共有結合（直接または間接）をいう。例えば、語句「細胞表面レセプターをコードしている遺伝子のイントロンによってコードされている少なくとも１つのアミノ酸に作動可能に連結された細胞表面レセプターの少なくとも１つのドメイン」の文脈中で用いた場合、細胞表面レセプターからのドメインのアミノ酸が、結合、代表的にはペプチド結合を介した直接結合などによって、細胞表面レセプターの遺伝子からのイントロンによってコードされているアミノ酸と共有結合していることを意味する。また、このような連結（代表的に、ペプチド結合を介した直接的なもの）は、例えば、リンカーまたは非ペプチド連結によって間接的に達成され得る。したがって、細胞表面レセプターをコードしている遺伝子のイントロンによってコードされている少なくとも１つのアミノ酸に作動可能に連結された細胞表面レセプターの少なくとも１つのドメインを含むポリペプチドは、イントロン融合タンパク質であり得る。これは、レセプターの優性型中には見つからないが、優性型をコードしている遺伝子のイントロンによってコードされている部分を含んでいる、１つ以上のアミノ酸を含む。これら１つ以上のアミノ酸は、細胞表面レセプターをコードしている遺伝子のイントロン配列によってコードされている。このようなポリペプチドをコードしている核酸は、イントロン配列がスプライシングされた場合、または他の様式で細胞表面レセプターのドメインをコードしているエキソン配列とフレーム内で共有結合された場合に産生されることができる。核酸分子の翻訳により、イントロン配列のアミノ酸が細胞表面レセプタードメインに共有結合しているポリペプチドが産生される。また、これらは、エキソンがイントロン部分とは異なる細胞表面レセプターアイソフォームの遺伝子によってコードされているキメライントロン融合タンパク質を含めて、エキソンを含む部分とイントロンを含む部分とを連結させることによっても合成して産生され得る。
【０１６１】
本明細書中で使用される場合、アイソフォームおよびイントロン融合タンパク質などのポリペプチドの作製に関して語句「核酸から作製した」は、核酸配列からアミノ酸の配列への翻訳による、文字通りポリペプチド分子の作製およびポリペプチドのアミノ酸配列の作製を含む。
【０１６２】
本明細書中で使用される場合、プロモーター領域とは、それが作動可能に連結されたＤＮＡの転写を制御する、遺伝子のＤＮＡの一部分をいう。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼによる認識、結合および転写開始に十分なＤＮＡの特定の配列を含まれる。プロモーター領域のこの一部分がプロモーターと呼ばれる。さらに、プロモーター領域には、ＲＮＡポリメラーゼのこの認識、結合および転写開始の活性をモジュレートする配列が含まれる。プロモーター領域のこの部分は、プロモーターと称される。さらに、プロモーター領域は、この認識、結合およびＲＮＡポリメラーゼの転写開始活性をモジュレートする配列を含む。これらの配列は、シス作用性であっても、トランス活性化因子に対して応答性であってもよい。プロモーターは、調節の性質に依存して、構成的であっても、調節されてもよい。
【０１６３】
本明細書中で使用される場合、調節領域とは、作動可能に連結された遺伝子の発現に正または負の影響を与える、シス作用性のヌクレオチド配列を意味する。調節領域には、遺伝子の誘導性の（すなわち転写の増大に物質もしくは刺激を要する）発現をもたらすヌクレオチドの配列が含まれる。誘導物質が存在するか、または濃度が上昇している場合は、遺伝子発現を増大させることができる。また、調節領域には遺伝子発現の抑制（すなわち物質または刺激が転写を減少させる）をもたらす配列が含まれている。抑制物質が存在するか、または濃度が上昇している場合は、遺伝子発現を減少させることができる。調節領域は、細胞増殖、細胞成長および細胞死、細胞分化ならびに免疫モジュレーションを含む多くのインビボ生物学的活性に影響を与えるか、それをモジュレートするか、または制御することが公知である。調節領域は、代表的には１つ以上のトランス作用性タンパク質に結合し、その結果、遺伝子の転写の増大または減少のどちらかがもたらされる。
【０１６４】
遺伝子調節領域の具体例はプロモーターおよびエンハンサーである。プロモーターとは、転写または翻訳開始部位の周辺に位置する、代表的には翻訳開始部位の５’に配置されている配列である。プロモーターは通常、翻訳開始部位の１Ｋｂ以内に位置するが、さらに離れて、例えば、２Ｋｂ、３Ｋｂ、４Ｋｂ、５Ｋｂ以上、１０Ｋｂを含めてそれ以内に位置することができる。エンハンサーは、遺伝子の５’もしくは３’に配置されている場合、あるいはエキソンもしくはイントロンの中またはその一部に配置されている場合に、遺伝子発現に影響を与えることが知られている。また、エンハンサーは、遺伝子から顕著な距離、例えば、約３Ｋｂ、５Ｋｂ、７Ｋｂ、１０Ｋｂ、１５Ｋｂ以上の距離でも機能することができる。
【０１６５】
また、調節領域には、プロモーター領域に加えて、翻訳を促進する配列、イントロンのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのフレーム内翻訳を可能にするための遺伝子の正しい読み枠の維持、終止コドン、リーダー配列および融合パートナー配列、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）、多重遺伝子または多シストロン性メッセージを作製するための要素、目的遺伝子の転写物の正確なポリアデニル化をもたらすためのポリアデニル化シグナルならびに終止コドンが含まれ、必要に応じて発現ベクター中に含まれ得る。
【０１６６】
本明細書中で使用される場合、本明細書中に表わす様々なアミノ酸配列中に出現する「アミノ酸」は、その周知の三文字または一文字の略記に従って同定される（表１を参照のこと）。様々なＤＮＡフラグメント中に出現するヌクレオチドは、当該分野で慣用的に使用される標準の一文字の名称を用いて指定する。
【０１６７】
本明細書中で使用される場合、「アミノ酸残基」とは、ペプチド結合におけるポリペプチドの化学的消化（加水分解）の際に形成されるアミノ酸をいう。本明細書中に記載のアミノ酸残基は一般に「Ｌ」異性体である。「Ｄ」異性体中の残基で任意のＬ−アミノ酸残基を置き換えることができるが、ただし、所望の機能特性がポリペプチドに保持されていなければならない。ＮＨ２とは、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基をいう。ＣＯＯＨとは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基をいう。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４３：３５５２〜５９（１９６９）に記載されており、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１〜１．８２２で採用された標準のポリペプチド命名法を順守して、アミノ酸残基の略記を表１に示す。
【０１６８】
【表１】
2009515521.tif 000002
式によって本明細書中に表すアミノ酸残基の全ての配列は、アミノ末端からカルボキシル末端への習慣的な方向で、左から右への方向である。さらに、語句「アミノ酸残基」は、対応表に記載のアミノ酸の改変されたアミノ酸、非天然アミノ酸および異例のアミノ酸を含むように定義されている。さらに、アミノ酸残基の配列の始めまたは終わりのダッシュ記号は、１つ以上のアミノ酸残基のさらなる配列、あるいはＮＨ２などのアミノ末端基またはＣＯＯＨなどのカルボキシル末端基へのペプチド結合を示すことに留意されたい。
【０１６９】
ペプチドまたはタンパク質では、アミノ酸の適切な保存的置換は当業者に公知であり、一般に、その結果生じる分子の生物学的活性を変更せずに行うことができる。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域中の単一のアミノ酸置換によっては生物学的活性が実質的に変更されないことを理解されるべきである（例えば、Ｗａｔｓｏｎ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ、第４版、１９８７、Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．ｃｏ．、ページ２２４を参照のこと）。
【０１７０】
このような置換は、以下の表２に記載のものに従って行われ得る。
【０１７１】
【表２】
2009515521.tif 000003
他の置換も許容され、他の知られている保存的または非保存的置換に従って決定され得る。
【０１７２】
本明細書中で使用される場合、２つのタンパク質または核酸間の「類似性」とは、タンパク質のアミノ酸配列間または核酸のヌクレオチド配列間の関連性をいう。類似性は、残基の配列およびそれに含まれている残基の同一性ならびに／または相同性の度合に基づくことができる。タンパク質間または核酸間の類似性の度合の評価方法は当業者に知られている。例えば、配列の類似性の評価方法の１つでは、２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を、配列間で最大レベルの同一性をもたらす様式でアラインメントを行う。「同一性」とは、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列が不変である程度をいう。アミノ酸配列のアラインメント、ならびにある程度はヌクレオチド配列のアラインメントには、保存的差異および／またはアミノ酸（もしくはヌクレオチド）の頻繁な置換も考慮することができる。保存的差異とは、関与する残基の物理化学的特性が保たれるものである。アラインメントは、全体的（配列の全長にわたり、全ての残基を含む配列を比較したアラインメント）または局所的（最も類似した領域もしくは複数の領域のみを含む配列の一部分のアラインメント）であり得る。
【０１７３】
本明細書中で使用される場合、用語「相同性」および「同一性」は、別段に指定しない限りは多くの場合互換性があるように用いられが、タンパク質についての相同性は保存的アミノ酸変化を含み得る。一般に、対応する位置を同定するために、最も高い桁数の一致が得られるように配列のアラインメントを行う（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１；Ｃａｒｒｉｌｌｏ他（１９８８）ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ、４８：１０７３参照）。
【０１７４】
本明細書中で使用される場合、「配列同一性」とは、試験ポリペプチドまたは試験ポリヌクレオチドと、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチドとの間の比較において同一のアミノ酸（またはヌクレオチド塩基）の数をいう。相同性のポリペプチとは、同一または相同性のアミノ酸残基の所定の数をいう。相同性は、保存的アミノ酸置換、同様に同一の残基を含む。配列同一性は、それぞれの供給元によって確立された初期設定のギャップペナルティーで使用される標準的なアラインメントアルゴリズムプログラムによって決定され得る。相同性の核酸分子とは、所定の数の同一または相同性のヌクレオチドをいう。相同性は、コードされているアミノ酸を変えない置換（すなわち、「サイレント置換」）、同様に同一の残基を含む。実質的に相同性の核酸分子は、代表的に、核酸の全ての長さあるいは目的の完全長核酸分子の少なくとも約７０％、８０％または９０％に沿って、中程度のストリンジェンシーまたは高いストリンジェンシーにてハイブリダイズする。ハイブリダイズする核酸分子中のコドンの場所に縮重コドンを含む核酸分子もまた、企図される（タンパク質の相同性の決定について、保存的アミノ酸は、同一のアミノ酸と同様にアラインメントされ得る；この場合において、同一性の％および相同性の％は変動する）。任意の２つの核酸分子が少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％「同一である」ヌクレオチド配列を有する（または任意の２つのポリペプチドが少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％「同一である」アミノ酸配列を有する）か否かは、例えばＰｅａｒｓｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２４４４に記載の初期設定パラメータを用いた「ＦＡＳＴ  Ａ」プログラムなどの知られているコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる（他のプログラムにはＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２（Ｉ）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３（１９９０）；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ、Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９４、およびＣａｒｒｉｌｌｏ他（１９８８）ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ、４８：１０７３）が含まれる。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎデータベースのＢＬＡＳＴ機能を用いて同一性を決定することができる。他の市販されているかまたは一般に利用可能なプログラムには、ＤＮＡＳｔａｒの「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧ）の「ギャップ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）が含まれる。タンパク質および／または核酸分子の相同性もしくは同一性の％は、例えば、ギャップコンピ���ータプログラムを用いて配列情報を比較することによって決定することができる（例えばＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２：４８２））が改良したＮｅｅｄｌｅｍａｎ他（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３）。手短に述べると、ギャッププログラムは、類似性を、類似しているアラインメントされた記号（すなわちヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を、２つの配列のうちの短い方中の記号の合計数で除算した数値として定義する。ギャッププログラムの初期設定パラメータには、（１）単項比較マトリックス（同一性には値１、非同一性には０）、およびＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ編、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ｐｐ．３５３−３５８（１９７９）に記載のＧｒｉｂｓｋｏｖ他（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１４：６７４５の重みつき比較マトリックス；（２）それぞれのギャップに３．０のペナルティおよびそれぞれのギャップ中のそれぞれの記号にさらに０．１０のペナルティ；ならびに（３）末端のギャップにはペナルティなしが含まれていることができる。したがって、本明細書中で使用される場合、用語「同一性」とは、試験ポリペプチドまたは試験ポリヌクレオチドと、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチドとの間の比較を表す。１つの非限定的な例において、「と少なくとも９０％同一である」とは、参照ポリペプチドに対して９０〜１００％の同一性の割合をいう。９０％以上のレベルの同一性は、例示目的で１００個のアミノ酸の長さの試験ポリペプチドおよび参照ポリペプチドを比較したと仮定した場合、試験ポリペプチド中１０％（すなわち１００個のうち１０個）未満のアミノ酸しか参照ポリペプチドのアミノ酸と異ならないという事実の指標である。試験ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドとの間で類似の比較を行うことができる。このような差異は、アミノ酸配列の全長にわたるランダムな点突然変異として表れるか、または、これらは最大の許容である、例えば、１０／１００個のアミノ酸の差異（約９０％の同一性）までの様々な長さの１つ以上の位置で集まっていることができる。差異は、核酸もしくはアミノ酸の置換、挿入または欠失として定義される。約８５〜９０％を超える相同性または同一性のレベルでは、その結果はプログラムおよびギャップパラメータのセットと独立しているべきであり、このような高レベルの同一性は、多くの場合、ソフトウェアに依存しない手動のアラインメントによって容易に評価することができる。
【０１７５】
本明細書中で使用される場合、アラインメントされた配列とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列中の対応する位置のアラインメントを行うための相同性（類似性および／または同一性）の使用をいう。代表的には、５０％以上の同一性で関連している２つ以上の配列はアラインメントされている。アラインメントされた配列のセットとは、対応する位置でアラインメントされた２つ以上の配列をいい、ＥＳＴなどのＲＮＡ由来のアラインメントされた配列およびゲノムＤＮＡ配列とアラインメントされた他のｃＤＮＡを含み得る。
【０１７６】
本明細書中で使用される場合、「プライマー」とは、適切な条件下（例えば４種の異なるヌクレオシド三リン酸およびＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素などの重合剤の存在下）で、適切な緩衝液中かつ適切な温度において、鋳型に指揮されるＤＮＡ合成開始点として作用することができる核酸分子をいう。特定の核酸分子が「プローブ」および「プライマー」として役割を果たすことができることは、理解されるべきである。しかし、プライマーは伸長用の３’ヒドロキシル基を有する。プライマーは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ、ＲＮＡ  ＰＣＲ、ＬＣＲ、多重ＰＣＲ、パンハンドル（ｐａｎｈａｎｄｌｅ）ＰＣＲ、捕捉ＰＣＲ、発現ＰＣＲ、３’および５’ＲＡＣＥ、インサイチュＰＣＲ、ライゲーション媒介ＰＣＲおよび他の増幅プロトコルを含む様々な方法において用いることができる。
【０１７７】
本明細書中で使用される場合、「プライマー対」とは、（例えばＰＣＲによって）増幅する配列の５’末端とハイブリダイズする５’（上流）プライマーおよび増幅する配列の３’末端の相補体とハイブリダイズする３’（下流）プライマーを含むプライマーの組をいう。
【０１７８】
本明細書中で使用される場合、「特異的にハイブリダイズする」とは、核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）の標的核酸分子への、相補的な塩基対合によるアニーリングをいう。当業者は、特異的ハイブリダイゼーションに影響を与える、特定分子の長さおよび組成などのインビトロならびにインビボのパラメータに精通している。特にインビトロハイブリダイゼーションに関連するパラメータには、アニーリングおよび洗浄温度、緩衝液の組成ならびに塩濃度がさらに含まれる。高ストリンジェンシーにおいて非特異的に結合した核酸分子を除去する例示的な洗浄条件は０．１×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳ、６５℃であり、中程度のストリンジェンシーでは０．２×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳ、５０℃である。匹敵するストリンジェンシー条件が当該分野で公知である。当業者は、特定の用途に適切な核酸分子と標的核酸分子との特異的ハイブリダイゼーションを成すために、これらのパラメータを容易に調節し得る。
【０１７９】
（Ｂ．細胞表面レセプターアイソフォームおよびリガンドアイソフォーム）
ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの分泌、発現、および／または精製を変更することなどによってＣＳＲアイソフォームの産生を変更する別の核酸に融合された細胞表面レセプター（ＣＳＲ）アイソフォームまたはリガンドアイソフォームをコードする核酸が、本明細書中に提供される。アイソフォーム融合体は、別の核酸配列との融合体ではないアイソフォームと比較して改善された分泌および発現を有するポリペプチドをもたらす。また、本明細書中に提供されるアイソフォームをコードする核酸を含む発現ベクター、およびこのようなベクターを含む細胞が、本明細書中に提供される。
【０１８０】
本明細書中に例示されるアイソフォームは、選択的スプライシングまたは組換え方法もしくは合成的（例えば、インシリコおよび／または化学合成）方法によって産生され得る優性型または野生型の遺伝子の改変体を示す。上記アイソフォームは、関連出願（同時係属中の米国特許出願第１０／８４６，１１３号および対応する国際ＰＣＴ出願の国際公開第０５／０１６９６６号、米国特許出願第１１／１２９，７４０号、米国仮特許出願第６０／６７８，０７６号、および米国特許出願番号（代理人整理番号１７１１８−０４５Ｐ０１／Ｐ２８２４）（全てのこのような文書は、その全体が参考として援用される））において記載される。代表的に、選択的スプライシングされたＲＮＡから産生されたアイソフォームは、遺伝子によってコードされた優性型のポリペプチドではない。いくつかの場合において、アイソフォームは、組織特異的ポリペプチドもしくは発生段階特異的ポリペプチドであり得るか、または疾患特異的であり得る（すなわち、アイソフォームは、非疾患状態と比較して、組織と組織の間もしくは段階と段階との間または疾患の段階において異なるレベルで発現され得るか、あるいは疾患のプロセスもしくは進行の段階またはその間においてのみ組織中で発現され得る）。あるいは、アイソフォームをコードし得るスプライシングされたＲＮＡ形態としては、エキソン欠失、エキソン保持、エキソン伸長、エキソン切断、およびイントロン保持の選択的スプライシングされたＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、本明細書中に提供されるアイソフォームは、イントロン改変によって産生される。
【０１８１】
コードする核酸分子の選択的スプライシングによって産生されるアイソフォームは、１つ以上のイントロン由来の１つ以上のコドン（終止コドンを含む）が野生型または優性型のアイソフォームをコードするｍＲＮＡ転写物と比較して保持されるイントロン融合タンパク質を含む。１つ以上のイントロンコドンの保持は、野生型または優性型のアイソフォームと比較して短縮されているアイソフォームをコードする転写物を産生し得る。保持されたイントロン配列は、上記転写物中に終止コドンを導入し得、したがってコードされたポリペプチドを成熟前に終結させる。保持されたイントロン配列はまた、１つ以上のアミノ酸がアイソフォームのドメイン中に挿入されるように、さらなるアミノ酸をアイソフォームポリペプチド中に導入（例えば、転写物への１つ以上のコドンの挿入）し得る。イントロン保持は、アイソフォームをコードする転写物中に完全または部分的なイントロン配列を含むことを包含する。保持されたイントロン配列は、インフレームでコドンを有するヌクレオチド配列を、取り囲むエキソン中に導入し得るか、または保持されたイントロン配列は、フレームシフトを転写物に導入し得る。
【０１８２】
（１．細胞表面レセプターアイソフォーム）
細胞表面レセプターアイソフォームであるアイソフォームは、本明細書中に記載されるようなシグナル配列または前駆体配列に連結され得るか、あるいはそのアイソフォームは、前駆体配列またはシグナル配列に作動可能に連結されたアイソフォームをコードする核酸構築物の発現によって産生され得る。ＣＳＲアイソフォームは、新規のドメインを含み得、そして／あるいは野生型および／または優性型のレセプターと比較して、新規かまたは異なる生物学的機能を示し得る。例えば、イントロンにコードされたアミノ酸は、新規のドメインまたはその部分をアイソフォーム中に導入し得る。変更され得る生物学的活性としては、タンパク質−タンパク質相互作用（例えば、ダイマー化、マルチマー化および複合体形成）、リガンドに対する特異性および／または親和性、細胞の局在および再局在、膜係留（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）、キナーゼ活性などの酵素活性、シグナル伝達経路などにおける調節性タンパク質、補因子、および他のシグナル伝達分子を含む調節性分子に対する応答が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、生物学的活性は、野生型および／または優性型のレセプターと比較して、アイソフォームにおいて少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、または１０倍変更される。代表的に、生物学的活性は、１０、２０、５０、１００または１０００倍あるいはそれ以上変更される。例えば、アイソフォームは、生物学的活性において減少し得る。
【０１８３】
ＣＳＲアイソフォームはまた、野生型および／または優性型のレセプターの活性をモジュレートし得る。例えば、ＣＳＲアイソフォームは、ＣＳＲアイソフォームと直接的かまたは間接的に相互作用し得、そして上記レセプターの生物学的活性をモジュレートする。変更され得る生物学的活性としては、タンパク質−タンパク質相互作用（例えば、ダイマー化、マルチマー化および複合体形成）、リガンドに対する特異性および／または親和性、細胞の局在および再局在、膜係留、キナーゼ活性などの酵素活性、シグナル伝達経路などにおける調節性タンパク質、補因子、および他のシグナル伝達分子を含む調節性分子に対する応答が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８４】
ＣＳＲアイソフォームは、細胞表面レセプターの生物学的活性をモジュレートすることなどによって生物学的効果を引き起こすか、または生物学的効果に関与するために、その細胞表面レセプターと直接的かまたは間接的に相互作用し得る。ＣＳＲアイソフォームはまた、シグナル伝達経路を開始または阻害することなどによって、生物学的効果を引き起こすために細胞表面レセプターとは独立して相互作用し得る。例えば、ＣＳＲアイソフォームは、シグナル伝達経路を開始し、そして細胞増殖を増強または促進し得る。別の例において、ＣＳＲアイソフォームは、例えば、細胞増殖を妨害または阻害し得るシグナル伝達経路を阻害することによって生物学的効果を引き起こすリガンドとして、細胞表面レセプターと相互作用し得る。したがって、本明細書中に提供されるアイソフォームは、それらが、同族リガンドがレセプターと相互作用し、そしてその同族リガンドがレセプター活性を変更する様式と同じ様式で標的レセプターと相互作用するという点において、細胞表面レセプターリガンドとして機能し得る。上記アイソフォームは、リガンド結合部位に対して、必ずではないがリガンドとして結合し、そしてレセプターダイマー化をブロックするように機能し得る。それらのアイソフォームは、それらが上記レセプターと相互作用するという点においてリガンドとして作用する。上記ＣＳＲアイソフォームはまた、上記レセプターに対するリガンドに結合することおよび／またはレセプター活性を妨げることによって作用し得る（例えば、ダイマー化）。
【０１８５】
例えば、ＣＳＲアイソフォームは、リガンドの結合に関してＣＳＲと競合し得る。ＣＳＲアイソフォームは、それがレセプターに結合する場合、レセプター機能の阻害をもたらす負のエフェクターリガンドであり得る。いくつかのＣＳＲアイソフォームが上記レセプターの活性を生じる同族レセプターに結合することも、可能である。ＣＳＲアイソフォームは、例えば、ＣＳＲアイソフォームと複合体化し、そして他のＣＳＲとマルチマー化（例えば、ダイマー化またはトリマー化）するＣＳＲの能力を変更することによってＣＳＲの競合的インヒビターとして作用し得る。ＣＳＲアイソフォームは、シグナル伝達経路における他のポリペプチドおよび補因子との相互作用に関してＣＳＲと競合し得る。本明細書中に提供される細胞表面アイソフォームおよびアイソフォームのファミリーとしては、レセプターチロシンキナーゼのアイソフォーム（本明細書中でＲＴＫアイソフォームとも称される）およびＣＳＲの他のファミリーのアイソフォーム（例えば、ＴＮＦおよび他のＧ−タンパク質共役レセプター）が挙げられるが、これらに限定されない。１つの例において、ＣＳＲアイソフォームは、可溶性ポリペプチドである。例えば、ＣＳＲアイソフォームは、膜貫通ドメインの少なくとも一部または全てを欠く。可溶性アイソフォームは、野生型または優性型のレセプターの生物学的活性をモジュレートし得る（例えば、Ｋｅｎｄａｌｌら（１９９３）ＰＮＡＳ  ９０：１０７０５、Ｗｅｒｎｅｒら（１９９２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：８２、Ｈｅａｎｅｙら（１９９５）ＰＮＡＳ  ９２：２３６５、Ｆｕｋｕｎａｇａら（１９９０）ＰＮＡＳ  ８７：８７０２、Ｗｙｐｙｃｈら（１９９５）Ｂｌｏｏｄ  ８５：６６−７３、Ｂａｒｒｏｎら（１９９４）Ｇｅｎｅ  １４７：２６３、Ｃｈｅｎｇら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：１７５９、Ｄａｓｔｏｔら（１９９６）ＰＮＡＳ  ９３：１０７２３、Ａｂｒａｍｏｖｉｃｈら（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３３８：２９５、Ｄｉａｍａｎｔら．（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４１２：３７９、Ｋｕら（１９９６）Ｂｌｏｏｄ  ８８：４１２４、Ｈｅａｎｅｙ  ＭＬおよびＧｏｌｄｅ  ＤＷ（１９９８）、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．６４：１３５−１４６を参照のこと）。
【０１８６】
レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）アイソフォームまたは腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）アイソフォームまたはＲＡＧＥアイソフォームを含む例示的なＣＳＲアイソフォームは、本明細書中に提供され、そして当業者に公知であるＣＳＲイントロン融合タンパク質を含む（同時係属中の米国特許出願第１０／８４６，１１３号および対応する国際ＰＣＴ出願の国際公開第０５／０１６９６６号、米国特許出願第１１／１２９，７４０号、米国仮特許出願第６０／６７８，０７６号、および米国特許出願番号（代理人整理番号１７１１８−０４５Ｐ０１／Ｐ２８２４）に記載される任意のものを含む）。
【０１８７】
一般に、ＣＳＲイントロン融合タンパク質は、同族細胞表面レセプターをコードする遺伝子の選択的スプライシングによって産生される核酸分子によってコードされる。代表的に、ＣＳＲアイソフォームポリペプチドは、エキソンの末端において切断されたか、または同族細胞表面レセプターをコードする遺伝子のイントロンによってコードされる少なくとも１つのアミノ酸に連結されたかのいずれかである細胞表面レセプターの少なくとも１つのドメインを含む。ＣＳＲは、全ての細胞表面レセプター（例えば、レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）レセプター、ＴＮＦＲレセプター、およびＲＡＧＥレセプター）を含む。
【０１８８】
ＲＴＫの例としては、エリスロポエチン産生肝細胞（ＥＰＨ）レセプター（エフリンレセプターとも称される）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプター、線維芽細胞  増殖因子（ＦＧＦ）レセプター、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）レセプター、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプター、細胞接着ＲＴＫ（ＣＡＫ）、ＴＩＥ／Ｔｅｋレセプター、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）レセプター（ＭＥＴと称される）、ジスコイジンドメインレセプター（ＤＤＲ）、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）レセプター、インスリンレセプター関連（ＩＲＲ）レセプターおよび他のもの（例えば、Ｔｙｒｏ３／Ａｘｌ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＴＮＦＲの例としては、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲｒｐ、低親和性神経増殖因子レセプター、Ｆａｓ抗原、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、およびヘルペスウイルス進入媒介物質（ＨＶＥＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＲＴＫまたはＴＮＦＲをコードする例示的な遺伝子としては、表３に記載される任意のものが挙げられ、それらとしては、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ  ４、ＥｐｈＡ  ５、ＥｐｈＡ  ６、ＥｐｈＡ  ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ５、ＥｐｈＢ６、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３、ＦＧＦＲ−４、Ｆｌｔ１（ＶＥＧＦＲ−１としても公知である）、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３（ＶＥＧＦＲＣとしても公知である）、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＰＤＧＦＲ−Ａ、ＰＤＧＦＲ−Ｂ、ＣＳＦ１Ｒ、Ｆｌｔ３、ＫＩＴ、ＴＩＥ−Ｉ、ＴＥＫ（ＴＩＥ−２としても公知である）、ＨＥＲ−２、ＲＡＧＥ、ＴＮＦＲ２、ならびに上に記載されたＲＴＫおよびＴＮＦＲならびに示されていないＲＴＫおよびＴＮＦＲをコードする遺伝子が挙げられる。表３は、例示的なポリペプチド配列およびコードする核酸配列についての配列番号を含む例示的なＣＳＲイントロン融合タンパク質の非限定的な例を提供する。代表的に、当業者は、アイソフォームの同族完全長レセプターと比較して、前駆体またはシグナル配列または他のタンパク質ドメインを含むアイソフォームの構造的モチーフの存在または非存在を決定し得る。例えば、アイソフォームと完全長同族レセプターとのアラインメントは、シグナル配列および／または同族レセプターについて存在することが公知である他のドメインの存在または非存在を決定するために行われ得る。このようなアラインメントを使用して、例示的なＣＳＲアイソフォームのシグナル配列に含まれるアミノ酸残基は、表３に記載される。別の例において、ドメインの活性が、減少するか、または排除されるか否か、そして／あるいは構造が、完全長同族レセプターと比較して変更されるか否かを決定するために、アイソフォームは、例えば、分泌またはリガンド結合などの活性について試験され得る。ＣＳＲアイソフォーム（例えば、表３で以下に記載されるもの）は、ＣＳＲアイソフォームの分泌などによって産生を改善するために融合タンパク質で使用され得る。
【０１８９】
【表３−１】
2009515521.tif 000004
【０１９０】
【表３−２】
2009515521.tif 000005
【０１９１】
【表３−３】
2009515521.tif 000006
（２．リガンドアイソフォーム）
リガンドアイソフォームは、通常はＣＳＲなどのレセプターと相互作用するリガンドのアイソフォームである。リガンドアイソフォームは、野生型および／または優性型のリガンドと比較して新規のドメインおよび／または機能を含み得る。リガンドアイソフォームのポリペプチド配列における欠失、破壊および／または挿入は、１つ以上のドメインの排除あるいはドメインまたはその部分（例えば、遺伝子中のイントロンによってコードされるもの）の付加などによって、野生型または優性型のリガンドのポリペプチド配列と比較して活性を変更するか、あるいは野生型または優性型のリガンドと比較して構造を変化させることに十分である。１つ以上の活性は、野生型または優性型のリガンドと比較して、リガンドアイソフォームにおいて変更され得る。変更された活性は、１つ以上のレセプターとの変更された相互作用および／またはこのような相互作用から生じる変更されたシグナル伝達を含む。例えば、このような変更された活性によって、リガンドアイソフォームは、そのレセプターへの結合を競合的に阻害することなどによって野生型リガンドの活性のアンタゴニストとして作用し得る。
【０１９２】
一般に、リガンドの活性（すなわち、レセプター相互作用）またはリガンド（すなわち、シグナル伝達）の活性によって生じるプロセスは、野生型および／または優性型のリガンドと比較してリガンドアイソフォームにおいて少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、または１０倍変更される。代表的に、活性は、１０、２０、５０、１００もしくは１０００倍またはそれ以上変更される。例えば、アイソフォームは、野生型および／または優性型のリガンドと比較して、活性の減少を示し得る。アイソフォームはまた、野生型および／または優性型のリガンドと比較して、増大した活性を示し得る。代表的に、いくつかの活性または機能を有するリガンドのリガンドアイソフォームは、このような活性または機能の１つ以上を欠く。例えば、いくつかのリガンドは、カスケードの事象（例えば、シグナル伝達）において生じるレセプターに結合する。上記リガンドアイソフォームは、上記レセプターに結合し得るが、カスケードの事象を開始し損なうか、またはカスケードの事象をより低い程度に開始する。
【０１９３】
リガンドアイソフォームの例は、増殖因子リガンドアイソフォームである。それらの例は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）アイソフォームである。１つの例において、ＨＧＦアイソフォームは、レセプター相互作用を含む細胞表面相互作用において変更される。例えば、アイソフォームは、例えば、ＭＥＴレセプターなどの１つ以上のレセプターに対する結合親和性が減少する。別の例において、アイソフォームは、１つ以上のレセプターに対する増大した親和性を示す。ＨＧＦアイソフォームなどのリガンドアイソフォームは、他の細胞表面分子に対する変更された結合を示し得る。１つの例において、アイソフォームは、ヘパリンまたは硫酸ヘパリンなどのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）に対する結合において変更され得る。別の例において、アイソフォームは、例えば、内皮ＡＴＰシンターゼ、アンギオモチン（ａｎｇｉｏｍｏｔｉｎ）、αｖβ３インテグリン、アネキシンＩＩ、および／または任意の１つ以上の増殖因子レセプター（例えば、ＭＥＴ、ＦＧＦＲ、またはＶＥＧＦＲ）などの新脈管形成に関与する他の細胞表面タンパク質への結合において変更され得る。ＨＧＦアイソフォームは、シグナル伝達の１つ以上の局面において変更され得る。アイソフォームは、野生型または優性型のＨＧＦと比較して、レセプターに対する細胞応答の誘導、増大、抑制および妨害を含む１つ以上の生物学的活性のモジュレーションにおいて変更され得る。ＨＧＦアイソフォームによって変更され得る細胞応答の例としては、分裂促進応答、運動源性応答、形態形成応答および脈管形成応答の誘導、ならびに／またはシグナル伝達分子（例えば、シグナル伝達経路に関与するもの）の誘導が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９４】
ＨＧＦアイソフォームなどのリガンドアイソフォームはまた、別のポリペプチドの活性をモジュレートし得る。モジュレートされたポリペプチドは、野生型または優性型のリガンド（例えば、ＨＧＦ）であり得るか、または野生型または優性型の別の増殖因子（例えば、ＦＧＦ−２またはＶＥＧＦ）であり得る。例えば、ＨＧＦアイソフォームはまた、疾患または状態において発現されるアイソフォームなどの別のＨＧＦアイソフォーム、ＦＧＦ−２アイソフォーム、またはＶＥＧＦアイソフォームをモジュレートし得る。このようなＨＧＦアイソフォームは、野生型または優性型の増殖因子リガンド／レセプター対の１つ以上の活性を妨害または阻害することによって負に作用するリガンドとして作用し得る。負に作用するリガンドは、レセプターのドメインに結合するリガンドに結合または影響する必要も、レセプターのリガンド結合に影響する必要もない。
【０１９５】
１つの例において、ＨＧＦアイソフォームは、増殖因子のレセプターダイマー化および／または脈管形成応答を媒介するために必要な細胞表面タンパク質への結合に関して別の増殖因子リガンドと競合する。例えば、ＨＧＦアイソフォームは、ヘパリンまたはＧＡＧへの結合に関して別の増殖因子リガンドと競合し、したがってリガンドに媒介されるそのレセプターのシグナル伝達に必要とされるダイマーリガンドの形成を妨害し得る。別の例において、ＨＧＦアイソフォームは、レセプター結合に関して別のＨＧＦ形態と競合する。したがって、このようなアイソフォームは、レセプターに結合し得、そして他のＨＧＦポリペプチドに結合するのに利用可能なレセプターの量を減少させ得る。１つ以上のＨＧＦのレセプターに結合し、そして競合するＨＧＦアイソフォームは、シグナル伝達に関与しないか、同族ＨＧＦと比較してシグナル伝達に関与するそれらの能力が減少するＨＧＦアイソフォームを含み得る。
【０１９６】
ＨＧＦイントロン融合タンパク質アイソフォームを含む例示的なリガンドアイソフォームとしては、本明細書中に提供され、そして当業者に公知であるリガンドアイソフォーム（米国仮特許出願第６０／７３５，６０９号（２００５年１１月１０日出願）ならびに対応する米国特許出願番号（代理人整理番号１７１１８−０４５００１／２８２４）およびそれと同日に出願された国際出願番号（代理人整理番号１７１１８−０４５ＷＯ１／２８２４ＰＣ）において記載される任意のものを含む）が挙げられる。一般に、リガンドアイソフォームは、リガンドをコードする遺伝子の選択的スプライシングによって産生される核酸分子によってコードされる。代表的に、リガンドイントロン融合タンパク質アイソフォームポリペプチドは、リガンドをコードする遺伝子のイントロンによってコードされる少なくとも１つのアミノ酸に連結されたリガンドの少なくとも１つのドメインを含むか、またはスプライシングの際にイントロン中の第１のコドンとして生じる終止コドンを導入する選択的スプライシングによってエキソンの末端において切断される。
【０１９７】
表４は、例示的なポリペプチド配列およびコードする核酸配列についての配列番号を含む例示的なリガンドイントロン融合タンパク質アイソフォームの非限定的な例を提供する。当業者は、当業者は、アイソフォームの同族完全長リガンドと比較して、前駆体またはシグナル配列または他のタンパク質ドメインを含むアイソフォームの構造的モチーフの存在または非存在を決定し得る。例えば、アイソフォームと完全長同族リガンドとのアラインメントは、シグナル配列および／または同族リガンドについて存在することが公知である他のドメインの存在または非存在を決定するために行われ得る。このようなアラインメントを使用して、例示的なリガンドアイソフォームのシグナル配列に含まれるアミノ酸残基は、表４に記載される。別の例において、ドメインの活性が、減少するか、または排除されるか否か、そして／あるいは構造が、完全長同族リガンドと比較して変更されるか否かを決定するために、アイソフォームは、例えば、分泌またはレセプター結合などの活性について試験され得る。リガンドアイソフォーム（例えば、表４で以下に記載されるもの）は、リガンドアイソフォームの分泌などによって産生を改善するために融合タンパク質で使用され得る。
【０１９８】
【表４】
2009515521.tif 000007
（３．アイソフォームの対立遺伝子改変体および種改変体ならびに突然変異）
特定のＣＳＲアイソフォームもしくはリガンドアイソフォームと１つ以上のアミノ酸が異なるＣＳＲアイソフォーム配列またはリガンドアイソフォーム配列の対立遺伝子改変体が、生じるか、または産生もしくは同定され得る。このような変異は、単一の集団または種間における対立遺伝子の間の変異を含む。
【０１９９】
変異は、種間で生じる集団および種の変異のメンバーの間で生じる対立遺伝子変異を含む。改変体はまた、動物において生じるか、または合成的に産生される突然変異を含む。例えば、アイソフォームは、遺伝子の異なる対立遺伝子に由来し得る；それぞれの対立遺伝子は、他の対立遺伝子との１つ以上のアミノ酸の差異を有し得る。このような対立遺伝子は、保存的アミノ酸および／または非保存的アミノ酸の差異を有し得る。改変体はまた、異なる被験体（例えば、個々の被験体または動物モデルまたは他の動物）から産生または同定されたアイソフォームを含む。アミノ酸の変化は、アイソフォーム活性のモジュレーションをもたらし得る。いくつかの場合において、アミノ酸の差異は、活性に対して効果を有さないか、または実質的に検出不可能な効果を有する「サイレント（ｓｉｌｅｎｔ）」であり得る。アイソフォームの改変体はまた、突然変異誘発によって産生され得る。このような突然変異誘発は、ランダムまたは位置指定であり得る。例えば、アミノ酸配列、あるいはアイソフォームの部位における増大したグリコシル化または阻害されたグリコシル化などのアイソフォームのグリコシル化の変化（代替のグリコシル化を含む）を達成する可能性のあるグリコシル化部位を変更する対立遺伝子改変体アイソフォームが、産生され得る。
【０２００】
対立遺伝子改変体アイソフォームおよび他の改変体アイソフォームは、配列がアイソフォームと少なくとも９０％同一であり得る。一般に、同一種由来の改変体アイソフォームは、アイソフォームと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であり、代表的に、対立遺伝子改変体は、アイソフォームと９８％、９９％、９９．５％同一である。同じタンパク質についての種間における改変体は、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％およびそれ以上であり得る。本明細書中に提供されるアイソフォームの１つ以上の対立遺伝子改変体を含む例示の非限定的なポリペプチド配列は、配列番号２９０〜３０３、４２９〜４５９、または４６２に示される。ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの対立遺伝子改変体は、本明細書中に提供される融合タンパク質中に含まれ得、そして本明細書中に提供される核酸構築物によってコードされ得、そしてその発現のための方法は、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの分泌などによる産生を改善する。
【０２０１】
（Ｃ．アイソフォーム融合タンパク質の産生）
多くの治療用タンパク質が、適切な原核生物宿主または真核生物宿主における組換え遺伝子発現によって産生される。いくつかのタンパク質は、細胞において産生され、そしてそれらから単離される。他のタンパク質に関して、発現されたタンパク質産物は、培地中（グラム陰性菌の場合においては、内側の細胞膜と外側の細胞膜との間のペリプラズム中）への分泌後に単離される。しかし、多くのタンパク質の精製に関して、分泌の速度は、タンパク質産物の全収率を制限する。ポリペプチドの産生は、ポリペプチドの分泌、発現、および精製によって影響され得る。
【０２０２】
分泌経路への分泌されるタンパク質の進入は、原核生物および真核生物において、ポリペプチド鎖のＮ末端における特定のシグナルペプチドによって導かれ、そのシグナルペプチドは、分泌の間において切り取られる。シグナル配列は、優勢に疎水性（発生期のペプチドを原核生物の内膜または真核生物の小胞体（ＥＲ）膜を横切る分泌タンパク質の輸送のために膜に方向付けることにおいて重要であり得る特徴）である。原核生物シグナル配列および真核生物シグナル配列の間の類似性に起因して、シグナル配列は、一般に、種々の同種タンパク質および異種タンパク質の分泌を標的とすることに適応する。しかし、分泌は、細胞の分泌機構のいくつかのエレメントおよびシグナルペプチド中の特定の配列エレメントを含む複数工程のプロセスである（例えば、Ｍｉｌｌｅｒら．、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１１４０９を参照のこと）。したがって、異なるシグナルペプチドは、使用される宿主細胞に依存して、それらのシグナルペプチドが特定の分泌を導くそれらの効率において変動する。同様に、異なるシグナルペプチドは、それらのシグナルペプチドが異種タンパク質の分泌を導く効率において変動する。したがって、タンパク質の効率的な分泌のために、タンパク質、シグナル配列、および宿主細胞の適合性を実験的に決定することが、必要である。
【０２０３】
イントロン融合タンパク質を含むＣＳＲアイソフォームおよび／またはリガンドアイソフォームの調製のための方法および産物が、提供される。これらのＣＳＲアイソフォームおよび／またはリガンドアイソフォームは、ポリペプチドアイソフォームの改善された産生をもたらす配列に連結されたポリペプチドをコードする核酸分子の発現によって産生される。ポリペプチドの改善された分泌および／または精製のために前駆体配列、エピトープタグ、蛍光部分、または他のタグを含むタグのうちの任意の１つ以上に直接的または間接的に融合されたアイソフォームが、本明細書中に提供される。
【０２０４】
（１．分泌）
宿主細胞において発現された組換えポリペプチドは、以下の３つの区画のうちの１つに蓄積する：細胞質、細菌のペリプラズム、または細胞外培地。細胞外培地中へのタンパク質の効率的な分泌は、いくつかの応答についてのポリペプチドのより容易な精製のための手段を提供する。第１に、通常、少ない夾雑タンパク質が存在し、そのことは、精製の方法論を単純化する。また、細胞外産生は、標的タンパク質を回収するための膜の破壊を必要とせず、したがって細胞内プロテアーゼによって組換えポリペプチドのタンパク質分解を回避する。最終的に、核酸がシグナル配列に正しく融合されると仮定すると、分泌されたポリペプチドのＮ末端アミノ酸残基は、特定のシグナルペプチダーゼ、エンドプロテアーゼ、またはエキソプロテアーゼによる前駆体配列の切断後に、天然の遺伝子産物と同一であり得る。
【０２０５】
分泌は、上記ポリペプチドがリボソームにおいて合成された後の翻訳共役トランスロケーション（ｃｏｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）における小胞体（ＥＲ）を横切るタンパク質のトランスロケーションを必要とする。多くのポリペプチドは、プレ配列および／またはプロ配列を含むプレプロタンパク質またはプロタンパク質として合成される。哺乳動物細胞において、プレ配列（シグナル配列とも称される）は、それがＥＲに接触するまでトランスロケーション適格性のコンホメーションで発生期の鎖を保持すると考えられるシグナル認識粒子（ＳＲＰ）の５４ｋＤａタンパク質によって認識される。ＳＲＰは、７Ｓ  ＲＮＡおよび６個の異なるポリペプチドからなる。上記７Ｓ  ＲＮＡおよび哺乳動物ＳＲＰの５４ｋＤａのシグナル配列結合タンパク質（ＳＲＰ５４）は、細菌におけるシグナル認識粒子を形成するＥ．ｃｏｌｉの４．５Ｓ  ＲＮＡおよびＰ４８  タンパク質（Ｆｆｈ）に強い類似性を示す。一般に、ＥＲを横切るポリペプチドのトランスロケーションは、そのポリペプチドが依然としてリボソームにおいてトランスロケーションおよび合成されつつ生じる。上記ＥＲ膜において、発生期のタンパク質は、上記ＥＲ膜を通過するタンパク質チャネル中に挿入される。上記シグナル配列は、一旦上記ポリペプチドがトランスロケーションされると、即座にそのポリペプチドから切断される。いくつかのポリペプチドはまた、例えば、活性ポリペプチドの折畳みを支援し、したがって分子内シャペロンとして機能することなどの種々の機能を有し得る１つ以上のプロ配列を含むが、プロ配列は、他の調節機能を示し得る。折畳みの完了の際に、プロ配列は、エンドプロテアーゼまたはエキソプロテアーゼによって切断される。なぜならば、一般に、上記プロ配列は、成熟ポリペプチドの活性または安定性に必要ではない。上記ＥＲはまた、他の常在性シャペロンを含み、そのシャペロンはまた、またポリペプチドタンパク質の折畳みを容易にする。
