(57)【要約】  本発明は一般的に植物育種の分野に関し、植物が開花を開始する時点を決定する方法に関する。さらに具体的には、本発明は個々の植物基準で開花開始を決定する方法であって、前記植物の構造のデジタル画像から得た植物の生殖構造を測定し、測定値と平均生長速度から開花開始を推測することによる前記方法に関する。本発明はまた、植物の開花開始を特にハイスループットな方式で決定する装置にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の開花開始を決定する方法であって、
(i)植物の花序をデジタル的に画像化するステップ；および
(ii)デジタル画像から花序を測定するステップ；および
(iii)ステップ(ii)から導き出された測定値と花序の平均生長速度から開花開始を計算するステップ
を含んでなる前記方法。
【請求項２】
花序がその最大サイズに達する前に、前記花序を画像化する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記花序を、植物の成熟まで少なくとも７日毎に画像化する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
対照植物と比較して開花時が改変された植物を選択するステップをさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記植物がイネ、コムギおよびトウモロコシなどの穀類である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
開花開始を決定する装置であって、
（i）１つ以上の植物を生育する容器を支持し、かつ移動させる輸送手段；
（ii）発生する植物の花序を画像化するのに十分な解像度をもつ１台以上のデジタルカメラ；
（iii）植物の花序を検出し、測定し、花序の測定値と平均生長速度から開花開始を導き出すコンピューター手段
を含んでなる前記装置。
【請求項７】
前記容器が関連づけられた固有の識別子を含む、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記１台以上のデジタルカメラが約100ピクセルの最少サイズをもつように花序を画像化することができる、請求項６または７に記載の装置。
【請求項９】
対照植物と比較して改変された開花時を有する植物を育種するための、請求項６〜８のいずれか１項に記載の装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に植物育種の分野に関し、植物が開花を開始する時点を決定する方法に関する。さらに具体的には、本発明は、植物の生殖構造をこれらの構造のデジタル画像から測定し、測定値と平均生長速度から開花開始を推測することにより、個々の植物基準で開花開始を決定する方法に関する。本発明はまた、植物の開花開始を特にハイスループットな方式で決定する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の発育は２つの異なる期、すなわち栄養生長期と生殖期から構成され；これらの２つの期の間の移行が開花開始を表わす。栄養生長期に、植物は集光構造（一般的には茎と葉の形態およびその他の緑色部で）および栄養摂取構造（一般的には根の形態で）を発達させる。生殖段階に、植物の資源は花と種子の発達に関わる構造に、および種子と果実などの生殖構造に貯蔵するための貯蔵炭水化物の産生に向けられる。栄養生長期の長さが集光構造のサイズを決定し、そして生殖構造中で産生し次いで貯蔵することができる貯蔵炭水化物の量を決定する。ある特定の時点で、栄養生長期を終えて生殖発達が進行し、生育期が終わる前に完了できるようにする。生育期の長さは季節因子に依存して場所ごとに大きく異なる。広範囲の環境シグナルが栄養生長期の生殖期への移行を制御する。重要なシグナルは日長、温度（春化（vernalisation））、栄養および水の利用可能性ならびにジベリン酸（GA）などの植物ホルモンである。これらのシグナルは栄養頂端分裂組織実体の変化、いわゆる花成（floral transition）を誘導し、この移行により花序分裂組織が確立される。栄養頂端分裂組織の産物は葉原基であるが、花序分裂組織が産生する原基は初期生殖発達中に二次花序に分化し、この段階の後期に花に分化する。
【０００３】
栄養生長期と生殖期の間のこの移行は植物ライフサイクルにおける重要な発達事象であり、有性生殖の第１ステップであって、農業、園芸および植物育種において非常に重要である。開花開始を正確に測定する能力は、早いまたは遅い開花などの開花に関係する形質、およびさらに非開花性形質について、植物を頻繁に育種し選択する農業および育種産業にとって非常に有益でありうる。この能力は、収穫量を最適化すること（これは種子または果実用に栽培する植物において特に重要である）、早いおよび遅い品種を識別すること、および所与の生育期または所与の場所における生育条件によく適合したライフサイクルをもつ植物を提供することなどの多くの利点を有しうる。
