(57)【要約】特定の分析物に対するイムノアッセイで使用するために増大した感度または増大した特異性を有するモノクローナル抗体試薬を精製するための方法、およびそのような抗体試薬を用いるアッセイ。モノクローナル抗体試薬は異なるｐＨでのモノクローナル抗体精製ロットの連続的な溶出によって調製される。一実施形態において、本発明は、イソサブクラスの部分集団を含む異種モノクローナル抗体調製物から得られた１種以上のイソサブクラスを含むモノクローナル抗体試薬に関する。
2009508087.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の分析物の存在または量を決定するためのイムノアッセイであって、該イムノアッセイは、
モノクローナル抗体試薬を提供する工程であって、該モノクローナル抗体試薬は、各々が該分析物を認識し該分析物に特異的に結合する１以上の異なるイソサブクラスの部分集団を含み、そのような部分集団は、該部分集団が由来する異種モノクローナル抗体におけるイソサブクラスの集団に存在する異なるイソサブクラスのうちすべてに満たないクラスを含む、工程；
該モノクローナル抗体試薬を該サンプルと、該モノクローナル抗体が該サンプル中の分析物に結合するために十分な時間の間組み合わせる工程
を包含し、該モノクローナル抗体試薬を用いて行われる該イムノアッセイは、該異種モノクローナル抗体を用いて行われるイムノアッセイより良好な特異性または感度を示す、イムノアッセイ。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体試薬が固定されているか、または固相に固定され得る、請求項１に記載のイムノアッセイ。
【請求項３】
前記サンプルおよびモノクローナル抗体試薬と指示試薬とを組み合わせる工程をさらに包含し、該指示試薬は、該サンプル中の分析物の存在または量に関連する量で該モノクローナル抗体試薬または分析物に特異的に結合する結合タンパク質を含む、請求項２に記載のイムノアッセイ。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体試薬が、前記指示試薬の結合タンパク質が結合するエピトープ部位と異なる前記分析物のエピトープ部位に特異的に結合する、請求項３に記載のイムノアッセイ。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体試薬が標識されており、前記サンプル中に存在する分析物の存在または量が、該分析物に結合したモノクローナル抗体試薬の量を測定することによって決定される、請求項１に記載のイムノアッセイ。
【請求項６】
前記分析物がトロポニンである、請求項２に記載のイムノアッセイ。
【請求項７】
前記分析物が心筋トロポニンＩ、心筋トロポニンＩＣまたは心筋トロポニンＩＴＣ複合体である、請求項６に記載のイムノアッセイ。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体試薬が、精製されたモノクローナル異種抗体の１回以上の溶出を用いて得られ、第１の溶出が第１のｐＨを有する緩衝液を用いて行われ、第２の溶出が第２のｐＨを有する緩衝液を用いて行われる、請求項１に記載のイムノアッセイ。
【請求項９】
前記第１のｐＨが約４．５であり、前記第２のｐＨが約３．２である、請求項８に記載のイムノアッセイ。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体試薬が、イソサブクラスの部分集団に分離されたＩｇＧ２ｂ抗心筋トロポニンＩ抗体である、請求項７に記載のイムノアッセイ。
【請求項１１】
サンプル中の分析物の存在または量を検出するための試験キットであって、該試験キットは、
モノクローナル抗体試薬であって、該モノクローナル抗体試薬は、該分析物を認識し、該分析物に結合し；そして固相に固定されているか、または検出可能な標識で標識されている、モノクローナル抗体試薬
を備え、
該モノクローナル抗体試薬が固相に固定されている場合、該キットはさらに指示試薬を含み、該指示試薬は、該サンプル中の分析物の存在または量に関連する量で該抗体試薬または分析物に特異的に結合する標識された結合タンパク質を含み、あるいは該モノクローナル抗体試薬が検出可能な標識で標識されている場合、該キットはさらに、固相に結合された捕捉結合タンパク質を含み、該捕捉結合タンパク質は、該サンプル中の分析物の存在または量に関連する量で該モノクローナル抗体試薬または分析物のいずれかに結合し得、
該モノクローナル抗体試薬は、各々が該分析物を認識し該分析物に特異的に結合する１以上の異なるイソサブクラスの部分集団を含み、そのような部分集団は、該部分集団が由来する異種モノクローナル抗体におけるイソサブクラスの集団に存在する異なるイソサブクラスのうちすべてに満たないクラスを含み；該モノクローナル抗体試薬を用いるイムノアッセイの感度および特異性は、該異種モノクローナル抗体を用いて行われるイムノアッセイの感度または特異性よりも改良される、試験キット。
【請求項１２】
前記標識が、酵素、酵素反応の基質、蛍光標識および化学発光標識からなる群より選択される、請求項１１に記載の試験キット。
【請求項１３】
前記標識がアルカリホスファターゼである、請求項１１に記載の試験キット。
