(57)【要約】  本発明は、凍結保存用肝細胞の調製方法、単離した肝細胞の凍結保存方法及び凍結保存した単離肝細胞の培養物の作製方法に関する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結保存用肝細胞の調製方法において、
（ａ）基質を準備するステップ、
（ｂ）単離した肝細胞を準備するステップ、
（ｃ）基質の上に肝細胞を２〜４×１０３／ｍｍ２の密度で播種するステップ、
（ｄ）細胞が基質に付着しうるように、細胞で覆われた基質を１０〜１８０分静置するステップ、
（ｅ）細胞で覆われた基質から付着していない細胞を洗浄するステップ、
（ｆ）細胞で覆われた基質を最大１８０分まで静置するステップ、
（ｇ）細胞で覆われた基質を凍結培地中で凍結するステップ
を含む方法。
【請求項２】
基質がコラーゲン基質である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｄ）において３０〜９０分静置する請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｅ）において培地を積層し、続いて細胞で覆われた基質の上の液状上清を吸引して除く請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｆ）において３０〜１８０分静置する請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｇ）において０．５μｌ／ｍｍ２の量の凍結培地を加える請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
凍結培地が１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び１０％ＤＭＳＯを含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｇ）において細胞で覆われた基質に凍結培地を積層することによって凍結を行い、０．５〜２０℃／分の冷却速度で−８０℃以下に制御された冷却を行い、場合によっては相転移を補償する請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
単離した肝細胞の凍結保存方法において、
請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法のステップ（ａ）〜（ｇ）、
（ｈ）凍結した、細胞で覆われた基質を貯蔵するステップ、
（ｉ）凍結した、細胞で覆われた基質を解凍するステップ、
（ｊ）細胞で覆われた基質から付着していない細胞を洗浄するステップ、
（ｋ）解凍した、細胞で覆われた基質に第２の基質を積層するステップ、
（ｌ）基質の間に埋め込まれた細胞を再培養するステップ
を含む方法。
【請求項１０】
ステップ（ｈ）において貯蔵を−１５０℃で行う請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｉ）において、細胞で覆われた基質に温かい培地を積層する請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｊ）において、細胞で覆われた基質に培地を積層し、続いて細胞で覆われた基質の上の液状上清を吸引して除く請求項９〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか１つに記載の方法のステップ（ａ）〜（ｌ）を含む、凍結保存した単離肝細胞のサンドイッチ培養物の作製方法。
【請求項１４】
ステップ（ａ）が、
（ａ１）動物又はヒトの生体から肝組織を準備するステップ、
（ａ２）上記組織から肝細胞を単離するステップ
を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１３又は１４のいずれか１つに記載の方法により作製される凍結保存肝細胞のサンドイッチ培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凍結保存の技術分野、具体的には凍結保存用の肝細胞の調製方法、単離した肝細胞の凍結保存方法、及び凍結保存した単離肝細胞のサンドイッチ培養物の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織塊から単離した肝臓細胞、特に肝細胞は、とりわけ初代細胞培養物の形で薬剤候補の生理的作用の試験のために使用される。新たに調製したヒトの初代肝細胞は特に、一連のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で有効物質候補を確認し、又は有効物質の代謝若しくは酵素誘導について研究を行うための「判断基準」である。新たに単離したヒト肝細胞は常時かつ随時に入手できないのが欠点である。そこで単離した肝細胞をある時間にわたって貯蔵することができる方法が必要になる。その場合、細胞の生理的機能、即ちとりわけその代謝的又は酵素的能力ができる限り完全に維持されなければならない。
