(57)【要約】  本発明は、細胞分泌プロセスを調節する方法を含む。より具体的には、本発明は、炎症細胞中の小胞又は顆粒からの炎症媒介物質の放出に関連する機序を阻害することによって、炎症細胞からの炎症媒介物質の放出を調節又は低下させることに関する。これに関して、本発明は、炎症細胞中の小胞からの炎症媒介物質の分泌を伴う疾患における薬理学的介入のためのいくつかの新規細胞内標的を明らかにする細胞内シグナル伝達機序を開示する。ＭＡＮＳペプチド及びその活性断片は、このような方法において有用である。
2009531307.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの炎症細胞からの少なくとも１つの炎症媒介物質の開口分泌性放出を阻害する方法であり、細胞内部の小胞内に含有された少なくとも１つの炎症媒介物質を含む前記少なくとも１つの炎症細胞を、後記少なくとも１つのペプチドの不存在下で起こる炎症細胞の同一種からの前記炎症媒介物質の放出と比べて前記炎症細胞からの前記炎症媒介物質の放出を低下させるのに有効な量で、ＭＡＮＳペプチド及びその活性断片からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドと接触させることを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ペプチドが配列番号１を含むＭＡＮＳペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記活性断片が、配列番号１の少なくとも６つのアミノ酸を含む少なくとも１つミリストイル化されたＮ末端断片を含み、前記断片の最初のアミノ酸が配列番号１のＮ末端グリシンから始まる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記活性断片が、Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶ（配列番号２０）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡ（配列番号３）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡ（配列番号４）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥ（配列番号５）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧ（配列番号６）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰ（配列番号７）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲ（配列番号８）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥ（配列番号９）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡ（配列番号１０）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡ（配列番号１１）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡ（配列番号１２）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥ（配列番号１３）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧ（配列番号１４）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（配列番号１５）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡ（配列番号１６）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡ（配列番号１７）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴ（配列番号１８）；及びＮ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫ（配列番号１９）からなる群から選択されることができる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記炎症細胞が白血球である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記炎症細胞が顆粒球である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記炎症細胞が、好中球、好塩基球、好酸球及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記炎症細胞が単球又はマクロファージである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記炎症媒介物質が、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、主要塩基性タンパク質［ＭＢＰ］、リゾチーム、グランザイム、ヒスタミン、プロテオグリカン、プロテアーゼ、走化性因子、サイトカイン、アラキドン酸の代謝物、デフェンシン、殺菌性透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）、エラスターゼ、カテプシンＧ、カテプシンＢ、カテプシンＤ，β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α―マンノシダーゼ、ホスホリパーゼＡ２、コンドロイチン−４−サルファート、プロテイナーゼ３、ラクトフェリン、コラーゲナーゼ、補体活性化因子、補体受容体、Ｎ−ホルミルメチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ＦＭＬＰ）受容体、ラミニン受容体、チトクロムｂ５５８、単球走化性因子、ヒスタミナーゼ、ビタミンＢ１２結合タンパク質、ゼラチナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子、β−Ｄ−グルクロニダーゼ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記炎症媒介物質が、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、主要塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、リゾチーム、グランザイム及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドの前記有効量が、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の不存在下で少なくとも１つの炎症細胞から放出される量と比べて約１％から約９９％、少なくとも１つの炎症細胞から放出される炎症媒介物質の量を低下させるＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の脱顆粒阻害量を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドの前記有効量が、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の不存在下で少なくとも１つの炎症細胞から放出される量と比べて約５〜５０％と約９９％の間に、少なくとも１つの炎症細胞から放出される炎症媒介物質の量を低下させるＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の脱顆粒阻害量を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
対象の組織及び／又は液体中の少なくとも１つの炎症細胞からの少なくとも１つの炎症媒介物質の放出を阻害する方法であり、細胞内部の小胞内に含有された少なくとも１つの炎症媒介物質を含む少なくとも１つの炎症細胞を含む前記対象の組織及び／又は液体に、少なくとも１つのペプチドの不存在下で起こる炎症細胞の同一種の少なくとも１つからの前記炎症媒介物質の放出と比べて、少なくとも１つの炎症細胞からの前記炎症媒介物質の放出を低下させる治療的有効量で、ＭＡＮＳペプチド及びその活性断片からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを含む医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１４】
炎症媒介物質の放出の前記低下が、前記炎症細胞からの炎症媒介物質を放出する機序を遮断又は阻害することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドが配列番号１を含むＭＡＮＳペプチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記活性断片が、配列番号１の少なくとも６つのアミノ酸を含む少なくとも１つミリストイル化されたＮ末端断片を含み、前記断片の最初のアミノ酸が配列番号１のＮ末端グリシンから始まる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記活性断片が、Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶ（配列番号２０）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡ（配列番号３）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡ（配列番号４）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥ（配列番号５）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧ（配列番号６）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰ（配列番号７）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲ（配列番号８）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥ（配列番号９）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡ（配列番号１０）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡ（配列番号１１）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡ（配列番号１２）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥ（配列番号１３）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧ（配列番号１４）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（配列番号１５）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡ（配列番号１６）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡ（配列番号１７）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴ（配列番号１８）；及びＮ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫ（配列番号１９）からなる群から選択されることができる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記炎症細胞が白血球である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記炎症細胞が顆粒球である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記炎症細胞が、好中球、好塩基球、好酸球及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記炎症細胞が単球又はマクロファージである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記炎症媒介物質が、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、主要塩基性タンパク質［ＭＢＰ］、リゾチーム、グランザイム、ヒスタミン、プロテオグリカン、プロテアーゼ、走化性因子、サイトカイン、アラキドン酸の代謝物、デフェンシン、殺菌性透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）、エラスターゼ、カテプシンＧ、カテプシンＢ、カテプシンＤ，β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α―マンノシダーゼ、ホスホリパーゼＡ２、コンドロイチン−４−サルファート、プロテイナーゼ３、ラクトフェリン、コラーゲナーゼ、補体活性化因子、補体受容体、Ｎ−ホルミルメチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ＦＭＬＰ）受容体、ラミニン受容体、チトクロムｂ５５８、単球走化性因子、ヒスタミナーゼ、ビタミンＢ１２結合タンパク質、ゼラチナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子、β−Ｄ−グルクロニダーゼ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
前記炎症媒介物質が、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、主要塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、リゾチーム、グランザイム及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記ペプチドの前記有効量が、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の不存在下で少なくとも１つの炎症細胞から放出される量と比べて約１％から約９９％、少なくとも１つの炎症細胞から放出される炎症媒介物質の量を低下させるＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の脱顆粒阻害量を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ペプチドの前記有効量が、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の不存在下で少なくとも１つの炎症細胞から放出される量と比べて約５〜５０％と約９９％の間に、少なくとも１つの炎症細胞から放出される炎症媒介物質の量を低下させるＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の脱顆粒阻害量を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象が呼吸器系疾患に罹患している、請求項１３に記載の方法。
【請求項２７】
前記呼吸器系疾患が、喘息、慢性気管支炎及びＣＯＰＤからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記対象が哺乳動物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２９】
前記哺乳動物が、ヒト、イヌ、ウマ及びネコからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記投与が、局所投与、非経口投与、直腸投与、肺投与、経鼻投与及び経口投与からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項３１】
前記肺投与が、エアロゾル、乾燥粉末吸入器、定量噴霧式吸入器及び噴霧器からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
抗生物質、抗ウイルス性化合物、抗寄生虫化合物、抗炎症性化合物及び免疫抑制物質からなる群から選択される第二の分子の前記対象への投与をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象が、腸疾患、皮膚疾患、自己免疫疾患、疼痛症候群及びこれらの組み合わせからなる群から選択される疾病に罹患している、請求項１３に記載の方法。
【請求項３４】
前記腸疾患が、潰瘍性大腸炎、クローン病及び過敏性腸症候群からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記皮膚疾患が、酒さ、湿疹、乾癬及び重度のにきびからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記対象が関節炎又は嚢胞性繊維症に罹患している、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００１年６月２６日に出願された米国仮出願６０／３００，９３３号の優先権を主張し、２００２年６月２６日に出願され、現在は放棄されている米国特許出願１０／１８０，７５３号の継続出願である２００４年３月１７日に出願された米国特許出願１０／８０２，６４４号の一部継続出願である２００６年３月６日に出願された米国特許出願１１／３６７，４４９の優先権を主張するものであり、これらの開示内容全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府の支援についての記述
本発明は、国立衛生研究所からのグラント番号Ｒ０１ＨＬ３６９８２の下で、合衆国連邦政府からの支援を受けて為された。合衆国政府は、本発明に対して一定の権利を有し得る。
【０００３】
発明の分野
本発明は、細胞分泌プロセスを調節する方法に関する。より具体的には、本発明は、炎症媒介物質の放出を調節することに関する。本発明は、炎症細胞中の膜に結合された小胞又は顆粒からの炎症媒介物質の分泌を制御する細胞内シグナル伝達機序にも関する。
【背景技術】
【０００４】
粘液の過剰分泌は、ヒト及びヒト以外の動物における数多くの気道炎症性疾患の発病に寄与している。増加した粘液分泌は、喘息、ＣＯＰＤ及び慢性気管支炎などの慢性的な病状；嚢胞性繊維症状などの遺伝性疾患；アレルギー性症状（アトピー、アレルギー性炎症）；気管支拡張症；並びに肺炎、鼻炎、インフルエンザ又は一般的な風邪などの多数の急性感染性呼吸器疾患に見られる。
【０００５】
これらの呼吸器疾患の多くにおいて付随する粘液の過剰分泌は、気道中における炎症細胞の恒常的な存在である。これらの細胞は、これらの細胞から放出される炎症媒介物質によって行われる組織損傷を介したこれらの疾病の病変に大きく寄与する。この慢性炎症を介したこのような破壊の一例は、好中球（例えば、ミエロペルオキシダーゼ）から放出された媒介物質が気道の上皮組織の剥離を誘導する嚢胞性繊維症の患者に生じる。
【０００６】
粘液の過少分泌も、有害な効果を有する。気道粘液は、生物学的に活性な吸入された粒子に対する物理的障壁として作用し、気道の細菌コロニー形成を防ぎ、白血球から放出された細胞毒性産物を不活化するのに役立ち得る。Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｒｅｓｐｉｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６２：４７−５９（１９８５）；Ｖｉｓｈｗａｎａｔｈ  ａｎｄ  Ｒａｍｐｈａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４５：１９７（１９８４）；Ｃｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｌａｎｃｅｔ  １：１３２８（１９８４）。眼では、粘液は涙膜を維持し、眼の健康と快適性にとって重要である。胃腸管中の粘液分泌は、細胞保護機能も有する。化学的、生物学的及び機械的障壁としての粘液の役割は、粘膜による異常に低い粘液分泌は望ましくないということを意味する。
【０００７】
哺乳動物の気道は、気道上皮（杯）細胞及び小唾液腺によって産生及び分泌される粘液の薄い層によって裏打ちされている。喘息、慢性気管支炎及び嚢胞性繊維症などの気道疾患では、粘液の過剰分泌が一般的な症候である。過剰な粘液は、閉塞及び感染に対する感受性に寄与し得る。粘液の主成分は、分泌細胞によって合成されるムチン糖タンパク質であり、細胞質顆粒内に貯蔵される。ムチンは、気道、消化管及び雌性生殖器系の上皮細胞を含む上皮細胞によって分泌される糖タンパク質のファミリーである。ムチンは、粘液の粘弾性特性に必要であり、少なくとも８つのムチン遺伝子が知られている。Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，９５６１−９５６６（１９９７）。ムチンの過剰分泌及び／又は粘液細胞過形成によって引き起こされた粘液毛様体の損傷は、慢性的な感染、気流閉塞を促進し、時には死を促進する気道粘液閉塞を引き起こす。慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、気管支拡張症、喘息、嚢胞性繊維症及び細菌感染症などの多くの気道疾患は、ムチンの過剰生産によって特徴付けられる。Ｅ．Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．，８：１３３３−１３３８（１９９５）；Ｋ．Ｃ．Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．，１０：１４３８（１９９７）；Ｄ．Ｓｔｅｉｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．ＣｅｌｌＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２：３０７−３１４（１９９５）。適切な刺激が生じると、顆粒膜が形質膜と融合している細胞周辺へ顆粒が移行し、内容物の管腔分泌を可能とする開口分泌プロセスを介して、ムチン顆粒が放出される。
【０００８】
このプロセスの明白な病態生理学的な重要性に関わらず、細胞表面での刺激をムチン顆粒放出と結び付ける細胞内シグナル伝達機序は、最近になって解明されたに過ぎない。Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７６：４０９８２−４０９９０（２００１）を参照されたい。様々な因子及び炎症／液性媒介物質がムチン分泌を誘発することが知られている。これらには、コリン作動性アゴニスト、脂質媒介物質、酸化体、サイトカイン、ニューロペプチド、ＡＴＰ及びＵＴＰ、細菌性産物、好中球エラスターゼ及び吸入された汚染物質が含まれる。Ａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９，２４５−２４８（１９９８）を参照されたい。興味深いことに、これらの分泌促進物質の多くは、幾つかのタンパク質キナーゼを活性化することも知られており、様々な種に由来する気道上皮細胞によるムチンの過剰分泌の制御を調べる研究は、分泌プロセスにタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）又はｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＧ）の何れかが関与していることを一貫して示唆している。例えば、Ｋｏ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．ＣｅｌｌＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６，１９４−１９８（１９９７）；Ａｂｄｕｌｌａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７３，Ｌ２０１−Ｌ２１０（１９９７）；Ａｂｄｕｌｌａｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．  ３１６，９４３−９５４（１９９６）；Ｌａｒｉｖｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ．Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．ＣｅｌｌＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１，１９９−２０５（１９９４）；及びＦｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．ＣｅｌｌＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０，４１３−４２２（１９９９）を参照されたい。ムチン分泌の制御における、これら２つのタンパク質キナーゼ間での協調された相互作用又は「クロストーク」がＭＡＲＣＫＳタンパク質を伴うことは、最近になって示されたに過ぎない。Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７６：４０９８２−４０９９０（２００１）を参照されたい。しかしながら、最終的にムチン顆粒の開口分泌性放出をもたらすこれらのタンパク質キナーゼの協調された作用の下流に存在するシグナル伝達現象は、完全には解明されていない。
【０００９】
