(57)【要約】  置換クロマトグラフィー方法および当該方法に用いられ、一般式（Ｉ）を有する置換剤化合物：式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ’１、Ｒ’２およびＲ’３基は各々独立して、アルキル、アリールおよびアラルキルから選択され得、そしてＲ１およびＲ２、Ｒ１およびＲ’１、Ｒ１およびＲ４、Ｒ４およびＲ’４、またはＲ４およびＲ５のいずれか１以上によって、四級窒素を１以上含む環が形成され得；Ｒ４、Ｒ’４、Ｒ５、およびＲ’５は各々独立して、アルキル、アリール、アラルキルおよび−（ＣＨ２）ａ−（ＣＨＹ）ｂ−（ＣＨ２）ｃ−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ａｎ−から選択され得、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は上記定義の通りであり；各Ｙは独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲ６、ハロ、アルキル、アリールおよびアラルキルから選択され得、−Ｒ６はアルキルまたは−（ＣＨ２）ａ−（ＣＨＯＨ）ｂ−（ＣＨ２）ｃ−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ａｎ−であり得、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は上記定義の通りであり；ｑおよびｚは、ｑ＋ｚが約６以下になるという条件で、各々独立して０から約６の任意の整数であり得；ａ、ｂおよびｃはどのフラグメントにおいてもａ＋ｂ＋ｃの合計が少なくとも１になるという条件で、各々独立して０から２の任意の整数であり得；そして、Ａｎ−は、中性化合物を得るために必要に応じて各々独立して１以上の有機または無機の一価または多価の陰イオンであり得る。
2009515164.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
置換クロマトグラフィー方法であって、
１以上の分離される成分を含む混合物を適切な固定相にロードする工程；
一般式（Ｉ）：
【化１】
2009515164.tif 000024
を有する置換剤化合物を含む混合物を該固定相にアプライすることによって、該固定相から該１以上の成分の少なくとも１つを置換する工程であって、
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ’１、Ｒ’２およびＲ’３基は各々独立して、アルキル、アリールおよびアラルキルから選択され得、そしてＲ１およびＲ２、Ｒ１およびＲ’１、Ｒ１およびＲ４、Ｒ４およびＲ’４、またはＲ４およびＲ５のいずれか１以上によって、四級窒素を１以上含む環が形成され得；
Ｒ４、Ｒ’４、Ｒ５、およびＲ’５は各々独立して、アルキル、アリール、アラルキルおよび−（ＣＨ２）ａ−（ＣＨＹ）ｂ−（ＣＨ２）ｃ−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ａｎ−から選択され得、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は上記定義の通りであり；
各Ｙは独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲ６、ハロ、アルキル、アリールおよびアラルキルから選択され得、−Ｒ６はアルキルまたは−（ＣＨ２）ａ−（ＣＨＯＨ）ｂ−（ＣＨ２）ｃ−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ａｎ−であり得、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は上記定義の通りであり、そして１以上のＹが、１以上の電磁的方法によって検出可能な基であり得；
ｑおよびｚは、ｑ＋ｚが約６以下になるという条件で、各々独立して０から約６までの任意の整数であり得；
ａ、ｂおよびｃは、どのフラグメントにおいてもａ＋ｂ＋ｃの合計が少なくとも１になるという条件で、各々独立して０から２までの任意の整数であり得；そして
Ａｎ−は、中性化合物を得るために必要に応じて、各々独立して１以上の有機または無機の一価または多価の陰イオンであり得る、工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記固定相が、陽イオン交換材料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１以上の成分が、１以上のポリペプチド、１以上のタンパク質またはそれらのいずれか２以上の混合物を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記１以上のタンパク質が、約５ｋＤ以上の分子量を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記混合物からのタンパク質および／またはポリペプチドが、該タンパク質および／またはポリペプチドが実質的に濃縮されている画分、および／または該タンパク質および／またはポリペプチドが、他のタンパク質および／またはポリペプチド成分から実質的に分離されている画分において、前記固定相から置換される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記混合物が、２以上のタンパク質、２以上のポリペプチド、またはそれらの混合物を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記混合物からのタンパク質および／またはポリペプチドが、該タンパク質および／またはポリペプチドが実質的に濃縮されている画分、および／または該タンパク質および／またはポリペプチドが、他のタンパク質および／またはポリペプチド成分から実質的に分離されている画分において、前記固定相から置換される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記混合物が、少なくとも２の分離される成分を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記混合物が、少なくとも１の前記成分および少なくとも１の不純物を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記固定相から出てくる前記置換剤化合物を検出する工程をさらに含み、該検出する工程が、紫外／可視吸収分光法、蛍光発光分光法、質量分析法、ｐＨ、電気伝導度、および１以上の電気化学的方法の１以上による、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記固定相を再生する工程をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記再生する工程が、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属塩、アルカリ土類水酸化物、アルカリ土類塩、有機酸、アルキルスルホン酸、四級アンモニウム水酸化物、四級アンモニウム塩、アルキルアミンの１以上の溶液で前記固定相を処理することを含み、該溶液が適切なｐＨ緩衝液をさらに含み得る、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記再生する工程が、水と有機共存溶媒とを含む溶液で前記固定相を処理することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記置換剤化合物が、ＤＢＱである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記置換剤化合物が、ＤＭＴＱである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記置換剤化合物が、ＤＢＴＱである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記置換剤化合物が、ＴＢＴＱ−Ａである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記置換剤化合物が、ＢＴＡである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記置換剤化合物が、ＤＢＤである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記混合物が、１以上の天然または組換えの抗体、またはそのような抗体のいずれか２以上の混合物を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記混合物が、１以上の