【請求項１４】
前記分析物がトロポニンである、請求項１１に記載の試験キット。
【請求項１５】
前記分析物が、心筋トロポニンＩ、心筋トロポニンＩＣまたは心筋トロポニンＩＴＣ複合体である、請求項１２に記載の試験キット。
【請求項１６】
前記モノクローナル抗体試薬が、精製されたモノクローナル異種抗体の１回以上の溶出を用いて得られ、第１の溶出が第１のｐＨを有する緩衝液を用いて行われ、第２の溶出が第２のｐＨを有する緩衝液を用いて行われる、請求項１１に記載の試験キット。
【請求項１７】
前記第１のｐＨが約４．５であり、前記第２のｐＨが約３．２である、請求項１６に記載の試験キット。
【請求項１８】
前記モノクローナル抗体試薬が、イソサブクラスの部分集団に分離されたＩｇＧ２ｂ抗心筋トロポニンＩ抗体である、請求項１４に記載のイムノアッセイ。
【請求項１９】
所望のイソサブクラスの部分集団を含む標的に特異的に結合するためのモノクローナル抗体試薬であって、そのような部分集団は、異種モノクローナル抗体に存在するイソクラスの集団から１種以上のイソサブクラスを除去することによって生成され、該モノクローナル抗体試薬は、異種モノクローナル抗体よりも良好な特異性で該標的を認識し、該標的に結合する、モノクローナル抗体試薬。
【請求項２０】
前記モノクローナル抗体試薬が、精製されたモノクローナル異種抗体の１回以上の溶出を用いて得られ、第１の溶出が第１のｐＨを有する緩衝液を用いて行われ、第２の溶出が第２のｐＨを有する緩衝液を用いて行われる、請求項１９に記載のモノクローナル抗体試薬。
【請求項２１】
前記標的がトロポニンである、請求項１９に記載のモノクローナル抗体試薬。
【請求項２２】
標的に特異的に結合するモノクローナル抗体試薬を生成するための方法であって、該方法は、
該標的に特異的に結合し、イソサブクラスの集団を含む異種モノクローナル抗体免疫グロブリン溶液を提供する工程；
モノクローナル抗体免疫グロブリンの単一のサブクラスを選択マトリクスに結合させる工程；
結合したモノクローナル抗体免疫グロブリンのイソサブクラスの部分集団を溶出によって下位分画する工程；
イソサブクラスの１以上の部分集団を選択的に除去する工程であって、該部分集団は、該マトリクスからの該異種モノクローナル抗体免疫グロブリンの集団よりも少なくとも１少ないイソサブクラスを含む、工程；および
診断アッセイで使用するため、または目的の治療を果たすためにイソサブクラスの１以上の部分集団を選択する工程
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記標的がトロポニンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記標的が、心筋トロポニンＩ、心筋トロポニンＩＣまたは心筋トロポニンＩＴＣ複合体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記イソサブクラスの部分集団の下位分画が、カラムを第１のｐＨで緩衝液を用いて溶出する工程、次いで該カラムを第２のｐＨで緩衝液を用いて再度溶出する工程、次いで溶出物を回収する工程を包含する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１のｐＨが約４．５であり、前記第２のｐＨが約３．２である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記モノクローナル抗体試薬が、イソサブクラスの部分集団に分離されたＩｇＧ２ｂ抗心筋トロポニンＩ抗体である、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概して、モノクローナル抗体試薬の分野に関し、試薬を生成する方法およびイムノアッセイにおけるそのようなモノクローナル抗体試薬の使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
モノクローナル抗体は、診断目的および治療目的のために広範に使用されるようになっている。なぜなら、モノクローナル抗体は目的の標的分析物に特異的に結合する能力を有するからである。モノクローナル抗体は、イムノアッセイ、診断的適用、治療的送達システム、および細胞抽出で使用されている。モノクローナル抗体の使用のための適用が同定されるにつれて、そして特に、治療的送達システムの一部としてのモノクローナル抗体の使用に伴って、モノクローナル抗体を産生する新しい方法が開発されている。
【０００３】
