(57)【要約】  本発明は、因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａペプチドおよびＰＥＧ部分間の複合体を提供する。複合体は、ペプチドおよび修飾基の間に介在されると共に、共有結合された無処置グリコシルリンク基を介してリンクされている。複合体は、グリコシル化および未グリコシル化ペプチドの両方から、グリコシルトランスフェラーゼの作用により形成される。グリコシルトランスフェラーゼは、修飾糖質部分をペプチド上のアミノ酸またはグリコシル残基のいずれかに結合する。この複合体を含む医薬品配合物がまた提供されている。複合体の調製方法もまた本発明の範囲内である。
2009515508.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式、
【化１】
2009515508.tif 000159
（式中、
Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、
Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｒ１から選択されるメンバーであり、
Ｒ１は、直鎖ポリ（エチレングリコール）残基および分岐ポリ（エチレングリコール）残基から選択されるメンバーを含む部分であり、および
Ｍは、Ｈ、金属および単一の陰電荷から選択されるメンバーであり、
Ｌは、結合、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
ここで、ＤがＯＨであるときＧはＲ１−Ｌ−であり、およびＧが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるときＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である）
を有する修飾シアル残基を含むグリコシルリンカーを含む因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の製造方法であって、
（ａ）グリコシル部分、
【化２】
2009515508.tif 000160
を含む因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを、
式、
【化３】
2009515508.tif 000161
を有するＰＥＧ−シアル酸ドナー部分と、
前記ＰＥＧ−シアル酸を前記グリコシル部分のＧａｌへ転移させる酵素に、前記転移に適切な条件で接触させるステップを含む、方法。
【請求項２】
Ｌ−Ｒ１が、式、
【化４】
2009515508.tif 000162
（式中、
ａは、０〜２０から選択される整数である）
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ１が、
【化５】
2009515508.tif 000163
（式中、
ｅ、ｆ、ｍおよびｎは、１〜２５００から独立して選択される整数であり、および
ｑは、０〜２０から選択される整数である）
から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ１が、
【化６】
2009515508.tif 000164
（式中、
ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００から独立して選択される整数であり、および
ｑおよびｑ’は、１〜２０から独立して選択される整数である）
から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ１が、
【化７】
2009515508.tif 000165
（式中、
ｅおよびｆは、１〜２５００から独立して選択される整数である）
から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記グリコシルリンカーが、式、
【化８】
2009515508.tif 000166
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチド複合体が、
【化９】
2009515508.tif 000167
（式中、ＡＡは前記ペプチド複合体のアミノ酸残基であり、およびｔは、０および１から選択される整数である）
から選択される式に基づく前記グリコシルリンカーの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチド複合体が、少なくとも１つの前記グリコシルリンカーを含み、ここで、前記グリコシルリンカーの各々は、以下の式、
【化１０】
2009515508.tif 000168
（式中、ＡＡは前記ペプチド複合体のアミノ酸残基であり、およびｔは、０および１から選択される整数である）
から独立して選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチド複合体が、
【化１１】
2009515508.tif 000169
【化１２】
2009515508.tif 000170
（式中、ＡＡは前記ペプチド複合体のアミノ酸残基であり、およびｔは、０および１から選択される整数であり、および
式中、Ｇを含まないシアリル部分の０および２つから選択されるメンバーがない）
から選択される式に基づく前記グリコシルリンカーの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチド複合体が、
【化１３】
2009515508.tif 000171
【化１４】
2009515508.tif 000172
（式中、ＡＡは前記ペプチド複合体のアミノ酸残基であり、およびｔは、０および１から選択される整数であり、および
式中、Ｇを含まないシアリル部分の０および２つから選択されるメンバーがない）
から選択される式に基づく少なくとも１つの前記グリコシルリンカーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記グリコシルリンカーが、前記因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドに、セリンおよびスレオニンから選択されるアミノ酸残基を介して結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記グリコシルリンカーが、前記因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドに、アスパラギン残基であるアミノ酸残基を介して結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記アスパラギン残基が、Ｎ１５２、Ｎ３２２およびこれらの組み合わせから選択されるメンバーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記因子ＶＩＩａペプチドが生理活性因子ＶＩＩａペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ａ）の前に、
（ｂ）前記因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを好適な宿主において発現させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記宿主が哺乳類発現系である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
それを必要とする対象における状態を処置する方法であって、前記状態は前記対象における易感染性凝固効力により特徴付けられ、前記対象における前記状態の回復に有効な量の、請求項１に記載の方法により産生された因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項１９】
ある量の、請求項１に記載の方法により産生された因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を前記哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物における凝固効力を増強させる方法。
【請求項２０】
式、
【化１５】
2009515508.tif 000173
（式中、
Ｒ２はＨ、ＣＨ２ＯＲ７、ＣＯＯＲ７またはＯＲ７であり、
式中、
Ｒ７は、Ｈ、置換または非置換アルキルまたは置換または非置換ヘテロアルキルを表し、
Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、置換または非置換アルキル、ＯＲ８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ９から独立して選択されるメンバーであり、
式中、
Ｒ８およびＲ９は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルまたはシアル酸から独立して選択され、
Ｒ１６およびＲ１７は、独立して選択される高分子アームであり、
Ｘ２およびＸ４は、高分子部分Ｒ１６およびＲ１７をＣに結合する、独立して選択されるリンケージ断片であり、
Ｘ５は非反応性基であり、および
Ｌａはリンカー基である）
を有する修飾シアリル残基を含むグリコシルリンカーを含む因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の製造方法であって、
（ａ）グリコシル部分、
【化１６】
2009515508.tif 000174
を含む因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを、
式、
【化１７】
2009515508.tif 000175
を有するＰＥＧ−シアル酸ドナー部分と、
ＰＥＧ−シアル酸を前記グリコシル部分のＧａｌへ転移させる酵素に、前記転移に適切な条件で接触させるステップを含む、方法。
【請求項２１】
部分、
【化１８】
2009515508.tif 000176
が、
【化１９】
2009515508.tif 000177
（式中、
ｅ、ｆ、ｍおよびｎは、１〜２５００から独立して選択される整数であり、および
ｑは、０〜２０から選択される整数である）
から選択されるメンバーである式を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
部分、
【化２０】
2009515508.tif 000178
が、
【化２１】
2009515508.tif 000179
（式中、
ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００から独立して選択される整数であり、および
ｑおよびｑ’は、１〜２０から独立して選択される整数である）
から選択されるメンバーである式を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記グリコシルリンカーが式、
【化２２】
2009515508.tif 000180
を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体が式、
【化２３】
2009515508.tif 000181
（式中、
ＡＡは、前記ペプチドのアミノ酸残基であり、
ｔは、０および１から選択される整数であり、および
Ｒ１５は修飾シアリル部分である）
を有する少なくとも１つのグリコシルリンカーを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記グリコシルリンカーが、前記因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドに、アスパラギン残基であるアミノ酸残基を介して結合されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記アスパラギン残基が、Ｎ１５２、Ｎ３２２およびこれらの組み合わせから選択されるメンバーである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記因子ＶＩＩａペプチドが生理活性因子ＶＩＩａペプチドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（ａ）の前に、
（ｂ）因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを好適な宿主において発現させるステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記宿主が哺乳類発現系である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
それを必要とする対象における状態を処置する方法であって、前記状態は前記対象における易感染性凝固効力により特徴付けられ、前記対象における前記状態の回復に有効な量の、請求項２０に記載の方法により産生された因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項３２】
ある量の、請求項２０に記載の方法により産生された因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を前記哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物における凝固効力を増強させる方法。
【請求項３３】
ａ）シアリダーゼ、
ｂ）グリコシルトランスフェラーゼ、エキソグリコシダーゼおよびエンドグリコシダーゼから選択されるメンバーである酵素、
ｃ）修飾糖質／修飾シアリル残基、
ｄ）因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド
を組み合わせて、前記因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａペプチド複合体を合成するステップを含む、因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａペプチド複合体の合成方法。
【請求項３４】
前記組み合わせるステップが、１０時間未満の時間である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
キャッピングステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、すべて目的についてそれらの全体が参照により援用される、２００６年５月９日出願の米国仮特許出願第６０／７４６，８６８号明細書；２００６年１月５日出願の同第６０／７５６，４４３号明細書；２００５年１１月４日出願の同第６０／７３３，６４９号明細書；２００５年１０月２６日出願の同第６０／７３０，６０７号明細書；２００５年１０月１１日出願の同第６０／７２５，８９４号明細書；２００５年８月１９日出願の同第６０／７０９，９８３号明細書に関連する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
発明の概要
１つ以上のポリ（エチレングリコール）部分を有する因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａの制御された修飾は、関連する未変性（未ペグ化）因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａと比して向上した薬物動態学的特性を有する新規な因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａペプチド複合体をもたらすことが今では発見されている。さらに、本発明の因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａペプチド複合体の産生の、信頼性があると共に再現性のある経済的な方法が発見され、および開発された。
【０００３】
例示的な実施形態において、本発明の「グリコペグ化」因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａ分子は、グリコシル化または非グリコシル化因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａペプチドと、ポリ（エチレングリコール）などの高分子修飾基などの修飾基をその構造内に含む酵素的に転移可能な糖部分との複合体の酵素媒介形成により産生される。ＰＥＧ部分は、糖部分に、直接的に（すなわち、２つの反応性基の反応によって形成された単一の基を介して）または例えば、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル等といったリンカー部分を介して結合される。
【０００４】
それ故、一態様において、本発明は、例えばＰＥＧといったＰＥＧ部分と、技術分野において認識されている因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａに同様の、またはそうでなければ類似のインビボ活性を有するペプチドとの複合体を提供する。本発明の複合体において、ＰＥＧ部分は、共有結合的にペプチドに、無処置グリコシルリンク基を介して結合している。例示的な無処置グリコシルリンク基としては、ＰＥＧと共に誘導されるシアル酸部分が挙げられる。
【０００５】
高分子修飾基は、因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａのグリコシル部分のいずれかの位置に結合されていることが可能である。しかも、高分子修飾基は、グリコシル残基に、野生種または変異因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａペプチドのアミノ酸配列におけるいずれかの位置で結合されていることが可能である。
【０００６】
例示的な実施形態において、本発明は、グリコシルリンク基を介して高分子修飾基に複合化された因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａペプチドを提供する。例示的な因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａペプチド複合体としては、
【化１】
2009515508.tif 000003
から選択される式を有するグリコシルリンク基が挙げられる。
【０００７】
式ＩおよびＩＩにおいて、Ｒ２はＨ、ＣＨ２ＯＲ７、ＣＯＯＲ７、ＣＯＯ−またはＯＲ７であり、ここで、Ｒ７は、Ｈ、置換または非置換アルキルまたは置換または非置換ヘテロアルキルを表す。符号Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ６’は、独立してＨ、置換または非置換アルキル、ＯＲ８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ９を表す。指数ｄは、０または１である。Ｒ８およびＲ９は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルまたはシアル酸から独立して選択される。Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ６’の少なくとも１つが、例えばＰＥＧといった高分子修飾基を含む。例示的な実施形態において、Ｒ６およびＲ６’は、これらが結合している炭素と一緒に、シアリル部分の側鎖の構成成分である。さらなる例示的な実施形態において、この側鎖は、高分子修飾基で官能基化されている。
【０００８】
例示的な実施形態において、高分子修飾基は、一般的には、以下に示されるリンカー、Ｌを介して、
【化２】
2009515508.tif 000004
（Ｒ１は高分子修飾基であり、およびＬは、結合およびリンク基から選択される）、グリコシルコア上のヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ）を介してグリコシルリンク基に結合している。指数ｗは、１〜６、好ましくは１〜３およびより好ましくは１〜２から選択される整数を表す。例示的なリンク基としては、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル部分およびシアル酸が挙げられる。リンカーの例示的な成分は、アシル部分である。他の例示的なリンク基は、アミノ酸残基（例えば、システイン、セリン、リシン、および短鎖オリゴペプチド、例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｃｙｓ−Ｌｙｓ、Ｓｅｒ−Ｌｙｓ等）である。
【０００９】
Ｌが結合である場合、これは、Ｒ１の前駆体上の反応性官能基と、グリコシルリンク基の前駆体上の補完的な反応性の反応性官能基との反応により形成される。Ｌが非ゼロ次のリンク基である場合、Ｌは、Ｒ１前駆体との反応前に、グリコシル部分上にあることが可能である。あるいは、Ｒ１およびＬの前駆体は、その後グリコシル部分に結合される予め形成されたカセットに組み込まれることが可能である。本願明細書において規定されている通り、適切な反応性官能基を有する前駆体の選択および調製は、当業者の能力の範囲内である。しかも、前駆体のカップリングは、技術分野においてよく理解されている化学によって進行する。
【００１０】
例示的な実施形態において、Ｌは、アミノ酸、または小型ペプチド（例えば、１〜４個のアミノ酸残基）から、高分子修飾部分が置換アルキルリンカーを介して結合されている修飾糖質を提供することで形成されるリンク基である。例示的なリンカーとしては、グリシン、リシン、セリンおよびシステインが挙げられる。本願明細書において定義されるアミノ酸類似体はまた、リンカー構成成分としての使用のものである。アミノ酸は、アミノ酸残基のアミン部分を介して形成された例えばアミドまたはウレタンといったアシルリンケージを介して、共有結合される例えばアルキル、ヘテロアルキルといったリンカーの追加の成分で修飾され得る。
【００１１】
例示的な実施形態において、グリコシルリンク基は、式Ｉによる構造を有し、およびＲ５は高分子修飾基を含む。他の例示的な実施形態において、Ｒ５は、高分子修飾基および高分子修飾基をグリコシルコアに結合するリンカー、Ｌの両方を含む。Ｌは、直鎖または分岐構造であることが可能である。同様に、高分子修飾基は、分岐または直鎖であることが可能である。
【００１２】
高分子修飾基は、水溶性または基本的に不水溶性であることが可能である２つ以上の反復単位を含む。本発明の化合物において用いられる例示的な水溶性ポリマーとしては、ＰＥＧ、例えば、ｍ−ＰＥＧ、ＰＰＧ、例えば、ｍ−ＰＰＧ、ポリシアル酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリリジン、ポリエチレンイミン、生分解性ポリマー（例えば、ポリラクチド、ポリグリセリド）、および官能基化ＰＥＧ、例えば、末端−官能基化ＰＥＧが挙げられる。
【００１３】
因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａペプチド複合体において用いられるグリコシルリンク基のグリコシルコアは、天然および非天然フラノースおよびピラノースの両方からから選択される。非天然サッカライドは、任意により、アルキル化またはアシル化ヒドロキシルおよび／またはアミン部分、例えば、環上のエーテル、エステルおよびアミド置換基を含む。他の非天然サッカライドは、Ｈ、ヒドロキシル、エーテル、エステルまたはアミド置換基を、天然サッカライドには置換基が存在しないような環状の位置に含む。あるいは、炭水化物は、例えばデオキシ糖質といったその名前が由来する炭水化物に見出されるであろう置換基に欠いている。また、さらなる例示的な非天然糖質は、酸化（例えば、−ｏｎｉｃおよび−ｕｒｏｎｉｃ酸）および還元（糖質アルコール）炭水化物の両方を含む。糖質部分は、モノ−、オリゴ−またはポリ−サッカライドであることが可能である。
【００１４】
本発明においてグリコシルリンク基の構成成分として用いられる例示的な天然糖質としては、グルコース、グルコサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、フコース、マンノース、マンノサミン、キシラノース（ｘｙｌａｎｏｓｅ）、リボース、Ｎ−アセチルグルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、およびシアル酸が挙げられる。
【００１５】
一実施形態において、本発明は、部分、
【化３】
2009515508.tif 000005
を含む因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａペプチド複合体を提供し、式中、Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり；Ｇは、ＨおよびＲ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、Ｒ１は、直鎖または分岐ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分であり；およびＬは、例えば結合（「ゼロ次」）、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルといったリンカーである。例示的な実施形態において、ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ１−Ｌ−であり、およびＧが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるときＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。
【００１６】
他の態様において、本発明は、因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａであることが可能であるペプチドを含む因子ＶＩＩまたはＶＩＩａペプチド複合体を提供する。複合体はまたグリコシルリンク基を含み、ここで、グリコシルリンク基は、前記ペプチドのアミノ酸残基に結合されており、および前記グリコシルリンク基は、
【化４】
2009515508.tif 000006
から選択されるメンバーである式を有するシアリルリンク基を含み、
式中、
【化５】
2009515508.tif 000007
は修飾基である。Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ２ＯＲ７、ＣＯＯＲ７、ＣＯＯ−およびＯＲ７から選択されるメンバーである。Ｒ７は、Ｈ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーである。Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、置換または非置換アルキル、ＯＲ８、およびＮＨＣ（Ｏ）Ｒ９から独立して選択されるメンバーである。Ｒ８およびＲ９は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルおよびシアリルから独立して選択される。Ｌａは、結合、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるリンカーである。Ｘ５、Ｒ１６およびＲ１７は、非反応性基および高分子アーム（例えばＰＥＧ）から独立して選択される。Ｘ２およびＸ４は、高分子部分Ｒ１６およびＲ１７をＣに結合する独立して選択されるリンケージ断片である。指数ｊは、１〜１５から選択される整数である。
【００１７】
他の例示的な実施形態において、高分子修飾基は以下の式による構造を有する。
【化６】
2009515508.tif 000008
ここで、指数ｍおよびｎは、０〜５０００から独立して選択される整数である。Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０およびＡ１１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、−ＮＡ１２Ａ１３、−ＯＡ１２および−ＳｉＡ１２Ａ１３から独立して選択されるメンバーである。Ａ１２およびＡ１３は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから独立して選択されるメンバーである。
【００１８】
例示的な実施形態において、高分子修飾基は、以下の式による構造を有する。
【化７】
2009515508.tif 000009
【００１９】
上記式による他の例示的な実施形態において、高分子修飾基は、以下の式による構造を有する。
【化８】
2009515508.tif 000010
例示的な実施形態において、Ａ１およびＡ２は、各々、−ＯＨおよび−ＯＣＨ３から選択されるメンバーである。
【００２０】
この実施形態による例示的な高分子修飾基は、
【化９】
2009515508.tif 000011
を含む。
【００２１】
本発明は、因子ＶＩＩおよび因子ＶＩＩａから選択されるメンバーであるペプチドを含む因子ＶＩＩまたはＶＩＩａペプチド複合体を提供する。複合体はまたグリコシルリンク基を含み、ここで、グリコシルリンク基は、ペプチドのアミノ酸残基に結合されており、および、グリコシルリンク基は、式、
【化１０】
2009515508.tif 000012
を有するシアリルリンク基を含み、
式中、
【化１１】
2009515508.tif 000013
は修飾基である。指数ｓは、１〜２０から選択される整数である。指数ｆは、１〜２５００から選択される整数である。Ｑは、Ｈおよび置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルから選択されるメンバーである。
【００２２】
例示的な実施形態において、本発明は、以下の式を有する修飾糖質を提供する。
【化１２】
2009515508.tif 000014
【００２３】
本発明は、例えば、因子ＶＩＩおよび因子ＶＩＩａといった因子ＶＩＩペプチドの複合体を形成する方法を提供する。本方法は、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを、糖質に共有結合した修飾基を有する修飾糖質ドナーと接触させるステップを含む。修飾糖質部分は、ドナーから、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に、酵素の作用により転移される。代表的な酵素としては、これに限定されないが、グリコシルトランスフェラーゼ、例えばシアリルトランスフェラーゼが挙げられる。本方法は、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを、ａ）修飾糖質ドナーと、ｂ）修飾糖質部分を修飾糖質ドナーからペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に転移させることが可能である酵素とを、修飾糖質部分を、ドナーからペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に転移させる適切な条件下で接触させ、これにより前記因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を合成するステップを含む。
【００２４】
好ましい実施形態において、ステップａ）の前に、ペプチドはシアリダーゼと接触され、これにより、ペプチド上のシアル酸の少なくとも一部を除去する。
【００２５】
他の好ましい実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドは、シアリダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾糖質ドナーと接触される。この実施形態において、ペプチドは、シアリダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾糖質ドナーと、基本的に同時に、種々の構成成分の添加の順番に関係なく接触される。反応は、シアル酸残基をペプチドから除去するためにシアリダーゼについて適切な条件下で；および修飾糖質部分を修飾糖質ドナーからペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に転移させるために、グリコシルトランスフェラーゼについて適切な条件下で実施される。
【００２６】
他の好ましい実施形態において、脱シアル化および複合化は、同一の容器内で実施され、および脱シアル化ペプチドは、好ましくは複合化ステップの前に精製されない。他の例示的な実施形態において、本方法は、ペプチド複合体のシアル化を含む「キャッピング」ステップをさらに含む。このステップは、シアリダーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよび修飾糖質ドナーを含有する同一反応容器内で事前の精製無しで実施される。
【００２７】
他の好ましい実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの脱シアル化が実施され、およびアシアロペプチドが精製される。精製されたアシアロペプチドが、次いで、複合化反応条件に供される。他の例示的な実施形態において、本方法は、ペプチド複合体のシアル化を含む「キャッピング」ステップをさらに含む。このステップは、シアリダーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよび修飾糖質ドナーを含有する同一反応容器内で事前の精製無しで実施される。
【００２８】
他の例示的な実施形態において、キャッピングステップ、ペプチド複合体のシアル化は、シアリダーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよび修飾糖質ドナーを含有する同一反応容器内で、事前の精製無しで実施される。
【００２９】
例示的な実施形態において、接触ステップは、２０時間未満、好ましくは１６時間未満、より好ましくは１２時間未満、さらにより好ましくは８時間未満、およびなおより好ましくは４時間未満の時間である。
【００３０】
さらなる態様において、本発明は、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体反応混合物を提供する。反応混合物は、ａ）シアリダーゼ、ｂ）グリコシルトランスフェラーゼ、エキソグリコシダーゼおよびエンドグリコシダーゼから選択されるメンバーである酵素、ｃ）修飾糖質；およびｄ）因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを含む。
【００３１】
他の例示的な実施形態において、シアリダーゼ対因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの比は、０．１Ｕ／Ｌ：２ｍｇ／ｍＬ〜１０Ｕ／Ｌ：１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．５Ｕ／Ｌ：２ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１．０Ｕ／Ｌ：２ｍｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは１０Ｕ／Ｌ：２ｍｇ／ｍＬ、なおより好ましくは０．１Ｕ／Ｌ：１ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．５Ｕ／Ｌ：１ｍｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは１．０Ｕ／Ｌ：１ｍｇ／ｍＬ、およびなおより好ましくは１０Ｕ／Ｌ：１ｍｇ／ｍＬから選択される。
【００３２】
例示的な実施形態において、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％の前記因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体が、最大で２つのＰＥＧ部分を含む。ＰＥＧ部分は、ワンポットプロセスで付加されることが可能であり、またはこれらは、アシアロ因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａが精製された後に付加されることが可能である。
【００３３】
他の例示的な実施形態において、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％の因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体が、最大で１つのＰＥＧ部分を含む。ＰＥＧ部分は、ワンポットプロセスで付加されることが可能であり、またはこれは、アシアロ因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａが精製された後に付加されることが可能である。
【００３４】
さらなる例示的な実施形態において、本方法は、「キャッピング」、またはシアル酸をペプチド複合体に付加するステップをさらに含む。他の例示的な実施形態において、シアリダーゼは、３０分、１時間、１．５時間、または２時間遅れで添加され、その後、グリコシルトランスフェラーゼ、エキソグリコシダーゼ、またはエンドグリコシダーゼが添加される。
【００３５】
他の例示的な実施形態において、シアリダーゼは、３０分、１時間、１．５時間、または２時間遅れで添加され、その後、グリコシルトランスフェラーゼ、エキソグリコシダーゼ、またはエンドグリコシダーゼが添加される。本発明の他の目的および利点は、以下の詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。
【００３６】
他の例示的な実施形態において、本方法は：（ａ）
【化１３】
2009515508.tif 000015
から選択されるグリコシル基を含む因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを、
式、
【化１４】
2009515508.tif 000016
を有する修飾糖質と、
グリコシルリンク基を、前記グリコシル基のＧａｌＮＡｃ、ＧａｌおよびＳｉａから選択されるメンバーへ転移させる適切なトランスフェラーゼとに、前記転移に適切な条件で接触させるステップを含む。例示的な修飾糖質は、リンカー部分を介して、例えば直鎖または分岐ポリ（エチレングリコール）部分といったポリマーで修飾されたＣＭＰ−シアル酸である。
【００３７】
ペプチドは、基本的にいずれかのソースから得ることが可能であるが、しかしながら、一実施形態において、上述のとおり修飾される前に、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドが好適な宿主において発現される。哺乳類（例えば、ＢＨＫ、ＣＨＯ）、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））および昆虫細胞（例えば、Ｓｆ−９）は、本願明細書に記載の組成物および方法において用いられる因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａを提供する例示的な発現系である。
【００３８】
例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体は、虚血、外傷、炎症、または有害物質との接触などの組織外傷の処置のために、患者に投与され得る。他の例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体は、血友病Ａを有する患者、血友病Ｂの患者、因子ＶＩＩＩに対する抗体をも有する血友病Ａを有する患者、因子ＩＸに対する抗体をも有する血友病Ｂを有する患者、および肝硬変を有する患者の処置のために患者に投与され得る。
【００３９】
他の例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体は、救急での出血、待機的手術、心臓外科手術、脊髄手術、肝臓移植、部分肝切除、骨盤寛骨臼骨折再構築、および同種幹細胞移植処置のために患者に投与され得、他の例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体は、急性脳内出血、外傷性脳外傷、静脈瘤出血および上部胃腸管系の出血の処置のために患者に投与され得る。
【００４０】
他の態様において、本発明は、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬品配合物を提供する。
【００４１】
因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体において、基本的に、グリコシルリンク基または修飾基が結合したアミノ酸残基の各々は同一の構造を有する。例えば、一つのペプチドが、Ｔｈｒがリンクしたグリコシル残基を含む場合、固体群中の少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、９９．２％、９９．４％、９９．６％、またはより好ましくは９９．８％のペプチドが、同一のＴｈｒ残基に共有結合的に結合した同一のグリコシルリンク基を有するであろう。
【００４２】
本発明の他の目的および利点は、以下の詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
発明の詳細な説明および好ましい実施形態
略語
ＰＥＧ、ポリ（エチレングリコール）；ＰＰＧ、ポリ（プロピレングリコール）；Ａｒａ、アラビノシル；Ｆｒｕ、フルクトシル；Ｆｕｃ、フコシル；Ｇａｌ、ガラクトシル；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミニル；Ｇｌｃ、グルコシル；ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミニル；Ｍａｎ、マンノシル；ＭａｎＡｃ、マンノサミニルアセテート；Ｘｙｌ、キシロシル；ＮｅｕＡｃ、シアリルまたはＮ−アセチルノイラミニル；Ｓｉａ、シアリルまたはＮ−アセチルノイラミニル；およびこれらの誘導体および類似体。
【００４４】
定義
他に定義されていない限りにおいて、本願明細書で用いたすべての技術的および科学的用語は、一般に、本発明が属する当該技術分野の当業者によって通常理解されている同一の意味を有する。一般的には、細胞培養、分子遺伝学、有機化学および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションにおいて、本願明細書において用いた命名および実験用手法は、技術分野において周知であると共に、普通用いられているものである。標準的な技術が核酸およびペプチド合成について用いられる。技術および手法は、一般的には、技術分野および、本明細書の全体を通して提供されている種々の一般的な文献における従来の方法に従って実施される（一般的には、本願明細書において参照により援用される、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ」、第２版（１９８９年）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）を参照のこと）。本願明細書に用いられる命名ならびに、以下に記載の分析化学および有機合成において用いられる実験用手法は、技術分野において周知であると共に、普通用いられているものである。標準的な技術、またはそれらの改良は、化学合成および化学分析について用いられている。
【００４５】
本願明細書に記載のすべてのオリゴ糖は、非還元サッカライド（すなわちＧａｌ）についての名称または略記、続いて、グリコシド結合（αまたはβ）、環結合（１または２）の構成、結合に関与する還元サッカライドの環位置（２、３、４、６または８）、および次いで還元サッカライド（すなわち、ＧｌｃＮＡｃ）の名称または略記で記載されている。各サッカライドは、好ましくはピラノースである。標準的な糖鎖生物学命名の概説については、「Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ」ヴァルキ（Ｖａｒｋｉ）ら編、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９年）を参照のこと。
【００４６】
オリゴ糖は、還元末端でのサッカライドが実際に還元糖質であるか否かに関わらず、還元末端および非還元末端を有すると見なされる。受け入れられている命名に従って、オリゴ糖は、本願明細書においては、左側の非還元末端および右側の還元末端と共に表す。
【００４７】
用語「シアル酸」または「シアリル」は、９−炭素カルボキシル化糖質のファミリーのいずれかのメンバーを指す。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノース（ｇａｌａｃｔｏｎｏｎｕｌｏｐｙｒａｎｏｓ）−１−オン酸（度々、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡとして略記される）である。ファミリーの第２のメンバーは、Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）であり、ここで、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基はヒドロキシル化されている。第３のシアル酸ファミリーメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）である（ナダノ（Ｎａｄａｎｏ）ら、（１９８６年）「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６１：第１１５５０〜１１５５７ページ；カナモリ（Ｋａｎａｍｏｒｉ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６５：第２１８１１〜２１８１９ページ（１９９０年））。９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃなどの９−置換シアル酸もまた含まれる。シアル酸ファミリーの概説については、例えば、ヴァルキ（Ｖａｒｋｉ）、「Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ２」：第２５〜４０ページ（１９９２年）；Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｒ．シャウアー（Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ）編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−  Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９９２年））を参照のこと。シアル化手法におけるシアル酸化合物の合成および使用は、１９９２年１０月１日公開の国際公開第９２／１６６４０号パンフレットに開示されている。
【００４８】
「ペプチド」は、モノマーがアミノ酸であると共に、アミド結合を介して一緒に結合されているポリマーを指し、あるいは、ポリペプチドとして称される。さらに、非天然アミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンがまた含まれる。遺伝子コード化されていないアミノ酸もまた本発明において用いられ得る。しかも、反応性基、グリコシル化部分、ポリマー、治療的部分、生体分子等を含むよう修飾されたアミノ酸もまた、本発明において用いられ得る。本発明において用いられるアミノ酸のすべては、Ｄ−またはＬ−異性体のいずれかである。Ｌ−異性体が一般的には好ましい。さらに、他のペプチド模倣薬もまた本発明において有用である。本願明細書において用いられるところ、「ペプチド」は、グリコシル化および未グリコシル化ペプチドの両方を指す。ペプチドを発現する系により不完全にグリコシル化されたペプチドもまた含まれている。一般的な概説については、スパトラＡ．Ｆ．（Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．）、「ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ，ＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ」、Ｂ．バインスタイン（Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、第２６７ページ（１９８３年）を参照のこと。本発明のペプチドのいくつかのリストが図１３に提供されている。
【００４９】
用語「ペプチド複合体」は、ペプチドが本願明細書に記載の修飾糖質と複合化された本発明の種を指す。
【００５０】