天然または組換えの酵素、またはそのような酵素のいずれか２以上の混合物を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記混合物が、診断使用のための１以上の天然または組換えのタンパク質および／またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質および／またはポリペプチドのいずれか２以上の混合物を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記混合物が、ヒトまたは獣医学用の治療的使用のための１以上の天然または組換えのタンパク質またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質および／またはポリペプチドのいずれか２以上の混合物を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記混合物が、１以上の天然または組換えの動物またはヒトの血漿に由来する１以上のタンパク質またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質および／またはポリペプチドのいずれか２以上の混合物を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記混合物が、１以上の天然または組換えの植物性材料に由来する１以上のタンパク質またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質および／またはポリペプチドのいずれか２以上の混合物を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記混合物が、動物またはヒトの乳または組換え動物から得られた乳の１以上に由来する１以上のタンパク質またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質および／またはポリペプチドのいずれか２以上の混合物を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記混合物が、１以上の天然または組換えの鳥卵に由来する１以上のタンパク質またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質および／またはポリペプチドのいずれか２以上の混合物を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記混合物が、１以上の天然または組換えの細菌、酵母、真菌、ウイルスまたは昆虫に由来する１以上のタンパク質またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質および／またはポリペプチドのいずれか２以上の混合物を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記混合物が、１以上の天然または組換えの哺乳類の細胞培養物または動物組織に由来する１以上のタンパク質またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質および／またはポリペプチドのいずれか２以上の混合物を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記混合物が、１以上の有機化合物、医薬品または医薬品中間体、またはそれらのいずれか２以上の混合物を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記１以上の有機化合物、医薬品または医薬品用中間体の１以上が、キラル体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記混合物が、１以上の微量成分を含み、そして前記方法が、該混合物内の該微量成分の検出、収集または定量の１以上をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
置換クロマトグラフィーで有用な置換剤組成物であって：
適切な水溶液中に、一般式（Ｉ）：
【化２】
2009515164.tif 000025
を有する置換剤化合物を含み、
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ’１、Ｒ’２およびＲ’３基は各々独立して、アルキル、アリールおよびアラルキルから選択され得、そしてＲ１およびＲ２、Ｒ１およびＲ’１、Ｒ１およびＲ４、Ｒ４およびＲ’４、またはＲ４およびＲ５のいずれか１以上によって、四級窒素を１以上含む環が形成され得；
Ｒ４、Ｒ’４、Ｒ５、およびＲ’５は各々独立して、アルキル、アリール、アラルキルおよび−（ＣＨ２）ａ−（ＣＨＹ）ｂ−（ＣＨ２）ｃ−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ａｎ−から選択され得、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は上記定義の通りであり；
各Ｙは独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲ６、ハロ、アルキル、アリールおよびアラルキルから選択され得、−Ｒ６はアルキルまたは−（ＣＨ２）ａ−（ＣＨＯＨ）ｂ−（ＣＨ２）ｃ−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ａｎ−であり得、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は上記定義の通りであり、そして１以上のＹが、１以上の電磁的方法によって検出可能な基であり得；
ｑおよびｚは、ｑ＋ｚが約６以下になるという条件で、各々独立して０から約６までの任意の整数であり得；
ａ、ｂおよびｃは、どのフラグメントにおいてもａ＋ｂ＋ｃの合計が少なくとも１になるという条件で、各々独立して０から２までの任意の整数であり得；そして
Ａｎ−は、中性化合物を得るために必要に応じて、各々独立して１以上の有機または無機の一価または多価の陰イオンであり得る、
置換剤組成物。
【請求項３４】
前記置換剤化合物が、ＤＢＱ、ＤＭＴＱ、ＤＢＴＱ、ＢＴＡおよびＤＢＤ以外である、請求項３３に記載の置換剤組成物。
【請求項３５】
前記置換剤化合物が、以下の構造を有する、請求項３３に記載の置換剤組成物。
【化３】
2009515164.tif 000026
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多重四級アンモニウム塩（多重四級体（multiple quats））を含む組成物、および、クロマトグラフィー精製における置換剤として当該組成物を用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィーの置換モードは、Ｔｓｗｅｔｔによって１９０６年に最初に見出され、彼は、オーバーロードした溶出クロマトグラフィーの条件下で試料の置換が生じたことに着目した。１９４３年には、Ｔｉｓｅｌｉｕｓが、クロマトグラフィーの幅広いサブジェクトが、３つの異なった「モード」−前端モード、溶出モード、および置換モード−に基づいて構成され得ることを提唱した。それ以来、溶出クロマトグラフィーの分野のほとんどの発展および応用（特に分析クロマトグラフィーにおける）が起こった。実に、現在では、特に限定がなければ「クロマトグラフィー」との用語は、一般に、溶出モードのクロマトグラフィーをいう。
【０００３】
溶出モードおよび置換モードは、理論上および実践上の両方において容易に識別される。溶出クロマトグラフィーでは、精製される試料の溶液が、一般的にはカラム内で固定相にアプライされる。移動相は、試料が不可逆的に吸着されたり全く吸着されずにいたりするのではなく、むしろ可逆的に結合するように、選択される。移動相が固定相上を流されると、移動相と固定相との間に平衡が生じ、それによって、固定相に対する親和性に依存して、試料は、元の試料内に存在し得る他の成分との相対的な親和性を反映した速さで、カラム内を通過する。標準的な溶出クロマトグラフィーについて特に注目に値するのは、溶出溶媒最前部（あるいは定組成溶出におけるゼロカラム容量）が常に、カラム外で試料に先行することである。
【０００４】
定組成溶出クロマトグラフィーの変更および拡張が、段階勾配クロマトグラフィーで見られ、段階勾配クロマトグラフィーでは、様々な組成の一連の溶離剤が固定相を通過する。例えば、イオン交換クロマトグラフィーにおいて、移動相の塩濃度および／またはｐＨの段階的な変更が、分離を経た分析物の溶出または脱着に用いられる。
【０００５】
