(57)【要約】  本発明は、増大したタンパク質産生能を有する安定した哺乳動物細胞系を作製するための新規の方法、並びに関心対象の生物製剤タンパク質の高レベルの発現のための発現ベクター及び関連方法を提供する。
2009535065.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）ゲノム内に組み込まれたＲＮＡ分子のＤＮＡコピーを有する受け手の哺乳動物宿主細胞の宿主細胞に、ａ）哺乳動物レトロウイルスＧａｇ−Ｐｒ断片をコードするＤＮＡ断片及びｂ）関心対象のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットと隣接するように配置された哺乳動物レトロウイルスＥｎｖ断片をコードするＤＮＡ断片を含む組換え発現ベクターを形質移入し、これにより形質移入された受け手の宿主細胞を形成する工程；２）前記形質移入された受け手の宿主細胞を単離する工程並びに３）細胞系の産生能を決定する工程を含む、増大されたタンパク質産生能を有する安定した哺乳動物細胞系を作製するための方法。
【請求項２】
宿主細胞が、ＣＨＯ細胞であり、及び哺乳動物レトロウイルスＧａｇ−Ｐｒ断片をコードするＤＮＡ断片が、発現カセットに対して５’に配置された配列番号４からなるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
宿主細胞がＣＨＯ細胞であり、及び哺乳動物レトロウイルスＥｎｖ断片をコードするＤＮＡ断片が、発現カセットに対して３’に配置された配列番号５からなるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯミエローマ細胞、サル腎臓ＣＯＳ細胞、サル腎臓線維芽ＣＶ−１細胞、ヒト胚性腎臓２９３細胞、ヒト乳癌ＳＫＢＲ３細胞、ヒトジャーカットＴ細胞、イヌ腎臓ＭＤＣＫ細胞及びヒト子宮頸癌Ｈｅｌａ細胞の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＲＮＡ分子のＤＮＡコピーが、レトロウイルスプロウイルス、レトロウイルス様ＤＮＡ配列、レトロトランスポゾン及びレトロ転写産物から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ａ）哺乳動物レトロウイルスＧａｇ−Ｐｒ由来のＤＮＡ断片と、及びｂ）哺乳動物宿主細胞中での直接的な発現に必要とされる制御配列に作用可能に連結された関心対象のタンパク質を含む発現カセットをコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットに隣接するように配置された哺乳動物レトロウイルスＥｎｖ遺伝子由来のＤＮＡ断片とを含む、哺乳動物発現ベクター。
【請求項７】
発現ベクターｐＡＢＭＭ４８（配列番号３）。
【請求項８】
発現ベクターｐＡＢＭＥ１５（配列番号６）。
【請求項９】
抗体発現カセットに作用可能に連結されたＣＨＯレトロウイルスＧａｇ−Ｐｒをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号４）。
【請求項１０】
抗体発現カセットに作用可能に連結されたＣＨＯレトロウイルスＥｎｖをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号５）。
【請求項１１】
哺乳動物レトロウイルスＧａｇＰｒをコードするＤＮＡ配列（配列番号４）と、及び哺乳動物宿主細胞中での直接的な発現に必要とされる制御配列に作用可能に連結された関心対象のタンパク質をコードする発現カセットに隣接するように配置された哺乳動物レトロウイルスＥｎｖタンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号５）とを含む、発現ベクター。
【請求項１２】
高い転写活性によって特徴付けられる宿主細胞のゲノムの一部位中に組み込まれた請求項６に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１３】
宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
細胞が、ＣＨＯレトロウイルスＧａｇ−Ｐｒ及び発現カセットに隣接するＣＨＯレトロウイルスＥｎｖ遺伝子由来のＤＮＡ断片を欠如する発現ベクターによって形質移入された宿主細胞の産生能に比べて増大されたタンパク質産生能によって特徴付けられる、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
１）ゲノム内に組み込まれたＲＮＡ分子のＤＮＡコピーを有する受け手の哺乳動物宿主細胞に、ａ）哺乳動物レトロウイルスＧａｇ−Ｐｒ断片をコードするＤＮＡ断片と及びｂ）抗体をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットに隣接するように配置された哺乳動物レトロウイルスＥｎｖ断片をコードするＤＮＡ断片とを含む組換え発現ベクターを形質移入し、これにより形質移入された受け手の宿主細胞を形成する工程；２）前記形質移入された受け手の宿主細胞を単離する工程及び３）細胞系の抗体産生能を決定する工程を含む、増大した抗体産生能を有する安定した哺乳動物細胞系を作製するための方法。
【請求項１６】
宿主細胞がＣＨＯ細胞であり、並びに哺乳動物レトロウイルスＧａｇ−ＰｒをコードするＤＮＡ断片が配列番号４を含み、及び哺乳動物レトロウイルスＥｎｖ断片をコードするＤＮＡ断片が配列番号５を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ゲノム内に組み込まれたＲＮＡ分子のＤＮＡコピーを有する受け手の哺乳動物宿主細胞宿主細胞に、ａ）哺乳動物レトロウイルスＧａｇ−ＰｒをコードするＤＮＡ断片（配列番号４）と及びｂ）組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットに隣接するよう配置された哺乳動物レトロウイルスＥｎｖ断片（配列番号５）とを含む発現ベクターを形質移入し、これにより、形質移入された受け手の宿主細胞を形成する工程；及び前記形質移入された受け手の宿主細胞を単離する工程；及び３）増大したタンパク質産生に適した条件下で、工程２）の単離された宿主細胞を培養する工程を含む、組換えタンパク質の高レベルを産生するための方法。
【請求項１８】
組換えタンパク質が抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ゲノム中に内在性レトロウイルス配列を有する受け手の哺乳動物細胞に、相同的組換えによって前記内在性レトロウイルス配列と組み合わせることができる少なくとも１つの組換えポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド配列に作用可能に連結された発現カセットを含む発現ベクターを形質移入することを含む、哺乳動物細胞の形質移入の効率を調節するための方法。
【請求項２０】
哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞であり、及び相同的組換えによって内在性レトロウイルス配列と組み合わせることができる組換えポリヌクレオチド配列がＣＨＯレトロウイルスＧａｇ−Ｐｒをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号４）と発現カセットに作用可能に連結されたＣＨＯレトロウイルスＥｎｖ断片（配列番号５）とを含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」という表題の２００６年５月４日に出願された米国仮出願第６０／７４６，４９０号の、米国特許法第１１９条第（ｅ）項の規定に基づく利益を主張する。本仮出願の開示は、その全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明の技術分野
本発明は、一般に、組換えタンパク質産生の分野に関し、より具体的には、生物製剤タンパク質の産生のための安定した産生細胞系の作製に関する。
【背景技術】
【０００３】
哺乳動物細胞は、生物製剤タンパク質を製造するために広く使用されている。複雑な翻訳後修飾を含む抗体等のタンパク質の産生のため、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、典型的には、安定した哺乳動物産生細胞系の作製のために選択される宿主細胞である。哺乳動物遺伝子発現ベクターの設計及び精巧さに関して、近年、著しい進歩を遂げたにもかかわらず、哺乳動物細胞中での生物製剤タンパク質の頑強な産生は、通例の事項とはなっていない。組換えタンパク質の大規模な産生のための発現系を開発するには、細胞増殖の特徴、導入遺伝子発現レベル、翻訳後修飾の性質及び程度、関心対象のタンパク質の生物活性並びに規制上の問題及び経済的な考慮を含む多くの因子を注意深く考慮することが必要である。
【０００４】
哺乳動物宿主細胞中への形質移入後、関心対象の生物製剤タンパク質に関するコード化配列（すなわち、導入遺伝子）を含む発現ベクターは通常、宿主細胞のゲノム中に無作為に組み込まれる。典型的には、ある細胞中において、組込みは、単一の位置で生じ、その結果、異なる細胞は異なる位置（染色体上の位置）で組込みを示すことが期待され得る。哺乳動物のゲノムのサイズが大きいため、無作為な組込みの工程は、一般に、変動する最適下の発現レベルによって特徴付けられる形質移入された宿主細胞を与える。この結果は、高い転写活性によって特徴付けられるゲノムの部位（すなわち、ホットスポット）中に、導入遺伝子が無作為に組み込まれる可能性が低いという事実によるところが大きい。驚くべきことではないが、形質移入された宿主細胞の圧倒的大部分は、導入遺伝子によってコードされるタンパク質産物を低レベルで産生するに過ぎない。それゆえ、形質移入された宿主細胞の多くは、関心対象のタンパク質を産生している細胞を同定するために選別される必要がある。
【０００５】