【０００４】
開花開始を決定する通常の方法としては、植物を拡大下で切開して分裂組織における栄養または生殖構造の存在を決定する方法が挙げられる。この技法はその技法の主観性、その低い精度および時間のかかる特性などのいくつかの欠点があり、一般的に多数の植物に関わる育種に十分に適していない。さらに、解体した植物は一般的にもう生存しない。
【０００５】
開花開始を決定するために植物育種者が利用する時間のかからない方法は、「出芽（emergence）」または「出穂時間（heading time）」としても知られる花序の出芽を監視する方法である。出穂時間は第１花序が葉鞘から生じて肉眼で見えるようになる時点として定義される。しかし、開花開始は花序の出芽が認められる数日またはさらに数週前に起こりうるので、この方法は開花開始について不満足な評価しか与えない。
【０００６】
開花開始を決定するさらなる方法は、花粉が葯から放出される瞬間である開花（anthesis）を監視することである。この方法は、葯が明瞭に見える開放受粉種に限られるという欠点がある。
【０００７】
作物の開花開始を決定するために農場で広く利用される方法は、小区画を繰り返し目視検査し、小区画内に存在する開花植物の数を求めることを含む。農学では、小区画内の植物の50％が出芽花序を示したときに、小区画は「開花」したと通常受け入れられている。この技法は、植物の１群が開花したかどうかについて大まかな概念を与えうるが、個々の植物基準における開花開始を決定するのには適していない。しかし、個々の植物基準の差異は重要であり、例えば、穀粒または果実の収穫は、全植物が成熟したときに最もよく行われるが、これは遅い開花個体が収穫時期を決定し、早い個体は過熟となるかまたは種子もしくは果実を失うリスクを伴うことを意味する。同様に、もし収穫を早い開花個体に合わせて行うと、未熟のものを収穫するリスクがある。
【０００８】
これらの通常の方法に関連する主な欠点は、目視による検査とかかる検査に関連する主観性に依ることである。例えば、一個人により行われる観察は他の個人によりなされるものと大きく異なりうる。光の質と量、時刻などの因子も読取値の精度に影響を与えうる。さらに、確実に良い育種を行うためには、開花時の差が１〜２日の変化(resolution)であることが望ましく、典型的には開花前後の期間に毎日観察する必要があり；これを行うにはかなりのマンパワーを必要とする。いくつかの変数の影響は、同じ人が観察することにより制御または少なくとも最小化できるが、他の因子は特に圃場で制御することは非常に難しい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、以上記載した問題のいくつかを軽減する開花開始を決定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、本発明の第１の実施形態によれば、開花開始を決定する方法であって、
(i)植物の花序をデジタル的に画像化するステップ；および
(ii)デジタル画像から花序を測定するステップ；および
(iii)ステップ(ii)から導き出された測定値と花序の平均生長速度から開花開始を計算するステップ
を含んでなる前記方法を提供する。
【００１１】
本明細書で使用する用語「花序」は広く生殖構造を意味するものである。花序の形態は問題の植物種に応じて変わりうるが、当業者は測定すべき関連構造を理解しうるであろう。
【００１２】
有利なことに、本発明の方法は個々の植物レベルで開花開始を正確に決定することを可能にする。
【００１３】
さらに、該方法は花序の存在または不存在から開花および非開花植物を識別する方法を提供する。
【００１４】
花序の次元（一般的には面積、しかしこれは長さおよび／または幅であってもよい）をデジタル画像から測定し、この情報と（問題の植物種または品種の）花序の平均生長速度とを利用して花序の出芽点に戻す計算をすることができる。例えば、ある特定の植物種または品種の花序の平均生長速度が１日当たり10cmであり、同じ植物種または品種の花序の観察サイズが30cmであれば、花序は観察時点の３日前に現れたと推測できる。従って開花開始も観察時点の３日前であろう。
【００１５】
開花開始を決定する本発明の方法は、検出可能かつ測定可能な花序が画像化の時点で存在する必要はあるが、これが最初の花序である必要はない。さらに、花序は画像化の時点で最大サイズに達していてはならない。従って、花序の出芽とそれが最大サイズに達するまでの間に少なくとも1回の観測を行う十分な観測頻度が必要であろう。当業者は観測頻度を容易に決定することができ、その頻度は勿論問題の種または品種に依存しうる。
