(57)【要約】本発明は、繊毛虫テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）の熱ショックタンパク質ファミリーの熱誘導性プロモーター、特に配列番号１のヌクレオチド配列を有するプロモーターまたはそのプロモーター有効断片に関する。さらに、繊毛虫テトラヒメナ・サーモフィラ（における相同および／または異種タンパク質の発現のための本発明の熱誘導性プロモーターの使用も請求される。
2009501015.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊毛虫テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）の熱ショックタンパク質ファミリーの熱誘導性プロモーターであって、配列番号１のヌクレオチド配列またはそのプロモーターとして有効な断片を有する、上記熱誘導性プロモーター。
【請求項２】
繊毛虫テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）における相同および／または異種タンパク質の発現のための、請求項１に記載の熱誘導性プロモーターの使用。
【請求項３】
熱誘導性プロモーターが目的タンパク質のヌクレオチド配列を含む発現ベクターに組み込まれている、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
ベクターが目的タンパク質のコード配列の３’位に隣接するテトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）の(−チューブリン２ターミネーター配列を含む、請求項２および／または３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組み換え分子生物学の分野に関し、主題は生物系における産物合成に用いられる強力な誘導性プロモーターである。
【背景技術】
【０００２】
テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）は、原生動物界に属し、および２つの核すなわち転写不活性な二倍体生殖小核（ＭＩＣ）および転写活性な倍数体細胞大核（ＭＡＣ）を有する、繊毛性の真核単細胞生物である。１９２３年に、ノーベル賞受賞者アンドレ・ルウォフ（Ａｎｄｒｅ Ｌｗｏｆｆ）がテトラヒメナを純粋培養で増殖させるのに成功した時、このアルベオラータを生物モデルとして使用する基礎ができた。テトラヒメナで行われた画期的な発見は、ダイニンモーター、テロメア、ＲＮＡ媒介触媒作用、テロメラーゼ、および転写調節におけるヒストンアセチルトランスフェラーゼの機能の発見である。最近十年間に、テトラヒメナのゲノムおよびプロテオームを改変するための分子生物学的方法が開発されており、ＤＮＡトランスフェクション法は、ＭＡＣへのマイクロインジェクションから、ＭＡＣへのエレクトロポレーション、ＭＩＣおよびＭＡＣの遺伝子銃にわたる。ｒＤＮＡ−レプリコンを基礎とするエピソームプラスミド、および相同組み換えに基づくノックアウト／ノックイン法が利用可能である。タンパク質レベルでは、近縁種の異種発現が実施されており、およびまた内因性タンパク質が新規のアンチセンスリボソーム法で転写抑制された。テトラヒメナの生物工学的潜在性は多数の文献で証明されており、速やかな増殖、高いバイオマス、通常の細菌／酵母用設備での発酵、スケールアップ性、安価なおよび化学的に規定された培地の存在を実証している。
【０００３】
現在までのところ、ほんの少数のプロモーター活性なテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）ＤＮＡ配列が、分子生物学において研究に用いられるのに有用な程度まで特徴づけられている。これらは、かなり弱くおよびさらに細胞周期依存性のヒストン−1およびベータ−チューブリン−プロモーター2およびまた重金属誘導性メタロチオネイン−プロモーターを含む3,4。メタロチオネインは、ストレスに際してアップレギュレートされる、細胞での解毒に関与する金属結合タンパク質である。テトラヒメナではメタロチオネインが知られており、そのプロモーターはカドミウム、銅、亜鉛の存在によって非常に良好に誘導できるが（誘導はこの順で弱くなる）、しかし過酸化物または熱といった他のストレス因子ではほとんど誘導できない。重金属は毒性であって細胞増殖を阻害しおよび（より高濃度では）細胞死に繋がるため、系の健康に及ぼす影響がより小さい系、および痕跡無しに除去されうる誘導因子が好ましい。さらに重金属陽イオンによる環境に対する重大な影響のため、汚染培地の廃棄は時間および資源を要する。商業的生物生産工程における財政努力は最小でなければならないため、メタロチオネインプロモーターは最適な誘導系とは思われない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