【０００３】
周知のように肝細胞は凍結保存して貯蔵される。通常、肝細胞は懸濁液中に凍結保存される。懸濁液は肝細胞のほかに、凍結及び解凍による細胞の損傷を防止するための凍結培地を含む。貯蔵のために懸濁液はたいてい−８０℃以下の温度に冷凍される。貯蔵後の使用のために、凍結した細胞懸濁液が解凍され、細胞は培養プレート又は培養容器で培養される。解凍した細胞の再培養のために通常、培養容器を基質材料で被覆する。細胞はその上に付着することができる。効果的な付着は再培養とその後の研究のために不可欠である。しかし多くの場合、初めに凍結された細胞のうち生きた状態で維持され、再培養されるのはごく一部に過ぎない。この操作の欠点は、とりわけ懸濁液から解凍された細胞が培養プレートに付着するか、どれだけの割合が付着するかを予測できないことである。バッチ中の付着細胞の割合は個々のバッチに左右される。通常、解凍した凍結保存細胞が十分に培養プレートに付着するのは少数のバッチに過ぎない。
【０００４】
別の周知の凍結保存法は、新たに単離した細胞を培養容器で平板培養し、平板培養した細胞を続いて培養容器とともに凍結するものである。この場合も平板培養の前に、培養容器は細胞が付着しうる基質で被覆される。周知のようにコラーゲンゲルを使用することが好ましい。周知の方法では肝細胞をＩ型コラーゲンで被覆された培養プレートの上に播種し、コラーゲン基質に約４時間かけて付着させる。生じる単層培養物（単細胞層培養物）を次に約２０時間培養する。続いて付着していない細胞を洗浄する。さらに６時間の後に培養物に凍結培地を積層し、−７０℃に冷却して貯蔵する（Watts & Grant, 1998, Human & Experimental Toxicology 15:30-37）。続いて使用するために、単層培養物を解凍し、再培養する。しかし解凍された培養物は高い割合の未付着の死細胞及び細胞破片を有する。たいてい基質の大部分は細胞で覆われているが、しかしコンフルエントな連続する細胞集団は生じない。
【０００５】
別の周知の方法では肝細胞をサンドイッチ構造、即ち二重ゲル配列で凍結する。そのためにまずコラーゲンゲルで被覆した細胞培養プレートに肝細胞懸濁液を播種する。２４時間の細胞培養の後にコラーゲンゲルの第２の層を播種された細胞の上に注ぎ加える。続いてこうして得たサンドイッチ培養物を凍結培地の中で−７０℃に凍結し、貯蔵する（Koebeら、1990; Cryobiology 27:576-584）。
【０００６】
凍結の前に肝細胞を基質の上又は２つの基質の間に固定化することによって、細胞が機械的に安定化され、こうして生存率が高められる。細胞は新たに単離した高生存力段階で付着することができるから、懸濁液中で凍結され解凍される凍結保存細胞の付着に比して付着率が著しく高い。それでもこの場合も解凍の後に大きな割合の未付着の又は非生存細胞が生じる。生肝細胞のコンフルエントな培養という理想的状態は得られない。しかも懸濁液中で凍結した細胞は通常、解凍後数時間以内にその代謝能力を失うことが示されている。この細胞はその後に行う多数のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に不適当である。
【０００７】
さらにヒトの臓器から単離された細胞は動物モデルから採取した細胞よりも多くの場合安定性が劣る。これはとりわけドナー臓器のヒト細胞が通常、たいていこの目的のために特別に飼育して静死させる動物（例えばラット、マウス又はブタ）の細胞より不利な条件で得られることに原因する。従ってヒト細胞は極めて入念な培養条件を必要とする。ヒト肝細胞を首尾よく凍結保存し、続いて長期間にわたりｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を行うことができるような凍結保存方法は知られていない。
【０００８】
