(57)【要約】  本発明は、免疫刺激性組成物、および、病気を治療するための医薬品の製造におけるそのような化合物の使用、加えて、インビトロでの使用を提供する。本発明の組成物は、具体的には、配列依存性免疫刺激配列モチーフを包含する免疫刺激性オリゴリボヌクレオチドを含む。リン酸結合に関与する特定の修飾、ヌクレオチド類似体、付加物、および、それらの組み合わせが提供される。本発明の組成物は任意に抗原を含んでいてもよいく、このような組成物は、単独で用いてもよいし、または、免疫応答を刺激または強化するその他の治療と併用してもよい。また、感染、癌、アレルギー状態、喘息、気道リモデリング、または、免疫不全を有する被検体を治療するのに有用な組成物および方法も提供される。本発明の免疫刺激性オリゴリボヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様受容体８（ＴＬＲ８）を刺激すると考えられる。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症誘発性サイトカインの生産を刺激する方法：
であって、該方法は、インビトロでＴＬＲ８を発現する細胞と、炎症誘発性サイトカインの生産を刺激するのに有効な量のＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＲＮ）とを接触させることを含み、
ここで該ＯＲＮは、Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２を含み、ここで式中Ｎは、リボヌクレオチドであり、Ｎは、Ｕを含まず、Ｕは、ウラシルまたはその誘導体であり、Ｒは、リボヌクレオチドであり、ここでＲ１およびＲ２の少なくとも一方が、アデノシン（Ａ）もしくはシトシン、またはそれらの誘導体であり、ここでＮ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２に少なくとも２個のＡが含まれない限り、ＲはＵではなく、ここで該ＯＲＮは、ＡＣＣＣＡＵＣＵＡＵＵＡＵＡＵＡＡＣＵＣ（配列番号８９）ではなく、且つＴＬＲ７／８モチーフを含まず、ここで該ＯＲＮは、長さが４〜１００であり、ここで該ＯＲＮに応答するＩＦＮ−γの生産は、バックグラウンドに対して有意に誘導されない、上記方法。
【請求項２】
炎症誘発性サイトカインの生産を刺激する方法：
であって該方法は、インビトロでＴＬＲ８を発現する細胞と、炎症誘発性サイトカインの生産を刺激するのに有効な量のＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＲＮ）とを接触させることを含み、
ここで該ＯＲＮは、Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２を含み、式中Ｎは、リボヌクレオチドであり、Ｎは、Ｕを含まず、Ｕは、ウラシルまたはその誘導体であり、Ｒは、リボヌクレオチドであり、ここでＲ１およびＲ２の少なくとも一方が、アデノシン（Ａ）もしくはシトシン、またはそれらの誘導体であり、ここでＮ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２に少なくとも２個のＡが含まれない限り、ＲはＵではなく、ここで該ＯＲＮは、ＴＬＲ７／８モチーフを含まず、且つＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルファート（ＤＯＴＡＰ）と複合体化されず、ここで該ＯＲＮは、長さが４〜１００であり、ここで該ＯＲＮに応答するＩＦＮ−γの生産は、バックグラウンドに対して有意に誘導されない、上記方法。
【請求項３】
前記ＯＲＮに応答するＩＦＮ−γの生産が、３００ｐｇ／ｍｌ未満である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＯＲＮが、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルファート（ＤＯＴＡＰ）、または、ポリカチオン性ペプチドと複合体化される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｎが、アデノシンもしくはシトシン（Ｃ）、またはそれらの誘導体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
Ｎが、アデノシン、または、シトシンである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
Ｕが、ウラシルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記ＯＲＮが、少なくとも１つのＡＵを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記ＯＲＮが、少なくとも１つのＣＵを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＬＲ８を発現する細胞が、単球、または、単球から誘導された樹状細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＬＲ８を発現する細胞が、ｍＤＣである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＯＲＮが、少なくとも２つのＡＵを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＯＲＮが、少なくとも３つのＡＵを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２が、少なくとも３個のＡを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２が、少なくとも２個のＣを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２が、少なくとも１個のＧまたはＣを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＯＲＮが、少なくとも１個の主鎖の修飾を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＯＲＮが、一本鎖化されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１９】
Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２を含むＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＲＮ）：
であって、式中Ｎは、リボヌクレオチドであり、Ｎは、Ｕを含まず、Ｕは、ウラシルまたはその誘導体であり、Ｒは、リボヌクレオチドであり、ここでＲ１およびＲ２の少なくとも一方が、アデノシン（Ａ）もしくはシトシン、またはそれらの誘導体であり、ここでＮ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２に少なくとも２個のＡが含まれない限り、ＲはＵではなく、ここで該ＯＲＮは、ＡＣＣＣＡＵＣＵＡＵＵＡＵＡＵＡＡＣＵＣ（配列番号８９）ではなく、且つＴＬＲ７／８モチーフを含まず、ここで該ＯＲＮは、長さが４〜１００であり、且つ少なくとも１個の主鎖の修飾を含む、上記ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
製薬上許容できるキャリアーをさらに含む、請求項１９に記載のＯＲＮ。
【請求項２１】
前記ＯＲＮが、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルファート（ＤＯＴＡＰ）と複合体化されている、請求項１９に記載のＯＲＮ。
【請求項２２】
前記ＯＲＮが、一本鎖化されている、請求項１９に記載のＯＲＮ。
【請求項２３】
Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２を含むＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＲＮ）：
であって、式中Ｎは、リボヌクレオチドであり、Ｎは、Ｕを含まず、Ｕは、ウラシルまたはその誘導体であり、Ｒは、リボヌクレオチドであり、ここでＲ１およびＲ２の少なくとも一方が、アデノシン（Ａ）もしくはシトシン、またはそれらの誘導体であり、ここでＮ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２に少なくとも２個のＡが含まれない限り、ＲはＵではなく、ここで該ＯＲＮは、ＴＬＲ７／８モチーフを含まず、且つＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルファート（ＤＯＴＡＰ）と複合体化されず、ここで該ＯＲＮは、長さが４〜１００であり、且つ少なくとも１個の主鎖の修飾を含み、さらに該ＯＲＮは、製薬上許容できるキャリアー中で製剤化される、上記ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
Ｎが、アデノシンもしくはシトシン（Ｃ）、またはそれらの誘導体である、請求項１９または２３に記載のＯＲＮ。
【請求項２５】
Ｎが、アデノシン、または、シトシンである、請求項１９または２３に記載のＯＲＮ。
【請求項２６】
Ｕが、ウラシルである、請求項１９または２３に記載のＯＲＮ。
【請求項２７】
前記ＯＲＮが、少なくとも１つのＡＵを含む、請求項１９または２３に記載のＯＲＮ。
【請求項２８】
前記ＯＲＮが、少なくとも１つのＣＵを含む、請求項１９または２３に記載のＯＲＮ。
【請求項２９】
Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２が、少なくとも３個のＡを含む、請求項１９または２３に記載のＯＲＮ。
【請求項３０】
Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２が、少なくとも２個のＣを含む、請求項１９または２３に記載のＯＲＮ。
【請求項３１】
Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２が、少なくとも１個のＧまたはＣを含む、請求項１９または２３に記載のＯＲＮ。
【請求項３２】
前記ＯＲＮが、一本鎖化されている、請求項１９または２３に記載のＯＲＮ。
【請求項３３】
前記ＯＲＮが、以下のうちいずれか１種である、請求項１９または２３に記載のＯＲＮ：
Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ（配列番号２）、
Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ（配列番号４）、
Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号１１）、
Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ（配列番号１２）、
Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ（配列番号１３）、
Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ（配列番号１６）、
Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ（配列番号１７）、
Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ（配列番号１８）、
Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ（配列番号２４）、
Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ（配列番号３０）、または、
Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ（配列番号３３）。
【請求項３４】
ネブライザーをさらに含む、請求項１９または２３に記載のＯＲＮ。
【請求項３５】
吸入器をさらに含む、請求項１９または２３に記載のＯＲＮ。
【請求項３６】
前記吸入器が、定量吸入器である、請求項３５に記載のＯＲＮ。
【請求項３７】
前記吸入器が、粉末吸入器である、請求項３５に記載のＯＲＮ。
【請求項３８】
化学療法剤をさらに含む、請求項１９または２３に記載のＯＲＮ。
【請求項３９】
抗ウイルス剤をさらに含む、請求項１９または２３に記載のＯＲＮ。
【請求項４０】
抗原をさらに含む、請求項１９または２３に記載のＯＲＮ。
【請求項４１】
前記製薬上許容できるキャリアーが、注射に適するように製剤化される、請求項２０または２３に記載のＯＲＮ。
【請求項４２】
前記製薬上許容できるキャリアーが、粘膜投与に適するように製剤化される、請求項２０または２３に記載のＯＲＮ。
【請求項４３】
癌を治療する方法であって、それを必要とする被検体に、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載のＯＲＮを癌を治療するのに有効な量で投与することを含む、上記方法。
【請求項４４】
前記被検体に、化学療法剤を投与することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記被検体に、放射線を投与することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
喘息を治療する方法であって、それを必要とする被検体に、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載のＯＲＮを喘息を治療するのに有効な量で投与することを含む、上記方法。
【請求項４７】
アレルギーを治療する方法であって、それを必要とする被検体に、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載のＯＲＮをアレルギーを治療するのに有効な量で投与することを含む、上記方法。
【請求項４８】
前記被検体が、アレルギー性鼻炎を有する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
被検体における免疫応答を調節する方法であって、それを必要とする被検体に、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載のＯＲＮを免疫応答を調節するのに有効な量で投与することを含む、上記方法。
【請求項５０】
前記ＯＲＮが、前記被検体における自己免疫疾患を治療するために前記被検体に送達される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＯＲＮが、前記被検体における気道リモデリングを治療するために前記被検体に送達される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＯＲＮが、抗原を用いないで前記被検体に投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＯＲＮが、経口、経鼻、舌下、静脈内、皮下、粘膜、呼吸器、直接注射、および、皮膚からなる群より選択される経路で送達される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＯＲＮが、サイトカインの発現を誘導するのに有効な量で前記被検体に送達される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記サイトカインが、ＴＮＦα、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＭＣＰ１、および、ＩＬ−１２からなる群より選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
ウイルス感染により悪化した喘息を治療する方法であって、それを必要とする被検体に、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載のＯＲＮを、ウイルス感染により悪化した喘息を治療するのに有効な量で投与することを含む、上記方法。
【請求項５７】
感染症を治療する方法であって、それを必要とする被検体に、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載のＯＲＮを感染症を治療するのに有効な量で投与することを含む、上記方法。
【請求項５８】
前記被検体が、ウイルス感染を有する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ウイルス感染が、Ｂ型肝炎である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ウイルス感染が、Ｃ型肝炎である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記被検体に、抗ウイルス剤を投与することをさらに含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記抗ウイルス剤が、前記ＯＲＮに連結している、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＯＲＮが、経口、経鼻、舌下、静脈内、皮下、粘膜、呼吸器、直接注射、および、皮膚からなる群より選択される経路で送達される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＯＲＮモチーフが、非ヌクレオチドリンカーによって５’リボヌクレオチドから離れている、請求項１９または２３に記載のＯＲＮ。
【請求項６５】
前記ＯＲＮモチーフが、非ヌクレオチドリンカーによって３’リボヌクレオチドから離れている、請求項１９または２３に記載のＯＲＮ。
【請求項６６】
前記ＯＲＮモチーフが、非ヌクレオチドリンカーによって５’および３’リボヌクレオチドから離れている、請求項１９または２３に記載のＯＲＮ。
【請求項６７】
前記ＯＲＮが、ポリカチオン性のキャリアー中で製剤化される、請求項１９または２３に記載のＯＲＮ。
【請求項６８】
前記被検体に、免疫刺激性ＣｐＧ核酸を投与することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＯＲＮおよび免疫刺激性ＣｐＧ核酸が、別々に投与される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＯＲＮおよび免疫刺激性ＣｐＧ核酸が、結合体として製剤化される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＯＲＮおよび免疫刺激性ＣｐＧ核酸が、混合物として製剤化される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
免疫抑制性のＣＤ４＋調節（Ｔｒｅｇ）細胞をダウンレギュレートする方法であって、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞と、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の阻害作用を減少させるのに有効な量の請求項１９〜２３のいずれか一項に記載のＯＲＮを含む組成物とを接触させることを含む、上記方法。
【請求項７３】
前記組成物が、免疫刺激性ＣｐＧ核酸をさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＯＲＮおよび免疫刺激性ＣｐＧ核酸が、連結されていない、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＯＲＮおよび免疫刺激性ＣｐＧ核酸が、結合体として存在する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
癌を治療するための医薬品の製造における、請求項１９〜４２のいずれか一項に記載のＯＲＮの組成物の使用。
【請求項７７】
前記医薬品が、化学療法剤と共に使用される、請求項７６に記載の使用。
【請求項７８】
前記医薬品が、放射線と共に使用される、請求項７６に記載の使用。
【請求項７９】
喘息を治療するための医薬品の製造における、請求項１９〜４２のいずれか一項に記載のＯＲＮの組成物の使用。
【請求項８０】
アレルギーを治療するための医薬品の製造における、請求項１９〜４２のいずれか一項に記載のＯＲＮの組成物の使用。
【請求項８１】
前記アレルギーが、アレルギー性鼻炎である、請求項８０に記載の使用。
【請求項８２】
免疫応答を調節するための医薬品の製造における、請求項１９〜４２のいずれか一項に記載のＯＲＮの組成物の使用。
【請求項８３】
前記医薬品が、自己免疫疾患の治療において使用される、請求項８２に記載の使用。
【請求項８４】
前記医薬品が、気道リモデリングの治療において使用される、請求項８２に記載の使用。
【請求項８５】
前記医薬品が、抗原と共に使用される、請求項８２に記載の使用。
【請求項８６】
前記医薬品が、経口、経鼻、舌下、静脈内、皮下、粘膜、呼吸器、直接注射、および、皮膚からなる群より選択される経路による使用のためである、請求項８２に記載の使用。
【請求項８７】
前記免疫応答が、サイトカインの誘導を含む、請求項８２に記載の使用。
【請求項８８】
前記サイトカインが、ＴＮＦα、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＭＣＰ１、および、ＩＬ−１２からなる群より選択される、請求項８７に記載の使用。
【請求項８９】
ウイルス感染により悪化した喘息を治療するための医薬品の製造における、請求項１９〜４２のいずれか一項に記載のＯＲＮの組成物の使用。
【請求項９０】
感染症の治療のための医薬品の製造における、請求項１９〜４２のいずれか一項に記載のＯＲＮの組成物の使用。
【請求項９１】
前記医薬品が、ウイルス感染の治療において使用される、請求項９０に記載の使用。
【請求項９２】
前記ウイルス感染が、Ｂ型肝炎である、請求項９１に記載の使用。
【請求項９３】
前記ウイルス感染が、Ｃ型肝炎である、請求項９１に記載の使用。
【請求項９４】
前記医薬品が、抗ウイルス剤と共に使用される、請求項９１に記載の使用。
【請求項９５】
前記抗ウイルス剤が、前記ＯＲＮに連結している、請求項９４に記載の使用。
【請求項９６】
前記医薬品が、経口、経鼻、舌下、静脈内、皮下、粘膜、呼吸器、直接注射、および、皮膚からなる群より選択される経路による送達のためのである、請求項９０に記載の使用。
【請求項９７】
前記ＯＲＮモチーフが、非ヌクレオチドリンカーによって５’リボヌクレオチドから離れている、請求項１９または２３に記載のＯＲＮ。
【請求項９８】
前記ＯＲＮモチーフが、非ヌクレオチドリンカーによって３’リボヌクレオチドから離れている、請求項１９または２３に記載のＯＲＮ。
【請求項９９】
前記ＯＲＮモチーフが、非ヌクレオチドリンカーによって５’および３’リボヌクレオチドから離れている、請求項１９または２３に記載のＯＲＮ。
【請求項１００】
前記医薬品が、免疫刺激性ＣｐＧ核酸と共に使用される、請求項７６に記載の使用。
【請求項１０１】
前記ＯＲＮおよび免疫刺激性ＣｐＧ核酸が、別々の投与に適している、請求項１００に記載の使用。
【請求項１０２】
前記ＯＲＮおよび免疫刺激性ＣｐＧ核酸が、結合体として製剤化される、請求項１００に記載の使用。
【請求項１０３】
前記ＯＲＮおよび免疫刺激性ＣｐＧ核酸が、混合物として製剤化される、請求項１００に記載の使用。
【請求項１０４】
免疫抑制性のＣＤ４＋調節（Ｔｒｅｇ）細胞をダウンレギュレートする方法であって、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞と、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の阻害作用を減少させるのに有効な量の請求項１９〜４２のいずれか一項に記載のＯＲＮを含む組成物とを接触させることを含む、上記方法。
【請求項１０５】
前記組成物が、免疫刺激性ＣｐＧ核酸をさらに含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ＯＲＮおよび免疫刺激性ＣｐＧ核酸が、連結されていない、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ＯＲＮおよび免疫刺激性ＣｐＧ核酸が、結合体として存在する、請求項１０５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的に、免疫学の分野に関し、より具体的には免疫刺激性の分子に関する。本発明は、より具体的には、免疫刺激活性を有するオリゴリボヌクレオチドのようなリボ核酸（ＲＮＡ）分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識する高度に保存されたパターン認識受容体（ＰＲＲ）ポリペプチドのファミリーに属しており、これらは哺乳動物における先天性免疫において重要な役割を果たす。現在のところＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０と名付けられた少なくとも１０種のファミリーが同定されている。様々なＴＬＲの細胞質内ドメインは、Ｔｏｌｌ−インターロイキン１受容体（ＴＩＲ）ドメインを特徴とする。Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒ等（１９９８）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２：２５３〜８。ＴＬＲによって微生物の侵入が認識されると、ショウジョウバエおよび哺乳動物において進化的に保存されたシグナル伝達カスケードの活性化が起こる。ＴＩＲドメインを含むアダプタータンパク質ＭｙＤ８８は、ＴＬＲに付随して、インターロイキン１受容体関連キナーゼ（ＩＲＡＫ）、および、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）をＴＬＲに補充することが報告されている。ＭｙＤ８８依存性シグナル伝達経路は、免疫活性化および炎症性サイトカインの生産において重要な工程であるＮＦ−κＢ転写因子、および、ｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２末端キナーゼ（Ｊｎｋ）マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化を引き起こすとと考えられている。総論として、Ａｄｅｒｅｍ  Ａ等（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：７８２〜８７、および、Ａｋｉｒａ  Ｓ等（２００４）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４：４９９〜５１１を参照。
【０００３】
多数の特異的なＴＬＲリガンドが同定されている。ＴＬＲ２に関するリガンドとしては、ペプチドグリカン、および、リポペプチドが挙げられる。Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ａ等（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３：１〜５；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ａ等（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３：１〜５；Ａｌｉｐｒａｎｔｉｓ  ＡＯ等（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：７３６〜９。リポ多糖体（ＬＰＳ）は、ＴＬＲ４のリガンドである。Ｐｏｌｔｏｒａｋ  Ａ等（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２０８５〜８；Ｈｏｓｈｉｎｏ  Ｋ等（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２：３７４９〜５２。細菌のフラジェリンは、ＴＬＲ５のリガンドである。Ｈａｙａｓｈｉ  Ｆ等（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：１０９９〜１１０３。ペプチドグリカンは、ＴＬＲ２だけでなくＴＬＲ６のリガンドであると報告されている。Ｏｚｉｎｓｋｙ  Ａ等（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：１３７６６〜７１；Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｏ等（２００１）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：９３３〜４０。近年、所定の低分子量の合成化合物であるイミダゾキノリン類のイミキモド（Ｒ−８３７）、および、レシキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）（Ｒ−８４８）が、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８のリガンドであると報告されている。Ｈｅｍｍｉ  Ｈ等（２００２）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：１９６〜２００；Ｊｕｒｋ  Ｍ等（２００２）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：４９９。
【０００４】
メチル化されていない細菌のＤＮＡ、および、それらの合成類似体（ＣｐＧ  ＤＮＡ）は、ＴＬＲ９のリガンドであるという近年の発見（Ｈｅｍｍｉ  Ｈ等（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：７４０〜５；Ｂａｕｅｒ  Ｓ等（２００１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８，９２３７〜４２）が発端となって、所定のＴＬＲのリガンドには、所定の核酸分子が含まれることが報告されている。近年、所定のタイプのＲＮＡが、配列に依存しないで、または、配列に依存して免疫刺激性であることが報告されている。さらに、これらの様々な免疫刺激性ＲＮＡが、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、または、ＴＬＲ８を刺激することが報告されている。
【発明の開示】
【０００５】
発明の要約
本発明は、一般的に、所定の免疫刺激性ＲＮＡモチーフを含む免疫刺激性オリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）に関し、加えて、このような免疫刺激性ＯＲＮを含む関連する免疫刺激性組成物、ならびに、このような免疫刺激性ＯＲＮおよび組成物の使用方法に関する。本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、免疫応答の刺激または促進が要求されるあらゆる環境または用途において有用である。以下で開示されるように、本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、感染、癌、アレルギーおよび喘息などの様々な状態の治療に使用するためのアジュバント、ワクチン、および、その他の医薬品を含む医薬組成物の製造において特に有用である。本発明は、所定の形態によれば、本発明の免疫刺激性ＯＲＮを含む免疫刺激性組成物、加えて、それらの使用方法に関する。さらに以下で開示されたように、本免疫刺激性ＯＲＮ、および、本発明の免疫刺激性組成物は、免疫細胞を活性化する方法、被検体にワクチン接種すること、免疫系の不全を有する被検体を治療すること、感染を有する被検体を治療すること、自己免疫疾患を有する被検体を治療すること、癌を有する被検体を治療すること、アレルギー状態を有する被検体を治療すること、喘息を有する被検体を治療すること、気道リモデリング、エピトープ散布（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）を促進すること、および、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）において特に有用である。
【０００６】
以下でより詳細に開示したように、本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、それらに少なくとも１種の配列依存性の免疫刺激性ＲＮＡモチーフを包含することを特徴とする。このような配列依存性の免疫刺激性ＲＮＡモチーフは、一般的に、短いＲＮＡ配列であるが、具体的な実施態様において、このようなモチーフはまた、修飾されたインターヌクレオチドリン酸結合、修飾核酸塩基、修飾された糖、ヌクレオチド類似体、またはあらゆるそれらの組み合わせのような修飾を含んでいてもよい。以下で詳細に説明されるように、一実施態様において、このような免疫刺激性ＲＮＡモチーフは、本発明の免疫刺激性ＯＲＮがより長い状況において発生する。またこのような免疫刺激性ＲＮＡモチーフは、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ核酸分子の状況において発生する可能性もある。
【０００７】
このようなモチーフを包含した配列依存性の免疫刺激性ＲＮＡモチーフ、および、免疫刺激性ＯＲＮが開示される。より具体的には、少なくとも一部の配列依存性の免疫刺激性ＲＮＡモチーフ、免疫刺激性ＯＲＮ、および、免疫刺激性のキメラＤＮＡ：ＲＮＡ核酸分子は、ＴＬＲ８のアゴニストであるが、ＴＬＲ７のアゴニストではないことが開示される。
【０００８】
本発明のいくつかの形態による免疫刺激性ＲＮＡモチーフは、Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２である。
Ｎは、リボヌクレオチドであり、Ｎは、Ｕを含まない。いくつかの実施態様において、Ｎは、アデノシンもしくはシトシン（Ｃ）、またはそれらの誘導体である。
【０００９】
Ｕは、ウラシルまたはそれらの誘導体である。
Ｒは、リボヌクレオチドであり、ここでＲ１およびＲ２の少なくとも一方が、アデノシン（Ａ）もしくはシトシン、またはそれらの誘導体である。Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２に少なくとも２個のＡが含まれない限り、ＲはＵではない。
【００１０】
本発明のＯＲＮは、少なくとも１個の、いくつかの実施態様において１個より多くの（すなわち２、３または４個の）免疫刺激性モチーフ、Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２を含む。本ＯＲＮは、ＴＬＲ７／８モチーフを含まない。本ＯＲＮは、好ましくは、長さが４〜１００であり、任意に少なくとも１個の主鎖の修飾を含んでいてもよい。
【００１１】
いくつかの実施態様において、Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２は、少なくとも３個のＡ、または、少なくとも２個のＣを含んでいてもよい。任意に、Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２は、少なくとも１個のＧまたはＣを含んでいてもよい。
【００１２】
いくつかの実施態様において、本ＯＲＮ は、ＡＣＣＣＡＵＣＵＡＵＵＡＵＡＵＡＡＣＵＣ （配列番号８９）ではない。
その他の実施態様において、本ＯＲＮモチーフは、非ヌクレオチドリンカーによって５’リボヌクレオチドから分離されている。さらにその他の実施態様において、本ＯＲＮモチーフは、非ヌクレオチドリンカーによって３’リボヌクレオチドから離れている。任意に、本ＯＲＮモチーフは、非ヌクレオチドリンカーによって５’および３’リボヌクレオチドから分離していてもよい。
【００１３】
本ＯＲＮは、製薬上許容できるキャリアーをさらに含んでいてもよく、このようなキャリアーは、任意に、脂質キャリアーであってもよく、例えばＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルファート（ＤＯＴＡＰ）である。その他の実施態様において、本ＯＲＮは、ＤＯＴＡＰと複合体化されない。
【００１４】
本ＯＲＮは、一本鎖の形態でもよいし、または、二本鎖の形態でもよい。
その他の実施態様において、本ＯＲＮは、少なくとも１つのＡＵを含む。さらにその他の実施態様において、本ＯＲＮは、少なくとも１つのＣＵを含む。
【００１５】
いくつかの実施態様において、本ＯＲＮは、以下のうちいずれか１種である：
Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ（配列番号４）、
Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号１１）、
Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ（配列番号１２）、
Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ（配列番号１３）、
Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ（配列番号１６）、
Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ（配列番号１７）、
Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ（配列番号１８）、
Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ（配列番号２４）、
Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ（配列番号３０）、
Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ（配列番号３３）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号４８）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号７６）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号４２）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ（配列番号３９）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号６５）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号４４）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号４７）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号３８）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号３７）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号４０）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号５５）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号８２）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号８５）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号６３）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号４３）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号３６）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号８７）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号４５）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号４１）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号８３）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号４６）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号８８）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号３５）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号８４）、または、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号５６）。
【００１６】
本ＯＲＮは、具体的に言えば、ＴＬＲ７／８モチーフを含まない。
ＴＬＲ７／８モチーフは、例えばリボヌクレオチド配列を含んでいてもよく、このようなリボヌクレオチド配列は、以下から選択される：
（ｉ）５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’、
（ｉｉ）５’−Ｒ−Ｕ−Ｒ−Ｇ−Ｙ−３’、
（ｉｉｉ）５’−Ｇ−Ｕ−Ｕ−Ｇ−Ｂ−３’、
（ｉｖ）５’−Ｇ−Ｕ−Ｇ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’、および、
（ｖ）５’−Ｇ／Ｃ−Ｕ−Ａ／Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−３’、
式中、Ｃ／Ｕは、シトシン（Ｃ）またはウラシル（Ｕ）であり、Ｇ／Ｕは、グアニン（Ｇ）またはＵであり、Ｒは、プリンであり、Ｙは、ピリミジンであり、Ｂは、Ｕ、ＧまたはＣであり、Ｇ／Ｃは、ＧまたはＣであり、Ａ／Ｃは、アデニン（Ａ）またはＣである。
【００１７】
様々な実施態様において、５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’は、ＣＵＧＵ、ＣＵＵＵ、ＵＵＧＵ、または、ＵＵＵＵである。
様々な実施態様において、５’−Ｒ−Ｕ−Ｒ−Ｇ−Ｙ−３’は、ＧＵＡＧＵ、ＧＵＡＧＣ、ＧＵＧＧＵ、ＧＵＧＧＣ、ＡＵＡＧＵ、ＡＵＡＧＣ、ＡＵＧＧＵ、または、ＡＵＧＧＣである。一実施態様において、その塩基配列は、ＧＵＡＧＵＧＵである。
【００１８】
様々な実施態様において、５’−Ｇ−Ｕ−Ｕ−Ｇ−Ｂ−３’は、ＧＵＵＧＵ、ＧＵＵＧＧ、または、ＧＵＵＧＣである。
様々な実施態様において、５’−Ｇ−Ｕ−Ｇ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’は、ＧＵＧＵＧ、または、ＧＵＧＵＵである。一実施態様において、その塩基配列は、ＧＵＧＵＵＵＡＣである。
【００１９】
様々な実施態様において、５’−Ｇ／Ｃ−Ｕ−Ａ／Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−３’は、ＧＵＡＧＧＣＡＣ、ＧＵＣＧＧＣＡＣ、ＣＵＡＧＧＣＡＣ、または、ＣＵＣＧＧＣＡＣである。
【００２０】
一形態において、本発明は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮ、および、アジュバントを含む免疫刺激性組成物を提供する。様々な実施態様において、アジュバントとは、持続作用をもたらすアジュバント、免疫刺激性のアジュバント、または、持続作用をもたらし免疫系を刺激するアジュバントである。一実施態様において、この本発明の形態に係る本免疫刺激性組成物は、本免疫刺激性ＯＲＮとアジュバントとの結合体である。一実施態様において、本発明のこの形態に従って、本免疫刺激性ＯＲＮは、アジュバントに共有結合で連結している。その他の実施態様において、これらは、結合体ではない。一実施態様において、アジュバントは、ＴＬＲ９のアゴニストである。一実施態様において、アジュバントは、免疫刺激性ＣｐＧ核酸である。
【００２１】
本発明の組成物は、任意に抗原を含んでいてもよい。従って、一形態において、本発明は、ワクチンを提供し、ここで本ワクチンは、本発明の免疫刺激性ＯＲＮと抗原とを含む。一形態において、本発明は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮと抗原との結合体を含むワクチンを提供する。一実施態様において、この本発明の形態に係る結合体は、抗原に共有結合で連結した本免疫刺激性ＯＲＮを含む。その他の実施態様において、これらは、結合体ではない。様々な実施態様において、抗原は、抗原そのものであってもよい。抗原は、どのような抗原でもよく、例えば、癌抗原、微生物抗原、または、アレルゲンが挙げられる。
【００２２】
一形態において、本発明は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮと親油性成分との結合体を含む免疫刺激性組成物を提供する。一実施態様において、本免疫刺激性ＯＲＮは、親油性成分に共有結合で連結している。一実施態様において、親油性成分は、コレステリル、パルミチル、および、脂肪酸アシルからなる群より選択される。一実施態様において、親油性成分は、コレステロール誘導体、例えばコレステリルである。
【００２３】
一実施態様において、本免疫刺激性ＯＲＮは、少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチドを含む。上記少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチドは、一般的に、免疫刺激性ＲＮＡモチーフの外側どこかに存在する可能性がある。様々な実施態様において、上記少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または、２４個の連続したデオキシリボヌクレオチドである。また本発明は、連続していないデオキシリボヌクレオチドを含む免疫刺激性ＯＲＮも考慮する。様々な実施態様において、上記少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチドは、本免疫刺激性ＯＲＮの５’末端、３’末端、または、５’末端および３’末端の両方である。また上記少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチドは、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ分子のＤＮＡ部分にも相当する。一実施態様において、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ分子のＤＮＡ部分は、ＣｐＧ核酸、すなわちＴＬＲ９アゴニストを含む。一実施態様において、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ分子のＤＮＡおよびＲＮＡ部分は、インターヌクレオチドリン酸結合を介して共有結合で連結されている。その他の実施態様において、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ分子のＤＮＡおよびＲＮＡ部分は、リンカー、例えば非ヌクレオチドリンカーを介して共有結合で連結されている。
【００２４】
一形態において、本発明は、共有結合で閉環した、部分的に一本鎖のダンベル型の核酸分子を含む免疫刺激性組成物を提供し、ここで、このような分子の少なくとも１つの一本鎖部分に、本発明の免疫刺激性ＲＮＡモチーフが含まれる。
【００２５】
一形態において、本発明は、運搬手段と共に、前述した本発明の形態のいずれかに記載の組成物、ならびに、任意に製薬上許容できるキャリアーを含む医薬組成物を提供し、ここでこのような運搬手段は、カチオン脂質、リポソーム、渦巻型の手段（ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）、ビロゾーム、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、単層の小胞（ＬＵＶ）、多層の小胞、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、エマルソーム（ｅｍｕｌｓｏｍｅ）、および、ポリカチオン性ペプチドから選択される。一実施態様において、本発明のこの形態に従って、本医薬組成物は、抗原を含む。
【００２６】
本ＯＲＮは、ネブライザー、または、吸入器、例えば定量吸入器もしくは粉末吸入器用に製剤化されてもよい。いくつかの実施態様において、本ＯＲＮは、追加の組成物、例えば化学療法剤、抗ウイルス剤、または、製薬上許容できるキャリアーをさらに含む。製薬上許容できるキャリアーは、注射または粘膜投与用に配合されてもよい。
【００２７】
さらに本発明のこれらの形態のおよびその他の形態によれば、様々な実施態様において、本免疫刺激性ＯＲＮは、任意に、少なくとも１個の５’−５’インターヌクレオチド結合、少なくとも１個の３’−３’インターヌクレオチド結合、少なくとも１個の５’−５’インターヌクレオチド結合（リンカー成分を含む）、少なくとも１個の３’−３’インターヌクレオチド結合（リンカー成分を含む）、または、それらのあらゆる組み合わせを含んでいてもよい。一実施態様において、このようなリンカー成分は、非ヌクレオチドリンカー成分である。
【００２８】
さらに本発明のこれらの形態のおよびその他の形態によれば、様々な実施態様において、本免疫刺激性ＯＲＮは、任意に、少なくとも１個の２’−２’インターヌクレオチド結合、少なくとも１個の２’−３’インターヌクレオチド結合、少なくとも２’−５’インターヌクレオチド結合、または、それらのあらゆる組み合わせを含んでいてもよい。好ましい実施態様において、少なくとも１個の２’−２’インターヌクレオチド結合、少なくとも１個の２’−３’インターヌクレオチド結合、または、少なくとも２’−５’インターヌクレオチド結合は、免疫刺激性ＲＮＡモチーフの外側に存在する。
【００２９】
またこれらのおよび本発明のその他の形態によれば、一実施態様において、本免疫刺激性ＯＲＮは、少なくとも１個の樹状化単位（ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  ｕｎｉｔ）を含む。従って、具体的な実施態様において、本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、分岐状構造を有していてもよい。分岐状の組成物は、３’−５’、５’−５’、３’−３’、２’−２’、２’−３’、または、２’−５’インターヌクレオチド結合をあらゆる組み合わせで含んでいてもよい。一実施態様において、本免疫刺激性ＯＲＮは、少なくとも２個の樹状化単位を含み、それによりいわゆるデンドリマーが生じる。加えて、具体的な実施態様において、本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、２個またはそれより多くの免疫刺激性ＲＮＡモチーフを含んでいてもよく、これらのモチーフは、例えば直鎖状のＯＲＮに沿ってタンデム状に配置されるか、分岐状構造の異なるアームに配置されるか、または、直鎖状のＯＲＮに沿ってタンデム状に、且つ分岐状構造の異なるアームに配置される。デンドリマーなどの分岐状構造は、任意に、少なくとも１個の免疫刺激性ＣｐＧ核酸を、例えば分岐状構造の別々のアームとして含んでいてもよい。
【００３０】
さらに本発明のこれらの形態のおよびその他の形態によれば、一実施態様において、本免疫刺激性ＯＲＮは、ＣＧで構成されるＤＮＡまたはＲＮＡジヌクレオチドを含まない。
一形態において、本発明は、免疫抑制性のＣＤ４＋調節（Ｔｒｅｇ）細胞をダウンレギュレートする方法を提供する。本発明のこの形態に係る方法は、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞と、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の阻害作用を減少させるのに有効な量の本発明のＴＬＲ８特異的な免疫刺激性ＯＲＮを含む組成物とを接触させる工程を含む。一実施態様において、本組成物は、ＴＬＲ８特異的なＯＲＮ、および、免疫刺激性ＣｐＧ核酸を含み、ここでこのＴＬＲ８特異的なＯＲＮおよび免疫刺激性ＣｐＧ核酸は、連結されていない。一実施態様において、本組成物は、ＴＬＲ８特異的なＯＲＮ、および、免疫刺激性ＣｐＧ核酸を含み、ここでこのＴＬＲ８特異的なＯＲＮおよび免疫刺激性ＣｐＧ核酸は、結合体として存在する。
【００３１】
その他の形態において、本発明は、被検体において免疫応答を調節する方法を提供し、本発明のこの形態に係る方法は、上記被検体に、有効量の本発明の組成物を投与する工程を含む。いくつかの実施態様において、本ＯＲＮは、上記被検体における自己免疫疾患または気道リモデリングを治療するために被検体に送達することもできる。本ＯＲＮは、抗原と共に上記被検体に投与してもよいし、または、それを含まないで投与してもよい。任意に、本ＯＲＮは、経口、経鼻、舌下、静脈内、皮下、粘膜、呼吸器、直接注射、および、皮膚のような経路で送達されてもよい。本ＯＲＮは、サイトカイン（例えばＴＮＦα、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＭＣＰ１、および、ＩＬ−１２）の発現を誘導するのに有効な量で上記被検体に送達されてもよい。
【００３２】
一形態において、本発明は、被検体にワクチン接種する方法を提供する。本発明のこの形態に係る方法は、上記被検体に、抗原、および、本発明の免疫刺激性ＯＲＮを投与する工程を含む。
【００３３】
一形態において、本発明は、感染症を有する被検体、または、その危険性がある被検体を治療する方法を提供する。本発明のこの形態に係る方法は、上記被検体に、有効量の本発明の組成物を投与する工程を含む。一実施態様において、本方法は、上記被検体に、有効量の本発明の免疫刺激性ＯＲＮを投与する工程を含む。一実施態様において、上記被検体は、ウイルス感染を有する。ここでのウイルス感染とは、例えばＢ型肝炎またはＣ型肝炎であり得る。上記被検体に、抗ウイルス剤が投与されてもよい。このような抗ウイルス剤は、任意に本ＯＲＮに連結していてもよい。
【００３４】
一形態において、本発明は、癌を有する被検体、または、その危険性がある被検体を治療する方法を提供する。本発明のこの形態に係る方法は、上記被検体に、有効量の本発明の組成物を投与する工程を含む。一実施態様において、本方法は、上記被検体に、有効量の本発明の免疫刺激性ＯＲＮを投与する工程を含む。一実施態様において、上記被検体に、化学療法剤または放射線が投与されてもよい。
【００３５】
一形態において、本発明は、癌を有する被検体、または、その危険性がある被検体を治療する方法を提供する。本発明のこの形態に係る方法は、上記被検体に、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の阻害作用を減少させるのに有効な量の本発明のＴＬＲ８特異的な免疫刺激性ＯＲＮを含む組成物を投与する工程を含む。一実施態様において、本組成物は、ＴＬＲ８特異的なＯＲＮ、および、免疫刺激性ＣｐＧ核酸を含み、ここでこのＴＬＲ８特異的なＯＲＮおよび免疫刺激性ＣｐＧ核酸は、連結されていない。一実施態様において、本組成物は、ＴＬＲ８特異的なＯＲＮ、および、免疫刺激性ＣｐＧ核酸を含み、ここでこのＴＬＲ８特異的なＯＲＮおよび免疫刺激性ＣｐＧ核酸は、結合体として存在する。
【００３６】
一形態において、本発明は、アレルギー状態を有する被検体、または、その危険性がある被検体を治療する方法を提供する。本発明のこの形態に係る方法は、上記被検体に、有効量の本発明の組成物を投与する工程を含む。一実施態様において、本方法は、上記被検体に、有効量の本発明の免疫刺激性ＯＲＮを投与する工程を含む。一実施態様において、上記被検体は、アレルギー性鼻炎を有する。
【００３７】
一形態において、本発明は、喘息を有する被検体、または、その危険性がある被検体を治療する方法を提供する。本発明のこの形態に係る方法は、上記被検体に、有効量の本発明の組成物を投与する工程を含む。一実施態様において、本方法は、上記被検体に、有効量の本発明の免疫刺激性ＯＲＮを投与する工程を含む。一実施態様において、喘息は、ウイルス感染により悪化した喘息である。本ＯＲＮは、アレルゲンと共に投与してもよいし、または、それを含まないで投与してもよい。
【００３８】
その他の形態において、本発明は、気道リモデリングを有する被検体を治療する方法を提供する。本発明のこの形態に係る方法は、上記被検体に、有効量の本発明の免疫刺激性ＯＲＮを投与する工程を含む。
【００３９】
一形態において、本発明は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を高める方法を提供する。本発明のこの形態に係る方法は、ＡＤＣＣを高めることが必要な被検体に、ＡＤＣＣを高めるのに有効な量の本発明の免疫刺激性ＯＲＮ、および、抗体を投与する工程を含む。一実施態様において、抗体は、癌抗原、または、癌細胞によって発現されるその他の抗原に特異的な抗体である。一実施態様において、抗体は、ＩｇＧ抗体である。
【００４０】
本発明は、一形態において、エピトープ散布を強化する方法を提供する。本発明のこの形態に係る方法は、免疫系の細胞と抗原とを接触させ、その後、その細胞と、少なくとも２回の用量の本発明の免疫刺激性ＯＲＮとを接触させる連続工程を含む。一実施態様において、本方法はインビボで行われる。一実施態様において、本方法は、被検体に、抗原およびアジュバントを含むワクチンを投与し、その後、その被検体に、少なくとも２回の用量の本発明の免疫刺激性ＯＲＮを、複数のエピトープ特異的な免疫応答を誘導するのに有効な量で投与する工程を含む。一実施態様において、本方法は、被検体の免疫系における抗原曝露が発生する治療手順を適用し、続いて、少なくとも２回の用量の本発明の免疫刺激性ＯＲＮを、複数のエピトープ特異的な免疫応答を誘導するのに有効な量で投与することを含む。様々な実施態様において、上記治療手順は、外科手術、放射線、化学療法、その他の癌治療薬、ワクチン、または、癌ワクチンである。一実施態様において、本免疫刺激性ＯＲＮの少なくとも２回の用量は、少なくとも１日から１週間の期間互いに間隔を置いて投与される。一実施態様において、本免疫刺激性ＯＲＮの少なくとも２回の用量は、少なくとも１週間から１ヶ月の期間互いに間隔を置いて投与される。一実施態様において、本免疫刺激性ＯＲＮの少なくとも２回の用量は、少なくとも１ヶ月から６ヶ月の期間互いに間隔を置いて投与される。
【００４１】
一形態において、本発明は、炎症誘発性サイトカインの生産を刺激する方法であり、本方法は、ＴＬＲ８を発現する細胞と、炎症誘発性サイトカインの生産を刺激するのに有効な量のＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＲＮ）とを接触させることによってなされ、ここで該ＯＲＮは、Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２を含み、ここで式中Ｎは、リボヌクレオチドであり、Ｎは、Ｕを含まず、Ｕは、ウラシルまたはそれらの誘導体であり、Ｒは、リボヌクレオチドであり、ここでＲ１およびＲ２の少なくとも一方が、アデノシン（Ａ）もしくはシトシン、またはそれらの誘導体であり、ここでＮ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２に少なくとも２個のＡが含まれない限り、ＲはＵではなく、ここで該ＯＲＮは、ＴＬＲ７／８モチーフを含まず、ここで該ＯＲＮは、長さが４〜１００であり、ここで該ＯＲＮに応答するＩＦＮ−γの生産は、バックグラウンドに対して有意に誘導されない。いくつかの実施態様において、本ＯＲＮに応答するＩＦＮ−γの生産は、３００ｐｇ／ｍｌ未満である。一実施態様において、本ＯＲＮは、ＡＣＣＣＡＵＣＵＡＵＵＡＵＡＵＡＡＣＵＣ（配列番号８９）ではない。本ＯＲＮは、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルファート（ＤＯＴＡＰ）と複合体化されてもよいし、または、複合体化されていなくてもよい。
【００４２】
いくつかの実施態様において、ＴＬＲ８を発現する細胞は、単球、または、ｍＤＣである。さらにその他の実施態様において、ＴＬＲ８を発現する細胞は、インビトロまたはインビボの環境にある。
【００４３】
本発明のこれらの特徴およびその他の特徴を、発明の詳細な説明に関連させてさらに詳細にする。
発明の詳細な説明
本発明は、発明者等が多数の配列特異的な免疫刺激性ＲＮＡモチーフを発見したことに一部関連する。現在、免疫刺激性ＲＮＡモチーフを含む分子は、単独で、または、所定のその他の構成要素と組み合わせて、免疫応答を誘導する、増大させる、または、再び応答するようにすることが有利なことが予想される状態を有する、または、その危険性がある被検体を治療する多数の方法において用途が見出される重要な免疫刺激性化合物であることがわかっている。一実施態様において、本発明の免疫刺激性組成物は、本明細書で用いられる場合、本発明の免疫刺激性ＯＲＮのことである。
【００４４】
所定の配列特異的なＲＮＡモチーフが、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８に作用するその他のモチーフ（ＧＵリッチおよびＣＵリッチ）とは対照的に、ＴＬＲ８を介して作用する免疫刺激性、であることが発見されている。好ましくはＡＵリッチな配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＲＮ）は、ＴＬＲ８を介して免疫応答を刺激する。これらの異なるクラスのＯＲＮ（例えばＡＵおよびＧＵを含む反復を含むＯＲＮ）においてＩＦＮ−アルファ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１２生産の間に差があることが観察された。興味深いことに、本発明の免疫刺激性ＯＲＮが、ＩＦＮ−アルファおよびＩＦＮ−アルファ関連の分子を除いて、強い炎症誘発性サイトカイン応答を生産することが見出された。これらの新規のＯＲＮで刺激すると、ＩＦＮ−アルファ生産は、減少するか、または、なくなった。
【００４５】
本発明のいくつかの形態による免疫刺激性ＲＮＡモチーフは、Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２である。
Ｎは、リボヌクレオチドであり、Ｎは、Ｕを含まない。いくつかの実施態様において、Ｎは、アデノシンもしくはシトシン（Ｃ）、またはそれらの誘導体である。
【００４６】
Ｕは、ウラシルまたはそれらの誘導体である。
Ｒは、リボヌクレオチドであり、ここでＲ１およびＲ２の少なくとも一方が、アデノシン（Ａ）もしくはシトシン、またはそれらの誘導体である。Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２に少なくとも２個のＡが含まれない限り、ＲはＵではない。
【００４７】
本発明のＯＲＮは、少なくとも１つの免疫刺激性モチーフ、Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２を含み、いくつかの実施態様において、１個より多くの（すなわち、２、３、または、４個の）免疫刺激性モチーフ、Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２を含む。本ＯＲＮは、ＴＬＲ７／８モチーフを含まない。
【００４８】
本ＯＲＮは、オリゴヌクレオチドである。本オリゴヌクレオチドは、任意に、長さが４〜１００であってもよい。また本ＯＲＮは、長さが例えば８〜４０、１５〜２５、または、２０〜３０個のヌクレオチドであってもよい。本ＯＲＮは、任意に、少なくとも１個の主鎖の修飾を含んでいてもよい。
【００４９】
いくつかの実施態様において、Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２は、少なくとも３個のＡ、または、少なくとも２個のＣを含んでいてもよい。Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２は、任意に、少なくとも１個のＧまたはＣを含んでいてもよい。
【００５０】
いくつかの実施態様において、本ＯＲＮは、ＡＣＣＣＡＵＣＵＡＵＵＡＵＡＵＡＡＣＵＣ（配列番号８９）ではない。
本ＯＲＮは、製薬上許容できるキャリアーをさらに含んでいてもよく、このようなキャリアーは、任意に、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルファート（ＤＯＴＡＰ）のような脂質キャリアーであってもよい。その他の実施態様において、本ＯＲＮは、ＤＯＴＡＰと複合体化されない。その他の実施態様において、製薬上許容できるキャリアーは、ポリカチオン性ペプチドのようなペプチドであってもよい。ポリカチオン性ペプチドとしては、例えば、５個より多い、特に８個より多いアミノ酸残基の範囲において５０％より多い塩基性アミノ酸（特にアルギニンまたはリシン残基）を含む樹状構造のポリリシン、ポリアルギニンおよびポリペプチド、またはそれらの混合物が挙げられ、例えば、天然に存在する昆虫の抗菌性タンパク質の誘導体であり得る。
【００５１】
その他の実施態様において、本ＯＲＮは、少なくとも１つのＡＵを含む。
本免疫刺激性ＲＮＡモチーフは、配列特異的であることに加えて、一本鎖ＲＮＡ、部分的に二本鎖のＲＮＡ、または、完全に二本鎖のＲＮＡとしても有効である。
【００５２】
本発明のＯＲＮ、および、ＴＬＲ７／８モチーフを有する、すなわちＧＵを含む反復を有するＯＲＮにおいて、ＩＦＮ−アルファおよびＩＦＮ−アルファ関連分子と、その他の炎症誘発性サイトカイン、例えばＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１０、ＩＬ−６およびＩＬ−１２との間に明らかな生産の差が観察された。本発明のＮ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２モチーフを有するＯＲＮ、例えばＡＵまたはＡＵＵ反復を含むＯＲＮ（配列番号１２、配列番号１３）は、ＰＢＭＣおよびｐＤＣ刺激の際にＩＦＮ−アルファサイトカインを生産しないことが明らかになった。それに対して、配列中に３個およびそれより多いＵを有するＯＲＮ（配列番号１４、配列番号１５）は、Ａが存在するにもかかわらずＩＦＮ−アルファ生産を誘導した。興味深いことに、ＧがＡに置換されたこと以外は同一のＯＲＮ群を用いたところ、ＰＢＭＣ刺激の際に強いＩＦＮ−アルファ生産が観察された。本明細書で示されたデータから、２種の異なるＯＲＮクラスの存在、すなわち、ＴＬＲ８を発現する細胞、例えば単球およびｍＤＣ（配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６〜配列番号１８）に作用し、ＯＲＮに本発明のＮ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２モチーフが含まれるＯＲＮクラス、および、ＴＬＲ７／８の両方を発現する細胞、例えば単球、ｍＤＣｓおよびｐＤＣ（配列番号１４、配列番号１５、配列番号１９〜配列番号２３）に作用し、ＣＵ、ＧＵおよびＧＵＵ配列を含むＯＲＮクラスが存在することが強く示唆される。
【００５３】
従って、本発明のＯＲＮは、バックグラウンドに対して有意な量のＩＦＮ−アルファまたはＩＦＮ−アルファ関連分子を誘導することなく、免疫応答を誘導する能力を有する。バックグラウンドに対して有意なの量のＩＦＮ−アルファまたはＩＦＮ−アルファ関連分子とは、好ましくは、バックグラウンドに対してＩＦＮ−アルファまたはＩＦＮ−アルファ関連分子のレベルの変化が２０％未満であることをいう。いくつかの実施態様において、この変化は、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または、１％未満である。その他の実施態様において、誘導されるＩＦＮ−アルファまたは関連分子の量は、バックグラウンドと同等であるか、または、バックグラウンドレベルより少ない。さらにその他の実施態様において、本発明のＯＲＮにより誘導されたＩＦＮ−アルファの量は、ＴＬＲ７／８ＯＲＮにより誘導されたＩＦＮ−アルファの２０％未満か、または、それに等しい。本発明のＯＲＮにより誘導されたＩＦＮ−アルファの量は、インビトロでの分析では任意に３００ｐｇ／ｍｌ未満であってもよく、または、１．５μＭより大きいＥＣ５０を有していてもよい。
【００５４】
本明細書で用いられるＩＦＮ−アルファ関連分子とは、ＩＦＮ−アルファの発現に関連するサイトカインまたは因子に関する。これらの分子としては、これらに限定されないが、ＭＩＰ１−ベータ、ＩＰ−１０、および、ＭＩＰ１−アルファが挙げられる。
【００５５】
近年、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞はＴＬＲ８を発現し、これらの細胞におけるＴＬＲ８のシグナル伝達によって、それらの免疫抑制機能が減少したり、または、逆行したりすることが報告されている。Ｐｅｎｇ  Ｇ等（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：１３８０〜４。様々なタイプの癌を有する患者において、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞群の増加が観察されており、このような場合、免疫抑制は、免疫「回避」、および、これらの癌の調節不能な増殖に寄与する可能性がある。従って、Ｔｒｅｇが媒介する抑制を減少させることは、癌治療において有益であると予想される。
【００５６】
本ＯＲＮは、ＴＬＲ７／８モチーフを有さないことを特徴とする。ＴＬＲ７／８モチーフは、本発明のＯＲＮの特徴的な免疫刺激特性を覆い隠す優勢な結果を生じる可能性があることが発見されている。ＴＬＲ７／８モチーフは、例えば５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’、５’−Ｒ−Ｕ−Ｒ−Ｇ−Ｙ−３’、５’−Ｇ−Ｕ−Ｕ−Ｇ−Ｂ−３’、５’−Ｇ−Ｕ−Ｇ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’、または、５’−Ｇ／Ｃ−Ｕ−Ａ／Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−３’のようなリボヌクレオチド配列を含む可能性がある。Ｃ／Ｕは、シトシン（Ｃ）、または、ウラシル（Ｕ）であり、Ｇ／Ｕは、グアニン（Ｇ）、または、Ｕであり、Ｒは、プリンであり、Ｙは、ピリミジンであり、Ｂは、Ｕ、ＧまたはＣであり、Ｇ／Ｃは、ＧまたはＣであり、Ａ／Ｃは、アデニン（Ａ）、または、Ｃである。５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’は、ＣＵＧＵ、ＣＵＵＵ、ＵＵＧＵ、または、ＵＵＵＵであり得る。様々な実施態様において、５’−Ｒ−Ｕ−Ｒ−Ｇ−Ｙ−３’は、ＧＵＡＧＵ、ＧＵＡＧＣ、ＧＵＧＧＵ、ＧＵＧＧＣ、ＡＵＡＧＵ、ＡＵＡＧＣ、ＡＵＧＧＵ、または、ＡＵＧＧＣである。一実施態様において、その塩基配列は、ＧＵＡＧＵＧＵである。様々な実施態様において、５’−Ｇ−Ｕ−Ｕ−Ｇ−Ｂ−３’は、ＧＵＵＧＵ、ＧＵＵＧＧ、または、ＧＵＵＧＣである。様々な実施態様において、５’−Ｇ−Ｕ−Ｇ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’は、ＧＵＧＵＧ、または、ＧＵＧＵＵである。一実施態様において、その塩基配列は、ＧＵＧＵＵＵＡＣである。様々なその他の実施態様において、５’−Ｇ／Ｃ−Ｕ−Ａ／Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−３’は、ＧＵＡＧＧＣＡＣ、ＧＵＣＧＧＣＡＣ、ＣＵＡＧＧＣＡＣ、または、ＣＵＣＧＧＣＡＣである。
【００５７】
本発明は、一般的に、１個またはそれより多くの免疫刺激性ＲＮＡモチーフを含む免疫刺激性オリゴリボヌクレオチド、１種またはそれより多くの本発明の免疫刺激性ＯＲＮを含む免疫刺激性組成物、ならびに、本免疫刺激性ＯＲＮおよび本発明の免疫刺激性組成物の使用方法に関する。
【００５８】
本明細書で用いられる用語「ＲＮＡ」、それと同様に用いられる「天然のＲＮＡ」は、３’−５’ホスホジエステル結合によって一つに共有結合した２個またはそれより多くのリボヌクレオチド（すなわち、それぞれリン酸基、および、プリンまたはピリミジン核酸塩基（例えば、グアニン、アデニン、シトシン、または、ウラシル）に連結したリボース糖を含む分子）を意味することとする。
【００５９】
免疫刺激性ＲＮＡモチーフは、（本免疫刺激性ＯＲＮが、遊離末端を有する場合）本免疫刺激性ＯＲＮの末端に発生する可能性がある。例えば、遊離末端を有し、本免疫刺激性ＯＲＮの末端に免疫刺激性ＲＮＡモチーフが配置された免疫刺激性ＯＲＮは、ＸａＭ、または、ＭＸｂのように示すことができる（式中、Ｍは、免疫刺激性ＲＮＡモチーフを示し、ＸａおよびＸｂはそれぞれ独立して、免疫刺激性ＲＮＡモチーフ以外の免疫刺激性ＯＲＮを構成する１個またはそれより多くの同一または異なるヌクレオチドを示す）。
【００６０】
あるいは、免疫刺激性ＲＮＡモチーフは、その両方の末端に本免疫刺激性ＯＲＮの少なくとも１個の追加のヌクレオチドが配置されていいてもよく、ここでその免疫刺激性ＯＲＮは、遊離末端を有していてもよいし、または、有していなくてもよい。例えば、遊離末端を有する免疫刺激性ＯＲＮ、および、免疫刺激性ＲＮＡモチーフの端にあるヌクレオチドは、ＸａＭＸｂのように示すことができ、ここでＭは免疫刺激性ＲＮＡモチーフを示し、ＸａおよびＸｂはそれぞれ独立して、免疫刺激性ＲＮＡモチーフ以外の免疫刺激性ＯＲＮを構成する１個またはそれより多くの同一または異なるヌクレオチドを示す。