約８２ｋＤのタンパク質であるＭＡＲＣＫＳは、Ｎ末端、リン酸化部位ドメイン（ＰＳＤ）及び多重相同性２（ＭＨ２；ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ２）ドメインという進化的に保存された３つの領域を有する（Ａｄｅｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８８；３３２：３６２−３６４；Ｔｈｅｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９１；３５１：３２０−３２２；Ｈａｒｔｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９２；３５６：６１８−６２２；Ｓｅｙｋｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９６；２７１：１８７９７−１８８０２）。末端グリシン残基に付着されたミリスチン酸部分を有するＮ末端の２４アミノ酸配列は、ＭＡＲＣＫＳの膜への結合に関与しており（Ｓｅｙｋｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９６；２７１：１８７９７−１８８０２）、おそらくは、カルモジュリンへの結合にも関与している（Ｍａｔｓｕｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００３；２７８：４８８９８−４８９０２）。この２４アミノ酸配列は、ＭＡＮＳペプチドとして知られている。ＭＡＮＳペプチド及びその活性断片は、膜結合に関して、細胞中の固有のＭＡＲＣＫＳと競合し得る。浸潤白血球の顆粒からの炎症媒介物質の放出へのＭＡＲＣＫＳタンパク質の関与は、喘息、ＣＯＰＤ及び嚢胞性繊維症などの気道炎症によって特徴付けられる肺疾患など、あらゆる組織及び臓器中の疾病における炎症と関わっている。しかしながら、気道中の炎症及び粘液分泌は、２つの別個の、独立したプロセスである（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００１；２７６：４０９８２−４０９９０；Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００４；１０：１９３−１９６）。粘液産生と分泌は、炎症細胞によって放出される媒介物質を含む多数の因子によって誘発され得るが、過剰な粘液と炎症の間には、公知の直接的な関連性は存在しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ＭＡＮＳペプチドとしても知られる２４アミノ酸のミリストイル化されたポリペプチドに対する新たな使用に関する。本発明は、その刺激経路がタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の基質ＭＡＲＣＫＳタンパク質及び細胞内小胞又は顆粒からの内容物の放出を含むあらゆる細胞分泌プロセス、特に、炎症細胞からの炎症媒介物質の放出を伴うものを遮断するための新規方法にも関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、少なくとも１つの炎症細胞からの少なくとも１つの炎症媒介物質の開口分泌性放出を阻害する方法であり、細胞内部の小胞内に含有された少なくとも１つの炎症媒介物質を含む前記少なくとも１つの炎症細胞を、後記少なくとも１つのペプチドの不存在下で起こる炎症細胞の同一種からの前記炎症媒介物質の放出と比べて前記炎症細胞からの前記炎症媒介物質の放出を低下させるのに有効な量で、ＭＡＮＳペプチド及びその活性断片からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドと接触させることを含む、前記方法に関する。
【００１２】
本発明は、さらに、対象の組織及び／又は液体中の少なくとも１つの炎症細胞からの少なくとも１つの炎症媒介物質の放出を阻害する方法であり、前記細胞内部の小胞内に含有された少なくとも１つの炎症媒介物質を含む少なくとも１つの炎症細胞を含む前記対象の組織及び／又は液体に、少なくとも１つのペプチドの不存在下で起こる炎症細胞の同一種の少なくとも１つからの前記炎症媒介物質の放出と比べて少なくとも１つの炎症細胞からの前記炎症媒介物質の放出を低下させるための治療的有効量で、ＭＡＮＳペプチド及びその活性断片からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを含む医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、前記方法に関する。より具体的には、炎症媒介物質の放出の阻害が、前記炎症細胞からの炎症媒介物質の放出を遮断又は低下させることを含む。
【００１３】
より具体的には、本発明は、対象中の炎症を低下させる方法であり、ＭＡＮＳペプチド［すなわち、Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶ（配列番号２０）］又はその活性断片を含む医薬組成物の治療的有効量の投与を含む前記方法を含む。この活性断片は、少なくとも６アミノ酸の長さである。本明細書において使用される、ＭＡＲＣＫＳタンパク質の「活性断片」は、ＭＡＲＣＫＳタンパク質によって媒介される放出に影響を与える（阻害又は増強する）断片である。活性断片は、Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡ（配列番号３）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡ（配列番号４）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥ（配列番号５）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧ（配列番号６）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰ（配列番号７）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲ（配列番号８）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥ（配列番号９）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡ（配列番号１０）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡ（配列番号１１）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡ（配列番号１２）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥ（配列番号１３）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧ（配列番号１４）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（配列番号１５）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡ（配列番号１６）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡ（配列番号１７）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴ（配列番号１８）；及びＮ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫ（配列番号１９）からなる群から選択され得る。これらのペプチド中の疎水性Ｎ末端ミリスチン酸部分の存在は、形質膜とのこれらの適合性を増強することができ、おそらくは形質膜に対するこれらの透過性を増強することができ、ペプチドが細胞によって取り込まれ得るようにする可能性を秘める。ミリスタートの二重層中への疎水的挿入は、最大１０４Ｍ−１の分配係数若しくは脂質との見かけの会合定数又は約８ｋｃａｌ／ｍｏｌのユニタリーＧｉｂｂｓ自由結合エネルギーを与えることができ（例えば、Ｐｅｉｔｚｓｃｈ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ  ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｓ．  １９９３，Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ａｃｙｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｔｏ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ｐｅｒｔｉｎｅｎｃｅ  ｔｏ  ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ３２：１０４３６−１０４４３を参照）、これは、少なくとも部分的に、本明細書中に記載されているＭＡＮＳペプチド及びミリストイル化されたＭＡＮＳペプチド断片の、細胞の形質膜中への分配を可能とするのに十分であり、さらなる官能基及び（ミリストイル化されている）ＭＡＮＳペプチド内及びミリストイル化されているＭＡＮＳペプチド断片内でのそれらの相互作用がそれらの相対的膜透過性を強化することができる。これらの断片は、それぞれ、それらの各構造を代表す���分配係数及び膜親和性を呈することができる。これらの断片は、固相ペプチド合成（例えば、  Ｃｈａｎ，Ｗｅｎｇ  Ｃ．．ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，Ｐｅｔｅｒ  Ｄ．Ｅｄｓ．，Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）；ａｎｄ  Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９７）に記載されている方法を参照）によるなどの本分野で公知のペプチド合成法によって調製され得、高圧液体クロマトグラフィーによるなどの本分野で公知の方法によって精製され得る。各ペプチドの分子量は、質量分析法によって確認することが可能であり、各々、適切な分子量を有するピークを示す。本開示の方法における各ペプチド及び各ペプチドの組み合わせ（例えば、ペプチドの２つの組み合わせ、ペプチドの３つの組み合わせ、ペプチドの４つの組み合わせ）の効果は、本明細書に開示されている実施例に記載されている操作を用いて、過度の実験操作を行わずに容易に決定することができる。好ましい組み合わせは、ペプチドの２つを含み、ペプチドの好ましいモル比は５０：５０から９９．９９：０．０１であり得、この比は、本明細書に開示されている実施例に記載されている操作を用いて容易に決定することができる。
【００１４】
好ましくは、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片は、炎症を遮断するのに有用である医薬組成物中に含有される。本発明は、対象中の細胞分泌プロセスを制御する方法であり、対象中の免疫媒介物質を制御する、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片を含む化合物の治療的有効量の投与を含む前記方法も含む。投与は、一般に、局所投与、非経口投与、直腸投与、肺投与、吸入及び経鼻又は経口投与からなる群から選択され、肺投与は、一般に、エアロゾル、乾燥粉末吸入器、定量噴霧式吸入器及び噴霧器を含む。
【００１５】
ヒト又は動物用途のためのＭＡＮＳペプチドの脱顆粒阻害量又はその活性断片の脱顆粒阻害量を含む組成物（ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の医薬組成物など）の投与は、少なくとも組織中若しくは組織上の部位へ、又は炎症性顆粒球細胞が存在する組織若しくはその中に炎症性顆粒球細胞が侵入する組織の表面と接触している液体含有層若しくは粘液含有層へ、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片を提供し、これにより、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片が炎症性顆粒球細胞に接触できるようになる。一態様において、このような組成物の投与は、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の不存在において生じる炎症の量を低下させるために、炎症の最初の発生若しくは最初の検出時に、又はヒト若しくは動物による炎症の第一の知覚又はヒト若しくは動物における炎症のレベルの最初の知覚可能な変化時に行うことができる。別の態様において、投与は、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の不存在で生じるさらなる炎症の量を低下させるために、ヒト又は動物中の組織の継続する炎症の間に行うことができる。投薬の量及び頻度は、臨床的な評価によって決定することができ、疾病又は炎症源並びに関与する組織の程度並びに患者の年齢及び大きさの関数であり得るが、医薬組成物の投薬は、医薬組成物の最初の投与から３から８時間後に、好ましくは６から８時間後に反復することができると予想される。
【００１６】
本発明は、対象中の炎症を低下させる方法であり、炎症媒介物質のＭＡＲＣＫＳ関連放出を阻害する化合物の治療的有効量の投与を含み、前記治療の不存在下で生じる放出と比べて、前記対象における少なくとも１つの炎症媒介物質の放出が低下する。本明細書において使用される「低下する」とは、一般に、炎症の効果の低減を意味する。好ましくは、炎症媒介物質は、開示されている方法によって阻害又は遮断される。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、対象中の炎症を低下させる方法であり、炎症媒介物質のＭＡＲＣＫＳ関連放出を阻害する化合物の治療的有効量の投与を含み、前記治療の不存在下で生じる炎症と比べて、前記対象中の炎症が低下する、前記方法を含む。本発明は、対象中の炎症を低下又は阻害する方法であり、ＭＡＮＳペプチド又は炎症部位において炎症媒介物質を調節するのに有効なその活性断片の治療的有効量の投与を含む、前記方法も開示する。「阻害する」という用語は、炎症媒介物質分泌の量の低下を意味する。「完全に阻害する」という用語は、炎症媒介物質分泌の量がゼロまで低下することを意味する。ここでも、上述のように、活性断片は、少なくとも６アミノ酸の長さである。「開口分泌プロセス」という用語は、開口分泌、すなわち、細胞内に存在する小胞内に含有される物質が、外側細胞膜との、小胞の小胞膜の融合によって細胞から放出される細胞分泌又は排出のプロセスを意味する。「脱顆粒」とは、細胞顆粒含有物の放出を意味する。「脱顆粒阻害」という用語は、炎症細胞の顆粒内に含有される炎症媒介物質の放出の低下を意味する。従って、ＭＡＮＳペプチド及び／又はその活性断片の脱顆粒阻害量とは、同じペプチドの不存在下での放出に比べて、顆粒中に含有される炎症媒介物質の放出を低下させるのに十分であるこれらのペプチドの量である。
【００１８】
ＭＡＮＳペプチド及びその活性断片は、炎症媒介物質によって引き起こされる動物中の組織における炎症の量の抑制又は低下において有用であり得る。ＭＡＮＳペプチド及びその活性断片は、炎症媒介物質によって産生される又は引き起こされる動物中の組織損傷の量の抑制又は低下において有用であり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
ここで、本発明の好ましい実施形態が例示されている添付の図面を参照しながら、本明細書の以下に、本発明をより完全に記載する。しかしながら、本発明は、様々な形態で具体化され得、本明細書に記載されている実施形態に限定されるものと解釈すべきでない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が完璧で、完全であるように、及び本発明の範囲を当業者に完全に伝達するように提供されている。
【００２０】
別段の定義がなければ、本明細書に使用されている全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的によって理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に挙げられている全ての公報、特許出願、特許及び他の参考文献は、参照により、その全体が組み込まれる。本発明の全ての態様を記載するための本明細書における「ａ」又は「ａｎ」という用語の使用は、１つ又はそれ以上を示すものとして解釈すべきである。
【００２１】
本発明は、少なくとも１つの炎症細胞からの少なくとも１つの炎症媒介物質の開口分泌性放出を阻害する方法であり、細胞内部の小胞内に含有された少なくとも１つの炎症媒介物質を含む前記少なくとも１つの炎症細胞を、後記少なくとも１つのペプチドの不存在下で起こる炎症細胞の同一種からの前記炎症媒介物質の放出と比べて前記炎症細胞からの前記炎症媒介物質の放出を低下させるのに有効な量で、ＭＡＮＳペプチド及びその活性断片からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドと接触させることを含む、前記方法に関する。
【００２２】
本発明は、さらに、対象の組織及び／又は液体中の少なくとも１つの炎症細胞からの少なくとも１つの炎症媒介物質の放出を阻害する方法であり、前記細胞内部の小胞内に含有された少なくとも１つの炎症媒介物質を含む少なくとも１つの炎症細胞を含む前記対象の組織及び／又は液体に、後記少なくとも１つのペプチドの不存在下で起こる炎症細胞の同一種の少なくとも１つからの前記炎症媒介物質の放出と比べて少なくとも１つの炎症細胞からの前記炎症媒介物質の放出を低下させるための治療的有効量で、ＭＡＮＳペプチド及びその活性断片からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを含む医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、前記方法に関する。より具体的には、炎症媒介物質の放出を低下させることは、前記炎症細胞からの炎症媒介物質を放出する機序を遮断又は阻害させることを含む。
【００２３】
上記されている本方法において使用されるＭＡＮＳペプチドは、配列番号１を含む。本発明において有用な活性断片は、配列番号１の少なくとも６つのアミノ酸を含む少なくとも１つミリストイル化されたＮ末端断片を含み、前記断片の最初のアミノ酸は配列番号１のＮ末端グリシンから始まる。より具体的には、活性断片は、Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡ（配列番号３）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡ（配列番号４）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥ（配列番号５）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧ（配列番号６）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰ（配列番号７）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲ（配列番号８）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥ（配列番号９）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡ（配列番号１０）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡ（配列番号１１）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡ（配列番号１２）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥ（配列番号１３）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧ（配列番号１４）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（配列番号１５）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡ（配列番号１６）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡ（配列番号１７）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴ（配列番号１８）；及びＮ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫ（配列番号１９）からなる群から選択することができる。
【００２４】
本発明は、上に及び本明細書全体に記載されているペプチドの、細胞内部の小胞内に含有される少なくとも１つの炎症媒介物質を含有する対象の組織又は液体中に含有され得る何れかの公知の炎症細胞との接触及び／又は投与に関する。これらの炎症細胞は、好ましくは、白血球、より好ましくは顆粒球であり、これらは、好中球、好塩基球、好酸球又はこれらの組み合わせとしてさらに分類することができる。本方法において接触される炎症細胞は、単球／マクロファージでもあり得る。
【００２５】
本発明は、炎症細胞の小胞内に含有される炎症媒介物質の放出を低下させることに関し、これらの炎症媒介物質は、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、主要塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、リゾチーム、グランザイム、ヒスタミン、プロテオグリカン、プロテアーゼ、走化性因子、サイトカイン、アラキドン酸の代謝物、デフェンシン、殺菌性透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）、エラスターゼ、カテプシンＧ、カテプシンＢ、カテプシンＤ，β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α―マンノシダーゼ、ホスホリパーゼＡ２、コンドロイチン−４−サルファート、プロテイナーゼ３、ラクトフェリン、コラーゲナーゼ、補体活性化因子、補体受容体、Ｎ−ホルミルメチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ＦＭＬＰ）受容体、ラミニン受容体、チトクロムｂ５５８、単球走化性因子、ヒスタミナーゼ、ビタミンＢ１２結合タンパク質、ゼラチナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子、β−Ｄ−グルクロニダーゼ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。好ましくは、これらの炎症媒介物質は、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、主要塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、リゾチーム、グランザイム及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２６】
本発明は、本ペプチドの有効量を炎症細胞と接触させる。ここにおいて、前記有効量は、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の不存在下で少なくとも１つの炎症細胞から放出される量と比べて約１％から約９９％、少なくとも１つの炎症細胞から放出される炎症媒介物質の量を低下させるＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の脱顆粒阻害量として定義される。より好ましくは、接触されるペプチドのこの有効量は、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の不存在下で少なくとも１つの炎症細胞から放出される量と比べて約５〜５０％と約９９％の間に、少なくとも１つの炎症細胞から放出される炎症媒介物質の量を低下させるＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の脱顆粒阻害量を含む。
【００２７】
一実施形態における本発明は、対象の組織又は液体中に、治療的有効量でＭＡＮＳペプチド及びこの活性断片を含む少なくとも１つのペプチドを投与することに関し、前記対象は、呼吸器疾患（好ましくは、喘息、慢性気管支炎又はＣＯＰＤである。）に罹患している。さらなる実施形態において、対象は、腸疾患、皮膚疾患、自己免疫疾患、疼痛症候群及びこれらの組み合わせに罹患し得る。腸疾患は、潰瘍性大腸炎、クローン病又は過敏性腸症候群であり得る。対象は、酒さ、湿疹、乾癬及び重度のにきびなどの皮膚疾患に罹患し得る。対象は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性紅斑性狼瘡などの関節炎にも罹患し得る。嚢胞性繊維症に罹患した対象も、本方法及びペプチドによって治療され得る。本方法は、好ましくは、哺乳動物、好ましくは、ヒト、イヌ、ウマ及びネコなどの対象の治療に関して有用である。
【００２８】
対象の本治療方法は、本明細書に記載されているＭＡＮＳペプチド又は活性断片を含む１つ又はそれ以上のペプチドの投与により、局所投与、非経口投与、直腸投与、肺投与、経鼻投与又は経口投与を含む。より具体的には、肺投与は、エアロゾル、乾燥粉末吸入器、定量噴霧式吸入器及び噴霧器の群から選択される。さらに、開示されている方法は、抗生物質、抗ウイルス性化合物、抗寄生虫化合物、抗炎症性化合物及び免疫抑制物質からなる群から選択される第二の分子の前記対象への投与をさらに含み得る。
【００２９】
