(57)【要約】Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３味覚受容体のＴ１Ｒ２モノマーを利用した、甘味応答のアゴニストおよび調節剤を同定するための機能的方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
味覚細胞における甘味シグナリングを調節する剤を同定する方法であって、
（ｉ）甘味刺激に応答するＴ１Ｒ２ホモマー味覚受容体を発現する細胞を、任意に他の剤の存在下で、剤と接触させること、および
（ｉｉ）少なくとも１つの剤が細胞における味覚受容体の機能活性に作用するかどうかを、細胞における少なくとも１つの機能的応答により決定すること、
を含み、
ここで、前記Ｔ１Ｒ２甘味受容体は、配列番号２と実質的に相同なポリペプチド、配列同一性によって決定される、配列番号１と実質的に相同なヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、およびハイブリダイゼーションによって決定される、配列番号１と実質的に相同なヌクレオチドによってコードされるポリペプチドからなる群より選択され、
実質的に相同なポリペプチドは少なくとも６９％の配列同一性を有し、
配列同一性によって決定される実質的に相同なヌクレオチドは少なくとも６４％の配列同一性を有し、
ハイブリダイゼーションによって決定される配列番号１と実質的に相同なヌクレオチドは、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％のＳＤＳからなる溶液中での４２℃の温度、ならびに０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳからなる溶液中での６５℃での洗浄のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、
Ｔ１Ｒ２ホモマー甘味受容体発現細胞はＴ１Ｒ３受容体を発現しない、前記方法。
【請求項２】
細胞が、Gタンパク質をも発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Gタンパク質が、Ｇａｑ−ガストデューシンに基づくキメラGタンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｇタンパク質が、キメラＧタンパク質であるＧアルファ１６−ガストデューシン４４である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ｉｉ）が、細胞内メッセンジャーにおける変化または細胞内メッセンジャーに起因する変化の計測によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
機能的応答が、ＩＰ３およびカルシウム２＋から選択される細胞内メッセンジャーの変化を計測することによって決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
細胞が、細菌細胞、真核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、両生類細胞、およびぜん虫細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
細胞が、哺乳類細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞が、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａおよびＨＥＫ−２９３からなる群より選択された哺乳類細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）が、Ｔ１Ｒ２甘味受容体を甘味物質の存在下で試験剤と接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
甘味物質が、ペリラルチンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）Ｔ１Ｒ２受容体ホモマー、または実質的に類似するそのホモログを発現するが、Ｔ１Ｒ３受容体は発現しない組換え細胞、および
（ｉｉ）Ｔ１Ｒ２ホモマーのアゴニスト
を、Ｔ１Ｒ２ホモマーの調節剤としての試験剤を同定するための組み合わせて利用するために含むキット。
【請求項１３】
請求項１２に記載のキットを使用する方法であって、
（ｉ）固体支持体上で組換え細胞を成長させること、
（ｉｉ）定義されたプレートまたはウェルの培養培地へ、アゴニストの存在下、適切な濃度で試験剤を添加すること、および
（ｉｉｉ）試験剤の存在下および非存在下での応答を比較することにより、細胞の機能的応答の変化を決定し、それにより、試験剤がＴ１Ｒ２ホモマーまたはその実質的に類似するホモログの調節物質であることを同定すること
を含む、前記方法。
【請求項１４】
約１ｎＭ〜１００ｍＭまたはそれ以上の量の試験剤を、適切な濃度のアゴニストの存在下で、定義されたプレートまたはウェルの培養培地に添加することを含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能的アッセイ方法において甘味物質を含む甘味調節剤の同定に利用する、Ｔ１Ｒ２受容体タンパク質に基づく方法に関する。Ｔ１Ｒ２によるアッセイはヒトにおける味覚応答を調節できる剤（甘味調節剤）の同定に利用することができ、それによってある食物をより口当たりのよいものとし、または経口薬剤および栄養補助食品に対する患者コンプライアンスを増大させる。かかる甘味調節剤には、ヒトにおける味覚応答を誘導する甘味料を含む。
【背景技術】
【０００２】
甘味の感知は受容体、味覚受容体細胞に特異的に発現し、甘味受容体ダイマー複合体（Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー）を形成する、２つのサブユニットＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３を含む、受容体によって媒介されることが知られている。双方のサブユニットはともに、「Ｇタンパク質共役受容体」またはＧＰＣＲと呼ばれるファミリー、特にクラスＣ  ＧＰＣＲに属する。
【０００３】
他のほとんどのＧＰＣＲのように、クラスＣ受容体は７本へリックス膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を有する。しかしながら他のタイプのＧＰＣＲとは異なり、クラスＣ  ＧＰＣＲは２つの部分：リガンド結合に関連する「ビーナスフライトラップモジュール」（ＶＦＴＭ）と、高度に保存された９つのシステインを含有し、ＶＦＴＭをＴＭＤに連結しているシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）、からなる大きな細胞外ドメインも有する。様々な長さの細胞内Ｃ末端によってクラスＣ受容体が完成する。
【０００４】
甘味受容体応答の活性化には甘味受容体ダイマー複合体の両サブユニットが必要であると考えられており、これまでのところ、全ての試験された甘味料はＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーを活性化する。Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーが、天然の糖（スクロース、フルクトース、グルコース、マルトース）、甘味アミノ酸（Ｄ−トリプトファン）、および人工甘味料（アセスルファム−Ｋ、アスパルテーム、サイクラミン酸塩、サッカリン、スクラロース）から、甘味タンパク質（モネリン、ソーマチン、ブラゼイン）に至る範囲の、広範囲の化学的に異なった甘味料に応答するにもかかわらず、ヒト甘味受容体の分離したサブユニット（Ｔ１Ｒ２ホモマーまたはＴ１Ｒ３ホモマー）による公知の試験は、何らの活性も示さなかった（例えばLi et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(7),4692〜6を参照）。
【０００５】
キメラＴ１Ｒ受容体および部位特異的変異導入の研究は、甘味化合物サイクラミン酸塩がＴ１Ｒ３のＴＭＤに結合し、したがってヘテロダイマーＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体複合体を活性化することを示している。反対に、甘味タンパク質ブラゼインはＴ１Ｒ３のシステインリッチドメインに結合し、したがってヘテロダイマーＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体複合体を活性化することが報告されている。
【０００６】
Ｔ１Ｒ２ホモマー結合アッセイは、ＵＳ２００５００３２１５８に記載されている。結合アッセイは、機能的受容体活性化ではなく結合のみを示し、エンドポイントに基づくものであり、反応速度測定を含むより迅速な機能アッセイと比較すると時間がかかる。ＵＳ２００５００３２１５８はさらに、知られた機能的受容体Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３およびＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３に適した、Ｔ１Ｒの細胞ベースのアッセイを含む、機能アッセイについても記載している。
【０００７】
今まで、１つのＴＡＳ１ＲモノマーのＴＭＤは甘味化合物と結合し得るだけでなく他の必須のモノマーパートナーの不在下でＧタンパク質を活性化することは示されていなかっただけでなく、両サブユニット（つまり甘味のためにはＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー受容体複合体）の存在がシグナル伝達に不可欠であることもまた信じられていた。
本発明者らは、既知のＴ１Ｒ２ホモマーが、驚くべきことに、甘味物質（例えばスクロースより約３７０倍強い／甘い合成オキシムであるペリラルチン）と結合するだけでなく、機能的応答を誘発することができ、Ｔ１Ｒ３の非存在下でＧタンパク質を活性化することができる機能的甘味受容体を形成することを見出した。
【０００８】
本明細書中で利用される用語、Ｔ１Ｒ２「ホモマー」または「ホモマーの」ポリペプチド、タンパク質、または受容体は、ヘテロダイマーＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体複合体の対語としてＴ１Ｒ２ポリペプチドまたはタンパク質のモノマー、ダイマーまたはオリゴマーを包含する。
本発明による方法において、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤおよびＧタンパク質を発現するが、Ｔ１Ｒ３を発現しない細胞を、甘味調節剤としての前記剤の特性を決定するために、任意に知られたまたは新たに決定された甘味物質と組み合わせた試験剤と接触させる。本アッセイは、したがって、甘味物質または（甘味物質、Ｔ１Ｒ２、または下流イベントの）甘味応答の調節剤としての試験剤の同定に利用され得る。
受容体およびＧタンパク質における剤の機能的な効果は、これに限定することなく、例えば細胞内ＩＰ３およびＣａ２＋などの伝達経路のパラメータの変化を計測するアッセイなど、適した機能的アッセイによって、またはＧＴＰγＳを標識するなどの当業者に知られた技術に従った他のＧタンパク質特異的アッセイによって決定される。
【０００９】
本明細書に記載されているクローニング、リガンド−受容体ペアの解明、および甘味応答の調節剤の検索に関する様々な態様および実施例の実践において、分子生物学、微生物学および組換技術および甘味試験における慣習的な技術が利用さる。これらには、Ｔ１Ｒ２を含むＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に適した様々な知られた方法を含む。したがって、当業者にはかかる技術が十分に知らされており、それゆえ以下では本発明の状況をより十分に記載するために、かかる技術はごく簡略化して論じる。
【発明の開示】
【００１０】
概略
最初の側面において、味覚細胞における甘味シグナリングを調節する剤を同定する方法であって、該方法が
（ｉ）甘味刺激に応答するＴ１Ｒ２ホモマー味覚受容体を発現する細胞を、任意に他の剤の存在下で、剤と接触させること、および
（ｉｉ）少なくとも１つの剤が細胞における味覚受容体の機能活性に作用するかどうかを、細胞における少なくとも１つの機能的応答により決定すること、
を含み、
