(57)【要約】  本願は、新たに記載するＧ−ＣＳＦ糖鎖付加パターンを有する遺伝子導入トリによって生み出された卵から入手される顆粒球コロニー刺激因子に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
家禽由来の糖鎖付加パターンを有するＧ−ＣＳＦを含む組成物であって、ここで、糖鎖付加パターンはＣＨＯ細胞において産生されるＧ−ＣＳＦの糖鎖付加パターン以外のものである、組成物。
【請求項２】
Ｇ−ＣＳＦが単離されている、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
Ｇ−ＣＳＦが固い殻の卵の中に存在する、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
Ｇ−ＣＳＦがトリの輸卵管細胞においてグリコシル化されている、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
輸卵管細胞が管状腺細胞である、請求項５記載の組成物。
【請求項６】
Ｇ−ＣＳＦがニワトリの輸卵管細胞においてグリコシル化されている、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
Ｇ−ＣＳＦがスレオニン１３３にてグリコシル化されている、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
組成物が医薬組成物である、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
Ｇ−ＣＳＦが配列番号４１のアミノ酸配列を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
糖鎖付加パターンがヒト細胞において産生されるＧ−ＣＳＦの糖鎖付加パターン以外のものである、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
Ｇ−ＣＳＦを含む組成物であって、ここで、Ｇ−ＣＳＦは、以下：
【化１】
2009530377.tif 000043
【化２】
2009530377.tif 000044
【化３】
2009530377.tif 000045
【化４】
2009530377.tif 000046
【化５】
2009530377.tif 000047
【化６】
2009530377.tif 000048
【化７】
2009530377.tif 000049
でグリコシル化されている、組成物。
【請求項１２】
Ｇ−ＣＳＦが固い殻の卵から入手される、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
Ｇ−ＣＳＦが単離されている、請求項１１記載の組成物。
【請求項１４】
Ｇ−ＣＳＦがスレオニン１３３にてグリコシル化されている、請求項１１記載の組成物。
【請求項１５】
Ｇ−ＣＳＦが配列番号４１のアミノ酸配列を有する、請求項１１記載の組成物。
【請求項１６】
以下：
【化８】
2009530377.tif 000050
でグリコシル化されているＧ−ＣＳＦ分子を含む組成物。
【請求項１７】
Ｇ−ＣＳＦが固い殻の卵の中に存在する、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
Ｇ−ＣＳＦが単離されている、請求項１６記載の組成物。
【請求項１９】
スレオニン１３３にてグリコシル化されている、請求項１６記載の組成物。
【請求項２０】
Ｇ−ＣＳＦが配列番号４１のアミノ酸配列を有する、請求項１６記載の組成物。
【請求項２１】
以下：
【化９】
2009530377.tif 000051
でグリコシル化されているＧ−ＣＳＦ分子を含む組成物。
【請求項２２】
Ｇ−ＣＳＦが固い殻の卵の中に存在する、請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
Ｇ−ＣＳＦが単離されている、請求項２１記載の組成物。
【請求項２４】
スレオニン１３３にてグリコシル化されている、請求項２１記載の組成物。
【請求項２５】
Ｇ−ＣＳＦが配列番号４１のアミノ酸配列を有する、請求項２１記載の組成物。
【請求項２６】
以下：
【化１０】
2009530377.tif 000052
でグリコシル化されているＧ−ＣＳＦ分子を含む組成物。
【請求項２７】
Ｇ−ＣＳＦが固い殻の卵の中に存在する、請求項２６記載の組成物。
【請求項２８】
Ｇ−ＣＳＦが単離されている、請求項２６記載の組成物。
【請求項２９】
スレオニン１３３にてグリコシル化されている、請求項２６記載の組成物。
【請求項３０】
Ｇ−ＣＳＦが配列番号４１のアミノ酸配列を有する、請求項２６記載の組成物。
【請求項３１】
以下：
【化１１】
2009530377.tif 000053
でグリコシル化されているＧ−ＣＳＦ分子を含む組成物。
【請求項３２】
Ｇ−ＣＳＦが固い殻の卵の中に存在する、請求項３１記載の組成物。
【請求項３３】
Ｇ−ＣＳＦが単離されている、請求項３１記載の組成物。
【請求項３４】
スレオニン１３３にてグリコシル化されている、請求項３１記載の組成物。
【請求項３５】
Ｇ−ＣＳＦが配列番号４１のアミノ酸配列を有する、請求項３１記載の組成物。
【請求項３６】
以下：
【化１２】
2009530377.tif 000054
でグリコシル化されているＧ−ＣＳＦ分子を含む組成物。
【請求項３７】
Ｇ−ＣＳＦが固い殻の卵の中に存在する、請求項３６記載の組成物。
【請求項３８】
Ｇ−ＣＳＦが単離されている、請求項３６記載の組成物。
【請求項３９】
スレオニン１３３にてグリコシル化されている、請求項３６記載の組成物。
【請求項４０】
Ｇ−ＣＳＦが配列番号４１のアミノ酸配列を有する、請求項３６記載の組成物。
【請求項４１】
糖鎖付加パターンを含むＧ−ＣＳＦを含む組成物であって、ここで、糖鎖付加パターンはＣＨＯ細胞において産生されるＧ−ＣＳＦの糖鎖付加パターン以外のものであり、かつＧ−ＣＳＦはニワトリの輸卵管細胞において産生される、組成物。
【請求項４２】
Ｇ−ＣＳＦが単離されている、請求項４２記載の組成物。
【請求項４３】
輸卵管細胞が管状腺細胞である、請求項４１記載の組成物。
【請求項４４】
患者に治療有効量のＴＰＤ  Ｇ−ＣＳＦを投与する工程を包含する、患者において白血球カウントを増加させる方法。
【請求項４５】
治療有効量が、患者にて白血球カウントを所望の量によって増加させる量である、請求項４４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願情報
本出願は、２００６年３月１７日出願の米国仮特許出願第６０／７８３，６４８２００６号；および２００６年８月２５日出願の米国仮特許出願第６０／８４０，２９１号の恩典を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、鳥類細胞への外因性の遺伝的材料の導入および鳥類細胞における外因性の遺伝物質の発現に関する。本発明は、詳細には、遺伝子導入のトリ種（ニワトリ、ウズラおよびシチメンチョウを含む）、ならびに医薬用タンパク質などの外因性タンパク質を含む卵を産むトリに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
多数の天然または合成タンパク質が、診断および治療に応用されており；ほかの多くのタンパク質が開発中であるか、または臨床試験中である。最新のタンパク質の産生方法としては、天然の供給源からの単離、および細菌および哺乳動物細胞中での組換え産生が挙げられる。しかし、これらのタンパク質産生方法の複雑性および高い費用が原因で、代替法を開発する取り組みが進行中である。例えば、ブタ、ヒツジ、ヤギおよびウシの乳汁中で外因性タンパク質を産生する方法が報告されている。これらのアプローチは、ファウンダー（founder）および作製した遺伝子導入群の間の長い発生期間、畜産および獣医にかかる膨大な費用、およびゲノムでの導入遺伝子の挿入部位に対する位置効果が原因である発現レベルの変動を含む、特定の制限を有する。タンパク質はまた、粉砕およびマルティング（malting）プロセスを使用して、オオムギおよびライムギから産生されている。しかし、植物の翻訳後修飾は動物の翻訳後修飾とは異なり、これはしばしば医薬用タンパク質などの外因性タンパク質の機能に対して重大な効果を有する。
【０００４】
組織培養物および乳腺バイオリアクターのように、トリ輸卵管は、バイオリアクターとして強力に役立ち得る。高いレベルの外因性タンパク質が輸卵管中で分泌され、卵中に包まれるようにトリの遺伝物質を改変する、うまくいく方法は、安価なタンパク質の大量製造であろう。そのようなアプローチのいくつかの利点は、ａ）短い発生時間；ｂ）フロックサイズ（flock size）を増加させることによって製造物を容易に増減させて、製造物の必要を満たし；ｃ）発現されるタンパク質の翻訳後修飾；４）自動化されている給餌および卵の回収；ｄ）天然に無菌の卵白；ならびにｅ）卵白中の高濃度のタンパク質に起因する、処理費用の低減であろう。
【０００５】
ニワトリの生殖器系を含むトリ生殖器系は、よく記載されている。雌鳥の卵は、輸卵管中の通過の間に卵黄の上に分泌されるいくつかの層からなる。卵の産生は、雌鳥の卵巣での大きな卵黄の形成と一緒に開始する。次いで、未受精の卵母細胞が、卵黄嚢の上端に位置する。排卵または輸卵管からの卵黄の放出に際して、卵母細胞は、輸卵管の卵管漏斗へと移動し、精子が存在する場合、ここで卵母細胞は受精される。次いで、卵母細胞は、管状腺と繋がっている輸卵管の筒部へと移動する。これらの細胞は、卵白アルブミン、リゾチーム、オボムコイド、コンアルブミンおよびオボムチンを含む卵白タンパク質を、卵管漏斗の管腔（ここで、これらのタンパク質がトリ胚および卵黄状に沈着する）へと分泌する。
【０００６】
卵白アルブミン遺伝子は、輸卵管の卵管漏斗の管状腺細胞において特異的に発現する４５ｋＤのタンパク質である（Beato Cell 56:335-344(1989)）。卵白アルブミンは、もっとも多い卵白タンパク質であって、管状腺細胞によって産生される全タンパク質の５０％超、または大型のグレードＡの卵１つあたりに約４ｇ含まれる（Gilbert, ”Egg albumen and its formation” in Physiology and Biochemistry of the Domestic Fowl, Bell and Freeman, eds., Academic Press, London, N.Y., pp. 1291-1329）。卵白アルブミン遺伝子および両側の隣接領域２０ｋｂ超がクローニングされ、分析されている（Lai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:2205-2209 (1978)；Gannon et al., Nature 278:428-424 (1979)；Roop et al., Cell 19:63-68 (1980)；およびRoyal et al., Nature 279:125-132 (1975)）。
【０００７】
卵白アルブミンの調節に、多くの注意が払われている。遺伝子は、エストロゲン、グルココルチコイドおよびプロゲステロンなどのステロイドホルモンに応答し、未成熟のヒヨコの管状細胞あたり約７０，０００個の卵白アルブミンｍＲＮＡ転写物、および成熟の産卵鶏の管状腺細胞あたり１００，０００個の卵白アルブミンｍＲＮＡ転写物の蓄積を誘導する（Palmiter, J. Biol. Chem. 248:8260-8270 (1973); Palmiter, Cell 4:189-197 (1975)）。形質移入した管状腺細胞でのＤＮＡｓｅ過敏性分析およびプロモーター−レポーター遺伝子アッセイによって、卵白アルブミン遺伝子の発現に必要とされる配列を含む７．４ｋｂの領域が決定されている。この５’隣接領域は、転写開始部位から−０．２５、−０．８、−３．２および−６．０に集中している４つのＤＮＡｓｅ  Ｉ−過感受性部位を含む。これらの部位は、ＨＳ−Ｉ、−ＩＩ、−ＩＩＩおよび−ＩＶとそれぞれ呼ばれている。これらの領域は、クロマチン構造における変化を反映しており、輸卵管細胞での卵白アルブミン遺伝子の発現と特異的に関連している（Kaye et al., EMBO 3:1137-1144 (1984)）。ＨＳ−ＩＩおよび−ＩＩＩの過感受性は、エストロゲン誘導性であって、卵白アルブミン遺伝子の発現のホルモン誘導でのこれらの領域の役割を指令している。
【０００８】
ＨＳ−ＩおよびＨＳ−ＩＩはともに、卵白アルブミン遺伝子の転写のステロイド誘導に必要とされ、これらのエレメントを含む５’側の領域１．４ｋｂが、外植管状腺細胞におけるステロイド依存性の卵白アルブミンの発現を駆動させることに十分である（Sanders and McKnight, Biochemistry 27: 6550-6557 (1988)）。ＨＳ−Ｉは、ホルモンがない場合に卵白アルブミンの発現を抑圧する負の調節エレメントをいくつか含むので、負の応答エレメント（”ＮＲＥ”）といわれる（Haekers et al., Mol. Endo. 9:1113-1126 (1995)）。タンパク質因子は、輸卵管核においてのみ見出されるいくつかの因子を含むタンパク質因子はこれらのエレメントに結合しており、組織特異的な発現における役割を示唆している。ＨＳ−ＩＩは、転写のステロイドを促進することに必要とされるので、ステロイド依存性応答エレメント（”ＳＤＲＥ”）といわれる。ＨＳ−ＩＩは、Ｃｈｉｒｐ−Ｉとして知られるタンパク質またはタンパク質複合体に結合する。Ｃｈｉｒｐ−Ｉはエストロゲンによって誘導され、シクロヘキサミドの存在下で迅速に代謝回転する（Dean et al., Mol. Cell. Biol. 16:2015-2024 (1996)）。外植の管状腺細胞培養系を使用する実験によって、ＮＦκＢ様因子を含む、ステロイド依存性の様式でＳＤＲＥに結合する因子のさらなるセットが決定されている（Nordstrom et al., J. Biol. Chem. 268:13193-13202 (1993); Schweers and Sanders, J. Biol. Chem. 266: 10490-10497 (1991)）。
【０００９】
ＨＳ−ＩＩＩおよび−ＩＶの機能については、あまり知られていない。ＨＳ−ＩＩＩは、機能性のエストロゲン応答エレメントを含んでおり、エストロゲン受容体ｃＤＮＡをＨｅＬａ細胞に同時形質導入した場合、エストロゲン誘導能を卵白アルブミン近位プロモーターまたは異種プロモーターのいずれかに与える。これらのデータは、ＨＳ−ＩＩＩが卵白アルブミンの全体の調節において、機能性の役割を担い得ることを暗示している。ＨＳ−ＩＶについては、機能性のエストロゲン応答エレメントを含まないこと以外は、全く知られていない（Kato et al., Cell 68: 731-742 (1992)）。
【００１０】
外来性の遺伝物質の導入および／または特定の遺伝子の破壊によって真核生物のゲノムを改変することへの関心は高い。特定の真核生物の細胞は、外因性の真核生物タンパク質の産生に優れた宿主であることが解っている。特定のタンパク質をコードする遺伝子の導入はまた、経済的価値の増した新たな表現型の作製を可能にする。さらに、遺伝的に欠損した細胞がこれらの細胞ではさもなければ産生し得ないタンパク質を発現することを可能にする外来性遺伝子の導入によって、遺伝的に引き起こされるいくつかの疾患状態が治療され得る。遂に、遺伝物質の挿入または除去による動物ゲノムの改変は、遺伝子機能の基礎研究を可能にし、最終的には、疾患状態を治療するか、または動物の表現型の改善をもたらすために使用され得る遺伝子の導入を可能にし得る。
【００１１】
遺伝子組換えは、いくつかの異なる方法によって哺乳動物において成し遂げられている。まず、マウス、ブタ、ヤギ、ヒツジおよびウシを含む哺乳動物において、導入遺伝子は受精卵の前核にマイクロインジェクトされ、次いで、フォスターマザー（foster mother）の子宮に入れ、ここで生殖系列中に導入遺伝子を担持するファウンダー動物を生じさせる。導入遺伝子は操作されて、外来性タンパク質の発現を特定の細胞型に指令する特定の調節配列を有するプロモーターを担持する。導入遺伝子はゲノムにランダムに挿入されるので、ゲノムへの導入遺伝子の挿入部位に対する位置効果は、導入遺伝子の発現レベルの減少を可変的に引き起こし得る。この取り組みはまた、所望の細胞型において導入遺伝子の発現を指令することに必要な配列を決定し、かつ導入遺伝子ベクター中に含まれるようなプロモーターの特徴付けを必要とする（Hogan et al. Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988)）。
【００１２】
動物の遺伝子組換えをもたらす第２の方法は、標的遺伝子の破壊であって、ここで、選択可能なマーカー遺伝子に隣接する標的遺伝子の配列を含む標的化ベクターは胚性幹（”ＥＳ”）細胞に導入される。相同組換えによって、標的化ベクターは染色体座で標的遺伝子配列を置換するか、または標的遺伝子産物の発現を抑制する内部配列に挿入する。適切に破壊された遺伝子を有するＥＳ細胞のクローンを選択し、次いで、初期の胚盤胞に注入してキメラのファウンダー動物を生じ、そのうちのいくつかは、生殖細胞にて導入遺伝子を有する。導入遺伝子が標的遺伝子座を欠失させる場合、導入遺伝子は、遺伝子座を導入遺伝子ベクターが有する外来性ＤＮＡ（培養物中の形質導入されたＥＳ細胞を検出することに有用な選択可能なマーカーをコードするＤＮＡからなり、次いで、標的遺伝子のプロモーターが外来性遺伝子の発現を駆動させるように、欠失した遺伝子の場所に挿入される外来性タンパク質をコードするＤＮＡ配列をさらに含み得る）と置換する(米国特許第5,464,764号および第5,487,992号(M. P. Capecchi and K. R. Thomas))。このアプローチは、ＥＳ細胞がヤギ、ウシ、ヒツジおよびブタを含む多くの哺乳動物において利用可能でないという制限を受けている。さらに、この方法は、欠失される遺伝子が生物または細胞型の生存または適切な発達に必要とされる場合に有用でない。
【００１３】
トリの遺伝子組換えにおける近年の発達は、トリゲノムの改変を可能にしている。生殖細胞遺伝子導入ニワトリは、新鮮な生み立ての卵において、ニワトリの胚盤葉の胚下腔中に複製欠損のレトロウイルスを注入することによって産生され得る(米国特許第5,162,215号; Bosselman et al., Science 243:533-534 (1989); Thoraval et al., Transgenic Research 4:369-36 (1995))。外来性遺伝子を担持するレトロウイルスの核酸は、胚細胞の染色体にランダムに挿入されて、遺伝子導入動物を生じ、そのうちのいくつかはそれらの生殖細胞中に導入遺伝子を有する。挿入部位に対する位置効果を乗り越えるために融合遺伝子構築物の５’または３’領域に挿入されたインスレーター配列の使用が記載されている(Chim et al., Cell 74:504-514 (1993))。
【００１４】
別のアプローチにおいて、導入遺伝子は、受精卵の胚盤中に微量注入されて、遺伝子がＦ１世代に渡り得る、安定した形質導入ファウンダートリを産生する(Love et al., Bio/Technology 12:60-63 (1994))。しかし、この方法は、いくつかの不利点を有する。受精卵を収集するために雌鳥を犠牲にしなければならず、形質導入ファウンダーの割合は小さく、注入された卵は、代理の殻におけるインビトロでの重労働な培養を必要とする。
【００１５】
別のアプローチにおいて、仮定的な始原生殖細胞（”ＰＧＣ”）を含む胚盤葉細胞をドナーの卵から切除し、導入遺伝子を形質導入し、レシピエントの胚の胚下腔に導入する。形質導入したドナー細胞をレシピエントの胚に組み込み、形質導入胚を発生させ、そのいくつかは生殖細胞中に導入遺伝子を有すると期待される。導入遺伝子は、非相同組換えによって、ランダムな染色体部位に挿入される。しかし、この方法によって、形質導入ファウンダートリは生じていない。
【００１６】
Lui, Poult. Sci. 68:999-1010 (1995)では、ビテロゲニン遺伝子の隣接ＤＮＡ配列を含む標的化ベクターを使用して、培養物中のニワトリ胚盤葉細胞中の常在性の遺伝子の部分を欠失させている。しかし、これらの細胞が生殖細胞に寄与し、形質導入胚を産生し得ることは示されていない。さらに、この方法は、欠失される遺伝子が生物または細胞型の生存または適切な発達に必要とされる場合に有用でない。
従って、適切なプロモーターに作動可能に連結されている外来性ＤＮＡからなりＤＮＡをトリゲノムに導入して、外因性遺伝子の発現が達成され得る方法の必要があることが理解されるだろう。さらに、輸卵管において外因性遺伝子を発現し、発現された外因性タンパク質を卵中に分泌する、生殖細胞が改変されている形質導入トリを作り出す必要がある。
【００１７】
インターフェロンが１９５７年に発見された際に、インターフェロンは重要な抗ウイルス剤として歓迎された。１９７０年代後半、インターフェロンは、組換え遺伝子技術と関連づけられた。現在、インターフェロンは、ガンの生物学的プロセスの複雑性の象徴であって、かつ、この複雑性に対処する耐久性および持続性の価値である。
【００１８】
ガンを引き起こす異常な遺伝子は、少なくとも３つの型を含む：第１に、ガン遺伝子であって、ガン遺伝子が変化した場合、ガンを特徴付ける異常な増殖および分化を促す。第２に、ガン抑制遺伝子であって、ガン抑制遺伝子が変化した場合、この異常な増殖および分化が制御できない。第３に、ＤＮＡ修復遺伝子であって、ＤＮＡ修復遺伝子が変化した場合、ガンを誘導し得る変異を修復できない。研究者らは、体の中に約３０〜４０個のガン抑制遺伝子が存在し、各遺伝子はタンパク質を産生すると考えている。これらのタンパク質は、Ｒｂ（網膜芽細胞腫に最初に関連する）やｐ５３（多くの異なる腫瘍に関連する）などの”主要な”ガン抑制タンパク質によって制御され得る。研究結果から、これらのガン抑制遺伝子のわずか１つを正常な機能に戻すことで、悪性腫瘍の侵襲性がおよそ低減され得ることが示唆されている。
【００１９】
インターフェロンが細胞増殖を抑制することが発見されたことで、科学者はインターフェロンに興味を示すようになった。さらに、インターフェロンは、インターフェロンは、免疫系に対して特定の陽性効果を有することが見出されている。インターフェロンは現在、ガン抑制タンパク質に類似していると考えられている：インターフェロンは細胞、特に悪性細胞の増殖を抑制し；インターフェロンは、多くのガン遺伝子および増殖因子の効果をブロックし；他の生物学的薬剤とは異なり、インターフェロンは転移プロセスに重要な細胞の運動性を抑制する。
【００２０】
細胞間情報伝達は、メッセージが伝達される組織の全ての構造成分（マトリックス、細胞膜、細胞骨格、および細胞自体）の正常な機能に依存している。ガンにおいて、細胞間の情報伝達ネットワークは、破壊されている。細胞骨格が破壊されている場合、メッセージは核に到達せず、核は異常に機能し始める。核はガン遺伝子またはガン抑制遺伝子のスイッチがオンまたはオフになる部位であるので、細胞は、この異常な機能は悪性腫瘍を導き得る。これが発生した場合、細胞は不規則に増殖し始め、分化しない。これらの細胞はまた、移動を開始し、他の細胞を破壊し始める。インターフェロンは、おそらく他の細胞外および細胞性物質に呼応して、均衡および恒常性を回復し、メッセージが正常に到達することを確実にしている。インターフェロンは、接着分子を介して、増殖を停止させ、運動性を停止させ、かつ細胞の能力を増強して、その環境に応答する。インターフェロンはまた、細胞骨格上の欠損および傷害を是正する。インターフェロンは、血管新生、悪性腫瘍の増殖に必要な新たな血管の形成におけるの最初のステップをブロックすることが見出されている。さらに、インターフェロンは線維症、多くの異なる種類の細胞を刺激し、細胞増殖を促す傷害への応答をブロックする(Kathryn L. Hale, Oncolog, Interferon: The Evolution of a Biological Therapy, Taking a New Look at Cytokine Biology)。
【００２１】
インターフェロンは、動物細胞がウイルスに侵入された場合に産生され、血流または細胞間液に放出され、健康な細胞を誘導して、感染に対抗する酵素を作る。長年、研究用のインターフェロンの供給は、割高な抽出技術によって制限されていた。しかし、１９８０年、タンパク質は遺伝子工学によって高い品質で利用可能になった（すなわち、タンパク質の組換え形態）。科学者らはまた、体が３つの異なる型のインターフェロン（α−（アルファ）、β−（ベータ）、およびγ−（ガンマ）インターフェロンという）を作ることを決定した。インターフェロンは最初、高度に種特異的であると考えられていたが、現在では、それぞれのインターフェロンは、他の種において異なる範囲の活性を有し得ることが知られている。アルファインターフェロン（α−ＩＦＮ）は、ヘアリーセル白血病、Ｃ型肝炎に対する治療上の使用に承認されている。α−ＩＦＮはまた、Ｂ型慢性肝炎、肝ガンおよび肝硬変の主要な原因、ならびに性器疣贅およびいくつかの稀な血液および骨髄のガンの治療に有効であることが見出されている。α−ＩＦＮを含む点鼻薬は、ライノウイルスによって引き起こされる風邪に対する防御をいくらか提供する。ヒトα−ＩＦＮは、抗ウイルス、抗増殖および免疫調節性活性を有する細胞外情報伝達タンパク質のファミリーに分類される。ＩＦＮ−αタンパク質は、ヒト染色体９上に密集する１３遺伝子を含む多重遺伝子ファミリーによってコードされている。ＩＦＮ−α遺伝子の大半は、センダイウイルスによって誘導される白血球においてｍＲＮＡレベルで発現される。さらに、少なくとも９個の異なる亜型もタンパク質レベルで産生されることが示されている。いくつかの類似のＩＦＮ−αタンパク質の発現の生物学的な重要性が知られているものの、これらのＩＦＮ−αタンパク質は、定量的に異なるパターンの抗ウイルス、増殖抑制およびキラー細胞刺激活性を有していると考えられている。現在、２つのＩＦＮ−αバリアント、ＩＦＮ−α  ２ａおよびＩＦＮ−α  ２ｂが組換え技術によって大腸菌で大量に産生され、薬物として市販されている。
【００２２】
天然のＩＦＮ−αと異なり、これらの組換えＩＦＮ−α製品は、何人かの患者において免疫原性であることが示されており、これはＩＦＮ−αタンパク質の不自然な形態に起因している可能性がある。従って、ＩＦＮ−α薬物の開発には、正常なヒト白血球において発現されるＩＦＮ−α亜型およびバリアントを同定するだけでなく、それらの考え得る翻訳後修飾を特徴付ける必要がある(Nyman et al. (1998) Eur. J. Biochem. 253:485-493)。
【００２３】
Nymanら(上記)は、天然のヒトＩＮＦ−αの糖鎖付加を研究している。彼らは、センダイウイルスの誘導後に白血球が産生する９つの亜型のうち２つ、すなわちＩＦＮ−α１４ｃおよびＩＮＦ−α  ２ｂがグリコシル化されることを見出しており、これは初期の研究と一致している。ＩＦＮ−α１４は、考え得るＮ−糖鎖付加部位、Ａｓｎ２およびＡｓｎ７２を有する唯一のＩＦＮ−α亜型であって、Ａｓｎ７２のみが実際にグリコシル化される。ＩＦＮ−α  ２は、スレオニン１０６（Ｔｈｒ１０６）でＯ−グリコシル化される。興味深いことに、他のＩＦＮ−α亜型はこの位置にＴｈｒを含まない。この研究において、Nymanらは、オリゴ糖鎖を遊離させ、単離し、質量分析および特異的グリコシダーゼ消化によって分析した。ＩＦＮ−α  ２ｂおよびＩＦＮ−α１４ｃの両方が逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）において３つのピークに分解された。ＲＰ−ＨＰＬＣ由来のＩＦＮ−α  ２ｂ画分のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）分析は、それらの分子量における差異を明らかにし、これらが異なるグリコフォームを示すことを示唆した。このことは、各フラクションの遊離Ｏ−グリカンの質量分析によって確認されている。ＩＦＮ−α  ２ｂは、約２０％のコア型−２五糖、および５０％の二シアル酸付加および３０％の一シアル酸付加コア型−１グリカンを含むと推定された。Nymanらのデータは、従前のＩＮＦ−α  ２ｂ糖鎖付加の部分的な特徴付けと一致している（Adolf et al. (1991) Biochem. J. 276:511-518）。ＩＮＦ−α  １４ｃおよびＩＮＦ−α  ２ｂにおける糖鎖付加の役割は、明らかには確立されていない。Nymanら(上記)によると、糖鎖は、生物学的活性に必要ではないが、糖鎖付加はタンパク質の薬物動態および安定性に対して効果を有し得る。