【０２０６】
一旦折畳まれると、上記タンパク質は、グリコシル化などによって改変され、小胞中にパッケージングするためのゴルジ装置に輸送され、そしてエキソサイトーシスによって細胞から分泌される。ポリペプチドの分泌は、構成的に生じ得、それは、全ての細胞における初期状態の経路であり、それによって形質膜に向かう輸送小胞はポリペプチドのエキソサイトーシスのために絶え間なく続くトランス−ゴルジネットワークを離れる。神経細胞または内分泌細胞などのいくつかの細胞において、ポリペプチドの分泌は、例えば、異なる型の刺激に対する応答におけるその後の放出のためにポリペプチドを分泌小胞に対して標的性にする局在化シグナルまたは保留シグナルの存在などによって、調節され得る。
【０２０７】
原核細胞は、オルガネラ（例えば、ＥＲ）を有さないが、それらは、グラム陰性細菌中の形質膜と細胞壁との間の空間（ペリプラズム空間）中への分泌のために分泌されるタンパク質を合成する、形質膜に結合されたリボソームを有する。このような分泌されたタンパク質は、分泌後に切断される真核生物の分泌されるタンパク質に類似するＮ末端ペプチド配列を有する。一般に、分泌されたポリペプチドは、成熟前のポリペプチドとして細胞質で合成され、そして細胞質からペリプラズム中への輸送の間のシグナルペプチドの切断の際に成熟ポリペプチドへと変換される。いくつかの分泌されたタンパク質は、ペリプラズム空間から培地中に漏れ出すが、Ｅ．ｃｏｌｉは、通常、細胞外にタンパク質を分泌しない。むしろ、ペリプラズムから細胞外培地へのポリペプチドの移動は、外膜の破壊を必要とする。前駆体配列の存在に加えて、多くの方法が、Ｅ．ｃｏｌｉからのポリペプチドの細胞外分泌を促進するために適用され、それらとしては、ヘモリジンまたはＯｍｐＦ融合、ｋｉｌまたはｔｏｌＡの同時発現、Ｌ形態細胞の使用、細胞壁が薄い細胞または細胞壁欠損細胞、および／あるいはバクテリオシン放出タンパク質（ＢＲＰ）の同時発現（例えば、Ｃｈｏｉら．、（２００４）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、６４：６２５を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０８】
代表的に、ポリペプチドのシグナル配列は、以下の３つの領域からなる：正に荷電したアミノ酸残基を含むシグナルペプチドのＮ末端におけるアミノ末端領域（ｎ−領域）、７〜８個よりも多いの疎水性アミノ酸残基の中心の疎水性コア（ｃｏｒｅ）（ｈ−領域）、およびシグナルペプチド切断部分を含み、そしてより極性の領域であるカルボキシ末端領域（ｃ−領域）。真核生物において、ｎ−領域の特徴的変化が、Ｎ末端アミノ酸における遊離アミノ基によって供給されるのに対して、原核生物において、Ｎ末端アミノ酸は、ホルミル化され、そして正に荷電した側鎖を有するアミノ酸が、必要とされる。さらに、真核生物のｈ−領域が、ＶａＩ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、およびＩｌｅのいくつかの出現を伴ってＬｅｕによって支配されるのに対して、原核生物のｈ−領域は、ほぼ等しい比率でＬｅｕおよびＡｌａによって支配される。成熟タンパク質からのシグナルペプチドの切断は、ｃ−領域中の特定の部位において生じ、そして切断特異性は、上記シグナル配列の最後の残基に存在する。ｃ−領域の１位および３位における小さい中性のアミノ酸（通常は、Ａｌａ）は、プロセシング特異性を提供する。僅かに異なる配列の優先度に加えて、真核生物のシグナルペプチドは、グラム陰性シグナルペプチドよりも短いものであり、そしてグラム陽性シグナルペプチドよりも著しく短い物である。
【０２０９】
種々の方法は、Ｎ末端配列がシグナルペプチドの機能を行い得ることを予測するために使用されている。例えば、広範に使用されるアルゴリズムは、Ｎｉｅｌｓｅｎら．、（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：１に記載される。このアルゴリズムは、配列が適切な程度の正確性でシグナルペプチドとして機能し得ることを予測する。しかし、それは、配列が最も効率的に機能することを予測しない。このような方法はまた、部分的に、シグナルペプチドと成熟タンパク質との間の連結における切断の部位を予測し得るだけである；例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎらの方法は、原核生物のシグナル配列の８９％のみでシグナルペプチドの切断の部位を正確に予測する。実際に、いくつかのシグナルペプチダーゼは、−３、−１法則に従ってコンセンサス配列を含む領域に偏ったが、切断部位付近の特定のアミノ酸配列以外の知られていない三次元モチーフを認識するようである（ＤｅｖおよびＲａｙ（１９９０）Ｊ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ  ２２：２７１）
タンパク質分泌の効率は、宿主株、シグナル配列、および分泌されるタンパク質の型に依存して変動する。したがって、所与の組換えタンパク質についてその首尾よい分泌を保証する適切なシグナル配列を選択することにおいて、一般的な法則は存在しない。例えば、シグナルペプチドの間の類似性にかかわらず、各々は、特有の配列を有する。したがって、異なるシグナルペプチドにおいて見出される種々の配列は、異なる様式で宿主細胞分泌機構と相互作用するようである。さらに、シグナルペプチドをコードする配列はまた、多くの場合、成熟タンパク質内の下流の配列と相互作用する。例えば、原核生物において、アミノ酸Ａｌａ、Ａｓｐ／ＧｌｕおよびＳｅｒ／Ｔｈｒについて首尾よく切断された成熟タンパク質の最初の５アミノ酸において、偏りが存在する。成熟タンパク質のＮ末端に近い荷電した残基は、分泌に負に影響し得る（「電荷遮断」効果と称される、例えば、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、（１９９３）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．２３９：２５６を参照のこと）。
【０２１０】
したがって、ポリペプチドの分泌および発現を最適化するためのシグナル配列選択は、主に経験的である。なぜならば、シグナル配列は、タンパク質のトランスロケーションを容易にするそれらの能力において広く異なり、そしてこれは、多くの場合、発現されるポリペプチドに依存する。シグナル配列の機能におけるバリエーションについての基本的な理由は、異種の分泌シグナルと同種の分泌シグナルとの間における効力の差異に関連する。例えば、多くのタンパク質は、生理学的条件下において調節されるので、天然の内因性調節シグナル（シグナル配列を含む）の使用は、同種の宿主系におけるポリペプチドの分泌および過剰発現に関して望ましくない。別の例において、外来シグナル配列｛例えば哺乳動物シグナル配列）は、異種宿主細胞（例えば、昆虫細胞など）において必ずしも効率的ではない。したがって、それは、多くの場合（しかし、必ずではない）、宿主発現細胞の種に由来するシグナル配列によって外来ポリペプチドの内因性シグナル配列を置換するために必要である。
【０２１１】
アイソフォーム融合体の発現のための宿主細胞の使用はまた、経験的に決定され得る。一般に、宿主細胞は、シグナルペプチドが宿主細胞と適合性である場合に使用される。機能的シグナルペプチドは、そのポリペプチドの細胞外分泌、次なるそのポリペプチド由来のシグナルペプチドの切断を促進する。特定のエンドプロテアーゼは、シグナルペプチドが確実な標的配列を得るために切断されることを可能にする。重要なことに、シグナルペプチドが切断される位置は、最適なエンドプロテアーゼの存在に部分的に起因して、組換えポリペプチドを発現することに使用される宿主細胞の型などの因子に従って変動し得る。したがって、いくつかの場合において、特定の宿主細胞における特定のシグナルペプチドの使用は、１つよりも多い部位におけるシグナルペプチドの切断から生じる、異なるＮ末端アミノ酸を有するポリペプチド混合物の分泌をもたらし得る。
【０２１２】
代表的に、使用されるシグナル配列の検討は、発現に使用される宿主細胞に依存するが、いくつかのシグナル配列は、異種の宿主と適合性である。例えば、ネイティブなイントロン融合タンパク質アイソフォームポリペプチドを認識およびプロセシングしない原核生物宿主細胞に関して、原核生物シグナル配列（例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダー）は、内因性イントロン融合タンパク質シグナル配列を置換し得るか、または機能的シグナル配列を含まないイントロン融合タンパク質に作動可能に連結され得る。別の例において、酵母の分泌に関して、酵母インベルターゼ、α因子、または酸性ホスファターゼシグナル配列は、ネイティブなイントロン融合タンパク質アイソフォームシグナル配列を置換し得るか、またはシグナル配列を含まないイントロン融合タンパク質に融合され得る。昆虫細胞におけるアイソフォームポリペプチドの分泌および発現は、イントロン融合タンパク質アイソフォームをシグナル配列で置換するか、またはイントロン融合タンパク質アイソフォームにシグナル配列を提供するために、昆虫シグナル配列（例えば、ｇｐ６７またはミツバチメリチン（ｈｏｎｅｙｂｅｅ  ｍｅｌｌｉｔｉｎ）であるが、これらに限定されない）を使用することによって容易にされ得る。さらに、植物由来シグナル配列は、植物におけるイントロン融合タンパク質アイソフォームの分泌のためにシグナル配列を置換または提供するために使用され得る。哺乳動物細胞発現において、内因性シグナル配列は、それが機能的である場合に十分であり得るが、例えば、組織プラスミノーゲンアクチベータシグナル配列などの他の哺乳動物シグナル配列は、アイソフォームの分泌が望ましい場合、特に優れている可能性がある。
【０２１３】
いくつかの例において、異種シグナル配列は、宿主細胞におけるＣＳＲイントロン融合タンパク質またはリガンドイントロン融合タンパク質を含むイントロン融合タンパク質アイソフォームの分泌のために、十分であり、そして多くの場合、その分泌にとって望ましい。交差宿主（ｃｒｏｓｓ−ｈｏｓｔ）分泌シグナルを使用するための検討は、１）シグナル配列が異なる起源（すなわち、原核生物または真核生物）の核酸の分泌を与える；２）シグナル配列の機能性がその元の宿主を超えて拡大すること；ならびに３）ポリペプチドの発現および分泌がかなりの量の機能的産物をもたらすことを含む。例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）シグナル配列は、細菌宿主発現系、昆虫宿主発現系、および哺乳動物宿主発現系におけるイントロン融合タンパク質を含む組換えタンパク質の分泌および発現を促進し得る。別の例において、ヒト血清アルブミン（ｈＨＳＡ）シグナル配列は、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞におけるアイソフォームポリペプチドの発現および分泌を容易にするために、内因性シグナル配列を置換し得、そして／またはイントロン融合タンパク質アイソフォームに機能的シグナル配列を提供し得る。さらに、組織プラスミノーゲンアクチベータ由来のシグナル配列は、昆虫細胞および哺乳動物細胞におけるＣＳＲイントロン融合タンパク質アイソフォームおよびリガンドイントロン融合タンパク質アイソフォームを含むポリペプチドの分泌を媒介するために使用され得る。例示的なシグナル配列は、植物、細胞、酵母、昆虫、および哺乳動物のシグナル配列から選択されるシグナル配列を含む原核生物シグナル配列および真核生物シグナル配列を含み得る。
【０２１４】
例示的なポリペプチド前駆体配列は、シグナル配列を含み得、そしてまた必要に応じて、プロ配列を含み得る。プロ配列によってコードされるリーダープロペプチドは、代表的に、短い組成であり、そしてプロテアーゼによる切断のための特定の切断部位を含む。一般に、プロペプチド配列の切断は、エンドプロテアーゼなどによって分泌前に細胞内で生じるが、例えば、ａｐｏ  Ａ１およびプロレニンなどのいくつかのポリペプチドは、インタクトで分泌され、そして細胞外プロテアーゼまたはエキソプロテアーゼによって切断される。いくつかの例において、プロ配列は、エンドプロテアーゼおよび細胞外プロテアーゼの両方によって切断される。例えば、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）のプロ配列は、分泌前に細胞中でフューリンによって切断され、次いで細胞からの分泌後にプラスミン様プロテアーゼによって切断される。一般に、ＫＥＸ型活性またはフューリン型活性によるものなどのプロペプチドプロセシングに関与するエンドプロテアーゼは、三塩基性シグナルおよび四塩基性シグナルによって二塩基性残基の後で切断する。多くの例外が、切断の必要について存在するが、一般に、プロペプチド切断部位は、４位における塩基性残基によって特徴付けられる。機能的に、プロペプチド配列は、異なり、そしてポリペプチドのコンホメーションを維持するため、プロペプチドの除去の際にポリペプチドの活性を提供するため、および／または認識部位を提供するために機能し得る。例えば、組織プラスミノーゲンアクチベータにおいて、他のプロ配列は、明確な機能を果たさず、そして進化的なレムナントとして保持され得る（Ｂｅｒｇら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ、１７９：１２８９）。例示的な前駆体配列は、表５に記載される。
【０２１５】
【表５−１】
2009515521.tif 000008
【０２１６】
【表５−２】
2009515521.tif 000009
（２．精製および／または検出）
ポリペプチドの精製は、一般に、研究および治療的使用のためにかなりの量でポリペプチドを産生するために必要とされる。ポリペプチド精製における検討は、精製された調製物における夾雑する物質の存在を最小化することを含む。精製の間に生じる夾雑する物質の供給源は、他のポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、または出発サンプルにおける任意の他の物質を含み得る。さらに、ポリペプチドは、最適に、精製後にその生物学的活性を保持する。
【０２１７】
一般に、ポリペプチドの精製は、他のポリペプチドまたは潜在的に夾雑する物質の間における固有の類似性および差異に依存する。例えば、ポリペプチドの類似性が、ポリペプチドを他の非ポリペプチド夾雑物から離して精製するために使用される。対照的に、ポリペプチドにおける差異（例えば、大きさ、形状、電荷、疎水性、可溶性、または生物学的活性における差異）は、ポリペプチドを他の非ポリペプチド夾雑物から離して精製するために使用される。精製技術の例としては、免疫親和性クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、タンパク質沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１８】
「タグ」をポリペプチドに結合することは、組換えポリペプチドの精製および／または検出を容易にし得る。ポリペプチドタグをコードする核酸は、タグを付加したポリペプチドを産生するために、そのカルボキシ末端コード末端またはアミノ末端コード末端において核酸に直接的に融合され得る。一般に、特定のタグについてのコード配列は、発現の際にそのタグがアイソフォームポリペプチドに融合されるキメラポリペプチドを産生するために、アイソフォーム（例えば、イントロン融合タンパク質アイソフォーム）をコードするものなどの核酸分子のコード配列と一緒にインフレームでスプライシングされ得る。上記タグは、ポリペプチドまたは他のこのような試薬に対するポリペプチドまたは抗体の任意の特性の知見を必要としないポリペプチドの検出および／または効率的な精製のために使用され得る。特定のタグは、特定の抗体によって精製または検出され得るエピトープをコードする。それらの特性によって、上記タグは、所望されるポリペプチドの精製を単純化し得る。例えば、タグは、親和性リガンドによって固定化された、例えば、カラムまたはビーズなどの結合マトリックスに結合するための公知のエピトープを提供することによってポリペプチドのアフィニティー精製を容易にし得る。そのカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかにタグを含むポリペプチドは、溶液（例えば、細胞培地）を、カラムマトリックスがタグに対して高い親和性を有するアフィニティーカラムに通すことによって、１工程のプロセスで精製され得る。
【０２１９】
タグは、十分に規定されたペプチドの短い断片（例えば、ポリＨｉｓ、Ｆｌａｇ−エピトープまたはｃ−ｍｙｃエピトープまたはＨＡ−タグ）または小さいタンパク質（細菌ＧＳＴ、ＭＢＰ、チオレドキシン、ｂ−ガラクトシダーゼ、またはＶＳＶ−糖タンパク質）を含み得る。１つの例において、タグは、オリゴ−タグを形成する複数のペプチドを含み得る。例えば、オリゴヒスチジン（ポリＨｉｓ）タグは、一連のヒスチジン残基（すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のヒスチジン残基）を構成するように調製され得る。１つの実施形態において、融合ポリペプチドの発現は、ポリペプチドがそのポリペプチドに対する新規の特異的な抗体を産生することなく研究されることを可能にする、タグ特異的抗体を使用してモニタリングされ得る。エピトープタギングは、生細胞において遺伝子産物を局在化させるか、関連タンパク質を同定するか、または細胞内の融合タンパク質の動きを追跡するために使用され得る。別の実施形態において、多くのタグは、精製目的で利用され得るそれらの独自の結合特性を有する。例えば、ポリＨｉｓ融合タンパク質は、ニッケル−セファロースまたはニッケル−ＨＲＰに結合し得る。ＧＳＴ融合タンパク質は、グルタチオン−セファロースに結合し得る。ＧＳＴ融合タグは、細菌宿主細胞発現系において特に有効である。なぜならば、ＧＳＴアイソフォームは、通常、細菌において見出されず、したがってグルタチオン精製樹脂に対する結合に関して内因性の細菌タンパク質との競合が、存在しないからである。別の例において、ユビキチンタグまたはＳＵＭＯタグが、使用され得、それらは、精製を容易にすることに加えて、ポリペプチドの正しい折畳みを促進するシャペロンとしても機能する。
【０２２０】
タグはまた、発光タンパク質または蛍光タンパク質ならびに／あるいはポリペプチドの局在化および／または精製のために検出され得る任意の他のタンパク質または酵素などの標識であり得る。１つの局面において、アイソフォーム融合体は、ＣＳＲイントロン融合タンパク質またはリガンドイントロン融合タンパク質を含む核酸アイソフォームに作動可能に連結されている発光タンパク質および／または蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含み得る。発光ポリペプチドおよび／または蛍光ポリペプチドは、ポリペプチドの検出、精製、および／または細胞局在化を容易にする。検出可能な光を放出するタンパク質（ルシフェリン、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質を含む）などの種々の分子が、本明細書中で企図される。任意の種々の検出可能な化合物が、使用され得、そして例えば、蛍光計、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）、および／または蛍光顕微鏡検査を使用することなどによる任意の種々の公知の画像化方法によって、ポリペプチドの検出または精製のために画像化され得る。エピトープタグ、蛍光部分、またはポリペプチドの検出および／または精製のための他の部分を含む例示的な融合タグは、表６に記載される。
【０２２１】
【表６】
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１つ以上の融合タグを含むアイソフォームポリペプチドは、生物学的研究のために直接使用され得、そして／または抗体を産生するためまたは他のインビボ用途のために動物に直接注射され得る。とりわけ、これらのタグは、比較的小さいＨｉｓタグ（すなわち、１０アミノ酸未満）であり、したがって、他のより大きなタグよりも免疫原性が小さい。さらに、その小さい大きさに起因して、Ｈｉｓタグは、精製されたポリペプチドの下流の適用のために除去される必要がない可能性がある。例えば、治療的使用などの他の目的のため、およびポリペプチドを妨害し得るいくつかのより大きい融合タグとの使用のために、融合タグは、タグを含まない組換えポリペプチドアイソフォームを産生するために酵素を用いた処理によって、ポリペプチドの精製後に除去され得る。１つの例において、ユビキチン（Ｕｂ）タグは、アイソフォーム配列に融合され得、そしてアイソフォームポリペプチドの発現および精製の後に、脱ユビキチン酵素（ＤＵＢ）は、ネイティブなポリペプチドを産生するためにＵｂを除去し得る。別の例において、ＳＵＭＯプロテアーゼは、アイソフォームポリペプチド融合体からＳＵＭＯタグを切断するために使用され得る。さらなる例において、融合ポリペプチドは、部位特異的プロテアーゼに対する認識部位をコードするように設計され得る。例えば、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ  ３Ｃ）プロテアーゼ認識部位（ＬｅｕＧｌｕＶａｌＬｅｕＰｈｅＧｌｎ／ＧｌｙＰｒｏ（配列番号１３８））は、タグをコードする核酸と目的のコードする核酸との間で融合ポリペプチド中に設計され得る。タグを含む融合ポリペプチド（例えば、Ｈｉｓタグ、Ｓ−タグ、チオレドキシン、ＧＳＴ、ＮｕｓＡ、または任意の他の融合タグであるが、これらに限定されない）およびＨＲＶ  ３Ｃプロテアーゼ認識部位は、一旦融合ポリペプチドがポリペプチドの放出のために親和性マトリックスに結合されると、ＨＲＶ  ３Ｃプロテアーゼと一緒にインキュベートされ得る。他のプロテアーゼ認識部位（トロンビン（Ｒ／ＸまたはＫ／Ｘ；配列番号１３３）、エンテロキナーゼ（ＤＤＤＤＫ／；配列番号１３４）、ＴＥＶ−プロテアーゼ（ＥＮＬＹＦＱ／Ｇ；配列番号１３５）、Ｘａ因子（Ｉ（ＤまたはＥ）ＧＲ／；配列番号１３６）、Ｇｅｎｅａｓｅ  Ｉ（ＨＹＥまたはＨＹＤ；配列番号１３７）または当業者に公知である任意の他のプロテアーゼ認識部位が挙げられるが、これらに限定されない）は、部位特異的プロテアーゼによる認識およびタグを含まないポリペプチドの放出のために、タグを含む融合ポリペプチド中に設計され得る。いくつかの場合において、プロテアーゼ認識部位は、融合タグと目的のポリペプチドとの間のリンカーが続く精製タグに隣接して設計され得る。
【０２２２】
（Ｄ．アイソフォーム融合体）
イントロン融合タンパク質融合体ポリペプチド（ＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームを含む）をコードする核酸配列が、イントロン融合タンパク質アイソフォームおよびコードされたタンパク質の産生のために本明細書中に提供される。ＤＮＡ融合構築物は、シグナルおよび他のプロセシング配列、発現、産生および／または精製を容易にするタグおよび他の部分をコードする核酸を含み得る。アイソフォーム融合体をコードする融合構築物は、細胞内でプロセシングされ得、そしてまた、細胞外でプロセシングされ得る。
【０２２３】
構築物を産生するために、イントロン融合タンパク質をコードする核酸（例えば、配列番号１４０、１４２、１４３、１４５、１４７、１４９、１５０、１５２、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８１、１８３、１８５、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３０、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７４〜２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２８９、３５０、３５２、３５４のうちのいずれか１つに示される配列の全てまたは部分あるいはその対立遺伝子改変体をコードする核酸）が、機能的な分泌配列、プロセシング配列および／もしくは輸送配列を置換し、そして／またはそれらを提供する同種または異種の前駆体配列をコードする核酸に融合され得る。例示的なコードされる前駆体配列は、配列番号２または６０〜９３のうちのいずれか１つに示される。１つの例において、同族レセプターまたは同族リガンドのネイティブな前駆体配列または内因性前駆体配列（例えば、シグナル配列）を含むイントロン融合タンパク質アイソフォームは、アイソフォームポリペプチドの分泌および産生を導く異種または同種の前駆体配列によって補充または置換されるその前駆体配列を有し得る。別の例において、同族レセプターまたは同族リガンドの前駆体配列を含まないイントロン融合タンパク質アイソフォームが、アイソフォームポリペプチドの分泌および産生を改善するアイソフォーム配列と融合された異種または同種の前駆体配列によって提供され得る。代表的に、通常は（そのネイティブな形態において）シグナル配列を含むアイソフォームは、異種前駆体配列を含む融合ポリペプチドに含まれるこの配列を有さない。上記前駆体配列は、一般に、それを宿主細胞から分泌される組換えタンパク質のＮ末端に配置することによって利用される。核酸前駆体配列は、前駆体配列コード領域がアイソフォーム融合体を提供するアイソフォームコード領域の上流（すなわち、５’）であり、かつそのアイソフォームコード領域と同じ読み枠にあるような様式で、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームのコード領域を含む核酸に作動可能に結合または連結され得る。
【０２２４】
ポリペプチドリンカーをコードする核酸配列は、前駆体配列をリガンドアイソフォームまたはＣＳＲアイソフォームに連結するために、融合タンパク質において使用され得る。上記連結は、直接的であっても、リンカーを介してもよい。このようなポリペプチドリンカーは、代表的に、約２アミノ酸残基もしくは２アミノ酸残基〜約６０アミノ酸残基もしくは６０アミノ酸残基（例えば、約５〜４０アミノ酸残基、あるいは約１０〜３０アミノ酸残基、２から６、７または８アミノ酸残基まで）を含む。上記リンカーは、例えば、立体障害を緩和するか、あるいは変更された可溶性などの特性を与えるか、あるいは輸送を導くかまたは輸送に関与するために使用され得る。上記リンカーはまた、融合タンパク質の産生のために、核酸配列の直接的な連結を容易にすることに使用される制限酵素配列を導入するために使用され得る。このような制限酵素リンカーは、本明細書中に記載され、そして当該分野において公知である。選択されるリンカーの長さは、リンカーが含まれる用途などの因子に依存する。
【０２２５】
このようなコードされたポリペプチドリンカーは、有益な特性を与えるために使用され得る。例えば、上記リンカー部分は、単鎖抗体において使用されるものなどの柔軟性のスペーサーアミノ酸配列であり得る。公知のリンカー部分の例としては、ｎが１〜６（１〜４および２〜４を含む）であり、かつｍが１〜６（１〜４、および２〜４を含む）である（ＧｌｙｍＳｅｒ）ｎおよび（ＳｅｒｍＧｌｙ）ｎなどのペプチド、酵素切断可能なリンカー、輸送のためのリンカーおよびその他のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２６】
アイソフォーム融合体は、そのカルボキシ末端がリガンドアイソフォームまたはＣＳＲアイソフォームのアミノ末端に結合された前駆体配列を含む融合ポリペプチドを提供するために、真核細胞などの宿主細胞において発現され得る。上記融合ポリペプチドは、宿主細胞から分泌され得る。代表的に、前駆体配列は、細胞環境の外部、またはいくつかの場合において、ペリプラズム空間に分泌されたアイソフォームの蓄積をもたらす分泌プロセスの間に、上記融合ポリペプチドから切断される。
【０２２７】
必要に応じて、融合核酸であるイントロン融合タンパク質はまた、アイソフォームポリペプチドの精製および／または検出を促す配列番号９４〜１２７のうちのいずれか１つに示されるタグをコードする配列などの別の核酸配列または配列との作動可能な連結を含み得る。他の実施形態において、ＣＳＲイントロン融合タンパク質またはリガンドイントロン融合タンパク質の核酸配列は、内因性シグナル配列を含み得、そして融合タグまたはタグをコードする核酸配列との融合体を含み得る。シグナル配列およびプロ配列を含む多くの前駆体配列ならびに／または融合タグ配列（例えば、本明細書中に提供されかつ記載されるものであるが、これらに限定されない）は、同定されており、かつ当該分野において公知であり、そしてそれらは、アイソフォーム核酸分子と組み合わせて使用されることが企図される。前駆体配列は、アイソフォームの遺伝子またはｃＤＮＡに対して同種であっても異種であってもよく、前駆体配列は、化学的に合成されてもよい。ほとんどの場合において、シグナルペプチドおよび／またはプロペプチドの存在による宿主細胞からのアイソフォームポリペプチドの分泌は、分泌されたイントロン融合タンパク質ポリペプチドからのシグナルペプチドまたはプロペプチドの除去をもたらす。上記前駆体配列は、発現ベクターの成分であり得るか、またはそれは、発現ベクター中に挿入されるアイソフォーム核酸配列の部分であり得る。
【０２２８】
したがって、宿主細胞による融合核酸の発現は、シグナルペプチドの分泌機能および／または精製されたアイソフォームタンパク質の活性に不利に影響しないさらなるアミノ酸を含むアイソフォーム融合タンパク質を提供し得る。例えば、分泌プロセスを促す融合タンパク質の好ましい立体配置を提供するためにアイソフォームタンパク質からシグナルペプチドを隔てるさらなるアミノ酸が、その融合タンパク質に含まれ得る。分離因子（ｓｅｐａｒａｔｏｒ）として機能し得るこのようなさらなるアミノ酸の数は、変動し得、そして一般に、６０アミノ酸を上回らない。別の例において、融合タンパク質は、制限酵素リンカー配列によってコードされるアミノ酸残基を含み得る。さらなる例において、アイソフォーム融合タンパク質は、シグナルペプチドおよび／またはエピトープタグのアミノ酸と、上記アイソフォームタンパク質のアミノ酸配列との間の結合にて選択的切断部位を含み得る。このような選択的切断部位は、選択的な酵素的切断、タンパク質分解性の切断、化学的切断、または他の切断に感受性である部位を提供する１つ以上のアミノ酸残基を含み得る。例えば、上記さらなるアミノ酸は、部位特異的プロテアーゼによる切断のための認識部位であり得る。上記融合タンパク質は、それらからアイソフォームタンパク質を切断するために、さらにプロセシングされ得る；例えば、上記アイソフォームタンパク質が、さらなるアミノ酸を含まないで必要とされる場合。
【０２２９】
（１．例示的なｔＰＡ分泌配列）
アイソフォームに連結するためのシグナルポリペプチドの例は、真核細胞において、連結されたポリペプチドの分泌および他の輸送を導き得るｔＰＡ前駆体配列である。
【０２３０】
（組織プラスミノゲンアクチベータ）
組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）は、チモーゲンプラスミノーゲンをその活性形態（プラスミン）へと変換することによって止血を調節するセリンプロテアーゼである。他のセリンプロテアーゼと同様に、ｔＰＡは、タンパク質分解性プロセシングによって活性化される不活性チモーゲンとして合成および分泌される。特に、ｔＰＡの成熟した部分的に活性な単鎖チモーゲン形態は、プラスミン、組織カリクレインまたはＸａ因子によって触媒される、配列番号４のＡｒｇ−３１０の後の切断によって二本鎖の完全に活性な形態へとさらにプロセシングされ得る。ｔＰＡは、フィブリンが豊富な領域である、血栓を直接取り囲む領域において内皮細胞によって血液中に分泌される。ｔＰＡは、プラスミノーゲンのプラスミン（フィブリンクロットの調節因子）への変換についてのその高い触媒活性に起因するフィブリン溶解を調節する。プラスミンはまた、ｔＰＡによるそのチモーゲン形態の切断の際に酵素的に活性な二本鎖形態に変換されるセリンプロテアーゼである。プラスミンが機能して、種々の場所においてフィブリンのメッシュを切断することによって血栓のフィブリンネットワークを分解し、他のプロテアーゼまたは腎臓および肝臓によって除去される循環するフラグメントの産生をもたらす。
【０２３１】
ｔ−ＰＡの前駆体配列は、配列番号４に示され、そして配列番号２に例示される完全長ｔＰＡ配列のアミノ酸残基１〜３５に対応するプレ配列およびプロ配列を含むポリペプチドをコードする。ｔＰＡの前駆体配列は、アミノ酸１〜２３を含むシグナル配列を含み、そしてまた、プロ配列を含み、そのプロ配列は、配列番号２または４に示される例示的なｔＰＡプレ／プロ配列のアミノ酸２４〜３５、アミノ酸２４〜３２およびアミノ酸３３〜３５を含み得るプロ配列を生じる２つの切断配列を含むアミノ酸１〜３５を含む。ｔＰＡのシグナル配列は、ＥＲにおいて同時翻訳的に切断され、そしてプロ配列は、配列番号２または４に示される例示的な配列のアミノ酸２９〜３２において生じる配列ＲＦＲＲの後のフューリンプロセシング部位における切断によってゴルジ装置において除去される。ｔＰＡプロ配列のフューリンによる切断は、配列番号２または４に示される例示的なｔＰＡ配列のアミノ酸３３〜３５として示される３つのアミノ酸のプロ配列ＧＡＲを保持する。保持されたプロ配列部位の切断は、配列番号４に示されるＳｅｒ３６において始まる成熟ｔＰＡポリペプチドを得るために、プラスミン様細胞外プロテアーゼによって媒介される。培地中に、例えば、アプロチニンなどのプロテアーゼインヒビターを含むことは、エキソペプチダーゼ切断を妨害し、したがってｔＰＡの成熟ポリペプチド中のＧＡＲプロ配列を保持し得る（Ｂｅｒｇら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ、１７９：１２８９）。
【０２３２】
代表的に、ｔＰＡは、構成的な分泌経路によって分泌されるが、いくつかの細胞において、ｔＰＡは、調節された様式で分泌される。例えば、内皮細胞において、ｔＰＡの調節された分泌は、例えば、ヒスタミン、血小板活性因子またはプリンヌクレオチドによる内皮細胞活性化後に誘導され、そして内皮Ｃａ２＋シグナル伝達およびｃＡＭＰシグナル伝達を必要とする（Ｋｎｏｐら、（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １６００：１６２）。例えば神経細胞などの他の細胞において、ｔＰＡの分泌を誘導し得る特定の刺激は、自動運動、精神的ストレス、電撃療法、および外科手術を含む（Ｐａｒｍｅｒら、（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：１９７６）。ｔＰＡの調節された分泌を媒介する機構が、ｔＰＡポリペプチド自体においてシグナルを必要とするのに対し、ｔＰＡのシグナル配列は、ｔＰＡの構成的分泌を効率的に媒介する。なぜならばｔＰＡのシグナル配列のみに作動可能に連結されたＧＦＰ分子が、カルバコール刺激の非存在下において構成的に分泌されるからである（Ｌｏｃｈｎｅｒら、（１９９８）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ、９：２４６３）。ｔＰＡシグナル配列の非存在下において、ｔＰＡ／ＧＦＰハイブリッドタンパク質は、細胞から分泌されない。
【０２３３】
ｔＰＡのプレ／プロペプチド配列を含む例示的なｔＰＡ前駆体配列は、配列番号２に示され、そして配列番号１に示される核酸配列によってコードされる。ｔＰＡのシグナル配列は、配列番号２のアミノ酸１〜２３を含み、そしてそのプロ配列は、配列番号２のアミノ酸２４〜３５を含み、ここで、フューリンに切断されるプロ配列は、アミノ酸２４〜３２を含み、そしてプラスミン様エキソプロテアーゼに切断されるプロ配列は、アミノ酸３３〜３５を含む。ｔＰＡプレ／プロ配列の対立遺伝子改変体はまた、本明細書中に提供される（例えば、配列番号６に示され、配列番号５に示される核酸配列によってコードされるもの）。さらに、哺乳動物起源および非哺乳動物起源のｔＰＡのプレ／プロ配列のイントロン融合タンパク質融合体が、企図され、そして例示的な配列は、配列番号５２〜５９に示される。
【０２３４】
前駆体配列をコードする核酸に融合されたイントロン融合タンパク質などのＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームを含むｔＰＡ−イントロン融合タンパク質融合体ポリペプチドをコードする核酸分子または構築物が、本明細書中に提供される。本明細書中に提供されるこのようなイントロン融合タンパク質配列は、改善された産生のための、増強されたイントロン融合タンパク質ポリペプチドの細胞内発現および分泌が示され得る。
【０２３５】
（２．ｔＰＡ−イントロン融合タンパク質および他のＣＳＲ融合体）
ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォーム（例えば、イントロン融合タンパク質）を含むｔＰＡ−イントロン融合タンパク質融合体ポリペプチドをコードする核酸分子および構築物が、本明細書中に提供される。ｔＰＡプレ／プロ配列に作動可能に連結されたイントロン融合タンパク質の全てまたは部分あるいはその対立遺伝子改変体（例えば、配列番号１４０、１４２、１４３、１４５、１４７、１４９、１５０、１５２、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８１、１８３、１８５、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３０、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７４〜２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２８９、３５０、３５２、３５４のうちのいずれか１つに示されるアイソフォームまたはその対立遺伝子改変体）をコードする核酸配列が、提供される。ｔＰＡプレ／プロ配列は、配列番号１として示され、そして配列番号２に示されるポリペプチドをコードするｔＰＡプレ／プロ配列を含み得る。いくつかの例において、ｔＰＡプレ／プロ配列は、イントロン融合タンパク質の内因性前駆体配列を置換し得、そして／またはイントロン融合タンパク質ポリペプチドの分泌のために最適な前駆体配列を提供し得る。
【０２３６】
他の実施形態において、イントロン融合タンパク質あるいはその対立遺伝子改変体（配列番号１４０、１４２、１４３、１４５、１４７、１４９、１５０、１５２、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８１、１８３、１８５、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３０、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７４〜２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２８９、３５０、３５２、３５４のうちの１つに示されるアイソフォームまたはその対立遺伝子改変体）の全てまたは部分をコードする核酸は、ｔＰＡのプレ／プロ配列（配列番号２に示される例示的なｔＰＡプレ−プロ配列のコードされたアミノ酸１〜３２）のフューリン切断部位までの核酸配列を含むｔＰＡプレ／プロ配列の部分に作動可能に連結され得、したがってアミノ酸ＧＡＲ（配列番号２に示される例示的なｔＰＡプレ−プロ配列のコードされたアミノ酸３３〜３５）をコードする核酸を除外する。
【０２３７】
さらに、イントロン融合タンパク質あるいはその対立遺伝子改変体（例えば、配列番号１４０、１４２、１４３、１４５、１４７、１４９、１５０、１５２、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８１、１８３、１８５、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３０、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７４〜２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２８９、３５０、３５２、３５４のうちのいずれか１つに示されるアイソフォームまたはその対立遺伝子改変体）の全てまたは部分をコードする核酸配列は、配列番号５に示される任意の対立遺伝子改変体をコードするようなｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分の対立遺伝子改変体との作動可能な連結を含み得るか、あるいは配列番号５２〜５９のうちのいずれか１つに示されるｔＰＡプレ／プロ配列をコードするような哺乳動物起源および非哺乳動物起源の他のｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分との作動可能な連結を含み得る。本明細書中に提供されるイントロン融合タンパク質−ｔＰＡプレ／プロ融合配列は、改善された産生のためのイントロン融合タンパク質ポリペプチド増強された細胞発現および分泌を示し得る。
【０２３８】
別の実施形態において、イントロン融合タンパク質またはその対立遺伝子改変体（例えば、配列番号１４０、１４２、１４３、１４５、１４７、１４９、１５０、１５２、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８１、１８３、１８５、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３０、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７４〜２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２８９、３５０、３５２、３５４のうちのいずれか１つに示されるアイソフォームまたはその対立遺伝子改変体）の全てまたは部分をコードする核酸配列は、配列番号２として示される例示的なｔＰＡプレ／プロ配列のアミノ酸１〜２３をコードする例示的なシグナル配列などのｔＰＡプレ／プロ配列のプレ配列（シグナル配列）のみとの作動可能な連結を含み得る。本明細書中に提供されるイントロン融合タンパク質−ｔＰＡプレ配列融合体は、改善された産生のための、イントロン融合タンパク質ポリペプチドの増強された細胞発現および分泌を示し得る。
【０２３９】
さらなる実施形態において、同族レセプターまたは同族リガンドの内因性シグナル配列を含むイントロン融合タンパク質またはその対立遺伝子改変体（例えば、配列番号１４０、１４２、１４３、１４５、１４７、１４９、１５０、１５２、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８１、１８３、１８５、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３０、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７４〜２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２８９、３５０、３５２、３５４のうちのいずれか１つに示されるアイソフォームまたはその対立遺伝子改変体）の全てまたは部分をコードする核酸配列は、ｔＰＡプロ配列との融合を含み得る（ここで、ｔＰＡプロ配列の挿入は、イントロン融合タンパク質内因性のシグナル配列と、イントロン融合タンパク質のコード配列との間にある）。１つの例において、ｔＰＡプロ配列は、配列番号２として示される例示的なｔＰＡプレ／プロ配列のアミノ酸２４〜３２をコードする核酸配列を含む。別の例において、ｔＰＡプロ配列は、配列番号２として示される例示的なｔＰＡプレ／プロ配列のアミノ酸３３〜３５をコードする核酸配列を含む。さらなる例において、ｔＰＡプロ配列は、配列番号２として示される例示的なｔＰＡプレ／プロ配列のアミノ酸２４〜３５をコードする核酸配列を含む。他のｔＰＡプロ配列は、配列番号５に示されるようなｔＰＡプレ／プロ配列の対立遺伝子改変体または配列番号５２〜５９のうちのいずれか１つに示される種改変体のアミノ酸２４〜３２、アミノ酸３３〜３５もしくはアミノ酸２４〜３５をコードする核酸配列を含み得る。本明細書中に提供されるイントロン融合タンパク質−ｔＰＡプロ配列融合体は、改善された産生のためのイントロン融合タンパク質ポリペプチドの増強された細胞発現および分泌を示し得る。
【０２４０】
さらに、イントロン融合タンパク質またはｔ−ＰＡ−イントロン融合タンパク質（例えば、イントロン融合タンパク質−ｔＰＡプレ／プロ配列融合体、イントロン融合タンパク質−ｔＰＡプレ配列融合体、および／またはイントロン融合タンパク質−ｔＰＡ  プロ配列融合体）をコードする核酸はまた、必要に応じて、イントロン融合タンパク質ポリペプチドの精製および／または検出を容易にする、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のタグを含む。一般に、特定のタグについてのコード配列は、イントロン融合タンパク質ポリペプチドをコードする核酸分子のコード配列と一緒に、リンカー領域を有するかまたはそれを有さないアミノ末端またはカルボキシ末端においてインフレームでスプライシングされ得る。融合が配列のアミノ末端上にある場合、融合タグは、内因性前駆体配列または異種前駆体配列の間に配置され得る。１つの実施形態において、ｃ−ｍｙｃタグ、８×Ｈｉｓタグ、あるいは当業者に公知であるか、または配列番号９４〜１２７のうちのいずれか１つに示される任意の他の融合タグなどのタグをコードする核酸は、イントロン融合タンパク質の内因性シグナル配列とイントロン融合タンパク質のコード配列との間に配置され得る。別の実施形態において、融合タグは、配列番号２に示される異種前駆体配列（例えば、ｔＰＡプレ／プロ配列、プレ配列、またはプロ配列）をコードする核酸配列と、イントロン融合タンパク質のコード配列との間に配置され得る。他の実施形態において、融合タグは、イントロン融合タンパク質融合体のポリペプチド配列をコードする核酸のカルボキシ末端に直接おかれ得る。いくつかの場合において、イントロン融合タンパク質融合体は、内因性または異種の前駆体配列と融合タグとの間にリンカーを含み得る。本明細書中に提供される１つ以上の融合タグを含むイントロン融合タンパク質融合体（イントロン融合タンパク質−ｔＰＡ融合体を含む）は、改善された産生のためのイントロン融合タンパク質ポリペプチドのより簡単な検出および／または精製を容易にし得る。
【０２４１】
（ａ．ＦＧＦＲ−２  ｔＰＡ−イントロン融合タンパク質融合体）
ＦＧＦＲ−２イントロン融合タンパク質ポリペプチドの改善された産生のためにｔＰＡのプレ／プロ配列の全てまたは部分と、必要に応じてｃ−ｍｙｃ融合タグとを含むＦＧＦＲ−２のアイソフォームが、本明細書中に提供される。ＦＧＦＲ−２は、線維芽細胞増殖因子レセプターファミリーのメンバーである。ＦＧＦＲ−２に対するリガンドとしては、ＦＧＦ−１（塩基性ＦＧＦ）、ＦＧＦ−２（酸性ＦＧＦ）、ＦＧＦ−４およびＦＧＦ−７などのいくつかのＦＧＦタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。ＦＧＦレセプターは、発生の間における組織リモデリングの細胞−細胞の連絡および成体組織における細胞恒常性に関与している。ＦＧＦＲ−２の過剰発現、またはその突然変異は、乳房、膵臓、結腸直腸、膀胱および子宮頚部の悪性腫瘍を含めた様々なヒトの癌を含めた過剰増殖性疾患に関連している。ＦＧＦＲ−２イントロン融合タンパク質などのＦＧＦＲ−２アイソフォームは、癌を含めた、ＦＧＦがアップレギュレートされた状態の処置に用いることができる。
【０２４２】
ＦＧＦＲ−２タンパク質（配列番号４１１として記載したＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿０００１３２）は、アミノ酸１〜２１の間のシグナル配列によって特徴付けられる。ＦＧＦＲ−２はまた、以下の３つの免疫グロブリン様ドメインを含む；アミノ酸４１〜１２５の間のドメイン１、アミノ酸１５９〜２４９の間のドメイン２、およびアミノ酸２５６〜３６０の間のドメイン３。ＦＧＦＲ−２はまた、アミノ酸３７８〜４００の間の膜貫通ドメインおよびアミノ酸４８１〜７５７の間のプロテインキナーゼドメインを含む。
【０２４３】
例示的なＦＧＦＲ−２アイソフォームとしては、配列番号１７８および１８０に示されるＦＧＦＲ−２アイソフォームが挙げられる。これらの例示的なＦＧＦＲ−２アイソフォームは、配列番号４１１に示されるような同族ＦＧＦＲ−２と比較して、１つ以上のドメインまたはその一部を欠く。配列番号１８０として示される例示的なＦＧＦＲ−２アイソフォームは、アミノ酸１〜２１におけるシグナルペプチド、および以下の３つの免疫グロブリン様ドメインを含むが、膜貫通ドメインおよびプロテインキナーゼドメインを欠く；アミノ酸４１〜１２５の間のドメイン１、アミノ酸１５９〜２４９の間のドメイン２、およびアミノ酸２５６〜３６０の間のドメイン３。配列番号１７８として示される例示的なＦＧＦＲ−２アイソフォームは、アミノ酸１〜２１におけるシグナルペプチド、アミノ酸４４〜１３４の間の免疫グロブリン様ドメイン２およびアミノ酸１４１〜２４５の間のドメイン３を含むが、免疫グロブリン様ドメイン１、膜貫通ドメイン、またはプロテインキナーゼドメインを含まない。
【０２４４】
本明細書中のＦＧＦＲ−２アイソフォームを含むＦＧＦＲ−２アイソフォームは、ＦＧＦＲ−２アイソフォームポリペプチド中に対立遺伝子変異を含み得る。例えば、ＦＧＦＲ−２アイソフォームは、同族ＦＧＦＲ−２の対立遺伝子改変体に存在する１つ以上のアミノ酸の差異を含み得る。１つの例において、ＦＧＦＲ−２の対立遺伝子改変体は、配列番号４１１と比較して１つ以上のアミノ酸の変化を含む。例えば、１つ以上のアミノ酸の変異は、ＦＧＦＲ−２の免疫グロブリンドメイン中で起こり得る。対立遺伝子改変体は、例えばＹがＣで置換され得る１０５位、または例えばＭがＴで置換され得る１６２位、または例えばＡがＦで置換され得る１７２位、または例えばＭがＴで置換され得る１８６位（ＳＮＰ番号７５５７９３）、または例えばＳがＰで置換され得る２６７位、または例えばＦがＶで置換され得る２７６位、または例えばＣがＦで置換され得る２７８位、または例えばＹがＣで置換され得る２８１位、または例えばＱがＰで置換され得る２８９位、または例えばＷがＣで置換され得る２９０位、または例えばＡがＳで置換され得る３１５位、または例えばＧがＲで置換され得る３３８位、または例えばＹがＨで置換され得る３４０位、または例えばＴがＰで置換され得る３４１位、または例えばＣがＲ、Ｙ、Ｓ、Ｆ、もしくはＷで置換され得る３４２位、または例えばＡがＰもしくはＧで置換され得る３４４位、または例えばＳがＣで置換され得る３４７位、または例えばＳがＣで置換され得る３５１位、または例えばＳがＣで置換され得る３５４位において、アミノ酸の変化を含み得る。アミノ酸の変化のさらなる例は、膜貫通ドメイン中で起こり得る。対立遺伝子改変体は、例えばＧがＲで置換され得る３８４位において、アミノ酸の変化を含み得る。また、さらなるアミノ酸の変化は、プロテインキナーゼドメイン中でも起こり得る。対立遺伝子改変体は、例えばＮがＨで置換され得る５４９位、または例えばＥがＧで置換され得る５６５位、または例えばＫがＲで置換され得る６４１位、または例えばＫがＮで置換され得る６５９位、または例えばＧがＥで置換され得る６６３位、または例えばＲがＧで置換され得る６７８位において、アミノ酸の変化を含み得る。対立遺伝子変異は、例えばＲがＰで置換され得る６位、または例えばＴがＩで置換され得る３１位、または例えばＲがＧで置換され得る１５２位、または例えばＳがＷもしくはＬで置換され得る２５２位、または例えばＰがＳもしくはＲで置換され得る２５３位、または例えばＳがＣで置換され得る３７２位、または例えばＹがＣで置換され得る３７５位においても起こり得る。上に記載される１つ以上のアミノ酸の変化を含む例示的なＦＧＦＲ−２対立遺伝子改変体は、配列番号４４４として示され、そしてＦＧＦＲ−２アイソフォームは、配列番号４４４に示されるような任意の１つ以上の対立遺伝子変異を含み得る。ＦＧＦＲ−２アイソフォーム中の対立遺伝子変異は、１０５位、１６２位、１７２位、１８６位、２６７位、２７６位、２７８位、２８１位、２８９位、２９０位、３１５位、３３８位、３４０位、３４１位、３４２位、３４４位、３４７位、３５１位、または３５４位などで、免疫グロブリンドメイン中に１つ以上のアミノ酸の変化を含み得る。さらなる対立遺伝子変異は、６位、３１位、１５２位、２５２位、または２５３位などにおける１つ以上のアミノ酸の変化を含み得る。
