(57)【要約】  本発明は、植物から単離されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列、植物中の遊離アスパラギンレベルを低下させるための方法、低レベルのアクリルアミドを含む熱処理食品を生産するための方法、およびこれらの方法によって得られる植物および食品を提供する。
2009508526.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱処理した植物製品中のアクリルアミド含量を下げる方法であって、製品を製造するために使用される植物中のアスパラギンレベルを下げる工程を含む方法。
【請求項２】
前記アスパラギンレベルを下げる工程が、前記植物中において第一ポリヌクレオチドを発現させることを含み、前記第一ポリヌクレオチドが、（ｉ）アスパラギン生合成に関与する遺伝子または遺伝子のプロモーターおよび（ｂ）アスパラギン代謝に関与する遺伝子のうち少なくとも１つの完全または部分配列を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一ポリヌクレオチドが、（ａ）（ｉ）アスパラギンシンテターゼ遺伝子、（ｉｉ）硝酸レダクターゼ遺伝子および（ｉｉｉ）ヘキソキナーゼ遺伝子からなる群より選択される遺伝子またはその遺伝子のプロモーターからの完全なまたは部分的なセンスおよび／またはアンチセンス配列と、（ｂ）（ｉ）アスパラギン遺伝子および（ｉｉ）グルタミンシンテターゼ遺伝子からなる遺伝子の群より選択される遺伝子の完全なまたは部分的な配列とのうち少なくとも１つを含み、（ａ）における完全なまたは部分的な配列の発現が、それらの遺伝子の内因性コピーであるｍＲＮＡレベルを抑える制御効果を有し、（ｂ）における配列が、それらの遺伝子の総ｍＲＮＡレベルを促進する制御をするために過剰発現される配列である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一ポリヌクレオチドが、アスパラギンシンテターゼ遺伝子の少なくとも一部を含み、かつ配列番号１または２に示す配列の少なくとも一部に対して少なくとも７０％の同一性を示す配列を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第一ポリヌクレオチドが、機能的に活性なアスパラギナーゼ遺伝子を含み、かつ配列番号９、１４または３１〜３３に示す配列に対して少なくとも７０％の同一性を示す配列を含む請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記第一ポリヌクレオチドに、少なくとも１つの組織特異的な植物プロモーターが機能するように結合している請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記組織特異的な植物プロモーターが、塊茎特異的または種子特異的プロモーターである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組織特異的な植物プロモーターが、ジャガイモ顆粒結合デンプンシンターゼプロモーター、ジャガイモＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ遺伝子プロモーター、ジャガイモパタチンプロモーター、ジャガイモフラボノイド３’−モノオキシゲナーゼ遺伝子プロモーター、またはコムギピューロインドール遺伝子プロモーターの少なくとも一部に対して少なくとも７０％同一である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ジャガイモ顆粒結合デンプンシンターゼプロモーターが、配列番号８に示す配列の少なくとも一部を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ジャガイモＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ遺伝子プロモーターが、配列番号７に示す配列の少なくとも一部を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記パタチン遺伝子プロモーターが、配列番号２２に示す配列の少なくとも一部を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記フラボノイドモノオキシゲナーゼ遺伝子プロモーターが、配列番号１３に示す配列より上流の配列の少なくとも一部を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一ポリヌクレオチドが、アスパラギン生合成遺伝子のセンスおよび／またはアンチセンスフラグメントの少なくとも１つのコピーを含み、かつ熱処理食品を生産するために使用される植物の組織において、総アスパラギンシンテターゼｍＲＮＡレベルを抑える制御をするために発現される請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一ポリヌクレオチドに、その５’末端でプロモーターが機能できるように結合しており、かつその３’末端でプロモーターが機能できるように結合している請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ１遺伝子およびホスホリラーゼＬ遺伝子からなる群より選択される遺伝子のセンスおよび／またはアンチセンス方向に、（ｉ）少なくとも１コピーの少なくとも１つを含む第二ポリヌクレオチドを発現させることをさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記第一および第二ポリヌクレオチドが、トランスファーＤＮＡ内に位置し、かつ配列番号２３に示す配列と少なくとも７０％の同一性を共有する配列を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記植物が塊茎を有する植物である請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
第一ポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物の組織から得られる熱処理製品であって、前記第一ポリヌクレオチドが、アスパラギン生合成またはアスパラギン代謝に関与する遺伝子の完全または部分配列を備え、かつ非トランスジェニックの同一植物の対応する組織から製造される熱処理製品よりも低いアクリルアミド濃度を有する熱処理製品。
【請求項１９】
前記トランスジェニック植物から製造される製品が、野生型の塊茎から製造される同一の製品に比べて改善された味覚特性を有する請求項１８に記載の熱処理製品。
【請求項２０】
前記トランスジェニック植物が塊茎を有する植物である請求項１８に記載の熱処理製品。
【請求項２１】
前記塊茎を有する植物の製品が、フライドポテト、チップ、クリスプ、ジャガイモまたはベークドポテトである請求項２０に記載の熱処理製品。
【請求項２２】
前記トランスジェニック植物の細胞が、（ｉ）Ｒ１遺伝子またはその遺伝子フラグメントに対応するセンスおよび／またはアンチセンス配列並びに（ｉｉ）ホスホリラーゼＬ遺伝子またはその遺伝子フラグメントに対応するセンスおよび／またはアンチセンス配列のうち少なくとも１つを含む第二ポリヌクレオチドをさらに含む請求項１８に記載の熱処理製品。
【請求項２３】
前記製品が、非トランスジェニック植物の熱処理製品中のアクリルアミドの濃度よりも少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％低いアクリルアミド濃度を有する請求項１８に記載の熱処理製品。
【請求項２４】
アスパラギン生合成またはアスパラギン代謝に関与する遺伝子の完全または部分配列を含む第一ポリヌクレオチドを、そのゲノム内に含む植物。
【請求項２５】
前記植物が、塊茎を有する請求項２４に記載の植物。
【請求項２６】
塊茎を有する前記植物が、ジャガイモ植物である請求項２５に記載の植物。
【請求項２７】
（ｉ）Ｒ１遺伝子またはその遺伝子フラグメントに対応するセンスおよび／またはアンチセンス配列並びに（ｉｉ）ホスホリラーゼＬ遺伝子またはその遺伝子フラグメントに対応するセンスおよび／またはアンチセンス配列のうち少なくとも１つを含む第二ポリヌクレオチドを、そのゲノム内にさらに含む請求項２４に記載の植物。
【請求項２８】
植物中のアクリルアミドレベルを低下させることができるポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項２９】
前記核酸配列が、配列番号１、２、９、１０、１４、１５および２８〜３５、またはそれらの変異体、フラグメント、相補配列、またはそれらの逆相補配列からなる群より選択され、前記核酸が、アスパラギナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする請求項２８に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項３０】
前記変異体が、配列番号１、２、１７、２０、２１のいずれか１つの配列に対して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％若しくは６０％等しくまたはそれ以上の配列同一性を有する請求項２９に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項３１】
（１）植物組織中のアスパラギナーゼのレベルを上昇させる工程または（２）植物組織中のアスパラギンシンテターゼのレベルを低下させる工程を含む低アスパラギンを有する植物組織から食用植物製品を製造する方法。
【請求項３２】
前記植物細胞中のアスパラギナーゼのレベルを上昇させる工程が、細胞においてアスパラギナーゼ遺伝子を発現させることを含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記植物細胞中のアスパラギンシンテターゼのレベルを低下させる工程が、ポリヌクレオチドを植物細胞において発現させることを含み、前記ポリヌクレオチドが、（ｉ）Ｒ１遺伝子、（ｉｉ）ホスホリラーゼＬ遺伝子および（ｉｉｉ）アスパラギンシンテターゼ遺伝子のうち少なくとも１つのフラグメントをセンスおよび／またはアンチセンス方向に含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記食用植物製品が、塊茎、フライドポテト、チップ、クリスプ、ベークドポテトまたは乾燥ポテトである請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記食用植物製品が、前記アスパラギナーゼのレベルを上昇させるまたはアスパラギンシンテターゼのレベルを低下させる工程を行っていない植物製品におけるアクリルアミドのレベルと比較して、製品を加熱した後、より低いアクリルアミドレベルを有する請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
（ｉ）アスパラギン生合成遺伝子の発現を抑える制御をする工程および／またはアスパラギン代謝遺伝子に関与する遺伝子の発現を促進する制御をする工程、並びに（ｉｉ）製品の原料となる野菜、種子または果実を作る植物組織において（ａ）Ｒ１遺伝子および（ｂ）ホスホリラーゼＬ遺伝子の少なくとも１つの発現または活性を抑える制御をする工程を含む低レベルのアクリルアミドを含む食用植物製品を生産する方法。
【請求項３７】
前記Ｒ１遺伝子、ホスホリラーゼＬ遺伝子およびアスパラギン生合成遺伝子を抑える制御をする工程が、（ｉ）Ｒ１遺伝子、（ｉｉ）ホスホリラーゼＬ遺伝子および（ｉｉｉ）アスパラギンシンテターゼ遺伝子のうち少なくとも１つのフラグメントを植物細胞においてセンスおよび／またはアンチセンス方向に発現させることを含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記食用植物製品が、塊茎、フライドポテト、チップ、クリスプまたはベークドポテトである請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記食用植物製品が、非トランスジェニック植物の植物製品におけるアクリルアミドのレベルと比較して、製品を加熱した後、より低いアクリルアミドレベルを有する請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
食用トランスジェニック植物製品を製造する方法であって、前記食用トランスジェニックが、加熱後、非トランスジェニック植物の同一製品を加熱したもののアクリルアミドレベルよりも低いアクリルアミドレベルを有し、前記植物においてアスパラギン生合成またはアスパラギン代謝に関与する遺伝子の発現レベルを変化させることにより、トランスジェニック植物においてアスパラギンレベルを低下させることを含む方法。
【請求項４１】
アスパラギンシンテターゼ遺伝子、硝酸レダクターゼ遺伝子またはヘキソキナーゼ遺伝子からの完全または部分配列の少なくとも１つのコピーを、センスおよび／またはアンチセンス方向に発現させることによってアスパラギンレベルを低下させる請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記植物においてアスパラギナーゼ遺伝子またはグルタミンシンテターゼ遺伝子の完全または機能的に活性な部分配列を発現させることによってアスパラギンレベルを低下させる請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
配列番号１３に示す配列の少なくとも一部に対して少なくとも７０％の同一性を示す配列を遺伝子に機能できるように結合することにより、ジャガイモ塊茎においてその遺伝子を過剰発現させるための方法。
【請求項４４】
前記植物のデンプン質組織においてアスパラギンレベルを低下させる請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
前記食用植物製品が、改変されていない同一製品に比べて改善された食味特性を有する請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】
食用植物製品が、外観、風味、香気およびテクスチャからなる群より選択される少なくとも１つの改善された食味特性を有する請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［優先権出願の相互参照］
この米国特許本出願は、どちらも参照により本明細書に組み込まれる、２００５年９月２０日出願の米国特許仮出願第６０／７１８，３３５号、および２００６年７月２８日出願の同第６０／８３３，７８８号の優先権を主張するものである。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、たとえばこれらの植物のデンプンに富む貯蔵器官において、これらの器官の加工に関連する加熱時に蓄積するアクリルアミドのレベルを低下させるため、植物において遺伝子を下方制御および上方制御するための遺伝的方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
遊離アスパラギンと還元糖の両方を含む食品の加熱はアクリルアミドの生成を生じさせる。アクリルアミドは、ポリアクリルアミドを合成するために世界中で使用されている工業化学物質である。この反応性化合物への暴露は、迅速な吸収、およびさらには組織中への分布を生じさせる（Ｂａｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ２００１，２２，３４１〜３５３）。げっ歯動物における、高濃度のアクリルアミド（＞２ｍｇ／ｋｇ体重）の毒性作用は、神経症状、受精能の低下および癌を含む（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，，２００３，５１，４５０４〜４５２６）。
【０００４】
高濃度のアクリルアミドへの職業上の暴露も、ヒトにおいて神経毒性の発生率を上昇させることが知られている（ＬｏＰａｃｈｉｎ，Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２００４，２５，６１７〜６３０）が、ヒトの生殖または発癌現象へのアクリルアミドの作用は実証されていない。アクリルアミドおよびその酸化代謝産物であるグリシドアミドの両方が、ヘモグロビンのアミノ末端のバリンと反応して付加物を形成する。付加物形成の程度は暴露レベルについての良好なマーカーであり、1日約１００μｇの摂取量を示していた（Ｔａｒｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２００２，５０，４９９８〜５００６）。飲料水、化粧品および喫煙が、当初、アクリルアミドへのバックグラウンド暴露の唯一の主要なソースであると考えられたが（Ｂｅｒｇｍａｒｋ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ，１９９７，１０，７８〜８４）、最近の分析は、油で揚げたまたは焼いたデンプン質食品の消費がアクリルアミド摂取の約３６％に寄与することを示唆している（Ｂｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｄｉｅｔａｒｙ  ｈａｂｉｔｓ  ａｎｄ  ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｉｎｔａｋｅ  ｉｎ  Ｓｗｅｄｅｎ  １９９７〜９８．Ｒｉｋｓｍａｔｅｎ  １９９７〜９８，１９９９）。
【０００５】
食事性アクリルアミドは、主として遊離アミノ酸アスパラギンのアミノ基と還元糖のカルボニル基の間の加熱誘導性反応に由来する（Ｍｏｔｔｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１９，４４８〜４４９；Ｓｔａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１９，４４９〜４５０）。新鮮ジャガイモ塊茎は非常に高いレベルのアスパラギンを含むが、還元糖グルコースおよびフルクトースの濃度は比較的低い。しかし、スクロースのグルコースおよびフルクトースへの転換を触媒する、低温誘導性インベルターゼの発現を通して、低温貯蔵の間に還元糖が蓄積する。
【０００６】
デンプン質食品中のアクリルアミドの蓄積を制限するためのこれまでの試みは、実用的で費用効果の高い適用をもたらさなかった。先行技術の最初の方法は、表面対容積比、温度および揚げ時間などの加工パラメータを変化させることに基づく。そのような方法の適用はアクリルアミドの蓄積を低下させる上で部分的には有効であると考えられるが、色を減退させる、形状を変化させる、および味とテクスチャを変化させることによって最終食品の感覚特性を変化させる。そのような変化は望ましくない。
【０００７】
２番目の方法は、部分的に処理した食品を加熱の前にアスパラギナーゼ（ＥＣ３．５．１．１）またはグルタミナーゼ（ＥＣ３．４．１．２）と共にインキュベートすることに基づく（国際公開公報第２００４／０３０４６８  Ａ３号および国際公開公報第２００４／０２６０４２  Ａｌ号参照）。この方法は費用がかかり、酵素と容易に混合することができる小麦粉などの材料に対してのみ容易に適用できる。
【０００８】
３番目の方法は、グリシンなどのアスパラギン競合物質を部分処理した食品に添加する（ジャガイモ塊茎については国際公開公報第２００５／０２５３３０  Ａｌ号、焙煎コーヒー豆については米国特許出願第２００４／００８１７２４  Ａｌ号、カカオ豆については国際公開公報第２００５／００４６２０  Ａｌ号、トウモロコシベースの食品については国際公開公報第２００５／００４６２８  Ａｌ号）。この方法は部分的にのみ有効であるが、高濃度の添加物を必要とし、また広く適用するには費用がかかりすぎる。
【０００９】
４番目の方法は、アルドースレダクターゼを含む、還元糖を変化させる酵素を加熱の前に食品材料に添加する（米国特許第６９８９１６７号参照）。この方法はあまり有効ではなく、広く適用するには費用がかかりすぎる。
【００１０】
