(57)【要約】方法、組成物およびキットを、インビボで癌転移を効果的に処置し、および防ぐために、および転移性腫瘍を負う対象物の生存率を増やすために、リジルオキシダーゼまたはそのモジュレーター、特にヒトリジルオキシダーゼを標的とすることによって提供する。また、リジルオキシダーゼインヒビター(抑制物質)を識別するための方法、およびそのようなインヒビターの使用を、腫瘍、特に転移性腫瘍を防ぎ、および処置するために、単独で、および化学療法薬剤との組合せで提供する。さらに、転移の可能性および生存率を測定するためのリジルオキシダーゼレベルの使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象物において腫瘍増殖をインビボで減らす方法であって、次の、即ち
それを必要とする対象物にリジルオキシダーゼ活性のインヒビターの効果的な量、および
随意に、製薬上許容可能な担体を投与する工程
を具える、方法。
【請求項２】
腫瘍増殖は転移性腫瘍増殖である、請求項1の方法。
【請求項３】
腫瘍増殖は、少なくとも少なくとも25%、50%、75%、90%、または95%、処置された対象物において減らされる、請求項1の方法。
【請求項４】
インヒビターは抗体、小分子インヒビター、siRNA、shRNAまたはアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項1の方法。
【請求項５】
インヒビターは小分子インヒビターである、請求項1の方法。
【請求項６】
小分子インヒビターは低酸素性条件下に活性化されるプロドラッグである、請求項4の方法。
【請求項７】
インヒビターは抗体である、請求項1の方法。
【請求項８】
抗体はヒトリジルオキシダーゼ(hLOX)に特異的に結合する、請求項7の方法。
【請求項９】
抗体は、ヒトリジルオキシダーゼ(hLOX)に、リジルオキシダーゼ様またはリジルオキシダーゼ関連タンパク質に対するよりも少なくとも10、100、または1000倍大きな結合親和性を伴って特異的に結合する、請求項8の方法。
【請求項１０】
リジルオキシダーゼ様またはリジルオキシダーゼ関連タンパク質は、LOL1、LOL2、LOL3およびLOL4からなる群より選ばれる、請求項9の方法。
【請求項１１】
抗体は、配列番号1および13〜73からなる群より選ばれるhLOXの領域に特異的に結合する、請求項7の方法。
【請求項１２】
抗体は配列番号1のhLOXの領域に特異的に結合する、請求項7の方法。
【請求項１３】
抗体は、hLOXの分泌された形態に特異的に結合するが、アミノ酸配列の配列番号8を持つhLOXのプレプロタンパク質にはそうしない、請求項7の方法。
【請求項１４】
hLOXの分泌された形態はアミノ酸配列の配列番号9を持つ、請求項13の方法。
【請求項１５】
抗体は、hLOXの成熟した形態に特異的に結合するが、アミノ酸配列の配列番号8を持つhLOXのプレプロタンパク質にはそうしない、請求項7の方法。
【請求項１６】
hLOXの成熟した形態はアミノ酸配列の配列番号10を持つ、請求項15の方法。
【請求項１７】
抗体は、アミノ酸配列の配列番号8を持つhLOXのプレプロタンパク質に特異的に結合するが、アミノ酸配列の配列番号9を持つhLOXの分泌された形態、またはアミノ酸配列の配列番号10を持つhLOXの成熟した形態にはそうしない、請求項7の方法。
【請求項１８】
抗体は単クローン性のヒト抗体またはヒト化された抗体である、請求項7の方法。
【請求項１９】
インヒビターはリジルオキシダーゼmRNAを標的とする核酸である、請求項1の方法。
【請求項２０】
リジルオキシダーゼmRNAは配列番号11である、請求項19の方法。
【請求項２１】
リジルオキシダーゼmRNAを標的とする核酸は配列番号12に対するアンチセンスヌクレオチドである、請求項19の方法。
【請求項２２】
インヒビターはshRNAである、請求項1の方法。
【請求項２３】
腫瘍は悪性の固形腫瘍である、請求項1の方法。
【請求項２４】
腫瘍は胸部腫瘍、膵腫瘍、肺腫瘍、頚部腫瘍、大腸腫瘍および頭頚部腫瘍からなる群より選ばれる、請求項1の方法。
【請求項２５】
さらに対象物に抗癌性薬剤を投与する工程を具える、請求項1の方法。
【請求項２６】
インヒビターはエストロゲン受容体(ER)陰性胸部腫瘍を有する対象物に投与される、請求項1の方法。
【請求項２７】
癌を有する対象物において、転移をインビボで処置する方法であって、次の、即ち
それを必要とする対象物にリジルオキシダーゼ活性のインヒビターの効果的な量を投与する工程、それによって転移を、処置される対象物において抑制する工程
を具える、方法。
【請求項２８】
転移は対象物において対象物における処置前の転移と比較して少なくとも25%、50%、75%、90%、または95%減らされる、請求項1の方法において、請求項27の方法。
【請求項２９】
インヒビターは抗体、小分子インヒビター、siRNA、shRNAまたはアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項27の方法。
【請求項３０】
インヒビターは小分子インヒビターである、請求項27の方法。
【請求項３１】
小分子インヒビターは低酸素性条件下に活性化されるプロドラッグである、請求項30の方法。
【請求項３２】
インヒビターは抗体である、請求項27の方法。
【請求項３３】
抗体はヒトリジルオキシダーゼ(hLOX)に特異的に結合する、請求項32の方法。
【請求項３４】
抗体は、ヒトリジルオキシダーゼ(hLOX)に、リジルオキシダーゼ様またはリジルオキシダーゼ関連タンパク質に対するよりも少なくとも10、100、または1000倍大きな結合親和性を伴って特異的に結合する、請求項33の方法。
【請求項３５】
リジルオキシダーゼ様またはリジルオキシダーゼ関連タンパク質は、LOL1、LOL2、LOL3およびLOL4からなる群より選ばれる、請求項34の方法。
【請求項３６】
抗体は、配列番号1および13〜73からなる群より選ばれるhLOXの領域に特異的に結合する、請求項32の方法。
【請求項３７】
抗体は配列番号1のhLOXの領域に特異的に結合する、請求項32の方法。
【請求項３８】
転移性腫瘍を有する対象物の生存の可能性を増やし、または強化する方法であって、次の、即ち
それを必要とする対象物にリジルオキシダーゼ活性のインヒビターの効果的な量を投与する工程、それによって、処置される対象物の生存の可能性を一定の期間の時間増やし、または強化する工程
を具える、方法。
【請求項３９】
対象物の生存は、少なくとも10日、1月、3月、6月、1年、1.5年、2年、3年、4年、5年、8年、または10年の間増やされる、請求項38の方法。
【請求項４０】
インヒビターは抗体、小分子インヒビター、siRNA、shRNAまたはアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項38の方法。
【請求項４１】
インヒビターは小分子インヒビターである、請求項38の方法。
【請求項４２】
小分子インヒビターは低酸素性条件下に活性化されるプロドラッグである、請求項41の方法。
【請求項４３】
インヒビターは抗体である、請求項38の方法。
【請求項４４】
抗体はヒトリジルオキシダーゼ(hLOX)に特異的に結合する、請求項43の方法。
【請求項４５】
抗体は、ヒトリジルオキシダーゼ(hLOX)に、リジルオキシダーゼ様またはリジルオキシダーゼ関連タンパク質に対するよりも少なくとも10、100、または1000倍大きな結合親和性を伴って特異的に結合する、請求項44の方法。
【請求項４６】
リジルオキシダーゼ様またはリジルオキシダーゼ関連タンパク質は、LOL1、LOL2、LOL3およびLOL4からなる群より選ばれる、請求項45の方法。
【請求項４７】
抗体は、配列番号1および13〜73からなる群より選ばれるhLOXの領域に特異的に結合する、請求項38の方法。
【請求項４８】
抗体は配列番号1のhLOXの領域に特異的に結合する、請求項38の方法。
【請求項４９】
対象物の転移性腫瘍量を安定化させる方法であって、次の、即ち
それを必要とする対象物にリジルオキシダーゼ活性のインヒビターの効果的な量を投与する工程、それによって、対象物の転移性腫瘍量を一定の期間の時間安定化させる工程
を具える、方法。
【請求項５０】
対象物の転移性腫瘍量は、少なくとも10日、1月、3月、6月、1年、1.5年、2年、3年、4年、5年、8年、または10年の間安定化される、請求項49の方法。
【請求項５１】
製薬上の組成物であって、次の、即ち
治療上効果的な量のリジルオキシダーゼインヒビターを、随意に製薬上許容可能な不活性担体物質において具える、製薬上の組成物。
【請求項５２】
インヒビターの量は対象物においてインビボで転移性腫瘍増殖を防ぎ、または処置するのに効果的である、請求項51の製薬上の組成物。
【請求項５３】
インヒビターは抗体、小分子インヒビター、siRNA、shRNAまたはアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項51の製薬上の組成物。
【請求項５４】
インヒビターは小分子インヒビターである、請求項51の製薬上の組成物。
【請求項５５】
小分子インヒビターは低酸素性条件下に活性化されるプロドラッグである、請求項54の製薬上の組成物。
【請求項５６】
インヒビターは抗体である、請求項51の製薬上の組成物。
【請求項５７】
抗体はヒトリジルオキシダーゼ(hLOX)に特異的に結合する、請求項56の製薬上の組成物。
【請求項５８】
抗体は、ヒトリジルオキシダーゼ(hLOX)に、リジルオキシダーゼ様またはリジルオキシダーゼ関連タンパク質に対するよりも少なくとも10、100、または1000倍大きな結合親和性を伴って特異的に結合する、請求項57の製薬上の組成物。
【請求項５９】
リジルオキシダーゼ様またはリジルオキシダーゼ関連タンパク質は、LOL1、LOL2、LOL3およびLOL4からなる群より選ばれる、請求項558(58)の製薬上の組成物。
【請求項６０】
抗体は、配列番号1および13〜73からなる群より選ばれるhLOXの領域に特異的に結合する、請求項56の製薬上の組成物。
【請求項６１】
抗体は配列番号1のhLOXの領域に特異的に結合する、請求項56の製薬上の組成物。
【請求項６２】
腫瘍転移を抑制するために調剤される、請求項56の製薬上の組成物。
【請求項６３】
対象物において腫瘍転移の危険性を防ぎ、または減らす方法であって、次の、即ち
それを必要とする対象物にリジルオキシダーゼ活性のインヒビターの効果的な量、および
随意に、製薬上許容可能な担体を投与する工程、それによって、腫瘍転移の危険性を防ぎ、または減らす、防ぎ、または減らす工程
を具える、方法。
【請求項６４】
対象物は、遺伝的に癌に罹り易いか、または進行性癌の高リスクの個体である、請求項63の方法。
【請求項６５】
対象物において腫瘍増殖または転移を病期診断する方法であって、次の、即ち
対象物の腫瘍においてリジルオキシダーゼのレベルを評価する工程を具え、それによって腫瘍におけるリジルオキシダーゼレベルの対照試料との比較においての変化は転移性腫瘍増殖の存在を指し示す、方法。
【請求項６６】
リジルオキシダーゼはヒトリジルオキシダーゼ(hLOX)である、請求項65の方法。
【請求項６７】
腫瘍におけるリジルオキシダーゼレベルの対照試料との比較においての増加は転移性腫瘍増殖の存在または増加を指し示す、請求項65の方法。
【請求項６８】
対照試料は対象物の腫瘍からより一層早い時期の時間点で採取される試料、または同じ対象物からの、または別の個体からの通常の組織からの試料である、請求項65の方法。
【請求項６９】
リジルオキシダーゼのレベルは、リジルオキシダーゼ遺伝子発現のレベル、またはリジルオキシダーゼタンパク質のレベルである、請求項65の方法。
【請求項７０】
リジルオキシダーゼタンパク質は、hLOXのプレプロタンパク質、分泌されたhLOXまたは成熟したhLOXである、請求項69の方法。
【請求項７１】
リジルオキシダーゼタンパク質の腫瘍におけるレベルは、リジルオキシダーゼに対する抗体を用いて測定される、請求項69の方法。
【請求項７２】
リジルオキシダーゼのレベルは、リジルオキシダーゼの酵素活性のレベルを対象物の腫瘍において測定することによって定められる、請求項67の方法。
【請求項７３】
対象物において癌転移を診断する方法であって、次の、即ち
対象物の血液においてリジルオキシダーゼレベルを評価する工程を具え、それによって、血液におけるリジルオキシダーゼレベルの対照試料との比較においての変化は癌転移の存在又は増加を指し示す、方法。
【請求項７４】
血液におけるリジルオキシダーゼレベルの対照試料との比較においての減少は癌転移の存在又は増加を指し示す、請求項73の方法。
【請求項７５】
対照試料は対象物の血液からより一層早い時期の時間点で採取される試料、または別の個体の血液からの試料である、請求項74の方法。
【請求項７６】
リジルオキシダーゼのレベルはリジルオキシダーゼタンパク質のレベルである、請求項73の方法。
【請求項７７】
リジルオキシダーゼタンパク質は、hLOXのプレプロタンパク質、分泌されたhLOXまたは成熟したhLOXである、請求項73の方法。
【請求項７８】
リジルオキシダーゼタンパク質の血液におけるレベルは、リジルオキシダーゼに対する抗体を用いて測定される、請求項73の方法。
【請求項７９】
リジルオキシダーゼのレベルは、リジルオキシダーゼの酵素活性のレベルを対象物からの血液において測定することによって定められる、請求項73の方法。
【請求項８０】
腫瘍細胞増殖を抑制する化合物を識別する方法であって、次の、即ち
リジルオキシダーゼを候補化合物と接触させる工程、
候補化合物と接触させるときのリジルオキシダーゼの活性を定める工程、および
候補化合物で処置されるときの腫瘍の増殖を定める工程
を具え、候補化合物で、前記リジルオキシダーゼの活性が候補化合物の不存在において検出される活性と比較して減るものは、腫瘍細胞増殖を抑制する化合物として識別される、方法。
【請求項８１】
候補化合物は転移性癌細胞と低酸素性条件下に接触される、請求項80の方法。
【請求項８２】
候補化合物はペプチド、抗体、小分子インヒビター、siRNA、shRNA、またはアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項80の方法。
【請求項８３】
細胞はインビボで腫瘍増殖抑制を定めるために接触される、請求項80の方法。
【請求項８４】
腫瘍の増殖を定める工程は、ホスホFAKを候補化合物と共に、および共にでなく測定する工程を具え、それによって、リジルオキシダーゼインヒビターは更にホスホFAKにおける減少により識別される、請求項80の方法。
【請求項８５】
癌転移を処置し、又は防ぐためのキットであって、次の、即ち
リジルオキシダーゼインヒビター、および随意に製薬上許容可能な担体を具える、キット。
【請求項８６】
リジルオキシダーゼはヒトリジルオキシダーゼである、請求項85のキット。
【請求項８７】
さらに、次の、即ち
リジルオキシダーゼインヒビターがそれを必要とする対象物にどのようにして投与されるかを記載する書面での指示を具える、請求項85のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明者はジャニーンエルラーおよびアマートジアッチアである。
(関連出願への相互参照)本発明は、2006年6月20日付け出願の、“腫瘍増殖の処置およびそれに関連する診断のためのリジルオキシダーゼの抑制”と題する米国特許出願番号第11/471,033号に対して、および2006年4月27日付け出願の、“癌の防止および処置のためのリジルオキシダーゼの抑制”と題する米国仮特許出願番号第60/795,378号に対する優先権を主張する。
【０００２】
(政府支持の記述)本発明は、米国国立衛生研究所のグラント(認可)番号CA09151およびCA067166によってサポートされている。米国政府は本発明において一定の権利を持ち得る。
【０００３】
(配列表、コンピュータープログラム、またはコンパクトディスクへの言及)配列表を後に続ける。
【０００４】
(発明の背景)(発明の分野)本発明は、医学の分野、および特に癌の診断および処置に関する。とりわけ、本発明は病気進行の指標および治療上の薬剤の標的としてのリジルオキシダーゼに関する。
【０００５】
(関連した技術)(背景)リジルオキシダーゼは、細胞外マトリクス(基質)の形成にとって不可欠な酵素である。リジルオキシダーゼは、コラーゲンにおいてのペプチジルリジンおよびヒドロキシリジンの残基、およびエラスチンにおいてのペプチジルリジン残基の酸化的脱アミノ化に触媒作用を及ぼす。結果として生じるペプチジルアルデヒドは、自発的に、凝縮(短く)され、および酸化的な反応を受け、細胞外基質の通常の構造的完全性のために必要なリジンから導き出された共有結合性架橋(lysine-derivedcovalent cross-links)を形成する。リジルオキシダーゼのその基質との反応において、過酸化水素(H2O2)およびアンモニウムは、ペプチジルアルデヒド生成物と共に化学量論的な量において(in quantities stoichiometric)放出される。例えば、Kagan(カーガン)et al.(等)、J. Cell. Biochem (ジャーナル・オブ・セルラー・バイオケミストリー)88: 660-72頁(2003年)参照。
【０００６】
リジルオキシダーゼは細胞外環境中に分泌され、そこではそれが次いで機能的な30kDaの酵素および18kDaのプロペプチドへのタンパク質分解開裂によって処理される。30kDaのリジルオキシダーゼは酵素的に活性であり、その一方、50kDaのプロ酵素はそうではない。プロコラーゲンのC-プロテイナーゼ(タンパク質分解酵素)は、プロリジルオキシダーゼをその活性型にまで処理し、およびそれらは、Bmp1、Tll1およびTll2の遺伝子の生成物である。酵素の局在性は主に細胞外であるが、処理されたリジルオキシダーゼはまた細胞内に及び核に局在する。プロペプチドについてコードする配列は中程度に(60〜70%)保存され、その一方で、プロ酵素のC末端の30kDaの領域についてコードする配列は、そこで活性部位が配置され、高度に保存される(およそ95%)。Kagan et al.、J. Cell Biochem. 59: 329-38頁(1995年)参照。LOX(リジルオキシダーゼ)は、多数の増殖因子およびステロイドで、TGF-β、TNF-αおよびインターフェロン17のようなものによって誘導される。4種のLOX関連のタンパク質は識別されており、それは、すべてが205のアミノ酸のLOX触媒性領域をそれらのカルボキシ末端において含む17。これらのファミリー(族)のメンバー(構成員)は、若干の重複を構造および機能において示す17。LOXの主な活性は、細胞の外側のコラーゲンおよびエラスチンにおける特定のリジン残基の酸化であるが、それはまた、細胞内で振舞う(act)ことができ、そこでは、それは遺伝子の発現を調整し得る18,19。加えて、LOXは単球、線維芽細胞および平滑筋細胞の走化性を誘導する20-22。
【０００７】
すべての固形腫瘍は、低い酸素圧(酸素張力)(低酸素(hypoxia))の区域を含む。低酸素性の(Hypoxic、低酸素症の)細胞は大いなる問題を癌の処置において提示し、その理由は、これらの細胞が高度に攻撃的であり、転移性であり、および治療に対して耐性だからである。これらの特長に寄与する根底にある機構はよく理解されていない。転移は胸部癌(乳癌)において特定の問題を提起し、それは、検出可能な転移性胸部癌を有する受動体(患者)の大多数にとって効果的な処置がないからである4。
【０００８】
細胞外マトリクス(ECM)は、腫瘍細胞上に主要な影響を持つことができる5,6。低酸素に曝されるマウスは、リジルオキシダーゼ(LOX)活性において、ECMの形成および維持における不可欠な役割を演ずる(play)アミンオキシダーゼにおいての組織特異的増加を見せる7。最近のマイクロアレイ調査(study)は、LOXが低酸素によって誘導された遺伝子であることを多様な細胞系において確認した8。しかし、低酸素条件下のLOXの生物学的役割は識別されなかった。LOXはECMにおけるコラーゲンおよびエラスチンの共有結合性架橋結合(covalent crosslinking)を惹起し、不溶性のマトリクス(基材)堆積及び引っ張り強さが増加する9。LOX発現は、創傷治癒および通常の結合組織機能にとって不可欠であり、およびノックアウトマウスは心血管不安定のために出産後すぐに死ぬ10。減少したLOX活性は、エーラス・ダンロス症候群(Ehler-Danlos syndrome)のような病気と関係している11-13。増加したLOX活性は、線維性および組織再構築性(tissue remodeling)の病気で、肝硬変のようなものの一因になる14-16。
【０００９】
LOXの高められた発現は、腎細胞癌における病期診断の亢進(increased staging)と相関し27、および増加したLOX発現は高度な転移性および/または浸潤性(invasive)の胸部癌細胞系において観察される28,29。対照的に、LOXは、ラス形質転換された線維芽細胞の非腫瘍形成の復帰変異体(revertant)における腫瘍サプレッサー(抑止物質)として振舞う23。LOXの損失は、胃、大腸(結腸)および前立腺の癌のようないくつか(5、6くらい)の癌の種類における腫瘍形成と関係する24-26。このように、LOXの腫瘍抑止的役割は細胞の種類および形質転換状態に依存するように見える。プロペプチドのドメイン(圏域)(および活性な酵素でないもの)は、最近、腫瘍抑止物質活性の原因であることが示された(Palamakumbara(パラマクンバラ) et al., JBC(ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー) 2004年)。胸部癌において、増加したLOX発現は初期の(early)間質性の反応と関係し30、およびこの癌細胞の種類におけるアンチセンスLOXによる処置はインビトロ(試験管内)での浸潤を防ぐ29。
【００１０】
(追加の特許および出版物の引用)
(1)Kirschmann(キルシュマン), et al.の“A Molecular Role for Lysyl Oxidase in Breast Cancer Invasion(リジルオキシダーゼについての胸部癌浸潤における分子的役割)”Cancer Research(キャンサー・リサーチ)、62: 4478-4483頁(2002年)(参考文献29)はMDA-MB-231およびHs578Tの細胞にトランスフェクション(形質移入)されるLOXアンチセンスヌクレオチドがインビトロでIV型コラーゲン/ラミニン/ゼラチンのマトリクスを通して浸潤を抑制することを開示する。
(2)Payne(ペイン), et al. の“Lysyl Oxidase Regulates Breast Cancer Cell Migration and Adhesion through a Hydrogen Peroxide-Mediated Mechanism(リジルオキシダーゼは胸部癌細胞遊走および付着を過酸化水素-媒介機構を通じて調整する)”Cancer Research 65、11429-11436頁、2005年12月15日は、上記論文に関連し、および触媒的に活性なLOXがインビトロでの運動性(motility)/遊走および細胞マトリクス付着形成を調整することを開示する。
(3)Sandel(サンデル), et al. の“Merkel cell carcinoma: does tumor size or depth of invasion correlate with recurrence, metastasis, or patient survival?(メルケル細胞癌腫: 腫瘍サイズ(大きさ)または浸潤の深さは、再発、転移または患者生存と相関するか？)”Laryngoscope(ラリンゴスコープ)116(5): 791-5頁(2006年5月)は、メルケル細胞癌腫(皮膚癌(から)の転移性(形態))と診断される46名の受動体からの臨床的および組織学的な基準を相関させる遡及的調査を開示する。傾向は、腫瘍サイズまたは浸潤の深さを、局所再発(P=0.07)を伴うが、領域性再発(regional recurrence)(P=0.93およびP=0.60)または遠隔転移(P=0.16およびP=0.24)に対する相関を伴わずに比較して見出された。
(4)Tubiana(チュビアナ), et al. “Natural history of human breast cancer: recent data and clinical implications(ヒト胸部癌の自然な経過: 最近のデータおよび臨床的関連)”、Breast Cancer Res Treat.(ブレスト・キャンサー・リサーチ・アンド・トリートメント) 1991年8月、18(3): 125-40頁は、調査される場合が腫瘍のサイズおよび遠隔転移散在の可能性の間の高度に有意な相関を見せたこと、しかし、リンパの伝播のための能力が、平均して、転移の伝播のための能力よりも著しく早い時期に獲得されたことを開示する。
(5)Molnar(モリナール) et al. の“Structural and functional diversity of lysyl oxidase and the LOX-like proteins(リジルオキシダーゼおよびLOX様タンパク質の構造上および機能上の多様性)”、Biochimica et Biophysica Acta(バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ) 1647 (2003年) 220-224は、リジルオキシダーゼ(LOX)および4種のリジルオキシダーゼ様タンパク質、LOXL、LOXL2、LOXL3およびLOXL4の役割を議論する。LOXLタンパク質は、腫瘍抑止物質として振舞い得ることが示唆される。
(6)U.S.(米国)(特許)第4,997,854号のet al.へのもので、1991年3月5日付け発行の、“Anti-fibrotic agents and methods for inhibiting the activity of lysyl oxidase in-situ using adjacently positioned diamine analogue substrates(リジルオキシダーゼの活性をインサイツ(原位置)で隣接的に位置されるジアミン類似体基質を用いて抑制するための抗線維性薬剤および方法)”と題されたものは、抗線維性薬剤のクラス(部類)およびリジルオキシダーゼのインサイツでの効果的な抑制物質基質類似体としてのそれらの使用をするための方法を開示する。
(7)Farjanel(ファージャネル), et al. へのU.S.のPGPUBの第2004/0248871号で、2004年12月9日に出版され、“Use of lysyl oxidase inhibitors for cell culture and tissue engineering(リジルオキシダーゼ抑制物質の、細胞培養および組織工学のための使用)”と題するものは、リジルオキシダーゼ抑制物質の、インビトロでの細胞培養方法の履行の状況における使用を開示し、それは組織療法、または細胞療法において、あるいは実験的薬理学において、すなわちLOXを妨げることによって細胞の表現型を維持するための方法として用いることが可能である。また、ラビット(ウサギ)からの多クローン性の抗LOXおよび抗LOXL1の抗体が開示される。
(8)Erler(エルラー), et al.の“Lysyl oxidase is essential for hypoxia-induced metastasis(リジルオキシダーゼは、低酸素誘導された転移にとって不可欠である)”、Nature(ネイチャー)440, 1222-1226頁(2006年4月27日)は、本発明者によって書かれた。
(9)Erler et al.の“Hypoxia promotes invasion and metastasis of breast cancer cells by increasing lysyl oxidase expression(低酸素は、胸部癌細胞の浸潤および転移をリジルオキシダーゼ発現の増加によって増進する)”は、本発明者によってのもので、6月/17日/05年にオンラインで出版された要約である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
(発明の概要)
以下の概要は本発明のすべての特長および局面を含むことを意図せず、また、それは本発明がこの要旨において議論するすべての特長および局面を含まなければならないことを意味しない。
【００１２】
本発明は、1種の局面において、リジルオキシダーゼ(LOX)発現の調節(modulation)を含み、特に低酸素性腫瘍において、腫瘍の増殖を抑制するか、または減らし、それは一次(primary)腫瘍の増殖を含むが、しかし特に転移性の腫瘍の増殖を含む。この酵素は転移性の病気に対する新しい治療上の薬剤のための重要な標的である。
【００１３】
このように、1種の局面では、本明細書において提供するものは、転移性腫瘍増殖を対象物(対象体)においてインビボ(生体内)で抑制するか、または減らす方法であり、その必要がある対象物に、リジルオキシダーゼ活性のインヒビター(抑制物質)の効果的な量(有効量)、および随意に製薬上許容可能なキャリヤ(担体)を管理(投与)すること、それによって腫瘍増殖を抑制するか、または減らすことを具える。抑制物質は、ペプチド、抗体、薬理学上の抑制物質、siRNA、shRNAまたはアンチセンス核酸であり、それらはリジルオキシダーゼ(好ましくは、ヒトリジルオキシダーゼ)、またはリジルオキシダーゼのモジュレーター(調節物質、修飾物質)で、フィブロネクチン、プロコラーゲンC-プロテイナーゼ(またはBMP-1)、およびトロイド(tolloid)プロテイナーゼ(例は、mTLD、mTLL-1、およびmTLL-2)のようなものである。若干の具体例において、抑制物質は、小分子であり、それは概して、約500ダルトン(Daltons)より小さい分子量を持ち、BAPN(β-アミノプロプリオニトリル(aminoproprionitrile)のようなものであり、それはLOXと共にアミンおよびニトリルの基を通して共有結合を形成する。一定の具体例において、腫瘍は特定の種類のもので、例は、胸部腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、頚部(子宮頸部)腫瘍、大腸(結腸)腫瘍または頭頸部腫瘍のものである。これらの模範的な種類に関するデータは得られている。とりわけ、この方法は有用で、腫瘍が低酸素性のときであり、この条件がLOX合成を増やすからである。
【００１４】
別の局面では、本明細書において提供するものは、転移を、癌を有する対象物においてインビボで処置する方法であり、それはその必要がある対象物にリジルオキシダーゼ活性の抑制物質の効果的な量を投与すること、それによって転移を処置される対象物において抑制することを具える。
【００１５】
さらに別の局面では、本明細書において提供するものは、転移性腫瘍を有する対象物の生存の可能性を増やすか、または強化する方法であり、それは、その必要がある対象物に、リジルオキシダーゼ活性の抑制物質の効果的な量を投与すること、それによって処置される対象物の生存の可能性を増やすか、または強化することを具える。
【００１６】
さらに別の局面では、本明細書において提供するものは、腫瘍転移の危険を対象物において防ぐか、または減らす方法であり、それはその必要がある対象物に、リジルオキシダーゼ活性の抑制物質の効果的な量、および随意に製薬上許容可能な担体を投与すること、それによって腫瘍転移の危険を防ぐか、または減らすことを具える。抑制物質は、ペプチド、抗体、薬理学上の抑制物質、siRNA、shRNAまたはアンチセンス核酸であることができる。そのような予防薬(prophylactic)を必要とする対象物は、遺伝的に癌にかかり易いか、または癌の家族歴および発癌性の環境のような種々の理由のために癌に進行する高い危険性がある固体であり得る。
【００１７】
別の局面では、本明細書において提供するものは、転移性腫瘍細胞増殖を抑制する化合物を識別するための方法であり、それは、リジルオキシダーゼまたは細胞であってリジルオキシダーゼを発現しているものを、候補化合物と接触させること、およびリジルオキシダーゼの発現または活性を定めることを具え、それによって前記リジルオキシダーゼの発現または活性を、その化合物の不存在下において検出される発現または活性に比べて減らす候補化合物を、転移性腫瘍細胞増殖を抑制する化合物として識別する。特定の具体例において、化合物を、リジルオキシダーゼまたは低酸素条件の下でリジルオキシダーゼを発現する細胞と接触させる。
【００１８】
さらに、本明細書に提供するものは、転移性腫瘍に対して化学療法剤の有効性を増やす化合物を識別する方法であり、それは、リジルオキシダーゼを発現する細胞を、候補化合物と接触させることであり、そこでは、化合物はリジルオキシダーゼの発現または生物学的活性を抑制するものであり、細胞を化学療法剤と同時にか、または順次に接触させること、細胞の生存率、増殖、または転移を定めることを具え、それによって処置の不存在下において、または化合物または化学療法剤のいずれかの存在下において検出される細胞の生存率または増殖に比べて、細胞の生存率、増殖、または転移を減らす候補化合物が、転移性腫瘍に対して化学療法剤の有効性を増やす化合物として識別される。
【００１９】
さらに別の局面では、本明細書において提供するものは、化学療法剤の有効性を増やす方法であり、それは、その必要がある対象物に、リジルオキシダーゼ活性の抑制物質の効果的な量、少なくとも1種の化学療法剤との組合せで、および随意に、製薬上許容可能な担体を投与すること、それによって化学療法剤の有効性を増やすことを具える。
【００２０】
1種の局面において、本明細書に提供するものは、癌の受動体における腫瘍増殖を病期診断する方法であり、それは、リジルオキシダーゼのレベル(水準)を血液においてまたは腫瘍において評価することを具え、それによってリジルオキシダーゼレベルにおいて対照試料との比較における変化が、転移性腫瘍増殖の存在を指し示す。また、予後(前兆)マーカー(指標)を、受動体が転移性病気を持つか、またはそれを持つ危険があるとして識別することのために提供し、それは、リジルオキシダーゼおよび予後指標のようなものを用いるキットを具える。
