(57)【要約】本発明は糖吸収調節剤、これを含む薬学的組成物及び前記組成物の有効量を哺乳類に投与して哺乳類の糖尿病または糖尿病合併症を治療する方法に関するものである。【選択図】図１Ａ
2009500401.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リソフォスファチジルコリン（ＬＰＣ）、リゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ）、リソホスファチジン酸（ＬＰＡ）及びウロコルチン（ＵＣＮ）からなる群の中から選択されたいずれかの化合物を含むことを特徴とする糖吸収調節剤。
【請求項２】
ＬＰＣに対する糖吸収調節はＰＫＣδ抑制剤であるロットレリン及びＰＫＣδの優性陰性的発現によって阻害され、ＰＩ３−キナーゼ依存型信号伝達経路に独立的であることを特徴とする、請求項１に記載の糖吸収調節剤。
【請求項３】
前記リソフォスファチジルコリンはミリストイルＬＰＣまたはパルミトイルＬＰＣであることを特徴とする、請求項１に記載の糖吸収調節剤。
【請求項４】
ウロコルチンはインシュリンと共にインシュリン−敏感化剤として作用することを特徴とする、請求項１に記載の糖吸収調節剤。
【請求項５】
リソフォスファチジルコリン、リゾホスファチジルセリン、リソホスファチジン酸及びウロコルチンからなる群の中で選択された少なくともいずれか１つの糖吸収調節剤を含むことを特徴とする薬学的組成物。
【請求項６】
薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤をさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
インシュリン分泌強化剤、ビグアナイド剤及びα−グルコシダーゼ抑制剤からなる群の中で選択された少なくともいずれか１つの化合物をさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記糖吸収調節剤はインシュリンと混合して使用されることを特徴とする請求項５に記載の、薬学的組成物。
【請求項９】
リソフォスファチジルコリン、リゾホスファチジルセリン、リソホスファチジン酸及びウロコルチンからなる群の中で選択されたいずれか１つの糖吸収調節剤を有効量で哺乳類に投与することを含む哺乳類の糖尿病または糖尿病合併症の治療方法。
【請求項１０】
前記糖尿病はインシュリン−依存型糖尿病またはインシュリン−非依存型糖尿病であることを特徴とする、請求項９に記載の治療方法。
【請求項１１】
前記糖尿病合併症は肥満、高脂血症、動脈硬化症、高血圧または心臓病であることを特徴とする、請求項１０に記載の治療方法。
【請求項１２】
インシュリン分泌強化剤、ビグアナイド剤及びα−グルコシダーゼ抑制剤からなる群の中で選択された少なくともいずれか１つの化合物を混合して製造された糖吸収調節剤を有効量で哺乳類に投与することをさらに含むことを特徴とする、請求項１１に記載の治療方法。
【請求項１３】
前記ウロコルチンはインシュリンと混合して投与されることを特徴とする、請求項９に記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖吸収調節剤、これを含む薬学的組成物及び前記組成物の有効量を哺乳類に投与して哺乳類の糖尿病または糖尿病合併症を治療する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
インシュリンに共に多様なホルモンまたは生理学的因子は糖吸収を促進することができる。例えば、運動はインシュリンに独立的な経路を通じて骨格筋に糖吸収を誘導し、α１−アドレナリンまたはアンドセリンＡ受容体もインシュリンと独立的な経路を通じて糖吸収率を増加させる。このような物質代謝反応に関与する信号伝達メカニズムのうちの一部はインシュリンのそれと類似しているが、大部分はインシュリンのそれと相異している。例えば、ペルオキシソーム増殖体活性化受容体γ作用剤（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ γ ａｇｏｎｉｓｔ）であるアラキドン酸で処理された脂肪細胞では糖吸収の促進が発生するが、これは特異的なでインシュリンと独立的な信号伝達メカニズムと関連されている。
【０００３】
数年間脂肪組織は身体の全般的脂質及びエネルギー恒常性に重要な役割を果たしてきた。身体内の循環から超過した糖の除去を通じて脂肪組織及び筋肉組織内に糖輸送が促進される。タイプ２糖尿病（ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅ）で糖耐性は脂肪組織内に糖輸送が円滑でなくて現れたものであると思われている。したがって、脂肪細胞で糖輸送を調節する新たな内在的因子を探すことは糖尿病の発生過程をさらに理解し、改善された治療戦略を通じて治療剤を開発するのに必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ホルモン、神経伝達物質及びサイトカインなどの生体活性分子は生物体内の多くの調節過程で重要な役割を果たし、細胞間の信号伝達に必須構成要素で、さらに人間の疾病を診断及び治療するのに利用されている。新たな生体活性分子をスクリーニングする方法としては、一般に連続カラム−クロマトグラフィーが使用されているが、多くのカラム段階によって不充分な目的分子の回収率が低いという限界があった。
【０００５】
このような問題を解決するために本発明者らは、本発明に先立ち多様な内在的リガンドをスクリーニングすることができる新たな統合方法であるリガンド検出及び同定（Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＬＰＩ）法を開発した。平行カラムクロマトグラフィー及び高感度ＭＳ分析方法に基づくこのような方法は、迅速で同時に不充分な生体活性分子をスクリーニングするのに適合する。最近は前記生体活性分子を効率的に精製するためにプロテアーゼフィルタリング工程を追加して前記ＬＰＩ技術を発展させた。したがって、本発明者らはこのような体系的で高感度の分析器術が組織または体液内の新規の生体活性分子をスクリーニングするのに効果的に使用されると考えた。
【０００６】
このような分析器術は先行文献に参照として含まれているので、本明細書では具体的に言及したり食欲抑制剤とインシュリン敏感化剤を結合させて結合による効能については言及しなかった。副作用がなくて優れた糖尿病治療効果を有する薬として十分に改良された優れた薬を開発することが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明では血清から３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖吸収を促進する新たなリガンドをスクリーニングし、糖吸収を促進する新規のリガンドであるリソフォスファチジルコリン（ＬＰＣ）を検出した。本発明ではまた、前記ＬＰＣが脂肪細胞の糖吸収を促進させて糖尿病マウスモデルの血糖数値を下げる可能性があることを最初に確認し、さらにこのようなＬＰＣの物質代謝調節にはＰＫＣδの活性が必要であることを明らかにした。
【０００８】
本発明の一側面で、周辺のウロコルチン（ｕｒｏｃｏｒｔｉｎ、ＵＣＮ）の役割については糖恒常性で調査された。ＵＣＮは人間インシュリン受容体が過発現されたＲａｔ−１細胞（ｈＩＲｃＢ細胞）及びＣ２Ｃ１２繊維亜細胞でインシュリンによって誘導されたＩＲの燐酸化及び以降細胞内信号伝達を促進させた。さらに、本発明の生体外実験結果と同様にＵＣＮをＳＴＺマウスの尻尾静脈内に投与する場合、インシュリンによって誘導された血糖数値の減少が促進された。したがって、本発明では内在的ペプチドをスクリーニングしてインシュリン敏感化剤を検出した。
【０００９】
本発明の目的は、リソフォスファチジルコリン（ＬＰＣ）、リゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ）、リソホスファチジン酸（ＬＰＡ）及びウロコルチン（ＵＣＮ）からなる群の中で選択されたいずれか１つの化合物を含む糖吸収促進剤を提供することにある。前記リソフォスファチジルコリン、リゾホスファチジルセリン及びリソホスファチジン酸はインシュリンなくても糖吸収を促進させ、ウロコルチンは糖恒常性調節でインシュリンの活性のための補助剤として作用する。
【００１０】
前記リソフォスファチジルコリンはＡｋｔ燐酸化にいかなる影響も与えず、リソホスファチジルのアシル基は１４個乃至１６個の炭素数を有する。ミリストイル（ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ）ＬＰＣとパルミトイルＬＰＣは糖吸収を促進させるが、反面ステアロイル（ｓｔｅａｒｏｙｌ）ＬＰＣは複数のリゾリン脂質（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）が処理された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖吸収を促進させなかった。
【００１１】
パルミトイルリソホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）、パルミトイルリソホスファチジルグリセロール（ＬＰＧ）及びパルミトイルリソホスファチジルイノシトール（ＬＰＩ）は全て３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖吸収を促進させなかったが、これはＬＰＣのヘッド基が３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞でＬＰＣによる糖吸収の促進と関する構造的選択性に影響を与えたものと思われる。
【００１２】
【化１】
2009500401.tif 000003
【００１３】
本発明の他の目的は、リソフォスファチジルコリン、リゾホスファチジルセリン、リソホスファチジン酸及びウロコルチンからなる群の中で選択されたいずれかの化合物を含む薬学的組成物を提供することにある。前記薬学的組成物は希釈剤または賦形剤を追加的に含み、インシュリン分泌強化剤、ビグアナイド剤（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）及びα−グルコシダーゼ抑制剤からなる群の中で選択された少なくともいずれかの化合物をさらに含む。
【００１４】
本発明の他の目的は、ウロコルチンとインシュリンを混合した薬学的組成物を提供することにある。
【００１５】
本発明の他の目的は、リソフォスファチジルコリン、リゾホスファチジルセリン、リソホスファチジン酸及びウロコルチンからなる群の中で選択されたいずれかのインシュリン敏感化剤の有効量を哺乳類に投与して哺乳類の糖尿病または糖尿病合併症を治療する方法を提供することにある。前記糖尿病合併症は肥満、高脂血症、動脈硬化症、高血圧または心臓病である。前記方法はインシュリン分泌強化剤、ビグアナイド剤及びα−グルコシダーゼ抑制剤からなる群の中で選択された少なくともいずれかの化合物を混合して製造されたインシュリン敏感化剤の有効量を哺乳類に投与する段階を追加的に含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を下記の実施例によって詳しく説明する。
本明細書で糖吸収調節剤とはインシュリンに対する組織反応を増加させて血糖数値を下げる物質のことを意味する。
【００１７】
インシュリン耐性高血圧に敏感な患者とはインシュリンに耐性を現わして高血圧にかかりやすい患者のことを意味し、このような患者は当該技術分野における通常の知識を有する医者によく知らされて簡単に判断される。
【００１８】
治療とはインシュリン耐性及び/または高循環インシュリン数値によって生じた血圧を下げることを意味し、予防とは疾病の深刻性によってインシュリン耐性患者に現れる高血圧を現れないようにすることを意味する。
【００１９】
