(57)【要約】本発明は、オステオポンチンの血清レベルに基づいた診断法を提供する。本開示は、ヒト対象患者における中皮腫のための非侵襲的マーカーとしてのオステオポンチンの使用に関するものである。オステオポンチンレベルは、中皮腫の患者の血清において上昇し、これらのレベルの測定は、診断、予後、および治療のために好都合に行うことができる。また、本開示は、オステオポンチンを発見するための少なくとも１つの結合剤を含むキットと、オステオポンチンレベルと、中皮腫の存在に対応する１つまたは複数の所定の値とを比較するための手段とを提供する。
2009515141.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胸膜中皮腫の存在に対してヒト対象患者を診断的に評価する方法であって、（ａ）前記対象患者から生物学的試料を得るステップと、（ｂ）存在するオステオポンチン濃度に対して前記試料を分析するステップと、（ｃ）前記ステップ（ｂ）の分析によって得られた結果と、１つ以上の対照試料の分析から得られた結果とを比較するステップと、（ｄ）前記対称患者の試料における前記オステオポンチン濃度が、前記１つまたは複数の対照試料における濃度よりも高い場合に、前記対象患者は胸膜中皮腫を有する危険性が高いという結論を下すステップと、を含む方法。
【請求項２】
前記試料内に存在するオステオポンチンの濃度は、免疫学的検定法によって測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料におけるオステオポンチンの濃度は、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ：酵素免疫測定法）を使用して測定される。請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的試料は、血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記１つ以上の対照試料は、アスベスト曝露した対象患者から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記対照試料から得られた結果は、一般集団から採取した一群の対照試料から得られた結果と比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記対照患者の試料における前記オステオポンチン濃度が、前記１つまたは複数の対照試料における濃度よりも所定の値だけ高い場合に、前記対象患者は胸膜中皮腫を有する危険性が高いという結論が下される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
癌の診断マーカーに対して少なくとも１つの更なる分析を行うステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記癌は、非中皮腫アスベスト関連の肺癌である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
胸膜中皮腫の存在に対してヒト対象患者を診断的に評価する方法であって、（ａ）前記対象患者から血清試料を調製するステップと、（ｂ）存在するオステオポンチンの濃度に対して前記血清試料を分析するステップと、（ｃ）ＡＵＣ（Ａｒｅａ  Ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  Ｃｕｒｖｅ：曲線下面積）の分析を行うステップであって、６２．４ｎｇ／ｍｌを超える血清オステオポンチンレベルがステージＩの中皮腫を示すステップと、を含む方法。
【請求項１１】
中皮腫の存在に対してヒト対象患者を診断的に評価する方法であって、（ａ）前記対象患者から血清試料を調製するステップと、（ｂ）存在するオステオポンチンの濃度に対して前記血清試料を分析するステップと、（ｃ）ＡＵＣの分析を行うステップであって、中皮腫が存在しないアスベスト曝露から区別したときに、４８．４ｎｇ／ｍｌを超える血清オステオポンチンレベルが中皮腫を示すステップと、を含む方法。
【請求項１２】
中皮腫の診断に従って、ヒト対象患者における中皮腫治療を診断的に評価する方法であって、（ａ）治療中の異なる時点で、前記対象患者から少なくとも第一および第二の生物学的試料を得るステップと、（ｂ）存在するオステオポンチンの濃度に対して前記試料を分析するステップと、（ｃ）前記ステップ（ｂ）の分析によって得られた結果と、前記対象患者からの治療前の試料の分析から得られた結果とを比較するステップと、（ｄ）前記治療前の試料におけるオステオポンチンの濃度が、前記第一および／または第二の試料における濃度よりも高い場合に、前記治療は中皮腫の深刻さの低減に有効であるという結論を下すステップと、を含む方法。
【請求項１３】
前記生物学的試料は、血清試料である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記治療前の血清オステオポンチンレベルが少なくとも６０ｎｇ／ｍｌであり、前記第一および第二の試料のうちの少なくとも１つの血清オステオポンチンレベルは３０乃至５８ｎｇ／ｍｌである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト患者における中皮腫を評価する方法であって、前記患者から得られた試料内のオステオポンチンの量を評価するステップと、前記量を既知の中皮腫状態の１例以上の基準ヒトに由来する基準値とを比較するステップとを含み、それによって、前記比較ステップは、前記基準ヒトの中皮腫の状態に対する前記患者の中皮腫の状態を示す、方法。
【請求項１６】
前記中皮腫は、胸膜中皮腫である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料は、血清を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ヒト患者が中皮腫を発病する可能性を評価する方法であって、前記患者から得られた試料内のオステオポンチンの量を評価するステップと、前記量を既知の中皮腫予後の１例以上の基準ヒトに由来する基準値とを比較するステップとを含み、それによって、前記比較ステップは、前記患者が中皮種を発病する可能性を示す、方法。
【請求項１９】
前記中皮腫は、胸膜中皮腫である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料は、血清を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
中皮種に対する治療の有効性を評価する方法であって、前記治療を複数回行った患者から得られた試料内のオステオポンチンの量を比較するステップを含み、それにって、前記量の経時的な減少は、前記治療が有効であることを示す、方法。
【請求項２２】
前記中皮腫は、胸膜中皮腫である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料は、血清を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数の回数は、治療の開始前に回数を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
ヒト患者における中皮腫を評価する方法であって、胸膜液内のオステオポンチンを評価するステップを含み、それによって、前記胸膜液内の異常に高レベルのオステオポンチンは、前記患者が中皮種を患っていることを示す、方法。
【請求項２６】
前記胸膜液は、胸膜浸出液、胸膜漏出液、胸膜洗浄液、胸膜吸引物、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記胸膜液は、胸膜滲出を患っている患者から採集される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記胸膜液は、胸膜滲出を呈する疑いのある患者から採集される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記胸膜液は、患者から胸腔穿刺によって採集される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
ヒト対象患者における中皮種を診断する方法であって、前記患者の生物学的試料内に存在するオステオポンチンの量と、中皮種を患っていない対照ヒト（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｈｕｍａｎ）の同じタイプの試料内に通常存在するオステオポンチンの量とを比較するステップを含み、それによって、前記対象患者から得られた前記試料内に存在するオステオポンチンの量がより多いことは、前記対象患者が中皮種を患っていることを示す、方法。
【請求項３１】
ヒト対象患者における中皮腫を診断するキットの製造時にオステオポンチンを発見するための試薬の使用。
【請求項３２】
ヒト対象患者における中皮種を診断する方法であって、前記対象患者の生物学的試料内のオステオポンチンの発現と、中皮種を患っていない対照ヒトの同じタイプの試料内のオステオポンチンの正常発現とを比較するステップを含み、それによって、前記対象患者から得られた前記試料内のオステオポンチンのより多くの発現は、前記対象患者が中皮種を患っていることを示す、方法。
【請求項３３】
ヒト対象患者における中皮腫を診断するキットの製造時にオステオポンチンの発現を発見するための試薬の使用。
【請求項３４】
前記試薬は、オステオポンチンを符号化するヒト遺伝子の増幅産物と結合するポリヌクレオチドである、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
中皮種を治療した対象患者における再発を観察する方法であって、経時的に前記対象患者の生物学的試料内に存在するオステオポンチンの量を観察するステップを含み、それによって、前記試料内の経時的なオステオポンチンの量の増加は、前記患者が再発していることを示す、方法。
【請求項３６】
中皮種を治療した対象患者における再発を観察するためのキットの製造時にオステオポンチンを発見するための試薬の使用。
【請求項３７】
