(57)【要約】狭く規定された縦方向に均一な、及び非-無作為に組織化された空隙率及び孔密度を持つ細胞-支持基材、及びその調製のための方法である。基材は、関節の硝子質-様軟骨の成長及び新たな形成のための細胞性又は無細胞性の移植物の調製に適する。ゲル基材複合体系は、硝子質-様軟骨生成を軟骨細胞からインビボ及びインビトロで導き得る狭く規定される多孔性を持つコラーゲンに基づく基材を備える。
2009508596.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞支持基材であって、狭く規定され及び縦方向に均一な、及び非-無作為に組織化された空隙率及び孔密度を持ち、前記基材は生物学的適合性の物質から調製され、前記多孔性は孔寸法によって定められ、及び前記孔寸法は直径において実質均質である、細胞支持基材。
【請求項２】
前記生物学的適合性の物質は、I型コラーゲン、II型コラーゲン、IV型コラーゲン、ゼラチン、アガロース、ヒアルロニン、プロテオグリカンを含む細胞収縮性コラーゲン、グリコサミノグリカン、糖タンパク質、フィブロネクチン、ラミニン、生物学的に活性なペプチド増殖因子、サイトカイン、エラスチン、フィブリン、合成重合体繊維で、ポリ酸、ポリ乳酸(Aポリ酸のポリ乳酸)、ポリグリコール酸又はポリアミノ酸から作成されるもの、ポリカプロラクトン、ポリアミノ酸、ポリペプチドゲル、それらの共重合体、それらの前躯体及びそれらの組合せからなる群より選ばれ、前記前躯体は、アルファ1(I型)ペプチド、アルファ2(I型)ペプチド、2(アルファ1、I型)ペプチド、1(アルファ2、I型)ペプチド、3(アルファ1、II型)及びそれらの組合せからなる群より選ばれる、請求項1の基材。
【請求項３】
前記生物学的適合性の物質はI型コラーゲンである、請求項2の基材。
【請求項４】
前記孔寸法は約200±100ミクロン(μm)の範囲の内で少なくとも95%均質である、請求項3の基材。
【請求項５】
前記孔寸法は約200±100ミクロン(μm)の範囲の内で少なくとも98%均質である、請求項3の基材。
【請求項６】
前記基材は、無細胞性又は細胞性の移植物として関節軟骨の傷害又は損傷の処置及び修復のために適する、請求項4の基材。
【請求項７】
前記基材は、結合組織の傷害の処置のための無細胞性又は細胞性の移植物用に適する、請求項4の基材。
【請求項８】
前記基材は、硝子質又は硝子質様の軟骨、腱、靭帯又は半月板のインビトロ生産のために適する請求項4の基材。
【請求項９】
狭く規定され及び縦方向に均一な及び非-無作為に組織化された空隙率及び孔密度を持つ細胞支持基材を生産するにあたり、次の工程、即ち、
a. 前記基材を生物学的適合性の物質から調製する工程、及び
b. 孔寸法、孔分布の均質性及び孔の縦方向配向を定める工程
を備える、方法。
【請求項１０】
前記生物学的適合性の物質は、I型コラーゲン、II型コラーゲン、IV型コラーゲン、ゼラチン、アガロース、ヒアルロニン、プロテオグリカンを含む細胞収縮性コラーゲン、グリコサミノグリカン、糖タンパク質、フィブロネクチン、ラミニン、生物学的に活性なペプチド増殖因子、サイトカイン、エラスチン、フィブリン、合成重合体繊維で、ポリ酸、ポリ乳酸(Aポリ酸のポリ乳酸)、ポリグリコール酸又はポリアミノ酸から作成されるもの、ポリカプロラクトン、ポリアミノ酸、ポリペプチドゲル、それらの共重合体、それらの前躯体及びそれらの組合せからなる群より選ばれ、前記前躯体は、アルファ1(I型)ペプチド、アルファ2(I型)ペプチド、2(アルファ1、I型)ペプチド、1(アルファ2、I型)ペプチド、3(アルファ1、II型)及びそれらの組合せからなる群より選ばれる、請求項9の方法。
【請求項１１】
前記生物学的適合性の物質はI型コラーゲンである、請求項10の方法。
【請求項１２】
前記I型コラーゲンは約4から約8までのmg/mLのコラーゲンを備える溶液において調製される、請求項11の方法。
【請求項１３】
前記コラーゲンが水性アンモニアの存在において重合にかけられる請求項12の方法。
【請求項１４】
前記アンモニアは約3%の濃度において存在し、及び前記コラーゲンに約1からの約5までのmL容量で添加される、請求項13の方法。
【請求項１５】
前記コラーゲンは表面活性剤の存在において重合にかけられる、請求項14の方法。
【請求項１６】
前記表面活性剤は、重量によって0.3%の濃度において存在する、請求項15の方法。
【請求項１７】
前記重合は減圧下に約3 及び約10の間のトル(1トル=約0.133322kPa、約0.399966〜約1.33322kPa)で実行する、請求項13の方法。
【請求項１８】
前記重合は不活性雰囲気において実行する、請求項17の方法。
【請求項１９】
前記重合は窒素又はアルゴンの雰囲気の下で実行する、請求項18の方法。
【請求項２０】
前記コラーゲンは約4及び約6のmg/mLの間の濃度におけるものであり、約2-4からのmL容量において添加される3%アンモニアの存在において、及び約3トルの減圧下に、窒素雰囲気において、重合される、請求項13の方法。
【請求項２１】
前記重合は表面活性剤の存在において実行される、請求項20の方法。
【請求項２２】
狭く規定され及び縦方向に均一な及び非-無作為に組織化された空隙率及び孔密度を持つコラーゲンに基づく支持基材であって、前記基材はI型コラーゲンから調製され、前記多孔性は約200±100μmの孔寸法によって定められ、及び前記孔寸法は約95％の均質性である、基材。
【請求項２３】
軟骨細胞の懸濁物をゲル溶液において播種された、請求項22の基材。
【請求項２４】
前記ゲルは、コラーゲン、ゾル-ゲル又はヒドロゲルである、請求項23の基材。
【請求項２５】
前記ゾル-ゲルは、ゾルからゲルまでの転移温度、約37℃を持つ、請求項24の基材。
【請求項２６】
前記軟骨細胞は、25マイクロリッタ当り約25,000から約300,000までの細胞の細胞密度において播種される、請求項22の基材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
狭く規定される縦方向に均一な、及び非無作為に組織化された多孔性及び孔密度を持つ細胞支持基材、及びそれを調製するための方法に関する。
(発明の背景)(発明の分野)この発明は、狭く規定され、及び縦方向に均一な、及び非無作為に組織化された多孔性及び孔密度を持つ、生物学的適合性の細胞支持基材、及びそれを調製するための方法に関連する。とりわけ、本発明は、実質同じ寸法の孔を持つ生物適合性細胞-支持基材又は支持基質に関連し、前記基材又は基質は生きた細胞の懸濁物のための支持構造を提供する。基材は、縦方向に非無作為に配向し、実質均質な孔寸法、及び狭く規定される直径の開口孔を持つ。
【０００２】
支持基材は、軟骨細胞懸濁物をまかれ、成長の惹起及び硝子質又は硝子質様軟骨のインビトロ及びインビボでの新たな形成、並びに細胞性又は無細胞性の移植物の関節軟骨へのインサイツでの移植用の調製のために適する。
【０００３】
本発明は、そのうえ、コラーゲン基材複合系(システム)に関連し、それは軟骨細胞の懸濁物をまかれた前記支持基材を備え、前記系は硝子質又は硝子質様軟骨を軟骨細胞からインビトロで、又は関節軟骨中にインサイツで導入するときにはインビボで誘導し得るものである
【０００４】
(背景及び関連する開示)軟骨の欠陥及び傷害の修復用の移植物としての使用のためのコラーゲン基材はこの技術において既知である。特定の興味あるものは、コーケン社(株式会社高研、Koken Company, Ltd.)、日本、東京所在によって、商品名ハニカムスポンジの下で、開発されたハニカム構造であり、日本国特許第3170693号明細書に記述される。他のこの対象に関する特許は、組織工学のためのコラーゲンに基づく基質(米国特許第6,790,454号明細書)、コラーゲン/多糖の二層(bilayer)基材(米国特許第6,773,723号明細書)、コラーゲン/多糖の二層基材(米国特許第6,896,904号明細書)、ヒアルロン酸及び加水分解コラーゲンから形成される組織工学のための基材(米国特許第6,737,072号明細書)、多孔質基材粒子の作成のための方法(米国特許5,629,191号明細書)、多孔質生分解性重合体の作成のための方法(米国特許第6,673,286号明細書)、マクロ多孔性高分子骨組み(macroporous polymer scaffold)における組織増殖のための処理(米国特許第6,875,442号明細書)、多孔性物質における空隙率の保護(preserving)のための方法(米国特許第4,522,753号明細書)、コラーゲン-グリコサミノグリカンの複合体材料の調製用の方法(米国特許第4,448,718号明細書)、コラーゲン及びグリコサミノグリカンからの複合体物質の調製用の手法(米国特許第4,350,629号明細書)及び架橋結合されたコラーゲン-ムコ多糖類の複合体物質(米国特許第4,280,954号明細書)を開示する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、多くの上記開示された構造は不均等(uneven)で及び調節されない空隙率、不均等な密度の孔、不均等な寸法の孔及び無作為な孔の支持基材内での分布のような調節されない媒介変数を持つ。そのような調節されない媒介変数は、細胞を生成する軟骨の基材のための支持体を提供するのに、立体的に(sterically)不安定な構造を導き、それはこれらの構造が、軟骨生成細胞(cartilage producing cells)を含む溶液又は懸濁物と接触する際、容易に崩壊するからである。