モノクローナル抗体は、１９７０年代に、ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＫｏｈｌｅｒによって記載され、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６、４９５〜４９７頁（１９７５）で報告された方法を用いるハイブリドーマ技術の使用によって最初に産生された。この方法では、マウスまたは他の適切な動物に免疫原が注射される。その動物は屠殺され、そしてその動物の腹水からの脾細胞またはリンパ球が腫瘍細胞株融合され、したがってハイブリッド細胞またはハイブリドーマを産生する。ハイブリドーマは不死であり、遺伝的にコードされた抗体を産生し得る。ハイブリドーマの集団はスクリーニングされて、個々のクローンが単離され、その各々は、単一の抗体種を分泌する。現在、所望のモノクローナル抗体は、２つの方法（適切に調製されたマウスの腹腔への注射による方法（インビボ、または腹水方法）、またはインビトロ組織培養による方法）のいずれかで増殖される。インビトロでモノクローナル抗体を産生するための最も単純なアプローチは、バッチ中でハイブリドーマ培養物を増殖させ、その培養培地から所望のモノクローナル抗体を精製することである。組織培養培地におけるウシ胎仔血清のような血清の使用は、その血清が得られた動物によって産生された免疫グロブリンを含み、それが汚染を生じるので、多くの企業はハイブリドーマ細胞株の増殖を支援するために無血清培地製剤を開発してきた。
【０００４】
免疫グロブリンは、体内で天然に産生され、すべて同じ基本単位を含む。それらすべては、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖から構成される４つの鎖構造を有する。その重鎖および軽鎖の両方は、そのアミノ酸配列の可変性に基づく２つの領域（可変領域および定常領域）を含む。免疫グロブリンは、その重鎖の定常領域中のアミノ酸配列の相違に基づいて５つの異なるクラスに分けられ得る。α、γ、δ、εおよびμと称される５つの主要な重鎖のクラスが存在し、それぞれ、対応する免疫グロブリンクラスＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭを規定する。いくつかのクラスは、その重鎖の定常領域中のアミノ酸配列の小さな相違に基づいてサブクラスに分けられる。ＩｇＧの４つのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）、ならびにＩｇＡの２つのサブクラス（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）が同定されている。
【０００５】
重鎖定常領域を規定するクラスおよびサブクラスに加えて、軽鎖は、その軽鎖の定常領域中のアミノ酸配列の相違に基づいてサブタイプに分けられ得る。特定のモノクローナル抗体をそのクラスおよびサブクラスへ特徴付けることは、ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体の型を同定するための手段としての役割を果たす。この知見は、そのサブクラスの物理的特性および生化学的特性に基づくモノクローナル抗体のための精製スキームの作製に役立ち得る。
【０００６】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、代表的に、検出もしくは定量されるサンプル中の分析物の量が非常に低い濃度であることが理由でアッセイが非常に感度がよくなければならない場合に、イムノアッセイで使用される。しかし、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の使用は、その患者サンプル中に存在する成分への抗体の非特異的結合を生じ得る。そのような成分の存在は、イムノアッセイを妨げ得る偽陽性または偽陰性の結果を生じる。例えば、サンプル中に存在する内因性免疫グロブリンまたは補体タンパク質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と非特異的に反応し得る。免疫グロブリンに対して向けられる抗動物抗体（一般に、異好性抗体（ｈｅｔｅｒｏｐｈｉｌｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）として知られる）が患者の血清または血漿に存在することは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いる任意のイムノアッセイ形式において誤った結果を潜在的に生じ得る。
【０００７】
各々分析物分子における異なるエピトープに向けられる２つの抗体を用いるツーサイトサンドイッチ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ  ｓａｎｄｗｉｃｈ）イムノアッセイにおいて、異好性抗体によって引き起こされる干渉は、誤った結果の源として認識されている。特定のツーサイトサンドイッチアッセイ（例えば、ヒト心筋トロポニンＩについてのアッセイ）において、偽陽性の結果が、しばしば、異好性抗体に起因して報告されている。異好性ブロック剤は、いくつかのサンプルに対するイムノアッセイにおいて偽陽性の減少を生じるが、すべてのサンプルに対してではない。ツーサイトサンドイッチイムノアッセイを含むイムノアッセイの特異性および感度を改良することは、誤った結果の発生をさらに減少し得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
