(57)【要約】  本発明は、野生型ＩＦＮα２と比べて改善された特異的なアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性を有する、ＩＦＮα２変異体、並びにその活性断片、類似体、誘導体、及び変種を提供する。本発明はさらに、癌、自己免疫疾患、感染症、又はＩＦＮα２発現の増大を伴う障害を治療又は予防するのに有用な、ＩＦＮα２変異体を含む薬剤組成物も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸残基５７〜８９内の少なくとも１つのアミノ酸置換、Ｃ末端アミノ酸残基１５９〜１６５の少なくとも１つのアミノ酸置換、及びそれらの組合せから選択される変異を含み、野生型ＩＦＮα２（配列番号２）と比べて改善された特異的なアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性を有する、組換えインターフェロンα２（ＩＦＮα２）ポリペプチド、その活性断片、類似体、誘導体、及び変種。
【請求項２】
Ｈ５７Ａ（配列番号２４）、Ｅ５８Ａ（配列番号２５）、Ｑ６１Ａ（配列番号２６）、Ｈ５７Ｙ（配列番号２７）、Ｅ５８Ｎ（配列番号２８）、Ｑ６１Ｓ（配列番号２９）、及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの変異を含み、野生型ＩＦＮα２（配列番号２）と比べて改善された特異的なアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
野生型ＩＦＮα２（配列番号２）と比べて改善された特異的活性を有する、３重変異体Ｈ５７Ａ、Ｅ５８Ａ、Ｑ６１Ａ（配列番号５）を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
野生型ＩＦＮα２（配列番号２）と比べてアンタゴニスト活性を有する、４重変異体Ｎ６５Ａ、Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ａ、Ｙ８９Ａ（配列番号６）を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
野生型ＩＦＮα２（配列番号２）と比べて改善された特異的活性を有する、Ｃ末端のＥＳＬＲＳＫＥからＫＲＬＫＳＫＥへの置換（配列番号７）を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
野生型ＩＦＮα２（配列番号２）と比べて改善された特異的活性を有する、３重変異体Ｈ５７Ａ、Ｅ５８Ａ、Ｑ６１Ａ及びＣ末端のＥＳＬＲＳＫＥからＫＲＬＫＳＫＥへの置換の組合せ（配列番号８）を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
野生型ＩＦＮα２（配列番号２）と比べてアンタゴニスト活性を有する、４重変異体Ｎ６５Ａ、Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ａ、Ｙ８９Ａ及びＣ末端のＥＳＬＲＳＫＥからＫＲＬＫＳＫＥへの置換の組合せ（配列番号９）を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
野生型ＩＦＮα２（配列番号２）と比べて改善された特異的活性を有する、３重変異体Ｈ５７Ｍ、Ｅ５８Ｄ、Ｑ６１Ｌ（配列番号１０）を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
野生型ＩＦＮα２（配列番号２）と比べて改善された特異的活性を有する、３重変異体Ｈ５７Ｙ、Ｅ５８Ｎ、Ｑ６１Ｓ（配列番号１１）を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
野生型ＩＦＮα２（配列番号２）と比べて改善された特異的活性を有する、３重変異体Ｈ５７Ｍ、Ｅ５８Ｄ、Ｑ６１Ｌ及びＣ末端のＥＳＬＲＳＫＥからＫＲＬＫＳＫＥへの置換の組合せ（配列番号１２）を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
野生型ＩＦＮα２（配列番号２）と比べて改善された特異的活性を有する、３重変異体Ｈ５７Ｙ、Ｅ５８Ｎ、Ｑ６１Ｓ及びＣ末端のＥＳＬＲＳＫＥからＫＲＬＫＳＫＥへの置換の組合せ（配列番号１３）を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ＰＥＧにさらに結合されている請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
アミノ酸残基５７〜８９内の少なくとも１つのアミノ酸置換、Ｃ末端アミノ酸残基１５９〜１６５の少なくとも１つのアミノ酸置換、及びそれらの組合せから選択される変異を含み、野生型ＩＦＮα２（配列番号２）と比べて改善された特異的なアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ分子。
【請求項１４】
配列番号１５〜２３及び配列番号３０〜３５からなる群から選択される配列を含む請求項１３に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１５】
１種又は複数種の転写制御エレメントに作働可能に連結された請求項１３又は１４に記載のＤＮＡ分子を含むベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
アミノ酸残基５７〜８９内の少なくとも１つのアミノ酸置換、及びＣ末端アミノ酸残基１５９〜１６５の少なくとも１つのアミノ酸置換、並びにそれらの組合せから選択される変異を含み、野生型ＩＦＮα２（配列番号２）と比べて改善された特異的なアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性を有する、組換えインターフェロンα２（ＩＦＮα２）ポリペプチド、その活性断片、類似体、誘導体、及び変種を有効成分として含み、製薬上許容される担体をさらに含む、薬剤組成物。
【請求項１８】
配列番号５〜１３及び配列番号２４〜２９のいずれか１つを有する組換えインターフェロンα２（ＩＦＮα２）ポリペプチド、その断片、類似体、誘導体、及び変種を含む、請求項１７に記載の薬剤組成物。
【請求項１９】
改善された特異的なアゴニスト活性を有する、配列番号５、７、８、１０、１１、１２、及び１３のいずれか１つを有する組換えインターフェロンα２（ＩＦＮα２）ポリペプチド、その断片、類似体、誘導体、及び変種を含む、請求項１８に記載の薬剤組成物。
【請求項２０】
改善された特異的なアンタゴニスト活性を有する、配列番号６及び９のいずれか１つを有する組換えインターフェロンα２（ＩＦＮα２）ポリペプチド、その断片、類似体、誘導体、及び変種を含む、請求項１８に記載の薬剤組成物。
【請求項２１】
インターフェロン（ＩＦＮ）の調節に関連している障害又は疾患を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に請求項１９に記載の薬剤組成物を治療有効量投与するステップを含み、前記障害又は疾患が、癌、自己免疫疾患、及び感染症からなる群から選択される方法。
【請求項２２】
前記癌が、ヘアリー細胞白血病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、及び黒色腫からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症（ＭＳ）である請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＭＳが、再発寛解型ＭＳ、二次性進行型ＭＳ、一次性進行型ＭＳ、及び進行再発型ＭＳからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記感染症が肝炎ウイルス感染症である請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
肝炎ウイルスが、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、及びＣ型肝炎からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＩＦＮα２の発現の増大を伴う障害を治療又は予防するための方法であって、それを必要とする対象に請求項２０に記載の薬剤組成物を治療有効量投与するステップを含む方法。
【請求項２８】
前記障害がインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記障害が全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
アミノ酸残基５７〜８９内の少なくとも１つのアミノ酸置換、Ｃ末端アミノ酸残基１５９〜１６５の少なくとも１つのアミノ酸置換、及びそれらの組合せから選択される変異を含み、野生型ＩＦＮα２（配列番号２）と比べて改善された特異的なアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性を有する、組換えインターフェロンα２（ＩＦＮα２）ポリペプチド、その活性断片、類似体、誘導体、及び変種の、ＩＦＮの調節に関連した障害又は疾患の治療又は予防用の医薬品を調製するための使用。
【請求項３１】
ＩＦＮの調節に関連した障害又は疾患の治療又は予防用の医薬品を調製するための、請求項２〜１２のいずれか一項に記載のインターフェロンα２（ＩＦＮα２）変異体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型ＩＦＮα２と比べて改善された特異的なアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性を有する、組換えインターフェロンα２（ＩＦＮα２）変異体、その断片、類似体、誘導体、及び変種、並びに、癌、自己免疫疾患、感染症、及びＩＦＮα２発現の増大を伴う障害を治療又は予防するのに有用な、その薬剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロン（ＩＦＮ）は１９５７年にＩｓａａｃｓ及びＬｉｎｄｅｎｍａｎｎによって発見され、ウイルス増殖を妨げるその能力にちなんで命名された。インターフェロンはまた、細菌感染症及び寄生虫感染症と闘い、細胞分裂を阻害し、自発的アポトーシスを阻害し、且つ、細胞分化を促進又は妨害することができる。受容体特異性に基づいて、２つのタイプのインターフェロン、すなわちＩ型及びＩＩ型が認識されている。Ｉ型インターフェロンは、白血球の産生物であるＩＦＮα及びＩＦＮω、線維芽細胞によって産生されるＩＦＮβ、並びに有蹄動物種においてのみ説明されているＩＦＮτを含む、単量体タンパク質のファミリーである。
【０００３】
公知である唯一のＩＩ型インターフェロンは、リンパ球によって専ら産生される二量体ＩＦＮγである。インターフェロンαファミリーは、イントロン無しの完全に翻訳された遺伝子１３種（偽遺伝子を除く）から構成される。各メンバーには、２つの保存されたジスルフィド結合、すなわちＣｙｓ１−Ｃｙｓ９８及びＣｙｓ２９−Ｃｙｓ１３８を含む、１６５個又は１６６個のアミノ酸残基からなる成熟タンパク質が含まれる。高レベルの配列相同性（８０％）が、様々なインターフェロンαサブタイプの間で示されており、また、これらのサブタイプとＩＦＮβの間に約３５％の相同性が存在する。異なるサブタイプは相同性が高いにもかかわらず、それらの生物活性、中でも抗増殖活性、抗ウイルス活性、及び免疫調節活性は、著しく異なる。
【０００４】
マウスのＩＦＮβ（１ＩＦＡ、１ＲＭＩ）、ヒトＩＦＮβ（１ＡＵ１）、ヒトＩＦＮα２（１ＲＨ２、１ＩＴＦ）、及びヒツジＩＦＮτ（１Ｂ５Ｌ）を含めて、いくつかのＩ型インターフェロンの構造が解明されている。構造的には、インターフェロンは、αヘリックスサイトカインファミリーのメンバーである。Ｉ型インターフェロンはすべて、ＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２から構成される共通の受容体複合体を介してシグナルを伝達する。Ｉ型インターフェロン受容体の主要なリガンド結合構成要素はＩＦＮＡＲ２であり、ＩＦＮα２に対する結合親和力は、約１０ｎＭである。ＩＦＮＡＲ２の細胞外部分の構造は、２つの免疫グロブリン様ドメインからなり、ＩＦＮα２の結合部位は、Ｎ末端ドメイン及び結合ループに位置している。
【０００５】
成熟したＩＦＮＡＲ１は、５３０アミノ酸のタンパク質であり、２１残基から構成される膜貫通セグメント及び１００残基の細胞質ドメインを有する。ＩＦＮＡＲ１の細胞外部分の構造は不明であるが、その配列から、４つの免疫グロブリン様ドメインから構成されていると推論することができる。ＩＦＮＡＲ１へのＩＦＮα２の結合は弱く、人口膜上で測定された親和力は１．５μＭ〜５μＭである。ウシＩＦＮＡＲ１（ＢｏＩＦＮＡＲ１）及びヒトＩＦＮＡＲ１（ＨｕＩＦＮＡＲ１）は、６８％同一である。ＨｕＩＦＮＡＲ１のサブドメイン２及び３は、ＩＦＮα２への結合の際に重要な役割を果たすことが示されている。これらのサブドメインを相同なＢｏＩＦＮＡＲ１と交換することによって、親和力は実質的に増加した。可溶性ＢｏＩＦＮＡＲ１は、１０ｎＭの親和力でヒトインターフェロンに結合することができ、これは、ＨｕＩＦＮＡＲ１の親和力より５００倍大きい。ＩＦＮＡＲ２を発現するマウス細胞は、８ｎＭの親和力でＩＦＮα２に結合するのに対し、ＩＦＮＡＲ１のみを発現する細胞は、リガンド結合を示さない。ＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２を同時発現させると、ＩＦＮα２に対する親和力の１０倍の増加が観察された。人工膜上でのｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究によって、ＩＦＮＡＲ１によって誘導される、三元複合体の結合親和力の増加の大きさは、この受容体の相対的な表面濃度に関係することが示された。インターフェロン上のＩＦＮＡＲ１結合部位の位置は、Ｂヘリックス、Ｃヘリックス、及びＤヘリックス、並びにＤＥループ上に位置するようにＩＦＮβ上でマッピングされたのに対し、ＩＦＮα２のＡｌａスキャン変異誘発では、ＩＦＮＡＲ１結合部位がＢヘリックス及びＣヘリックスに限られていることが示唆された。
【０００６】
いくつかの研究により、三元複合体の形成が、順次的に起こること、すなわち、初めにインターフェロンがＩＦＮＡＲ２に結合して中間複合体を形成し、続いてＩＦＮＡＲ１が動員されることが示唆された。ＩＦＮＡＲ１−ＩＦＮβ−ＩＦＮＡＲ２複合体は、１：１：１の化学量論比を有することが示されている。ＩＦＮＡＲ１受容体は、インターフェロン受容体複合体の不可欠な構成要素であり、ＩＦＮＡＲ１無発現変異又はこの受容体に対する中和Ａｂの添加は、ＩＦＮα及びＩＦＮβに対する抗ウイルス応答及び抗増殖応答の完全な欠如をもたらす。ＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２が結合すると、構成的に結合している細胞内キナーゼＪａｋ１及びＴｙｋ２の活性化が刺激されて、チロシンリン酸化カスケードが生じ、それにより、リン酸化シグナル伝達因子及び転写活性化因子（ＳＴＡＴ）の二量体化、並びに核中への移行が起こり、核中で、それらは特定のＤＮＡ配列に結合し、何百個もの応答性遺伝子の転写を刺激する。
【０００７】
非常に類似したＩＦＮが同じ細胞型に対してどのようにして差次的な活性を誘導するかに関する疑問は未解決のままである。異なるＩＦＮαサブタイプの生物活性は、それらの各自の結合親和力及び使用される細胞型と相関があることが示唆されている。
【０００８】
脊椎動物のＩ型インターフェロンは、２種の膜貫通型タンパク質（ＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２）から構成される単一の共有受容体によって認識され、結合したＪａｋキナーゼを介して、主要標的としてのＳｔａｔ転写因子を用いて活性を示す（Ｂｒｉｅｒｌｅｙ，Ｍ．Ｍ．及びＦｉｓｈ，Ｅ．Ｎ．２００２年、Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．２２巻、８３５〜８４５頁）。細胞外ドメイン（ｈＣＲドメイン）のＩｇＧ様のフォールディングによって通常認識されるように、ＩＦＮＡＲ２及びＩＦＮＡＲ１は、それぞれ、結合タンパク質及び補助的な形質導入因子、すなわちヘテロマー受容体のα鎖及びβ鎖とみなされる。２つの鎖のリガンド解離定数の差異が、定義に潜在的に含まれている。それでもなお、どちらも、高親和性の結合部位を作り出すことに寄与している。様々な認識鎖と「共通の」β鎖の組合せは、様々なリガンドに差次的に応答するヘテロマー受容体の特徴である。様々なα鎖と相互作用する能力により、差次的な受容体発現のための潜在的なネットワーク連絡が確立される（Ｋｏｔｅｎｋｏ，Ｓ．Ｖ．及びＬａｎｇｅｒ，Ｊ．Ａ．２００４年、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４巻、５９３〜６０８頁）。ＩＦＮＡＲ１と同様に、それらが、様々なシグナル伝達経路の要素と相互作用する能力を有している場合、それらは、差次的な遺伝子発現のための連絡を確立し得る（Ｐｌａｔａｎｉａｓ，Ｌ．Ｃ．及びＦｉｓｈ，Ｅ．Ｎ．１９９９年、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２７巻、１５８３〜１５９２頁）。
【０００９】
ヒトＩＦＮを数えると、１２種の異なる非対立遺伝子αタンパク質、１種のβ、及び１種のωがある。著しい配列相同性、共有される３Ｄコア構造、及び共有受容体を有するファミリーから予想されるように、Ｉ型ＩＦＮの活性は重複している。それでもなお、アミノ酸の差異によってそれらを認識し、さらには分類することができ、且つ、活性の相対的差異の多数の例が注目されている。浮かび上がってくるイメージは、機能的差異は、特定の生理学的状況においてのみ現れるというものである。ほぼすべての細胞に抗ウイルス防御を与える際の局所作用の他に、それらは、第２の系統の抗ウイルス防御の発達に関係があるとされている。ＩＦＮ間で存在し得る差異が、ＩＦＮＡＲ１に強固に結合する潜在能力であり得ることが注目された（Ｒｏｉｓｍａｎら、２００５年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３５３巻、２７１〜２８１頁）。