【００６１】
様々な実施態様において、免疫刺激性ＲＮＡモチーフを含む免疫刺激性ＯＲＮは、単一のモチーフを含んでいてもよいし、または、１種より多くの免疫刺激性ＲＮＡモチーフを含んでいてもよい。２種またはそれより多くの免疫刺激性ＲＮＡモチーフを単一の免疫刺激性ＯＲＮに含むことは利点を有する可能性があると考えられ、例えば、このようなモチーフが、本免疫刺激性ＯＲＮが２種またはそれより多くのＴＬＲに関与できるように離れて存在するような場合に利点を有する可能性がある。例えば、本免疫刺激性ＯＲＮは、２種またはそれより多くのＴＬＲ８受容体に関与していてもよく、それによって得られた免疫刺激作用を増幅させたり、または、改変したりできる。
【００６２】
本免疫刺激性ＯＲＮが、１個より多くの免疫刺激性ＲＮＡモチーフを含む場合、一実施態様において、本免疫刺激性ＯＲＮは、Ｍ１ＸＭ２のように示すことができ、ここでＭ１およびＭ２はそれぞれ独立して免疫刺激性ＲＮＡモチーフを示し、Ｘは、免疫刺激性ＲＮＡモチーフ以外の免疫刺激性ＯＲＮを構成する１個またはそれより多くの同一または異なるヌクレオチドを示す。一実施態様において、Ｘには、本明細書において説明されているような非ヌクレオチドリンカーが含まれる。一実施態様において、Ｘには、本明細書において説明されているような分岐した単位が含まれる。
【００６３】
本免疫刺激性ＯＲＮ内に１個より多くの免疫刺激性ＲＮＡモチーフが存在する場合、このようなモチーフは、一般的に、本免疫刺激性ＯＲＮ内のどこの位置に存在していてもよい。例えば、２個のモチーフが存在する場合、これらはそれぞれ、本免疫刺激性ＯＲＮの末端に存在していてもよい。あるいは、末端に存在するモチーフは１個でもよく、１個のモチーフにおいて、その両方の末端に本免疫刺激性ＯＲＮの少なくとも１個の追加のヌクレオチドが存在していてもよい。さらにその他の実施態様において、各モチーフにおいて、その両方の末端に本免疫刺激性ＯＲＮの少なくとも１個の追加のヌクレオチドが存在していてもよい。
【００６４】
免疫刺激性ＯＲＮは、これらに限定されないが、以下に示される５’から３’への（左から右への）リーディングを含んでいてもよい：
いくつかの実施態様において、本ＯＲＮは、以下の表１および２に示される活性ＯＲＮのいずれか１つであり、例えば以下が挙げられる：
Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ（配列番号２）、
Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ（配列番号４）、
Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号１１）、
Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ（配列番号１２）、
Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ（配列番号１３）、
Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ（配列番号１６）、
Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ（配列番号１７）、
Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ（配列番号１８）、
Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ（配列番号２４）、
Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ（配列番号３０）、Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ（配列番号３３）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号４８）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号７６）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号４２）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ（配列番号３９）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号６５）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号４４）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号４７）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号３８）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号３７）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号４０）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号５５）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号８２）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号８５）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号６３）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号４３）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号３６）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号８７）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号４５）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号４１）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号８３）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号４６）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号８８）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号３５）、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号８４）、または、
Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ（配列番号５６）。
【００６５】
上述したように、ＲＮＡは、３’−５’ホスホジエステル結合を介して連結されたリボヌクレオチドのポリマーである。具体的な実施態様において、本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、ＲＮＡである。しかしながら、本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、以下で説明されるようにＲＮＡに限定されない。
【００６６】
一実施態様において、本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、修飾核酸塩基、すなわちＡ、Ｃ、Ｇ、および、Ｕの誘導体を１種またはそれより多く含んでいてもよい。これらの修飾核酸塩基の具体的な実施態様としては、これらに限定されないが、５−置換シトシン（例えば、５−メチル−シトシン、５−フルオロ−シトシン、５−クロロ−シトシン、５−ブロモ−シトシン、５−ヨード−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシメチル−シトシン、５−ジフルオロメチル−シトシン、および、非置換または置換された５−アルキニル−シトシン）、６−置換シトシン、Ｎ４−置換シトシン（例えば、Ｎ４−エチル−シトシン）、５−アザ−シトシン、２−メルカプト−シトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、縮合環系を有するシトシン類似体（例えば、Ｎ，Ｎ’−プロピレンシトシン、または、フェノキサジン）、および、ウラシル、および、その誘導体（例えば、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−ブロモビニル−ウラシル、４−チオ−ウラシル、５−ヒドロキシ−ウラシル、５−プロピニル−ウラシル）、チミン誘導体（例えば、２−チオチミン、４−チオチミン、６−置換チミン）、グアノシン誘導体（７−デアザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン（例えば、７−デアザ−７−（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルグアニン）、７−デアザ−８−置換グアニン、ヒポキサンチン、Ｎ２−置換グアニン（例えば、Ｎ２−メチル−グアニン）、８−置換グアニン（例えば、８−ヒドロキシグアニン、および、８−ブロモグアニン）、および、６−チオグアニン）、または、アデノシン誘導体（５−アミノ−３−メチル−３Ｈ，６Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２，７−ジオン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、プリン、インドール、アデニン、置換されたアデニン（例えば、Ｎ６−メチル−アデニン、８−オキソ−アデニン））が挙げられる。またこのような塩基は、万能な塩基（例えば、４−メチル−インドール、５−ニトロ−インドール、３−ニトロピロール、Ｐ−塩基、および、Ｋ−塩基）、芳香環系（例えば、ベンズイミダゾール、または、ジクロロ−ベンズイミダゾール、１−メチル−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−カルボン酸アミド）、芳香環系（例えば、フルオロベンゼン、または、ジフルオロベンゼン）、または、水素原子（ｄスペーサー）で置換することもできる。好ましい塩基の修飾は、ウラシル、および、７−デアザ−グアニンである。これらの修飾されたＵ核酸塩基、および、それに対応するリボヌクレオシドは、商業的な供給元より入手可能である。
【００６７】
修飾されたＧ核酸塩基の具体的な実施態様としては、Ｎ２−ジメチルグアニン、７−デアザグアニン、８−アザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン、７−デアザ−７−（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルグアニン、７−デアザ−８−置換グアニン、８−ヒドロキシグアニン、６−チオグアニン、および、８−オキソグアニンが挙げられる。一実施態様において、修飾されたＧ核酸塩基は、８−ヒドロキシグアニンである。これらの修飾されたＧ核酸塩基、および、それに対応するリボヌクレオシドは、商業的な供給元より入手可能である。
【００６８】
具体的な実施態様において、少なくとも１個のβ−リボース単位は、β−Ｄ−デオキシリボース、または、修飾糖単位で置き換えられていてもよく、ここでこのような修飾糖単位は、例えば、β−Ｄ−リボース、α−Ｄ−リボース、β−Ｌ−リボース（「鏡像体分子（Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）」として）、α−Ｌ−リボース、２’−アミノ−２’−デオキシリボース、２’−フルオロ−２’−デオキシリボース、２’−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−リボース［好ましくは２’−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−リボースは、２’−Ｏ−メチルリボースである］、２’−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル−リボース、２’−［Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル］−リボース、ＬＮＡ、および、α−ＬＮＡ（Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｐ等（２００２）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ８：７１２〜２２）、β−Ｄ−キシロ−フラノース、α−アラビノフラノース、２’−フルオロアラビノフラノース、および、炭素環、および／または、鎖が開環した糖の類似体（例えば、Ｖａｎｄｅｎｄｒｉｅｓｓｃｈｅ等（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：７２２３で説明されている）、および／または、ｂｉｃｙｃｌｏｓｕｇａｒ類似体（例えば、Ｔａｒｋｏｖ  Ｍ等（１９９３）Ｈｅｌｖ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ７６：４８１で説明されている）から選択される。
【００６９】
あるいは、本発明の免疫刺激性ＯＲＮの個々のリボヌクレオチドおよびリボヌクレオシドは、非ヌクレオチドリンカーで連結されていてもよく、具体的には、脱塩基リンカー（ｄスペーサー）、トリエチレングリコール単位、または、ヘキサエチレングリコール単位で連結されていてもよい。さらなるリンカーの例は、アルキルアミノリンカーであり、例えばＣ３、Ｃ６およびＣ１２アミノリンカーであり、さらにアルキルチオールリンカーでもよく、例えばＣ３またはＣ６チオールリンカーである。あるいは、本発明の免疫刺激性ＯＲＮの個々のヌクレオチドおよびリボヌクレオシドは、芳香族残基で連結されていてもよく、このような芳香族残基は、さらにアルキルまたは置換アルキル基で置換されていてもよい。
【００７０】
ＲＮＡは、３’−５’ホスホジエステル結合を介して連結されたリボヌクレオチドのポリマーである。また本発明の免疫刺激性ＯＲＮのヌクレオチドは、３’−５’ホスホジエステル結合を介して連結されていてもよい。しかしながら、本発明はまた、通常ではないインターヌクレオチド結合を有する免疫刺激性ＯＲＮも包含し、このような通常ではないインターヌクレオチド結合としては、具体的には５’−５’、３’−３’、２’−２’、２’−３’、および、２’−５’インターヌクレオチド結合が挙げられる。一実施態様において、１個またはそれより多くのこのような通常ではない結合が本免疫刺激性ＯＲＮ内のどこかに存在する可能性があるが、このような通常ではない結合は、免疫刺激性ＲＮＡモチーフからは除外される。遊離末端を有する免疫刺激性ＯＲＮの場合、１個の３’−３’インターヌクレオチド結合を含ませることによって、２個の遊離の５’末端を有する免疫刺激性ＯＲＮが生じる可能性がある。逆に言えば、遊離末端を有する免疫刺激性ＯＲＮの場合、１個の５’−５’インターヌクレオチド結合を含ませることによって、２個の遊離の３’末端を有する免疫刺激性ＯＲＮが生じる可能性がある。
【００７１】
本発明の免疫刺激性組成物は、２種またはそれより多くの免疫刺激性ＲＮＡモチーフを含んでいてもよく、これらのモチーフは分岐した単位を介して連結されていてもよい。そのインターヌクレオチド結合は、３’−５’、５’−５’、３’−３’、２’−２’、２’−３’、または、２’−５’結合であり得る。それによって、リボースの炭素原子に従い２’−５’という学術名が選択される。通常ではないインターヌクレオチド結合は、ホスホジエステル結合であり得るが、その代わりに、ホスホロチオエート、または、本明細書において説明されているようなその他のあらゆる修飾された結合のように修飾されていてもよい。以下の式は、ヌクレオチドの分岐した単位を介した本発明の分岐状の免疫刺激性ＯＲＮの一般構造を示す。これに関して、Ｎｕ１、Ｎｕ２およびＮｕ３は、３’−５’、５’−５’、３’−３’、２’−２’、２’−３’、または、２’−５’−結合を介して連結されていてもよい。また免疫刺激性ＯＲＮの分岐は、非ヌクレオチドリンカー、および、脱塩基スペーサーの使用を含んでいてもよい。一実施態様において、Ｎｕ１、Ｎｕ２およびＮｕ３は、同一または異なる免疫刺激性ＲＮＡモチーフを示す。その他の実施態様において、Ｎｕ１、Ｎｕ２、および、Ｎｕ３は、少なくとも１個の免疫刺激性ＲＮＡモチーフ、および、少なくとも１個の免疫刺激性ＣｐＧ  ＤＮＡモチーフを含む。
【００７２】
【化１】
2009517048.tif 000003
【００７３】
本免疫刺激性ＯＲＮは、２倍化または３倍化する単位（グレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），スターリング，バージニア州）、具体的には３’−３’結合を有する免疫刺激性ＯＲＮを含む単位を含んでいてもよい。一実施態様において、２重の単位は、１，３−ビス−［５−（４，４’−ジメトキシトリチロキシ）ペンチルアミド］プロピル−２−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホアミダイトに基づくものが可能である。一実施態様において、３重の単位は、トリス−２，２，２−［３−（４，４’−ジメトキシトリチロキシ）プロピルオキシメチル］エチル−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホアミダイトの取り込みに基づくものが可能である。本免疫刺激性ＯＲＮが複数の２倍、３倍またはその他の倍数の単位により分岐するとデンドリマーが生じるが、これは、本発明のさらなる実施態様である。本免疫刺激性ＯＲＮの分岐していない形態と比べて異なる免疫作用を有するＴＬＲ３、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８のような免疫刺激性ＲＮＡの場合、分岐状の免疫刺激性ＯＲＮにより、受容体の架橋が形成される可能性がある。加えて、分岐状、または、それ以外のタイプの多量体の免疫刺激性ＯＲＮの合成は、分解に対してＲＮＡを安定化させる可能性があり、弱い、または、有効性が限られたＲＮＡ配列に、治療上有用なレベルの免疫活性を作動させる可能性がある。また本免疫刺激性ＯＲＮは、ペプチドを修飾する試薬、または、オリゴヌクレオチドを修飾する試薬（グレン・リサーチ）から得られたリンカー単位を含んでいてもよい。さらに本免疫刺激性ＯＲＮは、ペプチド（アミド）結合によって上記ポリマーに連結された１個またはそれより多くの天然または非天然のアミノ酸残基を含んでいてもよい。
【００７４】
３’−５’、５’−５’、３’−３’、２’−２’、２’−３’、および、２’−５’インターヌクレオチド結合は、直接の結合であってもよいし、または、間接的な結合であってもよい。このような状況において、直接の結合とは、リンカー成分が介在しない本明細書において開示されたようなリン酸結合または修飾されたリン酸結合を意味する。介在するリンカー成分とは、本明細書において開示されたようなリン酸結合または修飾されたリン酸結合とは異なる有機成分であり、このようなリンカー成分としては、例えば、ポリエチレングリコール、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ｄスペーサー（すなわち、脱塩基デオキシリボヌクレオチド）、２重の単位、または、３重の単位が挙げられる。
【００７５】
具体的な実施態様において、本免疫刺激性ＯＲＮは、その他の物体と共役して、結合体を提供することができる。本明細書で用いられるように、結合体は、疎水性相互作用、および、共有結合によるカップリングなどの何らかの物理化学的な手段で互いに結合したあらゆる２種またはそれより多くの物体の組み合わせを意味する。
【００７６】
その他の実施態様において、本免疫刺激性ＯＲＮは、免疫調節受容体によって認識される低分子量のリガンドに共役されていてもよい。この受容体は、好ましくは、ＴＬＲファミリーに属する受容体であり、例えばＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、または、ＴＬＲ９である。このような低分子量のリガンドは、これらの受容体に関する天然リガンドの模擬体である。例えば、これらに限定されないが、Ｒ−８４８（レシキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ））、Ｒ−８３７（イミキモド；アルダラ（ＡＬＤＡＲＡＴＭ）、３Ｍファーマシューティカルズ（３Ｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））、７−デアザ−グアノシン、７−チア−８−オキソ−グアノシン、および、７−アリル−８−オキソ−グアノシン（ロキソリビン（Ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ））が挙げられ、これらはＴＬＲ７またはＴＬＲ８のいずれかを刺激する。また、３Ｄ−ＭＰＬ（ＴＬＲ４リガンド）のようなＤ−グルコピラノース誘導体も、本免疫刺激性ＯＲＮに共役させてもよい。Ｐａｍ３−Ｃｙｓは、免疫刺激性ＯＲＮに共役させることができるＴＬＲ２リガンドの例である。ＣｐＧモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチドは、ＴＬＲ９リガンドであり、これらはまた、本発明の免疫刺激性ＯＲＮに共役させることができる。一実施態様において、少なくとも１種のＴＬＲ９シグナル伝達を刺激するのに有効なＣｐＧモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチドは、本発明の免疫刺激性ＯＲＮと共役する。様々なＴＬＲに関するリガンドと、１つの分子との共役により、受容体の多重結合が生じる可能性があり、それにより強化された免疫刺激が生じるか、または、このようなリガンドうちいずれか単一種から得られた免疫刺激プロファイルと異なる免疫刺激プロファイルが生じる。
【００７７】
一形態において、本発明は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮと親油性成分との結合体を提供する。具体的な実施態様において、本免疫刺激性ＯＲＮは、親油性成分に共有結合で連結している。このような親油性成分は、一般的に、遊離末端を有する免疫刺激性ＯＲＮの１個またはそれより多くの末端に存在すると予想されるが、具体的な実施態様において、このような親油性成分は、本免疫刺激性ＯＲＮ内のどこに存在していてもよく、従って、本免疫刺激性ＯＲＮは、遊離末端を有していなくてもよい。一実施態様において、本免疫刺激性ＯＲＮは、３’末端を有し、その３’末端に親油性成分が共有結合で連結している。親油性基は、一般的に、コレステリル、改変されたコレステリル、コレステロール誘導体、還元されたコレステロール、置換されたコレステロール、コレスタン、Ｃ１６アルキル鎖、胆汁酸、コール酸、タウロコール酸、デオキシコレート、オレイルリトコール酸、オレオイルコレイン酸（ｏｌｅｏｙｌ  ｃｈｏｌｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、グリコリピド、リン脂質、スフィンゴ脂質、イソプレノイド、例えばステロイド、ビタミン、例えばビタミンＥ、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、脂肪酸エステル、例えばトリグリセリド、ピレン、ポルフィリン、テキサフィリン、アダマンタン、アクリジン、ビオチン、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ジゴキシゲニン、ジメトキシトリチル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、シアニン色素（例えば、Ｃｙ３またはＣｙ５）、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３２５８色素、ソラレン、または、イブプロフェンであり得る。具体的な実施態様において、親油性成分は、コレステリル、パルミチル、および、脂肪酸アシルから選択される。一実施態様において、親油性成分は、コレステリルである。本発明の免疫刺激性ＯＲＮにこのような親油性成分を１個またはそれより多く含むことは、それらにヌクレアーゼによる分解に対するさらに追加の安定性を付与すると考えられる。単一の単一の本発明の免疫刺激性ＯＲＮ中に２個またはそれより多くの親油性成分が存在する場合、それぞれの親油性成分は、その他のあらゆるものから独立して選択することができる。
【００７８】
一実施態様において、親油性基は、本免疫刺激性ＯＲＮのヌクレオチドの２’位に結合している。その代わりに、または、それに加えて、親油性基は、本免疫刺激性ＯＲＮのヌクレオチドの複素環式の核酸塩基に連結していてもよい。親油性成分は、あらゆる適切な直接または間接的な結合を介して、本免疫刺激性ＯＲＮに共有結合で連結していてもよい。一実施態様において、上記結合は直接的な結合であり、エステルまたはアミド結合である。一実施態様において、上記結合は間接的な結合であり、ここで含まれるスペーサー成分は、例えば１個またはそれより多くの脱塩基ヌクレオチド残基、オリゴエチレングリコール、例えばトリエチレングリコール（スペーサー９）、または、ヘキサエチレングリコール（スペーサー１８）、または、アルカン−ジオール、例えばブタンジオールである。
【００７９】
一実施態様において、本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、カチオン脂質、または、カチオン性ペプチドと組み合わせることが有利である。カチオン脂質、および、カチオン性ペプチドは、ＴＬＲ８が見出されているエンドソーム区画への免疫刺激性ＯＲＮの出入りを補助すると考えられる。一実施態様において、このようなカチオン脂質は、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルファート）である。ＤＯＴＡＰは、ＲＮＡオリゴマーを細胞に輸送し、特に、ｐＨに依存してＲＮＡオリゴマーを放出する所であるエンドソーム区画に出入りすると考えられる。一度エンドソーム区画に入ると、ＲＮＡは、所定の細胞内ＴＬＲとと相互作用が可能になり、それにより免疫応答の発生に関与するＴＬＲ媒介シグナル伝達経路を開始させる。ＤＯＴＡＰの代わりに、または、それに加えて、エンドソーム区画へ輸送する物質などの類似の特性を有するその他の物質が用いることができる。その他の脂質調合物としては、例えば、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥＴＭ（特殊なＤＮＡ濃縮エンハンサーを有する非リポソーム性の脂質）、および、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴＴＭ（新規の活性なデンドリマー技術）が挙げられる。リポソームは、ギブコ・ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）から例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ、および、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥＴＭとして市販されており、これらは、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）、および、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）のようなカチオン脂質の形態から形成される。リポソームの製造方法は当業界周知であり、多くの出版物で説明されている。またリポソームは、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  Ｇ（１９８５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３：２３５〜２４１でも総論されている。
【００８０】
一実施態様において、本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、一次および２次構造両方を有する共有結合で閉環したダンベル型の分子の形態である。以下で説明されているように、一実施態様において、このような環状オリゴリボヌクレオチドは、介在する二本鎖セグメントで連結された２つの一本鎖ループを含む。一実施態様において、少なくとも１個の一本鎖ループに、本発明の免疫刺激性ＲＮＡモチーフが含まれる。本発明のその他の共有結合で閉環したダンベル型の分子は、二本鎖セグメントが少なくとも部分的にＤＮＡであるキメラＤＮＡ：ＲＮＡ分子（例えば、ホモ二量体のｄｓＤＮＡ、または、ヘテロ二量体のＤＮＡ：ＲＮＡのいずれか）を含み、少なくとも１個の一本鎖ループに、本発明の免疫刺激性ＲＮＡモチーフが含まれる。あるいは、このようなキメラ分子の二本鎖化されたセグメントは、ＲＮＡである。
【００８１】
具体的な実施態様において、本免疫刺激性ＯＲＮは、単離される。単離された分子は、実質的に純粋な分子であり、自然状態で、または、インビボの系において通常見出されるその他の物質をその目的とする用途にとって実用的で適切な程度に含まない。具体的には、本免疫刺激性ＯＲＮは、例えば医薬製剤の生産において有用となるように十分に純粋であり、細胞のその他の生物学的な成分から十分に分離されている。医薬製剤中において、単離された本発明の免疫刺激性ＯＲＮは製薬上許容できるキャリアーと混合された状態であるため、このような製剤中に含まれる免疫刺激性ＯＲＮの重量パーセントの割合は極めてわずかでもよい。それでもなお、本免疫刺激性ＯＲＮは、生物系に付随する可能性がある物質から実質的に分離されているという点で、実質的に純粋である。
【００８２】
本発明における使用に関して、本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、当業界周知の多数の手法のいずれかを用いて、または、それらに基づいてデノボ合成することができる。例えば、β−シアノエチルホスホアミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ  ＳＬ等（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２２：１８５９）；ヌクレオシドＨ−ホスホナート方法（Ｇａｒｅｇｇ  Ｐ等（１９８６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２７：４０５１〜４；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  ＢＣ等（１９８６）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １４：５３９９〜４０７；Ｇａｒｅｇｇ  Ｐ等（１９８６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２７：４０５５〜８；Ｇａｆｆｎｅｙ  ＢＬ等（１９８８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２９：２６１９〜２２）である。これらの化学的方法は、市販の様々な自動式の核酸シンセサイザーによって行うことができる。本発明に従って有用なさらなる合成方法が、Ｕｈｌｍａｎｎ  Ｅ等（１９９０）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９０：５４４〜８４、および、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ  Ｊ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １：１６５で開示されている。
【００８３】
オリゴリボヌクレオチド合成は、溶液中、または、固相支持体上のいずれかで行うことができる。溶液中では、ブロックカップリング反応（二量体、三量体、四量体など）が好ましく、一方、固相合成は、好ましくは、モノマーのビルディングブロックを用いた段階的な工程で行われる。様々な化学法、例えばホスホトリエステル法、Ｈ−ホスホナート法、および、ホスホアミダイト法が説明されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  Ｆ（１９９１）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬプレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ），オックスフォード）。ホスホトリエステル法において、反応性のリン基は酸化状態＋Ｖであるが、ホスホアミダイトおよびＨ−ホスホナートアプローチに従ったカップリング反応では、より高い反応性を有するリン＋ＩＩＩ誘導体が用いられる。後者の２種のアプローチにおいて、リンは、カップリング工程の後に酸化され、安定なＰ（Ｖ）誘導体が生じる。酸化剤がヨウ素／水／塩基である場合、脱保護の後にホスホジエステルが得られる。それに対して、酸化剤が、ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）試薬のような硫化剤である場合、脱保護の後にホスホロチオエートが得られる。
【００８４】
効率的なオリゴリボヌクレオチド合成方法は、ＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓによって最初に説明されたオリゴデオキシヌクレオチドのようなホスホアミダイト化学法を用いた固形支持体による合成の組み合わせである。Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  ＭＤ等（１９８１）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １０３：３１８５。
【００８５】
オリゴリボヌクレオチドの合成は、オリゴデオキシヌクレオチドに類似しているが、オリゴリボヌクレオチドに存在する２’−ヒドロキシ基を、適切なヒドロキシ保護基で保護する必要があるという違いがある。このような単量体は、例えばＲＮＡモノマーのビルディングブロックにおいて２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基で保護することができる。しかしながら、２’−Ｏ−トリイソプロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）基を含む単量体（ＴＯＭで保護された基（ＴＯＭ−Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ−ＧｒｏｕｐＴＭ））を用いたＲＮＡ合成が、より高いカップリング効率を生じることが報告されており、これはなぜなら、ＴＯＭで保護された基は、ＴＢＤＭＳ基よりも低い立体障害を示すためである。ＴＢＤＭＳ保護基はフッ化物を用いて除去されるが、ＴＯＭ基の迅速な脱保護は、エタノール／水中のメチルアミンを用いて室温で達成される。オリゴ（リボ）ヌクレオチド合成において、３’−から５’末端への鎖の伸長が好ましく、これは、３’−リン（ＩＩＩ）基またはその活性化された誘導体を有するリボヌクレオチド単位の、その他のヌクレオチド単位の遊離の５’−ヒドロキシ基へのカップリングによって達成される。
【００８６】