【０２４５】
本明細書中に提供されるＦＧＦＲ−２アイソフォームまたはその対立遺伝子変異は、ｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分による内因性シグナル配列の置換などのｔＰＡとの融合を含み得る。配列番号１７８または１８０として本明細書中に提供される例示的なＦＧＦＲ−２アイソフォームに関して、アミノ酸１〜２１を含む内因性シグナル配列を含むＦＧＦＲ−２アイソフォームのアミノ酸１〜２２は、例えば、配列番号２として示され、かつ配列番号１として示されるｔＰＡプレ／プロ配列によってコードされる例示的なｔＰＡプレ／プロ配列などのｔＰＡプレ／プロ配列によって置換され得る。例えば、配列番号４０に示されるポリペプチドをコードする、配列番号３９に示される例示的なｔＰＡ−ＦＧＦＲ−２イントロン融合タンパク質融合体の核酸配列は、ｔＰＡプレ／プロ配列（配列番号３９のヌクレオチド１〜１０５）を含む配列およびＸｈｏＩ制限酵素リンカー部位（配列番号３９のヌクレオチド１３６〜１４１）を含む配列に５’末端にて作動可能に連結された、配列番号１７８に示されるＦＧＦＲ−２アイソフォームのアミノ酸２３〜２８１をコードする核酸配列を含み得る。必要に応じて、配列番号３９に示され、かつ配列番号４０に示されるポリペプチドをコードする例示的なｔＰＡ−ＦＧＦＲ−２イントロン融合タンパク質融合体の配列はまた、上記ｔＰＡプレ／プロ配列と上記ＸｈｏＩリンカー部位との間に作動可能に融合された、ヌクレオチド１０６〜１３５として示されるｍｙｃエピトープタグを含み得る。別の例において、配列番号３６に示されるポリペプチドをコードする、配列番号３５に示される例示的なｔＰＡ−ＦＧＦＲ−２イントロン融合タンパク質融合体の核酸配列は、ｔＰＡプレ／プロ配列（配列番号３５のヌクレオチド１〜１０５）を含む配列およびＸｈｏＩ制限酵素リンカー部位（配列番号３５のヌクレオチド１３６〜１４１）を含む配列に５’末端にて作動可能に連結された、配列番号１８０に示されるＦＧＦＲ−２アイソフォームのアミノ酸２３〜３９６をコードする核酸配列を含み得る。必要に応じて、配列番号３５に示され、かつ配列番号３６に示されるポリペプチドをコードする例示的なｔＰＡ−ＦＧＦＲ−２イントロン融合タンパク質融合体の配列はまた、上記ｔＰＡプレ／プロ配列と上記ＸｈｏＩリンカー部位との間に作動可能に融合されたヌクレオチド１０６〜１３５として示されるｍｙｃエピトープタグを含み得る。
【０２４６】
（ｂ．ＦＧＦＲ−４−ｔＰＡイントロン融合タンパク質融合体）
ＦＧＦＲ−４イントロン融合タンパク質ポリペプチドの改善された産生のためにｔＰＡのプレ／プロ配列の全てまたは部分と、必要に応じてｃ−ｍｙｃ融合タグとを含むＦＧＦＲ−４のアイソフォームが、本明細書中に提供される。ＦＧＦＲ−４は、ＦＧＦレセプターチロシンキナーゼファミリーのメンバーである。ＦＧＦＲ−４の調節は、いくつかの癌細胞において改変されている。例えば、いくつかの腺癌では、ＦＧＦＲ−４は、正常な線維芽細胞中での発現と比較してダウンレギュレートされている。ＦＧＦＲ−４の代替形態が、いくつかの腫瘍細胞中で発現される。例えば、ｐｔｄ−ＦＧＦＲ−４は、ＦＧＦＲ−４細胞外ドメインの部分を欠くが、第３のＩｇ様ドメイン、膜貫通ドメインおよびキナーゼドメインを含む。このアイソフォームは、下垂体腫瘍中に見出され、腫瘍形成性がある。ＦＧＦＲ−４アイソフォームは、ＦＧＦＲ−４が誤調節されている疾患および状態の処置に用いることができる。例えば、ＦＧＦＲ−４アイソフォームは、ｐｔｄ−ＦＧＦＲ−４などの腫瘍形成性ＦＧＦＲ−４アイソフォームのダウンレギュレーションを行うために用いることができる。
【０２４７】
ＦＧＦＲ−４タンパク質（配列番号４１３として記載したＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００２００２）は、アミノ酸１〜２４の間のシグナル配列によって特徴付けられる。ＦＧＦＲ−４はまた、以下の３つの免疫グロブリン様ドメインを含む；アミノ酸３５〜１１３の間のドメイン１、アミノ酸１５２〜２４２の間のドメイン２、およびアミノ酸２４９〜３５１の間のドメイン３。ＦＧＦＲ−４はまた、アミノ酸３７０〜３８６の間の膜貫通ドメインおよびアミノ酸４６７〜７４３の間のプロテインキナーゼドメインを含む。
【０２４８】
例示的なＦＧＦＲ−４アイソフォームは、配列番号４１３に示されるような同族ＦＧＦＲ−４と比較して、１つ以上のドメインまたはその一部を欠く。配列番号１８５として示される例示的なＦＧＦＲ−４アイソフォームは、アミノ酸１〜２４の間のシグナルペプチド、アミノ酸３５〜１１３の間の免疫グロブリン様ドメイン１、アミノ酸１５２〜２４２の間の免疫グロブリン様ドメイン２、およびアミノ酸２４９〜３５１の間の免疫グロブリン様ドメイン３を含むが、同族レセプター（例えば、配列番号４１３）に存在する膜貫通レセプターおよびプロテインキナーゼドメインを欠く。
【０２４９】
本明細書中に提供されるＦＧＦＲ−４アイソフォームを含むＦＧＦＲ−４アイソフォームは、ＦＧＦＲ−４アイソフォームポリペプチド中に対立遺伝子変異を含み得る。例えば、ＦＧＦＲ−４アイソフォームは、同族ＦＧＦＲ−４の対立遺伝子改変体に存在する１つ以上のアミノ酸の差異を含み得る。１つの例において、ＦＧＦＲ−４の対立遺伝子改変体は、配列番号４１３と比較して１つ以上のアミノ酸の変化を含む。例えば、１つ以上のアミノ酸の変異は、ＦＧＦＲ−４の免疫グロブリンドメイン中で起こり得る。対立遺伝子改変体は、例えばＳがＲで置換され得る２７５位（ＳＮＰ番号１１９５４４５６）、または例えばＤがＶで置換され得る２９７位（ＳＮＰ番号１０５７６３３）において、アミノ酸の変化を含み得る。さらなるアミノ酸の変化は、プロテインキナーゼドメイン中で起こり得る。対立遺伝子改変体は、例えばＲがＬで置換され得る位置６１６（ＳＮＰ番号２３０１３４４）でアミノ酸の変化を含み得る。対立遺伝子変異は、例えばＶがＩで置換され得る位置１０（ＳＮＰ番号１９６６２６５）、または例えばＰがＬで置換され得ることができる位置１３６（ＳＮＰ番号３７６６１８）、または例えばＧがＲで置換され得る位置３８８（ＳＮＰ番号３５１８５５）においても起こり得る。上述の１つ以上のアミノ酸の変化を含む例示的なＦＧＦＲ−４対立遺伝子改変体は、配列番号４４６として示され、そしてＦＧＦＲ−４アイソフォームは、配列番号４４６に示されるような任意の１つ以上の対立遺伝子変異を含み得る。ＦＧＦＲ−４アイソフォーム中の対立遺伝子変異は、配列番号４１３の２７５位または２９７位に対応するアミノ酸などにおける免疫グロブリンドメイン中の１つ以上のアミノ酸の変化を含み得る。ＦＧＦＲ−４アイソフォームのさらなる対立遺伝子改変体は、配列番号４１３のアミノ酸位置１０または１３６に対応するアミノ酸などの任意の１つ以上のアミノ酸の変化を含み得る。
【０２５０】
本明細書中に提供されるＦＧＦＲ−４アイソフォームまたはその対立遺伝子変異、ｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分による内因性シグナル配列の置換などのｔＰＡとの融合を含み得る。配列番号１８５として本明細書中に提供される例示的なＦＧＦＲ−４アイソフォームに関して、アミノ酸１〜２４を含む内因性シグナル配列を含むＦＧＦＲ−４アイソフォームのアミノ酸１〜２５は、例えば、配列番号２として示され、かつ配列番号１として示されるｔＰＡプレ／プロ配列によってコードされる例示的なｔＰＡプレ／プロ配列などのｔＰＡプレ／プロ配列によって置換され得る。例えば、配列番号４２に示されるポリペプチドをコードする、配列番号４１に示される例示的なｔＰＡ−ＦＧＦＲ−４イントロン融合タンパク質融合体の核酸配列は、ｔＰＡプレ／プロ配列（配列番号４１のヌクレオチド１〜１０５）を含む配列およびＸｈｏＩ制限酵素リンカー部位（配列番号４１のヌクレオチド１３６〜１４１）を含む配列に５’末端にて作動可能に連結された、配列番号１８５に示されるＦＧＦＲ−４アイソフォームのアミノ酸２６〜４４６をコードする核酸配列を含み得る。必要に応じて、配列番号４１に示される例示的なｔＰＡ−ＦＧＦＲ−４イントロン融合タンパク質融合体の配列はまた、上記ｔＰＡプレ／プロ配列と上記ＸｈｏＩリンカー部位との間に作動可能に融合された、ヌクレオチド１０６〜１３５として示されるｍｙｃエピトープタグを含み得る。
【０２５１】
（ｃ．ＶＥＧＦＲ−１−ｔＰＡイントロン融合タンパク質融合体）
ＶＥＧＦＲ−１イントロン融合タンパク質ポリペプチドの改善された産生のためにｔＰＡのプレ／プロ配列の全てまたは部分と、必要に応じてｃ−ｍｙｃ融合タグとを含むＶＥＧＦＲ−１のアイソフォームが、本明細書中に提供される。ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１））は、チロシンキナーゼのＶＥＧＦレセプターファミリーのメンバーである。ＶＥＧＦＲ−１に対するリガンドとしては、ＶＥＧＦ−ＡおよびＰｌＧＦ（胎盤増殖因子）が挙げられる。ＶＥＧＦＲ−１およびそのリガンドは新脈管形成に重要であるので、これらのタンパク質の調節不備は、固形腫瘍の増殖または転移、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、網膜症および乾癬などの異常な新脈管形成から生じる種々の疾患に対して顕著な影響を有する。ＶＥＧＦＲ−１はまた、川崎病（微小血管高透過性（ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）を伴う全身性血管炎）に関連している。
【０２５２】
配列番号４２６として記載したＶＥＧＦＲ−１ポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００２０１０、配列番号４２６）は、アミノ酸１〜２６の間のシグナル配列によって特徴付けられる。ＶＥＧＦＲ−１ポリペプチドはまた、以下の４つの免疫グロブリン様ドメインを含む；アミノ酸２３１〜３３７の間のドメイン１、３３２〜４２７の間のドメイン２、アミノ酸５５８〜６５６の間のドメイン３、およびアミノ酸６６１〜７４９の間のドメイン４。ＶＥＧＦＲ−１はまた、アミノ酸７６４〜７８０の間の膜貫通ドメインおよびアミノ酸８２７〜１１５４の間のプロテインキナーゼドメイン含む。
【０２５３】
配列番号２７９として示される例示的なＶＥＧＦＲ−１アイソフォームは、アミノ酸１〜２６の間のシグナルペプチド、アミノ酸２３１〜３３７の間およびアミノ酸３３２〜４２７の間の２つの免疫グロブリン様ドメインを含むが、免疫グロブリン様ドメイン２および３を含まない。例示的なＶＥＧＦＲ−１アイソフォームはまた、配列番号４２６に示されるような同族ＶＥＧＦＲ−１と比較して、１つ以上の他のドメインまたはその一部を欠き得る。例えば、例示的なＶＥＧＦＲ−１アイソフォーム（例えば配列番号２７９）は、同族ＶＥＧＦＲ−１（例えば配列番号４２６）と比較して、膜貫通ドメインおよびプロテインキナーゼドメインを欠く。本明細書中のＶＥＧＦＲ−１アイソフォームを含むＶＥＧＦＲ−１アイソフォームは、ＶＥＧＦＲ−１ポリペプチド中に、同族ＶＥＧＦＲ−１ポリペプチド（例えば、配列番号４２６）と比較して１つ以上のアミノ酸の変化などの対立遺伝子変異を含み得る。
【０２５４】
いくつかの実施形態において、配列番号４２６として示されるようなＶＥＧＦＲ−１ポリペプチドは、７つのＩｇ様ドメインを含むことが記載される（例えば、Ｗｉｅｓｍａｎｎら．（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．７８：２４７−２６０を参照のこと）。このような記載は、ＩｇＶ型またはＩｇＣ型の代表的なドメイン分類に分類されないＩｇ様ドメインを含む。例えば、配列番号４２６に示されるＶＥＧＦＲ−１ポリペプチドは、アミノ酸１〜２６の間のシグナル配列を含む。それはまた、アミノ酸３８〜１２９の間のドメイン１、１４９〜２２４の間のドメイン２、アミノ酸２４３〜３２９の間のドメイン３、アミノ酸３４８〜４２５の間のドメイン４、アミノ酸４３９〜５５３の間のドメイン５、アミノ酸５６８〜６４３の間のドメイン６、およびアミノ酸６７３〜７３８の間のドメイン７を含む７つの免疫グロブリン様ドメインを含む。ＶＥＧＦＲ−１はまた、アミノ酸７７０〜７７９の間の膜貫通ドメインおよびアミノ酸８２７〜１１５４の間のプロテインキナーゼドメインを含む。したがって、上の記載に基づいて、配列番号２７９として示される例示的なＶＥＧＦＲ−１アイソフォームは、アミノ酸１〜２６の間のシグナルペプチド、アミノ酸３８〜１２９の間、１４９〜２２４の間、２４３〜３２９の間、および３４８〜４２５の間の４つの免疫グロブリン様ドメインを含む。さらに、例示的なＶＥＧＦＲ−１アイソフォームは、同族ＶＥＧＦＲ１の５番目のＩｇ様ドメインに対応するアミノ酸５２２〜５５３を欠くアミノ酸４３９〜５６０の間の部分的な免疫グロブリンドメインを含み、そして同族ＶＥＧＦＲ−１（例えば配列番号４２６）と比較して、６番目および７番目のＩｇ様ドメイン、膜貫通ドメインならびにプロテインキナーゼドメインを含まない。
【０２５５】
本明細書中に提供されるＶＥＧＦＲ−１アイソフォームまたはその対立遺伝子変異、ｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分による内因性シグナル配列の置換などのｔＰＡとの融合を含み得る。配列番号２７９として本明細書中に提供される例示的なＶＥＧＦＲ−１アイソフォームに関して、ＶＥＧＦＲ−１アイソフォームのアミノ酸１〜２６を含む内因性シグナル配列は、例えば、配列番号２として示され、かつ配列番号１として示されるｔＰＡプレ／プロ配列によってコードされる例示的なｔＰＡプレ／プロ配列などのｔＰＡプレ／プロ配列によって置換され得る。例えば、配列番号３１に示され、かつ配列番号３２に示されるポリペプチドをコードする、例示的なｔＰＡ−ＶＥＧＦＲ−１イントロン融合タンパク質融合体の核酸配列は、ｔＰＡプレ／プロ配列（配列番号３１のヌクレオチド１〜１０５）を含む配列およびＸｈｏＩ制限酵素リンカー部位（配列番号３１のヌクレオチド１３６〜１４１）を含む配列に５’末端にて作動可能に連結された、配列番号２７９に示されるＶＥＧＦＲ−１アイソフォームのアミノ酸２７〜５４１をコードする核酸配列を含み得る。必要に応じて、配列番号３１に示され、かつ配列番号３２に示されるポリペプチドをコードする例示的なｔＰＡ−ＶＥＧＦＲ−１イントロン融合タンパク質融合体の配列はまた、上記ｔＰＡプレ／プロ配列と上記ＸｈｏＩリンカー部位との間に作動可能に融合されたｍｙｃヌクレオチド１０６〜１３５として示されるエピトープタグを含み得る。
【０２５６】
（ｄ．ｔＰＡ−ＭＥＴイントロン融合タンパク質体）
ＭＥＴイントロン融合タンパク質ポリペプチドの改善された産生のためにｔＰＡのプレ／プロ配列の全てまたは部分と、必要に応じてｃ−ｍｙｃ融合タグとを含むＭＥＴのアイソフォームが、本明細書中に提供される。ＭＥＴは、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（すなわち細胞の増殖、形態形成および運動性を制御する多機能性サイトカイン）に対するＲＴＫである。主に間葉細胞によって産生されるパラ分泌因子であるＨＧＦは、迅速な膜ラフリング、微小突起の形成、および細胞の運動性の増加を含む、分裂促進的ならびに形態形成的な変化を誘導する。ＭＥＴによるシグナル伝達は、腫瘍形成性を増加させ、細胞運動性を誘導し、インビトロでの侵襲性およびインビボでの転移を亢進することができる。ＭＥＴシグナル伝達はまた、プロテアーゼおよびウロキナーゼの産生を増加させることもでき、これにより、腫瘍の転移の促進に重要な細胞外基質／基底膜の分解がもたらされる。
【０２５７】
ＭＥＴは、肝細胞中で高度に発現されるＲＴＫである。ＭＥＴは、２つのジスルフィドで連結されたサブユニット（５０ｋＤａのαサブユニットおよび１４５ｋＤａのβサブユニット）から構成される。完全にプロセシングされたＭＥＴタンパク質では、αサブユニットは細胞外にあり、βサブユニットは細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびチロシンキナーゼドメインを有する。ＭＥＴに対するリガンドは、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）である。ＦＧＦおよびＭＥＴによるシグナル伝達は、細胞の増殖、運動性および侵襲を含む、肝細胞ならびに上皮細胞における分裂促進的な活性を刺激する。他のＲＴＫと同様に、これらの特性は、ＭＥＴを発癌活性に関連付ける。癌における役割に加えて、ＭＥＴは、マラリア感染の発症において重要な因子であることも示されている。肝細胞をマラリアによる感染に対して感受性をもたせるためにＭＥＴの活性化が必要であり、したがって、ＭＥＴは、この疾患の予防の主要な標的である。
【０２５８】
ＭＥＴレセプター（配列番号４１４として記載したＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿０００２３６）は、アミノ酸１〜２４の間のシグナル配列およびアミノ酸５５〜５００の間のＳｅｍａドメインによって特徴付けられる。ＭＥＴに加えて、Ｓｅｍａドメインは、その一部が軸索ガイダンスの間に忌避性シグナルとして機能する、分泌された膜貫通タンパク質の大きなファミリーであるセマフォリン中に発生する。ＭＥＴにおいて、Ｓｅｍａドメインは、リガンド結合に加えてレセプターのダイマー化に関与する。ＭＥＴタンパク質はまた、アミノ酸５１９〜５６２の間のプレキシンのシステインが豊富な反復、アミノ酸５６３〜６５５の間、アミノ酸６５７〜７３９の間およびアミノ酸７４２〜８３６の間の３つのＩＰＴ／ＴＩＧドメインによって特徴付けられる。ＩＰＴとは、プレキシンおよび転写因子に共有される免疫グロブリン様の折畳みの略である。ＴＩＧとは、転写因子中の免疫グロブリン様ドメイン（転写因子ＩＧ）の略である。ＭＥＴ中のＴＩＧドメインは、細胞外基質とレセプターシグナル伝達との間の相互作用のいくつかを媒介する役割を担っている可能性がある。ＭＥＴタンパク質はまた、アミノ酸９５１〜９７３の間の膜貫通ドメインおよびアミノ酸１０７８〜１３３７の間の細胞質プロテインキナーゼドメインによっても特徴付けられる。
【０２５９】
本明細書中に提供される例示的なＭＥＴアイソフォームは、野生型または優性型のＭＥＴレセプター（例えばとして示される配列番号４１４）の１つ以上のドメインを含む。例えば、配列番号２１４として示される例示的なＭＥＴレセプターアイソフォームは、アミノ酸１〜２６の間のシグナルペプチド、完全なＳｅｍａドメイン、完全なプレキシンのシステインが豊富な反復ドメイン、および３つの完全なＩＰＴ／ＴＩＧドメインを含む。さらに、本明細書中に提供されるＭＥＴの例示的なアイソフォームは、配列番号４１４に示されるような同族ＭＥＴレセプターと比較して、１つ以上のドメインまたはその一部を欠く。本明細書中に提供される例示的なＭＥＴレセプターアイソフォーム（例えば、配列番号２１４）は、膜貫通ドメインおよびプロテインキナーゼドメインを欠く。
【０２６０】
本明細書中のＭＥＴアイソフォームを含むＭＥＴアイソフォームは、ＭＥＴポリペプチド中に対立遺伝子変異を含み得る。例えば、ＭＥＴアイソフォームは、、同族ＭＥＴの対立遺伝子改変体に存在する１つ以上のアミノ酸の差異（例えば、配列番号４１４と比較して１つ以上のアミノ酸の変化など）を含み得る。例えば、１つ以上のアミノ酸の変異は、ＭＥＴのＳｅｍａドメイン中で起こり得る。対立遺伝子改変体は、例えばＫがＲで置換され得る１１３位、または例えばＤがＮで置換され得る１１４位、または例えばＶがＡで置換され得る１４５位、または例えばＨがＲで置換され得る１４８位、または例えばＴがＰで置換され得る１５１位、または例えばＶがＡで置換され得る１５８位、または例えばＥがＤで置換され得る１６８位、または例えばＩがＴで置換され得る１９３位、または例えばＶがＬで置換され得る２１６位、または例えばＶがＡで置換され得る２３７位、または例えばＴがＡで置換され得る２７６位、または例えばＦがＬで置換され得る３１４位、または例えばＬがＰで置換され得る３３７位、または例えばＤがＶで置換され得る３４０位、または例えばＮがＤで置換され得る３８２位、または例えばＲがＧで置換され得る４００位、または例えばＨがＲで置換され得る４７６位、または例えばＬがＭで置換され得る４８１位、または例えばＤがＧで置換され得る５００位において、アミノ酸の変化を含み得る。さらなる例では、１つ以上のアミノ酸の変異は、ＭＥＴのプレキシンのシステインが豊富な反復ドメイン中で起こり得る。対立遺伝子改変体は、例えばＨがＹで置換され得る５４２位において、アミノ酸の変化を含み得る。他の例では、１つ以上のアミノ酸の変異は、ＭＥＴのＩＰＴ／ＴＩＧドメイン中で起こり得る。対立遺伝子改変体は、例えばＬがＳで置換され得る６２２位、または例えばＦがＳで置換され得る７２０位、または例えばＡがＴで置換され得る７２９位において、アミノ酸の変化を含み得る。さらなる例では、１つ以上のアミノ酸の変異は、ＭＥＴのプロテインキナーゼドメイン中で起こり得る。対立遺伝子改変体は、例えばＨがＲで置換され得る１０９４位、または例えばＮがＹで置換され得る１１００位、または例えばＹがＣで置換され得る１２３０位、または例えばＹがＤで置換され得る１２３５位、または例えばＭがＴで置換され得る１２５０位において、アミノ酸の変化を含み得る。対立遺伝子改変体はまた、例えばＶがＡで置換され得る３７位、または例えばＭがＴで置換され得る３９位、または例えばＱがＲで置換され得る４２位、または例えばＹがＨで置換され得る５０１位、または例えばＴがＡで置換され得る５１１位などにおいても、１つ以上のアミノ酸の変化を含み得る。上に記載される１つ以上のアミノ酸の変化を含む例示的なＭＥＴ対立遺伝子改変体は、配列番号４４７として示される。ＭＥＴアイソフォームは、配列番号４４７に示されるような１つ以上の対立遺伝子変異を含み得る。対立遺伝子変異は、１１３位、１１４位、１４５位、１４８位、１５１位、１５８位、１６８位、１９３位、２１６位、２３７位、２７６位、３１４位、３３７位、３４０位、３８２位、４００位、４７６位、４８１位、または５００位などで、Ｓｅｍａドメイン中に１つ以上のアミノ酸の変化を含み得る。対立遺伝子変異は、５４２位などで、プレキシンのシステインが豊富な反復ドメイン中においても起こり得る。さらなる対立遺伝子変異はまた、６２２位、７２０位、または７２９位などで、ＩＰＴ／ＴＩＧドメイン中においても起こり得る。対立遺伝子変異はまた、３７位、３９位、４２位、５０１位、または５１１位などで、他のアミノ酸の変化を含み得る。
【０２６１】
本明細書中に提供されるＭＥＴアイソフォームまたはその対立遺伝子変異、ｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分による内因性シグナル配列の置換などのｔＰＡとの融合を含み得る。配列番号２１４として本明細書中に提供される例示的なＭＥＴアイソフォームに関して、アミノ酸１〜２４を含む内因性シグナル配列を含むＭＥＴアイソフォームのアミノ酸１〜２５は、例えば、配列番号２として示され、かつ配列番号１として示されるｔＰＡプレ／プロ配列によってコードされる例示的なｔＰＡプレ／プロ配列などのｔＰＡプレ／プロ配列によって置換され得る。例えば、配列番号３３に示され、配列番号３４に示されるポリペプチドをコードする、例示的なｔＰＡ−ＭＥＴイントロン融合タンパク質融合体の核酸配列は、ＸｈｏＩ制限酵素リンカー部位（配列番号３３のヌクレオチド１３６〜１４１）を含む配列が続くｔＰＡプレ／プロ配列（配列番号３３のヌクレオチド１〜１０５）を含む配列に５’末端にて作動可能に連結された、配列番号２１４に示されるＭＥＴアイソフォームのアミノ酸２６〜８７７をコードする核酸配列を含み得る。必要に応じて、配列番号３３に示され、配列番号３４に示されるポリペプチドをコードする、例示的なｔＰＡ−ＭＥＴイントロン融合タンパク質融合体の配列はまた、上記ｔＰＡプレ／プロ配列と上記ＸｈｏＩリンカー部位との間に作動可能に融合されたヌクレオチド１０６〜１３５として示されるｍｙｃエピトープタグを含み得る。
【０２６２】
（ｅ．ｔＰＡ−ＲＯＮイントロン融合タンパク質融合体）
ＲＯＮイントロン融合タンパク質ポリペプチドの改善された産生のためにｔＰＡのプレ／プロ配列の全てまたは部分と、必要に応じてｃ−ｍｙｃ融合タグとを含むＲＯＮ（ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ  ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ  ｎａｎｔａｉｓ；マクロファージ刺激１レセプター（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）としても公知である）のアイソフォームが、本明細書中に提供される。ＲＯＮは、ＲＴＫのＭＥＴサブファミリーのメンバーである。ＲＯＮに対するリガンドは、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）である。ＲＯＮは、上皮由来の細胞中で発現される。ＲＯＮは、肺癌および結腸癌を含めた上皮癌において役割を果たす。ＲＯＮおよびＭＥＴは、卵巣癌において発現され、そして癌細胞に選択的利点を与えることによって癌の進行を促進することが示唆されている。ＲＯＮはまた、特定の結腸直腸癌中で過剰発現される。ＲＯＮ遺伝子中の生殖系列の突然変異は、ヒトの腫瘍形成に関連している。ＲＯＮアイソフォームは、ＲＯＮが過剰発現される疾患および状態においてＲＯＮの活性をモジュレートすることなどによって、ＲＯＮをモジュレートするために用いることができる。
【０２６３】
ＲＯＮタンパク質（配列番号４１５として記載したＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００２４３８）は、アミノ酸１〜２４の間のシグナル配列を含む。ＲＯＮはまた、アミノ酸５８〜５０７の間のＳｅｍａドメイン、アミノ酸５２６〜５６８の間のプレキシンのシステインが豊富なドメイン、３つのＩＰＴ／ＴＩＧドメイン（アミノ酸５６９〜６７１の間、アミノ酸６８４〜７６７の間、およびアミノ酸７７０〜８６０の間）、アミノ酸９６０〜９８２の間の膜貫通ドメインならびにアミノ酸１０８２〜１３４１の間の細胞質プロテインキナーゼドメインによって特徴付けられる。
【０２６４】
例示的なＲＯＮアイソフォームは、配列番号４１５に示されるような同族ＲＯＮと比較して、１つ以上のドメインまたはその一部を欠く。例えば、配列番号２２３として示される例示的なＲＯＮアイソフォームは、膜貫通ドメインおよびプロテインキナーゼドメインを欠く。配列番号２２３に示される例示的なＲＯＮアイソフォームは、完全なＳｅｍａドメイン、プレキシンのシステインが豊富なドメイン、および３つのＩＰＴ／ＴＩＧドメインを含む。
【０２６５】
本明細書中に提供されるＲＯＮアイソフォームを含むＲＯＮアイソフォームは、ＲＯＮポリペプチド中に対立遺伝子変異を含み得る。例えば、ＲＯＮアイソフォームは、同族ＲＯＮの対立遺伝子改変体に存在する１つ以上のアミノ酸の差異（例えば、配列番号４１５と比較して１つ以上のアミノ酸の変化）を含み得る。例えば、１つ以上のアミノ酸の変異は、ＲＯＮのＳｅｍａドメイン中で起こり得る。対立遺伝子改変体は、例えばＧがＳで置換され得る１１３位（ＳＮＰ番号３７３３１３６）、または例えばＧがＡで置換され得る２０９位、または例えばＱがＲで置換され得る３２２位（ＳＮＰ番号２２３０５９３）、または例えばＮがＳで置換され得る４４０位（ＳＮＰ番号２２３０５９２）において、一塩基多型（ＳＮＰ）を含み得る。アミノ酸の変異はまた、例えばＲがＱで置換され得る５２３位（ＳＮＰ番号２２３０５９０）、または例えばＶがＭで置換され得る９４６位（ＳＮＰ番号１３０７８７３５）においても起こり得る。さらに、１つ以上のアミノ酸の変異は、ＲＯＮのプロテインキナーゼドメイン中で起こり得る。対立遺伝子改変体は、例えばＧがＳで置換され得る１１９５位（ＳＮＰ番号７４３３２３１）、または例えばＲがＧで置換され得る１３３５位（ＳＮＰ番号１０６２６３３）、または例えばＤがＶで置換され得る１２３２位、または例えばＭがＴで置換され得る１２５４位において、アミノ酸の変化を含み得る。上に記載される１つ以上のアミノ酸の変化を含む例示的なＲＯＮ対立遺伝子改変体は、配列番号４４８として示され、そしてＲＯＮアイソフォームは、配列番号４４８に示されるような対立遺伝子改変体中に任意の１つ以上のアミノ酸の差異を含み得る。対立遺伝子改変体は、１１３位、２０９位、３２２位または４４０位などでＳＥＭＡドメイン中に１つ以上のアミノ酸の変化を含み得る。対立遺伝子改変体はまた、５２３位などにおいて１つ以上のアミノ酸の変化を含み得る。
【０２６６】
本明細書中に提供されるＲＯＮアイソフォームまたはその対立遺伝子変異は、ｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分による内因性シグナル配列の置換などのｔＰＡとの融合を含み得る。配列番号２２３として本明細書中に提供される例示的なＲＯＮアイソフォームに関して、アミノ酸１〜２４を含む内因性シグナル配列を含むＲＯＮアイソフォームのアミノ酸１〜２５は、例えば、配列番号２として示され、かつ配列番号１として示されるｔＰＡプレ／プロ配列によってコードされる例示的なｔＰＡプレ／プロ配列などのｔＰＡプレ／プロ配列によって置換され得る。例えば、配列番号４７に示され、配列番号４８に示されるポリペプチドをコードする、例示的なｔＰＡ−ＲＯＮイントロン融合タンパク質融合体の核酸配列は、ＸｈｏＩ制限酵素リンカー部位（配列番号４７のヌクレオチド１３６〜１４１）を含む配列が続くｔＰＡプレ／プロ配列（配列番号４７のヌクレオチド１〜１０５）を含む配列に５’末端にて作動可能に連結された、配列番号２２３に示されるＲＯＮアイソフォームのアミノ酸２６〜９０８をコードする核酸配列を含み得る。必要に応じて、配列番号４７に示され、配列番号４８に示されるポリペプチドをコードする例示的なｔＰＡ−ＲＯＮイントロン融合タンパク質融合体の配列はまた、上記ｔＰＡプレ／プロ配列と上記ＸｈｏＩリンカー部位との間に作動可能に融合されたヌクレオチド１０６〜１３５として示されるｍｙｃエピトープタグを含み得る。
【０２６７】
（ｆ．ｔＰＡ−ＨＥＲ２イントロン融合タンパク質融合体）
ＨＥＲ２イントロン融合タンパク質ポリペプチドの改善された産生のためにｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分と、必要に応じてポリＨｉｓ融合タグとを含むＨＥＲ２のアイソフォームが、本明細書中に提供される。ヒト上皮増殖因子レセプター２遺伝子（ＨＥＲ２；ＥｒｂＢ２、ＮＥＵ、ＮＧＬとも称される）は、癌遺伝子に関連していると考えられているレセプターチロシンキナーゼを含む。ＨＥＲ２は、約１８５ｋＤａ（ｐ１８５ＨＥＲ２）のポリペプチドをコードする４．５Ｋｂの主要なｍＲＮＡ転写物を有する。ＨＥＲ２は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４もまた含まれるヒト上皮増殖因子レセプター（ＨＥＲ）ファミリーのメンバーである。ＨＥＲ１に対するリガンド、ＨＥＲ３に対するリガンド、およびＨＥＲ４に対するリガンドは、ＨＥＲ１自体、トランスフォーミング増殖因子−α、アンフィレグリン、ベタセルリン、およびヘレグリンを含む。ＨＥＲ２に対するリガンドは、同定されているが、ＨＥＲ２は、他のＨＥＲファミリーメンバーの好ましいヘテロダイマー化パートナーであり、したがってそれらのリガンドに対するそれらの親和性を増強し、そしてそれらのシグナルを増幅する。ＨＥＲ２は、２５〜３０％のヒト乳癌および８〜１１％のヒト卵巣癌において過剰発現される。
【０２６８】
ＨＥＲ２（配列番号４０８として示されるＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００４４３９）は、他のＨＥＲファミリーと同様に、Ｉ型ＲＴＫである。Ｉ型ＲＴＫは、細胞外ドメイン、単独で疎水性である膜貫通セグメント、および細胞質チロシンキナーゼドメインを含む。ＨＥＲ２を含むＩ型ＲＴＫの細胞外ドメインは、以下の４つのドメインに分けられている：Ｉ（アミノ酸２３〜２１７の間）、ＩＩ（アミノ酸２１８〜３４２の間）、ＩＩＩ（アミノ酸３４２〜５００の間）、およびＩＶ（アミノ酸５０１〜５８２の間）。上記細胞外領域は、ＥＧＦＲ様ドメインと称される約１９０アミノ酸のＬドメインからなる２つのドメイン単位のタンデムリピートとして配置される４つのドメインを含む。なぜならば、ＥＧＦについての主要な決定因子が、約１２０アミノ酸のシステインが豊富なドメインまたはフューリン様ドメイン（ドメインＩＩおよびＩＶ）が続くＥＧＦＲ（ドメインＩおよびＩＩＩ）のドメインＩＩＩに位置するからである。特に、ＨＥＲ２は、アミノ酸１〜２２の間のシグナル配列、アミノ酸５２〜１７３の間および３６６〜４８６の間の２つのレセプターＬドメイン（ＥＧＦＲ様ドメインとも称される）、アミノ酸１８９〜３４３の間のフューリン様ドメイン、アミノ酸６３３〜６５４の間の膜貫通ドメイン、ならびにアミノ酸７２０〜９８７の間のプロテインキナーゼドメインを含むアミノ酸６５５〜１２３４の間の細胞内細胞質ドメインによって特徴付けられる。
【０２６９】
ＨＥＲ２の数種のアイソフォームが産生され、そしてそれらのアイソフォームは、タンパク質分解性プロセシングによって産生されたポリペプチドおよび選択的スプライシングされたＲＮＡから産生された形態を含む。ＨＥＲ２アイソフォームには、ヘルスタチンとして指定されるものがある。ヘルスタチンおよびそのフラグメントは、ＨＥＲ２遺伝子によってコードされるＨＥＲ２結合タンパク質である。ヘルスタチン（ｐ６８ＨＥＲ−２とも称される）は、ｐ１８５−ＨＥＲ２レセプターをコードする遺伝子の選択的スプライシングされた改変体によってコードされ、そしてＨＥＲ２遺伝子のイントロン８部分を保持する。例えば、１つのヘルスタチンは、胎児の腎臓および肝臓において生じ、そして膜局在化レセプターと比較して、Ｃ末端に７９アミノ酸のイントロンをコードした挿入物を含む（例えば、米国特許第６，４１４，１３０号および公開された米国特許出願２００４００２２７８５を参照のこと）。数種のヘルスタチン改変体が、同定されている（例えば、米国特許第６，４１４，１３０号；公開された米国特許出願２００４００２２７８５、米国特許出願第０９／２３４，２０８号；米国特許出願第０９／５０６，０７９号；公開された国際出願の国際公開第００４４４０３号および同第０１６１３５６号を参照のこと）。
【０２７０】
本明細書中に提供される例示的なＨＥＲ２アイソフォームは、野生型または優性型のＨＥＲ２同族レセプター（例えば、配列番号４０８として示される）の１つ以上のドメインを含む。例えば、本明細書中に提供され、配列番号２８９に示される例示的なＨＥＲ２ヘルスタチンアイソフォーム（例えば、ＤｉｍｅｒｃｅｐｔＴＭヘルスタチン）は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインの部分（代表的に、最初の３４０アミノ酸）を含む。ヘルスタチンは、アミノ酸１〜２２の間のシグナルペプチド、ならびにＨＥＲ２細胞外ドメインのサブドメインＩおよびＩＩおよびアミノ酸３４１とアミノ酸４１９との間のドメインＩＩＩの部分（ＩＩＩａサブドメインと称される）、ならびにイントロンによってコードされるＣ末端ドメインを含む。得られたヘルスタチンポリペプチドは、代表的に、４１９アミノ酸（細胞外ドメインのサブドメインＩおよびＩＩを含む３４０アミノ酸に加えてイントロン８由来の７９アミノ酸）を含む。ヘルスタチンタンパク質は、細胞外ドメインＩＶ、ならびに膜貫通ドメインおよびキナーゼドメインを欠く。
【０２７１】
ヘルスタチンは、ＨＥＲ２に結合するが、そのレセプターを活性化しない。ヘルスタチンは、レセプターチロシンキナーゼのＥＧＦ−ファミリーのメンバー、ならびにインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）レセプターおよび他のレセプターを阻害し得る。ヘルスタチンは、トランスリン酸化およびレセプター活性化に必要とされる生産的なレセプターダイマー（ホモダイマーおよびヘテロダイマー）の形成を妨げる。あるいは、またはさらに、ヘルスタチンは、レセプター末端への結合に関してリガンドと競合することができる（例えば、米国特許第６，４１４，１３０号；公開された米国特許出願２００４００２２７８５、米国特許出願第０９／２３４，２０８号；米国特許出願第０９／５０６，０７９号；公開された国際出願の国際公開第００４４４０３号および同第ＷＯ０１６１３５６号を参照のこと）。
【０２７２】
本明細書中に提供されるヘルスタチンアイソフォームを含むＨＥＲ２アイソフォームは、ＨＥＲ２ポリペプチド中に対立遺伝子変異を含み得る。例えば、ヘルスタチンアイソフォームは、同族ＨＥＲ２の対立遺伝子改変体に存在する１つ以上のアミノ酸の差異（例えば、配列番号４０８と比較して１つ以上のアミノ酸の変化）を含み得る。例えば、１つ以上のアミノ酸の変異は、ＨＥＲ２のレセプターＬドメイン中で起こり得る。対立遺伝子改変体は、例えばＷがＣで置換され得る４５２位においてアミノ酸の変化を含み得る。他の対立遺伝子変異は、例えばＩがＶで置換され得る６５４位、または例えばＩがＶで置換され得る６５５位、または例えばＰがＡで置換され得る１１７０位などにおいて細胞内細胞質ドメイン中で起こり得る。上に記載される１つ以上のアミノ酸の変化を含む例示的なＨＥＲ２対立遺伝子改変体は、配列番号４４２として示される。ヘルスタチンを含むＨＥＲ２アイソフォームは、例えば、配列番号４４２に示されるような対立遺伝子変異などのＨＥＲ２の任意の１つ以上の対立遺伝子変異を含み得る。
【０２７３】
さらに、本明細書中に提供されるヘルスタチンアイソフォームは、ヘルスタチンポリペプチドのイントロン８部分中に対立遺伝子変異（例えば、配列番号３１９と比較して１つ以上のアミノ酸の変化）を含み得る。例えば、対立遺伝子改変体は、例えばＴがＳで置換され得る２位、または例えばＬがＰで置換され得る５位、または例えばＰがＬで置換され得る６位、または例えばＬがＱで置換され得る１６位、または例えばＭがＬもしくはＩで置換され得る１８位、または例えばＧがＤ、Ａ、もしくはＶで置換され得る２１位、または例えばＬがＩで置換され得る３６位、または例えばＰがＲで置換され得る５４位、または例えばＰがＬで置換され得る６４位、または例えばＤがＨもしくはＮで置換され得る７３位、または例えばＲがＣで置換され得る１７位、または例えばＲがＩで置換され得る３１位においてアミノ酸の変化を含み得る。ヘルスタチン改変体はまた、上に示されるようなヘルスタチンのイントロン８部分における任意の１つ以上のアミノ酸の変異を含み得る。ヘルスタチンまたはそのイントロン８部分において生じ得る対立遺伝子変異の概要は、以下の表７において括弧内に示されるような配列番号を伴って示される。上に記載されるような任意の１つ以上のアミノ酸の変化を含む例示的なイントロン８は、配列番号３２０〜３３３に示され、そしてイントロン８にコードされる部分における任意の１つ以上のアミノ酸の変化を含むヘルスタチン対立遺伝子改変体は、配列番号２９０〜３０３に示される。ヘルスタチンアイソフォームは、配列番号２９０〜３０３のいずれか１つに示されるような任意の１つ以上のアミノ酸の変異を含み得る。
【０２７４】
【表７】
2009515521.tif 000011
本明細書中に提供されるヘルスタチンアイソフォームまたはその対立遺伝子変異は、ｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分による内因性シグナル配列の置換などのｔＰＡとの融合を含み得る。配列番号２８９として本明細書中に提供される例示的なヘルスタチンアイソフォーム（ＤｉｍｅｒｃｅｐｔＴＭとも称される）に関して、アミノ酸１〜２２を含む内因性シグナル配列を含むヘルスタチンアイソフォームのアミノ酸１〜２３は、例えば、配列番号２として示され、かつ配列番号１として示されるｔＰＡプレ／プロ配列によってコードされる例示的なｔＰＡプレ／プロ配列などのｔＰＡプレ／プロ配列によって置換され得る。例えば、配列番号３７に示され、配列番号３８に示されるポリペプチドをコードする、例示的なｔＰＡ−ヘルスタチンイントロン融合タンパク質融合体の核酸配列は、ＸｂａＩ制限酵素リンカー部位（配列番号３７のヌクレオチド１０６〜１１１）を含む配列が続くｔＰＡプレ／プロ配列（配列番号３７のヌクレオチド１〜１０５）を含む配列に５’末端にて作動可能に連結された、配列番号２８９に示されるヘルスタチンアイソフォームのアミノ酸２４〜４１９をコードする核酸配列を含み得る。必要に応じて、配列番号３７に示され、ポリペプチド配列番号３８に示されるをコードする例示的なｔＰＡ−ヘルスタチンイントロン融合タンパク質融合体の配列はまた、ＸｂａＩリンカー部位とヘルスタチンの配列との間に作動可能に融合されたヌクレオチド１１２〜１３５として示される８×ポリＨｉｓエピトープタグを含み得る。
【０２７５】
（ｇ．ｔＰＡ−ＲＡＧＥイントロン融合タンパク質融合体）
ＲＡＧＥイントロン融合タンパク質ポリペプチドの改善された産生のためにｔＰＡのプレ／プロ配列の全てまたは部分と、必要に応じてｃ−ｍｙｃ融合タグとを含むＲＡＧＥのアイソフォームが、本明細書中に提供される。ＲＡＧＥは、免疫グロブリンファミリーのメンバーである細胞表面レセプターである。ＲＡＧＥは、種々の高分子リガンドと相互作用する。例えば、非酵素的グリケーションによって産生されるグリコタンパク質（ｇｌｙｃａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）およびグリコ脂質（ｇｌｙｃａｔｅｄ  ｌｉｐｉｄ）などの高分子のグリケーションされた添加物は、ＲＡＧＥと相互作用する。これらのグリケーションされた添加物（終末糖化産物（ＡＧＥ）としても公知である）は、通常の老化プロセスの間に細胞および組織に蓄積する。ＡＧＥの増強および／または加速した蓄積は、炎症部位、腎不全、全身的または局所的な酸化的ストレスの血糖上昇状態において生じる。蓄積は、組織（例えば、血管組織）において生じ得る。例えば、ＡＧＥは、ＡＧＥ−β２−透析関連性アミロイドーシスを有する患者においてミクログロブリンとして蓄積し、そして糖尿病患者の脈管構造および組織に蓄積する。ＲＡＧＥは、さらなるリガンドに結合し得、そのリガンドとしては、Ｓ１００／カルグラニュリン、β−シート繊維状物質、アミロイドβペプチド、Ａβ、アミリン、血清アミロイドＡ、プリオン由来ペプチドおよびアムホテリンが挙げられる。Ｓ１００／カルグラニュリンは、サイトカイン様炎症誘発性分子である。Ｓ１００タンパク質（Ｓ１００Ｐ）は、カルシウム依存性の調節および他のシグナル伝達経路に関与する。Ｓ１００Ｐは、Ｓ１００Ａ１２を形成し、そしてＳ１００Ｂは、細胞外にあり、かつＲＡＧＥに結合し得る。Ｓ１００Ｐは、胎盤および食道の上皮細胞における発現を含む制限されたパターンで発現される。Ｓ１００Ｐはまた、乳癌、結腸癌、前立腺癌、および膵腺癌を含む癌細胞において発現される。アムホテリンは、神経系において発現される約３０ｋＤａのポリペプチドである。それは、ｃ６神経膠腫細胞、ＨＬ−６０前骨髄球、Ｕ９３７前単球、ＨＴ１０８０線維肉腫細胞およびＢ１６黒色種細胞などの形質転換された細胞において発現される（Ｈｏｒｉら、（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２７０：２５７５２−６１）。
【０２７６】
ＲＡＧＥポリペプチド（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＰ＿００１１２７、配列番号４２１）は、いくつかのドメインを含む。ＲＡＧＥポリペプチドは、Ｎ末端に位置するシグナルペプチドを有する。例えば、配列番号４２１として本明細書中に示され、そして配列番号３８４によってコードされる例示的な完全長ＲＡＧＥポリペプチドにおいて、シグナルペプチドは、アミノ酸１〜２２に位置する。ＲＡＧＥは、膜貫通ドメインを含む。配列番号４２１として本明細書中に示される例示的な完全長ＲＡＧＥポリペプチドにおいて、膜貫通ドメインは、アミノ酸３４３と３６３との間にある。ＲＡＧＥはまた、膜貫通ドメインからＮ末端側に３つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメインを含む。配列番号４２１として本明細書中に示される例示的な完全長ＲＡＧＥポリペプチドにおいて、Ｉｇ様ドメインは、アミノ酸２３〜１１６、１２４〜２２１および２２７〜３１７に位置する。第１のＩｇ様ドメイン（配列番号４２１のアミノ酸２３〜１１６）は、可変型（Ｖ型）Ｉｇ様ドメインであるのに対して、他の２つのＩｇ様ドメインは、定常領域と同様（Ｃ型）であると特徴付けられる。Ｖ型Ｉｇ様ドメインは、リガンド（例えば、ＡＧＥ）との相互作用を媒介し得る（Ｋｉｓｌｉｎｇｅｒら、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３１７４０−４９）。ＲＡＧＥタンパク質のＣ末端は、細胞内にある。配列番号４２１として本明細書中に示される例示的な完全長ＲＡＧＥポリペプチドにおいて、そのＣ末端は、アミノ酸３６４〜４０４を含む。そのＣ末端は、ＲＡＧＥ媒介性シグナル伝達に関与する（Ｄｉｎｇら、（２００５）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ３７３：６７−７２）。
【０２７７】
本明細書中に提供される例示的なＲＡＧＥアイソフォームは、ＲＡＧＥの１つ以上のドメインまたはＲＡＧＥの１つ以上のドメインの部分を欠く。本明細書中に提供されるＲＡＧＥアイソフォームには、配列番号２３７として示され、配列番号２３６として示される核酸配列によってコードされるアイソフォームＣ０２がある。Ｃ０２は、２６６アミノ酸を含む。このアイソフォームは、アミノ酸２３〜１１６におけるＶ型Ｉｇ様ドメインおよびアミノ酸１２４〜２３７における１つのＣ型Ｉｇ様ドメインが続くアミノ酸１〜２２におけるＮ末端シグナル配列を含む。それは、配列番号４２１のアミノ酸２２７−２３０に対応する最初の４アミノ酸（アミノ酸２４３〜２４６）以外の第２のＣ型Ｉｇ様ドメインを欠く。さらに、Ｃ０２に含まれる第１のＣ型Ｉｇ様ドメインは、中断を含む。さらなる１６アミノ酸が、挿入される；これらの１６アミノ酸は、配列番号２３７の１４２〜１５７位である。これらのアミノ酸に対する挿入点は、配列番号４２１のアミノ酸１４１〜１４２に対応する。Ｃ０２アイソフォームは、そのポリペプチドのＣ末端に、同族ＲＡＧＥには存在しないさらなる２０アミノ酸を含む（アミノ酸２４７〜２６６）を含む。
【０２７８】
本明細書中のＲＡＧＥアイソフォームを含むＲＡＧＥアイソフォームは、ＲＡＧＥポリペプチド中に対立遺伝子変異を含み得る。例えば、ＲＡＧＥアイソフォームは、同族ＲＡＧＥの対立遺伝子改変体に存在する１つ以上のアミノ酸の差異（例えば、配列番号４２１と比較して１つ以上のアミノ酸の変化）を含み得る。例えば、１つ以上のアミノ酸の変異は、ＲＡＧＥのＩｇ様ドメイン中で起こり得る。対立遺伝子改変体は、例えばＲがＣによって置換されている７７位、例えばＧがＳによって置換されている８２位においてアミノ酸の変化を含み得る。別の例において、１つ以上のアミノ酸の変化は、ＲＡＧＥのＣ末端中で起こり得る。対立遺伝子改変体は、例えばＲがＱで置換され得る３６９位、または例えばＲがＧで置換され得る３６５位、または例えばＨがＱで置換され得る３０５位、または例えばＳがＣで置換され得る３０７位においてアミノ酸の変化を含み得る。上に記載される１つ以上のアミノ酸の変化を含む例示的なＲＡＧＥ対立遺伝子改変体は、配列番号４５３として示される。ＲＡＧＥアイソフォームは、配列番号４５３に示されるような１つ以上の対立遺伝子変異を含み得る。対立遺伝子変異は、７７位または８２位などにおいてＩｇ様ドメイン中に１つ以上のアミノ酸の変化を含み得る。
【０２７９】
本明細書中に提供されるＲＡＧＥアイソフォームまたはその対立遺伝子変異は、ｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分による内因性シグナル配列の置換などのｔＰＡとの融合を含み得る。配列番号２３７として本明細書中に提供される例示的なＲＡＧＥアイソフォームに関して、アミノ酸１〜２２を含む内因性シグナル配列を含むＲＡＧＥアイソフォームのアミノ酸１〜２３は、例えば、配列番号２として示され、かつ配列番号１として示されるｔＰＡプレ／プロ配列によってコードされる例示的なｔＰＡプレ／プロ配列などのｔＰＡプレ／プロ配列によって置換され得る。例えば、配列番号４３に示され、配列番号４４に示されるポリペプチドをコードする、例示的なｔＰＡ−ＲＡＧＥイントロン融合タンパク質融合体の核酸配列は、ＸｈｏＩ制限酵素リンカー部位（配列番号４３のヌクレオチド１３６〜１４１）を含む配列が続くｔＰＡプレ／プロ配列（ヌクレオチド１〜１０５の配列番号４３）を含む配列に５’末端にて作動可能に連結された、配列番号２３７に示されるＲＡＧＥアイソフォームのアミノ酸２３〜２６６をコードする核酸配列を含み得る。必要に応じて、配列番号４３に示され、ポリペプチド配列番号４４に示されるをコードする例示的なｔＰＡ−ＲＡＧＥイントロン融合タンパク質融合体の配列はまた、上記ｔＰＡプレ／プロ配列と上記ＸｈｏＩリンカー部位との間に作動可能に融合されたヌクレオチド１０６〜１３５として示されるｍｙｃエピトープタグを含み得る。
【０２８０】
（ｈ．ｔＰＡ−ＴＥＫイントロン融合タンパク質融合体）
ＴＥＫイントロン融合タンパク質ポリペプチドの改善された産生のためにｔＰＡのプレ／プロ配列の全てまたは部分と、必要に応じてｃ−ｍｙｃ融合タグとを含むＴＥＫ（Ｔｉｅ−２とも称される）のアイソフォームが、本明細書中に提供される。ＴＥＫに対する既知のリガンドは、アンジオポイエチン（Ａｎｇ）−１およびＡｎｇ−２を含む。ＴＩＥ  ＲＴＫ（Ｔｉｅ−１およびＴＥＫを含む）は、胚の脈管構造の発生において重要な役割を果たし、成体の内皮細胞中で発現され続ける。ＴＥＫは、血管内皮中でほぼ排他的に発現されるＲＴＫである。ＴＥＫの発現は、胚の脈管構造の発生に重要である。ＴＥＫの過剰発現および／または突然変異は、病原性新脈管形成、したがって腫瘍増殖、ならびに骨髄白血病に関連している。
【０２８１】
ＴＥＫタンパク質（配列番号４２３として記載したＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿０００４５０）は、アミノ酸１〜１８の間のシグナル配列を含む。ＴＥＫはまた、アミノ酸２１９〜２６８の間のラミニンＥＧＦ様ドメイン、３つのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（アミノ酸４４４〜５２９の間、アミノ酸５４３〜６２６の間、およびアミノ酸６３９〜７２４の間）、アミノ酸７４８〜７７０の間の膜貫通ドメイン、ならびにアミノ酸８２４〜１０９２の間の細胞質プロテインキナーゼドメインによって特徴付けられる。
【０２８２】
例示的なＴＥＫアイソフォームは、配列番号４２３に示されるような同族ＴＥＫと比較して、１つ以上のドメインまたはその一部を欠く。例えば、配列番号２４５に示されるような例示的なＴＥＫアイソフォームは、膜貫通ドメインおよびキナーゼドメインを欠き得る。ＴＥＫアイソフォームはまた、ＴＥＫ同族レセプターの他のドメインを含み得る。例えば、配列番号２４５として示される例示的なＴＥＫアイソフォームは、アミノ酸１〜１８の間のシグナル配列、アミノ酸２１９〜２６８の間のラミニンＥＧＦ様ドメインを含むが、３つのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを欠いている。
【０２８３】
本明細書中に提供されるＴＥＫアイソフォームを含むＴＥＫアイソフォームは、ＴＥＫポリペプチド中に対立遺伝子変異を含み得る。例えば、ＴＥＫアイソフォームは、同族ＴＥＫの対立遺伝子改変体に存在する１つ以上のアミノ酸の差異（例えば、配列番号４２３と比較して任意の１つ以上のアミノ酸の変化）を含み得る。例えば、１つ以上のアミノ酸の変異は、ＴＥＫのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン中で起こり得る。対立遺伝子改変体は、例えばＶがＩで置換され得る４８６位（ＳＮＰ番号１３３４８１１）、または例えばＩがＴで置換され得る６９５位、または例えばＡがＴで置換され得る７２４位（ＳＮＰ番号４６３１５６１）において、一塩基多型（ＳＮＰ）を含み得る。対立遺伝子改変体はまた、ＴＥＫのプロテインキナーゼドメイン中で起こり得る。対立遺伝子改変体は、例えばＲがＷで置換され得る８４９位において、アミノ酸を含み得る。アミノ酸の変異はまた、例えばＰがＱで置換され得る３４６位において起こり得る。上に記載される１つ以上のアミノ酸の変化を含む例示的なＴＥＫ対立遺伝子改変体は、配列番号４５４として示され、そしてＴＥＫアイソフォームは、配列番号４５４に示されるような同族ＴＥＫの対立遺伝子改変体に存在する１つ以上のアミノ酸の差異を含み得る。ＴＥＫアイソフォームの対立遺伝子改変体は、４８６位または６９５位などにおいてフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン中に１つ以上のアミノ酸の変化を含み得る。ＴＥＫアイソフォームの対立遺伝子改変体はまた、３４６位などにおいて１つ以上のアミノ酸の変化を含み得る。