そこで入念な凍結保存、即ちとりわけ生存率が高い入念な解凍を可能にする改善された肝細胞凍結保存方法が必要になる。改善された凍結保存方法は、単離したヒト肝細胞を首尾よく凍結保存するのにとりわけ適していなければならない。その場合解凍された細胞の大部分ができる限りコンフルエントな単層（連続する単層）として培養基質上で再培養されることを保証しなければならない。さらに本方法は高い割合の生細胞を含む単離肝細胞の改善されたサンドイッチ培養物を作製するのに適していなければならない。さらに凍結保存の後に解凍され再培養された細胞ができる限り長い期間にわたってその代謝的又は酵素的能力を維持し、多数のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に使用できることを保証しなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで本発明の根底にある技術問題は、凍結保存した肝細胞が最終的に改善されたサンドイッチ培養物として再培養されるように改善された単離肝細胞、特にヒト肝細胞の凍結保存方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
根底にある技術問題は、請求項１に基づく方法、特に下記のステップを含む凍結保存用肝細胞の調製方法によって解決される。
【００１１】
ステップ（ａ）において、基質、特にコラーゲン基質、好ましくはコラーゲンゲルを準備する。基質は細胞培養容器、例えば６ウェル・プレートに導入することが好ましい。培養容器を基質材料で被覆することが好ましい。
【００１２】
ステップ（ｂ）において、単離した肝細胞、特に組織から単離した肝細胞を用意する。
【００１３】
次のステップ（ｃ）では、単離した肝細胞を基質の上に播種する。その場合基質上の肝細胞の密度は基質面積１ｍｍ２につき２〜４×１０３である。好ましい細胞密度は２．６〜３．２×１０３／ｍｍ２である。即ち基準面積、例えば６ウェル・プレートの１つのウェルの底面積が９．６ｃｍ２の培養容器で、播種される細胞の数はウェル当り２．５〜３×１０６である。
【００１４】
別の、とりわけ直後のステップ（ｄ）において、細胞を基質上に静止させる（静置段階、付着段階）。そのために基質の上に播種された細胞が基質に付着することができるように、細胞で覆われた基質を１０〜１８０分、好ましくは３０〜９０分、特に好ましくは約１時間にわたり静置する。静置は好ましくは培養器（培養器）で特に温度３７℃、５％ＣＯ２、相対大気湿度９５％の標準条件で行う。有効な付着をさらに顕微鏡検査で検証することができる。
【００１５】
ステップ（ｄ）で静置した後、基質に付着していない細胞をステップ（ｅ）で、細胞で覆われた基質からとりわけ入念に洗浄する（洗浄ステップ）。細胞で覆われた基質に培地を積層し、続いて培地の液状上清及び付着していない細胞を吸引して除くことにより洗浄を行うことが好ましい。このステップを少なくとも１回繰り返すことが好ましい。
【００１６】
別のステップ（ｆ）では、洗浄した、細胞で覆われた基質を再び静置する（第２の静置段階）。この静置は最大１８０分、特に３０〜１８０分、特に好ましくは約１時間にわたり行う。培養器で特に温度３７℃、５％ＣＯ２、相対大気湿度９５％の標準条件で静置することが好ましい。
【００１７】
第２の静置段階の後に、細胞で覆われた基質をステップ（ｇ）で凍結培地の中で凍結する（凍結ステップ）。凍結の前かつ第２の静置段階の後に、とりわけ残りの未付着細胞を除去するために、細胞で覆われた基質を再び洗浄することが好ましい（洗浄ステップ）。この操作は好ましくはステップ（ｅ）に相当する。
【００１８】
このように本発明に基づく方法は単離した肝細胞を所定の密度で基質に播種し、所定の順序の静置段階と洗浄の後に未付着の細胞を凍結培地の中で凍結するものである。こうして細胞で覆われた基質、特に細胞が付着して特に単層をなすコラーゲン基質が凍結される。本発明に基づく方法によって、意外なことに無傷の細胞の培養物が得られ、これを特に良好に凍結、即ち凍結保存することができる。その場合、本発明に基づき調製され、凍結保存された培養物は、解凍の後に特に生存能力を有し（生きており）、基質に付着する多数の細胞を有することが明かになる。その場合解凍された細胞はコンフルエントな単層として再培養される利点がある。
【００１９】
