(57)【要約】   脳アミロイドアンギオパチーは、学習及び記憶に必要とされるタンパク質合成を障害し、及び虚血損傷の閾値を低下させることができる動脈血流の減少を介してアルツハイマー認知症に関与する。アルツハイマー病（ＡＤ）に苦しめられている又は発生のリスクを有する対象において上昇した血清応答因子（ＳＲＦ）又はミオカルディン（ＭＹＯＣＤ）活性は、脳動脈の「血管平滑筋細胞」（ＶＳＭＣ）過収縮表現型を促進し、及び血管壁におけるＡβの蓄積を増強する。順に、このことはＡＤにおいて普通に見られる脳動脈低灌流及び神経血管脱共役を起こし得る脳動脈での疾患プロセスを開始し得る。それ故、ＳＲＦ及びＭＹＯＣＤは、ＡＤにおける認知機能低下に関連する動脈機能障害を治療するための新たな標的となっている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病の過収縮表現型を治療する方法であって、患者の血管系の少なくとも一つの細胞における血清応答因子（ＳＲＦ）及び／又はミオカルディン（ＭＹＯＣＤ）調節遺伝子発現を減少させることを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
アンチセンス阻害が該減少を起こす、請求項１の方法。
【請求項３】
該アンチセンス阻害が、オリゴヌクレオチド又は該オリゴヌクレオチドを産生する発現構築物、及び生理学的に許容できるビヒクルを含んでなる、パイロジェンフリー組成物により仲介される、請求項２の方法。
【請求項４】
ＲＮＡ干渉が該減少を起こす、請求項１の方法。
【請求項５】
該ＲＮＡ干渉が、ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ前駆体を産生する発現構築物、及び生理学的に許容できるビヒクルを含んでなるパイロジェンフリー組成物により仲介される、請求項４の方法。
【請求項６】
ＳＲＦ及び／又はＭＹＯＣＤトランスドミナント干渉が該減少を起こす、請求項１の方法。
【請求項７】
該トランスドミナント干渉が、ドミナントネガティブＳＲＦ及び／又はＭＹＯＣＤ突然変異体を産生する発現構築物、及び生理学的に許容できるビヒクルを含んでなるパイロジェンフリー組成物により仲介される、請求項６の方法。
【請求項８】
一つ又はそれより多くの収縮タンパク質の細胞中の発現が減少する、請求項１〜７のいずれか一項の方法。
【請求項９】
血流が増加する、請求項１〜７のいずれか一項の方法。
【請求項１０】
治療がインビボで実施される、請求項１〜７のいずれか一項の方法。
【請求項１１】
治療がエキソビボで実施され、そして該細胞が次ぎに移植される、請求項１〜７のいずれか一項の方法。
【請求項１２】
該細胞が平滑筋細胞である、請求項１〜７のいずれか一項の方法。
【請求項１３】
対象におけるアルツハイマー病を診断する方法であって：
（ａ）該対象から体液又は組織のサンプルを提供すること、
（ｂ）転写、翻訳又はタンパク質活性のレベルでＳＲＦ又はＭＹＯＣＤ発現を決定すること、及び
（ｃ）アルツハイマー病の存在又は発生についてのリスクファクターとして増加したＳＲＦ又はＭＹＯＣＤ発現を同定すること、
を含んでなる、前記方法。
【請求項１４】
追加のリスクファクターとして、血管過収縮性を同定することをさらに含んでなる、請求項１３の方法。
【請求項１５】
追加のリスクファクターとして、減弱された血管拡張又は血管収縮薬への増強された応答を同定することをさらに含んでなる、請求項１３又は１４の方法。
【請求項１６】
追加のリスクファクターとして、アミロイドアンギオパチー又は減少した血流を同定することをさらに含んでなる、請求項１３〜１５のいずれか一項の方法。
【請求項１７】
アルツハイマー病を治療する医薬の製造のための、平滑筋細胞中のＳＲＦ及び／又はＭＹＯＣＤ調節遺伝子発現の阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００５年１１月１４日に出願された米国仮出願番号60/735,965の優先権を主張する。
【０００２】
政府援助研究又は開発
米国保健福祉省からのＮＩＨ助成金AG023084又はAG023993 の条件により規定されているように、米国政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
背景技術
本発明は、病因論に取り組みことによるアルツハイマー病（ＡＤ）及びその病変形成に関し、それによりその過収縮（hypercontractile）表現型を寛解させる又は逆行させる。本明細書で使用される生成物及びプロセスが提供される。
【０００４】
アルツハイマー認知症は、神経血管性機能障害１，２、Ａβ毒素の脳クリアランス障害２０，２２，２３及び神経細胞傷害及び損失１９，２０に付随する進行性認知機能低下により特徴付けられる。動脈低灌流が、ＡＤの動物モデル２４〜２６及びＡＤ患者２７〜３０においてＡβ蓄積及び大脳萎縮に先行していてもよい。脳アデノパチーは脳への血流を減少させる。それは認知機能低下及び血管壁でのＡβ蓄積を付随し、脳アミロイドアンギオパチー（ＣＡＡ）として知られている３，４。
【０００５】
ＡＤにおいて、軟膜及び内大脳動脈の直径を制御することにより脳への動脈血流を調節する脳血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）１，２は、ＳＭＣ表現型を組織化する２つの相互作用する転写因子、血清応答因子（ＳＲＦ）及びミオカルディン（ＭＹＯＣＤ）を高レベルでインビトロ及びインビボで発現することを我々は示した１３，１４。ＡＤ  ＶＳＭＣはＳＲＦ−ＭＹＯＣＤ調節収縮タンパク質を過剰発現し１３，１８、及び過収縮性を示す。ヒト脳ＶＳＭＣへのＭＹＯＣＤ遺伝子導入はＡＤ様過収縮性動脈表現型を誘発し、一方、ＡＤ  ＶＳＭＣにおけるＳＲＦ遺伝子のサイレンシングは収縮タンパク質含量及び細胞収縮性を正常化する。マウス動脈のＭＹＯＣＤ遺伝子の導入は、内皮依存性動脈血管拡張を減弱させ、血管収縮薬への応答を増強する。インビトロ又はＡＤのＡβ過剰産生マウスモデル２１において、アルツハイマー毒素、アミロイドβ−ペプチド（Ａβ）１９，２０への暴露は脳ＶＳＭＣにおいてのＳＲＦ発現には影響しなかったが、一方、ＡＤ  ＶＳＭＣにおけるＳＲＦ遺伝子のサイレンシングはＡβ凝集体のクリアランスを促進し、Ａβリポタンパククリアランスレセプターの上方調節と一致した２２，２３。それ故、脳ＶＳＭＣにおけるＳＲＦ−ＭＹＯＣＤ遺伝子活性化は、認知機能低下を付随するアルツハイマーアンギオパチーを惹起することができる。
【０００６】
それ故、アルツハイマー病を患った（療法）又はその発生のリスクを有する（予防）対象のための治療を提供することが本発明の一つの目的である。長年にわたる要求に取り組み、それによりアルツハイマー病に付随する症状の数及び／又は重症度を軽減する。さらなる目的及び利点は以下に説明されている。
【０００７】
発明の要旨