一態様において、本発明は、医薬組成物を投与する方法に関する。この医薬組成物は、公知の化合物の治療的有効量と及び医薬として許容される担体とを含む。本明細書において使用される「治療的有効」量は、対象によって呈される症候を改善するのに十分な化合物の量である。治療的有効量は、患者の年齢及び身体的状態、治療されている患者の症状の重度、治療の期間、何れかの同時治療の性質、使用されている医薬として許容される担体ならびに当業者の知識及び専門的技術に属する同様の因子に応じて変動する。医薬として許容される担体は、好ましくは、錠剤又はカプセルなどの固体剤形である。経口投与用の液体調製物も使用することができ、シロップ又は懸濁液、例えば、活性成分、糖並びにエタノール、水、グリセロール及びプロピレングリコールの混合物を含有する溶液の形態で調製され得る。所望であれば、このような液体調製物は、以下のうちの１つ又はそれ以上：着色剤、着香剤及びサッカリンを含み得る。さらに、カルボキシメチルセルロース等の濃縮剤及び他の許容可能な担体も使用され得、その選択は本分野において公知である。
【００３０】
上述のように、本発明は、細胞分泌プロセス、特に、炎症細胞から炎症媒介物質を放出する細胞分泌プロセスを制御するための方法に関する。本明細書で使用される「制御する」という用語は、遮断し、阻害し、減少し、低下し、増加し、増強し又は刺激することを意味する。多数の細胞分泌プロセスは、細胞内の膜結合された小胞又は顆粒からの内容物の放出を含む。膜結合された小胞又は顆粒は、主に、小胞性（すなわち細胞内部の小胞）であり、分泌され得る貯蔵された材料を含有する細胞内粒子として定義される。炎症細胞中に含有されているものなど、これらの小胞の内容物の幾つかは、多数の哺乳動物組織中の様々な病変の原因であることが見出されている。これらの分泌の効果の幾つかは、炎症の間における、以前に健康であった組織の損傷を含むようである。本発明は、細胞内分泌経路において重要な特異的分子に合成ペプチドを標的化することによって、炎症細胞中に見出されるものなど、何れかの膜結合された小胞からの分泌を遮断する手段を提供する。このアプローチは、ヒト及び動物中の多様な過剰分泌性及び炎症性症状の治療にとって治療的に重要であり得る。
【００３１】
より具体的には、本発明は、細胞の細胞質内の１つ又はそれ以上の顆粒又は小胞中に炎症媒介物質を含有する炎症細胞を標的とする。これらの細胞は、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片から選択される１つ又はそれ以上のペプチド（これらの全てが、本明細書中に詳しく記載されている。）と接触される。好ましくは、ペプチドの炎症細胞（これらの炎症細胞は特異的な組織又は組織内の液体中に存在する。）との接触は、疾病に冒され又は罹患している対象への投与を経る。該ペプチドを細胞に投与し又は細胞と接触させると、該ペプチドは、炎症媒介物質を含有する細胞内顆粒又は小胞の膜への固有のＭＡＲＣＫＳタンパク質の結合に関して拮抗的に競合し及び拮抗的にこれを阻害する。炎症細胞中の小胞へのＭＡＲＣＫＳタンパク質の結合を遮断する結果、それらの炎症媒介物質の内容物を細胞から開口分泌的に放出するように刺激されたときに、これらの細胞中のこれらの小胞が通常行うように、これらの細胞中のこれらの小胞は細胞の形質膜へ移動しない。従って、本発明の方法は、細胞の形質膜への小胞の移動を阻害し、次いで、炎症細胞からの炎症媒介物質の放出を低下させる。炎症細胞からの媒介物質の放出速度及び放出量は何れも、投与された及び炎症細胞と接触されたペプチドの濃度に依存するので、時間が経過するにつれて、細胞から放出される炎症媒介物質の量は低下する。
【００３２】
本発明の１つの利点は、粘液分泌の直接的遮断を含む治療法を特有の抗炎症性療法と組み合わせ得ることである。免疫系の全体的な抑制に影響を与える現行の抗炎症療法に比べた本発明の利点は、本ペプチドが炎症細胞から分泌された細胞内成分のみの分泌を遮断すると考えられることである。従って、免疫系の多くの態様は、炎症媒介物質が阻害されても、なお機能するはずである。
【００３３】
本発明の化合物は、細胞からの炎症媒介物質の放出を制御し得る、すなわち遮断し得る。炎症媒介物質の放出のこの阻害は、様々な疾患、例えば炎症を伴う疾病及び病的症状を予防及び治療するための魅力的な手段である。従って、本発明の化合物は、このような症状の治療のために有用であり得る。これらは、骨関節炎、多発性硬化症、ギランバレー症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、移植片対宿主病、全身性紅斑性狼瘡及びインシュリン依存性糖尿病を含む（但し、これらに限定されない。）気道疾患及び慢性炎症性疾患を包含する。本発明の化合物は、様々な感染性因子に対する応答などの炎症促進媒介物質及び酵素の上昇したレベルの活性を伴う他の疾患並びに関節リウマチ、毒素性ショック症候群、糖尿病及び炎症性腸疾患などの多数の自己免疫疾患を治療するためにも使用することができる。
【００３４】
本発明のペプチド及び方法の使用には、ペプチドの抗炎症活性を粘液分泌を遮断するその能力と組み合わせる治療法とともに炎症を撲滅する治療法が含まれる。炎症と粘液分泌の両方を遮断するペプチドの能力によって治療され得る疾病には、炎症性腸疾患、消化性疾患（すなわち、炎症性胆嚢、メネトリエ病）及び炎症性気道疾患が含まれるが、これらに限定されない。ペプチドは、膵臓の膵島細胞からの過剰なインシュリンの放出を遮断するためにも使用され得る。
【００３５】
他の炎症促進性媒介物質は、炎症又は傷害の部位内への好中球の流入と相関する様々な病状と相関してきた。阻止抗体は、急性炎症における好中球関連組織傷害に対する有用な治療法であると示されている（Ｈａｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｏｄａｙ  ２，４８２）。炎症媒介物質を放出し得る好中球以外の細胞には、好塩基球、好酸球、単球及びリンパ球などの他の白血球が含まれ、これらの細胞からの分泌に対して治療法が誘導され得る。好中球、好酸球及び好塩基球は、それぞれ、顆粒球（すなわち、その細胞質中に顆粒を有する白血球）の一種である。白血球は、細胞質の顆粒中にパッケージ及び貯蔵される多数の炎症媒介物質を合成する。これらの媒介物質に属するのは、例えば、好中球中のミエロペルオキシダーゼ［ＭＰＯ］（Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ  Ｎ，Ｃｏｗｌａｎｄ  ＪＢ．Ｇｒａｎｕｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ．Ｂｌｏｏｄ  １９９７；８９：３５０３−３５２１）、好酸球中の好酸球ペルオキシダーゼ［ＥＰＯ］及び主要塩基性タンパク質［ＭＢＰ］（Ｇｌｅｉｃｈ  Ｇ  Ｊ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００；１０５：６５１−６６３）、単球／マクロファージ中のリゾチーム（Ｈｏｆｆ  Ｔ，Ｓｐｅｎｃｋｅｒ  Ｔ，Ｅｍｍｅｎｄｏｅｒｆｆｅｒ  Ａ．，Ｇｏｐｐｅｌｔ−Ｓｔｒｕｅｂｅ  Ｍ．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＴＰＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  １９９２；５２：１７３−１８２；Ｂａｌｂｏａ  Ｍ  Ａ，Ｓａｅｚ  Ｙ，Ｂａｌｓｉｎｄｅ  Ｊ．  Ｃａｌｃｉｕｍ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｕ９３７  ｐｒｏｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１７０：５２７６−５２８０）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び細胞傷害性リンパ球中のグランザイム（Ｂｏｃｈａｎ  ＭＲ，Ｇｏｅｂｅｌ  ＷＳ，Ｂｒａｈｍｉ  Ｚ．  Ｓｔａｂｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｏｒｉｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｈｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｙｔｉｃ  ａｂｉｌｉｔｙ．Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９５；１６４：２３４−２３９；Ｇｏｎｇ  Ｊ  Ｈ．，Ｍａｋｉ  Ｇ，Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＮＫ−９２）  ｗｉｔｈ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １９９４；８：６５２−６５８；Ｍａｋｉ  Ｇ，Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ，Ｍａｒｔｉｎｓｏｎ  ＪＡ，Ｔａｒｎ  ＹＫ．  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ，ＮＫ−９２．Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２００１；１０：３６９−３８３；ａｎｄ  Ｔａｋａｙａｍａ  Ｈ，Ｔｒｅｎｎ  Ｇ，Ｓｉｔｋｏｖｓｋｙ  ＭＶ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９８７；１０４：１８３−１９０７−１０）である。これらの媒介物質は、傷害の部位で放出されることができ、肺及びその他の場所などにおいて、傷害又は疾病の組織部位へのこれらの細胞の浸潤の結果として、炎症と修復に寄与し得る。白血球は、開口分泌機構を介して、これらの顆粒を放出する（Ｂｕｒｇｏｙｎｅ  ＲＤ，Ｍｏｒｇａｎ  Ａ．  Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｅｘ  ｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２００３；８３：５８１−６３２；Ｌｏｇａｎ  ＭＲ，Ｏｄｅｍｕｙｉｗａ  ＳＯ，Ｍｏｑｂｅｌ  Ｒ．  Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ：ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１１１：９２３−９３２）。
【００３６】
肥満細胞（通常は血流中を循環していない。）及び好塩基球は、細胞活性化に際して、ヒスタミンなどの予め形成された炎症性（アナフィラキシー性）媒介物質；ヘパリン及びコンドロイチン硫酸などのプロテオグリカン；トリプターゼ、キマーゼ、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシンＧ様プロテアーゼなどのプロテアーゼ；脈管構造、平滑筋、結合組織、粘液腺及び炎症細胞に対して作用する、走化性因子、サイトカイン及びアラキドン酸の代謝物を貯蔵し、放出することができる分泌性細胞質顆粒を含有する。
【００３７】
多形核白血球（ＰＭＮ）としても知られる好中球は、総循環白血球の５０から６０％を含む。好中球は、感染又は傷害の部位において身体の物理的障害を貫通する、細菌、真菌、原虫、ウイルス、ウイルスに感染した細胞及び腫瘍細胞などの感染性因子に対して作用する。好中球は、骨髄芽球、前骨髄芽球、骨髄球、後骨髄球、非分節（バンド）好中球及び分節（機能的に活性な）好中球という６つの形態的なステージを通じて成熟する。
【００３８】
好中球では、炎症媒介物質は、一次（アズール親和性）、二次（特異的）及び三次（ゼラチナーゼ）顆粒中並びに二次小胞中に貯蔵される。多数の炎症媒介物質のうち、一次（アズール親和性）顆粒は、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、リゾチーム、デフェンシン、殺菌性透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）、エラスターゼ、カテプシンＧ、カテプシンＢ、カテプシンＤ，β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α―マンノシダーゼ、ホスホリパーゼＡ２、コンドロイチン−４−サルファート、プロテイナーゼ３（例えば、Ｈａｒｔｗｉｇ  ＪＨ，Ｔｈｅｌｅｎ  Ｍ，Ｒｏｓｅｎ  Ａ，Ｊａｎｍｅｙ  ＰＡ，Ｎａｉｒｎ  ＡＣ，Ａｄｅｒｅｍ  Ａ．ＭＡＲＣＫＳ  ｉｓ  ａｎ  ａｃｔｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ａｎｄ  ｃａｌｃｉｕｍ−ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  １９９２；３５６：６１８−６２２）参照）を含有し、二次（特異的）顆粒は、リゾチーム、ラクトフェリン、コラーゲナーゼ、補体活性化因子、ホスホリパーゼＡ２、補体受容体、例えば、ＣＲ３、ＣＲ４、Ｎ−ホルミルメチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ＦＭＬＰ）受容体、ラミニン受容体、チトクロムｂ５５８、単球走化性因子、ヒスタミナーゼ及びビタミンＢ１２結合タンパク質を含有し、並びに小貯蔵顆粒は、ゼラチナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子、カテプシンＢ、カテプシンＤ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α−マンノシダーゼ及びチトクロムｂ５５８を含有する。
【００３９】
好中球顆粒は、抗微生物性又は細胞傷害性物質、中性プロテイナーゼ、酸ヒドロラーゼ及び細胞質膜受容体のプールを含有する。アズール親和性顆粒構成成分のうち、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）は、過酸化水素を次亜塩素酸への転化において重要な酵素である。過酸化水素及びハロゲン化物補因子と一緒に、次亜塩素酸は、白血球の効果的な殺微生物及び細胞傷害性機序であるミエロペルオキシダーゼ系を形成する。
【００４０】
アズール親和性顆粒タンパク質の３０から５０％を占めるデフェンシンは、多岐にわたる細菌、真菌及び幾つかのウイルスに対して細胞傷害性である小さな（分子量４０００未満）強力な抗菌性ペプチドである。それらの毒性は、他のチャンネル形成タンパク質（パーフォリン）に類似する標的細胞の膜透過化によるものであり得る。
【００４１】
細菌性透過性亢進（ＢＰＩ）タンパク質は、パーフォリンのメンバーである。細菌性透過性亢進（ＢＰＩ）タンパク質は、グラム陰性細菌に対して高度に毒性であるが、グラム陽性細菌又は真菌に対しては高度に毒性でなく、エンドトキシン（グラム陰性細菌の細胞外被の毒性リポ多糖成分）を中和することもできる。
【００４２】
ラクトフェリンは、遊離の鉄を隔離し、これにより、死滅プロセスを生き残る摂取された微生物の増殖を抑え、リゾチームに対する細菌の透過性を増加させる。
【００４３】
エラスターゼ及びカテプシンＧなどのセリンプロテアーゼは、細菌細胞外被中のタンパク質を加水分解する。顆粒球エラスターゼの基質には、コラーゲン架橋物及びプロテオグリカン並びに血管、靭帯及び軟骨のエラスチン成分が含まれる。カテプシンＤは軟骨プロテオグリカンを切断するのに対して、顆粒球コラーゲナーゼはＩ型を切断する上で活性を示し、より低い程度であるが、骨、軟骨及び腱からのＩＩＩ型コラーゲンを切断する上で活性を示す。コラーゲン分解産物は、好中球、単球及び繊維芽細胞に対して走化性活性を有する。
【００４４】
リソゾームプロテアーゼの組織破壊能の制御は、α２−マクログロブリン及びα１−アンチプロテアーゼなどのプロテアーゼ阻害剤によって媒介される。これらのアンチプロテアーゼは、血清及び滑液中に存在する。これらのアンチプロテアーゼは、プロテアーゼの活性部位に結合し、プロテアーゼの活性部位を覆うことによって機能し得る。プロテアーゼ−アンチプロテアーゼの不均衡は、気腫の発病において重要であり得る。
【００４５】
アズール親和性顆粒は、主に、細胞内環境中（貪食性リソソーム液胞中）において機能し、細胞内環境中（貪食性リソソーム小胞中）で、アズール親和性顆粒は、微生物の死滅及び分解に関与する。好中球特異的顆粒は、細胞外へのそれらの内容物の放出に対して感受性であり、炎症を開始する上で重要な役割を有する。特異的な顆粒は、チトクロムｂ（スーパーオキシドの産生に必要な酵素であるＮＡＤＰＨオキシダーゼの成分）、補体成分ｉＣ３ｂ（ＣＲ３、ＣＲ４）に対す受容体、ラミニンに対する受容体及びホルミルメチオニルペプチド化学誘引物質を含む様々な形質膜成分の細胞内貯蔵所に相当する。それ以外に、ヒスタミンの分解に関連するヒスタミナーゼ、ビタミン結合タンパク質及びＣ５からのＣ５ａのプラスミン形成及び切断に必要とされるプラスミノーゲン活性化因子が存在する。
【００４６】
炎症における好中球顆粒の重要性は、顆粒の先天異常を有する数人の患者の研究から明らかである。チェディアック・東症候群を有する患者は、炎症応答の確立の速度に大きな異常を有し、異常に大きなリソゾーム顆粒を有する。特異的な顆粒欠乏の先天的症候群は、減少した炎症応答並びに皮膚及び深部組織の重度の細菌感染を特徴とする極めて希な疾患である。
【００４７】
これらの顆粒の開口分泌性の分泌を制御する機序は、部分的に理解されているに過ぎないが、細胞内Ｃａ２＋の一過性上昇（Ｒｉｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９０；８７：９４７２−９４７６；Ｂｌａｃｋｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９９０；２６６：１９５−２００）、Ｇタンパク質、チロシン及びタンパク質キナーゼ（ＰＫ、特にＰＫＣ）（Ｓｍｏｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９０；１０５２：１３３−１４２；Ｎｉｅｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １９９４；１２２３：２６７−２７３；Ｎａｕｃｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｓｔ  ２００２；１２１；１４２−１５０）、Ｒａｃ２（Ａｂｄｅｌ−Ｌａｔｉｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０４：８３２−８３９；Ｌａｃｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１７０：２６７０−２６７９）及び様々なＳＮＡＲＥ、ＳＮＡＰ及びＶＡＭＰ（Ｓｏｌｌｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９３；３６２：３１８−３２４；Ｌａｃｙ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００５；１０７：３５８−３７６）など、本プロセスにおける数個の主要な分子が同定されてきた。
【００４８】
ＳＮＡＲＥ（可溶性Ｎ−エチルマレイミド付着タンパク質受容体）タンパク質は、ＳＮＡＲＥモチーフと称されるα螺旋状コイルドコイルドメインを特徴とする膜会合型タンパク質のファミリーである（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．ＬｉｆｅＳｃｉ．６０：９４２−９６０（２００３））。これらのタンパク質は、小胞又は標的膜上へのそれらの局在化に基づいて、ｖ−ＳＮＡＲＥ及びｔ−ＳＮＡＲＥとして分類される。別の分類スキームは、ＳＮＡＲＥモチーフの中央中に保存されたアルギニン又はグルタミン残基に基づいて、Ｒ−ＳＮＡＲＥ及びＱ−ＳＮＡＲＥを定義する。ＳＮＡＲＥは、分泌及び開口分泌性輸送経路の異なる膜区画に局在化され、細胞内膜融合プロセスの特異性に寄与する。ｔ−ＳＮＡＲＥドメインは、コイルドコイルツイストを有する４ラセンの束からなる。ＳＮＡＲＥモチーフは、２つの膜の融合に寄与する。ＳＮＡＲＥモチーフは、シンタキシン１ａの相同体（ｔ−ＳＮＡＲＥ）、ＶＡＭＰ−２（ｖ−ＳＮＡＲＥ）並びにＳＮＡＰ−２５のＮ末端及びＣ末端ＳＮＡＲＥモチーフという４つのクラスに該当する。各クラスからの１つのメンバーは、ＳＮＡＲＥ複合体を形成するように相互作用し得る。ＳＮＡＲＥモチーフは、神経伝達物質放出のために必要とされるシンタキシン１ａ（Ｌｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：８４７０−８４７９（２０００））及びエンドソームの輸送小胞中に見出されるシンタキシン６（Ｍｉｓｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：９１８４−９１８９（２００２））などのある種のシンタキシンファミリーメンバーのＮ末端ドメイン中に見出される。
【００４９】
ＳＮＡＰ−２５（シナプトソーム関連タンパク質２５ｋＤａ）タンパク質はＳＮＡＲＥ複合体の成分であり、これは膜融合の特異性を説明し得、シナプス小胞及び形質膜を一緒にする強固な複合体（ＳＮＡＲＥ又はコア複合体）を形成することによって融合を直接実施し得ることを説明し得る。ＳＮＡＲＥは、コイルドコイルを形成する傾向が高く、しばしば、カルボキシ末端の膜貫通領域が先行するＳＮＡＲＥモチーフとして知られる６０残基の配列によって特徴付けられるタンパク質の巨大ファミリーを構成する。シナプスコア複合体は、単離時には構造化されていないが、集合すると平行な４螺旋束を形成する４つのＳＮＡＲＥモチーフ（２つはＳＮＡＰ−２５に由来し、それぞれ１つはシナプトブレビン及びシンタキシン１に由来する。）によって形成される。コア複合体の結晶構造は、螺旋束が高度にねじれていること及び表面上に幾つかの塩橋及び内部疎水性残基の層を含有することが見い出されている。複合体の中心の極性層は、３つのグルタミン（ＳＮＡＰ−２５由来の２つ及びシンタキシン１由来の１つ）及び１つのアルギニン（シナプトブレビン由来）（Ｒｉｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３：６４１−６５３（２００２））によって形成される。ＳＮＡＰ−２５ファミリーのメンバーは、膜付着のためにパルミトイル化され得るシステイン残基のクラスターを含有する（Ｒｉｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２４４０８−２４４１４（１９９３））。
【００５０】
好中球の主要な役割は、感染性因子を貪食し、破壊することである。好中球は、適応（特異的）免疫応答の開始前に、幾つかの微生物の増殖も制約する。好中球は宿主防御に必須であり、好中球は、多くの慢性炎症条件の病変及び虚血再灌流傷害にも関与していると推定されている。好中球起源の加水分解性の酵素及び酸化的に不活化されたプロテアーゼ阻害剤が、炎症部位から単離された液体中に検出され得る。正常な条件下で、好中球は、宿主組織への損傷なしに感染の部位に遊走することができる。しかしながら、宿主組織に対する望ましくない損傷が、時に起こり得る。この損傷は、幾つかの独立した機序を通じて起こり得る。これらには、遊走中の未熟な活性化、幾つかの微生物の死滅に際しての有毒な産物の細胞外放出、組織リモデリングにおける第一の工程としての、感染した若しくは損傷宿主細胞及び破砕片の除去又は急性炎症応答の終結の失敗が含まれる。虚血再灌流傷害は、影響を受けた組織中への好中球の流入及びその後の活性化を伴う。これは、損傷を受けた宿主細胞から放出された物質によって、又はキサンチンオキシダーゼを通じたスーパーオキシド生成の結果として引き金が引かれ得る。
【００５１】
正常な条件下では、血液は、正常な好中球、抗原刺激された好中球、活性化された好中球及び消費された好中球の混合物を含有し得る。炎症部位では、主に、活性化された好中球と消費された好中球が存在する。活性化された好中球は、反応性酸素中間体（ＲＯＩ）の強化された産生を有する。増強された呼吸性バーストを有する好中球の亜集団が、急性細菌性感染を有する者及び急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ；ａｄｕｌｔ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を有する患者の血液中に検出される。これは、好中球パラドックスの例である。肺内へのこれらの細胞の大規模な流入並びに活性化された好中球から放出された酸化体及び加水分解酵素によって引き起こされた付随する組織損傷のために、好中球は、この症状の病変に関与していると推定されている。ＡＲＤＳが悪化するにつれて起こる好中球殺菌活性の障害は、炎症性産物によって局所的に誘導される宿主の一部に対する保護的応答であり得る。
【００５２】
熱的傷害の急性期には、好中球の活性化も伴い、これには、様々な好中球機能の全般的な障害が後続する。滑液中の免疫複合体による好中球の活性化は、関節リウマチの病変に寄与する。好中球によって生成された幾つかのＲＯＩはＤＮＡを傷つけ、プロテアーゼは腫瘍細胞の遊走を促進するので、好中球の慢性的な活性化は腫瘍の発達も開始し得る。重度の火傷を負った患者では、細菌感染の開始と抗体及び補体受容体に対して陽性な好中球の割合及び絶対数の低下との間に相関が確定されている。好中球起源の酸化体は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も酸化することが示されており、次いで、ＬＤＬは、特異的なスカベンジャー受容体を通じて、マクロファージの形質膜へより効果的に結合される。マクロファージによるこれらの酸化されたＬＤＬの取り込みは、アテローム性動脈硬化を開始し得る。さらに、抗原刺激された好中球は、本態性高血圧、ホジキン病、炎症性腸疾患、乾癬、サルコイドーシス及び敗血症を有する者に見出されており、この場合、初回抗原刺激は循環ＴＮＦ−α（カヘクチン）の高濃度と相関している。
【００５３】
抗酸化剤及びアンチプロテアーゼスクリーンが圧倒されると、宿主組織への加水分解性損傷が、従って慢性炎症症状が起こり得る。アンチプロテアーゼの欠乏は、肺気腫の病変の原因であると考えられる。多くのアンチプロテアーゼは、セリンプロテアーゼ阻害剤（ＳＥＲＰＩＮ）ファミリーのメンバーである。循環はアンチプロテアーゼに富んでいるが、好中球はそれらの標的に接着するので、これらの巨大タンパク質は、炎症部位において、選択的に除外され得る。酸化的ストレスは、放出されたプロテアーゼを阻害するために必要とされるレベルを下回るまで、細胞外アンチプロテアーゼの濃度を低下させることによって、組織損傷を開始し得る。塩素化された酸化体及び過酸化水素は、α−プロテアーゼ阻害剤及びα２−マクログロブリン（これらは、内在性のエラスターゼ阻害剤である。）などのアンチプロテアーゼを不活化することができるが、同時に、アンチプロテアーゼのさらなる不活化に寄与するコラーゲナーゼ及びゼラチナーゼなどの潜在型メタロプロテアーゼを活性化する。
