(57)【要約】関節炎を診断する方法およびキットが提供される。前記方法には、血清または滑液のサンプルにおける14-3-3エータまたはガンマタンパク質の検出が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで試験する方法であって：
関節炎を有している又は関節炎を有している危険性があると同定された哺乳類の被験者から血清または滑液のサンプルを得ることと；および
前記サンプル中のタンパク質14-3-3エータまたは14-3-3ガンマの存在, 非存在, または量を試験することと；
を備える方法。
【請求項２】
インビトロで診断する方法であって、哺乳類の被験者の滑液または血清におけるタンパク質14-3-3エータまたは14-3-3ガンマの存在, 非存在または量を試験することと及び前記タンパク質の存在, 非存在または量の少なくとも一部に基づいて関節炎の病状の状態を評価することとを備える方法。
【請求項３】
関節炎の投薬の有効性を見積もるインビトロでの方法であって：
投薬での治療の経過を経験している哺乳類の被験者の滑液または血清におけるタンパク質14-3-3エータまたは14-3-3ガンマの存在, 非存在または量を試験することと；
前記タンパク質の存在, 非存在または量の少なくとも一部に基づいて投薬（medication）の有効性を評価することと；
を備える方法。
【請求項４】
請求項1〜3の何れか一項に記載の方法であって、前記タンパク質は14-3-3エータである方法。
【請求項５】
請求項1〜4の何れか一項に記載の方法であって、前記被験者はヒトである方法。
【請求項６】
請求項1〜5の何れか一項に記載の方法であって、前記関節炎は関節リウマチである方法。
【請求項７】
請求項1〜6の何れか一項に記載の方法であって、前記被験者は関節炎の治療を経験している方法。 
【請求項８】
請求項7に記載の方法であって、前記治療が抗TNF治療である方法。
【請求項９】
請求項7に記載の方法であって、前記治療が、関節炎に対する疾患修飾性治療（a disease modifying therapy for arthritis）である方法。 
【請求項１０】
哺乳類の被験者における関節炎の病状を診断するためのタンパク質14-3-3エータまたは14-3-3ガンマに結合する化合物の使用。 
【請求項１１】
哺乳類の被験者における関節炎の病状の進行をモニター（monitoring）するためのタンパク質14-3-3エータまたはガンマに結合する化合物の使用。
【請求項１２】
請求項10または11に記載の使用であって、前記化合物が抗体である使用。
【請求項１３】
請求項10〜12の何れか一項に記載の使用であって、前記使用がインビトロである使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、細胞外の液体に見出される場合に関節炎の診断上のバイオマーカーである選択されたタンパク質アイソフォームのアッセイに関する。
【０００２】
［発明の背景］
一般に、関節炎または関節痛（arthralgia）は、身体の関節の炎症性の障害に関し、通常では疼痛（pain）, 腫脹および硬直（stiffness）が伴う。関節炎は、感染, 外傷（trauma）, 変性疾患（degenerative disorders）, 代謝性の障害または妨害（disturbances）または他の未知の病因を含む幾つかの原因から生じえる。関節炎は、より具体的には、例えば、関節リウマチ（rheumatoid arthritis）、骨関節炎（osteoarthritis）、細菌性の又は感染性の関節炎として記載してもよい。関節炎は、さらに痛風, 強直性脊椎炎, 炎症性の腸疾患または乾癬を含む他の 同定された障害を伴ってもよい。
【０００３】
正常な関節において、少量の滑液(SF)は軟骨および滑膜（synovium）をなめらかにし、溶質および少数の静止期（resting）の単核球および滑膜細胞（synovial cells）の貯蔵所として機能する(3)。慢性炎症の間、SF容量（SF volume）および免疫細胞の濃度および可溶性タンパク質が増加する(4)。  
幾つかの形態の関節炎〔例えば、関節リウマチ(RA)〕に関して、特定の原因は明らかではないだろう。RAは、疾患が明らかとなるために多くの遺伝的および環境的な影響が同じ人物に作用しなければならない「多因子性の閾値モデル（multifactorial threshold model）」として認識されるものである(1)。特定の標的を欠いているので、現行の治療は主に炎症反応の抑制を目的としている(2)。 RAの特徴は、線維芽細胞様の滑膜細胞(FLS)増殖および内膜下または滑膜の外層への炎症細胞浸潤を特徴とする滑膜の過形成である(5)。FLS（約三分の二の滑膜集団を含む）は、周知の分泌系(5)であり、RAにおいて大量 の破壊的マトリックスメタロプロテアーゼ(MMPs)を分泌し(6)、具体的にはMMP-1, 3, 8, 9, 10, 11 および 13である(7-11)。多数の研究者は、MMP-1 および MMP-3がRAにおいて重要な役割を演ずること(12)およびコラゲナーゼ (MMP-1)が最も豊富であること(6)を示した。MMP-1 および MMP-3の双方は、RAにおいて構造上のダメージに予測的妥当性（predictive validity）を有することが示されたバイオマーカーである。関節炎におけるMMPs（特に、MMP-1）の局所的な発現は、軟骨および骨の破壊の部位に隣接する関節パンヌス（joint pannus）で特に顕著である(13)。コラゲナーゼ（特に、MMP-1）は、中性のpHで本来（native）のコラーゲン分子を切断し、さらにコラーゲンを酵素の分解に感受性にする(14)。
【０００４】
FLSを活性化してMMP-1を産生する既知の因子にはインターロイキン-1 (IL-1)および腫瘍壊死因子アルファー(TNF-alpha)などの炎症促進性サイトカイン（pro-inflammatory cytokines）が含まれ、双方はRAに含まれる(15)。IL-1アルファーおよびTNF-アルファーは、インビトロで滑膜の線維芽細胞および軟骨細胞における他のMMPsおよびストロメライシンの産生を刺激する能力がある(16)。FLSと活性化のＴ細胞からのTNF-アルファーまたはIL-1アルファーとの相互作用によって、MMP-1の発現が誘導される(17)。また、Ｔ細胞は、FLSを活性化して炎症性メディエータのアレイ（array）を産生することができる(18)。 このFLSおよびＴ細胞および彼等のそれぞれのサイトカインの間の周期的なフィードバックループによって、Ｔ細胞の活性化および増殖が誘導され、RAで観察される持続性の炎症が支持される(19-21)。治療上の抗-TNFアルファー抗体が、TNFアルファーを中和し、この持続性の状態を導くＴ細胞活性化をブロックすることが示唆された(22)。
【０００５】