【００２４】
ヒトゲノム中においてＩＦＮ−αファミリーのタンパク質をコードする少なくとも１５個の機能性遺伝子が存在する。アミノ酸配列の類似性は一般に約９０％の範囲であり、従って、これらの分子は構造上密接に関連している。ＩＦＮ−αタンパク質は１６６アミノ酸（１６５アミノ酸を有するＩＦＮ−α  ２は例外として）を含み、２つのジスルフィド架橋を形成する４つの保存されたシステイン残基を特徴として含む。ＩＦＮ−α種は、特徴としていくぶん酸性であって、アスパラギンに結合した糖鎖付加についての認識部位を欠いている（アスパラギンに結合した糖鎖付加についての認識部位を含むＩＮＦ−α  １４は例外として）。位置２３および３４でアミノ酸が異なるＩＦＮ−α  ２の３つのバリアントが知られている：ＩＦＮ−α  ２ａ（Ｌｙｓ−２３、Ｈｉｓ−３４）；ＩＦＮ−α  ２ｂ（Ａｒｇ−２３、Ｈｉｓ−３４）；およびＩＦＮ−α  ２ｃ（Ａｒｇ−２３、Ａｒｇ−３４）。ＩＦＮ−α  ２ａおよびＩＦＮ−α  ２ｃは、ＩＦＮ−α  ２ｂの対立遺伝子バリアントである。Gewert et al (1993) J. Interferon Res. vol 13, p 227-231を参照のこと。ＩＮＦ−α種のアミノ酸含量におけるわずかな差異は、インターフェロンの糖鎖付加をもたらすことを期待されない。すなわち、糖鎖付加パターンは、ＩＮＦ−α  ２ａ、２ｂおよび２ｃのそれぞれで本質的に同じである。２つの他のヒトＩＦＮ種、すなわちＩＦＮ−ω１およびＩＦＮ−βはＮ−グリコシル化されており、ＩＦＮ−αと遠縁にあたる：ＩＦＮ−α、−βおよび−ωはまとめてクラスＩ  ＩＦＮといわれ、同じ高親和性細胞膜受容体に結合する(Adolf et al. (1991) Biochem. J. 276:511-518)。
【００２５】
Adolfら（上記）は、ヒト白血球ＩＦＮ由来の天然のＩＦＮ−α  ２の単離に、モノクローナル抗体の特性を使用した。彼らは、ＩＦＮ−αの期待された抗ウイルス活性が確認された免疫アフィニティークロマトグラフィーによって９５％の純度のタンパク質を得た。逆相ＨＰＬＣによる天然のＩＦＮ−α  ２の分析は、天然のタンパク質が２つの成分に分解され得、両方とも大腸菌由来のＩＦＮ−α  ２より親水性であることを示した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥは、タンパク質の分子量が不均一であって、３つのバンドをもたらし、その全てが等価の大腸菌由来のタンパク質より低い電気泳動移動度を有することを明らかにした。
【００２６】
Adolfら（上記）はまた、天然のＩＦＮ−α  ２はＯに結合した炭水化物残基を担持していると推測していた。彼らの仮説は、アルカリを用いた推定上のペプチド−炭水化物結合の開裂によって確認され；得られたタンパク質は相同であって、組換えタンパク質と同じ分子量を示した。得られたフラグメントの分離および分析に続く、タンパク質分解性の開裂による天然および組換えタンパク質のさらなる比較は、候補グリコペプチドの決定を可能にした。このペプチドの配列分析は、Ｏ−糖鎖付加部位としてＴｈｒ−１０６を同定した。公開されている全てのＩＦＮ−α  ２種のアミノ酸配列の比較は、このスレオニン残基がＩＦＮ−α  ２に特有であることを明らかにした。全ての他のタンパク質では、グリシン、イソロイシンまたはグルタミン酸が対応する位置（１０７）に存在している。
【００２７】
大腸菌において産生されるＩＮＦ−α  ２の調製物は、Ｏ−糖鎖付加を欠いており、多くの国で薬物として登録されている。しかし、治療上適用される大腸菌由来のＩＦＮ−α  ２の免疫原性は、糖鎖付加の欠如によって影響を受けているに違いない。研究は、酵母において産生された組換えのヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を受けた１６人の患者のうち４人がこのタンパク質に対する抗体を発達させたことを示している。興味深いことに、これらの抗体は、内因性のヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子においてＯに結合した糖鎖付加によって保護されているが、組換え体の因子においては露出しているエピトープと反応することが見出されている（Adolfら、上記）。
【００２８】
同様に、患者の処置を延長した後での組換えの大腸菌由来のＩＮＦ−α  ２に対する抗体の誘導について記載されており、天然のＩＮＦ−α  ２は、組換えのＩＮＦ−α  ２タンパク質より免疫原性が低くなり得ることが推測されている(Galton et al. (1989) Lancet 2:572-573)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
必要なことは、インターフェロン、Ｇ−ＣＳＦおよびエリスロポエチンを含む抗体およびサイトカインなどの治療または医薬用タンパク質を産生するための改善された方法が必要とされていることである。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
発明の概要
本発明は、外因性配列を発現させて、トリの表現型を変化させるか、あるいは所望のタンパク質を発現させることを目的として、トリのゲノムに外因性の核酸配列を安定的に導入するためのベクターおよび方法を提供する。特に、その輸卵管において外因性の配列を発現し、医薬用タンパク質などの外因性タンパク質を卵中に沈着する遺伝子導入トリが作製される。そのような外因性タンパク質を含むトリの卵は、本発明に含まれる。本発明はさらに、形質導入のトリの輸卵管において効率的に発現され、トリの卵に沈着する、インターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＭＣＳＦおよびエリスロポエチンを含む治療用タンパク質（例えば、ヒトサイトカイン）の新規の形態を提供する。
【００３１】
本発明の１つの態様は、トリの特定の組織において外因性タンパク質を産生する方法を提供する。外因性タンパク質を、トリの輸卵管、血液および／または他の細胞および組織において発現させてもよい。１つの実施態様において、例えばステージＸ付近の胚性胚盤葉細胞に導入遺伝子を導入して、遺伝子導入トリを作製し、目的のタンパク質を輸卵管の筒部の管状腺細胞において発現させて、管腔に分泌させ、固い殻の卵の卵白中に沈着させる。このように作製した遺伝子導入トリは、その生殖細胞中に導入遺伝子を担持する。従って、外因性遺伝子は、トリ胚細胞への外因性遺伝子の人工的な導入、およびメンデルの法則に従った様式でのトリの子孫への外因性遺伝子の安定した伝達の両方によって、トリに伝達され得る。
【００３２】
本発明は、トリの輸卵管において外因性タンパク質を産生する方法を含む。方法は、第１の工程として、コード配列およびコード配列と作動可能に連結された（プロモーターがトリの輸卵管において核酸の発現をもたらし得るように）プロモーターを含むベクターを提供する工程を含む。次いで、形質導入の細胞および／または組織を産生してもよい（ここで、ベクターは、培養物中で新たに単離したか、胚中のトリの胚性胚盤葉細胞に導入される）。ベクター配列を、例えばトリのゲノムにランダムに挿入するなど、挿入する。最後に、輸卵管において外因性タンパク質を発現する成熟形質導入トリを、形質導入細胞および／または組織から得てもよい。この方法はまた、輸卵管において発現させた外因性タンパク質を輸卵管管腔に分泌させ、卵中（例えば、固い卵の卵白中）に沈着させた場合に、医薬用タンパク質（例えば、サイトカイン）などの外因性タンパク質を含むトリの卵を産生するために使用され得る。
【００３３】
１つの態様において、トリゲノムへのベクターの染色体挿入による遺伝子導入トリの作製は、所望により、胚性胚盤葉細胞のＤＮＡ形質導入を含んでもよく、次いで、その細胞を、レシピエントの胚盤葉の真下の胚下腔に注入する。そのような方法において使用されるベクターは、外因性のコード配列に融合されているプロモーターを有してもよく、輸卵管の管状腺細胞中でコード配列の発現を指令する。
【００３４】
本発明の別の態様において、ランダムな染色体挿入および遺伝子導入トリの作製は、レトロウイルスレクター（rector）の５’および３’ＬＴＲの間に導入遺伝子の遺伝暗号を担持する、複製欠損または複製コンピテントなレトロウイルス粒子での胚性胚盤葉細胞の形質導入によって達成される。例えば、プロモーター領域のセグメントの下流に挿入されている外因性遺伝子を含む改変ｐＮＬＢプラスミドを含むトリの白血球ウイルス（ＡＬＶ）レトロウイルスベクターまたはマウスの白血球ウイルス（ＭＬＶ）レトロウイルスベクターを使用してもよい。ウイルス粒子にパッケージされている改変レトロウイルスベクターのＲＮＡコピーは、遺伝子導入トリに発達する胚性胚盤葉に感染させるために使用してもよい。あるいは、レトロウイルス形質導入粒子を産生するヘルパー細胞を胚性胚盤葉に送達してもよい。
【００３５】
本発明の別の態様は、コード配列がトリ輸卵管において発現されるような作動および位置関係にあるコード配列およびプロモーター配列を含むベクターを提供する。そのようなベクターとしては、限定するものではないが、トリの白血球ウイルス（ＡＬＶ）レトロウイルスベクター、マウスの白血球ウイルス（ＭＬＶ）レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターが挙げられる。さらに、ベクターは、トリの白血球ウイルス（ＡＬＶ）レトロウイルスベクター、マウスの白血球ウイルス（ＭＬＶ）レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターのＬＴＲを含む核酸配列であってもよい。プロモーターは、トリ輸卵管のコード配列の発現をもたらすことに十分である。コード配列は、固い殻の卵の卵白に沈着される外因性タンパク質をコードする。または、コード配列は、インターフェロン−α  ２ｂ（ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂ）および遺伝子導入家禽由来のエリスロポイエチン（ＴＰＤ  ＥＰＯ）および遺伝子導入家禽由来の顆粒球コロニー刺激因子などの遺伝子導入家禽由来のタンパク質などの外因性タンパク質をコードする。１つの実施態様において、本発明の方法で使用されるベクターは、トリおよびその卵における外因性タンパク質の発現に特に適しているプロモーターを含む。または、外因性コード配列の発現は、遺伝子導入トリの輸卵管および血液トリの卵の卵白において生じ得る。プロモーターとしては、限定するものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＭＤＯＴプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、β−アクチンプロモーター(例えば、ニワトリβ−アクチンプロモーター)、マウス白血球ウイルス（ＭＬＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、卵白アルブミンプロモーター、リゾチームプロモーター、コンアルブミンプロモーター、オボムコイドプロモーター、オボムチンプロモーターおよびオボトランスフェリンプロモーターが挙げられる。所望により、プロモーターは、オバルブミン−、リゾチーム−、コンアルブミン−、オボムコイド−、およびオボトランスフェリンプロモーター領域のセグメントなどの、少なくとも１つのプロモーター領域のセグメントであってもよい。１つの実施態様において、プロモーターは、オバルブミン−、リゾチーム−、コンアルブミン−、オボムコイド−、およびオボトランスフェリンプロモーターなどの１つ以上のプロモーターの組合せまたは融合体または１つ以上のプロモーターの部分の融合である。
【００３６】
本発明の１つの態様は、輸卵管の筒部の管状腺細胞での発現に必要とされるエレメントを保持するものの、ベクター中に容易に組み込まれ得るのに十分に小さくなるように、オバルブミンプロモーターを切り詰めることおよび／またはオバルブミンプロモーターの重要な調節エレメントを凝縮することを含む。例えば、オバルブミンプロモーター領域のセグメントを使用してもよい。このセグメントは、オバルブミン遺伝子の５’隣接領域を含む。オバルブミンプロモーターセグメントの全長は、約０．８８ｋｂ〜約７．４ｋｂの長さであって、好ましくは約０．８８ｋｂ〜約１．４ｋｂの長さである。セグメントは好ましくは、オバルブミン遺伝子のステロイド依存性調節エレメントおよび陰性制御エレメントの両方を含む。セグメントはまた、所望により、オバルブミン遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）由来の残基を含む。あるいは、プロモーターは、リゾチーム−、コンアルブミン−、オボムコイド−、およびオボトランスフェリン遺伝子のプロモーター領域のセグメントであってもよい。そのようなプロモーターの例としては、オボムコイド（ＭＤ）およびオボトランスフェリン（ＯＴ）プロモーター由来のエレメントからなる合成ＭＤＯＴプロモーターである。
【００３７】
本発明の別の態様において、トリゲノムに組込まれるベクターは、外因性コード配列に作動可能に連結されている構成的プロモーターを含む（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターおよびマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）プロモーター）。あるいは、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）などの非構成的プロモーターを使用してもよい。
【００３８】
本発明の他の態様は、生殖細胞組織の遺伝物質中に導入遺伝子を担持する遺伝子導入トリを提供する。さらに詳細には、導入遺伝子は作動および位置関係にある外因性遺伝子およびプロモーターを含んで、外因性遺伝子を発現する。外因性遺伝子は、トリ輸卵管および遺伝子導入トリの血液中で発現させてもよい。外因性遺伝子は、ＴＰＤ  ＩＦＮ−α（例えば、ＩＦＮ−α  ２）およびＴＰＤ  ＥＰＯおよびＴＰＤ  Ｇ−ＣＳＦなどのサイトカインを含む医薬用タンパク質などの外因性タンパク質をコードする。外因性タンパク質は、固い殻の卵の卵白中に沈着する。
【００３９】
本発明の別の態様は、トリ種に外因性であるタンパク質を含むトリ卵を提供する。本発明の使用は、輸卵管筒部の管腔へのタンパク質の分泌およびトリ卵の卵白への沈着を伴う輸卵管細胞での外因性タンパク質の発現を可能にする。卵中に内包されているタンパク質は、１ｇまでまたはそれ以上の量で存在してもよい。外因性タンパク質としては、限定するものではないが、ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２およびＴＰＤ  ＥＰＯおよびＴＰＤ  Ｇ−ＣＳＦが挙げられる。
【００４０】
本発明のさらに別の態様は、ヒトインターフェロン−α  ２ｂ（ＩＦＮ−α  ２ｂ）の最適化されたコード配列、すなわち、遺伝子導入家禽由来のインターフェロン−α  ２ｂ（ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂ）をコードする遺伝子導入家禽由来のインターフェロン−α  ２ｂをコードする組換えの配列を含む、単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。本発明はまた、ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂのポリヌクレオチド配列を含む単離されたタンパク質を含み、ここで、タンパク質はＴｈｒ−１０６にてN-アセチル-ガラクトースアミン、ガラクトース、N-アセチル-グルコサミン、シアル酸およびその組合せを用いてＯ−グリコシル化されている。
【００４１】
本発明はさらに、ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂのポリペプチド配列を含む医薬組成物を意図し、ここで、タンパク質はＴｈｒ−１０６にてＮ−アセチル−ガラクトースアミン、ガラクトース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、シアル酸およびその組合せを用いてＯ−グリコシル化されている。
【００４２】
本発明の１つの態様は、本明細書にて開示するように作製した外因性タンパク質のコード配列を提供し、ここで、コード配列はトリ、例えば、ニワトリにおける発現に最適化されているコドンである。コドンの最適化は、トリ細胞において発現されるタンパク質の少なくとも１つ、好ましくは２つ以上のコドン使用から決定してもよい。例えば、コドン使用は、ニワトリのオバルブミン、リゾチーム、オボムチンおよびオボトランスフェリンなどのタンパク質をコードする核酸配列から決定してもよい。例えば、外因性遺伝子のＤＮＡコード配列は、ニワトリ（Gallus gallus）のオバルブミン、リゾチーム、オボムコイドおよびオボトランスフェリンタンパク質から作製したコドン使用頻度表と一緒にＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰａｃｋａｇｅのＢＡＣＫＴＲＡＮＳＬＡＴＥ（登録商標）プログラム，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．１  （Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｉｎｃ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を使用して、最適化したコドンであってもよい。
【００４３】
本発明の１つの態様は、ヒトエリスロポイエチン（ＥＰＯ）の最適化されたコード配列、すなわち、遺伝子導入家禽由来のエリスロポイエチン（ＴＰＤ  ＥＰＯ）をコードする遺伝子導入家禽由来のエリスロポイエチンをコードする組換えの配列を含む単離されたポリペプチド配列を提供する。
【００４４】
本発明の別の態様は、第１および第２のコード配列、および第１および第２のコード配列に対して作動および位置関係にあるプロモーターを含むベクターを提供して、トリ輸卵管において第１および第２のコード配列を発現する。この態様において、ベクターは、第１と第２のコード配列の間に位置する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを含んでもよく、ここで、第１のコード配列はタンパク質Ｘをコードし、第２のコード配列はタンパク質Ｙをコードし、ここで、タンパク質Ｘおよびタンパク質Ｙの一方または両方は、固い殻の卵の卵（例えば、卵白）中に沈着される。
【００４５】
例えば、タンパク質Ｘは、モノクローナル抗体の軽鎖（ＬＣ）であってもよく、タンパク質Ｙは、モノクローナル抗体の重鎖（ＨＣ）であってもよい。あるいは、第２のコード配列にコードされるタンパク質（例えば、酵素）は、第１のコード配列にコードされるタンパク質の翻訳後修飾を提供可能である。ベクターは所望により、ベクター中の各コード配列がＩＲＥＳエレメントによって他方のコード配列から分離されるように、さらなるコード配列およびさらなるＩＲＥＳエレメントを含む。本発明における使用が意図されるＩＲＥＳを用いている他の例は、例えば、２００５年１月３１日に出願の米国特許出願１１／０４７，１８４において開示されている（開示全体を出典明示により援用する）。
【００４６】
本発明はまた、モノクローナル抗体、酵素および他のタンパク質を含む医薬用タンパク質などのタンパク質を含むトリの卵を産生する方法を意図している。そのような方法は、プロモーター、コード配列、および少なくとも１つのＩＲＥＳエレメントを有するベクターを提供し；トリ胚性胚盤葉細胞にベクターを導入することによって遺伝子導入細胞または組織を作製し、ここで、ベクターの配列はトリゲノムにランダムに挿入されており；遺伝子導入細胞または組織からトリを得る。そのようにして得られた遺伝子導入トリは、輸卵管においてコード配列を発現し得、輸卵管管腔に分泌された得られたタンパク質は固い殻の卵の卵白中に沈着される。さらに、本発明は、組換えタンパク質を含む卵を産生する遺伝子導入トリの子孫を含む。典型的には、子孫は、トリの本質的に全ての細胞に導入遺伝子を含んでいるか、あるいは子孫のトリの細胞は導入遺伝子を全く含んでいないかのいずれかである。
【００４７】
本発明の１つの重要な態様は、限定するものではないが、医薬用タンパク質を含む外因性ペプチドまたはタンパク質を含むトリの固い殻の卵（例えば、ニワトリの固い殻の卵）に関する。外因性ペプチドまたはタンパク質は、遺伝子導入トリの導入遺伝子によってコードされてもよい。１つの実施態様において、外因性ペプチドまたはタンパク質（例えば、医薬用タンパク質）はグリコシル化されている。タンパク質は、任意の有用な量で存在してもよい。１つの実施態様において、タンパク質は、約０．０１μｇ／固い殻の卵〜約１ｇ／固い殻の卵の間の範囲の量で存在する。別の実施態様において、タンパク質は、約１μｇ／固い殻の卵〜約１ｇ／固い殻の卵の間の範囲の量で存在する。例えば、タンパク質は、約１０μｇ／固い殻の卵〜約１ｇ／固い殻の卵の間の範囲の量（例えば、約１０μｇ／固い殻の卵〜約４００ｍｇ／固い殻の卵の間の範囲）で存在してもよい。
【００４８】
１つの実施態様において、外因性タンパク質（例えば、外因性医薬用タンパク質）は、卵の卵白中に存在する。１つの実施態様において、タンパク質は、約１ｎｇ／ｍｌ卵白〜約０．２ｇ／ｍｌ卵白の間の範囲の量で存在する。例えば、タンパク質は、約０．１μｇ／ｍｌ卵白〜約０．２ｇ／ｍｌ卵白の間の範囲の量で存在してもよい（例えば、タンパク質は、約１μｇ／ｍｌ卵白〜約１００ｍｇ／ｍｌ卵白の間の範囲の量で存在してもよい）。１つの実施態様において、タンパク質は、約１μｇ／ｍｌ卵白〜約５０ｍｇ／ｍｌ卵白の間の範囲の量で存在する。例えば、タンパク質は、約１μｇ／ｍｌ卵白〜約１０ｍｇ／ｍｌ卵白の間の範囲の量で存在してもよい（タンパク質は、約１μｇ／ｍｌ卵白〜約１ｍｇ／ｍｌ卵白の間の範囲の量で存在してもよい）。
【００４９】
本発明は、１つ以上の医薬用タンパク質を含む任意の有用なタンパク質を含む固い殻の卵の産生を意図する。そのようなタンパク質としては、限定するものではないが、ホルモン、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの部分、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポイエチンおよびインターフェロン）ならびにＣＴＬＡ４が挙げられる。本発明はまた、限定するものではないが、特定の有用なペプチド配列に融合させた免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの部分を含む融合タンパク質を含む固い殻の卵の産生を含む。１つの実施態様において、本発明は、抗体のＦｃフラグメントを含む固い殻の卵の産生を提供する。例えば、卵は、本発明によるＦｃ−ＣＴＬＡ４融合タンパク質を含み得る。ベクターが導入された胚盤葉細胞から発生したトリは、Ｇ０世代であって、「ファウンダー」という。ファウンダートリは典型的に、挿入された各導入遺伝子についてのキメラである。すなわち、Ｇ０の遺伝子導入トリの細胞のいくつかだけが導入遺伝子を含む。また、Ｇ０世代を非遺伝子導入動物と交配させて、導入遺伝子についてヘミ接合性であり、本質的に全てのトリ細胞中に導入遺伝子を含むＧ１遺伝子導入の子孫を生じさせてもよい。Ｇ１ヘミ接合性子孫を非遺伝子導入動物と交配させて、Ｇ２ヘミ接合性子孫を生じさせてもよく、または導入遺伝子についてホモ接合性のＧ２子孫をともに生じさせてもよい。Ｇ１の子孫から得られ、導入遺伝子について陽性であるトリの実質的に全ての細胞が、導入遺伝子を含む。１つの実施態様において、同じ系統由来のヘミ接合性Ｇ２子孫を交配させて、導入遺伝子についてホモ接合性であるＧ３子孫を生じさせる。１つの実施態様において、ヘミ接合性Ｇ０動物同士を交配させて、動物の各細胞に２コピーの導入遺伝子を含むホモ接合性のＧ１子孫を生じさせる。これらは、特定の有用な育種法の単なる例に過ぎず、本発明は、当業者に公知の任意の育種法などのいずれの有用な育種法の利用も意図している。
【００５０】
本発明の１つの態様は、ニワトリ由来の糖鎖付加パターンなどの家禽由来の糖鎖付加パターンを有する、本発明により産生されたタンパク質を含む組成物に関する。例えば、本発明は、本明細書にて開示する糖鎖付加パターンの１つ以上など、家禽由来の糖鎖付加パターンを有する医薬用タンパク質を含む。本発明はまた、本明細書にて開示する糖鎖付加パターンの１つ以上など、家禽由来の糖鎖付加パターンを有する医薬用ヒトタンパク質を含む。
【００５１】
１つの態様において、本発明はＧ−ＣＳＦ（ここで、Ｇ−ＣＳＦは家禽由来の糖鎖付加パターン、すなわち、遺伝子導入家禽由来のＧ−ＣＳＦまたはＴＰＤ  Ｇ−ＣＳＦ）を含む。１つ実施態様において、糖鎖付加パターンはヒト細胞および／またはＣＨＯ細胞において産生されるＧ−ＣＳＦの糖鎖付加パターン以外のものである。すなわち、組成物は、家禽由来の糖鎖（すなわち、糖鎖付加構造）を有するＧ−ＣＳＦ分子を有しており、その糖鎖または糖鎖付加構造は、ヒト細胞および／またはＣｈｏ細胞から得られたＧ−ＣＳＦ上では見出されない。しかし、組成物はまた、ＣＨＯ細胞および／またはヒト細胞から得られたＧ−ＣＳＦ上で見出されるものと同じである糖鎖付加構造を有するＧ−ＣＳＦ分子を含んでもよい。ＣＨＯ細胞において産生されたヒトＧ−ＣＳＦの糖鎖付加が、以下において開示されている：Holloway, C.J., European J. of Cancer (1994) vol 30A, pS2-S6（出典明示により開示全体を援用する）;Oheda et al (1988) J. Biochem., v 103, p 544-546（出典明示により開示全体を援用する）、およびAndersen et al (1994) Glycobiology, vol 4, p 459-467（出典明示により開示全体を援用する）。実施例２０にて示すＡおよびＧなどの構造は、ＣＨＯ細胞において産生されるＧ−ＣＳＦについて報告されている糖鎖付加構造と同じであるか、あるいは類似であり得るようである。１つの実施態様において、ＴＰＤ  Ｇ−ＣＳＦの糖鎖付加パターンは、哺乳動物細胞において産生されたＧ−ＣＳＦのパターン以外のものである。
【００５２】
１つの実施態様において、本発明は単離されるべきＧ−ＣＳＦを提供する。すなわち、組成物中に含まれるＧ−ＣＳＦは、単離されたＧ−ＣＳＦであってもよい。例えば、Ｇ−ＣＳＦは卵白から単離されてもよい。単離されたＧ−ＣＳＦは、Ｇ−ＣＳＦ分子のうち異なる糖鎖付加構造を有するＧ−ＣＳＦ分子であってもよく、あるいは、単離されたＧ−ＣＳＦは、Ｇ−ＣＳＦ分子種のうち唯一の特定の糖鎖付加構造を有する単離されたそれぞれのＧ−ＣＳＦ種であってもよい。
【００５３】
１つの実施態様において、本発明の組成物のＧ−ＣＳＦは、固い殻の卵の中に存在する。例えば、Ｇ−ＣＳＦは、本発明の遺伝子導入トリによって産卵された固い殻の卵の卵白中に存在する。すなわち、１つの実施態様において、本発明は、本発明のＧ−ＣＳＦを含むトリ（例えば、ニワトリ）の卵白に関する。１つの実施態様において、Ｇ−ＣＳＦは、約１μｇ／ｍｌ卵白を超える量で卵白中に存在する。例えば、Ｇ−ＣＳＦは、約２μｇ／ｍｌ卵白より多い量で卵白中に存在する（例えば、卵白１ｍｌあたり約２μｇ〜約２００μｇの量で存在する）。
【００５４】
本発明の１つの特定の態様において、Ｇ−ＣＳＦは、トリの輸卵管細胞においてグリコシル化される（例えば、ニワトリの輸卵管細胞においてグリコシル化される）。例えば、Ｇ−ＣＳＦは、輸卵管細胞において産生され、グリコシル化され得る。１つの実施態様において、Ｇ−ＣＳＦは管状腺細胞においてグリコシル化される（例えば、Ｇ−ＣＳＦは管状腺細胞において産生され、グリコシル化される）。