【０００６】
したがって、より一層均一な、及び立体的に安定な支持基材を、好ましくは生物学的適合性(生物適合性)の物質、コラーゲンのようなものから調製する必要性があり、そこでは、前記基材は狭く規定される寸法及び密度の孔を持ち、及び孔は均一に分布し、縦方向に配向し、及び非-無作為に組織化される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本発明の主たる目的は、立体的に安定な、生物適合性の、好ましくはコラーゲンに基づく基材を提供することであり、それは硝子質又は硝子質様の軟骨(hyaline-like cartilage)の誘導及び形成のために必要な数における軟骨細胞の付着を可能にする特性を持つ。
【０００８】
本発明はそのような基材及び/又はその製造のための方法を、立体的に安定な、及び生物適合性の基材、なるべくならI型コラーゲンから作成され、狭く規定される孔寸法及び密度を持ち、縦方向に組織化される前記孔を有し、そこでは、前記基材が、コラーゲン、ゲル、ゾル-ゲル又は物体温度でゲル化するヒドロゲルにおいて懸濁する軟骨細胞の播種及び付着を、十分に高い、新しい硝子質又は硝子質-様の軟骨の形成を誘導するための数を許す。本発明に従う基材は、直径において実質的に狭く規定される孔寸法及び縦方向に組織化される様式の孔密度を持ち、それは先端(apical)(頂部分又は滑膜)又は基底(底部分又は骨)の表面を移植物(implant)に対して創造するようにし、そこでは孔の寸法及び直径が双方の先端又は基底の表面上で、実質同じにされる。本発明に従うゲル系は、軟骨細胞の立体的に高められる使用可能性(enablement)についての条件を、グリコサミノグリカン及びII型コラーゲン及びその堆積物(deposition)を前記基材内で正常な健康的関節の硝子質軟骨にとって特徴的な比率において備える細胞外基材を生成させるように提供する。
【０００９】
すべての特許、特許出願及び本明細書において引用する刊行物は、本明細書に参考として組込む。
【００１０】
(概要)本発明の1種の局面は、狭く規定される均一な、及び縦方向に及び非-無作為に組織化される空隙率(organized porosity)及び孔密度(pore density)を持つ生物適合性支持基材であり、及びそれを調製するための方法である。
【００１１】
本発明の別の局面は、コラーゲンに基づく支持基材であり、それは狭く規定される均一な及び縦方向に及び非-無作為に組織化される空隙率及び孔密度を持ち、及びそれを調製するための方法である。
【００１２】
本発明のもう1種の局面は、I型コラーゲンに基づく支持基材であり、それは軟骨細胞懸濁物での播種のために適し、前記基材は、狭く規定される直径で約200±100μmの実質均質な孔寸法の縦方向に配向する開口孔(oriented open pore)を持つ。
【００１３】
またこの発明の別の局面は、支持基材であり、それは、硝子質-様軟骨のインビトロでの増殖及び新たな(デノボ)形成のために、及びインサイツ移植のための細胞性又は無細胞性の移植物のインビボでの調製のために適する
【００１４】
本発明の更に別の局面は、コラーゲン-基材複合体系(システム)(composite system)であり、それはI型コラーゲン基材及び前記基材中に播種される軟骨細胞の懸濁物を備え、そこでは、前記系は硝子質又は硝子質-様の軟骨を、軟骨細胞からインビトロで又はインビボで誘導し得、それは前記基材を、細胞を伴って又は伴わずに移植するときである。
【００１５】
本発明のもう1種の局面は、均一な及び立体的に安定な支持基材の調製のための方法であり、それは生物適合性コラーゲン物質から調製され、そこでは、前記基材は狭く規定される空隙率及び均一に分布して縦方向に配向し、及び非-無作為に組織化される実質同じ寸法の直径の孔を持つ。
【００１６】
またこの発明の更に別の局面は、立体的に安定なコラーゲンに基づく基材の調製のための方法であり、それは、約200±100μmの直径の孔寸法、約25±10/mm2の密度、及び均一な孔分布のような特性を持ち、硝子質又は硝子質-様の軟骨の形成の誘導のために必要な数での軟骨細胞の付着を可能にする。
【００１７】
また本発明の更に別の局面は、立体的に安定な、I型コラーゲンに基づく基材の製造のための方法であり、それは、I型コラーゲンにおいて、又は合成のゾル-ゲルであり、物体温度でゲル化するものにおいて懸濁する軟骨細胞の播種を許して、そこでは、前記基材は実質狭く規定される孔寸法の約200±100μm及び孔密度25±10/mm2を縦方向に組織化されるやり方で持ち、それは孔が頂部分(先端)及び底部分(基底)の表面の移植物で実質同じ寸法を持つのを確実にする。
【００１８】
本発明の更に別の局面は、立体的に高められる軟骨細胞の前記基材中への誘導のための条件を提供する系を備える、コラーゲン、ゲル、ゾル-ゲル又はヒドロゲルであり、それは、前記軟骨細胞が細胞外基材を生成するのを可能にし、その基材はグルコサミノグリカン及びII型コラーゲン及びその堆積物を前記基材内で正常な健康的な関節の硝子質軟骨について特徴的な比率において備える。
【００１９】
本発明の更に別の局面は、軟骨細胞の播種のためにI型コラーゲンに基づく基材を生成するための方法であり、そこでは、前記方法は、規定するコラーゲン量のコラーゲン懸濁物から、アンモニア、表面活性剤の存在下に、減少した圧力で又は不活性雰囲気、又はすべてのこれらの媒介変数の任意の組合せにおいて、前記基材を調製することを備える。
【００２０】
また本発明のもう1種の局面は、軟骨生成を誘導し得るゲル-基材複合体系であり、それは、軟骨細胞の懸濁物が播種されるコラーゲンに基づく基材を、コラーゲン又は物体温度でゲル化し得るゾル-ゲル重合体において備える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
(図の簡潔な説明)図面の簡単な説明の項に移す。
【００２２】
(定義)
“立体的に安定な支持性構造”は、コラーゲン-原線維(fibrillar)構造の非-無作為の縦方向配向を意味する。
“立体的に不安定な支持性構造”は、無作為な配向の網(メッシュ)-様コラーゲン-原線維構造を意味する。
“基材空隙率”は、支持基材又は基質内の空孔(holes)の直径、並びに孔(pore)分布の密度によって横断面領域のミリメータの関数として規定される孔寸法を意味する。
“実質均質”は、少なくとも85-99の%の同質性(homogeneity)を意味し、それは少なくとも、与えられる範囲の200±100μm内の寸法を有するすべての孔の少なくとも85%である。なるべくなら、同質性は95及び99の間の%である。
“実質均質な空隙率”は、孔寸法及び直径が孔寸法範囲の約200±100μm内であることを意味し、なるべくなら200±50μmの直径でのものである。
“頂部分表面”は、先端又は滑膜の側の接合部(joint)に向けられる基材を意味する。
“底部分表面”は基底で、骨表面に最も近い(closest to)基材を意味する。
“軟骨細胞”は、自然に関節軟骨に存する(residing in)細胞を意味する。
“約200±100μm”は、中間値平均が上部側面上で付加的な10-20μm内である(withing)孔を意味し、及びその孔をまた含むように意図される。
“S-GAG”は、硫酸グリコサミノグリカンを意味する。
(発明の詳しい記載)
【００２３】
本発明は実質均質な孔寸法を持つ規定される空隙率のコラーゲンに基づく(-based)基材、並びにそれを調製するための方法に指向する。本発明の方法に従って調製するコラーゲンに基づく基材は、均一に規定され縦方向に非-無作為に組織化される空隙率及び規定される孔密度を持つ。
【００２４】
支持基材又は基質は概して、コラーゲン、特にI型コラーゲンのような生物適合性物質から調製され、及び縦方向に非-無作為に配向される実質均質な孔寸法の狭く規定される直径の開口孔を持つ。基材は、軟骨細胞を播種される細胞性移植物又は無細胞性移植物の調製のため、並びに、硝子質又は硝子質-様の軟骨のインビトロ及びインビボでの成長及び新たな形成のために適する。
【００２５】
本発明は付加的に、コラーゲン-基材の複合体系に関連し、それは、軟骨細胞の懸濁物が、コラーゲン、ゲル、ゾル-ゲル又は熱可逆性(thermoreversible)のヒドロゲルにおいて播種される前記基材を備え、前記系は硝子質又は硝子質-様の軟骨の形成を可能にし、それは、前記系を損傷され(damaged)又は傷害された(injured)軟骨中にインサイツで移植し、細胞外の基材及びその成分のII型コラーゲン及びS-GAGを生産するときに行われる。
【００２６】
本発明にかかるI型コラーゲンに基づく基材は、実質均質な孔寸法範囲の約200±100μmを、なるべくなら約200±50μmを直径で持つ。この孔寸法は、軟骨細胞の基材の孔への最も大きな付着を提供するのに示される。
【００２７】
支持基材は、関節軟骨の傷害及び病変(lesion)を、損傷し、又は傷害された関節軟骨の処置、置換又は再生のための新しい硝子質又は硝子質-様の軟骨の成長のために提供する手段によって処置するのに極めて有用である。かかる処置は、目下困難であり、それは、関節軟骨の独特な特性のためであり、それは他の軟部(柔)組織と同じではなく、そのような挙動を示さないからである。
(I.関節軟骨)
【００２８】