一つの目的は、対象の血管系の少なくとも一つの細胞における血清応答因子（ＳＦＲ）及び／又はミオカルディン（ＭＹＯＣＤ）調節遺伝子発現を減少させることにより、アルツハイマー病に付随する過収縮表現型に取り組む（例えば、逆戻りさせる）ことである。ＳＲＦ／ＭＹＯＣＤ調節遺伝子発現の減少は、例えば、アンチセンス阻害、ＲＮＡ干渉、トランスドミナント干渉、及びＳＲＦ−ＭＹＯＣＤ転写経路中の遺伝子活性化又は調節の、他の阻害剤のような技術により達成することができる。こうした治療は、細胞中の一つ又はそれより多くの収縮タンパク質の減少した発現、及び／又は血管中の増加した血流も起こすことができる。対象の治療は、自家又は異種（即ち、同種間又は異種間）源からの移植可能な細胞（単数又は複数）を用い、インビボ又はエキソビボで一又はそれ以上の回数で実施することができる。
【０００８】
別の目的は、アルツハイマー病を診断することである。対象からの体液又は組織のサンプルを、転写、翻訳又はタンパク質活性のレベルでＳＲＦ及び／又はＭＹＯＣＤ発現について分析する。増加した発現はアルツハイマー病の存在又は発生のリスクファクターである。追加のリスクファクターは、血管過収縮性、アミロイドアンギオパチー、減少した血流及びいずれかそれらの組み合わせであることができる。該体液は、ＳＲＦ又はＭＹＯＣＤを発現する細胞を含有する脳間質液（ＩＳＦ）又は脳脊髄液（ＣＳＦ）、又は内皮（特に平滑筋）細胞の代替源であることができる。該組織は、大脳動脈、軟髄膜血管及び側頭動脈、ならびに他の内皮（特に平滑筋）細胞のような脳又は他の中枢神経系組織であることができる。
【０００９】
治療又は診断の対象は、好ましくは、アルツハイマー病の動物モデル、アルツハイマー病を罹患したヒト患者、又はアルツハイマー病を発生する一つ又はそれより多くのリスクファクターを有するヒト患者である。該細胞は、好ましくは、平滑筋細胞である。
【００１０】
本発明のさらなる側面は、具体的態様及び特許請求の範囲の以下の記述、及びそれらへの一般化から、当業者には明らかになるであろう。
【００１１】
本発明の具体的態様の記述
転写調節因子、血清応答因子（ＳＲＦ）及びその補助因子ミオカルディン（ＭＹＯＣＤ）の過剰発現は、アルツハイマー病様過収縮表現型を引き起こす。それは、少なくとも血管、具体的には脳又は動脈、及びより特別には大脳動脈細胞（例えば、平滑筋細胞）におけるＳＲＦ及び／又はＭＹＯＣＤ調節遺伝子発現を妨げることにより寛解させることができる。血管系において、血管拡張を減弱させることができ、及び血管収縮薬への応答を増強することができる。Ａβリポタンパククリアランスレセプター（ＬＲＰ）の増加した（正常又は非病的状態と比較して）活性及び／又はアミロイドβ−ペプチド（Ａβ）のクリアランスはそれらにより得ることができる。もしくは、アミロイドアンギオパチーのようなアルツハイマー病（ＡＤ）に関連する病的状態、及びその結果生じた血流の減少は、ＳＲＦ及び／又はＭＹＯＣＤ調節遺伝子発現を妨げることにより寛解させることができる。一つ又はそれより多くの収縮タンパク質の発現を減少させることができ、又はそれにより血管系において血流を増加させることができる。
【００１２】
該対象は、ヒト、他の霊長類、げっ歯類又は他の哺乳類であることができ；ＡＤの動物モデル、ＡＤを罹患した患者、又はＡＤを発生するリスクを有する患者であることができる。対象は、少なくともＳＲＦ又はＭＹＯＣＤの過剰発現により診断することができる。例えば、内皮細胞生検試料を、ＳＲＦ又はＭＹＯＣＤ変異、ＳＲＦ又はＭＹＯＣＤにより誘発された転写活性、ＳＲＦ又はＭＹＯＣＤ誘発遺伝子の発現、又はＳＲＦ又はＭＹＯＣＤのタンパク質生成物についてアッセイすることができる。こうした診断的アッセイは、該生検試料中のアミロイド沈着物の最適な決定で実施することができる。材料は脳、特に大脳動脈から得ることができる。もしくは、生検材料の起源は、血液又は骨髄細胞、軟髄膜血管、側頭動脈及び他の内皮（特に平滑筋）細胞である。アッセイは、核酸ハイブリダイゼーション又は抗体結合技術：例えば、転写の増幅（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）、ヌクレアーゼ保護、インサイツ又はマイクロアレイハイブリダイゼーション、ウエスタンブロッティング、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、免疫染色、又は蛍光細胞染色、により実施することができる。
【００１３】
ＳＲＦ及び／又はＭＹＯＣＤの転写活性を減少させるための医薬組成物、ならびにこれらの生成物を使用する及び作製するためのプロセスも提供される。該組成物はパイロジェンフリー（pyrogen-free）であり、及び生理学的に許容できるビヒクルをさらに含んでいる。しかしながら、生成物に関する特許請求の範囲は、該生成物請求項に該プロセスの特定の工程が再引用されない限り、これらのプロセスに限定されるわけではない。ＳＲＦ及び／又はＭＹＯＣＤ調節遺伝子発現は、アンチセンス阻害、ＲＮＡ干渉、非コード（例えば、転写又は翻訳調節領域）又はコード配列の遺伝子変異、トランスドミナント干渉（例えば、Ｍｙｏｃｄのカルボキシ末端欠失１７又はＳＲＦのスプライス変異体３３，３４）又は遺伝子発現の低分子量（例えば、３０００ＭＷ未満）可溶性阻害剤により減少させることができる。もしくは、こうした剤はＭＹＯＣＤを正に調節するので、これらをＦＯＸＯ及び／又はＭＥＦ２発現を減少させるために使用することができる。ＭＳＸ１及び／又はＭＳＸ２の遺伝子導入は、それらの発現を増加させるために使用することができ（ＭＳＸ１又はＭＳＸ２はＳＲＦ及びＭＹＯＣＤと三元複合体を形成し、それらのＣＡｒＧボックスへの結合を阻害する）、転写活性を阻害する。遺伝子発現の減少は、ＲＮＡを産生するＤＮＡの転写、タンパク質を産生するＲＮＡの翻訳、タンパク質活性のレベル又はいずれかのそれらの組み合わせで決定することができる。化学阻害剤のスクリーニングは、核局在化シグナル、タンパク質二量体形成領域、レポーター（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−グルコロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑又は赤色蛍光タンパク質、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ラクタマーゼ及びそれらの誘導体）又はいずれかのそれらの組み合わせに融合された非コード又はコードＳＲＦ及び／又はＭＹＯＣＤ配列の阻害についてアッセイすることにより実施することができる。多くの（しかしすべてではない）レポーターが同族基質を使用し、検出可能なシグナルを発生するであろう。阻害は検出されるシグナル（例えば、色素原又は蛍光）の減少を起こすであろう。