５番目の方法は、加熱の前に、アミノ酸含有化合物、アミノ酸塩、アミノ酸アミド、アミノ酸エステル、およびそれらの混合物からなる群より選択される試薬で食品を被覆する（国際公開公報第２００５／０７７２０３Ａ３号参照）。この方法は部分的にのみ有効であり、広く適用するには費用がかかりすぎる。
【００１１】
６番目の方法は、通常低レベルの還元糖とアスパラギンの両方を含む生殖質の選択に基づく。そのような生殖質の利用（ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）が、食品産業における広範な使用に許容される品種に対し、「低糖」および「低アスパラギン」形質を遺伝子移入することを可能にする。しかし、これまでのところ低アスパラギン作物は同定されていない。そのような生殖質が将来発見された場合でも、所望形質を商業品種に遺伝子移入するためには少なくとも１５〜２０年を要する。
【００１２】
７番目の方法は、還元糖のレベルを低下させるために作物を遺伝的に修飾する。この方法は、ジャガイモデンプン関連Ｒ１およびホスホリラーゼＬ遺伝子などのデンプン分解に関与する遺伝子の発現を下方制御することに基づく（たとえば米国特許出願第２００３／０２２１２１３  Ａｌ号参照）。部分的に有効であるが、修飾作物に由来する加工食品は、まだ、対照製品中で認められるアクリルアミドレベルの約３分の１を含む。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
このようにして、デンプン質作物から得られる加工食品中のアクリルアミドレベルを低下させるための方法に対する大きな需要が存在する。そのような方法は、食品の感覚特性を低下させずに費用効果的であるべきである。本発明はそのような方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
１つの実施形態では、本発明は、作物のデンプン質組織を加熱することによって得られる加工食品中のアクリルアミドのレベルを低下させるための新しい戦略を提供する。独自の点として、この戦略は、作物のデンプン質組織におけるアスパラギンのレベルを少なくとも５０％低下させるために遺伝子工学の方法を用いる。
【００１５】
１つの実施形態では、作物のデンプン質組織中のアスパラギンのレベルについて、アスパラギン生合成のレベルを低下させることおよび／またはアスパラギン代謝のレベルを上昇させることによって低下させる。どちらの機序も、各々のアスパラギン経路に直接または間接的に関与する遺伝子を下方制御または上方制御することを含み得る。１つの態様では、アスパラギン代謝に関与する遺伝子はアスパラギナーゼをコードする。１つの態様では、アスパラギン生合成に関与する遺伝子はアスパラギンシンテターゼをコードする。
【００１６】
もう１つの態様では、アスパラギン経路に間接的に関与する遺伝子は、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）遺伝子、硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子、１４−３−３遺伝子およびヘキソキナーゼ（ＨＸＫ）遺伝子からなる群より選択される。
【００１７】
１つの態様では、アスパラギン生合成に関与する少なくとも１個の遺伝子の発現を低減することによってアスパラギン生合成のレベルを低下させる。
【００１８】
１つの態様では、アスパラギン生合成に関与する遺伝子の発現低下は、５’から３’方向に、（ｉ）プロモーター、（ｉｉ）アスパラギン代謝に関与する少なくとも１個の遺伝子の少なくとも１つのフラグメントを含む配列の少なくとも１コピー、および場合により、（ｉｉｉ）それによって第一プロモーターと場合により存在する第二プロモーターが収束方向に位置する第二プロモーターまたはターミネーターのいずれか、を含む発現カセットを植物に導入することによって達成される。
【００１９】
１つの態様では、アスパラギン生合成に関与する遺伝子の発現を低下させるために使用する発現カセットは、アスパラギン代謝に関与する遺伝子の少なくとも１つのフラグメントを含む配列の２コピーを含む。
【００２０】
１つの態様では、２コピーは、（ｉ）逆方向反復配列または（ｉｉ）直列反復配列として位置する。
【００２１】
１つの態様では、アスパラギン生合成に関与する遺伝子は、ジャガイモ、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｐｈｕｒｅｊａなどの野生ジャガイモ、サツマイモ、ヤムイモ、コーヒーの木、カカオの木、コムギ、トウモロコシ、エンバク、モロコシまたはオオムギから単離され、アスパラギンシンテターゼをコードする。
【００２２】
１つの態様では、アスパラギンシンテターゼ遺伝子は、配列番号１に示す配列の少なくとも１つのフラグメントと少なくとも７０％の同一性を共有する配列を含む。
【００２３】
もう１つの態様では、アスパラギンシンテターゼ遺伝子は、配列番号２に示す配列の少なくとも１つのフラグメントと少なくとも７０％の同一性を共有する配列を含む。
【００２４】
１つの態様では、アスパラギン代謝に関与する遺伝子の過剰発現は、５’から３’方向に、第一プロモーター、アスパラギン生合成に関与する遺伝子、およびターミネーターを含む発現カセットを植物に導入することによって達成される。
【００２５】
１つの態様では、アスパラギン代謝に関与する遺伝子は、ジャガイモ、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｐｈｕｒｅｊａなどの野生ジャガイモ、サツマイモ、ヤムイモ、コーヒーの木、カカオの木、コムギ、トウモロコシ、エンバク、モロコシまたはオオムギから単離され、アスパラギナーゼをコードする。
【００２６】
１つの態様では、アスパラギナーゼ遺伝子は、配列番号９、１０、１４、１５、３１、３２または３３に示す配列と少なくとも７０％の同一性を共有する配列を含む。
【００２７】
もう１つの態様では、アスパラギナーゼ遺伝子は、配列番号１４に示す配列と少なくとも７０％の同一性を共有する配列を含む。
【００２８】
もう１つの態様では、アスパラギン生合成に関与する遺伝子は、グルタミンシンテターゼまたはヘキソキナーゼ遺伝子である。
【００２９】
１つの態様では、プロモーターは、（ｉ）ジャガイモ顆粒結合デンプンシンターゼ遺伝子、（ｉｉ）ジャガイモＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子、（ｉｉｉ）ジャガイモユビキチン−７遺伝子、（ｉｖ）ジャガイモパタチン遺伝子、（ｖ）ジャガイモフラボノイドモノオキシゲナーゼ遺伝子のプロモーターである。
【００３０】
１つの態様では、ジャガイモ顆粒結合デンプンシンターゼ遺伝子のプロモーターは、配列番号８の少なくとも一部と少なくとも７０％の同一性を共有し、ジャガイモＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子のプロモーターは、配列番号７の少なくとも一部と少なくとも７０％の同一性を共有し、ジャガイモユビキチン−７遺伝子のプロモーターは、配列番号２１の少なくとも一部と少なくとも７０％の同一性を共有し、ジャガイモパタチン遺伝子のプロモーターは、配列番号２２の少なくとも一部と少なくとも７０％の同一性を共有し、およびジャガイモフラボノイドモノオキシゲナーゼ遺伝子のプロモーターは、配列番号１３の少なくとも一部と少なくとも７０％の同一性を共有する。
【００３１】
もう１つの態様では、プロモーターは、食品加工用のデンプン質作物の塊茎、根または種子において発現される遺伝子のプロモーターである。
【００３２】
もう１つの実施形態では、本発明は、組織中のアスパラギンと還元糖の両方のレベルを同時に低下させることにより、作物の組織を加熱することによって得られる食品中のアクリルアミドのレベルを低下させるための方法を提供する。１つの実施形態では、組織は、作物または植物のデンプン質組織である。
【００３３】
１つの態様では、アスパラギンと還元糖のレベルの同時低下は、（ｉ）アスパラギン生合成に関与する遺伝子の発現を下方制御することまたはアスパラギン代謝に関与する遺伝子を過剰発現させることのいずれか、および（ｉｉ）デンプン分解に関与する少なくとも１個の遺伝子の発現を下方制御することによって得られる。
【００３４】
１つの態様では、デンプン分解に関与する遺伝子の発現は、５’から３’方向に、（ｉ）プロモーター、（ｉｉ）デンプン分解に関与する遺伝子の少なくとも１つのフラグメントを含む配列の少なくとも１コピー、および場合により、（ｉｉｉ）それによって第一プロモーターと場合により存在する第二プロモーターが収束方向に位置する、第二プロモーターまたはターミネーターのいずれか、を含む発現カセットを植物に導入することによって下方制御される。
【００３５】
１つの態様では、デンプン分解に関与する遺伝子は、（ｉ）デンプン関連Ｒ１遺伝子および（ｉｉ）デンプン関連ホスホリラーゼＬ遺伝子からなる群より選択される。
【００３６】
もう１つの実施形態では、本発明は、作物の組織を加熱することによって得られる食品中のアクリルアミドのレベルを低下させ、および同時に、組織中のアスパラギンと還元糖のレベルを同時に低下させることによってこの食品の感覚特性を上昇させるための方法を提供する。１つの実施形態では、組織は、作物または植物のデンプン質組織である。
【００３７】
１つの態様では、同時低下は、（ｉ）プロモーターに作動可能に連結されたアスパラギナーゼ遺伝子または（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結されたアスパラギンシンテターゼ遺伝子のフラグメントの少なくとも１コピーのいずれかを含む第一発現カセット、およびプロモーターに作動可能に連結されたＲ１遺伝子のフラグメントとホスホリラーゼ遺伝子のフラグメントの両方を含むＤＮＡセグメントの少なくとも１コピーを含む第二発現カセットを含み、第一発現カセットと第二発現カセットが同じ発現カセットであり得る、「多重遺伝子ターゲティング（ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」構築物を用いることによって達成される。
【００３８】
１つの実施形態では、植物は、「多重遺伝子ターゲティング」構築物で安定に形質転換された少なくとも１個の細胞を含む。さらなる実施形態では、植物は塊茎を坦持する。もう１つの実施形態では、塊茎担持植物はジャガイモ植物である。もう１つの実施形態では、塊茎担持植物は、そのゲノム内に安定に組み込まれたカセットを含む。
【００３９】
もう１つの態様では、本発明は、（ａ）トランスジェニック塊茎の少なくとも１個の細胞が「多重遺伝子ターゲティング」構築物を含み、および（ｂ）製品が、同じ品種の非トランスジェニック塊茎からの等価製品よりも低いアクリルアミド濃度を有する、トランスジェニック塊茎からの加工製品を提供する。
【００４０】
もう１つの態様では、本発明は、（ａ）トランスジェニック塊茎の少なくとも１個の細胞が「多重遺伝子ターゲティング」構築物を含み、（ｂ）製品が、同じ種の非トランスジェニック塊茎からの等価製品よりも低いアクリルアミド濃度を有し、および（ｃ）製品がさらに、同じ種の非トランスジェニック塊茎からの等価製品に比べてより低い速度の非酵素的褐変を示す、トランスジェニック塊茎からの製品を提供する。
【００４１】
もう１つの態様では、本発明は、（ａ）トランスジェニック塊茎の少なくとも１個の細胞が「多重遺伝子ターゲティング」構築物を含み、（ｂ）製品が、同じ種の非トランスジェニック塊茎からの等価製品よりも低いアクリルアミド濃度を有し、（ｃ）製品がさらに、同じ種の非トランスジェニック塊茎からの等価製品に比べてより低い速度の非酵素的褐変を示し、および（ｄ）製品がさらに、同じ種の非トランスジェニック塊茎からの等価製品に比べて高い感覚プロフィールを示す、トランスジェニック塊茎からの製品を提供する。１つの実施形態では、食用植物製品は、本発明の方法に従って修飾されていない植物から等価製品に比べて改善された感覚特性を有する。１つの実施形態では、食用植物製品は、外観、風味、香気およびテクスチャからなる群より選択される少なくとも１つの改善された感覚特性を有する。
【００４２】
１つの実施形態では、トランスジェニック塊茎はジャガイモである。さらなる実施形態では、製品はフライドポテトである。もう１つのさらなる実施形態では、製品はチップである。
【００４３】
もう１つの実施形態では、トランスジェニック塊茎はジャガイモであり、およびトランスジェニック塊茎の製品は、４℃〜１２℃で約１〜３０週間貯蔵されたとき、トランスジェニック塊茎と同じ貯蔵条件下で貯蔵された同じ種の非トランスジェニック塊茎のグルコースレベルの５０％未満のグルコースレベルを含む。
【００４４】
１つの実施形態では、植物は、ジャガイモ、トウモロコシ、コーヒー、ココアおよびコムギからなる群より選択される。
【００４５】
もう１つの実施形態では、植物は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、リゾビウム・トリホリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）、フィロバクテリウム・ミルシナセアルム（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｒｕｍ）、シノリゾビウム・メリロティ（ＳｉｎｏＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）およびメソリゾビウム・ロティ（ＭｅｓｏＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）からなる群より選択される細菌株で形質転換される。
【００４６】
１つの態様では、本発明は、植物中のアスパラギンレベルを低下させることができ、およびその結果として、この植物の加工製品中のアクリルアミドレベルを低下させることができるポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド配列を提供する。
【００４７】
１つの実施形態では、核酸は、配列番号９、１０、１４、１５、３１、３２および３３、またはその変異体またはフラグメントからなる群より選択される配列と少なくとも７０％の同一性を共有し、および前記核酸は、アスパラギナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【００４８】
さらなる実施形態では、変異体は、配列番号９、１０、１４、１５、３１、３２および３３のいずれか１つに対して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％または６０％以上の配列同一性を有する。
【００４９】
もう１つの態様では、植物中のアスパラギンレベルを低下させることができ、およびその結果として、この植物の加工製品中のアクリルアミドレベルを低下させることができるアスパラギナーゼをコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド配列が提供される。
【００５０】
もう１つの態様では、本発明は、低いアクリルアミド含量を有する加工食品を生産するために使用できる、低いアスパラギナーゼ発現レベルを有するトランスジェニック植物を提供する。
【００５１】
もう１つの態様では、本発明は、低いアスパラギン含量を有するトランスジェニック塊茎を加工することを通して得られる、低いアクリルアミド含量を有する食品を提供する。
【００５２】
米国食品医薬品局のデータに基づき（ｗｗｗ．ｃｆｓａｎ．ｆｄａ．ｇｏｖ／〜ｄｍｓ／ａｃｒｙｄａｔａ．ｈｔｍｌ）、大きなファーストフードチェーンのレストランで生産される典型的なフライドポテトは１００十億分率（ｐｐｂ）超のアクリルアミドを含有する。そのような典型的フライドポテト中のアクリルアミドの平均量は４０４ｐｐｂであり、フライドポテトの消費を通してのアクリルアミドの平均１日摂取レベルは０．０７μｇ／ｋｇ体重／日である。その結果、フライドポテトはアクリルアミドの総食事摂取量の１６％に当たる。商業的加工業者によって生産されるオーブンベークドポテトおよびポテトチップ中のアクリルアミドの平均量は、それぞれ６９８ｐｐｂおよび５９７ｐｐｂである。したがって、フライドポテト、オーブンベークドポテトおよびポテトチップを含むジャガイモ由来の加工食品は、アクリルアミドについての総食事摂取量の３８％に相当する。
【００５３】
本発明によれば、本発明の特定品種のトランスジェニック植物によって生産される塊茎から得られるフライドポテト、ベークドポテトまたはチップ中に存在するアクリルアミドのレベルは、同じ品種の非トランスジェニック植物から得られるフライドポテト、ベークドポテトまたはチップ中に存在するアクリルアミドのレベルよりも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍または２０倍超低い。
【００５４】
十億分率で言うと、本発明の塊茎から生産されるフライドポテトは、１〜２０ｐｐｂ、２０〜４０ｐｐｂ、４０〜６０ｐｐｂ、６０〜８０ｐｐｂまたは８０〜１００ｐｐｂアクリルアミドを有し得る。
【００５５】
十億分率で言うと、本発明の塊茎から生産されるオーブンベークドポテト、ポテトチップまたはハッシュドポテトは、１〜２０ｐｐｂ、２０〜４０ｐｐｂ、４０〜６０ｐｐｂ、６０〜８０ｐｐｂ、８０〜１００ｐｐｂ、１００〜１２０ｐｐｂ、１２０〜１４０ｐｐｂ、１４０〜１６０ｐｐｂ、１６０〜１８０ｐｐｂ、または１８０〜２００ｐｐｂアクリルアミドを有し得る。
【００５６】
本発明は、塊茎のフライドポテトおよびチップ製品中のアクリルアミドのレベルを低下させることに限定されない。他の食品も、アクリルアミドレベルを低下させるために本発明に従って操作し得る。
【００５７】
朝食用シリアル中のアクリルアミドのレベルは、約５０〜２５０ｐｐｂから、４０ｐｐｂ以下のレベル、好ましくは２０ｐｐｂ以下のレベルに低減することができる。
【００５８】
Ｄａｒｅ  Ｂｒｅｔｏｎ  Ｔｈｉｎ  Ｗｈｅａｔ  ＣｒａｃｋｅｒｓおよびＷａｓａ  Ｏｒｉｇｉｎａｌ  Ｃｒｉｓｐｂｒｅａｄ  Ｆｉｂｅｒ  Ｒｙｅなどのクラッカーにおけるアクリルアミドのレベルは、約３００〜５００ｐｐｂから、１００ｐｐｂ以下のレベル、好ましくは５０ｐｐｂ以下のレベルに低減することができる。
【００５９】
Ｇｈｉｒａｒｄｅｌｌｉ  Ｕｎｓｗｅｅｔｅｎｅｄ  ＣｏｃｏａまたはＨｅｒｓｈｅｙ’ｓ  Ｃｏｃｏａなどのチョコレートにおけるアクリルアミドのレベルは、約３００〜９００ｐｐｂから、２００ｐｐｂ以下のレベル、好ましくは５０ｐｐｂ以下のレベルに低減することができる。
【００６０】
クッキー中のアクリルアミドのレベルは、約５０〜２００ｐｐｂから、４０ｐｐｂ以下のレベル、好ましくは２０ｐｐｂ以下のレベルに低減することができる。
【００６１】
挽いたコーヒー中のアクリルアミドのレベルは、約１７５〜３５０ｐｐｂから、６０ｐｐｂ以下のレベル、好ましくは３０ｐｐｂ以下のレベルに低減することができる。
【００６２】
コムギパンにおけるアクリルアミドのレベルは、約５０〜１５０ｐｐｂから、３０ｐｐｂ以下のレベル、好ましくは１５ｐｐｂ以下のレベルに低減することができる。
【００６３】
多くの因子が最終食品中のアクリルアミドのレベルに影響を及ぼすことは理解されるべきである。そのような因子は、作物、品種、生育条件、収穫された種子または塊茎の貯蔵条件、および加熱温度、加熱時間、揚げるために使用される油の種類、および暴露表面などの加工変数を含む。
【００６４】
本発明において述べる方法の適用は、アクリルアミドレベルを少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約９０％超低下させる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
本発明は、アクリルアミドレベルを低下させるためのポリヌクレオチド配列および方法を提供する。
【００６６】