ここで、前記Ｔ１Ｒ２甘味受容体は、配列番号２と実質的に相同なポリペプチド、配列同一性によって決定される、配列番号１と実質的に相同なヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、およびハイブリダイゼーションによって決定される、配列番号１と実質的に相同なヌクレオチドによってコードされるポリペプチドからなる群より選択され、
【００１１】
実質的に相同なポリペプチドは少なくとも６９％の配列同一性を有し、
配列同一性によって決定される実質的に相同なヌクレオチドは少なくとも６４％の配列同一性を有し、
ハイブリダイゼーションによって決定される配列番号１と実質的に相同なヌクレオチドは、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％のＳＤＳからなる溶液中での４２℃の温度、ならびに０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳからなる溶液中での６５℃での洗浄のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、
Ｔ１Ｒ２ホモマー甘味受容体発現細胞はＴ１Ｒ３受容体を発現しない、前記方法を提供する。
【００１２】
１つの態様において、前記方法は、細胞がＧタンパク質もまた発現している。Ｇタンパク質発現細胞における機能応答は、例えば、ＩＰ３およびカルシウム２＋などの細胞内メッセンジャーの変化の計測によって決定される。
他の態様において、前記方法は、Ｇタンパク質が、Ｇａｑ−ガストデューシンに基づくキメラＧタンパク質である方法である。
さらに他の態様において、前記方法は、Ｇタンパク質がキメラＧタンパク質であるＧアルファ１６−ガストデューシン４４である方法である。
さらなる他の態様において、前記方法は、ステップ（ｉｉ）が細胞内メッセンジャーにおける変化または細胞内メッセンジャーに起因する変化の計測によって行われる方法である。
【００１３】
他の態様では、上述の方法において、細胞は、細菌細胞、真核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、両生類細胞、およびぜん虫細胞からなる群より選択される。
ある態様において、細胞は、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａおよびＨＥＫ−２９３からなる群より選択された哺乳類細胞である。
他の態様において、上記方法は、ステップ（ｉ）がＴ１Ｒ２甘味受容体を甘味物質の存在下で試験剤と接触させることをさらに含む。甘味物質は、例えば、ペリラルチンであり得る。
【００１４】
他の側面において、キットが提供され、キットは、
（ｉ）Ｔ１Ｒ２受容体ホモマー、または実質的に類似するそのホモログを発現するが、Ｔ１Ｒ３受容体は発現しない組換え細胞、および
（ｉｉ）Ｔ１Ｒ２ホモマーのアゴニスト
を、Ｔ１Ｒ２ホモマーの調節剤としての試験剤を同定するための組み合わせて利用するために含む。
【００１５】
さらに他の側面において、本発明は、以下の連続的なステップによって実施される上述のキットの利用方法に関する：
（ｉ）固体支持体上で組換え細胞を成長させること、および
（ｉｉ）約１ｎＭ〜１００ｍＭまたはそれ以上の量の試験剤を、適切な濃度のアゴニストの存在下で、定義されたプレートまたはウェルの培養培地に添加すること、
（ｉｉｉ）試験剤の存在下および非存在下での応答を比較することにより、細胞の機能的応答の変化を決定し、それにより、試験剤がＴ１Ｒ２ホモマーまたはその実質的に類似するホモログの調節物質であることを同定すること。
【００１６】
詳細な記載
アッセイに利用される細胞
本発明によるスクリーニングまたはアッセイに有用な細胞は、Ｔ１Ｒ３を含まない細胞である。トランスフェクトされたまたは内在性のＴ１Ｒ３は、Ｔ１Ｒ２のアゴニスト応答または他の調節剤による前記応答の変化を決定する方法を否定的に妨害し得る。Ｔ１Ｒ３の非存在は、Ｔ１Ｒ２活性化の決定にヌルバックグラウンド（null background）を提供し、観察されるシグナルは直接Ｔ１Ｒ２活性の結果とすることができる。このことは、Ｔ１Ｒ２を特異的に調節する剤の同定を可能にし、Ｔ１Ｒ３が甘味およびうま味ヘテロダイマー両方の一部であるため、うま味物質をも含み得るＴ１Ｒ３を活性化する剤を排除できる。
【００１７】
適切な真核細胞は、Ｔ１Ｒ３を含まない真核細胞、例えば、限定することなく、哺乳類細胞、酵母細胞、または昆虫細胞（Ｓｆ９を含む）、両生類細胞（メラニン保有細胞を含む）、またはCaenorhabditis細胞（Caenorhabditis elegansを含む）を含むぜん虫細胞などを含む。Ｔ１Ｒ３を含まない適切な哺乳類細胞は、例えば、限定することなく、ＣＯＳ細胞（Ｃｏｓ−１およびＣｏｓ−７を含む）、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ−ＲｅｘＴＭ細胞、または他のトランスフェクト可能な真核細胞細胞系を含む。Ｔ１Ｒ３を含有しない適切な細菌細胞は、限定することなく、E.Coliを含む。
【００１８】
細胞は、当業者によく知られているように、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質（受容体をホスホリパーゼＣシグナル伝達経路に連結する）を一過性にまたは安定的にトランスフェクトされる。味覚ＧＰＣＲとの増強されたカップリングを提供するキメラＧタンパク質Ｇアルファ１６−ガストデューシン４４（Ｇ．ｓｕｂ．．ａｌｐｈａ．１６  ｇｕｓｔ（ｄｕｃｉｎ）４４、Ｇ．ｓｕｂ．ａｌｐｈａ．１６ｇｕｓｔ（ｄｕｃｉｎ）４４、Ｇα１６ｇｕｓｔ（ｄｕｃｉｎ）４４、Ｇａ１６ｇｕｓｔ（ｄｕｃｉｎ）４４、Ｇα１６−ガストデューシン  ４４、または以下で使用されているように「Ｇ１６ｇｕｓｔ４４」としても知られている）の優れた異種発現系はＷＯ２００４／０５５０４８に詳細に記載されている。代替的に、ＷＯ２００４／０５５０４８に記載されているＧａｑ−ガストデューシンに基づく他のキメラＧタンパク質、または、例えばＧ１６またはＧ１５などの、他のＧタンパク質もまた利用してよい。
【００１９】
Ｔ１Ｒ２を、例えばホスホリパーゼＣシグナル伝達経路などの、シグナル伝達経路、または例えば後述のものを含むシグナル伝達経路と受容体を連結するＧタンパク質を有する細胞内で発現させることが可能である：アデニル酸シクラーゼ、グアニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣ、ＩＰ３、ＧＴＰａｓｅ／ＧＴＰ結合、アラキドン酸、ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ、ＤＡＧ、プロテインキナーゼｃ（ＰＫＣ）、ＭＡＰキナーゼ、チロシンキナーゼ、またはＥＲＫキナーゼ。
代替的に、以下に詳述するように、任意の適切なリポーター遺伝子をＴ１Ｒ２活性化応答プロモーターに連結し、Ｔ１Ｒ２活性の決定に利用してもよい。
【００２０】
上述の細胞中で利用されるベクター構築物
かかる細胞中でＧＰＣＲおよび／またはＧタンパク質を発現するベクター構築物は、例えば本質的にポリメラーゼ連鎖反応を利用する知られた方法によって産生されてよい。配列の点検後、ｃＤＮＡ断片は、例えばｐｃＤＮＡ３．１哺乳類細胞用哺乳類発現ベクターなど、適切なベクター内へサブクローニングされてよく、正しい遺伝子の発現を可能にするために、哺乳類宿主細胞に一過性にトランスフェクトされてよい。
【００２１】
代替的に、様々な非哺乳類発現ベクター／宿主システムが、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）Ｔ１Ｒ２をコードする配列の含有および発現に利用可能である。これらは、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌を含む微生物、酵母発現ベクターで形質転換された酵母、ウィルス発現ベクター（例えばバキュロウィルス）、または細菌発現ベクター（例えばｐＢＲ３２２プラスミド）で感染させた昆虫細胞システムなどを含む。以上に記載された系とともに利用することができる特定のベクターの例は、G-protein coupled receptors, Signal Transduction Series, 編者：Tatsuya Haga and Gabriel Berstein、第１版、CRC Press - Boca Raton FL; September 1999に記載されている。
【００２２】
細菌系において、多くのクローニングおよび発現ベクターが、ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチド配列について意図する利用に応じて選択し得る。例えば、ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチド配列のルーチンのクローニング、サブクローニング、および増殖が、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Stratagene, La Jolla Calif.）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Life Technologies）などの多機能性大腸菌ベクターを利用して行える。ＧＰＣＲをコードする配列の、ベクターのマルチクローニングサイトへのライゲーションはｌａｃＺ遺伝子を妨害し、組換え分子を含有する形質転換細菌の同定のための比色スクリーニング手法を利用可能にする。加えて、これらベクターはインビトロ転写、ジデオキシシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖レスキュー（single strand rescue）、およびクローニングされた配列内のネストされた欠失の作出にも有用であり得る。例えば抗体の産生など、多量のＧＰＣＲが必要な場合、ＧＰＣＲの高発現を導くベクターが利用し得る。例えば強い、誘導可能なＳＰ６またはＴ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターなどが利用し得る。
【００２３】
酵母発現系はＧＰＣＲの産生に利用されてよい。アルファファクター、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨプロモーターなどの構成的または誘導プロモーターを含む多数のベクターが酵母Saccharomyces cerevisiaeまたはPichia pastorisに利用し得る。加えて、かかるベクターは、発現タンパク質の分泌または細胞内の保持を導き、安定的増殖のための外来性配列の宿主遺伝子への統合を可能にする。
【００２４】
異種タンパク質の昆虫細胞細胞系での発現のために、例えば、Lepidopteran baculovirusまたはAutographia californicaマルチカプシドヌクレオウィルス（ＡｃＭＮＰＶ）の誘導体が利用可能である。このシステムにおいて、外来性遺伝子発現は、ポリヘドリンまたはｐ１０プロモーターのいずれかの、非常に強い後期ウィルスプロモーターに導かれ、多様なベクターが、組換えタンパク質の発現および回収の最適化に利用可能である。これらのベクターは膜結合型および分泌型タンパク質の両方を高度に発現することが可能であり、また哺乳類システム中で起こることが知られる、Ｎ−およびＯ−連結糖鎖付加、リン酸化、アシル化、タンパク質分解および分泌ワクチン成分を含む多くの翻訳後修飾も可能である。例えばInvitrogenのInsectSelectＴＭなどの多くのベクターが商業的に入手可能である。
【００２５】
発現系
求めるタンパク質（例えばＧＰＣＲおよびＧタンパク質）をコードするｃＤＮＡを発現するために、転写を導く強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーターおよび翻訳開始のためのリボソーム結合領域を含む、適切なｃＤＮＡが入った発現ベクターを典型的にサブクローニングする。例えばE.coli、Bacillus sp.、およびSalmonellaなど、適切な細菌プロモーターは当業者によく知られており、かかる発現系のためのキットが商業的に入手可能である。同様に、哺乳類細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核細胞発現系も商業的に入手可能である。真核細胞発現ベクターは、例えばアデノウィルスベクター、アデノ随伴ベクター、またはレトロウィルスベクターなどであってよい。
【００２６】