【０２８４】
本明細書中に提供されるＴＥＫアイソフォームまたはその対立遺伝子変異は、ｔＰＡプレ／プロ配列の全てまたは部分による内因性シグナル配列の置換などｔＰＡとの融合を含み得る。配列番号２４５として本明細書中に提供される例示的なＴＥＫアイソフォームに関して、アミノ酸１〜１８を含む内因性シグナル配列を含むＴＥＫアイソフォームのアミノ酸１〜１９は、例えば、配列番号２として示され、かつ配列番号１として示されるｔＰＡプレ／プロ配列によってコードされる例示的なｔＰＡプレ／プロ配列などのｔＰＡプレ／プロ配列によって置換され得る。例えば、配列番号４５に示され、配列番号４６に示されるポリペプチドをコードする例示的なｔＰＡ−ＴＥＫイントロン融合タンパク質融合体の核酸配列は、ＸｈｏＩ制限酵素リンカー部位（配列番号４５のヌクレオチド１３６〜１４１）を含む配列が続くｔＰＡプレ／プロ配列（配列番号４５のヌクレオチド１〜１０５）を含む配列に５’末端にて作動可能に連結された、配列番号２４５に示されるＴＥＫアイソフォームのアミノ酸２０〜３６７をコードする核酸配列を含み得る。必要に応じて、配列番号４５に示され、配列番号４６に示されるポリペプチドをコードする例示的なｔＰＡ−ＴＥＫイントロン融合タンパク質融合体の配列はまた、上記ｔＰＡプレ／プロ配列と上記ＸｈｏＩリンカー部位との間に作動可能に融合されたヌクレオチド１０６〜１３５として示されるｍｙｃエピトープタグを含み得る。
【０２８５】
（Ｅ．アイソフォーム融合ポリペプチドをコードする核酸を産生する方法）
本明細書中に記載されるｔＰＡ−イントロン融合タンパク質融合体を含むアイソフォーム融合核酸分子およびアイソフォーム融合ポリペプチドを産生するための例示的な方法が、提供される。このような方法としては、核酸分子についてのインビトロ合成方法（例えば、ＰＣＲ、合成遺伝子の構築、ならびに単離および／または合成された核酸フラグメントのインビトロでのライゲーション）が挙げられる。ＣＳＲアイソフォーム融合体またはリガンドアイソフォーム融合体についての核酸分子はまた、クローニング方法（細胞から単離されたＲＮＡおよびＤＮＡのＰＣＲを含む）、ならびにハイブリダイゼーションおよび／または発現スクリーニング方法による核酸分子ライブラリーのスクリーニングによって、単離され得る。
【０２８６】
ＣＳＲアイソフォームポリペプチドまたはリガンドアイソフォームポリペプチドは、インビトロ合成方法およびインビボ合成方法を用いてＣＳＲアイソフォーム核酸分子またはリガンドアイソフォーム核酸分子から作製され得る。アイソフォーム（アイソフォーム融合体（例えば、ｔＰＡ−イントロン融合タンパク質融合体）を包含する）は、投与および処置に必要とされる所要の量および形態のアイソフォームを産生することに適した、任意の生物中で発現され得る。発現用宿主は、原核生物ならびに真核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、植物、昆虫細胞、哺乳動物細胞（ヒト細胞株およびトランスジェニック動物を含む））を含む。ＣＳＲアイソフォームはまた、それが発現される細胞および生物（アイソフォームが組換えによって産生される細胞および生物、ならびにアイソフォームが組換え手段を用いずに合成される細胞および生物（例えば、選択的スプライシング事象によって産生されたゲノムにコードされたアイソフォーム）を包含する）から単離され得る。
【０２８７】
（１．合成遺伝子および合成ポリペプチド）
ＣＳＲアイソフォームポリペプチドまたはリガンドアイソフォームポリペプチドをコードする核酸分子は、合成遺伝子の合成を用いた、当業者に公知の方法によって合成され得る。このような方法では、アイソフォームをコードしている１つ以上の核酸分子を作製するために、アイソフォームのポリペプチド配列を「逆翻訳」する。その後、逆翻訳された核酸分子を、自動ＤＮＡ合成技法などを用いて１つ以上のＤＮＡフラグメントとして合成する。その後、それらのフラグメントを作動可能に連結させて、アイソフォームをコードしている核酸分子を形成する。アイソフォーム融合体は、アイソフォームをコードしている核酸分子とさらなる核酸分子（例えば、異種または同種の前駆体配列、エピトープまたは融合タグ、転写および翻訳を調節するための調節配列、ベクター、ならびに他のポリペプチドをコードする核酸分子）とを連結することによって産生され得る。アイソフォームをコードしている核酸分子はまた、追跡などのための他の融合タグまたは標識（放射性同位体標識および蛍光部分を包含する）と作動可能に連結され得る。
【０２８８】
逆翻訳のプロセスでは、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームなどの任意の目的ポリペプチドのヌクレオチド遺伝子配列を得るために遺伝暗号を用いる。遺伝暗号は縮重しており、６４種のコドンが２０個のアミノ酸および３個の終止コドンを特定する。このような縮重により核酸の設計および作製における柔軟性が許容され、これにより、例えば、核酸フラグメントの連結および／またはそれぞれの合成フラグメント内における独特の識別配列の配置を容易にするための、制限部位の組み込みが可能となる。また、遺伝暗号の縮重は、望ましくないヌクレオチド配列（望ましくない制限部位、スプライシングドナー部位もしくはアクセプター部位、または効率的な翻訳に有害である可能性のある他のヌクレオチド配列を含む）を回避するための核酸分子の設計も可能にする。さらに、生物は、ときとして、特定のコドンの使用法および／または規定されたＧＣ対ＡＴヌクレオチドの比を好む。したがって、遺伝暗号の縮重により、特定の生物または生物群中での発現用にあつらえられた核酸分子の設計が可能となる。さらに、核酸分子は、配列の最適化（または非最適化）に基づいて、種々のレベルの発現のために設計され得る。逆翻訳は、ポリペプチドをコードしているコドンを選択することによって行われる。このようなプロセスは、遺伝暗号の表およびポリペプチド配列を用いて、手動で行われ得る。あるいは、公的に利用可能なソフトウェアを含むコンピュータプログラムを用いて、逆翻訳された核酸配列を作製し得る。
【０２８９】
逆翻訳された核酸分子を合成するために、当該分野で利用可能な核酸合成のための任意の方法が用いられ得る。例えば、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームをコードしているヌクレオチド配列のフラグメントに対応する個々のオリゴヌクレオチドを、標準的な自動化された方法によって合成し、アニーリング反応またはハイブリダイゼーション反応中で一緒に混合する。このようなオリゴヌクレオチドは、一般に約１００ヌクレオチド長である二重鎖を形成する相補配列上に形成された重複する一本鎖突出部を用いて、そのオリゴヌクレオチド由来の遺伝子の自己アセンブリをアニーリングがもたらすように、合成される。二重鎖ＤＮＡ中の単一のヌクレオチド「ニック（ｎｉｃｋ）」は、例えば、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼによるライゲーションを用いて閉じられる。その後、例えば制限エンドヌクレアーゼリンカー配列を用いて、合成遺伝子をタンパク質の発現に適した様々な組換えＤＮＡベクターのうちの任意の１つに挿入し得る。別の類似の方法では、一連の重複オリゴヌクレオチドは、化学的なオリゴヌクレオチド合成方法によって調製される。これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングは、ギャップを含むＤＮＡ構造をもたらす。ＤＮＡポリメラーゼＩなどの酵素によって触媒されるＤＮＡ合成を用いて、これらのギャップを埋め得、そしてライゲーションが、二重鎖構造中の任意のニックを閉じるために用いられる。ＰＣＲおよび／または他のＤＮＡ増幅技術を適用して、形成された直鎖状ＤＮＡ二重鎖を増幅し得る。
【０２９０】
さらなるヌクレオチド配列が、ベクター（例えば、タンパク質発現ベクターまたはコアタンパク質をコードしているＤＮＡ配列を増幅するために設計されたベクター）中に合成遺伝子をクローニングするために制限エンドヌクレアーゼ部位を含むリンカー配列を含めて、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームをコードしている核酸分子と結合させ得、それによってアイソフォーム融合体を産生する。さらに、機能的ＤＮＡエレメントを特定するさらなるヌクレオチド配列を、アイソフォームをコードしている核酸分子に動作可能に連結させ得る。このような配列の例としては、細胞内でのタンパク質の発現を促進するために設計されたプロモーター配列、またはタンパク質の分泌を促進するために設計された前駆体配列が挙げられるが、これらに限定されない。アイソフォームをコードしている核酸分子に作動可能に連結され得るヌクレオチド配列の１つの例としては、アイソフォームの精製および／または検出を容易にする配列が挙げられる。例えば、融合タグ（例えば、エピトープタグまたは蛍光部分）は、アイソフォームに融合または連結され得る。タンパク質の結合領域を特定する配列などのさらなるヌクレオチド配列もまた、アイソフォームをコードしている核酸分子に連結させ得る。このような領域としては、特定の標的細胞内へのアイソフォームの取り込みを促進するための配列、または他の様式で合成遺伝子の薬物動態を亢進する配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９１】
ＣＳＲアイソフォームはまた、自動化された合成ポリペプチドの合成を用いて合成し得る。クローニングしたポリペプチド配列および／またはインシリコで作製したポリペプチド配列を、フラグメントとして合成し得、次いで化学的に連結し得る。あるいは、アイソフォームを、単一のポリペプチドとして合成し得る。その後、このようなポリペプチドを、本明細書中に記載のアッセイおよび治療的投与において用い得る。
【０２９２】
（２．アイソフォームおよびアイソフォーム融合体をクローニングする方法および単離する方法）
ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォーム（アイソフォーム融合体を包含する）は、核酸分子をクローニングおよび単離するための当該分野で公知である任意の利用可能な方法を用いて、クローニングまたは単離し得る。このような方法としては、核酸のＰＣＲ増幅、ならびにライブラリーのスクリーニング（核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体ベースのスクリーニングおよび活性ベースのスクリーニングを含む）が挙げられる。
【０２９３】
アイソフォームをコードしている核酸分子はまた、ライブラリーのスクリーニングを用いて単離し得る。例えば、発現されたＲＮＡ転写物をｃＤＮＡとして表す核酸ライブラリーを、ＣＳＲアイソフォームをコードしている核酸分子またはその一部分とのハイブリダイゼーションによってスクリーニングし得る。例えば、ＣＳＲ遺伝子由来のイントロン配列またはその一部分を用いて、相同配列へのハイブリダイゼーションに基づいてイントロン保持含有分子のスクリーニングを行い得る。発現ライブラリーのスクリーニングを用いて、ＣＳＲアイソフォームをコードしている核酸分子を単離し得る。例えば、特定のアイソフォームまたはアイソフォームの一部分を認識する抗体を用いて、発現ライブラリーのスクリーニングを行い得る。ＣＳＲアイソフォームまたはアイソフォームに含まれる領域もしくはペプチドに特異的に結合する抗体を、入手および／または調製し得る。アイソフォームに特異的に結合する抗体を用いて、イントロン融合タンパク質などのアイソフォームをコードしている核酸分子を含む発現ライブラリーのスクリーニングを行い得る。抗体（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびにそれら由来のフラグメントを含む）を調製する方法および単離する方法は、当該分野で周知である。組換え抗体および合成抗体を調製する方法および単離する方法も、当該分野で周知である。例えば、このような抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築し得、または候補ポリペプチドに特異的に結合する抗体の抗原結合部位のヌクレオチド配列情報およびアミノ酸配列情報を用いて、組換えによって産生し得る。抗体はまた、可変重鎖および可変軽鎖、またはそれらの抗原結合部分を含む、コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングを行うことによっても取得し得る。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および非天然の抗体を調製する方法、単離する方法および使用する方法は、例えば、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ編（２００１）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ；ＨｏｗａｒｄおよびＢｅｔｈｅｌｌ編（２００１）「Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ」ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；ならびにＯ’ＢｒｉｅｎおよびＡｉｔｋｉｎ編（２００１）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ」Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓに総説されている。このような抗体はまた、アイソフォームポリペプチドの存在についてスクリーニングするため（例えば、細胞、組織または抽出物中におけるＣＳＲアイソフォームの発現の検出するため）に使用され得る。
【０２９４】
核酸の増幅のための方法を用いて、アイソフォームコードしている核酸分子を単離し得、その方法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法が挙げられる。核酸を含む材料を、アイソフォームをコードしている核酸分子が単離され得る出発物質として用い得る。例えば、ＤＮＡ調製物およびｍＲＮＡ調製物、細胞抽出物、組織抽出物、流体サンプル（例えば、血液、血清、および唾液）、健康な被験体由来のサンプルおよび／または疾患状態の被験体由来のサンプルを、増幅方法で用い得る。また、核酸ライブラリーを出発物質源として用いることもできる。アイソフォームを増幅するために、プライマーを設計し得る。例えば、プライマーを、アイソフォームが作製される発現配列に基づいて、設計し得る。プライマーを、アイソフォームのアミノ酸配列の逆翻訳に基づいて設計し得る。増幅によって作製した核酸分子は、配列決定され得、そしてアイソフォームをコードしていることを確認され得る。
【０２９５】
（３．イントロン融合タンパク質融合体を産生する方法およびクローニングする方法）
ＤＮＡ配列を取得し得そして融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供するためにそのＤＮＡ配列を連結し得る方法は、組換えＤＮＡ技術の分野において周知である。前駆体配列についてのＤＮＡ（例えば、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ）は、オリゴヌクレオチド合成機を用いた合成；適切な制限酵素消化による前駆体配列を含む生物、細胞、またはベクターなどに由来する標的ＤＮＡからの単離を含む、種々の方法によって産生され得るか、あるいは適切なプライマーを用いたゲノムＤＮＡのＰＣＲによって標的供給源から得られ得る。同様に、アイソフォーム融合タンパク質をコードするＤＮＡ、エピトープタグをコードするＤＮＡ、またはアイソフォームに融合される他のタンパク質をコードするＤＮＡは、オリゴヌクレオチド合成機を使用して合成され得るか、上記タンパク質を産生する親細胞のＤＮＡから適切な制限酵素消化によって単離され得るか、または適切なプライマーを用いたゲノムＤＮＡのＰＣＲによって標的供給源（例えば、細胞、組織、ベクター、または他の標的供給源）から得られ得る。さらに、小さいエピトープタグ（例えば、ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、または他の小さいエピトープタグ）、および／または任意の他のさらなるＤＮＡ配列（例えば、制限酵素リンカー配列またはプロテアーゼ切断部位配列）が、融合タンパク質をコードするＤＮＡへの組み込みのために、ＰＣＲ増殖の際に別のタンパク質をコードする核酸配列への組み込みためのＰＣＲプライマー配列中に操作され得る。
【０２９６】
１つの例において、イントロン融合タンパク質融合体配列は、操作された組換え部位においてベクター中に、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ標的配列をライゲーションする、連続したラウンドによって産生され得る。例えば、イントロン融合タンパク質アイソフォームの核酸配列、融合タグの核酸配列、および／または同種もしくは異種の前駆体配列の核酸配列は、対抗する鎖にハイブリダイズしかつ標的ＤＮＡ中の目的の領域に隣接するプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅され得る。細胞または組織、あるいは標的ＤＮＡ分子を発現することが公知である他の供給源、または標的ＤＮＡ分子の配列を含むベクターを発現することが公知である他の供給源は、ＰＣＲ増幅事象のための出発産物として使用され得る。ＰＣＲ増幅された産物は、既にベクター内に含まれる別の核酸配列との融合体を作製するためなどの配列のさらなる組換え操作のためか、または標的分子の発現のために、ベクター中にサブクローニングされ得る。
【０２９７】
ＰＣＲ増幅において使用されるＰＣＲプライマーはまた、核酸配列の作動可能な連結を容易にするように操作され得る。例えば、非テンプレート相補的な５’伸長部が、増幅自体に対する顕著な効果を伴わずにＰＣＲ産物の種々の増幅後操作を可能にするためにプライマーに付加され得る。例えば、これらの５’伸長部は、制限酵素認識部位、プロモーター配列、エピトープタグについての配列などを含み得る。１つの例において、融合配列を作製するために、プライマー中に組み込まれ得る配列は、例えば、増幅されたＰＣＲ産物が目的の核酸配列とエピトープタグとの融合体を有効に含むように、ｍｙｃエピトープタグまたは他の小さいエピトープタグをコードする配列を含む。
【０２９８】
別の例において、制限酵素部位のプライマーへの組み込みは、（核酸配列のライゲーションのための粘着末端を提供することなどによる）適合性の制限酵素認識部位を含むベクターへの増幅産物のサブクローニングを、容易にし得る。単一のベクターへの複数のＰＣＲ増幅産物のサブクローニングは、種々の核酸配列を作動可能に連結または融合するためのストラテジーとして、使用され得る。プライマー配列中に組み込まれ得る制限酵素部位の例としては、ＸｈｏＩ制限酵素認識部位（ＣＴＣＧＡＧ、配列番号１２８）、ＮｈｅＩ制限酵素認識部位（ＧＣＴＡＧＣ、配列番号１３０）、ＮｏｔＩ制限酵素認識部位（ＧＣＧＧＣＣＧＣ、配列番号１３１）、ＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位（ＧＡＡＴＴＣ、配列番号１３２）、またはＸｂａＩ制限酵素認識部位（ＴＣＴＡＧＡ、配列番号１２９）が挙げられ得るが、これらに限定されない。ＰＣＲ産物をベクター中にサブクローニングするための他の方法としては、平滑末端クローニング、ＴＡクローニング、ライゲーション非依存性クローニング、およびインビボクローニングが挙げられる。
【０２９９】
有効な制限酵素部位をプライマー中に作製することは、粘着末端を露出するため、またはいくつかの制限酵素部位（平滑末端）のため、その後のサブクローニングのための、適合性の制限酵素を用いたＰＣＲフラグメントの消化を容易にする。制限酵素部位が制限酵素に対するその適合性を保持するように制限酵素部位をプライマー中に設計することにおいて考慮すべきいくつかの因子が、存在する。第１に、ＰＣＲプライマー中に設計された制限酵素認識部位の上流に２〜６個の余分な塩基を付加することは、増幅産物の消化の効率を大きく増大させ得る。制限酵素による制限酵素部位の消化を改善するために使用され得る他の方法は、ＤＮＡをブロックし得るあらゆる耐熱性ポリメラーゼを除去するためのプロテアーゼＫ処理、クレノウＤＮＡポリメラーゼまたはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼによる末端の研磨（ｅｎｄ−ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）、および／あるいはスペルミジンの添加を含む。ＰＣＲ産物の消化効率を改善するための代替方法はまた、増幅後のフラグメントのコンカテマー化（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を含み得る。これは、浄化されたＰＣＲ産物を、（プライマーが依然としてリン酸化されていない場合には）Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによって最初に処理することによって達成される。末端は、Ｐｆｕなどの校正耐熱性ポリメラーゼが使用された場合、既に平滑末端であり得、または増幅されたＰＣＲ産物は、Ｔａｑなどの非校正酵素が使用される場合、末端を研磨するためにＴ４  ＤＮＡポリメラーゼによって処理され得る。ＰＣＲ産物は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによってライゲーションされ得る。これは、有効に制限酵素部位をフラグメントの末端のから離して移動させ、そして効率的な消化を可能にする。
【０３００】
露出された制限酵素部位を含むＰＣＲ産物をベクター中にサブクローニングする（例えば、目的の配列との融合体を形成するため）前に、切断されていないままであるＰＣＲ産物から消化されたＰＣＲ産物を分離することが、ときとして必要である。このような例において、プライマーの５’末端における蛍光タグの付加は、ＰＣＲの前に付加され得る。これは、消化された産物の同定を可能にする。なぜならば、首尾よく消化された産物は、消化の際に蛍光標識を失っているからである。
【０３０１】
いくつかの場合において、融合配列の産生のために、その後のサブクローニングのための制限酵素認識部位をベクター中に含む増幅ＰＣＲ産物を使用することは、融合タンパク質産物中への制限酵素リンカー配列の組み込みをもたらし得る。一般に、このようなリンカー配列は、短く、そしてその配列が作動可能に連結される限り、ポリペプチドの機能を損なわない。
【０３０２】
アイソフォーム融合タンパク質をコードする核酸分子は、その核酸分子を含むベクターの形態で提供され得る。このようなベクターの１つの例は、プラスミドである。多くの発現ベクターが、利用可能であり、かつ当業者に公知であり、そしてアイソフォーム融合体を含むＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの発現のために使用され得る。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択によって影響を及ぼされ得る。一般に、発現ベクターは、転写プロモーター、必要に応じたエンハンサー、翻訳シグナル、ならびに転写終結シグナルおよび翻訳終結シグナル（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ）を含み得る。安定な形質転換のために使用される発現ベクターは、代表的に、形質転換細胞の選択および維持を可能にする選択マーカーを有する。いくつかの場合において、複製起点は、ベクターのコピー数を増幅するために使用され得る。
【０３０３】
（４．発現系）
ＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォーム（本明細書中に提供される天然のイントロン融合タンパク質およびコンビナトリアルイントロン融合タンパク質ならびに天然のアイソフォーム融合体およびコンビナトリアルアイソフォーム融合体を含む）は、インビボ方法およびインビトロ方法を含む当業者に公知である任意の方法によって産生され得る。ＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームならびに融合アイソフォームは、投与および処置に必要とされるアイソフォームの所要の量および形態を産生することに適した、任意の生物中で発現され得る。一般に、異種ＤＮＡを発現するために操作され得かつ分泌経路を有する任意の細胞型が、適切である。発現用宿主は、原核生物ならびに真核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、植物、昆虫細胞、ならびに哺乳動物細胞（ヒト細胞株およびトランスジェニック動物を含む））を含む。発現用宿主は、それらのタンパク質産生のレベルならびに発現されたタンパク質上に存在する翻訳後修飾の型において異なり得る。さらに、発現用宿主の選択は、多くの場合（しかし、必ずではない）、利用される前駆体配列の選択に依存する。例えば、多くの異種シグナル配列は、同一種の宿主細胞においてのみ発現され得る（すなわち、昆虫細胞シグナル配列は、昆虫細胞中で最適に発現される）。対照的に、他のシグナル配列は、異種宿主において使用され得る（例えば、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、または哺乳動物宿主細胞において良好に作用するヒト血清アルブミン（ｈＨＳＡ）シグナル配列、ならびに昆虫細胞および哺乳動物細胞において機能的であることが示されている組織プラスミノーゲンアクチベータプレ／プロ配列）（Ｔａｎら、（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１５：３３７）。発現用宿主の選択は、これらの要因および他の要因（調節性および安全性の考慮、生産コストならびに精製の必要性および精製方法）に基づいて行われ得る。
【０３０４】
（ａ．原核生物発現）
原核生物（特に、Ｅ．ｃｏｌｉ）は、大量のタンパク質（例えば、本明細書中に提供されるアイソフォームおよびアイソフォーム融合体）を産生するための系を提供する。桿菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス属の種々の種、または他の細菌株などの他の微生物株もまた、使用され得る。Ｅ．ｃｏｌｉを含む細菌の形質転換は、当業者に周知である簡便かつ迅速な技術である。このような原核生物系において、宿主と適合性である種に由来する複製部位および制御配列を含むプラスミドベクターが、多くの場合、使用される。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ用の一般的なベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢＡＤ、およびそれらの誘導体が挙げられる。リボソーム結合部位配列と共に、必要に応じてオペレーターを伴う転写開始のためのプロモーターを含む一般的に使用される原核生物制御配列としては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、アラビノースプロモーター、ならびにλ由来ＰｌプロモーターおよびＮ−遺伝子リボソーム結合部位などの、一般的に使用されるプロモーターが挙げられる。しかし、原核生物と適合性である任意の利用可能なプロモーター系が、使用され得る。Ｅ．ｃｏｌｉのための発現ベクターは、誘導性プロモーターを含み得る。このようなプロモーターは、高レベルのタンパク質発現を誘導するため、および宿主細胞に対してある程度の毒性を示すタンパク質を発現させるために、有用である。誘導性プロモーターの例としては、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７  ＲＮＡプロモーター、ＳＰ６  ＲＮＡプロモーター、および温度調節性λＰＬプロモーターが挙げられる。
【０３０５】
アイソフォームは、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質環境中で発現され得る。細胞質は還元性の環境であり、いくつかの分子にとって、このことは、不溶性の封入体の形成をもたらし得る。還元剤（ジチオスレイトールおよびβ−メルカプトエタノールなど）ならびに変性剤（グアニジン−ＨＣｌおよび尿素など）を用いて、タンパク質を再度溶解させ得る。代替手法は、酸化的環境ならびにシャペロニン様イソメラーゼおよびジスルフィドイソメラーゼを提供し、可溶性タンパク質の産生をもたらし得る、細菌のペリプラズム空隙におけるＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォーム（アイソフォーム融合体を含む）の発現である。代表的には、前駆体配列（例えば、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＦ、ＰｅｌＢ、または他の前駆体配列を含む細菌において使用するための本明細書中に記載される前駆体配列であるが、これらに限定されない）を、発現させるべきタンパク質と融合（例えば、内因性前駆体配列を置換することによる）させ、これによりタンパク質がペリプラズムに向けられる。その後、リーダーペプチドが、ペリプラズム内のシグナルペプチダーゼによって取り除かれる。ペリプラズムを標的とする前駆体配列またはリーダー配列の例には、ペクチン酸リアーゼ遺伝子由来のＰｅｌＢリーダーおよびアルカリホスファターゼ遺伝子由来のリーダーが含まれる。いくつかの場合において、ペリプラズムでの発現により、発現されたタンパク質が培地中に漏れることが可能となる。タンパク質の分泌は、培養上清からの急速かつ単純な精製を可能にする。分泌されなかったタンパク質は、浸透圧溶解によってペリプラズムから取得し得る。細胞質での発現と同様に、いくつかの場合において、タンパク質が不溶性となる可能性があり、変性剤および還元剤を用いて可溶化および再折畳みを促進し得る。誘導および増殖の温度も発現レベルおよび溶解度に影響を与える場合があり、代表的には２５℃〜３７℃の温度を用いる。代表的には、細菌はグリコシル化されていないタンパク質を産生する。したがって、タンパク質が機能のためにグリコシル化を必要とする場合は、宿主細胞から精製した後にグリコシル化をインビトロで付け足し得る。
【０３０６】
（ｂ．酵母）
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどの酵母は、ＣＳＲアイソフォームの産生に用い得る周知の酵母発現用宿主である。酵母は、エピソーム複製ベクターを用いてか、または相同組換えによる安定した染色体への組込みによって、形質転換させ得る。代表的には、誘導性プロモーターが、遺伝子発現を調節するために使用される。このようなプロモーターの例には、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ５ならびにメタロチオネインプロモーター（ＣＵＰ１、ＡＯＸ１など）、または他のＰｉｃｈｉａ属もしくは他の酵母のプロモーターが含まれる。他の酵母プロモーターは、解糖酵素の合成のためのプロモーター（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのためのもの、あるいはエノラーゼ遺伝子またはＹｅｐ１３から得られたＬｅｕ２遺伝子由来のもの）を含む。発現ベクターには、多くの場合、形質転換させたＤＮＡを選択および維持するためのＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３およびＵＲＡ３などの選択マーカーが含まれる。酵母において使用するための例示的な発現ベクター系は、ＰＯＴ１ベクター系（例えば、米国特許第４，９３１，３７３号を参照のこと）であり、ＰＯＴ１ベクター系は、形質転換細胞がグルコース含有培地での増殖によって選択されることを可能にする。酵母中で発現されたタンパク質は、多くの場合は可溶性である。シャペロニン（Ｂｉｐおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼなど）との同時発現は、発現レベルおよび溶解度を改善させ得る。さらに、酵母中で発現されたタンパク質は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の酵母交配型α−因子の分泌シグナルなどの分泌シグナルペプチド融合体、およびＡｇａ２ｐ交配接着レセプターまたはＡｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓのグルコアミラーゼなどの酵母細胞表面タンパク質との融合体、あるいは酵母中のポリペプチドの分泌を促進する任意の他の異種または同種の前駆体配列を用いて、分泌に指向させ得る。発現されたポリペプチドが分泌経路を出る際に、融合した配列がその発現されたポリペプチドから除去されるように、Ｋｅｘ−２プロテアーゼの切断部位などのプロテアーゼ切断部位を設計し得る。また、酵母もＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフにおいてグリコシル化が可能である。
【０３０７】
（ｃ．昆虫細胞）
昆虫細胞、特にバキュロウイルス発現を用いたものは、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォーム（アイソフォーム融合体を含む）などのポリペプチドの発現に有用である。昆虫細胞はタンパク質を高レベルで発現し、高等真核生物によって用いられる翻訳後修飾のほとんどを行い得る。バキュロウイルスは宿主範囲が制限されている。これにより、安全性が向上し、真核発現における規制面の懸案事項が軽減される。代表的な発現ベクターは、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターなど、高レベル発現用のプロモーターを用いる。一般的に用いられるバキュロウイルス系には、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）、およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）などのバキュロウイルス、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ（Ａ７Ｓ）およびＤａｎａｕｓ  ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ（ＤｐＮ１）由来のＳｆ９などの昆虫細胞系が含まれる。高レベルの発現には、発現させる分子のヌクレオチド配列をウイルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合させる。哺乳動物分泌シグナルは昆虫細胞中で正確にプロセシングされ、発現されたタンパク質を培地中に分泌させるために用い得る。例えば、哺乳動物組織プラスミノーゲンアクチベータ前駆体配列は、昆虫細胞によるタンパク質の発現および分泌を容易にする。さらに、細胞系Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ（Ａ７Ｓ）およびＤａｎａｕｓ  ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ（ＤｐＮ１）は、哺乳動物細胞系と類似したグリコシル化パターンを有するタンパク質を産生する。
【０３０８】
昆虫細胞における代替発現系は、安定に形質転換した細胞の使用である。Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒ  ２（Ｓ２）細胞ならびにＫｃ細胞（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）およびＣ７細胞（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）などの細胞系を、発現に用い得る。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのメタロチオネインプロモーターは、カドミウムまたは銅を用いた重金属での誘導の存在下で、高い発現レベルを誘導するために用い得る。発現ベクターは、代表的には、ネオマイシンおよびハイグロマイシンなどの選択マーカーを用いることによって維持される。
【０３０９】
（ｄ．哺乳動物細胞）
哺乳動物発現系を用いて、本明細書中に提供されるＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォーム（アイソフォーム融合体を含む）を発現させ得る。発現構築物は、アデノウイルスベクターなどを使用するウイルス感染によってか、またはリポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランを含む従来のトランスフェクション方法によって、ならびにエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションなどの物理的手段等の直接ＤＮＡ移行によって、哺乳動物細胞に移行させ得る。例示的な発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＩ発現プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、配列番号５０）、またはｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、配列番号５１）が挙げられる。哺乳動物細胞の発現ベクターには、代表的には、ｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列（コザックコンセンサス配列）およびポリアデニル化エレメントが含まれる。このようなベクターには、多くの場合、高いレベルの発現のために転写プロモーター−エンハンサー、例えばＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、ｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター−エンハンサー）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の末端反復配列、または他のウイルスプロモーター（例えば、ポリオーマ、アデノウイルスＩＩ、ウシパピローマウイルスまたはトリ肉腫ウイルスに由来するもの）が含まれる。さらなる適切な哺乳動物プロモーターとしては、β−アクチンプロモーター−エンハンサーおよびヒトメタロチオネインＩＩプロモーターが挙げられる。これらのプロモーター−エンハンサーは、多くの細胞型において活性である。また、組織型および細胞型のプロモーター領域およびエンハンサー領域も、発現に用い得る。例示的なプロモーター／エンハンサー領域としては、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳癌ウイルス、アルブミン、αフェトプロテイン、α１抗トリプシン、βグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２、および性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御などの遺伝子に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。発現構築物と共に細胞を選択および維持するために、選択マーカーを用い得る。選択マーカー遺伝子の例としては、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素およびチミジンキナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。ＴＣＲ−ζおよびＦｃεＲＩ−γなどの細胞表面シグナル伝達分子との融合により、細胞表面上に活性状態でタンパク質の発現を誘導し得る。
【０３１０】
多くの細胞系が哺乳動物の発現に利用可能であり、マウス細胞、ラット細胞、ヒト細胞、サル細胞、ニワトリ細胞およびハムスター細胞が含まれる。例示的な細胞株としては、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０（非分泌性）および他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマ細胞株およびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｔ、２９３Ｓ、２Ｂ８、ならびにＨＫＢ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。また、無血清培地に適合させた細胞株も利用可能であり、これにより、分泌されたタンパク質を細胞培養培地から精製することが容易となる。その一例は無血清ＥＢＮＡ−１細胞系である（Ｐｈａｍら、（２００３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、８４：３３２〜４２）。
【０３１１】
（ｅ．植物）
トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物を用いて、ＣＳＲアイソフォームを発現させ得る。発現構築物は、代表的には、微粒子銃ボンバードメントおよびプロトプラストへのＰＥＧ媒介性の移行などの直接ＤＮＡ移行によって、ならびにアグロバクテリウム媒介性の形質転換を用いて、植物へ移行される。発現ベクターは、プロモーター配列およびエンハンサー配列、転写終結エレメントならびに翻訳制御エレメントを含み得る。発現ベクターおよび形質転換技術は、通常、シロイヌナズナおよびタバコなどの双子葉植物宿主と、トウモロコシおよびイネなどの単子葉植物宿主との間で分けられる。発現に用いられる植物プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボービスホスフェートカルボキシラーゼプロモーターならびにユビキチンプロモーターおよびＵＢＱ３プロモーターが挙げられる。ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの選択マーカーが、多くの場合、形質転換細胞の選択および維持を容易にするために用いられる。形質転換植物細胞は、細胞（凝集体（カルス組織））として培養物中に維持されても、植物全体へと再生されてもよい。また、トランスジェニック植物細胞には、ＣＳＲアイソフォームを産生するように操作した藻類も包含され得る（例えば、Ｍａｙｆｉｅｌｄら、（２００３）ＰＮＡＳ、１００：４３８〜４４２を参照のこと）。植物は哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するので、これらの宿主中で産生されるＣＳＲアイソフォームの選択に影響が与えられる可能性がある。
【０３１２】
（５．トランスフェクションおよび形質転換の方法）
宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションは、選択された宿主細胞に適した標準的な技術を使用して達成される。トランスフェクションの方法は、当業者に公知である（例えば、リン酸カルシウムおよびエレクトロポレーション、ならびにトランスフェクションを容易にするＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００、またはＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）などの市販のカチオン性脂質試薬の使用）。使用される宿主細胞に依存して、形質転換は、このような細胞に適した標準的な技術を使用して行われる。例えば、塩化カルシウムを使用するカルシウム処理、またはエレクトロポレーションは、一般に、実質的な細胞壁バリアを含む原核生物または他の細胞に対して使用される。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる感染は、特定の植物細胞の形質転換のために使用される。このような細胞壁を有さない哺乳動物細胞について、リン酸カルシウム沈殿が、使用され得る。形質転換の一般的な局面は、植物細胞（例えば、Ｓｈａｗら、（１９８３）Ｇｅｎｅ、２３：３１５、ＷＯ８９／０５８５９を参照のこと）、哺乳動物細胞（例えば、米国特許第４、３９９，２１６号、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ．、（１９９０）１８５：５２７；Ｍａｎｓｏｕｒら、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：３４８を参照のこと）、または酵母細胞（例えばＶａｌ  Ｓｏｌｉｎｇｅｎら、（１９７７）Ｊ  Ｂａｃｔ（１９７７）１３０：９４６、Ｈｓｉａｏら、（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、７６：３８２９を参照のこと）について記載されている。宿主細胞にＤＮＡを導入するための他の方法としては、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、インタクトな細胞との細菌プロトプラスト融合、あるいはポリカチオン（ポリブレンまたはポリオルニチンなど）の使用が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０３１３】
（６．産生および精製）
発現ベクターを含む細胞は、上記融合ポリペプチドの産生に適した条件下で培養され、次いで、その融合ポリペプチドまたは切断された成熟組換えタンパク質（すなわち、前駆体ペプチド配列を有する発現タンパク質または前駆体ペプチド配列を有さない発現タンパク質）が、回収および精製される。一般に、回収されるタンパク質は、アイソフォーム融合ポリペプチド（例えば、エピトープタグとの融合体または他の融合配列との融合体を含む）または（前駆体ペプチドの切断後の）アイソフォーム、あるいはその両方である。上記融合ポリペプチドが分泌され、そして上記前駆体ペプチドがプロセシングの間に切断される場合、回収されるタンパク質は、アイソフォームタンパク質、またはその改変された形態であることが、明らかである。いくつかの場合において、上記融合ポリペプチドは、前駆体ペプチド配列とアイソフォームタンパク質との間に存在するさらなるアミノ酸（例えば、制限酵素リンカー部位）が存在し得るように設計される。これらの場合において、上記融合ポリペプチドからの前駆体ペプチドの切断により、そのＮ末端にさらなるアミノ酸を有する改変されたアイソフォームポリペプチドを産生し得る。制限酵素リンカー配列の存在に起因して分泌されたポリペプチドのＮ末端に組み込まれ得るさらなるアミノ酸の非限定的な例としては、例えば、ＳＲまたはＬＥが挙げられる。あるいは、上記融合ポリペプチドは、前駆体ペプチドが完全にはプロセシングされないように設計され得て、前駆体ポリペプチドの不完全な切断が生じるようにされ得る。例えば、ｔＰＡ前駆体配列に関して、不完全な切断は、フューリン切断部位またはプラスミン様切断部位において生じ得る。不完全な切断がプラスミン様切断部位において生じる場合、例えば、アミノ酸ＧＡＲの付加を含む変更されたＮ末端を有する改変されたアイソフォームが、産生され得る。いくつかの例において、精製されたアイソフォームは、プラスミン様プロテアーゼによって処理され得、そのＮ末端にＧＡＲ配列を保持しないポリペプチドを生じる。
【０３１４】
改変されたＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームは、そのＮ末端に１つ以上のさらなるアミノ酸を含み得る。これらのさらなるアミノ酸としては、ＧＡＲ、ＳＲ、ＬＥまたはその組合せ（例えば、ＧＡＲＳＲ（配列番号５６３）またはＧＡＲＬＥ（配列番号５６４））が挙げられ得るが、これらに限定されない。さらに、分泌されたポリペプチドはまた、分泌されたアイソフォームポリペプチドのＮ末端において、他の配列に加えてタグのアミノ酸配列を含み得る。
【０３１５】
アイソフォーム融合ポリペプチドは、当該分野で周知である種々の技術を使用して単離され得る。当業者は、本明細書中に提供される単離されたポリペプチドまたはタンパク質のうちの１つを得るために、ポリペプチドおよびタンパク質を単離するための公知の方法に容易に従い得る。これらとしては、イムノクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。イオン交換クロマトグラフィーの例としては、アニオン交換クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーが挙げられ、そしてＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、または当業者に公知である任意の他の同様のカラムが挙げられる。細胞培養培地または溶解した細胞からのアイソフォーム融合ポリペプチドの単離は、アイソフォーム融合ポリペプチド中のエピトープタグまたはアイソフォームポリペプチドのいずれかに対する抗体を使用して容易にされ得、次いで免疫沈降法によって単離され、そしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離される。あるいは、アイソフォーム融合体は、アイソフォーム融合ポリペプチドに対するポリペプチド特異的抗体の結合と、それに続くプロテインＡセファロースカラムまたはプロテインＧセファロースカラムに対するその抗体の結合、ならびにカラムからのそのタンパク質の溶出によって単離され得る。アイソフォーム融合タンパク質の精製はまた、タンパク質に結合する因子によって固定化されたアフィニティーカラムまたはアフィニティービーズ、上記結合因子からのタンパク質の溶出のための次なる１つ以上のカラム工程を含み得る。親和性因子の例としては、コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−トヨパール、またはＣｉｂａｃｒｏｍブルー３Ｇａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅが挙げられる。タンパク質はまた、フェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルなどの樹脂を使用して疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製され得る。
【０３１６】
いくつかの例において、アイソフォーム融合タンパク質は、免疫親和性クロマトグラフィーを使用して精製され得る。このような例において、アイソフォーム融合体は、本明細書中に記載されるものなどのエピトープタグ（マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（ＴＲＸ）、あるいはＨｉｓタグが挙げられるが、これらに限定されない）との融合タンパク質として発現され得る。このような融合タンパク質の発現および精製のためのキットは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、およびその他の業者から市販されている。上記タンパク質はまた、タグに融合され得、次いでこのようなエピトープに対する特異的な抗体を使用して精製され得る。いくつかの例において、エピトープタグ結合因子によって固定化されたアフィニティーカラムまたはアフィニティービーズは、アイソフォーム融合体を精製するために使用され得る。例えば、結合因子としては、ＧＳＴエピトープタグとの相互作用のためのグルタチオン、ポリＨｉｓタグとの相互作用のための固定化された金属親和性因子（例えば、Ｃｕ２＋またはＮｉ２＋）、抗エピトープ抗体（例えば、抗ｍｙｃ抗体）、および／またはアイソフォーム融合タンパク質の精製のためにカラムまたはビーズに固定化され得る任意の他の因子が挙げられ得る。
【０３１７】