置換クロマトグラフィーは、カラムから混合物の成分を除去するために置換剤化合物を用いる。置換剤化合物は、通常、固定相に対して、分離される混合物内のどの成分よりも、ずっと高い親和性を有する。これは溶出クロマトグラフィーとは対極にあり、溶出クロマトグラフィーでは、溶離剤が、固定相に対して、分離される成分よりも低い親和性を有する。置換クロマトグラフィーと溶出クロマトグラフィーまたは脱着クロマトグラフィーとを識別する鍵となる操作上の特徴は、置換剤化合物の使用である。置換クロマトグラフィーでは、まずカラムが、分離される成分の全てが固定相に対して比較的高い親和性を有する条件下で、キャリア溶媒によって平衡化される。ある量の供給混合物（大量かつ非常に希薄であり得る）がこのカラムにロードされて、供給混合物内の個々の成分が固定相に吸着する。すなわち、供給混合物の成分が固定相上に分配および吸着されて、その場にとどまる。これらの全ての成分が置換によって分離されるのであれば、キャリア溶媒は、カラムから試料を全く含まないで出てくる。供給混合物の成分はこの時固定相に存在し、カラム上の各成分の位置は、初期条件下の固定相に対するその相対的な親和性と相関している。原則として、何らかの成分の分子が、より低い親和性を有する何らかの異なる成分の分子と、固定相の所定の場所で置き換わる。結果として、最終的に、個々の成分が、親和性の最も高いものから最も低いものまで順番にカラム上に配置される。
【０００６】
供給混合物の一部の成分（例えば固定相に対する著しい親和性を持っていない成分）がキャリア溶媒と共にカラムを通り抜けることを許容することは、時に好都合である；この場合、保持された供給成分のみが置換クロマトグラフィーによって分離される。
【０００７】
試料がカラムにロードされたら、適切な溶媒中に置換剤化合物を含む溶液をカラム内に導入し、固定相を通過させる。置換剤化合物は、固定相に対して供給混合物のどの成分よりも高い親和性を有するように選択される。置換剤および移動相を適切に選択したとすれば、個々の成分は、吸着親和性が高くなる順に、高濃度の比較的純粋な物質の隣接ゾーンとしてカラムを出ていく。精製された個々の成分のゾーンに続いて、置換剤がカラムから出てくる。置換クロマトグラムは、置換剤化合物が試料に続くこと、そして供給物成分が、高濃度の比較的純粋な物質の隣接ゾーンとしてカラムから出てくることによって、溶出クロマトグラムと容易に区別される。
【０００８】
置換クロマトグラフィーは、プロセススケールクロマトグラフィーのための特に有利な特徴をいくつか有する。第１に、置換クロマトグラフィーは、一段階で生成物の分離および濃縮を達成することができる。比較して、定組成溶出クロマトグラフィーは、分離の間に著しい生成物の希釈を生じる。第２に、置換方法は、平衡等温線の非線形区域で作用するため、高いカラムローディングが可能である。これは、溶出クロマトグラフィーよりもずっと良好なカラムの利用を可能にする。第３に、カラムの展開および成分分離に必要とされる溶媒は、比較する溶出方法よりも少ない。第４に、典型的な溶出クロマトグラフィーにおいて満足な分離を得るためには比較的多くの分離要素が求められるのに対し、置換クロマトグラフィーは、分離要素の少ない混合物からの成分濃縮および精製をすることができる。
【０００９】
これらすべての利点によって、置換クロマトグラフィーは広く活用されると思われ得た。しかしながら、置換クロマトグラフィーには問題点が残っている。そのような問題点の１つは、使用後毎に固定相を廃棄するのは経済的でないため、カラムを再生させる必要があることである。もう１つの問題点は、比較的単純な化合物であって、合成が容易でおよび／または手頃な（経済的な）値段で市販可能な適切な置換剤化合物を得ることである。これらの２つの問題点は、溶出クロマトグラフィーに対する置換クロマトグラフィーの重大な欠点を示している。
【００１０】
再生に関しては、置換方法は固定相に対して非常に高い親和性を有する置換剤化合物を用いるため、カラムの再生および再平衡化に要する時間が溶出クロマトグラフィーと比較して長くなり得る。その上、多くの場合、再生の間に比較的多量の溶媒が必要である。これらの問題点が事実上、置換クロマトグラフィーの利点を溶出クロマトグラフィーよりも減じている。
【００１１】
２つ目の問題点である、比較的容易に合成することができ、および／または手頃な（経済的な）値段で市販可能な有用な置換剤化合物を得ることは、固定相に対して高い親和性も有するが、再生の間にカラムから比較的容易に除去もできる置換剤化合物が必要であることに起因する。先行技術によって提供されているそのような化合物は、これらの２つの重要な基準の一方または双方を満たしていない。様々な化合物が、低分子量の置換剤として提供されているが、これらは合成および精製が非常に難しく、そして手頃な値段では市販されていないか、または全く市販されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
置換クロマトグラフィーがクロマトグラフィー技術の主流となるために、効果的な置換剤の重大な満たされていない必要性がいまなお存在する。効果的な置換剤とは、その合成および精製が簡単で、大量生産しやすく、および／または市販可能であり、そして、固定相を置換クロマトグラフィー方法で引き続き再利用できるように、固定相の効率的な再生を可能とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
今回、低分子量の正に荷電した化合物の一群が、置換クロマトグラフィー方法における置換剤化合物として非常に効率的に機能し得ることがわかった。したがって、本発明は、置換クロマトグラフィー方法と置換剤化合物群との双方に関する。本発明における置換剤化合物は、置換クロマトグラフィー方法において置換剤化合物として用いられた後に固定相から効率的に除去され得、引き続く置換クロマトグラフィー方法における固定相の再生および再利用を可能とする。さらに、これらの置換剤化合物は、比較的簡単で安価な合成方法によって、良い収率で、そして高い純度で、作製され得る。したがって、本発明は、先行技術の置換クロマトグラフィー方法における上記の問題点を扱う。
【００１４】
本発明の実施態様における置換剤化合物は、有機四級アンモニウム塩（四級塩）として知られている化合物のクラスに属する。四級塩は正に荷電した窒素原子を含む組成物である。これらの組成物は脂肪族鎖を含むが、それにもかかわらず多くの場合水溶性であり得る。水に可溶であるとき、これらの化合物は、ｐＨの変化によって影響を受けない正電荷を有するという有用な特性を示す。すなわち、窒素中心の電荷はアミンの単純なプロトン化の結果ではないので、これらの塩類の水溶液のｐＨは、窒素中心の正電荷の損失を生じることなく幅広く調整され得る。一般的なポリアミンおよびその関連化合物は、通常、陽イオン交換置換クロマトグラフィーの置換剤化合物として有用ではない。なぜなら、これらは置換クロマトグラフィー樹脂に適合可能なｐＨの範囲では完全にはプロトン化されない（そして、そのために十分な正電荷を呈示しない）からである。対照的に、本発明の置換剤化合物は、クロマトグラフィー樹脂が安定であるどの範囲のｐＨにおいても使用され得る。
【００１５】
１つの実施態様において、本発明は、置換クロマトグラフィー方法に関し、この方法は、
少なくとも１の分離される成分を含む混合物を適切な固定相にロードする工程；
一般式（Ｉ）：
【００１６】
【化１】
2009515164.tif 000003
【００１７】
を有する置換剤化合物を含む混合物を固定相にアプライすることによって、固定相から上記の少なくとも１の成分を置換する工程を含み、
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ’１、Ｒ’２およびＲ’３基は各々独立して、アルキル、アリールおよびアラルキルから選択され得、そしてＲ１およびＲ２、Ｒ１およびＲ’１、Ｒ１およびＲ４、Ｒ４およびＲ’４、またはＲ４およびＲ５のいずれか１以上によって、四級窒素を１以上含む環が形成され得；
Ｒ４、Ｒ’４、Ｒ５、およびＲ’５は各々独立して、アルキル、アリール、アラルキルおよび−（ＣＨ２）ａ−（ＣＨＹ）ｂ−（ＣＨ２）ｃ−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ａｎ−から選択され得、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は上記定義の通りであり；
各Ｙは独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲ６、ハロ、アルキル、アリールおよびアラルキルから選択され得、−Ｒ６はアルキルまたは−（ＣＨ２）ａ−（ＣＨＯＨ）ｂ−（ＣＨ２）ｃ−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ａｎ−であり得、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は上記定義の通りであり、そして１以上のＹが、１以上の電磁的方法によって検出可能な基であり得；