【００１０】
Ｉ型ＩＦＮの差次的な活性は、何年にも渡って、熱心な研究の主題である。特に、ＩＦＮβがＩＦＮαを上回る付加的な範囲の活性を有することが注目された。これら２種のＩＦＮ間の差異を詳細に解析することにより、ＩＦＮβが、ＩＦＮ応答性遺伝子の転写活性化において一般により高い活性を有すること、及び低いＩＦＮレベルで活性であることが示された。結合研究により、補助的なサブユニットＩＦＮＡＲ１に対する親和力が、ＩＦＮα２とＩＦＮβの間の重要な差異であることが示唆された（Ｊａｉｔｉｎ、２００６年  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２６巻、１８８８〜１８９７頁）。
【００１１】
ＩＦＮα２は、抗癌作用を有することが公知である。しかし、この治療は常に効果的であるとは限らず、投薬量及び治療法の期間に関係のある容認し得ない副作用をもたらすことがある。ＷＯ  ９７／１２６３０では、ＩＦＮα２と組み合わせたテモゾロミドによる癌患者の治療を開示している。ＷＯ  ０１／５４６７８では、テモゾロミド及びペグ化インターフェロンによる癌患者の治療を開示している。
【００１２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症は、米国で最も一般的な慢性の血液感染症である。新たな感染の数は減少しているものの、慢性感染症の負担は相当である。疾病管理センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、米国で３９０万人（１．８％）の人が感染していると推定している。慢性肝疾患は、米国の成人の主要な死亡原因の１０番目であり、毎年約２５，０００件の死亡の原因であり、又は全死亡の約１％を占める。研究により、慢性肝疾患の４０％がＨＣＶに関係しており、毎年推定８，０００〜１０，０００件の死亡をもたらすことが示されている。ＨＣＶに関連した末期の肝疾患は、成人の肝臓移植の最も一般的な適応症である。
【００１３】
慢性Ｃ型肝炎の抗ウイルス治療法は、この１０年間で急速に発達し、治療の有効性の顕著な改善が認められている。それでもなお、ペグ化ＩＦＮαとリバビリンを使用する併用療法でさえ、４０％〜５０％の患者は治療法に失敗し、すなわち、非応答者又は再発者（ｒｅｌａｐｓｅｒ）である。これらの患者には、現在、有効な治療代替案が無い。特に、肝生検において進行した線維症又は肝硬変を有する患者は、腹水症、黄疸、静脈瘤出血、脳障害、及び進行性の肝不全を含めて、進行した肝疾患の合併症を発症するリスクが顕著であり、また、肝細胞癌のリスクが著しく増加している。
【００１４】
多発性硬化症（ＭＳ）は、慢性の神経学的自己免疫性脱髄性疾患である。ＭＳは、霧視、片側の視力低下（視神経炎）、平衡感覚の低下、協調不全、不明瞭言語、振戦、しびれ感、極端な疲労、知的機能（記憶力や集中力など）の変化、筋力低下、感覚異常、及び失明を引き起こし得る。多くの対象は慢性進行性の能力障害を発症するが、長期間の臨床的安定性により、悪化期間が中断される場合がある。神経学的欠損は、永続性又は一過性であり得る。ＭＳの病理学は、中枢神経系を対象とする異常な免疫応答を特徴とする。特に、Ｔリンパ球が、中枢神経系のミエリン鞘に対して活性化されて、脱髄を引き起こす。脱髄のプロセスにおいて、ミエリンは破壊され、且つ、プラークとして公知である、硬くなった「硬化性」組織の瘢痕によって置き換えられる。これらの病変は、脳、視神経、及び脊髄の全体にわたって散らばった位置に現れる。ＭＳの治療における使用が米国において認可されている２つのタイプのインターフェロンβは、インターフェロンβ１ａ及びインターフェロンβ１ｂである。
【００１５】
自己免疫性糖尿病又はインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）としても公知のＩ型糖尿病は、自己反応性Ｔリンパ球による膵臓（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｓｓ）細胞の選択的破壊を特徴とする自己免疫疾患である（Ｂａｃｈ、１９９４年、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１５巻：５１６〜５４２頁）。ＩＤＤＭの病理学は非常に複雑であり、後成的事象（おそらくウイルス感染）、膵島細胞、及び遺伝的に感受性である宿主の免疫系の相互作用を伴う。ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γを含むいくつかのサイトカインが、ヒト及びこの疾患の動物モデルにおけるＩＤＤＭの病因に関係があるとされている（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９１年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８７巻：７３９〜７４２頁）。ウイルスなど潜在的な糖尿病誘発性刺激に応答した膵島細胞によるＩＦＮ−αの局所的発現は、膵島炎の（ｉｎｓｕｌｉｔｉｃ）プロセスを誘発し得ると思われる。
【００１６】
ＷＯ９３０４６９９では、ＩＦＮ−αアンタゴニストを投与することを含む、インスリン依存性糖尿病を治療するための方法を開示している。
【００１７】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者におけるＩＦＮ−α発現レベルの上昇に基づいて、ＩＦＮ−αは、ＳＬＥの病因にも関係があるとされた（Ｙｔｔｅｒｂｅｒｇ及びＳｃｈｎｉｔｚｅｒ、１９８２年、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２５巻：４０１〜４０６頁）。ＷＯ０２０６６６４９では、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を治療するための抗ＩＦＮ−α特異的抗体を開示している。
【００１８】
米国特許出願公開第２００４０２３００４０号では、αインターフェロン−２のシステイン変種を開示している。米国特許出願公開第２００４０００２４７４号では、ヒトＤａｕｄｉ細胞系に基づいたアッセイにおいて抗増殖活性を有するαインターフェロンホモログを開示している。
【００１９】
米国特許第４，５８８，５８５号では、コドン１７の第１塩基のＴからＡへの変化によってＣｙｓ１７がＳｅｒ１７に変更された、不正確なジスルフィド結合形成を防ぐ、変異ＩＦＮ−β−１ｂを開示している。Ｗ０２００５０１６３７１では、特異的活性のより大きな改良された組換えヒトＩＦＮ−β−１ｂ変種を含む薬剤組成物を開示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
癌、感染症、多発性硬化症、及びＩＦＮα２の発現の増大を伴う自己免疫障害に対して利用可能な治療は高価で、特定の比率の患者においてのみ効果的であり、また、有害な副作用が珍しくない。安全で、信頼性が高く、有効で、且つ費用対効果が大きい適切な治療方法に対する医学的必要は依然として満たされていない。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、重要な治療的有用性を有する新規のＩＦＮα２変異体を提供する。本発明の変種は、アゴニスト又はアンタゴニストとして、野生型ＩＦＮα２と比べて改善された特異性を有する。
【００２２】
本発明は、組換えＩＦＮα２変異体が、ＩＦＮβ（配列番号３）の結合特性を模倣し、且つ差次的なＩＦＮβ活性の重要な特徴を示すという知見を初めて開示する。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの抗増殖活性の増大、並びにＩＦＮＡＲ２受容体の特異的な下方調節を含む。
【００２３】
第１の態様によれば、本発明は、アミノ酸残基５７〜８９内の少なくとも１つのアミノ酸置換、及びＣ末端アミノ酸残基１５９〜１６５の少なくとも１つのアミノ酸置換、並びにそれらの組合せから選択される変異を含み、野生型ＩＦＮα２（配列番号２）と比べて改善された特異的なアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性を有する、組換えインターフェロンα２（ＩＦＮα２）ポリペプチド、その活性断片、類似体、誘導体、及び変種を提供する。
【００２４】
いくつかの実施形態によれば、ポリペプチドは、Ｈ５７Ａ（配列番号２４）、Ｅ５８Ａ（配列番号２５）、Ｑ６１Ａ（配列番号２６）、Ｈ５７Ｙ（配列番号２７）、Ｅ５８Ｎ（配列番号２８）、Ｑ６１Ｓ（配列番号２９）、及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの変異を含み、前記ポリペプチドは、野生型ＩＦＮα２（配列番号２）と比べて改善された特異的なアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性を有する。
【００２５】
１つの実施形態によれば、本発明は、野生型ＩＦＮα２（配列番号２）と比べて改善された特異的活性を有する、３重変異体Ｈ５７Ａ、Ｅ５８Ａ、Ｑ６１Ａ（配列番号５）を提供する。
【００２６】
別の実施形態によれば、本発明は、野生型ＩＦＮα２と比べてアンタゴニスト活性を有する、４重変異体Ｎ６５Ａ、Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ａ、Ｙ８９Ａ（配列番号６）を提供する。
【００２７】
別の実施形態によれば、本発明は、野生型ＩＦＮα２と比べて改善された特異的活性を有する、Ｃ末端のＥＳＬＲＳＫＥからＫＲＬＫＳＫＥへの置換を含むＩＦＮα２タンパク質（配列番号７）を提供する。
【００２８】
本発明のＩＦＮα２変異体の特異的変異は、それぞれ、タンパク質上の異なる位置に位置しており、したがって、組み合わされて、付加的な効果又は増大された効果をもたらし得る。
【００２９】
１つの実施形態によれば、本発明は、３重変異体Ｈ５７Ａ、Ｅ５８Ａ、Ｑ６１Ａ及びＣ末端のＥＳＬＲＳＫＥからＫＲＬＫＳＫＥへの置換の組合せを含み、特異的活性が非常に高いＩＦＮα２変種（配列番号８）を提供する。
【００３０】
別の実施形態によれば、本発明は、４重変異体Ｎ６５Ａ、Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ａ、Ｙ８９Ａ及びＣ末端のＥＳＬＲＳＫＥからＫＲＬＫＳＫＥへの置換の組合せを含み、ＩＦＮＡＲ２への結合親和力が増大しているが、生物活性が非常に低いＩＦＮα２変種（配列番号９）を提供する。このＩＦＮα２変種は、それらの受容体を介してＩＦＮの天然の活性を妨害するＩＦＮアンタゴニストとして作用することを以下に開示する。
【００３１】
別の実施形態によれば、本発明は、野生型ＩＦＮα２（配列番号２）と比べて改善された特異的活性を有する、３重変異体Ｈ５７Ｍ、Ｅ５８Ｄ、Ｑ６１Ｌ（配列番号１０）を提供する。
【００３２】
さらに別の実施形態によれば、本発明は、野生型ＩＦＮα２（配列番号２）と比べて改善された特異的活性を有する、３重変異体Ｈ５７Ｙ、Ｅ５８Ｎ、Ｑ６１Ｓ（配列番号１１）を提供する。
【００３３】
さらに別の実施形態によれば、本発明は、野生型ＩＦＮα２（配列番号２）と比べて改善された特異的活性を有する、３重変異体Ｈ５７Ｍ、Ｅ５８Ｄ、Ｑ６１Ｌ及びＣ末端のＥＳＬＲＳＫＥからＫＲＬＫＳＫＥへの置換の組合せを含むＩＦＮα２変種（配列番号１２）を提供する。
【００３４】
さらに別の実施形態によれば、本発明は、野生型ＩＦＮα２（配列番号２）と比べて改善された特異的活性を有する、３重変異体Ｈ５７Ｙ、Ｅ５８Ｎ、Ｑ６１Ｓ及びＣ末端のＥＳＬＲＳＫＥからＫＲＬＫＳＫＥへの置換の組合せを含むＩＦＮα２変種（配列番号１３）を提供する。
【００３５】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、特異的活性が増大した、ＰＥＧ化ＩＦＮα２変異体を提供する。
【００３６】
別の態様によれば、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を提供する。１つの実施形態によれば、これらのＤＮＡ分子は、配列番号１５〜２３及び配列番号３０〜３５から選択される配列を含む。
【００３７】
さらなる態様によれば、本発明は、本発明のＤＮＡ分子を含むベクターであって、原核宿主細胞又は真核宿主細胞において変異体ＩＦＮα２ポリペプチドを発現することができるベクターを提供する。
【００３８】
さらに別の態様によれば、本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００３９】
別の態様によれば、本発明は、アミノ酸残基５７〜８９内の少なくとも１つのアミノ酸置換、Ｃ末端アミノ酸残基１５９〜１６５の少なくとも１つのアミノ酸置換、並びにそれらの組合せから選択される変異を含み、野生型ＩＦＮα２（配列番号２）と比べて改善された特異的なアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性を有する、組換えインターフェロンα２（ＩＦＮα２）ポリペプチド、その活性断片、類似体、誘導体、及び変種を有効成分として含み、製薬上許容される担体をさらに含む、薬剤組成物を提供する。
【００４０】
いくつかの実施形態によれば、薬剤組成物は、配列番号５〜１３及び配列番号２４〜２９のいずれか１つを有する組換えインターフェロンα２（ＩＦＮα２）ポリペプチド、その断片、類似体、誘導体、及び変種を含む。
【００４１】
１つの実施形態によれば、前記薬剤組成物は、改善された特異的なアゴニスト活性を有する、配列番号５、７、８、１０、１１、１２、及び１３のいずれか１つを有する組換えインターフェロンα２（ＩＦＮα２）ポリペプチド、その断片、類似体、誘導体、及び変種を含む。
【００４２】
別の実施形態によれば、薬剤組成物は、改善された特異的なアンタゴニスト活性を有する、配列番号６及び９のいずれか１つを有する組換えインターフェロンα２（ＩＦＮα２）ポリペプチド、その断片、類似体、誘導体、及び変種を含む。
【００４３】
別の態様によれば、本発明は、ＩＦＮの調節に関連している障害又は疾患を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の本発明の薬剤組成物を投与するステップを含み、前記障害又は疾患が、癌、自己免疫疾患、及び感染症からなる群から選択される方法を提供する。
【００４４】
１つの実施形態によれば、前記自己免疫疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）である。好ましい実施形態によれば、前記ＭＳは、再発寛解型ＭＳ、二次性進行型ＭＳ、一次性進行型ＭＳ、及び進行再発型ＭＳからなる群から選択される。
【００４５】
いくつかの実施形態によれば、配列番号５、７、８、１０、１１、１２、及び１３のいずれか１つを有するＩＦＮα２変異体が、ＭＳを治療又は予防するのに有用である。
【００４６】
１つの実施形態によれば、前記癌は、ヘアリー細胞白血病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、及び黒色腫からなる群から選択される。
【００４７】
別の実施形態によれば、本発明は、癌細胞の増殖を阻害する方法であって、配列番号５、７、８、１０、１１、１２、及び１３のいずれか１つを有するＩＦＮα２変異体、その断片、類似体、及び誘導体の治療有効量に癌細胞を曝露するステップを含む方法を提供する。
【００４８】
１つの実施形態によれば、前記感染症は、肝炎ウイルス感染症である。
【００４９】
いくつかの実施形態によれば前記肝炎は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、及びＣ型肝炎からなる群から選択される。
【００５０】
別の実施形態によれば、配列番号５、７、８、１０、１１、１２、及び１３のいずれか１つを有するＩＦＮα２変異体が、感染性肝炎ウイルス感染症を治療又は予防するのに有用である。
【００５１】
別の実施形態によれば、本発明は、それだけには限らないが、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含めて、ＩＦＮα２の発現の増大を伴う障害の治療又は予防の方法であって、それを必要とする対象に配列番号６及び９を有するＩＦＮα２変異体、その断片、類似体、及び誘導体を投与するステップを含む方法を開示する。
【００５２】
さらに別の態様によれば、本発明は、ＩＦＮの調節に関連した障害又は疾患の治療又は予防用の医薬品を調製するための、本発明のＩＦＮα２変異体の使用を提供する。
【００５３】
本発明のこれらの実施形態及び他の実施形態は、以下の図面、説明、及び特許請求の範囲と組み合わせて明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
本発明は、野生型ＩＦＮα２（配列番号２）と比べて改善されたアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性を有する、ＩＦＮα２変異体、並びにその活性断片、類似体、誘導体、及び変種を提供する。本発明の変異体は、特異性又は選択性の改善、作用持続期間の改善、安定性の改善、及びより少ない副作用から選択される少なくとも１種の利点を含み得る、改善された治療的有用性を提供する。
【００５５】
本発明はさらに、癌、多発性硬化症、感染症、及びインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）や全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などＩＦＮα２の発現の増大を伴う障害を治療又は予防するのに有用なＩＦＮα２変異体を含む薬剤組成物も提供する。
【００５６】
定義
インターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）（ＩＦＮ）又はインターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ）（ＩＦＮｓ）という用語は、分泌タンパク質のファミリーを意味し、これらは、抗ウイルス活性、抗原生動物活性、免疫調節活性、及び細胞増殖調節活性を有するサイトカインである。ＩＦＮは、当初、その供給源によって分類された。すなわち、白血球ＩＦＮα−１（配列番号１）、及びＩＦＮα−２（配列番号２）、線維芽細胞ＩＦＮ−β（配列番号３）、及び免疫細胞ＩＦＮ−γ（配列番号４）である。ＩＦＮα、ＩＦＮβ、及びＩＦＮγに特に注目する。インターフェロンαは、白血球によって産生されるインターフェロンの主要なタイプである。
【００５７】
「類似体」、「断片」、「誘導体」、及び「変種」という用語は、本発明の改善されたＩＦＮα２ポリペプチドに言及する場合、本明細書において説明するように、改善されたＩＦＮα２ポリペプチドと実質的に同様の機能活性又は実質的に同じ生物学的機能若しくは生物活性を保持している、そのような改善されたＩＦＮα２ポリペプチドの類似体、断片、誘導体、及び変種を意味する。
【００５８】
「類似体」は、少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸に置換されて、本明細書において列挙するポリペプチドと比べて増大した活性、安定性、又はより長い半減期を有する本発明のポリペプチドの活性な類似体を生じる、改善されたＩＦＮα２ポリペプチドを含む。
【００５９】
「断片」は、下記にさらに説明するとおり、本明細書において開示するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて示すように、改善されたＩＦＮα２ポリペプチドと実質的に同様の機能活性又は実質的に同じ生物学的機能若しくは生物活性を保持している、本発明の改善されたＩＦＮα２ポリペプチドの一部分である。
【００６０】
「誘導体」は、本明細書において開示する機能を実質的に維持し、且つ付加的な構造及び付随的な機能を含む、本発明の改善されたＩＦＮα２ポリペプチドに対する修飾体すべて、例えば、より長い半減期を有するＰＥＧ化ポリペプチドを含む。
【００６１】
「変種」は、元の変異体ＩＦＮα２ポリペプチドと比べて、実質的に同様の機能活性又は増大した機能活性を保持している、本発明の変異体ＩＦＮα２ポリペプチドの組合せを含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００６２】
「実質的に同様の機能活性」及び「実質的に同じ生物学的機能又は生物活性」は、それぞれ、各ポリペプチドの生物活性が同じ手順又はアッセイによって決定される場合に、生物活性の程度が、比較される相手のポリペプチドによって示される生物活性の約５０％〜１００％以上の範囲内、好ましくは８０％〜１００％以上の範囲内、より好ましくは約９０％〜１００％以上の範囲内であることを意味する。
【００６３】
２つのポリペプチド間の「類似性」は、あるポリペプチドのアミノ酸配列を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。あるポリペプチドのアミノ酸は、それが同一であるか、又は保存的なアミノ酸置換である場合には、第２のポリペプチドの対応するアミノ酸と同様である。保存的置換には、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．編、Ｔｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ワシントンＤ．Ｃ．（１９７８年）及びＡｒｇｏｓ，Ｐ．（１９８９年）ＥＭＢＯ  Ｊ．８巻：７７９〜７８５頁に記載されているものが含まれる。例えば、以下のグループのうち１つに属しているアミノ酸は、保存的な変化又は置換に相当する：Ａｌａ：−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ：−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；及び−Ａｓｐ、Ｇｌｕ。
【００６４】
「特異的活性」は、本発明のＩＦＮα２変異体に関して本明細書において使用される場合、ＩＦＮα２の生物活性又は生物学的機能を意味する。ＩＦＮα２の生物活性又は生物学的機能は、当技術分野において周知であり、それだけには限らないが、抗増殖活性が含まれる。このような特異的活性は、本明細書において説明する方法を用いて、又は当技術分野において公知である任意の方法を用いて、検出及び測定することができる。「改善された特異的活性」とは、本明細書において使用される場合、本発明のＩＦＮα２組成物の特異的活性又はアンタゴニスト活性が、参照ＩＦＮα２野生型組成物のものより大きいことを意味する。本発明のＩＦＮα２組成物の特異的活性は、例えば、本明細書において説明するような、又は当技術分野において公知であるような、ＩＦＮα２特異的活性を検出及び／又は測定するための方法を用いて、参照ＩＦＮα２野生型組成物の特異的活性と比べて分析することができる。
【００６５】
「ＩＦＮα２組成物」とは、ＩＦＮα２ポリペプチド、その断片、類似体、誘導体、若しくは変種、又は、ＩＦＮα２ポリペプチド、その断片、類似体、誘導体、若しくは変種を含む組成物（例えば、薬剤組成物）を意味する。
【００６６】
「組換えタンパク質又は組換えポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ技術によって作製された、すなわち、所望のタンパク質又はポリペプチドをコードする外来性組換えＤＮＡ発現構築物によって形質転換させた、例えば、微生物又は哺乳動物を含む、原核生物又は真核生物の細胞から産生された、タンパク質又はポリペプチドを意味する。大半の細菌培養物において発現されるタンパク質又はポリペプチドは、典型的には、グリカンを含まないと考えられる。酵母において発現されるタンパク質又はポリペプチドは、哺乳動物細胞において発現されるものと異なるグリコシル化パターンを有することがある。
【００６７】
「発現ベクター」とは、本明細書において使用される場合、宿主細胞中に形質転換、トランスフェクト、又は形質導入された場合に、複製することができ、且つ対象の遺伝子を発現することができる核酸分子を意味する。発現ベクターは、１種又は複数種の表現型選択マーカー、及びベクターの維持を確実にし、且つ、望ましいならば、宿主内での増幅を実現するための複製起点を含む。選択マーカーには、例えば、アンピシリン耐性配列、テトラサイクリン耐性配列、及びカナマイシン耐性配列など選択によって成功裡の形質転換体を得るのに使用され得るか、又は天然培地から入手できない重要な栄養素を供給し得る、抗生物質耐性マーカーを与える配列が含まれる。適切な発現ベクターは、市販されている、例えば、ｐＢＲ３２２プラスミド又は様々なｐＵＣプラスミドに由来するプラスミドでよい。他の発現ベクターは、バクテリオファージ、ファージミド、又はコスミド発現ベクターに由来するものでよく、これらはすべて、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第３版、２００１年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）のセクション１．１２〜１．２０に記載されている。当技術分野において周知であるように、単離されたプラスミド及びＤＮＡ断片を切断し、仕立て、且つ特定の順序で一緒に連結して、所望のベクターを作製する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの同書を参照されたい）。
【００６８】
「ネイティブな」、「天然の」、又は「野生型」（ｗｔ）のタンパク質又はポリペプチドという用語は、天然に存在する供給源から回収されたタンパク質又はポリペプチドを意味する。「ネイティブなＩＦＮ」又は「野生型ＩＦＮ」という用語は、ネイティブなＩＦＮ又は野生型ＩＦＮを含み、且つ、それだけには限らないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、アシル化、及び切断を含めて、ＩＦＮの翻訳後修飾を含む。
【００６９】
「組換え発現ベクター又はプラスミド」という用語は、本発明のタンパク質又はポリペプチドをコードするＤＮＡを増幅させるか、又は発現させるのに使用される、複製可能なＤＮＡベクター又はプラスミド構築物である。発現ベクター又はプラスミドは、ＤＮＡ制御配列及びコード配列を含む。ＤＮＡ制御配列には、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流の調節ドメイン、及びエンハンサーが含まれる。本明細書において定義する組換え発現系は、調節エレメントを導入すると、本発明のタンパク質又はポリペプチドを発現すると考えられる。
【００７０】
「形質転換された宿主細胞」という用語は、外来性ＤＮＡで形質転換及びトランスフェクトされた細胞を意味する。外来性ＤＮＡは、宿主細胞のゲノムを構成している染色体ＤＮＡに組み込まれて（すなわち、共有結合されて）も、組み込まれなくてもよい。原核生物及び酵母では、例えば、外来性ＤＮＡは、プラスミドなどのエピソームエレメント上で維持され得るか、又は染色体ＤＮＡ中に安定に組み込まれ得る。真核生物細胞に関して、安定に形質転換された細胞とは、外来性ＤＮＡが染色体中に組み込まれているものである。この安定性は、真核生物の細胞系又はクローンが、複製を経て、外来性ＤＮＡを含む娘細胞集団を生じる能力によって示される。
【００７１】
「プライマー」という用語は、本明細書において使用される場合、精製された制限酵素消化物中に天然に存在するか、又は合成によって作製されるかを問わず、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下、すなわち、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘導物質の存在下、且つ適切な温度及びｐＨ下に置かれた場合に、合成の開始点として働くことができるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、一本鎖でも二本鎖でもよく、且つ、誘導物質の存在下で所望の伸長生成物の合成を開始させるのに十分な長さでなければならない。
【００７２】
「治療的有効量」とは、それを必要とする対象に投与された場合に、状態又は障害の治療を実施するのに十分である、本発明の改善されたＩＦＮα２ポリペプチドの量を意味する。例えば、再発寛解型多発性硬化症（ＭＳ）、癌、感染症、又はインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）や全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などＩＦＮα２の発現の増大を伴う障害に対してである。
【００７３】
「対象」という用語は、ヒト対象及び非ヒト対象を意味する。
【００７４】
「癌」という用語は、組織病理学的なタイプ又は侵襲性の段階とは無関係に、あらゆるタイプの癌性増殖若しくは発癌性プロセス、転移性組織、又は悪性に形質転換された細胞、組織、若しくは器官を含むことを意図している。癌の例としては、それだけには限らないが、固形腫瘍及び白血病が挙げられ、以下のものが含まれる：アプドーマ、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心疾患、癌腫（例えば、ウォーカー癌腫、基底細胞癌、基底有棘細胞癌、ブラウン・ピアース癌、腺管癌、エールリッヒ腫瘍、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、乳頭状癌、細気管支癌、気管支原性癌、扁平上皮癌、及び移行上皮癌）、組織球障害、白血病（例えば、Ｂ細胞白血病、混合型白血病、ヌル細胞白血病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞性慢性白血病、ＨＴＬＶ−ＩＩ関連白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、肥満細胞性白血病、及び骨髄性白血病）、悪性組織球症、ホジキン病、免疫増殖性小（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ）、非ホジキンリンパ腫、プラズマ細胞腫、細網内皮症、黒色腫、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、線維肉腫、巨細胞腫、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、滑膜性腫瘍、腺線維腫、腺リンパ腫、癌肉腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、未分化胚細胞腫、過誤腫、間葉細胞腫、中腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント質腫、歯牙腫、奇形腫、胸腺腫、栄養膜腫瘍、腺癌、腺腫、胆管腫、コレステリン腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢胞腺腫、顆粒膜細胞腫、男性胚細胞腫、肝癌、汗腺腫、膵島細胞腫、ライディッヒ細胞腫、乳頭腫、セルトリ細胞腫、卵胞膜細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋芽細胞腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、上衣細胞腫、神経節細胞腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫、角化血管腫、好酸球増加随伴性血管類リンパ組織増殖症、硬化性血管腫、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮腫、血管腫、血管外皮細胞腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、嚢腫肉腫、葉状腫瘍（ｐｈｙｌｌｏｄｅｓ）、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫（ｌｅｉｍｙｏｓａｒｃｏｍａ）、白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、肉腫（例えば、ユーイング肉腫、実験的肉腫、カポジ肉腫、及び肥満細胞肉腫）、神経線維腫症、及び子宮頚部異形成、並びに、細胞が不死化されているか、又は形質転換されている他の状態。
【００７５】
本明細書において使用される「ＭＳを治療すること」とは、虚弱、しびれ感、振戦、視力低下、疼痛、麻痺、平衡感覚の低下、膀胱及び腸の機能不全、並びに認知的変化（一次的症状）；反復性の尿路感染症、廃用性衰弱、不良な姿勢調整及び体幹制御、筋肉不均衡、骨密度の減少、浅く非効率的な呼吸、及び褥瘡（二次的症状）；並びに、うつ（三次的症状）などＭＳに関連した症状を特徴とする対象の疾患状態の治療を包含し、且つ、（ｉ）その状態を阻害すること、すなわち、その発達を阻止すること、又は（ｉｉ）その状態を緩和すること、すなわちその状態の軽減をもたらすこと、を含む。
【００７６】
「肝炎ウイルス感染症」という用語は、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、又はＥ型の肝炎ウイルスのうち１種又は複数種による感染症を意味し、血液由来の肝炎ウイルス感染症が特に関心の対象である。
【００７７】
本明細書において使用される場合、「肝線維症（ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）」と同義的に使用される「肝線維症（ｈｅｐａｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）」という用語は、慢性の肝炎感染症において発生し得る、肝臓中の瘢痕組織の増殖を意味する。
【００７８】
本明細書において使用される「ペグ化されたＩＦＮα２変異体」という用語は、ＩＦＮα２変異体のポリエチレングリコールによって修飾された結合体を意味する。好ましいポリエチレングリコール−ＩＦＮα２変異体結合体は、ＷＯ２００４０８９２８０で記載されている方法に従って調製されるように、生理学的条件においてゆっくりと変換されて薬物になる可逆性の結合体である。他のＩＦＮα２変異体結合体は、ＩＦＮα２変異体を水溶性ポリマーに結合させることによって調製することができる。このようなポリマーの非限定的なリストは、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオール、それらの共重合体、及びそれらのブロック共重合体など他のポリアルキレンオキシドホモポリマーを含む。ポリアルキレンオキシドベースのポリマーの代替として、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、炭水化物ベースのポリマーなど効果的に非抗原性の材料を使用することができる。このようなインターフェロンα−ポリマー結合体は、米国特許第４，７６６，１０６号及び米国特許第４，９１７，８８８号に記載されている。
【００７９】
本明細書において定義されるように、「マイクロアレイ」とは、支持体に結合された複数の単離された核酸分子又はオリゴヌクレオチドプローブを意味し、それらの各核酸分子又はオリゴヌクレオチドプローブは、支持体の予め選択された特定の領域に結合されている。「核酸」という用語は、「ポリヌクレオチド」という用語と互換性がある。「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド鎖を意味する。好ましくは、この鎖は、約２０ヌクレオチド〜１０，０００ヌクレオチド、より好ましくは約１５０ヌクレオチド〜３，５００ヌクレオチドを有する。「プローブ」という用語は、ある遺伝子転写物又はその相補物とハイブリダイズして、ポリヌクレオチドプローブ／遺伝子転写物の複合体を形成することができるポリヌクレオチド配列を意味する。