変異は、ＳＲＦ及び／又はＭＹＯＣＤ配列中で起こるであろう；化学阻害剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ又はそれらの前駆物質、ドミナントネガティブ突然変異体タンパク質、天然物、コンビナトリアル合成）は、無細胞転写アッセイ又は細胞に基づいたアッセイ(Koehler et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 8420-8421, 2003; Bailey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 16144-16148, 2004 を参照されたい）における候補化合物のライブラリーから選択することができる。平滑筋細胞（ＳＭＣ）収縮タンパク質のＳＲＦ及びＭＹＯＣＤ調節発現について選択的である阻害剤が好ましい。核酸阻害剤は、自動化合成又は発現構築物により製造することができる。タンパク質阻害剤は、ウイルス感染又はトランスフェクションにより細胞内に導入された発現構築物から製造することができる。発現構築物は、好ましくは、血管細胞特異的であるか又はウイルスに由来する、又はそれらの組み合わせの調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー）から阻害���を転写する。該発現構築物は、担体中にタンパク質及び他の核酸を付随させることができる（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス又はレトロウイルスに由来するウイルス粒子中にパーッケージングされる、又はリポソーム中にカプセル封入される、又はポリマーと複合体形成される）。インビトロ治療には、対象の脈管構造内への直接的な医薬組成物（例えば、ウイルス又は核酸含有溶液）の点滴注入が含まれる。エキソビボ治療のためには、対象又はドナーからの細胞（例えば、血管細胞又はそれらの前駆体）をインビトロでウイルスに感染させ又はトランスフェクトし、次ぎに該対象の脈管構造内に移植することができる。一方、無細胞転写アッセイは、阻害剤を同定するために使用することができ、（ｉ）ランダム又は部位特異的変異誘発又は相同的組換えにより導入された変異を有する細胞、又は（ｉｉ）ＳＲＦ及び／又はＭＹＯＣＤの少なくとも一部及び随意にレポーターとの転写的又は翻訳的融合を含有する発現構築物でトランスフェクトされた細胞もアッセイし得る。細胞は、特別には脳又は動脈、及びより特別には大脳動脈の血管細胞（例えば、平滑筋細胞）であることができる。
【００１４】
材料及び方法
参加者及び神経病理学的診断
ＶＳＭＣは、１８個体からの小さな皮質軟膜動脈（領域９／１０）から、迅速な脳剖検で単離された。ＡＤ患者及び同年齢の対照は臨床的に評価し、University of Southern California のAD Research Centers 及びUniversity of Rochester Medical Center, New Yorkでの剖検に従った。ＡＤ及び対照個体のＣＤＲスコアは、それぞれ３〜５及び０であった。ＡＤ症例はブラーク病期Ｖ−ＶＩ３１であり、及びＣＥＲＡＤ３２は高頻度から中程度であった。対照はブラーク０又は０〜１、及びＣＥＲＡＤは陰性又は低密度であった。臨床的及び神経病理学的特性については表１を参照されたい。血管リスクファクター（例えば、高血圧、アテローム性動脈硬化症その他）の発生率、性比、死因及び死後間隔は、ＡＤ及び同年齢対照間で同程度であった。若年対照（平均年齢３１．２歳）からのＶＳＭＣは、Monroe Medical Examiner Center, Rochesterでの自動車事故後に剖検された、血管リスクファクターを有していない神経学的に正常な若年個体の迅速な脳剖検で単離された。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
ヒトＶＳＭＣ培養
軟膜動脈ＶＳＭＣが単離され、以前に記載されているように特徴付けられた５１。死後ヒト脳からの軟膜動脈血管を切り裂き、次ぎに１５ｍＭヘペス及び抗生物質を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の０．１％ディスパーゼ及び０．１％コラゲナーゼで消化した。細かく切られた血管は最初に４℃で２時間保ち、及び次ぎに３７℃で１．５時間インキュベートした後に摩砕した。遠心分離により細胞を集め、１０％ウシ胎児血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１００単位／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で培養した。培養されたＶＳＭＣは、血管平滑筋細胞α−アクチン、血管平滑筋ミオシン重鎖及びＳＭ２２αを強く発現することが示された。
【００１７】
ウエスタンブロッティング
ＶＳＭＣを冷リン酸緩衝食塩水で洗浄し、次ぎに「クラック（crack）」緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ、６．８、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１００μｇ／ｍｌ  ＰＭＳＦ、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール及び各々１μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、ロイペプチン及びアプロチニン）で溶解した。溶解液は、２３ｇ針を１０回通して剪断し、１０分煮沸し、次ぎに１４，０００ｇで１０分、４℃にて分離した。上清を集め、タンパク質アッセイキット（Pierce）で定量し、完全性及び相対的添加量についてクーマシー染色ポリアクリルアミドゲルで分析した。典型的には、変性１０％ポリアクリルアミドゲル（BioRad MiniProtean）に、５０〜１００μｇ／レーンのタンパク質を添加し、続いて１５０Ｖで１〜２時間電気泳動した。ゲルをニトロセルロースに移し、確立された方法によりイムノブロッティングのために処理した。一次抗血清及びそれらの希釈液は、ＳＲＦ（1:1000, Santa Cruz, sc-335）、ＳＭ−カルポニン (1 :10,000, hCP，Sigma ）、平滑筋ミオシン重鎖（SM-MHC, 1:500, Santa Cruz, sc-6956）、ＳＭ  α−アクチン（1:1000、Sigma A-2547）、ＳＭ２２α（1:2000, Univ. of Chicago のJulian Solway 博士からの寄贈）、ＭＹＯＣＤ（1:2000,Univ. of Texas South-western Antisera Coreからの寄贈）及びβ−チューブリン（1:1000, Pharmingen 556321）を含む。適切な二次抗血清とのインキュベーション後、免疫反応性生成物を化学発光キット（Pierce）で検出する。免疫反応性生成物の相対的レベルはレーザーデンシトメーター（Molecular Dynamics）で測定し、次ぎにβ−チューブリン対照抗体のレベルへの規格化により計算する。
