(57)【要約】本発明により、カーゴを細胞に送達する組成物及び方法が提供される。一つの態様は、カベオリン１又はそのフラグメントを、小胞中に脂質ラフトを形成するのに有用な量で含有する合成小胞を提供する。合成小胞を使用して、ポリヌクレオチド、タンパク質、治療剤又はこれらの組み合わせを、細胞の特定の膜結合区画に送達することができる。特定の態様において、合成小胞は、ミトコンドリアのような細胞オルガネラへカーゴを送達することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の脂質を、配列番号１（カベオリン１）と少なくとも約８０％の配列同一性を有する１つ以上のポリペプチド又はそのフラグメントと組み合わせて含み、該１つ以上の脂質、ポリペプチド又はそのフラグメントが、合成小胞において脂質ラフトを形成するのに有効な量で存在する、
合成小胞。
【請求項２】
前記１つ以上の脂質がカチオン性脂質を含む、請求項１記載の小胞。
【請求項３】
前記１つ以上の脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、コレステロール、イオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、コレステリルヘミスクシネート、３−〔Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル〕コレステロール塩酸塩（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジオレオイルホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアムモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、３β−〔［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル〕コレステロール（ＤＣ−コレステロール）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（グルタリル）（ＤＯＰＥ−グルタル酸）又はこれらの組み合わせを含む、請求項１記載の小胞。
【請求項４】
標的シグナルを更に含む、請求項１記載の小胞。
【請求項５】
前記ビヒクルが、ポリヌクレオチオ、ポリペプチド、有機低分子又はこれらの組み合わせを含む、請求項１記載の小胞。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はこれらの組み合わせを含む、請求項５記載の小胞。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、アンチセンスポリヌクレオチド、酵素ポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ又はこれらの組み合わせを含む、請求項６記載の小胞。
【請求項８】
細胞内領域が、ミトコンドリア、核、ゴルジ体、小胞体、リソソーム及びペルオキシソームからなる群より選択される、請求項１記載の小胞。
【請求項９】
標的ポリヌクレオチドを細胞に形質移入する方法であって、
該細胞を請求項１記載の小胞と接触させることを含み、ビヒクルが標的ポリヌクレオチドを含む  
方法。
【請求項１０】
標的ポリヌクレオチドを細胞に形質移入する方法であって、
該細胞を、ミトコンドリア融合を促進する条件下で組み換えミトコンドリアと接触させることを含み、該組み換えミトコンドリアが、該標的ポリヌクレオチドを含む、
方法。
【請求項１１】
前記標的ポリヌクレオチドが、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ又はポリペプチドをコードする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
レポーター及び標的ポリペプチドに機能的に結合している配列番号１のアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む、融合タンパク質。
【請求項１３】
前記レポーターが、緑色蛍光タンパク質又はその検出可能なフラグメントを含む、請求項１２記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
小胞輸送のインヒビターをスクリーニングする方法であって、
請求項１２記載の融合タンパク質を発現する細胞と、試験化合物とを接触させること；  
レポーターからのシグナルを検出することによって、該融合タンパク質の位置を決定すること；及び
該試験化合物に接触された細胞における融合タンパク質の位置と、対照細胞における融合タンパク質の位置とを比較すること
を含み、対照細胞に対して該融合タンパク質の分布が減少していることが、該試験化合物が小胞輸送のインヒビターであることを示す、
方法。
【請求項１５】
小胞輸送のアゴニストをスクリーニングする方法であって、
請求項１２記載の融合タンパク質を発現する細胞と、試験化合物とを接触させること；
レポーターからのシグナルを検出することによって、該融合タンパク質の位置を決定すること；及び
該試験化合物に接触された細胞における融合タンパク質の位置と、対照細胞における融合タンパク質の位置とを比較することを含み、対照細胞に対して該融合タンパク質の分布が増加していることが、該試験化合物が小胞輸送のアゴニストであることを示す、
方法。
【請求項１６】
ミトコンドリア障害を治療する方法であって、
請求項４記載の小胞を、その必要性のある宿主に投与することを含み、ポリヌクレオチドがミトコンドリアポリペプチドをコードする、
方法。
【請求項１７】
細胞の細胞内領域にカーゴを送達する方法であって、
該カーゴを請求項１記載の小胞に装填すること；及び
該装填小胞を細胞に投与すること、
を含む方法。
【請求項１８】
前記カーゴが、担体又は可溶化剤を含む、請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００６年３月２４日に出願された米国仮特許出願第６０／７８５，８００号に対する優先権および利益を主張する。許容される場合、米国仮特許出願第６０／７８５，８００号は、その全体が本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の態様は、一般に、カーゴを細胞に送達する方法及び組成物を対象とし、特に、低分子、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを細胞の内部に送達する脂質ラフトを含有する合成小胞を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
核酸の細胞への移動の促進は、最も重要であり、頻繁に使用されている近代生物科学の技術の一つである。現在の実験室において、この技術は、遺伝子治療研究、遺伝子制御の研究、タンパク質構造／機能分析、並びに組み換えタンパク質の産生を含む多数の目的のために実施される。現在、多種多様な遺伝子移動方法が利用可能であるが、それぞれ特定の欠点を有する。
【０００４】
核酸は、ＤＥＡＥ−デキストラン−ジエチルアミノエチル−デキストラン（ＤＥＡＥ−デキストラン）、リン酸カルシウム沈殿、カチオン性脂質（リポフェクション）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のような化学的な方法を使用し、標的タンパク質及びペプチドをカチオン性脂質と組み合わせて用いて、細胞に送達することができる。残念なことに、ＤＥＡＥ−デキストラン処理が効果的である細胞の種類の範囲には限界がある。リン酸カルシウム方法は、緩衝剤塩濃度、温度及びｐＨの僅かな変化に敏感であり、特にリンパ球のような浮遊細胞における新しい形質移入方法と比較して、形質移入効果が相対的に乏しい。カチオン性脂質については、一次ニューロン、一次樹状細胞及び一次内皮細胞のような数種類の初代培養細胞が、依然として、カチオン性脂質を含む非ウイルス性仲介形質移入方法に抵抗性を有している。更に、カチオン性脂質のインビボ遺伝子送達への適用は、依然として、困難である。
【０００５】
現存する標的タンパク質は、典型的には、カチオン性脂質と組み合わせて使用される。例えば、ＤＮＡを含む硫酸プロタミンに、引き続いてカチオン性脂質を添加することにより、脂質のみを用いるＤＮＡ送達と比較して、培養細胞において導入遺伝子の発現を増強することが報告されている。残念なことに、特定のウイルス標的タンパク質は、宿主において免疫原性反応を引き起こす可能性がある。加えて、カチオン性脂質と血清タンパク質との相互作用は、形質移入の効果を有意に低減する可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
脂質ラフトを含有する合成組成物及びカーゴを細胞に送達するその使用方法を提供することが、本発明の目的である。
【０００７】
脂質ラフトを含有する合成組成物を使用した疾患、障害又は疾患若しくは障害の症状を治療する方法を提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【０００８】
インビトロ又はインビボで細胞に形質移入するための脂質ラフトを含有する合成組成物を提供することが、本発明のなお別の目的である。
【０００９】
小胞輸送のモジュレーターを同定する方法及び組成物を提供することが、別の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
脂質ラフトを含有する合成ビヒクルが提供される。ビヒクル又は小胞は、カーゴを、細胞、細胞内膜又はオルガネラのような膜結合構造体へ送達するのに適している。代表的なビヒクルは、１つ以上の脂質を、小胞を形成する配列番号１（カベオリン１）と少なくとも約８０％の配列同一性を有する１つ以上のポリペプチド又はそのフラグメントと組み合わせて含む。カベオリン１は、典型的には、小胞において脂質ラフトを形成し、細胞の細胞内領域へのカーゴの送達を、例えば約５ｎＭから約１００μＭに促進するのに有効な量で小胞内に存在する。カーゴは、薬剤若しくは低分子治療剤、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又はこれらの組み合わせであることができる。
【００１１】
別の態様は、細胞と、開示されるビヒクルとを接触させる、標的ポリヌクレオチドの細胞への形質移入の方法を提供し、ここでこのビヒクルは、ポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、細胞又は細胞のオルガネラにおいて発現する。
【００１２】
なお別の態様は、細胞と、ミトコンドリア融合を促進する条件下で組み換えミトコンドリアとを接触させる工程を含む、標的ポリヌクレオチドで細胞を形質移入する方法を提供し、ここでこの組み換えミトコンドリアは、標的ポリヌクレオチドを含む。ミトコンドリアは、同じ生体由来のものであっても異なる生体由来のものであってもよい。
【００１３】
一つの態様は、レポーター及び標的ポリペプチドに機能的に結合している配列番号１のアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む融合タンパク質を提供する。融合タンパク質は、細胞において膜輸送を追跡するために使用できる。融合タンパク質は、細胞において膜輸送を操作するか又はその方向を変えるために使用できる。
【００１４】
なお別の態様は、開示された融合タンパク質を発現する細胞と、試験化合物とを接触させ、そして融合タンパク質のレポーター部分からのシグナルを検出することによって、融合タンパク質の位置を決定する、小胞輸送のインヒビターをスクリーニングする方法を提供する。試験化合物に接触している細胞における融合タンパク質の位置を、対照細胞における融合タンパク質の位置と比較することができる。対照細胞に対して融合タンパク質の分布が減少していることは、試験化合物が小胞輸送のインヒビターであることを示し、一方、対照細胞に対して融合タンパク質の分布が増加していることは、試験化合物が小胞輸送のアゴニストであることを示す。
【００１５】
別の態様は、開示されたビヒクルをその必要性のある宿主に投与することを含む、病理を治療する方法を提供し、ここでビヒクルは、ポリヌクレオチド、治療剤、ポリペプチド又はそれらの組み合わせを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（詳細な説明）
定義
特に指示のない限り、技術用語は、従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般的用語の定義は、Ｌｅｗｉｎ，  Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０００発行；  Ｋｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．  （編），  Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．，  １９９９発行；  及び  Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ  （編），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９５発行；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ．  （２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ．  ｅｄｉｔｉｏｎにおいて見出すことができる。