本発明に基づく方法は意外なことに特に細胞に対して穏やかで、従ってヒト臓器から単離した肝細胞のように安定性の劣る細胞にも適している。とりわけ本発明に基づき調製され、凍結保存された細胞は、解凍の後に第２の基質を積層すれば数日間、特に３日以上にわたってその全代謝活性及び／又は代謝能力を保持すると考えられる。
【００２０】
本発明の方法の好ましい実施形態では、ステップ（ｇ）で培養容器の基準面積１ｍｍ２につき約０．５ｍｌの量で加えられる凍結培地により凍結が行われる。そのために細胞で覆われた基質に凍結培地を積層することが好ましい。凍結培地は１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むことが好ましい。
【００２１】
特に好ましい実施形態では、ステップ（ｇ）で凍結培地の添加の後に、−８０℃以下の温度に制御して冷却、即ち凍結する。冷却のために毎分−０．５〜−２０℃の冷却速度を使用することが好ましい。その場合好ましい変法では、相転移が補償される。これはとりわけ＋１〜＋３℃／分の加熱速度における短時間の加熱によって行われる。
【００２２】
基質上の単離肝細胞の本発明に基づく調製及び凍結の後に、細胞で覆われた基質を凍結保存の仕組みのもとで凍結状態で貯蔵する。貯蔵時の温度は−８０℃以下、とりわけ−１５０℃以下であることが好ましい。貯蔵は冷凍庫又は液体空気若しくは液体窒素の蒸気相で行うことが好ましい。細胞の低温貯蔵のためのその他のすべての周知の方法も適している。当業者はその応用分野及び目的適合性に応じて貯蔵方法を選択するであろう。
【００２３】
また本発明は上記の特徴を有するステップ（ａ）〜（ｇ）を含み、別のステップ（ｈ）において、凍結された、細胞で覆われた基質を応用分野及び目的に応じて選定される不定の期間にわたり貯蔵する、単離肝細胞の凍結保存方法に関する。
【００２４】
後続の別のステップ（ｉ）においては、応用分野及び目的に応じて、とりわけ使用の直前又はその他の適当な時期に、凍結した、細胞で覆われた基質を再び解凍する。これはとりわけ凍結された、細胞で覆われた基質に温かい培地を積層することによって行われる。凍結された、細胞で覆われた基質は培養容器、例えば６ウェル・プレートの中にあることが好ましい。培養容器を冷凍庫又は窒素タンクから取り出し、特にその後直ちに培養器で標準条件（３７℃、５％ＣＯ２、９５％相対大気湿度）のもとで約５分間インキュベートすることが好ましい。次に解凍培地（培地１）をピペットでとりわけゆっくり滴下して細胞で覆われた基質に加えることが好ましい。基準値として、約９．６ｃｍ２の面積（６ウェル・プレート）におよそ１ｍｌの培地１を加える。培地の温度は約３７℃であることが好ましい。この操作は各培養容器ごとに繰り返される。基準値として、最大３個の６ウェル・プレートが使用され、最大１８個のウェルで細胞で覆われた基質に温かい培地が積層される。続いて各細胞培養容器又はウェルに同量の培地１（９．６ｃｍ２につき１ｍｌ）を同様に、とりわけゆっくり滴下して積層する。好ましい実施形態では、培地１はとりわけ１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む血清含有解凍培地である。
【００２５】
別の処理ステップ（ｊ）では、とりわけ付着していない細胞又は剥離した死細胞を細胞で覆われた基質から洗浄し、付着していない細胞を含まない基質を得る。そのためにまずステップ（ｉ）で培地１の添加によって得た、細胞で覆われた基質の上の上清をできる限り完全に吸引して除く。上清は解凍された、付着していない死細胞を主に含む。特に好ましい実施形態では、吸引した、細胞で覆われた基質の上に次に別の培地、即ち培地２をとりわけ滴下して加える。培地２は約３７℃の温度を有することが好ましい。培地２の添加の際に、ステップ（ｉ）で示した２段階操作を選ぶことが好ましい。即ちまず培地の最初の半量をすべての細胞培養容器にそれぞれ分配し、続いて第２の半量を適当に分配する。培地２の添加量はステップ（ｉ）の培地１の量に相当する。培地２は解凍培地（培地１）と異なる組成を有することが好ましい。培地２は血清を含有し、とりわけ１０％のＦＣＳを含む。
【００２６】
特に好ましい実施形態では、培地２を積層した、細胞で覆われた基質を次に培養器で標準条件下で約３０分間インキュベートする（静置段階、インキュベーション）。
【００２７】
次に付着していない死細胞を除去するために、細胞培養容器から細胞で覆われた基質の上の上清をできる限り完全に吸引して除く。こうして付着していない死細胞がおおむね除かれた、細胞で覆われた基質が得られる。
【００２８】