【００１８】
定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ｍＲＮＡは、蛍光標識化オリゴヌクレオチドプローブ５２を用い、ＴＡＱＭＡＮ（商標）増幅アッセイ（Applied Biosystems）を使用して定量した。
【００１９】
ＶＳＭＣ収縮応答能アッセイ
ＶＳＭＣを、２４ウェルプレート中、１０％ウシ胎児血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１００単位／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭに４ｘ１０４細胞／ウェルで蒔き、５０％〜６０％コンフルエントになるまでに増殖させた。収縮性活性測定のため、ＤＭＥＭをＯ２及びＣＯ２（それぞれ９５％及び５％）で通気した生理学的塩（クレブス）溶液で置き換えた。クレブス溶液中で５分インキュベーション後、細胞を７５ｍＭ  ＫＣｌクレブス溶液に２分暴露して収縮を誘導し、続いてＫＣｌフリーのクレブス溶液中でインキュベートした。時間経過研究のためには、ＶＳＭＣを倒立顕微鏡（Nikon TE2000-S）の試料台上のインキュベーションチャンバー中、３７℃に保ち、SimplePCIソフトウェアーパッケージ（Compix）により駆動されたデジタルカメラ（Spot）を使用し、２０ｘの拡大率で画像を捕捉した。細胞長及び領域は、Image-Pro Plusソフトウェアーを使用して異なった時点で決定した。典型的には、ＫＣｌ刺激の５から１０分以内に収縮活性が観察された。カルシウムがＶＳＭＣ収縮に必要とされるかどうかを決定するため、ＫＣｌフリー及びＫＣｌ含有クレブス溶液の２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２を除外し、上記のようにアッセイを実施した。アデノウイルス仲介ＭＹＯＣＤ遺伝子導入及びＳＲＦ遺伝子サイレンシングの効果を評価するため、同じアッセイを使用した。最大細胞短縮（収縮）は、群当たり３〜８の異なったＶＳＭＣ培養物を用い、培養物当たり１００の細胞から三重に決定した。
【００２０】
単一ＶＳＭＣ中の［Ｃａ２＋］の測定
ＫＣｌ刺激によるＶＳＭＣの細胞内カルシウムレベルを、記載されたように５３、カルシウム感受性蛍光色素、Ｆｕｒａ−２ＡＭ（Teflabs）を使用して画像化した。簡単には、カバースリップ上で培養したＶＳＭＣを、４μＭ  Ｆｕｒａ−２ＡＭのＤＭＥＭ溶液と４０分インキュベートした。カバースリップを、倒立Nikon Diaphot 300 顕微鏡の試料台に固定した灌流チャンバーへ移し、通常クレブス溶液で１５分灌流した後、７５ｍＭ  ＫＣｌを含むクレブス溶液で刺激した。［Ｃａ２＋］は、バージョン４．０ソフトウェアー（T.I.L.L. Photonics）を使用し、デジタル像蛍光顕微鏡法（対物レンズ, Fluor 40/1.3; Nikon）により測定した。蛍光像は、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（T.I.L.L. Photonics）で集めた。較正したデータをプールし、［Ｃａ２＋］の平均±s.e.m としてプロットした。
【００２１】
ヒト組織中の脳ＶＳＭＣの免疫染色
ＡＤ患者及び同年齢対照からの脳組織についての免疫組織化学的分析のため、脳表面及び軟膜血管に隣接する前頭皮質（領域９／１０）のパラフィン切片（６μｍ）を使用した。キシレンで洗浄することにより切片からパラフィンを除去し；次ぎに組織切片はエタノールの濃度を連続的に減少させて再水和した。抗原回収は、Retrievagen B（BD PharMingen）で組織を処理することにより実施した。以下の一次抗体を免疫組織化学的分析のために使用した：ヒトＳＲＦに対するモノクローナルマウス抗体（1:500, 0.2 mg/ml, Santa Cruz Biotechnology）、ヒトＭＹＯＣＤに対するヤギ抗体（1:1000, 0.2 mg/ml, Santa Cruz Biotechnology 及びUniv. of Texas Southwestern Antisera Core からの寄贈）；ヒト平滑筋特異的アクチンに対するモノクローナルマウス抗体（1:200, 0.2 mg/ml, Oncogene）、ヒトカルポニンに対するマウス抗体（1:500, 86 /μg/ml, DAKO）；ヒトＡβに対するポリクローナルウサギ抗体（1:500, 0.66 mg/ml, Biosource）。一次抗体はフルオレセイン又はローダミンコンジュゲート二次抗体で検出された。画像分析は、ＳＰＯＴデジタルカメラを備えたNikon 蛍光顕微鏡で実施した。微小血管サイズは以下のように決定した：毛細血管から小さな細動脈（＜２０μｍ）、中程度の細動脈及び小さな動脈（それぞれ２０μｍ〜４０μｍ及び４０μｍ〜１００μｍ）又はより大きな血管（＞１００μｍ）。シグナルの強度はImage-ProPlus を使用して測定した。１０の切片からの各領域中の、少なくとも１０のランダムに選択された視野を分析した。
【００２２】
ＲＮＡ干渉によるＳＲＦサイレンシング
簡単には、Ｕ６駆動ＳＲＦ  ＲＮＡｉカセット４２又は指示された対照を含有するシャトルベクター（ｐＥＮＴＲクラスベクター、Invitrogen）を、ＬＲクロナーゼ（Invitrogen）を使用してｐＡｄ／ｐｌ−ＤＥＳＴ（Invitrogen）と組換えてアデノウイルス構築物を作製した。ＰａｃＩ（New England Biolabs）での直線化に続いて、各アデノウイルス構築物を、リポフェクタミン２０００（Invitrogen）を用いて別々にＨＥＫ−２９３Ａ細胞内にトランスフェクトした。細胞溶解が９５％を越えて完了したと判断されるまでウイルス産生を進行させ、その時点で上清を集めた。粗ウイルス溶解物は、３回の凍結融解サイクルによりこの上清から調製し、試験して機能を確認した。引き続いて、アデノウイルスを増幅し、次ぎにVirapur からのAdenoMini キットを使用し、製造元の指示に従って精製した。感染単位（ＩＦＵ）で測定されるウイルス力価は、Adeno-X Rapid Titer キット（BD Clontech）を使用し、製造元の指示に従って決定した。大規模アデノウイルス調製物は、親切にもUniv. of Pittsburgh's National Heart Lung and Blood Institute-funded Vector Core Facility から提供された。収縮タンパク質のウエスタンブロット分析のため、６０ｍｍディッシュに蒔かれた２ｘ１０５のＡＤ  ＶＳＭＣを、１００の感染効率（ＭＯＩ）でのＡｄ．ｓｈＳＲＦ又はＡｄ．ｓｈＧＦＰと、ＤＭＥＭ／２％ＦＢＳ中、揺らしながら室温で２時間インキュベートした。ウイルス除去後、形質導入されたＡＤ  ＶＳＭＣをＤＭＥＭでさらに４日間培養した。インビトロ収縮性アッセイのためには、２４ウェルプレートに蒔かれた１ｘ１０４のＡＤ  ＶＳＭＣに、上記のごとく、１００のＭＯＩでＡｄ．ｓｈＳＲＦ又はＡｄ．ｓｈＧＦＰを形質導入した。