14-3-3 タンパク質は、ある範囲の機能に関与している二量体タンパク質のファミリーである(23-24)。七つの哺乳類の14-3-3 アイソフォーム、即ちベータ（β）, ガンマ（γ）, イプシロン（ε）, エータ(η), シグマ(σ), タウ（τ）およびゼータ（ζ）が存在している。1967年に最初に14-3-3 タンパク質が発見されていらい(26)、14-3-3 タンパク質ファミリーのメンバーは、主にシグナル伝達経路における彼等の新しい生物学的活性に基づいて繰り返しさらに発見されている。彼等は、トリプトファンおよびチロシン水酸化酵素(27-28)およびPKCインヒビター(29)の活性化因子として同定されている。引き続く研究によって、PKCs, Rafファミリーと相互作用する分子として14-3-3 タンパク質が同定され、現在DNAダメージおよび細胞周期制御(32-34)への細胞応答を含む重大な意味を持つ生物学的機能(30-31)を有する200以上の他の細胞内タンパク質が同定されている。 
［発明の概要］
本発明は、部分的に14-3-3 タンパク質の特定のアイソフォーム（14-3-3エータおよびガンマ）が、正常な患者と比較して、関節炎患者の血清および滑液におけるレベルが増加して存在しているとの驚くべき発見に基づいている。
【０００６】
本発明の一側面に従って、被験者の治療的な療法（therapeutic regimen）への反応性を予測するための方法が提供され、前記被験者は関節炎を有しているか又は疑われ、該方法はサンプル中のタンパク質14-3-3エータまたはガンマの存在, 非存在, 量または相対的なレベルを決定することを備え、前記アイソフォームの存在, 非存在, 量または相対的な レベルは被験者の関節炎への治療的な療法への感受性（sensitivity）の指標（indicative）である。
【０００７】
本発明の一側面にしたがって、患者サンプル（例えば、関節炎を有している又はその危険性がある患者からの血清または滑液のサンプル）における14-3-3エータまたはガンマタンパク質を検出するキットが提供される。前記キットは、少なくとも一つのこれらの14-3-3 タンパク質のアイソフォームを検出する特異的な少なくとも一つの抗体を含んでもよい。前記キットは、さらに少なくとも一つのマトリックスメタロプロテイナーゼを検出するための特異的な少なくとも一つの抗体を含んでもよい。 
本発明の一側面に従って、関節炎の治療に有用であることが既知の又は期待される治療的な療法の有効性を決定する対象の群から選択する方法が提供され、該方法は患者の血清または滑液サンプル中の14-3-3エータまたはガンマタンパク質の存在, 非存在, 量または相対的なレベルを決定することを備え、その液体中の一以上のこれらの14-3-3タンパク質のアイソフォームの存在, 非存在, 量または相対的なレベルは被験者の関節炎への治療的な療法への感受性の指標である。
【０００８】
本発明の別の側面に従って、関節炎の治療を必要とする哺乳類の被験者の関節炎を治療する方法が提供され、該方法はその被験者に治療的な療法を投与することを備え、その被験者からの血清または滑液中の14-3-3エータまたはガンマタンパク質アイソフォームの存在, 非存在, 量または相対的なレベルは治療的な療法への感受性の指標である。
【０００９】
本発明の別の側面に従って、関節炎の治療を必要とする哺乳類の被験者の関節炎を治療する方法が提供され：該方法は、治療的な療法への感受性の指標である血清または滑液における14-3-3エータまたはガンマタンパク質の存在, 非存在, 量または相対的なレベルを有している被験者を選択することと；および該被験者に該治療的な療法を投与することとを備える。
【００１０】
本発明の別の側面にしたがって、関節炎を治療するための治療的な療法への感受性が増加した哺乳類の被験者を同定する方法が提供され、該方法は血清または滑液における14-3-3エータまたはガンマタンパク質の存在, 非存在, 量または相対的なレベルに関して被験者の集団をスクリーニングすることと、および液体における前記タンパク質の存在, 非存在, 量または相対的なレベルの少なくとも一部に基づいて前記治療的な療法への被験者の感受性を同定することとを備える。
【００１１】
選択された態様において、本発明は、被験者の血清または滑膜の液体における他の関節炎マーカーに関するアッセイを、14-3-3エータまたはガンマタンパク質の存在, 非存在, 量または相対的なレベルに関するアッセイと関連させて（in conjunction with）含んでもよい。例えば、本発明のアッセイは、付加的に血清または滑液サンプルにおける一以上のマトリックスメタロプロテイナーゼ（例えば、MMP-1またはMMP-3）の存在, 非存在, 量または相対的なレベルを決定することを含んでもよい。
【００１２】
［詳細な記載］
「疾患活動性スコア（DAS；  Disease Activity Score）」は、患者の関節リウマチの活動性（activity）または状態（state）の測定を意味する。DASは、臨床で使用される幾つかの標準またはスコア（scores）の一つである。DASの計算には、次のパラメータを含んでもよい：つまり、触診に敏感な関節の数(TEN), 腫大した関節の数(SW), 赤血球沈降速度(ESR)および疾患の活動性の患者評価(VAS)である。代わりに、DASは、Ｃ反応性タンパク質マーカーの評価(CRP)を含んでもよい(Skogh T et al 2003.  Ann Rheum Dis 62:681-682)。
【００１３】
本明細書中に使用される患者または試験被験者（test subject）には、関節炎の治療を経験しているか、又は経験するところ（about to undergo）であるヒト患者が含まれる。試験被験者には、関節炎の治療を経験しているか、又は経験するところである非ヒト哺乳類が含まれる。試験被験者のケースにおいて、関節炎は、意識的（deliberately）に導入または移植されてもよい、又は自然発症的（spontaneously）に発生してもよい。患者または試験被験者は、本明細書中に記載される方法（又は、例えば、当該技術分野において既知の他の診断上の方法）を用いて前もって（previously）診断されていてもよい、又は一般的な集団（「対照」患者または「対照」試験被験者）の一部として選択されてもよい。患者および試験被験者（対照であろうとなかろうと）は、一般に被験者と称されえる。患者は、疾患の重症度, 性別, 年齢, または特定の治療又はアッセイの方法に対する適合性の基礎に基づき選択されてもよい又は鑑別（differentiated）されてもよい。
【００１４】
本明細書中に使用される、「アイソフォーム」は、類似するが同一ではないアミノ酸配列を有している任意の２以上の機能上類似するタンパク質を意味し、異なる遺伝子によって又は除去された異なるエキソンを有していた同じ遺伝子からのRNA転写物によってコード化される。
【００１５】
配列内のヌクレオチドまたはアミノ酸のポジションの数的な呼称（numerical designations）が特定の配列に対して相対的であることは当業者によって理解される。また、同じポジションが、配列が番号付けされる様式および選択される配列に応じて異なる数的な呼称が割当てられてもよい。さらにまた、挿入または欠失などの配列バリエーション（sequence variations）は、相対的なポジションで及び特定の部位の又はその周囲の特定のヌクレオチドまたはアミノ酸の数的な呼称で変化してもよい。