【００８０】
本発明は、ＲＮＡ又はその等価物、例えばｃＤＮＡ及びｃＲＮＡの検出を企図するため、「遺伝子」という用語は、ＲＮＡに転写され得る領域を含む。本発明の遺伝子には、それだけには限らないが、特定の生物学的プロセスに特異的であるか、若しくはそれらに関与しており、且つ／又はアポトーシス、分化、ストレス応答、加齢、増殖などの生物学的プロセスを指示する遺伝子；細胞機序遺伝子、例えば、細胞周期、シグナル伝達、毒性化合物の代謝など；疾患に関連した遺伝子、例えば、癌、多発性硬化症、感染症などに関与している遺伝子が含まれる。例えば、遺伝子は、細胞内での発現により、正常細胞から腫瘍細胞に変換するようにその細胞が誘導される、癌遺伝子でよい。遺伝子のさらなる例としては、それだけには限らないが、サイトカイン遺伝子、プリオン遺伝子、血管形成を誘導する分子をコードする遺伝子、接着分子をコードする遺伝子、細胞表面受容体をコードする遺伝子、転移プロセス及び／又は浸潤プロセスに関与しているタンパク質をコードする遺伝子、プロテアーゼの遺伝子、並びに、アポトーシス及び細胞周期を調節する分子の遺伝子が挙げられる。
【００８１】
本発明によれば、遺伝子転写物のレベルは、マイクロアレイハイブリダイゼーションなどの半定量的方法、又は定量的ｑＰＣＲなどのより定量性が高い方法を用いて、遺伝子転写物、例えば、ＲＮＡのレベルを測定することによって決定することができる。
【００８２】
本明細書において使用される場合、「発現及び／又は活性を調節すること」という用語は、一般に、細胞構成要素の量又は活性（機能性）を制御又は調節するように機能する任意のプロセスを意味する。静的調節は、発現及び／又は活性を何らかの所与のレベルで維持する。上方調節とは、発現及び／又は活性の相対的な増大を意味する。したがって、下方調節とは、発現及び／又は活性の相対的な低減を意味する。下方調節は、所与の細胞構成要素の活性の阻害と同義である。
【００８３】
本発明の改善されたＩＦＮα２ポリペプチドの特徴
３つの単一変異（Ｈ５７Ａ、Ｅ５８Ａ、Ｑ６１Ａ）（配列番号５）をＩＦＮα２に導入した。これは、野生型タンパク質（配列番号２）と比べて約３０倍、ＩＦＮＡＲ１受容体に対する結合親和力を特異的に増大させる。本明細書において使用される場合ＨＥＱと呼ばれる、変異体ＩＦＮα２タンパク質の親和力は、ＩＦＮβに関して測定される親和力と同様であり（表３）、他の任意のインターフェロンサブタイプの親和力をかなり上回る。ＨＥＱの生物活性を評価することにより、それが、ＩＦＮβ（配列番号３）と極めて類似した特徴を獲得したことが明確に実証される。すなわち、ＨＥＱは、ＩＦＮα２野生型（配列番号２）と比べて、抗ウイルス能力を２倍しか増大させないが、抗増殖能力を２５倍増大させる（表４）。
【００８４】
さらに２つの変異セットを、本明細書においてＭＤＬ（配列番号１０）と呼ぶＨＥＱ：Ｈ５７Ｍ、Ｅ５８Ｄ、Ｑ６１Ｌとして、及び本明細書においてＹＮＳ（配列番号１１）と呼ぶＨ５７Ｙ、Ｅ５８Ｎ、Ｑ６１Ｓとして、ＩＦＮα２の同じ位置に導入した。双方の抗ウイルス活性は、野生型の３倍以内である（表４）。しかし、それらの抗増殖活性は、ＩＦＮβのＨＥＱの抗増殖活性より高い。ＭＤＬの場合、活性は、野生型と比べて４０倍高く、ＹＮＳの場合、ＷＩＳＨ細胞において１６０倍高く、且つＭＤＡ２３１細胞において７０倍高く、これは、ＩＦＮβ（配列番号３）に関して測定した場合の３〜７倍である。
【００８５】
ＨＥＱ（配列番号５）の遺伝子転写プロファイルを、オリゴヌクレオチドマイクロアッセイ実験によって観察した。ＨＥＱ遺伝子活性化は、同じタンパク質濃度におけるＩＦＮα２の場合よりもずっと程度が高く、ＩＦＮβ（配列番号３）に対して記録された遺伝子活性化と同様である。ＹＮＳ又はＨＥＱは、ＩＦＮα２野生型又はＩＦＮβのいずれかと比べて、潜在的に、疾患の治療においてより効果的な薬物であり得る。ＩＦＮα２野生型より優れたＹＮＳ及びＨＥＱの利点は、副作用の軽減、及び癌又は多発性硬化症の治療に寄与し得る、より高い抗増殖特異性にある。ＹＮＳの利点は、特に、ヒト乳癌細胞、ＭＤＡ２３１において測定されるように、ＩＦＮβと比べてより高い抗増殖効果である。
【００８６】
本発明はさらに、野生型タンパク質と比べて１０００分の１の抗増殖活性及び１００分の１の抗ウイルス活性を有するが、それでもなお、野生型の親和力でＩＦＮＡＲ２に結合する（表２）、本明細書において使用される場合ＮＬＹＹと呼ばれる、４重変異体Ｎ６５Ａ、Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ａ、Ｙ８９Ａ（配列番号６）を提供する。
【００８７】
本発明は、本明細書において使用される場合α８テイルと呼ばれる、Ｃ末端のＥＳＬＲＳＫＥからＫＲＬＫＳＫＥへの置換を含むＩＦＮα２タンパク質（配列番号７）を提供する。α８テイル変異体は、ＩＦＮα２とその受容体ＩＦＮＡＲ２との静電気的結合エネルギーを最適化するために、インターフェロンα８の末端を有するように設計された。結合の測定により、α８テイル変異体は、ＩＦＮＡＲ２に対する結合親和力が野生型と比べて１８倍高いことが示された（表２）。α８テイル変異体の抗ウイルス活性は、野生型と比べて３倍高く、抗増殖活性は１０倍高い（表２）。
【００８８】
本発明の３つのＩＦＮα２変異体の個々の変異は、それぞれ、タンパク質上の異なる位置に位置しており、したがって、組み合わされて、付加的な効果又は増大された効果をもたらし得る。本発明は、３重変異体ＨＥＱ（配列番号５）、ＭＤＬ（配列番号１０）、又はＹＮＳ（配列番号１１）、及びＣ末端のＥＳＬＲＳＫＥからＫＲＬＫＳＫＥへの置換（配列番号７）の組合せを含む変種を提供する。これらの変種（配列番号８、１２、及び１３）は、特に抗増殖活性が増大しているため、癌を治療するにあたってより効率的となり得る。さらに、結合能力がより高いため、癌細胞の受容体下方調節の問題を克服することができる。ＨＥＱは、Ａｌａへの３つの単一の点突然変異から構成され、また、α８テイル変異体は、ネイティブなＩＦＮα８のＣ末端によるＩＦＮα２のＣ末端の置換を含み、特異的な免疫原性応答の可能性は小さい。
【００８９】
本発明はさらに、４重変異体Ｎ６５Ａ、Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ａ、Ｙ８９Ａ及びＣ末端のＥＳＬＲＳＫＥからＫＲＬＫＳＫＥへの置換の組合せを含み、ＩＦＮＡＲ２への結合親和力が増大しているが、生物活性が非常に低い変種（配列番号９）も提供する。このＩＦＮα２変種は、それらの受容体を介してＩＦＮの天然の活性を妨害するＩＦＮアンタゴニストである。
【００９０】
本発明の改善されたＩＦＮα２組成物は、参照ＩＦＮα２野生型組成物のものより少なくとも２倍、好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、さらにより好ましくは１０００倍大きな特異的活性を有する、ＩＦＮα２変異体ポリペプチド、又はその断片、類似体、誘導体、及び変種を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＩＦＮα２組成物は、野生型ＩＦＮα２に対するアンタゴニスト活性を有する。
【００９１】
本発明のアンタゴニスト
ＩＦＮαアンタゴニストは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＩＦＮαの生物活性の邪魔をすることができる任意の物質であると定義される。アンタゴニストはＩＦＮα活性を完全に中和する必要はなく、ＩＤＤＭ治療活性又はＳＬＥ治療活性をｉｎ  ｖｉｖｏで発揮するのに十分な程度まで中和しなければならない。ＩＦＮαは、複数の生物活性を有することが公知である。本明細書において使用するためのアンタゴニストは、これらの活性のうち任意の１種又は複数種を低減させるか、阻害するか、又は中和する。通常、アンタゴニストは、ＩＦＮαの抗ウイルス活性、抗増殖活性、又は免疫調節活性のうち少なくとも１種（好ましくはすべて）の邪魔をすると考えられる。
【００９２】
アンタゴニストは、一般に、以下のいくつかのカテゴリーから選択される：可溶型のαインターフェロン受容体、αインターフェロンがその受容体に結合するか、又は適切に相互作用するのを妨害する、抗αインターフェロン受容体抗体、αインターフェロンそれ自体に結合し、且つ中和することができる抗体、及び、受容体結合部位を求めてαインターフェロンと競合するが、それら自体は実質的なαインターフェロン活性を示さない非インターフェロンポリペプチド。本発明のアンタゴニストは、ＩＦＮα活性及びＩＦＮβ活性に拮抗する、ＩＦＮαの変異体である。
【００９３】
ＩＦＮα２変異誘発
特定の位置のアミノ酸を改変する効果は、アミノ酸置換を導入し、且つ、本明細書において説明するアッセイを用いて、改変されたＩＦＮα２ポリペプチドを生物活性に関して試験することによって、実験的に試験することができる。それだけには限らないが、化学変異誘発、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの部位特異的変異誘発などを含めて、当技術分野において公知である任意の変異誘発技術を使用することができる。アラニンスキャニング変異誘発などの技術は、この手法に特に適している。
【００９４】
核酸
本発明はさらに、本発明の改善されたＩＦＮα２ポリペプチドをコードする核酸分子も提供する。
【００９５】
核酸分子は、組換えＤＮＡ技術（例えばポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、増幅、クローニング）又は化学合成によって作製することができる。核酸配列には、天然の核酸配列及びその相同体が含まれ、それだけには限らないが、天然の対立遺伝子変異体、並びにヌクレオチドが挿入、欠失、置換、及び／又は逆転されており、そのような改変が、その核酸分子が本発明の組換えＩＦＮα２ポリペプチドをコードする能力を実質的に邪魔しない様式である、改変された核酸配列を含む。
【００９６】
ポリヌクレオチド配列又はオリゴヌクレオチド配列は、あるタンパク質の遺伝コードから推論することができるが、コードの縮重を考慮に入れなければならない。また、本発明の核酸配列は、遺伝コードの結果として縮重している配列も含み、これらの配列は、当業者は容易に決定することができる。
【００９７】
「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において使用される場合、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はヌクレオチド、及びそれらの断片又は一部分、並びにゲノム由来又は合成由来のＤＮＡ又はＲＮＡを意味し、これらは、単鎖でも二本鎖でもよく、且つ、センス鎖でもアンチセンス鎖でもよい。この用語はまた、ヌクレオチド類似体から作製され、且つ説明する実施形態に適用可能なＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかの類似体を等価物として含むと理解されるべきである。
【００９８】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、ＰＣＲ増幅又はハイブリダイゼーションアッセイ若しくはマイクロアレイにおいて使用することができる、少なくとも約６ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、好ましくは約１５〜３０ヌクレオチド、より好ましくは約２０〜２５ヌクレオチドの核酸配列を意味する。本明細書において使用される場合、オリゴヌクレオチドは、当技術分野において一般に定義されるように、「アンプライマー」、「プライマー」、「オリゴマー」、及び「プローブ」という用語と実質的に等しい。
【００９９】
本明細書において使用される場合、高度にストリンジェントな条件とは、最高で約５％〜約２５％、好ましくは最高で約５％〜約１５％の配列の相異（ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）を寛容する条件である。限定されるわけではないが、高度にストリンジェントな条件（算出されたハイブリッドのＴｍを−１０℃下回る）の例では、算出されたハイブリッドのＴｍを下回る適切なＴｉ（インキュベーション温度）で、０．１×ＳＳＣ（標準のクエン酸添加生理食塩水）及び０．５％ＳＤＳの洗浄溶液を使用する。特に、使用されるハイブリダイゼーション条件が、安定なハイブリッドと共に安定性のより低いハイブリッドが形成するのを可能にする条件である場合は、条件の最終的なストリンジェンシーは、主として、洗浄条件による。その場合、より高いストリンジェンシーでの洗浄条件により、安定性のより低いハイブリッドが除去される。前述の、高度にストリンジェントな洗浄条件〜中程度にストリンジェントな洗浄条件と共に使用することができる一般的なハイブリダイゼーション条件は、適切なＴｉにおける、６×ＳＳＣ（又は６×ＳＳＰＥ）、５×デンハート試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性断片化サケ精子ＤＮＡの溶液中でのハイブリダイゼーションである。（一般的に、適切な高ストリンジェンシー条件に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）を参照されたい）。
【０１００】
ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーション実験及び洗浄において使用される温度、ハイブリダイゼーション溶液及び洗浄溶液中の一価陽イオンのモル濃度、並びにハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージの関数である。一般に、プローブとのハイブリダイゼーションによる感受性は、プローブの量及び特異的活性、標的核酸の量、標識の検出能、ハイブリダイゼーション速度、並びにハイブリダイゼーションの持続期間によって影響を及ぼされる。ハイブリダイゼーション速度は、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＴｍを約２０℃〜２５℃下回り、且つ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのＴｍを約１０℃〜１５℃下回るＴｉで最大化される。これは、約１．５Ｍ  Ｎａ＋のイオン強度によっても最大化される。この速度は、二重鎖の長さに正比例し、且つ、ミスマッチの程度に反比例する。
【０１０１】
しかし、ハイブリダイゼーションの特異性は、所望のハイブリッドと「バックグラウンドの」ハイブリッドの安定性の差の関数である。ハイブリッドの安定性は、二重鎖の長さ、塩基組成、イオン強度、ミスマッチ、及び不安定化剤（もしあれば）の関数である。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの完璧なハイブリッドのＴｍは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈら（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８４年；１３８巻（２号）：２６７〜８４頁）の式を用いて概算することができる。
【０１０２】
改善されたＩＦＮα２ポリペプチドの発現及び精製
細菌中、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において組換えヒトＩＦＮα２を発現させ、且つ精製して、アゴニスト活性又はアンタゴニスト活性が改善されたＩＦＮα２ポリペプチドを得るためのいくつかの方法がある。公知の方法を用いて、クローン化遺伝子を細菌中で発現させることができる。クローン化した真核生物遺伝子を原核生物系において高レベルに発現させるためには、ｍＲＮＡ転写を指示する強力なプロモーターを含む発現ベクターを構築することが好ましい。
【０１０３】
この目的に適した調節領域の例は、大腸菌β−グルコシダーゼ遺伝子、大腸菌トリプトファン生合成経路のプロモーター及びオペレーター領域、又はファージＡ由来の左方向プロモーターである。大腸菌中で形質転換されるＤＮＡプラスミド中に選択マーカーを含めることも、有用である。このようなマーカーの例としては、アンピシリン、テトラサイクリン、又はクロラムフェニコールに対する耐性を規定する遺伝子が含まれる。グリコシル化などの翻訳後修飾は、原核細胞発現系の大腸菌においては起こらない。さらに、複雑なジスルフィドパターンを有するタンパク質は、大腸菌で発現された場合にミスフォールドされることがある。原核生物系を用いた場合、発現されるタンパク質は、細胞原形質中に不溶型で、細胞が溶解した後に可溶性画分中に見出される、いわゆる封入体中に存在するか、又は、適切な分泌シグナル配列の付加により、ペリプラズム中に誘導される。発現されるタンパク質が不溶性の封入体中にある場合、封入体の可溶化及びそれに続くリフォールディングが、通常必要とされる。
【０１０４】
ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、ウプサラ、スウェーデン）、ｐＫＫ２３３−２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、パロ・アルト、カリフォルニア州、米国）、及びｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、マディソン、ウィスコンシン州、米国）など多くの原核生物発現ベクターが当業者に公知であり、且つ、市販されている。組換え微生物発現系において一般に使用されるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ，Ａ．Ｃ．ら、１９７８年、Ｎａｔｕｒｅ  ２７５巻：６１７〜６２４頁）が含まれる。トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系及びＴａｃプロモーター（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、１９８９年）。別の有用な細菌発現系は、λファージｐＬプロモーター及びｃｌｔｓ８５７熱誘導性リプレッサーを使用する（Ｂｅｒｎａｒｄら、１９７９年、Ｇｅｎｅ  ５巻：５９〜７６頁）。