【００１７】
この開示の理解を促進するために、以下の定義を提示する。
【００１８】
用語「ポリペプチド」には、タンパク質及びそのフラグメントが含まれる。ポリペプチドは、アミノ酸残基配列として本明細書に開示される。これらの配列は、アミノからカルボキシ末端基の方向で左から右に記載されている。標準命名法に従って、アミノ酸残基配列は、以下に示されているように、３文字又は単一文字のコードで呼ばれている：アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）。
【００１９】
本明細書で使用されるとき、「低分子」は、約５ｋＤ未満、好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物を意味することを意図する。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣薬、炭水化物、脂質又は他の有機若しくは無機分子であることができる。代表的な低分子には、プロテアーゼインヒビター、抗生物質、抗酸化薬、ビタミン、補助因子、化学療法剤、細胞毒素、ホルモン、転写因子、抗炎症剤又はこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００２０】
「変種」は、基準ポリペプチド又はポリヌクレオチドと異なるが、本質的な特性を保持するポリペプチド又はポリヌクレオチドを意味する。ポリペプチドの典型的な変種は、別の基準ポリペプチドとアミノ酸配列が異なる。一般に、差は限定されているので、基準ポリペプチドと変種の配列は、全体的に極めて類似しており、多くの領域において同一である。変種及び基準ポリペプチドは、１つ以上の修飾（例えば、置換、付加及び／又は欠失）によってアミノ酸配列が異なる場合がある。置換又は挿入アミノ酸残基は、遺伝子コードでコードされていてもよいし、いなくてもよい。ポリペプチドの変種は、対立遺伝子変種のような天然に生じることもあるし、又は天然に生じることが知られていない変種であることもある。
【００２１】
修飾及び変化は、開示のポリペプチドの構造において行うことができ、それでも、ポリペプチドと同様の性質を有する分子を得ることができる（例えば、保存的アミノ酸置換）。例えば、特定のアミノ酸を、活性を明白に失うことなく、配列において他のアミノ酸で置換することができる。ポリペプチドの生物学的機能活性を定義するのは、ポリペプチドの相互作用能及び性質であるので、特定のアミノ酸配列の置換を、ポリペプチド配列において行うことができ、その場合でも同様の特性を持つポリペプチドを得ることができる。
【００２２】
そのような変化を行うには、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することができる。相互作用的生物学的機能をポリペプチドに付与する疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、一般に当該分野において理解されている。特定のアミノ酸を、同様の疎水性親水性指標又はスコアを有する他のアミノ酸で置換し、それでも、同様の生物学的活性を持つポリペプチドをもたらしうることが知られている。それぞれのアミノ酸には、その疎水性及び電荷性に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられている。これらの指標は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２，８）；システイン／システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。
【００２３】
アミノ酸の相対的な疎水性親水性の性質が、得られるポリペプチドの二次構造を決定し、そのことが、ポリペプチドと酵素、基質、レセプター、抗体、抗原などのような他の分子との相互作用を規定すると考えられる。アミノ酸を、同様な疎水性親水性指標を有する別のアミノ酸で置換し、それでも、機能的に同等のポリペプチドを得ることができることが当該分野において知られている。そのような変化において、疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがとりわけ好ましい。
【００２４】
同様のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて行うこともでき、それにより作り出された生物学的機能が同等なポリペプチド又はペプチドは、免疫学的実施態様における使用が意図される。以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；プロリン（−０．５±１）；トレオニン（−０．４）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸を、同様の親水性値を有する別のアミノ酸で置換し、それでも、生物学的に同等のもの、特に免疫学的に同等のポリペプチドを得ることができることが理解される。そのような変化において、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがとりわけ好ましい。
【００２５】
上記に概説したように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいている。前記の多様な性質が考慮される例示的な置換は、当業者に周知であり、（元の残基：例示的な置換）：（Ａｌａ：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ）、（Ａｒｇ：Ｌｙｓ）、（Ａｓｎ：Ｇｌｎ、Ｈｉｓ）、（Ａｓｐ：Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ）、（Ｇｌｎ：Ａｓｎ）、（Ｇｌｕ：Ａｓｐ）、（Ｇｌｙ：Ａｌａ）、（Ｈｉｓ：Ａｓｎ、Ｇｌｎ）、（Ｉｌｅ：Ｌｅｕ、Ｖａｌ）、（Ｌｅｕ：Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、（Ｌｙｓ：Ａｒｇ）、（Ｍｅｔ：Ｌｅｕ、Ｔｙｒ）、（Ｓｅｒ：Ｔｈｒ）、（Ｔｈｒ：Ｓｅｒ）、（Ｔｒｐ：Ｔｙｒ）、（Ｔｙｒ：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ）及び（Ｖａｌ：Ｉｌｅ、Ｌｅｕ）が含まれる。したがって本開示の実施態様は、上記に記載されたポリペプチドの機能的又は生物学的に同等なポリペプチドを企図する。特にポリペプチドの実施態様は、目的のポリペプチドに約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び９５％の配列同一性を有する変種を含む。
【００２６】
当該分野において既知の「同一性」は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列間の関係である。当該分野において、「同一性」はまた、そのような配列間のマッチにより決定される、ポリペプチド間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」及び「類似性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ，  Ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８；  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．，  Ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９３；  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．，  Ｅｄｓ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  １９９４；  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７；  及び  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  Ｅｄｓ．，  Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１；  及び  Ｃａｒｉｌｌｏ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｄ．，  ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，  ４８：  １０７３  （１９８８）に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない既知の方法により容易に計算することができる。
【００２７】
同一性を決定する好ましい方法は、試験した配列の間に最大のマッチを与えるように設計される。同一性及び類似性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラムにより体系化される。２つの配列間の同一率は、Ｎｅｅｄｅｌｒｎａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．，  ４８：  ４４３−４５３，  １９７０）のアルゴリズムを組み込んだ分析ソフトウエア（すなわち、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）を使用して（例えば、ＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴ）決定することができる。規定値パラメーターを使用して、本開示のポリペプチドの同一性を決定する。
【００２８】
例として、ポリペプチド配列は、基準配列と同一、すなわち１００％の同一性であることができるか、又は同一％が１００％未満になるように、基準配列と比較して特定の整数までのアミノ酸改変を含むことができる。そのような改変は、少なくとも１つのアミノ酸欠失、保存的及び非保存的置換を含む置換、又は挿入から選択され、前記改変は、基準ポリペプチド配列のアミノ−若しくはカルボキシ末端位置に生じることができるか、又は基準配列におけるアミノ酸のうちで個別に、若しくは基準配列内の１つ以上の隣接群として、末端位置の間のどこかに散在して生じることができる。所定の同一％におけるアミノ酸改変の数は、基準ポリペプチドのアミノ酸の総数に、対応する同一率の数値率を掛け（１００で割り）、次に、基準ポリペプチドのアミノ酸の前記総数からその積を引くことによって決定される。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、用語「低ストリンジェンシー」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが別の基質に、配列特異性がほとんど又は全くなく結合することを許容する状態を意味する。
【００３０】
本明細書で使用されるとき、用語「精製された」又は同様の用語は、通常、自然環境において分子又は化合物と関連する他の成分を実質的には無含有（少なくとも６０％無含有、好ましくは７５％無含有、最も好ましくは９０％無含有）の形態で、分子又は化合物を単離することを意味する。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容される担体」は、リン酸緩衝食塩水、水、及び、油／水又は水／油乳剤のような乳剤、並びに多様な種類の湿潤剤のような標準的医薬担体のいずれかを包含する。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」には、特定の障害若しくは状態に関連する症状を緩和すること、及び／又は前記症状を予防若しくは排除することが含まれる。
【００３３】
「機能的に結合する」は、成分がそれらの通常の機能を実施するように配置されている組み合わせを意味する。例えば、コード配列に機能的に結合している制御配列又はプロモーターは、コード配列の発現を実施することができ、タンパク質に機能的に結合しているオルガネラ局在化配列は、結合タンパク質を特定のオルガネラに局在化するように方向付ける。
【００３４】
