(57)【要約】本発明はＴＬＲのアンタゴニストとしての新規な免疫調節オリゴヌクレオチド（ＩＲＯ）、およびその使用方法を提供する。これらのＩＲＯは、ＴＬＲリガンドまたはＴＬＲアゴニストに対する反応において、ＴＬＲ媒介シグナル伝達を阻害するまたは抑制する特異的な配列を有する。かかる方法は、癌、自己免疫性疾患、気道炎症、炎症性疾患、感染症、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾患の予防および処置において有用であり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫調節オリゴヌクレオチド（ＩＲＯ）化合物を含むＴＬＲアンタゴニスト。
【請求項２】
免疫刺激性モチーフに隣接する配列における１つまたは２つ以上の化学修飾を有する、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項３】
１つまたは２つ以上の化学修飾がなければ免疫刺激性であるオリゴヌクレオチドモチーフにおいて、前記修飾を有する、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項４】
１つまたは２つ以上の化学修飾がなければ免疫刺激性であるオリゴヌクレオチドモチーフにおいて、前記修飾を該オリゴヌクレオチドモチーフに隣接する配列に有する、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項５】
構造：
５−Ｎｍ−Ｎ３Ｎ２Ｎ１ＣＧＮ１Ｎ２Ｎ３−Ｎｍ−３’
を有するＩＲＯ化合物。
式中：
ＣＧはオリゴヌクレオチドモチーフであり、およびＣはシトシンまたはピリミジンヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチド結合であり、Ｇはグアノシン、プリンヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチド結合であり；
Ｎ１〜Ｎ３は、それぞれの出現において、独立して、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチド結合であり；
Ｎｍは、それぞれの出現において、独立して、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチド結合であり；
ただし、少なくとも１つのＮ１〜Ｎ３および／またはＣおよび／またはＧはヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチド結合であり；
さらに、化合物は４未満の連続したグアノシンヌクレオチドを含有し、
そこにおいて、該オリゴヌクレオチドモチーフはヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチド結合がなければ免疫刺激性であり、
および、そこにおいてｍは約０〜約３０の数である。
【請求項６】
請求項１〜５に記載の組成物のいずれか１つおよび薬学的に許容し得る担体を含む、薬学的組成物。
【請求項７】
化学修飾を免疫刺激性オリゴヌクレオチドモチーフ中へとおよび／または免疫刺激性オリゴヌクレオチドモチーフ隣接配列へと導入することを含む、免疫刺激性オリゴヌクレオチドモチーフを含むＴＬＲ刺激性オリゴヌクレオチドを修飾する方法であって、該免疫刺激性オリゴヌクレオチドモチーフの免疫刺激性活性が該化学修飾により抑制される、前記方法。
【請求項８】
脊椎動物におけるＴＬＲ媒介免疫反応を阻害するための方法であって、該方法が脊椎動物へ請求項１〜５のいずれかに記載のＩＲＯ化合物を薬学的有効量で投与することを含む、前記方法。
【請求項９】
投与経路が非経口、粘膜投与、経口、舌下、経皮、局所、吸入、経鼻、エアロゾル、眼球内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃により、皮膚パッチあるいは点眼薬またはうがい薬の形態である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＩＲＯ化合物を投与することを含む、ＴＬＲ刺激を阻害するための方法。
【請求項１１】
ＴＬＲがＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項１２】
ＩＲＯ化合物を投与することを含む、ＴＬＲアゴニストの活性を阻害するための方法。
【請求項１３】
ＩＲＯをＴＬＲアゴニストと同時に投与することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項１４】
ＩＲＯをＴＬＲアゴニストに先立って投与することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項１５】
ＴＬＲアゴニストが、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９のアゴニストから選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１６】
ＴＬＲにより媒介される疾患を有する脊椎動物を治療的に処置するための方法であって、該方法が脊椎動物へと請求項１〜５に記載のＩＲＯ化合物を薬学的有効量で投与することを含む、前記方法。
【請求項１７】
疾患が、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、感染症、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾患である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＩＲＯ化合物が１つまたは２つ以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性物質、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲアンタゴニスト、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、アジュバントまたは共刺激分子との組み合わせで投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
投与経路が、非経口、粘膜投与、経口、舌下、経皮、局所、吸入、経鼻、エアロゾル、眼球内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃により、皮膚パッチあるいは点眼薬またはうがい薬の形態である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
脊椎動物における、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、感染症、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾患を防ぐための方法であって、該方法が脊椎動物に請求項１〜５のいずれかに記載のＩＲＯ化合物を薬学的有効量で投与することを含む、前記方法。
【請求項２１】
ＩＲＯ化合物が１つまたは２つ以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性物質、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲアンタゴニスト、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、アジュバントまたは共刺激分子とともに組み合わせて投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
投与経路が非経口、粘膜投与、経口、舌下、経皮、局所、吸入、経鼻、エアロゾル、眼球内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃により、皮膚パッチまたは点眼薬またはうがい薬の形態である、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、出願日２００５年１０月１２日の米国仮出願番号第60/726,034号、出願日２００６年３月２１日の米国仮出願番号第60/784,243号および出願日２００６年９月１３日の米国仮出願番号第60/825,440号の利益を主張し、その内容全体を引例として組み入れる。
【０００２】
本発明の背景
本発明は概して免疫学および免疫療法の分野に関し、ならびにより特別には免疫調節オリゴヌクレオチド（ＩＲＯ）組成物およびトール様受容体媒介免疫反応の阻害および／または抑制のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の概要
トール様受容体（ＴＬＲ）は免疫系の多くの細胞に存在し、先天性免疫応答に関連することが示されてきている(Hornung, V. et al., (2002) J. Immunol. 168:4531-4537)。脊椎動物において、このファミリーはＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０と呼ばれる１０のタンパク質からなり、それらは、細菌、菌類、寄生虫、およびウイルスからの分子パターンに関連する病原体を認識することが知られている(Poltorak, a. et al. (1998) Science 282:2085-2088; Underhill, D.M., et al. (1999) Nature 401:811-815; Hayashi, F. et. al (2001) Nature 410:1099-1103; Zhang, D. et al. (2004) Science 303:1522-1526; Meier, A. et al. (2003) Cell. Microbiol. 5:561-570; Campos, M.A. et al. (2001) J. Immunol. 167: 416-423; Hoebe, K. et al. (2003) Nature 424: 743-748; Lund, J. (2003) J. Exp. Med. 198:513-520; Heil, F. et al. (2004) Science 303:1526-1529; Diebold, S.S., et al. (2004) Science 303:1529-1531; Hornung, V. et al. (2004) J. Immunol. 173:5935-5943)。ＴＬＲは、哺乳類が異質分子に対する免疫反応を認識および開始する鍵となる手段であり、ならびに、先天性および適応的免疫反応が結合する手段をまた提供する(Akira, S. et al. (2001) Nature Immunol. 2:675-680; Medzhitov, R. (2001) Nature Rev. Immunol. 1:135-145)。ＴＬＲは、また、自己免疫、感染症、および炎症を含む、多くの疾患の発病においての役割を果たすことが示されてきており(Cook, D.N. et al. (2004) Nature Immunol. 5:975-979)、適切な薬剤を用いるＴＬＲ媒介活性化の調節により、疾患介入のための手段を提供する。
【０００４】
いくつかのＴＬＲは、細胞表面に配置され、細胞外病原体を検出し、それに対する反応を開始し、そして、他のＴＬＲは細胞内部に配置され、細胞内病原体を検出し、それに対する反応を開始する。表１は、ＴＬＲの代表例およびそして公知のアゴニストを提示する(Diebold, S.S. et al. (2004) Science 303:1529-1531; Liew, F. et al. (2005) Nature 5:446-458; Hemmi H et al. (2002) Nat Immunol 3:196-200; Jurk M et al., (2002) Nat Immunol 3:499; Lee J et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:6646-6651); (Alexopoulou, L. (2001) Nature 413:732-738)。
【表１】
2009515823.tif 000002
【０００５】