【００２１】
また、本明細書に提供するものは、転移性腫瘍増殖の予防および処置のための治療上の組成物であり、前記組成物は、次の、即ちリジルオキシダーゼ抑制物質の治療上の活性部分の効果的な量で、製薬上許容可能な不活性な担体物質におけるものを具え、そこでは抑制物質の量は転移性腫瘍増殖を防ぎ、および処置することにおいて効果的である。
【００２２】
さらに別の局面では、本明細書において提供するものは、転移性腫瘍増殖の予防および処置のための治療上の組成物であり、前記組成物は、次の、即ちリジルオキシダーゼ抑制物質の治療上活性な部分の効果的な量で、製薬上許容可能な担体においてのもの、および少なくとも1種の化学療法剤を具え、そこでは、抑制物質の量が転移性腫瘍増殖を防ぐこと、または処置することにおける化学療法剤の有効性を増やすことにおいて効果的である。抑制物質および化学療法剤は、少なくとも1回またはそれよりも多く、任意の順序においても投与することができる。
【００２３】
本発明の方法、組成物およびキットは、対象物で、動物、哺乳類、マウスまたはラットのような齧歯動物、またはヒト(人間)のようなものについて用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
(図面の簡単な記載)「図面の簡単な説明」の項に移す。
(好適例の詳細な記載)
【００２５】
(I.定義)
他に定めない限り、本明細書において用いるすべての技術的および科学的な用語は、本発明が属する技術における通常の技量の者によって普通に理解されるのと同じ意味を持つ。本明細書において参照するすべての特許、出願、出版された出願および他の出版物は、参照することによりその全体として組み込む。この区分において述べる定義が、本明細書において参照することにより組み込まれる特許、出願、出版された出願および他の出版物において述べられる定義に反するか、またはさもなければ矛盾する場合、この区分において述べる定義は、本明細書において参照することにより組み込まれる定義に勝る。本明細書に提供する見出しは、便宜上のためだけであり、どんな形であれ本発明を制限しない。
【００２６】
本明細書において用いられるように、“a(ある1つの)”、または“an”は“少なくとも1つの”または“1つまたはそれよりも多くの”を意味する。
本明細書で用いるように、用語“抗体”は、抗原性エピトープを特異的に結合するために必要な可変領域配列を備える、単離(分離)した、または組換え結合性薬剤を意味する。したがって、抗体は任意の形態の抗体、またはそれらのフラグメント(断片)であり、それは望ましい生物学的活性、例は、特定の標的抗原の結合性を見せる。このように、それは、最も広義に用いられ、および特に、モノクローナル抗体(全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ナノボディ(微小抗体)(nanobodies)、ディアボディ(二重特異性抗体)(diabody)、多選択(特異)性(multispecific)抗体(例は二選択性(bispecific)抗体)、および抗体断片で、制限されないが、scFv、FabおよびFab2を、それらが望ましい生物学的活性を示す限り含むものをカバーする。用語“ヒト抗体”は、従って可能なヒト(人間)以外のCDR領域を除いて、ヒト起源の配列を含む抗体に言及し、およびIg分子の完全な構造が存在することを意味しないが、抗体はヒトにおいて最小の免疫原性の効果を持つ。
【００２７】
“抗体断片”は、無傷の抗体の一部分、好ましくは無傷の抗体の抗原結合性または可変性の領域を備える。抗体断片の例には、Fab、Fab’、F(ab’)2、およびFv断片; 二重特異性抗体; 線形抗体(linear antibodies)(Zapata(サパタ) et al.、Protein Eng.(プロテイン・エンジニアリング)8(10): 1057-1062頁(1995年)); 単鎖抗体分子;および多選択性抗体で、抗体断片から形成されるものが含まれる。抗体のパパイン消化は、2つの同じ抗体結合断片を生成し、“Fab”断片と称され、各々単一抗体結合部位を有し、および残りの“Fc”断片は、指定(designation)が容易に結晶化する能力を反映する。ペプシンの処置は、2つの抗原組合せ部位(antigencombining site)を持ち、および架橋結合性(cross-linking)抗原でまだあり得るF(ab’)2の断片を産生させる。
【００２８】
“Fv”は、完全な抗原-認識および-結合の部位を含む最小限の抗体断片である。この領域は、密接な、非共有結合の関係において、1種の重鎖および1種の軽鎖の可変性の領域の二量体からなる。この構成において、各々の可変性のドメインの3つのCDRSがVH-VLの二量体の表面上で抗原結合性の部位を定めるために相互作用する。集合的に、6つのCDRsは、抗体に対する抗原結合性の特異性を与える。しかし、1つの単一な可変性のドメイン(または抗原にとって特異的な3つのCDRsだけを備えるFvの半分)でさえ認識され、および抗原を結合するための能力を持つが、それは、全体的な結合性部位よりも低い親和性である。
【００２９】
“Fab”断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の最初の定常ドメイン(CH1)を含む。Fab断片は、Fab’断片と異なり、少数(フュー、3、4くらい)の残基が重鎖CH1のドメインのカルボキシ端で、抗体のヒンジ領域からの1つまたはそれよりも多くのシステインを含み、添加されることによる。本明細書においてFab’-SHは、Fabのための指定であり、そこでは、定常ドメインのシステイン残基(群)は遊離のチオール基を負う。当初にF(ab’)2抗体は、Fab’断片の対として生産され、それらはらそれらの間でヒンジのシステインを持つ。抗体断片の他の化学的な対合(カップリング)もまた知られている。
【００３０】
任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の“軽鎖”は、2種の明らかに区別される種類の1種に割り当てられ得、カッパおよびラムダと呼ばれ、それはそれらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づく。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存し、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンの5種の主なクラスがあり、即ちIgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMであり、およびこれらのいくつか(5、6くらい)は更に、サブクラス(アイソタイプ)、例はIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAおよびIgA2に分けられ得る。
【００３１】
“単鎖Fv”または“sFv”の抗体断片は抗体のVHおよびVLのドメインを備え、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖において存在する。好ましくは、Fvポリペプチドは更にVHおよびVLのドメインの間でポリペプチドリンカーを含み、それはsFvが抗原結合のために望ましい構造を形成するのを可能にする。sFvの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(単クローン性抗体の薬理学)におけるPluckthun(プルクトゥーン)、vol. 113(第113巻)、Rosenburg(ローゼンブッシュ)およびMoore(ムーア) eds.(編集)、Springer-Verlag(シュプリンガー出版)、New York(米国、ニューヨーク州)、pp. 269-315(第269〜315頁)(1994年)を参照。
【００３２】
用語“二重特異性抗体”は、2つの抗原結合性部位を有する小さな抗体断片に言及し、それは断片が、同じポリペプチド鎖(VH-VL)において軽鎖の可変性ドメイン(VL)に接続する重鎖の可変性ドメイン(VH)を備える。リンカー(連結物質)を用いることによって、それは同じ鎖上で2種のドメイン間で対形成(ペアリング)を許すにはあまりに短く、これらのドメインは、別の鎖の補足的なドメインと対形成し、および2種の抗原-結合性部位を創造することを強いられる。二重特異性抗体は、例えば、EP(欧州特許)第404,097号(明細書)、WO(国際公開) 第93/11161号(パンフレット)、およびHollinger(ホリンガー) et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA(プロセーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ)、90:6444-6448 (1993年)において、より一層十分に記述される。
【００３３】
“分離した”抗体は、その自然な環境の成分から、識別され、および分けられ、および/または回収されたものである。その自然な環境の汚染物質成分は、抗体についての診断上または治療上の使用を妨げる物質であり、および酵素、ホルモン類、および他のタンパク質性または非タンパク性の溶質を含み得る。好適例において、抗体は、(1)Lowry(ローリー)法によって定められるような抗体の重量によって95%よりも高く、および最も好ましくは99重量%よりも高くにまで、(2)回転性カップシーケネイター(配列決定装置)(spinning cup sequenator)の使用によってＮ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも15個の残基を得るのに十分な程度にまで、または(3)クーマシーブルーまたは、好ましくは銀染色を用いて還元性、または非還元性条件の下でのSDS-PAGEによる均質性にまで、精製される。分離された抗体は、抗体をインサイツで組換え細胞内に含み、それは少なくとも1種の成分の抗体の自然な環境が存在しないからである。普通に、しかし、分離された抗体は、少なくとも1種の精製工程によって調製される。
【００３４】
抗体が、特定のポリペプチドに、または特定のポリペプチド上のエピトープに“特異的に結合し”、またはそれに “とって特異的”であることは、それがその特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合し、任意の他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープには実質結合しないものである。好ましくは、本発明に従う抗体は、ヒトのLOX(配列番号8、9または10のhLOXのようなもの)に、100nMに等しい、またはそれよりも低い解離定数Kd、随意には10nMよりも低く、随意に1nMより低く、随意に0.5nMより低く、随意に0.1nMより低く、随意に0.01nMより低く、または随意には0.005nMよりも低くで、モノクローナル抗体、scFv、Fabの形態、または約4℃、25℃、37℃または42℃の温度で測定される抗体の他の形態において特異的に結合する。
【００３５】
随意には、本発明に従う抗体は、特異的に、および選択的にヒトリジルオキシダーゼ(hLOX)に結合し、即ちより一層高い結合親和性を、他のリジルオキシダーゼ様、またはリジルオキシダーゼ関連のタンパク質への結合親和性よりも、好ましくは10倍、より一層好ましくは少なくとも100倍、および最も好ましくは少なくとも1000倍より高いものを持つ(例は、LOL1、LOL2、LOL3およびLOL4; Molnar(モリナール)et al. (2003年)Biochim Biophys. Acta.(バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ)、1647: 220-224参照)。好ましくは、抗体は、配列番号1および配列番号13〜73からなる群より選ばれるhLOXの領域におけるエピトープに特異的に結合する。随意に、抗体は、配列番号1の領域で、配列番号13〜73からなる群より選ばれる領域のようなもの以外のhLOXの領域におけるエピトープに特異的に結合する。
【００３６】
随意に、本発明に従う抗体は、特異的に、および選択的にヒトLOL1に結合し、即ち、より一層高い結合親和性を、hLOXおよび他のリジルオキシダーゼ様またはリジルオキシダーゼ関連のタンパク質に対する結合親和性よりも、好ましくは10倍、より一層好ましくは少なくとも100倍、および最も好ましくは少なくとも1000倍よりも高いものを持つ(例は、LOL2、LOL3、およびLOL4; Molnar et al. (2003) Biochim Biophys. Acta. 1647:220-224参照)。
【００３７】
随意に、本発明に従う抗体は、特異的に、および選択的にヒトLOL2に結合し、即ち、より一層高い結合親和性を、hLOXおよび他のリジルオキシダーゼ様またはリジルオキシダーゼ関連のタンパク質に対する結合親和性よりも、好ましくは10倍、より一層好ましくは少なくとも100倍、および最も好ましくは少なくとも1000倍よりも高いものを持つ(例は、LOL1、LOL3、およびLOL4; Molnar et al. (2003) Biochim Biophys. Acta. 1647:220-224参照)。
【００３８】
随意に、本発明に従う抗体は、特異的に、および選択的にヒトLOL3に結合し、即ち、より一層高い結合親和性を、hLOXおよび他のリジルオキシダーゼ様またはリジルオキシダーゼ関連のタンパク質に対する結合親和性よりも、好ましくは10倍、より一層好ましくは少なくとも100倍、および最も好ましくは少なくとも1000倍よりも高いものを持つ(例は、LOL1、LOL2、およびLOL4; Molnar et al. (2003) Biochim Biophys. Acta. 1647:220-224参照)。
【００３９】
随意に、本発明に従う抗体は、特異的に、および選択的にヒトLOL4に結合し、即ち、より一層高い結合親和性を、hLOXおよび他のリジルオキシダーゼ様またはリジルオキシダーゼ関連のタンパク質に対する結合親和性よりも、好ましくは10倍、より一層好ましくは少なくとも100倍、および最も好ましくは少なくとも1000倍よりも高いものを持つ(例は、LOL1、LOL2、およびLOL3; Molnar et al. (2003) Biochim Biophys. Acta. 1647:220-224参照)。
【００４０】
用語“抗癌性薬剤”は、化学的化合物、生物学的薬剤(例は、抗体)または電磁放射(特に、Ｘ線)を意味し、それは、腫瘍の増殖または転移を調節することが可能である。これらには、例は、ブスルファンのようなアルキル化薬剤、配位金属錯体(カルボプラチン、オキサリプラチン、およびシスプラチンのようなもの)、シクロホスファミド(シトキサン、cytoxan)、ダカルバジン、イホスファミド、メクロレタミン(mustargen、ムスタルゲン)およびメルファラン、ならびに4つのカーボンアルキル鎖の反対側に付着する2つの不安定な(labile)メタンスルホン酸基を持つ化合物が含まれる。他の例は、非ステロイド性のアロマターゼ抑制物質および免疫療法の薬剤、即ち悪性に関係するタンパク質を生産する癌細胞を標的とする抗体または抗体断片である。模範的免疫療法の薬剤はハーセプチン(Herceptin)が含まれ、それはHER2またはHER2/neu(ノイ)を標的とし、それは約25パーセントから30パーセントの胸部癌において高い数で発生し、および抗CD20を標的とし、B細胞リンパ腫においてアポトーシスの引き金となる(triggers)。付加的な免疫療法の薬剤には、免疫毒素が含まれ、そこでは、リシン、ジフテリア毒素およびシュードモナス毒素のような毒素分子が腫瘍特異性抗原を認識する抗体に共役される。共役は、生化学的に、または組換えDNA法を介して達成することができる。他の例には、ニトロソ尿素(nitrosurea, nitrosourea)の化合物が含まれ、それらは、それらが脳腫瘍を処置するのに用いられるように脳にトラベルする(旅する)ことができる。また、代謝拮抗物質が含まれ、それには、5-フルオロウラシル、メトトレキサート、ゲムシタビン(GEMZAR(商標、ジェムザール))、シタラビン(Ara-C)、およびフルダラビン、および抗腫瘍性抗生物質で、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン(Adriamycin(商標)、アドリアマイシン)、およびイダルビシンのようなものが含まれる。また、タキサンのような分裂抑制物質で、パクリタキセルおよびドセタキセルのようなもの、エポシロン、エトポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンが含まれる。用語“抗癌性薬剤”はまた化学療法剤も含み、見出し“併用療法(Combination therapy)”の下に後述する。用語抗癌性薬剤はまた、細胞において低酸素性を減らす物質での処置を含み、そのとき、そのような薬剤はLOX抑制と共に組み合わされる。そのような物質には、例は、p53を含み得る。Matoba(マトバ) et al.の、“p53 Regulates Mitochondrial Respiration(p53はミトコンドリア呼吸を調整する)”、Science(サイエンス) 2006年6月16日312: 1650-1653、2006年5月24日にオンラインで出版され、および本明細書に参考文献を引用した。LOXがこの場合上方調節されない限り、呼吸経路に向けて、および解糖系から離れて、癌細胞を導き出す物質が、LOX抑制物質と共に有利に用いられる。
【００４１】
本明細書で用いるように、“処置する”または“処置”は、未制御の転移性腫瘍増殖と関連した徴候の発達の先送り(postponement of development)、および/または発達するのを期待されるであろうか、または期待されるそのような徴候の重症度における減少を意味する。これらの用語は更に、既存の未抑制の、または望まれていない転移性腫瘍増殖関連の徴候を改善させること、追加の徴候を防ぐこと、および徴候の根底にある代謝原因を改善または防ぐことを含む。このように、用語は、有益な結果が、転移関係の病気または徴候を有するか、またはそのような転移性の病気または徴候を発達させる可能性(ポテンシャル)を有する哺乳類の対象物上に与えられていることを表示する。とりわけ、用語は転移性腫瘍形成を防ぎ、および/または存在する転移性腫瘍を抑制し、または殺す組成物の投与を含み、結果として生じる臨床的な利益を有する。このように、用語“転移性腫瘍増殖”は、転移性腫瘍、即ち一次腫瘍の部位から伝播された腫瘍の確立および増殖を意味する。
【００４２】
本明細書に用いるように、用語“リジルオキシダーゼ”は、以下の反応を触媒する酵素に言及し、即ちペプチジル-L-リジル-ペプチド+O2+H2O→ペプチジル-アライシル(allysyl)-ペプチド+NH3+H2O2LOである。リジルオキシダーゼ(EC(酵素番号)1.4.3.13)についての他の類義語には、プロテイン(タンパク質)-リジン6-オキシダーゼおよびプロテイン-L-リジン、即ちオキシゲン(酸素)6-酸化還元酵素(脱アミノ化)が含まれる。例えば、Harris(ハリス)et al.の、Biochim. Biophys. Acta 341:332-44 (1974年)、Rayton(レートン) et al.の、J. Biol. Chem.(ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー) 254:621-26 (1979年)、Stassen(スタッセン)の、Biophys. Acta(バイオフィジカ・アクタ) 438:49-60 (1976年)参照。銅含有キノプロテイン(quinoprotein)で、その活性中心でのチロシルキノンのリジル付加物(lysyl adduct)を有するもの、LOは、ペプチジルアルファ-アミノアジピン酸(aminoadipic)-デルタ-セミアルデヒドの形成を招く(result in)ために、ペプチジルリジンの酸化を触媒する。一旦形成されれば、このセミアルデヒドは隣接するアルデヒドと共に、または鎖内および鎖間の架橋結合を形成するために他のリジル基と共に自発的に凝縮することができる。例えば、Rucker(ラッカー) et al.の、Am. J. Clin. Nutr.(アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション) 67:996S-1002S (1998年)参照。“LOX”は、以下の配列の1種から発現または翻訳されるポリペプチドと実質同じアミノ酸配列を持つ酵素であり、即ちEMBL/GenBank(ジェンバンク)目録、即ちM94054; AAA59525.1 -- mRNA; S45875; AAB23549.1 - mRNA; S78694; AAB21243.1 - mRNA; AF039291; AAD02130.1 - mRNA; BC074820; AAH74820.1 - mRNA; BC074872; AAH74872.1 - mRNA; M84150; AAA59541.1 -- ゲノムDNAである。LOXの好ましい具体例は、ヒトのリジルオキシダーゼ(hLOX)プレプロタンパク質であり、アミノ酸配列(配列番号8、図1D)を持ち、配列番号11(図1E)のそのmRNAを有し、および配列番号12(図1F)のエンコーディング(暗号化)DNA、配列番号9(図1D)のようなシグナルペプチドの開裂後の分泌されたhLOXまたは配列番号10(図1D)のようなタンパク質分解処理の後の成熟したhLOXである。
【００４３】
若干の具体例において、リジルオキシダーゼ酵素は、リジルオキシダーゼ様酵素であり、例えば、Molnar et al., Biochim Biophys Acta. 1647:220-24 (2003)によって記述されるようなものである。これらの酵素には、LOXL1で、GenBank/EMBLのBC015090にて受託されるmRNAによって暗号化(コード化)されるもの、AAH15090.1、LOXL2で、GenBank/EMBLのU89942にて受託されるmRNAによってコード化されるもの、LOXL3で、GenBank/EMBLのAF282619にて受託されるmRNAによってコード化されるもの、AAK51671.1、およびLOXL4で、GenBank/EMBLのAF338441にて受託されるmRNAによってコード化されるもの、AAK71934.1が含まれる。
【００４４】
“リジルオキシダーゼ”またはLOXはまた、まだ実質的に、リジル残基の脱アミノ化を触媒するその酵素活性を保持する機能的な断片または派生物(derivative、誘導体)を包含する。典型的に、機能的な断片または派生物は、そのリジル酸化活性の少なくとも50%を保持する。好ましくは、機能的な断片または派生物は、そのリジル酸化活性の少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、99%または100%を保持する。また、リジルオキシダーゼがその活性を実質的には変えない保存されたアミノ酸置換を含むことができることは意図される。アミノ酸の適切な保存置換は、本技術における熟練の者に既知であり、および一般に、結果として生じる分子の生物学的活性を変えることなく作成され得る。本技術における熟練の者は、概して、ポリペプチドの必須でない領域の単一のアミノ酸置換が生物学的活性を実質的に変えないことを認識する。例えば、Watson(ワトソン)、et al.の、Molecular Biology of the Gene(遺伝子の分子生物学)、4th Edition、1987年、The Benjamin(ザ・ベンジャミン)/Cummings(カミングス) Pub. Co.(出版社)、p. 224参照。
【００４５】
“リジルオキシダーゼ活性の抑制物質”は、直接的または間接的にリジルオキシダーゼの活性、制限されないが、遺伝子発現、翻訳後修飾、酵素的な処理または開裂、リジルオキシダーゼのモジュレーター(調節物質)またはリジルオキシダーゼ酵素活性への結合を含むものを抑制する任意の薬剤であることができる。抑制物質は、ペプチド、抗体、薬理学的抑制物質、siRNA、shRNAまたはリジルオキシダーゼ(好ましくはヒトリジルオキシダーゼ)を抑制するアンチセンス核酸、またはリジルオキシダーゼのモジュレーターで、フィブロネクチン、プロコラーゲンC-プロテイナーゼ(またはBMP-1)、およびトロイドプロテイナーゼ(例は、mTLD、mTLL-1、およびmTLL-2)であり得る。
【００４６】
用語“転移”は、ホスト(宿主)組織に侵入し、遠位の、特定の器官部位に転移することが多いそのための腫瘍細胞の能力を意味する。既知のように、これは致死的腫瘍増殖の突出した特長である。転移の形成は、腫瘍細胞並びに正常な宿主組織および細胞の間の複雑な一連の独特な相互作用を介して起こる。本発明の状況においては、リジルオキシダーゼ活性は、腫瘍の転移性増殖、即ち転移の、特に低酸素条件の下での増殖において重要である。低酸素の腫瘍はまた、最も攻撃的であり、および伝統的な化学療法に耐性であるので、リジルオキシダーゼ発現および/または機能を調整する薬剤は、転移性腫瘍、特に化学療法剤耐性腫瘍に対して新規な治療法を提供する。“転移”は浸潤から区別される。“癌の一連の理解(Understanding Cancer Series): 癌”http://www.cancer.gov/cancertopics/understandingcancer/cancer
において記述されるように、浸潤は、癌細胞による隣接する組織中への直接的な遊走および浸透に言及する。
【００４７】
用語“製薬上許容可能な担体”は、安定化、可溶化、およびさもなければ、ヒトを含む、生きている動物に投与される活性な原材料と混合するのに用いる調剤物を含むことを意図する。これには、任意のおよびすべての溶媒、分散媒体(メディア)、コーティング(被膜)、抗菌性のおよび抗真菌性の薬剤、等張性および吸収遅延の薬剤、同様の他のものが含まれ、製薬上の投与と適合する。製薬上活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、この技術においてよく知られている。例えば、Remington(レミントン): The Science and Practice of Pharmacy(薬学の科学および実践) 20th Ed.(第20版) (Lippincott, Williams & Wilkins(リッピンコット、ウィリアムス・アンド・ウィルキンズ) 2003年)参照。任意の慣習的な媒体または薬剤でも活性化合物と不適合である限りは除いて、組成物におけるそのような使用は考慮される。
【００４８】
本明細書で用いるように、用語“小分子干渉(small interfering)RNA”(“siRNA”)または“低分子干渉(short interfering)RNA”は、RNA干渉を指向するか、または媒介することが可能な約10-50のヌクレオチド(またはヌクレオチド類似物)の間のものを備えるRNA(またはRNA類似物)に言及する。本明細書で用いるように、“shRNA”はsiRNAから区別されるべきである。Hannon(ハノン)et al.、“Unlocking the potential of the human genome with RNA interference(ヒトゲノムの可能性のRNA干渉を用いる解除)”、Nature 431, 371-378 (2004年9月16日)において記載されるように、shRNAは、RNAポリメラーゼIIまたはIIIのプロモーターから低分子ヘアピン型RNAs(shRNAs)の形態におけるmiRNAsの模擬体の発現に関与する。shRNAsは、典型的に19から29までの長さのヌクレオチドに及び、および自然なmiRNAsへの構造類似性の種々の程度を有する基部(stems)を持つ。これらの引き金はDNAベクターによって暗号化されるので、それらは、細胞に対し、異所性(ectopic)mRNA発現を許すDNA構築物の配送のために工夫されている任意の無数のやり方において配送することができる。これらは、レトロウイルスからアデノウイルスにまで及ぶウイルスを用いる標準的な一過性の形質移入、安定な形質移入および配送を含む。各々のshRNA発現構築物は、単一のsiRNAを生じさせる。
【００４９】
重要なことに、shRNAは、shRNAがノックダウンの安定した形態を招くという点でsiRNAと異なる。さらに、Robbins(ロビンス) et al.、“Stable expression of shRNAs in human CD34+ progenitor cells can avoid induction of interferon responses to siRNAs in vitro(ヒトCD34+前駆細胞におけるshRNAsの安定な発現はsiRNAsに対するインビトロでのインターフェロン反応の誘導を避けることができる)”、 Nature Biotechnology(ネイチャー・バイオテクノロジー) 24, 566 - 571 (2006年)で記述されるように、免疫賦活性の効果は、脂質-配送されたsiRNAsを用いて見出すことができるが、Pol IIIプロモーターで発現されたshRNAsにおいて見出されない。
【００５０】
shRNAベクターは商業上入手可能であり、例は、OriGene Technologies Inc.(オリジーン・テクノロジーズ社)からである。オリジーン(Origene)ベクターは、HuSH pRSプラスミドベクターに基づくもので、それはピューロマイシンマーカーおよびU6-shRNA発現カセットの側面に位置するMoloney(モロニー)マウス白血病ウイルス(MMLV)の双方の5および3のLTRsを含む。パッケージング(包装)細胞系へのプラスミドの一過性の形質移入により、複製欠損性ウイルスを得ることができ、および感染した標的細胞に対して用いられる。ピューロマイシン-N-アセチル転移酵素遺伝子はSV40初期プロモーターの下流に配置され、抗生物質ピューロマイシンの選別に対する耐性を招く。shRNA発現カセットは、21bpの標的遺伝子特異的配列、10bpのループ、および別の21bpの逆位の相補的な配列、すべてヒトU6プロモーターの下のものからなる。終止配列は、転写をRNA pol IIIによって終了させるために、第2の21bpの逆位の相補的な配列のすぐに下流に配置される。21bpの遺伝子特異的な配列は、標的遺伝子に対するその相手(match)を確実にするために、配列確認される(sequence-verif)。
【００５１】
本明細書で用いるように、用語“対象物”は、哺乳類の対象物を意味する。模範的な対象物には、制限されないが、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ネズミ(ラット)、ウシ(カウ)、ウマ、ヤギおよびヒツジ(シープ)が含まれる。若干の具体例において、対象物は癌を持ち、および後述するように本発明に従う薬剤を用いて処置されることができる。
【００５２】
本明細書に用いるように、用語“治療上効果的な量”または“効果的な量”は、抑制物質の量に言及し、それは、単独で、または付加的な治療上の薬剤との組合せで、細胞、組織または対象物に対して投与するとき、腫瘍関係の病的条件または病気の進行を防ぐか、または寛解させるのに効果的なものである。治療上効果的用量は更に、症状の寛解、例は、関連した病状の処置、治癒、予防または寛解、またはそのような条件の処置、治癒、予防または寛解の比率における増加を招くのに十分な化合物のその量に言及する。単独で投与される個々の活性原材料に対して適用されるとき、治療上効果的な用量は、単独でその原材料に言及する。組合せに対して適用されるとき、治療上有効な用量は、組合せにおいて、連続的に、または同時に投与されるかどうかに関係なく、治療上の効果を招く活性原材料の組み合わせられた量に言及する。例えば、LOX抗体のインビボでの投与が採用されるとき、投与の経路に依存して、正常な投薬量総計は、1日当り、約10ng/kgから最高100mg/kgの哺乳類体重またはそれより多くまで変動し得、好ましくは約1μg/kg/日から50mg/kg/日まで、随意に約100μg/kg/日から20mg/kg/日まで、500μg/kg/日から10mg/kg/日まで、または1mg/kg/日から10mg/kg/日までである。
【００５３】
用語“実質同じ”は、第1のアミノ酸配列の間での同一性を意味し、それは、アミノ酸残基の十分であるか、または最小限の数を含み、それらは、i)同じか、またはii)第1および第2のアミノ酸配列が共通の構造的ドメインおよび/または共通の機能的な活性を持つことができるように、整列された(aligned)アミノ酸残基の第2のアミノ酸配列における保存的な置換である。例えば、共通の構造的なドメインを含むアミノ酸配列は、少なくとも約60%、または65%の同一性を持ち、おそらく75%の同一性、より一層ありそうなものでは85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%のLOX、LOXL-2またはLOXL-4に対する同一性が十分に、または実質的に同一であると称される。ヌクレオチド配列の状況では、用語“実質同じ”は、本明細書において、第1の核酸配列に言及するために用い、それは、ヌクレオチドの十分であるか、または最小限の数を含み、それらは、第1および第2のヌクレオチド配列が、共通の機能的な活性を持つポリペプチドを暗号化するか、共通の構造的なポリペプチドドメインまたは共通の機能的なポリペプチド活性を暗号化するように、整列されたヌクレオチドに対して第2の核酸配列において同じである。例えば、ヌクレオチド配列は、少なくとも約60%、または65%の同一性を持ち、おそらく75%の同一性、より一層ありそうなものでは85%、90%.、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の本明細書において与える核酸の配列番号類に対して同一性のものが実質同一と称される。
(II. 一般化された方法および機器)
【００５４】
本発明を次に、(A)リジルオキシダーゼ(LOX)抑制物質の識別、(B)LOX抑制性組成物、(C)処置および診断の方法の局面に関して、特に説明する。
