(57)【要約】  標的相補的セグメントおよび検出可能タグを有するプローブを利用する、標的ポリヌクレオチド配列を検出するための方法が提供される。該検出可能タグを開裂し、該タグを、電極に結合したタグ相補体と結合させることによって、タグ:タグ相補体複合体の存在に関連している電気化学的シグナルを検出することができる。
2009501532.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的相補的セグメントおよび検出可能タグを含むプローブがプローブ-標的複合体を形成するのに有効な条件下で、前記プローブを、少なくとも1種の標的ポリヌクレオチド配列を含むサンプルに接触させるステップと、
前記検出可能タグを前記プローブから開裂するステップと、
遊離した前記タグを電極に結合しているタグ相補体と会合させて、前記電極において、固定化タグ:タグ相補体複合体を形成するステップと、
前記タグ:タグ相補体複合体の存在に関連している電気化学的シグナルを検出するステップと、
前記検出シグナルを、前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチド配列の存在に関連付けるステップとを含む、標的ポリヌクレオチド配列を検出する方法。
【請求項２】
前記検出シグナルを前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチド配列の量に関連付けるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記検出可能タグの開裂が、前記検出可能タグの酵素的開裂を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記開裂が、前記ハイブリダイズしたプローブのヌクレアーゼ酵素による開裂を含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記プローブがプライマー伸長の間に開裂される方法であって、ポリメラーゼ連鎖反応によって前記標的配列を増幅するステップをさらに含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記開裂が、DNAポリメラーゼ酵素の5'ヌクレアーゼ活性によって媒介される、請求項3から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記プローブがRNAセグメントを含み、前記開裂が前記プローブ-標的複合体をRNアーゼH活性を有する酵素と組み合わせるステップを含む、請求項3から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第2のプローブと前記標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイズするステップと、
第2の検出可能タグを、前記ハイブリダイズしたプローブから開裂するステップと
をさらに含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記遊離した検出可能タグが、非標的相補的ポリヌクレオチド配列を含み、前記タグ相補体が、前記非標的相補的ポリヌクレオチド配列に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記遊離した検出可能タグが、L-DNAポリヌクレオチド配列を含み、前記タグ相補体が、前記遊離した検出可能タグ内のL-DNAポリヌクレオチド配列に相補的なL-DNAポリヌクレオチド配列を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記タグ:タグ相補体複合体における二本鎖領域に会合している電気化学的メディエーターを用いて、前記電気化学的シグナルを生成させる、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記遊離した検出可能タグが、前記タグ相補体と複合体を形成することができるポリヌクレオチド部分を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記遊離した検出可能タグが、前記タグ相補体と複合体を形成することができる非ポリヌクレオチド部分を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記非ポリヌクレオチド部分が負に荷電しており、前記タグ相補体が正に荷電している、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記タグ相補体がポリカチオン性部分を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリカチオン性部分が複数の正に荷電した窒素含有複素環部分を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記非ポリヌクレオチド部分が1つまたは複数のスルフヒドリル基を含み、前記タグ相補体が金を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１８】
前記非ポリヌクレオチド部分がポリアニオン性部分を含み、前記電気化学的シグナルが、前記ポリアニオン性部分に静電気的に結合しているポリカチオン性電気化学的メディエーターを用いて生成される、請求項13に記載の方法。
【請求項１９】
前記開裂が前記タグ相補体の不在下で実施される、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記接触が、各々が別個の標的ポリヌクレオチド配列に相補的な複数のプローブと前記サンプルを接触させるステップを含み、前記検出が、少なくとも2種の異なる標的配列を検出するステップを含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記プローブの濃度が800nM以下である、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
複数のミクロ流体チャンバーおよびそれらの中に製造されたチャネルを有する基体;
前記基体表面に接着しているカバー;
少なくとも1種の標的ポリヌクレオチド配列を含有するサンプルを受けるために構成された入口;
標的相補的セグメントおよび検出可能タグを含むプローブを、前記サンプルに接触させるために構成された1つまたは複数のチャンバー;
前記サンプルを温度制御に供し、前記プローブから前記検出可能タグを開裂し、電極に結合しているタグ相補体に前記遊離したタグを会合させて、固定化タグ:タグ相補体複合体を形成するために構成された1つまたは複数のチャンバー;および
前記タグ:タグ相補体複合体の存在に関連している電気化学的シグナルを検出し;前記検出されたシグナルを、前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチド配列の存在に関連付けるために構成された計器装置
を含む、請求項1から21のいずれか一項に記載の、標的ポリヌクレオチド配列を検出するためのミクロ流体装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、本明細書に各々参照として組み込まれている、2005年7月15日出願の米国仮特許出願第60/699,950号;および2005年12月9日出願の米国仮特許出願第60/749,003号の米国特許法第119条に基づき、およびそれらの下での優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
核酸検出は、種々のアッセイ様式によって実施できる。このようなアッセイは、例えば、生物学的サンプルを評価するために使用される場合、定性的であり得る。しかし、煩わしいブロッティング法、または光学的方法で典型的に必要とされる高価で繊細な装置を要することなく標的核酸を検出することができることによって、多種多様の生物学的適用が改善できると考えられる。
【特許文献１】米国仮特許出願第60/699,950号
【特許文献２】米国仮特許出願第60/749,003号
【特許文献３】国際公開第98/39352号
【特許文献４】国際公開第99/14226号
【特許文献５】国際公開第00/56746号
【特許文献６】国際公開第99/60855号
【特許文献７】米国特許第5,210,015号
【特許文献８】米国特許第5,487,972号
【特許文献９】米国特許第5,985,557号
【特許文献１０】米国特許第5,994,069号
【特許文献１１】米国特許第6,090,543号
【特許文献１２】米国特許第6,511,810号
【特許文献１３】米国特許第5,403,711号
【特許文献１４】米国特許第5,011,769号
【特許文献１５】米国特許出願公開第2005/0112631号
【特許文献１６】PCT国際公開第03/072805号
【特許文献１７】米国特許第5,869,245号
【特許文献１８】米国特許第5,698,400号
【特許文献１９】米国特許第5,538,848号
【特許文献２０】欧州特許第733058号
【特許文献２１】欧州特許第871642号
【特許文献２２】PCT国際公開第98/20162号
【特許文献２３】米国特許第5,296,375号
【特許文献２４】米国特許第5,498,392号
【特許文献２５】国際公開第93/22053号
【特許文献２６】米国特許第5,455,175号
【特許文献２７】米国特許第5,262,035号
【非特許文献１】Koshkinら、Tetrahedron 54:3607-30頁(1998)
【非特許文献２】Piepenburgら(PLoS Biology 4:1115-1121頁(2006))
【非特許文献３】Tansilら(Anal.Chem.2005年、77(1)、126-134頁)
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本記載は標的ポリヌクレオチド配列を検出するシステムの方法に関するものである。該方法は、それ自体標的に相補的なセグメントおよび検出可能なタグを含むプローブがプローブ-標的複合体を形成するのに有効な条件下で、少なくとも1種の標的ポリヌクレオチド配列を含むサンプルに、該プローブを接触させることを含み得る。次いで、該検出可能タグを該プローブから開裂させ、次に、該遊離タグを、電極に結合しているタグ相補体と会合させ得る。固定化されたタグ:電極に固定化されたタグ相補体複合体によって検出される電気化学的シグナルは、該サンプル中の標的ポリヌクレオチド配列の存在に関連し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
いくつかの実施形態において、本記載は核酸の増幅物を検出する方法を含む。該方法では、図1を参照すると、増幅プローブ10が、ポリヌクレオチド増幅法に関するアンプリコンテンプレート、または標的であるポリヌクレオチド配列12にハイブリダイズされる。増幅プローブ10は、相補的ポリヌクレオチド配列14および1種以上の検出タグ16を含む。増幅過程の間に、酵素作用により、該相補的配列から1種以上の検出タグが開裂される。次に、図1に示されるように、開裂された検出タグの検出によって、開裂事象が検出される（したがって、アンプリコンテンプレートの複製が検出される）。
【０００５】
本明細書で用いられる「ハイブリダイゼーション」とは、2つのポリヌクレオチド配列が会合して、2つの配列における塩基間の水素結合を介して安定な二本鎖構造を形成することを言う。これら2つの配列が完全におよび正確に相補的でなくても、得られたハイブリッドが標準的な実験室条件下で安定である十分な相補性の領域をこれらの配列が含むならば、ある配列は第2の配列に「相補的」と考えることができる。アンプリコンテンプレートに対して少なくとも実質的に選択的なハイブリダイゼーションを行うことのできる任意の相補的配列が、本発明の方法にとって好適な相補的配列である。典型的に相補的配列は、ヌクレオチドおよび/またはそれらの類縁体からなり、増幅プローブに対して少なくともいくらかの結合特異性を与える上で十分な長さを有する。相補的配列としては、RNAもしくはDNA、またはそれらの混合物もしくはハイブリッドを挙げることができる。相補的配列としては、天然核酸ポリマー(出所が生物学的)または合成核酸ポリマー(人工的に修飾または調製された)を挙げることができる。