最終的に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（例えば、ペンダントメチル基または他のペンダント脂肪族基を有するシリカゲル）を使用する１つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程が、上記タンパク質をさらに精製するために使用され得る。上述の精製工程のいくつかまたは全てはまた、種々の組合せで、実質的に均一の単離された組換えタンパク質を提供するために使用され得る。
【０３１８】
精製の前に、分泌されたＣＳＲアイソフォームポリペプチドまたはリガンドアイソフォームポリペプチド（イントロン融合タンパク質を含む）を含む条件培地は、例えば、タンジェンシャルフロー膜（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）または撹拌細胞系フィルター（ｓｔｉｒｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｉｌｔｅｒ）などを使用して、濃縮され得る。種々の分子量（ＭＷ）の分離カットオフが、濃縮プロセスのために使用され得る。例えば、１０，０００ＭＷの分離カットオフが、使用され得る。
【０３１９】
（７．合成アイソフォーム）
アイソフォームの様々な合成形態を提供する。それらには、とりわけ、アイソフォームまたはイントロンにコードされたその一部分が、直接もしくはリンカーを介して標的化剤などの別の薬剤、またはアイソフォームの活性がモジュレートされるようにイントロンにコードされた部分もしくはアイソフォーム部分をＣＳＲアイソフォームもしくはリガンドアイソフォームに提示または提供する分子に連結されている結合体が含まれる。他の合成形態には、細胞外ドメイン部分およびイントロンにコードされた部分などのＣ末端部分が異なるアイソフォーム由来であるキメラが含まれる。また、ペプチド骨格中の１つ以上の結合がバイオイソスター（ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒｅ）または他の結合で置き換えられており、その結果生じるポリペプチドのペプチド模倣体が、改変されていない形態と比較してプロテアーゼ耐性などの特性が改善されている、「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」アイソフォームも提供する。
【０３２０】
（アイソフォーム結合体）
また、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームは、アイソフォームと別の薬剤との間の結合体として提供され得る。結合体は、アイソフォームが相互作用するレセプターおよび／またはアイソフォームを送達するための別の標的レセプターを標的とするために用い得る。このような結合体には、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームあるいはアイソフォーム融合体と標的薬剤および／または標的化剤との連結が含まれる。結合体は、代表的には成分中に存在するかもしくは付加したシステイン残基間のジスルフィド結合またはアミド結合もしくは他の適切な結合を介した、化学的結合体化または化学的カップリングを含む任意の適切な方法によって産生され得る。イオン結合または他の結合も企図される。アイソフォームと標的薬剤との結合体化はまた、標的薬剤もしくは標的化剤をコードしているＤＮＡが、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームあるいはアイソフォーム融合体（例えば、ｔＰＡ−イントロン融合タンパク質融合体）をコードしているＤＮＡに作動可能に（リンカー領域を用いてか、もしくは用いずに）連結することによって、アイソフォーム融合体内で産生され得る。
【０３２１】
薬学的組成物は、ＣＳＲアイソフォーム結合体およびリガンドアイソフォーム結合体あるいはアイソフォーム融合結合体から調製し得、治療的に有効な量の結合体を、例えば生理的に受容可能な賦形剤中で投与することによって治療を行い得る。また、アイソフォーム結合体は、ＣＳＲアイソフォーム結合体またはリガンドアイソフォーム結合体を融合タンパク質としてコードしている核酸を含むベクターを送達することなどによるインビボ治療方法において用いることもできる。
【０３２２】
アイソフォーム結合体は、直接か、またはリンカーを介して１つ以上の標的薬剤に連結された、１つ以上のＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームを含み得る：（ＣＳＲアイソフォーム）ｎ、（Ｌ）ｑ、（標的薬剤）ｍ；ここで、少なくとも１つのアイソフォームは、直接か、または１つ以上のリンカー（Ｌ）を介して少なくとも１つの標的薬剤に連結されている。また、このような結合体は、治療用の標的細胞型などの標的に結合するために十分な、アイソフォームの任意の一部分を用いて産生し得る。結合体のエレメント間の任意の適切な結合、ならびに任意数のエレメント（ｎおよびｍは１より大きい整数であり、ｑは０もしくは１より大きい任意の整数である）は、得られる結合体が標的としたレセプターまたは標的細胞型と相互作用する限り、企図される。
【０３２３】
標的薬剤の例には、薬物、ならびに細胞表面においてか、または細胞表面を介して作用する毒素および細胞内で作用する毒素などの他の細胞傷害性分子が含まれる。このような部分の例には、アイソフォームとカップリングさせた場合に標的とし得る、放射性核種、崩壊して例えば電離α粒子もしくはβ粒子、またはＸ線もしくはγ線を発する放射性原子が含まれる。他の例には、アイソフォームとカップリングさせることによって標的とし得る化学療法剤が含まれる。例えば、ゲルダナマイシンはプロテオソームを標的とする。アイソフォーム−ゲルダナマイシン分子を細胞内プロテオソームに向けさせ、標的アイソフォームを分解してプロテオソームの位置でゲルダナマイシンを遊離させ得る。他の毒性分子には、リシン、サポリンおよび巻貝または軟体動物門の他のメンバー由来の天然産物などの毒素が含まれる。標的薬剤との結合体の別の例は、例えばタンパク質融合体として抗体または抗体フラグメントとカップリングされたＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームである。例えば、好中球、ナチュラルキラー細胞、およびマクロファージにおいてキラーＴ細胞活性を誘導するために、ｔＰＡ−イントロン融合タンパク質融合体を、特異的細胞表面マーカーに結合する抗体のＦｃフラグメントとカップリングさせ得る。様々な毒素が当業者に周知である。
【０３２４】
アイソフォーム結合体はまた、直接か、またはリンカーを介して１つ以上の標的化剤に連結された、１つ以上のＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームを含み得る：（ＣＳＲアイソフォーム）ｎ、（Ｌ）ｑ、および（標的化剤）ｍ；ここで、少なくとも１つのアイソフォームは、直接か、または１つ以上のリンカー（Ｌ）を介して少なくとも１つの標的化剤に連結されている。結合体のエレメント間の任意の適切な会合、ならびに任意数のエレメント（ｎおよびｍは１より大きい整数であり、ｑは０もしくは１より大きい任意の整数である）は、得られる結合体が標的細胞型などの標的と相互作用する限り、企図される。
【０３２５】
標的化剤には、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームを、標的、例えば特定の組織または細胞型または器官の標的とする、任意の分子が含まれる。標的化剤の例には、細胞表面抗原、細胞表面レセプター、細胞表面上または細胞膜内のタンパク質部分、脂質部分、ならびに炭水化物部分、細胞表面上でプロセシングされた分子、分泌された分子および他の細胞外分子が含まれる。標的化剤として有用な分子としては、有機化合物；無機化合物；金属錯体；レセプター；酵素；抗体；タンパク質；核酸；ペプチド核酸；ＤＮＡ；ＲＮＡ；ポリヌクレオチド；オリゴヌクレオチド；オリゴ糖；脂質；リポタンパク質；アミノ酸；ペプチド；ポリペプチド；ペプチド模倣体；炭水化物；補因子；薬物；プロドラッグ；レクチン；糖；糖タンパク質；生体分子；高分子；バイオポリマー；ポリマー；および他のそのような生物学的物質が挙げられるが、これらに限定されない。標的化剤として有用な例示的な分子には、タンパク質性リガンドおよび低分子リガンドなどのレセプターに対するリガンド、ならびに抗原結合タンパク質などの抗体および結合タンパク質が含まれる。
【０３２６】
あるいは、特定のレセプター（またはレセプター）と特異的に相互作用するＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームが標的化剤であり、これが毒素、薬物または核酸分子などの標的薬剤に連結されている。核酸分子は、標的細胞中で転写および／もしくは翻訳されることができるか、または調節核酸分子であり得る。
【０３２７】
ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームは、標的薬剤（もしくは標的化剤）に直接か、またはリンカーを介して間接的に連結させ得る。リンカーにはペプチドリンカーおよび非ペプチドリンカーが含まれ、標的薬剤もしくは標的化剤がアイソフォームに接近していることによって引き起こされる立体障害を軽減または低下させるため、ならびに／あるいは特異性、毒性、溶解度、血清安定性および／もしくは細胞内利用能などの結合体の他の特性を増大または変更させるため、ならびに／あるいはＣＳＲアイソフォームと標的薬剤または標的化剤との間の結合の柔軟性を増加させるためなどの機能性について選択し得る。リンカーおよび結合体化方法の例は当該分野で公知である（例えば、国際公開第００／０４９２６号パンフレット参照）。また、本明細書中に提供されるアイソフォームは、リポソームおよび封入された分子または捕捉された分子の送達を誘導する他のそのような部分を用いて、標的とし得る。
【０３２８】
（８．マルチマーの形成）
上記アイソフォーム（プレプロ配列またはその部分に連結されたアイソフォームを含む）のマルチマーもまた、本明細書中に提供される。アイソフォームマルチマーは、上記アイソフォームのダイマー、トリマー、またはより高次のマルチマーを形成する、共有結合されたマルチマー、非共有結合されたマルチマー、または化学的に結合されたマルチマーであり得る。上記マルチマーのポリペプチド成分は、同一であっても異なっていてもよい。代表的に、本明細書中に提供されるアイソフォームマルチマーの成分は、配列番号３２〜４８のうちのいずれかに示されるポリペプチドをコードする配列番号３１〜４７のうちのいずれかに示されるアイソフォーム融合体の１つ以上である。いくつかの例において、マルチマーはまた、例えば、そのＮ末端に１つ以上のさらなるアミノ酸を含む任意のものなどの改変されたＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの間に形成され得る。これらのさらなるアミノ酸としては、ＧＡＲ、ＳＲ、ＬＥまたはそれらの組合せ（例えば、ＧＡＲＳＲ（配列番号５６３）またはＧＡＲＬＥ（配列番号５６４））が挙げられ得るが、これらに限定されない。マルチマーで使用され得るその改変された形態を含むＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームのポリペプチドおよびコードする核酸配列の例は、配列番号１３９〜３５４のいずれかに示される任意のものである。
【０３２９】
アイソフォームポリペプチドのマルチマーは、Ｆｃドメインの間の相互作用などのダイマー化によって形成され得るか、またはそれらは、共有結合され得る。２つのアイソフォームポリペプチドの間におけるマルチマー化は、自発的であっても、２つ以上のポリペプチドの強制的な連結に起因して生じてもよい。１つの例において、マルチマーは、アイソフォームポリペプチド上のシステイン残基の間に形成されるジスルフィド結合によって連結され得る。さらなる例において、マルチマーは、例えば、ヘテロ二官能性リンカーを使用することなどによる化学的連結によって、２つのポリペプチドの間に形成され得る。
【０３３０】
（ａ．ペプチドリンカー）
ペプチドリンカーは、ポリペプチドマルチマーを産生するために使用され得る。１つの例において、ペプチドリンカーは、第１のポリペプチドのＣ末端、および第２のポリペプチドのＮ末端に融合され得る。この構造は、少なくとも１つ（好ましくは、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の可溶性ポリペプチドがそれらの各々の末端にてペプチドリンカーを介して互いに連結されるように複数回繰り返され得る。例えば、マルチマーポリペプチドは、配列Ｚ１−Ｘ−Ｚ２を有し得、ここで、Ｚ１およびＺ２は、細胞表面ポリペプチドアイソフォームの全てまたは部分の各々の配列であり、そしてＸは、ペプチドリンカーの配列である。いくつかの場合において、Ｚ１および／またはＺ２は、アイソフォームポリペプチドの全てまたは部分である。別の例において、Ｚ１とＺ２とは、同一であるってもよいし、または異なっていてもよい。別の例において、上記ポリペプチドは、Ｚ１−Ｘ−Ｚ２（−Ｘ−Ｚ）ｎの配列を有し、ここで「ｎ」は、任意の整数であり、すなわち、一般的には１または２である。代表的に、上記ペプチドリンカーは、得られるポリペプチドが可溶性であるように、十分な長さである。ペプチドリンカーの例としては、ｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＧＧＧＧＧ（配列番号５８２）、ＧＧＧＧＳ（配列番号５８０）または（ＧＧＧＧＳ）ｎ、ＳＳＳＳＧ（配列番号５８１）または（ＳＳＳＳＧ）ｎなどのグリシンセリンポリペプチドが挙げられる。
【０３３１】
連結する部分は、例えば、Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８）ＰＮＡＳ  ８５：５８７９−５８８３、Ｗｈｉｔｌｏｗら、（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６：９８９−９９５、およびＮｅｗｔｏｎら、（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：５４５−５５３において記載される。他の適切なペプチドリンカーとしては、米国特許第４，７５１，１８０号または同第４，９３５，２３３号（本明細書によって参考として援用される）に記載される任意のものが挙げられる。所望のペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドは、任意の適切な従来技術を使用して、インフレームで、アイソフォーム中の任意の場所に挿入され得るか、あるいはＮ末端もしくはＣ末端、またはプレプロ配列の間に挿入され得る。
【０３３２】
（ｂ．ポリペプチドマルチマー化ドメイン）
２つ以上のポリペプチドの相互作用は、安定な構造を形成するためにそれら自体が相互作用し得る任意の部分または他のポリペプチドへの、直接的または間接的のいずれかでの連結によって容易にされ得る。例えば、別個のコードされたポリペプチド鎖は、上記ポリペプチドのマルチマー化がマルチマー化ドメインによって媒介されるようなマルチマー化によって結合され得る。代表的に、上記マルチマー化ドメインは、第１のキメラポリペプチドと第２のキメラポリペプチドとの間における安定したタンパク質−タンパク質相互作用の形成を提供する。キメラポリペプチドは、例えば、アイソフォームポリペプチドをコードする核酸と、マルチマー化ドメインをコードする核酸との連結（直接的または間接的）を含む。ホモマルチマーポリペプチドまたはヘテロマルチマーポリペプチドが、別個のキメラポリペプチドの同時発現から産生され得る。第１のキメラポリペプチドおよび第２のキメラポリペプチドは、同じであっても、異なっていてもよい。
【０３３３】
一般に、マルチマー化ドメインは、安定なタンパク質−タンパク質相互作用を形成し得る任意のものを含む。上記マルチマー化ドメインは、ホモマルチマーまたはヘテロマルチマーのキメラ分子の間における分子間ジスルフィド結合を形成する、免疫グロブリン配列、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、または遊離チオールを介して相互作用し得る。さらに、マルチマー化ドメインは、例えば、米国特許出願第０８／３９９，１０６号に記載されるような、穴（ｈｏｌｅ）を含むアミノ酸配列と相補的な突出を含むアミノ酸配列を含み得る。このようなマルチマー化領域は、立体的相互作用が、安定な相互作用を促進するだけでなく、キメラ単量体の混合物からのホモダイマーを上回るヘテロダイマーの形成をさらに促進するように、設計され得る。一般に、突出は、第１のポリペプチドの界面由来の小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）を用いて置換することによって構築される。上記突出に対する同一の大きさまたは類似する大きさの代償となる窪みは、必要に応じて、大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）を用いて置換することによって第２のポリペプチドの界面上に形成される。
【０３３４】
例えば、本明細書中に提供される任意のアイソフォームポリペプチドなどのキメラアイソフォームポリペプチドは、任意の場所で結合され得るが、代表的には、最終的に発現の際にキメラポリペプチドを形成するように、そのＮ末端またはＣ末端を介してマルチマー化ドメインのＮ末端またはＣ末端に結合され得る。
【０３３５】
得られるキメラポリペプチド、およびそこから形成されるマルチマーは、例えば、プロテインＡカラムまたはプロテインＧカラムに対するアフィニティクロマトグラフィーによるような任意の適切な方法によって精製され得る。異なるキメラポリペプチドをコードする２つの核酸分子によって、細胞を形質転換する場合、ホモダイマーおよびヘテロダイマーの形成が生じる。発現のための条件は、ヘテロダイマー形成がホモダイマー形成より好ましいように調整され得る。
【０３３６】
（ｉ．免疫グロブリンドメイン）
マルチマー化ドメインは、分子間ジスルフィド結合をさらなるアミノ酸配列のマルチマー化ドメインと形成するために反応し得る遊離チオール部分を含むものを含む。例えば、マルチマー化ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ５  ＩｇＭ、およびＩｇＥなどに由来する免疫グロブリン分子の部分を含み得る。一般に、このような部分は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）である。抗体由来ポリペプチドの種々の部分（Ｆｃドメインを含む）に融合された可溶性ＣＳＲ細胞外ドメインポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、記載されている（例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：１０５３５；Ｂｙｒｎら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ、３ＡＡ：６１１；ならびにＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈおよびＡｒｕｆｆｏ、（１９９２）「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４補遺、ｐｐ．１０．１９．１−１０．１９．１１を参照のこと）。
【０３３７】
抗体は、特定の抗原に結合し、そしてジスルフィド結合によって共有結合された２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖を含む。重鎖および軽鎖は、抗原に結合する可変領域、および定常（Ｃ）領域を含む。それぞれの鎖において、１つのドメイン（Ｖ）は、上記分子の抗体特異性に依存して、可変アミノ酸配列を有する。他のドメイン（Ｃ）はむしろ、同じクラスの分子に共通して定常配列を有する。上記ドメインは、配列において、アミノ末端から番号付けされる。例えば、ＩｇＧ軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端にＶＬ−ＣＬ（それぞれ、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインと称する）の順序で連結された２つの免疫グロブリンドメインから構成される。ＩｇＧ重鎖は、Ｎ末端からＣ末端にＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（可変重鎖ドメイン、定常重鎖ドメイン１、定常重鎖ドメイン２、および定常重鎖ドメイン３と称する）の順序で連結された４つの免疫グロブリンドメインから構成される。得られる抗体分子は、それぞれの重鎖がジスルフィド結合によって軽鎖に連結され、そして２つの重鎖がジスルフィド結合によって互いに連結される４つの鎖分子である。上記重鎖の連結は、ヒンジ領域として公知である重鎖の柔軟な領域によって媒介される。抗体分子のフラグメントは、例えば、酵素的切断などによって産生され得る。例えば、パパインによるプロテアーゼ切断の際に、重鎖定常領域のダイマー（Ｆｃドメイン）は、２つのＦａｂ領域（すなわち、可変領域を含む部分）から切断される。
【０３３８】
ヒトにおいて、それぞれ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＥの抗体のクラスを生じるデルタ（δ）、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、およびアルファ（α）およびイプシロン（ε）として示されるそれらの重鎖に基づいて分類される、５つの抗体アイソタイプが、存在する。ＩｇＡクラスおよびＩｇＧクラスは、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のサブクラスを含む。免疫グロブリン重鎖の間の配列の差異により、種々のアイソタイプは、例えばＣドメインの数、ヒンジ領域の存在、ならびに鎖間ジスルフィド結合の数および位置において異なっている。例えば、ＩｇＭ重鎖およびＩｇＧ重鎖は、ヒンジ領域を置換するさらなるＣドメイン（Ｃ４）を含有する。ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡのＦｃ領域は、互いに、それらのＣγ３、Ｃδ３およびＣα３ドメインを介して対合するが、一方、ＩｇＭおよびＩｇＥのＦｃ領域はそれらのＣμ４およびＣε４ドメインを介して二量体化する。ＩｇＭおよびＩｇＡは、それぞれ１０個および４個の抗原結合部位と、マルチマー構造を形成する。
【０３３９】
本明細書中に提供される免疫グロブリンキメラポリペプチドとしては、完全長免疫グロブリンポリペプチドが挙げられる。あるいは、この免疫グロブリンポリペプチドは、完全長未満、すなわち重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆｖ、またはＦｃを含む。１つの例において、この免疫グロブリンキメラポリペプチドは、単量体またはヘテロマルチマーもしくはホモマルチマーとして、特に二量体または四量体として構築される。種々の構造の鎖または基本単位が、この単量体またはヘテロマルチマーもしくはホモマルチマーを構築するために用いられ得る。例えば、アイソフォームポリペプチドは、免疫グロブリン分子の全てまたはその一部（免疫グロブリン分子のＣＨ、ＣＬ、ＶＨ、またはＶＬドメインの全てまたはそれらの一部を含む）に融合され得る（例えば、米国特許第５，１１６，９６４号を参照のこと）。キメラアイソフォームポリペプチドは、適切な核酸分子で形質転換された哺乳動物細胞によって容易に産生および分泌され得る。この分泌形態としては、そのアイソフォームポリペプチドが重鎖二量体で存在するもの；軽鎖単量体または二量体で存在するもの；ならびにそのアイソフォームポリペプチドが、１つ以上の軽鎖または重鎖に融合されいている重鎖へテロ四量体および軽鎖へテロ四量体（最大４つ全ての可変領域アナログが置換されているものを含む）が挙げられる。いくつかの例において、１つ以上の核酸融合分子が宿主細胞に形質転換され得、マルチマーのアイソフォーム部分が同一であるかまたは異なっているマルチマーを産生し得る。いくつかの例において、非アイソフォームポリペプチドの軽鎖−重鎖可変様ドメインが存在し、それによってヘテロ二官能性抗体を産生する。いくつかの例において、ヒンジジスルフィドを欠いた免疫グロブリン分子の一部に融合したキメラポリペプチドが産生され得、ここで２つのポリペプチドの非共有結合性相互作用または共有結合性相互作用がその分子をホモ二量体またはヘテロ二量体に結合させている。
【０３４０】
（ａ）Ｆｃドメイン
代表的に、上記免疫グロブリン部分は、免疫グロブリンポリペプチドの重鎖、最も一般的には重鎖の定常ドメインを含む。ヒトＩｇＧサブタイプについての重鎖定常領域の例示的配列は、公知である。例えば、配列番号５６５に示される例示的重鎖定常ドメインについて、ＣＨ１ドメインはアミノ酸１〜９８に相当し、ヒンジ領域はアミノ酸９９〜１１０に相当し、ＣＨ２ドメインはアミノ酸１１１〜２２３に相当し、そしてＣＨ３ドメインはアミノ酸２２４〜３３０に相当する。
【０３４１】
１つの例において、免疫グロブリンポリペプチドキメラタンパク質は、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域を含み得る。代表的に、そのような融合体は、少なくとも、免疫グロブリン重鎖の定常領域の機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを保持する。例えば、ＩｇＧ１の完全長Ｆｃ配列は、配列番号５６５に示される配列のアミノ酸９９〜３３０を含む。多数のＦｃドメインが公知であり、Ｔ細胞活性が低減されているかまたは除去されている改変Ｆｃドメインが挙げられる。結合が生成される正確な場所は重要ではなく：具体的な位置は周知であり、アイソフォームポリペプチドの生物学的活性、分泌、または結合特性を最適化するために選択され得る。Ｆｃドメインの例示的な配列は、配列番号５６６および５６７に示される。
【０３４２】
ｈＩｇＧ１に加えて、他のＦｃ領域もまた、本明細書中に提供されるアイソフォームポリペプチドに含まれ得る。例えば、Ｆｃ／ＦｃγＲ相互作用によって媒介されるエフェクター機能が最小化されるべき場合には、ほとんど補体またはエフェクター細胞をリクルートしないＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＦｃ）との融合が企図される。さらに、このＦｃ融合体は、任意の抗体クラス（ＩｇＧ（ヒトサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ヒトサブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭクラスの抗体が挙げられるがこれらに限定されない）に属する免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる免疫グロブリン配列を含有し得る。さらに、Ｆｃを別のポリペプチドに共有結合させてＦｃキメラを生成させるために、リンカーが使用され得る。
【０３４３】
改変型Ｆｃドメインもまた公知である（例えば、例示的な改変については米国特許出願公開第２００６／００２４２９８；および国際公開第２００５／０６３８１６号を参照のこと）。いくつかの例において、このＦｃ領域は、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域のエフェクター機能から変更（すなわち、増加または低減）されたエフェクター機能を有するものである。この抗体のＦｃ領域は、多数のＦｃレセプターおよびリガンドと相互作用し、エフェクター機能と呼ばれる多数の重要な機能的能力を付与する。Ｆｃエフェクター機能としては、例えば、Ｆｃレセプター結合、補体結合、およびＴ細胞枯渇活性が挙げられる（米国特許第６，１３６，３１０号を参照のこと）。Ｔ細胞枯渇活性、Ｆｃエフェクター機能、および抗体安定性をアッセイする方法は、当該分野で公知である。例えば、ＩｇＧ分子のＦｃ領域はＦｃγＲと相互作用する。これらのレセプターは、種々の免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、脂肪細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびγδＴ細胞を含む）において発現される。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成は、これらのエフェクター細胞を、結合した抗原の場所にリクルートし、代表的に、細胞内におけるシグナル伝達事象および重要なその後の免疫応答（例えば、炎症メディエーターの放出、Ｂ細胞活性化、エンドサイトーシス、食作用、および細胞傷害性攻撃）をもたらす。細胞傷害性および食作用のエフェクター機能を媒介する能力は、抗体が標的細胞を破壊する潜在的機構である。ＦｃγＲを発現する細胞傷害性細胞による標的細胞上での結合抗体の認識および溶解は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害と呼ばれる。種々の抗体アイソタイプに対する他のＦｃレセプターとしては、ＦｃεＲ（ＩｇＥ）、ＦｃαＲ（ＩｇＡ）およびＦｃμＲ（ＩｇＭ）が挙げられる。
【０３４４】
したがって、改変されたＦｃドメインは、変更された親和性（Ｆｃレセプターに関する増加した親和性または低減された親和性または親和性なし）を有する。例えば、異なるＩｇＧサブクラスは、ＦｃγＲに対する異なる親和性を有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３はＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりもレセプターに実質的によく結合する。さらに、異なるＦｃγＲは異なるエフェクター機能を媒介する。ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ／ｃ、およびＦｃγＲＩＩＩａは、免疫複合体によって引き起こされる活性化の正のレギュレーターであり、それらは、免疫レセプターチロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞内ドメインを有することによって特徴付けられる。しかしながら、ＦｃγＲＩＩｂは免疫レセプターチロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＨＭ）を有し、それゆえ阻害性である。したがって、レセプターに対するＦｃ領域の親和性の変更は、Ｆｃドメインによって誘導されるエフェクター機能をモジュレートする。
【０３４５】
１つの例において、より良くエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ）を媒介するように特定のＦｃγＲへの最適化された結合のために改変されたＦｃ領域が使用される。そのような改変されたＦｃ領域は、配列番号５６６に示される例示的Ｆｃ配列のＧ２０Ｓ、Ｇ２０Ａ、Ｓ２３Ｄ、Ｓ２３Ｅ、Ｓ２３Ｎ、Ｓ２３Ｑ、Ｓ２３Ｔ、Ｋ３０Ｈ、Ｋ３０Ｙ、Ｄ３３Ｙ、Ｒ３９Ｙ、Ｅ４２Ｙ、Ｔ４４Ｈ、Ｖ４８Ｉ、Ｓ５１Ｅ、Ｈ５２Ｄ、Ｅ５６Ｙ、Ｅ５６Ｉ、Ｅ５６Ｈ、Ｋ５８Ｅ、Ｇ６５Ｄ、Ｅ６７Ｌ、Ｅ６７Ｈ、Ｓ８２Ａ、Ｓ８２Ｄ、Ｓ８８Ｔ、Ｓ１０８Ｇ、Ｓ１０８Ｉ、Ｋ１１０Ｔ、Ｋ１１０Ｅ、Ｋ１１０Ｄ、Ａ１１１Ｄ、Ａ１１４Ｙ、Ａ１１４Ｌ、Ａ１１４Ｉ、Ｉ１６６Ｄ、Ｉ１１６Ｅ、Ｉ１１６Ｎ、Ｉ１１６Ｑ、Ｅ１１７Ｙ、Ｅ１１７Ａ、Ｋ１１８Ｔ、Ｋ１１８Ｆ、Ｋ１１８Ａ、およびＰ１８０Ｌのうちのいずれか１つまたはそれより多くに対応する改変を含有し得る。これらの変異を含有する改変されたＦｃは、ＦｃＲ（例えば、活性化レセプターＦｃγＩＩＩａ）への強化された結合を有し得、かつ／または阻害性レセプターＦｃγＲＩＩｂへの低減された結合を有し得る（例えば、ＵＳ２００６／００２４２９８を参照のこと）。ＦｃＲへの強化された結合を有するように改変されたＦｃ領域は、アイソフォームポリペプチドと連結されたときでさえ、患者における癌細胞の破壊を促進するのにより有効であり得る。抗体が腫瘍細胞を破壊する多数の可能な機構が存在し、この機構としては、必要な増殖経路の遮断による抗増殖、アポトーシスを導く細胞内シグナル伝達、レセプターの強化されたダウンレギュレーションおよび／またはターンオーバー、ＡＤＣＣ、および適応免疫応答の促進が挙げられる。
【０３４６】
別の例において、ＦｃγＲとの結合を低減または除去する置換を有する種々のＦｃ変異体もまた公知である。そのようなムテインは、Ｆｃによって媒介されるエフェクター機能が低減されるかまたは除去される必要がある場合において、有用である。これはしばしば、標的抗原を保持する細胞のアンタゴニズム（しかし殺傷はしない）が所望されるケースである。そのようなＦｃの例示は、米国特許第５，４５７，０３５号に記載されるＦｃムテインである。例示的なＦｃムテインは配列番号５６８に示されている。
【０３４７】
さらなる例において、ＦｃＲｎへの結合において改変され、それによって、Ｆｃキメラポリペプチドの薬物動態を改善されたＦｃ領域が用いられ得る。ＦｃＲｎは、新生仔のＦｃＲであり、その結合は、エンドソームから血流へと戻るエンドサイトーシスされた抗体を再利用する。このプロセスは、その完全長分子の大きなサイズに起因して、腎臓のろ過の妨げと併せて、１〜３週間の範囲の良好な抗体血清半減期をもたらす。ＦｃのＦｃＲｎへの結合はまた、抗体輸送においても役割を担う。
【０３４８】
代表的に、ポリペプチドマルチマーは、２つの同じかまたは異なるアイソフォームポリペプチドをＦｃポリペプチドに対して直接的または間接的に連結することによって作製された、２つのキメラタンパク質のダイマーである。いくつかの例において、アイソフォーム−Ｆｃ（本明細書中に記載されるプレ−プロ配列を含む）キメラタンパク質をコードする遺伝子融合体は、適切な発現ベクター内に挿入される。得られたＦｃキメラタンパク質は、組換え発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞において発現され得、そして、かなり類似した抗体分子を組み立てることを可能にする。ここで、Ｆｃ部分間に鎖間ジスルフィド結合が形成し、二価のポリペプチドを生じる。代表的に、宿主細胞および発現系は、Ｆｃタンパク質を安定化するためのグリコシル化を可能にする、哺乳動物発現系である。他の宿主細胞もまた使用され得、この場合、この位置でのグリコシル化は、考慮されない。
【０３４９】
この得られたＦｃ部分を含むキメラポリペプチドおよびそこから形成されるマルチマーは、プロテインＡカラムまたはプロテインＧカラムを通すアフィニティクロマトグラフィーにより容易に精製され得る。異なるキメラポリペプチドをコードする２つの核酸分子が細胞内に形質転換される場合、ヘテロダイマーの形成は、生化学的に達成されなければならない。なぜならば、Ｆｃドメインを有するキメラ分子は、ジスルフィド連結されたホモダイマーとしても発現されるからである。したがって、ホモダイマーは、鎖間ジスルフィドの破壊を好むが、鎖間のジスルフィドには影響を及ぼさない条件下で減少され得る。代表的に、異なる細胞外部分を有するキメラモノマーは、等モル量で混合され、そして、酸化されて、ホモダイマーおよびヘテロダイマーの混合物を形成する。この混合物の成分は、クロマトグラフィー技術により分離される。あるいは、この型のヘテロダイマーの形成は、アイソフォームポリペプチドを含み、その後に、ｈＩｇＧのＦｃドメインを含み、その後に、ｃ−ｊｕｎまたはｃ−ｆｏｓロイシンジッパー（以下を参照のこと）のいずれかを含む融合分子を遺伝子操作し、そして発現させることによって偏らせられ得る。ロイシンジッパーは、ヘテロダイマーを優先的に形成するので、これらは、所望される場合、ヘテロダイマーの形成を駆動するために使用され得る。Ｆｃ領域を含むキメラポリペプチドもまた、金属キレート化合物または他のエピトープを有するタグを含めるように操作され得る。タグを付加したドメインは、金属−キレート化合物クロマトグラフィーによって、および／または、抗体によって迅速に精製して、そして、ウェスタンブロット、免疫沈降、または、バイオアッセイにおける活性の減少／ブロッキングの検出を可能にするために使用され得る。
【０３５０】
（（ｂ）窪み内に入る突出部（すなわち、ノブと穴））
マルチマーは、ホモオリゴマー化より優先的なヘテロオリゴマー化を促進するために、第一のキメラポリペプチドと第二のキメラポリペプチドとの間に境界を含むように操作され得る。代表的に、第一のキメラポリペプチドおよび第二のキメラポリペプチドの一方または両方のマルチマー化ドメインは、抗体分子の境界が、ヘテロダイマー化を促進および／または助長するよう改変されるように、修飾された抗体フラグメントである。いくつかの場合において、抗体分子は、修飾されたＦｃ領域である。したがって、修飾は、突出部が窪み内に位置することを可能とし、第一のＦｃ含有キメラポリペプチドおよび第二のＦｃ含有キメラポリペプチドの複合体形成を促進するような、第一のＦｃポリペプチドへの突出部の導入、そして、第二のＦｃポリペプチド内への窪みの導入を包含する。
【０３５１】
代表的に、第一のキメラポリペプチドおよび第二のキメラポリペプチドの安定な相互作用は、免疫グロブリン定常ドメインのＣＨ３ドメインの十分な部分を含む、同じかまたは異なるマルチマー化ドメインの境界相互作用を介するものである。種々の構造的データおよび機能的データは、抗体重鎖の結合が、ＣＨ３ドメインにより指向されることを示唆する。例えば、Ｘ線結晶学は、Ｆｃ領域におけるヒトＩｇＧ１重鎖間の分子間結合が、ＣＨ３ドメイン間の広範囲にわたるタンパク質／タンパク質相互作用を含み、ここで、グリコシル化されたＣＨ２ドメインが、その炭化水素を介して相互作用することを実証している（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒら（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０：２３６１）。さらに、２つの重鎖間ジスルフィド結合が存在し、これらの結合は、重鎖が短縮して、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを除去しない限り、哺乳動物細胞における抗体発現の間に効率的に形成される（Ｋｉｎｇら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８１：３１７）。したがって、これとは逆に、重鎖の組み立ては、ジスルフィド結合の形成を促進するようである。ＣＨ３ドメインの境界を遺伝子操作することにより、異なる重鎖のヘテロマルチマーの形成が促進され、そして、対応するホモマルチマーの組み立てが妨害される（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号；国際特許出願ＷＯ  ９８／５０４３１およびＷＯ  ２００５／０６３８１６；Ｒｉｄｇｗａｙら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９：６１７−６２１を参照のこと）。
【０３５２】
したがって、本明細書中に提供されるマルチマーは、第一のキメラアイソフォームポリペプチドおよび第二のキメラアイソフォームポリペプチドの境界の間に形成され得（第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドは、同じであっても異なっていてもよい）、ここで、第一のポリペプチドのマルチマー化ドメインは、突出部を含むように改変されたＦｃドメインのＣＨ３境界の少なくとも十分な部分を含み、第二のポリペプチドのマルチマー化ドメインは、窪みを含むように改変されたＦｃドメインのＣＨ３境界の少なくとも十分な部分を含む。改変されたＣＨ３境界の全てまたは十分な部分は、ＩｇＧ免疫グロブリン、ＩｇＡ免疫グロブリン、ＩｇＤ免疫グロブリン、ＩｇＥ免疫グロブリンまたはＩｇＭ免疫グロブリンに由来し得る。種々の免疫グロブリン分子のＣＨ３ドメインにおける改変の標的とされる境界残基は、米国特許第５，７３１，１６８号に示される。一般に、マルチマー化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１のようなＩｇＧ抗体に由来するＣＨ３ドメインの全てまたは十分な部分である。
【０３５３】
ポリペプチド内に突出部または窪みをつくるための置き換えおよび／または改変のための標的とされるアミノ酸は、代表的には、第二のポリペプチドの境界において１以上のアミノ酸と相互作用または接触する境界アミノ酸である。突出部アミノ酸を含むように改変される第一のポリペプチドは、第一のポリペプチドの境界から突出する少なくとも１つの側鎖を有するアミノ酸を用いた、ネイティブなアミノ酸または元のアミノ酸の置き換えを含み、それゆえ、第二のポリペプチドの隣接する境界における埋め合わせとなる窪み内に位置することが可能である。置き換えアミノ酸は、元のアミノ酸残基よりも大きな側鎖の嵩を有するアミノ酸であることが最も多い。当業者は、アミノ酸残基の特性を決定および／または評価して、それが突出部をつくるために理想的な置き換えアミノ酸であると同定することができる。一般に、突出部を形成するための置き換え残基は、天然に存在するアミノ酸残基であり、例えば、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、またはトリプトファン（Ｗ）が挙げられる。いくつかの例において、置き換えのために同定された元の残基は、例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、スレオニンまたはバリンのような小さな側鎖を有するアミノ酸残基である。
【０３５４】
窪みを含むように改変される第二のポリペプチドは、第二のポリペプチドの境界から凹んだ少なくとも１つの側鎖を有するアミノ酸を用いた、ネイティブなアミノ酸または元のアミノ酸の置き換えを含み、それゆえ、第一のポリペプチドの境界からの対応する突出部を収容することが可能である。置き換えアミノ酸は、元のアミノ酸残基よりも小さな側鎖の嵩を有するアミノ酸であることが多い。当業者は、アミノ酸残基の特性を決定および／または評価して、それが窪みの形成のために理想的な置き換え残基であると同定することができる。一般に、窪みを形成するための置き換え残基は、天然に存在するアミノ酸残基であり、例えば、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）およびバリン（Ｖ）が挙げられる。いくつかの例において、置き換えのために同定された元のアミノ酸は、例えば、チロシン、アルギニン、フェニルアラニンまたはトリプトファンのような大きな側鎖を有するアミノ酸である。
【０３５５】
例えば、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３境界は、各表面から１０９０Å２埋まった、４つのアンチパラレルβ−ストランド上に位置する各ドメイン上の１６の残基を含む（例えば、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒら（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０：２３６１−２３７０；Ｍｉｌｌｅｒら、（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１６、９６５−９７３；Ｒｉｄｇｗａｙら、（１９９６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎ．、９：６１７−６２１；米国特許第５，７３１，１６８号を参照のこと）。突出部または窪みをつくるためのＣＨ３ドメインの改変は、例えば、以下に記載される：米国特許第５，７３１，１６８号；国際特許出願ＷＯ９８／５０４３１およびＷＯ２００５／０６３８１６；ならびにＲｉｄｇｗａｙら、（１９９６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎ．、９：６１７−６２１。例えば、突出部または窪みをつくるためのＣＨ３ドメインにおける改変は、配列番号５６５に示される配列の、境界アミノ酸Ｑ２３０、Ｖ２３１、Ｙ２３２、Ｔ２３３、Ｌ２３４、Ｖ２４６、Ｓ２４７、Ｌ２４８、Ｔ２４９、Ｃ２５０、Ｌ２５１、Ｖ２５２、Ｋ２５３、Ｇ２５４、Ｆ２５５、Ｙ２５６、Ｋ２７５、Ｔ２７６、Ｔ２７７、Ｐ２７８、Ｖ２７９、Ｌ２８０、Ｄ２８１、Ｇ２８５、Ｓ２８６、Ｆ２８７、Ｆ２８８、Ｌ２８９、Ｙ２９０、Ｓ２９１、Ｋ２９２、Ｌ２９３、Ｔ２９４およびＶ２９５に対応する任意のアミノ酸の置き換えであり得る。いくつかの例において、突出部または窪みをつくるためのＣＨ３ドメインの改変は、代表的には、２つの中心上にあるアンチパラレルβ−ストランド上に位置する残基を標的とする。この目的は、つくられる突出が、相手のＣＨ３ドメイン内の埋め合わせとなる窪みにより収容されるのではなく、周囲の溶媒内へと突出することにより収容され得るという危険性を最小限にすることである。例示的なこのような改変としては、例えば、境界アミノ酸Ｔ２４９、Ｌ２５１、Ｐ２７８、Ｆ２８８、Ｙ２９０およびＫ２９２に対応する任意のアミノ酸の置き換えが挙げられる。突出部／窪み相互作用をつくるためのＣＨ３ドメイン境界内の改変のための例示的なアミノ酸対としては、Ｔ２４９およびＹ２９０の改変；ならびにＦ２８８およびＴ２７７の改変が挙げられる。例えば、改変は、Ｔ２４９ＹおよびＹ２９０Ｔ；Ｔ２４９ＷおよびＹ２９０Ａ；Ｆ２８８ＡおよびＴ２７７Ｗ；Ｆ２８８ＷおよびＴ２７７Ｓ；ならびにＹ２９０ＴおよびＴ２４９Ｙを含み得る。
【０３５６】
いくつかの例において、１以上の境界相互作用が作製され得る。例えば、改変はまた、例えば、突出部をつくるための第一のポリペプチド内の２以上の改変、および、窪みをつくるための第二のポリペプチド内の２以上の改変を含む。例示的なこのような改変としては、例えば、第一のポリペプチド内のＴ２４９ＹおよびＦ２８８Ａの改変と第二のポリペプチド内のＴ２７７ＷおよびＹ２９０Ｔの改変；第一のポリペプチド内のＴ２７７ＷおよびＦ２８８Ｗの改変と第二のポリペプチド内のＴ２７７ＳおよびＹ２９０Ａの改変；または、第一のポリペプチド内のＦ２８８ＡおよびＹ２９０Ａの改変と第二のポリペプチド内のＴ２４９ＷおよびＴ２７７Ｓの改変が挙げられる。
【０３５７】
Ｆｃドメインまたはその改変体のような、あらゆる免疫グロブリン分子またはその改変体の全体または一部を含めた、本明細書中に記載される他のマルチマー化ドメインに関して、ＣＨ３突出部／窪み改変を含むＦｃ改変体は、アイソフォームポリペプチドのどこへでも接続され得るが、代表的には、そのＮ末端またはＣ末端を介して、第一および／または第二のアイソフォームポリペプチドのＮ末端またはＣ末端へと接続されて、キメラポリペプチドを形成し得る。この結合は、直接的であっても、リンカーを介して間接的であってもよい。また、キメラポリペプチドは、融合タンパク質であっても、共有結合性または非共有結合性の相互作用を介するような、化学的結合により形成されてもよい。代表的に、ノブおよび穴の分子は、ＣＨ３突出部改変を含むＦｃ改変体に連結された第一のアイソフォームポリペプチドと、ＣＨ３窪み改変を含むＦｃ改変体に連結された第二のアイソフォームポリペプチドとの同時発現により生成される。
【０３５８】
（ｉｉ．ロイシンジッパー）
マルチマーを調製するための別の方法は、ロイシンジッパードメインの使用を必要とする。ロイシンジッパーは、それらが見出されるタンパク質のマルチマー化を促進するペプチドである。代表的に、ロイシンジッパーは、いくつかのタンパク質において保存されたドメインとして存在する４〜５個のロイシン残基を含む、繰り返しの７個から成るモチーフを指すために使用される用語である。ロイシンジッパーは、短く、平行ならせん状コイルとして折り畳まれており、そして、これらがドメインを形成するタンパク質のオリゴマー化を担い得る。ロイシンジッパーは、最初に、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定され（例えば、Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９を参照のこと）、そして、それ以来、種々のタンパク質において見出されている。公知のロイシンジッパーの中でも、ダイマー化またはトリマー化する天然に存在するペプチドおよびその誘導体が知られる。ロイシンジッパーペプチドに対して直接的または間接的に連結されたアイソフォームポリペプチドを含む組換えキメラタンパク質は、適切な宿主細胞において発現され得、そして、形成されるオリペプチド（ｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）マルチマーは、培養上清から回収され得る。
【０３５９】
ロイシンジッパードメインは、短く、平行ならせん状コイルとして折り畳まれる（Ｏ’Ｓｈｅａら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４：５３９）。平行ならせん状コイルの一般構造は、「穴内に入るノブ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」パッキング（これは、最初に、１９５３年にＣｒｉｃｋにより提案された（Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、６：６８９））で特徴付けられた。ロイシンジッパードメインにより形成されるダイマーは、（ａｂｃｄｅｆｇ）ｎとして示される７個から成る繰り返しにより安定化され（例えば、ＭｃＬａｃｈｌａｎおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９７８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：２９３を参照のこと）、ここで、残基ａおよびｄは、一般に、疎水性残基であり、ｄはロイシンであり、そして、これらは、ヘリックスの同一平面上に整列する。逆に荷電された残基は、一般に、位置ｇおよびｅに生じる。したがって、２つのらせん状のロイシンジッパードメインから形成された平行ならせん状コイルにおいて、第一のヘリックスの疎水性側鎖により形成される「ノブ」は、第二のヘリックスの側鎖の間に形成される「穴」内へと詰め込まれる。
【０３６０】
位置ｄにおけるロイシン残基は、大きな疎水性安定化エネルギーに寄与し、そして、ダイマーの形成に重要である（Ｋｒｙｓｔｅｋら（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．３８：２２９）。疎水性安定化エネルギーは、らせん状モノマーからのらせん状コイルの形成のための主要な駆動力を提供する。静電相互作用もまた、らせん状コイルの化学量論および幾何学に寄与する。
【０３６１】
（（ａ）ｆｏｓおよびｊｕｎ）
２つの核トランスフォーミングタンパク質（ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ｆｏｓおよびｊｕｎ）は、ロイシンジッパードメインを示す。同様に、マウス癌原遺伝子ｃ−ｍｙｃの遺伝子産物もまた、ロイシンジッパードメインを示す。このロイシンジッパードメインは、これらのタンパク質における生物学的活性（ＤＮＡ結合）のために必要である。上記の核癌遺伝子ｆｏｓおよびｊｕｎの生成物は、ヘテロダイマーを優先的に形成するロイシンジッパードメインを含む（Ｏ’Ｓｈｅａら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４５：６４６；ＴｕｒｎｅｒおよびＴｉｊｉａｎ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：１６８９を参照のこと）。例えば、ヒト転写因子ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓのロイシンジッパードメインは、１：１の化学量論で安定なヘテロダイマーを形成することが示されている（例えば、ＢｕｓｃｈおよびＳａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６：３６−４０；Ｇｅｎｔｚら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：１６９５−１６９９を参照のこと）。ｊｕｎ−ｊｕｎホモダイマーもまた形成することが示されているが、それらのｊｕｎ−ｊｕｎホモダイマーは、ｊｕｎ−ｆｏｓヘテロダイマーの約１０００分の１の安定性である。
【０３６２】