【００１６】
「ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質」の用語は、互換的に（interchangeably）使用されてもよく、ペプチドに付加的な所望の特性（例えば、半減期の増加）を提供しえるペプチドアイソスター（修飾されたペプチド結合）などのペプチド結合または修飾されたペプチド結合によって共有結合性に連結された少なくとも二つのアミノ酸残基から構成される化合物を意味する。ペプチドは、少なくとも二つのアミノ酸を具備しえる。また、本明細書中に記載されるペプチドまたはタンパク質を含むアミノ酸は、天然のプロセス（例えば、翻訳後プロセシング）によって又は当該技術分野において周知の化学修飾技術によって修飾されてもよい。修飾は、ペプチドバックボーン, アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ末端を含むペプチドの任意の場所で生じえる。同じ型の修飾が所与のペプチドの幾つかの部位で同じ又は変化した程度で存在しえることが理解される。
【００１７】
本発明のペプチド化合物を記載するために使用される命名法は、各アミノ酸残基の左にアミノ基が及び右にカルボキシル基が提示される従来のプラックティスにしたがう。選択された本発明の特定の態様において、アミノ-およびカルボキシル-末端基は、特に示さないが、別途特定されないかぎり、生理的なpH値で想定されるだろう形態で存在することが理解される。アミノ酸の構造式において、各残基は、一般にアミノ酸の慣用名に対応する一文字または三文字の表記法によって表されてもよい。
【００１８】
本明細書中に使用される「抗体」の用語には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体, キメラ, 単鎖, またはヒト化抗体, 同様に, FabまたはF(ab)2 断片が含まれ、Fabまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリの産物が含まれる。係る抗体または断片を作出する方法は、当該技術分野において既知であり、文献（例えば、 HARLOW, E and LANE D. Antibodies: A Laboratory Manual. 1988. Cold Spring Harbor Laboratory Press）に見つけられる。タンパク質またはタンパク質のアイソフォームの間で分化する抗体を産生するためのエピトープとして使用する特定のペプチド類の選択または同定は、配列比較を用いてなしえる（当業者は、所望の選択性を有する抗体を産生するために有用であろう適切なペプチドまたはタンパク質の配列を同定することができる）。当業者に有用であろう配列の例には、配列番号1-7が含まれる。
【００１９】
本明細書中に使用される「関節炎（arthritis）」「関節痛（arthralgia）」は、身体の関節の炎症性の障害を意味する。疼痛（Pain）, 腫脹（swelling）, 硬直（stiffness）及び移動の困難性（difficulty of movement）は、頻繁に関節炎の疾患に関連している。関節炎は、感染, 外傷（trauma）, 変性疾患（degenerative disorders）, 代謝性の障害（disorders）または妨害（disturbances）または他の未知の病因を含む幾つかの原因から生じえる。関節炎は、より具体的には、例えば、関節リウマチ、骨関節炎（osteoarthritis）、細菌性の又は感染性の関節炎として記載してもよい。関節炎は、さらに痛風, 強直性脊椎炎, 炎症性の腸疾患または乾癬を含む他の 同定された障害を伴ってもよい。
【００２０】
14-3-3タンパク質（特に、エータおよびガンマアイソフォーム）は、関節リウマチなどの関節炎に冒された患者の滑液または血清中で容易に検出されえる。本発明の一態様において、炎症の部位のこれらのシグナル伝達タンパク質の検出は、関節炎の早期の又は単純化された診断に又は患者の多様なタイプの関節炎の間の鑑別に適用を有しえる。代わりに、14-3-3タンパク質のアイソフォームの存在または相対的なレベルは、衰弱の病態にまで進行する前の早期段階の関節炎の予後の指標でありえる。早期の予後または診断の利点は、早期に治療措置の手段をとれることである。或いは、患者サンプル中の14-3-3のアイソフォームの存在または相対的なレベルは、特定の治療措置に適合する患者の決定に有用である。 
多様なタイプの関節炎の治療措置は、当該技術分野において既知である。例えば、関節リウマチと診断される患者は、初期に非ステロイド性抗炎症医薬(NSAIDs)を処方されて、不快感を軽くし、炎症を減少させられる。他の治療措置には、例えば、シクロオキシゲナーゼ 2 特異的インヒビター(CSIs), 糖質コルチコイド, 疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARDs), 抗TNFアルファー中和因子または免疫抑制薬また細胞毒性薬（cytotoxic drugs）が含まれてもよい。特定の薬物の用量または例の詳細は、当業者に既知であり、文献（例えば、 Harrison’s Principles of Internal Medicine 15th ed. BRAUNWALD et al eds. McGraw-Hill または "The Pharmacological basis of therapeutics", 10th edition. HARDMAN HG., LIMBIRD LE. editors. McGraw-Hill, New York, and in "Clinical Oncology", 3rd edition.  Churchill Livingstone/ Elsevier Press, 2004.  ABELOFF, MD. editor）において見つけられる。
【００２１】
本発明の別の態様において、14-3-3エータまたはガンマタンパク質の存在または相対的なレベルは、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMPs), 例えば、MMP-1またはMMP-3などの患者サンプル中の他のタンパク質の存在または相対的なレベルと相関するだろう。MMPsは、細胞外基質の成分を分解する亜鉛結合性エンドプロテアーゼである。MMPsは、異なる基質特異性を有し、異なる遺伝子によってコード化される。少なくとも25の異なるMMPsが同定されている。患者サンプル中の14-3-3エータまたはガンマタンパク質と組み合わせた少なくとも一つのMMPの検出は、患者における関節炎の早期の又は単純化された診断に又は多様なタイプの関節炎の間の鑑別に適用しえる。或いは、患者サンプル中の14-3-3タンパク質のエータまたはガンマのアイソフォームと組み合わせた少なくとも一つのMMPの存在または相対的なレベルは、関節炎が衰弱の病態（debilitating form）にまで進行する前の早期段階の関節炎の予後の指標でありえる。早期の予後または診断の利点には、早期の治療措置の手段が含まれる。或いは、患者サンプル中の14-3-3タンパク質のエータまたはガンマのアイソフォームと組み合わせた少なくとも一つのMMPの存在または相対的なレベルは、特定の治療措置に適合する患者の決定に有用である。 