関節軟骨は骨の端部(ends)を先端接合部分において覆う。関節軟骨は独特な組織であり、そこでは、即ち、それは無血管性の、無神経性(aneural)の、及び無リンパ性(alymphatic)であり、及び成熟状態において、細胞の非常に小数を含む。これらの特性は、関節軟骨がなぜ治癒するのに乏しいそのような固有の能力(intrinsic capacity)しか持たないことの主な理由である(Install(インストール), J. N.及びScott(スコット), W. N., Surgery of the Knee(膝の外科)第3版、p. 341(2001年))。
【００２９】
関節軟骨は、比較的無細胞性の組織であるとして既知であり、その細胞外空間は間質液(60-80%)及び有機性細胞外基材(ECM)の成分、主にプロテオグリカン及びコラーゲンによって占められる。
【００３０】
未熟な軟骨細胞は幼若個体の軟骨において多数にて存在する関節軟骨の細胞である。未熟な軟骨細胞は幼若個体における軟骨の成長について関与する代謝的に活性な細胞である。成体個体において、骨の成長が停止し、軟骨が成熟した軟骨細胞を含み、それは、成熟した静止の軟骨における数に限られ、及びそれらの存在が主に代謝的に活性でない。
【００３１】
関節軟骨の機械的機能は、その高含水量によって、及びコラーゲン網状構造(ネットワーク)の特定の構想(アーキテクチャ)によって定められる。この網状構造は、肋軟骨下(subchondral)の骨から垂直に延び、及び表面的な帯域(ゾーン)における関節表面に平行な経路(コース)に対し緩徐に曲線を描く架橋結合された原線維(fibrils)からなる(“Form und Bau der Gelenkknorpel in ihren Beziehungen zur Funktion(機能との関連での関節軟骨の形成及び構造)”、Z. Zellforsch(ツェルカールス).、第2巻、pp. 783-862(1925年))。
【００３２】
任意の置換支持構造は、このようにして配向及び自然に観察されるのに似た組織化を持つべきである。結果的に、縦方向の配向の多孔性構造、なるべくなら生分解性物質から作成されるもので、軟骨基材の代わりに(in lieu of)用いるものを、軟骨のインビボでの再生のための重要な観点であるように思われ、それは自然な関節軟骨の似た構造のためである。結果的に、縦方向の多孔性構造の組合せは、コラーゲン、ゲル、ゾル-ゲル又は別のヒドロゲルにおいて懸濁される軟骨細胞と組み合わされる必要な支持体を提供し、それは同様にインビボでの軟骨の処置又はインビトロでの軟骨の再生のために有益であると思われ、それは、コラーゲン、ゲル、ゾル-ゲル又は別のヒドロゲルが、そこで軟骨細胞が懸濁され、生分解性の物質であり、自然な又は関節軟骨と生物適合性であり、及び従って軟骨細胞の表現型を維持し、及び軟骨の細胞外基材合成をインビトロ又はインビボで刺激し、それが軟骨細胞を播種する支持基材をインサイツで移植するときのことだからである。
(II.コラーゲンに基づく基材及びその調製のための方法)
【００３３】
本発明に従うコラーゲンに基づく基材は、軟骨細胞からの硝子質-様の軟骨の誘導を惹起することができるゲル-基材の複合体系の本質的成分である。
(A.基材の設計)
【００３４】
本発明に従う基材を支持基材のために必要な特性の要件を満たすように設計される。
【００３５】
最初の要件は、支持基材が生物適合性、及びなるべくなら生分解性物質で、関節軟骨において観察されるものと同じ又は似たものから調製されることである。
【００３６】
第2の要件は、支持基材が空間的な(spatial)組織化及び関節軟骨のものに似た配向を持つことである。
【００３７】
第3の要件は、支持基材が軟骨細胞の前記基材への播種を、多数の細胞において許す空隙率を持ち、それは、新しい硝子質の又は硝子質-様の関節軟骨のインビトロ及び/又はインビボでの形成の惹起のために十分なことである。
【００３８】
第4の要件は、支持基材が十分な数の孔を関節軟骨形成の惹起に必要な細胞の数のために持つこと、及び孔寸法が前記支持基材中に播種された軟骨細胞の主要部分が基材内において、新しい硝子質又は硝子質-様の軟骨の形成を招く数において懸濁されることである。
【００３９】
第5の要件は、孔が実質的に同じ寸法を約200±100μmからの、なるべくなら約200±50μmの間の範囲で孔直径において持ち、及びかかる寸法が、頂部分の先端から底部分の基底の表面までの孔で実質同じであり、前記孔が縦方向に頂部分から底部分まで組織化されることである。
(B.支持基材)
【００４０】
典型的に、支持基材は、なるべくならコラーゲンに基づく指示基材であり、本発明のものは、三次元構造であり、規定される密度及び空隙率の生物適合性及び/又は生分解性の物質から作成される。
【００４１】
典型的に、支持基材はコラーゲン性(collagenous)ゲル又はI型コラーゲン、II型コラーゲン、IV型コラーゲン、ゼラチン、アガロース、ヒアルロニン(hyaluronin)、プロテオグリカンを含む細胞-収縮性(cell-contracted)コラーゲン、グリコサミノグリカン又は糖タンパク質、フィブロネクチン、ラミニン、生物学的に活性な(bioactive)ペプチド増殖因子、サイトカイン、エラスチン、フィブリン、合成重合体線維で、ポリ乳酸、ポリグリコール酸又はポリアミノ酸のようなポリ酸から形成されるもの、ポリカプロラクトン、ポリアミノ酸、ポリペプチドゲル、それらの共重合体、それらの単独又は組合せを含むゲル溶液から調製される。加えて、支持基材はコラーゲンの前躯体から調製されてよい。例えば、コラーゲン前躯体を用い、基材の保護のためのコラーゲン原線維構造を再構成し得る。これらの前躯体は、例えばペプチド単量体であり、アルファ1(I型)、及びアルファ2(I型)コラーゲンペプチド又はアルファ1(I型)アルファ2(I型)ペプチド、組合せ、又は2(アルファ1、I型)及び1(アルファ2、I型)ペプチドのようなものである。
【００４２】
好ましくは、本発明に従う支持基材は、コラーゲンから、最も好ましくはI型コラーゲンで、複数の狭く縦方向に均一に規定され、及び非-無作為に組織化される孔を含むものから調製される。孔は実質均質な狭く規定される寸法及び直径を持ち、及び基材(行列)空間を流体充填された(fluid-filled)列(カラム)又は網状構造に分ける(dividing)基材を通して均一に分布する。
【００４３】
好適例において、I型コラーゲンに基づく基材は、コラーゲンに基づく海綿状物(スポンジ)-様構造又は蜂の巣状物(ハニカム)-様の規定される空隙率であり、縦方向に組織化された実質同じ寸法の孔を持つ。
(a.規定される空隙率)
【００４４】
本発明に従う支持基材は、一定の厚さ及び縦方向に組織化された孔の規定される直径を持ち、移植のための基材の先端(頂部分又は滑膜)又は基底(底部分又は骨)の表面を創造するように指向する。前記孔の直径は、基材が、軟骨細胞を含有するゲル、好ましくはゾル-ゲルに関連して、細胞外基材のグルコサミノグリカン及びII型コラーゲンの立体的に高められた誘導(sterically-enhanced induction)を、硝子質の関節軟骨の特徴的比率における堆積において促進するように選定される。
(b.孔寸法)
【００４５】
縦方向に指向する細胞性又は無細胞性の支持基材であり、生物適合性の物質から形成されるものは、予め定められる孔寸法の軟骨細胞懸濁物で充填されたものを持ち、インビボでの修復組織、及びインビトロでの関節軟骨の生成にとっての質の重要な局面である。
【００４６】
結果的に、多孔性基材のための最適な孔寸法を定めることが重要であり、それは基材の孔の寸法が基材の壁への軟骨細胞の付着に影響を与え、及び軟骨のインビトロ及びインビボでの再生のために必要な基材内での軟骨細胞の存在を確かにするからである。孔の寸法は、85%より上、好ましくは95%、より一層好ましくは約98-99%の均質性を有し、実質均質な孔であり、約200±100μm、好ましくは200±50μmの直径の寸法を持つ。
【００４７】
コラーゲンに基づく基材の孔は、ゲル溶液において懸濁する軟骨細胞を中に入れ(taking in)、及び均一に分布させ、及び懸濁された軟骨細胞によって細胞外の基材を生成するのを促す(conductive to)条件を提供することができる海綿状物-様構造が形成されるように均質に前記基材内で分布される。
【００４８】
コラーゲンに基づく基材の規定され、及び実質均質な孔寸法の直径は本発明の重要な局面である。本発明に従う規定された孔寸法のコラーゲンに基づく基材は、前記基材中への軟骨細胞のより一層速い又は遅い浸潤(infiltration)、細胞のより一層速い又は遅い成長及び増殖、及び最終的に、ゲル-基材系における細胞のより一層高い又は低い密度を許す異なる孔寸法の直径を持つ。かかる孔寸法は、ゲル溶液のpH、コラーゲン濃度、凍結乾燥条件、温度、コラーゲンの架橋の程度、等の変動によって調整し得る。
【００４９】
一般に、従来技術の構造において、孔寸法は規定されておらず、及び1種の実質同質な寸法に限られていない。従来技術において既知のコラーゲンに基づく基材は、ほとんどが約50から約2000μmまでの混合された孔寸法を持つ孔を含む構造である。
【００５０】
本発明にかかる支持基材は空間的な組織化及び関節軟骨のそれに似た配向を持つ。支持基材の空間的な組織化及び配向を、図1A及び1Bにおいて図式的に描写する。
【００５１】
図1Aは、支持基材の図式的な側面図であり、ゾル-ゲルにおいて懸濁される軟骨細胞で仮定的に(hypothetically)播種される支持基材の孔の縦方向の組織化及び配向を示す。
【００５２】