用語「アミノ酸」は、天然に生じるアミノ酸と同様に機能する、天然に生じるおよび合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣薬を指す。天然のアミノ酸は、遺伝コードによってコードされたもの、ならびに後に、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンで修飾されるアミノ酸によってコード化されるものである。アミノ酸類似体は、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム塩といった、天然に生じるアミノ酸と同一の基本的な化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合しているα炭素を有する化合物を指す。このような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド主鎖を有するが、天然に生じるアミノ酸と同一の基本的な化学構造を保持する。アミノ酸模倣薬は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然に生じるアミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。
【００５１】
本願明細書において用いられるところ、用語「修飾糖質」、または「修飾糖質残基」は、本発明のプロセスにおいてペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に酵素的に付加される天然に−または非天然に生じる炭水化物を指す。修飾糖質は、特にこれに限定されないが、糖質ヌクレオチド（モノ−、ジ−、およびトリ−リン酸塩）、活性糖質（例えば、ハロゲン化グリコシル、グリコシルメシレート）および活性糖質でもヌクレオチドでもない糖質を含む酵素基質から選択される。「修飾糖質」は、「修飾基」で共有結合的に官能基化されている。有用な修飾基としては、これに限定されないが、ＰＥＧ部分、治療的部分、診断上の部分、生体分子等が挙げられる。修飾基は、好ましくは天然に生じる、または未修飾炭水化物ではない。修飾基での官能化の部分は、「修飾糖質」が酵素的にペプチドに付加されることを防止しないよう選択される。
【００５２】
用語「水溶性」は、いくらかの検出可能な程度の溶解度を水中に有する部分を指す。水への溶解度を検出するおよび／または定量化する本方法は、技術分野において周知である。例示的な水溶性ポリマーとしては、ペプチド、サッカライド、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）等が挙げられる。ペプチドは、例えばポリ（リシン）の単一アミノ酸から構成される混合配列を有することが可能である。例示的な多糖はポリ（シアル酸）である。例示的なポリ（エーテル）はポリ（エチレングリコール）である。ポリ（エチレンイミン）は例示的なポリアミンであり、およびポリ（アクリル）酸は代表的なポリ（カルボン酸）である。
【００５３】
水溶性ポリマーのポリマー主鎖は、ポリ（エチレングリコール）（すなわちＰＥＧ）であることが可能である。しかしながら、他の関連するポリマーもまた、本発明の実施において用いるために好適であると共に、用語ＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）の使用は包括的であり、およびこの観点において排他的ではないことが意図されることが、理解されるべきである。用語ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）をそのいずれの形態においても含み、アルコキシＰＥＧ、二官能性ＰＥＧ、マルチアーム化ＰＥＧ、フォーク化ＰＥＧ、分岐ＰＥＧ、ペンダントＰＥＧ（すなわち、ポリマー主鎖に対し側基である一つ以上の官能基を有するＰＥＧまたは関連ポリマー）、または内部に分解性リンケージを有するＰＥＧが挙げられる。
【００５４】
ポリマー主鎖は直鎖または分岐であることが可能である。分岐ポリマー主鎖は、一般的には技術分野において公知である。典型的には、分岐ポリマーは、中央分岐コア部分および中央分岐コアにリンクされた複数の直鎖状ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは、普通、エチレンオキシドの、グリセロール、ペンタエリスリトールおよびソルビトールなどの種々のポリオールへの添加により調製されることが可能である分岐形態で用いられる。中央分岐部分はまた、リシンなどの数々のアミノ酸から誘導されることが可能である。分岐ポリ（エチレングリコール）は、一般にはＲ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍとしての形態で表されることが可能であり、ここで、Ｒは、グリセロールまたはペンタエリスリトールコア部分を表し、およびｍはアームの数を表す。その全体が本願明細書において参照により援用される米国特許第５，９３２，４６２号明細書において記載されているものなどのマルチアーム化ＰＥＧ分子もまたポリマー主鎖として用いることが可能である。
【００５５】
多くの他のポリマーもまた本発明のために好適である。結合について約２〜約３００部分内の非ペプチド性および水溶性であるポリマー主鎖が本発明において特に有用である。好適なポリマーの例としては、これに限定されないが、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールとプロピレングリコール等とのコポリマーなどの他のポリ（アルキレングリコール）；ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン系アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、その全体が本願明細書において参照により援用される米国特許第５，６２９，３８４号明細書に記載のものなど、ならびにこれらのコポリマー、ターポリマー、および混合物が挙げられる。ポリマー主鎖の各鎖の分子量は異なることが可能であるが、典型的には、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ、度々約６，０００Ｄａ〜約８０，０００Ｄａの範囲内である。
【００５６】
患者へのペプチド薬物の投与のコンテクストにおいて本願明細書において用いられるところ、「曲線下の面積」または「ＡＵＣ」は、ゼロから無限への時間の関数としての、患者の全身的な循環系における薬物の濃度を表す、曲線下の総面積として定義される。
【００５７】
用語「半減期」または「ｔ１／２」は、患者へのペプチド薬物の投与のコンテクストにおいて本願明細書において用いられるところ、患者における薬物のプラズマ濃度が半分に低減されるまでに必要とされる時間として定義される。複数のクリアランスメカニズム、再分布、および技術分野において周知である他のメカニズムに応じて、２つ以上の半減期が、ペプチド薬物に関連してあり得る。通常は、αおよびβ半減期は、α相は再分布に関連し、およびβ相はクリアランスに関連するよう定義される。しかしながら、大部分で血流に限定されるタンパク質薬では、少なくとも２つのクリアランス半減期があることが可能である。いくつかのグリコシル化ペプチドについて、急速β相クリアランスは、マクロファージ上の受容体、または末端ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコースアミン、マンノース、またはフコースを認識する内皮細胞を介して媒介され得る。より遅いβ相クリアランスは、＜２ｎｍ（およそ６８ｋＤ）の有効半径での分子についての腎性糸球体ろ過および／または組織における特定のまたは非特定の摂取および新陳代謝を介して生じ得る。グリコＰＥＧ化は、末端糖質（例えば、ガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミン）をキャップし得、およびこれにより、これらの糖質を認識する受容体を介する急速α相クリアランスをブロックする。より大きな有効半径がまた与えられ得、およびこれにより分布および組織摂取の量を低減させ、これにより遅いβ相を延ばす。それ故、グリコＰＥＧ化のα相およびβ相半減期に対する正確な影響は、技術分野において周知のように、サイズ、グリコシル化の状態、および他のパラメータに応じて異なり得る。「半減期」のさらなる説明は、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（１９９７年、ＤＦＡクロメリン（ＤＦＡ  Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ）およびＲＤシンデラー（ＲＤ  Ｓｉｎｄｅｌａｒ）編、Ｈａｒｗｏｏｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、アムステルダム（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）、第１０１〜１２０ページ）に見出される。
【００５８】
本願明細書において用いられるところ、用語「グリコ複合化」は、修飾糖質種の、例えば、本発明のＧ−ＣＳＦペプチドといった、ポリペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基への酵素的に媒介された複合化を指す。「グリコ複合化」の亜属は、修飾糖質の修飾基がポリ（エチレングリコール）、およびそのアルキル誘導体（例えば、ｍ−ＰＥＧ）または反応性誘導体（例えば、Ｈ２Ｎ−ＰＥＧ、ＨＯＯＣ−ＰＥＧ）である「グリコ−ＰＥＧ化」である。
【００５９】
用語「大規模」および「工業規模」は、同義に用いられ、少なくとも約２５０ｍｇ、好ましくは少なくとも約５００ｍｇ、およびより好ましくは少なくとも約１グラムの複合糖質を単一の反応サイクルの完了後に生成する反応サイクルを指す。
【００６０】
本願明細書において用いられるところ、用語「グリコシルリンク基」は、修飾基（例えば、ＰＥＧ部分、治療的部分、生体分子）が、共有結合しているグリコシル残基を指し；グリコシルリンク基は、修飾基を残りの複合体に結合する。本発明の方法において、「グリコシルリンク基」は、グリコシル化または未グリコシル化ペプチドに共有結合されることになり、これにより薬剤を、ペプチド上のアミノ酸および／またはグリコシル残基にリンクする。「グリコシルリンク基」は、一般的には、「修飾糖質」から、「修飾糖質」のペプチドのアミノ酸および／またはグリコシル残基への酵素的結合により有する同される。グリコシルリンク基は、修飾基−修飾糖質カセット（例えば、酸化→シッフ塩基形成→還元）の形成中に分解されるサッカライド−由来構造であることが可能であり、またはグリコシルリンク基は無処置であり得る。「無処置グリコシルリンク基」は、修飾基と残りの複合体をリンクするサッカライドモノマーが、例えばナトリウムメタ過ヨウ素酸により分解（例えば酸化）されない、グリコシル部分から誘導されるリンク基を指す。本発明の「無処置グリコシルリンク基」は、グリコシル単位の付加または一つ以上のグリコシル単位の親サッカライド構造からの除去により、天然に生じるオリゴ糖から誘導され得る。
【００６１】
本願明細書において用いられるところ、用語「非グリコシド修飾基」は、グリコシルリンク基に直接的にリンクされた天然に生じる糖質を含まない修飾基を指す。
【００６２】
本願明細書において用いられるところ、用語「標的指向化部分」は、身体の特定の組織または領域で、選択的に局在化されることとなる種を指す。局在化は、分子決定要因の特定、標的指向化剤または複合体の分子サイズ、イオン性相互作用、疎水性相互作用等の認識によって媒介される。薬剤を特定の組織または領域に標的化させる他のメカニズムが当業者に公知である。例示的な標的指向化部分としては、抗体、抗体断片、トランスフェリン、ＨＳ−糖タンパク質、凝塊因子、血清タンパク質、β−糖タンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ等が挙げられる。
【００６３】
本願明細書において用いられるところ、「治療的部分」とは、特にこれに限定されないが、抗生物質、抗炎症性剤、抗腫瘍薬、細胞毒、および放射性剤を含む、治療について有用であるいずれかの薬剤を意味する。「治療的部分」は、生理活性剤、２つ以上の治療的部分がキャリアに結合している構成物、例えば、多価剤のプロドラッグを含む。治療的部分はまた、タンパク質およびタンパク質を含む構成物を含む。例示的なタンパク質としては、これに限定されないが、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−β、−γ）、インターロイキン（例えば、インターロイキンＩＩ）、血清タンパク質（例えば、因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、およびＸ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）および抗体融合タンパク質（例えば腫瘍壊死因子受容体（（ＴＮＦＲ）／Ｆｃドメイン融合タンパク質））が挙げられる。
【００６４】
本願明細書において用いられるところ、「薬学的に許容可能なキャリア」は、複合体と組み合わされたときにおいて複合体の活性を保持すると共に、対象の免疫系と非反応性であるいずれかの材料を含む。例としては、これに限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および種々のタイプの湿潤剤などの標準的な医薬品キャリアのいずれかが挙げられる。他のキャリアはまた、無菌溶液、コート錠剤およびカプセルを含む錠剤を含み得る。典型的にはこのようなキャリアは、スターチ、乳剤、糖質、一定のタイプのクレイ、膠、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム、タルク、植物脂肪または油、ガム、グリコール、または他の公知の賦形物などの賦形物を含有する。このようなキャリアはまた、香料および着色添加剤または他の要素を含み得る。このようなキャリアを含む組成物は、周知の従来の方法によって配合される。
【００６５】
本願明細書において用いられるところ、「投与する」とは、対象への、経口投与、座薬としての投与、局所的接触、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内、鼻腔内または皮下投与、または例えばミニ浸透圧ポンプといった徐放デバイスの移植を意味する。投与は、非経口的、および経粘膜（例えば、経口、鼻の、膣の、肛門直腸の、または経皮的）を含むいずれかの経路による。非経口的投与としては、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、心室内、および頭蓋内が挙げられる。しかも、注射が、腫瘍の、例えばアポトーシスを含む治療である場合、腫瘍に直接的におよび／または腫瘍の周囲の組織へ投与し得る。送達の他のモードは、これに限定されないが、リポソーム配合物、静脈内点滴、経皮パッチ等の使用を含む。
【００６６】
用語「回復する」または「回復」は、寛解、緩解または症状の軽減または患者の物理的または精神的な状態の向上などのいずれかの客観的なまたは主観的なパラメータを含む、病理学の処置における成功のいずれかの証拠または状態を指す。症状の回復は、物理的試験および／または精神医学的評価の結果を含む客観的または主観的パラメータに基づくことが可能である。
【００６７】
用語「治療」は、疾病の症状をまだ経験していないまたは示していないが、疾病に罹りやすい可能性がある動物における疾病または状態の発症の予防（予防的処置）、疾病の阻害（その発達を遅延または停止させる）、症状または疾病の副作用からの軽減の提供（緩和処置を含む）、および疾病の軽減（疾病を退縮させる）を含む、疾病または状態を「処置すること」またはその「処置」を指す。
【００６８】
用語「有効量」または「有効な量」または「治療的に有効量」またはいずれかの文法的に同等の用語は、動物に疾病を処置するために投与されたときに、その疾病のための処置を有効とするに十分な量を意味する。
【００６９】
用語「単離された」とは、材料の生成に用いられる構成成分を実質的にまたは基本的に含まない材料を指す。本発明のペプチド複合体について、用語「単離された」とは、ペプチド複合体の調製に用いられる混合物における材料を通常伴う構成成分を実質的にまたは基本的に含まない材料を指す。「単離された」および「純粋な」は同義的に用いられる。典型的には、単離された本発明のペプチド複合体は、好ましくは範囲として表記される純度レベルを有する。ペプチド複合体についての純度の範囲の下限は、約６０％、約７０％または約８０％および純度の範囲の上限は約７０％、約８０％、約９０％または約９０％超である。
【００７０】
ペプチド複合体が約９０％を超えて純粋である場合、それらの純度はまた、好ましくは、範囲として表記される。純度の範囲の下限は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。純度の範囲の上限は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％純度である。
【００７１】
純度は、いずれかの技術分野において認識された分析方法により測定される（例えば、銀染色ゲルでのバンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、または同様の手段）。
【００７２】
本願明細書において用いられるところ、「基本的に固体群の各メンバー」は、ペプチドに付加された選択された割合の修飾糖質が、ペプチド上の複数の、同等の受容体部位に付加された本発明のペプチド複合体の固体群の特徴を表す。「基本的に固体群の各メンバー」とは、修飾糖質に複合化されたペプチド上の部位の「均質性」を表し、および、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％およびより好ましくは少なくとも約９５％均質である本発明の複合体を指す。
【００７３】
「均質性」は、修飾糖質が複合化される、受容体部分の固体群の全体にわたる構造的一貫性を指す。それ故、他のすべての修飾糖質が複合化された受容体部位と同一の構造を有する受容体部位に各修飾糖質部分が複合化された本発明のペプチド複合体において、ペプチド複合体は、約１００％均質であると言う。均質性は、典型的には、範囲として表記される。ペプチド複合体についての均質性の範囲の下限は約６０％、約７０％または約８０％であり、および純度の範囲の上限は、約７０％、約８０％、約９０％または約９０％超である。
【００７４】
ペプチド複合体が約９０％以上均質である場合、それらの均質性はまた、好ましくは範囲として表記される。均質性の範囲の下限は約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。純度の範囲の上限は約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％均質性である。ペプチド複合体の純度は、典型的には当業者に公知である一種以上の方法、例えば、液体クロマトグラフィー−質量分光測定（ＬＣ−ＭＳ）、マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析器（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）、毛管電気泳動等により測定される。
【００７５】
「実質的に均一なグリコフォーム」または「実質的に均一なグリコシル化パターン」は、グリコペプチド種に言及する場合、関心のあるグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、フコシルトランスフェラーゼ）によってグリコシル化された受容体部分の割合を指す。例えば、α１，２フコシルトランスフェラーゼの場合、実質的にすべての（以下に定義されたとおり）Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒおよびそのシアル化類似体が本発明のペプチド複合体においてフコシル化されていると、実質的に均一なフコシル化パターンが存在する。本願明細書に記載のフコシル化構造において、Ｆｕｃ−ＧｌｃＮＡｃリンケージは、一般的にはα１，６またはα１，３であり、α１，６が一般的には好ましい。出発材料は、グリコシル化受容体部分（例えば、フコシル化Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ部分）を含有し得ることが当業者によって理解されるであろう。それ故、算出されるグリコシル化割合は、本発明の方法によりグリコシル化された受容体部分、ならびに出発材料においてすでにグリコシル化されている受容体部分を含むであろう。
【００７６】
「実質的に均一な」の上記の定義における、用語「実質的に」は、一般的には、特定のグリコシルトランスフェラーゼついての、少なくとも約４０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、またはより好ましくは少なくとも約９０％、およびなおより好ましくは少なくとも約９５％の受容体部分がグリコシル化されていることを意味する。
【００７７】
置換基が、左から右に向かって記載されるそれらの従来の化学式により特定される場合、これらは、同様に、構造を右から左に記載してもたらされるであろう化学的に同等の置換基を包含し、例えば−ＣＨ２Ｏ−はまた−ＯＣＨ２−を表すことを意図する。
【００７８】
用語「アルキル」は、単独でまたは他の置換基の一部として、他に明記されていない限りにおいて、完全飽和、モノ−または多価不飽和であり得、およびジ−および多価ラジカルを含むことが可能であり、指定の数の炭素原子を有する（すなわちＣ１〜Ｃ１０は１〜１０個の炭素を意味する）、直鎖または分岐鎖、または環状炭化水素ラジカル、またはこれらの組み合わせを意味する。飽和炭化水素ラジカルの例としては、これに限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル；例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル等の同族体および異性体などの基が挙げられる。不飽和アルキル基は、一つ以上の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例としては、これに限定されないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、および高級同族体および異性体が挙げられる。用語「アルキル」はまた、特に記載のない限り、「ヘテロアルキル」などの以下により詳細に定義されるアルキルの誘導体を含むことを意味する。炭化水素基に限定されるアルキル基は「ホモアルキル」と称される。
【００７９】
用語「アルキレン」は、単独でまたは他の置換基の一部として、アルカン由来の二価ラジカルを意味し、制限されないが、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−により例示され、および「ヘテロアルキレン」として以下に記載の基のものをさらに含む。典型的には、アルキル（またはアルキレン）基は、１〜２４個の炭素原子を有し、１０個以下の炭素原子を有する基が本発明において好ましいであろう。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、短鎖のアルキルまたはアルキレン基であり、一般的には８個以下の炭素原子を有する。
【００８０】
用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）は、それらの従来の意味で用いられ、および分子の残りに、それぞれ、酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介して結合されたアルキル基を指す。
【００８１】
用語「ヘテロアルキル」は、単独でまたは他の用語と組み合わされて、他に明記されていない限りにおいて、明記された数の炭素原子から構成され、およびＯ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子から構成される、安定な直鎖または分岐鎖、または環状炭化水素ラジカル、またはこれらの組み合わせを意味し、ここで、窒素および硫黄原子は、任意により酸化されていてもよく、および窒素ヘテロ原子は任意により四級化されていてもよい。ヘテロ原子Ｏ、ＮおよびＳおよびＳｉは、ヘテロアルキル基のいずれかの内部分置またはアルキル基が分子の残りに結合している位置に位置され得る。例としては、これに限定されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２，−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられる。例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３などのように２つ以下のヘテロ原子が連続していてもよい。同様に、用語「ヘテロアルキレン」は、単独でまたは他の置換基の一部として、ヘテロアルキル由来の二価ラジカルを意味し、制限されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−として例示される。ヘテロアルキレン基について、ヘテロ原子はまた、鎖終端（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ等）のいずれかまたは両方を占有することが可能である。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレンリンク基について、リンク基の向きは、リンク基の式が記載されている方向によっては意味されない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−および−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の両方を表す。
【００８２】
用語「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、それら自体で、または他の用語と組み合わせて、他に明記されていない限りにおいて、「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状版を、それぞれ表す。さらに、ヘテロシクロアルキルについて、ヘテロ原子は、複素環が分子の残りに結合する位置を占有することが可能である。シクロアルキルの例としては、これに限定されないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチル等が挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては、これに限定されないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル等が挙げられる。
【００８３】
用語「ハロ」または「ハロゲン」は、それら自体でまたは他の置換基の一部として、他に明記されていない限りにおいて、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むことを意味する。例えば、用語「ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル」は、制限されないが、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピル等を含むことを意味する。
【００８４】
用語「アリール」は、他に明記されていない限りにおいて、単環または一緒に縮合されたまたは共有結合された多環（好ましくは１〜３環）であることが可能である多価不飽和、芳香族、置換基を意味する。用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択されるヘテロ原子を１〜４個含有するアリール基（または環）を指し、ここで、窒素および硫黄原子は、任意により酸化され、および窒素原子が任意により四級化される。ヘテロアリール基は、分子の残りとヘテロ原子を介して結合されていることが可能である。アリールおよびヘテロアリール基の非限定的な例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、テトラゾリル、ベンゾ［ｂ］フラニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル、ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルおよび６−キノリルが挙げられる。上記のアリールおよびヘテロアリール環系の各々についての置換基は、以下に記載の許容可能な置換基の群から選択される。
【００８５】
簡潔さのために、用語「アリール」は、他の用語と組み合わせて用いられる場合（例えば、アリーロキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）、上記に定義したアリールおよびヘテロアリール環の両方を含む。それ故、用語「アリールアルキル」は、例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピル等、炭素原子が（例えば、メチレン基）例えば、酸素原子により置き換えられたアルキル基を含むアルキル基にアリール基が結合しているラジカル（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチル等）を含むことを意味している。
【００８６】
上記の用語の各々（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）は、置換および非置換の両方の形態の指摘のラジカルを含むことを意味する。ラジカルの各タイプについての好ましい置換基が以下に記載されている。
【００８７】
アルキルおよびヘテロアルキルラジカルについての置換基（度々、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルとして称される基のものを含む）は、一般に、「アルキル基置換基」として称され、およびこれらは、特にこれに限定されないが、：ゼロから（２ｍ’＋１）の範囲の数（ここで、ｍ’はこのようなラジカルにおける炭素原子の総数である）での、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２から選択される多様な基の一種以上であることが可能である。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、各々、好ましくは、独立して、水素、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、例えば、１〜３個のハロゲンで置換されたアリール、置換または非置換アルキル、アルコキシまたはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。例えば本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含む場合、Ｒ基の各々は、２つ以上のこれらの基が存在する場合、各々Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基であるとして独立して選択される。Ｒ’およびＲ’’が同一の窒素原子に結合されている場合、これらは、窒素原子と組み合わされて、５−、６−、または７−員環を形成することが可能である。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、制限されないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むことを意図する。置換基の上記の考察から、当業者は、用語「アルキル」は、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３等）などの水素基以外の基に結合された炭素原子を含む基を含むことを意味していることを理解するであろう。
【００８８】
アルキルラジカルについて記載した置換基と同様に、アリールおよびヘテロアリール基についての置換基は、一般に、「アリール基置換基」として称される。置換基は、例えば：ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（ＰＨ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから、ゼロから芳香族環系上の空原子価の総数までの範囲の数で選択され、ここで、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、好ましくは、水素、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから独立して選択される。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基の各々は、２つ以上のこれらの基が存在する場合、各々Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基として独立して選択される。以下のスキームにおいて、符号Ｘは上記の「Ｒ」を表す。
【００８９】
アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の２つは、任意により、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｕ−Ｕ−の置換基で置き換えられ得、式中、ＴおよびＵは、独立して−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−または単結合であり、およびｕは、０〜３の整数である。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の２つは、任意により、式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−の置換基で置き換えられ得、ここで、ＡおよびＢは、独立して−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合であり、およびｒは１〜４の整数である。このように形成された新しい環の単結合の１つは、任意により、二重結合で置き換えられ得る。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子の置換基の２つは、任意により、式−（ＣＲＲ’）ｚ−Ｘ−（ＣＲ’’Ｒ’’’）ｄ−の置換基で置き換えられ得、ここで、ｚおよびｄは、独立して、０〜３の整数であり、およびＸは−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、好ましくは、水素または置換または非置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから独立して選択される。
【００９０】
本願明細書において用いられるところ、用語「ヘテロ原子」は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）およびシリコン（Ｓｉ）を含むことを意味する。
【００９１】
本願明細書において用いられるところ、因子ＶＩＩペプチドは、因子ＶＩＩおよび因子ＶＩＩａペプチドの両方を指す。用語は、一般的には、付加、削除、置換および融合タンパク質変異体を含むこれらのペプチドの変異体（ｖａｒｉａｎｔ、ｍｕｔａｎｔ）に言及する。因子ＶＩＩおよび因子ＶＩＩａの両方が用いられる場合、使用は、属「因子ＶＩＩペプチド」の２つの種の例示であることが意図される。
【００９２】
本発明は、本願明細書に記載の化合物に見出される特定の置換基に応じて、比較的無毒な酸または塩基で調製される本発明の化合物の塩を含むことを意味する。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を含有する場合、塩基付加塩は、このような化合物の中性形態を、そのままで、または好適な不活性溶剤中で十分な量の所望の塩基と接触させることにより得ることが可能である。塩基付加塩の例としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、またはマグネシウム塩、または同様の塩が挙げられる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を含有する場合、酸付加塩は、このような化合物の中性形態を、そのままで、または好適な不活性溶剤中で十分な量の所望の酸と接触させることにより得ることが可能である。酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、または亜リン酸等のような無機酸から誘導されるもの、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸等のような比較的無毒な有機酸から誘導される塩が挙げられる。アルギン酸等などのアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツロン酸等のような有機酸の塩（例えば、バージ（Ｂｅｒｇｅ）ら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６６：第１〜１９ページ（１９７７年）を参照のこと）もまた含まれる。本発明の一定の特定の化合物は、塩基性および酸性官能基の両方を含有して、化合物が塩基付加塩または酸付加塩のいずれにも添加されることを許容する。
【００９３】
化合物の中性形態は、好ましくは、塩を塩基または酸と接触させ、および親化合物を従来の方式で分離することにより生成される。化合物の親形態は、種々の塩形態とは、極性溶剤中の溶解度などの一定の物理特性で異なる。
【００９４】
本願明細書において用いられるところ、「塩対イオン」は、その部分の一つが陰性に荷電されている（例えばＣＯＯ−）場合の、本発明の化合物に関連する陽性荷電イオンを指す。塩対イオンの例としては、Ｈ＋、Ｈ３Ｏ＋、アンモニウム、カリウム、カルシウム、リチウム、マグネシウムおよびナトリウムが挙げられる。
【００９５】
本願明細書において用いられるところ、用語「ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ」は、ポリエチレングリコール部分を含むシアル酸に複合化されたシチジン一リン酸分子である。ポリエチレングリコール鎖の長さが特定されていない場合、いずれのＰＥＧ鎖長も可能である（例えば１ＫＤａ、２ＫＤａ、５ＫＤａ、１０ＫＤａ、２０ＫＤａ、３０ＫＤａ、４０ＫＤａ）。例示的なＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧは、スキーム１における化合物５である。
【００９６】
Ｉ．導入
本発明は、因子ＶＩＩのリモデリングおよび修飾方法を包含する。血液凝塊経路は、多くの事象を含む複雑な反応である。この経路における中間事象は因子ＶＩＩであり、組織因子およびカルシウムイオンの存在下で（その因子ＶＩＩａへの活性化で）因子ＸをＸａに転化することにより、血液凝塊の外因性経路に関与する酵素前駆体である。そして、因子Ｘａが、次いで、因子Ｖａ、カルシウムイオンおよびリン脂質の存在下で、プロトロンビンをトロンビンに転化する。因子Ｘの因子Ｘａへの活性化は、内因性および外因性血液凝塊経路の両方によって共有される事象であり、従って、因子ＶＩＩａは、因子ＶＩＩＩ欠乏性の患者または因子ＶＩＩＩの抑制剤を有する患者の処置に用いられることが可能である。因子ＶＩＩａは内因性経路にも関与し得ることを示唆するエビデンスがまたあり、従って、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａの血液凝塊における役割の顕著性および重要性が増加する。
【００９７】
因子ＶＩＩは、不活性な酵素原として血液中を循環する単鎖糖タンパク質である。因子ＶＩＩａの例示的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、図５に挙げられている。因子ＶＩＩのＶＩＩａへの活性化は、因子ＸＩＩａなどの数々の異なるプラズマプロテアーゼにより触媒され得る。因子ＶＩＩの活性化は、因子ＶＩＩペプチド主鎖がアスパラギン１５２で開裂されるときに生じる。活性化生成物、因子ＶＩＩａは、少なくとも１つのジスルフィド結合によって一緒に保持された重鎖および軽鎖を含む糖タンパク質である。さらに、因子ＶＩＩａに転化されることができない修飾因子ＶＩＩ分子が記載されており、およびこれらは、血液凝固、血栓症等の場合などの抗凝塊治療薬として有用である。因子ＶＩＩの血液凝塊経路における重要性、および凝塊の増加したレベルおよび低下したレベルの両方についての処置としてのその使用の重要性を考慮すると、より長い生物学的半減期を有する分子が効力を増加さるという結果となり、および、一般には、野生タイプ因子ＶＩＩにより類似の治療的プロファイルが、健常なヒトにおいて合成されおよび分泌されるため、血液凝塊疾患に対する処置として有益および有用であろう。
【００９８】
因子ＶＩＩは治療的用途について重要でかつ有用な化合物である一方、組み換え型細胞から因子ＶＩＩを産生する本方法は、かなり短い生物学的半減期および至的ではないグリコシル化パターンを有する生成物をもたらし、これは、潜在的に、免疫原性、機能の喪失、同じ効果等を達成するための、より多量での投与およびより頻繁な投与の両方に対する高い必要性をもたらす可能性が高い。
【００９９】
治療的目的のために用いられる組み換え型因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａの効力を向上させるために、本発明は、グリコシル化および未グリコシル化因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの修飾基との複合体を提供する。修飾基は、例えば、ＰＥＧ（ｍ−ＰＥＧ）、ＰＰＧ（ｍ−ＰＰＧ）等、治療的部分、診断上の部分、標的指向化部分等などの高分子修飾基から選択されることが可能である。因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの、例えば、水溶性高分子修飾基での修飾は、組み換え型因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａの患者の循環における安定性および滞留時間を向上させることが可能であり、および／または組み換え型因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａの抗原性を低減させることが可能である。
【０１００】
本発明のペプチド複合体は、修飾糖質のグリコシル化または未グリコシル化ペプチドへの酵素的結合により形成されることが可能である。グリコシル化部分および／または修飾グリコシル基は、修飾基を有する修飾糖質を、ペプチドに、例えばグリコ複合化により複合化する部分を提供する。
【０１０１】
本発明の方法はまた、実質的に均質な誘導体化パターンを有するペプチド複合体およびグリコペプチド複合体を集合させることができる。本発明において用いられる酵素は、一般的には特定のアミノ酸残基、アミノ酸残基の組み合わせ、特定のグリコシル残基、またはペプチドのグリコシル残基の組み合わせについて選択的である。本方法はまた、ペプチド複合体の大規模生産のために実用的である。それ故、本発明の方法は、予め選択された均一な誘導体化パターンを有するペプチド複合体の大規模な調製のための実用的な手段を提供する。本方法は、特にこれに限定されないが、細胞培養細胞（例えば、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌性細胞、イースト菌細胞、または原核細胞）または遺伝子組換え植物または動物における産生中に不完全にグリコシル化されたグリコペプチドを含む治療的ペプチドの修飾に特に良く適している。
【０１０２】
因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体は、ペプチド複合体ならびに薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬品配合物として産生されることが可能である。因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体は、出血エピソードを有する血友病患者、血友病Ａを有する患者、血友病Ｂの患者、血友病Ａを有する患者（ここで、患者はまた因子ＶＩＩＩに対する抗体を有する）、血友病Ｂを有する患者（ここで、患者はまた因子ＩＸに対する抗体を有する）、肝硬変を有する患者、同所性肝臓移植を有する硬変患者、上部胃腸管系の出血を有する硬変患者、骨髄移植を有する患者、肝臓摘出を有する患者、部分肝切除を有する患者、骨盤寛骨臼骨折再構築を経験している患者、急性脳内出血で出血している患者、同種幹細胞移植を経験している患者、外傷性脳外傷で出血している患者、救急で出血している患者、外傷からの出血を有する患者、静脈瘤出血を経験している患者、待機的手術で出血している患者、心臓外科手術で出血している患者、脊髄手術、肝臓摘出で出血している患者からなる群から選択される患者に投与され得る。例示的な実施形態において、患者はヒト患者である。
【０１０３】
本発明はまた、例えば、低減されたクリアランス速度、または低減された免疫系または細網内皮系（ＲＥＳ）による摂取速度により、長期化した治療的半減期を有するグリコシル化および未グリコシル化ペプチドの複合体を提供する。しかも、本発明の方法は、ペプチド上の抗原決定基をマスクする手段を提供し、それ故、ペプチドに対する宿主免疫応答を低減または排除する。標的指向化剤の選択的結合もまた、ペプチドを、特定の組織または、特定の標的指向化剤に特定的である細胞表面受容体に標的化するために用いられることが可能である。
【０１０４】
因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａ複合体の水溶性ポリマーとの調製についての至的条件の判定は、例えば、数多くのパラメータの至的化を含み、これはペプチドおよび水溶性ポリマーの同一性に依存する。例えば、ポリマーがポリ（エチレングリコール）、例えば、分岐ポリ（エチレングリコール）である場合、反応に用いられるポリマーの量およびこのポリマーの存在に起因する反応混合物の粘度の間に釣合いが好ましくは確立され、ポリマーが過度に濃縮されている場合、反応混合物は粘性になり、質量移動および反応速度を低下させる。
【０１０５】
さらに、酵素を過剰に添加することは直感的に明らかであるが、本発明者らは、酵素が過度の過剰量で存在する場合には、過剰な酵素が汚染物となり、その除去が余計な精製ステップおよび材料を必要とし、および最終生成物のコストを無用に増加させることを認識した。
【０１０６】
しかも、一般的には、制御された修飾レベルでペプチドを産生することが所望される。いくつかの事例においては、１種の修飾糖質を選択的に添加することが望ましい。他の場合において、２種の修飾糖質を選択的に添加することが望ましい。それ故、反応条件は、好ましくは、修飾基のペプチドへの複合化の程度を影響するよう制御される。
【０１０７】
本発明は、所望の複合化レベルを有する因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの収率が最大化される条件を提供する。本発明の例示的な実施形態における条件はまた、種々の試薬および材料の費用および生成物を精製するために必要な時間を認識し、本願明細書に記載の反応条件は、高価な試薬の廃棄を最低限としながら、所望の生成物の優れた収率を提供するよう最的化されている。
【０１０８】
ＩＩ．物質／ペプチド複合体の組成物
第１の態様において、本発明は、修飾糖質および因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの複合体を提供する。本発明はまた、修飾基および因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの複合体を提供する。ペプチド複合体は、数々の形態の一つを有することが可能である。例示的な実施形態において、ペプチド複合体は、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドおよびペプチドのアミノ酸にグリコシルリンク基を介してリンクされた修飾基を含むことが可能である。他の例示的な実施形態において、ペプチド複合体は、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドおよびペプチドに属するグリコシルにグリコシルリンク基を介してリンクされた修飾基を含むことが可能である。他の例示的な実施形態において、ペプチド複合体は、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドおよび、グリコペプチド炭水化物および直接的にペプチド主鎖のアミノ酸残基の両方に結合したグリコシルリンク基を含むことが可能である。さらに他の例示的な実施形態において、ペプチド複合体は、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドおよび直接的にペプチドのアミノ酸残基にリンクされた修飾基を含むことが可能である。この実施形態において、ペプチド複合体は、グリコシル基を含み得ない。これらの実施形態のいずれかにおいて、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドは、グリコシル化されていてもいなくてもよい。