特定のクラスおよびサブクラスのモノクローナル抗体は、哺乳動物の腹水および培養物中でハイブリドーマを増殖させることによるインビトロ技術を用いて産生される。免疫グロブリンのクラスの所望のサブクラスのモノクローナル抗体は、プロテインＡまたは他のリガンドへの親和性の相違を用いるアフィニティークロマトグラフィーの使用を包含する種々の方法を用いて精製される。より最近、等電点電気泳動が、電荷の相違に起因する特定のサブクラスの分析物とのモノクローナル抗体の集団の相違を同定するために、他の分離方法と組み合わせて使用されている。他の物理的相違はまた、培養条件の変化に起因して単一のサブクラスから分離可能な免疫グロブリン間で存在し得る。高度に精製されたモノクローナル免疫グロブリン調製物の中で、複数の異なる部分集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の間で物理的特性のわずかな相違の結果として溶出条件を変化させることによって、そのモノクローナル免疫グロブリン調製物の中から免疫グロブリン分子のその複数の異なる部分集団が分離可能である。単一の免疫グロブリンサブクラスまたはアイソタイプから分離可能な免疫グロブリンの異なる部分集団の間で観察される１つのそのようなわずかな相違は、見かけの電荷の相違である。本開示の目的のために、単一のサブクラスまたはアイソタイプに由来する免疫グロブリンを含む免疫グロブリン調製物から分離可能な、他の異なる免疫グロブリンの同一の同定可能な物理的特性とわずかに異なる同定可能な物理的特性を有し、かつ分析物に結合する、各々のそのような異なる免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子の群は、「イソサブクラス（ｉｓｏｓｕｂｃｌａｓｓ）」と称するものとする。
【０００９】
例えば、純粋なＩｇＧサブクラス調製物は、個々のアイソフォームに分解される。これらのサブクラスアイソフォーム集団を個々の集団的なサブグループに分割することは、サブクラスアイソフォーム編集（ｓｕｂｃｌａｓｓ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｅｄｉｔｉｎｇ）と称され得、これは、存在するアイソフォームのうちの１つより多くかつすべてに満たないクラスを含み得る。サブクラスアイソフォーム編集は、本明細書で言及される「イソサブクラス」の生成をもたらす。免疫グロブリン分子または「イソサブクラス」の分離可能な群における各々の免疫グロブリン分子は、同一のアミノ酸配列を有し、異種免疫グロブリン調製物を生成するために使用される分析物に結合する。用語「イソサブクラス」における「サブクラス」の使用は、免疫グロブリン分子の重鎖の相違に関連する相違に制限されるのではなく、その分子の他の免疫グロブリン構成要素の相違に関連する物理的特性も含む。
【００１０】
別の局面において、イソサブクラスは、Ｎ−結合型オリゴ糖プロフィールの相違を用いて分画（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅ）され得る。この説明に束縛されることなく、本発明者らは、イソサブクラス間の物理的特性は翻訳後改変の結果であり、そしてそのような物理的特性は培養条件によって変化し得ると考える。例えば、イソサブクラス間の電荷における物理的な相違は、おそらく、特定の免疫グロブリンエピトープの電荷マスキング（ｃｈａｒｇｅ  ｍａｓｋｉｎｇ）（これは次いで、フォールディングまたは見かけの等電電荷（ｉｓｏ−ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｃｈａｒｇｅ）の相違を招く）に起因する。上記改変は、グリケーションの変化に関連し得る。
【００１１】
本発明者らは、そのようなイソサブクラス間の物理的相違が、イムノアッセイおよび他の適用においてイソサブクラスの異なる部分集団の示差的な機能的性質を生じることを見出した。イムノアッセイでは、標的抗原に弱い親和性を有するイソサブクラスは、感度により負の影響を与える可能性があり得る。イムノアッセイでは、より均質なグリケーションパターンを有するイソサブクラスは、抗動物免疫グロブリンとの結合を減少し得、したがって、偽陽性の結果の減少を生じる。
【００１２】
本発明は、インビトロで生成された腹水原料から得られた、またはインビトロ技術を用いて生成される抗体から得られたモノクローナル抗体のサブクラスの異なるイソサブクラスが、そのような示差的な機能的性質を引き起こす物理的な相違を有するという認識に関する。一実施形態において、本発明は、イソサブクラスの部分集団を含む異種モノクローナル抗体調製物から得られた１種以上のイソサブクラスを含むモノクローナル抗体試薬に関する。別の実施形態では、分析物に特異的に結合するモノクローナル抗体試薬が、その分析物の存在または量を検出するために使用され、そのモノクローナル抗体試薬は、イソサブクラスの１種以上の部分集団を含む。そのような部分集団の各々は、異種モノクローナル抗体調製物から分離可能な１種以上のイソサブクラスを含み、現在そのような異種モノクローナル抗体調製物から精製されるモノクローナル抗体は、分離不可能なイソサブクラスの集団を含む。本明細書で使用される場合、用語「異種モノクローナル抗体」とは、精製されたモノクローナル抗体調製物中に存在するイソサブクラスの全集団を指し、そのようなモノクローナル抗体は結合する。イソサブクラスの部分集団は、分析物に対するアッセイの特異性および／または感度が、異種モノクローナル抗体が使用されるアッセイの特異性および／または感度よりも改良されるように選択される。
【００１３】