【０００６】
相補的配列は、任意の好適な天然および/または人工的構造を有し得る。核酸はホスホジエステル主鎖を含み得、その結果、該核酸は中性pHの水溶液中、負の電荷を有する。ホスホジエステル主鎖は一般に、糖部分とリン酸エステル部分とが交互にある糖-リン酸エステル主鎖を含み、各糖部分にはヌクレオチド塩基(一般に、プリン基またはピリミジン基)が結合している。とりわけ、リボース(RNAでは)、デオキシリボース(DNAでは)、アラビノース、ヘキソース、2'-フルオロリボース、および/または糖の構造的類縁体など、任意の糖(類)が該主鎖に含まれ得る。本教示の核酸検体および/またはプローブは、任意の好適な代替主鎖を含む類縁体であり得る。代表的な代替主鎖は、ホスホジエステル主鎖より少なく負に荷電し得、実質的に非荷電(正にも負にも荷電していない)であり得る。代表的な代替主鎖としては、ホスホルアミド類、ホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、O-メチルホスホロアミダイト類、ペプチド核酸(N-(2-アミノエチル)グリシン主鎖単位を含む)、ロックド核酸(例えば、各々参照として本明細書に組み込まれている、Koshkinら、Tetrahedron 54:3607-30頁(1998)、国際公開第98/39352号、国際公開第99/14226号、国際公開第00/56746号、および国際公開第99/60855号を参照)、正に荷電した主鎖、非リボース主鎖などを挙げることができる。人工的な主鎖および/または部分を有する核酸は、例えば、総電荷を増加または減少させるため、塩基対の安定性を増加または減少させるため、化学的安定性を増加または減少させるため、試薬による作用を受ける能力を変化させるためなどに好適であり得る。代表的な実施形態において、負電荷を減少させた核酸プローブ(ペプチド核酸など)は、検体の検出に関する光学的要素の感受性を高めるために、ホスホジエステルベースの検体と共に使用できる。
【０００７】
該相補的配列は任意に、1種以上の修飾塩基または結合を含むか、または非共有結合または共有結合している標識を含む。例えば該修飾塩基は、天然の修飾塩基または合成的に変化させた塩基であり得る。該核酸が修飾ヌクレオチド塩基を含む場合、該塩基としては、限定はしないが、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、イノシン、2-アミノアデニン、2-チオチミン、3-メチルアデニン、C5-ブロモウラシル、C5-フルオロウラシル、C5-ヨードウラシル、C5-メチルシトシン、7-デアザアデニン、7-デアザグアニン、8-オキソアデニン、8-オキソグアニン、2-チオシトシン、4-アセチルシチジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン、2'-O-メチルシチジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、2'-O-メチルプソイドウリジン、ベータ-D-ガラクトシルクオイオシン、2'-O-メチルグアノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、1-メチルアデノシン、1-メチルプソイドウリジン、1-メチルグアノシン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアノシン、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、3-メチルシチジン、5-メチルシチジン、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、ベータ-D-マンノシルクオイオシン、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メトキシウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、N-((9-ベータ-D-リボフラノシル-2-メチルチオプリン-6-イル)カルバモイル)トレオニン、N-((9-ベータ-D-リボフラノシルプリン-6-イル)N-メチルカルバモイル)トレオニン、ウリジン-5-オキシ酢酸-メチルエステル、ウリジン-5-オキシ酢酸、ウィブトキソシン、プソイドウリジン、クオイオシン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオシチジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、5-メチルウリジン、N-((9-ベータ-D-リボフラノシルプリン-6-イル)カルバモイル)トレオニン、2'-O-メチル-5-メチルウリジン、2'-O-メチルウリジン、ウィブトシン、3-(3-アミノ-3-カルボキシ-プロピル)ウリジン、および(acp3)uを挙げることができる。
【０００８】
1種以上の検出タグの存在に加えて、該プローブは、例えば、成分の混合物からの非開裂プローブの部分的または完全な除去を促進するために、反応性官能基を含むか、結合物質によって置換することができる。特に、開裂した検出タグからの非開裂プローブの分離を促進するために、該プローブを修飾できる。例えば、相補的プローブを3'端においてビオチンにより修飾することができ、その結果、ストレプトアビジン修飾した表面または基体によって開裂相補的プローブを固定することができる。
【０００９】
開裂した検出タグを検出することによって、標的アンプリコンの複製を検出することができる。本発明の目的に適合性である任意の方法を用いて、プローブ開裂を実施できる。プローブ開裂を実施するための代表的な非限定的な例としては、本明細書でさらに詳述されている5'-ヌクレアーゼ方法論(例えば、Gelfandら、米国特許第5,210,015号および米国特許第5,487,972号)、INVADER (商標)方法論(例えば、Prudentら、米国特許第5,985,557号、米国特許第5,994,069号、および米国特許第6,090,543号)、およびFEN-LCR方法論(例えば、Biら、米国特許第6,511,810号)が挙げられる。INVADERタイプ様式では、標的ポリヌクレオチドにおける隣接配列に結合するオリゴヌクレオチド対であって、第1のオリゴヌクレオチドの標的相補的な部分の3'端が第2のオリゴヌクレオチドの標的相補的な部分の5'端に直に隣接しているか、またはそれと重なっている開裂複合体を形成するオリゴヌクレオチド対が提供される。第1のプローブの標的相補的セグメントの3'末端ヌクレオチドに隣接している5'末端の相補的ヌクレオチドの5'側上の第2のオリゴヌクレオチドを開裂する、5'ヌクレアーゼ活性としても知られているフラップエンドヌクレアーゼ活性を含有する酵素によって、該複合体は認識される。第1のプローブが標的相補的配列の3'端に結合した1種以上の非相補的ヌクレオチドを含有する実施形態では、第2プローブの開裂は、5'末端の相補的ヌクレオチドの3'側で生じる。いくつかの実施形態において、開裂した第2プローブを、新たな非開裂プローブによって置換して、さらなる開裂プローブを作出できる。FEN-LCR法においては、第2のオリゴヌクレオチドが開裂された後、第1と第2のオリゴヌクレオチドは共に結合して、線形または指数関数的な増幅のためのアンプリコンの新たなコピーを作製できる。本発明に有用であり得る他の方法としては、例えば、RNA含有プローブがRNアーゼHによって開裂されるか、またはアベイシックなサブユニットを含有するプローブが、例えば、大腸菌のエンドヌクレアーゼIVなどの適切なエンドヌクレアーゼによって開裂できる、Walder(米国特許第5,403,711号)およびDuck(米国特許第5,011,769号)に開示されているようなプローブ開裂法が挙げられる。プローブ開裂の方法の他の例は、増幅された標的に対する開裂性プローブの結合を含むように修飾された場合、Piepenburgら(PLoS Biology 4:1115-1121頁(2006))および共同研究者(例えば、米国特許出願公開第2005/0112631号およびPCT国際公開第03/072805号)に記載されているようなリコンビナーゼポリメラーゼ増幅法(RPA)である。さらなる開裂法および酵素は、米国特許第5,869,245号(Yeung)および第5,698,400号(Cottonら)にも開示されている。全ての場合に、プローブの開裂によって、1種以上の電気化学的部分、または引き続く検出のための1種以上の結合相手を含む、または本明細書に例示されたものなどの検出可能タグと相互作用する電気化学的部分を用いて検出できる、検出可能タグが作製される。
【００１０】
該検出タグは、1種以上の検出可能標識18を含み得る。検出可能標識とは、検出でき、および/または定量化できる任意の部分を意味する。該検出タグは、直接的または間接的に検出できる。該検出タグが直接検出される場合、該検出タグは任意に、電気化学的部分などの検出可能標識を含む。
【００１１】
あるいは、該検出タグは、例えば、該検出タグとさらなる検出試薬との相互作用によって間接的に検出される。例えば、該検出タグは、標識抗体に対する、ハプテンなどの特異的結合対のメンバー、または相補的配列によって標識されている核酸配列を含み得る。該検出タグは、例えば、電気化学的部分によって標識された抗体に対する標的として使用できるジゴキシゲニン部分を含み得る。さらなる検出試薬が電気化学的部分を含んで、その結果、該試薬と該検出タグとの会合により該検出タグの電気化学的検出を促進することができる。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本発明は、電気化学的検出による標的の増幅を含み、それは任意に、電気化学的部分の存在下で行われる。該電気化学的部分は、検出タグ上の標識として結合され得るか、または検出タグと相互作用する検出試薬として存在し得る。該電気化学的部分は、電極へ、または電極から電子を移すことのできる任意の部分であり得る。該部分の選択は、選択されたプローブの特定の組成に依存する。特に好ましい部分としては、遷移金属錯体が挙げられる。好適な遷移金属錯体としては、例えば、ルテニウム2+(2,2'-ビピリジン)3(Ru(bpy)32+)、ルテニウム2+(4,4'-ジメチル-2,2'-ビピリジン)3(Ru(Me2-bpy)32+)、ルテニウム2+(5,6-ジメチル-1,10-フェナントロリン)3(Ru(Me2-フェン)32+)、鉄2+(2,2'-ビピリジン)3(Fe(bpy)32+)、鉄2+(5-クロロフェナントロリン)3(Fe(5-Cl-フェン)32+)、オスミウム2+(5-クロロフェナントロリン)3(Os(5-Cl-フェン)32+)、オスミウム2+(2,2'-ビピリジン)2(イミダゾリル)、ジオキソレニウム1+ホスフィン、およびジオキソレニウム1+ピリジン(ReO2(py)41+)が挙げられる。部分として有用ないくつかのアニオン錯体は、Ru(bpy)((SO3)2-bpy)22-およびRu(bpy)((CO2)2-bpy)22-および部分として有用ないくつかの両性イオン錯体は、Ru(bpy)2((SO3)2-bpy)およびRu(bpy)2((CO2)2-bpy)であり、式中、(SO3)2-bpy2-は、4,4'-ジスルホナート-2,2-ビピリジンであり、(CO2)2-bpy2-は、4,4'-ジカルボキシ-2,2'-ビピリジンである。