プロモーターに加えて、発現ベクターは典型的に、宿主細胞においてタンパク質をコードする核酸を発現するのに必要な付加的要素の全てを含む、転写ユニットまたは発現カセットを含む。典型的な発現カセットはしたがって、タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターおよび、転写の効率的なポリアデニレーションに必要なシグナル、リボソーム結合領域、および翻訳ターミネーションを含む。タンパク質をコードする核酸配列は典型的に、組換えタンパク質の効率的な細胞表面発現を推進するために、ラットソマトスタチン−３受容体配列のＮ末端４５アミノ酸などの、細胞表面受容体に有用な膜標的化シグナルに連結していてよい。付加的な要素は、例えばエンハンサーなどを含んでもよい。発現カセットはまた、構造遺伝子の下流に、効果的なターミネーションを提供するための転写終止領域も含むべきである。終止領域はプロモーター配列と同じ遺伝子から得てもよく、また異なる遺伝子から得てもよい。
【００２７】
タンパク質の発現のために、真核細胞または原核細胞における発現のために当業者によく知られた、慣用のベクターを利用してよい。ベクターの例は、例えばｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、およびｐＥＴ２３Ｄを含むプラスミドなどの細菌発現ベクター、および例えばＧＳＴおよびＬａｃＺなどの融合発現系を含む。
【００２８】
真核ウィルス由来の制御要素を含む発現ベクター、例えばＳＶ４０ベクター、サイトメガロウィルスベクター、パピローマウィルスベクター、およびエプスタイン・バーウィルス由来のベクターなどは、典型的に真核発現ベクターとして利用される。他の真核ベクターの例には、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウィルスｐＤＳＶＥ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＩＲＥＳ、およびＳＶ４０早期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウィルスプロモーター、ラウス肉腫ウィルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞内での発現に効果を示す他のプロモーターの指揮下でタンパク質を発現させられる他のいかなるベクターも含む。いくつかの発現系は、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸リダクターゼなどの遺伝子増幅を提供するマーカーを有する。
【００２９】
典型的に発現ベクターに含まれる要素には、E.Coli中で機能するレプリコン、組換えプラスミドを取り込んだ細菌の選別を可能にする薬剤耐性をコードする遺伝子、および真核配列の挿入を可能にするプラスミドの本質的でない領域のユニークな制限部位なども含む。選択される特定の薬剤耐性遺伝子は重大ではなく、当該技術分野で知られたあらゆる多くの薬剤耐性遺伝子が適している。必要ならば、原核配列は、真核細胞内でのＤＮＡの複製を妨害しないように任意に選択される。
【００３０】
細菌システムにおいて、ＧＰＣＲＧＰＣＲのｃＤＮＡ断片は、単独で、または、対象となるＧＰＣＲが、E.Coliペリプラズムマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）であって、シグナルペプチドを含むＭＢＰがＧＰＣＲのアミノ末端に連結しているものに融合した融合タンパク質として発現されてよい。野生型ＧＰＣＲのｃＤＮＡあるいはＭＢＰ：ＧＰＣＲ融合ｃＤＮＡは、例えばE.Coli  ＧＰＣＲの発現がｌａｃ野生型プロモーターによって駆動されるｐＢＲ３２２など、適切なプラスミドへサブクローニングされる。E.ColiにおけるＧＰＣＲの発現方法は、例えばG-protein coupled receptors, Signal Transduction Series, 編者：Tatsuya Haga and Gabriel Berstein, 第１版, CRC Press - Boca Raton FL; September 1999などに記載されている。
【００３１】
内在性ＧＰＣＲを欠損した遺伝子操作酵母システムおよび昆虫細胞システムは、Ｔ１Ｒ２活性化スクリーニングに対してヌルバックグラウンドであるという利点を提供する。遺伝子操作酵母システムはヒトＧＰＣＲおよびＧαタンパク質を、対応する内在性酵母フェロモン受容体経路の成分と代替するものである。下流シグナル経路はまた、通常の酵母シグナル応答が選択培地上でのプラス成長またはレポーター遺伝子発現に転換するように、改変される（Broach, J. R. and J. Thorner, 1996, Nature, 384 (supp.):14〜16に記載）。遺伝子操作された昆虫システムは、受容体をホスホリパーゼＣシグナル経路に連結できるヒトＧＰＣＲおよびＧαタンパク質を組み込んでいる（例えばKnight and Grigliatti, 2004, J. Receptors and Signal Transduction, 24: 241〜256参照）。両生類細胞システム、特にメラニン含有細胞は、例えばＧＰＣＲ発現系について記載した国際特許出願９２／０１８１０などに記載されている。
【００３２】
Ｔ１Ｒ２の過剰発現
Ｔ１Ｒ２は、例えばＣＭＶ早期プロモーターなどの強力な構成的プロモーターの制御下に置くことにより過剰発現されることができる。代替的に、保存されているＧＰＣＲアミノ酸またはアミノ酸ドメインのある変異を導入し、利用するＧＰＣＲを構成的に活性化させることが可能である。
【００３３】
Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ発現ベクター構築物の細胞内へのトランスフェクション
大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳類、酵母または昆虫細胞細胞系を産生するのに、標準的なトランスフェクション法が利用可能である。
核酸配列を宿主細胞に導入するために知られたいかなる方法も利用してよい。用いる特定の遺伝子操作手順は、対象となるタンパク質を発現できる宿主細胞中に関係する遺伝子を首尾良く導入できさえすればそれでよい。これらの方法は、クローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来性の遺伝物質を宿主細胞中に導入することを伴ってもよく、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウィルスベクターなどを含む。
【００３４】
例えば、Ｔ−ＲｅｘＴＭ発現系（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）を用いることができる。Ｔ−ＲｅｘＴＭシステムは、E.Coli Ｔｎ１０にコードされたテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性オペロン由来の調節エレメントを利用したテトラサイクリン制御哺乳類発現系である。Ｔ−ＲｅｘＴＭシステム中のテトラサイクリン調節は、テトラサイクリンのＴｅｔリプレッサーへの結合および対象となる遺伝子の発現を制御するプロモーターの抑制解除に基づいている。
【００３５】
細胞培養
トランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞は、当業者によく知られた標準的な培養条件で培養することができる。異なる細胞は、適切な温度および細胞培養培地を含む、異なる培養状態を要求することは、当業者に明らかである。
【００３６】
本明細書のアッセイによって同定され得る調節物質
Ｔ１Ｒ２受容体活性の調節物質（リガンド、アゴニスト、部分的アゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト、阻害剤、増強剤）は、以下に記載されたように同定可能である。これから前記アッセイによって同定され得る剤の定義について述べる。
【００３７】
調節剤は、１または２以上の後述のものの増大または減少を引き起こす剤である：受容体の細胞表面発現、リガンドの受容体への結合、または受容体の活性化形態によって開始される細胞内応答（アゴニストの存在下または非存在下における）。調節剤はそれ自身が受容体に結合し、それを活性化し、それによって細胞内応答の増大を調節するアゴニストであり得る。
【００３８】
調節剤は、小分子、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体またはその断片を含む様々なタイプの化合物を含む。それらは、合成または天然物質、天然材料の抽出物を含む様々な給源、例えば動物、哺乳類、昆虫、植物、細菌または真菌細胞材料または培養細胞、またはかかる細胞の馴化培地などに由来し得る。
【００３９】
リガンドは受容体と結合する剤であり、アゴニスト、部分的アゴニスト、増強剤、アンタゴニスト、または逆アゴニストであってもよい。アゴニスト（甘味物質）は、受容体を活性化し、受容体に結合したときにアゴニストの非存在下での細胞内応答と比較して、細胞内応答を増大させるＴ１Ｒ２受容体のリガンドである。付加的にまたは代替的に、アゴニストは、アゴニストの非存在下で細胞表面に存在する細胞表面受容体の数と比較して、受容体の細胞表面発現を増大させるように、細胞表面受容体の内在化を減少させ得る。
【００４０】
部分的アゴニストは、受容体を最大限活性化する他のアゴニストと比べて、部分的にしか作用しないアゴニストである。アンタゴニストは、アゴニストと同じ（競合的アンタゴニスト）または異なる（アロステリックアンタゴニスト）受容体の部位に結合するが、受容体の活性化形態によって起こる細胞内応答を活性化せず、それゆえアゴニストの存在下およびアンタゴニストの非存在下と比較して、アゴニストによって誘導される細胞内応答を阻害するリガンドである。受容体と結合する逆アゴニストは、受容体によって媒介される構成的細胞内応答を、逆アゴニストの非存在下における細胞内応答と比較して減少させる。阻害剤は、阻害剤の非存在下におけるアゴニストの結合と比較して、アゴニストと受容体との結合を減少させ、および／またはアゴニストによって誘導される細胞内応答を減少させる。増強剤は、アゴニストの受容体への結合を、増強剤の非存在下におけるアゴニストの結合と比較して増大させ、および／またはアゴニストによって誘導される細胞内応答を増大させる。
【００４１】
リガンドを結合し、例えばＧタンパク質（すなわち増強剤との種々の相互作用に起因して）などによりシグナルを伝達する受容体の活性または活性の変化は、以下に記載されるアッセイによって決定可能である。
【００４２】
Ｔ１Ｒ２受容体の調節剤同定のためのアッセイ
調節剤は、機能的効果／パラメータを決定および比較するための、多様なインビトロおよびインビボアッセイを利用して、同定可能である。受容体の機能上の試験剤の効果は適切な機能的パラメータを分析することで計測可能である。受容体活性に影響するあらゆる生理学的変化は、調節剤の同定のために利用可能である。
【００４３】
かかる機能的アッセイは、例えば動物から単離された無傷の細胞または組織を利用したアッセイおよび濃度または活性またはそれらの二次メッセンジャーの変化（例えば細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、イノシトールリン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール／ＤＡＧ、アラキドン酸、ＭＡＰキナーゼまたはチロシンキナーゼなどを含む）、イオンフラックス、リン酸化レベル、転写レベル、神経伝達物質レベルの計測に基づいたアッセイ、およびＧＴＰ結合性、ＧＴＰ分解酵素、アデニル酸シクラーゼ、リン脂質分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、アラキドン酸放出、ＰＫＣ、キナーゼおよび転写レポーターに基づいたアッセイなど、当業者によく知られている。いくつかの適切なアッセイが、例えばＷＯ  ０１／１８０５０に記載されている。
【００４４】
受容体活性化は、典型的には例えば、例えば細胞内に貯蔵されたカルシウムイオンを放出するＩＰ３などの二次メッセンジャーの増大など、後続する細胞内イベントの起点となる。いくつかのＧタンパク質共役受容体活性化は、ホスホリパーゼＣ媒介ホスファチジルイノシトール加水分解を通したイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の形成を刺激する。ＩＰ３は次に細胞内に貯蔵されたカルシウムイオンの放出を刺激する。全ての機能的アッセイは、例えば受容体をその表面または単離細胞膜画分上に発現する細胞を含有するサンプルで行うことができる。有用な細胞は上述されている。また、例えば遺伝子組換え動物からの組織も利用してよい。