別のステップ（ｋ）では、解凍され、洗浄された、細胞で覆われた基質に、第２の基質、とりわけコラーゲン基質、特に好ましくはコラーゲンゲルを積層し、又はゲルを注ぎ加える。とりわけ注ぎ加えたゲルは数分〜１時間の間に硬化することが好ましい。好ましい実施形態では、第１の下側基質と解凍の後に導入された第２の上側基質の組成はおおむね等しく、好ましくは同一である。第２の上側基質はゲルとして、下側基質に付着する解凍した肝細胞の単層の上に注ぎ加えることが好ましい。本発明に基づき単離肝細胞が２つの基質、特に２つのコラーゲンゲルの間に埋め込まれたサンドイッチ培養物がこうして得られる。
【００２９】
最後のステップ（ｌ）では、基質の間に埋め込んだ細胞が再培養され、直ちに又は適宜に選定した培養時間の後に、応用分野及び目的に応じて規定どおりに、即ちこ好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で使用される。
【００３０】
本発明に基づき調製され、凍結保存され、解凍され、再培養された単離肝細胞は特に高い生存率を有する。この肝細胞は解凍の後に特に長い時間にわたって代謝能力を示す。本発明に基づく手順によってとりわけヒト臓器から単離した安定性の乏しい肝細胞も凍結保存され、首尾よく解凍されることから、その後長い期間にわたって適当なｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で使用することができる。意外なことに、細胞をおおむねコンフルエントな単層として再培養することができ、死んだ及び／又は付着していない細胞の割合が極めて少ない細胞培養物が得られる。
【００３１】
そこで本発明はまた、凍結保存された単離肝細胞のサンドイッチ培養物の作製方法において、本発明の方法の少なくともステップ（ａ）〜（ｌ）を行い、上側及び下側基質の間に埋め込まれた細胞のサンドイッチ培養物を得る方法に関する。
【００３２】
最後に、本発明は、動物又はヒトの臓器の肝組織をまず用意し、続いて組織から肝細胞を単離し、少なくとも本発明に基づく処理ステップ（ａ）〜（ｌ）を行う単離肝細胞のサンドイッチ培養物の作製方法にも関する。当業者は組織から肝細胞を単離するための周知の方法を応用分野及び目的適合性に応じて選択するであろう。
【００３３】
最後に本発明は、上記の方法で作製することができ、とりわけこの方法で作製されるサンドイッチ培養物に関する。本発明に基づくサンドイッチ培養物は上記のすべての利点を有し、先行技術に比して改善された単離肝細胞の培養物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
下記の実施例と図で本発明を詳しく説明する。実施例は限定的と解すべきでなく、むしろそれによって本発明の根底にある発明思想を詳述し、具体例に基づいて発明の利点を解説するためのものである。
【実施例１】
【００３５】
凍結保存用ヒト肝細胞の調製
１．１  ヒト肝細胞の単離
提供者の了解を得て採取した、いずれにせよ外科的に除去される組織部分から、ヒト提供者の肝細胞を周知のように単離した。そのために組織を灌流し、その際肝細胞が組織塊から解離され、灌流液から得ることができた。回収した肝細胞の生存能をトリパンブルーアッセイにより決定した。その後の実験のために、７０％以上のトリパンブルー排除を示す細胞調製物のみを使用した。
【００３６】
１．２  基質の準備
次の実験でマルチウェル・プレート即ち６ウェル・プレート（６５７  １６０型、Greiner Bio-One社）の形の細胞培養容器を使用した。プレートをとりわけラットの尾から単離した天然コラーゲンゲルで被覆した。代案として１型コラーゲンであらかじめ被覆したマルチウェル・プレート即ち６ウェル・プレート（６５７  ９５０  ＣＥＬＬＣＯＡＴ型、Greiner Bio-One社）を使用した。６ウェル・プレートのウェル当りの底面積は９．６ｃｍ２であった。
【００３７】
１．３  細胞の播種
単離した肝細胞をマルチウェル・プレートに播種した。そのために懸濁液２ｍｌにつき２５０〜３００万個の生肝細胞を含む単離肝細胞の懸濁液を作製した。６ウェル・プレートのウェルごとに２ｍｌのこの細胞懸濁液をピペットで注入した。従って細胞密度は細胞培養容器の面積１ｍｍ２につき生肝細胞２６０〜３２０個であった。
【００３８】
播種の後にプレートを約１時間静置した。そのためにプレートを標準条件（３７℃、５％ＣＯ２、９５％相対大気湿度）が支配する培養器に移した。静置段階は細胞が懸濁液からコラーゲンゲルに付着することを可能にした。有効な付着を顕微鏡検査で判定することができた。