【００５４】
好中球の細胞質成分も、全身性血管炎及び糸球体腎炎の発達に密接に関連している特異的な抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）の形成の原因でもあり得る。ＡＮＣＡは、主として、好中球のアズール親和性又は一次顆粒内に見出される酵素に対して誘導される抗体である。エタノール固定された正常な好中球に対する間接的免疫蛍光による、これらが産生するパターンによって区別することができるＡＮＣＡの３つの種類が存在する。ウェゲナー肉芽腫中、顕微鏡的多発性動脈炎及びチャーグ・ストラウス症候群の幾つかの症例、並びに半月状及び分節性壊死性糸球体腎炎の幾つかの症例では、通例、拡散性の微少顆粒細胞質蛍光（ｃＡＮＣＡ）が見出される。標的抗原は、通常、プロテイナーゼ３である。顕微鏡的多発性動脈炎及び糸球体腎炎の多くの症例には、核周囲蛍光（ｐＡＮＣＡ）が見出される。これらの抗体は、しばしばミエロペルオキシダーゼに対するが、他の標的には、エラスターゼ、カテプシンＧ、ラクトフェリン、リゾチーム及びβ−Ｄグルクロニダーゼが含まれる。「非典型的な」ＡＮＣＡと表記される第三の群には、好中球の核蛍光及び幾つかの異常な細胞質パターンが含まれ、標的抗原の幾つかはｐＡＮＣＡと共有されているのに対して、他の標的抗原は未だ同定されていない。ｐＡＮＣＡは、クローン病を有する患者の１／３にも見出されている。関節リウマチ及びＳＬＥ中におけるＡＮＣＡの報告された発生率は、大幅に変動するが、パターンは、主に、ｐＡＮＣＡ及び非典型的なＡＮＣＡである。
【００５５】
好酸球は、主に粘膜下組織中に存在する、高度に分化した最終段階の白血球であり、アレルギー性疾患を含む特異的な免疫反応の部位に動員される。好酸球細胞質は、電子密度が高い結晶性の核及び部分的に透過性のマトリックスを有する巨大な楕円体顆粒を含有する。これらの巨大な一次晶質顆粒の他に、より小さく（小顆粒）、結晶性核を欠如する別の顆粒の種類が存在する。好酸球の巨大な特定の顆粒は、主要塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、好酸球陽イオン性タンパク質（ＥＣＰ）、好酸球由来神経毒（ＥＤＮ）及び好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）という少なくとも４つの異なる陽イオン性タンパク質を含有し、これらは、宿主細胞及び微生物標的に対して多岐にわたる生物学的効果を発揮する。好塩基球は、ＥＤＮ、ＥＣＰ及びＥＰＯの検出可能な量と一緒に、好酸球の約１／４の主要塩基性タンパク質を含有する。ＥＤＮ及びＥＣＰの少量は、好中球の中にも見出される（Ｇｌｅｉｃｈ  ＧＪ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００；１０５：６５１−６６３）。ＭＢＰは、酵素活性を欠如しているようであるが、脂質膜との相互作用によってその有毒な活性を発揮して、それらの撹乱を引き起こし得る高度に陽イオン性のポリペプチドである。ＭＢＰ及びＥＰＯは何れも、Ｍ２ムスカリン作動性受容体へのアゴニスト結合の選択的アロステリック阻害剤として作用することができる。これらのタンパク質は、Ｍ２受容体機能不全に寄与し、喘息における迷走神経性に媒介された気管支収縮を増強し得る。ＥＤＮは、神経細胞のミエリンコートに対して特異的に損傷を与えることができる。ヒスタミナーゼ及び様々な加水分解性リソゾーム酵素は、好酸球の巨大な特定顆粒中にも存在する。好酸球の小顆粒中の酵素としては、アリールスルファターゼ、酸性ホスファターゼ及び９２ｋＤａメタロプロテイナーゼ、ゼラチナーゼがある。好酸球は、好酸球に対する潜在的自己分泌型増殖因子活性を有するサイトカイン並びに急性及び慢性炎症応答において潜在的な役割を有するサイトカインを含むサイトカインを加工することができる。顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＬ−３及びＩＬ−５という３つのサイトカインが、好酸球に対して成長因子活性を有する。急性及び慢性炎症性応答において活性を有し得るヒト好酸球によって産生された他のサイトカインには、ＩＬ−１−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α及び両トランスフォーミング成長因子ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βが含まれる。
【００５６】
好酸球は、ＭＢＰ、好酸球陽イオン性タンパク質、ＥＰＯ及び好酸球由来神経毒を含有する晶質顆粒を含有する（Ｇｌｅｉｃｈ，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００；１０５：６５１−６６３）。ＥＰＯの分泌を調べるために、ヒト前骨髄球性細胞株ＨＬ−６０クローン１５を使用することができる。この細胞株は、２ヶ月間、上昇したｐＨで増殖され（Ｆｉｓｃｈｋｏｆｆ，Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ  １９８８；１２：６７９−６８６）、次いで、細胞を分化させて、好酸球特異的顆粒タンパク質の発現を含む末梢血好酸球の特徴の多くを呈するように酪酸で処理されたＨＬ−６０のクローンから確立された（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８９；１７０：１６３−１７６；Ｔｉｆｆａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  １９９５；５８：４９−５４；Ｂａｄｅｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ２００２；２２７：６４５−６５１）。
【００５７】
好酸球は、特に、２つの脂質炎症媒介物質であるロイコトリエンＣ４（ＬＴＣ４）及び血小板活性化因子（ＰＡＦ）を通じて、過敏症反応に関与することができる。これらの媒介物質の両方とも、気道の平滑筋を収縮させ、粘液の分泌を促進し、血管透過性を変化させ、並びに好酸球及び好中球浸潤を惹起させる。これらの好酸球由来媒介物質の直接的な活性に加えて、ＭＢＰは好塩基球及び肥満細胞からのヒスタミンの放出を刺激することができ、並びにＭＢＰは肥満細胞からのＥＰＯの放出を刺激することができる。好酸球は、特異的な脂質媒介物質の局所的な源としての役割を果たすことができる他、肥満細胞及び好塩基球からの媒介物質の放出を誘導することができる。好酸球顆粒の内容物は、好中球顆粒への類似の刺激の後に（例えば、オプソニン化された粒子の食作用の間に）、及び走化性因子によって放出される。好中球のリソゾーム酵素は、主としてファゴリソソーム中に貪食された物質に対して作用するのに対して、好酸球顆粒の内容物は、主に寄生虫及び炎症媒介物質などの細胞外標的構造に対して作用する。
【００５８】
単球及びマクロファージの発育は、骨髄中で起こり、以下の段階を経る。幹細胞、単分化能幹細胞（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、単芽球、前単球、骨髄中の単球、末梢血中の単球及び組織中のマクロファージ。骨髄中での単球の分化は、急速に進行する（１．５から３日）。分化の間に、顆粒は単球の細胞質中で形成され、これらは、好中球内におけると同様に、少なくとも２つの種類へ分化され得る。しかしながら、それらは、好中球の対応物（アズール親和性及び特異的顆粒）より数が少なく、小さい。それらの酵素含量は類似している。
【００５９】
単球／マクロファージの顆粒結合型酵素には、リゾチーム、酸ホスファターゼ及びβ−グルクロニダーゼが含まれる。インビボ研究のためのモデルとして、Ｕ９３７細胞からのリゾチーム分泌が使用された。この細胞株は、ヒト組織球性のリンパ腫に由来し、ＰＭＡなどの様々なアゴニストによって活性化され得る単球系細胞株として使用されてきた（Ｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  １９９２；５２：１７３−１８２；Ｂａｌｂｏａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１７０：５２７６−５２８０；Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，ｌｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９７６；１７：５６５−５７７）。
【００６０】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び細胞傷害性リンパ球は、パーフォリンなどの強力な細胞毒性顆粒、膜孔形成タンパク質及びグランザイム、リンパ球特異的セリンプロテアーゼを含有する。例えば、ＮＫ−９２細胞株は、急速に進行する非ホジキンリンパ腫を有する患者から確立されたＩＬ−２依存性ヒト株である（Ｇｏｎｇ  ＪＨ．，Ｍａｋｉ  Ｇ，Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＮＫ−９２）  ｗｉｔｈ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １９９４；８：６５２−６５８）。ＮＫ−９２細胞は、多様な悪性細胞を標的とするパーフォリン−グランザイム細胞溶解性経路に関与する分子の高いレベルを発現する（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，以下参照，ａｎｄ  Ｍａｋｉ  Ｇ，Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ，Ｍａｒｔｉｎｓｏｎ  ＪＡ，Ｔａｍ  ＹＫ．Ｆａｃｔｏｒｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ，ＮＫ−９２．  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２００１；１０：３６９−３８３）。
【００６１】
グランザイムは、細胞傷害性Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞内の細胞質顆粒によって放出される外来性セリンプロテアーゼである。グランザイムは、ウイルスに感染した細胞内のアポトーシスを誘導し、これにより、ウイルスに感染した細胞を破壊することができる。
【００６２】
顆粒球（又は白血球）からの炎症の媒介物質（炎症媒介物質）の細胞外放出及び顆粒球（又は白血球）からの２以上の炎症の媒介物質（炎症媒介物質）の細胞外放出は、本明細書において、時に脱顆粒と称されることがある。好ましい実施形態において、炎症の媒介物質の放出は、顆粒球又は白血球の内部に位置する顆粒からの前記媒介物質の放出を含む。炎症媒介物質の放出は、好ましくは、これらの顆粒からの炎症媒介物質の放出である。
【００６３】
好中球及びマクロファージは、ＴＮＦαなどの炎症促進因子（炎症刺激物質）による初発刺激に際して、それらのＭＡＲＣＫＳタンパク質の合成を劇的に増加させ、ＴＮＦα又はリポ多糖（ＬＰＳ）の何れかに応答して好中球によって形成される新規タンパク質の９０％がＭＡＲＣＫＳである（Ｔｈｅｌｅｎ  Ｍ，Ｒｏｓｅｎ  Ａ，Ｎａｉｒｎ  ＡＣ，Ａｄｅｒｅｍ  Ａ．Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｍｏｄｉｆｉｅｓ  ａｇｏｎｉｓｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９０；８７：５６０３−５６０７）。従って、ＭＡＲＣＫＳは、好中球及びマクロファージなどの顆粒含有細胞が、アゴニストによって刺激されたときに、炎症媒介物質、特にＰＫＣを活性化することによって作動する炎症媒介物質のその後の放出において重要な役割を果たすことができる（Ｂｕｒｇｏｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２００３；８３：５８１−６３２；Ｌｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１１１：９２３−９３２；Ｓｍｏｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９０；１０５２：１３３−１４２；Ｎｉｅｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９９４；１２２３：２６７−２７３；Ｎａｕｃｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ２００２；７１：７０１−７１０）。
【００６４】
本発明の一態様において、対象中の炎症部位（該炎症部位は、前記対象中の炎症部位での、疾病、症状、外傷、外来体又はこれらの組み合わせの進入の開始から生じる。）への、本明細書に記載されているＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の脱顆粒阻害量の投与は、前記炎症部位での浸潤白血球（白血球は、好ましくは顆粒球である。）から放出された炎症の媒介物質の量を低下させることができ、ＭＡＮＳペプチド及び／又は少なくとも１つのその活性断片の投与は、炎症部位中に浸潤する顆粒球などの白血球から放出される炎症の媒介物質の量を低下させることができる。ＭＡＮＳペプチドの脱顆粒阻害量又はその活性断片の脱顆粒阻害量は、前記部位中に浸潤する炎症細胞内に含有される顆粒からの炎症媒介物質の開口分泌性放出を低下させ又は阻害するのに十分である。脱顆粒阻害の効果は、ＭＡＮＳペプチドの不存在下及び／又はその活性断片の不存在下において、ほぼ同じ時点で放出又は産生された炎症の媒介物質のレベル又は量又は濃度に対して、前記細胞（白血球又は顆粒球又は他の炎症細胞）からの炎症の媒介物質の放出の阻害％（すなわち、低下のパーセント）を比較することによって、ＭＡＮＳペプチド又はその断片の投与後のある時点で測定される。さらに、当業者は、ＭＡＮＳペプチド及び／又はその活性断片の十分な又は治療的有効量が投与されたかどうかを決定するために、疾病の指標として知られている症候及び炎症のパラメータを測定することによって、組織部位における炎症が低下したかどうかを決定することができる。十分な脱顆粒阻害量は、炎症の部位において、顆粒球から放出された炎症の媒介物質の低下のパーセントであり、同じ条件下で検査されたＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の不存在下で前記顆粒球から放出された炎症の前記媒介物質の量の約１％から約９９％、好ましくは、５％から約９９％、より好ましくは、約１０％から約９９％、さらに好ましくは、約２５％から９９％、さらに好ましくは約５０％から約９９％である。
【００６５】
本発明の一態様において、動物中の炎症刺激の部位へのＭＡＮＳペプチドの脱顆粒阻害量の投与は（前記炎症刺激の部位は、当該部位への炎症刺激物質の炎症刺激量の投与によって作り出される。）、顆粒球から放出される炎症の媒介物質の量を低下させることができ、前記顆粒球は、前記炎症刺激物質の同一の炎症刺激量の存在下で、ＭＡＮＳペプチドの不存在下において、前記顆粒球から放出される炎症の前記媒介物質の量の約１％から約９９％、好ましくは、５％から約９９％、より好ましくは、約１０％から約９９％、さらに好ましくは、約２５％から約９９％、さらに好ましくは約５０％から約９９％まで、炎症刺激の前記部位において、前記炎症刺激物質によって刺激される。
【００６６】
本発明の別の態様において、動物中の炎症刺激の部位へのＭＡＮＳペプチドの脱顆粒阻害量の投与は（前記炎症刺激の部位は、当該部位への炎症刺激物質の炎症刺激量の投与によって作り出される。）、顆粒球から放出される炎症の媒介物質の量を低下させることができ、前記顆粒球は、前記炎症刺激物質の同一の炎症刺激量の存在下で、ＭＡＮＳペプチドの不存在下において前記顆粒球から放出される炎症の前記媒介物質の量の１００％、炎症刺激の前記部位において、前記炎症刺激物質によって刺激される。
【００６７】
本明細書中のインビトロでの実施例において使用された炎症刺激物質の例は、フォルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ）である。単球化学誘引タンパク質（ＭＣＰ−１）は、好塩基球の脱顆粒において、Ｃ５ａとほぼ同程度に有効であり、ＩＬ−８よりずっと強力であって、ヒスタミンの放出をもたらす。ヒスタミン放出は、ケモカイン（すなわち、化学誘引サイトカイン）、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＩＰ−１での刺激後に生じ得る。
【００６８】
好ましい実施形態において、炎症刺激部位に存在するＭＡＲＣＫＳペプチドの基底濃度に比べて、動物中の炎症刺激部位に投与されたＭＡＮＳペプチドの脱顆粒阻害量は、前記炎症刺激部位におけるＭＡＲＣＫＳペプチドの約１倍から約１，０００，０００倍の濃度、好ましくは、前記炎症刺激部位におけるＭＡＲＣＫＳペプチドの濃度の約１倍から約１００，０００倍、より好ましくは、前記炎症刺激部位におけるＭＡＲＣＫＳペプチドの濃度の約１倍から約１０，０００倍、さらに好ましくは、前記炎症刺激部位におけるＭＡＲＣＫＳペプチドの約１倍から約１，０００倍の濃度、さらに好ましくは、前記炎症刺激部位におけるＭＡＲＣＫＳペプチドの約１倍から約１００倍の濃度、及び、さらに好ましくは、前記炎症刺激部位におけるＭＡＲＣＫＳペプチドの約１倍から約１０倍の濃度を含む。
【００６９】
好ましい実施形態において、顆粒球は、動物、好ましくはヒトの気道上又は気道中に存在し、ＭＡＮＳペプチドは、ＭＡＮＳペプチドを含む医薬組成物、例えば、ＭＡＮＳペプチドと水溶液を含む医薬組成物（組成物はエアロゾルの形態で投与される。）又は乾燥粉末形態のＭＡＮＳペプチドを含む医薬組成物（組成物は乾燥粉末吸入器を用いて投与される。）の吸入によるなど、吸入によって投与される。例えば、液滴、スプレー及び噴霧器などの吸入による溶液又は粉末の投与のための、本分野で公知の他の方法及び装置が有用であり得る。
【００７０】
幾つかの実施形態において、本発明のペプチドは、基礎分泌機能を含む生理的に重要な分泌プロセスを遮断し得る。本発明者らは本発明の特定の理論に拘泥することを望むものではないが、このような基礎分泌を制御する機序は刺激された分泌を制御する機序とは異なるものと考えられている。あるいは、基礎分泌機序は、刺激された分泌より少ないＭＡＲＣＫＳタンパク質を必要とし得る。ＭＡＲＣＫＳによって媒介される分泌を遮断するための全ての治療法は全てのＭＡＲＣＫＳ機能を除去し得るとは限らないので、基礎分泌は保存され得る。
【００７１】
本明細書において使用される「ＭＡＲＣＫＳヌクレオチド配列」という用語は、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列、遺伝子のＤＮＡ配列、あらゆる転写されたＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ転写物のＲＮＡ配列及びタンパク質に結合されたＤＮＡ又はＲＮＡなど、ＭＡＲＣＫＳタンパク質をコードする遺伝子に由来するすべてのヌクレオチド配列を表す。
【００７２】
ＭＡＲＣＫＳ遮断ペプチドの正確な送達は、重要な分泌プロセスを遮断するあらゆる潜在的な制約も克服し得る。このような因子を呼吸器へ送達することは、吸入製剤を用いて容易に達成されるはずである。これらの因子は、炎症性腸疾患を治療する上で有用であり得るので、浣腸又は坐剤を用いて、直腸／大腸／腸管中に遮断剤を送達することを想定することができる。炎症状態の関節中への注射又は経皮送達は、局所化された炎症細胞からの分泌を制限することによって、関節疾患又は自己免疫疾患を有する患者に対して緩和を与え得る。神経末端を取り囲む領域中への注射は、神経伝達物質の幾つかの種類の分泌を阻害し得、重い疼痛又は制御されない筋痙攣の伝達を遮断し得る。炎症性皮膚疾患の治療のためのペプチドの送達は、本分野で公知の様々な局所製剤を用いて容易に達成されるはずである。
【００７３】
広く分布したＰＫＣの基質であるミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質（ＭＡＲＣＫＳ）は、正常なヒト気管支上皮（ＮＨＢＥ）細胞によるムチン顆粒の放出を媒介する中心的な制御分子であり得ることが示されている。これらの細胞からのムチンの分泌は、ＰＫＣ及びＰＫＧの両者の活性化によって最大化され得る。ＭＡＲＣＫＳは、ムチン顆粒放出を調節するために、これら２つのタンパク質キナーゼの作用を協調させるための収束点としての役割を果たすと考えられている。この機序は、ＭＡＲＣＫＳのＰＫＣ依存性リン酸化を含むものと思われ、前記リン酸化は、形質膜から細胞質中へＭＡＲＣＫＳを放出させ、次いで、細胞質中で、ＭＡＲＣＫＳは、ＰＫＧによって活性化されるタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰＡ２Ａ）によって脱リン酸化される。この脱リン酸化によって、ＭＡＲＣＫＳはその膜結合能を再獲得することができ、細胞質のムチン顆粒の膜への付着が可能となる。さらに、ＭＡＲＣＫＳは、細胞質中のアクチン及びミオシンと相互作用して、顆粒を細胞の収縮性装置に係留することが可能となり得、従って、その後の顆粒の運動及び開口分泌を媒介し得る。好中球からの炎症媒介性ＭＰＯの分泌は、（図１１から１５に図示されているように）ＰＫＣとＰＫＧの両者の活性化によっても最大化され得る。ＭＡＲＣＫＳは、炎症細胞中の膜結合型区画からの分泌（すなわち、好中球からのＭＰＯの分泌）を調節するこれら２つのタンパク質キナーゼの作用を協調させるための収束点としての役割を果たすことが可能である。
【００７４】
本発明は、ＰＫＣとＰＫＧの両者の同時活性化によって、イヌ又はヒト好中球からの炎症媒介物質ＭＰＯの分泌が増強されるのに対して、何れかのキナーゼ単独の活性化は、最大の分泌応答を誘導するのに不十分であったことを示している。ＰＭＡ単独に対する増強された分泌応答は、ＮＨＢＥ細胞（図１、列４）及び好中球（図１１）に記載されているが、応答の規模は、ラット杯様細胞株中で、他者によって観察されたものよりずっと小さかった。Ａｂｄｕｌｌａｈ  ｅｔ  ａｌ，上記参照。さらに、ｃＧＭＰ類縁体が培養されたモルモット気管上皮細胞からの著しいムチン分泌を誘導し得ることが以前に報告されたが（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，上記）、この応答が曝露の８時間まで、有意なレベルに達しなかったことを銘記すべきである。このような長い遅延期間を有する分泌応答が直接的効果である可能性は少なく、おそらくは、予め形成され、貯蔵された細胞質顆粒の放出ではなく、新規タンパク質合成を伴う。それにも関わらず、ＰＫＣ及びＰＫＧの両者の協調的活性化を伴う明白な相乗効果は、ムチン分泌及び／又は炎症媒介物質を媒介する複雑で、厳密なシグナル伝達機序を示唆し得る。出願人は、以下に開示されている経路が好中球からの炎症媒介物質放出を研究するために使用されたこと、及び杯細胞分泌を研究するために使用されたものと同じ経路であると思われることに注目する。
【００７５】
上述のように、本発明は、医薬製剤中において使用され得る。ある種の実施形態において、薬物産物は、経口投与に適切であり得る固体医薬組成物中に存在する。本発明の固体組成物を形成し、賦形剤とともに混合し得、及び／又は賦形剤によって希釈し得る。固体組成物は、例えば、カプセル、におい袋、錠剤、紙又は他の容器の形態であり得る担体内にも封入され得る。賦形剤が希釈剤として役割を果たす場合には、賦形剤は組成物に対するビヒクル、担体又は媒体として作用する固体、半固体又は液体材料であり得る。
【００７６】
様々な適切な賦形剤が当業者によって理解され、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，１９：２４０４−２４０６（２０００）（２４０４ページから２４０６ページの開示内容全体が、本明細書中に組み込まれる。）中に見出され得る。適切な賦形剤の例には、デンプン、アラビアゴム、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、メタクリラート、セラック、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ及びメチルセルロースが含まれるが、これらに限定されない。薬物製品製剤は、さらに、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油などの潤滑剤；湿潤剤；乳化剤及び懸濁剤；ヒドロキシ安息香酸メチル及びプロピルなどの防腐剤；甘味剤又は着香剤を含むことができる。ポリオール、緩衝液及び不活性充填剤も使用し得る。ポリオールの例には、マニトール、ソルビトール、キシリトール、スクロース、マルトース、グルコース、ラクトース、デキストロースなどが含まれるが、これらに限定されない。適切な緩衝剤には、ホスファート、シトラート、タートラート、スクシナートなどが含まれるが、これらに限定されない。使用され得る他の不活性充填剤には、本分野で公知である不活性充填剤が含まれ、様々な剤形の製造において有用である。所望であれば、固体製剤は、増量剤及び／又は顆粒化剤などの他の成分を含み得る。本発明の薬物製品は、本分野で周知の操作を使用することによって患者に投与した後、活性成分の迅速な放出、持続的放出又は遅延した放出を与えるように製剤化され得る。
【００７７】