【００４５】
それ自身がアゴニストではない（例えば、拮抗剤、部分的アゴニスト、逆アゴニスト、阻害剤、または増強剤）調節剤を同定するため、試験剤を有するおよび有さないサンプルを比較する。例えば、コントロール（アゴニストを含むが調節剤は含まない）の相対受容体活性値を１００とする。コントロールに対する活性の減少で阻害剤、拮抗剤または逆アゴニストが同定され、その増大で増強剤が同定される。通常、試験剤を含まないサンプルとの比較における、または試験剤を含むが、Ｔ１Ｒ２を発現しない細胞（モックトランスフェクションされた細胞）に基づくサンプルとの比較における、試験剤を含むサンプルにおける１０％またはそれ以上の計測された活性の増大または減少は、有意とみなすことができる。
【００４６】
アゴニストまたは部分的アゴニストの同定
アゴニストまたは部分的アゴニストを同定するために、試験剤を有するサンプルを、アゴニスト（例えばペリラルチン）を有するポジティブコントロールと比較し、または代替的に／付加的に、試験剤を有するおよび有さないサンプルを、その受容体活性について比較する。例えば、アゴニストまたは部分的アゴニストは、アゴニストまたは部分的アゴニストが１００ｍＭまたはそれ以下で存在していた場合、ポジティブコントロール甘味アゴニストの最大生物学的活性の少なくとも１０％に相当する生物学的活性を有しているだろうし、例えばアゴニストの最大生物学的活性に匹敵するまたはそれ以上の最大生物学的活性を有していてもよい。最大生物学的活性は、例えばペリラルチンなど、与えられた受容体アッセイフォーマット内で達成可能なアゴニストに対する最大達成可能受容体応答と定義され、その応答は、同じアゴニストの濃度を増大させても、さらに増大させることはできない。
【００４７】
代替的に、試験剤を有するサンプルの、例えば１０％またはそれ以上の計測活性の増大が、試験剤を有さないサンプルまたは試験剤を有するがＴ１Ｒ２を発現しない細胞（モックトランスフェクションされた細胞）に基づくサンプルと比較される。
拮抗剤を同定するために、試験剤を有するおよび有さない、知られたアゴニストの存在下における受容体活性が比較される。拮抗剤は、例えば少なくとも１０％の、アゴニスト刺激性受容体活性の減少を示す。
逆アゴニストを同定するために、試験剤を有するおよび有さない受容体活性が、上述のように、受容体を過剰発現した動物／細胞／膜を含有するサンプル中で比較される。逆アゴニストは、例えば少なくとも１０％の、受容体の構成的活性の減少を示す。アッセイにおけるＴ１Ｒ２ホモマー受容体活性計測の適切な検出法の様々な例が本明細書中に記載されている。
【００４８】
細胞質イオンまたは膜電位の変化の検出
"G-protein coupled receptors (Signal Transduction Series)", CRC Press 1999; 第１版, Haga and Berstein編に詳述されているように、受容体活性を報告するために細胞をイオン感受性色素で染色する。細胞質または膜電位におけるイオン濃度の変化は、それぞれイオン感受性または膜電位蛍光指標を利用して計測される。
【００４９】
カルシウムフラックス
ＧＰＣＲの活性化によって誘導される細胞内カルシウム放出は、カルシウムに結合する細胞持続性（cell-permanent）色素を利用して決定される。カルシウム結合性色素は、細胞内のカルシウム上昇に比例する蛍光シグナルを発生する。この方法は、受容体活性の迅速かつ定量的な計測を可能にする。
【００５０】
用いる細胞は、上述のようにホスホリパーゼＣ経路に連結できるようにするために、Ｔ１Ｒ２  ＧＰＣＲとＧタンパク質とを共発現するトランスフェクト細胞である。ネガティブコントロールは、候補化合物の可能な非特異的効果を排除するために、Ｔ１Ｒ２を発現しない細胞またはその膜（モックトランスフェクションしたもの）を含む。カルシウムフラックス検出手順はG-protein coupled receptors, Signal Transduction Series, 編者：Tatsuya Haga and Gabriel Berstein, 第１版, CRC Press - Boca Raton FL; September 1999に詳述されており、適合させたバージョンの概略を以下に記載する。
【００５１】
０日目：９６ウェルプレートに、１ウェルあたり８５００個の細胞を播種し、栄養成長培地中、一晩３７℃で維持する。
１日目：１ウェルあたり１５０ｎｇのＧＰＣＲ  ＤＮＡおよび０．３μｌのリポフェクタミン２０００（Invitrogen）を利用して、細胞をトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞は栄養成長培地中、一晩３７℃で維持する。
【００５２】
２日目：成長培地を捨て、細胞を、１．５μＭのFluo-4 AM（Molecular Probes）および２．５μＭのプロベニシド（probenicid）が溶解され、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２００μＭのＣａＣｌ２および０．１％のウシ血清アルブミンが添加されたハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、３７℃でｐＨ７．４、からなるカルシウムアッセイ溶液７５μｌで１時間（室温暗所で）インキュベートする。２．５μＭのプロベニシド（probenicid）が溶解され、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２００μＭのＣａＣｌ２および０．１％のウシ血清アルブミンが添加されたハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、３７℃でｐＨ７．４、からなる洗浄緩衝液１２５μｌをそれぞれのウェルに加え、プレートをさらに３０分室温暗所でインキュベートする。緩衝溶液を捨て、プレートを１００μｌの洗浄緩衝液で５回洗浄し、２００μｌの洗浄緩衝液に戻し、３７℃で１５分間インキュベートする。
【００５３】
プレートを、例えばFlexstation（Molecular Devices）またはFLIPR（Molecular Devices）などの蛍光マイクロプレートリーダーに設置し、２０μｌの１０倍濃縮リガンドストック溶液を加えて受容体活性化を開始する。
【００５４】
蛍光は、リガンドを加える１５秒前からリガンドを加えた後４５〜１１０秒後まで継続的に監視する。受容体活性化レベルは以下の２つの方程式で定義される：活性化の％＝（最大蛍光−基準蛍光／基準蛍光）×１００、または蛍光増加＝最大蛍光−基準蛍光、式中基準蛍光はリガンド添加前の平均蛍光レベルを表す。
【００５５】
有用な細胞は、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ−ＲｅｘＴＭ細胞などの上述した哺乳類細胞である。細胞は、当該技術分野でよく知られているとおりに、ＧＰＣＲとＧタンパク質で一過性にまたは安定的にトランスフェクトすることができる。優れた異種発現系は、ＷＯ２００４／０５５０４８に詳述されている。カルシウムフラックスアッセイは、例えば後述の例１に記載されているように行うことができる。
【００５６】
調節剤の同定は上述の方法を後述のとおりに変更して行われる。シグナルは、アゴニストの存在下だが試験剤の非存在下でＴ１Ｒ２を発現する遺伝子組換細胞から得られた、Ｔ１Ｒ２活性の基準レベルと比較される。例えば、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍またはそれ以上などの、Ｔ１Ｒ２活性における増大または減少は調節剤を同定する。
【００５７】
代替的に、同定は、調節剤が存在しないサンプルと比較した場合または調節剤は存在するがＴ１Ｒ２ポリペプチドを発現しない細胞（モックトランスフェクションした細胞）のサンプルと比較した場合、例えば１０％またはそれ以上の、蛍光強度の増大または減少を伴う。
【００５８】
アデニル酸シクラーゼ活性
アデニル酸シクラーゼ活性のためのアッセイは、例えばKenimer & Nirenberg, 1981, Mol. Pharmacol. 20: 585〜591に詳述されているように行われる。反応混合物は通常３７℃で１０分以下インキュベートされる。インキュベーション後、反応混合物は０．９ｍｌの冷６％トリクロロ酢酸を添加して除タンパクする。チューブを遠心し、それぞれの上清をＤｏｗｅｘ  ＡＧ５０ｗ−Ｘ４カラムに加える。カラムからのｃＡＭＰ画分を、アゴニストによる受容体活性化を受けて発生したｃＡＭＰレベルを計測するために、４ｍｌの０．１ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で計数バイアル中に溶出する。コントロール反応もまた、Ｔ１Ｒ２ポリペプチドを発現しない細胞のタンパク質ホモジネートを利用して行うべきである。
【００５９】
ＩＰ３／Ｃａ２＋シグナル
Ｇタンパク質を発現している細胞中で、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）／Ｃａ２＋およびその結果としての受容体活性に相当するシグナルを、蛍光を利用して決定可能である。ＧＰＣＲを発現している細胞は、細胞内貯蔵およびイオンチャネルの活性化経由の寄与の結果、細胞質カルシウムレベルの増大を見せ得、必須ではないが、カルシウムフリー緩衝液中でかかるアッセイを実施し、内在ストアからのカルシウム放出の結果による蛍光応答と区別するために、任意にＥＤＴＡなどのキレート剤を補完することが望ましいだろう。
【００６０】
ホスホリパーゼＣ／細胞内Ｃａ２＋シグナル
Ｔ１Ｒ２は、受容体とホスホリパーゼＣシグナル伝達経路を連結するＧタンパク質を有する細胞で発現される。細胞内Ｃａ２＋濃度の変化は、例えば蛍光Ｃａ２＋指示色素および／または蛍光イメージングなどを利用して、計測する。
【００６１】
ＧＴＰａｓｅ／ＧＴＰ結合
Ｔ１Ｒ２を含むＧＰＣＲにとって、受容体活性の指標はＧＰＣＲを含む細胞膜によるＧＴＰの結合である。計測されるのは、標識ＧＴＰの結合を検出することで膜と連結するＧタンパク質である。受容体を発現する細胞から単離された膜は、３５Ｓ−ＧＴＰγＳおよび未標識ＧＤＰを含有する緩衝液中でインキュベートされる。活性を有するＧＴＰａｓｅは無機リン酸塩として標識を放出し、これは２０ｍＭのＨ３ＰＯ４中の活性炭５％懸濁液中で遊離無機リン酸塩を分離した後にシンチレーションカウンティングによって決定される。混合物をインキュベートし、未結合標識ＧＴＰをＧＦ／Ｂフィルターでろ過して取り除く。結合した標識ＧＴＰを液体シンチレーションカウンティングで計測する。コントロールは、試験剤の非特異的効果の可能性を排除するために、Ｔ１Ｒ２を発現しない細胞（モックトランスフェクションしたもの）から単離した膜を利用するアッセイを含む。方法はTraynor and Nahorski, 1995, Mol. Pharmacol., 47: 848〜854に詳述されている。
【００６２】
調節剤を同定するために、上述の、ＧＴＰ結合またはＧＴＰａｓｅ活性などの、１０％またはそれ以上の変化（増大または減少）は通常十分である。しかしながら、作用薬を同定するためには、上述のアッセイは以下のように変更して実施する。剤は、化合物が１００ｍＭまたはそれ以下、例えば１０から５００μＭ、例えば約１００μＭで存在したときに、活性が、知られた作用薬（ペリラルチン）のそれの少なくとも５０％であった場合、または知られた作用薬によって誘導されるレベルと同じまたはそれ以上のレベルを誘導する場合、通常作用薬として同定される。
【００６３】
マイクロフィジオメーターまたはバイオセンサー
かかるアッセイはHafner, 2000, Biosens. Bioelectron. 15: 149〜158に詳述されているように行うことができる。
アラキドン酸
アラキドン酸の細胞内レベルは受容体活性の指標として採用される。かかる方法はGijon et al., 2000, J. Biol. Chem., 275:20146〜20156に詳述されている。
【００６４】
ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ
細胞内または細胞外ｃＡＭＰは、ｃＡＭＰラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または、例えばHorton & Baxendale, 1995, Methods Mol. Biol. 41: 91〜105に記載されているような、ｃＡＭＰ結合タンパク質を利用して計測される。代替的に、例えばLJL BiosystemsおよびNEN Life Science Productsの高効率蛍光偏光ベースホモジニアスアッセイなど、複数のｃＡＭＰ計測のためのキットもまた商業的に入手可能である。代替的に、ｃＧＭＰの細胞内または細胞外レベルもまた、例えばイムノアッセイを利用して計測可能である。例えば、Felly-Bosco et al., Am. J. Resp. Cell and Mol. Biol., 11:159〜164(1994)に記載の方法などが、ｃＧＭＰレベルを決定するのに利用され得る。代替的に、米国特許４，１１５，５３８に記載されているｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰを計測するアッセイキットもまた利用可能である。試験剤の非特異的効果の可能性を排除するためのモックトランスフェクションされた細胞またはその抽出物を有するネガティブコントロールが利用されるべきである。
【００６５】
ＤＡＧ／ＩＰ３
例えばPhospholipid Signaling Protocols, Ian M. Bird, Totowa, N.J.編, Humana Press, 1998に記載のように、受容体活性に起因するリン脂質分解によって放出される、二次メッセンジャーのジアシルグリセロール（ＤＡＧ）および／またはイノシトール三リン酸（ＩＰ３）を検出し、Ｔ１Ｒ２活性の指標として利用することが可能である。代替的に、Perkin Elmer and CisBio Internationalから商業的に入手可能な、イノシトール三リン酸の計測のためのキットが利用可能である。試験剤の非特異的効果の可能性を排除するためのモックトランスフェクションされた細胞またはその抽出物を有するネガティブコントロールが利用されるべきである。
【００６６】
ＰＫＣ活性
成長因子受容体チロシンキナーゼは、リン脂質およびカルシウム活性化タンパク質キナーゼファミリーの、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化を伴う経路を通してシグナリング可能である。ＰＫＣに誘導される遺伝子産物の増大は、ＰＫＣの活性化およびその結果としての受容体の活性化を示す。これらの遺伝子産物は、例えばガン原遺伝子転写因子コード遺伝子（ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｊｕｎを含む）、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤（コラーゲナーゼタイプＩおよびプラズミノーゲン活性化因子阻害剤を含む）、および接着分子（細胞内接着因子Ｉ（ＩＣＡＭ  Ｉ）を含む）などを含む。ＰＫＣ活性はKikkawa et al., 1982, J. Biol. Chem., 257: 13341に記載されているように、その後ホスホセルロースペーパーに結合することによって分離されるＰＫＣ基質ペプチドのリン酸化を計測することで、直接計測し得る。これは精製キナーゼまたは粗細胞抽出物中の活性の計測に利用可能である。タンパク質キナーゼＣサンプルは２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／２ｍＭ  ＤＴＴでアッセイ直前に希釈可能である。代替的なアッセイは、PanVeraから商業的に入手可能なタンパク質キナーゼＣアッセイキットを利用して行うことも可能である。
【００６７】
上述のＰＫＣアッセイは、Ｔ１Ｒ２を発現する細胞からの抽出物に対して行う。代替的に、活性は、ＰＫＣ活性化によって活性化される遺伝子の制御配列によって駆動するリポーター遺伝子構築物の利用を通して計測可能である。試験剤の非特異的効果の可能性を排除するためのモックトランスフェクションされた細胞またはその抽出物を有するネガティブコントロールが利用されるべきである。
【００６８】
ＭＡＰキナーゼ活性
ＭＡＰキナーゼ活性は、例えばNew England Biolabsのｐ３８ＭＡＰキナーゼアッセイキット、またはPerkin-Elmer Life ScienceのFlashPlateＴＭ ＭＡＰキナーゼアッセイなど、商業的に入手可能なキットを利用して計測可能である。ｐ４２／４４ＭＡＰキナーゼまたはＥＲＫ１／２は、ＧｑおよびＧｉ結合ＧＰＣＲを有する細胞を利用している場合、Ｔ１Ｒ２活性を示すために計測可能であり、ＧＰＣＲ活性化に続く内在性ＥＲＫ１／２キナーゼのリン酸化を計測するＥＲＫ１／２アッセイキットはTGR Biosciencesによって商業的に入手可能である。代替的に、知られた合成または天然チロシンキナーゼ基質および標識リン酸塩を通したチロシンキナーゼ活性の直接計測はよく知られており、他のタイプのキナーゼ（例えばセリン／スレオニンキナーゼ）の活性も同様に計測可能である。
【００６９】
全てのキナーゼアッセイは、精製キナーゼおよびＴ１Ｒ２ポリペプチドを発現する細胞から調製した粗抽出物両方で行うことができる。利用するキナーゼの基質は、全長タンパク質または基質の代わりとなる合成ペプチドであり得る。Pinna & Ruzzene（1996, Biochem. Biophys. Acta 1314: 191〜225）は、キナーゼ活性の検出に有用な複数のリン酸化基質部位を列挙している。複数のキナーゼ基質ペプチドが商業的に入手可能である。特に有用なものは、多くの受容体および非受容体チロシンキナーゼの基質である、「Ｓｒｃ−関連ペプチド」ＲＲＬＩＥＤＡＥＹＡＡＲＧ（Sigmaから商業的に入手可能）である。いくつかの方法は、ペプチド基質のフィルターへの結合を必要とし、そこでペプチド基質は、結合を促進するために、正味で正に荷電しているべきである。一般的に、ペプチド基質は少なくとも２つの塩基性残基および遊離アミノ末端を有しているべきである。反応は一般的に、０．７〜１．５ｍＭのペプチド濃度を利用する。試験剤の非特異的効果の可能性を排除するためのモックトランスフェクションされた細胞またはその抽出物を有するネガティブコントロールが利用されるべきである。
【００７０】
転写レポーター／Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ応答性プロモーター／レポーター遺伝子
レポーター遺伝子アッセイで調節剤を同定するためには、シグナルにおける少なくとも２倍の増大または１０％の減少が有意である。アゴニストは、試験剤の存在下および非存在下における活性を比較した場合、例えば少なくとも２倍、５倍、１０倍またはそれ以上刺激する。
Ｔ１Ｒ２へのアゴニストの結合によって開始される細胞内シグナルは細胞内事象のカスケードを動かし、最終結果として１または２以上の遺伝子の転写または翻訳における迅速かつ検出可能な変化となる。受容体の活性はしたがって、Ｔ１Ｒ２活性化に応答するプロモーターに駆動されるレポーター遺伝子の発現の計測によって決定される。
【００７１】
本明細書で使用される「プロモーター」は、遺伝子発現の受容体媒介制御に必要な１または２以上の転写制御エレメントまたは配列であり、これは受容体調節発現に必要な１または２以上の基本プロモーター、エンハンサーおよび転写因子結合部位を含む。Ｔ１Ｒ２へのアゴニストの結合の結果もたらされる細胞内シグナルに応答するプロモーターは、選択され、転写、翻訳または絶対的活性が容易に検出および計測可能な、対応するプロモーター制御レポーター遺伝子に作動可能に連結される。
【００７２】
レポーター遺伝子は、例えばルシフェラーゼ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびいわゆる「前初期」遺伝子、ｃ−ｆｏｓガン原遺伝子、転写因子ＣＲＥＢ、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）遺伝子、ソマトスタチン遺伝子、プロエンケファリン遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）遺伝子、ＮＦ−κＢに応答する遺伝子、およびＡＰ−１応答遺伝子（ＦｏｓおよびＪｕｎ、Ｆｏｓ関連抗原（Ｆｒａ）１および２、ＩκＢα、オルニチンデカルボキシラーゼ、およびアネキシンＩおよびＩＩの遺伝子を含む）から選択されてよい。プロモーターは、当業者には明らかなように、選択されたレポーター遺伝子に応じて選択される。ルシフェラーゼ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびその産物の検出のためのアッセイは当該技術分野でよく知られている。さらなるレポーター遺伝子の例は以下に記載されている。
【００７３】
「前初期」遺伝子は好適であり、速やかに誘導される（例えば受容体とエフェクタータンパク質またはリガンドとの接触から数分以内）。レポーター遺伝子の求められる特性には、次の１または２以上のものが含まれる：リガンド結合に対する速やかな応答性、休眠細胞における低発現または検出できない発現、新たなタンパク質合成の一過性かつ独立した誘導、後続する転写の遮断に新たなタンパク質合成が必要であること、およびこれらの遺伝子から転写されたｍＲＮＡが数分から数時間の短い半減期を有すること。同様に、プロモーターも、これらの特性を１つ、数個、または全て有し得る。
【００７４】
ｃ−ｆｏｓガン原遺伝子は、複数の異なる刺激に応答し、速やかな誘導を有する遺伝子の例である。ｃ−ｆｏｓ調節エレメントは、転写開始に必要なＴＡＴＡボックス、基本転写のための２つの上流エレメント、および、二回対称性を有するエレメントを含む、ＴＰＡ、血清、ＥＧＦ，およびＰＭＡによる誘導に必要なエンハンサーを含む。ｃ−ｆｏｓのｍＲＮＡキャップ部位の上流−３１７〜−２９８ｂｐの間に位置する２０ｂｐのｃ−ｆｏｓ転写エンハンサーエレメントは、血清枯渇ＮＩＨ３Ｔ３細胞の血清誘導に不可欠である。２つの上流エレメントのうちの１つは−６３〜−５７に位置し、ｃＡＭＰ調節のためのコンセンサス配列に類似する。
【００７５】
転写因子ＣＲＥＢ（サイクリックＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質）は細胞内ｃＡＭＰのレベルに応答する。したがって、ｃＡＭＰレベルの調節を通してシグナルする受容体の活性化は、転写因子の結合か、またはＣＲＥＢ結合エレメント（ＣＲＥ、またはｃＡＭＰ応答エレメントと称する）に連結されたレポーター遺伝子の発現を検出することで決定可能である。ＣＲＥのＤＮＡ配列はＴＧＡＣＧＴＣＡである。ＣＲＥＢ結合活性に応答するレポーター構築物は米国特許５，９１９，６４９に記載されている。
【００７６】
他の好適なレポーター遺伝子およびそのプロモーターは、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）遺伝子およびｃＡＭＰ応答性のそのプロモーター、ソマトスタチン遺伝子およびｃＡＭＰ応答性のそのプロモーター、プロエンケファリンおよびｃＡＭＰ、ニコチンアゴニストおよびホルボールエステルに応答性のそのプロモーター、およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）遺伝子およびｃＡＭＰ応答性のそのプロモーターを含む。
【００７７】
ＧＰＣＲ活性の変化に応答するレポーター遺伝子およびそのプロモーターのさらなる例は、ＡＰ−１転写因子およびＮＦ−κＢを含む。ＡＰ−１プロモーターは、回文配列ＴＧＡ（Ｃ／Ｇ）ＴＣＡであるコンセンサスＡＰ−１結合部位により特徴付けられる。ＡＰ−１はまた、ホルボールエステル１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−β−アセテート（ＴＰＡ）を含む腫瘍プロモーターによる誘導の媒介に関与しており、したがって、ＴＲＥ（ＴＰＡ応答性エレメント）と呼ばれることもある。ＡＰ−１は、増殖刺激に対する細胞の早期の応答に関与する複数の遺伝子を活性化する。ＡＰ−１応答性遺伝子の例は、ＦｏｓおよびＪｕｎ（タンパク質それ自体がＡＰ−１活性を組成する）、Ｆｏｓ関連抗原（Ｆｒａ）１および２、ＩκＢα、オルニチンデカルボキシラーゼ、およびアネキシンＩおよびＩＩの遺伝子を含む。
【００７８】
ＮＦ−κＢプロモーター／結合エレメントはコンセンサス配列ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣを有する。多くの遺伝子がＮＦ−κＢ応答性であると同定されていて、その制御エレメントをリポーター遺伝子と連結し、ＧＰＣＲ活性を監視することが可能である。ＮＦ−κＢに応答する遺伝子は、例えばＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＣＣＲ５、Ｐ−セレクチン、Ｆａｓリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩκＢαをコードするものを含む。ＮＦ−κＢ応答性レポーターをコードするベクターは当該技術分野で知られているか、または当該技術分野の通常の技術、例えば合成ＮＦ−κＢエレメントおよび最小プロモーターを用いて、またはＮＦ−κＢ制御に従うことが知られる遺伝子のＮＦ−κＢ応答性配列を用いて容易にに形成可能である。さらに、ＮＦ−κＢ応答性レポーター構築物は、例えばCLONTECHから商業的に入手可能である。