導入遺伝子の増幅は通常、生物学的評価及び産業的製造の目的のために必要とされる規模で生物製剤タンパク質を産生できる細胞系を作製することが必要とされる。従って、発現ベクターは、典型的には、増幅可能なマーカーを含む。例えば、発現ベクター中での増幅可能なマーカーとしてのジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を包め、選択のためにメトトレキサート（ＭＴＸ）を使用することによって、ＤＨＦＲ−／−ＣＨＯ細胞の遺伝子コピー数を、細胞１個あたり５０コピー又はそれ以上まで増加させることができる（Ｏｍａｓａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．９４，Ｎｏ．６，ｐｐ６００−６０５，２００２）。産生細胞系を作製するために段階的な遺伝子増幅戦略を使用することの周知の欠点には、増幅プロトコールに由来する異なるクローンのタンパク質発現レベルが２桁を超え得る広い範囲にわたり得るという事実、この戦略には変異細胞系を使用することが必要であるという事実、及び選択薬としてのＭＴＸの継続的存在が高いコピー数の細胞系を不安定にし得る細胞遺伝学的不均一性を促進するという事実が含まれる。後者に関する考慮は、産生細胞系のための規制認可過程に照らして、特に望ましくない。さらに、高い産生のための遺伝子増幅過程は、退屈で時間がかかる（おそらく、最長４ないし６ヶ月間を要する。）。歴史的には、次善の代替的な産生系はＣＯＳ細胞中での大規模な一過性発現であり、これは、より迅速であるが、より労力を要する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、高レベルの組換え遺伝子発現が可能な安定した細胞系が作製される頻度を増大させる方法に対する要望が本分野において存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
本明細書中に開示されている本発明は、外来性のコード化配列の組込みのための所望の標的としての宿主細胞ゲノム内での位置として、内在性ウイルス配列を活用することによって、組換えタンパク質の高レベルでの発現が可能な、安定した哺乳動物細胞系を作製するための方法を提供する。組換えタンパク質を高レベルで産生できる安定したＣＨＯ細胞系を作製する能力は、退屈な段階的増幅手法又は大規模な一過性ＣＯＳ形質移入の何回ものラウンドを実施しなければならないことに対する代替策を提供する。開示されている本発明はＣＨＯ細胞中で実施することができるので、研究者は、ＣＨＯ細胞が無血清培地中で十分に増殖し、能率化された産生及び精製過程を容易にする規模で馴致培地を簡単に作製するという事実を活用することが可能となる。
【０００８】
一態様において、本発明は、１）ゲノム内に組み込まれたＲＮＡ分子のＤＮＡコピーを有する受け手の哺乳動物宿主細胞に、ａ）哺乳動物レトロウイルスＧａｇ−Ｐｒ断片をコードするＤＮＡ断片（配列番号４）と、及びｂ）関心対象のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットに隣接するように配置された哺乳動物レトロウイルスＥｎｖ断片をコードするＤＮＡ断片（配列番号５）とを含む組換え発現ベクターを形質移入し、これにより形質移入された受け手の宿主細胞を形成する工程；２）前記形質移入された受け手の宿主細胞を単離する工程及び３）宿主細胞の前記タンパク質産生能を決定する工程を含む、増大したタンパク質産生能を有する安定した哺乳動物細胞系を作製するための方法を提供する。ＲＮＡ分子の組み込まれたＤＮＡコピーは、レトロウイルスプロウイルス、レトロウイルス様ＤＮＡ配列、レトロトランスポゾン及びレトロ転写産物であり得る。
【０００９】
本発明の本態様の具体的な実施形態において、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞であり、哺乳動物レトロウイルスＧａｇ−Ｐｒ断片をコードするＤＮＡ断片は、発現カセットに対して５’に配置された配列番号４からなるポリヌクレオチド配列を含み、哺乳動物レトロウイルスＥｎｖ断片をコードするＤＮＡ断片は、発現カセットに対して３’に配置された配列された配列番号５からなるポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯミエローマ細胞、サル腎臓ＣＯＳ細胞、サル腎臓線維芽細胞ＣＶ−１細胞、ヒト胚性腎臓２９３細胞、ヒト乳癌ＳＫＢＲ３細胞、ヒトジャーカットＴ細胞、イヌ腎臓ＭＤＣＫ細胞及びヒト子宮頸癌Ｈｅｌａ細胞の群から選択することができる。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、ａ）ＣＨＯレトロウイルスｇａｇタンパク質遺伝子由来のＤＮＡ断片と、及びｂ）哺乳動物宿主細胞中での導入遺伝子の直接的な発現に必要とされる調節配列に作用可能に連結された発現カセットを含むＤＮＡ配列に隣接するように配置されたＣＨＯレトロウイルスｅｎｖ遺伝子由来のＤＮＡ断片とを含む、哺乳動物発現ベクターを提供する。本発明によって提供される発現ベクターは、ｐＡＢＭＭ４８（配列番号３）及びｐＡＢＭＥ１５（配列番号６）によって例示される。
【００１１】
別の態様において、本発明は、ＣＨＯレトロウイルスＧａｇ−Ｐｒ（配列番号４）及び、ＣＨＯ細胞によって有される内在性レトロウイルス配列との相同的組換えによって組み合わせることができるＣＨＯレトロウイルスＥｎｖ断片（配列番号５）をコードするポリヌクレオチド配列を提供し、これにより、高い転写活性によって特徴付けられる宿主細胞の位置（すなわち、ホットスポット）において、発現カセットの、宿主細胞のゲノムへの組込みが容易になる。本発明の本態様の具体的な実施形態において、ポリヌクレオチド配列には、発現カセットに作用可能に連結された調節要素が含まれる。さらに具体的には、本発明は、レトロウイルスＧａｇＰｒ（配列番号４）と及び哺乳動物宿主細胞中での直接的な発現に必要とされる制御配列に連結された抗体をコードする発現カセットに隣接するように配置されたレトロウイルスＥｎｖタンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号５）との両者をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを提供する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、高い転写活性によって特徴付けられる哺乳動物宿主細胞のゲノムのある部位中に組み込まれた本発明の発現ベクターを含む哺乳動物宿主細胞を提供する。本明細書に示されているように、高い転写活性によって特徴付けられる宿主細胞ゲノム内の一部位に発現ベクターを誘導する（又は標的化させる）能力によって、発現カセットに隣接する哺乳動物レトロウイルス配列由来のＤＮＡ断片を欠如する発現ベクターを形質移入された宿主細胞の産生能に比べて増大したタンパク質産生能によって特徴付けられる受け手の宿主細胞が作製される。
【００１３】
本明細書中に開示され、権利請求されている方法、ベクター及び形質移入された宿主細胞は、増大した組換えタンパク質産生能を有する安定した哺乳動物（例えば、ＣＨＯ細胞）産生細胞系の作製に有用である。適切な産生細胞系は、１）そのゲノム内にＲＮＡ分子の組み込まれたＤＮＡコピーを有する受け手の哺乳動物宿主細胞に、ａ）哺乳動物レトロウイルスＧａｇ−ＰｒをコードするＤＮＡ断片と、及びｂ）組換え抗体等（これに限定されるわけではない。）の関心対象の生物製剤タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットに隣接するように配置された哺乳動物レトロウイルスＥｎｖ断片をコードするＤＮＡ断片とを含む組換え発現ベクターを形質移入し、これにより、形質移入された受け手の宿主細胞を形成することによって調製可能である。本発明の本態様の具体的な実施形態において、哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ細胞であり、第一のＤＮＡ断片は、発現カセットに対して５’に配置された配列番号４に記載されているヌクレオチド配列からなるＣＨＯレトロウイルスＧａｇ−Ｐｒポリヌクレオチド配列をコードし、第二のＤＮＡ断片は、発現カセットに対して３’に配置された配列番号５に記載されているヌクレオチド配列からなるＣＨＯレトロウイルスＥｎｖ断片ポリヌクレオチドをコードする。
【００１４】
本発明はまた、１）ゲノム内に組み込まれたＲＭＡ分子のＤＮＡコピーを有する受け手の哺乳動物宿主細胞に、ａ）哺乳動物レトロウイルスＧａｇ−ＰｒをコードするＤＮＡ断片（配列番号４）と、及びｂ）組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットに隣接するように配置された哺乳動物レトロウイルスＥｎｖ断片をコードするＤＮＡ断片（配列番号５）とを含む組換え発現ベクターを形質移入し、これにより形質移入された受け手の宿主細胞を形成する工程；２）形質移入された受け手の宿主細胞を単離する工程；３）増大したタンパク質産生に適した条件下で、工程２）の単離された宿主細胞を培養する工程を含む、安定した哺乳動物産生細胞系において組換えタンパク質の高レベルを産生するための方法も提供する。
【００１５】
具体的な実施形態において、本発明は、抗体の高レベルを作製するための方法を提供する。遺伝子増幅工程を必要とせずに、本発明を使用して作製される安定した細胞系は、１日あたり細胞１個あたり１０ｐｇ以上、好ましくは２０ｐｇ、より好ましくは３０ｐｇの産生レベルで抗体を産生する能力を有する。その産生レベルで、最適化された細胞培養条件で、抗体のＬ当りｇ単位が産生される。
【００１６】
本発明は、さらに、そのゲノム中に内在性レトロウイルス配列を有する受け手の哺乳動物細胞に、相同的組換えによって前記内在性レトロウイルス配列と組み合わせることができる少なくとも１つの組換えポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド配列に作用可能に連結された発現カセットを含む発現ベクターを形質移入することを含む、哺乳動物細胞の形質移入の効率を調節するための方法を提供する。本発明の本態様の具体的な実施形態において、方法は、関心対象の生物製剤タンパク質の高レベルを産生することができる形質移入された受け手の宿主細胞の頻度を増大させる手段を提供する。
【００１７】
発明の詳細な説明
本明細書及び特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈に別段の明確な記載がなければ複数形の参照を含む。
【００１８】
本明細書で使用される「産生細胞系」という語は、組換えＤＮＡ技術を使用して構築する発現ベクターで形質転換又は形質移入されており、組換えタンパク質をコードする配列を含有する宿主細胞を指す。形質転換とは、発現ベクター等の核酸の付加によって受け手の宿主細胞を修飾することを指す。形質移入とは、化学的手段又は電気穿孔法によって、受け手の宿主細胞中に核酸を導入することを指す。発現されたタンパク質は、好ましくは、発現ベクターの設計（例えば、分泌リーダーの包含）に応じて、培養上清中に分泌される。
【００１９】
本明細書で使用される「発現」という語は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される過程及び／又は転写されたｍＲＮＡ（「転写産物」ともいう。）が、その後、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳される過程を指す。転写産物及びコードされたポリペプチドは、遺伝子産物と総称される。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡ由来である場合、発現には、真核細胞中でのｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。
