(57)【要約】  本発明は、スレオニンアルドラーゼおよび脱炭酸酵素の存在下で、グリシンまたはグリシン塩とアルデヒドとを反応させて、対応する鏡像異性的に濃縮されたβ−アミノアルコールを形成し、スレオニンアルドラーゼまたは脱炭酸酵素の少なくともどちらかがβ−選択的である、鏡像異性的に濃縮されたβ−アミノアルコールを調製する方法に関する。本発明の好ましい実施態様では、スレオニンアルドラーゼまたは脱炭酸酵素の少なくともどちらかがエナンチオ選択的である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スレオニンアルドラーゼおよび脱炭酸酵素の存在下で、グリシンまたはグリシン塩とアルデヒドとを反応させて、対応する鏡像異性的に濃縮されたβ−アミノアルコールを形成し、スレオニンアルドラーゼまたは脱炭酸酵素の少なくともどちらかがβ−選択的である、鏡像異性的に濃縮されたβ−アミノアルコールを調製する方法。
【請求項２】
脱炭酸酵素がチロシン脱炭酸酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
スレオニンアルドラーゼまたは脱炭酸酵素の少なくともどちらかがエナンチオ選択的である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
アルデヒが式１、
【化１】
2009533034.tif 000012
（式中、
Ｒ１は、場合により置換されていてもよい（シクロ）アルキル、場合により置換されていてもよい（シクロ）アルケニルまたは場合により置換されていてもよいアルキニル、場合により置換されていてもよいアリールを、または複素環を表す）
のアルデヒドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
β−アミノアルコールが式２、
【化２】
2009533034.tif 000013
（式中、
Ｒ１は、場合により置換されていてもよい（シクロ）アルキル、場合により置換されていてもよい（シクロ）アルケニルまたは場合により置換されていてもよいアルキニル、場合により置換されていてもよいアリールを、または複素環を表す）
のβ−アミノアルコールである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ１が、フェニル、３−ヒドロキシフェニル、４−ヒドロキシフェニル、３，４−ジヒドロキシフェニル、２，４−ジヒドロキシフェニル、Ｏ，Ｏ’−メチレン−３，４−ジヒドロキシフェニル、３−（ヒドロキシメチル）−４−ヒドロキシフェニル、２−クロロフェニル、３−クロロフェニル、４−クロロフェニル、２−クロロ−４−ヒドロキシフェニル、４−メトキシフェニル、２−フルオロフェニル、３−フルオロフェニル、４−フルオロフェニル、２−フラニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、シクロヘキシルを表す、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
スレオニンアルドラーゼが、ＥＣ４．１．２．５またはＥＣ４．１．２．２５の酵素分類クラスに属する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
脱炭酸酵素が、ＥＣ４．１．１．２５またはＥＣ４．１．１．２８の酵素分類クラスに属する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
スレオニンアルドラーゼおよび／または脱炭酸酵素のβ−選択性が少なくとも５０％である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
スレオニンアルドラーゼおよび／または脱炭酸酵素のエナンチオ選択性が少なくとも９０％である、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
スレオニンアルドラーゼおよび脱炭酸酵素の双方がβ−選択的である場合、スレオニンアルドラーゼおよび脱炭酸酵素の双方が同一のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸についてβ−選択的である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
スレオニンアルドラーゼおよび脱炭酸酵素がエナンチオ選択的である場合、スレオニンアルドラーゼおよび脱炭酸酵素の双方がβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸の同一鏡像異性体についてエナンチオ選択的である、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
温度が１０〜３９℃の間で選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
方法で形成されるβ−アミノアルコールのアミノ基をｔｅｒｔ−ブチル保護されるアミノ基に変換するステップをさらに含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
方法で形成されるβ−アミノアルコールのアミノ基をイソプロピル保護されるアミノ基に変換するステップをさらに含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法で形成されるβ−アミノアルコールを医薬品有効成分にさらに変換する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、鏡像異性的に濃縮されたβ−アミノアルコールの酵素的調製方法に関する。鏡像異性的に濃縮されたβ−アミノアルコールは、例えば心臓血管疾患、心不全、喘息、および緑内障の治療のための重要な医薬品またはその前駆物質である。さらに鏡像異性的に濃縮されたβ−アミノアルコールは、非対称性合成で使用される触媒およびキラル分割剤の構成単位として使用できる。
【０００２】
このような方法については、Ｌ−選択的チロシン脱炭酸酵素でのＤＬ−スレオ−３−フェニルセリンまたはそのハロゲン置換生成物の変換による、（Ｒ）−２−アミノ−１−フェニルエタノールまたはそのハロゲン置換生成物の調製に関して方法が開示されている、欧州特許第Ｂ１−０７５１２２４号明細書から知られており、そのチロシン脱炭酸酵素は好ましくは、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）またはジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）に由来する。
【０００３】
この方法の主要な不都合は、エナンチオ選択的酵素を使用してラセミ出発原料を変換する際に、鏡像異性的に純粋な生成物の、達成できる最大収率が５０％であることである。
【０００４】
したがって本発明の目的は、最大値がより高くなり得る方法を提供することである。
【０００５】
この目的は、スレオニンアルドラーゼおよび脱炭酸酵素の存在下で、グリシンまたはグリシン塩とアルデヒドとを反応させて、対応する鏡像異性的に濃縮されたβ−アミノアルコールを形成する方法によって達成され、スレオニンアルドラーゼまたは脱炭酸酵素の少なくともどちらかはβ−選択的である。
【０００６】
実施例で示されるように、本発明の方法によって、５０％よりも高い収率でβ−アミノアルコールが高い鏡像体過剰率（ｅ．ｅ．）で調製できる。
【０００７】
エナンチオ選択的スレオニンアルドラーゼの存在下で、グリシンを広範なアルデヒドと反応させることによるβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸の酵素的調製方法は、キムラ（Ｋｉｍｕｒａ）ら、（１９９７年）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９巻、１１７３４〜１１７４２頁から知られている。この酵素的方法は、酵素がスレオまたはエリスロ形態のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸のどちらかを調製する優先傾向が、著しく低いという不都合を有する。この方法の別の欠点は、一般に収率が低いことである。
【０００８】
エナンチオ選択的スレオニンアルドラーゼの存在下で、グリシンとアルデヒドとを反応させて得られるβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸が低収率であることは、キムラ（Ｋｉｍｕｒａ）ら、（１９９７年）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９巻、１１７３４〜１１７４２頁で開示されているので、本発明の方法が、鏡像異性的に濃縮されたβ−アミノアルコールの高収率をもたらすことができるのは驚くべきことである。さらに上述の通り欧州特許第Ｂ１−０７５１２２４号明細書に従った方法で、エナンチオ選択的チロシン脱炭酸酵素を使用したβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸の脱カルボキシル化によるβ−アミノアルコールの最大収率はたった５０％である。したがってこれらの２方法を組み合わせることで、全体的収率が、これらの２方法を互いに独立して実施する場合よりも高くなるのは、驚くべきことである。
【０００９】
本発明の方法によって、β−アミノアルコールが高ｅ．ｅで調製できるのもまた驚くべきことである。上述の通り、エナンチオ選択的スレオニンアルドラーゼの存在下でグリシンと広範なアルデヒドとを反応させて、β−ヒドロキシ−α−アミノ酸を調製する方法において生成されるスレオ：エリスロ生成物の比率は１に近い（キムラ（Ｋｉｍｕｒａ）ら、（１９９７年）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９巻、１１７３４〜１１７４２頁）。したがって形成したスレオβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸、および形成したエリスロβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸それぞれの非−β−選択的脱カルボキシル化は、理論的には対応するβ−アミノアルコールの鏡像異性体混合物をもたらし、鏡像異性体の比率もまた１に近い。換言すれば、キムラ（Ｋｉｍｕｒａ）ら、（１９９７年）の方法に従ったβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸の酵素的調製と、β−ヒドロキシ−α−アミノ酸の脱カルボキシル化とを組み合わせることにより、対応するβ−アミノアルコールを形成させることで、鏡像体過剰率が皆無または低いβ−アミノアルコールが得られることが予期される。しかし実施例で示されるように、本発明の方法によってβ−アミノアルコールを高ｅ．ｅ．で調製し得る。
【００１０】
さらに本発明の方法では、５０％を超える収率を得ることができる。
【００１１】
