(57)【要約】  照射応答配列、低酸素症応答配列及びフリーラヂカル応答配列の如き他のプロモーター配列に関連されうる、問題の異種の遺伝子の発現を駆動することができる塩基対−５１３〜塩基対＋３５のＳＰＡＲＣ遺伝子ヒトプロモーターの領域に対応する単離されたＤＮＡ配列。本発明はまた前記ＳＰＡＲＣ遺伝子ヒトプロモーターの単離された配列及びそれに使用可能につなげられた少なくとも１の異種の遺伝子を含む、構築物及びＤＮＡ組換え発現ウイルスベクターをも提供し、ここで前記プロモーター配列は腫瘍細胞において少なくとも１の異種の遺伝子の発現を駆動する。腫瘍を処置するための医薬組成物及び方法もまた提供される。
2009535031.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基対−５１３〜塩基対＋３５のＳＰＡＲＣ遺伝子ヒトプロモーターの領域に対応するポリヌクレオチド配列配列ＩＤ番号１又は実質的に同等の機能を有する１以上のヌクレオチドの挿入、置換又は欠損により改変された前記ポリヌクレオチド配列の断片又は変形を含む単離されたＤＮＡ配列。
【請求項２】
請求項１に記載のプロモーター活性を有する配列であって、それに使用可能につなげられた問題の異種の遺伝子の発現を駆動することができる配列。
【請求項３】
他のプロモーター配列に関連する、請求項１に記載のプロモーター活性を有する配列。
【請求項４】
照射応答配列、低酸素症応答配列及びフリーラヂカル応答配列の如き少なくとももう一つのプロモーター配列に関連する、請求項３に記載のプロモーター活性を有する配列。
【請求項５】
塩基対−５１３〜塩基対＋３５のＳＰＡＲＣ遺伝子ヒトプロモーターの領域に対応するポリヌクレオチド配列、配列ＩＤ番号１又は実質的に同等の機能を有する１以上のヌクレオチドの挿入、置換又は欠損により改変された前記ポリヌクレオチド配列の断片又は変形を含む単離されたＤＮＡ配列の使用であって、その配列に使用可能につなげられた、少なくとも１の問題の異種の遺伝子の発現を駆動するための使用。
【請求項６】
（ａ）請求項１に記載のプロモーター活性を有するＤＮＡ配列；及び
（ｂ）前記プロモーター配列に使用可能につなげられた少なくとも１の異種の遺伝子
を含むＤＮＡ組換え発現構築物であって、ここで上記プロモーター配列は前記少なくとも１の異種の遺伝子の発現を駆動する、ＤＮＡ組換え発現構築物。
【請求項７】
前記異種の遺伝子は治療用遺伝子である、請求項６に記載の構築物。
【請求項８】
前記プロモーター配列は腫瘍細胞において前記異種の遺伝子の発現を駆動するのに特異的である、請求項６に記載の構築物。
【請求項９】
上記少なくとも１の異種の遺伝子はＥ１Ａ遺伝子、ｈｓｖ−ＴＫ遺伝子の如き自殺遺伝子、アデノウイルスゲノムＥ３領域又はＩＬ−１０、ＩＬ−１２又はＩＬ−２３の如きインターロイキンの遺伝子の群から選ばれる、請求項６に記載の構築物。
【請求項１０】
請求項１に記載のプロモーター活性を有するＤＮＡ配列はさらに他のプロモーター配列を含む又は他のプロモーター配列に関連する、請求項６に記載の構築物。
【請求項１１】
前記関連するもう一つのプロモーター配列は照射応答配列、低酸素症応答配列又はフリーラヂカル応答配列の如き配列である、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１２】
請求項６に記載の構築物を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１０に記載の構築物を含むベクター。
【請求項１４】
プラスミド又はウイルスベクターである、請求項１２又は１３のいずれか１に記載のベクター。
【請求項１５】
上記ウイルスベクターは組換えアデノウイルスである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
上記ウイルスベクターは条件付きで複製する腫瘍崩壊性アデノウイルスである、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
請求項１２〜１６のいずれか１に記載のベクターであって：
（ａ）塩基対−５１３〜塩基対＋３５のＳＰＡＲＣ遺伝子ヒトプロモーターの領域に対応するポリヌクレオチド配列、配列ＩＤ番号１又は実質的に同等の機能を有する１以上のヌクレオチドの挿入、置換又は欠損により改変された前記ポリヌクレオチド配列の断片又は変形を含む、プロモーター活性を有するＤＮＡ配列；及び
（ｂ）プロモーター活性を有する上記ＤＮＡ配列に使用可能につなげられた少なくとも１の異種の遺伝子
を含み、ここで上記プロモーター配列は前記少なくとも１の異種の遺伝子の発現を駆動する、ベクター。
【請求項１８】
前記異種の遺伝子は治療用遺伝子である、請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
前記プロモーター配列は腫瘍細胞において前記異種の遺伝子の発現を駆動するのに特異的である、請求項１７に記載のベクター。
【請求項２０】
塩基対−５１３〜塩基対＋３５のＳＰＡＲＣ遺伝子ヒトプロモーターの領域に対応するポリヌクレオチド配列、配列ＩＤ番号１及びプロモーター活性を有する前記ＤＮＡ配列の調節下のＥ１Ａタンパク質遺伝子を含む、プロモーター活性を有するＤＮＡ配列を含む、請求項１７に記載のベクター。
【請求項２１】
プロモーター活性を有する前記ＤＮＡ配列の調節下の自殺遺伝子をさらに含む、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
上記自殺遺伝子はヘルペスウイルス（ｈｓｖ−ＴＫ）のチミヂンキナーゼ遺伝子である、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
プロモーター活性を有する前記ＤＮＡ配列の調節下のアデノウイルスゲノムＥ３領域をさらに含む、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２４】
ホスト細胞内で外来ＤＮＡを発現する方法であって、上記ホスト細胞内に請求項６〜１１のいずれか１に記載のＤＮＡ組換え発現構築物を導入することを含み、ここで前記構築物は塩基対−５１３〜塩基対＋３５のＳＰＡＲＣ遺伝子ヒトプロモーターの領域に対応するポリヌクレオチド配列、配列ＩＤ番号１又は実質的に同等の機能を有する１以上のヌクレオチドの挿入、置換又は欠損により改変された前記ポリヌクレオチド配列の断片又は変形を含む、プロモーター活性を有するＤＮＡ配列；及びプロモーター活性を有する上記ＤＮＡ配列に使用可能につなげられた異種の遺伝子を含み、ここで上記プロモーター配列は前記ホスト細胞内で前記異種の遺伝子の発現を駆動する、方法。
【請求項２５】
医薬として好適な担体中に請求項１２〜２３のいずれか１に記載のベクターを含む、医薬組成物。
【請求項２６】
腫瘍を患う患者において腫瘍を治療する方法であって、上記患者に有効な量の請求項２５に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は遺伝子治療の分野に関する。詳細には、本発明は、詳細には腫瘍細胞において、問題の遺伝子の発現を駆動することができるプロモーター活性を有する単離されたＤＮＡ配列に関する。より詳細には、本発明は問題の遺伝子に関連するＳＰＡＲＣプロモーターから単離されたＤＮＡ断片を含むベクターに、医薬組成物及び癌治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
オステオネクチン又はＢＭ４０としても知られる、ＳＰＡＲＣタンパク質（分泌タンパク質、酸性及びシステインリッチタンパク質）はヒト及び非ヒト組織中に高く分布される分泌糖タンパク質であり、その機能及び効果は広く及びさまざまである。それは細胞外マトリックス成分と、成長因子と、サイトカインと及びマトリックスメタロプロテイナーゼの発現と相互作用することが発見されている。
【０００３】
ＳＰＡＲＣタンパク質はヒト黒色腫の悪性において中心的な役割を有するとしてＬｅｄｄａ  Ｍ．  Ｆ．  ｅｔ．  ａｌ．によりはじめに示された（Ｌｅｄｄａ，  Ｍ．  Ｆ．，  Ａｄｒｉｓ，  Ｓ．，  Ｂｒａｖｏ，  Ａ．Ｉ．，  Ｋａｉｒｉｙａｍａ，  Ｃ．，  Ｂｏｖｅｒ，  Ｌ．，  Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ，  Ｙ．，  Ｍｏｒｄｏｈ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｐｏｄｈａｊｃｅｒ，  Ｏ．  Ｌ．，  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＳＰＡＲＣ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｂｒｏｇａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ，  ３：  １７１−１７６，  １９９７）。続く研究は、ＳＰＡＲＣ過剰発現はさまざまな腫瘍型の悪性進行に関連することを示した（Ｐｏｒｔｅ，  Ｈ．，  Ｔｒｉｂｏｕｌｅｔ，  Ｊ．  Ｐ．，  Ｋｏｔｅｌｅｖｅｔｓ，  Ｌ．，  Ｃａｒｒａｔ，  Ｆ．，  Ｐｒｅｖｏｔ，  Ｓ．，  Ｎｏｒｄｌｉｎｇｅｒ，  Ｂ．，  ＤｉＧｉｏｉａ，  Ｙ．，  Ｗｕｒｔｚ，  Ａ．，  Ｃｏｍｏｇｌｉｏ，  Ｐ．，  Ｇｅｓｐａｃｈ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｃｈａｓｔｒｅ，  Ｅ．  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ−３，  ＢＭ−４０／ＳＰＡＲＣ，  ａｎｄ  ＭＥＴ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ４：  １３７５−１３８２，  １９９８）。ＳＰＡＲＣタンパク質はｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍の内皮及び活性化された線維芽細胞の両方で高く発現される（Ｌａｎｅ，  Ｔ．  Ｆ．  ａｎｄ  Ｓａｇｅ，  Ｅ．  Ｈ．  Ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＳＰＡＲＣ，  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｃｅｌｌ−ｍａｔｒｉｘ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．  Ｆａｓｅｂ  Ｊ，  ８：１６３−１７３，  １９９４）。
【０００４】
ヒトＳＰＡＲＣプロモーター（Ｈａｆｎｅｒ，  Ｍ．，  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，  Ｋ．，  Ｐｏｔｔｇｉｅｓｓｅｒ，  Ｊ．，  Ｋｒｉｅｇ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｎｉｓｃｈｔ，  Ｒ．  Ａ  ｐｕｒｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＢＭ−４０  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｓ  ａ  ｐｒｅｒｅｑｕｉｓｉｔｅ  ｆｏｒ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ，  １４：７３３−７４１，  １９９５）、マウスＳＰＡＲＣプロモーター（ＭｃＶｅｙ，  Ｊ．  Ｈ．，  Ｎｏｍｕｒａ，  Ｓ．，  Ｋｅｌｌｙ，  Ｐ．，  Ｍａｓｏｎ，  Ｉ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｈｏｇａｎ，  Ｂ．  Ｌ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ＳＰＡＲＣ／ｏｓｔｅｏｎｅｃｔｉｎ  ｇｅｎｅ．  Ｉｎｔｒｏｎ／ｅｘｏｎ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２６３：１１１１１−１１１１６，  １９８８）及びウシＳＰＡＲＣプロモーター（Ｙｏｕｎｇ，  Ｍ．  Ｆ．，  Ｆｉｎｄｌａｙ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，  Ｐ．，  Ｂｕｒｂｅｌｏ，  Ｐ．  Ｄ．，  ＭｃＱｕｉｌｌａｎ，  Ｃ．，  Ｋｏｐｐ，  Ｊ．  Ｂ．，  Ｒｏｂｅｙ，  Ｐ．  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｔｅｒｍｉｎｅ，  Ｊ．  Ｄ．  Ｏｓｔｅｏｎｅｃｔｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓ１  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｓｉｔｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  ｂｏｎｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２６４：  ４５０−４５６，１９８９）はクローニングされ、及び特徴付けられている。これらのプロモーター間の比較は、遺伝子レベルで観察されるものと同様に、高い配列ホモロジーが起こることを示す。
【０００５】
ヒトＳＰＡＲＣプロモーターの構造は図１中に示され、ここで第一のエクソン、ＧＧＡ１及びＧＧＡ２ボックス、それらを分離する１０ヌクレオチドＩｎｔｅｒ−ＣＧＡ領域及びＴＡＴＡ非コンセンサス配列が示される。ヒトＳＰＡＲＣプロモーターはＴＡＴＡコンセンサスボックスを欠くが（Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ  ｓｐｌｉｔ  ｇｅｎｅｓ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ５０：  ３４９−３８３，  １９８１）、慣用の配列といくつかの塩基を共有するいわゆるＴＡＴＡ様エレメントを含む。上記プロモーターは２のＧＣＡ１及びＧＣＡ２ボックスを有し、そのうちのＧＣＡ１ボックスはヒト及びウシ種の間で大きな類似性を示す。
【０００６】
Ｈａｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．は、ＧＣＡ１ボックスは最大転写活性を得るために必要十分であり、一方で上記２のＣＧＡボックスを分けるスペーシングエレメントはその発現に対して負の効果を有することを観察した（Ｈａｆｎｅｒ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）。このグループが、ヒトにおいて、ＣＧＡボックスのみを含むプロモーター領域は異なる細胞系において発現特異性を与えるのに単独では十分でないことを示したことに留意することは重要である。Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ  ｅｔ．  ａｌ．はウシ胎児細胞におけるＳＰＡＲＣ転写のための陽性エレメントとしてのウシプロモーターの塩基−５０４〜＋１１の間の領域を示した。この断片はまたＳＰＡＲＣ  ｍＲＮＡのより高い発現レベルを有する細胞においてより高い活性を示す特異的発現を与える（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，  Ｐ．，  Ｉｂａｒａｋｉ，  Ｋ．，  Ｒｏｂｅｙ，  Ｐ．Ｇ．，  Ｈｅｆｆｅｒａｎ，  Ｔ．  Ｅ．，  Ｔｅｒｍｉｎｅ，  Ｊ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，  Ｍ．  Ｆ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｓｔｅｏｎｅｃｔｉｎ  ｇｅｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｉｓ−ａｎｄ  ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂｏｎｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ，  ６：  １１２７−１１３６，  １９９１）。彼らはまた（多くのプロモーター領域において共通のエレメントであり及びそれらのコンセンサス配列はＧＧＧＣＧＧであり、１超のコピーで存在しうる。それは−４０〜−１００ｂｐの間に位置される）ＧＣボックス及びＧＣＡ１ボックスのみではウシ骨細胞における最大ＳＰＡＲＣ発現に十分でないこと、及び塩基−９２７〜−５０４の間に位置される領域は転写の劇的な阻害を作出することを観察した。
【０００７】
上記遺伝子治療はもしかすると医薬において起こる最も重要な発展の一つを代表するかもしれない。特異的細胞又は組織型を改変するために、治療用遺伝子は、上記遺伝子が適切なレベルで及び十分な時間発現するように、細胞に効率的に投与されなければならない。２の型の策は細胞へのＤＮＡ供給のために適用されており、これらはウイルス及び非ウイルスベクターによる。遺伝子移動に用途を予定される多数のウイルスが開発されており、主な関心はレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ−関連ウイルス及び単純ヘルペスウイルス１型に集中されている。第一世代アデノウイルスはＥ１Ａタンパク質において欠損しており、それゆえそれらは複製しない。初期Ｅ１Ａタンパク質は細胞内でウイルスＤＮＡを生成する第一のタンパク質である。Ｅ１Ａは他のウイルスタンパク質が生成されることを助けること及びＲｂ及び放出するＥ２Ｆを結合することにより細胞成長を刺激すること、ウイルス転写及び複製を促進することの如き、多くの機能を有する。それらのＥ１Ａタンパク質欠損アデノウイルスは癌前臨床モデルにおいてベクターとしてうまく使用されたが、同じ結果は臨床試験で使用されるとき達成されず、その低いｉｎ  ｖｉｖｏ形質導入能が主要な問題の一つであった（Ｖｉｌｅ，  Ｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ−ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ．  Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ，  ２：１４１−１４３，  ２０００）。
【０００８】
この欠点を克服するための一つの方法は腫瘍環境において条件付きで複製することができるベクターの新規世代の作出であった；これらのベクターはＣＲＡｄ（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｏｒ  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）と呼ばれる。ＣＲＡｄｓは、周りの組織へのダメージを避ける方法で、必要とされる組織又は細胞型において特に活性であるプロモーターでＥ１Ａタンパク質の発現を調節するためにアデノウイルスゲノムを改変することにより構築される。
【０００９】
昨年、いくつかの研究グループが組換えアデノウイルス構築に専心した。このように、過去に除去されたウイルス遺伝子のいくつかは、それらがウイルス複製を高めるとすれば、再び再挿入されている。それはＥ３領域の場合である。Ｅ３は９タンパク質をコードするウイルスＤＮＡ断片であり、その主要な機能はホスト免疫応答により誘導される細胞死の阻害である。９タンパク質のうち、ＡＤＰ（Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）は、それは細胞微小環境への成熟ビリオンの放出を許容するウイルス感染周期における後期細胞溶解を促進するので、それらのＥ３仲間に比較されるとき突出しており、矛盾した機能を有する。非発現ＡＤＰアデノウイルスに感染した細胞は野生型アデノウイルスに感染した細胞より長い時間生存したままであることが示されている（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ，  Ａ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ． Ｔｈｅ  Ｅ３−１１．６−ｋＤａ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＡＤＰ）  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ：  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｄｐ  ｍｕｔａｎｔｓ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ２２０：  １５２−１６２，  １９９６；  Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ，  Ａ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （Ｅ３−１１．６Ｋ）  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ａｔ  ｖｅｒｙ  ｌａｔｅ  ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ７０：  ２２９６−２３０６，  １９９６；  Ｋｒｕｙｔ，  Ｆ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ：  ｐａｉｒｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｍａｘｉｍａｌ  ｏｎｃｏｌｙｓｉｓ，  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，  １３：  ４８５−４９５，２００２）。
【００１０】
遺伝子治療の最も魅力的な方法の一つは自殺遺伝子の使用である。上記系の基礎は非毒性プロドラッグを代謝し、それを毒性薬物に変える能力を有する酵素をコードする遺伝子を導入することから成る。最も使用される遺伝子の一つはプロドラッグ、アシクロビル／ガンシクロビル（ウイルス感染のために通常使用される抗ウイルス剤）、グアノシンアナログをリン酸化することができる酵素に分類する、単純ヘルペスウイルスチミヂンキナーゼ又はＨＳＶ／ＴＫである。そのリン酸化形で、抗ヘルペス剤がＤＮＡ分子に組み込まれ、その複製を避け、及び細胞死を引き起こす（Ｍｏｏｌｔｅｎ，  Ｆ．  Ｌ．，  Ｄｒｕｇ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  （“ｓｕｉｃｉｄｅ”）  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｒｉｅ  Ｔｈｅｒ，  １：  ２７９−２８７，  １９９４）。近隣の形質導入されていない腫瘍細胞もまた、毒性代謝産物が影響された細胞から影響されていない細胞へ移されることを許容する、いわゆる傍観者効果により消去されうる。
【００１１】
腫瘍は腫瘍細胞、線維芽細胞及び内皮細胞により形成される。そういうわけで、ウイルスベクターでの有効な治療は、腫瘍進行の原因であるこれらの３の細胞型で複製することができるウイルスを必要とする。ＳＰＡＲＣが全てのこれらの細胞型で過剰発現されるとすれば、ＳＰＡＲＣプロモーターはＥ１Ａ遺伝子及び結果としてもう一つの治療用遺伝子の如き、問題の遺伝子を駆動するので、それはＣＲＡｄの構築のための優れた候補者を代表する。この意味で、腫瘍細胞はウイルス自体の複製により又は腫瘍環境で生成される毒性薬物の活性により消去されるであろう。
【発明の開示】
【００１２】
発明の要約
それゆえ、詳細には腫瘍細胞において、問題の遺伝子の発現を駆動することができる、プロモーター活性を有する、単離されたＤＮＡ配列を提供することが本発明の目的である。
本発明は詳細には腫瘍細胞において、問題の遺伝子の発現を駆動することができる、ヒトＳＰＡＲＣ遺伝子プロモーターから、単離された断片を提供する。
【００１３】
より詳細には、本発明は塩基対−５１３〜塩基対＋３５のヒトＳＰＡＲＣプロモーターの領域に対応するポリヌクレオチド配列、配列ＩＤ番号１又は１以上のヌクレオチドの挿入、置換又は欠損により改変された及び実質的に同等の機能を有する前記ポリヌクレオチド配列の断片又は変形を含む単離されたＤＮＡ配列を提供する。
【００１４】
追加の局面にしたがって、問題の遺伝子に使用可能につなげられた本発明に係るプロモーター配列を含む単離されたＤＮＡ組換え発現構築物が提供される。
【００１５】
他の追加の局面にしたがって、本発明にしたがうＳＰＡＲＣ遺伝子のヒトプロモーターの領域に対応するポリヌクレオチド配列、配列ＩＤ番号１はまた、照射、低酸素症、フリーラヂカル等の如き、他のプロモーター／調節配列に関連しうる。
【００１６】
本発明のさらに他の関連する局面にしたがって、本発明に係る以前に定義されたＤＮＡプロモーター配列及び／又は本発明に係る以前に定義された構築物を含む、ウイルス組換え発現ベクターが提供され、ここで上記ＤＮＡプロモーター配列は問題の治療用遺伝子に使用可能につなげられる。
【００１７】
本発明はまた所望のポリペプチド又はＲＮＡをコードする外来ＤＮＡに使用可能につなげられたポリヌクレオチド配列、配列ＩＤ番号１のプロモーターＤＮＡ分子を含む本発明に係るＤＮＡ組換え発現構築物又はウイルス組換え発現ベクターをホスト細胞において導入することを含む、ホスト細胞において外来ＤＮＡを発現する方法をも提供し、ここで前記外来ＤＮＡは発現される。
【００１８】
本発明はまた、ウイルス複製及び／又は本発明に係るプロモーター配列に使用可能につなげられた問題の治療用遺伝子の発現を駆動することができる、本発明に係るプロモーター配列を含む、ＤＮＡ組換え発現構築物又はウイルス組換え発現ベクターを含む有効な量の医薬組成物を患者に投与することを含む、腫瘍を患う患者において腫瘍を治療する方法をも提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
上記に開示されるように、本発明は主な局面で、塩基対−５１３〜塩基対＋３５のヒトＳＰＡＲＣ遺伝子プロモーターの領域に対応するポリヌクレオチド配列、配列ＩＤ番号１又は１以上のヌクレオチドの挿入、置換又は欠損により改変された及び実質的に同等の機能を有する前記ポリヌクレオチド配列の断片又は変形を含む単離されたＤＮＡ配列を提供する。
【００２０】
用語「単離された」は、本明細書中で使用されるとき、上記核酸が天然に存在する細胞又は生物中の汚染配列について実質的に分離された又は精製されたことを意味し、及び標準の精製技術により精製された核酸及び組換え技術又は化学合成のいずれかにより調製された核酸を含む。
【００２１】
用語「変形」は、本明細書中で使用されるとき、ヌクレオチド配列が配列ＩＤ番号１として確立された配列と実質的に同一であるＤＮＡ分子をいう。上記変形は、もしそれらの改変が中性の突然変異であり、及びそれらは上記ＤＮＡ分子のパフォーマンスに影響しないとすれば、１以上のヌクレオチドの挿入、置換又は欠損の如き改変の手段により達成されうる。
【００２２】
本発明にしたがう核酸配列の「断片」は完全配列より長さが短く及び少なくとも収斂条件下で本発明に係る核酸配列と特異的にハイブリダイズすることができる最小限の長さを含む核酸配列部分であり、前記断片は本発明において必要とされる生物学的条件を保持する。
【００２３】
本発明はまた（ａ）ヒトＳＰＡＲＣプロモーターに対応するＤＮＡ配列；及び（ｂ）問題の遺伝子の配列がホスト細胞内で転写され及び翻訳されうるように（ａ）中の上記プロモーターに使用可能につなげられた問題の遺伝子をコードする配列を含む選択されたコード配列の転写を駆動することにおいて有効な組換え発現構築物をも提供する。
【００２４】
１の態様にしたがって、ヒトＳＰＡＲＣプロモーターに対応する好ましいＤＮＡ配列は配列リストの配列ＩＤ番号１中に示される配列にしたがう塩基対−５１３〜塩基対＋３５になる。
【００２５】
「異種の」遺伝子は、本明細書中で使用されるとき、他のＤＮＡ配列と関連して、問題のアミノ酸又はタンパク質配列をコードし、前記関連は天然には存在しない、ＤＮＡ配列を意味する。
【００２６】
一般的に「治療用遺伝子」は、本明細書中で使用されるとき、ホスト細胞に対して治療効果を誘発することができる、アミノ酸又はタンパク質配列をコードするＤＮＡ配列を意味する。好ましくは、本発明の１の態様にしたがって、上記ホスト細胞は腫瘍細胞であり、より詳細には、上記腫瘍細胞は黒色腫細胞、胸部細胞、結腸細胞、頸部細胞である。
【００２７】
好ましい態様にしたがって、問題の遺伝子はＥ１Ａ遺伝子、ｈｓｖ−ＴＫ遺伝子の如き自殺遺伝子、Ｅ３と呼ばれるアデノウイルスゲノム領域、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２又はＩＬ−２３等の如きインターロイキンの遺伝子から選択されうる。
【００２８】