【００２０】
相同的組換えは、同一又は非常に類似した（すなわち、相同的な）配列の伸展（塩基対の数百ないし数千）内でＤＮＡ分子の破壊及び再結合を通じて生じる遺伝的再編成の一種である。ＤＮＡベクターのゲノムの一領域中への相同的組換えは、ほぼ全ての細胞種で実施可能であるが、低頻度で生じる。相同的組換えの頻度の増大は、（１）ベクターＤＮＡの直鎖化；（２）組換えに対する配列相同性の最大化；（３）形質移入されたＤＮＡの３’ヒドロキシルのジデオキシヌクレオチドによる修飾によって達成可能である。
【００２１】
本発明のポリヌクレオチド又は核酸は、ＲＮＡの形態又はＤＮＡの形態であり得、前記ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡを含む。「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という語は、互換的に使用される。本用語は、あらゆる長さのヌクレオチドの重合体形態を指し、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドの何れか又はこれらの類縁体を指す。ポリヌクレオチドは、あらゆる３次元構造を有し得、公知又は非公知の何れかの機能を発揮し得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である。遺伝子又は遺伝子断片のコード領域又は非コード領域、連鎖解析から規定される座位、エクソン、イントロン、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、何れかの配列の単離されたＤＮＡ、何れかの配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマー。
【００２２】
「ベクター」とは、好ましくは自己複製する、挿入された核酸分子を宿主細胞中に及び／又は宿主細胞間に転移させる核酸分子である。「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞中に導入された場合、転写され、ポリペプチドへと翻訳されることができるポリヌクレオチド配列である。「発現系」は通常、所望の発現産物を生じるように機能することができる発現ベクターを含む適切な宿主細胞を言外に含む。
【００２３】
「遺伝子」、「遺伝子断片」及び「コード化配列」という語は、本明細書において互換的に使用される。これらの語は、転写及び翻訳された後に特定のタンパク質をコードできる少なくとも１つの翻訳領域を含有するポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドが、コード化領域全体又はそのセグメントを包含し得る少なくとも１つの翻訳領域を含有する限り、遺伝子又は遺伝子断片は、ゲノム又はｃＤＮＡであり得る。
【００２４】
本明細書で使用される「異種性の」という語は、比較されている実体の残りとは遺伝子型として異なる実体に由来することを意味する。例えば、その元のコード化配列から取り出され、元の配列以外のコード化配列に作用可能に連結されたプロモーターは、異種性のプロモーターである。ポリヌクレオチド、ポリペプチドに適用される「異種性の」という語は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、比較されている実体の残りのものとは遺伝子型が異なる実態に由来することを意味する。例えば、異種性のポリヌクレオチド又は抗原は、異なる種起源、異なる細胞種及び異なる個体の細胞の同一種に由来し得る。
【００２５】
ポリヌクレオチドに適用される「組換え」という語は、ポリヌクレオチドが、天然に見出されるポリヌクレオチドとは異なるコンストラクトをもたらすクローニング工程、制限工程及び／又は連結工程の多様な組み合わせの産物であることを意味する。
【００２６】
本明細書で使用される「作用可能に連結された」又は「作用上連結された」という語は、そのように記載されている成分が、それらの所期の様式で機能できるような関係にあるような様式で並置されているＤＮＡ配列を表すために使用される。例えば、プロモーターは、配列の転写を調節する場合、コード化配列に作用可能に連結されており、又はリボソーム結合部位は、翻訳可能なように配置される場合、コード化配列に作用可能に連結される。シグナル配列のためのＤＮＡ（分泌リーダー）は、ポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現される場合、ポリペプチドに関するＤＮＡに作用可能に連結されている。一般に、作用可能に連結されたとは、連続的であることを意味する。
【００２７】
本明細書で使用される「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という語は、本明細書において互換的に使用され、あらゆる長さのアミノ酸の重合体を指す。重合体は、線形、環状又は分岐鎖であり得、修飾されたアミノ酸を含み得、非アミノ酸によって中断され得る。前記語は、例えば、硫酸化、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、ヨウ素化、メチル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、転移ＲＮＡにより仲介されるタンパク質へのアミノ酸の付加（アルギニル化など)、ユビキチン化又は他の操作（標識成分の連結など）等を介して修飾されたアミノ酸重合体も包含する。本明細書で使用される「アミノ酸」という語は、グリシン及びＤ型光学異性体又はＬ型光学異性体の両者及びアミノ酸類縁体を含む、天然及び／又は非天然アミノ酸又は合成アミノ酸を指す。
【００２８】
本明細書で使用される「抗体」という語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある部分を指し、すなわち、抗原を特異的に結合する（「抗原と免疫反応する」）抗原結合部位を含有する分子を指す。構造上、最も単純な天然の抗体（例えば、ＩｇＧ）は、４つのポリペプチド鎖、すなわち、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重鎖（Ｈ鎖）及び２つの軽鎖（Ｌ鎖）を含む。免疫グロブリンは、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥ等の分子の幾つもの種類を含む分子の大きなファミリーを表す。「免疫グロブリン分子」という語には、例えば、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びこれらの断片が含まれる。抗体断片の非限定的な例には、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（４）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（５）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（６）蝶番領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（７）より短いリンカーを有する２つの同一の単一鎖Ｆｖからなる二重特異性抗体；（８）より合わせコイルドメインの一対の相互作用によって安定化されるＦｖからなるｃｃＦｖ抗体が含まれる。
【００２９】
非ヒト（例えば、齧歯類又は霊長類）抗体に対して使用される「ヒト化」という語は、ハイブリッド免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するこれらの断片である。多くの場合、ヒト化抗体は、受け手の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は霊長類等の非ヒト種のＣＤＲ由来の残基（ドナー抗体）によって置換されているヒト免疫グロブリン（受け手抗体）である。幾つかの事例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。
【００３０】
導入遺伝子組込み部位は、組換え遺伝子の転写速度に対して（位置効果として本分野で呼ばれる。）顕著な効果を及ぼすことが知られている。無作為な組込み及び遺伝子発現停止に関する負の効果を克服するために、幾つもの戦略が使用されてきた。例えば、ある研究者は、導入遺伝子をインスレーター配列、境界要素、又は足場／マトリックス付着領域等の保護的シス調節要素と隣接することによって、無作為な組込みと関連した望ましくない結果を克服するという成功を報告している（Ｂｏｄｅ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．６（２−３）：１１５−３８．１９９６）。これらの要素は、高い転写活性を得るために良いと信じられている人工的なゲノム環境を提供する目的で、発現ベクター中に含まれる。それゆえ、これらの要素は、細胞のゲノムにおける位置効果を克服し、位置に比較的関係なく導入遺伝子を発現させる。これらのアプローチは、組換え遺伝子の高レベルの発現を可能にする形質転換体の頻度を増大させる上で程度の異なる成功を報告してきた（Ｐｈｉ−Ｖａｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１０（５）：２３０２−７，  １９９０；Ｓｃｉｐｐｅｌ  ＡＥ  ｅｔ  ａｌ，米国特許第５７３１１７８号、１９９８年３月２４日；Ｇｉｒｏｄ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．５；９１（１）：１−１１，  ２００５；Ｍｅｒｍｏｄ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ，米国特許第７１２９０６２号、２００６年１０月３１日）。
【００３１】
位置効果を回避する別の戦略は、宿主細胞のゲノムの転写活性領域へ導入遺伝子の組み込みを標的化するための遺伝子標的化戦略を設計及び実施することである。転写活性のある領域は通常、組換えタンパク質の高レベルの発現が可能な細胞から同定される。これらの高レベルの産生細胞系は、形質移入された細胞の多量を選別することから単離される。例の１つは、組換えタンパク質の高レベルの発現が可能な細胞系を選別するための翻訳上損傷を受けた優性の選択可能なマーカーを含有するＤＮＡベクター（Ｎｅｏｓｐｌａ）を使用することである（米国特許第５６４８２６７号）。Ｎｅｏｓｐｌａベクターにおいて、選択マーカーであるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｎｅｏ）遺伝子は、２つのエクソンに人工的に分岐されている。さらに、米国特許第５８３０６９８号は、相同的組換えによる部位特異的組込みのための３つのｎｅｏエクソンを含有する２つのベクター（作製プラスミド及び標的プラスミド）の使用を記載した。１つのｎｅｏエクソンを含有する作製プラスミドの機能は、宿主細胞中に標的部位を作製することである。２つのｎｅｏエクソンを含有する標的ベクターによる相同的組換えの後、機能的ｎｅｏ遺伝子を有する高レベルの産生細胞は、他の低レベルの細胞から選別される。このアプローチの後、１個あたり１日あたり０．３ないし４．５ｐｇの抗体生産性を有する細胞系を単離した。