本発明は、当業者に周知の用語および語句を使用する。異なる定義がない限り、ここで使用するすべての技術的および学術的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。一般に、ここで使用する命名法およびここで述べる細胞培養、分子遺伝学および核酸化学とハイブリダイゼーションの実験室手順は、周知であり、当分野において一般的に使用されるものである。組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、微生物培養、細胞培養、組織培養、形質転換、トランスフェクション、形質導入、分析化学、有機合成化学、化学合成、化学分析、および医薬品の製剤と送達については標準手法を用いる。一般に、酵素反応および精製および／または単離工程は製造者の仕様書に従って実施する。手法および手順は、一般に従来の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）に従って実施する。
【００６７】
アクリルアミド：単量体としてのアクリルアミドは毒性とみなされ、神経系に直接影響を及ぼす。発癌物質とみなされ得る。アクリルアミドは、水溶液から無傷皮膚を通して容易に吸収される。分子式はＣ３Ｈ５ＮＯ；構造：ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ２である。
【００６８】
アグロバクテリウムまたは細菌形質転換：当分野において周知のように、植物細胞を形質転換するために使用されるアグロバクテリウム菌は、通常、アグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲンの誘導体であり、非病原性である。植物、外植片、細胞またはプロトプラストの感染時に、アグロバクテリウムはプラスミドベクターからのＤＮＡセグメントを植物細胞核に移入する。ベクターは、典型的にはＴ−ＤＮＡまたはＰ−ＤＮＡの境界間に位置する所望ポリヌクレオチドを含む。しかし、リゾビウム・トリホリ、リゾビウム・レグミノサルム、フィロバクテリウム・ミルシナセアルム、シノリゾビウム・メリロティおよびメソリゾビウム・ロティなどの、植物細胞を形質転換することができるいかなる細菌も使用し得る。
【００６９】
被子植物：子房に包まれた種子を有する維管束植物。被子植物は、果実をつける花を生産する種子植物である。被子植物は双子葉植物と単子葉植物に分けられる。
【００７０】
アスパラギン生合成：アスパラギンを生産するために植物において生じる酵素触媒反応。
【００７１】
アスパラギン代謝：アスパラギンを他の化合物に転換するために植物において生じる酵素触媒反応。
【００７２】
アスパラギナーゼ：様々な植物、動物および細菌細胞で認められるアスパラギナーゼは、アスパラギン代謝に関与する酵素である。アスパラギンの脱アミノ化を触媒してアスパラギン酸とアンモニウムイオンを生成し、遊離循環アスパラギンの減少を生じさせる。
【００７３】
アスパラギンシンテターゼ：この酵素は、アスパラギンの生合成に関与し、アスパラギン酸塩からのアスパラギンの合成を触媒する。
【００７４】
抗生物質耐性：細胞が抗生物質の存在下で生存する能力。ここで使用する抗生物質耐性は、宿主細胞における抗生物質耐性遺伝子の発現から生じる。細胞はいかなる抗生物質に対する耐性も有し得る。一般的に使用される抗生物質の例は、カナマイシンおよびハイグロマイシンを含む。
【００７５】
双子葉植物：胚が２枚の子葉を持ち、分枝葉脈、および４または５の倍数の花部を有する顕花植物。双子葉植物の例は、ジャガイモ、テンサイ、ブロッコリー、キャッサバ、サツマイモ、コショウ、ポインセチア、マメ、アルファルファ、ダイズおよびアボカドを含むが、これらに限定されない。
【００７６】
内因性：形質転換しようとする植物または植物種のいずれかのゲノムから単離される、または形質転換しようとする植物種と生殖的に適合性があるかまたは異系交配できる植物または種から単離される核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子は、植物種に「天然」、すなわち固有である。
【００７７】
発現カセット：５’から３’方向に、（ａ）第一プロモーター、（ｂ）（ｉ）遺伝子または遺伝子フラグメントの少なくとも１コピーまたは（ｉｉ）遺伝子のプロモーターのフラグメントの少なくとも１コピー、および（ｃ）ターミネーターまたは第一プロモーターと反対方向に位置する第二プロモーターのいずれか、を含むポリヌクレオチド。
【００７８】
外来性：核酸に関して、「外来性」は、その核酸が、非植物生物に由来する、または形質転換しようとする植物と同じ種ではない植物に由来する、または形質転換しようとする植物と異系交配できない植物に由来せず、標的植物の種に属さないことを意味する。本発明によれば、外来性ＤＮＡまたはＲＮＡは、真菌、細菌、ウイルス、哺乳動物、魚類または鳥類の遺伝子構造において天然に生じるが、形質転換しようとする植物では天然に生じない核酸である。したがって、外来性核酸は、たとえば形質転換植物によって天然に生産されないポリペプチドをコードするものである。外来性核酸は、タンパク質産物をコードする必要はない。
【００７９】
遺伝子：遺伝子は、産物、ポリペプチド鎖、またはコードおよび非コード配列の両方を含むＲＮＡ分子の合成のために必要な全情報を含むＤＮＡ分子のセグメントである。遺伝子はまた、各々が独立して発現され、同じ機能的活性を示すわずかに異なるタンパク質をコードし得る、多配列であり得る。たとえばアスパラギンシンテターゼ１および２遺伝子は、合わせて、１個の遺伝子と称され得る。
【００８０】
遺伝因子：「遺伝因子」は、プロモーター、遺伝子、ターミネーター、イントロン、エンハンサー、スペーサー、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、またはリコンビナーゼ認識部位などの、しかしこれらに限定されない、何らかの別個のヌクレオチド配列である。
【００８１】
遺伝子修飾：分子および細胞生物学における方法を適用することによる、一定の生物のゲノムへのＤＮＡの安定な導入。
【００８２】
裸子植物：ここで使用するとき、子房を持たない裸の種子を有する種子植物を指す。裸子植物の例は、針葉樹、ソテツ、イチョウおよびマオウを含む。
【００８３】
導入：ここで使用するとき、感染、トランスフェクション、形質転換または形質導入を含む方法による、細胞への核酸配列の挿入を指す。
【００８４】
単子葉植物：１枚の子葉を持つ胚、平行葉脈、および３の倍数の花部を有する顕花植物。単子葉植物の例は、トウモロコシ、イネ、エンバク、コムギ、オオムギおよびモロコシを含むが、これらに限定されない。
【００８５】
天然：形質転換しようとする植物または植物種のゲノムから単離される、または形質転換しようとする植物種と生殖的に適合性であるかまたは異系交配できる植物または種から単離される核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子は、植物種に「天然」、すなわち固有である。
【００８６】
天然ＤＮＡ：形質転換しようとする植物または植物種のゲノムから単離される、または形質転換しようとする植物種と性的に適合性であるかまたは異系交配できる植物または種から単離される何らかの核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子は、植物種に「天然」、すなわち固有である。言い換えると、天然遺伝因子は、古典的植物育種を通した植物の改善のために植物育種家が使用し得るすべての遺伝物質である。天然核酸の何らかの変異体も、本発明に従って「天然」とみなされる。たとえば、点突然変異は天然に生じるため、天然ＤＮＡは点突然変異を含んでもよい。制限部位が植物ゲノム内に遍在するため、２個の異なる天然ＤＮＡをその部位により連結することも可能である。
【００８７】
天然核酸構築物：少なくとも１個の天然ＤＮＡを含むポリヌクレオチド。
【００８８】
作動可能に連結された：２以上の分子を、組み合わされてそれらが植物細胞において適切に機能するように組み合わせること。たとえばプロモーターは、プロモーターが構造遺伝子の転写を制御するとき、構造遺伝子に作動可能に連結されている。
【００８９】
過剰発現：トランスジェニックでない植物におけるよりも高いレベルの遺伝子の発現。
【００９０】
Ｐ−ＤＮＡ：本発明の植物由来のトランスファーＤＮＡ（「Ｐ−ＤＮＡ」）境界配列は、いかなる公知の細菌由来のＴ−ＤＮＡ境界配列ともヌクレオチド配列において同一ではないが、基本的に同じ目的のために機能する。すなわち、Ｐ−ＤＮＡは、あるポリヌクレオチドを別のポリヌクレオチドに転移し、組み込むために使用され得る。Ｐ−ＤＮＡは、従来のＴ−ＤＮＡの代わりにアグロバクテリウムからＴｉ−プラスミドとして腫瘍誘導プラスミドに挿入され、従来の形質転換プラスミドと同様に、細菌株において維持され得る。Ｐ−ＤＮＡは、細菌を介した植物形質転換によって植物ゲノムに組み込もうとする、所望ポリヌクレオチドを含むように操作することができる。すべて参照により本明細書に組み込まれる、国際公開公報第ＷＯ２００３／０６９９８０号、米国特許出願第ＵＳ−２００３−０２２１２１３号、米国特許出願第ＵＳ−２００４−０１０７４５５号および国際公開公報第ＷＯ２００５／００４５８５号参照。
【００９１】
表現型：表現型は、形質転換植物の少なくとも１個の植物細胞のゲノムに１以上の「所望ポリヌクレオチド」および／またはスクリーニング／選択マーカーを組み込むことにより本発明に従って変化させ得る、植物の識別特徴または特性である。「所望ポリヌクレオチド」および／またはマーカーは、形質転換植物細胞の数多くの遺伝的、分子的、生化学的、生理的、形態学的または農学的特徴または性質のいずれか１つまたは全体としての植物を変化させることにより、形質転換細胞の表現型に変化を与え得る。したがって、１以上の、植物ゲノムに安定に組み込まれた所望ポリヌクレオチドの発現は、植物組織において低いアクリルアミド濃度の表現型を生じる。
【００９２】
植物組織：「植物」とは、特徴的に胚を生産し、葉緑体を含み、セルロース細胞壁を有する植物界の様々な光合成、真核、多細胞生物のいずれかである。植物の部分、すなわち「植物組織」は、トランスジェニック植物を生産するように本発明の方法に従って処理し得る。多くの適切な植物組織が本発明に従って形質転換することができ、体細胞胚、花粉、葉、幹、カルス、ほふく茎、小塊茎（ｍｉｃｒｏｔｕｂｅｒ）および芽を含むが、これらに限定されない。したがって、本発明は、コムギ、トウモロコシ、イネ、オオムギ、エンバク、テンサイ、ジャガイモ、トマト、アルファルファ、キャッサバ、サツマイモおよびダイズなどの、被子植物および裸子植物の形質転換を想定する。本発明によれば「植物組織］はまた、植物細胞を包含する。植物細胞は、懸濁培養、カルス、胚、分裂領域、カルス組織、葉、根、芽、配偶体、胞子体、花粉、種子および小胞子を含む。植物組織は、成熟の様々な段階であり得、液体または固体培養中で、あるいは土壌中または鉢内の適切な媒質中で、温室または圃場で生育し得る。植物組織はまた、有性生殖または無性生殖によって生成されるそのような植物、種子、後代、珠芽の何らかのクローン、および挿し木または種子などのこれらのいずれかの子孫を指す。ジャガイモ、トウモロコシおよびコムギは特に興味深い。
【００９３】
植物形質転換および植物培養：広く、植物細胞が遺伝的に修飾され、維持、さらなる成長、および／またはさらなる発育のために適切な植物培地に移される工程を指す。そのような方法は当業者に周知である。
【００９４】
加工：少なくとも１２０℃に加熱することを含む、（１）たとえばコムギ、トウモロコシ、コーヒーの木またはカカオの木の種子、（２）たとえばジャガイモの塊茎、または（３）たとえばサツマイモおよびヤムイモの根、から食品を生産する工程。加工食品の例は、パン、朝食用シリアル、パイ、ケーキ、トースト、ビスケット、クッキー、ピザ、プレッツェル、トルティーヤ、フライドポテト、オーブンベークドポテト、ポテトチップ、ハッシュドポテト、焙煎したコーヒー、およびココアを含む。
【００９５】
子孫（後代）：トランスジェニック植物の子孫などの、本発明の「子孫」は、植物またはトランスジェニック植物から生まれる、生じるまたは由来するものである。したがって、「子孫」植物、すなわち「Ｆ１」世代植物は、本発明の方法によって作製されるトランスジェニック植物の子または子孫である。トランスジェニック植物の子孫は、その細胞ゲノムの少なくとも１つ、一部または全部に、ここで述べる方法によって親トランスジェニック植物の細胞に組み込まれた所望ポリヌクレオチドを含み得る。したがって、所望ポリヌクレオチドは、子孫植物によって「伝播される」または「遺伝的に受け継がれる」。子孫植物においてそのように受け継がれた所望ポリヌクレオチドは、同じくその親から子孫植物によって受け継がれたＴ−ＤＮＡまたはＰ−ＤＮＡ構築物内に存在し得る。ここで使用する「子孫」という用語はまた、植物の群の子または子孫であるとみなされ得る。
【００９６】
プロモーター：プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび／または他の転写調節エレメントに結合する核酸、好ましくはＤＮＡを意味することが意図されている。いかなるプロモーターとも同様に、本発明のプロモーターは、プロモーターに作動可能に連結された核酸分子からｍＲＮＡ分子を生成するためにＤＮＡまたはＲＮＡの転写を促進するまたは制御する。先に述べたように、生成されるＲＮＡは、タンパク質またはポリペプチドをコードし得るか、またはＲＮＡ干渉またはアンチセンス分子をコードし得る。
【００９７】
プロモーターは、それが結合している遺伝子が転写されることを可能にする核酸配列である。原核生物では、プロモーターは、典型的には遺伝子の上流、すなわち転写の方向で遺伝子に先立つ、−１０および−３５位の２個の短い配列からなる。−１０位の配列は、プリブナウボックスと呼ばれ、通常６個のヌクレオチドＴＡＴＡＡＴからなる。プリブナウボックスは原核生物において転写を開始させるために必須である。−３５位の他方の配列は、通常６個のヌクレオチドＴＴＧＡＣＡからなり、その存在は転写の速度を促進する。
【００９８】
真核生物プロモーターはより多様であり、したがって特徴付けることがより難しいが、一定の基本的特徴がある。たとえば真核生物プロモーターは、典型的にはそれらが最も近接して結びついている遺伝子の上流に存在する。プロモーターは、それらの転写開始部位から数キロ塩基離れて位置する調節エレメントを有し得るが、転写複合体による一定の三次構造形成は、調節因子を実際の転写部位により近づける、ＤＮＡの折りたたみを生じさせ得る。多くの真核生物プロモーターは、典型的にはヌクレオチド配列ＴＡＴＡＡＡによって表わされる、「ＴＡＴＡ」ボックスを含む。この因子は、ＲＮＡポリメラーゼ転写複合体の形成を助ける、ＴＡＴＡ結合タンパク質に結合する。ＴＡＴＡボックスは、典型的には転写開始部位の５０塩基内に存在する。
【００９９】
真核生物プロモーターはまた、転写複合体の形成に関与する転写因子に結合する一定の調節配列の存在によって特徴付けられる。一例は、塩基性ヘリックス−ループ−へリックスファミリー内の転写因子に結合する、配列ＣＡＣＧＴＧによって表わされるＥボックスである。またＧＣヌクレオチド含量が高い領域も存在する。
【０１００】
したがって、本発明によれば、本発明の所望ポリヌクレオチドの設計において使用し得る、プロモーター、たとえばアスパラギンシンテターゼ遺伝子の、部分配列または特異的プロモーター「フラグメント」は、これらのエレメントの１以上を含んでもまたは含まなくてもよく、あるいはこれらのエレメントのいずれも含まなくてもよい。１つの実施形態では、本発明のプロモーターフラグメント配列は機能性ではなく、ＴＡＴＡボックスを含まない。
【０１０１】
本発明の構築物のもう１つの特徴は、２個の反対向きのプロモーターによって、ターミネーターに直接作動可能に連結されているまたは連結されていないポリヌクレオチドの１以上のコピーの収束的転写を促進することである。終結シグナルが存在しないため、第一および第二プロモーターから転写されるＲＮＡ分子のプールの長さは、多様な長さであり得る。
【０１０２】
時として、たとえば転写機構が所望ポリヌクレオチド配列の「末端」を示す最後のヌクレオチドを越えて転写し続けることがある。従って、この特定の配置では、転写終結は、たとえばヘアピン形成を促進する下流配列の弱い、意図されたものでない作用を通して、またはトランスファーＤＮＡ組込み部位に隣接する植物ＤＮＡ内に位置する意図されたものでない転写終結因子の作用のいずれかを通して起こり得る。
【０１０３】
所望ポリヌクレオチドは、２つの異なる方向でプロモーターに連結され得る。１つの方向、たとえば「センス」方向では、生じるＲＮＡ転写産物の少なくとも５’部分が、少なくとも１つの標的転写産物の少なくとも一部と配列同一性を共有する。「アンチセンス」と称されるもう１つの方向では、予測転写産物の少なくとも５’部分が、少なくとも１つの標的転写産物の逆相補配列の少なくとも一部と同一または相同である。
【０１０４】
植物プロモーターは、その起源が植物細胞であるか否かにかかわらず、植物細胞において転写を開始させることができるプロモーターである。植物プロモーターの例は、植物、植物ウイルス、および植物細胞において発現される遺伝子を含むアグロバクテリウムまたはリゾビウムなどの細菌から得られるものを含むが、これらに限定されない。発生制御下のプロモーターの例は、木部、葉、根または種子などの一定の組織において選択的に転写を開始させるプロモーターを含む。そのようなプロモーターは組織優先的（ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーターと称される。一定組織においてのみ転写を開始させるプロモーターは、組織特異的プロモーターと称される。細胞型特異的プロモーターは、主として１以上の器官の一定の細胞型において、たとえば根または葉の導管細胞において発現を駆動する。誘導的または抑制的プロモーターは、環境制御下にあるプロモーターである。誘導的プロモーターによる転写に影響を及ぼし得る環境条件の例は、嫌気性条件または光の存在を含む。組織特異的、組織選択的、細胞型特異的および誘導的プロモーターは、非構成的プロモーターのクラスを構成する。構成的プロモーターは、ほとんどの環境条件下で、およびほとんどの植物部分において活性であるプロモーターである。
【０１０５】
ポリヌクレオチドは、遺伝子コード配列またはそのフラグメント（少なくとも１５個の連続ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０個の連続ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０個の連続ヌクレオチドを含む）、プロモーター、イントロン、エンハンサー領域、ポリアデニル化部位、翻訳開始部位、５’または３’非翻訳領域、レポーター遺伝子、選択マーカー等を含むヌクレオチド配列である。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。ポリヌクレオチドは、修飾塩基または修飾骨格を含み得る。ポリヌクレオチドは、ゲノム、ＲＮＡ転写産物（ｍＲＮＡなど）またはプロセシングされたヌクレオチド配列（ｃＤＮＡなど）であり得る。ポリヌクレオチドは、センスまたはアンチセンス方向の配列を含み得る。
【０１０６】
単離ポリヌクレオチドは、その天然の状態ではないポリヌクレオチドであり、たとえばポリヌクレオチドが天然では認められないヌクレオチド配列からなる、またはポリヌクレオチドが、それが典型的に隣接するヌクレオチド配列から分離されているまたはそれが典型的には隣接しないヌクレオチド配列に隣接している。
【０１０７】
種子：「種子」は、胚、および塊茎または胞子などの植物の繁殖部分を含む成熟した植物胚珠とみなし得る。種子は、たとえば発芽を促進するために、アグロバクテリウムを介した形質転換の前に暗所でインキュベートし得る。種子はまた、漂白剤での短時間の処理などにより、インキュベーションの前に滅菌し得る。生じた実生を、その後、所望菌株のアグロバクテリウムに暴露することができる。
【０１０８】
選択／スクリーニングマーカー：遺伝子が植物または植物組織において発現された場合、その遺伝子を発現しない他の植物または植物組織からそれらを識別することを可能にする遺伝子。スクリーニング手順は、スクリーニングマーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の発現に関するアッセイを必要とし得る。選択マーカーの例は、カナマイシンおよびゲネチシン耐性をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮｐｔＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンに対する耐性をコードするハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨｐｔＩＩ）遺伝子、または当分野で公知の他の同様の遺伝子を含む。