特定の態様にしたがって、本発明にしたがう、ヒトＳＰＡＲＣ遺伝子プロモーターの領域に対応するポリヌクレオチド配列、配列ＩＤ番号１は単独で遺伝子を駆動しうる又は照射、低酸素症、フリーラヂカル等に応答性の配列に関連しうる。これらは通常前記プロモーターの上流に位置される定義されたＤＮＡ配列である。この種類の組み合わせの１の特徴的な例はプロモーターの転写活性を強化するために既に使用されている低酸素症応答エレメント（ＨＲＥ）又は低酸素圧条件下での応答エレメントのそこでの使用である。Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｌｃｏｃｅｂａ  ｅｔ．  ａｌ．は胸部腫瘍においてエストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）を含むプロモーター応答を強化するために低酸素症応答エレメント（ＨＲＥ）を使用した（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｌｃｏｃｅｂａ  Ｒ，  Ｐｉｈａｌｊａ  Ｍ，  Ｎｕｎｅｚ  Ｇ，  Ｃｌａｒｋｅ  ＭＦ，  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００１  Ａｐｒ；８（４）：２９８−３０７）。前記応答エレメントは照射応答エレメントと結合された（Ｇｒｅｃｏ  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｏｖｅｌ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｔｏ  ｈｙｐｏｘｉａ  ａｎｄ  ｉｏｎｉｚｉｎｇ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００２；  ９：１４０３−１４１１）。それらは複製可能な又は複製不能なアデノウイルスの部分でありうる（Ｉｄｏ  Ａ．，  Ｕｔｏ  Ｈ．，  Ｍｏｒｉｕｃｈｉ  Ａ．，  Ｎａｇａｔａ  Ｋ．，  Ｏｎａｇａ  Ｙ．，  Ｏｎａｇａ  Ｍ．，  Ｈｏｒｉ  Ｔ．，  Ｈｉｒｏｎｏ  Ｓ．，  Ｈａｙａｓｈｉ  Ｋ．，  Ｔａｍａｏｋｉ  Ｔ．，  Ｔｓｕｂｏｕｃｈｉ  Ｈ．，  Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ａ  ｈｕｍａｎ  ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００１  Ａｐｒ  １；６１（７）：３０１６−２１；  Ｐａｒｋ  Ｊ．  Ｏ．，  Ｌｏｐｅｚ  Ｃ．  Ａ．，  Ｇｕｐｔａ  Ｖ．  Ｋ．，  Ｂｒｏｗｎ  Ｃ．  Ｋ．，  Ｍａｕｃｅｒｉ  Ｈ．  Ｊ．，  Ｄａｒｇａ  Ｔ．  Ｅ．，  Ｍａｎａｎ  Ａ．，  Ｈｅｌｌｍａｎ  Ｓ．，  Ｐｏｓｎｅｒ  Ｍ．  Ｃ．，  Ｋｕｆｅ  Ｄ．  Ｗ．，  Ｗｅｉｃｈｓｅｌｂａｕｍ  Ｒ．  Ｒ．，  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２００２  Ａｕｇ；１１０（３）：４０３−１０；  Ｃｏｗｅｎ  Ｒ．  Ｌ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｋ．  Ｊ．，  Ｃｈｉｎｊｅ  Ｅ．  Ｃ．，  Ｊａｆｆａｒ  Ｍ．，  Ｓｈｅｐｐａｒｄ  Ｆ．  Ｃ．，  Ｔｅｌｆｅｒ  Ｂ．  Ａ．，  Ｗｉｎｄ  Ｎ．  Ｓ．，  Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  Ｉ．  Ｊ．，  Ｈｙｐｏｘ���ａ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｉｒａｐａｚａｍｉｎｅ  ａｓ  ａｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｏ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ：  ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｃｕｒｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００４  Ｆｅｂ  １５；６４（４）：１３９６−４０２）。
【００２９】
本発明にしたがって、所望のポリペプチド又はＲＮＡをコードする外来ＤＮＡに使用可能につなげられたポリヌクレオチド配列、配列ＩＤ番号１のプロモーター分子を含む、本発明に係るＤＮＡ組換え発現構築物又はウイルス組換え発現ベクターをホスト細胞内に導入することを含む、ホスト細胞内で外来ＤＮＡを発現する方法もまた提供され、ここで前記外来ＤＮＡは発現される。
【００３０】
ホスト細胞内のＤＮＡの導入はどんな構築物の手段によっても行われることができ、及びプラスミド、ＤＮＡウイルス、レトロウイルス並びに単離されたヌクレオチド分子を含む。リポソーム仲介移動もまた使用されうる。
【００３１】
アデノウイルスは本発明において使用されうる前記ＤＮＡウイルスの一例である。４０超の異なる抗原型のヒトアデノウイルスが周知であり、Ａｄ５アデノウイルスは本発明におけるウイルスベクターとして特に好ましい；しかしながら、アデノウイルス３キャップシッド又はＲＧＤモチーフでのファイバー改変での如き、改変されたキャップシッド及び／又はファイバーＡｄ５アデノウイルスは捨てられない。
【００３２】
プロモーター配列及び所望の治療用遺伝子の配列を含む好適なベクターの構築は本分野において周知である標準の結合及び制限酵素技術により行われうる。特定の部位におけるＤＮＡ切断を約３〜１６時間、製造業者により示される条件下で適切な制限酵素での処理により行った。一般的に、上記制限酵素結果は、エチヂウムブロマイドを用いて、ＴＡＥ溶液（４０ｍＭトリ酢酸塩、２ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ．２Ｈ2Ｏ、ｐＨ８．５）中のアガロースゲル（０．８−１．６％）中での電気泳動分離により立証され及びトランスイルミネーター（Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．，  Ｕｐｌａｎｄ，  ＣＡ）下でＵＶ光で視覚化されうる。ライゲーションを製造業者のプロトコル（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄｓ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）にしたがって、バクテリオファージＴ４からのＤＮＡリガーゼにより行う。以下の式：
【数１】
2009535031.tif 000003
をとおして断片間の割合を計算して、１：１〜３：１の挿入物：ベクターの割合を使用した。
【００３３】
ベクター構築において、クイック分析の手段により外来ＤＮＡを組み込むベクターを非改変ベクターと区別することができることは有益である。一般的に細胞が適切な培地で生育されるときその発現が形質転換された細胞に同定可能な表現型を与える遺伝子を含むマーカーシステムが知られる。β−ガラクトシダーゼ遺伝子は例えば、Ｘ−ｇａｌを伴うプラーク中で青色表現型を示す、クローン中で検出可能な遺伝子である。
【００３４】
本発明は問題の遺伝子によりコードされるタンパク質が発現され及び前記タンパク質が患者の状態を直接的に又は間接的に高めるよう、腫瘍細胞へ問題の遺伝子を駆動することを含む。
【００３５】
本発明の特定の態様にしたがって、ＳＰＡＲＣプロモーターのＤＮＡ配列断片の調節下に、Ｅ１Ａタンパク質の遺伝子を含む、ＣＲＡｄ又は腫瘍崩壊性ベクター（条件付きで複製可能又は腫瘍崩壊性アデノウイルス）はアデノウイルスの基礎に基づいて調製される。有利なことに、本発明に係るＣＲＡｄｓは異なる型の腫瘍細胞（黒色腫、胸部、結腸、頸部）においてＥ１Ａの発現を駆動し、上記ウイルスそれ自体の複製をとおしてそれらの溶解及び消去を引き起こす。また有利なことに、以下に例示されるようなＥ１Ａ遺伝子を含む本発明に係るＣＲＡｄｓは、その発現が主に腫瘍細胞で発現するプロモーターにより駆動されるとすれば、正常細胞（間充織の、内皮の及び線維芽細胞）において減衰された溶解活性を有する。
【００３６】
また、他の特定の態様にしたがって、ＣＲＡｄベクターは例えば、プロドラッグアシクロビル／ガンシクロビルをリン酸化することができる酵素をコードする単純ヘルペスウイルスチミヂンキナーゼ（ｈｓｖ−ＴＫ）の如き自殺遺伝子をさらに含む。そのリン酸化形で、上記抗ヘルペス剤はＤＮＡ分子に組み込まれ、その複製を避け及び細胞死を引き起こす。この特定の態様にしたがって調製されるＣＲＡｄｓは異なる腫瘍細胞型においてｈｓｖ−ＴＫ発現を駆動し、溶解活性を完了させ、及び同時にその発現が主に腫瘍細胞において発現するプロモーターにより駆動されるとすれば、正常細胞において減衰された溶解活性を有する。
【００３７】
また、他の特定の態様にしたがって、９タンパク質をコードするＥ３と呼ばれるゲノムアデノウイルス領域をさらに含むＣＲＡｄベクターが調製される。そのうち、細胞微小環境への成熟ビリオンの放出を許容する、ウイルス感染周期中の後期細胞溶解を促進するＡＤＰ（Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）は突出している。Ｅ３領域を含むＣＲＡｄｓはＥ１Ａの溶解活性を強化し、同時にその発現が主に腫瘍細胞で発現するプロモーターにより駆動されるとすれば、それは正常細胞において減衰された溶解活性を有する。
【００３８】
本発明に係る構築物又はベクターは好適な担体中に媒介されて、注入、経口又は局所投与により、その必要のある患者に投与されうる。好適な担体は水性、脂性、リポソームのもの等でありうる。
【００３９】
ルシフェラーゼ、スフェロイド及びｉｎ  ｖｉｖｏ研究のデータ分析のために、ＡＮＯＶＡ分散分析、続いてＴｕｋｅｙ’ｓ試験を使用した。０．０５未満のＰ−値を有意であると考えた。また、生存曲線をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法にしたがって行い、及び異なる群間の統計的比較をｌｏｇ−ランク試験を適用して行った。
【００４０】
本発明は詳細な実験実施例の手段により以下に例示される。前記実施例は本発明のよりよい理解のために提供すると意図されるが、本発明の範囲は添付される請求項中に確立されるべきであるので、それらはいかなるようにも本発明を限定すると考えられるべきでない。
【実施例】
【００４１】
実施例
実施例１．−異なる腫瘍及び正常系におけるＳＰＡＲＣ  ｍＲＮＡの発現の評価
ＳＰＡＲＣタンパク質から生成されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の値を腫瘍細胞系及び正常細胞系においてリアルタイムＰＣＲにより評価した。
ヒト系ＨｅＬａ（頸部癌、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２）、Ｔ−４７Ｄ（乳癌、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１３３）、ＷＩ−３８（胎児肺線維芽細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−７５）、ＷＩ−３８  ＶＡ（形質転換された胎児肺線維芽細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−７５．１）、ＨＦＬ−１（線維芽細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１５３）、２９３（胚腎臓、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）、ＬｏＶｏ（結腸癌、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２２９）、ＨＣＴ−１１６（結腸癌、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２４７）、ＣａＣＯ２（結腸癌、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−３７）、ＨＴ−２９（結腸癌、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−３８）、Ｔ８４（結腸癌、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２４８）及び大動脈内皮細胞（ウシ大動脈内皮細胞、ＢＡＥＣ  ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１３９５）をＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ，  ＵＳＡ）から得た。ヒト黒色腫細胞系ＩＩＢ−ＭＥＬ−ＬＥＳ及びＩＩＢ−ＭＥＬ−Ｊ−ＮはＬｅｄｄａ  ｅｔ．  ａｌ．，  １９９７により以前に示された；ヒト黒色腫系ＳＢ２、Ａ３７５Ｎ及びＭＥＬ−８８８はＤｒ．  Ｅｓｔｅｌａ  Ｍｅｄｒａｎｏ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，  Ｔｅｘａｓ）により親切に提供された。全ての細胞を（Ｎａｔｏｃｏｒ，  Ｃａｒｌｏｓ  Ｐａｚ，  Ａｒｇｅｎｔｉｎａにより提供される）１０％ウシ胎児血清、２．５Ｕ／ｍｌ  ｄｅ  ペニシリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）及び２．５μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）で補充された推奨される培地中で培養し、５％ＣＯ2の気体中で３７℃で維持した。ＢＡＥＣ細胞を５％ＢＦＳで補充した。
【００４２】
ＳＰＡＲＣ  ｍＲＮＡ値の相対的定量をＰｆａｆｆｌ，  Ｍ．  Ｗ．  Ａ  ｎｅｗ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ２９：ｅ４５，  ２００１にしたがって行った。トータルＲＮＡをＴｒｉ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を用いることにより抽出した。５μｇのＲＮＡを５００ｎｇ  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを用いて２００Ｕ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）でレトロ−転写した。ｃＤＮＡリアルタイムＰＣＲ反応をｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）サーモサイクラー内で行った。上記反応を１  Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ユニット、１×ＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４及び５０ｍＭ  ＫＣｌ）、１．５ｍＭ  Ｍｇ2Ｃｌ、２．５μｇ  ＢＳＡ、０．０１％グリセロール、０．４μＭのそれぞれ特定のプライマー：ＳＰＡＲＣ（ＳＲＴｓｅ；ＡＡＣＣＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧ、配列ＩＤ番号２／ＳＲＴａｓ；ＧＣＡＡＡＧＡＡＧＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡ、配列ＩＤ番号３）及びβ−アクチン（Ａｃｓｅ；ＡＧＡＡＡＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣ、配列ＩＤ番号４／Ａｃａｓ；ＣＡＧＡＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＧＡＴＡＧＣ、配列ＩＤ番号５）、２００μＭ  ｄＮＴＰｓ及び０．３×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ溶液を含む２５μｌ体積中で行った。反応条件は：９４℃で９０秒間及びその後３０サイクルの９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で３０秒間であった。それぞれの反応を三重で行い、及びＳＰＡＲＣについて得られた結果をβ−アクチンについて同時に得られた結果で正規化した。
【００４３】
結果は図２中に示され、ここでＡ３７５Ｎ黒色腫細胞はより高いＳＰＡＲＣ  ｍＲＮＡ値を発現するように見られうる。残りの黒色腫系はＡ３７５Ｎに比較して低〜中程度のｍＲＮＡ値を発現する。胸部（Ｔ−４７Ｄ）、頸部（ＨｅＬａ）及び結腸（ＬｏＶｏ、ＨＣＴ−１１６、ＣａＣＯ２、ＨＴ−２９及びＴ８４）癌系はごくわずかなＳＰＡＲＣ値を発現することが観察された。低いＳＰＡＲＣ発現レベルは腎臓系について観察され、一方で線維芽細胞系は中程度の発現レベルを示し、及び１の大動脈ウシ内皮系（ＢＡＥＣ）はＡ３７５Ｎより高いＳＰＡＲＣ発現レベルを示す。
【００４４】
実施例２．−ｐＧＥＭ及びＴＯＰＯプラスミド中の１１断片のヒトＳＰＡＲＣプロモーターのクローニング。