合成は、自動的なＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて行うことが都合がよい。それによって、シンセサイザーの供給元が推奨するような合成サイクルを用いることができる。リボヌクレオシドホスホアミダイト単量体の場合、カップリング時間は、デオキシヌクレオシド単量体に比べて長い（例えば、４００秒）。固体支持体としては、５００〜１０００Åの制御多孔質ガラス（ＣＰＧ）支持体、または、有機ポリマー支持体、例えばプライマー支持体ＰＳ２００（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を用いることができる。このような固体支持体は通常、第一のヌクレオシドを含み、このような第一のヌクレオシドとしては、例えばその３’末端を介して結合した５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−６−ベンゾイルアデノシンが挙げられる。トリクロロ酢酸を用いて５’−Ｏ−ジメトキシトリチル基を切断した後、例えば５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−が保護された−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−ヌクレオシド−３’−Ｏ−ホスホアミダイトを用いて鎖の伸長が達成される。連続的にサイクルを繰り返した後、支持体から完成したオリゴリボヌクレオチドを切断し、濃アンモニア／エタノール（３：１、ｖ：ｖ）で３０℃で２４時間処理することによって脱保護する。最終的に、ＴＢＤＭＳブロック基はトリエチルアミン／ＨＦを用いて切断される。未精製のオリゴリボヌクレオチドは、イオン交換高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン対逆相ＨＰＬＣ、または、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって精製して、マススペクトロメトリーで特徴付けることができる。
【００８７】
５’−結合体の合成は、固相合成で、末端のヌクレオチドの５’−ヒドロキシ基にライゲーションしようとする分子のホスホアミダイトをカップリングすることによって直線的に進行する。このようなリガンドの様々なホスホアミダイト誘導体、例えばコレステロール、アクリジン、ビオチン、プソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎｅ）、エチレングリコール、または、アミノアルキル残基は、市販されている。あるいは、アミノアルキル官能基は、固相合成中に導入することができ、これは、活性化された結合体分子、例えば活性エステル、イソチオシアナートまたはヨード−アセトアミドによって合成後に誘導体化が可能である。
【００８８】
３’末端結合体の合成は、通常、それに応じて修飾された固体支持体を用いることによって達成され、このような固体支持体としては、例えば市販のコレステロールで誘導体化された固体支持体が挙げられる。しかしながら、インターヌクレオチド結合の核酸塩基において、または、リボース残基、例えばリボースの２’位において共役が形成されてもよい。
【００８９】
環状オリゴリボヌクレオチドの場合、オリゴヌクレオチド鎖の伸長は、標準的なホスホアミダイト化学法を用いてヌクレオチドＰＳ固体支持体（グレン・リサーチ）上で行うことができる。続いて、ホスホトリエステルカップリング法を用いて固体支持体上で環化反応を行う（Ａｌａｚｚｏｕｚｉ等（１９９７）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １６：１５１３〜１４）。最終的な水酸化アンモニウムを用いた脱保護の際に、実質的に溶液中に形成された生成物のみが、望ましい環状オリゴヌクレオチドである。
【００９０】
本発明の環状オリゴリボヌクレオチドは、ＲＮＡの閉環した形態を含み、さらに、一本鎖ＲＮＡを含んでいてもよく、二本鎖ＲＮＡを含んでいてもよいし、または、含まれなくてもよい。例えば、一実施態様において、環状オリゴリボヌクレオチドは二本鎖ＲＮＡを含み、介在する二本鎖セグメントで連結された２つの一本鎖ループを有するダンベル型のコンフォメーションを有する。共有結合で閉環した、ダンベル型のＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、米国特許第６，８４９，７２５号で説明されている。その他の実施態様において、環状オリゴリボヌクレオチドは二本鎖ＲＮＡを含み、介在する二本鎖セグメントによって連結された３またはそれより多い一本鎖ループを有するコンフォメーションを有する。一実施態様において、免疫刺激性ＲＮＡモチーフは、１またはそれより多くの一本鎖セグメント中に存在する。
【００９１】
本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、単独でも有用であり、または、アジュバントのようなその他の物質と組み合わせても有用である。本明細書で用いられるアジュバントは、抗原に応答して、例えば体液性および／または細胞性免疫応答に対して免疫細胞の活性化を強化する抗原以外の物質を意味する。アジュバントは、抗原特異的な免疫応答を強化するために補助細胞の蓄積および／または活性化を促進する。アジュバントを用いて、ワクチン、すなわち抗原に対する防御免疫を誘導するのに用いられる抗原を含む組成物の有効性を強化することができる。
【００９２】
アジュバントとしては、一般的に、持続作用をもたらすアジュバント、免疫刺激性のアジュバント、および、持続作用をもたらし免疫系を刺激するアジュバントが挙げられる。本明細書で用いられる持続作用をもたらすアジュバントとは、抗原を体内でゆっくり放出させることによって、免疫細胞の抗原への曝露期間を長くするアジュバントである。このクラスのアジュバントとしては、これらに限定されないが、アラム（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）；エマルジョンベースの調合物、例えば、鉱油、非鉱物性の油、油中水型または油中水中油型エマルジョン、水中油型エマルジョン、例えばモンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）アジュバントのＳｅｐｐｉｃ  ＩＳＡシリーズ（例えば、モンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）ＩＳＡ７２０；エアーリキッド（ＡｉｒＬｉｑｕｉｄｅ），パリ，フランス）；ＭＦ−５９（スパン（Ｓｐａｎ）８５およびトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０で安定化された水中スクアレン型のエマルジョン；カイロン社（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），エミリービル，カリフォルニア州）；および、ＰＲＯＶＡＸ（安定化洗浄剤、および、ミセル形成剤を含む水中油型エマルジョン；ＩＤＥＣファーマシューティカルズ社（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），サンディエゴ，カリフォルニア州）が挙げられる。
【００９３】
免疫刺激性のアジュバントとは、免疫系の細胞の活性化を引き起こすアジュバントである。このようなアジュバントは、例えば、免疫細胞にサイトカインを生産させ、それらを分泌させることができる。このクラスのアジュバントとしては、これらに限定されないが、キラヤ・サポナリア（Ｑ．ｓａｐｏｎａｒｉａ）の樹皮から精製したサポニン類、例えばＱＳ２１（ＨＰＬＣ分画化にて２１番目のピークで溶出させたグリコリピド；アクイラ・ファーマシューティカルズ社（Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．），ウースター，マサチューセッツ州）；ポリ［ジ（カルボキシラートフェノキシ）ホスファゼン（ＰＣＰＰポリマー；ウイルス・リサーチ・インスティテュート（Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ），米国）；リポ多糖類の誘導体、例えばモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ；リビ・イムノケム・リサーチ社（Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．），ハミルトン，モンタナ州）、ムラミールジペプチド（ＭＤＰ；リビ）ａｎｄｔｈｒｅｏｎｙｌ−ムラミールジペプチド（ｔ−ＭＤＰ；リビ）；ＯＭ−１７４（脂質Ａ関連のグルコサミン二糖類；ＯＭファーマ社（ＯＭ  Ｐｈａｒｍａ  ＳＡ），メイリン，スイス）；および、リーシュマニア延長因子（精製したリーシュマニアタンパク質；コリクサ社（Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、シアトル，ワシントン州）が挙げられる。またこのクラスのアジュバントには、ＣｐＧ  ＤＮＡも含まれる。
【００９４】
持続作用をもたらし免疫系を刺激するアジュバントとは、上記で確認された両方の機能を有する化合物である。このクラスのアジュバントとしては、これらに限定されないが、ＩＳＣＯＭＳ（免疫刺激複合体であり、混合されたサポニン類、脂質を含み、抗原を保持できる孔を有するウイルス大の粒子を形成する；ＣＳＬ，メルボルン，オーストラリア）；ＳＢ−ＡＳ２（スミスクライン・ビーチャム（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）の、ＭＰＬおよびＱＳ２１を含む水中油型エマルジョンであるアジュバント系番号２：  スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルズ（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）［ＳＢＢ］，Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ，ベルギー）；ＳＢ−ＡＳ４（ミスクライン・ビーチャムの、アラムおよびＭＰＬを含むアジュバント系番号４；ＳＢＢ、ベルギー）；ミセルを形成する非イオン性ブロックコポリマー、例えばＣＲＬ１００５（これらは、ポリオキシエチレン鎖を端に有する疎水性ポリオキシプロピレンの直鎖状の鎖を含む；バクセル社（Ｖａｘｃｅｌ，Ｉｎｃ．），ノークロス，ジョージア州）；および、シンテックスのアジュバント調合物（Ｓｙｎｔｅｘ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）（ＳＡＦ、トゥイーン８０、および、非イオン性ブロックコポリマーを含む水中油型エマルジョン；シンテックス・ケミカルズ社（Ｓｙｎｔｅｘ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．），ボルダー，コロラド州）が挙げられる。
【００９５】
本発明は、一形態において、本発明の免疫刺激性ＯＲＮそのものを含むアジュバントを提供する。その他の実施態様において、本発明は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮ、および、少なくとも１種のその他のアジュバントを含むアジュバント（混合型のアジュバント）を提供する。その他のアジュバントとしては、持続作用をもたらすアジュバント、免疫刺激性のアジュバント、持続作用をもたらし免疫系を刺激するアジュバント、および、それらのあらゆる組み合わせが挙げられる。一実施態様において、本発明の免疫刺激性ＯＲＮ、および、少なくとも１種のその他のアジュバントは、互いに共有結合で連結している。本発明に係る混合型のアジュバントは、本免疫刺激性ＯＲＮ単独の作用と少なくとも１種のその他のアジュバント単独の作用との合計と比較して、相乗的な免疫刺激作用を示す可能性がある。それに加えて、または、その代わりに、本発明に係る混合型のアジュバントは、本免疫刺激性ＯＲＮ単独、または、少なくとも１種のその他のアジュバント単独のいずれかの免疫刺激プロファイルと比較して、変更された免疫刺激プロファイルを示す可能性がある。例えば、混合型のアジュバントは、一実施態様において、Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫促進のよりバランスの取れた形態を提供する可能性があり、または、その他の実施態様において、より高度にＴｈ１／Ｔｈ２免疫促進に偏向した形態を提供する可能性がある。当業者であれば、望ましいタイプの免疫促進、例えばよりバランスの取れた免疫促進、または、より高度にＴｈ１およびＴｈ２の特徴に偏向した免疫促進を促進することができる個々の構成要素を選択する方法を認識していると思われる。以下で、Ｔｈ１およびＴｈ２をさらに説明する。
【００９６】
また、本発明の免疫刺激性ＯＲＮ、それに加えてその他のアジュバントを含む組成物も提供され、ここでその他のアジュバントは、サイトカインである。一実施態様において、本組成物は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮおよびサイトカインの結合体である。
【００９７】
サイトカインは、炎症性および免疫応答を媒介する多くのタイプの細胞によって生産された可溶性タンパク質および糖タンパク質である。サイトカインは、細胞を補充するため、および、それらの機能および増殖を調節するために、局所的に、加えて全身に作用する免疫系の細胞間のコミュニケーションを媒介する。サイトカインのカテゴリーとしては、先天性免疫の媒介物質および調節因子、適応免疫の媒介物質および調節因子、ならびに、造血の刺激因子が挙げられる。サイトカインとしては、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、および、インターロイキン１９〜３２（ＩＬ−１９〜ＩＬ−３２）が特に挙げられる）、ケモカイン（例えば、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−３α、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、エオタキシン、Ｉ−ＴＡＣ、および、ＢＣＡ−１が特に挙げられる）が挙げられ、加えて、その他のサイトカインとしては、１型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−γ、および、ＩＦＮ−β）、２型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）、および、様々なコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、および、Ｍ−ＣＳＦが挙げられる。
【００９８】
また、本発明の免疫刺激性ＯＲＮ、それに加えて免疫刺激性ＣｐＧ核酸を含む組成物も提供される。一実施態様において、本組成物は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮ、および、ＣｐＧ核酸の結合体であり、例えばＲＮＡ：ＤＮＡ結合体である。一実施態様において、本組成物は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮ、および、ＣｐＧ核酸の混合物であり、すなわちＲＮＡ：ＤＮＡ結合体ではない。
【００９９】
本明細書で用いられる免疫刺激性ＣｐＧ核酸は、ＣｐＧモチーフを含み、免疫系の細胞活性化または増殖を刺激する天然または合成ＤＮＡ配列を意味する。免疫刺激性ＣｐＧ核酸は、多数の発行された特許、公開された特許出願、および、その他の出版物で説明されており、例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；６，２０７，６４６号；６，２１４，８０６号；６，２１８，３７１号；６，２３９，１１６号；および、６，３３９，０６８号で説明されている。一実施態様において、免疫刺激性ＣｐＧ核酸は、長さが６〜１００個のヌクレオチドのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧＯＤＮ）である。一実施態様において、免疫刺激性ＣｐＧ核酸は、長さが８〜４０個のヌクレオチドのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧＯＤＮ）である。
【０１００】
免疫刺激性ＣｐＧ核酸としては、様々なクラスのＣｐＧ核酸が挙げられる。１つのクラスは、Ｂ細胞の活性化に関して有力だが、ＩＦＮ−γの誘導およびＮＫ細胞の活性化においては比較的弱い；このクラスは、Ｂクラスと名付けられている。ＢクラスのＣｐＧ核酸は、典型的には、完全に安定化されており、所定の好ましい塩基の構成内に非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；６，２０７，６４６号；６，２１４，８０６号；６，２１８，３７１号；６，２３９，１１６号；および、６，３３９，０６８号を参照。その他のクラスは、ＩＦＮ−γの誘導、および、ＮＫ細胞の活性化に関して有力だが、Ｂ細胞の刺激に関しては比較的弱い；このクラスは、Ａクラスと名付けられている。ＡクラスのＣｐＧ核酸は、典型的には、５’および３’末端のいずれか、または、その両方に少なくとも６個のヌクレオチド、および、安定化されたポリＧ配列を有するパリンドロームのホスホジエステルＣｐＧジヌクレオチドを含む配列を有する。例えば、公開された国際特許出願ＷＯ０１／２２９９０を参照。ＣｐＧ核酸のさらにその他のクラスは、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を活性化し、ＩＦＮ−γを誘導する；このクラスは、Ｃクラスと名付けられている。最初に特徴付けられたＣクラスのＣｐＧ核酸は、典型的には、完全に安定化されており、Ｂクラスタイプの配列、および、ＧＣリッチなパリンドローム、または、パリンドロームに近い形態などを含む。このクラスは、公開された米国特許出願第２００３／０１４８９７６号で説明されている、（その全内容をこの参照により開示に含める）。
【０１０１】
また免疫刺激性ＣｐＧ核酸には、公開された米国特許出願第２００３／０１４８９７６号（その全内容をこの参照により開示に含める）で開示されたようないわゆる軟質の切断され易いＣｐＧ核酸も含まれる。このような軟質の切断され易い免疫刺激性ＣｐＧ核酸は、ヌクレアーゼ耐性およびヌクレアーゼ感受性のインターヌクレオチド結合の組み合わせを包含し、ここでこれらの異なるタイプの結合は所定のルールに従って配置される。
【０１０２】
また、本発明の免疫刺激性ＯＲＮ、それに加えてその他のアジュバントを含む組成物も提供され、ここでその他のアジュバントは、Ｐａｍ３Ｃｙｓのようなリポペプチド、カチオン性多糖類、例えばキトサン、または、カチオン性ペプチド、例えばプロタミンである。一実施態様において、本組成物は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮ、および、このようなその他のアジュバントの結合体である。
【０１０３】
本発明は、一形態において、本発明の免疫刺激性ＯＲＮと抗原とを含むワクチンを提供する。本明細書で用いられる「抗原」は、Ｔ細胞抗原受容体、または、Ｂ細胞抗原受容体によって認識が可能なあらゆる分子を意味する。この用語は、典型的には、宿主免疫系によって外来と認識されるあらゆるタイプの分子を含む。抗原としては、一般的に、これらに限定されないが、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖類、多糖類結合体、ペプチド、および、多糖類ならびにその他の分子の非ペプチドミミック、低分子物質、脂質、糖脂質、多糖類、炭水化物、ウイルスおよびウイルス抽出物、ならびに、多細胞生物、例えば寄生体、および、アレルゲンが挙げられる。タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである抗原に関して、このような抗原は、このような抗原をコードする核酸分子を含んでいてもよい。抗原としては、より具体的には、これらに限定されないが、癌抗原、例えば、癌細胞、および、癌細胞内またはその表面で発現された分子；微生物抗原、例えば、微生物、および、微生物内またはその表面で発現された分子；および、アレルゲンが挙げられる。従って、具体的な実施態様において、本発明は、癌、感染因子およびアレルゲンのためのワクチンを提供する。
【０１０４】
本発明は、一形態において、被検体にワクチン接種するための医薬品の製造のための本発明の免疫刺激性ＯＲＮの使用を提供する。
本発明は、一形態において、ワクチンを製造する方法を提供する。本方法は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮを、抗原、および任意に製薬上許容できるキャリアーに密接に接触させる工程を含む。
【０１０５】
様々な実施態様において、抗原とは、微生物抗原、癌抗原、または、アレルゲンである。本明細書で用いられる「微生物抗原」は、これらに限定されないがウイルス、細菌、寄生体、および、菌類などの微生物に由来する抗原である。このような抗原としては、無傷の微生物、加えて、天然の分離菌、および、それらの断片または誘導体が挙げられ、さらに加えて天然の微生物抗原と同一であるか、または、それらに類似しており、その微生物に特異的な免疫応答を誘導する合成化合物も挙げられる。ある化合物が天然の微生物抗原に対して（体液性および／または細胞性）免疫応答を誘導する場合、その化合物は天然の微生物抗原に類似している。このような抗原は、当業界における慣例的手順で用いられ、当業者周知である。
【０１０６】
ウイルスは、一般的に核酸コアと外殻タンパク質コートとを含む小さい感染因子であるが、単独で生存する生物ではない。またウイルスは、タンパク質が欠失した感染性の核酸の形態をとることも可能である。ウイルスは、ウイルスを複製することができる生きた細胞がないと生存することができない。ウイルスは、エンドサイトーシス、または、ＤＮＡ（ファージ）の直接的な注入のいずれかによって特定の生きた細胞に侵入し、増殖し、病気を引き起こす。続いて複製されたウイルスは、放出されて、さらなる細胞に感染することができる。ある種のウイルスは、ＤＮＡ含有ウイルスであり、その他のウイルスは、ＲＮＡ含有ウイルスである。いくつかの形態において、本発明はまた、病気の進行にプリオンが関与する病気を治療することも目的とし、このような病気としては、例えば牛海綿状脳症（すなわち、狂牛病、ＢＳＥ）、または、動物におけるスクラピー感染、もしくは、ヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病が挙げられる。
【０１０７】
ウイルスとしては、これらに限定されないが、エンテロウイルス（例えば、これらに限定されないが、ピコルナウイルス科のウイルスが挙げられ、例えばポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルスなど）、ロタウイルス、アデノウイルス、肝炎ウイルスが挙げられる。ヒトに見出されるウイルスの具体的な例としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウィルス、例えばＨＩＶ−１（また、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、または、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、または、ＨＩＶ−ＩＩＩとも称される；および、その他の分離株、例えばＨＩＶ−ＬＰ；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウィルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸系発疹ウイルス）；オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（例えば、ハンターンウイルス、ブンヤウイルス、フレボウイルス、および、ナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、および、ロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウィルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）１型および２型、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ））；ポックスウイルス科（痘瘡ウィルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；イリドウイルス科（例えば、アフリカ豚コレラウイルス）；および、未分類のウイルス（例えば、海綿状脳症の病原因子、デルタ肝炎因子（Ｂ型肝炎ウィルスの欠陥のある付随体と考えられる）、非Ａ型、非Ｂ型肝炎因子（クラス１＝内部に浸透；クラス２＝非経口的に浸透（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークおよび関連ウイルス、ならびに、アストロウイルス）が挙げられる。
【０１０８】
細菌は、二分裂により無性的に増殖する単細胞生物である。細菌は、それらの形態、染色反応、栄養および代謝条件、抗原の構造、化学組成、および、遺伝学的な相同性に基づいて分類され、命名される。細菌は、それらの形態学的な形状、球状（球菌）、直線的な杆状（バチルス）、および、曲がった、または、らせん形の杆状（ビブリオ、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、らせん菌、および、スピロヘータ）に基づいて３つのグループに分類することができる。また細菌は、より一般的には、それらの染色反応に基づいて２つのクラスの生物、すなわち、グラム陽性およびグラム陰性にも分類される。グラムとは、微生物学研究の場で一般的に行われる染色方法を意味する。グラム陽性の生物は、染色手順後も染色を保持し、濃い紫色に見える。グラム陰性の生物は染色を保持しないが、逆の色素を吸収するため、ピンク色に見える。
【０１０９】
感染性の細菌としては、これらに限定されないが、グラム陰性、および、グラム陽性細菌が挙げられる。グラム陽性細菌としては、これらに限定されないが、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）の種、ブドウ球菌属の種、および、連鎖球菌属の種が挙げられる。グラム陰性細菌としては、これらに限定されないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シュードモナス属の種、および、サルモネラ属の種が挙げられる。感染性の細菌の具体的な例としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、マイコバクテリウム属の種（例えば、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、トリ結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、バテー杆菌（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウム・ゴルドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ））、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌属）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌属）、連鎖球菌属（ビリダンス群）、ストレプトコッカス・フェカーリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）、連鎖球菌属（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌、病原性のカンピロバクター属の種、エンテロコッカス属の種、ヘモフィルス・インフルエンゼ、炭素菌、コリネバクテリウム・ジフセリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム属の種、豚丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、パラウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、動物パスツレラ症病原菌（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイド属、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバシラス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、トレポネーマ・ペルテニュ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ属、リケッチア属、および、アクチノマイセス・イスラエリイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｌｉ）。
【０１１０】
寄生体は、生存するためにその他の生物に依存している生物であり、従って、それらの生活環を継続するためにその他の生物に侵入または感染しなければならない。感染した生物、すなわち宿主は、寄生体に栄養と生息環境の両方を提供する。その最も広い意味において、寄生体という用語は、全ての感染因子（すなわち、細菌、ウイルス、菌類、原生動物、および、蠕虫類）を含む場合があるが、一般的に言えば、この用語は、単に原生動物、蠕虫類、および、外部寄生する節足動物（例えば、マダニ、それ以外のダニ類など）を意味するものとして用いられる。原生動物は、細胞内および細胞外の両方で、具体的には血液、腸管、または、組織の細胞外マトリックス内で複製が可能な単細胞生物である。蠕虫類は、ほとんどの場合、細胞外に存在する多細胞生物である（例外は、旋毛虫属の種である）。蠕虫類は、通常、最初の宿主から出て、複製のために第二の宿主に移ることが必要である。これらの上述のクラスに対して、外部寄生する節足動物は、宿主の体の外表面と寄生的な関係を形成する。
【０１１１】
寄生体としては、細胞内寄生体、および、偏性細胞内寄生体が挙げられる。寄生体の例としては、これらに限定されないが、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）、Ｐｌａｓｍｄｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、バベシア・ディバージエンス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）、大型リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）、ドノバン・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ）、ブラジルリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ）、熱帯リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ）、ガンビアトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｇａｍｂｉｅｎｓｅ）、ローデシアトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ）、および、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）が挙げられる。
【０１１２】
菌類は、真核生物であり、そのうち脊椎のある哺乳動物において感染を引き起こすものはわずかである。なぜなら菌類は真核生物であり、これらは、サイズ、構造的な構成、生活環、および、増殖メカニズムにおいて原核性の細菌とは顕著に異なる。菌類は、一般的に、形態学的な特徴、繁殖様式、および、培養の特徴に基づいて分類される。菌類は、被検体において様々なタイプの病気を引き起こす可能性があり、このような病気としては、例えば真菌性の抗原を吸い込んだ後の呼吸器系のアレルギー、タマゴテングタケ（Ａｍａｎｉｔａ  ｐｈａｌｌｏｉｄｅｓ）の毒素、および、毒茸によって生産されたファロトキシン、および、アスペルギルス属の種によって生産されたアフラトキシン類のような有毒物質の摂取による真菌の中毒が挙げられるが、全ての菌類が感染症を引き起こすわけではない。
【０１１３】
感染性の菌類は、全身性または表面の感染を引き起こす可能性がある。正常な健康な被検体においては、一次的な全身性の感染が起こる可能性があり、免疫無防備状態の被検体においては、日和見感染が最も高頻度で見出される。一次的な全身性の感染を引き起こす最も一般的な真菌性の因子としては、ブラストミセス属、コクシジオイデス属、および、ヒストプラスマ属が挙げられる。免疫無防備状態の、または、免疫抑制された被検体において日和見感染を引き起こす一般的な菌類としては、これらに限定されないが、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、および、様々なアスペルギルス属の種が挙げられる。全身性真菌感染とは、内臓の侵襲性の感染である。このような生物は、肺、消化管、または、静脈内カテーテルを介して体内に侵入することが一般的である。これらのタイプの感染は、主要な病原性真菌、または、日和見真菌によって引き起こされる可能性がある。
【０１１４】
体表の真菌感染は、内部組織への侵入を起こさない外表面上での菌類の増殖に関する。典型的な体表の真菌感染としては、皮膚、毛髪または爪などの皮膚の真菌感染が挙げられる。
【０１１５】
真菌感染に関連する病気としては、アスペルギルス症、分芽菌症、カンジダ症、色素酵母菌症、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、真菌による眼感染症、真菌の毛髪、爪および経膚感染、ヒストプラスマ症、ロボ真菌症、菌腫、耳真菌症、パラコクシジオイデス症、播種性のペニシリウム・マルネッフィ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）、黒色菌糸症、リノスポリジウム症、スポロトリクム症、および、接合菌症が挙げられる。
【０１１６】
その他の医学上関連する微生物は、文献で広範囲にわたり説明されており、例えば、Ｃ．Ｇ．Ａ  Ｔｈｏｍａｓ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ  Ｔｉｎｄａｌｌ，英国１９８３（その全内容を参照により本発明に含める）を参照。上記で列挙したものはそれぞれ説明のためであり、それらに制限することは目的としない。
【０１１７】
本明細書で用いられる用語「癌抗原」および「腫瘍抗原」は、同じ意味で用いられており、腫瘍または癌細胞に結合し、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に関連して抗原提示細胞の表面で発現される場合に免疫応答を惹起することができるペプチド、タンパク質または糖タンパク質のような化合物を意味する。癌抗原は、癌細胞によって差異的に発現されるため、癌細胞を標的とするために活用することができる。癌抗原とは、腫瘍特異的と思われる免疫応答を刺激することが可能な抗原である。これらの抗原の一部は、必ずしも発現されないが、正常な細胞によってコードされている。これらの抗原は、正常な細胞では通常はサイレントである（すなわち発現されない）抗原、所定の分化段階でのみ発現される抗原、および、胚性および胎児性抗原のような一時的に発現される抗原のように特徴付けることができる。その他の癌抗原は、突然変異した細胞性遺伝子、例えば腫瘍遺伝子（例えば、活性化されたｒａｓ腫瘍遺伝子）、サプレッサー遺伝子（例えば、突然変異ｐ５３）、内部の欠失または染色体転座によって生じた融合タンパク質によってコードされている。さらにその他の癌抗原は、例えばＲＮＡおよびＤＮＡ腫瘍ウイルスが有するウイルス遺伝子によってコードされたものがある。
【０１１８】
癌抗原は、例えばＣｏｈｅｎ  ＰＡ等（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５４：１０５５〜８で説明されているように未精製の癌細胞抽出物を製造すること、抗原を部分的に精製すること、組換え技術、または、既知の抗原のデノボ合成のいずれかによって癌細胞から製造することができる。癌抗原としては、これらに限定されないが、組換えによって発現される抗原、腫瘍もしくは癌、またはそれらの細胞の免疫原性部分、または、それらの全体が挙げられる。このような抗原は、組換えによって、または、当業界既知のその他のあらゆる手段によって単離または製造することができる。
【０１１９】