【０１０９】
感覚特性：専門訓練を受けた個人の委員会は、食品を外観、風味、香気およびテクスチャなどの感覚特性に関して評価することができる。Ｒ１およびホスホリラーゼＬ遺伝子発現レベルが下方制御された塊茎から得られるフライドポテトの評定を実施例４で述べる。実施例５で述べる塊茎からのフライドポテトも高い感覚特性を示す。このようにして、本発明は、そのアスパラギン生合成および代謝経路を操作するために本発明に従って修飾された植物から得られる植物製品の感覚特性を改善することを考慮する。
【０１１０】
配列同一性：ここで使用する、２つの核酸またはポリペプチド配列に関する「配列同一性」または「同一性」は、指定領域にわたって最大に一致するように整列したとき同じである２つの配列内の残基への言及を含む。配列同一性のパーセンテージをタンパク質に関して使用するとき、同一でない残基位置はしばしば保存的アミノ酸置換によって異なり、保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基が類似の化学的性質（たとえば電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、したがって分子の機能的性質を変化させないことが認識される。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質に関して補正するために上方に調整され得る。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると称される。この調整を行うための手段は当業者に周知である。典型的には、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的ミスマッチとして採点し、それにより配列同一性パーセンテージを上昇させることを含む。したがって、たとえば同一アミノ酸に１のスコアが与えられ、非保存的置換にはゼロのスコアが与えられる場合、保存的置換にはゼロと１の間のスコアが与えられる。保存的置換の採点は、たとえばＭｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ，４：１１  １７（１９８８）のアルゴリズムに従って、たとえばＰＣ／ＧＥＮＥプログラム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）において実施されるように算定される。
【０１１１】
ここで使用する、配列同一性のパーセンテージは、比較ウインドウにわたって２つの最適に整列した配列を比較することによって決定される数値を意味し、この場合比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのために参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在してマッチする位置の数を生じる、位置の数を決定すること、マッチした位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数で除すること、およびその結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算定される。
【０１１２】
「配列同一性」は、当分野で認識されている意味を有し、公表されている手法を用いて算定できる。ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｌｅｓｋ，ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）、  ＢＩＯＣＯＭＰＵＴＩＮＧ：ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ  ＡＮＤ  ＧＥＮＯＭＥ  ＰＲＯＪＥＣＴＳ，Ｓｍｉｔｈ，ｅｄ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３），ＣＯＭＰＵＴＥＲ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＯＦ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＡＴＡ，ＰＡＲＴ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＆  Ｇｒｉｆｆｉｎ，ｅｄｓ．，（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４）、ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７），ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＰＲＩＭＥＲ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ＆  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，ｅｄｓ．（Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１）、およびＣａｒｉｌｌｏ  ＆  Ｌｉｐｔｏｎ，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３（１９８８）参照。２つの配列の間の同一性または類似性を決定するために一般的に用いられる方法は、ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＨＵＧＥ  ＣＯＭＰＵＴＥＲＳ，Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄ．，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４）およびＣａｒｉｌｌｏ  ＆  Ｌｉｐｔｏｎ，ｓｕｐｕｒａに開示されているものを含むが、これらに限定されない。同一性および類似性を決定する方法はコンピュータプログラム法に体系化されている。２つの配列の間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラムは、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０））、およびＦＡＳＴＤＢ（Ｂｒｕｔｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７（１９９０））を含むが、これらに限定されない。
【０１１３】
沈黙化：プロモーターからターミネーターまでの遺伝子または遺伝子フラグメントの一方向性で混乱のない転写は、標的遺伝子の転写後サイレンシングを引き起こすことができる。植物における転写後遺伝子サイレンシングのための初期の発現カセットは、転写開始と終結のための調節配列の間に、アンチセンス（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６６１７４９６号；Ｓｈｅｗｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５１０７０６５号）またはセンス（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：２９１〜２９９，１９９０）方向に位置する単一遺伝子フラグメントを含んだ。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）では、生じる転写産物のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる認識が二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡの生成を導く。Ｄｃｌ４などのダイサー様（Ｄｃｌ）タンパク質によるこのｄｓＲＮＡの切断は、２１ヌクレオチド（ｎｔ）の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を生じる。これらのｓｉＲＮＡは、アルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）（Ａｇｏ）ファミリーの成員を含むタンパク質と複合して、ＲＮＡ誘導のサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を生成する。ＲＩＳＣは、次に、エンドヌクレアーゼによる切断のために相同なＲＮＡを標的する。
【０１１４】
より有効なサイレンシング構築物は、センスとアンチセンス成分の両方を含み、ヘアピン構造に折りたたまれるＲＮＡ分子を生成する（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：１３９５９〜１３９６４，１９９８）。逆反復配列導入遺伝子の発現によって生成される高いｄｓＲＮＡレベルは、多くのＤｃｌの活性を促進すると仮定された。シロイヌナズナにおけるコンビナトリアルＤｃｌノックアウトの分析はこの概念を支持し、またＤｃｌ４をＲＮＡ切断に関与するタンパク質の１つと同定した。
【０１１５】
従来のセンス、アンチセンスおよび二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡに基づく遺伝子サイレンシング構築物の１つの成分は転写ターミネーターである。国際公開公報第ＷＯ２００６／０３６７３９号は、遺伝子フラグメントが２つの反対方向の機能的に活性なプロモーターの間に位置するときにはこの調節因子が使われなくなることを示す。生じる収束的転写は、一方向性の「プロモーターからターミネーターまで」の転写と少なくとも同程度に有効な遺伝子サイレンシングを引き起こす。短い多様な大きさの非ポリアデニル化ＲＮＡに加えて、ターミネーターを含まないカセットは、隣接プロモーターに達するより長い転写産物をまれにしか生成しなかった。プロモーター由来配列による遺伝子フラグメントの置換は、遺伝子サイレンシングの程度をさらに上昇させた。
【０１１６】
本発明の好ましい実施形態では、所望ポリヌクレオチドは、標的遺伝子プロモーターの部分配列または標的遺伝子プロモーターの一部と配列同一性を共有する部分配列を含む。したがって、本発明の所望ポリヌクレオチドは、対象とする特定標的遺伝子プロモーターの特定フラグメントを含む。
【０１１７】
所望ポリヌクレオチドは、１以上の機能的プロモーターに作動可能に連結され得る。本発明によって考慮される様々な構築物は、（１）所望ポリヌクレオチドが１以上のプロモーターフラグメント配列を含み、および両末端で機能的「駆動（ｄｒｉｖｅｒ）」プロモーターに作動可能に連結されている構築物。それらの２つの機能的プロモーターは、所望ポリヌクレオチドの各々の鎖が転写されるように収束方向に配置されている；（２）所望ポリヌクレオチドがその５’末端またはその３’末端のいずれかで１個の機能的プロモーターに作動可能に連結されており、所望ポリヌクレオチドがまた、機能的ターミネーター配列によってその非プロモーター末端で作動可能に連結されている構築物；（３）所望ポリヌクレオチドがその５’末端またはその３’末端のいずれかで１個の機能的プロモーターに作動可能に連結されているが、所望ポリヌクレオチドがターミネーターに作動可能に連結されていない構築物；または（４）所望ポリヌクレオチドが１以上のプロモーターフラグメント配列を含むが、いかなる機能的プロモーターまたはターミネーターにも作動可能に連結されていないカセット、を含むが、これらに限定されない。
【０１１８】
したがって、本発明の構築物は、所望ポリヌクレオチドの両方の鎖が転写されるように、１以上の所望ポリヌクレオチドに隣接するまたは所望ポリヌクレオチドのコピーに隣接する２以上の「駆動」プロモーターを含み得る。すなわち、１つのプロモーターは所望ポリヌクレオチドの５’末端の転写を開始させるように方向づけられ、一方２番目のプロモーターは、同じ所望ポリヌクレオチドの３’末端からの転写を開始させるように作動可能に方向づけられ得る。反対に方向づけられたプロモーターは、所望ポリヌクレオチドの多数のコピーに隣接し得る。したがって、「コピー数」は、構築物が、収束的転写を誘導するように方向づけられた「駆動」プロモーターによって隣接され得る、所望ポリヌクレオチドの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００または１００超のコピーまたはそれらの間の何らかの整数のコピーを含むように変化し得る。
【０１１９】
いずれのカセットもターミネーター配列を含まない場合、そのような構築物は、収束的転写配置により、種々の長さのＲＮＡ転写産物を作製し得る。
【０１２０】
この状況では、したがって、それぞれのカセットからの転写された所望ポリヌクレオチドの部分または完全長配列を含む部分的または完全転写ＲＮＡの小集団が存在し得る。あるいは、機能的ターミネーターの不在下では、転写機構は、所望ポリヌクレオチドの末端を越えて進行し、所望ポリヌクレオチドの長さよりも長い転写産物を生成し得る。
【０１２１】
ポリヌクレオチドの１つが他方に対して逆の相補的方向（ｉｎｖｅｒｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）に配向されているかまたは配向されていなくてもよく、およびポリヌクレオチドが収束的転写を誘導するようにプロモーターに作動可能に連結されており、および構築物中に機能的ターミネーターが存在しない、２コピーの所望ポリヌクレオチドを含む構築物では、したがって、１つの所望ポリヌクレオチドから開始される転写機構は、所望ポリヌクレオチドの他方のコピーを転写するように進行し、逆もまた同様であり得る。所望ポリヌクレオチドの多数のコピーが様々な順列で方向づけられ得る。２コピーの所望ポリヌクレオチドが構築物中に存在する場合、コピーは、たとえば両方が同じ方向に、互いに逆方向に、または互いに逆の相補的方向に配向され得る。
【０１２２】
所望ポリヌクレオチドの１つが他方のポリヌクレオチドに対して逆の相補的方向に配向されている配置では、第一ポリヌクレオチドの「センス」配列だけでなく第二ポリヌクレオチドからの「アンチセンス」配列も含むＲＮＡ転写産物が作製され得る。第一ポリヌクレオチドと第二ポリヌクレオチドが同じかまたは実質的に同じＤＮＡ配列を含む場合、１つのＲＮＡ転写産物は、互いに相補的であり、したがってアニールし得る２つの領域を含み得る。従って、そのように転写される１つのＲＮＡ転写産物は、部分的または完全なヘアピン二重鎖構造を形成し得る。
【０１２３】
他方で、各々のプロモーターから１つずつ、そのような長い転写産物の２コピーが作製された場合、各々が他方と配列相補性の領域を共有する、２個のＲＮＡ分子が存在する。したがって、第一ＲＮＡ転写産物の「センス」領域は第二ＲＮＡ転写産物の「アンチセンス」領域にアニールしてもよく、逆もまた同様であり得る。この配置では、したがって、１個の自己相補的ＲＮＡ転写産物から形成されるヘアピン二重鎖と異なり、２個の別々のＲＮＡ転写産物からなるもう１つのＲＮＡ二重鎖が形成され得る。
【０１２４】
あるいは、２コピーの所望ポリヌクレオチドは、読み過ごし転写の場合、１個のプロモーターから生成される長いＲＮＡ転写産物が、たとえば所望ポリヌクレオチドの第一コピーのセンス配列および所望ポリヌクレオチドの第二コピーのセンス配列を含み得るように、同じ方向に配向され得る。他方の収束的に方向づけられたプロモーターから作製されるＲＮＡ転写産物は、したがって、所望ポリヌクレオチドの第二コピーのアンチセンス配列および第一ポリヌクレオチドのアンチセンス配列を含み得る。従って、いずれのＲＮＡ転写産物も正確な相補性の領域を含まないと考えられ、したがって、いずれのＲＮＡ転写産物もヘアピン構造を生成するように折りたたまれる可能性が高い。他方で、２つの個々のＲＮＡ転写産物は互いにハイブリダイズすることができ、ＲＮＡ二重鎖を形成するようにアニールし得る。
【０１２５】
このようにして、１つの態様では、本発明は、ターミネーターを欠く、または自己スプライシングリボザイムをコードするＤＮＡ領域が先行するターミネーターを欠くが、所望ポリヌクレオチドに作動可能に連結された第一プロモーターを含む構築物を提供する。
【０１２６】
組織：食品を生産するために使用される植物の何らかの部分。組織は、ジャガイモの塊茎、サツマイモの根、またはトウモロコシ植物の種子であり得る。
【０１２７】
転写ターミネーター：本発明の発現ＤＮＡ構築物は、典型的には転写開始調節領域から反対側の末端に転写終結領域を有する。転写終結領域は、発現を高めるためのｍＲＮＡの安定性のため、および／または遺伝子転写産物に付加されるポリアデニル化尾部の付加のために選択され得る。新生ポリペプチドの翻訳は、３個の鎖終結コドンのいずれかがリボソーム上のＡ部位に入ったとき終結を受ける。翻訳終結コドンは、ＵＡＡ、ＵＡＧおよびＵＧＡである。
【０１２８】
本発明では、転写ターミネーターは、遺伝子からまたは、より好ましくは、遺伝子ではなく遺伝子間ＤＮＡである配列に由来する。たとえばジャガイモユビキチン遺伝子からのターミネーター配列が使用でき、この配列を配列番号５に示す。
【０１２９】
トランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）：トランスファーＤＮＡは、それぞれＴ−ＤＮＡまたはＰ−ＤＮＡを作製するようにＴ−ＤＮＡ境界またはＰ−ＤＮＡ境界によって規定されるＤＮＡセグメントである。Ｔ−ＤＮＡは、その境界内に含まれるヌクレオチド配列を別のゲノムに組み込むことができるエレメントとして周知の遺伝因子である。これに関して、Ｔ−ＤＮＡは、典型的には、２つの「境界」配列によって隣接される。本発明の所望ポリヌクレオチドおよび選択マーカーは、Ｔ−ＤＮＡの左側境界様配列と右側境界様配列の間に位置し得る。Ｔ−ＤＮＡ内に含まれる所望ポリヌクレオチドおよび選択マーカーは、その発現、すなわち所望ポリヌクレオチドまたは選択マーカーによってコードされるＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を促進するプロモーターおよびターミネーター調節エレメントのような、種々の異なる、植物特異的（すなわち天然）または外来性核酸に作動可能に連結され得る。
【０１３０】
植物細胞の形質転換：核酸が植物細胞のゲノムに安定に挿入される過程。形質転換は、当分野で周知の様々な方法を用いて天然または人為的条件下で起こり得る。形質転換は、「改良（ｒｅｆｉｎｅｄ）形質転換」または「精密育種（ｐｒｅｃｉｓｅ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ）」などのアグロバクテリウムを介した形質転換プロトコール、ウイルス感染、ウイスカー法、電気穿孔、微量注入、ポリエチレングリコール処理、熱ショック、リポフェクションおよびパーティクルガンを含む、原核または真核宿主細胞への核酸配列の挿入のための何らかの公知の方法に基づき得る。
【０１３１】
トランスジェニック植物：本発明のトランスジェニック植物は、外来性核酸が安定に組み込まれた少なくとも１個の細胞ゲノムを含むものである。本発明によれば、トランスジェニック植物は、遺伝子修飾された細胞および細胞ゲノムを１個だけ含む植物であるか、またはいくつかの遺伝子修飾された細胞を含む植物であるか、または細胞のすべてが遺伝子修飾された植物である。本発明のトランスジェニック植物は、植物の一定の部分においてのみ、所望ポリヌクレオチド、すなわち外来性核酸の発現を含むものであり得る。このようにして、トランスジェニック植物は、その構造の一定部分において遺伝子修飾された細胞だけを含み得る。
【０１３２】