【０１０９】
本発明の複合体は、典型的には、一般構造、
【化１５】
2009515508.tif 000017
に関連することとなり、ここで、符号ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｓは、正の、ゼロではない整数を表し、およびｔは０または正の整数の一方である。「薬剤」、または修飾基は、治療剤、生理活性剤、検出可能な標識、水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ｍ−ＰＥＧ、ＰＰＧ、およびｍ−ＰＰＧ）などの高分子修飾基等であることが可能である。「薬剤」、または修飾基は、ペプチド、例えば、酵素、抗体、抗原等であることが可能である。リンカーは、以下のリンク基の広いアレイのいずれかであることが可能である。あるいは、リンカーは単結合または「ゼロ次リンカー」であり得る。
【０１１０】
ＩＩ．Ａ．ペプチド
因子ＶＩＩは、約４０６アミノ酸長であり、およびおよそ５０ＫＤａの分子量を有する単鎖ポリペプチドである。因子ＶＩＩの因子ＶＩＩａへの転化は、因子ＶＩＩペプチド主鎖がアスパラギン１５２で開裂したときに生じる。因子ＶＩＩおよび／または因子ＶＩＩａペプチドは２つのＮ−グリカン部位を含有し、その一方はアスパラギン１４５に位置されており、および他方がアスパラギン３２２に位置されている。アスパラギン１４５でのＮ−グリカン部位は、ＦＶＩＩａの軽鎖上に位置されている一方で、アスパラギン３２２でのＮ−グリカン部位は、ＦＶＩＩａの重鎖上に位置されている。因子ＶＩＩおよび／または因子ＶＩＩａペプチドは、２つのＯ−グリカン部位を含有する。
【０１１１】
因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａをクローン化し、および配列決定した。例示的な実施形態において、因子ＶＩＩａペプチドは配列番号１に示す配列を有する。
【０１１２】
本発明は、本願明細書に記載の因子ＶＩＩ核酸およびアミノ酸配列に限定されると解釈されるべきでは決してない。特性を増加あるいは低下させ、またはペプチドの構造的機構を修飾するために変異化された、他の配列の因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの使用は本発明の範囲内である。例えば、本発明において用いられる変異因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドは、追加のＯ−グリコシル化部分または他の位置のこのような部位を有するものを含む。しかも、一つ以上のＮ−グリコシル化部分を含む変異ペプチドは、本発明において用いられる。因子ＶＩＩの変異体は、例えば、米国特許第４，７８４，９５０号明細書および同第５，５８０，５６０号明細書に記載されており、ここで、リシン−３８、リシン−３２、アルギニン−−２９０、アルギニン−３４１、イソロイシン−４２、チロシン−２７８、およびチロシン−３３２は、多様なアミノ酸で置き換えられている。さらに、米国特許第５，８６１，３７４号明細書、同第６，０３９，９４４号明細書、同第５，８３３，９８２号明細書、同第５，７８８，９６５号明細書、同第６，１８３，７４３号明細書、同第５，９９７，８６４号明細書、および同第５，８１７，７８８号明細書は、開裂して因子ＶＩＩａを形成しない因子ＶＩＩ変異体を記載する。当業者は、血液凝塊経路およびそこにおける因子ＶＩＩの役割は周知であり、および従って、上記の、天然に生じるおよび操作された多くの変異体の両方が、本発明に含まれることを認識するであろう。例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａ活性を有するペプチドは、本願明細書に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％相同的であるアミノ酸配列を有する。好ましくは、アミノ酸配列は、本願明細書に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％相同的である。
【０１１３】
例示的な実施形態において、グリコシルリンク基が結合しているアミノ酸残基は、セリン、スレオニンおよびアスパラギンから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態において、ペプチドは、配列番号１の配列を有する。他の例示的な実施形態において、アミノ酸残基は、Ａｓｎ１４５、Ａｓｎ３２２およびこれらの組み合わせから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態において、ペプチドは生理活性因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドである。
【０１１４】
さらに他の例示的な実施形態において、因子ＶＩＩａペプチド複合体の修飾糖質および／またはＰＥＧ部分は、軽鎖上に位置されている。さらに他の例示的な実施形態において、因子ＶＩＩａペプチド複合体の修飾糖質および／またはＰＥＧ部分は、主に重鎖上にある。さらに他の例示的な実施形態において、因子ＶＩＩａペプチド複合体の固体群において、軽鎖は、主に修飾糖質および／またはＰＥＧ部分を含有する。さらに他の例示的な実施形態において、因子ＶＩＩａペプチド複合体の固体群において、重鎖は主に修飾糖質および／またはＰＥＧ部分を含有する。
【０１１５】
他の例示的な実施形態において、固体群における軽鎖：重鎖官能化の比は約３３：６６である。他の例示的な実施形態において、固体群における軽鎖：重鎖官能化の比は約３５：６５である。他の例示的な実施形態において、固体群における軽鎖：重鎖官能化の比は約４０：６０である。他の例示的な実施形態において、固体群における軽鎖：重鎖官能化の比は約４５：５５である。他の例示的な実施形態において、比は約５０：５０である。他の例示的な実施形態において、比は約５５：４５である。他の例示的な実施形態において、比は約６０：４０である。他の例示的な実施形態において、比は約６５：３５である。他の例示的な実施形態において、比は約６６：３３である。他の例示的な実施形態において、比は約７０：３０である。他の例示的な実施形態において、比は約７５：２５である。他の例示的な実施形態において、比は約８０：２０である。他の例示的な実施形態において、比は約８５：１５である。他の例示的な実施形態において、比は約９０：１０である。他の例示的な実施形態において、固体群における軽鎖：重鎖官能化の比は約９０：１０を超える。
【０１１６】
因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａの発現方法および活性を測定する方法は技術分野において周知であり、例えば、米国特許第４，７８４，９５０号明細書に記載されている。簡潔には、因子ＶＩＩ、またはその変異体の発現は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、昆虫細胞を含む多様な原核および真核系の両方において、バキュロウイルス発現系を用いて達成することが可能であり、これらのすべては技術分野において周知である。
【０１１７】
本発明の方法に従って調製された因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の活性についてのアッセイは、技術分野において周知の方法を用いて達成されることが可能である。非限定的な例として、クイック（Ｑｕｉｃｋ）ら（「Ｈｅｍｏｒｒａｇｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ」、第２版、Ｌｅａｔ  Ｆｅｂｉｇｅｒ、フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）、１９６６年）は、本発明の方法に従って調製された因子ＶＩＩ分子の生物活性の測定に有用である一段凝固アッセイを記載する。
【０１１８】
本発明において用いられるペプチドは、修飾基が、
【化１６】
2009515508.tif 000018
であるときは、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａに制限されない。
これらの場合において、ペプチド複合体におけるペプチドは、図１３におけるペプチドから選択されるメンバーである。これらの場合において、ペプチド複合体におけるペプチドは、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩａ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、因子Ｘ、因子ＸＩから選択されるメンバーであり、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、α１−アンチトリプシン（ＡＴＴ、またはα−１プロテアーゼ抑制剤、グルコセレブロシダーゼ、組織タイププラスミノーゲン活性因子（ＴＰＡ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ウロキナーゼ、ヒトデオキシリボヌクレアーゼ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、ヒト成長ホルモン、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ  Ｆｃ領域融合タンパク質（エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（商標））、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（ヘルセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（商標））、呼吸器多核体ウイルスのタンパク質Ｆに対するモノクローナル抗体（シナジス（Ｓｙｎａｇｉｓ）（商標））、ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体（レミカーデ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）（商標））、糖タンパク質Ｉｌｂ／ＩＩＩａに対するモノクローナル抗体（レオプロ（Ｒｅｏｐｒｏ）（商標））、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体（リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（商標））、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ  ＩＩＩ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、α−ガラクトシダーゼ（ファブラザイム（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ）（商標））、α−イズロニダーゼ（アルズラザイム（Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ）（商標））、卵胞刺激ホルモン、β−グルコシダーゼ、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体（ＭＬＢ５０７５）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、β−グルコシダーゼ（ＭＬＢ５０６４）、α−ガラクトシダーゼＡ（ＭＬＢ５０８２）および線維芽細胞増殖因子から選択されるメンバーであるペプチドである。
【０１１９】
例示的な実施形態において、高分子修飾基は、以下の式による構造を有する。
【化１７】
2009515508.tif 000019
【０１２０】
本発明において用いられるペプチドはまた、修飾基が、
【化１８】
2009515508.tif 000020
であるときは、因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａに制限されない。
例示的な実施形態において、Ａ１およびＡ２は、各々−ＯＨおよび−ＯＣＨ３から選択されるメンバーである。
【０１２１】
この実施形態による例示的な高分子修飾基は、
【化１９】
2009515508.tif 000021
を含む。
【０１２２】
上記に示したもののような修飾基が分岐水溶性ポリマーである例示的な実施形態において、シアリダーゼの濃度が、反応混合物の約１．５〜約２．５Ｕ／Ｌであることが一般的には好ましい。より好ましくは、シアリダーゼの量は約２Ｕ／Ｌである。
【０１２３】
他の例示的な実施形態において、約５〜約９グラムのペプチド基質が、上記に規定の量のシアリダーゼと接触される。
【０１２４】
修飾糖質は、反応混合物中に、約１グラム〜約６グラム、好ましくは約３グラム〜約４グラムの量で存在する。分岐水溶性ポリマー修飾部分、例えば、上記に示した部分を有する修飾糖質の濃度を、約０．５ｍＭ未満で維持することが一般的には好ましい。好ましい実施形態において、修飾基は、約２０ＫＤａ〜約６０ＫＤａ、より好ましくは、約３０ＫＤａ〜約５０ＫＤａ、およびさらにより好ましくは約４０ＫＤａの分子量を有する分岐ポリ（エチレングリコール）である。約４０ＫＤａの分子量を有する例示的な修飾基は、約３５ＫＤａ〜約４５ＫＤａのものである。
【０１２５】
グリコシルトランスフェラーゼ濃度に関して、好ましい本実施形態において、上記に規定の修飾基を用いて、グリコシルトランスフェラーゼ対ペプチドの比は、約４０μｇ／ｍＬトランスフェラーゼ対約２００μＭペプチドである。
【０１２６】
ＩＩ．Ｂ．修飾糖質
例示的な実施形態において、本発明のペプチドは修飾糖質と反応され、これによりペプチド複合体が形成される。修飾糖質は「糖質ドナー部分」ならびに「糖質移動部分」を含む。糖質ドナー部分は、ペプチドに、グリコシル部分またはアミノ酸部分を介して、本発明の複合体として、結合されることとなる修飾糖質のいずれかの部分である。糖質ドナー部分は、修飾糖質からペプチド複合体のグリコシルリンク基へのそれらの転化の間に化学的に変性される原子を含む。糖質移動部分は、本発明の複合体としてペプチドに結合されることはない修飾糖質のいずれかの部分である。例えば、本発明の修飾糖質は、ＰＥＧ化糖質ヌクレオチド、ＰＥＧ−シアル酸ＣＭＰである。ＰＥＧ−シアル酸ＣＭＰについて、糖質ドナー部分、またはＰＥＧ−シアリルドナー部分はＰＥＧ−シアル酸を含み、一方で、糖質移動部分またはシアリル移動部分はＣＭＰを含む。
【０１２７】
本発明において用いられる修飾糖質において、糖部分は、好ましくは、サッカライド、デオキシ−サッカライド、アミノ−サッカライド、またはＮ−アシルサッカライドである。用語「サッカライド」およびその均等物は、「サッカリル（ｓａｃｃｈａｒｙｌ）」、「糖質」、および「グリコシル」は、モノマー、ダイマー、オリゴマーおよびポリマーを指す。糖質部分はまた、修飾基で官能基化されている。修飾基は、糖部分に、典型的には、アミン、スルフヒドリルまたはヒドロキシル、例えば、第１級ヒドロキシル、糖質上の部分での複合化を介して複合化されている。例示的な実施形態において、修飾基は、アミンと修飾基の反応性誘導体との反応により形成される、例えばアミド、ウレタンまたは尿素を介することで、糖質上のアミン部分を介して結合されている。
【０１２８】
いずれの糖部分も、修飾糖質の糖質ドナー部分として用いられることが可能である。糖部分は、マンノース、ガラクトースまたはグルコース、または公知の糖質の立体化学を有する種などの公知の糖質であることが可能である。これらの修飾糖質の一般式は、
【化２０】
2009515508.tif 000022
である。
【０１２９】
本発明の組成物の形成に有用である他の糖部分としては、これに限定されないが、フコースおよびシアル酸、ならびにグルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミンなどのアミノ糖質、シアル酸の５−アミンアナログ等が挙げられる。糖部分は、自然に見出される構造であることが可能であり、または修飾されて、修飾基が複合化する部位を提供することが可能である。例えば、一実施形態において、修飾糖質は、９−ヒドロキシ部分がアミンで置き換えられたシアル酸誘導体を提供する。アミンは、選択された修飾基の活性化アナログで容易に誘導される。
【０１３０】
本発明において用いられる修飾糖質の例が、本願明細書において参照により援用されるＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０５／００２５２２号明細書に記載されている。
【０１３１】
さらなる例示的な実施形態において、本発明は、６−ヒドロキシル位置が、関連する、上記に規定のものなどのリンカー−修飾基カセットを有するアミン部分に添加された修飾糖質を用いる。これらの修飾糖質のコアとして用いられることが可能である例示的なグリコシル基としては、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃ、Ｘｙｌ、Ｍａｎ等が挙げられる。この実施形態による代表的な修飾糖質は式、
【化２１】
2009515508.tif 000023
を有し、ここで、Ｒ１１〜Ｒ１４は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ＮＨ、およびＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３から独立して選択されるメンバーである。Ｒ１０は、他のグリコシル残基（−Ｏ−グリコシル）または因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド（−ＮＨ−（因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａ））のアミノ酸へのリンクである。Ｒ１４は、ＯＲ１、ＮＨＲ１またはＮＨ−Ｌ−Ｒ１である。Ｒ１およびＮＨ−Ｌ−Ｒ１は上述のとおりである。
【０１３２】
ＩＩ．Ｃ．グリコシルリンク基
例示的な実施形態において、本発明は、本発明の修飾糖質および因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの間で形成されるペプチド複合体を提供する。他の例示的な実施形態において、修飾糖質上の修飾基が
【化２２】
2009515508.tif 000024
である場合、ペプチド複合体におけるペプチドは、図１３におけるペプチドから選択されるメンバーである。さらに他の例示的な実施形態において、ペプチド複合体におけるペプチドは、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩａ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、因子Ｘ、因子ＸＩ、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、α１−アンチトリプシン（ＡＴＴ、またはα−１プロテアーゼ抑制剤、グルコセレブロシダーゼ、組織−タイププラスミノーゲン活性因子（ＴＰＡ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ウロキナーゼ、ヒトデオキシリボヌクレアーゼ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、ヒト成長ホルモン、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ  Ｆｃ領域融合タンパク質（エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（商標））、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（ヘルセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（商標））、呼吸器多核体ウイルスのタンパク質Ｆに対するモノクローナル抗体（シナジス（Ｓｙｎａｇｉｓ）（商標））、ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体（レミカーデ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）（商標））、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するモノクローナル抗体（レオプロ（Ｒｅｏｐｒｏ）（商標））、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体（リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（商標））、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ  ＩＩＩ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、α−ガラクトシダーゼ（ファブラザイム（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ）（商標））、α−イズロニダーゼ（アルズラザイム（Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ）（商標））、卵胞刺激ホルモン、β−グルコシダーゼ、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体（ＭＬＢ５０７５）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、β−グルコシダーゼ（ＭＬＢ５０６４）、α−ガラクトシダーゼＡ（ＭＬＢ５０８２）および線維芽細胞増殖因子から選択されるメンバーである。この実施形態において、修飾糖質の糖質ドナー部分（糖部分および修飾基など）は、「グリコシルリンク基」になる。「グリコシルリンク基」は、代替的に、ペプチドおよび修飾基の間に介在されるグリコシル部分を指すことが可能である。
【０１３３】
例示的な実施形態において、高分子修飾基は、以下の式による構造を有する。
【化２３】
2009515508.tif 000025
【０１３４】
例示的な実施形態において、修飾糖質上の修飾基は、
【化２４】
2009515508.tif 000026
である。
例示的な実施形態において、Ａ１およびＡ２は、各々、−ＯＨおよび−ＯＣＨ３から選択されるメンバーである。
【０１３５】
この実施形態による例示的な高分子修飾基は、
【化２５】
2009515508.tif 000027
を含む。
【０１３６】
ペプチド上のグリコシル残基を付加するおよび／または修飾するために利用可能な方法の多用途性により、グリコシルリンク基は実質的にいずれの構造をも有することが可能である。以下の考察において、本発明は、フラノースおよびピラノース選択された誘導体の使用に言及することにより例示される。当業者は、考察に焦点を当てるのは、例示を明確にするためであり、規定の構造および組成物は、一般的には、グリコシルリンク基および修飾糖質の属にわたって適用可能であることを認識するであろう。グリコシルリンク基は、事実上いずれのモノ−またはオリゴ−サッカライドも含むことが可能である。グリコシルリンク基は、アミノ酸に、側鎖またはペプチド主鎖のいずれかを介して結合されることが可能である。あるいは、グリコシルリンク基は、ペプチドに糖部分を介して結合されることが可能である。この糖部分は、ペプチドのＯ−結合型またはＮ−結合型グリカン構造の一部であることが可能である。
【０１３７】
例示的な実施形態において、本発明は、
【化２６】
2009515508.tif 000028
から選択される式を有する無処置グリコシルリンク基を含むペプチド複合体を提供する。
【０１３８】
式Ｉにおいて、Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ２ＯＲ７、ＣＯＯＲ７またはＯＲ７であり、ここで、Ｒ７は、Ｈ、置換または非置換アルキルまたは置換または非置換ヘテロアルキルを表す。ＣＯＯＲ７がカルボン酸またはカーボキシレートであるとき、両方の形態は、単一の構造ＣＯＯ−またはＣＯＯＨの記載によって表される。式ＩおよびＩＩにおいて、符号Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ６’は、独立して、Ｈ、置換または非置換アルキル、ＯＲ８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ９を表す。指数ｄは、０または１である。Ｒ８およびＲ９は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、シアル酸またはポリシアル酸から独立して選択される。Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ６’の少なくとも１つが修飾基を含む。この修飾基は、例えば、結合またはリンク基を介してリンクされたＰＥＧといった高分子修飾部分であることが可能である。例示的な実施形態において、Ｒ６およびＲ６’は、それらが結合された炭素と一緒に、シアル酸のピルビル側鎖の構成成分である。さらなる例示的な実施形態において、ピルビル側鎖は高分子修飾基で官能基化されている。他の例示的な実施形態において、Ｒ６およびＲ６’は、それらが結合された炭素と一緒に、シアル酸の側鎖の構成成分であり、および高分子修飾基はＲ５の成分である。
【０１３９】
例示的な実施形態において、本発明は、式、
【化２７】
2009515508.tif 000029
を有するグリコシルリンク基を用い、ここで、Ｊはグリコシル部分であり、Ｌは結合またはリンカーであり、およびＲ１は修飾基、例えば高分子修飾基である。例示的な結合は、グリコシル部分上のＮＨ２部分と修飾基上の補完的な反応性基との間に形成されるものである。例えば、Ｒ１がカルボン酸部分を含む場合、この部分は、グリコシル残基上のＮＨ２部分で活性化およびカップリングされ得、構造ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１を有する結合をもたらす。Ｊは、好ましくは、「無処置」であり、ピラノースまたはフラノース構造を開裂させる条件（例えば酸化性条件、例えばナトリウム過ヨウ素酸）への暴露により分解されていないグリコシル部分である。
【０１４０】
例示的なリンカーとしては、アルキルおよびヘテロアルキル部分が挙げられる。リンカーとしては、リンク基、例えばアシルベースのリンク基、例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−等が挙げられる。リンク基は、本発明の種の構成成分の間、例えばグリコシル部分とリンカー（Ｌ）との間、またはリンカーと修飾基（Ｒ１）との間に形成される結合である。他の例示的なリンク基は、エーテル、チオエーテルおよびアミンである。例えば、一実施形態において、リンカーは、グリシン残基などのアミノ酸残基である。グリシンのカルボン酸部分は、グリコシル残基上のアミンとの反応により関連するアミドに添加され、およびグリシンのアミンが、活性化カルボン酸または修飾基のカーボネートとの反応により関連するアミドまたはウレタンに転化される。
【０１４１】
ＮＨ−Ｌ−Ｒ１の例示的な種は、式、
−ＮＨ｛Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ａＮＨ｝ｓ｛Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨ｝ｔＲ１を有し、ここで、指数ｓおよびｔは、独立して０または１である。指数ａ、ｂおよびｄは、独立して０〜２０の整数であり、およびｃは１〜２５００の整数である。他の同様のリンカーは、−ＮＨ部分が他の基、例えば、−Ｓ、−Ｏまたは−ＣＨ２で置き換えられた種に基づく。当業者が認識するであろうとおり、指数ｓおよびｔに対応する括弧内の部分の一つ以上は、置換または非置換アルキルまたはヘテロアルキル部分で置き換えられることが可能である。
【０１４２】
より具体的には、本発明は、ＮＨ−Ｌ−Ｒ１が：ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ａＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨ（ＣＨ２）ａＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ａＮＨＲ１、ＮＨ（ＣＨ２）ａＮＨＲ１、およびＮＨＲ１である化合物を用いる。これらの式において、指数ａ、ｂおよびｄは０〜２０、好ましくは１〜５の整数から独立して選択される。指数ｃは、１〜約２５００の整数である。
【０１４３】
例示的な実施形態において、ｃは、ＰＥＧ部分がおよそ１ｋＤ、５ｋＤ、１０、ｋＤ、１５ｋＤ、２０ｋＤ、２５ｋＤ、３０ｋＤ、３５ｋＤ、４０ｋＤまたは４５ｋＤであるよう選択される。
【０１４４】
簡便性の目的のために、このセクションの残りにおけるグリコシルリンク基は、シアリル部分に基づくこととなる。しかしながら、当業者は、マンノシル、ガラクトシル、グルコシル、またはフコシルなどの他のグリコシル部分が、シアリル部分の代わりに用いられることができることを認識するであろう。
【０１４５】
例示的な実施形態において、グリコシルリンク基は、無処置グリコシルリンク基であり、ここで、リンク基を形成するグリコシル部分または部分は、化学的（例えば、ナトリウムメタ過ヨウ素酸）または酵素的（例えば、オキシダーゼ）プロセスによっては分解されない。本発明の選択された複合体は、アミノ−サッカライドのアミン部分、例えば、マンノサミン、グルコサミン、ガラクトサミン、シアル酸等に結合された修飾基を含む。このモチーフに基づく例示的な修飾基−無処置グリコシルリンク基カセットは、式、
【化２８】
2009515508.tif 000030
を有するものなどのシアル酸構造に基づいている。
【０１４６】
上記の式において、Ｒ１およびＬは上記のとおりである。例示的なＲ１基の構造についてのさらなる詳細が以下に提供されている。
【０１４７】
さらなる例示的な実施形態において、複合体は、ペプチドおよび修飾糖質の間に形成され、ここで、修飾基は、リンカーを介して、修飾糖質の６位の−炭素位置で結合されている。それ故、この実施形態による例示のグリコシルリンク基は、式、
【化２９】
2009515508.tif 000031
を有し、ここで、ラジカルは上述のとおりである。グリコシルリンク基としては、制限されないが、グルコース、グルコサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、マンノース、マンノサミン、Ｎ−アセチル−マンノサミン等が挙げられる。
【０１４８】
一実施形態において、本発明は、以下のグリコシルリンク基、
【化３０】
2009515508.tif 000032
を含むペプチド複合体を提供し、式中、Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、Ｇは、ＨおよびＲ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、Ｒ１は、直鎖または分岐ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分であり、およびＬは、リンカー、例えば、結合（「ゼロ次」）、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルである。例示的な実施形態において、ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ１−Ｌ−であり、およびＧが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるときＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。
【０１４９】
一実施形態において、本発明は、以下のグリコシルリンク基、
【化３１】
2009515508.tif 000033
を含むペプチド複合体を提供する。
【０１５０】
Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｒ１から選択されるメンバーであり、Ｒ１は、直鎖ポリ（エチレングリコール）残基および分岐ポリ（エチレングリコール）残基から選択されるメンバーを含む部分であり、およびＭは、Ｈ、塩対イオンおよび単一の陰電荷から選択されるメンバーであり、Ｌは、結合、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーである。例示的な実施形態において、ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ１−Ｌ−である。他の例示的な実施形態において、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるときＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。
【０１５１】
本発明のいずれかの化合物において、ＣＯＯＨ基は、代替的に、ＣＯＯＭであることが可能であり、式中、Ｍは、Ｈ、陰電荷、および塩対イオンから選択されるメンバーである。
【０１５２】
本発明は、式、
【化３２】
2009515508.tif 000034
を有するグリコシルリンク基を含むペプチド複合体を提供する。
【０１５３】
他の実施形態において、グリコシルリンク基は式、
【化３３】
2009515508.tif 000035
を有し、ここで、指数ｔは０または１である。
【０１５４】
さらなる例示的な実施形態において、グリコシルリンク基は式、
【化３４】
2009515508.tif 000036
を有し、ここで、指数ｔは０または１である。
【０１５５】
さらに他の実施形態において、グリコシルリンク基は式、
【化３５】
2009515508.tif 000037
を有し、ここで、指数ｐは、１〜１０の整数を表し、ａは０または１のいずれかである。
【０１５６】
他の例示的な実施形態において、ペプチド複合体は、式、
【化３６】
2009515508.tif 000038
【化３７】
2009515508.tif 000039
【化３８】
2009515508.tif 000040
【化３９】
2009515508.tif 000041
【化４０】
2009515508.tif 000042
【化４１】
2009515508.tif 000043
【化４２】
2009515508.tif 000044
【化４３】
2009515508.tif 000045
【化４４】
2009515508.tif 000046
【化４５】
2009515508.tif 000047
【化４６】
2009515508.tif 000048
【化４７】
2009515508.tif 000049
【化４８】
2009515508.tif 000050
から選択されるグリコシル部分を含み、ここで、指数ａおよびリンカーＬａは上述のとおりである。指数ｐは、１〜１０の整数である。指数ｔおよびａは、０または１から独立して選択される。これらの基の各々は、上記に規定の一分岐−、二分岐−、三分岐−および四分岐サッカライド構造の構成成分として含まれることが可能である。ＡＡはペプチドのアミノ酸残基である。
【０１５７】
例示的な実施形態において、ＰＥＧ部分は、約２０ＫＤａの分子量を有する。他の例示的な実施形態において、ＰＥＧ部分は約５ＫＤａの分子量を有する。他の例示的な実施形態において、ＰＥＧ部分は約１０ＫＤａの分子量を有する。他の例示的な実施形態において、ＰＥＧ部分は約４０ＫＤａの分子量を有する。
【０１５８】
例示的な実施形態において、グリコシルリンク基は、システイン残基に基づく分岐ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａ部分であり、およびこれらのグリコシルリンク基の１つまたは２つは、ペプチドに共有結合されている。他の例示的な実施形態において、グリコシルリンク基は、リシン残基に基づく分岐ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａ部分であり、およびこれらのグリコシルリンク基の１つまたは２つはペプチドに共有結合されている。例示的な実施形態において、グリコシルリンク基は、システイン残基に基づく分岐ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａ部分であり、およびこれらのグリコシルリンク基の１つまたは２つはペプチドに共有結合されている。例示的な実施形態において、グリコシルリンク基は、リシン残基に基づく分岐ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａ部分であり、およびこれらのグリコシルリンク基の１つまたは２つはペプチドに共有結合されている。例示的な実施形態において、グリコシルリンク基は、システイン残基に基づく分岐ＳＡ−ＰＥＧ−５ＫＤａ部分であり、およびこれらのグリコシルリンク基の１つ、２つまたは３つはペプチドに共有結合されている。例示的な実施形態において、グリコシルリンク基は、リシン残基に基づく分岐ＳＡ−ＰＥＧ−５ＫＤａ部分であり、およびこれらのグリコシルリンク基の１つ、２つまたは３つはペプチドに共有結合されている。例示的な実施形態において、グリコシルリンク基は、システイン残基に基づく分岐ＳＡ−ＰＥＧ−４０ＫＤａ部分であり、およびこれらのグリコシルリンク基の１つまたは２つはペプチドに共有結合されている。例示的な実施形態において、グリコシルリンク基は、リシン残基に基づく分岐ＳＡ−ＰＥＧ−４０ＫＤａ部分であり、およびこれらのグリコシルリンク基の１つまたは２つはペプチドに共有結合されている。
【０１５９】
例示的な実施形態において、本発明のグリコＰＥＧ化ペプチド複合体は、以下に規定の式、
【化４９】
2009515508.tif 000051
から選択される。
【０１６０】
上記の式において、指数ｔは、０〜１の整数であり、および指数ｐは、１〜１０の整数である。符号Ｒ１５’は、Ｈ、ＯＨ（例えば、Ｇａｌ−ＯＨ）、シアリル部分、シアリルリンク基（すなわち、シアリルリンク基−高分子修飾基（Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ１）、またはポリマー修飾シアリル部分が結合されたシアリル部分（例えば、Ｓｉａ−Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ１）（「Ｓｉａ−Ｓｉａｐ」））を表す。例示的なポリマー修飾糖部分は、式ＩおよびＩＩによる構造を有する。本発明の例示的なペプチド複合体は、式ＩまたはＩＩによる構造を含むＲ１５’を有する少なくとも１つのグリカンを含むであろう。式ＩおよびＩＩの空原子価の酸素は、好ましくは、グリコシドリンケージを介して、ＧａｌまたはＧａｌＮＡｃ部分の炭素に結合されている。さらなる例示的な実施形態において、酸素は、ガラクトース残基の位置３で炭素に結合されている。例示的な実施形態において、修飾シアル酸は、α２，３−でガラクトース残基にリンクされている。他の例示的な実施形態において、シアル酸は、α２，６−でガラクトース残基にリンクされている。
【０１６１】
例示的な実施形態において、シアリルリンク基は、ポリマー修飾シアリル部分が結合しているシアリル部分である（例えば、Ｓｉａ−Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ１）（「Ｓｉａ−Ｓｉａｐ」）。ここで、グリコシルリンク基は、ガラクトシル部分にシアリル部分、
【化５０】
2009515508.tif 000052
を介してリンクされている。
【０１６２】
このモチーフによる例示的な種は、Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ１をグリカンの末端シアル酸に、Ｓｉａ−Ｓｉａ結合、例えば、ＣＳＴ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩＩおよびＳＴ８Ｓｉａ−ＩＶを形成する酵素を用いて複合化することにより調製される。
【０１６３】
他の例示的な実施形態において、ペプチド複合体のグリカンは、群、
【化５１】
2009515508.tif 000053
から選択される式およびこれらの組み合わせを有する。
【０１６４】
上記式の各々において、Ｒ１５’は上述のとおりである。しかも、本発明の例示的なペプチド複合体は、式ＩまたはＩＩによる構造を有するＲ１５部分を有する少なくとも１つのグリカンを含むであろう。
【０１６５】
他の例示的な実施形態において、グリコシルリンク基は、式、
【化５２】
2009515508.tif 000054
を有する少なくとも１種のグリコシルリンク基を含み、式中、Ｒ１５は、前記シアリルリンク基であり、および指数ｐは、１〜１０から選択される整数である。
【０１６６】
例示的な実施形態において、グリコシルリンク部分は、式、
【化５３】
2009515508.tif 000055
を有し、ここで、ｂは、０〜１の整数である。指数ｓは、１〜１０の整数を表し、および指数ｆは１〜２５００の整数を表す。
【０１６７】
例示的な実施形態において、高分子修飾基はＰＥＧである。他の例示的な実施形態において、ＰＥＧ部分は、約２０ＫＤａの分子量を有する。他の例示的な実施形態において、ＰＥＧ部分は、約５ＫＤａの分子量を有する。他の例示的な実施形態において、ＰＥＧ部分は、約１０ＫＤａの分子量を有する。他の例示的な実施形態において、ＰＥＧ部分は、約４０ｋＤａの分子量を有する。他の例示的な実施形態において、グリコシルリンク基は、Ａｓｎ１４５、Ａｓｎ３２２、Ｓｅｒ５２、Ｓｅｒ６０またはこれらの組み合わせに結合されている。
【０１６８】
例示的な実施形態において、グリコシルリンク基は直鎖ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａ部分であり、およびこれらのグリコシルリンク基の１つまたは２つはペプチドに共有結合されている。他の例示的な実施形態において、グリコシルリンク基は直鎖ＳＡ−ＰＥＧ−２０ＫＤａ部分であり、およびこれらのグリコシルリンク基の１つまたは２つはペプチドに共有結合されている。例示的な実施形態において、グリコシルリンク基は直鎖ＳＡ−ＰＥＧ−５ＫＤａ部分であり、およびこれらのグリコシルリンク基の１つ、２つまたは３つはペプチドに共有結合されている。例示的な実施形態において、グリコシルリンク基は直鎖ＳＡ−ＰＥＧ−４０ＫＤａ部分であり、およびこれらのグリコシルリンク基の１つまたは２つはペプチドに共有結合されている。
【０１６９】
他の例示的な実施形態において、グリコシルリンク基は、式、
【化５４】
2009515508.tif 000056
を有するシアリルリンク基である。
【０１７０】
他の例示的な実施形態において、Ｑは、ＨおよびＣＨ３から選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態において、前記グリコシルリンク基は、式、
【化５５】
2009515508.tif 000057
を有し、式中、Ｒ１５は前記シアリルリンク基であり、および指数ｐは、１〜１０から選択される整数である。例示的な実施形態において、グリコシルリンク基は、式、
【化５６】
2009515508.tif 000058
を含み、式中、指数ｂは０および１から選択される整数である。例示的な実施形態において、指数ｓは１であり、および指数ｆは約２００〜約３００から選択される整数である。他の例示的な実施形態において、グリコシルリンク基は、ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａおよびＳＡ−ＰＥＧ−２０ＫＤａから選択されるメンバーであり、ここで、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドに共有結合された前記グリコシルリンク基の数は、１〜２から選択される整数である。他の例示的な実施形態において、グリコシルリンク基は、ＳＡ−ＰＥＧ−５ＫＤａおよびＳＡ−ＰＥＧ−４０ＫＤａから選択されるメンバーであり、ここで、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドに共有結合された前記グリコシルリンク基の数は、１〜３から選択される整数である。
【０１７１】
ＩＩ．Ｄ．修飾基
本発明のペプチド複合体は修飾基を含む。この基は、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドに、アミノ酸またはグリコシルリンク基を介して共有結合していることが可能である。他の例示的な実施形態において、修飾基がペプチド
【化５７】
2009515508.tif 000059
である場合、ペプチド複合体は、図１３におけるペプチドから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態において、ペプチド複合体におけるペプチドは、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩａ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、因子Ｘ、因子ＸＩ、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、α１−アンチトリプシン（ＡＴＴ、またはα−１プロテアーゼ抑制剤、グルコセレブロシダーゼ、組織−タイププラスミノーゲン活性因子（ＴＰＡ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ウロキナーゼ、ヒトデオキシリボヌクレアーゼ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、ヒト成長ホルモン、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ  Ｆｃ領域融合タンパク質（エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（商標））、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（ヘルセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（商標））、呼吸器多核体ウイルスのタンパク質Ｆに対するモノクローナル抗体（シナジス（Ｓｙｎａｇｉｓ）（商標））、ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体（レミカーデ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）（商標））、糖タンパク質Ｉｌｂ／ＩＩＩａに対するモノクローナル抗体（レオプロ（Ｒｅｏｐｒｏ）（商標））、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体（リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（商標））、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ  ＩＩＩ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、α−ガラクトシダーゼ（ファブラザイム（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ）（商標））、α−イズロニダーゼ（アルズラザイム（Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ）（商標））、卵胞刺激ホルモン、β−グルコシダーゼ、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体（ＭＬＢ５０７５）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、β−グルコシダーゼ（ＭＬＢ５０６４）、α−ガラクトシダーゼＡ（ＭＬＢ５０８２）および線維芽細胞増殖因子から選択されるメンバーである。「修飾基」は、標的指向化部分、治療的部分、生体分子を含む多様な構造を包含することが可能である。さらに、「修飾基」は高分子修飾基を含み、これは、身体における生体利用率または半減期などのペプチドの特性を変化させることが可能であるポリマーである。
【０１７２】
例示的な実施形態において、高分子修飾基は、以下の式による構造を有する。
【化５８】
2009515508.tif 000060
【０１７３】
上記式による他の例示的な実施形態において、高分子修飾基は、以下の式による構造を有する。
【化５９】
2009515508.tif 000061
例示的な実施形態において、Ａ１およびＡ２は、各々、−ＯＨおよび−ＯＣＨ３から選択されるメンバーである。
【０１７４】
この実施形態による例示的な高分子修飾基は、
【化６０】
2009515508.tif 000062
を含む。
【０１７５】
簡便性の目的のために、このセクションの残りにおける修飾基は、水溶性および不水溶性ポリマーなどの高分子修飾基に大きく基づいていることとなる。しかしながら、当業者は、標的指向化部分、治療的部分および生体分子などの他の修飾基が、高分子修飾基の代わりに用いられることができることを認識するであろう。