細菌性および合成ＤＮＡに存在するある非メチル化ＣｐＧモチーフは、免疫系を活性化し、抗腫瘍活性を誘発すると示されている。(Tokunaga T et al., J. Natl. Cancer Inst. (1984) 72:955-962; Shimada S, et al., Jpn. H Cancer Res, 1986, 77, 808-816; Yamamoto S, et al., Jpn. J. Cancer Res., 1986, 79, 866-73)。ＣｐＧジヌクレオチドを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる他の研究により、免疫反応を刺激することが示されてきた(Zhao Q, et al. (1996) Biochem.Pharmacol. 26:173-182)。その後の研究により、ＴＬＲ９が細菌性および合成ＤＮＡに存在する非メチル化ＣｐＧモチーフを認識することが示された(Hemmi, H. et al. (2000) Nature 408:740-745)。ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの他の修飾は、また、ＴＬＲ９を介する免疫反応のモジュレータとして作用するその能力に影響を及ぼすことができる（例えば、Zhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 51:173-182；Zhao et al. (1996) Biochem Pharmacol. 52:1537-1544；Zhao et al. (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:495-502；Zhao et al (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:3453-3458；Zhao et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:1051-1054；Yu, D. et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:2585-2588；Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2263-2267；およびKandimalla, E. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813を参照のこと）。さらに、構造活性相関研究により、合成モチーフおよび非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドから生じるものとは明白に異なる、特異的免疫反応プロフィールを誘発する新規のＤＮＡに基づく化合物の同定を可能にしてきた。(Kandimalla, E. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102:6925-6930. Kandimalla, E. et al. (2003) Proc. Nat. Acad. Sci. U S A 100:14303-14308; Cong, Y. et al.  (2003) Biochem Biophys Res. Commun.310:1133-1139; Kandimalla, E. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 306:948-953; Kandimalla, E. et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2393-2400; Yu, D. et al. (2003) Bioorg. Med. Chem.11:459-464; Bhagat, L. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun.300:853-861; Yu, D. et al. (2002) Nucleic Acids Res.30:4460-4469; Yu, D. et al. (2002) J. Med. Chem.45:4540-4548. Yu, D. et al. (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun.297:83-90; Kandimalla. E. et al. (2002) Bioconjug. Chem.13:966-974; Yu, D. et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:1613-1619; Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:2803-2808; Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2263-2267; Kandimalla, E. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813; Yu, D. et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:2585-2588; Putta, M. et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34:3231-3238)。
【０００６】
ＴＬＲの選択的局在化およびそこから生じるシグナル伝達により、免疫反応へのそれらの役割へのいくつかの洞察が提供される。かかる免疫反応は、反応と関連する細胞のサブセットに基づく、先天性および適応的反応の両方に関連する。例えば、遅延型過敏症および細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化などの古典的細胞媒介機能に関連するＴヘルパー（Ｔｈ）細胞は、Ｔｈ１細胞である。この反応は、抗原に対する体の先天性反応であり（例えば、ウイルス感染、細胞内病原体、および腫瘍細胞）、そしてＩＦＮ−ガンマの分泌およびＣＴＬの同時活性化をもたらす。代わりに、Ｂ細胞活性化のためのヘルパー細胞として関連する細胞は、Ｔｈ２細胞である。Ｔｈ２細胞は最近および寄生虫に対する反応において活性化されることが示されてきており、ＩＬ−４およびＩＬ−５の分泌を介して体の適応的免疫反応を媒介し得る（例えば、ＩｇＥ産生および好酸球活性化）。その型の免疫反応は、抗原暴露への反応において産生されるサイトカインにより影響を及ぼされ、Ｔｈ１およびＴｈ２により分泌されるサイトカインにおける差異により、これらの２つのサブセットの異なる生物学的機能という結果となり得る。
【０００７】
ＴＬＲの活性化は免疫反応を開始することに関係する一方、ＴＬＲを介する免疫系の非制御刺激は免疫低下対象において、特定の疾患を悪化させ得る。近年、いくつかのグループが、合成オリゴデオキシオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の炎症性サイトカインの阻害剤としての使用を示してきた(Lenert, P. et al. (2003) DNA Cell Biol. 22(10):621-631)。
【０００８】
ある合成ＯＤＮを用いて、Lenertらは阻害性ＯＤＮを産生する能力を報告した(Lenert, P. et al. (2003) DNA Cell Biol. 22(10):621-631)。これらの阻害性ＯＤＮは、２つのトリプレット配列、近位「ＣＴＴ」トリプレットおよび遠位「ＧＧＧ」トリプレットを必要とする。これらのトリプレット含有阻害性ＯＤＮに加えて、いくつかのグループは、ＣｐＧ含有ＯＤＮによるＴＬＲ−９−媒介活性化を阻害できるであろう、他の特定のＤＮＡ配列を報告してきた。これらの「阻害性」または「抑制性」モチーフは、ポリ「Ｇ」（例えば、「ＧＧＧＧ」または「ＧＣ」配列が豊富であり、メチル化されている傾向があり、哺乳類およびあるウイルスのＤＮＡ中に存在する（例えば、Chen, Y., et al., Gene Ther. 8: 1024-1032 (2001); Stunz, L.L., Eur. J. Immunol. 32: 1212-1222 (2002)を参照のこと）。Duramadら（Duramad, O., et al., J. Immunol., 174: 5193-5200 (2005)）およびJurkら(US 2005/0239733)は、配列内にＧＧＧＧモチーフを含有する阻害性ＤＮＡオリゴヌクレオチドに対する構造を記載する。Patoleらは、ＧＧＧＧ含有ＯＤＮは全身性ループスを抑制するであろうことを実証する(Patole, P. et al. (2005) J. Am. Soc. Nephrol. 16:3273-3280)。さらに、Gurselら（Gursel, I., et al., J. Immunol., 171: 1393-1400 (2003)）は、哺乳類テロメアにおいて高頻度で存在する、ＴＴＡＧＧＧ要素が、ＣｐＧ誘発免疫活性化を下方制御することを記載する。Shirotaら（Shirota, H., et al., J. Immunol., 173: 5002-5007 (2004)）は、ＴＴＡＧＧ要素を含有する合成オリゴヌクレオチドがこの活性を模倣し、あるＴｈ１依存性自己免疫疾患の予防／処置に有効であろうことを実証する。
【０００９】
対照的に、近年の研究により、ポリＧ含有ＯＤＮがＴＬＲのアンタゴニストとして作用するという視点が問われている。例えば、米国特許第6,426,334号（Agrawalら）は、ＧＧＧＧストリングを含有するＣｐＧオリゴヌクレオチドを投与することにより、強力な抗ウイルスおよび制癌活性を有し、さらにこれらの化合物の投与により血清ＩＬ−１２濃度の増加を引き起こすであろうことを実証する。さらにポリＧ配列を含有するＣｐＧオリゴはＴＬＲ９活性化を介して免疫反応を誘発することが知られ(Verthelyi D et al, J Immunol. 166, 2372, 2001; Gursel M et al, J Leukoc Biol, 71, 813, 2001, Krug A et al, Eur J Immunol, 31, 2154, 2001)、抗腫瘍、抗ウイルス活性を示す(Ballas GK et al, J Immunol, 167, 4878, 2001; Verthelyi D et al, J Immunol, 170, 4717, 2003)。加えて、また、ポリＧオリゴヌクレオチドはＨＩＶおよびＲｅｌ  Ａを阻害することが知られている(McShan WM, et al, J Biol Chem., 267(8):5712-21, 1992; Rando, RF et al., J Biol Chem, 270(4):1754-60, 1995; Benimetskaya L, et al., Nucleic Acids Res., 25(13):2648-56, 1997)。加えて、免疫刺激性ＣｐＧモチーフおよび４連続のＧオリゴヌクレオチドを含有するＯＤＮ（クラスＡ  ＯＤＮ類）は、免疫反応においてインターフェロン−γおよびＴｈ１シフトを誘発する。さらに、前臨床疾患モデルにおいて、クラスＡ  ＯＤＮはＴＬＲ媒介免疫反応を誘発すると示されている。
【００１０】
加えて、グアノシンストリング含有オリゴヌクレオチドは、四重体(tetraplex)口座王を形成し、アプタマーとして作用し、そしてトロン便活性を阻害すると示されてきている(Bock LC et al., Nature, 355:564-6, 1992; Padmanabhan, K et al., J Biol Chem., 268(24):17651-4, 1993)。そのため、一本鎖または複数鎖構造がＴＬＲ活性化を抑制するに有効であるかは明らかではない。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
本発明は、ＴＬＲのアンタゴニストとしての新規の免疫オリゴヌクレオチド（ＩＲＯ）化合物およびそれを用いる方法を提供する。これらのＩＲＯは、免疫刺激性モチーフに隣接する配列および／または修飾がなければ免疫刺激性であるオリゴヌクレオチドモチーフにおける１つまたは２つ以上の化学修飾を有する。
【００１２】