【００３２】
本明細書中に開示されている本発明は、可能なホットスポットを示すことが知られており、従って、相同的組換えによる導入遺伝子の組込みのための標的として外来性コード化配列の高レベルの発現を誘導する可能性があると推定される宿主細胞ゲノム内で、あらかじめ存在する内在性ＤＮＡ配列を標的化することを基礎としている。内在性ホットスポット配列に対して相同的であるように設計されたヌクレオチド配列と隣接するコード化配列を含む導入遺伝子の導入は、相同的組換えによる外来性コード化配列の組込みを促進する。この戦略は、導入遺伝子の高レベルの発現及びその結果得られる関心対象の生物製剤タンパク質の産生によって特徴付けられる安定した細胞系の産生のために、哺乳動物宿主細胞中に存在する内在性レトロウイルス配列を利用する新規方法を提供する。
【００３３】
内在性レトロウイルス及びレトロウイルス様配列は、ほぼ全ての哺乳動物ゲノム中に存在する。ヒトゲノムの配列決定による最近の知見は、ヒト及びマウスのゲノムの約８ないし１０％が、（構造タンパク質をコードする）ｇａｇ、ｐｏｌ（ウイルス酵素）及びｅｎｖ（表面外被タンパク質）を含む少なくとも３つの遺伝子並びに末端反復配列（ＬＴＲ）を含有する感染性レトロウイルスと類似した配列からなると思われることを明らかにする（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ＤＪ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２：１０１７．１−１０１７．５，  ２００１；Ｎａｔｕｒｅ  ４２０：５２０−５６２，  ２００２）。蓄積されたデータは、レトロウイルスの組込みが、ゲノム中で完全に無作為というわけではないことを示唆している。ＨＩＶ感染の場合、最新の研究は、レトロウイルスの組込みが、活性遺伝子を好むことを示した。報告された全ての組込み部位に関する分析は、９２．５％の組込み部位が、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）と隣接していることを示した（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００４，  ３２２：６７２−７）。Ｂｏｄｅ  Ｊら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，  ３５：２２３９−５２）は、レトロウイルスが、足場又はマトリックス付着領域（Ｓ／ＭＡＲ）を選択的に標的にすることを観察している。
【００３４】
レトロウイルスは、そのＲＮＡゲノムを、宿主染色体中に組込まれるおよび安定した遺伝要素として作用するＤＮＡへ逆転写する能力に関して全体的な構造的類似性（５’−ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−ＬＴＲ翻訳領域）の高い程度によって特徴付けられる。内在性レトロウイルスは、多くの種において存在することが知られており、例えば、公表された研究は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が、転写活性のある全長のＣ型プロウイルス配列を含有することを示している（Ｌｉｅ  ＹＳ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６８（１２）：７８４０−９．  １９９４）。ＣＨＯ細胞は、Ｃ型レトロウイルス配列の細胞１個あたり約１００ないし３００コピーの間を有すると推測されている（Ｄｉｎｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ｓｔａｎｄ．７６：２０１−７．  １９９２）。組換えの頻度が低い（１／１００ないし１／１０００）ので、複数の組込みを有する可能性は低い。
【００３５】
多くの齧歯類細胞系とは異なり、ＣＨＯ細胞は、感染性レトロウイルスの検出可能なレベルを生じない。しかしながら、Ｃ型レトロウイルス様粒子が、電子顕微鏡によってＣＨＯ細胞中で検出され、これは、レトロウイルス感染とは異なり、内在性起点上に関係するとされた。基礎を成す機序は完全には理解されていないが、レトロウイルスのプロウイルスが好ましい染色体部位内に選択的に組み込む傾向があることは明白である。特に、レトロウイルスの組込みの過程が、転写活性のある遺伝子を好むことが観察されている。
【００３６】
本願中に開示されている本発明は、発現ベクターの標的化された（又は誘導された）組込みのためのホットスポットとして、これらのレトロウイルス配列を利用する。より具体的には、本発明は、安定した哺乳動物産生細胞系の作製のための標的としてあらかじめ存在する又は内在性のウイルス配列を利用する。例えば、ＣＨＯレトロウイルス部位は、関心対象の生物製剤タンパク質をコードする発現カセットを含む導入遺伝子の誘導された組込みのための標的とすることができる。本明細書で示されるように、内在性ＣＨＯレトロウイルス配列と相同的組換えの可能なｇａｇ及びＥｎｇ遺伝子断片を有する隣接する抗体遺伝子は、レトロウイルス標的化配列を含まないベクターで形質移入された宿主細胞から産生される抗体のレベルと比較して、１０倍以上高いＩｇＧ１タンパク質を発現する安定した細胞系が作製される。
【００３７】
内在性レトロウイルスのプロウイルス配列による相同的組換えを誘導するように設計されたＤＮＡ配列を含む発現ベクターを利用する詳細な記載の実施例８ないし１０に記載されている形質移入実験の結果は、本発明の発現ベクターが、レトロウイルスＤＮＡ配列の非存在下での同一の調節要素及び発現カセットを全て含むベクターで作製された形質移入体よりも高レベルの抗体産生が可能であるより多くの形質移入体（受け手により形質移入された宿主細胞）を生じることを確立している。
【００３８】
本発明の哺乳動物発現系註で発現され得るポリペプチドの例には、インターロイキン−２、インターフェロン、ヒトインスリン、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、卵胞刺激ホルモンα、組織プラスミノーゲン活性化因子、血小板細胞由来増殖因子、腫瘍壊死因子、ＴＮＦ受容体、グルコセレブロシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ等の、（ヒト化抗体又はその断片を含む）抗体、ヒトサイトカイン、増殖因子、増殖因子受容体、酵素並びにＢ型肝炎抗原、ジフテリア毒素タンパク質等の組換えワクチンを含む（但し、これらには限定されない。）、関心対象の全ての生物製剤タンパク質が含まれ得る。
【００３９】
関心対象のポリペプチドは、本明細書中に開示されているベクターコンストラクトによる哺乳動物宿主細胞の形質転換又は形質移入など、本明細書中に開示されている方法の使用を通じた何れかの手段によって作製することが可能である。本発明の宿主細胞は、培養チューブ、フラスコ、回転瓶、振盪フラスコ又は発酵槽中での増殖など(但し、これらに限定されるわけではない。)、本分野で公知のあらゆる方法又は想定されるあらゆる方法によって増殖又は培養され得る。ポリペプチド産物の単離及び／又は精製は、本開示の実施例７に記載されている方法に従って、又は本分野で公知の何れかの手段によって実施可能である。
【００４０】
特定の理論に拘泥することを望むものではないが、高産生細胞系のより高い頻度が、発現ベクターによって利用される組込み部位の性質及び位置に関与すると考えられている。より具体的には、本発明の発現ベクターは、導入遺伝子を転写ホットスポットへ誘導すると信じられている。本効果は、活発に転写された遺伝子を好むことが知られているレトロウイルスの組込みの過程の結果であると考えられている。発現カセットを哺乳動物宿主細胞のゲノムの転写ホットスポット中に選択的に導入できる発現ベクターを設計することができることによって、安定した産生細胞系の作製及び生物製剤タンパク質の産生に適した製造過程の開発が容易となる。
【００４１】
産生細胞系を作製するのに使用するように設計された発現ベクターの要素、及び適切な宿主細胞中に発現ベクターを導入するように選択された形質転換プロトコールは、関心対象のタンパク質を作製するために使用されている哺乳動物細胞培養系の性質に依存する。当業者は、多くの異なるプロトコール及び宿主細胞を承知しており、彼らの選択した細胞系の要求に基づいて、所望のタンパク質の産生のための適切な系を選択することができる。
【００４２】
最新のデータは、ＣＨＯ細胞の細胞外レトロウイルス様粒子が、チャイニーズハムスター生殖系列中に存在する内在性プロウイルス要素の産物であることを示唆した（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＫＰ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．７５：１２３−１３２，  １９９１）。多くの内在性レトロウイルスは、初期の接合子分裂中に、生殖細胞中で高度に転写され、その結果、プロウイルスの組込みのより多くのコピーを生じる。内在性レトロウイルスの有害な結果に対抗するために、転写を遮断するためのプロモーターのＤＮＡメチル化、及びコード化配列を変化させるためのＤＮＡ又はＲＮＡ編集を含む、数多くの細胞防御戦略が、ウイルス増幅を相殺にすることに関与してきた。因子の状況として、本発明のためのＣＨＯゲノムＤＮＡから増幅されたレトロウイルスｇａｇ及びｅｎｖ断片は、コード化領域の内部に終止コドンを有する。それゆえ、ウイルス５’末端反復配列（ＬＴＲ）中の内在性ウイルスプロモーターは、ＬＴＲ配列の下流に組み込まれる場合、導入遺伝子発現のための活性を有するプロモーターでない場合があり得る。エンハンサー、プロモーター、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列等の適切な翻訳調節要素が、導入遺伝子に作用可能に連結されるために必要とされる。
【００４３】