【００５５】
Ｇ−ＣＳＦはスレオニン１３３にてグリコシル化されると考えられている。しかし、本発明は、Ｇ−ＣＳＦ分子上のいずれの特定の部位での糖鎖付加に限定されるものではない。
【００５６】
典型的には、本発明のＧ−ＣＳＦは、ヒトＧ−ＣＳＦである。１つの実施態様において、成熟Ｇ−ＣＳＦは図１８Ｃのアミノ酸配列を有する。
【００５７】
１つの実施態様において、本発明の組成物は、以下：
【化１】
2009530377.tif 000002
でグリコシル化されているＧ−ＣＳＦを含む。
【００５８】
本発明はまた、詳細には、これらの特定の糖鎖付加構造の１つを有するＧ−ＣＳＦ分子を含む組成物に関する。そのような組成物はまた、１つ以上の他の糖鎖付加構造を有する１つ以上のＧ−ＣＳＦ分子を含んでもよい。
【００５９】
すなわち、１つの実施態様において、本発明は、詳細には、以下：
【化２】
2009530377.tif 000003
を有するＧ−ＣＳＦ分子を含む組成物、および以下：
【化３】
2009530377.tif 000004
を有するＧ−ＣＳＦ分子を含む組成物、および以下：
【化４】
2009530377.tif 000005
を有するＧ−ＣＳＦ分子を含む組成物、および以下：
【化５】
2009530377.tif 000006
を有するＧ−ＣＳＦ分子を含む組成物、および以下：
【化６】
2009530377.tif 000007
を有するＧ−ＣＳＦ分子を含む組成物、および以下：
【化７】
2009530377.tif 000008
を有するＧ−ＣＳＦ分子を含む組成物、および以下：
【化８】
2009530377.tif 000009
［式中、Ｇａｌ＝ガラクトース、
ＮＡｃＧａｌ＝Ｎ−アセチル−ガラクロサミン、
ＮＡｃＧｌｕ＝Ｎ−アセチル−ガラクトサミンおよび
ＳＡ＝シアル酸］
を有するＧ−ＣＳＦ分子を含む組成物に関する。
【００６０】
本発明はまた、治療有効量のＴＰＤ  Ｇ−ＣＳＦを患者に投与する工程を包含する、患者において白血球カウントを増加させる方法に関する。典型的には、治療有効量は、所望の量によって患者において白血球カウントを増加させるＴＯＤ  Ｇ−ＣＳＦ量である。
【００６１】
関連、本願明細書および当業者の知識から明らかなそのような任意の組合せにおいて含まれる特徴が互いに矛盾しないという条件で、本願明細書に記載の特徴のいずれの有用な組合せが本発明の範囲内に含まれる。
【００６２】
さらに、本発明の目的および態様は、以下で説明する詳細な説明を、添付の図面（以下で簡単に説明する）と合わせて概観することでより明らかになるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
詳細な説明
特定の定義を本明細書において説明して、本発明を本明細書に記載するために使用する種々の用語の定義および範囲を示し、かつ定義する。
【００６４】
「核酸またはポリヌクレオチド」としては、限定するものではないが、天然のヌクレオシド塩基アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシルを含む、真核生物のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびに合成ＤＮＡおよびＲＮＡ配列が挙げられる。用語はまた、１つ以上の修飾塩基を有する配列を含む。
【００６５】
「治療用タンパク質」または「医薬用タンパク質」としては、全体または部分において薬物を構成するアミノ酸配列が挙げられる。「コード配列」または「読み取り枠」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、インビトロまたはインビボにおいて、ポリペプチドに、転写および翻訳され得る（ＤＮＡの場合）か、翻訳され得る（ｍＲＮＡの場合）ポリヌクレオチドまたは核酸配列をいう。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の翻訳開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンによって決定される。転写終結配列は通常、コード配列の３’側に位置する。コード配列は、非翻訳領域に５’側および／または３’側で隣接し得る。
【００６６】
「エキソン」は、遺伝子が核転写物に転写される場合に、核スプライシングによってイントロンまたは反転配列が除去された後で、細胞質のｍＲＮＡ上で発現される遺伝子の部分をいう。
【００６７】
核酸「制御配列」または「調節配列」は、定義の宿主細胞において所定のコード配列の転写および翻訳に必要かつ十分である、プロモーター配列、転写開始および終止コドン、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、エンハンサーなどをいう。真核生物細胞に適切な制御配列の例は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーである。所望の遺伝子の転写および翻訳に必要かつ十分である限り、これらの制御配列の全てが組換えベクター上に存在することが必要である。
【００６８】
「作動可能または作動可能に連結された」とは、所望の機能が実施されるような、コードおよび制御配列の配置をいう。従って、コード配列に作動可能に連結された制御配列は、コード配列の発現をもたらすことができる。ＤＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、コードされたタンパク質に転写され得るｍＲＮＡにコード配列が転写される場合、コード配列は細胞において転写調節領域の制御に作動可能に連結されているか、または制御下にある。制御配列がその発現を指令する限り、制御配列は、コード配列に近接する必要がある。従って、例えば、反転で翻訳されず、さらに転写もされない配列がプロモーター配列とコード配列の間に存在しており、プロモーター配列はまだ、コード配列に「作動可能に連結されている」と考えられ得る。
【００６９】
用語「異種」および「外因性」は、これらの用語がコード配列および制御配列などの核酸配列と関連する場合に、組換え構築物の領域または特定の染色体座とは通常関連しない、および／または特定の細胞とは関連しない配列を示す。従って、核酸構築物の「外因性」領域は、天然の他の分子とは関連が見出されない別の核酸分子内にあるか、または結合している核酸セグメントと同一であるといえる。例えば、構築物の外因性領域は、天然のコード配列との関連は見出されない配列に隣接するコード配列を含む。外因性コード配列の別の例は、コード配列自体が天然には見出されない構築物である（例えば、天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。同様に、本発明の目的について、宿主細胞中では通常存在しない構築物または核酸で形質転換した宿主細胞も外因性であると考えられる。
【００７０】
本明細書で使用する「外因性タンパク質」は、特定の組織または細胞中に天然では存在しないタンパク質、外因性発現構築物または導入遺伝子の発現産物であるタンパク質、または特定の組織または細胞では所定の量で天然には存在しないタンパク質をいう。卵に外因性であるタンパク質は、卵では通常見出されないタンパク質である。例えば、卵に外因性であるタンパク質は、産卵する動物の導入遺伝子中に存在するコード配列の発現の結果として卵中に存在するタンパク質であり得る。
【００７１】
「内因性遺伝子」とは、特定の細胞と通常関連する天然の遺伝子またはそのフラグメントをいう。
【００７２】
本明細書に記載の発現産物は、定義する化学構造を有するタンパク質性の物質からなり得る。しかし、タンパク質構造は多数の因子、特に、タンパク質に共通する化学修飾に依存している。例えば、全てのタンパク質は、イオン化可能なアミノおよびカルボキシル基を含むので、タンパク質は、酸性または塩基性塩の形態、あるいは中性塩の形態で得ることができる。一次アミノ酸配列は、糖分子（糖鎖付加）を使用するか、または、例えば、脂質、リン酸、アセチル基などとの共有またはイオン結合を含む、他の化学誘導体によって、誘導体化され得、しばしば糖類との関連によって生じる。これらの修飾は、インビトロまたはインビボで生じ得、ビボでは、翻訳後プロセッシング系を通じて宿主細胞によって実施される。そのような修飾は、分子の生物学的な活性を増加または減少させ得、そのように化学的に修飾された分子がまた本発明の範囲内になることが意図されている。
【００７３】
クローニング、増幅、発現および精製の代替方法は、当業者に明らかである。代表的な方法が、Sambrook, Fritsch, and Maniatis, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989)にて開示されている。
【００７４】
「ベクター」は、単鎖、二重鎖、管状またはスーパーコイル状ＤＮＡまたはＲＮＡからなるポリヌクレオチドである。典型的なベクターは、以下の機能性遺伝子の発現に適切な距離で作動可能に連結された以下のエレメントからなり得る：複製起点、プロモーター、エンハンサー、５’ｍＲＮＡリーダー配列、リボソーム結合部位、核酸カセット、終結およびポリアデニル化部位、ならびに選択可能なマーカー配列。１つ以上のこれらのエレメントが特定の適用において省略され得る。核酸カセットは、発現されるべき核酸配列の挿入のための制限部位を含み得る。機能性ベクターにおいて、核酸カセットは、翻訳開始および終結部位を含む、発現されるべき核酸配列を含む。イントロンは、所望により、構築物中、例えば、コード配列の５’側に含まれ得る。特定のコード配列が適切な調節配列を有するベクター中に配置されるように、ベクターは構築される。制御配列に関するコード配列の位置および配向は、コード配列が制御または調節配列の「制御」下で転写されるようになっている。目的の特定のタンパク質をコードする配列の改変は、本発明の目的を達成するために望ましい。例えば、いくつかの場合、配列を適切な配向とともに制御配列に結合させ得るように配列を改変するか；あるいは、読み枠を維持することが必要であり得る。制御配列および他の調節配列は、ベクターへの挿入より前にコード配列に連結され得る。あるいは、コード配列は、制御配列の調節性の制御を有しかつ調節性の制御下にあり、制御配列、および読み枠内にある適切な制限部位を既に含む発現ベクターに、直接クローニングされ得る。
【００７５】
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼが結合して遺伝子の転写を開始するＤＮＡ上の部位である。いくつかの実施態様において、プロモーターは配列の付加または欠失によって改変されるか、または天然および合成配列ならびに天然と合成配列の組合せであり得る配列を含む、別の配列で置換される。多くの真核生物プロモーターは、２つの型の認識配列、ＴＡＴＡボックスおよび上流プロモーター配列を含む。転写開始部位の上流に配置された上流プロモーターエレメントは、転写速度を決定し、ＴＡＴＡボックスの上流にあることが明らかな一方で、ＲＮＡポリメラーゼの正確な部位での転写の開始を指令することに関与している。エンハンサーエレメントはまた、連結されているプロモーターから転写を刺激され得るが、多くは特定の細胞型においてもっぱら機能している。ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターおよびマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）プロモーターなどのウイルス由来の多くのエンハンサー／プロモーターエレメントは、幅広い細胞型において全くの活性であって、「遍在性」といわれる。あるいは、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターなどの構成的プロモーターもまた、本発明において使用され得る。コード配列が目的のポリペプチドをコードする場合、コード配列は適切なｍＲＮＡ分子の産生をブロックし得る潜在性のスプライス部位を欠く、および／または異常にスプライスされたか異常であるｍＲＮＡ分子を産生するという条件で、クローニング部位に挿入される核酸配列は目的のポリペプチドをコードする任意の読み取り枠を有し得る。
【００７６】
用語「家禽由来」は、家禽で産生されるか家禽から得られた組成物または物質をいう。「家禽」は、限定するものではないが、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ウズラおよび走禽類を含む、家畜として飼育され得るトリをいう。例えば、「家禽由来」は、ニワトリ由来、シチメンチョウ由来および／またはウズラ由来をいい得る。
【００７７】
「マーカー遺伝子」は、正確に形質導入された細胞の同定および単離を可能にするタンパク質をコードする遺伝子である。適切なマーカー配列としては、限定するものではないが、緑色、黄色および青色蛍光タンパク質の遺伝子（それぞれＧＦＰ、ＹＦＰおよびＢＦＰ）が挙げられる。他の適切なマーカーとしては、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子が挙げられる。後者は、カナマイシン、ネオマイシンおよびギェネテシンなどのアミノグリコシド系抗生物質に対する抵抗を与える。これらのマーカー遺伝子、およびクロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）をコードするマーカー遺伝子など他のマーカー遺伝子が、所望のタンパク質を発現する遺伝子とともに主要な核酸カセットに組み込まれ得るか、あるいは選択マーカーが別々のベクター上に含まれて、同時形質導入され得る。
【００７８】
「レポーター遺伝子」は、レポーター遺伝子がコードするタンパク質の存在によって細胞中でのその活性を「報告」するマーカー遺伝子である。
【００７９】
「レトロウイルス粒子」、「形質導入用粒子」または「形質導入粒子」は、非ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に形質導入できる、複製欠損または複製コンピテントウイルスをいう。
【００８０】
用語「形質転換」、「形質導入」および「形質移入」は全て、ポリヌクレオチドのトリの胚盤葉細胞への導入を示す。「筒部」は、卵の卵白タンパク質を合成し、分泌する管状腺細胞を含む、卵管漏斗と峡部との間の輸卵管の部分である。
【００８１】
本明細書で使用する「ＭＤＯＴプロモーター」は、組織のうちとりわけ輸卵管の筒部の管状腺細胞において活性である合成プロモーターである。ＭＤＯＴは、オボムコイド（ＭＤ）およびオボトランスフェリンプロモーター由来のエレメントからなる（図１３）。
【００８２】
用語「最適化」は「最適化されたコード配列」に関連して使用され、ここで、卵白タンパク質オバルブミン、リゾチーム、オボムコイドおよびオボトランスフェリン中に見出される特定の各アミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンは、本発明のベクターに挿入されている、最適化されたヒトインターフェロン−α  ２ｂ（ＩＦＮ−α  ２ｂ）の設計において使用される。さらに詳細には、最適化されたヒトＩＦＮ−α  ２ｂについてのＤＮＡ配列は、雌鳥の輸卵管のコドンの使用頻度に基づいており、ニワトリ（Gallus gallus）のオバルブミン、リゾチーム、オボムコイドおよびオボトランスフェリンタンパク質から作製したコドン使用頻度表と一緒にＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰａｃｋａｇｅのＢＡＣＫＴＲＡＮＳＬＡＴＥ（登録商標）プログラム，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｉｎｃ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を使用して、作製される。例えば、４つの卵白タンパク質におけるアミノ酸アラニンの４つのコドンの使用頻度の割合は、ＧＣＵについて３４％、ＧＣＣについて３１％、ＧＣＡについて２６％、およびＧＣＧについて８％である。従って、ＧＣＵは、最適化されたヒトＩＦＮ−α  ２ｂコード配列において、大部分のアラニンについてコドンとして使用されている。最適化されたヒトＩＦＮ−α  ２ｂについての遺伝子を含むベクターは、家禽の組織および卵において形質導入された家禽由来のＩＦＮ−α  ２ｂ（ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂ）を発現する形質導入トリを産生するために使用される。同様に、上記の方法は、本発明によって産生され得るヒトエリスロポイエチン（ＥＰＯ）または他のタンパク質などの他のコード配列タンパク質の設計に用いられる。
【００８３】
本発明の方法によって、導入遺伝子はトリの胚性細胞に導入されて、生殖系列の組織の遺伝物質中に導入遺伝子を担持する、遺伝子導入ニワトリ、遺伝子導入シチメンチョウ、遺伝子導入ウズラおよび他のトリ種を産生できる。胚盤葉細胞は、代表的には、ステージＶＩＩ〜ＸＩＩの細胞またはその等価物であって、１つの実施態様において、ステージＸ付近である。本発明において有用な細胞はとしては、胚性胚（ＥＧ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、および始原生殖細胞（ＰＧＣ）が挙げられる。胚性胚盤葉細胞は新たに単離され、培養物中で維持されるか、あるいは胚中に存在してもよい。
【００８４】
本発明の方法を実施することに有用なベクターを本明細書に記載する。これらのベクターは、外因性コード配列のトリゲノムへの安定導入に使用され得る。あるいは、ベクターは、トリの特定の組織、例えば、トリの輸卵管組織において外因性タンパク質を産生するために使用され得る。ベクターはまた方法において使用されて、外因性タンパク質を含むトリの卵を産生し得る。１つの実施態様において、コード配列およびプロモーターはともに、胚盤葉細胞への導入前に、５’および３’ＬＴＲの間に位置する。１つの実施態様において、ベクターはレトロウイルス性であって、コード配列およびプロモーターはともに、レトロウイルスベクターの５’および３’ＬＴＲの間に位置する。１つの有用な実施態様において、ＬＴＲまたはレトロウイルスベクターは、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）またはレンチウイルスに由来する。
【００８５】
１つの実施態様において、ベクターはコード配列に作動可能に連結されているシグナルペプチドコード配列を含んでおり、細胞での翻訳に際して、シグナルペプチドはベクターによって発現された外因性タンパク質の固い殻の卵の卵白への分泌を指令する。ベクターは、マーカー遺伝子（ここで、マーカー遺伝子はプロモーターに作動可能に連結されている）を含み得る。
【００８６】
いくつかの場合において、本発明のベクターの胚性胚盤葉細胞への導入は、新たに単離されたか、培養中であるかのいずれかである胚性胚盤葉細胞を用いて実施される。次いで、遺伝子導入細胞は、代表的には、卵中のレシピエント胚盤葉の下の胚下腔に注入される。いくつかの場合において、しかし、ベクターは胚盤葉胚の細胞に直接送達される。
【００８７】
本発明の１つの実施態様において、胚盤葉細胞を形質移入し、トリゲノムへの安定した組込みを生じるために使用されるベクターは、トリ輸卵管の筒部の管状腺細胞においてコード配列を発現するような作動および位置関係にあるコード配列およびプロモーターを含み、ここで、コード配列は、固い殻の卵の卵白に沈着される外因性タンパク質をコードする。プロモーターは、所望により、管状腺細胞におけるコード配列の発現を指令するために十分大きなオバルブミンプロモーターの領域のセグメントであってもよい。本発明は、配列がベクター中に容易に組み込まれ得るために十分小さい一方、輸卵管の筒部の管状腺細胞における発現に必要とされる配列を保持するように、オバルブミンプロモーターを切断すること、および／またはオバルブミンプロモーターの重要な調節エレメントを凝縮することを含む。１つの実施態様において、オバルブミンプロモーター領域のセグメントが使用され得る。このセグメントは、オバルブミン遺伝子の５’隣接領域を含む。オバルブミンプロモーターセグメントの全長は、約０．８８ｋｂ〜約７．４ｋｂの長さであってもよく、好ましくは、約０．８８ｋｂ〜約１．４ｋｂの長さである。セグメントは、好ましくは、オバルブミン遺伝子のステロイド依存性調節エレメントおよび陰性調節エレメントの両方を含む。セグメントはまた、所望により、オバルブミン遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）由来の残基を含む。従って、プロモーターは、オバルブミン−、リゾチーム−、コンアルブミン−、オボムコイド−、オボトランスフェリン−またはオボムコイド遺伝子由来のプロモーター領域に由来してもよい（図１４）。そのようなプロモーターの例は、オボムコイドおよびオボトランスフェリンプロモーター由来のエレメントからなる合成ＭＤＯＴプロモーターである（図１３）。プロモーターはまた、リゾチームプロモーターなどの、筒部に対してかなりではあるものの完全にではなく特異的なプロモーターであり得る。プロモーターはまた、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターであってもよい。あるいは、プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＭＤＯＴプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス白血球ウイルス（ＭＬＶ）プロモーターなど）であってもよい。本発明の好ましい実施態様において、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＭＤＯＴプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）プロモーター、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、オバルブミンプロモーター、リゾチームプロモーター、コンアルブミンプロモーター、オボムコイドプロモーター、オボムチンプロモーター、およびオボトランスフェリンプロモーターである。所望により、プロモーターは、プロモーターは、オバルブミン−、リゾチーム−、コンアルブミン−、オボムコイド−およびオボトランスフェリン−プロモーター領域のセグメントなど、少なくとも１つのプロモーター領域のセグメントであり得る。１つの実施態様において、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。
【００８８】
図１Ａおよび１Ｂは、オバルブミンプロモーター発現ベクターの例を示している。遺伝子Ｘは、外因性タンパク質をコードするコード配列である。湾曲した矢印は、転写開始部位を示す。１つの例において、ベクターは、オバルブミン遺伝子の５’隣接領域の１．４ｋｂを含む（図１Ａ）。図１Ａの「１．４ｋｂのプロモーター」の配列は、オバルブミン転写開始部位の約１．４ｋｂ上流（１．４ｋｂ）から開始し、オバルブミン遺伝子の５’非翻訳領域に約９残基伸びる配列に対応している。約１．４ｋｂの長さのセグメントは、２つの重要な調節配列、ステロイド依存性調節エレメント（ＳＤＲＥ）および陰性調節エレメント（ＮＲＥ）を有している。ＮＲＥは、ホルモン（例えば、エストロゲン）の非存在下で遺伝子の発現をブロックするいくつかの陰性調節エレメントを含むので、ＮＲＥといわれる。０．８８ｋｂより短いセグメントがまた、両方のエレメントを含む。別の例において、ベクターは、オバルブミン遺伝子の５’隣接領域約７．４ｋｂを含み、さらなるエレメント（ＨＳ−ＩＩＩおよびＨＳ−ＩＶ、一方はエストロゲンによる遺伝子の誘導が可能な機能性エレメントを含むことが知られている）を有する（図ＩＢ）。６ｋｂより短いセグメントはまた、４つのエレメント全てを含み、所望により、本発明において使用してもよい。本発明によるランダムな組込みに使用される各ベクターは、好ましくは、ゲノムの挿入部位にて活性化および不活化の両方から遺伝子を絶縁するニワトリβ−グロビン遺伝子座由来の１．２ｋｂのエレメント少なくとも１つを含む。１つの実施態様において、２つのインスレーター配列がオバルブミン構築物の一方の末端に付加される。β−グロビン遺伝子座において、インスレーター配列は遠位性の遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）がグロビン遺伝子ドメインの上流遺伝子を活性化するのを阻害する働きをする。インスレーター配列は遺伝子導入ハエにおいて位置効果を克服することが示されており、挿入部位に対する陽性および陰性効果両方から守り得ることを示している。導入遺伝子は複数または直列のコピーで組み込まれ得、隣接する導入遺伝子のインスレーターに隣接する一連の遺伝子を作り出すので、インスレーター配列は、遺伝子の５’側または３’側のいずれかにおいてのみ必要とされる。別の実施態様において、インスレーター配列は、ベクターに連結されるが、ベクターと一緒に同時に形質移入される。この場合、ベクター及び配列は、ゲノムへのランダムな組込みプロセスによって細胞中で直列に繋げられる。
【００８９】
各ベクターはまた所望によりマーカー遺伝子を含み、発現ベクターを安定して組込んでいる細胞クローンの同定および濃縮を可能にし得る。マーカー遺伝子の発現は、広範な細胞型において高レベルの発現を駆動させる遍在性プロモーターによって駆動される。本発明の１つの実施態様において、マーカー遺伝子はリゾチームプロモーターによって駆動されるヒトインターフェロンである。別の実施態様において、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子（Zolotukhin et al., J. Virol 70:4646-4654 (1995)）が、ツメガエル伸長因子１−α（ｅｆ−１−α）プロモーターによって駆動される（Johnson and Krieg, Gene 147:223-26 (1994)）。ツメガエルｅｆ−１−αプロモーターは、広範な細胞型において発現される強力なプロモーターである。ＧＦＰは、その蛍光を増強する変異を含んでおり、ヒト化されているか、あるいは、コドンがヒト遺伝子のコドン使用頻度プロフィールに調和するように改変されている。トリのコドン使用頻度はヒトのコドン使用頻度と事実上同じなので、遺伝子のヒト化形態もまたトリの胚盤葉細胞において高度に発現される。別の実施態様において、マーカー遺伝子は、遍在性プロモーター、ＨＳＶ  ｔｋ、ＣＭＶ、β−アクチンまたはＲＳＶの１つに作動可能に連結される。
【００９０】
ヒトおよびトリのコドン使用頻度がよく調和されている一方で、非脊椎動物の遺伝子が導入遺伝子におけるコード配列として使用される場合、非脊椎動物の遺伝子配列は改変されて、コドンの使用頻度がヒトおよびトリのものに類似するように適切なコドンに変化させる。
【００９１】
胚盤葉細胞の形質移入は、当業者に公知のいくつもの方法によって媒介されてもよい。ベクターの細胞への導入は、まず核酸を細胞膜の通過を容易にすることに役立つポリリシンまたは陽イオン性脂質と混合することによって促進され得る。しかし、ベクターの細胞への導入は、好ましくは、リポソームまたはウイルスなどの送達ビヒクルの使用によって達成される。本発明のベクターを胚盤葉細胞に導入するために使用され得るウイルスとしては、限定するものではないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルスが挙げられる。胚盤葉細胞を形質移入する１つの方法において、パッケージされたレトロウイルスに基づくベクターが使用されて、ベクターを胚性胚盤葉細胞に送達され、ベクターがトリゲノムに組込まれる。
【００９２】