本発明は、５−Ｎｍ−Ｎ３Ｎ２Ｎ１ＣＧＮ１Ｎ２Ｎ３−Ｎｍ−３’、式中ＣＧはオリゴヌクレオチドモチーフであり、およびＣはシトシンまたはピリミジンヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチド結合であり、およびＧはグアノシン、プリンヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチド結合であり；Ｎ１〜Ｎ３は、それぞれの出現において、独立してヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチド結合であり；Ｎｍは、それぞれの出現において、独立してヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチドレンされあり；
【００１３】
ただし少なくとも１つのＮ１〜Ｎ３および／またはＣおよび／またはＧはヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチド結合であり；およびさらに、化合物は、オリゴヌクレオチドモチーフがヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチド結合がなければ免疫刺激性である４未満の連続したグアノシンヌクレオチドを含有し；および式中ｍは０〜約３０の数である、を有する新規のＩＲＯ組成物をさらに提供する。
【００１４】
本発明は、任意のＩＲＯおよび薬学的に許容し得る担体を含む薬学的組成物をさらに提供する。
【００１５】
本発明は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドモチーフ中へ、および／または免疫刺激性オリゴヌクレオチド隣接配列へと化学修飾を導入することを含む、免疫刺激性オリゴヌクレオチドモチーフを含むＴＬＲ刺激性オリゴヌクレオチドを修飾するための方法であって、かかる免疫刺激性オリゴヌクレオチドモチーフの免疫刺激性活性が化学修飾により抑制される、前記方法を提供する。
【００１６】
本発明は、脊椎動物においてＴＬＲ媒介免疫反応を阻害するための方法をさらに提供し、かかる方法は、投与経路が非経口、粘膜投与、経口、舌下、経皮、局所、吸入、経鼻、エアロゾル、眼球内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃により、皮膚パッチまたは点眼薬またはうがい薬の形態で、薬学的有効量でＩＲＯ化合物を脊椎動物へと投与することを含む。いくつかの好ましい態様において、本発明によるＩＲＯ化合物を投与することを含むＴＬＲ刺激を阻害することであって、かかるＴＬＲはＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９から選択される。
【００１７】
本発明は、ＩＲＯ化合物を投与することを含むＴＬＲアゴニストに活性を阻害するための方法をさらに提供し、かかるＩＲＯはＴＬＲアゴニストと同時に、先立ってまたはあとに投与される。好ましい態様において、かかるＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９のアゴニストから選択される。
【００１８】
本発明は、ＴＬＲにより媒介される疾患を有する脊椎動物を治療的に処置するための方法をさらに提供し、かかるは薬学的有効量の本発明によるＩＲＯ化合物を脊椎動物へ投与することを含む。好ましい態様において、かかる疾患は癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、感染症、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾患である。
【００１９】
いくつかの好ましい態様において、かかるＩＲＯ化合物は、１つまたは２つ以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性物質、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、TLRアゴニスト、TLRアンタゴニスト、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、DNAワクチン、アジュバントまたは共刺激分子との組み合わせで投与される。いくつかの好ましい態様において、かかる投与経路は、非経口、粘膜投与、経口、舌下、経皮、局所、吸入、経鼻、エアロゾル、眼球内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃により、皮膚パッチまたは点眼薬またはうがい薬の形態である。
【００２０】
本発明は、脊椎動物における癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、感染症、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾患を予防するための方法をさらに提供し、該方法は、脊椎動物に薬学的有効量の本発明によるＩＲＯ化合物を投与することを含む。いくつかの好ましい態様において、かかるＩＲＯ化合物を１つまたは２つ以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性物質、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲアンタゴニスト、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、アジュバントまたは共刺激分子との組み合わせで投与する。いくつかの好ましい態様において、かかる投与経路は非経口、粘膜投与、経口、舌下、経皮、局所、吸入、経鼻、エアロゾル、眼球内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃により、皮膚パッチまたは点眼薬またはうがい薬の形態である。
【００２１】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、免疫療法用途のための免疫モジュレーター薬剤としての新規のオリゴヌクレオチドの治療的使用に関する。特に、本発明は、ＴＬＲ媒介免疫反応を阻害するおよび／または抑制するためのトール様受容体（ＴＬＲ）のアンタゴニストとしての免疫調節オリゴヌクレオチド（ＩＲＯ）を提供する。これらのＩＲＯは内因性および／または外因性ＴＬＲリガンドまたはアゴニストに対する反応におけるＴＬＲ媒介シグナル伝達を阻害するまたは抑制する特異的な配列を有する。明細書中に引用される引例は本分野における知識のレベルを反映し、ここにその全体を引例として導入する。引用される引例および本明細書の教示の間の不一致は、後者を支持することにより解決するであろう。
【００２２】
本発明は、ＴＬＲにより引き起こされる免疫反応を抑制するための方法を提供し、成人および小児科学上のヒトおよび獣医学的用途において、限定することなく、癌の処置、自己免疫疾患、ぜんそく、呼吸器系アレルギー、食物アレルギー、皮膚アレルギー、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節炎、胸膜炎、慢性感染症、炎症性疾患、炎症性腸症候群、敗血症、ならびに細菌、寄生虫、およびウイルス感染などの免疫療法用途のために用いることができる。そのため、本発明は、免疫療法のための最適レベルの免疫モジュレーターを有するＩＲＯ化合物、ならびにそのような化合物を作るおよび用いるための方法を、さらに提供する。加えて、本発明の化合物は、例えば、ＤＮＡワクチン、抗原、抗体、およびアレルゲンとの組み合わせにおいて；および化学療法の薬剤（伝統的な化学療法および近代の標的療法、ともに）および／または疾患を予防するおよび処置するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドとの組み合わせにおいて、有用である。
【００２３】
定義
「オリゴヌクレオチド」の用語は、概して、複数の結合したヌクレオシド単位を含む、ポリヌクレオシドを指す。そのようなオリゴヌクレオチドは、ゲノムのまたはｃＤＮＡを含む、現存の核酸源から得ることができるが、好ましくは合成方法により作り出される。好ましい態様において、それぞれのヌクレオシド単位は、野生型オリゴヌクレオチドと比較して、限定せずに修飾したヌクレオシド塩基および／または修飾した糖単位を含む、さまざまな化学修飾および置換基を包含する。化学修飾の例は当業者に公知であり、例えば、Uhlmann E et al. (1990) Chem. Rev. 90:543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993; およびHunziker, J. et al. (1995) Mod. Syn. Methods 7:331-417; およびCrooke, S. et al. (1996) Ann.Rev. Pharm. Tox. 36:107-129に記載される。かかるヌクレオシド残基は、多数の公知のヌクレオシド内結合のうちの任意により互いに連結できる。そのようなヌクレオシド内結合は、限定なく、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダート、シロキサン、カルボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホロアミダート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホン ヌクレオシド内結合を含む。「オリゴヌクレオチド」の用語は、また、１つまたは２つ以上の立体特異的なヌクレオシド結合（例えば（ＲＰ）−または（ＳＰ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、またはホスホトリエステル結合）有するポリヌクレオシドを包含する。明細書中で用いる、「オリゴヌクレオチド」および「ジヌクレオチド」の用語は、かかる結合がリン酸基を含むかどうかいずれにせよ、任意のそのようなヌクレオシド内結合を有するポリヌクレオシドおよびジヌクレオシドを含むことを明確に意図する。ある好ましい態様において、これらのヌクレオシド内結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート結合、あるいはその組み合わせであってもよい。
【００２４】
「２’−置換リボヌクレオシド」または「２’−置換アラビノシド」という用語は、概して、ペントース部分の２’位の水酸基が置換され、２’−置換または２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドが作り出される、リボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドを含む。ある態様において、該置換は、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を含有する低級ヒドロカルビル基、ハロゲン原子、または６〜１０個の炭素原子を有するアリール基とともになされ、そこにおいて該ヒドロカルビル基、またはアリール基は、非置換であってもまたは置換であってもよく、例えば、ハロ基、水酸基、トリフルオロメチル基、シアノ基、ニトロ基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、カルボキシル基、カルボアルコキシ基、またはアミノ基である。２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−置換アラビノシドの例は、限定なく、２’−アミノ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−アルキルおよび２’−プロパルギルリボヌクレオシドまたはアラビノシド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メチルアラビノシドおよび２’−Ｏ−メトキシエトキシリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メトキシエトキシアラビノシドを含む。
【００２５】
「３’」という用語は、方向性で用いられるとき、概して、同一のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにおけるもう１つの領域または部位からの、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド３’（下流）における領域または部位を指す。