ｑおよびｚは、ｑ＋ｚが約６以下になるという条件で、各々独立して０から約６までの任意の整数であり得；
ａ、ｂおよびｃは、どのフラグメントにおいてもａ＋ｂ＋ｃの合計が少なくとも１になるという条件で、各々独立して０から２までの任意の整数であり得；そして
Ａｎ−は、中性化合物を得るために必要に応じて、各々独立して１以上の有機または無機の一価または多価の陰イオンであり得る。
【００１８】
１つの実施態様において、本発明は、上記一般式（Ｉ）で定義される組成物に関する。１つの実施態様において、本発明は、以下の構造を有しそしてＴＢＴＱ−Ａと呼ばれる組成物に関する：
【００１９】
【化２】
2009515164.tif 000004
【００２０】
１つの実施態様において、一般式（Ｉ）による組成物は、ＤＢＱ、ＤＭＴＱ、ＤＢＴＱ、ＢＴＡ、およびＤＢＤ以外であり、それぞれ以下に定義される構造を有する。
【００２１】
１つの実施態様において、本発明は、置換クロマトグラフィーに有用な置換剤組成物に関する。１つの実施態様において、置換剤組成物は、適切な水溶液中に、上記の一般式（Ｉ）の化合物を含む。１つの実施態様において、本発明は、上記の構造を有しそしてＴＢＴＱ−Ａとして認められる、置換クロマトグラフィーにおいて有用な置換剤組成物に関する。１つの実施態様において、置換剤組成物は、ＤＢＱ、ＤＭＴＱ、ＤＢＴＱ、ＢＴＡ、およびＤＢＤ以外である。
【００２２】
１つの実施態様において、本発明は、置換クロマトグラフィーに供される試料内の微量成分の検出、収集、または定量の１以上のための方法を提供する。
【発明の効果】
【００２３】
したがって、本発明は、置換クロマトグラフィーのための置換剤化合物、組成物および方法を提供する。これにより、その合成および精製が簡単で、そして大量生産しやすく、固定相を効率的に再利用できるように固定相の効率的な再生を可能にする、効果的な置換剤化合物の必要性が対処される。加えて、本発明は、試料または混合物の微量成分が検出、収集、および／または定量され得る方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本明細書において用いられる「ハロ」とは、ハロゲンを含む基を意味し、例えばクロロ、ブロモ、フルオロまたはヨードが挙げられる。
【００２５】
本明細書において用いられる「アルキル」および「アルキレン」とは、適宜１または２の水素原子を除去することによってアルカン分子から得られた炭素および水素原子でなる基を意味する。「アルキル」および「アルキレン」は、直鎖、環状、または分岐の部分を有する、飽和した一価および二価の炭化水素基を含み得る。「アルキル」または「アルキレン」基は、アルキル基が少なくとも２つの炭素原子を含む場合、任意の炭素−炭素間の二重または三重結合を含み得る。当該アルキル基において、環状部分には少なくとも３つの炭素原子が必要とされることが理解される。本発明において、アルキルおよびアルキレン基は、任意の数の炭素原子を含み得る。本発明の１つの実施態様においては、約２０以下の炭素原子が用いられ得る。例えば、１つの実施態様において、本発明では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の炭素のアルキル基が用いられ得る。もちろん、本発明では、より長いまたは分岐したアルキル基が用いられ得る。アルキレン基は、例えば、そうでなければアルキル基である２つの基から環が形成される実施態様において、用いられ得る。
【００２６】
本明細書において用いられる「アリール」とは、未置換のまたは置換した芳香族構造を意味し、例えば、フェニル、ナフチル、フルオレニル、フェナントリルなどが挙げられる。アリール基は、置換される場合、本明細書で定義されるハロ基、アルキル基、別のアリール基またはアラルキル基によって置換され得る。
【００２７】
本明細書において用いられる「アラルキル」とは、アルキル基の水素原子がアリール基に置換された基を意味する。「アリール」は、上記定義の通りである。本発明において、アラルキル基は任意の数の炭素原子を含み得る。本発明の１つの実施態様においては、アラルキル基は、約２０以下の炭素原子を含む。例えば、１つの実施態様において、本発明では、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の炭素のアラルキル基が用いられ得る。もちろん、本発明では、さらに炭素原子の多いアラルキル基が用いられ得る。
【００２８】
本明細書において用いられる「Ａｎ−」とは、本発明の置換剤化合物と会合する１以上の有機または無機の一価または多価の陰イオンを表す。本発明の四級アンモニウムイオンと会合する負に荷電した陰イオンの個数および総電荷は、混合物のｐＨ、および中和に用いられる１以上の酸の陰イオンに依存して変化する。本発明の陰イオン（Ａｎ−）は、当業者に公知の任意の有機または無機の一価または多価の陰イオンであり得、スルホネート、トリフラート、トリフィルアミド（trifylamide）、カルボキシレート、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、ＣｌＯ３−、ＨＳＯ４−、ＳＯ４２−、ＰＯ４３−、ＨＰＯ４２−、Ｈ２ＰＯ４−、ＰＯ３２−、ＨＰＯ３−、ＢＦ４−、ＰＦ６−などのような、一価、二価、および多価の陰イオンが挙げられる。一般に、Ａｎ−の価数および個数は、中性化合物を得るために、必要に応じて適切に選択され得る。
【００２９】
本明細書に示したいずれの数値も、どの低い方の数値とどの高い方の数値との間でも少なくとも２単位の間隔があれば、１単位の増分でその低い方の数値からその高い方の数値までの全ての数値を含む。一例として、成分の量、または、プロセス変数（例えば、温度、圧力、時間など）の数値が、例えば１から９０まで、好ましくは２０から８０まで、さらに好ましくは３０から７０までであると述べられている場合、１５から８５、２２から６８、４３から５１、３０から３２などのような数値が、本明細書において明示的に列挙されていると意図される。１より小さい数値については、１単位は、適宜０．０００１、０．００１、０．０１または０．１であると見なされる。これらは、具体的に意図した単なる例にすぎず、列挙した最小値と最大値との間の数値の全ての可能な組み合わせが、同様に本出願において明示的に述べられていると見なされる。
【００３０】
（陽イオン置換剤化合物）
本発明の陽イオン置換剤化合物は、式（Ｉ）：
【００３１】
【化３】
2009515164.tif 000005
【００３２】
を有するものを含み、
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ’１、Ｒ’２およびＲ’３の基は各々独立して、アルキル、アリールおよびアラルキルから選択され得、そしてＲ１およびＲ２、Ｒ１およびＲ’１、Ｒ１およびＲ４、Ｒ４およびＲ’４、またはＲ４およびＲ５のいずれか１以上によって、四級窒素含有環が形成され得；
Ｒ４およびＲ５は各々独立して、アルキル、アリール、アラルキルおよび−（ＣＨ２）ａ−（ＣＨＹ）ｂ−（ＣＨ２）ｃ−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ａｎ−から選択され、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は上記定義の通りであり；
各Ｙは独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲ６、ハロ、アルキル、アリールおよびアラルキルから選択され得、−Ｒ６はアルキルまたは−（ＣＨ２）ａ−（ＣＨＯＨ）ｂ−（ＣＨ２）ｃ−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ａｎ−であり得、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は上記定義の通りであり、そして１以上のＹが、１以上の電磁的方法によって検出可能な基であり得；
ｑおよびｚは、ｑ＋ｚが約６以下になるという条件で、各々０から約６までの任意の整数であり得；
ａ、ｂおよびｃは、どのフラグメントにおいてもａ＋ｂ＋ｃの合計が少なくとも１になるという条件で、各々０から２までの任意の整数であり得；そして
Ａｎ−は、中性化合物を得るために必要に応じて、１以上の有機または無機の一価または多価の陰イオンであり得る。
【００３３】