従って、代表的には、本明細書において提供されるアイソフォームポリペプチドマルチマーは、ｊｕｎ−ｆｏｓの組み合わせを使用して生成される。一般に、ｃ−ｊｕｎまたはｃ−ｆｏｓのうちのいずれかのロイシンジッパードメインは、融合遺伝子を遺伝子操作することによって、ポリペプチドのアイソフォームのＣ末端にインフレームで融合される。ｃ−ｊｕｎロイシンジッパードメインまたはｃ−ｆｏｓロイシンジッパードメインの例示的配列が、それぞれ、配列番号５６９および配列番号５７０に示される。ある場合には、ロイシンジッパーの配列は、例えば、ジスルフィド結合の形成を可能にするためのシステイン残基の付加によってか、またはペプチド濃度の測定を容易にするためのＣ末端でのチロシン残基の付加によって、改変され得る。改変型ｃ−ｊｕｎロイシンジッパードメインまたは改変型ｃ−ｆｏｓロイシンジッパードメインの例示的配列が、それぞれ、配列番号５７１および配列番号５７２に示される。さらに、アイソフォームポリペプチドとロイシンジッパーとの結合は、直接結合であってもよいし、柔軟なリンカードメイン（例えば、ＩｇＧのヒンジ領域）または種々の長さおよび組み合わせの他の小アミノ酸（例えば、グリシン、セリン、スレオニン、もしくはアラニン）ポリペプチドリンカーを使用し得る。ある場合には、コードされるポリペプチドのＣ末端からのロイシンジッパーの分離は、プロテアーゼ切断部位（例えば、トロンビン切断部位）をコードする配列との融合によって、もたらされ得る。さらに、上記キメラタンパク質は、例えば、６×Ｈｉｓタグ（金属キレートクロマトグラフィーによる迅速な精製を可能にする）によって、かつ／または抗体を入手し得るエピトープ（例えば、ｍｙｃタグ）（ウェスタンブロット、免疫沈降、もしくは活性除去（ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）／ブロックバイオアッセイにおける検出を可能にする）によって、タグ化され得る。
【０３６３】
（（ｂ）ＧＣＮ４）
ロイシンジッパードメインはまた、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける全体的窒素代謝制御（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ（ＧＣＮ４）ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）に関与する遺伝子ファミリーの転写アクチベータとして機能する、核タンパク質中に存在する。そのＧＣＮ４ロイシンジッパードメインの例示的な配列が、配列番号５７３に示される。このタンパク質は、ダイマー化して、ＧＣＮ４認識配列を含むプロモーター配列に結合することが可能であり、それにより、窒素の除去（ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ）に関する転写を活性化する。このＧＣＮ４ロイシンジッパードメインを表わす合成ペプチドのａ残基およびｄ残基におけるアミノ酸置換は、そのロイシンジッパードメインのオリゴマー化特性を変化させる。例えば、ａ位におけるすべての残基がイソロイシンへと変化させた場合、そのロイシンジッパーは、依然として、平行ダイマーを形成する。この変化に加えて、ｄ位におけるすべてのロイシン残基もまたイソロイシンへと変化させた場合、生じるペプチドは、溶液中でトリマー型平行らせん状コイルを自然形成する。ＧＣＮ４ロイシンジッパードメインのトリマー形態およびテトラマー形態の例示的配列が、それぞれ、配列番号５７４および配列番号５７５に示される。
【０３６４】
（ｉｉｉ．他のマルチマー化ドメイン）
他のマルチマー化ドメインは、当業者にとって公知であり、それらは、別々に生成および発現された２つ以上のポリペプチドのタンパク質間相互作用を促進する任意のドメインである。ポリペプチド間におけるタンパク質間相互作用を提供するために使用され得る他のマルチマー化ドメインの例としては、ｂａｒｎａｓｅ−ｂａｒｓｔａｒモジュール（例えば、Ｄｅｙｅｖら、（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：１４８６−１４９２）を参照のこと）；特定のタンパク質ドメインの選択（例えば、Ｔｅｒｓｋｉｋｈら、（１９９７）ＰＮＡＳ  ９４：１６６３−１６６８、およびＭｕｌｌｅｒら（１９９８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４２２：２５９−２６４を参照のこと）；特定のペプチドモチーフの選択（例えば、ｄｅ  Ｋｒｕｉｆら、（１９９６）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７６３０−７６３４、およびＭｕｌｌｅｒら、（１９９８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４３２：４５−４９を参照のこと）；ならびに安定性増大のためのジスルフィド架橋の使用（ｄｅ  Ｋｒｕｉｆら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７６３０−７６３４、およびＳｃｈｍｉｅｄｌら、（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１３：７２５−７３４を参照のこと）；が挙げられるが、これらに限定はされない。別の型のマルチマー化ドメインの例は、異なるサブユニットポリペプチド間でのタンパク質間相互作用（下記にＰＫＡ／ＡＫＡＰ相互作用について記載されるようなもの）によってマルチマー化が促進されるマルチマー化ドメインである。
【０３６５】
（Ｒ／ＰＫＡ−ＡＤ／ＡＫＡＰ）
マルチマーポリペプチドはまた、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の調節性（Ｒ）サブユニット（例えば、配列番号５７６もしくは配列番号５７８）と、Ａキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）（例えば、Ｒｏｓｓｉら、（２００６）ＰＮＡＳ  １０３：６８４１−６８４６を参照のこと）のアンカードメイン（ＡＤ）（例えば、配列番号５７７または配列番号５７９を参照のこと）との間のタンパク質間相互作用を利用して、生成され得る。２つの型のＲサブユニット（ＲＩおよびＲＩＩ）がＰＫＡにおいて見出され、その各々は、αアイソフォームおよびβアイソフォームを有する。これらのＲサブユニットは、ダイマーとして存在し、ＲＩＩに関しては、そのダイマー化ドメインは、４４個のアミノ末端残基中に存在する。ＡＫＡＰはその、ＡＤドメインの相互作用を介して、ＰＫＡのＲサブユニットと相互作用して、ＰＫＡの活性を調節する。ＡＫＡＰは、ダイマーＲサブユニットにのみ結合する。例えば、ヒトＲＩＩαに関して、そのＡＤは、２３個のアミノ末端残基から形成された疎水性表面に結合する。
【０３６６】
（Ｆ．アイソフォームの活性を評価するためのアッセイ）
ＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォーム（例えば、同族ＣＳＲアイソフォームまたは同族リガンドアイソフォームと比較してさらなるアミノ酸を含む、本明細書中に提供される任意のもの）は、そのアイソフォームの生成および精製の後にもその機能を保持する。そのような改変型融合アイソフォームとしては、分泌後の不完全なプロセシング（すなわち、ＧＡＲ）が原因でＮ末端にさらなるアミノ酸を有するアイソフォーム、コードされるリンカー配列（すなわち、ＬＥもしくはＳＲ）の存在が原因でＮ末端にさらなるアミノ酸を有するアイソフォーム、および／またはエピトープタグ（すなわち、ｃ−ｍｙｃもしくはＨｉｓタグ）の存在が原因でＮ末端にさらなるアミノ酸を有するアイソフォームが挙げられるが、これらに限定はされない。一般に、アイソフォームは、同族レセプターもしくは同族リガンドの完全長形態、野生型、または優性型と比較して、構造の変化または１つ以上の活性の変化を示す。さらに、アイソフォームは、同族レセプターまたは同族リガンドの活性を変化（モジュレート）させ得る。そのようなアイソフォームすべてが、候補治療剤である。
【０３６７】
上記アイソフォームが活性の差異を示す場合には、インビトロアッセイおよびインビボアッセイが、アイソフォームをモニターまたはスクリーニングするために使用され得る。インビトロアッセイおよびインビボアッセイはまた、アイソフォームをスクリーニングして、特定のレセプターまたは経路の活性をモジュレートするアイソフォームを同定または選択するために使用され得る。そのようなアッセイは、当業者にとって周知である。当業者は、レセプターまたはリガンドとの相互作用について、特定の精製されたアイソフォームを試験し得、かつ／あるいは活性を評価するため、または同族レセプターもしくは同族リガンドと比較して何らかの活性変化を評価するために、試験し得る。
【０３６８】
例示的なインビトロアッセイおよびインビボアッセイが、アイソフォームと、前駆体配列（例えば、ｔＰＡプレ／プロ配列）と、必要に応じて、エピトープタグとの融合から生成される精製されたアイソフォームの活性を評価することについて、本明細書において提供される。本明細書において提供されるアッセイはまた、同族レセプターまたは同族リガンドの野生型または優性型の活性に対するアイソフォームの活性の比較として、使用され得る。上記のアッセイのうちの多くは、ＲＴＫまたはＲＴＫアイソフォームに適用可能であるが、他のＣＳＲおよびＣＳＲアイソフォーム、ならびにＣＳＲ活性をモジュレートする他のリガンドアイソフォームを評価するために、使用され得る。さらに、多数のアッセイ（例えば、ＣＳＲのキナーゼ活性および細胞増殖活性についてのアッセイ）が、当業者にとって公知である。ＲＴＫアイソフォームの活性およびＲＴＫの活性についてのアッセイとしては、キナーゼ活性、ホモダイマー化アッセイおよびヘテロダイマー化アッセイ、タンパク質間相互作用アッセイ、構造アッセイ、細胞シグナル伝達アッセイ、およびインビボ表現型判定アッセイが挙げられるが、これらに限定はされない。アッセイはまた、動物モデル（活性が、観察され得かつ／または測定もしくは評価され得る、疾患モデルを包含する）の使用を包含する。そのようなアッセイにおけるＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォーム（例えば、アイソフォーム融合から生成されたアイソフォーム）の用量応答曲線は、生物学的活性のモジュレーションを評価するため、およびインビボ投与のためのアイソフォームの治療的に有効な量を決定するために、使用され得る。例示的アッセイが、下記に記載される。
【０３６９】
（１．キナーゼアッセイ）
キナーゼ活性は、直接および間接的に検出ならびに／または測定することができる。例えば、ホスホチロシンに対する抗体を用いて、ＲＴＫのリン酸化、ＲＴＫアイソフォーム、ＲＴＫ：ＲＴＫアイソフォーム複合体ならびに他のタンパク質およびシグナル伝達分子のリン酸化を検出することができる。例えば、ＲＴＫのチロシンキナーゼ活性の活性化は、ＲＴＫに対するリガンドの存在下で測定することができる。トランスリン酸化は、抗ホスホチロシン抗体によって検出することができる。トランスリン酸化は、ＲＴＫアイソフォームの存在下および非存在下で測定ならびに／または検出することができ、したがって、ＲＴＫアイソフォームがＲＴＫのトランスリン酸化をモジュレートする能力が測定される。手短に述べると、ＲＴＫアイソフォームを発現する細胞、またはＲＴＫアイソフォームに曝された細胞を、リガンドで処理する。細胞を溶解し、タンパク質抽出物（全細胞抽出物または分画した抽出物）をポリアクリルアミドゲルに載せ、電気泳動によって分離して、ウエスタンブロッティングで用いるものなどの膜に移す。また、抗ＲＴＫ抗体を用いた免疫沈降も、ゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングを行う前にＲＴＫタンパク質を分画ならびに単離するために用いることができる。抗ホスホチロシン抗体を用いて膜をプローブしてリン酸化を検出することができ、また、抗ＲＴＫ抗体を用いてプローブして全ＲＴＫタンパク質を検出することができる。比較のために、ＲＴＫアイソフォームを発現しない細胞およびリガンドに曝されていない細胞などのコントロール細胞を同じ手順に供することができる。
【０３７０】
また、チロシンのリン酸化は、質量分析などによって直接測定することもできる。例えば、ＲＴＫのリン酸化状態に対するＲＴＫアイソフォームの効果を、インタクトな細胞を様々な濃度のＲＴＫアイソフォームで処理してＲＴＫの活性化に対する効果を測定することなどによって、測定することができる。ＲＴＫは、免疫沈降によって単離することができ、質量分析による分析用のペプチドフラグメントを産生するためにトリプシン処理することができる。ペプチドの質量分析は、タンパク質のチロシンリン酸化の程度を定量的に決定するための良好に確立された方法である。チロシンのリン酸化は、ホスホチロシンを含むペプチドイオンの質量を増加させ、このペプチドは質量分析によってリン酸化されていないペプチドから容易に分離することができる。
【０３７１】
例えば、チロシン−１１３９およびチロシン−１２４８は、ＨＥＲ２  ＲＴＫ中で自己リン酸化されていることが公知である。トリプシン処理したペプチドは、例えばＥｘＰＡＳｙ−ＰｅｐｔｉｄｅＭａｓｓプログラムを用いることによって、ポリペプチドに基づいて経験的に決定または予測することができる。チロシン−１１３９およびチロシン−１２４８のリン酸化の程度は、これらのチロシンを含むペプチドの質量分析データから決定することができる。このようなアッセイを用いて、ＲＴＫアイソフォームの自己リン酸化の程度およびＲＴＫアイソフォームがＲＴＫのトランスリン酸化を行う能力を評価することができる。
【０３７２】
（２．複合体化）
ＲＴＫおよびＲＴＫアイソフォームのダイマー化ならびにＴＮＦＲおよびＴＮＦＲアイソフォームのトリマー化などの複合体化を、検出および／または測定することができる。例えば、単離されたポリペプチドを混合して、ゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングに供することができる。また、ＣＳＲおよび／またはＣＳＲアイソフォームを、全細胞もしくは分画した抽出物などの細胞および細胞抽出物に加えることができ、ゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングに供することができる。ポリペプチドを認識する抗体を用いて、モノマー、ダイマーおよび他の複合体形成した型の存在を検出することができる。あるいは、標識したＣＳＲおよび／または標識したＣＳＲアイソフォームをアッセイで検出することができる。
【０３７３】
例えば、このようなアッセイを用いて、ＲＴＫアイソフォームの存在下および非存在下で、ＲＴＫのホモダイマー化または２種以上のＲＴＫのヘテロダイマー化を比較することができる。また、ＲＴＫアイソフォームのホモダイマー化、および／またはＲＴＫとヘテロダイマー化するその能力を評価するために、アッセイを行うこともできる。例えば、ＥｒｂＢ２  ＲＴＫアイソフォームを、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４とヘテロダイマー化するその能力について評価することができる。さらに、ＨＥＲ２  ＲＴＫアイソフォームを、ＨＥＲ２が自己とホモダイマー化する能力をモジュレートするその能力について、評価することができる。
【０３７４】
（３．リガンド結合）
一般に、ＣＳＲは１つ以上のリガンドに結合する。リガンド結合はレセプターの活性をモジュレートし、したがって、例えばシグナル伝達経路のシグナル伝達をモジュレートする。ＣＳＲアイソフォームのリガンド結合およびＣＳＲアイソフォームの存在下におけるＣＳＲのリガンド結合を測定することができる。例えば、放射標識したリガンドなどの標識したリガンドを、ＣＳＲアイソフォームの存在下または非存在下（コントロール）で、精製したかもしくは部分的に精製したＣＳＲに加えることができる。免疫沈降および放射活性の測定を用いて、ＣＳＲアイソフォームが存在する場合および存在しない場合にＣＳＲに結合したリガンドの量を定量することができる。また、ＣＳＲアイソフォームは、ＣＳＲアイソフォームを標識したリガンドと共にインキュベートし、例えば対応するＣＳＲの野生型または優性型によって結合された量と比較してＣＳＲアイソフォームに結合された標識したリガンドの量を決定することなどによって、リガンド結合について評価することもできる。
【０３７５】
（４．レセプター結合）
ＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームは、細胞に対するアイソフォームの結合を評価することによって直接的に評価され得る。リガンドアイソフォームについて、結合は、細胞に対する同族リガンドの結合と比較され得る。いくつかの例において、結合レセプターを発現することが知られる細胞に対する結合についての競合的アッセイが、アイソフォームおよび他の公知のリガンドもしくはアイソフォームと共に用いられ得る。例えば、ＨＧＦアイソフォームが、ＭＥＴレセプターに対する結合についてＨＧＦと競合する能力が評価され得る。ＨＧＦおよびＨＧＦアイソフォームは、クロラミンＴ法（Ｎａｋａｍｕｒａら、（１９９７）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７、３３０５−３３１３を参照のこと）によって放射性ヨウ素処理され得、そして、１２５Ｉ−ＨＧＦおよび１２５Ｉ−ＨＧＦアイソフォームの比活性が測定され得る。ＭＥＴレセプターを通常発現する細胞は、結合アッセイのためにマルチウェルプレートにおいて培養される。これらの細胞は、氷冷結合緩衝液中で平衡状態にされ、そして、過剰モル比の非標識ＨＧＦまたは非標識ＨＧＦアイソフォームのあり・なしと共に、種々の濃度の１２５Ｉ−ＨＧＦまたは１２５Ｉ−ＨＧＦアイソフォームと共にインキュベートされる。競合的結合アッセイのために、一定濃度の１２５Ｉ−ＨＧＦおよび種々の濃度の非標識ＨＧＦもしくは非標識ＨＧＦアイソフォームが、細胞と共にインキュベートされる。インキュベーション期間の後、細胞は洗浄され、可溶化され、そして、結合した標識タンパク質が、γカウンターを用いて測定される。
【０３７６】
細胞表面分子に対するアイソフォームの結合は、１つ以上の細胞表面分子について直接的または間接的に測定され得る。例えば、免疫沈降が、細胞表面分子の結合を評価するために使用され得る。細胞溶解物は、アイソフォームと共にインキュベートされる。細胞表面分子（例えば、ＲＴＫ、ＴＮＦＲを含めたＣＳＲ、または他のリガンドレセプター）に対する抗体が、複合体を免疫沈降するために使用され得る。複合体中のアイソフォームの量は、抗アイソフォーム抗体を用いた免疫沈降物のウェスタンブロッティングを用いて、定量され、そして／または検出される。
【０３７７】
（５．細胞増殖アッセイ）
いくつかのＲＴＫ、例えばＶＥＧＦＲが、細胞増殖に関与している。細胞増殖に対するＲＴＫアイソフォームの効果を測定することができる。例えば、リガンドを、ＲＴＫを発現する細胞に加えることができる。ＲＴＫアイソフォームは、リガンドを加えて細胞増殖に対する効果を測定する前、それと同時に、またはその後に、このような細胞に加えることができる。あるいは、ＲＴＫアイソフォームは、このような細胞モデル中で、例えばアデノウイルスベクターを用いて発現され得る。例えば、ＶＥＧＦＲアイソフォームを、ＶＥＧＦＲを発現する内皮細胞に添加する。アイソフォームを添加した後、ＶＥＧＦリガンドを添加し、細胞を標準の増殖温度（例えば３７℃）で数日間インキュベートする。細胞をトリプシン処理し、トリパンブルーで染色し、生細胞を計数する。ＶＥＧＦＲアイソフォームおよび／またはリガンドに曝されていない細胞は、比較用のコントロールとして用いる。他の適切なコントロールを用いることができる。
【０３７８】
（６．運動原性（ｍｏｔｏｇｅｎｉｃ）アッセイ）
本明細書中に提供されるアイソフォーム融合から生成されるアイソフォームのようなＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームは、リガンド誘導性の細胞の運動性と干渉するその能力について評価され得る。例えば、内皮細胞は、培養皿表面にしっかりと接着するまで、マルチウェルプレートにおいて培養される。次いで、新鮮な培地が添加され、そして、蒸発を防ぐために軽いミネラルオイルで覆われる。ＨＧＦ、ＨＧＦアイソフォームもしくはＭＥＴアイソフォーム、またはこれらの組み合わせを含む培地が添加され、そして、デジタルカメラおよび継時露出撮影レコーダーを用いて像が記録される。移動した距離は、各フレームからの、規定された数の細胞から計算される。
【０３７９】
リガンド誘導性の細胞遊走に対するアイソフォームの作用はまた、内皮細胞傷害アッセイにより評価され得る。内皮細胞は、プレート上で培養され、そして、コンフルエンスに達するまで増殖させられる。細胞は、８２ゲージの針で傷付けられて、約２００μｍの創傷を生じる。これらの細胞は、次いで、洗浄され、そして、ＨＧＦアイソフォームもしくはＭＥＴアイソフォーム、ＨＧＦ、またはこれらの組み合わせを含む新鮮な培養培地が添加される。細胞遊走の像は、上述のように記録され、そして、創傷表面の上を越える移動距離が計算される。
【０３８０】
細胞遊走はまた、改変Ｂｏｙｄｅｎチャンバーアッセイを用いて評価され得る。内皮細胞（例えば、ヒト真皮微小血管内皮細胞）は、血清を絶たれ、次いで、１３．４μｇ／ｍｌフィブロネクチンでコーティングしたＴｒａｎｓｗｅｌｌプレート（直径６．５ｍｍのポリカーボネートメンブレン、５μｍ孔径、Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）の内側チャンバにプレーティングされる。ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームのあり・なしと共に、ＨＧＦ、ｂＦＧＦもしくはＶＥＧＦ、または細胞遊走を誘導する他のリガンドを含む培地が、外側チャンバに添加され、そして、一定期間インキュベートされる。メンブレンを通ってフィルタの下面へと移動する細胞の数は、各ウェルの無作為に選択された顕微鏡視野内の細胞をカウントすることによって定量される。
【０３８１】
（７．アポトーシスアッセイ）
多くのリガンドは、シグナル伝達を介し、特定のＣＳＲを介して、抗アポトーシス作用を及ぼす。例えば、ＨＧＦは、細胞傷害性因子（例えば、照射および特定の癌治療薬（シスプラチン、カンプトテシン（ｃａｍｔｏｔｈｅｓｉｎ）、アドリアマイシンおよびタキソールを含む））で処理された細胞に対して抗アポトーシス作用を及ぼす。ＨＧＦアイソフォームまたはＭＥＴアイソフォームの、ＨＧＦ処理の抗アポトーシス作用を変更する能力が測定され得る。細胞は、種々の濃度のＨＧＦアイソフォームもしくはＭＥＴアイソフォーム、および／またはＨＧＦを含む培地と共に培養される。細胞は、次いで、インキュベーション期間にわたり細胞傷害性因子に対して曝露され、そして、臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール（ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉｓａｚｏｌ）−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ，Ｓｉｇｍａ）アッセイを用いて、細胞の生存能力が測定される。
【０３８２】
アポトーシス性の細胞は、特徴的な核の断片化を示し、これは、核染色により可視化され得る。ＨＧＦで処理される細胞は、細胞傷害性因子に応答して核の断片化の減少を示す。ＨＧＦのこの作用に拮抗するＨＧＦアイソフォームもしくはＭＥＴアイソフォームの能力が評価され得る。細胞は、ガラススライド上にプレーティングされ、そして、細胞傷害性因子で処理され、その後、上述のようにＨＧＦ、および／または、ＨＧＦアイソフォームもしくはＭＥＴアイソフォームで処理される。細胞の核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２染色および３５０ｎｍの励起波長と４５０ｎｍの発光波長における蛍光顕微鏡を用いて可視化される。アポトーシスに対するＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの作用について評価するための他のアッセイとしては、ＤＮＡ断片化アッセイ、ＤＮＡフィルタ溶出（ｆｉｌｔｅｒ  ｅｌｕｔｉｏｎ）アッセイ、ＴＵＮＥＬ染色、カスパーゼ−３活性の測定、および／または、ＡＫＴの誘導についてのインビトロキナーゼ活性アッセイが挙げられ得る。
【０３８３】
（８．細胞疾患モデルアッセイ）
疾患もしくは状態由来の細胞、または疾患もしくは状態を模倣するようにモジュレートさせることができる細胞を用いて、ＣＳＲアイソフォームの効果を測定および／もしくは検出することができる。数々の動物モデルおよびインビトロ疾患モデルが当業者に知られている。例えば、ＣＳＲアイソフォームを細胞に添加するか、または細胞中で発現させ、ＣＳＲアイソフォームに曝していない、もしくはそれを発現しない細胞と比較して、表現型を測定または検出する。このようなアッセイは、細胞増殖、転移、炎症、新脈管形成、病原体感染および骨吸収に対する効果を含む効果を測定するために用いることができる。
【０３８４】
例えば、ＭＥＴアイソフォームの効果を、このようなアッセイを用いて測定することができる。ＨｅｐＧ２肝細胞などの肝細胞モデルを用いて、スポロゾイトによる培養中のマラリアの感染力をモニタリングすることができる。ＭＥＴアイソフォームなどのＲＴＫアイソフォームを細胞に添加するか、および／または細胞中で発現させる。その後、感染の結果として産生されるスポロゾイトのＥＥＦ（赤血球外形態）を染色および計数することなどによって、マラリアスポロゾイトを用いたこのような細胞の感染を測定する（Ｃａｒｒｏｌｏら（２００３）Ｎａｔ  Ｍｅｄ、９（１１）：１３６３〜１３６９）。ＲＴＫアイソフォームの効果は、この結果を、ＲＴＫアイソフォームに曝されていない細胞またはＲＴＫアイソフォームを発現する細胞および／または未感染の細胞と比較することによって評価することができる。
【０３８５】
新脈管形成に対するＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの効果が、測定され得る。例えば、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）などの内皮細胞によるインビトロでの細管形成は、新脈管形成および新脈管形成に対する効果を測定するアッセイとして用いることができる。種々の量のＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームをインビトロ新脈管形成のアッセイに添加することは、新脈管形成のモジュレーターとしてのＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの有効性のスクリーニングに有用な方法である。
【０３８６】
破骨細胞培養物を用いることなどによってＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの有効性を測定するために、細胞培養物における骨吸収を測定することができる。破骨細胞とは、生物において骨を再吸収する造血系起源の高度に分化した細胞であり、インビトロで骨切片から骨を再吸収することができる。破骨細胞の細胞培養方法および破骨細胞培養物において骨吸収を測定する定量的技法は、当該分野で記載されている。例えば、単核細胞をヒト末梢血から単離して培養することができる。ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの添加および／または発現を用いて、酒石酸耐性酸ホスファターゼに陽性である多核細胞ならびに再吸収された面積および骨切片から放出されたコラーゲンフラグメントを測定することなどによって、破骨細胞の形成に対する効果を評価することができる。用量応答曲線を用いて、骨吸収のモジュレートに必要なアイソフォーム
（９．動物モデル）
動物モデルを用いてＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームあるいはさらなるアミノ酸を含むそれらの改変形態の効果または活性を評価することができる。適切なモデルは、当業者に公知である。１つの例において、疾患の動物モデルを研究して、アイソフォームの導入により疾患に影響が与えられるかどうかを決定することができる。例えば、癌細胞の増殖、遊走および侵襲性を含む腫瘍形成に対するＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの効果を測定することができる。このようなアッセイの１つでは、卵巣癌細胞などの癌細胞を、アイソフォーム（例えば、内因性シグナル配列の非存在下でアイソフォームの配列に作動可能に連結されたｔＰＡプレ／プロ配列を主に含むアイソフォーム融合体）を発現するアデノウイルスで感染させる。インビトロ培養期間の後、細胞をトリプシン処理し、適切な緩衝液に懸濁させ、マウスに注射する（例えば、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスなどのモデルマウスの脇腹および肩に皮下注射する）。経時的に腫瘍増殖をモニタリングする。比較のために、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームを発現しないコントロール細胞をマウスに注射することができる。他の細胞型および動物モデル（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、マウス肺癌（ＬＬＣ）細胞、原発性膵腺癌（ＰＡＮＣ−１）細胞、ＴＡＫＡ−１膵管細胞、ならびにＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＳＣＩＤマウス）を用いて、同様のアッセイを行うことができる。さらなる例では、角膜マイクロポケットアッセイなどのアッセイを用いて眼球障害に対するＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの効果を評価することができる。手短に述べると、アッセイの２〜３日前に、アイソフォーム融合体（またはコントロール）を発現する細胞をマウスに注射によって与える。次いで、マウスに麻酔し、レセプターリガンドのペレットを眼の角膜マイクロポケット内に埋め込む。その後、例えば埋込みの５日後に新血管形成を測定する。その後、コントロールと比較した新脈管形成および眼の表現型に対するＣＳＲアイソフォームの効果を評価する。
【０３８７】
さらなる例では、ＩＩ型コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）のモデルにおけるアイソフォームの効果は、ＳＣＩＤマウスに、ＣＳＲアイソフォーム融合体またはリガンドアイソフォーム融合体のｃＤＮＡを含むレトロウイルスベクターで形質導入したＤＢＡ／１マウス由来の脾細胞あるいは未改変の脾細胞を腹腔内注射することによって評価することができる。未改変の脾細胞を与えたマウスは１１〜１３日以内に関節炎を発生し、これは、例えば関節炎の臨床的、組織学的、または免疫学的（すなわち抗体レベル）パラメータによって評価される、関節炎の発症に対するアイソフォームを発現する脾細胞の効果を決定するための参照コントロールとして用いることができる。別の例において、疾患は、組換え形態において投与されるか、または遺伝子治療を介してかのいずれかで、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの存在下または非存在下におけるウシＩＩ型コラーゲンの単回皮内注射によってＤＢＡ／１マウスにおいて直接誘導され得、そして関節炎の発症は、免疫化後に経時的（最大で数週間まで）に評価され得る。
【０３８８】
疾患の動物モデルに対するＣＳＲアイソフォームの効果は、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの精製した形態または組換え形態を投与することによってさらに評価することができる。例えば、創傷治癒は、遺伝的に糖尿病性であるｄｂ＋／ｄｂ＋マウスを利用して、創傷治癒障害のモデルで評価することができ、全層の切除創傷を糖尿病性マウスの背に与える。アイソフォームを用いて表面的（ｔｏｐｉｃａｌ）または全身的に処置した後、創傷縫合、創傷部位における炎症細胞の浸潤、および／または炎症性サイトカインの発現について解析することによって創傷治癒を評価することができる。創傷治癒に対するアイソフォームの効果を経時的に評価することができ、その効果を、コントロール処置、例えばビヒクルのみのコントロールを与えたマウスと比較することができる。さらなる例では、例えば肺損傷の組織学的切片の分析およびブレオマイシン／シリカに誘導される肺中のヒドロキシプロリン含有量の増加に対する効果のアッセイを行うことによって評価した肺線維症が軽減されるかどうかを決定するために、ブレオマイシンまたはシリカによって誘導した肺線維症のモデルに、例えば、ｔＰＡ−イントロン融合タンパク質融合体などのアイソフォーム融合体から産生された組換えアイソフォームを投与することができる。
【０３８９】
また、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームを欠く動物を用いてアイソフォームの生物学的活性をモニタリングすることもできる。例えば、レセプタータンパク質またはリガンドタンパク質が早期に終結することを確実にするためにＩＲＥＳ−ＬａｃＺカセットの上流の適切な読み枠内に翻訳終止コドンを導入した標的構築物を作製することによって、アイソフォームに特異的な破損を行うことができる。あるいは、ＬｏｘＰ／Ｃｒｅ組換えストラテジーを用いることができる。標的とした破損が確認された後、例えば、肺、肢、瞼、下垂体前葉腺、および膵臓などの様々な器官の発生を含む、野生型マウスと比較した欠乏マウスの表現型を分析することによって、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの欠乏の結果を確立することができる。さらに、特定の細胞集団の組織学または単離によってアポトーシスまたは細胞増殖などの他のパラメータを評価して、野生型ＣＳＲまたは野生型リガンドと、アイソフォームを欠く動物または単離された細胞とを比較した場合に差が存在するかどうかを決定することができる。また、シグナル伝達カスケードの構成要素および下流遺伝子の発現を評価して、ＣＳＲアイソフォームが存在しないことによりレセプターのシグナル伝達および遺伝子発現に影響が与えられるかどうかを決定することもできる。
【０３９０】
（Ｇ．ＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームならびにＣＳＲアイソフォーム組成物およびリガンドアイソフォーム組成物の調製、処方および投与）
ＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームならびにＣＳＲアイソフォーム組成物およびリガンドアイソフォーム組成物（特に、分泌後の不完全なプロセシング、コードされているリンカー配列の存在、またはエピトープタグの存在に起因してＮ末端にさらなるアミノ酸を含む改変されたＣＳＲアイソフォームポリペプチドおよびリガンドアイソフォームポリペプチド）は、筋肉内投与、静脈内投与、皮内投与、腹腔内投与、皮下投与、硬膜外投与、経鼻投与、経口投与、直腸投与、表面投与、吸入投与、頬側（ｂｕｃｃａｌ）（例えば舌下）投与、および経皮投与または任意の経路を含めた、当業者に公知である任意の経路による投与用に処方することができる。ＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームは、任意の都合のよい経路（例えば、注入またはボーラス注射）によって、上皮または粘膜皮膚の裏層（例えば口腔粘膜、直腸および腸管粘膜など）を通る吸収によって投与することができ、また、他の生物学的に活性な薬剤と共に、逐次的か、断続的か、または同じ組成物中で投与することができる。投与は、処置の位置に応じて局所投与、表面投与または全身投与であり得る。処置を必要としている領域への局所投与は、例えば、それだけには限定されないが、手術中の局所注入、例えば手術後の創傷包帯と組み合わせた表面塗布、注射、カテーテル、坐剤、またはインプラントを用いて行うことができる。また、投与には、徐放性処方物およびポンプを用いるものなど装置で制御する徐放系が含まれ得る。任意の与えられた事例において最も適切な経路は、処置される疾患または状態の性質および重篤度、ならびに使用される特定の組成物の性質に依存する。
【０３９１】
様々な送達系が公知であり、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォーム（発現または分泌された本明細書中に提供されるＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォーム）を投与するために用いることができる。それとしては、リポソームへの封入、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現し得る組換え細胞、レセプター媒介エンドサイトーシス、およびレトロウイルス送達系などのＣＳＲアイソフォームをコードしている核酸分子の送達が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９２】
ＣＳＲアイソフォームを含む薬学的組成物およびリガンドアイソフォームを含む薬学的組成物を調製することができる。一般に、薬学的に受容可能な組成物は、規制機関による認可を考慮して調製するか、または動物およびヒトでの使用について、一般に認識されている薬局方に従ってほかの方法で調製する。薬学的組成物には、アイソフォームを一緒に投与する希釈剤、佐剤、賦形剤、またはビヒクルなどのキャリアが含まれていることができる。このような薬学的キャリアは、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、およびゴマ油など、石油、動物、野菜または合成由来のものを含む、水および油などの無菌の液体であり得る。薬学的組成物を静脈内投与する場合、水が代表的なキャリアである。また、生理食塩水ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール溶液も、液体キャリアとして、特に注射可能な溶液に用いることができる。組成物は、活性成分と共に、ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウム、またはカルボキシメチルセルロースなどの希釈剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびタルクなどの滑沢剤；ならびにデンプン、アカシアゼラチンゴムなどの天然ゴム、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリジン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドンおよび当業者に公知である他のそのような結合剤などの結合剤を含み得る。適切な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールが含まれる。また、所望する場合は、組成物は少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤、例えば、アセテート、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、モノラウリン酸ソルビタン、酢酸トリエタノールアミンナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン、および他のそのような薬剤を含んでいることもできる。これらの組成物は、液剤、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル、散剤、および持続放出処方物の形をとることができる。組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤およびキャリアを用いて、坐剤として処方することができる。経口処方物には、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、および他のそのような薬剤などの標準的なキャリアが含まれていることができる。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎの「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。このような組成物は、患者に適切に投与するための形態を提供するために、一般に、精製した形態の治療的に有効な量の化合物を適切な量のキャリアと共に含む。処方物は、投与様式に適しているべきである。
【０３９３】
錠剤、カプセル、丸薬、散剤、顆粒、無菌的非経口液剤または無菌的非経口懸濁液、および経口液剤または経口懸濁液、ならびに適切な量の化合物または薬学的に受容可能なその誘導体を含む油水乳剤などの、単位投薬形態でヒトおよび動物に投与するための処方物を提供する。薬学的かつ治療的に活性な化合物およびその誘導体を代表的に処方し、単位投薬形態または複数の投薬形態で投与する。それぞれの単位用量が、所望の治療効果を生じるために十分な所定量の治療的に活性な化合物を、所要の薬学的キャリア、ビヒクルまたは希釈剤と共に含む。単位投薬形態の例には、アンプルおよび注射器ならびに個別にパッケージングした錠剤またはカプセルが含まれる。単位用量形態は、分割用量または複数用量で投与することができる。複数用量形態とは、区分した単位用量形態で投与するための、単一の容器中にパッケージングした複数の同一の単位投薬形態をいう。複数用量形態の例には、バイアル、錠剤もしくはカプセルの瓶またはパイントもしくはガロン単位の瓶が含まれる。したがって、複数用量形態とは、パッケージングが区別されていない複数の単位用量である。
【０３９４】
０．００５％〜１００％の範囲の活性成分を含み、非毒性のキャリアで構成されたバランスのとれた投薬形態または組成物を調製することができる。経口投与には、薬学的組成物は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンもしくはグリコール酸ナトリウムデンプン）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に受容可能な賦形剤を用いて、従来の手段によって調製した、例えば錠剤あるいはカプセルの形態をとることができる。錠剤は、当該分野で周知の方法によってコーティングすることができる。
【０３９５】
また、薬剤調製物は、液体形態、例えば、液剤、シロップもしくは懸濁液であるか、または使用前に水もしくは他の適切なビヒクルで再構成するための薬物製品として提供することもできる。このような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油状エステル、または分留した植物油）；および保存剤（例えば、メチル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸もしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）などの薬学的に受容可能な添加剤を用いて、従来の手段によって調製することができる。
【０３９６】
直腸投与に適した処方物を単位用量の坐剤として提供することができる。これらは、活性化合物を１つ以上の従来の固体キャリア、例えばカカオ脂と混合し、その後、生じた混合物を成型することによって調製することができる。
【０３９７】
皮膚または眼への表面塗布に適した処方物には、軟膏、クリーム、ローション、パスタ、ゲル、スプレー、エアロゾルおよび油が含まれる。例示的なキャリアには、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、およびこれらのうち２つ以上の組合せが含まれる。また、表面用処方物は、とりわけヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ／ヒドロキシアルキル、（メタ）アクリレートまたはポリ（メタ）アクリルアミドから選択される０．０５〜１５、２０、２５重量％の増粘剤を含み得る。表面用処方物は、多くの場合、結膜嚢への滴下によってか、または軟膏として適用される。また、これは、眼、顔面洞、および外耳道の灌注または潤滑に用いることもできる。また、これは、眼球前房および他の場所に注射することもできる。また、液状の表面用処方物は、条片またはコンタクトレンズの形態で親水性の三次元ポリマーマトリックス中に存在することもでき、これから活性成分が放出される。
【０３９８】
吸入による投与には、本明細書中で用いるための化合物は、適切な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体と共に使用して、加圧パックまたは噴霧器からエアロゾルスプレーを提供する形態で送達することができる。加圧エアロゾルの場合は、計量された量を送達するために弁を設けることによって単位用量を決定することができる。吸入器または注入器で用いるための例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含むように処方することができる。
【０３９９】
頬側（舌下）投与に適した処方物には、例えば、味付き基剤、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に活性化合物を含むロゼンジ；ならびにゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤中に化合物を含むトローチが含まれる。
【０４００】
ＣＳＲアイソフォームの薬学的組成物およびリガンドアイソフォームの薬学的組成物は、注射（例えばボーラス注射または持続注入）による非経口投与用に処方することができる。注射用の処方物は、単位投薬形態で、例えば、アンプルまたは複数用量の容器中で、保存剤を加えて提供することができる。組成物は、油状または水性ビヒクル中の懸濁液、液剤または乳剤であることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの処方剤を含み得る。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル、例えば、無菌的でありかつ発熱物質を含まない水または他の溶媒で再構成するための散剤形態であり得る。
【０４０１】
経皮投与に適した処方物は、長期にわたってレシピエントの表皮と密接して保たれるように適応させた個別のパッチとして提供することができる。このようなパッチは、活性化合物を、活性化合物に関して、例えば、０．１〜０．２Ｍの濃度の必要に応じて緩衝化した水溶液として、適切に含む。また、経皮投与に適した処方物は、イオン泳動によって送達することもでき（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３（６）、３１８（１９８６）を参照のこと）、代表的には、活性化合物の必要に応じて緩衝化した水溶液の形態をとる。
【０４０２】
また、薬学的組成物は、徐放性の手段および／または送達装置によって投与することもできる（例えば、米国特許第３，５３６，８０９号；同第３，５９８，１２３号；同第３，６３０，２００号；同第３，８４５，７７０号；同第３，８４７，７７０号；同第３，９１６，８９９号；同第４，００８，７１９号；同第４，６８７，６１０号；同第４，７６９，０２７号；同第５，０５９，５９５号；同第５，０７３，５４３号；同第５，１２０，５４８号；同第５，３５４，５６６号；同第５，５９１，７６７号；同第５，６３９，４７６号；同第５，６７４，５３３号および同第５，７３３，５６６号を参照のこと）。
【０４０３】
特定の実施形態では、リポソームおよび／またはナノ粒子もＣＳＲアイソフォーム投与に用い得る。リポソームは水性媒体中に分散させたリン脂質から形成され、多重膜の同心二重層の小胞を自発的に形成する（多重膜小胞（ＭＬＶ）とも称される）。ＭＬＶは一般に２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理により、コア（ｃｏｒｅ）に水溶液を含む、２００〜５００．ＡＮＧ．の範囲の直径を有する小さな単層小胞（ＳＵＶ）の形成がもたらされる。
【０４０４】
リン脂質は、水に分散させた際に、水に対する脂質のモル比に依存してリポソーム以外の様々な構造を形成することができる。低い比では、リポソームが形成される。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度および二価カチオンの存在に依存する。リポソームはイオン性および極性物質に対して低い透過性を示すが、高温ではその透過性を顕著に変更させる相転移を受ける。相転移は、ゲル状態として公知である密に詰められた秩序ある構造から、流体状態として知られる緩く詰められた秩序の低い構造への変化を含む。これは特徴的な相転移温度で起こり、イオン、糖および薬物への透過性の増加をもたらす。
【０４０５】
リポソームは、マクロファージおよび好中球などの細網内皮系の食細胞によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水性もしくは静電気的な力、または細胞表面成分との特異的相互作用のいずれかによる細胞表面への吸着；リポソーム内容物を細胞質中に同時放出することを伴った、リポソームの脂質二重層を形質膜内に挿入することによる形質細胞膜との融合；ならびにリポソーム内容物の会合を全く伴わない、細胞膜もしくは細胞下膜へのリポソーム脂質の移行、またはその逆による、異なる機構を介して細胞と相互作用する。リポソームの処方を変動することにより、どの機構が作動するかを変更することができるが、複数の機構が同時に作動することも可能である。
【０４０６】
一般に、ナノカプセルは化合物を安定かつ再現性のある様式で捕捉することができる。細胞内の高分子過負担による副作用を回避するために、このような超微粒子（約０．１μｍの大きさ）はインビボで分解されることができるポリマーを用いて設計すべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が本明細書中で用いるために企図され、このような粒子は容易に作製することができる。
【０４０７】
ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームを、分解性プロセス（例えば、タンパク質分解性の分解ならびに抗原応答および免疫原性応答による免疫学的介入）に曝すことを減らすための投与方法を用いることができる。このような方法の例には、処置部位における局所投与が含まれる。治療剤のペグ化は、タンパク質分解に対する耐性を増大させ、血漿半減期を増加させ、抗原性および免疫原性を低減させることが報告されている。ペグ化方法の例は、当該分野で公知である（例えば、ＬｕおよびＦｅｌｉｘ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．、４３：１２７〜１３８、１９９４；ＬｕおよびＦｅｌｉｘ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．、６：１４２〜６、１９９３；Ｆｅｌｉｘら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．、４６：２５３〜６４、１９９５；Ｂｅｎｈａｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：１３３９８〜４０４、１９９４；Ｂｒｕｍｅａｎｕら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５４：３０８８〜９５、１９９５参照；また、Ｃａｌｉｃｅｔｉら（２００３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、５５（１０）：１２６１〜７７ならびにＭｏｌｉｎｅｕｘ（２００３）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ、２３（８Ｐｔ２）：３Ｓ〜８Ｓも参照）。また、ペグ化は、インビボにおける核酸分子の送達に用いることができる。例えば、アデノウイルスのペグ化は安定性および遺伝子導入を増加させることができる（例えば、Ｃｈｅｎｇら（２００３）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０（９）：１４４４〜５１参照）。
【０４０８】