中皮種を治療した対象患者における再発を観察する方法であって、経時的に前記対象患者の生物学的試料内に存在するオステオポンチンの発現を観察するステップを含み、それによって、前記試料内の経時的なオステオポンチンの発現の増加は、前記患者が再発していることを示す、方法。
【請求項３８】
中皮種を治療した対象患者における再発を観察するためのキットの製造時にオステオポンチンの発現を発見するための試薬の使用。
【請求項３９】
アスベストに曝露したヒトにおける悪性腫瘍を診断する方法であって、前記ヒトの生物学的試料内に存在するオステオポンチンの量と、アスベストに曝露していない対照ヒトの同じタイプの試料内に通常存在するオステオポンチンの量とを比較するステップを含み、それによって、前記対象患者から得られた試料内に存在するオステオポンチンの量がより多いことは、前記対象患者が悪性腫瘍を患っていることを示す、方法。
【請求項４０】
アスベストに曝露したヒトにおける悪性腫瘍を診断するためのキットの製造時にオステオポンチンを発見するための試薬の使用。
【請求項４１】
アスベストに曝露したヒトにおける悪性腫瘍を診断する方法であって、ヒトの生物学的試料内のオステオポンチンの発現と、アスベストに曝露していない対照ヒトの同じタイプの試料内のオステオポンチンの正常発現とを比較するステップを含み、それによって、前記対象患者から得られた前記試料内のオステオポンチンの発現がより多いことは、前記患者が悪性腫瘍を患っていることを示す、方法。
【請求項４２】
アスベストに曝露したヒトにおける悪性腫瘍を診断するためのキットの製造時にオステオポンチンの発現を発見するための試薬の使用。
【請求項４３】
中皮腫を患っているヒトの治療の有効性を評価する方法であって、治療前に前記患者から得られた第一の生物学的試料内に存在するオステオポンチンの量と、治療後に前記ヒトから得られた同じタイプの第二の試料内のオステオポンチンの量とを比較するステップを含み、それによって、前記第二の試料内に存在するオステオポンチンの量がより少ないことは、前記治療が有効であることを示す、方法。
【請求項４４】
中皮腫を患っているヒトの治療の有効性を評価する方法であって、治療前に前記患者から得られた第一の生物学的試料内のオステオポンチンの発現と、治療後に前記ヒトから得られた同じタイプの第二の試料内のオステオポンチンの発現とを比較するステップを含み、それによって、それによって、前記第二の試料内に存在するオステオポンチンの量がより少ないことは、前記治療が有効であることを示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、胸膜中皮腫を患っている対象患者の組織および体液におけるオステオポンチンの発生に関するものであり、悪性腫瘍の無いアスベスト曝露した対象患者、悪性腫瘍の無い未曝露の対象患者、および胸膜中皮腫を有するアスベスト曝露した対象患者の、３つの集団における血清オステオポンチンレベルを開示するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来技術
胸膜中皮腫は、生存期間の中央値が８乃至１８ヵ月であるアスベスト関連の悪性腫瘍である（非特許文献１）。少数の胸膜中皮腫患者の遡及研究では、胸膜中皮腫に対して危険性の高い集団における症状をさかのぼるバイオマーカーを明確にしようと試みた。これらのマーカーには、組織ポリペプチド抗原、癌胎児性抗原、ヒアルロン酸およびフェリチン、ヒアルロン酸単独、Ｃｙｆｒａ  ２１ＴＭを含むサイトケラチン、ＣＡ−１２５、およびメソセリン関連のタンパク質（ＳＭＲＰ、Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔａｉｎ：血清メソセリン関連タンパク質）が挙げられる（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７）。
【０００３】
アスベスト曝露した集団における胸膜中皮腫の生涯リスクは、４．５乃至１０％である。高曝露の危険性がある労働者には、鉱山労働者、工場労働者、大工、電気技師、船舶組み立て工、船舶電気技師、ボイラー製造工、断熱材メーカー、鉄道従業員、防毒マスクメーカー、およびパイプ絶縁体が挙げられる（非特許文献１８）。米国内の７，５００，０００人もの建設労働者が、建物の耐火化、音響調整、ダクト作業、およびパイプ／ボイラー設置のためにアスベスト建設材料を使用していると推定されている（Ｓｃｈｏｔｔｅｎｆｅｌｄ  Ｄ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｗ．Ｂ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ社、１９８２）。さらに、なおもアスベストは、約１，３００，０００人の米国内の建設業界や、建造物および装置のメンテナンスに携わる労働者にとって危険である（米国労働省  ＯＳａＨＡ．  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｔｏｐｉｃｓ：Ａｓｂｅｓｔｏｓ．２００３）。
【０００４】
現在、米国内での中皮腫の新患者数は１年にわずか２５００乃至３０００であるのに、潜在的に危険性があるこれら全ての人々をスクリーニングするための経済的に実行可能で有効な物理療法は存在しない（年齢調整発生率２／１００，０００）（非特許文献１９）。しかし、中皮腫の発病率は、カナダやオーストラリアを含む、米国内外で増加している。診断から、胸膜中皮腫における生存期間の中央値は９乃至１２ヵ月である。進行した症例では、腫瘍を切除することで、約３ヶ月生存期間を延長することができる。しかし、ステージＩＡの疾患を有する患者は、腫瘍がすぐに切除されれば５年以上生存することができる。不都合にも、早期発見の難しさは、ステージＩＡにある胸膜中皮腫の患者が５％未満であることに表される。実際に、患者の８５％は、その疾患の症状を呈している時点で初めて現れる。したがって、アスベスト曝露した集団において、中皮腫の発症を予測するか、または初期ステージの胸膜中皮腫を発見することができるマーカーまたは一連のバイオマーカーは極めて価値のあるものとなる。
【非特許文献１】Ｍａｒｔｉｎｏ  Ｄ他、Ｃｌｉｎ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００４、５（５）：２９０−２９８
【非特許文献２】Ｅｂｅｒｔ  Ｗ他、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９７；１７（４Ｂ）：２８７５−２８７８
【非特許文献３】Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ  Ｔ他、Ｃｈｅｓｔ  １９８８；９４（５）：１０３７−１０３９
【非特許文献４】Ｆｒｅｂｏｕｒｇ  Ｔ他、Ｃａｎｃｅｒ  １９８７；５９（１２）：２１０４−２１０７
【非特許文献５】Ｒｏｂｏｚ  Ｊ他、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  １９８９；８１（１２）：９２４−９２８
【非特許文献６】Ｃｈｉｕ  Ｂ他、Ｃａｎｃｅｒ  １９８４；５４（１０）：２１９５−２１９９
【非特許文献７】Ｂｏｅｒｓｍａ  Ａ他、Ｂｕｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｐａｔｈｏｌ  Ｒｅｓｐｉｒ（Ｎａｎｃｙ）１９８０；１６（１）：４１−４５
【非特許文献８】Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ＰＥ他、Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ  １９７７；５８（２）：９７−１０２
【非特許文献９】Ｔｈｙｌｅｎ  Ａ他  Ｃａｎｃｅｒ  ２００１；９２（５）：１２２４−１２３０
【非特許文献１０】Ｐｌｕｙｇｅｒｓ  Ｅ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ  １９９２；１（２）：１２９−１３８
【非特許文献１１】Ｌｅｅ  ＹＣ他、Ａｕｓｔ  Ｎ  Ｚ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９９９；２９（６）：７６５−７６９
【非特許文献１２】Ｐａｇａｎｕｚｚｉ  Ｍ他、Ｃｈｅｓｔ  ２００１；１１９（４）：１１３８−１１４２
【非特許文献１３】Ｓｃｈｏｕｗｉｎｋ  Ｈ他、Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９９；２５（１）：２５−３２
【非特許文献１４】Ｍａｒｕｋａｗａ  Ｍ他、Ａｃｔａ  Ｍｅｄ  Ｏｋａｙａｍａ  １９９８；５２（２）：１１９−１２３
【非特許文献１５】Ｂｏｎｆｒｅｒ  ＪＭ他、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９７；１７（４Ｂ）：２９７１−２９７３
【非特許文献１６】Ａｌｍｕｄｅｖａｒ  ＢＥ他、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １９９７；３１（３）：２６７−２７３
【非特許文献１７】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＢＷ他、Ｌａｎｃｅｔ  ２００３；３６２（９３９６）：１６１２−１６１６
【非特許文献１８】Ｒｏｇｇｌｉ  ＶＬ他、Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００２；２６（２）：５５−６５
【非特許文献１９】Ｗｅｉｌｌ  Ｈ他、Ｏｃｃｕｐ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｅｄ  ２００４；６１（５）：４３８−４４１
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、ヒト対象患者における中皮腫のための非侵襲的マーカーとしてのオステオポンチンの使用に関するものである。オステオポンチンレベルは、中皮腫の患者の血清において上昇し、これらのレベルの測定は、診断、予後、および治療のために好都合に行うことができる。
【０００６】