ピリジン基、ビピリジン基およびフェナントロリン基の好適な置換誘導体もまた、前記金属のいずれかとの錯体に使用できる。好適な置換誘導体としては、限定はしないが、とりわけ、4-アミノピリジン、4-ジメチルピリジン、4-アセチルピリジン、4-ニトロピリジン、4,4'-ジアミノ-2,2'-ビピリジン、5,5'-ジアミノ-2,2'-ビピリジン、6,6'-ジアミノ-2,2'-ビピリジン、4,4'-ジエチレンジアミン-2,2'-ビピリジン、5,5'-ジエチレンジアミン-2,2'-ビピリジン、6,6'-ジエチレンジアミン-2,2'-ビピリジン、4,4'-ジヒドロキシル-2,2'-ビピリジン、5,5'-ジヒドロキシル-2,2'-ビピリジン、6,6'-ジヒドロキシル-2,2'-ビピリジン、4,4',4''-トリアミノ-2,2',2''-テルピリジン、4,4',4''-トリエチレンジアミン-2,2',2''-テルピリジン、4,4',4''-トリヒドロキシ-2,2',2''-テルピリジン、4,4',4''-トリニトロ-2,2',2''-テルピリジン、4,4',4''-トリフェニル-2,2',2''-テルピリジン、4,7-ジアミノ-1,10-フェナントロリン、3,8-ジアミノ-1,10-フェナントロリン、4,7-ジエチレンジアミン-1,10-フェナントロリン、3,8-ジエチレンジアミン-1,10-フェナントロリン、4,7-ジヒドロキシル-1,10-フェナントロリン、3,8-ジヒドロキシル-1,10-フェナントロリン、4,7-ジニトロ-1,10-フェナントロリン、3,8-ジニトロ-1,10-フェナントロリン、4,7-ジフェニル-1,10-フェナントロリン、3,8-ジフェニル-1,10-フェナントロリン、4,7-ジスペラミン-1,10-フェナントロリン、3,8-ジスペラミン-1,10-フェナントロリン、ジピリド[3,2-a:2',2'-c]フェナジン、および6,6'-ジクロロ-2,2'-ビピリジンが挙げられる。
【００１３】
検出を促進するために、プローブ開裂から生じた検出タグを、非開裂プローブから分離できる。分離工程は、開裂生成物が拡散できるように、検出タグまたは相補的配列のいずれかを所定の位置に係留または結合する、単純な拡散によるものであり得る。代替として、またはそれに加えて、開裂生成物の1つもしくは2つ以上、または非開裂プローブを該反応混合物から機械的に分離することができる。一態様において、該相補的配列は、該反応混合物からの相補的配列、したがって、非開裂プローブの除去を促進するビオチンなどの官能基を含む。該相補的配列がビオチン部分によって官能化されている場合、該反応混合物をストレプトアビジンでコーティングしたビーズと混合すること、または該反応混合物を、例えば、ストレプトアビジン修飾したマトリックスの中を通過させることが、相補的配列および非開裂プローブの捕捉に役立ち、開裂した検出タグの検出を容易にする。
【００１４】
いくつかの実施形態において、該検出タグはタグ配列を含む。該タグ配列はポリヌクレオチドを含み得、相補的配列に関して上記で挙げた任意の核酸組成物を含み得る。いくつかの実施形態において、該タグ配列は、アンプリコンテンプレートにハイブリダイズしないか、または会合しないように選択される。さらに、該タグ配列は典型的に、酵素作用によって開裂される接合部を有する相補的プローブに結合している。該タグ配列は、核酸の増幅、特に、PCRなど、アンプリコンテンプレートの増幅を促進する酵素によって開裂できることが好ましい。例えば、該タグ配列は、DNAポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性によってプローブから容易に開裂される。いくつかの実施形態において、タグ配列と相補的配列の双方がDNA配列である。例えば、該タグ配列は、約14から約40の塩基を含み得る。あるいは、該タグ配列は、約14から約20の塩基を含み得る。本法の特定の態様において、該タグ配列は19塩基長である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、5'-エンドヌクレアーゼ活性または5'-エキソヌクレアーゼ活性を含む酵素、例えばこのような活性を有する、フラップエンドヌクレアーゼまたはDNAポリメラーゼなどを用い、適切なハイブリダイゼーション複合体からフラップ部分を除去して、このようなタグ配列を作製することができる。例えばこのような複合体は、図2に示されたスキームのAに例示された形態を有し得る。
【００１６】
図2にAと称された複合体(「開裂複合体」)は、3'から5'方向が左から右に示された標的配列(「アンプリコンテンプレート」)であるポリヌクレオチド鎖、またはそれを含有するポリヌクレオチド鎖(「標的配列」)を含む。アンプリコンテンプレートの3'側には、複合体Aの左に5'端を有し(マークされていない)3'端を有する上流ポリヌクレオチドがハイブリダイズされる。いくつかの実施形態において、上流ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の間にプライマー伸長によってin situで作製できる。他の実施形態において、上流ポリヌクレオチドは、さらなる修飾または伸長をさせずに、インタクトな種として提供できる。アンプリコンテンプレートの右(5')側には、アンプリコンテンプレートにおける相補的配列にハイブリダイズするテンプレート結合性セグメントと、アンプリコンテンプレートにハイブリダイズしておらず、開裂性プローブのテンプレート結合性セグメントの5'端に結合しているタグ配列(または単に「タグ」)とを含有する開裂性プローブがハイブリダイズする。開裂複合体と上記のものなどの好適な酵素との反応により、アンプリコンテンプレート、上流ポリヌクレオチド、および開裂性プローブのテンプレート結合性セグメントを含む開裂複合体(図2でBと称されている)が提供される。本明細書でさらに検討されているように、引き続いての検出のために、該複合体から遊離できるタグ配列もまた作製される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、タグ配列は、5'ヌクレアーゼポリメラーゼ連鎖反応において作出できる。増幅される二本鎖標的配列の両端に相補的な第1および第2のプライマー（第1のプライマーが、ポリメラーゼ媒介プライマー伸長により、第1のプライマーがハイブリダイズするアンプリコンテンプレート鎖に相補的な鎖の合成を開始でき、第2のプライマーが、ポリメラーゼ媒介プライマー伸長により、アンプリコンテンプレート鎖またはそのコピーの、ポリメラーゼ媒介合成を開始できる）を含む反応混合物が提供される。該反応混合物は、第1および第2のプライマーが結合する配列の間に位置するアンプリコンテンプレートにおける相補的配列に結合するアンプリコンテンプレート結合性セグメントを有する上記のものなどの開裂プローブもまた含む。ヌクレオチドトリホスフェートが存在する場合、該開裂プローブは、例えば、3'末端ヌクレオチドサブユニットのリボース環またはデオキシリボース環における3'ヒドロキシルを、水素、フッ素、アミノ、または他の非ヒドロキシル部分によって置換するか、または3'ヒドロキシル基を、3'アミノ、3'フルオロ、3'H、3'ホスフェート、3'メチル、3'-tert-ブチル、もしくは3'トリチルなどのブロック基でブロックすることによって、該開裂プローブの3'端を伸長不可能にすることが好ましい。
【００１８】
例えば、第1のプライマーと開裂プローブの双方がアンプリコンテンプレート鎖にハイブリダイズする場合、5'ヌクレアーゼ活性を有するテンプレート依存性DNAポリメラーゼを用いて、ATP、CTP、GTP、およびTTPなどのヌクレオチドトリホスフェート(NTP類)、またはそれらの類縁体の存在下、プライマーを伸長させることができる。プライマーの3'端が開裂プローブの5'端に隣接するか、または重なるように、該プライマーが伸長された場合(上記AのスキームIを参照)、該プローブは該ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって開裂され、それによって該開裂複合体からフラップ部分が遊離する(BのスキームIIを参照)。プライマーは開裂した開裂プローブを通り、それを過ぎて伸長できるため、該ポリメラーゼは、該テンプレート結合性セグメントの残部が該アンプリコンテンプレートから解離するまで、さらなる部位における該プローブのテンプレート結合性セグメントを開裂できる。伸長したプライマーは、次いで、第2のプライマーが元の(最初の)アンプリコンテンプレート鎖を複製するテンプレートとして機能し得る。
【００１９】
上記のPCR例に用いられるプライマーおよびプローブは、本明細書における方法によって検出される検出可能なフラップの作製に好適な種々の長さおよび構成のいずれかを有し得る。典型的には、プライマーは、長さが約18ヌクレオチドから約30ヌクレオチド、または20ヌクレオチドから25ヌクレオチドであり得るが、これらの範囲外の長さも使用し得る。例えば、ロック核酸(LNA類)またはペプチド核酸(PNA類)などの、DNAまたはRNAに比較して増強した塩基対親和性を有する1種以上のヌクレオチド類縁体を含有するプライマーが用いられる場合、より短い長さが使用できる。同様に、プローブのテンプレート結合性セグメントは、任意の好適な長さ、典型的には、例えば、8ヌクレオチドから30ヌクレオチドのものであり得る。該プローブもまた、ポリヌクレオチドフラップ部分を含有する場合、該フラップ部分は、検出の所望の特異性および感受性に依存して、10ヌクレオチドから40ヌクレオチドなどの、任意の好適な長さのポリヌクレオチド配列を含み得る。
【００２０】
任意の所望の長さ、通常は、長さが少なくとも30ヌクレオチドから少なくとも50ヌクレオチド、および長さが、200ヌクレオチド、300ヌクレオチド、500ヌクレオチド、1000ヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドまでの増幅産物を作製する目的で結合させるために、第1および第2のプライマーを設計できる。該プローブおよびプライマーは、任意の好適な濃度で提供できる。例えば、正および逆プライマーは、20nMから500nM、または50nMから500nM、または100nMから500nM、または50nMから200nMなど、500nM以下の濃度で典型的に提供できる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、プローブは、20nMから500nM、または50nMから500nM、または100nMから500nM、または50nMから200nMなど、1000nM以下の濃度で典型的に提供される。NTP類、酵素、プライマーおよびプローブの濃度に関する代表的な条件は、米国特許第5,538,848号(参照として本明細書に組み込まれている)にも見ることができるか、または市販の反応成分(例えば、Applied Biosystems、フォスターシティー、カリフォルニア州から入手できるものなど)を用いて達成できる。
【００２２】
該方法の一態様において、タグ配列は、検出可能な標識に会合させることによって修飾できる。該タグ配列は、電気化学的活性成分、または特異的結合対のメンバーによって、5'末端に標識化できる。あるいは、タグ配列は、開裂後に、検出試薬に結合できるか、そうでなければ、検出試薬に会合するようになる。上記で検討したように、開裂したタグ配列は、溶液中で、または捕捉もしくは固定後に検出できる。非開裂タグ配列が開裂タグ配列の検出を妨げることを防ぐために、該方法は任意に分離ステップを含む。先の教示は、ポリヌクレオチド配列を含まないタグにも適用される。
【００２３】
該方法の一態様において、酵素的開裂後に、タグ配列は捕捉および/または固定化される。該タグ配列が検出可能標識を含む場合、次いで、該検出可能標識が検出される。該タグ配列が、引き続いて、検出試薬により標識化される場合、該検出試薬は、固定化されたタグ配列を標識化するか、それと複合体化できる。