【０１０５】
一般に、以下のプロトコールが使用された。ＩＦＮα２をコードする遺伝子は、本発明者らが開始コドンのすぐ上流に第２のシストロンを付加した、ｐＴ７Ｔ３−１８Ｕプラスミドをベースとする２−シストロン性の発現ベクター中にクローニングされた。第２のシストロンは、ＸｂａＩ制限部位及びＮｄｅＩ制限部位にはさまれたＳＤ部位を含むｌｐｐ５’遺伝子の最初の９個のアミノ酸からなる。第２のシストロンを挿入する理由は、異種タンパク質の発現の収量を改善することであった。さらに、発現レベルを改善するために、最初の２３個のアミノ酸に対するコドンが、ＴＧＴ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  ＴＣＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＡＣＴ  ＣＴＧ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＣＧＴ  ＣＧＴ（配列番号１４）に変更された。タンパク質は、富栄養培地中で一晩、ＢＬ２１細胞において発現させられる。ＩＦＮα２は、封入体中に存在し、封入体は、５ｍＭ  ＤＴＴを含む８Ｍ尿素中で溶解される。ＩＦＮα２は、２０倍希釈により、一晩、リフォールディングされた。タンパク質精製は、標準的な方法論によって実施される。タンパク質の典型的な収量は、１０ｍｇ／Ｌ（細胞培養物）であった。ＩＦＮα２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で１８ｋＤのシングルバンドとして泳動する。
【０１０６】
改善されたＩＦＮα２ポリペプチドの類似体、断片、誘導体、及び変種
本発明の改善されたＩＦＮα２ポリペプチドの類似体、断片、誘導体、又は変種は、以下のものでよい。すなわち、（ｉ）１つ若しくは複数のアミノ酸残基が、保存的若しくは非保存的なアミノ酸残基で置換されているもの、又は（ｉｉ）１つ若しくは複数のアミノ酸残基が置換基を含むもの、又は（ｉｉｉ）改善されたＩＦＮα２ポリペプチドが、改善されたＩＦＮα２ポリペプチドの半減期を延長する化合物（例えば、ポリエチレングリコール）など別の化合物と融合されているもの、又は（ｉｖ）リーダー配列若しくは分泌配列、又は成熟した改善されたＩＦＮα２ポリペプチドの精製のために使用される配列など付加的なアミノ酸が、成熟した改善されたＩＦＮα２ポリペプチドに融合されているもの、又は（ｖ）改善されたＩＦＮα２ポリペプチド配列が、効果の持続期間を延長するために、より大型のポリペプチド、すなわち、ヒトアルブミン、抗体若しくはＦｃと融合されているものである。このような類似体、断片、誘導体、及び変種は、本明細書における教示から当業者の能力の範囲内であるとみなされる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。非保存的置換は、保存されているアミノ酸残基又は保存されているタンパク質ドメイン内に存在するアミノ酸残基に対しては実施されないはずである。断片又は生物活性のある部分としては、医薬品及び研究試薬などとして使用するのに適したポリペプチド断片が挙げられる。断片としては、本発明の改善されたＩＦＮα２ポリペプチドのアミノ酸配列に十分に類似しているか、又はそれらに由来するアミノ酸配列を含み、且つ、そのポリペプチドの少なくとも１種の活性を示すが、本明細書において開示される完全長ポリペプチドより少ないアミノ酸を含むペプチドが挙げられる。典型的には、生物活性のある部分は、そのポリペプチドの少なくとも１種の活性を有するドメイン又はモチーフを含む。このような生物活性のある部分は、合成的に、又は組換え技術によって調製することができ、且つ、本明細書において開示する手段及び／又は当技術分野において周知の手段によって、本発明のポリペプチドの１種又は複数種の機能活性に関して評価することができる。
【０１０７】
本発明の好ましい誘導体としては、ポリペプチドの半減期を延長するか、且つ／又はポリペプチドの潜在的な免疫原性を低減させるための化合物（例えば、ポリエチレングリコール、「ＰＥＧ」）など別の化合物と融合された、改善されたＩＦＮα２ポリペプチドが挙げられる。ＰＥＧは、水溶性、大きさ、低い腎臓クリアランス速度、及び低い免疫原性を融合タンパク質に与えるために使用することができる。例えば、米国特許第６，２１４，９６６号を参照されたい。ＰＥＧ化の場合、改善されたＩＦＮα２ポリペプチドのＰＥＧへの融合は、当業者に公知である任意の手段によって遂行することができる。例えば、ＰＥＧ化は、最初に、改善されたＩＦＮα２ポリペプチドにシステイン変異を導入して、続いて、ＰＥＧ−マレイミドによって部位特異的に誘導体化することによって、達成することができる。システイン残基は、改善されたＩＦＮα２ポリペプチドのＣ末端に付加させることができる。例えば、Ｔｓｕｔｓｕｍｉ，Ｙ．ら、（２０００年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７巻：８５４８〜８５５３頁を参照されたい。
【０１０８】
本発明の改善されたＩＦＮα２ポリペプチドの変種としては、元の改善されたＩＦＮα２ポリペプチド又はその組合せのアミノ酸配列に十分に類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。変種には、変異誘発が原因でアミノ酸配列が異なる、改善されたＩＦＮα２ポリペプチドが含まれる。活性が改善された変種は、本発明の改善されたＩＦＮα２ポリペプチドの変異体、例えば、トランケーション変異体又は点変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。
【０１０９】
一実施形態では、変種の多様なライブラリーは、核酸レベルの組合せ変異誘発によって作製され、多様な遺伝子ライブラリーによってコードされる。変種の多様なライブラリーは、例えば、潜在的な変種アミノ酸配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、又は代わりに、その中に配列のセットを含む（例えば、ファージディスプレイのための）より大型の改善されたＩＦＮα２ポリペプチドのセットとして、発現可能となるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することによって、作製することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的な変種のライブラリーを作製するために使用できる様々な方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成機において実施することができ、次いで、その合成遺伝子を適切な発現ベクター中に連結することができる。遺伝子の縮重セットを使用することにより、１つの混合物中で、潜在的な変種配列の所望のセットをコードする配列すべてを提供することが可能になる。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当技術分野において公知である（例えば、Ｉｔａｋｕｒａ，Ｋ．ら、１９８４年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３巻：３２３〜３５６頁を参照されたい）。
【０１１０】
点変異又はトランケーションによって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、及び選択された特性を有する遺伝子産物を求めてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が、当技術分野において公知である。このような技術は、改善されたＩＦＮα２ポリペプチドの組合せ変異誘発によって作製された遺伝子ライブラリーを特異的活性に関して迅速にスクリーニングするのに適応させることができる。大型の遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのハイスループット解析に適する、最も広く使用されている技術は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローニングするステップと、結果として得られるベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換させるステップと、所望の活性の検出により、産生物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離が容易になる条件下で組合せ遺伝子を発現させるステップとを含む。帰納的アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）、すなわちライブラリー中の機能的変異体の出現率を高める技術を、スクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、所望の変種を同定することができる。
【０１１１】
本発明の薬剤組成物
本発明はまた、患者に投与して治療効果を達成することができる薬剤組成物も提供する。本発明の薬剤組成物は、所望の程度の純度を有する薬学的に有効な量の改善されたＩＦＮα２ポリペプチドを、製薬上許容される担体と組み合わせることによって、投与用に調製することができる。
【０１１２】
本発明の改善されたＩＦＮα２ポリペプチド及び薬剤組成物は、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、及び皮下投与）、局所投与、経口投与、吸入投与、又は局部投与に有用である。
【０１１３】
本発明の改善されたポリペプチドは、それだけには限らないが、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、又はくも膜下腔内投与を含めて、任意の適切な投与方法用の薬剤組成物中で使用され得る。したがって、前述のポリペプチドは、好ましくは、５パーセントデキストロース、乳酸加リンガー溶液、生理食塩水、滅菌水、又は、静脈内注入用に設計された他の任意の商業的に調製された生理的緩衝液など許容される無菌の薬剤用担体と組み合わせられる。担体溶液並びに組成物の投薬量及び投与方法の選択は、対象及び個々の臨床状態と共に変わり、且つ、標準的な医学的処置によって決定されることが、理解されるであろう。
【０１１４】
本発明の方法によれば、これらの薬剤組成物は、ＭＳ、癌、ＩＤＤＭ、又はＳＬＥに関連した病理学的な転帰又は症状を阻害又は改善するのに効果的な量で投与され得る。
【０１１５】
本発明の改善されたＩＦＮα２ポリペプチドの投与は、ボーラス静注によって、持続点滴静注によって、又は両方の経路の組合せによってよい。別法として、又はさらに、適切な賦形剤と混合した改善されたＩＦＮα２ポリペプチドを、筋肉内部位を通して血液循環中に取り込ませてもよい。
【０１１６】
ポリペプチドは、胃酸又は腸酵素による消化に感受性であるため、経口投与への適性が劣ることは明らかであるが、いくつかの実施形態では、特定の製剤が経口投与用に使用され得る。
【０１１７】
経口液状剤形（例えば、懸濁剤、エリキシル剤、及び液剤）の組成物を調製する際、水、グリコール、油、アルコール、矯味剤、保存剤、着色剤など典型的な薬学的媒体を使用することができる。同様に、経口固形剤形（例えば、散剤、錠剤、及びカプセル剤）を調製する場合、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などの担体が使用される。投与が容易であるという理由から、錠剤及びカプセル剤は、本発明の薬剤組成物のための望ましい経口剤形である。
【０１１８】
ポリペプチドは局所投与への適性が劣るが、局部治療のために、特定の製剤が使用され得る。
【０１１９】
局所投与の場合、本発明の改善されたＩＦＮα２ポリペプチドは、軟膏剤やクリーム剤など無刺激性の保湿基剤を用いて製剤化され得る。適切な軟膏基剤の例は、ワセリン、ワセリンと揮発性シリコン、ラノリン、及び油中水型エマルジョンである。
【０１２０】
吸入によって投与する場合、本発明に従って使用するためのＩＦＮα２ポリペプチドは、便宜的には、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオルエタン、又は二酸化炭素を用いて、加圧パック又はネブライザーから、エアロゾルスプレー授与の形態で送達される。加圧したエアロゾルの場合、投与単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定することができる。ペプチドの粉末混合物及びラクトースやデンプンなど適切な粉末基剤を含む、吸入器又は吹入器において使用するための、例えばゼラチンからなるカプセル剤及びカートリッジが、製剤化され得る。
【０１２１】
本発明の改善されたＩＦＮα２ポリペプチド及び薬剤組成物は、静脈内投与に特に有用である。投与用の組成物は、一般に、製薬上許容される担体中、好ましくは水性担体中に溶解された、改善されたＩＦＮα２ポリペプチドの溶液を含む。様々な水性担体、例えば、緩衝生理食塩水などが使用され得る。これらの溶液は無菌であり、一般に、望ましくない物質を含まない。組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌することができる。静脈内投与用の典型的な薬剤組成物は、当業者によって容易に決定され得る。投与される量は、タンパク質に特異的であることは明らかであり、且つ、その効力及び薬物動態学的プロファイルに依存する。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者には公知であるか、又は明らかであると考えられ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イーストン、ペンシルバニア州、１９９０年などの刊行物により詳細に記載されている。
【０１２２】
本発明の改善されたＩＦＮα２ポリペプチド又はそのカクテル（すなわち、他のタンパク質を伴う）を含む組成物は、治療的処置において投与され得る。治療的適用において、組成物は、ＭＳ、癌、及びＩＦＮαの増大したＩＦＮα２発現を伴う障害に罹患している患者に、その障害を治癒するか、又は少なくともある程度抑制するのに十分な量で投与される。これを実現するのに十分な量は、「治療有効用量」と定義される。この用途に有効な量は、疾患の重症度及び患者の健康の一般的状態に依存すると考えられる。
【０１２３】
組成物の１回又は複数回の投与は、患者に必要とされ、且つ許容される投薬量及び頻度に応じて、実施され得る。いずれにしても、組成物は、患者を効果的に治療するのに十分な量の本発明の改善されたＩＦＮα２ポリペプチドを提供すべきである。一般に、意図される投与様式に応じて、薬剤として許容される組成物は、約１重量％〜約９９重量％の本発明の改善されたＩＦＮα２ポリペプチド、及び９９重量％〜１重量％の適切な製薬用の賦形剤又は担体を含む。好ましくは、組成物は、約５重量％〜約７５重量％の本発明の改善されたＩＦＮα２ポリペプチドで、残りは、適切な製薬用の賦形剤又は担体である。
【０１２４】
本発明の改善されたＩＦＮα２ポリペプチド又はその薬剤として許容される組成物は、治療有効量で投与される。この治療有効量は、使用される個々の改善されたＩＦＮα２ポリペプチドの特異的活性；改善されたＩＦＮα２ポリペプチドの代謝安定性及び作用の長さ；患者の年齢、体重、全体的健康状態、性別、及び食生活；投与の様式及び時間；排泄速度；薬物の組合せ；個々の疾患の状態の重症度；並びに療法を受けるホストを含めて、様々な因子に応じて変動すると考えられる。一般に、治療的に有効な日用量は、投与１回につき、約０．１μｇ／ｋｇ体重〜約１０００μｇ／ｋｇ体重、好ましくは、投与１回につき、約０．５μｇ／ｋｇ体重〜約１００μｇ／ｋｇ体重の本発明の改善されたＩＦＮα２ポリペプチドである。例えば、７０ｋｇの人物に投与する場合、投薬量範囲は、治療計画に応じて、投与１回につき約１０μｇ〜約１００μｇの本発明の改善されたＩＦＮα２ポリペプチドであると考えられる。例えば、本発明の改善されたＩＦＮα２ポリペプチド又はそのポリペプチドを含む製剤が、１日に１回〜数回投与される場合は、製剤が１週１回、若しくは月１回、又はより低い頻度で投与される場合より、低用量が必要とされると考えられる。
【０１２５】
本発明のＩＦＮα２ポリペプチドは適切な用量で投与されることが期待される。用量は、一般に、最大耐量（ＭＴＤ）以下に調整される。インターフェロン毒性を示す徴候は、以下のものである：血液学的毒性に関しては、貧血、血小板減少、白血球減少；胃腸管毒性に関しては、下痢、消化不良、嚥下障害、Ｎ／Ｖ、腹痛；肝臓毒性に関しては、ビリルビン、アルカリホスファターゼ、及びＬＦＴの増加；腎臓及び膀胱に関しては、顕微鏡的血尿、膿尿、高窒素血、タンパク尿、急性腎不全、ネフローゼ症候群、糖尿、アルブミン尿；肺に関しては、起坐呼吸、呼吸困難、気管支痙攣、咳嗽、肺水腫、ＡＲＤＳ；心臓毒性に関しては、失神、ＭＩ、ＳＶＴ、徐脈、頻脈、めまい、低血圧、高血圧。神経学的毒性は、錯乱、振戦、しびれ感、感覚異常、集中できないこと、傾眠、幻覚、脳障害、発作、昏睡、精神運動遅滞、記憶機能障害、口渇、発汗、人格障害、興奮、神経障害、うつ、不安、苦悶、失語、視力低下を伴う網膜梗塞、眼の疼痛、半盲（ｈｅｍｉａｎｏｐｓｉｓ）、味覚変化、頭痛、失神、不眠症である。皮疹、じんま疹、表皮壊死、斑点状丘疹の皮膚毒性が挙げられる。代謝毒性は、高血糖として発現する。さらに、凝血が、ＰＴ／ＰＴＴの増加に対して観察される。また、咽頭炎（ｐｈｙａｒｎｇｉｔｉｓ）の存在、脱毛症、疲労、倦怠感、食欲不振、体重減少、発熱、悪寒、筋肉痛、関節炎、チアノーゼも、インターフェロンに対する潜在的な毒性応答である。
【０１２６】
治療適応症
多発性硬化症（ＭＳ）