その側面のうちの１つでは、本開示は、体液、または血液、血清、痰、気管支または肺胞の洗浄液、肺吸引物、胸膜液試料、または肺組織に由来する、またはこれと接触した別の試料のような、患者の他の生物学的試料内のオステオポンチンレベルを発見するステップと、前記レベルを所定の１つまたは複数の値、または既知の中皮種状態の別の患者から得られた比較可能な試料と比較するステップとによって、中皮種を診断する方法を提供する。
【０００７】
さらに別の側面では、本開示は、放射線または化学療法に対する中皮腫の反応を観察するための方法であって、前記中皮種を診断するステップと、前記放射線または化学療法の前、その間、および／またはその後のオステオポンチンレベルを測定するステップとを含む方法を提供する。
【０００８】
さらに別の側面では、本開示は、腫瘍治療に対する患者の反応を観察する方法であって、治療前、治療中の任意の時間、および治療後に前記患者から得られた体液内のオステオポンチンレベルを測定するステップと、前記レベルを互いに比較するか、中皮腫の存在を示す１つまたは複数の所定の値と比較するステップとを含む方法を提供する。
【０００９】
また、本開示は、オステオポンチンを発見するための少なくとも１つの結合剤を含むキットと、オステオポンチンレベルと、中皮腫の存在に対応する１つまたは複数の所定の値とを比較するための手段とを提供する。好適な較正手段の例には、所定の値またはある範囲の値に対応する量において標準化したオステオポンチン、前記キットの使用方法、および中皮種に対する陰性および陽性の結果に対応する様々な体液におけるオステオポンチンレベルの説明が含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本開示は、オステオポンチンは、胸膜中皮腫を含む中皮種に有用なバイオマーカーであるという新たな事実を提供するものであり、より具体的には、アスベスト関連の非悪性疾患を有する患者のコホート（ｃｏｈｏｒｔ：以下、アスベスト曝露群と称する）におけるオステオポンチンの血清レベルと、外科的に治療された胸膜中皮腫患者における術前レベルとの比較を提供するものである。アスベスト関連の非悪性疾患を有する集団は、腫瘍を発症する危険性が高いこと、発癌物質への測定可能で識別可能な曝露を有すること、明確かつよく研究された地理的領域内に存在すること、および長期的な追跡研究（Ｃｕｌｌｅｎ  ＭＲ他、Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  ２００５；１６１（３）：２６０−２７０）に適合していることから、胸膜中皮腫を早期発見するためのバイオマーカーの研究に理想的なコホートである。
【００１１】
以前の研究では、遺伝子発現アレイを使用して、胸膜中皮腫の生存および再発パターンを予測し（Ｐａｓｓ  ＨＩ他、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４；１０（３）：８４９−８５９）、胸膜中皮腫のスクリーニングおよび診断に有用であるマーカーを探索した。最も有望なバイオマーカーは、オステオポンチン、すなわち肺癌、乳癌、黒色腫、結腸直腸癌、胃癌、および卵巣癌において過剰発現する糖タンパク質であった（Ｆｅｄａｒｋｏ  ＮＳ他、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１；７（１２）：４０６０−４０６６；Ｓｈｉｎｇｈａｌ  Ｈ他、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９７；３（４）：６０５−６１１；Ｄｅｎｈａｒｄｔ  Ｄ．  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００５；１２４（５）：ｘｖｉ−ｘｖｉｉｉ；Ｄｉｎｇ  Ｌ他、Ｚｈｏｎｇｈｕａ  Ｗａｉ  Ｋｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ  ２００２；４０（１０）：７７３−７７５；Ｕｅ  Ｔ他、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９８；７９（２）：１２７−１３２；Ｓｃｈｏｒｇｅ  ＪＯ他、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４；１０（１０）：３４７４−３４７８；Ｂｒａｋｏｒａ  ＫＡ他、Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  ２００４；９３（２）：３６１−３６５；Ｋｉｍ  ＪＨ他、ＪＡＭＡ  ２００２；２８７（１３）：１６７１−１６７９）。オステオポンチンは、細胞基質相互作用とインテグリンおよびＣＤ４４受容体との結合を通じてシグナリングする細胞（Ｗａｉ  ＰＹ他、Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ  ２００４；１２１（２）：２８１−２４１）とを媒介し、アスベスト誘導の発癌に関連する細胞シグナル経路内のタンパク質によって調整される。さらに、高レベルのオステオポンチンは、腫瘍の浸潤、進行、および転移に互いに関連する。Ｓａｎｄｈｕは、オステオポンチンが、アスベスト発癌のラットモデルにおいて、および生体外でアスベストを処理した細胞において上昇傾向にあることを報告している（Ｓａｎｄｈｕ  Ｈ他、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２０００；２１（５）：１０２３−１０２９）。
【００１２】
オステオポンチンとは、これに限定されないが、Ｄｅｎｈａｒｄｔ  Ｄ．ＴおよびＧｕｏ  Ｘ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７：１４７５−８２（１９９３）、およびＤｅｎｈａｒｄｔ  Ｄ．Ｔ他（編者）、「Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ：Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ」、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．（１９９５）に記載されているタンパク質、および相同タンパク質を含む、保存ＧＲＧＤＳアミノ酸配列によって特徴付けられる、分泌強酸性糖リンタンパク質のことである。本願明細書で使用されるように、この用語は、オステオポンチンの変種および断片、すなわち、配列および／または長さにおいて、記述されたオステオポンチンに実質的に類似しているが、同一ではなく、下述するように特定の結合相互作用においてオステオポンチンの代用とすることができる、自然発生した形態のオステオポンチンを包含する。
【００１３】
ヒトオステオポンチンは、完全に配列決定されており、このタンパク質を認識する多クローン性および単クローン性抗体がどちらも市販されている（例、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、およびＡｂｃａｍ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）ことが分かっている。このタンパク質を発見するための方法は、従来技術で説明されており、ヒトタンパク質を数量化するためのＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ：酵素免疫測定法）分析は市販されている（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ社、Ａｎｎ、Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）。生物学的体液および試料内のオステオポンチンは、生体プロセスにより部分的に分解するか、または修飾形態となる場合もありうる。本願明細書の目的のために、オステオポンチンの断片またはオステオポンチンの修飾形態を発見するオステオポンチンレベルを測定するための分析は、本開示の範囲内に含まれるものと理解されよう。
【００１４】
現在の研究結果は、実施例に記述する。簡潔に、年齢を適合させた、アスベスト曝露および未曝露の対象患者間の血清オステオポンチンレベルにおける統計学的な有意差は見られなかった（それぞれ３０±３ｎｇ／ｍｌ対２０+４ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０６）。アスベスト曝露群の中で、血清オステオポンチンレベルの上昇は、肺の斑および線維形成（５６±１３ｎｇ／ｇｌ）に関連付けられたが、通常の放射線学的所見（２１±５ｎｇ／ｍｌ）、斑（２３±３ｎｇ／ｍｌ）、または線維形成（３２±７ｎｇ／ｍｌ）、ｐ＝０．００４とは関連付けられなかった。胸膜中皮腫を有する群内の血清オステオポンチンは、６９例のアスベスト曝露した対象患者において、１３３±１０ｎｇ／ｍｌおよび３０±３ｎｇ／ｍｌ（ｐ＜０．００１）であった。免疫組織化学は、オステオポンチンが、３８中３６の胸膜中皮腫の腫瘍細胞に限定されたことを明らかにした。アスベスト曝露した非悪性腫瘍群を中皮腫群と比較した血清オステオポンチンレベルのＲＯＣ分析では、４８．４ｎｇ／ｍｌのカットオフにおいて、感度は７７．６％、特異度は８７％であった。ステージＩの中皮種をアスベスト曝露した対象患者と比較したサブグループ分析では、６２．４ｎｇ／ｍｌのカットオフにおいて、感度は８４．６％、特異度は８８．４％であった。血清オステオポンチンレベルは、したがって、胸膜中皮腫を有するアスベスト曝露から悪性腫瘍のないアスベスト曝露を識別することができる。
【００１５】
したがって、アスベスト曝露群の６９例におけるオステオポンチンレベルは、年齢を適合させた対照とは異ならず、また、この群内のオステオポンチンレベルは、職業的な暴露時間および放射線学的異常を反映したものであることが分かった。対照的に、胸膜中皮腫を有する患者からの血清におけるオステオポンチンレベルは、アスベスト曝露群と比較して著しく高かった。暴露履歴のタイプの詳細な文書は、標準化された職業／環境アンケートを使用して完成され、放射線写真のＢ  ｒｅａｄｅｒ解釈によって、曝露期間を含む胸膜中皮腫に対する重要な危険因子によるアスベスト暴露した集団の分類が可能となった。重回帰分析では、暴露期間および放射線学的所見が、血清オステオポンチンレベルに対して最も重要な影響を与え、また、より長い暴露および放射線学的異常が、血清オステオポンチンレベルの上昇と有意に関連していることを明らかにした。胸膜斑ではなく線維症変化が、レベルの上昇と関連していた。オステオポンチンの血清レベルと放射線学的所見によって、治療士または診断医は、胸膜中皮腫に対する危険性に関して、アスベスト曝露した集団を階層化することができる。詳細な監視によって、長い曝露履歴、胸膜斑および線維形成、および血清オステオポンチンレベルの上昇が労働者に示される可能性がある。