【０１７６】
ＩＩ．Ｄ．ｉ．修飾基のリンカー
修飾基のリンカーは、修飾基（すなわち高分子修飾基、標的指向化部分、治療的部分および生体分子）をペプチドに結合するために役立つ。例示的な実施形態において、高分子修飾基は、一般的には、以下に示すリンカー、Ｌ、
【化６１】
2009515508.tif 000063
を介することで、コア上のヘテロ原子、例えば窒素を介してグリコシルリンク基に結合されている。Ｒ１は高分子部分であり、およびＬは結合およびリンク基から選択される。指数ｗは、１〜６、好ましくは１〜３およびより好ましくは１〜２から選択される整数を表す。例示的なリンク基は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル部分およびシアル酸を含む。リンカーの例示的な成分は、アシル部分である。
【０１７７】
本発明による例示的な化合物は上記式ＩまたはＩＩによる構造を有し、ここで、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ６’の少なくとも１つは、式、
【化６２】
2009515508.tif 000064
を有する。
【０１７８】
この実施形態による他の例において、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ６’の少なくとも１つは、式、
【化６３】
2009515508.tif 000065
を有し、ここで、ｓは０〜２０の整数であり、およびＲ１は直鎖高分子修飾部分である。
【０１７９】
例示的な実施形態において、高分子修飾基−リンカー構造は、中央部分に結合された２つ以上の高分子鎖を含む分岐構造である。この実施形態において、構造は、式、
【化６４】
2009515508.tif 000066
を有し、ここで、Ｒ１およびＬは上述のとおりであり、およびｗ’は、２〜６、好ましくは２〜４およびより好ましくは２〜３の整数である。
【０１８０】
Ｌが結合である場合、これは、Ｒ１の前駆体上の反応性官能基と、サッカリルコア上の補完的な反応性の反応性官能基との間に形成される。Ｌが非−ゼロ次リンカーである場合、Ｌの前駆体が、Ｒ１前駆体との反応の前にグリコシル部分上にあることが可能である。あるいは、Ｒ１およびＬの前駆体は、予め形成され、その後グリコシル部分に結合されるカセットに組み込まれることが可能である。本願明細書に記載されているとおり、適切な反応性官能基を有する前駆体の選択および調製は、当業者の能力の範囲内である。しかも、前駆体のカップリングは、技術分野においてよく理解されている化学によって進行する。
【０１８１】
例示的な実施形態において、Ｌは、アミノ酸、または小型ペプチド（例えば、１〜４アミノ酸残基）から、高分子修飾基が置換アルキルリンカーを介して結合された修飾糖質を提供することにより形成されるリンク基である。例示的なリンカーとしては、グリシン、リシン、セリンおよびシステインが挙げられる。ＰＥＧ部分は、リンカーのアミン部分に、アミドまたはウレタン結合を介して結合されていることが可能である。ＰＥＧは、システインおよびセリンの硫黄または酸素原子に、チオエーテルまたはエーテル結合を、それぞれ介してリンクされている。
【０１８２】
例示的な実施形態において、Ｒ５は高分子修飾基を含む。他の例示的な実施形態において、Ｒ５は、高分子修飾基および修飾基を分子の残りに結合するリンカー、Ｌの両方を含む。上述のとおり、Ｌは、直鎖または分岐構造であることが可能である。同様に、高分子修飾基は分岐または直鎖であることが可能である。
【０１８３】
ＩＩ．Ｄ．ｉｉ．水溶性ポリマー
多くの水溶性ポリマーが当業者に公知であり、本発明の実施に有用である。水溶性ポリマーという用語は、サッカライド（例えば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリ（シアル酸）、ヘパラン、ヘパリン等）；ポリ（アミノ酸）、例えば、ポリ（アスパラギン酸）およびポリ（グルタミン酸）；核酸；合成ポリマー（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エーテル）、例えば、ポリ（エチレングリコール）；ペプチド、タンパク質等などの種を包含する。本発明は、ポリマーは複合体の残りが結合することが可能である点を含まなければならないことのみを制限として、いずれの水溶性ポリマーでも実施され得る。
【０１８４】
ポリマーの活性化方法はまた、国際公開第９４／１７０３９号パンフレット、米国特許第５，３２４，８４４号明細書、国際公開第９４／１８２４７号パンフレット、国際公開第９４／０４１９３号パンフレット、米国特許第５，２１９，５６４号明細書、米国特許第５，１２２，６１４号明細書、国際公開第９０／１３５４０号パンフレット、米国特許第５，２８１，６９８号明細書、およびさらに国際公開第９３／１５１８９号パンフレットにおいて見出すことが可能であり、ならびに、活性化ポリマーおよびペプチド間の複合化の方法は、例えば凝塊因子ＶＩＩＩ（国際公開第９４／１５６２５号パンフレット）、ヘモグロビン（国際公開第９４／０９０２７号パンフレット）、酸素担持分子（米国特許第４，４１２，９８９号明細書）、リボヌクレアーゼおよび超酸化ジスムターゼ（ベロネーゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ）ら、Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：第１４１〜４５ページ（１９８５年））に見出すことが可能である。
【０１８５】
例示的な水溶性ポリマーは、ポリマーのサンプルにおける相当な比率のポリマー分子がおよそ同一の分子量のものであるものであり、このようなポリマーは「均質分散」である。
【０１８６】
本発明は、ポリ（エチレングリコール）複合体に言及することによりさらに例示されている。ＰＥＧの官能化および複合化についての数々の概説および専攻論文が入手可能である。例えば、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）、Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５：第３２５〜３７３ページ（１９８５年）；スカウテン（Ｓｃｏｕｔｅｎ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３５：第３０〜６５ページ（１９８７年）；ワン（Ｗｏｎｇ）ら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：第８６６〜８７４ページ（１９９２年）；デルガド（Ｄｅｌｇａｄｏ）ら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ９：第２４９〜３０４ページ（１９９２年）；ザリプスキー（Ｚａｌｉｐｓｋｙ）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６：第１５０〜１６５ページ（１９９５年）；およびバードラ（Ｂｈａｄｒａ）ら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、５７：第５〜２９ページ（２００２年）を参照のこと。反応性ＰＥＧ分子の調製経路および、反応性分子を用いる複合体の形成経路は、技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，６７２，６６２号明細書は、直鎖または分岐ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（オキシエチレート化ポリオール）、ポリ（オレフィン系アルコール）、およびポリ（アクリロモルホリン）から選択されるポリマー酸の活性エステルの水溶性および単離可能な複合体を開示する。
【０１８７】
米国特許第６，３７６，６０４号明細書は、ポリマーの末端ヒドロキシルと、ジ（１−ベンゾトリアゾリル）カーボネートとを有機溶剤中に反応させることにより、水溶性および非−ペプチド性ポリマーの水溶性１−ベンゾトリアゾリルカーボネートエステルを調製する方法を規定する。活性エステルは、タンパク質またはペプチドなどの生体活性剤と複合体を形成するために用いられる。
【０１８８】
国際公開第９９／４５９６４号パンフレットは、生体活性剤と、ポリマー主鎖に安定なリンケージを介してリンクされた少なくとも１つの終端を有するポリマー主鎖を含む活性化水溶性ポリマーとを含む複合体を記載し、ここで、少なくとも１つの終端は分岐部分にリンクされた近位の反応性基を有する分岐部分を含み、ここで、生体活性剤は、近位の反応性基の少なくとも１つにリンクされている。他の分岐ポリ（エチレングリコール）が国際公開第９６／２１４６９号パンフレットに記載されており、米国特許第５，９３２，４６２号明細書は、反応性官能基を含む分岐終端を含む分岐ＰＥＧ分子と形成された複合体を記載している。遊離性の反応性基が、タンパク質またはペプチドなどの生体活性種と反応するために利用可能であり、ポリ（エチレングリコール）および生体活性種の間で複合体が形成される。米国特許第５，４４６，０９０号明細書は、二官能性ＰＥＧリンカーおよびペプチドをＰＥＧリンカー終端の各々で有する複合体の形成におけるその使用を記載する。
【０１８９】
分解性ＰＥＧリンケージを含む複合体が、国際公開第９９／３４８３３号パンフレット、および国際公開第９９／１４２５９号パンフレット、ならびに米国特許第６，３４８，５５８号明細書に記載されている。このような分解性リンケージは、本発明に適用可能である。
【０１９０】
技術分野において認識された、上記に規定のポリマー活性化の方法は、本願明細書に記載の分岐ポリマーの形成において、および、これらの分岐ポリマーの他の種、例えば、糖質、糖質ヌクレオチド等への複合化のためにも、本発明のコンテクストにおいて用いられる。
【０１９１】
例示的な水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）、例えば、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）である。本発明において用いられるポリ（エチレングリコール）は、いずれの特定の形態または分子量範囲にも制限されない。非分岐ポリ（エチレングリコール）分子について、分子量は、好ましくは５００および１００，０００の間である。２０００〜６０，０００の分子量が好ましく用いられ、および好ましくは約５，０００〜約４０，０００である。
【０１９２】
ＩＩ．Ｄ．ｉｉｉ．分岐水溶性ポリマー
他の実施形態において、ポリ（エチレングリコール）は、２つ以上のＰＥＧ部分が結合された分岐ＰＥＧである。分岐ＰＥＧの例が、米国特許第５，９３２，４６２号明細書；米国特許第５，３４２，９４０号明細書；米国特許第５，６４３，５７５号明細書；米国特許第５，９１９，４５５号明細書；米国特許第６，１１３，９０６号明細書；米国特許第５，１８３，６６０号明細書；国際公開第０２／０９７６６号パンフレット；コデラＹ．（Ｋｏｄｅｒａ  Ｙ．）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：第２８３〜２８８ページ（１９９４年）；およびヤマサキ（Ｙａｍａｓａｋｉ）ら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、５２：第２１２５〜２１２７ページ、１９９８年に記載されている。好ましい実施形態において、分岐ＰＥＧの各ポリ（エチレングリコール）の分子量は、４０，０００ダルトン以下である。
【０１９３】
代表的な高分子修飾部分は、例えば、セリン、システイン、リシン、および小型ペプチド、例えば、ｌｙｓ−ｌｙｓといった側鎖含有アミノ酸に基づく構造を含む。例示的な構造としては、
【化６５】
2009515508.tif 000067
【化６６】
2009515508.tif 000068
が挙げられる。
【０１９４】
当業者は、ジ−リシン構造における遊離アミンはまた、ＰＥＧ部分とのアミドまたはウレタン結合を介してペグ化されることが可能であることを認識するであろう。
【０１９５】
さらに他の実施形態において、高分子修飾部分は、トリ−リシンペプチドに基づく分岐ＰＥＧ部分である。トリ−リシンは、モノ−、ジ−、トリ−、またはテトラ−ＰＥＧ−イル化されていることが可能である。この実施形態による例示的な種は、式、
【化６７】
2009515508.tif 000069
を有し、ここで、指数ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００から独立して選択される整数であり、および指数ｑ、ｑ’およびｑ’’は、１〜２０から独立して選択される整数である。
【０１９６】
当業者に明らかであろうとおり、本発明において用いられる分岐ポリマーは、上記に規定の主題上での変形を含む。例えば上に示すジ−リシン−ＰＥＧ複合体は、３つの高分子サブユニットを含むことが可能であり、３つ目は、上記構造において未修飾として示されているα−アミンに結合している。同様に高分子修飾部分で標識化された３つまたは４つの高分子サブユニットを有するトリ−リシン官能化物の所望の方式での使用は、本発明の範囲内である。
【０１９７】
本願明細書に議論したとおり、本発明の複合体において用いられるＰＥＧは、直鎖または分岐であることが可能である。本発明のこの実施形態によるペプチド複合体を含有する分岐ＰＥＧを形成するために用いられる例示的な前駆体は、式、
【化６８】
2009515508.tif 000070
を有する。
【０１９８】
本発明のこの実施形態によるペプチド複合体を含有する分岐ＰＥＧを形成するために用いられる他の例示的な前駆体は、式、
【化６９】
2009515508.tif 000071
を有する。
【０１９９】
この式による分岐ポリマー種は、基本的に純粋な水溶性ポリマーである。Ｘ３’は、イオン性（例えば、ＯＨ、ＣＯＯＨ、Ｈ２ＰＯ４、ＨＳＯ３、ＨＰＯ３、およびこれらの塩等）または例えば前述の他の反応性官能基を含む部分である。Ｃは炭素である。Ｘ５、Ｒ１６およびＲ１７は、非反応性基（例えば、Ｈ、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル）および高分子アーム（例えば、ＰＥＧ）から独立して選択される。Ｘ２およびＸ４は、好ましくは生理学的条件下で基本的に非反応性であるリンケージ断片であり、同一であっても異なっていてもよい。例示的なリンカーは、芳香族またはエステル部分のいずれも含まない。あるいは、これらのリンケージは、例えば、エステル、ジスルフィド等といった、生理学的に関連する条件下で分解するよう設計された一つ以上の部分を含むことが可能である。Ｘ２およびＸ４は、高分子アームＲ１６およびＲ１７をＣに結合する。Ｘ３’がリンカー上の補完的な反応性の反応性官能基と反応される場合、糖質またはリンカー−糖質カセット、Ｘ３’は、リンケージ断片Ｘ３の成分に転化される。
【０２００】
Ｘ２、Ｘ３およびＸ４についての例示的なリンケージ断片は独立して選択され、およびＳ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、（Ｏ）ＣＮＨおよびＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、およびＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＣＨ２Ｓ、ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２Ｓ、（ＣＨ２）ｏＯ、（ＣＨ２）ｏＳまたは（ＣＨ２）ｏＹ’−ＰＥＧを含み、式中、Ｙ’は、Ｓ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、またはＯであり、およびｏは１〜５０の整数である。例示的な実施形態において、リンケージ断片Ｘ２およびＸ４は、異なるリンケージ断片である。
【０２０１】
例示的な実施形態において、前駆体（式ＩＩＩ）、またはその活性化誘導体は、Ｘ３’と、例えばアミンといった糖質部分上の補完的な反応性基との反応を通して、糖質、活性化糖質または糖質ヌクレオチドと反応され、および、これにより糖質、活性化糖質または糖質ヌクレオチドに結合する。あるいは、Ｘ３’は、リンカー、Ｌの前駆体上の反応性官能基と反応する。式ＩおよびＩＩのＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ６’の一つ以上は、分岐高分子修飾部分を含むことが可能であり、またはこの部分はＬを介して結合する。
【０２０２】
例示的な実施形態において、高分子修飾基は、以下の式による構造を有する。
【化７０】
2009515508.tif 000072
【０２０３】
上記式による他の例示的な実施形態において、分岐ポリマーは、以下の式による構造を有する。
【化７１】
2009515508.tif 000073
例示的な実施形態において、Ａ１およびＡ２は、各々、−ＯＨおよび−ＯＣＨ３から選択される。
【０２０４】
この実施形態による例示的な高分子修飾基は、
【化７２】
2009515508.tif 000074
を含む。
【０２０５】
例示的な実施形態において、部分、
【化７３】
2009515508.tif 000075
は、リンカーアーム、Ｌである。この実施形態において、例示的なリンカーは、天然または非天然アミノ酸、アミノ酸アナログまたはアミノ酸擬態物、または一種以上のこのような種から形成される小型ペプチドから誘導される。例えば、本発明の化合物において見出される一定の分岐ポリマーは、式、
【化７４】
2009515508.tif 000076
を有する。
【０２０６】
Ｘａは、分岐高分子修飾部分の前駆体上の反応性官能基（例えばＸ３’）と、糖質部分上の反応性官能基との反応により形成されるリンケージ断片、またはリンカーの前駆体である。例えば、Ｘ３’がカルボン酸である場合、これは活性化され、およびアミノ−サッカライドのアミン側基（例えば、Ｓｉａ、ＧａｌＮＨ２、ＧｌｃＮＨ２、ＭａｎＮＨ２等）に直接的に結合されて、アミドであるＸａを形成する。追加の例示的な反応性官能基および活性化前駆体が、本願明細書以下に記載されている。指数ｃは、１〜１０の整数を表す。他の符号は、上述のものと同一である。
【０２０７】
他の例示的な実施形態において、Ｘａは、他のリンカー、
【化７５】
2009515508.tif 000077
と形成されたリンク部分であり、ここで、Ｘｂは第２のリンケージ断片であり、およびＸａについて規定された基から独立して選択され、および、Ｌと同様に、Ｌ１は結合、置換または非置換アルキルまたは置換または非置換ヘテロアルキルである。
【０２０８】
ＸａおよびＸｂについての例示的な種としては、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨおよびＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、およびＯＣ（Ｏ）ＮＨが挙げられる。
【０２０９】
他の例示的な実施形態において、Ｘ４は、Ｒ１７へのペプチド結合であり、これは、α−アミン部分および／または側鎖ヘテロ原子が高分子修飾部分で修飾されている、アミノ酸、ジ−ペプチド（例えば，、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）またはトリ−ペプチド（例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）である。
【０２１０】
さらに例示的な実施形態において、本発明のペプチド複合体は、
【化７６】
2009515508.tif 000078
から選択される式を有する、例えばＲ１５部分といった部分を含み、ここで、種々の符号によって表されるラジカルの同一性は、本願明細書上述のものと同一である。Ｌａは、ＬおよびＬ１について上述のとおり、結合またはリンカーであり、例えば、置換または非置換アルキルまたは置換または非置換ヘテロアルキル部分である。例示的な実施形態において、Ｌａは、示したとおり高分子修飾部分で官能基化されたシアル酸の側鎖の部分である。例示的なＬａ部分は、一つ以上のＯＨまたはＮＨ２を含む置換または非置換アルキル鎖を含む。
【０２１１】
さらに他の例示的な実施形態において、本発明は、式、
【化７７】
2009515508.tif 000079
を有する例えばＲ１５部分といった部分を有するペプチド複合体を提供する。
【０２１２】
種々の符号によって表されるラジカルの同一性は、本願明細書上述のものと同一である。当業者が認識するであろうとおり、式ＶＩおよびＶＩＩにおけるリンカーアームは、本願明細書に記載の他の修飾糖質にも等しく適応可能である。例示的な実施形態において、式ＶＩおよびＶＩＩの種は、本願明細書に記載のグリカン構造に結合されたＲ１５部分である。
【０２１３】
さらに他の例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体は、
【化７８】
2009515508.tif 000080
から選択されるメンバーである式を有するＲ１５部分を含み、ここで、ラジカルの同一性は上述のとおりである。Ｌａについての例示的な種は、−（ＣＨ２）ｊＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｈＣ（Ｏ）ＮＨ−であり、ここで、指数ｈおよびｊは、０〜１０から独立して選択される整数である。さらなる例示的な種は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。指数ｍおよびｎは、０〜５０００から独立して選択される整数である。Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０およびＡ１１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、−ＮＡ１２Ａ１３、−ＯＡ１２および−ＳｉＡ１２Ａ１３から独立して選択されるメンバーである。Ａ１２およびＡ１３は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから独立して選択されるメンバーである。
【０２１４】
上記に規定の本発明の実施形態は、ポリマーが水溶性ポリマー、特にポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）、例えば、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）である種に言及することにより、さらに例示されている。続くセクションにおける焦点は、例示の明確さのためであり、およびＰＥＧを例示的なポリマーとして用いて規定された種々のモチーフは、ＰＥＧ以外のポリマーが用いられる種に対しても同等に適用可能であることを当業者は認識するであろう。
【０２１５】
例えば、１ＫＤａ、２ＫＤａ、５ＫＤａ、１０ＫＤａ、１５ＫＤａ、２０ＫＤａ、２５ＫＤａ、３０ＫＤａ、３５ＫＤａ、４０ＫＤａおよび４５ＫＤａといったいずれかの分子量のＰＥＧが本発明において用いられる。
【０２１６】
例示的な実施形態において、Ｒ１５部分は、群、
【化７９】
2009515508.tif 000081
から選択されるメンバーである式を有する。
【０２１７】
上記構造の各々において、リンカー断片−ＮＨ（ＣＨ２）ａ−は存在していることも、不在であることも可能である。
【０２１８】
他の例示的な実施形態において、ペプチド複合体は、群、
【化８０】
2009515508.tif 000082
から選択されるＲ１５部分を含む。
【０２１９】
上記式の各々において、指数ｅおよびｆは、１〜２５００の整数から独立して選択される。さらなる例示的な実施形態において、ｅおよびｆは、約１ＫＤａ、２ＫＤａ、５ＫＤａ、１０ＫＤａ、１５ＫＤａ、２０ＫＤａ、２５ＫＤａ、３０ＫＤａ、３５ＫＤａ、４０ＫＤａおよび４５ＫＤａであるＰＥＧ部分を提供するよう選択される。符号Ｑは、置換または非置換アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、例えば、メチル）、置換または非置換ヘテロアルキルまたはＨを表す。
【０２２０】
他の分岐ポリマーは、例えば、
【化８１】
2009515508.tif 000083
といったジ−リシン（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）ペプチドに基づく構造を有し、および、例えば、
【化８２】
2009515508.tif 000084
といったトリ−リシンペプチド（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）に基づく構造を有する。
【０２２１】
上記図の各々において、指数ｅ、ｆ、ｆ’およびｆ’’は、１〜２５００から独立して選択される整数を表す。指数ｑ、ｑ’およびｑ’’は、１〜２０から独立して選択される整数を表す。
【０２２２】
他の例示的な実施形態において、修飾基、
【化８３】
2009515508.tif 000085
は、
【化８４】
2009515508.tif 000086
から選択されるメンバーである式を有し、式中、Ｑは、Ｈおよび置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルから選択されるメンバーである。指数ｅおよびｆは、１〜２５００から独立して選択される整数であり、および指数ｑは、０〜２０から選択される整数である。
【０２２３】
他の例示的な実施形態において、修飾基、
【化８５】
2009515508.tif 000087
は、
【化８６】
2009515508.tif 000088
から選択されるメンバーである式を有し、式中、Ｑは、Ｈおよび置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルから選択されるメンバーである。指数ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００から独立して選択される整数であり、およびｑおよびｑ’は、１〜２０から独立して選択される整数である。
【０２２４】
他の例示的な実施形態において、分岐ポリマーは、以下の式による構造を有する。
【化８７】
2009515508.tif 000089
ここで、指数ｍおよびｎは、０〜５０００から独立して選択される整数である。Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０およびＡ１１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、−ＮＡ１２Ａ１３、−ＯＡ１２および−ＳｉＡ１２Ａ１３から独立して選択されるメンバーである。Ａ１２およびＡ１３は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから独立して選択されるメンバーである。
【０２２５】
式ＩＩＩａは、式ＩＩＩのサブセットである。式ＩＩＩａによって記載される構造はまた、式ＩＩＩによっても包含される。
【０２２６】
例示的な実施形態において、高分子修飾基は、以下の式による構造を有する。
【化８８】
2009515508.tif 000090
【０２２７】
上記式による他の例示的な実施形態において、分岐ポリマーは、以下の式による構造を有する。
【化８９】
2009515508.tif 000091
例示的な実施形態において、Ａ１およびＡ２は、−ＯＨおよび−ＯＣＨ３から独立して選択されるメンバーである。
【０２２８】
この実施形態による例示的な高分子修飾基は、
【化９０】
2009515508.tif 000092
を含む。
【０２２９】
例示的実施形態において、修飾糖質はシアル酸であり、および選択される、本発明において用いられる修飾糖質化合物は、式、
【化９１】
2009515508.tif 000093
を有する。
【０２３０】
指数ａ、ｂおよびｄは、０〜２０の整数である。指数ｃは、１〜２５００の整数である。上記に規定の構造は、Ｒ１５の構成成分であることが可能である。
【０２３１】
他の例示的実施形態において、糖質の第１級ヒドロキシル部分は、修飾基で官能基化されている。例えば、シアル酸の９−ヒドロキシルは、関連するアミンに転化され、および官能基化されて、本発明による化合物を提供することが可能である。この実施形態による式としては、
【化９２】
2009515508.tif 000094
が挙げられる。上記に規定の構造は、Ｒ１５の構成成分であることが可能である。
【０２３２】
本発明が、前述のセクションにおいてＰＥＧについて言及することにより例示されているが、当業者が認識するであろうとおり、高分子修飾部分のアレイは、本願明細書に記載の化合物および方法において用いられるものである。
【０２３３】
選択された実施形態において、Ｒ１またはＬ−Ｒ１は、分岐ＰＥＧ、例えば、上記に規定された種の一つである。例示的な実施形態において、分岐ＰＥＧ構造は、システインペプチドに基づいている。この実施形態による例示的修飾糖質は、
【化９３】
2009515508.tif 000095
を含み、ここで、Ｘ４は結合またはＯである。上記構造の各々において、アルキルアミンリンカー−（ＣＨ２）ａＮＨ−は、存在していることも、不在であることも可能である。上記に規定された構造はＲ１５／Ｒ１５’の構成成分であることが可能である。
【０２３４】
本願明細書において考察されるとおり、本発明において用いられるポリマー−修飾シアル酸はまた直鎖構造であり得る。それ故、本発明は、
【化９４】
2009515508.tif 000096
などの構造から誘導されるシアル酸部分を含む複合体を提供し、ここで、指数ｑおよびｅは上述のとおりである。
【０２３５】
例示的な修飾糖質は、水溶性または不水溶性ポリマーで修飾されている。有用なポリマーの例が、以下にさらに例示されている。
【０２３６】
他の例示的な実施形態において、ペプチドは昆虫細胞由来のものであり、ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌをマンノースコアに付加し、および直鎖ＰＥＧ部分を有するシアル酸を用いてグリコペグ化することにより再構築され、式、
【化９５】
2009515508.tif 000097
を有する少なくとも１つの部分を含む因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドがもたらされ、ここで、指数ｔは、０〜１の整数であり、指数ｓは１〜１０の整数を表し、および指数ｆは、１〜２５００の整数を表す。
【０２３７】
一実施形態において、本発明は、以下のグリコシルリンク基、
【化９６】
2009515508.tif 000098
を含むペプチド複合体を提供する。
【０２３８】
Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｒ１から選択されるメンバーであり、Ｒ１は、直鎖ポリ（エチレングリコール）残基および分岐ポリ（エチレングリコール）残基から選択されるメンバーを含む部分であり、およびＭは、Ｈ、塩対イオンおよび単一の陰電荷から選択されるメンバーであり、Ｌは、結合、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーである。例示的な実施形態において、ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ１−Ｌ−である。他の例示的な実施形態において、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるときＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。
【０２３９】
例示的な実施形態において、Ｌ−Ｒ１は、式、
【化９７】
2009515508.tif 000099
を有し、式中、ａは、０〜２０から選択される整数である。
【０２４０】
例示的な実施形態において、Ｒ１は、
【化９８】
2009515508.tif 000100
から選択されるメンバーである構造を有し、式中、ｅ、ｆ、ｍおよびｎは、１〜２５００から独立して選択される整数であり、およびｑは、０〜２０から選択される整数である。
【０２４１】
例示的な実施形態において、Ｒ１は、
【化９９】
2009515508.tif 000101
から選択されるメンバーである構造を有し、式中、ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００から独立して選択される整数であり、およびｑおよびｑ’は、１〜２０から独立して選択される整数である。
【０２４２】
他の例示的な実施形態において、Ｒ１は、
【化１００】
2009515508.tif 000102
から選択されるメンバーである構造を有し、式中、ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００から独立して選択される整数であり、およびｑおよびｑ’は、１〜２０から独立して選択される整数である。
【０２４３】
他の例示的な実施形態において、Ｒ１は、
【化１０１】
2009515508.tif 000103
から選択されるメンバーである構造を有し、式中、ｅおよびｆは、１〜２５００から独立して選択される整数である。
【０２４４】
他の例示的な実施形態において、グリコシルリンカーは、式、
【化１０２】
2009515508.tif 000104
を有する。
【０２４５】
他の例示的な実施形態において、ペプチド複合体は、
【化１０３】
2009515508.tif 000105
から選択される式に基づく前記グリコシルリンカーの少なくとも１つを含み、式中、ＡＡは前記ペプチド複合体のアミノ酸残基であり、およびｔは、０および１から選択される整数である。
【０２４６】
他の例示的な実施形態において、ペプチド複合体は、前記グリコシルリンカーの少なくとも１つを含み、ここで、前記グリコシルリンカーの各々は、以下の式、
【化１０４】
2009515508.tif 000106
【化１０５】
2009515508.tif 000107
から独立して選択されるメンバーである構造を有し、式中、ＡＡは前記ペプチド複合体のアミノ酸残基であり、およびｔは、０および１から選択される整数である。
【０２４７】
他の例示的な実施形態において、ペプチド複合体は、
【化１０６】
2009515508.tif 000108
【化１０７】
2009515508.tif 000109
から選択される式に基づく前記グリコシルリンカーの少なくとも１つを含み、式中、ＡＡは前記ペプチド複合体のアミノ酸残基であり、およびｔは、０および１から選択される整数である。例示的な実施形態において、Ｇを含まないシアリル部分の０および２つから選択されるメンバーがない。例示的な実施形態において、Ｇを含まないシアリル部分の１および２つから選択されるメンバーがない。
【０２４８】
他の例示的な実施形態において、ペプチド複合体は、
【化１０８】
2009515508.tif 000110
【化１０９】
2009515508.tif 000111
から選択される式に基づく前記グリコシルリンカーの少なくとも１つを含み、式中、ＡＡは前記ペプチド複合体のアミノ酸残基であり、およびｔは、０および１から選択される整数である。例示的な実施形態において、Ｇを含まないシアリル部分の０および２つから選択されるメンバーがない。例示的な実施形態において、Ｇを含まないシアリル部分の１および２つから選択されるメンバーがない。
【０２４９】
他の例示的な実施形態において、ペプチド複合体は、
【化１１０】
2009515508.tif 000112
【化１１１】
2009515508.tif 000113
から選択される式に基づく少なくとも１つの前記グリコシルリンカーを含み、式中、ＡＡは前記ペプチド複合体のアミノ酸残基であり、およびｔは、０および１から選択される整数である。例示的な実施形態において、Ｇを含まないシアリル部分の０および２つから選択されるメンバーがない。例示的な実施形態において、Ｇを含まないシアリル部分の１および２つから選択されるメンバーがない。
【０２５０】
他の例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。他の例示的な実施形態において、グリコシルリンカーは、前記因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドに、セリンおよびスレオニンから選択されるアミノ酸残基を介して結合している。
【０２５１】
他の例示的な実施形態において、アスパラギン残基は、Ｎ１５２、Ｎ３２２およびこれらの組み合わせから選択されるメンバーである。
【０２５２】
他の例示的な実施形態において、因子ＶＩＩａペプチドは生理活性因子ＶＩＩａペプチドである。
【０２５３】
他の例示的な実施形態において、グリコシルリンカーは、前記因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドに、アスパラギン残基であるアミノ酸残基を介して結合されている。
【０２５４】
他の例示的な実施形態において、本発明は、好適な宿主において産生される因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを提供する。本発明はまた、このペプチドを発現させる方法を提供する。他の例示的な実施形態において、宿主は哺乳類発現系である。
【０２５５】
他の例示的な実施形態において、本発明は、それを必要とする対象における状態を処置する方法を提供し、前記状態は前記対象における易感染性凝固効力により特徴付けられ、前記方法は、前記対象における前記状態の回復に有効な量の、本発明の因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を対象に投与するステップを含む。他の例示的な実施形態において、本方法は、前記哺乳動物に、ある量の本願明細書に記載の方法に基づいて産生された因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を投与するステップを含む。
【０２５６】
他の態様において、本発明は、式、
【化１１２】
2009515508.tif 000114
を有する修飾シアリル残基を含むグリコシルリンカーを含む因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を形成する方法を提供し、式中、Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ２ＯＲ７、ＣＯＯＲ７またはＯＲ７である。Ｒ７は、Ｈ、置換または非置換アルキルまたは置換または非置換ヘテロアルキルを表す。Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、置換または非置換アルキル、ＯＲ８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ９から独立して選択されるメンバーである。Ｒ８およびＲ９は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルまたはシアル酸から独立して選択される。Ｒ１６およびＲ１７は、独立して選択される高分子アームである。Ｘ２およびＸ４は、高分子部分Ｒ１６およびＲ１７をＣに結合する独立して選択されるリンケージ断片である。Ｘ５は非反応性基であり、およびＬａはリンカー基である。本方法は、（ａ）グリコシル部分、
【化１１３】
2009515508.tif 000115
を含む因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを
式、
【化１１４】
2009515508.tif 000116
を有するＰＥＧ−シアル酸ドナー部分と、
ＰＥＧ−シアル酸を前記グリコシル部分のＧａｌへ転移させる酵素とに、前記転移に適切な条件で接触させるステップを含む。
【０２５７】
他の例示的な実施形態において、部分、
【化１１５】
2009515508.tif 000117
は、
【化１１６】
2009515508.tif 000118
から選択されるメンバーである式を有し、式中、ｅ、ｆ、ｍおよびｎは、１〜２５００から独立して選択される整数であり、およびｑは、０〜２０から選択される整数である。
【０２５８】
他の例示的な実施形態において、部分、
【化１１７】
2009515508.tif 000119
は、
【化１１８】
2009515508.tif 000120
から選択されるメンバーである式を有し、式中、ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００から独立して選択される整数であり、およびｑおよびｑ’は、１〜２０から独立して選択される整数である。
【０２５９】
他の例示的な実施形態において、グリコシルリンカーは、式、
【化１１９】
2009515508.tif 000121
を含む。
【０２６０】
他の例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体は、式、
【化１２０】
2009515508.tif 000122
を有する少なくとも１つのグリコシルリンカーを含み、式中、ＡＡは、前記ペプチドのアミノ酸残基であり、ｔは、０および１から選択される整数であり、およびＲ１５は修飾シアリル部分である。
【０２６１】
他の例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【０２６２】
他の例示的な実施形態において、グリコシルリンカーは、前記因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドに、アスパラギン残基であるアミノ酸残基を介して結合されている。
【０２６３】
他の例示的な実施形態において、アスパラギン残基は、Ｎ１５２、Ｎ３２２およびこれらの組み合わせから選択されるメンバーである。
【０２６４】
他の例示的な実施形態において、因子ＶＩＩａペプチドは生理活性因子ＶＩＩａペプチドである。
【０２６５】
他の例示的な実施形態において、本方法は、ステップ（ａ）の前に、（ｂ）因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを好適な宿主において発現させるステップを含む。
【０２６６】
他の態様において、本発明は、それを必要とする対象における状態を処置する方法を提供し、前記状態は前記対象における易感染性凝固効力により特徴付けられ、前記方法は、前記対象における前記状態の回復に有効な量の本願明細書に記載の方法に基づいて産生された因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を対象に投与するステップを含む。他の例示的な実施形態において、本方法は、前記哺乳動物に、ある量の本願明細書に記載の方法に基づいて産生された因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を投与するステップを含む。
【０２６７】
他の態様において、本発明は因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａペプチド複合体の合成方法を提供し、前記方法は、ａ）シアリダーゼ、ｂ）グリコシルトランスフェラーゼ、エキソグリコシダーゼおよびエンドグリコシダーゼから選択されるメンバーである酵素、ｃ）修飾糖質／修飾シアリル残基、ｄ）因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを組み合わせ、これにより、前記因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａペプチド複合体を合成するステップを含む。例示的な実施形態において、組み合わせるステップは１０時間未満の時間である。他の例示的な実施形態において、本発明は、キャッピングステップをさらに含む。
【０２６８】
ＩＩ．Ｄ．ｉｖ．不水溶性ポリマー
他の実施形態において、上記において考察したものと同様に、修飾糖質は、水溶性ポリマーより不水溶性ポリマーを含む。本発明の複合体はまた、一種以上の不水溶性ポリマーを含み得る。本発明のこの実施形態は、治療的ペプチドを制御された方式で送達するためのビヒクルとしての複合体の使用によって例示される。高分子薬物送達系は、技術分野において公知である。例えば、ダン（Ｄｕｎｎ）ら編、「ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＤＲＵＧＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ」、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ第４６９巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントンＤ．Ｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）１９９１年を参照のこと。実質的にいずれの公知の薬物送達系も本発明の複合体に適用可能であることを当業者は認識するであろう。
【０２６９】
Ｒ１、Ｌ−Ｒ１、Ｒ１５、Ｒ１５’および他のラジカルについての上記に規定のモチーフは、当業者に容易に利用可能な化学を用いて制限されることなく直鎖および分岐構造に組み込まれ得る不水溶性ポリマーについても同様に適用可能である。
【０２７０】
代表的な不水溶性ポリマーとしては、これに限定されないが、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ハロゲン化ポリビニル、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニックおよびポリビニルフェノールおよびこれらのコポリマーが挙げられる。
【０２７１】
本発明の複合体において用いられる合成的に修飾された天然ポリマーとしては、これに限定されないが、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、およびニトロセルロースが挙げられる。合成的に修飾された天然ポリマーの幅広いクラスの特に好ましいメンバーとしては、これに限定されないが、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシメチルセルロース、セルローストリアセテート、硫酸セルロースナトリウム塩、およびアクリルおよびメタクリル酸エステルおよびアルギン酸のポリマーが挙げられる。
【０２７２】
本願明細書において考察されたこれらのおよび他のポリマーは、シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．））、ポリサイエンシズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ペンシルベニア州ウォーレントン（Ｗａｒｒｅｎｔｏｎ，ＰＡ．））、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、フルカ（Ｆｌｕｋａ）（ニューヨーク州ロンコンコマ（Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ，ＮＹ））、およびバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）（カリフォルニア州リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ））等などの商業的供給者から容易に入手することが可能であり、これらの供給者から入手したモノマーから、標準的な技術を用いて合成されることが可能である。
【０２７３】
本発明の複合体において用いられる代表的な生分解性ポリマーとしては、これに限定されないが、ポリラクチド、ポリグリコリドおよびそのコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、これらのブレンドおよびコポリマーが挙げられる。特に用いられるのは、コラーゲン、プルロニック等を含むものなどのゲルを形成する組成物である。
【０２７４】
本発明において用いられるポリマーは、それらの構造の少なくとも一部中に生体吸収性分子を有する不水溶性材料を含む、「ハイブリッド」ポリマーを含む。このようなポリマーの例は、生体吸収性領域、親水性領域および複数の架橋性官能基／ポリマー鎖を有する不水溶性コポリマーを含むものである。
【０２７５】
本発明の目的について、「不水溶性材料」は、水または含水環境に実質的に不溶性である材料を含む。それ故、コポリマーの一定の領域またはセグメントが親水性またはさらには水溶性であり得ても、ポリマー分子は、全体として、水中には、いずれの実際的な尺度では溶解しない。
【０２７６】
本発明の目的について、用語「生体吸収性分子」は、代謝されまたは分解されて、再吸収および／または身体による通常の排泄経路を通じて排出されることが可能である領域を含む。このような代謝産物または分解生成物は、好ましくは、実質的に身体に無毒である。
【０２７７】
生体吸収性領域は、コポリマー組成物が全体として水溶性が付加されない限りにおいて疎水性または親水性のいずれかであり得る。それ故、生体吸収性領域は、ポリマーが、全体として、不水溶性のままでいる優先傾向に基づいて選択される。従って、相対的特性、すなわち、含有される官能基の種類、および生体吸収性領域の相対的比率、および親水性領域は、有用な生体吸収性組成物が不水溶性のままであることが保障されるよう選択される。