【００２４】
該タグ配列は、特異的または非特異的相互作用の結果、固定化できる。例えば、特異的結合対の他のメンバーの特定の空間的または極性構成に特異的に結合し、それと相補的な特異的結合対のメンバーによって、該タグ配列を誘導体化できる。代表的な特異的結合対としては、リガンドおよび受容体を挙げることができ、限定はしないが、以下の対を挙げることができる:抗原-抗体、ビオチン-アビジン、ビオチン-ストレプトアビジン、IgG-タンパク質A、IgG-タンパク質G、炭水化物-レクチン、酵素-酵素基質;DNA-アンチセンスDNA、およびRNA-アンチセンスRNA。
【００２５】
タグ配列が核酸配列であるか、または核酸配列を含む場合、該タグ配列に実質的に相補的なタグ相補的配列によって、該タグ配列自体を捕捉および/または固定化できる。例えば、それ自体、表面または他の基体上に固定されている捕捉アンチセンスオリゴヌクレオチドによって、開裂されたタグ配列を捕捉し固定化することができる。
【００２６】
捕捉配列(タグ相補体)としてアンチセンスオリゴ配列を使用することにより、例えば、各々が特徴的なタグ配列を有する複数の相補的なプローブを設計することによって、該方法を多重化することができる。複数の異なる検出領域における個々のタグ配列を局在化させ捕捉するために、選択されたタグ配列に個々それぞれに相補的な捕捉オリゴヌクレオチドのアレイが使用できる。
【００２７】
図3に示されるように、標的配列21に相補的な相補的配列20が相補的ポリヌクレオチド配列22を含む場合、該タグ配列は、追加の検出オリゴヌクレオチド23の配列に相補的な追加配列を含むように処方できる。PCRサイクル時にPCR反応混合物を冷却させることによって、追加の検出オリゴヌクレオチドは、開裂したタグ配列、ならびに該相補的プローブにまだ結合していた状態であり得るタグ配列にハイブリダイズできる。開裂されたタグ配列および追加の検出オリゴヌクレオチドの新たに形成された二重鎖24は、遊離の3'端で伸長し、より安定なds-DNAの形成がもたらされるが、非開裂タグ配列との二重鎖は、伸長できない状態のままであり、引き続いての温度上昇後、単に解離するだけである。
【００２８】
該タグ配列の伸長によって、離れた検出位置に固定された配列に相補的な新たな配列が作出される。一態様において、固定化配列26はペプチド核酸(PNA)配列であるため、PCR法を妨害し得ない。伸長したタグ配列の結合は、タグ配列自体上の、典型的には3'末端または5'末端における検出可能標識28の存在により、または、検出可能標識とタグ配列、もしくは固定化配列と会合したタグ配列との事後的な会合によって、上記のとおり検出できる。さらに、図3は非PCR実施形態にも使用できる。
【００２９】
一態様において、該固定化配列は金電極30上に固定化されているPNA配列であり、開裂され伸長されたタグ配列の存在は、該タグ配列の5'末端における検出可能な電気的活性標識28によって検出される。
【００３０】
他の態様において、タグ配列32は、図4に示されるように、安定なループ-ステム構造34を形成するために選択された逆方向反復配列を含む。したがって、相補的プローブからタグ配列が開裂されると、該タグ配列の3'端は、自身の伸長36をセルフプライミングすることができる。該セルフプライミング処理によって、PNA配列であり得、電極40上に固定化できる、固定化配列38に相補的な新たな配列を作出することができる。
【００３１】
他の態様において、本開示は、ジップコード配列を含むヘアピンループを含有するプローブを利用する方法を提供する。スキームの例示は、図5Aから5Cに示されている。プローブ41は電気的活性標識42によって標識され、スペーサー43によって共に結合した2つのポリヌクレオチド配列を含む。該プローブの3'端におけるヒドロキシル基は典型的に、アセチル基またはホスフェート基などの3'ブロック基によって、3'エキソヌクレアーゼ消化から保護される(図5Aに示されるように)。該プローブはPCR中に5'ヌクレアーゼ活性、例えば、DNAポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性によって開裂されるタグ配列をさらに含むことができ、非結合タグ配列をもたらし得る(図5Bに示されるように)。開裂したフラップは3'-OH基を有する。引き続いて、開裂フラップの3'端は、エキソヌクレアーゼIIIなどの3'エキソヌクレアーゼによって消化することができる(図5Cに示されるように)。エキソIIIは、3'-5'エキソ-デオキシリボヌクレアーゼ活性に特異的な二本鎖を有するが、4塩基未満を有する3'オーバーハングにも作用する。エキソIIIは、所望の場合は、消化ステップ後、80℃に加熱することによって非活性化できる。3'エキソヌクレアーゼ消化は、例えば、単に有機リンカーであり得るスペーサー43において停止する。該スペーサーの他方の側は、そのプローブに特徴的なタグ配列44である。したがって、開裂フラップ上のタグ配列が一本鎖になった後、例えば、電極表面46に結合した相補的固定化配列45にハイブリダイズできる(図5Dに示されるように)。非開裂プローブにおけるタグ配列は、ヘアピンループのためにハイブリダイゼーションに利用されない。したがって、検出前に、開裂プローブと非開裂プローブとを分離する必要がない。熱サイクル後、PCR反応物に3'エキソヌクレアーゼを添加してもよいし、1つ以上の電極を含む検出チャンバー内に置いてもよい。捕捉されたフラップは、本明細書に記載されたとおり、電極上で電気化学的に検出できる。
【００３２】
他の態様において、タグ配列54に相補的であるが、それより長い検出オリゴ52を加え、該タグ配列を開裂したら、作出された3'-OH基を、図6におけるハイブリダイズした複合体56によって示されるように、検出オリゴヌクレオチドと開裂タグ配列とのアニーリング後、該検出オリゴヌクレオチドに相補的に伸長できる。検出可能標識をタグ配列に結合してもよいし(図3の28に示されるように)、検出可能標識を検出オリゴヌクレオチドに結合してもよい(図6の58に示されるように)。先に検討したように、新たな配列は、PNA配列であり得、電極62上に固定化できる固定化配列60に相補的であり得、したがって、それに結合し得る。
【００３３】
タグ:タグ相補体複合体は、種々の好適な機構のいずれかによって検出できる。一般に、単なる受動的な相互作用、または、サイズ限定の多孔性マトリックスまたはバリア内への、またはそれを通っての単なる拡散とは対照的に、検出条件下で、特異的な共有的または非共有的相互作用によって(例えば、水素結合、イオン対またはファンデルワールス引力によって)タグ相補体と結合するか、またはタグ相補体との複合体を形成するタグが選択される。タグとタグ相補体との間のこのような特異的相互作用によって、更なるレベルの特異性がもたらされ、ノイズに対するシグナルを増加させる。さらに、該検出条件は、電気化学的部分からのシグナルを増幅できる電気化学的なメディエーターまたは基質を任意に含み得る。電気化学的活性部分がタグまたはタグ相補体上に存在する場合、このような部分は、メディエーターとして機能し得る。あるいは、1種以上の電気化学的メディエーターが溶液中に存在し得る。このようなメディエーターの一例はアスコルビン酸である。しかし、電気化学的部分自体が十分なシグナルを提供する場合は、本発明の操作にこのようなメディエーターは必要ない。
【００３４】
いくつかの実施形態において、該プローブは、プローブ開裂が生じる溶液と接触して、表面または基体に共有結合される。PCR実施形態においては、変性アンプリコンが相補的プローブにハイブリダイズできる。次いで、適切なプライマーが該アンプリコンにアニールでき、該アンプリコン配列の伸長が進行し得る。伸長時、酵素活性により、相補的プローブの開裂が生じ得る。例えば、増幅がPCRによって実施される場合、相補的プローブは、該ポリメラーゼ酵素のエンドヌクレアーゼ活性によって開裂される。
【００３５】
相補的プローブが1種以上のタグ配列によって標識化されている場合、該相補的プローブの開裂によって、該タグ配列の遊離がもたらされる。次いで、該反応の程度を、該反応溶液中のタグ配列の存在または定量化によって判定できる。該タグ配列が電気化学的に活性な標識であるか、またはそれを含む場合、該反応の進行は電気化学的に判定できる。
【００３６】
該タグ配列が遠隔部位で検出される場合、該タグ配列か遠隔部位のいずれか、または双方を、該遠隔検出部位と該タグ配列との間の相互作用を増強するように修飾することが有用であり得る。該タグ配列が電気化学的に活性な標識を含む場合、該遠隔検出部位は電極表面であり得る。あるいは、タグ配列を遠隔表面に局在化させ、引き続いて、電気化学的に活性なタグに結合させることができる。例えば、該タグ配列がポリヌクレオチドを含む場合、電気化学的活性部分がポリヌクレオチドに結合する挿入剤に組み込まれるように、電気化学的活性タグはポリヌクレオチドに選択的に結合できる(実施例2で検討したように)。
【００３７】
該タグ配列が電気化学的活性標識を含む場合、該標識を直接検出することもできるし、1種以上の中間体の酸化-還元(レドックス)活性種によって検出することもできる。このようなレドックス活性種は、電極表面から電気化学的活性標識に電子を往復移動できるか、またはさらに他のレドックス活性往復移動種へ電子を往復移動できる。
【００３８】
遠隔部位との相互作用を増強するために、該タグ配列を、1つ以上の捕捉部分を包含することによって修飾できる。一態様において、該遠隔部位は、金の金属表面を含み、捕捉部分は、チオールまたはジスルフィド官能基を含む。イオウ含有官能基と金表面との間の親和性により、タグ配列の結合が生じる。該タグ配列は、金表面との結合を最大化するために、複数のチオール含有官能基を含む高分子の、または樹状の構造を含み得る。該電気化学的活性基は、チオール化したタグ配列内に組み込むこともできるし、金表面への吸着の前後に、タグ配列に結合させることもできる(実施例7を参照)。
【００３９】
例えば、図7Aに示されるように、不活性固体基体66および該固体基体から離れた電極67を含むPCRチャンバー64を利用できる。所望のアンプリコンに相補的な複数の核酸鎖68を、該固体基体に係留できるか、そうでなければ固定できる。該相補鎖は、複数のチオールまたはジスルフィド官能基、または金表面への結合親和性を示す他の官能基を組み込むことのできるポリアニオン部分70によって官能化できる。
【００４０】
図7Bに示されるように、増幅時、相補鎖68はアンプリコン72にハイブリダイズし、ポリアニオン性部分70が該鎖から開裂し、図7Cに示されるように、自発的な金電極表面への化学吸着を起こす。次いで、図7Dに示されるように、検出試薬74の添加を用いて、電気化学的部分を吸着されたチオール化タグ配列へと輸送する。
【００４１】
例えば、電気化学的活性基を、ポリ(エチレンオキシド)に基づいた親水性樹状ポリマーに組み込むことができる。該樹状ポリマーは、複数のレドックス活性部位を組み込むことができる(実施例6を参照)。他の態様において、イオン性および/または静電気的相互作用による固定核酸配列と相互作用させるために、電気化学的活性部分は複数の正電荷を組み込むことができる(実施例3を参照)。
【００４２】
リアルタイム検出(例えば、選択された時間もしくは複数増幅サイクルを通しての検出シグナルのモニタリング、または各サイクル中、もしくは各サイクル後の選択された時点でのシグナル検出)のため、または増幅完了後にシグナルが検出され、最初のシグナルもしくは閾値シグナルと比較して、標的ポリヌクレオチドの存在、不在、または量を判定するエンドポイント検出のために、本発明の選択された方法が構成できる。例えば、図3から図7に示された実施形態は、リアルタイム検出にとって、またはエンドポイント検出にとって有利であり得るが、追加の実施形態は、エンドポイント検出にとってより好適であり得る。
【００４３】