本発明の別の態様において、患者サンプル中の14-3-3エータまたはガンマタンパク質または特定のMMPsの存在を検出するためのキットが提供され、そのキットは多様なタイプの関節炎の診断または鑑別に適切な診断上または予後の結果の提供に使用するために適切である。キットには、例えば、14-3-3 タンパク質のエータまたはガンマアイソフォームに特異的な抗体が含まれてもよい。かかるキットは、更に特定のMMPsに特異的な抗体を含んでもよい。キットは、更に標識二次抗体, 色素生産性または蛍光発生性の試薬, 重合剤などの14-3-3エータまたはガンマまたはMMPsの免疫学的な検出に必要な他の試薬および／または診断上または予後の目的としたキットを用いるための説明書を含んでもよい。 
一般的な方法
一旦、被験者が関節炎を発病または有している危険性があるとされたら、診断された関節炎の病状（disease state）, 関節炎に対する治療上の治療措置への反応性, または関節炎の予後, または関節炎の型を評価するための有用な情報は、患者または検査する被験者から取得しえる。バイオマーカーとして有用であろうタンパク質またはペプチド類を含む被験者からの生物学的サンプルを得るための様々な方法は、当該技術分野において既知である。例えば、組織サンプルを、腫瘍を標本抽出するための掻爬（curettage）, 針吸引バイオプシーまたは針(コア)バイオプシー, 切開性バイオプシー（incisional biopsybiopsy）、または所望の組織の全除去をふくみえる切除バイオプシー（excisional biopsy）によって得てもよい。代わりに、遺伝物質を含む他の身体サンプル（例えば、滑液, 毛髪, 痰, 尿, 便, 精液, 血漿, 血清または血液）を、当該技術分野において既知の方法を用いて採取してもよい。
【００２２】
生物学的サンプルにおける特異的なタンパク質もしくはペプチド類の存在または生物学的サンプルにおける特異的なタンパク質もしくはペプチド類の相対的なレベルは、当該技術分野において既知の任意の幾つかの方法によって検出しえる。かかる方法の例には、ウエスタンブロッティング, ELISA, 免疫組織化学, FACS, 表面プラズモン共鳴またはクロマトグラフィーなどの質量分光法, 免疫学に基づく技術が含まれる。これらの及び他の技術に関する方法は、文献（例えば、AUSUBEL et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1998:  ABELOFF, Clinical Oncology, 3rd edition.  Churchill Livingstone/ Elsevier Press, 2004; HARLOW, E and LANE D. Antibodies: A Laboratory Manual. 1988. Cold Spring Harbor Laboratory Press; SAMBROOK J and RUSSELL DW. Molecular cloning: A Laboratory Manual 2001 Cold Spring Harbor Laboratory Press; Harrison’s Principles of Internal Medicine 15th ed. BRAUNWALD et al eds. McGraw-Hill）に認められる。14-3-3の検出法は、例えば、WO 99/46401, US 2005/9094, WO 97/38315 および WO 97/33601に記載され、これらの文献の全ては本明細書中に参照によって援用される。
【００２３】
ウエスタンブロッティング
滑液または血清(各2 μl)を、12%(wt/vol)アクリルアミドゲルでSDS-PAGE分析し、PVDF膜（Millipore Corporation）に電気転写した。膜上の非特異的なタンパク質を、5%脱脂乳粉末をPBS-0.1% Tween-20中に含有するもので一晩ブロッキングした。免疫ブロットを、2 μg/mlの7アイソフォーム特異的なウサギ抗-ヒト14-3-3ポリクローナル抗体を用いて行った（Martin H, Patel Y, Jones D, Howell S, Robinson K and Aitken A 1993. Antibodies against the major brain isoforms of 14-3-3 protein. An antibody specific for the N-acetylated amino-terminus of a protein. FEBS Letters. 331:296-303）。その膜を、次に適切な二次の西洋わさびペルオキシダーゼ結合型抗-ウサギIgG (Sigma, St Louis, USA)または抗-マウスIgG(Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA)抗体(1:2500希釈)でインキュベーションした。免疫反応性のタンパク質を、次にECL + プラス  ウエスタンブロッティング検出システム（Amersham Biosciences, Buckinghamshire, England）を用いて視覚化した。ケラチノサイト細胞溶解産物(K)を、正の対照として使用した。SF: 滑液;  PS: 患者の血清。
【００２４】
患者サンプル
滑液を、抗-TNF療法の施設の前に活動的な滑膜炎を有する患者の膝関節から得た。全患者は、>6.0のDASスコアを有していた。適合した血液サンプルを、標準の静脈穿刺処置で得た。血餅を、遠心分離で除去した。
【００２５】
組換え型14-3-3エータ
ケラチノサイト由来の14-3-3エータに関するcDNAを、Ghahary等（Ghahary et al 2004 J Invest Dermatol 122:1188-1197）に記載された方法にしたがって、ヒトのケラチノサイトから抽出されたトータルRNAから調製し、クローン化し、大腸菌（E. coli）で発現し、アフィニティー精製した。14-3-3エータ  cDNAのPCR増幅に使用されたプライマーは、配列番号15 (GCGAATTCCTGCAGCGGGCGCGGCTGGCCGA)および配列番号16 (GCTCGAGCCTGAAGGATCTTCAGTTGCCTTC)であった。
【００２６】
例1
RAに冒された患者の滑液および血清の14-3-3発現