【０２７８】
例示的な再吸収性ポリマーは、例えば、ポリ（α−ヒドロキシ−カルボン酸）／ポリ（オキシアルキレン）の合成的に生成された再吸収性ブロックコポリマーを含む（コーン（Ｃｏｈｎ）ら、米国特許第４，８２６，９４５号明細書を参照のこと）。これらのコポリマーは、架橋されておらず、水溶性であり、従って、身体は分解されたブロックコポリマー組成物を排出可能である。ユーネス（Ｙｏｕｎｅｓ）ら、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２１：第１３０１〜１３１６ページ（１９８７年）；およびコーン（Ｃｏｈｎ）ら、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２２：第９９３〜１００９ページ（１９８８年）を参照のこと。
【０２７９】
ここで好ましい生体吸収性ポリマーとしては、ポリ（エステル）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミド）、ポリ（エステル−アミド）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（炭酸塩）、ポリ（ホスファジン）、ポリ（リン酸エステル）、ポリ（チオエステル）、多糖類およびこれらの混合物から選択される一種以上の構成成分が挙げられる。より好ましくは、生吸収性ポリマーとしては、ポリ（ヒドロキシ）酸成分が挙げられる。ポリ（ヒドロキシ）酸のうち、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロン酸、ポリ酪酸、ポリ吉草酸およびコポリマーおよびこれらの混合物が好ましい。
【０２８０】
インビボで吸収される（「生吸収される」）断片の形成に追加して、本発明の方法における使用のための好ましい高分子コーティングはまた、排出可能なおよび／または代謝可能な断片を形成することが可能である。
【０２８１】
より高次のコポリマーをまた本発明において用いることが可能である。例えば、１９８４年３月２０日発行のケージー（Ｃａｓｅｙ）ら、米国特許第４，４３８，２５３号明細書は、ポリ（グリコール酸）およびヒドロキシル−末端ポリ（アルキレングリコール）エステル交換から生成されるトリ−ブロックコポリマーを開示する。このような組成物は、再吸収性モノフィラメント縫合としての使用のために開示されている。このような組成物の柔軟性は、テトラ−ｐ−トリルオルトカルボネートなどの芳香族オルトカルボネートのコポリマー構造への組み込みによって制御される。
【０２８２】
乳酸および／またはグリコール酸に基づく他のポリマーもまた用いられることが可能である。例えば、１９９３年４月１３日発行のスピヌー（Ｓｐｉｎｕ）、米国特許第５，２０２，４１３号明細書は、ラクチドおよび／またはグリコリドの、オリゴマー系ジオールまたはジアミン残基のいずれかへの開環重合、これに続く、ジイソシアネート、塩化ジアシルまたはジクロロシランなどの二官能性化合物での鎖延長により生成された順番に秩序だったポリラクチドおよび／またはポリグリコリドのブロックを有する生分解性マルチ−ブロックコポリマーを開示する。
【０２８３】
本発明において有用なコーティングの生体吸収性領域は、加水分解的におよび／または酵素的に開裂可能であるように設計されることが可能である。本発明の目的について、「加水分解的に開裂可能」は、コポリマーの感受性、特に、水中でまたは含水環境で加水分解される生体吸収性領域を指す。同様に、本願明細書において用いられるところ、「酵素的に開裂可能」は、コポリマーの感受性、特に、内在性のまたは外因性の酵素によって開裂される生体吸収性領域を指す。
【０２８４】
身体内に置かれたときに、親水性領域は、排出可能なおよび／または代謝可能な断片に処理されることが可能である。それ故、親水性領域としては、例えば、ポリエーテル、ポリアルキレンオキシド、ポリオール、ポリ（ビニルピロリジン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキルオキサゾリン）、多糖類、炭水化物、ペプチド、タンパク質およびコポリマーおよびこれらの混合物を挙げることができる。さらに、親水性領域はまた、例えば、ポリ（アルキレン）オキシドであることが可能である。このようなポリ（アルキレン）オキシドは、例えば、ポリ（エチレン）オキシド、ポリ（プロピレン）オキシドおよびこれらの混合物およびコポリマーを含むことが可能である。
【０２８５】
ヒドロゲルの構成成分であるポリマーがまた本発明において有用である。ヒドロゲルは、比較的多量の水を吸収可能である高分子材料である。ヒドロゲル形成性化合物の例としては、これに限定されないが、ポリアクリル酸、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジン、膠、カラゲナンおよび他の多糖類、ヒドロキシエチレンメタクリル酸（ＨＥＭＡ）、ならびにこれらの誘導体等が挙げられる。ヒドロゲルは、安定、生分解性および生体吸収性であるよう生成されることが可能である。しかも、ヒドロゲル組成物は、これらの特性の一つ以上を示すサブユニットを含むことが可能である。
【０２８６】
その完全性を架橋性を通して制御することが可能である生適合性ヒドロゲル組成物が公知であり、および本願において、本発明の方法における使用に好ましい。例えば、１９９５年４月２５日に発行のハッベル（Ｈｕｂｂｅｌｌ）ら、米国特許第５，４１０，０１６号明細書および１９９６年６月２５日発行の米国特許第５，５２９，９１４号明細書は、２つの加水分解的に易動性延長部の間に挟まれた水溶性中央ブロック断片を有する架橋されたブロックコポリマーである水溶性系を開示する。このようなコポリマーは、光重合性アクリレート官能基でさらに末端封止されている。架橋されたとき、これらの系はヒドロゲルになる。このようなコポリマーの水溶性中央ブロックは、ポリ（エチレングリコール）を含むことが可能であり、一方で、加水分解的に易動性延長部は、ポリグリコール酸またはポリ乳酸などのポリ（α−ヒドロキシ酸）であることが可能である。ソーニー（Ｓａｗｈｎｅｙ）ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２６：第５８１〜５８７ページ（１９９３年）を参照のこと。
【０２８７】
他の好ましい実施形態において、ゲルは熱可逆性ゲルである。プルロニック、コラーゲン、膠、ヒアルロン酸、多糖類、ポリウレタンヒドロゲル、ポリウレタン−尿素ヒドロゲルおよびこれらの組み合わせなどの構成成分を含む熱可逆性ゲルが本願において好ましい。
【０２８８】
さらに他の例示的な実施形態において、本発明の複合体は、リポソームの成分を含む。リポソームは、例えば、エップスタイン（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ）ら、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載のものといった、当業者に公知の方法により調製されることが可能である。例えば、リポソーム配合物は、適切な脂質（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン、およびコレステロールなど）を無機溶剤中に溶解し、これを、次いで蒸発させて、乾燥した脂質の薄いフィルムをコンテナの表面に残留させることにより調製され得る。活性化合物またはその薬学的に許容可能な塩の水溶液が次いでコンテナに導入される。次いで、コンテナを手でかき混ぜて、脂質材料をコンテナの側面から遊離させて脂質凝集物を分散させ、これにより、リポソーム懸濁液が形成される。
【０２８９】
上述の微小粒子および微小粒子の調製方法が実施例により提供されており、およびこれらは、本発明において用いられる微小粒子の範囲を定義することを意図しない。異なる方法により構成された微小粒子のアレイが本発明において用いられることは当業者に明らかであろう。
【０２９０】
直鎖および分岐の両方の、水溶性ポリマーのコンテクストにおいて上記に考察された構造的様式は、一般的に、不水溶性ポリマーに関しても適用可能である。それ故、例えば、システイン、セリン、ジリシン、およびトリリシン分岐コアは、２つの不水溶性ポリマー部分で官能基化されていることが可能である。これらの種の生成に用いられる方法は、一般的には、水溶性ポリマーの生成に用いられるものに密接に類似している。
【０２９１】
ＩＩ．Ｄ．ｖ．高分子修飾基の生成方法
高分子修飾基は、グリコシルまたは糖部分またはアミノ酸部分との反応のために活性化されることが可能である。活性化種（例えば、炭酸塩および活性エステル）の例示的な構造としては、
【化１２１】
2009515508.tif 000123
【化１２２】
2009515508.tif 000124
が挙げられる。
【０２９２】
上記の図において、ｑは、１〜４０から選択されるメンバーである。本願明細書に記載の化合物の調製に用いられる直鎖および分岐ＰＥＧを活性化するために適切な他の活性化、または脱離基としては、これに限定されないが、種、
【化１２３】
2009515508.tif 000125
が挙げられる。これらのおよび他の種および活性化ＰＥＧの形成方法により活性化されるＰＥＧ分子が国際公開第０４／０８３２５９号パンフレットに規定されている。
【０２９３】
上に示す分岐ポリマーのｍ−ＰＥＧアームの一つ以上は、異なる終端、例えば、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、Ｃ２〜Ｃ１０−アルキル等を有するＰＥＧ部分により置き換えられることが可能であることを当業者は認識するであろう。しかも、上記構造は、アミノ酸側鎖のα−炭素原子および官能基の間にアルキルリンカーを挿入する（または炭素原子を除去する）ことにより、容易に修飾される。それ故、「ホモ」誘導体および高級相同体、ならびに低級相同体が、本発明において用いられる分岐ＰＥＧについてのコアの範囲内である。
【０２９４】
本願明細書に記載の分岐ＰＥＧ種は、以下のスキーム、
【化１２４】
2009515508.tif 000126
に規定されるものなどの方法により容易に調製され、ここで、ＸｄはＯまたはＳであり、およびｒは、１〜５の整数である。指数ｅおよびｆは、１〜２５００から独立して選択される整数である。例示的な実施形態において、これらの指数の一方または両方が、ポリマーが約５ＫＤａ、１０ＫＤａ、１５ＫＤａ、２０ＫＤａ、２５ＫＤａ、３０ＫＤａ、３５ＫＤａ、または４０ＫＤａの分子量であるよう選択される。
【０２９５】
それ故、本スキームによれば、天然または非天然アミノ酸が、活性化ｍ−ＰＥＧ誘導体、この場合トシレートと接触されて、側鎖ヘテロ原子Ｘｄのアルキル化により１が形成される。単官能性化ｍ−ＰＥＧアミノ酸が、Ｎ−アシル化条件に反応性ｍ−ＰＥＧ誘導体と共に供され、これにより分岐ｍ−ＰＥＧ２を集合させる。当業者が認識するであろうとおり、トシレート脱離基はいずれかの好適な脱離基、例えば、ハロゲン、メシレート、トリフレート等で置き換えられることが可能である。同様に、アミンのアシル化に用いられる反応性カーボネートは、活性エステル、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド等で置き換えられることが可能である、または酸は、ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール等などの脱水剤を用いてインサイチュで活性化されることが可能である。
【０２９６】
他の例示的な実施形態において、尿素部分はアミドなどの基で置き換えられる。
【０２９７】
ＩＩ．Ｅ．物質の均質分散ペプチド複合体組成物
化学的または酵素的に付加されたグリコシルリンク基を介して形成されるペプチド複合体の提供に追加して、本発明は、それらの置換パターンが高度に均質なペプチド複合体を含む物質の組成物を提供する。本発明の方法を用いて、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａ複合体の固体群にわたる実質的な比率のグリコシルリンク基およびグリコシル部分が構造的に同等のアミノ酸またはグリコシル残基に結合されているペプチド複合体を形成することが可能である。それ故、第２の態様において、本発明は、ペプチドに、グリコシルリンク基、例えば、無処置グリコシルリンク基を介して共有結合的に結合された水溶性ポリマー部分の固体群を有するペプチド複合体を提供する。本発明の例示的なペプチド複合体において、水溶性ポリマー固体群の基本的に各メンバーは、グリコシルリンク基を介してペプチドのグリコシル残基に結合しており、およびグリコシルリンク基が結合しているペプチドの各グリコシル残基は、同一の構造を有する。
【０２９８】
本発明はまた、ペプチドが修飾基、例えば治療的部分、診断上の部分、標的指向化部分、毒素部分等に、グリコシルリンク基を介して複合化されている上述のものと類似の複合体を提供する。上記に記載の修飾基の各々は、小型分子、天然ポリマー（例えば、ポリペプチド）または合成ポリマーであることが可能である。修飾基がシアル酸に結合されている場合、修飾基は実質的に非蛍光性であることが一般的に好ましい。
【０２９９】
例示的な実施形態において、本発明のペプチドは、高分子修飾基、例えば、ＰＥＧ部分を含む修飾糖質でグリコシル化された、少なくとも１つのＯ−結合型またはＮ−結合型グリコシル化部分を含む。例示的な実施形態において、ＰＥＧは、ペプチドに、無処置グリコシルリンク基を介して、または非グリコシルリンカー、例えば、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルを介して共有結合されている。グリコシルリンク基は、ペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残基のいずれかに共有結合されている。あるいは、グリコシルリンク基は、グリコペプチドの１つ以上のグリコシル単位に結合されている。本発明はまた、グリコシルリンク基がアミノ酸残基およびグリコシル残基の両方に結合されている複合体を提供する。
【０３００】
本発明のペプチド上のグリカンは、一般的には、哺乳類（ＢＨＫ、ＣＨＯ）細胞または昆虫（例えば、Ｓｆ−９）細胞により産生される因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドにおいて、本願明細書に記載の方法によるリモデリングで見出されるものに対応している。例えば、トリ−マンノシルコアと共に発現される昆虫−由来の因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドは、その後、ＧｌｃＮＡｃドナーおよびＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼおよびＧａｌドナーおよびＧａｌトランスフェラーゼと接触させられる。ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌのトリ−マンノシルコアへの付加は、２ステップまたは１ステップのいずれかで達成される。修飾シアル酸は、本願明細書において考察されたグリコシル部分の少なくとも一つの分岐に付加される。修飾シアル酸で官能基化されていないこれらのＧａｌ部分は、任意により、シアル酸ドナーとの、シアリルトランスフェラーゼの存在下での反応により「キャップ」される。
【０３０１】
例示的な実施形態において、ペプチドの固体群における末端Ｇａｌ部分の少なくとも６０％がシアル酸でキャップされ、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％およびさらにより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％がシアル酸でキャップされる。
【０３０２】
ＩＩ．Ｆ．ヌクレオチド糖質
本発明の他の態様において、本発明はまた、糖質ヌクレオチドを提供する。この実施形態による例示的な種は、
【化１２５】
2009515508.tif 000127
を含み、ここで、指数ｙは、０、１および２から選択される整数である。塩基は、アデニン、チミン、グアニン、シチジンおよびウリジンなどの核酸塩基である。Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は上記のとおりである。例示的な実施形態において、Ｌ−（Ｒ１）ｗは、
【化１２６】
2009515508.tif 000128
から選択されるメンバーであり、ここで、可変要素は上記のとおりである。
【０３０３】
例示的な実施形態において、Ｌ−（Ｒ１）ｗは、以下の式による構造を有する。
【化１２７】
2009515508.tif 000129
例示的な実施形態において、Ａ１およびＡ２は、各々、−ＯＨおよび−ＯＣＨ３から選択される。
【０３０４】
この実施形態による例示的な高分子修飾基は、
【化１２８】
2009515508.tif 000130
を含む。
【０３０５】
他の例示的な実施形態において、ヌクレオチド糖質は、
【化１２９】
2009515508.tif 000131
から選択されるメンバーである式を有する。
【０３０６】
この実施形態による例示的なヌクレオチド糖質は、構造、
【化１３０】
2009515508.tif 000132
を有する。
【０３０７】
この実施形態による例示的なヌクレオチド糖質は、構造、
【化１３１】
2009515508.tif 000133
を有する。
【０３０８】
他の例示的な実施形態において、ヌクレオチド糖質は、以下の式、
【化１３２】
2009515508.tif 000134
に基づいており、ここで、Ｒ基、およびＬは、上述のとおりの部分を表す。指数「ｙ」は０、１または２である。例示的な実施形態において、Ｌは、ＮＨおよびＲ１の間の結合である。塩基は核酸塩基である。
【０３０９】
例示的な実施形態において、Ｌ−Ｒ１は
【化１３３】
2009515508.tif 000135
から選択されるメンバーであり、ここで、可変要素は上記のとおりである。
【０３１０】
例示的な実施形態において、Ｌ−Ｒ１は、以下の式による構造を有する。
【化１３４】
2009515508.tif 000136
例示的な実施形態において、Ａ１およびＡ２は、各々、−ＯＨおよび−ＯＣＨ３から選択される。
【０３１１】
ＩＩＩ．方法
上記に考察した複合体に追加して、本発明は、これらのおよび他の複合体を調製する方法を提供する。しかも、本発明は、疾病を発症させるリスクにある対象または疾病を患っている対象に、本発明の複合体を投与することにより、疾病状態を予防し、治癒しまたは回復する方法を提供する。
【０３１２】
例示的な実施形態において、複合体は、高分子修飾部分およびグリコシル化または非グリコシル化ペプチドの間に形成される。ポリマーは、ペプチド（またはグリコシル残基）および修飾基（例えば、水溶性ポリマー）の間に介在され、およびその両方に共有結合されるグリコシルリンク基を介してペプチドに複合化される。本方法は、ペプチドを、修飾糖質と、例えば、グリコシルトランスフェラーゼといった修飾糖質を基質に複合化する酵素とを含有する混合物に接触させるステップを含む。反応は、適切な条件下で実施されて、共有結合を修飾糖質およびペプチドの間に形成する。修飾糖質の糖質部分は、好ましくは、ヌクレオチド糖質から選択される。因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を合成する方法は、ａ）シアリダーゼ、ｂ）グリコシルトランスフェラーゼ、エキソグリコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼなどのグリコシルリンク基の転移を触媒可能な酵素、ｃ）修飾糖質、ｄ）因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを組み合わせるステップを含み、これにより因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を合成する。反応は、適切な条件下で実施されて、共有結合を修飾糖質およびペプチドの間に形成する。修飾糖質の糖質部分は、好ましくは、ヌクレオチド糖質から選択される。
【０３１３】
例示的な実施形態において、上記に規定されたものなどの修飾糖質は、対応するヌクレオチド糖質として活性化される。本発明において、それらの修飾形態で用いられる例示的な糖質ヌクレオチドは、ヌクレオチド一−、二−または三リン酸塩またはこれらの類似体を含む。好ましい実施形態において、修飾糖質ヌクレオチドは、ＵＤＰ−グリコシド、ＣＭＰ−グリコシド、またはＧＤＰ−グリコシドから選択される。さらにより好ましくは、修飾糖質ヌクレオチドの糖質ヌクレオチド部分は、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−ガラクトサミン、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルコサミン、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−フコース、ＣＭＰ−シアル酸、またはＣＭＰ−ＮｅｕＡｃから選択される。例示的な実施形態において、ヌクレオチドリン酸はＣ−１に結合されている。
【０３１４】
本発明はまた、Ｌ−Ｒ１で、６−炭素位置で修飾された糖質ヌクレオチドの使用を提供する。この実施形態による例示的な種は、
【化１３５】
2009515508.tif 000137
を含み、ここで、Ｒ基、およびＬは上述のとおりの部分を表す。指数「ｙ」は０、１または２である。例示的な実施形態において、Ｌは、ＮＨおよびＲ１の間の結合である。塩基は核酸塩基である。
【０３１５】
６位置の炭素が修飾されている、本発明において用いられる例示的なヌクレオチド糖質は、ＧＤＰマンノースの立体化学を有する種、例えば、
【化１３６】
2009515508.tif 000138
を含み、ここで、Ｘ５は結合またはＯである。指数ｉは、０または１を表す。指数ａは、１〜２０の整数を表す。指数ｅおよびｆは、独立して、１〜２５００の整数を表す。Ｑは、上述のとおり、Ｈまたは置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。当業者が認識するであろうとおり、ＳがＯで置き換えられたセリン誘導体はまた、この一般モチーフ内に属する。
【０３１６】
さらなる例示的な実施形態において、本発明は、修飾糖質がＵＤＰガラクトースの立体化学に基づいている複合体を提供する。本発明において用いられる例示的なヌクレオチド糖質は、構造、
【化１３７】
2009515508.tif 000139
を有する。
【０３１７】
他の例示的な実施形態において、ヌクレオチド糖質はグルコースの立体化学に基づいている。この実施形態による例示的な種は、式、
【化１３８】
2009515508.tif 000140
を有する。
【０３１８】
それ故、グリコシル部分がシアル酸である例示的実施形態において、本発明の方法は、式、
【化１３９】
2009515508.tif 000141
を有する化合物を用い、ここで、Ｌ−Ｒ１は上述のとおりであり、およびＬ１−Ｒ１は修飾基に結合したリンカーを表す。Ｌと同様に、Ｌ１による例示的なリンカー種は結合、アルキルまたはヘテロアルキル部分を含む。
【０３１９】
しかも、上述のとおり、本発明は、直鎖または分岐のいずれかである水溶性ポリマーで修飾されたヌクレオチド糖質の使用を提供する。例えば、以下に示す式を有する化合物は、本発明の範囲にある複合体の調製に用いられる、
【化１４０】
2009515508.tif 000142
ここで、Ｘ４はＯまたは結合である。
【０３２０】
一般には、糖質部分または糖質部分−リンカーカセットおよびＰＥＧまたはＰＥＧ−リンカーカセット基は、新たな有機官能基または非反応性種へのリンクプロセスにより典型的には形質転化されている反応性基の使用を介して、一緒にリンクされている。糖質反応性官能基は、糖質部分上のいずれかの位置に位置されている。本発明の実施において有用な反応性基および反応のクラスは、一般的には、生物複合体化学の技術分野において周知であるものである。反応性糖質部分で得られる現在好まれる反応のクラスは、比較的緩和な条件下で進行するものである。これらとしては、これに限定されないが、求核性置換（例えば、アミンおよびアルコールのハロゲン化アシル、活性エステルとの反応）、求電子性置換（例えば、エナミン反応）および炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子多重結合への付加（例えば、マイケル反応、ディールズアルダー付加）が挙げられる。これらのおよび他の有用な反応は、例えば、３月、「ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ」、第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９８５年；ヘルマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、「ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、１９９６年；およびフィーニー（Ｆｅｅｎｅｙ）ら、「ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ」；「Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ」、第１９８巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントンＤ．Ｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）、１９８２年において考察されている。
【０３２１】
糖質核または修飾基からの側基である有用な反応性官能基としては、これに限定されないが、
（ａ）特にこれに限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび芳香族エステルを含む、カルボキシル基およびそれらの種々の誘導体、
（ｂ）例えば、エステル、エーテル、アルデヒド等に転化されることが可能であるヒドロキシル基、
（ｃ）ハライドが、後に、例えば、アミン、カルボン酸アニオン、チオールアニオン、カルバニオン、またはアルコキシドイオンなどの求核性基で置き換えられることが可能であり、これにより、ハロゲン原子の官能基での新たな基の共有結合がもたらされる、ハロアルキル基、
（ｄ）ディールスアルダー反応に関与することが可能である、例えばマレイミド基などのジエノフィル基、
（ｅ）例えばイミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンまたはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を介して、またはグリニャール付加またはアルキルリチウム付加などのメカニズムを介してその後の誘導体化が可能であるようなアルデヒドまたはケトン基、
（ｆ）例えばアミンとのその後の反応でスルホンアミドを形成するハロゲン化スルホニル基、
（ｇ）例えば、ジスルフィドに転化されるか、またはハロゲン化アシルと反応されることが可能であるチオール基、
（ｈ）例えば、アシル化、アルキル化または酸化されることが可能であるアミンまたはスルフヒドリル基、
（ｉ）例えば、環状付加、アシル化、マイケル付加等を受けることが可能であるアルケン、および
（ｊ）例えば、アミンおよびヒドロキシル化合物と反応することが可能であるエポキシドが挙げられる。
【０３２２】
反応性官能基は、反応性糖質核または修飾基を集合させるために必要な反応に関与または干渉しないように選択されることが可能である。あるいは、反応性官能基は、保護基の存在によって反応に関与することから保護されることが可能である。当業者は、選択された組の反応条件に干渉しないように特定の官能基をどのように保護するかを理解している。有用な保護基の例については、例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）ら、「ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９１年を参照のこと。
【０３２３】
以下の考察において、本発明の実施において有用である修飾糖質の多数の特定の例が規定されている。例示的な実施形態において、シアル酸誘導体は、修飾基が結合された糖質核として用いられる。シアル酸誘導体についての考察に焦点を当てるのは、あくまでも例示を明確にするためであり、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。多様な他の糖質部分は、例としてシアル酸を用いて規定されるものと類似の方式で活性化されおよび誘導されることが可能であることを当業者は認識するであろう。例えば、数多くの方法が、ガラクトース、グルコース、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびフコースを修飾して、技術分野において公知の方法で容易に修飾されるいくつかの糖質基質を命名するために利用可能である。例えば、エルハラビ（Ｅｌｈａｌａｂｉ）ら、「Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．」６：９３（１９９９年）；およびシェファー（Ｓｃｈａｆｅｒ）ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５：２４（２０００年））を参照のこと。
【０３２４】
例示的な実施形態において、修飾糖質は、６−アミノ−Ｎ−アセチル−グリコシル部分に基づいている。
【０３２５】
上記のスキームにおいて、指数ｎは、１〜２５００の整数を表す。例示的な実施形態において、この指数は、ポリマーが約１０ＫＤａ、１５ＫＤａまたは２０ＫＤａの分子量であるよう選択される。符号「Ａ」は、活性化基、例えば、ハロ、活性化エステルの成分（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、カーボネートの成分（例えば、ｐ−ニトロフェニルカーボネート）等を表す。他のＰＥＧ−アミドヌクレオチド糖質は、この方法および類似の方法によって容易に調製されることを当業者は認識するであろう。
【０３２６】
ペプチドは、典型的には、原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌性細胞）において、または哺乳類、イースト菌、昆虫、真菌性または植物細胞などの真核細胞において新たに合成され、または組換え発現される。ペプチドは、完全長タンパク質または断片のいずれかであることが可能である。しかも、ペプチドは、野生タイプまたは変異型ペプチドであることが可能である。例示的な実施形態において、ペプチドは、一種以上のＮ−またはＯ−結合型グリコシル化部分をペプチド配列に付加する突然変異を含む。
【０３２７】
本発明の方法はまた、組換え産生される不完全グリコシル化ペプチドの修飾を提供する。多くの組換え産生される糖タンパク質は、炭水化物残基を露出させる不完全グリコシル化であり、例えば、免疫原性、ＲＥＳによる認識といった望ましくない特性を有し得る。本発明の方法に修飾糖質を用いることで、ペプチドは、例えば水溶性ポリマー、治療剤等で、同時にさらにグリコシル化されおよび誘導されることが可能である。修飾糖質の糖質部分は、完全グリコシル化ペプチド中の受容体に適当に複合化されることとなる残基、または望ましい特性を有する他の糖質部分であることが可能である。
【０３２８】
いずれかのソースからの実質的にいずれのペプチドまたはグリコペプチドを用いても本発明は実施されることが可能であることを当業者は認識するであろう。本発明を実施することが可能である例示的なペプチドは、国際公開第０３／０３１４６４号パンフレット、およびこれに記載の文献に規定されている。
【０３２９】
本発明の方法により修飾されるペプチドは、合成または野生タイプペプチドであることが可能であり、またはこれらは、部位指向性変異誘発などの技術分野において公知である方法により産生された変異型ペプチドであることが可能である。ペプチドのグリコシル化は、典型的にはＮ−結合型またはＯ−結合型である。例示的なＮ−リンケージは、修飾糖質のアスパラギン残基の側鎖への結合である。Ｘがプロリン以外のいずれかのアミノ酸である、トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニンが、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素的結合についての認識配列である。それ故、これらのトリペプチド配列のいずれかの、ポリペプチド内での存在は潜在的なグリコシル化部分を形成する。Ｏ−結合型グリコシル化とは、１つの糖質（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、ＧｌｃＮＡｃ、グルコース、フコースまたはキシロース）と、ヒドロキシアミノ酸、好ましくはセリンまたはスレオニンのヒドロキシ側鎖との結合を指すが、異常なまたは非天然アミノ酸、例えば、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンもまた用いられ得る。
【０３３０】
しかも、ペプチドに追加して、本発明の方法は、他の生物学的構造（例えば、グリコシル化部分を含有する、糖脂質、脂質、スフィンゴイド、セラミド、細胞全体等）で実施することが可能である。
【０３３１】
グリコシル化部分のペプチドまたは他の構造への付加は、一つ以上のグリコシル化部分を含有するようにアミノ酸配列を変性させることにより、従来達成されている。付加はまた、−ＯＨ基、好ましくはセリンまたはスレオニン残基を、ペプチド（Ｏ−結合型グリコシル化部分について）の配列内に呈する一種以上の種の組み込みによりなされ得る。付加は、ペプチドの突然変異または完全な化学的合成によりなされ得る。ペプチドアミノ酸配列は、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変化、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるようにペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基で変異させることによって、変化される。ＤＮＡ突然変異は、好ましくは、当該技術分野において公知である方法を用いてなされる。
【０３３２】
例示的な実施形態において、グリコシル化部分は、ポリヌクレオチドをシャッフルすることにより付加される。候補ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡシャッフリングプロトコールで調節されることが可能である。ＤＮＡシャッフリングは、関連する遺伝子のプールの無作為な断片化により実施される反復的な組換えおよび突然変異、これに続く、ポリメラーゼ鎖反応−様プロセスによる断片の再構築のプロセスである。例えば、ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ」  ＵＳＡ９１：第１０７４７〜１０７５１ページ（１９９４年）；ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」３７０：第３８９〜３９１ページ（１９９４年）；および米国特許第５，６０５，７９３号明細書、同第５，８３７，４５８号明細書、同第５，８３０，７２１号明細書および同第５，８１１，２３８号明細書を参照のこと。
【０３３３】
本発明を実施することが可能である例示的なペプチド、グリコシル化部分を付加または除去する方法、およびグリコシル構造または下部構造を付加または除去する方法は、国際公開第０３／０３１４６４号パンフレットおよび関連米国およびＰＣＴ出願に詳細に記載されている。
【０３３４】
本発明はまた、ペプチドに、一つ以上の選択されたグリコシル残基を付加（またはから除去する）して、その後、修飾糖質が、ペプチドの少なくとも１つの選択されたグリコシル残基に複合化されることをも利用する。本実施形態は、例えば、ペプチド上に存在しないか、あるいは所望の量で存在しない選択されたグリコシル残基に、修飾糖質を複合化することが所望されるときに有用である。それ故、修飾糖質のペプチドへのカップリングの前に、選択されたグリコシル残基がペプチドに、酵素的または化学的カップリングにより複合化される。他の実施形態において、グリコペプチドのグリコシル化パターンは、修飾糖質の複合化の前に、炭水化物残基のグリコペプチドからの除去により変性される。例えば国際公開第９８／３１８２６号パンフレットを参照のこと。
【０３３５】
グリコペプチド上に存在するいずれかの炭水化物部分の付加または除去は、化学的に、あるいは酵素的に達成される。例示的な化学的脱グリコシル化は、ポリペプチド変異体を化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または同等化合物へ露出することによりもたらされる。この処置は、リンク糖質（Ｎ−アセチルグルコースアミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどのまたはすべての糖質の開裂をもたらし、一方でペプチドを無処置のまま残す。化学的脱グリコシル化は、ハキムディン（Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ）ら、「Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ」、２５９：５２（１９８７年）およびエッジ（Ｅｄｇｅ）ら、「Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」１１８：１３１（１９８１年）により記載されている。ポリペプチド変異体上の炭水化物部分の酵素的開裂は、トタクラ（Ｔｈｏｔａｋｕｒａ）ら、「Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．」１３８：３５０（１９８７年）に記載のとおり、多様なエンド−およびエクソ−グリコシダーゼの使用により達成することが可能である。
【０３３６】
例示的な実施形態において、ペプチドは、ペプチドにグリコ複合化またはリモデリングステップを実施する前に、ノイラミニダーゼで基本的に完全に脱シアル化されている。グリコ複合化またはリモデリングに続いて、ペプチドは、シアリルトランスフェラーゼを用いて任意に再−シアル化される。例示的な実施形態において、再−シアル化は、基本的に、シアリル受容体の固体群における、各（例えば、＞８０％、好ましくは８５％超、９０％超、好ましくは９５％超およびより好ましくは、９６％、９７％、９８％または９９％を超える）末端糖受容体において生じる。好ましい実施形態において、サッカライドは、実質的に均一なシアル化パターン（すなわち、実質的に均一なグリコシル化パターン）を有する。
【０３３７】
グリコシル部分の化学的付加は、技術分野において認識されたいずれかの方法により実施される。糖質部分の酵素的付加は、好ましくは、本発明において用いられる修飾糖質についての天然グリコシル単位を置き換えることによる、本願明細書に記載の方法の変形を用いて達成される。糖質部分を付加する他の方法は、米国特許第５，８７６，９８０号明細書、同第６，０３０，８１５号明細書、同第５，７２８，５５４号明細書、および同第５，９２２，５７７号明細書に開示されている。
【０３３８】
選択されたグリコシル残基についての例示的な結合点としては、これに限定されないが、（ａ）Ｎ−結合型グリコシル化についてのコンセンサス部位、およびＯ−結合型グリコシル化についての部位、（ｂ）グリコシルトランスフェラーゼについての受容体である末端グリコシル部分、（ｃ）アルギニン、アスパラギンおよびヒスチジン、（ｄ）遊離カルボキシル基、（ｅ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｆ）セリン、スレオニン、またはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、（ｇ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのものなどの芳香族残基、または（ｈ）グルタミンのアミド基が挙げられる。本発明において用いられる例示的な方法が、１９８７年９月１１日公開の国際公開第８７／０５３３０号パンフレット、およびアプリン（Ａｐｌｉｎ）およびリストン（Ｗｒｉｓｔｏｎ）、「ＣＲＣ  ＣＲＩＴ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．」、第２５９〜３０６ページ（１９８１年）に記載されている。
【０３３９】
一実施形態において、本発明は、２つ以上のペプチドをリンク基を介してリンクする方法を提供する。リンク基はいずれかの有用な構造のものであり、および直鎖状−および分岐−鎖構造から選択され得る。好ましくは、ペプチドに結合されているリンカーの各終端は、修飾糖質（すなわち、新生無処置グリコシルリンク基）を含む。
【０３４０】
本発明の例示的な方法において、２つのペプチドは、高分子（例えば、ＰＥＧリンカー）を含むリンカー部分を介して一緒に結合されている。コンストラクトは上記図に規定の一般構造と一致する。本願明細書に記載のとおり、本発明のコンストラクトは、２つの無処置グリコシルリンク基（すなわち、ｓ＋１＝１）を含む。２つのグリコシル基を含むＰＥＧリンカーの焦点は明確さの目的のためであり、および本発明のこの実施形態において用いられるリンカーアームの同一性を制限すると解釈されるべきではない。
【０３４１】
それ故、ＰＥＧ部分は、第１の終端において第１のグリコシル単位で官能基化され、および第２の終端において第２のグリコシル単位で官能基化されている。第１のおよび第２のグリコシル単位は、好ましくは、それぞれ、第１のおよび第２のペプチドの、第１のおよび第２のグリコシル単位への直交する結合を許容する、異なるトランスフェラーゼのための基質である。実際には、（グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２リンカーが、第１のグリコシル単位が基質である、第１のペプチドおよび第１のトランスフェラーゼと接触させられ、これにより、（ペプチド）１−（グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２が形成される。トランスフェラーゼおよび／または未反応ペプチドが、次いで、任意により反応混合物から除去される。第２のグリコシル単位が基質である第２のペプチドおよび第２のトランスフェラーゼが、（ペプチド）１−（グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２複合体に付加され、（ペプチド）１−（グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２−（ペプチド）２が形成され、グリコシル残基の少なくとも１つは、直接的にまたは間接的にＯ−結合されている。上記に要点を述べた方法はまた、例えば、分岐ＰＥＧ、デンドリマー、ポリ（アミノ酸）、多糖等の使用による３つ以上のペプチド間の複合体の形成に適用可能であることを当業者は認識するであろう。
【０３４２】
例示的な実施形態において、本発明の方法により修飾されるペプチドは、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）または遺伝子組換え動物において産生されるグリコペプチドであり、それ故、不完全にシアル化されたＮ−および／またはＯ−結合型オリゴ糖鎖を含有する。シアル酸を含まず、末端ガラクトース残基を含有するグリコペプチドのオリゴ糖鎖は、ＰＥＧ化され、ＰＰＧ化され、またはそうでなければ修飾シアル酸で修飾されることが可能である。
【０３４３】
スキーム１においては、アミノグリコシド１が、保護されたアミノ酸（例えば、グリシン）誘導体の活性エステルで処理されて、糖質アミン残基を対応する保護されたアミノ酸アミド付加物に転化する。この付加物が、アルドラーゼで処理されてα−ヒドロキシカーボキシレート２が形成される。化合物２は、ＣＭＰ−ＳＡシンセターゼの作用により対応するＣＭＰ誘導体に転化され、続いて、ＣＭＰ誘導体の接触水素化で化合物３が産生される。グリシン付加物の形成を介して導入されたアミンが、化合物３を活性化ＰＥＧまたはＰＰＧ誘導体（例えば、ＰＥＧ−Ｃ（Ｏ）ＮＨＳ、ＰＥＧ−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−ｐ−ニトロフェニル）と反応させることによりＰＥＧ結合の位置として用いられ、それぞれ、４または５などの種が産生される。
スキーム１
【化１４１】
2009515508.tif 000143
【０３４４】
例示的な実施形態において、修飾糖質は、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド上のＯ−グリカン結合部位に結合されることが可能である。この因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の産生に用いられることが可能であるグリコシルトランスフェラーゼとしては、Ｓｅｒ５６（−Ｇｌｃ−（Ｘｙｌ）ｎ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧ−についてはガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ；Ｓｅｒ５６−Ｇｌｃ−（Ｘｙｌ）ｎ−Ｘｙｌ−ＰＥＧ−についてはキシロシルトランスフェラーゼ；およびＳｅｒ６０−Ｆｕｃ−ＧｌｃＮＡｃ−（Ｇａｌ）ｎ−（ＳＡ）ｍ−ＰＥＧ−についてはＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼが挙げられる。
【０３４５】
ＩＩＩ．Ａ．修飾糖質のペプチドへの複合化
ＰＥＧ修飾糖質は、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドに、複合化を媒介するために適切な酵素を用いて複合化される。好ましくは、修飾ドナー糖質、酵素および受容体ペプチドの濃度は、受容体が消費されるまでグリコシル化が進行するように選択される。以下に考察された用件は、シアリルトランスフェラーゼのコンテクストに規定されているが、一般的に他のグリコシルトランスフェラーゼ反応に適用可能である。本発明における使用に好ましいシアリルトランスフェラーゼのリストが図３に提供されている。
【０３４６】
グリコシルトランスフェラーゼを用いて所望のオリゴ糖構造を合成する多数の方法は公知であり、および一般的に本発明に適用可能である。例示的な方法は、例えば、本願明細書において参照により援用される、国際公開第９６／３２４９１号パンフレット、イトウ（Ｉｔｏ）ら、「Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．」６５：７５３（１９９３年）、米国特許第５，３５２，６７０号明細書、同第５，３７４，５４１号明細書、同第５，５４５，５５３号明細書、所有者が共通の米国特許第６，３９９，３３６号明細書、および同第６，４４０，７０３号明細書、および所有者が共通の国際公開第０３／０３１４６４号パンフレット、国際公開第０４／０３３６５１号パンフレット、国際公開第０４／０９９２３１号パンフレットに記載されている。
【０３４７】
本発明は、単一のグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼの組み合わせを用いて実施される。例えば、シアリルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼの組み合わせを用いることが可能である。２つ以上の酵素を用いるこれらの実施形態において、酵素および基質は、好ましくは初期反応混合物中に組み合わされ、または第２の酵素反応のための酵素および試薬が、一旦第１の酵素反応が完了したらまたはほぼ完了したら、反応媒体に添加される。連続した２つの酵素反応を単一の容器内で実施することにより、中間体種が単離される手法を超えて全収率が向上する。しかも、余剰溶剤および副生成物のクリーンアップおよび廃棄が低減される。
【０３４８】
好ましい実施形態において、第１のおよび第２の酵素の各々はグリコシルトランスフェラーゼである。他の好ましい実施形態において、一つの酵素は、エンドグリコシダーゼである。追加の好ましい実施形態において、３つ以上の酵素が、本発明の修飾糖タンパク質を集合させるために用いられる。ペプチド上のサッカライド構造を変異させるために、酵素が、修飾糖質をペプチドへ付加する前または後のいずれかの時点で用いられる。
【０３４９】
他の実施形態において、本方法は、一種以上のエクソ−またはエンドグリコシダーゼを利用する。グリコシダーゼは、典型的には、グリコシル結合を、破損させるのではなく形成するために操作される変異体である。変異グリカナーゼは、典型的には、活性部位酸性アミノ酸残基のためのアミノ酸残基の置換を含む。例えば、エンドグリカナーゼがエンド−Ｈであるとき、置換活性部位残基は、典型的には、位置１３０でのＡｓｐ、位置１３２でのＧｌｕまたはこれらの組み合わせであることとなる。アミノ酸は、一般的には、セリン、アラニン、アスパラギン、またはグルタミンで置き換えられる。
