(57)【要約】  サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種（９°Ｎ−７株）から単離された熱安定性ＤＮＡリガーゼを表す組成物と、その製造及び使用方法について記載する。熱安定性ＤＭＡリガーゼはライゲーション中の補因子としてＡＴＰに依存するが、ＮＡＤ＋には依存せず、１００℃で活性を維持する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡリガーゼ活性をもち、配列番号１３に対して少なくとも９１％のアミノ酸配列一致度をもつ実質的に純粋な組換え蛋白質。
【請求項２】
（ａ）配列番号２と実質的に同一の配列；
（ｂ）配列番号２と実質的に相補的な配列；
（ｃ）ストリンジェント条件下で配列番号２とハイブリダイズする配列；及び
（ｄ）配列番号１３をコードする配列
から構成される群から選択されるＤＮＡ配列によりコードされるＤＮＡリガーゼ活性をもつ実質的に純粋な蛋白質。
【請求項３】
約１００℃の温度で３０分間インキュベーション後にリガーゼ活性の少なくとも２５％が維持されている請求項１に記載の蛋白質。
【請求項４】
約１００℃の温度で３０分間インキュベーション後にリガーゼ活性の少なくとも２５％が維持されている請求項２に記載の蛋白質。
【請求項５】
ライゲーション中に補因子としてＡＴＰを利用することができるが、ＮＡＤ＋は利用することができない請求項１、２、３又は４に記載の蛋白質。
【請求項６】
ＤＮＡリガーゼをコードするＤＮＡであって、ＤＮＡが、
（ａ）配列番号２と実質的に同一の配列；
（ｂ）配列番号２と実質的に相補的な配列；
（ｃ）ストリンジェント条件下で配列番号２とハイブリダイズする配列；及び
（ｄ）配列番号１３をコードする配列
から構成される群から選択される配列をもつ前記ＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項８】
請求項１に記載の蛋白質を発現することが可能な宿主細胞。
【請求項９】
（ａ）請求項１又は２に記載のリガーゼを選択する段階と；
（ｂ）少なくとも１本のＤＮＡ鎖に切れ目を含むＤＮＡとリガーゼを混合する段階と；
（ｃ）切れ目にホスホジエステル結合をライゲーションする段階を含むホスホジエステル結合のライゲーション方法。
【請求項１０】
リガーゼが古細菌単離株に由来する熱安定性リガーゼである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
古細菌単離株がＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）である請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）は古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）門の１属である。これらの古代生物は高温を含む極限条件下の各種環境で増殖する。これらの生物が実験室で増殖する能力は非常に限られているので、その生化学又はその代謝については殆ど分かっていない。
【０００２】
リガーゼは２本鎖ＤＮＡの１本鎖切れ目の部位におけるホスホジエステル結合の形成を触媒する酵素である。リガーゼ酵素は２本鎖ＤＮＡの一般に平滑末端同士又は付着末端同士の共有結合も触媒する。リガーゼは１種の熱安定性リガーゼであるＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑリガーゼ）を含む各種細菌からクローニングされている。このリガーゼは米国特許第６，０５４，５６４号に記載されている。
【０００３】
サーモコッカスはごく少数しか単離されていないので、これらの細菌に含まれるリガーゼ又はこのような蛋白質をコードする遺伝子の特性については殆ど分かっていない（例えばＮａｋａｔａｎｉら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８２：６４２４−６４３３（２０００）参照）。別のＡｒｃｈａｅａ属であるパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）に由来するリガーゼも例えば米国特許第５，５０６１３７号及び５，７００，６７２号と、Ｋｅｐｐｅｔｉｐｏｌａら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８７：６９０２−６９０８（２００５）に記載されている。
【０００４】
リガーゼはＤＮＡ増幅、配列決定及び一塩基多型の検出等の分子生物学の多くの技術で使用されている。高温で安定であり、迅速な反応速度と厳密な特異性をもつ改良型リガーゼを見出すことが依然として必要である。
【発明の開示】
【０００５】
本発明の１態様では、ＤＮＡリガーゼ活性をもち、配列番号１３に対して少なくとも９１％のアミノ酸配列一致度をもつ実質的に純粋な組換え蛋白質を提供する。
【０００６】
本発明の別の態様では、ＤＮＡリガーゼ活性をもち、ＤＮＡリガーゼが（ａ）配列番号２と実質的に同一の配列；（ｂ）配列番号２と実質的に相補的な配列；（ｃ）ストリンジェント条件下で配列番号２と実質的にハイブリダイズする配列；及び（ｄ）配列番号１３をコードする配列から構成される群から選択されるＤＮＡ配列によりコードされる実質的に純粋な蛋白質を提供する。
【０００７】
上記態様の蛋白質は更に約１００℃の温度で３０分間インキュベーション後にリガーゼ活性の少なくとも２５％がリガーゼにより維持されていることを特徴とする。更に、リガーゼはライゲーション中に補因子としてＡＴＰを利用するが、ＮＡＤ＋ではこの目的に検出可能な効果が得られないことも特徴とすることができる。
【０００８】