腫瘍抗原の例としては、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／メラン（Ｍｅｌａｎ）−Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシン−デアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連の抗原（ＣＲＣ）−−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ならびにその免疫原性エピトープＣＡＰ−１およびＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺に特異的な抗原（ＰＳＡ）、ならびにその免疫原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２およびＰＳＡ−３、前立腺に特異的な膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ゼータ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥ−ファミリー（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５）、腫瘍抗原のＧＡＧＥ−ファミリー（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、および、γ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、腺腫様多発結腸ポリープタンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネクシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２、および、ＧＤ２ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質のようなウイルス産物、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、ｌｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶでコードされた核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１、および、ＣＴ−７、および、ｃ−ｅｒｂＢ−２が挙げられる。この列挙は、限定することを意図していない。
【０１２０】
本明細書で用いられる「アレルゲン」とは、ＩｇＥ生産を特徴とする免疫応答を惹起することができる分子である。またアレルゲンは、感染しやすい被検体においてアレルギー性または喘息性の応答を誘導する可能性がある物質でもある。従って、本発明の状況に関して、アレルゲンという用語は、ＩｇＥ抗体が媒介するアレルギー性応答を開始させることができる特定のタイプの抗原を意味する。
【０１２１】
アレルゲンの種類は膨大であり、例えば、花粉、昆虫毒、動物の鱗屑が細かくなったもの、真菌胞子、および、薬物（例えば、ペニシリン）を挙げることができる。天然の動物および植物アレルゲンの例としては、以下の生物種に特異的なタンパク質が挙げられる：  イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）；ダニ（例えば、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ）；ネコ（Ｆｅｌｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）；ブタクサ（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ）；ライグラス（例えば、Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ、および、Ｌｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）；Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）；アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ）；アルダー；ハンノキ（Ａｌｎｕｓ  ｇｕｌｔｉｎｏｓａ）；カバノキ属（Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）；コナラ属（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ａｌｂａ）；オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａ）；ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）；プランタゴ（例えば、Ｐｌａｎｔａｇｏ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）；イラクサ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ）（例えば、Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、および、Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ）；チャバネゴキブリ属（例えば、Ｂｌａｔｔｅｌｌａ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ）；ミツバチ（例えば、Ａｐｉｓ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）；イトスギ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ）（例えば、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ａｒｉｚｏｎｉｃａ、および、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｍａｃｒｏｃａｒｐａ）；ビャクシン属（例えば、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ、および、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ａｓｈｅｉ）；ヒノキ科クロベ属（Ｔｈｕｙａ）（例えば、Ｔｈｕｙａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）；ヒノキ（例えば、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｏｂｔｕｓａ）；ワモンゴキブリ属（例えば、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）；シバムギ（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ）（例えば、Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｒｅｐｅｎｓ）；ライ麦（例えば、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）；コムギ属（例えば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）；カモガヤ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ）（例えば、Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ）；ウシノケグサ属（例えば、Ｆｅｓｔｕｃａ  ｅｌａｔｉｏｒ）；イチゴツナギ属（例えば、Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ、および、Ｐｏａ  ｃｏｍｐｒｅｓｓａ）；カラスムギ属（例えば、Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）；シラゲガヤ属（例えば、Ｈｏｌｃｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）；ハルガヤ属（例えば、Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ  ｏｄｏｒａｔｕｍ）；リボンガヤ（Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ）（例えば、Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ  ｅｌａｔｉｕｓ）；コヌカグサ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）（例えば、Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ａｌｂａ）；オオアワガエリ属（Ｐｈｌｅｕｍ）（例えば、Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）；クサヨシ属（Ｐｈａｌａｒｉｓ）（例えば、Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）；スズメノヒエ属（例えば、Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ��；モロコシ属（例えば、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｈａｌｅｐｅｎｓｉｓ）；および、ブロムグラス（例えば、Ｂｒｏｍｕｓ  ｉｎｅｒｍｉｓ）。
【０１２２】
本発明は、一形態において、本発明の免疫刺激性ＯＲＮ、および、抗原の結合体を提供する。一実施態様において、本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、抗原に共有結合で連結している。本免疫刺激性ＯＲＮと抗原との間の共有結合は、このようにして連結された本免疫刺激性ＯＲＮおよび抗原が、それぞれ個々の構成要素の測定可能な機能的な活性を保持しさえすれば、あらゆるタイプの適切な共有結合が可能である。一実施態様において、共有結合は、直接的である。その他の実施態様において、共有結合は、間接的である（例えばリンカー成分を介して）。共有結合で結合させた免疫刺激性ＯＲＮおよび抗原は、細胞内で一方から他方が放出されるようにプロセシングを受けてもよい。この方法において、いずれかの構成要素の細胞への送達は、別々の調製物、または、別々の構成要素として投与される場合のその送達と比較して強化される可能性がある。一実施態様において、抗原は抗原そのものであり、すなわち、抗原は、予め形成された抗原である。
【０１２３】
一形態において、本発明は、運搬手段と共に本発明の組成物を含む医薬組成物を提供する。様々な実施態様において、このような運搬手段は、カチオン脂質、リポソーム、渦巻型の手段、ビロゾーム、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、単層の小胞（ＬＵＶ）、多層の小胞、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、エマルソーム（ｅｍｕｌｓｏｍｅ）、および、ポリカチオン性ペプチド、および、任意に製薬上許容できるキャリアーから選択することができる。製薬上許容できるキャリアーは以下で考察される。本発明の医薬組成物は、任意に、さらに抗原を含んでいてもよい。本発明の組成物は、抗原が存在する場合は抗原と共に、あらゆる適切な方法を用いて運搬手段と物理的に結合させる。本免疫刺激性組成物は、運搬手段に内包されてもよいし、または、運搬手段の溶媒に露出した表面上に、または、それに結合して存在していてもよい。一実施態様において、本免疫刺激性ＯＲＮは、運搬手段の溶媒に露出した表面上で、または、それに結合して存在し、抗原が存在する場合、抗原は、運搬手段に内包される。その他の実施態様において、本免疫刺激性ＯＲＮおよび抗原の両方が、運搬手段の溶媒に露出した表面上で、または、それに結合して存在する。さらにその他の実施態様において、抗原が、運搬手段の溶媒に露出した表面上で、または、それに結合して存在し、本免疫刺激性ＯＲＮが、運搬手段に内包される。さらにその他の実施態様において、抗原が含まれる場合、本免疫刺激性ＯＲＮおよび抗原の両方が運搬手段に内包される。
【０１２４】
本発明はまた、本発明の免疫刺激性組成物の使用方法を提供する。一形態において、本発明は、免疫細胞を活性化する方法を提供する。本発明のこの形態に係る方法は、インビトロまたはインビボで免疫細胞と、有効量の本発明の組成物とを接触させ、免疫細胞を活性化する工程を含む。本発明の組成物は、任意に抗原を含んでいてもよい。本明細書で用いられる「免疫細胞」は、先天性または適応免疫応答に関与する可能性がある骨髄から誘導されたあらゆる細胞を意味する。免疫系細胞としては、これらに限定されないが、樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、顆粒球、Ｂリンパ球、血漿細胞、Ｔリンパ球、および、それらの前駆体細胞が挙げられる。
【０１２５】
本明細書で用いられる用語「有効量」は、望ましい生物学的作用を引き起こすのに必要な、または、十分な物質の量を意味する。有効量は、１回の投与で投与される量であってもよいが、それに限定する必要はない。
【０１２６】
本明細書で用いられる用語「免疫細胞を活性化する」は、免疫細胞が、免疫応答に対応して活性化された状態になるように誘導することを意味する。用語「免疫細胞を活性化する」は、免疫応答を誘導すること、および、免疫応答を促進することの両方を意味する。本明細書で用いられる用語「免疫応答」は、エフェクター免疫機能を増大させて、その機能が実行されるように、または、免疫応答に関与する遺伝子産物が生産されるように免疫細胞の活性化を引き起こす先天性または適応免疫応答のあらゆる形態を意味する。免疫応答に関与する遺伝子産物としては、分泌生成物（例えば、抗体、サイトカイン、および、ケモカイン）、加えて、免疫機能に特徴的な細胞内および細胞表面分子（例えば、分化（ＣＤ）抗原の所定のクラスター、転写因子、および、遺伝子転写物）が挙げられる。用語「免疫応答」は、単一の細胞に適応することもできるし、または、細胞群に適応することもできる。
【０１２７】
サイトカインの生産は、数種の当業界周知の方法のいずれかによって評価することができ、このような方法としては、生体反応分析、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、細胞内蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）解析、および、逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる。
【０１２８】
一実施態様において、免疫応答は、炎症誘発性サイトカイン免疫応答の発生に関与する。炎症誘発性サイトカイン免疫応答は、所定のサイトカイン、および、ケモカイン、例えばＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、および、それらのあらゆる組み合わせのいずれかの発現を含む可能性がある。本発明の目的において、特にＩＦＮ−γが排除される。
【０１２９】
一実施態様において、このような免疫応答は、免疫細胞の活性化の細胞表面マーカー、例えばＣＤ２５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、および、ＣＤ１５４のアップレギュレーションに関与する。このようなマーカーの細胞表面における発現を測定する方法は当業界周知であり、例えばＦＡＣＳ解析が挙げられる。
【０１３０】
細胞または細胞群における免疫応答を測定するために、一実施態様において、ＴＬＲ８を発現する細胞または細胞群を用いる。このような細胞は、ＴＬＲを自然に発現するものでもよいし、または、ＴＬＲに適した発現ベクターを細胞に導入することによってＴＬＲが発現されるように操作されたものでもよい。一実施態様において、このような細胞または細胞群は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）として得ることができる。一実施態様において、このような細胞または細胞群は、上記ＴＬＲを発現する細胞系として得ることができる。一実施態様において、このような細胞または細胞群は、上記ＴＬＲを発現する一時的な形質転換体として得ることができる。一実施態様において、このような細胞または細胞群は、上記ＴＬＲを発現する安定な形質転換体として得ることができる。
【０１３１】
また細胞または細胞群において免疫応答を測定するのに使用するためにも、細胞または細胞群に、ＴＬＲによる細胞内シグナル伝達に応答するレポーターコンストラクトを導入することが便利な場合がある。一実施態様において、このようなレポーターは、ＮＦ−κＢプロモーターの制御下に置かれた遺伝子である。一実施態様において、このようなプロモーターの制御下に置かれた遺伝子は、ルシフェラーゼである。適切な活性化の条件下で、ルシフェラーゼレポーターコンストラクトが発現されて、検出可能な光シグナルを放出するが、この光シグナルは、ルミノメーターを用いて定量的に測定することもできる。このようなレポーターコンストラクトおよびその他の適切なレポーターコンストラクトは、市販されている。
【０１３２】
また本発明は、ＴＬＲ活性化を検出する無細胞を利用した方法の使用も考慮する。
本発明は、所定の形態において、治療に使用するための組成物および方法に関する。本発明の免疫刺激性組成物は、単独で用いてもよいし、または、その他の治療剤と組み合わせて用いてもよい。本免疫刺激性組成物およびその他の治療剤は、同時に投与してもよいし、または、連続的に投与してもよい。本発明の免疫刺激性組成物およびその他の治療剤が同時に投与される場合、これらは、同じ調合物で投与してもよいし、または、別々の調合物で投与してもよいが、これらは同時に投与される。加えて、本発明の免疫刺激性組成物およびその他の治療剤が同時に投与される場合、これらは、同じ投与経路で投与してもよいし、または、別々の投与経路で投与してもよいが、これらは同時に投与される。本発明の免疫刺激性組成物の投与が、その他の治療剤の投与から時間的に別々になされる場合、本発明の免疫刺激性組成物およびその他の治療剤は連続的に投与される。これらの化合物が投与される間隔の期間は、分単位でもよいし、または、それより長くてもよい。一実施態様において、本発明の免疫刺激性組成物は、その他の治療剤の投与の前に投与される。一実施態様において、本発明の免疫刺激性組成物は、その他の治療剤の投与の後に投与される。加えて、本発明の免疫刺激性組成物およびその他の治療剤が連続的に投与される場合、これらは、同じ投与経路で投与してもよいし、または、別々の投与経路で投与してもよい。その他の治療剤としては、これらに限定されないが、感染、癌、アレルギーおよび喘息の治療に有用なアジュバント、抗原、ワクチンおよび医薬品が挙げられる。
【０１３３】
一形態において、本発明は、被検体にワクチン接種する方法を提供する。本発明のこの形態に係る方法は、被検体に、抗原および本発明の組成物を投与する工程を含む。一実施態様において、このような抗原の投与は、抗原をコードする核酸の投与を含む。
【０１３４】
本明細書で用いられる「被検体」は、脊椎動物を意味する。様々な実施態様において、上記被検体は、ヒト、ヒト以外の霊長類、または、その他の哺乳動物である。具体的な実施態様において、上記被検体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、または、ウマである。
【０１３５】
被検体にワクチン接種する方法で使用するために、一実施態様において、本発明の組成物は、抗原を含む。このような抗原は、本発明のＯＲＮから分離していてもよいし、または、本発明のＯＲＮに共有結合で連結していてもよい。一実施態様において、本発明の組成物そのものに抗原は含まれない。この実施態様において、抗原は、本発明の組成物と別々に、または、本発明の組成物と共に、のいずれかで被検体に投与することができる。別々の投与には、時間が別々の投与、位置または投与経路が別々の投与、または、時間と位置または投与経路の両方が別々の投与が含まれる。本発明の組成物および抗原が別々の時間に投与される場合、抗原は、本発明の組成物の前に投与してもよいし、または、その後に投与してもよい。一実施態様において、抗原は、本発明の組成物を投与してから４８時間〜４週間後に投与される。また本方法は、抗原および組成物の最初の投与後に、抗原単独、組成物単独、または、抗原と組成物とを併用した１種またはそれより多くのブースターを投与することも考慮する。
【０１３６】
また本発明は、被検体に本発明の組成物（ここで本組成物は抗原を含まない）を投与することによって、被検体が将来的に未知の抗原と遭遇することに対して準備することも考慮する。この実施態様によれば、被検体の免疫系は、後になって例えば環境または職業上の曝露によって被検体が遭遇する抗原に対してより強力な応答が生じるように準備される。このような方法は、例えば微生物因子に晒される可能性が高い旅行者、医療従事者および兵士のために用いることができる。
【０１３７】
一形態において、本発明は、免疫系の不全を有する被検体の治療方法を提供する。本発明のこの形態に係る方法は、被検体に、被検体を治療するのに有効な量の本発明の組成物を投与する工程を含む。本明細書で用いられる「免疫系の不全」は、抗原に対する免疫応答を発生させる免疫系の能力が異常に減少している状態を意味する。一実施態様において、免疫系の不全とは、被検体の免疫系が、通常の能力で機能しない病気または障害、または、例えば被検体における腫瘍もしくは癌または感染が除去されるように被検体の免疫応答を高めることが有用であると予想される病気または障害である。本明細書で用いられる「免疫不全を有する被検体」は、抗原に対する免疫応答を発生させる被検体の免疫系の能力が減少している被検体を意味する。免疫不全を有する被検体としては、後天性免疫不全を有する被検体が挙げられ、加えて、先天性免疫不全を有する被検体も挙げられる。後天性免疫不全を有する被検体としては、これらに限定されないが、慢性炎症性の状態を有する被検体、慢性腎機能不全または腎不全を有する被検体、感染を有する被検体、癌を有する被検体、免疫抑制薬が投与された被検体、その他の免疫抑制治療を摂取している被検体、および、栄養不良の被検体が挙げられる。一実施態様において、上記被検体は、抑制されたＣＤ４＋Ｔ細胞群を有する。一実施態様において、上記被検体は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に感染しているか、または、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を有する。従って、本発明のこの形態に係る方法は、より強力な免疫応答が必要な被検体において免疫応答を高める、または、免疫応答を発生させる能力を高める方法を提供する。
【０１３８】
本発明の組成物および方法は、単独で用いてもよいし、または、感染の治療に有用なその他の物質および方法と共に用いてもよい。一形態において、本発明は、感染を有する被検体の治療方法を提供する。本発明のこの形態に係る方法は、感染を有する被検体に、このような被検体を治療するのに有効な量の本発明の組成物を投与する工程を含む。
【０１３９】
一形態において、本発明は、感染を有する被検体の治療方法を提供する。本発明のこの形態に係る方法は、感染を有する被検体に、被検体を治療するのに有効な量の本発明の組成物、および、感染のための医薬品を投与する工程を含む。
【０１４０】
一形態において、本発明は、被検体において感染を治療する医薬品を製造するための本発明の免疫刺激性ＯＲＮの使用を提供する。
一形態において、本発明は、感染の治療に有用な組成物を提供する。この形態に係る組成物は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮ、および、感染のための医薬品を含む。
【０１４１】
本明細書で用いられる用語「治療する」は、病気または状態を有する被検体に対して用いられる場合、被検体における病気または状態のうち少なくとも１種の徴候または症状を予防する、改善する、または、除去することを意味するものとする。
【０１４２】
「感染を有する被検体」は、感染性微生物が体表から、局所的に、または、全身に被検体に侵入することによって生じる障害を有する被検体である。感染性微生物としては、上述のようなウイルス、細菌、真菌または寄生体が挙げられる。
【０１４３】
感染のための医薬品としては、これらに限定されないが、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、および、抗寄生虫剤が挙げられる。「抗感染薬物質」、「抗生物質」、「抗菌剤」、「抗ウイルス剤」、「抗真菌剤」、「抗寄生虫剤」および「駆虫薬」のような成句は、当業者にとって十分に確立された意味を有し、標準的な医療の教本で定義されている。簡単に言えば、抗菌剤は細菌を死滅させるか、または、阻害するものであり、例えば、抗生物質、加えて、類似の機能を有するその他の合成または天然の化合物が挙げられる。抗ウイルス剤は、自然源から単離してもよいし、または、合成してもよく、これらは、ウイルスを死滅または阻害させるのに有用である。抗真菌剤は、体表の真菌感染、加えて、日和見性および一次的な全身性真菌感染を治療するのに用いられる。抗寄生虫剤は、寄生体を死滅させるか、または、阻害する。多くの抗生物質は、微生物のような細胞で二次代謝産物として生産される低分子量の分子である。一般的に、抗生物質は、微生物に特異的であるが、宿主細胞には存在しない１種またはそれより多くの機能または構造を妨害する。
【０１４４】
抗感染治療が有する問題の１つは、抗感染薬物質で治療される宿主に生じる副作用である。例えば、多くの抗感染因子は、広範囲の微生物を死滅または阻害することができるが、特定の型の種に特異的ではない。これらのタイプの抗感染因子を用いた治療によって、感染性微生物と同様に宿主内に生息する正常な微生物フローラの死滅も招く。微生物フローラは感染性の病原体と競合して、それらに対するバリアとしてとして機能するため、微生物フローラの損失により病気の合併症が起こり、宿主がその他の病原体に感染しやすくなる可能性がある。微生物以外の細胞、または、宿主の組織に対するこれらの化学物質の特異的または非特異的な作用の結果として、その他の副作用が発生する可能性もある。
【０１４５】
抗感染剤の広範な使用に伴うその他の問題は、微生物の抗生物質耐性株が発生することである。すでに、バンコマイシン耐性エンテロコッカス属、ペニシリン耐性肺炎球菌、多剤耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、および、多剤耐性結核菌株が発生しており、主要な臨床上の問題になりつつある。抗感染剤の広範な使用は、多くの抗生物質耐性細菌株を生産する可能性が高いと予想される。結果として、これらの微生物と闘うための新規の感染を防ぐ方策が必要であると予想される。
【０１４６】
多様な細菌を死滅または阻害するのに有効な抗菌性抗生物質は、広域抗生物質と称される。グラム陽性またはグラム陰性のクラスの細菌に対しては、それ以外のタイプの抗菌性抗生物質が圧倒的に有効である。これらのタイプの抗生物質は、狭域抗生物質と称される。一種の生物または病気に対して有効であるが、その他のタイプの細菌に対しては有効ではないその他の抗生物質は、限定域（ｌｉｍｉｔｅｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ）抗生物質と称される。
【０１４７】
抗菌剤は、それらの主要な作用機序に基づいて分類される場合がある。一般的に、抗菌剤は、細胞壁合成阻害剤、細胞膜阻害剤、タンパク質合成阻害剤、核酸合成または機能の阻害剤、および、競合的阻害剤である。細胞壁合成阻害剤は、細胞壁合成プロセスにおける工程、および、一般的には細菌のペプチドグリカンの合成における工程を阻害する。細胞壁合成阻害剤としては、β−ラクタム抗生物質、天然ペニシリン、半合成のペニシリン、アンピシリン、クラブラン酸、セファロスポリン、および、バシトラシンが挙げられる。
【０１４８】
β−ラクタムは、ペプチドグリカン合成の最後の工程を阻害する４員環のβ−ラクタム環を含む抗生物質である。β−ラクタム抗生物質は、合成してもよいし、または、天然のものでもよい。ペニシリウム属によって生産されるβ−ラクタム系抗生物質は、ペニシリンＧまたはペニシリンＶのような天然ペニシリンである。これらは、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の発酵によって生産される。天然ペニシリンは、狭域の活性を有し、一般的に、連鎖球菌属、淋菌およびブドウ球菌属に対して有効である。グラム陽性菌に対しても有効なその他のタイプの天然ペニシリンとしては、ペニシリンＦ、Ｘ、Ｋ、および、Ｏが挙げられる。
【０１４９】
半合成ペニシリンは、一般的に、糸状菌によって生産される６−アミノペニシラン酸分子の改変型である。６−アミノペニシラン酸を側鎖の付加で修飾することによって、天然ペニシリンよりも広域の活性を有するか、または、様々なその他の有利な特性を有するペニシリンを得ることができる。一部のタイプの半合成ペニシリンは、グラム陽性およびグラム陰性菌に対して広域の活性を有するが、ペニシリナーゼによって不活性化される。これらの半合成ペニシリンとしては、アンピシリン、カルベニシリン、オキサシリン、アズロシリン、メズロシリン、および、ピペラシリンが挙げられる。その他のタイプの半合成ペニシリンは、グラム陽性菌に対して狭域の活性を有するが、ペニシリナーゼによって不活性化されないような特性を発達させている。このようなものとしては、例えば、メチシリン、ジクロキサシリン、および、ナフシリンが挙げられる。広域な活性を有する半合成ペニシリンのうちいくつかは、クラブラン酸およびスルバクタムのようなβ−ラクタマーゼ阻害剤と組み合わせて用いることができる。β−ラクタマーゼ阻害剤は抗菌作用を有さないが、これらはペニシリナーゼを阻害する機能を有するため、半合成ペニシリンを分解から保護する。
【０１５０】
その他のタイプのβ−ラクタム抗生物質は、セファロスポリンである。これは、細菌のβ−ラクタマーゼによる分解を受けやすいため、必ずしも単独で有効とは限らない。しかしながらセファロスポリンは、ペニシリナーゼに対して耐性である。これは、様々なグラム陽性およびグラム陰性菌に対して有効である。セファロスポリンとしては、これらに限定されないが、セファロチン、セファピリン、セファレキシン、セファマンドール、セファクロル、セファゾリン、セフロキシン、セフォキシチン、セフォタキシム、セフスロジン、セフェタメト、セフィキシム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフタジジン、および、モクサラクタムが挙げられる。
【０１５１】
バシトラシンは、ムロペプチドサブユニットまたはペプチドグリカンを膜の外側に送達する分子から、これらサブユニットの放出を阻害することによって細胞壁合成を阻害する抗生物質のその他のクラスである。バシトラシンはグラム陽性菌に対して有効であるが、その高い毒性のために、一般的に使用が外用投与に限定されている。
【０１５２】
カルバペネムは、細胞壁合成を阻害することができる広域の活性を有するその他のβ−ラクタム系抗生物質である。カルバペネムの例としては、これらに限定されないが、イミペネムが挙げられる。またモノバクタム系も広域の活性を有するβ−ラクタム系抗生物質であり、例えばユーズトレオナム（ｅｕｚｔｒｅｏｎａｍ）が挙げられる。またストレプトマイセスによって生産される抗生物質であるバンコマイシンも、細胞膜合成を阻害することによりグラム陽性菌に対して有効である。
【０１５３】
抗菌剤のその他のクラスは、細胞膜阻害剤である抗菌剤である。これらの化合物は、細菌の膜の構造を破壊するか、または、その機能を阻害する。細胞膜阻害剤である抗菌剤が有する一つの問題は、これらは、細菌および真核細胞の膜においてリン脂質が類似しているために、細菌に加えて真核細胞においても作用を生じる可能性があることである。従ってこれらの化合物は、これらの化合物を全身投与で使用することが許容されるのに十分な程度特異的であることはまれであり、局所投与のために高用量を使用することを妨げる。
【０１５４】
臨床的に有用な細胞膜阻害剤の１つは、ポリミキシンである。ポリミキシンは、膜のリン脂質に結合することによって膜の機能を妨げる。ポリミキシンは、主としてグラム陽性菌に対して有効であり、一般的に、重度のシュードモナス感染、または、毒性が少ない抗生物質に対して耐性のシュードモナス感染に用いられる。この化合物の全身投与に伴う重篤な副作用としては、腎臓およびその他の臓器に対するダメージが挙げられる。
【０１５５】
その他の細胞膜阻害剤としては、アンホテリシンＢ、および、ナイスタチンが挙げられ、これらは主として全身性真菌感染およびカンジダ酵母感染の治療で用いられる抗真菌剤である。イミダゾールは、細胞膜阻害剤である抗生物質のその他のクラスである。イミダゾールは抗菌剤、加えて抗真菌剤として用いられ、例えば酵母感染、皮膚糸状菌感染、および、全身性真菌感染の治療に用いられる。イミダゾールとしては、これらに限定されないが、クロトリマゾール、ミコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、および、フルコナゾールが挙げられる。
【０１５６】
多くの抗菌剤は、タンパク質合成阻害剤である。これらの化合物は、細菌が構造タンパク質および酵素を合成することを妨げるため、細菌細胞増殖もしくは機能の阻害、または、細胞死を引き起こす。一般的にこれらの化合物は、転写または翻訳プロセスを妨害する。転写をブロックする抗菌剤としては、これらに限定されないが、リファンピン、および、エタンブトールが挙げられる。リファンピンは、酵素ＲＮＡポリメラーゼを阻害するものであり、これは広域な活性を有し、グラム陽性およびグラム陰性菌、加えてヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に対して有効である。エタンブトールは、ヒト型結核菌に対して有効である。
【０１５７】
翻訳をブロックする抗菌剤は、細菌のリボソームを阻害して、ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されるのを妨げることができる。一般的に、このクラスの化合物としては、これらに限定されないが、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、マクロライド系（例えば、エリスロマイシン）、および、アミノグルコシド系（例えば、ストレプトマイシン）が挙げられる。
【０１５８】
アミノグルコシド系は、細菌ストレプトマイセスによって生産される抗生物質のクラスであり、例えばストレプトマイシン、カナマイシン、トブラマイシン、アミカシン、および、ゲンタマイシンが挙げられる。アミノグルコシド系は、グラム陽性およびグラム陰性菌によって引き起こされる多種多様の細菌感染に対して用いられてきた。ストレプトマイシンは、結核治療の主要な薬物として広範囲にわたり用いられてきた。ゲンタマイシンは、シュードモナス感染などの多くのグラム陽性およびグラム陰性菌株に対して、特にトブラマイシンと組み合わせて用いられる。カナマイシンは、ペニシリン耐性ブドウ球菌のような多くのグラム陽性菌に対して用いられる。それらの使用を臨床的に限定してきたアミノグルコシド系の副作用の１つは、有効性を得るのに必須な投与量だと、持続的に使用することによって、腎臓機能を損ない、聴覚消失症を発症する聴覚神経へのダメージを引き起こすことが認められていることである。
【０１５９】
その他のタイプの翻訳を阻害するタイプの抗菌剤は、テトラサイクリンである。テトラサイクリンは、広域な活性を有する抗生物質のクラスの１つであり、これらは、様々なグラム陽性およびグラム陰性菌に対して有効である。テトラサイクリンの例としては、テトラサイクリン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、および、クロルテトラサイクリンが挙げられる。これらは、多くのタイプの細菌の治療に重要であるが、特にライム病の治療において重要である。これらは毒性が低く、直接の副作用が最小であることから、テトラサイクリンは医学界で濫用、誤用され続け、問題となっている。例えば、それらの過剰使用は、耐性の出現が蔓延する原因となっている。
【０１６０】
マクロライド系のような抗菌剤は５０Ｓリボゾームサブユニットに可逆的に結合して、ペプチジルトランスフェラーゼによってタンパク質の伸長を阻害するか、または、細菌のリボソームからの非荷電性ｔＲＮＡの放出を妨害するか、または、その両方を行う。これらの化合物としては、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、オレアンドマイシン、および、アジスロマイシンが挙げられる。エリスロマイシンは、ほとんどのグラム陽性菌、ナイセリア属、レジオネラ属、および、ヘモフィルス属に対して活性を有するが、腸内細菌科に対しては活性を有さない。リンコマイシンおよびクリンダマイシンは、タンパク質合成中にペプチド結合の形成をブロックするものであり、グラム陽性菌に対して用いられる。
【０１６１】
その他のタイプの翻訳阻害剤は、クロラムフェニコールである。クロラムフェニコールは、７０Ｓリボソームに結合して細菌の酵素ペプチジルトランスフェラーゼを阻害し、それによってタンパク質合成中にポリペプチド鎖の成長を予防する。クロラムフェニコールに伴う１つの重篤な副作用は、再生不良性貧血である。再生不良性貧血は、細菌を治療するのに有効なクロラムフェニコール投与で少ない比率の患者（１／５０，０００）に発生する。クロラムフェニコールは、かつては頻繁に処方された抗生物質であったが、貧血による死亡が認められたために現在ではめったに用いられない。しかしながらクロラムフェニコールは、その有効性のために生命を脅かす状況（例えば、腸チフス）では未だに使用されている。