式（Ｉ）の置換剤化合物は、紫外／可視分光測定、蛍光発光、または当業者に公知の任意の他の方法による検出を容易にする付加置換基を含み得る。そのような置換基はまた、陽イオン交換クロマトグラフィーに対する化合物の親和性に影響を与え得、その結合の強さをより小さくするか、またはより大きくする。場合によっては、置換クロマトグラフィーによって精製される化合物を検出する標準手段を妨げる置換基を持たないことが、有利となる。この後者の場合の一例は、式（Ｉ）の置換剤化合物が、２８０ｎｍ（特定の生体高分子（タンパク質、オリゴペプチド、抗体など）が特徴的に吸収する波長）の紫外光を吸収しないことである。検出能を高めるための適切な誘導体化剤は当業者に公知であり、当業者によって適切に選択され得る。
【００３４】
１つの実施態様において、本発明における置換剤化合物内の１以上のＹは、１以上の電磁的方法によって検出可能な基であり得る。そのような電磁的方法には、例えば、紫外／可視分光光度測定法、蛍光分光光度測定法、および放射性検出方法が含まれる。適切なＹ基およびそのようなＹ基を検出するための適切な方法は、そのような方法での使用のために、当業者に公知である。
【００３５】
適切な例示となる陽イオン置換剤化合物には、例えば、以下の具体例が含まれる。各々の場合で、Ａｎ−は、１以上の有機または無機の一価または多価の陰イオンであり得、各々のＡｎ−の個数および価数は、中性化合物（すなわち、各々の分子の実効電荷は、それぞれのイオンの正および負の電荷の平衡が保たれており、ゼロである）を提供するように適切に選択される。以下の具体的な化合物は、上に説明した一般式（Ｉ）によって定義され、その中に定義される置換基を含む置換剤化合物の例として提供される。以下の例は限定を目的とするものではなく、むしろ発明の様々な実施態様における置換剤化合物を明らかにする具体例を提供することを目的とする。
【００３６】
ＤＢＱ（以下の構造式を有する）：
【００３７】
【化４】
2009515164.tif 000006
【００３８】
ＤＭＴＱ（以下の構造式を有する）：
【００３９】
【化５】
2009515164.tif 000007
【００４０】
ＤＢＴＱ（以下の構造式を有する）：
【００４１】
【化６】
2009515164.tif 000008
【００４２】
ＴＢＴＱ−Ａ（以下の構造式を有する）：
【００４３】
【化７】
2009515164.tif 000009
【００４４】
ＢＴＡ（以下の構造式を有する）：
【００４５】
【化８】
2009515164.tif 000010
【００４６】
ＤＢＤ（以下の構造式を有する）：
【００４７】
【化９】
2009515164.tif 000011
【００４８】
式中、このような各々の構造（すなわち、ＤＢＱ、ＤＭＴＱ、ＤＢＴＱ、ＴＢＴＱ−Ａ、ＢＴＡおよびＤＢＤ）において、Ａｎ−は１以上の有機または無機の１価の陰イオンであり得るか、またはＡｎ−は多価の陰イオンであり得、どちらの場合も、中性分子を得るために適した数のそのような部分が存在する。このＡｎ−の定義および使用は、この明細書全体に適用される。
【００４９】
ある例示となる置換剤化合物は、四級窒素含有環を含み、Ｒ４がエチレン基を介してＲ’４に結合され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３、Ｒ５およびＲ’５の全てがメチルであり、Ａｎ−は上記定義の通りであり、そしてＹ＝−ＯＨであり、以下の構造式を有する：
【００５０】
【化１０】
2009515164.tif 000012
【００５１】
１つの実施態様において、本発明の置換剤化合物は分子内にエーテル基を含まない。１つの実施態様において、本発明の置換剤化合物は、隣接した四級窒素原子を連結するエーテル基を含まない。１つの実施態様において、本発明の置換剤化合物は、ポリ四級基を含むが、隣接したポリ四級基はエーテル含有部分によって連結されていない。１つの実施態様において、本発明の置換剤化合物は、樹木状ポリエーテルを含まない。１つの実施態様において、本発明の置換剤化合物は、四級窒素原子を含むが、これらは、エーテルまたはポリエーテルから得られる基によって相互に連結されていない。
【００５２】
本発明の１つの実施態様によれば、適切な固定相は陽イオン交換樹脂である。適切な陽イオン交換樹脂は当該分野で公知であり、そして一般に、陽イオンが引き付けられる陰イオン部分（例えば、カルボキシメチル、スルホプロピル、スルホン酸、炭酸など）で誘導体化された、メタクリル酸、シリカ、ポリスチレン、またはポリスチレン−ジビニルベンゼンのような樹脂を含む。適切な陽イオン交換材料は、分離される材料のタイプに基づいて当業者によって選択され得る。１つの実施態様において、本発明での使用に適した陽イオン交換樹脂としては、例えば、Ｔｏｓｏｈ  ＳＰ−５ＰＷ、Ｔｏｓｏｈ  ＣＭ−６５０、ＳＰ−６５０、およびＳＰ−５５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）  Ｓｕｐｅｒ−Ｑ ６５０Ｓ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）  ＣＭ ６５０Ｓ、およびＴＳＫ  Ｇｅｌ  ＳＰ−５ＰＷの陽イオン交換樹脂（東ソー株式会社（東京、日本およびMontgomeryville、ペンシルバニア）から入手可能）が挙げられる。加えて、適切な陽イオン交換樹脂としては、例えば、ＵｎｏＳｐｈｅｒｅ  ＳおよびＭａｃｒｏＰｒｅｐ  Ｓ／ＭａｃｒｏＰｒｅｐ  Ｈｉｇｈ−Ｓ（Bio-Rad Laboratories（Hercules、カリフォルニア）から入手可能）；ＣＨＩＲＯＢＩＯＴＩＣ（登録商標）（Advanced Separation Technology（Whippany、ニュージャージー）から入手可能）；ＳＰ−８ＨＲおよびＳＰ−１５ＨＲ（Waters CORPORATION（Miliford、マサチューセッツ）から入手可能）；Ｍｉｎｉ  Ｓ、Ｓｏｕｒｓｅ  １５Ｓ、Ｍｏｎｏ  Ｓ、ＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）  ＨＰ、およびＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）  ＦＦ（GE-Amersham Biosciences（Piscataway、ニュージャージー）から入手可能）；ＳＨＯＷＤＥＸ（登録商標）  ＩＥＣ  ＳＰ−８２５およびＳＨＯＷＤＥＸ（登録商標）  ＩＥＣ  ＳＰ−２０２５（昭和電工（New York、ニューヨーク）から入手可能）；ＰＬ−ＳＣＸ（Polymer Laboratories（Amherst、マサチューセッツ）から入手可能）；Ｍａｃｒｏｓｐｈｅｒｅ３００（Alltech Laboratories（Deerfield、イリノイ）から入手可能）；ＰｏｌｙＳｕｌｆｏＥｔｈｙｌＡ（PolyLC,Inc.（Columbia、メリーランド）から入手可能）；ならびにＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（登録商標）  ＥＭＤ  ＳＥ  ＨｉｃａｐおよびＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（登録商標）  ＥＭＤ  ＳＯ３（EMD Chemicals Inc.（Gibbstown、ニュージャージー）から入手可能）が挙げられる。他の適切な陽イオン交換樹脂も同様に用いられ得る。
【００５３】
本発明の１つの実施態様によれば、置換クロマトグラフィー方法は、タンパク質およびポリペプチドの分離および精製に用いられ得る。本明細書で用いられるように、タンパク質は概して、約５ｋＤａ（キロダルトン）よりも大きな分子量を有するポリアミノ酸であると定義され、そしてポリペプチドは、約５ｋＤａよりも小さな分子量を有するポリアミノ酸である。当業者に理解されるように、タンパク質とポリペプチドとの間の相違点は、より多くの次数にもある。一般に、タンパク質は三次構造を示すのに対し、ポリペプチドは一般には示さない。
【００５４】
１つの実施態様において、本発明は、タンパク質およびポリペプチドのような成分をそのような成分を含む混合物から分離するために特に適用可能である。１つの実施態様において、混合物内の１以上の成分は、１以上のポリペプチド、１以上のタンパク質、またはそのようなタンパク質および／またはポリペプチドのいずれか２以上の混合物を含む。すなわち、本発明の方法は、タンパク質の混合物、ポリペプチドの混合物、およびタンパク質とポリペプチドとの両方の混合物の分離に適用可能である。１つの実施態様において、１以上のタンパク質は、約５ｋＤ以上の分子量を含む。１つの実施態様において、混合物は、２以上のタンパク質、２以上のポリペプチド、またはそれらの混合物を含む。
【００５５】