【００１６】
本発明の方法は、開花開始を個々の植物レベルで決定しうるので、とりわけ温室環境で、高水準の精度を保持して、ハイスループットな方法で多数の植物を扱うのに特に好適である。温室の利点は、植物を規定した支持体で生育させ、局所的な土壌条件による可変性を最小化できることである。また、植物に与える水と栄養の量を制御することもできる。
【００１７】
本発明の第２の実施形態によれば、開花開始を決定する装置であって、
（i）１以上の植物を生育させる容器を支持し、かつ移動させる輸送手段；
（ii）発生する植物の花序を画像化するのに十分な解像度をもつ１台以上のデジタルカメラ；ならびに
（iii）植物の花序を検出、測定し、花序の測定値と平均生長速度から開花開始を導き出すコンピューター手段
を含んでなる前記装置が提供される。
【００１８】
上記実施形態において、植物を、一般的には１本以上のコンベヤーベルト（無限ベルト）の形態の輸送手段上で、１台以上のデジタルカメラが植物の花序の画像を撮るステーションへ移動させる。植物が静止しており、そして１台以上のデジタルカメラが、植物の花序の画像を撮る該植物上を移動するように配置された別の実施形態も想定することができる。しかし、局所的環境条件の影響を最小化しうるので、植物を移動させる実施形態が好ましい。
【００１９】
１つ以上の植物を生育する容器はポット、トレイなどであってよい。好ましくは、容器は古典的な植物ポットである。生育培地は植物を生育させるのに好適ないずれの基質であってもよい。植物を組織化して、所与の実験グループに属する植物を容易に検索しかつ画像化ステーションに輸送するようにしてもよい。好ましくは、植物を温室で生育させ、局所的環境条件の影響を少なくするために同じ実験グループに属する植物を無作為化しうる。植物をマニュアルで検索しかつ画像化ステーションに輸送してもよいが、多数の（例えば、数千のオーダーの）サンプルを評価する場合、さらに、温室内の栽培されている場所から植物を検索し、該当ポットを連続的にカメラに提示し、植物の画像を記録し、そして植物を元の位置または他の位置に返すシステムを有することにより、コンピュータープログラムを用いて開花時の評価を所望する一連の植物を選択するステップを除いて、全て人が介入することなく、プロセスを自動化することができる。一般的に、本発明の装置を用いて毎時間に最小500本の植物を画像化し、分析することができる。
【００２０】
好ましくは、それぞれの容器または植物は、関連づけられた固有の識別子を有し、植物または植物の容器に関する情報をコンピューターデータベースの固有の識別子と連結することができる。記録するために有用でありうる情報のタイプとしては、種、栽培品種、親の情報、導入遺伝子の存在、導入遺伝子の識別子、実験グループ、播種日、花序測定値および／またはその他の測定値（日付印とともに）、およびその植物について行われた他の定量的または定性的観測値が挙げられる。データベースに含有されるデータは適当なソフトウエアを用いて検索することができる。これらのデータを統計的に解析して、異なる開花時特性をもつ植物のグループを識別し、興味深い形質を有する植物を同定することができる。固有の識別子を用いることにより、さらなる育種または商業用途のために興味深い形質に基づいて植物を選択することが可能になる。好ましくは、識別子はトランスポンダーであるが、バーコードなどのいずれの他の好適な方法を用いてもよい。
【００２１】
輸送手段上の植物を画像化ステーションに移動する。植物は、個々の植物を識別し、同定することができる方法でカメラに提示されなければならない。これによって、現存の統計的技法を用いて開花時に対する集団均一性の評価が可能になる。発生する植物の花序に対する好適なデジタルカメラは、花序を約100ピクセルの最小サイズを有するように画像化できるものである。
【００２２】
植物の花序を検出し、測定するコンピューター手段は、画像処理ソフトウエアを含む。一般的には、かかるソフトウエアは花序に特異的な特徴を利用して、花序を、例えば、栄養器官（茎および葉）から識別する。例えば、花は植物の残りの部分と異なる色および／または構造(texture)を示すことが多い。いくつかの穀類の場合、イネまたはコムギの様に、未熟な花序が示す色の範囲は茎または葉の色に近いので、ソフトウエアは形状およびパターンの相違を利用して、葉または茎より高いピクセル対ピクセル変化をもたらす花序のより粒状の構造を識別する。位相幾何学的な手がかりを用いて検出精度をさらに上げることもできる。例えば、花序は通常、植物の頂部に見出され、常に茎と接続している。
【００２３】