レトロウイルス性形質導入粒子を胚中の胚性胚盤葉細胞に送達するための別法として、レトロウイルスを産生するヘルパー細胞が胚盤葉に送達され得る。導入遺伝子のトリゲノムへのランダムな導入に有用なレトロウイルスは、複製欠損トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、複製欠損マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）またはレンチウイルスである。適切なレトロウイルスベクターを作製するために、ｐＮＬＢベクターが、オバルブミンプロモーターおよびレトロウイルスゲノムの５’および３’末端反復配列（ＬＴＲ）の間の１つ以上の外因性遺伝子の領域を挿入することによって改変される。本発明は、管状腺細胞において活性であるプロモーターの下流に入れられた任意のコード配列が、管状腺細胞において発現されることを意図している。例えば、オバルブミンプロモーターがオバルブミンタンパク質の発現を駆動させ、輸卵管管状腺細胞において活性であるので、オバルブミンプロモーターは輸卵管筒部の管状腺細胞において発現される。培養輸卵管管状腺細胞においてアッセイした場合、７．４ｋｂのオバルブミンプロモーターが最も活性な構築物を作り出すことが見出されている一方、レトロウイルス性ベクターにおける使用のために、好ましくは、オバルブミンプロモーターは短縮される。１つの実施態様において、レトロウイルス性ベクターは、１．４ｋｂのオバルブミンプロモーターセグメントを含み；０．８８ｋｂのセグメントもまた十分である。
【００９３】
本発明のベクターのいずれもまた、所望により、輸卵管の管状腺細胞からベクターのコード配列によって発現されるタンパク質の分泌を指令するシグナルペプチドをコードするコード配列を含んでもよい。本発明のこの態様は、本発明の方法を使用してトリの卵中に沈着され得る外因性タンパク質の範囲を有効に広げる。外因性タンパク質が分泌されない場合、コード配列を含むベクターは改変されて、リゾチーム由来のシグナルペプチドをコードする約６０ｂｐを含むＤＮＡ配列を含む。シグナルペプチドがＤＮＡによってコードされるタンパク質のＮ末端に位置するように、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は挿入される。
【００９４】
図２Ａ〜２Ｄは、適切なレトロウイルス性ベクター構築物の例を示している。ベクター構築物は、５’および３’隣接ＬＴＲとともにトリゲノムに挿入される。Ｎｅｏは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。湾曲した矢印は転写開始部位を示す。図２Ａおよび２Ｂはリゾチームシグナルペプチド（ＬＰＳ）をコードする配列を有するＬＴＲおよび輸卵管転写物を示す一方、図２Ｃおよび２Ｄは、そのような配列を有していない転写物を示している。レトロウイルス性ベクターのストラテジーには２つの部分がある。真核生物のシグナルペプチドを含むいずれのタンパク質も、図２Ｂおよび２Ｄで示すベクターにクローニングされ得る。通常分泌されないいずれのタンパク質も、図２Ａおよび２Ｂに示すベクターにクローニングされ、管状腺細胞からの分泌が可能になり得る。
【００９５】
図２Ｅは、外因性遺伝子をリゾチームシグナルペプチドベクターにクローニングするためのストラテジーを示す。２つの酵素を用いた消化の後に、増幅された遺伝子のプラスミドへの挿入を可能にする制限酵素部位を含むオリゴヌクレオチドプライマーの対を使用して、コード配列、遺伝子Ｘのコピーを増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応法が使用される。５’側および３’側オリゴヌクレオチドは、それぞれＢｓｕ３６ＩおよびＸｂａＩ制限部位を含む。本発明の別の態様は、本発明の任意のベクターにおける配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用を含み、ジシストロニックまたはポリシストロニックなｍＲＮＡ由来の２つ以上のタンパク質の翻訳を可能にする（実施例１５）。コード配列はＩＲＥＳによってもう一方のコード配列から分離されるように、ＩＲＥＳ単位は、１つ以上のさらなるコード配列の５’末端に融合され、次いで、ベクターの最初のコード配列の末端に挿入される（図２Ｆ、１５Ａおよび１５Ｄ）。一方のコード配列は他方のコード配列の産物を修飾可能な酵素をコードし得るので、本発明のこの態様に従うことで産物の翻訳後修飾が容易になる。例えば、第１のコード配列はヒドロキシル化されるコラーゲンをコードしてもよく、第２のコード配列によってコードされる酵素によって活性化される。図２Ｆのレトロウイルス性ベクターの例において、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントは、外因性コード配列（遺伝子Ｘおよび遺伝子Ｙ）の間に位置する。ＩＲＥＳは、オバルブミンプロモーターなどのプロモーターによって転写が指令される転写物から、タンパク質Ｘおよびタンパク質Ｙの両方が翻訳されることを可能にする。湾曲した矢印は、転写開始部位を示している。遺伝子Ｘによってコードされるタンパク質の発現は、管状腺細胞において最も高いことが期待され、遺伝子Ｘは特異的に発現されるが、分泌されない。遺伝子Ｙによってコードされるタンパク質もまた、管状腺細胞において特異的に発現されるが、効率的に分泌されるので、タンパク質Ｙは卵中にパッケージされる。図１５Ａおよび１５Ｄのレトロウイルス性ベクターにおいて、ヒトモノクローナル抗体の軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＬ）が脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来でＩＲＥＳの配置による単一のベクター、ｐＣＭＶ−ＬＣ−ｅｍｃｖＩＲＥＳ−ＨＣから発現される。転写はＣＭＶプロモーターによって駆動される（Murakami et al. (1997) ”High-level expression of exogenous genes by replication-competent retrovirus vectors with an internal ribosomal entry site” Gene 202:23-29；Chen et al. (1999) ”Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors” Dev. Biol. 214:370-384；Noel et al. (2000) ”Sustained systemic delivery of monoclonal antibodies by genetically modified skin fibroblasts” J. Invest. Dermatol. 115:740-745を参照のこと）。
【００９６】
本発明の別の態様において、産生されるＲＮＡに安定性を与えるために、本発明の任意の方法において使用されるベクターのコード配列には３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）が提供される。３’ＵＴＲがレトロウイルス性ベクターに付加される場合、３’ＵＴＲの付加がゲノムＲＮＡ全長の転写に干渉しないように、プロモーター、遺伝子Ｘおよび３’ＵＴＲの配向は構築物において反転されていなければならない。１つの実施態様において、３’ＵＴＲはオバルブミンまたはリゾチーム遺伝子のものであるか、または筒部細胞、すなわち、ＳＶ４０の後半領域において機能性である任意の３’ＵＴＲであってもよい。
【００９７】
本発明の別の実施態様において、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶ）は、トリの筒部において導入遺伝子のコード配列を発現させるために使用される。この場合、発現は筒部に限定されず；発現はまた、トリ内の他の組織（例えば、血液）においても生じる。構成的プロモーターおよびコード配列を含むそのような導入遺伝子の使用は、輸卵管でのタンパク質の発現、および続くタンパク質の卵白への分泌をもたらすか、または駆動させるために特に適切である（例えば、ニワトリにおけるＩＦＮ−α  ２ｂの発現用ｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＩＦＮベクターなどのＣＭＶ駆動構築物の例である図８Ａを参照のこと）。
【００９８】
図３Ａは、複製欠損トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）ベースのベクターｐＮＬＢ、本発明における使用に適切なベクターの略図を示している。ｐＮＬＢベクターにおいて、ＡＬＶベクターゲノムの大部分は、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）およびβ−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子によって置換される。図３Ｂは、ｌａｃＺがＣＭＶプロモーターおよびβ−ガラクタマーゼコード配列（β−ＬａまたはＢＬ）によって置換されているベクターｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＢＬを示している。ベクターの構築は、詳細な実施例において報告している（実施例１、下記参照）。β−ラクタマーゼタンパク質は、天然のシグナルペプチドであって；従って、血液および卵白において見出される。
【００９９】
トリ胚にｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＢＬベクターが形質移入される（実施例２、下記参照）。得られた安定形質移入雌鳥由来の卵の卵白は、卵１個あたり、分泌され、活性であるβ−ラクタマーゼ６０マイクログラム（μｇ）までを含む（実施例２および３、下記参照）。
【０１００】
図８Ａおよび８Ｂは、それぞれインターフェロン−α  ２ｂ（ＩＦＮ−α  ２ｂ）を発現するために使用されるｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＩＦＮベクター、およびエリスロポイエチン（ＥＰＯ）を発現するために使用されるｐＮＬＢ−ＭＤＯＴ−ＥＰＯベクターを示す。両方の外因性タンパク質（ＥＰＯ、ＩＦＮ）が、トリ、好ましくはニワトリおよびシチメンチョウにおいて発現される。
【０１０１】
ｐＮＬＢ−ＭＤＯＴ−ＥＰＯベクターが、ＢＬコード配列をＥＰＯコード配列と置換することで作製される（実施例１０、下記参照）。１つの実施態様において、ＭＤＯＴと呼ばれる合成プロモーターが、ＥＰＯの発現を駆動させるために用いられる。ＭＤＯＴは、オボムコイドおよびオボトランスフェリンプロモーター両方由来のエレメントを含む。ヒトＥＰＯについてのＤＮＡ配列は、ニワトリ（Gallus gallus）のオバルブミン、リゾチーム、オボムコイドおよびオボトランスフェリンタンパク質から作製したコドン使用頻度表と一緒にＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰａｃｋａｇｅのＢＡＣＫＴＲＡＮＳＬＡＴＥ（登録商標）プログラム，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．１  （Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｉｎｃ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を使用して作製された、雌鳥輸卵管に最適化されたコドン使用頻度に基づく。ＥＰＯのＤＮＡ配列は合成され、ベクターにクローニングされ、得られたプラスミドがｐＮＬＢ−ＭＤＯＴ−ＥＰＯである（ｐＡＶＩＪＣＲ−Ａ１４５．２７．２．２ともいう）。１つの実施態様において、形質移入用粒子（すなわち、形質移入粒子）がベクター用に作製され、これらの形質移入粒子は、胚に注入するために使用され得る適切な濃度を決定するために用量設定される。次いで、卵に形質移入用粒子が注入され、卵は２１日後に孵化する。
【０１０２】
次いで、孵化後１週間のヒヨコから収集した血清サンプルのＥＬＩＳＡアッセイによって、ＥＰＯレベルなどの外因性タンパク質レベルが測定され得る。交配のためにオスのトリを選択され、ここで、血清中にＥＰＯ導入遺伝子を含むＧ０雄鳥についてトリがスクリーニングされる。好ましくは、血清サンプル中に最も高いレベルの導入遺伝子を有する雄鳥を、人工授精によって非遺伝子導入雌鳥と交配させる。導入遺伝子の存在について、血液ＤＮＡサンプルをスクリーニングする。通常、多数のヒヨコが遺伝子導入体（Ｇ１トリ）であることが見出される。ヒトＥＰＯの存在について、ヒヨコの血清が試験される（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）。ヒトＥＰＯの存在について、Ｇ１の雌鳥由来の卵の卵白もまた試験される。本発明の卵中に存在するＥＰＯ（すなわち、ヒトＥＰＯの最適化されたコード配列由来）は、生物学的に活性である（実施例１１）。
【０１０３】
同様に、ＢＬコード配列をＩＦＮコード配列と置換することによってｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＩＦＮベクター（図８Ａ）が作製される（実施例１２、下記参照）。１つの実施態様において、構成的サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが、ＩＦＮの発現を駆動させるために用いられる。さらに詳細には、ＩＦＮコード配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）媒介即時型プロモーターおよびＳＶ４０ポリＡ部位によって制御される。図８Ａは、ニワトリおよびシチメンチョウなどのトリにおいてＩＦＮを発現させるために使用されるｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＩＦＮを示している。ヒトＩＦＮ−α  ２ｂに最適化されたコード配列を作製し、ここで、卵白タンパク質、オバルブミン、リゾチーム、オボムコイドおよびオボトランスフェリンにおいて見出される特定の各アミノ酸で最も頻繁に使用されるコドンを、本発明のベクターに挿入するヒトＩＦＮ−α  ２ｂ配列の設計において使用する。より詳細には、最適化されたヒトＩＦＮ−α  ２ｂについてのＤＮＡ配列（図１１Ａ）は雌鳥の輸卵管の最適化されたコドン使用頻度に基づいており、ニワトリ（Gallus gallus）のオバルブミン、リゾチーム、オボムコイドおよびオボトランスフェリンタンパク質から作製したコドン使用頻度表と一緒にＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰａｃｋａｇｅのＢＡＣＫＴＲＡＮＳＬＡＴＥ（登録商標）プログラム，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．１  （Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｉｎｃ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を使用して、作製される。例えば、４つの卵白タンパク質におけるアミノ酸アラニンの４つのコドンの使用頻度の割合は、ＧＣＵについて３４％、ＧＣＣについて３１％、ＧＣＡについて２６％、およびＧＣＧについて８％である。従って、ＧＣＵは、最適化されたヒトＩＦＮ−α  ２ｂコード配列において、大部分のアラニンについてコドンとして使用されている。最適化されたヒトＩＦＮ−α  ２ｂ配列についての遺伝子を含むベクターは、組織および卵においてＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂを発現する遺伝子導入トリを作製するために使用する。
【０１０４】
ベクター用に形質移入用粒子（すなわち、形質移入粒子）を作製し、胚に注入するために使用し得る適切な濃度を決定するために、用量設定をする（実施例２、下記参照）。上記のように、キメラトリを作製した（実施例１３も参照のこと、下記参照）。Ｓｐｅｋｓｎｉｊｄｅｒ手順（米国特許第５，８９７，９９８号）に従ってトリ卵に窓を作り、形質移入用粒子を卵に注入する。注入後約２１日で卵は孵化する。孵化１週間後にヒヨコから収集した血清サンプルから、ｈＩＦＮレベルを測定した（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）。ＥＰＯと同様に（上記）、交配のためにオスの鳥を選択する。血清中にＩＦＮ導入遺伝子を含むＧ０雄鳥についてスクリーニングするために、雄鳥の血清サンプルからＤＮＡが抽出される。血清サンプル中に最も高いレベルの導入遺伝子を有する雄鳥を、人工授精によって非遺伝子導入雌鳥と交配させる。導入遺伝子の存在について、血液ＤＮＡサンプルがスクリーニングされる。ｈＩＦＮの存在について、遺伝子導入雄鳥の血清が試験される（すなわち、ＥＬＩＳＡアッセイ）。外因性タンパク質が確認される場合、非遺伝子導入雌鳥の精子が人工授精に使用される。ここで、特定の割合の子孫は導入遺伝子を含む（例えば、５０％以上）。ＩＦＮ（すなわち、ヒトＩＦＮの最適化されたコード配列由来）が本発明の卵中に存在する場合、ＩＦＮは生物学活性について試験される。ＥＰＯと同様に、そのような卵は通常、ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂなどの生物学的に活性なＩＦＮを含む（図１１Ｂ）。
【０１０５】
トリ輸卵管における外因性タンパク質の産生および外因性タンパク質を含む卵の産生を提供する本発明の方法は、適切なベクターの提供およびベクターの胚性胚盤葉細胞への導入に続き、ベクターがトリゲノムに組込まれるようにさらなる工程を含む。続く工程は、前の工程において産生された遺伝子導入胚盤葉細胞から成熟遺伝子導入トリを得ることを含む。所望により、遺伝子導入胚盤葉細胞からを得ることは、遺伝子導入胚盤葉細胞を胚に移し、胚が完全に発生することを可能にし、結果として胚が発生可能になることで、細胞はトリに組込まれることになる。上記のように、得られたヒヨコは成長して成熟する。１つの実施態様において、胚盤葉胚の細胞は、胚の中で直接ベクターを形質移入または形質導入される（実施例２）。得られた胚は発生させられ、ヒヨコは成熟される。
【０１０６】
いずれにせよ、遺伝子導入胚盤葉細胞から作製した遺伝子導入トリは、ファウンダーとして知られている。いくつかのファウンダーは、輸卵管の筒部における管状腺細胞に導入遺伝子を担持する。これらのトリは、輸卵管において導入遺伝子によってコードされた外因性タンパク質を発現する。外因性タンパク質はまた、輸卵管に加えて他の組織（例えば、血液）において発現され得る。外因性タンパク質が適切なシグナル配列を含む場合、外因性タンパク質は輸卵管の管腔および卵の卵白に分泌される。いくつかのファウンダーは生殖系列ファウンダーである（実施例８および９）。生殖系列ファウンダーは、生殖系列組織の遺伝物質中に導入遺伝子を担持し、また、外因性タンパク質を発現する輸卵管筒部の管状腺細胞中に導入遺伝子を担持し得る。従って、本発明によれば、遺伝子導入トリ外因性タンパク質を発現する管状腺細胞を有し、遺伝子導入トリの子孫もまた、外因性タンパク質を発現する輸卵管筒部の管状腺細胞を有する。あるいは、子孫は、トリの特定の組織において外因性遺伝子を発現することによって決定される表現型を表す（実施例６、表２）。本発明の実施態様において、遺伝子導入トリは、ニワトリまたはシチメンチョウである。
【０１０７】
本発明は、ヒトおよび動物の医薬品、診断薬および家畜の飼料添加物として使用するタンパク質を含む、所望のタンパク質を低コストで大規模に発現させるために使用され得る。例えば、本発明は、タンパク質、および卵白にタンパク質を含む遺伝子導入トリによって産卵される卵を産卵する遺伝子導入トリを含む。本発明は、タンパク質のコード配列が、本発明によって輸卵管細胞に導入され得るという要件で、医薬用タンパク質を含む任意の所望タンパク質の産生における使用を意図する。実際、インターフェロン−α  ２ｂ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロンβ、エリスロポイエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合タンパク質およびβ−ラクタマーゼを含む、本発明による異種性の作製についてこれまでに試験した全てのタンパク質は、本明細書において開示する方法を用いてうまく産生されている。
【０１０８】
本明細書において開示するヒトタンパク質の産生は、特定の目的を有する。本明細書にて開示する、ヒト形態が存在する各タンパク質のヒト形態は、本発明による産生に意図される。
【０１０９】
本明細書にて開示する製造について意図されるタンパク質としては、限定するものではないが、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、リゾチーム、およびβ−カゼイン、アルブミン、α−１アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、コラーゲン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ、第Ｘ因子（など）、フィブリノゲン、インスリン、ラクトフェリン、プロテインＣ、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子融合タンパク質（ＧＭ−ＣＳＦ）、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ソマトトロンビンおよびキモトリプシンを含む、成長ホルモン、サイトカイン、構造タンパク質および酵素が挙げられる。ヒト腫瘍細胞上の表面抗原に結合し、それらを破壊する免疫毒素を含む、改変免疫グロブリンおよび抗体が、本明細書に開示するように製造され得る。
【０１１０】
本明細書で開示するように産生され得る治療用タンパク質の他の詳細な例としては、限定するものではないが、第ＶＩＩＩ因子、ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、活性化第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、抗凝固薬；ヒルジン、アルテプラーゼ、ｔｐａ、レテプラーゼ、ｔｐａ、５つのドメインのうち３つを欠失させたｔｐａ、インスリン、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、長時間作用性インスリンアナログ、ｈｇｈ、グルカゴン、ｔｓｈ、フォリトロピン−β、ｆｓｈ、ｇｍ−ｃｓｆ、ｐｄｇｈ、ＩＦＮ−α  ２、ＩＦＮ−α  ２ａ、ＩＦＮ−α  ２ｂ、ｉｎｆ−α、ｉｎｆ−β  １ｂ、ｉｆｎ−β  １ａ、ｉｆｎ−γ１ｂ、ｉｌ−２、ｉｌ−１１、ｈｂｓａｇ、ｏｓｐａ、Ｔリンパ球抗原に対するマウスｍａｂ、ｔａｇ−７２に対するマウスｍａｂ、腫瘍付随糖タンパク質、血小板表面受容体ｇｐＩＩ（ｂ）／ＩＩＩ（ａ）に対するキメラｍａｂ由来のｆａｂフラグメント、腫瘍付随抗原ｃａ１２５に対するマウスｍａｂフラグメント、ヒトガン胎児抗原に対するマウスｍａｂフラグメント、ｃｅａ、ヒト心筋ミオシンに対するマウスｍａｂフラグメント、腫瘍表面抗原ｐｓｍａに対するマウスｍａｂフラグメント、ｈｍｗ−ｍａａに対するマウスｍａｂフラグメント（ｆａｂ／ｆａｂ２混合）、カルシノーマ付随抗原に対するマウスｍａｂフラグメント（ｆａｂ）、ｎｃａ  ９０に対するｍａｂフラグメント（ｆａｂ）、表面顆粒球非特異性交差反応性抗原、Ｂリンパ球の表面上に見出されるｃｄ２０抗原由来のキメラｍａｂ、ｉｌ２受容体のα鎖に対するヒト化ｍａｂ、ｉｌ２受容体のα鎖に対するキメラｍａｂ、ｔｎｆ−αに対するキメラｍａｂ、呼吸器多核体ウイルスの表面上のエピトープに対するヒト化ｍａｂ、ｈｅｒ  ２に対するヒト化ｍａｂ、ヒト上皮増殖因子受容体２、サイトケラチン腫瘍付随抗原、抗ｃｔｌａ４に対するヒトｍａｂ、ｂリンパ球のｃｄ  ２０表面抗原ドルナーゼ−αに対するキメラｍａｂ、βグルコセレブロシダーゼ、ｔｎｆ−α、ｉｌ−２−ジフテリア毒素融合タンパク質、ｔｎｆｒ−ｌｇｇフラグメント融合タンパク質ラロニダーゼ、ディーエヌエーアーゼ（ｄｎａａｓｅ）、アレファセプト、ダルベポエチンアルファ（コロニー刺激因子）、トシツモマブ、マウスｍａｂ、アレムツズマブ、ラスブリカーゼ、アガルシダーゼベータ、テリパラチド、副甲状腺ホルモン誘導体、アダリムマブ（ｌｇｇ１）、アナキンラ、生物学的な改変体、ネシリチド、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ｈｂｎｐ）、コロニー刺激因子、ペグビソマント、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト、組換え活性型プロテインＣ、オマリズマブ、免疫グロブリンｅ（ｌｇｅ）ブロッカー、イブリツモマブチウキセタン、ＡＣＴＨ、グルカゴン、ソマトスタチン、成長ホルモン、チモシン、副甲状腺ホルモン、色素性ホルモン、ソマトメジン、エリスロポイエチン、黄体ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、視床下部放出因子、エタネルセプト、抗利尿ホルモン、プロラクチンおよび甲状腺刺激ホルモンが挙げられる。
【０１１１】
本発明は、抗体のような免疫グロブリンおよびその抗原結合フラグメントを含む、多量体タンパク質の製造方法を含む。従って、本発明の１つの実施態様において、多量体タンパク質は免疫グロブリンであって、第１および第２の異種性ポリペプチドは、それぞれ免疫グロブリン重鎖および軽鎖である。
【０１１２】
特定の実施態様において、少なくとも１つの発現ベクターの転写単位によってコードされる免疫グロブリンポリペプチドは、可変領域を含む免疫グロブリン重鎖ポリペプチドまたはその変異体であってもよく、Ｄ領域、Ｊ領域、Ｃ領域またはその組合せをさらに含んでもよい。発現ベクターによってコードされる免疫グロブリンポリペプチドは、可変領域を含む免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドまたはその変異体であってもよく、Ｊ領域およびＣ領域をさらに含んでもよい。本発明はまた、限定するものではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびニワトリを含む、同じ動物種または種の混合体由来の複数の免疫グロブリン領域を意図する。特定の実施態様において、抗体は、ヒトであるか、またはヒト化されている。
【０１１３】
別の実施態様において、少なくとも１つの発現ベクターによってコードされる免疫グロブリンポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖可変領域、免疫グロブリン軽鎖可変領域、および抗原に選択的に結合可能な一本鎖抗体を形成させるリンカーペプチドを含む。
【０１１４】
