(57)【要約】  MUC1のグリコシル化形態に対するアプタマー、MUC1の切断生産物に関連する状態の治療および診断におけるそれらの使用が記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えMUC1に対するアプタマーリガンド。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドがDNAである、請求項２に記載のアプタマー。
【請求項４】
1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項５】
少なくとも25ヌクレオチド長である、請求項２または３に記載のアプタマー。
【請求項６】
以下より選択される配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のアプタマー：
GAAGTGAAAATGACAGAACACAACA (配列番号１)
GGCTATAGCACATGGGTAAAACGAC (配列番号２)
CAAACAATCAAACAGCAGTGGGGTG (配列番号３)
TACTGCATGCACACCACTTCAACTA (配列番号４)
GGGTTATATTACTCGGCCGGTGTAA (配列番号５)
GGCTATAGCACATGGGTAAAACGAC (配列番号６)
GGCGTACGGTAGGCGGGGTCAACTG (配列番号７)
GCTGGGTAAATAGATGATTCCCGGC (配列番号８)
AGTGGTGGTTTTATAAGACTGATAC (配列番号９)
TAGCCTTAATGCCTTTGTAAGGCGA (配列番号１０)
CGGTCTACGGAGCCGCGTTAAACTT (配列番号１１)。
【請求項７】
配列番号１から１１のいずれか1つからなる、請求項６に記載のアプタマー。
【請求項８】
配列番号１から１１のいずれか1つに対して少なくとも70 %の同一性を有する配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項９】
グリコシル化MUC1に対するリガンドである、請求項１から８のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項１０】
非グリコシル化MUC1よりも、グリコシル化MUC1に対して、より高い結合親和性を有する、請求項１から９のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項１１】
3コピーの繰り返し配列APDTRPAPGSTAPPAHGVTS (配列番号１２)からなる60マー、あるいは9アミノ酸ペプチドAPDTRPAPG (配列番号１３)のいずれかまたは両方よりも、組換えMUC1に対して、より高い結合親和性を有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項１２】
MUC1とのアプタマー相互作用のKdが、1000 nMより小さい、請求項１から１１のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項１３】
他の活性成分と結合する、請求項１から１２のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項１４】
前記他の成分が標識である、請求項１３に記載のアプタマー。
【請求項１５】
前記他の成分が治療用薬剤である、請求項１３に記載のアプタマー。
【請求項１６】
前記他の成分が放射線源である、請求項１３に記載のアプタマー。
【請求項１７】
前記他の成分が抗体、またはフラグメント、または部分である、請求項１３に記載のアプタマー。
【請求項１８】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のアプタマーをコードする、発現ベクター。
【請求項１９】
配列番号１から１１のいずれか1つ、または配列番号１から１１のいずれか1つに対して少なくとも70 %の同一性を有する配列に対して相補的である、ヌクレオチド配列。
【請求項２０】
配列番号１から１１のいずれか1つ、または配列番号１から１１のいずれか1つに対して少なくとも70 %の同一性を有する配列に対して相同性のある、RNA配列。
【請求項２１】
請求項１から１７のいずれか一項に記載のアプタマーを被験者に投与することを含む、MUC1に関する状態の治療方法。
【請求項２２】
前記状態が、MUC1の上昇した生産に関する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記状態が、癌、嚢胞性線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、非上皮性悪性炎症性疾患、腺癌、乳癌、大腸癌、膵臓癌、肺腺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、子宮内膜癌、および結腸直腸癌から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１から１７のいずれか一項に記載のアプタマーの、細胞、組織、または試料に対する結合を検出することを含む、MUC1に関する状態を診断する方法。
【請求項２５】
治療または診断において使用するための、請求項１から１７のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項２６】
MUC1に関する状態を治療するための医薬の製造における、請求項１から１７のいずれか一項に記載のアプタマーの使用。
【請求項２７】
前記状態が、MUC1の上昇した生産に関する、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記状態が、癌、嚢胞性線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、非上皮性悪性炎症性疾患、腺癌、乳癌、大腸癌、膵臓癌、肺腺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、子宮内膜癌、および結腸直腸癌から選択される、請求項２６に記載の使用。
【請求項２９】
MUC1に関する状態を検出または診断するための診断薬の製造における、請求項１から１７のいずれか一項に記載のアプタマーの使用。
【請求項３０】
請求項１から１７のいずれか一項に記載のアプタマーを含む、薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、MUC1腫瘍マーカーのグリコシル化または非グリコシル化形態を認識するアプタマーの製造、アプタマーそれ自体、ならびにそのようなアプタマーに関わる使用および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、世界中で主要な死亡原因である。この病気の特徴である分子を同定するための仕事が、長年にわたり実行されている。多くのものが、腫瘍に特有であり、または癌において改変された、または別に異なって過剰発現されていることが発見されている。そのような腫瘍マーカーを、癌を診断および治療する免疫学的アプローチの多くで標的として使用される。
【０００３】