“単位投与量”とは医学的または獣医学的用途で投与するために適切な形態で糖吸収調節剤を分離した量を意味する。したがって、実際の単位投与量は、例えば、抗−糖尿病治療剤の使用後に生じた肥満を予防または治療する特定用途で使用される糖吸収調節剤の定量を含む１つの単位またはその全量を意味する。薬剤学を専攻した通常の知識を有する者には自明なことであるように、糖吸収調節剤は従来の単位投与量で公式化されることができる。このような単位投与量は多様な梯形、例えば、タブレット、硬質ゼラチンカプセル、ホイルパケット及びガラスアンプルなどで製造されることができる。類似に、前記単位投与量は薬品点滴器またはポンプスプレーで伝達することができる。その後、前記多様な単位投与量は薬学的に許容可能な多様な形態の液状物で経口または非経口投与することができる。例えば、一定量のホイルパケットを水に溶かして口腔投与することができ、一定量のガラスアンプルを投与することができる。類似に、薬品点滴器またはポンプスプレーのような不連続的な量の梯形は水に溶解され得る。
【００２０】
“哺乳動物”とは乳泉から分泌される牛乳で子を育てて通常皮膚が毛である程度覆われている人とその他の全ての動物を含む高等脊椎動物のある部類（哺乳類）を意味する。特に、このような定義に含まれる人は忍耐心、精力または運動能力が哺乳類の中で最適の状態ではない。このような人及び人を除いた動物は当該技術分野の医師または獣医師によって簡単に診断できる。
【００２１】
糖恒常性は肝臓の糖生産と細胞の糖吸収の最適の調和を通じて維持され、もし人間の身体で糖恒常性が維持されなければ、人間の身体は高血糖症または多様な代謝的不均衡状態になり得る。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖吸収を促進する新たな因子をスクリングすることにおいて、本発明者らは体系的な平行カラムクロマトグラフィー、プロテアーゼフィルタリング、高感度ＭＳ分析及び同定されたＬＰＣに基づく新たな統合方法を用いた。
【００２２】
本発明者らはＬＰＣが濃度及び時間に応じて糖吸収を促進するという事実を明らかにした。ＬＰＣ処理による糖吸収の促進はアシル基の長さ変化及びＬＰＣの極性ヘッド基差に敏感に反応する。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞にＬＰＣを処理する場合、細胞膜でのＧＬＵＴ４数値は顕著に増加し、糖吸収に対するＬＰＣのこのような効能はＰＫＣδ抑制剤のロットレリン及び優性陰性的ＰＫＣδの発現によって阻害される。また、ＬＰＣをマウスに投与する場合、血糖数値は顕著に減少し、特にタイプＩ糖尿病（インシュリン−依存性糖尿病）及びタイプＩＩ糖尿病（インシュリン−非依存性糖尿病）のマウスモデルで血糖数値が改善された。このような結果はＬＰＣが糖恒常性及び糖尿病の治療因子として新しく提示できることを意味する。
【００２３】
リゾリン脂質は細胞増殖、腫瘍細胞の浸潤及び炎症を含む多様な生物学的過程を調節する。ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）の活性によって生産されたＬＰＣは膜脂質の主要構成成分であり、脂肪酸とコリンを組織内に輸送する。また、ＬＰＣは糖恒常性調節と密接に関連していると知られている。最近はＬＰＣが膵臓細胞で糖依存性インシュリンの分泌を促進するという報告がある。今まで報告されたＬＰＣの生理学的活性のうちの１つは膵臓細胞からインシュリンの分泌を誘導することである。最近ＴａｋａｔｏｓｈｉなどはＬＰＣに対する新規のＧｓ−蛋白質結合受容体として孤児Ｇ−蛋白質結合受容体であるＧＰＲ１１９を特定した。前記ＧＰＲ１１９は膵臓細胞で顕著に発現し、ＬＰＣによって活性化して糖−依存性インシュリンの分泌を誘導する。
【００２４】
ＬＰＡは特異のＧ−蛋白質結合受容体を経由する幾多の細胞上のイベントを調節すると知られている強力で多面的な生体活性燐脂質である。ＬＰＡは血小板凝集、アクチン細胞骨格活性、繊維亜細胞増殖及び神経突起収縮を調節することができる。ＬＰＡは２種類の主な経路を通じて細胞外で生産されると見なされている。第１経路としてＬＰＡは活性化した血小板によって放出され、第２経路として前記ＬＰＡはオートタキシン（ｌｙｓｏ−ＰＬＤ）によってリゾリン脂質から生産される。最近ＬＰＡはオートタキシンの分泌によって脂肪細胞の細胞外培養液で生産されると報告された。したがって、ＬＰＡは全般的なエネルギー均衡を調節するのに重要な役割を果たす脂肪組織の発達を調節するのに関与することができる。
【００２５】
生体活性リゾリン脂質のうちの１つとしてリゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ）は免疫調節と関連していると思われている。しかし、細胞活性に対するＬＰＳの効能及びＬＰＳの標的分子の同定については明確に調査されたことがない。ＬＰＳはまた、卵巣ガン患者の腹水で発見され、卵巣ガン及び乳癌細胞株で細胞内カルシウム濃度を一時的に増加させるという報告がある。ＬＰＳはまた、ＪｕｒｋａｔＴ細胞でインターロイキン−２の生産を促進し、さらに神経促進因子に誘導されたラットの肥満細胞でのヒスタミン放出と神経促進因子に誘導されたＰＣ１２細胞の分化を促進する。このようにいくつかの生物学的反応を調節するＬＰＳの機能については制限的に研究されてきたので、多様な細胞活性に対するＬＰＳの機能及びその活性メカニズムについて調査されなければならない。
【００２６】
本発明は糖恒常性を調節するインシュリンの活性のための補助因子としてウロコルチン（ＵＣＮ）の新規の機能を調査した。ＵＣＮは血糖強化剤としてよく知られているが、ＵＣＮがインシュリン受容体（ＩＲ）が過発現されたｈＩＲｃＢ細胞及びＣ２Ｃ１２繊維亜細胞でインシュリン受容体（ＩＲ）、インシュリン受容体基質（ＩＲＳ）及び蛋白質キナーゼＢ（ＡＫＴ）のようなインシュリンによって誘導された信号伝達分子の活性を促進させることができるということについては知らされたことがないので、これについて調査した。興味深く、生体内でウロコルチンの効能は血糖数値を調節することにおいてその投与量と差があった。つまり、ウロコルチンを低濃度（０．１ｐＭ）で投与する場合、ウロコルチンは血糖数値を低くしてマウスの骨格筋でインシュリン受容体（ＩＲ）の燐酸化を増加させた。結論的に、本発明者らはインシュリンに対する敏感性を強化させるウロコルチンの生理的な現象を示しながら、これによってウロコルチンが糖尿病治療の標的として有用に使用される可能性があることを提示しようとした。
【００２７】
ウロコルチン（ＵＣＮ）はコルチコトロフィン放出因子（ＣＲＦ）類のうちの１つで、４０個のアミノ酸を有するペプチドであり、視床下部脳下垂体副腎（ＨＰＡ）軸調節に関与する主要視床下部因子として知られている。ＵＣＮは食欲を抑制し、カテコールアミン性システムを通じた体熱発生及び空腹状態を活性化し、そして多様な動物モデルで結腸のモータ機能を促進する。最近は骨格筋のような周辺組織でもＵＣＮが発現すると報告されているが、このようなＵＣＮの発現が糖調節と関連しているかどうかについては依然として知らされたことがない。
【００２８】
リゾリン脂質は細胞増殖及び腫瘍細胞の浸潤を含む多様な生物学的過程を調節する。ホスファチジルコリン上でホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）の活性によって生産されたリソフォスファチジルコリン（ＬＰＣ）は血管内皮細胞固着分子の発現増加と成長因子、単核球走化性及び大食細胞の活性を含む炎症効能を促進する。本発明はＬＰＣが糖恒常性と関する血管媒介ホルモンであることを最初に証明しようとし、このために本発明者らは平行カラムクロマトグラフィー、プロテアーゼフィルタリング及び高感度ＭＳ分析を含む新たな統合方法を用いた（Ｂａｅｋ， Ｍ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ６， ｐｐ１７４１−１７４９， ２００６）。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞にＬＰＣを処理する場合、ＰＩ３−キナーゼに独立的なＰＫＣδ活性を通じて３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞での糖吸収は速かに促進され、さらに糖尿病マウスモデルにＬＰＣを投与する場合、血糖数値が顕著に減少した。ＬＰＣの他にも多くのリゾリン脂質（ＬＰＬ）は多様な生理的及び病理的機能を持っていると知られているが、これらが糖吸収の調節と関連しているということは報告されたことがなかった。糖代謝と関する内在的脂質としては副腎皮質生殖ホルモン（ＤＨＥＡ）が報告されたことがあり、最近の研究結果によるとＤＨＥＡが脂肪細胞で糖吸収率を増加させると報告したが、動物モデルでＤＨＥＡの効能を証明することはできなかった。したがって、本発明者らはＬＰＣが正常マウスだけでなく糖尿病マウスモデルで血糖数値を調節する最初の内在的脂質であることを提示した。
【００２９】
新たな活性リガンドをスクリーニングするために、本発明者らは本発明に先立って平行ＨＰＬＣ及びＭＳ分析を用いた活性切片検出に基づいたＬＰＩと呼ばれる新たな方法を考案した。前記平行ＨＰＬＣは上述した発明に記載された通りに収率を増加させて活性分子を特定する効果的な方法で、本発明者らは前記活性分子をより効率的に精製するために前記平衡ＨＰＬＣにプロテアーゼフィルタリング工程を追加した。プロテアーゼは蛋白質マッピングまたは蛋白質同定に通常使用されるが、前記プロテアーゼフィルタリング工程ではカラムクロマトグラフィーのような精製道具としてプロテアーゼが使用される。特に、プロテアーゼフィルタリングは活性分子と類似な物理化学的特徴を有する不活性ペプチドを除去するのに効果的である。前記不活性ペプチドは通常の連続クロマトグラフィーによって簡単には除去されないが、プロテアーゼの処理による不活性ペプチドが切断されて不活性ペプチドの構造的な変化がまねかれ、引き続くカラムクロマトグラフィーによって活性分子から分離できる。このようなプロテアーゼフィルタリング工程及び平行ＨＰＬＣを結合して本発明者らは新規のリガンドの同定方法を考案してＬＰＣをより簡単に特定した。したがって、このような統合方法は少量の出発物質を用いて孤児Ｇ−蛋白質結合受容体（ＧＰＣＲ）研究のような多様な生体活性分子をスクリーニングするのに有用に使用することができる。
【００３０】
ＬＰＣ処理による３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞での糖吸収促進とマウスでの血糖減少はＬＰＣアシル基の長さ変化に敏感に反応する。パルミトイルＬＰＣ及びミリストイルＬＰＣは３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖吸収を促進させたが、ステアロイルＬＰＣは３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖吸収を促進させなかった。パルミトイルＬＰＣと極性ヘッド基が構造的に異なる幾つかのリゾリン脂質を３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に処理した時にも糖吸収が促進されなかったが、このようなＬＰＣの構造的特異性もまたマウスモデルで確認された。このような結果はＬＰＣのアシル基長さ及びホスファチジルコリンのヘッド基が全て３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞での糖吸収促進及びマウスでの血糖数値減少に非常に重要であることを意味する。
ＬＰＣ作用での速い開始と構造的特異性に基づいて、本発明者らはＬＰＣの生物学的活性はＬＰＣと細胞表面にある特異的なＬＰＣ受容体の結合によって説明できると考えた。このようなＧ−蛋白質結合受容体（ＧＰＣＲ）部類に対するリガンドとしていくつかのリゾリン脂質が報告され、ＬＰＣはＧ２Ａ及びＧＰＲ４に直接結合して活性化させるリガンドとして知られている。しかし、最近他の研究結果によるとＬＰＣはＧ２Ａ及びＧＰＲ４と直接結合しない投与量でも活性化できると報告された。したがって、ＬＰＣがＧ２Ａ及びＧＰＲ４と直接結合する経路を通じて糖吸収を促進するかまたは知られていない他の経路を通じて糖吸収を促進するかについての未解決問題が残っている。