本発明の方法において産生され得る治療用タンパク質の例としては、限定するものではないが、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）（トラスツズマブ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，ＣＡ）（これは、転移性乳ガンを有する患者の治療のためのヒト化抗−ＨＥＲ２モノクローナル抗体である）；ＲＥＯＰＲＯ（商標）（アブシキシマブ）（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）（これは、血餅形成を抑制するための、血小板上の糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に対するものである）；ＺＥＮＡＰＡＸ（商標）（ダクリズマブ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（これは、急性の同種移植拒絶を抑制するための、免疫抑制性ヒト化抗ＣＤ２５モノクローナル抗体である）；ＰＡＮＯＲＥＸ（商標）（これは、マウス抗ｌ７−ＩＡ細胞表面抗原ＩｇＧ２ａ抗体である）（Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ／Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；ＢＥＣ２（これは、マウス抗イディオタイプ（ＧＤ３エピトープ）ＩｇＧ抗体（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）である）；ＩＭＣ−Ｃ２２５（これは、キメラ抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧ抗体（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）である）；ＶＩＴＡＸＩＮ（商標）（これは、ヒト化抗αＶβ３インテグリン抗体である）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）；Ｃａｍｐａｔｈ；Ｃａｍｐａｔｈ  １Ｈ／ＬＤＰ−０３（これは、ヒト化抗ＣＤ５２  ＩｇＧ１抗体である）（Ｌｅｕｋｏｓｉｔｅ）；Ｓｍａｒｔ  Ｍ１９５（これは、ヒト化抗ＣＤ３３  ＩｇＧ抗体である）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂ／Ｋａｎｅｂｏ）；ＲＩＴＵＸＡＮ（商標）（これは、キメラ抗ＣＤ２Ｏ  ＩｇＧ１抗体である）（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，  Ｒｏｃｈｅ／Ｚｅｔｔｙａｋｕ）；ＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ（商標）（これは、ヒト化抗ＣＤ２２  ＩｇＧ抗体である）（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）；ＩＣＭ３はヒト化抗ＩＣＡＭ３抗体であり（ＩＣＯＳ  Ｐｈａｒｍ）；ＩＤＥＣ−１１４は、霊長類抗−ＣＤ８０抗体であり（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍ／Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）；ＺＥＶＡＬＩＮ（商標）は放射標識したマウス抗ＣＤ２０抗体であり（ＩＤＥＣ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧ）；ＩＤＥＣ−１３ｌはヒト化抗ＣＤ４０Ｌ抗体であり（ＩＤＥＣ／Ｅｉｓａｉ）；ＩＤＥＣ−１５１は霊長類化抗ＣＤ４抗体であり（ＩＤＥＣ）；ＩＤＥＣ−１５２は霊長類化抗ＣＤ２３抗体であり（ＩＤＥＣ／Ｓｅｉｋａｇａｋｕ）；ＳＭＡＲＴ抗ＣＤ３はヒト化抗ＣＤ３  ＩｇＧであり（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂ）；５Ｇ１．ｌはヒト化抗補体因子５（ＣＳ）抗体であり（Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍ）；Ｄ２Ｅ７はヒト化抗ＴＮＦ−α抗体であり（ＣＡＴＩＢＡＳＦ）；ＣＤＰ８７０はヒト化抗ＴＮＦ−α  Ｆａｂフラグメントであり（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）；ＩＤＥＣ−１５１は霊長類化抗ＣＤ４  ＩｇＧ１抗体であり（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍ／ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）；ＭＤＸ−ＣＤ４はヒト抗ＣＤ４  ＩｇＧ抗体であり（Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｅｉｓａｉ／Ｇｅｎｍａｂ）；ＣＤＰ５７１はヒト化抗ＴＮＦ−α  ＩｇＧ４抗体であり（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）；ＬＤＰ−０２はヒト化抗α４β７抗体であり（ＬｅｕｋｏＳｉｔｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃ���）；ＯｒｔｈｏＣｌｏｎｅ  ＯＫＴ４Ａはヒト化抗ＣＤ４  ＩｇＧ抗体であり（Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）；ＡＮＴＯＶＡ（商標）はヒト化抗ＣＤ４０Ｌ  ＩｇＧ抗体であり（Ｂｉｏｇｅｎ）；ＡＮＴＥＧＲＥＮ（商標）はヒト化抗ＶＬＡ−４  ＩｇＧ抗体であり（Ｅｌａｎ）；ＣＡＴ−１５２、ヒト抗ＴＧＦ−β２抗体（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｂ  Ｔｅｃｈ）；Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（ＢＭＳ）はモノクローナル抗ＥＧＦ受容体（ＥＧＦｒ）抗体であり；Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）ｇは抗ＶＥＧＦヒトモノクローナル抗体であり；Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒｅ，  ＪＪ）は自己免疫障害を処置するために使用されるキメラ（マウスおよびヒト）モノクローナル抗体であり；Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ（Ｗｙｅｔｈ）は化学療法に使用されるモノクローナル抗体であり；そして、Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は黄斑変性症を処置するために使用されるキメラ（マウスおよびヒト）モノクローナル抗体である、が挙げられる。
【０１１５】
１つの態様において、本発明は家禽において産生されるＧ−ＣＳＦを含む。１つの態様において、本発明は、家禽由来の糖鎖付加パターンを有するＧ−ＣＳＦ（ＴＰＤ  Ｇ−ＣＳＦ）を含み、ここで、Ｇ−ＣＳＦはニワトリ、ウズラまたはシチメンチョウのトリ細胞などのトリ細胞から得られる。家禽において産生され、単離または精製されたＧ−ＣＳＦなどのサイトカイン含むヒトタンパク質、家禽において産生されたＧ−ＣＳＦなどのサイトカインを含む、医薬組成物中に存在するヒトタンパク質もまた本発明に含まれる。Ｇ−ＣＳＦを含むタンパク質の単離は、当該分野に容易に明らかなやり方によって達成され得る。医薬物の製造に有用な処方物の製法もまた、当該分野で周知である。
【０１１６】
本発明は、トリに由来する家禽由来の糖鎖付加パターンを有する、家禽由来の治療用または医薬用タンパク質を含む。例えば、本発明は、トリ由来のインターフェロン−α  ２（ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２）を含む。ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２は、ヒト末梢血白血球由来のインターフェロン−α  ２（ＰＢＬ  ＩＦＮ−α  ２ｂ）では通常見られない新たな糖鎖付加パターンを示しており、新たなグリコフォームを含む（バンド４および５はα−Ｇａｌが伸長された二糖であり；図９を参照のこと）。ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂはまた、ヒトＰＢＬ  ＩＦＮ−α  ２ｂに類似し、ニワトリにおいてヒト形態より効率的に産生されるＯ結合型糖鎖構造を含む。
【０１１７】
本発明は、本明細書で開示するように製造されるタンパク質の最適化されたポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリペプチドを意図する。例えば、本発明は、ヒトＩＦＮ−α  ２ｂについて最適化されたトリコード配列、すなわち、遺伝子導入家禽由来の組換えインターフェロン−α  ２ｂ（ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂ）（配列番号１）を含む。最適化ヒトＩＦＮ−α  ２ｂについてのコード配列は、４９８ヌクレオチドおよび１６５アミノ酸を含む（配列番号１および図１１Ａを参照のこと）。同様に、天然のヒトＩＦＮ−α  ２ｂについてのコード配列は、４９８ヌクレオチド（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ４０５５３９およびＧＩ：１５４８７９８９）、１６５アミノ酸（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＬ０１０４０およびＧＩ：１５４８７９９０）を含む。卵白タンパク質オバルブミン、リゾチーム、オボムコイドおよびオボトランスフェリンにおいて見出される特定の各アミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンは、本発明のベクターに挿入される最適化されたヒトＩＦＮ−α  ２ｂコード配列の設計において使用される。より詳細には、最適化されたヒトＩＦＮ−α  ２ｂについてのＤＮＡ配列は、雌鳥の輸卵管のコドンの使用頻度に基づいており、ニワトリ（Gallus gallus）のオバルブミン、リゾチーム、オボムコイドおよびオボトランスフェリンタンパク質から作製したコドン使用頻度表と一緒にＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰａｃｋａｇｅのＢＡＣＫＴＲＡＮＳＬＡＴＥ（登録商標）プログラム，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．１  （Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｉｎｃ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を使用して、作製される。例えば、４つの卵白タンパク質におけるアミノ酸アラニンの４つのコドンの使用頻度の割合は、ＧＣＵについて３４％、ＧＣＣについて３１％、ＧＣＡについて２６％、およびＧＣＧについて８％である。従って、ＧＣＵは、最適化されたヒトＩＦＮ−α  ２ｂコード配列において、大部分のアラニンについてコドンとして使用されている。最適化されたヒトＩＦＮ−α  ２ｂについての遺伝子を含むベクターは、家禽の組織および卵において形質導入された家禽由来のＩＦＮ−α  ２ｂ（ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂ）を発現する形質導入トリを産生するために使用される。
【０１１８】
実施例１３（下記参照）にて考察するように、ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂはニワトリにおいて産生される。しかし、ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂはまた、シチメンチョウおよびウズラなどの他のトリ種においても産生され得る。本発明の好ましい実施態様において、ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂは、ニワトリおよびシチメンチョウならびにそれらの固い殻の卵において発現される。単糖分析およびＦＡＣＥ分析を含む炭水化物分析（実施例１４、下記参照）によって、タンパク質の糖構造または新規の糖鎖付加パターンが明らかにされる。あるいは、ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂは、以下の単糖残基を示す：Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＮＡｃＧａｌ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＮＡｃＧｌｕ）およびシアル酸（ＳＡ）。しかし、ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂ中にはＮ結合型糖鎖付加は存在しない。代わりに、ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂは、Ｔｈｒ−１０６にてＯ−グリコシル化される。この型の糖鎖付加はヒトＩＦＮ−α  ２に類似しており、１０６位のＴｈｒ残基はＩＦＮ−α  ２に特有である。天然のＩＦＮ−αに類似であるＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂは、マンノース残基を有していない。ＦＡＣＥ分析は種々の糖残基を表す６つのバンド（図９）を明らかにし、ここで、バンド１、２および３は、それぞれ非シアル酸付加、シアル酸付加および二シアル酸付加されている（図１０）。シアル酸（ＣＡ）結合はガラクトース（Ｇａｌ）に対してアルファ２−３であり、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＮＡｃＧａｌ）に対してアルファ２−６である。バンド６は、非シアル酸付加四糖を表している。バンド４および５は、ヒトＰＢＬ  ＩＦＮ−α  ２ｂまたは天然のヒトＩＦＮ（天然ｈＩＦＮ）において見られないアルファ−ガラクトース（アルファ−Ｇａｌ）伸長型二糖である。図１０は、ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂ（卵白ｈＩＦＮ）とヒトＰＢＬ  ＩＦＮ−α  ２ｂ（天然ｈＩＦＮ）の比較を示す。微小のバンドがＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂにおけるバンド３と４との間、およびバンド４と５との間に存在している（下記参照）。
【０１１９】
本発明は、ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂの単離されたポリペプチド配列（配列番号２）（図１１Ｂも参照のこと）およびその医薬組成物を意図し、ここで、タンパク質は、本明細書で開示する以下の糖鎖構造の１つ以上とともに、Ｔｈｒ−１０６にてＯ−グリコシル化されている：
式（ｉ）：
【化９】
2009530377.tif 000010
式（ｉｉ）：
【化１０】
2009530377.tif 000011
式（ｉｉｉ）：
【化１１】
2009530377.tif 000012
式（ｉｖ）：
【化１２】
2009530377.tif 000013
式（ｖ）：
【化１３】
2009530377.tif 000014
式（ｖｉ）：
【化１４】
2009530377.tif 000015
［式中、Ｇａｌ＝ガラクトース、
ＮＡｃＧａｌ＝Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、
ＮＡｃＧｌｕ＝Ｎ−アセチル−グルコサミンおよび
ＳＡ＝シアル酸］。
【０１２０】
本発明の１つの実施態様において、割合は、
式（ｉ）：
式（ｉ）：
【化１５】
2009530377.tif 000016
が約２０％であって；
式（ｉｉ）：
【化１６】
2009530377.tif 000017
が約２９％であって；
式（ｉｉｉ）：
【化１７】
2009530377.tif 000018
が約９％であって；
式（ｉｖ）：
【化１８】
2009530377.tif 000019
が約６％であって；
式（ｖ）：
【化１９】
2009530377.tif 000020
が約２０％であって；
式（ｖｉ）：
【化２０】
2009530377.tif 000021
が約１２％である。
【０１２１】
微小のバンドがバンド３と４との間、およびバンド４と５との間に存在し、ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂにおいて約１７％を占める。
【０１２２】
１つの実施態様において、本発明は、家禽由来の糖鎖付加パターンを有するヒトタンパク質に関する。１つの実施態様において、家禽由来の糖鎖付加パターンは、トリ輸卵管細胞、例えば、管状腺細胞から入手される。例えば、本発明によってニワトリの輸卵管細胞において産生されたヒトタンパク質上に存在することが示された糖鎖付加パターンが、本明細書にて開示される。
【０１２３】
１つの実施態様において、本発明は、家禽由来の糖鎖付加パターンを有する、ニワトリ、シチメンチョウおよびウズラなどのトリ（例えば、トリ輸卵管細胞）において産生されたヒトＧ−ＣＳＦに関する。成熟ｈＧ−ＣＳＦアミノ酸配列を図１８Ｃに示す。Ｇ−ＣＳＦを製造するために本明細書で使用するヌクレオチド配列を、図１８ＡおよびＮＣＢＩアクセッションＮＭ１７２２１９に示す。トリ（例えば、ニワトリ）のコドン使用頻度について最適化されたヌクレオチド配列を、Ｇ−ＣＳＦ、および本発明によって製造されたヒトタンパク質などの他のタンパク質を製造するための使用についても意図している。
【０１２４】
本発明は、以下：
【化２１】
2009530377.tif 000022
で表す糖鎖付加構造１つ以上を含む本発明のＧ−ＣＳＦ分子を含む、卵および卵を産むトリ（例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよびウズラ）を含む：
【０１２５】
１つの実施態様において、本発明は、Ｇ−ＣＳＦ分子の混合物を含み、ここで、混合物は構造Ａ、構造Ｂ、構造Ｃ、構造Ｄ、構造Ｅ、構造Ｆおよび構造Ｇの１つ以上から選択される糖鎖付加構造を有するＧ−ＣＳＦ分子を含む。本発明はまた、Ｇ−ＣＳＦ分子の混合物を含み、ここで、混合物は構造Ａ、構造Ｂ、構造Ｃ、構造Ｄ、構造Ｅ、構造Ｆおよび構造Ｇの１つ以上から選択される糖鎖付加構造を有するＧ−ＣＳＦ分子を含み、混合物は単離または精製されており、例えば、本発明によって産生された卵または卵白から精製される。また、Ｇ−ＣＳＦ分子の混合物が含まれ、ここで、混合物は構造Ａ、構造Ｂ、構造Ｃ、構造Ｄ、構造Ｅ、構造Ｆおよび／または構造Ｇのうち２つ、３つ、４つ、５つまたは６つを有するＧ−ＣＳＦ分子を含む。また、Ｇ−ＣＳＦ分子の混合物が含まれ、ここで、混合物は構造Ａ、構造Ｂ、構造Ｃ、構造Ｄ、構造Ｅ、構造Ｆおよび／または構造Ｇのうち２つ、３つ、４つ、５つまたは６つを有するＧ−ＣＳＦ分子を含み、混合物は単離または精製されており、例えば、本発明によって産生された卵または卵白から精製される。
【０１２６】
本発明はまた、構造Ａを含む個別のＧ−ＣＳＦ分子を含む。本発明はまた、構造Ｂを含む個別のＧ−ＣＳＦ分子を含む。本発明はまた、構造Ｃを含む個別のＧ−ＣＳＦ分子を含む。本発明はまた、構造Ｄを含む個別のＧ−ＣＳＦ分子を含む。本発明はまた、構造Ｅを含む個別のＧ−ＣＳＦ分子を含む。本発明はまた、構造Ｆを含む個別のＧ−ＣＳＦ分子を含む。本発明はまた、構造Ｇを含む個別のＧ−ＣＳＦ分子を含む。本発明はまた、構造Ａを含む個別のＧ−ＣＳＦ分子を含む。１つの実施態様において、それぞれのＧ−ＣＳＦ分子は、単離または精製したＧ−ＣＳＦ分子の混合物であり得るＧ−ＣＳＦ混合物（混合物は本発明によって産生された卵または卵白から精製される）中に存在し得る。１つの実施態様において、それぞれのＧ−ＣＳＦ分子は単離または精製され、例えば、本明細書で開示するように精製される（例えば、実施例２０にて開示するＨＰＬＣによって）。
【０１２７】
Ｇ−ＣＳＦ、例えば、Ｇ−ＣＳＦ分子の混合物および個別のＧ−ＣＳＦ分子（上の２段落）に関して本明細書で詳述する本発明の実施態様はまた、一般に、本発明によって産生されたほかのタンパク質、およびそれらに対応する家禽由来の糖鎖付加構造について適用可能である。
【０１２８】
本発明の１つのタンパク質上に存在することが示されている糖鎖付加構造が、本発明の別のタンパク質上に存在し得ることもまた意図される。例えば、ＴＰＤ  Ｇ−ＣＳＦ上に存在することが示されている糖鎖付加構造もまた、ＴＰＤ  ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＤ  ＥＰＯ、ＴＰＤ  ＩＦＮおよび／または他のＴＰＤタンパク質上に存在し得る。別の例において、ＴＰＤ  ＩＦＮα２条に存在することが示されている糖鎖付加構造が、ＴＰＤ  Ｇ−ＣＳＦ、ＴＰＤ  ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＤ  ＥＰＯおよび／または他の遺伝子導入家禽由来の（ＴＰＤ）タンパク質上に存在し得ることが意図される。詳細には、本発明はまた、一般に、本明細書で開示するＴＰＤ糖鎖付加構造１つ以上を有するヒトタンパク質を意図する。
【０１２９】
治療での使用のために、本発明によって産生される治療用タンパク質をそのままの形態で投与してもよいが、治療用タンパク質を医薬処方物の部分として投与することが好ましい。
【０１３０】
従って、本発明はさらに、１つ以上の医薬上許容される担体および、所望により、他の治療用および／または予防用成分と一緒に、家禽由来のグリコシル化された治療用タンパク質またはその医薬上許容される誘導体を含む医薬処方物、ならびにそのような医薬処方物を投与する方法を提供する。担体は、処方物の他の成分と適合性であって、そのレシピエントに有害でないという意味において、許容されるものでなければならない。本発明の医薬組成物を使用して患者を治療する方法（例えば、投与する医薬用タンパク質の量、投与の頻度および処置の持続時間）は、当業者に公知で標準的なやり方を使用して決定され得る。
【０１３１】
医薬処方物は、経口、直腸内、経鼻、局所（頬側および舌下を含む）、膣内または非経口に適切なものを含む。医薬処方物は、筋肉内、皮下および静脈内投与を含む注射による投与に適切なものを含む。医薬処方物はまた、吸入またはガス注入による投与のためのものを含む。処方物は、必要に応じて、分離した投与量単位で好適に存在し得、当該分野で周知の任意の方法によって調製され得る。医薬処方物を製造する方法は典型的に、治療用タンパク質を、液体担体もしくは細かく分割した固体担体または両方に加え、次いで、必要であれば生成物を所望の処方物に形成する工程を包含する。
【０１３２】
経口投与に適切な医薬処方物は、好適に、事前に計量した量の有効成分をそれぞれ含む、カプセル、カシェット（cachet）または錠剤などの分離した単位として；散剤または顆粒として；溶液として；懸濁物として；または乳濁液として存在し得る。有効成分はまた、ボーラス、舐剤またはペーストとして存在し得る。経口投与のための錠剤およびカプセルは、結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤または湿潤剤などの従来の賦形剤を含み得る。錠剤は、当該分野で公知の方法に従ってコーティングされ得る。経口の液体調製物は、水溶液、油性懸濁物、溶液、乳濁液、シロップまたはエリキシル剤などの形態であってもよく、あるいは、使用前に水または他の適切なビヒクルでの構成用の乾燥した製品として調製してもよい。そのような液体調製物は、懸濁剤、乳化剤、非水ビヒクル（食用油を含む）または保存料などの従来の添加剤を含んでもよい。
【０１３３】
本発明の治療用タンパク質はまた、非経口投与のために処方され得（例えば、ボーラス注射または持続点滴などの注射によって）、アンプル、事前に充填されたシリンジ、少量の点滴での単位用量、または保存料を添加した複数回投与容器中に調製され得る。治療用タンパク質は、例えば、皮下注射、筋肉内注射および静脈内点滴または注射によって注射され得る。
【０１３４】
医療用タンパク質は、油性または水性ビヒクル中の懸濁物、溶液または乳濁物などの形態をなし得、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの処方用薬剤を含み得る。治療用タンパク質は、散剤形態であって、滅菌固体の滅菌単離または溶液の凍結乾燥によって入手され、滅菌で発熱物質を含まない水などの適切なビヒクルでの構築用であってもよい。
【０１３５】
表皮への局所投与のために、本発明によって産生された治療用タンパク質は、軟膏、クリームもしくはローション、または経皮パッチとして処方され得る。例えば、軟膏およびクリームは、増粘剤および／またはゲル化剤に加えて、水性または油性基剤を用いて処方され得る。ローションは、水性または油性基剤を用いて処方され得、一般に、乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤または着色料のうち１つ以上を含む。
【０１３６】
口中での局所投与に適切な処方物は、通常スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガントといった風味付けした基剤中に有効成分を含む薬用キャンディー；ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性な基剤中に有効成分を含むトローチ；ならびに、適切な液体担体中に有効成分を含む口腔洗浄薬を含む。
【０１３７】
直腸内投与に適切な医薬処方物（担体は固体である）は、単位用量坐薬として最も好ましくは表される。適切な担体は、ココアバターおよび当該分野にて一般に使用される他の材料を含み、坐薬を、有効化合物と軟化させたかあるいは融かした担体との混合物によって好適に形成してもよく、型の中で冷却し成形する。
【０１３８】
膣内投与に適切な処方物は、有効成分に加えて、当該分野で適切であると知られているそのような担体を含む、膣坐薬、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡またはスプレーとして与えてもよい。
【０１３９】
鼻腔内投与のために、本発明の治療用タンパク質を液体スプレーまたは分散性散剤として、またはドロップの形態で使用してもよい。
【０１４０】
ドロップは、１つ以上の分散剤、可溶化剤または懸濁剤を含む水性または非水性基剤と一緒に処方してもよい。液体スプレーは、加圧パックから好適に送達される。
【０１４１】
吸入による投与のために、本発明による治療用タンパク質は、吸入器、噴霧器または加圧パックまたはエアロゾルスプレーを送達する従来の手段から好適に送達され得る。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体などの適切な噴霧剤を含み得る。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、計量した量を送達するためのバルブを与えることによって決定され得る。
【０１４２】
吸入またはガス注入による投与のために、本発明による治療用タンパク質は、化合物、およびラクトースまたはデンプンなどの適切な散剤基剤の散剤混合物などの乾燥散剤組成物の形態をなし得る。散剤組成物は、カプセルもしくはカートリッジなどの中の単位投与量形態、あるいは、例えば、吸入器または噴霧器を用いて散剤を投与し得るゼラチンまたはブリスターパック形態で与えられ得る。
【０１４３】
必要に応じて、有効成分の徐放を与えるように適応させた上記の処方物を用いてもよい。
【０１４４】
本発明による医薬組成物はまた、抗菌剤または保存料などの他の有効成分を含んでもよい。
【０１４５】
さらに、本発明の治療用タンパク質は、他の治療剤と組み合わせて使用してもよい。
【０１４６】
本発明の組成物または化合物は、種々の状態を処置するために使用され得る。例えば、その治療方法が当業者に公知で、細胞培養物（例えば、ＣＨＯ細胞）から入手した治療用タンパク質を用いる多くの状態が存在する。本発明は、家禽由来の糖鎖付加パターンを含む、トリ系において産生された治療用タンパク質をそのような状態を処置するために用いてもよいことを意図する。すなわち、本発明は、本発明によって製造される治療用タンパク質を使用することによって、従来産生されている治療用タンパク質によって処置可能であることが知られている状態の処置を意図する。当該分野で理解されるように、例えば、本発明によって製造されるエリスロポイエチンを、貧血および腎臓障害（例えば、慢性腎不全）などのヒトの状態を処置するために使用してもよく、本発明によって製造されるＧ−ＣＳＦを、ガン患者を処置するために使用してもよい。
【０１４７】
一般に、投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康および体重、併用の処置の型、処理の頻度などに依存して変動する。通常、有効成分の投与量は、約０．０００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。正確な投与量、投与の頻度、処置の期間は、各治療用タンパク質の投与分野の当業者によって決定され得る。