ＩＦＮの２つの型、すなわちＩＦＮβ１ａ及びＩＦＮβ１ｂが、再発寛解型ＭＳの治療用に承認されている。ＩＦＮβは、性器いぼを治療するのにも使用されている。本発明の改善されたＩＦＮα２ポリペプチドは、上記の疾患、障害、又は状態において有用であり、且つ、二次性進行型ＭＳ、一次性進行型ＭＳ、及び進行再発型ＭＳを含めて、他の形態のＭＳの治療にも有用である。有用とは、改善されたＩＦＮα２ポリペプチドが、疾患の治療に有用であること、例えば、疾患を予防するか、若しくは疾患がより重症の状態に進行するのを防止するか、又は、ＭＳなどの疾患の症状若しくは転帰を改善するか、若しくは軽減することを意味する。
【０１２７】
癌
癌治療における多数の進歩、癌のリスクを大きく低減させ得る周知の生活様式の変更、及び一部の癌が与える早期の警告徴候にもかかわらず、多くの患者が依然として、何らかの妥当な治癒の希望又は有意な緩和を与える従来の療法が利用可能ではない癌を発症する。ＩＦＮα２は、抗癌効果を有することが公知である。
【０１２８】
進行癌に罹患している人は、以下の徴候又は症状のうち１種又は複数種を提示することがある：癌性腫瘍の存在、疲労、疼痛、全身腫瘍量に起因するパフォーマンスステータスの低下、及び具体的な各癌に関連した周知の症状。
【０１２９】
本発明を実施するために、ＩＦＮα２変異体は、１種又は複数種の上記の徴候又は症状を提示している患者に、それらの１種又は複数種の徴候若しくは症状を無くすか、又は少なくとも緩和するのに十分な量で投与される。
【０１３０】
肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症
ＨＣＶ感染症を治療するための現在の治療法は、いくつかの弱点を欠点として持つ。長期間に渡る治療期間を通して、ＩＦＮ−αを毎日（ＱＤ）、１日おき（ＱＯＤ）、又は１週３回（ＴＩＷ）注射する投薬計画は、以下の１つ又は複数の弱点を欠点として持つ。すなわち、（１）投薬計画は、患者に不快感を与え、場合によっては、患者のコンプライアンスの低下をもたらす；（２）投薬計画は、しばしば、有害作用を伴って、患者への付加的な不快感を引き起こし、場合によっては、患者のコンプライアンスの低下をもたらす；（３）投薬計画は、血清ＩＦＮ−α濃度の「ピーク値」（Ｃｍａｘ）及び「トラフ値」（Ｃｍｉｎ）をもたらし、「トラフ」期間の間に、ウイルスが複製し、且つ／又は別の細胞に感染し、且つ／又は変異する場合がある；（４）多くの場合、初期のウイルス応答の間のウイルス力価の対数減少は、ウイルスの排除を最終的にもたらす持続的ウイルス応答を実施するには不十分である。本発明は、肝炎ウイルス感染症を治療する治療可能性の改善において有意な影響力を有し得る。
【０１３１】
インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）
ＩＤＤＭの病因は、大きな論議を呼んでいる。遺伝的素因及び環境の影響を含めて、多因性であると思われる。ＩＤＤＭと、第６染色体の短腕上に位置している主要組織適合遺伝子複合体領域によってコードされている特定のＨＬＡとの間に強い関連が確認されている。主要な高リスクの対立遺伝子はＤＲ３及びＤＲ４である。重要であると考えられている環境の影響には、ウイルスが含まれ、いくつかの系統の証拠がこの見解を裏付けている。いくつかの糖尿病誘発性又は関連したウイルス（流行性耳下腺炎、はしか、風疹、脳心筋炎Ｍ、コクサッキーウイルスＢ、及びレオウイルス（ｒｈｅｏｖｉｒｕｓ））が、ＩＤＤＭの発症に疫学的に関連づけられており、又は、げっ歯動物に接種された場合に糖尿病を引き起こし得る。糖尿病誘発性ウイルスは、培養中のＢ細胞に直接感染することができる。さらに、コクサッキーウイルスＢ４が、重度のケトアシドーシスで死亡した新規発症ＩＤＤＭの少年の膵臓から単離され、且つ、このウイルスは、感染された動物のＢ細胞中のウイルス抗原と共に、実験動物において糖尿病をもたらした。ＩＤＤＭ患畜のＢ細胞はαインターフェロンを分泌した。したがって、本発明のアンタゴニストＩＦＮα２ポリペプチドは、ＩＤＤＭの治療可能性の改善において有意な影響を有し得る。
【０１３２】
エリテマトーデス（ＬＥ）
ＬＥは、関節、腎臓、心臓、肺、脳、血管、及び皮膚を含めて、様々な体の組織及び一部分に炎症及び損傷を引き起こす自己免疫疾患である。ＬＥの最も一般的な症状としては、関節の痛み又は関節の膨れ（関節炎）、発熱、長期の疲労又は極端な疲労、皮疹、及び腎臓の問題が挙げられる。ＬＥの原因は依然として不明であるが、ＬＥは、遺伝的要因、環境要因、及びおそらくはホルモン要因の組合せによって引き起こされると考えられている。ＬＥは、疾患又は発赤の期間、並びに健全又は寛解の期間によって特徴付けることができる。したがって、ＬＥの効果的な治療の目標は、発赤を予防し、器官の損傷及び合併症を最小限に抑え、且つ、正常な身体機能を維持することである。ＬＥに対して一般に処方される医薬品としては、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、アセトアミノフェン、コルチコステロイド、抗マラリア薬、及び免疫調節薬が挙げられる。現在利用可能な医薬品による成功は限られており、且つ、それらには潜在的に重大な副作用があるため、ＬＥに対する代替の効果的な治療を提供することが重要である。
【０１３３】
本発明の組成物は、ＬＥ患者の様々な症状を最小限に抑え、且つ／又は無くすのに効果的である場合がある。
【０１３４】
これまで本発明を一般的に説明したが、同じことが、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。これらの実施例は、例証として提供され、本発明を限定するものと意図されない。
【実施例】
【０１３５】
方法：
（ｉ）部位特異的変異誘発
部位特異的変異誘発を、以前に説明されているように（Ｐｉｅｈｌｅｒ，Ｊ．及びＳｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｇ．１９９９年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ２９４巻、２２３〜２３７頁）、高忠実度ポリメラーゼｐｗｏ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）及びｐｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用して、変異させたコドンを含む１８〜２１ヌクレオチドのプライマーを用いて、発現プラスミドｐＴ７２Ｃα２のＰＣＲ増幅によって実施した。リン酸化及びライゲーションの後、変異させたプラスミドを大腸菌ＴＧ１細胞中に形質転換させた。変異を含む発現された遺伝子全体の配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１３６】
（ｉｉ）タンパク質発現及び精製
以前に説明されているように（Ｐｉｅｈｌｅｒ，Ｊ．及びＳｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｇ．１９９９年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８９巻、５７〜６７頁）、ＩＦＮα２及びＩＦＮＡＲ２−ＥＣを大腸菌中で発現させ、且つ、イオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ＩＦＮα２に対してはε２８０＝１８０７０ｃｍ−１Ｍ−１、及びＩＦＮＡＲ２−ＥＣに対してはε２８０＝２６５００ｃｍ−１Ｍ−１を用いて、２８０ｎｍでの吸光度からタンパク質濃度を決定した。ＩＦＮＡＲ１−ＥＣをＳｆ９昆虫細胞中で発現させ、且つ、説明されているように精製した（Ａｒｄｕｉｎｉ，Ｒ．Ｍ．ら、１９９９年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８巻、１８６７〜１８７７頁）。
【０１３７】
タンパク質純度は、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。活性なＩＦＮα２タンパク質の濃度を、以前に説明されているように（Ｐｉｅｈｌｅｒ，Ｊ．及びＳｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｇ．１９９９年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８９巻、５７〜６７頁）、ＩＦＮＡＲ２−ＥＣと共に、分析ゲル濾過により、すべての変異体に関して決定した。リガンド結合研究のために、マレイミドの化学的性質を用いて、部位特異的にＩＦＮα２及びＩＦＮβを標識した。ＩＦＮβは、ＨＢＳ中で２時間、２倍モル過剰量のオレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ）４８８（ＯＧ４８８）マレイミド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）のインキュベーションによって、遊離のシステイン残基を直接標識した。ＩＦＮα２は、追加のシステイン残基を組み入れた（変異Ｓ１３６Ｃ）（ＩＦＮＡＲ１−ＥＣとの相互作用にもＩＦＮＡＲ２−ＥＣとの相互作用にも影響を及ぼさないことが示されている）後に、ＯＧ４８８で標識した（Ｇａｖｕｔｉｓら、２００５年、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ８８巻（６号）：４２８９〜４３０２頁）。
【０１３８】
（ｉｉｉ）ＩＦＮα２−ＹＮＳ変異体の発達及びリフォールディング
大腸菌を７５０ｍｌフラスコ中で増殖させた。細菌を遠心分離し、溶解緩衝液３０ｍｌ中に再懸濁し、且つ、３０秒間５回、細菌学的に超音波処理した。１６，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、沈殿物（封入体）を約３０ｍｌのトリトン洗浄溶液（０．５％トリトン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ８、及び１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中に再懸濁した。封入体を２５，０００ｇ（ｓｓ３４ソーバル（ｓｏｒｖａｌ）中１４，５００ｒｐｍ）で遠心分離し、且つ、４〜５回洗浄した。１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（８．４）を用いて最終洗浄を実施して、トリトンを除いた。精製した封入体を、４℃で約１２時間、穏やかに攪拌しながら６Ｍグアニジン５ｍｌ中に溶解した。２５０００ｇで２０分間遠心分離した後、上清を保存し、沈殿を廃棄した。
【０１３９】
リフォールディングのために、上清を０．８Ｍアルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎ）（ｐＨ９．３）中に１：２０で希釈し、ボルテックスを用いてゆっくりと穏やかに攪拌し、且つ、２０℃で２時間振とうした。１６，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、Ｔｒｉｓ７．４に対して透析した後、タンパク質をイオン交換クロマトグラフィーによって精製して、約５ｍｇ／Ｌの純粋なタンパク質を得た。
【０１４０】
（ｉｖ）結合親和力の測定
組換えＩＦＮＡＲ１−ＥＣとＩＦＮα２の相互作用を、流動条件下で、反射率測定干渉分光法（ＲＩｆＳ）によって観察した（Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｈ．Ｍ．ら、１９９７年、Ｂｉｏｓｅｎｓ．＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．１２巻、８０９〜８１６頁）。この方法では、境界での生体分子相互作用を、薄いシリカ層の見かけの光学的厚さの変化として検出する。表面への結合は、干渉スペクトルのシフトとして観察される。１ｐｍのシフトは、表面上の約１ｐｇ／ｍｍ２のタンパク質に相当する。リアルタイムの結合測定のために適用される第２の方法は、ＰｒｏｔｅＯＮ（Ｂｉｏｒａｄ社）を用いたＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）によった。測定はすべて、泳動用緩衝液としてＨＢＳ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）を用いて実施した。チップ表面へのＩＦＮＡＲ１受容体サブユニットの結合は、２つの方法によって実施した。１つめの方法では、非中和性の抗ＩＦＮＡＲ１−ＥＣ  ｍＡｂ  ＤＢ２を、アミンカップリング化学反応により、露出したアミノ基を介して（アミノ官能化させたデキストランＡＭＤ  ５００）表面に結合させた。ＩＦＮＡＲ１−ＥＣを表面に親和力で捕捉させ、続いて、第２のｍＡｂ  ＡＡ３と架橋させた。第２の方法では、ＩＦＮＡＲ１のＨｉｓタグ付きテイルを、チップのＮＴＡ表面に直接連結させた。インターフェロンとＩＦＮＡＲ２−ＥＣの相互作用を測定するために使用される方法の詳細な説明は、Ｐｉｅｈｌｅｒ，Ｊ．及びＳｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｇ．２００１年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８９巻、１７３〜１８６頁に記載されている。弱い結合の場合、解離定数ＫＤの決定は、タンパク質濃度に対してプロットし、且つ質量作用の法則に従ってフィッティングした平衡応答から得た。より強固な結合相互作用の場合、動力学的速度定数を決定し、親和力を、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎ＝ＫＤから、並びに平衡応答から直接算出した。
【０１４１】
（ｖ）抗ウイルス防御活性のアッセイ
野生型ＩＦＮα２及び変異体ＩＦＮα２の抗ウイルス活性を、ヒトＷＩＳＨ細胞に対する水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の細胞変性効果の阻害として分析した（Ｅｖｉｎｇｅｒ，Ｍ．ら、１９８１年、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２１０巻、３１９〜３２９頁）。ＩＦＮα２変異体の相対的活性は、５０％の防御に必要とされる野生型ＩＦＮα２の濃度と比べた、細胞の５０％の防御に必要とされる濃度として決定した。
【０１４２】
（ｖｉ）抗増殖性のアッセイ
バーキットリンパ腫Ｄａｕｄｉ細胞に対するＩＦＮα２の抗増殖活性を、説明されているようにして分析した（Ｐｉｅｈｌｅｒ，Ｊ．ら、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５巻、４０４２５〜４０４３３頁）。これらの細胞をＩＦＮで６０時間処理した。次いで、生細胞の数を、テトラゾリウム塩ＸＴＴが切断されてホルマザンになるのを比色定量によって検出することに基づく、細胞染色キット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｃｏ社、イスラエル）を用いて測定した。ＷＩＳＨ細胞に対する抗増殖アッセイは、増殖培地に様々な希釈率のインターフェロンを添加し、且つ、７２時間後にクリスタルバイオレット染色によって細胞濃度を観察することによって実施した。
【０１４３】
（ｖｉｉ）誤差
ＲＩｆＳを用いて測定したＩＦＮα２−ＩＦＮＡＲ２結合のＫＤの誤差（σ）は２０％であり、相対的親和力（野生型／変異体）については３０％である。ＩＦＮα２−ＩＦＮＡＲ１の場合、ＫＤの誤差（σ）は３５％であり、相対的親和力（野生型／変異体）については５０％である。基本的な信頼水準として２σ（信頼性９５％）を用いると、これにより、最小で２倍の変化が有意とみなされ得ることが示唆される。個々の生物活性測定値（抗ウイルス又は抗増殖）に対する誤差（σ）の大きさは、３５％である。したがって、２つの測定値間の２σ信頼水準により、２倍を下回る差異は、実験の誤差の範囲内であることが示唆されると考えられる。
【０１４４】
（ｖｉｉｉ）スポット式のオリゴヌクレオチドマイクロアレイ実験
ほぼ１９，０００種の異なるプローブ（Ｃｏｍｐｕｇｅｎ社のヒトオリゴヌクレオチドセット）を含む、ポリＬ−リシンでコーティングしたガラス製マイクロアレイを、ＣＡＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社のためのセンター、ニュージャージー州）から購入した。マイクロアレイを、シアニン（Ｃｙ）３標識ｃＤＮＡ又はＣｙ５標識ｃＤＮＡからなる混合物でプローブし、ＩＦＮ処理群及び非処理（対照）群とする。ＷＩＳＨ細胞を様々なＩＦＮで１６時間処理し、それらのＲＮＡを抽出し（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉキット、Ｑｉａｇｅｎ社）、そのうち１００μｇを、ａａ−ｄＵＴＰとｄＴＴＰの比が４：１のヌクレオチド混合物中に混合した、アミノアリルで修飾したｄＵＴＰヌクレオチド（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いた逆転写（Ｍ−ＭＬＶ  Ｈ−点変異体ＲＴ酵素、Ｐｒｏｍｅｇａ社）に供した。作製したｃＤＮＡを、ａａ−ｄＵＴＰに結合する、ＮＨＳで活性化したＣｙ３又はＣｙ５蛍光プローブ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）で標識した。取込みを評価し（ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計）、また、標識ｃＤＮＡを、目標体積１００μｌで、最終２×ＳＳＣ、０．０８％ＳＤＳ、及び６μｌのブロッキング溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）中で、当量の蛍光色素（各１００ｐｍｏｌｅ）と混合し（一方の色と処理群及びもう一方の色と対照群）、９５℃で３分間変性させ、冷却し、且つ、持ち上げたカバーガラス（ＬｉｆｔｅｒＳｌｉｐ、Ｅｒｉｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ社）とアレイの間に添加した。ハイブリダイゼーションを暗所、５５℃で１２時間実施した。その後、スライドを、５５℃で５分間、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中で洗浄し、室温、０．５×ＳＳＣ中で５分間洗浄し、最後に、室温、０．０５×ＳＳＣ中で５分間洗浄した。次いで、これを１０００ｒｐｍで３分間遠心脱水することによって乾燥させ、スキャンするまで暗所で保存した。