さらに、表面に固定されたプローブを用いるいくつかの実施形態が本明細書に示されているが、このような実施形態は、実施例8に示されるような溶液においての使用にも適用できる。電気化学的検出のための化合物および方法に関するさらなる指針は、欧州特許第733058号および欧州特許第871642号ならびにPCT国際公開第98/20162号(Meade、Kayyamら)に見ることができる。
【００４４】
ミクロ流体
本明細書に開示された方法および材料は、種々の器具または装置のいずれかと関連させて使用できる。本発明の有利な態様において、開示された方法は、ミクロ流体装置と関連させて実施できる。ミクロ流体装置は、ナノリットル、またはさらにピコリットルの桁での少量の液体を利用する装置である。ミクロ流体装置は、サンプルを調製、輸送、および/または分析するために、種々の幾何学的形状に配置された種々のマイクロチャネル、ウェル、および/またはバルブを利用できる。これらのマイクロチャネル、ウェルおよび/またはバルブは、ミリメートル(mm)からマイクロメートル(μm)、またはさらにナノメートル(nm)の範囲の寸法を有し得る。ミクロ流体装置は、限定はしないが、「メソスケール」装置、または「マイクロマシーン」装置と称することもできる。ミクロ流体装置は、該装置を通して液体を輸送するために、とりわけ、注入、ポンピング、適用吸引、毛細管作用、浸透圧作用、熱膨張、および収縮などの種々の力に基づく。一実施形態において、ミクロ流体装置は、水性のサンプル、試薬、および緩衝液の輸送を助けるために、活性電気浸透に基づき得る。種々のミクロ流体装置は、Krickaらに対する米国特許第5,296,375号(1994);Wildingらに対する米国特許第5,498,392号(1996);およびWildingらによる国際公開第93/22053号(1993)に記載されており、各々参照として本明細書に組み込まれている。
【００４５】
標的ポリヌクレオチド配列の検出に有用なミクロ流体装置は、複数のミクロ流体のチャンバーおよびチャネルが組み立てられた基体、および該基体の表面に接着しているカバーを、典型的に含む。該装置は、少なくとも1つの標的ポリヌクレオチド配列を含有するサンプルを受けるために構成された入口、ならびに上記で検討した標的相補的セグメントおよび検出可能なタグを含むプローブを生物学的サンプルに接触させるために構成された1つ以上のチャンバーを典型的に含む。該ミクロ流体装置は、該サンプルをポリメラーゼ連鎖反応に供し、検出可能なタグを該プローブから開裂し、遊離したタグを、電極に結合しているタグ相補体と結合させて、固定化したタグ:タグ相補体複合体を形成するために構成された1つ以上のチャンバーを含み得る。該タグ:タグ相補体複合体は典型的に、タグ:タグ相補体複合体の存在に関連した電気化学的シグナルを検出するために構成された計器装備によって検出および/または定量化され;検出/定量化されたシグナルは、該サンプル中の標的ポリヌクレオチド配列の存在/量に相関している。
【００４６】
標的核酸ポリマーの増幅および引き続いての検出に好適な代表的なミクロ流体装置は、図8に示されている。ミクロ流体装置62は、略図として描かれており、簡潔さのために、このようなミクロ流体システムに存在し得る全てのマイクロチャネルおよびウェルを含んでいるわけではない。ミクロ流体装置62は、電極アセンブリ64、および電極アセンブリ64にかけられた電位を制御するために構成されたコントローラー66を含む。該コントローラーは典型的に、電力供給および電流測定を実施するための装置の双方として役立つ。
【００４７】
電極アセンブリ64から上流は、対象となっているサンプル溶液を調製するために構成されたミクロ流体装置のサンプル調製領域68である。サンプル調製領域68は、サンプル調製工程に有用な試薬を供給するために構成された試薬リザーバ70を含む。ミクロ流体装置の種々のチャンバーは、試薬、サンプル溶液、および反応産物を該装置を通して輸送するために、特に、このような種を電極アセンブリ64へ、および電極アセンブリ64から輸送するために好適なミクロ流体チャネルシステム72によって相互接続されている。
【００４８】
サンプル、典型的には生物学的サンプルは、入口74によって該ミクロ流体装置内へ導入できる。該サンプルは、注入により、毛細管作用により、または任意の他の好適な導入法によって導入できる。該ミクロ流体装置は任意に、予備処理用のウェルまたはチャンバー76を含む。予備処理用チャンバー76は、所望の場合、サンプルの消化、処分、または希釈を目的として、該生物学的サンプルが試薬と混合されることを可能にする。このような予備処理は、下流の処理の有効性を増強する上で該生物学的サンプル液体を十分なものにするために用いることができる。
【００４９】
この予備処理後、サンプルは、典型的には電気浸透ポンピングによって、フィルター78を通して反応チャンバー80内へ輸送できる。フィルター78は、下流の反応を妨害する恐れのある大きな粒子を除去するために使用できる。該フィルターは、調査中の生物学的サンプルに適合性である任意の適切なフィルター剤であり得る。例えば、フィルター78は、膜フィルター、または比較的大きな孔径、例えばおよそ100μmを有するフリットガラスフィルターを含み得る。
【００５０】
反応チャンバー80は、サンプルの溶解および変性のために使用できる。図8に示されるように、溶解および/または変性処理に有用な試薬は、バルブ84によって試薬リザーバ82から添加できる。溶解および/または変性処理は、加熱ユニット86による加熱によって促進できる。加熱ユニット86は、1つ以上の加温ランプ、加熱コイル、流体熱交換器、または他の任意の好適な加熱装置、ならびに、ファン、送風器、熱交換器、または反応チャンバー80を冷却するための他の好適な冷却装置を含み得る。
【００５１】
溶解および/または変性後、サンプルは途中でフィルター90を通過してPCRチャンバー88に輸送される。比較的粗いフィルター78とは異なり、フィルター90は、およそ5〜10μmの孔径用に選択され、溶解/変性処理の不要な副産物を除去することが意図されている。サンプルがPCRチャンバー88に到達したら、PCR法に有用な試薬を、バルブ94によりPCR試薬リザーバ92からPCRチャンバー88に添加できる。本発明の一態様において、反応チャンバーに添加される試薬は、標的ポリヌクレオチド配列に相補的なセグメントおよび開裂可能で検出可能なタグを含む、上記で検討された本発明によるプローブを含む。PCRチャンバー88は、加熱ユニット96によって加熱できる。加熱ユニット86と同様に、加熱ユニット96は、PCR法を促進するための任意の適切な加熱装置であり得、加熱サイクルがPCRチャンバー88内で達成できるように、冷却装置を典型的に含む。選択された好適な熱サイクル装置は、参照として本明細書に組み込まれている、Wittwerらに対する米国特許第5,455,175号(1995)に記載されている。当然のことながら、PCRチャンバーは、熱サイクルを必要としない適用に関しては、定温様式で使用できる。
【００５２】
PCR完了後、サンプルは、孔径がおよそ5〜10μmの他のフィルター98を通して電気分解チャンバー97に輸送できる。電気分解チャンバー97は、コントローラーによって制御される電極100を含む。図8ではコントローラー66に電気的に接続しているように描かれているが、電極100に関するコントローラーは、電極64に関するコントローラーと同じであってもよいし、異なっていてもよい。適切な試薬を、バルブ104によって試薬リザーバ102から電気分解チャンバー97に添加できる。次いで、PCRの間にヌクレアーゼ活性によって該プローブから開裂されたタグは、電極64に結合しているタグ相補体に結合でき、タグ:タグ相補体複合体の存在に関連した電気化学的シグナルが、任意に1種以上の電気化学的メディエーターの存在によって検出される。
【００５３】
増幅完了後、電気分解ウェル97における電極100と電気分解ウェル108における電極106との間に電位を課すことができる。典型的に、電極100は陰極電位に保持され、電極106は陽極電位に保持されるため、架橋ポリアクリルアミドゲル108の薄層と組み合わせて、ゲル110にわたって電気泳動が生じる。電気泳動が生じている間、電極64は典型的に電気的中性である。
【００５４】
該ポリアクリルアミドゲルは典型的に、低程度の架橋によって調製される。これらの電気泳動条件下で、複合体しハイブリダイズしたDNAを除く全ての核酸断片は、電気分解チャンバー110へ移動する。比較的大型の核酸複合体は、それらの大きなサイズおよび架橋ポリアクリルアミドゲルの薄層を透過する比較的無能力なために後に残される。
【００５５】
電気泳動による分離を記載したが、開裂したタグを単離するために、例えば、機械的分離、サイズ排除クロマトグラフィー、例えば、磁気ビーズまたはストレプトアビジン修飾マトリックスなどの誘導体化ビーズまたはマトリックスを用いた分離など、任意の好適な分離方法を使用し得る。
【００５６】
タグ:タグ相補体複合体を電極表面に結合したら、該複合体に存在する検出可能標識を、上記および以下の実施例において検討されるとおり検出および/または定量化できる。
【００５７】
キット
本明細書に開示されたプローブは、本発明の方法により、標的ポリヌクレオチド配列を検出するためのキットの形態で提供できる。これらのキットは任意に、選択された標的ポリヌクレオチド配列に相補的なセグメント、および検出可能タグを含む1種以上のプローブを含む。該キットは、複数の別個の異なる標的ポリヌクレオチド配列に関して選択的なプローブを含み得る。該キットは、各々が異なる個々に検出可能なタグを有するプローブを含み得る。該キットは、該プローブから該タグを開裂した際に、タグ:タグ相補体複合体を形成するために1種以上のタグ相補体を任意に含む。該キットは、例えば検量を目的として該キットに存在するプローブに対応する標的ポリヌクレオチド配列のサンプルを、任意に含む。該キットは、該プローブの溶液および/または該標的ポリヌクレオチド配列の溶液の調製に好適な1種以上の緩衝液または緩衝剤を任意に含む。
【００５８】
該キットは、限定はしないが、電気化学的検量標品、酵素、酵素基質、核酸鎖、標識化抗体、および/または他の追加の検出試薬などの追加の試薬を任意に組み込んでいる。本発明のプローブは任意に、凍結乾燥固体として、または濃縮原液として、または適切なアッセイでの使用に備えた予備希釈溶液において存在できる。典型的に、該キットは、自動化および/またはハイスループットアッセイでの使用に適合性であるように設計され、したがって、ミクロ流体法および/または他の自動化ハイスループット法に十分に適合性であるように設計される。
【００５９】
電気化学的組成物
本発明はまた、本明細書に記載されているような電気化学的化合物も提供する。このような化合物は、限定はしないが、本明細書に開示された標的ポリヌクレオチド配列を検出する方法などの種々の電気化学的適用に有用である。
【００６０】
例えば、本開示は、下記のスキーム5に示された形態のビス-オスミウム化合物を提供する。
【００６１】
化合物21においてスキーム10で示された形態の化合物、および、スキーム10に示された代替の芳香族アルキルアミン反応物を用いて作製できる構造的に関連した化合物もまた本明細書に開示されている。
【００６２】
また、スキーム6(例えば化合物10および11)、スキーム7(例えば化合物14および15)、スキーム15(例えば化合物2)、スキーム16(例えば化合物4)、スキーム17(例えば化合物6)、およびスキーム18から20、ならびにそれらの類縁体および誘導体において示された形態のポリ-オスミウム化合物も開示されている。
【実施例】
【００６３】
(実施例1)DNA増幅プローブの調製
食品病原菌であるリステリア菌のリステリオリシン(Hly)遺伝子の増幅に関して選択的であるプローブを調製する。相補的プローブ(またはプライマー)は、該配列の5'端でビオチン化する。該相補的プローブは、また、最後のdT残基にビオチンを含み、そして、PCR時の該プローブの伸長化を防ぐために、3'末端アミノ基を含む。相補的配列は、下記の太活字で示された19塩基のタグ配列によって修飾される。