図1Aに見られるように、孔は直径で実質同じ寸法であり、及び各孔において細胞の数はまた、実質同じである。本明細書に示す細胞は、円形であり、及び支持基材のための付着要件(requirement)を例証する孔の壁に接触する。
【００５３】
軟骨細胞のための懸濁溶液は任意のゲル溶液、なるべくならコラーゲンを含有するものであり、ゲル、ゾル-ゲル又は熱可逆性ヒドロゲルであり、それはゾルからゲルにまで温度に依存してその状態を変化させることができる。
【００５４】
図1Bは図式的な平面図であり、支持基材を通しての孔の理想的に同質な分布を仮定的に示し、そこでは孔は、同じ寸法を持ち、及び軟骨細胞は等しく孔内で分布する。孔の壁は個々の孔に分かれ、またそれが見られる。
【００５５】
図1Bは、ゲル-基材複合体系(システム)の図式的な平面図であり、それは、I型コラーゲンから作成され、及びゾル-ゲルにおいて懸濁する軟骨細胞で埋められ(embedded)るコラーゲンに基づく基材成分を備え、それは、前記コラーゲンに基づく基材内の軟骨細胞の分布を、約200μmの規定される直径を持つ孔内で実質同質であるように示す。外側の円は全体の基材ウェファの寸法を規定する。より一層小さい円は実質同じ寸法を持つ孔である。孔の円の内側はそこでゾル-ゲル溶液において堆積する軟骨細胞である。
【００５６】
図1Cは、本発明の方法に従って生産される実際のI型コラーゲンの基材の写真で、拡大しないものである。基材の孔は黒い点(ドット)として見られる。基材は、完全な適合を得るために、必要な場合、例えば、関節軟骨移植のために、双方の方向において列を減少させることができる(can be cut to order in both directions)。
【００５７】
図1Dは、4×で拡大した実際のI型コラーゲン基材の写真であり、基材内での孔分布を示す。
【００５８】
図1Eは、およそ4×で拡大した実際のI型コラーゲン基材の写真であり、より一層良好な対比(コントラスト)で基材内での孔分布を示すために暗くした背景を有する。
【００５９】
コラーゲン、ゲル、ゾル-ゲル又は熱可逆性のヒドロゲル溶液において懸濁する軟骨細胞は、より一層狭く規定される孔で、基材内での実質同じ寸法及び分布のものの中に導入される。縦方向に分けられる列は、実質同じ直径及び規定された寸法の孔を持つ。孔は軟骨細胞懸濁物で充填される。この配置(arrangement)は、立体的に有益な条件を、孔内の軟骨細胞の堆積の均質な分布のために提供し、健康的な硝子質軟骨でこれらの化合物について観察される比率に対応する比率においてプロテオグリカン及びII型コラーゲンの高められた生産を導く。
【００６０】
構造的な高分子及び軟骨は、20から30までの%の湿重量の軟骨を占め、及びII型コラーゲン、大きな凝集性(large aggregating)プロテオグリカン及び非-コラーゲン性タンパク質又は糖タンパク質を含む。成熟と共に、コラーゲンは50%を超えて貢献し、及びプロテオグリカンは基材の乾燥重量の30-35%に貢献する。
【００６１】
基材は典型的に、図1C-1Eにおいて見られるように複合体の筒状(円柱状)ウェファとして、又は約4mmから約25mmまでの直径及び0.5から約5mmまでの厚さを持つウェファ-様基材構築物に切断される矩形のブロック構造として調製される。この構築物の播種密度は、約1千万-1千2百万細胞/mLに対応するコラーゲン溶液の25μLにつき約25,000-300,000個の軟骨細胞である。上記の密度数は単に模範的であり、及びより一層少ない播種密度さえ可能であり、及び硝子質又は硝子質-様の軟骨の生産を導くことが示された。播種のための細胞密度の範囲は、約1から約30までの百万個/mLが好ましい。軟骨細胞は好ましくは、I型又はII型のコラーゲンにおいて、又はゾル-ゲル又はヒドロゲル及びそのような懸濁物において懸濁し、支持基材と組み合わせて、本発明に従うゲル-基材複合体系を形成する。
(C.支持基材の調製)
【００６２】
本発明は付加的に、区分IIAにおいて述べる要件を満たす支持基材の調製のための新しい方法に関連する。
【００６３】
そのような規準に沿う支持基材の調製のための方法は、本発明に従うコラーゲンに基づく基材の孔寸法、縦方向の配向及び組織化、均質性及び均一性を標準化するための処理(プロセス)を包含する。
【００６４】
この支持基材の調製のための製造方法は、生物適合性の成分及び/又は添加剤及びそれらの量、又は反応条件、例えば、pH、温度、圧力、減少した圧、不活性気体の存在、及びこれらの媒介変数(パラメータ)をすべて単独で又は種々の組合せにおいて試験するための機器のようなものから構成される種々の媒介変数の研究に基づく。
(1.支持基材の調製のための機器)
【００６５】
本発明に従う支持基材の調製のための製造の組立ては処理のために選ばれる条件によって変動可能な成分を備える。
【００６６】
それは典型的に、支持基材の調製のために選ばれる生物適合性の物質又はその前躯体で、好ましくはI型コラーゲンを含む密封容器を備え、そこでは前記物質は、支持基材の試験及び最適化のため、又は最終的な調製のための種々の条件にかけれら得る。加わる特色には、増加するか又は減少する圧力、温度、調整されるpH、添加される他の成分、ポンプ、気体タンク、弁、等のための手段が包含され得る。
【００６７】
支持基材の調製のための1種の例示的な組立てを図2において示す。
【００６８】
図2は、本発明に従う支持基材の調製のために用いる1種の実験的な組立て(experimental set-up)の図式的な表示であり、水性アンモニアの導入のための手段、圧力を減らすための手段及び不活性雰囲気を提供するための手段を備える。典型的に、出発物質、この場合、コラーゲン溶液は、不活性気体の真空ポンプ及び供給源に更に連通する真空計(ゲージ)に接続される出口を持つ密閉容器中に配置される。図2では、2種の供給源が、水性アンモニアを供給するため、及び窒素を貯えるため、窒素を系中に導入するための手段と共に示される。出発物質は、次いで予め定めた量の水性アンモニアを前記容器中に導入すること、及び/又は更に窒素又はアルゴンのような、不活性気体の導入、又は1種の代わりもの、空気、及び随意に減圧下の反応の実行、表面活性剤の存在又は他の反応条件下のものによってアンモニア蒸気に曝される。すべてこれらのものは、最適の期待される結果を達成するために任意の組合せにおいて実行し、及び/又は試験され得る。
(2.支持基材の調製のための方法)
【００６９】
支持基材の孔寸法のための選定規準は、前記基材内で実質均質な集団(population)の孔を持つ支持基材を調製するために設定され、そこでは前記孔が約200±100μmの直径において実質同じ寸法を持った。
【００７０】
予備調査は、これらの媒介変数が、約2から約10までのmg/mLのコラーゲンの溶液における濃度においてI型コラーゲンの利用に最も沿い得ることを定め、及びこれらの溶液が従って、更に上記の設定規準に沿う支持基材の調製のための条件を最適化するために研究された。
【００７１】
条件の最適化のための処理は、これらの規準に沿う支持基材の調製のため、溶液の1mL当り2、4、6、8、及び10mgでのI型コラーゲンの試験、1、2、3、4、5、及び6mLの容量において添加される3%の水性アンモニアの存在下でのその重合が包含される。同じコラーゲン調製物を、添加された非-イオン表面活性剤(Pluronic(R)(プルロニック(商標))、F86、0.3重量/%)を用いて試験し、及び同じコラーゲン溶液を、不活性雰囲気において、及び減圧下で重合した。上記条件の種々の組合せを更に、最も小さく、及び最も均質な孔寸法を有する支持基材を得るために試験した。
【００７２】
結果を表1-3及び代表的な図3-6にまとめる。
(a.孔寸法に及ぼすアンモニア存在の効果)
【００７３】
1具体例において、支持基材は、ウシI型アテロコラーゲン(2.9mg/mL、pH 2.1)から調製し、それはInamed Corporation(イネムド社)、Fremont(フリーモン)、カリフォルニア州、米国から得られた。コラーゲンを、沈殿により、次いで遠心分離によって濃縮し、及び次いで望ましい濃度に達するように水性HClにおいて溶解した。アンモニアの存在における支持基材の調製のための手法を例3で記載する。
【００７４】
これらの条件の下に得られる支持基材の孔寸法は、コラーゲンの濃度及びアンモニア溶液の容量/濃度の関数として表わされ、それは表1に見られる。
【００７５】
【表１】
2009508596.tif 000003
【００７６】
孔寸法を形成された基材の表面の1mm内で測定した。
【００７７】
表1に見られるように、2.8及び2.9mg/mLの間で含まれるコラーゲンの溶液の重合は、多孔性基材の形成を招かず、どの位多くのアンモニアが添加されたかにもかかわらなかった。コラーゲンを4mg/mLで及び3mL又は5mLのアンモニアで好ましくは及び/又は受入れ可能な孔寸法を256±68μm及び259±48μmの範囲のそれぞれにおいて持つ基材中に重合した。6mLのアンモニアで、334±89μmの範囲において孔寸法を有する基材を形成した。
【００７８】
図3A及び図3Bは、約259±48μm及び約334±89μmの孔寸法範囲をそれぞれ招く、5又は6mLのアンモニアの存在下に4mg/mLのコラーゲンから調製される支持基材の代表的な顕微鏡写真である。顕微鏡写真は双方とも、同じ尺度(尺度lOOOμm)上にあり、及びそれらの寸法における相違ははっきり目に見える。
【００７９】