１つの実施態様において、混合物からのタンパク質および／またはポリペプチドが、当該タンパク質および／またはポリペプチドが実質的に濃縮されている画分、および／または当該タンパク質および／またはポリペプチドが他のタンパク質および／またはポリペプチド成分から実質的に分離されている画分において、固定相から置換される。すなわち、１つの実施態様において、目的とするタンパク質またはポリペプチドを含む混合物が固定相にアプライされ、当該タンパク質またはポリペプチドが固定相から置換されて１以上の画分中に収集されると、当該タンパク質および／またはポリペプチドは、当該画分中にいずれかまたは両方が濃縮された（すなわちより高濃度な）形態で得られるか、または元の混合物中の他の異なるタンパク質および／またはポリペプチド成分から実質的に分離されて得られる。したがって、明らかに、混合物は、分離される２以上の成分を含み得る。後に述べるように、いくつかの実施態様において、本発明の置換クロマトグラフィーに供される混合物は、様々な異なる供与源からの多くの異なる物質の組み合わせを含み得、そして本発明の方法は、それらの様々な成分を分離するためにそのような複雑な混合物に有用に適用され得る。
【００５６】
別の実施態様において、本発明は、少なくとも１の成分（例えば、タンパク質、ポリペプチドまたはその他、以下詳述）および少なくとも１の不純物を含む混合物に適用可能である。本実施態様において、本発明の方法は、成分を不純物から精製するために用いられ得る。このような不純物の除去は、（１）目的のまたは所望の成分が置換された後の固定相上への固定化または保持による（例えば、固定相がフィルターの働きをする場合）、または（２）固定相から洗い出すまたは固定相から溶出させることによる（不純物が「伝統的な」溶出クロマトグラフィーに対してより類似した方法で除去される場合）かのいずれかであり得る。本実施態様においては、不純物がカラム上に固定化されたかまたはカラムから除去されたら、本明細書に記載される置換クロマトグラフィーによって、所望の成分がカラムから取り出され得る。
【００５７】
本発明は、広範囲にわたる様々な成分（上述のタンパク質、ポリペプチド、および不純物ばかりでなく、他の多くの成分を含む）に適用可能である。１つの実施態様において、混合物は、１以上の天然または組換えの抗体、またはそのような抗体のいずれか２以上の混合物を含み得る。１つの実施態様において、混合物は、１以上の天然または組換えの酵素、またはそのような酵素のいずれか２以上の混合物を含み得る。１つの実施態様において、混合物は、診断使用のための１以上の天然または組換えのタンパク質またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質および／またはポリペプチドのいずれか２以上の混合物を含み得る。１つの実施態様において、混合物は、ヒトまたは獣医学用の治療的使用のための１以上の天然または組換えのタンパク質またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質および／またはポリペプチドのいずれか２以上の混合物を含み得る。１つの実施態様において、混合物は、１以上の天然または組換えの動物またはヒトの血漿に由来する１以上のタンパク質またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質および／またはポリペプチドのいずれか２以上の混合物を含み得る。１つの実施態様において、混合物は、１以上の天然または組換えの植物性材料に由来する１以上のタンパク質またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質および／またはポリペプチドのいずれか２以上の混合物を含み得る。１つの実施態様において、混合物は、動物またはヒトの乳または組換え動物から得られた乳の１以上に由来する１以上のタンパク質またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質および／またはポリペプチドのいずれか２以上の混合物を含み得る。１つの実施態様において、混合物は、１以上の天然または組換えの鳥卵に由来する１以上のタンパク質またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質および／またはポリペプチドのいずれか２以上の混合物を含み得る。１つの実施態様において、混合物は、１以上の天然または組換えの細菌、酵母、真菌、ウイルスまたは昆虫に由来する１以上のタンパク質またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質および／またはポリペプチドのいずれか２以上の混合物を含み得る。１つの実施態様において、混合物は、１以上の天然または組換えの哺乳類の細胞培養物または動物組織に由来する１以上のタンパク質またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質および／またはポリペプチドのいずれか２以上の混合物を含み得る。１つの実施態様において、混合物は、１以上の有機化合物、医薬品または医薬品中間体、またはそれらのいずれか２以上の混合物を含み得る。１つの実施態様において、上記１以上の有機化合物、医薬品または医薬品中間体の１以上が、キラル体である。１つの実施態様において、混合物は、上記のいずれの混合物または組み合わせ、例えば、抗体および酵素の混合物、または植物性材料および鳥卵から得られたタンパク質および／またはポリペプチドの混合物、または本発明の方法が適用可能であり得る上記の例示となる成分のいずれかのいかなる混合物をも、含み得る。
【００５８】
１つの実施態様において、本発明の方法は、固定相から出てくる置換剤化合物を検出する工程をさらに含み、この検出する工程は、紫外／可視吸収分光法、蛍光発光分光法、質量分析法、ｐＨ、電気伝導度、および１以上の電気化学的方法の１以上による。上記の方法は、置換剤化合物の検出のために最も一般的に適用可能な方法であるが、当該分野で公知の他の適切な方法を用いてもよい。そのような検出は、上に述べたような、１以上の「Ｙ」置換基の検出であってもよい。
【００５９】
１つの実施態様において、成分が固定相から置換されるのを検出するのに用いられる方法は、目的の具体的な成分に基づいて適切に決定され得る。したがって、例えば、タンパク質およびポリペプチドは、それらの可視／紫外吸収スペクトルまたは特定吸収波長に基づいて、または可視化剤でそれらを誘導体化することによって決定され得る。同様に、医薬品および医薬品中間体は、それらの可視／紫外吸収スペクトルまたは特定吸収波長に基づいて決定され得る。
【００６０】
１つの実施態様において、本発明の方法は、固定相を再生する１以上の工程をさらに含む。１つの実施態様において、再生する工程は、例えばアルカリ金属水酸化物、アルカリ金属塩、アルカリ土類水酸化物、アルカリ土類塩、有機酸、アルキルスルホン酸、四級アンモニウム水酸化物、四級アンモニウム塩、アルキルアミンの１以上の溶液での固定相の処理を含み得、溶液は適切なｐＨ緩衝液をさらに含み得る。他の適切な再生工程が、必要に応じて適宜追加され得、この工程は、精製水による単なる洗浄を含む。１つの実施態様において、再生は、水との有機共存溶媒の使用を含む。
【００６１】
１つの実施態様において、本発明は、置換クロマトグラフィーに供される試料内の微量成分の検出、収集または定量の１以上のための方法を提供する。本発明の方法は、一般的には、先の実施態様に記載したように、予備精製の方法として用いられ得るが、置換クロマトグラフィーは、試料内の微量成分の容易な検出、収集および定量を可能にする効果的な試料調製技術でもある。どの位置においてもクロマトグラフィー樹脂の容量を飽和するのに十分でない濃度の試料成分は、置換の列に加わらないかもしれないが、その代わり、試料内の主要成分の間、および最後の主要成分と置換剤との間の狭い移行ゾーンに保持され得る。これは、移行ゾーンをＡ、ＢおよびＣと標示した図２において明瞭に示される。理論に束縛されないが、これらの微量成分は置換クロマトグラフィー方法に完全には加わっていないかのように見える。いずれにせよ、微量成分はカラムから外れ、そして検出され、収集され、および／または定量され得る。
【００６２】
これらの移行ゾーンに対応する画分の単離は、微量成分が著しく濃縮（１０〜４００倍）され、主要成分が著しく減少した試料を提供する。この組み合わせのため、非主要成分および不純物の同定および定量が、元の試料と比較してよりずっと容易になる。これらの濃縮された試料の分析は、あらゆる適切な方法によってなされ得、このような方法には、置換クロマトグラフィーに用いられるものと同じ樹脂での溶出クロマトグラフィーが含まれる。あるいは、十分な量の微量成分が収集された場合には、これらの成分は置換クロマトグラフィーに供され得る。この実施態様は、最終製品分析、バイオマーカーの発見、方法管理および方法最適化に有用である。本明細書において用いられる用語「微量成分」とは、置換クロマトグラフィーに供される混合物内に存在する相対的に主要でない成分を意味し、そして各々のそのような微量成分は、本発明の置換クロマトグラフィー方法に最初に供される混合物の約０．０１質量％から約１０質量％までを構成し得る。