図２はイネ植物のデジタル画像の例を示すが、これから植物の花序を測定することができる。図２のＡは開始時または元の画像である。この画像を、全ての非植物部分の除去を含むいわゆる「閾値化（Thresholding）」処理をする。閾値化はバックグラウンドおよび植物器官と異なる色域を示す非植物部分を利用して達成される。図２のＢは閾値化後の画像を示す。これに続いて、残りのピクセルに「色変化解析」と呼ばれる統計的方法を適用して、どの部分が花序のものと類似した構造特性を示すかを決定する。図２のＣは色変化解析後の画像を示す。花序色および構造についての従来の知識がこのステップのために必要であろう。色変化解析処理によって「非花序」と分類された対象を取り除く。最後に、「花序」として分類された、残りの対象の次元をソフトウエアにより記録する。花序のいくつかの部分は葉などの他の植物部分に隠れるかも知れないので、測定値を、数枚の写真、例えば少なくとも３枚そして一般に６枚以下の写真または画像から得た結果を平均化することにより正確にすることが好ましい。
【００２４】
固有の識別子を用いて採取したデータの統計解析を行うこともできる。例えば、開花開始を決定するための統計データ解析は次の３ステップに基づいて行うことができる。第１ステップは、花序の存在を論理規則に基づいて修正する、すなわち、いずれか１つの画像から撮った６枚の写真または画像の間の一貫性が存在すること、ある特定のサイズより小さい植物上に花序は存在しないこと、および花序は一度存在すると消えないことを仮定する。第２ステップは植物の全バッチにおける花序生長の速度を見積もる。このステップにおいて、花序のサイズを植物のサイズに対して修正し、生長の第１週では指数関数的な花序生長を仮定し、花序発生の日付をそれぞれの植物に対して見積もる。第３ステップで、花序出芽日の集団平均値およびこれらの見積値の標準誤差を生存率法（Coxモデル）に基づいて計算する。
【００２５】
もし、例えば、植物を週間隔で画像化すれば、１つの画像上に１つの花序が存在すると、１週の解像度(resolution)で開花開始を決定することが可能になる。花序のサイズを利用するもっと徹底したデータ解析を用いて２つの画像間に内挿し、開花開始を個々の植物に対してより低い解像度(resolution)で決定することができる。
【００２６】
花序のサイズを利用するもっと徹底したデータ解析を用いて、最後の画像化の時点で開花していなかった植物の存在を考慮すると、植物の集団に対する開花の平均開始のもっと信頼性の高い見積りを与えることもできる。
【００２７】
本発明の方法および装置はいずれの植物に対しても好適である。好ましい植物は穀類、例えばイネ、コムギ、およびトウモロコシである。またダイズ、ワタおよび菜種／キャノーラも好ましい。
【００２８】
本明細書で使用する用語「含んでなる」は「含む」の観念および「本質的に、から成る」の観念を包含することを意図する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明をこれから、実施例を用いて付随する図面を参照しながら説明する。
【００３０】
示した装置は温室（示されてない）内に設けられ、異なる処理をして異なる環境を作ることができるいくつもの領域を有しうる。例えば、当該領域の温度と湿度は、生育する特別な植物のニーズに従って、あるいは実験設定に従って、変えることができる。装置は、図1aおよび1bにおいて植物ポットとして示した１つの植物を生長促進培地で生育する容器(2)を支持し、移動させる第１の輸送手段(1)を含んでなる。容器(2)を第１の輸送手段(1)に沿って、植物を画像化しかつ画像の詳細を記録するステーションに向けて移動させる。容器(2)を回転プレート(3)上に移動させて中心垂直軸上で回転できるようにする。示した最初の押出し機(4）は容器(2)を第１の輸送手段(1)から回転プレート(3)上に移動する。植物の写真を記録するカメラ(5)は回転プレート(3)から好適な距離に水平に配置され、光源(6)は植物を均一に照明するように回転プレート(3)から好適な距離に水平に配置される。カメラ(5)と接続されたコンピューター(7)は、カメラが撮影した画像を採取し、保存し、そして解析する適当なソフトウエアプログラムを含んでなる。示した固有の識別子読取機(8)は、植物または容器(2)内の植物に関連づけられた固有の識別子を読み取る。示した第２の輸送手段(9)は容器(2)を支持して移動させ、元の位置に戻すかまたは他の位置に移す。第２の押出機(10)は、容器(2)を回転プレート(3)から第２の輸送手段へ移動させる。
【００３１】