本発明の一局面において、異種モノクローナル抗体から１種以上のイソサブクラスの部分集団を分離するための方法が記載され、ここで、上記異種モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体が結合する選択マトリクスの分離カラムに適用され、その後、様々な条件下で溶出されて、その異種モノクローナル抗体を構成する分離されていないイソサブクラスの集団からイソサブクラスの部分集団が分離される。溶出条件は、イソサブクラスの部分集団間の所望の物理的相違に依存して変化する。例えば、一実施形態において、異なるｐＨでのクロマトフォーカシング溶出を行う段階的プロセスにより、異種モノクローナル抗体におけるイソサブクラスの集団に存在する１種以上の望ましくないイソサブクラスが排除された、分離されたイソサブクラスの部分集団の生成、および／または分離されたイソサブクラスの部分集団への１種以上の所望のイソサブクラスの含有が生じ、ここで、上記分離された部分集団は、異種モノクローナル抗体におけるイソサブクラスの集団に存在するイソサブクラスのうちのすべてに満たないクラスを含む。
【００１４】
なお別の実施形態において、ヒト心筋トロポニンＩ抗原（ｃＴｎＩ）に特異的に結合するモノクローナル抗体試薬が、イソサブクラスの部分集団を含んで生成され、ここで、部分集団が得られる異種モノクローナル抗体に存在するイソサブクラスの集団における１種以上のイソサブクラスは、モノクローナル抗体試薬に含まれない。一実施形態において、上記モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体調製物を高いｐＨ条件下でアフィニティー樹脂に結合させ、その後、所定のより低いｐＨで予備溶出分画（ｐｒｅ−ｅｌｕｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）して、イソサブクラスの部分集団を選択的に得ることによって調製され、ここで、異種モノクローナル抗体におけるイソサブクラスの集団から１種以上のイソサブクラスが排除される。次いで、最終的なモノクローナル抗体試薬は、イソサブクラスの所望の部分集団を含む異種抗体画分を選択的に溶出するために使用されたｐＨとは異なる所定の低いｐＨで溶出された。種々の結合条件および溶出条件が、イソサブクラスの所望の部分集団をモノクローナル抗体試薬に含めるために使用され得、ここで、そのような所望の部分集団は、異種モノクローナル抗体におけるすべてのイソサブクラスの集団と比較した場合の、そのような部分集団の機能的性質の相違に基づいて選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（詳細な説明）
本発明の１つの方法において、インビボまたはインビトロ技術を用いて生成された免疫グロブリンの単一のクラスのモノクローナル免疫グロブリン分子を含む腹水または細胞培養培地は、免疫グロブリンのあるクラスのサブクラスが示差的に結合する基質（例えば、プロテインＡ）を含むアフィニティーカラムまたは他のマトリクスを流される。モノクローナル免疫グロブリン分子は、目的の分析物に特異的に結合するように選択される。免疫グロブリンクラスのモノクローナル抗体調製物をサブクラスまたはアイソタイプに分離し、そのようなサブクラスまたはアイソタイプの画分を精製するための方法は、当該分野で周知である。本明細書で使用される場合、語句「特異的に結合する」とは、免疫グロブリン分子が目的の分析物と免疫学的に反応する能力を指す。
【００１６】
抗体が結合したカラムは、次に、洗浄緩衝液で洗浄されて、そのカラムからいずれの不純物も除去される。本発明の一局面において、イオン強度を低下させることを伴う首尾よい洗浄が使用され得、一方でｐＨは一定に保たれる。
【００１７】
１以上の段階的な溶出洗浄が、モノクローナル抗体調製物の結合したカラムに適用される。このような溶出は、一連の酸性洗浄剤を用いてｐＨレベルを減少させて行われ得る。適切な溶出洗浄剤の例としては、グリシンおよびクエン酸が挙げられる。本発明の一実施形態において、粗製のモノクローナル抗体が高ｐＨ緩衝液中でマトリクスに結合される。次いで、結合した抗体調製物は、選択的低ｐＨ緩衝液を用いて段階的溶出を用いて洗浄される。
【００１８】
連続溶出プロセスは、イソサブクラスの異なる結合特徴を生かして、抗体調製物の生成中に生成されたすべてのイソサブクラスの集団を含む、結合した異種モノクローナル抗体集団から特定のイソサブクラスを除去する。減少するｐＨレベルでマトリクスを溶出することによって、１種以上のイソサブクラスの別個の部分集団が各洗浄とともに除去される。これらの部分集団は、異なる結合性質を示すイソサブクラスを含む。結果として、望ましくないイソサブクラスが選択的溶出によって除去されて、改良された性質を有する１種以上の望ましいイソサブクラスの部分集団が得られ得る。
【００１９】
本発明の一局面において、モノクローナル抗体の連続溶出を使用して、望ましくないイソサブクラスが除去され得る。結合の後、１回以上の溶出が行われ得る。これらの溶出の間に溶出されたイソサブクラスの部分集団は、望ましくないイソサブクラスを含む。次いで、１回以上のその後の溶出が、異なるｐＨ条件で行われ、望ましいイソザブクラスの部分集団が得られる。
【００２０】