「局在化シグナル若しくは配列若しくはドメイン」又は「標的シグナル若しくは配列若しくはドメイン」は、交換可能に使用され、分子を、特定の細胞、組織、オルガネラ又は細胞内領域へ方向付けるシグナルを意味する。シグナルは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド若しくは炭水化物部分であることができるか、又は結合分子を所望の位置へ方向付けるのに十分な有機若しくは無機化合物であることができる。例示的なオルガネラ局在化シグナルには、当該分野に既知の核局在化シグナル、並びに表２及び３に提示されているもの、Ｅｍａｎｕｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｔｈｅｉｒ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  ３００（４）：  １００５−１６，  ２０００  ＪｕＩ  ２１，  及び  Ｃｌｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｅｎｒｙ，  Ｉｍｐｏｒｔ  ａｎｄ  Ｒｏｕｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｕｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ  Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  １２：１−２６，  １９９６（これらの開示はその全体が参照として本明細書に組み込まれる）に記載されているもののような当該技術に既知の他のオルガネラ局在化シグナルが挙げられる。表２及び３に示している全配列が含まれる必要はなく、配列が結合分子を特定のオルガネラに方向付けるように作用する限り、これらの配列の切断を含む修飾は、本開示の範囲内であることが理解される。本開示のオルガネラ局在化シグナルは、表２及び３の配列と８０〜１００％の同一性を有することができる。一つの部類の適切なオルガネラ局在化シグナルには、レセプター：リガンド機構における標的オルガネラと相互作用しないものが含まれる。例えば、オルガネラ局在化シグナルには、実効電荷、例えば正電荷を有する又は付与するシグナルが含まれる。正電荷シグナルを使用して、ミトコンドリアのような負電荷オルガネラを標的にすることができる。負電荷シグナルを使用して、正電荷オルガネラを標的にすることができる。
【００３５】
「タンパク質伝達ドメイン」又はＰＴＤは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜又は小胞膜の横断を促進するポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物又は有機化合物若しくは無機化合物を意味する。別の分子に結合しているＰＴＤは、例えば、細胞外空間から細胞内空間への、又はサイトゾルからオルガネラ内への分子の膜横断を促進する。例示的なＰＴＤには、ＨＩＶ  ＴＡＴ  ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）又はＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２）；７−１１個のアルギニン残基、又は８〜１５個の残基、好ましくは９〜１１個の残基を有する正電荷ポリペプチド若しくはポリヌクレオチド；ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号３）；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号４）；ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＡ（配列番号５）；ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号６）又はＲＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ（配列番号７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、用語「外来性ＤＮＡ」又は「外来性核酸配列」又は「外来性ポリヌクレオチド」は、外部供給源から細胞又はオルガネラに導入された核酸配列を意味する。典型的には、導入された外来性配列は、組み換え配列である。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、用語「形質移入」は、核酸配列を生細胞の膜密閉空間の内部へ導入することを意味し、核酸配列を細胞のサイトゾルの中へ、並びにミトコンドリア、核又は葉緑体の内部空間へ導入することを含む。核酸は、多様なタンパク質と関連する裸ＤＮＡ又はＲＮＡの形態であってもよいし、又は核酸をベクターに組み込むこともできる。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」は、核酸配列を細胞内に導入するのに使用されるビヒクルに関して使用される。ウイルスベクターは、組み換えＤＮＡ配列を宿主細胞又は細胞オルガネラに導入するのを可能にするように修飾されたウイルスである。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、用語「オルガネラ」は、葉緑体、ミトコンドリア及び核のような細胞膜結合構造体を意味する。用語「オルガネラ」には、天然及び合成オルガネラが含まれる。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、用語「非核オルガネラ」は、核以外で細胞内に存在する任意の細胞膜結合構造体を意味する。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」は、一般に、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを意味し、これは、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又は修飾されたＲＮＡ若しくはＤＮＡであることができる。したがって、例えば、本明細書で使用されるとき、ポリヌクレオチドは、とりわけ、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖と二本鎖の領域の混合であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、一本鎖と二本鎖の領域の混合であるＲＮＡ、一本鎖、又はより典型的には二本鎖、又は一本鎖と二本鎖の領域の混合でありうる、ＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子を意味する。用語「核酸」又は「核酸配列」は、上記で定義されたポリヌクレオチドも包含する。
【００４２】
加えて、本明細書で使用されるとき、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味する。そのような領域の鎖は、同じ分子から又は異なる分子からのものであることができる。領域は、１つ以上の分子の全部を含むことができるが、より典型的には分子の一部の領域のみに関わる。三重螺旋領域の分子のうちの１つは、多くの場合、オリゴヌクレオチドである。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、用語ポリヌクレオチドには、１つ以上の修飾塩基を含有する上記で定義されたＤＮＡ又はＲＮＡが含まれる。したがって、安定性又は他の理由で修飾された主鎖を有するＤＮＡ又はＲＮＡは、「ポリヌクレオチド」であり、この用語が本明細書で意図される。更に、２つだけ例を挙げると、イノシンのような通常ではない塩基、又はトリチル化塩基のような修飾塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡは、本明細書中で使用される用語としてのポリヌクレオチドである。
【００４４】
当業者に既知の多くの有用な目的に役に立つ多種多様な修飾が、ＤＮＡ及びＲＮＡに対して行われてきたことが理解される。本明細書で用いられる用語ポリヌクレオチドは、とりわけ、そのような化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、並びに、ウイルス及び単純型及び複雑型細胞を含む細胞のＤＮＡ及びＲＮＡ特性の化学的形態を包含する。
【００４５】
「オリゴヌクレオチド」は、比較的短いポリヌクレオチドを意味する。しばしば、この用語は、一本鎖デオキシリボヌクレオチドを意味するが、とりわけ、一本鎖又は二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、及び二本鎖ＤＮＡも意味することができる。
【００４６】
（Ｉ．合成小胞組成物）
カベオリン１を含む脂質ラフトは、小胞、オルガネラ及び他の膜結合領域の間の細胞内輸送に寄与することが発見されている。更に、カベオリン１又はそのフラグメントを１つ以上の脂質、例えばカチオン性脂質と組み合わせて含む合成カーゴ送達ビヒクルは、カーゴを、細胞外空間から細胞内空間へ、細胞膜の間で、並びにミトコンドリア、核若しくは他のオルガネラのような特定のオルガネラへ又はその間で送達するのに有用であることが発見されている。一つの実施態様は、脂質ラフトを含有する合成ビヒクルを提供する。合成ビヒクルは、脂質ラフトを含有する合成小胞又はリポソームであることができる。脂質ラフトは、ビヒクルに挿入された１つ以上のタンパク質と、ビヒクルを形成する脂質とを相互作用させることによって形成することができる。代表的なタンパク質は、カベオリン１、その脂質ラフト形成フラグメント、又はその変種である。小胞が、二重層である場合、脂質ラフトは、外側層、内側層、又は両方にあることができる。
【００４７】
（Ａ．脂質ラフト）
一つの実施態様において、合成小胞は１つ以上の脂質ラフトを含む。一つの実施態様において、人工脂質ラフト組成物は、コレステロール、並びにスフィンゴミエリン、ガングリオシド、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール及びセラミドからなる群より選択される１つ以上の脂質を含む。代表的な脂質組成物は、表１に提示されている（Ｓｍａｒｔ  ＥＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｖｅｏｌｉｎｓ，  ｌｉｑｕｉｄ−ｏｒｄｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎｓ，  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．  ＭｏＩ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９（１１）：７２８９−３０４  （１９９９））。
【００４８】
【表１】
2009531438.tif 000002
脂質ラフトは、細胞膜内、最も顕著には原形質膜内のコレステロール及びスフィンゴ糖脂質含有量が高い局在化領域であるが、ゴルジ体、小胞体及び核も脂質ラフトを有する（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ５３７（Ｐｔ  ２）：５３７−５２  （２００１））。脂質ラフト及び小嚢に存在するリン脂質のアシル基は、周囲の膜に存在するものよりも高度に飽和している。このことは、スフィンゴ脂質の飽和アシル鎖を有するリン脂質側鎖の緊密な充填を可能にし、相（液体−固体）分離を増強する。コレステロールの存在に起因して、周囲の原形質膜よりも低い流動性を示す液体秩序ドメインが形成され、したがって、大量のより液状のリン脂質中の脂質ラフトという用語となる。コレステロール関連タンパク質カベオリンで被覆されている小型原形質膜陥入である小嚢は、脂質ラフトの下位分類である。脂質ラフト及び小嚢内の、多くのレセプターを含む細胞シグナル伝達に関与する多様な膜タンパク質の存在は、これらの脂質ドメインが、相互作用するタンパク質を隣接するマイクロドメインと共局在化させることによってシグナル伝達の過程において重要な役割を果たすという意見の一致をもたらした。これらマイクロドメインは、細胞外シグナルの伝達における枠組みのナノ構築を提供するので、シグナロソームと呼ばれている。
【００４９】
脂質ラフトとの関連性を示すタンパク質には、グリコシルフォスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカードタンパク質、Ｓｒｃファミリーの二重アシル化チロシンキナーゼ、及び膜貫通タンパク質が含まれる。この関連性は、少なくとも部分的にはチロシンキナーゼ及びＧＰＩ係留タンパク質の両方のアシル化飽和テールに起因することができ、膜の残りの部分よりもスフィンゴ脂質の特性とマッチしている（Ｓｉｍｏｎｓ，  Ｋ．，  Ｉｋｏｎｅｎ，  Ｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３８７（６６３３）：５６９−５７２  （１９９７））。これらのタンパク質は継続的に脂質ラフトに存在する傾向があるが、タンパク質が活性化されたときだけ脂質ラフトと関連する他のものも存在する。これらの幾つかの例には、Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）、ＰＡＧ及びＣＤ３９と呼ばれる酵素が挙げられるが、これらに限定されない。脂質ラフトに関連する、又はその形成を助ける他のタンパク質には、ＭＡＲＫＳ、ＣＡＰ、ＧＡＰ−４３又はこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。タンパク質は、典型的には、約５ｎＭ〜約１００μＭの範囲の量で存在する。
【００５０】
一つの実施態様において、合成小胞の脂質ラフトは、１つ以上のコレステロール、スフィンゴ糖脂質、アラキドン酸、プラスメニルエタノールアミン、カベオリン１及び２、ヘテロ三量体Ｇタンパク質及び単量体Ｇタンパク質、ＥＧＦ＆ＰＤＧＦレセプター、Ｆｙｎ、ＧＰＩ結合酵素、インテグリン、フロチリン、又はこれらの組み合わせを含む。
【００５１】