【００３１】
脂肪細胞及び筋肉細胞で糖吸収の促進とＰＫＣζ活性の関連性は長い間よく知られているが、ＰＫＣδの活性もまた糖輸送を調節する。糖輸送の活性とＰＫＣδとの関連性は薬剤及びインシュリンを利用する研究で本来評価された。インシュリンをラットの骨格筋細胞に処理する場合、インシュリンによる前記細胞の細胞膜に対するＧＬＵＴ４の転座及び糖吸収の促進はロットレリンによって阻害された。さらに、インシュリンによって過発現されたＰＫＣδは細胞膜に対するＧＬＵＴ４の転座を誘導し、糖吸収数値を増加させた。
本発明において、ＬＰＣによって誘導された糖吸収の促進はロットレリン及び優性陰性的ＰＫＣδの発現によって阻害されたが、従来のＰＫＣ抑制剤であるＧｏ６９７６を前処理したりまたは優性陰性的ＰＫＣζを発現させる場合、ＬＰＣによる糖吸収の促進にいかなる影響も与えなかった。これはＰＫＣδがＬＰＣによる糖吸収の促進に必須の要素であることを意味する。
【００３２】
今まで報告されたＬＰＣの生理学的活性のうちの１つは膵臓β−細胞からインシュリンの分泌を誘導することである。最近ＴａｋａｔｏｓｈｉなどはＬＰＣに対する新規のＧｓ−蛋白質結合受容体として孤児Ｇ−蛋白質結合受容体であるＧＰＲ１１９を特定した（Ｓｏｇａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３２６， ｐｐ７４４−７５１、２００５）。前記ＧＰＲ１１９は膵臓β−細胞で顕著に発現され、ＬＰＣによって活性化して糖−依存性インシュリンの分泌を誘導する。本発明において本発明者らは断食状態（ｆａｓｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）にあるマウスにＬＰＣを投与し、投与後血清内でインシュリンの濃度変化が殆どないことを確認した。これはマウスでの血糖減少はインシュリンの分泌によるものでなく、ＬＰＣの促進によるＬＰＣの直接的な機能によるものであることを意味する。
【００３３】
要約すると、本発明はＬＰＣが３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖吸収を促進するということを示すもので、このような効能はＰＩ３−キナーゼに独立的なＰＫＣδ依存性信号伝達経路によって行われる。さらに、ＬＰＣは糖尿病マウスモデルで血糖数値を直接的に減少させたが、このようなＬＰＣの新規の機能は糖恒常性及び糖代謝関連生物学分野で新しく認識できる。ＬＰＣと代謝症候群間の関連性もまたさらに研究する価値がある。最後に、本発明の結果はＬＰＣが糖尿病に対する薬品治療法を開発するのに有用なターゲットになり得るより高い可能性を提示する。
【００３４】
ＵＣＮは血糖強化剤として知られているが、本発明では正常ＩＣＲマウスにＵＣＮを投与する場合に血糖数値が減少し（図１４Ａ）、特にストレプトゾトキシン（ＳＴＺ）−マウスにＵＣＮとインシュリンを共に投与する場合、インシュリンを単独で投与した場合に比べて血糖数値がさらに減少した（図１４Ｂ）。さらに、本発明ではＵＣＮと関する血糖数値減少の分子的メカニズムを調査しようとし、その結果、本発明者はＵＣＮがインシュリン受容体（ＩＲ）が過発現されたＲａｔ−１細胞（ｈＩＲｃＢ細胞）及び分化するＣ２Ｃ１２繊維亜細胞でＩＲの活性化に影響を与える、インシュリンによるＩＲの燐酸化を促進するということを確認した（図１２、１３）。そして、このような効果はＣ２Ｃ１２繊維亜細胞で糖吸収と関連されていた。したがって、本発明はＧ−蛋白質結合受容体（ＧＰＣＲ）リガンドがインシュリンによって誘導されたＩＲの活性及び生理的機能の糖調節に特異的に敏感に反応するということを最初に明らかにした。
【００３５】
インシュリンは血液内に存在する主要糖調節剤として知られているが、血糖数値を効率的で正確に調節するためには、インシュリンの機能を補助する補助因子などが必要であると提案されてきた。このような補助因子などは生理的及び病理的条件の間で互いに異なる機能的特徴を有することができる。正常的な生理的条件でインシュリンは主要糖調節剤の役割を果たすので、前記補助因子などは糖恒常性調節で付随的な役割を果たすことができる。しかし、糖尿病及び肥満のような病理的条件でインシュリンの機能は顕著に減少するので、前記補助因子はインシュリン作用を強化させて糖を調節する非常に重要な役割を果たすことができる。
【００３６】
インシュリンをＳＴＺ−マウスに投与して糖調節をする場合、一部マウス及び補助的な効果が現れたが、ＵＣＮは低血糖効果を示した。したがって、ＵＣＮは病理的条件で糖を調節するのにさらに強力な効能を有することができる。結論的に、本発明ではインシュリンと関する糖調節の新規のメカニズム及びＵＣＮの新規の機能を明らかにした。糖恒常性側面から見る時、Ｇ−蛋白質結合受容体（ＧＰＣＲ）とＵＣＮによって調節できるＩＲの活性が中枢神経系（ＣＮＳ）と周辺システムの間で現れる機能と互いに相反するというのは非常に興味深いことである。
【００３７】
本発明の薬学的組成物は糖尿病または糖尿病合併症を予防または治療するための薬剤として使用することができる。前記糖尿病の例としてはインシュリン−依存型糖尿病及びインシュリン−非依存型糖尿病などがある。特に、本発明の薬学的組成物は糖尿病合併症（例えば、神経病症、腎臓病、網膜症、巨大血管病症、冠状動脈疾患、骨粗しょう症など）を予防または治療するための薬剤として使用することができ、また糖耐性損傷を治療するための薬剤として使用することができる。
【００３８】
さらに、本発明の薬学的組成物をインシュリン分泌強化剤、ビグアナイド剤及びα−グルコシダーゼ抑制剤などと混合して処理するとより優れた血糖阻害効果を提供することができる。
【００３９】
本発明の薬学的組成物またはこれらそれぞれの活性成分の投与形態はタブレット、カプセル（軟質カプセル及び微細カプセルを含む）、パウダー、顆粒及びシロップなどのような経口投与形態;及び注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈注射剤、筋肉内注射剤及び腹腔内注射剤など）、外部適用剤（例えば、鼻噴霧剤、経皮吸収剤及び軟膏など）、座剤（例えば、直腸座剤及び膣座剤など）、ペレット及び点滴注入などのような非経口投与形態を含む。
【００４０】
本発明の薬学的組成物の投与量は前記各薬剤に応じて勧告された投与量を参照して適切に決定することができ、投与対象、投与対象の年齢及び体重、現在の臨床的状態、投与時間、投与形態、投与方法及び薬剤の組み合わせなどに応じて適切に選択することができる。インシュリン敏感化剤及び食欲抑制剤の投与量は臨床的に使用される投与量に基づいて適切に選択される。インシュリン敏感化剤を成人糖尿病患者（体重:５０ｋｇ）に投与する場合、１日当たり０．０１乃至１０００ｍｇ、好ましくは０．１乃至５００ｍｇがよく、前記投与量は一日に複数回に分けて投与することができる。
【００４１】
本発明を下記の実施例によってより詳しく説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するために過ぎず、本発明が下記の実施例に限定されるわけではない。
【実施例】
【００４２】
［物質］
合成１４:０、１８:０、１８:１リソフォスファチジルコリン（ＬＰＣ）、インシュリン及びストレプトゾトシン（ＳＴＺ）はシグマ（セントルイス、ＭＯ）から購入し、他のリゾリン脂質はＡｖａｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ社から購入した。全てのリピドを５０ｍＭの固定濃度でメタノールに溶解してガラスバイアールに１回分量で分株した後、−７０℃の窒素に貯蔵して一ケ月内に使用した。Ｇｏ６９７６及びロットレリンはカルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）から購入し、抗体は下記の会社から購入した:多クローン抗−ＧＬＵＴ４抗体はバイオゼニシスＬｔｄ（サンダウン、ＮＨ）から購入し、抗−ホスホ−Ｓｅｒ４７３ＡＫＴ１抗体はシグマから購入し、抗−ホスホ−Ｔｙｒ９８９ＩＲＳ１は本実験室で製造し、[１４Ｃ]２−デオキシ−Ｄ−グルコース（３００ｍＣｉ/ｍｍｏｌ）はモラベクバイオケミカル（Ｍｏｒａｖｅｋ Ｂｉｏｃｈｅｍｉａｃｌ）から購入し、トリプシンはロッシュ（マンハイム、ドイツ）から購入し、組織培養培地及び牛胎児血清はＧＩＢＣＯから購入した。その他の全ての試薬は分析用級で準備した。
【００４３】
［細胞培養］
３Ｔ３−Ｌ１繊維亜細胞は高い糖濃度、１０％の牛胎児血清、５０Ｕ/ｍｌのペニシリンと５０ｕｇ/ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地と３７℃、５％の二酸化炭素が供給される湿気のある空気条件で維持されたまま増殖した。３Ｔ３−Ｌ１細胞を脂肪細胞に分化させるために、前記で記述された方法を用いた（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇｈｅ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４、ｐｐ．２３７２−２３７７、１９９４）。
【００４４】
［動物］
雄ＩＣＲマウスはヒョチャン科学（ＲＯＫ）から購入し、Ｃ５７ＢＬＫＳＪ−ｄｂ/ｄｂマウスはＳＬＣ（日本）から購入した。ＬＰＣをマウス尻尾静脈内に投与した後、尻尾の端部を切断して携帯用糖測定器（Ｇｌｕｃｏ−Ｄｒ、ＲＯＫ）を用いて定期的に血糖を測定した。血清内インシュリンの濃度を測定するためにマウスの血液試料をインシュリン−ＲＩＡキット（ＬＩＮＣＯ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）で分析した。インシュリン欠乏マウスはクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）に溶解されたＳＴＺ（２００ｍｇ/ｋｇ）を毎日２回連続的に雄ＩＣＲマウスの腹腔内に投与して誘導した。最後のＳＴＺを投与した後から３日目になる日に前記のような方法でビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）、ＬＰＣまたはインシュリンをマウス尻尾静脈内に投与して急性糖阻害効果を分析した。
【００４５】
［ＨＰＬＣ精製］
約３５０ｍｌの新鮮な人間血清を７０％（ｖ/ｖ）のアセトン、１Ｍの酢酸及び２０ｍＭの塩酸と混合して２０，０００ｇ、３０分間４℃で遠心分離し、これから得られた上澄み液を収集した後、ジエチルエーテルで３回抽出した。抽出された液状部位を再び２０，０００ｇ、３０分間４℃で遠心分離し、これから得られた上澄み液を事前洗浄のためにＳｅｐＰａｋＣ１８（水）カートリッジに積載し、溶出するためにＣ１８逆相ＨＰＬＣカラム（Ｖｙｄａｃ ２１８ＴＰ１０２２、２２ｍｍｘ２５０ｍｍ）に直接積載した。１０ｍｌの分画物を収集し、各分画物の１％未満を３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖吸収を分析するのに使用した。活性分画物は３７℃で１２時間トリプシンで処理した後、同一量をＣ４逆相ＨＰＬＣカラム（Ｖｙｄａｃ ２１４ＴＰ５２１５、２．１ｍｍｘ１５０ｍｍ）及び陽イオン−交換ＨＰＬＣカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｍｉｎ−Ｓ ＨＲ５/５、４．６ｍｍｘ５０ｍｍ）に使用した。
【００４６】
［質量分析及びデータ分析］
電気噴射イオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）及び連続質量分析（ＭＳ/ＭＳ）はナノ−電気噴射イオン化（ｎａｎｏ−ＥＳＩ）基質が装着されたＱＳＴＡＲ ＰＵＬＳＡＲ Ｉ ｈｙｂｒｉｄ Ｑ−ＴＯＦＭＳ/ＭＳ（バイオシステム社から供給されたＰＥ ＳＣＩＥＸ、トロント、オンタリオ）を用いて行った。準備された試料はプロタナナノ噴霧チップ（オデンス、デンマーク）を用いてＥＳＩ基質内に伝達された０．１％のトリフルオロ酢酸に溶解された。ＱＳＴＡＲによって検出された全ての試料の質量はバイオシステム社から供給された分析用ＱＳソフトウェアを用いて測定した。ＱＳＴＡＲは２４時間維持される外部目盛り（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）を用いて１０〜３０ｐｐｍの質量精密度と８，０００−１０，０００の解像度で作動された。前記噴射チップの電圧を２３００Ｖに調節し、質量情報による通常の質量を確認するために結合されたオンライン−データベース;Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｃｈａｐｍａｎ & Ｈａｌｌ/ＣＲＣ）を用いた。