MUC1タンパク質は、悪性細胞で過剰発現されていることが知られるそのようなマーカーの1つである。この上皮ムチンはMUC1遺伝子によりコードされている。それは、消化管および呼吸管を覆う粘膜層の主成分として発見されるもののような、典型的な細胞外ムチン複合体ではなく、ほとんどの腺上皮細胞により発現される膜貫通分子である。このタンパク質は、推定シグナルペプチドおよび縮退タンデムリピートを有するN末端、膜貫通領域、ならびにC末端細胞質尾部を含む、複数の独特な領域からなる。このタンパク質の主な部分はタンデムリピート領域である。この領域は、独特なペプチド配列APDTRPAPGSTAPPAHGVTSの縮重繰り返しからなる。繰り返しの数はアリルにより異なり、そのためその遺伝子およびタンパク質は高度な多型となっている。MUC1はまた、MUC-1、ムチン１(mucin 1)、muc-1、エピスタリン(episialin)、ピーナッツ反応性尿ムチン(PUM)、多型上皮ムチン(PEM)、CD227、上皮膜抗原(EMA)、DF3抗原、およびH23抗原とも呼ばれる。
【０００４】
MUC1ムチンは、微小線維ネットワークとの相互作用により、頂端細胞表面に限定されている。MUC1は正常腺上皮細胞により広く発現されるが、細胞が悪性となったときに劇的に発現は増加する。このことは、乳癌および卵巣癌、ならびに複数の肺癌、膵臓癌、および前立腺癌においてよく例証されている。最近、MUC1が膀胱癌の有用なマーカーであり、複数の研究においてその診断に使用されていることも示されている。抗体研究によってもまた、MUC1が癌腫で過剰発現されているだけでなく、グリコシル化のパターンも半跏していることが示されている。乳癌ムチンにおいて、グリコシル化の変化により、哺乳類乳腺により生産されるムチン中にマスクされるコアタンパク質中のあるエピトープが暴露される。MUC1のこれらの特性は、主に乳癌および膀胱癌に対する放射線標識抗体に関する複数の免疫治療アプローチにおいて、何年にもわたり探求されている。MUC1による活性特異的免疫治療に対する他の試みは、MUC1による免疫原の効能を調査するための動物モデルにおいてもまた実行されている。
【０００５】
これらの免疫治療アプローチは、複数の有望な結果をもたらし、ワクチン治療および抗体治療の両方に対する臨床試験に続いている。しかしこれらの戦略に問題がないわけではない。放射線標識抗体の長時間にわたる循環は骨髄毒性の問題をもたらすため、放射線標識抗体技術は、中程度（ミリキュリー）の照射に制限される。別の問題は、特異的モノクローナル抗体を作製するために必要な期間である。さらに、抗体の代わりにペプチドを使用する最近の試みにより、MUC1ムチンに対して非常に低い親和性を有する分子がもたらされている。
【０００６】
国際特許出願WO2004/081574には、合成MUC1ペプチドに対するアプタマーの製造が記載されている。この文献には、3コピーの繰り返し配列APDTRPAPGSTAPPAHGVTS（配列番号１２）からなる60マーペプチド、またはこの配列中に含まれる9アミノ酸配列APDTRPAPG（配列番号１３）のいずれかを標的とするアプタマーの製造が記載されている。このアプローチで有用なアプタマーを製造してよい一方、別のアプローチがMUC1ペプチドの異なるエピトープに対するアプタマーの製造に有用であってよい可能性がある。さらに、非グリコシル化合成ペプチドに対するアプタマーが、腫瘍グリコシル化MUC1タンパク質に対して作られた別のアプタマーほどペプチドに対して有効に結合しないように、MUC1のin vivoにおけるグリコシル化パターンが、腫瘍で改変されていることが知られている。
【特許文献１】WO2004/081574
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、組換えMUC1タンパク質に基づくアプタマーの同定に関するこれらの問題のうち少なくともいくつかを克服する、または軽減することを目的とする。好ましい実施態様において、この組換えタンパク質は、天然に利用されているものに類似した様式でグルコシル化されており、出願人のアプタマーが作用する（例えば体内における治療法または診断法として）in vivo条件に近づける際におけるさらなるレベルの改善を提供する。
【０００８】
MUC1を認識する抗体に基づく既存の発明に対する本発明の利点は、アプタマーがMUC1標的タンパク質に対して、はるかにより特異的で強い結合を提供し、そして溶液内の前記タンパク質を認識する際により敏感となり、そして現在の診断アッセイにおける腫瘍マーカーの認識レベルにおける有意な減少の潜在性を提供し、より敏感なアッセイをもたらし、より良い予後/早期診断値を提供する。さらに、治療法として抗体と比較した際に、アプタマーは、ほとんどまたは全く免疫原性を示さず、より良い腫瘍浸潤性、腎臓および尿を通した迅速なクリアランス、ならびに一定の時間後の天然分解を示す。
【０００９】
本発明は、癌の診断、イメージング、および治療に市販して適用することができる。それは、腫瘍マーカー、腫瘍細胞に特徴的である、または正常細胞に対して腫瘍細胞において異なる形状である分子を認識する分子からなる。この腫瘍マーカーは、癌細胞の表面で発現されるが、それはまた血流中にも流される。そのようにして、本発明を構成する前記分子は診断アッセイ/血液検査において使用される可能性を有し、腫瘍または転移性疾患の予後および/または早期診断を提供する。さらに、前記分子は、細胞を殺すことができる効果のある様式を、腫瘍細胞の表面にもたらすことができる。そして、前記分子をクロマトグラフィまたは放射線治療剤と組み合わせることにより、それらを腫瘍細胞特異的に作用し、そして一般的な治療に関する副作用を軽減することができる。最後に、前記薬剤を蛍光、近赤外線、MRI、または放射性核種リガンドと組み合わせることにより、イメージング感度および画像の鮮明度を有意に増強するであろう強力なイメージング剤を作り出すことができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
＜発明の概要＞
本発明は、アプタマーと呼ばれる新しいカテゴリーの生物学的治療法により、MUC1と呼ばれる腫瘍マーカーを認識することに基づく。アプタマーは、腫瘍細胞の表面でマーカーを認識することができ、適切に標識されれば、特異的な量の放射線、MRI、NIR、および蛍光様式のような他のイメージング剤、あるいはイメージングのための化学療法剤、ならびに/あるいは腫瘍細胞のみを特異的に殺すことによる治療を送達し、体の残りの部分に対する損傷からの好ましくない副作用を回避する。さらに、アプタマーは、前記疾患の最初または再発を示すことができる診断アッセイにおいて、患者の血中に存在するときには腫瘍マーカーMUC1を認識することができる。それゆえ、本発明の潜在的な適用は、多様な、市販のCA15-3 MUC1診断アッセイのような現在のアッセイの改善から、乳、腹、腎臓、前立腺などの腫瘍を含む多様な上皮腫瘍を有する癌患者のイメージングおよび治療にわたる範囲である。
【００１１】
出願人は、MUC1のグリコシル化形態に対するアプタマーを製造する方法を同定した；この形態は、in vivoで、特に癌化組織によって発現されるMUC1の形態に非常によく類似している。それゆえ、この方法は、先行技術の方法に比べて臨床上または診断上の使用により適するアプタマーを製造するであろうことが期待される。