【００６３】
以下の実施例に、例示となる合成手順を提供し、それによって、これらの例示となる陽イオン置換剤化合物が合成され得る。本発明の範囲内の他の適切な陽イオン置換剤化合物は、当業者に公知の方法および／または当業者に理解されるように上記から応用した方法で合成され得る。
【００６４】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すために含まれる。以下の実施例で開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが発明者によって見出された技術の代表であり、したがって、その実施のために好ましい態様を構成すると考えられることが、当業者に理解される。しかしながら、本明細書の開示を考慮すれば、当業者には、開示されている具体的な実施態様内で多くの変更が可能であり、そして、添付の請求の範囲によってのみ限定される発明の趣旨および範囲から外れることなく、同じか類似した結果がなお得られることが理解される。
【実施例】
【００６５】
実施例１−テトラ四級（Tetraquat）、ＤＢＱの合成：
１，３−ジクロロ−２−プロパノール（ＤＣＰ）を、本質的にはPerrine（J.Organic Chemistry、１８巻、１１３７頁〜１１４１頁（１９５３年））によって記載されたように、２当量のジメチルアミンとの反応によって、１，３−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−２−プロパノール（「ＢＤＡＰ」）に転換する。次いで、新たに蒸留したＢＤＡＰ（１４６ｇ、１モル）およびおよそ１７０ｍＬの水を、還流冷却器を取り付けた丸底フラスコに投入する。Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−クロロプロピル）−Ｎ−ベンジル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（９０５ｇ（固形分５９．８％にて）＝５４１ｇ＝２モル）の水溶液を３時間にわたって滴下しながら添加する。得られた溶液を、室温で１１時間攪拌する。次いで、この溶液を５０℃に加熱し、連続的に攪拌しながら１時間この温度で保持し、その後、室温まで冷却させる。得られたＤＢＱ水溶液は、陽イオン交換媒体のような固定相での置換剤化合物としての使用に適している。固体のＤＢＱ（これもまた置換剤化合物としての使用に適している）は、ロータリーエバポレーションによって水を除去し、その後２−プロパノールからの析出を繰り返し、そして最終的に高真空下で溶媒を除去することで回収し得る。
【００６６】
実施例２−トリ四級（Triquat）、ＤＭＴＱの合成：
滴定分析法（ヨウ化テトラブチルアンモニウム／過塩素酸法）によって７２．９質量％の活性エポキシ種を含むことが見出されたグリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（ＧＭＡＣ）（Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ＃３０３３−７７−０）水溶液を用いる。約４００ｍＬ水中の塩酸ジメチルアミン（４０８ｇ、５モル、Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液を、還流冷却器に取り付けられた丸底フラスコ内で激しく攪拌する。これに、１０４０ｇのＧＭＡＣ溶液（＝７５８ｇ活性＝５モル）を、外部から加熱も冷却もせずに約１時間にわたって滴下させながら添加する。この添加では、通常目立った発熱を生じない。得られた溶液を、添加が完了してから１時間、室温で攪拌する。この時点で、別の等量のＧＭＡＣ溶液（５モル）の滴下による添加を開始する。この添加により強い発熱が生じ、ＧＭＡＣ溶液の添加を続けると最終的には溶液の還流が生じる。この第２のＧＭＡＣ投入の添加速度は、発熱を管理しておけるように調整する。添加が完了すると、溶液を放冷しながら攪拌する。温度が約７０℃に達したら（約３時間後）、電子コントローラ（Ｊ−Ｋｅｍ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）で設定値７０℃に制御された加熱マントルを用いて、外部加熱をあてがう。この溶液を、約２４時間、７０℃で保持する。室温に冷却されると、ＤＭＴＱ溶液は、陽イオン交換媒体のような適切な固定相での置換剤化合物としての使用に適している。
【００６７】
実施例３−トリ四級（Triquat）、ＴＢＴＱ−Ａの合成：
トリアミンＮ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−トリメチル−１，３−プロパンジアミン（ＰＯＬＹＣＡＴ（登録商標）７７としても知られる）の原液を、２−プロパノール中で調製し、ドライ窒素下で数日間、ＣａＨ２と共に攪拌することによって乾燥させる。テフロン（登録商標）でコートされたサーモカップルおよびゴムのセプタムが取り付けられた２５０ｍＬの３首丸底フラスコに、このろ液１０７ｍＬ（１２．５ｇのＰＯＬＹＣＡＴ（登録商標）７７（０．０６モル）を含む）と、磁気攪拌子とを投入する。フラスコに窒素をフラッシュし、窒素の陽圧下で密封する。臭化ベンジル（３５ｇ、０．２モル、Ａｌｄｒｉｃｈ）を、約３時間にわたって、シリンジポンプによって一定の速さで、テフロン（登録商標）のニードルを通して攪拌されたフラスコに添加する。緩やかな発熱がみられ、内部温度は約３０℃まで上昇する。臭化ベンジルの添加が完了すると、この溶液を、４０〜４５℃で１４時間加熱し、室温まで冷却し、ロータリーエバポレーターで粘性油まで脱水し、メタノール中に集めて６０ｍＬのシクロヘキサンで３回抽出し、炭素で脱色し、ろ過し、そして乾燥するまで脱水して、オフホワイトの固体であるＴＢＴＱ−Ａを得る。この物質は、陽イオン交換媒体のような適切な固定相での置換剤化合物としての使用に適している。
【００６８】
実施例４−ジ四級（Diquat）、ＢＴＡの合成：
ＤＣＰ（８０ｇ、０．６モル）および４０％の水性トリメチルアミン（１８８ｇ（４０質量％にて）＝７５ｇ＝１．２７モル）を、還流冷却器を取り付けた５００ｍＬの丸底フラスコに投入する。この混合物を７５℃に加熱し、激しく磁気攪拌しながら４８時間この温度で保持する。この終了時の透明な無色の溶液を、室温まで冷却させる。ＢＴＡの収率は＞９８％である。室温に冷却されると、ＢＴＡ溶液は、陽イオン交換媒体のような適切な固定相での置換剤化合物としての使用に適している。
【００６９】
実施例５−ジ四級（Diquat）、ＤＢＤの合成：
臭化ベンジル（８７ｇ、０．５モル、Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００ｍＬのアセトニトリル（ＨＰＬＣグレード、Ｆｉｓｈｅｒ）、および磁気攪拌子を、サーモカップルを取り付けた５００ｍＬの３首丸底フラスコに投入し、次いで窒素下で密封する。蒸留して得たＢＤＡＰ（３５ｇ、０．２４モル）を、メスシリンダーに入れて計量し、次いで６０ｍＬの添加漏斗に投入して、２０ｍＬの無水アセトニトリルと共に濯ぎ入れる。得られたＢＤＡＰ溶液の滴下による添加を、８０分にわたって実施する。すぐに強い発熱がみられ；添加を続けると溶液の温度はゆっくりと約４５℃まで上昇する。添加は、約４５℃の温度を維持するために終点付近で加速し得る。ＢＤＡＰ溶液の添加が完了すると、加熱マントルを配置し、溶液を５５℃で３時間、次いで７０℃で１５時間、加熱する。この溶液を室温に冷却し、回収フラスコに移し、ロータリーエバポレーターで脱水して粘性液とする。この液体をアセトン／水中に集め、そしてロータリーエバポレーターで再度揮発し、黄褐色の固体であるＤＢＤ１２２．７ｇ（収率１００％）を得、これは、分析ＨＰＬＣによって本質的に１００％の純度である。この物質は、陽イオン交換媒体のような適切な固定相での置換剤化合物としての使用に適している。
【００７０】
実施例６−タンパク質混合物の置換クロマトグラフィー
（材料および装置）
ウシのシトクロムＣ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｃ３１３１、分子量１２，３２７）およびウマのシトクロムＣ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｃ７７５２、分子量１２，３８４）を、受けとったままの状態で用いる。ＨＰＬＣ分析によれば、それらは、それぞれ約８７％の純度、および約８６％の純度であり、残りは２８０ｎｍおよび４３０ｎｍに吸収を持つ、損傷を受けたシトクロム分子またはアイソフォームである。他の全ての化学薬品は、特に明記しない限りＡＣＳ試薬グレードかそれ以上であり、受けとったままの状態で用いる。緩衝溶媒はＨＰＬＣグレードの蒸留水である。ローディング／平衡化緩衝液は、２５ｍＭのＭＯＰＳＯ（２−ヒドロキシ−３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）を含む（ＮａＯＨでｐＨ＝７．０に調整）。置換剤溶液は、濃原液をローディング緩衝液で所望の濃度に希釈することによって調製する。全ての緩衝溶液は、ヘリウムパージし、そして０．２μｍのフィルターを通してろ過してから使用する。置換実験はＫｎａｕｅｒ  ＨＰＬＣシステム（Ｋ−１００１型ポンプ、Ｋ−２６００型ＵＶ検出器、４チャンネルのデガッサー、および溶媒オーガナイザー）を用いて実施する。画分分析は、Ｗａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣシステム（６００型ポンプおよび制御装置、９９６型検出器（ＰＡＤ）、および冷蔵試料トレイを備えた７１７ｐｌｕｓ型オートサンプラー）を用いて実施する。