【００４７】
［糖吸収測定］
３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞での糖吸収を測定するために、細胞を血清が含有されていないＤＭＥＭで１６時間増殖させた後、インシュリンまたはリゾリン脂質を添加したり添加せずに３７℃で指示された時間の間に培養した。吸収率は１μＣｉの[１４Ｃ]２−デオキシ−Ｄ−グルコース及び３ｍＭの２−デオキシ−Ｄ−グルコースを添加して測定し、添加されて１０分後冷たいＰＢＳで２回急速に洗浄して前記反応を終結した。細胞は０．５ＮのＮａＯＨ及び０．１％のＳＤＳが含まれた０．５ｍｌの粉砕溶液を用いて粉砕し、粉砕された細胞粉砕物を液体閃光係数を測定するのに用い、非特異的な吸収率は１０μＭのサイトカラシンＢの存在下で分析された。
【００４８】
［脂肪細胞の膜分離］
３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞から全体膜（ＴＭ）を得るために、細胞を１０ｍｌの冷たいＨＥＳ溶液（２５０ｍＭのスクロース、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド[ＰＭＳＦ]、１μＭのペプスタチン、１μＭのアプロチニン、１μＭのロイペプチン及び２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）内で収集した後、４℃のガラスダウンスホモジナイザーを用いて３０ストロークで均質化した。粉砕されない細胞を除去するために４℃、１，０００ｇで５分間遠心分離し、これから得られた上澄み液を４℃、２１２，０００ｇで９０分間遠心分離し、全体細胞の膜を収得した。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞から原形質膜細胞以下の分画物を得るために、前記に記述された通りに差別的な超遠心分離を用いた（Ｐｅｒｒｉｎｉ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ５３， ｐｐ．４１−５２，２００４）。
【００４９】
［ＰＫＣ同種体（ｉｓｏｆｏｒｍ）のアデノウイルス感染］
ＰＫＣδまたはＰＫＣζ再組み合わせアデノウイルスを製造するためのアデノウイルス発現ベクターは前記で記述されたことがある。培養した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を分化させた後、培養液を除去してＰＫＣδまたはＰＫＣζ再組み合わせアデノウイルスを含むウイルス培養液を２４時間前記細胞に感染させた。その後、前記感染された細胞をＤＭＥＭで２回洗浄し、４８時間感染させた後に培養して糖吸収または免疫反応に使用した。
【００５０】
［免疫反応］
全体細胞粉砕物を準備するために３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞をカルシウム/マグネシウムが添加されていないＰＢＳで洗浄し、粉砕溶液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１０％のグリセロール、１％のトリトンＸ−１００）内で粉砕した後、前記細胞粉砕物を４℃、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。蛋白質をｌａｅｍｍｌｉサンプル溶液と混合して９５℃で５分間加熱して変成させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥから分離した。ホファーウェットトランスシステム（Ｈｏｅｆｅｒ ｗｅｔ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍ）を用いてＳＤＳ−ゲルをニトロセルロース膜に伝達し、前記膜を５％の脱脂乳パウダーを含むＴＴＢＳ溶液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）の中で所々に集めた後、３時間続けて抗体と反応させた。ＴＴＢＳを用いて前記膜を複数回洗浄した後、ＨＲＰ（西洋ワサビ過酸化水素）−結合された塩素抗−ウサギ抗体と１時間反応させ、再びＴＴＢＳで洗浄してＥＣＬで発色した。
【００５１】
［統計分析］
全てのデータは平均±標準誤差で表記し、統計分析はＳｔｕｄｅｎ'ｓｔテストで行った。*Ｐ＜０．０１は統計的有意性があることを意味する。
【００５２】
［実施例１］人間血清内の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞から糖吸収促進因子であるリソホスファチジルコリンの同定
３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖吸収を促進する内在的因子を調査するために、本発明者らは体系的な平行カラムクロマトグラフィー、プロテアーゼフィルタリング、高感度ＭＳ分析に基づく新たな統合方法を用いた（図１Ａ）。平行ＨＰＬＣの基本的な原理は従来の連続的な分離（Ｂａｅｋ， Ｍ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ６， ｐｐ， １７４１−１７４９，２００６）の代わりにターゲット分子を確認するために検出分析を利用することである。多段階の連続カラムによる低い収率は精製するのに非常に大きな短所となるが、これは各カラムによる収率が精製過程でも急激に減少するためである。このような新たな方法は連続的なＨＰＬＣ段階を最少化し、ターゲット分子を特定するために一部精製されたＨＰＬＣ分画物を用い、連続的なＨＰＬＣに比べて単に少量の出発物質が要求される。
【００５３】
平行ＨＰＬＣと共に本発明者らは効率的な精製のためにプロテアーゼフィルタリング法を用いた。つまり、特異プロテアーゼを処理した後、活性分画物の活性が消失しなければ、本発明者らは活性分子を含む分画物と次いで行われるカラムクロマトグラフィーを用いて多様な不活性ペプチドから前記活性分画物を確実に分離することができる。したがって、このような方法は脂質、アミン及び炭水化物のような非−ペプチド分子を分離するのに有用である。このような新たな方法で本発明者らは最初にＣ１８逆相ＨＰＬＣによって人間血清からアセトン抽出物を分画した。分画されたＨＰＬＣ分画物は３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で処理され、糖吸収率は[１４Ｃ]２−デオキシ−Ｄ−グルコース吸収率の増加を通じて測定された（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇｈｅ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４， ｐｐ．２３７２−２３７７， １９９４）。
【００５４】
図１Ｂに示したように、少なくとも４種類の活性分画物が検出され（Ａ−Ｄ）、これらの活性がトリプシン処理によって減少したかどうかを調べた結果、分画物Ｄの活性のみがトリプシン処理によって影響を受けなかった。したがって、前記分画物Ｄをトリプシンで処理し、平行状態にあるＣ４ＨＰＬＣ及び陽イオン−交換（ＳＣＸ）ＨＰＬＣを用いて追加的に分離した。Ｃ４ＨＰＬＣ及びＳＣＸＨＰＬＣの全ての分画物は３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞から糖吸収を測定してスクリーニングされた（図１Ｃ及び１Ｄ）。
【００５５】
各カラム（Ｃ４からは３７分、ＳＣＸからは６分）から得られた活性分画物をＥＳＩ−ＱＴＯＦ質量分析器で分析し、標準質量を探すために各質量スペクトルを比較した結果、単一同位元素質量として４９５．３３の単に１つの標準質量値があった（図１Ｅ−上端の絵及び図１Ｅ−中央の絵）。このような質量情報を用いて本発明者らは結合されたオンライン−データベース（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）で検索し、パルミトイルリソフォスファチジルコリン（ＬＰＣ）を特定した。ターゲット分子がＬＰＣであるかどうかを確認するために、本発明者らはＭＳ/ＭＳスペクトル上で標準ＬＰＣと４９５．３３質量の各断片化様相を分析した（図１Ｆ）。陽性−イオンモードで標準ＬＰＣ産物−イオンスペクトルはｍ/ｚ１８３で最も強いピークを含むホスホコリンヘッド基の衝突によって誘導された分離から発生した複数のイオンを現わした（図１Ｆ−下端パネル及び１Ｇ）。Ｃ４ＨＰＬＣ及びＳＣＸＨＰＬＣから得られた４９５．３３質量の断片化様相は標準ＬＰＣと正確に一致した（図１Ｆ−上端パネル及び１Ｆ−中央パネル）。前記で言及した物理的特徴に基づいて本発明者らは活性基質がＬＰＣであると決めた。
【００５６】
図１Ａ乃至１Ｅは血清から新規の糖吸収促進剤を特定したものを示し、図１Ａは３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖吸収を促進する血清因子の同定方法を概略的に示したもので、図１Ｂは血清のＣ１８逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ ２１８ＴＰ１０２２、２２ｍｍｘ２５０ｍｍ）の溶出様相を示したものである。相対的な２−デオキシ−Ｄ−グルコース吸収率は３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞でビヒクル処理に対する各分画物処理によって得られた増加比率として現わした。活性分画物Ｄは無作為に選択され、追加的な精製のためにトリプシンで処理された。図１Ｃは分画物ＤのＣ４逆相ＨＰＬＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｍｉｎｉ−ＳＨＲ５/５、４．６ｍｍｘ５０ｍｍ）の溶出様相を示し、図１ＥはＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析器による質量分析を示す。図１Ｃ（上端）、図１Ｄ（中央）及び標準パルミトイル１６:０ＬＰＣ（下端）は活性分画物の質量スペクトルを示し、図１Ｆは図１Ｅの各質量スペクトルで質量断片化及び４９５．３３質量のＭＳ/ＭＳスペクトルの様相分析を示したものである。
【００５７】
［実施例２］３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖吸収に対するＬＰＣの効能
糖吸収に対するＬＰＣの効能を調査するために、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を多様な濃度の標準ＬＰＣ存在下で時間に応じて培養した。ＬＰＣは３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で時間及び濃度に応じて糖吸収の増加を促進した。糖吸収に対するＬＰＣの初期の統計的な有効量は１μＭであり、最適の有効量は２０μＭで確認された（図２Ａ）。２０μＭのＬＰＣで処理する場合、１０分後に糖吸収が最大に増加した（図２Ｂ）。このようなＬＰＣ濃度は細胞毒性が現れず、４０乃至５０μＭの臨界ミセル濃度（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）より低濃度である（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ９７， ６７４−６８１，２００５）。
【００５８】