本発明の方法の追加的利点は、例えば出発原料が入手しやすいことが多く商業的に魅力的であること、化学的段階が必要ないこと、反応をワンポット内で実施できて中間体β−ヒドロキシ−α−アミノ酸を単離しなくてもよいことである。これによって本発明の方法は、商業的および操作的観点から、非常に魅力的である。
【００１２】
本発明の枠内で、鏡像異性的に濃縮されたとは、「化合物の（Ｒ）−または（Ｓ）−鏡像異性体の鏡像体過剰率（ｅ．ｅ．）を有する」ことを意味する。好ましくは鏡像体過剰率は＞６０％、より好ましくは＞７０％、さらにより好ましくは＞８０％、特には＞９０％、より特には＞９５％、さらにより特には＞９８％、最も特には＞９９％である。
【００１３】
本発明の一実施態様では、本発明の方法で形成される鏡像異性的に濃縮されたアミノアルコールのｅ．ｅ．は、当該技術分野で知られている分割手順を使うことで、さらに改善されてもよい。分割手順は、鏡像異性的に濃縮された化合物を得ることを目指した鏡像異性体分離のための手順である。分割手順の例としては、結晶化誘起分割、ジアステレオ異性的塩形成（古典的分割）または同調化を通じた分割、例えばキラル刺激移動床クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー分離法、および酵素的分割が挙げられる。
【００１４】
グリシン塩とは、アミノ酢酸アニオンとカチオンから構成される化合物を意味する。グリシン塩中のカチオンの例としては、例えばナトリウムなどのアルカリ金属塩と、例えばアンモニウムなどの四価のＮ化合物と、または例えばテトラブチルアンモニウムなどのテトラアルキルアンモニウムとが挙げられる。
【００１５】
好ましくは、アルデヒドは式１
【化１】
2009533034.tif 000002
（式中、
Ｒ１は、場合により置換されていてもよい（シクロ）アルキル、場合により置換されていてもよい（シクロ）アルケニルまたは場合により置換されていてもよいアルキニル、場合により置換されていてもよいアリールを、または複素環を、好ましくは場合により置換されていてもよいフェニルを表す）
を有する。
【００１６】
好ましくは場合により置換されていてもよい（シクロ）アルキル、場合により置換されていてもよい（シクロ）アルケニルまたは場合により置換されていてもよいアルキニルは、１〜２０個のＣ原子、より好ましくは１〜１０個のＣ原子（置換基のＣ原子を含む）を有する。
【００１７】
アルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、デシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチル、およびイソヘキシルが挙げられる。シクロアルキルとしては、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが挙げられる。アルケニルとしては、例えばビニル、アリル、イソプロペニルが挙げられる。（シクロ）アルケニルとしては、例えばシクロヘキセニルおよびシクロペンタジエニルが挙げられる。アルキニルとしては、例えばエチニルおよびプロピニルが挙げられる。
【００１８】
好ましくは場合により置換されていてもよいアリールは、１〜２０個のＣ原子、より好ましくは１〜１０個のＣ原子（置換基のＣ原子を含む）を有する。場合により置換されていてもよいアリールとしては、例えばフェニル、ナフチル（ｎａｐｈｔｙｌ）およびベンジルが挙げられる。
【００１９】
好ましくは場合により置換されていてもよい複素環は、１〜２０個のＣ原子、より好ましくは１〜１０個のＣ原子（置換基のＣ原子を含む）を有する。複素環としては、例えばピリド−２−イル、ピリド−３−イル、ピリミジン−２−イル、フラン−２−イル、フラン−３−イル、チオフェン−２−イル、イミダゾール−２−イル、イミダゾール−５−イルなどの場合により置換されていてもよい芳香族複素環と、例えばモルホリン−２−イル、ピペリジン−２−イルおよびピペリジン−３−イルなどの場合により置換されていてもよい（部分的）飽和複素環が挙げられる。
【００２０】
（シクロ）アルキル、（シクロ）アルケニル、アルキニル、アリール、および複素環は、非置換でもまたは置換されていてもよく、置換基（ｓｕｂｓｓｔｉｔｕｅｎｔｓ）は、１つ以上の位置で置換されていてもよい。フェニルは、例えばオルトおよび／またはメタおよび／またはパラ位で置換されていてもよい。
【００２１】
置換基としては、例えば１〜４個のＣ原子があるアルキル；例えば３〜１０個のＣ原子があるアリール；例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉであるハロゲン；例えばＢ（ＯＨ）２、Ｂ（ＣＨ３）２、Ｂ（ＯＣＨ３）２などのホウ素含有基；式ＮＲ２Ｒ３のアミン（式中、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、ＯＨ、アルコキシを、または例えばホルミルとアセチルとベンゾイルとベンジルとベンジルオキシとカルボニルなどの既知のＮ−保護基を、例えばｔ−ブチルオキシカルボニルとフルオレン−９−イル−メトキシカルボニルなどのアルキルオキシカルボニルを、例えばトシルなどのスルホニルを、または例えばトリメチルシリルまたはｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルなどのシリルを表す）；イソシアネート；アジ化物；イソニトリル；シアノ基；ＯＲ４（式中、Ｒ４はＨ、アルキル、アリールを、または例えばベンジルとアセチルとベンゾイルなどの既知のＯ−保護基を、例えばメトキシメチルなどのアルキルオキシカルボニル、シリル、テトラヒドロピラン−２−イル、例えばトシルなどのスルホニルを、またはホスホリルを表す）；例えばトリ−メチルシリルまたはトリ−フェニルシリルなどの（三置換）シリル；例えば−Ｐ（Ｒ５）２、−Ｐ（Ｒ６）３＋Ｘ−、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ７）２、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒ８）２（式中、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８はそれぞれ独立してアルキル、アリールを表し、およびＸ−は例えばハロゲン、ニトロ、ニトロソなどのアニオンを表す）などのリン含有基；ＳＲ９（式中、Ｒ９はＨ、アルキルまたはアリールを表す）；ＳＳＲ１０（式中、Ｒ１０はＨ、アルキルまたはアリールを表す）；例えばＳＯ２ＯＮａ、ＳＯ２ＯＣＨ３などのスルホン酸（エステル）またはその塩；ＳＯ２Ｒ１１（式中、Ｒ１１はアルキル、アリールまたはＨを表す）；ＳＯＲ１２（式中、Ｒ１２はアルキル、アリールまたはＨを表す）；ＳＯ２ＮＲ１３Ｒ１４（式中、Ｒ１３およびＲ１４はそれぞれ独立してアルキル、アリール、またはＨを表す）；ＳｅＲ１５（式中、Ｒ１５はアルキル、アリールまたはＨを表す）；ＳＯ２Ｃｌ、または例えばピペリジン−１−イル、モルホリン−４−イル、ベンゾトリアゾール−１−イル、インドール−１−イル、ピロール−１−イル、イミダゾール−１−イルなどの複素環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｌｅ）が挙げられる。
【００２２】
本発明の方法において、グリシンと式１のアルデヒドとを反応させると、式２の、対応する鏡像異性的に濃縮されたβ−アミノアルコールが形成される。
【化２】
2009533034.tif 000003
式中、Ｒ１は上に定義したとおりである。反応は式（３）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸中間体を通じて進行することが推測される。
【化３】
2009533034.tif 000004
式中、Ｒ１は上に定義したとおりであるが、別の機序の可能性も除外されない。
【００２３】
好ましくは、形成される鏡像異性的に濃縮されたβ−アミノアルコールは、２−アミノ−１−フェニルエタノール、２−アミノ−１−（４−ヒドロキシフェニル）エタノール、２−アミノ−１−（３−ヒドロキシフェニル）エタノール、２−アミノ−１−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール、２−アミノ−（４−フルオロフェニル）エタノール、２−アミノ−（３−フルオロフェニル）エタノール２−アミノ−（２−フルオロフェニル）エタノール、２−アミノ−（３−クロロフェニル）エタノールである。好ましくは形成される鏡像異性的に濃縮されたβ−アミノアルコールは、式（２）（式中、Ｒ１は上に定義したとおりである）のβ−アミノアルコールであり、より好ましくは式（２）（式中、Ｒ１はフェニル、３−ヒドロキシフェニル、４−ヒドロキシフェニル、３，４−ジヒドロキシフェニル、２，４−ジヒドロキシフェニル、Ｏ，Ｏ’−メチレン−３，４−ジヒドロキシフェニル、３−（ヒドロキシメチル）−４−ヒドロキシフェニル、２−クロロフェニル、３−クロロフェニル、４−クロロフェニル、２−クロロ−４−ヒドロキシフェニル、４−メトキシフェニル、２−フルオロフェニル、３−フルオロフェニル、４−フルオロフェニル、２−フラニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、シクロヘキシルを表す）のβ−アミノアルコールである。
【００２４】
本発明の枠内で、スレオニンアルドラーゼとは、アルデヒド依存炭素−炭素リアーゼ（ＥＣ４．１．２）群に属し、好ましくは酵素分類クラスＥＣ４．１．２．５またはＥＣ４．１．２．２５に属する、スレオニンアルドラーゼ活性を有する酵素を意味する。スレオニンアルドラーゼ活性は、グリシンおよび対応するアルデヒドへのβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸の可逆的分裂を触媒する能力と定義される。スレオニンアルドラーゼは、時折フェニルセリンアルドラーゼまたはβ−ヒドロキシアスパルテートアルドラーゼとも称される。スレオニンアルドラーゼは実質的に遍在性酵素であり、例えば以下をはじめとする細菌、古細菌、酵母、および真菌中に見られる。シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｐ．フルオレセンス（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、アエロモナス・ジャンダエイ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｊａｎｄａｅｉ）、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、シリシバクター・ポメロイイ（Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉ）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、バラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、コルウェリア・サイクレリスレア（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ  ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒｅａｅ）、およびサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）。好ましくは、例えばＰ．プチダ（ｐｕｔｉｄａ）、Ｐ．フルオレセンス（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）または緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などのシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種からのスレオニンアルドラーゼが使用される。所望のβ−アミノアルコールをもたらす所望の中間体β−ヒドロキシ−α−アミノ酸に対応する、グリシンおよび特定アルデヒドの変換に（最も）適したスレオニンアルドラーゼをどのようにして見つけるかは、当業者に知られている。より好ましくは、Ｐ．プチダ（ｐｕｔｉｄａ）からのスレオニンアルドラーゼが使用される。最も好ましくは、Ｐ．プチダ（ｐｕｔｉｄａ）ＮＣＩＭＢ１２５６５、またはＰ．プチダ（ｐｕｔｉｄａ）ＡＴＣＣ１２６３３からのスレオニンアルドラーゼが使用される。