【００１２】
本発明の最初の態様によれば、組換えMUC1に対するアプタマーリガンドが提供される。
【００１３】
好ましくは前記アプタマーはオリゴヌクレオチドを含み、および/または前記アプタマーはオリゴヌクレオチドである。前記オリゴヌクレオチドはDNA、RNAであってよく、および/またはアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシル以外のヌクレオチドを含んでよい；これらは、これらの天然存在ヌクレオチドに基づく修飾ヌクレオチドであってよい。あるいは、前記アプタマーはペプチド、PNA、または他の化合物、例えば、その内容がここに参照して取り込まれるWO2004/081574に記載されているようなものであってよい。好ましくは、前記アプタマーは、少なくとも25ヌクレオチド長であり、好ましくは25ヌクレオチド長である。
【００１４】
好ましくは、前記アプタマーは、以下より選択される配列を含む：
GAAGTGAAAATGACAGAACACAACA (配列番号１)
GGCTATAGCACATGGGTAAAACGAC (配列番号２)
CAAACAATCAAACAGCAGTGGGGTG (配列番号３)
TACTGCATGCACACCACTTCAACTA (配列番号４)
GGGTTATATTACTCGGCCGGTGTAA (配列番号５)
GGCTATAGCACATGGGTAAAACGAC (配列番号６)
GGCGTACGGTAGGCGGGGTCAACTG (配列番号７)
GCTGGGTAAATAGATGATTCCCGGC (配列番号８)
AGTGGTGGTTTTATAAGACTGATAC (配列番号９)
TAGCCTTAATGCCTTTGTAAGGCGA (配列番号１０)
CGGTCTACGGAGCCGCGTTAAACTT (配列番号１１)。
【００１５】
前記アプタマーは、配列番号１から１１のいずれか一つからなってよい；前記アプタマーは、付加配列を含んでよい。前記アプタマーは、配列番号１から１１のいずれか一つに対して、少なくとも95%、または少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70% の配列同一性を有する配列を含んでよい。
【００１６】
好ましくは前記アプタマーは、グリコシル化MUC1に対するリガンドである。あるいは、前記アプタマーは、非グリコシル化MUC1に対するリガンドであってよい。特定のアプタマーが、グリコシル化および非グリコシル化MUC1の両方に親和性を有してよいことが理解されるであろう。好ましくは前記アプタマーは、非グリコシル化MUC1よりもグリコシル化MUC1に対してより高い結合親和性を有する。
【００１７】
本発明で使用される組換えMUC1は、配列番号１２の５回縦列繰り返しを有する組換えMUC1である。好ましくは、前記アプタマーは、３コピーの繰り返し配列APDTRPAPGSTAPPAHGVTS（配列番号１２）からなる60マー、または９アミノ酸のペプチドAPDTRPAPG（配列番号１３）のいずれか、または両方よりもこの組換えMUC1に対して、より高い結合親和性を有する。前記組換えMUC1は、非グリコシル化であってよいが、グリコシル化されているのが好ましい。
【００１８】
好ましくは、前記アプタマーのMUC1との相互作用のKdは、1000 nM未満、500 nM,未満、250 nM未満、好ましくは200 nM未満、100 nM未満、90 nM未満である。
【００１９】
前記アプタマーは、他の活性成分と結合してよい。前記アプタマーは、他の活性成分と共有結合または共役していてよく、あるいはそれらと他の仕様で結合していてよい。他の活性成分は、放射性標識、蛍光標識、または発光標識のような、標識であってよい。他の活性成分は、さらなるアプタマーのようなリガンド、あるいは別のリガンドであってよい。他の活性成分は、イムノグロブリン、あるいはイムノグロブリンのフラグメントまたは部分であってよい。他の活性成分は、治療薬剤、例えば放射線源；抗体またはフラグメントまたは部分；抗癌治療薬；あるいはたの薬物または生物学的活性薬剤であってよい。
【００２０】
本発明はさらに、ここで記載されるようなアプタマーをコードする発現ベクターを供給する。また、配列番号１から１１のいずれかに相補的、および配列番号１から１１のいずれかに相当するRNAなヌクレオチド配列も提供する。
【００２１】
本発明のある態様によれば、MUC１に関する条件の治療方法が提供され、前記方法はここに記載されているようなアプタマーを被験者に投与することを含む。
【００２２】
条件は好ましくはMUCの生産が上昇することと関わりがある。好都合なことに、前記条件は以下より選択されてよい：癌、嚢胞性線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、非上皮性悪性炎症性疾患、腺癌、乳癌、大腸癌、膵臓癌、肺腺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、子宮内膜癌、および結腸直腸癌。
【００２３】
さらに本発明はMUC1に関する、好ましくはMUC1の生産上昇に関する条件を診断する方法を提供し、前記方法はここで記載されるアプタマーの、細胞、組織、または試料に対する結合を検出することを含む。前記方法は、in vivoまたはin vitroで実効されてよい。前記アプタマーの結合は、都合のよいどのような方法でも、例えば、アプタマーに結合する標識を検出する、アプタマーをイメージングする、または結合したアプタマーの量を検出することにより、検出してよい。適する方法は、WO2004/081574に記載されている。
【００２４】
本発明のさらなる態様によれば、治療または診断に使用するためにここで記載されるアプタマーが供給される。
【００２５】
本発明はまた、MUC1に関する状態を治療するための医薬の製造における、ここで記載されるアプタマーの使用も提供する。
【００２６】
前記状態は好ましくは、MUC1の生産上昇に関わる。好都合なことに、前記状態は以下より選択されてよい：がん、嚢胞性線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、非上皮性悪性炎症性疾患、腺癌、乳癌、大腸癌、膵臓癌、肺腺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、子宮内膜癌、および結腸直腸癌。
【００２７】
本発明はまた、MUC1に関する状態を検出または診断するための診断薬剤の製造における、ここで記載されるアプタマーの使用も提供する。
【００２８】
本発明はさらに、ここで記載されるアプタマーを含む薬剤組成物も提供する。前記組成物はさらに、薬剤として許容しうる担体を含んでよい。
【００２９】