(A. リジルオキシダーゼ抑制物質の識別)
【００５５】
本明細書において転移性腫瘍細胞増殖を抑制する化合物を識別するための方法を提供し、それは、リジルオキシダーゼまたはリジルオキシダーゼを発現する細胞を、候補化合物と接触させること、およびリジルオキシダーゼの発現または活性を定めることを具え、それによって、候補化合物であって、前記リジルオキシダーゼの発現または活性を、化合物の不存在において検出される発現または活性に比べて減らすものを、転移性腫瘍細胞増殖を抑制する化合物として識別する。特定の具体例において、化合物は、リジルオキシダーゼまたはリジルオキシダーゼを発現する細胞と低酸素条件の下で接触させる。
【００５６】
また、本明細書において化合物を識別するための方法を提供し、その化合物は化学療法剤の有効性を増加させるものであり、その方法は、リジルオキシダーゼまたはリジルオキシダーゼを発現する細胞と候補化合物とを接触させること、およびリジルオキシダーゼの発現または活性を定めることを具え、それによって、候補化合物であって、前記リジルオキシダーゼの発現または活性を、化合物の不存在において検出される発現または活性に比べて減らすものを、転移性腫瘍細胞増殖を抑制することまたは減少させることにおいて化学療法剤の有効性を増加させる化合物として識別する。
【００５７】
リジルオキシダーゼの任意の適切な供給源は、本発明に従う方法における抑制物質の標的として採用し得る。酵素は導き出され、単離され、またはこの技術において既知の任意の供給源から、酵母、微生物(microbial)、および哺乳類を含めて、組換えにより生成させるることができ、それは検出可能な薬剤を生じさせることができ、または適切なアッセイにおいて生物学的に活性である適切な生成物の産生を許す。1種の具体例において、リジルオキシダーゼは、ヒト、ウシ属のもの(bovine)、または他の哺乳類の起源である。例えば、Williams, et al., Anal. Biochem.(アナリティカル・バイオケミストリー) 113:336 (1985年); Kirschmann et al., 上記(supra); Cancer Res. 62:4478-83 (2002)参照、LOXは、登録(Accession)番号NP002308(プレタンパク質配列、配列番号8)、登録番号NM02317(mRNA配列番号11)から得られ得る。まだ実質的に、リジルオキシダーゼの酸化を触媒するその酵素の活性を保持するリジルオキシダーゼの機能的な断片または派生物も用いることができる。リジルオキシダーゼ酵素は、時にプレプロタンパク質、プロタンパク質、タンパク質、またはその生物学的に活性な断片であることができる。例えば、リジルオキシダーゼは、ヒトリジルオキシダーゼのプレプロタンパク質の断片であり得(hLOX、配列番号8)、Cys21-Ala22部位(図1Dで強調されるもの)でのhLOXの分泌された形態のもの(例は、配列番号9)のようなものでN末端シグナルペプチドの開裂の、またはhLOXの成熟した形態(例は、配列番号10)を招くためにGly168-Asp169-Asp170の部位(図1Dで強調されるもの)でのプロコラーゲンC-プロテイナーゼによる開裂の結果としてのものである。
【００５８】
リジルオキシダーゼの酵素活性は、任意の適切な方法によって評価することができる。リジルオキシダーゼ活性を評価する模範的な方法には、Trackman(トラックマン) et al., Anal. Biochem. 113:336-342 (1981)、Kagan, et al., Methods Enzymol.(メソッヅ・イン・エンザイモロジー) 82A:637-49 (1982年)、Palamakumbura(パラマクンブラ) et al., Anal. Biochem. 300:245-51 (2002)、Albini(アルビーニ) et al., Cancer Res. 47: 3239-45 (1987)、Kamath(カマス) et al, Cancer Res. 61:5933-40 (2001)、US 特許第4,997,854号、およびUS 特許出願第2004/0248871号で前に引用したものが含まれる。例えば、リジルオキシダーゼの酵素活性は、“リジルオキシダーゼ副産物”で、H2O2生産、コラーゲンピリジニウム残基アンモニウム(collagen pyridinium residuesammonium)生産、アルデヒド生成物の生産、リジル酸化、デオキシピリジノリン(Dpd)のようなものを検出および/または定量することによって評価することができる-下記に議論する。また、あるものは、インビトロでの細胞浸潤性能力、細胞性接着およびインビトロでの増殖、およびインビボでの転移性増殖を検出し、および定量化し得る。インビボでのモデルには、制限されないが、適切な同系の(syngeneic)モデル、ヒト腫瘍異種移植片(xenograft)モデル、正所性モデル、転移性モデル、トランスジェニック(遺伝子導入)モデル、および遺伝子ノックアウトモデルが含まれる。例は、Teicher(タイシャー)、Tumors Models in Cancer Research(癌研究における腫瘍モデル) (Humana Press(ヒュマーナ・プレス) 2001年)参照。
【００５９】
低酸素条件は、誘導し、または自然に発生させることができる。低酸素区域は、固形腫瘍の内側部分でしばしば発生する。低酸素性はまた、インビボで、特に実験的な動物モデルにおいて、腫瘍に対する動脈血流の縮小(diminution)または休止(cessation)または血管収縮性化合物の投与を用いて誘導することもできる。例は、米国特許第5,646,185号参照。模範的な血管収縮性化合物には、アドレナリン作動性の直接的および間接的なアゴニスト(作用薬)で、ノルエピネフリン、エピネフリン、フェニレフリン、およびコカインのようなものが含まれる。対象物において存在する固形腫瘍における低酸素領域の存在は、核磁気共鳴(NMR)および酸素電極pO2ヒストグラフィ(組織描写)を含め、この技術において現在既知の多数の方法によって観察することができる。そのような方法は、本発明に従う状況において用い得(下記のように)、低酸素性処置の標的領域を識別するため、およびそのような領域に対する処置組成物の投与における案内をするためである。インビトロでの、低酸素条件は、任意の適切な方法を用いて誘導することができる。例えば、細胞は、無酸素性(anoxic)(<0.1%のO2)条件の下で37℃での嫌気性(anaerobic)チャンバー(室)内で、または低酸素(1から2までの%のO2)条件の下で37℃での、5%のCO2を充填され、および1から2までの%のO2がN2と釣り合わされたモジュラーインキュベーター(温置装置)内で維持することができる。例は、Erler et al., Mol. Cell. Biol. 24:2875-89 (2004年)参照。
【００６０】
本発明に従うスクリーニング(選別)方法は、FAKレベルを測定するステップ(工程)も含み得る。後述するように、FAK(Focal Adhesion Kinase、接着斑キナーゼ[p125FAK])は、細胞運動性プロセス(処理)の一部として活性化される。LOXがshRNAを用いて抑制されたとき、FAKのリン酸化は低酸素条件の下で増加しない。これは、方法(Methods)の項において記載するように、抗-リン酸-FAK抗体を用いて検出することができる。化合物選別性のアッセイでは、第2の工程は、試験化合物の添加を伴って、および伴わないでの双方でリン酸FAKレベルの検出を含み得る。LOXを抑制する試験化合物はまたリン酸FAKのレベルも減らす。
【００６１】
化合物が、発現または活性またはリジルオキシダーゼ(リジルオキシダーゼの発現または活性)を、化合物の不存在において観察されるものに関(と比較)して減らすとき、化合物は、リジルオキシダーゼの発現または生物学的活性の抑制物質である。1種の具体例において、化合物はリジルオキシダーゼの抑制物質であり、それは、化合物が転移の発生率を、化合物の不存在において観察されるものに関して減らし、および更なる試験において、転移性腫瘍の増殖を抑制するときである。腫瘍の抑制は任意の慣習的な方法の測定を用いて定量化することができる。転移の発生率は、相対的な散在(relative dissemination)(例は、関与する器官系の数)および相対的な腫瘍量(tumor burden)をこれらの部位において検査することによって評価することができる。適切であるように、転移性増殖は、微視的または巨視的な分析によって確かめることができる。腫瘍転移は、約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%またはそれよりも多くだけ減らすことができる。若干の具体例において、化合物は、リジルオキシダーゼの発現または生物学的活性に影響力を与えない他の化合物に関して評価することができる。試験化合物は、腫瘍接種の時点で、一次腫瘍増殖の確立の後、または局所的および/または遠隔転移の確率の後に、投与することができる。試験化合物の単一の、または多重の投与は、任意の慣習的なモード(様態)の投与で、制限されないが静脈内、腹腔内、腫瘍内、皮下、および皮内を含むものを用いて与えることができる。
【００６２】
また、動物、例は、イヌおよび齧歯動物において、転移性腫瘍の予防または処置のために効果的であると定められる化合物は、ヒトにおける腫瘍の処置において有用であり得る。ヒトにおいて腫瘍を処置する技術の熟練者(当業者)は、動物の調査において得られるデータに基づいて、ヒトに対する化合物の投与の投薬量および経路を知る。概して、体表面積について整えるとき、ヒトにおける投与の投薬量および経路は動物におけるものと似ていると期待される。
【００６３】
1種の具体例において、リジルオキシダーゼ発現はプロモーター分析を用いて評価される。プロモーター活性分析のための任意の便利なシステム(系)でも採用することができる。典型的に、リポーター遺伝子系は、プロモーター活性がリポーター分子の発現を招くように、リポーター分子に付着するリジルオキシダーゼプロモーターを用いてプロモーター活性が検出されるのを許す。例は、Ausubel(オースベル) et al., Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学におけるカレントプロトコルズ(手順))(John Wiley & Sons(ジョン・ウィリー・アンド・サンズ)、current edition(現行版)第9.6章、参照。普通に用いられるリポーター分子には、CAT、ベータ-ガラクトシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ(発光酵素)、および緑色蛍光タンパク質が含まれる。ベクターは入手可能であり、それは、興味のあるプロモーターを挿入することができる制限部位に隣接してリポーター遺伝子および哺乳類のプロセシング(処理)シグナル(信号)を含む。通常、リジルオキシダーゼプロモーターを含むベクターを、標的細胞中に一時的に形質移入する。しかし、それは、本明細書に説明するように、安定して発現させることができる。リジルオキシダーゼプロモーター活性は、誘導され、または構成的であることができる。模範的なリジルオキシダーゼプロモーター配列は、Csiszar(シスザール) et al., Mol. Biol. Rep.(モレキュラー・バイオロジー・レポーツ) 23:97-108 (1996年)において開示される。LOXプロモーター配列についての知識は、LOX発現を抑制するためにこの配列上に作用する薬物の使用を可能にする。例えば、以下に示すように、HIFはLOX発現がそれに依存する転写因子である。LOXプロモーター部位は、DNA結合性薬物で、アンチセンスDNAのようなものによってブロック(阻止)され得る。リジルオキシダーゼプロモーターは、双方の陽性(正)および陰性(負)のシス作用性(cis-acting)要素を持ち、更に活性化性化合物の使用を可能にし、それは陰性の作用性プロモーター要素に結合する。Jourdan-Le Saux(ジュールダン-ル・ソー) et al. “Functional analysis of the lysyl oxidase promoter in myofibroblast-like clones of 3T6 fibroblast(3T6線維芽細胞の筋線維芽細胞におけるリジルオキシダーゼプロモーターの機能的分析)”、J. Cell Biochem. 1997年2月、64(2):328-41、参照。
【００６４】
また、LOXはそのmRNAの分解によって抑制され得る。遺伝子調整のこの形態へのアプローチ(取組み)は、Wilson(ウィルソン)et al.,  “Modulation of LDL receptor mRNA stability by phorbol esters in human liver cell culture models(ヒト肝細胞におけるホルボールエステルによるLDL受容体mRNAの安定性の調節)”、Lipid Res.(ジャーナル・オブ・リピッド・リサーチ) 38, 437-446 (1997年)において記載される。
【００６５】
リジルオキシダーゼを発現する任意の適切な細胞でも、本発明に従う方法と共に採用され得る。本明細書で用いるように、用語“細胞”は、生物学的な細胞(例はHeLa(ヒーラ))を含む。細胞は、ヒトのものであるか、または非ヒトのものであり得る。細胞は、新しく分離することができ(即ち、一次的な)、または短期-、または長期の樹立した細胞系から導き出すことができる。模範的な生物学的細胞系には、MDA-MB 231ヒト胸部癌細胞、MDA-MB 435ヒト胸部癌細胞、U-87 MG神経膠腫、SCL1扁平上皮癌腫細胞、CEM、HeLa上皮癌腫、およびChinese(チャイニーズ)ハムスター卵巣(CHO)細胞が含まれる。そのような細胞系は、例えば、American Type Culture Collection(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション)(ATCC、ロックビル、MD(米国メリーランド州))のCell Line Catalog(細胞系カタログ)において記述される。
【００６６】
細胞は、内因的に、または外因的に(例は、遺伝子の安定な移行の結果として)、リジルオキシダーゼまたはそのプロモーターを発現することができる。本明細書で提供するように、細胞による内因的な発現は、内在性遺伝子の構成的な、または誘導される発現から結果として生じることができる。
【００６７】
本明細書で提供するように、細胞による外因性の発現は、リジルオキシダーゼをコード化(暗号化)する核酸配列またはその生物学的に活性な断片、またはリジルオキシダーゼプロモーター核酸配列の導入から結果として生じることができる。形質転換は、この技術において既知のウイルスベクター、リン酸カルシウム、DEAE-デキストラン、エレクトロポーレーション(電気穿孔)、陽イオン性脂質試薬、または任意の他の便利な技術を用いて達成し得る。本発明において有用な形質転換の様式(マナー)は、慣習的であり、およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel, et al., eds. 2000)において例証される。リジルオキシダーゼまたはそのプロモーターの外因性の発現は、一時的で、安定で、またはそれらの若干の組合せであることができる。酵素の外因性発現は、構成的プロモーター、例は、SV40、CMV、など、およびこの技術において既知の誘導可能なプロモーターを用いて達成することができる。適切なプロモーターは興味のある細胞において機能するものである。
【００６８】
リジルオキシダーゼ酵素またはリジルオキシダーゼ発現性細胞は、任意の適切な長さの時間の間、任意の適切な様式において化合物と接触させることができる。薬剤の皮下での配送に到達できる腫瘍領域のために、直接に低酸素領域中に抑制性化合物を注入することは望ましいかもしれない。細胞は、温置または処置の間、一回よりも多くの回数化合物と接触することができる。典型的に、抗体のために必要な用量は、約1マイクロg/mlから1000マイクロg/mlまでの範囲にあり、より一層典型的には、100マイクロg/mlから800マイクロg/mlまでの範囲にある。正確な用量は、細胞のインビトロ培養物および細胞の変動する化合物の用量に対しての曝露から容易に定めることができる。典型的に、細胞が化合物と共に接触される時間の長さは、約5分、約15分、約30分、約1時間、約4時間、約12時間、約36時間、約48時間から約3日であり、より一層典型的には、約24時間である。インビトロでの浸潤アッセイのために、任意の適切なマトリクスを用い得る。1種の具体例において、マトリクスは再構成された基底膜マトリゲルTM(商標)マトリクス(BD Sciences(サイエンシーズ社))である。
(B.LOX抑制物質組成物)
【００６９】
抑制物質化合物は、好ましくは転移性腫瘍の増殖を減らすために、リジルオキシダーゼ機能活性を抑制または減らすそれらの分子である。そのような抑制は、リジルオキシダーゼの1種またはそれよりも多くの絶対的な結合性残基の直接的結合を通して、または立体障害、リジルオキシダーゼの酵素的な変更、転写または翻訳の抑制、mRNAの転写物の不安定化、リジルオキシダーゼの損なわれた搬出、処理または局在化、などを含む間接的な干渉を通して起こることができる。本明細書で用いるように、用語“抑制物質化合物”には、タンパク質および非タンパク質の分けられた部分(moieties)を含む。若干の具体例では、抑制物質は小分子である。好ましくは、抑制物質は、コラーゲンが豊富な組織に対する全体的な毒性を避ける十分な特異性を有する化合物である。
【００７０】
様々な異なる試験的抑制性化合物を、本明細書で提供するような方法を用いて識別し得る。試験的抑制性化合物は、数多くの化学的クラスを包含することができる。特定の具体例において、それらは有機分子であり、好ましくは小さな有機化合物で、50よりも高く、および約2,500よりも低いダルトンの分子量を持つ。試験的抑制性化合物は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合のために必要な官能基を備えることができ、および少なくともアミン、カルボニル、水酸基またはカルボキシルの基、好ましくは、少なくとも2種の機能的な化学基を含むことができる。試験的抑制性化合物は、環状炭素または複素環式構造および/または芳香族または多環芳香族構造で、上記の官能基の1種またはそれよりも多くで置換されたものを備えることができる。試験的抑制性化合物はまた、ペプチド、糖質、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体類、それらの構造的類似物または組合せのような生体分子を包含する。興味のある試験的抑制性化合物はまた、ペプチドおよびタンパク質の薬剤で、抗体またはそれらの結合性断片または模倣剤のようなもの、例は、Fv、F(ab’)2およびFabをも、以下に更に説明するように含むことができる。
【００７１】
試験的抑制性化合物はまた、合成の、または天然の化合物のライブラリを含む多種多様な供給源から得ることができる。例えば、数多くの手段は、多種多様な有機化合物および生体分子のランダムな、および指向された合成のために、ランダム化されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含めて入手し得る。代わりに、細菌、菌類、植物および動物の抽出物の形態における自然な化合物のライブラリが、入手可能であり、または容易に生産される。その上、自然な、または合成により生産されたライブラリおよび化合物は、慣習的な、化学的、物理的および生化学的な手段を通して容易に修飾され、および組合せのライブラリを生産するのに用いられ得る。既知の薬理学的薬剤は、指向された、またはランダムな化学的な修飾で、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化(amidification)、その他を、構造的な類似物を生成させるために受け得る。
(プロドラッグ)
【００７２】
本発明にかかるLOX抑制物質はまた、プロドラッグとして調製され、および投与され得る。既知のように、プロドラッグは活性な薬物の誘導体であり、比較的単純な誘導体で、その特性は、その薬物のものに比べてかなり減らされているものであることが多い。プロドラッグは、活性な薬物に、意図された作用の領域において、この場合、腫瘍または転移の部位において、転換する。
【００７３】
本発明に従う組成物において、LOX抑制性化合物は、プロドラッグとして合成され、それは低酸素条件によって活性な抑制物質に転換する。他のプロドラッグ戦略を用い得、例は、増加した経口利用能を有する薬物への転換である。
【００７４】
LOX発現が低酸素条件の下で増加するので、低酸素条件はプロドラッグから活性なLOX酵素抑制物質までの転換を引き起こすために活用され得る。このようにして、抗LOXプロドラッグは、腫瘍細胞での、またはそこにおいての転換のために標的にされ、それは典型的に低酸素性である。栄養分および酸素は、腫瘍において迅速に(rapidly)消耗される。低酸素性または酸素の低レベルへの曝露に応じて、組織は細胞代謝を調整することによって、および血管形成を誘導することによって恒常性(ホメオスタシス)を回復させようとする。Cryer(クライヤー)et al.の“Changes in enzyme activities in tissues of rats exposed to hypoxia(低酸素性に曝されるラットの組織における酵素活動での変化)”、Biochem J.(バイオケミカル・ジャーナル)の1973年8月、134(4): 1119-1122は、低酸素性条件の下で調節される酵素のリストを記述する。例えば、そこでは、アルファ-グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ活性が低酸素条件の下で肝臓において増加したことが報告された。この酵素は他の組織において見出され、およびドナー(供与体)のCH-OH基上に作用する酸化還元酵素である。したがって、例えば、LOX抑制物質は設計され得、それはこの代謝条件をCH-OH結合の開裂を通して活用する。別の可能性のある酵素の機構には、グルタチオンS-転移酵素が含まれる。この酵素(特にπ-イソ酵素)のレベルは多くの固形腫瘍において上昇し、およびその酵素は多くの薬物抵抗性腫瘍において過剰に発現される。別の構造がプロドラッグのために用いられ、それは葉酸塩の基(folate group)であり、それは葉酸受容体を発現する細胞に対する薬物を標的にし、それは典型的に腫瘍細胞において上方調整される。他のプロドラッグ戦略は、Hu(フー)の“Prodrugs: Effective Solutions for Solubility, Permeability and Targeting Challenges(プロドラッグ: 溶解性、透過性および標的指向化の攻撃のための効果的な解法),”IDrugs(アイドラッグズ)2004年7(8):736-742において開示される。
【００７５】
LOX抑制物質のプロドラッグの別の例は、低酸素性細胞において、シトクロムp450酵素(CYP)によって活性化される薬物である。ヒトの癌で、結腸、胸部、肺、肝臓、腎臓および前立腺を含むものは、3Aおよび1Aサブファミリー(亜族)のメンバー(一員)を含むシトクロムP450(CYP)のアイソフォームを発現することが知られている。この種類のプロドラッグの例は、AQ4N(バノキサントロン(banoxantrone))、CYP3Aによって生体内還元性に(bioreductively)活性化される化学療法的なプロドラッグである。プロドラッグ転換はNADPHに依存し、および空気または一酸化炭素によって抑制される。
【００７６】
AQ4NはアルキルアミノアントラキノンN-オキサイド(酸化物)(1,4-ビス{[2-(ジメチルアミノ-N-オキサイド)エチル]アミノ}5,8-ジヒドロキシアントラセン-9,10-ジオン)であり、それは選択的に、低酸素性条件の下で、対応する塩基性のアミンにまで、酵素的な還元を通して活性化される(McFadyen(マクファダイン)et al.の“Cytochrome P450 enzymes: Novel options for cancer therapeutics(シトクロムP450酵素：癌治療学のための新しい選択肢),”Mol Cancer Ther.(モレキュラー・キャンサー・セラペウティクス)2004;3: 363-371、2004年参照)。この生体内変換(biotransformation)はカチオン電荷を導入し、それは大いに、DNA結合親和性を増加させ、低酸素性の選択的プロドラッグ活性化機構を提供することができる。このようにして、低酸素条件の下で、AQ4Nは正に荷電する安定した化合物AQ4にまで還元されることができる。
【００７７】
同様に、BAPN(後述する)のようなLOX抑制物質はアミン基を通して作用する。LOX抑制性プロドラッグを調製することができ、それには活性アミノ基を持つ化合物にまで還元されるべき誘導体が含まれる。生体内還元性の分けられた部分、即ち、それは低酸素性細胞において活性な形態にまで転換することができ、Ono(オノ)et al.に対しての、1999年10月19日に発行され、“Bioreductive cytotoxic agents(生体内還元性の細胞傷害性薬剤),”と題する、米国(特許)第5,969,133号(明細書)において与えられ、本明細書によって参照することにより組み込む。
(小分子抑制物質)
【００７８】
本発明において有用な模範的な化合物には、制限されないが、β-アミノプロプリオニトリル(BAPN)のような化合物、並びにPalfreyman(パルフレイマン)et al.に対して、1990年10月23日付発行の、“Inhibitors of lysyl oxidase(リジルオキシダーゼの抑制物質)”と題され、リジルオキシダーゼの抑制物質およびコラーゲンの異常な堆積と関係する病気および条件の処置におけるそれらの使用に関する、米国(特許)第4,965,288号明細書において、Kagan(カーガン)et al.に対する、1991年3月5日付発行の、“Anti-fibrotic agents and methods for inhibiting the activity of lysyl oxidase in-situ using adjacently positioned diamine analogue substrate(リジルオキシダーゼの活性をインサイツで隣接的に位置されるジアミン類似体基質を用いて抑制するための抗線維性薬剤および方法)”と題し、種々の病理学的な線維性の状況の処置のためにLOXを抑制する化合物に関する米国(特許)第4,997,854号明細書において開示される化合物が含まれ、それらを本明細書において参照することにより組み込む。さらに模範的な抑制物質は、Palfreyman, et al.に対する、1990年7月24日付発行の、“Inhibitors of lysyl oxidase(リジルオキシダーゼの抑制物質)”と題され、2-イソブチル-3-フロオロ-、クロロ-またはブロモ-アリルアミンに関する米国(特許)第4,943,593号明細書に、並びに、例には、米国(特許)第5,021,456号、第5,5059,714号、第5,120,764号、第5,182,297号、第5,252,608号(2-(1-ナフチルオキシメチル)-3-フロオロアリルアミンに関するもの)明細書、および米国特許出願第2004/0248871号明細書において記載され、それらを本明細書において参照することにより組み込む。模範的な抑制物質の化合物にはまた、リジルオキシダーゼの活性部位のカルボニル基と反応する一級アミン、およびより一層特には、カルボニルと結合した後に、生成され、共鳴によって安定化される生成物で、次の一級アミンのようなもの、即ち、エチレンジアミン、ヒドラジン、フェニルヒドラジン、およびそれらの誘導体、セミカルバジドおよび尿素誘導体、アミノニトリルで、ベータ-アミノプロピオニトリル(BAPN)のようなもの、または2-ニトロエチルアミン、不飽和または飽和のハロアミン類で、2-ブロモ-エチルアミン、2-クロロエチルアミン、2-トリフルオロエチルアミン、3-ブロモプロピルアミン、p-ハロベンジルアミン、セレノホモシステインラクトンのようなものが含まれる。別の具体例では、抑制物質の化合物は銅のキレート剤であり、細胞を透過するか、または透過しない。追加の模範的な化合物には、間接的な抑制物質が含まれ、そのような化合物は、リジルオキシダーゼで、チオールアミンのようなもの、とりわけD-ペニシラミン、またはその類似物で、2-アミノ-5-メルカプト-5-メチルヘキサン酸、D-2-アミノ-3-メチル-3-((2-アセトアミドエチル)ジチオ)ブタン酸、p-2-アミノ-3-メチル-3-((2-アミノエチル)ジチオ)ブタン酸ナトリウム-4-((p-1-ジメチル-2-アミノ-2-カルボキシエチル)ジチオ)ブタンスルフィン酸塩(sulphinate)、2-アセトアミドエチル-2-アセトアミドエタンチオールスルファネート(sulphanate)、ナトリウム-4-メルカプトブタンスルフィン酸塩三水和物のようなものによって、リジルおよびヒドロキシリジルの残基の酸化的脱アミノ(oxidative deamination)から由来するアルデヒド誘導体をブロックする。
(抑制性抗体)
【００７９】
Burbelo(バーベロ)et al.の“Monoclonal antibodies to human lysyl oxidase(ヒトリジルオキシダーゼに対する単クローン抗体)”Coll Relat Res.(コラーゲン・アンド・リレーテッド・リサーチ)1986年6月、6(2):153-62(それを本明細書において参照することにより組み込む)は、Sp. 2.0-Ag 14骨髄腫細胞を、臍帯から分離されるリジルオキシダーゼを用いて過免疫されたマウスからの脾臓細胞と共に融合することによって生産されるヒトリジルオキシダーゼに対するハイブリドーマ(雑種細胞腫)抗体を開示する。リジルオキシダーゼに対する、他の単クローン性抗体、単鎖抗体、またはFab断片を調製し得る。
【００８０】
好ましくは、抗体はLOXの触媒ドメインに指向される。このドメインは、Ｃ末端領域において、触媒活性のために必要な要素を含む(銅の結合部位、チロシルおよびリジルの残基で、それらはカルボニルコファクター(共同因子)、および10のシステイン残基に寄与する)。Thomassin(トーマシン)et al.の“The Pro-regions of lysyl oxidase and lysyl oxidase-like 1 are required for deposition onto elastic fibers(リジルオキシダーゼおよびリジルオキシダーゼ-様物1のプロ-領域は弾性線維上への堆積のために必要である)”、J Biol Chem. 12月30日2005年、280(52): 42848-55を更に詳細のために参照。
【００８１】
1種の具体例において、抑制性化合物は、抗体またはその生物学上活性な断片である。慣習的な方法を、抗体を調製するのに用いることができる。例えば、ペプチドまたは全長リジルオキシダーゼタンパク質を用いることによって、多クローン性抗血清または単クローン性抗体を、標準的な方法を使用して作成することができる。哺乳類、(例は、マウス、ハムスター、またはラビット)は、哺乳類において抗体反応を誘発する(elicits)ペプチドの免疫原性の形態で免疫化することができる。ペプチド上での免疫原性の付与のための技術には、キャリヤー(担体)への接合(複合)またはこの技術においてよく知られる他の技術が含まれる。例えば、タンパク質またはペプチドを、アジュバント(補助剤)の存在の下に投与することができる。免疫化の進行は、抗体の力価を血しょうまたは血清において検出することによって監視することができる。標準的なELISAまたは他の免疫アッセイ手法を、抗体のレベルを評価するために、抗原としての免疫原と共に用いることができる。免疫化に次いで、抗血清を、血清から得ることができ、および必要に応じて、それから分離する多クローン性抗体であり得る。
【００８２】
抗体は、細胞培養において、ファージにおいて、または種々の動物であって、制限されないが、ウシ、ラビット、ヤギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヒツジ(シープ)、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、類人猿を含むものにおいて発生させることができる。したがって、本発明に従う方法において有用な抗体は、典型的に哺乳類の抗体である。ファージ技術は、初期の抗体を分離するのに、または変えられた特異性または親和力(avidity)の特徴を有する変異体を生じさせるのに用いることができる。そのような技術は、この技術において日常的であり、および良く知られる。1種の具体例において、抗体はこの技術において知られている組換え体の手段において生産される。例えば、組換え体の抗体は、宿主細胞を、抗体をコード化するDNA配列が備わるベクターを用いて形質移入することによって生産することができる。1種またはそれよりも多くのベクターは、少なくとも1種のVLおよび1種のVH領域が発現されるDNA配列を宿主細胞において形質移入させるのに用いることができる。抗体生成および生産の組換え体の手段の模範的な説明は、Delves(デルベス)の、Antibody Production: Essential Techniques(抗体生産：エッセンシャル技術)(Wiley(ワイリー)、1997年)、Shephard(シェパード)et al.の、Monoclonal Antibodies(単クローン性抗体)(Oxford University Press(オックスフォード・ユニバーシティー・プレス社)、2000年)、およびGoding(ゴディング)et al.の、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice(単クローン性抗体：原理および実際)(Academic Press(アカデミック・プレス社)、1993年)に含まれる。1種の特定の抑制物質抗体は、リジルオキシダーゼ(LOX)酵素の活性部位に対して指向される抗体である。
【００８３】