【００１６】
本研究の重要な結果は、早期の胸膜中皮腫（ステージＩ）を同定する、オステオポンチンのＥＬＩＳＡ分析の能力である。この所見には、ステージＩの胸膜中皮腫を有する患者の生存に影響することがあるので、即時の臨床応用および産業上の利用可能性がある。さらに、免疫組織化学では、オステオポンチンが、基質ではなく胸膜中皮腫の腫瘍細胞内に存在することが示され、形質転換中皮細胞に対するオステオポンチンの特異度をサポートする。
【００１７】
オステオポンチンは、他のタイプの癌におけるバイオマーカーとして研究されているので、このタンパク質を使用した発見方法は、従来技術において利用可能である。免疫組織化学を用いて、Ｃｏｐｐｏｌａ（Ｃｏｐｐｏｌａ  Ｄ他、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４；１０（１  Ｐｔ  １）：１８４−１９０）は、とりわけ胃、結腸直腸、膵臓、肺、および卵巣の癌腫、および病理学的ステージとの強力な相関を説明している。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｓ他、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４；１０（５）：１５８８−１５９６）は、リアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応によって測定した高組織オステオポンチンレベルが、切除した非小細胞肺癌における生存性の低下と互いに関連することを見出した。膵癌および乳癌の両方で、ＥＬＩＳＡで測定した血清オステオポンチンレベルが、新たな、または進行性の腫瘍を有する患者において上昇した（Ｋｏｏｐｍａｎｎ  Ｊ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ  ２００４；１３（３）：４８７−４９１、Ｍａｒｔｉｎｅｔｔｉ  Ａ他、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００４；１１（４）：７７１−７７９）。
【００１８】
これらのデータは、中皮腫の組織構造に関係なく、血清オステオポンチンレベルを、アスベスト曝露した人々と早期ステージの胸膜中皮腫を有する人々との間で識別することが可能であることを示している。さらに、０．９に近づくＡＵＣ（Ａｒｅａ  Ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  Ｃｕｒｖｅ：曲線下面積）は、オステオポンチンが、卵巣癌に対して、ＣＡ１２５のものと同等な陽性予測力を有することを示している。しかし、オステオポンチンレベルは、胃腸、喉頭、および泌尿器の腫瘍を含む他のタイプの癌においても上昇し、これらの悪性腫瘍は、アスベスト曝露と弱く関連付けられた。オステオポンチンレベルが、中皮腫以外の悪性腫瘍を発病するアスベスト労働者において増加する可能性があるという仮定は、調査中である。それでも、本願明細書に開示されたデータに基づいて、中皮腫を有するとは考えにくい高オステオポンチンレベルを有するアスベスト労働者を調査して、肺の悪性腫瘍を含む他の悪性腫瘍を除外しなければならず、オステオポンチンの上昇は、肺癌に進行するアスベスト関連の傷害に対するマーカーとして機能することができる。
【００１９】
中皮腫に対する有用な分子マーカーであることに加えて、オステオポンチンレベルは、予後的に使用して、治療後の再発の可能性を評価することができる。本願明細書のデータに基づいて、本開示は、患者の中皮種を発見するための、および中皮種を再発する危険性が高い患者を特定するための非侵襲的な方法を提供する。
【００２０】
オステオポンチンは、血液（プラズマ、血清）、リンパ、胸膜滲出、尿、胆汁、母乳、唾液、涙などの体液に分泌されるので、患者におけるオステオポンチンレベルは、非侵襲的手段を使用して発見および観察することができる。体液（好ましくは血液）内のオステオポンチンレベルは、オステオポンチンを同定および数量化することができる、あらゆるタンパク質化学的分析手法または生物検定によって発見することが可能である。これらの方法は、従来技術において既知のものであり、タンパク質分析および／または生物検定法における当業者によって日常的に使用される。好適な方法は、高度選択的な様態でオステオポンチン（またはその変種または断片）と反応する結合剤の使用を伴う。結合剤自体は、レポーター基（例、放射性同位元素、ランタン系列の蛍光発行金属、化学発光または蛍光分子、常磁性の群、または酵素）を含むことが可能である。別様には、好適なレポーター分子を含み、結合剤オステオポンチン複合体を結合することができる検出用試薬を使用することが可能である（例、抗免疫グロブリン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ）。有用な結合剤の例には、抗体、受容体、リガンド、またはキャリア分子が挙げられる。発見は、既知の技術である免疫学的検定法および免疫試薬を使用して行われることが好ましい（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８）。オステオポンチン発見に関連する分析の詳細は、例えば米国特許公報第２００３００４８６２号に開示されている。
【００２１】
抗体という用語は、完全な抗体分子および完全な抗体のタンパク質分解開裂によって生成されるＦａｂおよびＦ（ａｂ’）のような抗原結合性フラグメントを指すことを意図したものである。オステオポンチンの１つ以上のエピトープに対して導かれるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、本願明細書に記述された方法に使用することができる。オステオポンチンに対するポリクローナル抗体は、オステオポンチンによって免疫化された動物の血清から、または市販の供給源から得ることができる。モノクローナル抗体は、周知の方法によって調製することができる（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７、１９７５）。
【００２２】
免疫学的検定法は、溶液中で行われるか、または好ましくは、抗原または抗体を結合することができる固相担体上で行われる。２抗体サンドイッチ型免疫学的検定法では、精製された抗体が固体担体に結合され、その担体は十分な時間、試験液状試料と接触されて、試料内の抗原（すなわち、オステオポンチン）が抗体に結合できるようにする。洗浄して非結合タンパク質を取り除くと、第二の抗体が抗原に結合することができる。この抗体は、レポーター基によって標識化され、固定化抗体によって結合されたエピトープとは異なり、またこれとオーバーラップしない抗原上のエピトープに対して導かれる。洗浄後、固体支持体に結合した標識化された第二の抗体の量を測定する。モノクローナル抗体またはアフィニティー精製したポリクローナル抗体のいずれかを、この分析に使用することができる。分析の検出限界は、一般的に約０．０１乃至０．１ｎｇの抗原である。分析の感度は、好適な標識の選択によって変化させることができる。
【００２３】
本開示の実行に使用する１つの好適な分析は、二次抗体が酵素レポーター基に結合される２抗体サンドイッチタイプ分析（ＥＬＩＳＡ）である。その基質に暴露されたときに、酵素は、分光分析によって、または定量的な分析法（例、蛍光、化学発光、生物発光、リン光を発する、または放射性標識産物）によって発見することができる産物を生成する。好適な酵素には、これに限定されないが、アルカリ性リン酸塩、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カタラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、西洋わさびペルオキシダーゼ、イースト、アルコール脱水素酵素などが挙げられる。
【００２４】
別様には、体液内のオステオポンチンの発見および計量は、抗原捕捉分析を使用して実行することが可能である。前記分析では、亜飽和量の非標識化抗体（ポリクローナル抗体、高親和性モノクローナル抗体、またはプールしたモノクローナル抗体）を固体担体に結合し、タンパク質結合のための部位を、好適なブロッキング緩衝剤（例、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ：リン酸緩衝生理食塩水）に３％のＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ：ウシ血清アルブミン）を溶解したもの）によってブロックし、標識化精製抗原（抗体に結合する直線範囲内で十分な信号を提供するように選択されたもの）を含む液状試料を添加して、抗体に結合することができる。洗浄後、標識化抗原の量を測定する。異なる液状試料における抗原の相対的なレベルは、例えば、各液状試料の段階希釈物を分析して、滴定曲線の中間点を比較することによって測定することができる。試料内の抗原の絶対量は、測定値と、標準曲線内の純粋な非標識化抗原の既知の量を使用して得た値とを比較することによって測定することができる。抗体と、標識化および非標識化オステオポンチンを含む液状試料との間の結合反応は、マイクロタイタプレートにおいて好都合に実行される。別様には、結合は、固定化抗免疫グロブリン抗体または免疫グロブリンに固有のタンパク質（例、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ）を反応混合物と接触させることによって、反応混合物から分離した溶液および複合体において実行することが可能である。
【００２５】