【００７９】
与えられたプロモーター構築物は、構築物をトランスフェクトした、Ｔ１Ｒ２発現細胞を、アゴニスト（例えばペリラルチン）に曝露することで簡単に試験できる。アゴニストに応答するレポーター遺伝子の発現における、少なくとも２倍の増大は、レポーターがＴ１Ｒ２活性を計測するのに適していることを示す。転写アッセイのためのコントロールは、Ｔ１Ｒ２を発現しないがレポーター構築物を保持している細胞およびプロモーターのないレポーター構築物を有する細胞の両方を含む。
【００８０】
レポーター遺伝子の活性化によって示されるＴ１Ｒ２活性を調節する剤は、他のプロモーターおよび／または他の受容体を用いて、シグナルのＴ１Ｒ２特異性を立証し、およびその活性範囲を決定することによって立証可能であり、これにより、あらゆる非特異的シグナル、例えばレポーター遺伝子経路経由の非特異的シグナルなどを排除する。
【００８１】
イノシトールリン酸（ＩＰ）計測
ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）加水分解は、少なくとも４８時間またはそれ以上の３Ｈ−ミオイノシトールによる細胞標識を伴う、米国特許５，４３６，１２８に記載されているように決定できる。標識細胞は試験剤に１時間接触させ、次いでそれらの細胞を溶解し、クロロホルム−メタノール−水に抽出する。その後、イノシトールリン酸をイオン交換クロマトグラフィで分離し、シンチレーションカウンティングで定量する。アゴニストに関して、刺激比（fold stimulation）は、試験剤の存在下における計数毎分（ｃｐｍ）の、緩衝液コントロールの存在下でのｃｐｍに対する比を計算して決定される。同じように、阻害剤、アンタゴニストおよび逆アゴニストに関して、阻害比は、試験剤の存在下における計数毎分（ｃｐｍ）の、緩衝液コントロール（アゴニストを含有してもしなくてもよい）の存在下でのｃｐｍに対する比を計算して決定される。
【００８２】
Ｔ１Ｒ２受容体および実質的に相同なポリペプチドならびに核酸
本方法で有用なＴ１Ｒ２ホモマー受容体は野生型受容体、または代替的に実質的に相同で依然として機能的である（つまりリガンドと結合しリガンドによって活性化される）受容体（またはＴ１Ｒ２受容体を形成するヌクレオチド配列）であってよい。かかる相同的な受容体は、例えば、ヒト受容体またはラット（約７０％のアミノ酸配列同一性）、マウス（約６９％のアミノ酸配列同一性および約６４％の核酸同一性）、またはイヌ（約７６％のアミノ酸配列同一性）、またはヒト受容体と十分なアミノ酸配列同一性を有する他のあらゆる種を含む異なる種の受容体の対立遺伝子変異体であってよい。
【００８３】
さらに、実質的に相同なＴ１Ｒ２核酸またはポリペプチド配列は、保存的変異および／または点突然変異により形成されてもよく、下記のあらゆる保存的に改変された変異体を含む。
核酸配列について、保存的に改変された変異体は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列（保存的に置換されたアミノ酸、すなわちアルギニンに差し替えられたリシンおよび下記に説明されているさらなる例など）をコードする核酸を意味する。
【００８４】
遺伝コードの縮重によって、配列は異なるが機能的に同一な複数の核酸が任意の与えられたポリペプチド／タンパク質をコードする。かかる核酸変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の１種である。ポリペプチドをコードするそれぞれの核酸配列はまた、全ての可能な核酸のサイレント変異を記載している。したがって、それぞれの核酸中のコドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）は、同一のポリペプチドを産生する機能的に同一の核酸配列を得るために改変し得る。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異は、それぞれの与えられた核酸配列に内在する。
【００８５】
アミノ酸配列について、アミノ酸置換は、かかる変化をＴ１Ｒ２配列に導入するのに利用することができる、ＰＣＲ、遺伝子クローニング、ｃＤＮＡの部位特異的突然変異誘発法、宿主細胞のトランスフェクション、およびインビトロ転写を含む、遺伝子組換え技術の知られた手順を利用して導入することができる。次いで、変異体を、味覚細胞特異的ＧＰＣＲ機能活性についてスクリーニングすることができる。機能的に類似しているアミノ酸を提供する保存的置換表は当該技術分野でよく知られている。例えば、保存的置換を選択する１つの典型的な指針は（オリジナルの残基の後に典型的な置換が続く）：ａｌａ／ｇｌｙまたはｓｅｒ、ａｒｇ／ｌｙｓ、ａｓｎ／ｇｌｎまたはｈｉｓ、ａｓｐ／ｇｌｕ、ｃｙｓ／ｓｅｒ、ｇｌｎ／ａｓｎ、ｇｌｙ／ａｓｐ、ｇｌｙ／ａｌａまたはｐｒｏ、ｈｉｓ／ａｓｎまたはｇｌｎ、ｉｌｅ／ｌｅｕまたはｖａｌ、ｌｅｕ／ｉｌｅまたはｖａｌ、ｌｙｓ／ａｒｇまたはｇｌｎまたはｇｌｕ、ｍｅｔ／ｌｅｕまたはｔｙｒまたはｉｌｅ、ｐｈｅ／ｍｅｔまたはｌｅｕまたはｔｙｒ、ｓｅｒ／ｔｈｒ、ｔｈｒ／ｓｅｒ、ｔｒｐ／ｔｙｒ、ｔｙｒ／ｔｒｐまたはｐｈｅ、ｖａｌ／ｉｌｅまたはｌｅｕを含む。
【００８６】
代替的な典型的な指針は、お互いが保存的置換であるアミノ酸をそれぞれ含有する後続の６群：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）を利用する。他の代替的な指針は、全ての荷電アミノ酸を、正であるか負であるかで、相互の保存的置換を認めるものである。加えて、独立的コードされた配列における単一のアミノ酸または小さい割合（例えば３１％まで、または２０％まで、または１０％まで、または５％まで）のアミノ酸を変化させ、追加し、または削除する個別の置換、欠失または付加もまた保存的に改変された変異とみなされる。実質的に相同なヌクレオチドまたはペプチド配列は、以下に示す配列同一性の度合いを有するか、または以下に示すある一定のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
【００８７】
％配列同一性
実質的に相同なヌクレオチド配列は、例えば少なくとも６４％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の％配列同一性を有する。実質的に相同なポリペプチド配列は、例えば少なくとも６９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の％配列同一性を有する。
【００８８】
配列同一性の計算は、後述のように決定される：ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Serch Tool）は、http://www.ncbi.nlm.nih.govで利用可能なプログラムｂｌａｓｔｎに使用されているヒューリスティックな検索アルゴリズムである。他のヌクレオチド配列に対するヌクレオチドクエリー配列の％同一性を決定するために、１０のＥＸＰＥＣＴ（データベース配列に対する一致を報告するための統計学的に有意な閾値）、およびＤＵＳＴフィルタリングを含む、ＢＬＡＳＴバージョン２．２．１．３のデフォルトパラメーターを用いたＢｌａｓｔｎが利用される。他のポリペプチド配列に対するポリペプチドクエリー配列の％同一性を決定するために、１０のＥＸＰＥＣＴ、およびＤＵＳＴフィルタリングを含む、ＢＬＡＳＴバージョン２．２．１．３のデフォルトパラメーターを用いたＢｌａｓｔｐが利用される。
【００８９】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
ヌクレオチド配列は、本明細書で提示するヌクレオチド配列、またはその相補体と、以下に詳述するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズできた場合、実質的に相同であると考えられる。
ストリンジェントな条件は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％のＳＤＳからなる溶液中の４２℃の温度、および０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）からなる溶液中での６５℃での洗浄である。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、他のヌクレオチド配列が、例えばスクリーニングされるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ中に存在するために起こり得る。バックグラウンドの少なくとも２倍、任意にバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍の陽性シグナルが、標的ＤＮＡとの特異的相互作用であるとみなされる。相互作用の強度は、例えば、プローブを、例えば３２Ｐによって放射性標識して計測することができる。
【００９０】
調節剤を同定するキット：
例えばスクリーニングキットまたはハイスループットスクリーニングキットなどの、Ｔ１Ｒ２ホモマー、またはその実質的に相同な配列を発現するがＴ１Ｒ３は発現しないトランスフェクト細胞を含有し；例えばペリラルチンなどのＴ１Ｒ２ホモマーのアゴニストを含有するキットがまた提供される。
【００９１】
任意に、細胞はさらに例えばカルシウムシグナリングのためのＧタンパク質を含む。好適なＧタンパク質は既知であり、上述されており、当業者は必要な場合にそれをどのように細胞に導入すればよいかを承知している。非常に有用なキメラＧタンパク質はＧアルファ１６−ガストデューシン４４である。アゴニストは、例えば１ｎＭから１０ｍＭ、または０．１マイクロＭ〜１ミリＭ、例えば０．１マイクロＭ〜１００マイクロＭなどの好適な濃度で提供される。
【００９２】
キットの任意構成要素は、限定することなく、提供される組換え細胞を培養するための好適な培地、および、細胞をその上で成長させるための固体支持体、例えば細胞培養皿またはマイクロタイタープレートなどを含み、これらの任意構成要素は当業者が容易に入手できる。
キットは以下のように利用されてよい：
（ｉ）組換え細胞を固体支持体上で成長させる。
（ｉｉ）約１ｎＭまたはそれ以下から１００ｍＭまたはそれ以上までの濃度の試験剤を、所定のプレートまたはウェルの培養培地に好適な濃度のアゴニストの存在下で加える。
（ｉｉｉ）細胞の機能的応答の変化が、試験剤の存在下および非存在下での応答を比較することで決定され、その結果試験剤が調節剤であり得るかどうかが決定される。
【００９３】
例えば、ステップ（ｉｉｉ）は上述のアッセイのいずれかに従い、上述の受容体活性を報告する検出方法のいずれかと組合せて行うことができる。これは、同じく上述された、特別に選択したまたは適応させた組換え細胞を必要とすることがある。好適なアッセイは、例えば、Ｔ１Ｒ２の活性化および試験剤に応答したその変化を決定するためのカルシウムフラックスアッセイである。
【００９４】
同定された調節剤の確認
上述の方法によって同定された調節剤は、フレーバリストのパネルまたは試験者に同定された調節剤をテイスティングさせる単純な官能試験によって簡単に確認し得る。化合物は、例えば、甘味を確認するために水中で、または甘味を増強する調節剤であることを確認するために甘味料と一緒に、調節剤のないネガティブコントロールと比較してテイスティングする。
【００９５】
大規模スクリーニングアッセイ
上述の転写レポーターアッセイおよびほとんどの細胞ベースのアッセイは、ライブラリーをＴ１Ｒ２活性を調節する剤についてスクリーニングするのに適している。アッセイは、アッセイ工程の自動化および、典型的には平行して実行される（例えばロボットアッセイにおけるマイクロタイタープレート上のマイクロタイター形式など）、任意の好都合な給源からの化合物のアッセイへの供給によって、巨大な化学的ライブラリをスクリーニングするように設計され得る。
【００９６】