【００２６】
「５’」という用語は、方向性で用いられるとき、概して、同一のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにおけるもう１つの領域または部位からの、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド５’（上流）における領域または部位を指す。
【００２７】
「約」という用語は、正確な数が重大でないということを意味する。そのため、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオシド残基の数は重大でなく、１つまたは２つより少ないヌクレオシド残基、または１〜数個の追加のヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、上記の態様のそれぞれの同等物と考えられる。
【００２８】
「アゴニスト」という用語は、概して、細胞の受容体へ結合し、反応を誘発する物質を指す。アゴニストは、しばしば、リガンドなどの天然発生の物質の作用を模倣する。
【００２９】
「アンタゴニスト」の用語は、概して、アゴニストの効果を減衰させる物質を指す。
【００３０】
「アジュバント」の用語は、ワクチンまたは抗原などの免疫原へと付加するとき、混合物への暴露に際し、受領ホストにおける薬剤への免疫反応を増強するまたは促進する物質を指す。
【００３１】
「気道炎症」の用語は、概して、ぜんそくを限定なく含む。
【００３２】
「アレルゲン」の用語は、概して、抗原または分子の抗原部分、しばし、対象への暴露に際しアレルギー反応を発する、タンパク質を指す。典型的には、かかる対象は、例えば、膨疹および発赤試験または業界で公知の任意の方法により示されるアレルゲンに対してアレルギー性である。たとえ対象の小さなサブセットのみがかかる分子への暴露に際しアレルギー性免疫反応を呈するとしても、分子はアレルゲンであると言われる。
【００３３】
「アレルギー」という用語は、概して、炎症を特徴とする、不適切な免疫反応を指し、食物アレルギーおよび呼吸器系アレルギーを限定なく含む。
【００３４】
「抗原」という用語は、概して、認識され、抗体またはＴ細胞抗原受容体により選択的に結合され、免疫反応の誘発を引き起こす物質を指す。抗原は、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、およびその組み合わせを、限定なく含む。抗原は天然または合成であってよく、概して、その抗原に特異的な免疫反応を誘発する。
【００３５】
「自己免疫疾患」の用語は、概して「自己」構成要素が免疫系による攻撃を受ける、障害を指す。
【００３６】
「ＴＬＲ媒介疾患」または「ＴＬＲ媒介障害」の用語は、概して、１つまたは２つ以上のＴＬＲの活性化が要因である、任意の病態を意味する。かかる状態は、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、感染症、皮膚疾患、アレルギー、ぜんそくまたは病原体により引き起こされる疾患を限定なく含む。
【００３７】
「生理学的に許容し得る」の用語は、概して、ＩＲＯ化合物の有効性に干渉せず、細胞、細胞培養、組織、または有機体などの生物系に適合する原料を指す。好ましくは、かかる生物系は、例えば脊椎動物などの、生きた有機体である。
【００３８】
「担体」の用語は、概して、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、バッファ、安定剤、可溶化剤、オイル、脂質、脂質含有ベシクル、ミクロスフェア、リポソームカプセル化、または製剤処方における使用のために業界で周知の他の原料を包含する。当然のことながら、担体、賦形剤、または希釈剤の特徴は、特別な用途に対する投与経路に依存するであろう。これらの原料を含有する薬学的に許容し得る処方の調製は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に記載される。
【００３９】
「共投与」の用語は、少なくとも２つの異なる物質の、十分に近接した時間での、免疫反応を調節する投与を指す。共投与は、少なくとも２つの異なる物質を、任意の順序で、単回投与または個別の投与のいずれかでの、同時投与、ならびに７日まで隔てた時間的に隔てた順序を指す。
【００４０】
「相補的」の用語は、概して、核酸へとハイブリダイズする能力を有することを意味する。かかるハイブリダイゼーションは、相補鎖間の水素結合の結果によるものであり、好ましくはワトソン−クリックまたはフーグスティン（Hoogsteen）塩基対を形成するが、他の様式の水素結合、ならびに塩基のスタッキングもまた、ハイブリダイゼーションへと導くことができる。
【００４１】
「有効量」または「十分量」の用語は、概して、所望の生物学的効果、例えば有益な結果など、を及ぼすに十分な量を指す。そのため、「有効量」または「十分量」は、投与される文脈に依存するであろう。共投与する抗原への免家期反応を調整する組成物を投与する文脈において、ＩＲＯ化合物および抗原の有効量は、抗原が単独で投与されるとき得られる免疫反応と比較して、所望の調節を達成するに十分な量である。有効量は、１つまたは２つ以上の投与においてであってよい。
【００４２】
「組み合わせで」という用語は、概して、患者における疾患または障害を処置する過程で、ＩＲＯ化合物の免疫調節効果を縮小しない、疾患または障害を処置するに有用なＩＲＯ化合物および薬剤を投与することを意味する。かかる組み合わせの処置は、ＩＲＯ化合物および／または独立しての薬剤の単回投与以上を、また、含んでもよい。かかるＩＲＯ化合物および／またはかかる薬剤の投与は、同じまたは異なる経路であってよい。
【００４３】
「個体」または「対象」または「脊椎動物」は、概して、ヒトなどの哺乳類を指す。哺乳類は、概して、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ(cattle)、ウシ(cows)、ブタ、ヒツジ、およびウサギを、限定することなく含む。
【００４４】
「ヌクレオシド」の用語は、該して、糖、通常はリボースまたはデオキシリボース、およびプリンまたはピリミジン塩基からなる化合物を指す。
【００４５】
「ヌクレオチド」という用語は、概して、糖に付着するリン酸基を含むヌクレオシドを指す。
【００４６】
明細書中で用いる、「ピリミジンヌクレオシド」という用語は、かかるヌクレオシドの塩基構成要素がピリミジン塩基（例えば、シトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）など）である、ヌクレオシドを指す。同様に、「プリンヌクレオシド」の用語は、ヌクレオシドの塩基構成要素がプリン塩基（例えば、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））であるヌクレオシドを指す。
【００４７】
「類似体」または「誘導体」という用語は、概して、修飾した塩基および／または糖を有する任意のプリンおよび／またはピリミジンヌクレオチドまたはヌクレオシドを指すことに用いるために、相互的に用いることができる。修飾した塩基は、グアニン、シトシン、アデニン、チミンまたはウラシルでない塩基である。修飾した糖は、リボースまたは２’デオキシリボースでない任意の糖であり、オリゴヌクレオチドに対する骨格において用いることができる。
【００４８】
「阻害する」または「抑制する」という用語は、概して、そうでなければ反応の導出および／または刺激が起こるであろう、反応における反応または量的差異における減少を指す。
「非ヌクレオチドリンカー」という用語は、概して、リン含有結合を介する以外でオリゴヌクレオチドを結合するまたはオリゴヌクレオチドに結合されることができる、任意の結合または部分を指す。好ましくは、かかるリンカーは約２オングストローム〜約２００オングストロームの長さである。
「ヌクレオチド結合」は、概して、リン含有結合を介して、２つのヌクレオシドの３’および５’水酸基に直接接続する、直接の３’−５’結合を指す。
【００４９】
「オリゴヌクレオチドモチーフ」の用語は、ジヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド配列を意味する。「１つまたは２つの修飾がなければ免疫刺激性であるオリゴヌクレオチドモチーフ」は、親オリゴヌクレオチドにおいて免疫刺激性であるが、誘導体オリゴヌクレオチドにおいて免疫刺激性ではなく、かかる誘導体オリゴヌクレオチドはかかる親オリゴヌクレオチドに基づくが、１つまたは２つ以上の修飾を有する、オリゴヌクレオチドモチーフを意味する。
【００５０】
ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊という用語は、免疫刺激性であって、シトシンまたはシトシン類似体およびグアニンまたはグアニン類自体を含む、オリゴヌクレオチドモチーフを指す。
「処置」という用語は、概して、徴候の緩和、または疾患の進行の遅延または改善を含んでもよい、有益なまたは所望の結果を獲得することを意図するアプローチを指す。
【００５１】
第１の側面において、本発明は免疫調節オリゴヌクレオチド（ＩＲＯ）化合物を提供する。「ＩＲＯ」という用語は、１つまたは２つ以上のＴＬＲに対するアンタゴニストである免疫調節オリゴヌクレオチド化合物を指し、かかる化合物はオリゴヌクレオチドモチーフおよび少なくとも１つの修飾を含み、かかるオリゴヌクレオチドモチーフは、かかる化合物が４未満の連続したグアノシンヌクレオチド、好ましくは３未満の連続したグアノシンヌクレオチドを含有するという前提で、オリゴヌクレオチドモチーフの活性を抑制する１つまたは２つ以上の修飾がなければ免疫刺激性（例えば、非メチル化ＣｐＧ）である。かかる修飾は、オリゴヌクレオチドモチーフに隣接する配列内の、および／またはオリゴヌクレオチドモチーフ内の、オリゴヌクレオチド５’末端内であってもよい。これらの修飾の結果、ＴＬＲ調節免疫刺激を抑制するＩＲＯ化合物を生じる。かかる修飾は、ヌクレオチド／オリゴヌクレオシドモチーフに隣接するヌクレオシド、またはオリゴヌクレオチドモチーフ内の塩基、糖残基および／またはリン酸骨格であることができる。
【００５２】
好ましい態様において、かかる修飾が２’アルキル化またはアルコキシ化であるとき、かかる修飾はオリゴヌクレオチドモチーフへの５’隣接ではない；かかる修飾が非帯電のヌクレオシド内結合であるとき、かかる修飾はオリゴヌクレオシドモチーフ５’隣接ではない；および、かかる修飾が３’アルキル化またはアルコキシ化であるとき、かかる修飾はオリゴヌクレオチドモチーフへの５’または３’隣接ではない。
好ましい態様において、かかるＩＲＯ化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００５３】
ＩＲＯ化合物の一般構造は、５’−Ｎｍ−Ｎ３Ｎ２Ｎ１ＣＧＮ１Ｎ２Ｎ３−Ｎｍ−３’で表してもよく、式中ＣＧは免疫刺激性モチーフであり、およびＣはシトシンまたはピリミジンヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチドリンカーであり、およびＧはグアノシン、プリンヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチドリンカーであり；Ｎ１〜Ｎ３は、それぞれの出現において、独立して、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチドリンカーであり；Ｎｍは、それぞれの場合において、独立してヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチドリンカーであり；ただし少なくとも１つのＮ１〜Ｎ３および／またはＣおよび／またはＧはヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチドリンカーであり；さらに、ただし、化合物は４未満の連続したグアノシンヌクレオチド、好ましくは３未満の連続したグアノシンを含有し、式中ＣＧの免疫刺激性活性はヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチドリンカーにより抑制され；および式中ｍは０〜約３０の数である。
【００５４】