変異体：ここで使用する、「変異体」は、特定遺伝子またはタンパク質の標準または所与のヌクレオチドまたはアミノ酸から逸脱するヌクレオチドまたはアミノ酸配列を意味すると理解される。「アイソフォーム」、「アイソタイプ」および「類似体」という用語も、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の「変異体」形態を指す。１以上のアミノ酸の付加、除去または置換、またはヌクレオチド配列の変化によって変化したアミノ酸配列は、「変異体」配列とみなされ得る。変異体は、置換されたアミノ酸が類似の構造または化学特性を有する、「保存的」変化、たとえばイソロイシンによるロイシンの置換を有し得る。変異体は、「非保存的」変化、たとえばトリプトファンによるグリシンの置換を有し得る。類似の重要でない変異はまた、アミノ酸欠失または挿入またはその両方を含み得る。いずれのアミノ酸残基を置換、挿入または欠失させ得るかを決定するときの指針は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ（ＩｎｆｏｒＭａｘ，ＭＤ）ソフトウエアなどの当分野において周知のコンピュータプログラムを用いて見出し得る。「変異体］はまた、Ｍａｘｙｇｅｎに譲渡された特許に述べられているような「シャッフルされた遺伝子」を意味し得る。
【０１３３】
本発明がここで述べる特定の方法、プロトコール、ベクター、および試薬等に限定されないことは、これらが変化し得るので、理解される。また、ここで使用する用語は、特定実施形態を説明する目的ためにのみ使用され、本発明の範囲を限定することを意図しないことは理解される。本明細書中および付属の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形態「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から明らかに異なる指示がない限り、複数の言及を含む。したがって、たとえば「１個の遺伝子」への言及は１以上の遺伝子への言及であり、当業者に公知のその等価物等を含む。実際に、当業者は、植物宿主系において何らかの天然遺伝子（現在公知のまたはその後公知となる）を発現するためにここで述べる方法を用いることができる。
【０１３４】
（ポリヌクレオチド配列）
本発明は、配列番号１、２、３、４、９、１０、１４、１５、２３、２４または２５のポリヌクレオチド配列のいずれかからなる群より選択される配列を有するポリヌクレオチドを含む単離核酸分子に関する。本発明はまた、配列番号１、２、３、４、９、１０、１４、１５、２３、２４または２５のポリヌクレオチド配列の機能的フラグメントを提供する。本発明はさらに、配列番号１、２、３、４、９、１０、１４、１５、２３、２４または２５のポリヌクレオチド配列のいずれかに相補的な核酸またはそのフラグメント、ならびに配列番号１、２、３、４、９、１０、１４、１５、２３、２４または２５のポリヌクレオチド配列のいずれかにハイブリダイズする、少なくとも１５の隣接塩基を含む核酸を提供する。
【０１３５】
「単離された」核酸分子とは、その天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。たとえばＤＮＡ構築物に含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的に関して単離されたとみなされる。単離ＤＮＡ分子のさらなる例は、異種宿主細胞中で維持される組換えＤＮＡ分子または溶液中の精製された（部分的にまたは実質的に）ＤＮＡ分子を含む。単離ＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子のインビトロＲＮＡ転写産物を含む。本発明に従った単離核酸分子は、合成によって作製されるそのような分子をさらに含む。
【０１３６】
本発明の核酸分子は、ｍＲＮＡなどのＲＮＡの形態、または、たとえばクローニングによって得られるまたは合成によって作製されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む、ＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡは、センス鎖としても知られるコード鎖であり得るか、または非コード鎖でもあり得、さらにアンチセンス鎖であり得る。
【０１３７】
異なる指示がない限り、ここでＤＮＡ分子を塩基配列決定することによって決定されるすべてのヌクレオチド配列は、自動ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．からの３７３型など）を用いて決定された。したがって、この自動化アプローチによって決定されるいかなるＤＮＡ配列に関しても当分野で公知のように、ここで決定されるすべてのヌクレオチド配列はある程度の誤りを含み得る。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されるＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して典型的には少なくとも約９５％同一、より典型的には少なくとも約９６％から少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当分野で周知の手動によるＤＮＡ塩基配列決定法を含む他のアプローチによってより正確に決定することができる。同じく当分野で公知のように、実際の配列と比較して、決定されたヌクレオチド配列内の１個の挿入または欠失が、決定されたヌクレオチド配列によってコードされる予測アミノ酸配列が、そのような挿入または欠失点から始まる、配列決定されたＤＮＡ分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なり得るようなヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを生じさせる。
【０１３８】
ここで示す各々の「ヌクレオチド配列」は、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと略される）の配列として提示される。しかし、核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」とは、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドに関しては、デオキシリボヌクレオチドの配列を意味し、ＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドに関しては、特定デオキシヌクレオチド配列内の各々のチミジンデオキシヌクレオチド（Ｔ）がリボヌクレオチドウリジン（Ｕ）で置換された、リボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＵ）の対応する配列を意味する。
【０１３９】
本発明はまた、ここで述べる単離核酸分子のフラグメントを対象とする。好ましくは、ＤＮＡフラグメントは、診断プローブおよびプライマーとして有用な、少なくとも１５ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長、さらに一層好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド長を含む。言うまでもなく、本発明の核酸分子全体の長さまでのより大きな核酸フラグメントも、従来のハイブリダイゼーション手法に従ってプローブとして、または、たとえばその開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌ．，（２００１），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに述べられているように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による標的配列の増幅のためのプライマーとして、診断上有用である。少なくとも２０ヌクレオチド長のフラグメントとは、たとえば、配列番号１、２、１７、２０、２１のヌクレオチド配列から２０以上の隣接塩基を含むフラグメントを意味する。配列番号１、２、１７、２０、２１に列挙されるヌクレオチド配列を含む核酸は、当業者に常套的な従来のＤＮＡ合成の方法を用いて作製できる。たとえば制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波処理によるせん断は、様々な大きさのフラグメントを作製するために容易に使用できる。あるいは、本発明のＤＮＡフラグメントは公知の手法に従って合成によって作製することができる。
【０１４０】
もう１つの態様では、本発明は、上述した本発明の核酸分子内のポリヌクレオチドの一部に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離核酸分子を提供する。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、標準ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド、より一層好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド、さらに一層好ましくは３０ヌクレオチド超にハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を意味する。標準フラグメントにハイブリダイズするこれらのフラグメントは、診断プローブおよびプライマーとして有用である。プローブは、ここで使用するとき、配列番号１−〜２３０に示す核酸配列の１つの少なくとも約１００個の隣接塩基と定義される。本発明に関して、２つの配列は、それらが６ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５Ｘデンハルト溶液および非特異的キャリアーＤＮＡ１００μｇのハイブリダイゼーション溶液中で二本鎖複合体を形成するときハイブリダイズする。Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｅｃｔｉｏｎ  ２．９，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２７（１９９４）参照。配列は、６ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５Ｘデンハルト溶液および非特異的キャリアーＤＮＡ１００μｇのハイブリダイゼーション溶液中６０℃の温度と定義される、「中ストリンジェンシー」でハイブリダイズし得る。「高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーションのためには、温度を６８℃に上昇させる。中ストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション反応後、ヌクレオチドを室温にて２ＸＳＳＣプラス０．０５％ＳＤＳの溶液中で５回洗浄し、その後６０℃にて０．１ＸＳＳＣプラス０．１％ＳＤＳで１時間洗浄する。高ストリンジェンシーについては、洗浄温度を６８℃に上昇させる。本発明に関して、ハイブリダイズしたヌクレオチドは、ハイブリダイズしたヌクレオチドが７０℃にて７２時間以内のＸ線フィルムへの暴露後に明らかに可視となる、１０，０００ｃｐｍ／ｎｇの比放射能を有する放射標識プローブ１ｎｇを用いて検出されるものである。
【０１４１】
本出願は、配列番号１、２、１７、２０、２１に示す核酸配列に少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸分子を対象とする。しかし、配列番号１、２、１７、２０、２１のいずれかに示す核酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸分子が好ましい。２つの核酸配列間の相違は、標準ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置で、または標準配列内のヌクレオチドまたは標準配列内の１以上の隣接グループ内のヌクレオチドの間に個別に散在する、それらの末端位置の間のどこかで生じ得る。
【０１４２】
実際問題として、任意の特定核酸分子が標準ヌクレオチド配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、当分野で周知の標準アルゴリズムを用いて２個の分子の間で行われる比較を示し、従来、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムなどの公的に入手可能なコンピュータプログラムを用いて決定することができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２（１９９７）参照。
【０１４３】
（配列分析）
比較のための配列のアラインメントの方法は当分野において周知である。比較のための配列の最適アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズムによって；  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって；Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａによるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡを含むが、これらに限定されない、これらのアルゴリズムのコンピュータでの実行によって実施し得る；ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ  ７３：２３７  ２４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１  １５３（１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６：１０８８１〜９０（１９８８）；Ｈｕａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８：１５５〜６５（１９９２）、およびＰｅａｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４：３０７〜３３１（１９９４）によって詳細に説明されている。
【０１４４】
データベース類似性検索のために使用できるＢＬＡＳＴファミリーのプログラムは以下を含む：ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのＢＬＡＳＴＮ；タンパク質データベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのＢＬＡＳＴＸ；タンパク質データベース配列に対するタンパク質問い合わせ配列のためのＢＬＡＳＴＰ；ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質問い合わせ配列のためのＴＢＬＡＳＴＮ；ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのＴＢＬＡＳＴＸ。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １９，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２１５：４０３〜４１０（１９９０）；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２（１９９７）参照。
【０１４５】
ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウエアは、たとえばＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列における同じ長さのワードを用いてアラインメントする場合、いくつかの正の値の閾値スコアＴにマッチするかまたはそれを満足するかいずれかの、問い合わせ配列における短いワード長Ｗを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と称される。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するための種（ｓｅｅｄｓ）として働く。次に、このワードヒットを、累積アラインメントスコアが増加し得る限り各々の配列に沿って両方向に伸長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメータＭ（マッチする残基対のリワードスコア）；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基のペナルティースコア；常に＜０）を用いて算定する。アミノ酸配列に関しては、累積スコアを算定するためにスコアリングマトリックスを使用する。各々の方向のワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアが、その最大達成値から数量Ｘだけ低下したとき；１以上の負のスコアを持つ残基のアラインメントの蓄積のために、累積スコアが０以下になったとき；またはいずれかの配列の末端に達したときに停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラムは（ヌクレオチド配列に関して）、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列に関しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）。
【０１４６】
パーセント配列同一性を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性の統計分析を実施する（たとえばＫａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５８７７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の適合が偶然に発生する確率の指標を提供する。
【０１４７】
配列のマルチプルアラインメントは、ＣＬＵＳＴＡＬアラインメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１  １５３）を使用してデフォルトパラメータ（ギャップペナルティー＝１０、ギャップ長ペナルティー＝１０）で実施できる。ＣＬＵＳＴＡＬ法を用いたペアワイズアラインメントについてのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ  １、ギャップペナルティー＝３、ウインドウ＝５および保存された対角＝５である。
【０１４８】
ポリヌクレオチド配列についてのＥ値およびパーセンテージ同一性に寄与するＢＬＡＳＴＮを使用したアラインメントおよび類似性の決定のために以下の実行パラメータが好ましい：Ｕｎｉｘ（登録商標）実行コマンド：ｂｌａｓｔａｌｌ  −ｐ  ｂｌａｓｔｎ  −ｄ  ｅｍｂｌｄｂ  −ｅ  １０  −Ｇ０  −Ｅ０  −ｒ  １  −ｖ  ３０  −ｂ  ３０  −ｉ  問い合わせ配列  −ｏ  結果；パラメータは以下のとおりである。−ｐ  プログラム名［ストリング］；−ｄ  データベース［ストリング］；−ｅ  期待値（Ｅ）［実測］；−Ｇ  ギャップのオープンに対するコスト（ゼロはデフォルト行動を呼び出す）［整数］；−Ｅ  ギャップの伸長に対するコスト（ゼロはデフォルト行動を呼び出す）［整数］；−ｒ  ヌクレオチドマッチに対するリワード（ｂｌａｓｔｎのみ）［整数］；−ｖ  １行記述（ｏｎｅ−ｌｉｎｅ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）の数（Ｖ）［整数］；−ｂ  示すアラインメントの数（Ｂ）［整数］；−ｉ  問い合わせファイル［Ｆｉｌｅ  Ｉｎ］；および−ｏ  ＢＬＡＳＴレポート出力ファイル［Ｆｉｌｅ  Ｏｕｔ］オプション。
【０１４９】
ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＰまたは同様のアルゴリズムによって作製される問い合わせ配列による１以上のデータベース配列に対する「ヒット」を、整列し、配列の類似部分を同定する。ヒットを、類似度および配列オーバーラップの長さの順に並べる。データベース配列に対するヒットは一般に、問い合わせ配列の配列長の一部だけのオーバーラップを示す。
【０１５０】
ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴＰアルゴリズムはまた、アラインメントについての「期待」値を出力する。期待値（Ｅ）は、一定サイズのデータベースを検索したとき一定数の隣接配列にわたって偶然見つけることが「期待」できるヒットの数を示す。期待値は、好ましいＥＭＢＬデータベースなどのデータベースに対するヒットが本当の類似性を示しているかどうかを決定するための有意性閾値として使用される。たとえばポリペプチドヒットに与えられる０．１のＥ値は、ＥＭＢＬデータベースの大きさのデータベースにおいて、単に偶然に類似スコアを有する配列の整列した部分で０．１のマッチが認められることが期待されることを意味すると解釈される。この判定基準により、整列してマッチしたポリヌクレオチド配列の部分は、同じである確率が９０％である。整列してマッチした部分で０．０１以下のＥ値を有する配列については、ＥＭＢＬデータベースにおいて偶然マッチを発見する確率は、ＢＬＡＳＴＮまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いて１％以下である。
【０１５１】
１つの実施形態によれば、「変異体」ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの各々に関して、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドの各々と同じ数かまたはそれより少ない核酸を有し、および本発明のポリヌクレオチドと比較したとき０．０１以下のＥ値を生成する配列を含む。すなわち変異体ポリヌクレオチドは、上述したパラメータに設定したＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して０．０１以下のＥ値を有するとして測定される、本発明のポリヌクレオチドと同じであることの少なくとも９９％の確率を有する配列である。
【０１５２】
あるいは、本発明の変異体ポリヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、９、１０、１４、１５、２３、２４または２５に示すポリヌクレオチド配列、またはそれらの配列の相補配列、逆配列または逆相補配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズする。
【０１５３】
本発明はまた、開示配列と異なるが、遺伝暗号の縮重の結果として、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるものと同じポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。したがって、保存的置換の結果として、配列番号１、２、３、４、９、１０、１４、１５、２３、２４または２５に示すポリヌクレオチド配列；またはそれらの配列の相補配列、逆配列または逆相補配列と異なる配列を含むポリヌクレオチドは、本発明によって考慮され、本発明に包含される。加えて、合計で総配列長の１０％未満の欠失および／または挿入の結果として、配列番号１、２、３、４、９、１０、１４、１５、２３、２４または２５に示すポリヌクレオチド配列、またはそれらの配列の相補配列、逆配列または逆相補配列と異なる配列を含むポリヌクレオチドも、本発明によって考慮され、本発明に包含される。
【０１５４】
本発明のポリヌクレオチド配列に対して規定のパーセンテージ同一性を有することに加えて、変異体ポリヌクレオチドは、好ましくは本発明のポリヌクレオチドと共通する付加的な構造および／または機能的特徴を有する。本発明のポリヌクレオチドと一次構造において高度の類似性を共有することに加えて、本発明のポリヌクレオチドに規定の程度の同一性を有するまたは本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、好ましくは以下の特徴の少なくとも１つを有する。（ｉ）本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと実質的に同じ機能的性質を有するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームまたは部分的オープンリーディングフレームを含む；または（ｉｉ）共通のドメインを有する。
【０１５５】
（エレメントおよびＤＮＡ配列のソース）
ここで述べるエレメントおよびＤＮＡ配列のいずれかまたは全部は、１以上の植物ゲノムに内因性であり得る。従って、本発明の１つの特定実施形態では、最終的な転移カセットのために選択されるエレメントおよびＤＮＡ配列のすべてが、形質転換しようとする植物のゲノムに内因性であるまたは天然である。たとえば配列のすべてがジャガイモゲノムに由来し得る。あるいは、エレメントまたはＤＮＡ配列の１以上は、形質転換しようとする植物の種と同じではないが、宿主植物細胞における何らかの事象において機能する植物ゲノムに内因性であり得る。そのような植物は、ジャガイモ、トマトおよびアルファルファ植物を含む。本発明はまた、形質転換しようとする植物と異系交配できる植物からの１以上の遺伝因子の使用を包含する。
【０１５６】
これに関して、本発明の「植物」は、ジャガイモ、トマト、アボカド、アルファルファ、テンサイ、キャッサバ、サツマイモ、ダイズ、エンドウマメ、マメ、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギおよびモロコシを含むが、これらに限定されない。したがって、植物は単子葉植物または双子葉植物であり得る。「植物」および「植物材料」はまた、植物細胞、種子、植物後代、有性生殖または無性生殖によって生成される珠芽、および挿し木または種子などの、これらのいずれかの子孫を包含する。「植物材料」は、植物細胞、細胞懸濁培養、カルス、胚、分裂領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉、種子、発芽実生および小胞子を意味し得る。植物は、成熟の様々な段階であり得、液体または固体培養中で、あるいは土壌中または鉢内の適切な媒質中で、温室または圃場で生育し得る。植物における導入されたリーダー、トレーラーまたは遺伝子配列の発現は一過性または恒久的であり得る。
【０１５７】
これに関して、本発明の植物由来トランスファーＤＮＡ（「Ｐ−ＤＮＡ」）境界配列は、公知のいかなる細菌由来Ｔ−ＤＮＡ境界配列ともヌクレオチド配列において同一ではないが、基本的に同じ目的のために機能する。すなわち、Ｐ−ＤＮＡは、あるポリヌクレオチドを別のポリヌクレオチドに転移し、組み込むために使用できる。Ｐ−ＤＮＡは、従来のＴ−ＤＮＡの代わりにアグロバクテリウムからＴｉ−プラスミドなどのような腫瘍誘導プラスミドに挿入され、従来の形質転換プラスミドと同様に、細菌株において維持され得る。Ｐ−ＤＮＡは、細菌を介した植物形質転換によって植物ゲノムに組み込もうとする、所望ポリヌクレオチドを含むように操作することができる。すべて参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｏｍｍｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．の国際公開公報第ＷＯ２００３／０６９９８０号、米国特許出願第ＵＳ−２００３−０２２１２１３号、米国特許出願第ＵＳ−２００４−０１０７４５５号および国際公開公報第ＷＯ２００５／００４５８５号参照。
【０１５８】
したがって、Ｐ−ＤＮＡ境界配列は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲンなどのアグロバクテリウム種からの公知のＴ−ＤＮＡ境界配列と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のヌクレオチドによって異なる。
【０１５９】
Ｐ−ＤＮＡ境界配列は、アグロバクテリウムＴ−ＤＮＡ境界配列とヌクレオチド配列において９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５３％、５２％、５１％または５０％以下の類似性である。
【０１６０】
植物、特にジャガイモおよびコムギからのトランスファーＤＮＡを同定し、単離するための方法が開発され、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第ＵＳ−２００４−０１０７４５５号に述べられている境界モチーフコンセンサスが利用された。
【０１６１】
これに関して、ここで開示する任意の配列、切断部位、領域またはエレメントなどの本発明の植物由来ＤＮＡは、それが結合しているポリヌクレオチドを植物染色体などのもう１つ別の核酸分子に、約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９４％、約９３％、約９２％、約９１％、約９０％、約８９％、約８８％、約８７％、約８６％、約８５％、約８４％、約８３％、約８２％、約８１％、約８０％、約７９％、約７８％、約７７％、約７６％、約７５％、約７４％、約７３％、約７２％、約７１％、約７０％、約６９％、約６８％、約６７％、約６６％、約６５％、約６４％、約６３％、約６２％、約６１％、約６０％、約５９％、約５８％、約５７％、約５６％、約５５％、約５４％、約５３％、約５２％、約５１％、約５０％、約４９％、約４８％、約４７％、約４６％、約４５％、約４４％、約４３％、約４２％、約４１％、約４０％、約３９％、約３８％、約３７％、約３６％、約３５％、約３４％、約３３％、約３２％、約３１％、約３０％、約２９％、約２８％、約２７％、約２６％、約２５％、約２４％、約２３％、約２２％、約２１％、約２０％、約１５％、または約５％または少なくとも約１％の形質転換頻度で、転移し、組み込むことを促進する場合、機能性である。
【０１６２】
そのような形質転換関連配列およびエレメントのいずれもが、形質転換効率を変化させるように修飾するまたは突然変異させることができる。他のポリヌクレオチド配列を本発明の形質転換配列に付加し得る。たとえば５’および３’マルチプルクローニングサイト、または付加的な制限部位を有するように修飾し得る。ここで開示するような切断部位の配列は、たとえば付随のベクターからバックボーンＤＮＡが植物ゲノムに組み込まれない可能性を高めるように修飾し得る。
【０１６３】
いかなる所望ポリヌクレオチドも、ここで述べる切断または境界配列の間に挿入し得る。たとえば所望ポリヌクレオチドは、植物種に天然である野生型または修飾遺伝子であり得るか、または非植物ゲノムからの遺伝子であり得る。たとえばジャガイモ植物を形質転換するときは、所望ジャガイモ遺伝子またはそのフラグメントに作動可能に連結されたジャガイモ特異的プロモーターおよびジャガイモ特異的ターミネーターを含む発現カセットを作製することができる。発現カセットは、遺伝子の５’末端にインフレームで融合したシグナルペプチド配列、およびジャガイモ転写エンハンサーなどの付加的なジャガイモ遺伝因子を含み得る。本発明はそのような配置に限定されず、形質転換カセットは、所望ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結されているが、ターミネーター配列に作動可能に連結されていないように構築し得る。
【０１６４】
ここで述べるような、形質転換関連配列またはエレメントが植物から同定され、単離されるとき、およびその配列またはエレメントがその後同じ種の植物を形質転換するために使用される場合、その配列またはエレメントは、その植物ゲノムに「天然（ｎａｔｉｖｅ）」であると記載することができる。
【０１６５】
したがって、「天然」遺伝因子は、形質転換しようとする植物のゲノム内に天然に存在する、それを起源とする、またはそれに属する核酸を指す。同様に、「内因性」という用語も、特定核酸、たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ、またはタンパク質を植物に「天然」であると同定するために使用できる。内因性は、生物内を起源とする因子を意味する。したがって、形質転換しようとする植物または植物種のゲノムから単離される、または形質転換しようとする植物種と性的に適合性であるかまたは異系交配できる植物または種から単離される核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子は、植物種に「天然」、すなわち固有である。言い換えると、天然遺伝因子は、古典的植物育種を通した植物の改善のために植物育種家が使用し得るすべての遺伝物質である。天然核酸の何らかの変異体も、本発明に従って「天然」とみなされる。これに関して、「天然」核酸はまた、植物またはその性的に適合性である種から単離して、生じる変異体が、植物から単離される修飾されていない天然タンパク質とヌクレオチド配列において９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％または６０％以上類似するように修飾または突然変異させ得る。天然核酸変異体はまた、ヌクレオチド配列において約６０％未満、約５５％未満、または約５０％未満の類似性であり得る。
【０１６６】
植物から単離される「天然」核酸はまた、核酸から転写され、翻訳される、天然に生じるタンパク質産物の変異体をコードし得る。したがって、天然核酸は、核酸が単離された植物において発現される修飾されていない天然核酸とアミノ酸配列において９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％または６０％以上類似するタンパク質をコードし得る。
【０１６７】
（プロモーター）
本発明のポリヌクレオチドは、植物の組織においてポリペプチドまたはタンパク質の発現を特異的に指令するために使用できる。本発明の核酸も、植物の組織において、標的遺伝子の発現を阻害するまたは完全にブロックするために有用であり得る、アンチセンスＲＮＡ、または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に関与するＲＮＡの発現を特異的に指令するために使用できる。ここで使用する、「コード産物」は、プロモーターに作動可能に連結された核酸の最終産物を意味することが意図されている。たとえばタンパク質またはポリペプチドはコード産物であり、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸の最終産物であるアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡも同様である。コード産物はまた、非翻訳ｍＲＮＡであり得る。ポリペプチドとタンパク質という用語は、ここでは交換可能に使用される。ここで使用する、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび／または他の転写調節因子に結合する核酸、好ましくはＤＮＡを意味することが意図されている。いかなるプロモーターとも同様に、本発明のプロモーターは、プロモーターに作動可能に連結された核酸分子からｍＲＮＡ分子を生成するためにＤＮＡまたはＲＮＡの転写を促進するまたは制御する。ＲＮＡは、タンパク質またはポリペプチドをコードし得るか、またはＲＮＡ干渉分子またはアンチセンス分子をコードし得る。ここで使用する、「作動可能に連結された」は、プロモーター−核酸配列の組合せが、核酸配列がＲＮＡセグメントに転写されるために適切な方向で形成されるような、化学融合、連結またはＤＮＡの合成を指すことが意図されている。本発明のプロモーターはまた、生じるｍＲＮＡ転写産物の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の一部または全部を含み得る。他方で、本発明のプロモーターは、必ずしも５’ＵＴＲのいずれかを有する必要はない。
【０１６８】
ここで使用する、プロモーターは、調節エレメントを含み得る。逆に、調節エレメントはプロモーターから離れていてもよい。調節エレメントはプロモーター領域に多くの重要な特徴を与える。一部のエレメントは、作動可能に連結された核酸の転写速度を高める転写因子に結合する。別のエレメントは、転写活性を阻害するリプレッサーに結合する。プロモーター活性への転写因子の作用は、プロモーター活性が高いか低いか、すなわちプロモーターが「強い」か「弱い」かを決定し得る。
【０１６９】
もう１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド配列を発現するために構成的プロモーターを使用し得る。
【０１７０】
もう１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド配列を発現するために様々な誘導的植物遺伝子プロモーターが使用できる。誘導的プロモーターは、環境、ホルモンまたは化学的シグナルに応答して遺伝子発現を調節する。ホルモン誘導的プロモーターの例は、オーキシン誘導的プロモーター（Ｂａｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １１：３２３〜３３４（１９９９））、サイトカイニン誘導的プロモーター（Ｇｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：７４３〜７５３（１９９８））、およびジベレリン応答性プロモーター（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：１０５３〜１０６０（１９９８））を含む。加えて、熱、光、創傷、病原体耐性、およびジャスモン酸メチルまたはサリチル酸などの化学物質に応答性のプロモーターが、本発明のポリヌクレオチド配列を発現するために使用し得る。
【０１７１】
１つの実施形態では、プロモーターは、顆粒結合デンプンシンターゼプロモーター、ジャガイモＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ遺伝子プロモーター、またはフラボノイド３’−モノオキシゲナーゼ遺伝子プロモーターである。もう１つの実施形態では、プロモーターは種子特異的プロモーターである。
【０１７２】
本発明はまた、開示配列と異なるが、遺伝暗号の縮重の結果として、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるものと同じポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。したがって、保存的置換の結果として、配列番号１、２、３、４、９、１０、１４、１５、２３、２４または２５に示すポリヌクレオチド配列；またはそれらの配列の相補配列、逆配列または逆相補配列と異なる配列を含むポリヌクレオチドは、本発明によって考慮され、本発明に包含される。加えて、合計で総配列長の１０％未満の欠失および／または挿入の結果として、配列番号１、２、３、４、９、１０、１４、１５、２３、２４または２５に示すポリヌクレオチド配列、またはそれらの配列の相補配列、逆配列または逆相補配列と異なる配列を含むポリヌクレオチドも、本発明によって考慮され、本発明に包含される。
【０１７３】
本発明のポリヌクレオチド配列に対して規定のパーセンテージ同一性を有することに加えて、変異体ポリヌクレオチドは、好ましくは本発明のポリヌクレオチドと共通する付加的な構造および／または機能的特徴を有する。本発明のポリヌクレオチドと一次構造において高度の類似性を共有することに加えて、本発明のポリヌクレオチドに規定の程度の同一性を有するまたは本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、好ましくは以下の特徴の少なくとも１つを有する。（ｉ）本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと実質的に同じ機能的性質を有するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームまたは部分的オープンリーディングフレームを含む；または（ｉｉ）共通のドメインを有する。
【０１７４】
（エレメントおよびＤＮＡ配列のソース）