【００２５】
本発明の枠内で、脱炭酸酵素とは、脱炭酸酵素活性を有する酵素を意味する。好ましくは脱炭酸酵素として、炭素−炭素カルボキシリアーゼ（ＥＣ４．１．１）が使用される。より好ましくは脱炭酸酵素は、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＥＣ４．１．１．２８）またはチロシン脱炭酸酵素（ＥＣ４．１．１．２５）に属するアミノ酸脱炭酸酵素である。チロシン脱炭酸酵素の生理学的反応において、チロシンなどの芳香族アミノ酸は脱カルボキシル化されて、チラミンなどの芳香族一級アミンと二酸化炭素になる。チロシン脱炭酸酵素は、例えばエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、オランダゼリ属（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ）またはケシ属（Ｐａｐａｖｅｒ）中に見られる。好ましくは、ラクトバチルス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）に属する細菌からのチロシン脱炭酸酵素が使用される。なおもより好ましくは、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、エンテロコッカス・ヒラエ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）からのチロシン脱炭酸酵素が使用される。最も好ましくは、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５３８、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ＪＨ２−２またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）ＤＯからのチロシン脱炭酸酵素が使用される。所望のβ−アミノアルコールをもたらすβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸の変換に（最も）適したチロシン脱炭酸酵素をどのようにして見つけるかは、当業者に知られている。
【００２６】
特に好ましいのは、［配列番号２］、［配列番号４］または［配列番号６］の配列を有する脱炭酸酵素およびその相同体である。［配列番号２］、［配列番号４］、および［配列番号６］の脱炭酸酵素をコードする核酸配列は、それぞれ［配列番号１］、［配列番号３］または［配列番号５］で記載される。
【００２７】
相同体は特に、［配列番号２］、［配列番号４］、および［配列番号６］と少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、より特には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する脱炭酸酵素である。
【００２８】
本発明の目的で、配列同一性は、クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｗ、バージョン１．８２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）多配列アラインメントをデフォルト設定（ｍａｔｒｉｘ：Ｇｏｎｎｅｔ２５０；ＧＡＰ  ＯＰＥＮ：１０；ＥＮＤ  ＧＡＰＳ：１０；ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＳＩＯＮ：０．０５；ＧＡＰ  ＤＩＳＴＡＮＣＥＳ：８）で使用した配列アラインメント調査において判定される。
【００２９】
所望のβ−アミノアルコールをもたらすβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸の変換のためのさらに適切な脱炭酸酵素は、グルタメート脱炭酸酵素（ＥＣ４．１．１．１５）およびヒドロキシグルタメート脱炭酸酵素（ＥＣ４．１．１．１６）群中に見いだせる。これらの脱炭酸酵素は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などの細菌中に見いだせる（ＵｍｂｒｅｉｔおよびＨｅｎｅａｇｅ、１９５３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１、１５〜２０頁）。所望のβ−アミノアルコールをもたらすβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸の変換に（最も）適した脱炭酸酵素をどのようにして見つけるかは、当業者に知られている。特に好ましいのは、［配列番号１７］または［配列番号１８］の配列を有する脱炭酸酵素およびそれらの相同体である。
【００３０】
相同体は、具体的には、［配列番号１７］または［配列番号１８］と少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、より特には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する脱炭酸酵素である。
【００３１】
例えばスレオニンアルドラーゼおよび脱炭酸酵素は、粗製酵素として、市販酵素として、市販の調製品からさらに精製された酵素として、天然にまたは遺伝子改変を通じて、スレオニンアルドラーゼおよび／または脱炭酸酵素活性を有するホールセル中で（場合により透過化処理および／または固定化された）、またはこのような活性がある細胞の溶解産物中で、既知の精製法の組み合わせによってその起源から得られる酵素として、例えば分散体形態、エマルジョン形態、溶液形態で、または固定化形態で、それぞれ独立して存在してもよい。
【００３２】
ホールセルを使用する場合、好ましくは細胞はスレオニンアルドラーゼおよび脱炭酸酵素活性の双方を有する。ホールセル中のスレオニンアルドラーゼおよび／または脱炭酸酵素の発現は、当業者に知られている方法を使用して強化されてもよい。
【００３３】
本発明に従った方法において、スレオニンアルドラーゼおよび／または脱炭酸酵素活性がある天然（野性型）酵素の突然変異体もまた利用できることは、当業者には明らかである。野生型酵素の突然変異体は、例えば当業者に知られている変異誘発技術（ランダム変異誘発、部位特異的変異誘発、定方向進化、遺伝子シャフリング、例えばスレオニンアルドラーゼと脱炭酸酵素の融合タンパク質のような融合タンパク質など）を使用して、適切な（宿主）細胞内で、ＤＮＡが野性型酵素と少なくとも１つのアミノ酸が異なる酵素をコードするように野性型酵素をコードするＤＮＡを改変することで、そしてこのようにして改変されたＤＮＡの発現をもたらすことで作ることができる。スレオニンアルドラーゼおよび／または脱炭酸酵素の突然変異体は、例えば基質選択性および／または活性および／または安定性および／または溶剤抵抗性および／またはｐＨプロフィールおよび／または温度プロフィールに関して、改善された特性を有してもよい。同様に、または代案としては、その発現を増強するために、野性型酵素をコードするＤＮＡを改変してもよい。
【００３４】
本発明の枠内で、エナンチオ選択的スレオニンアルドラーゼまたはエナンチオ選択的脱炭酸酵素とは、酵素が、使用するアルデヒドに対応するβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸中間体の鏡像異性体の１つを好み、すなわちカルボン酸基に関してα位の炭素（アミノ基が付着する炭素）のＬ−またはＤ−体のどちらかに対してエナンチオ選択性を有する、スレオニンアルドラーゼまたは脱炭酸酵素であることを意味する。例えばカルボン酸基に関してαの炭素のＬ−体に対して選択的なスレオニンアルドラーゼ、ならびにそのＤ−体に対して選択的なスレオニンアルドラーゼが、当業者に知られている。
【００３５】
好ましくは少なくとも１つの酵素のエナンチオ選択性は、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、および最も特には少なくとも９９％である。
【００３６】
本発明の枠内で、例えばスレオニンアルドラーゼの９０％のエナンチオ選択性とは、グリシンおよびアルデヒドが、使用するアルデヒドに対応するβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸中間体の１つの鏡像異性体（例えばβ−ヒドロキシ−Ｌ−α−アミノ酸）に９０％変換され、対応するβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸のその他の鏡像異性体（例えばβ−ヒドロキシ−Ｄ−α−アミノ酸）に１０％変換されることを意味し、それはβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸の鏡像異性体の１つ（例えばβ−ヒドロキシ−Ｌ−α−アミノ酸）の８０％の鏡像体過剰率に相当する。
【００３７】
好ましくはスレオニンアルドラーゼおよび脱炭酸酵素がどちらもエナンチオ選択的である場合、スレオニンアルドラーゼおよび脱炭酸酵素はどちらも、β−ヒドロキシ−α−アミノ酸の同一鏡像異性体に対してエナンチオ選択的である。スレオニンアルドラーゼおよび／または脱炭酸酵素のエナンチオ選択性が高いほど、スレオニンアルドラーゼおよび脱炭酸酵素はβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸の同一鏡像異性体に対してエナンチオ選択的なので、より好ましい。
【００３８】
本発明の枠内で、β−選択的とは、β−ヒドロキシ−α−アミノ酸のβ−炭素原子のどちらか一方の立体配置に対する好み（β−選択性）がある、スレオニンアルドラーゼまたは脱炭酸酵素を意味する。換言すれば「β−選択的」とは、中間体β−ヒドロキシ−α−アミノ酸のβ−炭素の立体配置に対して選択的であることと定義される。β−炭素とは、カルボン酸基、すなわちヒドロキシ基が付着する炭素に関してβ−位の炭素原子を意味する。