コラーゲンを6mg/mLの濃度において、2mL又は4mLのアンモニアの存在下に重合し、約233±55μm及び約235±67μmのそれぞれの最適範囲における孔寸法を持つ支持基材を産生した(yielded)。6mLのアンモニアで、基材は334±89μmの範囲における孔寸法を有して形成された。
【００８０】
図4A及び図4Bは6mg/mLのコラーゲン及び2又は4mLのアンモニアから調製される支持基材の代表的な顕微鏡写真であり、約233±55μm及び約235±67μmの孔寸法範囲を招く。双方の顕微鏡写真は同じ尺度(尺度lOOOμm)上にある。双方の顕微鏡写真は、孔がおよそ同じ寸法であることを示す。それらの分布の均質性ははっきり目に見える。
【００８１】
8mg/mLのコラーゲンで、及び2、3、及び4mLのアンモニアでのコラーゲンの重合は、284±90μm、299±73μm及び1195±294μmのそれぞれの範囲におけるより一層大きな孔を持つ支持基材を招いた。10mg/mLでの重合は、474±108μ,mの範囲における孔を有する基材を産生し、コラーゲンのより一層高い濃度を用いて発生する固有の変動性を例証する。
【００８２】
これらの結果から見られるように、支持基材は4及びなるべくなら6の間のmg/mLのコラーゲンの適当な量を用いて、アンモニアの適当な容量の存在下、2及び4のmLの間において調製し、約200±10Oμmの最適範囲内の孔寸法を持つ基材を招いた。
(b(a).不活性雰囲気及び減圧の効果) 
【００８３】
別の具体例では、支持基材をウシのI型アテロコラーゲンから、既に上述したように調製し、及び支持基材を不活性の窒素雰囲気で及び減少した圧力で調製した。アンモニアの存在下、及び不活性雰囲気及び減少した圧力で支持基材を調製するための手法の条件を、例5において記載する。
【００８４】
これらの条件の下で得られる支持基材及びコラーゲン濃度及びアンモニア溶液の容量/濃度の関数として表される孔寸法は、表2に見られる。
【００８５】
【表２】
2009508596.tif 000004
【００８６】
表2はアンモニア溶液の容量/濃度及び減少した圧力の関数として孔寸法を示す。孔寸法は形成された骨組みの表面の1mm以内で測定される。
【００８７】
表2に見られるように、すべての例において5mg/mLのコラーゲン濃度で、1、2又は3mLのアンモニアの存在と共に、最も小さい孔が三トルでの減圧と組み合わせる不活性雰囲気において得られた。その例では、孔寸法は253±59μmからの範囲にあった。他の組合せすべては300μmより大きく、より一層大きな孔寸法を招いた。
【００８８】
図5Aは、基材の253±59μmの孔寸法を示し、それは、5mg/mLのコラーゲンを、窒素の雰囲気において三トルにまで減少された圧力で、1mLのアンモニアでの重合から作成された。
【００８９】
図5Bは、323±82μmの孔寸法を持つ基材を示し、それは5mg/mLのコラーゲンを、1mLのアンモニアと共に、窒素雰囲気において10トルに減らされた圧力での重合から作成された。
【００９０】
図5Cは、基材の538±135μmの孔寸法を示し、それは5mg/mLのコラーゲンを、3mLのアンモニアと共に、窒素雰囲気において10トルに減らされた圧力での重合によって作成された。
【００９１】
これらの結果から見られるように、支持基材は小量のアンモニアと、不活性な雰囲気において実行される圧力の適当な減少とで組み合わせて調製され、最適な範囲の約200±100μm内の孔寸法を持つ基材を招いた。
(c.孔寸法に及ぼす表面活性剤の効果)
【００９２】
別の具体例では、支持基材はウシのI型アテロコラーゲンから、上述のように調製された。支持基材の表面活性剤存在における調製のための手法は例4において記載する。
【００９３】
これらの条件下に得られる支持基材及び孔寸法はPluronic(R)表面活性剤の0.3重量%の存在におけるコラーゲン濃度の関数として表され、表3において見られる。
【００９４】
【表３】
2009508596.tif 000005
【００９５】
表3において見られる孔寸法はコラーゲン濃度の関数として表される。孔寸法は形成された基材の表面の1mm以内で測定される。
【００９６】
表3で見られるように、コラーゲン濃度の4mg/mLで、及び表面活性剤の存在において、支持基材の孔寸法は約198±47μmであった。6mg/mLで及び8mg/mLでのコラーゲンで、支持基材は、約256±59μm及び約380±100μmからの範囲における孔寸法を持つ。
【００９７】
図6A、6B及び6Cは、同じ尺度を持ち、コラーゲンの4、6及び8mg/mLの表面活性剤の存在における重合から招かれる基材の顕微鏡写真である。これらの図は明らかに、得られる孔の均一性及び均質性並びにそれらの均一寸法を示す。
【００９８】
コラーゲンの重合前混合物(pre-polymerization mixture)における表面活性剤の存在は明らかに、最適な範囲内の孔寸法の形成に影響を与え、特に、コラーゲンのより一層低い濃度と組み合わされるとき、コラーゲン(4mg/mL)の重合は最適に大きさを作られる孔の約198±47μmを持つ基材を招いた。
(d.他の因子)
【００９９】
若干の他の因子はまた、上述されるものに似た孔寸法に肯定的に影響を与え得る。
【０１００】
例えば、コラーゲンの前駆体を、基材保護のためのコラーゲン線維構造を再構成するのに用い得る。これらの前駆体は、例えば、ペプチド単量体で、アルファ1(I型)のようなもの、及びアルファ2(I型)コラーゲンペプチド又は2(アルファ1、I型)及び1(アルファ2、I型)のペプチドの組合せにおいて、又は3(アルファ1(I)、II型)である。
【０１０１】
操作され得る他の因子は、ペプチド単量体の選択的な渦巻きのせん断加工(vortical shearing)、可溶化の緩衝剤の化学的組成及びpHである。
【０１０２】
渦巻きせん断加工の工程は関連するコラーゲン原線維のアルファ1(I)(I型)及びアルファ2(II)(I型)のペプチドの分散及び整合(alignment)を定める。この手法の間、窒素又はアルゴンの雰囲気における平衡はpHを調節する。
【０１０３】
用い得る他の因子は、重合のための中和反応体、温度、水除去の比率及び割合(パーセント)である。
【０１０４】
コラーゲンに基づく基材の調製のための模範的な条件は次の通りである。
【０１０５】
コラーゲンに基づく基材の製造のためのI型コラーゲンの濃度は約2から約10まで、好ましくは約4から約8まで、最も好ましくは約4から約6までのmg/mLである。コラーゲンのそのような濃度は、原線維形成(fibrillogenesis)を招く初期の重合のために重大であり、それは原線維の形成のためである。以前及び現在の調査は、そのようなものが若干の他の成分の添加によって増進され(promoted)なければ、3mg/mLより少ないコラーゲン濃度で、原線維形成がなく、及びこうして孔形成されないことを示す。
【０１０６】
I型コラーゲンの可溶化のための適する緩衝剤は、pH4.8で緩衝剤を含むギ酸、pH5.0で緩衝剤を含む酢酸、又はpH3.0での希釈した塩化水素酸である。
【０１０７】
コラーゲン溶液のせん断加工は、例えば、約10-60秒間で10-100ダイン/cm2であるように設定される。
【０１０８】
せん断加工されたペプチドは、約30分から約2時間まで約4℃で窒素又はアルゴンの気体のような不活性気体雰囲気において平衡化される。不活性気体の使用は、酸化体(オキシダント)として働き、及び原線維形成を減少させ得る酸素を含む空気を置換する。この因子は重合及び孔形成に肯定的に影響を与えることが見出された。
【０１０９】
中和は典型的に、約12から約24の時間の期間にわたり約0.3%アンモニアの蒸気において遂行される。この因子はまた、コラーゲン重合及び均質な孔寸法を持つ孔の形成に影響を与えることが見出された。
【０１１０】
凍結は、もしあれば、-40℃から約-60℃までへの約2から約12までの時間の期間にわたり遂行される。
【０１１１】
水の除去は、-20℃から約50℃まで、好ましくは37℃で、約24から約48までの時間の間、無水雰囲気への曝露によって達成される。
【０１１２】
段階的な性質(gradual nature)の重合及び水除去の遅い処理は典型的に、骨組みのコラーゲン系の構想的要素を維持し、硝子質軟骨の細胞外の基材の堆積に必要な長さ方向の孔構造の適切な配向及び直径を達成する。
【０１１３】
多孔性のI型コラーゲン内において新しく合成された軟骨特異的な基材の組織化は、例えば、タンパク質のレベルを定めるためのELISA/ウエスタンブロット法、又はm-RNAのレベルのための量的なRT-PCR又は実時間PCRによって視覚化され、及び定量化される。
(III(I).硝子質軟骨の立体的に高められた誘導)
【０１１４】
本発明の主要な局面は、孔寸法が狭く規定される直径に、好ましくは約200±100、なるべくなら200±50μmの孔寸法直径に実質均質に制限されるとき、及びそのような孔が縦方向に組織化されるとき、前記孔のかかる直径が軟骨細胞の懸濁物と共に硝子質軟骨の立体的に高められた使用可能性を促進し、細胞外の基材の形成をもたらすという知見である。そのような立体的に高められた使用可能性は、コラーゲンのII型及びプロテオグリカンの堆積を基材内において、関節軟骨に特徴的な比率で導く。
(IV.軟骨の生産を誘導し得るゲル基材複合体系)
【０１１５】
1具体例において、本発明はI型コラーゲンから調製されるコラーゲンに基づく基材に関連し、それは物体温度でゲル化する合成的なゾル-ゲルにおいて懸濁する軟骨細胞を播種される。
【０１１６】