別の局面において、本発明の方法を使用して、分析物に対するアッセイの感度および／または特異性が改良され得る。改良された感度とは、本明細書で使用される場合、本発明のモノクローナル抗体試薬が分離された異種モノクローナル抗体調製物を用いて同じ条件下で行われるアッセイで得られるバックグラウンドレベルおよびシグナル対ノイズ比と比較した場合に、その本発明のモノクローナル抗体試薬を用いて得られる低下したバックグラウンドおよび増加したシグナル対ノイズ比を意味する。改良された特異性とは、本明細書で使用される場合、サンプル中で妨害する異好性物質へのモノクローナル抗体の結合の減少および／またはそのアッセイで使用されたモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体試薬である場合に、そのアッセイにおいて、モノクローナル抗体として異種モノクローナル抗体調製物を用いて行われたアッセイよりも誤った結果が減少することを意味する。
【００２１】
低い感度および／または特異性を有するか、あるいは誤った結果を生成する可能性が高い望ましくないイソサブクラスは、同定され得、そして選択的クロマトフォーカシングを通して異種モノクローナル抗体調製物集団から除去され得る。得られるイソサブクラスの部分集団は、モノクローナル抗体試薬として、分析物に結合するそのモノクローナル抗体試薬をサンプルと組み合わせて、そのサンプル中のその分析物の存在または量を決定することによって、イムノアッセイにおいて使用される。モノクローナル抗体試薬は固定され得るか、または固相に固定され得る。
【００２２】
固相は、例えば、ガラス、紙、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、アミラーゼ、天然のセルロースおよび改変されたセルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、またはマグネタイトのような物質で構成され得る。固相の構造的コンフギュレーションは、特定のイムノアッセイにおける使用の利便性で変化する。その構造的コンフギュレーションは球形（ビーズなど）、円筒形（試験管の内面など）であり得るか、または平坦（例えば、試験ストリップ）であり得る。
【００２３】
イムノアッセイは、少なくとも１種の抗原（すなわち、分析物）と少なくとも１種の抗体との間の反応に関連するサンプル中のその分析物の存在または量を検出するための方法である。抗原は、タンパク質または炭水化物、またはそれらのフラクションのような物質であり、免疫グロブリンを産生する動物またはヒトに導入された場合に免疫応答を誘導し得る。抗体が結合する抗原上の部位は、エピトープと称される。ほとんどの抗原は、抗体に対して複数の、そしてしばしば反復する結合部位を有する。この抗原のポリエピトープ（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）性質および抗体の構造（エピトープ結合部位を有する２つの軽鎖）は、抗体：抗原複合体がイムノアッセイにおいて形成されることを可能にする。サンプル中の分析物の存在または量は、抗原に対する抗体の結合によって形成する免疫複合体の量に関連する。多くのイムノアッセイにおいて、免疫複合体の存在は、サンプル中の抗原の存在または量に関連する量で抗体もしくは抗原もしくは免疫複合体に特異的に結合する結合タンパク質を含む指示試薬を調製することによって決定され、ここで、その結合タンパク質は、シグナル生成化合物で標識される。「標識」、「標識された（標識した）」および「標識された結合体」などは、結合成分またはタンパク質と化学標識（例えば、酵素、蛍光化合物、放射性同位体、発色団、または任意の他の検出可能な化学種）との結合体であって、その結合パートナーに特異的に結合する能力を有するものを指す。
【００２４】
本発明のモノクローナル抗体試薬の、異種モノクローナル抗体よりも改良された性質は、サンプル中のヒト心筋トロポニンＩ（「ｃＴｎＩ」）の存在または量を検出するために、アッセイにおいて特に有用である。ｃＴｎＩについてのイムノアッセイのローエンドな感度および特異性を改良することは、興味深いことである。なぜなら、心筋の筋肉細胞の損傷のない健常な個体の血流中にｃＴｎＩは全く存在しないからである。異種モノクローナル抗体を用いるイムノアッセイでは、異好性抗体として知られる免疫グロブリンに対する抗動物抗体のような物質の存在に部分的に起因する偽陽性の結果の発生が、このツーサイト（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ）アッセイで特に重要である。
【００２５】
本発明の別の局面において、本発明の望ましいイソサブクラスの部分集団を含む選択的に増強されたモノクローナル抗体試薬は、目的の分析物の存在または量を検出するために、試験キットに含まれる。「キット」は、通常は必要な緩衝液、塩、および安定剤とともに配合される試薬の組み合わせを指すように本明細書で使用され、ここで、試薬は、アッセイ感度を少なくとも実質的に最適化するように前処理される。試験キットは、望ましくないイソサブクラスがクロマトフォーカシング溶出によって除去されたイソサブクラスの部分集団から構成されるモノクローナル抗体試薬を含む。抗体試薬は固定され得るか、常磁性粒子のような固相に固定され得る。望ましくないイソサブクラスを除去することによって、残りのイソサブクラスは特定の所望の特徴について選択され得る。