【００２３】
ＭＹＯＣＤ遺伝子導入
アデノウイルス構築は、本質的には記述されているように４２実施した。簡単には、ＣＭＶ駆動ヒトＭＹＯＣＤ（Dr.Michael Parmacek から親切にも寄贈された）又は指示された対照を、ＬＲクロナーゼ（Invitrogen）を使用してｐＡｄ／ｐｌ−ＤＥＳＴ（Invitrogen）と組換えてアデノウイルス構築物を作製した。組換えに先立って、ＦＬＡＧエピトープをコードする短い配列をインフレームのＭＹＯＣＤのＮ末端に挿入した。ＰａｃＩ（New England Biolabs）での直線化、ＨＥＫ−２９３Ａ細胞のトランスフェクション、ウイルス産生、粗ウイルス溶解物の調製、アデノウイルスの増幅及び精製は上に記載した。収縮タンパク質プロフィールのウエスタンブロット分析のためには、同年齢対照ＶＳＭＣを１００のＭＯＩでＡｄ．ＭＹＯＣＤ又はＡｄ．ＧＦＰとインキュベートした。ウイルス除去後、形質導入対照ＶＳＭＣを４８時間培養した。インビトロ収縮性アッセイのためには、２４ウェルプレートに蒔かれた１ｘ１０４の対照ＶＳＭＣに、上記のごとく、１００のＭＯＩでＡｄ．ＭＹＯＣＤ又はＡｄ．ＧＦＰを形質導入した。
【００２４】
マウス血管収縮性アッセイ
National Institutes of Health ガイドラインに従って承認された研究所プロトコールを使用し、麻酔した（０．５ｍｇ／ｋｇケタミン及び５ｍｇ／ｋｇキシラジンｉ．ｐ．）野生型マウスから、結合組織を含まない胸部大動脈を単離し及び除去した。３〜４ｍｍの切片を使用し、１０ｍｌのRadnoti器官浴システム及びGrassミオグラフ（Grass-Telefactor Instruments）を使用して収縮及び弛緩を決定した。組織をクレブス溶液に浸し、ｐＨ７．４及び３７℃±０．５℃にて９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２を連続的に通気した。静止張力は０．５ｇに維持した。フェニレフリンに対する収縮、及び０．２５μＭフェニレフリンによる前収縮に続くアセチルコリンに対する弛緩についての累積用量応答曲線はＡｄ．ＭＹＯＣＤ又はＡｄ．ＧＦＰを形質導入した大動脈環で決定した。
【００２５】
マウス動脈の形質導入
胸部大動脈を、上記のように麻酔した３〜４ヶ月齢のＣ５７ＢＩ／６Ｊマウスから単離した。ＭＹＯＣＤ遺伝子の形質導入は、エキソビボ動脈調製について記載したように実施した５４，５５。簡単には、９６ウェルプレートを使用し、２つの４ｍｍセグメントを、５ｘインスリン／トランスフェリン／セレン（Sigma）及びペニシリン／ストレプトマイシン補給ヒト内皮−ＳＦＭ（Life Technologies）中、Ａｄ．ＭＹＯＣＤ又はＡｄｔ．ＧＦＰの２ｘ１０８ｐｆｕを含有する５０μｌのウイルス懸濁液と一緒に、９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２下、３７℃で２時間インキュベートした。１００μｌの内皮増殖培地（１０％ウシ胎児血清、１０％Nuserum、３０μｇ／ｍｌ内皮細胞増殖サプルメント（Sigma）、５Ｕ／ｍｌヘパリン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸、１％ビタミン、２５ｍＭヘペス、１００単位／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ１６４０）を加えた後、インキュベーションを一夜続けた（２０〜２４時間）。β−ガラクトシダーゼの検出は、記載されているように実施した５６。染色後、動脈セグメントをＯＣＴに包埋し、クリオスタットで１０μｍの薄片とし、４ｘの拡大率で撮影した。ＧＦＰ発現は、倒立蛍光顕微鏡（Nikon TE2000-S）で可視化し、及び１０ｘの拡大率で撮影した。ウエスタンブロット分析については、大動脈環を氷冷ＰＢＳで２回すすぎ、次ぎに各環を２５μｌの１ｘＳＤＳ試料緩衝液中で溶解した。マウスモノクローナル抗ヒト抗体（SM-MHC, 1:2,000, Upstate）を有するミオシン重鎖を検出するため、溶解液（レーン当たり１０μｌ）を６％ポリアクリルアミドゲルで分離した。β−チューブリンをタンパク質添加についての内部対照として使用した。
【００２６】
トランスジェニックマウス
Ｔｇ２５７６ＡＰＰｓｗ＋／−マウス２１を１８〜２２ヶ月齢で使用した。National Institutes of Health ガイドラインに従って承認された研究所プロトコールを使用し、麻酔した（０．５ｍｇ／ｋｇケタミン及び５ｍｇ／ｋｇキシラジンｉ．ｐ．）マウスから脳を除去した。ＳＲＦ及びＡβについての免疫染色分析は、ヒトＳＲＦに対するポリクローナルウサギ抗体（1:1000, 0.2mg/ml, Santa Cruz Biotechnology）及びヒトＡβ特異的モノクローナル抗体６６．１（1:500、SUNY Stonybrook のvan Nostrand 博士から入手した）を使用し、６μｍ厚パラフィン切片で実施した。
【００２７】
Ａβ沈着物の細胞クリアランス
このことは報告されているように実施した４８，５０。マルチスポットガラススライドを、細胞無しで、５００の対照脳ＶＳＭＣと、５００のＡＤ  ＶＳＭＣと、又は５００のＡｄ．ｓｈＳＲＦ又は  Ａｄ．ｓｈＧＦＰを形質導入したＡＤ  ＶＳＭＣとともに、Ｃｙ３標識Ａβ４２（５μｇ／スポット）で被覆した。細胞を７２時間インキュベートし、残余蛍光Ｃｙ３強度を、倒立顕微鏡（Nikon TE2000-S）を使用して決定した。核をヘキスト染色により可視化した。Ｃｙ３−Ａβ４２とのＶＳＭＣインキュベーションに先立って、５Ａ６抗体（1:1000; Calbiochem）を使用し、記載されているように２３、細胞中のＬＲＰの相対レベルを決定した。
【００２８】
統計解析
ＡＮＯＶＡが統計学的有意差を決定するために使用された。ｐ＜０．０５が統計学的に有意であると考えられた。
【００２９】
実施例