【０３５０】
変異酵素は、通常は、エンドグリカナーゼ加水分解ステップの逆反応に類似の合成ステップにより反応を触媒する。これらの実施形態において、グリコシルドナー分子（例えば、所望のオリゴ−またはモノ−サッカライド構造）は脱離基を含有し、および反応は、ドナー分子をタンパク質のＧｌｃＮＡｃ残基へ付加することで進行する。例えば、脱離基はフッ化物などのハロゲンであることが可能である。他の実施形態において、脱離基はＡｓｎ、またはＡｓｎ−ペプチド部分である。さらなる実施形態において、グリコシルドナー分子のＧｌｃＮＡｃ残基が修飾される。例えば、ＧｌｃＮＡｃ残基は、１，２オキサゾリン部分を含み得る。
【０３５１】
好ましい実施形態において、本発明の複合体の産生に用いられる酵素の各々は、触媒量で存在する。特定の酵素の触媒量は、その酵素の基質の濃度ならびに温度、時間およびｐＨ値などの反応条件に応じて異なる。予め選択された基質濃度および反応条件下での所与の酵素についての触媒量を決定するための手段は、当業者に周知である。
【０３５２】
上記のプロセスが実施される温度は、凝固点より僅かに高温からほとんどの感受性の酵素が変性される温度の範囲であることが可能である。好ましい温度範囲は、約０℃〜約５５℃、およびより好ましくは約２０℃〜約３７℃である。他の例示的な実施形態において、本方法の一つ以上の構成部分は、好熱性酵素を用いて高温で実施される。
【０３５３】
反応混合物は、受容体がグリコシル化されるに十分な時間の間維持され、これにより、所望の複合体が形成される。複合体のいくつかは、度々、回収可能な量で数時間後に検出されることが可能であり、通常は２４時間以内で入手される。反応速度は、選択された系について最適化される、多数の異なる要因（例えば、酵素濃度、ドナー濃度、受容体濃度、温度、溶剤体積）に依存することを当業者は理解する。
【０３５４】
本発明はまた、修飾ペプチドの工業規模生産を提供する。本願明細書において用いられるところ、工業規模は、一般的には、少なくとも１グラムの最終、精製複合体を生産する。
【０３５５】
以下の考察において、本発明は、修飾シアル酸部分をグリコシル化ペプチドへ複合化することによって例示される。例示的な修飾シアル酸は、ＰＥＧで標識化される。ＰＥＧ−修飾シアル酸およびグリコシル化ペプチドの使用についての以下の考察に焦点を当てるのは、あくまでも例示を明確にるためであり、本発明がこれらの２つのパートナーの複合化に制限されることを示唆することを意図するものではない。考察は、一般的に、シアル酸以外の修飾グリコシル部分の付加に適用可能であることを当業者は理解する。しかも、考察は、グリコシル単位の、他のＰＥＧ部分、治療的部分、および生体分子を含むＰＥＧ以外の薬剤での修飾に同等に適用可能である。
【０３５６】
酵素的アプローチを、ＰＥＧ化またはＰＰＧ化炭水化物のペプチドまたはグリコペプチドへの選択的な導入に用いることが可能である。本方法は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、またはマスク化反応性官能基を含有し、および適切なグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシンターゼと組み合わされる修飾糖質を用いる。所望の炭水化物リンケージを形成することとなるグリコシルトランスフェラーゼを選択することにより、および修飾糖質をドナー基質として用いることにより、ＰＥＧまたはＰＰＧは、ペプチド主鎖、グリコペプチドの既存の糖質残基またはペプチドに付加された糖質残基に直接的に導入されることが可能である。
【０３５７】
例示的な実施形態において、シアリルトランスフェラーゼについての受容体は、修飾されるべきペプチド上に、天然に生じる構造として、または組換え的に、酵素的にまたは化学的に配置されて存在する。好適な受容体としては、例えば、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ、ラクト−Ｎ−テトラオース、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３Ａｒａ、Ｇａｌβ１，６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（ラクトース）などのガラクトシル受容体、および当業者に公知である他の受容体（例えば、ポールソン（Ｐａｕｌｓｏｎ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２５３：第５６１７〜５６２４ページ（１９７８年）を参照のこと）。例示的なシアリルトランスフェラーゼは本願明細書に記載されている。
【０３５８】
一実施形態において、シアリルトランスフェラーゼについての受容体は、グリコペプチドのインビボ合成で修飾されるべきグリコペプチド上に存在する。このようなグリコペプチドは、特許請求の範囲の方法を用いて、グリコペプチドのグリコシル化パターン事前の修飾無しでシアル化されることが可能である。あるいは、本発明の方法は、好適な受容体を含まないペプチドのシアル化に用いられることが可能である；第１に、ペプチドを、当業者に公知の方法により受容体を含むよう修飾するもの。例示的な実施形態において、ＧａｌＮＡｃ残基は、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの作用によって付加される。
【０３５９】
例示的な実施形態において、ガラクトシル受容体は、ガラクトース残基を、ペプチド、例えば、ＧｌｃＮＡｃに結合された適切な受容体に結合することにより集合される。本方法は、修飾されるべきペプチドを、好適な量のガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｇａｌβ１，３またはＧａｌβ１，４）、および好適なガラクトシルドナー（例えば、ＵＤＰ−ガラクトース）を含有する反応混合物と共にインキュベートするステップを含む。反応は実質的に完了するまで進行されるか、あるいは、反応は、予め選択された量のガラクトース残基が付加された時点で停止される。選択されたサッカライド受容体を集合される他の方法は当業者に明らかであろう。
【０３６０】
さらに他の実施形態において、グリコペプチド−結合型オリゴ糖は、先ず、全体でまたは部分的に、「トリム」して、シアリルトランスフェラーゼのための受容体あるいは１つ以上の適切な残基が付加されることが可能である部分を露出して好適な受容体が得られる。グリコシルトランスフェラーゼおよびエンドグリコシダーゼなどの酵素（例えば米国特許第５，７１６，８１２号明細書を参照のこと）は、結合およびトリム反応について有用である。この方法の他の実施形態において、ペプチドのシアル酸部分は、基本的に完全に除去されて（例えば、少なくとも９０、少なくとも９５または少なくとも９９％）、修飾シアル酸についての受容体を露出させる。
【０３６１】
以下の考察において、本発明の方法は、これに結合されたＰＥＧ部分を有する修飾糖質の使用によって例示されている。考察に焦点を当てるのは、あくまでも例示を明確にするためである。考察は、修飾糖質が治療的部分、生体分子等を有する実施形態と同等に関連していることを当業者は認識するであろう。
【０３６２】
炭水化物残基が、修飾糖質の付加前に「トリム（ｔｒｉｍｍｅｄ）」される本発明の例示的な実施形態においては、高マンノースは、第１世代二分岐構造にトリムして戻される。ＰＥＧ部分を有する修飾糖質は、「トリムし戻す（ｔｒｉｍｍｉｎｇ  ｂａｃｋ）」ことにより露出された一種以上の糖質残基に複合化される。一つの例において、ＰＥＧ部分は、ＰＥＧ部分に複合化されたＧｌｃＮＡｃ部分を介して付加される。修飾ＧｌｃＮＡｃは、二分岐構造の末端マンノース残基の一方または両方に結合される。あるいは、未修飾ＧｌｃＮＡｃが、分岐種の終端の一方または両方に付加されることが可能である。
【０３６３】
他の例示的な実施形態において、ＰＥＧ部分は、二分岐構造の末端マンノース残基の一方または両方に、末端マンノース残基に付加されたＧｌｃＮＡｃ残基に複合化されたガラクトース残基を有する修飾糖質を介して付加される。あるいは、未修飾Ｇａｌが、末端ＧｌｃＮＡｃ残基の一方または両方に付加されることが可能である。
【０３６４】
さらなる例において、ＰＥＧ部分が、上記に考察されたものなどの修飾シアル酸を用いてＧａｌ残基上に付加される。
【０３６５】
他の例示的な実施形態において、高マンノース型構造は、二分岐構造が分岐するマンノースから「トリムし戻される」。一つの例において、ＰＥＧ部分は、ポリマーで修飾されたＧｌｃＮＡｃを介して付加される。あるいは、未修飾ＧｌｃＮＡｃがマンノースに付加され、次いで、結合されたＰＥＧ部分を有するＧａｌが付加される。さらに他の実施形態において、未修飾ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌ残基は、順次にマンノースに付加され、続いてＰＥＧ部分で修飾されたシアル酸部分が付加される。
【０３６６】
高マンノース型構造はまた、基本トリ−マンノシルコアにトリムし戻されることが可能である。
【０３６７】
さらなる例示的な実施形態において、高マンノースは、第１のマンノースが結合されたＧｌｃＮＡｃ「トリムし戻される」。ＧｌｃＮＡｃは、ＰＥＧ部分を有するＧａｌ残基に複合化される。あるいは、未修飾ＧａｌがＧｌｃＮＡｃに付加され、次いで、水溶性糖質を有するシアル酸修飾が付加される。さらなる例においては、末端ＧｌｃＮＡｃがＧａｌと複合化され、およびＧｌｃＮＡｃが、続いて、ＰＥＧ部分を有する修飾フコースでフコシル化される。
【０３６８】
高マンノースはまた、ペプチドのＡｓｎに結合された第１のＧｌｃＮＡｃにトリムし戻され得る。一つの例において、ＧｌｃＮＡｃ−（Ｆｕｃ）ａ残基のＧｌｃＮＡｃは、水溶性ポリマーを有するＧｌｃＮＡｃで複合化される。他の例において、ＧｌｃＮＡｃ−（Ｆｕｃ）ａ残基のＧｌｃＮＡｃは、水溶性ポリマーを有するＧａｌで修飾される。さらなる実施形態において、ＧｌｃＮＡｃは、Ｇａｌで修飾され、次いで、ＰＥＧ部分で修飾されたシアル酸のＧａｌに複合化される。
【０３６９】
他の例示的な実施形態が、所有者が共通の米国特許出願公開第２００４０１３２６４０号明細書；同第２００４００６３９１１号明細書；同第２００４０１３７５５７号明細書；米国特許出願第１０／３６９，９７９号明細書；同第１０／４１０，９１３号明細書；同第１０／３６０，７７０号明細書；同第１０／４１０，９４５号明細書および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／３２２６３号明細書に記載されており、これらの各々は本願明細書において参照により援用される。
【０３７０】
上記に規定された例は、本願明細書に記載の方法の能力の例示を提供する。本願明細書に記載の方法を用いて、「トリムし戻す」こと、および実質的にいずれか所望の構造の炭水化物残基を構築することが可能である。修飾糖質は、上記に規定された炭水化物部分の終端に付加されることが可能であり、またはペプチドコアと炭水化物の終端との中間体であることが可能である。
【０３７１】
例示的な実施形態において、既存のシアル酸はシアリダーゼを用いてグリコペプチドから除去され、これにより下位のガラクトシル残基のすべてのまたはほとんどを脱マスク化する。あるいは、ペプチドまたはグリコペプチドは、ガラクトース残基、またはガラクトース単位中で終結するオリゴ糖残基で標識化される。ガラクトース残基の露出または付加に続いて、適切なシアリルトランスフェラーゼが用いられて、修飾シアル酸が付加される。
【０３７２】
他の例示的な実施形態においては、シアル酸をシアル酸に転移させる酵素が用いられる。この方法は、シアリダーゼを有するシアル化グリカンを処理してシアル酸下でグリカン残基を露出させることなく実施されることが可能である。例示的なポリマー−修飾シアル酸は、ポリ（エチレングリコール）で修飾されたシアル酸である。シアル酸残基を含むグリカン上にシアル酸および修飾シアル酸部分を付加するか、またはこれらの種についてのグリカン上の既存のシアル酸残基を交換する他の例示的な酵素としては、ＳＴ３Ｇａｌ３、ＣＳＴ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩＩおよびＳＴ８Ｓｉａ−ＩＶが挙げられる。
【０３７３】
さらなるアプローチにおいて、マスク化反応性官能基がシアル酸に存在する。マスク化反応性基は、好ましくは、修飾シアル酸を因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドに結合する条件によっては影響されない。修飾シアル酸のペプチドへの共有結合後、マスクは除去され、およびペプチドがＰＥＧなどの薬剤と複合化される。薬剤は、修飾糖質残基上の非マスク化反応性基とのその反応による、特定の方式でペプチドに複合化される。
【０３７４】
いずれかの修飾糖質は、グリコペプチドのオリゴ糖側鎖の末端糖質に依存して、その適切なグリコシルトランスフェラーゼと共に用いられることが可能である。上述のとおり、ＰＥＧ化構造の導入に必要とされるグリコペプチドの末端糖質は、発現中に自然に導入されることが可能であり、または適切なグリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼとグリコシルトランスフェラーゼとの混合物を用いて発現後に産生されることが可能である。
【０３７５】
さらなる例示的な実施形態において、ＵＤＰ−ガラクトース−ＰＥＧがβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼと反応され、これにより修飾ガラクトースが適切な末端Ｎ−アセチルグルコースアミン構造に転移される。グリコペプチド上の末端ＧｌｃＮＡｃ残基は、哺乳類、昆虫、植物または真菌類などの発現系において生じるように発現中に産生され得るが、必要に応じて、グリコペプチドを、シアリダーゼおよび／またはグリコシダーゼおよび／またはグリコシルトランスフェラーゼで処理することにより産生されることも可能である。
【０３７６】
他の例示的な実施形態においては、ＧＮＴ１〜５などのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼが用いられて、ＰＥＧ化−ＧｌｃＮＡｃがグリコペプチド上の末端マンノース残基に転移される。さらなる例示的な実施形態においては、Ｎ−および／またはＯ−結合型グリカン構造が、グリコペプチドから酵素的に除去されて、アミノ酸または、その後、修飾糖質と複合化される末端グリコシル残基を露出させる。例えば、エンドグリカナーゼが、グリコペプチドのＮ−結合型構造の除去に用いられて、末端ＧｌｃＮＡｃをグリコペプチド上のＧｌｃＮＡｃ−結合型−Ａｓｎとして露出させる。ＵＤＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧおよび適切なガラクトシルトランスフェラーゼが、ＰＥＧ−ガラクトース官能基を露出されたＧｌｃＮＡｃに導入するために用いられる。
【０３７７】
代替的な実施形態において、修飾糖質は、ペプチド主鎖に、糖質残基をペプチド主鎖に転移させると公知であるグリコシルトランスフェラーゼを用いて直接的に付加される。本発明の実施に有用である例示的なグリコシルトランスフェラーゼとしては、これに限定されないが、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃ  Ｔ１−１４）、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ等が挙げられる。このアプローチの使用により、修飾糖質をいかなる炭水化物も含まないペプチド上、あるいは、既存のグリコペプチドへ直接的な付加をすることが可能になる。両方の場合において、修飾糖質の付加は、化学的方法を用いるタンパク質のペプチド主鎖の修飾の間に生じるような無作為な方式ではなく、グリコシルトランスフェラーゼの基質特異性によって画定されるペプチド主鎖上の特定の位置で生じる。薬剤のアレイは、適切なアミノ酸配列をポリペプチド鎖中に操作することにより、グリコシルトランスフェラーゼ基質ペプチド配列を含まないタンパク質またはグリコペプチドに導入されることが可能である。
【０３７８】
上記の例示的な実施形態の各々において、修飾糖質のペプチドへの複合化の後に、一種以上の追加の化学的または酵素的修飾ステップを利用することが可能である。例示的な実施形態において、酵素（例えばフコシルトランスフェラーゼ）が、ペプチドに結合された末端修飾糖質上にグリコシル単位（例えば、フコース）を結合するために用いられる。他の例において、酵素反応が、修飾糖質が複合化できない部位を「キャップ」するために用いられる。あるいは、化学的反応が、複合化された修飾糖質の構造を変性するために用いられる。例えば、複合化された修飾糖質は、修飾糖質が結合されたペプチド成分とのそのリンケージを安定化または不安定化させる薬剤と反応させられる。他の例において、修飾糖質の成分は、ペプチドへのその複合化に続いて脱保護化される。本発明の方法において、修飾糖質がペプチドに複合化された後の段階で有用である酵素的および化学的手法のアレイがあることを当業者は認識するであろう。さらに、修飾糖質−ペプチド複合体の同化は本発明の範囲内である。
【０３７９】
本発明の複合体を調製するための酵素および反応条件が、本出願の親出願ならびに所有者が共通の国際公開第０３／０３１４６４号パンフレット、国際公開第０４／０３３６５１号パンフレット、国際公開第０４／０９９２３１号パンフレットに詳細に考察されている。
【０３８０】
選択された実施形態において、昆虫細胞において発現された因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドは、再構築されたグリコペプチド上のグリカンがＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌグリコシル残基を含むように再構築される。ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌの付加は、個別の反応としてまたは単一の反応として単一の容器中に生じることが可能である。この例においては、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩおよびＧａｌ−トランスフェラーゼＩが用いられる。修飾シアリル部分はＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩＩを用いて付加される。
【０３８１】
他の実施形態において、ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌおよび修飾Ｓｉａの付加はまた、単一の反応容器中において、上記の酵素を用いて生じることが可能である。酵素的リモデリングおよびグリコＰＥＧ化ステップの各々は、個別に実施される。
【０３８２】
ペプチドが哺乳類細胞中に発現されるとき、異なる方法が用いられる。一実施形態において、ペプチドは、ペプチドを修飾シアル酸を直接的にペプチド上のシアル酸上に転移させるシアリルトランスフェラーゼと接触させてＳｉａ−Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ１を形成することにより、またはペプチド上のシアル酸を修飾シアル酸と交換して、Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ１を形成することにより複合化前のリモデリングの必要無しで複合化される。この方法において用いられる例示的な酵素はＣＳＴ−ＩＩである。シアル酸をシアル酸に付加する他の酵素は、当業者に公知であり、このような酵素の例が本願明細書に添付の図に示されている。
【０３８３】
本発明の複合体を調製するさらに他の方法において、哺乳類系において発現されたペプチドは、シアリダーゼを用いて脱シアル化される。露出されたＧａｌ残基は、Ｏ−結合型グリカンに特異的であるシアリルトランスフェラーゼを用いて修飾シアル酸でシアル化され、Ｏ−結合型修飾グリカンを有する因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを提供する。脱シアル化、修飾因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドは、任意により、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩなどのシアリルトランスフェラーゼを用いて部分的にまたは完全に再シアル化される。
【０３８４】
他の態様において、本発明は、本発明のＰＥＧ化因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を形成する方法を提供する。本方法は、（ａ）
【化１４２】
2009515508.tif 000144
から選択されるグリコシル基を含む因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを、
【化１４３】
2009515508.tif 000145
から選択されるメンバーである式を有するＰＥＧ−シアル酸ドナーと、
ＰＥＧ−シアル酸を、前記ドナーから、前記グリコシル基のＧａｌＮＡｃ、ＧａｌおよびＳｉａから選択されるメンバーへ転移させる酵素とに、前記転移に適切な条件で接触させるステップを含む。例示的な修飾シアル酸ドナーは、リンカー部分を介して、ポリマー、例えば、直鎖または分岐ポリ（エチレングリコール）部分で修飾されたＣＭＰ−シアル酸である。本願明細書において考察されるとおり、ペプチドは、任意により、ＧａｌＮＡｃおよび／またはＧａｌおよび／またはＳｉａで、修飾糖質の結合の前にグリコシル化される（「リモデルされる」）。リモデリングステップは、同一の容器中に、ステップ間でのグリコシル化ペプチドの精製無しで連続して生じることが可能である。あるいは、一つ以上のリモデリングステップに続いて、グリコシル化ペプチドは、次のグリコシル化またはグリコＰＥＧ化ステップに供される前に精製されることが可能である。例示的な実施形態において、本方法は、ペプチドを宿主中に発現させるステップをさらに含む。例示的な実施形態において、宿主は哺乳類細胞または昆虫細胞である。他の例示的な実施形態において、哺乳類細胞は、ＢＨＫ細胞およびＣＨＯ細胞から選択されるメンバーでありおよび昆虫細胞はヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞である。
【０３８５】
例に示されおよび以下に考察されているとおり、ＰＥＧ−糖質についての受容体部分の設置は、いずれか所望の数のステップで達成される。例えば、一実施形態において、ＧａｌＮＡｃをペプチドへ付加することで、ＰＥＧ−糖質がＧａｌＮＡｃに同一反応容器内で複合化される第２のステップが続くことが可能である。あるいは、これらの２つのステップは、単一の容器中においておよそ同時に実施されることが可能である。
【０３８６】
例示的な実施形態において、ＰＥＧ−シアル酸ドナーは、式、
【化１４４】
2009515508.tif 000146
を有する。
【０３８７】
他の例示的な実施形態において、ＰＥＧ−シアル酸ドナーは、式、
【化１４５】
2009515508.tif 000147
を有する。
【０３８８】
さらなる例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドは、グリコペグ化または再構築される前に適切な発現系において発現される。例示的な発現系としては、Ｓｆ−９／バキュロウイルスおよびチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。
【０３８９】
例示的な実施形態において、本発明は、式、
【化１４６】
2009515508.tif 000148
を有する修飾シアリル残基を含むグリコシルリンカーを含む因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を形成する方法を提供し、式中、Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｒ１から選択されるメンバーであり、Ｒ１は、直鎖ポリ（エチレングリコール）残基および分岐ポリ（エチレングリコール）残基から選択されるメンバーを含む部分であり、Ｍは、Ｈ、金属および単一の負電荷から選択されるメンバーであり、Ｌは、結合、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、ここで、ＤがＯＨであるときＧはＲ１−Ｌ−であり、およびＧが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるときＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−であり、前記方法は、（ａ）グリコシル部分、
【化１４７】
2009515508.tif 000149
を含む因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを、
式、
【化１４８】
2009515508.tif 000150
を有するＰＥＧ−シアル酸ドナー部分と、
前記ＰＥＧ−シアル酸を前記グリコシル部分のＧａｌへ転移させる酵素とに、前記転移に適切な条件で接触させるステップを含む。
【０３９０】
例示的な実施形態において、Ｌ−Ｒ１は、式、
【化１４９】
2009515508.tif 000151
を有し、ここで、ａは、０〜２０から選択される整数である。
【０３９１】
他の例示的な実施形態において、Ｒ１は、
【化１５０】
2009515508.tif 000152
から選択されるメンバーである構造を有し、ここで、ｅ、ｆ、ｍおよびｎは、１〜２５００から独立して選択される整数であり、およびｑは、０〜２０から選択される整数である。
【０３９２】
大規模または小規模量の因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を本願明細書に記載の方法によって生成することが可能である。例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド量は、約０．５ｍｇ〜約１００ｋｇから選択される要素である。例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド量は、約０．１ｋｇ〜約１ｋｇから選択される要素である。例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド量は、約０．５ｋｇ〜約１０ｋｇから選択される要素である。例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド量は、約０．５ｋｇ〜約３ｋｇから選択される要素である。例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド量は、約０．１ｋｇ〜約５ｋｇから選択される要素である。例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド量は、約０．０８ｋｇ〜約０．２ｋｇから選択される要素である。例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド量は、約０．０５ｋｇ〜約０．４ｋｇから選択される要素である。例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド量は、約０．１ｋｇ〜約０．７ｋｇから選択される要素である。例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド量は、約０．３ｋｇ〜約１．７５ｋｇから選択される要素である。例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド量は、約２５ｋｇ〜約６５ｋｇから選択される要素である。
【０３９３】
本願明細書に記載の反応に用いられる因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの濃度は、約０．５〜約１０ｍｇ因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド／ｍＬの反応混合物から選択される要素である。例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド濃度は、約０．５〜約１ｍｇ因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド／ｍＬの反応混合物から選択される要素である。例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド濃度は、約０．８〜約３ｍｇ因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド／ｍＬの反応混合物から選択される要素である。例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド濃度は、約２〜約６ｍｇ因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド／ｍＬの反応混合物から選択される要素である。例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド濃度は、約４〜約９ｍｇ因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド／ｍＬの反応混合物から選択される要素である。例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド濃度は、約１．２〜約７．８ｍｇ因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド／ｍＬの反応混合物から選択される要素である。例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド濃度は、約６〜約９．５ｍｇ因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド／ｍＬの反応混合物から選択される要素である。
【０３９４】
本願明細書に記載の反応において用いられることが可能であるＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧの濃度は、約０．１〜約１．０ｍＭから選択される要素である。濃度を増加または低減させる因子としては、ＰＥＧのサイズ、インキュベーション時間、温度、緩衝液成分、ならびに用いられるグリコシルトランスフェラーゼのタイプ、および濃度が挙げられる。例示的な実施形態において、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ濃度は、約０．１〜約１．０ｍＭから選択される要素である。例示的な実施形態において、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ濃度は、約０．１〜約０．５ｍＭから選択される要素である。例示的な実施形態において、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ濃度は、約０．１〜約０．３ｍＭから選択される要素である。例示的な実施形態において、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ濃度は、約０．２〜約０．７ｍＭから選択される要素である。例示的な実施形態において、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ濃度は、約０．３〜約０．５ｍＭから選択される要素である。例示的な実施形態において、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ濃度は、約０．４〜約１．０ｍＭから選択される要素である。例示的な実施形態において、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ濃度は、約０．５〜約０．７ｍＭから選択される要素である。例示的な実施形態において、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ濃度は、約０．８〜約０．９５ｍＭから選択される要素である。例示的な実施形態において、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ濃度は、約０．５５〜約１．０ｍＭから選択される要素である。
【０３９５】
本願明細書に記載の反応において用いられることが可能であるＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧのモル当量は、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａタンパク質に付加されることが可能であるＳＡ−ＰＥＧの理論的数に基づいている。ＳＡ−ＰＥＧの理論的数は、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧのＭＷおよび従ってモル数と比したときの、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａタンパク質上のシアル化部位の理論的数ならびに、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａタンパク質のＭＷに基づく。２つのグリカン部位のみを有する主に二分岐および三分岐であるＮ−グリカンに基づく、約４つまたは５つのＰＥＧの因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａについて。例示的な実施形態において、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧのモル当量は、１〜２０から選択される整数である。例示的な実施形態において、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧのモル当量は、１〜２０から選択される整数である。例示的な実施形態において、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧのモル当量は、２〜６から選択される整数である。例示的な実施形態において、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧのモル当量は、３〜１７から選択される整数である。例示的な実施形態において、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧのモル当量は、４〜１１から選択される整数である。例示的な実施形態において、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧのモル当量は、５〜２０から選択される整数である。例示的な実施形態において、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧのモル当量は、１〜１０から選択される整数である。例示的な実施形態において、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧのモル当量は、１２〜２０から選択される整数である。例示的な実施形態において、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧのモル当量は、１４〜１７から選択される整数である。例示的な実施形態において、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧのモル当量は、７〜１５から選択される整数である。例示的な実施形態において、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧのモル当量は、８〜１６から選択される整数である。
【０３９６】
ＩＩＩ．Ｂ．因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａの同時脱シアル化およびグリコＰＥＧ化
本発明は、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａをグリコペグ化する「ワンポット」法を提供する。ワンポット法は、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を形成する他の例示的なプロセスとは異なり、連続的なシアリダーゼでの脱シアル化、その後のアシアロ因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａのアニオン交換カラムでの精製、次いでＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧおよびグリコシルトランスフェラーゼ（ＳＴ３Ｇａｌ３などの）、エキソグリコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼを用いるグリコＰＥＧ化を利用する。因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体は、次いで、アニオン交換、続いてサイズ排除クロマトグラフィーを介して精製されて、精製された因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を生成する。
【０３９７】
ワンポット法は、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を生産する改良法である。この方法において、脱シアル化およびグリコＰＥＧ化反応がワンポット反応に組み合わされており、これは、アシアロ因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを精製するための既述のプロセスにおいて用いられていた第１のアニオン交換クロマトグラフィーステップを除去する。このプロセスステップの減少は数々の利点を生む。先ず、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の生成に必要なプロセスステップ数が減少され、これはまた、プロセスの操作複雑性を低減させる。第２に、ペプチド複合体の生成のためのプロセス時間が、例えば、４〜２日間短縮される。これは、イン−プロセス制御に関連する原料要件および品質制御費用を低減させる。第３に、本発明はより少量のシアリダーゼを用い、例えば、２０倍以下で少量のシアリダーゼ、例えば、５００ｍＵ／Ｌが、プロセスと比して因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の生成に必要とされる。シアリダーゼの使用におけるこの低減は、反応混合物中のシアリダーゼなどの汚染物の量を著しく低減させる。
【０３９８】
例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体は、以下の方法により調製される。第１のステップにおいて、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドが、本発明の修飾糖質であるシアリダーゼ、およびグリコシルリンク基の修飾糖質からペプチドへの転移を触媒することが可能である酵素と組み合わされ、これにより、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体が調製される。いずれかのシアリダーゼがこの方法において用いられ得る。本発明において用いられる例示的なシアリダーゼは、ケージー（ＣＡＺＹ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／ＣＡＺＹ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌおよびｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／ＣＡＺＹを参照のこと）において見出されることが可能である。例示的なシアリダーゼは、いずれかの数々の供給業者から購入することが可能である（ＱＡ−バイオ（ＱＡ−Ｂｉｏ）、カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、マルキン（Ｍａｒｕｋｉｎ）、プロザイム（Ｐｒｏｚｙｍｅ）等）。例示的な実施形態において、シアリダーゼは、細胞質シアリダーゼ、リソソームシアリダーゼ、エクソ−αシアリダーゼ、およびエンドシアリダーゼから選択されるメンバーである。他の例示的な実施形態において、用いられるシアリダーゼは、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）または肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などの細菌、またはアデノウイルスなどのウイルスから産生される。例示的な実施形態において、グリコシルリンク基の修飾糖質からペプチドへの転移を触媒することが可能である酵素は、シアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼなどのグリコシルトランスフェラーゼ、ならびにエキソグリコシダーゼおよびエンドグリコシダーゼから選択されるメンバーである。例示的な実施形態において、酵素は、ＳＴ３Ｇａｌ３であるグリコシルトランスフェラーゼである。他の例示的な実施形態において、用いられる酵素は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ）などの細菌またはクロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などの真菌類から産生される。他の例示的な実施形態において、シアリダーゼは、グリコシルトランスフェラーゼよりも前に、特定の時間で因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドに付加され、これにより、ＰＥＧ−シアル酸試薬およびグリコシルトランスフェラーゼの付加を伴うグリコＰＥＧ化反応の開始よりも前に、シアリダーゼ反応を進行させる。これらの例の多くが本願明細書において考察されている。最後に、本願明細書に記載のいずれかの修飾糖質がこの反応において用いられることが可能である。
【０３９９】
他の例示的な実施形態において、本方法は、「キャッピング」ステップをさらに含む。このステップにおいては、追加の非ＰＥＧ化シアル酸が反応混合物に添加される。例示的な実施形態において、このシアル酸は、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドまたはペプチド複合体に付加され、これによりＰＥＧ−シアル酸のさらなる付加を防止している。他の例示的な実施形態において、このシアル酸は、グリコシルトランスフェラーゼの反応混合物における機能を妨害して、効果的にグリコシルリンク基を因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドまたはペプチド複合体に付加することを停止する。最も重要なことに、反応混合物に付加されたシアル酸は未グリコＰＥＧ化グリカンをキャップし、これにより向上した薬物動態を有する因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を提供する。さらに、このシアリダーゼは、一定の量のＰＥＧ化量が所望される場合、グリコＰＥＧ化反応混合物に直接的に事前の精製無しで添加されることが可能である。
【０４００】
例示的な実施形態において、キャッピングステップの後、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドまたはペプチド複合体のシアル化部位の約５０％未満がシアリル部分を含まない。例示的な実施形態において、キャッピングステップの後、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドまたはペプチド複合体のシアル化部位の約４０％未満がシアリル部分を含まない。例示的な実施形態において、キャッピングステップの後、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドまたはペプチド複合体のシアル化部位の約３０％未満がシアリル部分を含まない。例示的な実施形態において、キャッピングステップの後、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドまたはペプチド複合体のシアル化部位の約２０％未満がシアリル部分を含まない。例示的な実施形態において、キャッピングステップの後、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドまたはペプチド複合体のシアル化部位の約１０％未満がシアリル部分を含まない。例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドまたはペプチド複合体のシアル化部位の約２０％および約５％がシアリル部分を含まない。例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドまたはペプチド複合体のシアル化部位の約２５％および約１０％がシアリル部分を含まない。例示的な実施形態において、キャッピングステップの後、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドまたはペプチド複合体の基本的にすべてのシアル化部位がシアリル部分を含む。
【０４０１】
ＩＩＩ．Ｃ．因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの脱シアル化および選択的修飾
他の例示的な実施形態において、本発明は、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを脱シアル化する方法を提供する。本方法は、好ましくは、少なくとも約４０％、好ましくは４５％、好ましくは約５０％、好ましくは約５５％、好ましくは約６０％、好ましくは約６５％、好ましくは約７０％、好ましくは約７５％、好ましくは約８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは、少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９４％、さらにより好ましくは少なくとも９６％、なおより好ましくは少なくとも９８％、およびなおより好ましくは１００％脱シアル化された因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを提供する。
【０４０２】
本方法は、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドをシアリダーゼと、好ましくは一定の時間接触させるステップを含む。因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを、所望の程度に脱シアル化する予め選択された時間が十分である。好ましい実施形態において、脱シアル化因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドは脱シアル化の所望の程度が達成されたらシアリダーゼから分離される。例示的な脱シアル化反応および精製サイクルは本願明細書に記載されている。
【０４０３】
当業者は、脱シアル化反応を実施する適切な予め選択された時間を決定できる。例示的な実施形態において、時間は２４時間未満、好ましくは８時間未満、より好ましくは６時間未満、より好ましくは４時間未満、なおより好ましくは２時間未満およびさらにより好ましくは未満１時間である。
【０４０４】
他の例示的な実施形態において、脱シアル化反応の最後での因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａ調製において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの固体群のメンバーの少なくとも１０％は、これに結合するシアル酸を１つだけ有し、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、なおより好ましくは少なくとも４０％、さらになおより好ましくは少なくとも５０％およびより好ましくは少なくとも６０％、およびなおより好ましくは完全に脱シアル化されている。
【０４０５】
さらなる例示的な実施形態において、脱シアル化反応の最後での因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａ調製において、少なくとも１０％の、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、なおより好ましくは少なくとも５０％およびさらになおより好ましくは少なくとも６０％の因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの固体群のメンバーが完全に脱シアル化されている。
【０４０６】