アッセイは、多くの潜在的調節剤を含むコンビナトリアルケミカルまたはペプチドライブラリーの提供を伴う、ハイスループットスクリーニング法で実行されてもよい。かかるライブラリーは、次いで、上述の活性を呈するライブラリー剤（特に化学種またはサブクラス）を同定するために、上述の１またはそれ以上のアッセイでスクリーニングされる。こうして同定された調節剤は直接利用でき、または、誘導体を製造および試験することでさらなる調節剤を同定するためのリードとして利用することができる。合成化合物ライブラリは、Maybridge Chemical Co.（Trecillet, Cornwall, UK）、Comgenex（Princeton, N.J.）、Brandon Associates（Merrimack, N.H.）、およびMicrosource（New Milford, Conn.）を含む多くの企業から商業的に入手可能である。
【００９７】
試験剤のライブラリ
コンビナトリアルケミカルライブラリは、試薬などの多くの化学的「ビルディングブロック」の組合せることにより、化学合成または生物学的合成のいずれかによって生成された様々な化学化合物のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリなどのリニアコンビナトリアルケミカルライブラリは、所定の化合物長（すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）について、化学的ビルディングブロック（アミノ酸）のセットをあらゆる可能な方法で組合せることによって形成される。何百万もの化学的化合物が、かかる化学的ビルディングブロックの組合せ混合を通して合成可能である。レアケミカルライブラリはAldrich（Milwaukee, Wis.）から入手可能である。
【００９８】
細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリは、例えばPan Laboratories（Bothell, Wash.）またはMycoSearch（NC）から商業的に入手可能であり、あるいは、当該技術分野で知られた方法で容易に生成可能である。さらに、天然および合成的に産生されたライブラリおよび化合物は、慣用の化学的、物理的および生化学的手法で容易に改変される。他のライブラリとしては、タンパク質／発現ライブラリ、例えば食物、植物、動物、細菌を含む天然給源からのｃＤＮＡライブラリ、１または２以上のポリペプチドをランダムにまたは体系的に変異させた変異体を発現するライブラリ、および１つの細胞または組織のｍＲＮＡ内容を発現させるのに利用されるウィルスベクターでのゲノムライブラリを含む。
【００９９】
ハイスループットアッセイでは、数千の異なる調節剤またはリガンドを１日でスクリーニングすることが可能である。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルは、選択された潜在的調節剤に対する別個のアッセイの実施に利用でき、または、濃度またはインキュベーション時間の効果を観察すべき場合、各５〜１０ウェルで１つの増強物を試験可能である。したがって、1つの標準的なマイクロタイタープレートは約１００の調節剤をアッセイ可能である。１５３６ウェルプレートを利用した場合、１つのプレートは、約１００から約１５００の異なる化合物を、簡単にアッセイ可能である。１日にいくつかの異なるプレートをアッセイ可能なので、約６，０００〜２０，０００の異なる化合物のためのアッセイスクリーニングが可能である。
【０１００】
本アッセイ方法でＴ１Ｒ２の調節効果を試験し得る試験剤のタイプ
試験剤は、小化学化合物、化学ポリマー、生物ポリマー、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、核酸および脂質を含む任意の剤であり得る。剤は、合成化合物、化合物の混合物、天然産物または天然サンプル、例えば植物抽出物、培養上清、または組織サンプルなどであり得る。
【０１０１】
甘味料、または甘味を改変する化合物の例として、テアサポニンＥ１、アセスルファムＫ、アリテーム、アスパルテーム、ＣＨ４０１、ズルチン、エリスリトール、グアニジン甘味料、イソマルト、イソマルトシルフルクトシド（isomaltosylfructoside）、イソラフィノース、ＮＣ１７４、ネオテーム、ペリラルチン、フェニルアセチルグリシル−Ｌ−リシン、サッカリン、ＳＣ４５６４７、サイクラミン酸ナトリウム、ソルビトール、スクラロース、スクロノン酸（sucrononic acid）、スオサン（Suosan）、スーパーアスパルテーム、メチルアルファ−Ｌ−アラビノシド、メチルベータ−Ｌ−アラビノシド、メチルベータ−Ｄ−グルコシド、メチルａ−Ｄ−マンノシド、メチルベータ−Ｌ−キシロピラノシド、メチルアルファ−Ｄ−キシロシド、メチルアルファ−Ｄ−グルコシド２，３−ジ−スレオニン、メチルアルファ−Ｄ−グルコシド２，３−ジ−イソロイシン、プロトカテク酸、シナリン、グリシフィリン、
【０１０２】
レバウジオシドＣ、アブルソシドＡ（Abrusoside A）、アブルソシドＢ、アブルソシドＣ、アブルソシドＤ、アブルソシドＥ、アピオグリチルリチン、アラボグリチルリチン、バイユノシド、ブラゼイン、ブリオズルコシド、カルノシフルオシドＶ（Carnosifloside V）、カルノシフルオシドＶＩ、Ｄ．クミンシー、シクロカリオシドＡ、シクロカリオシドＩ、ズルコシドＡ、フルオレン−４−アルファ，６−ジカルボキシル酸、４−ベータ，１０−アルファ−ジメチル−１，２，３，４，５，１０−ヘキサヒドロ−ガウジカウジオシドＡ（4-beta, 10-alpha-dimethyl-1,2,3,4,5,10-hexahydor-Gaudichaudioside A）、グリチルリチン酸、ヘルナンズルチン、ヘルナンズルチン、４ベータ−ヒドロキシ−ヘスペリチン−７−グルコシドジヒドロカルコン、ハンキオシドＥ（Huangqioside E）、ハンキオシドＥ、
【０１０３】
３−ヒドロキシフロリジン、ケンフェロール、２，３−ジヒドロ−６−メトキシ３−Ｏ−アセテート、マビンリンマルトシル−アルファ−（１，６）−ネオヘスペリジンジヒドロカルコン、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、１１−オキソモグロシドＶ、モナチン、モネリン、モノアンモニウムグリチルリチン塩（Ｍａｇ）、ムクロジオシドＩｉｂ（Mukurozioside Iib）、ナリンジンジヒドロカルコン、ネオアスチルビン、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＨＤＨＣ）、ネオモグロシド、オスラジン、ペンタジン、ペリアンドリンＩ、ペリアンドリンＩＩ、ペリアンドリンＩＩＩ、ペリアンドリンＩＶ、ペリアンドリンＶ、フロミソシドＩ（Phlomisoside I）、フロリジン、フィロズルチン、ポリポドシドＡ、グリチルリチンカリウムマグネシウムカルシウム、プテロカリオシドＡ（Pterocaryoside A）、プテロカリオシドＢ、クエルセチン、
【０１０４】
２，３−ジヒドロ−３−Ｏ−アセテート、クエルセチン、２，３−ジヒドロ−６−メトキシ−クエルセチン、２，３−ジヒドロ−６−メトキシ−３−Ｏ−アセテート、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、ルブソシド、スカンデノシドＲ６（Scandenoside R6）シアメノシドI、グリチルリチン酸ナトリウム、ステビオールビオシド、ステビオシド、ステビオシド、アルファ−グリコシルスアビオシドＡ、スアビオシドＢ、スアビオシドＧ、スアビオシドＨ、スアビオシドＩ、スアビオシドＪ、タウマチン、グリチルリチン酸トリアンモニウム（ＴＡＧ）、トリロバチンセリゲアインＡ（Trilobatin Selligueain A）、ヘマトキシリン、マルチトール、マンニトール、メチルアルファ−Ｄ−グルコシド２，３−ジ−アスパラギン酸、安息香酸、２−（４−ジメチルアミノベンゾイル）−安息香酸、２−ヒドロキシ−４−アミノメチル安息香酸、２−（３−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾイル）−メチルベータ−Ｄ−フルクトシド、
【０１０５】
メチルアルファ−Ｄ−ガラクトシド、メチルベータ−Ｄ−ガラクトシド、クルクリン、ストロジン１、ストロジン２、ストロジン４、ミラクリン、フェニル酢酸、３，４−ジメトキシ−アミノ安息香酸、３−アニス酸、ベンジルアルコール、３−アミノ−４−ｎ−プロポキシル３，４−カフェイン酸、ケイ皮酸、ジヒドロキシケイ皮酸、２，４−フェルラ酸、加水分解グアーガム、ヒドロキシアミノ安息香酸、２，４−ニゲロオリゴサッカリン酸塩、サトウキビバガス抽出物、ジヒドロ安息香酸、２，３−ジヒドロ安息香酸、２，４−クマル酸、ｐ−ジヒドロ安息香酸、３，５−ヒドロキシ安息香酸、３−グルマリン、ギムネマサポニンＩＩＩ、ギムネマサポニンＩＶ、ギムネマサポニンＶ、ギムネマサポニンＩＩＩ、ギムネム酸Ｉ、ギムネム酸ＩＩ、ギムネム酸ＩＩＩ、ギムネム酸ＩＶ、ホダルシン、ジュジュバサポニンＩＩ、ジュジュバサポニンＩＩＩ、プロピオン酸、（−）−２−（４−メトキシフェノキシ）ジジフィン、
【０１０６】
エチルマルトール、マルトール、ブタン酸、２−オキソ−３−メチルアラニン、Ｎ−（１−メチル−４−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）クレアチニン、アブルソシドＥ、モノ−メチルエステル、ラクチトール、ペリアンドリン酸Ｉ、モノグルクロニド、ペリアンドリン酸ＩＩ、モノグリクロニド、キシリトール、タガトース、ｄ−ベンゾイルオキシ酢酸、４−メトキシホズロシドＩ（4-Methoxy Hoduloside I）、４−ニトロフェニルａ−Ｄ−ガラクトシド、４−ニトロフェニルアルファ−Ｄ−グルコシド、４−ニトロフェニルベータ−Ｄ−グルコシド、４−ニトロフェニルアルファ−Ｄ−マンノピラノシド、尿素、（Ｎ−（４−シアノフェニル）−Ｎ’−（（ソディオスルホ）メチル）クロランフェニコール、クロロゲン酸、メチルアルファ−Ｄ−グルコース、メチルアルファ−Ｄ−グルコシド２，３−ジ−アラニン、メチルアルファ−Ｄ−グルコシド２，３−ジ−グリシン、
【０１０７】
メチルアルファ−Ｄ−グルコシド２，３−ジ−プロリン、メチルアルファ−Ｄ−グルコシド２，３−ジ−バリン、アニリン、２−ブトキシ−５−ニトロ−アニリン、２−エトキシ−５−ニトロ−アニリン、２−メトキシ−５−ニトロ−アニリン、３−ニトロ−（+）−バイユノール−ベータ−Ｄ−グルコシド−アルファ−Ｄ−グルコシド、アニリン、１，３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジルアニリン、２−プロポキシ−５−ニトロ−（Ｐ４０００）ベンゾ−１，４−ジオキサン２−（３−ヒドロキシー４−メトキシフェニル）−ベンゾ−１，３−ジオキサン−４−オン２−（３−ヒドロキシ４−メトキシフェニル）安息香酸、２−ベンゾイル−４−メトキシ−安息香酸、２−（４−メトキシベンゾイル）−ベンゾ−１，３（４Ｈ）−キサチアン、２−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−ベンゾ−１，４−キサチアン３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−ブタン酸、
【０１０８】
４−［３，５−ジヒドロキシ−４−［３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−１−オキソプロピル］フェノキシ］−２−ヒドロキシ−モノナトリウム塩、ブタン酸、４−［３，５−ジヒドロキシ−４−［３−（３ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−１−オキソプロピル］フェノキシ］−３−オキソ−モノナトリウム塩、シクロヘキサジエン−１，４１−カルボキシアルデヒド−４−（メトキシメチル）−、（Ｅ）オキシムエチルベンゼン、ベータ−（１，３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジル）−ヘスペルチンジヒドロカルコン、３’−カルボキシ−ヘスペルチンジヒドロカルコン、３’−ホルミル−イソクマリン、３，４−ジヒドロ−３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシ）−ペリラルチン、８，９−エポキシ−フェニル３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジルエーテル、リン酸、［３−［３，５−ジヒドロキシ−４−［３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−１−オキソプロピル］フェノキシ］プロピル］モノカリウム塩、
【０１０９】