【０１６２】
いくつかの抗菌剤は、核酸合成または機能を崩壊させるが、例えばＤＮＡまたはＲＮＡのメッセージが読めなくなるようにＤＮＡまたはＲＮＡに結合する。このようなものとしては、これらに限定されないが、キノロン類およびコトリモキサゾール類（いずれも合成化学物質）、および、リファマイシン（天然または半合成の化学物質）が挙げられる。キノロンは、細菌が自身の環状ＤＮＡを生産するのに必要な酵素であるＤＮＡジャイレースを阻害することによって細菌のＤＮＡ複製をブロックする。これらは広域の活性を有し、例えば、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、ナリジクス酸、および、テマフロキサシンが挙げられる。ナリジクス酸は、殺菌性の物質であり、これは、ＤＮＡ複製に必須であるＤＮＡジャイレース酵素（トポイソメラーゼ）に結合し、スーパーコイルを緩めて改質し、ＤＮＡジャイレース活性を阻害することができる。ナリジクス酸の主要な用途は、下部尿路感染症（ＵＴＩ）の治療にあるなぜならナリジクス酸は、ＵＴＩに共通の原因である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、および、プロテウス属にような数種のタイプのグラム陰性菌に対して有効である。コトリモキサゾールは、スルファメトキサゾールとリメトプリムとの組み合わせであり、これは、ＤＮＡヌクレオチドを作製するのに必要な細菌の葉酸合成をブロックする。リファンピシンは、グラム陽性菌（例えば、ヒト型結核菌、および、髄膜炎を引き起こすナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、および、一部のグラム陰性菌に対して活性なリファマイシン誘導体である。リファンピシンは、ポリメラーゼのベータサブユニットに結合し、ポリメラーゼを活性化するのに必要な最初のヌクレオチドの付加をブロックすることによって、ｍＲＮＡ合成をブロックすることができる。
【０１６３】
抗菌剤のその他のクラスは、細菌の酵素の競合的阻害剤として機能する化合物である。競合的阻害剤は、ほぼ全てが構造的に細菌の増殖因子に類似しており、結合に関して競合するが、細胞における代謝機能は行わない。これらの化合物としては、スルホンアミド類、および、さらにより強力で広域の抗菌活性を有するスルファニルアミドの化学修飾された形態が挙げられる。スルホンアミド類（例えば、ガントリシンおよびリメトプリム）は、肺炎連鎖球菌、ベータ−溶血性連鎖球菌、および、大腸菌の治療に有用であり、これらは、大腸菌によって引き起こされる合併症のないＵＴＩの治療、および、髄膜炎菌性髄膜炎の治療で用いられている。
【０１６４】
抗ウイルス剤は、ウイルスによる細胞の感染、または、細胞内でのウイルス複製を防ぐ化合物である。抗ウイルス薬物は、抗菌性薬物よりもずっと少ないが、これはなぜなら、ウイルス複製のプロセスは、宿主細胞内でのＤＮＡ複製と密接に関連するため、非特異的な抗ウイルス剤は宿主にとって毒性であることが多いためである。ウイルス感染のプロセスには、抗ウイルス剤によってブロックまたは阻害することができる段階がいくつかある。これらの段階としては、ウイルスの宿主細胞への付着（免疫グロブリン、または、結合ペプチド）、ウイルスの脱殻（例えば、アマンタジン）、ウイルスｍＲＮＡの合成または翻訳（例えば、インターフェロン）、ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡの複製（例えば、ヌクレオシド類似体）、新しいウイルスタンパク質の成熟（例えば、プロテアーゼ阻害剤）、および、ウイルスの出芽および放出が挙げられる。
【０１６５】
その他の抗ウイルス剤の種類は、ヌクレオシド類似体である。ヌクレオシド類似体とは、ヌクレオシドに類似しているが、不完全な、または、一般的ではないデオキシリボースまたはリボース基を有する合成化合物である。ヌクレオシド類似体が細胞内に入ると、これらはリン酸化されて三リン酸の形態になるため、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡへの取り込みに関して正常なヌクレオチドと競合する。ヌクレオシド類似体の三リン酸の形態が成長中の核酸鎖に組み込まれると、それらはウイルスポリメラーゼと不可逆的な結合を引き起こすため、鎖がそこで終結する。ヌクレオシド類似体としては、これらに限定されないが、アシクロビル（単純疱疹ウイルス、および、水痘−帯状疱疹ウイルスの治療に用いられる）、ガンシクロビル（サイトメガロウイルスの治療に有用）、イドクスウリジン、リバビリン（呼吸器系合胞体ウイルスの治療に有用）、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジン、および、ジドブジン（アジドチミジン）が挙げられる。
【０１６６】
抗ウイルス剤のその他のクラスとしては、インターフェロンのようなサイトカインが挙げられる。インターフェロンは、ウイルスに感染した細胞、加えて免疫細胞によって分泌されるサイトカインである。インターフェロンは、感染した細胞に隣接する細胞上の特異的な受容体に結合することによって作用し、細胞に、ウイルスによる感染からその細胞が保護されるような変化をもたらす。またαおよびβ−インターフェロンは、感染した細胞の表面でクラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子の発現も誘導し、それにより、宿主の免疫細胞に認識させるための抗原提示の増加が起こる。αおよびβ−インターフェロンは組換えの形態として入手することができ、慢性Ｂ型およびＣ型肝炎感染の治療に用いられてきた。インターフェロンは、抗ウイルス治療に有効な投与量で、発熱、倦怠感および体重減少のような重度の副作用が生じる。
【０１６７】
免疫グロブリン療法は、ウイルス感染の予防に用いられる。ウイルス感染のための免疫グロブリン療法は、抗原特異性によるのではないという点で細菌感染の場合とは異なり、このような免疫グロブリン療法は、細胞外のビリオンに結合して、それらがウイルス感染を受けやすい細胞に付着し侵入することを予防することにより作用する。このような治療は、宿主中に抗体が存在する期間中はウイルス感染の予防において有効性を示す。一般的に、２タイプの免疫グロブリン療法があり、一方は、通常の免疫グロブリン療法であり、もう一方は高力価免疫グロブリン療法である。通常の免疫グロブリン療法は、正常な血液ドナーの血清から調製されプールされた抗体製品を利用する。このプールした製品は、Ａ型肝炎、パルボウイルス、エンテロウイルス（特に新生児における）のような多様なヒトウイルスに対して低力価の抗体を含む。高力価免疫グロブリン療法は、特定のウイルスに対して高力価の抗体を有する個体の血清から調製された抗体を利用する。従ってこのような抗体は、特定のウイルスに対して用いられる。高力価免疫グロブリンの例としては、帯状疱疹免疫グロブリン（免疫無防備状態の子供および新生児における水痘の予防に有用）、ヒト狂犬病免疫グロブリン（狂犬病の動物に噛まれた被検体の曝露後予防において有用）、Ｂ型肝炎免疫グロブリン（特にウイルスに晒された被検体におけるＢ型肝炎ウィルスの予防において有用）、および、ＲＳＶ免疫グロブリン（呼吸器系合胞体ウイルス感染の治療において有用）が挙げられる。
【０１６８】
抗真菌剤は、感染性の真菌類の治療および予防に有用である。抗真菌剤は、それらの作用機序によって分類されることがある。いくつかの抗真菌剤は、グルコースシンターゼを阻害することによって細胞壁阻害剤として機能する。このようなものとしては、これらに限定されないが、バシウンギン（ｂａｓｉｕｎｇｉｎ）／ＥＣＢが挙げられる。その他の抗真菌剤は、膜の完全性を不安定にすることによって作用する。このようなものとしては、これらに限定されないが、イミダゾール、例えばクロトリマゾール、セルタコンゾール（ｓｅｒｔａｃｏｎｚｏｌｅ）、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、および、ボリコナゾール（ｖｏｒｉｃｏｎａｃｏｌｅ）が挙げられ、加えて、ＦＫ４６３、アンホテリシンＢ、ＢＡＹ３８−９５０２、ＭＫ９９１、プラジミシン、ＵＫ２９２、ブテナフィン、および、テルビナフィンも挙げられる。その他の抗真菌剤は、キチンを分解することによって（例えば、キチナーゼ）、または、免疫抑制（５０１クリーム）によって機能する。
【０１６９】
駆虫薬は、寄生体を直接的にを殺す物質である。このような化合物は当業界既知であり、一般的に市販されている。ヒトへの投与に有用な駆虫薬の例としては、これらに限定されないが、アルベンダゾール、アンホテリシンＢ、ベンズニダゾール、ビチオノール、塩酸クロロキン、リン酸クロロキン、クリンダマイシン、デヒドロエメチン、ジエチルカルバマジン、フランカルボン酸ジロキサニド、エフロールニチン、フラゾリダオン（ｆｕｒａｚｏｌｉｄａｏｎｅ）、糖質コルチコイド、ハロファントリン、ヨードキノール、イベルメクチン、メベンダゾール、メフロキン、メグルミンアンチモニエート、メラルソプロール、メトリホネート、メトロニダゾール、ニクロサミド、ニフルチモックス、オキサムニキン、パロモマイシン、ペンタミジンイセチオネート、ピペラジン、プラジカンテル、リン酸プリマキン、プログアニル、パモ酸ピランテル、ピリメタミン（ｐｙｒｉｍｅｔｈａｎｍｉｎｅ）−スルホンアミド類、ピリメタミン−スルファドキシン、塩酸キナクリン、硫酸キニン、グルコン酸キニジン、スピラマイシン、スチボグルコン酸ナトリウム（グルコン酸アンチモンナトリウム）、スラミン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、チアベンダゾール、チニダゾール、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、および、トリパルサミドが挙げられる。
【０１７０】
またＯＲＮは、自己免疫疾患を治療および予防することにも有用である。自己免疫疾患は、被検体自身の抗体と宿主組織とが反応する病気のクラス、または、免疫エフェクターＴ細胞が内因性の自己ペプチドと自己反応し、組織の破壊を引き起こす病気のクラスである。従って、被検体自身の抗原（自己抗原と称される）に対して免疫応答が発生する。自己免疫疾患としては、これらに限定されないが、リウマチ様関節炎、クローン病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症（ＭＧ）、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡（例えば、尋常性天疱瘡）、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体を有する強皮症、混合性結合組織病、多発性筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自己免疫に関連する不妊症、腎炎（例えば、半月形糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎）、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、インスリン耐性、および、自己免疫性糖尿病が挙げられる。
【０１７１】
本明細書で用いられる「自己抗原」は、正常な宿主組織の抗原を意味する。正常な宿主組織は、癌細胞を含まない。従って、自己抗原に対して発生した免疫応答は、自己免疫疾患の状況では望ましくない免疫応答であり、正常な組織の破壊および損傷に寄与するが、それに対して癌抗原に対して発生した免疫応答は、望ましい免疫応答であり、腫瘍または癌の破壊に寄与する。従って、本発明の自己免疫障害を治療することを目的とする形態のいくつかにおいて、ＯＲＮが、自己抗原と共に投与されること、具体的には自己免疫障害の標的である自己抗原と共に投与されることは推奨されない。
【０１７２】
その他の例において、ＯＲＮは、低用量の自己抗原と共に送達してもよい。多数の動物実験によって、低用量の抗原の粘膜投与が、免疫低応答状態または「寛容」を引き起こす可能性があることが実証されてきた。その活性なメカニズムは、Ｔｈ１から離れて主にＴｈ２およびＴｈ３（すなわちＴＧＦ−β優勢）応答に向かうサイトカインが介在する免疫偏向のようである。また低用量の抗原送達を用いる活性な抑制も、無関係の免疫応答（バイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）抑制）を抑制することができ、これは、自己免疫疾患（例えばリウマチ様関節炎およびＳＬＥ）の治療において非常に興味深い。バイスタンダー抑制は、炎症誘発性およびＴｈ１サイトカインが抗原特異または抗原非特異いずれかで放出されるような局所環境における、Ｔｈ１を逆調節するサプレッサーサイトカインの分泌に関与する。本明細書で用いられる「寛容」とは、この現象を意味するために用いられる。実際に、経口寛容は、動物における多数の自己免疫疾患の治療：例えば、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、実験性自己免疫性筋無力症、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）、および、インスリン依存性糖尿病などの治療において有効であった。これらのモデルにおいて、自己免疫疾患の予防および抑制は、抗原特異的な体液性および細胞性応答におけるＴｈ１からＴｈ２／Ｔｈ３応答へのシフトに関連する。
【０１７３】
本発明の組成物および方法は、単独で用いてもよいし、または、癌治療に有用なその他の物質および方法と共に用いてもよい。一形態において、本発明は、癌を有する被検体の治療方法を提供する。本発明のこの形態に係る方法は、癌を有する被検体に、このような被検体を治療するのに有効な量の本発明の組成物を投与する工程を含む。
【０１７４】
一形態において、本発明は、癌を有する被検体の治療方法を提供する。本発明のこの形態に係る方法は、癌を有する被検体に、被検体を治療するのに有効な量の本発明の組成物、および、抗癌治療剤を投与する工程を含む。
【０１７５】
一形態において、本発明は、被検体において癌を治療する医薬品を製造するための、本発明の免疫刺激性ＯＲＮの使用を提供する。
一形態において、本発明は、癌治療に有用な組成物を提供する。この形態に係る組成物は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮ、および、癌治療薬を含む。
【０１７６】
癌を有する被検体とは、検出可能な癌細胞を有する被検体である。癌は、悪性の癌の場合もあるし、または、良性の癌の場合もある。本明細書で用いられる「癌」は、体内の臓器およびシステムの正常な機能を妨害する制御不能な細胞増殖を意味する。癌は、その元の位置から移動して正常な臓器に転移し、最終的に影響を受けた臓器の機能が劣化することによって被検体を死亡させる。白血病のような造血系の癌は、被検体の正常な造血組織の区画に侵入して、それによって造血不能に陥り（貧血、血小板減少症、および、好中球減少症の形態で）、最終的には死をもたらす可能性がある。
【０１７７】
転移は、原発腫瘍から体のその他の部分への癌細胞の内転移によって生じた原発腫瘍の位置とは異なる癌細胞の領域である。原発腫瘍の質量を診断する時に、転移の存在に関して被検体はをモニターすることが可能である。転移は、ほとんどの場合、核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）でのスキャン、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）でのスキャン、血液および血小板の計数、肝臓機能の研究、胸部Ｘ線、および、骨のスキャンそれぞれ単独で、または、それらと特定の症状のモニターとを併用することによって検出される。
【０１７８】
癌としては、これらに限定されないが、基底細胞癌腫、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳および中枢神経系（ＣＮＳ）の癌；乳癌；子宮頚癌；絨毛上皮腫；結腸および直腸癌；結合組織癌；消化器系癌；子宮内膜癌；食道癌；眼癌；頭頸部癌；上皮内新生物；腎臓癌；喉頭癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）；リンパ腫、例えばホジキンおよび非ホジキンリンパ腫；黒色腫；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔癌（例えば、唇、舌、口腔および咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽腫；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系の癌；肉腫；皮膚癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮癌；泌尿器系の癌、加えてその他の癌腫、腺癌および肉腫が挙げられる。
【０１７９】
また本発明の免疫刺激性組成物は、抗癌治療と共に投与してもよい。抗癌治療としては、癌治療薬、放射線、および、外科手術が挙げられる。本明細書で用いられる「癌治療薬」は、被検体に癌治療の目的で投与される物質を意味する。本明細書で用いられる「癌を治療すること」は、癌の発症を予防すること、癌の症状を低減すること、および／または、すでに発症した癌の成長を阻害することを含む。その他の形態において、癌治療薬は、癌を発症する危険性がある被検体に、癌を発症させる危険を減少させる目的で投与される。本明細書において様々なタイプの癌治療のための医薬品を説明する。本明細書の目的において、癌治療薬は、化学療法剤、免疫療法剤、癌ワクチン、ホルモン療法、および、生体応答調整物質に分類される。
【０１８０】
化学療法剤は、メトトレキセート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、糖を含まないクロロエチルニトロソウレア、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラジリン（ｆｒａｇｙｌｉｎｅ）、メグルミン（ｍｅｇｌａｍｉｎｅ）ＧＬＡ、バルルビシン、カルムスタイン（ｃａｒｍｕｓｔａｉｎｅ）、および、ポリフェルポサン（ｐｏｌｉｆｅｒｐｏｓａｎ）、ＭＭＩ２７０、ＢＡＹ１２−９５６６、ＲＡＳファメシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＲＡＳ  ｆａｍｅｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ファメシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＭＭＰ、ＭＴＡ／ＬＹ２３１５１４、ＬＹ２６４６１８／ロメテキソール（Ｌｏｍｅｔｅｘｏｌ）、グラモレック（Ｇｌａｍｏｌｅｃ）、ＣＩ−９９４、ＴＮＰ−４７０、ハイカムチン／トポテカン、ＰＫＣ４１２、バルスポダール／ＰＳＣ８３３、ノバントロン／ミトロキサントロン（Ｍｉｔｒｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、メタレット（Ｍｅｔａｒｅｔ）／スラミン、バチマスタット（Ｂａｔｉｍａｓｔａｔ）、Ｅ７０７０、ＢＣＨ−４５５６、ＣＳ−６８２、９−ＡＣ、ＡＧ３３４０、ＡＧ３４３３、Ｉｎｃｅｌ／ＶＸ−７１０、ＶＸ−８５３、ＺＤ０１０１、ＩＳＩ６４１、ＯＤＮ６９８、ＴＡ２５１６／マーミスタット（Ｍａｒｍｉｓｔａｔ）、ＢＢ２５１６／マーミスタット、ＣＤＰ８４５、Ｄ２１６３、ＰＤ１８３８０５、ＤＸ８９５１ｆ、レモナール（Ｌｅｍｏｎａｌ）ＤＰ２２０２、ＦＫ３１７、ピシバニール／ＯＫ−４３２、ＡＤ３２／バルルビシン、メタストロン／ストロンチウム誘導体、テモダール／テモゾロマイド、エバセット（Ｅｖａｃｅｔ）／リポソーマルドキソルビシン、ユータキサン（Ｙｅｗｔａｘａｎ）／パクリタキセル、タキソール／パクリタキセル、キセロード（Ｘｅｌｏａｄ）／カペシタビン、フルツロン／ドキシフルリジン、シクロパックス（Ｃｙｃｌｏｐａｘ）／経口パクリタキセル、経口タキソイド、ＳＰＵ−０７７／シスプラチン、ＨＭＲ１２７５／フラボピリドール（ｆｌａｖｏｐｉｒｉｄｏｌ）、ＣＰ−３５８（７７４）／ＥＧＦＲ、ＣＰ−６０９（７５４）／ＲＡＳ腫瘍遺伝子阻害剤、ＢＭＳ−１８２７５１／経口白金、ＵＦＴ（テガフール／ウラシル）、エルガミゾール（Ｅｒｇａｍｉｓｏｌ）／レバミソール、エニルウラシル／７７６Ｃ８５／５ＦＵエンハンサー、カンプト／レバミソール、カンプトサール（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）／イリノテカン、ツモデックス（Ｔｕｍｏｄｅｘ）／ラリトレキセド（Ｒａｌｉｔｒｅｘｅｄ）、ロイスタチン／クラドリビン、パキセクス（Ｐａｘｅｘ）／パクリタキセル、ドキシル／リポソーマルドキソルビシン、カエリクス（Ｃａｅｌｙｘ）／リポソーマルドキソルビシン、フルダラ／フルダラビン、ファルマルビシン（Ｐｈａｒｍａｒｕｂｉｃｉｎ）／エピルビシン、デポサイト（ＤｅｐｏＣｙｔ）、ＺＤ１８３９、ＬＵ７９５５３／ビス−ナフタルイミド、ＬＵ１０３７９３／ドラスタイン（Ｄｏｌａｓｔａｉｎ）、カエチクス（Ｃａｅｔｙｘ）／リポソーマルドキソルビシン、ジェムザール／ゲムシタビン、ＺＤ０４７３／アノーメッド（Ａｎｏｒｍｅｄ）、ＹＭ１１６、ヨウ素種（Ｉｏｄｉｎｅ  ｓｅｅｄ）、ＣＤＫ４およびＣＤＫ２阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｄ４８０９／デキシフォサミド（Ｄｅｘｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、アイフェス（Ｉｆｅｓ）／メスネックス（Ｍｅｓｎｅｘ）／イフォサミド（Ｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、ブモン（Ｖｕｍｏｎ）／テニポシド、パラプラチン／カルボプラチン、プランチノール（Ｐｌａｎｔｉｎｏｌ）／シスプラチン、ベペシド（Ｖｅｐｅｓｉｄｅ）／エトポシド、ＺＤ９３３１、タキソテール／ドセタキセル、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、タキサン類似体、ニトロソウレア類、アルキル化剤、例えばメルフェラン（ｍｅｌｐｈｅｌａｎ）、および、シクロホスファミド、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロロムブシル（Ｃｈｌｏｒｏｍｂｕｃｉｌ）、塩酸シタラビン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−２１３）、フロクシウリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヒドロキシ尿素（ヒドロキシカルバミド）、イフォスファミド、インターフェロンアルファ−２ａ、アルファ−２ｂ、酢酸ロイプロリド（ＬＨＲＨ−放出因子類似体）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、塩酸メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルカプトプリン、メスナ（Ｍｅｓｎａ）、ミトタン（ｏ．ｐ’−ＤＤＤ）、塩酸ミトキサントロン、オクトレオチド、プリカマイシン、塩酸プロカルバジン、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、エリスロポエチン、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、インターロイキン２、ミトグアゾン（Ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）（メチル−ＧＡＧ；メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン；ＭＧＢＧ）、ペントスタチン（２’デオキシコホルマイシン）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、テニポシド（ＶＭ−２６）、および、硫酸ビンデシンからなる群より選択してもよい（ただしこれらに限定されない）。
【０１８１】
免疫療法剤は、３６２２Ｗ９４、４Ｂ５、ＡＮＡ  Ａｂ、抗ＦＬＫ−２、抗ＶＥＧＦ、ＡＴＲＡＧＥＮ、アバスチン（ベバシズマブ；ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））、ＢＡＢＳ、ＢＥＣ２、ベクサー（ＢＥＸＸＡＲ）（トシツモマブ；グラクソ・スミスクライン（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ））、Ｃ２２５、キャンパス（ＣＡＭＰＡＴＨ）（アレムトツマブ（ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）；ジェンザイム社（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐ．）、シーサイド（ＣＥＡＣＩＤＥ）、ＣＭＡ６７６、ＥＭＤ−７２０００、セツキシマブ（セツキシマブ；イムクローン・システムズ社（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））、グリオマブ（Ｇｌｉｏｍａｂ）−Ｈ、ＧＮＩ−２５０、ハーセプチン（トラスツズマブ；ジェネンテック）、ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８、ＩｍｍｕＲＡＩＴ−ＣＥＡ、ｉｏｒ  ｃ５、ｉｏｒ  ｅｇｆ．ｒ３、ｉｏｒ  ｔ６、ＬＤＰ−０３、リンフォサイド（ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ）、ＭＤＸ−１１、ＭＤＸ−２２、ＭＤＸ−２１０、ＭＤＸ−２２０、ＭＤＸ−２６０、ＭＤＸ−４４７、メリミューン（ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ）−１、メリミューン−２、モノファーム（Ｍｏｎｏｐｈａｒｍ）−Ｃ、ノボＭＡｂ（ＮｏｖｏＭＡｂ）−Ｇ２、オンコリム（Ｏｎｃｏｌｙｍ）、ＯＶ１０３、オバレックス（ＯｖａＲｅｘ）、パノレックス（Ｐａｎｏｒｅｘ）、プレターゲット（Ｐｒｅｔａｒｇｅｔ）、クアドラメット、リブタキシン（Ｒｉｂｕｔａｘｉｎ）、リツキサン（リツキシマブ；ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））、ＳＭＡＲＴ１Ｄ１０Ａｂ、ＳＭＡＲＴ  ＡＢＬ３６４Ａｂ、ＳＭＡＲＴ  Ｍ１９５、ＴＮＴ、および、ＺＥＮＡＰＡＸ（ダクリズマブ；ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））からなる群より選択してもよい（ただしこれらに限定されない）。
【０１８２】
癌ワクチンは、ＥＧＦ、抗イディオタイプ癌ワクチン、Ｇｐ７５抗原、ＧＭＫ黒色腫ワクチン、ＭＧＶガングリオシド結合ワクチン、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、オバレックス（ＯｖａＲｅｘ）、Ｍ−Ｖａｘ、Ｏ−Ｖａｘ、Ｌ−Ｖａｘ、ＳＴｎ−ＫＨＬセラトープ（Ｔｈｅｒａｔｏｐｅ）、ＢＬＰ２５（ＭＵＣ−１）、リポソーマルイディオタイプワクチン（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  ｖａｃｃｉｎｅ）、メラシン（Ｍｅｌａｃｉｎｅ）、ペプチド抗原ワクチン、毒素／抗原ワクチン、ＭＶＡベースのワクチン、ＰＡＣＩＳ、ＢＣＧワクチン、ＴＡ−ＨＰＶ、ＴＡ−ＣＩＮ、ＤＩＳＣ−ウイルス、および、イムシスト（ＩｍｍｕＣｙｓｔ）／テラシス（ＴｈｅｒａＣｙｓ）からなる群より選択してもよい（ただしこれらに限定されない）。
【０１８３】
本発明の組成物および方法は、単独で用いてもよいし、または、アレルギーの治療に有用なその他の物質および方法と共に用いてもよい。一形態において、本発明は、アレルギー状態を示す被検体の治療方法を提供する。本発明のこの形態に係る方法は、アレルギー状態を示す被検体に、このような被検体を治療するのに有効な量の本発明の組成物を投与する工程を含む。
【０１８４】
一形態において、本発明は、アレルギー状態を示す被検体の治療方法を提供する。本発明のこの形態に係る方法は、アレルギー状態を示す被検体を治療するために、アレルギー状態を示す被検体に、有効量の本発明の組成物、および、抗アレルギー治療剤を投与する工程を含む。
【０１８５】
一形態において、本発明は、被検体において、アレルギー状態を治療する医薬品を製造するための、本発明の免疫刺激性ＯＲＮの使用を提供する。
一形態において、本発明は、アレルギー状態の治療に有用な組成物を提供する。この形態に係る組成物は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮ、および、アレルギー治療薬を含む。
【０１８６】
「アレルギー状態を示す被検体」は、現在アレルゲンに反応して起こるアレルギー反応を示す、または、そのような状態を以前に経験したことがある被検体を意味することとする。
【０１８７】
「アレルギー状態」または「アレルギー」は、物質（アレルゲン）に対する後天性の過敏症を意味する。アレルギー状態としては、これらに限定されないが、湿疹、アレルギー性鼻炎、または、鼻感冒、枯草熱、アレルギー性結膜炎、気管支喘息、じんましん（ｈｉｖｅｓ）、および、食物アレルギー、その他のアトピー性の状態、例えばアトピー性皮膚炎；アナフィラキシー；薬物アレルギー；および、血管性浮腫が挙げられる。
【０１８８】
アレルギーは、典型的には、アレルゲンに対する免疫グロブリンの特定のクラス、ＩｇＥからの抗体生産を伴う一次的な状態である。また、一般的な空気アレルゲンに対してＩｇＥが媒介する応答が発生することは、喘息の発症に対する素因を示すファクターの一つでもある。アレルゲンが、好塩基球（血液中を循環する）または肥満細胞（固形組織全体に分散している）の表面上でＩｇＥＦｃ受容体（ＦｃεＲ）に結合した特異的なＩｇＥに遭遇すると、その細胞は活性化され、ヒスタミン、セロトニン、および、脂質媒介物質のような媒介物質の生産および放出が起こる。
【０１８９】
アレルギー反応は、組織を感作するＩｇＥ型の免疫グロブリンが外来のアレルゲンと反応すると起こる。ＩｇＥ抗体が肥満細胞および／または好塩基球に結合すると、これらの特殊化した細胞は、アレルゲンが抗体分子の末端と架橋を形成することによって刺激されてアレルギー反応の化学媒介物質（血管作動性アミン）を放出する。ヒトにおけるアレルギー反応の最もよく知られた媒介物質のなかでも、ヒスタミン、血小板活性化因子、アラキドン酸代謝産物、および、セロトニンが挙げられる。ヒスタミンおよびその他の血管作動性アミンは、通常、肥満細胞および塩基好性白血球中に保存される。肥満細胞は動物組織全体に分散しており、好塩基球は血管系内を循環している。これらの細胞は、ＩｇＥ結合を含む特殊化した一連の現象が起こり、その放出を開始させない限り、細胞内でヒスタミンを製造し保存する。
【０１９０】
アレルギー反応の症状は、ＩｇＥが抗原と反応する体の部位に応じて様々である。このような反応が気道上皮上で起こると、その症状は、一般的に、くしゃみ、咳、および、喘息の反応である。食物アレルギーの場合のように消化管内でこのような相互作用が起こると、腹痛、および、下痢が起こることが多い。例えば蜂に刺された後、または、アレルギー性の被検体にペニシリンを投与した後のような全身性のアレルギー反応は重篤になる可能性があり、生命を脅かすことが多い。
【０１９１】
アレルギーは、Ｔｈ２型の免疫応答に関連しており、これは、少なくとも部分的にＴｈ２サイトカインＩＬ−４およびＩＬ−５、加えてＩｇＥに切り換える抗体のアイソタイプを特徴とする。Ｔｈ１およびＴｈ２型の免疫応答は、相互に逆調節性であることによって、免疫応答をＴｈ１型の免疫応答に偏向させて、アレルギーを含むＴｈ２型の免疫応答を予防または改善することができる。従って、本発明のＯＲＮは、免疫応答をＴｈ１型の免疫応答に偏向させることができるため、このようなＯＲＮはそれ自身アレルギー状態を有する被検体を治療するのに有用である。その代わりに、または、それに加えて、本発明のＯＲＮとアレルゲンとを併用して、アレルギー状態を有する被検体を治療することができる。
【０１９２】
また本発明の免疫刺激性組成物は、抗アレルギー治療剤と共に投与してもよい。従来のアレルギーの治療または予防方法には、アレルギー治療薬の使用または脱感作療法が含まれていた。アレルギーを治療または予防するための開発中の療法のいくつかとしては、抗ＩｇＥ抗体の中和の使用がある。アレルギー反応の化学媒介物質の作用をブロックする抗ヒスタミン剤およびその他の薬物は、アレルギーの症状の辛さを調節するのには役立つが、アレルギー反応を予防せず、その後に起こるアレルギー性応答に対する作用もない。脱感作療法は、アレルゲンに対するＩｇＧ型の応答を誘導するために、一般的には皮下注射で少ない用量のアレルゲンを投与することによって行われる。ＩｇＧ抗体の存在は、ＩｇＥ抗体の誘導により生じた媒介物質の生産を阻害するのに役立つと考えられている。重篤な反応の誘導を回避するために、最初のうちは被検体は極めて低用量のアレルゲンで治療され、その後用量を徐々に増加させる。このタイプの治療は、被検体は、実際にアレルギー性応答を引き起こす化合物投与され、重篤なアレルギー反応が生じる可能性があるため危険である。
【０１９３】
アレルギー治療薬としては、これらに限定されないが、抗ヒスタミン剤、コルチコステロイド、および、プロスタグランジン誘導物質が挙げられる。抗ヒスタミン剤は、肥満細胞または好塩基球によって放出されたヒスタミンを中和するように作用する化合物である。これらの化合物は当業界周知であり、一般的にアレルギー治療に頻繁に使用されている。抗ヒスタミン剤としては、これらに限定されないが、アクリバスチン、アステミゾール、アゼタジン（ａｚａｔａｄｉｎｅ）、アゼラスチン、ベタタスチン（ｂｅｔａｔａｓｔｉｎｅ）、ブロムフェニルアミン、ブクリジン（ｂｕｃｌｉｚｉｎｅ）、セチリジン、セチリジン類似体、クロルフェニラミン、クレマスチン、ＣＳ５６０、シプロヘプタジン、デスロラタジン、デキスクロルフェニルアミン、エバスチン、エピナスチン、フェキソフェナジン、ＨＳＲ６０９、ヒドロキシジン、レボカバスチン、ロラチジン（ｌｏｒａｔｉｄｉｎｅ）、メトスコポラミン、ミゾラスチン、ノラステミゾール（ｎｏｒａｓｔｅｍｉｚｏｌｅ）、フェニンダミン、プロメタジン、ピリラミン、テルフェナジン、および、トラニラストが挙げられる。
【０１９４】
コルチコステロイドとしては、これらに限定されないが、メチルプレドニゾロン、ブレドニゾロン、プレドニゾン、ベクロメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、フルニソリド、プロピオン酸フルチカゾン、および、トリアムシノロンが挙げられる。デキサメタゾンは抗炎症性作用を有するコルチコステロイドであるが、デキサメタゾンは極めて吸収されやすく、有効量で長期にわたる抑制性の副作用を示すため、アレルギーまたは喘息の治療に吸入される形態でデキサメタゾンが定期的に用いられることはない。しかしながら、デキサメタゾンは、本発明の組成物と組み合わせて投与すれば、デキサメタゾンを低用量で投与することができ、従って副作用を減少させることができるため、本発明に従ってアレルギーまたは喘息を治療するのに用いることができる。コルチコステロイド使用に伴う副作用のいくつかとしては、咳、発声困難、口腔カンジダ症（カンジダ症）、および、より高用量では、全身性の作用、例えば副腎抑制、グルコース不耐性、骨粗しょう症、無菌性骨壊死、白内障の形成、成長抑制、高血圧、筋衰弱、皮膚の薄化、および、易傷性が挙げられる。Ｂａｒｎｅｓ  ＆  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ（１９９３）Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ  １４８：Ｓ１−Ｓ２６；および、Ｋａｍａｄａ  ＡＫ等（１９９６）Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １５３：１７３９〜４８。
【０１９５】
本発明の組成物および方法は、単独で用いてもよいし、または、喘息の治療に有用なその他の物質および方法と共に用いてもよい。一形態において、本発明は、喘息を有する被検体の治療方法を提供する。本発明のこの形態に係る方法は、喘息を有する被検体に、このような被検体を治療するのに有効な量の本発明の組成物を投与する工程を含む。
【０１９６】
一形態において、本発明は、喘息を有する被検体の治療方法を提供する。本発明のこの形態に係る方法は、喘息を有する被検体に、このような被検体を治療するのに有効な量の本発明の組成物、および、抗喘息治療剤を投与する工程を含む。