【００６４】
【化１】
2009501532.tif 000003
【００６５】
（式中、T*は、ビオチン化塩基を印している。ビオチン化によって、ストレプトアビジン修飾ビーズを用いて相補的配列を除去することが可能になる）
【００６６】
対照反応と比較して、アンプリコンの電気泳動分析により検証すると、該タグ配列の存在は標的配列のPCR増幅に影響を及ぼさない。
【００６７】
PCR時に用いられたフォワードおよびリバースプライマーは以下のとおりである:
5'-CATGGCACCACCAGCATCT
および
5'-ATCCGCGTGTTTCTTTTCGA
（式中、各プライマーの5'末端もまた、ストレプトアビジンビーズを用いた除去のためにビオチン化される）
【００６８】
PCR反応は、95℃で10分間、次いで、6mMのMgCl2を加えたPCR緩衝液A(Applied Biosystems、カタログ番号N808-0228)中で(95℃で15秒間、63℃で1分間)×40サイクル行った。プライマーおよびプローブは、それぞれ200nMおよび400nMの濃度であった。Waters社からのHPLCカラムXTerroMSC18(2.5mm×50mm)を、7%ACN(アセトニトリル)+93%TEAA(0.1Mのトリエタノールアミンアセテート、pH 6.8)によって平衡化した。勾配溶出(0.3ml/分、60℃)を三段階で実施した:ステップ1:7%ACN+93%TEAAで7分間、ステップ2:10%ACN+90%TEAAで10分間、ステップ3:35%ACN+65%TEAAで10分間(ACN-アセトニトリル、TEAA-0.1Mのトリエタノールアミン-酢酸、pH6.8)。PCRは、それぞれ、200nMのプライマー濃度および400nMのプローブ濃度において、95℃で10分間行い、次いで、(95℃で15秒間、63℃で1分間)×40サイクル行う。
【００６９】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の完了後、該反応混合物を、NaCl溶液の添加により1Mの塩に調整する。次いで、該反応混合物をストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズと共に15分間インキュベートする。まだ非開裂タグ配列を含む相補的プローブを含むビオチン化相補的プローブを磁気ビーズに吸着させ、該反応混合物から除去する。ビオチン化アンプリコンを同様に該混合物から除去し、該溶液に開裂タグ配列を残す。
【００７０】
5'末端を蛍光標識(フルオレセイン)によって標識化しているタグ配列と共に増幅および開裂を実施した後、HPLCによる特性化を行うと、20塩基長の開裂産物が作製されること、およびストレプトアビジンでコーティングしたビーズによる該反応混合物からの除去によって非開裂プローブが除去されることが示される。図9に示されるように、リステリアDNAの3000コピー出発材料で、約50%のプローブが開裂するが、無テンプレート対照は開裂オリゴヌクレオチドを含まない。しかし、この方法は、該反応混合物中に3コピーのテンプレートで作出後に検出可能な開裂産物を作製する上で十分感受性である。
【００７１】
タグ配列は、また、電気化学的に検出できる。ストレプトアビジンでコーティングしたビーズ上で除去した後、標的含有サンプルおよび無テンプレート対照溶液を双方とも、開裂配列に相補的な固定化捕捉プローブにより官能化した金電極に、分離のため曝露する。ビーズ分離ステップから直接該溶液を、45℃で1時間ハイブリダイズさせ、次いで、10mMのトリス、100mMのNaCl(pH=8)ですすぐ。次いで、該電極を、電気化学的セル内で5分間、10mMのトリス、100mMのNaCl(pH=8)中、電気触媒的オスミウム2,2-ビス(ビピリジン)(スキーム1の構造を参照)で標識したスレッディングインターカレーターの100μg/mL溶液に曝露する。PBS緩衝液(20mMのホスフェートおよび100mMの塩化ナトリウム、pH7)および10%エタノール中NaClで飽和させたホスフェート緩衝液で洗浄後、ベースライン電流を、200μLのPBS中、0.2V対Ag/AgClで得た。6.25mMのアスコルビン酸基質800μLを添加すると、インターカレーターの量、したがって、ハイブリダイズした標的の量に比例して電流が増加した(図10を参照)。
【００７２】
電極および電気化学的器具。作用電極は、100オングストロームのCr層、引き続いて2000オングストロームの金層を有するブランケットスパッターコーティング4''シリコンウェーハ(Lance Goddard Associates、フォスターシティー、カリフォルニア州)により製造する。次いで、該ウェーハを手動でダイスし、およそ1cm×1.5cmのセグメントを形成する。該電極をUV-Ozoneクリーナー(モデル42、Jelight社、アービン、カリフォルニア州)を用いて20分間清浄にした後、無水エタノールに20分間曝露する。次いで、該電極を、1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH=7)中、チオール化DNA捕捉プローブの0.5μM溶液に、10分間曝露し、続いて5秒間水ですすぐ。該捕捉プローブ配列は、下記に示されている:
5'(DTPA)(DTPA)(DTPA)AAAAAATTGAGAGCTTTGATTCGTG3'
（式中、DTPAはスキーム20に示されたタイプのジスルフィド含有ホスフェートリンカーであり、ジチオールホスホルアミダイト(Glen Research、スターリング、ヴァージニア州)から調製される）
次いで、該電極を、水中、メルカプトヘキサノールの1mM 溶液に一晩曝露した後、30秒間水ですすぐ。次いで、該電極を窒素下で乾燥する。
【００７３】
CHIモデル660Bポテンシオスタット(CH Instruments、オースチン、テキサス州)を用い、作用電極領域対Ag/AgCl参照電極を規定する1/8''IDo-リング(Cypress Systems、ローレンス、カンザス州)および白金コイルカウンター電極を有する電気化学的セルの中で、電気化学的測定を実施できる。
【００７４】
(実施例2)フェロセン(Fc)標識プローブを用いたPCR進行の電気化学的モニタリング
この実験では、プローブを5'端においてフェロセン部分により置換し(「Synthegene」、ヒューストン、テキサス州)、テンプレートとしてリステリアDNAの100,000コピーを使用したことを除いて、該反応混合物の組成および増幅プロトコルは、実施例1のものと同じであった。同一のPCR反応混合物の50μlのアリコートを含有する6本の管を9700サーモサイクラー(Applied Biosystems、フォスターシティー、カリフォルニア州)内に入れた。増幅の20、26、29、32および38サイクル後、該サーモサイクラーから連続的に管を取り出した。無テンプレート対照(NTC)に相当する管は、38サイクル後に取り出した。実施例1に記載されたとおり、ストレプトアビジン磁気ビーズを用いて、非開裂プローブから、開裂したフェロセン含有20量体断片(検出可能タグ)を精製した。精製したFe20量体(1MのNaCl中)の30μlアリコートを、金電極の表面上に1時間置き、相補的捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせた。電極をPBS緩衝液により簡単にすすいだ後、各電極を、実施例1に記載したチャンバー内に置いた。チャンバーをおよそ100μlのPBS緩衝液で充填し、図11に示されたように電気化学的測定を行った。
【００７５】
電気化学的シグナル幅は、実施されたPCRサイクル数に依存する。図11Aは、アンプリコンのゲル電気泳動分析および濃度測定定量化の結果を示す。図11Bは、アンプリコンの量対PCRサイクル数のプロットである。図11Cは、電気化学的測定結果を示す。図11Dは、電気化学的シグナル価(ピークの面積)対PCRサイクル数のプロットを示す。図11Bと図11Dに示された曲線の一致によって、この方法論がPCR反応の定量的モニタリングを可能にすることが示されている。
【００７６】
(実施例3)電気触媒的核酸インターカレーターの調製
該検出試薬は、場合によっては、核酸鎖に関するインターカレーターである電気化学的部分である。代表的なインターカレーターは、スキーム1に示された式を有し、Tansilら(Anal.Chem.2005年、77(1)、126-134頁)の方法と同様に調製される。3.0mLの無水THF中、1(3-アミノプロピル)イミダゾールの溶液6.0mL(24.92mmol)を、水冷却器、等圧滴下漏斗、および1/4''磁気撹拌棒を装備した50mL二口丸底フラスコ内に入れる。該反応スキームをスキーム2に提供する。
【００７７】
【化２】
2009501532.tif 000004
【００７８】
【化３】
2009501532.tif 000005
【００７９】
この溶液に、3.0mLの無水THF中、0.6058g(2.26mmol)の1,4,5,8-ナフタレンテトラカルボン酸二無水物の懸濁液を、常時撹拌しながら15分間かけて加える。該反応混合物を24時間、還流下加熱する。該反応混合物の色は、30分以内に、淡黄橙色から黒褐色に変わる。該反応時間の最後に、該反応混合物を周囲温度まで冷却し、アセトン/水の混合物(3:1 v:v)の混合物20mLを速やかに撹拌しながら加える。該混合物を周囲温度に5分間放置する。上澄み層をデカントする。該残査に、10mLのメタノールを加え、生じたスラリーを撹拌する。吸引ろ過により黄色結晶を採集する。該フィルターケークを、メタノールで簡単に洗浄し、吸引しながら風乾する。該沈殿物を20mLのクロロホルム/エタノール混合物(1:1 v:v)で再結晶し、続いて、40℃で一晩減圧乾燥して、0.236g(収率22%、報告収率85%)の生成物を得る。該生成物の1H-NMRスペクトルは、文献に報告されたものと完全に合致する。この反応のスキームを、スキーム3に提供する。
【００８０】
【化４】
2009501532.tif 000006
【００８１】
16.0mLのエチレングリコール中、0.642g(0.52mmol)のOS(bpy)2Cl2溶液に、0.236g(0.25mmol)のPIND(スキーム3の左側の構造を参照)を、少量ずつ、常時撹拌しながら10分間かけて加える。該最終混合物を、180℃の温度のオイルバスで、30〜40分間加熱する。60℃でロータリーエバポレーションによりエチレングリコールを除去し、粘稠な油性残査を得る。該粘稠残査に、150mLのTHFを激しく撹拌しながら加えると、沈殿物が形成する。該沈殿物を吸引ろ過により採集し、無水THFですすぎ、フィルター上で乾燥すると、129.3mg(収率50%、報告収率78%)の生成物が、水およびエタノールにきわめて可溶性の暗紫色粉末として得られる。対照的に、出発物質(OS(bpy)2Cl2)は、水に不溶性でエタノールにわずかに可溶性の暗紫色粉末である。該生成物のUV-可視スペクトルは、文献に報告されたものと合致する。
【００８２】
(実施例4)ポリカチオン性電気化学的部分
該開示された方法の選択された態様において、タグ配列は、検出前に、遠隔電極に固定化される。例えば、該タグ配列が、1つ以上のチオールまたはジスルフィドなどのイオウ含有官能基を含む場合、該電極は、金金属表面を含む。これらの態様において、該タグ配列の検出は、吸着されたタグ配列と静電気的に相互作用する電気化学的部分の添加によって促進することができる。このような静電気的相互作用は、表面ポリヌクレオチドプローブとタグ配列とのハイブリダイゼーションに依存しないし、それを必要ともしない。
【００８３】
チオール化結合タグ配列に対するポリカチオンの結合は、下記のスキーム4に単純化した図で示す:
【００８４】
【化５】
2009501532.tif 000007
【００８５】
（図中、ポリカチオンは、複数のレドックス可逆性中心を含む）