内在性レトロウイルスゲノムによる相同的組換えを達成するために、ウイルス配列に対する相同性を有する配列の２つが、導入遺伝子に隣接するのに必要とされる。哺乳動物細胞中での効率的な組換えに関して報告されている最小の相同性は、２００ｂｐである。相同性の長さがより長ければ、効率がより高くなり得ると一般的に考えられている。好ましくは、ＤＮＡ相同性断片の１ｋｂないし５ｋｂが、組換えに使用され得る。多くのレトロウイルスは、８ないし１１ｋｂの大きさ内の遺伝子構造：５’ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−３’ＬＴＲを共有している。下流の精製にとって有害な完全なウイルス粒子を生じる完全なウイルスゲノムを除き、原則として、数百ないし数千ｂｐの長さを有するウイルスゲノムの２つの末端に由来するあらゆる２つの断片を相同的組換えに使用することができる。隣接しているウイルス配列は、完全に合成可能であり、又は本発明において実施されるように、宿主ゲノムから増幅可能である。
【００４４】
真核生物ｃＤＮＡ配列の最適な発現は、発現カセットに隣接する５’及び３’非翻訳配列並びに翻訳開始コドンの周りのヌクレオチド構成などの幾つもの構造的特徴を注意深く検討することを必要とする。真核細胞では、ほとんどのｍＲＮＡの翻訳は、「走査モデル」に従って開始される。しかしながら、翻訳開始の走査モデルは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）として知られる内部部位において、キャップ非依存的に翻訳される多くのウイルスの及び幾つかの細胞のメッセージに対しては当てはまらない。細胞のトランス作動性タンパク質が、ＩＲＥＳ要素に結合し、リボソームの結合及び翻訳の開始を容易にすると考えられている。本発明のベクター等の頑強な多シストロン性ベクターは、典型的には、ＩＲＥＳ要素を利用して、内部リボソームが、第二の及びその後の転写単位に結合するのを容易にする。
【００４５】
本発明はまた、適切な宿主細胞のゲノム内のホットスポット中に外来性コード化配列（すなわち遺伝子）を組み込むように誘導することができ、これにより生物製剤タンパク質の製造において使用するのに適したタンパク質産生の高いレベルを可能にする産生細胞系を作製できる相同的組換えベクターも提供する。
【００４６】
一般的にいえば、組換え発現ベクターには、哺乳動物及び／又はウイルスの遺伝子に由来する適切な翻訳調節要素に作用可能に連結されたタンパク質配列をコードするｃＤＮＡ由来の又は合成のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）配列が含まれる。このような調節要素には、典型的には、転写プロモーター、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに、転写及び翻訳の終止を調節する配列が含まれる。哺乳動物発現ベクターはまた、複製起点、発現されるべき遺伝子（例えば、コード化配列）に連結された適切なプロモーター及びエンハンサー、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位等の他の５’又は３’隣接配列、並びに転写終止配列等の非転写要素も含み得る。場合によって、宿主中で複製する能力を付与する複製起点、及び形質転換の認識を容易にするための選択可能な遺伝子も含まれ得る。
【００４７】
哺乳動物細胞を形質転換する際に使用するために設計された発現ベクター中の転写及び翻訳調節配列が、ウイルス源から取得され得ることは周知である。例えば、共通して使用されるプロモーター及びエンハンサーは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、ヒトサイトメガロウイルス、ポリオーマ又はアデノウイルス２由来である。発現を駆動するために、ウイルスゲノムプロモーター、調節配列及び／又はシグナル配列を利用することであるが、ただし、このような調節配列は、宿主細胞と適合性である。外来性（すなわち、異種性）ＤＮＡ配列の発現に必要とされる他の遺伝的要素を提供するために、ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０開始点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライシング部位及びアデニル化部位を使用し得る。
【００４８】
慣用のレトロウイルスベクターは、（１）ウイルス５’末端反復配列（ＬＴＲ）中のプロモーター；（２）ウイルス粒子中へのベクターＲＮＡの直接的な組込みに対するウイルス被包シグナル（ψ又はＥ）；（３）第一鎖及び第二鎖ＤＮＡ合成の開始のための転移ＲＮＡ結合部位（ＰＢＳ）及びポリプリン路（ＰＰＴ）並びにテンプレート間でのＤＮＡ合成の転移に必要とされるウイルスＲＮＡの両末端にある末端反復配列（ＬＴＲ）を含む、逆転写に必要とされるシグナル；並びに（４）組込みに必要とされるウイルスＬＴＲの末端に配置される短い部分的に逆転した反復を典型的に含む多くのシス作動性ウイルス要素を含まなければならない。対照的に、本発明の発現ベクターは、導入遺伝子の末端にある上述のウイルス要素の幾つかを含み得るが、上に列挙されている要素全てを含み得るわけではなく、これに基づくと、定義上、ウイルスベクターではない。さらに、本発明における発現ベクターＲＮＡは、細胞感染のために、ウイルス粒子中に被包されない。
【００４９】
ほぼ全ての哺乳動物細胞中に内在性レトロウイルスが存在するので、産生宿主細胞系を作製するために多様な哺乳動物細胞培養系を使用することができる。適切な宿主細胞の例には、内在性レトロウイルス配列、レトロウイルス様ＤＮＡ配列、レトロトランスポゾン及びレトロ転写産物を有する細胞系、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯミエローマ細胞、サル腎臓ＣＯＳ細胞、サル腎臓線維芽細胞ＣＶ−１細胞、ヒト胚性腎臓２９３細胞、ヒト乳癌ＳＫＢＲ３細胞、ヒトジャーカットＴ細胞、イヌ腎臓ＭＤＣＫ細胞、ヒト子宮頸癌Ｈｅｌａ細胞が含まれる。異なる種に由来する細胞系でのレトロウイルスの変動のため、発現ベクターに対するレトロウイルス配列は異なり得る。好ましくは、導入遺伝子に隣接する配列は、形質移入のための個々の細胞系から増幅され、又は同一細胞系から単離されたウイルス配列から合成される。
【００５０】
本明細書で提供される例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系ＣＨＯ−ＤＧ４４が、本発明の方法において使用するのに適していることを確立している。グリシン、チミジン及びヒポキサンチンに関して栄養要求性であるＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞は、一般に使用されている宿主細胞であり、増幅可能な優性マーカーとしてＤＨＦＲｃＤＮＡを使用して、ＤＨＦＲ＋表現型に形質転換可能である。本発明において、ＤＨＦＲの選択可能なマーカーは発現ベクター中に構築され、必要であれば、遺伝子増幅のために使用することができる。一般的にいえば、同一のゲノム背景を有するＣＨＯ−ｋ１、ＣＨＯ−Ｓ、ＧＳ−ＣＨＯ等の他のＣＨＯ細胞系も、本発明の実施例に記載されているベクターを使用する組換えタンパク質発現に適している。
【００５１】
形質移入という語は、宿主細胞中に外来ＤＮＡを導入するための本分野で認められた多様なプロトコールを指す（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：５３７（１９８８）参照）。形質変換プロトコールの選択は、宿主細胞並びに導入遺伝子及びタンパク質産物の性質に依存する。適切なプロトコールの基礎的な要件は、まず、宿主細胞中に関心対象のタンパク質をコードする外来性ＤＮＡを導入すること、並びに安定した発現可能な様式で異種性ＤＮＡを組み込んだ宿主細胞を単離及び選択できることである。
【００５２】
宿主細胞中に外来性ＤＮＡを導入するために一般的に使用される方法には、リン酸カルシウム沈殿又はＤＥＡＥ−デキストラン仲介性形質移入が含まれる。あるいは、誘導されたＤＮＡを宿主細胞の細胞質中に導入するために電気穿孔法を使用することができ、又は、脂質核酸複合体が培養細胞に適用される場合には、宿主細胞中への核酸の取り込みを容易にする脂質核酸複合体若しくはリポソームを形成できる試薬（例えば、リポフェクチン（登録商標）試薬若しくはリポフェクタミン（登録商標）試薬、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用することができる。
【００５３】
関心対象の遺伝子を増幅する方法も望ましく、典型的には、選択可能な表現型を付与する選択遺伝子の使用を包含する。一般的にいえば、「選択遺伝子」とは、検出可能なタンパク質として遺伝子を発現する細胞において表現型を付与する遺伝子である。選択遺伝子の一般的に使用される例には、抗生物質抵抗性遺伝子が含まれるが、これに限定されるわけではない。例えば、薬物（又は選択試薬）が細胞培養物に外来的に添加される場合、有用な優性選択可能なマーカーには、ネオマイシン、カナマイシン又はハイグロマイシンに対する耐性を付与する微生物由来の抗生物質抵抗性遺伝子が含まれる。
【００５４】
遺伝子増幅の過程は、関心対象の生物製剤タンパク質をコードする発現カセットを含む導入遺伝子のコピー数を増大するために日常的に使用される。例えば、（ＤＦＲ−）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系中でジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子増幅系が使用される場合、形質移入されたＣＨＯ細胞は、毒性薬物（すなわち、ＭＴＸ）を含有する培地中で培養される。この薬物は、コードされたマーカー遺伝子によって発現される酵素を阻害する。選択は、ＭＴＸの存在下では、細胞のほとんどが生き残らないが、数個の細胞、特に形質移入された選択可能なマーカー遺伝子のより多くの数を含有する細胞が生き残るという事実を基礎としている。目的の遺伝子のコピー数は、マーカー遺伝子の数と相関しており、マーカー遺伝子の数と共に増大する。それゆえ、ＭＴＸ濃度を増大する過程は、高い生産性の細胞系に関して同時に選択する。
【００５５】
段階的な増幅は、通常の方法から得られた典型的な細胞である、１日細胞１個あたり１ｐｇを下回る数の低レベル産生細胞にとって特に重要である。高レベルの生産性を達成するために、細胞中の導入遺伝子の数は、３０ないし５０コピーまで増幅される必要があり、前記細胞の本来の生産性に応じて、複数の工程によるＭＴＸ濃度は高い（すなわち、１ｍＭ）。１日あたり細胞１個あたり約３ｐｇの生産性を有するｎｅｏｓｐｌａベクターから得られた比較的高レベルの産生細胞でさえ、治療用抗体を産生するために、ＭＴＸの低濃度（５０ｎＭ）で細胞１個あたり約１０コピーの導入遺伝子まで増幅される必要がある（米国特許第５８３０６９８号）。本発明の発現ベクターは、ネオマイシン及びＤＨＦＲという２つの２つの選択可能なマーカーを有する。培地中のＭＴＸにより、導入遺伝子は、必要であれば増幅可能である。しかしながら、レトロウイルス隣接配列を有するベクターから単離された細胞の本来の生産性レベルが高いので、段階的な増幅過程は、ほとんどの場合必要ではないであろう。例えば、実施例１０において単離された細胞系１Ｄ１は、最適化されていない条件（通常の振盪フラスコ）下で、抗体の約２０ｐｇ／個／日の生産性を有する。治療用組換えタンパク質の産生に十分であるほどより高い最適化された培養条件を用いて、発酵槽中で、さらにずっと高いｐｇ／個／日の数（すなわち３０ないし４０ｐｇ／個／日）に到達することが可能である。第一列中に示される米国特許において報告された方法を使用して報告された生産性に対する、本発明の方法を用いた細胞系の生産性の比較を、表１に提供する。