好ましくは、抗-LOX抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体である。非ヒト(例は、ネズミ類)の抗体のヒト化形態は、キメラの免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片(抗体のFv、Fab、Fab’、F(ab’)2または他の抗原結合性サブシークエンスのようなもの)で、それらは、非ヒト免疫グロブリンから導き出される最小の配列を含む。ヒト化抗体には、ヒト免疫グロブリン(レシピエント(受取り体)抗体)が含まれ、そこではレシピエントの補完性決定領域(complementary determining region)(CDR)からの残基が、非ヒトの種(ドナー(供与体)抗体)で、望ましい特異性、親和性および能力(容量)を持つマウス、ラットまたはラビットのようなもののCDRからの残基によって置換される。若干の場合には、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク(枠組み)残基は、対応する非ヒトの残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエントの抗体において、または移入された(imported)CDRまたはフレームワーク配列においてのいずれかにおいても見出されない残基を備え得る。概して、ヒト化抗体は実質すべての少なくとも1種の、および典型的には2種の、可変性ドメインを備え、そこでは、すべての、または実質すべてのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、およびすべてのまたは実質すべてのFR領域はヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列(共通配列)のものである。
【００８４】
ヒト化抗体はまた、随意に少なくとも1部分の免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを備える(Jones(ジョーンズ)et al.のNature、321：522-525頁(1986年)、Riechmann(リーマン)et al.のNature、332：323-329(1988年)、およびPresta(プレスタ)の、Curr. Op. Struct. Biol.(カレント・オピニオン・イン・ストラクチュラル・バイオロジー)2：593-596(1992年))。
【００８５】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、この技術においてよく知られる技術である。概して、ヒト化抗体は、その中には1種またはそれよりも多くのアミノ酸残基で、非ヒトである供給源から導入されるものを持つ。これらの非ヒトのアミノ酸残基は“移入”または“ドナー”の残基と称されることが多く、それらは典型的に“移入”または“ドナー”の可変性ドメインから取られる。ヒト化は本質的に、Winter(ウィンター)および共同者の方法に従い(Jones et al., Nature, 321:522 525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323 327 (1988)); Verhoeyen(フェルホーエン)et al. Science, 239:1534 1536 (1988年))、齧歯類のCDRsまたはCDR配列をヒト抗体の対応する配列のための代わりにすることによって実行することができる。したがって、そのような“ヒト化された”抗体には、キメラ抗体(米国特許第4,816,567号明細書)が含まれ、そこでは、実質無傷のヒト可変性ドメインに満たないものが、非ヒト種からの対応する配列によって代えられている。実際、ヒト化抗体は、典型的にヒト抗体であり、そこでは、若干のCDR残基およびおそらく若干のFR残基が類似物からの残基によって齧歯類の抗体において代えられる。
【００８６】
ヒト抗体はまた、この技術において既知の種々の技術で、ファージ提示ライブラリー(Hoogenboom(フーゲンブーム)およびWinterの、J. Mol. Biol.(ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー)、227:381(1991年)、Marks(マークス)et al.のJ. Mol. Biol.、222：581(1991年))を含めて用いて生産することもできる。Cole(コール)et al.およびBoerner(ベールナー)et al.の技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(単クローン性抗体および癌療法)、Alan(アラン) R. Liss(リス)の、p. 77 (1985年)およびBoerner et al., J. Immunol.(ジャーナル・オブ・イムノロジー)、147(1):86-95 (1991年))。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンの遺伝子座をトランスジェニック(遺伝子導入)動物、例はマウスで、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的、または完全に不活性化されているもの中に導入することによって作成することができる。チャレンジ(攻撃)により、ヒト抗体生産が観察され、それはヒトにおいて、すべての点で、遺伝子再編成(rearrangement)、アセンブリ(組立て)、および抗体レパートリーを含めて見られるよく似たものである(closely resembles)。この取組みは、例えば、米国特許第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,661,016号明細書において、および次の科学的な出版物の、Marks et al.の、Bio/Technology(バイオ/テクノロジー)10、779-783(1992年)、Lonberg(ロンベルグ)et al.の、Nature 368、856-859(1994年)、Morrison(モリソン)、Nature 368、812、13(1994年)、Fishwald(フィッシュワルト)et al.の、Nature Biotechnology 14、845-51(1996年)、Neuberger(ニューベルガー)、Nature Biotechnology 14、826(1996年)、LonbergおよびHuszar(ハッザー)の、Intern. Rev. Immunol.(インターナショナル・リビューズ・オブ・イムノロジー)13：65-93(1995年)において記載される。
【００８７】
抗体はまた、上述のように既知の選定および/または変異誘発の方法を用いて親和性成熟させ(affinity matured)得る。好適な親和性成熟された抗体は、出発抗体(starting antibody)(概して、ネズミ、ラビット、ニワトリ、ヒト化又はヒト)のそれから熟された抗体が調製されるものより、五倍、より一層好ましくは10倍、更により一層好ましくは20または30倍大きな親和性を持つ。
【００８８】
抗LOX抗体はまた、二重特異性抗体であってもよい。二重特異性抗体は単クローン性であり、好ましくはヒトの、又はヒト化の抗体であり、それらは、少なくとも2種の異なる抗原のための結合特異性を持つ。本発明に従う場合には、結合特異性の1種は、LOXについてのものであり、他の1種は任意の他の抗原について、および好ましくは細胞表面タンパク質または受容体または受容体サブユニットについてのものである。
【００８９】
二重特異性抗体を作成する方法は、この技術において既知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え体の生産は2種の免疫グロブリンの重鎖/軽鎖の対の同時発現に基づき、そこでは、2種の重鎖は異なる特異性を持つ(Milstein(ミルシスタイン)およびCuello(クエロ)、Nature、305:537 539(1983年))。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のランダム(無作為)な種別のため、これらのハイブリドーマ(クアドローマ(4倍雑種細胞腫))は10種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生産し、それらのわずかに1種だけが正しい二重特異性構造を持つ。正しい分子の精製は通常、アフィニティ(親和性)クロマトグラフィの工程によって達成される。類似する手法は、WO 93/08829、1993年5月13日に出版されたものにおいて、およびTraunecker(トローネッカー)et al.の、EMBO J.、10：3655-3659(1991年)において開示される。
【００９０】
望ましい結合特異性を有する抗体可変性ドメイン(抗体-抗原の組合せ部位(結合部位)は、免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合されることがある。融合は好ましくは、免疫グロブリンの重鎖の定常ドメインとであり、少なくとも1部分のヒンジ、CH2およびCH3の領域を備える。融合体の少なくとも1種において存在する軽鎖結合のために必要な部位を含む第1の重鎖定常領域(CH1)を持つのが好ましい。免疫グロブリンの重鎖の融合体、および必要に応じて、免疫グロブリンの軽鎖をコード化するDNAsは、別々の発現ベクター中に挿入され、および適切な宿主有機体中に同時形質移入される。二重特異性抗体を生じさせることの更なる詳細について、例えば、Suresh(スレッシュ)et al.の、Methods in Enzymology、121:210(1986年)を参照。
【００９１】
WO 96/27011において記述される別の取組みに従い、1対の抗体分子間の界面(インターフェース)は、組換え体の細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合(パーセンテージ)を最大にするために設計することができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのCH3領域の少なくとも1部分を備える。この方法においては、第1の抗体分子の界面からの1種またはそれよりも多くの小さなアミノ酸側鎖が、より一層大きな側鎖(例は、チロシンまたはトリプトファン)で置換される。大きな側鎖(群)に対して同じか、または似たサイズの補償性(Compensatory)“キャビティ(空洞)”は、第2の抗体分子の界面上で、大きなアミノ酸側鎖をより一層小さなもの(例は、アラニンまたはスレオニン)で置換することによって創作される。このことは、ヘテロ二量体の収量(yield)を、ホモ二量体のような他の望まれていない最終生産物を超えて増加させるための機構を提供する。
【００９２】
二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片(例は、F(ab’)2の二重特異性抗体)として調製することができる。抗体断片から二重特異性抗体を生じさせるための技術は、刊行物において記述されている。例えば、調製することができる二重特異性抗体は、化学的な連結を用いて調製することができる。Brennan(ブレナン)et al.の、Science 229:81(1985年)は、無傷の抗体がF(ab’)2断片を生じさせるためにタンパク分解性に開裂される手法を記述する。これらの断片は、近接のジチオール(vicinal dithiols)を安定化させ、および分子間ジスルフィドの形成を防ぐために、ジチオール錯化性薬剤の亜ヒ酸ナトリウムの存在において還元される。生じるFab’断片は次いで、チオニトロ安息香酸塩(TNB)の誘導体にまで転換される。Fab’-TNB誘導体の1種は次いで、Fab’-チオールにまで、メルカプトエチルアミンを伴う還元によって再転換され、および二重特異性抗体を形成するために、他のFab’-TNB誘導体の等モル量と共に混合される。生産される二重特異性抗体は、酵素の選択的な固定化のための薬剤として用いることができる。
【００９３】
Fab’断片は、E. coli(エシェリキア・コリ、大腸菌)から直接回収し、および二重特異性抗体を形成するために化学的に対合させ得る。Shalaby(シャラービー)et al.の、J. Exp. Med.(ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン)175：217-225(1992年)は、十分にヒト化された二重特異性抗体F(ab’)2分子の生産を記述する。各Fab’断片は、別々にE. coliから分泌され、二重特異性抗体を形成させるために、インビトロにおいて定方向の化学的な対合(directed chemical coupling)に指向された。このようにして形成される二重特異性抗体は、ErbB2受容体および正常なヒトT細胞を過剰発現させる細胞に結合し、並びにヒト胸部腫瘍の標的に対するヒトの細胞障害性リンパ球の溶解活性の引き金を引くことができる。
【００９４】
二重特異性抗体断片を、組換え体の細胞培養から直接的に作成し、および分離するための種々の技術はまた、記述されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて生産されている。Kostelny(コステルニー)et al.の、J. Immunol. 148(5)：1547-1553(1992年)。Fos(フォス)およびJun(ジュン)のプロテインからのロイシンジッパーペプチドは、2種の異なる抗体のFab’タンパク質に対して遺伝子融合によってリンク(結び付け)された。抗体のホモ二量体は、単量体を形成するためにヒンジ領域で還元され、および次いで抗体のヘテロ二量体を形成するために再-酸化され(re-oxidized)た。この方法はまた、抗体のホモ二量体の生産のために利用することもできる。Hollinger(ホリンガー)et al.の、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993年)により記述される“二特異性抗体(diabody)”の技術は、二重特異性抗体の断片を作成するための代わりの機構を提供した。断片は、重鎖の可変性ドメイン(VH)を軽鎖の可変性ドメイン(VL)に接続するリンカーによって備え、リンカーは同じ鎖上での2種のドメイン間での対形成を許すにはあまりに短い。したがって、1種の断片のVHおよびVLのドメインは、別の断片の相補的なVLおよびVHのドメインと対合することを強いられ、それによって2つの抗原-結合部位が形成される。二重特異性抗体の断片を、単鎖Fv(sFv)二量体の使用によって形成するための別の戦略はまた、報告されている。Gruber(グルーバー)et al.の、J. Immunol. 152:5368(1994年)参照。
【００９５】
2種よりも多くの結合価(valencies)を有する抗体が考慮される。例えば、三重特異性(trispecific)抗体を調製することができる。Tutt(ツット)et al.の、J. Immunol. 147:60(1991年)。
【００９６】
模範的な二重特異性抗体は、本明細書において所定のLOXポリペプチド上の2種の異なるエピトープに対して結合し得る。代わりに、抗-LOXポリペプチドのアーム(腕部分)は、T細胞受容体分子(例は、CD2、CD3、CD28、またはB7)、またはIgG(FcγR)のためのFc受容体のような白血球上の引き金を引く分子で、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)およびFcγRIII(CD16)のようなものに結合するアームと組合わされ得、細胞防衛機構を、特定のPROポリペプチドを発現する細胞に対して集中させる。二重特異性抗体はまた、細胞障害性薬剤を、特定のPROポリペプチドを発現する細胞に対して局在化させるために用い得る。これらの抗体は、PRO結合性アームおよび細胞障害性薬剤または放射性核種キレート剤で、EOTUBE、DPTA、DOTA、またはTETAのようなものを結合するアームを所有する。興味ある別の二重特異性抗体は、PROポリペプチドを結合し、および更に組織因子(TF)を結合する。
【００９７】
抗-LOX抗体はまた、ヘテロ接合抗体であってよい。ヘテロ接合抗体は、2種の共有結合的に一緒にされた抗体から構成される。そのような抗体は、例えば、免疫系の細胞を、望まれていない細胞[米国特許第4,676,980号明細書]に対して標的とするために、およびHIV感染の処置[WO 91/00360、WO 92/200373、EP(欧州特許)第03089号明細書]のために提案されている。抗体が、インビトロにおいて、合成タンパク質化学における既知の方法を、架橋結合の薬剤を包含するものを含めて用い、調製し得ることは考慮される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用い、または、チオエーテル結合を形成することによって構築し得る。この目的のための適切な試薬の例には、イミノチオラートおよびメチル-4-メルカプトブチルイミデート(mercaptobutyrimidate)および例えば、米国特許第4,676,980号明細書において開示されるものが含まれる。
【００９８】
抗-LOX抗体を、エフェクター(効果器)に関して、例は、抗体の有効性を癌転移の処置または防止において強化するために修飾することは望ましいことがある。例えば、システイン残基(群)は、Fc領域中に導入し得、それによってこの領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を許す。このようにして生じるホモ二量体抗体は、優れた内部移行能力および/または増加した補完媒介細胞殺滅(cell killing)および抗体依存性細胞障害活性(ADCC)を持ち得る。Caron(キャロン)et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195(1992年)およびShopes(ショープス), J. Immunol., 148: 2918-2922(1992年)を参照。ホモ二量体抗体で、強化された抗腫瘍活性を有するものはまた、Wolff(ウォルフ)et al. Cancer Research, 53: 2560-2565(1993年)において記載されるように、ヘテロ二機能架橋リンカーを用いて調製され得る。代わりに、抗体を設計することができ、それは二重の(dual)Fc領域を持ち、およびそれによって強化された補完性の溶解(complement lysis)およびADCC能力を持ち得る。Stevenson(スティーヴンスン)et al.の、Anti-Cancer Drug Design(アンチ-キャンサー・ドラッグ・デザイン)、3: 219-230(1989年)参照。
【００９９】
抗-LOX抗体はまた、免疫複合体でもあってよい。そのような免疫複合体は、細胞障害性薬剤で、化学療法剤、毒素(例は、細菌、菌類、植物、または動物の起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらの断片)、または放射性同位元素(即ち、放射性複合体のようなものに対して接合(共役)される抗LOX抗体を備える。
【０１００】
そのような免疫複合体の生成に有用な化学療法剤は、上述されている。酵素的に活性な毒素および用いることができるそれらの断片には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素A鎖(Pseudomonas aeruginosa(シュードモナス・エルジノーサ)、緑膿菌から)、リシンA鎖、アブリンA鎖、modeccin(モデシン)A鎖、アルファ-sarcin(サルシン)、Aleurites fordii(アレウリテス・フォルディ)タンパク質、ジアンシン(dianthin)タンパク質、Phytolaca americana(フィトラッカ・アメリカーナ)タンパク質(PAPI、PAPIIおよびPAP-S)、momordica charantia(モノルディカ・カランティア)の抑制物質、curcin(クルシン)、crotin(クロチン)、sapaonaria officinalis(サパオナリア・オフィシナリス)の抑制物質、gelonin(ゲロニン)、mitogellin(ミトゲリン)、restrictocin(リストリクトシン)、phenomycin(フェノマイシン)、enomycin(エノマイシン)およびtricothecenes(トリコテセン)が含まれる。様々な放射性核種は、放射性複合抗体の生産のために入手可能である。例には、212Bi、131I、131In、90Y、および186Reが含まれる。抗体および細胞障害性薬剤の複合体は、様々な二機能性タンパク質-対合薬剤で、N-サクシニミジル-3-(2-ピリジルジチオール)プロピオン酸塩(SPDP)、iminothiolane(イミノチオレーン)(IT)、イミドエステル(ジメチルアジプイミデート(adipimidate)HCLのようなもの)の二機能性誘導体、活性エステル類(ジスクシニミジルスベリン酸塩のようなもの)、アルデヒド(グルタルアルデヒド(glutareldehyde、glutaraldehyde)のようなもの)、ビスアジド化合物(ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミンのようなもの)、ビスジアゾニウム誘導体(ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミンのようなもの)、ジイソシアネート類(トリエン(tolyene)2,6-ジイソシアネートのようなもの)、およびビス活性フッ素化合物(1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼンのようなもの)のようなものを用いて作成される。例えば、リシンの免疫毒素は、Vitetta(ビテッタ)et al.の、Science, 238：1098(1987年)において記載のように調製することができる。炭素-14のラベルが付いた(標識化)1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸(MX-DTPA)は、抗体への放射性核種の複合化(コンジュゲーション)のための模範的なキレート剤である。WO94/11026を参照。
【０１０１】
別の具体例において、抗LOX抗体は、腫瘍の予備標的化(pretargeting)における利用のために“受容体”(そのようなストレプトアビジン)に対して接合され得、そこでは、抗体-受容体の複合体が受動体に投与され、次に未結合の複合体が循環からキレート剤を用いて除去され、および次いで“リガンド”(例は、アビジン)が投与され、それは細胞障害性薬剤(例は、放射性核種)に接合される。
【０１０２】
本明細書において開示する抗LOX抗体はまた、免疫リポソームとして調剤され得る。抗体を含むリポソームは、この技術において既知の方法で、Epstein(イプシュタイン)et al.の、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688(1985年)、Hwang(ウォン)et al.の、Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030(1980年)、および米国特許第4,485,045号および第4,544,545号明細書において記述されるようなものによって調製される。強化された循環時間を有するリポソームは、米国特許第5,013,556号明細書において開示される。
【０１０３】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)を備える脂質組成を用いる逆相蒸発方法によって生じさせることができる。リポソームは、望ましい直径を有するリポソームを産生させるために、規定された孔サイズのフィルタを通して押し出される。本発明に従う抗体のFab’断片は、リポソームに、Martin(マーティン)et al.の、J. Biol. Chem., 257: 286 288(1982年)に記述されるように、ジスルフィドの交換反応を介して接合させることができる。化学療法剤(ドキソルビシンのようなもの)は、随意にリポソーム内に含まれる。Gabizon(ガビゾン)et al.の、J. National Cancer Inst.(ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート)、81(19)：1484(1989年)参照。
【０１０４】
リポフェクションまたはリポソームはまた、抗LOX抗体、または抗体断片を、細胞中に配送するのに用いることができる。抗体断片が用いられる場合には、標的LOXタンパク質の結合性ドメインに対して特異的に結合する最も小さな抑制性断片が好まれる。例えば、抗体の可変性領域配列に基づいて、ペプチド分子は設計され、それは標的LOXタンパク質配列を結合するための能力を保持することができる。そのようなペプチドは、化学的に合成し、および/または組換えDNA技術によって生産することができる。例は、Marasco(マラスコ)et al.の、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889 7893(1993年)を参照。本明細書における調剤物はまた、処理される特定の徴候、好ましくは、互いに悪影響を与えない補完的な活性を有するもののために、必要に応じて、1種よりも多くの活性化合物を含み得る。代わりに、または加えて、組成は、その機能を強化する薬剤で、例えば、細胞障害性薬剤、サイトカイン、化学療法剤、または成長(増殖)抑制性薬剤のようなものを備え得る。そのような分子は、意図される目的のために効果的である量における組合せにおいて適切に存在する。活性な原材料はまた、マイクロカプセル類で、例えば、コアセルベーション(液滴形成)技術によって、または界面重合で、例えば、ヒドロキシメチルセルロースによって調製されるもの、またはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルにおいて、それぞれ、コロイド薬物配送システム(系)(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア(微小球体)、マイクロエマルション(乳濁液)、ナノ粒子、およびナノカプセル)において、またはマクロエマルションにおいて、封入され得る。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences、前述において開示される。
【０１０５】
インビボでの管理(投与)のために用いられるべき調剤物は、滅菌されてなければならない。これは除菌ろ過膜を通してのろ過によって容易に達成される。持続性放出の調製物を調製し得る。持続性放出の調製物の適切な例には、抗体を含む固形の疎水性ポリマー(重合体)の半透性のマトリクスが含まれ、そのマトリクスは造形品の形態であり、例は、フィルム(薄膜)、またはマイクロカプセルである。持続性放出のマトリクスの例には、ポリエステル類、ヒドロゲル類(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリ乳酸(米国特許第3,773,919号明細書)、L-グルタミン酸およびγ-エチル-L-グルタミン酸塩の共重合体、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(R)(ルプロン・デポ)(商標)(乳酸-グリコール酸の共重合体および酢酸ロイプロリドから構成される注入可能なマイクロスフィア)のような分解可能な乳酸-グリコール酸の共重合体、およびポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニルおよび乳酸-グリコール酸のような重合体は、分子の放出を、100日を超える間可能にするが、一定のヒドロゲルは、より一層短い時間の期間、タンパク質を放出する。カプセル被包された抗体が長時間の間、体において残るとき、それらは、37℃での水分への曝露の結果として変性され、または凝集することがあり、生物学的な活性の損失および免疫原性における起こり得る変化を招く。論理的な戦略は、安定化のために、関与する機構によって工夫することができる。例えば、凝集の機構がチオ-ジスルフィドの交換を通した分子間S-S結合の形成であると発見される場合、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、含水量のコントロール(制御)、適切な添加物質の使用、および特定の重合体マトリクス組成の開発によって達成することができる。
【０１０６】
抗LOX抗体の治療上の使用に加え、抗LOX抗体は、LOXのための診断アッセイ(診断検査法)、例は、その特定の細胞、組織、または血清における、発現(および若干の場合においては、差次的発現(発現差異、differential expression))の検出において用い得る。種々のこの技術において既知の診断アッセイの技術で、異質または同質の相のいずれかでも行なわれる、種競合的結合アッセイ、直接的または間接的なサンドイッチアッセイおよび免疫沈降アッセイのようなものを用い得る(Zola(ゾラ)の、Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques(単クローン性抗体：技術のマニュアル)、CRC Press, Inc.(CRCプレス社)(1987年)pp. 147-158)。診断アッセイにおいて用いられる抗体は、検出可能なわけられた部分を用いてラベルを付けることができる。検出可能な分けられた部分は、直接または間接的のいずれにも、検出可能なシグナルを生産可能であるべきである。例えば、検出可能な分けられた部分は、放射性同位元素で、3H、14C、32P、35S、または125Iのようなもの、蛍光性または化学発光性の化合物で、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリンのようなもの、または酵素で、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼまたはホースラディッシュ(西洋ワサビ)ペルオキシダーゼのようなものであり得る。この技術において、抗体を検出可能な分けられた部分に対して接合させるために、既知の任意の方法を採用し得、それらには、Hunter(ハンター)et al., Nature, 144:945(1962年)、David(デイビット)et al., Biochemistry(バイオケミストリー), 13:1014(1974年)、Pain(ペイン)et al., J. Immunol. Meth.(ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッヅ), 40:219(1981年)、およびNygren(ニーグレン), J. Histochem. and Cytochem.(ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリー), 30:407(1982年)によって記述されるそれらの方法が含まれる。
【０１０７】
抗LOX抗体はまた、組換え体の細胞培養または自然な供給源からのLOXのアフィニティ精製のために有用である。この製造方法において、LOXに対する抗体は、適切な支持体で、そのようなSephadex(セファデックス)樹脂またはろ紙の上で、この技術において既知の方法を用いて固定される。固定された抗体は次いで、精製されるべきLOXを含む試料と接触され、およびしかる後、支持体は、適切な溶媒で、試料において、LOXを除く実質すべての物質が除去されるものを用いて洗浄され、そのLOXは固定された抗体に対して結合する。最後に、支持体は、LOXを抗体から解放する別の適切な溶媒を用いて洗浄される。
(抑制性ペプチド)
【０１０８】
若干の具体例において、抑制性化合物は、ペプチドまたはペプチド模倣物質(peptidomimetic)である。模範的なペプチドには、フィブロネクチンペプチド、トロポエラスチンペプチド、タイプI(I型)コラーゲンペプチド、または配列番号の1および13-73のペプチドのようなhLOXから導き出されたペプチドまたは5-20のa.a.(アミノ酸)の長さのそれらの断片が含まれる。これらのペプチドのペプチド模倣物質はまた、これらのペプチドの配列に基づいて調製することができる。
【０１０９】
既知の配列に基づくペプチド模倣物質を作成す方法は、この技術において既知である。例は、米国特許第5,631,280号、第5,612,895号、および第5,579,250号参照。ペプチド模倣物質の使用には、非アミノ酸残基の非アミド連結を用いる所定位置での組込みを包含する(involve)ことができる。本発明に従う1種の具体例は、ペプチド模倣物質であり、そこでは化合物は、結合、ペプチドバックボーン(骨格)またはアミノ酸成分で適切な模倣体を用いて置換されたものを持つ。適切なアミノ酸の模倣体であり得る自然なものでないアミノ酸の例には、制限されないが、ベータ-アラニン、L-ガンマ-アミノ酪酸、L-アルファ-アミノ酪酸、L-アルファ-アミノイソ酪酸、L-エプシロン-アミノカプロン酸、7-アミノヘプタン酸、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、N-エプシロン-Boc(ブチルオキシカルボニル)-N-アルファ-CBZ-L-リジン、N-エプシロン-Boc-N-アルファ-Fmoc(エフモック)-L-リジン、L-メチオニンスルホン、L-ノルロイシン、L-ノルバリン、N-アルファ-Boc-N-デルタ-CBZ-L-オルニチン、N-アルファ-Boc-N-アルファ-CBZ-L-オルニチン、Boc-p-ニトロ-L-フェニルアラニン、Boc-ヒドロキシプロリン、およびBoc-L-チオプロリンが含まれる。適切なペプチド模倣物質には、リジルオキシダーゼの生物学的に関連する部分、リジルオキシダーゼ発現または上流および下流の成分、および同様のものを含む生物学的活性に対して絶対的な任意のタンパク質のペプチド模倣物質が含まれる。
(核酸系抑制物質、RNAi、またはアンチセンス)
【０１１０】