プールされた患者の滑液 (SF) および 血清 (PS)のサンプルにおける14-3-3 タンパク質 - β, γ, ε, η, τ σ および ζの異なるアイソフォームのレベルを、正の対照としてケラチノサイト細胞溶解産物(K)を用いてウエスタン分析で分析した。η および γ アイソフォームのみが、SFサンプルで検出され、PSと比較して強い強度で染色された。活動的な滑膜炎を呈するが抗-TNF療法をまだ受けていない17のRA患者からの関節の滑液サンプルも、14-3-3のηアイソフォームの一貫した発現を呈した（図 2）。全患者は、6.0より大きい疾患活動性スコア(DAS)を有していた。
【００２７】
例2
患者の滑液血清におけるMMP発現
これらのバリエーションが同じ滑膜サンプルにおけるMMP-1およびMMP-3のものと相関するかを決定するために、全体の12のRA滑液サンプル及びそれらの適合した血清サンプルを14-3-3 η およびγに関して同様にMMP-1およびMMP-3タンパク質に関して同時に評価した(図 3)。14-3-3 ηは、全サンプル中で検出された。MMP-1は全サンプル中（SFおよびPSの両方）で検出されたが、MMP-3は検出のレベルにおいてより可変的（variable）であった。14-3-3 γ アイソフォームも、患者の滑液および血清のサンプル中で検出された(図 4, 5)。 
MMP-1 および MMP-3の発現は、滑液および血清の両方において14-3-3 η および γ アイソフォームの発現との有意な相関性が実証された(表 1)。
【表１】
2009536318.tif 000002
例3
患者の血清および滑液のサンプル中の14-3-3 タンパク質のウエスタンブロット検出の感受性
滑液 および 血清 サンプルにおける14-3-3 η の検出レベルを決定するために、12のRAに冒された又は正常な患者（RA-affected or normal patients）からのサンプルをプールし、プールしたサンプルの限界希釈をウエスタンブロットで分析した。14-3-3 ηを、滑液の0.1 μlの有効容積（effective volume）および血清の1.0 μlの有効容積の程度に低い希釈の範囲で検出可能であった(図 6A)。 
2 μlのプールした正常な血清(NS)または患者の血清(PS)を、0.05 -2.0 μgの範囲の組換え型の 14-3-3 ηの既知の濃度と共に分析した。2 μlの容量のNS および PS サンプルは、それぞれ約 1-1.5 および 15-20 μgの14-3-3 ηを有すると見積もられた(図 6B)。これによって、14-3-3 η のレベルが通常の患者と比較してRAに冒された患者の血清に約10倍過剰に生じることが示唆される。
【００２８】
例4
抗-TNF療法の前後での14-3-3 ηの検出
図 7は、抗-TNF-a治療の前(U)および後(T)のRA患者からの4 mlの血清サンプル中の14-3-3 エータタンパク質のレベルの経時的な検出を説明している。N= 負の対照であり、これは12の健常個体から得られた12の血清サンプルから調製された4 mlのプールされた血清サンプルである。P= 正の対照であり、これは4 mgのケラチノサイトの細胞溶解産物のトータルタンパク質（total protein）である。
【００２９】
[参考文献]
以下の文献は、本明細書中に参照によって援用される：
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本発明の特定の態様が記載および説明されたが、かかる態様は本発明を説明するだけであると考えるべきであり、付随する特許請求の範囲に基づいて解釈される本発明を限定しない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
本発明の態様を図解する図面
【図１】関節炎患者の滑液 (SF) および 血清 (PS)における14-3-3の様々なアイソフォームのウエスタンブロットによる検出。ケラチノサイト溶解産物(K)を、正の対照として使用した。
【図２】17の関節炎患者の滑液における14-3-3 ηの検出。滑液のサンプル(2 μl/レーン)を、活動的な滑膜炎を有する17のRA患者から得て、14-3-3 ηアイソフォームに対するアイソフォーム特異的抗体を用いるウエスタンブロットで分析した。ケラチノサイト溶解産物(K)を、正の対照として使用した。14-3-3 η のレベルは調査された患者集団において変動するが、全滑液サンプルにおいて確実（reliably）に検出された。
【図３】患者の血清および滑液における14-3-3 η, MMP-1 および MMP-3 発現。12の患者の適合した滑液 および 血清 サンプルをウエスタンブロットで検査した。ケラチノサイト細胞溶解産物(K)を、正の対照として使用した。SF: 滑液; PS: 患者 血清; MMP-1: マトリックスメタロプロテイナーゼ1; MMP-3: マトリックスメタロプロテイナーゼ3。
【図４】9の適合した患者の血清および滑液のサンプルにおける14-3-3 η および γ のレベルの検出および比較。患者の滑液または血清(2 μl/レーン)を、ウエスタンブロットで抗 14-3-3 ηまたはγ抗体を用いて分析した。ケラチノサイト細胞溶解産物(K)を、正の対照として使用した。SF, 滑液;  PS, 患者の血清。
【図５】適合した患者の血清および滑液のサンプルにおける14-3-3 η のレベルを、濃度測定で定量し、下部のパネルに表した。ソリッドバー（Solid bars）は、同じ患者からの滑液サンプル（オープンバー）に対して標準化された血清における14-3-3 η のレベルを示す。
【図６Ａ】正常および患者の血清の異なる容量における14-3-3 η, γ, MMP-1およびMMP-3の検出。
【００３１】
A)  プールされた12の正常または患者の血清を調製し、ある範囲の容量（0.1-2.0 μl/レーン）をウエスタンブロットで14-3-3 η, γ, MMP-1またはMMP-3を用いて分析した。罹患した患者からの2 μlのプールした滑液(SF)を、正の対照として含ませた。
【図６Ｂ】正常および患者の血清の異なる容量における14-3-3 η, γ, MMP-1およびMMP-3の検出。
【００３２】
B)  組換え型（recombinant）の14-3-3 η アイソフォーム(0.01- 2.0 μg/レーン)を、2μlの正常な(NS)または患者の血清(PS)と並行してウエスタンブロットで分析した。
【図７】図7は、抗-TNF療法の前後での14-3-3 ηの検出を説明する。
【００３３】
抗-TNF-a治療の前(U)および後(T)のRA患者からの4 mlの血清サンプル中の14-3-3 エータタンパク質のレベル。N= 負の対照であり、これは12の健常個体から得られた12の血清サンプルから調製された4 mlのプールされた血清サンプルである。P= 正の対照であり、これは4 mgのケラチノサイトの細胞溶解産物のトータルタンパク質（total protein）である。
【図１】
2009536318.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【配列表】