ゲル-基材複合体系は、約200±100μm、なるべくなら200±5Oμmの孔直径を持つ基材を備え、それは軟骨細胞/ゲルの懸濁物の孔中への均一注入を許し、及びコラーゲンのII型及びプロテオグリカン(グリコサミノグリカン)の基材内での関節軟骨の特徴的な比率での堆積を誘導する。
【０１１７】
本発明に従うコラーゲンに基づく基材は、例えば、運ばれ(wicking)又は注入によって、懸濁した軟骨細胞で浸潤されるとき、多孔性の海綿状物のように働き、そこで細胞が基材の孔内に分布する。
【０１１８】
この配置は、軟骨細胞が支持基材において立体的に高められた様式で移動し及び安定する(settle)のを許し、及びそれらが増殖し及び新しい細胞外の基材の世代のための物質を分泌することを可能にし、及び結局、硝子質軟骨を生成する。
【０１１９】
軟骨細胞のための懸濁溶液は任意のゲル溶液であり、好ましくはコラーゲンを含むもの、ゲル、ゾル-ゲル又は熱可逆性のヒドロゲルで、その状態がゾルからゲルにまで温度によって変化し得るものであり、及び好ましくは熱-可逆性のゲル化(凍結)ヒドロゲル(TRGH)の物質であり、そこでは、ゾル-ゲルの転移が寒天及びゼラチンのゲルの反対の温度周期上で起こる。結果的に、粘性の流体相はゾル段階にあり、及び固形相はゲル段階にある。TRGHは非常に速いゾル-ゲルの変換を持ち、それは硬化(治療)時間を要求せず、及びヒステリシスのない温度の関数として単純に起こる。軟骨細胞をコラーゲンに基づく基材内に埋め込むためのゾル-ゲルの転移温度は、ゾル-ゲルがゾルの状態にある温度に設定され、一方、軟骨細胞を基材内で安定化するための温度は約37℃の範囲における物体温度で設定される。
(V.比較実験調査)
【０１２０】
比較実験調査を、コラーゲンにおける軟骨細胞の懸濁物を播種された多孔性の基材を生化学的に評価し、及び更に軟骨細胞の増殖及び細胞外の基材形成に及ぼす多孔性支持基材の孔寸法の効果を評価するために実行した。
【０１２１】
これらの調査は、ヒトの軟骨細胞を用いて実行した。健康なヒトの関節軟骨(hAC)の組織はTissue Bank(ティッシュ・バンク)、The National Disease Research Interchange(ザ・ナショナル・ディジーズ・リサーチ・インターチェンジ)、Philadelphia(フィラデルヒィア)、PA(ペンシルベニア州、米国)から得られた。軟骨の組織を消化し、分離した軟骨細胞を培養皿(ディッシュ)上に播種し、及び単一層細胞の拡がりのために予備培養した。単離した軟骨細胞を、例7及び8に記載する手法に従って3D(3次元)培養物において播種した。
(A.細胞の播種及びプロテオグリカンの時間-依存生成)
【０１２２】
この調査のために、合計での硫酸グリコサミノグリカン(S-GAG)含量の生産を、0及び21の日の培養後のDMBアッセイによって測定した。
【０１２３】
実験的組立てを例6に記載する。簡潔には、細胞を支持基材中に播種し、及び一昼夜培養し、及びそれらのS-GAG含量及びDNA(細胞の数を示す)を零及び21の日に定めた。
結果を表4及び図7A及び7Bにまとめる。
【０１２４】
【表４】
2009508596.tif 000006
【０１２５】
0日で、S-GAG含量の平均は28.53±4.35μgであった。21日では、S-GAGの量は117.42±16.55μgであった(表4及び図7A)。基材におけるS-GAGの蓄積は21日で0日のそれと比べて十分に増加した。結果は、表4において及び図7Aで見られる。
【０１２６】
21日で、S-GAG蓄積は、0日でのものよりも4.2倍大きかった(P<0.05)。0及び21の日の間のDNA含量に統計的な差は確認されなかったが、DNA含量が増加する傾向が0日に比べて21日で観察された。 
【０１２７】
図7AはDMBアッセイの結果を示し、そこでは、S-GAG含量が零日及び21日に定められた。図7Aで見られるように、複合体の21日間の培養は、S-GAGの大幅に高められた生産を導いた。対照的に、DNAの生産は、図7Bで見られるように、これらの条件の下で増加せず、そこではμg/複合体でのDNAを定めた。
【０１２８】
コラーゲンのヒドロゲルにて懸濁される軟骨細胞を備えたコラーゲンに基づく多孔性の基材の新しい複合体において、軟骨細胞の増殖及び高められた軟骨の蓄積が観察された。この知見は、コラーゲンに基づく多孔性の基材及びヒドロゲル懸濁物の軟骨細胞の複合体が、軟骨に特異的な細胞外基材のインビトロでの細胞の付着及び増殖及び蓄積のために有益であることを示す。
(B.細胞外基材生産に及ぼすコラーゲンに基づく支持体の孔寸法の効果の評価)
【０１２９】
生化学的な媒介変数に及ぼす孔寸法の効果を評価するために、合計のS-GAG含量を、21日の培養後のDMBアッセイによって測定した。実験の手法は例8に記載する。
【０１３０】
小さな孔寸法を有する構造体におけるS-GAG含量の平均は、183.01±39.78μgであった(表5及び図8A)。図8Aにおいて表5で見られるように、大きな孔寸法を有する構築物のS-GAGの量は115.56±13.50μgであった(表4及び図8A)。小さな孔寸法を有する構築物のS-GAG蓄積は、大きな孔寸法を有するものより十分に大きかった(表5及び図8A)。
【０１３１】
小さな孔寸法を有する構築物のS-GAG蓄積は、大きな孔寸法を有するものよりも1.6倍大きかった(表5及び図8A)(P<0.05)。
【０１３２】
小さな孔寸法を有する構築物のDNA含量は大きな孔寸法を有する構築物のものよりも十分に大きかった(表5及び図8A)。小さな孔寸法を有する構築物のDNA含量は大きな孔寸法を有するものよりも1.5倍大きかった(表5及び図8A) (P<0.05)。
【０１３３】
【表５】
2009508596.tif 000007
【０１３４】
この調査の結果を図8A及び8Bに例証する。図8AはDMBアッセイにおいて得られる結果を示し、そこではS-GAG含量の/複合体当たりのものが大きいか又は小さな孔を持つ複合体について示される。図8Aに見られるように、小さな孔の複合体は、大きな孔を持つ複合体よりもS-GAGのおよそ半分より多くを生成した。同様な結果は、大きいか又は小さな孔を持つ複合体のDNA含量を例示する図8Bで見られた。S-GAGについて観察されるように、より一層小さな孔を持つ複合体のDNA含量は、大きな孔を持つ複合体におけるものよりも十分に高かった。
【０１３５】
図8Aではっきり見られるように、S-GAGの生産は、大きな孔を持つ複合体と比較するとき、軟骨のECM形成が小さな孔を持つ複合体において十分に高かったという証拠を提供する。図8BはDNAアッセイによって測定されるDNA含量を示すグラフであり、そこでは複合体において、小さな孔(153±39μm)又は大きな孔(435±60μm)を持つ。図8Bではっきり見られるように、DNAの生産は、より一層大きな孔を有するものと比べて、より一層小さな孔を持つ複合体において十分に高かった。
【０１３６】
複合体の多孔性基材の小さな孔寸法は、基材において有意な細胞の増殖及び軟骨の特異的な蓄積を、大きな孔寸法のそれと比べて示す。
(C.生存可能性の決定)
【０１３７】
本発明に従う支持基材の生物学的適合性を確立するために、生存可能性調査を実行した。実験手法を例9において記載する。
【０１３８】
異なるコラーゲン濃度を表面活性剤の存在下に用いて調製した基材は容易に、軟骨細胞が負荷されたゲルを吸収した。以下の表6において見られるように、細胞の計数は、図6において存在する孔寸法分布に一貫し、98-99%の細胞の生存可能性を有した。
【０１３９】
【表６】
2009508596.tif 000008
【０１４０】
本発明に従う基材及び系は硝子質軟骨のインサイツ又はインビトロでの生産のために有用である。双方の場合において、コラーゲンに基づく基材を基材ウェファとして調製する。
移植物を用いて達成されるインサイツでの使用のために、基材ウェファは軟骨の欠陥(defect)の寸法に切断され、軟骨の欠陥又は病変又は骨軟骨(osteochondral)の欠陥のような若干の骨の損失を有する軟骨中に導入される。
【０１４１】
軟骨細胞の懸濁物は次いで、物体温度よりも冷たい温度の下でゾルとして病変又は欠陥において埋設される前記基材中に導入され、それによって、ゲル-基材複合体系をインサイツで生じさせ、及び温度を物体温度にまで上昇させ、それによってゾルを過渡的にゲルにまで変化させる。
【０１４２】
代わりに、本発明は無細胞性移植物のためのものと同じやり方で働き、そこでは、ゾル-ゲルで充填されるコラーゲンに基づく基材が軟骨細胞なしで導入される。移植物は物体において新しい硝子質軟骨が発生するまで残り、及び基材は生物学的に適合性であり、自己-分解する。
【実施例】
【０１４３】
インビトロ使用のためには、処理は同様であるが、硝子質軟骨が生成されるまで同じ条件下の管又はペトリ皿において進められる。かかる軟骨は、次いで移植物として、軟骨の欠陥又は病変中に用いられ得る。
(例1)
(コラーゲンに基づく基材の調製)
【０１４４】
この例はコラーゲンに基づく基材の調製のための1種の模範的な方法を記載する。
【０１４５】
I型コラーゲンをpH4.8のギ酸緩衝剤において溶解し、及びその濃度を約5.2mg/mLに合わせる。溶液を1cmにつき10ダインで10秒間、渦のせん断加工にかける。せん断加工されたペプチドを次いで、空気を転置するために4℃で30分間の窒素の気体で平衡化する。中和を24時間の期間にわたり0.3%アンモニアの蒸気で遂行する。溶液を次いで2時間の期間にわたり-40℃で凍結にかける。凍結した溶液を24時間37℃の無水雰囲気に曝露することによって水を除去する。