別の具体例において、抑制性化合物は、siRNA分子である。RNA干渉または“RNAi”は、RNAの選択的な細胞内分解に言及する。RNA干渉は、二本鎖RNA(dsRNA)を用い、dsRNAと同じ配列を含むメッセンジャー(伝令)RNA(mRNA)を分解する、転写後の、標的とされる遺伝子-サイレンシング技術である。このプロセスは、内在性リボヌクレアーゼが、より一層長いdsRNAをより一層短く、21-または22-ヌクレオチドの長さのRNAsで、小さい干渉性RNAsまたはsiRNAsと称されるものにまで開裂させるときに起こる。より一層小さなRNAセグメント(区分)は、次いで標的のmRNAの分解を媒介する。RNAiの合成のためのキットは商業上入手可能である。例は、米国特許出願第20040203145号明細書参照。このようにして、RNAiは、リジルオキシダーゼそれ自体の発現に対して指向され、またはリジルオキシダーゼ発現または機能のための任意の絶対的な上流または下流のエフェクターが考慮される。
【０１１１】
時には、抑制物質化合物はアンチセンス核酸である。リジルオキシダーゼのアンチセンスは、日常的な方法を用い、本明細書において記載するように創作し、および細胞中に導入することができる。例は、Lichtenstein(リキテンスタイン)et al.の、Antisense Technology：A Practical Approach(アンチセンス技術：実際的なアプローチ)(Oxford University Press 1998年)参照。
【０１１２】
プレゼンテーション(提示)のリジルオキシダーゼ活性の抑制物質にはまた、フィブロネクチン、BMP-1(プロコラーゲンC-プロテイナーゼ)、およびトロイドプロテイナーゼ(mTLD、mTLL-1、mTLL-2)の抑制によってリジルオキシダーゼの処理を抑制する薬剤が含まれる。LOXのタンパク質分解活性を、LOXおよびフィブロネクチンの結合によって一定状況下に調節することができるので(Fogelgren(フォーゲルグレン)et al.(2005年)のJ. Biol. Chem. 280：24690-24697)、フィブロネクチンの抑制は減少したリジルオキシダーゼ活性を招くことがあった。成熟したリジルオキシダーゼの形態へのプロ-リジルオキシダーゼの処理は、プロコラーゲンCプロテイナーゼによるタンパク質分解の処理を要する(Panchenko(パンチェンコ)et al.(1996) J. Biol. Chem. 271：7113-7119)。BMP-1およびトロイドプロテイナーゼが双方ともプロ-リジルオキシダーゼをその成熟させた形態にまで処理することができることが報告されている。したがって、BMP-1またはトロイドプロテイナーゼのいずれかの抑制は、LOX活性を、その不活性なプロ-リジルオキシダーゼの形態に保つことによって、LOX活性の抑制を招くことができた。リジルオキシダーゼの直接的な抑制と同様に、これらのプロコラーゲンCプロテイナーゼは、小さな干渉性RNAsまたはアンチセンス分子を通して、抗体を用い、小分子抑制物質と共に、またはヒトリジルオキシダーゼのGly-Asp-Aspの開裂配列を含む合成オリゴペプチドまたはペプチド模倣物質によって遺伝的に抑制することができた。細胞シグナリング経路においてリジルオキシダーゼの上流のこれらの標的を抑制することによって、癌の転移は、効率的に処置し、または防止することができる。
(併用療法)
【０１１３】
任意の適切な制癌性薬剤で、化学療法剤のようなものは、本発明の方法において採用し得る。1種の局面において、本発明は、侵襲性(invasiveness)および腫瘍細胞の転移を抑制するための方法を特色とし、それは、細胞を、少なくとも1種の細胞障害性薬剤および少なくとも1種のリジルオキシダーゼ抑制物質と接触させることによる。概して、この方法には、転移性腫瘍細胞を、少なくとも1種の細胞障害性薬剤および少なくとも1種のリジルオキシダーゼ抑制物質のある量で、それは、組合せにおいて、細胞の侵襲または転移性の可能性を減らし、または抑制するために効果的なものと接触させる工程を含む。本発明の方法は、細胞上で培養物において、例は、インビトロまたはエキソビボにおいて実行することができ、または対象物において存在する細胞上で、例は、インビボの治療上のプロトコル(手順)の1部分として実行することができる。治療上の養生法は、ヒト上または他の動物の対象物で実行することができる。本明細書に提供されるリジルオキシダーゼ抑制物質は、化学療法剤に関して任意の順序においてでも投与することができる。時に、抑制物質および薬剤は、同時にまたは順次に投与される。それらは、異なる部位で、および異なる投与計画上で投与することができる。本発明に従う併用療法の強化された治療上の有効性は、制癌性薬剤の慣習的な高い有毒な養生法に対する有望な選択肢を表す。
【０１１４】
そのような化学療法剤には、制限されないが、微小管阻害の(antimicrotubule)薬剤、トポイソメラーゼI抑制物質、トポイソメラーゼII抑制物質、代謝拮抗物質、分裂(有糸分裂)抑制物質、アルキル化剤、挿入剤、シグナル伝達抑制物質、抗ホルモン剤、プロアポトーシス(アポトーシス促進性)の薬剤、プロネクローシス(プロ壊死)の薬剤、サイトカインで、インターフェロン、インターロイキン、および腫瘍壊死因子のようなもの、および放射線が含まれる。模範的な細胞障害性薬剤は、以下のものを含む、即ち、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、タキソテール(、)アムサクリン(taxotere amsacrine)、(例は、Docetaxel(ドセタキセル))、カンプトテシン、トポテカン、塩酸イリノテカン(例は、Camptosar(カンプトサー))、エトポシド、ミトキサントロン、ダウノルビシン、エピルビシン、merbarone(メルバロン)、塩酸piroxantrone(ピロキサントロン)、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、リン酸フルダラビン、シタラビン(Ara(アラ)-C)、トリメトレキサート、ゲムシタビン、アシビシン、アラノシン、ピラゾフリン、N-Phosphoracetyl(ホスホラセチル)-L-Asparate(アスパレート)=PALA、ペントスタチン、5-アザシチジン、5-アザ-2'-デオキシシチジン、アデノシンアラビノシド(アラ-A)、イダルビシン、テニポシド、アムサクリン、エピルビシン、「merebarone(メレバロン)、塩酸piroxantrone(ピロキサントロン)、」5-フルオロウラシル、「メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、リン酸フルダラビン、シタラビン(Ara(アラ)-C)、トリメトレキサート、ゲムシタビン、アシビシン、アラノシン、ピラゾフリン、N-Phosphoracetyl(ホスホラセチル)-L-Asparate(アスパレート)(PALA)、ペントスタチン、5-アザシチジン、5-アザ-2'-デオキシシチジン、アデノシンアラビノシド(アラ-A)、」クラドリビン、ftorafur(フトラフル)、UFT(ウラシルおよびftorafurの組合せ)、5-フルオロ-2'-デオキシウリジン、5-フルオロウリジン、5’-デオキシ-5-フロロウリジン、ヒドロキシ尿素、ジヒドロレンクロラムブシル(dihydrolenchlorambucil)、チアゾフリン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、マイトマイシンC、BCNU(例は、Carmustine(カルムスチン))、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、クロラムブシル、プリカマイシン、ダカルバジン、イホスファミドリン酸塩、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、ウラシルマスタード、ピポブロマン、4-ipomeanol(イポメアノール)、dihydrolenperone(ジヒドロレンペロン)、spiromustine(スピロムスチン)、geldenamycin(ゲルデナマイシン)、サイトカラシン、デプシペプチド、リュープロリド(例は、Lupron(リュープロン))、ケトコナゾール、タモキシフェン、ゴセレリン(例は、Zoladex(ゾラデックス))、フルタミド、4'-シアノ-3-(4-フルオロフェニルスルホニル)-2-ヒドロキシ-2-メチル-3'-(トリフルオロメチル)propionanilide(プロピオナニリド)、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターロイキン2、インターロイキン4、インターロイキン12、腫瘍壊死因子、および放射線である。化学療法剤を用いたリジルオキシダーゼ抑制物質(群)の強化された効果は、これらの化学療法剤の有効性の改善に加え、これらの化学療法剤のより一層低い用量の投与を許し得、このようにして、対象物における副作用の誘導を減らす。
(調剤物)
【０１１５】
開示した方法を用いて抑制物質として識別される化合物を備える治療上の組成物はまた、考慮される。1種の具体例において、本明細書で提供するものは、転移性腫瘍の増殖の予防および処置のための治療上の組成であり、前記組成は、抑制物質の治療上活性な部分の効果的な量を、製薬上(薬学的に)許容可能な担体物質において備え、そこでは、前記抑制物質はリジルオキシダーゼを抑制し、そこで、抑制物質の量は転移性腫瘍の増殖の防止および処置において効果的である。別の具体例において、本明細書では、転移性腫瘍の増殖の予防および処置のための治療上の組成を提供し、それは、製薬上許容可能な担体において、リジルオキシダーゼ抑制物質の治療上活性な部分の効果的な量、および少なくとも1種の化学療法剤を備え、そこでは、抑制物質の量は、化学療法剤の有効性を増すことにおいて、転移性腫瘍の増殖の防止または処置で効果的である。
【０１１６】
種々の製薬上の組成物およびそれらの調製および使用のための技術は、本発明の開示に照らしてこの技術において熟練する者に知られている。適切な薬理学上の組成物、および関係する管理上の技術の詳細なリストのために、あるものは本明細書における詳細な教示を参照し得、それはRemington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (Lippincott, Williams & Wilkins 2003)のような教科書によってさらに補われ得る。
【０１１７】
組成物は更には、製薬上許容可能な物質、組成または運搬体(ビヒクル)で、液体または固体の充填材、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル被包性物質、即ち、担体を含む。これらの担体は、対象の化学物質を、1種の器官、または本体の部分から、別の器官、または本体の部分にまで搬送することに関与する。各々の担体は、調剤物の他の原材料と適合性があり、および受動体に対して傷害性でないという意味において“許容可能”でなければならない。製薬上許容可能な担体として働くことができる若干の物質の例には、以下が含まれ、即ち、糖で、乳糖、ブドウ糖およびショ糖のようなもの、でんぷんで、コーンスターチおよびポテトでんぷんのようなもの、セルロース、およびその誘導体で、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースのようなもの、粉末状のトラガカント(ゴム)、モルト(麦芽)、ゼラチン、タルク、賦形剤で、カカオバターおよび坐薬のワックスのようなもの、油で、ピーナッツ(落花生)油、綿実油、サフラワー(紅花)油、ゴマ油、オリーブ油、コーン(トウモロコシ)油および大豆油のようなもの、グリコールで、プロピレングリコールのようなもの、ポリオール(多価アルコール)で、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールのようなもの、エステル類で、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなもの、アガー(寒天)、緩衝性薬剤で、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのようなもの、アルギン酸、パイロジェン(発熱物質)フリー(を含まない)水、等張性塩水(食塩水)、リンガー溶液(Ringer's solution)、エチルアルコール、リン酸塩緩衝液、および製薬上の調剤物において採用される他の非毒性の適合性物質である。湿潤剤(Wetting agents)、乳化剤および滑剤で、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのようなもの、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤(flavoring)および芳香剤(perfuming agents)、保存剤および酸化防止剤はまた、この組成物において存在することができる。
【０１１８】
本発明の別の局面は、リジルオキシダーゼと他の治療上の化合物との併用投与を実行するためのキットに関する。1種の具体例において、キットは、製薬上の担体において調剤されるリジルオキシダーゼ抑制物質、および少なくとも1種の細胞障害性薬物を備え、1種またはそれよりも多くの別々の製薬上の調製物において、適切であるように調剤される。
【０１１９】
調剤および配送方法は概して、処置されるべき部位および病気に従って適応される(adapted)。模範的な調剤物には、制限されないが、非経口的な投与のために適切なもの、例は、静脈内、動脈内、筋肉内、または皮下の投与で、ミセル、リポソームまたは薬物-放出カプセルにおいて被包される調剤物が含まれ(活性薬剤で緩徐な放出のために設計される生物学的適合性のコーティング(被膜)内に組込まれるもの)、摂取可能な調剤物、局所使用のための調剤物で、クリーム、軟膏およびゲル類のようなもの、および他の調剤物で、吸入剤、エアロゾルおよびスプレイ(噴霧剤)のようなものが含まれる。本発明に従う化合物の投与量は、処置のための必要性、投与される組成物の活性、対象物の全体的な健康状態(general health)、および熟練した専門家に対してよく知られた他の配慮の範囲および重大性によって変動する。
【０１２０】
本明細書に記載するような薬剤は、投与にとって適切な製薬上の組成物中に組み込むことができる。そのような組成物は典型的に、薬剤および製薬上許容可能な担体を備える。補助的な活性化合物をまた、組成物中に組み込むことができる。
(C.病気の処置、予防および診断の方法)
【０１２１】
本明細書では、腫瘍の増殖、好ましくは転移性の腫瘍増殖を、対象物においてインビボで予防し、または減らすための方法を提供し、それには、それを必要とする(in need thereof)対象物に対して、リジルオキシダーゼ活性の抑制物質の効果的な量を、および随意に、製薬上許容可能な担体を、投与することが具わり、それによって腫瘍増殖を、例えば、少なくとも25%、50%、75%、90%、または95%だけ、処置される対象物において、防ぐか、または減らす。本発明に従う処置方法において用いられる適切な組成物の詳細な説明が、上記に与えられる。とりわけ、この方法は、腫瘍が低酸素性のときに有用である。低酸素性の腫瘍は、この技術における日常的な方法を用いて容易に識別することができる。例は、米国特許第5,674,693号参照。以下に示すように、LOX抑制物質の投与は、既存の腫瘍のサイズを小さくすること、転移を防ぐこと、および既存の転移のサイズを小さくする(または、排除する)ことが見出された。
【０１２２】
このようにして、本明細書では、転移を、癌を有する対象物においてインビボで処置する方法を提供し、それには、それを必要とする対象物に対してリジルオキシダーゼ活性の抑制物質の効果的な量を投与することが具わり、それによって、転移が、例えば、少なくとも25%、50%、75%、90%、または95%だけ、処置される対象物において抑制させる。好ましくは、リジルオキシダーゼの抑制物質は特異的にヒトのリジルオキシダーゼ(hLOX)を抑制するもので、hLOXに対して特異的に結合し、他のリジルオキシダーゼ様またはリジルオキシダーゼ関連のタンパク質にはそうしない抗体のようなものである(例は、LOL1、LOL2、LOL3、およびLOL4、Molnar(モルナール)et al.の(2003年)Biochim Biophys. Acta.(バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ)1647：220-224参照)。そのような抗体の例には、制限されないが、抗体が含まれ、それらの各々がhLOXの領域においてエピトープに対して特異的に結合し、配列番号の1および13-73からなる群より選ばれる。特定の種類のリジルオキシダーゼ(例は、hLOX-特異性のもの)に特異的な抑制物質は、リジルオキシダーゼのファミリー(族)の他のメンバー(一員)との交差反応を最小にし、およびこのようにして複雑化(complications)および正常な組織毒性による潜在的な不都合な副作用(adverse side effects)を減らすために望ましいかもしれない。
【０１２３】
また、本明細書では、転移性腫瘍を有する対象物の生存の機会(チャンス、可能性)を、増やし、または強化する方法を提供し、それには、それを必要とする対象物に対してリジルオキシダーゼ活性の抑制物質の効果的な量を投与することが具わり、それによって、処置される対象物の生存の機会が、一定の時間の期間、例えば、少なくとも10日、1ヵ月、3ヵ月、6ヵ月、1年、1.5年、2年、3年、4年、5年、8年、または10年だけ増加し、または強化される。対象物の生存における増加は、例えば、癌の転移の前臨床動物モデル(例は、転移性癌を有するマウス)の生存における特定の時間の期間だけの、例えば、少なくとも10日、1ヵ月、3ヵ月、6ヵ月、または1年だけの、または少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、8倍、または10倍、それよりも多くのコントロール(対照)動物モデル(それは、同じ種類の転移性癌を持つもの)であり、本発明の方法での処置を伴わないものでの増加として規定することができる。随意に、哺乳類の生存における増加はまた、例えば、癌の転移を有する受動体の生存における、一定の時間の期間だけ、例えば、少なくとも10日、1ヵ月、3ヵ月、6ヵ月、1年、1.5年、2年、3年、4年、5年、8年、または10年だけの、それよりも多くの、それと同じ種類の転移性癌を有するが本発明の方法での処置を伴わない受動体のものでの増加として規定することができる。コントロールの受動体は、プラセボ(偽薬)によって、または支持的な標準的手当て(supportive standard care)で、治療の1部分として本発明に従う方法を含まない化学治療、生物学的製剤および/または放射線のようなものを用いて処置され得る。
【０１２４】
また、本明細書では、対象物の転移性腫瘍量を安定化する方法を提供し、それには、それを必要とする対象物に対してリジルオキシダーゼ活性の抑制物質の効果的な量を投与することが具わり、それによって、対象物の転移性腫瘍量を、一定の時間の期間、例えば、少なくとも10日、1ヵ月、3ヵ月、6ヵ月、1年、1.5年、2年、3年、4年、5年、8年、または10年の間、安定させる。対象物の転移性腫瘍量の安定は、転移性腫瘍量を有する前臨床動物モデル(例は、転移性腫瘍を有するマウス)の、一定の時間の期間、例えば、少なくとも10日、1ヵ月、3ヵ月、6ヵ月、または1年の間、それよりも多くの、コントロールの動物モデル(それは、同じ種類の転移性腫瘍を持つ)での、本発明の方法を用いる処置を伴わないものに比べての安定として規定することができる。
【０１２５】
好ましくは、リジルオキシダーゼの抑制物質は、ヒトのリジルオキシダーゼ(hLOX)を特異的に抑制するもので、hLOXに特異的に結合するが、他のリジルオキシダーゼ様のもの、またはリジルオキシダーゼ関連のタンパク質にはそうしないようなものである(例は、LOL1、LOL2、LOL3、およびLOL4、Molnar et al.(2003年) Biochim Biophys, Acta. 1647：220-224参照)。そのような抗体の例には、制限されないが、抗体類が含まれ、それらの各々は、hLOXの領域におけるエピトープに対して特異的に結合するものであり、配列番号の1および13-73からなる群より選ばれる。
【０１２６】
本発明の処置方法にはまた、化学療法剤の有効性を増加させるための方法が含まれ、それには、それを必要とする対象物に対してリジルオキシダーゼ活性の抑制物質の効果的な量を、および随意に、製薬上許容可能な担体を投与すること、それによって、化学療法剤の有効性を増加させることが具わる。また、考慮されるものは、LOX抑制性の調剤物の配送を放射線療法と組み合わせて包含する方法である。放射線療法は、固形腫瘍のほとんどすべての種類で、脳、胸部、頸部、喉頭、肺、膵臓、前立腺、皮膚、脊椎(spine)、胃、子宮または軟部組織肉腫の癌を含むものを処置するのに用い得る。放射線はまた、白血病およびリンパ腫(造血性の(blood-forming)細胞およびリンパ系の癌のそれぞれ)を処置するのに用いることができる。各々の部位への放射線の用量は、癌の種類を含む多数の因子、および放射線によって損害を受け得る組織および器官が近くにあるかどうかに依存する。放射線は典型的にX線として配送され、そこでは、投与量は処置される組織に依存する。放射性医薬品、放射性ヌクレオチド(radionucleotides)としても知られるものはまた、癌で、甲状腺癌、胸壁において再発する(recurs)癌、および骨までへの癌の拡がり(骨転移)によって引き起こされる痛みを含め、処置するのに用いられ得る。
【０１２７】
本発明の方法によって処置され、または診断される対象物には、転移性の腫瘍増殖を持つか、またはその危険性がある対象物が含まれる。そのような腫瘍は、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、胸部、頸部、胆嚢、節(ガングリオン)、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓(spleen)、精巣、胸腺、甲状腺および子宮の癌であることができる。本発明の方法の化合物によって処置される腫瘍には、制限されないが、次の、即ち、中枢神経系の新生物、多形性膠芽腫(glioblastomamultiforme)、星状細胞腫、乏突起膠細胞の(oligodendroglial)腫瘍、上衣および脈絡叢の腫瘍、松果体部腫瘍(pineal tumors)、ニューロン(神経細胞)腫瘍、髄芽(細胞)腫、シュワン(細胞)腫(神経鞘腫)、髄膜腫、髄膜肉腫のもの、眼の新生物のもの、基底細胞癌腫、扁平上皮細胞癌腫(squamous cell carcinoma)、メラノーマ(黒色腫)、横紋筋肉腫、網膜芽(細胞)腫のもの、内分泌腺の新生物のもの、下垂体性新生物(pituitary neoplasms)、甲状腺の新生物、副腎皮質の新生物、神経内分泌システム(系)の新生物、胃腸膵管の(gastroenteropancreatic)内分泌系の新生物、性腺の新生物のもの、頭頸部の新生物のもの、頭頸部癌、口腔、咽頭、喉頭、歯(原)性腫瘍のもの、胸郭(部)の新生物のもの、肺大細胞癌腫(large cell lung carcinoma)、肺小細胞癌腫、非小細胞肺癌腫、胸郭の新生物、悪性中皮腫、胸腺腫、胸郭の一次性胚細胞腫瘍のもの、消化管の新生物のもの、食道の新生物、胃の新生物、肝臓の新生物、胆嚢の新生物、膵外分泌の新生物、小腸、虫垂および腹膜の新生物、結腸および直腸の腺癌、肛門の新生物のもの、尿生殖路の新生物のもの、腎細胞癌腫、腎盂および尿管の新生物、膀胱の新生物、尿道の新生物、前立腺の新生物、陰茎の新生物、精巣の新生物のもの、雌性生殖器の新生物のもの、陰門および鞘(膣)の新生物、頸部の新生物、子宮体部(uterine corpus)の腺癌、卵巣癌、婦人科の肉腫のもの、胸部の新生物のもの、皮膚の新生物のもの、基底細胞癌腫、扁平上皮癌、皮膚線維肉腫、Merkel(メルケル)細胞腫瘍のもの、悪性黒色腫のもの、骨および軟部組織の新生物のもの、骨原性肉腫、悪性線維性組織球腫、クロンドロ肉腫(chrondrosarcoma)、Ewing’s(ユーイングの)肉腫、原始神経外胚葉性腫瘍、血管肉腫のもの、造血系の新生物のもの、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、HTLV-1、およびT-細胞白血病/リンパ腫、慢性リンパ性白血病、ヘアリーセル(有毛細胞)白血病、Hodgkin’s(ホジキン)病、非-Hodgkin’sリンパ腫、マスト(肥満)細胞白血病のもの、チルドレン(子供たち)の新生物のもの、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄球性(myelocytic)白血病、神経芽細胞腫、骨腫瘍、横紋筋肉腫、リンパ腫、腎臓および肝臓の腫瘍が含まれる。一定の具体例において、腫瘍は、胸部腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、頸部腫瘍(腫瘤)、結腸腫瘍または頭頸部腫瘍である。
【０１２８】
本発明はまた、腫瘍転移の危険性を対象物において防ぎ、または減らすための方法を提供し、それには、それを必要とする対象物に対してリジルオキシダーゼ活性の抑制物質の効果的な量を、および随意に、薬学上許容可能な担体を、投与すること、それによって、腫瘍転移の危険性を防ぎ、または減らすことが具わる。抑制物質は、ペプチド、抗体、薬理学的抑制物質、siRNA、shRNAまたはアンチセンス核酸であり得る。そのような予防薬を必要とする対象物は、個体であって、そのものは、癌に対して遺伝的にかかり易いか、または癌および発癌性の環境の家族歴のような種々の理由による癌を発達させる高い危険性があるものでよい。
【０１２９】
癌の発症(onset)または発達において関与するヒトの遺伝子の例には、制限されないが、VHL(Renal Cell Carcinoma(腎細胞癌腫)に関与するVon Hippon Landau(フォン・ヒッポン・ランドー)遺伝子)、P16/INK4A(リンパ腫に関与する)、E-カドヘリン(胸部、甲状腺、胃の癌の転移に関与する)、hMLH1(結腸、胃、子宮内膜の癌におけるDNA修復に関与する)、BRCA1(胸部および卵巣の癌におけるDNA修復に関与する)、LKB1(結腸および胸部の癌(乳癌)に関与する)、P15/INK4B(白血病で、AMLおよびALLのようなものに関与する)、ER(エストロゲン受容体で、胸部、結腸の癌および白血病に関与する)、O6-MGMT(脳、結腸、肺の癌およびリンパ腫においてDNA修復に関与する)、GST-pi(パイ)(胸部、前立腺、および腎臓の癌に関与する)、TIMP-3(組織メタロプロテアーゼ(金属プロテアーゼ)で、結腸、腎臓、および脳の癌の転移に関与する)、DAPK1(DAPキナーゼで、B細胞リンパ腫細胞のアポトーシス(予定死)に関与する)、P73(リンパ腫細胞のアポトーシスに関与する)、AR(アンドロゲン受容体で、前立腺癌に関与する)、RAR-ベータ(レチノイン酸受容体-ベータで、前立腺癌に関与する)、エンドセリン-B受容体(前立腺癌に関与する)、Rb(網膜芽細胞腫の細胞周期調整(cell cycle regulation)に関与する)、p53(重要な腫瘍サプレッサー(抑止)遺伝子)、P14ARF(細胞周期調整に関与する)、RASSF1(シグナル伝達に関与する)、APC(シグナル伝達に関与する)、カスパーゼ-8(アポトーシスに関与する)、TERT(老化に関与する)、TERC(老化に関与する)、TMS-1(アポトーシスに関与する)、SOCS-1(肝細胞癌(hepatocarcinoma)の増殖因子反応に関与する)、PITX2(肝細胞癌（、）胸部癌)、MINT1、MINT2、GPR37、SDC4、MYOD1、MDR1、THBS1、PTC1、およびpMDR1で、Santini(サンティーニ)et al.の(2001年)Ann. of Intern. Med.(アニュアルズ・オブ・インターナル・メディシン)134:573-586において記載するようなもので、それを、本明細書で参照することによりその全体において組み込むものが含まれる。これらの遺伝子のヌクレオチド配列は、National Center for Biotechnology Information (ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション、NCBI)のウェブサイトから取り出すことができる。
【０１３０】
白血病は血液の癌であるが、それが他の器官に影響を及ぼし、または事実上(in effect)、転移することに注目すべきである。急性白血病において、異常な細胞は、体における中枢神経系、精巣、皮膚および任意の他の器官に集まり得る。白血病は既に体における骨髄のすべてに包含され、および多くの場合において、肝臓、脾臓、およびリンパ節のような他の器官にまでの拡がりを持つので、白血病の病期診断は生存のための受動体の見通し(patient's outlook)を反映する他の情報に依存する。異なる病期診断の系が、慢性白血病の異なる種類のために用いられる。若干の種類は、何らの病期診断系を持たない。
【０１３１】
固形腫瘍癌の病期診断はよく知られる。TNM系は、最も普通に用いられる病期診断系の1種である。この系は、International Union Against Cancer (インターナショナル・ユニオン・アゲインスト・キャンサー、UICC)およびAmerican Joint Committee on Cancer(アメリカン・ジョイント・コミッティ・オン・キャンサー、AJCC)によって受け入れられている。大部分の医療設備は、TNMシステムを、癌を報告するためのそれらの主要な方法として用いる。PDQ(R)(商標)、NCI’s包括的癌データベースはまた、TNM系を用いる。
【０１３２】
TNM系、本明細書において、“病期診断”と称するものは、腫瘍の範囲、リンパ節への拡がりの範囲、および転移の存在に基づく。
【０１３３】
診断の方法に関して、患者の試料の選別または診断の分析は、LOXレベルを、および従って腫瘍の転移性の攻撃性(metastatic aggressiveness)を定めるために実行することができる。この分析は、リジルオキシダーゼ特異的療法を用いる処置の開始に先立ち、高められたLOXの発現または活性を持つ腫瘍を識別するために、実行され得る。そのような診断の分析は、任意の試料を用いて実行することができ、それには、制限されないが、細胞、タンパク質または細胞の膜抽出物、生物学的流体で、唾液、血液、血清、血しょう、または尿のようなもの、または生物学的試料で、凍結組織セクション(切片)のようなものが、本発明に従う抗体を採用し、含まれる。リジルオキシダーゼ発現の検出および分析のための任意の適切な方法を用いることができる。本明細書において用いるように、用語“試料”はヒト、動物からの試料に、または研究用試料(research sample)で、例は、細胞、組織、器官、流体、ガス(気体)、エアロゾル、スラリー(泥状物)、コロイド、または凝固した物質に言及する。試料はまたインビボにおいて、例は、ヒトまたは動物から取り出され(除去され)ることなく試験され得、またはそれはインビトロにおいて試験され得る。試料は、処理、例は、組織学的方法によってのものの後に、試験され得る。用語“試料”はまた、細胞、組織、器官、または流体で、ヒトまたは動物から新鮮なもので採取されるもの、または細胞、組織、器官、または流体で、処理されるか、または保存されるものに言及し得る。
【０１３４】
また、本明細書においては、腫瘍増殖または転移の対象物における病期診断のための方法を提供し、それには、リジルオキシダーゼ(好ましくは、ヒトのリジルオキシダーゼ)のレベルを、対象物の腫瘍において評価することが具わり、それによって、リジルオキシダーゼレベル(例は、遺伝子発現または酵素活性においてのもの)における、腫瘍においての変化が、対照(リファレンス)試料と比較して、転移性の腫瘍増殖の存在を指し示す。若干の場合には、腫瘍におけるhLOXレベルまたは活性は、同じ対象物についてより一層早期に測定したものよりも高いか、または正常な組織から採取される対照の試料におけるものよりも高くてよく、それは、患者に、腫瘍転移のより一層大きな危険性があること、腫瘍が転移していること、または腫瘍転移が増加していることを指し示し得る。
【０１３５】
また、本明細書において、癌の転移を対象物において診断するための方法を提供し、それには、リジルオキシダーゼ(好ましくは、ヒトのリジルオキシダーゼ)のレベルを血液において評価することが具わり、それによって、リジルオキシダーゼレベル(例は、遺伝子発現または酵素の活性におけるもの)における血液での変化が、対照試料と比較して、転移性の腫瘍増殖の存在を指し示す。若干の場合に、血液におけるhLOXレベルまたは活性は、より一層早期に測定されるときのものより低いことがあり得、それは、患者に、癌転移のより一層大きな危険性があること、癌が転移していること、または癌転移が増加していることを指し示し得る。
【０１３６】
対照試料は、同じ対象物から導き出され、同じ腫瘍から異なる時点で、または体の他の部位から、または別の個体から採取され得る。
【０１３７】
LOXレベルの測定は、免疫学的アッセイの形態を採り得、それは、LOXタンパク質の存在を、そのタンパク質に対する抗体、好ましくは、hLOXに特異的に結合する抗体を用いて検出する。他のタンパク質のためのそのようなアッセイはよく知られており、およびLOXタンパク質の検出に適応させ得る。免疫アッセイもまた、レーザー誘導される蛍光と併せて用い得る(例えば、Schmalzing(シュマルツィング)およびNashabeh(ナシャベ)の、Electrophoresis(エレクトロフォレシス) 18：2184-93(1997年)、Bao(バオ)の、J. Chromatogr. B. Biomed. Sci.(ジャーナル・オブ・クロマトグラフィ・B-アナリティカル・テクノロジーズ・イン・ザ・バイオメディカル・アンド・ライフ・サイエンシーズ) 699：463-80(1997年)、それらの各々を本明細書において参照することにより組み込む)。リポソーム免疫アッセイで、フローインジェクションリポソーム免疫アッセイおよびリポソーム免疫センサーのようなものはまた、本発明の方法に従いLOXレベルを定めるのに用い得る(Rongen(ロンゲン)et al.のJ. Immunol. Methods(ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッヅ)204：105-133(1997年)、それを本明細書において参照することにより組み込む)。免疫アッセイで、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISAs)のようなものは、本発明の方法において特に有用であることができる。放射性免疫アッセイもまた、試料がLOXについて陽性であるかどうかを定めるため、またはLOXのレベルを定めるため、有用であることができる。放射性免疫アッセイは、例えば、ヨウ素-125標識した二次抗体を使用して、用い得る。