液状試料内の抗原レベルを検出するための別の方法では、液状試料を固体担体に直接結合し、洗浄によって非結合タンパク質を取り除き、その抗原に固有の抗体を添加して結合できるようにする。洗浄によって非結合抗体を取り除いた後に、固体担体に結合した抗体の量を、標識化二次免疫試薬（例、標識化抗免疫グロブリン抗体、タンパク質Ａ、またはタンパク質Ｇ）を使用して測定する。この方法は、試料内で抗原が総タンパク量のごくわずかな割合しか占めていない場合には有用でない。計量のために、試料は、同等量のタンパク質を含まなければならない。一般的に、高タンパク質結合能を有する固体担体（例、ニトロセルロース）が使用され、一次および二次抗体の両方が過度に使用される。ルーチン実験を用いる当業者は、試料内のオステオポンチンの発見に必要である最適な分析条件を決定することができよう。
【００２６】
分析に好適な固相担体は、当業者に既知のものとなろう。前記固相担体には、マイクロタイタウェル、膜、磁気ビーズ、ディスク、ゲル、平板、試験片、ファイバ、および抗原および抗体を担体に付着させることができる他の構成およびタイプの材料が挙げられる。付着は、非共有結合的または共有結合的手段によって行うことができる。付着は、マイクロタイタプレート内のウェルへの、またはニトロセルロースのような膜への抗体または抗原の吸収によって行われることが好ましい。これらの手法は、免疫学の当業者にはよく知られており、また既知の技術である。
【００２７】
本開示の方法によって患者における中皮腫の有無を判断するために、本願明細書に開示された様な方法で発見されるオステオポンチンレベルは、一般的に、中皮腫の存在を、特定の患者集団（例、アスベスト曝露の履歴を有する集団）におけるアスベスト曝露の中皮種ではない後遺症と区別することができる所定の値と比較される。所定の値は、経験的に測定された値、または特定のクラスの腫瘍（例、他の肺腫瘍）を有する患者群への試験測定によって測定された値とすることが可能である。所定の値によって、患者をステージＩ、ステージＩＩ、またはステージＩＩＩの中皮種のうちのいずれかに識別することが可能である。また、所定の値は、ステージＩの中皮種を有する患者に対するスクリーニング、より具体的には、患者に症状が現れる前に使用することも可能である。別様には、所定の値は、ある期間にわたって特定の患者において測定した値に基づくことが可能である。下記の実施例は、血清オステオポンチンレベルに対する所定の値を、中皮種の有無に関わらず、患者において測定することが可能である。当業者は、当該の方法はルーチンであり、他のクラスの腫瘍および血清外の流体による過度の実験を行わずに使用することができ、ヒトおよびヒト以外の哺乳類において有用であると予想されるものと理解されたい。
【００２８】
別の好適な実施態様では、この所定の値は、受信者動作特性曲線を使用して測定される。本方法を使用して、診断検査法の誤った陽性レートおよび誤った陰性レートを考慮するして、最も正確なカットオフ値に達することが可能である。
【００２９】
分析は、膜内に結合剤を固定することによって、フロースルーまたはストリップ試験フォーマットで実行することができる。フロースルー試験では、試料は、結合剤を有する試料複合材に含まれる膜およびオステオポンチンを通過する。第二の標識化結合剤を含む溶液は膜を通過し、複合物に結合する検出試薬の量が測定される。ストリップ試験では、固定化結合剤を含む膜が、患者から得た液状試料に浸漬される。試料は、膜に沿って、第二の固定化結合剤を含む領域を通って、固定化結合剤を含む領域に移動する。固定化結合剤の量は、試料が特定のレベルのオステオポンチンを含むときに、視覚的に検出可能なパターンを発生させるように選択される。抗体および抗原結合性フラグメントは、当該の分析に好適であり、その量は、２５ｎｇ乃至約１ｕｇが好ましく、約５０ｎｇ乃至５００ｎｇがより好ましい。当該の試験には、ごくわずかな量の患者試料しか必要としない。有用な方法の具体例は、米国特許第５，５１８，８６９号および第５，７１２，１７２号に見られる。
【００３０】
自然発生的な核酸を含む核酸、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびオステオポンチンを符号化する核酸にハイブリッド化する合成オリゴヌクレオチドも、中皮腫患者の生物学的試料（例、体液）内のオステオポンチンの存在を発見する薬剤として有用である。ヒトオステオポンチン遺伝子の配列は、他者によって開示されている。本発明は、オステオポンチンの符号化配列およびその相補配列に対応する核酸配列の使用を含み、また、中皮種を発症する危険性の高い患者から得られたヒトの喀痰、気管支洗浄液、血液、または血清のような、ヒト対象患者から得られた生物学的試料におけるオステオポンチンの発現を発見するための薬剤としての使用に対して、符号化配列（例えば、５’および３’非翻訳領域に含まれるか、またはこれに延びる配列）からさらに上流または下流に生じる、オステオポンチン転写配列と相補的な配列も含む。
【００３１】
オステオポンチンの存在を発見するための好適なオリゴヌクレオチドは、オステオポンチンを符合化するｃＤＮＡ配列の少なくとも一部と相補的なものである。これらの相補配列も、「アンチセンス」配列として既知の技術である。これらのオリゴヌクレオチドは、オリゴリボヌクレオチドまたはオリゴデオキシリボヌクレオチドとすることが可能である。加えて、オリゴヌクレオチドは、生物学的に有意なヌクレオチド、すなわち、Ａ（アデニン）、ｄＡ（デオキシアデニン）、Ｇ（グアニン）、ｄＧ（デオキシグアニン）、Ｃ（シトシン）、ｄＣ（デオキシシトシン）、Ｔ（チミン）、およびＵ（ウラシル）とすること、または、例えばメチル基または硫黄原子をインターヌクレオチドリン酸ジエステル結合内のリン酸酸素の代用にする修飾オリゴヌクレオチド種とすることが可能である。加えて、これらのヌクレオチド自体、および／またはリボース部分を修飾することが可能である。
【００３２】
オリゴヌクレオチドは、従来技術によく記述されている既知の化学的オリゴヌクレオチド合成方法のうちのいずれかを使用して、化学的に合成することが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドは、市販の自動核酸合成装置のうちのいずれかを使用して調製される。別様には、オリゴヌクレオチドは、例えば非翻訳ストランドの転写を誘導する標準組み換えＤＮＡ手法によって作り出すことが可能である。オステオポンチンを符合化するＤＮＡ配列は、組み換えＤＮＡシステムにおいて反転することが可能であり、例えば、非翻訳ストランドが転写されるように、好適なプロモータの下流に逆方向に挿入される。
【００３３】
あらゆる長さのオリゴヌクレオチドを使用して、オステオポンチンを符合化する核酸ににハイブリッド化することが可能であるが、一般的に、８乃至１００のヌクレオチドの範囲内のオリゴヌクレオチドが好ましい。尿試料におけるオステオポンチンの発見に使用するオリゴヌクレオチドは、１５乃至５０のヌクレオチドの範囲内のものが最も好ましい。
【００３４】
化学的に合成されるか、組み換えＤＮＡ技術によるかに関わらず、オステオポンチン核酸ににハイブリッド化するために選択されたオリゴヌクレオチドは、次いで、標準的な手法を使用して分離および精製され、次いで、好ましくは、標準的な標識化プロトコルを使用して（例、３５Ｓまたは３２Ｐに）標識化される。
【００３５】
本発明は、生物学的流体におけるオステオポンチンの発現の発見に対して定性的、半定量的、または非定量的である、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）におけるオリゴヌクレオチド対の使用も含む。オリゴヌクレオチド対は、オステオポンチンプライマおよび逆オステオポンチンプライマから構成される。
【００３６】
患者の生物学的流体の試料におけるオステオポンチンの存在は、これに限定されないが、ノーザンブロット分析、ドットブロット法、マイクロアレイハイブリダイゼーション、サザンブロット分析、蛍光インシトゥハイブリダイゼーション法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＦＩＳＨ）、およびＰＣＲなどの、核酸ハイブリダイゼーションによって測定することができる。クロマトグラフィ、好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および他の既知の分析法を使用して、試料内のオステオポンチンのメッセンジャーＲＮＡレベルを測定することも可能である。
【００３７】
オステオポンチンＤＮＡは、考えられるところでは、調査中の流体に流されたか、または放出されたオステオポンチン陽性の癌細胞の内部の生物学的流体内に見出すことが可能である。
【００３８】
一側面では、本発明は、患者の生物学的流体内のオステオポンチンを発見するための薬剤として拡散を使用することを考慮する。なお、核酸は標識化されている。核剤は、放射性標識、蛍光標識、酵素、化学発光タグ、比色タグ、または上述の、または従来技術において既知の他の標識またはタグで標識化することが可能である。
【００３９】
別の側面では、本発明は、体液の試料内のオステオポンチンｍＲＮＡの存在を発見するために、ノーザンプロット法の使用を考慮する。分析の第一のステップは、ゲル電気泳動によって、オステオポンチン核酸を含む試料を分離するステップを伴う。分散した核酸は、次いで、ニトロセルロースフィルタまたは別のフィルタに転写される。続いて、標識化オリゴヌクレオチドは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｍａｎｉａｔｉｓ他（１９８２、ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に記述されているように、好適なハイブリッド化条件（例、５０％のホルムアミド、５Ｘ  ＳＳＰＥ、２Ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、４２℃で０．１％のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ：ドデシル硫酸ナトリウム））の下でフィルタに曝露される。従来技術において既知の他の有用な手順には、溶液ハイブリダイゼーション、ドットおよびＲＮＡハイブリダイゼーション、およびプローブベースのマイクロアレイが挙げられる。従来技術において既知の標準的な手順を用いてハイブリッド化した断片の放射能を測定することで、患者の生物学的流体内に存在するオステオポンチン核酸の量を数量化する。