本発明のアプタマー、ならびにその配合物または組成物を、一般に当業者に既知であるように、患者あるいは標的組織または器官に、直接または局所的に（例えば、部分的に）投与してよい。例えば組成物は、被験者に投与するために、リポソームを含む送達ビヒクルを含むことができる。担体および希釈物、ならびにそれらの塩が、薬剤として許容しうる配合物中に存在することができる。核酸分子を、以下を含むが、それに限定されない種々の当業者に既知の方法により投与することができる：リポソーム中へのカプセル化、イオン導入(iontophoresis)、生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリンポリ（乳-コ-グリコール）酸 (PLGA)およびPLGAミクロスフェア、生分解性ナノカプセル、ならびに生体接着性ミクロスフェアのような他のビヒクルへの導入、ならびにタンパク性ベクター。
【００３０】
本発明で使用してよい送達系は、例えば、水性および非水性ゲル、クリーム、複数のエマルジョン、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水性および非水性溶液、ローション、エアゾール、炭化水素ベースと粉末を含み、可溶化剤、浸透剤（例えば脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコールやアミノ酸）、ならびに親水性ポリマー（例えばポリカルボフィル(polycarbophil)およびポリビニルピロリドン）のような賦形剤を含むことができる。ある実施態様において、前記薬剤として許容しうる担体は、リポソームまたは経皮増強剤(transdermal enhancer)である。
【００３１】
本発明の薬剤配合物は、細胞、または例えばヒトを含む被験者に、投与、例えば全身または局所投与に適する形態である。適切な形態は、部分的に、使用または流入の経路、例えば経口、経皮、または注射に依存する。他の要素は当業者に既知であり、毒性、ならびに組成物または配合物がその効果を発揮するのを妨げる形態のようなことに対する考慮を含む。
【００３２】
本発明はまた、薬剤として許容しうる担体または希釈剤中に、薬学的有効量の所望の化合物を含む、貯蔵または投与のために調製される組成物もまた含む。治療上の使用に許容しうる担体または希釈剤は、薬学の当業者に既知である。例えば、保存剤、安定化剤、染料および芳香剤を提供することができる。これらは、ナトリウムベンゾエート、ソルビン酸、およびp-ヒドロキシ安息香酸のエステルを含む。さらに、抗酸化剤、および懸濁化剤を使用することができる。
【００３３】
薬学的有効量は、疾患状態の発生を防ぐ、阻害する、または治療する（ある程度症状を、好ましくは症状の全てを軽減する）ために必要な投与量である。薬学的有効量は、疾患のタイプ、使用される組成物、投与の経路、治療する哺乳類のタイプ、考慮される特定の哺乳類の身体的特徴、同時治療、ならびに当業者が認識するであろう他の要素に依存する。
【００３４】
一般的に、0.1 mg/kg体重/日と100 mg/kg体重/日との間の量の活性成分が投与される。
【００３５】
本発明の配合物を、伝統的な薬剤として許容しうる担体、アジュバント、および/またはビヒクルを含む単位用量配合物中で投与することができる。配合物は、経口使用に適した形態、例えば錠剤、トローチ、薬用キャンデー、水性または油性懸濁液、分散性粉末または顆粒、エマルジョン、ハードまたはソフトカプセル、またはシロップやエキシリル剤である可能性がある。経口使用を意図した組成物を、薬剤組成物を製造するための当業者に既知の方法のいずれかにより調製することができ、そのような組成物は、薬剤として適切で口当たりのよい調整物を提供するために、甘味料、芳香剤、着色剤、または保存剤のようなものの1つまたは複数を含むことができる。錠剤は、錠剤の製造に適する、非毒製の薬剤として許容しうる賦形剤と混合した活性成分を含むことができる。
【００３６】
これらの賦形剤を、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムのような不活性希釈財；顆粒化剤および崩壊剤、例えばコーンスターチ、またはアルギン酸；結合剤、例えばスターチ、ゼラチン、またはアカシア；ならびに平滑剤、例えばマグネシウムステアレート、ステアリン酸、またはタルクである可能性がある。前記錠剤は、被覆されていない可能性があり、または既知の技術で被覆されている可能性がある。ある場合には、そのような被覆を既知の技術で調製して、消化管中における分解および吸着を遅延させることができ、それにより、より長い期間にわたり持続した作用を提供することができる。例えば、グリセロールモノステアレートまたはグリセロールジステアレートのような時間遅延物質を使用することができる。
【００３７】
経口使用のための配合物もまた、不活性固体希釈物、例えばカルシウムカルボネート、カルシウムホスフェート、またはカオリンと活性成分が混合されているハードゼラチンカプセル、あるいは水またはオイル媒体、例えばピーナッツオイル、液体パラフィンまたはオリーブオイルと活性成分が混合されているソフトゼラチンカプセルとしても提示することができる。
【００３８】
水性懸濁物は、水性懸濁物の製造に適する賦形剤と混合して活性物質を含む。そのような賦形剤は、懸濁剤、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムアルギネート、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、およびアカシアゴムであり；分散剤または湿潤剤は天然存在リン脂質、例えばレシチン、あるいは脂肪酸を有するアルキレンオキシド、例えばポリオキシエチレンステアレートの濃縮生産物、あるいは長鎖脂肪族アルコールを有するエチレンオキシド、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノールの濃縮生産物、あるいはポリオキシエチレンソルビトールモノオレイエートのような脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分的エステルを有するエチレンオキシドの濃縮生産物、あるいは脂肪酸およびヘキシトール無水物、例えばポリエチレンソルビタンモノオレイエートに由来する部分的エステルを有するエチレンオキシドの濃縮生産物である。前記水性懸濁物はまた、1つまたは複数の保存剤、例えばエチル、またはn-プロピルp-ヒドロキシベンゾエート、1つまたは複数の着色剤、1つまたは複数の芳香剤、ならびにスクロースまたはサッカリンのような1つまたは複数の甘味剤を含むこともできる。
【００３９】
油性懸濁物を、植物性油、例えばラッカセイオイル、オリーブオイル、ゴマ油、またはココナッツオイル中、あるいは液体パラフィンのような鉱油中に、活性成分を懸濁することにより配合することができる。前記油性懸濁物は、増粘剤、例えばビーズワックス、ハードパラフィン、またはセチルアルコールを含むことができる。甘味剤および芳香剤を添加して、口当たりのよい経口調製物を提供することができる。これらの組成物を、アスコルビン酸のような抗酸化剤の添加により保存することができる。
【００４０】
水を添加することにより水性懸濁物を調製するために適する分散粉末および顆粒により、分散剤または湿潤剤、懸濁剤、および1つまたは複数の保存剤と混合して活性成分を提供する。適切な分散剤または湿潤剤、あるいは懸濁剤は、上記すでに言及されたものにより例示される。添加の賦形剤、例えば甘味剤、芳香剤、および着色剤もまた存在することができる。
【００４１】