骨格筋は糖代謝で中枢的な役割を担当すると知られており、骨格筋で糖代謝の損傷はしばしば糖尿病を招く（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｋ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ ９０，１１Ｇ−１８Ｇ， ２００２;Ｂｅｃｋ−Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ３７， ｐｐ２１７−２２１，１９９４）。このような研究報告は３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に限定されてきたが、本発明者らはまたＬＰＣがＣ２Ｃ１２筋肉細胞で濃度依存的に糖吸収率を増加させることを確認した。このような結果はＬＰＣが脂肪細胞及び筋肉細胞全てで糖を調節することを意味する。
【００５９】
ＬＰＣのアシル基長さ変化が糖吸収に影響を与えるかどうかを知るためにいくつかのＬＰＣを対象として試験した。興味深く、ミリストイルＬＰＣ及びパルミトイルＬＰＣは３Ｔ３−Ｌ１細胞で糖吸収を促進させたが、ステアロイルＬＰＣは糖吸収を促進させなかった（図２Ｃ）。他のリゾリン脂質に対しても３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖吸収を促進させるかどうかを調査するために複数のリゾリン脂質を３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に処理した。図２Ｄに示したように、パルミトイルＬＰＥ、パルミトイルＬＰＧ及びパルミトイルＬＰＩは３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖吸収を促進させなかったが、これはＬＰＣのヘッド基が３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞でＬＰＣによる糖吸収促進に構造的な選択性を付与していることを意味する。
【００６０】
図２Ａ乃至２Ｄは３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖吸収に対するＬＰＣの効能を現わすもので、図２Ａは６−ウォールプレートで増殖させた３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に糖のないＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ溶液で１時間平衡化させ、ＬＰＣ（０乃至３０μＭ）またはインシュリン１０ｎＭ）を１０分間処理した後、物質方法に記述されたように[１４Ｃ]２−デオキシ−Ｄ−グルコース吸収率を１０分間の測定した結果を示したものであり、図２Ｂは３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞にＬＰＣ（２０μＭ）を０乃至２０分間処理及び培養した結果を示したものである。図２Ｃ及び２Ｄは３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に等モル濃度のミリストイルリソフォスファチジルコリン（１４:０ＬＰＣ）、パルミトイルリソフォスファチジルコリン（１６:０ＬＰＣ）、ステアロイルリソフォスファチジルコリン（１８:０ＬＰＣ）、パルミトイルリゾホスファチジルエタノールアミン（１６:０ＬＰＥ）、パルミトイルリソホスファチジルイノシトール（１６:０ＬＰＩ）、パルミトイルリソホスファチジルグリセロール（１６:０ＬＰＧ）を１０分間の処理するか処理せずに（対照群）培養して相対的な[１４Ｃ]２−デオキシ−Ｄ−グルコース吸収率の測定結果を示したものである。測定値は３回の独立的な実験を行って得られた結果を平均±標準誤差で示す値である。*Ｐ＜０．０５ｖｓ．対照群。
【００６１】
［実施例３］３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞でＧＬＵＴ４転座を促進するＬＰＣ
３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖輸送を促進するＬＰＣの機能がＬＰＣによって誘導された前記細胞表面にある糖輸送蛋白質量の変化と関連されているかどうかを調査するために、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で発現する主要糖輸送同種体であるＧＬＵＴ４蛋白質の数値をＬＰＣまたはインシュリンを処理するか処理しない基底状態の原形質膜（ＰＭ）分画物で測定した。ＬＰＣはインシュリンのようにＧＬＵＴ４蛋白質のＰＭ濃度（対照群の１８０％）を顕著に増加させた（図３Ａ及び３Ｂ）。このような結果はインシュリン及びＬＰＣ全てＧＬＵＴ４転座を促進させ、糖吸収実験で観察されたことと一致していることが分かる。
【００６２】
図３Ａ及び３ＢはＬＰＣが３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞でＧＬＵＴ４転座を促進していることを示したものである。Ａ）３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の原形質膜（ＰＭ）でＧＬＵ４転座に対するインシュリンの効能。ＬＤＭ、低濃度ミクロソーム。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を１００ｎＭのインシュリンまたは２０μＭのリゾリン脂質で１０分間処理して促進させた後、ＧＬＵ４の統合密度値（ＩＤＶ）の相対的な減少または増加を測定した。Ｂ）相対的に増加された値を定量化して表記。測定値は３回の独立的な実験を行って得られた結果を平均±標準誤差で示した値である。*Ｐ＜０．０５。
【００６３】
［実施例４］ＰＫＣδ活性化を通じて糖吸収を促進するＬＰＣ
脂肪細胞でインシュリンが糖吸収を促進するためにはＩＲＳ１、ＰＩ３−キナーゼ及び次に起こるＡＫＴの活性が必要である（Ｂｕｒｇｅｒｉｎｇ， Ｂ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７６， ｐｐ．５９９−６０２，１９９５;Ｂａｕｍａｎｎ， Ｃ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４０７、ｐｐ２０２−２０７， ２０００）。したがって、ＬＰＣによって増加された糖吸収がインシュリン依存型信号伝達経路、ＩＲＳ１及びＡＫＴ燐酸化と関連されているかどうかを調査しようとした。予想通りに３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に１０ｎＭのインシュリンを処理する場合、ＩＲＳ１及びＡＫＴ燐酸化が促進された。反面、脂肪細胞にＬＰＣを処理する場合、ＩＲＳ１及びＡＫＴ燐酸化にいかなる影響も与えなかったが、これはＬＰＣが多様な細胞で従来及び新規のＰＫＣを活性化するためであり（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ９７， ６７４−６８１，２００５）、ＬＰＣによって誘導された糖輸送の増加とこのようなＰＫＣの関連性については次に調査した。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に従来のＰＫＣ抑制剤である２μＭのＧｏ６９７６を３０分間前処理する場合、ＬＰＣは糖吸収を促進させなかったが、ＰＫＣδ抑制剤である１０μＭのロットレリンを前処理する場合にはＬＰＣによって促進された糖吸収が完全に抑制された（図４Ａ）。
【００６４】
ＰＫＣの機能をより直接的に調査するために、本発明者らは３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に特異のＰＫＣ同種体及び優性陰性的ＰＫＣ同種体を過発現させるアデノウイルス発現システムを用い、自然型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）、優性陰性的ＰＫＣδまたは優性陰性的ＰＫＣζを過発現する３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖吸収を分析した。自然型ＰＫＣδ発現は対照群３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のそれと比較した時、ＬＰＣによって促進された糖輸送活性を微々に増加させ、優性陰性的ＰＫＣδの発現はＬＰＣによって促進された糖輸送活性を顕著に減少させた。反面、優性陰性的ＰＫＣζの発現はＬＰＣ及びインシュリンによって誘導された糖吸収にいかなる影響も与えなかった（図４Ｂ）。このような結果はＰＫＣδがＬＰＣによって誘導された糖輸送活性に関与していることを意味する。
【００６５】
図４Ａ及び４ＢはＬＰＣがＰＫＣδを活性化して、糖吸収を促進するのを示すことで、図４Ａは６−ウォールプレートで増殖させた３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に糖のないＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ溶液で１時間平衡化させ、２μＭのＧｏ６９７６、１０μＭのロットレリンまたは溶液単独を３０分間処理した後、前記細胞にビヒクル（開放棒）または２０μＭのＬＰＣ（満たされた棒）を１０分間処理して物質方法に記述された通りに[１４Ｃ]２−デオキシ−Ｄ−グルコース吸収率を１０分間測定した結果を示したものであり、図４ＢはＰＫＣδ及びＰＫＣζ蛋白質の発現数値を示したものである。対照群３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞及び自然型ＰＫＣδ、優性陰性的ＰＫＣδまたは優性陰性的ＰＫＣζを発現する３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞から得られた細胞粉砕物をそれぞれ抗−ＰＫＣδ抗体または抗−ＰＫＣζ抗体と免疫反応させ（上端）、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖吸収を測定した（下端）。前記各細胞にビヒクル、２０μＭのＬＰＣまたは１０ｎＭのインシュリンを１０分間処理及び培養した。測定値は３回の独立的な実験を行って得られた結果を平均±標準誤差で示した値である。*Ｐ＜０．０５。
【００６６】
［実施例５］マウスでＬＰＣの糖阻害効能
ＬＰＣの生体内効能は雄アルビノＩＣＲ（癌研究学会）マウスを用いて調査した。前記マウスの尻尾静脈内にＬＰＣを投与する場合、３０分以内に血糖数値が統計的に留意に減少したが（図５Ａ）、このような効能は濃度に依存的であるが、血液内インシュリン数値の変化によるものではない（図５Ｃ）。
【００６７】
ＬＰＣの種類に応じてその活性が異なるかどうかを調査するために多様な長さのアシル基を有するＬＰＣまたは他のリゾリン脂質であるリソホスファチジルエタノールアミンを３０μｍｏｌ/ｋｇの等モル濃度でマウスの尻尾静脈内に投与した。興味深く、単にパルミトイルＬＰＣのみが血糖を顕著に減少させた（図５Ｂ）。次いで、本発明者らは３０μｍｏｌ/ｋｇのＬＰＣをストレプトゾトキシン（ＳＴＺ）−処理されたインシュリン欠乏マウスに投与し、その結果ＬＰＣが血糖濃度を顕著に減少させ、このような効果はインシュリンを投与した結果と類似していた（図５Ｄ）。
【００６８】
次に、本発明者らはＬＰＣの投与がインシュリン−耐性の肥満ｄｂ/ｄｂマウスの血糖症（ｇｌｙｃｅｍｉａ）にも影響を与えるかどうかを調査し、その結果ＬＰＣ投与後に血糖がほとんど正常数値に落ちることを確認した（図５Ｅ）。総合してみると、このような結果はＬＰＣが正常マウスだけでなくタイプＩ及びタイプＩＩ糖尿病マウスモデルでも血糖数値を調節することができることを意味する。
【００６９】