別の態様では、（ａ）配列番号２と実質的に同一の配列；（ｂ）配列番号２と実質的に相補的な配列；（ｃ）ストリンジェント条件下で配列番号２とハイブリダイズする配列；及び（ｄ）配列番号１３をコードする配列から構成される群から選択される配列をもつＤＮＡリガーゼをコードするＤＮＡを提供する。
【０００９】
別の態様では、上記ＤＮＡを含むベクターを記載する。更に、前記ベクターからリガーゼを発現することが可能な宿主細胞を提供する。
【００１０】
別の態様では、上記型のＤＮＡリガーゼを選択する段階と；少なくとも１本のＤＮＡ鎖に切れ目を含むＤＮＡとリガーゼを混合する段階と；切れ目にホスホジエステル結合をライゲーションする段階を含むホスホジエステル結合のライゲーション方法を提供する。
【００１１】
前記方法の１例では、ＤＮＡリガーゼは古細菌単離株、より詳細にはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）に由来する熱安定性リガーゼである。
【００１２】
（態様の詳細な説明）
「熱安定性リガーゼ」なる用語は本明細書ではＤＮＡのライゲーションを触媒し、１００℃で３０分後にその活性の少なくとも２５％を維持する酵素の意味で使用する。この非常に高温下での熱安定性はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓリガーゼ（古細菌）をＴｈｅｒｍｕｓリガーゼ（細菌）から区別する特徴である。
【００１３】
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）は熱水噴出孔から単離されたＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種である（Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈら，ＰＮＡＳ  ９３：５２８１（１９９６））。
【００１４】
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）ＤＮＡリガーゼの２種の公知最近縁種はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓリガーゼとＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓリガーゼ（ＪＰ  ２０００３０８４９４−Ａ／１）であり、夫々アミノ酸レベルで８８％と９０％の一致度をもつ。これらはどちらもＮＡＤ＋又はＡＴＰを補因子として利用すると報告されているので、新規類のリガーゼである。Ｔ．ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓリガーゼはＮＡＤ＋又はＡＴＰを等しく良好に利用することがＮａｋａｔａｎｉら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８２：６４２４−６４３３（２０００））により報告されており、Ｔ．ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓリガーゼはＡＴＰの代わりにＮＡＤ＋を使用すると活性レベルが低下し、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）はＮＡＤ＋では活性を検出できなかった（実施例２）。
【００１５】
「実質的に同一」及び「実質的に相補的」なる用語はＤＮＡ又はアミノ酸配列が指定配列とほぼ同一もしくは一致しているか、又は相補的配列とほぼ同一もしくは一致していることを意味する。この用語は図面に示したアミノ酸又はＤＮＡ配列に対して僅かな配列相違を含む配列も包含する。このような相違は蛋白質のライゲーション機能を有意に妨げない突然変異イベントに起因すると思われる。
【００１６】
本発明の１態様では、ストリンジェントハイブリダイゼーションは以下の条件下で実施される。ａ）ハイブリダイゼーション：０．７５Ｍ  ＮａＣｌ，０．１５  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１％  ＮａＣｌ，０．１％  ＳＬＳ，０．０３％  ＢＳＡ，０．０３％  Ｆｉｃｏｉｌ  ４００，０．０３％  ＰＶＰ及び１００μｇ／ｍｌ煮沸仔ウシ胸腺ＤＮＡ中で５０℃にて約１２時間；ｂ）４５℃にて０．１×ＳＥＴ，０．１％  ＳＤＳ，０．１％  ＮａＣｌ及び０．１Ｍリン酸緩衝液で３０分間３回洗浄し、ハイブリダイズした２本鎖ＤＮＡの存在をサザンブロットで検出する。
【００１７】
本明細書に引用する全文献及び米国予備出願第６０／７１７，２９６号（出願日２００５年９月１５日）は参照により本明細書に組込む。
【実施例１】
【００１８】
縮重プライマーを使用したＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）ＤＮＡリガーゼ遺伝子のクローニング
まずＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）ゲノムＤＮＡからＰＣＲにより遺伝子を増幅した。フォワードプライマーの配列はＮａｋａｔａｎｉら，Ｊ．Ｂａｃｔ  １８２（２２）：６４２４−６４３３（２０００）（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）とＲｏｌｌａｎｄら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔ．２３６（２）：２６７−２７３（２００４）（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ）の文献に記載のものを利用した。指定の縮重度をもつコンセンサス配列を以下のようにデザインした。
【００１９】
【化１】
2009508488.tif 000003
【００２０】
【化２】
2009508488.tif 000004