経口投与用の錠剤を形成するために、本発明の組成物は、直接的な圧縮工程によって作製され得る。本工程では、活性な薬物成分は、例えば、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マニトール、デンプン、アミロペクチン、セルロース誘導体又はゼラチン及びこれらの混合物などの固体、粉状（ｐｕｌｖｅｒａｎｔ）担体と、並びに、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム及びポリエチレングリコール蝋などの減摩剤と混合され得る。次いで、混合物は、所望の錠剤サイズを得るために、適切な穿孔機と金型を備えた機械を用いて、打錠され得る。機械の動作パラメータは、当業者によって選択され得る。あるいは、経口投与用錠剤は、湿式造粒法によって形成され得る。活性な薬物成分は、賦形剤及び／又は希釈剤と混合され得る。固体物質は、所望の粒子サイズへすりつぶされ、又は篩をかけられ得る。薬物に、結合剤を添加し得る。結合剤は、適切な溶媒中で懸濁され、及び均質化され得る。活性成分及び補助剤は、結合剤溶液とも混合され得る。生じた乾燥混合物は、溶液で、均一に湿らせられる。湿らせることによって、通例、粒子に若干の凝集が発生し、生じた塊は、所望のサイズを有するステンレス鋼の篩を通して圧縮される。次いで、所望の粒子サイズと稠度を達成するのに必要な時間の決定された長さにわたって、制御された乾燥単位で混合物が乾燥される。乾燥された混合物の顆粒は、何れかの粉末を除去するために篩にかけられる。この混合物に、崩壊剤、減摩剤及び／又は粘着防止剤が添加され得る。最後に、混合物は、所望の錠剤サイズを得るために、適切な穿孔機と金型を備えた機械を用いて、打錠される。機械の動作パラメータは、当業者によって選択され得る。
【００７８】
被覆された錠剤が望ましければ、上記調製されたコアは、アラビアゴム、ゼラチン、タルク、二酸化チアンを含有し得る糖若しくはセルロースポリマーの濃縮溶液で、又は揮発性有機溶媒若しくは溶媒の混合物中に溶解されたラッカーで被覆され得る。錠剤を異なる活性化合物と区別し、又は存在する活性化合物の異なる量と区別するために、このコーティングに、様々な色素を添加し得る。特定の実施形態において、活性成分は、腸溶コーティング層を含む１つ又はそれ以上の層によって取り囲まれているコア中に存在し得る。
【００７９】
カプセルが活性成分及び植物油の混合物を含有する軟ゼラチンカプセルを調製し得る。硬ゼラチンカプセルは、例えば、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マニトール、ポテトスターチ、コーンスターチ、アミロペクチン、セルロース誘導体及び／又はゼラチンなどの固体粉状担体と組み合わせて、活性成分の顆粒を含有し得る。
【００８０】
経口投与用の液体調製物は、シロップ又は懸濁液、例えば、活性成分、糖並びにエタノール、水、グリセロール及びプロピレングリコールの混合物を含有する溶液の形態で調製され得る。所望であれば、このような液体調製物は、以下のうちの１つ又はそれ以上：着色剤、着香剤及びサッカリンを含み得る。カルボキシメチルセルロースなどの濃縮剤も使用され得る。
【００８１】
上記医薬が非経口投与のために使用されるべき場合には、このような製剤は、本発明の組成物を含む無菌水性注射溶液、非水性注射溶液又は両方を含み得る。注射水溶液が調製される場合には、組成物は、医薬として許容される水溶性の塩として存在し得る。非経口調製物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び製剤を意図される服用者の血液と等張にする溶質を含有し得る。水性及び非水性無菌懸濁液は、懸濁剤及び濃縮剤を含み得る。製剤は、単位投薬又は複数投薬容器、例えば、密封された注射器及び容器中に存在し得る。即興の注射溶液及び懸濁液は、既に述べられた種類の、滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製し得る。
【００８２】
局所投与（例えば、スキンクリーム）に適切であり得るように、組成物を調合することもできる。これらの製剤は、当業者に公知の様々な賦形剤を含有し得る。適切な賦形剤には、セチルエステル蝋、セチルアルコール、白ろう、モノステアリン酸グリセリル、プロピレングリコール、モノステアラート、ステアリン酸メチル、ベンジルアルコール、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、鉱物油、水、カルボマー、エチルアルコール、アクリラート接着剤、ポリイソブチレン接着剤及びシリコーン接着剤が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００８３】
ここに、本発明を記載してきたが、例示のみを目的とて本明細書に含められ、本発明を限定することを意図したものではないある種の実施例を参照することによって、本発明が例示される。
【実施例】
【００８４】
実施例
ＮＨＢＥ細胞からのムチン過剰分泌はＰＫＣとＰＫＧの両方の活性化を伴う
ムチン分泌プロセスにおけるＰＫＣ及び／又はＰＫＧの潜在的な役割を決定するために、以下の２つの特異的なタンパク質キナーゼ活性化物質にＮＨＢＥ細胞を曝露した。ＰＫＣの活性化に関しては、フォルボールエステル、フォルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ）及びＰＫＧの活性化に関しては、非加水分解性のｃＧＭＰ類縁体８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ。様々な濃度で、異なる時間にわたって（最大１μＭ、２時間）、ＰＭＡ刺激に応答するムチン分泌を調べる予備的研究は、ＰＫＣ単独の活性化はＮＨＢＥ細胞から有意なムチン分泌を誘導しなかったが、中程度の分泌応答が、１００ｎＭより高いＰＭＡ濃度で繰り返し観察されたことを示した（０．０５＜ｐ＜０．１）。また、細胞は、最高５００μＭの濃度で、最大２時間曝露しても、ｃＧＭＰ類縁体に対して応答しなかった。しかしながら、ＰＫＣ及びＰＫＧの二重活性化に影響を与えるＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの組み合わせは、分泌の急速な増加（曝露の１５分以内に、ほぼ、分泌を倍増）を誘発した（図１Ａ）。ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰによって誘導されたこの分泌応答は濃度依存性であり、１００ｎＭＰＭＡ＋１μＭ８−Ｂｒ−ｃＧＭＰにおいて最大の刺激であった（図１Ｂ及び１Ｃ）。図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃでは、ＮＨＢＣ細胞は、表記の試薬又は培地のみ（ＣＴＬ）に、１５分間曝露された。図１Ｄでは、ＮＨＢＥ細胞は、表記阻害剤とともに１５分間、予め温置され、次いで、１００μＭＵＴＰで２時間刺激された。この処理に応答して分泌されたムチンを集めて、ＥＬＩＳＡによってアッセイを行った。データは、平均±標準誤差として表されている（各点ｎ＝６）。＊は、溶媒対照と有意に異なることを表し（ｐ＜０．０５）、＃は溶媒対照と異なることを表し（０．０５＜ｐ＜０．１）、‡はＵＴＰ刺激と有意に異なることを表すＣＤ＜０．０５）。
【００８５】
ＵＴＰは、十分に確定された病態生理的に関連するムチン分泌促進物質である。Ｌｅｔｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．ＣｅｌｌＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．９，３１５−３２２（１９９３）。本発明は、さらに、２時間の曝露後に、様々な濃度、好ましくは４０から１４０μＭのＵＴＰが、ＮＨＢＥ細胞からのムチン分泌の有意な増加を誘導し得ることを示す。ＰＫＣ及びＰＫＧが病態生理的な刺激に応答してムチン分泌の制御に関与していたかどうかを決定するために、ＵＴＰによって誘導されたムチン分泌に対するＰＫＣ／ＰＫＧ阻害剤の効果を調べた。ＮＨＢＥ細胞を、様々な阻害剤とともに１５分間、予め温置し、次いで、阻害剤を加えたＵＴＰ（１００μＭ）に、２時間曝露した。ＥＬＩＳＡによって、分泌されたムチンを測定した。分泌応答が、ＰＫＣ阻害剤カルフォスチンＣ（５００ｎＭ）、ＰＫＧ阻害剤Ｒｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰ（１０μＭ）又は可溶性グアニリルシクラーゼ（ＧＣ−Ｓ）阻害剤ＬＹ８３５８３（５０μＭ）によって独立に弱められたのに対して、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）阻害剤ＫＴ５７２０（５００ｎＭ）によっては弱められないように見受けられたので（図１Ｄ）、結果は、ＵＴＰによって誘発されたムチン分泌がＰＫＣとＰＫＧ活性の両方を必要とし得ることを示唆した。明らかに、ＮＨＢＥ細胞中でのムチン分泌は、ＰＫＣとＰＫＧの両方を伴うシグナル伝達機序によって制御され得る。
【００８６】
分泌プロセスへのＰＫＧの関与を調べるために、これらの研究において、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰを使用した。８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの第一の生理的効果はＰＫＧを活性化することであるが、幾つかの細胞では、ｃＧＭＰ開口型イオンチャンネルに対するアゴニストとして作用し、高濃度ではＰＫＡを交叉活性化することも報告されている。ｃＧＭＰ開口型イオンチャンネル及び／又はＰＫＡがＮＨＢＥ細胞によるムチン分泌において役割を果たし得るという可能性を除外するために、Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（８−Ｂｒ−ｃＧＭＰと同様に、ｃＧＭＰ開口型イオンチャンネルを活性化することができるが、ＰＫＧ活性を阻害する特有のｃＧＭＰ類縁体）をアゴニストとして使用して、ムチン放出に対するＰＫＧ及びｃＧＭＰ開口型イオンチャンネルの効果を区別した。図に示されているように、特に図１Ａ（列１１）に示されているように、ＰＭＡとともに細胞に添加されたときに、Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＧＭＰはムチン分泌を増強しなかった。同様に、特異的なＰＫＡ阻害剤であるＫＴ５７２０（５００ｎＭ）は、ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ又はＵＴＰの何れかによって誘導されたムチン分泌に影響を与えなかった（図１Ｄ、列４）。これらの研究は、ｃＧＭＰ開口型イオンチャンネル又はＰＫＡがムチン分泌と関連しているという可能性を否定し得、ＮＨＢＥ細胞中のＰＫＧの活性化が、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰが増強された分泌に寄与する機序であることを示唆している。さらに、ＵＴＰによって誘導されたムチン過剰分泌は、可溶性グアニリルシクラーゼ（ＧＣ−Ｓ）阻害剤ＬＹ８３５８３によって弱められ得るので、ＰＫＧの活性化は、分化したモルモット気管上皮細胞において、以前インビトロで示されたように、酸化窒素（ＮＯ）−＞ＧＣ−Ｓ−＞ｃＧＭＰ−＞ＰＫＧというシグナル伝達経路を介して起こる。
【００８７】
ムチン分泌プロセスへのＰＫＣ及びＰＫＧの両者の関与に鑑みて、本発明は、キナーゼ活性化の下流のシグナル伝達現象において役割を果たし得るこれらの酵素の細胞内基質の候補を調査する。多数の細胞内基質がＰＫＣ又はＰＫＧによってリン酸化され得るが、１つのこのような基質であるＭＡＲＣＫＳタンパク質のＰＫＣによるリン酸化は、特に、興味深いと思われる。ＭＡＲＣＫＳのリン酸化は、細胞移動、有糸分裂誘発及び神経伝達物質放出など、ＰＫＣシグナル伝達及び細胞骨格の収縮を伴う多数の細胞プロセスと相関することが観察されている。分泌の動的プロセスには、キナーゼの活性化と細胞内顆粒の細胞周囲への転位の両方を必要とするので、ＭＡＲＣＫＳは、ＰＫＣ／ＰＫＧ活性化とムチン顆粒開口分泌を結び付ける媒介物質分子の候補と思われる。
【００８８】
ＭＡＲＣＫＳは、ＰＫＣ／ＰＫＧ活性化をＮＨＢＥ細胞中でのムチン分泌と関連付ける中心的分子である
タンパク質キナーゼ活性化の下流のシグナル伝達機序を明らかにするために、キナーゼの活性化を顆粒放出と関連付ける上で役割を果たしている可能性があるＰＫＣの特異的な細胞基質であるＭＡＲＣＫＳタンパク質について研究した。第一に、［３Ｈ］ミリスチン酸によって標識された免疫沈降アッセイによって、ＮＨＢＥ細胞中のＭＡＲＣＫＳの存在が確認された。図２Ａに示されているように、ＭＡＲＣＫＳはＮＨＢＥ細胞中で発現され、このタンパク質の多くは、非刺激条件下において、膜に会合していた。図２Ａでは、［３Ｈ］ミリスチン酸で細胞を一晩標識し、次いで、分画遠心法によって、膜（レーン１）及びサイトゾル（レーン２）画分を単離した。ムチン分泌経路の中心的な制御成分としてのＭＡＲＣＫＳに対する役割が、３つの異なる方法で示され得る。
【００８９】
上述のように、ＮＨＢＥ細胞によるムチン分泌へのＭＡＲＣＫＳの直接的関与は、３つの別個の証拠によって実証され得る。第一に、ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ又はＵＴＰによる刺激に応じたムチン分泌は、ＭＡＮＳペプチド（ＭＡＲＣＫＳのＮ末端領域と同一のアミン酸配列を有した。）によって濃度依存的な様式で阻害されたのに対して、同一のアミノ酸組成を含有するが、ランダムな順序で配置されている対応する対照ペプチド（ＲＮＳ）は分泌に影響を与えなかった。ＭＡＲＣＫＳのＮ末端ミリストイル化されたドメインは、ＭＡＲＣＫＳ膜会合を媒介することが知られている。図８に示されているように、ＭＡＲＣＫＳは、そのＮ末端ドメインにおいて、顆粒膜と相互作用し、アクチン繊維へそのＰＳＤ部位において結合することによって分子リンカーとして機能し得、これにより、移動及び開口分泌のために、収縮性細胞骨格に顆粒を係留させる。図８は、ムチン分泌促進物質が気道上皮（杯）細胞と相互作用し、２つの別個のタンパク質キナーゼＰＫＣとＰＫＧを活性化させることを図示する想定可能な機序を示している。活性化されたＰＫＣはＭＡＲＣＫＳをリン酸化し、形質膜から細胞質へのＭＡＲＣＫＳの転位を引き起こすのに対して、酸化窒素（ＮＯ）−＞ＧＣ−Ｓ−＞ｃＧＭＰ−＞ＰＫＧ経路を介して活性化されるＰＫＧは、続いて、細胞質ＰＰ２Ａを活性化し、細胞質ＰＰ２ＡはＭＡＲＣＫＳを脱リン酸化する。この脱リン酸化は、顆粒膜へのＭＡＲＣＫＳの付着を安定化させる。さらに、ＭＡＲＣＫＳは、アクチン及びミオシンとも相互作用し、これにより、その後の移動及び開口分泌性放出のための細胞収縮機構に顆粒を関連付ける。ＭＡＲＣＫＳが細胞質中に放出された後の顆粒へのＭＡＲＣＫＳの付着は、ＭＡＲＣＫＳのＮ末端ドメインが関与する特異的な標的化タンパク質又はタンパク質−タンパク質相互作用の他の幾つかの形態によっても誘導され得る。何れかの事例においても、ＭＡＮＳペプチド又は少なくとも６つのアミノ酸を含むその活性断片は、ムチン顆粒の膜へのＭＡＲＣＫＳの標的化を競合的に阻害するように作用し、これにより、分泌を遮断する。
【００９０】
第二の検査は、ＭＡＲＣＫＳ特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドのムチン分泌に対する阻害的効果を示した。図３Ａから３Ｃに示されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＮＨＢＥ細胞中のＭＡＲＣＫＳｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを下方制御し、ＰＫＣ／ＰＫＧ活性化によって誘導されたムチン分泌を大幅に弱めた。この阻害は、ＭＡＮＳペプチドを用いて見られたように劇的なものではなく、これは、ＮＨＢＥ細胞中の内在性ＭＡＲＣＫＳタンパク質の高いレベル及びＭＡＲＣＫＳｍＲＮＡの比較的長い半減期（ｔ１／２＝４から６時間）によるものであり得る。図３Ａから３Ｃでは、ＮＨＢＥ細胞をアンチセンス又は対照オリゴヌクレオチドで３日間処理し、次いで、ＰＭＡ（１００ｎＭ）＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１μＭ）で１５分間刺激した。ＥＬＩＳＡによって、ムチン分泌を分析した。処理された細胞から全ＲＮＡ及びタンパク質を単離した。ノーザンハイブリダイゼーションによってＭＡＲＣＫＳｍＲＮＡを評価し、ウェスタンブロットによって、タンパク質を評価した。ＰＭＡ（１００ｎＭ）＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１μＭ）では、図３Ａは、添付のチャート中の対照と比較して、ＭＡＲＣＫＳｍＲＮＡの約１５％の減少を示したノーザンブロットである。図３Ｂは、添付のグラフ中において、ＭＡＲＣＫＳタンパク質の約３０％の減少を示したウェスタンブロットである。図３Ｃは、アンチセンスオリゴヌクレオチドによってムチン過剰分泌が著しく弱められたのに対して、対照オリゴヌクレオチドは効果を有さないことを示している。データは、平均±標準誤差として表され（各点、ｎ＝６）、＊は溶媒対照と有意に異なり（ｐ＜０．０５）、‡はＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激とは有意に異なる（ｐ＜０．０５）。さらに、ＣＴＯという用語は対照オリゴヌクレオチドであるのに対して、ＡＳＯという用語はアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが注目される。
【００９１】
特異的なＲＮＡに相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞遺伝子がタンパク質として発現することを阻害できることが示されている。「Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｉｚａｎｔ，Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  Ａｎｄ  ＤＮＡ，Ｖｏｌ．１５  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９９２」を参照されたい。例えば、正常な遺伝子と１つのヌクレオチドだけ異なるｐ２１遺伝子の選択的阻害が報告されている。Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９１），３０：８２８３−８２８６。アンチセンスオリゴヌクレオチドが遺伝子発現を阻害する機序を説明するために多くの仮説が提案されているが、関与する具体的な機序は、研究されている細胞の種類、標的とされるＲＮＡ、標的とされるＲＮＡ上の特異的部位及びオリゴヌクレオチドの化学的性質に依存し得る。Ｃｈｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１，２６６：１８１６２−１８１７１；Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８８，４８：２６５９−２６６８。
【００９２】
第三の実験は、ＨＢＥ１細胞をＰＳＤ欠失された変異体ＭＡＲＣＫＳで形質移入することによって、ＰＫＣ／ＰＫＧ活性化によって誘導されたムチン分泌の有意な抑制がもたらされることを示した。ＰＳＤの欠失は、ＭＡＲＣＫＳがアクチンに結合する能力を失わせる。図８に示されているように、ＰＳＤ末端切断されたＭＡＲＣＫＳは、アクチン繊維と相互作用することができないので、顆粒膜への結合に関して固有のＭＡＲＣＫＳと競合することによって、ＰＳＤ末端切断されたＭＡＲＣＫＳは、これにより、顆粒放出を阻害し得る。野生型ＭＡＲＣＫＳｃＤＮＡによるこれらの細胞の形質移入は、さらに、ムチン分泌を増強しなかった。ウェスタンブロットアッセイは、ＨＢＥ１細胞中の内在性ＭＡＲＣＫＳの発現レベルは極めて高く、ＮＨＢＥ細胞中の発現レベルと同等であり、野生型ＭＡＲＣＫＳｃＤＮＡの形質移入は、これらの細胞中の全体的なＭＡＲＣＫＳタンパク質レベルの顕著な増加をもたらさないことを示した。これは、野生型ＭＡＲＣＫＳでの形質移入がさらなる分泌を増強しなかった理由を説明し得、ＰＳＤ欠失されたＭＡＲＣＫＳでの形質移入がムチン分泌を部分的に妨げたに過ぎない理由も説明し得る。
【００９３】
ペプチド遮断研究−ＭＡＮＳ又はＲＮＳペプチド（１から１００μＭ）とともに、ＮＨＢＥ細胞を１５分間予め温置し、次いで、ＰＭＡ（１００ｎＭ）＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１μＭ）又はＵＴＰ（１００μＭ）を添加し、さらに１５分間又は２時間、それぞれ、細胞を温置した。ＥＬＩＳＡによって、ムチン分泌を測定した。図２Ｂに示されているように、ＭＡＮＳペプチドとのＮＨＢＥ細胞の温置は、ＰＫＣ／ＰＫＧ活性化又はＵＴＰ刺激に応答したムチン分泌の濃度依存性抑制をもたらしたのに対して、対照ペプチド（ＲＮＳ）は、これらの同じ濃度で、分泌に影響を与えなかった可能性がある。図２Ｂでは、ＭＡＮＳペプチドは、濃度依存的な様式で、ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ又はＵＴＰによって誘導されたムチン過剰分泌を遮断する。ＮＨＢＥ細胞を、表記ペプチドとともに１５分間、予め温置し、次いで、ＰＭＡ（１００ｎＭ）＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１μＭ）に１５分間又はＵＴＰ（１００μＭ）に２時間曝露した。ＥＬＩＳＡによって、ムチン分泌を測定した。データは、平均±標準誤差として表され（各点、ｎ＝６）、＊は溶媒対照と有意に異なりｐ＜０．０５）、†はＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激と有意に異なり（ｐ＜０．０５）、及び‡はＵＴＰ刺激とは有意に異なる（ｐ＜０．０５）。ＭＡＮＳ及びＲＮＳペプチドは何れも乳酸脱水素酵素放出又は細胞による［３Ｈ］デオキシグルコースの取り込みに影響を与えなかったので、ＭＡＮＳペプチドの効果は、細胞代謝活性の細胞毒性又は全般的な抑制に関連していないようであった。
【００９４】
アンチセンスオリゴヌクレオチド研究−ムチン分泌経路の中心的シグナル伝達成分としてＭＡＲＣＫＳをさらに実証するために、ムチン分泌に対する、ＭＡＲＣＫＳに対して誘導されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を調べた。図３に示されているように、このアンチセンスオリゴヌクレオチドはＮＨＢＥ細胞中のＭＡＲＣＫＳのｍＲＮＡ及びタンパク質レベルをともに下方制御し、ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰによって誘導されたムチン分泌を大幅に弱めたのに対して、対照オリゴヌクレオチドは効果がなかった。
【００９５】
ＭＡＲＣＫＳは、ＰＫＣとＰＫＧ経路のクロストークを媒介する収束的なシグナル伝達分子としての役割を果たす
総合すると、上記結果は、ＭＡＲＣＫＳがムチン分泌プロセスに一体的に関わっていることを示した。次に、本発明者らは、ＰＫＣとＰＫＧが収束してムチン分泌を制御する中心的制御分子として、どのようにＭＡＲＣＫＳが作用するかについて取り組んだ。図５に示されているように、ＭＡＲＣＫＳはＰＫＣによってリン酸化され、従って、膜から細胞質へと転位された。ここで、ＰＫＧは、ＭＡＲＣＫＳの脱リン酸化を誘導するようであった（図５Ａ、レーン４、及び図５Ｂ）。この脱リン酸化は、ＰＫＧ阻害剤であるＲｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰ（図５Ａ、レーン５）によって元に戻され、脱リン酸化が特異的にＰＫＧ依存性であったことを示唆する。図５では、ＮＨＢＥ細胞は［３２Ｐ］オルトホスファートで標識され、次いで、表記の試薬に曝露された。この処理に応答したＭＡＲＣＫＳリン酸化は、免疫沈降アッセイによって評価された。図５Ａでは、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰは、ＰＭＡによって誘導されたＭＡＲＣＫＳを元に戻し、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰのこの効果は、Ｒｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰ（ＰＫＧ阻害剤）又はオカダ酸（ＰＰ１／２Ａ阻害剤）によって遮断され得る。図５Ｂに関しては、ＰＭＡによって誘導されたＭＡＲＣＫＳのリン酸化は、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰへの細胞のその後の曝露によって元に戻された。レーン１、溶媒のみ８分間；レーン２、１００ｎＭＰＭＡ３分間；レーン３、１００ｎＭＰＭＡ３分間、次いで、１μＭ８−Ｂｒ−ｃＧＭＰとともに５分間；レーン４、１００ｎＭＰＭＡ８分間；レーン５、溶媒のみ３分間、次いで１００ｎＭＰＭＡ＋１μＭ８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ５分間。図５Ｃでは、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ−によって誘導されたＭＡＲＣＫＳの脱リン酸化は、濃度依存的な様式で、フォストリエシンによって弱められた。
【００９６】
ＰＫＧはタンパク質ホスファターゼの活性化を介してＭＡＲＣＫＳを脱リン酸化するように作用すると考えられる。図５Ａ（レーン６）に示されているように、５００ｎＭのオカダ酸（ＰＰ１及びＰＰ２Ａの両方を阻害することができる濃度）は、ＰＫＧによって誘導されたＭＡＲＣＫＳの脱リン酸化を遮断し、ＰＰ１及び／又はＰＰ２Ａを活性化することによって、ＰＫＧが脱リン酸化を引き起こしたことを示唆する。フォストリエシン用いたさらなる研究及びホスファターゼ活性の直接アッセイは、ＰＰ２ＡのみがＰＫＧによって活性化され、ＭＡＲＣＫＳからのリン酸基の除去に必要であることを示した（図５Ｃ）。オカダ酸又はフォストリエシンの何れかは、ＰＫＧによって誘導されたＭＡＲＣＫＳの脱リン酸化を阻害する濃度で、図６に示されているように、ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ又はＵＴＰによって誘導されたムチン分泌を弱めたようである。図６は、ＰＰ２Ａがムチン分泌経路の必須成分であることを示すのに役立つ。フォストリエシンの表記濃度、オカダ酸（５００ｎＭ）又は溶媒のみとともに、ＮＨＢＥ細胞を１５分間予め温置し、次いで、ＰＭＡ（１００ｎＭ）＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１μＭ）で１５分間又はＵＴＰ（１００μＭ）で２時間刺激した。ＥＬＩＳＡによって、分泌されたムチンを測定した。データは、平均±標準誤差として表され（各点、ｎ＝６）、＊は溶媒対照と有意に異なることを表し（ｐ＜０．０５）、†はＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激とは有意に異なることを表し（ｐ＜０．０５）、及び‡はＵＴＰ刺激とは有意に異なることを表すｐ＜０．０５）。このように、ＰＫＧによって活性化されたＰＰ２ＡによるＭＡＲＣＫＳの脱リン酸化は、ムチン顆粒の開口分泌を引き起こすシグナル伝達経路の不可欠な成分であると思われる。