【００３９】
付着／静置段階の後に、主に付着していない細胞を有する細胞懸濁液の上清を吸引して除いた。
【００４０】
１．３  細胞で覆われた基質の凍結
上清の吸引の後、ウェルごとに約１ｍｌの温度３７℃の培地１を加えた。次に細胞を再び培養器で標準条件下でさらに約１時間静置した。次に主に付着していない細胞を含む上清を完全に吸引して除いた。
【００４１】
培地１は肝細胞のための標準細胞培地から誘導されたもので、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む。
【００４２】
凍結のためにウェルごとに０．５ｍｌの凍結培地を加えた。凍結培地の添加はすばやく行った。凍結培地の添加の後に直ちにプレートを０℃に予冷した冷凍機の中に置き、凍結プログラムを設定した。
【００４３】
凍結培地はおおむね培地１をベースとし、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。
【００４４】
凍結プログラムは相転移の補償を見込んでおり、−１００℃の目標温度に到達するものとした。
【００４５】
凍結した細胞培養プレートを続いて冷凍庫又は窒素タンクの気相の中に−１５１℃で貯蔵した。
【実施例２】
【００４６】
凍結保存した肝細胞の解凍
実施例１により凍結し、−１５１℃で貯蔵した肝細胞培養物をｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で引き続き使用するために、４週間以下の貯蔵時間の後に解凍し、再培養した。
【００４７】
凍結保存した肝細胞培養物の解凍のために、６ウェル・プレートをまず冷凍庫又は窒素タンクから取り出した後直ちに、標準条件で操作される培養器（実施例１を参照）に５分間置いた。続いてウェルごとに１ｍｌの３７℃に予熱した培地１（実施例１を参照）をゆっくり滴下して各ウェルに加えた。同時に解凍される最大３個の６ウェル・プレート、即ち最大１８個のウェルでこの操作を繰り返した。
【００４８】
続いて操作を繰り返し、その際再びウェルごとにそれぞれ１ｍｌの培地１をゆっくり加えた。次に上清をパスツール・ピペットで吸引して除いた。上清はおおむね解凍された未付着の死細胞を含んでいた。
【００４９】
続いて洗浄するために、１ｍｌの温度３７℃の培地２を同様にそれぞれ２回加えた。なお培地２は培地１について前述したように各ウェルに１ｍｌずつ２回加えた。次にプレートを培養器で標準条件下で約３０分間インキュベートした。インキュベーションの後にその他の付着していない死細胞を含む全上清をパスツール・ピペットで吸引して除いた。
【００５０】
サンドイッチ構造を得るために、こうして得た付着肝細胞の単層に別のコラーゲンゲル層を積層した。コラーゲンゲルは注ぎ加えた後約３０分で硬化した。この層は培養容器に導入した下側コラーゲンゲルの組成におおむね相当する組成を有した。
【００５１】
培地２は肝細胞の長時間培養のための標準培地であり、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む。
【００５２】
得られたサンドイッチ培養のその後の再培養は培地２で行い、この培地をおよそ２４時間おきに新しい培地と交換した。
【実施例３】
【００５３】
生存細胞数の決定
新たに単離した肝細胞の培養及び本発明に基づき凍結保存した肝細胞の培養で形態的に無傷の細胞を計数することによって、生存（生）細胞の数を決定した。その場合０．２５９ｍｍ２の大きさの基準面の写真を計数した。基準面に見出された無傷細胞の数から全細胞培養容器の無傷細胞の数を推定した（使用したウェル当り９．６ｃｍ２の面積を有する６ウェル・プレートでは補正係数３７００となった）。
【００５４】
凍結の前及び凍結保存後の解凍の後の様々な時点で、再培養した肝細胞の形態を写真で記録し、新たに単離して培養した肝細胞の培養物と比較した。
【００５５】
結果：
図１は、新たに単離し、コラーゲンゲル層の上に播種したヒト肝細胞の形態（図１Ａ）、及び、凍結保存し、解凍し、７日間再培養した単離ヒト肝細胞の形態（図１Ｂ）を示す。再培養した凍結保存細胞は新たに単離した細胞と形態的にほとんど相違がない。
【００５６】
培養物中の生細胞の割合は、新たに単離した肝細胞の培養物中の生細胞の割合に比して僅かに減少したに過ぎない。図２は、生存（生）ヒト肝細胞の数を肝細胞の解凍後の再培養時間の関数として示す。基準曲線は新たに単離した細胞を同じ期間にわたって培養したときの生存ヒト肝細胞の数を示す。初めに凍結保存のために３００万の細胞、新鮮調製物のために１５０万の細胞を播種した。