【００５６】
【表１】
2009535065.tif 000003
【００５７】
本開示と共に提供される例及び図は、安定した哺乳動物細胞系を作製するための本発明の組成物及び方法を使用して得られる結果を示す。以下の実施例は、本発明の実施形態を例示することを意図したものであり、いかなる意味においても、本発明の範囲を限定すべきではない。本開示を読むことによって、多くの修飾及び変形が当業者に自明である。このような修飾及び変形は、本発明の一部を構成する。
【００５８】
別段の記載がなければ、本発明の実施は、当業者の技術常識に属する細胞生物学、分子生物学、細胞培養などを使用する。本明細書で引用される全ての公報及び特許出願は、本発明が冠する技術分野における当業者の技術水準を示しており、その全ての内容が全体として参照により本明細書によって組み入れられる。
【実施例１】
【００５９】
哺乳動物細胞におけるＩｇＧ発現のためのｐＡＢＭＭ１ベクターの構築
以下の３工程によって、バックボーンベクターｐｃＤＮＡ６／Ｈｉｓ−５Ａから、ｐＡＢＭＭ１（配列番号１）を作製した。第一に、合成ポリＡ、ベクターｐｃDNA３からＰＣＲによって増幅されるＳＶ４０プロモーター、ＣＨＯ−Ｋ細胞のＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって増幅されるＤＨＦＲ  ｃＤＮＡ、合成ＳＰ１６３（ＶＥＧＦの５’ＵＴＲ由来の内部リボソーム進入部位）及びベクターｐｃＤＮＡ３からＰＣＲによって増幅されるネオマイシンｃＤＮＡである５個のＤＮＡ断片から、重複するＰＣＲを通じて、２つの選択剤ＤＨＦＲ／ネオマイシンのための発現カセットをコードするＤＮＡ断片を構築した。ポリＡ−ＳＶ４０プロモーター−ＤＨＦＲ−ＳＰ１６３−ネオマイシンのＤＮＡ断片をベクターｐｃＤＮＡ６／Ｈｉｓ−５Ａ中に、ＮｈｅＩ及びＤｒａＩＩＩ制限部位によってクローン化した。
【００６０】
第二に、ヒト抗体シグナルペプチド、部分的Ｊｋセグメント及びヒトｋ定常部をコードするＤＮＡ断片を、上述の修飾されたｐｃＤＮＡ６ベクター中のｐＣＭＶプロモーターの下流に挿入した。シグナル配列が、サイレント変異によってＮｈｅＩ部位を有するヒト抗体ＶＫ  ＶＩ−Ａ１４から合成され、Ｃｋ定常部が、ヒト脾臓ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）からＲＴ−ＰＣＲによって増幅されるＰＣＲ構築から、このＤＮＡ断片を作製した。
【００６１】
第三の工程は、ＳａｌＩ部位によってＤＨＦＲ／ネオマイシン選択マーカーの下流に、抗体重鎖発現カセットを挿入することであった。ＣＭＶプロモーター、重鎖シグナル配列、部分的ＪＨセグメント、及びヒトＩｇＧ１のＣＨ１ないしＣＨ３を含むこの重鎖断片を、ＰＣＲ構築を通じて作製した。アミノ酸ＬＫをコードするＡｆｌＩＩ部位配列を有するヒト抗体ＶＨ３＿３−２３（ＤＰ４７）から、重鎖シグナル配列を合成した。ヒトＩｇＧ１抗体ＣＨ１ないしＣＨ３に関するｃＤＮＡを、ヒト脾臓ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。
【実施例２】
【００６２】
哺乳動物細胞におけるＩｇＧ発現のためのｐＡＢＭＭ７２ベクターの構築
ｐＡＢＭＭ７２（配列番号２）は、ｐＡＢＭＭ１由来であった。ｐＡＢＭＭ１ベクター中のＤＨＦＲ／ネオマイシンのためのＳＶ４０プロモーターを、ＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩ部位における内部リボソーム進入配列ＳＰ１６３によって置換すると、抗体軽鎖、ＤＨＦＲ、及びｐＡＢＭＭ７２ベクター中の単一ＣＭＶプロモーターから駆動されるネオマイシンに関する１つの転写物を得た。さらに、抗ＶＥＧＦ抗体重鎖及び軽鎖可変部遺伝子ＶＨ及びＶｋを、ＮｈｅＩ／ＢｓｉＷＩ部位及びＡｆｌＩＩ／ＸｈｏＩ部位によってそれぞれ、このベクター中にクローン化した。
【実施例３】
【００６３】
哺乳動物細胞におけるＩｇＧ発現のためのｐＡＢＭＭ４８ベクターの構築
以下に記載されるとおり、ｐＡＢＭＭ４８（配列番号３）をｐＡＢＭＭ１ベクターから構築した。第一に、抗体（抗ＶＥＧＦ抗体）重鎖及び軽鎖可変部遺伝子ＶＨ及びＶｋを、ＮｈｅＩ／ＢｓｉＷＩ部位及びＡｆｌＩＩ／ＸｈｏＩ部位によってそれぞれ、このベクター中にクローン化した。第二に、レトロウイルスＧａｇ−Ｐｒ遺伝子断片に関するＤＮＡ断片１５４０ｂｐを、軽鎖のＣＭＶプロモーターの上流のＢｇｌＩＩ部位中に挿入した。レトロウイルスＧａｇ−Ｐｒ  ＤＮＡ断片（配列番号４）を、ＰＣＲによって、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞から増幅した。前記ＤＮＡ断片には、切断されたｇａｇ−ｐｒタンパク質（アミノ酸３０ないし３８１、及び３８３ないし５４５、その間に終止コドンを有する。）をコードする２つの翻訳領域があり、マウス白血病ウイルスｇａｇ−ｐｏｌポリタンパク質（全長１７３６個のアミノ酸）と６１％（３１７／５１８）同一である。第三に、レトロウイルスＥｎｖ遺伝子に関するＤＮＡ断片１４６２ｂｐ（配列番号５）を、ＰＣＲによってＣＨＯ−ＤＧ４４細胞から増幅し、重鎖発現カセットの下流のＳａｌＩ部位中に挿入した。Ｅｎｖ断片には、２つの切断型被包タンパク質（アミノ酸７２ないし３０５、及び３３９ないし４９２）をコードする２つの翻訳領域があり、マウス白血病ウイルスｇＰｒ８０被包タンパク質（全長６５２個のアミノ酸）と５８％（１１８／２０２）同一であった。
【実施例４】
【００６４】
哺乳動物細胞におけるＩｇＧ発現のためのｐＡＢＭＥ１５ベクターの構築
ｐＡＢＭＥ１５ベクターは、ｐＡＢＭＭ７９ベクター（配列番号６）由来であった。１５６１ｂｐで１個のＢｇｌＩＩ部位を、７６２８ｂｐで１個のＳａｌＩ部位を除去し、３０２９ｂｐで１個のＮｏｔＩ部位を、７５００ｂｐで１個のＡｓｃＩ部位を挿入することによって、ｐＡＢＭＭ４８からベクターｐＡＢＭＭ７９を作製した。この工程は、発現ベクター中の各機能的セグメントに関して独特の制限部位を導入することである。ネオマイシン発現に抗体軽鎖カセットを付着させるため、まず、ｐＡＢＭＭ７９由来のＸｂａＩ−ＸｈｏＩ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）ベクター中にクローン化し、次に、この修飾されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）ベクター由来のＮｏｔＩ−ＭｌｕＩ断片を使用して、ｐＡＢＭＭ７９中の相当する断片を置換した。本工程は、新たなベクター中にｐＣＭＶ−Ｌ鎖−ＳＰ１６３−ネオマイシン−ＳＶ４０ポリＡの発現カセットを生じた。さらに、ＳＰ１６３−ＤＨＦＲに関するＤＮＡ断片を、ＡｓｃＩ部位によって抗体重鎖の下流に挿入した。本工程によって、ｐＡＢＭＥ１５ベクター（配列番号７）中に、ｐＣＭＶ−重鎖−ＳＰ１６３−ＤＨＦＲ−合成ポリＡのカセットが作製された。抗体軽鎖発現に対する選択マーカーネオマイシン、抗体重鎖発現に対するＤＨＦＲの付着は、重鎖及び軽鎖の両者の発現を確実にし、ＤＮＡ再構成から抗体の何れかの鎖を損失する可能性を防止する。
【実施例５】
【００６５】
ＣＨＯ−ＤＧ４４の培養及び形質移入
９０％ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）及び１０％ＣＨＯ  Ｅｘ細胞無血清培地（ＪＲＨ）を含有し、８ｍＭグルタミン及び０．３％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）を有する無血清培地を有する懸濁液中で、チャイニーズハムスター卵巣細胞系ＣＨＯ−ＤＧ４４を培養した。簡潔には、５０ｍＬ無血清増殖培地を含有する２５０ｍＬ振盪フラスコに細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２の恒温器中で１３０ｒｐｍの振盪速度で増殖させた。細胞に新鮮な培地を当日供給し、１日おきに２つの振盪フラスコ中に分割した。細胞生存率が９５％超であり、細胞の３０％ないし５０％が分裂している中間対数相にある細胞のみを形質移入に使用した。
【００６６】
ベクターＤＮＡを有する細胞の形質移入を電気穿孔法によって実施した。まず、ベクターＤＮAを制限酵素ＢｇｌＩＩ（ｐＡＢＭＭ７２用）又はＨｉｎｄＩＩＩ（ｐＡＢＭＭ４８及びｐＡＢＭＥ１５用）で線形化した。１０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、１×１０７個／ｍＬの密度で氷冷ＰＢＳ中に再懸濁した。次に、細胞４００μＬをベクターＤＮＡ２０μｇと混合し、電気穿孔用の氷冷しておいた０．４ｃｍキュベットに転移した。Ｂｉｏｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩを、最大５００Ｖの容量、０．３５０ＫＶの電位、及び６００μＦの電気容量に設定した。衝撃を与えた後、細胞を室温に１５分間置き、３０ｍＬ培地を有する５０ｍＬ遠心チューブに転移し、次に、増殖及び選択のため、３個の９６ウェルプレート中に播種した。
【実施例６】
【００６７】
抗体検出のためのＥＬＩＳＡアッセイ
抗ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＣＨＯ細胞培養物中のヒトＩｇＧを定量した。簡潔には、０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中の１μｇ／ｍＬでヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）に対する抗体で９６ウェルプレートを被膜し、４℃で一晩定温放置した。次に、ＰＢＳＴ中の５％乳を使用して、プレートを室温で１時間ブロッキングした。連続希釈による細胞培養上清を各ウェルに添加し、室温で１時間定温放置した。その間、濃度が明らかなヒトＩｇＧタンパク質（Ｓｉｇｍａ）を標準物質として、並行して同一プレートに添加した。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、３％乳−ＰＢＳＴ中の二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧκ鎖−ＨＲＰ接合体、Ｓｉｇｍａ）を室温で１時間添加した。最後に、安定した過酸化物基質緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）中のＡＢＴＳ基質を添加して、発色させた。プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で３０分間発色させた後、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。ＩｇＧの標準物質直線は、０ないし１２．５ｎｇ／ｍＬ内で作成した。光学密度の読み取りに従って、標準曲線から、細胞培養上清中のヒトＩｇＧの濃度を算出した。