【０１４５】
（ｉｘ）マイクロアレイイメージ及びデータ解析
ハイブリダイズさせたマイクロアレイのスキャニングを、ＤＮＡマイクロアレイスキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて実施した。自動のスポット検出、バックグラウンド除去、及び強度定量を、ＳｐｏｔＲｅａｄｅｒ（Ｎｉｌｅｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）ソフトウェアを用いて実施した。データの標準化、フィルタリング、及びクラスター解析を、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（ＳｉｌｉｃｏｎＧｅｎｅｔｉｃｓ社）ソフトウェアを用いて実施した。この解析は、各スポットの処理群と対照群の比に基づき、且つ、バックグラウンド（ノイズ）に比較した、ＳｐｏｔＲｅａｄｅｒ出力フラグ、すなわちシグナルの質の指標によるデータフィルタリングなどの操作を含む。各処理（条件）は、２色素交換マイクロアレイレプリケートによって表される。インターフェロンによって調節される遺伝子の開始リストに、少なくとも２つの条件において１．７の閾値を越え、遺伝子１つにつきすべての条件において、「ノイジー」スポットを示している１つの「アブセント」（Ａ）フラグのみを許容している、遺伝子を統合した。この判定基準は、本当の上方調節又は下方調節が、ただ１つではないＩＦＮ処理において観察されることを理解した後で選択した。したがって、最小限、すなわち低いストリンジェンシーの閾値として２つの条件を選択することは、比較的低いレベルで改変されたＩＳＧを含むために必要である。
【０１４６】
これらの遺伝子のリストをＥｘｃｅｌのワークシートに書き出した。また、このリストは、処理群と対照群の比の平均値、レプリケートの値、ｔ検定のｐ値（レプリケート間の距離に基づいた、マイクロアレイ技術の誤差の概算値である）、及びフラグコードを含んだ。次いで、各ペアのレプリケート間の距離及び条件間の距離を比較し、同様にｐ値及び「Ａ」フラグの出現率も考察することによって、遺伝子の有意性を眼で見てスクリーニングした。１つの条件につき小数のレプリケートに対して生じるノイズが比較的大きいことが原因で、統計学的選択では、上方／下方調節されたものが明らかに漏れるため、この時間のかかる解析が必要であった。１．７の閾値を上回る平均値であり、レプリケートのうち１つがこの閾値を下回るか、又は、レプリケート間の距離が平均に比べて大きく、且つ、同様のレベル及び有意なレベルの他の条件を伴わない場合、真の調節ではなく、技術上のノイズとみなされ、したがって、その遺伝子は、リストから除外した。最終的なリストは、１６時間の処理でインターフェロンによって上方調節又は下方調節される、３９５種の遺伝子からなった。クラスター解析は、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇにインポートして戻した後で、このリストを用いて実施した。
【０１４７】
（実施例１）
光学的バイオセンサーシステムによる、ＩＦＮα２−ＩＦＮＡＲ１−ＥＣ相互作用の特徴付け
ＩＦＮＡＲ１−ＥＣとＩＦＮα２の相互作用を、ＲｉｆＳを用いた非標識固相検出によって調査した。この技術は、相互作用する化合物のうち一方をチップ表面に固定化することを必要とする。ＩＦＮＡＲ２−ＥＣに対して以前に成功裡に使用された方法を使用した。この方法では、アミノカップリングを介してそれら自体が表面に固定化されているｍＡｂを用いて、受容体が固定化される（Ｐｉｅｈｌｅｒ、Ｊ．及びＳｃｈｒｅｉｂｅｒ、Ｇ．２００１年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８９巻、１７３〜１８６頁）。非中和性抗ＩＦＮＡＲ１−ＥＣ  ｍＡｂ  ＤＢ２を、その露出したアミノ基を介して、アミノ官能化させたデキストランＡＭＤ５００の表面に結合させた。ＩＦＮＡＲ１−ＥＣをｍＡｂ表面に親和力で捕捉させ、続いて、第２のｍＡｂ  ＡＡ３と架橋させた。リアルタイムＲＩｆＳにおいて追跡したプロセスを図１Ａに示す。ＲＩｆＳ表面に結合されるＩＦＮＡＲ１−ＥＣの結合活性は、０．１２μＭ〜４μＭの範囲の濃度のＩＦＮα２タンパク質を注入することによって決定した。ＩＦＮα２のＩＦＮＡＲ１−ＥＣへの結合親和力が低いため、結合及び解離の動力学的データは決定することができなかった。したがって、結合親和力は、質量作用の法則に従って、タンパク質濃度に対して定常状態の応答をプロットすることにより、決定した。これにより、野生型ＩＦＮα２に対しては１．５μＭの親和定数が得られる（Ｌａｍｋｅｎ，Ｐ．ら、２００４年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４１巻、３０３〜３１８頁）。
【０１４８】
（実施例２）
ＩＦＮＡＲ１に対するＩＦＮα２の結合部位のマッピング
ＩＦＮα２上のＩＦＮＡＲ１の結合部位を位置づけるために、Ｂヘリックス及びＣヘリックス上に位置している大半の残基のＡｌａスキャンを実施した（図２及び図３）。全体として、２１個の単一点突然変異を作製し、且つ、ＩＦＮＡＲ２及びＩＦＮＡＲ１に対するそれらの結合親和力をＲＩｆＳ又はＰｒｏｔｅＯＮによって測定した。変異が、ＩＦＮα２上のＩＦＮＡＲ２結合部位の反対の表面に位置しているため、ＩＦＮＡＲ２に対する様々な変異体タンパク質の結合親和力は、野生型ＩＦＮα２のものに非常に類似していた（表１）。このことは、すべての変異体タンパク質の適切なフォールディング、及びそれらの活性な濃度を実証するため、心強い。ＩＦＮα２とＩＦＮＡＲ２−ＥＣとの結合は、明瞭な動力学的シグナルを提供するが、ＩＦＮＡＲ１−ＥＣに対する結合は、はるかに弱く、リガンドの濃度を変更することにより、定常状態の親和力の屈折単位（ＲＵ）シグナルに従って解析しなければならない。この場合、ＩＦＮα２タンパク質すべての正確且つ厳密な濃度を知ることが不可欠である。したがって、すべての変異体タンパク質濃度を、ＩＦＮＡＲ２−ＥＣに結合する能力を基準として、分析用ゲル濾過カラムを用いて確認した。結合測定値すべての結果を表１及び表３並びに図３Ａに要約する。３つの単一変異は結合の増大を引き起こす（Ｈ５７Ａ、Ｅ５８Ａ、Ｑ６１Ａ）のに対し、６つの変異は、結合の低減を引き起こす（Ｆ６４Ａ、Ｎ６５Ａ、Ｔ６９Ａ、Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ａ、Ｙ８９Ａ）。しかし、結合に関するホットスポットは同定されず、したがって、どの変異も、親和力の５倍を超える変化をもたらさない。単一変異の影響を確認するために、単一変異Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ａ、Ｙ８９Ａを含む３重変異体（本明細書においてＬＹＹと呼ぶ）及び４重変異体Ｎ６５Ａ、Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ａ、Ｙ８９Ａ（配列番号６）（本明細書においてＮＬＹＹと呼ぶ）を調製した。これら２種の変異体タンパク質に対する結合は、測定値の閾値を下回っていた。
【表１】
2009501514.tif 000002
【０１４９】
（実施例３）
ＩＦＮα２変異体の抗増殖活性及び抗ウイルス活性
抗ウイルス活性を、ＷＩＳＨ細胞（羊膜由来のヒト上皮細胞系）に対する水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の細胞変性作用の阻害として分析した。抗増殖活性は、（方法において説明したように）細胞増殖の５０％阻害として、ＷＩＳＨ細胞及びＤａｕｄｉ細胞の両方に対して決定した。図４Ａは、段階希釈した濃度のＩＦＮα２及びＩＦＮβを７２時間適用した際の、染色後にＷＩＳＨ細胞によって示される強度の結果を示し、これから、抗増殖作用を促進するインターフェロン濃度を推論することができる。濃度測定分析のためにこれらのウェルをスキャンし、その結果を、適用したタンパク質の濃度に対してプロットした（図４Ｂ）。同じようにして、ＷＩＳＨ細胞に対するインターフェロンの抗ウイルス能力を決定した（図４Ｃ）。５０％活性点並びに活性の変化率（勾配）を、式１のＩＦＮ用量反応曲線から導き出した。
ｙ＝Ａ０＋Ａ／（１＋（ｃ／ｃ５０）ｓ）    （式１）
式中、ｙは、細胞の数に関係する透過率であり、Ａ０はオフセットであり、Ａは振幅であり、ｃは濃度であり、ｃ５０は５０％の活性を与える濃度であり、ｓは勾配である。５０％の抗ウイルス防御を促進するＩＦＮα２及びＩＦＮβの平均濃度は、それぞれ０．８５ｐＭ及び０．４３ｐＭである（６回の実験の平均）。５０％の抗増殖活性を促進するＩＦＮα２及びＩＦＮβの平均濃度は、１３６０ｐＭ及び２９ｐＭである（それぞれ、１７回及び７回の実験の平均）。興味深いことに、Ｄａｕｄｉ細胞において５０％の抗増殖活性を促進するＩＦＮα２濃度は、０．５ｐＭにすぎず（表２）、ＷＩＳＨ細胞に対して測定される値の１０００分の１未満であり、このことから、全実験に対して同じ細胞系を使用することの重要性が強調される。
【０１５０】
すべてのインターフェロン変異体タンパク質の抗ウイルス活性及び抗増殖活性を、野生型ＩＦＮα２の活性に対して決定し（野生型／変異体）、その結果を表２及び表４に要約した。ＩＦＮＡＲ１−ＥＣに対する結合親和力に関して認められるように、抗ウイルス活性及び抗増殖活性は、変異しても劇的には変化しなかった。抗ウイルス活性の有意な増大（２倍超）を引きこす唯一の変異体は、Ｅ５８Ａである。Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ａ、及びＹ８９Ａは、抗ウイルス活性の有意な減少を引き起こす（ただし、いずれも６倍は超えない）。しかし、組み合わせられたＬＹＹ変異体及びＮＬＹＹ変異体の抗ウイルス能力は、それぞれ３０分の１及び１００分の１に低下した。この低下は、単一変異の相加効果にほぼ一致する（ＬＹＹの場合、０．５×０．２６×０．２０＝０．０２９が、３重変異体に対して得られる結果と類似している）。変異体の同じセットの抗増殖活性に対する影響は、より著しく、Ｅ５８Ａ及びＱ６１Ａの双方が活性の有意な増大を引き起こすのに対し、Ｎ６５Ａ、Ｔ６９Ａ、Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ａ、及びＹ８９Ａは、活性の有意な減少を引き起こす。さらに、ＷＩＳＨ細胞を用いた抗増殖解析において測定された活性の減少の大きさは、抗ウイルス防御に関して測定された値より有意に大きい。多重変異体ＬＹＹ及びＮＬＹＹの活性は、それぞれ１９０分の１及び１１００分の１に低下している。この場合、単一変異は、多重変異体に対して測定される影響を約３０倍過大評価する（例えば、ＬＹＹの場合、実験的に測定された値０．００５７に対して０．１４×０．０３５×０．０４４＝０．０００２２であり、ＮＬＹＹの場合、実験的に測定された０．０００９２に対して、０．１６×０．１４×０．０３５×０．０４４＝０．００００３５である）。解析した全変異体の抗ウイルスの結果及び抗増殖の結果を図５Ａにプロットする。興味があったため、本発明者らは、ＩＦＮβに対する測定値も加えた。このグラフから、抗増殖応答が、抗ウイルス応答と比べて、特定のＩＦＮα２変異体に対して感受性がはるかに強いと考えられる。さらに、この傾向は、ＩＦＮβに関するデータにもあてはまり、抗ウイルス活性は、ＩＦＮα２の値より２倍高い（Ｅ５８Ａ変異体の抗ウイルス活性と同様）のに対し、その抗増殖活性は約５０倍高い。測定したＩＦＮＡＲ１に対する結合親和力と生物活性を比較することにより、双方の活性が、一般に、結合親和力と共に高くなるが、スケール全体に渡ってではないことが示される（図５Ｂ）。
【表２】
2009501514.tif 000003
【０１５１】
（実施例４）
三元複合体の安定性は、ＩＦＮα２と比べて、ＨＥＱによって増強される
Ａｌａに対する３つの変異が、結合を２〜４倍増加させることが発見されたため、これら３種のＩＦＮα２変異（Ｈ５７Ａ、Ｅ５８Ａ、Ｑ６１Ａ）を、単一のＩＦＮα２変異体タンパク質中に組み合わせた。本明細書において使用する場合、これをＨＥＱ（配列番号５）と呼ぶ。
【０１５２】
Ｉ型インターフェロン受容体細胞外ドメイン（ＩＦＮＡＲ１−ＥＣ）並びにＩＦＮＡＲ１−ＥＣ及びＩＦＮＡＲ２−ＥＣを含む三元複合体へのＩＦＮの結合を、全反射蛍光分光法（ＴＩＲＦＳ）によって研究した。ＩＦＮＡＲ２−ＥＣ及びＩＦＮＡＲ１−ＥＣを、Ｃ末端ヒスチジンタグを介して、固体で支持された脂質二重層上につなぎ留めた。ＩＦＮＡＲ１−ＥＣからのＩＦＮα２野生型、ＨＥＱ、及びＩＦＮβの解離動態をＴＩＲＦＳによって測定し、図１Ｃにおいて比較する。ＨＥＱに関しては、複合体の存続期間がＩＦＮα２と比べて２０倍延長することが観察され、ＩＦＮβに関しては同様の解離動態が観察された（表３）。一方、極めて類似した結合速度定数が、３種すべてに対して得られた。これらのデータから、ＨＥＱ／ＩＦＮＡＲ１−ＥＣ複合体の平衡解離定数ＫＤは８３ｎＭと決定され、ＹＮＳ／ＩＦＮＡＲ１−ＥＣ複合体のＫＤは３３ｎＭと決定され、ＩＦＮα２野生型／ＩＦＮＡＲ１−ＥＣ複合体のＫＤは１．６μＭと決定され、ＩＦＮβ／ＩＦＮＡＲ１−ＥＣ複合体のＫＤは６６ｎＭと決定された。ＩＦＮＡＲ２−ＥＣに対するＨＥＱの結合親和力は、ＩＦＮα２野生型に対する測定値（５ｎＭ）と同様であり、ＩＦＮβの値より約１０分の１である（表３）。したがって、ＩＦＮＡＲ１に対するＨＥＱの親和力のみが、ＩＦＮβと同様であるが、ＩＦＮＡＲ１に対しては同様ではない。
【０１５３】
ＩＦＮは、１：１：１の化学量論比の三元複合体（ＩＦＮＡＲ１−ＩＦＮ−ＩＦＮＡＲ２）を形成することによって、生物活性を誘導する。表面に結合された２つの受容体サブユニットへの協同的結合が理由となって、見かけのリガンド結合親和力は、ＩＦＮＡＲ２単独への結合よりも大きく、且つ、受容体表面相対濃度及び受容体表面絶対濃度に依存する（Ｌａｍｋｅｎ，Ｐ．ら、２００４年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４１巻、３０３〜３１８頁）。ＩＦＮＡＲ１に対する親和力の増大による、三元複合体の安定性の上昇は、リガンドの解離動態によって探索することができる。したがって、ＩＦＮα２（配列番号２）、ＨＥＱ（配列番号５）、ＹＮＳ（配列番号１１）、α８テイル（配列番号７）、及びＩＦＮβ（配列番号３）の解離を、化学量論比の様々な濃度のＩＦＮＡＲ１−ＥＣ及びＩＦＮＡＲ２−ＥＣで比較した。ＩＦＮβの場合、測定は、野生型ＩＦＮＡＲ２に対するＩＦＮα２の場合と同様に、５ｎＭの親和力でＩＦＮβに結合するＩＦＮＡＲ２上で、Ｉ４７Ａ変異体を用いて実施した（表３）。これにより、リガンド解離に対するＩＦＮＡＲ１表面濃度の影響のみを比較することになる。ＩＦＮα２の場合、解離動態は、受容体表面濃度に強く依存するが、ＩＦＮβ及びＨＥＱの場合は、重なった（ｏｖｅｒｌａｙｉｎｇ）解離曲線が観察された。これにより、ＩＦＮβ及びＨＥＱで形成された三元複合体のより高い安定性が明瞭に実証される。（細胞当たり受容体１０００個の細胞受容体濃度をはるかに上回る）最も高い受容体濃度でさえ、最も低い受容体濃度でのＩＦＮβ及びＨＥＱに対してよりも速い、ＩＦＮα２野生型の解離が観察された。しかし、受容体の表面濃度がさらに上昇した場合、最終的には、ＩＦＮα２野生型は、ＩＦＮβ又はＨＥＱと同程度の速度で解離する。三元複合体の安定性は、表面受容体濃度及び個々の受容体に対する結合親和力を組み合わせた関数である。三元複合体の安定性が生物活性に関係していると想定すると、より強固な結合ＩＦＮの差次的な活性化が、天然に（Ｄａｕｄｉ細胞においてのような）又はトランスフェクションにより、受容体数の多い細胞中に隔離され得ることは意外ではない。これにより、通常は無視されている問題である、非天然レベルの細胞表面受容体を細胞にトランスフェクトする危険も強調される。
【表３】
2009501514.tif 000004
【０１５４】
（実施例５）
ＩＦＮα２変異体：ＨＥＱ、ＭＤＬ、α８テイル、及びＹＮＳの抗ウイルス活性及び抗増殖活性
ＷＩＳＨ細胞に対するＩＦＮβの抗ウイルス能力は、ＩＦＮα２と比べて２倍高いだけであるのに対し、抗増殖活性は約５０倍高いことが注目されている。図４Ｂ〜図４Ｃは、ＷＩＳＨ細胞に対して測定された、ＩＦＮα２野生型、ＨＥＱ（配列番号５）、及びＩＦＮβの抗ウイルス活性及び抗増殖活性を示す。このアッセイにおいて、ＨＥＱの活性プロファイルは、ＩＦＮβのプロファイルと比較可能である。ＩＦＮＡＲ１に対するＨＥＱの結合親和力は大きく増大するものの、その抗ウイルス能力は、野生型ＩＦＮα２の能力より２倍しか高くない。ＩＦＮβの抗増殖活性が４２倍増大するのに対し、抗増殖活性は、約２５倍増大する（表４）。同じ傾向が、ＭＤＬ（配列番号１０）及びＹＮＳ（配列番号１１）にも当てはまる。それらの抗ウイルス活性は、ＩＦＮα２の活性とほぼ同じであるのに対し、抗ウイルス活性ははるかに高い。ＭＤＬは、ＩＦＮβと同じ活性レベルを示し、ＹＮＳは、さらに高いレベルの抗増殖活性を示す。抗増殖活性の増大は、ＩＦＮＡＲ１に対するこれら２種のＩＦＮの親和力の増大と一致している。前述したように、ＩＦＮβは、ＩＦＮα２よりも速く、増殖を停止させるようである。結果として、高濃度のＩＦＮを適用した後の細胞総数は、ＩＦＮβの場合の方が少ない。この現象は、より高い濃度のＩＦＮα２を用いることによって埋め合わせることができず、質的な差である（図４Ｂ）。この態様において、ＨＥＱ及びＹＮＳは、ＩＦＮα２野生型のように挙動し、ＩＦＮβのように挙動しない。ＨＥＱの滴定曲線の勾配（濃度依存性の開始に関する）は、野生型ＩＦＮα２及びＩＦＮβの中間の勾配である。
【表４】
2009501514.tif 000005
【０１５５】
（実施例６）
遺伝子チップ技術を用いた、遺伝子活性化のモニタリング