【００２６】
一実施形態において、イソサブクラスの部分集団は、モノクローナル抗体試薬がサンプルと組み合わされた場合に誤った結果（目的の分析物の存在または量が誤って示される）の数が減少するように選択される。試験キットはまた、サンプル中の目的の分析物の存在または量に関連する量で目的の抗体試薬または分析物に特異的に結合する標識された結合タンパク質を含む指示試薬を含む。適切な標識の例としては、酵素、酵素反応の基質、蛍光標識および化学発光標識が挙げられる。本発明に有用な１つの特定の標識は、アルカリホスファターゼである。
【００２７】
以下の実施例は本発明の例示であり、添付の特許請求の範囲に示されるような本発明の範囲を制限することを意図しない。
【実施例】
【００２８】
実施例１：グリシンを用いる抗ｃＴｎＩのクロマトフォーカシング溶出
無血清培地を使用して、ＣＴｎＩ１９Ｃ７  ２８４細胞を増殖させ、ヒト心筋トロポニンＩ、心筋トロポニンＩＣおよび心筋トロポニンＩＴＣ複合体に対してモノクローナルＩｇＧ２ｂ抗ｃＴｎＩ抗体を産生させた。これらの粗製の抗体を、ｐＨ８．６で高塩グリシン結合緩衝液を用いてシリカマトリクス上のプロテインＡアフィニティー（例えば、ＰｒｏＳｅｐ  Ａ親和性培地）樹脂に固定した。次いで、結合した抗体のカラムを、ｐＨを一定に保ちながらイオン強度が減少する連続的な低塩グリシン洗浄剤を用いて洗浄した。次いで、溶出洗浄物でイソサブクラスの分離を行った。第１の溶出を、ｐＨ４．５で１００ｍＭ  グリシン／ＨＣｌを用いて行い、イソサブクラスの１つの部分集団を得た。次いで、より低いｐＨ溶出を、ｐＨ３．２で１００ｍＭ  グリシンを用いて行い、イソサブクラスの異なる部分集団を得た。この２つの溶出物を、２Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）に取り、そのそれぞれのモノクローナル抗体プールをすぐに中性にし、低ｐＨストレスを最小にした。イソサブクラスの溶出部分集団を、その後の分析の間に比較した。
【００２９】
４．５および３．２のｐＨ溶出物のトロポニンに対するモノクローナル抗体のＩｇＧ２ｂの種々の精製ロットの生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）製の市販の等電点電気泳動ゲルを用いて、等電点電気泳動によって比較した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎタンパク質マーカーも使用した。その結果を図１に示す。カラム１は、３−１０Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎマーカーを示す。カラム２は、精製ロットＭ０１０６−５２−１１４Ａから分離したイソサブクラスを示す。カラム３は、精製ロットＭ０１０６−５２−１１４Ｂを用いて分離したイソサブクラスを示す。カラム４は、精製ロットＭ０１０６−５２−１１５Ａでの４．５ｐＨ溶出液を含む。カラム５は、精製ロットＭ０１０６−５２−１１５Ｂから得られた３．２ｐＨ溶出液を含む。カラム６は、精製ロットＭ０１０７−５２−１１６Ｂの分離を示す。カラム７は、精製ロットＭ０１０７−５２−１１７Ｂの溶出物を示す。カラム８は、精製ロットＭ０１０７−５２−１１８Ｂの分離を示す。カラム９は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製の２．５−６．５タンパク質マーカーで得られた分離を示し、カラム１０は、３−１０Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎマーカーでの分離を示す。分離バンドは、個々のイソサブクラスに対応する。２つのカラムは共通の３つのバンドを含み、両方の部分集団溶出液に３つのサブクラスが含まれることを示した。しかし、各カラム（部分集団）は、他のカラムに見出されないバンド（イソサブクラス）も含む。これらの固有のバンドは、特定のサブクラスが段階的ｐＨ溶出プロセスによって選択的に除去されたことを示す。
【００３０】
表ＩおよびＩＶ（実施例２を参照のこと）に示されるように、本発明の連続的溶出方法により、コントロールおよび４．５ｐＨ溶出画分の両方と比較して、改良されたシグナル対ノイズ比（Ｓ１／Ｓ０）および増大した用量応答（Ｓ５／Ｓ０）を有する３．２溶出画分を得た。４．５および３．２ｐＨ溶出物を、以下のとおりにアッセイ感度について分析した。各々の溶出された抗体画分を、常磁性粒子（サンプル中の心筋トロポニンＩ（分析物）を捕捉するための固相支持体）に結合させた。結合した分析物を、酵素に結合体化させた二次抗心筋トロポニンＩモノクローナル抗体によって検出した。インキュベーションおよび結合していない酵素を除去するための洗浄工程の後、その酵素標識と反応して光を生じる化学発光基質を添加した。生じた相対発光量（ＲＬＵ）は、分析物濃度に正比例した。表１に示されるデータは、６つのキャリブレータレベル（それぞれ、Ｓ０、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４およびＳ５において、１ｍＬの分析物あたり０ｎｇ、０．