本発明の薬剤組成物はまた、水中油エマルジョンの形態であることもできる。油相は、植物油または鉱油、またはこれらの混合物であることができる。適切な乳化剤は、天然存在ゴム、例えばアカシアゴム、またはトラガカントゴム、あるいは天然存在リン脂質、例えばダイズ粉末、レシチン、脂肪酸およびヘキシトール由来のエステルまたは部分エステル、ならびに無水物、例えばソルビタンモノオレイエート、ならびにエチレンオキシドを有する前記部分エステル、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレイエートの濃縮生産物である可能性がある。前記乳化剤はまた、甘味剤および芳香剤を含むことができる。
【００４２】
シロップおよびエリキシル剤を、甘味剤、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコースまたはスクロースと配合することができる。そのような配合物はまた、鎮痛剤、保存剤、芳香剤、および着色剤も含むことができる。前記薬剤組成物は、無菌注射可能な水性または油性懸濁物の形態であることができる。
【００４３】
この懸濁物を、上記言及された適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁剤を使用して既知の技術により配合することができる。
【００４４】
無菌注射可能な調製物はまた、非毒性で母体として許容しうる希釈剤または溶媒、例えば1,3-ブタンジオール中の溶液として無菌注射可能な溶液または懸濁物であることができる。使用することができる、許容しうるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液(Ringer's solution)、等張塩化ナトリウム溶液、および塩化ナトリウムおよびカリウムを含む等張塩溶液がある。さらに、無菌な固定油が、溶媒または懸濁媒体として伝統的に使用されている。この目的のために、いずれかの無菌性の固定油を、合成モノまたはジグリセリドを含めて使用することができる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸が注射物質の調製に使用されることが見出される。
【００４５】
本発明の組成物をまた、坐薬、例えば薬剤の直腸投与の形態で投与することもできる。これらの組成物を、常温で固体であるが直腸温度で液体であり、それゆえ溶解して薬剤を直腸で放出する、適切な非刺激性賦形剤と混合することにより調製することができる。そのような物質は、ココアバターおよびポリエチレングリコールを含む。
【００４６】
本発明の組成物を、無菌媒体中に非経口で投与することができる。前記薬剤を、使用されるビヒクルおよび濃度により、ビヒクル中に懸濁するか、または溶解することができる。有利には、局所麻酔剤のようなアジュバント、保存剤および緩衝剤をビヒクル中に溶解することができる。
【００４７】
いずれかの特定の被験者に対する特定の投与量レベルは、以下を含む種々の要素に依存することが理解されるであろう：使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、および排泄率、薬剤の組み合わせ、ならびに治療を行う特定の疾患の重篤度。
【００４８】
非ヒト動物に対する投与のために、前記組成物をまた動物の餌または飲用水に添加することもできる。動物が、その食事に、治療上適切な量の組成物を取り込むために、動物の餌および飲用水に組成物を配合することは都合がよい可能性がある。餌および飲用水に前もって混合して前記組成物を提示することもまた好都合である可能性がある。
【００４９】
本発明の組成物をまた、他の薬剤化合物と組み合わせて被験者に投与して、全体の治療効果を増強することもできる。症状を治療するために多種の化合物を使用することにより、有利な効果を増強する一方、副作用の存在を軽減することができる。
【００５０】
本発明の態様は、組換えタンパク質標的に対するアプタマーリガンドを同定する方法であり、前記方法は以下の工程を含む：
a) 組換えタンパク質標的を、固体支持体に接着させる工程；
b) アプタマーのライブラリを前記接着させた標的と混合する工程；
c) 固体支持体から非結合アプタマーを溶出する工程；
d) 前記接着させた標的から結合したアプタマーを放出させる工程；
e) 前記固体支持体から放出されたアプタマーを溶出する工程；
f) 放出させ、溶出させたアプタマーを増幅する工程；および
g) 増幅したアプタマーを同定する工程。
前記組換えタンパク質は、好ましくはグリコシル化されている。
【００５１】
前記組換えタンパク質は、好ましくは全長タンパク質である。
【００５２】
前記方法はさらに、前記固体支持体に結合させる前に、前記組換えタンパク質を発現する工程を含んでよい。他の適切な発現系が当業者に既知であろうが、前記タンパク質を、原核生物宿主、伝統的には大腸菌中で発現してよい。
【００５３】
前記方法は、前記固体支持体に結合させる前に、前記組換えタンパク質をグリコシル化する工程を含んでよい。
【００５４】
工程b)からf)を、２回、３回、５回、１０回繰り返してよい。
【発明の効果】
【００５５】
＜発明の詳細な記載＞
本発明は、以下の実験手順および結果を参照する実施例によりさらにここに記載されるであろう。
【００５６】
＜方法＞
１．MUC1 5TRの発現および精製
以下の文献による一連の単純な工程により、タンパク質を生産し、精製した：Brokx, R. D. et al. Nuclear Magnetic Resonance-Based Dissection of a Glycosyltransferase Specificity for the Mucin MUC1 Tandem Repeat. Biochemistry 42, 13817-13825 (2003)。
【００５７】
BL21大腸菌細胞(Novagen, USA)の一時的なグリセロールストック中で、バクテリアをカルベニシリンプレート上に新鮮な状態でストリークし、単一コロニーを拾い、40 mlの最初の培養物に播種するために使用した。最初の培養物を、濁るまで一晩培養し、接種物をLBカルベニシリンフラスコに移し、37°Cで培養し、25°Cで振盪しながら0.4 mMイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)で、培養物がMUC1の生産を誘導されるまで継続した。菌のペレットを遠心により回収し、変性条件下でMUC1を精製した。
【００５８】
ペレットを溶菌し、ニッケルNTAアガロース(Qiagen, Mississauga, On, Canada)により精製した。タンパク質を強力に透析し、HPLC精製し、凍結乾燥させた。試料をさらにSDSゲル電気泳動により解析し、正確なバンドサイズを得るためにuniversal dye simply blue (Invitrogen, USA)で染色した。凍結乾燥した粉末は、理論的に11.800 KDa MWであると産出され、MALDIマススペクトロスコピーにより確認された。
【００５９】
２．組換えppGalNAc-T1の発現および精製