本発明の装置を用いて開花開始を決定する方法は、一般的には、次のステップを含む。第１の輸送手段(1)を始動して容器(2)を回転プレート(3)の前面に運ぶ。次に、第１の輸送手段(1)を停止する。第１の押出機(4)を稼働して容器(2)を回転プレート(3)上に押し出す。あるいは、植物を回転プレート上に配置する作業を人手でまたは植物を掴んでそれを規定位置に移動できる好適なグリッパーをもつロボットアームにより行ってもよい。回転プレート(3)上の容器(2)をカメラ(5)の前面で回転させ、光源(6)のスイッチを入れる。写真撮影の各サイクルにおいて安定な照明を確実なものにするために、光源(6)は通常、各植物の間でスイッチを切らない。次いでカメラ(5)は、回転プレート(3)が回転し始めると規則的な間隔で写真撮影を開始し、完全な１回転の後に停止する。１サイクル当たり撮影する写真の数は通常、少なくとも３枚そして通常は６枚以下である。植物または容器(2)内の植物に関連づけられた固有の識別子は、識別子読取機(8)により読取られてデータケーブル結線を通してコンピューター(7)に送られる。カメラ(5)は記録した写真をデータケーブル結線を通してコンピューター(7)に送る。植物の固有の識別子（示していない）は、画像を保存し、解析するときに画像に連結される。好ましくは、画像ファイルを保存するときに識別子は画像ファイルの名称に組み込まれるが、コンピューターデータベースにおいて識別子と画像の名称が明解に連結していれば、いずれの命名システムを用いて画像を名づけてもよい。花序の存在とサイズは好適なソフトウエアを用いて画像から推論され、その結果はコンピューターデータベースにユニークな植物の固有の識別子と連結して保存される。第２の押出機(10)は容器(2)を第２の輸送手段(9)上に移動させ、該輸送手段(9)を始動させて容器(2)をカメラ(5)から取り去る。あるいは、同じ作業を人手で、または植物を掴んでそれを規定位置に移動できる好適なグリッパーをもつロボットアームにより行ってもよい。
【実施例】
【００３２】
次の実施例は本発明を実証するために行われた。以下の表１は、特別な遺伝子構築物の存在が、その構築物を用いて形質転換された遺伝子組換えイネ植物に対して、対照植物と比較して、開花時の変化を与えることを実証することを目的とした実験の結果をまとめたものである（前記対照植物は遺伝子組換え植物と同じ母植物由来の同胞種であるが、メンデル分離の故にその構築物が遺伝されなかった植物である）。
【００３３】
本実験は７つの独立した形質転換の試みまたは形質転換事象、すなわちＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧを含む。それぞれの事象については、９つの遺伝子組換え植物と９つの対照植物を対象とした。それぞれの植物を、播種後10日に開始して成熟まで７日毎に１回画像化した。この実験での各植物の開花時は上に記載の通り計算した。好適な統計方法を適用して、それぞれの形質転換事象において、遺伝子組換え植物と対照植物の間に見られる相違の有意性のレベルを決定した。
【００３４】
表１に示したデータは、全ての遺伝子組換え植物が対照植物と比較して開花を遅延させたことを示す。絶対的な差は1.7〜4.1日の範囲、または相対単位(relative unit)で2％〜6％の範囲であった。その差は、事象Ｂ、Ｄ、Ｅについては統計的に有意（P<0.05）、そして事象Ａ、Ｆ、Ｇについては高度に有意（P<0.01）であった。事象Ｃだけが統計的に有意でなかったが、それでもp値は0.05に非常に近かった。全事象にわたる、全体の差はさらに高度に有意であった（P<0.001）。
【表１】
2009526536.tif 000002
【００３５】
本実験は、本発明の方法を用いて、その開花時が２日以下だけ異なる植物のグループを識別できることを実証しうる。さらに、本方法は、画像化頻度が７日毎である１実験グループ当たり、９個体しか必要としなかった。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】頂部から見た本発明の装置の模式的表現（上面図）である。左側の図は写真撮影サイクルの開始時における装置のエレメントを表す。中央の図は写真の記録中の装置のエレメントを表す。右側の図は写真撮影サイクルの終了時における装置のエレメントを表す。矢印は移動エレメントの運動方向を示す。
【図１Ｂ】側面から見た本発明の装置の模式的表現（側面図）である。左側の図は写真撮影サイクルの開始時における装置のエレメントを表す。中央の図は写真の記録中の装置のエレメントを表す。右側の図は写真撮影サイクルの終了時における装置のエレメントを表す。矢印は移動エレメントの運動方向を示す。
【図２】イネ植物のデジタル画像を示し、これから植物の花序を測定できる。Ａは開始または元の画像を示し、Ｂは閾値化後の画像を示し、Ｃは色変化解析後の画像を示す。
【図３】実施例１の実験結果のグラフ表示である。
【図１Ａ】
2009526536.tif 000003
【図１Ｂ】
2009526536.tif 000004
【図２】
2009526536.tif 000005
【図３】
2009526536.tif 000006
【国際調査報告】
2009526536.tif 000007
2009526536.tif 000008
2009526536.tif 000009