【００４０】
ドットブロット法は、対象となる核酸を含む試料を膜に適用するステップを伴う。核酸は、膜への適用前か後に変性させることができる。膜は、標識プローブで培養される。ドットブロット手順は、当業者には既知のものであり、米国特許第４，５８２，７８９号および第４，６１７，２６１号に詳細に記述されており、これらの開示は参照することにより本願明細書に組み込まれる。
【００４１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、重合のためのプライマおよび薬剤を使用して核酸内に存在する１つ以上の特定の核酸配列を増幅し、次いで増幅配列を発見するためのプロセスである。他のものにハイブリッド化したときに、１つのプライマの拡張産物は、所望の特定の核酸配列を生成するためのテンプレートとなり、また逆も同じである。このプロセスは、所望の量の配列を生成するに必要なだけ繰り返される。
【００４２】
当業者が所望の配列を発見するために通常行っているＰＣＲの具体例は、逆転写ＰＣＲである。ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ＰＣＲ：逆転写ＰＣＲ）は、総ＲＮＡを生物学的流体から分離するステップと、所望の核酸配列を認識するプライマの存在下でＲＮＡを変性させるステップと、逆転写によってＲＮＡのｃＤＮＡコピーを発生させるようにプライマを使用するステップと、特定のプライマを使用したＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅するステップと、電気泳動または当業者が既知の他の方法によって増幅ｃＤＮＡを発見するステップとを伴う。生物学的試料内のオステオポンチン核酸を検出する他の好適な方法には、ノーザンブロット分析、ドットブロット法、サザンブロット分析、ＦＩＳＨ、およびＰＣＲが挙げられる。
【００４３】
上述の説明は、単なる例示に過ぎず、いずれにせよ本開示の範囲の限定を意図するものではない。当業者は、オステオポンチン、その断片、および変種の測定での使用に好適な他のタイプの分析法を認識されよう。
【００４４】
本開示の方法は、患者の中皮腫の治療に対する反応の観察、および治療後の再発の危険性の予測にも有用である。本願明細書に記述された非侵襲性の発明的方法を用いることで、オステオポンチンレベルは、中皮腫が、最初に種々の治療ステージを通じて患者において診断され、次いで治療後の再発の可能性を評価する期間から得ることができる。さらに、中皮種を有する患者におけるオステオポンチンレベルは、これらの患者における有用な予後指標である。
【００４５】
本開示は、すでに発見した、または発見段階にある癌の診断、予後、および治療のための、例えば、これに限定されないが、ＰＡＩ−１、ｕＰＡ、ｕＰＡＲ、ＴＦ，ＶＥＧＦ、アドレノメデュリン、形質転換成長因子−α、溶解性のメソシリン関連ぺプチド（Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏ：ＳＭＲＰ）、ＣＡ−１２５、ＣＹＦＲＡ、および他の遺伝子産物のような、他の選択された癌関連タンパク質と組み合わせたオステオポンチン測定の使用も包含する。この点に関しては、他の手法を使用することができるが、マイクロアレイ技術が好都合な手法である。
【００４６】
本願明細書の診断および予後の方法は、単独で使用するか、またはアスベスト関連の腫瘍を発見する他の方法と組み合わせて使用することが可能である。いくつかの実施態様では、オステオポンチンの発見に使用した化合物は、他のアスベスト関連の腫瘍の発見に使用される化合物と組み合わせることができ、例えば、１つのコンテナまたは検出面に一緒にしたキットの形態とするか、または別々に提供される。例えば、米国特許第４，５６９，７８８号では、非小細胞肺癌を発見するためのモノクローナル抗体を開示しており、米国特許第６，９０２，８９０号では、肺癌を発見するための方法および組成物を開示している。当該の方法および組成物は、対象患者が肺の中皮腫または別の腫瘍を有するかどうかを判断するために、本方法に関連して使用することもできる。これらの方法および組成物は、患者の化学療法に対する反応の観察、および中皮種を含むアスベスト関連の腫瘍の他の治療にも使用される。
【００４７】
本開示は、ヒト患者における中皮腫を評価する方法も包含し、本方法は、胸膜液内のオステオポンチンを評価するステップを含み、それによって、胸膜液内の高レベルのオステオポンチンは、患者が中皮種を患っている標識となる。胸膜液は、胸膜浸出液、胸膜漏出液、胸膜洗浄液、胸膜吸引物、およびそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。胸膜液は、胸膜滲出を患っている患者から、または胸膜滲出を呈する疑いのある患者から採集することが可能である。胸膜液は、例えば従来技術において既知の方法を使用して、患者から胸腔穿刺によって採集することができる。
【００４８】
別の側面では、本開示は、従来技術において既知の、中皮腫の動物の腫瘍モデルの体液におけるオステオポンチンレベルの測定に基づいて、中皮腫関連の治療に対するスクリーニングを包含する。
【００４９】
本開示は、中皮腫を有する患者からの液状試料におけるオステオポンチンレベルを発見するための少なくとも１つの結合剤（および、状況に応じて、検出用薬剤）と、前記レベルを１つまたは複数の所定の値と比較するための較正手段とを含む、本開示の実行に使用するキットを含む。
【００５０】
本願明細書に記述された開示の側面は、ヒトおよび獣医薬における使用を対象とするものである。
【００５１】
以下の実施例は、例証のためだけに示されるものであり、特許請求の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００５２】
実施例１
患者集団
アスベスト曝露群
血清は、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｒｏｙａｌ  Ｏａｋ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）、２００４年７月−２００４年９月において、石綿肺症と一致するアスベスト曝露および／または放射線学的変化の履歴を有する６９例から、書面によるインフォームドコンセントを行った後に得たものである。このコホートのエントリ基準は、Ｃｕｌｌｅｎ（Ｃｕｌｌｅｎ  ＭＲ、Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  ２００５；１６１（３）：２６０−２７０）によって記述されたものに類似したものである。アスベスト曝露およびその期間は、ＡＴＳ−Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｕｎｇ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ＤＬＤ）−７８  Ａｄｕｌｔ  ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（Ｆｅｒｒｉｓ  ＢＧ．  Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ  １９７８；１１８（６  Ｐｔ  ２）：１−１２０）を用いて文書化した。
【００５３】
対象患者は、アスベスト関連の疾患の危険性が高いことが文書化されている、既定の常習的なアスベスト曝露を伴う作業（断熱材、板金作業、配管、石膏版施工、船舶の組立、船舶の電気工事、ボイラー製作、または船舶のスケーリングを含む）に従事していた者（Ｓｅｌｉｋｏｆｆ  ＩＪ他、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  ｃｌｉｎ  １９８４；３４（１）：４８−５６）か、またはあらゆる職務または職業における職業的なアスベスト曝露（ＡＴＳ−Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｕｎｇ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ＤＬＤ）−７８  Ａｄｕｌｔ  ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅによって特定される）を経験し、非悪性アスベスト関連の疾患の診断と一致する放射線学的変化の徴候のあった者である。これらの放射線学的所見には、両側の肺の胸膜面上の増粘性または線維形成斑として、および／または両側の肺に小さく不規則な陰影が認められるびまん性肺の瘢痕化として定義される良性の胸膜疾患を含んだ。
【００５４】
各対象患者は、単純な胸部放射線撮影を行い、国際労働事務所（ＩＬＯ）の分類体系を用いて、塵肺に対する胸部放射線写真の分類に熟達した１人の経験のある放射線科医（米国立労働安全衛生研究所、「Ｂ−ｒｅａｄｅｒ」）によって判断された。Ｂ−ｒｅａｄｅｒは、特に、斑および肺線維形成を含む、胸膜変化の有無についてコメントした。肺線維形成は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｓ  ｏｆ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｎｉｏｓｅｓ（ＩＬＯのウェブサイトより入手可能）を用いて判断された。この１２ポイントシステムでは、異常部位（０／−乃至３／＋）のサイズおよび数によって線維形成を分類し、示度が１／０以上のものだけを石綿肺症に分類した。
【００５５】
未曝露であるが類似した集団における血清オステオポンチンレベルを文書化するために、化学予防試験のエントリ基準として、４５例の現在（２５例）または以前の喫煙者から、インフォームドコンセントを行った後に血清を採集した。全てのこれらの対象患者（３３歳乃至７４歳）に関する職業歴を記録して、既知のアスベストへの曝露がないことを文書化した。全てのこれらの対象患者は、胸部放射線写真で正常であった。
【００５６】