【００５７】
解凍して再培養したヒト肝細胞はコンフルエントに増殖し、付着する生細胞の数は比較対象の新鮮培養の生細胞の数と有意な差がないことが示される。その場合凍結保存して解凍した調製物の生細胞の数は比較的長い培養期間の後もほぼ一定であることが注目される。
【実施例４】
【００５８】
凍結保存した肝細胞の酵素活性
テストステロンの酵素水酸化の誘導は、肝細胞の代謝及び／又は酵素能力の優れた指標である。無傷の肝細胞ではこの反応の基礎代謝「基礎レベル」が存在し、その際ヒドロキシテストステロン（ＯＨＴ）が生成される。無傷の細胞では酵素誘導によって生成率が増大する。従って培養した肝細胞でのＯＨＴの生成の検出から、培養した肝細胞の酵素能力及び生理的機能が推定される。
【００５９】
部位及び／又は立体選択的テストステロン水酸化の分析及び定量を周知のように（例えばFriedrichら、2003（J. Chromatogr. B, 784:49-61）で発表）行った。
【００６０】
この研究のために、本発明に基づき凍結保存したヒト肝細胞を解凍し、２日間再培養し、続いてさらに２４時間リファンピシン中でインキュベートした。リファンピシンは６β、１６α及び２β位でテストステロンの水酸化を誘導する。６α位のテストステロン水酸化はリファンピシンによって刺激されない。そこで６α水酸化テストステロンの測定をリファンピシンによる酵素誘導との比較測定のために利用した。
【００６１】
対照として、新たに単離した培養物を２日間培養した後に、同じく２４時間リファンピシン中でインキュベートした。培養条件は本発明の方法と同様に選定した。
【００６２】
酵素誘導性のほかに、凍結保存して再培養した細胞及び新たに調製して培養した細胞のテストステロン基礎代謝を決定した。
【００６３】
結果：
本発明に基づき凍結保存して再培養した肝細胞、及び新たに調製して培養した肝細胞は同程度の酵素誘導性を示した。テストステロンの水酸化の誘導の平均値を次表に示す。
【００６４】
【表１】
2009517007.tif 000003
【００６５】
予想通り、リファンピシンは、凍結保存して再培養した肝細胞でも、新たに培養した肝細胞でも、６α−ヒドロキシテストステロン（６α−ＯＨＴ）の生成を誘導することができなかった。
【００６６】
図３はリファンピシンによるテストステロン水酸化の誘導の前後に生成されたヒドロキシテストステロンの絶対濃度を示す（６β−ＯＨＴ及び１６α−ＯＨＴについて例示）。図の左側部分には新たに培養した肝細胞についての結果を示し、図の右側部分には本発明に基づき凍結保存して再培養した肝細胞についての結果を示す。図３Ａは６β−ＯＨＴの生成、図３Ｂは１６α−ＯＨＴの生成を示す。箱ヒゲ図は四分位を表す。有意水準はｐ＜０．０５（ｔ検定）を示す。
【００６７】
懸濁液中で凍結保存した肝細胞による経験から、凍結保存はテストステロン水酸化での基礎代謝を、新たに調製した肝細胞に比して大幅に減少することが知られている。単層で凍結保存した肝細胞でも、再培養した肝細胞の基礎活性は新鮮培養物と比較して、予想通り減少した。しかし解凍の２４時間及び７２時間後に依然として基礎活性を検出することができた。
【００６８】
特に、凍結保存した肝細胞は解凍の７２時間後及びリファンピシンとともに２４時間前インキュベーションの後の時点で、テストステロン水酸化の明瞭な誘導性を有することが示される。
【００６９】
少なくとも３日間にわたって基礎活性が維持されるとともに誘導性が減少しなかったことは、本発明に基づき凍結保存されたヒト肝細胞が多数のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に有効に使用できることの重要な示唆である。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】培養した肝細胞の顕微鏡写真を示す（倍率約１５０倍）。図１Ａ：新たに単離したヒト肝細胞、図１Ｂ：凍結保存したヒト肝細胞。
【図２】生肝細胞の数を培養時間の関数として示す。
【図３】リファンピシンによる酵素誘導の後の６β−ＯＨＴ及び１６α−ＯＨＴの生成を示す。
【図１】
2009517007.tif 000004
【図２】
2009517007.tif 000005
【図３】