望ましい血液レベルは、血漿レベルによって確かめられるように活性剤を持続注入することによって維持することができる。担当医は、毒性、または骨髄、肝臓もしくは腎臓の機能不全に起因して、どのようにおよびいつ処置を終結するか、中断するか、またはより低い用量に調整するかを理解しているであろうことに、留意されたい。逆に、担当医は、臨床反応が十分でない場合は（毒性がある副作用を除外する）、処置をどのようにおよびいつ、より高いレベルに調整するかも理解しているであろう。例えば、経口、肺、非経口（筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内（ＩＶ）注射もしくは皮下注射）、吸入（微粉処方物による）、経皮、経鼻、経膣、直腸、または舌下の投与経路によって投与し、それぞれの投与経路に適切な投薬形態で処方することができる（例えば、国際ＰＣＴ特許出願の国際公開第９３／２５２２１号パンフレットおよび国際公開第９４／１７７８４号パンフレット；ならびに欧州特許出願６１３，６８３号を参照のこと）。
【０４０９】
ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームは、処置する患者に対して望ましくない副作用が存在しないように治療的に有用な効果を発揮するために十分な量を、薬学的に受容可能なキャリア中に含める。治療的に有効な濃度は、化合物を本明細書中に提供されるアッセイなどの既知のインビトロおよびインビボ系で試験することによって、経験的に決定することができる。
【０４１０】
組成物中のＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの濃度は、複合体の吸収速度、失活速度および排泄速度、複合体の物理化学的特徴、投薬スケジュール、投与量、ならびに当業者に公知である他の因子に依存する。疾患または状態（例えば、癌、自己免疫疾患および感染症）を処置するために投与するＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの量は、標準的な臨床技法によって決定することができる。さらに、インビトロアッセイおよび動物モデルを用いて、最適用量範囲の決定を支援することができる。経験的に決定することができる正確な用量は、投与経路および疾患の重篤度に依存する可能性がある。投与するための適切な用量範囲は、体重１ｋｇあたり約０．０１ｐｇ〜１ｍｇ、より代表的には患者の体重１ｋｇあたり０．０５ｍｇ〜２００ｍｇのＣＳＲアイソフォームの範囲であり得る。
【０４１１】
ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームは、一度に投与するか、または一定の時間の間隔をあけて投与する、いくつかのより少ない用量に分けることができる。ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームは、処置期間（例えば、数時間、数日、数週間、または数カ月）にわたる１つ以上の用量で投与することができる。いくつかの場合において、連続投与が有用である。正確な用量および処置期間は処置する疾患と相関関係にあり、既知の試験プロトコルを用いてか、またはインビボ試験データもしくはインビトロ試験データから外挿することによって経験的に決定することができることを理解されたい。また、濃度および用量の値も、緩和させる状態の重篤度に応じて変動する可能性があることも留意されたい。さらに、任意の特定の被験体について、個々の要求および投与を行う人もしくは組成物の投与を管理する人の専門的な判断に従って具体的な投薬レジメンを時間と共に調節すべきであり、そして本明細書中に記載した濃度範囲は例示的なもののみであり、組成物およびそれを含む組合せの範囲または使用を限定することを意図しないことを、理解されたい。
【０４１２】
（Ｈ．ＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームのインビボ発現および遺伝子治療）
ＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォーム（特に、発現および分泌後にそれらのＮ末端にさらなるアミノ酸を含む改変されたＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォーム）は、核酸分子の発現によって細胞および組織に送達することができる。ＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームは、エキソビボ技法およびインビボでの直接発現を含めて、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームをコードしている核酸分子として投与することができる。
【０４１３】
（１．核酸の送達）
核酸（例えば、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、または４７のいずれかに示されるものであるが、これらに限定されない）は、当業者に公知である任意の方法によって細胞および組織に送達することができる。
【０４１４】
（ａ．エピソームベクターおよび組込みベクター）
コードしている核酸分子の発現によるＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームの投与方法には、組換えベクターの投与が含まれる。ベクターは、複製起点を含めることなどによってエピソームとして保持されるように設計するか、または細胞の染色体中に組み込まれるように設計することができる。
【０４１５】
また、ＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームは、非ウイルスベクターを用いたエキソビボ遺伝子発現治療にも用いることができる。例えば、ＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームを発現するよう細胞を操作することができ、これは、調節配列に作動可能に連結するか、またはゲノム位置内で調節配列に作動可能に連結して配置されるように、ＣＳＲアイソフォームをコードしている核酸およびリガンドアイソフォームをコードしている核酸をゲノム位置内に組み込むことなどによる。その後、このような細胞を、処置を必要としている患者などの被験体に局所投与または全身投与することができる。
【０４１６】
ウイルスベクターには、例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスが含まれ、遺伝子治療用に設計された他のものを用いることができる。ベクターは、エピソームとして保持されるか、または処置する被験体の染色体内に組み込まれ得る。ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォーム、はウイルスによって発現されることができ、これを、処置を必要としている被験体に投与する。遺伝子治療に適したウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよび上述の他のウイルスが含まれる。例えば、アデノウイルス発現技術は当該分野で周知であり、アデノウイルスの産生および投与方法も周知である。アデノウイルスの血清型は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手可能である。アデノウイルスをエキソビボで用いることができ、例えば、処置を必要としている患者から細胞を単離し、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームを発現するアデノウイルスベクターを用いて形質導入する。適切な培養期間の後、形質導入された細胞を、被験体に局所投与および／または全身投与する。あるいは、被験体の疾患もしくは状態の予防、治療または寛解のために治療的に有効な量を送達するために、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームを発現するアデノウイルス粒子を単離して薬学的に受容可能なキャリア中に処方する。代表的には、アデノウイルス粒子を被験体の重量１ｋｇあたり粒子１個〜１０１４個の範囲（一般に、被験体の重量１ｋｇあたり粒子１０６個または１０８個〜１０１２個の範囲）の用量で送達する。いくつかの状況では、核酸の供給源を、細胞表面膜タンパク質もしくは標的細胞に特異的な抗体または標的細胞上のレセプターに対するリガンドなどの細胞を標的とする薬剤と共に提供することが望ましい。
【０４１７】
（ｂ．人工染色体および他の非ウイルスベクターの送達方法）
また、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームを、非ウイルスベクターを用いたエキソビボ遺伝子発現治療で用いることもできる。例えば、細胞を操作してＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームを発現するものを作製することができ、これは、調節配列に作動可能に連結するか、またはゲノム位置内で調節配列に作動可能に連結して配置されるように、ＣＳＲアイソフォーム配列またはリガンドアイソフォーム配列をゲノム位置内に組み込むことなどによる。その後、このような細胞を、処置を必要としている患者などの被験体に局所投与または全身投与することができる。
【０４１８】
核酸分子を人工染色体および他の非ウイルスベクター中に導入することができる。人工染色体（例えば、米国特許第６，０７７，６９７号およびＰＣＴ国際ＰＣＴ出願の国際公開第０２／０９７０５９号パンフレット参照）は、アイソフォームをコードおよび発現するように操作することができる。
【０４１９】
（ｃ．リポソームおよび他の封入された形態ならびに核酸を含む細胞の投与）
核酸をリポソームなどのビヒクル中に封入するか、または細菌細胞、特に弱毒化した細菌などの細胞内に導入するか、またはウイルスベクター中に導入することができる。例えば、リポソームを用いる場合は、標的化ならびに／または取込みの促進のために、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質と結合するタンパク質、例えば、カプシドタンパク質もしくは特定の細胞型に向性を有するそのフラグメント、サイクリングにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、および細胞内局在化を標的として細胞内半減期を亢進するタンパク質を用い得る。
【０４２０】
（２．インビトロ送達およびエキソビボ送達）
エキソビボ方法およびインビボ方法には、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームをコードしている核酸分子を、適切なドナーまたは処置する被験体由来である細胞内に導入する。ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームのインビボ発現は、さらなる分子の発現と連関している可能性がある。例えば、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの発現は、操作したウイルス中などの細胞傷害性がある産物の発現、または細胞傷害性があるウイルス中で発現された細胞傷害性産物と連関している可能性がある。このようなウイルスは、治療効果の標的である特定の細胞型を標的とすることができる。発現されたＣＳＲアイソフォームは、ウイルスの細胞傷害性を亢進するために用いることができる。発現されたＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォーム（特に、それらのＮ末端にさらなるアミノ酸を含むＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームの発現および分泌された改変形態）は、ウイルスの細胞傷害性を増強するために使用され得る。
【０４２１】
ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームのインビボ発現は、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームをコードしている核酸分子を、細胞特異的プロモーターまたは組織特異的プロモーターなどの特異的調節配列に作動可能に連結することを含み得る。また、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームは、標的細胞型および／もしくは標的組織中で特異的に感染ならびに／または複製されるベクターから発現され得る。誘導性プロモーターを用いて、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの発現を選択的に調節することができる。
【０４２２】
治療目的のために核酸を導入することができる細胞は、処置する疾患または状態に適した任意の所望の利用可能な細胞型が包含され、それらとしては、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；様々な幹細胞または前駆細胞（特に、造血幹細胞または前駆細胞（例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓、およびそれらの他の源から得た幹細胞など））が挙げられるが、これらに限定されない。また、腫瘍細胞も、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームのインビボ発現の標的細胞であり得る。アイソフォームのインビボ発現に用いる細胞はまた、患者の自己細胞を含む。このような細胞を患者から取り出し、ＣＳＲアイソフォームを発現させるための核酸を導入し、その後、注射または移植などによって患者に投与することができる。
【０４２３】
核酸をインビトロで哺乳動物細胞内に移行させるために適切な技術は、リポソームおよびカチオン性脂質の使用（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌ）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、ならびにリン酸カルシウム沈降法を含む。ＤＮＡ送達方法を用いて、ＣＳＲアイソフォームをインビボで発現させることができる。このような方法は、エレクトロポレーション、超音波、およびリン酸カルシウム送達を用いたものなどの局所送達および全身送達を含む、核酸のリポソーム送達ならびにむき出しのＤＮＡの送達を含む。他の技術は、マイクロインジェクション、細胞融合、染色体媒介性遺伝子導入、微小核体媒介性遺伝子導入およびスフェロプラスト融合を含む。
【０４２４】
エキソビボ処置では、処置する被験体に適合性のあるドナー由来の細胞または処置する被験体由来の細胞を取り出し、核酸をこれら単離された細胞内に導入し、改変した細胞を被験体に投与する。
【０４２５】
処置は、直接投与（例えば、患者に移植される多孔性膜内に封入したものなど）を含む（例えば、米国特許第４，８９２，５３８号および同第５，２８３，１８７号を参照のこと）。核酸をインビトロで哺乳動物細胞内に移行させるために適した技術は、リポソームおよびカチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌ）の使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、ならびにリン酸カルシウム沈降方法を含む。ＤＮＡ送達方法を用いて、ＣＳＲアイソフォームをインビボで発現させることができる。このような方法は、エレクトロポレーション、超音波、リン酸カルシウム送達を用いたものなどの局所送達および全身送達を含む、核酸のリポソーム送達ならびにむき出しのＤＮＡの送達が含まれる。他の技術は、マイクロインジェクション、細胞融合、染色体媒介性遺伝子導入、微小核体媒介性遺伝子導入およびスフェロプラスト融合を含む。
【０４２６】
ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームのインビボ発現は、さらなる分子の発現と連関している可能性がある。例えば、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの発現は、操作したウイルス中などの細胞傷害性がある産物の発現、または細胞傷害性があるウイルス中で発現された細胞傷害性産物と連関している可能性がある。このようなウイルスは、治療効果の標的である特定の細胞型を標的とすることができる。発現されたＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームは、ウイルスの細胞傷害性を亢進するために用いることができる。
【０４２７】
ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームのインビボ発現は、ＣＳＲアイソフォームをコードしている核酸分子を、細胞特異的プロモーターまたは組織特異的プロモーターなどの特異的調節配列に作動可能に連結することを含み得る。また、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームは、標的細胞型および／もしくは標的組織中で特異的に感染ならびに／または複製されるベクターから発現させることもできる。誘導性プロモーターを用いて、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの発現を選択的に調節することができる。さらに、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームのインビボ発現は、標的細胞型からのＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームの分泌を達成するための、ｔＰＡプレ／プロ配列を含む前駆体配列などの配列を有するＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームをコードする核酸の作動可能な連結を含み得る。
【０４２８】
（３．全身送達、局所送達および表面送達）
むき出しの核酸としての核酸分子、またはベクター、人工染色体、リポソームおよび他のビヒクル中の核酸分子は、全身投与、表面、局所および他の投与経路によって被験体に投与することができる。全身投与およびインビボ投与する場合、核酸分子または核酸分子を含むビヒクルは、細胞を標的とすることができる。
【０４２９】
また、投与は、代表的には細胞または組織を標的とするベクターまたは細胞の投与などによる、直接投与であり得る。例えば、腫瘍細胞および増殖細胞を、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームのインビボ発現の標的細胞とすることができる。また、アイソフォームのインビボ発現に用いる細胞は、患者の自己細胞を含む。このような細胞を患者から取り出し、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームを発現させるための核酸を導入し、その後、注射または移植などによって患者に投与することができる。
【０４３０】
（Ｉ．ＣＳＲアイソフォームを用いた例示的な処置および研究）
ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォーム（特に、そのアイソフォームの発現および分泌の後にＮ末端に１つ以上のさらなるアミノ酸を含む改変されたＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォーム）を用いた疾患および状態の処置の方法が、本明細書中に提供される。本明細書中に提供される。ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームには、例えば、分泌後の不完全なプロセシング（すなわち、ＧＡＲ）、コードされたリンカー配列（すなわち、ＬＥまたはＳＲ）の存在、および／またはエピトープタグ（すなわちｃ−ｍｙｃまたはＨｉｓタグ）の存在に起因してＮ末端にさらなるアミノ酸を有するアイソフォームが含まれる。このようなＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォーム（例えば、ＲＴＫアイソフォーム、ＴＮＦＲアイソフォーム、ＲＡＧＥアイソフォーム、およびＨＧＦアイソフォームを含むリガンドアイソフォーム）またはＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームをコードする核酸は、本明細書中に記載されるものを含む種々の疾患および状態の処置において使用され得る。代表的に、本明細書中に提供されるポリペプチドアイソフォームまたはポリペプチドアイソフォームをコードする核酸による疾患、障害、または状態の処置は、同族レセプターまたはリガンドによって媒介されるものである。例えば、ＲＡＧＥ媒介性シグナル伝達によって誘導される慢性的な活性化は、加齢性黄斑変性における疾患の進行に寄与する。したがって、ＲＡＧＥアイソフォーム（例えば、任意の本明細書中に提供されるもの）による加齢性黄斑変性の処置は、加齢性黄斑変性および他の脈管形成状態の処置として使用され得る。他の疾患および障害に対する同族ＣＳＲおよび同族リガンドの寄与は、当業者に公知であり、そして以下で本明細書中に例示される。
【０４３１】
処置は、適切な経路でポリペプチドの処方物を投与することによって行うことができ、これは、ポリペプチドとして組成物中に提供され得、かつ標的性送達のために標的化剤に連結されても、リポソームなどの送達ビヒクル中に封入されてもよい。あるいは、ポリペプチドをコードしている核酸を、むき出しの核酸としてか、またはベクター（特に、遺伝子治療ベクター）中で投与することができる。遺伝子治療は、当業者に公知である任意の方法によって行うことができる。遺伝子治療は、核酸またはベクターを直接投与することによってインビボで行うことができる。例えば、核酸を、全身送達、局所送達、表面送達、または任意の適切な経路によって送達することができる。ベクターまたは核酸は、ウイルスもしくはリポソームなどの送達ビヒクル中に標的化剤を含めることによって標的とすることができるか、またはそれらは、抗体などの標的化剤に結合体化させることができる。ベクターまたは核酸は、細胞を被験体または適切なドナーから取り出し、ベクターまたは核酸を細胞内に導入し、その後、改変した細胞を被験体内に導入することによって、エキソビボで細胞に導入することができる。
【０４３２】
本明細書中に提供されるＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォーム（特に、不完全なプロセシング、コードされたリンカー配列の存在、またはエピトープタグの存在に起因してＮ末端にさらなるアミノ酸を有する改変されたアイソフォーム）は、種々の障害（特に、増殖性障害、免疫障害および炎症性障害）を予知するために使用され得る。処置としては、眼疾患、アテローム硬化症、癌および血管傷害を含む新脈管形成に関連する疾患および状態、アルツハイマー病を含む神経変性疾患、アテローム硬化症を含む炎症性疾患および炎症性状態、癌および平滑筋関連状態を含む細胞増殖に関連する疾患および状態、ならびに種々の自己免疫疾患の処置が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な処置および前臨床研究は、ＲＴＫアイソフォーム、ＴＮＦＲアイソフォーム、ＲＡＧＥアイソフォーム、またはＨＧＦアイソフォームによる処置および治療について記載される。このような記載は、単なる例示であることが意味され、そして特定のＲＴＫアイソフォーム、ＴＮＦＲアイソフォーム、ＲＡＧＥアイソフォーム、またはＨＧＦアイソフォームであるが、これらに限定されない。特定の処置および投薬量は、当業者によって決定され得る。処置の評価における考慮は、以下を含む；処置される疾患、疾患の重篤度および経過、上記分子が予防目的または治療目的のどちらで投与されるか、以前の治療、患者の病歴および治療に対する応答、および担当医の判断。
【０４３３】
（１．新脈管形成に関連する状態）
ＣＳＲアイソフォーム（ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＭＥＴ、ＴＩＥ／ＴＥＫ、ＥＧＦＲ、およびＥｐｈＡを含むＲＴＫアイソフォーム、ならびにＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２を含むＴＮＦＲアイソフォーム、ＲＡＧＥアイソフォーム、ならびにＨＧＦアイソフォームが挙げられるが、これらに限定されない）は、新血管形成を伴う眼疾患を含む、眼の疾患および状態などの新脈管形成に関連する疾患および状態の処置に用いることができる。眼の血管新生疾患は、網膜または角膜などの眼の構造中への新しい血管侵襲によって特徴付けられている。これは失明の最も一般的な原因であり、約２０種の眼疾患に関与している。加齢性黄斑変性では、関連するウイルス性の懸案事項は、網膜色素上皮下における維管束組織の増殖を伴ったブルッフ膜中の欠陥を介した脈絡毛細血管の内植によって引き起こされる。また、脈管形成性の損傷は、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒絶、血管新生緑内障および水晶体後線維増殖症にも関連している。角膜血管新生に関連する他の疾患としては、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズの過剰装着、アトピー性角膜炎、上輪部結膜炎、翼状片乾燥性角膜炎、シェーグレン、酒さ性ざ瘡、フリクテン症、梅毒、マイコバクテリア感染、脂質の変性、化学熱傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状疱疹感染症、原虫感染、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン周辺変性症、周辺角質溶解、関節リウマチ、全身性ループス、多発性動脈炎、外傷、ウェゲナーサルコイドーシス、強膜炎、スティーブンスジョンソン病、類天疱瘡放射状角膜切開、および角膜移植拒絶が挙げられるが、これらに限定されない。網膜／脈絡の新血管形成に関連する疾患としては、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、鎌状赤血球貧血、サルコイド、梅毒、弾性線維性偽黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頸動脈閉塞性疾患、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎、マイコバクテリア感染、ライム病、全身性エリテマトーデス、未熟児網膜症、イールズ病、ベーチェット病、網膜炎または脈絡膜炎を引き起こす感染、推定眼ヒストプラスマ症、ベスト病、近視、視窩、スタルガルト病、扁平部炎、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラズマ症、外傷およびレーザー後合併症が挙げられるが、これらに限定されない。他の疾患としては、ルベオーシス（隅角の新血管形成）に関連する疾患、および増殖性硝子体網膜症の全ての形態を含む、維管束組織または線維組織の異常な増殖によって引き起こされる疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４３４】
眼疾患の治療などにおける新脈管形成に対するＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームの改変された形態を含むＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームの治療効果は、動物モデル、例えば本明細書中に記載されるようなものなどの角膜移植において評価することができる。例えば、ＲＴＫなどにおける新脈管形成のモジュレーションは、ヌードマウスにおける類表皮Ａ４３１腫瘍およびヌードマウスに移植した、ＶＥＧＦまたはＰＩＧＦで形質導入したラットＣ６神経膠腫などの、ヌードマウスモデルで評価することができる。ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームは、タンパク質として局所注射または全身注射することができる。あるいは、ＣＳＲアイソフォームを発現する細胞を局所的にまたは腫瘍から離れた部位に接種することができる。腫瘍は、コントロールで処置したモデルとＣＳＲアイソフォームで処置したモデルとの間で比較を行って、血管化の乏しく血液に乏しい（ｐａｌｅ）な腫瘍、壊死、増殖の低下および腫瘍細胞アポトーシスの増加を含む、腫瘍の阻害の表現型を観察することができる。このような処置の１つでは、Ｆｌｔ−１アイソフォームを用いて、眼疾患を治療し、このようなモデルにおいて評価する。
【０４３５】
ＴＩＥ／ＴＥＫアイソフォームを用いて治療することができる眼障害の例は、眼の新血管形成によって特徴付けられている眼疾患であり、その疾患としては、糖尿病性網膜症（糖尿病の主要な合併症）、未熟児網膜症（頻繁に慢性の視覚問題をもたらし、失明のリスクが高いこの荒廃的な眼状態は、未熟児の介護の間における重篤な合併症である）、血管新生緑内障、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、ブドウ膜炎、黄斑変性症、および角膜移植新血管形成が挙げられるが、これらに限定されない。他の眼の炎症性疾患、眼球腫瘍、および脈絡または虹彩の新血管形成に関連する疾患も、ＴＩＥ／ＴＥＫアイソフォームを用いて治療することができる。
【０４３６】
例えば、ＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォーム（ＲＡＧＥアイソフォームを含む）は、加齢性黄斑変性を含む眼疾患および状態の処置において使用され得る。加齢性黄斑変性は、眼のドルーゼンの蓄積によって生じる失明、ブルッフ膜における細胞外沈着、ならびに網膜色素上皮（ＲＰＥ）および眼のドルーゼンを覆う光レセプターにおける変性の細胞変化および分子変化に起因するＲＰＥ不全に関連している。加齢した眼における酸化ストレスに部分的に起因する、ＲＰＥにおいて生じるこれらの細胞変化および分子変化としては、サイトカイン遺伝子の発現変化、マトリックス組織化、細胞接着、およびブルッフ膜の縁における病巣炎症応答の誘導をもたらす可能性があるアポトーシスが挙げられる。例えば、酸化ストレスとしては、初期加齢性黄斑変性におけるＲＰＥおよび光レセプター層におけるＲＡＧＥリガンドの蓄積が挙げられる。ＲＡＧＥリガンドの蓄積は、ＲＡＧＥ発現ＲＰＥ細胞を刺激し、ＮＦκＢの核局在化、アポトーシス、および最も重要なことにＲＡＧＥレセプター自身のアップレギュレーション（これは、継続的なリガンド利用可能性によって維持される正のフィードバックループを開始する）を誘導する。リガンド／ＲＡＧＥ媒介性シグナル伝達によって誘導される慢性的活性化は、加齢性黄斑変性における疾患の進行に寄与する。早期段階の加齢性黄斑変性のＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームでの処置は、この疾患の１つ以上の症状を軽減し得る。
【０４３７】
また、ＰＤＧＦＲアイソフォームも、増殖性硝子体網膜症の処置に用いることができる。例えば、ＰＤＧＦＲアイソフォームをコードしている核酸分子を含む、レトロウイルスベクターなどの発現ベクターを構築する。レトロウイルスベクターなどについては形質移入によってか、またはプラスミドベースもしくは染色体ベースのベクターなどについては形質転換によって、この発現ベクターを含むウサギ結膜線維芽細胞（ＲＣＦ）を、産生する。ＰＤＧＦＲアイソフォームの発現は、ＰＤＧＦＲアイソフォームを認識する抗体の使用を含む当該分野で公知である手段ならびにペプチドタグ（例えば、ｍｙｃタグ）および対応する抗体の使用によって、細胞中でモニタリングすることができる。ＲＣＦを、眼の硝子体部分に注射する。例えば、ウサギ動物モデルでは、約１×１０５個のＲＣＦを、気体硝子体切除（ｇａｓ  ｖｉｔｒｅｏｍｙ）によって注射する。ＰＤＧＦＲアイソフォームを発現するレトロウイルスの約２×１０７ＣＦＵを、同じ日に注射する。疾患症状の減衰などの増殖性硝子体網膜症に対する効果は、例えば手術の２〜４週間後に観察することができる。
【０４３８】
ＥｐｈＡアイソフォームを用いて、眼疾患などにおいて誤調節されたか、そして／もしくは不適切な新脈管形成を有する疾患または状態を処置することができる。例えば、ＥｐｈＡアイソフォームを、マウス角膜モデルなどの動物モデルにおいて、エフリンＡ−１誘導性の脈管形成に対する効果について評価することができる。エフリンＡ−１を単独かまたはＥｐｈＡアイソフォームタンパク質と共に含むヒドロンペレットを、マウスの角膜に移植する。移植後の日に視覚的な観察を行い、ＥｐｈＡアイソフォームの阻害または新脈管形成の低下を観察する。ＶＥＧＦＲアイソフォームについて記載されたものなどの抗脈管形成の治療および方法が、ＥｐｈＡアイソフォームに適応可能である。
【０４３９】
（２．新脈管形成に関連するアテローム硬化症）
ＲＴＫアイソフォーム（例えば、ＶＥＧＦＲ  Ｆｌｔ−１アイソフォームおよびＴＩＥ／ＴＥＫアイソフォーム）を含むＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームを用いて、アテローム性動脈硬化性斑の新血管形成などの、アテローム硬化症に関連する新脈管形成状態を処置することができる。血管の管腔内に形成された斑は、脈管形成刺激活性を有することが示されている。ヒト冠状動脈アテローム硬化性の病変におけるＶＥＧＦの発現は、ヒト冠状動脈アテローム硬化症の進行に関連している。
【０４４０】
動物モデルを用いて、アテローム硬化症の処置においてＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームを評価することができる。アポリポタンパク質−Ｅ欠損マウス（ＡｐｏＥ−／−）はアテローム硬化症に罹患しやすい。このようなマウスは、ＲＴＫアイソフォーム（例えば、Ｆｌｔ−１イントロン融合タンパク質などのＶＥＧＦＲアイソフォーム）を、５、１０および２０週齢から開始して５週間などの一定期間の間注射することによって処置する。アイソフォームで処置したマウスにおけるアテローム硬化性病変の低下を観察するために、大動脈起始部の病変を、コントロールＡｐｏＥ−／−マウスとアイソフォームで処置したＡｐｏＥ−／−マウスとの間で評価する。
【０４４１】
（３．新脈管形成に関連する糖尿病）
ＲＡＧＥアイソフォームを含む、ＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームは、血管疾患、歯周疾患および自己免疫疾患のような糖尿病に関連する疾患状態を処置するために使用され得る。糖尿病は、２つの主要な形態により生じ得る：１型糖尿病は、膵臓β島細胞の進行性の破壊により特徴付けられ、インシュリン欠乏症を生じる；２型糖尿病は、インシュリンの抵抗性の増大および／または分泌不全により特徴付けられ、高血糖につながる。高血糖に起因する合併症（例えば、心筋梗塞、脳卒中および指または肢の切断）は、罹患率および死亡率につながり得る。高血糖は、ＲＡＧＥリガンドの持続的な蓄積をもたらし、そのリガンドによるＲＡＧＥのシグナル伝達は、糖尿病組織および慢性的なリガンド媒介性のＲＡＧＥシグナル伝達におけるＲＡＧＥレセプターの増強された発現に寄与する。
【０４４２】
（ａ．血管疾患）
例えば、ＲＡＧＥアイソフォームのようなＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームは、糖尿病に関連する血管疾患（大血管および微小血管の両方の疾患を含む）を処置するために使用され得る。２型糖尿病において生じる高血糖は、種々の大血管の摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）（アテローム硬化性プラークの発生、血管平滑筋の増殖の増強、細胞外マトリックスの生成、および血管の炎症を含む）により特徴付けられる慢性的な血管傷害をもたらす。血管の炎症は、そのリガンドによるＲＡＧＥの係合により引き起こされ、そして悪化されて、慢性的な血管の炎症、加速的なアテローム硬化症、および、血管再生手順後の肥大した再狭窄につながり得る。ＲＡＧＥアイソフォームは、そのリガンドによるＲＡＧＥのライゲーションをブロックするために用いられて、糖尿病の血管合併症を抑制し得る。例えば、糖尿病に関連する高浸透性の動物モデルにおいて、可溶性ＲＡＧＥアイソフォームを用いた動物の処置は、組織浸透性のほぼ正常化をもたらし得る。糖尿病に関連する血管疾患の別の例において、糖尿病を発症するように誘導された、ＡｐｏＥ−／−マウスまたはＬＤＬレセプター−／−マウスのような高脂血症の動物モデルは、ＲＡＧＥリガンドの蓄積の増加と、ＲＡＧＥの発現の増強とを示す。可溶性のＲＡＧＥアイソフォームを用いた糖尿病マウスの処置は、ビヒクル処置マウスと比較したとき、アテローム硬化性病巣領域のサイズの減少、組織因子であるＶＣＡＭ−１およびＮＦκＢのレベルの低下により立証されるように、糖尿病に関連するアテローム発生を減少させ得る。糖尿病性のアテローム硬化症をブロックするためのＲＡＧＥアイソフォームを用いた処置は、アテローム硬化性プラークが確立した後を含め、疾患進行の間のあらゆる時点において与えられ得る。
【０４４３】
糖尿病に関連する血管疾患はまた、微小脈管構造において現れ得、眼、腎臓および末梢神経を冒す。重要なことには、腎疾患は、あらゆる糖尿病特異的な合併症の死亡率の最大の割合を占める。ＲＡＧＥアイソフォームは、腎疾患を含めた糖尿病に関連する血管疾患を処置するために使用され得る。例えば、糖尿病のマウスモデル、インスリン抵抗性のｄｂ／ｄｂマウスにおいて、ＲＡＧＥは、腎臓の糸球体において（特に有足突起細胞などにおいて）アップレギュレートされており、ＲＡＧＥ−リガンドを発現する単核食細胞もまた、糸球体において蓄積される。可溶性のＲＡＧＥアイソフォームを用いたｄｂ／ｄｂマウスの処置は、高浸透性と、糸球体内の単核食細胞の漸増とを媒介することが知られる因子である、ＶＥＧＦの発現をブロックする。さらに、ＲＡＧＥアイソフォームを用いた処置はまた、糸球体およびメサンギウムの拡大を減少させ、そして、アルブミンの排泄速度を減少させる。
【０４４４】
ＲＡＧＥアイソフォームを含む、ＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームはまた、創傷治癒を伴う糖尿病関連の血管疾患を処置するために使用され得る。糖尿病にはしばしば、慢性的な創傷治癒が伴い、そして、感染および切断のような合併症につながり得る。２型糖尿病のｄｂ／ｄｂマウスモデルを使用すると、創傷治癒モデルは、厚み全体にわたる切除創傷を行って慢性的な潰瘍を生成することにより確立され得る。このようなモデルにおいて、ＲＡＧＥおよびそのリガンドのレベルは高められる。可溶性のＲＡＧＥアイソフォームを用いたマウスの処置は、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αならびにＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−９を含むサイトカインのレベルを抑制することによって、創傷の閉鎖を増大させ得る。サイトカインレベルのこの減少は、慢性的な炎症の減少に寄与し、そして、最終的には、厚みのある、十分に血管が発達した顆粒組織の生成と、ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦ−Ｂのレベルの増加とを増強する。
【０４４５】
（ｂ．歯周疾患）
ＲＡＧＥアイソフォームを含む、ＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームは、糖尿病に関連する歯周疾患を処置するために使用され得る。糖尿病は、多数の因子（例えば、細菌病原体の侵入時の宿主の防御不全、そして、いったん感染が確立されたときの誇張された炎症性応答、が挙げられる）に起因する、歯周疾患の発症についての危険因子である。不適切な免疫応答は、複数の機構（例えば、病原性細菌による感染の後の好中球の漸増および機能の不全、コラーゲン生成の減少およびコラーゲン分解活性の誇大化、遺伝的性質、ならびに、例えば、持続的なＲＡＧＥによるシグナル伝達のような増強された炎症性応答につながる機構、が挙げられる）により歯周疾患に特徴的な歯槽骨の減損につながり得る。ＲＡＧＥおよびそのリガンドは、歯肉炎−歯周炎を有する患者における、糖尿病性歯肉における複数の細胞型（内皮および浸潤性の単核食細胞を含む）において蓄積される。糖尿病を誘導するためにストレプトゾトシンを用い、その後、ヒト歯周病病原体であるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓをマウスに接種した、糖尿病マウスモデルは、歯周疾患のモデルとして使用され得る。２ヶ月にわたり、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを接種した直後に、１日１回腹腔内注射することによるなどして、ＲＡＧＥアイソフォームを用いて処置されたマウスは、歯槽骨の減損の程度を評価することによって、歯周疾患について観察され得る。非鉱化結合組織および骨における破壊への関与が示される、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−９のようなサイトカインおよびマトリックスメタロプロテイナーゼのビヒクルコントロールと比較した減少はまた、ＲＡＧＥアイソフォームを用いて処置した後に観察され得る。
【０４４６】
（４．さらなる新脈管形成に関連する処置）
ＶＥＧＦＲアイソフォーム（例えば、Ｆｌｔ１アイソフォーム）ならびにＥｐｈＡアイソフォームなどのＲＴＫアイソフォームを含むＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームもまた、関節リウマチ（ＲＡ）などにおいて存在する、滑膜細胞の増殖、炎症細胞の浸潤、軟骨の破壊およびパンヌスの形成を含む炎症性関節疾患などの脈管形成ならびに炎症性関連の状態の処置に用いることができる。例えば、マウスで誘導した多関節関節炎などの、ＩＩ型コラーゲン誘導性関節炎の自己免疫モデルを、ヒトＲＡのモデルとして用いることができる。このようなモデルにおいて、マウスは、タンパク質の局所注射または遺伝子治療などによってＣＳＲのリガンドアイソフォーム（ＨＥＲ２アイソフォーム、ＦＧＦＲアイソフォーム、ＶＥＧＦＲアイソフォーム、または他のこのようなアイソフォーム（例えば、本明細書中に記載される任意のもの）が挙げられるが、これらに限定されない）で処置され得る。処置の後、そのマウスは、足の膨張、紅班および強直症を含む関節炎の症状の低下について観察され得る。また、滑膜新脈管形成および滑膜炎症の低下も、観察され得る。
【０４４７】
ＶＥＧＦＲアイソフォームを用いた処置が受け入れられる他の新脈管形成に関連する状態は、血管腫を含む。小児期に最も頻繁に起こる脈管形成疾患の１つが血管腫である。ほとんどの症例で、腫瘍は良性であり、介入なしに消失する。より重篤な症例では、腫瘍は、大きな空洞性かつ浸潤性の形態に進行し、臨床的合併症を生じる。血管腫の全身性形態である血管腫症は、死亡率が高い。現在用いられている治療剤では処置することができないか、または処置が困難な血管腫の症例が数多く存在する。
【０４４８】
ＶＥＧＦＲアイソフォームを、オスラー−ウェーバー−ランドー病、または遺伝性昜出血性毛細血管拡張などの、新脈管形成が損傷の原因であるそのような疾患および状態の処置に用いることができる。これは、複数の小さな血管腫、血管またはリンパ管の腫瘍によって特徴付けられている、遺伝する疾患である。血管腫は皮膚および粘膜中に見つかり、多くの場合、鼻出血（鼻血）または消化管出血、およびときとして、胚または肝臓の動静脈瘻を伴う。また、望ましくない血管透過性によって特徴付けられている疾患および障害も、ＶＥＧＦＲアイソフォームによって処置することができる。これは、脳腫瘍に関連する浮腫、悪性疾患に関連する腹水、メーグス症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心外膜液および胸水を含む。
【０４４９】
また、新脈管形成は、再生および創傷治癒などの正常な生理的プロセスにも関与している。新脈管形成は排卵の重要な工程であり、受精後の胞胚の着床にも重要な工程である。ＶＥＧＦＲアイソフォームによる新脈管形成のモジュレーションを用いて、排卵を遮断するまたは胞胚の着床を予防するために無月経を誘発することができる。ＶＥＧＦＲアイソフォームも手術手順で用いることができる。例えば、創傷治癒では、過剰の修復または線維増殖が手術手順の有害な副作用となる場合があり、これは新脈管形成によって引き起こされるか、または悪化する場合がある。癒着は手術の頻繁な合併症であり、小腸閉塞などの懸案事項をもたらす。
【０４５０】
ＰＤＧＦＲアイソフォームを、動脈手術などにおける動脈傷害後の新生内膜形成の調節に用いることができる。例えば、ＰＤＧＦＲＢアイソフォームを用いて、新生内膜形成に関与しているものなどのＰＤＧＦ−ＢＢ誘導性の細胞増殖を調節することができる。ＰＤＧＦＲアイソフォームは、例えば、バルーン損傷の雄鶏大腿動脈モデルにおいて評価することができる。ＰＤＧＦＲアイソフォームを発現するアデノウイルスベクターを構築し、動脈モデルにインビボで形質導入する。新生内膜関連の血栓症を、形質導入した動脈で評価して、コントロールと比較した場合の低下を観察する。
【０４５１】
新脈管形成に関連する疾患および状態の処置に有用なＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームは、抗新脈管形成薬、およびＶＥＧＦＲリガンドのモジュレーションを含めてＲＴＫ関連経路において他のシグナル伝達分子と相互作用する分子などとの併用療法で用いることもできる。例えば、既知の抗リウマチ薬であるブシラミン（ＢＵＣ）は、その作用機構に滑膜細胞によるＶＥＧＦ産生の阻害を含むことが示された。ＢＵＣの抗リウマチ効果は、滑膜細胞によるＶＥＧＦ産生の阻害による、関節炎滑膜における新脈管形成および滑膜増殖の抑制によって媒介される。このような薬物とＶＥＧＦＲアイソフォームとの併用療法は、処置に関して、複数の作用機構および作用部位を可能にし得る。
【０４５２】
（５．癌）
ＥＧＦＲ、ＴＩＥ／ＴＥＫ、ＶＥＧＦＲおよびＦＧＦＲのアイソフォームなどのＲＴＫアイソフォームを癌の処置に用いることができる。ＲＴＫアイソフォーム（ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３アイソフォームなどのＥＧＦＲ  ＲＴＫアイソフォーム、Ｆｌｔ１アイソフォームなどのＶＥＧＦＲアイソフォーム、ＦＧＦＲ４アイソフォームなどのＦＧＦＲアイソフォーム、ならびにＥｐｈＡ１アイソフォームが挙げられるが、これらに限定されない）は、癌の処置に用いることができる。ここで処置される癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ性悪性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のさらなる例としては、扁平上皮癌（例えば、上皮  扁平上皮癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）または消化管癌を含む胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎細胞癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部癌が挙げられる。併用療法は、抗ホルモン性化合物、心保護剤、ならびに化学療法剤および増殖阻害剤などの抗癌剤を含むＥＧＦＲアイソフォームと共に用いることができる。
【０４５３】
ＥＧＦＲアイソフォームを用いて処置可能な癌は、一般に、ＥＧＦＲレセプターまたはＥＧＦリガンドが相互作用するレセプターを発現する癌である。このような癌は当業者に公知であり、そして／またはＥＧＦＲの発現を検出するための当該分野で公知である任意の手段によって同定することができる。ＥｒｂＢ２発現の利用可能な診断的／予後的アッセイの例としては、ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ．ＲＴＭ．（Ｄａｋｏ）が挙げられる。パラフィンに包埋した腫瘍生検の組織切片は、ＩＨＣアッセイに供され、ＥｒｂＢ２タンパク質の染色強度基準を認容した。閾値よりも低いスコアが認められた腫瘍は、ＥｒｂＢ２を過剰発現していないと特徴付けることができるが、一方で、閾値を超えるかまたは閾値に等しいスコアを有する腫瘍は、ＥｒｂＢ２を過剰発現していると特徴付けることができる。処置の１つの例において、ＥｒｂＢ２を過剰発現する腫瘍を、ＥｒｂＢ２アイソフォームなどのＥＧＦＲアイソフォームを用いた処置の候補として評価する。
【０４５４】
本明細書中に提供されるアイソフォームを癌の処置に用いることができる。例えば、ＴＩＥ／ＴＥＫアイソフォームを、腫瘍関連の新脈管形成をモジュレートすることなどによる癌の処置に用いることができる。血管新生は、癌の増殖および拡散の調節に関与している。例えば、新脈管形成および新生血管形成の阻害は、固形腫瘍の増殖および拡大を阻害する。Ｔｉｅ２などのＴＩＥ／ＴＥＫレセプターは、正常組織および癌組織において血管発生に影響を与えることが示されている。ＴＩＥ／ＴＥＫアイソフォームは、腫瘍の新脈管形成のインヒビターとして用いることができる。ＴＩＥ／ＴＥＫアイソフォームは、細胞中でのタンパク質の発現などによって産生される。例えば、ＴＩＥ／ＴＥＫアイソフォームの分泌された形態を細胞中で発現させ、培地から収穫することができる。タンパク質は、当該分野で知られている生化学的手段により、そしてＴＩＥ／ＴＥＫアイソフォームもしくはその一部分に対して産生させた抗体などの抗体精製を用いることによってか、またはタグを付加したＴＩＥ／ＴＥＫアイソフォームおよび対応する抗体を用いることによって、精製あるいは部分的に精製することができる。新脈管形成の効果は、動物モデルにおいて、手術によってラット角膜のマイクロポケット内に移植したヒドロンペレット中の馴化培地としてか、またはウィンドウチャンバ（ｗｉｎｄｏｗ  ｃｈａｍｂｅｒ）に投与した精製したタンパク質（例えば１００μｇ／用量）として処方した、ＴＩＥ／ＴＥＫアイソフォームを用いてラット角膜を処理することなどによってモニタリングすることができる。例えば、無血管角膜を有するＦ３４４ラットなどのラットモデルを、腫瘍細胞馴化培地と組み合せてか、または新脈管形成を誘導するために腫瘍の断片を眼のウィンドウチャンバ内に移植することによって、用いることができる。腫瘍細胞馴化培地によって誘導された新脈管形成の阻害を検出するために、角膜を組織学的に検査することができる。また、ＴＩＥ／ＴＥＫアイソフォームを用いて、原発性および転移性の肉腫および癌腫を含む固形腫瘍などの悪性状態ならびに転移状態を処置することもできる。
【０４５５】
ＦＧＦＲ４アイソフォームを用いて、癌（例えば、下垂体腫瘍）を処置することができる。動物モデルを用いて、ヒト下垂体腫瘍進行の進行を模擬することができる。例えば、トランスジェニックマウス内で発現されたＦＧＦＲのＮ末端が短縮された形態、ｐｔｄ−ＦＧＦＲ−４は、持続的かつ巨大な過形成が存在しない下垂体腺種の形成を含めて、下垂体の腫瘍形成を再現している（Ｅｚｚａｔら、（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０９：６９〜７８）。ＦＧＦＲ−４アイソフォームをｐｔｄ−ＦＧＦＲ４マウスに投与することができ、下垂体の構築および腫瘍進行の経過をコントロールマウスと比較する。
【０４５６】
（６．アルツハイマー病）
ＥＧＦＲアイソフォームなどのＣＳＲレセプターまたはリガンドアイソフォームも、炎症性状態ならびにアルツハイマー病および関連状態などのこのような応答を含む他の状態の処置に用いることができる。種々のマウスモデルが、ヒトアルツハイマー病について利用可能であり、そのマウスモデルとしては、変異体アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスおよび家族性常染色体性優性関連ＰＳ１を発現するマウスならびに両方のタンパク質（ＰＳ１  Ｍ１４６Ｌ／ＡＰＰＫ６７０Ｎ：Ｍ６７１Ｌ）を発現するマウスが挙げられる。アルツハイマー病のモデルは、ＥｒｂＢアイソフォームの注射などによって処置される。斑の発生は、染色および抗体免疫反応アッセイを用いて、海馬、嗅内皮質、および大脳皮質中での神経斑の観察などによって評価することができる。
【０４５７】
クロイツフェルト−ヤーコプ病およびハンティングトン病などの他の神経変性疾患は、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームを用いて処置され得る。例えば、ＲＡＧＥおよびそのリガンドは、クロイツフェルト−ヤーコプ病におけるプリオンタンパク質斑、およびハンティングトン病における尾状核中に蓄積される。例えば、ＲＡＧＥアイソフォームなどのＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームを用いた神経変性疾患の処置は、持続的なＲＡＧＥシグナル伝達に関連する炎症および疾患を制限し得る。