【００９７】
ＭＡＲＣＫＳがキナーゼの活性化をムチン分泌に結び付ける分子現象を明らかにするために、ＰＫＣ／ＰＫＧ活性化に応答したＭＡＲＣＫＳのリン酸化を詳しく調べた。図４Ａに示されているように、ＰＭＡ（１００ｎＭ）は、ＮＨＢＥ細胞中のＭＡＲＣＫＳリン酸化の有意な増加（３から４倍）を誘導した可能性があり、このリン酸化は、ＰＫＣ阻害剤であるカルホスチンＣ（５００ｎＭ）によって弱められた。一旦リン酸化されると、ＭＡＲＣＫＳは、形質膜から細胞質へ転位された（図４Ｂ）。より具体的には、図４Ａは、ＰＫＣの活性化はＮＨＢＥ細胞中のＭＡＲＣＫＳのリン酸化をもたらすことを示している。［３２Ｐ］オルトホスファートで細胞を２時間標識し、次いで、刺激的及び／又は阻害的試薬に曝露した。この処理に応答したＭＡＲＣＫＳのリン酸化を、記載されているように、免疫沈降によって評価した。レーン１、溶媒対照；レーン２、ビヒクル、０．１％Ｍｅ２ＳＯ；レーン３、１００ｎＭ４α―ＰＭＡ；レーン４、１００ｎＭＰＭＡ；レーン５、１００ｎＭＰＭＡ＋５００ｎＭカルホスチンＣ；レーン６、５００ｎＭカルホスチンＣ。図４Ｂは、リン酸化されたＭＡＲＣＫＳは形質膜から細胞質へ転位されることを示す。３２Ｐ標識された細胞をＰＭＡ（１００ｎＭ）又は溶媒のみに５分間曝露し、次いで、膜とサイトゾル画分を単離した。８−Ｂｒ−ｃＧＭＰによるＰＫＧの活性化（１μＭ、ムチン分泌を誘発するのに必要な別のキナーゼ活性化現象）は、ＭＡＲＣＫＳリン酸化を引き起こさず、実際には、反対の効果が観察された。ＰＭＡによって誘導されたＭＡＲＣＫＳリン酸化は、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰによって元に戻された（図５Ａ）。ＰＭＡによって誘導されたリン酸化は、細胞へのその後の８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの添加によって元に戻され得るので、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰのこの効果はＰＫＣ活性の抑制によるものではなかった（図５Ｂ）。従って、ＰＫＧの活性化は、ＭＡＲＣＫＳの脱リン酸化をもたらす可能性が高い。
【００９８】
さらなる調査は、ＰＫＧによって誘導されたＭＡＲＣＫＳの脱リン酸化が、タンパク質ホスファターゼ（１型及び／又は２Ａ（ＰＰ１／２Ａ））阻害剤である５００ｎＭオカダ酸によって遮断されることを示した（図５Ａ、レーン６）。従って、脱リン酸化はＰＰ１及び／又はＰＰ２Ａによって媒介されるように見受けられた。関与するタンパク質ホスファターゼのサブタイプを確定するために、新しい、より特異的なＰＰ２Ａ阻害剤であるフォストリエシン（ＩＣ５０＝３．２ｎＭ）をさらなるリン酸化研究において使用した。図５Ｃに示されているように、フォストリエシンは、濃度依存的な様式で（１から５００ｎＭ）、ＰＫＧによって誘導されたＭＡＲＣＫＳ脱リン酸化を阻害し、ＰＰ２Ａの活性化を介して、ＰＫＧが脱リン酸化を誘導したことを示唆する。ＮＨＢＥ細胞中のＰＫＧによるＰＰ２Ａのさらなる活性化を確認するために、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰへの細胞の曝露後に、サイトゾルのＰＰ１及びＰＰ２Ａ活性を測定した。ＰＰ２Ａ活性は、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの０．１μＭという低濃度で、約３倍増加され（０．１から０．３ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質、ｐ＜０．０１）のに対して、ＰＰ１活性は不変のままであった。本データは、ＰＰ２ＡがＰＫＧによって活性化され得ること、及びＭＡＲＣＫＳの脱リン酸化に必要であることを示している。従って、ムチン分泌が起こるためにこのＰＰ２Ａ活性が不可欠であるように思われた。ＰＫＧによって誘導されたＭＡＲＣＫＳ脱リン酸化がオカダ酸又はフォストリエシンによって遮断されると、ＰＫＣ／ＰＫＧ活性化又はＵＴＰ刺激に対する分泌応答が軽減された（図６）。
【００９９】
ＭＡＲＣＫＳは、細胞質中で、アクチン及びミオシンと会合する
図７は、ＭＡＲＣＫＳが２つの他のタンパク質（約２００及び４０ｋＤａ）と細胞質中で会合し得ることを明らかにする放射線標識された免疫沈降アッセイを図示している。図７では、［３Ｈ］ロイシン及び［３Ｈ］プロリンで、ＮＨＢＥ細胞を一晩標識し、「実験操作」に記載されているように、膜及びサイトゾル画分を調製した。単離された画分は、非免疫対照抗体（６Ｆ６）で予め明確にした。次いで、サイトゾルを２つの画分に等しく分け、それぞれ、抗ＭＡＲＣＫＳ抗体２Ｆ１２（レーン２）及び非免疫対照抗体６Ｆ６（レーン３）を用いて、１０μＭサイトカラシンＤ（Ｂｉｏｍｏｌ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｐａ．）の存在下で実施された免疫沈降のために使用した。膜画分中のＭＡＲＣＫＳタンパク質は、抗体２Ｆ１２を用いた免疫沈降によっても評価した（レーン１）。沈降されたタンパク質複合体は、８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分割され、増強されたオートラジオグラフィーによって可視化された。ＭＡＲＣＫＳは、それぞれ、約２００及び４０ｋＤａの分子量を有する２つの細胞質タンパク質と会合するように見受けられた。これら２つのＭＡＲＣＫＳ会合タンパク質をゲルから切り出し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間質量分析／内部配列決定によって分析した（ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎ．Ｙ．）。得られたペプチドの質量及び配列データは、ＩｎｔｅｒｎｅｔプログラムＰｒｏＦｏｕｎｄ及びＭＳ−Ｆｉｔを介してタンパク質データベースを検索するために使用した。結果は、これらが、それぞれミオシン（重鎖、非筋肉Ａ型）及びアクチンであることを示している。マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間質量分析／内部配列分析は、これら２つのＭＡＲＣＫＳ会合タンパク質が、それぞれ、ミオシン（重鎖、非筋肉Ａ型）及びアクチンであったことを示している。
【０１００】
これらの研究は、気道ムチン顆粒の開口分泌性分泌を調節するシグナル伝達機序に対する新たな概念を示唆するともに、生理的プロセスにおけるＭＡＲＣＫＳの特異的な生物機能を示す最初の直接的証拠と考えられるものを提供する。ＭＡＲＣＫＳは、ヒト気道上皮細胞中でのムチン顆粒の放出を制御する中心的な媒介物質分子としての役割を果たしている。気道ムチン分泌の誘導には、二重活性化並びにＰＫＣ及びＰＫＧの相乗的な作用が必要であると考えられる。活性化されたＰＫＣはＭＡＲＣＫＳをリン酸化し、形質膜の内面から細胞質中へのＭＡＲＣＫＳの転位をもたらす。続いて、ＰＫＧの活性化はＰＰ２Ａを活性化し、ＰＰ２Ａは細胞質中のＭＡＲＣＫＳを脱リン酸化する。ＭＡＲＣＫＳの膜会合能はそのリン酸化状態に依存するので、この脱リン酸化によって、ＭＡＲＣＫＳがその膜結合能を再獲得することが可能となり得、細胞質ムチン顆粒の膜にＭＡＲＣＫＳが付着することが可能となり得る。細胞質中のアクチン及びミオシンと相互作用することによっても（図７）、その後、ＭＡＲＣＫＳは、顆粒を細胞の収縮性装置に係留することが可能であり得、細胞周辺への顆粒の移動及びその後の開口分泌放出を媒介し得る。ＭＡＲＣＫＳの広い分布は、この機序又は類似の機序が、正常な条件又は病的な条件下で、様々な細胞種中で、膜結合型顆粒の分泌を制御し得るという可能性を示唆する。
【０１０１】
本発明は、その刺激経路がタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の基質であるＭＡＲＣＫＳタンパク質及び膜結合型小胞からの内容物の放出を含むあらゆる細胞の開口分泌性分泌プロセス、特に、炎症細胞内に含有される顆粒からの炎症媒介物質を放出するプロセスを遮断するための新規方法にも関する。具体的には、本発明者らは、ヒト（図９）又はイヌ（図１０）好中球からの炎症媒介物質ミロペルオキシダーゼの刺激された放出は、ＭＡＮＳペプチドによって、濃度依存的な様式で遮断され得ることを示した。具体的には、図９は、１００ｎＭＰＭＡ及び１０μＭ８−Ｂｒ−ｃＧＭＰを用いて、ミロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）を分泌するように刺激された、単離された好中球を示している。１００μＭＭＡＮＳペプチドは、対照レベルまでＭＰＯの分泌を減少させた（＊＝ｐ＜０．０５）。１０μＭＭＡＮＳは、ＭＰＯ分泌の僅かな減少を引き起こす。対照ペプチド（ＲＮＳ）の１０又は１００μＭは、ＭＰＯ分泌に対して効果を持たない。図１０では、単離された好中球が、１００ｎＭＰＭＡ及び１０μＭ８−Ｂｒ−ｃＧＭＰを用いて、ミロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）を分泌するように刺激された。１００μＭＭＡＮＳペプチドは、対照レベルまでＭＰＯの分泌を減少させた（＊＝ｐ＜０．０５）。１０μＭＭＡＮＳは、ＭＰＯ分泌の僅かな減少を引き起こす。対照ペプチド（ＲＮＳ）の１０又は１００μＭは、ＭＰＯ分泌に対して効果を持たない。従って、本ペプチドは、あらゆる組織中の浸潤している炎症細胞から分泌される炎症の媒介物質の放出を遮断するために治療的に使用され得る。これらの放出される媒介物質の多くは、様々な慢性的炎症性疾患（すなわち、喘息、慢性気管支炎及びＣＯＰＤなどの呼吸器疾患、潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む炎症性腸疾患、自己免疫疾患、酒さ、湿疹及び重度のにきびなどの皮膚疾患、関節リウマチ及び繊維筋痛症などの関節及び疼痛症候群）中で観察される広範な組織損傷の原因である。本発明は、関節炎、慢性気管支炎、ＣＯＰＤ及び嚢胞性繊維症などの疾病を治療するために有用であり得る。従って、本発明は、ヒト及び動物の両方の疾病、特に、ウマ、イヌ、ネコ及びその他の家庭用ペットが罹患する疾病における治療に対して有用である。
【０１０２】
図１１から１５は、ヒト及びイヌの両者に対するＭＰＯ分泌を示している。これらの実験の全てにおいて、単離された好中球は、図面に示されているように刺激を加える前に、３７℃で１０分間、１×１０−６Ｍの濃度のＬＰＳで刺激された。ＬＰＳは、細胞が分泌促進物質に対して応答できるように、細胞を抗原刺激する。
【０１０３】
一実施形態において、本発明は、対象中の炎症を制御する方法であり、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片を含む医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む前記方法を開示する。本実施形態の一態様において、ＭＡＮＳタンパク質の前記活性断片は、少なくとも６つのアミノ酸を含む。別の態様において、前記炎症は、呼吸器疾患、腸疾患、皮膚疾患、自己免疫疾患及び疼痛症候群によって引き起こされる。別の態様において、前記呼吸器系疾患は、喘息、慢性気管支炎及びＣＯＰＤからなる群から選択される。別の態様において、前記腸疾患は、潰瘍性大腸炎、クローン病及び過敏性腸症候群からなる群から選択される。別の態様において、前記皮膚疾患は、酒さ、湿疹、乾癬及び重度のにきびからなる群から選択される。別の態様において、前記炎症は、関節炎又は嚢胞性繊維症によって引き起こされる。別の態様において、前記対象は哺乳動物である。さらに、別の態様において、前記哺乳動物はヒト、イヌ、ウマ及びネコからなる群から選択される。別の態様において、前記投与工程は、局所投与、非経口投与、直腸投与、肺投与、経鼻投与、吸入及び経口投与からなる群から選択される。別の態様において、前記肺投与は、エアロゾル、乾燥粉末吸入器、定量噴霧式吸入器及び噴霧器からなる群から選択される。
【０１０４】
別の実施形態において、本発明は、対象中の細胞分泌プロセスを制御する方法であり、対象中の免疫媒介物質を制御する、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片を含む少なくとも１つの化合物を含む医薬組成物の治療的有効量の投与することを含む前記方法を開示する。本実施形態の一態様において、ＭＡＮＳタンパク質の前記活性断片は、少なくとも６つのアミノ酸を含む。別の態様において、細胞分泌プロセスを制御することは、細胞分泌プロセスを遮断又は低下させることである。別の態様において、前記炎症媒介物質は、呼吸器疾患、腸疾患、皮膚疾患、自己免疫疾患及び疼痛症候群によって引き起こされる。別の態様において、前記呼吸器系疾患は、喘息、慢性気管支炎及びＣＯＰＤからなる群から選択される。別の態様において、前記腸疾患は、潰瘍性大腸炎、クローン病及び過敏性腸症候群からなる群から選択される。別の態様において、前記皮膚疾患は、酒さ、湿疹、乾癬及び重度のにきびからなる群から選択される。別の態様において、前記炎症媒介物質は、関節炎又は嚢胞性繊維症によって引き起こされる。別の態様において、前記対象は哺乳動物である。別の態様において、前記哺乳動物はヒト、イヌ、ウマ及びネコからなる群から選択される。別の態様において、前記投与工程は、局所投与、非経口投与、直腸投与、肺投与、経鼻投与、吸入及び経口投与からなる群から選択される。別の態様において、前記肺投与は、エアロゾル、乾燥粉末吸入器、定量噴霧式吸入器及び噴霧器からなる群から選択される。
【０１０５】
別の実施形態において、本発明は、対象中の炎症を低下させる方法であり、炎症媒介物質のＭＡＲＣＫＳ関連放出を阻害する化合物の治療的有効量の投与を含み、前記治療の不存在下で生じる放出と比べて、前記対象中の炎症媒介物質の放出が低下する、前記方法を開示する。本実施形態の一態様において、前記化合物は、ＭＡＲＣＫＳタンパク質の少なくとも１つの活性断片である。別の態様において、前記活性断片は、少なくとも６つのアミノ酸長である。別の態様において、前記化合物はＭＡＮＳペプチド又はその活性断片である。別の態様において、前記化合物はＭＡＲＣＫＳタンパク質又はその活性断片のコード配列に対して誘導されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の態様において、前記活性断片は、少なくとも６つのアミノ酸長である。
【０１０６】
別の実施形態において、本発明は、対象中の炎症を低下させる方法であり、炎症媒介物質のＭＡＲＣＫＳ関連放出を阻害する化合物を含む医薬として活性な組成物の治療的有効量を投与することを含み、前記治療の不存在下で生じる炎症と比べて、前記対象中の前記炎症が低下する、前記方法を開示する。本実施形態の一態様において、前記化合物は、ＭＡＲＣＫＳタンパク質の活性断片である。別の態様において、前記活性断片は、少なくとも６つのアミノ酸長である。別の態様において、前記化合物はＭＡＮＳペプチド又はその活性断片である。別の態様において、前記化合物はＭＡＲＣＫＳタンパク質又はその活性断片のコード配列に対して誘導されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の態様において、前記活性断片は、少なくとも６つのアミノ酸長である。本発明は、ＭＡＮＳペプチド及びその活性断片の１つ又はそれ以上を含有する組成物並びに炎症細胞の顆粒又は小胞からの炎症媒介物質の放出を阻害する治療におけるその使用を包含するものとする。
【０１０７】
別の実施形態において、本発明は、対象中のムチン顆粒放出を制御する方法であり、ムチン顆粒放出を制御する化合物を投与することを含み、ムチン顆粒が、前記ムチン顆粒の不存在下で起こるものと比べて低下している、前記方法を開示する。本実施形態の一態様において、前記化合物は、ＭＡＲＣＫＳタンパク質の活性断片である。別の態様において、前記化合物はＭＡＮＳペプチドである。
【０１０８】
別の実施形態において、本発明は、対象中の気道ムチン顆粒の開口分泌性分泌を制御する方法であり、ムチン顆粒放出を制御する化合物を投与することを含み、ムチン顆粒が、前記ムチン顆粒の不存在下で起こるものと比べて低下している、前記方法を開示する。本実施形態の一態様において、前記化合物は、ＭＡＲＣＫＳタンパク質の活性断片である。別の態様において、前記化合物はＭＡＮＳペプチドである。
【０１０９】
別の実施形態において、本発明は、対象中の粘液分泌を調節する方法であり、ＭＡＲＣＫＳタンパク質又はその活性断片をコードする配列に相補的であるアンチセンス配列の治療的量を投与することを含み、前記細胞による粘液分泌が、このような投与の不存在下で生じるものと比べて阻害される、前記方法を開示する。本実施形態の一態様において、前記配列は少なくとも１８の核酸長である。別の態様において、前記化合物はＭＡＮＳペプチド又はその活性断片をコードする配列に相補的である。別の態様において、粘液分泌を調節することは、粘液分泌を遮断又は低下させることである。
【０１１０】
別の実施形態において、本発明は、対象中の炎症を低下又は阻害する方法であり、ＭＡＮＳペプチド又は炎症部位での炎症媒介物質を調節するのに有効なその活性断片を含む少なくとも１つのペプチドの治療的有効量を投与することを含む、前記方法も開示する。本実施形態の一態様において、前記活性断片は少なくとも６つのアミノ酸長である。別の態様において、前記炎症媒介物質は、好中球、好塩基球、好酸球、単球及び白血球からなる群から選択される細胞によって産生される。好ましくは、細胞は白血球、より好ましくは顆粒球、さらに好ましくは、好中球、好塩基球、好酸球又はこれらの組み合わせである。別の態様において、前記因子は、経口、非経口、経空洞（ｃａｖｉｔａｒｉｌｙ）、直腸的に、又は気道を通じて投与される。別の態様において、前記組成物は、抗生物質、抗ウイルス性化合物、抗寄生虫化合物、抗炎症性化合物及び免疫抑制物質からなる群から選択される第二の分子をさらに含む。
【０１１１】
ＭＡＮＳペプチドの活性断片は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９のミリストイル化されたペプチドからなる群から選択することができる。
【０１１２】
本発明の別の態様において、本発明に開示されている方法は、本発明に開示されているペプチドの組み合わせの使用又は投与によって、すなわち、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８配列番号１９及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチドの使用又は投与によって達成することができる。好ましくは、本明細書に開示されている方法では、単一のペプチドが使用又は投与される。
【０１１３】
炎症性刺激物質によるタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化に応答して、好中球、好酸球、単球／マクロファージ及びリンパ球からなる群から選択される細胞中での脱顆粒は、ＭＡＲＣＫＳタンパク質のＮ末端領域と同一のペプチドとの事前温置によって、及び同時温置によって弱めることができ、前記ペプチドは、ＭＡＮＳペプチド（配列番号１）及びミリストイル化されたそのＮ末端断片（配列番号３から１９）からなる群から選択される。時間経過と濃度は細胞種ごとに変動し得るが、全ての事例で、ＭＡＮＳペプチドは、ＰＫＣによって誘導される脱顆粒を弱める。
【０１１４】
方法と材料
ＮＨＢＥ細胞培養−空気／液体界面中でのＮＨＢＥ細胞の増殖、冷凍保存及び培養は、以前に記載したとおりに行った。Ｋｒｕｎｋｏｓｋｙらを参照されたい。簡潔に述べると、ＮＨＢＥ細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を、換気されたＴ７５組織培養フラスコ（５００細胞／ｃｍ２）中に播種し、細胞が７５から８０％の集密度に達するまで培養した。次いで、トリプシン／ＥＤＴＡによって細胞を解離させ、継代２として凍結した。ラットの尾のコラーゲンＩ型（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）で薄く被覆されたＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（Ｒ）透明培養挿入物（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）中に、継代２細胞（２×１０４細胞／ｃｍ２）を播種することによって、空気／液体界面培養を開始した。ほぼ集密状態になるまで、加湿された９５％空気、５％ＣＯ２環境中の培地中に、５から７日間細胞を浸して培養した。この時点で、先端部の培地を除去し、基底外側から細胞を供給することによって、空気／液体界面を作出した。その後、培地を毎日交換した。完全な分化を可能とするために、さらに１４日間細胞を培養した。
【０１１５】
ＥＬＩＳＡによるムチン分泌の測定−「ベースライン」及び「試験」ムチン試料を集める前に、リン酸緩衝化された生理的食塩水ｐＨ７．２で洗浄することによって、細胞の先端面に蓄積された粘液を除去した。ベースライン分泌を集めるために、培地のみとともに細胞を温置し、先端培地中の分泌されたムチンを集め、保存した。細胞を２４時間静置し、次いで、選択された刺激的及び／又は阻害的試薬（又は適切な対照）を含有する培地に曝露した後、分泌されたムチンを集め、検査試料として保存した。ベースライン及び試験に対する温置時間は同じであったが、使用した試験試薬に応じて変動した。ベースライン及び試験分泌は何れも、本分野で公知の抗体捕捉方法を用いてＥＬＩＳＡによって分析した。例えば、「Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｐｐ．５７０−５７３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）」を参照されたい。このアッセイのための一次抗体は、ヒト気道ムチン上の炭水化物エピトープと特異的に反応するモノクローナル抗体である１７Ｑ２（Ｂａｂｃｏ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ．）であった。ムチン分泌を定量するために、「分泌指数」と類似する試験／ベースラインムチンの比を使用して、各培養皿がそれ自身の対照としての役割を果たすことができ、従って、培養ウェル間の変動によって引き起こされる偏差を最小化できるようにした。Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１，Ｌ８５４−Ｌ８６１（１９９６）。培地対照のパーセントとして、ムチン分泌のレベルを報告した。
【０１１６】
放射線標識された免疫沈降アッセイ−［３２Ｐ］ホスファートで標識した場合、０．２％ウシ血清アルブミンを含有する無ホスファートＤｕｌｂｅｃｃｏ改変イーグル培地中で２時間、細胞を予め温置し、次いで、０．１ｍＣｉ／ｍｌ［３２Ｐ］オルトホスファート（９０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２時間標識した。［３Ｈ］ミリスチン酸又は３Ｈ−アミノ酸での標識のために、５０μＣｉ／ｍｌ［３Ｈ］ミリスチン酸（４９Ｃｉ／ｍｍｏｌ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）又は０．２ｍＣｉ／ｍｌ［３Ｈ］ロイシン（１５９Ｃｉ／ｍｍｏｌ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）＋０．４ｍＣｉ／ｍｌ［３Ｈ］プロリン（１００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する培地中で、細胞を一晩温置した。標識後、細胞を刺激試薬に５分間曝露した。阻害剤を使用した場合に、刺激前に１５分間、細胞を阻害剤とともに予め温置した。処理の終了時に、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭベンズアミジン、１０μｇ／ｍｌペプスタチンＡ及び１０μｇ／ｍｌロイペプチンを含有する緩衝液中に細胞を溶解した。トリクロロ酢酸沈殿及びシンチレーションカウンティングは、各培養中の放射線標識効率を決定し得る。等しいカウント／分を含有する細胞可溶化液を用いてＳｐｉｚｚとＢｌａｃｋｓｈｅａｒの方法に従って、ＭＡＲＣＫＳタンパク質の免疫沈降を実施した。Ｓｐｉｚｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，５５３−５６２（１９９６）。沈降されたタンパク質は、８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分割され、オートラジオグラフィーによって可視化された。本アッセイでは、抗ヒトＭＡＲＣＫＳ抗体（２Ｆ１２）及び非免疫対照抗体（６Ｆ６）を使用した。
【０１１７】
異なる細胞内画分中のＭＡＲＣＫＳ又はＭＡＲＣＫＳ会合タンパク質複合体を評価するために、均質化緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭベンズアミジン、１０μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、１０μｇ／ｍｌロイペプチン）中に、放射線標識及び処理された細胞を掻き取り、次いで、窒素キャビテーション（４℃で２０分間、８００ポンド／平方インチ）によって破壊された。４℃で１０分間、６００×ｇで細胞可溶化液を遠心して、核及び破壊されていない細胞を除去した。４℃で３０分間、４００，０００×ｇでの超遠心によって、核後の上清を膜及びサイトゾル画分へ分離した。音波処理によって、膜沈降物を溶解緩衝液中に可溶化した。次いで、上述のように、免疫沈降を実施した。
【０１１８】