本発明者により行われるヒトＳＰＡＲＣプロモーターの配列分析は塩基＋２９／＋３３の間に存在するＤＰＥ配列（Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ）及び既に示されている２の可能性のある転写開始部位、ＩＮＲ１及びＩＮＲ２（上記に引用される図１を参照のこと）を明らかにした。ＤＰＥ配列はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーター中で示され、及びＴＡＴＡ配列を含まないそれらのプロモーター中でトランスクリプトーム組立てにおいて役割を有すると考えられる（Ｋａｄｏｎａｇａ，  Ｊ．  Ｔ．  Ｔｈｅ  ＤＰＥ，  ａ  ｃｏｒｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ．  Ｅｘｐ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，  ３４：  ２５９−２６４，  ２００２）。この分析の結果として、本発明者は上記プロモーターの方向づけられた突然変異を行った。その目的のために、彼らは５’末端：（完全なプロモーターをクローニングするために）−１１７５、（ウシプロモーターとの類推により）−５１３及び（ＧＧＡ１配列を厳密に含む）−１２０について行った。３’末端突然変異は完全なエクソン１及びＤＰＥ配列を含む又は含まない多様な欠損（＋２４，＋２８，＋３５，＋７１）を含む。図３は異なる断片が由来するＳＰＡＲＣプロモーターの２のスキームを示す。ＧＧＡボックスの位置、可能性のある転写開始部位（ＩＮＲ）のＴＡＴＡ様配列及びＤＰＥ配列が示される。ＳＰＡＲＣプロモーター断片を構築するために使用された異なる限界が示される。５’末端を塩基−１１７５、−５１３及び−１２０までクローニングした；一方で３’末端から塩基を＋２４、＋２８、＋３５及び＋７１までクローニングした。ＧＧＡボックス間の欠損領域もまた示され、この欠損は断片−１１７５／＋７１Δ１０に起源を与える。
【００４５】
ヒトＳＰＡＲＣプロモーター領域からの１２４６ｂｐの断片をＳｐｆｓｅ及びＳＰＰ３’２オリゴヌクレオチドでヒトリンパ球のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した（転写開始部位に比較して−１１７５〜＋７１ｂｐ）（表１を参照のこと）。このＰＣＲ産物、−１１７５／＋７１をｐＧＥＭ（−１１７５／＋７１）を得るためにｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）中にクローニングした。このプラスミドをプロモーター変異体の鋳型として使用し、その断片を今度は以下の表１中に詳述されるプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
【００４６】
【表１】
2009535031.tif 000004
【００４７】
増幅周期は９４℃で３分間の開始変性、続いて３５増幅周期：９４℃、１分間、アニーリング  Ｔ（それぞれの生成物に因り変動可能、表１）、１分間及び７２℃、２分間、続いて７２℃で１０分間の最終延長に対応する。上記ＰＣＲはＰＴＣ−２００サーモサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，  Ｗｈａｌｔａｍ，  ＭＡ）内で行った。
【００４８】
上記ＰＣＲ産物をはじめにｐＧＥＭ−ｔ−ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｏｒｐ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）又はＴＯＰＯ−ｐＣＲ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）中にクローニングし、そのようにして以下のベクターを得た：
【００４９】
ａ−ｐＧＥＭ（−１１７５／＋７１）、（配列ＩＤ番号１７）、完全なプロモーター。配列＋１／＋７０は翻訳されない第一のエクソンを含む。
【００５０】
ｂ−ｐＧＥＭ（−１１７５／＋７１Δ１０）（配列ＩＤ番号１８）。このプロモーターは完全なＳＰＡＲＣプロモーター−１１７５／＋７１の改変であり、ここで転写を阻害すると考えられる、２のＧＧＡボックスの間に位置される１０ｂｐの配列は欠損している（Ｈａｆｎｅｒ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）。この目的のために、オーバーラップ延長によるスプライシングＰＣＲ（ＰＣＲ−ＳＯＥ）を本発明者により以前にクローニングされた２のＳＰＡＲＣプロモーター断片：１０８４塩基対のＳｐｄｅｌ  １．１Ｋｂ及び２０９塩基対のＧＧＡ１を用いて適用した。最終的なＰＣＲ産物をｐＧＥＭベクター中にクローニングし、及び欠損をシークエンシングにより確認した。
【００５１】
ｃ−ＴＯＰＯ（−１１７５／＋３５）、（配列ＩＤ番号１９）はＤＰＥ配列を含む。
ｄ−ＴＯＰＯ（−１１７５／＋２８）、（配列ＩＤ番号２０）はＤＰＥ配列を除外する。
ｅ−ＴＯＰＯ（−５１３／＋７１）、（配列ＩＤ番号２１）は完全な第一エクソンを含む。
【００５２】
ｆ−ＴＯＰＯ（−５１３／＋３５）、（配列ＩＤ番号１）はＤＰＥ配列を含む。
ｇ−ＴＯＰＯ（−５１３／＋２８）、（配列ＩＤ番号２２）はＤＰＥ配列を除外する。
ｈ−ＴＯＰＯ（−５１３／＋２４）、（配列ＩＤ番号２３）はＩＮＲ２配列までを含む。
ｉ−ＴＯＰＯ（−１２０／＋７１）、（配列ＩＤ番号２４）は完全な第一エクソンを含む。
ｊ−ＴＯＰＯ（−１２０／＋３５）、（配列ＩＤ番号２５）はＤＰＥ配列を含む。
ｋ−ＴＯＰＯ（−１２０／＋２８）、（配列ＩＤ番号２６）はＤＰＥ配列を除外する。
【００５３】
実施例３Ａ．−ヒトＳＰＡＲＣプロモーターの断片の選択
実施例２にしたがって得られたプロモーターをルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流のｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，  ＵＳＡ）のＭｌｕＩ／ＢｇｌＩＩ、ＭｌｕＩ／ＸｈｏＩ又はＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローニングした。全ての上記クローニングを制限酵素プロファイルにより及びユニバーサルプライマーＴ７（ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ；配列ＩＤ番号２７）；Ｓｐ６（ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ；配列ＩＤ番号２８）、Ｔ３（ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡ；配列ＩＤ番号２９）又はＰ２（ＣＴＴＴＡＴＧＴＴＴＴＴＧＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡ；配列ＩＤ番号３０）及びＰ３（ＣＴＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＧＣＴＧＴＣＣＣＣ；配列ＩＤ番号３１）でベクター（ｐＧＥＭ、ＴＯＰＯ及び／又はｐＧＬ３）をシークエンシングすることにより確認した。
【００５４】
ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃプラスミドは遺伝子調節因子の結合を妨げ、制限酵素部位を除去し、ペルオキシソームへのタンパク質輸送を妨げるために改変されたＦｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼレポーター遺伝子（ｌｕｃ＋）を含み、及びそれは翻訳効率を最適化するためにルシフェラーゼ遺伝子の５’末端にＫｏｚａｋ配列を含む。
【００５５】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子の存在は、ルシフェラーゼ酵素活性を計測することにより、実施例２において得られた１１断片におけるＳＰＡＲＣプロモーター活性の定量化を許容した。上記分析を、上記実施例１の教示にしたがって、（黒色腫）Ａ３７５Ｎ系は高いＳＰＡＲＣ値を発現するのでモデルとして（黒色腫）Ａ３７５Ｎ系及びＳＰＡＲＣを発現しない（頸部）ＨｅＬａ及び（胸部）Ｔ−４７Ｄ系を用いて３の細胞系において行った。
上記細胞を４×１０4細胞／ウェルの濃度で２４−ウェルプレート中にまいた。２４時間後、それらを製造業者により示される条件にしたがってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いてトランスフェクトした。それぞれの処理を抗生物質を伴わない５０μｌのＤＭＥＭ培地で０．８μｇの処理プラスミドを０．１μｇのｐＲＬ−ＣＭＶプラスミドと共に５分間、及び同時に５０μｌの同じ培地で１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００をインキュベートして、それぞれの細胞系について少なくとも二重で行った。これらの２の調製物を混合し、及び室温で２０分間インキュベートした。細胞血清を含む上記培地を除去し、ＰＢＳで洗浄し、及び２００μｌの高グルコースＤＭＥＭを血清なし及び抗生物質なしで添加した；続いて、リポフェクション混合物を含む１００μｌの培地を添加し、及びＢＦＳで補充されたそれぞれの細胞系に対応する８００μｌの培養培地を４時間後に添加した。使用された細胞を５％ＣＯ2で３７℃で４６時間温室中で維持した。Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）をルシフェラーゼ分析のために使用した。このシステムは同じ系における２の個々のレポーター酵素の同時発現を意味し、１のみの連続分析においてＦｉｒｅｆｌｙツチボタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）及びＲｅｎｉｌｌａ腔腸動物（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からのルシフェラーゼ酵素により生成される活性の評価を許容する（Ｓｈｅｒｆ，  Ｂ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ：  Ａｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｏ−Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  Ｆｉｒｅｆｌｙ  ａｎｄ  Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙｓ．  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｎｏｔｅｓ  Ｍａｇａｚｉｎｅ：  ２−９，  １９９６）。上記データを以下のように正規化した：
【００５６】
【数２】
2009535031.tif 000005
【００５７】
上記データをｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃコントロールプラスミド（プロモーターなし）で得られた活性に比較した誘導量として表した。上記結果は図４Ａ中に示される。ＳＶ４０からのウイルスプロモーターがルシフェラーゼ酵素の発現を駆動するｐＧｌ３−プロモータープラスミド（ｐＧＬ３−ｐｒｏｍ，  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）をトランスフェクションコントロールとして使用した。
【００５８】
黒色腫系におけるより低いプロモーター活性は完全なＳＰＡＲＣプロモーター（−１１７５／＋７１）で得られた。より高い非特異性は断片−１２０／＋７１で観察され、及びＳＰＡＲＣを発現する系においてより高い特異性及びより高い活性を示す断片は断片−５１３／＋３５であるとわかった（図４Ａ）。プロモーター−５１３／＋３５、これ以降はＦ５１２を、プロモーター−１１７５／＋７１Δ１０がＡ３７５Ｎ黒色腫系においてＦ５１２と同じ活性を有するとすればＳｐｄｅｌと呼ばれるプロモーター−１１７５／＋７１Δ１０に対して比較したその特徴付けで続けるためにこの分析をとおして選択した。
【００５９】
実施例３Ｂ．−ヒトＳＰＡＲＣプロモーターからの断片の選択
同様のプロモーター活性を有する及び実施例３Ａの方法により同定される上記２のプロモーターＦ５１２及びＳｐｄｅｌを異なる腫瘍及び正常細胞系において評価した（実施例１中の引用を参照のこと）。結果は図４Ｂ中に示される。
【００６０】
比較結果から、Ｓｐｄｅｌは、その活性が４３０倍高い黒色腫系ＭＥＬ８８８を除いて、腫瘍及び正常系の両方において、空のベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃについて、１４０倍高い活性の平均を示すことが留意されうる（図４Ｂ）。したがって、Ｓｐｄｅｌ活性は使用された細胞系においてＳＰＡＲＣ発現とは独立しているという結果になる。
【００６１】
Ｆ５１２プロモーターは黒色腫系において及びより高いＳＰＡＲＣ発現を有する内皮ＢＡＥＣ系において活性であることがわかった。ＳＢ２系はより低いプロモーター活性、Ａ３７５Ｎにおいて観察された活性の約１／３を有し、この結果はＳＰＡＲＣ  ｍＲＮＡ発現率と一致する（図２及び４Ｂ）。驚くべきことに、２の黒色腫系、Ｍｅｌ８８８及びＭｅｌＪにおける活性はＡ３７５Ｎについてよりも３．５〜４倍高い。これらの結果は、Ｆ５１２断片は黒色腫系において活性であるが、そのふるまいはＳＰＡＲＣ  ｍＲＮＡ発現と必ずしも一致しないことを示す。全ての系において同じ活性を有するＳｐｄｅｌとは異なり、Ｆ５１２はほとんど又は全くＳＰＡＲＣ発現を有しない結腸（Ｔ８４、ＬｏＶｏ）、グリオーマ（Ｕ８７）又は頸部（ＨｅＬａ）の如きそれらの系においてより低い活性を示す（図４Ｂ）。しかしながら、この活性はごくわずかではないが、これに反して、Ｔ８４のようないくつかの場合には、それは黒色腫系について観察される活性の半分に達する。さらに、上記プロモーターはまた使用される線維芽細胞系（ＷＩ−３８  ＶＡ）において活性である。
これらの結果はアデノベクターにおける問題の遺伝子の発現を駆動するためのＦ５１２プロモーターの選択を許容する。
【００６２】
実施例４．−Ｅ１Ａ遺伝子の上流にＦ５１２を含むシャトルプラスミドの構築。
問題の遺伝子を含むシャトルプラスミドの構築を、領域（その複製のために必要な）Ｅ１及びＥ３におけるその遺伝子が欠損しているヒトアデノウイルス５型を含む、ｐＡＤＰＳＹシャトルベクターからはじめて行った。それから、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター及びＳＶ４０のポリアデニル化シグナル（Ｍａｒｉａｎｏ  Ｊ．  Ａｌｖａｒｅｚ，  Ｆｅｄｅｒｉｃｏ  Ｐｒａｄａ，  Ｅｄｇａｒｄｏ  Ｓａｌｖａｔｉｅｒｒａ，  Ａｌｉｃｉａ  Ｉ．  Ｂｒａｖｏ，  Ｖｉｖｉａｎａ  Ｐ．  Ｌｕｔｚｋｙ，  Ｃｅｃｉｌｉａ  Ｃａｒｂｏｎｅ，  Ｆｅｒｎａｎｄｏ  Ｊ．  Ｐｉｔｏｓｓｉ，  Ｈ．  Ｅｄｕａｒｄｏ  Ｃｈｕｌｕｙａｎ  ａｎｄ  Ｏｓｖａｌｄｏ  Ｌ．  Ｐｏｄｈａｊｃｅｒ；  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｃｉｄｉｃ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈ  ｉｎ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｃａｐａｃｉｔｙ；  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６５，  ５１２３−５１３２，  Ｊｕｎｅ  １５，  ２００５）はΔＥ１領域中に挿入された。特有のクローニング部位の多様性を増大させるようこのベクターを改善するために、複数のクローニング部位（ＭＣＳ）を設計し及び含め、ＲＳＶプロモーターを置換して、ｐＡｄ−Ｘｐプラスミド（配列ＩＤ番号３２）を得た；このベクターを複数のクローニング部位の存在を立証するためにシークエンスした。