【０１４６】
多孔性のI型コラーゲン内において新しく合成された軟骨に特異的な基材の組織化は、免疫組織化学的な方法を用いて視覚化され、及び定量化され、及び基材-特異的遺伝子発現をインサイツmRNAのハイブリダイゼーションによって定量化する。
(例2)
(コラーゲンに基づく基材の調製)
【０１４７】
この例はコラーゲンに基づく基材の調製のための別の模範的な方法を例示する。
【０１４８】
1%の水性アテロコラーゲンの溶液(VITROGEN(R)ビトロゲン(商標))の300グラムをpH3.0に維持し、10x20cmの盆(トレイ)に注ぐ。この盆を次いで、5リットル容器中に置く。30mLの3%水性アンモニア溶液を含む50mLの開放容器を次いで、アテロコラーゲンの前記1%の水溶液の300グラムを含む5リットル室(チャンバ)において、盆の隣に置く。アテロコラーゲン及びアンモニアの開放し盆を含む5リットル容器を次いで密封し、及び12時間室温に放置する。この期間の間に、アンモニア気体は、水性アンモニアの開放容器から解放され、及び密封された5リットル容器内で限られ、水性アテロコラーゲンと反応し、前記水性アテロコラーゲンの水溶液をゲル化させる。
【０１４９】
コラーゲン性ゲルを次いで水で一昼夜洗浄し、及びその後、凍結乾燥し、海綿様基材を産生させる。この凍結乾燥基材を次いで四角に切断し、殺菌し、及び滅菌包装(ラップ)の下で貯える。
(例3)
(多孔性蜂の巣状物骨組みの調製に及ぼすアンモニアの効果)
【０１５０】
この例は実質同じ寸法及び分布の孔を持つ多孔性蜂の巣状物骨組みの調製のためにアンモニアを利用する一般的な手法を例示する。
【０１５１】
約3Ogのコラーゲンの溶液(表1において挙げる濃度)でpH3.0-4.8を有するものを、100mLのガラスビーカに添加した。溶液は、気泡を除くために800×gで5-10分間、遠心分離機にかけた。遠心分離後に、コラーゲン溶液を有するビーカを、3%の水性アンモニアと一緒に7.1dm3の容器中に密封した。コラーゲン溶液を、アンモニア気体の存在において、3-14h(時間)の間、沈殿させ、縦方向の円錐形によって形付けられる孔を形成し、そこでは直径が深さと共に高められた。余分なアンモニア及び形成された塩を除くために、沈殿の後、コラーゲンゲルを、脱イオン化水を用いて1-3日間洗浄した。洗浄したコラーゲンを次いで、緩徐に凍らせ、凍結乾燥した。
(例4)
(孔寸法に及ぼす表面活性剤の効果)
【０１５２】
この例は表面活性剤の存在における多孔性蜂の巣状物骨組みの調製を例示する。
【０１５３】
20gのコラーゲン溶液を、Pluronic(R)F68(BASF社)の0.3重量%と共に、pH3.5-3.8を有する非イオン性表面活性剤と、100mLのガラスビーカに添加した。コラーゲン濃度対最終的な孔寸法は以下の表に挙げる。溶液を、気泡を除くために、800×gの5-10分間、遠心分離機にかけた。遠心分離後、コラーゲン溶液を有するビーカを、3%の水性アンモニアを有する7.1dm3容器において密封した。コラーゲン溶液をアンモニア気体の存在下、２時間沈殿させ、縦方向の円錐形によって形付けられる孔を形成し、そこでは、直径が深さと共に高められた。沈殿後、余分なアンモニア及び形成された塩を除くため、コラーゲンゲルを、脱イオン化された水を用いて1日間洗浄した。洗浄されたコラーゲンを次いで、緩徐に凍らせ、及び凍結乾燥した。
(例5)
(孔寸法に及ぼす不活性雰囲気及び減圧の効果)
【０１５４】
この例は不活性雰囲気(N2)及び減圧の下の蜂の巣状物多孔性骨組みの調製を例示する。
5mg/mLの濃度及び3.3のpHの水性HClにおいて溶解したウシのI(1)型アテロコラーゲンの15gを、100mLガラスビーカに添加した。気泡を除くために、溶液を800×gで5-10分間、遠心分離機にかけた。遠心分離後、コラーゲン溶液を9.1dm3容器にて置いた。容器を密封し、及び空気を約2トル(水はほとんど沸騰する)の圧力まで真空ポンプを使用して脱気した。ポンプを切り、及び系を約27トルまでの窒素で充填した。脱気及び充填は3回繰返した。アンモニアの添加前に、圧力を再度約2トルにまで減少させ、及び真空ポンプ及びフラスコを閉じた。水性アンモニアをフラスコに充填し、及び30秒後に容器への連通を開き、及び窒素を用いて、コラーゲン溶液を有する容器中にアンモニア気体を洗い流した。容器における最終的な圧力は3-15トルの範囲にあった。孔の沈殿及び形成は40分に完了した。
【０１５５】
形成された孔は縦方向であり、及び円錐形状であり、及び直径はコラーゲンゲルの表面から増加した間隔と共に増加された。余分なアンモニア及び形成された塩を除くため、沈殿したコラーゲンを、脱イオン化した水で1日間洗浄した。洗浄したコラーゲンを次いで緩徐に凍らせ、及び凍結乾燥した。
(例6)
(プロテオグリカンの時間-依存生産の評価)
【０１５６】
この例は硝子質の軟骨の生産の誘導のための孔寸法の重要性の評価について実行する調査を記載する。
【０１５７】
多孔性の基材を通し、孔寸法の効果を評価するために、2種の異なる大きさの孔に作られた基材を調製した。大きな孔寸法の基材は435μmの平均寸法を持った。小さな孔の基材は153μmの平均寸法の孔を持った。
【０１５８】
細胞をトリプシン(Trypsin)-EDTA(Invitrogen(インビトロゲン社))を用いて収集した。ヒトの関節軟骨(hACs)から入手された三十万の軟骨細胞をヒドロゲル(コラーゲンゲル)中に懸濁し、及び平均孔寸法435μm又は平均孔寸法153μmを持つ多孔性の海綿状基材の複合体中に播種した。複合体を次いで培養媒体に移した。予備培養12時間後に、細胞の構築物を、5%C02、2%O2を備える媒体で、及び37℃の多重気体温置機(マルチガスインキュベータ)において10%FBS、1%ITS、0.1%ゲンタマイシン(Invitrogen)を有するDMEM/F-12媒体を用いて培養した。21日の培養後に、構築物を生化学的な評価のために収集した。
(例7)
(生化学的な評価)
【０１５９】
この例はコラーゲンに基づく複合体の生化学的な評価のために用いる方法を記載する。
【０１６０】
生化学的な分析のために、複合体を18時間パパインにおいて60℃で消化した。DNAを、Anal. Biochem.(アナリティカル・バイオケミストリ), 174:168-176(1988年)に記述されるHoechst(ヘキスト) 33258 染料法を用いて測定した。硫酸化-グリコサミノグリカン(S-GAG)の含量を、Connect. Tissue Res.(コネクティブ・ティッシュ・リサーチ), 9:247-248(1982年)に記述される修飾ジメチルメチレンブルー(DMB)マイクロアッセイを用いて測定した。
(例8)
(三次元のコラーゲンに基づく基材における細胞播種)
【０１６１】
この例は本発明に従うコラーゲンに基づく基材において収集され、及び播種される細胞のために用いる手法を記載する。
【０１６２】
細胞をTrypsin-EDTA(Invitrogen)を用いて収集した。三十万のヒト関節軟骨細胞(hACs)をコラーゲンヒドロゲルにおいて懸濁し、及び予め定めた平均孔寸法435μm又は153μmを持つ多孔性のコラーゲンに基づく基材の複合体中に播種した。細胞の構築物を、37℃で約一時間のコラーゲンゲル化の間温置し、及び次いで培養媒体中に移した。12時間の予備温置後、軟骨細胞を備える複合体を育成した(cultivated)。培養の零及び21の日の後、構築物を生化学的な評価のために収集した。
(例9)
(生存可能性の決定)
【０１６３】
この例は細胞の生存可能性の決定を例示する。
【０１６４】
表面活性剤法によって調製したコラーゲンに基づく基材を、およそ200,000個の軟骨細胞を用いて、吸収によってコラーゲンゲルにおいて播種し、及び3日間温置した。n=3を各群のために用いた。終了時に、軟骨細胞含有基材を1.5mLのマイクロ遠心管(microcentrifuge tubes)に配置し、及び一昼夜、0.15%のコラゲナーゼにおいて温置した。消化物を2000rpmで5分間回転させ及び上清を吸引した。培養媒体の部分(アリコート、0.1ml)を細胞ペレットに対し添加し、及び部分を計数のため採取した。細胞生存可能性及び合計細胞の計数を、トリパン青を用いて測定した。 
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１Ａ】実質均質な孔寸法の約200±100μｍ及び軟骨細胞を伴い狭く規定される空隙率を持ち、基材の孔に基材内で実質同じ分布模様(パターン)において播種されて示されるコラーゲンに基づく基材の図式的な側面図である。
【図１Ｂ】軟骨細胞をコラーゲンに基づく基材内に播種し、規定される直径の約200±100μmを持つ孔内に実質均質になるようにされる分布を示すコラーゲンに基づく基材の図式的な平面図である。
【図１Ｃ】実際のＩ型コラーゲン基材で、本発明の方法に従い生成された拡大していない図面代用写真である。
【図１Ｄ】およそ2.5×に拡大した実際のＩ型コラーゲン基材で、基材内の孔分布を示す図面代用写真である。
【図１Ｅ】およそ2.5×に拡大した実際のＩ型コラーゲン基材の、基材内の孔の分布を良好な対比(コントラスト)で示すための暗くした背景を伴う図面代用写真である。
【図２】本発明に従う支持基材の調製のための実験的な組立ての図式(スキーム)であり、水性アンモニアの貯蔵及び導入、不活性雰囲気の導入及び減圧を創造するための手段を提供する。