【００２１】
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）のプライマーを使用してゲノムＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）ＤＮＡからＤＮＡリガーゼの遺伝子を増幅した。遺伝子をクローニングするために使用したＰＣＲ反応条件は以下の通りとした。
【００２２】
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ，ｐＨ８．８、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４及び４ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、各ｄＮＴＰ  ２００μＭ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）ゲノムＤＮＡ５０ｎｇ、フォワードプライマー及びリバースプライマー各５００ｎｇ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ２．５単位並びにＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ０．０２単位を含有する反応混合物１００μｌを９４℃まで１分間加熱した後、１分間で４５℃とした後、３分間で７２℃にした。この温度サイクルを３０回繰返した。サイクリングの完了後、反応温度を室温まで下げ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗフラグメント５単位を加え、更に５分間室温でインキュベートした。次に反応混合物を７０ｍＭ  ＥＤＴＡに調整した。ＰＣＲ産物をフェノール抽出し、アルコール沈殿させ、ＣＬ６Ｂセファローススピンカラムで脱塩した。
【００２３】
１７００ｂｐ  ＰＣＲ産物を大腸菌にクローニングした。ＥｃｏＲＶで開裂したｌｉｔｍｕｓ  ２８ｉをベクターとして使用してＤＮＡフラグメントをクローニングした。
【００２４】
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液にインサート８０ｎｇ、ｌｉｔｍｕｓベクター８０ｎｇ及びＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）４００単位を加えてライゲーション反応液１０μｌとした。ライゲーション反応液を１６℃で一晩インキュベートし、大腸菌ＴＢ１細胞にエレクトロポレーションし、ＩＰＴＧ  ＸＧＡＬプレートにプレーティングした。
【００２５】
白色コロニーをピッキングした。９個の白色コロニーのうちの１個は１７００ｂｐインサートを含んでいた。別のエレクトロポレーションにより、１７００ｂｐインサートを含む更に１個のクローンが得られた。これらの２個のクローンのインサートを配列決定した。
【００２６】
これらのクローンの配列から、縮重度の低い新規フォワードプライマーを次のようにデザインした。
【００２７】
【化３】
2009508488.tif 000005
【００２８】
（２）（１）のプライマーよりも縮重度の低い第２のフォワードプライマーを使用したＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）リガーゼのクローニング
５個の縮重塩基を含む上記（１）のフォワードプライマーの代わりに縮重塩基を１個しか含まない９°Ｎ−７フォワードプライマーを使用して独立したＰＣＲ反応を更に４回実施した。
【００２９】
Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）１００μｌにＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）ゲノムＤＮＡ５０ｎｇ、フォワードプライマー及びリバースプライマー各５００ｎｇ、各ｄＮＴＰ  ２００μＭ並びにＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）１μｌを加え、９８℃まで３０秒間加熱した後、９８℃で１０秒間→７０℃で３０秒間→７２℃で１分間を２５サイクル繰返した。次に反応混合物を７２℃で５分間インキュベートした。各ＰＣＲ反応の産物を最初のＰＣＲ反応と同様に処理し、上記のようにｌｉｔｍｕｓ  ２８ｉにクローニングした。ＰＣＲ反応からの２個の独立したクローン（Ａ１及びＡ３）は他の３回のＰＣＲ反応の各々からの１個のクローン（Ｂ２、Ｃ３、Ｄ３）と同様に１７００塩基対インサートを含むことがミニプレップＤＮＡにより確認された。これらのクローンを次に増殖させ、その粗抽出液をＳＤＳ  ＰＡＧＥで電気泳動させた。各クローンは６０ｋｄ蛋白質を発現した。
【００３０】
クローンＡ１、Ａ３、Ｂ２、Ｃ３、Ｄ３に加え、ｌｉｇ７及びｌｉｇ８からのプラスミドを精製し、インサートを配列決定した。ＤＮＡ配列を図１ａ−１〜１ａ−５（配列番号１〜７）に示す。
【００３１】
理論により限定する意図はないが、観察された配列の僅かな相違はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）細胞集団内のクローン変異に起因するものと思われる。配列変異は全て３位置換ないし保存アミノ酸置換である。クローンＢ２はリガーゼのコンセンサス配列の代表例である。このＤＮＡリガーゼを先ず厳密に制御された発現ベクターで発現させた（図２）。
【００３２】
（３）大腸菌におけるリガーゼ遺伝子（Ｂ２）の発現
ＮｄｅＩとＸｂａＩで開裂することによりＢ２フラグメントをｌｉｔｍｕｓベクターから切り出した。１７００ｂｐフラグメントをアガロースゲルから切り出し、ゲルスライスをアガロースで消化し、フラグメントを遊離させた。