【００３９】
好ましくは少なくとも１つの酵素のβ−選択性は、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、特には８０％、より特には少なくとも９０％、さらにより特には少なくとも９５％、最も特には少なくとも９９％である。
【００４０】
スレオニンアルドラーゼの９０％のβ−選択性とは、スレオニンアルドラーゼによって、グリシンおよびアルデヒドが、β−ヒドロキシ−α−アミノ酸の１つの立体異性体（例えばβ−スレオ−ヒドロキシ−α−アミノ酸）に９０％、前記β−ヒドロキシ−α−アミノ酸のその他の立体異性体（例えばβ−エリスロ−ヒドロキシ−α−アミノ酸）に１０％変換されることを意味する。その結果、好ましくは形成される立体異性体（例えばβ−スレオ−ヒドロキシ−α−アミノ酸）のジアステレオマー過剰率（ｄ．ｅ．）は８０％になる。
【００４１】
脱炭酸酵素の９０％のβ−選択性とは、β−ヒドロキシ−α−アミノ酸の双方の立体異性体が等量で存在する場合、脱炭酸酵素が５０％の全体的変換で、前記β−ヒドロキシ−α−アミノ酸の１つの立体異性体（例えばβ−エリスロ−ヒドロキシ−α−アミノ酸）の９０％、およびその他の立体異性体（例えばβ−スレオ−ヒドロキシ−α−アミノ酸）の１０％を変換することを意味する。
【００４２】
好ましくはスレオニンアルドラーゼおよび脱炭酸酵素がどちらもβ−選択的である場合、スレオニンアルドラーゼおよび脱炭酸酵素のどちらもβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸のβ−炭素の同一立体配置に対してβ−選択的である。スレオニンアルドラーゼおよび／または脱炭酸酵素のβ−選択性が強いほど、スレオニンアルドラーゼおよび脱炭酸酵素は同一のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸に対してβ−選択的なので、より好ましい。
【００４３】
好ましい本発明の実施態様では、スレオニンアルドラーゼまたは脱炭酸酵素の少なくともどちらかがエナンチオ選択的である。
【００４４】
選択される反応条件は、酵素の選択およびアルデヒドの選択に左右される。当業者は、温度、ｐＨ、濃度、溶剤の使用などの様々なパラメーターをどのように最適化するかを知っている。
【００４５】
温度およびｐＨは、本発明の方法においてあまり重要でない。しかし好ましくは、方法は４〜１０の間のｐＨで実施される。特に変換は、ｐＨ４．５以上、およびｐＨ６．５以下で実施される。温度は好ましくは、０〜８０℃の間で選択される。好ましくは温度は５℃よりも高く、より好ましくは１０℃よりも高い。好ましくは温度は５０℃よりも低く、より好ましくは３９℃よりも低い。
【００４６】
本発明の方法で適切な溶剤としては、水；水と、例えば水混和性アルコール（例えばメタノールなど）、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、アセトニトリルなどの水混和性有機溶剤との単相混合物；または水と、例えば炭化水素エーテルなどの非混和性有機溶剤との二相混合物；または例えばヘキサフルオロリン酸、テトラフルオロホウ酸、またはトリフルオロメタンスルホン酸のような酸の１，３−ジアルキルイミダゾリウム塩またはＮ−アルキルピリジニウム塩、またはアニオン性対応物としての（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｎ−のようないわゆるイオン性液体が挙げられる。好ましくは本発明の方法では、例えばＤＭＳＯ含量が１〜５０％ｖ／ｖ、より好ましくは５〜３０％ｖ／ｖ、最も好ましくは１０〜２０％ｖ／ｖの水などの水とジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）との単相混合物が使用される。
【００４７】
また本発明の方法を大粒径エマルジョンまたは微小エマルジョン、有機相を含んでなる共連続系（アルデヒド基材がある）、水相（通常グリシンまたはグリシン塩、スレオニンアルドラーゼおよび脱炭酸酵素がある）、および適切な界面活性剤（非イオン性、カチオン性またはアニオン性）などのエマルジョン系内で実施することも可能である。
【００４８】
本発明の目的で、エマルジョン系は、水と、界面活性剤と、脂肪族アルカンであってもよい油相との三元混合物と定義される。エマルジョン中で油相として使用してもよい脂肪族アルカンの例としては、シクロヘキサン、イソオクタン、テトラデカン、ヘキサデカン、オクタデカン、スクアレンが挙げられる。界面活性剤は、例えばトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、ドデシル硫酸ナトリウム、ＡＯＴ、ＣＴＡＢ、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−８０、トゥイーン−２０、スパン（Ｓｐａｎ）−８０などのあらゆる非イオン性、カチオン性またはアニオン性界面活性剤であることができる。水中油（Ｏ／Ｗ）エマルジョンは、例えば増大する内側面をもたらし、したがって相間の質量移動を容易にする激しい混合によって形成されてもよい。特に興味深いエマルジョンは、熱力学的に安定して、ナノメートル範囲の領域サイズを有する微小エマルジョンである（例えばＣｌａｐｅｓら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２００５年、１１、１３９２〜１４０１頁、およびＳｃｈｗｕｇｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５年、９５、８４９〜８６４頁を参照されたい）。
【００４９】
グリシンまたはその塩とアルデヒドとのモル比は、原則として重要でない。好ましくはグリシンまたはその塩とアルデヒドとのモル比は＞１であり、例えば１０００：１であってもよく、好ましくは１００：１、より好ましくは１０：１である。
【００５０】
試薬であるグリシンまたはその塩およびアルデヒドと、酵素である脱炭酸酵素およびスレオニンアルドラーゼの添加の順序は、原則として重要でない。例えば方法はバッチ（すなわち全てを一度に添加する）、または流加様式（すなわち典型的に試薬の片方または双方を供給するが、酵素もまた供給してよい）で行ってもよい。反応中に形成されるβ−アミノアルコールを除去すること、および／またはスレオニンアルドラーゼをリサイクルすること、および／または脱炭酸酵素をリサイクルすることが有利かもしれない。これはバッチの合間に実行できるが、もちろんまた連続的に行ってもよい。
【００５１】
補助因子を反応に添加して、スレオニンアルドラーゼおよび／または脱炭酸酵素の酵素活性を増強することが、好ましいかもしれない。補助因子の例は当業者に知られており、ピリドキサール−５−ホスフェート、補酵素Ｂ１２、フラビンアデニンジヌクレオチド、ホスホパンテイン、チアミン、Ｓ−アデノシルメチオニン、ビオチン、例えばＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、およびＣｌ−などの塩が挙げられる。例えばピリドキサール−５−ホスフェートは、例えば０．００１〜１０ｍＭ、好ましくは０．０１〜１ｍＭ、より好ましくは０．１〜０．５ｍＭの濃度で工程に添加されてもよい。補助因子の選択は、酵素の選択に左右され、例えば腸球菌からのチロシン脱炭酸酵素、およびＰ．プチダ（ｐｕｔｉｄａ）からのスレオニンアルドラーゼの酵素活性をピリドキサール−５−ホスフェートの添加によって強化してもよい。
【００５２】
スレオニンアルドラーゼおよび／または脱炭酸酵素の量は、原則として重要でない。スレオニンアルドラーゼおよび／または脱炭酸酵素の最適量は、使用される基質アルデヒドに左右され、日常的実験法を通じて当業者により容易に判定できる。
【００５３】
使用されるグリシンまたはその塩の濃度は、原則として重要でない。好ましくはグリシンまたはその塩は、０．１〜４Ｍ、より好ましくは０．５〜３Ｍ、最も好ましくは１．０〜２．５Ｍの濃度で使用される。
【００５４】
アルデヒドの濃度は、原則として重要でない。好ましくはアルデヒドは、１〜１０００ｍＭ、より好ましくは１０〜５００ｍＭ、最も好ましくは２０〜１００ｍＭの濃度で使用される。
【００５５】
本発明に従った方法によって得られる生成物は、例えばノルアドレナリンまたはノルフェネフリンなどの医薬品であってもよい。
【００５６】
さらなる態様では、本発明は、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法によって形成されるβ−アミノアルコールが、医薬品有効成分にさらに変換される方法に関する。例えば本発明に従った方法は、本発明に従った方法によって得られる生成物のアミン基をｔｅｒｔ−ブチルで保護されるアミン基に変換するステップをさらに含んでなってもよい。例えばこのようにしてレバブテロールが得られてもよい本発明に従った方法が、本発明に従った方法によって得られる生成物のアミン基をイソプロピルで保護されるアミン基に変換するステップをさらに含んでなることもまた可能である。例えばこのようにしてソタロールが得られてもよい。
【００５７】
本発明をここで以下の実施例により、しかしそれらに制限することなく解明する。
【００５８】
［実施例］
【化４】
2009533034.tif 000005
【００５９】
［スキーム（Ｉ）］
スキーム（Ｉ）は実施例を図示することを意図する。スキーム（Ｉ）は、本発明をどのようにも限定することを意図しない。スキーム（Ｉ）では、スレオニンアルドラーゼ（ＴＡ）の存在下で、式（１）（式中、Ｒ１は上述の通り）のアルデヒドをグリシンと反応させて、式（２）の対応するβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸中間体を形成し、次にそれを脱炭酸酵素（ＴＤＣ）の存在下で式（３）の対応するβ−アミノアルコールに変換する。β−選択的スレオニンアルドラーゼまたはβ−選択的脱炭酸酵素を使用することで、式（３）のβ−アミノアルコールは鏡像異性的に濃縮される。
【００６０】
［Ｌ−チロシン脱炭酸酵素遺伝子のクローニング］
２つのエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種からの３種類のＬ−チロシン脱炭酸酵素（ＴｙｒＤＣ）を潜在的にコードする３つの読み取り枠（ＯＲＦ）を、次のインビトロジェン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）クローニングシステムを使用してクローンした。［配列番号２］で記載されるアミノ酸配列があるチロシン脱炭酸酵素（ＥｆａＴｙｒＤＣ）をコードするエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３［配列番号１］のｔｙｒＤ遺伝子、およびエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）ＤＯのゲノム配列内で同定されたＥ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３ｔｙｒＤ遺伝子と高い同一性があるさらに別の２つのＯＲＦ。Ｅ．フェシウム（ｆａｅｃｉｕｍ）ＤＯ  ｔｙｒＤ１遺伝子［配列番号３］はＥ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３［配列番号１］からのｔｙｒＤのＤＮＡ配列と７８％同一であり、ＥｆｉＴｙｒＤＣ−１［配列番号４］の対応するアミノ酸配列はＥｆａＴｙｒＤＣ［配列番号２］のアミノ酸配列と８３％同一である。Ｅ．フェシウム（ｆａｅｃｉｕｍ）ＤＯ  ｔｙｒＤ２遺伝子［配列番号５］はＥ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３［配列番号１］からのｔｙｒＤのＤＮＡ配列と６２％同一であり、ＥｆｉＴｙｒＤＣ−２［配列番号６］の対応するアミノ酸配列はＥｆａＴｙｒＤＣ［配列番号２］のアミノ酸配列と５９％同一である。Ｅ．フェシウム（ｆａｅｃｉｕｍ）ＤＯからの２つのＬ−チロシン脱炭酸酵素遺伝子はＤＮＡレベル［配列番号３＋５］で６３％の同一性を、対応するアミノ酸配列［配列番号４＋６］で５９％の同一性を共有する。
【００６１】
相同的組換えによるゲートウェイクローニング（インビトロジェン）に適したａｔｔＢ部位を含有する６つの遺伝子特異的プライマー［配列番号７〜１２］部位を３つのＬ−チロシン脱炭酸酵素遺伝子［配列番号１、３＋５］のために作成し、インビトロジェン（ＵＫ）で合成した。先に単離されたＥ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３およびＥ．フェシウム（ｆａｅｃｉｕｍ）ＤＯのゲノムＤＮＡをそれぞれテンプレートとして、これらのプライマーをそれぞれ各遺伝子のための少なくとも３つの独立したＰＣＲ反応で使用した。インビトロジェンからのプルーフリーディング・スーパーミックス（Ｓｕｐｅｒｍｉｘ）ＨｉＦｉ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して、供給元の取扱説明書に従って、Ｅ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３からのｔｙｒＤでは４８℃、そしてＥ．フェシウム（ｆａｅｃｉｕｍ）ＤＯからのｔｙｒＤ１では４４℃のアニーリング温度で、ｔｙｒＤおよびｔｙｒＤ１を増幅した。Ｅ．フェシウム（ｆａｅｃｉｕｍ）ＤＯからのｔｙｒＤ２増幅のためには、５４℃のアニーリング温度で、プルーフリーディング・プラチナム（Ｐｌａｔｉｎｕｍ）ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン）を使用した。全てのＰＣＲで、約１，９００塩基対（ｂｐ）の予期されたサイズの特異的増幅生成物のみが得られた。ｔｙｒＤ、ｔｙｒＤ１、およびｔｙｒＤ２増幅生成物をそれぞれプールして精製した（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）からのキアクイック（ＱｉａＱｕｉｃｋ）ＰＣＲ純精製キット）。
【００６２】
精製されたＰＣＲ産物をゲートウェイＢＰクローニング反応で使用して、標的遺伝子を中間体クローニングベクターｐＤＯＮＲ２０１（インビトロジェン）内に挿入し、それぞれのエントリーベクターｐＥＮＴＲ−ｔｙｒＤ、ｐＥＮＴＲ−ｔｙｒＤ１、およびｐＥＮＴＲ−ｔｙｒＤ２を発生させた。インビトロジェンからのコンピテント大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞の形質転換後、得られた形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｄｓ）をプールして、全プラスミドＤＮＡを単離した（キアジェンからのプラスミドＤＮＡスピンミニキット（Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ））。
【００６３】
ｐＥＮＴＲ−ｔｙｒＤ、ｐＥＮＴＲ−ｔｙｒＤ１、およびｐＥＮＴＲ−ｔｙｒＤ２のプールされたプラスミド調製品を各遺伝子に特異的な制限酵素で、制限分析によって分析した。制限パターンから、≧９９％のプールプラスミド調製品が予期された断片を含有したと結論できた。次にプラスミドｐＤＥＳＴ１４（インビトロジェン）でのゲートウェイＬＲクローニング反応に、プラスミドｐＥＮＴＲ−ｔｙｒＤ、ｐＥＮＴＲ−ｔｙｒＤ１、およびｐＥＮＴＲ−ｔｙｒＤ２を適用して、発現ベクターｐＤＥＳＴ１４−ｔｙｒＤ＿Ｅｆａ、ｐＤＥＳＴ１４−ｔｙｒＤ１＿Ｅｆｉ、およびｐＤＥＳＴ１４−ｔｙｒＤ２＿Ｅｆｉをそれぞれ得た。ＬＲ反応による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０の形質転換は、それぞれ１００を超える個々のコロニーを生じる。制限分析によって、遺伝子あたり３個のクローンを試験し、それらがそれぞれ予期された制限パターンを与えることが分かった。
【００６４】
［大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）中でのＬ−チロシン脱炭酸酵素遺伝子の異種性発現］
単離されたｐＤＥＳＴ１４発現プラスミドを化学的にコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ）ｐＬｙｓＳ細胞の形質転換のために使用し、それを引き続いて選択的ルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび３５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール添加ＬＢ）上に播種した。２つのエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種からの３個のＬ−チロシン脱炭酸酵素遺伝子のそれぞれについて、３から４個の単一コロニーを使用し、５０ｍｌの前培養（１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび３５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール添加ＬＢ）に接種した。前培養を２８℃で１分あたり１８０回転（ｒｐｍ）の旋回振盪機上で一晩インキュベートした。これらの前培養の中から３つの１ｌのＬＢ培養（１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび３５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加した）をおよそＯＤ６２０＝０．０５の細胞密度に接種した。次にこれらの発現培養を２８℃で１８０ｒｐｍの旋回振盪機上でインキュベートした。３つの標的ｔｙｒＤ遺伝子の発現は、対数生育相（約０．６のＯＤ６２０）の最中に、それぞれの培養への１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘発される。同一条件下でインキュベーションを４時間継続した。引き続いて細胞を遠心分離（５，０００×ｇで１０分間、４℃）によって収集し、１００μＭのピリドキサール５’−ホスフェート（ＰＬＰ）および１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）をそれぞれ含有する、５０ｍｌのクエン酸／リン酸緩衝液ｐＨ６．０（０．０３７Ｍのクエン酸＋０．１２６ＭのＮａ２ＨＰＯ４）に再懸濁した。細胞懸濁液を−８５℃で凍結した。細胞を溶解して無細胞抽出物を得るために、懸濁液を３０℃水浴中で解凍し、引き続いて氷上で１時間インキュベートして、遠心分離（３９，０００×ｇで３０分間、４℃）して細胞残骸を除去した。上清を新しいフラスコに移した（無細胞抽出物）。
【００６５】
［ＤＬ−スレオ−フェニルセリンによるチロシン脱炭酸酵素活性アッセイ］
ＤＬ−スレオ−フェニルセリンを基質として、過剰発現されたＥ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３、Ｅ．フェシウム（ｆａｅｃｉｕｍ）ＤＯ  ＴｙｒＤＣ−１またはＴｙｒＤＣ−２からのＴｙｒＤＣを含有する無細胞抽出物中のチロシン脱炭酸酵素活性を判定した。１００μＭのＰＬＰおよび１ｍＭのＤＴＴを含有するクエン酸／リン酸緩衝液ｐＨ５．５（０．０４３Ｍのクエン酸＋０．１１４ＭのＮａ２ＨＰＯ４）中のシグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）からの１００ｍＭのＤＬ−スレオ−フェニルセリン溶液０．９ｍｌを無細胞抽出物０．１ｍｌと共に室温（２５℃）でインキュベートした。一定時間間隔で５０μｌのサンプルを取り除き、９５０μｌの０．１ＭのＨＣｌＯ４（水中、ｐＨ１）で停止させた。基質および生成物検出のために、市販のＤＬ−スレオ−フェニルセリン、（Ｓ）−２−アミノ−１−フェニル−エタノール、および（Ｓ）−２−アミノ−１−フェニル−エタノール（シグマ・アルドリッチ）を標準物質として、２０６ｎｍの波長を使用して、（ダイセル（Ｄａｉｃｅｌ））からのクラウンエーテル（Ｃｒｏｗｎｅｔｈｅｒ）Ｃｒ（＋）カラム上でのＨＰＬＣによって、Ｌ−スレオ−フェニルセリンの減少、および（Ｓ）−２−アミノ−１−フェニル−エタノールの形成を定量化した。１Ｕのチロシン脱炭酸酵素活性は、１００μＭのＰＬＰおよび１ｍＭのＤＴＴ含有クエン酸／リン酸緩衝液ｐＨ５．５（０．０４３Ｍのクエン酸＋０．１１４ＭのＮａ２ＨＰＯ４）中において、２５℃で１分内に１μｍｏｌのＤＬ−スレオ−フェニルセリンを２−アミノ−１−フェニル−エタノールに脱カルボキシル化するのに要する酵素の量と定義される。
【００６６】
過剰発現されたエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３からのＴｙｒＤＣおよびＥ．フェシウム（ｆａｅｃｉｕｍ）ＤＯからのＴｙｒＤＣ−１がある大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）無細胞抽出物では、無細胞抽出物中に１５０〜１６０Ｕ／ｇ総タンパク量の比活性が得られた。Ｅ．フェシウム（ｆａｅｃｉｕｍ）ＤＯからのＴｙｒＤＣ−２は、約１０Ｕ／ｇ総タンパク量の比活性を有した。ＨＰＬＣ分析は、３つのＴｙｒＤＣの全てが、スレオ−フェニルセリンのＬ−型を排他的に脱カルボキシル化し、（Ｒ）−２−アミノ−１−フェニル−エタノールのみをエナンチオ選択的に形成したことをさらに示した。
【００６７】
［シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＮＣＩＭＢ１２５６５からのスレオニンアルドラーゼ遺伝子のクローニング］