さらなる他の例示的な実施形態において、脱シアル化反応の最後での因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａ調製において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド固体群のメンバーの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または６０％は、単一のシアル酸のみを有し、および因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または６０％が完全に脱シアル化されている。
【０４０７】
好ましい実施形態において、脱シアル化反応の最後での因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａ調製において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの固体群の少なくとも５０％が脱シアル化されており、および因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド固体群のメンバーの少なくとも４０％が単一のシアル酸部分のみを有する。
【０４０８】
脱シアル化に続いて、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドは、任意により修飾糖質と複合化される。例示的な修飾糖質は、分岐または直鎖ポリ（エチレングリコール）部分に結合した糖部分を含む。複合化は、修飾糖質を修飾糖質ドナーから因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に転移させる酵素によって触媒される。例示的な修飾糖質ドナーは、分岐または直鎖ポリ（エチレングリコール）部分を有するＣＭＰ−シアル酸である。例示的なポリ（エチレングリコール）部分は、少なくとも約２ＫＤａ、より好ましくは少なくとも約５ＫＤａ、より好ましくは少なくとも約１０ＫＤａ、好ましくは少なくとも約２０ＫＤａ、より好ましくは少なくとも約３０ＫＤａ、およびより好ましくは少なくとも約４０ＫＤａの分子量を有する。
【０４０９】
例示的な実施形態において、修飾糖質部分の修飾糖質ドナーからの転移に用いられる酵素はグリコシルトランスフェラーゼ、例えば、シアリルトランスフェラーゼである。本発明の方法において用いられる例示的なシアリルトランスフェラーゼはＳＴ３Ｇａｌ３である。
【０４１０】
本発明の例示的な方法は、少なくとも一つ、好ましくは少なくとも二つ、好ましくは少なくとも三つの修飾基を有する修飾因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドをもたらす。一実施形態において、生成された因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドは、単一の修飾基を因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの軽鎖上に有する。他の実施形態において、本方法は、単一の修飾基を重鎖上に有する修飾因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを提供する。さらなる他の実施形態において、本方法は、単一の修飾基を軽鎖上におよび単一の修飾基を重鎖上に有する修飾因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを提供する。
【０４１１】
他の態様において、本発明は、修飾因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを調製する方法を提供する。本方法は、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを、修飾基を有する修飾糖質ドナーおよび修飾糖質部分を修飾糖質ドナーからペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基上に転移させることが可能である酵素に接触させるステップを含む。
【０４１２】
例示的な実施形態において、本方法は、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％およびさらにより好ましくは少なくとも８０％の固体群メンバーが因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの軽鎖にモノ−複合化された、修飾因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの固体群を提供する。
【０４１３】
例示的な実施形態において、本方法は、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％およびさらにより好ましくは少なくとも８０％の固体群メンバーが因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの軽鎖にジ−複合化された、修飾因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの固体群を提供する。
【０４１４】
この態様の例示的な実施形態において、本方法は、５０％以下、好ましくは３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下の固体群メンバーが因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの重鎖にモノ−複合化された、修飾因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの固体群を提供する。
【０４１５】
この態様の例示的な実施形態において、本方法は、５０％以下、好ましくは３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下の固体群メンバーが因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの重鎖にジ−複合化された、修飾因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドの固体群を提供する。
【０４１６】
因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドは、接触ステップの前にシアリダーゼの作用に供されることが可能であり、またはこのペプチドは、事前の脱シアル化無しで用いられることが可能である。ペプチドがシアリダーゼと接触されるとき、基本的に完全に脱シアル化されるか、または部分的にのみ脱シアル化されていることが可能である。好ましい実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドは、接触ステップの前に少なくとも部分的に脱シアル化される。因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドは、基本的に完全に脱シアル化（基本的にアシアロ）されるか、または部分的にのみ脱シアル化され得る。好ましい実施形態において、脱シアル化因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドは、本願明細書上述の脱シアル化実施形態の一つである。
【０４１７】
ＩＩＩ．Ｄ．因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の合成に添加される試薬の追加のアリコート
本願明細書に記載のペプチド複合体の合成の例示的な実施形態において、反応成分／試薬の一つ以上の追加のアリコートが、選択された時間の後に反応混合物に添加される。例示的な実施形態において、ペプチド複合体は因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体である。他の例示的な実施形態において、添加される反応成分／試薬は修飾糖質ヌクレオチドである。修飾糖質ヌクレオチドの反応への導入は、グリコＰＥＧ化反応を完了へ導く可能性を高めるであろう。例示的な実施形態において、ヌクレオチド糖質は、本願明細書に記載のＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧである。例示的な実施形態において、添加される反応成分／試薬はシアリダーゼである。例示的な実施形態において、添加される反応成分／試薬は、グリコシルトランスフェラーゼである。例示的な実施形態において、添加される反応成分／試薬はマグネシウムである。例示的な実施形態において、添加される追加のアリコートは、反応の開始時に添加された元の量の約１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％または９０％を表す。例示的な実施形態において、反応成分／試薬は、開始から約３時間、または６時間、または８時間、または１０時間、または１２時間、または１８時間、または２４時間、または３０時間、または３６時間後に反応に添加される。
【０４１８】
ＩＩＩ．Ｅ．軽鎖ＰＥＧ化因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の選択的生成
例示的な実施形態において、本発明は、重鎖上の軽鎖で修飾された因子ＶＩＩａペプチド複合体の産生を増加させる方法を提供する。この方法は重鎖の失活または隔離を含み、これにより、グリコＰＥＧ化を軽鎖上で優先的に生じさせる。因子ＶＩＩａの重鎖のセリンプロテアーゼ活性は、この隔離に基づいて利用されることが可能である。ベンズアミジンマトリックスおよび／またはセリンプロテアーゼについての擬似アフィニティー樹脂をグリコＰＥＧ化反応混合物に添加することで、重鎖の隔離をもたらす一方で、グリコＰＥＧ化が軽鎖上で進行する。軽鎖は、次いで、重鎖から、当該技術分野において公知である標準的な技術により精製されることが可能である。重鎖は、ベンズアミジンの付加によりマトリックスから除去されることが可能であり、または樹脂から、溶液のｐＨを低下させることにより除去されることが可能である。このステップで導入されるベンズアミジン不純物は、ダイアフィルトレーションにより除去されることが可能である。
【０４１９】
ＩＩＩ．Ｅ．因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の精製
上記プロセスによって生成される生成物は、精製せずに用いられることが可能である。しかしながら、通常は、生成物および一種以上の中間体、例えば、ヌクレオチド糖質、分岐および直鎖ＰＥＧ種、修飾糖質および修飾ヌクレオチド糖質を回収することが好ましい。薄層または厚層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、またはメンブランろ過などのグリコシル化ペプチドの回収のための標準的な周知技術を用いることが可能である。メンブランろ過を用いることが好ましく、より好ましくは逆浸透圧メンブラン、または本願明細書中後述におよび本願明細書に引用される文献中に考察されるとおり、回収のための一種以上のカラムクトマトグラフィー技術を用いることが好ましい。例えば、メンブランが、約３０００〜約１０，０００の分子量カットオフを有するメンブランろ過が、グリコシルトランスフェラーゼなどのタンパク質の除去に用いられることが可能である。場合によっては、不純物および生成物間の分子量カットオフ差が、生成物の精製を確実にするために利用されることとなる。例えば、因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ＫＤａ生成物を未反応ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ＫＤａから精製するためには、例えば、因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ＫＤａを濃縮水中に残留させる一方で、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ＫＤａを濾液中に流出させるフィルタが選択されなければならない。ナノろ過または逆浸透法が、次いで、塩を除去するためにおよび／または生成物サッカライドを精製するために用いられることが可能である（例えば、国際公開第９８／１５５８１号パンフレットを参照のこと）。ナノろ過メンブランは、単価の塩を通過させるが、多価塩および用いられるメンブランに応じて約１００〜約２，０００ダルトンより大きい未荷電の溶質を保持する逆浸透法メンブランのクラスである。それ故、典型的な用途において、本発明の方法によって調製されたサッカライドは、メンブラン中に保持され、汚染源の塩は通過されることとなる。
【０４２０】
ペプチドが細胞内で産生される場合には、第１のステップとして、宿主細胞または溶解した断片といった微粒子状デブリが除去される。グリコＰＥＧ化に続いて、ＰＥＧ化ペプチドが、例えば、遠心分離または限外ろ過といった技術分野において認識された方法によって精製され、任意により、タンパク質が、市販されているタンパク質濃度フィルタで濃縮され得、続いて、ポリペプチド変異体が他の不純物から、免疫親和性クロマトグラフィー、イオン交換カラム分別（例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）またはカルボキシメチルまたはスルホプロピル基含有マトリックスで）；ブルー−セファロース、ＣＭブルー−セファロース、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンチルレクチン−セファロース、ＷＧＡ−セファロース、Ｃｏｎ  Ａ−セファロース、エーテルトーヨーパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）、ブチルトーヨーパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）、フェニルトーヨーパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）、またはタンパク質Ａセファロースでのクロマトグラフィー；ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー；シリカクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；逆相ＨＰＬＣ（例えば付随脂肪族基を有するシリカゲル）；例えばセファデックス分子ふるいを用いるゲルろ過；またはサイズ−排除イオンクロマトグラフィー；ポリペプチド、およびエタノールまたは硫酸アンモニウム沈殿物と選択的に結合するカラムでのクロマトグラフィーから選択される一つ以上のステップにより分離される。精製は、本セクションにおいて後にさらに記載されるとおり、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の一方の鎖を他方の鎖から分離するのに用いられることが可能である。
【０４２１】
培養において産生された修飾グリコペプチドは、通常は、細胞、酵素等からの初期抽出、これに続く、濃度、塩析、水性イオン交換、またはサイズ−排除イオンクロマトグラフィーステップの一つ以上により単離される。さらに、修飾糖タンパク質は、親和性クロマトグラフィーにより精製され得る。最後に、ＨＰＬＣが最終精製ステップに利用され得る。
【０４２２】
プロテアーゼ抑制剤が、前述のステップのいずれかにおいて、タンパク質分解および抗生物質を阻害するために含まれていてもよく、または防腐剤が外来性汚染物の増殖を防止するために含まれていても良い。前述のステップにおいて用いられるプロテアーゼ抑制剤は、アンチパイン、α−１−アンチトリプシン、抗トロンビン、ロイペプチン、アマスタチン、キモスタチン、ベンズアミジン、ならびに他のセリンプロテアーゼ抑制剤（すなわちセルピン）を含む低分子量抑制剤であり得る。一般的には、セリンプロテアーゼ抑制剤は、０．５〜１００μＭの範囲の濃度で用いられるべきであるが、細胞培養中のキモスタチンは、２００μＭを超える濃度で用いられ得る。他のセリンプロテアーゼ抑制剤は、キモトリプシン様、サブチリシン様、α／βヒドロラーゼ、またはセリンプロテアーゼのシグナルペプチダーゼｃｌａｎに対して特異的な抑制剤を含むであろう。セリンプロテアーゼの他、他のタイプのプロテアーゼ抑制剤もまた用いられ得、システインプロテアーゼ抑制剤（１〜１０μＭ）およびアスパラギン酸プロテアーゼ抑制剤（１−５μＭ）、ならびにペプスタチンなどの非特異的プロテアーゼ抑制剤（．１〜５μＭ）が挙げられる。本発明において用いられるプロテアーゼ抑制剤はまた、ヒルから単離されたヒルスタシン（ｈｉｒｕｓｔａｓｉｎ）抑制剤などの天然プロテアーゼ抑制剤を含み得る。いくつかの実施形態において、プロテアーゼ抑制剤は、プロテアーゼ触媒部位に特異的に結合して、グリコＰＥＧ化反応での干渉無しで因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａを安定化させることができる合成ペプチドまたは抗体を含むであろう。
【０４２３】
他の実施形態中において、本発明の修飾グリコペプチドを産生する系からの上澄は、先ず、市販されているタンパク質濃度フィルタ、例えば、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）またはミリポアペリコン（  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）限外ろ過ユニットを用いて濃縮される。濃縮ステップに続いて、濃縮物は、好適な精製マトリックスに適用され得る。例えば、好適な親和性マトリックスは、ペプチドについてのリガンド、好適な支持体に結合したレクチンまたは抗体分子を含み得る。あるいは、アニオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ側基を有するマトリックスまたは基質を利用し得る。好適なマトリックスとしては、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製において通常用いられる他のタイプが挙げられる。あるいは、カチオン−交換ステップが利用され得る。好適なカチオン交換体としては、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが挙げられる。スルホプロピル基が特に好ましい。
【０４２４】
精製において用いられ得る他の方法としては、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびブルーセファロースでのクロマトグラフィーが挙げられる。これらの方法および他の有用な方法が、共譲渡された米国仮特許出願（２００５年５月６日出願の代理人整理番号第４０８５３−０１−５１６８−Ｐ１）に例示されている。
【０４２５】
疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えば、メチル側基または他の脂肪族側基を有するシリカゲルを利用する一つ以上のＲＰ−ＨＰＬＣステップが、ポリペプチド複合体組成物をさらに精製するために用いられ得る。前述の精製ステップのいくつかまたはすべてがまた、種々の組み合わせで、均質なまたは基本的に均質な修飾糖タンパク質を提供するために利用されることが可能である。
【０４２６】
大規模発酵からもたらされる本発明の修飾グリコペプチドは、ウルダル（Ｕｒｄａｌ）ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１（１９８４年）により開示されているものと類似の方法により精製され得る。この文献は、組み換え型ヒトＩＬ−２の分取ＨＰＬＣカラムでの精製についての、２つの連続的な、ＲＰ−ＨＰＬＣステップを記載する。あるいは、親和性クロマトグラフィーなどの技術が修飾糖タンパク質の精製に用いられ得る。
【０４２７】
例示的な実施形態において、精製は、２００５年３月２４日出願の所有者が共通の、共譲渡済みの米国仮特許出願第６０／６６５，５８８号明細書に記載の方法により達成される。
【０４２８】
本発明によれば、連続的な脱シアル化または同時的なシアル化の一方を介して生成された、ペグ化ペプチド、例えば、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩａペプチドまたはペプチド複合体は、塩化マグネシウム勾配を用いることにより精製されまたは分離されることが可能である。
【０４２９】
例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体は、軽鎖および重鎖に分離されることが可能であり、および一方の鎖が他方から精製されることが可能である。他の例示的な実施形態において、生成物における因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の少なくとも８０％が因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の軽鎖部分である生成物が得られる。他の例示的な実施形態において、生成物における因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の少なくとも９０％が因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の軽鎖部分である生成物が得られる。他の例示的な実施形態において、生成物における因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の少なくとも９５％が因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の軽鎖部分である生成物が得られる。他の例示的な実施形態において、生成物における因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の基本的にすべてが因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の軽鎖部分である生成物が得られる。この生成物は、本発明のいずれの化合物についても可能である。
【０４３０】
他の例示的な実施形態において、生成物における因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の少なくとも８０％が因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の重鎖部分である生成物が得られる。他の例示的な実施形態において、生成物における因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の少なくとも９０％が因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の重鎖部分である生成物が得られる。他の例示的な実施形態において、生成物における因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の少なくとも９５％が因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の重鎖部分である生成物が得られる。他の例示的な実施形態において、生成物における因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の基本的にすべてが因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の重鎖部分である生成物が得られる。この生成物は、本発明のいずれの化合物についても可能である。
【０４３１】
ＩＩＩ．Ｆ．因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａ複合体の特性
例示的な実施形態において、本発明の因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体は、未変性因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドと基本的に同一の生化学的特性を有する（例えば凝固）。例示的な実施形態において、本発明の因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体は、ＰＥＧ化の部位、付加されたＰＥＧのサイズおよび付加されたＰＥＧの数に応じて、未変性因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドより、低減された、または増加された生化学的特性を有する（例えば凝固）。
【０４３２】
因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体は、血液凝固プロセスに関与する。例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体は、未変性因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａの、約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％、または約４５％、または約５０％、または約５５％、または約６０％、または約６５％、または約７０％、または約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５％の凝固活性を保持する。
【０４３３】
因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体は、アミド分解活性を有する。例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体は、未変性因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａの、約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％、または約４５％、または約５０％、または約５５％、または約６０％、または約６５％、または約７０％、または約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５％のアミド分解活性を保持する。
【０４３４】
因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体は因子Ｘを因子Ｘａに転化することが可能である。例示的な実施形態において、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体は、未変性因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａの、約２０％、または約２５％、または約３０％、または約３５％、または約４０％、または約４５％、または約５０％、または約５５％、または約６０％、または約６５％、または約７０％、または約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５％の因子Ｘ転化活性を保持する。
【０４３５】
ＩＶ．医薬品組成物
他の態様において、本発明は医薬品組成物を提供する。医薬品組成物は、薬学的に許容可能な希釈剤、および非天然に生じる、ＰＥＧ部分、治療的部分または生体分子およびグリコシル化または非グリコシル化ペプチド間の共有結合複合体を含む。ポリマー、治療的部分または生体分子は、ペプチドに、ペプチドおよびポリマー、治療的部分または生体分子の両方の間に介在されおよびこの両方を共有結合する無処置グリコシルリンク基を介して複合化される。
【０４３６】
本発明の医薬品組成物は、多様な薬物送達系における使用について好適である。本発明における使用に好適な配合物は、レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）の「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルベニア州フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）、第１７版（１９８５年）に見出される。薬物送達の方法の簡潔な概説については、ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２４９：第１５２７〜１５３３ページ（１９９０年）を参照のこと。
【０４３７】
例示的な実施形態において、医薬品配合物は、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体と、塩化ナトリウム、塩化カルシウム二水和物、グリシルグリシン、ポリソルベート８０、およびマンニトールから選択されるメンバーである薬学的に許容可能な希釈剤とを含む。他の例示的な実施形態において、薬学的に許容可能な希釈剤は塩化ナトリウムおよびグリシルグリシンである。他の例示的な実施形態において、薬学的に許容可能な希釈剤は塩化カルシウム二水和物およびポリソルベート８０である。他の例示的な実施形態において、薬学的に許容可能な希釈剤はマンニトールである。
【０４３８】
医薬品組成物は、例えば、局所的、経口、鼻の、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下または筋肉内投与を含む投与のいずれかの適切な方式のために配合され得る。皮下注入などの非経口的な投与について、キャリアは、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックスまたは緩衝液を含む。経口投与について、上記キャリアのいずれかまたは、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウムなどの固体キャリアが用いられ得る。生分解性微小球（例えば、ポリラクテートポリグリコレート）がまた、本発明の医薬品組成物についてのキャリアとして用いられ得る。好適な生分解性微小球が、例えば米国特許第４，８９７，２６８号明細書および同第５，０７５，１０９号明細書に開示されている。
【０４３９】
普通、医薬品組成物は、非経口的、例えば静脈内で投与される。それ故、本発明は、許容可能なキャリア、好ましくは水性キャリア、例えば、水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ等中に溶解されたか、または懸濁された化合物を含む非経口的な投与についての組成物を提供する。この組成物は、ｐＨ調整および緩衝液、張度調整剤、湿潤剤、洗剤等などの生理学的条件に近づけるのに必要な薬学的に許容可能な補助物質を含有し得る。
【０４４０】
これらの組成物は、従来の滅菌技術により滅菌され得、または無菌ろ過され得る。得られる水溶液は、そのまま用いられるようにパッケージされ得、または凍結乾燥されて、この凍結乾燥調製物が無菌水性キャリアと投与の前に組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には、３および１１、より好ましくは５〜９および最も好ましくは７および８の間となるであろう。
【０４４１】
いくつかの実施形態において、本発明のグリコペプチドは、標準的な小水疱形成性脂質から形成されたリポソーム中に組み込まれることが可能である。多様な方法が、例えば、スゾカ（Ｓｚｏｋａ）ら、「Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．」９：４６７（１９８０年）、米国特許第４，２３５，８７１号明細書、同第４，５０１，７２８号明細書および同第４，８３７，０２８号明細書に記載のとおりリポソームの調製に利用可能である。多様な標的指向化剤（例えば、本発明のシアリルガラクトシド）を用いるリポソームの標的指向化が当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号明細書および同第４，６０３，０４４号明細書を参照のこと）。
【０４４２】
標的指向化剤をリポソームにカップリングするための標準的な方法が用いられることが可能である。これらの方法は、一般的には、標的指向化剤、または本発明の脂質由来グリコペプチドなどの誘導親油性化合物の結合のために活性化されることが可能である、ホスファチジルエタノールアミンなどの脂質構成成分のリポソームへの組み込みを含む。
【０４４３】
標的指向化メカニズムは、一般的には、例えば細胞表面受容体といった標的との相互作用のために標的部分が利用可能であるような方式で、標的指向化剤がリポソームの表面上に位置されることを必要とする。本発明の炭水化物は、当業者に公知の方法を用いてリポソームが形成される前に脂質分子に結合され得る（例えば、炭水化物上に存在するヒドロキシル基の、それぞれ、長鎖ハロゲン化アルキルまたは脂肪酸でのアルキル化またはアシル化）。あるいは、リポソームは、コネクタ部分が、先ず、メンブランの形成時にメンブランに組み込まれるような方法で仕上げられ得る。コネクタ部分は、親油性部分を有していなければならず、これが、メンブランに強固に埋め込まれおよび固着される。これはまた、反応性部分を有していなければならず、これが、リポソームの水性表面上で化学的利用可能である。反応性部分は、安定な化学的結合を標的指向化剤または後に添加される炭水化物と形成するに化学的に好適であるよう選択される。ある場合には、標的指向化剤をコネクタ分子に直接的に結合することが可能であるが、ほとんどの場合、化学的橋架として第３の分子を用いることがより好適であり、これにより、メンブラン中のコネクタ分子と、小水疱表面から三次元的に延長された標的指向化剤または炭水化物とがリンクされる。
【０４４４】
本発明の方法によって調製される化合物はまた、診断上の試薬としての使用が見出され得る。例えば、標識化化合物は、炎症を疑われる患者における炎症または腫瘍転移領域の検出に用いられることが可能である。この使用については、化合物は、１２５Ｉ、１４Ｃ、または三重水素で標識化されることが可能である。
【０４４５】
本発明の医薬品組成物において用いられる活性メンバーは、血液凝固産生を刺激する生物学的特性を有する因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体である。好ましくは、因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体は、非経口的（例えばＩＶ、ＩＭ、ＳＣまたはＩＰ）に投与される。有効投与量は、治療される状態および投与経路に依存して著しく異なることが想定されるが、活性材料の約０．１（約７Ｕ）〜１００（約７０００Ｕ）μｇ／ｋｇ体重の範囲であると想定される。貧血性状態の処置についての好ましい投与量は、約５０〜約３００単位／ｋｇを１週間に３回である。本発明は、増強されたインビボ滞留時間を有する因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを含む物質の組成物を提供するため、本発明の組成物が投与されるとき、規定の投与量は、任意により低減される。
【０４４６】
本発明の組成物の調製において用いられる種についての調製方法は、一般的には、例えば、米国特許出願公開第２００４０１３７５５７号明細書；国際公開第０４／０８３２５８号パンフレット；および国際公開第０４／０３３６５１号パンフレットといった種々の特許公開に規定されている。以下の実施例は、本発明の複合体および方法を例示するために提供されているが、本発明の特許請求の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【０４４７】
実施例
実施例１
因子ＶＩＩａの脱シアル化。
血清−遊離媒体中に発現した因子ＶＩＩａ、媒体を含有する血清中に産生した因子ＶＩＩａ、および三種の因子ＶＩＩａ変異体Ｎ１４５Ｑ、Ｎ３２２Ｑ、およびアナログＤＶＱ（Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ）。
【０４４８】
酵素的脱シアル化のための調製において、因子ＶＩＩａを、ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６中に、一晩、４℃で、１０ＫＤａのＭＷＣＯと共にスネークスキン透析チューブ中で透析した。因子ＶＩＩａ（１ｍｇ／ｍＬ）の脱シアル化を、アルスロバクターウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））からの１０Ｕ／Ｌ可溶性シアリダーゼと共に、３２℃で１８時間、交換緩衝液中で実施した。
【０４４９】
実施例２
因子ＶＩＩａのシアリル−ＰＥＧ化。
シアリル−ＰＥＧ化（「グリコＰＥＧ化」）を、アシアロ−因子ＶＩＩａ（１ｍｇ／ｍＬ）に、１００Ｕ／Ｌ  ＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩＩおよび２００μＭ  ＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧ（４０ＫＤａ、２０ＫＤａ、１０ＫＤａ、５ＫＤａ、および２ＫＤａ）と共に、３２℃で、脱シアル化緩衝液中に２〜６時間実施した。適切な反応時間の経過後、ＰＥＧ化サンプルを直ぐに精製して、さらなるグリコＰＥＧ化を最低限とした。
【０４５０】
グリコＰＥＧ化因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａを、シアル酸でキャップされたサンプルでキャップするために、シアリダーゼを、先ず、以下に示すとおり、アシアロ−因子ＶＩＩａから、アニオン交換クロマトグラフィーにより除去した。過剰量のＣＭＰ−シアル酸（５ｍＭ）を添加し、３２℃で２時間インキュベートし、グリコＰＥＧ化因子ＶＩＩａをシアル酸でキャッピングした。因子ＶＩＩａのシアリル−ＰＥＧ化形態を、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により説明されているとおり、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（トリス−グリシンゲルおよび／またはＮｕＰＡＧＥゲル）およびコロイド状青色染色キットにより分析した。
【０４５１】
実施例３
ＰＥＧ化因子ＶＩＩａの精製。
因子ＶＩＩａのグリコＰＥＧ化サンプルを、修飾アニオン交換法で精製した。サンプルは５℃で扱った。カラムを充填する直前に、１ｇのキレックス（Ｃｈｅｌｅｘ）１００（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ））／１０ｍＬ因子ＶＩＩａ溶液を、再構築したサンプルに添加した。１０分間攪拌した後、懸濁液を、セルロースアセテートメンブラン（０．２μｍ）で、バキュームシステムを用いてろ過した。フィルタ上に残留したキレート剤樹脂を、１〜２ｍＬ水／１０ｍＬバルクで１回洗浄した。濾液の導電率を５℃で１０ｍＳ／ｃｍに調整し、および必要であればｐＨ８．６に調整した。
【０４５２】
アニオン交換を８〜１０℃で実施した。ＱセファロースＦＦを含有するカラムを、１Ｍ  ＮａＯＨ（１０カラム体積）、水（５カラム体積）、２Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＨＯＡｃ、ｐＨ３（１０カラム体積）で洗浄し、１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  グリシルグリシン、ｐＨ８．６（１０カラム体積）で平衡化させることにより充填前に用意した。各ＰＥＧ化反応について、１５〜２０ｍｇ因子ＶＩＩａをＸＫ１６カラム（アマシャムバイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））に、１０ｍＬ  ＱセファロースＦＦ（２ｍｇタンパク質／ｍＬ樹脂以下）と共に、１００ｃｍ／時間の流速で充填した。２ＫＤａ直鎖ＰＥＧについて、２０ｍｇ因子ＶＩＩａを、ＸＫ２６カラム（アマシャムバイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））に、４０ｍＬ  ＱセファロースＦＦ（０．５ｍｇタンパク質／１ｍｇ樹脂）と共に、１００ｃｍ／時間の流速で充填した。
【０４５３】
充填後、カラムを、１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  グリシルグリシン、ｐＨ８．６  １０カラム体積）および５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  グリシルグリシン、ｐＨ８．６（２カラム体積）で洗浄した。溶離を、１５ｍＭ  ＣａＣｌ２のステップ勾配で、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  グリシルグリシン、１５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ８．６（５カラム体積）を用いることにより実施した。カラムを、次いで、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  グリシルグリシン、ｐＨ８．６（５カラム体積）で洗浄した。溶離液を２８０ｎｍでの吸光度で監視した。画分（５ｍＬ）を、流通および２回の洗浄の最中に採取し；２．５ｍＬ画分をＣａＣｌ２および１Ｍ塩溶離の最中に採取した。因子ＶＩＩａを含有する画分を、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（トリス−グリシンゲルおよび／またはＮＵＰＡＧＥゲル）およびコロイド状青色染色キットにより分析した。因子ＶＩＩａを有する適切な画分をプールし、およびｐＨを４Ｍ  ＨＣｌで７．２に調整した。
【０４５４】
因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａを、以下の変更を除き上記のとおり精製した。ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）をＰＥＧ化因子ＶＩＩａ溶液に添加し、ｐＨをｐＨ６に調整し、および導電率を５℃で５ｍＳ／ｃｍに調整した。約２０ｍｇの因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａを、ＸＫ１６カラム（アマシャムバイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））に、１０ｍＬポロス（Ｐｏｒｏｓ）５０ミクロンＨＱ樹脂（以下２ｍｇタンパク質／ｍＬ、樹脂）と共に、１００ｃｍ／時間の流速で充填した。充填後、カラムを、１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ヒスチジン、ｐＨ６（１０カラム体積）および５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ヒスチジン、ｐＨ６（２カラム体積）で洗浄した。溶離を、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ヒスチジン、ｐＨ６（５カラム体積）中２０ｍＭ  ＣａＣｌ２のステップ勾配で、実施した。カラムを、次いで、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ヒスチジン、ｐＨ６（５カラム体積）で洗浄した。
【０４５５】
因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａを含有するアニオン交換溶出液（２５ｍＬ）を、製造業者の説明書（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））に従ってアミコンウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）−１５  １０Ｋ遠心ろ過装置を用いることにより、５〜７ｍＬに濃縮した。濃縮に続いて、サイズ排除クロマトグラフィーを実施した。サンプル（５〜７ｍＬ）を、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  グリシルグリシン、１５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．２中に平衡化したスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００（ハイロード（ＨｉＬｏａｄ）１６／６０、プレップグレード；アマシャムバイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を含有するカラムにほとんどのＰＥＧ化変異体について充填した。因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａを、未修飾、アシアロ−因子ＶＩＩａから、１ｍＬ／分の流速で分離し、および吸光度を２８０ｎｍで監視した。因子ＶＩＩａを含有する画分（１ｍＬ）を採取し、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（トリス−グリシンゲルおよび／またはＮｕＰＡＧＥゲル）およびコロイド状青色染色キットで分析した。標的とされたＰＥＧ化アイソフォームを含有すると共に未修飾、アシアロ−因子ＶＩＩａを欠く画分をプールし、１ｍｇ／ｍＬに、アミコンウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）−１５  １０Ｋ遠心ろ過装置を用いて濃縮した。タンパク質濃度を、１．３７（ｍｇ／ｍＬ）−１ｃｍ−１の吸光係数を用いて２８０ｎｍでの吸光度読取値から測定した。
【０４５６】
実施例４
逆相ＨＰＬＣ分析によるＰＥＧ化アイソフォームの判定。
ＰＥＧ化因子ＶＩＩａを、逆相カラム（ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）３００ＳＢ−Ｃ３、５μｍ粒径、２．１×１５０ｍＭ）でのＨＰＬＣにより分析した。溶離液は、Ａ）水中の０．１ＴＦＡおよびＢ）アセトニトリル中の０．０９％ＴＦＡとした。検出は２１４ｎｍであった。勾配、流速、およびカラム温度は、ＰＥＧ長さに依存する（４０ＫＤａ、２０ＫＤａ、および１０ＫＤａ  ＰＥＧ：３０分で３５〜６５％Ｂ、０．５ｍＬ／分、４５℃；１０ＫＤａ  ＰＥＧ：３０分で３５〜６０％Ｂ、０．５ｍＬ／分、４５℃；５ＫＤａ：４０分で４０〜５０％Ｂ、０．５ｍＬ／分、４５℃；２ＫＤａ：６７分で３８〜４３％Ｂ、０．６ｍＬ／分、５５℃）。各ピークの同一性を、未変性因子ＶＩＩａの既知の滞留時間、単離されたピークのＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動、単離されたピークのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル、および結合しているＰＥＧの数の増加を伴う各ピークの滞留時間の秩序だった進行の、４つの異なるエビデンスの一部の２つ以上を基準として特定した。
【０４５７】
実施例５
逆相ＨＰＬＣによるＰＥＧ結合部位の判定。
因子ＶＩＩａおよびＰＥＧ化因子ＶＩＩａ変異体を、サンプル（１ｍｇ／ｍＬの濃度で１０μＬ）を、還元性緩衝液（４０μＬ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  グリシルグリシン、１５ｍＭ  ＥＤＴＡ、８Ｍ  尿素、２０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８．６）と、１５分、室温で混合することにより還元した。水（５０μＬ）を添加し、サンプルを、ＨＰＬＣ上に注入されるまで４℃に冷却した（＜１２時間）。ＨＰＬＣカラム、溶離液、および検出は、非還元サンプルについての上記のとおりとした。流速は０．５ｍＬ／分、９０分で勾配は３０〜５５％Ｂであり、９０％Ｂ以下の簡単な洗浄サイクルを続けた。各ピークの同一性を、実施例４に記載のとおり割当てた。
【０４５８】
実施例６
因子ＶＩＩａ凝固アッセイ。
ＰＥＧ化サンプルおよび標準を、重複してテストし、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％  ＢＳＡ（ｗｔ／ｖｏｌ）、５０ｍＭ  トリス、ｐＨ７．４中に希釈した。標準およびサンプルを０．１〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲にわたって検査した。同体積の希釈した標準およびサンプルを、因子ＶＩＩａ欠乏プラズマ（ダイアグノースティカスタゴ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ））と混合し、これらを検査する前に氷上に４時間以内で保管した。
【０４５９】
凝固時間を、ＳＴａｒｔ４凝固測定機（ダイアグノースティカスタゴ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ））で計測した。凝固測定機で、サンプルキュベット中の磁性ボールの穏やかな前後方向の移動の停止によって示される、インビトロ凝固が形成されるまでの経過時間を計測した。
【０４６０】