2009517007.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月20日(2007.9.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結保存用肝細胞の調製方法において、
（ａ）基質を準備するステップ、
（ｂ）単離した肝細胞を準備するステップ、
（ｃ）基質の上に肝細胞を２〜４×１０３／ｍｍ２の密度で播種するステップ、
（ｄ）細胞が基質に付着しうるように、細胞で覆われた基質を１０〜１８０分静置するステップ、
（ｅ）細胞で覆われた基質から付着していない細胞を洗浄するステップ、
（ｆ）細胞で覆われた基質を最大１８０分まで静置するステップ、
（ｇ）細胞で覆われた基質を凍結培地中で凍結するステップ
を含む方法。
【請求項２】
基質がコラーゲン基質である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｄ）において３０〜９０分静置する請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｅ）において培地を積層し、続いて細胞で覆われた基質の上の液状上清を吸引して除く請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｆ）において３０〜１８０分静置する請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｇ）において０．５μｌ／ｍｍ２の量の凍結培地を加える請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
凍結培地がウシ胎児血清（ＦＣＳ）及びＤＭＳＯを含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｇ）において細胞で覆われた基質に凍結培地を積層することによって凍結を行い、０．５〜２０℃／分の冷却速度で−８０℃以下に制御された冷却を行い、場合によっては相転移を補償する請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
単離した肝細胞の貯蔵及び再培養方法において、
請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法のステップ（ａ）〜（ｇ）、
（ｈ）凍結した、細胞で覆われた基質を貯蔵するステップ、
（ｉ）凍結した、細胞で覆われた基質を解凍するステップ、
（ｊ）細胞で覆われた基質から付着していない細胞を洗浄するステップ、
（ｋ）解凍した、細胞で覆われた基質に第２の基質を積層するステップ、
（ｌ）基質の間に埋め込まれた細胞を再培養するステップ
を含む方法。
【請求項１０】
ステップ（ｈ）において貯蔵を−１５０℃で行う請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｉ）において、細胞で覆われた基質に温かい培地を積層する請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｊ）において、細胞で覆われた基質に培地を積層し、続いて細胞で覆われた基質の上の液状上清を吸引して除く請求項９〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか１つに記載の方法のステップ（ａ）〜（ｌ）を含む、単離肝細胞のサンドイッチ培養物の作製方法。
【請求項１４】
ステップ（ａ）が、
（ａ１）動物又はヒトの生体から肝組織を準備するステップ、
（ａ２）上記組織から肝細胞を単離するステップ
を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１３又は１４のいずれか１つに記載の方法により作製される肝細胞のサンドイッチ培養物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
１．３  細胞の播種
単離した肝細胞をマルチウェル・プレートに播種した。そのために懸濁液２ｍｌにつき２５０〜３００万個の生肝細胞を含む単離肝細胞の懸濁液を作製した。６ウェル・プレートのウェルごとに２ｍｌのこの細胞懸濁液をピペットで注入した。従って細胞密度は細胞培養容器の面積１ｍｍ２につき生肝細胞２６００〜３２００個であった。
【国際調査報告】
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