遺伝子特異的プライマー［配列番号１５＋１６］を使用してＰＣＲ増幅により、［配列番号１４］で記載される低特異性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ（Ｌ−ＴＡ）をコードするｌｔａ遺伝子［配列番号１３］を、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＮＣＩＭＢ１２５６５株のゲノムＤＮＡから得た。５０μｌのＰｆｘ増幅緩衝液（インビトロジェン）、０．３ｍＭのｄＮＴＰ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌの各プライマー、１μｇのゲノムＤＮＡ、および１．２５単位のプルーフリーディング・プラチナムＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン）中で、ＰＣＲ反応を実施した。温度サイクルは次のとおりであった。（１）９６℃で５分、（２）９６℃で３０秒、４６．７℃で３０秒、および６８℃で１．５分を５サイクル、（３）９６℃で３０秒、５１．７℃で３０秒、および６８℃で１．５秒を２５サイクル。
【００６８】
順方向プライマーはＡＴＧ開始コドンを含有し、逆方向プライマーはＴＣＡ停止コドンを含有する。ＢｓｍＢＩ制限部位を導入して、ＮｃｏｌおよびＸｈｏｌ適合性オーバーハングがあるＰＣＲ断片を得た。増幅された断片をＢｓｍＢＩで消化し、ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＣベクター（インビトロジェン）中にライゲートしてそれをＮｃｏｌおよびＸｈｏｌで消化した。得られたコンストラクトｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＣ＿ＬＴＡ＿ｐｐ１２５６５を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換した。
【００６９】
［大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）中のｌｔａ遺伝子の異種性発現］
ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＣ＿ＬＴＡ＿ｐｐ１２５６５を含有する組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有する５０ｍｌのルリア・ベルターニ培地中で、２８℃で一晩前培養した。前培養を使用して、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有する１ｌの同培地に接種して、２００ｒｐｍで振盪しながら２８℃で生育させた。０．５〜１のＯＤ６２０において、０．００２％（ｗ／ｖ）のＬ−アラビノース添加によって細胞を誘導した。細胞を２００ｒｐｍで振盪しながら室温（２０〜２２℃）でさらに一晩インキュベートした。１２，５００×ｇで１５分間の遠心分離によって細胞を収集し、１０μＭのＰＬＰおよび１０ｍＭのＤＴＴを含有する５０ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で２回洗浄した。４０ｍｌの同一緩衝液に細胞を再懸濁後、細胞をＭＳＥ  Ｓｏｎｉｐｒｅｐ  １５０内での超音波処理によって４℃で１２分間破壊した（最大振幅、１０秒間オン／１０秒間オフ）。４℃において２０，０００×ｇで２０分間の遠心分離によって、細胞残骸を除去した。無細胞抽出物のアリコートを使用時まで−２０℃で保存した。
【００７０】
［Ｌ−スレオニンによるスレオニンアルドラーゼアッセイ］
室温におけるＮＡＤＨ消費を通じて、過剰発現されたスレオニンアルドラーゼがある無細胞抽出物の活性を分光光度的に判定した。３ｍｌガラスキュベット（経路長１ｃｍ）内で、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ８、５０μＭのピリドキサール５−ホスフェート、２００μＭのＮＡＤＨ、３０Ｕの酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（シグマ・アルドリッチ）、および５０ｍＭのＬ−スレオニンを含有する２９５０μＬの緩衝液中で、５０μＬのＣＦＥ（またはその適切な希釈液）を希釈した。このアッセイでは、Ｌ−スレオニンアルドラーゼの作用によって、Ｌ−スレオニンがアセトアルデヒドおよびグリシンに変換される。次に酵母アルコールデヒドロゲナーゼによって、アセトアルデヒドがエタノールに還元され、それは等モル量のＮＡＤＨ消費量の酸化と結びついている。ＮＡＤＨ消費は、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ラムダ（Ｌａｍｂｄａ）２０分光光度計中の３４０ｎｍにおける吸光度の低下として測定された。１Ｕのスレオニンアルドラーゼ活性は、室温において、５０μＭのピリドキサール５’−ホスフェート、２００μＭのＮＡＤＨ、３０Ｕの酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（シグマ・アルドリッチ）、および５０ｍＭのＬ−スレオニンを含有する１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ８中で、１分間に１μｍｏｌのＬ−スレオニンをグリシンおよびアセトアルデヒドに分割するのに要する酵素の量と定義される。
【００７１】
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＮＣＩＭＢ１２５６５からの過剰発現されたスレオニンアルドラーゼがある大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）無細胞抽出物では、Ｌ−スレオニンを基質として、無細胞抽出物中に１８Ｕ／ｍｇ総タンパク量の比活性が得られた。Ｄ−スレオニン（シグマ・アルドリッチ）では、変換は得られなかった。
【００７２】
［ＤＬ−スレオ−フェニルセリンによるスレオニンアルドラーゼアッセイ］
二酵素／ワンポット反応中の適用スレオニンアルドラーゼとチロシン脱炭酸酵素量とを互いに比較するために、ＤＬ−スレオ−フェニルセリンによるスレオニンアルドラーゼの第２の活性アッセイを使用した。室温において、パーキン・エルマー・ラムダ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ）２０分光光度計中の１ｍｌ石英キュベット内で、１００μＭのＰＬＰおよび１ｍＭのＤＴＴを含有するクエン酸／リン酸緩衝液ｐＨ５．５中の９９０μｌの１００ｍＭのＤＬ−スレオ−フェニルセリン（シグマ・アルドリッチ）溶液をＰ．プチダ（ｐｕｔｉｄａ）ＮＣＩＭＢ１２５６５からの過剰発現したスレオニンアルドラーゼを含有する１０μｌの無細胞抽出物と共にインキュベートした。スレオニンアルドラーゼによりグリシンおよびベンズアルデヒドに変換されたＤＬ−スレオ−フェニルセリンの量は、ベンズアルデヒドε２７９＝１．４ｃｍ２／μｍｏｌのモル吸収係数を使用して、２７９ｎｍにおける吸光度増大として定量化した。基質ＤＬ−スレオ−フェニルセリンに対する１単位のスレオニンアルドラーゼ活性は、上述の条件下で１分以内に、１μｍｏｌのこの基質をベンズアルデヒドおよびグリシンに変換に要する酵素の量と定義される。
【００７３】
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＮＣＩＭＢ１２５６５からの過剰発現されるスレオニンアルドラーゼがある大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）無細胞抽出物では、ｐＨ５．５でＤＬ−スレオ−フェニルセリンを基質として、無細胞抽出物中に１０Ｕ／ｍｇ総タンパク量の比活性が得られた。
【００７４】
［溶液中のタンパク質濃度判定］
Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２、２４８〜２５４ページ（１９７６年）で述べられるようにして、修正タンパク質−染料結合法を使用して、無細胞抽出物などの溶液中のタンパク質濃度を判定した。
【００７５】
［実施例１−（Ｒ）−２−アミノ−１−フェニル−エタノールの酵素的合成］
鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−２−アミノ−１−フェニル−エタノール（Ｒ−ＡＰＥ）の合成のために、０．１０６ｇのベンズアルデヒドを２．３ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、クエン酸／リン酸緩衝液ｐＨ６．０（０．０３７Ｍのクエン酸＋０．１２６ＭのＮａ２ＨＰＯ４）中のＰ．プチダ（ｐｕｔｉｄａ）ＮＣＩＭＢ１２５６５からの１７５Ｕのスレオニンアルドラーゼ（ＤＬ−スレオ−フェニルセリンで活性をアッセイ）、およびエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）ＤＯからの２２．５ＵのＴｙｒＤＣ−１（チロシン脱炭酸酵素−１）（ＤＬ−スレオ−フェニルセリンで活性をアッセイ）と共に、３．７５ｇのグリシンと混合した。混合物を５０ｍｌ丸底フラスコ内で撹拌しながら、室温でインキュベートした。
【００７６】
異なる時点で５０μｌのサンプルを採取して、９５０μｌの０．１ＭのＨＣｌＯ４（水中、ｐＨ１）の添加によってクエンチし、ＵＶ検出器を２０６ｎｍで使用して、ＤＬ−スレオ−フェニルセリン、ＤＬ−エリスロ−フェニルセリン、（Ｒ）−２−アミノ−１−フェニル−エタノール、および（Ｓ）−２−アミノ−１−フェニル−エタノールを標準物質として、ダイセル・クラウンエーテル（Ｄａｉｃｅｌ  Ｃｒｏｗｎｅｔｈｅｒ）Ｃｒ（＋）カラム上で、鏡像異性的に濃縮されたフェニルセリンおよび２−アミノ−１−フェニル−エタノール（ＡＰＥ）の形成について分析した。この経時変化実験のＨＰＬＣ分析の結果を表１に示す。これらの結果は、スレオニンアルドラーゼ反応がわずか２５％の最大ジアステレオマー過剰率（ｄ．ｅ．）で起きるが、ＴｙｒＤＣ反応とのカップリングは６０％を超える鏡像体過剰率（ｅ．ｅ．）がある生成物（Ｒ）−ＡＰＥをもたらすことを示す。さらに古典的な動的分割の最大収率５０％を明らかに上回る。
【００７７】
【表１】
2009533034.tif 000006
【００７８】
［実施例２−Ｄ−ノルアドレナリンの酵素的合成］
鏡像異性的に濃縮されたＤ−ノルアドレナリン（＝（Ｓ）−２−アミノ−１−（３，４−ジヒドロキシ−）フェニル−エタノール）の合成のために、０．１３８ｇの３，４−ジヒドロキシ−ベンズアルデヒドを２．３ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、クエン酸／リン酸緩衝液ｐＨ６．０（０．０３７Ｍのクエン酸＋０．１２６ＭのＮａ２ＨＰＯ４）中のＰ．プチダ（ｐｕｔｉｄａ）ＮＣＩＭＢ１２５６５からの１７５Ｕのスレオニンアルドラーゼ（ＤＬ−スレオ−フェニルセリンで活性をアッセイ）およびエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）ＤＯからの４３．８ＵのＴｙｒＤＣ−１（ＤＬ−スレオ−フェニルセリンで活性をアッセイ）と共に、３．７５ｇのグリシンと混合した。混合物を５０ｍｌ丸底フラスコ内で撹拌しながら、室温でインキュベートした。
【００７９】