【０１４８】
以下の詳細な実施例は本発明を説明することを意図し、本発明の範囲を制限するように構成されていない。
【実施例】
【０１４９】
実施例１
ベクターの構築
ｐＮＬＢのｌａｃＺ遺伝子、複製欠損のトリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）ベースのベクター(Cosset et al., 1991)を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびレポーター遺伝子、β−ラクタマーゼからなる発現カセットで置換する。ｐＮＬＢおよびｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＢＬベクター構築物を、図３Ａおよび３Ｂにてそれぞれ略図で示す。
【０１５０】
ｐＮＬＢのｌａｃＺ遺伝子を導入遺伝子と効率的に置換するために、まず中間体アダプタープラスミド、ｐＮＬＢＡｄａｐｔｅｒを作製した。ｐＮＬＢのｃｈｅｗｅｄ  ｂａｃｋ  ＡｐａＩ／ＡｐａＩフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（−）のｃｈｅｗｅｄ−ｂａｃｋ  ＫｐｎＩ／ＳａｃＩ部位に挿入することによって、ｐＮＬＢＡｄａｐｔｅｒを作製した（ｐＮＬＢにおいて、５‘側ＡｐａＩはｌａｃＺの上流２８９ｂｐに存在し、３’側ＡｐａＩは３‘ＬＴＲおよびＧａｇセグメントの３’側に存在する）(Cosset et al., J. Virol. 65:3388-94 (1991))。ｐＣＭＶ−ＢＬのフィルインしたＭｌｕＩ／ＸｂａＩフラグメント(Moore et al., Anal.Biochem. 247: 203-9 (1997))をｐＮＬＢ−Ａｄａｐｔｅｒのｃｈｅｗｅｄ−ｂａｃｋ  ＫｐｎＩ／ＮｄｅＩ部位に挿入し、ｌａｃＺをＣＭＶプロモーターおよびＢＬ遺伝子で置換し（ｐＮＬＢにおいて、ＫｐｎＩはｌａｃＺの上流６７ｂｐに存在し、ＮｄｅＩはｌａｃＺ終止コドンの上流１００ｂｐに存在する）、それによってｐＮＬＢ−Ａｄａｐｔｅｒ−ＣＭＶ−ＢＬを作製した。ｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＢＬを作製するために、  ｐＮＬＢのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｌｐＩの挿入部分（ｌａｃＺを含む）をｐＮＬＢ−Ａｄａｐｔｅｒ−ＣＭＶ−ＢＬのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｌｐＩ挿入部分で置換した。未知の理由で、平滑末端フラグメントのｐＮＬＢのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｌｐＩ部位への直接のライゲーションは大部分が再編成されたサブクローンを生じるので、この２段階のクローニングは必要である。
【０１５１】
実施例２
ｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＢＬファウンダー群の作製
ＳｅｎｔａｓおよびＩｓｏｌｄｅｓを、Ｆ１０（Ｇｉｂｃｏ）、５％新生牛血清（Ｇｉｂｃｏ）、１％ニワトリ血清（Ｇｉｂｃｏ）、５０μｇ／ｍｌフレオマイシン（Ｃａｙｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および５０μｇ／ｍｌハイグロマイシン（Ｓｉｇｍａ）中で培養した。以下の例外を用いて、Ｃｏｓｓｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３（出典明示によって本明細書にて援用する）に記載のように、形質導入粒子を作製した。レトロウイルスベクターｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＢＬ（実施例１から、上記）の９×１０５のＳｅｎｔａｓに形質移入した２日後、ウイルスを６〜１６時間新たな培地中に回収し、濾過した。全ての培地を使用して、最終濃度４マイクロｇ／ｍｌまで加えたポリブレンを用いて、３枚の１００ｍｍプレート上で３×１０６のＩｓｏｌｄｅｓに形質導入した。翌日、５０μｇ／ｍｌフレオマイシン、５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンおよび２００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ）を含む培地で培地を交換した。１０〜１２日後に、Ｇ４１８耐性の単一コロニーを単離し、２４ウェルプレートに移した。７〜１０日後に、Ｓｅｎｔａｓの形質導入によって、各コロニー由来の力価を決定し、Ｇ４１８選択を行った。典型的に、６０コロニーのうち２コロニーが１〜３×１０５の力価であった。Ａｌｌｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６５：３０−７（１９９４）（出典明示によって本願明細書で援用する）に記載のように、これらのコロニーを拡大させ、ウイルスを２〜７×１０６まで濃縮した。ＮＬＢ−ＣＭＶ−ＢＬ形質導入粒子で形質導入した細胞の培地中でβ−ラクタマーゼについてアッセイすることによって、ＣＭＶ−ＢＬ発現カセットのインテグリティー（integrity）を確認した。
【０１５２】
形質導入ベクター、ｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＢＬを５４６個の非インキュベートＳＰＦ白色レグホン胚の胚下腔に注入した。そのうち１２６個からヒヨコが孵化し、β−ラクタマーゼ（ラクタマーゼ）の血中への分泌についてアッセイした。未知のサンプル中の活性型ラクタマーゼ濃度を測定するために、ラクタマーゼによってＰＡＤＡＣ（紫色の物質）が黄色の化合物に特異的に転換される動態比色分析を用いた。標準的な反応時間の間でのＯＤ５７０の減少をモニターすることによって、ラクタマーゼの活性を定量化し、精製したラクタマーゼレベルを変動させた検量線と比較した（「ラクタマーゼアッセイ」という）。一晩または数日間、試験サンプル中の紫色から黄色への転換について目視でスコア化することによって、サンプル中のラクタマーゼの有無も決定した（「一晩ラクタマーゼアッセイ」）。後者の方法は、非常に低いレベルのラクタマーゼの検出または多数のサンプルをスクリーニングすることに適切であった。１〜４週齢で、ラクタマーゼの存在についてヒヨコ血清サンプルを試験した。２７羽のヒヨコは血清中にラクタマーゼが非常に低いレベルで、一晩ラクタマーゼアッセイ後のみ検出可能であり、これらのトリが成熟すると、ラクタマーゼはもはや検出不可能であった。下記の表１および図４Ａにて示すように、さらなるトリ（３羽のオスおよび６羽のメス）は、孵化後６〜７か月で１１．９〜１７３．４ｎｇ／ｍｌの範囲のラクタマーゼ血清レベルであった。
【０１５３】
【表１】
2009530377.tif 000023
【０１５４】
実施例３
Ｇ０の雌鳥の卵白におけるβ−ラクタマーゼの発現
ｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＢＬレトロウイルスベクターを形質導入した若い雌鳥５７羽を性的に成熟するまで飼育し、月齢８か月で、活性型β−ラクタマーゼ（ラクタマーゼ）について各雌鳥由来の卵白を試験した。５７羽のトリのうち、６羽が５６．３〜２５０．０ｎｇ／ｍｌの範囲の有意なラクタマーゼレベルを有していた（表１、上記）。数日間ＰＡＤＡＣをサンプルとインキュベートした後でも、この群のほかの雌鳥は卵白中に検出可能なレベルのラクタマーゼを有していなかった。偽の注入をした２４羽の雌鳥由来の卵白、およびラクタマーゼ導入遺伝子を担持していないＮＬＢベクターを形質導入した４２羽の雌鳥では、ラクタマーゼを検出できなかった。最初のアッセイから６か月後でなお、６羽の発現している雌鳥の卵白にて、安定した発現が検出可能であった（表１、上記）。
【０１５５】
抗β−ラクタマーゼ抗体を用いたウェスタンブロットアッセイによって、６羽の雌鳥全ての卵白におけるラクタマーゼを検出した。卵白のラクタマーゼは、標準品として使用した、細菌で産生し、精製したラクタマーゼと同じ大きさであった。ウェスタン分析によって卵白にて検出した量は、酵素アッセイによって決定した量と一致し、卵白のラクタマーゼの有意な割合が生物学的に活性であることが示された。雌鳥によって産生され、４℃で保存した卵白中のラクタマーゼの活性は損なわれておらず、数か月間の貯蔵の後でも分子量の変化を示さなかった。この観察は、分析まで延長した期間の間、ラクタマーゼを含む卵の貯蔵を可能にした。
【０１５６】
実施例４
Ｇ１およびＧ２遺伝子導入ニワトリにおける、β−ラクタマーゼの生殖細胞系伝達および血清発現
５６羽のＧ０雄鳥から回収した精子からＤＮＡを抽出し、５６羽のトリのうち、定量的ＰＣＲによって測定し、精子ＤＮＡにおいて有意なレベルの導入遺伝子を有していた３羽を、飼育するために選択した。これらの雄鳥は、血中のβ−ラクタマーゼ（ラクタマーゼ）レベルが最も高いことが同じ３羽であった（雄鳥２３９５、２４２１および２４２８）。雄鳥２３９５が３羽のＧ１の遺伝子導入子孫（４２２羽の子孫のうち）を生じた一方、残りの２羽は遺伝子導入の子孫を生じなかった（合計６５０羽の子孫のうち）。３羽のＧ１遺伝子導入ニワトリそれぞれ由来の血液ＤＮＡをサザン分析することによって、導入遺伝子がインタクトであって、特有で無作為の遺伝子座に組込まれていることを確認した。比かご６〜１１週目で、Ｇ１遺伝子導入ヒヨコ、５３０８、５６５７および４１３３の血清は、それぞれ０．０３、２．０および６．０μｇ／ｍｌのラクタマーゼを含んでいた。月齢６〜７か月でニワトリを再度アッセイした場合、ラクタマーゼレベルは０．０３、１．１および５．０μｇ／ｍｌのレベルに低下していた（図４Ａ）。
【０１５７】
雌鳥５６５７および雄鳥４１３３を非遺伝子導入ニワトリと交配させ、導入遺伝子についてヘミ接合性である子孫を入手した。雄鳥４１３３および雌鳥５６５７に由来する遺伝子導入ニワトリの系統、およびその後の世代を図５にて示す。遺伝子導入雄鳥５３０８も交配させたが、このトリの子孫は、血清および卵白において非常に低いかまたは検出できないかのいずれかであるラクタマーゼの濃度を示した。無作為に選択したＧ２遺伝子導入ヒヨコの血清中の活性型ラクタマーゼの濃度を、孵化後３〜９０日目に測定した。雌鳥５６５７から生まれたＧ０遺伝子導入体の５羽の全てが、１．９〜２．３μｇ／ｍｌの濃度の活性型ラクタマーゼを有していた（親の発現１．１μｇ／ｍｌと比較して、図４Ｂ）。同じ期間にサンプル全てを回収した。従って、雌鳥５６５７での濃度は成熟するのに比例して低下しているので、子孫の血清中のラクタマーゼ濃度は親の濃度より高いことが期待された。同様に、雄鳥４１３３から生まれた遺伝子導入ヒヨコから無作為に選択した５羽は全て、親と類似しているがより高い血清ラクタマーゼ濃度を有していた（図４Ｂ）。
【０１５８】
実施例５
遺伝子導入雌鳥の卵白におけるβ−ラクタマーゼの発現
Ｇ１雌鳥５６５７由来の卵、卵白１ｍｌあたり活性型β−ラクタマーゼ（ラクタマーゼ）１３０ｎｇを含んでいた（図６Ａ）。ラクタマーゼの濃度は、最初に産卵されたいくつかの卵においてより高く、次いで少なくとも９か月間安定な安定期に達した。雌鳥５３５７および非遺伝子導入雄鳥から生まれた遺伝子導入雌鳥由来の卵は親と類似したラクタマーゼ濃度を有していた（図６Ａ）。雌鳥６９７８は、Ｇ２雌鳥８６１７および兄弟Ｇ２雄鳥８８３９から生まれ、定量的ＰＣＲおよびサザン分析によって、導入遺伝子についてホモ接合性であることを決定した。期待したように、トリ６９７８の卵におけるラクタマーゼ濃度は、ヘミ接合性の親よりほぼ２倍高かった（図６Ｂ）。雌鳥６９７８は雌鳥５６５７のヒヨコの中で唯一のメスであってので、雌鳥５６５７から生まれたＧ３雌鳥はほかに分析していない。雌鳥８８６７、８８６８および８８６９由来の卵は、１１か月離れて回収されており、類似したラクタマーゼ濃度を有しており、卵白中の発現レベルが産卵期間を通じて一致していることが示されたことに留意することが重要である。雄鳥４１３３を非遺伝子導入トリと交配させて、ヘミ接合性のＧ２雌鳥を入手した。分析した１５羽の遺伝子導入雌鳥の全てが、卵白中に０．４７〜１．３４μｇ／ｍｌの範囲の濃度でラクタマーゼを有していた。４羽の代表的な雌鳥を図７Ａにて示す。６か月後にアッセイした場合、平均発現レベルは約１．０μｇ／ｍｌ〜０．８μｇ／ｍｌに低下していた（図７Ａ）。発現レベルは最初の卵において高く、数か月間にわたって安定であった。その後に、卵中のラクタマーゼレベルは一定のままであった。
【０１５９】
Ｇ２雌鳥および兄弟Ｇ２雄鳥８１９１を交配させ、ヘミ接合性およびホモ接合性Ｇ３雌鳥を生じさせた。全ての遺伝子導入のＧ３雌鳥が０．５２〜１．６５μｇ／ｍｌの範囲の濃度で卵白においてラクタマーゼを発現させていた（図７Ｂ）。ホモ接合性であるＧ３雌鳥についての平均発現は、ヘミ接合性であるＧ２雌鳥およびＧ３雌鳥より４７％高かった。雄鳥４１３３およびその子孫から生まれたＧ２およびＧ３雌鳥由来の卵中のラクタマーゼ量は有意に変動したが（図７Ａおよび７Ｂ）、その群の任意で所定の雌鳥由来の卵におけるレベルは比較的一定であった。ラクタマーゼの発現平均は、ホモ接合性遺伝子型の２倍であることが期待された。ウェスタンブロット分析によって、導入遺伝子はＧ２遺伝子導入体の卵においてインタクトなラクタマーゼを正確に産生していることが確認された。ウェスタンブロットで検出されたラクタマーゼレベルはまた、酵素活性アッセイによって決定されたものと相互で密接に関連しており、卵白ラクタマーゼの重要な部分が生理活性であることを示している。従って、レトロウイルスベクターをうまく用いて、ニワトリにおける導入遺伝子の安定で信頼性のある発現を実施することができる。
【０１６０】
卵黄におけるラクタマーゼの沈着は検出可能であるものの、卵白のものより低かった。雄鳥４１３３系統のＧ２またはＧ３雌鳥７羽を分析したが、卵黄において１０７〜３７５ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度であって、卵白における濃度の約２０％であった。所定の雌鳥の卵黄と卵白のラクタマーゼレベルの間に関連はなかった(Harvey et al., ”Expression of exogenous protein in egg white of transgenic chickens” (April 2002) Nat. Biotechnol. 20:396-399)。
【０１６１】
実施例６
メスのファウンダーの作製
ｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＢＬ形質導入のために、新たに生まれた受精白色レグホン卵を使用した。７〜１０μｌの濃縮粒子を窓を作った卵の胚下腔に注入し、窓をシールした後でヒヨコに孵化させた。５４６個の卵に注入した。血液ＤＮＡを抽出し、Ｔａｑｍａｎアッセイを介してｎｅｏ耐性を検出するように設計したプローブプライマーセットを使用して、導入遺伝子の存在について分析した。下記の表３にて理解されるように、全ヒヨコの約２５％が血液ＤＮＡにおいて検出可能なレベルの導入遺伝子を有していた。
【０１６２】
【表２】
2009530377.tif 000024
【０１６３】
【表３】
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【０１６４】
実施例７
導入遺伝子の生殖細胞系伝達の割合
挿入されたベクター配列の組込みおよびインテグリティーを確認するために、Ｇ１およびＧ２遺伝子組換え由来のＤＮＡに対してサザンブロット分析を実施した。血液ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、ｎｅｏ耐性プローブに対してハイブリダイズさせて、ｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＢＬベクター中に見出した内部のＨｉｎｄＩＩＩ部位、および組込み部位に隣接するゲノムの部位によって作製された接合部フラグメントを検出した（図３Ｂ）。ＮＬＢ−ＣＭＶ−ＢＬを担持するＧ１トリ３羽それぞれが、特有の大きさの接合部フラグメントを有しており、導入遺伝子は３つの異なるゲノムの部位に組込まれていることが示唆された。Ｇ１を非遺伝子導入雌鳥と交配させ、ヘミ接合性のＧ２を入手した。表２（上記）にて理解されるように、組込まれた単一の導入遺伝子のメンデル型分離について予測されるように、のＮＬＢ−ＣＭＶ−ＢＬを有するＧ１雄鳥由来の子孫の５０．８％が遺伝痔導入であった。Ｇ２子孫由来で、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したＤＮＡのサザン分析によって、遺伝子導入の親から生じたものとサイズが類似している接合部フラグメントが検出され、導入遺伝子がインタクトに伝達されていたことが示された。
【０１６５】
実施例９
導入遺伝子についてホモ接合性のＧ３子孫についてのスクリーニング
導入遺伝子についてホモ接合性である遺伝子導入ニワトリを入手するために、同じ部位に組込まれたＮＬＢ−ＣＭＶ−ＢＬを有するＧ２ヘミ接合性のトリ（例えば、同じＧ１オスの子孫）を交配させた。２つのグループが生まれた：第１のグループはＧ１  ４１３３から生じた雌鳥および雄鳥であって、第２のグループはＧ１  ５６７７雌鳥由来のものである。Ｔａｑｍａｎアッセイを使用して、検量線を使用し、Ｇ３子孫においてｎｅｏ耐性導入遺伝子を定量的に検出した。サザン分析によって決定されている、導入遺伝子についてヘミ接合性であるＧ１遺伝子導入体４１３３オス由来で既知のゲノムＤＮＡ量を使用して、検量線を構築した。検量線は、導入遺伝子の合計コピー数１０３〜１．６×１０４の範囲であるか、あるいは二倍体ゲノムあたりの導入遺伝子コピー数０．２〜３．１の範囲であった。対数期の間は反応成分が限定されているので、増幅は非常に効率的であって、所定のコピー数について再現可能な値を与えた。コピー数が互いに２倍異なる検量線の間で、再現可能な１サイクルの差異が存在した。
【０１６６】
Ｇ３子孫における導入遺伝子アレルの数を決定するために、ＤＮＡを増幅し、標準品と比較した。非遺伝子組換え由来のＤＮＡは、増幅しなかった。導入遺伝子アレルについてホモ接合性であるトリは、アレルについてヘミ接合性であるものより１サイクル早く増幅が開始するプロットを生じた。配列検出プログラムは、サンプルの増幅プロットが有意な増加を示す検量線およびサイクル閾値（Ｃｔ）に基づいて、未知のサンプル中のアレル数を産出可能である。データを下記の表３にて示す。
【０１６７】
Ｔａｑｍａｎコピー数分析を確認するために、ＰｓｔＩで消化したＤＮＡ、およびｎｅｏ耐性遺伝子に相補的なプローブを使用するサザンブロッティングによって、選択したトリのＤＮＡを分析して、０．９ｋｂのフラグメントを検出した。小さなＤＮＡのゲルからメンブランへの移動はより定量的であるので、小さなフラグメントの検出も選択した。０．９ｋｂのバンドのシグナル強度は、Ｔａｑｍａｎアッセイによって決定したＧ３遺伝子導入トリのコピー数によく対応した。サザンブロッティングによって分析した、さらに１８羽のＧ３遺伝子導入トリのコピー数もまた、Ｔａｑｍａｎによって決定したものと一致した。４１３３系統について、３３羽の全子孫を分析し、９羽（２７．３％）が非遺伝子導入体であって、１６羽（４８．５％）がヘミ接合性であって、８羽（２４．２％）がホモ接合性であった。５６５７系統について、１０羽の全子孫を分析し、５羽（５０．０％）が非遺伝子導入体であって、１羽（１０．０％）がヘミ接合性であって、４羽（４０．０％）がホモ接合性であった。４１３３系統Ｇ３子孫について、非遺伝子組換え、ヘミ接合体およびホモ接合体の観察された割合は、χ２試験によって決定した１：２：１の期待された比率とは実質的に異なっていた（Ｐは０．０５以下である）。５６５７系統の子孫は、期待した分布を有していなかったが、これは試験した子孫の数が少ないことに起因したといえる(Harvey et al., "Consistent production of transgenic chickens using replication deficient retroviral vectors and high-throughput screening procedures" (February 2002) Poultry Science 81:202-212)。
【０１６８】
【表４】
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【０１６９】
実施例１０
ｐＮＬＢ−ＭＤＯＴ−ＥＰＯベクターのためのベクター構築
本明細書の実施例１（ベクター構築）の教示に従って、ＥＰＯコード配列をＢＬコード配列に置換し、ｐＮＬＢ−ＭＤＯＴ−ＥＰＯベクターを作製した（図８Ｂ）。ＣＭＶプロモーターを使用する代わりに、ＭＤＯＴを使用した（図１３）。ＭＤＯＴは、オボムコイド（ＭＤ）およびオボトランスフェリン（ＴＯ）プロモーター両方由来のエレメントを含む合成プロモーターである（ｐＮＬＢ−ＭＤＯＴ−ＥＰＯベクター、別名をｐＡＶＩＪＣＲ−Ａ１４５．２７．２．２という）。
【０１７０】
ニワトリ（Gallus gallus）のオバルブミン、リゾチーム、オボムコイドおよびオボトランスフェリンタンパク質から作製したコドン使用頻度表と一緒にＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰａｃｋａｇｅのＢＡＣＫＴＲＡＮＳＬＡＴＥ（登録商標）プログラム，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．１  （Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｉｎｃ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を使用して、雌鳥輸卵管の最適化されたコドン使用頻度に基づくヒトＥＰＯについてのＤＮＡ配列を作製した。ＤＮＡ配列を合成し、契約ベースのＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩｏｗａによってｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の３’側突出Ｔにクローニングした。次いで、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＦｓｅ  Ｉを用いてｐＥｐｏＭＭからＥＰＯコード配列を除去し、０．８％アガロース−ＴＡＥゲルから精製し、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＦｓｅ  Ｉで消化し、アルカリホスファターゼで処理したｐＣＭＶ−ＩＦＮＭＭにライゲーションした。得られたプラスミドはｐＡＶＩＪＣＲ−Ａ１３７．４３．２．２であって、サイトメガロウイルス即時型プロモーター／エンハンサーおよびＳＶ４０ポリＡ部位によって制御されるＥＰＯコード配列を含む。プラスミドｐＡＶＩＪＣＲ−Ａ１３７．４３．２．２をＮｃｏＩおよびＦｓｅＩを用いて消化し、適切なフラグメントをＮｃｏＩおよびＦｓｅＩで消化したｐＭＤＯＴＩＦＮのフラグメントにライゲーションし、ＭＤＯＴプロモーターによって駆動するＥＰＯを含むｐＡＶＩＪＣＲ−Ａ１３７．８７．２．１を入手した。ＭＤＯＴプロモーターによって制御されるＥＰＯコード配列をＮＬＢレトロウイルスプラスミドにクローニングするために、プラスミドｐＡＬＶＭＤＯＴＩＦＮおよびｐＡＶＩＪＣＲ−Ａ１３７．８７．２．１をＫｐｎＩおよびＦｓｅＩを用いて消化した。０．８％アガロース−ＴＡＥゲルから適切なＤＮＡフラグメントを精製し、次いで、ライゲーションし、ＤＨ５  α細胞に形質転換した。得られたプラスミドは、ｐＮＬＢ−ＭＤＯＴ−ＥＰＯである（別名をｐＡＶＩＪＣＲ−Ａ１４５．２７．２．２という）。
【０１７１】
実施例１１
ＥＰＯを発現する遺伝子導入ニワトリおよび完全遺伝子導入Ｇ１ニワトリの作製
NLB-CMV-BL（実施例２を参照のこと）について記載するように、ＮＬＢ−ＭＤＯＴ−ＥＰＯ形質移入粒子の作製を実施した。Ｓｐｅｋｓｎｉｊｄｅｒ手順（米国特許第５，８９７，９９８号）に従って約３００個の白色レグホン卵に窓を作り、次いで、卵１個あたり約７×１０４の形質導入粒子を注入した。注入から２１日後に卵が孵化した。孵化から１週間後のヒヨコから血清サンプルを収集し、ＥＰＯレベルをＥＰＯ  ＥＬＩＳＡによって測定した。精子中にＥＰＯ導入遺伝子を含むＧ０雄鳥についてスクリーニングするために、Ｃｈｅｌｅｘ−１００  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  (Walsh et al., 1991)によって雄鳥血清サンプルからＤＮＡを抽出した。次いで、”ｎｅｏ  ｆｏｒ−１”（５’−ＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴ−３’；配列番号５）および”ｎｅｏ  ｒｅｖ−１”（５’−ＴＧＣＣＣＡＧＴＣＡＴＡＧＣＣＧＡＡＴ−３’；配列番号６）プライマーならびにＦＡＭ標識化ＮＥＯ−ＰＲＯＢＥ１（５’−ＣＣＴＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＣＧＧＣＣＧ−３’；配列番号７）を使用して、ＤＮＡサンプルを７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上でＴａｑｍａｎ（登録商標）分析に供して、導入遺伝子を検出した。精子サンプルにおける最も高い導入遺伝子レベルを有するＧ０雄鳥８羽を、非遺伝子導入ＳＰＡＦＡＳ（白色レグホン）雌鳥と人工受精によって交配させた。上記のＴａｑｍａｎ（登録商標）分析によって、導入遺伝子の存在について血液ＤＮＡサンプルをスクリーニングした。
【０１７２】
１０５４羽の子孫のうち、１６羽のヒヨコが遺伝子導入体（Ｇ１トリ）であることを見出した。ヒトＥＰＯの存在について、ＥＰＯ  ＥＬＩＳＡによってニワトリ血清を試験した。ＥＰＯは約７０ｎｇ／ｍｌ存在した。ヒトＥＰＯの存在について、ＥＰＯ  ＥＬＩＳＡによってＧ１雌鳥由来の卵の卵白も試験し、約７０ｎｇ／ｍｌのヒトＥＰＯを含むことを見出した。細胞培養アッセイにおいて、ヒトＥＰＯ応答性細胞株（ＨＣＤ５７マウス赤血球細胞）を試験した場合、卵中に存在するＥＰＯ（すなわち、ヒトＥＰＯについての最適化されたコード配列由来）が生物学的に活性であることを見出した。
【０１７３】
実施例１２
ｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＩＦＮのためのベクター構築
実施例１の教示に従って、ＩＦＮコード配列を実施例１のＢＬコード配列に置換し、ｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＩＦＮベクターを作製した。
【０１７４】
最適化されたコード配列を作製し、ここで、卵白タンパク質オバルブミン、リゾチーム、オボムコイドおよびオボトランスフェリンにおいて見出される特定のアミノ酸それぞれについて最も頻繁に使用されるコドンを、本発明のベクターに挿入する最適化されたヒトＩＦＮ−α  ２ｂコード配列の設計において使用した。より詳細には、最適化されたヒトＩＦＮ−α  ２ｂについてのＤＮＡコード配列は、雌鳥輸卵管の最適化されたコドン使用頻度に基づいており、ニワトリ（Gallus gallus）のオバルブミン、リゾチーム、オボムコイドおよびオボトランスフェリンタンパク質から作製したコドン使用頻度表と一緒にＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰａｃｋａｇｅのＢＡＣＫＴＲＡＮＳＬＡＴＥ（登録商標）プログラム，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．１  （Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｉｎｃ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を使用して作製した。例えば、４つの卵白タンパク質におけるアミノ酸アラニンの４つのコドンの使用頻度の割合は、ＧＣＵについて３４％、ＧＣＣについて３１％、ＧＣＡについて２６％、およびＧＣＧについて８％であった。従って、ＧＣＵを、最適化されたヒトＩＦＮ−α  ２ｂコード配列において、大部分のアラニンについてコドンとして使用した。最適化されたヒトＩＦＮ−α  ２ｂについての遺伝子を含むベクターを、家禽の組織および卵において形質導入された家禽由来のＩＦＮ−α  ２ｂ（ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂ）を発現する形質導入トリを産生するために使用した。