【００６３】
昨年多くの研究が、ある細胞型について特異的であるプライマーはそれらがウイルスゲノムに導入されたときのようにはたらかないことを示した（Ｓｔｅｉｎｗａｅｒｄｅｒ，  Ｄ．  Ｓ．  ａｎｄ  Ｌｉｅｂｅｒ，  Ａ．  Ｉｎｓｕｌａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｖｉｒａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，  ７：  ５５６−５６７，  ２０００．）。これはＩＴＲ配列（逆向き末端繰返し）及びアデノウイルスゲノム封じ込みシグナルはそれらの特異性を改変するプロモーター活性に影響するエンハンサーを有するという事実のためである（Ｈｅａｒｉｎｇ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ，  Ｔ．  Ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ５  Ｅ１Ａ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ｔｗｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｄｏｍａｉｎｓ：  ｏｎｅ  ｉｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  Ｅ１Ａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｏｔｈｅｒ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ａｌｌ  ｅａｒｌｙ  ｕｎｉｔｓ  ｉｎ  ｃｉｓ．  Ｃｅｌｌ，  ４５：  ２２９−２３６，  １９８６．）。この問題は絶縁体、すなわち、上記プロモーター活性を単離し、及びそれがその特異性を発展することを許容する配列の使用により部分的に避けられうる（Ｓｔｅｉｎｗａｅｒｄｅｒ，  Ｄ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；  Ｍａｒｔｉｎ−  Ｄｕｑｕｅ，  Ｐ．，  Ｊｅｚｚａｒｄ，  Ｓ．，  Ｋａｆｔａｎｓｉｓ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｖａｓｓａｕｘ，  Ｇ．  Ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌａｔｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ    ａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，  １５：  ９９５−１００２，  ２００４．）。これらの発見から、本発明者はｐＡｄ−ＸｐシャトルベクターＭＣＳにおいて、絶縁体配列（ウシ成長ホルモンの停止シグナル）（Ｍａｒｔｉｎ−Ｄｕｑｕｅ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）をクローニングすることを決定し、新規ｐＡｄ（Ｉ）−Ｘｐシャトルベクター（配列ＩＤ番号３３）を作出した。上記絶縁体配列をＩＮＳＵ−Ｆ−ＳｐｅＩ（ＣＣＡＣＴＡＧＴＧＣＴＡＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣ；配列ＩＤ番号３４）及びＩＮＳＵ−Ｒ−ＫｐｎＩ（ＣＧＧＴＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣ；配列ＩＤ番号３５）プライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。この反応の産物をＴＯＰＯ−ｐＣＲ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）中にクローニングし、及び続いてｐＡｄ−ＸｐのＳｐｅＩ及びＫｐｎＩ部位中にサブクローニングし、ｐＡｄ（Ｉ）−Ｘｐを作出した。
【００６４】
Ｅ１Ａタンパク質のｃＤＮＡをそれを構成的に発現する２９３ヒト胚腎臓細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）のゲノムＤＮＡからはじめてＰＣＲによりクローニングした。上記ウイルスゲノムの５６０−１６３２ヌクレオチドに対応する断片をＰＣＲにより増幅した。この断片をＴＯＰＯ−ｐＣＲ４（配列ＩＤ番号３６及び配列ＩＤ番号３７）ベクター中にクローニングし、及び上記配列の同一性を立証するためにシークエンスした。上記構築物をｐｃＤＮＡ３発現ベクター中にサブクローニングし、及びＨｅＬａ細胞中で発現させた。完全な溶解物からのタンパク質のウェスタンブロットを行い、及びそれらを抗Ｅ１Ａ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ，  ＃５５４１５５）で同定することができた。
第一段階において、Ｅ１Ａタンパク質遺伝子をｐＡｄ（Ｉ）−Ｘｐ及びｐＡｄ−Ｘｐベクター中にクローニングした。その目的のために、Ｅ１Ａタンパク質ｃＤＮＡをＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩ酵素でＴＯＰＯ−ｐＣＲ４−Ｅ１Ａベクター（配列ＩＤ番号３６）から抽出し、及びｐＡｄ（Ｉ）−Ｘｐ及びｐＡｄ−ＸｐのＢｇｌＩＩ部位に挿入し、ｐＡｄ（Ｉ）−Ｘｐ−Ｅ１Ａ（配列ＩＤ番号３８）及びｐＡｄ−Ｘｐ−Ｅ１Ａ（配列ＩＤ番号３９）を作出した。第二段階において、Ｆ５１２をＭｌｕＩ及びＢｇｌＩＩでｐＧＬ３（−５１３／＋３５）から抽出し、及びそれをｐＡｄ（Ｉ）−Ｘｐ−Ｅ１Ａ及びｐＡｄ−Ｘｐ−Ｅ１ＡのＭｌｕＩ及びＢｇｌＩＩ部位中にクローニングし、Ｆ５１２の下流のＥ１Ａタンパク質ｃＤＮＡを残した。そのようにして、ｐＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２（配列ＩＤ番号４０）及びｐＡｄ−Ｆ５１２（配列ＩＤ番号４１）ベクターを得た；両方のベクター配列はｐＡｄ−センス（ＴＧＴＴＴＴＴＣＴＣＡＧＧＴＧＴＴＴＴＣＣＧ；配列ＩＤ番号４２）プライマーでシークエンシングにより確認した。
【００６５】
実施例５．−ｈｓｖ−ＴＫ自殺遺伝子の上流にＦ５１２を含むシャトルプラスミドの構築。
ｈｓｖ−ＴＫをコードするｃＤＮＡをｐＡＧＯプラスミド（Ｂｅｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．，  Ａｄｒｉｓ，  Ｓ．，  Ｌｅｄｄａ，  Ｆ．，  Ｗｏｌｆｍａｎｎ，  Ｃ．，  Ｍｅｄｉｎａ，  Ｊ．，  Ｂｒａｖｏ，  Ａ．，  Ｍｏｒｄｏｈ，  Ｊ．，  Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｐｏｄｈａｊｃｅｒ，  Ｏ．  Ｌ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｒａｔ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，  ６：  ３５８−３６６，  １９９９）のＤＮＡを鋳型として及びＦＴＫ／ＲＴＫ（ＧＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＧＴＡＣＣＣＣＧＧＣＣ；配列ＩＤ番号４３／ＧＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＣＴＣ；配列ＩＤ番号４４）プライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ反応の産物をＴＯＰＯ−ｐＣＲ４ベクター中にクローニングした。得られたＴＫ−ＴＯＰＯ−ｐＣＲ４プラスミド（配列ＩＤ番号４５）を制限酵素での消化により及びＴ３（ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡ；配列ＩＤ番号２９）及びＴ７（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ；配列ＩＤ番号２７）ユニバーサルプライマーを用いてシークエンシングにより確認した。
【００６６】
ｈｓｖ−ＴＫ酵素のｃＤＮＡをＮｃｏＩ及びＳａｌＩでの酵素消化によりＴＫ−ＴＯＰＯ−ｐＣＲ４プラスミド（配列ＩＤ番号４５）から抽出した。このＮｃｏＩ−ＴＫ−ＳａｌＩ断片をキャッピングなしでより大きな翻訳効率を許容する内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）の下流のｐＣＩＴＥベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）中にクローニングした。生ずるｐＣＩＴＥ−ＴＫベクターを制限酵素での消化により確認した。続いて、ｐＣＩＴＥ−ＴＫベクターのＩＲＥＳ−ＴＫ断片をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ酵素での消化により抽出した。ＥｃｏＲＩ部位をＫｌｅｎｏｗ酵素で埋め、及びＩＲＥＳ−ＴＫ−ＳａｌＩ断片を、事前にＥｃｏＲＶ及びＳａｌＩ酵素で消化された、実施例４中で得られたｐＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２ベクター中にサブクローニングした。前記クローニングから生ずるベクター、ｐＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ（配列ＩＤ番号４６及び配列ＩＤ番号４７）の取得を制限酵素での消化及びｐＡｄ−センス（ＴＧＴＴＴＴＴＣＴＣＡＧＧＴＧＴＴＴＴＣＣＧ；配列ＩＤ番号４２）及びｐＡｄ−アンチセンス（ＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＴＴＴ；配列ＩＤ番号４８）プライマーでのシークエンシングにより確認した。
【００６７】
実施例６．−ＥＧＦＰグリーンタンパク質をコードする遺伝子の上流にＦ５１２を含むシャトルプラスミドの構築。
その５’末端でＩＲＥＳ配列につなげられたＥＧＦＰタンパク質ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ酵素での消化によりｐＤＣ３１５−ｉＧＦＰプラスミド（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，  Ｔｏｒｏｎｔｏ，  Ｏｎｔａｒｉｏ，  ＣａｎａｄａからのｐＤＣ３１５市販プラスミドから改変されたプラスミド）から抽出した。上記ＥｃｏＲＩ部位をＫｌｅｎｏｗ酵素で埋め、及びＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ＳａｌＩ断片を、事前にＥｃｏＲＶ及びＳａｌＩ酵素で消化した実施例４中に開示されるものにしたがって得られたｐＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２ベクター中にサブクローニングした。このクローニングから生ずるベクター、ｐＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＥＧＦＰ（配列ＩＤ番号４９及び配列ＩＤ番号５０）の取得を制限酵素での消化及びｐＡｄ−センス（ＴＧＴＴＴＴＴＣＴＣＡＧＧＴＧＴＴＴＴＣＣＧ；配列ＩＤ番号４２）及びｐＡｄ−アンチセンス（ＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＴＴＴ；配列ＩＤ番号４８）プライマーでのシークエンシングにより確認した。
【００６８】
実施例７．−Ａｄ−Ｆ５１２組換えウイルスの取得
実施例４中に開示されるものにしたがって得られたｐＡｄ−Ｆ５１２プラスミド（配列ＩＤ番号４１）をＦｓｐＩ酵素で直線化し、及びＥ３領域における欠損を伴うｍｕ２．６〜ｍｕ１００を含む、ＣｌａＩ酵素で事前に制限酵素処理したアデノウイルス５型断片で共に共トランスフェクトした。共トランスフェクションはリン酸カルシウムの手段（Ｆｅｒｒａｒｉ，  Ｃ．  Ｃ．，  Ｄｅｐｉｎｏ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｐｒａｄａ，  Ｆ．，  Ｍｕｒａｒｏ，  Ｎ．，  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｓ，，  Ｐｏｄｈａｊｃｅｒ，  Ｏ．，  Ｐｅｒｒｙ，  Ｖ．  Ｈ．，  Ａｎｔｈｏｎｙ，  Ｄ．  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｐｉｔｏｓｓｉ，  Ｆ．  Ｊ．  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ，  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｂｒｅａｋｄｏｗｎ，  ａｎｄ  ｐｒｏｎｏｕｎｃｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ＩＬ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，  １６５：  １８２７−１８３７，  ２００４）により２９３細胞で及び２９３細胞においてＮｅｖｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．プロトコル（Ｎｅｖｉｎｓ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ２  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，  ６５：  ７６８−７８５，  １９８０）にしたがって行った。上記２のトランスフェクトされた断片Ａｄ−Ｆ５１２（配列ＩＤ番号５１及び配列ＩＤ番号５２）のアデノウイルス領域の間の相同組換えにより、上記組換えアデノウイルスが得られた。Ａｄ−Ｆ５１２構築アデノウイルススキームは図５Ａ中に示される。
【００６９】
一旦得られたら、Ａｄ−Ｆ５１２組換えアデノウイルスをクローニングし、及びストック精製を塩化セシウムダブル勾配（Ｌｉｅｂｅｒ，  Ａ．，  Ｈｅ，  Ｃ．  Ｙ．，  Ｋｉｒｉｌｌｏｖａ，  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｋａｙ，  Ｍ．  Ａ．  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｌａｒｇｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  Ｃｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆｉｒｓｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ７０：  ８９４４−８９６０，  １９９６）の手段により行った。上記アデノウイルス調製物を２９３細胞においてＤＩＣＴ５０の手段（Ｌｉｅｂｅｒ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）により滴定し、Ａｄ−Ｆ５１２について１０12ｖｐ／ｍｌを得た。Ａｄ５−ｗｔを上記分析における陽性複製コントロールとして含め、そこからそのタイターが６．８×１０11ｖｐ／ｍｌである調製物を得た。