ＭＡＲＣＫＳ関連ペプチド−ミリストイル化されたＮ末端配列（ＭＡＮＳ）及びランダムＮ末端配列（ＲＮＳ）ペプチドを、Ｇｅｎｅｍｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．，（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）で合成し、次いで、高圧液体クロマトグラフィー（＞９５％純粋）によって精製し、質量分析法によって確認し、それぞれ、適切な分子量を有する単一のピークを示した。ＭＡＮＳペプチドは、ＭＡＲＣＫＳの最初の２４アミノ酸（すなわち、膜内へのＭＡＲＣＫＳ挿入を媒介するミリストイル化されたＮ末端領域ＭＡ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１（ＭＡ＝Ｎ末端ミリスチン酸鎖））と同一の配列からなった。対応する対照ペプチド（ＲＮＳ）は、ＭＡＮＳと同じアミノ酸組成を含有したが、ランダムな順序で配置されたＭＡ−ＧＴＡＰＡＡＥＧＡＧＡＥＶＫＲＡＳＡＥＡＫＱＡＦ（配列番号２）。これらの合成ペプチド中における疎水性ミリスチン酸部分の存在は、形質膜に対するそれらの透過性を増強し、ペプチドが細胞によって容易に取り込まれ得るようにする。ムチン分泌に対するこれらのペプチドの効果を測定するために、分泌促進物質の添加前に１５分間、細胞をペプチドとともに予め温置し、次いで、ＥＬＩＳＡによって、ムチン分泌を測定した。
【０１１９】
アンチセンスオリゴヌクレオチド−ＭＡＲＣＫＳアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその対応する対照オリゴヌクレオチドは、ＢｉｏｇｎｏｓｔｉｋＧｍｂＨ（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において合成された。先端部において、（最初の２４時間は、２μｇ／ｍＬリポフェクチンの存在下で）５μＭアンチセンス又は対照オリゴヌクレオチドでＮＨＢＥ細胞を３日間処理した。次いで、分泌促進物質とともに細胞を温置し、ＥＬＩＳＡによってムチン分泌を測定した。処理された細胞から全ＲＮＡ及びタンパク質を単離した。ヒトＭＡＲＣＫＳｃＤＮＡをプローブとして使用する慣用の操作に従って、ノーザンハイブリダイゼーションによって、ＭＡＲＣＫＳｍＲＮＡを評価した。一次検出抗体として、精製された抗ＭＡＲＣＫＳＩｇＧ１（クローン２Ｆ１２）を用いるウェスタンブロットによって、ＭＡＲＣＫＳタンパク質レベルを測定した。
【０１２０】
一過性形質移入−ＭＡＲＣＫＳのリン酸化部位ドメイン（ＰＳＤ）は、ＰＫＣ依存性リン酸化部位及びアクチン繊維結合部位を含有する。ＰＳＤが欠失されたＭＡＲＣＫＳｃＤＮＡを構築するために、ＰＳＤ配列に隣接する２つの断片（２５アミノ酸をコードする。）をポリメラーゼ連鎖反応によって作製し、次いで、ポリメラーゼ連鎖反応のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に付着されたＸｈｏＩ部位を通じて連結した。得られた変異体ｃＤＮＡ及び野生型ＭＡＲＣＫＳｃＤＮＡを、それぞれ、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）中に挿入した。制限消化物及びＤＮＡ配列決定によって、単離された組み換え構築物を確認した。
【０１２１】
ＨＢＥ１は、空気／液体界面中で培養されたときにムチンを分泌することができる、パピローマウイルスによって形質転換されたヒト気管支上皮細胞株である。ＨＢＥ１細胞の形質移入は、製造業者の指示書に従い、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ形質移入試薬（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて行った。簡潔に述べると、空気／液体界面中で増殖された分化したＨＢＥ１細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡによって解離させ、１×１０５細胞／ｃｍ２で、１２ウェル培養プレート中に再度播種した。一晩温置した後、野生型ＭＡＲＣＫＳｃＤＮＡ、ＰＳＤ末端切断されたＭＡＲＣＫＳｃＤＮＡ又はベクターＤＮＡで細胞を形質移入した。遺伝子を発現させるために、細胞を４８時間培養し、次いで、分泌促進物質に曝露させ、ＥＬＩＳＡによって、ムチン分泌を測定した。全ての形質転換は、形質移入効率の変動をモニターするために、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｌａｃＺプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＤＮＡ比６：１、ＤＮＡ計１μｇ、ＤＮＡ：Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬の比＝１：２５）の存在下で実施した。結果は、形質転換された細胞から単離された細胞可溶化液中のβ−ガラクトシダーゼ活性に有意差がないことを示し、異なるＤＮＡ構築物間で形質転換効率が類似していることを示唆した（データは示さず。）。
【０１２２】
タンパク質ホスファターゼ活性アッセイ−僅かな修飾を加えて、本分野において公知であるように、タンパク質ホスファターゼアッセイ系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、ＰＴ１及びＰＰ２Ａ活性を測定した。Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．ＭｅｄＢｉｏｌ．３９６，２０９−２１５（１９９６）。簡潔に述べれば、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ又は培地のみで、ＮＨＢＥ細胞を５分間処理した。次いで、溶解緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１％β−メルカプトエタノール、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭベンズアミジン（ｂｅｎａａｍｉｄｉｎｅ）、１０μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、１０μｇ／ｍｌロイペプチン）中に、細胞を掻き取り、４℃で２０秒間の音波処理によって破壊した。細胞可溶化液を遠心し、ホスファターゼ活性アッセイのために上清を保存した。３２Ｐ標識されたホスホリラーゼＡを基質として用いたアッセイを行った。放出された３２Ｐｉを、シンチレーションによってカウントした。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって、各試料のタンパク質濃度を測定した。ＰＰ２Ａ活性は、１ｎＭオカダ酸の存在下で残存している活性を試料の総ホスファターゼ活性から差し引いたものとして表した。ＰＰ１活性は、それぞれ、１ｎＭ及び１μＭオカダ酸の存在下で残存している活性間の差として表した。タンパク質ホスファターゼ活性は、１分当たりに放出されたＰｉのｎｍｏｌ／ｍｇ総タンパク質として報告した。
【０１２３】
細胞毒性アッセイ−細胞からの乳酸脱水素酵素の全ての放出を測定することによって、ＮＨＢＥ細胞を処理する際に使用した全ての試薬を細胞毒性に関して調査した。アッセイは、製造業者の指示書に従い、ＰｒｏｍｅｇａＣｙｔｏｔｏｘ９６Ｋｉｔを用いて行った。全ての実験は、非細胞毒性濃度の試薬を用いて行った。
【０１２４】
統計解析−Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの検定後補正とともに片側分散分析を使用して、有意差に関してデータを分析した。処理間の差は、ｐ＜０．０５で有意と考えた。
【０１２５】
イヌの血液からのＰＭＮの単離−ＰＭＮの単離に含まれる工程には、１０ｍＬのＡＣＤ抗凝固血液を集めることが含まれる。次いで、ＰＭＮ単離培地（ＩＭ）が室温（ＲＴ）になるように確保しつつ、ＰＭＮ単離培地３．５ｍＬ上に５ｍＬを重層した。次に、室温で、３０分間、５５０×ｇ、１７００ＲＭＰで血液を遠心した。低い低部の白色バンドを、１５ｍＬの円錐形遠心管（ＣＣＦＴ）中に移した。次に、１０％ウシ胎児血清（ＰＢＳ）を加えた２ＶＨＥＳＳを添加し、室温で、１０分間、４００×ｇ、１４００ＲＭＰで遠心した。次いで、ＰＢＳを加えた１−１ＥＳＳ５ｍＬ中に、沈降物を再懸濁した。氷冷した０．８８％ＮＨ４Ｃｌ２０ｍＬを含有するＣＣＦＴ５０ｍＬに細胞懸濁液を添加し、２から３回反転させた。得られた産物を、１０分間、８００×ｇ、２０００ＲＰＭで遠心した後、吸引し、ＦＢＳを加えたＨＢＳＳ５ｍＬ中に再懸濁した。計数及びサイトスピンによって調製物を調べ、好ましくは、全血に関しては、細胞数は１０９から１０１１細胞の間とすべきであり、ＰＭＮに関しては、細胞数は２から４×１０７細胞の間とすべきである。一般的には、「Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，“Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＩＣＡＭ−Ｉ  ａｎｄ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ，”６４８７−９４（２０００）」を参照されたい。
【０１２６】
ＭＰＯ比色酵素アッセイ−サンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）を用いて、９６ウェル丸底マイクロタイタープレート中のＭＰＯ活性に関して、試料をアッセイした。簡潔に述べれば、試料２０μＬを、各マイクロタイターウェル中の３３ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０、０．５６％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１１ｍＭ過酸化水素及び０．３６ｍＭＯ−ジアニシジン二塩酸塩を含有する基質混合物１８０μＬと混合する。アッセイ混合物中の最終濃度は、以下のとおりであった。３０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１ｍＭ過酸化水素及び０．３２ｍＭＯ−ジアニシジン二塩酸塩。混合後、室温で５分間、アッセイ混合物を温置し、５５０ｎｍで、ＭＰＯ酵素活性を分光学的に測定した。試料は、２つ組でアッセイした。
【０１２７】
炎症媒介物質分泌研究
フォルボールエステルによって誘導されるＰＫＣの活性化に応答して特異的な顆粒内容物を分泌する４つの異なる白血球の種類又はモデルを使用した。ヒト血液から好中球を単離し、これらの細胞によるＭＰＯのインビトロ放出を評価した。市販のヒト白血球細胞株からの膜結合型炎症媒介物質の放出も評価した。ＥＰＯの分泌を評価するために、ヒト前骨髄球性細胞株ＨＬ−６０クローン１５を使用した（Ｆｉｓｃｈｋｏｆｆ  ＳＡ．Ｇｒａｄｅｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬ−６０  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｕｎｄｅｒ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ  １９８８；１２：６７９−６８６；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＨＦ，Ａｃｋｅｒｍａｎ  Ｓ  Ｊ，Ｔｅｎｅｎ  ＤＧ．Ｈｕｍａｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  ａｎｄ  ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｔｏｘｉｎ  ｗｉｔｈ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８９；１７０：１６３−１７６；Ｔｉｆｆａｎｙ  ＨＬ，Ｌｉ  Ｆ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＨＦ．Ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ａ  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  １９９５；５８：４９−５４；Ｂａｄｅｗａ  ＡＰ，Ｈｕｄｓｏｎ  ＣＥ，Ｈｅｉｍａｎ  ＡＳ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｏｔａｘｉｎ，ｅｏｔａｘｉｎ−２，ａｎｄ  ｅｏｔａｘｉｎ−３  ｏｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ａｎｉｏｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ２００２；２２７：６４５−６５１）。リゾチームの分泌を評価するために、単球系白血病細胞株Ｕ９３７を使用した（Ｈｏｆｆ  Ｔ，Ｓｐｅｎｃｋｅｒ  Ｔ，Ｅｍｍｅｎｄｏｅｒｆｆｅｒ  Ａ．，Ｇｏｐｐｅｌｔ−Ｓｔｒｕｅｂｅ  Ｍ．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＴＰＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  １９９２；５２：１７３−１８２；Ｂａｌｂｏａ  Ｍ  Ａ，Ｓａｅｚ  Ｙ，Ｂａｌｓｉｎｄｅ  Ｊ．  Ｃａｌｃｉｕｍ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｕ９３７  ｐｒｏｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１７０：５２７６−５２８０；Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ  Ｃ，Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｋ．  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（Ｕ−９３７）．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９７６；１７：５６５−５７７）。グランザイムの放出を��価するために、リンパ球ナチュラルキラー細胞株ＮＫ−９２を使用した（Ｇｏｎｇ  ＪＨ．，Ｍａｋｉ  Ｇ，Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＮＫ−９２）  ｗｉｔｈ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １９９４；８：６５２−６５８；Ｍａｋｉ  Ｇ，Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ，Ｍａｒｔｉｎｓｏｎ  ＪＡ，Ｔａｒｎ  ＹＫ．Ｆａｃｔｏｒｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ，ＮＫ−９２．Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２００１；１０：３６９−３８３；Ｔａｋａｙａｍａ  Ｈ，Ｔｒｅｎｎ  Ｇ，Ｓｉｔｋｏｖｓｋｙ  ＭＶ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９８７；１０４：１８３−１９０）。全てのケースで、２４アミノ酸のＭＡＲＣＫＳＮ末端と同一の合成ペプチド［ＭＡＮＳ−ミリストイル化されたＮ−末端配列ペプチド；ＭＡ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）］（ＭＡは、アミド結合によって、ペプチドのＮ末端アミンに付着されたミリストイルである。）又は同じ２４アミノ酸からなるが、ランダムな順序の配列で配置されており、ＭＡＮＳペプチド配列と１３％未満の配列同一性を有するミスセンスの対照ペプチド［ＲＮＳ：ランダムＮ末端配列ペプチドＭＡ−ＧＴＡＰＡＡＥＧＡＧＡＥＶＫＲＡＳＡＥＡＫＱＡＦ（配列番号２）］の多岐にわたる濃度とともに、細胞を予め温置した。
【０１２８】
各細胞種において、ＭＡＮＳは、濃度依存的な様式で炎症媒介物質の放出を弱めるが、ＲＮＳは弱めない。観察の有用な時間経過は、０．５から３時間である。結果は、白血球の脱顆粒を引き起こす細胞内経路に関与しているＭＡＲＣＫＳタンパク質のＮ末端領域と合致している。
【０１２９】
ヒト好中球の単離−これらの研究は、ＮＣＳＵヒト研究治験審査委員会（ＩＲＢ）によって承認された。ヒト好中球は、僅かな改変を加えて、以前に記載されたとおりに単離した（Ｔａｋａｓｈｉ  Ｓ，ＯｋｕｂｏＹ，ＨｏｎｒｉｅＳ．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ５４  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ａｎｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００１；９１：６１３−６２２を参照されたい。）簡潔に述べれば、正常で健康なボランティアからヘパリン処理された静脈血を取得し、１：１の比で、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ；Ｍｅｄｉａｔｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）で希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（密度、１．０７７ｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）上に重層し、４℃で２０分間、４００ｇで遠心した。上清及び界面の単核細胞を注意深く除去し、沈降物中の赤血球を、冷却した蒸留水中に溶解した。単離された顆粒球を、Ｈａｎｋｓの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、氷上のＨＢＳＳ中に再懸濁した。実験のために用いた好中球は、９８％超の純度で、好酸球によるきょう雑が２％未満であり、Ｔｒｙｐａｎブルー色素排除によって測定したところによれば、生存率は９９％超であった。
【０１３０】
放出された好中球ＭＰＯ活性の測定−ＭＰＯ放出の測定のために、ＨＢＳＳ中に懸濁された、精製されたヒト好中球を、１５ｍＬチューブ中に、４×１０６細胞／ｍＬで分取し、３７℃で１０分間、ＭＡＮＳ又はＲＮＳペプチドの５０又は１００μＭの何れかとともに予め温置した。次いで、１００ｎＭフォルボール１２−ピリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ）で、最長３時間、細胞を刺激した。１５ｍＬのチューブ中に、４×１０６細胞／ｍＬで分取され、ＨＢＳＳ中に懸濁された精製されたヒト好中球を用いて対照基準（ＰＭＡ対照基準）を確立し、ＭＡＮＳ又はＲＮＳペプチドの不存在下で、同じ時間、１００ｎＭフォルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ）で刺激した。氷上にチューブを配置することによって反応を停止させ、４℃で５分間、４００ｇで遠心した。
【０１３１】
細胞上清中のＭＰＯ活性は、以前に確立された技術に基づいて、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いてアッセイした（Ａｂｄｅｌ−Ｌａｔｉｆ  Ｄ，Ｓｔｅｗａｒｄ  Ｍ，Ｍａｃｄｏｎａｌｄ  ＤＬ，Ｆｒａｎｃｉｓ  ＧＡ．，Ｄｉｎａｕｅｒ  ＭＣ，Ｌａｃｙ  Ｐ．Ｒａｃ２  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０４：８３２−８３９）。簡潔に述べれば、ＴＭＢ基質溶液１００μＬを、９６ウェルマイクロプレート中の細胞上清又は標準ヒトＭＰＯ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｇｅ，ＣＡ）５０μＬに添加した後、室温で１５分間温置した。１ＭＨ２ＳＯ４５０μＬの添加によって反応を停止し、分光光度的マイクロプレートリーダー（ＶＥＲＳＡ  ｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）中で、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。
【０１３２】
白血球培養研究
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から、ヒト白血球細胞株の３つの種類、具体的には、前骨髄球性細胞株ＨＬ−６０クローン１５、単球性細胞株Ｕ９３７及びリンパ球ナチュラルキラー細胞株ＮＫ−９２を購入した。３７℃で、５％ＣＯ２を含有する雰囲気において、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ；ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、５０ＩＵ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び２５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．８が補充された、Ｌ−グルタミンを加えたＲＰＭＩ１６４０からなる培地中に、ＨＬ−６０クローン１５細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１９６４）を維持した。好酸球様表現系への最終的な分化は、以前に記載されたように、０．５ｍＭ酪酸（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏ．）を含有する上記培地中の５×１０５細胞／ｍＬで細胞を５日間培養することによって開始した（Ｔｉｆｆａｎｙ  ＨＬ，Ｌｉ  Ｆ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＨＦ．Ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ａ  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  １９９５；５８：４９−５４；Ｔｉｆｆａｎｙ  ＨＬ，Ａｌｋｈａｔｉｂ  Ｇ，Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅ  Ｃ，Ｂｅｒｇｅｒ  ＥＡ，Ｍｕｒｐｈｙ  ＰＭ．ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  １  ａｎｄ  ３  ａｒｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＩＬ−５  ｄｕｒｉｎｇ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ  ＨＬ−６０  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８；１６０：１３８５−１３９２）。１０％ＦＢＳ、５０Ｉ／ｍＬペニシリン及び５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンが補充された、Ｌ−グルタミンを加えたＲＰＭＩ１６４０からなる完全培地中、５％ＣＯ２の雰囲気中において、３７℃でＵ９３７細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５９３．２）を増殖させた。ＮＫ−９２細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−２４０７）を、５％ＣＯ２を含有する雰囲気において、３７℃で、２０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬインターロイキン−２（ＩＬ−２）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、５×１０−５Ｍ２−メルカプトエタノール、５０ＩＵ／ｍＬペニシリン及び５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンが補充されたα−ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏ．）中に維持した。細胞の形態は、ライト・ギムザ染色された細胞の評価によって判断した。実験のために採集された細胞の生存率はトリパンブルー排除によって評価し、９５％超の生存率を有する細胞の集団を使用した。
【０１３３】
脱顆粒アッセイのための細胞の温置
ＨＬ−６０クローン１５、Ｕ９３７及びＮＫ−９２細胞を洗浄し、全ての脱顆粒アッセイに関して、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ−１６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）中に２．５×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。１５ｍＬのチューブ中の細胞の分取試料を、３７℃で１０分間、ＭＡＮＳ又はＲＮＳペプチドの表記濃度とともに予め温置した。次いで、最大２時間、ＰＭＡで細胞を刺激した。それぞれ、洗浄され、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ−１６４０中に２．５×１０６細胞／ｍＬで再懸濁され、ＰＭＡを用いて、但し、ＭＡＮＳ又はＲＮＳペプチドの不存在下で、同じ時間にわたって刺激されたＨＬ−６０クローン１５、Ｕ９３７及びＮＫ−９２細胞を用いて、各細胞種に対して対照基準（ＰＭＡ対照基準）を確立した。チューブを氷の上に置き、４００ｇで、５分間４℃で細胞を遠心することによって反応を停止させた。
【０１３４】
好中球から放出されたＭＰＯ及びＵ９３７細胞から放出されたリゾチームの測定のために、本発明者らは、それぞれ、ヒトＭＰＯ及び卵白オボアルブミンを標準物質として使用することによって分泌を定量することが可能であった。ＨＬ−６０クローン１５細胞から放出されたＥＰＯ及びＮＫ−９２細胞から放出されたグランザイムに関しては、定量のために使用するための標準物質は入手できなかった。従って、ＥＰＯ及びグランザイムの（溶解された細胞からの）放出されたレベル及び細胞内レベルをともに測定し、それぞれに対する合計（細胞内及び放出されたもの）のパーセントとして、放出されたＥＰＯ及びグランザイムを表した。ＨＬ−６０クローン１５細胞中の細胞内ＥＰＯ及びＮＫ−９２細胞中の細胞内グランザイムを測定するために、以下に記載されている細胞内顆粒タンパク質の定量のために、０．１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００によって溶解された細胞の適切な分取試料を採取した。培養物間の変動を最小限に抑えるために、全ての処理は、対照のパーセントとして表した。