組換えppGalNAc-T1遺伝子産物を、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)株KM71H中で発現した。典型的には、単一ピキアコロニーをプレートからBMGY培地に接種することによりT1発現は実行され、30°Cで激しく振盪しながら濁るまで(48時間)培養する；前記酵母を室温で10分間4 krpmで短時間遠心することにより回収し、ペレットを10分の1容量(30 - 50 ml)のBMMY培地中に再懸濁する；さらに48時間培養を継続し、さらにエタノール(100% 0.25 ml)を24時間ごとに添加した。
【００６０】
前記酵母を回収し、測定シリンダーに上清を除去した；ペレットを、後で再使用するために低温質で保存してよい。その後上清を、すぐに2分の1容量の３ｘT1バッファーを添加してバッファリングし、完全に混合し、Steriflipフィルター(Millipore, USA)を使用してフィルター滅菌し、4°Cに冷却した。この溶液を、10 kDAカットオフ値の膜を有するAmiconユニット(Viva Science, USA)を使用して濃縮した。酵素の生産をSDSゲル電気泳動で観察した。前記酵素は4°Cで安定であることが見出され、さらにTn抗原の構築のためにそれを利用した。
【００６１】
３．ppGalNAc-T1を有する組換え MUC1 5TRのグリコシル化：Tn抗原
反応混合物は、蒸留水、0.5 M MESバッファー、pH 6、1 M MgCl2、50 mM UDP-GaINAc, 10 mg/mL MUC1-5TR、0.2 M MnCI2および生のT1酵素からなるものであった。前記反応混合物を37°Cで静置インキュベーター中で、48時間、またはグリコシル化反応の完了までインキュベートした。このプロトコルを、グリコシル化反応に必須であるMgCl2で前もって最適化されていた。この化合物は、前記反応に必要な触媒であると考えられている。反応の生成物を、4 - 20 %SDSゲル電気泳動ゲル(Invitrogen)によるSDSゲル電気泳動解析で解析し、マススペクトロメトリーで確認した。
【００６２】
４．親和性クロマトグラフィーin vitro選択法
5TR MUC1組換えタンパク質に対するアプタマーのin vitro選択のための方法論に基づく2つの親和性クロマトグラフィーを使用した。
【００６３】
第一の方法論は、NHS-HiTrapセファロース活性カラム(1 ml) (Uppsala, Sweden)の固定化に基づく。前記カラムは、製造者の説明により官能化された。前記タンパク質3 mgをカラムマトリックスに固定化し、アプタマー選択に使用した。カラム官能化後に存在するタンパク質の量を、製造者の説明による紫外線分光光度計により測定した。NHS-HiTrapセファロース活性カラムの使用により、前記タンパク質のアミノ末端を介するカラムへのタンパク質の固定化が可能となった。
【００６４】
あるいは、親和性クロマトグラフィー法を、5TR MUC1組換えタンパク質に存在する6-Hisタグを利用して開発した。MUC1タンパク質中に存在する前記6ヒスチジンタグを、HisTrap(登録商標)キレートHPカラム(GE Healthcare previously Amersham Pharmacia, Sweden)に対する結合により架橋した。前記HisTrapキレートHPカラム(1 ml)を、イミノ二酢酸がスペーサー腕を介していずれかの基に安定に結合している、高度に架橋されたアガロースビーズよりなるSepharose high performanceをキレートして封入した。前記キレートマトリックスを、500 μlの100 mMニッケル溶液で充填した。結合した標的物を、SDS PAGEゲル電気泳動により可視化し、ペプチド負荷の試験のために取り去った。前記カラムを、1 mlの10 mg/mlグリコシル化MUC1 5TRおよび/または10 mg/ml非グリコシル化MUC1 5TRで再装填した。前記カラムを5倍カラム容量の洗浄バッファーで洗浄し、選択ラウンドに使用した。
【００６５】
バッファーのストリンジェントな系を設計して、高度に特異的なssDNAアプタマーを開発した。結合バッファーは100mM NaCl2、および5mM MgCl2 (pH 7.4)からなり、選択を37 °Cで実行して、生理的条件下で使用するためのアプタマーを取得した。洗浄バッファーおよび溶出バッファーは、濃度で異なる塩化ナトリウム組成物（それぞれ、0.15 Mおよび1.5 M）を有する同一のものからなった。高容量洗浄により引き起こされる相互作用へのストレスが増加するために、弱い結合剤を洗い流すことを可能にする5倍カラム容量の結合バッファーによる洗浄工程が、1.5倍容量の溶出工程に先行する。ライブラリを、固定化標的-グリコシル化5TR MUC1ペプチドに対して、室温で10ラウンド連続してスクリーニングした。各ラウンドの間に、PD-10脱塩カラムでライブラリを脱塩化し、試料中の過剰の塩を除去し、凍結乾燥して試料の容量を減少させ、さらに増幅して、複数の結合アプタマー成分による競合を増強させた。最後の選択ラウンドにおいて、前記選択プロトコールに付加的な工程を付加した。スクリーニングしたライブラリを、コアMUC1ペプチドに結合したアプタマー（カラムに結合したアプタマー）を、Tn抗原に結合したアプタマー（洗浄を通して通過したGalNac糖アプタマー）から分離するために、ニッケルで充填され、10 mgの非グリコシル化5TR MUC1を保持するHiTrapキレートカラムにおける結合についてスクリーニングした。この第一の工程により、5TR MUC1コアアプタマー結合物、およびMUC1 5TR Tn抗原結合アプタマーの両方を選択することができる。
【００６６】
11ラウンドの選択の後、最終プールをpCR(登録商標)21.TOPOベクターにクローニングし、クローンをさらに解析し、シークエンス解読して、アプタマーの最終プールのDNAベース組成がもたらされた。配列解読を、Macrogen (Seoul, Korea)に送った。配列をアラインし、ファミリーをBopEdit配列アラインメントエディター(Tom Hall, Ibis Therapeutics, Carlsbad, CA, USA)により解析した。
【００６７】
５．最終選択ラウンド後のアプタマーのクローニングおよび配列解析
最終ラウンドのDNAプールをPCRによりさらに一回増幅し、pCR(登録商標)21.TOPOベクターにクローニングした。50個のランダムにピックアップされたプラスミドクローンを、配列解析し、さらにBopEdit配列アラインメントエディターを使用して解析した。ラウンド10のアプタマーのうち90 %は、以下に示す配列により再提示された。
【００６８】
６．選択アプタマーと5TR-MUC1タンパク質との間の相互作用の、親和性クロマトグラフィー特性。
合成アプタマーを最初にスクリーニングし、クローニングおよび配列解析過程におけるアーティファクトにより製造された非結合配列のいずれかのためにスクリーニングされた。選択アプタマーを1 x結合バッファー(100 mM NaCl、5 mM MgCl2、pH 7.2)中に溶解し、1カラム容量の最終容量とし、それにより室温で1時間の調製された選択レジンとともにインキュベートしてもよい。インキュベーション後、FPLC系中1 ml/分の流速で、最初のバッファー（1 x洗浄バッファー、150 mM NaCl、5 mM MgCl2、pH 7.2）および最終バッファー（1 x溶出バッファー、1.5 M NaCl、5 mM MgCl2、pH 7.2）である塩勾配を使用して、前記アプタマーを溶出した。