異なる時点で５０μｌのサンプルを採取して、９５０μｌの０．１ＭのＨＣｌＯ４（水中、ｐＨ１）の添加によってクエンチし、ＵＶ検出器を２０６ｎｍで使用して、ダイセル・クラウンエーテルＣｒ（＋）カラム上で、３，４−ジヒドロキシ−ベンズアルデヒドの減少および鏡像異性的に濃縮されたノルアドレナリンの形成について分析した。市販のＤＬ−ノルアドレナリンおよびＬ−ノルアドレナリン（シグマ・アルドリッチ）を標準物質として使用して、生成したノルアドレナリンの立体配置を判定した。この経時変化実験のＨＰＬＣ分析の結果を表２に示す。
【００８０】
【表２】
2009533034.tif 000007
【００８１】
［実施例３−（Ｓ）−オクトパミンの酵素的合成］
鏡像異性的に濃縮された（Ｓ）−オクトパミン（＝（Ｓ）−２−アミノ−１−（４−ヒドロキシ−）フェニル−エタノール）の合成のために、０．９７７ｇの４−ヒドロキシ−ベンズアルデヒドを１６ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、クエン酸／リン酸緩衝液ｐＨ６．０（０．０３７Ｍのクエン酸＋０．１２６ＭのＮａ２ＨＰＯ４）中のＰ．プチダ（ｐｕｔｉｄａ）ＮＣＩＭＢ１２５６５からの１，４００Ｕのスレオニンアルドラーゼ（ＤＬ−スレオ−フェニルセリンで活性をアッセイ）およびエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）ＤＯからの４０ＵのＴｙｒＤＣ−１（ＤＬ−スレオ−フェニルセリンで活性をアッセイ）と共に、３０ｇのグリシンと混合した。混合物を２５０ｍｌ丸底フラスコ内で撹拌しながら、室温でインキュベートした。
【００８２】
異なる時点で５０μｌのサンプルを採取して、９５０μｌの０．１ＭのＨＣｌＯ４（水中、ｐＨ１）の添加によってクエンチし、ＵＶ検出器を２０６ｎｍで使用して、市販の（ＲＳ）−オクトパミン（シグマ・アルドリッチ）を標準物質として、ダイセル・クラウンエーテルＣｒ（＋）カラム上で、鏡像異性的に濃縮されたオクトパミンの形成について分析した。この経時変化実験のＨＰＬＣ分析の結果を表３に示す。
【００８３】
【表３】
2009533034.tif 000008
【００８４】
反応混合物をｐＨ１〜２に酸性化し、沈殿したタンパク質を遠心分離によって除去した。ｐＨ３への滴定後、限外濾過を施した（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）８０５０撹拌細胞、ＹＭ−１０メンブラン、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））。限外濾過液を真空内で０．１ｌに濃縮し、アセトンを添加して混合物を−２０℃に１時間保存した。沈殿したグリシンを漉し取って、濾液を４０ｍｌの容積に濃縮した。ＮａＯＨ（３０％）でｐＨ１０．５に調節した後、溶液を真空中で６０℃で蒸発させ、残った液体残留物を酢酸エチルで処理した。沈殿した固形物を漉し取って、濾液を再度真空中で蒸発させた。比率７５／２０／５（ｖ／ｖ／ｖ）のジクロロメタン／メタノール／２５％水性ＮＨ３を溶出剤として、５０ｇシリカ上のカラムクロマトグラフィーによって残った液体を精製した。純粋生成物を含有する画分をプールして蒸発させ、ＮＭＲ−およびＨＰＬＣ−分析による標品と同一である５７４ｍｇの固体（Ｓ）−オクトパミン（４７％）を得た。
【００８５】
パーキン・エルマー２４１旋光計で測定された生成物の旋光度は、［α］Ｄ２０＝＋２７．７（ｃ＝０．５５、水）であった。（Ｒ）−オクトパミンについて報告された旋光度は、［α］Ｄ２０＝＋３７．４（ｃ＝０．１、水）である（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、２００２年、第１３巻、１２０９〜１２１７頁）。これはここで合成される（Ｓ）−オクトパミンの７４％のｅ．ｅ．に対応し、それはキラルＨＰＬＣ分析によって判定されたｅ．ｅ．の値、８１％と合致する。
【００８６】
（Ｓ）−オクトパミン生成物のＮＭＲデータを以下に示す。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ／ＤＣｌ，１，４−ジオキサン内部基準（３．７５ｐｐｍ））：δ７．３（ｍ，２Ｈ）、６．９５（ｍ，２Ｈ），４．９６（ｄｄ，１Ｈ），３．２０−３．３３（ｍ，２Ｈ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ／ＤＣｌ，１，４−ジオキサン内部基準（６７．２ｐｐｍ））：δ１５６．４，１３２．０，１２８．４，１１６．３，６９．９，４５．９。
【００８７】
［実施例４−ＤＬ−エリスロ−フェニルセリンの変換］
欧州特許第０２２０９２３号明細書で述べられている手順に従って、ラセミＤＬ−エリスロ−フェニルセリンを合成した。ＤＬ−エリスロ−フェニルセリンをそれぞれ９および５ｍＭの濃度で、それぞれＥ．フェシウム（ｆａｅｃｉｕｍ）ＤＯからの０．０６ＵのＴｙｒＤＣ−１、またはＥ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３からの０．１８ＵのＴｙｒＤＣと共に総容積１ｍｌでインキュベートした。反応を２５℃でインキュベートした。反応の途上で５０μｌのサンプルを採取して、９５０μｌの０．１ＭのＨＣｌＯ４（水中、ｐＨ１）の添加によってクエンチし、ＵＶ検出器を２０６ｎｍで使用して、ＤＬ−スレオ−フェニルセリン、ＤＬ−エリスロ−フェニルセリン、（Ｒ）−２−アミノ−１−フェニル−エタノール、および（Ｓ）−２−アミノ−１−フェニル−エタノールを標準物質として、ダイセル・クラウンエーテルＣｒ（＋）カラム上で、鏡像異性的に濃縮されたフェニルセリンおよび２−アミノ−１−フェニル−エタノール（ＡＰＥ）形成について分析した。ＨＰＬＣ分析の結果を表４に示す。いずれのサンプル中でも（Ｒ）−２−アミノ−１−フェニル−エタノールまたはＤ−またはＬ−スレオ−フェニルセリンのいずれも検出できなかった（検出限界≦０．００４ｍＭ）。Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの濃度が一定のままであるのに対し、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンは経時的に減少し、ＴｙｒＤＣがα−アミノ位置に対してエナンチオ選択的であることが示唆された。
【００８８】
【表４】
2009533034.tif 000009
【００８９】
［実施例５−ＴｙｒＤＣありまたはなしでの３．４−ジヒドロキシ−ベンズアルデヒドの変換］
０．１ｍＭのＰＬＰおよび２．５Ｍグリシンを含有する８０μｌの０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０に、ＤＭＳＯ中の２０μｌの０．５〜１．０Ｍの３，４−ジヒドロキシ−ベンズアルデヒド（３，４−ＯＨ−ＢＡ）溶液を添加した。Ｐ．プチダ（ｐｕｔｉｄａ）ＮＣＩＭＢ１２５６５からの０．６Ｕのスレオニンアルドラーゼ（ＤＬ−スレオ−フェニルセリンでアッセイした）、およびＥ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３からの０．４Ｕのチロシン脱炭酸酵素またはＥ．フェシウム（ｆａｅｃｉｕｍ）ＤＯからの０．６５Ｕのチロシン脱炭酸酵素（ＤＬ−スレオ−フェニルセリンでアッセイした）のそれぞれの添加によって、反応を開始した。並行して、チロシン脱炭酸酵素なしの反応を対照とした。全ての反応（総容積０．２ｍｌ）を室温で４８時間撹拌した。反応の途上で２５μｌのサンプルを採取して、４２５μｌの０．１ＭのＨＣｌＯ４（水中、ｐＨ１）の添加によってクエンチし、ＵＶ検出器を２０６ｎｍで使用して、ダイセル・クラウンエーテルＣｒ（＋）カラム上で、３，４−ジヒドロキシ−ベンズアルデヒドの減少と、３，４−ジヒドロキシ−フェニルセリン（３，４−ＯＨ−ＰＳ）および鏡像異性的に濃縮されたノルアドレナリンの形成について分析した。市販のＤＬ−ノルアドレナリンおよびＬ−ノルアドレナリン（シグマ・アルドリッチ）を標準物質として使用して、生成したノルアドレナリンの立体配置を判定した。この経時変化実験のＨＰＬＣ分析の結果を表５に示す。
【００９０】
チロシン脱炭酸酵素活性の添加なしには、出発原料３，４−ジヒドロキシ−ベンズアルデヒドの非常に低い変換のみが得られ、形成される３，４−ジヒドロキシ−フェニルセリンは低いβ−選択性で形成され、Ｌ−エリスロ−３，４−ジヒドロキシ−フェニルセリンに２０％未満のｄ．ｅ．をもたらすことは明白である。対照的にチロシン脱炭酸酵素活性との反応は、出発原料３，４−ジヒドロキシ−ベンズアルデヒドの顕著により高い変換を示す。チロシン脱炭酸酵素を添加すると、５０％超からほぼ定量的な９２％変換が得られる。さらにβ−選択性は２０％未満から約８０％に顕著に改善され、チロシン脱炭酸酵素を含有する反応中のＤ−ノルアドレナリンの７８〜８４％のｅ．ｅ．値に反映される。
【００９１】
【表５】
2009533034.tif 000010
【００９２】
上に示す結果は、特に芳香族（ａｒｏｍａｔｉｖ）アルデヒドが変換され、およびチロシン脱炭酸酵素が本発明に従った方法で使用される場合に、鏡像異性的に純粋な生成物よりも５０％高い収率が得られるかもしれないことが、本発明に従った方法の利点であることを例証する。
【００９３】
［実施例６−代案の基質（式（１）などの置換芳香族アルデヒド）］
０．１３ｍＭのＰＬＰおよび１．２７Ｍのグリシンを含有する０．１５ｍｌの０．２７Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０に、ＤＭＳＯ中の２０μｌの０．２５〜０．５Ｍのアルデヒド溶液を添加した。Ｐ．プチダ（ｐｕｔｉｄａ）ＮＣＩＭＢ１２５６５からの１０μｌのスレオニンアルドラーゼ（無細胞抽出物；５９Ｕ／ｍｌ、ＤＬ−スレオ−フェニルセリンでアッセイした）Ｅ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３からの２０μｌのチロシン脱炭酸酵素（無細胞抽出物；１．８Ｕ／ｍｌ、ＤＬ−スレオ−フェニルセリンでアッセイした）の添加によって反応を開始した。溶液を室温で１〜３日間撹拌し、対応する置換フェニルセリン（式（３）参照）およびβ−アミノアルコール（式（２）参照）の形成をシリカ被覆ガラスプレート上の薄層クロマトグラフィーによって監視した。Ｒｆ値：Ｒｆ＝０．６〜０．７のβ−アミノアルコール、Ｒｆ＝０．２〜０．３の置換フェニルセリン、Ｒｆ＝０のグリシン（溶出剤：水性アンモニア７５／２０／５（ｖ／ｖ／ｖ）のジクロロメタン／メタノール／２５％；ニンヒドリン染色）。２−フルオロベンズアルデヒド、３−フルオロベンズアルデヒド、４−フルオロベンズアルデヒド、２−クロロベンズアルデヒド、３−クロロベンズアルデヒド、４−クロロベンズアルデヒド、３−ブロモベンズアルデヒド、４−ブロモベンズアルデヒド、３−メチルベンズアルデヒド、４−メチルベンズアルデヒド、３−ヒドロキシベンズアルデヒド、３−メトキシベンズアルデヒド、３−ニトロベンズアルデヒド、３，４−（メチレンジオキシ）−ベンズアルデヒド、２−フルアルデヒド、ピリジン−２−カルボキサルデヒド、ピリジン−３−カルボキサルデヒド、ピリジン−４−カルボキサルデヒド、およびヘキサヒドロベンズアルデヒドは、スレオニンアルドラーゼおよびチロシン脱炭酸酵素によって変換され、対応するβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸中間体および対応するβ−アミノアルコールになる。