【実施例７】
【００６８】
抗体の産生及び精製
ＣＨＯ  Ｅｘ細胞培地（ＪＲＨ）、８ｍＭグルタミン（ＧＩＢＣＯ）、０．３％抗生物質（ＧＩＢＣＯ）を含有する産生培地中で、ＩｇＧ産生のために選択された安定したクローンを増殖した。簡潔には、３０ｍＬ産生培地を有する２５０ｍＬ振盪フラスコ中で、２０万ないし３０万個／ｍＬの密度で細胞を播種した。３７℃、５％ＣＯ２の恒温器中で、振盪器を１３０ｒｐｍの速度に設定した。当日、細胞に新鮮な培地を供給した。培養物が累積的に１Ｌに到達するまで、培地を１日おきに交換した。次に、１００万個／ｍLの細胞密度で、産生培地１Ｌを有する３Ｌの振盪フラスコに細胞を転移し、３７℃、５％ＣＯ２の恒温器中で、８０ｒｐｍの振盪速度で増殖した。細胞密度が、３００万ないし４００万個／ｍＬに到達するまで、毎日ないし１日おきに、細胞に５０ｍＬの新鮮な産生培地を供給した。次に、培養温度を３３℃に移行し、ＩｇＧ産生を促進した。細胞生存率が、８０ないし８５％以下になるまで、毎日又は１日おきに、５０ｍＬの新鮮な産生培地を細胞に供給した。上清を回収し、遠心分離によって細胞を除去した。
【００６９】
細胞培養物から回収された上清をまず、０．４μｍのフィルターで濾過し、５０ｋＤａカットオフフィルターを使用して、Ｐａｌｌ正接流濾過装置を通じて１００ないし２００ｍＬに濃縮した。次に、５ｍＬ／分の流速で、試料をＭａｂＳｅｌｅｃｔ（プロテインＡ）カラム（２５ｍｍ×２００ｍｍ、ＣＶ＝９８．２ｍＬ、Ｐｍａｘ＝４０）に負荷した。緩衝液Ａ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）の５カラム容積及び緩衝液Ｂ（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）の５カラム容積で洗浄した後、緩衝液Ｃ（１００ｍＭ酢酸、２２ｍＭリン酸、ｐＨ２．０）の５カラム容積でＩｇＧタンパク質を溶出した。ＯＤ２８０で拾ったヒトＩｇＧの画分を回収及び組み合わせ、１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）の５％画分容積でｐＨを中和した。ｐＨ中和中に形成された沈殿物を、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することによって除去した。ＴＳＫ−ＧＥＬ  ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を装備したＡｇｉｌｅｎｔ  １１００ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）での分子ふるい高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を使用して、精製された抗体をさらに分析した。簡潔には、希釈された試料１０μＬをＴＳＫ−ＧＥＬ  ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラムに流速０．２５ｍＬ／分で負荷した。０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを有するリン酸緩衝塩類溶液ＰＢＳを移動相に使用した。２８０ｎｍの紫外線シグナルをモニターして、タンパク質の拾い上げを決定した。アッセイ中、ゲル濾過のための分子量マーカータンパク質（２９ｋＤないし６６０ｋＤ、Ｓｉｇｍａ）を標準物質として使用した。
【実施例８】
【００７０】
ベクターの組込みに関する分析
ゲノムＤＮＡは、安定した細胞系から抽出される。簡潔には、細胞を１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、核溶解緩衝液（１０ｍＭトリスＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、０．４Ｍ  ＮａＣｌ）で１回洗浄する。核溶解緩衝液３ｍＬ中で再懸濁した後、１００μＬのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍＬ）及び１０％ＳＤＳ４００μＬを添加することによって細胞を溶解し、４５℃で一晩定温放置する。次に、溶解液からの上清を使用して、ＤＮＡを調製する。容積全体の１／１０の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）及び容積全体の３倍の１００％冷イソプロパノールを添加することによって、ゲノムＤＮＡを沈殿させ、７０％エタノールで洗浄する。ＤＮＡの乾燥ペレットを２００μＬのＨ２Ｏ中に再懸濁する。
【００７１】
ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、Ｌａｍｂｄａ  ＤＡＳＨ  ＩＩ／ＥｃｏＲＩベクターキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）の一部であるあらかじめ消化しておいたＬａｍｂｄａ  ＤＡＳＨ  ＩＩベクターのＥｃｏＲＩ部位中に連結した。製造元の説明書（Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）に従って、被包抽出物を使用して、組換えλファージを被包する。ファージ宿主としてＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦの細菌系を使用して、得られたライブラリのうち、約１×１０６個のプラーク形成単位（ｐｆｕ）をＮＺＹアガープレート上に播種し、３７℃で一晩定温放置する。製造元の説明書に従って、ライブラリを増幅して、ライブラリの高い力価のストックの安定した多量を調製する。
【００７２】
大きな１５０ｍｍＮＺＹアガープレート上に５００００ｐｆｕ／プレートでライブラリを播種し、３７℃で一晩定温放置する。ニトロセルロースメンブレン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）を各ＮＺＹアガープレート上に２分間配置し、ファージの粒子をメンブレンに転移させる。針を使用して、配向のためにメンブレン及びアガーに孔を開ける。メンブレンを１．５Ｍ  ＮａＣｌ及び０．５Ｍ  ＮａＯＨの溶液で２分間変性した後、１．５Ｍ  ＮａＣｌ及び０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）中で５分間中和する。０．２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び２×ＳＳＣ溶液緩衝液を含有する溶液中でメンブレンを３０秒間すすぐ。最後に、ＵＶトランスイルミネーターを使用して、ＤＮＡをメンブレンに架橋する。ゲノムＤＮＡライブラリをサザンブロット分析によってスクリーニングする。ヒト抗体重鎖及び軽鎖定常部を含有する２つのＤＮＡプローブを標識し、スクリーニングに使用する。スクリーニングから単離された陽性クローンをＤＮＡ配列決定によって分析し、組込み部位の配列を決定する。
【実施例９】
【００７３】
ｐＡＢＭＭ７２ベクターによる安定した細胞系の作製
３７℃、５％ＣＯ２恒温器中で、１３０ｒｐｍの速度で２５０ｍＬ振盪フラスコ中の無血清培地中で、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を増殖した。細胞は、培養５日後、９６％の細胞生存率で、４０％の細胞が分裂している中間対数相に到達した。氷冷ＰＢＳで２回洗浄した後、１×１０７個／ｍＬの密度で、氷冷ＰＢＳ中でＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を再懸濁し、氷上で１５分間定温放置した。次に、ＢｇｌＩＩ部位で線形化したｐＡＢＭ７２ベクターＤＮＡ２０μｇと細胞４００μＬを混合し、氷冷しておいた電気穿孔用キュベットに移した。
【００７４】
最大５００Ｖの容量、０．３５０ＫＶの電位及び６００μＦの電気容量の設定でＢｉｏｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩを使用して、電気穿孔を実施した。合計４回の電気穿孔を実施した。衝撃を与えた後、細胞を室温で１５分間放置し、３０ｍＬの培地を有する５０ｍＬの遠心チューブに転移した。形質移入した細胞を増殖培地で洗浄し、各電気穿孔につき３枚の９６ウェルプレート中に播種した。電気穿孔の２日（４８時間）後、ＨＴ及び０．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を有する増殖培地を添加することによって、細胞を選択した。培地を３ないし４日ごとに５０％だけ交換した。選択２ないし３週間後、顕微鏡下で増殖クローンが観察可能であった。各ウェルからの培養上清１００μＬを発現スクリーニングのために採取した（１枚の９６ウェルプレートからの典型的なデータを図５Ａに示した。）。これらの実験において、遺伝子増幅過程を実施しなかった。
【００７５】
実施例５に記載されている抗ヒトＦｃ／抗ヒトＫ鎖ＥＬＩＳＡを実施し、個々のクローンの発現レベルを評価した。次に、ＥＬＩＳＡの読み取りの高いクローンを２４ウェルプレート、６ウェルプレート及び増殖用Ｔ７５フラスコに転移した。この細胞増殖過程用に、合計５０個のクローンを拾い上げた。Ｔ７５フラスコ中での４８時間の培養物から回収した上清を、定量的ＥＬＩＳＡに使用した。各クローンに関してヒトＩｇＧ産生レベル（ｐｇ／個／日）を算出することによって、細胞系の生産性を評価した。表２は、上位６種のクローンから得られた結果を示している。
【００７６】
【表２】
2009535065.tif 000004
【００７７】
最高値のクローン１３−３−Ｄ６は、５×１０６個／ｍＬの細胞密度で振盪フラスコ培養の１０日後に１Ｌあたり５４ｍｇのＩｇＧの全体的な生産を提供可能な１．０９ｐｇ／個／日のレベルでヒトＩｇＧを産生した。
【実施例１０】
【００７８】
ｐＡＢＭＭ４８ベクターによる安定した細胞系の作製