熱ショックタンパク質すなわちＨＳＰは、細胞内で複数の保護機能を有する、進化的に保存されたストレス応答タンパク質である。これらのタンパク質は遍在性であって現在までに試験されたすべての真核生物で見出されており、および熱ショックによっておよびさまざまな他の外的因子によって誘導されうる。このように、細胞は、生育温度の上昇といったこれらの誘導因子に、高レベルのＨＳＰを合成しおよび連係的に他の細胞タンパク質の合成の速度を低下させることにおって応答する。ＨＳＰはサイズに基づいていくつかの群に分類される。テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）におけるＨＳＰの存在もまた、２０年以上前に記載されている5。テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）では、ＨＳＰ７０（登録番号ＡＡＫ２９１００）およびＨＳＰ９０（登録番号ＡＡＤ４１３５７）ファミリーに属する４種類のタンパク質が記載されおよび部分アミノ酸配列について特徴づけられているが6、しかしプロモーター活性配列はまだ解明されていない。
【０００５】
別の系におけるＨＳＰの調節はさまざまな著者によって広く研究されており、およびプロモーター強度はタンパク質発現のレベルを単独で担うのではないことがわかっている。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＨＳＰ７０について、ｈｓｐ７０遺伝子転写物の３’非翻訳領域もまた、細胞におけるタンパク質およびｍＲＮＡ合成のレベルの調節を、誘導および非誘導状態の両方で担うことが知られている。プロモーター領域に、熱ショック配列ＨＳＥが、真核熱ショック遺伝子の開始ＡＴＧの５’に見出される7。この領域は、少なくとも２回頭部−頭部または尾部−尾部方向で反復される、配列ｎＧＡＡｎおよびｎＴＴＣｎを含む。ＨＳＰ遺伝子上のＨＳＥの数および方向は種間で異なるが、しかし正のトランス活性化因子である熱ショック因子（ＨＳＦ）の熱ショック配列への結合は、他のどの既知の哺乳類転写因子のそれぞれの結合部位への結合よりも約百倍高く、これらのプロモーターをこれまでに知られた最強としている。
【０００６】
したがってさまざまな生物のＨＳＰプロモーターが、多数のタンパク質のための異種発現系に用いられている8,9。
【０００７】
生物のゲノムはコドン使用頻度だけでなくＡＴ含量もさまざまであるため、より遠縁の種のプロモーターはこれらの系間で交換された場合に作用しないことは明らかである。原生生物界ではゲノムは非常にＡＴに富み、および上記の通り、特徴づけられているプロモーターは少数しかない。酵母、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、哺乳類およびウイルスの、よく知られおよび広く用いられているプロモーターは、繊毛虫で作用することが見つかっていない（未発表自己データ）。
【０００８】
本発明はしかし、請求項１で定義されるテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）熱ショックタンパク質ファミリーのプロモーターが、高いレベルでの調節された外来遺伝子発現に使用されうることを示す。本発明に記載の熱誘導性プロモーターは、配列番号１のヌクレオチド配列、別名ＨＳＰ９０プロモーター、またはそのプロモーター有効断片を有することが特に好ましい。
【０００９】
本発明はまた、繊毛虫テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）における相同および／または異種タンパク質の発現のための、本発明に記載の熱誘導性プロモーターの使用に関する。
【００１０】
本発明に記載の熱誘導性プロモーターが、目的タンパク質のヌクレオチド配列を含む発現ベクターに組み込まれていることが好ましい可能性がある。このベクターは好ましくは、目的タンパク質のコード配列の３’位に隣接するテトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）の(−チューブリン２ターミネーター配列を含む。
【００１１】
これらのプロモーターは単に熱によって誘導可能であり、および化学物質が添加されることを必要としない。産物の誘導は多様である。転写活性のバックグラウンドレベルは低いため、他では毒性または致命的な産物について理想的なプロモーターであること、および条件ノックアウトおよびノックインのために非常に良い手段となることを示す。発酵中に、合成過程は単に温度を低下させることによって容易に停止されうる。細胞は回収され、および生合成はまた再誘導されうる。このことは、他の系よりも高い収量をもたらす。連続発酵法は繊毛虫についてよく確立された方法であるため、および温度ストレスは培養から容易に除去されうるため、生産サイクルは繰り返し反復されうる。下記に示す実施例では、生産された異種ｍＲＮＡは内因性ＨＳＰ−ｍＲＮＡよりも安定である。これは、Ｔ．サーモフィラ（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）の(−チューブリン２の３’ターミネーターの使用によって達成される。このため、標的遺伝子のｍＲＮＡは培養の回復相にまだ存在しおよび翻訳される。本発明のこれらの性質は、まだ記述されていない新規の効率的な製造工程に繋がる。
【００１２】
本発明はここで下記の実施例によってより詳細に記載される。
【実施例】