一つの実施態様において、合成小胞の脂質ラフトは、１つ以上のコレステロール、スフィンゴ糖脂質及び他のアニオン性リン脂質を含む。この実施態様において、脂質ラフトを形成する脂質は、約１０％未満のホスファチジルイノシトール、典型的には約５％未満のホスファチジルイノシトールを含む。
【００５２】
（Ｂ．小嚢）
別の実施態様は、カーゴを細胞間オルガネラ又は小胞に送達することができる合成小嚢を提供する。小嚢は、原形質膜内に陥入活性マイクロドメインを形成する小胞オルガネラ（直径５０〜１００ｎｍ）であり、ポトサイトーシスと呼ばれるプロセスである、分子のレセプター仲介取込に関与すると考えられている。カベオリンは、小嚢膜ドメインの形成のために必要かつ十分な構造タンパク質である。カベオリン１及び２は、大部分の細胞型において共発現するが、カベオリン３の発現は、筋肉特異的である。小嚢のマイクロドメイン内において、カベオリンは、Ｓｒｆファミリーチロシンキナーゼ、ｐ４２／４４、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ及び内皮酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）を含む多様な下流シグナル伝達分子と相互作用し、これらのシグナルトランスデューサーを、適切な刺激により活性化されるまで、不活性立体構造に保持する。カベオリンは、また、小嚢の細胞レベル下標的に関与し、特定のシグナロソームを、ゴルジ体、ＥＲ又は核の標的にすることができる。ミトコンドリアは、かなりの量のカベオリン１を有することが示されているが、それがミトコンドリア内でどのような役割を果たしているかは不明である。事実、カベオリン１ノックアウトマウスの組織は、正常な酸化代謝を有するにもかかわらず、拡張した、マトリックス材料及びクリスタがほとんどないミトコンドリアにおいて、著しい摂動を有する（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。
【００５３】
一つの実施態様は、カーゴを、細胞、細胞内小胞、オルガネラ又は細胞内膜に送達するビヒクルを提供する。ビヒクルは、ビヒクル中に脂質ラフトを生じるのに有効な、例えば約５ｎＭ〜約１００μＭで、１つ以上の脂質、カベオリン１（Ｃａｖ１）、Ｃａｖ１のフラグメント又はＣａｖ１の変種を含む。カベオリンは、天然若しくは供給源から単離することができるか、又は組み換えカベオリンであることができる。あるいは、カベオリンペプチド又はタンパク質は、標準的ペプチド合成技術を使用して合成することができる。ビヒクルは、場合により、追加のタンパク質、例えばＣａｖ２及び／又はＣａｖ３を、ビヒクル中に脂質ラフトを生じるのに有効な量で含む。特定の実施態様において、脂質は、内部領域を有する球状構造を形成する。例えば、ビヒクルは、単層、二層又は多層小胞を形成することができる。単層小胞にはミセルが含まれ、二層小胞にはリポソームが含まれる。内部領域は、細胞に送達されるか又は細胞内のオルガネラに送達されるカーゴを収容することができる。カーゴには、ポリペプチド、ポリヌクレオチド又は細胞膜を受動的に又は容易に横断することができない他の化合物が含まれる。
【００５４】
適切な脂質には、場合により安定化脂質又は作用物質と組み合わされたカチオン性脂質が含まれるが、これに限定されない。例示的な脂質には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、コレステロール、イオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、コレステリルヘミスクシネート、３−〔Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル〕コレステロール塩酸塩（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジオレオイルホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアムモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、３β−〔［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル〕コレステロール（ＤＣ−コレステロール）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（グルタリル）（ＤＯＰＥ−グルタル酸）又はこれらの組み合わせが挙げられる。安定化脂質には、コレステロール及びコレステロールの改質形態が含まれる。
【００５５】
別の実施態様は、１つ以上の脂質を、配列番号（カベオリン１）と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する１つ以上のポリペプチド又はそのフラグメントと組み合わせて含むビヒクルを提供し、ここで１つ以上のポリペプチド又はそのフラグメントは、細胞の細胞内領域へのカーゴの送達を促進するのに有効な量で存在する。
【００５６】
修飾及び変化は、配列番号１のアミノ酸配列において行うことができ、それでも、ポリペプチドと同様の性質を有する分子を得ることができる（例えば、保存的アミノ酸置換）。例えば、特定のアミノ酸を、活性を明白に失うことなく、配列において他のアミノ酸で置換することができる。ポリペプチドの生物学的機能活性を定義するのは、ポリペプチドの相互作用能及び性質であるので、特定のアミノ酸配列の置換を、ポリペプチド配列において行うことができ、その場合でも同様の特性を持つポリペプチドを得ることができる。
【００５７】
そのような変化を行うには、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することができる。相互作用的生物学的機能をポリペプチドに付与する疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、一般に当該分野において理解されている。特定のアミノ酸を、同様の疎水性親水性指標又はスコアを有する他のアミノ酸で置換し、それでも、同様の生物学的活性を持つポリペプチドをもたらしうることが知られている。それぞれのアミノ酸には、その疎水性及び電荷性に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられている。これらの指標は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２，８）；システイン／システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。
【００５８】
アミノ酸の相対的な疎水性親水性の性質が、得られるポリペプチドの二次構造を決定し、そのことが、ポリペプチドと酵素、基質、レセプター、抗体、抗原などのような他の分子との相互作用を定義すると考えられる。アミノ酸を、同様な疎水性親水性指標を有する別のアミノ酸で置換し、それでも、機能的に同等のポリペプチドを得ることができることが当該分野において知られている。そのような変化において、疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがとりわけ好ましい。
【００５９】
同様のアミノ酸の置換を、親水性に基づいて行うこともでき、特に、それにより作り出された生物学的機能が同等なポリペプチド又はペプチドは、免疫学的実施態様における使用が意図される。以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；プロリン（−０．５±１）；トレオニン（−０．４）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸を、同様の親水性値を有する別のアミノ酸で置換し、それでも、生物学的に同等のもの、特に免疫学的に同等のポリペプチドを得ることができることが理解される。そのような変化において、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがとりわけ好ましい。
【００６０】
上記に概説したように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいている。前記の多様な性質が考慮される例示的な置換は、当業者に周知であり、（元の残基：例示的な置換）：（Ａｌａ：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ）、（Ａｒｇ：Ｌｙｓ）、（Ａｓｎ：Ｇｌｎ、Ｈｉｓ）、（Ａｓｐ：Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ）、（Ｇｌｎ：Ａｓｎ）、（Ｇｌｕ：Ａｓｐ）、（Ｇｌｙ：Ａｌａ）、（Ｈｉｓ：Ａｓｎ、Ｇｌｎ）、（Ｉｌｅ：Ｌｅｕ、Ｖａｌ）、（Ｌｅｕ：Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、（Ｌｙｓ：Ａｒｇ）、（Ｍｅｔ：Ｌｅｕ、Ｔｙｒ）、（Ｓｅｒ：Ｔｈｒ）、（Ｔｈｒ：Ｓｅｒ）、（Ｔｒｐ：Ｔｙｒ）、（Ｔｙｒ：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ）及び（Ｖａｌ：Ｉｌｅ、Ｌｅｕ）が含まれる。したがって本開示の実施態様は、上記に記載された機能的又は生物学的に同等なカベオリン１を考慮する。特にポリペプチドの実施態様は、配列番号１のポリペプチドに約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％及び９９％又はそれ以上の配列同一性を有する変種を含むことができる。
【００６１】
開示されたビヒクルは、更に標的シグナルを含む。標的シグナルには、核酸局在化シグナル、ミトコンドリア局在化シグナル、葉緑体局在化シグナル、又はこれらの組み合わせのようなペプチドシグナルが含まれる。あるいは、標的シグナルは、ビヒクルに電荷、例えば正電荷を付与する化学基であることができる。標的シグナルを、カベオリン１ポリペプチドに組み込むことができる。一つに実施態様において、標的シグナルは、抗体又は抗原結合抗体フラグメントである。適切な標的シグナルを表２に提示する。これらの標的シグナルの配列は当該分野において既知であり、例えばジェンバンク又は他の公的に入手可能なデータベースから入手可能である。
【００６２】
（Ｃ．カーゴ）
細胞又はオルガネラに送達されるカーゴは、典型的にはポリヌクレオチド、ポリペプチド、有機低分子又はこれらの組み合わせを含む。ポリヌクレオチドは、機能的タンパク質、例えば、ミトコンドリア呼吸鎖成分、治療タンパク質、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、又はこれらの組み合わせをコードすることができる。ポリペプチドカーゴは、酵素、抗体、抗原結合抗体フラグメント、転写因子、成長因子、ペプチドホルモン及びこれらの組み合わせを含むことができる。ポリヌクレオチドカーゴは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はこれらの組み合わせを含むことができる。幾つかの実施態様において、ポリヌクレオチドカーゴは、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ又はこれらの組み合わせを含む。ポリヌクレオチドカーゴは、発現ベクターのようなベクター、及び細胞翻訳機構により翻訳されるｍＲＮＡを産生するように転写することができるＤＮＡ構築物を含む。ベクターは、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、及びベクターによりコードされるタンパク質又は核酸の発現を制御するために必要であることが当該分野において公知の他の調節エレメントを含むことができる。
【００６３】
カーゴを合成ビヒクル又は合成小胞に装填するには、米国特許第６，１５６，３３７号に記載されている方法が含まれる。代表的な方法には、下記が挙げられるが、これに限定されない：
ａ）水混和性有機溶媒中に小胞を形成するのに適している脂質のような両親和性物質を混合すること、
ｂ）固体支持体の存在下で溶媒を除去すること、あるいは乾燥両親和性物質又はその混合物を任意の形態（粉末、顆粒など）で直接使用すること、
ｃ）工程ｂ）の産物を取り出して、生理学的に適合する溶液中のバイオポリマー物質の溶液の中に入れること、
ｄ）可溶性又は分散性を有する有機溶媒を加えること、並びに
ｅ）工程ｄ）で得た画分を、バイオポリマー物質の機能を保持する条件下で乾燥すること。
【００６４】
カーゴを、特定の細胞内領域、又はミトコンドリア、核、ゴルジ体、小胞体、リソソーム及びペルオキシソームのようなオルガネラへ方向付けることができる。
【００６５】
適切なカーゴは、薬学的に活性な作用物質も含む。活性作用物質の適切な部類には、抗生物質剤、抗微生物剤、抗ざ瘡剤、抗菌剤、抗真菌剤、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、モルフォゲン、抗ウイルス剤、ステロイド性抗炎症剤、非ステロイド性抗炎症剤、麻酔剤、止痒剤、抗原虫剤、抗酸化薬、抗ヒスタミン薬、ビタミン及びホルモンが含まれるが、これらに限定されない。
【００６６】