９０％ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）と１０％ＣＨＯ  Ｅｘ細胞無血清培地（ＪＲＨ）とを含有し、ＨＴを有する無血清培地を有する懸濁液中で、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を培養した。簡潔には、５０ｍＬ無血清増殖培地を含有する２５０ｍＬ振盪フラスコに細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２の恒温器中で１３０ｒｐｍの速度で振盪した。細胞に新鮮な培地を当日供給し、１日おきに２つの振盪フラスコ中に分割した。細胞生存率が９６％であり、３８％の細胞が分裂している中間対数相にある細胞のみを形質移入に使用した。氷冷ＰＢＳで２回洗浄した後、１×１０７個／ｍＬの密度で、氷冷ＰＢＳ中でＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を再懸濁し、氷上で１５分間定温放置した。次に、ＨｉｎｄＩＩＩ部位で線形化したｐＡＢＭ４８ＤＮＡ２０μｇと細胞４００μＬを混合し、氷冷しておいた電気穿孔用キュベットに転移した。
【００７９】
最大５００Ｖの容量、０．３５０ＫＶの電位及び６００μＦの電気容量の設定でＢｉｏｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩによって、電気穿孔法を実施した。合計４回の電気穿孔を実施した。衝撃を与えた後、細胞を室温で１５分間放置し、３０ｍＬの培地を有する５０ｍＬの遠心チューブに転移した。形質移入した細胞を増殖培地で洗浄し、各電気穿孔につき３枚の９６ウェルプレート中に播種した。電気穿孔の２日（４８時間）後、ＨＴ及び０．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を有する増殖培地によって、細胞を選択した。培地を３ないし４日ごとに交換した。増殖クローンは、選択の２ないし３週間後に顕微鏡下で観察可能であった。各ウェルからの培養上清１００μＬを、発現スクリーニング用に採取した。合計約１０００個のクローンをスクリーニングした。しかし、これらの実験において、遺伝子増幅過程を実施しなかった。
【００８０】
実施例５に記載されている抗ヒトＦｃ／抗ヒトＫ鎖ＥＬＩＳＡを実施し、個々のクローンの発現レベルを評価した。図５ＢにおけるＥＬＩＳＡデータは、ｐＡＢＭＭ４８による形質移入の結果、産生クローンのより高い頻度が得られることを確立している。次に、ＥＬＩＳＡの読み取りの高いクローンを２４ウェルプレート、６ウェルプレート及び増殖用Ｔ７５フラスコに転移した。この細胞増殖用に、合計５０個のクローンを選択した。
【００８１】
Ｔ７５フラスコの４８時間培養の上清を、定量的ＥＬＩＳＡに使用して、４８時間及び２日間での抗体濃度を細胞数で除することによって、ヒトＩｇＧの産生レベル（ｐｇ／個／日（ｐｃｄ））を測定した。ｐｃｄ数は、４８時間での細胞数のみを使用するため、過小評価され得、２日間の培養の間で最高の数である。ヒトＩｇＧ１の発現の高い上位９個のクローンを表３に示した。
【００８２】
【表３】
2009535065.tif 000005
【００８３】
最高値のクローン１Ｄ１は、５×１０６個／ｍＬの細胞密度で振盪フラスコ培養１０日後に６１０ｍｇのＩｇＧを結果として産生可能な１２．２ｐｇ／個／ｍＬ（Ｔ７５フラスコから測定）のレベルでヒトＩｇＧを産生した。（レトロウイルス配列を含む）ｐＡＢＭＭ４８ベクターが、１０倍以上高いＩｇＧ生産性によって特徴付けられることが、（レトロウイルス配列を含まない）ｐＡＢＭＭ７２から生じた安定した細胞系からの発現レベルの比較によって明らかである（図６）。
【００８４】
振盪フラスコ中での抗体産生のため、最良のクローン１Ｄ１をさらに規模拡大した。簡潔には、３０ｍＬ産生培地を有する２５０ｍＬ振盪フラスコ中で、３０万個／ｍＬの密度で細胞を播種した。３７℃、５％ＣＯ２の恒温器中で、振盪器を１３０ｒｐｍの速度に設定した。当日、細胞に新鮮な１０％培地を供給した。培養物が０．５Ｌに到達するまで、培地を１日おきに交換した。次に、１００万個／ｍＬの細胞密度で、産生培地０．４Ｌを有する３Ｌの振盪フラスコ中に細胞を転移し、３７℃、５％ＣＯ２の恒温器中で８０ｒｐｍの振盪速度で増殖し、細胞密度が、４００万個／ｍＬに到達するまで、５０ｍＬの新鮮な産生培地を毎日供給した。次に、ＩｇＧ産生のため、培養温度を３３℃に移行した。細胞に５０ｍＬの新鮮な産生培地を毎日供給した。３日後、上清０．５５Ｌを回収した。定量的ＥＬＩＳＡのため、第１日、第２日、第３日の上清を回収した。図７にあるデータは、第１日ないし第３日のＩｇＧの産生が、２９．４ｍｇ／Ｌ、９９．８ｍｇ／Ｌ及び２２７ｍｇ／Ｌであることを示した。
【００８５】
培養上清中のＩｇＧタンパク質を、以下に記載されるとおり精製した。上清をまず、０．４μｍのフィルターで濾過し、５０ｋＤａカットオフフィルターを使用して、Ｐａｌｌ正接流濾過装置を通じて１００ｍＬに濃縮した。次に、５ｍＬ／分の流速で、試料をＭａｂＳｅｌｅｃｔ（プロテインＡ）カラム（２５ｍｍ×２００ｍｍ、ＣＶ＝９８．２ｍＬ、Ｐｍａｘ＝４０）に負荷した。緩衝液Ａ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）の５カラム容積及び緩衝液Ｂ（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）の５カラム容積で洗浄した後、緩衝液Ｃ（１００ｍＭ酢酸、２２ｍＭリン酸、ｐＨ２．０）の５カラム容積でＩｇＧタンパク質を溶出した。ＯＤ２８０で拾い上げたヒトＩｇＧの画分を回収及び組み合わせ、１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９）の５％画分容積でｐＨを中和した。ｐＨ中和中に形成された沈殿物を、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することによって除去した。
【００８６】
３日間の培養のこの０．５５Ｌから最終的に精製されたヒトＩｇＧは、１６３ｍｇであり、２０ｐｇ／個／日の生産性を付与すると算出され、５×１０６個／ｍＬの細胞密度で振盪フラスコ培養１０日間によるＩｇＧ産生１ｇに変換された。さらに、分析用ＨＰＬＣアッセイ用の分子ふるいカラムＴＳＬ−ＧＥＬ  Ｓｕｐｅｒ  ＳＷ３０００（Ｔｏｓｏｈ）に、希釈された精製済みＩｇＧタンパク質１０μＬを負荷した。ＨＰＬＣデータは、ＩｇＧの唯一のシグナルピークで純度を確認した。
【００８７】
これらの結果は、（レトロウイルス配列を含む）ｐＡＢＭＭ４８ベクターにより形質移入されたＣＨＯ産生細胞系が、レトロウイルス配列を含まないベクターから作製されたクローンよりも多くの抗体を産生したことを確立している。本明細書に呈されるデータは、本発明の内在性レトロウイルス配列を含む発現ベクターの使用が、従来の発現ベクターと比較して、正規のベクターを使用して得られる１ｐｇ／個／日未満から、２０ｐｇ／個／日まで、組換え抗体の細胞生産性を増大させることを示している。これは、細胞生産性が２０倍増大したことを示す。
【００８８】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、哺乳動物発現ベクターｐＡＢＭＭ１（配列番号１）の模式的な提示である。これは、ｐｃＤＮＡ６／Ｈｉｓ−５Ａに由来し、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での抗生物質による選択のためのアンピシリン抵抗性遺伝子、プラスミド複製開始点（ｐＵＣｏｒｉ）、哺乳動物細胞において選択するためのＤＨＦＲ遺伝子及びネオマイシン遺伝子の発現カセット（ｐＳＶ４０−ＤＨＦＲ−ＩＲＥＳ−ネオマイシン−ポリＡ）、抗体軽鎖発現カセット（ｐＣＭＶ−軽鎖−ポリＡ）及び抗体重鎖発現カセット（ｐＣＭＶ−重鎖−ポリＡ）を含む。
【図２】図２は、哺乳動物発現ベクターｐＡＢＭＭ７２（配列番号２）の模式的な提示である。これは、ｐＡＢＭＭ１ベクターに由来し、イー・コリ中での抗生物質による選択のためのアンピシリン抵抗性遺伝子（ＡＭＰｒ）、プラスミド複製開始点（ｐＵＣｏｒｉ）、抗体重鎖の発現カセット（ｐＣＭＶ−重鎖−ポリＡ）、並びに、２つのＩＲＥＳ配列によってＤＨＦＲ遺伝子及びネオマイシン遺伝子が結合した、抗体軽鎖のための発現カセット（ｐＣＭＶ-軽鎖−ＳＰ１６３−ＤＨＦＲ−ＳＰ１６３−ネオマイシン−ポリＡ）を含む。ＶＨ遺伝子及びＶｋ遺伝子は、ＶＥＧＦに対する抗体の発現のため、このベクター中にクローニングされた。
【図３】図３は、哺乳動物発現ベクターｐＡＢＭＭ４８（配列番号４）の模式的提示である。これは、ｐＡＢＭＭ１ベクターに由来し、イー・コリ中での抗生物質選択のためのアンピシリン抵抗性遺伝子（ＡＭＰｒ）、プラスミド複製開始点（ｐＵＣｏｒｉ）、哺乳動物細胞において選択するためのＤＨＦＲ遺伝子及びネオマイシン遺伝子の発現カセット（ｐＳＶ４０−ＤＨＦＲ−ＩＲＥＳ−ネオマイシン−ポリＡ）、抗体軽鎖発現カセット（ｐＣＭＶ−軽鎖−ポリＡ）及び抗体重鎖発現カセット（ｐＣＭＶ−重鎖−ポリＡ）を含む。さらに、ＣＨＯレトロウイルスＧａｇ−Ｐｒ遺伝子由来のＤＮＡ断片を軽鎖発現カセットの上流に挿入し、ＣＨＯレトロウイルスＥｖｎ遺伝子由来のＤＮＡ断片を、抗体重鎖発現カセットの下流に配置した。ＶＨ遺伝子及びＶｋ遺伝子は、ＶＥＧＦに対する抗体の発現のため、このベクター中にクローニングされた。
【図４】図４は、哺乳動物発現ベクターｐＡＢＭＥ１５（配列番号７）の模式的な提示である。これは、最初、ｐＡＢＭＭ４８ベクターに由来し、イー・コリ中での抗生物質による選択のためのアンピシリン抵抗性遺伝子（ＡＭＰｒ）、プラスミド複製開始点（ｐＵＣｏｒｉ）、ＩＲＥＳ配列によってネオマイシン遺伝子が結合した、抗体軽鎖のための発現カセット（ｐＣＭＶ−軽鎖−ＳＰ１６３−ネオマイシン−ポリＡ）、並びに、ＩＲＥＳ配列によってＤＨＦＲ遺伝子が結合した、抗体重鎖の発現カセット（ｐＣＭＶ−重鎖−Ｓｐ１６３−ＤＨＦＲ−ポリＡ）を含む。さらに、ＣＨＯレトロウイルスＧａｇ−Ｐｒ遺伝子由来のＤＮＡ断片を軽鎖発現カセットの上流に配置し、ＣＨＯレトロウイルスＥｎｖ遺伝子由来のＤＮＡ断片を、抗体重鎖発現カセットの下流に配置した。ＶＨ遺伝子及びＶｋ遺伝子は、ＶＥＧＦに対する抗体の発現のため、このベクター中にクローニングされた。
【図５】図５Ａ及び５Ｂは、９６ウェルプレート中で安定した細胞系を検出するための抗ヒト抗体ＥＬＩＳＡアッセイの結果のグラフ表示を提供する。図５Ａは、ベクターｐＡＢＭＭ７２から生じるＣＨＯ細胞系から得られる細胞上清中での組換え抗体発現の異なるレベルを示す。図５Ｂは、ベクターｐＡＢＭＭ４８から生じる培養上清中の組換え抗体の発現レベルを示す。
【図６】図６は、レトロウイルス配列を含む（Ｍ４８クローン）又は含まない（Ｍ７２クローン）発現ベクターから生じる異なる細部系の抗体産生度を示す。
【図７】図７は、３日間（すなわち、培養７２時間）にわたるレトロウイルス配列を含むｐＡＢＭＭ４８で生じた１つの細胞系に由来する抗体産生の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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