各キュベットに、１つの磁性ボールを置き、さらに、１００μＬ因子ＶＩＩａサンプル／欠乏プラズマおよび１００μＬの希釈ラット脳セファリン溶液（氷上に４時間以内で保管した）を入れた。各試薬を、各ウェルに５秒間の間隔で添加し、および最終混合物を３００秒、３７℃でインキュベートした。希釈したラット脳セファリン（ＲＢＣ）溶液を、２ｍＬＲＢＣストック溶液（ヘマケム（Ｈａｅｍａｃｈｅｍ）製の１バイアルＲＢＣストック、および１０ｍＬの１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）および４ｍＬ  １００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％  ＢＳＡ（ｗｔ／ｖｏｌ）、５０ｍＭ  トリス、ｐＨ７．４から形成した。
【０４６１】
３００秒、可溶性組織因子（２μｇ／ｍＬ；アミノ酸１〜２０９）の１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％  ＢＳＡ（ｗｔ／ｖｏｌ）、５０ｍＭ  トリス、ｐＨ７．４中の予め加熱した（３７℃）溶液の１００μＬの添加によりアッセイを開始した。再度、この次の溶液を、サンプル毎に５秒の間隔で添加した。
【０４６２】
希釈した標準からの凝固時間を用いて検量線を生成した（ｌｏｇ凝固時間対ｌｏｇ因子ＶＩＩａ濃度）。得られた直鎖の曲線からの回帰を用いて、ＰＥＧ化変異体の相対的な凝固活性を判定した。ＰＥＧ化因子ＶＩＩａ変異体を、因子ＶＩＩａのアリコートストックと比較した。
【０４６３】
実施例７
ＢＨＫ細胞中で産生した組み換え型因子ＶＩＩａのグリコＰＥＧ化
この実施例は、ＢＨＫ細胞において形成した組み換え型因子ＶＩＩａのＰＥＧ化を規定する。
【０４６４】
アシアロ−因子ＶＩＩａの調製。組み換え型因子ＶＩＩａをＢＨＫ細胞（ベビーハムスター腎臓細胞）中に産生させた。因子ＶＩＩａ（１４．２ｍｇ）を１ｍｇ／ｍＬで緩衝溶液（ｐＨ７．４、０．０５Ｍトリス、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００１Ｍ  ＣａＣｌ２、０．０５％ＮａＮ３）中に溶解させ、３００ｍＵ／ｍＬシアリダーゼ（コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ））−アガロース複合体と共に、３日間、３２℃でインキュベートした。反応を監視するために、反応の少量のアリコートを適切な緩衝液で希釈し、およびＩＥＦゲルをインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）手法（図１５７）に従って実施した。混合物を３，５００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを採取した。樹脂を、上記緩衝溶液（ｐＨ７．４、０．０５Ｍトリス、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３）で３回（３×２ｍＬ）洗浄し、組み合わせた洗浄物をセントリコン−プラス（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−Ｐｌｕｓ）−２０中で濃縮した。残った溶液を、０．０５Ｍトリス（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３で１４．４ｍＬの最終体積に緩衝液交換した。
【０４６５】
因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−１ＫＤａおよび因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａの調製。因子ＶＩＩａ溶液の脱シアル化を２つの等量の７．２ｍＬサンプルに分けた。各サンプルに、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１ＫＤａ（７．４ｍｇ）またはＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａ（７．４ｍｇ）の一方を添加した。ＳＴ３Ｇａｌ３（１．５８Ｕ）を両方のチューブに添加し、反応混合物を３２℃で９６時間インキュベートした。反応を、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により説明された試薬および条件を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより監視した。反応が完了したら、反応混合物をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．１）を用いるトーソー（Ｔｏｓｏ）Ｈａａｓ  ＴＳＫ−ゲル−３０００分取カラムを用いて精製し、および画分をＵＶ吸収に基づいて採取した。生成物を含有する組み合わせた画分を、４℃で、セントリコン−プラス（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−Ｐｌｕｓ）−２０遠心ろ過（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ））中に濃縮し、濃縮した溶液を再配合して１．９７ｍｇ（ビシンコニン酸タンパク質アッセイ、ＢＣＡアッセイ、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））の因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧを得た。反応の生成物を、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）提供の手法および試薬に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＥＦ分析を用いて分析した。サンプルを、水に対して透析し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析した。図７は、未変性因子ＶＩＩａについてのＭＡＬＤＩ結果を示す。図８は、因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−１ＫＤａについてのＭＡＬＤＩ結果を含む。図９は、因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａについてのＭＡＬＤＩ結果を含む。図１０は、すべての反応生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を表し、因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａについてのバンドが明らかである。
【０４６６】
実施例８
因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａ：ワンポット法
因子ＶＩＩａ（５ｍｇを生成物配合物緩衝液に希釈して、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度とした）、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａ（１０ｍＭ、６０μＬ）およびクロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酵素ＳＴ３Ｇａｌ３（３３Ｕ／Ｌ）および１０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２を、１０Ｕ／Ｌ、１Ｕ／Ｌ、０．５Ｕ／Ｌまたは０．１Ｕ／Ｌのいずれかの量のシアリダーゼ（カルバイオケム（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ））と共に反応容器中に組み合わせた。成分を混合し、３２℃でインキュベートした。反応進度を、最初の４時間の間はアリコートを３０分間隔で分析することにより計測した。アリコートを、次いで、２０時間の時点で除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＰＥＧ化の程度を、１．５、２．５および３．５時間の時点で１ｍＬを除去することにより判定し、サンプルをポロ（Ｐｏｒｏｓ）５０ＨＱカラムで精製した。
【０４６７】
１０Ｕ／Ｌのシアリダーゼを含有する反応条件について、相当量の因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ生成物は形成されなかった。１Ｕ／Ｌのシアリダーゼを含有する反応条件について、反応混合物中の因子ＶＩＩａの約１７．６％が、１．５時間後、モノまたはジＰＥＧ化のいずれかであった。これが、２．５時間後には２９％に、および３．５時間後には４０．３％に増加した。０．５Ｕ／Ｌのシアリダーゼを含有する反応条件について、反応混合物中の因子ＶＩＩａの約４４．５％が、３時間後、モノまたはジＰＥＧ化のいずれかであり、０．８％がトリＰＥＧ化以上であった。２０時間後、６９．４％がモノまたはジＰＥＧ化のいずれかであり、および１８．３％がトリＰＥＧ化以上であった。
【０４６８】
０．１Ｕ／Ｌのシアリダーゼを含有する反応条件について、反応混合物中の因子ＶＩＩａの約２９．６％が、３時間後、モノまたはジＰＥＧ化のいずれかであった。２０時間後、７１．３％がモノまたはジＰＥＧ化のいずれかであり、および１５．１％がトリＰＥＧ化以上であった。
【０４６９】
結果が図１１および図１２に示されている。
【０４７０】
実施例９
システイン−ＰＥＧ２の調製（２）
【化１５１】
2009515508.tif 000153
【０４７１】
ａ．化合物１の合成
水酸化カリウム（８４．２ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、粉末として）を、Ｌ−システイン（９３．７ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）の無水メタノール（２０Ｌ）中の溶液に、アルゴン雰囲気下で添加した。混合物を室温で３０分攪拌し、次いで、分子量２０キロダルトンのｍＰＥＧ−Ｏ−トシレート（Ｔｓ；１．０ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を、数回に分けて２時間かけて添加した。混合物を室温で５日間攪拌し、ロータリー蒸発により濃縮した。残渣を水（３０ｍＬ）で希釈し、および室温で２時間攪拌して、いずれかの過剰量の２０キロダルトンｍＰＥＧ−Ｏ−トシレートを破壊した。溶液を、次いで、酢酸で中和してｐＨをｐＨ５．０に調整し、および逆相クロマトグラフィー（Ｃ−１８シリカ）カラムに充填した。カラムをメタノール／水（生成物は約７０％メタノールで溶出される）の勾配で溶出し、生成物溶離を蒸発光散乱により監視し、適切な画分を採取し、水（５００ｍＬ）で希釈した。この溶液をクロマトグラフィー（イオン交換、ＸＫ５０Ｑ、ビッグ（ＢＩＧ）ビーズ、３００ｍＬ、水酸化物形態；水対水／酢酸−０．７５Ｎの勾配）にかけ、および適切な画分のｐＨを酢酸で６．０に下げた。この溶液を、次いで、逆相カラム（Ｃ−１８シリカ）で捕獲し、上記のメタノール／水勾配で溶出した。生成物画分をプールし、濃縮し、水中に再溶解させ、凍結乾燥させて４５３ｍｇ（４４％）の白色の固体（１）を得た。
【０４７２】
化合物についての構造データは以下のとおりであった：１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；Ｄ２Ｏ）δ２．８３（ｔ，２Ｈ，Ｏ−Ｃ−ＣＨ２−Ｓ）、３．０５（ｑ，１Ｈ，Ｓ−ＣＨＨ−ＣＨＮ）、３．１８（ｑ，１Ｈ，（ｑ，１Ｈ，Ｓ−ＣＨＨ−ＣＨＮ）、３．３８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３Ｏ）、３．７（ｔ，ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、３．９５（ｑ，１Ｈ，ＣＨＮ）。生成物の純度をＳＤＳ  ＰＡＧＥにより確認した。
【０４７３】
ｂ．システイン−ＰＥＧ２（２）の合成
トリエチルアミン（約０．５ｍＬ）を、化合物１（４４０ｍｇ、２２μｍｏｌ）を溶液が塩基性になるまで無水ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）に溶解させた溶液に滴下した。２０キロダルトンｍＰＥＧ−Ｏ−ｐ−ニトロフェニルカーボネート（６６０ｍｇ、３３μｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３．６ｍｇ、３０．８μｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中の溶液を、数回に分けて１時間かけて室温で添加した。反応混合物を室温で２４時間攪拌した。溶剤を、次いで、ロータリー蒸発により除去し、残渣を水（１００ｍＬ）中に溶解し、ｐＨを１．０Ｎ  ＮａＯＨで９．５に調整した。塩基性溶液を室温で２時間攪拌し、次いで、酢酸でｐＨ７．０に中和した。溶液を、次いで、逆相クロマトグラフィー（Ｃ−１８シリカ）カラムに充填した。カラムをメタノール／水（生成物は約７０％メタノールで溶出される）の勾配で溶出し、生成物溶離を蒸発光散乱により監視し、適切な画分を採取し、水（５００ｍＬ）で希釈した。この溶液を、クロマトグラフィー（イオン交換、ＸＫ５０Ｑ、ビッグ（ＢＩＧ）ビーズ、３００ｍＬ、水酸化物形態；水対水／酢酸−０．７５Ｎの勾配）にかけ、適切な画分のｐＨを酢酸で６．０に下げた。この溶液を、次いで、逆相カラム（Ｃ−１８シリカ）で捕獲し、上記のメタノール／水の勾配で溶出した。生成物画分をプールし、濃縮し、水中に再溶解し、凍結乾燥して５７５ｍｇ（７０％）の白色の固体（２）を得た。
【０４７４】
化合物についての構造データは以下のとおりであった：１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；Ｄ２Ｏ）δ２．８３（ｔ，２Ｈ，Ｏ−Ｃ−ＣＨ２−Ｓ）、２．９５（ｔ，２Ｈ，Ｏ−Ｃ−ＣＨ２−Ｓ）、３．１２（ｑ，１Ｈ，Ｓ−ＣＨＨ−ＣＨＮ）、３．３９（ｓ，３ＨＣＨ３Ｏ）、３．７１（ｔ，ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）。生成物の純度をＳＤＳ  ＰＡＧＥにより確認した。
【０４７５】
実施例１０
因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ＫＤａ
因子ＶＩＩａのグリコＰＥＧ化（キャッピングを伴うワンポット）。因子ＶＩＩａのグリコＰＥＧ化を、脱シアル化およびＰＥＧ化が同時に生じ、シアル酸でのキャッピングが続くワンポット反応で達成した。再循環水浴により３２℃に制御したジャケット付きのガラス容器中で反応を実施した。先ず、濃縮した０．２μｍ−ろ過済因子ＶＩＩａを容器に入れ、および攪拌棒で２０分間混合することにより３２℃に加熱した。シアリダーゼの溶液を、４，０００Ｕ／Ｌの濃度で、１０ｍＭヒスチジン／５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０中の乾燥粉末から形成した。一旦因子ＶＩＩａを３２℃に再加熱したら、シアリダーゼを因子ＶＩＩａに添加し、および反応物をおよそ５分間混合して、混合を停止した後の均一な溶液を確実とした。脱シアル化を１．０時間、３２℃で進めさせた。脱シアル化反応の最中に、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ＫＤａを１０ｍＭヒスチジン／５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０緩衝液に溶解し、および濃度を２７１ｎｍでのＵＶ吸光度により判定した。ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ＫＤａが溶解した後、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ＫＤａならびにＳＴ３Ｇａｌ３を反応物に添加し、反応物をおよそ１５分間、攪拌棒で攪拌して均一な溶液を確実とした。緩衝液の８５ｍＬの追加の量を添加して、反応を１．０Ｌとした。反応物を、ＣＭＰ−ＳＡを４．３ｍＭの濃度に添加して反応物をクエンチし、残った末端ガラクトース残基をシアル酸でキャップする前に攪拌せずに２４時間進行させた。クエンチを３０分間３２℃で混合しながら進行させた。反応物の総体積はクエンチ前は１．０Ｌであった。０、４．５、７．５、および２４時間での時点のサンプル（１ｍＬ）を得、ＣＭＰ−ＳＡでクエンチし、およびＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０４７６】
因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ＫＤａの精製。キャッピングの後、溶液を、一晩４℃で保管しておいた２．０Ｌの１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０で希釈し、サンプルを、０．２μｍミリパック（Ｍｉｌｌｉｐａｋ）６０フィルタを通してろ過した。得られた充填量は３．１Ｌであった。ＡＥＸ２クロマトグラフィーを、２０〜２５℃（周囲室温で、アクタパイロット（Ａｋｔａ  Ｐｉｌｏｔ）システムで実施した。充填後、平衡緩衝液での１０カラム体積洗浄を実施し、生成物をカラムからＭｇＣｌ２の１０カラム体積勾配を用いて溶出し、未ＰＥＧ化因子ＶＩＩａからのＰＥＧ化−因子ＶＩＩａ種の分離をもたらした。このカラムについての充填物は、意図的に低く維持した、標的指向化＜２ｍｇ因子ＶＩＩａ／ｍＬ樹脂であった。選択された画分および画分のプールのＲＰ−ＨＰＬＣ分析に追加してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをバルク生成物のプールを形成するために行った。プールした画分のｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨで６．０に調整し、２〜８℃の低温室で一晩保管した。
【０４７７】
最終濃度／ダイアフィルトレーション、無菌ろ過およびアリコート化。プールした画分を、ミリパック（Ｍｉｌｌｉｐａｋ）２０  ０．２μｍフィルタを通してろ過し、２〜８℃で一晩保管した。濃度／ダイアフィルトレーションを実施するために、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）０．１ｍ２３０ＫＤａ再生セルロースメンブランを、ぜん動ポンプおよびシリコーンチューブを備えたシステム中に用いた。システムを組み立て、水でフラッシュし、次いで、０．１Ｍ  ＮａＯＨで少なくとも１時間殺菌し、次いで、０．１Ｍ  ＮａＯＨ中に、１０ｍＭヒスチジン／５ｍＭ  ＣａＣｌ２／１００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．０ダイアフィルトレーション緩衝液と平衡化させて使用する直前まで保管した。生成物を、およそ４００ｍＬに濃縮し、次いで、およそ５ダイアボリューム（ｄｉａｖｏｌｕｍｅｓ）の一定体積の緩衝液で膜分離した。生成物を、次いで、およそ３００ｍＬに濃縮し、５分間の低圧再循環の後に回収し、および５分間再循環させることにより、メンブランを２００ｍＬのダイアフィルトレーション緩衝液ですすいだ。洗浄物を生成物と共に回収し、他の５０ｍＬの緩衝液を、さらなる５分間最終の洗浄のために再循環させた。得られたバルクはおよそ５１０ｍＬであり、これを、０．２μｍ  ＰＥＳメンブラン（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を備える１Ｌ真空フィルタを通してろ過した。無菌的に−ろ過したバルクを、次いで、５０ｍＬ無菌ファルコンチューブ中に２５ｍＬアリコートで分取し、および−８０℃で凍結した。
【０４７８】
【表１】
2009515508.tif 000154
【０４７９】
２４時間後、バルク生成物ＰＥＧ−状態分布は：０．７％未ペグ化、８５．３％モノ−ペグ化、１１．５％ジ−ペグ化、および０．３％トリ−ペグ化であった。カラムクロマトグラフィーは、主に未ペグ化材料をモノ−およびジ−ペグ化種から除去することによる、生成物分布を生成するプロセスにおけるメインステップである。
【０４８０】
実施例１１
因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａ
以下の実施例は、因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａの軽および重鎖への修飾糖質結合の数を逆相ＨＰＬＣにより測定する手法を説明する。
【０４８１】
因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａを、重鎖を軽鎖から分離するために還元条件下に供した。分離の後、重鎖および軽鎖を、分離逆相ＨＰＬＣ実験に供した。未変性因子ＶＩＩａ対照のクロマトグラムにおける非修飾因子ＶＩＩａピークと相対的にそれらの位置を基準にしてピークを特定した。
【０４８２】
以下の表は、軽鎖についてのＨＰＬＣ溶剤勾配パラメータを説明する。カラム温度は３９℃であった。
【０４８３】
【表２】
2009515508.tif 000155
【０４８４】
軽鎖因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａ（上）および未変性軽鎖因子ＶＩＩａ（下）のクロマトグラムが図１４Ａに提供されている。
【０４８５】
以下の表は、重鎖についてのＨＰＬＣ溶剤勾配パラメータを記載する。カラム温度は５２℃であった。
【０４８６】
【表３】
2009515508.tif 000156
【０４８７】
重鎖因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａ（上）および未変性重鎖因子ＶＩＩａ（下）のクロマトグラムが図１４Ｂに提供されている。
【０４８８】
実施例１２
因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ＫＤａ
以下の実施例は、因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ＫＤａの軽および重鎖への修飾糖質結合の数を逆相ＨＰＬＣにより判定する手法を記載する。
【０４８９】
因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ＫＤａを、重鎖を軽鎖から分離するために、還元条件に供した。分離の後、重鎖および軽鎖を、分離逆相ＨＰＬＣ実験に供した。未変性因子ＶＩＩａ対照のクロマトグラムにおける非修飾糖質ピークと相対的にそれらの位置を基準にしてピークを特定した。
【０４９０】
以下の表は、軽鎖についてのＨＰＬＣ溶剤勾配パラメータを記載する。カラム温度は２５℃であった。
【０４９１】
【表４】
2009515508.tif 000157
【０４９２】
軽鎖因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ＫＤａ（下）および未変性軽鎖因子ＶＩＩａ（上）のクロマトグラムが図１５Ａに提供されている。
【０４９３】
以下の表は、重鎖についてのＨＰＬＣ溶剤勾配パラメータを記載する。カラム温度は４０℃であった。
【０４９４】
【表５】
2009515508.tif 000158
【０４９５】
重鎖因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ＫＤａ（下）および未変性重鎖因子ＶＩＩａ（上）のクロマトグラムが図１５Ｂに提供されている。
【０４９６】
本願明細書に記載の実施例および実施形態は、例示的目的のみのためであり、それらを考慮にいれた種々の改良または変更は当業者に示唆されていることとなり、およびこれらは本出願の思想および範囲および添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されるべきであることが理解される。本願明細書に引用したすべての公報、特許、および特許出願は、すべての目的について参照によりそれらの全体が援用される。
【図面の簡単な説明】
【０４９７】
図面の簡単な説明
【図１】本発明の実施において有用である例示的な修飾シアル酸ヌクレオチドを示す。Ａ．例示的な分岐（例えば、３０ＫＤａ、４０ＫＤａ）ＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧ糖質ヌクレオチドの構造。Ｂ．直鎖因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａの構造。
【図２】本発明の複合体の調製において用いられる例示的なＰＥＧ−グリコシルリンク基前駆体（修飾糖質）を産生する合成スキームである。
【図３】例えば、ペプチドを修飾シアル酸でグリコＰＥＧ化するために、本発明の複合糖質の形成において用いられる、例示的なシアリルトランスフェラーゼを提供する表である。
【図４】図４Ａ〜４Ｅを含み、因子ＶＩＩおよび因子ＶＩＩａ上のグリカン構造をリモデリングするための例示的なスキームを規定する。図４Ａは、リモデリングのために想定されたグリカンに結合する残基を示す因子ＶＩＩおよび因子ＶＩＩａペプチドを表す図である。図４Ｂは、リモデリングのために想定されたグリカンに結合する残基を示す因子ＶＩＩおよび因子ＶＩＩａペプチドＡ（中実線）およびＢ（点線）、およびグリカンについての式を表す図である。図４Ｃ〜４Ｅは、図４Ｂにおけるペプチドのグリカンの、ペプチドが発現される細胞のタイプおよび所望の再構築されるグリカン構造に基づく想定されるリモデリングステップの図である。
【図５】図５Ａおよび５Ｂを含み、例示的なヌクレオチドであり、および因子ＶＩＩａの対応するアミノ酸配列（それぞれ、配列番号１および２）である。
【図６】アシアロ−因子ＶＩＩａの等電点電気泳動ゲル（ｐＨ３〜７）のイメージである。レーン１は因子ＶＩＩａ；レーン２〜５はアシアロ−因子ＶＩＩａである。
【図７】因子ＶＩＩａのＭＡＬＤＩスペクトラムのグラフである。
【図８】因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−１ＫＤａのＭＡＬＤＩスペクトラムのグラフである。
【図９】因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａのＭＡＬＤＩスペクトラムを表すグラフである。
【図１０】ＰＥＧ化因子ＶＩＩａのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのイメージである。レーン１はアシアロ−因子ＶＩＩａである。レーン２は、アシアロ−因子ＶＩＩａおよびＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１ＫＤａのＳＴ３Ｇａｌ３との反応の４８時間後の生成物である。レーン３は、アシアロ−因子ＶＩＩａおよびＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１ＫＤａのＳＴ３Ｇａｌ３との反応の４８時間後の生成物である。レーン４は、アシアロ−因子ＶＩＩａおよびＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａのＳＴ３Ｇａｌ３との反応の９６時間での生成物である。
【図１１】図１１Ａ〜Ｂは、少量のシアリダーゼ、での同時脱シアル化およびＰＥＧ化を示す。これらの図は、シアリダーゼの存在下でのキャッピングが有効であることを強調する。図１１Ａは、シアリダーゼが０．５Ｕ／Ｌのレベルのときの反応経路を示す。レーン１は、未変性因子ＶＩＩａに対応し、一方で、レーン２はアシアロ因子ＶＩＩａに対応する。レーン３〜レーン７では、時間の経過に伴ってＰＥＧ化生成物の量が増加している。レーン３において、主生成物はモノＰＥＧ化されており（６４でのスポットを参照のこと）、一方で、後にアッセイされたアリコートは、ジ（９７直下のスポットを参照のこと）、トリ（９７直上のスポットを参照のこと）、およびより高級ＰＥＧ化生成物の形成および量の増加を示す。レーン８および９は、反応への「キャッピング」、またはシアル酸付加の結果を示す。反応がキャップされる場合、レーン５、８および９に見出される同様のＰＥＧ化生成物分布からも見ることが可能であるとおり、反応の程度が停止する。図１１Ｂは、シアリダーゼが０．１Ｕ／Ｌのレベルのときの反応経路を示す。
【図１２】図１２Ａは、シアリダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼが同時に添加される状況を示す。図１２Ｂは、シアリダーゼが先ず添加され、続いてグリコシルトランスフェラーゼが３０分後に添加される状況を示す。
【図１３】本発明のペプチド複合体を提供するために、一つ以上のグリコシルリンク基が結合されることが可能であるペプチドの表である。
【図１４】図１４ＡおよびＢは、ＨＰＬＣ実験の結果を示すクロマトグラムを表す。図１４Ａは、軽鎖方法により分析された、因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａ（上）および未変性因子ＶＩＩａ対照（下）の標識化クロマトグラムを表す。ＬＣ（軽鎖）、１×１０ＫＤａ−ＰＥＧ−ＬＣ、２×１０ＫＤａ−ＰＥＧ−ＬＣ、および３×１０ＫＤａ−ＰＥＧ−ＬＣの他の生成物からの分離が示されている。図１４Ｂは、重鎖方法により分析された因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ＫＤａ（上）および未変性因子ＶＩＩａ対照（下）の標識化クロマトグラムを表す。ＨＣ（重鎖）、１×１０ＫＤａ−ＰＥＧ−ＨＣ、２×１０ＫＤａ−ＰＥＧ−ＨＣ、および３×１０ＫＤａ−ＰＥＧ−ＨＣの他の生成物からの分離が示されている。
【図１５】図１５ＡおよびＢは、ＨＰＬＣ実験の結果を示すクロマトグラムを表す。図１５Ａは、軽鎖方法によって分析された還元未変性因子ＶＩＩａ対照（上）および還元因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ＫＤａ（下）の標識化クロマトグラムを表す。ＬＣ（軽鎖）、１×４０ＫＤａ−ＰＥＧ−ＬＣ、２×４０ＫＤａ−ＰＥＧ−ＬＣ、および３×４０ＫＤａ−ＰＥＧ−ＬＣの他の生成物からの分離が示されている。図１５Ｂは、重鎖方法により分析された還元未変性因子ＶＩＩａ対照（上）および因子ＶＩＩａ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ＫＤａ（下）の標識化クロマトグラムを表す。ＨＣ（重鎖）、１×４０ＫＤａ−ＰＥＧ−ＨＣ、２×４０ＫＤａ−ＰＥＧ−ＨＣ、および３×４０ＫＤａ−ＰＥＧ−ＨＣの他の生成物からの分離が示されている。
【図１Ａ】
2009515508.tif 000182
【図１Ｂ】
2009515508.tif 000183
【図２】
2009515508.tif 000184
【図３Ａ】
2009515508.tif 000185
【図３Ｂ】
2009515508.tif 000186
【図３Ｃ】
2009515508.tif 000187
【図３Ｄ】
2009515508.tif 000188
【図３Ｅ】
2009515508.tif 000189
【図３Ｆ】
2009515508.tif 000190
【図３Ｇ】
2009515508.tif 000191
【図３Ｈ】
2009515508.tif 000192
【図３Ｉ】
2009515508.tif 000193
【図３Ｊ】
2009515508.tif 000194
【図３Ｋ】
2009515508.tif 000195
【図３Ｌ】
2009515508.tif 000196
【図３Ｍ】
2009515508.tif 000197
【図３Ｎ】
2009515508.tif 000198
【図４Ａ】
2009515508.tif 000199
【図４Ｂ】
2009515508.tif 000200
【図４Ｃ】
2009515508.tif 000201
【図４Ｄ】
2009515508.tif 000202
【図４Ｅ】
2009515508.tif 000203
【図５Ａ】
2009515508.tif 000204
【図５Ｂ】
2009515508.tif 000205
【図６】
2009515508.tif 000206
【図７】
2009515508.tif 000207
【図８】
2009515508.tif 000208
【図９】
2009515508.tif 000209
【図１０】
2009515508.tif 000210
【図１１Ａ】
2009515508.tif 000211
【図１１Ｂ】
2009515508.tif 000212
【図１２Ａ】
2009515508.tif 000213
【図１２Ｂ】
2009515508.tif 000214
【図１４Ａ】
2009515508.tif 000215
【図１４Ｂ】
2009515508.tif 000216
【図１５Ａ】
2009515508.tif 000217
【図１５Ｂ】
2009515508.tif 000218
【図１３Ａ】
2009515508.tif 000219
【図１３Ｂ】
2009515508.tif 000220
【図１３Ｃ】
2009515508.tif 000221
【図１３Ｄ】
2009515508.tif 000222
【図１３Ｅ】
2009515508.tif 000223
【図１３Ｆ】
2009515508.tif 000224
【図１３Ｇ】
2009515508.tif 000225
【図１３Ｈ】
2009515508.tif 000226
【図１３Ｉ】
2009515508.tif 000227
【図１３Ｊ】
2009515508.tif 000228
【図１３Ｋ】
2009515508.tif 000229
【図１３Ｌ】
2009515508.tif 000230
【図１３Ｍ】
2009515508.tif 000231
【図１３Ｎ】
2009515508.tif 000232
【図１３Ｏ】
2009515508.tif 000233
【図１３Ｐ】
2009515508.tif 000234
【図１３Ｑ】
2009515508.tif 000235
【図１３Ｒ】
2009515508.tif 000236
【図１３Ｓ】
2009515508.tif 000237
【図１３Ｔ】
2009515508.tif 000238
【図１３Ｕ】
2009515508.tif 000239
【図１３Ｖ】
2009515508.tif 000240
【図１３Ｗ】
2009515508.tif 000241
【図１３Ｘ】
2009515508.tif 000242
【図１３Ｙ】
2009515508.tif 000243
【図１３Ｚ】
2009515508.tif 000244
【図１３ＡＡ】
2009515508.tif 000245
【図１３ＢＢ】
2009515508.tif 000246
【図１３ＣＣ】
2009515508.tif 000247
【配列表】
2009515508000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年1月6日(2009.1.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式、
【化１】
2009515508.tif 000248
（式中、
Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、
Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｒ１から選択されるメンバーであり、
Ｒ１は、直鎖ポリ（エチレングリコール）残基および分岐ポリ（エチレングリコール）残基から選択されるメンバーを含む部分であり、および
Ｍは、Ｈ、金属および単一の陰電荷から選択されるメンバーであり、
Ｌは、結合、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
ここで、ＤがＯＨであるときＧはＲ１−Ｌ−であり、およびＧが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるときＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である）
を有する修飾シアル残基を含むグリコシルリンカーを含む因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の製造方法であって、
（ａ）グリコシル部分、
【化２】
2009515508.tif 000249
を含む因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを、
式、
【化３】
2009515508.tif 000250
を有するＰＥＧ−シアル酸ドナー部分と、
前記ＰＥＧ−シアル酸を前記グリコシル部分のＧａｌへ転移させる酵素に、前記転移に適切な条件で接触させて、前記複合体を形成するステップを含む、方法。
【請求項２】
Ｌ−Ｒ１が、式、
【化４】
2009515508.tif 000251
（式中、
ａは、０〜２０から選択される整数である）
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ１が、
【化５】
2009515508.tif 000252
（式中、
ｅ、ｆ、ｍおよびｎは、１〜２５００から独立して選択される整数であり、および
ｑは、０〜２０から選択される整数である）
から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ１が、
【化６】
2009515508.tif 000253
（式中、
ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００から独立して選択される整数であり、および
ｑおよびｑ’は、１〜２０から独立して選択される整数である）
から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ１が、
【化７】
2009515508.tif 000254
（式中、
ｅおよびｆは、１〜２５００から独立して選択される整数である）
から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記グリコシルリンカーが、式、
【化８】
2009515508.tif 000255
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチド複合体が、
【化９】
2009515508.tif 000256
（式中、ＡＡは前記ペプチド複合体のアミノ酸残基であり、およびｔは、０および１から選択される整数である）
から選択される式に基づく前記グリコシルリンカーの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチド複合体が、少なくとも１つの前記グリコシルリンカーを含み、ここで、前記グリコシルリンカーの各々は、以下の式、
【化１０】
2009515508.tif 000257
（式中、ＡＡは前記ペプチド複合体のアミノ酸残基であり、およびｔは、０および１から選択される整数である）
から独立して選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチド複合体が、
【化１１】
2009515508.tif 000258
【化１２】
2009515508.tif 000259
（式中、ＡＡは前記ペプチド複合体のアミノ酸残基であり、およびｔは、０および１から選択される整数であり、および
式中、Ｇを含まないシアリル部分の０および２つから選択されるメンバーがない）
から選択される式に基づく前記グリコシルリンカーの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチド複合体が、
【化１３】
2009515508.tif 000260
【化１４】
2009515508.tif 000261
（式中、ＡＡは前記ペプチド複合体のアミノ酸残基であり、およびｔは、０および１から選択される整数であり、および
式中、Ｇを含まないシアリル部分の０および２つから選択されるメンバーがない）
から選択される式に基づく少なくとも１つの前記グリコシルリンカーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記グリコシルリンカーが、前記因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドに、セリンおよびスレオニンから選択されるアミノ酸残基を介して結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記グリコシルリンカーが、前記因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドに、アスパラギン残基であるアミノ酸残基を介して結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記アスパラギン残基が、Ｎ１５２、Ｎ３２２およびこれらの組み合わせから選択されるメンバーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記因子ＶＩＩａペプチドが生理活性因子ＶＩＩａペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ａ）の前に、
（ｂ）前記因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを好適な宿主において発現させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記宿主が哺乳類発現系である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
それを必要とする対象における状態を処置する方法であって、前記状態は前記対象における易感染性凝固効力により特徴付けられ、前記対象における前記状態の回復に有効な量の、請求項１に記載の方法に基づいて産生された因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項１９】
ある量の、請求項１に記載の方法に基づいて産生された因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を前記哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物における凝固効力を増強させる方法。
【請求項２０】
式、
【化１５】
2009515508.tif 000262
（式中、
Ｒ２はＨ、ＣＨ２ＯＲ７、ＣＯＯＲ７またはＯＲ７であり、
式中、
Ｒ７は、Ｈ、置換または非置換アルキルまたは置換または非置換ヘテロアルキルを表し、
Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、置換または非置換アルキル、ＯＲ８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ９から独立して選択されるメンバーであり、
式中、
Ｒ８およびＲ９は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルまたはシアル酸から独立して選択され、
Ｒ１６およびＲ１７は、独立して選択される高分子アームであり、
Ｘ２およびＸ４は、高分子部分Ｒ１６およびＲ１７をＣに結合する、独立して選択されるリンケージ断片であり、
Ｘ５は非反応性基であり、および
Ｌａはリンカー基である）
を有する修飾シアリル残基を含むグリコシルリンカーを含む因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の製造方法であって、
（ａ）グリコシル部分、
【化１６】
2009515508.tif 000263
を含む因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを、
式、
【化１７】
2009515508.tif 000264
を有するＰＥＧ−シアル酸ドナー部分と、
ＰＥＧ−シアル酸を前記グリコシル部分のＧａｌへ転移させる酵素に、前記転移に適切な条件で接触させて、前記複合体を形成するステップを含む、方法。
【請求項２１】
部分、
【化１８】
2009515508.tif 000265
が、
【化１９】
2009515508.tif 000266
（式中、
ｅ、ｆ、ｍおよびｎは、１〜２５００から独立して選択される整数であり、および
ｑは、０〜２０から選択される整数である）
から選択されるメンバーである式を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
部分、
【化２０】
2009515508.tif 000267
が、
【化２１】
2009515508.tif 000268
（式中、
ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００から独立して選択される整数であり、および
ｑおよびｑ’は、１〜２０から独立して選択される整数である）
から選択されるメンバーである式を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記グリコシルリンカーが式、
【化２２】
2009515508.tif 000269
を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体が式、
【化２３】
2009515508.tif 000270
（式中、
ＡＡは、前記ペプチドのアミノ酸残基であり、
ｔは、０および１から選択される整数であり、および
Ｒ１５は修飾シアリル部分である）
を有する少なくとも１つのグリコシルリンカーを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記グリコシルリンカーが、前記因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドに、アスパラギン残基であるアミノ酸残基を介して結合されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記アスパラギン残基が、Ｎ１５２、Ｎ３２２およびこれらの組み合わせから選択されるメンバーである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記因子ＶＩＩａペプチドが生理活性因子ＶＩＩａペプチドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（ａ）の前に、
（ｂ）因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを好適な宿主において発現させるステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記宿主が哺乳類発現系である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
それを必要とする対象における状態を処置する方法であって、前記状態は前記対象における易感染性凝固効力により特徴付けられ、前記対象における前記状態の回復に有効な量の、請求項２０に記載の方法に基づいて産生された因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項３２】
ある量の、請求項２０に記載の方法に基づいて産生された因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を前記哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物における凝固効力を増強させる方法。
【請求項３３】
ａ）シアリダーゼと、
ｂ）グリコシルトランスフェラーゼ、エキソグリコシダーゼおよびエンドグリコシダーゼから選択されるメンバーである酵素と、
ｃ）修飾糖質／修飾シアリル残基と、
ｄ）因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドと、
を前記複合体を合成するのに適切な条件下で組み合わせて、前記因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａペプチド複合体を合成するステップを含む、因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａペプチド複合体の合成方法。
【請求項３４】
前記組み合わせるステップが、１０時間未満の時間である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
キャッピングステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
（ｂ）（ａ）で形成された前記ペプチド複合体を、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
（ｂ）（ａ）で形成された前記ペプチド複合体を、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて精製するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【国際調査報告】
2009515508.tif 000271
2009515508.tif 000272