【０１７５】
Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）を用いたＰＣＲ（９４℃、１分間；５０℃、３０分間；および７２℃、１分間を２０サイクル、ならびに１０秒）によって、下記の表４にて列挙した鋳型およびプライマーオリゴヌクレオチドを増幅した。１２％ポリアクリルアミド−ＴＢＥゲルから、「粉砕および浸漬」法（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８２）によってＰＣＲ産物を精製し、次いで、プライマーとしてＩＦＮ−１およびＩＦＮ−８（表４を参照のこと）のみを使用する増幅反応中に鋳型として組み入れた。Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＸｂａ  Ｉを用いて得られたＰＣＲ産物を消化し、２％アガロース−ＴＡＥゲルから精製し、次いで、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＸｂａ  Ｉで消化し、アルカリホスファターゼで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にライゲーションし、プラスミドｐＢｌｕＫＳＰ−ＩＦＮＭａｇＭａｘを生じさせた。ユニバーサルＴ７およびＴ３プライマーを使用して、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡシークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  Ｃａｌｉｆ．）上でのサイクル配列決定によって、両方の鎖を配列決定した。元のオリゴヌクレオチドプライマー鋳型に由来するｐＢｌｕＫＳＰ−ＩＦＮ上の変異を、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  Ｃａｌｉｆ．）を用いた部位特異的変異誘発によって訂正した。次いで、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＸｂａ  １を用いて、ＩＦＮコード配列を訂正したｐＢｌｕＫＳＰ−ＩＦＮから除去し、０．８％アガロース−ＴＡＥゲルから精製し、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＸｂａ  Ｉで消化し、アルカリホスファターゼで処理したｐＣＭＶ−ＢｅｔａＬａ−３Ｂ−ｄＨにライゲーションした。得られたプラスミドはｐＣＭＶ−ＩＦＮであって、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）媒介即時型プロモーターおよびＳＶ４０ポリＡ部位によって制御されるＩＦＮコード配列を含んでいた。ＣＭＶプロモーター／エンハンサーによって制御されるＩＦＮコード配列をＮＬＢレトロウイルスプラスミドにクローニングするために、ＣｌａＩおよびＸｂａＩを用いてｐＣＭＶ−ＩＦＮをまず消化し、次いで、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）を用いて両方の末端を埋めた。ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩを用いてｐＮＬＢ−ａｄａｐｔｅｒを消化し、Ｔ４ポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）によって両方の末端を平滑にした。０．８％アガロース−ＴＡＥゲル上で適切なフラグメントを精製し、次いで、ライゲーションし、ＤＨ５  α細胞に形質転換した。得られたプラスミドがｐＮＬＢ−ａｄａｐｔｅｒ−ＣＭＶ−ＩＦＮである。次いで、ＭｌｕＩを用いてこのプラスミドを消化し、ＢｌｐＩを用いて部分的に消化し、適切なフラグメントをゲル精製した。ＭｌｕＩおよびＢｌｐＩを用いてｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰを消化し、次いで、アルカリホスファターゼ処理し、ゲル精製した。ｐＮＬＢ−ａｄａｐｔｅｒ−ＣＭＶ−ＩＦＮのＭｌｕＩ／ＢｌｐＩ部分フラグメントをｐ��ＬＢ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰのＭｌｕＩ／ＢｌｐＩ消化由来の大きなフラグメントにライゲーションし、ｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＩＦＮを作製した。
【０１７６】
【表５】
2009530377.tif 000027
【０１７７】
【表６】
2009530377.tif 000028
【０１７８】
実施例１３
ＩＦＮを発現する遺伝子導入ニワトリおよび完全遺伝子導入Ｇ１ニワトリの作製
実施例２の手順に従って、ｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＩＦＮ  の形質導入粒子を作製した。Ｓｐｅｋｓｎｉｊｄｅｒ手順（米国特許第５，８９７，９９８号）に従って、約３００個の白色レグホン（系統０）卵に窓を作り、次いで、卵１個あたり７×１０４の形質導入粒子を注入した。卵は注入から２１日後に孵化した。孵化から１週間後のヒヨコから血清サンプルを収集し、ヒトＩＦＮレベルをＩＦＮ  ＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１７９】
精子中にＥＰＯ導入遺伝子を含むＧ０雄鳥についてスクリーニングするために、Ｃｈｅｌｅｘ−１００  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  （Walsh et al., 1991）によって雄鳥血清サンプルからＤＮＡを抽出した。次いで、”ｎｅｏ  ｆｏｒ−１”（５’−ＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴ−３’；配列番号５）および”ｎｅｏ  ｒｅｖ−１”（５’−ＴＧＣＣＣＡＧＴＣＡＴＡＧＣＣＧＡＡＴ−３’；配列番号６）プライマーならびにＦＡＭ標識化ＮＥＯ−ＰＲＯＢＥ１（５’−ＣＣＴＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＣＧＧＣＣＧ−３’；配列番号７）を使用して、ＤＮＡサンプルを７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上でＴａｑｍａｎ（登録商標）分析に供して、導入遺伝子を検出した。精子サンプルにおける最も高い導入遺伝子レベルを有するＧ０雄鳥８羽を、非遺伝子導入ＳＰＡＦＡＳ（白色レグホン）雌鳥と人工受精によって交配させた。
【０１８０】
上記のＴａｑｍａｎ（登録商標）分析によって、導入遺伝子の存在について、血液ＤＮＡサンプルをスクリーニングした。１５９７羽の子孫のうち、１羽の雄鳥が遺伝子導入体（別名を「Ａｌｐｈｉｅ」という）であることを見出した。ｈＩＦＮの存在についてＡｌｐｈｉｅをｈＩＦＮ  ＥＬＩＳＡによって試験し、ｈＩＦＮが２００ｎｇ／ｍｌで存在した。
【０１８１】
非遺伝子導入ＳＰＡＦＡＳ（白色レグホン）雌鳥の人工授精のために、Ａｌｐｈｉｅの精子を使用した。Ｔａｇｍａｎ（登録商標）分析によって、２０２羽の子孫のうち１０６羽が導入遺伝子を含んでいることを検出した。メンデルの遺伝様式に従っており、Ａｌｐｈｉｅが遺伝子導入体であることを示した。
【０１８２】
実施例１４
遺伝子導入家禽由来のインターフェロン−α  ２ｂ（ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂ）の炭水化物分析
実験的な証拠によって、トリ由来のインターフェロン−α  ２ｂ（すなわち、ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂ）において新たな糖鎖付加パターンが明らかになった。ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２は、ヒト末梢血白血球由来のインターフェロン−α  ２（ＰＢＬ  ＩＦＮ−α  ２ｂ）または天然のヒトインターフェロン−α  ２（天然ｈＩＦＮ）では通常見られない新たな糖鎖付加パターンを示しており、新たなグリコフォームを含む（バンド４および５はα−Ｇａｌが伸長された二糖であり；図９を参照のこと）。ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂはまた、ヒトＰＢＬ  ＩＦＮ−α  ２ｂに類似し、ニワトリにおいてヒト形態より効率的に産生されるＯ結合型糖鎖構造を含む。では通常見られない新たな糖鎖付加パターンを示しており、新たなグリコフォームを含む（バンド４および５はα−Ｇａｌが伸長された二糖であり；図９を参照のこと）。ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂはまた、ヒトＰＢＬ  ＩＦＮ−α  ２ｂに類似し、ニワトリにおいてヒト形態より効率的に産生されるＯ結合型糖鎖構造を含むことを見出した。
【０１８３】
ヒトＩＦＮ−α  ２ｂについてのコード配列を最適化し（実施例１２、上記）、組換えＩＦＮ−α  ２ｂコード配列を生じさせた。次いで、ニワトリにおいてＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂを産生させた（実施例１３、上記）。単糖分析およびＦＡＣＥ分析を含む炭水化物分析によって、糖構造およびタンパク質の糖鎖付加パターンが明らかになった。あるいは、ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂは、以下の単糖残基を示す：Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＮＡｃＧａｌ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＮＡｃＧｌｕ）およびシアル酸（ＳＡ）。しかし、ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂ中にはＮ結合型糖鎖付加は存在しない。代わりに、ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂは、Ｔｈｒ−１０６にてＯ−グリコシル化される。この型の糖鎖付加はヒトＩＦＮ−α  ２に類似しており、１０６位のＴｈｒ残基はＩＦＮ−α  ２に特有である。天然のＩＦＮ−αに類似であるＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂは、マンノース残基を有していない。ＦＡＣＥ分析は種々の糖残基を表す６つのバンド（図９）を明らかにし、ここで、バンド１、２および３は、それぞれ非シアル酸付加、シアル酸付加および二シアル酸付加されている（図１０）。シアル酸（ＣＡ）結合はガラクトース（Ｇａｌ）に対してアルファ２−３であり、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＮＡｃＧａｌ）に対してアルファ２−６である。バンド６は、非シアル酸付加四糖を表している。バンド４および５は、ヒトＰＢＬ  ＩＦＮ−α  ２ｂまたは天然のヒトＩＦＮ（天然ｈＩＦＮ）において見られないアルファ−ガラクトース（アルファ−Ｇａｌ）伸長型二糖である。図１０は、ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂ（卵白ｈＩＦＮ）とヒトＰＢＬ  ＩＦＮ−α  ２ｂ（天然ｈＩＦＮ）の比較を示す。微小のバンドがＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂにおけるバンド３と４との間、およびバンド４と５との間に存在している（下記参照）。
【０１８４】
タンパク質がＴｈｒ−１０６にて以下の特定の残基でＯ−グリコシル化されていることを見出した：
式（ｉ）：
【化２２】
2009530377.tif 000029
式（ｉｉ）：
【化２３】
2009530377.tif 000030
式（ｉｉｉ）：
【化２４】
2009530377.tif 000031
式（ｉｖ）：
【化２５】
2009530377.tif 000032
式（ｖ）：
【化２６】
2009530377.tif 000033
式（ｖｉ）：
【化２７】
2009530377.tif 000034
［式中、Ｇａｌ＝ガラクトース、
ＮＡｃＧａｌ＝Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、
ＮＡｃＧｌｕ＝Ｎ−アセチル−グルコサミンおよび
ＳＡ＝シアル酸］。
【０１８５】
割合は、
式（ｉ）：
【化２８】
2009530377.tif 000035
が約２０％であって；
式（ｉｉ）：
【化２９】
2009530377.tif 000036
が約２９％であって；
式（ｉｉｉ）：
【化３０】
2009530377.tif 000037
が約９％であって；
式（ｉｖ）：
【化３１】
2009530377.tif 000038
が約６％であって；
式（ｖ）：
【化３２】
2009530377.tif 000039
が約２０％であって；
式（ｖｉ）：
【化３３】
2009530377.tif 000040
が約１２％であった。
【０１８６】
微小のバンドがバンド３と４との間、およびバンド４と５との間に存在し、ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂにおいて約１７％を占めた。
【０１８７】
実施例１５
トリ細胞における、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳを使用したプラスミド形質移入およびレトロウイルス形質導入からのＭＡｂｓの発現
脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来のＩＲＥＳをＬＣおよびＨＣコード配列の間に配置することによってヒトモノクローナル抗体の軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を単一のベクター、ｐＣＭＶ−ＬＣ−ｅｍｃｖＩＲＥＳ−ＨＣから発現させた（Jang et al. (1988) ”A segment of the 5' nontranslated region of encephalomyocarditis virus RNA directs internal entry of ribosomes during in vitro translation” J. Virol. 62:2636-2643も参照のこと）。
【０１８８】
２つの別々のベクターからのモノクローナル抗体の発現を試験するために、ＣＭＶプロモーターに連結したＬＣまたはＨＣをＬＭＨ／２ａ細胞、エストロゲン応答性のニワトリ肝細胞株に同時形質移入した（Binder et al. (1990) "Expression of endogenous and transfected apolipoprotein II and vitellogenin II genes in an estrogen responsive chicken liver cell line" Mol. Endocrinol. 4:201-208も参照のこと）。ｐＣＭＶ−ＬＣおよびｐＣＭＶ−ＨＣの同時形質移入が３９２  ｎｇ／ｍｌのＭＡｂｓを生じた一方、ｐＣＭＶ−ＬＣ−ｅｍｃｖＩＲＥＳ−ＨＣの形質移入が１８５  ｎｇ／ｍｌのＭＡｂを生じたことを、ＭＡｂ  ＥＬＩＳＡによって検出した。
【０１８９】
モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に基づくレトロウイルスベクターに、ＣＭＶ−ＬＣ−ｅｍｃｖ−ＨＣカセットを挿入し、ｐＬ−ＣＭＶ−ＬＣ−ｅｍｃｖＩＲＥＳ−ＨＣ−ＲＮ−ＢＧを作製した。ＬＭＨ細胞(Kawaguchi et al. (1987) "Establishment and characterization of a chicken hepatocellular carcinoma cell line, LMH" Cancer Res. 47:4460-4464も参照のこと)、ＬＭＨ／２ａの親株を標的細胞として使用したが、これはこれらの細胞がネオマイシン耐性でないからである。ＬＭＨ細胞をＬ−ＣＭＶ−ＬＣ−ｅｍｃｖＩＲＥＳ−ＨＣ−ＲＮ−ＢＧレトロウイルスベクターで形質導入し、ネオマイシンを用いて選択し、数週間継代した。ＬＭＨ細胞を別々に形質導入し、親のＭＬＶベクター、ＬＸＲＨを用いてネオマイシン選択した。ＬＸＲＨ細胞由来の培地はＭＡｂについて陰性であったが、Ｌ−ＣＭＶ−ＬＣ−ｅｍｃｖＩＲＥＳ−ＨＣ−ＲＮ−ＢＧを形質導入した細胞由来の培地は、２２ｎｇ／ｍｌのＭＡｂを含んでいた。
【０１９０】
実施例１６
ＭＡｂを発現する形質導入ニワトリおよび完全形質導入Ｇ１ニワトリの作製
実施例１５のＣＭＶ−ＬＣ−ｅｍｃｖ−ＨＣカセットを、実施例１のｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＢＬのＣＭＶ−ＢＬカセットに置換することによって、ｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＬＣ−ｅｍｃｖ−ＨＣベクターを作製した。
【０１９１】
実施例２の手順に従って、ｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＬＣ−ｅｍｃｖ−ＨＣの形質導入粒子を作製した。Ｓｐｅｋｓｎｉｊｄｅｒ手順（米国特許第５，８９７，９９８号）に従って約３００個の白色レグホン卵に窓を作り、次いで、卵１個あたり約７×１０４の形質導入粒子を注入した。注入から２１日後に卵が孵化した。孵化から１週間後のヒヨコから血清サンプルを収集し、ＥＰＯレベルをＥＰＯ  ＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１９２】
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）分析によって、精子中にＥＰＯ導入遺伝子を含むＧ０雄鳥を同定した。血清サンプル中に最も高いレベルの導入遺伝子を有する雄鳥を、人工授精によって非遺伝子導入ＳＰＡＦＡＳ（白色レグホン）雌鳥と交配させた。
【０１９３】
１０００羽の子孫についてスクリーニングし、１０羽超のヒヨコが遺伝子導入体（Ｇ１トリ）であることを見出した。ＭＡｂの存在について、ヒヨコ血清をＥＬＩＳＡによって試験した。ＭＡｂが１０μg/ml血清より多い量で存在することを見出す。ＭＡｂの存在について、Ｇ１雌鳥由来の卵白もＥＬＩＳＡによって試験し、１０μg/ml血清より多い量で存在することを見出す。
【０１９４】
実施例１７
ｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ｈＧ−ＣＳＦの構築
このベクターは、実施例１２のｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＩＦＮベクターのＩＦＮコード領域をＧ−ＣＳＦのコード配列で効率的に置換する。プライマー５’ＧＣＳＦ  （ｇｇｇｇｇｇａａｇｃｔｔｔｃａｃｃａｔｇｇｃｔｇｇａｃｃｔｇｃｃａ；配列番号３２）および３’ＧＣＳＦ  （ａｃｔａｇａｃｔｔｔｔｃａｇｇｇｃｔｇｇｇｃａａｇｇｔｇｇｃｇ；配列番号３３）を用いて、ｐＯＲＦ９−ｈＧ−ＣＳＦｂ（カタログ番号ｐｏｒｆ−ｈｇｃｓｆｂ，Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からｈＧ−ＣＳＦ  ＯＲＦ（ヒト顆粒球コロニー刺激因子読み取り枠）を増幅して、６４２塩基対（ｂｐ）のＰＣＲ産物を作製した。ｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＩＦＮ  ａｌｐｈａ−２ｂにおいて見出されるものと一致するＧ−ＣＳＦコード配列の３’側コード配列を有するｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ｈＧ−ＣＳＦ構築物を提供するために、プライマー５’ＧＣＳＦ−ＮＬＢ（ｃｃａｇｃｃｃｔｇａａａａｇｔｃｔａｇｔａｔｇｇｇｇａｔｔｇｇｔｇ；配列番号３４）および３’ＧＣＳＦ−ＮＬＢ  （ｇｇｇｇｇｇｇｃｔｃａｇｃｔｇｇａａｔｔｃｃｇｃｃ；配列番号３５）を使用するＰＣＲによって、ｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＩＦＮ  ａｌｐｈａ−２ｂの８６ｂｐフラグメント（ＩＦＮコード配列の３’末端に隣接して存在する）を増幅した。２つのＰＣＲ産物（６４２ｂｐおよび８６ｂｐ）を混合し、プライマー５’ＧＣＳＦおよび３’ＧＣＳＦ−ＮＬＢを用いたＰＣＲ増幅によって融合させた。説明書に従って、ＰＣＲ産物をｐＣＲ（登録商標）４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（登録商標）プラスミドベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ＤＨ５α−Ｅ細胞にエレクトロポレーションし、ｐＦｕｓｉｏｎ−ｈＧ−ＣＳＦ−ＮＬＢを作製した。Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＢｌｐ  Ｉを用いてｐＦｕｓｉｏｎ−ｈＧ−ＣＳＦ−ＮＬＢを消化し、、６９０ｂｐのＧ−ＣＳＦフラグメントをゲル精製した。Ｂｌｐ  Ｉを用いて消化することによって、ｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＩＦＮ  ａｌｐｈａ−２ｂからＩＦＮ  ａｌｐｈａ−２ｂコード配列を除去した。次いで、ベクターを再度消化し、ＩＦＮをコードする挿入部分を欠損したクローンを選択し、ｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ｄｅｌｔａ  ｈＩＦＮ  ａｌｐｈａ−２ｂを作製した。Ｂｌｐ  Ｉを用いてｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ｄｅｌｔａ  ＩＦＮ  ａｌｐｈａ−２ｂを消化し、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩを用いて部分的に消化し、８７３２ｂｐのＢｌｐ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩベクターフラグメントをゲル精製した。６９０ｂｐのＨｉｎｄ  ＩＩＩ／Ｂｌｐ  Ｉ  Ｇ−ＣＳＦフラグメントに、８７３２ｂｐのフラグメントをライゲーションし、ｐＮＬＢ−ＣＭＶ−Ｇ−ＣＳＦを作製した。配列決定することによって、Ｇ−ＣＳＦ  ＯＲＦを確認した。
【０１９５】
実施例１８
ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ−ＣＳＦ）を発現する遺伝子導入ニワトリの作製
実施例２においてＮＬＢ−ＣＭＶ−ＢＬについて記載したように、ＮＬＢ−ＣＭＶ−ｈＧ−ＣＳＦ形質導入粒子の作製を実施した。ステージＸの卵２７７個の胚に、７μｌのＮＬＢ−ＣＭＶ−ｈＧ−ＣＳＦ形質導入粒子を注入した（力価は２．１×１０７〜６．９×１０７であった）。８６羽のヒヨコが孵化し、性的に成熟するまで飼育した。６０羽のヒヨコがＧ−ＣＳＦについて陽性であって、性別に分けた：３０羽のオスおよび３０羽のメス。ｈＧ−ＣＳＦについて、２１羽の雌鳥由来の卵白をＥＬＩＳＡによってアッセイした。５羽の雌鳥が０．０５μｇ／ｍｌ〜０．５μｇ／ｍｌの範囲の有意なレベルのｈＧ−ＣＳＦタンパク質を有していることを見出した。
【０１９６】
Ｃｈｅｌｅｘ−１００  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  （Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）によって雄鳥血清サンプルからＤＮＡを抽出した。次いで、プライマーＳＪ−Ｇ−ＣＳＦ（ｃａｇａｇｃｔｔｃｃｔｇｃｔｃａａｇｔｇｃｔｔａ）およびＳＪ−Ｇ−ＣＳＦ  ｒｅｖ（ｔｔｇｔａｇｇｔｇｇｃａｃａｃａｇｃｔｔｃｔ）ならびにＳＪ−Ｇ−ＣＳＦプローブ（ａｇｃａａｇｔｇａｇｇａａｇａｔｃｃａｇｇｇｃｇ）を使用して、ＤＮＡサンプルを７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上でＴａｑｍａｎ（登録商標）分析に供して、導入遺伝子を検出した。精子サンプルにおける最も高い導入遺伝子レベルを有するＧ０雄鳥８羽を、非遺伝子導入ＳＰＡＦＡＳ（白色レグホン）雌鳥と人工受精によって交配させた。
【０１９７】
上記のＴａｑｍａｎ（登録商標）分析によって、導入遺伝子の存在について、血液ＤＮＡサンプルをスクリーニングした。２２６４羽の子孫のうち、１３羽の雄鳥が遺伝子導入体であることを見出し、それぞれがＧ−ＣＳＦの存在について陽性であって、ＥＬＩＳＡによって測定したところ、ある雌鳥は血清において約１３６．５ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ、卵白において５．６μｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦを有していた。
【０１９８】
ＸＧＦ４９８と同じ系統である２羽のＧ１雄鳥（ＱＧＦ９１０およびＤＤ９０２７）（従って、ゲノム中、同一の位置に挿入された同一の導入遺伝子を有する）を非遺伝子導入雌鳥と交配させ、家禽由来のＧ−ＣＳＦを含む卵を産むメスの子孫を作製した。ＱＧＦ９１０およびＤＤ９０２７子孫の卵から卵白を収集し、ミリグラムの分量のＧ−ＣＳＦを精製した。実施例２０において開示したように得られた家禽由来のＧ−ＣＳＦの代表的な糖鎖付加パターンを決定した。
【０１９９】
実施例１９
ヒト細胞傷害性抗原４−Ｆｃ融合タンパク質（ＣＴＬＡ４−Ｆｃ）を発現する遺伝子導入ニワトリの作製
２００５年１月３１日に出願された米国特許第１１／０４７，１８４号（出典明示によってその全体を本願明細書にて援用する）にて開示されているように、ｐＮＬＢ−１．８ＯＭ−ＣＴＬＡ４Ｆｃ  ａｎｄ  ｐＮＬＢ−３．９ＯＭ−ＣＴＬＡ４Ｆｃを構築した。実施例２においてｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＢＬについて記載するように、ｐＮＬＢ−１．８ＯＭ−ＣＴＬＡ４ＦｃおよびｐＮＬＢ−３．９ＯＭ−ＣＴＬＡ４Ｆｃ形質導入粒子の作製を実施した。７μｌのｐＮＬＢ−１．８ＯＭ−ＣＴＬＡ４Ｆｃ形質導入粒子を１９３個の白色レグホン卵に注入し（力価は〜４×１０６であった）、７２羽のヒヨコが孵化した。７μｌのｐＮＬＢ−３．９ＯＭ−ＣＴＬＡ４Ｆｃ形質導入粒子を１９９個の白色レグホン卵に注入し（力価は〜４×１０６であった）、２０羽のヒヨコが孵化した。
【０２００】
ＣＴＬＡ４−Ｆｃの存在について、ｐＮＬＢ−１．８ＯＭ−ＣＴＬＡ４Ｆｃ粒子を用いて作製した３０羽の雌鳥由来の卵白をＥＬＩＳＡによってアッセイした。１羽の雌鳥が、０．１３２μｇ／ｍｌの平均レベル（５個の卵をアッセイした）で、卵白において有意なＣＴＬＡ４−Ｆｃタンパク質レベルを有していることを見出した。ＣＴＬＡ４−Ｆｃの存在について、ｐＮＬＢ−３．９ＯＭ−ＣＴＬＡ４Ｆｃ粒子を用いて作製した７羽の雌鳥由来の卵白をＥＬＩＳＡによってアッセイした。２羽の雌鳥が、一方の雌鳥について０．１６４μｇ／ｍｌの平均レベル（５個の卵をアッセイした）、もう一方の陽性の雌鳥について０．１２３μｇ／ｍｌの平均レベル（５個の卵をアッセイした）で、卵白において有意なＣＴＬＡ４−Ｆｃタンパク質レベルを有していることを見出した。
【０２０１】
実施例２０
遺伝子導入家禽由来Ｇ−ＣＳＦの炭水化物分析