【００３３】
ＮｄｅＩとＸｂａＩで開裂することにより発現ベクターｐＭａｌＣ２Ｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を作製し、脱リン酸化した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液にインサート４００ｎｇとベクター１００ｎｇとＴ４  ＤＮＡリガーゼ２００単位を加えた反応液１０μｌ中、１６℃で１６時間インキュベートすることにより、１７００塩基対の開裂ＰＣＲフラグメントをｐＭａｌＣ２Ｘベクターにライゲーションした。ライゲーション反応物を大腸菌ＴＢ１細胞にエレクトロポレーションし、１７００ｂｐフラグメントをもつクローンを単離し、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）Ｂ２−１（図３）と命名した。
【００３４】
クローンをＬＢ培地で増殖させ、ＩＰＴＧで誘導した。誘導細胞のサンプルを溶解させ、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで電気泳動させると、〜６０ｋｄのサイズの蛋白質に対応するバンドが検出された。ＤＮＡ配列に由来する蛋白質配列を分析した処、遺伝子は２６個のレアアルギニンコドンをもつ蛋白質をコードすることが分かった。従って、より高レベルの発現が得られるようにアルギニンのレアｔＲＮＡを含む宿主細胞（大腸菌ＢＬ−２（ＤＥ３）ＲＩＬ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  ＪｏＩＩａ，ＣＡ）を使用した。Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）の誘導後に、宿主サンプル中のＢ２−１プラスミドをＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した処、顕著な６０ｋｄバンドが観察された。
【００３５】
（４）Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）リガーゼと他の熱安定性ＤＮＡリガーゼの比較
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）ＤＮＡリガーゼアミノ酸配列をＣＬＵＳＴＡＬ多重配列アラインメントにより４種の他の好熱性ＤＮＡリガーゼと比較した。
【００３６】
ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（１．８２）多重配列アラインメント
配列フォーマットはＰｅａｒｓｏｎである。
配列１：９°Ｎ−７−Ｂ２（配列番号１５）５６４ａａ
配列２：Ｔ．ｋｏｄａｋａｒａｅｎｉｓ（配列番号１６）５６２ａａ
配列３：Ｐ．ａｂｙｓｓｉ（配列番号１７）５５９ａａ
配列４：Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ（配列番号１８）５６１ａａ
配列５：Ｔ．ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ（配列番号１９）５５９ａａ。
一致度スコア：
配列（１：２）整列。スコア：９０
配列（１：３）整列。スコア：８１
配列（１：４）整列。スコア：７８
配列（１：５）整列。スコア：８８
配列（２：３）整列。スコア：８０
配列（２：４）整列。スコア：８０
配列（２：５）整列。スコア：８７
配列（３：４）整列。スコア：９０
配列（３：５）整列。スコア：７８
配列（４：５）整列。スコア：７７。
【００３７】
アラインメントを図４に示す。Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）ＤＮＡリガーゼに最も近縁の公知のものはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｅｎｓｉｓ  ＤＮＡリガーゼであり、アミノ酸一致度９０％及びヌクレオチド一致度８０．９％である。
【００３８】
（５）Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）ＤＮＡリガーゼの精製
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）に由来するＤＮＡリガーゼのＢ２フラグメントを含むｐＭａｌＣ２Ｘプラスミド（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）で大腸菌ＢＬ−２１（ＤＥ３）−ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  ＪｏＩＩａ，ＣＡ）を形質転換した。アンピシリン５０μｇ／ｍｌとクロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを添加した３７℃のＬＢ培地１００ｍｌ中で細胞を増殖させた。一晩インキュベーション後、培養液を１０リットル容発酵槽に移し、ＯＤ６００が０．５９になるまで３７℃でインキュベートし、ＩＰＴＧ  ０．１ｇを加えた。培養液を更に５．７５時間インキュベートし、回収した。細胞ペーストを−２０℃で保存した。
【００３９】