【図３Ａ】4mg/mLのコラーゲンから5mLの3%アンモニアの存在下に調製されるI型コラーゲンに基づく基材の図面代用顕微鏡写真であり、孔寸法約259±48μmを示す。図3Aは明らかに、基材が実質同じ寸法の孔及び基材を通して等しい分布を持つことを示す。
【図３Ｂ】アンモニア容量を6mLに増加させるとき、孔寸法は、図3Bに見られるように、334±89μmに増加した。尺度(スケール)(1000μm、即ち1cm)を、左上隅において示す。
【図４Ａ】6mg/mLのコラーゲンから2mLの3%アンモニアの存在下に調製されるI型コラーゲンに基づく基材の図面代用顕微鏡写真であり、孔寸法255±55μmを示し、ここでは孔寸法及び基材を通しての孔の分布は実質同じである。
【図４Ｂ】同じ条件下、アンモニア容量を4mLにまで増加させたとき、孔寸法は、図4Bに見られるように、わずかに235±67μmにまでだけ増加した。尺度(1000μm、即ち1cm)を、左上隅において示す。
【図５Ａ】5mg/mLのコラーゲンから、1mLの3%アンモニアで、不活性(窒素)雰囲気において減圧(3トル)の下で調製されるものの存在下に調製されるI型コラーゲンに基づく基材の図面代用顕微鏡写真であり、孔寸法253±59μmを示し、ここでは孔寸法及び基材を通しての孔の分布は実質同じである。
【図５Ｂ】同じ条件下、窒素雰囲気の圧力を、更に10トルにまで減らしたとき、孔寸法は、図5Bに見られるように、わずかに323±82μmにまで増加した。
【図５Ｃ】同じ条件下、アンモニア容量を3mLにまで増加させたとき、孔の寸法は、図5Cに見られるように、538±135μmにまで増加した。尺度(1000μm、即ち1cm)を、左上隅において示す。
【図６Ａ】4mg/mLのコラーゲンから、5mLの3%アンモニアで、非-イオン性表面活性剤(Pluronic(R)(プルロニック)(商標)F68; 0.3%重量/%)の存在下で調製されるものの存在下に調製されるI型コラーゲンに基づく基材の図面代用顕微鏡写真である。基材の表面での孔寸法は198±47μmであり、孔寸法及び基材を通しての孔の分布は同質であり、及び孔寸法は実質同じである。
【図６Ｂ】同じ条件下、コラーゲンの量を6mg/mLに増加させたとき、孔寸法は図6Bに見られるように、256±59μmにまで増加した。
【図６Ｃ】同じ条件下、コラーゲンの量を8mg/mLにまで増加させたとき、孔の寸法は、図6Cに見られるように、380±100μmにまで増加した。尺度は500μmで、右下隅において示す。
【図７】ＡはS-GAGの含量の決定の結果を示すグラフであり、零日及び21日での、200±50の孔寸法を持つ基材中に軟骨細胞を播種して得るDMBアッセイにより測定される。Ｂは零日及び21日でDNAアッセイによって測定されるDNAの含量を示すグラフである。
【図８】Ａは小さな孔(153±39μm)又は大きな孔(435±60μm)を持つ支持基材において播種した軟骨細胞によって生成されるS-GAGの含量を示すグラフである。
【図１Ａ】
2009508596.tif 000009
【図１Ｂ】
2009508596.tif 000010
【図１Ｃ】
2009508596.tif 000011
【図１Ｄ−Ｅ】
2009508596.tif 000012
【図２】
2009508596.tif 000013
【図３Ａ】
2009508596.tif 000014
【図３Ｂ】
2009508596.tif 000015
【図４Ａ】
2009508596.tif 000016
【図４Ｂ】
2009508596.tif 000017
【図５Ａ】
2009508596.tif 000018
【図５Ｂ】
2009508596.tif 000019
【図５Ｃ】
2009508596.tif 000020
【図６Ａ】
2009508596.tif 000021
【図６Ｂ】
2009508596.tif 000022
【図６Ｃ】
2009508596.tif 000023
【図７】
2009508596.tif 000024
【図８】
2009508596.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成20年7月29日(2008.7.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
前記生物学的適合性の物質は、I型コラーゲン、II型コラーゲン、IV型コラーゲン、ゼラチン、アガロース、ヒアルロニン、プロテオグリカンを含む細胞収縮性コラーゲン、グリコサミノグリカン、糖タンパク質、フィブロネクチン、ラミニン、生物学的に活性なペプチド増殖因子、サイトカイン、エラスチン、フィブリン、合成重合体繊維で、ポリ乳酸、ポリグリコール酸又はポリアミノ酸のようなポリ酸から作成されるもの、ポリカプロラクトン、ポリアミノ酸、ポリペプチドゲル、それらの共重合体、それらの前躯体及びそれらの組合せからなる群より選ばれ、前記前躯体は、アルファ1(I型)ペプチド、アルファ2(I型)ペプチド、2(アルファ1、I型)ペプチド、1(アルファ2、I型)ペプチド、3(アルファ1、II型)及びそれらの組合せからなる群より選ばれる、請求項1の基材。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０】
前記生物学的適合性の物質は、I型コラーゲン、II型コラーゲン、IV型コラーゲン、ゼラチン、アガロース、ヒアルロニン、プロテオグリカンを含む細胞収縮性コラーゲン、グリコサミノグリカン、糖タンパク質、フィブロネクチン、ラミニン、生物学的に活性なペプチド増殖因子、サイトカイン、エラスチン、フィブリン、合成重合体繊維で、ポリ乳酸、ポリグリコール酸又はポリアミノ酸のようなポリ酸から作成されるもの、ポリカプロラクトン、ポリアミノ酸、ポリペプチドゲル、それらの共重合体、それらの前躯体及びそれらの組合せからなる群より選ばれ、前記前躯体は、アルファ1(I型)ペプチド、アルファ2(I型)ペプチド、2(アルファ1、I型)ペプチド、1(アルファ2、I型)ペプチド、3(アルファ1、II型)及びそれらの組合せからなる群より選ばれる、請求項9の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
8mg/mLのコラーゲンで、及び2、3、及び4mLのアンモニアでのコラーゲンの重合は、284±90μm、299±73μm及び1195±294μmのそれぞれの範囲におけるより一層大きな孔を持つ支持基材を招いた。10mg/mLでの重合は、474±108μmの範囲における孔を有する基材を産生し、コラーゲンのより一層高い濃度を用いて発生する固有の変動性を例証する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
これらの結果から見られるように、支持基材は4及びなるべくなら6の間のmg/mLのコラーゲンの適当な量を用いて、アンモニアの適当な容量の存在下、2及び4のmLの間において調製し、約200±10Oμmの最適範囲内の孔寸法を持つ基材を招いた。
(b.不活性雰囲気及び減圧の効果) 
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
例えば、コラーゲンの前駆体を、基材保護のためのコラーゲン線維構造を再構成するのに用い得る。これらの前駆体は、例えば、ペプチド単量体で、アルファ1(I型)のようなもの、及びアルファ2(I型)コラーゲンペプチド又は2(アルファ1、I型)及び1(アルファ2、I型)のペプチドの組合せにおいて、又は3(アルファ1、II型)である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
渦巻きせん断加工の工程は関連するコラーゲン原線維のアルファ1(I型)及びアルファ2(I型)のペプチドの分散及び整合(alignment)を定める。この手法の間、窒素又はアルゴンの雰囲気における平衡はpHを調節する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
多孔性のI型コラーゲン内において新しく合成された軟骨特異的な基材の組織化は、例えば、タンパク質のレベルを定めるためのELISA/ウエスタンブロット法、又はm-RNAのレベルのための量的なRT-PCR又は実時間PCRによって視覚化され、及び定量化される。
(III.硝子質軟骨の立体的に高められた誘導)
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
この例は不活性雰囲気(N2)及び減圧の下の蜂の巣状物多孔性骨組みの調製を例示する。
5mg/mLの濃度及び3.3のpHの水性HClにおいて溶解したウシのI型アテロコラーゲンの15gを、100mLガラスビーカに添加した。気泡を除くために、溶液を800×gで5-10分間、遠心分離機にかけた。遠心分離後、コラーゲン溶液を9.1dm3容器にて置いた。容器を密封し、及び空気を約2トル(水はほとんど沸騰する)の圧力まで真空ポンプを使用して脱気した。ポンプを切り、及び系を約27トルまでの窒素で充填した。脱気及び充填は3回繰返した。アンモニアの添加前に、圧力を再度約2トルにまで減少させ、及び真空ポンプ及びフラスコを閉じた。水性アンモニアをフラスコに充填し、及び30秒後に容器への連通を開き、及び窒素を用いて、コラーゲン溶液を有する容器中にアンモニア気体を洗い流した。容器における最終的な圧力は3-15トルの範囲にあった。孔の沈殿及び形成は40分に完了した。
【国際調査報告】
2009508596.tif 000026