当業者に周知である以下の分析技術を用いることによって、ＴＰＤ  Ｇ−ＣＳＦのオリゴ糖構造を決定した。ペプチド骨格から遊離させた後に、オリゴ糖に対して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析）分析およびＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析）を実施した。Ｏ結合型オリゴ糖をタンパク質から化学的に遊離させ、無水ＤＭＳＯ下でのヨウ化メチルとの反応を含むＮａＯＨ法を使用して、パーメチル化（permethylated）させ、分析の直前にクロロホルムによって抽出した。インタクトでグリコシル化されたＧ−ＣＳＦに対して直接質量分析を実施した。ＨＰＬＣ分析を使用して、多糖構造に対しても分析を実施した。つまり、タンパク質骨格からの遊離の後に、ＨＰＬＣを使用して構造を分離した。特定の酵素を用いて各多糖種のサンプルを消化し、消化産物をＨＰＬＣによって分析し、当業者に理解される構造決定を提供した。
【０２０２】
決定した構造は以下：
【化３４】
2009530377.tif 000041
である。興味深いことに、構造Ｃおよび構造Ｄは、図において示す構造Ｅの前駆体形態であり得る。限定するものではないが、構造Ａは家禽由来のグリコシル化されたＧ−ＣＳＦ上に約２０％〜約４０％の確率で存在し、構造Ｂは家禽由来のグリコシル化されたＧ−ＣＳＦ上に約５％〜約２５％の確率で存在し、構造Ｃは家禽由来のグリコシル化されたＧ−ＣＳＦ上に約１０％〜約２０％の確率で存在し、構造Ｄは家禽由来のグリコシル化されたＧ−ＣＳＦ上に約５％〜約１５％の確率で存在し、構造Ｅは家禽由来のグリコシル化されたＧ−ＣＳＦ上に約１％〜約５％の確率で存在し、構造Ｆは家禽由来のグリコシル化されたＧ−ＣＳＦ上に約１０％〜約２５％の確率で存在し、構造Ｇは家禽由来のグリコシル化されたＧ−ＣＳＦ上に約２０％〜約３０％の確率で存在すると推定された。
【０２０３】
当業者に容易に利用可能な方法を使用して、アルビトール（内部標準）を用いてスパイクし、加水分解し、Ｎ−アセチル化し、かつＴＭＳ誘導体化した家禽由来のＧ−ＣＳＦに対して、ＧＣ／ＭＳ（ガスクロマトグラフィー質量分析）によって単糖分析を実施した。誘導体化したサンプルを同様に誘導体化したサンプルの標準混合物と比較した。ケトデオキシノヌロソン酸でスパイクし、凍結乾燥させ、次いで加水分解し、脱塩し、再度凍結乾燥させた後で、家禽由来のＧ−ＣＳＦのシアル酸分析を実施した。適切な標準品を使用するＤｉｏｎｅｘ  ＢｉｏＬＣシステム上で、サンプルの分析を実施した。表５にて理解されるように、これらの分析によって、ガラクトース、グルコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびシアル酸（Ｎ−アセチルアセチルノイラミン酸）の存在が示された。表５におけるデータは、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析によって得られた予備的なデータ（かなりの割合のＮ−アセチルグルコサミンが存在すると決定していた）に取って代わるものである。
【０２０４】
【表７】
2009530377.tif 000042
【０２０５】
ＴＦＡ中で加水分解し、ボロジュウテリウム化ナトリウム中で還元した家禽由来のＧ−ＣＳＦのパーメチル化グルカンサンプルに対して、結合分析を実施した。メタノール：氷酢酸（９：１）を３回添加することによってホウ酸を除去し、凍結乾燥、次いで、無水酢酸によってアセチル化した。クロロホルムを用いた抽出によって精製した後で、サンプルをＧＣ／ＭＳによって試験した。同じ条件下で、標準品混合物も流した。結合を以下のように決定した：
ｉ．シアル酸結合は、ガラクトースに対して２〜３個、Ｎ−アセチルガラクトサミンに対して２〜４個である；
ｉｉ．ガラクトース結合は、Ｎ−アセチルガラクトサミンに対して２〜３個、Ｎ−アセチルグルコサミンに対して２〜４個である；
ｉｉｉ．Ｎ−アセチルグルコサミン結合は、Ｎ−アセチルガラクトサミンに対して２〜６個である。
【０２０６】
実施例２１
家禽由来Ｇ−ＣＳＦ（ＴＰＤ  Ｇ−ＣＳＦ）のインビトロにおける細胞増殖活性
ＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイを使用して、ＴＰＤ  Ｇ−ＣＳＦのインビトロでの生物学的活性を示した。つまり、ＧＭ−ＣＳＦを含む培地中で、ＮＦＳ−６０細胞を維持した。コンフルエントな細胞を回収し、洗浄し、培地のみを含むウェル１つあたり１０５の細胞密度でプレーティングした。ＴＰＤ  Ｇ−ＣＳＦおよび細菌由来のヒトＧ−ＣＳＦ（すなわち、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標））を培地中に段階希釈し、３連のセパレートウェルに添加した。３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の代謝還元によって細胞増殖を決定し、分光測定によって定量化した。Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）のＥＤ５０を精製したトリ由来のＧ−ＣＳＦと比較することによって、トリ由来のＧ−ＣＳＦの特異的な活性を決定した。１４日間にわたって、ＴＰＤ  Ｇ−ＣＳＦの特異的な活性を、細菌由来のＧ−ＣＳＦ  Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）の活性を十分に上回ることを決定した。図１７を参照のこと。
【０２０７】
本明細書に記載の全ての文献（例えば、米国特許、米国特許出願、刊行物）を、出典明示によって援用する。本発明の種々の修飾および変動は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明を、本発明の好ましい実施態様と関連させて記載しているが、権利を主張する本発明は、そのような特定の実施態様に限定されるものではない。さらに、本明細書に記載し、当業者に明らかな本発明を実施する態様の種々の改変も、上記の特許請求の範囲に含まれることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０２０８】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、オバルブミンプロモーターセグメントおよびコード配列、遺伝子Ｘ（これは、外因性タンパク質Ｘをコードする）を含む、オバルブミンプロモーター発現ベクターを示す。Ｘは、目的の外因性遺伝子または外因性タンパク質のいずれかを示す。
【図２−１】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄは、オバルブミンプロモーターおよびコード配列、遺伝子Ｘ（これは、外因性タンパク質Ｘをコードする）を含む、レトロウイルスベクターを示す。Ｘは、目的の外因性遺伝子または外因性タンパク質のいずれかを示す。
【図２−２】図２Ｅは、２Ａおよび２Ｂのベクターへの挿入用の外因性遺伝子を増幅するための方法を示す。
【図２−３】図２Ｆは、コード配列、遺伝子Ｘの発現を制御するオバルブミンプロモーター、および第２のコード配列、遺伝子Ｙの発現を可能にする配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを含むレトロウイルスベクターを示し、遺伝子ＸおよびＹは任意の目的の遺伝子を示す。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、それぞれＡＬＶ由来のベクター、ｐＮＬＢおよびｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＢＬの略図を示す。ＮＬＢは全体が配列決定されていないので、ｂｐ（塩基対）の測定値は、公開されているデータ(Cosset et al., 1991; Thoraval et al., 1995) および本明細書で考察するデータからの推定されるものである。ベクターはこれら図から明らかな一方、ニワトリゲノムに組み込まれている。
【図４−１】図４Ａおよび４Ｂは、キメラおよび遺伝子導入ニワトリの血清中のβ−ラクタマーゼ（ラクタマーゼ）の量を示す。図４Ａにおいて、ＮＬＢ−ＣＭＶ−ＢＬ導入遺伝子で形質導入したＧ０ニワトリの血清中の生理活性ラクタマーゼの濃度を、パッチ後８ヶ月目に測定した。世代、性別およびウィングバンド数を示す。ラクタマーゼの血清濃度を、Ｇ１遺伝子導入ニワトリについてパッチ後６〜７ヶ月に測定した。矢印は、雄鳥２３９５から生まれたＧ１ニワトリを示す。図４Ｂにおいて、ラクタマーゼの血清濃度を、Ｇ１およびＧ２遺伝子導入ニワトリについて測定した。矢印は、雌鳥５６５７または雄鳥４１３３から生まれたＧ２を示す。ニワトリ４１３３、５３０８および５６５７からのサンプルは、図４Ａに記載のものと同じである。５６５７から生まれたＧ２のトリ由来のサンプルは、パッチ後３〜６０日目で収集した。４１３３から生まれたＧ２のトリ由来のサンプルは、パッチ後３ヶ月目で収集した。
【図４−２】図４Ａおよび４Ｂは、キメラおよび遺伝子導入ニワトリの血清中のβ−ラクタマーゼ（ラクタマーゼ）の量を示す。図４Ａにおいて、ＮＬＢ−ＣＭＶ−ＢＬ導入遺伝子で形質導入したＧ０ニワトリの血清中の生理活性ラクタマーゼの濃度を、パッチ後８ヶ月目に測定した。世代、性別およびウィングバンド数を示す。ラクタマーゼの血清濃度を、Ｇ１遺伝子導入ニワトリについてパッチ後６〜７ヶ月に測定した。矢印は、雄鳥２３９５から生まれたＧ１ニワトリを示す。図４Ｂにおいて、ラクタマーゼの血清濃度を、Ｇ１およびＧ２遺伝子導入ニワトリについて測定した。矢印は、雌鳥５６５７または雄鳥４１３３から生まれたＧ２を示す。ニワトリ４１３３、５３０８および５６５７からのサンプルは、図４Ａに記載のものと同じである。５６５７から生まれたＧ２のトリ由来のサンプルは、パッチ後３〜６０日目で収集した。４１３３から生まれたＧ２のトリ由来のサンプルは、パッチ後３ヶ月目で収集した。
【図５】図５は、雌鳥５６５７（図５Ａ）または雄鳥４１３３（図５Ｂ）が有する導入遺伝子座を含むニワトリの系図を示す。２３９５は多重導入遺伝子座を担持する雄鳥であった。２３９５を非遺伝子導入雌鳥と交配させて、ニワトリゲノムの特有の位置に導入遺伝子をそれぞれ担持する３羽の子孫を生じさせた。単純にするために、発現データが示されなかった遺伝子導入の子孫および非遺伝子導入の子孫は、系図から除いている。バンド数は、以下の記号を示す：○  雌鳥；□  雄鳥；●  NLB-CMV-BL導入遺伝子を担持する雌鳥；■  NLB-CMV-BLを担持する雄鳥。
【図６】図６は、雌鳥５６５７およびその子孫の卵白中のβ−ラクタマーゼ（ラクタマーゼ）を示す。図６Ａにおいて、雌鳥５６５７およびその遺伝子導入の子孫由来の卵白を活性ラクタマーゼについてアッセイしている。コントロールは、未処理の雌鳥であって、交配相手は雌鳥５６５７から生まれた非遺伝子導入体Ｇ２である。２０００年３月に収集した。矢印は雌鳥５６５７から生まれたＧ２を示している。図６Ｂにおいて、導入遺伝子（ヘミ接合性）１コピーを担持するＧ２の遺伝子導入雌鳥由来の卵白サンプルを、２コピー（ホモ接合性）を有するＧ３の雌鳥６９７８と比較している。２００１年２月に卵を回収した。世代およびウィングバンド数を左に示している。
【図７】図７は、雄鳥４１３３から生まれたＧ２およびＧ３雌鳥の卵中のβ−ラクタマーゼ（ラクタマーゼ）を示す。図７Ａにおいて、雄鳥４１３３から生まれたヘミ接合性遺伝子導入雌鳥の代表的な４羽由来の卵白を活性ラクタマーゼについてアッセイしている。１９９９年１０月および２００１年２月に卵を収集し、各セットを収集した後に、雌鳥１羽あたり最低４個の卵をアッセイした。コントロールは、未処理の雌鳥由来の卵白を示す。バンド数を左に示す。各期間の４羽の雌鳥の平均を計算している。図７Ｂにおいて、ヘミ接合性のＧ２遺伝子導入雌鳥由来の卵白を、ヘミ接合性およびホモ接合性の遺伝子導入Ｇ３雌鳥の卵白と比較した。２００１年２月に卵を収集した。世代数および導入遺伝子のコピー数を、各雌鳥についてのデータバーにて示す。１または２コピーを担持する雌鳥についての平均濃度を表の下方に示す。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、ニワトリでのＩＦＮ−α  ２ｂ発現用ｐＮＬＢ−ＣＭＶ−ＩＦＮベクター；およびニワトリでのエリスロポイエチン（ＥＰＯ）発現用ｐＮＬＢ−ＭＤＯＴ−ＥＰＯｗｐそれぞれ示す。
【図９】図９は、６バンド全てを含む、遺伝子導入家禽由来のインターフェロン−α  ２ｂ（ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂ）の新規の糖鎖付加パターンを表す。
【図１０】図１０は、ヒト末梢血白血球由来のインターフェロン−α  ２ｂ（ＰＢＬ  ＩＦＮ−α  ２ｂまたは天然のｈＩＦＮ）と遺伝子導入家禽由来のインターフェロン−α  ２ｂ（ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂまたは卵白ｈＩＦＮ）との比較を示す。
【図１１】図１１Ａは、最適化されたヒトインターフェロン−α  ２ｂ（ＩＦＮ−α  ２ｂ）、すなわち、組換えＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂ（配列番号１）の合成核酸配列（ｃＤＮＡ、残基１〜４９８）を表す。図１１Ｂは、遺伝子導入家禽由来のインターフェロン−α  ２ｂ（ＴＰＤ  ＩＦＮ−α  ２ｂ）（配列番号２）の合成アミノ酸配列（残基１〜１６５）を表す。
【図１２】図１２Ａは、最適化されたヒトエリスロポイエチン（ＥＰＯ）、すなわち、組換えＴＰＤ  ＥＰＯ（配列番号３）の合成核酸配列（ｃＤＮＡ、残基１〜５７９）を表す。図１２Ｂは、遺伝子導入家禽由来のエリスロポイエチン（ＴＰＤ  ＥＰＯ）（配列番号４）の合成アミノ酸配列（残基１〜１９３）を表す（天然のヒトＥＰＯについて、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ０００７９０も参照のこと）。
【図１３】図１３は、ＩＦＮ−ＭＭ  ＣＤＳに連結された合成ＭＤＯＴプロモーターを示す。ＭＤＯＴプロモーターは、−４３５〜１６６ｂｐの範囲のニワトリオボムコイド遺伝子（オボムコイドプロモーター）、および−２５１〜＋２９ｂｐの範囲のニワトリコンアルブミン遺伝子（オボトランスフェリンプロモーター）由来のエレメントを含む（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｙ００４９７、Ｍ１１８６２およびＸ０１２０５を参照のこと）。
【図１４】図１４は、主要な卵白タンパク質の概要を提供する。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｄは、ｐＣＭＶ−ＬＣ−ｅｍｃｖＩＲＥＳ−ＨＣベクターを示し、ここで、モノクローナル抗体の発現を試験するために、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来のＩＲＥＳの配置によってヒトモノクローナル抗体の軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）をこの単一のベクターから発現させた。比較として、図１５Ｂおよび１５Ｃは、別々のベクターｐＣＭＶ−ＨＣおよびｐＣＭＶ−ＬＣをそれぞれ示し、ここで、これらのベクターもモノクローナル抗体の発現を試験するために使用した。
【図１６】図１６は、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（レーンＡ）およびＴＰＤ  Ｇ−ＣＳＦ（レーンＢ）の銀染色したＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。
【図１７】図１７は、１４日間にわたる、細菌由来のヒトＧ−ＣＳＦと比較したＴＰＤ  Ｇ−ＣＳＦの好中球絶対数の増加を表す。
【図１８】図１８Ａ（配列番号３９）は、図１８Ｂのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。図１８Ｂ（配列番号４０）（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ７５７７３７３に対応する）は、細胞の分泌の間に成熟Ｇ−ＣＳＦを形成するために切り離される天然のシグナル配列を含む、Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列を示す。図１８Ｃ（配列番号４１）は、本発明によって産生される成熟Ｇ−ＣＳＦタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１】
2009530377.tif 000055
【図２−１】
2009530377.tif 000056
【図２−２】
2009530377.tif 000057
【図２−３】
2009530377.tif 000058
【図３】
2009530377.tif 000059
【図４−１】
2009530377.tif 000060
【図４−２】
2009530377.tif 000061
【図５】
2009530377.tif 000062
【図６】
2009530377.tif 000063
【図７】
2009530377.tif 000064
【図８】
2009530377.tif 000065
【図９】
2009530377.tif 000066
【図１０】
2009530377.tif 000067
【図１１Ａ】
2009530377.tif 000068
【図１１Ｂ】
2009530377.tif 000069
【図１２Ａ】
2009530377.tif 000070
【図１２Ｂ】
2009530377.tif 000071
【図１３】
2009530377.tif 000072
【図１４】
2009530377.tif 000073
【図１５】
2009530377.tif 000074
【図１６】
2009530377.tif 000075
【図１７】
2009530377.tif 000076
【図１８Ａ】
2009530377.tif 000077
【図１８Ｂ】
2009530377.tif 000078
【図１８Ｃ】
2009530377.tif 000079
【手続補正書】
【提出日】平成20年11月20日(2008.11.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
家禽由来の糖鎖付加パターンを有するＧ−ＣＳＦを含む組成物であって、ここで、糖鎖付加パターンはＣＨＯ細胞において産生されるＧ−ＣＳＦの糖鎖付加パターン以外のものである、組成物。
【請求項２】
Ｇ−ＣＳＦが単離されている、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
Ｇ−ＣＳＦが固い殻の卵の中に存在する、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
Ｇ−ＣＳＦがトリの輸卵管細胞においてグリコシル化されている、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
輸卵管細胞が管状腺細胞である、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
Ｇ−ＣＳＦがニワトリの輸卵管細胞においてグリコシル化されている、請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
Ｇ−ＣＳＦがスレオニン１３３にてグリコシル化されている、請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項８】
組成物が医薬組成物である、請求項１〜７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
Ｇ−ＣＳＦが配列番号４１のアミノ酸配列を有する、請求項１〜８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】
糖鎖付加パターンがヒト細胞において産生されるＧ−ＣＳＦの糖鎖付加パターン以外のものである、請求項１〜９のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１１】
Ｇ−ＣＳＦがＧ−ＣＳＦのヒト形態である、請求項１〜１０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１２】
Ｇ−ＣＳＦを含む組成物であって、ここで、Ｇ−ＣＳＦは、以下：
【化１】
2009530377.tif 000080
【化２】
2009530377.tif 000081
【化３】
2009530377.tif 000082
【化４】
2009530377.tif 000083
【化５】
2009530377.tif 000084
【化６】
2009530377.tif 000085
【化７】
2009530377.tif 000086
でグリコシル化されている、組成物。
【請求項１３】
Ｇ−ＣＳＦが固い殻の卵から入手される、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
Ｇ−ＣＳＦが単離されている、請求項１２または１３記載の組成物。
【請求項１５】
Ｇ−ＣＳＦがスレオニン１３３にてグリコシル化されている、請求項１２〜１４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１６】
Ｇ−ＣＳＦが配列番号４１のアミノ酸配列を有する、請求項１２〜１５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１７】
Ｇ−ＣＳＦがＧ−ＣＳＦのヒト形態である、請求項１２〜１６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１８】
以下：
【化８】
2009530377.tif 000087
でグリコシル化されているＧ−ＣＳＦ分子を含むＧ−ＣＳＦを含む組成物。
【請求項１９】
Ｇ−ＣＳＦが固い殻の卵の中に存在する、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
Ｇ−ＣＳＦが単離されている、請求項１８または１９記載の組成物。
【請求項２１】
スレオニン１３３にてグリコシル化されている、請求項１８〜２０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２２】
Ｇ−ＣＳＦが配列番号４１のアミノ酸配列を有する、請求項１８〜２１のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２３】
Ｇ−ＣＳＦがＧ−ＣＳＦのヒト形態である、請求項１８〜２２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２４】
以下：
【化９】
2009530377.tif 000088
でグリコシル化されているＧ−ＣＳＦ分子を含むＧ−ＣＳＦを含む組成物。
【請求項２５】
Ｇ−ＣＳＦが固い殻の卵の中に存在する、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
Ｇ−ＣＳＦが単離されている、請求項２４または２５記載の組成物。
【請求項２７】
スレオニン１３３にてグリコシル化されている、請求項２４〜２６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２８】
Ｇ−ＣＳＦが配列番号４１のアミノ酸配列を有する、請求項２４〜２７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２９】
Ｇ−ＣＳＦがＧ−ＣＳＦのヒト形態である、請求項２４〜２８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３０】
以下：
【化１０】
2009530377.tif 000089
でグリコシル化されているＧ−ＣＳＦ分子を含むＧ−ＣＳＦを含む組成物。
【請求項３１】
Ｇ−ＣＳＦが固い殻の卵の中に存在する、請求項３０記載の組成物。
【請求項３２】
Ｇ−ＣＳＦが単離されている、請求項３０または３１記載の組成物。
【請求項３３】
スレオニン１３３にてグリコシル化されている、請求項３０〜３２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３４】
Ｇ−ＣＳＦが配列番号４１のアミノ酸配列を有する、請求項３０〜３３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３５】
Ｇ−ＣＳＦがＧ−ＣＳＦのヒト形態である、請求項３０〜３４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３６】
以下：
【化１１】
2009530377.tif 000090
でグリコシル化されているＧ−ＣＳＦ分子を含むＧ−ＣＳＦを含む組成物。
【請求項３７】
Ｇ−ＣＳＦが固い殻の卵の中に存在する、請求項３６記載の組成物。
【請求項３８】
Ｇ−ＣＳＦが単離されている、請求項３６または３７記載の組成物。
【請求項３９】
スレオニン１３３にてグリコシル化されている、請求項３６〜３８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４０】
Ｇ−ＣＳＦが配列番号４１のアミノ酸配列を有する、請求項３６〜３９のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４１】
Ｇ−ＣＳＦがＧ−ＣＳＦのヒト形態である、請求項３６〜４０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４２】
以下：
【化１２】
2009530377.tif 000091
でグリコシル化されているＧ−ＣＳＦ分子を含むＧ−ＣＳＦを含む組成物。
【請求項４３】
Ｇ−ＣＳＦが固い殻の卵の中に存在する、請求項４２記載の組成物。
【請求項４４】
Ｇ−ＣＳＦが単離されている、請求項４２または４３記載の組成物。
【請求項４５】
スレオニン１３３にてグリコシル化されている、請求項４２〜４４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４６】
Ｇ−ＣＳＦが配列番号４１のアミノ酸配列を有する、請求項４２〜４５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４７】
Ｇ−ＣＳＦがＧ−ＣＳＦのヒト形態である、請求項４２〜４６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４８】
糖鎖付加パターンを含むＧ−ＣＳＦを含む組成物であって、ここで、糖鎖付加パターンはＣＨＯ細胞において産生されるＧ−ＣＳＦの糖鎖付加パターン以外のものであり、かつＧ−ＣＳＦはニワトリの輸卵管細胞において産生される、組成物。
【請求項４９】
Ｇ−ＣＳＦが単離されている、請求項４８記載の組成物。
【請求項５０】
輸卵管細胞が管状腺細胞である、請求項４８または４９記載の組成物。
【請求項５１】
Ｇ−ＣＳＦがＧ−ＣＳＦのヒト形態である、請求項４８〜５０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５２】
患者に治療有効量のＴＰＤ  Ｇ−ＣＳＦを投与する工程を包含する、患者において白血球カウントを増加させる方法。
【請求項５３】
治療有効量が、患者にて白血球カウントを所望の量によって増加させる量である、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
Ｇ−ＣＳＦがＧ−ＣＳＦのヒト形態である、請求項５２または５３記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成20年11月28日(2008.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009530377000001.app