図５Ａ乃至５Ｅは糖尿病マウスモデルで尻尾静脈内に投与されたＬＰＣの抗−糖尿効能を示したもので、図５Ａ及び５ＢはＩＣＲマウスでＬＰＣによる急性糖阻害効能を示したものである。８周齢の雄マウスにＰＢＳ、インシュリン、ＬＰＣまたはＬＰＥを尻尾静脈内に投与し、血糖は投与した後にモニターした（０乃至１２０分）。図５Ｃは８周齢の雄マウスの尻尾静脈内にＬＰＣを単一投与した後に血清内インシュリン数値を示したものであり、図５Ｄはストレプトゾトキシン（ＳＴＺ）−処理されたインシュリン欠乏ＩＣＲ雄マウスでＬＰＣによる急性糖阻害効能を示したものであり、図５Ｅはインシュリン−耐性の肥満Ｃ５７ＢＬＫＳＪ−ｄｂ/ｄｂマウスでＬＰＣによる急性糖阻害効能を示したものである。全ての動物は水を自由に摂取し、国際的な指針にしたがって保護された。全てのデータは平均±標準誤差で示した（ｎ=５−６）。*Ｐ＜０．０５。
【００７０】
［実施例６］糖吸収に対するＬＰＳの効能
（６−１）３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖吸収に対するＬＰＳの効能
ＬＰＣと関する実施例と実質的に同様な方法で３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞でＬＰＳの効能を調査し、その結果を図６Ａ及び６Ｂに示した。
【００７１】
６−ウォールプレートで増殖させた３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に糖のないＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ溶液で１時間平衡化させ、等モル濃度（２０μＭ）のリソフォスファチジルコリン（ＬＰＣ）、リゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ）、リソホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）、リソホスファチジルイノシトール（ＬＰＩ）、リソホスファチジルグリセロール（ＬＰＧ）をそれぞれ１０分間処理及び培養した。図６ＡはＬＰＣ及びＬＰＳが３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で特異的に糖吸収を促進することを示したもので、図６ＢはＬＰＳが濃度依存的に糖吸収を促進することを示したものである（０乃至３０μＭ）。測定値は３回の独立的な実験を行って得られた結果を平均±標準誤差で示した値である。*Ｐ＜０．０５ｖｓ．対照群。
【００７２】
（６−２）糖尿病マウスモデルでＬＰＳの糖阻害効能
ＬＰＣと関する実施例と実質的に同様な方法でマウスでＬＰＳの効能を調査し、その結果を図７Ａ乃至７Ｄに示した。
【００７３】
図７Ａ乃至７Ｂは糖尿病マウスモデルで尻尾静脈内に投与されたＬＰＳの糖阻害効能を示したものである。８周齢の雄マウスにＰＢＳ、インシュリン、ＬＰＳを尻尾静脈内に投与し、血糖は投与した後にモニターした（０乃至１２０分）。図７Ａに示したようにＬＰＳは濃度−依存的に正常マウスの血糖数値を減少させた。Ｓ１Ｐ及びＬＰＥのような他のリゾリン脂質は正常マウスで血糖数値を減少させなかった（図７Ｂ）。次に、８周齢の雄マウスの尻尾静脈内にＬＰＳを単一投与した後、血清内インシュリン数値を測定し、その結果血糖数値が統計的に有意に減少したが、このような効能は血液内インシュリン数値の変化によるものではない（図７Ｃ）。次いで、本発明者らはＬＰＳをストレプトゾトキシン（ＳＴＺ）−処理されたインシュリン欠乏マウスに投与し、その結果ＬＰＳが血糖濃度を顕著に減少させ、このような効果はインシュリンを投与した結果と類似していた（図７Ｄ）。このような結果からＬＰＳは血糖数値を濃度−依存的に阻害させ、インシュリン分泌に影響を与えず、特にインシュリンが欠乏したタイプＩ糖尿病マウスモデルで糖を調節する効能があった。全ての動物は水を自由に摂取し、国際的な指針にしたがって保護された。全てのデータは平均±標準誤差で示した（ｎ=５−６）。*Ｐ＜０．０５。
【００７４】
［実施例７］３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖吸収に対するＬＰＡの効能
（７−１）３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖吸収に対するＬＰＡの効能
ＬＰＣと関する実施例と実質的に同様な方法で３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞でＬＰＡの効能を調査し、その結果を図８Ａ及び８Ｂに示した。糖吸収に対するＬＰＡの効能を調査するために３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を多様な濃度の標準ＬＰＡの存在下で時間に応じて培養した。ＬＰＡは３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で時間及び濃度に応じて糖吸収の増加を促進させた。糖吸収に対するＬＰＡの初期の統計的な有効量は１μＭであり、最適の有効量は２０μＭで確認された（図８Ａ）。２０μＭのＬＰＡに処理する場合、１０分後に糖吸収が最大に増加した（図８Ｂ）。図９Ａは６−ウォールプレートで増殖させた３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に糖のないＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ溶液で１時間平衡化させ、ＬＰＡ（０乃至２０μＭ）またはインシュリン（１０ｎＭ）を１０分間処理した後、物質方法に記述されたように[１４Ｃ]２−デオキシ−Ｄ−グルコース吸収率を１０分間の測定した結果を示したものであり、図９Ｂは３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞にＬＰＡ（２０μＭ）を０乃至２０分間処理及び培養した結果を示したものである。
【００７５】
（７−２）ＬＰＡによる糖吸収促進の信号伝達メカニズム
ＬＰＣと関する実施例と実質的に同様な方法で３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞でＬＰＡの効能を調査し、その結果を図９Ａ及び９Ｂ、図１０Ａ及び１０Ｂに示した。ＬＰＡがその受容体を通じて糖吸収に影響を与えるかどうかを調査するために、本発明者らはＬＰＡ受容体拮抗剤であるＫｉ１６４２５を用いた。図９ＡはＬＰＡによって促進された糖吸収がＫｉ１６４２５前処理によって完全に抑制されることを示したものである。次いで、本発明者らはＬＰＡがＧαｉ抑制剤である百日咳毒素（ｐｅｒｔｕｓｓｉ ｔｏｘｉｎ）を用いてＧαｉと結合したＬＰＡ受容体を活性化するかどうかを調査した。
【００７６】
図９ＢはＬＰＡがＧαｉを活性化させて糖吸収を促進することを示したものである。
インシュリンがＰＩ３−キナーゼ依存型信号伝達経路を通じて糖吸収を促進するということはよく知られているので、このような信号伝達経路を通じてＬＰＡが糖吸収を促進するかどうかを調査するために、本発明者らはＰＩ３−キナーゼの下位信号であるＡＫｔを確認し、その結果ＡｋｔがＬＰＡによって影響を受けることを確認した。図１０ＡはＬＰＡがＡｋｔ燐酸化を促進していることを示したもので、このような燐酸化はＰＩ３−キナーゼ抑制剤であるＬＹ２９４００２前処理を通じて抑制された。次いで、ＬＰＡがＰＩ３−キナーゼ信号伝達経路を通じて実質的に糖吸収を促進するかどうかを調査するために本発明者らは３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞にＬＹ２９４００２を前処理し、糖吸収を測定した。図１０ＢはＬＰＡによって促進された糖吸収がＰＩ３−キナーゼ活性に依存的であることを示したものである。
【００７７】
（７−３）マウスモデルでＬＰＡの糖阻害効能
ＬＰＣと関する実施例と実質的に同様な方法で動物モデルでＬＰＡの糖−阻害効能を調査し、その結果を図１１Ａ乃至１１Ｄに示した。
【００７８】
図１１Ａ乃至１１Ｂはマウスモデルで尻尾静脈内に投与されたＬＰＡの糖阻害効能を示したものである。８周齢の雄マウスにＰＢＳ、インシュリン、ＬＰＡを尻尾静脈内に投与し、血糖は投与後モニターした（０乃至１２０分）。図１１Ａは８周齢の雄マウスの尻尾静脈内にＬＰＡを単一投与した後に血清内インシュリン数値を示したもので、ＬＰＡは正常マウスで濃度−依存的に血糖数値を減少させた。Ｓ１Ｐ及びＬＰＥのような他のリゾリン脂質は正常マウスで血糖数値を減少させなかった（図１１Ｂ）。このような効能は血液内インシュリン数値の変化によるものではない（図１１Ｃ）。
【００７９】
最後に、本発明者らはＬＰＡによる糖阻害効能がＬＰＡ受容体の活性に依存的であるかどうかを調査しようとした。ＬＰＡを投与する前、ＬＰＡ受容体抑制剤であるＫｉ１６４２５を投与した。図１１ＤはＬＰＡによって促進された糖吸収がＬＰＡ受容体抑制剤によって抑制されることを示したものである。このような結果から、ＬＰＡは血糖数値を濃度−依存的に阻害させ、インシュリン分泌に影響を与えず、特に、ＬＰＡによる血糖阻害はＬＰＡ受容体活性と関していた。全ての動物は水を自由に摂取し、国際的な指針にしたがって保護された。全てのデータは平均±標準誤差で示した（ｎ=５−６）。*Ｐ＜０．０５。
【００８０】
［実施例８］ｈＩＲｃＢ細胞でＩＲ自動燐酸化に対するＵＣＮの効能
物質:Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）はＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社から購入し、牛胎児血清（ＦＢＳ）及び馬血清（ＥＳ）はＨｙＣｌｏｎｅ社（Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）から購入した。コルチコトロフィン放出因子（ＣＲＦ）、ウロコルチン（ＵＣＮ）、ストレスコルピン防虫ペプチド（ＳＲＰ）及びストレスコルピンはアニゲン（光州、韓国）で合成し、ホスホ−インシュリン受容体抗体、ＩＲＳ抗体、ＩＲ抗体及びＡＫＴ抗体はセルシグナル社（ビーバーリ、ＭＡ）から購入し、[１４Ｃ]２−デオキシ−Ｄ−グルコースはモラベック（マーキュリー、ＣＡ）から購入した。その他の全ての試薬はシグマ（セントルイス、ＭＯ）から入手した。
【００８１】
免疫反応を含む全ての実験は独立的に少なくとも３回反復実施し、本発明の免疫反応は３回以上の独立的な実験の中で代表的なものである。定量的なデータは平均±標準誤差で表記し、”Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓｔテスト”を適切に使用した。Ｐ＜０．０５は統計的有意性があることを意味する。
【００８２】
図１２Ａは１ｍＭのＣＲＦ類及び/または２ｎＭのインシュリンまたは培地単独を１分間処理して培養した細胞から収得したＣＲＦ類の中でインシュリンに対する敏感性を比較した結果を示したものである。インシュリンに対するＵＣＮの敏感性は濃度（１２Ｂ、１２Ｃ）及び時間（１２Ｄ）によって増加した。図１２Ｂは２ｎＭのインシュリン及び多様な濃度のＵＣＮ（２ｎＭ乃至１ｍＭ）を１分間処理して培養した細胞から得られた結果であり、図１２Ｃは１００ｎＭ及び多様な濃度のインシュリンを１分間処理して培養した細胞から得られた結果である。ＩＲの燐酸化は抗−ｐＴｙｒ抗体を用いた“ウェスタンブロット”で分析した。図１３Ｄは１００ｎＭのＵＣＮ及び/または１０ｎＭのインシュリンを０、２、１０、３０及び６０分間処理して培養した細胞から得られた結果で、この時、ＩＲの燐酸化は抗−ｐＩＲ抗体を用いた“ウェスタンブロット”で分析した。ＩＲ自動燐酸化の定量はイメージゲージソフトウェア（富士フィルム）を用いて測定した。測定値は３回の独立的な実験から得られた結果を平均±標準誤差で示した値である（ｎ=５−６）。*，Ｐ＜０．０５。
【００８３】
［細胞培養］
ｈＩＲｃＢ細胞は１０％（ｖ/ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭと３７℃、５％の二酸化炭素及び９５％の空気が供給される湿気のある空気条件で維持されたまま増殖した。
【００８４】
［免疫沈澱及び免疫反応］