【００１３】
下記の実施例は、本発明の実施形態を説明するために提供されるが、その範囲を限定することは意図されない。
【００１４】
テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）の培養および形質転換
使用したすべての系統はテトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）に由来し、および以前に詳細に記載されている。Ｔ．サーモフィラ細胞の形質転換は、以前に公表された通り改変して実施された10,11。培養は３０℃にて実施された。標的遺伝子発現は、４１℃での熱ショックによって（ＨＳＰ）または２０ｎＭ Ｃｄ2+の添加によって（ＭＴＴ１）誘導された。
【００１５】
ＨＳＰプロモーター領域、コード配列およびベクター構造のクローニング
配列番号１はＴ．サーモフィラ（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ゲノムＤＮＡから二種類のプライマーＨＳＰ９０＿Ｆ ＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＡＧＣＡＴＧＣＴＴＴＴＴＣＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴＣＣおよびＨＳＰ９０＿Ｒ ＡＴＣＣＡＴＴＴＣＴＴＡＴＧＡＴＡＴＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＧＣ（下線の塩基はプライマー伸長を含む）によって増幅された。得られたＰＣＲ断片はゲル電気泳動に供され、精製され、ＸｈｏＩで切断され、およびベクター ｐＰＴ Ｃｉｌｉａｎにライゲーションされ、前述の配列の調節下にあるＥＧＦＰをコードする遺伝子を発現する機能性テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）ベクターｐＰＴ ＨＳＰ９０を与えた。ＥＧＦＰ遺伝子のコード領域の３’領域は、Ｔ．サーモフィラの(−チューブリン２遺伝子のターミネーター配列が隣接している（図１参照）。ＭＴＴ１プロモーターを用いる対照ベクター（ｐＰＴ ＭＴＴ１）は、プライマー対ＭＴＴ１＿Ｆ ＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＧＡＴＡＡＧＴＡＡＴＡＴＡＴＴＴＡＧＴＧＣＡＣＡＡＴＧＴＴＴＧＡＡＴＧ および ＭＴＴ１＿Ｒ ＡＴＣＣＡＴＴＡＴＴＴＴＡＡＧＴＴＴＡＧＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＡＧによって同様に構築された。
【００１６】
ＥＧＦＰの検出
採集されたＴ．サーモフィラ（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）形質転換体はＳＤＳ試料緩衝液中で沸騰され、およびＳＤＳゲル電気泳動に供された。分離されたタンパク質はニトロセルロース膜にブロッティングされ、およびＥＧＦＰは特異的一次抗体に次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ複合化二次抗体と組み合わせたピアース社（Ｐｉｅｒｃｅ）スーパーシグナル（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ）によって、レイテスト社（ｒａｙｔｅｓｔ）アイダ（ＡＩＤＡ）で検出された。
【００１７】
Ｔ．サーモフィラ（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ＨＳＰ９０プロモーターの調節下にあるレポータータンパク質の誘導性異種発現
同定されたＨＳＰプロモーターが外来遺伝子を発現できるかどうかを試験するため、ｐＰＴ ＨＳＰ９０をトランスフェクションした指数増殖中のＴ．サーモフィラ細胞培養を分割し、半分を３０℃にて増殖させ、残り半分に熱ショックを与えた。ＭＴＴ１プロモーターに導かれる外来遺伝子発現は、ｐＰＴ ＭＴＴ１形質転換細胞においてカドミウムの添加によって誘導された。
【００１８】
図２はこれらの培養の細胞溶解物のウェスタンブロットを示す。ｐＰＴ形質転換細胞だけが、対照と同じ分子量で泳動される検出可能なバンドを示す。野生型対照（レーン２）は全くブランクである。熱による（レーン４）またはカドミウムによる（レーン６）発現の強い誘導は、非誘導細胞（レーン３および５）と比較して明らかである。さらに非誘導細胞は両方のプロモーター系で非常に低い基礎活性を示す。
【００１９】
図２に示すデータから、配列番号１（ＨＳＰ９０）のプロモーター活性は、すでに公表されたＭＴＴ１プロモーター活性と同程度に正確に調節できること、および比較的強いことが結論できる。
【００２０】
したがって、本発明に記載の熱誘導性プロモーターは、ＭＴＴ１プロモーターが用いられる一覧12のようなすべての生物工学用途で使用でき、一方で非毒性の誘導性のためにさらに秀れておりおよび好ましい。
【００２１】
引用文献