図12に示されるように、静電気的に結合したレドックス中心は、電極表面における検出を媒介できる。図12の「基質」は、検出可能タグの検出を促進できる任意のレドックス活性の化合物または物質を指すことに注意されたい(ここで、結合タグは、ポリアニオン性であってレドックス活性部分を含むポリカチオン部分(例えばオスミウム複合体)と複合体化されるssDNAフラップであり、その存在は、図12に示されるレドックスサイクルにより検出できる)。
【００８６】
(実施例3A)
レドックス可逆性ポリカチオンは、下記のスキーム5に示されるように、α,ω-ジイミダゾリルアルカン類のオスミウム複合体を含み得る。
【００８７】
【化６】
2009501532.tif 000008
【００８８】
(実施例3B)
あるいは、該ポリカチオン性電気化学的部分は、下記に示されるようなさらなるオスミウム複合体を含み得る。ビス-およびテトラ-オスミウム複合体はそれぞれ、適切な二酸またはテトラ酸をチオニルクロリドと反応させることによって合成される。得られたアシルクロリド化合物は、他にも方法はあるが、その中でも、減圧蒸留により精製できる。いくつかの態様において、該アシルクロリド化合物は、それらのN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル対応物に変換される。NHSエステルは、ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)の存在下、該酸をジスクシンイミジルカーボネート(DSC)によって処理することにより調製できる。該反応法をスキーム6に示す。
【００８９】
【化７】
2009501532.tif 000009
【００９０】
(実施例3C)
あるいは、ビス-およびテトラ-オスミウム複合体は、下記に示されたプロトコルに従って調製できる。水性エタノール中、2-(2-アミノエチル)ピリジンとOs(bpy)2Cl2との反応、該生成物の沈殿および精製により、所望のオスミウム複合体が得られる。ジ-およびテトラ-アシルクロリド化合物は、それらのNHSエステル類縁体を含めて、上記のプロトコルに従って調製できる。該合成法をスキーム7に示す。
【００９１】
【化８】
2009501532.tif 000010
【００９２】
(実施例3D)
さらに他の実施例において、レドックス可逆性ポリカチオンは、例えば、オスミウム複合体などの複数の電気的活性中心を含むポリマーであり得る。このようなポリマーポリカチオンは、米国特許第5,262,035号(参照として本明細書に組み込まれている)に報告されたものと同様なプロトコルに従って、ポリ(4-ビニルピリジン)とOs(bpy)2Cl2とを処理することによって調製できる。高pHでのα-除去を防ぐために、ピリジニウム環系に結合している2-アミノ基または2-ヒドロキシエチル基をメチル基によって置換することができる。該合成法をスキーム8に示す。
【００９３】
【化９】
2009501532.tif 000011
【００９４】
(実施例3E)
選択された代替の実施形態において、ポリカチオン性の電気化学的部分は、下記に示されるように、ポリ(1-ビニルイミダゾール)から調製できる。該ポリマー主鎖は、TEMEDの存在下、開始剤として過硫酸アンモニウムを用いて、1-ビニルイミダゾールの溶液重合によって調製できる。1-ビニルイミダゾールのフリーラジカル重合もまた、水溶性アゾ化合物、例えば、2,2-アゾビス[2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン]ジヒドロクロリドによって開始できる。得られたポリマー18は、水溶性であり、例えば、透析によって精製できる。ポリイミダゾール化合物を、例えば、水性エタノール中のOs(bpy)2Cl2により処理することによって、該ポリマー上に複数のレドックス活性中心の付加が生じる。非置換のままのイミダゾール環が少ない高程度の変換では、生じたポリカチン性化合物は、THFからの沈殿によって単離および精製できる。いくつかの態様において、得られたポリマーの特定の物理的および化学的性質を所望の通りに変化させるために、N,N-ジメチルアクリルアミドなどの所望のモノマーをビニルイミダゾール化合物と共に共重合できる。該合成法をスキーム9に示す。
【００９５】
【化１０】
2009501532.tif 000012
【００９６】
(実施例3F)
選択された実施形態において、ポリカチオン性電気化学的部分は、N,N-ジアリル-3-ヒドロキシアゼチジニウム塩の重合または共重合によって調製された、ポリマー主鎖に沿ったヒドロキシアゼチジニウム基を有する水溶性ポリマーを含み得る。あるいは、POLYCUPポリマーは、エピクロロヒドリンを、アジピン酸とN,N-ジ(2-アミノエチル)アミンのポリアミドによって処理することにより調製できる。ポリマー20は高カチオン性で、水にきわめて溶解性である。アゼチジニウムクロリドは、アミノ基およびカルボキシル基に高反応性である。レドックス可逆性イミダゾリル-Os(bpy)2Clは、示されたように組み込んで、21を得ることができ、これを、メタノールまたはTHFからの沈殿によって単離し、透析によって精製できる。
【００９７】
【化１１】
2009501532.tif 000013
【００９８】
(実施例3C)
あるいは、オスミウム複合体ではなく、電気的活性フェロセン複合体を、20と2-アミノエチルフェロセンまたはフェロセン酢酸との反応により組み込むことができる。
【００９９】
(実施例3D)
特定の実施例において、POLYCUPポリマー20の12%溶液のアリコートを、多官能性アミンであるポリ(エチレンイミン)24の10%水溶液の等量に加える。該反応混合物は、50℃の水浴中、加熱15分間以内に固体ゲルに変わり、アミン官能基に対する20中アゼチジニウム環の反応性の高さを示す。20との反応に関して、多官能性アミンである24を単一官能性アミンである3-アミノプロピルイミダゾール25によって置換した場合は、ゲルは形成されない。スキーム11を参照されたい。
【０１００】
【化１２】
2009501532.tif 000014
【０１０１】
(実施例5)1,1-(1,6-ヘキサンジイル)ビス(イミダゾール)の調製
磁気スターラー、滴下漏斗、およびディーン-スターク冷却器を装備した250mLの三口丸底フラスコに、撹拌しながら、3.0mLの水および5.82g(103.7mmol)の水酸化カリウムを入れた。KOHが溶解したら、100mLのトルエンを加え、引き続き、6.81g(100.0mmol)のイミダゾールを加える。イミダゾールが溶解したら、40.0mLのDMSOを加える。
【０１０２】
水が共蒸留されなくなるまで、またはおよそ4時間、該混合物を133℃の油浴内で加熱撹拌する。およそ8mlの水が生じる。
【０１０３】
該反応混合物の温度が90℃未満に低下した後、12.07g(49.5mmol)の1,6-ジブロモヘキサンを、常時撹拌しながら滴下により加える。この添加の間に白色沈殿が形成する。
【０１０４】
該混合物を、85〜90℃で17時間撹拌する。
【０１０５】
ろ過により、臭化カリウムを除去する。減圧下蒸留(49℃、0.5mm Hg)により、ろ液中のトルエンおよびDMSOを除去し、粘稠なオイルを得る。
【０１０６】
少量の白色結晶固体を減圧蒸留し(0.02mm Hgで90℃)、1H-NMRスペクトロスコピーによりイミダゾールとして同定する。ジクロロメタンとメタノールの1:1 v:v混合物を用いて、残査オイルをクロマトグラフィー精製に供し、8.0g(収率74%)の生成物を得る。該生成物の1H-NMRスペクトルは、予想された構造に合致する。該合成スキームをスキーム12に示す。
【０１０７】
【化１３】
2009501532.tif 000015
【０１０８】
(実施例6) オスミウム置換1,1-(1,6-ヘキサンジイル)ビス(イミダゾール)の調製
磁気スターラーおよび冷却器を装備した500mLの丸底フラスコに、2.0g(3.5mmol)のオスミウムビピジニルジクロリド、0.38g(1.76mmol)の1,6-ビス(イミダゾリル)ヘキサン、100.0mLのエタノール、および100.0mLの脱イオン化水を加える。該反応混合物を、オイルバス内で16時間、緩やかな還流に加熱し、暗紫色溶液を得る。次いで、該反応混合物を周囲温度まで冷却し、減圧下、溶媒を除去する。
【０１０９】
残査を、60mLのTHF中、15分間粉砕する。沈殿物を吸引ろ過により採集し、THFですすいで1,6-ビス(イミダゾリル)ヘキサンを除去し、吸引風乾して、暗紫色結晶粉末を得る。
【０１１０】
該生成物を55℃で一晩減圧乾燥し、2.26g(収率94.5%)の生成物を得る。該生成物の1H-NMRスペクトルは、予想された構造に合致する。該合成スキームをスキーム13に示す。
【０１１１】
【化１４】
2009501532.tif 000016
【０１１２】
(実施例7)DNA修飾電極における化合物7の応答
平面金電極は、10nmのクロム層、続いて500nmの金層でシリコン酸化ウェーハをコーティングし、ブランケットスパッターにより製造される。次いで、このウェーハのスクライブした断片を、市販のUV-Ozoneクリーナーを用いて30分間清浄化し、引き続いて、無水エタノール中に20分間浸漬する。次いで、該電極を、窒素下乾燥する。曝露面積を規定するためにPDMSガスケットを用い、種々の濃度のDTPA修飾25塩基DNA鎖(ここでのDTPAは、スキーム20で示されているタイプのジスルフィド含有ホスフェートリンカーである)を、20分間電極表面上に沈着させ、引き続いて、水中、1mMのメルカプトヘキサノールに10分間曝露する。水ですすいだ後、該電極を、Millipore水中、7(スキーム14を参照)の100μg/mL溶液に1分間曝露し、水中で20秒間すすぐ。
【０１１３】
【化１５】
2009501532.tif 000017
【０１１４】
次いで、電極面積を規定するために3mm直径の0-リングを用い、該電極を電気化学的セル内にはめ込む。図13に示されるように、10mMのトリス緩衝液(pH 8)中、100mV/秒で該電極を用い、白金カウンター電極およびAg/AgCl参照電極を用いて、サイクリックボルタモグラムを実施する。
【０１１５】
次に、化合物1および7に関するDNA濃度に対して、測定した積分電荷をプロットする。得られたプロットは、図14に示されている。
【０１１６】
(実施例8)樹状電気化学的部分
Polymer Source(ケベック、カナダ国)より市販の4アームポリ(エチレンオキシド)スクシンイミジル末端ペンタエリトリトールにより、レドックス可逆性メディエーターを調製できる。下記に示されるように、該エリトリトール中間体の反応により、その後、Os(bpy)2)Cl2と反応して4アームレドックス部分を与える化合物が得られる。得られた化合物は親水性であり、化学吸着をより受けにくい。本明細書に示された各ポリカチオンに関して、任意の好適なイオン交換法、例えば、アニオン交換樹脂、またはpH7超での透析により、対イオンを置換できる。
【０１１７】
4アーム電気化学的部分の調製に関する合成法を、スキーム15に示す。
【０１１８】
【化１６】
2009501532.tif 000018
【０１１９】
レドックス可逆性メディエーターはまた、さらなる数のアームを有して調製できる。例えば、6アーム部分は、やはり市販(Polymer Source、ケベック、カナダ国)の6アームポリ(エチレンオキシド)スクシンイミジル末端ジペンタエリトリトールにより、同様に調製できる。スキーム16に示されるように、スクシンイミジルエステル化合物と遷移金属のアミン含有錯体との反応によって、6アーム樹状メディエーターが得られる。
【０１２０】
【化１７】
2009501532.tif 000019
【０１２１】
6アーム樹状電気化学的メディエーターの代替例は、下記のスキーム17に記載されているが、ここでは、オスミウムベースのレドックス中心を含む6アーム樹状メディエーターを調製するために、6アームポリ(エチレンオキシド)スクシンイミジル末端トリメチロールプロパンが用いられる。