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５，２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１．０ｍＭ  ＤＴＴの混合物４０ｍｌ中の細胞ペースト１０ｇを解凍し、音波処理により溶解させた。抽出液を０．３ｍＭ  ＰＭＳＦ及び２００ｍＭ  ＮａＣｌにした。抽出液を遠心により清澄化した。清澄化した抽出液を０．２Ｍ  ＮａＣｌのＤＥＡＥセファロースカラムに通した。カラムを通過した蛋白質をプールし、１００ｍＭ  ＮａＣｌまで希釈した。これをホスホセルロースカラムにアプライし、吸収された蛋白質を１００ｍＭ→１．１Ｍ  ＮａＣｌ勾配で溶出させた。フラクション（図５）をＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析し、主６０ｋｄピークをプールし、７５℃まで３０分間加熱した。この溶液を遠心により清澄化し、清澄化溶液を１００ｍＭ  ＮａＣｌまで希釈し、ヒドロキシアパタイトカラムにアプライした。硫酸アンモニウムの０→１３％勾配をカラムにアプライし、フラクションを集め、ＨｉｎｄＩＩＩλＤＮＡ  ５０μｇ／ｍｌを基質として各種フラクションをＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）中でインキュベートすることにより活性をアッセイした。反応液を３７℃で１０分間インキュベートした。１０％  １００ｍＭ  ＥＤＴＡと５０％グリセロール及びブロムフェノールブルー色素を加えることにより反応を終了した。反応液を６５℃まで加熱し、分析のために１％アガロースゲルにロードした。
【００４０】
リガーゼ活性約８０％を含む試験管をプールし、５０％グリセロール、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ，ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１．０ｍＭ  ＤＴＴで透析した。精製したＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ株）ＤＮＡリガーゼを−２０℃で保存した。
【実施例２】
【００４１】
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）ＤＮＡリガーゼの特性
推奨反応条件は以下の通りである：
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
２．５ｍＭ  ＤＴＴ
３００ｕＭ  ＡＴＰ。
【００４２】
４５℃で活性をアッセイするための典型的な基質はλＤＮＡである。適切に消化したλＤＮＡはλＤＮＡの両末端に１２塩基伸長部のライゲーションを検出することができる。一般にＨｉｎｄＩＩＩ又はＢｓｔＥＩＩで予め消化したＤＮＡを使用した。ライゲーションの分析はアガロースゲル電気泳動で実施した。
【００４３】
ＡＴＰのＫｍは１００μＭ未満であると思われる。活性はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により刺激した。
【００４４】
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ  ＤＮＡリガーゼと異なり、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）リガーゼはＮＡＤ＋の存在下で活性を検出できかなった。
【００４５】
この酵素はマグネシウムイオンを必要とする。２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２では、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２の１０倍の活性が得られた。
【００４６】
酵素を約１００℃で３０分間インキュベートした後に活性の２５％〜５０％が維持された（図６）。
【００４７】
このリガーゼはニックの入ったＤＮＡを９０℃でシールすることができる。ＤＮＡリガーゼをＢｓｔＮＢＩによりニックを入れたｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡと共にインキュベートすると、ニックの入った弛緩プラスミドを共有結合で閉じた環状ＤＮＡに変換することがアガロースゲル電気泳動により判明した。反応速度は４５℃よりも８０℃のほうが速かった。ニックの入ったプラスミドは９０℃で変性したが、ニックの入ったプラスミドの全てが変性により１本鎖になる前に９０℃で実質的なニックのシールが生じた。
【実施例３】
【００４８】
ＤＮＡ修復混合物におけるＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）ＤＮＡリガーゼの使用
９°Ｎ−７株ＤＮＡリガーゼを含む酵素混合物を使用して、脱プリン化により損傷したＤＮＡの修復を行った。
【００４９】
Ｉｄｅ，Ｈ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２（３２）：８２７６−８３（１９９３）により記載されているように、実験反応のＤＮＡを脱プリン化により損傷させた。λＤＮＡ（ＮＥＢ＃Ｎ３０１１，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）をエタノール沈殿させた。ＤＮＡを脱プリン化緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭクエン酸，ｐＨ５．０）に０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁し、７０℃で１２０分間インキュベートした。次にサンプルをエタノール沈殿させ、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ，０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０の溶液に再懸濁した。緩衝液対照で校正後にＤＮＡ含有溶液のＡ２６０を測定することによりＤＮＡ濃度を測定した。
【００５０】