アスベスト曝露群の６９例の対象患者のうち、５７例（８３％）は５年以上にわたってアスベスト関連の職業での曝露があり、７例（１０％）はそのような曝露が５年未満であり、５例（７％）は、インタビューによる文書化は行われなかったが、アスベスト曝露に一致する放射線学的異常を有した。アスベスト曝露を有する６４例の関係者の職業は、次の通りであった。鋳造労働者（１１）、配管工（７）、建築および製造（７）、製造または家族によるパッシブ曝露（６）、ブレーキアセンブリ／修理（５）、ボイラ修理（４）、バーミキュライト断熱材曝露（４）、グラインダ機械工（３）、配管工（３）、工具およびダイ業界（２）、船舶建造者（２）、機械装置組立工（２）、消防士（２）、レンガ製造者（２）、電気技師（２）、およびアスベスト除去者（２）。線維形成の放射線学的徴候は６９例中２３例（３３％）に見られ、胸膜斑は６９例中５０例（７３％）に見られた。５乃至３７年の曝露経験を持つ６例の関係者には放射線学的異常が無く、５３例には斑または線維形成のいずれかがあり、１０例には斑と線維形成の両方が見られた。
【００５７】
胸膜中皮腫
血清は、腫瘍縮小手術の前に、Ｗａｙｎｅ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｄ１４２０）の承認の下で、７６例から、書面によるインフォームドコンセントを行った後に得たものである。最も古い血清は分析の７７ヵ月前に得たものであり、最も新しいものは３ヶ月前に得たものである。アスベスト曝露は、中皮腫患者の７６例中５９例（７８％）において職業ごとに文書化した。全ての患者は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ  Ｉｎｔｅｒｓｔ  Ｇｒｏｕｐ（ＩＭＩＧ）のステージングシステム（Ｒｕｓｃｈ  ＶＷ．  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９６；１４（１）：１−１２）に基づいた外科的ステージングを完了し（ステージＩ−１３、ＩＩ−２０、ＩＩＩ−４３）、その後、死亡するまで３乃至４ヶ月ごとに胸部のコンピュータ断層撮影を行った。腫瘍は、上皮性（５０例）、肉腫様（４例）、または混合性（２２例）に分類した。表１は、アスベスト曝露および中皮腫群の特性をリストしたものである。
【００５８】
【化１】
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統計分析
Ｋａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒのサバイバルプロットおよびログランク検定を用いて、胸膜中皮腫患者に対する生存性の差異を評価した。アスベスト関連の群から胸膜中皮腫群を区別する血清オステオポンチンレベルの能力は記述統計、および受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線（Ｍｅｔｓ  ＣＥ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  １９７８；８（４）：２８３−２９８、Ｚｗｅｉｇ  ＭＨ他、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  １９９３；３９（４）：５６１−５７７）によって評価した。ＲＯＣ曲線下面積（ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ：ＡＵＣ）を計算し、９５％信頼区間を使用して、理論的領域が０．５であることを前提に試験を行った。信頼区間が０．５という値を含まなかったＡＵＣは、検査が中皮腫と石綿肺症とを区別する何らかの能力を有する証拠とみなされた（Ｚｗｅｉｇ  ＭＨ他、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  １９９３；３９（４）：５６１−５７７、Ｈａｎｌｅｙ  ＪＡ他、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  １９８２；１４３（１）：２９−３６）。群同士の差異は、ＡＮＯＶＡ（ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ：分散分析）を使用して、モデルにおいてｐ＜０．０５である値のみを入力する段階的形態で、重回帰分析によって算出した。全ての統計分析は、ＭｅｄＣａｌｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社（Ｍａｒｉａｋｅｒｋｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して行った。
【００５９】
実施例２
胸膜中皮腫のステージごとの生存性
本研究において中皮腫患者が他の一連の研究と類似した結果であったかどうかを判断するために、ＩＭＩＧのステージング状態に基づいた進行曲線に対する生存性および期間を生成した。図１は、以下のステージに基づいた生存および進行の有意差を示す図である。（Ａ）１３例のステージＩ、２０例のステージＩＩ、および４０例のステージＩＩＩの患者はそれぞれ３２、１９、および１３ヶ月であり、ログランク検定ｐ＝０．００６であった。（Ｂ）１３例のステージＩ、２０例のステージＩＩ、および４０例のステージＩＩＩの患者の進行までの期間の中央値は、それぞれ２３、１４、および７ヶ月であり、ログランク検定ｐ＜０．００１であった。これらの結果は、ＩＭＩＧステージングシステムを使用した他の研究のものと一致する（Ｐａｓｓ  ＨＩ他、Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  １９８８；１１５（２）：３１０−３１７、Ｒｕｓｃｈ  ＶＷ他、Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ  １９９９；６８（５）：１７９９−１８０４、Ｒｕｓｃｈ  ＶＷ他、Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  １９９６；１１１（４）：８１５−８２５）。
【００６０】
実施例３
免疫組織化学
免疫組織化学は、多組織胸膜中皮腫アレイに行い、切除された腫瘍および正常組織対照の２ｍｍの代表領域で構成された。血清オステオポンチンに対して研究した７６例のうち３８例の胸膜腫瘍を、アレイ上で観測した。他の３８例は、アレイ構成時に利用できなかった。免疫組織化学は、標準のＡＢＣ手法を使用して行った。一次抗体、モノクローナルの抗オステオポンチン抗体（クローンＯＰ３Ｎ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を、室温で９０分間、１：１５０に希釈してアレイに適用した。二次抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を、室温で３０分間、１：２００に希釈して適用した。陽性対照および陰性対照（二次抗体を取り除くことによって得られる）を各適用時に含めた。症例は、陽性腫瘍細胞の（１）強度（Ｉ）（スケール１乃至３）、および（２）程度（Ｅ）に対して別々に記録した（１・１０％、２＝・１０乃至・５０％、３＝・５０％）。
【００６１】
オステオポンチン染色に利用可能な腫瘍組織（７６例の中皮腫のうちの３８例）のうち、３８例中３６例がオステオポンチンに対して陽性であった（図２）。それらは、５０％の腫瘍細胞内に細胞質の染色を示し、染色強度は１乃至３（１３＝１、８＝２、１５＝３）であった。オステオポンチンは、全て胸膜中皮腫の変種と思われる（上皮１９例／２０例、二相性１５例／１６例、および肉腫様２例／例２）。肺実質および隣接した通常の胸膜は、陰性であった。腫瘍関連の基質内の線維芽細胞は、まれに弱陽性であった。血管の媒体および内膜は、弱陽性を示した。図２Ａでは、倍率はＸ１００である。図２Ｂでは、倍率はＸ４００である。
【００６２】
実施例４
オステオポンチンに対するＥＬＩＳＡ分析
オステオポンチンのＥＬＩＳＡに関しては、ヒトオステオポンチン分析キット（ＩＢＬ社、群馬、日本）を使用して血清オステオポンチンのレベルを測定した。全ての試料を符号化した。各標本は、繰り返して試験を行い、その結果は標準曲線を使用してｎｇ／ｍｌで数量化した。
【００６３】
アスベスト曝露および未曝露群
アスベスト曝露群全体におけるオステオポンチンの平均血清レベルは、３０±３ｎｇ／ｍｌであった（範囲２乃至２２１ｎｇ／ｍｌ、９５％信頼区間（ＣＩ）＝２３．１乃至３６．１ｎｇ／ｍｌ）。放射線写真で正常であった年齢を適合させた未曝露の対照におけるレベルは、アスベスト曝露群に対して測定したものとは異ならなかった（年齢＜５０：それぞれ１２±５ｎｇ／ｍｌ対２５±１１ｎｇ／ｍｌ、９５％ＣＩの差異＝−１６乃至４１ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．３４、年齢５０乃至６０：それぞれ１９±６ｎｇ／ｍｌ対２４±５ｎｇ／ｍｌ、９５％ＣＩの差異＝−１２乃至２２ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．５６、年齢＞６０：それぞれ２４±５ｎｇ／ｍｌ対３２±４ｎｇ／ｍｌ、９５％ＣＩの差異＝−２３乃至７ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．３４、図３Ａ）。アスベスト曝露したコホートに関しては、性別または胸膜斑の有無によるオステオポンチンレベルの有意差は無かった（それぞれｐ＝０．１９、ｐ＝０．８８；図３ＢおよびＤ）。
【００６４】
肺線維形成を有するサブグループは、線維形成の無いサブグループよりも著しく高いオステオポンチンの平均レベルを有した（それぞれ４３ｎｇ／ｍｌ対２３ｎｇ／ｍｌ、９５％ＣＩの差異＝７乃至３３ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．００４）。平均レベルは、１０年以上の曝露したものにおいて著しく高かった（それぞれ３４ｎｇ／ｍｌ対１６ｎｇ／ｍｌ、９５％ＣＩの差異＝４乃至３３ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０１５、図３Ｃ）。最も高いレベルの血清オステオポンチンは、斑および線維形成のどちらも有する対象患者において見られた（５６±１３ｎｇ／ｍｌ）。