2009536318000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年3月10日(2009.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで試験する方法であって：
関節炎を有している又は関節炎を有している危険性があると同定された哺乳類の被験者から血清または滑液のサンプルを得ることと；および
前記サンプル中のタンパク質14-3-3エータまたは14-3-3ガンマの存在, 非存在, または量を試験することと；
を備える方法。
【請求項２】
インビトロで診断する方法であって、哺乳類の被験者の滑液または血清におけるタンパク質14-3-3エータまたは14-3-3ガンマの存在, 非存在または量を試験することと及び前記タンパク質の存在, 非存在または量の少なくとも一部に基づいて関節炎の病状の状態を評価することとを備える方法。
【請求項３】
関節炎の投薬の有効性を見積もるインビトロでの方法であって：
投薬での治療の経過を経験している哺乳類の被験者の滑液または血清におけるタンパク質14-3-3エータまたは14-3-3ガンマの存在, 非存在または量を試験することと；
前記タンパク質の存在, 非存在または量の少なくとも一部に基づいて投薬（medication）の有効性を評価することと；
を備える方法。
【請求項４】
請求項1〜3の何れか一項に記載の方法であって、前記タンパク質は14-3-3エータである方法。
【請求項５】
請求項1〜4の何れか一項に記載の方法であって、前記被験者はヒトである方法。
【請求項６】
請求項1〜5の何れか一項に記載の方法であって、前記関節炎は関節リウマチである方法。
【請求項７】
請求項1〜6の何れか一項に記載の方法であって、前記被験者は関節炎の治療を経験している方法。 
【請求項８】
請求項7に記載の方法であって、前記治療が抗TNF治療である方法。
【請求項９】
請求項7に記載の方法であって、前記治療が、関節炎に対する疾患修飾性治療（a disease modifying therapy for arthritis）である方法。 
【請求項１０】
哺乳類の被験者における関節炎の病状を診断するためのタンパク質14-3-3エータまたは14-3-3ガンマに結合する化合物の使用。 
【請求項１１】
哺乳類の被験者における関節炎の病状の進行をモニター（monitoring）するためのタンパク質14-3-3エータまたはガンマに結合する化合物の使用。
【請求項１２】
請求項10または11に記載の使用であって、前記化合物が抗体である使用。
【請求項１３】
請求項10〜12の何れか一項に記載の使用であって、前記使用がインビトロである使用。
【請求項１４】
哺乳類の被験者のための関節炎の管理療法（arthritis management regimen）を提供するための方法であって：
哺乳類の被験者から生物学的サンプルを得ることと；
前記生物学的サンプルを、14-3-3ガンマアイソフォームおよび14-3-3エータアイソフォームからなる群から選択される少なくとも一つの14-3-3 タンパク質アイソフォームの存在, 非存在, または量に関して試験して、試験結果をえることと；および
前記試験結果を前記哺乳類の被験者の関節炎の管理療法の調製のための参照として用いることと
を備える方法。
【請求項１５】
請求項14に記載の方法であって、前記14-3-3ガンマアイソフォームは、配列番号 2として同定されるアミノ酸配列を含む方法。
【請求項１６】
請求項14または15に記載の方法であって、前記14-3-3エータアイソフォームは、配列番号 3として同定されるアミノ酸を含む方法。
【請求項１７】
請求項14〜16の何れか一項に記載の方法であって、前記生物学的サンプルは、さらに関節炎マーカーの存在, 非存在, または量に関して試験される方法。
【請求項１８】
請求項17に記載の方法であって、前記関節炎マーカーは、Ｃ反応性タンパク質と反応するマーカー、環状シトルリン化ペプチド（cyclic citrullinated peptide）と反応するマーカー、リウマチ因子と反応するマーカー、Ｉ型コラーゲンのＣ末端断片と反応するマーカー、ＩＩ型コラーゲンのＣ末端断片と反応するマーカー、オステオプロテグリンと反応するマーカー、核因子κBリガンド(RANK  L)のレセプターアクチベータと反応するマーカー、およびマトリックスメタロプロテイナーゼと反応するマーカーからなる群から選択される方法。
【請求項１９】
請求項14〜18の何れか一項に記載の方法であって、前記生物学的サンプルは、さらにそれと関連する赤血球沈降速度を決定するために試験される方法。
【請求項２０】
請求項18に記載の方法であって、前記マトリックスメタロプロテイナーゼは、マトリックスメタロプロテイナーゼ-1, マトリックスメタロプロテイナーゼ-3, マトリックスメタロプロテイナーゼ-8, マトリックスメタロプロテイナーゼ-9, マトリックスメタロプロテイナーゼ-10, マトリックスメタロプロテイナーゼ-11, および マトリックスメタロプロテイナーゼ-13からなる群から選択される方法。
【請求項２１】
請求項14〜20の何れか一項に記載の方法であって、前記生物学的サンプルは、血液, 血清, 血漿, 滑液, 尿, 痰 および 組織からなる群から選択される方法。
【請求項２２】
請求項14〜21の何れか一項に記載の方法であって、前記14-3-3ガンマアイソフォームおよび14-3-3エータアイソフォームからなる群から選択される少なくとも一つの14-3-3 タンパク質アイソフォームの存在, 非存在, または量が、前記生物学的サンプルを質量分析法を用いて処理することによって決定される方法。
【請求項２３】
請求項14〜21の何れか一項に記載の方法であって、前記14-3-3ガンマアイソフォームおよび14-3-3エータアイソフォームからなる群から選択される少なくとも一つの14-3-3 タンパク質アイソフォームの存在, 非存在, または量が、抗体, 無機の化学的な反応物, 有機の化学的な反応物, 及びその組み合わせからなる群から選択される反応物（reactant）で前記生物学的サンプルを処理することによって決定される方法。
【請求項２４】
請求項14〜23の何れか一項に記載の方法であって、前記関節炎の管理療法は、薬用療法（medicinal therapy）, 栄養療法（nutritional therapy）, 物理療法（physical therapy）, 介入療法（intervention therapy）, および外科療法（surgical therapy）からなる群から選択される少なくとも一つの療法である方法。
【請求項２５】
請求項14〜24の何れか一項に記載の方法であって、前記試験結果が規定の臨床試験結果の標準のセットと比較される方法。
【請求項２６】