１．カーン（Ｋａｈｎ），Ｒ．Ｗ．，アンダーセン（Ａｎｄｅｒｓｅｎ），Ｂ．Ｈ．＆ブルンク（Ｂｒｕｎｋ），Ｃ．Ｆ．外来遺伝子のマイクロインジェクションによるテトラヒメナ・サーモフィラの形質転換（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ｂｙ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅ．）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ９０，９２９５−９２９９ （１９９３）．
２．ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ），Ｄ．Ｓ．，ガオ（Ｇａｏ），Ｙ．，アソカン（Ａｓｏｋａｎ），Ｋ．＆ ゲルティグ（Ｇａｅｒｔｉｇ），Ｊ．熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質はｉ自由生活繊毛虫テトラヒメナ・サーモフィラの細胞表面に発現されおよび局在化する（Ｔｈｅ ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｆｒｅｅ−ｌｉｖｉｎｇ ｃｉｌｉａｔｅ Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ．） Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１２２，１１９−１２６ （２００２）．
３．シャン（Ｓｈａｎｇ），Ｙ．他．頑健な誘導性抑制プロモーターが相同および異種遺伝子の遺伝子ノックアウト、条件発現、および過剰発現をテトラヒメナ・サーモフィラで大幅に促進する（Ａ ｒｏｂｕｓｔ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ−ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｇｒｅａｔｌｙ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔｓ，ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ．） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ９９，３７３４−３７３９ （２００２）．
４．ボルドリン（Ｂｏｌｄｒｉｎ），Ｆ．，サントビト（Ｓａｎｔｏｖｉｔｏ），Ｇ．，ネグリソロ（Ｎｅｇｒｉｓｏｌｏ），Ｅ．＆ ピッチニ（Ｐｉｃｃｉｎｎｉ），Ｅ．テトラヒメナ・サーモフィラおよびＴ．ピグメントサに由来する四種類の新規のメタロチオネイン遺伝子のクローニングおよび配列決定：テトラヒメナＭＴファミリーにおける進化的関係（Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｆｏｕｒ ｎｅｗ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ａｎｄ Ｔ．ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ： ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｉｎ Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ＭＴ ｆａｍｉｌｙ．） Ｐｒｏｔｉｓｔ．１５４，４３１−４４２ （２００３）．
５．フィンク（Ｆｉｎｋ），Ｋ．＆ツォイテン（Ｚｅｕｔｈｅｎ），Ｅ．増殖条件下で試験したテトラヒメナにおける熱ショックタンパク質（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｓｔｕｄｉｅｄ ｕｎｄｅｒ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．） Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１２８，２３−３０ （１９８０）．
６．ウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ），Ｎ．Ｅ．＆ ネルセン（Ｎｅｌｓｅｎ），Ｅ．Ｍ．ＨＳＰ７０およびＨＳＰ９０ホモログはテトラヒメナのヘテロオリゴマー複合体、繊毛および皮層においてチューブリンと結合する（ＨＳＰ７０ ａｎｄ ＨＳＰ９０ ｈｏｍｏｌｏｇｓ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｕｂｕｌｉｎ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏ−ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，ｃｉｌｉａ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｒｔｅｘ ｏｆ Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ．）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１０ （ Ｐｔ １４），１６６５−１６７２ （１９９７）．