３ｎｇ、１．２ｎｇ、２５ｎｇおよび１００ｎｇ）で測定したＲＬＵを示す。シグナル対ノイズ比を、最も低いキャリブレータレベルとＳ０とのＲＬＵの比から計算した。表Ｉに示されるように、プロテインＡ結合ＩｇＧの連続溶出によって精製された捕捉モノクローナル抗体は、ｐＨ３．２での従来の単一の溶出緩衝液と比較して、より低いＳ０  ＲＬＵおよびより高いＲＬＵ応答を生じた。グリシンおよびクエン酸緩衝液の両方が、類似の結果を生じた。２種の異なるｐＨで上記の緩衝液を用いる連続溶出による捕捉モノクローナル抗体の精製は、心筋トロポニンＩイムノアッセイに増大した感度の性質をもたらした。図１に示されるように、３．２ｐＨ溶出液は、ｐＨ４．５溶出液と異なるイソサブクラスの集団を含み、捕捉抗体試薬は、４．５ｐＨ溶出液中に見出されるあまり望ましくないイソサブクラスを排除することによって、４．５または単一のｐＨ３．２溶出からの抗体試薬より良好な感度を生じる。
【００３１】
【表１】
2009508087.tif 000003
心筋トロポニンＩアッセイを、表ＩＩおよびＩＩＩに示されるように、４．５および３．２ｐＨグリシン希釈物の特異性を評価するためにも行った。各々の溶出した抗体画分を、心筋トロポニンＩを捕捉するための固相としての常磁性粒子に結合させた。結合した分析物を、酵素に結合体化させた二次抗心筋トロポニンＩモノクローナル抗体によって検出した。腹水増殖細胞によって産生させ、ｐＨ３．２での標準的な１工程溶出によって精製したモノクローナル抗体を、コントロールとして使用した。インキュベーションおよび結合していない酵素をサンプルから除去するための洗浄工程の後、化学発光基質を添加した。ＲＬＵは、分析物濃度に正比例した。アッセイした１２個のサンプルの心筋トロポニンＩ（ｎｇ／ｍＬで測定した）を、ストアードマルチポイントキャリブレーション曲線（ｓｔｏｒｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）（例えば、市販のＡｃｃｕＴｎＩアッセイキャリブレータおよびＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）によって販売されるイムノアッセイキットで使用されるキャリブレーションカーブ）を用いて決定した。１２個のサンプルのすべては、コントロール抗体試薬を用いて偽陽性のトロポニン値（健常な成人の９９パーセンタイルよりも大きい（０．０４ｎｇ／ｍＬ））を生じた。表ＩＩおよびＩＩＩに示される第１のサンプルは、マウスＩｇＧ免疫化ヤギからのサンプルであった。残りのサンプルは、心筋障害を有さない健常な被験体から収集した異好性の患者サンプルであった。
【００３２】
アッセイにおいて検出モノクローナル抗体源として使用したモノクローナル抗体は、異なる供給源からのものであった。連続溶出によって精製した捕捉モノクローナル抗体は、
従来の単一のｐＨ溶出工程の方法と比較して、改良された心筋トロポニンＩアッセイ特異性を生じた。２工程精製捕捉モノクローナル抗体法によって決定した心筋トロポニンＩ値は、最初の６つのサンプルおよびヤギ抗マウス血清においてより低いことが示された。この結果は、段階的ｐＨ溶出が改良されたアッセイ特異性に寄与したことを示す。
【００３３】
【表２】
2009508087.tif 000004
【００３４】
【表３】
2009508087.tif 000005
表ＩＩおよびＩＩＩに示される改良された特異性は、本発明の精製方法で精製した捕捉抗体によってもたらされ、検出抗体として使用した二次モノクローナル抗体に依存しない。
【００３５】
実施例２：グリシンを用いる抗ｃＴｎＩ抗体のクロマトフォーカシング溶出
実施例１のように、モノクローナル抗体を生成し、アフィニティー樹脂に結合させ、そして洗浄した。次いで、結合した抗体を、グリシンをｐＨ４．５で、次いでｐＨ３．２で使用して、段階的溶出洗浄に供した。
【００３６】
上の実施例１のように、各々の溶出した抗体画分を、サンプル中に存在する心筋トロポニンＩを捕捉するための固相支持体として常磁性粒子に結合させた。結合した分析物を、酵素（アルカリホスファターゼ）に結合体化させた二次抗心筋トロポニンＩのモノクローナル抗体によって検出した。ＲＬＵを、６つのキャリブレータレベル（分析物１ｍＬあたり０．０ｎｇ、０．３ｎｇ、１．２ｎｇ、２５ｎｇおよび１００ｎｇ）を用いて測定した。
【００３７】
【表４】
2009508087.tif 000006
実施例１のように、連続溶出によって精製した捕捉モノクローナル抗体は、従来の単一のｐＨ溶出工程方法と比較して、改良された心筋トロポニンＩアッセイ感度を生じた。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態が記載されているが、種々の変更、適合および改変が、本発明の精神および添付の特許請求の範囲の範囲から逸脱することなくそれらの実施形態においてなされ得ることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、ｐＨ３．２での溶出画分とｐＨ４．５での溶出画分とを比較した、モノクローナル抗体の精製ロットからの溶出画分による等電点電気泳動ゲルの画像の図である。
【図１】
2009508087.tif 000007