【０１３８】
加えて、あるものはLOX活性を測定し得、このようにして、不活性酵素の量を無視する。LOX活性は、多数のやり方において、基質として標識されたリジンを有する可溶性エラスチンまたは可溶性コラーゲンを使用して測定し得る。活性のアッセイの詳細は、Royce(ロイス)et al.の、“Copper metabolism in mottled mouse mutants. The effect of copper therapy on lysyl oxidase activity in brindled (Mobr) mice(ぶちのマウス変異体における銅の代謝。まだらの(Mobr)マウスにおけるリジルオキシダーゼ活性上の銅治療の効果),”Biochem J. 1982年2月15日; 202(2): 369-371において与えられる。色素生成性アッセイが特に好まれる。あるものは、Palamakumbura et al.の、“A fluorometric assay for detection of lysyl oxidase enzyme activity in biological samples(生物学的試料におけるリジルオキシダーゼ酵素活性の検出のための蛍光定量的アッセイ),”Anal Biochem. 2002年1月15日;300(2):245-51において記述される。この方法は、本発明の作業において用い、LOXの抑制を、BAPNによって、および抗LOX抗体の細胞における培養物において(馴化媒体を用い)、およびマウスにおいて(血しょうを用い)、96ウェルのフォーマット(形式)におけるものによって評価した。
【０１３９】
血液(または尿)におけるLOXのレベルを測定することに加え、あるものは、LOX活性の第二の生成物を測定し得る。例えば、デオキシピリジノリン(Dpd)を、リジン残基上にリジルオキシダーゼの酵素作用によって形成する。Dpdは、骨の破骨細胞破壊(osteoclastic degradation)の結果として、循環中に放出される。それは再利用することができず、および腎臓によってきれいにされ、および変化されず尿において排泄される。このようにして、Immunodiagnostic Systems (IDS) Gamma BCT Dpd(イムノダイアグノスティック・システムズ(IDS)・ガンマ・BCT Dpd)のアッセイに基づく試験は、抗Dpd単クローン性抗体を用いる被覆されたチューブ(管状)RIAを用い、LOX活性を測定するのに用いることができる。
【０１４０】
本発明に従う化合物または組成物、好ましくは、抗LOX抗体はまた、病気または異所性(aberrant)コラーゲン代謝と関係した条件で、種々の線維性の条件のようなものの処置または診断において、例えば、肺線維症、ならびに増殖性硝子体網膜症(proliferative vitreo retinopathy)、手術瘢痕(surgical scarring)、全身性硬化症、強皮症(scleroderma)、創傷収縮、肥厚性瘢痕(hypertrophic scars)、線維腫症(特にDupuytren's disease(デュピュイトランの病気))、およびケロイドにおいて用いる得る。
次の例は、例示するために与えるが、本発明を制限するものではない。
【実施例】
【０１４１】
(III. 例)
下記の例は、LOXが、ヒトの胸部癌細胞および他の癌細胞の転移の可能性を、低酸素性の微小環境において増加させること、およびLOXの抑制が転移の抑制を招くことを実証する。何らかのある種の理論によって拘束されることを望まないが、コラーゲン上に作用する分泌されたLOXが、低酸素性のヒトの胸部および頸部癌細胞の浸潤性の、および転移性の特性についての原因であることが見出された。この分泌されたLOXは、細胞の外側で見出され得、および従って抗体およびペプチドの処置のための標的を表し得る。
【０１４２】
LOXの発現/活性の抑制は、インビトロでの浸潤およびインビボでの転移を、特に酸素欠乏させた(oxygen-deprived)条件において防止した。正所性に増殖した胸部癌腫瘍を有するマウスで、LOXの化学的な抑制物質を用いて処置されたものは、転移を表示しなかった。LOXは、診断上の適用性を持ち、エストロゲン受容体の陰性胸部癌受動体で、高いLOX発現性腫瘍を有するものが、貧困地区(poor distant)の無再発性の転移および全体的な生存を持ったことの知見が含まれる。
(例1)(ヒトの頸部癌細胞および胸部癌細胞は低酸素性条件下に増加したLOX発現を示す)
【０１４３】
ヒトの頸部癌細胞およびMDA 435およびMDA 231のヒトの胸部癌細胞の低酸素性(2%酸素)または無酸素性(0.02%酸素)の条件下での18時間の温置は、正常酸素圧の(normoxic)試料(20%酸素)と比較して高められたLOX mRNAレベル(最高9倍)を招き、セミ(半)および完全な量的なRT-PCR(逆転写PCR)(データは示さず)によって評価された。これは、低酸素誘導性因子(HIF)-1に依存することが見出され、それは、低酸素下に転写物発現および安定性の双方を増加させた。
【０１４４】
LOXプロモーター構築物で、LOX翻訳開始点(出発部位)の上流の最高1.8Kbを含むものを、標準的なルシフェラーゼ(発光酵素)アッセイ系を採用する低酸素性反応性(responsiveness、応答性)について試験した。正常酸素圧の条件下、HIF-1αは、von Hippel Lindau(フォンヒッペル・リンダウ)(VHL)ユビキチンE3リガーゼ1を包含する機構を介して、プロテアソーム(タンパク質分解酵素複合体)によって迅速に分解される。VHLを欠く細胞は、HIF-1αを構成的に発現し、および従って活性な低酸素性遺伝子発現を好気的な(aerobic)条件下に実証する。HIF-1依存性を評価するために、LOX mRNA発現レベルを、VHLを欠くか、または安定して形質移入されたVHLを有するかのどちらでものヒトのRCC4腎臓癌腫細胞において分析した。LOX mRNAレベルは、VHLを発現する細胞(VHL+)において低酸素性および無酸素下に誘導されたが、VHLを欠く細胞(VHL-)は、細胞正常酸素圧の条件においてさえ、構成的に高められた。HIF-1-依存性は、正常酸素圧において確認され、およびMDA231細胞は、非分解性HIF-1変異体を用いて形質移入され、いずれかでも、酸素依存性分解ドメイン(ODD)(ドメイン)を欠くか、またはVHL媒介された分解のために必要な双方のプロリン部位で変異された(二重の変異体)32。これらの細胞は、高レベルのHIF-1αタンパク質を空気中で発現させ(図1の下側パネル参照)、ならびにLOX mRNA発現を高め、それは、酸素を与えない細胞およびHIF安定化薬剤、デスフェリオキサミン(DFO)または塩化コバルト(CoCl2)を用いて処置された細胞において見出されたものに等しく、HIF-1誘導されたLOX発現を示唆した。
(例2。設計されたLOXプロモーター構築物は低酸素性の反応性を調節することができる)
【０１４５】
ヒトLOXプロモーターの検査は、数多くの潜在的低酸素性の反応性要素(HREs)を明らかにし、それには、HIF-1が結合し、および遺伝子発現を調整することができた。LOXプロモーター配列は、pGL3-Basic(ベイシック)(Promega(プロメガ社))中にクローン化され、および部位指向的突然変異誘発(site-directed mutagenesis)(Stratagene(ストラタジーン社))によって、製造者の指示に従って変異された。5種の低酸素反応性の要素(HREs)を含む陽性コントロールを用いた。試験されるプロモーター断片は、初めに分離され、およびCsiszar et al.33によって記述され、および若干の低酸素反応性が酸素を与えない条件において示された(図1の中央のパネル、黒色のバー)。HIF-1のために役割を、転写的に調整されるLOXにおいて研究するために、細胞を、それらがHIF-1αタンパク質の高レベルを空気中で発現するように(図1Dの下側パネル)、ODD変異体構築物(上記参照)を用いて形質移入した。ルシフェラーゼ発現を、これらの好気性細胞において、それらがLOXプロモーター構築物およびHIFのODD構築物を用いて形質移入されるときに誘導され、LOXプロモーターがHIFに直接的に応答したことを示した(図1、白色バー)。酸素欠乏(Oxygen deprivation)またはHIF-1を用いる形質移入は、増加されたルシフェラーゼ発現を招き、それは、開始点の上流でHRE 70bpの変異により無効にされた(abolished upon)(図1)。インビボでのLOXの低酸素性誘導を確認するために、MDA231の正所性腫瘍を負うマウスを、犠牲にする前に1時間、ピモニダゾール(pimonidazole)(100mg/kg)を与え、低酸素の領域を識別した。ホルマリンで固定し、およびパラフィンで包埋した腫瘍の連続切片を、LOXおよびピモ(pimo)について染色した。染色法(Staining)は、ピモおよびLOX発現の間の強い関係を明らかにした。合わせて考慮すると、これらの結果は、LOX mRNAレベルが、低酸素性条件下に、HIF-1依存性の増加を通してHREで導き出された転写物発現において高められることを指し示した。
(例3:LOX転写物の安定性)
【０１４６】
LOX転写物の安定性を検査した。アクチノマイシンD(転写の抑制物質)の添加は、緩徐な低下を、LOX mRNAレベルにおいて、空気および低酸素における双方の時間にわたって引き起こした。しかし、LOX転写物の安定性は、低酸素性条件下に明らかに高められた。SiRNAを用いる形質移入によるHIF-1αの発現の消失(Ablation)は、LOX mRNA安定性を低酸素において激減させた。
【０１４７】
量的RT-PCRは、LOX mRNAレベルを評価するのに実行され、それは、18SのrRNAレベルにまで、次いでアクチノマイシンD添加の後0時間でのLOX mRNAレベルにまで標準化された。図2において示すように、データを、3通りの読み(triplicate readings)のため、内部実験的な(intra-experimental)平均±標準誤差としてプロットした。発現レベルを、siRNAを標的とするHIF-1アルファを用いて形質移入される細胞のそれら(低酸素HIFなし;以前に記載したもの47)と、酸素欠乏に先立つ24時間で、HIF-1の関係を研究するために比較した。HIF-1アルファのタンパク質発現レベルの消失は、ウエスタンブロットによって確認した。HIF-1のsiRNA(+)またはスクランブルされた(混ぜられた、組換えられた)コントロールの配列(-)を用いて形質移入される細胞を、正常酸素圧(N)または低酸素性(H)の条件下に温置し、および免疫ブロット法を、材料および方法において記載するように実行した。
(例4:LOXタンパク質発現レベルは頭頸部癌組織において高められる)
【０１４８】
LOXタンパク質発現レベルは、免疫組織化学的染色を通して頭頸部(H&N)癌受動体組織のアレイ(整列体)において検査され、および腫瘍の低酸素性に、炭酸脱水酵素-IX(CA-IX)染色(低酸素についての既知の固有のマーカー(標))および受動体の生存によって定められるように関連した51-52。LOX発現レベルは、CA-IXの発現と有意に相関した(p=0.006)。図3は、LOXタンパク質発現レベルの、頭頸部癌患者(n=91)からの組織アレイ調査におけるCA-IXのそれらとの比較からのデータを示す。フィルド(塗り込まれた)バー、LOX陽性、オープン(開放)バー、LOX陰性である。P=0.006。CA IXは、CA IX陰性であったLOX陰性の場合において十分に増加した。
(例5：LOXは発現について、エストロゲン受容体(ER)陰性胸部癌受動体においてより一層低い生存と関係する)
【０１４９】
295体の胸部癌受動体からの最近出版されたマイクロアレイデータセット(組)を、LOX発現について追加的に分析した41。エストロゲン受容体(ER)の状況(status)は、LOXの過剰発現と統計的に関係し(全体のデータセットにわたっての平均(中央値)よりも高い)、およびリンパ節の状況、腫瘍の等級またはサイズ、または受動体の年齢ではない(表1)。ER陰性胸部癌受動体は、より一層悪い予後(worse prognosis)を持ち、および再発の高い危険性のそれらは、目下、分子的に標的とされる治療上の選択肢を持たない。LOXの過剰発現は、統計学的に十分により一層低い遠隔転移フリーの生存(p=0.02図2E)および全体的な生存(p=0.015図2F)を、ER陰性腫瘍を有する受動体において関係させたが、ER陽性の腫瘍または全体的なデータセットにおいてはそうでなかった(それらは、主としてER陽性の腫瘍から構成される)。これらのカプラン-マイヤープロット上に見られる分離は、胸部癌受動体において1種の遺伝子単独について以前に見られた任意のものと似ていない。Kaplan, E.L.; Meier(マイアー), Paul(ポール). “Nonparametric estimation from incomplete observations.(不完全な観察からのノンパラメトリックな推定)”J. Am. Stat. Assoc.(ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・スタティスティカル・アソシエーション) 53, 457-481(1958年)参照。生存時間関数(survival function)のKaplan-Meier(Meyer)の推定のプロットは、下降性の規模(declining magnitude)の一連の水平工程であり、それらは、大きく十分な試料が採取されるとき、その集団(population)のための真の生存時間関数に近づく。連続的な別個のサンプリングされた観察の間の生存時間関数の値は、一定であると評価される。
【０１５０】
【表１】
2009536925.tif 000002
【０１５１】
図4AおよびBは、ER陰性胸部腫瘍を、高いLOX発現レベルを伴って有する受動体が、統計学的に有意の減少した転移のない生存を持ったことを示すカプラン-マイヤープロットを(示し)含み、(4A：P=0.009)、および全生存(C：P=0.015)、受動体の低いLOX発現レベルよりもである。高いLOX発現を有する受動体は、減少した無再発性の生存、転移フリーの生存(p=0.02図4C)および全生存(p=0.046図4D)を有する、統計学的に有意のより一層悪い成果を持った。
(例6。LOXを抑制するために設計されるshRNA細胞のインビボおよびインビトロでの増殖)
【０１５２】
次いで、低酸素誘導されたLOXが、どのようにして転移および生存に、癌受動体において影響を及ぼすかを、研究した。レトロウイルスの感染を介して、安定にLOX shRNAを発現するMDA 231のヒト胸部癌細胞を発生させた。これらの細胞は、有意により一層少ないLOX mRNAおよびタンパク質のレベルを、スクランブルされたコントロールの配列を発現する細胞と比較して、低酸素性の条件下に特に発現した。LOX mRNAおよびタンパク質の発現レベルを、LOXに特異的なshRNAまたはスクランブルされたコントロール配列を発現する細胞(shRNA)、(コントロール)において検査し、およびLOX(+LOX)の成熟した形態を用いて一過性に形質移入されるsiRNA細胞のものと比較した。LOX mRNAの添加は、LOX mRNA発現のレベルを回復させた。加えて、MDA 231および野生型およびLOX shRNA発現性の細胞を、2D(2次元)培養において増殖させ、および毎日計数した。細胞数は、shRNAおよびコントロールの細胞について等しくインビトロで増加した。このようにして、コントロールおよびshRNA発現性細胞は、2Dにおいて同様の速度で増殖し、および細胞の似た分布を細胞周期の異なる相(フェーズ、期)において持ち、S相を横断する同数の細胞を有し、および低酸素に応じてわずかなG1停止(arrest)を実証した。植え込まれた腫瘍のインビボでの腫瘍サイズをまた測定した。インビボでの腫瘍サイズは、コントロールの細胞および4週間のインビボでのshRNA細胞の双方において等しく、その後、shRNA細胞は、腫瘍サイズのわずかな減少を示したが、コントロールの腫瘍は引き続きサイズを増加させた(平均で約500から800までのmm3)。
(例7。正所性の腫瘍を植え込まれたマウスは、LOX発現が、shRNAによって、LOX抗体を用いて、またはBAPNを用いて抑制されるときに、より一層少数の転移見せる)
【０１５３】
加えて、MDA231細胞は、正所性腫瘍として、ヌードマウスにおいて増殖した。LOXの低酸素性の調整を、腫瘍において、LOXおよびピモニダゾールについて染色することによって確認した。ShRNA発現性腫瘍を負うマウスは、十分に少数の肺転移しか持たず、および肝転移はなく、野生型腫瘍(図5A、B)と対照的であった。図5 AおよびBにおいて、データは、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色される肺および肝臓における転移の微視的な定量によって得られた。各々のバーの頂部分で示されるデータは、マウスにつき6週間の実験終了で形成される転移の数(平均±標準偏差.)の10種の工程セクションについてのもので、3種の独立した実験的な繰返しに基づく。4wk(週)のBAPNは週4、等で開始された処置を表す。結果は、週4で開始された処置が、その時における点でのコントロールの腫瘍において見出される転移性腫瘍の数から見て、形成された腫瘍を実際に排除したことを指し示す。
【０１５４】
LOXを抑制することについての治療上の有用性を評価するため、コントロールのMDA231腫瘍を有するマウスを、β-アミノプロピオニトリル(aminoproprionitrile、aminopropionitrile)(BAPN)、LOXの酵素活性の特異的な、および不可逆的な抑制物質を用いて処置した。BAPNは他のLOXファミリーのメンバーズ(それらには、若干の重複部分を構造および機能において有する4種がある)上に影響を及ぼすことが報告されているので、マウスはまた、本発明者らの精製したLOX抗体を用いて処置され、それは、ネズミのLOXと交差反応し、有害な副作用の評価を考慮した。BAPNまたは20mg kg-1の抗体を用いて処置されるマウスは、何らの肺転移もまたは肝転移も持たなかった(図5A、B)。減少させた抗体用量およびBAPN処置の期間を受け取るマウスは、有意により一層少数の肺転移しか表示せず、および肝転移を示さず、それは転移が既に形成されたときでさえそうである(図5C)。図5Cにおいて、転移は10のセクション(n=5マウス)について6週にわたって毎週計数した。実線で円を有するものはコントロールの肺、点線で三角形を有するものはコントロールの肝臓、実線で四角を有するものはBAPNの肺、点線で四角を有するものはBAPNの肝臓である。BAPNは週2で開始した。抗体の用量は、即ち、標識してないものは20mg kg-1、星印は4mg kg-1、2つの星印は1mg kg-1である。コントロールはn=10、LOX shRNAはn=10、4週BAPNはn=10、3週BAPNはn=3、2週BAPNはn=3、LOX抗体はn=5である。処置の詳細は、方法の項において与える。
【０１５５】
このようにして、例6および7を比較し、LOXの抑制(shRNA、BAPNまたは抗体を用いる)は、一次(primary)腫瘍の増殖上にわずかな効果を及ぼし、しかし、腫瘍サイズおよび転移の数の間の関係はなかった(データを示さず)。減少したLOX活性の、BAPN処置されたおよび抗体処置されたマウスの血液においてのレベルを観察し、抗体がLOX酵素の活性を妨げ得ることを指し示し、それは、インビトロでのアッセイにおいて確認された(図5D)。他方、高度に転移性のMDA231細胞によって形成される腫瘍からの転移の数は劇的に減少した。
(例8。分泌されたLOXは細胞の浸潤において役割を演ずる)
【０１５６】
転移プロセスの第1工程は細胞の浸潤である。コントロール、BAPN処置され、または抗体処置されるマウスからの一次腫瘍は、浸潤の証拠を示し、一方、LOX shRNAを発現する腫瘍はそうではなかった。種々のヒトの癌細胞のインビトロでの浸潤を検査した。研究されるすべての細胞系は、正常酸素圧の細胞と比較して、低酸素または無酸素の下で著しく増加した浸潤を示した(図6Aおよび図6B)。これは、LOXアンチセンスオリゴヌクレオチド(それは、LOX mRNA発現を減少させ、アンチセンス(AS)処置された細胞において減少したLOX mRNAレベルを指し示すゲル類によって示されるようなもので、レベルをコントロールと比較することによるRT-PCRによって確かめられるようなもの)、BAPN、LOX抗体またはshRNA発現を用いるが、LOXセンスオリゴヌクレオチドを用いないで、処置することによって防げることができた(図6AおよびB)。浸潤は、shRNA細胞において、成熟したヒトのLOXの過剰発現を通してであるが(それはshRNA抑制を克服する)、触媒的に不活性なLOX遺伝子(デルタcat(キャット))の形質移入を伴わずに、回復することができた。浸潤はまた、コントロール細胞またはshRNA細胞でLOXを用いて形質移入した細胞からの馴化媒体(CM)の添加によってではあるが、好気的または低酸素のshRNA細胞からのCMの添加によってではなく、増加した(図6)。LOXが、細胞内または細胞外で作用することができる銅依存酵素であるので、細胞はバソクプロイン(bathocuprione、bathocuproine)二硫酸塩(disulphonate)(BCS)、細胞膜を浸透することができない銅キレート剤を用いて処置された。細胞外LOXのこの抑制は、低酸素性細胞の高められる浸潤を防いだ(図6A、B)。BAPNを用いる処置も、またBCSを用いる処置も、細胞の生存能力に影響を及ぼさず(データは示さず)、および本発明者らはヒストンのアセチル化における本発明者らの細胞系で、異なる処置を伴うものでの違いを観察せず、細胞内LOX介入(involvement)を除外した(データは示さない)。
【０１５７】
細胞浸潤の癌の異なる種類上での更なるデータを、図7において提供する。バーはインビトロでの浸潤アッセイを、LOXアンチセンス、またはセンスのホスホロチオエート修飾されたオリゴヌクレオチドで、またはBAPNで、正常酸素圧の(白色バー)または無酸素の(黒色バー)の温置に先立って処置する細胞を用いて表す。結果は、少なくとも3種の独立した実験的な繰返しを代表する(平均±標準誤差としてプロットする)。
合わせて考慮すると、これらの結果は、酵素的に活性な分泌されたLOXについての、強化されたインビトロでの浸潤における酸素を与えない細胞での役割を実証する。
【０１５８】
三次元のI型コラーゲンゲル類を、再編成(reorganize)し、および収縮する(contract)ための細胞の能力は、浸潤についてのインビトロでのモデルとみなされる。空気において、コントロール細胞は、コラーゲン上で増殖する浸潤性のヒト癌細胞に特有である(typical of)分枝性形態形成(branching morphogenesis)示し、それは、低酸素性によって高められた。LOX shRNA細胞は著しく異なる様式で増殖し、回転楕円体様の細胞集塊において残り、空気または低酸素においてわずかにしか分岐しないことを示した。これらの結果もまた、LOXについての、低酸素性のヒト癌細胞の浸潤性表現型の発達におけるインビトロでの役割を指し示す。
【０１５９】
細胞が遊走し、および侵入することができる前に、運動性の獲得は必要である。浸潤性の細胞の遊走は、アクチンの重合によって導き出される先端(leading edge)での仮足突起(pseudopod protrusion)を用いて始まる(commences)多段階プロセス17であり、接着斑(focal adhesion、接着点)形成、およびインテグリンおよび接着点キナーゼ(FAK)の活性化を招く。細胞外LOXの極めて強い免疫蛍光染色は、コラーゲン上で増殖するMDA231細胞の先端で、特に低酸素性条件において観察された。LOXタンパク質発現は、細胞表面からコラーゲンマトリクス中に突出する毛様線維に沿って拡がった。これはLOX shRNAの細胞において観察されず、それは抗体を含んでいないコントロールに等価な細胞内LOX発現のレベルを示した。張力線維および接着点のinMDA231コントロール細胞の、特に低酸素での増加した形成を有するアクチン細胞骨格の再構築が観察され、それはLOX shRNAを発現する細胞において見られなかった。低酸素性は、コントロール細胞においてFAKリン酸化を追加的に増加させ(活性化)た(以前の報告と一致する)が、LOX shRNA細胞ではそうでなかった。
(例9。フィブロネクチンはLOX作用のために必要ではない)
【０１６０】
フィブロネクチン(FN)についての役割を探求し、それはそれがLOX発現と、分析された胸部癌のマイクロアレイのデータセットにおいて強く関係したからであり(データは示さず)、浸潤を調整することが報告され、インテグリンに対して結合し、およびLOXと相互作用し、および誘導された低酸素性である。しかし、FAKリン酸化も、細胞浸潤も、FNアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる形質移入によって、またはプラズマ(原形質、血しょう性)FN(pFN)または細胞性FN(cFN)(それらはそれぞれ、LOXと相互作用し、および相互作用しない)の追加によって影響を受けなかった。さらに、FAKリン酸化はFN-ヌル細胞において無傷であったが、LOXアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる形質移入によって減少し、それは強く浸潤を抑制した(BAPN添加に対して同様に)。FAKリン酸化は、成熟したLOX(しかし、触媒的に死んだLOXでなく)を用いる形質移入によってLOX shRNAを発現する細胞において、誘導され得、LOXについての役割がFAKリン酸化において確認される。これは、BAPNまたはカタラーゼの添加(最近の報告9と一致する)、またはb1インテグリンに対してのもので、a6インテグリンに対するものではないブロッキング抗体によって妨げられ得るものであった。これらの結果は、LOXについての酵素の役割を、b1インテグリンを通してのFAKの調整において、FNから独立した様式で示す。本明細書は、これが、LOXによって線維性(fibrillar)コラーゲンを増加させるからであることを提唱し、それはb1インテグリンのためのリガンドである。他のインテグリン経路は、低酸素によって誘導された浸潤を媒介することが報告されている。FAK活性の低酸素性コントロール細胞での完全な排除は、双方のβ1インテグリンの活性化および過酸化水素生産(LOX活性の副産物)が妨げられたとき達成され(図8A)、双方のこれらの機構の重要性が低酸素で実証される。
(例10。LOXはコラーゲンおよびMatrigel(マトリゲル)(rtm)細胞基質に対する付着を増加させる)
【０１６１】
増加された付着は間葉系の表現型を有する浸潤性の細胞の特徴であり、およびそれらの運動性のために不可欠である。双方のMDA231およびLOX shRNAを発現する細胞は、コラーゲンI(図8B)およびマトリゲル(Matrigel)に対する減少した付着を示し(データは示さず)、それは成熟したLOXを用いる形質移入上で回復され得るものであった。浸潤性遊走において、増加した付着は付加的に、付着部位に対してプロテアーゼの補充(recruitment)を招く(マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMPs))。MMP-2およびMMP-9の発現レベルは、低酸素によって高められ、以前の報告21と一致し、およびMMP-2およびMMP-14の発現は、LOXと、胸部癌受動体において強く相関したが、LOX発現はMMP活性に影響を及ぼさなかった(データは示さず)。しかし、野生型の細胞およびコラーゲンマトリクス内でLOX shRNAを発現するか、または掻爬アッセイにかけられる細胞のコマ撮り撮影は、LOX抑制が完全に細胞運動を防ぐことを明らかにした。合わせて考慮すると、これらの結果は、FAK活性化を通しての細胞付着上のその影響を通して、細胞運動性においてLOXについての重大な役割を実証する。
(例11。shRNAによるLOX抑制はより一層少数の転移を尾部静脈アッセイにおいて招く)
【０１６２】
尾部-静脈の調査を通した転移の早期の浸潤性工程の排除は、転移の後期段階におけるLOXについての役割を明らかにしたが、即ち、LOX shRNAを発現するMDA 231胸部癌細胞を注入されたマウスは、より一層少数の肺病巣を持った(図9A)。細胞のクローニング効率はコントロール細胞のものに似ていたが、それらの転移性のインビトロでの増殖は、激しく損なわれた(図9B)。これは、大量の増殖を許容し、および支持するのに要求される不完全な細胞-マトリクスまたは細胞外マトリクス(ECM)-タンパク質の相互作用によるものと思われた。本発明者らの正所性の調査において形成される転移性病変が、コントロール細胞を用いて植え込まれたマウスにおいて、shRNA細胞でのものよりも著しく大きく、およびBAPN処置されたマウスにおいて完全に不存在であったという本発明者らの観察が、これと一致する。これらの転移性病変の厳重な検査は、それらがほとんど炎症性の細胞から構成されたことを明らかにした。
(例12：LOX shRNAを発現する腫瘍を負うマウスは、未処置の腫瘍を有するものらを超えて生き残り、および転移を見せなかった)
【０１６３】
ヒト肺癌A549細胞(ATCC CCL 185)は、高度に転移性であることが知られ、方法の項(Methods)で記載するように、LOXを標的とするshRNAが安定して発現されるために生じさせた。RT-PCR分析は、減少したLOX発現を、特に低酸素性(H)の条件(N=正常酸素圧に対し)において明らかにした。1×106細胞を、マウスの尾部静脈中に注入した(すべての細胞は肺まで行く)。図10において見ることができるように、コントロール細胞を有するすべてのマウスは、22日内で死亡した(N=5)。細胞発現のLOX shRNAを有するマウスは、示される実験的な時間を超えて生存した(N=10)。
【０１６４】
コントロールの腫瘍を負う死んだマウスからの肺を、ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、およびH&E染色し、肺腫瘍を定量化した。大部分の肺は腫瘍を含まなかったが、すべてのマウスは数多くのリンパ節転移を持ち、およびあるものは肝転移を持った。LOX shRNAを発現する肺腫瘍を負うN=5マウスは、デイ(Day)22で犠性にされた。これらのマウスは、転移ではないが、肺に数多くの腫瘍を持った。加えて、毎日のBAPN(100mg/kg)で処置されるコントロール腫瘍を負うn=5マウスは、デイ22で犠性にされた。これらのマウスは、非常に少数の腫瘍しか持たず、および転移性でなかった。A549のコントロール動物についての肺腫瘍の数は低く、それは腫瘍が肺から転移したと信じられるからである。BAPN処置された群における腫瘍の数は低く、それは、BAPNが、腫瘍細胞死を招き、一次腫瘍の増殖並びに転移性の増殖上のLOX抑制の効果を示すからである。図11の差し込み図は皮下の腫瘍(0日での1×106細胞)として増殖するコントロールおよびshRNAの細胞の増殖率を示し、それは双方の細胞系について同じであった。図11は、shLOX腫瘍における肺腫瘍の数が、未処置の腫瘍またはBAPNで処置される腫瘍におけるよりも著しく高いと思われることを示す。
(例13：LOXL-2およびLOXL-4のタンパク質はまた、細胞浸潤および転移に係わる)
【０１６５】
別の実験において、LOXL-1、LOXL-2、LOXL-3およびLOX-4の発現レベルを、通常、および低酸素性の条件の下で、RT PCR分析およびブロットのイメージング(画像処理)によって検査した(データは示さず)。BAPNがまた、リジルオキシダーゼ様のタンパク質、(LOXL 1-4)を抑制することもできるので、本発明者らは、それらの発現レベルおよび低酸素性の反応性を、MDA 231ヒト胸部癌細胞およびSiHaヒト頸部癌細胞において研究した。RT-PCR分析は、LOXLs 1+2の低い発現、LOXL-3の高い発現、およびLOXL-4の中程度の発現を明らかにした。LOXLタンパク質のどれも、低酸素性誘導を示さなかった。
【０１６６】
インビトロでの浸潤アッセイを、方法の項において記載したように、および図6と関連して記載したように遂行した。LOXL-1、2、3および4を、通常の、および低酸素性の条件の下で調査した。低酸素性の条件は、LOXアンチセンスを用いて処置される野生型細胞の侵襲性を増加させることが見出された。また、shLOXL-2およびshLOXL-4の細胞、即ち、LOXL-2またはLOXL-4に対するベクターを持つものにおいて、野生型LOXL-2またはLOXL-4の細胞と比較して、相違は見られなかった。
【０１６７】
掻爬アッセイを、LOXL-1、LOXL-2、LOXL-3、およびLOXL-4のアンチセンスで処理された細胞の細胞遊走を検査するために実行した。微視的に検査されるように、shLOXL-4だけが、創傷修復における軽微な欠陥を示した。また、胸部癌の正所性腫瘍モデルにおいて、LOXL-2およびLOXL-4に対するshRNAを用いる処置は、転移の形成を防止した。
LOXL-2およびLOXL-4は、このようにして、腫瘍の増殖および転移においてLOXのものに似ていると思われる役割を演ずる。
(例14。LOXに対するマウス単クローン性抗体)
【０１６８】