組成物は、場合により１つ以上の追加的な薬学的に活性な作用物質を含有する。活性作用物質の適切な部類には、抗生物質剤、抗微生物剤、抗ざ瘡剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、ステロイド性抗炎症剤、非ステロイド性抗炎症剤、麻酔剤、止痒剤、抗原虫剤、抗酸化薬、抗ヒスタミン薬、ビタミン及びホルモンが含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
（ｉ．抗生物質）
代表的な抗生物質には、限定することなく、過酸化ベンゾイル、オクトピロキス、エリスロマイシン、亜鉛、テトラサイクリン、トリクロサン、アゼライン酸及びその誘導体、フェノキシエタノール及びフェノキシプロポノール、酢酸エチル、クリンダマイシン及びメクロサイクリン、フラビノイドのようなセボスタット、アルファ及びベータヒドロキシ酸、シムノールスルフェート及びその誘導体のような胆汁酸塩、デオキシコレート、並びにコール酸塩が含まれる。抗生物質は、抗真菌剤であることができる。適切な抗真菌剤には、クロトリマゾール、エコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、ミコナゾール、オキシコナゾール、スルコナゾール、ブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィン、ウンデシレン酸、トルナフテート及びナイスタチンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
抗生物質の濃度は、最終組成物の約０．０１重量％〜約２０重量％、好ましくは約１重量％〜約１５重量％、より好ましくは約６重量％〜約１２重量％である。
【００６９】
（ｉｉ．非ステロイド性抗炎症剤）
非ステロイド性抗炎症剤の代表的な例には、限定することなく、ピロキシカム、イソキシカム、テノキシカム、スドキシカムのようなオキシカム；アスピリン、ジサルシド、ベノリレート、トリリセート、サファプリン、ソルプリン、ジフルニサール及びフェンドサールのようなサリチレート；ジクロフェナク、フェンクロフェナク、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、イソキセパク、フロフェナク、チオピナク、ジドメタシン、アセマタシン、フェンチアザク、ゾメピラック、クリンダナク、オキセピナク、フェルビナク及びケトロラクのような酢酸誘導体；メフェナム酸、メクロフェンアミド酸、フルフェナム酸、ニフルム酸及びトルフェナム酸のようなフェンナメート；イブプロフェン、ナプロキセン、ベノキサプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、フェノプロフェン、フェンブフェン、インドプロペン、ピルプロフェン、カルプロフェン、オキサプロジン、プラノプロフェン、ミロプロフェン、チオキサプロフェン、スプロフェン、アルミノプロフェン及びチアプロフェンのようなプロピオン酸誘導体；フェニルブタゾン、オキシフェニルブタゾン、フェプラゾン、アザプロパゾン及びトリメタゾンのようなピラゾールが挙げられる。これらの非ステロイド性抗炎症剤の混合物、並びにこれらの作用物質の皮膚科学的に許容される塩及びエステルの混合物を用いることもできる。例えば、フルフェナム酸誘導体であるエトフェナメートは局所適用に特に有用である。
【００７０】
（ｉｉｉ．ステロイド性抗炎症剤）
ステロイド性抗炎症薬の代表的な例には、限定することなく、ヒドロコルチゾン、ヒドロキシルトリアムシノロン、アルファ−メチルデキサメタゾン、リン酸デキサメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、吉草酸クロベタゾール、デソニド、デソキシメタゾン、酢酸デソキシコルチコステロン、デキサメタゾン、ジクロリゾン、二酢酸ジフロラゾン、吉草酸ジフルコルトロン、フルアドレノロン、フルクロロロンアセトニド、フルドロコルチゾン、フルメタゾンピバレート、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルコルチンブチルエステル、フルオコルトロン、酢酸フルプレドニデン（フルプレドニリデン）、フルランドレノロン、ハルシノニド、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフルロゾン、フルラドレノロン、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフルロゾン、フルラドレノロンアセトニド、メドリゾン、アムシナフェル、アムシナフィド、ベクロメタゾン及びそのエステルの残余、クロロプレドニゾン、酢酸クロロプレドニゾン、クロコルテロン、クレシノロン、ジクロリゾン、ジフルルプレドネート、フルクロロニド、フルニソリド、フルオロメタロン、フルペロロン、フルプレドニゾロン、吉草酸ヒドロコルチゾン、シクロペンチルプロピオン酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルタメート、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、トリアムシノロン及びこれらの混合物のようなコルチコステロイドが挙げられる。
【００７１】
（ｉｖ．抗微生物剤）
適切な抗微生物剤には、ベータラクタム系薬剤、キノロン系薬剤、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、アミカシン、トリクロサン、  ドキシサイクリン、カプレオマイシン、クロルヘキシジン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、  クリンダマイシン、エタンブトール、メトロニダゾール、ペンタミジン、ゲンタマイシン、カナマイシン、リネオマイシン、メタサイクリン、メテナミン、ミノサイクリン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン及びミコナゾールのような抗菌剤、抗真菌剤、抗ざ瘡剤及び抗ウイルス剤が含まれるが、これらに限定されない。また含まれるものは、塩酸テトラサイクリン、ファメゾール、エリスロマイシンエストレート、ステアリン酸エリスロマイシン（塩）、硫酸アミカシン、塩酸ドキシサイクリン、グルコン酸クロルヘキシジン、塩酸クロルヘキシジン、塩酸クロルテトラサイクリン、塩酸オキシテトラサイクリン、塩酸クリンダマイシン、塩酸エタンブトール、塩酸メトロニダゾール、塩酸ペンタミジン、硫酸ゲンタマイシン、硫酸カナマイシン、塩酸リネオマイシン、塩酸メタサイクリン、馬尿酸メテナミン、マンデル酸メテナミン、塩酸ミノサイクリン、硫酸ネオマイシン、硫酸ネチルマイシン、硫酸パラモマイシン、硫酸ストレプトマイシン、硫酸トブラマイシン、塩酸ミコナゾール、塩酸アマンファジン、硫酸アマンファジン、トリクロサン、オクトピロキス、ナイスタチン、トルナフテート、クロトリマゾール、アニデュラファンギン、ミカファンギン、ボリコナゾール、  ラノコナゾール、シクロピロクス及びこれらの混合物である。
【００７２】
（ＩＩ．製造方法）
脂質ラフトを含有するビヒクルは、リポソーム又は脂質小胞を生成する従来の方法を使用して生成することができる。例えば、脂質成分をクロロホルムのような適切な溶媒に溶解して、都合のよい処理濃度（１〜１０ｍｇ／ｍＬ）にする。代表的な脂質には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、コレステロール、イオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、コレステリルヘミスクシネート、３−〔Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル〕コレステロール塩酸塩（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジオレオイルホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアムモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、３β−〔［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル〕コレステロール（ＤＣ−コレステロール）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（グルタリル）（ＤＯＰＥ−グルタル酸）又はこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００７３】
各成分のアリコートを、例えばガラスシリンジを使用して、ガラスバイアルの中に入れることができる。成分をガラスバイアルの中で混合し、溶媒を例えば真空吸引により除去する。脂質を蒸留水に２回再懸濁して、最終脂質濃度にする。カベオリン１又はその変種を水性懸濁液に加えて、所望の濃度にする。懸濁液を、等量の所望の緩衝剤（例えば、３０８ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのヘペス、ｐＨ７．４）と共に超音波処理して、明澄にすることができる。必要であれば、溶液を更に超音波処理し、従来の方法を使用して滅菌することができる。
【００７４】
カーゴを、従来の技術を使用して、ビヒクルの調製の際又は後で、送達ビヒクルに添加することができる。例えば、カーゴは、小胞の形成の間又は小胞の形成の後でも、存在することができる。
【００７５】
合成小胞は、「小型の単層小胞」又は「超音波処理単層小胞」であることができ、通常、カップホーン、浴又はプローブチップソニケーターを使用する超音波処理により調製される。合成小胞は、「大型の単層小胞」であることもでき、押出（ＬＵＶＥＴすなわち「押出技術により調製された大型の単層小胞」）、洗剤透析（ＤＯＶすなわち透析オクチルグルコシド小胞）、ＳＵＶの融合（ＦＵＶすなわち「融合単層小胞」）、逆蒸発（ＲＥＶすなわち「逆蒸発小胞」）及びエタノール注入を含む多様な方法により調製することができる。単層小胞は、ＭＬＶ又はＬＭＶ（大型の多層小胞）から調製され、両親媒性脂質が水和されると大型の「タマネギ様」構造が形成される。ＳＵＶは、典型的には直径が１５〜３０ｎｍであり、一方、ＬＵＶは１００〜２００ｎｍ又はそれ以上の範囲である。ＬＵＶは、保存安定性があるが、ＳＵＶは、小胞を形成する脂質の相移転温度よりも下がると、自発的に融合する。
【００７６】
（ＩＩＩ．使用方法）
開示されているカーゴ送達ビヒクルを使用して、低分子、特に治療化合物を細胞の内部に送達することができる。特定の実施態様において、送達ビヒクルは、薬剤又は化合物をオルガネラ、例えばミトコンドリア、葉緑体又は核に送達する。典型的には、送達される低分子は、電荷、サイズ又はこれらの組み合わせのために、細胞外膜を容易に横切ることができない。カーゴを、溶媒、担体又は可溶化剤に懸濁することができ、得られた組み合わせを、送達ビヒクルに装填することができる。開示されているビヒクルは、対照と比較して、特定のオルガネラへ送達されるカーゴの量を増加させることができる。
【００７７】
本開示の他の実施態様は、遺伝子治療プロトコール及び遺伝子関連疾患又は障害の治療に適用可能な組成物及び方法を提供する。オルガネラ機能障害も、開示されている組成物及び方法を使用して治療又は低減することができる。特に、ミトコンドリア又は葉緑体の問題は、疾患をもたらす可能性がある。ミトコンドリア疾患は、赤血球を除いて体の全ての細胞に存在する特殊な区画であるミトコンドリアの機能不全によりもたらされる。細胞損傷、さらには、細胞死は、ミトコンドリアの機能不全によりもたらされる。このプロセスが体全体で繰り返されると、系全体が機能しなくなり始め、このことが起こっている人の生命が著しく損なわれる。この疾患は、子供、例えば年齢が１８歳未満、典型的には年齢が１２歳未満の個人、又は成人、例えば年齢が１８歳以上の個人に起こりうる。したがって、本開示の実施態様は、ベクターを宿主の細胞に送達することにより、オルガネラ関連疾患、特にミトコンドリア疾患が診断されている宿主を治療することを対象としており、ここで、ベクターはオルガネラに特異的に結合し、ベクターは、ミトコンドリアタンパク質又はペプチドをコードする核酸を含む。本開示は、哺乳類細胞ミトコンドリアゲノムの一部を操作、増強又は取り換えて、ミトコンドリア遺伝子欠陥又は異常により引き起こされる疾患を治療することを包含する。
【００７８】
本明細書に開示されている組成物により治療できる適切な遺伝子系疾患には以下が含まれるが、これらに限定されない：