ここで述べるエレメントおよびＤＮＡ配列のいずれかまたは全部は、１以上の植物ゲノムに内因性であり得る。従って、本発明の１つの特定実施形態では、最終的な転移カセットのために選択されるエレメントおよびＤＮＡ配列のすべてが、形質転換しようとする植物のゲノムに内因性であるまたは天然である。たとえば配列のすべてがジャガイモゲノムに由来し得る。あるいは、エレメントまたはＤＮＡ配列の１以上は、形質転換しようとする植物の種と同じではないが、宿主植物細胞における何らかの事象において機能する植物ゲノムに内因性であり得る。そのような植物は、ジャガイモ、トマトおよびアルファルファ植物を含む。本発明はまた、形質転換しようとする植物と異系交配できる植物からの１以上の遺伝因子の使用を包含する。
【０１７５】
これに関して、本発明の「植物」は、ジャガイモ、トマト、アルファルファ、テンサイ、キャッサバ、サツマイモ、ダイズ、エンドウマメ、マメ、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギおよびモロコシを含むが、これらに限定されない。「植物」および「植物材料」はまた、植物細胞、種子、植物後代、有性生殖または無性生殖によって生成される珠芽、および挿し木または種子などの、これらのいずれかの子孫を包含する。「植物材料」は、植物細胞、細胞懸濁培養、カルス、胚、分裂領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉、種子、発芽実生および小胞子を意味し得る。植物は、成熟の様々な段階であり得、液体または固体培養中で、あるいは土壌中または鉢内の適切な媒質中で、温室または圃場で生育し得る。植物における導入されたリーダー、トレーラーまたは遺伝子配列の発現は一過性または恒久的であり得る。
【０１７６】
（核酸構築物）
本発明は、本発明の単離核酸分子およびポリペプチド配列を含む構築物を提供する。１つの実施形態では、本発明のＤＮＡ構築物は、Ａ．ツメファシエンスに由来するＴｉプラスミドである。
【０１７７】
本発明の核酸構築物を作製するとき、構築物の様々な成分またはそれらのフラグメントは、通常、好都合なクローニングベクター、たとえば細菌宿主、たとえば大腸菌において複製することができるプラスミドに挿入され得る。文献において記述されている数多くのベクターが存在し、それらの多くは市販されている。各々のクローニング後、所望挿入物を含むクローニングベクターを単離し、所望配列の成分に適合させるために、制限消化、新しいフラグメントまたはヌクレオチドの挿入、連結、欠失、突然変異、切り出し等のようなさらなる操作に供し得る。ひとたび構築物が完成されれば、宿主細胞の形質転換の様式に従ってさらなる操作のために適切なベクターに移入することができる。
【０１７８】
本発明の組換えＤＮＡ分子は、典型的には、形質転換した細胞を非形質転換細胞から容易に同定し、選択することができるように選択マーカーを含む。そのようなマーカーの例は、カナマイシン耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１８３〜１８８（１９８５））を含むが、これに限定されない。ｎｐｔＩＩ遺伝子を発言する細胞は、カナマイシンまたはＧ４１８などの適切な抗生物質を使用して選択できる。他の一般的に使用される選択マーカーは、バイアラホス耐性を与えるバー遺伝子（ｂａｒ  ｇｅｎｅ）、グリホセート耐性を与える突然変異型ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子（Ｈｉｎｃｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９１５〜９２２（１９８８））、およびイミダゾリノンまたはスルホニル尿素耐性を与える突然変異型アセトラクテートシンターゼ遺伝子（欧州特許出願第１５４，２０４号、１９８５）を含む。
【０１７９】
加えて、ベクターは、特定宿主細胞のための複製起点（レプリコン）を含み得る。様々な真核生物レプリコンが当業者に公知であり、真核宿主細胞において組換え分子の自律複製と維持を指令するように機能する。
【０１８０】
本発明はまた、本発明のＤＮＡ構築物を含む宿主細胞を提供する。ここで使用するとき、宿主細胞は、コード産物が最終的に発現される細胞を指す。従って、宿主細胞は、個々の細胞、細胞培養または生物の一部としての細胞であり得る。宿主細胞はまた、胚、内乳、精子または卵細胞、または受精卵の一部であり得る。
【０１８１】
従って、本発明はまた、本発明のＤＮＡ構築物を含む植物または植物細胞を提供する。好ましくは、植物は被子植物または裸子植物である。本発明の発現構築物は、単子葉植物（たとえばコムギ、芝草、トウモロコシ、イネ、エンバク、コムギ、オオムギ、モロコシ、ラン、アイリス、ユリ、タマネギ、バナナ、サトウキビおよびヤシ）、双子葉植物（たとえばシロイヌナズナ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アボカド、コショウ、テンサイ、ブロッコリー、キャッサバ、サツマイモ、綿、ポインセチア、マメ科植物（ｌｅｇｕｍｅ）、アルファルファ、ダイズ、エンドウマメ、マメ、キュウリ、ブドウ、アブラナ、ニンジン、イチゴ、レタス、オーク、カエデ、クルミ、バラ、ミント、カボチャ、ヒナギク、およびサボテン、オーク、ユーカリ、カエデ）、および裸子植物（たとえばオウシュウアカマツ；Ａｒｏｎｅｎ，Ｆｉｎｎｉｓｈ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｒｅｓ．Ｐａｐｅｒｓ，Ｖｏｌ．５９５，１９９６参照）、ホワイトスプルース（Ｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：８４〜８９，１９９３）、およびカラマツ（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  ２７：２０１〜２０７，１９９１）の様々な植物を形質転換するために使用し得る。
【０１８２】
（植物形質転換および再生）
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、組換え配列を標的宿主細胞に導入するための当分野において公知の標準手法によって宿主植物細胞に導入し得る。そのような手順は、トランスフェクション、感染、形質転換、自然取込み、電気穿孔、バイオリスティクスおよびアグロバクテリウム法を含むが、これらに限定されない。生物学的および物理的植物形質転換プロトコールを含む、外来遺伝子を植物に導入するための方法は、当分野において公知であり、本発明の構築物を植物宿主に挿入するために使用できる。たとえばＭｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，「Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ」，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ｐａｇｅｓ  ６７〜８８参照。選択される方法は宿主植物によって異なり、リン酸カルシウム法などの化学的トランスフェクション法、アグロバクテリウムなどの微生物を介した遺伝子導入（Ｈｏｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１２２９〜３１，１９８５）、電気穿孔法、微量注入法、およびバイオリステイックガン法を含む。好ましい形質転換法は、精密育種（ｐｒｅｃｉｓｅ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ）（米国特許出願第２００３／０２２１２１３  Ａ１号、同第２００４／０１０７４５５  Ａ１号および同第２００５／０２２９２６７  Ａ１号参照）および改良形質転換（ｒｅｆｉｎｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（米国特許出願第２００５／００３４１８８  Ａ１号参照）を含む。
【０１８３】
従って、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む植物または植物細胞を提供する。１つの実施形態では、植物は被子植物または裸子植物である。通常の植物の意味を超えて、「植物」という用語はまた、植物の果実、種子、花、球花（円錐体、ｓｔｒｏｂｉｌｕｓ）等を意味することが意図されている。本発明の植物は、ベクターがアグロバクテリウムなどを通して植物に直接導入されたことを意味する、直接形質転換体であり得るか、または植物は、トランスフェクトされた植物の子孫であり得る。子孫はまた、トランスフェクトされた植物の無性生殖によっても得られ得る。第二世代またはそれ以後の世代の植物は、有性生殖、すなわち受精によって生成されてもよく、またはそれによって生成されなくてもよい。さらに、植物は配偶体（単相）または胞子体（複相）であり得る。
【０１８４】
これに関して、本発明は、遺伝的に植物を起源とする１以上の形質転換因子で植物を形質転換することを考慮する。本発明は、植物にとって天然である形質転換因子だけが形質転換を通して最終的に所望植物に組み込まれる、形質転換のための「全天然（ａｌｌ−ｎａｔｉｖｅ）」アプローチを包含する。これに関して、本発明は、特定植物種をその植物種にとって天然である遺伝的形質転換因子だけで形質転換することを包含する。天然アプローチはまた、特定形質転換因子が、形質転換しようとする同じ植物、同じ植物種、または形質転換しようとする植物と有性的に異系交配できる植物から単離されることを意味し得る。
【０１８５】
他方で、形質転換しようとする植物は、異なる種の植物を起源とする１以上の遺伝因子および配列を含む形質転換カセットで形質転換され得る。たとえば、トマトまたはコショウ植物を形質転換するための形質転換カセットまたはプラスミドにおいてジャガイモゲノムに天然である切断部位を使用することは望ましいと考えられる。
【０１８６】
本発明は、しかしながら、天然または全天然アプローチに限定されない。本発明の形質転換カセットまたはプラスミドはまた、細菌種からなどの、他の生物からの配列および因子を含むことができる。
【０１８７】
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態の代表として示すものである。これらの実施例は、いかなる意味においても本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本発明の精神と範囲内にとどまりつつ、多くの変更および修正を行い得ることが理解されるべきである。
【実施例１】
【０１８８】
（アスパラギンシンテターゼ遺伝子の下方制御発現）
この実施例は、作物のデンプン質組織におけるアスパラギン生合成に関与する遺伝子の下方制御された発現が、これらのデンプン質組織中のアスパラギンの量を低下させ、その結果、これらのデンプン質組織を加熱することから得られる食品中のアクリルアミドの量を低下させることを明らかにする。
【０１８９】
ジャガイモアスパラギンシンテターゼ１（Ａｓｔ１）遺伝子の配列を配列番号１に示す。ジャガイモアスパラギンシンテターゼ２（Ａｓｔ２）遺伝子の部分配列を配列番号２に示す。
【０１９０】
配列番号３および４に示す、これらの遺伝子のフラグメントを連結して、配列番号５を作製した。生じたＤＮＡセグメント２コピーを、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（Ａｇｐ）と顆粒結合デンプンシンターゼ（Ｇｂｓｓ）遺伝子の収束的方向のプロモーター（それぞれ配列番号７および８）の間に、逆反復配列としておよび配列番号６に示すスペーサーによって分離して、挿入した。
【０１９１】
生じたサイレンシング構築物を、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）選択マーカー遺伝子のための発現カセットに既に含まれているＴ−ＤＮＡの境界の間に挿入した。
【０１９２】
ｐＳＩＭ１１４８（図１Ａ）と命名した、このＴ−ＤＮＡを担持するバイナリーベクターを、以下のようにアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４に導入した。コンピテントＬＢ４４０４細胞（５０μＬ）を、ベクターＤＮＡ１μｇの存在下で氷上にて５分間インキュベートし、液体窒素中で約１５秒間凍結し、３７℃で５分間インキュベートする。液体ブロス１ｍＬを添加した後、処理した細胞を２８℃で３時間増殖させ、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびカナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）を含む液体ブロス／寒天上に塗布した。次にベクターＤＮＡを、個々のＬＢＡ４４０４コロニーの一晩培養物から単離し、無傷のプラスミドＤＮＡの存在を確認するため制限分析によって検査した。
【０１９３】
一晩増殖させたアグロバクテリウム培養物の１０倍希釈を５〜６時間増殖させ、２，８００ＲＰＭで１５分間沈殿させて、スクロース（３％、ｐＨ５．７）を添加したＭＳ液体培地（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で洗い、同じ培地に０．２ＯＤ／６００ｎｍで再懸濁した。再懸濁した細胞を混合し、ジャガイモ品種「Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔ」の０．４〜０．６ｍｍの節間セグメントに感染させるために使用した。
【０１９４】
感染茎部を、Ｐｅｒｃｉｖａｌ増殖チェンバー（１６時間照明）内で２２℃にて、６ｇ／Ｌ寒天を含む共培養培地（１／１０ＭＳ塩、３％スクロース、ｐＨ５．７）で２日間インキュベートし、その後、チメンチン（ｔｉｍｅｎｔｉｎ）（１５０ｍｇ／Ｌ）およびカナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）を含むカルス誘導培地（ＣＩＭ、３％スクロース、２．５ｍｇ／Ｌのゼアチンリボシド、０．１ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸、および６ｇ／Ｌの寒天を添加したＭＳ培地）に移した。ＣＩＭでの１ヶ月の培養後、外植片を、シュートが生じるまでチメンチンとカナマイシン（それぞれ１５０および１００ｍｇ／Ｌ）を含むシュート誘導培地（ＳＩＭ、３％スクロース、２．５ｍｇ／Ｌのゼアチンリボシド、０．３ｍｇ／Ｌのジベレリン酸ＧＡ３、および６ｇ／Ｌの寒天を添加したＭＳ培地）に移した。再生期間の最後に生じたシュートを、３％スクロース、６ｇ／Ｌ寒天およびチメンチン（１５０ｍｇ／Ｌ）を添加したＭＳ培地に移した。トランスジェニック植物を土壌に移し、温室に置いた。
【０１９５】
３ヵ月後、塊茎を採集し、Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ（２００２），１７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＡＯＡＣ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ９８２．３０に従ってアスパラギンレベルを分析した。この分析は、２６のｐＳＩＭ１１４８植物のうち１７が、対照植物中に存在するアスパラギンの約２５％〜５０％のアスパラギンしか含まないことを明らかにした（表１）。
【０１９６】
低アスパラギン植物の一部からの塊茎を切り取り、湯通しして、パーフライ処理し（ｐａｒ−ｆｒｉｅｄ）、フライドポテトを生産するために仕上げフライした。これらのフライドポテトを液体窒素中で微粉末に粉砕し、ドライアイス上でＣｏｖａｎｃｅ研究所に発送した。Ｃｏｖａｎｃｅにおいて、液体クロマトグラフィー／タンデム型質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）（米国食品医薬品局、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｆｏｏｄ  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  ＆  Ｄａｉｒｙ  Ｆｏｏｄｓ  ａｎｄ  Ｂｅｖｅｒａｇｅｓ，「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｉｎ  Ｆｏｏｄｓ」，２００２）を実施することによってアクリルアミドレベルを測定した。表２は、低アスパラギンｐＳＩＭ４８植物からのフライドポテトは、対照フライドポテト中で生成されるアクリルアミドの約３分の１未満しか蓄積しないことを示す。
【０１９７】
ＡｇｐおよびＧｂｓｓプロモーターを調節因子と使用する代わりに、２つのＧｂｓｓプロモーターを用いることも可能である。２つのＧｂｓｓプロモーターの間に挿入されたＡｓｔ１およびＡｓｔ２遺伝子フラグメントを含む逆反復配列を含む構築物を、Ｔ−ＤＮＡ境界の間に導入してバイナリーベクターｐＳＩＭ１１５１（図１Ｂ）を作製した。このベクターを、ｐＳＩＭ１１４８について述べたのと同様にしてトランスジェニックジャガイモ系統を生成するために使用した。さらに、Ａｓｔ遺伝子由来配列をプロモーターとターミネーターの間に挿入することができる。
【０１９８】
いかなるＡｓｔ遺伝子についても、高度の配列類似性を有する他の配列が存在し得る。サイレンシング構築物を作製するためにそのような相同配列を使用することが可能である。たとえばトマトＡｓｔ遺伝子のフラグメントは、ジャガイモにおいて相同なＡｓｔ遺伝子を沈黙化するために使用し得る。
【０１９９】
植物由来のＡｓｔ遺伝子の同定後、この遺伝子のＰＣＲ増幅のために遺伝子特異的プライマーを設計する。ＰＣＲ増幅は、当分野で公知の方法に従って実施し、その後ＰＣＲ増幅されたアスパラギナーゼ遺伝子をクローニングベクターにクローニングする。
【０２００】
Ａｓｔ遺伝子は、データベースを検索するかまたは植物ＤＮＡから単離することによって同定できる。ジャガイモ以外の作物からのＡｓｔ遺伝子の一例は、配列番号３４および３５に示すコムギからのＡｓｔ遺伝子である。コムギ粒子におけるこれらの遺伝子の同時サイレンシングは、小麦粉中のアスパラギンレベルを低下させ、その結果、たとえばパン、ビスケット、クッキーまたはクラッカー中のアクリルアミドレベルを低下させることを可能にする。
【０２０１】
サイレンシング構築物の作製のためにＡｓｔ遺伝子フラグメントを使用する代わりに、Ａｓｔ遺伝子のプロモーターから得たフラグメントを用いることも可能である。そのようなプロモーターは、インバースＰＣＲなどの方法を適用することによって単離でき、２コピーの特異的１５０〜６００塩基対プロモーターフラグメントを、その後、プロモーターとターミネーターの間または２つの収束方向プロモーターの間に逆反復配列として挿入することができる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｏｍｍｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開公報第２００６／０３６７３９  Ａ２号参照）。
【実施例２】
【０２０２】
（アスパラギナーゼ遺伝子の過剰発現）
この実施例は、作物のデンプン質組織におけるアスパラギン代謝に関与する遺伝子の過剰発現がこれらのデンプン質組織中のアスパラギンの量を低下させ、その結果、これらのデンプン質組織を加熱することから得られる食品中のアクリルアミドの量を低下させることを明らかにする。
【０２０３】
ジャガイモ品種Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔからのジャガイモアスパラギナーゼ（Ａｓｇ１）遺伝子の配列を配列番号９に示す。対応するオープンリーディングフレームおよび予測アミノ酸配列をそれぞれ配列番号１０および１１に示す。ＡｇｐプロモーターとＵｂｉ３ターミネーター（配列番号１２）の間に挿入されたＡｓｇ１遺伝子を含むバイナリーベクターをｐＳＩＭ６５８（図１Ｃ）と命名する。
【０２０４】
塊茎におけるＡｓｇ１遺伝子の発現レベルを、定量的リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲを適用することによって測定した。表３は、２５のｐＳＩＭ６５８植物のうち１８の塊茎がＡｓｇ１遺伝子を約２〜２０倍過剰発現したことを示す。これらの塊茎を、フライドポテトを生産するために使用した。化学分析は、２つのトランスジェニック系統のフライドポテトが低いレベルのアクリルアミドを含むことを明らかにした（表４）。
【０２０５】