ＤＮＡ（１ｎｇ）；１００μＭ  ｄＮＴＰ（ＮＥＢ＃Ｍ０４４７，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；１ｍＭ  ＡＴＰ；Ｔａｑリガーゼ（ＮＥＢ＃Ｍ０２０８，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）４８０単位又は９°Ｎ−７  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ＃Ｍ０２３８，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）５００単位；大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ  Ｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｏｌＩ）（ＮＥＢ＃Ｍ０２０９，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）０．１単位；大腸菌Ｅｎｄｏ  ＩＶ（ＮＥＢ＃Ｍ０３０４，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）１０単位；１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（ＮＥＢ＃Ｂ９００４，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）で最終容量４７．５μＬとした酵素混合物中で、損傷したＤＮＡを室温にて１０分間インキュベートした。
【００５１】
反応後にサンプルを氷に移した後、増幅した。陰性対照は酵素を添加しない以外は上記のように処理した。
【００５２】
ＤＮＡ増幅反応
プライマーとしてＣＧＡＡＣＧＴＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＡＡＣＡＧＧ（Ｌ７２−５Ｒ）（配列番号２３）とＣＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＧＣ（Ｌ３０３５０Ｆ）（配列番号２４）を使用し、Ｗａｎｇら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：１１９７−１２０７（２００４）の方法に従ってλのＤＮＡ増幅を実施した。
【００５３】
増幅混合物２．５μｌを上記修復混合物４７．５ｍｌに加えた。増幅混合物は１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液中、各ｄＮＴＰ  １００μＭ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）５単位、Ｖｅｎｔ（登録商標）（ｅｘｏ＋）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）０．１単位、プライマーＬ７２−５Ｒ  ５×１０−１１Ｍ及びプライマーＬ３０３５０Ｆ  ５×１０−１１Ｍとした。
【００５４】
修復酵素を反応から除外した場合の酵素保存緩衝液作用を補正するために、適切な容量のその保存緩衝液を反応液に加えた。いずれの場合も、増幅反応液は９５℃で２０秒間を１サイクル後に９４℃で５秒間、次いで７２℃で５分間を２５サイクルというパラメーターを使用してサーマルサイクラーで処理した。増幅するアンプリコンのサイズは５ｋｂとした。
【００５５】
ＤＮＡ（５ｋｂ）の増幅結果を１％アガロースゲル電気泳動により測定した。６×ローディング色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１，ｐｐ．５．４−５．１７）を増幅反応液５０μｌに加えた。次にサイズ標準として２−ｌｏｇラダー（ＮＥＢ＃Ｎ３２００，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）１μｇと共にこの溶液２０μｌをアガロースゲルにロードした。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１ａ−１】図１ａ−１〜１ａ−５は９°Ｎ−７  ＤＮＡリガーゼ変異体（配列番号１〜７）のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１ａ−２】図１ａ−１〜１ａ−５は９°Ｎ−７  ＤＮＡリガーゼ変異体（配列番号１〜７）のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１ａ−３】図１ａ−１〜１ａ−５は９°Ｎ−７  ＤＮＡリガーゼ変異体（配列番号１〜７）のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１ａ−４】図１ａ−１〜１ａ−５は９°Ｎ−７  ＤＮＡリガーゼ変異体（配列番号１〜７）のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１ａ−５】図１ａ−１〜１ａ−５は９°Ｎ−７  ＤＮＡリガーゼ変異体（配列番号１〜７）のＤＮＡ配列アラインメントを示す。
【図１ｂ−１】図１ｂ−１〜１ｂ−２はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）ＤＮＡリガーゼ変異体（配列番号８〜１５）の蛋白質アラインメントを示す。
【図１ｂ−２】図１ｂ−１〜１ｂ−２はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）ＤＮＡリガーゼ変異体（配列番号８〜１５）の蛋白質アラインメントを示す。
【図２】ｌｉｔｍｕｓ  ２８ｉに挿入したＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）ＤＮＡリガーゼ遺伝子のプラスミドマップを示す。