【００７０】
なお、ウイルスストックの同一性を確認するために、ウイルスＤＮＡ調製物を作出し、それを制限酵素での消化及びｐＡｄ−センス（ＴＧＴＴＴＴＴＣＴＣＡＧＧＴＧＴＴＴＴＣＣＧ；配列ＩＤ番号４２）及びｐＡｄ−アンチセンス（ＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＴＴＴ；配列ＩＤ番号４８）内部プライマーを用いたシークエンシングに使用した（図５Ｂを参照のこと）。
【００７１】
実施例８．−Ａｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ組換えウイルスの取得
実施例７中に示されるのと同様の方法で、実施例５中で得られたｐＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ（配列ＩＤ番号４６及び配列ＩＤ番号４７）プラスミドをＦｓｐＩ酵素で直線化し、及び領域Ｅ３における欠損を伴うｍｕ２．６〜ｍｕ１００を含むＣｌａＩ酵素で事前に制限酵素処理したＡｄ５断片と共に共トランスフェクトした。共トランスフェクションをリン酸カルシウム法の手段（Ｆｅｒｒａｒｉ，  Ｃ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）により２９３細胞において及び２９３細胞においてＮｅｖｉｎｓのプロトコル（Ｎｅｖｉｎｓ，  Ｊ．  Ｒ．，；１９８０）にしたがって行った。上記２の共トランスフェクトされた断片のアデノウイルス領域の間の相同組換えにより、Ａｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ（配列ＩＤ番号５３及び配列ＩＤ番号５４）組換えアデノウイルスを得た。そのスキームは図５Ａ中に示される。
【００７２】
一旦得られたら、Ａｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫアデノウイルスをクローニングし、及びストック精製を塩化セシウムダブル勾配（Ｌｉｅｂｅｒ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．；  １９９６）の手段により行った。上記アデノウイルス調製物を２９３細胞においてＤＩＣＴ５０の手段（Ｌｉｅｂｅｒ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）により滴定し、１０12ｖｐ／ｍｌのタイターを得た。Ａｄ５−ｗｔを上記分析における陽性複製コントロールとして含め、そこからそのタイターが６．８×１０11ｖｐ／ｍｌである調製物を得た。
【００７３】
なお、ウイルスストックの同一性を確認するために、ウイルスＤＮＡ調製物を作出し、それを制限酵素での消化及びｐＡｄ−センス（ＴＧＴＴＴＴＴＣＴＣＡＧＧＴＧＴＴＴＴＣＣＧ；配列ＩＤ番号４２）及びｐＡｄ−アンチセンス（ＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＴＴＴ；配列ＩＤ番号４８）内部プライマーを用いたシークエンシングに使用した（図５Ｂを参照のこと）。
【００７４】
実施例９．−Ａｄ（Ｉ）−Ｆ５１２（Ｅ３）組換えウイルスの取得
実施例６中で得られたｐＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＥＧＦＰプラスミド（配列ＩＤ番号４９及び配列ＩＤ番号５０）を実施例７及び８でのようにＦｓｐＩ酵素で直線化したが、この場合は、共トランスフェクションはＥ１領域を除いて、しかしＥ３領域を含むＡｄ５ゲノム全体を含むもう一つのプラスミド、ＪＭ１７（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，  Ｔｏｒｏｎｔｏ，  Ｏｎｔａｒｉｏ，  Ｃａｎａｄａ）と共に行った。共トランスフェクションをリン酸カルシウム法の手段（Ｆｅｒｒａｒｉ，  Ｃ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）により２９３細胞において及び２９３細胞においてＮｅｖｉｎｓのプロトコル（Ｎｅｖｉｎｓ，  Ｊ．  Ｒ．，；１９８０）にしたがって行った。上記２の共トランスフェクトされた断片のアデノウイルス領域の間の相同組換えにより、Ａｄ（Ｉ）−Ｆ５１２（Ｅ３）（配列ＩＤ番号５５及び配列ＩＤ番号５６）組換えアデノウイルスを得、そのスキームは図５Ａ中に示され、及びそれは元のウイルス（Ａｄ５）のＥ３領域を含む。
【００７５】
一旦得られたら、Ｅ３領域を含む組換えアデノウイルスをクローニングし、及びストックをダブル塩化セシウム勾配の手段（Ｌｉｅｂｅｒ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．；  １９９６）により精製した。上記アデノウイルス調製物を２９３細胞においてＤＩＣＴ５０の手段（Ｌｉｅｂｅｒ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）により滴定し、１．５×１０12ｖｐ／ｍｌのタイターを得た。上記分析における陽性複製コントロールとしてＡｄ５−ｗｔを含め、そこからそのタイターが６．８×１０11ｖｐ／ｍｌである調製物を得た。
【００７６】
なお、上記ウイルスストックの同一性を確認するために、ウイルスＤＮＡ調製を行い、それを制限酵素での消化及びｐＡｄ−センス（ＴＧＴＴＴＴＴＣＴＣＡＧＧＴＧＴＴＴＴＣＣＧ；配列ＩＤ番号４２）及びｐＡｄ−アンチセンス（ＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＴＴＴ；配列ＩＤ番号４８）内部プライマーを用いたシークエンシングに使用した（図５Ｂを参照のこと）。
【００７７】
実施例１０．−細胞伝染性の決定のためのＡｄ−Ｆ５１２、Ａｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ及びＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２（Ｅ３）アデノウイルスでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析のために、実施例７、８及び９で得られたアデノウイルスを使用した。使用された細胞系は既に実施例１において開示されている。
本発明において使用されたウイルスはＡｄ５に基づき、それを介するエントランスはＣＡＲ受容体（ｃｏｘｓａｃｋｉｅ−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及びインテグリン（Ｋａｎｅｒｖａ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｈｅｍｍｉｎｋｉ，  Ａ．  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．  Ａｎｎ  Ｍｅｄ，  ３７：  ３３−４３，  ２００５）を通る。ＣＡＲ発現は異種であるとすれば、翻訳分析はβ−ガラクトシダーゼ酵素を発現する非複製アデノウイルス（Ａｄ−β−ｇａｌ）を伴って異なる細胞系で行われた。
【００７８】
異なる腫瘍及び正常系をＡｄ−β−ｇａｌで異なる感染多重度（ＭＯＩ）で感染させ、及び感染割合を登録した（表２を参照のこと）。３日後、Ｘ−ｇａｌでの分析をβ−ガラクトシダーゼを明らかにするために行った。青色細胞をカウントし（感染細胞インジケーター）及び非感染細胞に関する割合を計算した。少なくとも３の異なる範囲をカウントした。
【００７９】
【表２】
2009535031.tif 000006
【００８０】
１０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、５０％でしか感染されないＢＡＥＣ及びＡ３７５Ｎ細胞のものを除く、ほとんど全ての系が少なくとも７５％で感染されることが留意された。１００未満のＭＯＩで、９５％超の伝染性を有するＳＢ２黒色腫系を除いて、低い細胞伝染性が観察される（約２５％）。１０のＭＯＩで、ＳＢ２を除いて、ほとんど感染細胞はどの系でも見られない。
要約すると、試験された細胞系の感染能はＳＢ２＞Ｔ８４＞ＨｅＬａ＞ＷＩ−３８ＶＡ＞ＷＩ−３８＞ＬｏＶｏ＞ＢＡＥＣ＞Ａ３７５Ｎであろう。
【００８１】
実施例１１．−腫瘍崩壊能の評価のためのＡｄ−Ｆ５１２、Ａｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ及びＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２（Ｅ３）アデノウイルスでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析
本発明にしたがって構築されたアデノウイルス（ＣＲＡｄｓ）の腫瘍崩壊能を試験するために、それらをｉｎ  ｖｉｔｒｏで異なるＳＰＡＲＣ発現レベルを有する細胞を感染するために使用した。詳細には、ＳＢ２黒色腫、Ａ３７５Ｎ及びＭｅｌＪ系；ＷＩ−３８、ＷＩ−３８ＶＡ及びＨＦＬ−１線維芽細胞系；Ｔ８４及びＬｏＶｏ結腸系；ＨｅＬａ頸部系；ＢＡＥＣ内皮系；及び正常間充織細胞を使用した。Ａｄ５−ｗｔ（野生型）をコントロールとして使用した。上記異なる腫瘍系をＡｄ−Ｆ５１２（配列ＩＤ番号５１及び配列ＩＤ番号５２）、Ａｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ（配列ＩＤ番号５３及び配列ＩＤ番号５４）、Ａｄ−（Ｉ）Ｆ５１２（Ｅ３）（配列ＩＤ番号５５及び配列ＩＤ番号５６）及びＡｄ５−ｗｔアデノウイルスで感染させた。アデノウイルス溶解効果を紫色結晶で実験後プレートに接着したままである細胞を染色することにより及びＭＴＴ分析の手段により代謝活性の定量化をとおして評価した。
【００８２】
アデノウイルスの溶解効果を紫色結晶で染色することにより評価した：  図６を参照して、細胞病理学上の効果の研究に進む単層感染は以下のとおりである：上記細胞を１×１０4細胞／ウェルの濃度で２４−ウェルプレート中にまいた。翌日、それらを２００μｌのハイグルコースＤＭＥＭ２％ＢＦＳ中で３時間異なる感染多重度（ＭＯＩｓ）で感染させた。感染後、８００μｌのそれぞれの細胞系に対応する培地を添加した。１０日後、上記細胞を紫色結晶（４０％メタノール中の溶液０．７５％）で染色し又はβ−ガラクトシダーゼで染色し、及びこの後者の場合、感染割合を登録するために２以上の範囲をカウントした。図６は、使用された異なる細胞系についての、プレート中の紫色結晶での染色分析の写真を示す。
【００８３】
アデノウイルスの溶解効果をＭＴＴ分析の手段により代謝活性の定量化をとおして評価した。  ＭＴＴ分析（細胞生存力）は紫色化合物（フォルマザン）中の黄色テトラゾリウム塩の切断に基づく。この反応はミトコンドリア呼吸鎖中に存在するコハク酸塩−テトラゾリウム還元酵素を有する代謝的に活性な細胞中でのみ起こる。代謝活性の機能として計測される溶解効果（ＭＴＴ分析）は図７中に示される。この分析で、９６ウェルプレートに５×１０3細胞／ウェルの濃度でまき、及び翌日それらを２５μｌ（ハイグルコースＤＭＥＭ２％）中で２時間感染させた。２時間後、１００μｌのそれぞれの細胞系に対応する培地を添加した。１０日後、細胞生存力をＭＴＴ法の手段により計算した（Ｍｏｓｍａｎｎ，  Ｔ．  Ｒａｐｉｄ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ６５：  ５５−６３，  １９８３）。
【００８４】
ＭＴＴでの生存力分析は図７中に示される。一般的に、溶解活性は紫色結晶をとおして示されるものと同様にさまざまな細胞型について留意される；しかしこの場合、紫色結晶での対応する染色の生存力より大きな生存力がそれぞれのＭＯＩについて留意された。これらの分析で、３の系の乳癌（５７８Ｔ、ＭＣＦ７及びＴ−４７Ｄ）が含まれ、それらの全ては非常に低いＳＰＡＲＣ発現を有し、及びＴ−４７Ｄの場合低いＦ５１２活性を有した。驚くべきことに、２の系（ＭＣＦ７及びＴ−４７Ｄ）は１００のＭＯＩでＣＲＡｄｓにかかりやすいことがわかった。
【００８５】
驚くべきことに、上記腫瘍細胞の全てはＣＲＡｄｓにより溶解された。しかしながら、上記腫瘍細胞中でのＣＲＡｄｓの溶解活性はＳＰＡＲＣ  ｍＲＮＡ発現程度に又は上記細胞系におけるプロモーター活性に独立であることがわかった。したがって、例えば、黒色腫細胞について、全てのウイルスはＭｅｌＪ又はＡ３７５ＮにおけるよりＳＢ２においてより有効であるという結果になった。この結果は細胞伝染性と一致するが、プロモーター活性と又はＳＰＡＲＣ発現とは一致しない。ウイルスはそれぞれの系で異なる感染能を有するとすれば、異なるウイルス間の比較は同じ細胞系の中で主になされた。第一の場合、ＳＢ２はＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２（Ｅ３）＞Ａｄ−Ｆ５１２−Ａｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ±ＧＣＶでより効果的に溶解され、一方ＭｅｌＪ（プロモーターはもっと高い活性を示した）はＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２（Ｅ３）−Ａｄ−Ｆ５１２＞Ａｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ±ＧＣＶでより効果的に溶解される。
【００８６】
この比較から、より強くないウイルスは絶縁体配列を含めたものであること、及びＥ３領域の追加は溶解をより効果的にすることが明らかである。なお、溶解効果の増大はＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫで感染された細胞培養物にＧＣＶを添加するのに際して留意されなかった。
【００８７】
一方、Ｔ８４結腸及びＬｏＶｏ系はＡｄ−Ｆ５１２に非常にかかりやすいことがわかったことが留意された。ＬｏＶｏの場合、この効果はＳＢ２黒色腫細胞について観察されたものより強い。Ａｄ−Ｆ５１２は５００のＭＯＩで（中程度にＳＰＡＲＣタンパク質を発現する）ＷＩ−３８線維芽細胞を溶解することができ、一方ウイルスＩＴＲ及びプロモーターの間に絶縁体配列を有する２のウイルスは１０００のＭＯＩで溶解性であることがわかったことが留意されうる。ＧＣＶの追加はＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫの溶解能をわずかに増大させる。Ａｄ−Ｆ５１２ウイルスで分析された２の追加の線維芽細胞系−ＷＩ−３８ＶＡ及びＨＦＬ−１−は１０００のＭＯＩであまり溶解されなかった。３の線維芽細胞系で、Ａｄ５−ｗｔは１のＭＯＩで溶解することができた。内皮細胞はそれらの高いＳＰＡＲＣ発現に独立して、Ａｄ−Ｆ５１２にかかりやすくなかった。骨髄由来の初代間充織細胞は１００のＭＯＩで、Ａｄ−Ｆ５１２によっては影響されなかったが、Ａｄ５−ｗｔによっては影響された。
【００８８】
結論として、３のアデノベクター中のＦ５１２はほとんどの部分の腫瘍系において溶解性であることがわかり、一方それは間充織及び内皮細胞及びいくつかの線維芽細胞のような正常細胞には影響しない。
【００８９】
実施例１２．−異なる細胞系で作出されるウイルス
異なる腫瘍系におけるＣＲＡｄｓの複製能を評価するために、ウイルス収率についての分析を行った。その結果は図８中に示される。