哺乳類の被験者に提供される関節炎の治療措置の有効性を見積もる方法であって、前記関節炎の治療措置は薬用療法（medicinal therapy）, 栄養療法（nutritional therapy）, 物理療法（physical therapy）, 介入療法（intervention therapy）, および外科療法（surgical therapy）からなる群から選択される少なくとも一つの療法を含み、以下の工程を備える方法：
処方された関節炎の治療措置を受けている哺乳類の被験者に、第一の生物学的サンプルを第一のサンプル期間及び少なくとも第二の生物学的サンプルを少なくとも第二のサンプル期間からえるための少なくとも二つの期間が離れたサンプル期間（spaced-apart sample periods）を処方することと；
前記第一の生物学的サンプルを処方された第一のサンプル期間に前記哺乳類の被験者から得ることと；
前記第一の生物学的サンプルを、14-3-3ガンマアイソフォームおよび14-3-3エータアイソフォームからなる群から選択される少なくとも一つの14-3-3 タンパク質アイソフォームの存在, 非存在, または量に関して試験して、産生性の試験結果をえることと；
少なくとも第二の生物学的サンプルを少なくとも処方された第二のサンプル期間に前記哺乳類の被験者から得ることと；
前記第二の生物学的サンプルを、14-3-3ガンマアイソフォームおよび14-3-3エータアイソフォームからなる群から選択される少なくとも一つの14-3-3 タンパク質アイソフォームの存在, 非存在, または量に関して試験して、産生性の試験結果をえることと；
前記第一の生物学的サンプルからの試験結果と前記第二の生物学的サンプルからの試験結果とを比較すること。
【請求項２７】
請求項26に記載の方法であって、前記第一の生物学的サンプルと比較した前記少なくとも第二の生物学的サンプルにおける少なくとも一つの選択された14-3-3 タンパク質アイソフォームのレベルの減少は、前記関節炎の治療措置が前記被験者における関節炎を治療するために効果的であるとの指標である方法。
【請求項２８】
請求項26または27に記載の方法であって、少なくとも第一の生物学的サンプルおよび少なくとも第二の生物学的サンプルは、さらに関節炎マーカーの存在, 非存在, または量に関して試験される方法。
【請求項２９】
請求項28に記載の方法であって、前記関節炎マーカーは、Ｃ反応性タンパク質と反応するマーカー、環状シトルリン化ペプチド（cyclic citrullinated peptide）と反応するマーカー、リウマチ因子と反応するマーカー、Ｉ型コラーゲンのＣ末端断片と反応するマーカー、ＩＩ型コラーゲンのＣ末端断片と反応するマーカー、オステオプロテグリンと反応するマーカー、核因子κBリガンド(RANK  L)のレセプターアクチベータと反応するマーカー、およびマトリックスメタロプロテイナーゼと反応するマーカーからなる群から選択される方法。
【請求項３０】
請求項26〜29の何れか一項に記載の方法であって、少なくとも第一の生物学的サンプルおよび少なくとも第二の生物学的サンプルは、さらにそれと関連する赤血球沈降速度を決定するために試験される方法。
【請求項３１】
請求項29に記載の方法であって、前記マトリックスメタロプロテイナーゼは、マトリックスメタロプロテイナーゼ-1, マトリックスメタロプロテイナーゼ-3, マトリックスメタロプロテイナーゼ-8, マトリックスメタロプロテイナーゼ-9, マトリックスメタロプロテイナーゼ-10, マトリックスメタロプロテイナーゼ-11, および マトリックスメタロプロテイナーゼ-13からなる群から選択される方法。
【請求項３２】
請求項26〜31の何れか一項に記載の方法であって、前記少なくとも第一の生物学的サンプルおよび前記少なくとも第二の生物学的サンプルにおける、前記14-3-3ガンマアイソフォームおよび14-3-3エータアイソフォームからなる群から選択される少なくとも一つの14-3-3 タンパク質アイソフォームの存在, 非存在, または量が、前記少なくとも第一の生物学的サンプルおよび前記少なくとも第二の生物学的サンプルを質量分析法を用いて処理することによって決定される方法。
【請求項３３】
請求項26〜31の何れか一項に記載の方法であって、前記14-3-3ガンマアイソフォームおよび14-3-3エータアイソフォームからなる群から選択される少なくとも一つの14-3-3 タンパク質アイソフォームの存在, 非存在, または量が、抗体, 無機の化学的な 反応物, 有機の化学的な反応物, 及びその組み合わせからなる群から選択される反応物（reactant）で前記生物学的サンプルを処理することによって決定される方法。
【請求項３４】
請求項26〜33の何れか一項に記載の方法であって、前記第一の生物学的サンプルおよび前記少なくとも第二の生物学的サンプルは、血液, 血清, 血漿, 滑液, 尿, 痰 および 組織からなる群から選択される方法。
【請求項３５】
請求項26〜34の何れか一項に記載の方法であって、複数の期間が離れたサンプル期間が、処方された関節炎の治療措置を受けている哺乳類の被験者に処方される方法。
【請求項３６】
請求項35に記載の方法であって、前記複数の期間が離れたサンプル期間からの複数の試験結果は、哺乳類の被験者における関節炎の進行の程度に関して比較される方法。
【請求項３７】
哺乳類の被験者における関節炎の状態を診断するための方法であって、以下の工程を備える方法：
哺乳類の被験者から生物学的サンプルを得ることと；
前記生物学的サンプルを、14-3-3ガンマアイソフォームおよび14-3-3エータアイソフォームからなる群から選択される少なくとも一つの14-3-3 タンパク質アイソフォームの存在, 非存在, または量に関して試験して、試験結果をえることと；および
前記試験結果を処方された診断上の試験プログラムにおいて複数の哺乳類の被験者から前に採取されたプールした参照データのセットと比較すること。
【請求項３８】
請求項37に記載の方法であって、前記生物学的サンプルは、さらに関節炎マーカーの存在, 非存在, または量に関して試験される方法。
【請求項３９】
請求項38に記載の方法であって、前記関節炎マーカーは、Ｃ反応性タンパク質と反応するマーカー、環状シトルリン化ペプチド（cyclic citrullinated peptide）と反応するマーカー、リウマチ因子と反応するマーカー、Ｉ型コラーゲンのＣ末端断片と反応するマーカー、ＩＩ型コラーゲンのＣ末端断片と反応するマーカー、オステオプロテグリンと反応するマーカー、核因子κBリガンド(RANK  L)のレセプターアクチベータと反応するマーカー、およびマトリックスメタロプロテイナーゼと反応するマーカーからなる群から選択される方法。 
【請求項４０】
請求項37〜39の何れか一項に記載の方法であって、前記生物学的サンプルは、さらにそれと関連する赤血球沈降速度を決定するために試験される方法。
【請求項４１】
請求項39に記載の方法であって、前記マトリックスメタロプロテイナーゼは、マトリックスメタロプロテイナーゼ-1, マトリックスメタロプロテイナーゼ-3, マトリックスメタロプロテイナーゼ-8, マトリックスメタロプロテイナーゼ-9, マトリックスメタロプロテイナーゼ-10, マトリックスメタロプロテイナーゼ-11, および マトリックスメタロプロテイナーゼ-13からなる群から選択される方法。