【００６５】
年齢を適合させた未曝露の対照（年齢６４±３歳）に対する血清オステオポンチンレベルを、斑および線維形成を有するアスベスト曝露した対象患者（年齢６４±３歳）と比較したところ、オステオポンチンレベルにおける有意差が示された（１４±６ｎｇ／ｍｌ対５６±１３ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０３）。胸部放射線写真で正常であったアスベスト曝露した対象患者（２１±５ｎｇ／ｍｌ）、斑（２３±３ｎｇ／ｍｌ）を有する対象患者、または線維形成（３２±７ｎｇ／ｍｌ）を有する対象患者も、斑および線維形成を有する対象患者よりも著しく低いオステオポンチンレベルを有した（ｐ＝０．００４）。年齢、アスベスト曝露期間、線維形成の存在、斑の存在、および国際労働機関の放射線撮影スコアを含む、複数の回帰分析を行った。アスベスト曝露期間（ｐ＝０．００１）および放射線撮影スコア（ｐ＜０．００１）だけは、それぞれ０．３５７および０．３９９のゼロ次相関係数によって、オステオポンチンレベルに単独で関連付けた。
【００６６】
胸膜中皮腫
中皮腫群における平均血清オステオポンチンレベル（１３３±１０ｎｇ／ｍｌ（範囲６乃至３８５ｎｇ／ｍｌ、９５％信頼区間１１３乃至１５４ｎｇ／ｍｌ））は、アスベスト曝露群の平均値（３０±３ｎｇ／ｍｌ、範囲２乃至２２１ｎｇ／ｍｌ、９５％ＣＩ＝２３．１乃至３６．１ｎｇ／ｍｌ、ｐ＜０．００１）と著しく異なった。ステージＩ中皮腫（１４７±２６ｎｇ／ｍｌ、範囲１０乃至３４１ｎｇ／ｍｌ、９５％ＣＩ＝９２乃至２０４ｎｇ／ｍｌ）、ステージＩＩ中皮腫（１５８±２２ｎｇ／ｍｌ、範囲１４乃至３８５ｎｇ／ｍｌ、９５％ＣＩ＝９９乃至２１６ｎｇ／ｍｌ）、またはステージＩＩＩ中皮腫（１１８±１２ｎｇ／ｍｌ、範囲４乃至３０２ｎｇ／ｍｌ、９５％ＣＩ＝８３乃至１４５ｎｇ／ｍｌ）において、平均オステオポンチンレベルには有意差はなかった（ｐ＝０．１５、ステージＩＩ対ステージＩＩＩ）。しかし、全てのこれらのステージにおける平均値は、アスベスト曝露群の平均値（３０±３ｎｇ／ｍｌ、範囲２乃至２２１ｎｇ／ｍｌ、９５％ＣＩ＝２３．１乃至３６．１ｎｇ／ｍｌ、ｐ＜０．００１）とは著しく異なった。さらに、斑および線維形成を有するアスベスト曝露した対象患者の血清オステオポンチンレベルを、胸膜中皮腫群によるレベルと比較した場合、そのレベルは著しく異なった（それぞれ５６±１３ｎｇ／ｍｌ対１３３±１０ｎｇ／ｍｌ、９５％ＣＩの差異＝４９乃至１１４ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０００１）。平均オステオポンチンレベルは、中皮腫を有する男性および女性において類似しており（それぞれ１３６±１２ｎｇ／ｍｌ対１２５±２１ｎｇ／ｍｌ、９５％ＣＩの差異＝−６１乃至３９ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．６５７５）、腫瘍の組織構造による変化（上皮１２８±１３ｎｇ／ｍｌ対、非上皮１３３±１８ｎｇ／ｍｌ、９５％ＣＩの差異＝−２８乃至５９ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．４９）、またはアスベスト曝露履歴（曝露有１５１±２４ｎｇ／ｍｌ対、曝露無１２８±１２ｎｇ／ｍｌ、９５％ＣＩの差異＝−７３乃至２８ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．３７）による変化は無かった。
【００６７】
実施例５
受信者動作特性曲線
アスベスト曝露した対象患者を、膜中皮腫患者と比較するＲＯＣ分析で、０．８８８の曲線下面積（ＡＵＣ）であった（９５％ＣＩ＝０．８２５乃至０．９３４）（図４）。
【００６８】
図４の６つのパネルは次の通りである。（Ａ）中皮種の全７６例対アスベスト曝露の６９例、曲線下面積（ＡＵＣ）＝０．８８８。（Ｂ）１０．９ｎｇ／ｍｌのカットオフレベルでの中皮腫の早期発見に対する高感度。（Ｃ）総分類誤差を最小化するためのカットオフ、レベル＞４８．４ｎｇ／ｍｌ。（Ｄ）ステージＩの中皮種対アスベスト曝露した対象患者（ＡＵＣ＝０．９０６）。（Ｅ）９．５ｎｇ／ｍｌのカットオフレベルでのステージＩの中皮種の早期発見対アスベスト曝露した対象患者に対する高感度。（Ｆ）ステージＩ対アスベスト曝露の総分類誤差を最小化するためのカットオフ、レベル＞６２．４ｎｇ／ｍｌ。
【００６９】
サブグループ分析では、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩ／ＩＩ、およびステージＩＩＩの胸膜中皮腫に対するＡＵＣを明らかにし、アスベスト対照と比較して、それぞれ０．９０６、０．９２５、０．９１７、および０．８６５であった。４８．４ｎｇ／ｍｌのカットオフ（７８％および８７％の感度および特異度）は、中皮腫の無いアスベスト曝露したコホートからの中皮腫の確認に対して最も高い精度（最小の偽陰性および偽陽性）であった。スクリーニングのために、すなわち、中皮種の早期発見のために、最高（９５乃至９９％）の感度を有するカットオフは、特異度に関わらず最も適切であると考えられ、１０．９ｎｇ／ｍｌのカットオフでは、オステオポンチンレベルに対する感度は９６．１％、特異度は２３．２％であった。ステージＩの疾患だけに対するスクリーニングであれば、９．５ｎｇ／ｍｌのカットオフによって１００％の感度、２０．３％の特異度となる。なお、ステージＩの中皮種（８４．６％の感度および８８．４％の特異度）の発見に対する最も正確なカットオフは６２．４ｎｇ／ｍｌのものであった。
【００７０】
全ての引用文献は、参照することによりその全体が本願明細書に組み込まれる。本発明を完全に説明したが、当業者は、本発明またはそのあらゆる実施態様の趣旨および範囲に影響を与えることなく、条件、パラメータなどの広範かつ同等な範囲内で本発明を実行することが可能であるものと理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、７６の中皮種の試験セットに対する自然な成長のバリデーションを示すグラフである。図１Ａは、ステージＩ（実線）、ステージＩＩ（長い破線）、ステージＩＩＩ（短い破線）の患者の生存期間の中央値を示す図である。図１Ｂは、ステージＩ（実線）、ステージＩＩ（長い破線）、ステージＩＩＩ（短い破線）の患者に対する進行までの時間の中央値を示す図である。
【図２】図２Ａは、１００倍に拡大した胸膜中皮腫内のオステオポンチン免疫組織化学を示す写真である。図２Ｂは、４００倍に拡大した胸膜中皮腫内のオステオポンチン免疫組織化学を示す写真である。
【図３Ａ】図３Ａ乃至３Ｄは、アスベストの血清オステオポンチンレベルへの影響の人口統計を示す棒グラフである。図３Ａは、アスベスト曝露した対象患者（Ｅ）年齢（ｙ）が５０歳以下、５０歳を超え６０歳未満、または６０歳以上の対象患者に年齢を適合させた対照（Ｕ）におけるオステオポンチンレベルを示す図である。
【図３Ｂ】図３Ａ乃至３Ｄは、アスベストの血清オステオポンチンレベルへの影響の人口統計を示す棒グラフである。図３Ｂは、アスベスト曝露した対象患者および年齢を適合させた対照におけるオステオポンチンレベルを性別（女性：Ｆ、男性：Ｍ）によって示す図である。
【図３Ｃ】図３Ａ乃至３Ｄは、アスベストの血清オステオポンチンレベルへの影響の人口統計を示す棒グラフである。図３Ｃは、アスベスト曝露の年数（ｙ）によるオステオポンチンのレベルを示す図である。
【図３Ｄ】図３Ａ乃至３Ｄは、アスベストの血清オステオポンチンレベルへの影響の人口統計を示す棒グラフである。図３Ｄは、オステオポンチンレベルに関する放射線学的異常の程度を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａ乃至Ｆは、中皮腫対アスベスト曝露した集団のＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ：受信者動作特性）曲線を示すグラフである。図４Ａは、７６例の中皮種対６９例のアスベスト曝露の全てを示す図である。
【図４Ｂ】図４Ａ乃至Ｆは、中皮腫対アスベスト曝露した集団のＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ：受信者動作特性）曲線を示すグラフである。図４Ｂは、１０．９ｎｇ／ｍｌのカットオフレベルでの中皮腫の早期発見に対する高感度を示す図である。
【図４Ｃ】図４Ａ乃至Ｆは、中皮腫対アスベスト曝露した集団のＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ：受信者動作特性）曲線を示すグラフである。図４Ｃは、総分類誤差を最小化するためのカットオフを示す図である。
【図４Ｄ】図４Ａ乃至Ｆは、中皮腫対アスベスト曝露した集団のＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ：受信者動作特性）曲線を示すグラフである。図４Ｄは、ステージＩの中皮種対アスベスト曝露した対象患者を示す図である。
【図４Ｅ】図４Ａ乃至Ｆは、中皮腫対アスベスト曝露した集団のＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ：受信者動作特性）曲線を示すグラフである。図４Ｅは、９．５ｎｇ／ｍｌのカットオフレベルでのステージＩの中皮種の早期発見対アスベスト曝露した対象患者に対する高感度を示す図である。
【図４Ｆ】図４Ａ乃至Ｆは、中皮腫対アスベスト曝露した集団のＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ：受信者動作特性）曲線を示すグラフである。図４Ｆは、ステージＩ対アスベスト曝露の総分類誤差を最小化するためのカットオフを示す図である。
【図１】
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【図４Ａ】
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【図４Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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