ステビオシドアナログ、スルファミン酸、［２−［３，５−ジヒドロキシ−４−［３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−１−オキソプロピル］フェノキシ］エチル］−モノカリウム塩、尿素、およびＮ−（４−シアノフェニル）−Ｎ’−（２−カルボキシエチル）−Ｌ−テアニンを挙げることができる。
【０１１０】
同定された甘味料は、例えば、甘味知覚を誘発することが可能な人工甘味料が含まれてよい。これらは、例えばカロリーを減少させるためまたは歯にとってより健康な消費材を提供するために、糖化合物の代わりに利用可能であるという点で特に興味がある。消費材は食料製品、飲料、口腔ケア製品、およびかかる製品を混合した組成物、特に風味組成物を含む。風味組成物は、加工食品または飲料の産生を通して添加され得る、またはそれら自身が、例えばソースなどの調味料など、実際に消費材となり得る。甘味料は、菓子類およびデザートを含む他の甘味消費材において特に有用であるが、風味のあるおよび甘酸っぱい消費材においても同じである。消費材の例は、限定することなく、菓子製品、ケーキ、シリアル製品、パン屋製品、パン製品、ガム、チューインガム、ソース（調味料）、スープ、加工食品、調理果物および野菜製品、肉および肉製品、卵製品、乳および乳製品、チーズ製品、バターおよび代替バター製品、代替乳製品、大豆製品、食用油および油脂製品、薬剤、飲料、アルコール飲料、ビール、ソフトドリンク、食品抽出物、植物抽出物、肉抽出物、調味料、甘味料、栄養補助食品、薬剤および非薬剤ガム、錠剤、トローチ、ドロップ、乳剤、エリキシル剤、シロップおよび飲料を作るための他の調製物、インスタント飲料および発泡錠を含む。
【０１１１】
Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ配列
配列は後述の配列表に示されている。配列番号１はＴ１Ｒ２受容体をコードするヌクレオチド／核酸配列に対応し、配列番号２はＴ１Ｒ２受容体タンパク質のポリペプチド／アミノ酸配列に対応する。
【０１１２】
これより以下に、上述の方法を例証する一連の例が続く。以下の例は単なる例示であって、いかようにも本方法またはキットを限定すると解すべきではない。
【０１１３】
例
全ての例はヒト受容体を利用する。
例１
Ｆｌｕｏ−４カルシウムアッセイ
Ｆｌｕｏ−４は、細胞内カルシウムの蛍光指示薬であり、カルシウム濃度の変化、特にリガンド（例えばペリラルチン）添加後に起こる受容体活性化に応答した増加の決定を可能にする。
Ｇアルファ１６−ガストデューシン４４（Ｇα１６ｇｕｓｔ４４）を安定発現し、例２、３または４に記載されているようにトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を宿主細胞として利用した。
【０１１４】
黒く、底が透明な９６ウェルプレートを全てのアッセイで利用した。アッセイの前日、プレートに、ウェル毎に８５００個のトランスフェクト細胞を播種し、用いた細胞に適した成長培地中、３７℃で一晩維持した。ＨＥＫ２９３については、高グルコース、Ｌ−グルタミン、塩酸ピロキシジンを含有し、１０％ウシ胎仔血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地をＨＥＫ２９３細胞の成長および維持に利用した。
【０１１５】
アッセイの際に成長培地を廃棄し、細胞を１時間（３７℃にて暗所で）、Ｃ１緩衝溶液に溶解した１．５μＭのＦｌｕｏ−４ＡＭ（Molecular ProbesTM, Invitrogen, US）および２．５μＭのプロベニシド（Sigma-Aldrich）からなる５０μｌのカルシウムアッセイ溶液でインキュベートした。Ｃ１緩衝溶液は１３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２ｍＭのＣａＣｌ２および１０ｍＭのグルコース（ｐＨ７．４）を含有する。
【０１１６】
最初の１時間の負荷期間の後、プレートをウェルあたり１００μｌのＣ１緩衝液で５回、自動プレート洗浄機（BioTek）を利用して洗浄し、洗浄の後、Ｆｌｕｏ−４−ＡＭの完全な脱エステル化をもたらすために、プレートを室温にて３０分間暗所でさらにインキュベートした。緩衝溶液を廃棄し、プレートを１００μｌのＣ１洗浄緩衝液で洗浄し、最終的に細胞を１８０μｌのＣ１洗浄緩衝液中に入れた。
【０１１７】
アッセイの読み取りのため、プレートをＦＬＩＰＲ（蛍光イメージングプレートリーダー（FLIPR-Tetra, Molecular Devices））中に置き、受容体活性化を、２０μｌの１０×濃縮リガンドストック溶液の添加後に開始させた。
蛍光は、リガンド添加前１５秒間およびリガンド添加後１０５秒間で継続的に監視した（４５〜１０５秒で十分であろう）。
受容体活性化は相対蛍光単位（ＲＦＵ）で与えられ、次の等式で定義される：
蛍光増加＝最大蛍光−基準蛍光
式中、基準蛍光はリガンド添加前の最初の１０〜１５秒について計算した平均蛍光を表す。
【０１１８】
ネガティブコントロールとして、モックトランスフェクションした細胞を同濃度のリガンドに曝露し、シグナルに対応しない微量のカルシウム濃度を決定した。活性化された受容体を有する細胞は、ネガティブコントロールを有意に上回るシグナル（ＲＦＵ）によって同定した。
【０１１９】
例２
Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、およびＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３のトランスフェクションならびに異種発現
Ｔ１Ｒ２ベクター構築物を形成するために、ヒトＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３全タンパク質コード配列を含有するｃＤＮＡ断片がヒト茸状細胞ｃＤＮＡライブラリから単離され、完全にシークエンシングされ、そこでｐＣＤＮＡ３．１（Invitrogen）にサブクローンされた。
【０１２０】
安定的にＧ１６ｇｕｓｔ４４を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＷＯ２００４／０５５０４８に記載されているように形成）にＴ１Ｒ２ベクター構築物を以下のようにトランスフェクトした：
０日目に、ＨＥＫ２９３Ｔ／Ｇ１６ｇｕｓｔ４４細胞を、９６ウェルプレートにウェルあたり８，５００個の密度で播種し、選択成長培地で一晩成長させた。
１日目に、培地を抗生物質不含、血清不含の成長培地に交換し、７５ｎｇのＴ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３ベクター構築物ＤＮＡおよび０．３μｌのリポフェクタミン２０００（Invitrogen）を利用してトランスフェクトした。
【０１２１】
Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーのトランスフェクションのために、７５ｎｇの各Ｔ１Ｒベクター構築物を総量１５０ｎｇで組み合わせ、０．３μｌのリポフェクタミン２０００と共に利用した。リポフェクタミン／ＤＮＡ混合物を細胞とともに３〜４時間インキュベートし、抗生物質不含の血清含有成長培地と取り替えた。細胞を一晩成長させ、Ｆｌｕｏ−４カルシウムアッセイを例１に記載されているように実施した。
発現構築物を一過性にトランスフェクトされた細胞は、例１に記載されているように蛍光イメージングプレートリーダー（FLIPR-Tetra, Molecular Devices）を利用して同定された。
【０１２２】
例３
Ｔ１Ｒ３の存在下および非存在下における、ペリラルチンによるＴ１Ｒ２の活性化
５０μＭのペリラルチンによる刺激に引き続く細胞内カルシウム応答はＧ１６ｇｕｓｔ４４を安定的に発現し、Ｔ１Ｒ２モノマー、Ｔ１Ｒ３モノマー、ならびにＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ダイマーを与えるようにＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３両方をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において決定された。
トランスフェクションは例２に記載されている方法に従って実施され、結果は例１に記載されているように計算された（データは刺激後の蛍光における基準値以上の正味の増加（ＲＦＵ）を示し、平均値±６反復の標準偏差が与えられている）。
【０１２３】
Ｔ１Ｒ２モノマーを発現する細胞において、カルシウムシグナルの顕著な増大が観察され、シグナルはＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ダイマーのシグナルに匹敵する強度であった。Ｔ１Ｒ３モノマーを発現する細胞においては、顕著な増大は観察されず、そのシグナルはネガティブコントロール（Ｇ１６ｇｕｓｔ４４キメラＧタンパク質のみを発現するモックトランスフェクション細胞）のシグナルを十分下回っていた。
【表１】
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【０１２４】
人工甘味料であるサイクラミン酸塩、アスパルテーム、Ｄ−トリプトファン、スクラロース、およびステビオシドによる実験では、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ダイマーとこれらの人工甘味料ではペリラルチンのシグナル強度に匹敵する強いシグナルを見せたが、Ｔ１Ｒ２モノマーではネガティブコントロール（モックトランスフェクション細胞）において観察されたシグナルを顕著には上回っていないシグナルを見せた。
【０１２５】
例４
Ｔ１Ｒ２を発現する安定的細胞系の形成のためのＴ１Ｒ２のトランスフェクション
ヒトＴ１Ｒ２／ｐｃＤＮＡ４−Ｚｅｏｃｉｎ構築物５μｇをＰｖｕＩＩで消化して直鎖化し、Wizard DNA Clean-Up System（Promega）を利用して精製した。ＤＮＡはリポフェクタミン２０００試薬を利用して、既に安定的にＧ１６ｇｕｓｔ４４Ｇタンパク質を発現する細胞（ＷＯ２００４／０５５０４８に記載されているように形成）中にトランスフェクトされた。
【０１２６】
２４時間後、トランスフェクトされた細胞はトリプシン処理され、１：１００，０００まで１０×希釈液を選択成長培地（１０％のＦＢＳ、Ｇ４１８（０．３６ｍｇ／ｍＬ）、およびゼオシン（０．２ｍｇ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭ）を含有する１５０ｍｍディッシュに再播種した。７〜１４日後、Ｇ４１８／ゼオシン耐性増殖巣を採取し、１〜２週間拡大して、５０μＭのペリラルチンに対するその応答をカルシウムフラックスアッセイ（例１に、より詳細に記載）によって機能的に解析した。このカルシウムフラックスアッセイにFLIPRが利用され、クローンをウェルあたり１５，０００個の濃度で、９６ウェルの黒い、透明底のプレートに、解析前に４０〜４８時間成長できるように播種した。５０μMのペリラルチンに対する応答は、受容体特異的シグナルを確認および定量化するためにネガティブコントロール（Ｃ１緩衝液）から得られたシグナルと比較された。
【０１２７】
結果は、下記表参照のこと。実験のシグナル平均と同様に標準偏差（ＳＴＤ）がＲＦＵで与えられている。２つのクローンが解析された。Ｇ１６ｇｕｓｔ４４のみを発現する未トランスフェクト細胞が一般的なネガティブコントロールの役割を果たす。カルシウムシグナルの顕著な増大が、安定的にＴ１Ｒ２モノマーを発現する複数のクローン細胞系で観察され、獲得したペリラルチン依存性シグナルは、Ｇ１６ｇｕｓｔ４４キメラＧタンパク質のみを発現するネガティブコントロール細胞で獲得されたものより少なくとも１０倍大きかった。
【表２】
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【０１２８】
本方法およびキットは上記である例示的な態様に関して記載されているが、同様の機能を実施するために、他の同様の態様が利用されてよく、または改変および付加が加えられてもよいと理解されるべきである。さらに、全ての開示された実施例は必ずしも互いに排他的ではなく、様々な実施例は必要な特性を提供するために組み合わせてもよい。当業者は、本開示の精神と範囲から離れることなく変更を加えることができる。したがって、本方法およびキットはいかなる単一の態様に限定されるべきではなく、むしろ請求項の記載にしたがった幅および範囲をもって解釈されるべきである。
【配列表】
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【国際調査報告】
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