アルツハイマー動脈症の分子又は細胞基盤はあまり理解されていない。ここでは、脳活性化間に、血流に対して最も大きな抵抗を与え及び脳血流（ＣＢＦ）調節において主たる役割を果たす小皮質性軟膜及び内大脳動脈に由来する血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）１，２を分析した。ＶＳＭＣは、重度の病態を有する８人の後期アルツハイマー病（ＡＤ）患者［ブラーク（Braak）−Ｖ〜ＶＩ３１、ＣＥＲＡＤ（Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease プロトコール）−高頻度又は中程度３２、臨床認知症評価尺度（ＣＤＲ）スコア−４、ＣＡＡ存在、年齢−７９歳］、病態がないか又はわずかである（ブラーク−０又は０〜１、ＣＥＲＡＤ−陰性又は低密度、認知症スコア−０、非ＣＡＡ、年齢−７７歳）５人の神経学的に正常で認知症ではない同年齢対照、及び５人の病態を有しない若年対照（年齢−３２歳）から得た。ＡＤ及び同年齢対照間には、性、死因、死後間隔（＜４時間）及び血管リスクファクターの発生率に相違はなかった（表１）。第一に、対照と比較してＡＤにおいて、ＶＳＭＣ限定タンパク質をコードする遺伝子の下位集団が大量に提示されることがマイクロアレイスクリーニングにおいて注目された（データは示されていない）。いくつかのこうしたマーカーについてのウエスタンブロッティング１３は、ＳＭＣ収縮タンパク質、即ち、ＳＭミオシン重鎖、ＳＭ−カルポニン、ＳＭα−アクチン及びＳＭ２２αのレベルが、同年齢ＶＳＭＣと比較してＡＤ  ＶＳＭＣにおいて、それぞれ１０、７、２．５及び１．７倍上昇していることを示した（図１Ａ−１Ｂ）。同年齢及び若年対照間では、収縮タンパク質の発現に有意な相違はなかった（示されていない）。多数のＳＭＣ限定遺伝子が、ＣＡｒＧボックスとして知られている１，２１６倍縮重シスエレメントに結合する転写因子、ＳＲＦにより調節されている１３。完全長ＳＲＦのレベルは、対照と比較したＡＤ  ＶＳＭＣにおいて２３倍高かった（図１Ａの上側の矢印、図１Ｃのアイソフォーム１）。対照的に、ＳＲＦの天然ドミナントネガティブアイソフォームをコードする低分子量ＳＲＦスプライス変異体３３，３４は、ＡＤ  ＶＳＭＣにおいてほとんど検出不能であったが、対照ＶＳＭＣにおいては大量に発現されていた（図１Ａの下側の矢印、図１Ｃのアイソフォーム４）。
【００３０】
ＳＲＦは、心臓及びＳＭＣ限定コアクチベーターＭＹＯＣＤを結合する３５。ＳＲＦ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ−００３１３１及びＮＣ−０００００６は、それぞれｍＲＮＡ及びゲノムＤＮＡ配列である）及びＭＹＯＣＤ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ−１５３６０４及びＮＣ−００００１７は、それぞれｍＲＮＡ及びゲノムＤＮＡ配列である）は一緒に、ＳＭＣ分化のプログラムを強力に活性化する１３，１７，３５。Ｍｙｏｃｄの遺伝子不活性化３６及びＳｒｆのコンディショナル切断（conditional ablation）３７は、ＣＡｒＧ依存性ＶＳＭＣ遺伝子発現の喪失及び胎児性致死を生じた。図１Ｄは、対照と比較して、ＡＤ  ＶＳＭＣがほぼ１０倍高いレベルでＭＹＯＣＤ  ｍＲＮＡを発現することを示している。インサイツでのヒト脳中皮質動脈血管の二重免疫染色分析は、ＳＲＦ及びＳＭα−アクチン間、及びＭＹＯＣＤ及びＳＭα−アクチン間の重複（図２Ａ〜２Ｂ）、及び２０〜４０μｍ、４０〜１００μｍ及び＞１００μｍの異なる内径の細動脈及び小動脈中の、対照ＶＳＭＣと比較してＡＤ  ＶＳＭＣにおけるＳＲＦ及びＭＹＯＣＤの実質的に増加した発現レベル（図２Ｄ〜２Ｅ）を示した。一貫して、既知のＳＲＦ依存性遺伝子、ＳＭ−カルポニン３８は異なったサイズのＡＤ血管において６．６倍高く発現され（図２Ｃ、図２Ｆ）、及びＳＭα−アクチンはＡＤにおいて３．５倍増加した（示されていない）。
【００３１】
ＡＤ  ＶＳＭＣにおける収縮タンパク質の増加した発現に基づき（図１Ａ〜１Ｄ；図２）、我々はそれらの収縮活性が同年齢対照ＶＳＭＣと比べてより高くてもよいことを仮定した。図１Ｃは、塩化カリウム（ＫＣｌ）に応答したＶＳＭＣ短縮（収縮）を示しており、ＫＣｌ投与後５〜１０分で最大効果があり（図１Ｆ）、及び収縮前の寸法にゆっくりと戻る（弛緩）（図１Ｅ〜１Ｆ）。細胞短縮及び本来のＫＣｌ前寸法への復帰が細胞ストレスというよりはむしろ細胞収縮及び弛緩を反映していることは、乳酸デヒドロゲナーゼ放出の有意な増加がないことにより、及び収縮状態に対応するアクチンストレス繊維の再配置を示しているＫＣｌ暴露１０分後のファロイジン染色により（示されていない）確認された。培養ＳＭＣは、それらの表現型変調のため一般に収縮刺激に反応せず１４、それはインビボでのそれらの迅速な応答と比較して、インビトロでの脳ＶＳＭＣの比較的に遅い収縮及び弛緩２を説明することができる。
【００３２】
培地からのカルシウムイオン（Ｃａ２＋）の除去は、ＫＣｌ投与による細胞長を中程度に増加させ、及び細胞短縮を消失させ（図６Ａ〜６Ｂ）、ＶＳＭＣ収縮に細胞外Ｃａ２＋が必要とされること３９を確認している。ＶＳＭＣの多数の独立した培養物（図１Ａ〜１Ｄ；表１で使用されたものと同一）の分析は、対照ＶＳＭＣと比較して、ＡＤ  ＶＳＭＣにおけるＫＣｌ誘導細胞短縮が統計的に有意に増加することを示した（ｐ＜０．０５）；即ち、それぞれ９．２％対２４．５％（図１Ｇ）。ＡＤ  ＶＳＭＣ過収縮についての機構としての増加したＣａ２＋流入を除外するため、Ｃａ２＋取り込みを測定した。図６Ｃは、マイクロアレイデータ（示されていない）により示唆されたカルシウムチャネルの発現には変化がないことと一致して、ＡＤ及び対照ＶＳＭＣ間の同程度の短期滞在を示している。それ故、ＡＤ  ＶＳＭＣにおける収縮タンパク質の上昇した発現は、過収縮に対するそれらの固有の能力とよく相関した。
【００３３】
我々は次ぎに、脳ＶＳＭＣにおいてＭＹＯＣＤ遺伝子を過剰発現することは、収縮タンパク質発現及び活性を増加させ、ＡＤ様表現型を導くであろうことを仮定した。ＭＹＯＣＤはＳＭＣ分化のプログラムを惹起し得るが、それが収縮を促進し得るかどうかは不明確である４０。ヒトＭＹＯＣＤ遺伝子のアデノウイルス仲介導入は、用量依存的にＶＳＭＣにおけるＭＹＯＣＤ  ｍＲＮＡ発現を増加させ（示されていない）、及び収縮タンパク質、ＳＭミオシン重鎖、ＳＭ−カルポニン及びＳＭα−アクチンのレベルを有意に（ｐ＜０．０１）増加させ（図３Ａ〜３Ｂ）、以前の報告１７，１８と一致している。さらに、ＭＹＯＣＤ導入はＧＦＰ導入対照と比較して、増加したＶＳＭＣ収縮性を生じた（図３Ｃ）。ＭＹＯＣＤは全ＳＭＣ遺伝子プログラムを活性化しないが４１、我々のデータは、ヒト脳ＶＳＭＣ中のＭＹＯＣＤはそれでもなお、ＡＤ様過収縮性ＶＳＭＣ表現型と似ている機能的収縮状態を方向付け得ることを示唆する。
【００３４】
ＭＹＯＣＤと対照的に、ショートヘアピンＳＲＦ  ＲＮＡ（Ａｄ．ｓｈＳＲＦ）のアデノウイルス仲介導入でのＡＤ  ＶＳＭＣ中のＳＲＦサイレンシングは、ＳＲＦの発現を約７０％、ならびにＳＲＦ依存性ＶＳＭＣ収縮タンパク質ＳＭ−カルポニンの発現を減少させた（図３Ｄ〜３Ｅ）。この発見は、多様な細胞株においてＡｄ．ｓｈＳＲＦが内在性ＳＲＦレベル及びＳＲＦ標的遺伝子の発現を効果的に減少させるという我々の観察４２と一致している。ＳＲＦ遺伝子のサイレンシングは、ＡＤ  ＶＳＭＣの収縮性も減少させ（図３Ｆ）、ＳＲＦは、多分その方向付けられたＶＳＭＣ収縮遺伝子の発現を介して、ＡＤにおける過収縮性ＶＳＭＣ表現型の発生に関係付けることができることを示唆している。
【００３５】