本発明のある態様において、その５’−、３’−または２’−末端においてＩＲＯ化合物はヌクレオチド結合、または非ヌクレオチドリンカーにより、または非ヌクレオチドリンカーまたはヌクレオチド結合を介して糖を官能化することによりまたは核酸塩基を官能化することにより、共有結合的に結合する、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含んでもよい。かかるＩＲＯ化合物は、直鎖状であっても分枝状であってもよい。非限定の例として、かかるリンカーは３’−水酸基に付着してもよい。かかる態様において、かかるリンカーは、例えばホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、などのリン酸塩に基づく結合により、または非リン酸塩に基づく結合により３’−水酸基へと付着する、官能基を含む。かかるリボヌクレオチドの共役の可能性のある部位は以下の式Ｉで示され、式中、Ｂは複素環の塩基を表し、Ｐを指す矢印はリンへの任意の付着を示す。
【化１】
2009515823.tif 000003
【００５５】
いくつかの態様において、かかる非ヌクレオチドリンカーは小分子、高分子または生分子であり、ポリペプチド、抗体、脂質、抗原、アレルゲン、およびオリゴ糖を限定なく含む。いくつかの他の態様において、かかる非ヌクレオチドリンカーは小分子である。本発明の例に対して、小分子は１，０００Ｄａ未満の分子量を有する有機質部分である。いくつかの態様において、かかる小分子は７５０Ｄａ未満の分子量を有する。
【００５６】
いくつかの態様において、かかる小分子は脂肪族または芳香族炭化水素であり、そのいずれかは、オリゴリボヌクレオチドに接続するまたはそこへと付加される直鎖における、水酸基、アミノ基、チオール基、チオエーテル基、エーテル基、アミド基、チオアミド基、エステル基、尿素基、またはチオ尿素基を限定することなく含む、１つまたは２つ以上の官能基を含むことができる。かかる小分子は環式または非環式であることができる。小分子リンカーの例は、限定なく、アミノ酸、炭水化物、シクロデキストリン、アダマンタン、コレステロール、ハプテンおよび抗生物質を含む。しかしながら、非ヌクレオチドリンカーを記載する目的に対して、「小分子」の用語はヌクレオシドを含むことを意図しない。
【００５７】
いくつかの態様において、非ヌクレオチドリンカーはアルキルリンカーまたはアミノリンカーである。かかるアルキルリンカーは、分枝または非分枝、環状または非環状、置換または非置換、飽和または非飽和、キラル、アキラルまたはラセミ混合物であってよい。かかるアルキルリンカーは約２〜約１８の炭素原子を有することができる。いくつかの態様において、かかるアルキルリンカーは約３〜約９の炭素原子を有する。いくつかのアルきるリンカーは、水酸基、アミノ基、チオール基、チオエーテル基、エーテル基、アミド基、チオアミド基、エステル基、尿素基、およびチオエーテル基を限定することなく含む、１つまたは２つ以上の官能基を含む。かかるアルキルリンカーは、１，２プロパンジオール、１，２，３プロパントリオール、１，３プロパンジオール、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ポリエチレングリコールリンカー（例えば［−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−］ｎ（ｎ＝１〜９））、メチルリンカー、エチルリンカー、プロピルリンカー、ブチルリンカー、またはヘキシルリンカーを限定することなく含むことができる。いくつかの態様において、かかるアルキルリンカーはペプチドまたはアミノ酸を含んでもよい。
【００５８】
いくつかの態様において、かかる非ヌクレオチドリンカーは、表２で一覧するものを、限定することなく含んでもよい。
【表２】
2009515823.tif 000004
【００５９】
【表３】
2009515823.tif 000005
【００６０】
【表４】
2009515823.tif 000006
【００６１】
【表５】
2009515823.tif 000007
【００６２】
【表６】
2009515823.tif 000008
【００６３】
いくつかの態様において、小分子リンカーは、グリセロールまたは式ＨＯ−（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ２）ｐ−ＯＨで表されるグリセロールホモログであって、式中ｏおよびｐは独立して１〜約６、１〜約４、または１〜約３の整数である。いくつかの他の態様において、かかる小分子リンカーは１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの誘導体である。いくつかのそのような誘導体は、式ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−ＯＨを有し、式中ｍは０〜約１０、０〜約６、２〜約６、２〜約４の整数である。
【００６４】
本発明によるいくつかの非ヌクレオチドリンカーは、２つより多いオリゴヌクレオチドの付着を容認する。例えば、かかる小分子リンカーグリセロールは、オリゴヌクレオチドが共有結合的に付着してもよい３つの水酸基を有する。それゆえ、本発明によるいくつかのＩＲＯは、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーへと結合する２つまたは３つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。かかるＩＲＯは「分枝」であると呼ばれる。
【００６５】
ＩＲＯ化合物は、静電相互作用、疎水的相互作用、π−スタッキング相互作用、水素結合およびその組み合わせなどの、非共有結合的に結合した少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含んでもよい。かかる非共有結合性結合の非限定の例は、ワトソン−クリック塩基対合、フーグスティン塩基対合および塩基のスタッキングを含む。
【００６６】
２つまたは３つ以上のオリゴヌクレオチドが結合することができる方法のいくつかを、表３に示す。
【表７】
2009515823.tif 000009
【００６７】
ある態様において、本発明による組成物および方法において用いられる免疫調節オリゴヌクレオチドにおけるピリミジンヌクレオシドは、構造（ＩＩ）を有する：
【化２】
2009515823.tif 000010
式中：
Ｄは水素結合供与体であり；
Ｄ’は水素、水素結合供与体、水素結合受容体、親水基、疎水基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択され；
Ａは水素結合受容体または親水基であり；
Ａ’は水素結合受容体、親水基、疎水基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択され；
Ｘは炭素または窒素であり；および、
Ｓ’は五単糖環または六単糖環、または糖類似体である。
【００６８】
ある態様において、糖環は、リン酸塩部分、修飾リン酸塩部分、またはピリミジンヌクレオシドのもう１つのヌクレオシドまたはヌクレオシド誘導体へと結合させるのに好適な他のリンカー部分とともに誘導体化される。
【００６９】
いくつかの態様において、水素結合供与体は、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−ＯＨを限定なく含む。好ましい水素結合受容体は、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、および芳香族複素環の環窒素原子、例えば、シトシンのＮ３など、を限定なく含む。
【００７０】
いくつかの態様において、（ＩＩ）はピリミジンヌクレオシド誘導体である。ピリミジンヌクレオシド誘導体の例は、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシン、またはＮ４−エチルシトシン、アラＣ、５−ＯＨ−ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ−ｄＣ、および４−チオウラシルを限定なく含む。化学的修飾誘導体は、また、チミンまたはウラシル類自体を、限定なく含む。いくつかの態様において、（ＩＩ）における糖部分Ｓ’は、糖誘導体である。適合した糖誘導体は、トレハロースまたはトレハロース誘導体、ヘキソースまたはヘキソース誘導体、アラビノースまたはアラビノース誘導体を、限定なく含む。
【００７１】
いくつかの態様において、本発明による組成物および方法において用いられる免疫調節オリゴヌクレオチドにおけるプリンヌクレオシドは、構造（ＩＩＩ）を有する：
【化３】
2009515823.tif 000011
式中：
Ｄは水素結合供与体であり；
Ｄ’は水素、水素結合供与体、および親水基からなる群から選択され；
Ａは水素結合受容体または親水基であり；
Ｘは炭素または窒素であり；
ＬのそれぞれはＣ、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択され；および、
Ｓ’は五単糖環または六単糖環、あるいは糖類似体である。
【００７２】
ある態様において、糖環は、リン酸塩部分、修飾リン酸塩部分、またはピリミジンヌクレオシドをもう１つのヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体へと結合させるのに好適な他のリンカー部分とともに誘導体化される。
【００７３】
ある態様において、水素結合供与体は、限定なく、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−ＯＨを含む。ある態様において、水素結合受容体は、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、−ＮＯ２および芳香族複素環の環窒素原子、例えばグアニンのＮ１、を限定なく含む。
【００７４】
いくつかの態様において、（ＩＩＩ）はプリンヌクレオシド誘導体である。プリンヌクレオシド誘導体の例は、グアノシン類似体、例えば、７−デアザ−Ｇ、７−デアザ−ｄＧ、アラ−Ｇ、６−チオーＧ、イノシン、イソ−Ｇ、ロキソリビン、ＴＯＧ（７−チオ−８−オキソ）−Ｇ、８−ブロモ−Ｇ、８−ヒドロキシ−Ｇ、５−アミノホルマイシン  Ｂ、オキソホルマイシン、７−メチル−Ｇ、９−ｐ−クロロフェニル−８−アザ−Ｇ、９−フェニル−Ｇ、９−ヘキシル−グアニン、７−デアザ−９−ベンジル−Ｇ、６−クロロ−７−デアザグアニン、６−メトキシ−７−デアザグアニン、８−アザ−７−デアザ−Ｇ（ＰＰＧ）、２−（ジメチルアミノ）グアノシン、７−メチル−６−チオグアノシン、８−ベンジルオキシグアノシン、９−デアザグアノシン、１−（Ｂ−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンなどを限定なく含む。化学的修飾誘導体は、また、アデニン類似体、例えば９−ベンジル−８−ヒドロキシ−２−（２−メトキシエトキシ）アデニン、２−アミノ−Ｎ２−Ｏ−、メチルアデノシン、８−アザ−７−デアザ−Ａ、７−デアザ−Ａ、ビダラビン、２−アミノアデノシン、Ｎ１−メチルアデノシン、８−アザアデノシン、５−ヨードツベルシジン、およびＮ１−Ｍｅ−ｄＧを限定なく含む。いくつかの態様において、（ＩＩＩ）における糖部分Ｓ’は、式ＩＩで定義される糖誘導体である。
【００７５】
本発明のある態様において、免疫調節核酸は、少なくとも１つのＢ−Ｌ−デオキシ  ヌクレオシドまたは３’−デオキシヌクレオシドを含有する核酸配列を含む。
【００７６】
本発明のある態様において、かかる免疫調節オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊から選択された少なくとも１つのジヌクレオチドを含有する核酸を含み、式中、Ｃはシトシンまたは２’−デオキシシチジン、Ｇはグアノシンまたは２’−デオキシグアノシン、Ｃ＊は２’−デオキシチミジン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル））−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリン、２’−ジデオキシ−５−ハロシトシン、２’−ジデオキシ−５−ニトロシトシン、アラビノシチジン、２’−デオキシ−２’−置換アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジン、または他のピリミジンヌクレオシド類似体あり、Ｇ＊は２’−デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシ−２’置換−アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換−アラビノグアノシン、２’−デオキシイノシン、または他のプリンヌクレオシド類似体であり、およびｐはホスホジエステル、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエートからなる群から選択されたヌクレオシド内結合であり、そこにおいて少なくとも１つのジヌクレオチドの活性は隣接配列により調整される。