【００６９】
選択されたアプタマーは、1.35 M NaCl （± 0.05 M；図１参照）で親和性クロマトグラフィーマトリックスから溶出されることが見出された。同様の研究で、よく特徴づけられ、市販されているC595モノクローナル抗体が、およそ0.8 M NaSCNでクロマトグラフィーマトリックスから溶出されることが示された。
【００７０】
７．競合ELISAを使用したアプタマー5TR-MUC1の特徴づけ
酵素免疫吸着アッセイを、結合の評価およびエピトープの特徴づけのために実行した。簡単には、ELISAマイクロタイタープレートを、100 μLカルボン酸バッファー(0.05 mol/L, pH 9.6)中、5 μgのMUC1ペプチドでコートし、4°Cで一晩放置した。37 °Cで1時間、ウェルを順次1 % (w/v) BSAを含むPBS 100 μLでブロックした。その後ウェルを0.05 % (v/v) tween-20を含むPBS 200 μLで3回洗浄した。過剰のC595抗MUC1モノクローナル抗体50 μLを、一定の濃度（0.05% tween-20および1 % BSAを含む30 μM PBS）で、ウェルごとに添加し、全ての結合部位が飽和しているのを確保し、37 °Cで1時間インキュベートした。前記プレートを洗浄し、100 mM NaCl、5 mM MgCl2、100 mM KCl、および5% glycerolを含むバッファー中、100 nMから700 nMの範囲にある一連の濃度のアプタマー50 μLを各ウェルに添加し、37 °Cで1時間インキュベートさせた。プレートを再度洗浄し、パーオキシダーゼ共役抗マウス２次抗体(Sigma)50 μLをプレートに添加し、37 °Cで1時間インキュベートした。ウェルをさらに3回上記のように洗浄し、2,2'-アジノ-ジ-(3-エチル-ベンゾ-チオゾリンスルホン酸)反応剤(Sigma)により、着色を発現させた。
【００７１】
MUC1ペプチドに対する結合におけるアプタマーの効率を確認するため、および確立されたエピトープ結合のための抗MUC1抗体と競合させるため、以前に記載された競合ELISA [Missailidis S, Thomaidou D, Borbas KE, and Price MR: Selection of aptamers with high affinity and high specificity against C595, an anti-MUC1 lgG3 monoclonal antibody, for antibody targeting. J Immunol Methods 2005; 296: 45-62]を使用した。MUC1ペプチドエピトープに対して結合するアプタマーの能力を確認するため、およびC595抗体と競合させるため、前記5TR MUC1組換えタンパク質を、一晩ELISAプレートに直接吸着させた。市販のC595抗体をELISAに過剰に添加し、飽和させ、全ての利用可能なペプチドに結合させた。過剰の抗体を洗浄し、0 nM - 600nMの間の範囲である濃度で、関係するアプタマーをウェルに添加した。２次抗マウスHRP共役抗体を使用して着色を発現させた。ELISAプレートのウェルに前記ペプチドが固定化されたため、アプタマーの添加後に前記ペプチドに結合したままであるいずれかの抗体が、セイヨウワサビパーオキシダーゼ共役ウサギ抗マウスイムノグロブリンと相互作用し、着色を発現するであろう。アプタマーが前記ペプチドに結合したため、前記ペプチドに競合して結合しなかった抗体は、種々の洗浄工程で除去された。このELISAで選択され、試験されたアプタマーは、種々の塩基組成を獲得している。塩基組成7A, 5G, 7C, 6Tを有する混合アプタマーが、このELISA系においてC595とMUC1ペプチドの間の相互作用を妨げないことが以前示されている。結果を対アプタマー吸収の％としてプロットした（図２参照）。
【００７２】
その天然抗原タンパクをC595抗体に置き換えるアプタマーの能力は、選択されたアプタマー種の間で非常に類似しているようであり、およそ200 nMのアプタマーが、50 %以上の抗体の置換を達成するために十分であった。
【００７３】
８．SPRを使用する選択アプタマーと5TR-MUC1組換えタンパク質の相互作用の特徴づけ
種々の選択アプタマーと5TR-MUC1組換えタンパク質の相互作用を定量化するため、およびその相互作用を結合定数および解離定数の形で表現するため、出願人はBIAcore装置でSPRを利用した。結合の変化（共鳴の単位）および時間（秒）をプロットすることにより、実験結合曲線を取得し、結合定数および解離定数を算出した。
【００７４】
出願人の実験において、molecular probes (USA)より得られるFluoReporter(登録商標)ビオチンXXタンパク質ラベリングキットを使用して、ビオチン化5TR-MUC1タンパク質を生産した。簡単には、5 mgのペプチドを、共役の直前にカルボン酸バッファー（0.1 M 重炭酸ナトリウム、pH 8.3）1 mL中に溶解させた。使用する直前に、ビオチンXXスクシンイミジルエステル2 mgを、室温でDMSO 0.1 mL中に溶解させ、溶解するまでボルテックス(vortex)し、製造者の仕様書のようにペプチド溶液に添加し、室温で2時間インキュベートさせた。前記溶液をPD-10カラム(Pharmacia, Sweden)中で脱塩し、染料HABA(4'-ヒドロキシアゾベンゼン-2-カルボン酸)の固有特性を利用した、製造者の説明キット手順によりビオチンレベルを試験した。製造者の仕様書により、前記レベルを500 nmの紫外線吸収を利用して測定し、対照(PBS)と比較したビオチン化ペプチド試料に対する吸収の差異を算出した。
【００７５】
ビオチン化5TR-MUC1タンパク質を、BIAcore SAセンサーチップ（金-スロレプトアビジン）上に固定化し、系を最適化して全体の移動、立体障害、込み合い、結合力、および凝集を軽減した。1 μMから1 nMの範囲のペプチド濃度を、異なる注入回数で試験し、使用した最適化条件は、各個別チャンネルにわたり25 μL/分の速度で60秒パルスの間灌流するランニングバッファー中、1 nMペプチド100 μLであった。ペプチドレベルに対するチップの再生後、10 mM NaOHを伴う30秒パルスの順次適用した。前記アプタマーを、その選択バッファー（100 mM NaCl、5 mM MgCl2を含む燐酸バッファー、pH 7.4）中、1 μMで調製し、選択バッファーとともに、5秒の洗浄工程を伴う30秒の注入で適用し、非特異物質を除去させた。チップ表面を、1.5 M NaCl、5 mM MgCl2、pH 7.4の10 μLパルスを適用することにより再生した（溶出工程）。
【００７６】
BIAcore実験データを、非線形回帰解析を使用して、結合定数(ka)、および解離定数(kd)を決定するために2つの数式に近似させた。各々のペプチド標的に対するの急速な結合および解離を表すSPRセンソグラム(sensogram)を図３に示し、Origin 6.0で近似した（図３参照）。
【００７７】