方法の項に与えるペプチドは、ラビットを免疫化するのにそれが用いられ、マウスを免疫化するのに用いられる。BALB/cマウスは、160mgの精製されたペプチドを用いて注射される。初期の注射のために、ペプチドを、Freund's(フロイントの)完全なアジュバントと混合し(1:1)、および皮下に注射する。その後には、注射は、腹膜内にアジュバントの不存在において行う。LOXに対する血清抗体は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって定められ、そこでは全長LOXタンパク質がポリスチレンプレートに結合する。7ヵ月の期間にわたる9つの免疫化の後、LOXに対して指向される高タイター(力価)の抗体を有する1種のマウスの脾臓を除去し、およびP3U1マウス形質細胞腫の細胞系の細胞と融合させる。結果として生じるクローンは、ELISAアッセイにおいてLOXおよびLOXの触媒ドメインを結合するそれらの能力についてスクリーニング(選別)する。LOXの触媒ドメインとの反応性を有するハイブリドーマ生成抗体を、分離(単離)し、およびサブクローン化する。このハイブリドーマは、組織培養媒体において増殖し、ならびに腹水においてLOX抗体の供給源として働く。
(例15。LOXに対するヒト単クローン性抗体)
【０１６９】
EP 0239400(Winter et al.)において記述されるように、上述のマウスモノクローナルでは、その相補性決定性領域(CDRs)をヒトモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体断片中に置換することによって変えられる。ヒトの重鎖および軽鎖のIg可変領域ドメインからのCDRsを、ネズミの可変領域ドメインからの代わりのCDRsによる。これらの変えられたIg可変領域は次いで、創作された抗体に対するヒトIg定常領域と結合し得、それらは、置換されたネズミのCDRsを除いて組成において全体としてヒトである。そのようなCDR置換された抗体は、キメラ抗体と比較してヒトにおいて免疫反応をあまり誘発しそうでないと予測され、それは、CDR置換された抗体が著しく少ない非ヒト成分しか含まないからである。CDR“グラフティング(接ぎ合わせ、移植)”を介して単クローン性抗体をヒト化するためのプロセスは、“リシェーピング(再形成)”と呼ばれている。(Riechmann et al. 1988年、Nature 332：323-327, “Reshaping human antibodies for therapy(処置のためのヒト抗体の再形成)”、Verhoeyen et al.、1988年、Science 239：1534-1536、“Reshaping of human antibodies using CDR-grafting in Monoclonal Antibodies(ヒト抗体の、CDR接ぎ合わせを用いる単クローン性抗体における再形成)”。
【０１７０】
ネズミLOX抗体CDRsの移植(上記、Burbelo et al.(1986年)において記述されたネズミ単クローン性抗体からのCDRsのようなもの)は、CDRのDNA配列がネズミの重鎖および軽鎖の可変(V)領域遺伝子セグメントのクローン化により定められる遺伝子工学によって達成され、および次いで対応するヒトV領域にまで部位指向的突然変異誘発によって移される。プロセスの最終的段階において、望ましいアイソタイプのヒトの定常領域遺伝子セグメント(通常、CHのためのガンマIおよびCLのためのカッパ)を添加し、およびヒト化された重鎖および軽鎖の遺伝子は、可溶性のヒト化抗体を生産するために、哺乳類の細胞において同時発現させる。
【０１７１】
ヒト抗体に対するこれらのCDRsの移行は、この抗体上に元のネズミ抗体の抗原結合特性を与える。ネズミ抗体における6種のCDRsは、V領域の
“フレームワーク”領域上に構造的に装着される。CDRsの接ぎ合わせが成功する理由は、マウスおよびヒトの抗体の間のフレームワーク領域が、CDRsの交換ができるように、CDRSのための付着の似た点を有する非常に似た3-D(三次元)構造を持ち得ることである。そのようなヒト化抗体の相同体(ホモローグ)は、Jones et al., 1986年 Nature 321: 522-525, “Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse(ヒト抗体における相補性決定領域のマウスからのものでの置換)”、Riechmann、1988年、Nature 332:323-327、“Reshaping human antibodies for therapy”、Queen(クイーン) et al.、1989年、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:10029、“A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor(インターロイキン2受容体に結合するヒト化抗体)”およびOrlandi(オルランディ)et al.、1989年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833“Cloning Immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction(免疫グロブリンの可変ドメインの発現のためのポリメラーゼ連鎖反応によるクロンーン化)”において例証されるようにして調製し得る。
【０１７２】
なお、フレームワーク領域内の一定のアミノ酸は、CDRsと相互作用し、および全体的な抗原結合性の親和性に影響を与えると考えられる。ヒトのV領域のフレームワークの任意の修飾も伴わないヒト化抗体を生産するために、CDRsの、ネズミ抗体からの、直接の移行は、結合性の親和性の部分的または完全な損失を招くことが多い。このように、結合性の活性を得るために、アクセプター抗体のフレームワーク領域における残基を変えることが望ましいことがある。
【０１７３】
Queen et al.、1989年、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033、“A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor”およびWO 90/07861(Protein Design Labs Inc.(プロテイン・デザイン・ラボズ社)は、ヒト化抗体の調製を記述し、それは、修飾された残基をアクセプター抗体のフレームワーク領域において含み、それはネズミmAb(抗Tac)のCDRsをヒトの免疫グロブリンのフレームワークおよび定常領域と組み合わせることによってである。彼らは、1種の解法を実証し、それは、結合性の親和性の損失の問題に対してのもので、直接的なCDR移行からヒトのV領域のフレームワーク残基の任意の修飾を伴わないで招かれ、それらの解法には、2種のキーの(鍵となる)工程が包含される。まず、ヒトのVのフレームワーク領域を、この場合に、抗Tac MAbで、元のネズミ抗体のV領域のフレームワークに対する最適なタンパク質配列相同性についてコンピュータ分析者によって選ばれる。第2の工程では、ネズミV領域の第三構造を、フレームワークアミノ酸残基を視覚化するためにコンピュータによってモデル化し(modeled)、それは、ネズミのCDRsと相互作用するであろうし、およびこれらのネズミのアミノ酸残基は次いで、相同のヒトのフレームワークの上に重ねられる(superimposed on)。推定のネズミの接触残基を有する相同のヒトフレームワークを採用することによる彼らの取組みは、インターロイキン2受容体に関し(Queen et al.、1989年[上記])、およびまた、単純疱疹(ヘルペス)ウイルス(HSV)に特異的な抗体について(Co.(コー) et al., 1991年, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 2869-2873, “Humanised antibodies for antiviral therapy(抗ウイルス療法のためのヒト化抗体)”)の、元のネズミ抗体に対する似た結合性の親和性を有するヒト化抗体を招いた。
【０１７４】
このヒト化の手法の更なる詳細は、Winter et al.への米国(特許)第4,816,567号明細書、Boss(ボス)et alへの米国(特許)第4,816,397号明細書およびCabilly(カビリー)et al.への米国(特許)第4,816,567号および米国(特許)第4,816,567号明細書に与えられ、それらのすべてはこの技術における者に既知であり、および特に参照することにより例証される調製を記載する目的のために組み込む。
(例16。LOX抑制は、多数の異なる細胞種類における転移性腫瘍の増殖を防ぐ)
いくつかの異なる細胞種類を用いて行う実験の結果を、次に簡潔に記載する。
【０１７５】
膵臓のもの：LOX shRNAを発現するPanc-1ヒト膵臓細胞(ATCC CRL-1469を参照)を、それらの転移性増殖をコントロールPanc-1細胞のものと比較する尾部静脈転移アッセイにかけた。胸部癌細胞と同じ効果が観察され、即ち、LOX shRNAを発現する細胞で注射されたマウスは、より一層少数の肺病巣を持った(微小転移巣(micro-metastase))を持った。
【０１７６】
頸部のもの：尾部静脈転移アッセイを、Caskiのヒト頸部癌細胞(CRL-1550を参照)を用いて実行した。4週の増殖の後、半分のマウスをBAPNで処置した。これは、任意の肺病巣(微小転移巣)の形成を排除した。
【０１７７】
結腸：HCT116のヒト結腸癌細胞(CCL-247を参照)は、LOX shRNAを発現させるために形質移入し、およびヌードマウスにおいて皮下の腫瘍として増殖させ、その一方、それらの増殖をコントロール細胞のそれと比較した。双方の腫瘍種類のものは、同じ速度(率)で増殖した。しかし、4週以内に、コントロール腫瘍を負うすべてのマウスは死亡し、および広範囲にわたる転移を、特にGIトラクト(胃腸管、消化管)において表示した。対照的に、LOX shRNAを発現する腫瘍を負うマウスは、プロトコルによって許される最大のサイズに達したときに実験が終了されるまで生き残った(1000mm3)。これらのマウスは転移を表示しなかった。
【０１７８】
加えて、図7において示すように、LOX抑制は、いくつかの他の癌の種類、即ち、Head ＆ Neck(頭頸部)、Melanoma(メラノーマ)、Colon(結腸)、Pancreatic(膵臓)、Lung(肺)およびRenal(腎臓)の低酸素性細胞のインビトロの浸潤を防ぐことが、本明細書において示されていることに留意すべきである。
(例17。癌に苦しめられる動物の生存)
【０１７９】
野生型またはLOX shRNA A549非小細胞肺癌細胞を、免疫不全マウスの尾部静脈中に注射し、および181日の期間の間の生存(率)の相違について分析した。野生型腫瘍を有する動物の100%は、LOXに対するshRNAを用いて安定的に形質移入された動物の40%だけと比較して、35日以内に死亡した。若干の動物は、転移を発達させるために2週間を見込まれ、および次いで、未処置のままか、または週2回LOX抗体の2mg/kgを用いて例7において処置された。図12は、動物の生存を示すカプラン-マイヤープロットである。図12において示すように、すべての未処置の動物は日35までに死んだが、loxのAbで処置した動物のどれも転移により死ななかった(died of metastases)。これらのデータは、群につき少なくとも5体の動物を表す。
【０１８０】
野生型またはLOX shRNA HCT116結腸直腸癌細胞を、免疫不全マウスの尾部静脈中に注射し、および生存の相違について70日の期間にわたり分析した。図13は動物の生存を示すカプラン-マイヤープロットである。図13に示すように、未処置の動物の100%は、転移からの無死と比較して、動物のshRNA LOX HCT116の群において、注射の後、日25までに死亡した。
【０１８１】
Caski頸部癌細胞を、免疫不全マウスの尾部静脈中に注射し、生存の相違について分析した。転移を2週の間、動物が最高40日の間、毎日100mg/kgのBAPNで処置される前に、形成させておいた。図14は動物の生存を示すカプラン-マイヤープロットである。図14で示すように、これらの条件の下で、動物の100%は生存した。BAPN処置の停止(discontinuation)により、動物は死に始めた。90日後、BAPN処置を施され、および既に転移を隠された(harbored)それらの処置された動物が、処置されず、および死んだそれらの動物と比較して、安定化された。
【０１８２】
図15A-Dは、膵臓腫瘍の正所性植え込み(orthotopic implantation、同所植え込み)(図A-C)を免疫不全マウスにおいて、および肝臓へのそれらの転移を実証する像である(図D)。正所性植え込みは、腫瘍細胞を直接的にマウス膵臓中に注射することによって達成された。
【０１８３】
免疫不全マウスにおける正所性腫瘍は、未処置のままであったか、または週2回、4週間2mg/kgのLOX Abで処置されたかのいずれでもあった。図16は、動物の生存を示すカプラン-マイヤープロットである。図16に示すように、LOX抗体で処置される例7での動物の100%は、15週において死んだすべての未処置の動物と比較して生存した。
【０１８４】
図17A-CはLOX shRNA、例7においてLOX抗体またはBAPNで処置された、および未処置のマウスからの肺の像であり、転移上のLOX処置の効果を肺において示す。図17A-Cおよび図17Dは、肺および骨転移の安定化した病気または退行のいずれをもそれぞれ示す。
【０１８５】
野生型またはLOX shRNA A549 非小細胞肺癌細胞は、正所性に免疫不全マウス中に植え込まれ、および250日の期間の間、生存の相違について分析された。図18は、動物の生存を示すカプラン-マイヤープロットである。図18に示すように、野生型腫瘍を有する動物の100%は、LOXに対するshRNAで安定的に形質移入された動物の70%と比較して、60日以内に死んだ。若干の動物は転移を発達させるために2週間を見込まれ、および次いで、未処置のまま、または週2回LOX抗体の1mg/kgで例7において処置された。すべての未処置の動物は日60までに死んだが、loxのAbで処置された動物のどれも転移により死ななかった。これらのデータは、群につき少なくとも3体の動物を表す。
(例18。低酸素性腫瘍細胞によって転移性腫瘍細胞のためのニッチの形成において分泌されるリジルオキシダーゼの役割)
【０１８６】
上述したように、腫瘍細胞におけるLOXの発現は、低酸素性の生理学的に関連したレベルによって増加され、および発現の抑制および分泌されたLOXの酵素活性は、転移を胸部癌の正所性モデルにおいて排除した。興味あることに、正所性に植え込まれたヒト胸部腫瘍細胞を負うマウスの血液におけるLOX活性は、肺性の転移性病変の形成と共に減少する(図19A)。これらのデータは、本発明者らが、低酸素性腫瘍細胞から分泌される循環性LOXに応じた転移病巣の形成および増殖を調査することを促した。
【０１８７】
増加した循環性LOXレベルによる転生部位での腫瘍細胞病巣の増殖上に及ぼす影響が、一次腫瘍からの転移の初期工程から独立していたかどうかを定めるために(Steeg(スティーグ)(2006年)Nat. Med.(ネイチャー・メディシン)12:895-904)、本発明者らは、静脈内に、LOX-標的化(ターゲティング)shRNAまたはスクランブルされたコントロール配列(Wt)のいずれかが発現されるMDA231のヒト胸部癌細胞を注射した。本発明者はまた、循環性LOXを提供し、それは、低酸素性(H)または正常酸素圧(N)の条件に対してインビトロで24時間曝されるWtまたはLOX shRNAの細胞からの馴化媒体(CM)の毎日の腹腔内注射による。低酸素性Wt細胞からの馴化媒体は、好気的Wt細胞および低酸素性LOX shRNA細胞からのCMと比較してLOX活性のレベルを十分に上昇させた。好気的LOX shRNA細胞からのCMは、最も低いLOX活性を持った(図19B)。
【０１８８】
本発明者らは、LOX活性を、マウスの血液において、14日間の毎日のCM注射の後、測定し(図19C)、および低酸素性Wt CMの注射が、LOX活性を、非腫瘍を負うマウスの循環において著しく増加させることを見出した(図19D)。しかし、循環性LOX活性は、自然なレベルで、腫瘍細胞の静脈注射の後よりも低くにまで、継続的なCM投与または注射された腫瘍細胞の種類に関係なく、減らされた(図19D)。通常の循環性LOX活性レベルは、低酸素性LOX shRNA CMが投与されるとき有意に変化しなかった(図19D)。肺組織を検査する際、本発明者らは、腫瘍細胞病巣と関係する領域において、低酸素性Wt CMを注射されるマウスで強いLOX染色を観察した(図19E)。重大なLOX染色は、低酸素性LOX shRNA CMの注射後に観察されなかったが、Wt腫瘍細胞病巣は、局所のLOX染色を生成させた。合わせて考慮して、データは、LOXが肺の転移病巣と関係すると見出されたこと、およびLOXレベルが腫瘍細胞注射の後、外因性LOXが循環中に供給されるときでも、血流において減少したことを指し示す。
【０１８９】
高いLOX活性を有するCMの注射(低酸素性Wt細胞から)は、shRNA腫瘍細胞からの肺病巣の増殖を支持することができ(図19F-G)、酵素的に活性なLOXが、循環において、典型的に非転移性の腫瘍細胞からの腫瘍細胞病巣の増殖を増進するのに十分であったことを実証する。低酸素性LOX shRNA細胞からのCMは、病巣の増殖に影響を及ぼさず(図19F-G)、およびLOX活性の小分子抑制物質(ベータアミノプロプリオニトリル、BAPN)または例7におけるLOX抗体のいずれでも、処置は、病巣形成を縮小させた。Wt腫瘍細胞によるLOXの局所的分泌は、Wt病巣の増殖を、外因性の循環性LOXの不存在において持続することができたが、より一層大きな病巣が、低酸素性Wt CMからの循環性LOXが供給されるときに存在した(図19F-G)。循環性LOXレベルがマウスにおいて一次腫瘍からの転移の形成に先立ち最も高いので(図19A)、本発明者は毎日CMを2週間、静脈内の(i.v.)腫瘍細胞注射に先立って注射した(図19B)。興味あることに、転移の病巣はより一層大きく、およびLOXを含むCMで“予備処置された”マウスにおいてより一層豊富であり、LOXが転移性病巣の増殖に、腫瘍細胞が到達する前に影響を与えることを指し示す。
【０１９０】
腫瘍が分泌したLOXがBMDCsのクラスター形成に肺性の転移の部位で関与するかどうか定めるために、本発明者は、BMDCの時間にわたってのクラスター化を用いるLOXおよびFNの染色を、MDA231のヒト胸部腫瘍細胞で正所性に植え込まれたマウスにおいて評価した。本発明者らは、肺のFN染色を3日の腫瘍植え込み後で見出し、それは日7までで非常により一層強かった(図20A)。対照的に、本発明者らは、低いLOX染色を日3で観察したが、重大なLOX染色が植え込み後1週間に終端の細気管支および遠位肺胞(転移の双方の共通部位)で見出された。LOX染色は、次の2-3週にわたって強まった。LOXおよびFN染色の領域におけるBMDCsの蓄積は、植え込み後3週間で観察され、および腫瘍細胞を週4で含む別個の病変を形成した(図20A)。併せて考慮すると、これらのデータは、正所性MDA231腫瘍からの肺性の転移の形成において、増加されたFN発現が血液からのLOX結合性に先行し、および次いでその後の腫瘍細胞到達でのBMDC補充が続くことを示唆する。
【０１９１】
本発明者らは次いで、低酸素性腫瘍細胞からの循環性LOXの高められたレベルがBMDC補充および転移のニッチの形成に影響を及ぼすことができるかどうか定めた。本発明者らは、雄性の骨髄細胞を雌性のマウス中に、WtまたはLOX shRNA MDA231細胞を正所性に植え込む前に移植し、およびBMDC補充を研究するために、Y染色体に特異的なプローブと共にインサイツハイブリダイゼーション(ハイブリッド形成)を用いた。本発明者らは、一次腫瘍形成に2週間を見込み、および次いで、マウスを、循環性LOXの異なるレベルを用いて4週の間、毎日の腹膜内CM注射によって補充した(図20B)。Wt腫瘍を負うマウスは、大多数の肺の転移を表示し、それは循環性LOXの補足と共にCM注射を通して増加しなかった(図20C)が、例7においてBAPNまたはLOX抗体での処置によって排除された。対照的に、LOX shRNA腫瘍を負うマウスは、有意により一層少数の転移性病変を形成したが、この数は有意に、低酸素性Wt細胞からのCMの多重の注射の後に増加した(図20C)。低いLOX活性を有する細胞からのCMの注射は、病変形成に有意に影響を及ぼさなかった(図20)。重要なことに、低酸素性Wt細胞からのCMに応じてのLOX shRNA腫瘍細胞の転移における増加は、BAPNを用いる処置によって妨げられ、それは、CMにおける分泌されたLOXであり、それは転移性の増殖にとって不可欠であることを実証する。
【０１９２】
転移性病変の免疫蛍光染色は、腫瘍細胞が、Wt腫瘍を負うマウスの肺で、注射されるCMに関係なく、BMDCsと強く関係したことを明らかにした(図20D)。腫瘍細胞を有するBMDCsの関連付けはまた、低酸素性Wt細胞からのCMを用いて、しかしLOX shRNA細胞からのCM(図20D)を用いるのでなく、またはLOX抑制を用いるのでなく、注射された低酸素性LOX shRNA腫瘍を負うマウスにおいて観察された。これらの細胞の骨髄由来の供給源は、Y染色体特異的な蛍光プローブを用いて実証された(図20E)。
【０１９３】
図20Bにおいて示される実験からの転移性病変の免疫蛍光染色は、LOXおよびFNの強い共局在(co-localization)を、Wt腫瘍を負うマウスの肺において、CM注射に関係なく明らかにした(図21A)。FN染色の領域はまた、LOX shRNA腫瘍を負うマウスの肺においても観察されたが、LOX同時染色は、これらのマウスが低酸素性Wt細胞からのCMを用いて注射されたときに観察されるだけであった(図21A)。これらのデータは、図2Aにおいて提示されるデータと共に考慮され、強い肺のFN染色の“パッチ(patches、継ぎ)”がLOXから独立していること、および循環におけるLOXが予備転移性の部位でのFNと関係することを示唆する。
【０１９４】
LOXレベルがBMDCsの遊走または浸潤に影響を及ぼしたかどうか定めるため、本発明者らは、インビトロでの浸潤アッセイを、化学誘引物質としてCMを用いて実行した(図21B)。BMDCsの遊走は、FNによって、LOXに関係なく増やされた。対照的に、BMDCsの浸潤の能力は、LOXを含む低酸素性Wt CMが化学誘引物質として、FNを伴って、または伴わずに用いるとき、強く増やされた(図21B)。重要なことに、低酸素性LOX shRNA細胞からのCMは、BMDCの浸潤を強化せず、および低酸素性Wt CMを用いて観察される増やされたBMDCの浸潤は、BAPNを用いるLOXの化学的な抑制を通して防止することができた(図21B)。
【０１９５】
本発明者らは、CMによって誘導されるBMDC MMP活性における変化を検査した(図21C)。MMP-9活性は、LOXまたはFNの単独によって影響を及ぼされなかったが、FNを補足されたCMにおいて、LOXの状況に関係なく高められた。これは、FNがLOXより強い影響をBMDCの遊走上に持つという本発明者らの知見と一致する。本発明者らは、MMP-2活性レベルが低酸素性のWt細胞からのCMと共に温置されるBMDCsにおいて増加することを知見した。MMP-2活性は、BAPNでのLOX抑制によって減らされ、および低酸素性LOX shRNA細胞からのCMはBMDC MMP-2活動を増やさず、MMP-2の活性化におけるLOXについての役割を意味付ける。興味あることに、抑制されたLOXを含むCMへのFNの添加は、MMP-2活性レベルを回復させた。これらの結果は、LOXがFNおよび胸部癌受動体においけるMMP-2発現と強く関係するという本発明者らの以前の知見と一致する。これらのデータは、予備転移性のニッチの形成におけるLOXについての役割を、FNとの相互作用を通して指し示し、BMDCの補充およびそれに次ぐ腫瘍細胞補充を許す増加されたMMP活性を招く。
【０１９６】
本発明者らはまた、LOXおよびFNの化学誘引物質の特性を、インビボにおいてBMDCsを定量化することによって研究し、それは皮下に植え込まれるCM浸漬されたマトリゲル(Matrigel)のプラグをマウスにおいて浸透させた。マウスにおけるBMDC蓄積は、低酸素性Wt CMまたはFNを用いて浸漬されるプラグにおいて増やされ、および双方を用いて浸漬されるプラグにおいて最も高かった(図21D)。このようにして、LOXを含むCMは、BMDCsのための化学誘引物質としてインビトロおよびインビボの双方において振舞うことができ、およびこの誘引はFNによって強化される。
【０１９７】
LOXが分泌されたタンパク質であり、およびLOX活性のレベルが血液において検出することができるので(Murawaki(ムラワキ)et al.(1991年)Hepatology(ヘパトロジー)14：1167-73)、本発明者らは、LOX酵素の活性を前立腺癌を有する患者から収集される血しょうにおいて測定し、およびそれを健康な対象物におけるレベルと比較した。本発明者らのマウスのデータと一致し、それは一次腫瘍植え込みの後、増加した時間を有する減少した循環性LOX活性を指し示し(図19A)、本発明者らは、転移性前立腺癌を有する患者が、健康な対象物または非転移性前立腺癌患者とそれぞれ比較しておよそ5倍および3倍、循環性LOX活性のレベルの縮小を持つことを見出した(図22A)。さらに、5年の治療後無病の患者における循環性LOX活性は、健康な対象物と有意に異ならなかった(図22B)。これらのデータは、循環性LOX活性レベルが、転移性の病気および処置への反応のための有用な予後指標を表すことができ、それは、特にあるものが一次腫瘍生検のセクションにおいてLOX染色を評価することに対して比較される血液を収集し、および試験することの相対的な容易さを考慮するときであることを示唆する。本発明者らはまた、ステージ(段階)IIIおよびIVの頭頸部癌を有する患者の血液においてLOX活性のレベルを測定し、およびLOX活性のレベルおよび生存、特に病気特有の生存の間の有意な関係を見出した(図22C)。このように、一次腫瘍における低酸素性および一次性腫瘍におけるLOX染色の高レベルに応じてのLOX発現の増加は、乏しい生存と関係する一方、本発明者らのデータはまた、血液におけるLOXの酵素活性が転移の発達と共に減少することを示唆し、それはLOXが予備的な転移性のニッチの必須の成分だからである。本発明者らのデータは更に、転移性癌の処置および防止のために低酸素性誘導され分泌されたLOXを標的にすることを支持する。
(IV。方法)
(細胞培養および酸素欠乏)
【０１９８】
ATCCから得られる細胞系を日常的に培養し、および以前記載した47ように、酸素を18時間の間奪った。DsRed SiHa細胞はN. Dornhofer(ドルンホファー)からの贈呈物であった。アクチノマイシンD(5μgml-1)、デスフェリオキサミン/CoCl2/バソキュプロインジスルフォニック(bathocuproinedisulphonic)酸/カタラーゼ(100mM)およびBAPN(200mM)を所定の濃度で用いた(Sigma(シグマ社))。
(遡及的(Retrospective)臨床調査)
【０１９９】
各胸部癌試料における平均的低酸素性のスコア(得点)は、LOXを伴わない低酸素性遺伝子サインを備えるすべての122のユニーク(独特)なユニジーン(Unigene)クラスターの発現値を平均することによって、以前に記載するように算出した。平均された低酸素性スコアおよび各胸部癌試料におけるLOX発現間の相関関係を次に算出した。カプラン-マイヤープロットのため、LOX発現レベルを、記載するように定め、頂部分および底部分の段(tiers)をプロットした。
(免疫学調査)
【０２００】
方法を前述のように実行した。用いる一次抗体は、HIF-1α(BD Transduction Labs(トランスダクション・ラボズ社))、α-チューブリン(Reaerch Diagnostics(リサーチ・ダイアグノスティックス社))、およびphoshpho(ホスホ)-FAK(Santa Cruz(サンタクルス))であった。LOXを、ヒトのLOXの合成ペプチドに対して生じさせた(raised)ラビット多クローン性抗体を用いることによって分析した(EDTSCDYGYHRRFA(配列番号1)、Open Biosystems(オープン・バイオシステムズ社))。低酸素性領域は、Pimonidazole(ピモニダゾール)のための染色によって識別した。LOX免疫ブロットのために、馴化媒体におけるタンパク質を、Microcon(マイクロコン)のフィルタ(Millipore(ミリポア社))を用いて濃縮し、20mlの試料を負荷した。定量化を、ImageQuant(イメージ・クワント)のソフトウェアを用いて実行した。
(半定量的な、および十分に定量的なRT-PCR分析)
【０２０１】
方法を、以前に記載したように実行した。LOXのためのTaqman(タックマン)PCRプライマー配列は、以下の通りであった、即ち、ATGAGTTTAGCCACTTGTACCTGCTT(配列番号2)およびAAACTTGCTTTGTGGCCTTCA(配列番号3)である。
(LOXプロモーターの低酸素性反応性)
【０２０２】
ルシフェラーゼアッセイを以前記載したように実行した。製造者の指示に従って、LOXプロモーター配列を、部位指向的突然変異誘発(Stratagene)によって変異させた。5種の低酸素反応性要素(HREs)を含む陽性コントロールを追加的に用いた。
(細胞の一時的な、およびレトロウイルスによる形質移入)
【０２０３】
センスまたはアンチセンスのホスホロチオエート修飾されたLOXに特異的なセンスまたはアンチセンスのオリゴヌクレオチド(Integrated DNA Technologies(インテグレーテッドDNAテクノロジーズ社))を用いる細胞の処置は、以前に記載したように実行した(ref.(参考文献)29)。HIF-1酸素依存性分解(ODD)ドメインおよびプロリン二重変異体の構築物は、D. Chan(チャン)の贈呈物であった。成熟したLOXおよびLOXデルタキャット変異体(触媒的ドメインを欠く)は、A. Di Donato(ダイ・ドナート)からの贈呈物であった。HIF-1αshRNA構築物は、Erler et al. “Hypoxia-Mediated Down-Regulation of Bid and Bax in Tumors Occurs via Hypoxia-Inducible Factor 1-Dependent and -Independent Mechanisms and Contributes to Drug Resistance(ビッドおよびバックスのタンパク質の腫瘍における低酸素媒介下方調整は低酸素誘導因子１の依存及び非依存の機構を介し引き起こされ、および薬物耐性に寄与する)”Molecular and Cellular Biology、2004年4月、p. 2875-2889、Vol. 24、No. 7において記載される。すべての一時的な形質移入は、Lipofectamine(リポフェクタミン)2000(Invitrogen(インビトロゲン社))を、製造者の指示に従って用いて遂行した。形質移入効率を、GFP発現ベクターを用いる同時形質移入を介して各細胞系について定め、それはほぼMDA 231および435の細胞のための90%、および50%であった。
【０２０４】
MDA-MB 231およびSiHaのヒト癌細胞を、pBabeベクターを用いレトロウイルス的に形質移入し、それはLOX特異的ターゲティング(標的性)配列(5’-GTTCCTGCTCTCAGTAACC-3’(配列番号4))を含む。この配列は、特異性を確認するために、データベースに対して点検された(checked)。陰性コントロールとして、スクランブルされた配列を用いた(5’-CACATGTTCCGATCTCGGC-3’(配列番号5))。感染させた細胞を、ピューロマイシン(Sigma)においていくつかの週の間選定し、および次いで多クローン性細胞集団を減らされたLOX発現レベルについて試験した。pBABEベクターは更に、Spicher(スピッシャー)et al.のRef. 49で記述される。
(インビトロ浸潤分析)
【０２０５】
浸潤性の挙動をインビトロにおいて以前記載したように検査した。簡潔には、細胞を、24時間血清欠乏させ、次いで2.5×104個の細胞をマトリゲルで被覆した挿入物および被覆してない挿入物の双方上で3通りに接種し、化学誘引物質として750μLのFBSを含むチャンバに対して動かし、および正常酸素圧または酸素欠乏させた条件において24時間の間温置した。ベータアミノプロプリオニトリルまたはバソクプロイン(bathocuprione、bathocuproine)二硫酸塩(Sigma)を用いる処置を24時間、血清欠乏に先立ち実行し、および実験の間中続けた。
【０２０６】
付着フリーのおよび3Dの細胞の増殖を培養物において評価する。単分子層増殖曲線のため、細胞を平板培養し(プレートし)、および血球計を用いて各々の日で計数した。マトリゲルおよびI型コラーゲン(双方はBD Biosciences)における3D増殖を、以前に記載したように実行した。簡潔には、2×104個の細胞を播種し、および4日の温置(コラーゲン)に先立つ3日の間、または単純に正常酸素圧または低酸素性の10日(マトリゲル)の間増殖させた。
(インビボでの尾部静脈転移アッセイ)
【０２０７】
LOX siRNAまたはスクランブルされたコントロール配列を発現するMDA 231細胞を、5×105個の細胞を用い0.1mLのDMEMにおいて静脈内に尾部静脈を介して注射した。合計10体のマウスを、細胞系につき注射した。注射の４週間後、マウスを安楽死させた。肺病巣の微視的な定量化を、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色される、ホルマリン固定、パラフィン包埋された肺の代表的な横断面上で実行した。マイクロ(微小)転移(大核(large nuclei)を有する4種のヒト細胞の最小値)の正しい識別は、正式の(board-certified)獣医学の病理学者によって快く確認された。
(正所性の腫瘍としてのMDA-MB231細胞の増殖)
【０２０８】