指示された時間及び濃度でリガンドを処理した後、細胞を冷たいＰＢＳで洗浄してプロテアーゼ抑制剤（０．５ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍｇ/ｍｌのロイペプチン及び５ｍｇ/ｍｌのアプロチニン）及びフォスファターゼ抑制剤（３０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４及び３０ｍＭのＮａ４Ｏ７Ｐ２）を含む粉砕溶液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のトリトンＸ−１００，１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロール）内で粉砕した。粉砕された前記細胞粉砕物を４℃で１時間反応させて１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、同量の液状抽出物を５ｍｇ抗−ＩＲ抗体及び３０ｍｌレジン体積の固定蛋白質Ａと共に４時間反応させた。ゲル電気泳動を行うために前記沈殿物をレムルリサンプル溶液と混合してＳＤＳ−ＰＡＧＥから分離した後、ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ社、ＢＡ８５）に伝達した。ブロッキングは５％の脱脂乳パウダーを含むＴＴＢＳ溶液（１０ｍＭのＴｒｉｓ/ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で行い、前記膜を３時間室温で１次抗体と反応させた。次いで、前記防止する洗浄して西洋ワサビ過酸化水素−結合された２次抗体と１時間室温で反応させた後、ＴＴＢＳ溶液で４回洗浄し、西洋ワサビ過酸化水素−依存型化学発光試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）で発色した。
【００８５】
本実施例でウロコルチン（ＵＣＮ）及びコルチコトロピンフィン放出因子（ＣＲＦ）はＩＲ過発現されたｈＩＲｃＢ細胞で他の類、つまり、ストレス−関連ペプチド（ＳＲＰ）及びストレスコルピン（ＳＣＰ）に比べてインシュリンによるＩＲ燐酸化に優勢に作用していることを確認した（図１２Ａ）。ＵＣＮ及びＣＲＦ単独はＩＲ燐酸化にいかなる影響も与えなかった。ＵＣＮ及びＣＲＦがインシュリンによるＩＲ燐酸化に優勢に作用するとしてもＵＣＮはＣＲＦに比べてＣＲＦ受容体１（ＣＲＦＲ１）により高い親和性を持っている。ＵＣＮによって誘導されたインシュリンによるＩＲ燐酸化は濃度（図１２Ｂ）及び時間（図１２Ｄ）に応じて促進された。特に、図１２Ｃに示したようにＩＲ燐酸化に対するＵＣＮの効能は低濃度のインシュリン存在下でさらに強力であるが、これはＵＣＮがｈＩＲｃＢ細胞で特異的にインシュリンによるＩＲ燐酸化に敏感に反応するためである。
【００８６】
［実施例９］Ｃ２Ｃ１２繊維亜細胞で糖吸収及びＩＲ燐酸化に対するＵＣＮの効能
ＵＣＮはインシュリンによって誘導された糖吸収及びＩＲ燐酸化、ＩＲＳ及びＡｋｔを促進させた。繊維亜細胞は２ｎＭのＵＣＮ及び/または多様なインシュリン濃度（０乃至２０ｎＭ）で１分間培養され、ＩＲＳ及びＡｋｔの燐酸化は抗−ｐＩＲＳ抗体及び抗−ｐＡｋｔ抗体を用いたウェスタンブロットで分析した。糖吸収は下記のように行った。
【００８７】
［細胞培養］
Ｃ２Ｃ１２細胞は１０％（ｖ/ｖ）のＦＢＳを含むＤＭＥＭと３７℃、５％の二酸化炭素及び９５％の空気が供給される湿気のある空気条件で維持されたまま増殖した。Ｃ２Ｃ１２細胞の分化のために増殖用培地を２％（ｖ/ｖ）のＥＳを含むＤＭＥＭで変えて７日間培養した。
【００８８】
［糖吸収分析］
細胞を分化させた後、細胞を洗浄して１３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１．３ｍＭのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．３ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．４を含む２ｍｌのＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＫＲＰ）で３時間培養した。糖吸収に対するＵＣＮの効能を分析するために指示された条件で１ｍｌのＫＲＰで１０分間培養して行った。前記反応は[１４Ｃ]２−ＤＧ（１ｍＣｉ/ｍｌ）及び非−放射能２−ＤＧ（最終濃度:２０ｍＭ）の混合物を１０分間添加して行い、溶媒を除去した後に冷たい燐酸緩衝溶液（水１Ｌに８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、１．１５ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ及び０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４を含むＰＢＳ）で急速に２回洗浄した。細胞−連関放射能は１ＮのＮａＯＨで細胞を粉砕した後、閃光係数で測定し、非特異的な吸収率は全体吸収率値から特異的な吸収率の値を除いて測定した。
【００８９】
免疫沈澱及び免疫反応は実施例８の方法によって行った。
ＩＲ活性は筋肉で糖吸収に中枢的な役割を担当すると知られており、ＵＣＮはインシュリンによるＩＲ活性化を促進させて糖吸収を調節すると見なされている。これを確認するために本発明者らはＣ２Ｃ１２繊維亜細胞で糖吸収及びインシュリンによる信号伝達を調査した。ＵＣＮの存在下でインシュリンによるＩＲ燐酸化は強化され、インシュリンによる糖吸収もまた顕著に増加したが（図１３）、ＵＣＮ単独ではこのような効果が現れなかった。このような結果はＵＣＮがＣ２Ｃ１２繊維亜細胞でインシュリンによって促進された糖吸収に優勢に作用してインシュリン−媒介信号伝達経路でインシュリンの敏感化剤として作用して誘導されたものであると言える。
【００９０】
［実施例１０］正常及びＳＴＺ−マウスで原形質糖調節に対するＵＣＮの効能
ＵＣＮはＨＰＡ軸を促進させて血糖を強化させる強化剤としてよく知られており、ＵＣＮの生体内機能は血糖数値を抑制するという本発明の生体内結果とは相反する。したがって、これらの間の不一致を区別するために本発明者らはマウスに多様な濃度のＵＣＮを投与し、血糖数値の変化を調査した。
【００９１】
図１４ＡはＩＣＲマウスでＵＣＮによって減少した血糖を示したものであり、挿入された免疫反応データは骨格筋でＵＣＮによるＩＲ燐酸化を示したものである。マウスにビヒクル（０．１％のＢＳＡを含む食塩水）またはＵＣＮ（０．１−１００ｐＭ）を尻尾静脈内に投与し、測定値は４匹の対照群及び４匹のＵＣＮ−処理されたマウスから得られた結果を平均±標準誤差で示した値である。図１４ＢはＳＴＺマウスでＵＣＮによって減少した血糖を示したものであり、挿入された免疫反応データはＳＴＺマウスの骨格筋でＵＣＮ処理によるＩＲ燐酸化を示したものである。マウスにビヒクル（０．１％のＢＳＡを含む食塩水）、ＵＣＮ（０．１ｐＭ）及び/またはインシュリン（１ｎＭ）を尻尾静脈内に投与し、糖の原形質数値を４５分間測定した。測定値は６匹の各群から得られた結果を平均±標準誤差で示した値である。*，Ｐ＜０．０５。
【００９２】
（１０−１）試験動物準備
正常試験動物を準備するために体重が２０〜２５ｇで８周齢の雄ＩＣＲ（癌研究学会）マウスをヒョチャン科学から購入し、温度及び光が調節された部屋（２０〜２２℃;１２時間の照明と１２時間の暗黒サイクル;午前７時に照明開始）にあるケージ内で４日間適応させ、一般的な平常時食事と水を自由に供給した。動物実験の手続は実験動物使用及び管理に関する韓国政府の指針にしたがって行われた。生体内実験で一晩断食させたマウスに０．１％のＢＳＡを含む食塩水またはＵＣＮを尻尾静脈内に投与した後、糖分析器（モデルＡＧＭ−２１００，ａｌｍｅｄｉｃｕｓ社、安養、韓国）を用いて時間に応じる原形質糖を測定した。
【００９３】
ＳＴＺ−マウスを準備するために体重が２０〜２５ｇで８周齢の雄ＩＣＲ（癌研究学会）マウスをヒョチャン科学から購入した。ＳＴＺによって誘導された糖尿病マウスは１日間断食させた雄ＩＣＲマウスにＳＴＺ（シグマ社、セントルイス、ＭＯ）（７５ｍｇ/ｋｇ）を尻尾静脈内に投与して準備し、翌日ＳＴＺをさらに一回投与した。原形質濃度が２８０ｍｇ/ｄｌであるマウスをタイプＩ糖尿病を有するマウスに決めた。全ての試験はＳＴＺ投与した後、３日間行った。
【００９４】
（１０−２）マウス骨格組織でＩＲ信号伝達分析
一晩断食させたマウスに作用剤を尻尾静脈内に投与して１５分後に殺した後、ヒラメ筋（ｓｏｌｅｕｓ ｍｕｓｃｌｅ）を迅速に切開して液体窒素で凍結させた。細胞粉砕物はプロテアーゼ抑制剤（０．５ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍｇ/ｍｌのロイペプチン及び５ｍｇ/ｍｌのアプロチニン）及びフォスファターゼ抑制剤（３０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４及び３０ｍＭのＮａ４Ｏ７Ｐ２）を含む粉砕溶液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のトリトンＸ−１００、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロール）内で前記組織を均質化して準備した。破片は４℃、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して除去し、免疫沈澱及びウェスタンブロットは前記で記述された方法で行った。
【００９５】
予想の通り１００ｐＭ以上のＵＣＮを単独処理すると血糖数値を増加させたが、興味深く０．１ｐＭのＵＣＮを単独処理すると血糖数値を減少させた。生体内システムと反対に血液内には基底インシュリンが存在するために本発明者らはＵＣＮがマウスで基底血中インシュリンを有することによって糖阻害効能を有し、ＨＰＡ軸はピコモル以下の濃度では活性化しないと予想した。また、ＵＣＮがインシュリン分泌を調節することができ、インシュリンに独立的に血糖数値を阻害することができるといういくつかの可能性もある。したがって、本発明者らはインシュリン−媒介生理学でＵＣＮの機能を調査するためにインシュリン−欠乏モデルシステムであるストレプトゾトキシン（ＳＴＺ）−処理されたマウスを用いた。
【００９６】
図１４Ｂに示したように、ＵＣＮを単独処理すると血糖数値変化にいかなる影響も与えなかった。これはＵＣＮが血糖数値調節でインシュリンと独立的に作用しないことを意味する。しかし、ＵＣＮを不活性濃度のインシュリンと共にＳＴＺ−マウスに投与する場合、血糖数値が顕著に減少した。このような結果はマウス骨格筋でのＩＲ燐酸化と非常に密接な関係があり、ＵＣＮはマウス骨格筋でインシュリンによって誘導されたＩＲ燐酸化に非常に敏感に反応した。