【００７７】
本研究において用いられるこれらの一般構造内の特異的なＩＲＯの配列は、表４において示されるものを、限定なく含む。
【表８】
2009515823.tif 000012
【００７８】
【表９】
2009515823.tif 000013
【００７９】
【表１０】
2009515823.tif 000014
【００８０】
【表１１】
2009515823.tif 000015
太字のＧ、ＡまたはＵ＝２’−ＯＭｅ；太字のＴ＝３’−ＯＭｅ；Ａ１＝３’−ＯＭｅ；Ｇ１＝７−デアザ−ｄＧ；ｍ＝Ｐ−Ｍｅ；Ａ２、Ｔ２、Ｃ２、およびＧ２＝Β−Ｌ−デオキシヌクレオシド；Ｘ１＝脱塩基；Ｘ２＝グリセロールリンカー、Ｘ３＝Ｃ３−リンカー；Ｃ３およびＧ３＝３’−デオキシ−ヌクレオシド；Ｇ４＝アラＧ；Ｃ４＝アラＣ；Ｃ５＝５−ＯＨ−ｄＣ；Ｃ６＝１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリン；Ｇ５＝Ｎ１−Ｍｅ−ｄＧ；Ｃ７＝Ｎ３−Ｍｅ−ｄＣ；Ｕ１＝３’−ＯＭｅ；Ｕ２＝ｄＵ
【００８１】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドはそれぞれ、約６〜約３５のヌクレオシド残基、好ましくは約９〜約３０のヌクレオシド残基、より好ましくは約１１〜約２３のヌクレオシド残基を有する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、約６〜約１８を有する。
第２の側面において、本発明は、本発明によるＩＲＯ化合物を含む製剤処方および生理学的に許容し得る担体を提供する。
第３の側面において、本発明は、脊椎動物における免疫反応のＴＬＲ媒介誘導を阻害するまたは抑制するための方法を提供し、かかる方法は脊椎動物に本発明によるＩＲＯ化合物を投与することを含む。いくつかの態様において、かかる脊椎動物は、哺乳類である。好ましい態様において、ＩＲＯ化合物を免疫抑制の必要のある脊椎動物に投与する。
【００８２】
本発明の側面に従って、ＩＲＯ化合物はさらなるＴＬＲリガンドまたはＴＬＲアゴニストに対するＴＬＲに基づく免形反応を抑制することができる。下の例でさらに論じるように、ＴＬＲアゴニストまたはＴＬＲリガンド（例えば、免疫調節オリゴヌクレオチド）によるＴＬＲに基づく免疫反応の活性化は、ＩＲＯ化合物の同時投与、前投与または後投与により抑制／阻害することができ、かかる抑制／阻害は、投与後延長された期間（例えば、数日）の間、維持されうる。本発明のこの有益な性質は、疾患または障害の予防および／または処置に対し独自の利点を有する。疾患を処置する過程での所定のＴＬＲアゴニストの適用により、ＩＲＯ化合物が抑制／阻害できる、不要な免疫刺激を引き起こし得る。ＴＬＲアゴニストの同時投与、前投与および／または後投与でのＩＲＯ化合物の投与により、ＴＬＲアゴニストからの治療的利益を可能とし、一方、不要な副作用を抑制／阻害する。さらに、ＩＲＯの後投与により、引き続くまたは後のＴＬＲアゴニストによる付加に対する免疫反応（例えば、アレルギー反応）を予防しうる。
【００８３】
本発明の本側面による方法において、ＩＲＯ化合物の投与は、任意の適合する経路によることが可能であり、非経口、粘膜投与、経口、舌下、経皮、局所、吸入、経鼻、エアロゾル、眼球内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃により、皮膚パッチまたは点眼薬またはうがい薬の形態において限定なく含む。ＩＲＯ化合物の治療組成物の投与を、疾患の徴候または代理マーカーを低下させるのに有効な用量および期間において、公知の手順を用いて実行することができる。全身的に投与する場合、かかる治療組成物は、好ましくは約０．０００１μＭ〜約１０μＭのＩＲＯ化合物の血中レベルを達成するに十分な用量で投与される。局所投与の場合、これよりもさらに低濃度が有効であり得、そしてさらに高濃度を耐容し得る。好ましくは、ＩＲＯ化合物の総投与量は、患者１日あたり約０．００１ｍｇ〜キロ体重あたり１日約２００ｍｇの範囲にわたる。治療的有効量の１つまたは２つ以上の本発明のよる治療組成物を単一の処置エピソードとしての個体へと同時に、または順に投与することが望ましいだろう。
【００８４】
ＩＲＯ化合物は１つまたは２つ以上のアレルゲンおよび／または抗原（自己または異種）、免疫原性タンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、コレラ毒素Ｂサブユニット、または任意の他の免疫原性担体タンパク質へと任意に結合する。ＩＲＯは、ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＴＬＲ２アゴニストおよびＴＬＲ９アゴニスト）、フロイント不完全アジュバント、ＫＬＨ、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ミョウバン、ならびにＱＳ−２１およびイミキモドを含むサポニン、またはそれらの組み合わせを限定なく含む、他の化合物（例えばアジュバント）と組み合わせて用いることができる。
【００８５】
本発明の本側面による方法は、免疫系のモデル調査に対し有用である。かかる方法は、また、ヒトまたは動物の疾患の予防的または治療的処置に対して有用である。例えば、小児学的および獣医学的ワクチン適用に対して有用である。
第４の側面のおいて、本発明は疾患または障害を有する患者を治療的に処置するための方法を提供し、かかる方法は患者に本発明によるＩＲＯ化合物を投与することを含む。さまざまな態様において、処置される疾患または障害は癌、自己免疫性疾患、感染症、気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、ぜんそく、または病原体により引き起こされる疾患である。病原体は、細菌、寄生虫、菌類、ウイルス、ウイロイド、およびプリオンを含む。投与は本発明の第３の側面に対して記載したように実行する。
【００８６】
第５の側面において、本発明は疾患または障害を予防するための方法を提供し、かかる方法は本発明によるＩＲＯ化合物を患者に投与することを含む。さまざまな態様において、予防される疾患または障害は癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、感染症、アレルギー、ぜんそく、または病原体により引き起こされる疾患である。病原体は細菌、寄生虫、菌類、ウイルス、ウイロイド、およびプリオンを含む。投与は本発明の第３の側面に対して記載したように実行される。
【００８７】
本発明の本側面による任意の方法において、かかるＩＲＯ化合物はＩＲＯ化合物の免疫調節効果を縮小しない疾患または状態を処置するために有用な任意の他の薬剤と組み合わせて投与することができる。本発明による任意の方法において、疾患または状態を処置するために有用な薬剤は、１つまたは２つ以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性物質、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲアンタゴニスト、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチンおよび／または免疫反応の特異性または強度を増強するアジュバント、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチドおよび修飾アミノ酸を含むペプチドを限定なく含む。例えば、癌の処置において、かかるＩＲＯ化合物は、１つまたは２つ以上の化学療法化合物、標的療法薬剤および／またはモノクローナル抗体と組み合わせて投与されてもよい。代わりに、かかる薬剤は、抗原またはアレルゲンをコード化するＤＮＡベクターを含むことができる。これらの態様において、本発明によるＩＲＯ化合物はアジュバントとして多様に作用することができる、および／または直接の免疫調節効果を作り出すことができる。
【００８８】
以下の例は本発明による所定の例示的な態様をさらに記載することを意図し、本発明の範囲を限定することを意図しない。例えば、代表的なＴＬＲリガンドが以下の例に示されるが、本発明のＩＲＯがアンタゴニストとして作用するリガンドの範囲を限定を限定しない。
【００８９】
例１
免疫調節部分を含有するオリゴヌクレオチドの合成
全てのＩＲＯは標準的な手順に従って合成された（例えば、米国特許公報第20040097719号を参照のこと）。
【００９０】
オリゴヌクレオチドは、標準的な線形合成または平行合成手順に従って、自動化ＤＮＡ合成器(Expedite 8909; PerSeptive Biosystems, Framingham, Mass.)を用いて、１μＭスケールで合成された。
【００９１】
デオキシリボヌクレオシドホスホアミダイトは、(Aldrich-Sigma, St Louis, Mo)より得た。１’，２’−ジデオキシリボースホスホアミダイト、プロピル−１−ホスホアミダイト、２−デオキシウリジンホスホアミダイト、１，３−ビス−［５−（４，４’−ジメトキシトリチル）ペンチルアミジル］−２−プロパノールホスホアミダイトおよびメチルホスホンアミダイトは、Glen Research (Sterling, Va.)より得た。ベータ−Ｌ−２’−デオキシリボヌクレオシドホスホアミダイト、アルファ−２’−デオキシリボヌクレオシドホスホアミダイト、モノ−ＤＭＴ−グリセロールホスホアミダイトおよびジ−ＤＭＴ−グリセロールホスホアミダイトは、ChemGenes (Willmington, Mass.)より得た。（４−アミノブチル）−１，３−プロパンジオールホスホアミダイトはClontech (Palo Alto, Calif.)より得た。アラビノシチジンホスホアミダイト、アラビノグアノシン、アラビノチミジンおよびアラビノウリジンは、Reliable Pharmaceutical (St. Louis, Mo.)より得た。アラビノグアノシンホスホアミダイト、アラビノチミジンホスホアミダイトおよびアラビノウリジンホスホアミダイトは、Idera Pharmaceuticals, Inc. (Cambridge, Mass.)において合成した(Noronha et al. (2000) Biochem., 39:7050-7062)。
【００９２】
全てのヌクレオシドホスホアミダイトは、３１Ｐおよび１Ｈ  ＮＭＲスペクトルにより特徴付けた。修飾ヌクレオシドが特定の部位に、通常の結合周期を用いて導入された。合成後、オリゴヌクレオチドは濃縮水酸化アンモニウムを用いて脱保護され、そして逆相ＨＰＬＣを用いて精製され、次いで透析された。ナトリウム塩の形態の精製オリゴヌクレオチドは使用に先立って凍結乾燥された。純度をＣＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより試験した。
【００９３】
例２
ＴＬＲ刺激の阻害
ＴＬＲを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞(Invivogen)を、レポーター遺伝子、Ｓｅａｐ、(Invivogen)で６時間、一過的に形質導入した。細胞を０．５μｇ／ｍｌの5’-CTATCTGACGTTCTCTGT-3’（マウスＣｐＧ配列；ＩＭＯ／配列番号１；：０用量）単独および多様な濃度のＩＲＯ５または６で、１８時間処置した。ＴＬＲ９依存性レポーター遺伝子発現は、製造者のプロトコール(Invivogen)に従って決定され、結果をＴＬＲ９刺激オリゴヌクレオチド（１００％）の％活性で表現する。結果を図１に示す。これらの結果により、ＩＲＯ５がＩＭＯのＴＬＲ９アゴニスト活性を阻害することが実証される。
【００９４】
例３
ＩＲＯ特異的阻害ＴＬＲ９刺激