ミトコンドリア疾患：アルパース病；バルト症候群；β酸化異常；カルチニン−アシル−カルチニン欠損症；カルチニン欠損症；コエンザイムＱ１０欠損症；複合体Ｉ欠損症；複合体ＩＩ欠損症；複合体ＩＩＩ欠損症；複合体ＩＶ欠損症；複合体Ｖ欠損症；チトクロームｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）欠損症、ＬＨＯＮ−レーベル遺伝性視神経症；ＭＭ−ミトコンドリア筋疾患；ＬＩＭＭ−致死性小児ミトコンドリア筋疾患；ＭＭＣ−母性筋疾患及び心筋症；ＮＡＲＰ−神経原性筋虚弱、運動失調症及び網膜色素変性症；リー病；ＦＩＣＰ−致死性小児心筋症プラス、ＭＥＬＡＳ関連心筋症；ＭＥＬＡＳ−乳酸アシドーシス及び脳卒中様発作を有するミトコンドリア脳筋症；ＬＤＹＴ−レーベル遺伝性視神経症及び異緊張症；ＭＥＲＲＦ−赤色ぼろ筋線維を伴うミオクローヌスてんかん；ＭＨＣＭ−母系遺伝性肥大型心筋；ＣＰＥＯ−慢性進行性外眼筋麻痺；ＫＳＳ−カーンズセイアー症候群；ＤＭ−真性糖尿病；ＤＭＤＦ  真性糖尿病＋聴覚消失；ＣＩＰＯ−筋疾患及び眼筋麻痺を有する慢性腸管仮性閉塞症；ＤＥＡＦ−母系遺伝性聴覚消失又はアミノグリコシド誘発性聴覚消失；ＰＥＭ−進行性脳症；ＳＮＨＬ−感音性難聴；脳筋症；ミトコンドリア細胞症；拡張型心筋症；ＧＥＲ−胃腸逆流；ＤＥＭＣＨＯ−認知症及び舞踏病；ＡＭＤＦ−運動失調症、ミオクローヌス；運動不耐性；ＥＳＯＣ  てんかん、卒中、視神経萎縮及び認知低下；ＦＢＳＮ  家族性両側性線条体壊死；ＦＳＧＳ  巣状分節性糸球体硬化症；ＬＩＭＭ  致死性小児ミトコンドリア筋症；ＭＤＭ  筋症及び真性糖尿病；ＭＥＰＲ  ミオクローヌスてんかん及び精神運動退縮；ＭＥＲＭＥ  ＭＥＲＲＦ／ＭＥＬＡＳ重複疾患；ＭＨＣＭ  母系遺伝性肥大型心筋症；ＭＩＣＭ  母系遺伝性心筋症；ＭＩＬＳ  母系遺伝性リー症候群；ミトコンドリア脳心筋症；多系ミトコンドリア障害（筋症、脳症、視覚消失、聴力損失、末梢神経障害）；ＮＡＩＯＮ  非動脈炎性虚血性視神経症；ＮＩＤＤＭ  インスリン非依存型糖尿病；ＰＥＭ  進行性脳症；ＰＭＥ  進行性ミオクローヌスてんかん；ＲＴＴ  レット症候群；ＳＩＤＳ  乳児突然死症候群；ＭＩＤＤ  母系遺伝性糖尿病及び聴覚消失；並びにＭＯＤＹ  若年発症の成人型糖尿病。
【００７９】
幾つかのミトコンドリア疾患は、ミトコンドリアにおける呼吸鎖の問題によりもたらされる。呼吸鎖は、４つの大型のタンパク質複合体：Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ（チトクロームｃオキシダーゼ又はＣＯＸ）、ＡＴＰシンターゼ、電子の周りで輸送する２つの低分子、コエンザイムＱ１０、並びにチトクロームｃから構成される。呼吸鎖は、ミトコンドリアのエネルギー作製プロセスにおける最終工程であり、ここで大部分のＡＴＰが生成される。１つ以上の特定の呼吸鎖複合体の欠損により引き起こされる可能性があるミトコンドリア脳筋症には、ＭＥＬＡＳ、ＭＥＲＦＦ、リー症候群、ＫＳＳ、ピアソン、ＰＥＯ、ＮＡＲＰ、ＭＩＬＳ及びＭＮＧＩＥが含まれる。
【００８０】
ミトコンドリア呼吸鎖は、核及びｍｔＤＮＡ由来のタンパク質により構成される。ほぼ１００個の呼吸鎖タンパク質のうち１３個だけがｍｔＤＮＡ由来であるが、これらの１３個のタンパク質は、複合体ＩＩ以外の呼吸鎖の全ての部分に寄与し、他の２４個のミトコンドリア遺伝子がこれらの１３個のタンパク質を作製するためだけに必要となる。したがって、核遺伝子又は３７個のミトコンドリア遺伝子のうちの１個のいずれかにおける欠陥が、呼吸鎖の崩壊を引き起こす可能性がある。本開示の範囲は、ミトコンドリアに、ミトコンドリアの機能に関わる少なくとも１個の遺伝子又は１個の遺伝子の一部を、特に３７個のミトコンドリア遺伝子のうちの少なくとも１個又はその一部を形質移入して、呼吸鎖の機能を回復又は増加することを含むことが理解される。ミトコンドリアゲノム、例えばヒトミトコンドリアゲノムのいずれか又はその一部を、本明細書に記載されている方法を使用して宿主ミトコンドリアに導入することができる。
【００８１】
ミトコンドリアの疾患は、脳、心臓、肝臓、骨格筋、腎臓、並びに内分泌及び呼吸器系の細胞に対して最もひどく損傷を引き起こすと思われる。したがって、これらの細胞及び組織のミトコンドリアに、特定の核酸を形質移入すること、特に、ミトコンドリアに、核コードタンパク質ではなくミトコンドリアコードタンパク質をコードする核酸を形質移入することは、本開示の範囲内である。ミトコンドリアに形質移入して、ミトコンドリアに天然に存在するか若しくはしない、又はｍｔＤＮＡ若しくは核ＤＮＡで天然にコードされている、任意のタンパク質を発現するようにできることが理解される。どの細胞が影響を受けるかによって、症状には、運動制御の喪失、筋力低下及び疼痛、胃腸障害及び嚥下困難、低成長、心臓病、肝疾患、糖尿病、呼吸器合併症、発作、視覚／聴覚の問題、乳酸アシドーシス、発育遅延及び感染症に対する感受性を含むことができる。
【００８２】
本開示が対処することができる例示的なｍｔＤＮＡ突然変異には、ｔＲＮＡｌｅｕ−Ａ３２４３Ｇ、Ａ３２５１Ｇ、Ａ３３０３Ｇ、Ｔ３２５０Ｃ  Ｔ３２７１Ｃ及びＴ３３９４Ｃ；ｔＲＮＡＬｙｓ−Ａ８３４４Ｇ、Ｇ１１７７８Ａ、Ｇ８３６３Ａ、Ｔ８３５６Ｃ；ＮＤ１−Ｇ３４６０Ａ；ＮＤ４−Ａ１０７５０Ｇ、Ｇ１４４５９Ａ；ＮＤ６−Ｔ１４４８４Ａ；１２Ｓ  ｒＲＮＡ−Ａ１５５５Ｇ；ＭＴＴＳ２−Ｃ１２２５８Ａ；ＡＴＰａｓｅ  ６−Ｔ８９９３Ｇ、Ｔ８９９３Ｃ；ｔＲＮＡＳｅｒ（ＵＣＮ）−Ｔ７５１１Ｃ；１１７７８及び１４４８４、ＬＨＯＮ突然変異、並びにＮＤ２、ＮＤ３、ＮＤ５、チトクロームｂ、チトクロームオキシダーゼＩ−ＩＩＩ及びＡＴＰａｓｅ  ８における突然変異又は欠失が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
核疾患：筋ジストロフィー、エリス・ヴァンクレベルド症候群、マルファン症候群、筋緊張性ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症、胎性軟骨異栄養症、筋萎縮性側索硬化症、シャルコー・マリー・トゥース症候群、コケイン症候群、捻曲性骨異形成症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、エリス・ヴァンクレベルド症候群、進行性骨化性線維異形成症、アルツハイマー病、アンジェルマン症候群、てんかん、本態性振戦、脆弱Ｘ症候群、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、ニーマン・ピック病、パーキンソン病、プラダー・ウィリ症候群、レット症候群、脊髄小脳萎縮症、ウィリアムズ症候群、毛細管拡張性失調症、貧血、鎌状赤血球、バーキットリンパ腫、ゴーシェ病、血友病、白血病、発作性夜間血色素尿症、ポルフィリン症、地中海貧血、クローン病、アルファ−１−抗トリプシン欠乏症、嚢胞性線維症、聴覚消失、ペンドレッド症候群、緑内障、脳回転状網膜脈絡膜萎縮、副腎過形成、副腎脳白質ジストロフィー、コケイン症候群、ＱＴ延長症候群、高ＩｇＭ免疫不全症、アルポート症候群、エリス・ヴァンクレベルド症候群、進行性骨化性線維異形成症、ワールデンブルグ症候群、ウェルナー症候群。
【００８４】
感染症：ウイルス−エイズ、エイズ関連症候群、水痘（水疱瘡）、感冒、サイトメガロウイルス感染症、コロラドダニ熱、デング熱、エボラ出血熱、流行性耳下腺炎、かぜ、手足口病、肝炎−単純ヘルペス、帯状ヘルペス、ＨＰＶ、インフルエンザ、ラッサ熱、麻疹、マールブルク出血熱、感染性単核球症、おたふくかぜ、灰白髄炎、進行性多病巣性白質脳炎、狂犬病、風疹、サーズ、天然痘（痘瘡）、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性肺炎、西ナイル病−黄熱；細菌−炭疽、細菌性髄膜炎、ブルセラ症、腺ペスト、カンピロバクター症、ネコひっかき病、コレラ、ジフテリア、発疹チフス、淋疾、ハンセン病、レジオネラ症、らい、レプトスピラ症、リステリア症、ライム病、類鼻疽、ＭＲＳＡ感染、ノカルジア症、疫咳、肺炎球菌肺炎、オウム病、Ｑ熱、ロッキー山紅斑熱又はＲＭＳＦ、サルモネラ症、猩紅熱、シゲラ症、梅毒、破傷風、トラコーマ、結核、ツラレミア、チフス熱、チフス、百日咳；寄生虫−アフリカトリパノソーマ症、アメーバ症、回虫症、バベシア症、シャーガス病、肝吸虫症、クリプトスポリジウム症、嚢虫症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、自由生活アメーバ感染症、ジアルジア症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポーラ症、カラアザール、リーシュマニア症、マラリア、メタゴニムス症、ハエウジ症、オンコセルカ症、シラミ症、蟯虫感染症、疥癬、住血吸虫症、テニア症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫症、トリヒナ症、鞭虫症、トリパノソーマ症。
【００８５】
癌：乳癌及び卵巣癌、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病、結腸癌、肺癌、悪性黒色腫、多発性内分泌腫瘍、神経線維腫症、ｐ５３リフラウメニ、膵癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、フォンヒッペル・リンダウ症候群、多発性嚢胞腎、結節性硬化症。
【００８６】
代謝障害：副腎脳白質ジストロフィー、アテローム性動脈硬化症、ベスト病、ゴーシェ病、グルコースガラクトース吸収不良症、脳回転状萎縮症、若年発症糖尿病、肥満症、発作性夜間血色素尿症、フェニルケトン尿症、レフサム病、タンジール病、テイ・サックス病、副腎脳白質ジストロフィー、２型糖尿病、ゴーシェ病、遺伝性ヘモクロマトーシス、レッシュ・ナイハン症候群、カエデシロップ尿症、メンケス症候群、ニーマン・ピック病、膵癌、プラダー・ウィリ症候群、ポルフィリン症、レフサム病、タンジール病、ウィルソン病、ツェルウェーガー症候群、早老症、ＳＣＩＤ。
【００８７】
自己免疫性疾患：多腺性自己免疫症候群、ループス、Ｉ型糖尿病、強皮症、多発性硬化症、クローン病、慢性活動性肝炎、リウマチ様関節炎、グレーヴス病、重症筋無力症、筋炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、ぶどう膜炎、多発性筋炎、レイノー現象及び脱髄性神経障害、並びにリウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎、シェーグレン症候群、ベーチェット病、チャーグ・ストラウス症候群及び高安動脈炎のような希な障害。
【００８８】
炎症性障害：脱毛症、捻曲性骨異形成症、エリス・ヴァンクレベルド症候群、喘息、骨関節炎、リウマチ様関節炎及び脊椎関節症を含む関節炎。
【００８９】
加齢性障害：アルツハイマー病、パーキンソン病、アテローム性動脈硬化症、加齢性黄斑変性、  加齢性骨粗鬆症。
【００９０】
開示されている方法及び組成物を使用して、加齢、組織再生／再生医療、幹細胞移植、可逆的遺伝子修飾の誘発、ミトコンドリアゲノムによるｄｓＲＮＡの発現、認知強化、動作強化、及びヒト又は非ヒト動物の美容上の変化に関する症状を治療、管理又は低減することができる。
【００９１】
本開示の１つの実施態様は、開示されているビヒクルを宿主に投与することを含む、宿主細胞において呼吸鎖機能を回復又は増加する方法を提供し、ここでビヒクルは、遺伝子機能障害を補う、例えば、呼吸鎖タンパク質又はペプチドであるか又はこれらをコードする、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又はこれらの組み合わせを含む。
【００９２】
本開示の別の実施態様は、開示されているビヒクルを使用して、細胞、例えば骨格筋細胞中のミトコンドリアに形質移入することを含む、宿主においてチトクロームオキシダーゼ活性を回復又は増加する方法を提供し、ここでビヒクルは、チトクロームオキシダーゼ又はその機能的成分をコードする核酸を含む。機能的成分とは、独立して、又は別のタンパク質、フラグメント若しくはサブユニットと組み合わされて生物学的機能を実施する、タンパク質又はタンパク質複合体又はサブユニットの一部又はフラグメントを意味する。
【００９３】
本開示のなお別の実施態様は、宿主から細胞を得て、宿主の細胞中のオルガネラに、開示されているビヒクルを使用して、β酸化スパイラル及びカルチニン輸送に関与するタンパク質、又はそのようなタンパク質をコードする核酸を送達して形質移入することを含む、宿主においてβ酸化を増加又は回復する方法を提供する。
【００９４】
開示の別の実施態様は、点突然変異又は欠失の結果として失われたか又は減少したミトコンドリア機能を回復する方法を対象とする。例えば、ＫＳＳ、ＰＥＯ及びピアソンは、欠失と呼ばれるｍｔＤＮＡ突然変異（ＤＮＡの特定の部分が失われている）又はｍｔＤＮＡ欠乏（ｍｔＤＮＡの一般的な不足）の種類からもたらされる３つの疾患である。したがって、ＫＳＳ、ＰＥＯ及びピアソン又は同様の疾患と診断された宿主からの細胞は、そのミトコンドリアに、開示されているビヒクルを使用して形質移入することができる。疾患状態を引き起こすｍｔＤＮＡの欠失を補う核酸を含むビヒクルを使用して、核酸を細胞に導入することができる。核酸を発現させることができ、次にタンパク質をミトコンドリアに組み込み、ミトコンドリア機能を増加又は回復させることができる。形質移入細胞を、宿主に再導入することができる。宿主の細胞又は他の細胞を本明細書に開示されているように形質移入し、機能障害性オルガネラ、特にミトコンドリアを有する宿主に導入することができることが理解される。
【００９５】
本開示は、核酸を、別々に又は組み合わせて、ｍｔＤＮＡ又は核ＤＮＡで天然にコードされているミトコンドリアに送達することを包含することが、当業者に理解される。
【００９６】
本開示は、形質移入又は非形質移入ミトコンドリアを有する細胞を作り出すことによって、ミトコンドリア疾患の症状を緩和することも考慮する。あるいは、細胞中の全てのミトコンドリアを形質移入又は取り換えることができる。
【００９７】