【０１９７】
一形態において、本発明は、被検体において、喘息を治療する医薬品を製造するための、本発明の免疫刺激性ＯＲＮの使用を提供する。
一形態において、本発明は、喘息の治療に有用な組成物を提供する。この形態に係る組成物は、本発明の免疫刺激性ＯＲＮ、および、喘息治療薬を含む。
【０１９８】
本明細書で用いられる「喘息」は、炎症および気道狭窄、ならびに、気道における吸入用薬剤への反応性の増加を特徴とする呼吸器系の障害を意味する。喘息は、それ単独ではなく、アトピー性の状態、または、アレルギー状態に伴って生じることが多い。喘息の症状としては、気道閉塞による再発性の喘鳴、息切れ、胸部圧迫感および咳が挙げられる。喘息に伴う気道炎症は、気道上皮の剥脱、基底膜下でのコラーゲン沈着、浮腫、肥満細胞の活性化、好中球、好酸球およびリンパ球などの炎症性細胞の浸潤のような多数の生理学的な変化を観察することによって検出することができる。喘息患者は、気道炎症の結果として、気道過敏症、空気流が限定されること、呼吸器の症状、および、病気の慢性化にかかることが多い。空気流の限定としては、急性の気管支収縮、気道浮腫、粘液栓の形成、および、気道リモデリングが挙げられ、それにより気管支閉塞を引き起こすことが多いことを特徴とする。喘息の一部の例においては、基底膜下で線維症が発生して、肺機能に持続的な異常をもたらす可能性がある。
【０１９９】
過去数年間にわたる調査では、喘息は、炎症性細胞、媒介物質、ならびに、気道に存在するその他の細胞および組織間の複雑な相互作用の結果生じる可能性が高いことが明らかになった。肥満細胞、好酸球、上皮細胞、マクロファージ、および、活性化Ｔ細胞はいずれも、喘息に関連する炎症性のプロセスにおいて重要な役割を果たす。Ｄｊｕｋａｎｏｖｉｃ  Ｒ等（１９９０）Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ  １４２：４３４〜４５７。これらの細胞は、局所組織に直接的または間接的に作用することができる予め形成された、および、新たに合成された媒介物質の分泌によって気道の機能に影響を与えることができると考えられる。また、Ｔリンパ球（Ｔｈ２）の部分集団は、選択的なサイトカインを放出することによって気道におけるアレルギー性炎症の調節に重要な役割を果たし、病気の慢性化を確立することも認識されている。Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＤＳ等（１９９２）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２６：２９８〜３０４。
【０２００】
喘息は、発達中の様々な段階で発生する複合的な障害であり、急性、亜急性または慢性のように症状の程度に基づいて分類することができる。急性の炎症性応答は、初期に細胞が気道へ補充されることに関連する。亜急性の炎症性応答は、細胞の補充、それに加えて、より持続的な炎症パターンを引き起こす常在する細胞の活性化に関与する。慢性の炎症性応答は、持続的なレベルの細胞損傷、および、進行中の修復プロセスを特徴とし、気道内で永続的な異常を引き起こす可能性がある。
【０２０１】
「喘息を有する被検体」は、炎症および気道狭窄、ならびに、気道における吸入用薬剤への反応性の増加を特徴とする呼吸器系の障害を有する被検体である。喘息の開始に関連する因子としては、これらに限定されないが、アレルゲン、冷温、運動、ウイルス感染、および、ＳＯ２が挙げられる。
【０２０２】
上述したように、喘息は、Ｔｈ２型の免疫応答に関連する可能性があり、このＴｈ２型の免疫応答は、少なくとも部分的にＴｈ２サイトカインＩＬ−４、および、ＩＬ−５、加えてＩｇＥに切り換える抗体のアイソタイプを特徴とする。Ｔｈ１およびＴｈ２型の免疫応答は、相互に逆調節性であることによって、免疫応答をＴｈ１型の免疫応答にそらして、アレルギーを含むＴｈ２型の免疫応答を予防または改善することができる。従って、本発明の修飾オリゴリボヌクレオチド類似体は、免疫応答をそらすＴｈ１型の免疫応答にことができるため、それ自身、喘息を有する被検体を治療するのに有用である。その代わりに、または、それに加えて、本発明の修飾オリゴリボヌクレオチド類似体は、アレルゲンと組み合わせて、喘息を有する被検体を治療するのに用いることができる。
【０２０３】
また本発明の免疫刺激性組成物は、喘息治療薬と共に投与してもよい。従来の喘息の治療または予防方法は、抗アレルギー治療薬（上述の）、および、吸入用薬剤などの多数のその他の物質の使用が必要であった。
【０２０４】
喘息の治療のための薬物療法は、一般的に、２つのカテゴリー、すなわち迅速に緩和するタイプの薬物療法、および、長期にわたりコントロールするタイプの薬物療法に分けられる。長期にわたりコントロールするタイプの薬物療法は、持続性の喘息のコントロールを達成し、それを維持するために喘息の患者に毎日施される。長期にわたりコントロールするタイプの薬物療法としては、抗炎症薬、例えばコルチコステロイド、クロモリンナトリウム、および、ネドクロミル；持続型の気管支拡張剤、例えば持続型のβ２−アゴニスト、および、メチルキサンチン；および、ロイコトリエン調節剤が挙げられる。迅速に緩和するタイプの薬物療法としては、短時間作用型のβ２アゴニスト、抗コリン作動薬、および、全身性コルチコステロイドが挙げられる。これらの薬物それぞれに伴う多くの副作用があり、喘息を予防すること、または、喘息を完全に治療することができる薬物は、単独でも、または、組み合わせても存在しない。
【０２０５】
喘息治療薬としては、これらに限定されないが、ＰＤＥ−４阻害剤、気管支拡張剤／ベータ−２アゴニスト、Ｋ＋チャネル開口薬、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、ニューロキンアンタゴニスト、トロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）合成阻害剤、キサンチン、アラキドン酸アンタゴニスト、５リポキシゲナーゼ阻害剤、ＴＸＡ２受容体アンタゴニスト、ＴＸＡ２アンタゴニスト、５−リポキシ活性化タンパク質の阻害剤、および、プロテアーゼ阻害剤が挙げられる。
【０２０６】
気管支拡張剤／β２アゴニストは、気管支拡張または平滑筋の弛緩を引き起こす化合物クラスである。気管支拡張剤／β２アゴニストとしては、これらに限定されないが、サルメテロール、サルブタモール、アルブテロール、テルブタリン、Ｄ２５２２／ホルモテロール、フェノテロール、ビトルテロール、ピルブテロール（ｐｉｒｂｕｅｒｏｌ）メチルキサンチン、および、オルシプリナリンが挙げられる。持続型β２アゴニスト、および、気管支拡張剤は、抗炎症性の治療に加えて、長期間の症状の予防に用いられる化合物である。持続型β２アゴニストとしては、これらに限定されないが、サルメテロール、および、アルブテロールが挙げられる。これらの化合物は、コルチコステロイドと併用されることが一般的であり、炎症の治療薬と併用することなく用いられることは通常ない。これらは、頻脈、骨格筋の震え、低カリウム血症、および、過量でのＱＴｃ間隔の延長のような副作用を伴うことがあった。
【０２０７】
例えばテオフィリンなどのメチルキサンチンは、症状の長期間のコントロールおよび予防に用いられてきた。これらの化合物は、ホスホジエステラーゼ阻害によって生じる気管支拡張を引き起こし、さらにアデノシン拮抗作用によって生じる可能性もある。これらのタイプの化合物が有する具体的な問題は、用量依存性の急性毒性である。結果として、代謝クリアランスの個人差から生じる毒性、および、制限された治療域を考慮するために、血清濃度を定期的にモニターしなければならない。副作用としては、頻脈、頻拍性不整脈、吐き気、および、嘔吐、中枢神経系の刺激、頭痛、発作、吐血、高血糖症、および、低カリウム血症が挙げられる。短時間作用型のβ２アゴニストとしては、これらに限定されないが、アルブテロール、ビトルテロール、ピルブテロール、および、テルブタリンが挙げられる。短時間作用型のβ２アゴニスト投与に伴う有害作用のいくつかとしては、頻脈、骨格筋の震え、低カリウム血症、乳酸の増加、頭痛、および、高血糖症が挙げられる。
【０２０８】
クロモリンナトリウムおよびネドクロミルは、主として、運動またはアレルゲンに起因するアレルギーの症状から生じる喘息の症状を予防するために長期にわたりコントロールするタイプの薬物療法として用いられる。これらの化合物は、塩素チャネルの機能を妨害することによってアレルゲンに対する初期および後期の反応をブロックすると考えられる。さらにこれらは、肥満細胞膜も安定化させ、媒介物質の活性化、および、それらのイノシネオフィル（ｉｎｏｓｉｎｅｏｐｈｉｌ）および上皮細胞からの放出を阻害する。最大の効果を達成するには、一般的に４〜６週間の投与が必要である。
【０２０９】
抗コリン作用薬は、一般的に、急性気管支痙攣の軽減に用いられる。これらの化合物は、ムスカリン様コリン作用性受容体の競合阻害によって機能すると考えられる。抗コリン作用薬としては、これらに限定されないが、臭化イプラトロピウムが挙げられる。これらの化合物は、コリン作用が介在する気管支痙攣のみに拮抗し、抗原に対するいかなる反応も改変することはない。副作用としては、口の渇き、および、呼吸分泌物、人によっては喘鳴の増加が挙げられ、さらに、目に噴霧された場合は視力障害もある。
【０２１０】
また本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、気道リモデリングを治療するのにも有用な可能性がある。気道リモデリングは、気道における平滑筋細胞増殖および／または粘膜下の肥厚によって生じ、最終的には気道狭窄を引き起こし、空気流が制限される。本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、さらなるリモデリングを予防することが可能であり、場合によってはリモデリングプロセスによって生じる組織形成をさらに減少させることもあり得る。
【０２１１】
また本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、樹状細胞の生存、分化、活性化および成熟の改善にも有用である。本免疫刺激オリゴリボヌクレオチドは、樹状細胞の細胞生存、分化、活性化および成熟を促進する特有の能力を有する。
【０２１２】
また本発明の免疫刺激性ＯＲＮは、ナチュラルキラー細胞の溶解作用、および、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）も増加させる。ＡＤＣＣは、免疫刺激性ＯＲＮを、癌細胞のような細胞標的に特異的な抗体と併用して行うことができる。このような抗体と共に免疫刺激性ＯＲＮが被検体に投与されると、腫瘍細胞を殺すように被検体の免疫系が誘導される。ＡＤＣＣ法において有用な抗体としては、体内の細胞と相互作用する抗体が挙げられる。このような細胞標的に特異的な抗体の多くは当業界において説明されており、多くは市販されている。一実施態様において、このような抗体は、ＩｇＧ抗体である。
【０２１３】
特定の形態において、本発明は、エピトープ拡散を強化する方法を提供する。本明細書で用いられる「エピトープ拡散（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）」は、最初に目標となった自己または外来タンパク質に対して向けられた優勢なエピトープに特異的な免疫応答からの、そのタンパク質（分子内の拡散）において、または、その他のタンパク質（分子間の拡散）において亜優占種の、および／または潜在的なエピトープへの、エピトープの特異性の多様化を意味する。エピトープ拡散によって、複数のエピトープ特異的な免疫応答が起こる。
【０２１４】
このような免疫応答は、初期の拡大相（この相は、自己免疫疾患のような場合は有害にもなり得るし、または、ワクチン接種のような場合は有益になり得る）、および、免疫系をホメオスタシスに戻し、記憶を生成する後期のダウンレギュレート相からなる。エピトープ拡散は、どちらの相においても重要な要素である可能性がある。腫瘍の場合におけるエピトープ拡散を強化すれば、被検体の免疫系において、最初のうちは元の治療手順に応答して免疫系によって認識されない標的エピトープを追って決定することが可能になり、同時に、腫瘍群中の変異体が逸散する可能性を低くするため、病気の進行に影響を与えることができる。
【０２１５】
本発明のオリゴリボヌクレオチドは、癌、ウイルスおよび細菌感染、ならびにアレルギーのような治療上有益な適応症におけるエピトープ拡散を促進するのに有用であり得る。一実施態様において、本方法は、被検体に、抗原およびアジュバントを含むワクチンを投与する工程、および、続いて、被検体に、少なくとも２種の用量の本発明の免疫刺激性ＯＲＮを、複数のエピトープ特異的な免疫応答を誘導するのに有効な量で投与することを含む。一実施態様において、本方法は、被検体に、腫瘍抗原およびアジュバントを含むワクチンを投与する工程、および、続いて、被検体に、少なくとも２種の用量の本発明の免疫刺激性ＯＲＮを、複数のエピトープ特異的な免疫応答を誘導するのに有効な量で投与することを含む。一実施態様において、本方法は、被検体において免疫系における抗原曝露が生じる治療手順を適用すること、続いて、複数のエピトープ特異的な免疫応答を誘導するために、すなわちエピトープ拡散を促進するために、本発明の免疫刺激性オリゴリボヌクレオチドを少なくとも２回投与することを含む。様々な実施態様において、このような治療手順は、外科手術、放射線、化学療法、その他の癌治療薬、ワクチン、または、癌ワクチンである。
【０２１６】
このような治療手順は、それに続く免疫刺激剤による治療に加えて、免疫刺激剤を併用して実施してもよい。例えば治療手順がワクチンの場合、ワクチンは、アジュバントと共に投与してもよい。ワクチンとアジュバントとの組み合わせは、混合物であってもよいし、または、投与を分けてもよく、すなわち注射によって（すなわち、同じドレナージ領域に）投与してもよい。投与は、必ずしも同時に行わななくてもよい。異なる時間に注射で投与される場合、そのタイミングは、アジュバントの予備的な注射、それに続くワクチン製剤の注射に関連する可能性がある。
【０２１７】
治療手順が実施された後、免疫刺激剤による単剤療法が開始される。最適化された頻度、持続時間および投与部位は標的およびその他の因子に依存すると予想されるが、例えば、６ヶ月〜２年の期間中に１月に１回〜２回の投与であり得る。あるいは、毎日、毎週、または、２週間に１回のペースで投与してもよいし、または、１日、１週または１月の間に複数回投与してもよい。場合によっては、投与期間は治療の長さに依存する場合があり、例えば、１週間、１ヶ月後に終了してもよいし、１年後、または、数年後に終了してもよい。その他の例において、単剤療法は、例えば点滴静注を用いて連続的に行ってもよい。免疫刺激剤は、標的に共通のドレナージ領域に投与してもよい。
【０２１８】
治療での使用の際には、化合物の活性、投与方式、免疫化の目的（すなわち、予防目的か、または、治療目的か）、障害の性質および重症度、被検体の年齢および体重に応じて様々な用量が被検体の治療に必要な場合がある。所定用量の投与は、別個になった用量単位の形態での１回の投与、または、数回のより少量の用量単位のいずれで行ってもよい。抗原特異的な免疫応答を高めるためには、週単位または月単位で間隔を置いた特定のインターバルで複数回の用量を投与することが一般的である。
【０２１９】
本明細書で示された教示と合わせて、特定の被検体を治療するために、様々な活性な化合物から選択すること、および、効力、相対的生物学的利用率、患者の体重、有害な副作用の重症度、および、好ましい投与様式のような要因を検討することによって、実質的な毒性を引き起こさず、さらに極めて有効な予防または治療的処置の処方計画を計画することができる。あらゆる特定の適用に対する有効量は、治療される病気または状態、投与される具体的な治療剤、被検体の大きさ、または、病気または状態の重症度のような要因に応じて様々であってよい。当業者であれば、特定の核酸および／またはその他の治療剤の有効量を、余計な実験を行うことなく経験的に決定することができる。
【０２２０】
本明細書において説明される化合物の被検体への用量は、典型的には約０．１μｇ〜１０，０００ｍｇ、より典型的には約１μｇ／日〜８０００ｍｇ、最も典型的には約１０μｇ〜１００μｇの範囲である。被検体の体重に関して述べれば、典型的な投与量は、約０．１μｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ／日、より典型的には約１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、最も典型的には約１〜５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
【０２２１】
核酸および／またはその他の化合物を含む本医薬組成物は、薬物療法を施すためのあらゆる適切な経路によって投与することができる。様々な投与経路が利用可能である。当然ながら、選択された具体的な様式は、具体的な物質または選択された物質、治療される具体的な状態、および、治療効果に必要な用量に依存すると予想される。一般的に言えば、本発明の方法は、医学上許容できるどのような投与様式を用いて実施してもよく、すなわちこの投与様式とは、臨床的に許容できない有害作用を引き起こすことなく有効なレベルの免疫応答を生じるあらゆる様式を意味する。本明細書において、好ましい投与様式を考察する。治療に使用するために、核酸および／またはその他の治療剤の有効量は、望ましい表面（例えば粘膜、全身）に上記物質が送達されるあらゆる様式で被検体に投与することができる。
【０２２２】
本発明の医薬組成物の投与は、当業者既知のどのような手段で達成してもよい。投与経路としては、これらに限定されないが、経口、非経口、静脈内、筋肉内、腹膜内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入法、皮下、眼、膣および直腸投与が挙げられる。喘息またはアレルギーを治療または予防するためには、このような化合物は、好ましくは、吸入、摂取によって、または、全身性の経路によって投与してもよい。全身性の経路としては、経口および非経口の経路が挙げられる。いくつかの実施態様において、吸入による薬物療法は、主として喘息患者において炎症部位である肺へ直接送達されるために好ましい。吸入法による投与には、数種のタイプの装置が定期的に用いられる。これらのタイプの装置としては、定量吸入器（ＭＤＩ）、吸気作動式ＭＤＩ、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、ＭＤＩおよびネブライザーと組み合わせたスペーサー／ホールディングチャンバーが挙げられる。
【０２２３】
本発明の治療剤は、ベクターを用いて、特定の組織、細胞型もしくは免疫系へ、またはその両方に送達することができる。「ベクター」とは、最も広い意味で、本組成物の標的細胞への移動を容易にすることができるあらゆる媒体のことである。ベクターは、一般的に、免疫刺激性の核酸、抗体、抗原および／または障害に特異的な医薬品を、ベクター非存在下で生じ得る分解の程度に比べて低い分解の程度で標的細胞に輸送する。
【０２２４】
一般的に、本発明において有用なベクターは、２つのクラス：生物学的なベクター、および、化学的／物理的なベクターに分類される。生物学的なベクター、および、化学的／物理的なベクターは、本発明の治療剤の送達および／または取り込みにおいて有用である。
【０２２５】
ほとんどの生物学的なベクターは、核酸の送達に用いられ、これは、免疫刺激性の核酸そのもの、または、免疫刺激性の核酸を含む治療剤の送達において最も適切であると思われる。
【０２２６】
本明細書において考察される生物学的なベクターに加えて、化学的／物理的なベクターを用いて、免疫刺激性の核酸、抗体、抗原、および、障害に特異的な医薬品などの治療剤を送達してもよい。本明細書で用いられるように、「化学的／物理的なベクター」とは、核酸および／またはその他の医薬品を運搬することができる、細菌学的な源またはウイルス源から誘導されたもの以外の天然または合成分子を意味する。
【０２２７】
本発明の好ましい化学的／物理的なベクターは、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、および、リポソームなどの脂質ベースの系が挙げられる。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、インビボまたはインビトロでの送達ベクターとして有用な人工膜装置である。サイズが０．２〜４．０μｍの範囲である一枚膜リポソーム（ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＬＵＶ）が、大きい高分子を封入することができることが示されている。その水性の内部に、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび無傷のビリオンを封入して、それらを生物学的に活性な形態で細胞に送達することができる。Ｆｒａｌｅｙ等（１９８１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ６：７７。
【０２２８】
リポソームをモノクローナル抗体、糖、グリコリピドまたはタンパク質のような特異的なリガンドにカップリングすることによって、リポソームを特定の組織に標的化することができる。リポソームを免疫細胞に標的化するのに有用な可能性があるリガンドとしては、これらに限定されないが、免疫細胞に特異的な受容体と相互作用する分子の完全体または断片、および、抗体のような、免疫細胞の細胞表面のマーカーと相互作用する分子が挙げられる。このようなリガンドは、当業者周知の結合分析によって容易に同定することができる。さらに他の実施態様において、このようなリポソームは、リポソームを上記で考察された免疫療法のための抗体の１種にカップリングすることによって癌に標的化することもできる。加えて、上記ベクターを核を標的とするペプチドにカップリングして、ベクターを宿主細胞の細胞核に向かわせることもできる。
【０２２９】
トランスフェクションのための脂質調合物が、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）から市販されており、例えば、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥＴＭ（特殊なＤＮＡ濃縮エンハンサーを有する非リポソーム性の脂質）、および、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴＴＭ（新規の活性なデンドリマー技術）がある。
【０２３０】
リポソームは、ギブコ・ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）から例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ、および、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥＴＭとして市販されており、これらは、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）、および、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）のようなカチオン脂質の形態から形成される。リポソームの製造方法は当業界周知であり、多くの出版物で説明されている。またリポソームは、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  Ｇ（１９８５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３：２３５〜２４１でも総論されている。
【０２３１】
所定のカチオン脂質、例えば、具体的にはＮ−［１−（２，３ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルファート（ＤＯＴＡＰ）は、本発明の修飾オリゴリボヌクレオチド類似体と組み合わせると特に有利であるとみられる。
【０２３２】
一実施態様において、このような媒体は、哺乳動物であるレシピエントへの埋め込みまたは投与に適している生体適合性の微粒子またはインプラントである。この方法に従って有用な生浸食性の（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）インプラントの典型例は、ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ／０３３０７号（公報番号ＷＯ９５／２４９２９、名称は「Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ」）で説明されているＰＣＴ／ＵＳ／０３０７は、適切なプロモーターの制御下で外因性遺伝子を包含させるための、生体適合性の、好ましくは生分解性高分子マトリックスを説明している。このような高分子マトリックスを用いて、被検体内での治療剤の持続放出を達成することができる。
【０２３３】
好ましくは、高分子マトリックスは、マイクロスフェア（ここで核酸および／またはその他の治療剤は、固体の高分子マトリックス内全体に分散される）、または、マイクロカプセル（ここで核酸および／またはその他の治療剤は、高分子シェルのコア内に保存される）のような微粒子の形態である。治療剤を包含させるためのその他の高分子マトリックスの形態としては、フィルム、コーティング、ゲル、インプラント、および、ステントが挙げられる。高分子マトリックス装置のサイズおよび組成は、マトリックスが導入される組織中で好都合な解離動態が生じるように選択される。高分子マトリックスのサイズはさらに、用いられる送達方法に従って選択され、このような送達方法は、典型的には、組織への注射、または、鼻および／または肺の領域へのエアロゾルによる懸濁液の投与である。好ましくは、エアロゾル経路が用いられる場合、高分子マトリックス、ならびに核酸および／またはその他の治療剤は、界面活性剤である媒体に包含される。高分子マトリックスの組成を、好都合な分解速度を有し、さらに、生体接着性の材料から形成されるように選択することによって、マトリックスが傷害を受けた鼻および／または肺の表面に投与される場合に移動の有効性が高くすることができる。またマトリックスの組成は、崩壊するのではなく、長期間にわたり拡散によって放出されるように選択してもよい。いくつかの好ましい実施態様において、本核酸は、インプラントによって被検体に投与され、一方その他の治療剤は短時間で投与される。経口送達または粘膜への送達のような送達に適した生体適合性のマイクロスフェアが、Ｃｈｉｃｋｅｒｉｎｇ等（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｅｎｇ  ５２：９６〜１０１、および、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ  Ｅ等（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：４１０〜４１４、および、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９７／０３７０２で開示されている。
【０２３４】
非生分解性および生分解性高分子マトリックスのどちらを用いても、本核酸および／またはその他の治療剤を被検体に送達することができる。好ましくは、生分解性のマトリックスである。このような高分子は、天然高分子でもよいし、または、合成高分子でもよい。このような高分子は、望ましい放出がなされる期間に基づいて選択され、一般的に数時間から数年の規模であり、または、それより長くてもよい。典型的には、数時間から３〜１２ヶ月の範囲の期間にわたる放出が、本核酸物質にとって最も望ましい。このような高分子は、任意に、水中でその重量の約９０％まで吸収することができるヒドロゲルの形態でもよいし、さらに、任意に、多価イオン、またはその他のポリマーで架橋されていてもよい。
【０２３５】
特に興味深い生体接着性ポリマーとしては、Ｈ．Ｓ．Ｓａｗｈｎｅｙ，Ｃ．Ｐ．ＰａｔｈａｋおよびＪ．Ａ．Ｈｕｂｅｌｌ  ｉｎ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，（１９９３）２６：５８１〜５８７（その教示は、本明細書に包含される）で説明されている生浸食性のヒドロゲルが挙げられる。このようなものとしては、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸塩、キトサン、ポリ（メチルメタクリラート）、ポリ（エチルメタクリラート）、ポリ（ブチルメタクリラート）、ポリ（イソブチルメタクリラート）、ポリ（ヘキシルメタクリラート）、ポリ（イソデシルメタクリラート）、ポリ（ラウリルメタクリラート）、ポリ（フェニルメタクリラート）、ポリ（メチルアクリラート）、ポリ（イソプロピルアクリラート）、ポリ（イソブチルアクリラート）、および、ポリ（オクタデシルアクリラート）が挙げられる。
【０２３６】
治療剤が核酸である場合、凝集剤の使用も望ましい場合がある。また凝集剤は、単独で用いてもよいし、または、生物学的または化学的／物理的なベクターと組み合わせて用いてもよい。本明細書で用いられる「凝集剤」は、核酸の負電荷を中和することによって、核酸を微細な顆粒に圧縮できるようにする物質を意味し、例えばヒストンである。核酸を圧縮すると、標的細胞による核酸の取り込みが容易になる。凝集剤は、単独で用いてもよく、すなわち細胞により効率的に取り込まれるような形態で核酸を送達することができ、または、より好ましくは、１種またはそれより多くの上述のベクターと組み合わせて用いてもよい。
【０２３７】
核酸の取り込みを容易にするのに用いることができるその他の典型的な組成物としては、リン酸カルシウム、およびその他の細胞内輸送の化学的媒介物質、マイクロインジェクション用の組成物、エレクトロポレーションおよび相同組換え用の組成物（例えば、標的細胞の染色体内の予め選択された位置に核酸を統合するための組成物）が挙げられる。
【０２３８】
このような化合物は、単独で（例えば、塩類溶液または緩衝液中で）投与してもよいし、または、当業界既知のあらゆる運搬手段を用いて投与してもよい。例えば以下の運搬手段が説明されている：渦巻型の手段（ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）（Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ等，１９９４，１９９６）；Ｅｍｕｌｓｏｍｅｓ（Ｖａｎｃｏｔｔ等，１９９８，Ｌｏｗｅｌｌ等，１９９７）；ＩＳＣＯＭ（Ｍｏｗａｔ等，１９９３，Ｃａｒｌｓｓｏｎ等，１９９１，Ｈｕ  ｅｔ．，１９９８，Ｍｏｒｅｉｎ等，１９９９）；リポソーム（Ｃｈｉｌｄｅｒｓ等，１９９９，Ｍｉｃｈａｌｅｋ等，１９８９，１９９２，ｄｅ  Ｈａａｎ  １９９５ａ，１９９５ｂ）；生細菌のベクター（例えば、サルモネラ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、カルメット−ゲラン杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕeｒｉｎ）、シゲラ、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ））（Ｈｏｎｅ等，１９９６，Ｐｏｕｗｅｌｓ等，１９９８，Ｃｈａｔｆｉｅｌｄ等，１９９３，Ｓｔｏｖｅｒ等，１９９１，Ｎｕｇｅｎｔ等，１９９８）；非ウイルスベクター（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、単純ヘルペス）（Ｇａｌｌｉｃｈａｎ等，１９９３，１９９５，Ｍｏｓｓ等，１９９６，Ｎｕｇｅｎｔ等，１９９８，Ｆｌｅｘｎｅｒ等，１９８８，Ｍｏｒｒｏｗ等，１９９９）；マイクロスフェア（Ｇｕｐｔａ等，１９９８，Ｊｏｎｅｓ等，１９９６，Ｍａｌｏｙ等，１９９４，Ｍｏｏｒｅ等，１９９５，Ｏ’Ｈａｇａｎ等，１９９４，Ｅｌｄｒｉｄｇｅ等，１９８９）；核酸ワクチン（Ｆｙｎａｎ等，１９９３，Ｋｕｋｌｉｎ等，１９９７，Ｓａｓａｋｉ等，１９９８，Ｏｋａｄａ等，１９９７，Ｉｓｈｉｉ等，１９９７）；ポリマー（例えば、カルボキシメチルセルロース、キトサン）（Ｈａｍａｊｉｍａ等，１９９８，Ｊａｂｂａｌ−Ｇｉｌｌ等，１９９８）；ポリマーリング（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｒｉｎｇ）（Ｗｙａｔｔ等，１９９８）；プロテオソーム（Ｖａｎｃｏｔｔ等，１９９８，Ｌｏｗｅｌｌ等，１９８８，１９９６，１９９７）；フッ化ナトリウム（Ｈａｓｈｉ等，１９９８）；トランスジェニック植物（Ｔａｃｋｅｔ等，１９９８，Ｍａｓｏｎ等，１９９８，Ｈａｑ等，１９９５）；ビロゾーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）（Ｇｌｕｃｋ等，１９９２，Ｍｅｎｇｉａｒｄｉ等，１９９５，Ｃｒｙｚ等，１９９８）；および、ウイルス様粒子（Ｊｉａｎｇ等，１９９９，Ｌｅｉｂｌ等，１９９８）。
【０２３９】
本発明の調合物は、製薬上許容できる溶液の形態で投与され、このような溶液には、慣例的手順で、製薬上許容できるの濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性のキャリアー、アジュバント、および、任意にその他の治療用成分を含ませることができる。
【０２４０】
製薬上許容できるキャリアーという用語は、ヒトまたはその他の脊椎動物に投与するのに適した１種またはそれより多くの適合性の固形または液状充填剤、希釈剤、または、カプセル封入剤を意味する。キャリアーという用語は、活性成分の適用が容易になるようにそれらが混合される、天然または合成の有機または無機物質成分を意味する。また本医薬組成物の構成要素は、望ましい薬剤の効率を実質的に損なう可能性がある相互作用が起こらないように本発明の化合物と混合してもよいし、これらの構成要素を互いに混合してもよい。
【０２４１】
経口投与のためには、上記化合物（すなわち、核酸、抗原、抗体、および、その他の治療剤）は、活性な化合物と当業界周知の製薬上許容できるキャリアーとを混合することによって容易に製剤化することができる。このようなキャリアーによって、本発明の化合物を、治療しようとする被検体が経口摂取するための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化することが可能になる。経口で使用するための医薬製剤は、固形賦形剤として得ることができ、任意に、得られた混合物を粉砕して、必要に応じて適切な助剤を添加した後に顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠コアを形成してもよい。適切な賦形剤は、具体的には、糖類のような充填剤、例えばラクトース、スクロース、マンニトール、または、ソルビトール；セルロース調製物、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／または、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。必要に応じて崩壊剤を添加してもよく、このような崩壊剤としては、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、または、アルギン酸もしくはそれらの塩、例えばアルギン酸ナトリウムが挙げられる。任意に、経口製剤はまた、製剤中の酸性状態を中和するための塩類溶液または緩衝液中で製剤化してもよいし、または、キャリアーをまったく用いないで投与してもよい。
【０２４２】
糖衣錠コアには、適切なコーティングが提供される。この目的のために、濃縮した糖溶液を用いてもよく、このような濃縮した糖溶液は、任意に、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール、および／または、二酸化チタン、ラッカー液、および、適切な有機溶媒または溶媒混合物を含んでいてもよい。識別するために、または、異なる活性な化合物の用量の組み合わせを特徴付けるために、錠剤または糖衣錠のコーティングに染料または顔料を添加してもよい。
【０２４３】
経口で用いることができる医薬製剤としては、ゼラチンで作製されたプッシュフィット式カプセル、加えて、ゼラチン、ならびに、グリセロールまたはソルビトールのような可塑剤で作製された軟質の封入カプセルが挙げられる。プッシュフィット式カプセルは、活性成分を、充填剤、例えばラクトース、結合剤、例えばスターチ、および／または、潤滑剤、例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウム、および、任意に安定剤と混合された形態で含んでいてもよい。ソフトカプセル中において、活性な化合物は、脂肪油、流動パラフィンまたは、液状のポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解または懸濁させてあってもよい。それに加えて安定剤を添加してもよい。また経口投与用に製剤化されたマイクロスフェアを用いてもよい。このようなマイクロスフェアは、当業界においてよく定義されている。経口投与のための製剤はいずれも、このような投与法に適した投与量で用いられる必要がある。