ＴＬＲ９またはＴＬＲ３を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞(Invitrogen)をレポーター遺伝子、Ｓｅａｐ、(Invitrogen)で６時間、一過的に形質導入した。細胞を０．５ｍｇ／ｍｏｌのＩＭＯ１（０．５μｇ／ｍｌ）、ＩＲＯ５（２．０μｍｇ／ｍｌ）、Ｒ８４８（５．０μｇ／ｍｌ）、またはポリ（Ｉ）．ポリ（Ｃ）（０．５μｇ／ｍｌ）およびＩＭＯ＋ＩＲＯ、Ｒ８４８＋ＩＲＯ、またはポリ（Ｉ）．ポリ（Ｃ）＋ＩＲＯの組み合わせで１８時間処置した。ＴＬＲ９またはＴＬＲ３依存性レポーター遺伝子発現は、製造者のプロトコール(Invitrogen)に従って決定され、結果をＮＦ−ｋＢ活性における倍加変化(fold change)として表現された。結果を図２に示す。これらの結果により、ＩＲＯ５はＴＬＲ９アゴニストの活性を阻害するが、ＴＬＲ３のアゴニストではなく、そしてより一般的にはＩＲＯのものは選択的にＴＬＲ活性化を阻害することが実証される。
【００９５】
例４
ＩＲＯによる用量依存性の阻害
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、左腋下に０．２５ｍｇ／ｋｇの刺激性5’-TCTGACG1TTCT-X-TCTTG1CAGTCT-3’（ＩＭＯ／配列番号３：G1=７−デアザＧ、X=グリセロール）を、および右腋下に異なる用量のＩＲＯ５を皮下注射（s.c.）した。刺激性ＩＭＯ３注射の２時間後に血清試料を採取し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１２レベルを決定した。結果を図３に示す。これらの結果により、ＩＲＯによる用量依存性の阻害が実証される。
【００９６】
例５
ＩＲＯによる時間依存性の阻害
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、左腋下に０．２５ｍｇ／ｋｇの刺激性ＩＭＯ３を、および刺激性ＩＭＯの１時間前（−１ｈ）または同時（０ｈ）のいずれかに右腋下に１ｍｇ／ｋｇのＩＲＯ５または５’−ＣＴＡＴＣＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣＴＧＴ−５’（非ＣｐＧ非刺激性対照：オリゴ／配列番号４）を皮下注射した。刺激性ＩＭＯ注射の２時間後に血清試料を採取し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１２レベルを決定した。図４Ａにおける結果により、刺激性ＩＭＯの１時間前（−１ｈ）または同時（０ｈ）のいずれかに、ＩＲＯ５または（オリゴ４）の投与後の血清ＩＬ−１２のレベルにおける低下が実証される。
【００９７】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、左腋下に０．２５ｍｇ／ｋｇ刺激性ＩＭＯ３を皮下注射し、および刺激性ＩＭＯと同時（０ｈ）に１０ｍｇ／ｋｇＩＲＯ１０２を経鼻投与した。刺激性ＩＭＯ注射の２時間後に血清試料を採取し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１２レベルを決定した。図４Ｂにおける結果により、ＩＭＯの皮下投与と同時のＩＲＯ１０２の経鼻投与後の血清ＩＬ−１２レベルにおける低下が実証される。
【００９８】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、左腋下に０．２５ｍｇ／ｋｇの刺激性ＩＭＯ３を、および刺激性ＩＭＯ（０ｈ）の１時間前（−１ｈ）、２４時間前（−２４）または７２時間前（−７２）のいずれかに右腋下に２ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの刺激性ＩＲＯ１７、９９、１０２を皮下注射した。刺激性ＩＭＯ注射の２時間後に血清試料を採取し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１２レベルを決定した。結果を図４Ｃ〜Ｄに示す。これらの結果により、ＩＲＯの前投与および同時投与によりＴＬＲ９のアゴニストを阻害できること、およびより一般的には、ＩＲＯのものはＴＬＲ活性化を阻害できることが実証される。
【００９９】
例６
ＴＬＲ９刺激の阻害
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、左腋下に０．２５ｍｇ／ｋｇの刺激性ＩＭＯを、および刺激性ＩＭＯの１時間前（−１ｈ）または同時（０ｈ）に右腋下に１ｍｇ／ｋｇのＩＲＯ２１または対照オリゴ４を皮下注射した。刺激性ＩＭＯ注射の２時間後に血清試料を採取し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１２レベルを決定した。結果を図５Ａおよび５Ｂに示す。これらの結果により、その５’末端に結合するＣｐＧオリゴヌクレオチドが阻害性を示し、より一般的には、その５’末端に結合する免疫刺激性ＣｐＧオリゴヌクレオチドがＴＬＲ活性化を阻害できることが実証される。
【０１００】
例７
ヒト細胞培養におけるＴＬＲ９の阻害
ヒトｐＤＣおよびＰＢＭＣを１０ｕｇの５’−ＣＴＡＴＣＴＧＴＣＧＴＴＣＴＣＴＧＴ−３’（ヒトＣｐＧ配列：ＩＭＯ／配列番号２）および４０ｕｇのＩＲＯ１０で、２４時間培養した。結果を図６に示す。これらの結果により、ＩＲＯがヒト培養細胞においてＴＬＲ９アゴニスト活性を阻害すること、より一般的にはＩＲＯがヒト細胞におけるＴＬＲを阻害できることが実証される。
【０１０１】
例８
ＯＶＡにより誘発されるＴｈ２免疫反応におけるＩＲＯ効果
結果を図７に示す。これらの結果により、ＩＲＯはオボアルブミン（「ＯＶＡ」）誘発Ｔｈ２免疫反応への効果を有しないが、一方、ＩＭＯ化合物はＯＶＡ誘発Ｔｈ２反応を低下させ、Ｔｈ１サイトカインの産生を引き起こすことが実証される。
【０１０２】
例９
Ｔｈ１およびＴｈ２免疫反応へのＩＭＯ効果のＩＲＯ阻害
結果を図８に示す。これらの結果により、ＩＲＯがＴｈ２阻害性を逆転化し、ＩＭＯにより誘発されるＴｈ１免疫反応を阻害できることが実証される。
【０１０３】
例１０
ＩＭＯおよびＩＲＯに対する抗体反応
マウスを、ｗｋ０およびｗｋ２においてＩＭＯおよびＩＲＯ５または６ならびにその組み合わせの存在下および不存在において、ＨＢｓＡｇで免疫化した。結果は図９に示され、ＩＭＯ誘発性ＩｇＧ２Ａ免疫反応でのＩＲＯによる低下が実証される。
【０１０４】
例１１
免疫刺激性オリゴヌクレオチドの阻害
ＴＬＲ９を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞(Invivogen)を、レポーター遺伝子、Ｓｅａｐ、(Invivogen)で６時間、一過性に形質導入した。細胞を０．２５μｇ／ｍｌ単独（ＩＭＯ１；０用量）および様々な濃度のＩＲＯで、１８時間処置した。ＴＬＲ９依存性レポーター遺伝子発現は、製造者のプロトコール(Invivogen)に従って決定され、結果を免疫刺激性オリゴヌクレオチド活性の％阻害で表現する。結果を以下の図５および６に示す。かかる結果により、ＩＲＯがＩＭＯの活性を阻害することが実証される。
【０１０５】
【表１２】
2009515823.tif 000016
様々な修飾を含有するＩＲＯは、ＴＬＲ９を発現するＨＥＫ２９３細胞におけるＩＭＯのＮＦ−κＢ活性化を阻害し、より一般的には、様々な修飾を含有するＩＲＯはＩＭＯのＮＦ−κＢの活性化を阻害することができる。
【０１０６】
【表１３】
2009515823.tif 000017
様々な修飾を含有するＩＲＯは、ＴＬＲ９を発現するＨＥＫ２９３細胞におけるＩＭＯのＮＦ−κＢ活性化を阻害し、より一般的には、様々な修飾を含有するＩＲＯはＩＭＯのＮＦ−κＢ活性化を阻害することができる。
【０１０７】
例１２
ＩＲＯによる時間依存性の阻害
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、左腋下に０．２５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇのＴＬＲアゴニストを、ＴＬＲアゴニストの１時間前（−１ｈ）〜４８時間前（−４８ｈ）または同時（ｏｈ）に右腋下に１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇのＩＲＯ５、１７、または３７あるいは５’−ＴＣＣＴＧＧＣＧＧＧＧＡＡＧＴ−３’（ポリｄＧ対照；オリゴ配列番号４９）を、皮下注射した。刺激性ＩＭＯ注射の２時間後に血清試料を採取し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１２レベルを決定した。結果を以下の表７〜２２に示す。これらの結果により、ＩＲＯの前投与および同時投与の両方により、ＴＬＲ９のアゴニストを阻害すること、およびＩＲＯの阻害活性はＩＭＯ投与４８時間前に投与するときでさえも有効であることが実証される。より一般的には、これらの結果により、ＩＬＲの前投与および同時投与によりＴＬＲアゴニストを阻害できること、およびＩＲＯの阻害活性がＴＬＲアゴニストの投与の何時間も前に投与されるときでさえも見られることが実証される。
【０１０８】
【表１４】
2009515823.tif 000018
ＩＲＯ５は、ＩＲＯ投与後６時間以内に注射されるとき、ＩＭＯ誘発性ＩＬ−１２産生を阻害した。より一般的には、これらの結果により、ＩＭＯが存在するときまたはＩＲＯ投与の数時間後に最初に存在するようになるとき、ＩＲＯがＴＬＲ活性化およびＩＭＯ誘発性ＩＬ−１２産生を阻害できるということが実証される。
【０１０９】
【表１５】
2009515823.tif 000019
ＩＲＯ５は、ＩＲＯ投与後６時間以内に注射されるとき、ＩＭＯ誘発性ＩＬ−１２産生を強力に阻害した。より一般的には、これらの結果により、ＩＭＯが投与されるとき、またはＩＲＯ投与の数時間後に最初に存在するようになるとき、ＩＲＯがＴＬＲ活性化およびＩＭＯ誘発性ＩＬ−１２産生を実質的に阻害することが実証される。
【０１１０】
【表１６】
2009515823.tif 000020
ＩＲＯ５は、ＩＲＯ投与後４８時間以内に注射されるとき、ＩＭＯ誘発性ＩＬ−１２産生を強力に阻害した。より一般的には、これらの結果により、ＩＭＯが投与されるとき、またはＩＲＯ投与の数時間後に最初に存在するようになるとき、ＩＲＯがＴＬＲ活性化およびＩＭＯ誘発性ＩＬ−１２産生を実質的に阻害できることが実証される。
【０１１１】
【表１７】
2009515823.tif 000021
ＩＲＯ１７は、ＩＲＯ投与６時間以上後に注射されるとき、ＩＭＯ誘発性ＩＬ−１２産生を阻害した。より一般的には、これらの結果により、ＩＭＯが投与されるとき、またはＩＲＯ投与の数時間後に最初に存在するようになるとき、ＩＲＯがＴＬＲ活性化およびＩＭＯ誘発性ＩＬ−１２産生を阻害できることが実証される。
【０１１２】
【表１８】
2009515823.tif 000022
ＩＲＯ３７は、ＩＲＯ投与後３時間以内に注射されるとき、ＩＭＯ誘発性ＩＬ−１２産生を阻害した。より一般的には、これらの結果により、ＩＭＯが投与されるとき、またはＩＲＯ投与の数時間後に最初に存在するようになるとき、ＩＲＯがＴＬＲ活性化およびＩＭＯ誘発性ＩＬ−１２産生を阻害できることが実証される。
【０１１３】
【表１９】
2009515823.tif 000023
ＴＬＲ９アンタゴニスト活性を示すことが知られているポリｄＧ化合物は、ＩＲＯ投与後６時間以内に注射されるとき、ＩＭＯ誘発性ＩＬ−１２産生を阻害した。ＩＲＯに対するデータ（例えば、表７におけるＩＲＯ５）と比較し、対照ポリｄＧオリゴアンタゴニストの効果は短期間であり、そして一過性である。
【０１１４】
【表２０】
2009515823.tif 000024
ＴＬＲ９アンタゴニスト活性を示すことが知られているポリｄＧ化合物は、ＩＲＯ投与後６時間以内に注射されるとき、ＩＭＯ誘発性ＩＬ−１２産生を阻害した。ＩＲＯに対するデータ（例えば、表７におけるＩＲＯ５）と比較し、対照ポリｄＧオリゴアンタゴニストの効果は短期間であり、そして一過性である。
【０１１５】
【表２１】
2009515823.tif 000025
ＩＲＯ５は、ＩＲＯ投与後１時間以内に注射されるとき、Ｒ８４８誘発性ＩＬ−１２産生の低度の一過性の阻害を示す。より一般的には、これらのデータにより、ＩＲＯは細胞内ＴＬＲの活性を阻害できることが実証される。
【０１１６】
【表２２】
2009515823.tif 000026