一つの実施態様は、宿主においてｍｔＤＮＡ突然変異を補う方法であって、ｍｔＤＮＡ突然変異を有する宿主を同定すること、前記宿主から前記ｍｔＤＮＡ突然変異を含む細胞を得ること、開示されているビヒクルを使用し、宿主細胞のミトコンドリアに形質移入して、ｍｔＤＮＡ突然変異に対応する機能的産物をコードする核酸を送達すること、及び前記形質移入細胞を宿主に導入することを含む方法を提供する。ｍｔＤＮＡ突然変異に対応する機能的産物をコードする核酸とは、対応する突然変異のないタンパク質を産生する配列を意味する。例えば、宿主細胞が、ＮＤ４−Ａ１０７５０Ｇ突然変異を有する場合、形質移入核酸は、ＮＤ４遺伝子の野生型産物をコードする。
【００９８】
別の実施態様は、細胞と開示しているビヒクルとを接触させることを含む、標的ポリヌクレオチドの細胞への形質移入の方法を提供し、ここでカーゴ送達ビヒクルは、標的ポリヌクレオチドを含む。
【００９９】
なお別の実施態様は、細胞又はミトコンドリアと、ミトコンドリア融合を促進する条件下で組み換えミトコンドリアとを接触させることを含む、標的ポリヌクレオチドで細胞又はミトコンドリアを形質移入する方法を提供し、ここで組み換えミトコンドリアは、標的ポリヌクレオチドを含む。標的ポリヌクレオチドは、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ又はポリペプチドをコードするか、又はアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ又はポリペプチドである。一つに実施態様において、ミトコンドリア融合は、Ｍｆｎ１、Ｍｆｎ２のような融合タンパク質、ＧＴＰ、クレアチン、ＡＴＰのような化合物、Ｄｒｐ１及びｈＦｉｓ１に対するｓｉＲＮＡのようなミトコンドリア分裂のインヒビターにより促進される。
【０１００】
組み換えミトコンドリアは、ミトコンドリア以外からの供給源由来の核酸で形質移入されたミトコンドリアであるか、又はミトコンドリア若しくはミトコンドリアのゲノムに核酸を挿入するか、若しくはそれから欠失させることによって改変されたゲノムを有するミトコンドリアである。典型的には、組み換えミトコンドリアは、外来性核酸を発現する。核酸は、細胞のミトコンドリア又は核における遺伝子欠陥を補うポリペプチドをコードすることができる。
【０１０１】
（ＩＶ．融合タンパク質）
一つの実施態様は、レポーター及び場合により標的ポリペプチドに機能的に結合している配列番号１のアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む融合タンパク質を提供する。適切なレポーターには、蛍光タンパク質、発光タンパク質、又はこれらの組み合わせが含まれる。例示的なレポーターは緑色蛍光タンパク質又はその変種である。適切な標的ポリペプチドは、リンゴ酸デヒドロゲナーゼからのミトコンドリアマトリックス局在化シグナルを含む。他のミトコンドリア標的ポリペプチドを使用できることが理解される。融合タンパク質は、細胞の小胞輸送機構によるＣａｖ１の移動を追跡するのに有用である。
【０１０２】
他の実施態様において、開示されている融合タンパク質を合成送達ビヒクルに組み込むことができる。
【０１０３】
別の実施態様は、開示されている融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを提供する。適切なベクターにはプラスミドが含まれるが、これに限定されない。ベクターは、場合により、細胞において核酸を発現するのに十分な制御配列を含む。例えば、ベクターは、プロモーター、典型的には誘発性プロモーターを含むことができる。大腸菌において発現するのに適したプロモーターには、例えば、Ｔ７、Ｔ５、Ｌａｃプロモーターが含まれる。使用される細胞の種類に応じて、アデノウイルス主要後期プロモーターのようなアデノウイルスプロモーター；又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのような異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターのような誘導性プロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターのようなウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ；βアクチンプロモーター；及びヒト成長ホルモンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない他のプロモーターを使用することができる。
【０１０４】
（Ｖ．キット）
別の実施態様は、１つ以上の開示されているカーゴ送達ビヒクル、融合タンパク質、又は、１つ以上の開示されている融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸を含むキットを提供する。キットは、場合により、ビヒクルを含有する溶液のｐＨ及び／又は塩濃度を緩衝する緩衝担体溶液を含む。別の実施態様は、１つ以上の開示されている融合タンパク質を発現する細胞を含むキットを提供する。緩衝溶液及び細胞培地もキットに含めることができる。
【０１０５】
別の実施態様は、開示されている合成ビヒクルを生成するための試薬を提供する。適切な試薬には、脂質、ＣＡＶ１タンパク質又はポリペプチド、溶媒及び緩衝剤が含まれる。脂質は、乾燥して又は溶媒中で提供することができる。
【０１０６】
（投与）
本明細書で提供される送達ビヒクルを、生理学的に許容される担体で宿主に投与することができる。典型的な宿主には、哺乳動物、好ましくはヒトが含まれる。投与の好ましい方法には、全身的又は細胞への直接的な投与が含まれる。小胞組成物を、細胞又は患者に投与することができ、そのことは遺伝子治療用途では一般に知られている。遺伝子治療用途では、オルガネラに形質移入するために、組成物を細胞に導入する。
【０１０７】
「遺伝子治療」は、永続効果が、単回の治療、及び治療上有効なＤＮＡ又はＲＮＡの１回の投与又は反復投与を含む、遺伝子治療剤の投与により達成される、両方の従来の遺伝子治療を含む。
【０１０８】
小胞組成物を、薬学的に許容される担体ビヒクルと混合して組み合わせることができる。治療製剤は、保存のため、所望の程度の純度を有する活性成分と、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．  （１９８０））とを混合して、凍結乾燥製剤又は水性液剤の形態に調製される。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いられる投与量及び濃度で摂取者に対して非毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０個未満の残基）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖、二糖及び他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトール又はソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；及び／又はＴｗｅｅｎ（商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ又はＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０１０９】
本開示の組成物は非経口的に投与することができる。本明細書で使用されるとき、「非経口投与」は、医薬組成物を被験者の組織の物理的進入を介して投与することを特徴とする。非経口投与には、注射による、外科的切開を介した、又は組織浸透性非外科的創傷を介した投与などが含まれる。特に、非経口投与には、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内、胸骨内注射、及び腎臓透析注入技術が含まれる。
【０１１０】
非経口製剤は、活性成分を、滅菌水又は滅菌等張食塩水のような薬学的に許容される担体と組み合わせて含むことができる。そのような製剤を、ボーラス投与又は連続投与に適した形態で調製、包装又は販売することができる。注射用製剤を、アンプル又は防腐剤を含有する多用量容器のような単位投与形態で調製、包装又は販売することができる。非経口投与製剤には、懸濁剤、液剤、油状又は水性ビヒクル中の乳剤、ペースト剤、再構成乾燥（すなわち、粉末又は顆粒）製剤、及び移植型の持続放出性又は生分解性製剤が含まれる。そのような製剤は、懸濁剤、安定剤又は分散剤を含む１つ以上の追加の成分を含むこともできる。非経口製剤を、滅菌注射用水性又は油性懸濁剤若しく液剤の形態で調製、包装又は販売することができる。非経口製剤は、本明細書に記載されている分散剤、湿潤剤又は懸濁剤を含むこともできる。これらの種類の製剤を調製する方法は既知である。滅菌注射用製剤は、水、１，３−ブタンジオール、リンゲル液、等量塩化ナトリウム溶液のような非毒性で非経口的に許容される希釈剤又は溶媒、及び合成モノグリセリド又はジグリセリドのような固定油を使用して調製することができる。他の非経口投与製剤には、微晶質形態、リポソーム調製物及び生分解性ポリマー系が含まれる。持続放出性又は移植用の組成物には、エマルション、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー及び難溶性塩のような薬学的に許容されるポリマー又は疎水性物質を含むことができる。
【０１１１】
医薬組成物を、口腔内用製剤として調製、包装又は販売することができる。そのような製剤は、既知の方法により作製される錠剤、粉末剤、エアゾール剤、噴霧液剤、懸濁剤又はロゼンジ剤の形態であることができ、約０．１％〜約２０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含有し、製剤の残りの部分は経口溶解性若しくは分解性組成物、及び／又は本明細書に記載されている１つ以上の追加の成分を含有することができる。好ましくは、粉末又はエアゾール製剤は、分散されるとき、約０．１ナノメーターから約２００ナノメーターの範囲の平均粒径又は液滴サイズを有する。
【０１１２】
本明細書で使用されるとき、「追加の成分」には、１つ以上の、以下：賦形剤、界面活性剤、分散剤、不活性希釈剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味料、風味剤、着色剤、防腐剤、生理学的に分解しうる組成物（例えば、ゼラチン）、水性ビヒクル、水性溶媒、油状ビヒクル及び油状溶媒、懸濁剤、分散剤、湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、緩衝剤、塩、増粘剤、充填剤、乳化剤、酸化防止剤、抗生物質、抗真菌剤、安定剤、及び薬学的に許容されるポリマー及び疎水性物質が含まれる。医薬組成物に含めることができる他の「追加の成分」は既知である。適切な追加の成分は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｇｅｎａｒｏ，  ｅｄ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．  （１９８５）に記載されている。
【０１１３】
本開示の医薬組成物において、本明細書に開示されている変更されたベクターの投与量及び望ましい濃度は、想定される特定の使用に応じて変わることができる。適切な投与量又は投与経路の決定は、十分に、通常の医師の技能の範囲内である。動物実験は、ヒト治療に有効な用量を決定するために信頼できる指針を提供する。種間の有効用量のスケーリングは、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｃｈａｐｐｅｌｌ，  Ｗ．  ”Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｃａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ”  Ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ｙａｃｏｂｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｅｄｓ．，  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９，  ｐｐ．  ４２−９６により定められた原則に従って実施することができる。
【０１１４】
本明細書及び添付の請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈から明白に示される場合を除いて、複数対象を含むことに留意するべきである。したがって、例えば、「化合物」を含有する組成物の参照は、２つ以上の化合物の混合物を含む。用語「又は」は、文脈から明白に示される場合を除いて、一般に、その意味において「及び／又は」を含んで用いられることにも留意するべきである。
【実施例】
【０１１５】
材料及び方法
以下の例示的な方法及び材料は、付随する実施例の表されるデータを提供するために使用した。
【０１１６】
ＤＮＡ構築物：ＭＬＳ−Ｃａｖ１−ＧＦＰは、ＰＣＲにより生成した。簡潔には、ｍＭＤＨのミトコンドリア標的シグナルを組み込むプライマーを生成し、Ｃａｖ１  ｃＤＮＡをＩＭＡＧＥクローンから増幅した。ＭＬＳ−Ｃａｖ１  ＰＣＲ産物を、ｐＴＯＰＯＴＡ−Ｃ末端ＧＦＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトポイソメラーゼＴＡクローニングした。得られたクローンを配列決定により確認した。ｐＤｓＲｅｄ２−Ｍｉｔｏは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入した。