【０１２２】
【化１８】
2009501532.tif 000020
【０１２３】
(実施例9)オスミウムレドックス中心を含む検出タグの調製
スキーム18の合成法に従って、オスミウム電気的活性部分を含む検出タグを調製できる。
【０１２４】
【化１９】
2009501532.tif 000021
【０１２５】
イミダゾールベースの検出タグの代替物として、スキーム19に示された合成法に示されたようなピリジン環を組み込んだ、オスミウム中心を含む検出タグもまた調製できる。
【０１２６】
【化２０】
2009501532.tif 000022
【０１２７】
オスミウムレドックス中心とジスルフィド部分の双方を組み込んでいる検出タグは、スキーム20の合成法に示されるとおりに調製される。
【０１２８】
【化２１】
2009501532.tif 000023
【０１２９】
上記のとおり、ジスルフィド部分は、金電極表面への吸着を促進し、一方、ポリアニオン性ホスフェート基は、ポリカチオン性電気化学的部分との相互作用を促進するため、ジスルフィド標識したオリゴヌクレオチド出発物質は、それ自体で検出タグとして有用である。しかし、末端アミン基の存在により、該検出タグは、オスミウム電気化学的部分を含むようにさらに修飾することが可能になる。
【０１３０】
(実施例10)非修飾金電極上での荷電タグの捕捉
PCR条件は、以下の配列を有するレポータープローブを除いては、実施例1に記載されたものと同じである。
(DTPA)(DTPA)(DTPA)CACGAATCAAAGCTCTCAACGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCA(ビオチン) 
（式中、DTPAは、スキーム20に示されたタイプのジスルフィド含有ホスフェートリンカーであり、該プローブ内の3つのDTPA単位は、ハイブリダイゼーション事象なしに電極表面への化学吸着を促進する）
【０１３１】
PCRの後、ストレプトアビジンでコーティングしたDynal磁気ビーズに関する上記のプロトコルを用いて、非開裂のプローブおよびアンプリコンを除去した。
【０１３２】
先に記載したとおり、電極を調製し、清浄化した。ストレプトアビジンでコーティングしたDynal Beadsを用いて、非開裂のプローブおよびアンプリコンを分離した後、該溶液を新たに清浄化した金電極に20分間曝露し、引き続き、5秒間水ですすぎ、メルカプトヘキサノールの1mM水溶液に10分間曝露する。次いで、該電極を指示されたカチオン性レドックスレポーター分子の水溶液に10分間曝露してから、水中で20秒間すすぐ。800nMのプローブおよび化合物21の溶液のサイクリックボルタモグラム(スキーム10に示されている)を、図15に示すように、Ag/AgCl参照電極および白金対電極に対して記録した。800nMのプローブおよび化合物7の溶液のサイクリックボルタモグラムを、図16に示すように、Ag/AgCl参照電極および白金対電極に対して記録した。
【０１３３】
(実施例11)非開裂プローブの存在下での開裂タグの検出
本実施例は、タグ相補体が、金電極などの金表面への結合に対して特異性を示すチオール部分(本明細書では、DTPA部分によって提供されている)により電極に固定化されており、開裂可能なプローブが(i)標的相補的セグメントの5'端に結合したポリヌクレオチド配列および(ii)固定化されたタグ相補体による開裂タグの捕捉後、電気化学的検出のためのオスミウム含有複合体を含む検出可能タグを含む、実施形態を例示する。
【０１３４】
捕捉プローブ(タグ相補体)が電極表面に近接した非開裂プローブのタグの選択的結合によって非開裂(完全)プローブの捕捉を不安定化させるように適切な捕捉プローブを選択することにより、該開裂プローブを、非開裂プローブの存在下、検出および/または測定することができる。その結果、捕捉プローブは、該プローブに結合した非開裂タグ部分よりも安定に開裂タグにハイブリダイズする。
【０１３５】
1X PCR緩衝液A(Applied Biosystems、P/N N808-0228)、6mMのMgCl2、200μMの各dNTP、200nMの正および逆プライマー(実施例1を参照)、400nMの5'-Os-標識プローブ(各プローブ上の5'アミノ基に結合したOs複合体標識物質に関しては、下記スキーム21を参照)、0.05単位のGold AmpliTaq(商標)ポリメラーゼおよび3,000コピーのリステリア菌DNAを含有する50μlの反応混合物を調製する。
【０１３６】
以下の組合せに示すように、開裂可能プローブおよび固定化タグ相補体の3つの異なる組合せを試験した。各組み合わせにおいて、上の配列(下線)は、検出されるべきOs-標識化開裂タグを表し、下の配列は、5'端で3つのDTPA部分により電極に結合しており、タグ配列に結合するためのタグ相補体を含む捕捉プローブを表している。
【０１３７】
【化２２】
2009501532.tif 000024
【０１３８】
熱サイクルは、95℃で10分間、次いで、(92℃で15秒間、66℃で30秒間)×40サイクル実施した。次いで、実施例1および実施例2に記載されたとおり、該PCR混合物を電気化学的測定のために、電気化学的セル内に入れる。測定は、31℃(IDTウェブサイト:www.idt.comにおけるTm計算器プログラムを用いて計算した、上記組合せ3における15量体開裂タグ配列の融解温度(Tm)からおよそ10度下)で、実施例2のハイブリダイゼーション緩衝液を用いて実施した。結果を、図16に示す。
【０１３９】
【化２３】
2009501532.tif 000025
【０１４０】
先の操作原理および好ましい実施形態を挙げて本発明を示し記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、形態および詳細における種々の変更をなし得ることが、当業者には明らかであろう。本発明は、このような全ての代替、修飾および変型を包含するものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】本発明の一実施形態による、アンプリコンテンプレートであるポリヌクレオチド配列にハイブリダイズした代表的な増幅プローブを示す、スキームである。
【図２】ハイブリダイズした核酸複合体からのフラップ部分の開裂を示すスキーム図である。
【図３】本発明の一実施形態による、検出オリゴヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のモニタリングを示すスキーム図である。
【図４】本発明の一実施形態による、増幅中に自身の伸長をセルフプライミングできる核酸配列の使用を示すスキーム図である。
【図５】本発明の一実施形態による、タグ配列を含有するヘアピンループを含む核酸配列の使用を示すスキーム図である。
【図６】本発明の一実施形態による、増幅中に検出オリゴヌクレオチドに相補的な開裂可能タグ配列の使用を示すスキーム図である。
【図７】開裂タグと電極表面との相互作用による、該開裂部位から離れたタグ配列の検出を示すスキーム描写図である。
【図８】本発明の一実施形態による、ミクロ流体システムのスキーム描写図である。
【図９】実施例1に記載した、対照反応に比較してアンプリコンの電気泳動分析により検証した場合に、タグ配列の存在が標的配列のPCR増幅に影響を及ぼさないことを示す。
【図１０】実施例1に記載した、タグ配列の電気化学的検出を示す。
【図１１】実施例2に記載した、タグ配列の電気化学的検出の別の例を示す。
【図１２】実施例4で検討した、静電気的に結合したレドックス中心による電極でのタグ検出を示すスキーム図である。
【図１３】実施例7に記載した、媒介化合物の電気化学的応答を示すボルタモグラムである。
【図１４】実施例7に記載した、化合物1および7に関する積算電荷対DNA濃度のプロットである。
【図１５】実施例10に記載した、増幅プローブおよび化合物21のサイクリックボルタモグラムを示す。
【図１６】実施例10に記載した、増幅プローブおよび化合物7のサイクリックボルタモグラムを示す。
【図１７】実施例11に記載した、タグ配列1、2、および3に関する開裂タグ配列の検出と非開裂タグ配列の検出との間の差を示す。
【符号の説明】
【０１４２】
10    増幅プローブ
12    ポリヌクレオチド配列
14    相補的ポリヌクレオチド配列
16    検出タグ
18    検出可能標識
20    標的配列に相補的な配列
21    標的配列
22    相補的ポリヌクレオチド配列
23    追加検出オリゴヌクレオチド配列
24    新たに形成された二重鎖
26    固定化配列
28    検出可能標識、検出可能な電気的活性標識
30    金電極
32    タグ配列
34    ループ-ステム構造
36    タグ配列自体の伸長
38    固定化配列
40    電極
41    プローブ
42    電気的活性標識
43    スペーサー
44    プローブにユニークなタグ配列
45    相補的固定化配列
46    電極表面
52    検出オリゴ
54    タグ配列
56    ハイブリダイズした複合体
60    固定化配列
62    電極(図6)、ミクロ流体装置(図8)
64    PCRチャンバー(図7)、電極アセンブリ、電極(図8)
66    不活性固体基体(図7)、コントローラー(図8)
67    電極
68    相補的核酸鎖(図7)、サンプル調製領域(図8)
70    ポリアニオン部分(図7)、試薬リザーバ(図8)
72    アンプリコン(図7)、ミクロ流体チャネルシステム(図8)
74    検出試薬(図7)、入口(図8)
76    チャンバー
78    フィルター
80    反応チャンバー
84    バルブ
86    加熱ユニット
88    PCRチャンバー
90    フィルター
92    PCR試薬リザーバ
94    バルブ
96    加熱ユニット
97    電気分解チャンバー、電気分解ウェル
98    フィルター
100    電極
102    試薬リザーバ
104    バルブ
106    電極
108    電気分解ウェル
110    ゲル、電気分解チャンバー
【図１】
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【図２】
2009501532.tif 000027
【図３】
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【図４】
2009501532.tif 000029
【図５】
2009501532.tif 000030
【図６】
2009501532.tif 000031
【図７】
2009501532.tif 000032
【図８】
2009501532.tif 000033
【図９】
2009501532.tif 000034
【図１２】
2009501532.tif 000035
【図１５】
2009501532.tif 000036
【図１６】
2009501532.tif 000037
【図１７】
2009501532.tif 000038
【図１０】
2009501532.tif 000039
【図１１】
2009501532.tif 000040
【図１３】
2009501532.tif 000041
【図１４】
2009501532.tif 000042
【配列表】
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【国際調査報告】
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2009501532.tif 000044
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