異なる細胞系におけるウイルス生成についての一般的な進行は以下に開示される：
０日目、１０００００細胞を６ウェルプレートのそれぞれのウェル中にまいた。１日目、細胞をハイグルコースＤＭＥＭ培地２％ＢＦＳ中でウェル当たり３００μｌの体積中で５０ＭＯＩで感染させた。感染は少なくとも２の攪拌操作で３７℃で１時間行った。続いて、上記培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄し、及び１ｍｌの１０％ＢＦＳ培地を添加した。３日後、細胞を室温で１５分間維持し、及び培地と共に取り上げた。上清をエッペンドルフ管に移し、及び３の凍結／融解周期を液体窒素を用いて行った。続いて、それを４５００ｒｐｍで遠心分離し、及び前記上清の１／１０連続希釈をハイグルコースＤＭＥＭ培地５％ＢＦＳ及び０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ中で行った。１００μｌのそれぞれの希釈物を２００００細胞／ウェルの割合で２９３細胞を前日にまいた９６ウェルプレートの１のウェル中にまいた（六重）。５日後、上記細胞を４％パラフォルムアルデヒドで固定し、及び紫色結晶溶液で染色した。
【００９０】
図８について、異なる系（黒色腫、結腸、胸部、線維芽細胞及び内皮）におけるアデノウイルス収率はｍｌ当たりのウイルス粒子（ｖｐ／ｍｌ）として表され、及びそれぞれの棒は少なくとも２の独立した分析の平均を示す。
【００９１】
第一に、アデノウイルス収率はＳＰＡＲＣ  ｍＲＮＡ発現とは独立であることが指摘されうる。第二に、全ての系はＡｄ−Ｆ５１２ウイルスのそれより大きなＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２（Ｅ３）複製を示す。第三に、Ａｄ５−ｗｔアデノウイルス収率は１０5までの割合で異なる系の間で異なり（例えば、ＬｏＶｏに５７８Ｔを比較して）、それは一部にはいくつかの系の低い伝染性のためでありうる。なお、より大量のＣＲＡｄｓを生成する系はＣＲＡｄｓに対してより大きなかかりやすさを有するもの（結腸系）である。
【００９２】
実施例１３．−非複製ウイルス及び複製ウイルスの間の協同効果についての研究
上記に示されるように、非複製アデノウイルスは複製を開始するために、トランスのＥ１Ａタンパク質の供給を必要とする。非複製アデノウイルスが増幅されるとき、それらはＥ１Ａタンパク質を構成的に発現するよう改変された２９３細胞で使用されたが、このタンパク質はまた複製アデノウイルスによっても供給されうる。Ａｄ−Ｆ５１２及び非複製アデノウイルス（Ａｄ−β−ｇａｌ）の協同を研究するために、Ｔ８４結腸細胞を一定量のＡｄ−β−ｇａｌ（ＭＯＩ１０）及び増大する量のＡｄ−Ｆ５１２に感染させた。Ａｄ−Ｆ５１２が増大するとき青色染色された細胞における増大が観察され、Ａｄ−β−ｇａｌウイルスにおける局所増大を表すので、Ａｄ−Ｆ５１２は非複製アデノウイルスを補完することができ、その複製及び近隣の細胞をとおした分布を許容する。図９はＴ８４結腸細胞における異なる分析されたＭＯＩｓについてのβｇａｌの染色を示す。
【００９３】
実施例１４．−Ａｄ−Ｆ５１２及びＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ  ＣＲＡｄｓを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ分析
（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌａ  Ｐｌａｔａにより提供される）６−８週齢のＡｔｈｙｍｉｃ雄Ｎ：ＮＴＨ（Ｓ）−ｎｕマウスを分析のために使用した。３の異なるｉｎ  ｖｉｖｏ分析を本発明にしたがって得られた組換えアデノウイルスを用いて行った：２の分析はＡｄ−Ｆ５１２で、及び１はＡｄ−（Ｉ）Ｆ５１２−ＴＫで。
【００９４】
上記動物に４×１０6ＳＢ２黒色腫細胞の接種物を皮下注入した。腫瘍が１００ｍｍ3の平均体積に達したとき（注入後約２０日）、アデノウイルスの腫瘍内注入を投与当たり１０10ｖｐ／３０μｌで開始した。それぞれの動物は処置の開始から数えて０、２、及び８日目に３の投与を受けた。上記分析の１において、ｈｓｖ−ＴＫヘルペス酵素を同時に発現するＣＲＡｄを用いるとき、アデノウイルスでの処置は図１０Ａ中に示されるものにしたがって、ガンシクロビルプロドラッグ（ＧＣＶ，Ｃｙｔｏｖｅｎｅ（商標），Ｒｏｔａｎｇ）の注入に変えた、ここで図１０Ａ中の矢印はＣＲＡｄ注入及びＧＣＶでの処置を示す。この薬物は３０ｍｇ／ｋｇで一日一回投与された。
【００９５】
コントロール群はまた本分析において使用される２のＣＲＡｄｓのうちの１の代わりに、非治療用遺伝子を発現する非複製アデノウイルス（Ａｄ−β−ｇａｌ）の注入を受けた。
図１０ＡはＡｄ−Ｆ５１２−ＴＫ  ＣＲＡｄを用いた分析における腫瘍成長曲線を示し、ここで投与されたＣＲＡｄ注入及びガンシクロビル投与もまた示される。図１０ＢはＡｄ−Ｆ５１２での分析において使用されたマウスにおける腫瘍成長曲線を示す。図１０Ｃは（Ａｄ−β−ｇａｌを注入された）コントロールマウスにおける及びＡｄ−Ｆ５１２  ＣＲＡｄで処置されたマウスにおける腫瘍領域の写真である。図１０Ｄは処置の開始から１４日後にいくつかの動物になされた組織学的切断の写真を示す。最後に、図１０Ｅ及び１０ＦはＡｄ−Ｆ５１２で実現された両方の分析についてのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線（生存率％）である。
【００９６】
Ａｄ−Ｆ５１２での両方の分析において、腫瘍部位におけるあとを残して（図１０Ｃ中で矢印の手段により示される）、ほとんどの部分の処置された腫瘍における全体の軽減（図１０Ｂ、１０Ｅ及び１０Ｆ）が留意された。図１０Ｅ及び１０Ｆを再び参照して、これらの曲線は、Ａｄ−Ｆ５１２で処置された動物の腫瘍は成長しない、それらは全体的に退行する又はそれらはより小さい速度で成長するので、Ａｄ−Ｆ５１２で処置された動物のほとんどが９０日後にまだ生きていること、一方コントロール動物（腫瘍＋Ａｄ−β−ｇａｌ）はそれらの腫瘍は成長し続けるので死ぬことを示す。
【００９７】
組織学的研究をフォルムアルデヒド１０％中での固定及び続くプロセッシングにより、いくつかの動物で行った。このようにして、きずあと領域の組織学的研究は処置の開始から数えて１４及び９０日目の間で差を示した：１４日目では豊富なマクロファージは内部に色素を伴って浸潤し、多形核病巣では、核の残存及び肉芽腫性血管新生が観察されうる（図１０Ｄを参照のこと）一方、９０日目では組織は完全に修復されたことが留意されうる。両方の場合において、剖検を全ての動物で行い、転移は発見されなかった；しかしながら、９０日目に動物のうちの１において、線維症病巣を有する脾臓及び肝炎病巣を有する肝臓が観察された。分析されたコントロールのいずれもこれらの特徴を示さなかった。
Ａｄ−Ｆ５１２での両方の分析における生存曲線（図１０Ｅ及び１０Ｆ）は互いに非常に類似しており、及びそれらはコントロールとは顕著に異なる。
【００９８】
なお、図１０Ａを参照して、自殺ＴＫ遺伝子を発現するＣＲＡｄでの分析はＧＣＶの存在下又は不在下で統計的有意差を示さなかったが、上記ウイルスはコントロールに比較して同等に有効であるという結果になった。
【００９９】
実施例１５．−Ａｄ−Ｆ５１２、Ａｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ及びＡＤ（Ｉ）−Ｆ５１２（Ｅ３）ＣＲＡｄｓを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析
ａ）腫瘍系の分析
この段階では、実施例１１中に示されるように行われた以前の分析は黒色腫、結腸、胸部及びすい臓癌の他の腫瘍系を試験することにより拡大された。上記細胞に対するウイルスの細胞病理学的効果をアデノウイルスでの感染後１０日後にウェルに接着したままであった細胞を紫色結晶で染色することにより分析した。結果は図１１中に示される。（Ｄｒ．  Ｅｓｔｅｌａ  Ｍｅｄｒａｎｏ，  Ｈｏｕｓｔｏｎ，  ＴＸにより親切に提供された）Ｍｅｌ８８８黒色腫細胞を上記実施例１１中で試験されるＳＢ２及びＩＩＢ−Ｍｅｌ−Ｊ細胞（前者はＤｒ．  Ｅｓｔｅｌａ  Ｍｅｄｒａｎｏ，  Ｈｏｕｓｔｏｎ，  ＴＸにより、及び後者はＬｅｄｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＳＰＡＲＣ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｂｒｏｇａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  １９９７  Ｆｅｂ；  ３（２）：１７１−６により親切に提供された）での分析のための濃度と同じウイルス濃度でアデノウイルスにより溶解した。これらの新規分析中に含まれた２の結腸系ＨＴ２９（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−３８）及びＣａＣＯ−２（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−３７）もまた構築されたＣＲＡｄｓに対する結腸細胞のかかりやすさを示す。ＭＩＡ−ＰａＣａ−２すい臓癌系（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４２０）は５×１０7ｖｐ／ｍｌアデノウイルス濃度に感受性であり、一方４の分析された５７８Ｔ胸部系（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１２６）、Ｔ−４７Ｄ（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１３３）、ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−２２）及びＭＤＡ−２３１（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−２６）はＣＲＡｄｓにより影響されないことがわかった（図１１を参照のこと）。全ての場合において、野生型ウイルス（Ａｄ５−ｗｔ）は全ての腫瘍細胞を消去することができる。
【０１００】
ｂ）正常系の分析
臨床分析において腫瘍崩壊性アデノウイルスを用いる必要性の一つは、それが腫瘍細胞において活性であり、及び正常細胞において不活性であるはずであることである。３の構築された腫瘍崩壊性ウイルスの正常細胞における減衰レベルを確立するために、それらの活性を１パネルの前記細胞において分析した。正常メラニン形成細胞、結腸及び胸部細胞系並びに線維芽細胞、ケラチン生成細胞及びヒト微小内皮細胞を含めた。５×１０6ウイルス粒子／ｍｌのＡｄ−Ｆ５１２、Ａｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ又はＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２（Ｅ３）での感染後１０日後、メラニン形成細胞の生存力は９５％超であり、一方１００％の細胞はＡｄ−ｗｔにより溶解された（図１２Ａを参照のこと）。（図１２Ｂを参照のこと）腫瘍崩壊性ウイルスはまた正常ＣＣＤ８４１結腸細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７９０）及び正常ＭＣＦ−１２Ａ胸部細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１０７８２）に対して影響を有しなかったことが示された（図１２Ｃを参照のこと）。これらの系はＳＰＡＲＣを発現を有しない（以下の表３を参照のこと）。ＳＰＡＲＣ発現を有する（Ｉｓａｉａｈ  Ｆｉｄｌｅｒ，  Ｈｏｕｓｔｏｎ，  ＴＸにより親切に提供された）ｈＭＥＣ−１ヒト微小内皮細胞もまた分析され、及びそれらは高いＭＯＩのアデノウイルスにより溶解されることが留意された（図１２Ｄを参照のこと）。続いて、ケラチン生成細胞又は線維芽細胞のような皮膚中に存在する他の細胞成分を分析した。前者はＳＰＡＲＣを生成せず、一方後者はＡ３７５Ｎ腫瘍細胞系に比較されるとき中程度のＳＰＡＲＣ発現を有する（以下の表３を参照のこと）。ケラチン生成細胞（Ｃｒａｖｅｒｉ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより親切に提供されたＨａＣａＴ）に対する、ＣＣＤ１１４０線維芽細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２７１４）に対する及びＭａｌｍｅ−３（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１０２）に対するウイルス効果は図１２Ｅ中に示される。ケラチン生成細胞も線維芽細胞系もアデノウイルスによって溶解されなかったことが留意された。
【０１０１】
それゆえ、ＣＲＡｄｓはＳＰＡＲＣを発現しない正常細胞（結腸、胸部、メラニン形成細胞、ケラチン生成細胞）は溶解しないが、その代わりとしてＳＰＡＲＣを発現するｈＭＥＣ−１微小内皮細胞は溶解する。
【０１０２】
【表３】
2009535031.tif 000007
【０１０３】
ｃ）ＳＰＡＲＣを発現する細胞：単層で成長する腫瘍及び間質細胞（線維芽細胞及び内皮）におけるＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ溶解効果
腫瘍間質細胞（内皮及び線維芽細胞）でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析は、高い又は中程度のＳＰＡＲＣ発現でさえも上記アデノウイルスは腫瘍細胞におけるのと同じ活性を有しなかったことを示した。 本発明者の仮説にしたがって、正常細胞はウイルス複製に対してより抵抗性を有する。この場合、毒性遺伝子を添加することはＳＰＡＲＣプロモーターが活性であるそれらの細胞において特定の様式で溶解能を高めることを許容しうる。したがって、Ａｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析を行い、そこで、上記細胞をまたガンシクロビル（ＧＣＶ）プロドラッグを添加することにより処理した。第一に、ＧＣＶを添加することはＳＢ２黒色腫細胞におけるウイルス溶解を改善することが留意された（図１３Ａを参照のこと）；この改善は、ＧＣＶの添加が腫瘍崩壊性ウイルス活性の開始７２時間後に開始する場合、より有効である。内皮細胞について、それらはプロドラッグのみの存在に対して感受性である（図１３Ｂ中の左側のはじめの３の棒を参照のこと）。７５０のＭＯＩで及びＧＣＶ５０μＭ又は１００μＭの存在下でウイルスを添加することはほとんど全ての細胞の消去を許容する（図１３Ｂ中の最後の２のカラム）。他の分析された内皮細胞はウシ大動脈のものであった（ＢＡＥＣ，  Ｈｅｌｅｎｅ  Ｓａｇｅ，  Ｓｅａｔｔｌｅ，  ＵＳＡにより親切に提供された）。しかしながら、Ａ３７５Ｎより高いＳＰＡＲＣ値を発現する及びＦ５１２ヒトプロモーターが非常に活性である（上記実施例１及び３Ｂを参照のこと）これらの細胞はＡｄ５キャップシッドで適切に感染されない。ｈＭＥＣ−１と同様に、上記細胞はプロドラッグに感受性であるが、ウイルスに加えてＧＣＶプロドラッグの存在はウイルス単独では効果を有しないウイルス濃度で細胞の消去を許容する（図１３Ｃを参照のこと）。
【０１０４】