【０１１７】
ｓｉＲＮＡ：Ｃａｖ１、Ｍｆｎ１及びｈＦｉｓ１に対する二本鎖ｓｉＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎから購入し、末端ｄＵｄｔオーバーハングに含めた。Ｃａｖ１に対するｓｉＲＮＡ配列は、５′−ＡＧＡＣＧＡＧＣＵＧＡＧＣＧＡＧＡＡＧＣＡ−３′（配列番号８）（センス）及び５′−ＣＵＵＣＵＣＧＣＵＣＡＧＣＵＣＧＵＣＵＧＣ−３′（配列番号９）（アンチセンス）であった。ｈＦｉｓ１に対するｓｉＲＮＡ配列は、５′−ＧＴＡＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＴＴＧＴＡＡ−３′（配列番号１０）（センス）及び５′−ＴＴＡＣＧＧＡＴＧＴＣＡＴＣＡＴＴＧＴＡＣ−３′（アンチセンス）であった。Ｍｆｎ１に対するｓｉＲＮＡ配列は、５′−ＡＡＧＧＧＧＡＴＴＡＣＴＧＣＡＡＴＣＴＴＴ−３′（配列番号１１）（センス）及び５′−ＡＡＡＧＡＴＴＧＣＡＧＴＡＡＴＣＣＣＣＴＴ−３′（配列番号１２）（アンチセンス）であった。
【０１１８】
細胞培養：ＳＨ−Ｓｙ５ｙ神経芽細胞腫細胞を、完全ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で増殖させ、トリプシン処理し、カウントし、カバーガラスで覆ったＭａｔｅｋ皿において５０％コンフルエントで平板培養した。
【０１１９】
形質移入：ｓｉＲＮＡを、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ形質移入試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を規制されている通りに使用して細胞に形質移入した。ＭＬＳ−Ｃａｖ１−ＧＦＰ形質移入ＳＨ−Ｓｙ５ｙ細胞には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００形質移入試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者の説明書に従って使用した。
【０１２０】
免疫染色：ｓｉＲＮＡ形質移入の少なくとも２４時間後、細胞を、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄと共に３７℃で１０分間インキュベートし、ハンクス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、氷冷メタノールにより３７℃で１０分間固定した。ＰＢＳによる追加的な洗浄の後、細胞に、ＰＢＳ中の０．１％トリトンを１０分間浸透させた。３％ＢＳＡ−０．２％ツイーン２０により３７℃で１時間ブロックした後、細胞を、ＢＳＡ遮断溶液中のマウスモノクローナル抗Ｃａｖ１（ＵｐＳｔａｔｅ）抗体又は抗Ｍｆｈ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）抗体と共に、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳで４回洗浄した。細胞を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８又は５６８抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）二次抗体と共に、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳで４回洗浄した。細胞を、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）によりカバーガラスで覆った。
【０１２１】
共焦点顕微鏡法：ＭＬＳ−Ｃａｖ１−ＧＦＰ、ｐＤＳＲｅｄ２−Ｍｉｔｏ又は免疫染色細胞の単一面共焦点画像を、ＯｌｙｍｐｕｓＩＸ７０顕微鏡に搭載したＯｌｙｍｐｕｓ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して集めた。２４ビットＴＩＦＦ共焦点画像を、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用し、画像輝度又は色を変えることなく１６ビットＲＧＢビットマップ画像に変換した。
【０１２２】
（実施例１：脂質ラフトはミトコンドリアと共局在化する）
まず、ミトコンドリアと脂質ラフトの関係を認識するために、細胞を、ＦＩＴＣに共有結合しているコレラ毒素の脂質ラフト結合ベータサブユニット（ＣＴＢ−ＦＩＴＣ）と共にインキュベートした。Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄで染色すると、細胞は、共局在領域を有した。この共局在化は、ベクタータンパク質／ＤＮＡ複合体の添加の際にも見られ、これは、ミトコンドリアと共局在化する脂質ラフトの亜集団が存在すること及びこの共局在化は、特定の刺激により見ることができることを意味している。ミトコンドリア膜による脂質ラフトの組み込みは、この組み込みを支持する融合機構が存在しうることを示唆している。
【０１２３】
ミトコンドリアが他のミトコンドリアと融合するので、同じ融合機構が、脂質ラフトとミトコンドリアとの融合を仲介することができる可能性がある。まず、この仮説を試験するために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、最初に、抗カベオリン及び抗Ｍｆｎ１（Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ  １）抗体で染色した。基底状態において、両方のタンパク質が共局在化している領域があるようであった。Ｃａｖ１のノックダウンを達成するためにｓｉＲＮＡを使用して、脂質ラフトの成分を欠いていることが、細胞へのベクタータンパク質／ＤＮＡ複合体の取り込みを防止するかという問題に対処した。Ｃａｖ１発現を欠いており、ベクタータンパク質／Ａｌｅｘａ４８８−ＤＮＡ複合体と共にインキュベートした細胞は、サイトゾルへのタンパク質／ＤＮＡ複合体の取り込みを生じ、小嚢が取り込みにとって重要であるが必須ではないことを示した。更に、Ｃａｖ１を欠いている細胞は、低減した膜電位及び管状ミトコンドリアに対する球状を示して、ミトコンドリア形態に著しい変化を生じ、Ｃａｖ１は、ミトコンドリア形態のレギュレーターであることを示唆した。
【０１２４】
ミトコンドリア融合機構がベクタータンパク質−ＤＮＡ複合体の取り込みに関与しているかを試験するために、Ｍｆｎ１の発現をノックダウンし、細胞をベクタータンパク質／ＤＮＡ複合体と共にインキュベートした。複合体の免疫染色は、サイトゾルへの取り込みを示し、Ｍｆｎ１が原形質膜からの脂質ラフト内部移行に関与しないことを示唆した。このことは、Ｍｆｎ１の厳密なミトコンドリア局在化を考慮すると、驚くことではなかった。
【０１２５】
（実施例２：ＭＬＳ−Ｃａｖ１−ＧＦＰは原形質膜に転位する）
ミトコンドリアＣａｖ−１の動力学をより良好に理解するために、リンゴ酸デヒドロゲナーゼからのミトコンドリアマトリックス局在化シグナルを使用してＧＦＰに融合したミトコンドリア標的カベオリン１（ＭＬＳ−Ｃａｖ１−ＧＦＰ）を生成した。この構築物をＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に形質移入することによって、サイトゾル局在化と原形質膜局在化の両方を生じ、これは、いったんミトコンドリアに移入されると、ＭＬＳ−Ｃａｖ１−ＧＦＰは原形質膜に転位できることを意味した。
【０１２６】
ＡＴＰａｓｅサブユニット、ＶＤＡＣ、ｍｔＤＮＡコードＮＤ２などを含む多くのミトコンドリアタンパク質が、原形質膜の脂質ラフトにおいて見出されるので、ミトコンドリア分裂機構は、ミトコンドリア膜から、Ｃａｖ１を含有する脂質ラフトをつみ取ることに関与する場合があり、ここで脂質ラフトは、原形質膜のような他の細胞膜と自由に関連する。この疑問について判断するために、ＭＬＳ−Ｃａｖ１−ＧＦＰ構築物とｐＤｓＲｅｄ２−Ｍｉｔｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で共形質移入した細胞を、形質移入の２４時間後、３６時間後及び４８時間後に画像化した。２４時間の時点で、赤色蛍光ミトコンドリア（ｍｉｔｏ−ＲＦＰ）は、ほとんど周辺部において緑色蛍光ｃａｖ１発現の領域を有し、ミトコンドリア外膜との関連性を示唆したが、マトリックス局在化も明白であった。
【０１２７】
Ｃａｖ１のＲＮＡｉ仲介ノックダウンは、ミトコンドリアの形態に変化を生じたので、ミトコンドリア分裂機構のメンバーである、ｈＦｉｓ１に対するｓｉＲＮＡ（Ｓｔｏｊａｎｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）を、細胞へのＭＬＳ−Ｃａｖ１−ＧＦＰ及びＤｓＲｅｄ２−Ｍｉｔｏによる共形質移入に利用した。これらの細胞は、ミトコンドリアからのＣａｖ１の転位の完全な抑制を有し、ミトコンドリアから脂質ラフトを放出するミトコンドリア分裂を示唆した。
【０１２８】
（実施例３：細胞への全ミトコンドリアの取り込み）
原形質膜における脂質ラフトは、細胞外環境と相互作用することが知られており、ウイルス及び細菌を含む大型の複合体のエンドサイトーシスに関与する。以前に、Ｃｌａｒｋ及びＳｈａｙ（１９８２）は、インサイチュでミトコンドリアを形質移入し、ｒｈｏゼロ表現型をレスキューする手段として、細胞への全ミトコンドリアの取り込みを示した（Ｃｌａｒｋ  ａｎｄ  Ｓｈａｙ，  １９８２）。ミトコンドリア及びそれらの構成成分が形質移入可能であるかを確認するために、ＭＬＳ−Ｃａｖ１−ＧＦＰを発現する細胞を、ＤｓＲｅｄ２−Ｍｉｔｏで形質移入した細胞と共に同時培養した。細胞を、ＭＬＳ−Ｃａｖ１−ＧＦＰ又はＤｓＲｅｄ２−Ｍｉｔｏの構築物により別々の皿で形質移入し、２４時間回復させた。次に細胞を収集し、洗浄し、同じ培養皿にプレーティングした。陰性対照には、両方のＤＮＡ構築物の存在下でプレーティングした疑似形質移入細胞が含まれた。２４時間後、同時培養細胞を黄色蛍光の領域について共焦点下で可視化し、一方の細胞型（例えば、ＤｓＲｅｄ２−Ｍｉｔｏ）が別の（ＭＬＳ−Ｃａｖ１−ＧＦＰ）ミトコンドリアに侵入したことを示した。驚くべきことに、同時培養は、抗体染色により確認された黄色の領域を生じ、一方、対照細胞は、どのような蛍光も示さなかった。この時点では、細胞融合を排除することはできないが、文献は、細胞融合は希な事象であり、本所見を説明するには不十分であることを示唆している。
【０１２９】
カベオリンタンパク質配列。アクセッション番号〔ｇｉ：３８５１６〕（配列番号１）
ｍｓｇｇｋｙｖｄｓｅ  ｇｈｌｙｔｖｐｉｒｅ  ｑｇｎｉｙｋｐｎｎｋ  ａｍａｄｅｌｓｅｋｑ  ｖｙｄａｈｔｋｅｉｄ  ｌｖｎｒｄｐｋｈｌｎ
ｄｄｖｖｋｉｄｆｅｄ  ｖｉａｅｐｅｇｔｈｓ  ｆｈｇｉｗｋａｓｆｔ  ｔｆｒｖｔｋｙｗｆｙ  ｒｌｌｓａｌｆｇｉｐ  ｍａｌｉｗｇｉｙｆａ
ｉｌｓｆｌｈｉｗａｖ  ｖｐｃｉｋｓｆｌｉｅ  ｉｑｃｔｓｒｖｙｓｉ  ｙｖｈｔｖｃｄｐｌｆ  ｅａｖｇｋｉｆｓｎｖ  ｒｉｎｌｑｋｅｉ
表２
ミトコンドリアを標的にする局在化シグナル。
（ミトコンドリアプロジェクトＭＩＴＯＰデータベースを使用して確認−ｈｔｔｐ：／／ｍｉｐｓ．ｇｓｆ．ｄｅ／ｐｒｏｊ／ｍｅｄｇｅｎ／ｍｉｔｏｐ／）
【０１３０】
【表２−１】
2009531438.tif 000003
【０１３１】
【表２−２】
2009531438.tif 000004
【０１３２】
【表２−３】
2009531438.tif 000005
【０１３３】
【表２−４】
2009531438.tif 000006
【０１３４】
【表２−５】
2009531438.tif 000007
【０１３５】
【表２−６】
2009531438.tif 000008
【０１３６】
【表２−７】
2009531438.tif 000009
【０１３７】
【表２−８】
2009531438.tif 000010
【０１３８】
【表２−９】
2009531438.tif 000011
【０１３９】
【表２−１０】
2009531438.tif 000012
表３
葉緑体を標的にする局在化シグナル
【０１４０】
【表３】
2009531438.tif 000013
本明細書に開示及び請求されている全ての組成物及び方法を、本開示を考慮して過剰な実験をすることなく作製及び実施することができる。本発明の組成物及び方法は好ましい実施態様に関して記載されてきたが、本発明の概念、精神及び範囲を逸脱することなく、本明細書に開示されている組成物、方法、及び方法の工程又は一連の工程に変形を適用できることは、当業者に理解される。より詳細には、科学的にも生理学的にも関連する特定の作用物質を、本明細書に記載の作用物質で置換することができ、同じ又は同様の結果が得られることが理解される。そのような同様の置換及び変更は、全て、当業者に明白であり、添付の請求項で定義されている本発明の精神、範囲及び概念の範囲内であることが認められる。したがって、特許を受けようとする専用実施権は、請求項に記載されている。
【配列表】
2009531438000001.app
【国際調査報告】
2009531438.tif 000014
2009531438.tif 000015
2009531438.tif 000016