Ａｓｇ１遺伝子の発現を駆動するために他の塊茎特異的プロモーターを使用することも可能である。プラスミドｐＳＩＭ７５７は、Ａｓｇ１遺伝子に作動可能に連結されたＧｂｓｓプロモーターを含む。このプラスミドのトランスファーＤＮＡによるジャガイモの形質転換は、Ａｓｇ１遺伝子を過剰発現するカナマイシン耐性植物を生成する。ジャガイモ塊茎においてアスパラギナーゼ発現を駆動するために使用できる他のプロモーターは、パタチンプロモーター、低温誘導性プロモーター、およびフラボノイド３’−モノオキシゲナーゼ（Ｆｍｏ）プロモーターからなる群より選択できる。１つのＦｍｏプロモーターを配列番号１３に示す。このプロモーターは、半成熟および成熟塊茎において活性であるが、ミニ塊茎では活性でない。
【０２０６】
Ａｓｇ１遺伝子を使用する代わりに、他のアスパラギナーゼ遺伝子を利用することも可能である。配列番号１４は、選択的ジャガイモアスパラギナーゼＡｓｇ２遺伝子のｃＤＮＡ配列を示す。アスパラギナーゼ遺伝子の他の例は、大腸菌（アクセッション番号Ｚ１０５１ｍ；配列番号３１）、アグロバクテリウム（アクセッション番号Ａｔｕ３０４４；配列番号３２）、オオムギ（アクセッション番号ＡＦ３０８４７４；配列番号３３）のアスパラギナーゼ遺伝子、およびモチーフｐｆａｍ０１１１２．１２を有するタンパク質をコードする何らかの遺伝子（Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３，Ｄ  １９２〜６，２００５）を含む。
【０２０７】
コムギからのアスパラギナーゼ遺伝子の配列を配列番号１５に示す。予測アミノ酸配列を配列番号１６に示す。
【０２０８】
いかなるアスパラギナーゼ遺伝子についても、高度の配列類似性を有する他のアスパラギナーゼ配列が存在し得る。たとえば植物由来のアスパラギナーゼ遺伝子は、ＮＣＢＩによって保持されているようなデータベースを検索することによって同定し得る。
【０２０９】
植物由来のアスパラギナーゼ遺伝子の同定後、アスパラギナーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅のために遺伝子特異的プライマーを設計する。ＰＣＲ増幅は、当分野で公知の方法に従って実施し、その後ＰＣＲ増幅されたアスパラギナーゼ遺伝子をクローニングベクターにクローニングする。
【０２１０】
アスパラギナーゼを、配列番号１７に示すピューロインドリン遺伝子プロモーターなどの種子特異的プロモーターに作動可能に連結する。生じた発現カセットを含むトランスファーＤＮＡを、低アスパラギンコムギの生産のために従来の形質転換法を用いて導入する。このコムギ種子に由来する小麦粉は、加熱の間により少ないアクリルアミドを蓄積する。
【実施例３】
【０２１１】
（グルタミンシンテターゼの過剰発現）
グルタミンシンテターゼ遺伝子の過剰発現はアスパラギンのレベル低下を生じさせる。グルタミンシンテターゼ活性を有するタンパク質をコードするいかなる配列も、ジャガイモ塊茎などの所望植物器官において発現されるプロモーターに作動可能に連結することができる。ジャガイモは、配列番号２８〜３０に示す３つの関連グルタミンシンテターゼ遺伝子を含む。これらの遺伝子の各々のフラグメントを含むＤＮＡセグメントは、グルタミンシンテターゼ活性を有効に下方制御するために使用できる。このために、セグメントの少なくとも１コピーを２つの収束性プロモーターの間またはプロモーターとターミネーターの間に挿入することができる。生じた発現カセットを、何らかの形質転換法を使用することによって対象とする植物に導入できる。その後、低アスパラギン植物器官を生産するトランスジェニック植物を選択することができる。これらの植物器官の加熱処理は、対応物から得られる製品よりも低いアクリルアミドを含有する製品を提供する。たとえば加工されたトランスジェニック塊茎は、非形質転換塊茎から得られるフライドポテトよりも低いアクリルアミドレベルを含むフライドポテトを生成する。アスパラギンレベルに関するグルタミンシンテターゼ過剰発現の結果は、Ｈａｒｒｉｓｏｎと共同研究者達によって（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３３：２５２〜２６２，２００３）記述されている。しかし、これらの著者達は、加熱が誘導するアクリルアミド蓄積の強力な低下への低アスパラギンレベルの意外な影響を予測できなかった。
【０２１２】
同様に、硝酸レダクターゼ活性を示す内因性遺伝子の発現を下方制御することが可能である。このために、硝酸レダクターゼ遺伝子の一部またはそのプロモーターの少なくとも１コピーを発現させることができる。トランスジェニック植物を硝酸レダクターゼ発現レベルに関してスクリーニングし、低レベルを示す系統を、その後、低アスパラギンレベルに関してスクリーニングすることができる。また、ヘキソースキナーゼ遺伝子を沈黙化し、アスパラギンレベルを低下させつつアスパラギン酸レベルを上昇させることも可能である。硝酸レダクターゼおよびヘキソキナーゼ遺伝子のいずれかの過剰発現と高いアスパラギンレベルの間の相関が以前に記述されている（Ｒｏｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ  ５７：６７５〜７０９，２００６；Ｓｚｏｐａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ  ３０：４０５〜４１０，２００２）。しかし、著者らは、最終的に食品においてアクリルアミドレベルを低下させるための反対のアプローチを予想しなかった。
【０２１３】
明らかに、アスパラギンの合成または代謝に直接または間接的に関与する遺伝子の発現を変化させることによって植物におけるアスパラギンレベルを調節するための他の戦略が存在する。我々の結果は、これらの方法のいずれもが低アクリルアミド食品を生産するために使用できることを示唆する。
【実施例４】
【０２１４】
（デンプン分解遺伝子とアスパラギン生合成遺伝子の同時下方制御発現）
この実施例は、作物のデンプン質組織においてそれぞれデンプン分解とアスパラギン生合成に関与する遺伝子の同時下方制御発現が、これらのデンプン質組織を加熱することから得られる食品中のアクリルアミド蓄積を低下させ得ることを明らかにする。
【０２１５】
低レベルの還元糖とアスパラギンを含む塊茎を生産するトランスジェニック植物を２工程で作製した。最初に、植物をバイナリーベクターｐＳＩＭ３７１のＰ−ＤＮＡで形質転換した。このＰ−ＤＮＡは、ＧｂｓｓプロモーターとＵｂｉ３ターミネーターの間に逆反復配列として挿入された、ＰＰＯ（配列番号１８）、Ｒ１（配列番号１９）、およびｐｈＬ（配列番号２０）遺伝子のフラグメントを含むポリヌクレオチドの２コピーを含む。
【０２１６】
ｐＳＩＭ３７１と、Ｔ−ＤＮＡ境界の間に挿入されたｎｐｔＩＩおよびｃｏｄＡ遺伝子の両方についての発現カセットを含むＬｉｆｅＳｕｐｐｏｒｔベクターｐＳＩＭ３６８の両方を担持するアグロバクテリウム菌株を、２１，９００のジャガイモ茎外植片を感染させるために使用した。２日間の共培養期間後、一過性ｎｐｔＩＩ遺伝子発現に関して選択するために感染外植片を５日間カナマイシンに供した。安定に組み込まれたＴ−ＤＮＡを含む細胞の増殖を防ぐため、外植片を、その後、５−フルオロシトシン（５ＦＣ）を含む培地に移した。この化学物質は、ｃｏｄＡ遺伝子産物によって毒性の５−フルオロウラシル（５ＦＵ）に変換される（Ｐｅｒｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。二重選択で生き残った合計３，８２２のシュートを、Ｐ−ＤＮＡの存在、およびＴ−ＤＮＡまたはプラスミドバックボーンのいずれかからの何らかの外来性ＤＮＡの不在に関して遺伝子分類した。この分析は２５６の全天然ＤＮＡ（遺伝子内（ｉｎｔｒａｇｅｎｉｃ））シュートを同定し、それらを発根させて、土壌に定植し、生育チェンバーにおいて６週間成長させた。ＰＰＯ活性に関してスクリーニングするため、採集した〜２ｃｍミニ塊茎の切断面にカテコール溶液をピペットで分注した。カテコール誘導の塊茎褐変が阻止された４８系統を、半成熟塊茎を生産するために温室で３ヶ月間成長させ、ＰＰＯ活性の残留レベルに関して生化学的に評価した。この分析は、ＰＰＯ遺伝子サイレンシング構築物の使用がＰＰＯ活性を約９０％低下させることを明らかにした。４８の遺伝子内系統と非形質転換Ｒａｎｇｅｒ  ＲｕｓｓｅｔおよびＲｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照植物の両方を、その後、Ｉｄａｈｏ，Ａｂｅｒｄｅｅｎの圃場で繁殖させ、成長させた。
【０２１７】
すべての遺伝子内および対照系統の成熟塊茎を、３ヶ月間および６ヶ月間の低温貯蔵後にグルコースレベルに関して分析した。大部分の系統（４３）は、デンプン関連遺伝子の１つだけを沈黙化させておいた対照系統で得られるよりも大きな低温誘導性甘味化の低下（〜６０％）を示した。植物３７１−２８および３７１−３８の沈黙化塊茎に由来するフライドポテトは、対照フライドポテト中に蓄積した神経毒アクリルアミドの３分の１未満を含んだ（表４）。アクリルアミドは主として還元糖のカルボニル基とアスパラギンの間の加熱誘導性反応に由来するので、そのような低下は予想された（Ｍｏｔｔｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｓｔａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０２１８】
改変フライドポテトの感覚特性を、８名の専門訓練を受けた個人の委員会によって評価した。改変Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔの塊茎に由来するフライドポテトは、Ｒａｎｇｅｒ  ＲｕｓｓｅｔまたはＲｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋのいずれかからのフライドポテトよりも良好な視覚的外観を示した。さらに、遺伝子内フライドポテトは、鼻腔蓋に位置する嗅上皮によって察知される有意により良好な全体的香気を示した。同様の傾向が、４℃で１０週間貯蔵しておいた塊茎に関しても認められた。実際に、低温貯蔵した遺伝子内系統３７１−２８、３０、３８および６８は、まだ新鮮非形質転換品種の感覚属性に合致するかまたはそれを超えていた。
【０２１９】
１つの低糖ジャガイモ系統をｐＳＩＭ１１４８で再形質転換した。もとのｐＳＩＭ１１４８植物からのフライドポテトと比較して、カナマイシン耐性二重形質転換体からのフライドポテトは、一般にさらに低レベルのアクリルアミドを示す。したがって、二重形質転換体は、（ｉ）低レベルのアクリルアミドを含み、および（ｉｉ）高い感覚特性を示す、フライドポテトを得るために使用できる塊茎を生産する。
【実施例５】
【０２２０】
（ジャガイモ塊茎においてアスパラギンレベルおよび低温誘導甘味化の両方を低下させるための全天然ＤＮＡ形質転換法）
この実施例は、ジャガイモ塊茎においてアスパラギンレベルおよび低温誘導甘味化の両方を低下させるための全天然ＤＮＡ形質転換法の使用を述べる。これらの塊茎から得られる加工食品は低レベルのアクリルアミドを含む。
【０２２１】
形質転換のために使用するトランスファーＤＮＡは、ジャガイモ由来境界領域の間に挿入された２つの発現カセットを含み、配列番号２３に示されている（図２）。最初のカセットは、Ａｇｐ遺伝子の機能的に活性なプロモーターとユビキチン−３遺伝子のターミネーターの間に逆反復配列として挿入された、Ｐｐｏ（配列番号２４）、ＰｈＬ（配列番号２５）およびＲ１（配列番号２６）遺伝子のプロモーターフラグメントを含むＤＮＡセグメントの２コピーを含む。２番目のカセットは、Ｇｂｓｓ遺伝子の２つの機能的に活性な、収束方向のプロモーターの間に逆反復配列として挿入されたＡｓｔ１、Ａｓｔ２およびＰｐｏ（配列番号２７）遺伝子のフラグメントを含むＤＮＡセグメントの２コピーを含む。
【０２２２】
トランスファーＤＮＡおよびアグロバクテリウムイソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子のための発現カセットの両方を含むプラスミドをアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４に導入し、生じた菌株を、マーカーフリー形質転換法（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｒａｉｇ  Ｒｉｃｈａｅｌ，「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ  ａｎｄ  ｂａｃｋｂｏｎｅ−ｆｒｅｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｂｉｎａｒｙ  ａｐｐｒｏａｃｈ」，仮出願番号第６０／７６５，１７７号参照）を使用することにより、Ｒａｎｇｅｒ  ＲｕｓｓｅｔおよびＡｔｌａｎｔｉｃなどのジャガイモ品種を形質転換するために使用する。矮化成長および発根不能などを典型とするサイトカイン表現型を示さない形質転換植物に塊茎を生成させる。これらの系統の一部の塊茎は、５０ｍＭカテコール０．５ｍＬを新鮮切断塊茎表面にピペットで分注することによって試験できるように、低レベルのＰｐｏ酵素活性を示す。Ｐｐｏ酵素活性のレベルは、粉砕した塊茎（１ｇ）をｐＨ６．５の５０ｍＭ  ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液（５ｍＬ）中で１時間混合することによってより正確に測定できる。固体分画の沈殿後、ＯＤ４１０の変化を経時的に測定できる。２５％未満のＰｐｏ酵素活性を含む塊茎の系統を、約４℃で塊茎をインキュベートすることによってさらに試験する。少なくとも１ヵ月後、グルコースレベルを、たとえばグルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ試薬（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を使用することによって測定できる。＞７５％低いｐｐｏ活性レベルおよび＞５０％低い低温誘導性甘味化の両方を示す塊茎の系統を、遊離アスパラギンレベルに関して分析することができる。遊離アスパラギンレベルが約＞５０％低下していれば、塊茎を加工し、アクリルアミドレベルに関して分析することができる。低いＰｐｏおよび低い低温誘導性甘味化に加えて、低アスパラギンレベルを含む形質転換系統は、大量生産（ｂｕｌｋ−ｕｐ）および商業生産のために考慮することができる。好ましい系統の塊茎由来のフライドポテトはより少ない還元糖を含み、したがって漂白時間を短縮し、もとのジャガイモの風味を保つことを可能にする。さらに、糖端（ｓｕｇａｒ  ｅｎｄｓ）および黒点変色がないことによりそれらの視覚的魅力が高められる。フライドポテトはまた、フライドポテトを感覚特性に関して評価するための訓練を受けた感覚委員会によって測定され得るように、より良好な香気を有し、低レベルのアクリルアミドを蓄積する。
【実施例６】
【０２２３】
（ＴＩＬＬＩＮＧ法）
アスパラギンシンテターゼなどのアスパラギンの生合成に関与する遺伝子も、それらを突然変異させることによって発現を下方制御することができる。この目的を達成するための１つの方法は「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ＩＮ  Ｇｅｎｏｍｅｓ」（ＴＩＬＬＩＮＧ法）と称される。この方法は、ヘテロ二本鎖分析によって塩基対変化を検出する変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）の能力とメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）誘導の突然変異誘発の効率を組み合わせる。この方法は、広範囲の突然変異型対立遺伝子を生成し、迅速で自動化可能であり、化学的に突然変異誘発できる任意の生物に適用し得る。基本的ＴＩＬＬＩＮＧ法では、ＥＭＳで処理することによって種子を突然変異誘発する。生じたＭ１植物を自家受精させ、Ｍ２世代の個体を、それらの種子を保管する一方で、突然変異スクリーニングのためのＤＮＡ試料を調製するために使用する。ＤＮＡ試料をプールし、プールをマイクロタイタープレートに整列し、遺伝子特異的ＰＣＲに供する（ＭｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８：４５５〜４５７）。
【０２２４】
ＴＩＬＬＩＮＧには様々な代替法がある。たとえば高速中性子またはジエポキシブタン（ＤＥＢ）などの異なる種類の突然変異原を用いることが可能である。これらの方法はすべて、あらかじめ選択された遺伝子についての突然変異体のスクリーニングと単離を可能にする逆遺伝学プラットフォームと結合することができる。方法は、たとえばＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｌｏｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，  Ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ，２００６，Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓの中で詳細に述べられている。
【０２２５】
さらに、単に入手可能な生殖質を低アスパラギン表現型に関してスクリーニングすることが可能である。したがって、植物分子育種、突然変異育種、および系統選択はすべて、「低アスパラギン」品種を得ることを可能にする方法を提供する。
【実施例７】
【０２２６】
（アスパラギンレベルの低下）
アスパラギンレベルはまた、栽培者の慣行を変化させることによっても低減できる。たとえばアスパラギンシンテターゼ遺伝子は炭素によって抑制される（Ｋｏｃｈ  ＫＥ．Ｃａｒｂｏｎｈｙｄｒａｔｅ−ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４７：５０９〜５４０，１９９６）。また、土壌中の窒素／硫黄比を低下させることによってアスパラギン蓄積を低減することも可能である。相対的に低い窒素レベルは、低濃度のＮに富む化合物および、システイン、グルタチオンおよびＳ−アデノシルメチオニンなどのＳ含有代謝産物の上昇を生じさせる。したがって、比較的高いＣ、高いＳ、および低いＮを含む土壌は、比較的低いアスパラギンを含む食品を生産するために使用できる。
【０２２７】
【表１】
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【０２２８】
【表２】
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【０２２９】
【表３】
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【０２３０】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０２３１】
【図１】（Ａ）ｐＳＩＭ１１４８、（Ｂ）ｐＳＩＭ１１５１および（Ｃ）ｐＳＩＭ６５８を示す図である。ＬＢ＝左側Ｔ−ＤＮＡ境界、Ｐ：Ａｇｐ＝ジャガイモＡｇｐプロモーター、２ａ＝ａｓｔ２遺伝子フラグメントのアンチセンスコピー、１ａ＝ａｓｔ１遺伝子フラグメントのアンチセンスコピー、１ｂ＝ａｓｔ１遺伝子フラグメントのセンスコピー、２ｂ＝ａｓｔ２遺伝子フラグメントのセンスコピー、Ｐ：Ｇｂｓｓ＝ジャガイモＧｂｓｓプロモーター、Ｔ：ｎｏｓ＝アグロバクテリウム菌のノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーター、Ｐ：ｎｏｓ＝アグロバクテリウム菌のノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター、ＲＢ＝右側Ｔ−ＤＮＡ境界、Ｐ：Ｕｂｉ７＝ジャガイモユビキチン−７遺伝子のプロモーター。
【図２】Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｏｉｓｅ構築物を示す図である。ＰＦ＝プロモーターフラグメント、ＧＦ＝遺伝子フラグメント。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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