ＡＤ様過収縮表現型をマウスモデルの動脈に誘導し得るかどうかを決定するため、エキソビボでマウス大動脈環にＭＹＯＣＤ遺伝子又はＧＦＰを導入し、一酸化窒素産生を増加させる内皮依存性血管拡張薬であるアセチルコリン、及び直接ＶＳＭＣ血管収縮薬であるフェニレフリン４３に対する導入血管の応答を研究した。図４Ａ〜４Ｂは、ＧＦＰ導入対照と比較してＭＶＯＣＤ導入血管では、アセチルコリン誘発動脈弛緩曲線及びフェニレフリン誘発収縮曲線のそれぞれ右及び左へのシフトを示し、ＭＹＯＣＤ遺伝子導入は動脈血管拡張を減少させ、及び動脈収縮性を増幅させることを示唆している。これらの発見と一致して、我々はＭＹＯＣＤ導入血管におけるＳＭミオシン重鎖レベルの２．２倍の増加も観察した（図４Ｃ）。
【００３６】
Ａβ血管沈着及びＳＲＦ発現間に関連が存在するかどうかを試験するため、ヒト培養脳ＶＳＭＣでのＳＲＦ発現に対するＡβの効果を研究した。異なった濃度での外因性病原性Ａβ４２、構造形態（例えば、オリゴマー、凝集体）４４、及び２４〜７２時間の過剰なインキュベーション時間はＳＲＦ発現に影響しなかった（図７）。次ぎに、１２月齢後に実質的Ａβ脳蓄積を発生するＡＤ２１のＡＰＰｓｗ＋／−マウスモデル４５におけるＳＲＦ発現を研究した。ＳＲＦ陽性血管プロフィール及び血管ＳＲＦシグナルの相対強度はＡＰＰｓｗ＋／−及び１８〜２２ヶ月齢の同年齢同腹子対照間で有意に異なっておらず（図８）、Ａβへの暴露はＡＰＰｓｗ＋／−マウスにおけるＳＲＦ  ＶＳＭＣ発現に影響しないことを示唆している。二重免疫染色分析は、ＳＲＦ陽性血管がＡＰＰｓｗ＋／−マウスにおいてＡβはごく希に陽性であり、一方、ＡＰＰｓｗ＋／−マウスにおいてほとんどのＡβ陽性血管は、ＳＲＦについて典型的には陰性であったことを裏付けた（図８）。Ａβ４２の亜致死濃度は培養ニューロンのＳＲＦ活性を低下できることが報告されているが４６、この発見の病態生理学的意義は不明である。ニューロンにおけるＳＲＦ機能は、ＶＳＭＣにおける機能とは異なっているようであり３７，４７、ニューロンにおける初期の研究４６及び本発見間の相異は、異なった細胞型（例えば、ニューロンはＭＹＯＣＤを発現しないような）により説明し得る。
【００３７】
ＡＰＰｓｗ＋／−マウスにおけるデータと対照的に、ＡＤにおけるＳＲＦ陽性血管プロフィールの有意な増加（図２Ａ及び２Ｄ）は増加したＡβ血管免疫染色を伴い、及びＡＤにおけるほとんどのＳＲＦ陽性血管はＡβについて陽性であった（図９）ことが発見された。この結果は、ＡβはＶＳＭＣにおけるＳＲＦ発現には影響しないが、ＶＳＭＣにおいて増加したＳＲＦ活性はＡβ血管蓄積を増加させることができる可能性を上昇させている。この仮説を試験するため、アストロサイトにおいて報告されているモデル４８と同様のモデルを使用し、ＡＤ  ＶＳＭＣによるＣｙ３標識Ａβ４２凝集体のクリアランスを研究し、ＳＲＦ遺伝子のサイレンシングがＶＳＭＣ仲介Ａβクリアランスに影響するかどうかを調べた。ＡＤ  ＶＳＭＣは、対照ＶＳＭＣと比較してＡβクリアランスの＞７０％減少を示すこと（図５Ａ〜５Ｃ、５Ｆ）、及び正常脳ＶＳＭＣは、レセプター関連タンパク質、ＬＲＰリガンド２２，２３（図５Ｂ）及び抗ＬＲＰ抗体（示されていない）での有意な阻害により示されたように、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質１（ＬＲＰ）を介してＡβをクリアランスすることが示された。脳ＶＳＭＣによるＬＲＰ仲介Ａβクリアランスの実証は、ＶＳＭＣ４９、アストロサイト５０、脳内皮細胞及び血液脳関門全体２２，２３における以前の報告と一致しており、一方でＡＤ  ＶＳＭＣによるＡβの減少したクリアランスは、ＡＤにおける血管細胞の他の非ＶＳＭＣ型について報告されているような２２，２３、ＬＲＰ発現の有意な減少（ｐ＜０．０５）（図５Ｇ）と一致している。しかしながら、ＡＤ  ＶＳＭＣへのＡｄ．ｓｈＳＲＦの導入は、Ａβクリアランスを有意に（ｐ＜０．０５）改良し（図５Ｄ〜５Ｅ）、及びＡｄ．ＧＦＰを導入した細胞と比較して、ＡＤ  ＶＳＭＣ中のＡβ  ＬＲＰクリアランスレセプターのレベルを増加させた（図５Ｇ）。
【００３８】
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本明細書で引用した特許、特許出願、本及び他の出版物は、それらの全体が本明細書において援用される。
【００３９】
クレームの意味及びそれらの法的均等物内に含まれるすべての修飾及び置換はそれらの範囲内に包含されるべきである。「含んでなる」を記述するクレームは、クレームの範囲内にある他の要素の包含を許可し；本発明は、用語「含んでなる」の代わりに、「から本質的に成る」（即ち、もし本発明の操作に物質的に影響しないならば、クレームの範囲内にある他の要素の包含を許可している）又は「から成る」（即ち、本発明に普通に付随する不純物又は取るに足らない活性物以外はクレーム中に列挙された要素のみを許可する）を記述しているこうしたクレームによっても記述される。これら３つの経過のいずれかを、本発明を特許請求するために使用し得る。
【００４０】
本明細書に記載されている要素は、それがクレームに明確に記述されない限り、本特許請求された発明の制限と解釈すべきではないことを理解すべきである。それ故、付与されたクレームは、クレームに読み込まれている本明細書の制限ではなく、法的保護の範囲を決定するための基準である。対照的に、請求された発明を予期させる又は新規性を壊すであろう具体的態様について、従来の技術は本発明から明確に排除される。
【００４１】
さらに、関係がクレーム中で明確に記述されない限り、クレームの制限間に特定の関係は意図されない（例えば、明確にそのようであると述べられていないならば、製品クレームにおける成分の並べ方又は方法クレームにおける工程の順序はクレームの制限ではない）。本明細書に開示された個々の要素の、すべての可能な組み合わせ及び順列は、本発明の側面であると考えられる。同様に、本発明の記述の一般化は、本発明の一部であると考えられる。
【００４２】
以上から、本発明はその精神又は本質的特性から離れることなく他の特別な形態に具体化し得ることが当業者には明らかであろう。本発明について提供される法的保護の範囲は、本明細書によるよりもむしろ付随するクレームにより示されるので、記載された態様は、限定的ではなく例示のためのみであると考えるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１−１】図１は、アルツハイマー病脳動脈平滑筋細胞におけるＳＲＦ／ＭＹＯＣＤ及び収縮タンパク質発現及び活性を示している。（Ａ）ＡＤ及び同年齢対照ＶＳＭＣにおける、平滑筋ミオシン重鎖（ＳＭ−ＭＨＣ）、完全長ＳＲＦ（上側矢印）及びそのドミナントネガティブアイソフォーム（下側矢印）、ＳＭα−アクチン、ＳＭ２２α及びＳＭ−カルポニンについてのウエスタンブロット。（Ｂ−Ｃ）ＡＤ（白いバー）及び対照（黒いバー）における、ＶＳＭＣ収縮タンパク質の発現の相対的水準（Ｂ）及びＳＲＦアイソフォーム（Ｃ）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．は５〜８の独立した培養物からである。