MDA-MB231細胞を、6週間の年長の(old)雌性のNude(ヌード)(nu(ヌー)/ヌー)マウス、次いで皮内の0.1mLのPBSにおける1×107の細胞の乳房の脂肪パッドへの注射において皮下の正所性腫瘍として増殖させた。マウスを犠牲にし、および腫瘍を接種後、6週で切除した。若干のマウスを2週間、毎週最高20mg kg-1の精製されたLOX抗体を用いて、接種後の2週間で、または、毎日100mg kg-1のBAPN(腹腔内に)、最後の4、3または2週の腫瘍の増殖の間処置した(4、3および2週間のBAPN、それぞれで、これらの用量および持続期間は有害な副作用を持たない)。肺および肝の転移は、少なくとも25の細胞の肉眼的病変(gross lesions)として規定された。ヒト腫瘍細胞の存在は、サイトケラチン染色によって確かめられた(示していない)。
【０２０９】
LOX活性アッセイ。原法は、Folgelgren(フォルゲルレン)et al.のJ. Biol. Chem. 280：24690-24697(2005年)に記述される。インビボでのデータについて、ターミナルの(末端)出血を、上述の実験終了時に、未処置の(コントロールの)マウスの、2および3の週のBAPNマウス、および抗体で処置したマウスから採取した。血しょう(10mL)を試験し、および蛍光(LOX活性の測定値)をプロットし、そこでは、0 =試料t500μMのBAPN(完全なLOX抑制)である。インビトロでのデータのために、馴化したフェノールレッドフリーの媒体の50のμLを、低酸素の条件下で24時間温置される細胞から採取した。試料を、BAPNの異なる濃度と共に、または精製されたLOX抗体を20mg kg-1の用量と等価な濃度と共に37℃で一昼夜温置した。再び、0=500μMのBAPNの蛍光の読みである。活性は、好気的な、およびLOX shRNAを発現する細胞からのCMにおいて、または腫瘍を負わないマウスからの血液において検出することができなかった(データは示さない)。
【０２１０】
(付着アッセイ)
MDA231細胞のために、即ち、2.5×105の細胞を、無血清媒体においてコラーゲン被覆された96ウェル(穴)プレートで平板培養した。付着細胞を、トリプシン処理し、および血球計を用いて8時間の時間的経過にわたって計数した。DSRED SiHa細胞のために、即ち、2.5×105の細胞を、無血清媒体において平板培養し、および付着させた。ウェルを洗浄し、および媒体をPBSで、特定の時間で8時間の時間的経過にわたって入れ替え、その後蛍光を測定し、および付着細胞の数を標準曲線から定めた(2.5×103から5×105までの個数の細胞を伴い発生する)。
【０２１１】
(例18における骨髄移植)
ヌード(ヌー/ヌー)6週間の年長雌性マウスを、致死的に照射し(950ラド)、およびヌード(ヌー/ヌー)雄性マウスの脛骨および大腿から48時間後に分離された106個の骨髄細胞を用いて移植した。4週間後、shRNAを標的とするLOXまたはスクランブルされたコントロール配列のいずれかを発現する107のMDA231ヒト胸部癌細胞を、正所性に乳房の脂肪パッドにおいて植え込んだ。
【０２１２】
(例18における免疫学的調査)
組織を固定し、およびOCT(組織-Tek)またはパラフィンにおいて包埋した。以下の抗体を用いた。即ち、フィブロネクチンTV-1(Chemicon(ケミコン社))、c-キットACK2(eBioscience(イーバイオサイエンス社))、B220(Becton Dickinson(ベクトン・ディキンソン社))、LOX(例7)、パン(汎)サイトケラチン(ICN)。Alexa(アレクサ)488および432の複合化蛍光二次抗体を用い、免疫蛍光染色を視覚化した。画像を、ニコン360顕微鏡カメラおよびQ-キャプチャ(捕獲)ソフトウェアを用いて撮影した。Y染色体染色を、製造者の指示に従ってStarFISHキット(Openbiosystems)を用いて実行した。
【０２１３】
(例18における馴化媒体アッセイ)
馴化媒体(CM)はMDA231 LOX shRNAの上、または正常酸素圧(N、21%のO2)または低酸素(H、2%のO2)において24時間温置されるコントロール細胞上で培養される無血清の修飾イーグル培地(Modified Eagle’s Medium)からなった。CMは0.22μmのフィルタを通過させ、および300mLを腹腔内に毎日マウス中に注射した(Kaplan(2005年)、上記)。定められたとき、ベータ-アミノプロプリオニトリルを、100mg/kgの注射用量についてCMに添加した。正所性調査のため、CMを一次腫瘍植え込みの後の2週間に始め4週間の間毎日注射した(骨髄移植後の6週間)。静脈内に腫瘍細胞を注射されたマウスについて、CMを10日間毎日注射し、若干のマウスは、静脈内(i.v.)で腫瘍細胞投与に先立ち毎日のCM注射を2週間の間受けた。肺は、PBSを用い、切除後、OCTにおける包埋の前、免疫蛍光調査のため、かん流させた。
【０２１４】
(例18におけるLOX酵素の活性アッセイ)
蛍光に基づくアッセイを上述のように実行し、マウス中に注射するCM試料において、マウスの血しょうにおいて、および受動体の血しょうにおいてLOX酵素の活性を評価した。
【０２１５】
(例18における遊走/浸潤のアッセイ)
CMに向かうRAWマクロファージ(大食細胞)細胞のインビトロでの遊走および浸潤(化学誘引物質として)を、上述のようにトランスウェル(transwell)アッセイにおいて測定した。フィブロネクチン(cFN、Sigma)を、25μg/mLで用い、および200μMでBAPNを用いた。マトリゲル(Matrigel)のプラグは、60%のマトリゲルと40%のCMを混合することによって、混合物の500μLの皮下の注射に先立ち形成した。プラグは7日後に除去し、OCTにおいて固定し、セクションし、およびB細胞(B220)について染色した。10種の視野における細胞を、プラグの縁部から少なくとも50μm離れて計数した。
【０２１６】
(例18におけるMMPゼラチンのエンザイモグラフィー(酵素画法))
ゼラチンの酵素画法を実行し、説明するようにMMP活性を評価した[17]。タンパク質濃度を、等しい負荷を確かにするために定量化した。
【０２１７】
(例18における統計的な分析)
結果を、平均±標準偏差(平均値の標準誤差)として現す。データを、Student's t-test(スチューデントｔ検定)および一元配置分散分析法(ANOVA、分散分析)によって分析した。P値<0.05は有意であると考えられ、および*によって表示した。誤差バーは標準偏差を描く。
(v。概要および結論)
【０２１８】
いくつかの因子は、なぜLOXが転移性増殖のために必要とされるかについて説明し得る。まず、LOXはFAK活性のために必要とされ、それは細胞の繁殖および生存を媒介することが既知である。第2に、LOXはFAK活性化を通してFN活性を調整し得、転移性腫瘍細胞増殖を支持するために許容されるニッチを提供する。最後に、LOX活性は、成熟したECMの形成にとって不可欠であり、それは疑いようもなく、生存シグナル伝達および細胞の増殖のために必要とされる。本発明者らが一次腫瘍の増殖上のLOX抑制の有意な効果を観察しなかったことは注目に値するが、一方、本発明者らは著しい効果を肺および肝臓における転移性増殖上に見出した。とりわけ、正所性に植え込まれるshRNAを発現する細胞は、野生型の細胞と同じ動態学を有する一次腫瘍として増殖した。これらのデータは、細胞付着、遊走、浸潤および三次元増殖上に及ぼすLOXの効果が、一次増殖について、転移性腫瘍のためのものよりもあまり重要でないことを示す。
【０２１９】
本明細書において提示するデータは、LOXが胸部癌における転移の防止のための良好な治療上の標的であること、および分泌されたLOXを標的にすることが転移の初期及び後期の段階を防ぐための機構を提示するという強力な証拠を提供する。本明細書では、低酸素性が、LOX mRNA、LOXタンパク質および分泌されたLOX活性を増加させ、転移性の拡がり(転移拡散)のために必要とされる強化された浸潤性の遊走を招くことを示す。加えて、増加されたLOX活性および細胞遊走から生じる再構築されたマトリクストラックはハイウェイを提供し、それに沿って他の細胞がより一層簡単にトラベルすることができ、そのようにして、遊走および浸潤が増やされる。LOXが形質転換増殖因子-βのような増殖因子によって誘導され、および/または活性化することが知られているが、低酸素性は腫瘍の進行に関しより一層臨床的であり得る。多くの調査は、低酸素性が癌細胞の攻撃性を増進することを示した。好気的な条件下のLOXの抑制は、腫瘍細胞浸潤にわずかに影響を及ぼすだけであるが、低酸素性下に観察される非常により一層高いLOX発現レベルの抑制は一貫して、より一層際立った効果を生成した。さらにまた、好気的な条件(21%のO2)は典型的に、多くのインビトロでのアッセイのために採用され、実際には、体において、特に固形腫瘍の範囲内で経験する酸化のレベルと比較して高酸素性である。実際に、LOX発現は、酸素欠乏を伴わない若干の腫瘍細胞系において未検出であり(図1)、再び、LOXの低酸素性誘導されたレベルの関連性および臨床的意味が強調される。
【０２２０】
低酸素性誘導されたLOXは、腫瘍転移において鍵となる機能を持つ。本明細書で議論されるデータは、低酸素性の導き出された転移およびECMの転移性の拡がり上の影響のための機構的な証拠を提供し、および転移性の病気を防止し、および処置するためにLOXの治療上の標的を支持する。また、本明細書で提供されるデータは、ヒトの低酸素性癌細胞が、不利な環境における増加した遊走および生存を通してインビトロおよびインビボにおいて強化された浸潤性および転移性の可能性を持つことを実証する。これらの効果は、LOX発現の抑制によってブロックすることができる。LOX発現が他の薬剤(TGF-βのようなもの)によって誘導されることが既知であるが、低酸素性は腫瘍の進行において最も臨床的に関連する。低酸素性は、腫瘍細胞においてLOX mRNAレベルを、転写産物の発現および安定性におけるHIF-1で導き出される増加を通し、LOXプロモーターにおけるHREを介して増加させた。これは、それが処理される細胞からの強化されたLOXプロ酵素分泌を招き、ECMにおいて、活性な、成熟した酵素の量を増やす。LOXは、コラーゲン線維上で腫瘍細胞を囲む間質において振舞い、ECMの堆積および線維症(異所性コラーゲンの堆積)を増やし、およびLOXは追加的にフィブロネクチンと相互作用する。線維性コラーゲンおよびフィブロネクチンがインテグリンのための双方の主要なリガンドであるので、データはLOX活性が、接着斑の形成、FAK活性化およびすべてがLOX依存性である低酸素性において観察される細胞運動性を強化する増加したインテグリンの刺激を招くことを示唆する。増加したLOX活性および細胞の遊走から得られる再構築されたマトリクストラックは、追加的に、他の細胞がより一層簡単に移行することができる“ロード(道)”を提供し、遊走および転移を増やす。本発明者らの知見と一致して、局在されたものから浸潤性または転移性の表現型までへの遊走は、若干の癌の種類(胸部癌のようなもの)において、線維性の病巣の形成および線維形成(普通でない密度でのコラーゲン性の間質の存在)と関係することが多い。一旦、腫瘍が、本発明者らの低酸素性の細胞において観察されるように、EMTの間のような単細胞の散布の脱分化された段階を達成したなら、転移性の拡がりが増やされ、予後不良を招く。実際に、本発明者らは、LOX発現レベルが頭頸部および胸部の癌受動体において転移がなく、および全体的な生存に対して臨床的に関連することを見出した。胸部癌において、LOX発現は、ER陰性の胸部癌受動体において減少した生存と関係した(しかしER陽性でない)。この腫瘍の種類を有する受動体は、より一層悪い予後を持ち、および非常に攻撃的な腫瘍を表示することが知られる。
【０２２１】
本明細書に提示するデータは、LOXが胸部癌における転移の防止のための良好な治療上の標的であるという強力な証拠を提供する。分泌されたLOXを標的とすることは、転移のすべての段階を防ぐために、魅力的な機構を提示する。LOXの抑制は、低酸素性の胸部癌細胞の浸潤および転移をブロックし、および好気的な細胞におけるこれらの効果を減らす。データはこれらの効果が、重大な役割のためであり、LOXが細胞マトリクスの付着において、およびECMの生存のシグナル伝達において役割を演ずることを実証し、それは以前には報告されていない。LOX発現および/または活性を抑制することによって、細胞は動くことが不可能であり(受動的でさえ)、隣接した組織の細胞の遊走および浸潤を防止し、および細胞は追加的に、不利な環境で、脈管系または新しい宿主の環境のようなものにおいて良好に生存することができなかった。データはこれが減少した繁殖、および細胞マトリクスの付着の相互作用での干渉により引き起こされる増加したアポトーシスによるものであり得ることを指し示した。本発明者らは、LOXに特異的な精製された抗体を、マウスにおいてもたらされる、BAPN処置を用いるが、しかしコラーゲンの豊富な通常の組織への有害な副作用を伴わずに観察されるものと比較して似た結果を生成するために用いた。
【０２２２】
データは低酸素性で導き出される転移、および転移上のECMの影響のための機構的な証拠を提供し、およびLOXを標的にすることによって、転移性胸部癌および潜在的な他の固形腫瘍を予防し、および処置するために、低酸素性で導き出される経路を標的とすることを支持した。本発明者らの知る限りでは、このことは最初の報告であり、そこでは、低酸素性に関連するタンパク質の抑制が、胸部癌モデルにおける転移を完全に防ぐ。
【０２２３】
本例、方法、手法、特定の化合物および分子は、本発明を例証し、例示することを意味し、本発明の範囲を制限するものとは決してみなすべきでなく、それは添付の請求の範囲の文字通りの範囲、および等価な範囲によって規定される。本明細書において言及される任意の特許または出版物は、この特許が関係する技術における熟練した者のレベルを指し示し、それははっきりと述べられてないかもしれないが、この技術分野における作業者によって理解される本発明の詳細を伝達することを意図する。そのような特許または出版物は、本明細書により、参照することによって、まるで各々が参照によって、特別に、および個々に組み込まれるかのように同じ範囲に対して、および言及される方法または材料が記述され、可能にされることの目的のために組み込まれる。
【０２２４】
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【図面の簡単な説明】
【０２２５】
【図１−１】LOX HRE(図1A)(配列番号6および7で、それぞれは現れる順に開示する)、ルシフェラーゼ(発光酵素)アッセイ(検定)の結果(図1 B)およびルシフェラーゼ発現における増加(図1C)を示す。
【図１−２】ヒトのリジルオキシダーゼ(hLOX)プレプロタンパク質のアミノ酸配列(図1D)を示す。
【図１−３】その配列番号11のmRNA (図1E)を示す。
【図１−４】配列番号12の暗号化DNA(図1F) を示す。
【図１−５】配列番号12の暗号化DNA(図1F) を有し、配列番号9のようなシグナル(信号)ペプチドの開列後の分泌されたhLOX(図1D)または配列番号10のようなタンパク質分解処理後の成熟したhLOX(図1D)、およびhLOXの領域のアミノ酸配列であり、hLOXに対する抗体の結合部位であり得るもの(図1G)を示す。
【図２】細胞が18時間の間2%の酸素(低酸素)でインキュベーション(温置)され、次いでアクチノマイシンDを用いて処置されたときに得られるグラフである。細胞はアクチノマイシンD、および抽出されたmRNAの添加後、2、4および6時間に収集された。
【図３】LOXタンパク質発現レベルとCA-IXのそれらのもの(炭酸脱水酵素IX、低酸素において上方調整される)との頭頸部癌受動体(n=91)からの組織アレイ(整列)調査における比較を示すグラフである。塗り込まれた(Filled)バー(棒グラフ)、LOXポジティブ(陽性)、オープン(白抜き)バー、LOXネガティブ(陰性)である。LOX染色およびCAIX染色の間の関係値、P=0.006である。
【図４】生存のKaplan-Meyer plots(カプランマイヤープロット)を示している一連のグラフA-Dであり、(A-B)カプランマイヤープロットは、高いLOX発現レベルを有するエストロゲン受容体(ER)-陰性染色胸部腫瘍を有する受動体が、受動体の低いLOX発現レベルよりも、統計学的に有意な減少した転移フリー(のない)生存(A: P=0.009)、および全体的な生存(B: P=0.015)を持ったことを示し、(C-D)カプランマイヤープロットは、頭頸部癌受動体で、その腫瘍がLOXについて陽性に染色され、腫瘍がLOXについて陰性に染色された受動体よりも、統計学的に有意な減少した転移フリー生存(C: P=0.02)、および全体的な生存(D: P=0.046)を持ったことを示す。
【図５】AおよびBは、転移の微視的な定量化を、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色される肺(A)および肝臓(B)において示す。データは、マウスあたり6週間の実験の終わりに形成された転移の数であり(平均±s.e.m.(標準偏差))、10回の工程セクション(区分)について、3回の独立した実験的繰返しに基づく。抗体の用量は、未標識のもの、20mg kg-1; アステリスク(星印)、4mg kg-1;  2つの星印、1mg kg-1。コントロール(比較対照)、n=10; LOX shRNA、n=10; 4wk (4週)BAPN、n=10; 3wk BAPN、n=3; 2wk BAPN、n=3; LOX抗体、n=5であり、CおよびDは、10回の区分について6週間にわたって毎週計数される(A)転移(n=5のマウス)を示すグラフである。ダーク(濃い)実線、コントロール肺; 点線、コントロール肝臓; 四角を有する実線、ボトム(底部分)ダーク点線、BAPN肝臓; (B)LOX蛍光活性アッセイ、左側、インビボ酵素アッセイ; 右側、インビトロ酵素アッセイ(矢印で示された点は、20mg kg-1 のLOX抗体を指示する)。すべてのデータは平均±標準偏差としてプロットする。
【図６】MDA231(頂部分、A)およびSiHa(底部分、B)細胞のインビトロ浸潤を示す一対のグラフである。結果は、3種の独立した実験的な繰返し(平均±標準偏差)を代表する。星印は、コントロール細胞からの有意差(P<0.01)を指示する(スチューデントの(Student’s)t-検定)。白地、空気; 灰色地、低酸素である。
【図７】LOXのアンチセンスまたはセンスのホスホロチオエート(phosphorothioate)-修飾されたオリゴヌクレオチドで、またはBAPNで処置される細胞を用いて実行されるインビトロでの浸潤アッセイを示すグラフであり、正常酸素圧(normoxia)(白色バー)または無酸素(黒色バー)での温置前のものである。結果は少なくとも3種の独立した実験的な繰返しを代表する(平均±標準誤差としてプロットされる)。
【図８】フィブロネクチンヌルマウス胚線維芽細胞(embryonic fibroblasts)のインビトロ浸潤アッセイにかけられたものを示すグラフ(A)であり、未処置の浸潤はLOXアンチセンスオリゴ(Antisense(アンチセンス))で形質移入されたか、またはBAPNと共に温置される細胞のものと比較され、およびDSREDをマトリクスに対して発現するSiHa細胞の(B)付着は時間にわたり評価した。
【図９】肺病巣(左側、A)の数、および形成されるコロニー(右側、B)の数を示す一組の(pf,of)グラフであり、その中で、Aは、LOX shRNAまたはコントロールMDA231細胞を用いる尾部静脈転移アッセイを示し; データを、10種の工程セクションについてのマウス当りの肺病巣の平均数±標準誤差としてプロットし、2種の独立した実験的な繰返しに基づき; Bにおいて、MDA231のコントロールまたはLOX shRNA細胞は、軟寒天において、またはマトリゲル(Matrigel)において、10日間、正常酸素圧または低酸素の条件で増殖させ; 10×フィールド(視野)当りのコロニーの平均数をプロットする。
【図１０】ヒト肺癌細胞系A549で、LOXを標的にするshRNAを安定して発現するために操作されたものからの細胞を注入したマウスの生存を示すカプランマイヤープロットである。
【図１１】図10からの、植え込みまたはBAPN処置の後の3週間のマウスにおける肺腫瘍の平均数を示す棒グラフであり、および差し込み図は、shRNAの皮下植え込みおよびコントロール腫瘍細胞から腫瘍増殖を示すグラフである。
【図１２】野生型またはLOX shRNA A549 Non-Small Cell Lung Cancer Cells(非小細胞肺癌細胞)を用いて注入されるマウスの生存を示すカプランマイヤープロットであり、それらの若干は毎週2回LOX抗体の2mg/kgを用いて処置された。
【図１３】野生型またはLOX shRNA HCT116結腸直腸癌細胞を用いて注入されるマウスの生存を示すカプランマイヤープロットである。
【図１４】Caski(CaSki、ヒト子宮頸部癌腫)頸部癌細胞を用いて注入されるマウスの生存を示すカプランマイヤープロットであり、それらの若干は最高40日の間で毎日100mg/kgのBAPNを用いて処置された。
【図１５】A-Dは、膵臓腫瘍の免疫不全マウスにおける正所性植え込み(orthotopic implantation)(A-C)およびそれらの肝臓への転移(D)を実証する像である。
【図１６】図15において示すような正所性腫瘍を用いて植え込まれるマウスの生存を示すカプランマイヤープロットであり、それらは、未処置のままか、または4週間、毎週2回LOX抗体の2mg/kgを用いて処置された。
【図１７】A-Cは、LOX shRNA、LOX抗体またはBAPNを用いて処置された、および未処置のマウスからの肺の像であり、肺での転移上でのLOX処置の効果を示す。A-CおよびDはそれぞれ、肺および骨の転移の安定化した病気または退行を示す。
【図１８】野生型またはLOX shRNA A549非小細胞肺癌細胞を用いて正所性に植え込まれるマウスの生存を示すカプランマイヤープロットであり、それらの若干はLOX抗体を用いて処置された。
【図１９】低酸素性腫瘍細胞から分泌されるLOXが肺において留められ、および転移の増殖を増進することを示す。(A)時間にわたり正所性MDA231腫瘍を負うマウスの血しょうにおけるLOXの酵素活性対肺転移の蛍光に基づく測定。(B)野生型(Wt)または21%(N)または2%(H)のO2に対し24時間曝されるLOX shRNAを発現するMDA231細胞からの馴化媒体(メディア)(CM)におけるLOX活性。(C)実験的な戦略。(D)毎日のCM注入の2週後の循環性LOX活性、および毎日のCM注入を用いる5×105 Wtまたは毎日のCM注入を有するLOX shRNA腫瘍細胞の静脈内注入後の10d(日)。(E)(D)からのマウス肺におけるLOX免疫蛍光染色、(F) (D)におけるマウスからのH&E染色された肺、若干はCM予備処置を有する。矢印は形成された細胞クラスター(群れ)を指示する。(G)(F)におけるクラスター(病巣)の数である。平均±SE(標準誤差)、n=5ランダム4×視野。p<0.05=*。
【図２０】腫瘍分泌されたLOXが予備転移性ニッチ(適所)(metastatic niche)の形成に関与することを示す。(A)正所性Wt腫瘍を負うマウスの肺におけるLOXおよびFN染色の時間経過(30×)(i)(ii)。腫瘍細胞は汎サイトケラチン(pan-cytokeratin)(iii)によって識別され、および正所性LOX shRNA腫瘍を負うマウスからの肺は、LOX染色のための陰性コントロールであった(iv)。黒色矢印は強い(intense)染色の区域を指示し、青色矢印はBMDC蓄積の区域を指示する。(B)実験的な戦略。(C) 肺の転移性病変の、1×107 Wtまたは4wk間毎日のCM注入を有するLOX shRNA細胞の6wkのポスト正所性植え込みである。平均±SE、群当り5匹のマウスを伴うn=10の区分。(D)(C)からの肺の転移性病変の併合された(Merged)免疫蛍光染色であり、BMDCs(B220)および腫瘍細胞(汎サイトケレーション(cytokeration))(10×)を識別するためのもの。(E)(C)からの転移性病変で、Y染色体蛍光プローブ(探索子)を用いてハイブリダイゼーション(交雑)させたもの(40×)。p<0.05=*。
【図２１】低酸素腫瘍細胞から分泌されるLOXがFNに結合し、BMDCsを補充し、およびMMP活性を増進することを示す。(A)LOXおよびFNのための2(C)からの肺の転移性病変の併合された免疫蛍光染色(10×)。(B)化学誘引物質(差込図)としてCMを用いるRAWマクロファージ(大食細胞)のインビトロでの浸潤。平均細胞数±SE、n=5ランダム視界(10×)。(C)24時間CMと共に温置されるRAWマクロファージのMMP活性を示すゼラチンザイモグラフィ(酵素電気泳動)。3種の独立した実験的な繰返しの代表。(D)マトリゲルプラグに浸漬したCM侵入性BMDCsの数(FN添加を伴うか、または伴わない)、マウスにおいて皮下植え込み後の7d(日)のもの。平均±SE、n=10のランダム視野で、群当り3匹のマウスを伴う。p<0.05=*。
【図２２】生存のための予後インジケーター(表示)として、癌受動体の血液におけるLOX活性レベルを示す。(A)正常なマウスとそれに対する6wkのポスト正所性MDA231腫瘍植え込みのマウスの血しょうにおけるLOX活性。(B)健康な対象物、非転移性前立腺癌受動体、骨転移を有する前立腺癌受動体、および5年の無病の受動体の血しょうにおけるLOX活性。(C)血しょうLOX活性によって重層化するステージ(段階)III/IVの頭頸部(head and neck)癌受動体のための全体的な、および無病の生存のカプランマイヤープロット。(D)予備転移性ニッチの形成におけるLOX。(1)予備転移性部位(Kaplan et al. (2005年)Nature 438: 820-827頁)での高められたFN。(2)低酸素性腫瘍細胞がLOXを分泌し、LOXはFNに結合する。(3)LOX/FNの相互作用はBMDCの遊走/浸潤を増やし、BMDCsを予備転移性部位に補充した。(4)ECM再構築およびBMDC MMP活性は腫瘍細胞を引き付ける。p<0.05=*。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年3月17日(2009.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リジルオキシダーゼ活性のインヒビターであって、癌を有する対象物において転移の防止または処置で使用するためのインヒビター。
【請求項２】
前記対象物における転移は、処置前の対象体における転移に比べて少なくとも２５％、５０％、７５％、９０％、または９５％だけ減少する、請求項１記載のインヒビター。
【請求項３】
抗体、小分子インヒビター、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項１または２記載のインヒビター。
【請求項４】
小分子インヒビターである、請求項３記載のインヒビター。
【請求項５】
インヒビターは低酸素条件下に活性化されるプロドラッグである、請求項４記載のインヒビター。
【請求項６】
リジルオキシダーゼ活性のインヒビターであって、線維性条件の防止または処置で使用するためのインヒビター。
【請求項７】
インヒビターは抗体である、請求項１〜３または６のいずれか１項記載のインヒビター。
【請求項８】
前記抗体はヒトリジルオキシダーゼに特異的に結合する抗体である、請求項７記載のインヒビター。
【請求項９】
抗体は、ヒトリジルオキシダーゼ（ｈＬＯＸ）に、リジルオキシダーゼ様またはリジルオキシダーゼ関連タンパク質への結合親和性よりも少なくとも１０、１００、または１０００倍高い結合親和性を伴い特異的に結合する、請求項８記載のインヒビター。
【請求項１０】
リジルオキシダーゼ様またはリジルオキシダーゼ関連タンパク質は、ＬＯＬ１（ＬＯＸＬ１）、ＬＯＬ２（ＬＯＸＬ２）、ＬＯＬ３（ＬＯＸＬ３）およびＬＯＬ４（ＬＯＸＬ４）からなる群より選ばれる、請求項９記載のインヒビター。
【請求項１１】
抗体は、配列番号１および１３〜７３からなる群より選ばれるｈＬＯＸの領域に特異的に結合する、請求項７から１０までのいずれか１項記載のインヒビター。
【請求項１２】
抗体は配列番号１に特異的に結合する、請求項１１記載のインヒビター。
【請求項１３】
抗体はｈＬＯＸの分泌された形態に特異的に結合する、請求項７から１０までのいずれか１項記載のインヒビター。
【請求項１４】
抗体は単クローン性のヒトのまたはヒト化された抗体である、請求項７から１３までのいずれか１項記載のインヒビター。
【請求項１５】
リジルオキシダーゼ活性のインヒビターであって、転移性腫瘍を有する対象物の生存の可能性の増加または強化で使用するためのインヒビター。
【請求項１６】
リジルオキシダーゼ活性のインヒビターであって、対象物の転移性腫瘍量の安定化で使用するためのインヒビター。
【請求項１７】
対象物の転移性腫瘍量は、少なくとも１０日、１月、３月、６月、１年、１．５年、２年、３年、４年、５年、８年、または１０年間安定化される、請求項１６記載のインヒビター。
【請求項１８】
腫瘍は、胸部腫瘍、膵腫瘍、肺腫瘍、頚部腫瘍、大腸腫瘍および頭頚部腫瘍からなる群より選ばれる、請求項１５から１７までのいずれか１項記載のインヒビター。
【請求項１９】
腫瘍はエストロゲン受容体（ＥＲ）陰性胸部腫瘍である、請求項１８記載のインヒビター。
【請求項２０】
リジルオキシダーゼ活性のインヒビターであって、転移性細胞の侵襲性の抑制で使用するためのインヒビター。
【請求項２１】
リジルオキシダーゼ活性のインヒビターであって、ＢＭＤＣｓの浸潤能の抑制で使用するためのインヒビター。
【請求項２２】
リジルオキシダーゼ活性のインヒビターであって、腫瘍増殖または転移の病期診断のための方法で使用するためのものであり、方法は、ヒトリジルオキシダーゼ（ｈＬＯＸ）レベルを対象物の腫瘍において評価する工程を備え、それにより腫瘍でのリジルオキシダーゼレベルにおける対照試料と比べての増加が転移性腫瘍増殖の存在を指し示す、インヒビター。
【請求項２３】
リジルオキシダーゼ活性のインヒビターであって、癌転移を、対象物の血液におけるヒトリジルオキシダーゼ（ｈＬＯＸ）レベルを測定することによる診断で使用するためのものであり、リジルオキシダーゼレベルにおける対照試料と比べての減少が癌転移の存在または増加を指し示す、インヒビター。
【請求項２４】
対照試料は、初期時間点での対象物の血液から採取される試料、または別の個体の血液からの試料である、請求項２３記載のインヒビター。
【請求項２５】
血液においてのヒトリジルオキシダーゼタンパク質のレベルは、リジルオキシダーゼに対する抗体を用いて測定される、請求項２３または２４記載のインヒビター。
【請求項２６】
ヒトリジルオキシダーゼのレベルは対象物からの血液においてリジルオキシダーゼの酵素活性のレベルを測定することによって定められる、請求項２３または２４記載のインヒビター。
【請求項２７】
製薬上の組成物であって、リジルオキシダーゼ活性のインヒビターを、随意に、製薬上許容される不活性な担体物質において備える、組成物。
【請求項２８】
癌を有する対象物における転移の防止または処置で使用するための、請求項２７記載の製薬上の組成物。
【請求項２９】
線維性条件の防止または処置で使用するための請求項２７記載の製薬上の組成物。
【請求項３０】
腫瘍細胞増殖をインビボで抑制する化合物を識別するための方法であって、リジルオキシダーゼを候補化合物と接触させる工程、候補化合物と接触させたときにリジルオキシダーゼの活性を定める工程、および候補化合物で処置したときに腫瘍の増殖を定める工程を備え、前記リジルオキシダーゼの活性を化合物の不存在下に検出される活性に比べて減少させる候補化合物を、インビボで腫瘍細胞増殖を抑制する化合物として識別する、方法。
【請求項３１】
候補化合物は転移性癌細胞と低酸素条件下に接触される、請求項３０の方法。
【請求項３２】
候補化合物は、ペプチド、抗体、小分子インヒビター、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項３０または３１の方法。
【請求項３３】
細胞はインビボで腫瘍増殖抑制を定めるために接触される、請求項３０から３２までのいずれか１項の方法。
【請求項３４】
細胞はインビトロで腫瘍細胞増殖抑制を定めるために接触される、請求項３０から３２までのいずれか１項の方法。
【請求項３５】
腫瘍の増殖を定める工程は、リン酸化接着斑キナーゼ（ホスホ−ＦＡＫ）を、候補化合物を伴い、および伴わないで測定する工程を備え、それによりリジルオキシダーゼはさらにリン酸化接着斑キナーゼ（ホスホ−ＦＡＫ）における減少によって識別される、請求項２７から３０までのいずれか1項の方法。
【請求項３６】
転移性腫瘍細胞増殖を抑制する化合物を識別するための方法であって、
（ａ）随意にリジルオキシダーゼまたはリジルオキシダーゼを発現する細胞を候補化合物と接触させる工程、および
（ｂ）リジルオキシダーゼの発現または活性を定める工程
を備え、それにより前記リジルオキシダーゼの発現または活性を化合物の不存在下に検出される発現または活性に比べて減少させる候補化合物が、転移性腫瘍細胞増殖を抑制する化合物として識別される、方法。
【請求項３７】
化合物は、リジルオキシダーゼと、またはリジルオキシダーゼを発現する細胞と低酸素条件下に接触される、請求項３６の方法。
【請求項３８】
さらに、腫瘍細胞の増殖をインビトロで化合物の存在において定める工程を備える、請求項３６または３７のいずれかの方法。
【請求項３９】
さらに、腫瘍細胞の増殖をインビボで化合物の存在において定める工程を備える、請求項３６または３７のいずれかの方法。
【請求項４０】
候補化合物は、ペプチド、抗体、小分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項３６から３９のいずれか１項の方法。
【請求項４１】
リジルオキシダーゼの発現または活性における減少は、リン酸化接着斑キナーゼ（ホスホ−ＦＡＫ）のレベルを候補化合物の存在および不存在において測定することによって評価する、請求項３６から４０のいずれか１項の方法。
【国際調査報告】
2009536925.tif 000029
2009536925.tif 000030
2009536925.tif 000031