【請求項４２】
請求項37〜41の何れか一項に記載の方法であって、前記14-3-3ガンマアイソフォームおよび14-3-3エータアイソフォームからなる群から選択される少なくとも一つの14-3-3 タンパク質アイソフォームの存在, 非存在, または量が、生物学的サンプルを質量分析を用いて処理することによって決定される方法。
【請求項４３】
請求項42に記載の方法であって、前記14-3-3ガンマアイソフォームおよび14-3-3エータアイソフォームからなる群から選択される少なくとも一つの14-3-3 タンパク質アイソフォームの存在, 非存在, または量が、抗体, 無機の化学的な 反応物, 有機の化学的な反応物, 及びその組み合わせからなる群から選択される反応物（reactant）で前記生物学的サンプルを処理することによって決定される方法。
【請求項４４】
請求項37〜43の何れか一項に記載の方法であって、前記生物学的サンプルは、血液, 血清, 血漿, 滑液, 尿, 痰 および 組織からなる群から選択される方法。
【請求項４５】
14-3-3ガンマアイソフォームおよび14-3-3エータアイソフォームからなる群から選択される少なくとも一つの14-3-3 タンパク質アイソフォームと特異的に結合する少なくとも一つの試薬を含んでいるキット。
【請求項４６】
請求項45に記載のキットであって、14-3-3ガンマアイソフォームと特異的に結合する第一の試薬および14-3-3エータアイソフォームと特異的に結合する第二の試薬を含んでいるキット。
【請求項４７】
請求項45に記載のキットであって、前記試薬は、抗体, 有機化合物, 無機化合物, 及びその組み合わせからなる群から選択されるキット。 
【請求項４８】
請求項45〜47の何れか一項に記載のキットであって、さらにマトリックスメタロプロテイナーゼと特異的に結合する少なくとも一つのさらなる試薬を具備するキット。
【請求項４９】
請求項48に記載のキットであって、前記マトリックスメタロプロテイナーゼは、マトリックスメタロプロテイナーゼ-1, マトリックスメタロプロテイナーゼ-3, マトリックスメタロプロテイナーゼ-8, マトリックスメタロプロテイナーゼ-9, マトリックスメタロプロテイナーゼ-10, マトリックスメタロプロテイナーゼ-11, および マトリックスメタロプロテイナーゼ-13からなる群から選択されるキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
14-3-3タンパク質（特に、エータおよびガンマアイソフォーム）は、関節リウマチなどの関節炎に冒された患者の滑液または血清中で容易に検出されえる。本発明の一態様において、炎症の部位のこれらのシグナル伝達タンパク質の検出は、関節炎の早期の又は単純化された診断に又は患者の多様なタイプの関節炎の間の鑑別に適用を有しえる。代わりに、14-3-3タンパク質のアイソフォームの存在または相対的なレベルは、衰弱の病態にまで進行する前の早期段階の関節炎の予後の指標でありえる。衰弱の病態は、軟骨および骨の破壊が構造上のダメージを生じるものであってもよい。早期の予後または診断の利点は、早期に治療措置の手段をとれることである。或いは、患者サンプル中の14-3-3のアイソフォームの存在または相対的なレベルは、特定の治療措置に適合する患者の決定に有用である。 
多様なタイプの関節炎の治療措置は、当該技術分野において既知である。関節炎への療法アプローチは、例えば、関節炎に対する疾患修飾性治療または緩解性の療法（remittive therapies）として一般的に特徴付けられてもよい。例えば、関節リウマチと診断される患者は、初期に非ステロイド性抗炎症医薬(NSAIDs)を処方されて、不快感を軽くし、炎症を減少させられる。他の治療措置には、例えば、シクロオキシゲナーゼ 2 特異的インヒビター(CSIs), 糖質コルチコイド, 疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARDs), 抗TNFアルファー中和因子または免疫抑制薬また細胞毒性薬（cytotoxic drugs）が含まれてもよい。特定の薬物の用量または例の詳細は、当業者に既知であり、文献（例えば、 Harrison’s Principles of Internal Medicine 15th ed.  BRAUNWALD et al eds.  McGraw-Hill または "The Pharmacological basis of therapeutics", 10th edition. HARDMAN HG., LIMBIRD LE. editors.  McGraw-Hill, New York, and in "Clinical Oncology", 3rd edition.  Churchill Livingstone/ Elsevier Press, 2004.ABELOFF, MD.  editor）において見つけられる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
ウエスタンブロッティング
滑液または血清(各2 μl)を、12%(wt/vol)アクリルアミドゲルでSDS-PAGE分析し、PVDF膜（Millipore Corporation）に電気転写した。膜上の非特異的なタンパク質を、5%脱脂乳粉末をPBS-0.1% Tween TM-20中に含有するもので一晩ブロッキングした。免疫ブロットを、2 μg/mlの7アイソフォーム特異的なウサギ抗-ヒト14-3-3ポリクローナル抗体を用いて行った（Martin H, Patel Y, Jones D, Howell S, Robinson K and Aitken A 1993. Antibodies against the major brain isoforms of 14-3-3 protein. An antibody specific for the N-acetylated amino-terminus of a protein. FEBS Letters. 331:296-303）。
その膜を、次に適切な二次の西洋わさびペルオキシダーゼ結合型抗-ウサギIgG (Sigma, St Louis, USA)または抗-マウスIgG(Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA)抗体(1:2500希釈)でインキュベーションした。免疫反応性のタンパク質を、次にECL + プラス  ウエスタンブロッティング検出システム（Amersham Biosciences, Buckinghamshire, England）を用いて視覚化した。ケラチノサイト細胞溶解産物(K)を、正の対照として使用した。SF: 滑液;  PS: 患者の血清。
【国際調査報告】
2009536318.tif 000011
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