【００９４】
［実施例７−Ｌ−ノルフェネフリンの酵素的合成］
鏡像異性的に濃縮されたＬ−ノルフェネフリン（＝（Ｒ）−２−アミノ−１−（３−ヒドロキシ−）フェニル−エタノール）の合成のために、０．１Ｍの３−ヒドロキシ−ベンズアルデヒドを５０μＭのピリドキサール５’−ホスフェートを含有する５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液ｐＨ５．５中のＰ．プチダ（ｐｕｔｉｄａ）ＮＣＩＭＢ１２５６５からの３８Ｕのスレオニンアルドラーゼ（ＤＬ−スレオ−フェニルセリンで活性アッセイ）およびエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３からの０．４ＵのＴｙｒＤＣ（ＤＬ−スレオ−フェニルセリンで活性アッセイ）と共に、１ｍｌの総容積中で１Ｍのグリシンと反応させた。混合物を撹拌しながら室温（２５℃）でインキュベートした。
【００９５】
ＵＶ検出器を２１０ｎｍで使用して、市販のシグマ（Ｓｉｇｍａ）からのＤＬ−ノルフェネフリンを標準物質として、ダイセル・クラウンエーテルＣｒ（＋）カラム上で、鏡像異性的に濃縮されたノルフェネフリンの形成について反応を分析した。２４時間後、供給された３−ヒドロキシ−ベンズアルデヒドの７６％は、５６％のｅ．ｅで鏡像異性的に濃縮されたＬ−ノルフェネフリンに変換された。パーキン・エルマー３４１旋光計上で旋光度を測定した：
［α］２０Ｄ−１１．１（ｃ＝１．０、ＥｔＯＨ）；文献値：［α］２０Ｄ−１．７（ｃ＝５．８、ＭｅＯＨ）
またＮＭＲデータは、Ｌｕｎｄｅｌｌら、（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、２００４年、１５、３７２３頁）によって報告されたものと一致する。
【００９６】
［実施例８−鏡像異性的に濃縮されたハロゲン化２−アミノ−１−フェニル−エタノールの酵素的合成］
１．０ｍｌの緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ、ｐＨ５．５）中のハロゲン化ベンズアルデヒド誘導体（０．１ｍｍｏｌ）、グリシン（１．０ｍｍｏｌ）、およびピリドキサール５’−ホスフェート（５０ｎｍｏｌ）溶液に、Ｐ．プチダ（ｐｕｔｉｄａ）ＮＣＩＭＢ１２５６５からの３８Ｕのスレオニンアルドラーゼ（ＤＬ−スレオ−フェニルセリンで活性アッセイ）、およびエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３からの０．４Ｕのチロシン脱炭酸酵素またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）ＤＯからのＴｙｒＤＣ−１（ＤＬ−スレオ−フェニルセリンで活性アッセイ）を添加した。反応混合物を２５℃で撹拌し、２４および５７時間後、ＨＰＬＣによって収率およびｅ．ｅ．を判定した。
【００９７】
ＣＤＣｌ３（１Ｈ：δ７．２６、１３Ｃδ７７．０）、Ｄ２Ｏ（１Ｈ：δ４．７９）またはＤＭＳＯ＊ｄ６（１Ｈ：δ２．５０、１３Ｃδ４０．２）の残留ピークを標準として使用して、Ｖａｒｉａｎ  ＩＮＯＶＡ５００（１Ｈ４９９．８２ＭＨｚ、１３Ｃ１２５．６９ＭＨｚ）またはＶａｒｉａｎ  ＧＥＭＩＮＩ２００（１Ｈ１９９．９８ＭＨｚ、１３Ｃ５０．２９ＭＨｚ）上で、１Ｈおよび１３ＣＮＭＲスペクトルを記録した。Ｈ２Ｏ／Ｄ２Ｏ−ＮＭＲサンプルを水溶液から直接採取してＤ２Ｏ（１：１）で希釈し、Ｈ２Ｏプレサチュレーションを使用して記録した。Ｇ１３１５Ａダイオードアレー検出器を使用して、ヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）シリーズ１１００  ＨＰＬＣで、分析的ＨＰＬＣを実施した。２−アミノ−１−フェニルエタノールおよびその誘導体をクラウンパック（登録商標）Ｃｒ（−）（１５０ｍｍ、５μｍ）、標準条件下のカラム（ＨＣｌＯ４溶液ｐＨ１．０、１１４ｍＭ、１．０ｍｌ／分、１５℃）上で分析した。旋光度をパーキン・エルマー３４１旋光計上で測定した。
【００９８】
【表６】
2009533034.tif 000011
【００９９】
［ＮＭＲ−データ：］
（Ｒ）−２−アミノ−１−（３−フルオロフェニル）エタノール
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＳＭＯ）δ２．５６（ｄｄ，１Ｈ，ＣＨ−Ｎ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ），２．６９（ｄｄ，１Ｈ，ＣＨ−Ｎ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１２．５Ｈｚ），４．４８（ｄｄ，１Ｈ，ＣＨ−Ｏ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．０２（ｄｔ，１Ｈ，ＡｒＨ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．１３（ｍ，２Ｈ，ＡｒＨ），７．３３（ｄｄ，１Ｈ，ＡｒＨ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｊ＝１４．５Ｈｚ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ＊ｄ６）δ５０．５，７４．３，１１３．２（ｄ，Ｊ＝２１．５Ｈｚ），１１４．０（ｄ，Ｊ＝２１．０Ｈｚ），１２２．６（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），１３０．５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），１４８．３（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１６２．９（ｄ，Ｊ＝２４１Ｈｚ）；
［α］２０Ｄ−２９．３（ｃ１．０、ＥｔＯＨ）
（Ｒ）−２−アミノ−１−（４−フルオロフェニル）エタノール
［α］２０Ｄ−１２．５（ｃ＝１．０、ＥｔＯＨ）；（Ｓ）−２−アミノ−１−（４−フルオロフェニル）エタノールの文献値［α］２０Ｄ＋４０．９（ｃ＝０．４８、ＥｔＯＨ）；ＨＰＬＣ：ｔｓ＝２８．８分、ｔＲ＝３２．２分；またＮＭＲデータはＣｈｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、２００２年、１３、１２０９頁で報告されたものと一致する。
（Ｒ）−２−アミノ−１−（２−クロロフェニル）エタノール
［α］２０Ｄ−５９（ｃ＝１．０、ＥｔＯＨ）；（Ｓ）−２−アミノ−１−（２−クロロフェニル）エタノールの文献値［α］２０Ｄ＋９２．５（ｃ＝１．０２、ＣＨ２Ｃｌ２）；ＨＰＬＣ：ｔｓ＝２１．０分、ｔＲ＝２４．６分；またＮＭＲデータはＮｏｅら、Ｍｏｎａｔｓｈ．Ｃｈｅｍ．１９９５年、１２６、４８１頁で報告されたものと一致する。
（Ｒ）−２−アミノ−１−（３−クロロフェニル）エタノール
［α］２０Ｄ−２８．７（ｃ＝１．０、ＥｔＯＨ）；（Ｓ）−２−アミノ−１−（３−クロロフェニル）エタノールの文献値［α］２０Ｄ＋７８．９（ｃ＝０．２１、ＥｔＯＨ）；ＨＰＬＣ：ｔｓ＝２０．５分，ｔＲ＝２３．９分；またＮＭＲデータはＣｈｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、２００２年、１３、１２０９頁で報告されたものと一致する。
（Ｒ）−２−アミノ−１−（４−クロロフェニル）エタノール
［α］２０Ｄ−３４．４（ｃ＝１．０、ＥｔＯＨ）；（Ｓ）−２−アミノ−１−（４−クロロフェニル）エタノールの文献値［α］２０Ｄ＋４０．５（ｃ＝０．５３、ＥｔＯＨ）；ＨＰＬＣ：ｔｓ＝２０．５分、ｔＲ＝２３．７分；またＮＭＲデータはＣｈｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、２００２年、１３、１２０９頁で報告されたものと一致する。
【０１００】
［実施例９−スレオニンアルドラーゼおよびチロシン脱炭酸酵素での脂肪族化合物の変換］
スレオニンアルドラーゼおよびチロシン脱炭酸酵素による、シクロヘキシル−カルボキサルデヒドおよびグリシンの２−アミノ−１−シクロヘキシルエタノールへの同時ワンポット変換のために、総容積１ｍｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５．５、５０μＭのＰＬＰ含有）中で、Ｐ．プチダ（ｐｕｔｉｄａ）ＮＣＩＭＢ１２５６５からの４０Ｕのスレオニンアルドラーゼ、およびエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｖ５８３からの２．５ＵのＴｙｒＤＣまたはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）ＤＯからの２．５ＵのＴｙｒＤＣ−１を０．１Ｍのシクロヘキシル−カルボキサルデヒドおよび１．０Ｍのグリシンと反応させた。対照反応として、総容積１ｍｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５．５、５０μＭのＰＬＰ含有）中で、Ｐ．プチダ（ｐｕｔｉｄａ）ＮＣＩＭＢ１２５６５からの４０Ｕのスレオニンアルドラーゼのみを０．１Ｍのシクロヘキシル−カルボキサルデヒドおよび１．０Ｍのグリシンと反応させた。反応を磁気撹拌しながら２５℃でインキュベートした。４８時間後、反応を０．５％のメタンスルホン酸（水中、ｐＨ１．３）で７．５倍に希釈し、ポジティブモード（フルスキャン）で作動する飛行時間型ＭＳ検出器の大気圧イオン化−電子スプレー時間と合わせて、プリベイル（Ｐｒｅｖａｉｌ）Ｃ１８カラム（２５０×４．０ｍｍ、５μｍ；溶出剤Ａ：０．５％水中のメタンスルホン酸ｐＨ１．３；溶出剤Ｂ：アセトニトリル中の０．５％メタンスルホン酸；流速：１ｍｌ／分；勾配：１５分以内に９５％溶出剤Ａ＋５％溶出剤Ｂから５％溶出剤Ａ＋９５％溶出剤Ｂ）を使用して、ＬＣ−ＭＳで分析した。
【０１０１】
スレオニンアルドラーゼとチロシン脱炭酸酵素の双方を含有する反応中でのみ、２−アミノ−１−シクロヘキシルエタノール（滞留時間５．６５分）が、Ｍｅｃｃａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、２００１年、１２、１２２５〜１２３３頁に従って化学的に合成された標準物質との比較で、その分子量ｍ＋１＝１４４に応じて同定できた。スレオニンアルドラーゼのみでの対照反応は、連動したスレオニンアルドラーゼとチロシン脱炭酸酵素反応とによって、２−アミノ−１−シクロヘキシルエタノールが生成された場合を除いて、この脂肪族β−アミノアルコールの検出可能量の形成をもたらさなかった。
【配列表】
2009533034000001.app
【国際調査報告】
2009533034.tif 000014
2009533034.tif 000015
2009533034.tif 000016