急速な最初の結合フェーズを、以下の式により表現される、１相指数関数結合モデル(one-phase exponential association model)の非線形回帰解析により解析した：
［反応］  ＝  ［プラトー］  ＋  ［期間］(1 -exp (-K(t-t0)))
解離フェーズもまた、以下の式により表現される、１相指数関数結合モデルの非線形回帰解析に従った：
［反応］  ＝  ［ボトム(Bottom)］  ＋  (［プラトー］−［ボトム(Bottom)］)exp (-kd(t-t0))
【００７８】
MUC1の量に比較して、系に過剰量が適用されたため、遊離アプタマーの濃度は、一定であるとみなされる。それゆえ、Kは kaC+kdと等しく、ここでCは系におけるアプタマーの総濃度であり、ka値は以下の関係式より取得された：ka=(K-kd)/C
Kdは以下の関係式より取得された：Kd = kd/ka
データの統計近似はχ2で表された。
【００７９】
図３は組換えヒトMUC1ペプチドアプタマーMUC1 5TR-1相互作用に相当するSPR実験の曲線近似を表す。結合（左）および解離（右）プロットは、Origin 6.0グラフ化ソフトウェアにより解析された。X軸c0（算出された）は秒の時間に相当する。Y軸c0（算出された）は、BIAcore 2000ソフトウェアにより与えられるRU単位に相当する。
【００８０】
残りのアプタマーに対して類似したグラフが得られた。測定した結合定数は、表１に一覧された。
【００８１】
【表１】
2009535051.tif 000002
【００８２】
前記SPRデータにより、Kd値がnM範囲であり、溶液中における5TR-MUC1タンパク質に対するアプタマーの親和性が高いことが確認された。
【００８３】
９．グリコシル化MUC1 5TRとのニッケルNTA糖タンパク質-DNAアプタマー相互作用
グリコシル化MUC1アプタマー：糖タンパク質相互作用を評価するために、（HiTrapキレートカラムで使用されたように）ニッケル磁気アガロースビーズによりHisタグ化物捕捉の原理を使用してアッセイを実行した。このアッセイにより、３工程、結合：洗浄：分離、プロトコールに基づいてグリコシル化ペプチドに対して結合するアプタマーのチューブ中での迅速な検出/スクリーニングが可能となる。
【００８４】
Hisタグ精製のためにニッケルでコートされた、5 %溶液比率のアガロース磁気ビーズを含むキアゲンキットを、前記アッセイのために使用した。それぞれスタートバッファー(100mM NaCl2、5mM MgCl2、pH 7.4) 900 μlを含み、グリコシル化MUC1 5TRペプチドの10 μM溶液に再懸濁して使用される7本のチューブを、製造者の仕様書にしたがって調製した：5 %ビーズ溶液10 μlを溶液に添加し、4°Cで30分間、撹拌しながらインキュベートした。30分後、上清を除去した。スタートバッファーを添加することによりビーズを1分から5分の洗浄時間で洗浄した。スタートバッファー中の各グリコシル化MUC1アプタマー1 mM (500 μl)を、前に調製したHisタググリコシル化MUC1を含む磁気ビーズに添加した。複合化したビーズおよびアプタマー溶液を含む溶液を、37°Cで1時間、振盪しながらインキュベートした。
【００８５】
1時間後、上清を除去し、260 nmにおけるその吸光度を、紫外線分光光度計(Eppendorf, USA)を使用して測定した。残りの磁気ビーズを、500 μlの洗浄バッファー（150 mM NaCl2、5mM MgCl2、pH 7.4）で3回洗浄した。上清を除去し、50 μlの溶出バッファー（1.5M NaCl2、5mM MgCl2、pH 7.4）を添加した。溶出バッファーを、振盪しながら5分間磁気ビーズとインキュベートした。磁気ビーズを4000 rpmで30秒遠心して、ペレットにした。磁気ビーズを磁石棒を使用して集め、上清を除去した。溶出した上清を除去し、260 nmの吸光度を、紫外線分光光度計(Eppendorf, USA)を使用して測定した。
【００８６】
図４は、ニッケルNTAアプタマーを表す：260 nm紫外線分光光度計により測定された最初のDNA濃度、洗浄DNA濃度、および最終結合濃度を示すTn抗原相互作用ヒストグラム（上）、ならびに結果の表（下）。
【００８７】
＜結論＞
上記一連の全てのアッセイより、全てのMUC1 5TRおよびグリコシル化MUC1 5TR Tn抗原アプタマーが解析され、その標的に対するよい結合物であることが見出され、選択的に、高い親和性で結合する能力を有することを出願人は確認することができ、以下にしゅとくそれたアプタマー配列を示す。
【００８８】
MUC1 5TR, 生理学的、バクテリア由来(最も有力)
Non-Tn 5TR:
MUC1 5TR-1 GAAGTGAAAATGACAGAACACAACA (配列番号１)
MUC1 5TR-2 GGCTATAGCACATGGGTAAAACGAC (配列番号２)
MUC1 5TR-3 CAAACAATCAAACAGCAGTGGGGTG (配列番号３)
MUC1 5TR-4 TACTGCATGCACACCACTTCAACTA (配列番号４)
MUC1 5TRグリコシル化、生理学的、バクテリア由来、T1でグリコシル化（糖選択）
TR-T1 GGGTTATATTACTCGGCCGGTGTAA (配列番号５)
5TR-T2 GGCTATAGCACATGGGTAAAACGAC (配列番号６)
5TR-T3 GGCGTACGGTAGGCGGGGTCAACTG (配列番号７)
5TR-T4 GCTGGGTAAATAGATGATTCCCGGC (配列番号８)
5TR-T5 AGTGGTGGTTTTATAAGACTGATAC (配列番号９)
5TR-T6 TAGCCTTAATGCCTTTGTAAGGCGA (配列番号１０) 
TR-T7 CGGTCTACGGAGCCGCGTTAAACTT (配列番号１１) 
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１ａ】MUC1 5TR親和性カラムからの5TR-1アプタマーの溶出を表す。
【図１ｂ】MUC1 5TR親和性カラムからの5TR-2アプタマーの溶出を表す。
【図１ｃ】MUC1 5TR親和性カラムからの5TR-3アプタマーの溶出を表す。
【図１ｄ】MUC1 5TR親和性カラムからの5TR-4アプタマーの溶出を表す。
【図２】ELISA試験からのアプタマー濃度に対する吸収％を表す。
【図３】組換えヒトMUC1タンパク質-アプタマーMUC1 5TR-1相互作用に相当するSPR実験の近似曲線を表す。
【図４】ニッケルNTAアプタマーを表す：Tn抗原相互作用ヒストグラム。
【図１ａ】
2009535051.tif 000003
【図１ｂ】
2009535051.tif 000004
【図１ｃ】
2009535051.tif 000005
【図１ｄ】
2009535051.tif 000006
【図２】
2009535051.tif 000007
【図３】
2009535051.tif 000008
【図４】
2009535051.tif 000009
【国際調査報告】
2009535051.tif 000010
2009535051.tif 000011
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