【０４５８】
（７．平滑筋増殖に関連する疾患および状態
ＥｒｂＢアイソフォームなどのＥＧＦＲアイソフォームを含むＣＳＲアイソフォームを、ヒトなどの哺乳動物における平滑筋細胞増殖に関与する様々な疾患および状態の処置に用いることができる。例は、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の増殖を含み、血管狭窄症などの内膜の過形成、脈管形成術もしくは手術またはステント移植から生じる再狭窄、アテローム硬化症および高血圧をもたらす、心疾患の処置である。このような状態では、様々な細胞および放出されたサイトカインが、自己分泌、パラ分泌または接触分泌の様式で作用し、これにより、培地中のその正常な位置から損傷した内膜へのＶＳＭＣの遊走がもたらされる。遊走したＶＳＭＣは過剰に増殖し、内膜の肥厚をもたらし、これは狭窄症または血管の閉塞をもたらす。この懸案事項は、血小板の凝集および病変部位での堆積により度合が強まる。多機能性セリンプロテアーゼであるα−トロンビンが、血管損傷部位で濃縮されており、ＶＳＭＣの増殖を刺激する。このレセプターが活性化されたのち、ＶＳＭＣはＰＤＧＦ−ＡＡ、ＨＢ−ＥＧＦおよびＴＧＦを含む様々な自己分泌増殖因子を産生および分泌する。ＥＧＦＲは、最終的に線維芽細胞およびＶＳＭＣの遊走ならびに増殖をもたらすシグナル伝達カスケード、ならびに内皮細胞に分裂促進的な様々な因子を分泌させるＶＳＭＣの刺激および内皮細胞における化学走性応答の誘導に関与している。ＥＧＦＲアイソフォームを用いた処置を用いて、このようなシグナル伝達および応答をモジュレートすることができる。
【０４５９】
ＥｒｂＢ２アイソフォームおよびＥｒｂＢ３アイソフォームなどのＥＧＦＲアイソフォームを用いて、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３などのＥＧＦＲが、尿路下部に影響を与える閉塞性症候群に応答して起こる膀胱壁の肥厚などの膀胱のＳＭＣをモジュレートする状態を処置することができる。ＥＧＦＲアイソフォームを、膀胱平滑筋細胞の増殖の制御、結果的には尿路閉塞性症候群の予防または処置に用いることができる。
【０４６０】
ＥＧＦＲアイソフォームを用いて、平滑筋細胞増殖に関与する根本的な病理学を有する閉塞性気道疾患を処置することができる。一例は、気道の炎症および気管支収縮に現れる喘息である。ＥＧＦは、ヒト気道ＳＭＣの増殖を刺激することが示されており、閉塞性気道疾患において気道ＳＭＣの病理学的増殖に関与する因子の１つである可能性が高い。ＥＧＦＲアイソフォームは、ＥＧＦＲによる、ＥＧＦに対する効果および応答をモジュレートするために用いることができる。
【０４６１】
（８．炎症性疾患）
ＴＮＦＲアイソフォームまたはＲＡＧＥアイソフォームなどのＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームは、中枢神経系疾患（ＣＮＳ）、自己免疫疾患、喘息におけるものなどの気道過敏症状態、関節リウマチおよび炎症性腸疾患を含む炎症性疾患の処置に用いることができる。
【０４６２】
ＴＮＦ−αおよびリンホトキシン（ＬＴ）は、炎症誘発性サイトカインであり、多発性硬化症などの疾患および状態の炎症反応における重大な媒介物質である。ＴＮＦ−αおよびＬＴ−αは、リンパ球およびマクロファージを浸潤することによって産生され、また、さらに、活性化されたＣＮＳ実質細胞、ミクログリア細胞および星細胞によって産生される。ＭＳ患者では、ＴＮＦ−αは血清および脳脊髄液中で過剰に産生されている。病変中では、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦＲが、大規模に発現される。ＴＮＦ−αおよびＬＴ−αは、原発性オリゴデンドロサイトの選択的毒性を誘発させることができ、ＣＮＳ組織においてミエリン損傷を誘発させる。したがって、これら２つのサイトカインは脱髄に関連するとされている。
【０４６３】
実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症（ＭＳ）のモデルとして役割を果たすことができる（例えば、Ｐｒｏｂｅｒｔら（２０００）Ｂｒａｉｎ、１２３：２００５〜２０１９参照）。ＥＡＥは、ミエリンならびにミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）などのミエリン成分を用いて免疫化を行うことによって、いくつかの遺伝的に感受性のある種において誘導され得る。例えば、ＭＯＧ誘導性ＥＡＥは、炎症の病理組織学的三徴候の慢性的でありかつ再発性の臨床疾患経過、反応性グリオーシス、および大きなコンフルエントな脱ミエリン化された斑の形成を含むヒトＭＳの本質的な特徴を再現している。さらなるＭＳモデルは、非自己免疫媒介性のＭＳのモデルである、ＴＮＦ−αを過剰発現するトランスジェニックマウスを含む。トランスジェニックマウスは、ＴＮＦ−αを局所的にグリア細胞中で発現するように操作されている；ヒトおよびネズミのＴＮＦ−αは、ＭＳ様の症状を始動させる。ＴＮＦＲアイソフォームは、ＥＡＥ動物モデルにおいて評価することができる。アイソフォームを注射などによって投与し、症状の経過および進行をコントロール動物と比較してモニタリングする。
【０４６４】
ＴＮＦαなどのサイトカインは、気道平滑筋の収縮特性にも関与している。ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２は、気道平滑筋における生物学的影響をモジュレートすることにおいて役割を果たしている。ＴＮＦＲ２は、カルシウム恒常性をモジュレートし、したがって気道平滑筋の応答性亢進をモジュレートする。ＴＮＦＲ１は、気道平滑筋におけるＴＮＦ−αの効果をモジュレートする。気道平滑筋の応答は、カルバコールを用いて誘発させたネズミの気管輪において評価することができる。ＴＮＦ−αが存在する場合および存在しない場合におけるカルバコール誘導性収縮などの効果を、モニタリングすることができる。気道平滑筋に対するアイソフォームの効果を評価するために、ＴＮＦＲアイソフォームを気管輪に添加することができる。
【０４６５】
ＴＮＦＲおよび他のＣＳＲを含むＣＳＲは、関節リウマチ（ＲＡ）などの疾患において炎症をモジュレートする（Ｅｄｗａｒｄｓら（２００３）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、５５（１０）：１３１５〜３６）。ＴＮＦＲ１アイソフォームまたはＴＮＦＲ２アイソフォームを含むＴＮＦＲアイソフォームを用いて、ＲＡを処置することができる。例えば、ＴＮＦＲアイソフォームを局所注射または全身注射することができる。アイソフォームは、毎日または週１回投薬することができる。ＰＥＧ化したＴＮＦＲアイソフォームは、免疫原性を低下させるために用いることができる。霊長類モデルが、ＲＡ処置のために利用可能である。ＴＮＦＲアイソフォーム処置を評価するために、柔らかい関節および膨張した関節の応答をＴＮＦＲアイソフォームで処置した被験体ならびにコントロールにおいてモニタリングすることができる。
【０４６６】
（９．心臓血管疾患）
ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォーム（例えば、ＲＡＧＥアイソフォームが挙げられる）は、心臓血管疾患の処置に使用され得る。ＲＡＧＥおよびそのリガンドは、持続的かつ慢性的なＲＡＧＥ媒介性シグナル伝達をもたらす老化（ａｇｅｉｎｇ）したヒト心臓を含む老化組織において蓄積する。例えば、ＲＡＧＥシグナル伝達は、例えば、心筋線維症（ｃａｒｄｉａｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）に関連する心臓線維芽細胞において観察されている基質メタロプロテイナーゼの活性化によって細胞−基質相互作用の調節を媒介し得る。反対に、冠状動脈疾患を有する患者の血漿における可溶性ＲＡＧＥアイソフォームのレベルの減少（しかし、コントロール被験体においては減少していない）は、アテローム硬化症の進行および冠状動脈疾患に関連する血管の炎症と相関する。ＲＡＧＥアイソフォームを用いた心臓血管疾患および関連状態を有する患者の処置は、リガンド媒介性であるＲＡＧＥ依存性の細胞活性化を予防することによって抗アテローム発生効果を発揮し得る。
【０４６７】
（１０．腎疾患）
ＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォーム（ＲＡＧＥアイソフォームが挙げられる）は、慢性腎疾患の処置に使用され得る。腎疾患は、慢性炎症ならびにＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、およびＡＧＥ、ＲＡＧＥに対するリガンドなどの炎症誘発性サイトカインの高い血液レベルによって特徴付けられる。ＲＡＧＥはまた、腎機能が悪化するにつれて漸増的に、慢性腎疾患を有する患者由来の末梢血単球において蓄積される。ＲＡＧＥ／ＲＡＧＥリガンドシグナル伝達は、慢性腎疾患に関連する慢性的な単球媒介性全身炎症に関連する。ＲＡＧＥアイソフォームを用いた処置は、細胞表面ＲＡＧＥに対するＲＡＧＥリガンドの結合を減少させ、そしてＲＡＧＥ媒介性シグナル伝達（例えば、ＴＮＦ−αのような炎症誘発性サイトカインの産生）を減衰させ得る。
【０４６８】
（Ｊ．併用療法）
ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォーム（特に、発現または分泌の後にそれらのＮ末端にさらなるアミノ酸を含むように改変され、本明細書中に提供されるもの）は、互いに組み合わせてか、他の細胞表面レセプターまたはリガンドアイソフォーム（例えば、ヘルスタチン、もしくは例えば、米国特許出願第０９／９４２，９５９号、同第０９／２３４，２０８号、同第０９／５０６，０７９号；米国仮特許出願第６０／５７１，２８９号、同第６０／５８０，９９０号および同第６０／６６６，８２５号；ならびに米国特許第６，４１４，１３０号、公開された国際ＰＣＴ特許出願の国際公開第００／４４４０３号、同第０１／６１３５６号、同第２００５／０１６９６６号に記載の任意のもの（配列番号３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、１４０、１４２、１４３、１４５、１４７、１４９、１５０、１５２、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１−１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８１、１８３、１８５、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３０〜２３３、２２５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４８〜２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６４〜２７０、２７２、２７４〜２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２８９〜３０３、または３１９〜３３３のいずれか１つに示されるものが挙げられるが、これらに限定されない））と組み合わせてか、ならびに／または本明細書中に示され、そして当業者に公知であるような疾患および状態（特に、異常な新脈管形成および／または新生血管形成を含むもの（癌および増殖性障害、炎症性疾患ならびに自己免疫障害が挙げられるが、これらに限定されない））を処置するための他の既存の薬物および治療剤と組み合わせて使用され得る。
【０４６９】
例えば、本明細書中に記載されるように、いくつかのアイソフォームを用いて、新脈管形成に関連する状態および疾患ならびに／またはコントロール腫瘍増殖を処置することができる。このような処置は、抗脈管形成薬および／もしくは抗腫瘍形成薬ならびに／または治療剤と組み合わせて行うことができる。抗脈管形成薬および抗腫瘍形成薬ならびに併用療法に有用な治療は、チロシンキナーゼインヒビター、ならびにチロシンキナーゼシグナル伝達をモジュレートする能力を有し、そして併用療法で使用され得る分子を含み、その分子としては、４−アミノピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（例えば、米国特許第５，６３９，７５７号を参照のこと）、キナゾリン化合物およびキナゾリン組成物（例えば、米国特許第５，７９２，７７１号）が挙げられるが、これらに限定されない。併用療法において有用な他の化合物としては、アンジオスタチン４，９（１１）−ステロイドおよびＣ２１−含酸化ステロイドなどのステロイド、アンジオスタチン、エンドスタチン、バスキュロスタチン（ｖａｓｃｕｌｏｓｔａｔｉｎ）、キャンスタチン（ｃａｎｓｔａｔｉｎ）およびマスピン、アンジオポイエチン、細菌性多糖ＣＭ１０１および抗体ＬＭ６０９（米国特許第５，７５３，２３０号）、トロンボスポンジン（ＴＳＰ−１）、血小板因子４（ＰＦ４）、インターフェロン、メタロプロテイナーゼインヒビター、ＡＧＭ−１４７０／ＴＮＰ−４７０、サリドマイド、およびカルボキシアミドトリアゾール（ＣＡＩ）を含む薬理学的因子、ヘパリンまたはヘパリンフラグメントが存在する場合などのコルチゾン、抗侵襲性因子、レチノイン酸およびパクリタキセル（本明細書中に参考として援用される米国特許第５，７１６，９８１号）、サメ軟骨抽出物、アニオン性ポリアミドもしくはポリ尿素オリゴマー、オキシインドール誘導体、エストラジオール誘導体およびチアゾロピリジミン誘導体が挙げられる。
【０４７０】
別の例において、ＶＥＧＦアイソフォームなどのＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームを、糖尿病を処置するための薬剤と共に投与することができる。このような薬剤は、糖尿病性歯周病、糖尿病性血管疾患、尿細管間質性疾患および糖尿病性神経障害などの任意または全ての状態を処置するための薬剤を含む。別の例では、ＣＳＲアイソフォームは、抗癌剤、化学療法剤、および増殖阻害剤などの癌を標的とする薬剤（異なる化学療法剤のカクテルの同時投与を含む）と一緒に投与される。化学療法剤の例としては、タキサン類（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）およびアントラサイクリン抗生物質が挙げられる。このような化学療法剤についての調製および投薬スケジュールは、製造者の指示に従って使用されても、当業者によって経験的に決定されるように使用されてもよい。このような化学療法の調製および投薬スケジュールはまた、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ編、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．（１９９２）に記載される。処置される癌の例としては、扁平上皮癌（例えば上皮の扁平上皮癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）または消化管癌を含む胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎細胞癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部癌が挙げられる。任意のＣＳＲアイソフォームを、疾患または状態を処置するための２つ以上の薬剤と組み合わせて投与することができる。
【０４７１】
さらなる化合物を、ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームと共に併用療法において用いることができる。抗ホルモン化合物を、ＥＧＦＲアイソフォームと共になど、併用療法で用いることができる。このような化合物の例には、タモキシフェンなどの抗エストロゲン化合物；オナプリストンなどの抗プロゲステロンおよびフルタミドなどの抗アンドロゲンが、このような分子について公知の投薬量で含まれる。心保護剤（治療に関連している可能性のある心筋機能不全を予防または軽減させるため）または１つ以上のサイトカインを同時投与することもまた、有益であり得る。上記治療レジームに加えて、患者は、手術による癌細胞の除去および／または放射線療法に供され得る。
【０４７２】
ＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォーム（特に、それらのＮ末端に１つ以上のさらなるアミノ酸を含むアイソフォームの改変された形態を含む本明細書中に提供されるもの）と、１つ以上の異なるＣＳＲアイソフォームまたはリガンドアイソフォームとの組合せ（ヘルスタチンおよび癌および異常な新脈管形成を含む他の障害を処置するために使用され得る他の薬剤（例えば、同時係属かつ公開された出願の米国特許出願第０９／９４２，９５９号、同第０９／２３４，２０８号、同第０９／５０６，０７９号；米国仮特許出願第６０／５７１，２８９号、同第６０／５８０，９９０号および同第６０／６６６，８２５号；ならびに米国特許第６，４１４，１３０号、公開された国際ＰＣＴ特許出願の国際公開第００／４４４０３号、同第０１／６１３５６号、同第２００５／０１６９６６号を参照のこと）との組合せを含む）が、提供される。細胞表面レセプターは、ＶＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ（Ｒα、Ｒβ、ＣＳＦ１Ｒ、Ｋｉｔを含む）、Ｍｅｔ（ｃ−ｍｅｔ、ｃ−ＲＯＮを含む）、ＴＩＥおよびＥＰＨＡファミリーのメンバーなどのレセプターチロシンキナーゼを含む。これは、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ−２）、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＲ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＢ１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３、ＦＧＦＲ−４、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲ−Ａ、ＴＥＫ、Ｔｉｅ−１、ＫＩＴ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、Ｆｌｔ１、Ｆｌｔ３、ＲＯＮ、またはＣＳＦ１Ｒ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＲＯＮ、ＣＳＦＲ１およびその他のものを含み得る。細胞表面レセプターはまた、ＴＮＦＲまたはＲＡＧＥのアイソフォームを含み得る。リガンドアイソフォームはまた、ＨＧＦアイソフォームを含む組合せにおいて使用され得る。このようなアイソフォームの例は、ヘルスタチン（配列番号２９０〜３０３、およびコードする核酸配列（配列番号３０４〜３１８に示される）を参照のこと）、ヘルスタチンのイントロン部分を含むポリペプチド（配列番号３１９〜３３３、およびコードする核酸配列（配列番号３３４〜３４８に示される）を参照のこと）、および本明細書中に提供される任意のアイソフォームである。選択したアイソフォームおよび／または薬物の組合せは、処置する疾患と相関関係にあり、標的組織および標的細胞ならびにそれらの上で発現されたレセプターの検討に基づいている。
【０４７３】
組合せは、例えば、脈管形成および／もしくは内皮細胞の維持経路中の２つ以上の細胞表面レセプターまたは工程を標的としても、疾患プロセス（例えば、炎症性疾患、腫瘍および本明細書中に記載され、当業者に公知である全ての他のものなどの、これらの経路のうち一方または両方が関連するとされている任意のもの）中の２つ以上の細胞表面レセプターまたは工程を標的としてもよい。２つ以上の薬剤は、単一の組成物として投与されても、２つ以上の組成物（２つより多い薬剤が存在する場合）として同時か、断続的かもしくは逐次的に投与されてもよい。これらは、２つ以上の組成物を個別に含むか、または合わせた組成物を含み、かつ必要に応じて投与のための指示書および／もしくは注射器などの投与するためのデバイスを含むキットとしてパッケージングすることができる。
【０４７４】
アジュバントおよび他の免疫調節因子は、癌の処置において、例えば、腫瘍細胞に対する免疫応答を増大させるために、ＣＳＲアイソフォームと組み合わせて用いることができる。併用療法は、処置の有効性を増大させることができ、いくつかの場合において、組合せが処置の個別の相加効果よりも有効であるように相乗効果が生じる。アジュバントの例としては、細菌ＤＮＡ、弱毒化マイコバクテリア細胞の核酸画分（ＢＣＧ；カルメット−ゲラン杆菌）、ＢＣＧゲノム由来の合成オリゴヌクレオチド、およびＣｐＧモチーフを含む合成オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ；Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅら（１９９７）Ｂｌｏｏｄ、８９：２９９４〜２９９８）、レバミゾール、水酸化アルミニウム（ミョウバン）、ＢＣＧ、フロイト不完全アジュバント（ＩＦＡ）、ＱＳ−２１（植物由来の免疫刺激因子）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、およびジニトロフェニル（ＤＮＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。免疫調節因子の例としては、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−１ＲＡ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、オンコスタチンＭ、エリスロポエチン、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インターフェロン、Ｂ７．１（ＣＤ８０としても公知である）、Ｂ７．２（Ｂ７０、ＣＤ８６としても公知である）、ＴＮＦファミリーメンバー（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＴ−β、ＣＤ４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢＬ、Ｔｒａｉｌ）、およびＭＩＦなどのサイトカイン、インターフェロン、ＩＬ−２およびＩＬ−１２などのサイトカイン；ならびにメトトレキサートおよびクロラムブシルなどの化学療法剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４７５】
（前臨床研究）
モデル動物の研究を、候補治療剤であるＲＴＫアイソフォームの前臨床評価で用いることができる。評価することができるパラメータとしては、有効性濃度応答、安全性、薬物動態、種間スケーリングおよび組織分布が挙げられるが、これらに限定されない。モデル動物の研究は、本明細書中に記載されるようなものなどのアッセイおよび当業者に公知であるアッセイを含む。動物モデルを用いて、その後に臨床治験およびＲＴＫアイソフォームを用いた処置を設計するためにヒト投薬量に外挿することができるデータを得ることができる。例えば、ヒトで使用するための所要の有効な範囲のＶＥＧＦＲに対する抗体などの、治療的インヒビターを維持するために有効な臨床的投薬レジメンを定義するために、腫瘍保有マウスにおける有効性濃度応答ＶＥＧＦＲインヒビターを、ヒトでの処置に外挿することができる（Ｍｏｒｄｅｎｔｉら、（１９９９）Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ．、１月〜２月；２７（１）：１４〜２１）。同様のモデルおよび用量の研究を、ＶＥＧＦＲアイソフォームの投薬量の決定および適切なヒト用量への翻訳、ならびに当業者に公知である他の技術に適用することができる。前臨床安全性研究および前臨床薬物動態学を、例えば、サル、マウス、ラットおよびウサギにおいて行うことができる。マウス、ラットおよびサルからの薬物動態データは、非比例的スケーリングを用いて、ヒトにおける対応治療剤の薬物動態の予測に用いられている。したがって、関節リウマチ、眼球新血管形成および癌を含むヒトの病的状態を処置するための適切な投薬量の情報を決定することができる。抗ＶＥＧＦ抗体のヒト化バージョンが抗癌剤として臨床治験で用いられており（Ｂｒｅｍ、（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５８（１３）：２７８４〜９２；Ｐｒｅｓｔａら、（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５７（２０）：４５９３〜９）、このような臨床データはまた、ＶＥＧＦＲアイソフォームの治療的用量を設計する場合に参照の供給源としてみなすことができる。
【０４７６】
以下の実施例は、例示目的のみのために含まれ、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【０４７７】
（Ｋ．実施例）
（実施例１  ＣＳＲアイソフォームをクローニングするための方法）
（Ａ．メッセンジャーＲＮＡの調製）
健康かまたは疾患状態の組織または細胞株由来の主要なヒト組織型から単離したｍＲＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から購入した。等量のｍＲＮＡをプールし、逆転写に基づいたＰＣＲ増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）用のテンプレートとして用いた。
【０４７８】
（Ｂ．ｃＤＮＡの合成）
ｍＲＮＡを４０％のＤＭＳＯの存在下、７０℃で１０分間変性させ、氷上でクエンチした。１本目のｃＤＮＡ鎖は、１０％のＤＭＳＯ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭずつの各ｄＮＴＰ、５μｇのｍＲＮＡ、および２００ユニットのＳｔｒａｔａｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を含む２０μｌの反応液中の２００ｎｇのオリゴ（ｄＴ）または２０ｎｇのランダムヘキサマーのいずれかを用いて合成した。３７℃で１時間インキュベーションを行った後、両方の反応からのｃＤＮＡをプールし、１０単位のＲＮａｓｅＨ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で処理した。
【０４７９】
（Ｃ．ＰＣＲ増幅）
Ｏｌｉｇｏ  ６．６ソフトウェア（Ｍｏｌｅｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｓｃａｄｅ、ＣＯ）を用いて細胞表面レセプター（例えば、例示的な細胞表面レセプターについては、表８を参照のこと）に特異的な遺伝子特異的ＰＣＲプライマーを選択し、Ｑｉａｇｅｎ−Ｏｐｅｒｏｎ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）によって合成した。順方向プライマー（例えば、表９を参照のこと）が開始コドンに隣接（ｆｌａｎｋ）する。逆方向プライマーは、終止コドンに隣接するか、または逆方向プライマーを、開始コドンから少なくとも１．５ｋｂ下流の領域から選択した（表９を参照のこと）。それぞれのＰＣＲ反応液は、１０ｎｇの逆転写されたｃＤＮＡ、０．０２５Ｕ／μｌのＴａｑＰｌｕｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、０．００３５Ｕ／μｌのＰｆｕＴｕｒｂｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ならびに０．２μＭの順方向プライマーおよび逆方向プライマーを、５０μｌの全体積中に含んでいた。ＰＣＲ条件は、３５サイクルならびに９４．５℃で４５秒間、５８℃で５０秒間、および７２℃で５分間であった。反応は、７２℃で１０分間の伸長工程で終結させた。
【０４８０】
【表８−１】
2009515521.tif 000012
【０４８１】
【表８−２】
2009515521.tif 000013
【０４８２】
【表９−１】
2009515521.tif 000014
【０４８３】
【表９−２】
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【０４８４】
【表９−３】
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（Ｄ．ＰＣＲ産物のクローニングおよび配列決定）
ＰＣＲ産物を、１％のアガロースゲル上で電気泳動し、検出可能なバンドからのＤＮＡをＧｅｌｓｔａｒ（ＢｉｏＷｈｉｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で染色した。ＤＮＡバンドを、ＱｉａＱｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）で抽出し、ｐＤｒｉｖｅ  ＵＡ−クローニングベクター（Ｑｉａｇｅｎ）内にライゲーションし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中に形質転換させた。１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ寒天プレート上で組換えプラスミドを選択した。それぞれのトランスフェクションにおいて１９２個コロニーをランダムに選択し、Ｍ１３順方向ベクタープライマーおよびＭ１３逆方向ベクタープライマーを用いたＰＣＲによってそのｃＤＮＡ挿入物の大きさを決定した。その後、蛍光イメージング（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）によって可視化して区別可能な分子量を有するＰＣＲ産物由来の代表的なクローンについて、ベクタープライマー（Ｍ１３順方向およびＭ１３逆方向）を用いて両方向から配列決定を行った。ギャップを含む領域にわたる方向付けした配列決定の完了のためのカスタムプライマーを用いて、すべてのクローンの全体の配列決定を行った。
【０４８５】
（Ｅ．配列解析）
選択的スプライシングのコンピュータ解析を、ＳＩＭ４（スプライシング改変体を分析するためのコンピュータプログラム）を用いて、それぞれのｃＤＮＡ配列をそのそれぞれのゲノム配列とアラインメントさせることによって行った。正準（例えば、ＧＴ−ＡＧ）のドナー−アクセプタースプライシング部位を有する転写物のみの解析を、検討した。ＣＳＲアイソフォームをコードしているクローンのさらなる研究を行った（以下の表１０を参照のこと）。
【０４８６】
（Ｆ．例示的なＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォーム）
本明細書中に記載の方法を用いて調製した例示的なＣＳＲアイソフォームおよびリガンドアイソフォームを、以下の表１０に示す。ＣＳＲアイソフォームをコードしている核酸分子およびリガンドアイソフォームをコードしている核酸分子を提供し、これらは、ヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログもしくはリボヌクレオチドアナログの配列を含むものを含む。例示的なＣＳＲアイソフォームポリペプチドの例示的な核酸配列およびアミノ酸配列についての配列番号は、表１０に示される。
【０４８７】
【表１０−１】
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【０４８８】
【表１０−２】
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【０４８９】
【表１０−３】
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（実施例２  ヒト細胞におけるイントロン融合タンパク質構築物の調製および発現）
（Ａ．ｔＰＡ  ｃＤＮＡの生成）
ヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）ｃＤＮＡを得るために、ｔＰＡシグナル／プロ配列（配列番号１に示されるヒトｔＰＡ  ｃＤＮＡ配列に基づく）を含むヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）の５’部分に特異的なＰＣＲプライマーを、公開された情報（Ｋｏｈｎｅら（１９９９）Ｊ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７５：４４６−４６１）に基づいて選択し、そして、Ｑｉａｇｅｎ−Ｏｐｅｒｏｎ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）により合成した。プライマーの配列は、配列番号７および配列番号８に示される。各ＰＣＲ反応は、５０μｌの総容量中に、１０ｎｇの逆転写ｃＤＮＡ、０．０２５Ｕ／μｌのＴａｑＰｌｕｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、０．００３５Ｕ／μｌのＰｆｕＴｕｒｂｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）ならびに０．２μＭの順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含んだ。ＰＣＲの条件は、９４．５℃で４５秒間、５８℃で５０秒間、そして７２℃で５分間を３５サイクルであった。反応は、７２℃で１０分間の伸長ステップにより終結させた。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル上で電気泳動し、そして、検出可能なバンドからのＤＮＡをＧｅｌｓｔａｒ（ＢｉｏＷｈｉｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で染色した。ＤＮＡのバンドを、ＱｉａＱｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて抽出し、ｐＤｒｉｖｅ  ＵＡ−クローニングベクター（Ｑｉａｇｅｎ）内へとライゲーションし、そして、ｐＤｒｉｖｅ−ｔＰＡベクターの精製のためにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉへと形質転換した。
【０４９０】
（Ｂ．ｔＰＡシグナル／プロ配列のＰＣＲ増幅および発現クローニング）
配列番号１に示されるｔＰＡシグナル／プロ配列（表１１を参照のこと）をコードするヌクレオチドを含む核酸の一部をクローニングするために、配列番号９および配列番号１０に示されるプライマー（表１２を参照のこと）を用いてＰＣＲを行った。これらのプライマーは、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩについての制限酵素切断部位ならびにｍｙｃタグを含むように作製して、増幅した生成物のｐＣＩ発現プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）へのクローニングを容易にした。あるいは、配列番号１１および配列番号１２に示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことによりＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩについての制限酵素切断部位を作製し、そして増幅した生成物をｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとクローニングした。ＰＣＲ反応は、上述のように、１０ｎｇのｐＤｒｉｖｅ−ｔＰＡを用いて行った。ＰＣＲの条件は、９４．５℃で４５秒間、５８℃で５０秒間、そして７２℃で５分間の３５サイクルを含んだ。反応は、７２℃で１０分間の伸長ステップにより終結させた。ｔＰＡをコードするｃＤＮＡを、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩまたはＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩにより消化して、ｔＰＡシグナル／プロ配列フラグメントを生成し、そして、これを、ＮｈｅＩ部位およびＸｈｏＩ部位においてｐＣＩ発現プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）へとサブクローニングしてｐＣＩ−ｔＰＡ：ｍｙｃベクターを形成するか、または、ＥｃｏＲＩ部位およびＸｂａＩ部位においてｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとサブクローニングしてｐｃＤＮＡ３．１−ｔＰＡベクターを形成した。
【０４９１】
【表１１】
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（Ｃ．ｐＣＩ−ｔＰＡベクター内へのイントロン融合タンパク質のクローニング）
イントロン融合タンパク質を、それぞれ、そのｐＤｒｉｖｅ配列決定ベクターからＰＣＲ増幅し、そしてその後、ｐＣＩ−ｔＰＡ：ｍｙｃベクターへとクローニングした。ＰＣＲ増幅のために、順方向プライマーは、ＸｈｏＩ部位を含み、そして、逆方向プライマーはＮｏｔＩ部位を含む。シグナル配列なしのＶＥＧＦＲ１−イントロン融合タンパク質（配列番号２７９）を、配列番号１３および１４に示されるプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。シグナル配列なしのＭｅｔ−イントロン融合タンパク質（配列番号２１４）を、配列番号１５および１６に示されるプライマーを用いて増幅した。シグナル配列なしのＦＧＦＲ２−イントロン融合タンパク質（配列番号１８０）を、配列番号１７および１８に示されるプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。シグナル配列なしのＦＧＦＲ２−イントロン融合タンパク質（配列番号１７８）を、配列番号２１および２２に示されるプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。シグナル配列なしのＦＧＦＲ４−イントロン融合タンパク質（配列番号１８５）を、配列番号２３および２４に示されるプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。シグナル配列なしのＲＡＧＥイントロン融合タンパク質（例えば、配列番号２３７を参照のこと）を、配列番号２５および２６に示されるプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。シグナル配列なしのＴＥＫイントロン融合タンパク質（例えば、配列番号２４５を参照のこと）を、配列番号２７および２８に示されるプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。シグナル配列なしのＲＯＮイントロン融合タンパク質（例えば、配列番号２２３を参照のこと）を、配列番号２９および３０に示されるプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。各ＰＣＲ反応は、５０μｌの総容量中に、１０ｎｇの逆転写ｃＤＮＡ、０．０２５Ｕ／μｌのＴａｑＰｌｕｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、０．００３５Ｕ／μｌのＰｆｕＴｕｒｂｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）ならびに０．２μＭの順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含んだ。ＰＣＲの条件は、９４．５℃で４５秒間、５８℃で５０秒間、そして７２℃で５分間を２５サイクルであった。反応は、７２℃で１０分間の伸長ステップにより終結させた。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル上で電気泳動し、そして、検出可能なバンドからのＤＮＡをＧｅｌｓｔａｒ（ＢｉｏＷｈｉｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で染色した。ＤＮＡのバンドを、ＱｉａＱｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて抽出し、ｔＰＡ／プロ配列の下流にあるＸｈｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位においてｐＣＩ−ｔＰＡ：ｍｙｃベクター内にサブクローニングして、配列番号３１〜３５、３９〜４７（ヌクレオチド）および３２〜３６、４０〜４８（アミノ酸）に示されるｔＰＡ：ｍｙｃ−イントロン融合タンパク質構築物を作製した。
【０４９２】
配列番号２８９に示される、シグナル配列なしのヘルスタチン（ＤｉｍｅｒｃｅｐｔＴＭ）−イントロン融合タンパク質をコードする核酸を、ｐｃＤＮＡ３．１  Ｈｉｓ−ヘルスタチン（Ｇａｉｌ  Ｃｌｉｎｔｏｎ（ＯＨＳＵ）により供与）からＰＣＲ増幅し、その後、ｐｃＤＮＡ３．１−ｔＰＡベクターへとクローニングした。ＰＣＲ増幅のために、順方向プライマーはＸｂａＩ部位を含むように作製し、そして、逆方向プライマーは、ＮｏｔＩ部位を含むように作製した。ヘルスタチン−イントロン融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを、配列番号１９および２０に示されるプライマーを用いて増幅した。ＰＣＲ反応は、上述のように行った。ＰＣＲ産物を精製して、ＸｂａＩ部位およびＮｏｔＩ部位においてｐｃＤＮＡ３．１−ｔＰＡベクター内にサブクローニングし、配列番号３７（ヌクレオチド）および配列番号３８（アミノ酸）に示されるようなｔＰＡ−ＨＥＲ２イントロン融合タンパク質構築物を作製した。例示的なｔＰＡ−イントロン融合タンパク質を表１３に示す。
【０４９３】
【表１２】
2009515521.tif 000021
【０４９４】
【表１３】
2009515521.tif 000022
（Ｄ．タンパク質の発現および分泌）
培養ヒト細胞からの培地を、ｔＰＡ−イントロン融合タンパク質の各々の分泌について評価した。ヒト細胞においてｔＰＡ−イントロン融合タンパク質を発現させるために、ヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞を、２×１０６細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種し、そして、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）および１０％胎仔ウシ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持した。細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの日に、０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ中で５μｇのプラスミドＤＮＡを１５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００と混合した。この混合物を、室温で２０分間インキュベートし、その後、これを細胞に添加した。細胞を、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて４８時間培養した。イントロン融合タンパク質のタンパク質分泌を調べるために、トランスフェクションから４８時間後に馴化培地を回収し、そして、その発現レベルをウェスタンブロッティングにより解析した。馴化培地を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、その後、抗Ｍｙｃ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または抗ヘルスタチン抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）を用いた免疫ブロット法により解析した。抗体は、１：５０００に希釈した。細胞によるイントロン融合タンパク質のタンパク質発現を調べるために、細胞培養培地を除いた後、トランスフェクトした細胞を回収し、そして、細胞溶解緩衝液（ＰＢＳ／０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で溶解した。溶解物を遠心分離により清澄にして、不溶性の細胞破片を除いた。代表的には、タンパク質濃度を決定した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で各サンプルから１０μｇのタンパク質が分離された。細胞溶解物を、抗Ｍｙｃ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または抗ヘルスタチン抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）を用いたウェスタンブロッティングにより解析した。ｔＰＡプレ／プロ配列を含むイントロン融合タンパク質の発現および分泌を、元のシグナルペプチドまたは内因性のシグナルペプチドを含むイントロン融合タンパク質と比較した。イントロン融合タンパク質の発現および分泌の比較を、表１４および表１５に示す。
【０４９５】
【表１４】
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【０４９６】
【表１５】
2009515521.tif 000024
（実施例３  ヘルスタチン（ＤｉｍｅｒｃｅｐｔＴＭ）の精製および細胞ベースの増殖阻害アッセイ）
（Ａ．２９３細胞を用いたｔＰＡ−ＨＥＲ２の一過性の発現）
２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を、ＤＭＥＭ／１０％胎仔ウシ血清中に維持した。トランスフェクションのために、細胞を、１０ｃｍ細胞培養プレート１枚あたり１×１０７個の密度で播種した。２４時間後に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅＴＭ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の推奨に従って用いて一過性のトランスフェクションを行った。簡単に述べると、２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションを開始する直前に、無血清ＤＭＥＭに交換した。各２９３Ｔ細胞プレートのトランスフェクションのために、７５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ  ２０００および２５μｇのｔＰＡ−ＨＥＲ２発現構築物（またはｐｃＤＮＡコントロールプラスミド）を２ｍｌの無血清ＤＭＥＭ中で混合した。ＤＮＡ−ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ混合物を室温で２０分間インキュベートし、その後、２９３Ｔ細胞プレートに滴加した。４８時間後にトランスフェクトした細胞の上清を回収し、遠心分離し、そしてろ過して、残った細胞を除いた。清澄にした上清を、タンパク質精製のために処理した。
【０４９７】
（Ｂ．部分的に精製したヘルスタチン（ＤｉｍｅｒｃｅｐｔＴＭ）の精製）
構築物によりコードされる発現されたヘルスタチンタンパク質生成物を含む、一過性にトランスフェクトされた細胞の馴化培養培地を、タンジェンシャルフロー膜または分子量１００００の分離能を示す撹拌細胞系フィルターのいずれかを用いて、約１０倍に濃縮した。メンブランまたはフィルタにより保持される物質をさらに処理した。上述の濃縮／容量減少の後、サンプルを、５０ｍＭの冷酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）で希釈し（サンプルを、一当量または二当量のいずれかの緩衝液で希釈した）、そして、ｐＨをモニターし、５．５の最終ｐＨを達成するために必要な場合、酢酸またはＨＣｌを用いてｐＨを調節した。ｐＨを調節した後、カラムクロマトグラフィーを行う前に、馴化培地を０．４５ミクロンフィルタに通してあらゆる微粒子を除いた。
【０４９８】
上述の濃縮／馴化物質を、続いて、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）で平衡化したＳＰ−セファロースイオン交換クロマトグラフィーカラム上に装填した（５ｍｌの吸着床容積あたり５０〜３００ｍｌの供給；１〜３ｍｌ／分の流速）。この装填物を、カラムの平衡緩衝液を用いてカラム上で洗浄し、そして、２８０ｎｍにおける吸光度が最小かつ一定になるまで、この洗浄した溶出物をモニターした。この得られたフロースルー（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）およびカラムの洗浄液を、最後の評価のために保持した。
【０４９９】
以下の緩衝液を順次連続して使用する、均一濃度段階溶出アプローチを用いて、結合したタンパク質のカラムの溶出を行った：５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、２００ｍＭの塩化ナトリウム；５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、５００ｍＭの塩化ナトリウム：５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、１Ｍの塩化ナトリウム；そして、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、２Ｍの塩化ナトリウム。各溶出段階において、溶出液の２８０ｎＭにおける吸光度のプロフィールをモニターし、そして、そのそれぞれの条件下においてカラムから溶出した物質を含むベースラインからベースラインまでのプールを作製した。画分をプールした直後に、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いてｐＨを７．０と７．５との間に調節した（約１０μｌ／ｍｌの画分のプール）。
【０５００】
ほとんどの操作を、２〜８℃で行った。このように調製した物質、および単離プロセスの間に生成した全ての画分のアリコートを、さらなる解析まで、２〜８℃または−８０℃のいずれかで保存した。
【０５０１】
（Ｃ．抗増殖活性についての精製ヘルスタチン（ＤｉｍｅｒｃｅｐｔＴＭ）のアッセイ）
（バイオアッセイの評価−ヘルスタチンについてのＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ増殖阻害アッセイ）
ＤＵ−１４５細胞を、アッセイの１日前に、２％胎仔ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中、１ウェルあたり５０００個で、９６ウェルプレートに播種した。細胞を、０．２％のＦＢＳ／ＤＭＥＭ中、精製ヘルスタチン（ｎＤｃｐ）およびコントロールのプールした画分の２倍段階希釈（アッセイ容量の場合、１０％、５％、２．５％、１．２５％および０．７５％を意味する）を用いて処理した。３７℃で５日間インキュベートした後、ウェル中の細胞濃度をＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｒ７０１７）法により測定した。１００μｌの２×Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅを、１００μｌの培養培地を含む各ウェルに添加し、そして、２〜４時間で、処理したウェルおよびコントロールウェルの各々について、励起＝５３０ｎｍ／放射＝５９０ｎｍにおいて蛍光を測定した。蛍光の読み値に基づく用量−反応曲線によりＤＵ１４５の増殖阻害を解析し、そして、コントロール処理群からの結果と比較した。精製ヘルスタチンのプールした画分は、アッセイ容積の０．７５％の濃度において、約１５％細胞の増殖および成長を阻害し、最大の阻害は、アッセイ容積の１．２５％のときに観察された（ｐｃＤＮＡコントロールと比較して、８０％の阻害）。
【０５０２】
当業者には改変が明らかであるので、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることが意図される。
【配列表】
2009515521000001.app