【０１３５】
ＨＬ−６０ＥＰＯの放出の測定
ＨＬ−６０クローン１５細胞によって放出されたＥＰＯ活性は、以前に確立された技術に従い、ＴＭＢを用いてアッセイされた（Ｌａｃｙ  Ｐ，Ｍａｈｍｕｄｉ−Ａｚｅｒ  Ｓ，Ｂａｂｌｉｔｚ  Ｂ，Ｈａｇｅｎ  ＳＣ，Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ  ＪＲ，Ｍａｎ  ＳＦ，Ｍｏｑｂｅｌ  Ｒ．  Ｒａｐｉｄ  ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｌｙ  ｓｔｏｒｅｄ  ＲＡＮＴＥＳ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  １９９９；９４：２３−３２）。従って、ＴＭＢ基質溶液１００μＬを、９６ウェルマイクロプレート中の試料５０μＬ（μＬ＝マイクロリットル）に添加し、室温で１５分間（ｍｉｎ＝分）温置された。１．０ＭＨ２ＳＯ４５０μＬの添加によって反応を停止させ、４５０ｎｍ（ｎｍ＝ナノメートル）の吸光度を分光学的マイクロプレートリーダー中で読み取った。ｔｒｉｔｏｎＸ−１００によって溶解された細胞の同数で得られた量を用いて、分泌されたＥＰＯの量を全含量のパーセントとして表した。
【０１３６】
単球リゾチーム分泌の測定
Ｕ９３７細胞によって分泌されたリゾチームは、僅かに改変された前述のような分光学的アッセイを用いて、測定された（Ｂａｌｂｏａ  Ｍ  Ａ，Ｓａｅｚ  Ｙ，Ｂａｌｓｉｎｄｅ  Ｊ．  Ｃａｌｃｉｕｍ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｕ９３７  ｐｒｏｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１７０：５２７６−５２８０）。従って、試料１００μＬを、９６ウェルマイクロプレート中のミクロコッカス・リソデイクチカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）懸濁液１００μＬ（０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０中、０．３ｍｇ／ｍＬ）と混合した。４５０ｎｍの吸光度の減少を室温で測定した。ニワトリ卵白リゾチーム（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を標準として使用して、較正曲線を構築した。
【０１３７】
ＮＫ細胞グランザイム分泌の測定
ＮＫ−９２細胞から分泌されたグランザイムは、実質的に以前に記載されたように、Ｎα−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジンチオベンジルエステル（ＢＬＴ）の加水分解を測定することによってアッセイされた（Ｔａｋａｙａｍａ  Ｈ，Ｔｒｅｎｎ  Ｇ，Ｓｉｔｋｏｖｓｋｙ  ＭＶ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９８７；１０４：１８３−１９０）。上清５０μＬを９６ウェルプレートに移し、リン酸緩衝化された生理的食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ  ７．２）中のＢＴＬ溶液１５０μＬ（０．２ｍＭＢＬＴ；ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，及び０．２２ｍＭＤＴＮＢ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）（ｍＭ＝ミリモラー）を上清に添加した。室温で３０分間温置した後に、４１０ｎｍの吸光度を読み取った。結果は、ｔｒｉｔｏｎＸ−１００によって溶解された細胞の同数で得られた量を用いて、全細胞酵素含量のパーセントとして表された。
【０１３８】
統計解析：
様々な処理群間の差の統計的な有意差は、片側ＡＮＯＶＡを用いて評価された。０．０５未満のＰ値を有意と考えた。
【０１３９】
好中球ＭＰＯの放出
１００ｎＭＰＭＡは（炎症媒介物質放出の刺激物質として）、ＰＭＡ対照基準中、３０分の時点での対照レベルと比べて、ヒト好中球ＭＰＯ放出を約３倍増加させ、ＭＰＯの放出は、３時間後に、約５から６倍まで増加していることが見出された。３０分の時点で、対照ＭＰＯ活性を１００％として、ＰＭＡ不存在及びＰＭＡ不存在＋ＭＡＮＳ又はＲＮＳ、ＰＭＡ対照基準のＭＰＯ活性は約２７５％であり、ＰＭＡ＋５０μＭＭＡＮＳは約２７５％であり、及び１００μＭＭＡＮＳは約３０５％であった。従って、ＭＡＮＳペプチドは３０分の時点で検出される効果を有さなかった。しかしながら、１時間までに、ＭＡＮＳのより高い濃度（１００μＭ）は、有意な阻害効果を有しており（対照の約２６０％で測定された。）、すなわち、ＰＭＡ対照基準レベル（対照の約３４０％で測定された。）に比べてＭＰＯ放出が約２５％低下した。５０μＭＭＡＮＳ試料は対照の約２９０％と測定され、すなわち、ＰＭＡ対照基準に比べて約１５％低下した。２時間までに、及び３時間の時点で持続し、ＭＡＮＳペプチドは、濃度依存的な様式で、ＭＰＯ活性を有意に弱めた。２時間の時点で、ＰＭＡ対照基準ＭＰＯ活性は、対照の約５４０％であり、５０μＭＭＡＮＳ（対照の約３７５％を測定）は、ＰＭＡ対照基準に比べて、ＭＰＯ放出の約３０％低下を引き起こし、１００μＭＭＡＮＳＡ（対照の約２９５％を測定）は、ＰＭＡ対照基準に比べて、ＭＰＯ放出の約４５％低下を引き起こした。３時間で、ＰＭＡ対照基準ＭＰＯ活性は、対照の約５６０％であり、５０μＭＭＡＮＳ（対照の約３７５％を測定）は、ＰＭＡ対照基準に比べて、ＭＰＯ放出の約３３％低下を引き起こし、１００μＭＭＡＮＳＡ（対照の約３２０％を測定）は、ＰＭＡ対照基準に比べて、ＭＰＯ放出の約４０％低下を引き起こした。ＲＮＳペプチドは、検査された時点又は濃度の何れにおいても、ＰＭＡによって誘導されたＭＰＯ放出に影響を与えなかった。
【０１４０】
ＨＬ−６０ＥＰＯの放出
ＨＬ−６０クローン１５細胞の上清中のＥＰＯ活性は、ＰＭＡ刺激から１時間及び２時間後に、著しく増強された。１時間の時点で、対照のＥＰＯ活性を１００％として、ＰＭＡ対照基準は約１１０％で測定され；１０μＭＭＡＮＳを含有する試料は、約９５％で測定され、ＰＭＡ対照基準に比べてＥＰＯ活性の約１５％の低下を与え；５０μＭＭＡＮＳを含有する試料は、約７８％で測定され、ＰＭＡ対照基準に比べてＥＰＯ活性の約３０％の低下を与え；及び１００μＭＭＡＮＳを含有する試料は、約６５％で測定され、ＰＭＡ対照基準に比べてＥＰＯ活性の約４０％低下を与えた。２時間の時点で、対照のＥＰＯ活性を１００％として、ＰＭＡ対照基準は約１４５％で測定され；１０μＭＭＡＮＳを含有する試料は、約１３０％で測定され、ＰＭＡ対照基準に比べてＥＰＯ活性の約１０％の低下を与え；５０μＭＭＡＮＳを含有する試料は、約７０％で測定され、ＰＭＡ対照基準に比べてＥＰＯ活性の約５０％の低下を与え；及び１００μＭＭＡＮＳを含有する試料は、約７２％で測定され、ＰＭＡ対照基準に比べてＥＰＯ活性の約５０％低下を与えた。従って、１時間及び２時間の両者で、５０又は１００μＭのＭＡＮＳは、ＥＰＯ放出を著しく弱めた。ＲＮＳペプチドは、検査された時点又は濃度の何れにおいても、ＰＭＡによって強化されたＥＰＯ放出に影響を与えなかった。
【０１４１】
Ｕ９３７リゾチームの放出
Ｕ９３７細胞によるリゾチームの分泌は、温置から１時間後までに、ＰＭＡ刺激によって増加され、２時間の時点でさらに増加された。１時間の時点で、対照のＵ９３７細胞によるリゾチーム分泌を１００％として、ＰＭＡ対照基準は約２１０％で測定され；１０μＭＭＡＮＳを含有する試料は約１７０％で測定され、ＰＭＡ対照基準と比べて、Ｕ９３７細胞によるリゾチーム分泌の約２０％低下を与え；５０μＭＭＡＮＳを含有する試料は約１７０％で測定されて、ＰＭＡ対照基準と比べてＵ９３７細胞によるリゾチーム分泌の約２０％低下を与え；及び１００μＭＭＡＮＳを含有する試料は約１１５％で測定されて、ＰＭＡ対照基準と比べてＵ９３７細胞によるリゾチーム分泌の約４５％低下を与えた。２時間の時点で、対照のＵ９３７細胞によるリゾチーム分泌を１００％として、ＰＭＡ対照基準は約２４０％で測定され；１０μＭＭＡＮＳを含有する試料は約１９５％で測定されて、ＰＭＡ対照基準と比べて、Ｕ９３７細胞によるリゾチーム分泌の約２０％低下を与え；５０μＭＭＡＮＳを含有する試料は約１８５％で測定されて、ＰＭＡ対照基準と比べて、Ｕ９３７細胞によるリゾチーム分泌の約２５％低下を与え；及び１００μＭＭＡＮＳを含有する試料は約１４０％で測定されて、ＰＭＡ対照基準と比べて、Ｕ９３７細胞によるリゾチーム分泌の約４０％低下を与えた。このように、リゾチーム分泌は、ＭＡＮＳの１００μＭによる刺激から１時間及び２時間後において著しく弱められたのに対して、ＭＡＮＳ５０又は１０μＭによって、それほど弱められなかった。ＲＮＳペプチドは、検査された時点又は濃度の何れにおいても、ＰＭＡによって強化されたリゾチーム分泌に影響を与えなかった。
【０１４２】
ＮＫ細胞のグランザイム放出
１時間の時点で、対照のＮＫ−９２細胞によるグランザイム分泌を１００％として、ＰＭＡ対照基準は約１２５％で測定され；１０μＭＭＡＮＳを含有する試料は約１１５％で測定されて、ＰＭＡ対照基準と比べて、ＮＫ−９２細胞によるグランザイム分泌の約１０％低下を与え；及び１００μＭＭＡＮＳを含有する試料は約８５％で測定されて、ＰＭＡ対照基準と比べて、ＮＫ−９２細胞によるグランザイム分泌の約３０％低下を与えた。２時間の時点で、対照のＮＫ−９２細胞によるグランザイム分泌を１００％として、ＰＭＡ対照基準は約２２０％で測定され；１０μＭＭＡＮＳを含有する試料は約２００％で測定されて、ＰＭＡ対照基準と比べて、ＮＫ−９２細胞によるグランザイム分泌の約１０％低下を与え；及び１００μＭＭＡＮＳを含有する試料は約８０％で測定されて、ＰＭＡ対照基準と比べて、ＮＫ−９２細胞によるグランザイム分泌の約６０％低下を与えた。このように、ＮＫ−９２細胞によるグランザイム放出は、１時間の時点では、ＰＭＡによって有意に増加されなかったが、２時間の時点で２倍を超えて増加した。ＭＡＮＳ１００μＭは、温置から１時間及び２時間後に、グランザイム分泌を弱めたが、ＭＡＮＳ１０μＭはグランザイム放出を弱めなかった。ＲＮＳペプチドは、検査された時点又は濃度の何れにおいても、ＰＭＡによって強化されたグランザイム分泌に影響を与えなかった。
【０１４３】
細胞毒性
ＬＤＨ保持／放出によって評価された場合に、処理の何れもが、細胞中に毒性応答を生成しなかった（データは示さず。）（Ｐａｒｋ  Ｊ−Ａ，Ｈｅ  Ｆ，Ｍａｒｔｉｎ  ＬＤ，Ｌｉ  Ｙ，Ａｄｌｅｒ  ＫＢも参照）。ヒト好中球エラスターゼは、ＰＫＣδによって媒介される機序を介して、インビトロで、ヒト気管支上皮細胞からのムチンの過剰分泌を誘導する。Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００５；１６７：６５１−６６１）。
【０１４４】
先の実施例は、本発明の例示であり、その範囲を限定するものと解釈すべきでない。本発明は、以下の特許請求の範囲により定義され、特許請求の範囲には、特許請求の範囲の均等物が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｄは、ＰＫＣとＰＫＧの両方の活性化によって、ＮＨＢＥ細胞によるムチンの過剰分泌が最大化されることを表す棒グラフである。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｄは、ＰＫＣとＰＫＧの両方の活性化によって、ＮＨＢＥ細胞によるムチンの過剰分泌が最大化されることを表す棒グラフである。
【図１Ｃ】図１Ａ−１Ｄは、ＰＫＣとＰＫＧの両方の活性化によって、ＮＨＢＥ細胞によるムチンの過剰分泌が最大化されることを表す棒グラフである。
【図１Ｄ】図１Ａ−１Ｄは、ＰＫＣとＰＫＧの両方の活性化によって、ＮＨＢＥ細胞によるムチンの過剰分泌が最大化されることを表す棒グラフである。
【図２Ａ】図２Ａから２Ｂは、ＭＡＲＣＫＳタンパク質がムチン分泌経路の中心的な成分であることを示す。
【図２Ｂ】図２Ａから２Ｂは、ＭＡＲＣＫＳタンパク質がムチン分泌経路の中心的な成分であることを示す。
【図３Ａ】図３Ａ−３Ｃは、ＭＡＲＣＫＳに対して誘導されたアンチセンスオリゴヌクレオチドがＭＡＲＣＫＳ発現を下方制御し、ムチンの過剰分泌を弱めることを示すゲルを図示している。
【図３Ｂ】図３Ａ−３Ｃは、ＭＡＲＣＫＳに対して誘導されたアンチセンスオリゴヌクレオチドがＭＡＲＣＫＳ発現を下方制御し、ムチンの過剰分泌を弱めることを示すゲルを図示している。
【図３Ｃ】図３Ａ−３Ｃは、ＭＡＲＣＫＳに対して誘導されたアンチセンスオリゴヌクレオチドがＭＡＲＣＫＳ発現を下方制御し、ムチンの過剰分泌を弱めることを示すゲルを図示している。
【図４Ａ】図４Ａ−４Ｂは、ＰＫＣ依存性リン酸化が形質膜から細胞質へＭＡＲＣＫＳを放出することを示している。
【図４Ｂ】図４Ａ−４Ｂは、ＰＫＣ依存性リン酸化が形質膜から細胞質へＭＡＲＣＫＳを放出することを示している。
【図５Ａ】図５Ａから５Ｃは、ＰＫＧがＰＰ２Ａを活性化することによってＭＡＲＣＫＳの脱リン酸化を誘導することを示している。
【図５Ｂ】図５Ａから５Ｃは、ＰＫＧがＰＰ２Ａを活性化することによってＭＡＲＣＫＳの脱リン酸化を誘導することを示している。
【図５Ｃ】図５Ａから５Ｃは、ＰＫＧがＰＰ２Ａを活性化することによってＭＡＲＣＫＳの脱リン酸化を誘導することを示している。
【図６】図６は、ＰＰ２Ａがムチン分泌経路の必須成分であることを示す棒グラフを図示している。
【図７】図７は、ＭＡＲＣＫＳが細胞質中のアクチン及びミオシンと会合することを示すゲルである。
【図８】図８は、ヒト気道上皮細胞によるムチン分泌を制御するシグナル伝達機序を図示している。
【図９】図９は、ＭＡＮＳペプチドが単離されたイヌ好中球からのミロペルオキシダーゼの分泌を遮断する能力を図示する棒グラフである。
【図１０】図１０は、ＭＡＮＳペプチドが単離されたヒト好中球からのミロペルオキシダーゼの分泌を遮断する能力を図示する棒グラフである。
【図１１】図１１は、ＰＭＡが、ＬＰＳによって刺激されたヒト好中球からのＭＰＯ分泌の僅かな増加を刺激し、これは８−Ｂｒ−ｃＧＭＰでの共同刺激によって濃度依存的様式で増強されることを示す棒グラフである。
【図１２】図１２は、ＰＭＡでの共同刺激が濃度依存的様式で起こるまで、ＬＰＳによって刺激されたヒト好中球からのＭＰＯ分泌に対して、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激が殆ど効果を及ぼさないことを示す棒グラフである。
【図１３】図１３は、ＰＭＡが、ＬＰＳによって刺激されたイヌ好中球からのＭＰＯ分泌の僅かな増加を刺激し、これは８−Ｂｒ−ｃＧＭＰでの共同刺激によって濃度依存的様式で増強されることを示す棒グラフである。
【図１４】図１４は、ＰＭＡでの共同刺激が濃度依存的様式で起こるまで、ＬＰＳによって刺激されたイヌ好中球からのＭＰＯ分泌に対して、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激が殆ど効果を及ぼさないことを示す棒グラフである。
【図１５】図１５は、ＬＰＳによって刺激されたイヌ好中球からの最大ＭＰＯ分泌のために、ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰでの刺激が必要とされることを示す棒グラフである。
【図１Ａ】
2009531307.tif 000003
【図１Ｂ】
2009531307.tif 000004
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
2009531307.tif 000007
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
2009531307.tif 000009
【図３Ｂ】
2009531307.tif 000010
【図３Ｃ】
2009531307.tif 000011
【図４Ａ】
2009531307.tif 000012
【図４Ｂ】
2009531307.tif 000013
【図５Ａ】
2009531307.tif 000014
【図５Ｂ】
2009531307.tif 000015
【図５Ｃ】
2009531307.tif 000016
【図６】
2009531307.tif 000017
【図７】
2009531307.tif 000018
【図８】
2009531307.tif 000019
【図９】
2009531307.tif 000020
【図１０】
2009531307.tif 000021
【図１１】
2009531307.tif 000022
【図１２】
2009531307.tif 000023
【図１３】
2009531307.tif 000024
【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
2009531307000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年11月7日(2008.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象中の炎症を治療するための医薬の製造のためのＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の使用であり、前記医薬は、前記ペプチド又はその活性断片の不存在下で生じる炎症細胞の同じ種類からの炎症媒介物質の放出と比べて、少なくとも１つの炎症細胞からの、前記炎症細胞内部の小胞内に含有される少なくとも１つの炎症媒介物質の放出を低下させるように投与するために調製される前記使用。
【請求項２】
前記ペプチドが配列番号１を含むＭＡＮＳペプチドである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記活性断片が、配列番号１の少なくとも６つのアミノ酸を含む少なくとも１つミリストイル化されたＮ末端断片を含み、前記断片の第一のアミノ酸が配列番号１のＮ末端グリシンから始まる、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記活性断片が、Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（配列番号１５）Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶ（配列番号２０）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡ（配列番号３）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡ（配列番号４）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥ（配列番号５）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧ（配列番号６）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰ（配列番号７）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲ（配列番号８）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥ（配列番号９）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡ（配列番号１０）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡ（配列番号１１）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡ（配列番号１２）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥ（配列番号１３）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧ（配列番号１４）；；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡ（配列番号１６）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡ（配列番号１７）；Ｎ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴ（配列番号１８）；及びＮ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫ（配列番号１９）からなる群から選択される、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記炎症細胞が白血球である、請求項１から４の何れかに記載の使用。
【請求項６】
前記炎症細胞が、好中球、好塩基球、好酸球及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１から４の何れかに記載の使用。
【請求項７】
前記炎症細胞が単球又はマクロファージである、請求項１から４の何れかに記載の使用。
【請求項８】
前記炎症媒介物質が、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、主要塩基性タンパク質［ＭＢＰ］、リゾチーム、グランザイム、ヒスタミン、プロテオグリカン、プロテアーゼ、走化性因子、サイトカイン、アラキドン酸の代謝物、デフェンシン、殺菌性透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）、エラスターゼ、カテプシンＧ、カテプシンＢ、カテプシンＤ，β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α―マンノシダーゼ、ホスホリパーゼＡ２、コンドロイチン−４−サルファート、プロテイナーゼ３、ラクトフェリン、コラーゲナーゼ、補体活性化因子、補体受容体、Ｎ−ホルミルメチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ＦＭＬＰ）受容体、ラミニン受容体、チトクロムｂ５５８、単球走化性因子、ヒスタミナーゼ、ビタミンＢ１２結合タンパク質、ゼラチナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子、β−Ｄ−グルクロニダーゼ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１から７の何れかに記載の使用。
【請求項９】
前記炎症媒介物質が、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、主要塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、リゾチーム、グランザイム及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記医薬が、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の不存在下で少なくとも１つの炎症細胞から放出される量と比べて約１％から約９９％、少なくとも１つの炎症細胞から放出される炎症媒介物質の量を低下させるＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の脱顆粒阻害量を含む、請求項１から９の何れかに記載の使用。
【請求項１１】
前記医薬が、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の不存在下で少なくとも１つの炎症細胞から放出される量と比べて約５〜５０％と約９９％の間に、少なくとも１つの炎症細胞から放出される炎症媒介物質の量を低下させるＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の脱顆粒阻害量を含む、請求項１から９の何れかに記載の使用。
【請求項１２】
炎症媒介物質の放出を低下させることが、前記炎症細胞からの炎症媒介物質を放出する機序を遮断又は阻害することを含む、請求項１から１１の何れかに記載の使用。
【請求項１３】
前記対象が、ヒト、イヌ、ウマ及びネコからなる群から場合によって選択される哺乳動物である、請求項１から１２の何れかに記載の使用。
【請求項１４】
前記医薬が、局所投与、非経口投与、直腸投与、肺投与、経鼻投与及び経口投与による投与のために調製される、請求項１から１３の何れかに記載の使用。
【請求項１５】
前記肺投与が、エアロゾル、乾燥粉末吸入器、定量噴霧式吸入器及び噴霧器からなる群から選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記医薬が、抗生物質、抗ウイルス性化合物、抗寄生虫化合物、抗炎症性化合物及び免疫抑制物質からなる群から選択される第二の分子とともに投与するために調製される、請求項１から１５の何れかに記載の使用。
【請求項１７】
前記対象が呼吸器系疾患に罹患している、請求項１から１６の何れかに記載の使用。
【請求項１８】
前記呼吸器系疾患が、喘息、慢性気管支炎及びＣＯＰＤからなる群から選択される、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記対象が、腸疾患、皮膚疾患、自己免疫疾患、疼痛症候群及びこれらの組み合わせからなる群から選択される疾病に罹患している、請求項１から１６の何れかに記載の使用。
【請求項２０】
前記腸疾患が、潰瘍性大腸炎、クローン病及び過敏性腸症候群からなる群から選択される、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記皮膚疾患が、酒さ、湿疹、乾癬及び重度のにきびからなる群から選択される、請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
前記対象が関節炎又は嚢胞性繊維症に罹患している、請求項１から１６の何れかに記載の使用。