【図３】ｐＭａｌＣ２ｘに挿入したＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）ＤＮＡリガーゼ遺伝子のプラスミドマップを示す。
【図４−１】Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）（配列番号１５）とＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ（配列番号１６）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（配列番号１７）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ（配列番号１８）、及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（配列番号１９）の蛋白質アラインメントを示す。
【図４−２】Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（９°Ｎ−７株）（配列番号１５）とＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ（配列番号１６）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（配列番号１７）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ（配列番号１８）、及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（配列番号１９）の蛋白質アラインメントを示す。
【図５】ホスホセルロースカラムフラクションのＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。レーンは以下の通りである：ＦＴ（カラムのフロースルー）はフラクション番号２３−３４である；ＭＷは分子量標準である。矢印はゲル上のＤＮＡリガーゼに対応するバンドの位置を示す。
【図６】９°Ｎ−７  ＤＮＡリガーゼの熱安定性を示す。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＤＴＴ、３００μＭ  ＡＴＰ及び０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の混合物３０μｌに精製９°Ｎ−７  ＤＮＡリガーゼの１００倍希釈液３μｌを加え、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＤＴＴ、３００μＭ  ＡＴＰ及び０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で更に３倍系列希釈した。４個の同一希釈液セットを３０分間４℃、８０℃、９０℃又は１００℃でインキュベートした。反応を終了するために、サンプルを氷上に置き、等容量の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ，ｐＨ７．５、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＤＴＴ、３００μＭ  ＡＴＰ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び５０μｇ／ｍｌ  ＢｓｔＥＩＩλＤＮＡを各管に加えた。次に反応液を４５℃で１５分間インキュベートした後、０．１５倍容量の５０％グリセロール、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ及びブロモフェノールブルーを各管に加えた。次に反応液を７５℃で５分間インキュベートし、１％アガロースＴＢＥゲルで電気泳動させた。パネルＡは氷上で３０分間インキュベーションの結果を示す。パネルＢは８０℃で３０分間インキュベーションの結果を示す。パネルＣは９０℃で３０分間インキュベーションの結果を示す。パネルＤは１００℃で３０分間インキュベーションの結果を示す。各パネルのレーンは以下の通りである：レーン１はそれ以上希釈しない場合を示す；レーン２は３倍に希釈した；レーン３は９倍に希釈した；レーン４は２７倍に希釈した；レーン５は８１倍に希釈した。
【図７】大腸菌ポリメラーゼ及び大腸菌Ｅｎｄｏ  ＩＶを含む修復混合物で９°Ｎ−７ポリメラーゼをＴａｑポリメラーゼと比較したゲルを示す。修復混合物は脱プリン化ＤＮＡと共にインキュベートし、増幅した。レーン１は対照であり；レーン２は修復混合物の不在下のＤＮＡであり；レーン３及び４はＤＮＡとＴａｑリガーゼ４８０単位を加えた修復混合物の二重サンプルであり；レーン５及び６はＤＮＡと９°Ｎ−７リガーゼ５００単位を加えた修復混合物の二重サンプルである。
【図１ａ−１】
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【図１ａ−２】
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【図１ａ−３】
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【図１ａ−４】
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【図１ａ−５】
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【図１ｂ−１】
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【図１ｂ−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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