７．ソージャー（Ｓｏｒｇｅｒ），Ｐ．Ｋ．熱ショック因子および熱ショック応答（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．） Ｃｅｌｌ ６５，３６３−３６６ （１９９１）．
８．アサノ（Ａｓａｎｏ），Ｍ．，ナガシマ（Ｎａｇａｓｈｉｍａ），Ｈ．，イワクラ（Ｉｗａｋｕｒａ），Ｙ．＆ カワデ（Ｋａｗａｄｅ），Ｙ．異種誘導性エンハンサーおよびプロモーターの調節下でのインターフェロン産生（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２，５８９−５９６ （１９８８）．
９．マッジ（Ｍａｇｇｉ），Ｒ．Ｇ．＆ ゴビンド（Ｇｏｖｉｎｄ），Ｎ．Ｓ．デバリオマイセス・ハンセニイにおける緑色蛍光タンパク質の調節発現（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ．） Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１，３０１−３１０ （２００４）．
１０．ゲルティグ（Ｇａｅｒｔｉｇ），Ｊ．，サッチャー（Ｔｈａｔｃｈｅｒ），Ｔ．Ｈ．，グー（Ｇｕ），Ｌ．＆ ゴロフスキー（Ｇｏｒｏｖｓｋｙ），Ｍ．Ａ．テトラヒメナ・サーモフィラにおけるポジティブおよびネガティブ選択可能なベータチューブリン遺伝子のエレクトロポレーション媒介置換（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｂｅｔａ−ｔｕｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ．） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ９１，４５４９−４５５３ （１９９４）．
１１．ゲルティグ（Ｇａｅｒｔｉｇ），Ｊ．＆ ゴロフスキー（Ｇｏｒｏｖｓｋｙ），Ｍ．Ａ．接合体のエレクトロポレーションによるテトラヒメナ・サーモフィラの効率的な大量形質転換（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍａｓｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｎｔｓ．）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ８９，９１９６−９２００ （１９９２）．
１２．ゴロフスキー（Ｇｏｒｏｖｓｋｙ），Ｍ．Ａ．，シャン（Ｓｈａｎｇ），Ｙ．＆ ソング（Ｓｏｎｇ），Ｘ．テトラヒメナメタロチオネイン遺伝子プロモーター およびその使用（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ Ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ．）ＰＣＴ／ＵＳ０２／２２５９５．７−１５−２００２．
Ｒｅｆ Ｔｙｐｅ： Ｐａｔｅｎｔ
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、さまざまなプロモーター活性配列によって導かれる外来遺伝子のタンパク質生合成を検証するために使用した発現プラスミドを示す。ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における増幅のための細菌骨格（濃灰色四角）、Ｔ．サーモフィラ（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）におけるプラスミド安定性のためのＴ．サーモフィラ特異的起源（淡灰色四角）、形質転換した繊毛虫の特定のためのネオマイシンに基づく選択カセット（白矢印）、およびレポータータンパク質のオープンリーディングフレーム（黒矢印）とそれに続くＴ．サーモフィラの(−チューブリン２ターミネーター配列（白四角）から成る。推定されるプロモーター配列（黒四角）は単回切断エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＶによってこのベクターへクローニングされうる。
【図２】誘導に際して組み換えＥＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質）の発現を示すさまざまなＴ．サーモフィラ（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）形質転換体のウェスタンブロット。  レーン１：陽性対照、レーン２：１，０００細胞陰性対照（野生型）、レーン３：１，０００細胞ｐＰＴ ＨＳＰ９０非誘導、レーン４：１，０００細胞ｐＰＴ ＨＳＰ９０、４時間誘導、レーン５：１，０００細胞ｐＰＴ ＭＴＴ非誘導、レーン６：１，０００細胞ｐＰＴ ＭＴＴ４時間誘導
【図３】図３はＨＳＰ９０プロモーターのヌクレオチド配列を示す（配列番号１）。
【図３】
2009501015.tif 000003
【図１】
2009501015.tif 000004
【図２】
2009501015.tif 000005
【国際調査報告】
2009501015.tif 000006
2009501015.tif 000007