実施例１６．−Ａｄ−Ｆ５１２及びＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ  ＣＲＡｄｓを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ分析
ｉｎ  ｖｉｖｏ分析を動物（６−８週齢無胸腺症雄マウスＮ：ＮＩＨ（Ｓ）−ｎｕ）で行い、それらに腫瘍及び間質細胞を含む混合された黒色腫腫瘍を注入した。続いて、これらの腫瘍を黒色腫細胞のみの腫瘍についてのものと同じプロトコルを用いて本発明にしたがって得られたＣＲＡｄｓで処置した。
【０１０５】
図１４Ａは、動物がＳＢ２／ｈＭＥＣ−１／ＷＩ−３８混合腫瘍を有し、及びＡｄ−Ｆ５１２で処置された分析の結果を示す。悪性細胞が内皮細胞（ｈＭＥＣ−１）及び線維芽細胞（ＷＩ−３８）で共注入されたときでさえも、アデノウイルスでの処置は成長腫瘍における関連する遅延を作出することが留意され、このウイルスは腫瘍において起こる同様の状況において有効でありうることを示した。
同じ結果は分析を繰り返すとき得られた（データは示されていない）。
【０１０６】
腫瘍細胞及び線維芽細胞の混合された腫瘍に対するアデノウイルス処置の有効性もまた評価した。Ａｄ−Ｆ５１２でのＳＢ２／ＷＩ３８腫瘍の処置は部分的に有効であるという結果になったことが留意された（図１４Ｂ）。ＳＢ２／ｈＭＥＣ−１細胞が注入されたとき、拒絶反応はなかったが、動物のいくつかは上記処置に対してよりよく応答したことが留意された（図１４Ｃ）。最後に、ＳＢ２／ＷＩ−３８腫瘍はＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ＋ＧＣＶで処置され、全部で５の動物のうちの３の動物は完全に腫瘍を拒絶することが留意され、ＴＫ毒性遺伝子の添加は上記ウイルス効果を顕著に改善することを示した（図１４Ｄ）。
【０１０７】
なお、多くのＣＲＡｄｓはｉｎ  ｖｉｖｏよりｉｎ  ｖｉｔｒｏでより大きな非特異性を示すことが開示されている（Ｙａｍａｚａｋｉ，  Ｍ．，  Ｓｔｒａｕｓ，  Ｆ．  Ｈ．，  Ｍｅｓｓｉｎａ，  Ｍ．，  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｂ．  Ｇ．，  Ｔａｋｅｄａ，  Ｔ．，  Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ，  Ｋ．，  ａｎｄ  ＤｅＧｒｏｏｔ，  Ｌ．  Ｊ．  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ／ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｍｕｒｉｎｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，  １１：  ８−１５，  ２００４．）。実施例１１中に開示されるように、本発明に係るウイルスはｉｎ  ｖｉｔｒｏで結腸癌細胞を消去することができた。しかしながら、以前の研究（Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  上記）は、これは非特異的効果のためでありうることを示唆した。それゆえ、結腸及びすい臓癌腫瘍でのｉｎ  ｖｉｖｏ分析を行った。
【０１０８】
結腸腫瘍に対する注目すべきｉｎ  ｖｉｖｏ効果が留意された。実際に、Ａｄ−Ｆ５１２及びＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫはｉｎ  ｖｉｖｏでＬｏＶｏ細胞腫瘍を消去することができなかった（図１５Ａ）；しかしながら、それらの腫瘍への及びＧＣＶの存在下でのｈＭＥＣ−１内皮細胞の添加は、コントロール群の腫瘍に比較して、結腸腫瘍成長における遅延を許容し、ＳＰＡＲＣを発現する内皮細胞の存在はその悪性細胞がＳＰＡＲＣを発現しない腫瘍の消去を高めうることを示した（図１５Ｂ）。
【０１０９】
同じ基礎で、他の群の実験において、Ｍｉａ−ＰａＣａ−２（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４２０）（悪性、すい臓）／ｈＭＥＣ−１混合腫瘍はＡｄ−Ｆ５１２及びＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ＋ＧＣＶで処置され、驚くべきことに、これらの腫瘍は完全に消去されることを示した（図１５Ｃ）。
【０１１０】
本明細書中に開示される本発明の例示される態様は本発明に係る対象を満たすが、多くの改変及び他の態様は当業者に明らかでありうる。それゆえ、添付された請求項は本発明の本質及び範囲内であろう前記改変及び態様の全てを含むことが意図されることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１はヒトＳＰＡＲＣプロモーター、ＨＳＢＭ４０ＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＃  Ｘ８８２５９）の構造スキームを示す。
【図２】図２は異なる腫瘍及び正常系におけるＳＰＡＲＣｍＲＮＡの発現レベルの相対的な評価を示す。
【図３】図３は異なる断片が由来するＳＰＡＲＣプロモーター領域の２のスキームを示す。
【図４Ａ】図４ＡはＡ３７５Ｎ（黒色腫）、ＨｅＬａ（頸部）及びＴ−４７Ｄ（胸部）細胞系においてルシフェラーゼレポーター遺伝子の酵素活性を計測することによりＳＰＡＲＣプロモーターの１１断片のプロモーター活性を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂはさまざまな正常及び腫瘍細胞系においてルシフェラーゼレポーター遺伝子の酵素活性を計測することによりＳＰＡＲＣプロモーターの断片−５１３／＋３５（Ｆ５１２）及び−１１７５／＋７１Δ１０（Ｓｐｄｅｌ）のプロモーター活性を比較する。
【図５Ａ】図５Ａは本発明にしたがって構築されたＡｄ−Ｆ５１２、Ａｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ及びＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２（Ｅ３）アデノウイルスのスキームを示す。
【図５Ｂ】図５ＢはＨｉｎｄＩＩＩ酵素での、本発明に係るＡｄ−Ｆ５１２、Ａｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ及びＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２（Ｅ３）アデノウイルスの制限酵素プロファイルを示す。
【図６】図６はＡｄ５−ｗｔをコントロールとして用いた、本発明にしたがって構築されたＡｄ−Ｆ５１２、Ａｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ及びＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２（Ｅ３）アデノウイルスの異なる腫瘍系における単層細胞病理学的効果を示す。
【図７Ａ】感染１０日後の異なるＭＯＩｓでの本発明に係るＡｄ−Ｆ５１２及びＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２（Ｅ３）アデノウイルスの単層溶解効果（ＭＴＴ分析）を示す；Ａ−黒色腫、ＳＢ２細胞；Ｂ−黒色腫、Ｍｅｌ−Ｊ細胞；Ｃ−結腸細胞；Ｄ−胸部細胞。
【図７Ｂ】感染１０日後の異なるＭＯＩｓでの本発明に係るＡｄ−Ｆ５１２及びＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２（Ｅ３）アデノウイルスの単層溶解効果（ＭＴＴ分析）を示す；Ａ−黒色腫、ＳＢ２細胞；Ｂ−黒色腫、Ｍｅｌ−Ｊ細胞；Ｃ−結腸細胞；Ｄ−胸部細胞。
【図７Ｃ】感染１０日後の異なるＭＯＩｓでの本発明に係るＡｄ−Ｆ５１２及びＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２（Ｅ３）アデノウイルスの単層溶解効果（ＭＴＴ分析）を示す；Ａ−黒色腫、ＳＢ２細胞；Ｂ−黒色腫、Ｍｅｌ−Ｊ細胞；Ｃ−結腸細胞；Ｄ−胸部細胞。
【図７Ｄ】感染１０日後の異なるＭＯＩｓでの本発明に係るＡｄ−Ｆ５１２及びＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２（Ｅ３）アデノウイルスの単層溶解効果（ＭＴＴ分析）を示す；Ａ−黒色腫、ＳＢ２細胞；Ｂ−黒色腫、Ｍｅｌ−Ｊ細胞；Ｃ−結腸細胞；Ｄ−胸部細胞。
【図８】図８は異なるヒト腫瘍系における本発明に係るＡｄ−Ｆ５１２及びＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２（Ｅ３）アデノウイルスの生成を示す。
【図９】図９はＡｄ−β−ｇａｌアデノウイルスの複製に対するＡｄ−Ｆ５１２により与えられるＥ１Ａ遺伝子の協同効果を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｆはｉｎ  ｖｉｖｏ分析結果を示す。図１０ＡはＡｄ（Ｉ）Ｆ５１２−ＴＫでの分析についての腫瘍成長曲線を示す。
【図１０Ｂ】図１０ＢはＡｄ−Ｆ５１２での第一分析における動物の腫瘍成長曲線を示す。
【図１０Ｃ】図１０ＣはＡｄ−β−ｇａｌで及びＡｄ−Ｆ５１２で処置された腫瘍を示す。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは１４日後の、１０Ｃにおいて示される領域の組織学的写真を示す。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは分析ＢについてのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を示す。
【図１０Ｆ】図１０ＦはＡｄ−Ｆ５１２での第二分析についてのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を示す。
【０１１２】
【図１１】図１１は本発明に係るＡｄ−Ｆ５１２、Ａｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ及びＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２（Ｅ３）ＣＲＡｄｓの単層における細胞病理学的効果を示す。感染後１０日後の異なる濃度での細胞単層におけるＣＲＡｄｓの溶解効果（紫色結晶で染色する）が示される。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｅは正常細胞における、本発明に係るＡｄ−Ｆ５１２、Ａｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ及びＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２（Ｅ３）ＣＲＡｄｓの細胞病理学的効果を示す；図１２Ａは正常メラニン形成細胞において感染後１０日後に撮られたＣＲＡｄｓ写真を示す；ＡＤ−ｗｔ及び処置なし（ＰＢＳ）コントロールの写真が含まれる；図１２Ｂは正常ＣＣＤ８４１結腸細胞に対する細胞病理学的効果を示す；図１２Ｃは正常ＭＣＦ１２Ａ胸部細胞に対する細胞病理学的効果を示す；図１２Ｄは微小内皮細胞に対する溶解効果を示す；図１２Ｅはケラチン生成細胞及び線維芽細胞（ＣＣＤ１１４０及びＭａｌｍｅ−３）に対するウイルス効果を示す。
【図１３】図１３Ａ〜１３ＣはＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫの単層細胞病理学的効果を示す；ＧＣＶプロドラッグの存在下又は不在下での感染後１０日後の異なるウイルス濃度での細胞の単層に対するＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫの溶解効果（紫色結晶で染色する又はＭＴＴにより計測される生存細胞）；図１３ＡはＳＢ２黒色腫細胞での分析を示す；図１３ＢはＧＣＶ及びＧＣＶ＋ウイルスの存在下でのｈＭＥＣ−１細胞の生存細胞を示す；図１３ＣはＢＡＥＣ細胞に対する細胞病理学的効果を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｄは黒色腫腫瘍でのｉｎ  ｖｉｖｏ分析を示す；図１４ＡはＡｄ−Ｆ５１２で処置されたＳＢ２／ＷＩ−３８／ｈＭＥＣ−１腫瘍での分析を示す；
【図１４Ｂ】図１４ＢはＡｄ−Ｆ５１２で処置されたＳＢ２／ＷＩ−３８腫瘍での分析を示す；
【図１４Ｃ】図１４ＣはＡｄ−Ｆ５１２で処置されたＳＢ２／ｈＭＥＣ−１腫瘍を示す；
【図１４Ｄ】図１４ＤはＡｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ＋ＧＣＶ、ｎ＝５又はＰＢＳ＋ＧＣＶ、ｎ＝４で処置されたＳＢ２／ＷＩ−３８腫瘍を示し、ここでｎは処置された動物数である。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５Ｄは結腸及びすい臓腫瘍でのｉｎ  ｖｉｖｏ分析を示す；図１５ＡはＡｄ−Ｆ５１２（ｎ＝７）、Ａｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ（ｎ＝６）又はＰＢＳ（ｎ＝７）で処置されたＬｏＶｏ腫瘍に対する分析を示す；
【図１５Ｂ】図１５ＢはＡｄ−Ｆ５１２（ｎ＝６）、Ａｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ＋ＧＣＶ（ｎ＝６）又はＰＢＳ＋ＧＣＶ（ｎ＝６）で処置されたＬｏＶｏ／ｈＭＥＣ−１腫瘍の平均を示す；
【図１５Ｃ】図１５ＣはＡｄ−Ｆ５１２（ｎ＝６）、Ａｄ（Ｉ）−Ｆ５１２−ＴＫ＋ＧＣＶ（ｎ＝６）又はＰＢＳ＋ＧＣＶ（ｎ＝５）で処置されたＭｉａ−ＰａＣａ／ｈＭＥＣ−１の腫瘍成長を示す。全ての場合において、ｎは処置された動物数を示す。
【図１】
2009535031.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
2009535031.tif 000011
【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2009535031.tif 000014
【図６】
2009535031.tif 000015
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
2009535031.tif 000020
【図９】
2009535031.tif 000021
【図１０Ａ】
2009535031.tif 000022
【図１０Ｂ】
2009535031.tif 000023
【図１０Ｃ】
2009535031.tif 000024
【図１０Ｄ】
2009535031.tif 000025
【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2009535031.tif 000030
【図１４Ａ】
2009535031.tif 000031
【図１４Ｂ】
2009535031.tif 000032
【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
2009535031.tif 000035
【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【配列表】
2009535031000001.app
【国際調査報告】
2009535031.tif 000038
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2009535031.tif 000040