ＩＲＯ５は、ＩＲＯ投与後１時間以内に注射されるとき、ポリＩ．ポリＣ誘発性ＩＬ−１２産生の低度の一過性の阻害を示す。より一般的には、これらのデータにより、ＩＲＯはＴＬＲ活性化およびポリＩ．ポリＣ誘発性Ｉｌ−１２産生を阻害できることが実証される。
【０１１７】
【表２３】
2009515823.tif 000027
ＩＲＯ５は、ＩＲＯ投与後１時間以内に注射されるとき、ＩＭＯ誘発性ＭＣＰ−１産生の強力な阻害を示す。より一般的には、これらのデータにより、ＩＲＯはＴＬＲ活性化およびＩＭＯ誘発性ＭＣＰ−１産生を阻害できることが実証される。
【０１１８】
【表２４】
2009515823.tif 000028
ＩＲＯは、ＩＲＯ投与後１時間以内に注射されるとき、Ｒ８４８誘発性ＭＣＰ−１産生の低度の一過性の阻害を示す。より一般的には、これらのデータにより、ＩＲＯがＴＬＲ活性化および細胞内ＴＬＲを介するＭＣＰ−１産生を阻害できることが実証される。
【０１１９】
【表２５】
2009515823.tif 000029
ＩＲＯ５は、ＩＲＯ投与の１時間後以内に注射されるとき、ポリＩ．ポリＣ誘発性ＭＣＰ−１産生の低度の一過性の阻害を示す。より一般的には、これらのデータにより、ＩＲＯがＴＬＲの活性化およびポリＩ．ポリＣのＭＣＰ−１産生を阻害できることが実証される。
【０１２０】
【表２６】
2009515823.tif 000030
ＩＲＯ５は、ＩＲＯ投与後７日以内に注射されるとき、ＩＭＯ誘発性ＩＬ−１２産生の強力な阻害を示す。より一般的には、これらのデータにより、ＩＲＯは哺乳類におけるＴＬＲ活性化およびＩＭＯ誘発性ＩＬ−１２産生を阻害できることが実証される。
【０１２１】
【表２７】
2009515823.tif 000031
ＩＲＯ５は、ＩＲＯ投与後７２時間以内に注射されるとき、ＩＭＯ誘発性ＩＬ−１２産生の強力な阻害を示す。より一般的には、これらのデータにより、ＩＲＯは、ＩＲＯが投与された数時間後に、哺乳類において、ＴＬＲ活性化およびＩＭＯ誘発性ＩＬ−１２産生を阻害できることが実証される。
【０１２２】
【表２８】
2009515823.tif 000032
ＩＲＯ５は、ＩＲＯ投与後７２時間以内に注射されるとき、Ｒ８４８誘発性ＩＬ−１２産生の阻害を示す。より一般的には、これらのデータにより、ＩＲＯは、ＩＲＯが投与された数時間後に、哺乳類において、細胞内ＴＬＲのアゴニストの活性およびＴＬＲアゴニスト誘発性ＩＬ−１２産生を阻害できることが実証される。
【０１２３】
【表２９】
2009515823.tif 000033
ＩＲＯ５は、ＩＲＯ投与後７２時間以内に注射されるとき、ポリＩ．ポリＣ誘発性ＩＬ−１２産生の阻害を示さない。
【０１２４】
例１３
ＴＬＲアゴニストに対するＩＲＯの短期および長期遮断活性
ＩＲＯ化合物の短期活性および選択性を評価するために、左側腹部へのＴＬＲアゴニストの皮下投与１時間前（−１ｈ）に、マウスに、右側腹部に２ｍｇ／ｋｇのＩＲＯを皮下注射した。血清試料をＴＬＲアゴニスト投与後２時間で採取し、Biosource (Camarill, CA)より得た複数のサイトカイン／ケモカインを検出するLuminexキットを用いて解析した。サイトカイン／ケモカイン値をLuminex 100機器上で決定された標準曲線に当てはめた平均値から決定した。Luminex解析は、STarStationソフトフェア(Applied Cytometry Systems, Sacramento, CA)を用いて実施した。以下の代表的なアゴニストを指示する用量で用いた：５’−ＴＣＴＧＡＣＧ１ＴＴＣＴ−Ｘ−ＴＣＴＴＧ１ＣＡＧＴＣＴ−５’（ＴＬＲ９アゴニスト；０．２５ｍｇ／ｋｇ、Ｇ１＝７−デアザ−ｄＧ）、Ｒ８４８（ＴＬＲ７／８アゴニスト、０．１ｍｇ／ｋｇ）、ロキソリビン（ＴＬＲ７アゴニスト、１００ｍｇ／ｋｇ）、Flagellin（ＴＬＲ５アゴニスト、０．２５ｍｇ／ｋｇ）、ＬＰＳ（ＴＬＲ４アゴニスト、０．２５ｍｇ／ｋｇ）、ポリＩ．ポリＣ（ＴＬＲ３アゴニスト、２０ｍｇ／ｋｇ）、およびＭＡＬＰ−２（ＴＬＲ２アゴニスト、０．５ｍｇ／ｋｇ）。かかる結果を図１０〜１２に示す。これらの結果により、ＩＲＯが、ＴＬＲアゴニストに対する反応において、サイトカイン／ケモカイン産生を阻害できることが実証される。かかる効果は、細胞外ＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ５）と比較して、細胞内ＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９）に対しては、より大きい。
【０１２５】
ＩＲＯ化合物の長期活性および選択性を評価するために、ＴＬＲアゴニスト（上記のように）を左腹側に皮下投与する７２時間前（−７２ｈ）に、１０ｍｇ／ｋｇのＩＲＯを右腹側に皮下注射した。血清試料をＴＬＲアゴニストの投与２時間後に採取し、上記のように解析した。結果を図１３〜１５に示す。これらの結果により、ＩＲＯの前投与によりＴＬＲアゴニストを阻害できること、およびＩＲＯの阻害活性はアゴニストの投与７２時間前に投与されるときでさえ有効であることが実証される。
【０１２６】
例１４
ループスマウスモデルにおけるＩＲ化合物の活性
野生型（ＢＡＬＢ／ｃ）およびループスプローン(lupus prone)（ＭＲＬ−ｌｐｒ）マウスからの精製したマウス脾臓Ｂ細胞を、０．３ｍｇ／ｍｌのＩＭＯ存在下または非存在の１ｍｇ／ｍｌのＩＲＯ−１７、あるいは０．３ｍｇ／ｍｌのＩＭＯまたは媒体単独で７２時間培養した。結果を図１６に示す。これらの結果により、ＩＲＯの投与によりＢリンパ球増殖を阻害できることが実証される。
【０１２７】
野生型（ＢＡＬＢ／ｃ）およびループスプローン（ＭＲＬ−ｌｐｒ）マウスからの精製したマウス脾臓Ｂ細胞を、０．３ｍｇ／ｍｌのＩＭＯ存在下または非存在の１ｍｇ／ｍｌのＩＲＯ−１７、あるいは０．３ｍｇ／ｍｌのＩＭＯまたは媒体単独で７２時間培養した。結果を図１７Ａに示す。これらの結果により、ＩＲＯの投与によりマウスＢリンパ球によるＩＬ−６産生を阻害できることが実証される。野生型（ＢＡＬＢ／ｃ）およびループスプローン（ＮＺＢＷ）マウスからの精製マウス脾臓Ｂ細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＩＭＯの存在下の０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌのＩＲＯ−１７で、または１０ｍｇ／ｍｌのＩＲＯ−１７、１ｍｇ／ｍｌのＩＭＯまたは媒体単独で、７２時間培養した。結果を図１７Ｂおよび１７Ｃに示す。これらの結果により、ＩＲＯが、マウス脾臓細胞によりＩＬ−６およびＩＬ−１２産生を阻害できることが実証される。
【０１２８】
ループスプローンＭＲＬ−ｌｐｒマウスに、１００μｇの用量のＩＲＯ−５を第９〜１８週、および第２１〜２３週に１週間に１度、またはＩＲＯ−１７を第１０〜１５週に開始して、第１８〜２１週には１００μｇで週あたり３度、および第２２〜２４週には４０ｍｇで週あたり３度、皮下注射した。血液および尿を、毎週、ＩＲＯ注射前に採集した。マウスを第２４週に殺処分した。血清抗ＤＮＡ  ＩｇＧ１レベルをＥＬＩＳＡで決定した。結果を図１８Ａ〜１８Ｅに示す。これらの結果により、ＩＲＯおよびＩＲＯ１７が、ループスプローンマウスにおいてＩｇＧ１およびＩｇＧ２Ａ産生ならびに尿中タンパク質を阻害できることが実証される。
【０１２９】
ループスプローンＮＺＢＷマウスに、第６週に開始して、２週間ごとに１度、３００μｇのＩＲＯ−５を皮下投与した。血清抗ＤＮＡ  ＩｇＧ２ａレベルを第１６週および第２０週において決定した。かかる結果を図１９に示す。これらの結果により、ＩＲＯ投与によりＮＺＢＷマウスにおいて血清抗ＤＮＡ  ＩｇＧ２ａが阻害されることが実証される。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】ＩＭＯのＴＬＲ９アゴニスト活性のＩＲＯ阻害を実証するグラフである。
【図２】１つのＩＲＯ化合物のＴＬＲ９対ＴＬＲ３のアンタゴニストとしての特異性を実証するグラフである。
【図３】ＩＲＯによる用量依存性の阻害を実証するグラフである。
【図４Ａ】ＩＲＯの前投与および同時投与によりＴＬＲ９のアゴニストを阻害することができることを実証するグラフである。
【図４Ｂ−４Ｄ】ＩＲＯの前投与および同時投与によりＴＬＲ９のアゴニストを阻害することができることを実証するグラフである。
【図５】５’末端で結合する２つのＣｐＧオリゴヌクレオチドがＴＬＲ阻害性を示すことを実証するグラフである。
【図６】ヒト細胞培養においてＩＲＯがＴＬＲ９アゴニスト活性を阻害したことを実証するグラフである。
【図７】ＯＶＡにおけるＩＲＯ効果によりＴｈ２およびＴｈ１免疫反応が誘発されたことを実証するグラフである。
【図８】ＩＲＯがＴｈ２阻害性を逆転化し、ＩＭＯにより誘発されるＴｈ１免疫反応を阻害することを実証するグラフである。
【図９】ＩＭＯおよびＩＲＯの抗体反応を実証するグラフである。
【０１３１】
【図１０】in vivoでのＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９における選択されたＩＲＯの早期阻害活性を実証するグラフである。
【図１１】in vivoでのＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９における選択されたＩＲＯの早期阻害活性を実証するグラフである。
【図１２】in vivoでのＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９における選択されたＩＲＯの早期阻害活性を実証するグラフである。
【図１３】in vivoでのＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９における選択されたＩＲＯの長期アンタゴニスト活性を実証するグラフである。
【図１４】in vivoでのＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９における選択されたＩＲＯの長期アンタゴニスト活性を実証するグラフである。
【図１５】in vivoでのＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９における選択されたＩＲＯの長期アンタゴニスト活性を実証するグラフである。
【図１６】in vitroでＩＲＯが野生型（ＢＡＬＢ／ｃ）およびループスプローン（ＭＲＬ−ｌｐｒ）マウスＢリンパ球増殖を阻害することを実証するグラフである。
【図１７Ａ】in vitroでＩＲＯが、野生型（ＢＡＬＢ／ｃ）およびループスプローン（ＭＰＬ−ｌｐｒ）マウスＢリンパ球およびループスプローン（ＮＺＢＷ）マウス脾臓細胞によるＩＬ−６産生を阻害したことを実証するグラフである。
【図１７Ｂ】同じくin vitroでＩＲＯが、野生型（ＢＡＬＢ／ｃ）およびループスプローン（ＭＰＬ−ｌｐｒ）マウスＢリンパ球およびループスプローン（ＮＺＢＷ）マウス脾臓細胞によるＩＬ−６産生を阻害したことを実証するグラフである。
【図１７Ｃ】同じくin vitroでＩＲＯが、野生型（ＢＡＬＢ／ｃ）およびループスプローン（ＭＰＬ−ｌｐｒ）マウスＢリンパ球およびループスプローン（ＮＺＢＷ）マウス脾臓細胞によるＩＬ−１２産生を阻害したことを実証するグラフである。
【図１８Ａ】ＩＲＯを注射されたＭＲＬ−ｌｐｒマウスが、血清において抗ＤＮＡ  ＩｇＧ１抗体のレベルを低下させることを実証するグラフである。
【図１８Ｂ】ＩＲＯを注射されたＭＲＬ−ｌｐｒマウスが、血清において抗ＤＮＡＩｇＧ２ａ抗体のレベルを低下させることを実証するグラフである。
【図１８Ｃ】ＩＲＯを注射されたＭＲＬ−ｌｐｒマウスが、尿中のタンパク質のレベルを低下させることを実証するグラフである。
【図１８Ｄ】ＩＲＯを注射されたＭＲＬ−ｌｐｒマウスが、血清において抗ＤＮＡ  ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体のレベルを低下させることを実証するグラフである。
【図１８Ｅ】ＩＲＯを注射されたＭＲＬ−ｌｐｒマウスが、尿中のタンパク質のレベルを低下させることを実証するグラフである。
【図１９】ＮＺＢＷマウスにおいてＩＲＯが血清抗ＤＮＡ  ＩｇＧ２ａを阻害することを実証するグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ−４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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