このような結果はウロコルチンもまた生体内でインシュリンに敏感な効能を有していることを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１Ａ】図１Ａは、血清から新規の糖吸収促進剤を特定したことを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、血清から新規の糖吸収促進剤を特定したことを示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、血清から新規の糖吸収促進剤を特定したことを示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、血清から新規の糖吸収促進剤を特定したことを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖吸収を促進するＬＰＣの効能を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖吸収を促進するＬＰＣの効能を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖吸収を促進するＬＰＣの効能を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で糖吸収を促進するＬＰＣの効能を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞でＧＬＵＴ４の転座を促進するＬＰＣを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞でＧＬＵＴ４の転座を促進するＬＰＣを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ＰＫＣδを活性化して糖吸収を促進するＬＰＣを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＰＫＣδを活性化して糖吸収を促進するＬＰＣを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、正常マウスとタイプＩ及びタイプＩＩ糖尿病マウスモデルでそれぞれ尻尾静脈内に投与されたＬＰＣの抗−糖尿効果を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、正常マウスとタイプＩ及びタイプＩＩ糖尿病マウスモデルでそれぞれ尻尾静脈内に投与されたＬＰＣの抗−糖尿効果を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、正常マウスとタイプＩ及びタイプＩＩ糖尿病マウスモデルでそれぞれ尻尾静脈内に投与されたＬＰＣの抗−糖尿効果を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、正常マウスとタイプＩ及びタイプＩＩ糖尿病マウスモデルでそれぞれ尻尾静脈内に投与されたＬＰＣの抗−糖尿効果を示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、正常マウスとタイプＩ及びタイプＩＩ糖尿病マウスモデルでそれぞれ尻尾静脈内に投与されたＬＰＣの抗−糖尿効果を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で特異的に糖吸収を促進するＬＰＳを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で濃度による糖吸収を促進するＬＰＳを示す。
【図７Ａ】図７Ａは、正常マウス及びタイプＩ糖尿病マウスモデルで血糖数値を下げるＬＰＣを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、正常マウス及びタイプＩ糖尿病マウスモデルで血糖数値を下げるＬＰＣを示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、正常マウス及びタイプＩ糖尿病マウスモデルで血糖数値を下げるＬＰＣを示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、正常マウス及びタイプＩ糖尿病マウスモデルで血糖数値を下げるＬＰＣを示す。
【図８Ａ】図８Ａは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で濃度及び時間による糖吸収を促進するＬＰＡを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で濃度及び時間による糖吸収を促進するＬＰＡを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞でＬＰＡ受容体及びＧαｉを活性化させて糖吸収を促進するＬＰＡを示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞でＬＰＡ受容体及びＧαｉを活性化させて糖吸収を促進するＬＰＡを示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞でＰＩ３−キナーゼ依存型信号伝達経路を通じて糖吸収を促進するＬＰＡを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞でＰＩ３−キナーゼ依存型信号伝達経路を通じて糖吸収を促進するＬＰＡを示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、正常マウスでＬＰＡ受容体を活性化させて血糖数値を下げるＬＰＡを示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、正常マウスでＬＰＡ受容体を活性化させて血糖数値を下げるＬＰＡを示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、正常マウスでＬＰＡ受容体を活性化させて血糖数値を下げるＬＰＡを示す。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、正常マウスでＬＰＡ受容体を活性化させて血糖数値を下げるＬＰＡを示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ｈＩＲｃＢ細胞でＩＲ自動燐酸化に対するＵＣＮの効能を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ｈＩＲｃＢ細胞でＩＲ自動燐酸化に対するＵＣＮの効能を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ｈＩＲｃＢ細胞でＩＲ自動燐酸化に対するＵＣＮの効能を示す。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、ｈＩＲｃＢ細胞でＩＲ自動燐酸化に対するＵＣＮの効能を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、Ｃ２Ｃ１２繊維亜細胞でＩＲ燐酸化及び糖吸収に対するＵＣＮの効能を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、Ｃ２Ｃ１２繊維亜細胞でＩＲ燐酸化及び糖吸収に対するＵＣＮの効能を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、正常マウス及びＳＴＺマウス血糖調節に対するＵＣＮの効能を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、正常マウス及びＳＴＺマウス血糖調節に対するＵＣＮの効能を示す。
【図１Ａ】
2009500401.tif 000004
【図１Ｂ】
2009500401.tif 000005
【図１Ｃ】
2009500401.tif 000006
【図１Ｄ】
2009500401.tif 000007
【図２Ａ】
2009500401.tif 000008
【図２Ｂ】
2009500401.tif 000009
【図２Ｃ】
2009500401.tif 000010
【図２Ｄ】
2009500401.tif 000011
【図３Ｂ】
2009500401.tif 000012
【図４Ａ】
2009500401.tif 000013
【図４Ｂ】
2009500401.tif 000014
【図５Ａ】
2009500401.tif 000015
【図５Ｂ】
2009500401.tif 000016
【図５Ｃ】
2009500401.tif 000017
【図５Ｄ】
2009500401.tif 000018
【図５Ｅ】
2009500401.tif 000019
【図６Ａ】
2009500401.tif 000020
【図６Ｂ】
2009500401.tif 000021
【図７Ａ】
2009500401.tif 000022
【図７Ｂ】
2009500401.tif 000023
【図７Ｃ】
2009500401.tif 000024
【図７Ｄ】
2009500401.tif 000025
【図８Ａ】
2009500401.tif 000026
【図８Ｂ】
2009500401.tif 000027
【図９Ａ】
2009500401.tif 000028
【図９Ｂ】
2009500401.tif 000029
【図１０Ｂ】
2009500401.tif 000030
【図１１Ａ】
2009500401.tif 000031
【図１１Ｂ】
2009500401.tif 000032
【図１１Ｃ】
2009500401.tif 000033
【図１１Ｄ】
2009500401.tif 000034
【図１２Ｃ】
2009500401.tif 000035
【図１２Ｄ】
2009500401.tif 000036
【図１３Ｂ】
2009500401.tif 000037
【図１４Ａ】
2009500401.tif 000038
【図１４Ｂ】
2009500401.tif 000039
【図３Ａ】
2009500401.tif 000040
【図１０Ａ】
2009500401.tif 000041
【図１２Ａ】
2009500401.tif 000042
【図１２Ｂ】
2009500401.tif 000043
【図１３Ａ】
2009500401.tif 000044
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月22日(2008.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リソフォスファチジルコリン（ＬＰＣ）、リゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ）、リソホスファチジン酸（ＬＰＡ）及びウロコルチン（ＵＣＮ）からなる群の中から選択されたいずれかの化合物を含むことを特徴とする糖吸収調節剤。
【請求項２】
ＬＰＣに対する糖吸収調節はＰＫＣδ抑制剤であるロットレリン及びＰＫＣδの優性陰性的発現によって阻害され、ＰＩ３−キナーゼ依存型信号伝達経路に独立的であることを特徴とする、請求項１に記載の糖吸収調節剤。
【請求項３】
前記リソフォスファチジルコリンはミリストイルＬＰＣまたはパルミトイルＬＰＣであることを特徴とする、請求項１に記載の糖吸収調節剤。
【請求項４】
ウロコルチンはインシュリンと共にインシュリン−敏感化剤として作用することを特徴とする、請求項１に記載の糖吸収調節剤。
【請求項５】
リソフォスファチジルコリン、リゾホスファチジルセリン、リソホスファチジン酸及びウロコルチンからなる群の中で選択された少なくともいずれか１つの糖吸収調節剤を含むことを特徴とする薬学的組成物。
【請求項６】
薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤をさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
インシュリン分泌強化剤、ビグアナイド剤及びα−グルコシダーゼ抑制剤からなる群の中で選択された少なくともいずれか１つの化合物をさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記糖吸収調節剤はインシュリンと混合して使用されることを特徴とする請求項５に記載の、薬学的組成物。
【請求項９】
前記組成物は糖尿病または糖尿病合併症の治療用であることを特徴とする、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記糖尿病はインシュリン−依存型糖尿病またはインシュリン−非依存型糖尿病であることを特徴とする、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記糖尿病合併症は肥満、高脂血症、動脈硬化症、高血圧または心臓病であることを特徴とする、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記ウロコルチンはインシュリンと混合して投与されることを特徴とする、請求項９に記載の薬学的組成物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は糖吸収調節剤及びこれを含む薬学的組成物に関するものである。
【国際調査報告】
2009500401.tif 000045
2009500401.tif 000046
2009500401.tif 000047