【０２４４】
口腔投与のためには、本組成物は、従来の方式で製剤化された錠剤またはロゼンジの形態をとっていてもよい。
吸入法による投与の場合、本発明に従って使用するための上記化合物は、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、またはその他の適切なガスを使用して、加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレーを噴霧する形態で送達することが都合のよい形態であり得る。加圧エアロゾルの場合、定量を送達するためのバルブを設けることによって投与単位を決定してもよい。吸入器または吹き付け器に使用するための、例えばゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、上記化合物、および、適切な粉末ベース（例えばラクトースまたはスターチ）の粉末混合物を含ませて製剤化してもよい。
【０２４５】
上記化合物は、それらを全身に送達することが望ましい場合、注射、例えば大量注射または持続点滴による非経口投与のために製剤化してもよい。注射用製剤は、１回投与量の場合は例えばアンプルの形態で提供してもよいし、または、保存剤を添加した複数回投与用の容器の形態で提供してもよい。本組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態をとることもでき、さらに、懸濁剤、安定剤および／または分散剤のような成形剤を含んでいてもよい。
【０２４６】
非経口投与のための医薬製剤としては、水溶性の形態の活性な化合物の水溶液が挙げられる。加えて、活性な化合物の懸濁液は、適切な油性懸濁注射液として製造してもよい。適切な親油性溶媒または媒体としては、脂肪油、例えばゴマ油、または、合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル、もしくは、トリグリセリド、または、リポソームが挙げられる。水性懸濁注射液は、懸濁液の粘度を高める物質を含んでいてもよく、このような物質としては、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、または、デキストランが挙げられる。任意に、懸濁液はまた、適切な安定剤、または、上記化合物の溶解性を高める物質を含んでいてもよく、それにより高度に濃縮された溶液の製造が可能になる。
【０２４７】
あるいは、活性な化合物は、使用前に適切な媒体（例えば滅菌パイロジェンフリー水）と共に構成するために、粉末形態であってもよい。
また上記化合物は、直腸または膣用の組成物として製剤化してもよく、このような製剤としては、例えば、カカオバターまたはその他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を含む坐剤または保留浣腸が挙げられる。
【０２４８】
これまで説明した製剤に加えて、上記化合物はまた、デポ製剤として製剤化してもよい。このような持続型製剤は、適切な高分子材料または疎水性材料（例えば、許容できる油中のエマルジョンとして）、または、イオン交換樹脂を用いて製剤化してもよいし、または、難溶性の誘導体（例えば難溶性の塩）として製剤化してもよい。
【０２４９】
また本医薬組成物は、適切な固相またはゲル相キャリアー、または、賦形剤を含んでもよい。このようなキャリアーまたは賦形剤の例としては、これらに限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類、スターチ、セルロース誘導体、ゼラチン、および、ポリエチレングリコールのようなポリマーが挙げられる。
【０２５０】
適切な液状または固形医薬製剤の形態は、例えば、吸入のための水溶液または食塩水の形態、マイクロカプセル化の形態、渦巻（ｅｎｃｏｃｈｌｅａｔｅｄ）の形態、顕微鏡レベルの金粒子上に被覆された形態、リポソーム中に内包された形態、噴霧された形態、エアロゾルの形態、皮膚に埋め込むためのペレットの形態、または、皮膚を引っ掻くために鋭利な物体上に乾燥させた形態である。また本医薬組成物は、顆粒、粉末、錠剤、コーティング錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、エマルジョン、懸濁液、クリーム、ドロップ、または、活性な化合物を長期にわたって放出させる製剤の形態が挙げられ、その製造において、賦形剤および添加剤、および／または、助剤、例えば崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、潤滑剤、矯味矯臭薬剤、甘味料、または、可溶化剤が、上述したように習慣的に用いられる。本医薬組成物は、様々な薬物送達システムへの使用に適している。薬物送達方法の簡単な総論としては、Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜１５３３を参照（参照することにより本明細書に含まれる）。
【０２５１】
本核酸、ならびに任意にその他の治療剤および／または抗原は、そのままの（純粋な）形態で投与してもよいし、または、製薬上許容できる塩の形態で投与してもよい。医薬品で用いられる場合、このような塩は製薬上許容できるものと予想されるが、製薬上許容できる塩以外のものも、それらの製薬上許容できる塩を製造するために都合よく用いられる可能性がある。このような塩としては、これらに限定されないが、以下の酸から製造された塩が挙げられる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、および、ベンゼンスルホン酸。また、このような塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類塩として製造することもでき、例えば、カルボン酸基のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩として製造することもできる。
また、このような塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類塩として製造することもでき、例えば、カルボン酸基のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩として製造することもできる。
【０２５２】
適切な緩衝剤としては、酢酸および塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸および塩（１〜３％ｗ／ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；および、リン酸および塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）が挙げられる。適切な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）、および、チメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）が挙げられる。
【０２５３】
本組成物は、１回投与量で提供されることが都合がよい場合があり、これは、薬学分野において周知の方法のいずれかによって製造することができる。いずれの方法も、上記化合物を、１種またはそれより多くの付属的な成分を構成するキャリアーに接触させる工程を含む。一般的に、本組成物は、上記化合物を、液状キャリアー、微粉化した固形キャリアー、または、その両方に均一かつ密接に接触させ、続いて、必要に応じて生成物を成形することによって製造される。液体の用量単位は、バイアルまたはアンプルである。固体の用量単位は、錠剤、カプセルおよび坐剤である。
【０２５４】
その他の送達システムとしては、徐放性、遅延放出、または、持続放出型の送達システムが挙げられる。このようなシステムによって、上記化合物の繰り返しの投与を避けることができるため、被検体および医師にとっての利便性を高めることができる。多くのタイプの放出送達システムが利用可能であり、当業者既知である。これらの例としては、ポリマーベースのシステム、例えばポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサラート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、および、ポリ無水物が挙げられる。例えば米国特許第５，０７５，１０９号で、薬物を含む前述のポリマーのマイクロカプセルが説明されている。また送達システムとしてはさらに、以下のような非ポリマーシステムも挙げられる：ステロールなどの脂質、例えばコレステロール、コレステロールエステル、および、脂肪酸、または、中性脂肪、例えばモノ、ジおよびトリグリセリド；ヒドロゲル放出システム；シラスティック（Ｓｉｌａｓｔｉｃ）システム；ペプチドベースのシステム；ワックスコーティング；従来の結合剤および賦形剤を用いた圧縮錠剤；部分的に融合したインプラント；など。具体的には、これらに限定されないが、例えば以下が挙げられる：（ａ）例えば米国特許第４，４５２，７７５号、４，６７５，１８９号および５，７３６，１５２号で説明されているような、本発明の物質がマトリックス内に含まれる形態の浸食性のシステム、および、（ｂ）例えば米国特許第３，８５４，４８０号、５，１３３，９７４号および５，４０７，６８６号で説明されているような、ポリマーから活性成分が制御された速度で透過する拡散性のシステム。加えて、ポンプベースの硬質の送達システムを用いることができ、そのうちのいくつかは、埋め込みに適応されている。
【０２５５】
以下の実施例を用いて本発明をさらに説明するが、さらに制限するものとして解釈すべきではない。
【実施例】
【０２５６】
実施例１
Ｎ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２を含むオリゴリボヌクレオチドに対するヒトＰＢＭＣの反応性
方法：ルミネックス技術
ルミネックスで、マイクロスフェアと呼ばれる小型のビーズを１００種の別々の群に色分けした。各ビーズ群は、特定の分析物のサンプルからの捕獲および検出を可能にする特定の生物学的分析に特異的な試薬で被覆した。ルミネックス製の小型の解析器において、レーザーによって、各マイクロスフェア粒子を同定する内部の色素を励起させ、さらに分析中に捕捉されるあらゆるレポーター色素も励起させた。各ビーズ群において多くの測定値が得られ、さらにその結果を確認した。この方法で、ルミネックス技術は、単一のサンプル内で１００種までの別個の分析を急速かつ正確に同時に行うことを可能にする。
【０２５７】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を健康なドナーから単離し、平板培養し、インビトロで様々な試験およびコントロール免疫促進剤で１６時間刺激した。１６時間後、上清を回収し、次にＥＬＩＳＡ分析によって解析した。ＤＯＴＡＰと複合体化されたＮ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２を含むオリゴリボヌクレオチドの試験は、全範囲の滴定曲線（７種の濃度）を用いて、ＤＯＴＡＰ（２５μｇ／ｍｌ）と複合体化されたＯＲＮ（２μＭ）から開始して、３分の１希釈する工程を用いて行われた。また所定のネガティブコントロール、例えば培地単独およびＤＯＴＡＰ単独（２５μｇ／ｍｌ（培養液ウェル）；「リポソーム」）なども用いられた。コントロール免疫促進剤としては、イミダゾキノリンＲ−８４８（２μＭ，３分の１希釈する工程、および、７種の濃度）、ＴＬＲ７に関して報告されているリガンド、ＡＵおよびＡＵＵ配列のようなＴＬＲ８モチーフを有するＯＲＮ（配列番号１３〜配列番号１５）、ＣＵ、ＧＵおよびＧＵＵ配列のようなＴＬＲ７／８モチーフを有するＯＲＮ（配列番号１９〜配列番号２３）が用いられた。図１および３に結果を示す。
【０２５８】
異なるＯＲＮ配列を試験する類似の分析が、単離されたｐＤＣ、単球、および、ｍＤＣ刺激を用いて行われた。細胞を、ＤＯＴＡＰ（１０μｇ／ｍｌ）と複合体化されたＯＲＮ（０．５μＭ）、０．５μＭのＣｐＧＯＤＮ、または、ＤＯＴＡＰ、または、培地単独で刺激した。１６時間後、上清を回収し、ＩＦＮ−アルファ、ＴＮＦ−アルファ、および、ＩＬ−１２ｐ４０レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。図２に、結果を示す。
【０２５９】
図１は、ＡＵ配列を含む配列番号１２、および、ＧＵ配列を含む配列番号２１に関して、ＰＢＭＣ刺激によるＴＮＦ−アルファ生産とＩＦＮ−アルファ生産との間に明確な差があることを示す。さらなる配列解析から、ＣＵＡ反復（配列番号２４）は、ＩＦＮ−アルファ生産を伴わない追加のＴＮＦ−アルファを誘導するＯＲＮであることが明らかになった。ＡＵおよびＧＵ反復を含むより短いＯＲＮ（配列番号２９〜配列番号３４）から、より長いＯＲＮ（配列番号１２〜配列番号２３）と比較して類似した結果が示されたが、有効性および効力は低下した。
【０２６０】
図２および６は、単離された単球、ｐＤＣおよびｍＤＣにおけるＡＵ−ＯＲＮ（配列番号１３）、および、ＧＵ−ＯＲＮ（配列番号２１）の解析を示し、これから、ＡＵ−ＯＲＮ（配列番号１３）に関してＩＦＮ−アルファ生産が顕著に減少したこと、ならびに、両方のＯＲＮに関して明らかにＴＮＦ−アルファおよびＩＬ−１２ｐ４０が生産されたことがわかる。ＯＲＮ刺激の際のｐＤＣからのＩＦＮ−アルファ生産は、ＴＬＲ７が媒介しているようであるが、一方で、単離された単球およびｍＤＣからのＴＮＦ−アルファおよびＩＬ−１２ｐ４０生産は、ＴＬＲ８が媒介しているようである。
【０２６１】
ルミネックスの結果は、ＥＬＩＳＡデータに匹敵する結果を示し、ＧＵ−ＯＲＮとＡＵ−ＯＲＮとの間の主要な差は、ＩＦＮ−アルファ生産、および、ＩＦＮ−アルファ関連の遺伝子／サイトカインによるものであることが証明された（図３および８ａ）。加えて、さらなるルミネックスのデータによれば、ＩＦＮ−アルファ、および、ＩＦＮ−アルファ関連の遺伝子／  サイトカインに対して、その他のサイトカイン／ケモカインは、影響を受けないこと（図７および８ａ〜ｄ）が示された（ただし、１つの範囲から外れたＣＤ１２３−ＣＤ１４−細胞由来のＩＬ−６を含む）。このＩＬ−６生産は、ＴＬＲ７が媒介するＢ細胞の活性化に起因する可能性がある。
【０２６２】
実施例２
オリゴリボヌクレオチドのＩＦＮ−アルファおよびＴＮＦ−アルファの最大活性の比較
ヒトＰＢＭＣを、ＤＯＴＡＰと複合体化されたＯＲＮで刺激した。１６時間後、上清を回収し、ＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−アルファレベルを測定した。３〜６種の血液ドナーおよび２回の独立した実験から、０．６μＭにおける平均／最大活性を決定した。図４に、結果を示す。これらのデータにおいて、明らかに、ＴＬＲ８と、ＴＬＲ７／８モチーフとの間で違いが示された：すなわち、モチーフＮ−Ｕ−Ｒ１−Ｒ２を有するＯＲＮの場合、３００ｐｇ／ｍｌ未満でＩＦＮ−アルファ生産を示したが、ＴＬＲ７／８ＯＲＮの場合、ＰＢＭＣ刺激の際により高いＩＦＮ−アルファ生産を示した（図４ａ）。ＴＬＲ８およびＴＬＲ７／８ＯＲＮは、赤色のラインで分けられている。それに対して、ＴＮＦ−アルファレベルの測定からは、ＴＬＲ８を有するＯＲＮ、および、ＴＬＲ７／８モチーフを有するＯＲＮはいずれも、ＴＮＦ−アルファ生産を刺激することが示された。
【０２６３】
実施例３
オリゴリボヌクレオチドのＩＦＮ−アルファに対する最大活性、および、ＩＦＮ−アルファのＥＣ５０の比較
ヒトＰＢＭＣを、ＤＯＴＡＰと複合体化されたＯＲＮで刺激した。１６時間後、上清を回収し、ＩＦＮ−アルファレベルを測定した。３〜６種の血液ドナー、および、２回の独立した実験からの、完全な滴定曲線（範囲：２μＭ〜０，９ｎＭ）の０．６μＭおよびＥＣ５０における平均／最大活性を決定した。図５に、結果を示す。ＥＣ５０および最大活性から、ＴＬＲ８およびＴＬＲ７／８モチーフに関して同様の結果が示された。低いＥＣ５０／高い最大活性は、ＴＬＲ７／８ＯＲＮを示す（図５ａ）、それに対して高いＥＣ５０、および、低い最大活性は、ＴＬＲ８ＯＲＮを示す（図５ｂ）。
【０２６４】
表１に列挙された本ＯＲＮの配列を、ヒトＰＢＭＣ刺激におけるＩＦＮ−アルファおよびＴＮＦ−アルファ生産に関して試験した。ヒトＰＢＭＣを指定されたＯＲＮで１６時間刺激し、上清を回収し、サイトカインの生産をＥＬＩＳＡによって測定した。表２に、ＯＲＮのＩＦＮ−アルファ、および、ＴＮＦ−アルファ生産に関する最小／最大活性、および、ＥＣ５０を要約する。
【０２６５】
【表１】
2009517048.tif 000004
【０２６６】
【表２−１】
2009517048.tif 000005
【０２６７】
【表２−２】
2009517048.tif 000006
【０２６８】
実施例４
合成ＯＲＮは、ヒトＰＢＭＣ刺激の際にＩＦＮ−アルファの放出と、ＴＮＦ−アルファの放出とを区別する
ＣＤ１２３＋精製したｐＤＣ（図１０ａおよび１０ｂ）、または、単離された単球（図１０ｃ）を、ＤＯＴＡＰ（２５μｇ／ｍｌ）と複合体化されたＯＲＮ（１μＭ）、または、ＤＯＴＡＰ単独（図１０ａ）、または、ＤＯＴＡＰと複合体化された指定されたＯＲＮ、または、ＤＯＴＡＰ単独（図１０ｂ〜１０ｃ）とインキュベートした。１６時間後、細胞を回収し、ＣＤ１２３、ＣＤ１１ｃおよびＨＬＡ−ＤＲ抗体（図１０ａ、および、１０ｂ）、または、ＣＤ１４、および、ＣＤ１９（図１０ｃ）で染色した。ＣＤ８６のＦＡＣＳ解析によれば、ＡＵリッチなＯＲＮ（配列番号１３）、および、ＧＵリッチなＯＲＮ（配列番号２１）は、ｐＤＣ刺激の際のＣＤ８６の表面におけるマーカー発現において差を示すことが示される（図１０ａ）。ＡＵリッチなＯＲＮ（配列番号１３）で刺激しても、極めてわずかなＣＤ８６活性化しか生じないが、それに対してＧＵリッチなＯＲＮ（配列番号２１）で刺激すると、有意なＣＤ８６活性化が生じる。この活性化は、用量依存性であると決定された（図１０ｂ）。ＡＵリッチなＯＲＮ（配列番号１３）、および、ＧＵリッチなＯＲＮ（配列番号２１）は、ヒトＰＢＭＣ（データ示さず）およびＣＤ１４陽性細胞刺激の際にＣＤ８０の表面におけるマーカー発現において差を示さなかった（図１０ｃ）。
【０２６９】
実施例５
ＡＵリッチなＯＲＮ（配列番号１３）、および、ＧＵリッチなＯＲＮ（配列番号２１）は、特定のヒトＴＬＲ８シグナル伝達を用量に依存して刺激する
反応性が低いＨＥＫ−２９３細胞を、ヒトＴＬＲ３またはＴＬＲ８発現プラスミド、および、ＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子コンストラクトで安定してトランスフェクションした。細胞を、指定されたＯＲＮ配列（１０μＭのＤＯＴＡＰと複合体化された（５０μｇ／ｍｌ））、または、コントロールの刺激物質（１０μＭのＲ−８４８、５０μｇ／ｍｌのポリＩＣ、３，３μＭのＯＤＮ１０１０３、または、ＤＯＴＡＰ（５０μｇ／ｍｌ））と共に１６時間インキュベートした。ＮＦκＢ−活性化を、ルシフェラーゼ活性を分析することによって測定した。その結果、バックグラウンド（培地）を超える誘導の倍率として示した。６回の独立した反復のうち１つの代表的な実験を示す（図９ａ）。
【０２７０】
ヒトＴＬＲ８を発現する安定してトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３細胞を、既定濃度のＤＯＴＡＰと複合体化されたＯＲＮ（５０μｇ／ｍｌから開始，３分の１希釈）、または、ＤＯＴＡＰ単独（５０μｇ／ｍｌから開始，３分の１希釈）で１６時間刺激した。ＮＦκＢ活性化を、ルシフェラーゼ活性を分析することによって測定した。結果は、バックグラウンド（培地）を超える誘導の倍率として示した。３回の独立した同じ実験の繰り返しのうち１つの代表的な実験を示す（図９ｂ）。
【０２７１】
反応性のないＨＥＫ−２９３細胞を、ヒトＴＬＲ８発現プラスミド、および、ＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子コンストラクトで安定してトランスフェクションした。細胞を、指定されたＯＲＮ配列（１５μＭのＤＯＴＡＰと複合体化された（７５μｇ／ｍｌ））、または、コントロール刺激（１５μＭのＲ−８４８、または、ＤＯＴＡＰ（７５μｇ／ｍｌ））、および、培地（左）、２００ｎＭのＢａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ（Ｂａｆ．，中央）、または、１ｍＭのクロロキン（ＣＱ，右）と１６時間インキュベートした。ＮＦκＢ−活性化を、ルシフェラーゼ活性を分析することによって測定した。結果は、バックグラウンド（培地）を超える誘導の倍率として示した。４回の独立した同じ実験の繰り返しのうち１つの代表的な実験を示す（図９ｃ）。
【０２７２】
ＲＰＭＩ８２２６細胞を、１０００Ｕ／ｍｌイントロンＡと共に３時間プレインキュベートし、培地で２回洗浄し、次に、既定濃度のＤＯＴＡＰと複合体化されたＯＲＮ（５０μｇ／ｍｌから開始，３分の１希釈）で１６時間刺激した。ＩＰ−１０のサイトカイン放出をＥＬＩＳＡによって測定した。結果をｐｇ／ｍｌとして示す。３回の独立した同じ実験の繰り返しのうち１つの代表的な実験を示す（図９ｄ）。
【０２７３】
これらのデータは、配列番号１３および配列番号２１のＴＬＲ８に対する特異性を実証する。
このような分析を、ＴＬＲ８ＯＲＮ（配列番号１３）、ＴＬＲ７／８ＯＲＮ（配列番号２１）、および、コントロールＯＲＮ（配列番号５）（表３）を用いて、高用量（Ｈ．Ｄ．，１０μｇ／ｍｌ）、および、低用量（Ｌ．Ｄ．，２．５μｇ／ｍｌ）の両方で繰り返した。配列番号２１での処理だけが、ＩＬ−１２、および、ＴＮＦ−アルファの有意な生産（それぞれ図１１ａおよび１１ｂ）を引き起こした。全てのＯＲＮが、ＩＦＮ−γの生産を刺激した（図１１ｃ）。
【０２７４】
【表３】
2009517048.tif 000007
【０２７５】
実施例６
マウスマクロファージは、インビトロまたはインビボでＡＵリッチなＯＲＮ（配列番号１３）に応答しない
Ｒａｗ２６４．７細胞（図１２ａ）、Ｊ７７４細胞（図１２ｂ）、および、精製したＣＤ１１ｃ＋細胞（ミルテニー（Ｍｉｌｔｅｎｙ）、磁気ビーズで標識）を、ｓｖ１２９マウス脾細胞（図１２ｃ〜１２ｅ）から単離し、既定濃度のＤＯＴＡＰと複合体化されたＯＲＮ（５０μｇ／ｍｌ、および、ＯＲＮで希釈）、Ｒ−８４８、または、ＤＯＴＡＰ単独（５０μｇ／ｍｌ）で刺激した。１６時間（図１２ａ、および、１２ｂ）後、または、２０時間（図１２ｃ〜１２ｅ）後、上清を回収し、ＴＮＦ−アルファ（図１２ａ、および、１２ｂ）、ＩＬ−１２ｐ４０（図１２ｃ）、ＩＦＮ−アルファ（図１２ｄ）、および、ＩＰ−１０（図１２ｅ）のＥＬＩＳＡに用いた。データは、少なくとも３回の実験からの個々のデータ（図１２ａおよび１２ｂ）、および、３匹のマウスの平均（図１２ｃ〜１２ｅ）を示す。ＡＵリッチなＯＲＮの、インビボでマウス細胞を刺激する能力を測定するために、ｓｖ１２９マウス（ｎ＝５／グループ）に、ＤＯＴＡＰ（６０、２０、または、６μｇ／ｍｌ）を用いて配合された指定されたＯＲＮを注射し、３時間後に採血した。全血中のＩＬ−１２ｐ４０（図１２ｆ）、ＩＦＮ−アルファ（図１２ｇ）、および、ＩＰ−１０（図１２ｈ）の生産を、ＥＬＩＳＡによって測定した。
【０２７６】
実施例７
精製したラット脾細胞は、ＡＵリッチなＯＲＮ（配列番号１３）に応答しない
３匹のスプラーグ−ドーリーラットからの脾細胞をプールし、既定濃度の配列番号２１、配列番号１３（いずれも、６２．ＤＯＴＡＰ（５μｇ／ｍｌ）と複合体化された，５分の１希釈）、Ｒ−８４８、または、ＤＯＴＡＰ単独（６２．５μｇ／ｍｌから開始，５分の１希釈）で刺激した。２０時間後に上清を回収し、ＴＮＦ−アルファレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。図１３で示されるように、ＧＵリッチなＯＲＮ（配列番号２１）での刺激は、ＴＮＦ−アルファ生産を引き起こすが、それに対してＡＵリッチなＯＲＮ（配列番号１３）での刺激は、ＴＮＦ−アルファ生産を引き起こさない。
【０２７７】
実施例８
げっ歯類細胞がＡＵリッチなＯＲＮ（配列番号１３）に応答しなかったことは、種間のＴＬＲ８多形が原因である可能性がある
ヒトおよびウシ細胞をＡＵリッチなＯＲＮで刺激すると、サイトカインの生産が起こったが、それに対してマウスおよびラット細胞を刺激してもそのような生産は起こらなかった。ＴＬＲ８配列のアライメントおよび解析を行った。様々な脊椎動物（ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ウシ、ブタ、マウス、および、ラット）間のＴＬＲ８のタンパク質配列を比較したところ、ドメイン１のロイシンリッチな反復（ＬＲＲ）３に大きな差があることが示された。ヒト、チンパンジーおよびサルでは高度に保存されているが、ラット、マウスおよびブタは、１０６位（マウス）、１０３位（ラット）、または、１０２位（ブタ）において４ＡＡの欠失を示し、ウシでは、ヒトと比較して２ＡＡ（１０５〜１０６）の挿入があることが示された。興味深いことに、ブタおよびウシでは、同じ領域内（９７位）にその他の２ＡＡの欠失が見出された。ドメイン１のロイシンリッチな反復領域における欠失は、ＡＵリッチなＯＲＮ結合に干渉する可能性があると言える。
【０２７８】
等価物
以上に記載された明細書は、当業者が本発明を実施するのに十分であるとみなされる。実施例は、本発明の一形態の単なる説明として意図されており、その他の機能的に同等な実施態様も本発明の範囲内であるため、本発明は、提供された実施例によってその範囲が限定されないこととする。本明細書において示され説明されたものに加えて、本発明の様々な改変が、当業者であれば前述の説明から十分明らかであると思われ、それらは添付の請求項の範囲内に含まれる。本発明の利点が、必ず本発明の各実施態様に包含されるわけではない。
【０２７９】
本願で引用された全ての参考文献、特許および特許公報は、参照によりそれらの全体が本明細書に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０２８０】
【図１−１】図１Ａ〜Ｃは、ＰＢＭＣ刺激の際にＯＲＮによって誘導されたサイトカイン生産を示す一連のグラフである。ＩＦＮ−アルファおよびＴＮＦ−アルファのサイトカイン生産を測定することによって、ＴＬＲ８とＴＬＲ７／８モチーフとの間に差が観察された。滴定曲線の全範囲で、ヒトＰＢＭＣを、ＤＯＴＡＰ（２５μｇ／ｍｌ，３分の１希釈）と複合体化された指定されたＯＲＮ（２μＭ，３分の１希釈）、または、Ｒ−８４８（２μＭ，３分の１希釈）で刺激した。１６時間後、上清を回収し、ＩＦＮ−アルファ（図１ａ）およびＴＮＦ−アルファ（図１ｂ）をＥＬＩＳＡによって測定した。データは、少なくとも３回の独立した実験で３種の血液ドナーから得られた値の平均を示す。ＤＯＴＡＰ単独では、作用を示さなかった。このＯＲＮは、ＤＯＴＡＰと複合体化され、Ｒ−８４８は、複合体化されていない。ＤＯＴＡＰ単独は、コントロールである。図１ｃにおいて、ヒトＰＢＭＣを、ＤＯＴＡＰ（２．２μｇ／ｍｌ）と複合体化された指定されたＯＲＮ（０．２μＭ）、または、Ｒ−８４８（２μＭ）で刺激した。１６時間後、上清を回収し、ＩＦＮ−アルファ（左のパネル）およびＴＮＦ−アルファ（右のパネル）をＥＬＩＳＡによって測定した。示されたデータは、３種のドナーから得られた値の平均（±ＳＥＭ）である。
【図１−２】図１Ａ〜Ｃは、ＰＢＭＣ刺激の際にＯＲＮによって誘導されたサイトカイン生産を示す一連のグラフである。
【図２】単離されたｐＤＣ（図２Ａ）、単球（図２Ｂ）、および、ｍＤＣ（図２Ｃ）刺激の際にＯＲＮによって誘導されたサイトカイン生産を示す一連の棒グラフである。細胞を、ＤＯＴＡＰ（１０μｇ／ｍｌ）と複合体化されたＯＲＮ（０．５μＭ）、０．５μＭのＣｐＧＯＤＮもしくはＤＯＴＡＰ、または、培地単独で刺激し、ＩＦＮ−アルファ（図２ａ）、ＴＮＦ−アルファ（図２ｃ）、および、ＩＬ−１２ｐ４０（図２ｃ）を測定した。
【図３】図３ＡとＢは、ＰＢＭＣ刺激の際にＯＲＮによって誘導されたサイトカイン生産を示す一連の棒グラフである。ヒトＰＢＭＣを、ＤＯＴＡＰ（１０μｇ／ｍｌ）と複合体化された指定されたＯＲＮ（０．５μＭのＯＲＮ）で刺激し、ＩＦＮ−アルファ（図３Ａ）およびＴＮＦ−アルファ（図３Ｂ）を測定し、サイトカインの生産をＥＬＩＳＡ技術で測定し、ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）技術で比較した。
【図４Ａ】指定されたＯＲＮのＩＦＮ−アルファ（図４ａ）およびＴＮＦ−アルファ（図４ｂ）の最大活性の比較を示す棒グラフである。ヒトＰＢＭＣを、ＤＯＴＡＰ（２５μｇ／ｍｌから開始，３分の１希釈）と複合体化されたＯＲＮ（７種の濃度，２μＭから開始，３分の１希釈）で刺激し、２回の独立した実験で３〜６種の血液ドナーの０．６μＭにおける平均最大活性を評価した。
【図４Ｂ】指定されたＯＲＮのＩＦＮ−アルファ（図４ａ）およびＴＮＦ−アルファ（図４ｂ）の最大活性の比較を示す棒グラフである。
【図５Ａ】ＩＦＮ-アルファの最大活性（図５a）とＩＦＮ-アルファ EC５０（図５b）との比較を示す棒グラフである。ヒトＰＢＭＣを、ＤＯＴＡＰと複合体化されたＯＲＮで刺激し、ＩＦＮ−アルファを測定した。
【図５Ｂ】ＩＦＮ-アルファの最大活性（図５a）とＩＦＮ-アルファ EC５０（図５b）との比較を示す棒グラフである。
【図６−１】図６Ａ〜Ｄは、３種の血液ドナーからのＰＢＭＣ、単離されたｐＤＣ、または、単離された単球に関するＴＬＲ８（配列番号１３）またはＴＬＲ７／８（配列番号２１）を用いたＯＲＮの滴定曲線を比較する一連のグラフである。これらの細胞を、ＤＯＴＡＰ（２５μｇ／ｍｌから開始，４分の１希釈）と複合体化されたＯＲＮ（４種の濃度，１μＭから開始，４分の１希釈）で刺激した。１６時間後、上清を回収し、サイトカインの生産を、ルミネックス技術によって測定した。このグラフは、配列番号２１（０．３μＭにおける）のサイトカイン生産のパーセントを示す。
【図６−２】図６Ａ〜Ｄは、３種の血液ドナーからのＰＢＭＣ、単離されたｐＤＣ、または、単離された単球に関するＴＬＲ８（配列番号１３）またはＴＬＲ７／８（配列番号２１）を用いたＯＲＮの滴定曲線を比較する一連のグラフである。
【図７−１】３種の血液ドナーの、あらゆる濃度における、ＰＢＭＣ、単離された単球、単離されたｐＤＣ、および、ＣＤ１４−ＣＤ１２３−ＰＢＭＣに関する平均最大活性示す一連の棒グラフを示す。これらの細胞を、ＤＯＴＡＰ（２５μｇ／ｍｌから開始，４分の１希釈）と複合体化されたＯＲＮ（４種の濃度，１μＭから開始，４分の１希釈）で刺激した。１６時間後、上清を回収し、サイトカインの生産を、ルミネックス技術によって測定した。赤色の四角は、ＤＯＴＡＰおよび培地のバックグラウンドを超える陽性反応を意味する。
【図７−２】３種の血液ドナーの、あらゆる濃度における、ＰＢＭＣ、単離された単球、単離されたｐＤＣ、および、ＣＤ１４−ＣＤ１２３−ＰＢＭＣに関する平均最大活性示す一連の棒グラフを示す。
【図７−３】３種の血液ドナーの、あらゆる濃度における、ＰＢＭＣ、単離された単球、単離されたｐＤＣ、および、ＣＤ１４−ＣＤ１２３−ＰＢＭＣに関する平均最大活性示す一連の棒グラフを示す。
【図７−４】３種の血液ドナーの、あらゆる濃度における、ＰＢＭＣ、単離された単球、単離されたｐＤＣ、および、ＣＤ１４−ＣＤ１２３−ＰＢＭＣに関する平均最大活性示す一連の棒グラフを示す。
【図８−１】図８Ａ〜Ｄは、ＴＬＲ８（配列番号１３）およびＴＬＲ７／８（配列番号２１）のＯＲＮ間の差を示す一連の棒グラフである。これらの細胞を、ＤＯＴＡＰ（２５μｇ／ｍｌから開始，４分の１希釈）と複合体化されたＯＲＮ（４種の濃度，１μＭから開始，４分の１希釈）で刺激した。１６時間後、上清を回収し、サイトカインの生産を、ルミネックス技術によって測定した。このグラフにおいて、あらゆる濃度におけるサイトカインの生産の測定された最大値の平均を、ＴＬＲ８ＯＲＮ（配列番号１３）のＴＬＲ７／８のＯＲＮ（配列番号２１）に対するパーセントとして示した。これは、単離されたｐＤＣ、ＰＢＭＣ、単離された単球、および、ＣＤ１２３−ＣＤ１４−ＰＢＭＣに関して示される。
【図８−２】図８Ａ〜Ｄは、ＴＬＲ８（配列番号１３）およびＴＬＲ７／８（配列番号２１）のＯＲＮ間の差を示す一連の棒グラフである。
【図９−１】図９Ａ〜Ｄは、安定してトランスフェクションされたＨＥＫ-２９３細胞内でＴＬＲ８を介して作用するＴＬＲ８ＯＲＮ（配列番号１３）、および、ＴＬＲ７/８のＯＲＮ （配列番号２１）の反応を示す一連の棒グラフおよび曲線である。ＮＦκＢ−ルシフェラーゼを読み出すレポーター、および、ヒトＴＬＲ８で安定してトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３細胞を、指定されたＯＲＮで１６時間刺激した。１６時間後、上清を除去し、細胞を溶解させ、ルシフェラーゼ活性またはサイトカインレベルを測定した。図９ａおよび９ｂは、刺激後のＮＦκＢ−ルシフェラーゼの誘導倍率を示す。図９ｃは、阻害剤の存在下で刺激した後のＮＦκＢ−ルシフェラーゼの誘導倍率を示す。図９ｄは、ルシフェラーゼ分析によって測定された刺激後のＩＰ−１０の刺激を示す。
【図９−２】図９Ａ〜Ｄは、安定してトランスフェクションされたＨＥＫ-２９３細胞内でＴＬＲ８を介して作用するＴＬＲ８ＯＲＮ（配列番号１３）、および、ＴＬＲ７/８のＯＲＮ （配列番号２１）の反応を示す一連の棒グラフおよび曲線である。
【図１０】図１０Ａ〜Ｃは、ヒトｐＤＣをＡＵリッチまたはＧＵリッチなＯＲＮで刺激した際の表面におけるマーカー発現を示す一連のグラフである。ＣＤ１２３＋精製ｐＤＣ（図１０ａおよび１０ｂ）、または、単離された単球（図１０ｃ）を、ＤＯＴＡＰ（２５μｇ／ｍｌ）と複合体化されたＯＲＮ（１μＭ）、または、ＤＯＴＡＰ単独（図１０ａ）、または、ＤＯＴＡＰと複合体化された指定されたＯＲＮ、または、ＤＯＴＡＰ単独（図１０ｂ〜１０ｃ）とインキュベートした。１６時間後、細胞を回収し、ＣＤ１２３、ＣＤ１１ｃ、および、ＨＬＡ−ＤＲ抗体（図１０ａ、および、１０ｂ）、または、ＣＤ１４、および、ＣＤ１９（図１０ｃ）で染色した。細胞表面マーカーの活性化を、ＣＤ８６（図１０ａ、および、１０ｂ）、または、ＣＤ８０（図１０ｃ）発現によって測定した。図１０ａは、ＡＵリッチなＯＲＮ（配列番号１３）、および、ＧＵリッチなＯＲＮ（配列番号２１）は、ｐＤＣの刺激の際のＣＤ８６の表面におけるマーカー発現において差があることを実証したＦＡＣＳ解析を示す。図１０ｂは、ヒトｐＤＣの刺激の際のＣＤ８６の表面におけるマーカー発現は、用量依存性であることを説明するグラフである。図１０ｃは、ＡＵリッチなＯＲＮ（配列番号１３）、および、ＧＵリッチなＯＲＮ（配列番号２１）は、ヒトＰＢＭＣ（データ示さず）、および、ＣＤ１４陽性細胞刺激の際に、ＣＤ８０の表面におけるマーカー発現において差がないことを示すグラフである。
【図１１−１】図１１Ａ〜Ｃは、ＴＬＲ８ＯＲＮ（配列番号１３）と、ＴＬＲ７／８ＯＲＮ（配列番号２１）との間の差を示す一連の棒グラフである。コントロールとして、配列番号５のＯＲＮを用いた。ウシＰＢＭＣを、１０μｇ／ｍｌのＯＲＮ（ＨＤ）、または、２．５μｇ／ｍｌのＯＲＮ（ＬＤ）のいずれかと４８時間インキュベートした。上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって解析した。図１１ａ〜ｃは、それぞれＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、および、ＴＮＦ−アルファのレベルを示す。
【図１１−２】ＴＬＲ８ＯＲＮ（配列番号１３）と、ＴＬＲ７／８ＯＲＮ（配列番号２１）との間の差を示す一連の棒グラフである。
【図１２−１】図１２Ａ〜Ｈは、マウスの細胞は、インビボまたはインビトロでＡＵリッチなＯＲＮ（配列番号１３）に応答しないことを示す一連のグラフである。用いられた細胞は、マウスのマクロファージ細胞系Ｒａｗ２６４．７細胞（図１２ａ）、Ｊ７７４細胞（図１２ｂ）、精製したマウスＣＤ１１ｃ＋細胞（ｓｖ１２９マウス）（図１２ｃ〜１２ｇ）、および、インビボのマウス細胞である。サイトカイン濃度をＥＬＩＳＡで評価した。
【図１２−２】図１２Ａ〜Ｈは、マウスの細胞は、インビボまたはインビトロでＡＵリッチなＯＲＮ（配列番号１３）に応答しないことを示す一連のグラフである。
【図１３】ラット脾細胞は、ＡＵリッチなＯＲＮ（配列番号１３）に応答しないことを示すグラフである。３匹のスプラーグ−ドーリーラットからの脾細胞をプールし、既定濃度の配列番号２１、配列番号１３（いずれも５分の１希釈でＤＯＴＡＰ（６２．５μｇ／ｍｌ）と複合体化された）、Ｒ−８４８、または、ＤＯＴＡＰ単独（６２．５μｇ／ｍｌから開始，５分の１希釈）で刺激した。２０時間後に上清を回収し、ＴＮＦ−アルファレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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