【図１−２】図１は、アルツハイマー病脳動脈平滑筋細胞におけるＳＲＦ／ＭＹＯＣＤ及び収縮タンパク質発現及び活性を示している。（Ｄ）ＡＤ（白いバー）及び対照（黒いバー）のＶＳＭＣにおける、ＭＹＯＣＤ  ｍＲＮＡについてのＱＲＴ−ＰＣＲＦ。（Ｅ−Ｆ）塩化カリウム（ＫＣｌ）の刺激前（対照）、間（収縮）及び後（弛緩）の脳ＶＳＭＣ。（Ｇ）ＫＣｌで刺激後、培養当たり１００の細胞から決定された、対照ＶＳＭＣと比較したＡＤ  ＶＳＭＣの増加した収縮性。平均±ｓ．ｅ．ｍ．は５〜８の独立した培養物からである。
【図２−１】図２は、アルツハイマー病脳動脈血管のインサイツでのＳＲＦ／ＭＹＯＣＤ及び収縮タンパク質発現を示している。（Ａ−Ｂ）ＡＤ又は同年齢対照脳における、ＳＲＦ及びＳＭα−アクチン（Ａ）又はＭＹＯＣＤ及びＳＭα−アクチン（Ｂ）についての二重染色。（Ｃ）ＡＤ対対照における脳組織中のカルポニン染色。バー＝５０μｍ。平均±ｓ．ｅ．ｍ．は群当たり５つの脳からである。
【図２−２】図２は、アルツハイマー病脳動脈血管のインサイツでのＳＲＦ／ＭＹＯＣＤ及び収縮タンパク質発現を示している。（Ｄ−Ｆ）ＡＤ（白いバー）及び対照（黒いバー）における、ＳＲＦ陽性（Ｄ）、ＭＹＯＣＤ陽性（Ｅ）及びＳＭ−カルポニン陽性（Ｆ）血管プロフィールの相対強度。平均±ｓ．ｅ．ｍ．は群当たり５つの脳からである。
【図３−１】図３は、ＭＹＯＣＤ及びＳＲＦがアルツハイマー病における脳動脈平滑筋細胞収縮表現型を調節していることを示している。（Ａ−Ｃ）ＳＲＦ、ＳＭα−アクチン、ＳＭ−カルポニン及びＳＭ−ＭＨＣについてのウエスタンブロット分析（Ａ）；収縮ＶＳＭＣタンパク質の相対的水準（Ｂ）；及び、ＭＹＯＣＤ形質導入対照脳ＶＳＭＣ（Ａｄ．ＭＶＯＣＤ）（黒いバー）又はＡｄ．ＧＦＰ形質導入ＶＳＭＣ（白いバー）における、塩化カリウム（ＫＣｌ）で刺激後のＶＳＭＣ収縮性（Ｃ）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．は３〜５の独立した培養物からである。
【図３−２】図３は、ＭＹＯＣＤ及びＳＲＦがアルツハイマー病における脳動脈平滑筋細胞収縮表現型を調節していることを示している。（Ｄ−Ｆ）ＳＲＦ及びＳＭ−カルポニンについてのウエスタンブロット（Ｄ）、Ａｄ．ｓｈＳＲＦ（黒いバー）又はＡｄ．ｓｈＧＦＰ（白いバー）を形質導入したアルツハイマー病ＶＳＭＣにおけるそれらの発現の相対的水準（Ｅ）、及びＫＣｌ刺激後のＶＳＭＣ収縮性（Ｆ）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．は３〜５の独立した培養物からである。
【図４】図４は、マウス動脈中へのＭＹＯＣＤ遺伝子導入が、血管活性変調剤へのそれらの応答に影響することを示している。（Ａ−Ｂ）Ａｄ．ＭＹＯＣＤ（黒丸）又はＡｄ．ＧＦＰ（白丸）を形質導入したマウス胸部大動脈環における、アセチルコリン（Ａ）及びフェニレフリン（Ｂ）に対する累積用量応答曲線；＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）Ａｄ．ＭＹＯＣＤ又はＡｄ．ＧＦＰ形質導入血管における平滑筋ミオシン重鎖（ＳＭ−ＭＨＣ）のウエスタンブロット分析。（差し込み図）マウス大動脈平滑筋細胞層（左）におけるエキソビボアデノウイルス仲介β−ガラクトシダーゼ遺伝子発現。スケール、１００μｍ。データは、３〜５匹のマウスからの平均±ｓ．ｅ．ｍ．である（＊Ｐ＜０．０６）。
【図５】図５は、ＳＲＦ遺伝子サイレンシングがアルツハイマー病脳動脈平滑筋細胞によるＡβクリアランスを改良することを示している。（Ａ−Ｅ）無細胞（Ａ）、対照脳ＶＳＭＣと（Ｂ）、ＡＤ脳ＶＳＭＣと（Ｃ）、及びＡｄ．ｓｈＳＲＦ（Ｅ）又はＡｄ．ｓｈＧＦＰ（Ｄ）を形質導入したＡＤ  ＶＳＭＣとともにＣｙ３標識Ａβ４２で被覆したマルチスポットガラススライドの蛍光顕微鏡法。Ｃｙ３−Ａβ４２シグナル及びヘキスト核染色。（Ｆ）レセプター関連タンパク質（ＲＡＰ）有り又は無しの対照ＶＳＭＣ、及び単独及びＡｄ．ｓｈＧＦＰ又はＡｄ．ｓｈＳＲＦを形質導入したＡＤ  ＶＳＭＣにおける相対Ｃｙ３−Ａβ４２蛍光強度。非処理無細胞スライドのシグナル強度を任意に１００％として採用した。（Ｇ）対照脳ＶＳＭＣ及びＡＤ脳ＶＳＭＣにおける、及びＡｄ．ｓｈＧＦＰ及びＡｄ．ｓｈＳＲＦを形質導入したＡＤ脳ＶＳＭＣにおけるＬＲＰレベル。平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝群当たり３つの独立した培養物から９回の測定。
【図６】図６は、脳ＶＳＭＣ収縮にＣａ２＋イオンが必要とされること、及びＣａ２＋流入がアルツハイマー病ＶＳＭＣにおいて変化していないことを示している。（Ａ）Ｃａ２＋フリークレブス溶液における脳ＶＳＭＣの弛緩。（Ｂ）Ｃａ２＋フリー培地で培養された脳ＶＳＭＣにおける塩化カリウム（ＫＣｌ）誘発収縮の欠如。平均±ｓ．ｅ．ｍ．ｎ＝３つの異なった培養物からの培養物当たり５０細胞。（Ｃ）ＫＣｌに応答したＡＤ及び同年齢対照脳ＶＳＭＣにおけるＣａ２＋流入。群当たり３つの独立した培養物からの平均±ｓ．ｅ．ｍ．。
【図７】図７は、Ａβがヒト脳ＶＳＭＣにおけるＳＲＦ発現に影響しないことを示している。（Ａ）ヒトＶＳＭＣを、正常培養培地又は２０μＭ  Ａβ４２オリゴマー又は凝集体と８、２４又は７２時間インキュベートした。ＳＲＦレベルはウエスタンブロット分析により決定した。（Ｂ）ＳＲＦ対β−アクチンバンドのシグナル強度のスキャニングデンシトメトリーにより決定された相対ＳＲＦレベル。群当たり３つの独立した培養物からの平均±ｓ．ｅ．ｍ．。
【図８】図８は、１８〜２２ヶ月齢ＡＰＰｓｗ＋／−マウスの動脈脳微小血管におけるＳＲＦ発現は血管周囲のＡβ沈着に依存しないことを示している。１８〜２２ヶ月齢ＡＰＰｓｗ＋／−マウスにおいて、それぞれ、（Ａ）ＳＲＦ陽性血管（矢印）はごくまれにＡβについて陽性であり（矢頭）、一方、（Ｂ）ＳＲＦ陽性血管（矢頭）は典型的にはＳＲＦ免疫染色について陰性である。（Ｃ）２０ヶ月齢対照同腹子マウスにおけるＳＲＦ陽性免疫染色（矢印）及びＡβについての陰性染色。バー＝１００μｍ。（Ｄ）１８〜２２ヶ月齢のＡＰＰｓｗ＋／−マウス及び同年齢同腹子対照マウスにおける相対的ＳＲＦ強度／ｍｍ２。対照マウスにおけるＳＲＦ強度は任意に１として設定した。群当たり３匹のマウスからの平均±ｓ．ｅ．ｍ．。
【図９】図９は、Ａβ沈着が共存するアルツハイマー病の脳血管におけるＳＲＦ発現を示している。ＡＤ患者に由来する脳組織中のＳＲＦ（Ａ）及びＡβ（Ｂ）についての二重免疫染色。（Ｃ）合併した像は脳血管におけるＳＲＦ染色とＡβ沈着の共存を示す。バー＝２５μｍ。データは５つのＡＤ症例を代表している。対照的に、同年齢対照個体の脳血管において、ＳＲＦ又はＡβは比較的にわずかしか染色されない（示されていない）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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