遺伝子チップは、差次的な遺伝子活性化に関する完全な情報を得るための標準技術となっている。実際、いくつかの研究が、ＩＦＮ誘導の際の遺伝子発現プロファイルを調査するために実施されている（ｄｅ  Ｖｅｅｒ，Ｍ．Ｊ．ら、２００１年、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．６９巻、９１２〜９２０頁）。遺伝子発現に対するＩＦＮの影響を、スポット式のオリゴヌクレオチドマイクロアレイ実験によって観察した。ＷＩＳＨ細胞を、０．３ｎＭのＩＦＮα２、３ｎＭ（１０，０００ユニット）のＩＦＮα２、０．３ｎＭのＨＥＱ、及び０．１５ｎＭのＩＦＮβ（１，０００ユニット）で１６時間処理した。濃度は、ＷＩＳＨ細胞において９０％超の抗増殖応答（ＩＦＮα２野生型−３ｎＭ、ＨＥＱ、及びＩＦＮβ）又は１０％未満の抗増殖応答（ＩＦＮα２野生型−０．３ｎＭ）をもたらすように選択した。各条件において、ＩＦＮ処理群対非処理群の実験を、デュプリケートな色素交換マイクロアレイにおいて実施した。さらに、非処理群対非処理群からなるマイクロアレイ実験の４つのレプリケートを、追加の対照として使用した。２つの色の標準化した比率を、誘導のレベルとみなす。ＩＦＮによって調節された遺伝子を定義するために選択された基準は、方法のセクションにおいて説明する。
【０１５６】
遺伝子チップの結果は、遺伝子単位で、又は遺伝子誘導の一般的傾向を考察して、解析することができる。図６は、ＩＦＮβ（０．１５ｎＭ）、ＨＥＱ及びＩＦＮα２野生型（それぞれ０．３ｎＭ及び３ｎＭ）による処理後１６時間目の、ＩＦＮによって調節される３９５種の遺伝子の発現レベルの変化を記録した傾向の概要を与えるものである。図６Ａでは、３９５種の遺伝子の（非処理群に対する）相対的発現レベルを、変化率に従って昇順でプロットした。黒の点は、双方の色チャネル上に未処理試料のみの混合物を含む、対照チップのものである。これは、予想されるランダムな変動の推定値を与える。対照チップに関して記録された発現レベルの最大変化及び最小変化は、０．６５〜１．６倍であり、２つのチャネル間の比率は、遺伝子の上位９５％に対して０．７５〜１．４倍にすぎなかった。遺伝子発現のランダムな変動が低レベルであると、データの質の信頼性は高レベルになる。一般に、遺伝子発現レベルは、ＩＦＮβ（０．１５ｎＭ）及びＨＥＱ（０．３ｎＭ）（図６Ａ）に対しては同様であるが、ＩＦＮα２野生型（０．３ｎＭ）に対しては、はるかに低レベルの誘導が記録された。３ｎＭのＩＦＮα２野生型を添加した際の遺伝子誘導は、ＩＦＮα２野生型（０．３ｎＭ）及びＩＦＮβ（０．１５ｎＭ）又はＨＥＱ（０．３ｎＭ）に関して記録されたレベルの中間である。差次的な発現レベルを解析する代替方法は、様々な処理間の遺伝子活性化の変化率をプロットするものである（図６Ｂ）。ＩＦＮβが最大の変化を誘導したため、ＩＦＮβの誘導に比べて、他の値すべてを算出した。対照は図６Ａと同じである。やはり、ＩＦＮβ及びＨＥＱは、すべての遺伝子に対して同じレベルの変化を誘導するようである（緑色の線は、対照の黒色の線に随行する）。これは、ただ１つの遺伝子も、ＩＦＮβによる誘導の際に、ＨＥＱと有意に異なって挙動しないことを意味する。この注目すべき結果は、これらのＩＦＮの双方がどれだけ類似しているかを示す。最も差次的な発現は、ＩＦＮβとＩＦＮα２野生型（０．３ｎＭ）の間で見出される。やはり、ＩＦＮα２野生型（３ｎＭ）に関する結果は、ＩＦＮα２野生型（０．３ｎＭ）及びＨＥＱに関して記録された結果の中間である。
【０１５７】
４通りの処理に対するＩＦＮによって誘導される遺伝子のクラスター解析を実施して、図６Ａ及び図６Ｂにグラフによって示した結果を独立に検証した。図６Ｃは、ＩＦＮβ及びＨＥＱのクラスターの遺伝子発現プロファイルを共に示す。両者間の距離は非常に短い。３ｎＭのＩＦＮα２野生型で処理した細胞の発現プロファイルは隣でクラスター形成するが、０．３ｎＭのＩＦＮα２野生型の遺伝子発現プロファイルは、より遠くに離れている。遺伝子発現プロファイリングは、ＩＮＦβとＩＦＮα２の間で観察される差次的な生物活性と良好に一致しており、やはり、ＨＥＱがＩＦＮβの特徴すべてを有するＩＦＮα２であることが実証される。
【０１５８】
遺伝子チップは、ゲノムを含む個々の遺伝子の発現レベルの詳細な情報を与える。ＩＦＮβ対ＩＦＮα２野生型の遺伝子発現プロファイルを解析する最も興味深い態様の１つは、差次的な活性化及び差次的な活性とＩＦＮ濃度の関係を調査することである（Ｄｅｒ，Ｓ．Ｄ．ら、１９９８年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５巻、１５６２３〜１５６２８頁）。３９５種の誘導された遺伝子のうち、５９種の上方調節された遺伝子及び９種の下方調節された遺伝子を、様々な処理間の差次的な活性化レベルに基づいて選択した（Ｊａｉｔｉｎら、２００６年、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２６巻（５号）：１８８８〜１８９７頁、表３）。
【０１５９】
濃度０．３ｎＭのＩＦＮα２によって誘導されない多くの遺伝子を含めて、大半の遺伝子におけるＩＦＮβ及びＨＥＱ（配列番号５）の発現に対する影響は、等価な抗ウイルス活性濃度、すなわち、それぞれ０．１５ｎＭ及び０．３ｎＭのＩＦＮα２によって誘導される影響よりずっと強かった。
【０１６０】
（実施例７）
ＭＤＡ２３１腫瘍予防モデル
皮下（ｓ．ｃ．）腫瘍を確立させるために、ＭＤＡ２３１細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで７０％コンフルエントな状態まで増殖させ、トリプシン処理し、１０８細胞／ｍｌの濃度でＰＢＳ中に懸濁させ、且つ、１０７個の細胞をヌードマウスの側腹部に皮下注射した。次いで、マウスを無作為化し、１群当たり６動物からなる３つの処置群に分けた。処置計画は１日目に開始し、３４日目まで継続した。１週２回、３４日間、マウスにＰＢＳ又は個々の処置を皮下注射した。３４日間の処置後、動物を屠殺し、腫瘍を摘出し、腫瘍サイズを決定した。これらの結果を表５に要約する。これらの結果により、組織培養実験と一致して、ＹＮＳが、ＭＤＡ２３１乳癌細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｖｏで抑制するのに非常に効果的であることが明確に実証される。ＹＮＳによる３４日間の処置後に、ＹＮＳで処置したマウスはすべて、腫瘤が無かったのに対し、ＩＦＮα２で処置したマウス６匹中５匹、及びＰＢＳで処置したマウス６匹すべてには、様々なサイズの腫瘤があった。
【表５】
2009501514.tif 000006
【０１６１】
（実施例８）
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）
実験的アレルギー性脳脊髄炎としても公知である実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症（ＭＳ）の動物モデルである。誘導の方法、動物の系統、及び疾患を誘導するのに使用される抗原によって、様々なＥＡＥモデルが、当技術分野において公知である。ＥＡＥは、急性又は慢性の、再発性、後天性、炎症性、且つ脱髄性の自己免疫疾患である。様々な形態のＥＡＥは、様々な形態及び病期のＭＳに極めてよく似ている。
【０１６２】
本発明の研究において、ＥＡＥは、ＭＳの急性期のモデルを作るための公知の方法である、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の注入によって誘導される。このモデルにおいて、疾患の発症は、誘導後約１０日目の臨床症状の出現によって観察される。疾患は進行し、臨床スコアは上昇して１５日目頃にピークとなり、また、自発的な回復が、疾患の誘導後２３日目頃に観察される。
【０１６３】
メスのＬｅｗｉｓラット（平均体重１３０〜１８０ｇ、Ｈａｒｌａｎ社、イスラエル）の後肢に、完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ社）０．１ｍｌ中に乳濁させた、精製したモルモットミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、Ｓｉｇｍａ社）２５μｇを皮下注射する。明１２時間／暗１２時間の処置計画のもと、２２℃の一定温度で、食品及び水を適宜与えて、動物を維持する。誘導後８日目から開始して、毎日動物をフォローアップする。結果を臨床スコアとして記録する。スコア０は、臨床徴候を伴わない正常な動物を示し、０．５は、尾部の遠位部における張度の低下を示し、１は尾部全体の麻痺を示し、１．５は、一方の後肢の衰弱を示し、２は、双方の後肢の衰弱を示し、２．５は、一方の前肢の場合を示し、３は、四肢すべての麻痺を示し、４は、全面的な身体麻痺及び瀕死状態を示し、５は死亡を示す。疾患の発症後約１５日間、研究の終わりである誘導後２５日目まで、動物の臨床スコアを記録し、且つ、この期間を通しての曲線下面積（ＡＵＣ）を算出する。
【０１６４】
０．５〜１の臨床スコアを付けることができる、疾患の症状を提示している動物を、疾患の発症から開始して連続した３日間（疾患誘導後９日目〜１１日目頃）、ＨＥＱ（配列番号５）、ＹＮＳ（配列番号１１）、又は溶媒対照の組成物で処置する。いくつかの投与経路、例えば、５ｍｌ／ｋｇの体積用量での静脈内投与（溶媒中）又は胃管栄養法による経口投与（溶媒中）を評価する。調査の最終日（約２５日目）に、動物にナトリウムペントバルビトン１００ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与して安楽死させる。
【０１６５】
結果を平均値±ＳＥＭとして表し、且つ、処置群間の差異を、分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くチューキー（Ｔｕｋｅｙ）の事後検定によって解析した。ｐ＜０．０５の値は、統計学的に有意であるとみなされ、該当の処置群の上のアスタリスクによって図面上で示される。
【０１６６】
モデルの妥当性は、メチルプレドニゾロンを陽性対照として用いて確かめる。ＭＢＰ注射による疾患誘導の日から開始して５日間連続で毎日、３０ｍｇ／ｋｇのステロイドが静脈内投与される場合、ＡＵＣの３４％の減少が報告された。
【０１６７】
（実施例９）
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の動物モデル
メスの（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１ハイブリッドマウス（以下、「ＮＺＢ／Ｗマウス」と呼ぶ）は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対する血清自己抗体の存在を特徴とする狼瘡様の疾患を自発的に発症する。最終的には全体的な腎不全を経験するこれらのマウスは、ヒトの狼瘡をより良く理解し、治療することを目的とした実験用モデルとしてしばしば使用される。時間とともに、ＮＺＢ／Ｗマウスのこの病態は進行して、タンパク尿の出現によって顕在化する腎機能不全となる。
【０１６８】
３２週齢のメスのＮＺＢ／Ｗマウスを実験で使用して、ＮＬＹＹ（配列番号６）が狼瘡様疾患の発症を遅延させ得るかどうかを判定する。マウスを２群に分け、且つ、ＮＬＹＹ（マウス１０匹からなる群）又は対照としてのラットＩｇＧ（マウス１０匹からなる群）のいずれかを腹腔内注射によって投与して、１日おきに各群を処置する。処置を５週間継続し、これらのマウスを、タンパク尿の存在に関して毎週評価する。
【０１６９】
個々の実施形態の前述の説明により、本発明の一般的性質が十分に明らかになるため、他の研究者は、現在の知識を適用することにより、過度に実験をすることなく、且つ、一般的な概念から逸脱することなく、このような個々の実施形態を容易に修正し、且つ／又は様々な応用のために適合させることができ、したがって、このような適合及び修正は、開示される実施形態の等価物の意味及び範囲内で理解されるべきであり、理解されると意図される。本発明は、その特定の実施形態に関連して説明されるが、多くの代替、修正、及び変形が当業者には明らかであろうことは、明白である。したがって、添付の特許請求の精神及び広い範囲内に含まれる、このようなすべての代替、修正、及び変形を包含することが意図される。
【０１７０】
詳細な説明及び個々の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものの、本発明の精神及び範囲内の様々な変更及び修正が、この詳細な説明から当業者には明らかになると考えられるため、それらは、例証として与えられるにすぎないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】ＩＦＮα２のアフィニティー捕捉及び結合による、Ｉ型インターフェロン受容体−細胞外ドメイン（ＩＦＮＡＲ１−ＥＣ）の固定化を示す。  図１Ａは、固定化されたｍＡｂ  ＤＢ２によるＩＦＮＡＲ１の捕捉と、それに続くｍＡｂ  ＡＡ３による架橋の結合曲線を示す。  図１Ｂは、定常状態での親和力解析を示す。表面に固定化されたＩＦＮＡＲ１への、０．２５〜４μＭ（図中の数字を参照されたい）の様々な濃度のＩＦＮα２  Ｅ５８Ａ（太い灰色）及びＥ９６Ａ（細い黒色）の結合である。  図１Ｃは、リアルタイムで追跡した、表面に固定化されたＩＦＮＡＲ１−ＥＣからのＩＦＮα２、ＩＦＮβ、及び３重変異体Ｈ５７Ａ、Ｅ５８Ａ、Ｑ６１Ａ（配列番号５）の解離反応を示す。解離速度は、結合親和力に直接関係しており、このデータを表１及び表３に要約する。
【図２】ＩＦＮα２に対するＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２結合の変異体解析を示す図である。Ｉ型インターフェロンをＩＦＮα２に対してアラインする。下線を引いている残基は、Ａｌａへの変異が、いずれの受容体に対する結合も変えなかったものである。上部の「＋」及び「−」の記号は、変異が、変異の際にＩＦＮα２の結合親和力の増加を引き起こしたか、又は減少を引き起こしたかを表す（表１を参照されたい）。上部の数字は、その変化がＩＦＮＡＲ１（１）への結合に起因するか、又はＩＦＮＡＲ２（２）への結合に起因するかを表す。ＩＦＮα８のＣ末端残基は、配列番号７において作り出された変化をマークするために、ボールド体である。四角で囲んだ残基は、配列番号５〜１３に関係するものである。
【図３】ＩＦＮα２上でＩＦＮＡＲ１を結合させるための機能的エピトープを示す。  図３Ａは、ＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２の両方に対する、本発明者らが解析した変異タンパク質すべての結合親和力の変化のプロットを示す。  図３Ｂは、以前に決定された、ＩＦＮα２とＩＦＮＡＲ２との複合体のモデルの表面図である。変異するとＩＦＮＡＲ１への結合が変化する残基に番号を付与している。変異すると結合親和力が２倍超増大する残基に下線を引いている（５７、５８、６１）。この図は、ＰｙＭｏｌを用いて作図された。
【図４】ＷＩＳＨ細胞に対する、インターフェロンの抗ウイルス応答及び抗増殖応答の濃度依存性を示す。  図４Ａは、範囲が２５０ｎＭ〜０．４８ｐＭのＩＦＮα２及び１２５ｎＭ〜０．２４ｐＭのＩＦＮβであるインターフェロン段階希釈物を投与した際の、抗増殖応答の１セットの生データを示す。  図４Ｂ及び４Ｃは、３重変異体Ｈ５７Ａ、Ｅ５８Ａ、Ｑ６１Ａ（配列番号５）も含む、３回の独立した抗増殖性実験（４Ｂ）及び抗ウイルス実験（４Ｃ）の濃度測定値を示す。データは、６回の繰り返しからなり、標準誤差を含めて示す。曲線は、用量反応式にフィッティングされ、且つ、統合されたデータに対して最適なフィッティングを示している。
【図５】インターフェロン変異体の生物活性を示す。  図５Ａは、２１種のＩＦＮα２単一変異体、３重変異体Ｈ５７Ａ、Ｅ５８Ａ、Ｑ６１Ａ（配列番号５）、４重変異体Ｎ６５Ａ、Ｌ８０Ａ、Ｙ８５Ａ、Ｙ８９Ａ（配列番号６）、（配列番号７）、３重変異体Ｈ５７Ｙ、Ｅ５８Ｎ、Ｑ６１Ｓ（配列番号１１）、及びＩＦＮβの相対的抗増殖活性に対してプロットした、（野生型に対する）相対的抗ウイルス活性を示す。  図５Ｂは、ＩＦＮＡＲ１−ＥＣに対する相対的結合親和力に対してプロットした、同じタンパク質の相対的な抗ウイルス活性及び抗増殖活性を示す。データはすべて表１〜４に由来する。直線は、生物活性と親和力の理論上の関係を表す。線の上側の点は、生物活性（抗ウイルス活性又は抗増殖活性）の変化の方が親和力の変化より小さい変異体であり、線の下側の点は反対である。
【図６】スポット式のオリゴヌクレオチドマイクロアレイ実験によって観察した、遺伝子発現に対するインターフェロンの影響を示す。次の４種の異なる１６時間のインターフェロン処理を試験した：０．３ｎＭ（１，０００ユニット）のＩＦＮα２野生型、３ｎＭ（１０，０００ユニット）のＩＦＮα２野生型、０．３ｎＭのＨＥＱ（配列番号５）、及び０．１５ｎＭのＩＦＮβ（１，０００ユニット）。デュプリケートな色素交換マイクロアレイにおいて、未処理対ＩＦＮ処理によって、各条件を示す。さらに、別の試料に由来する未処理群対未処理群からなるマイクロアレイ実験の４つのレプリケートは、対照としてのＩＦＮ未処理群に相当する。  図６Ａは、変化率に従って昇順でプロットした３９５遺伝子の（未処理群に対する）相対的発現レベルを示す。  図６Ｂは、０．１５ｎＭのＩＦＮβを添加した際の発現レベルに対してプロットした発現レベルを示す。未処理対照群（黒の点）の発現レベルに対する場合との唯一の例外は、ランダムなレベルの変動を評価するために第２のセットの対照に対してプロットしていることである。  図６Ｃは、４種の処理に対するインターフェロンで誘導された遺伝子のクラスター解析を示す。ＩＦＮβ及びＨＥＱ（配列番号５）の遺伝子発現プロファイルは一箇所でクラスター形成し、相互の距離は非常に短い。３ｎＭのＩＦＮα２野生型で処理した細胞の発現プロファイルは隣でクラスター形成するのに対し、０．３ｎＭのＩＦＮα２野生型の場合の遺伝子発現プロファイルはより遠く離れている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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