【００７１】
（カラム調製）
固定相（陽イオン交換樹脂（Ｔｏｓｏｈ  ＳＰ−５ＰＷ）、６．０×１５０ｍｍカラムにロードした）を、メソッドＣ（下記）を用いて洗浄および再生し、次いで、ローディング／平衡化緩衝液内でナトリウム型として保存する。カラムのアウトプットは、２６４ｎｍでモニターされた紫外／可視フロー検出器、電気伝導度フローセルおよびｐＨフローセルを通過させる。カラムを流速０．１７ｍＬ／分のローディング緩衝液で平衡化する。３つ全ての信号（ＵＶ吸収、電気伝導度、ｐＨ）が安定した平坦なベースラインを形成すると（約２５分、１ＣＶ）、置換実験をすぐに開始する。カラムの先端部をナトリウム型から水素型に変換することがないように、平衡化時間が過度になることを避ける。
【００７２】
（破過実験）
ローディング緩衝液内のウシのシトクロムＣの４ｍＭの溶液、およびローディング緩衝液内のウマのシトクロムＣの４ｍＭの溶液を用いて、０．１〜０．５ｍＬ／分の間の様々な流速で破過（breakthrough）実験を行う。これらの実験から、満足のいくそして再現可能なデータが、０．１７ｍＬ／分で得られ得ることが見出される。カラム飽和容量は、ウシのシトクロムＣで１４８ｍｇ（３４．７ｍｇ／ｍＬ  マトリックス）、ウマのシトクロムＣで１５０ｍｇ（３５．２ｍｇ／ｍＬ  マトリックス）であることが見出される。
【００７３】
（置換実験）
ウシのシトクロムＣ（４．１２ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ  ＃Ｃ３１３１、分子量＝１２，３２７）およびウマのシトクロムＣ（４．１０ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ  ＃Ｃ７７５２、分子量１２，３８４）の各溶液を、ローディング緩衝液中で調製する。タンパク質の濃度は、ＢＣＡ−ＣｏｐｐｅｒおよびＢｒａｄｆｏｒｄ分析を用いて決定する。これらの２つのシトクロム溶液を等容量で混合し、２０．０μＬの試料ループにロードし、次いで洗浄され適切に平衡化された陽イオン交換カラムに、０．１７ｍＬ／分の定流速で１２０分間、送り込む。ループをインプットフロー路外に切り換え、ローディング緩衝液を０．１７ｍＬ／分で２５分間カラムの間中に送り込む。最後に、ローディング緩衝液中の４．０ｍＭのＤＢＱ置換剤溶液を０．１７ｍＬ／分でカラムに送り込み、カラムのアウトプットを紫外／可視フロー検出器（１０μＬフローセル、２６４、２８０、４３０ｎｍでモニター）を経由してフラクションコレクターへと通過させる。時間を関数とした紫外／可視検出器の出力を、図１に再現する。
【００７４】
置換剤溶液がカラム内へと流れ始めてからおよそ７０分間、カラム流出物内でいかなるタンパク質物質も検出されないため、この間は画分を収集しない。画分１を、置換剤のフローを開始してから約７０分後に収集し、その後の画分を１分毎に収集する。電気伝導度フローセルおよびｐＨフローセル（上記参照）は、置換実験の経過をモニターするために、通常は紫外／可視検出器の後ろのアウトプット路にある；しかしながら、画分を収集するときは、これらの２つのセルを、置換ピーク間の移行の幅を広げないようにフロー路外に切り換える。合計１０８の画分を収集する。収集されると、画分は、後のＨＰＬＣ分析のために、密封し、冷蔵する。置換実験は室温（２２℃）で実施する。
【００７５】
（置換実験画分のＨＰＬＣ分析）
置換実験で収集された１０８全ての画分を、それぞれの内容物を決定するためにＨＰＬＣ分析に供する。
この分析の条件は：
カラム：
ステンレス鋼、４．６（内径）×２００ｍｍ、ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ Ａ、強陽イオン交換シリカベースマトリックス、粒子径５μｍ、細孔径３００オングストローム、ＰｏｌｙＬＣ（Columbia、メリーランド）社製
緩衝溶媒：
ＨＰＬＣグレード蒸留水
溶出緩衝液：  
Ａ−２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  （ＮａＯＨでｐＨ＝６．８に調整）
Ｂ−５００ｍＭ  ＮａＣｌ＋２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ＮａＯＨでｐＨ＝６．８に調整）
溶出緩衝液は０．２μｍフィルターを通してろ過し、粒状物を除去した。
流速：
１．０ｍＬ／分で一定。
勾配方法：
０〜２分      １００％Ａ、定組成
２〜６２分    １００％Ａから１００％Ｂ、線形
６２〜７２分  １００％Ｂ、定組成
ＵＶ検出器：  
２６４ｎｍ−ＤＢＱ＋全タンパク質
２８０ｎｍ−全タンパク質
４３０ｎｍ−シトクロムタンパク質のみ
試料調製：  
画分試料３０μＬおよび用時調製した１０ｍＭの１，４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）３０μＬを混合する。この混合物５０μＬをカラムに注入する。
【００７６】
各々の画分における成分濃度は、分析ＨＰＬＣピークの積分によって決定する。その結果は、図２にグラフ表示したヒストグラムにまとめられる。純画分をプールし、表１にまとめたデータを得る。カラムからの全タンパク質の収率は９８％である。
【００７７】
【表１】
2009515164.tif 000013
【００７８】
実施例７−タンパク質混合物の置換クロマトグラフィー
（材料および装置）
ウシのシトクロムＣ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｃ３１３１、概算分析(approx. assay)＝８９％）およびウシのα−キモトリプシノゲンＡ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｃ４８７９、概算分析＝６５％）を、受け取ったままの状態で用いる。他の全ての化学薬品は、特に明記しない限りＡＣＳ試薬グレードかそれ以上であり、受け取ったままの状態で用いる。緩衝溶媒はＨＰＬＣグレードの蒸留水である。ローディング／平衡化緩衝液は、２５ｍＭのＭＯＰＳＯ（２−ヒドロキシ−３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）を含む（ＮａＯＨでｐＨ＝７．０に調整）。置換剤溶液は、濃原液をローディング緩衝液で所望の濃度に希釈することによって調製する。全ての緩衝溶液は、ヘリウムパージし、そして０．２μｍのフィルターを通してろ過してから使用する。置換実験はＫｎａｕｅｒ  ＨＰＬＣシステム（Ｋ−１００１型ポンプ、Ｋ−２６００型ＵＶ検出器、４チャンネルのデガッサー、および溶媒オーガナイザー）を用いて実施する。画分分析は、Ｗａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣシステム（６００型ポンプおよび制御装置、９９６型検出器（ＰＡＤ）、および冷蔵試料トレイを備えた７１７ｐｌｕｓ型オートサンプラー）を用いて実施する。
【００７９】
（カラム調製）
カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｍｏｎｏ Ｓ、５．０×２００ｍｍ）を、メソッドＣ（下記）を用いて洗浄および再生し、次いで、塩化ナトリウム緩衝液（２．０Ｍ  ＮａＣｌ＋２５ｍＭ  ＭＯＰＳＯ、ＮａＯＨでｐＨ＝７．０に調整）内でナトリウム型として保存する。カラムのアウトプットは、２６４ｎｍでモニターされた紫外／可視フロー検出器、電気伝導度フローセルおよびｐＨフローセルを通過させる。カラムを流速０．２０ｍＬ／分のローディング緩衝液（上記参照）によって平衡化する。３つ全ての信号（ＵＶ吸収、電気伝導度、ｐＨ）が安定した平坦なベースラインを形成すると（約２０分、１ＣＶ）、置換実験をすぐに開始する。カラムの先端部をナトリウム型から水素型に変換することがないように、平衡化時間が過度になることを避ける。
【００８０】
（破過実験）
ローディング緩衝液内のウシのシトクロムＣの４．０ｍｇ／ｍＬの溶液およびローディング緩衝液内のウシのα−キモトリプシノゲンＡの４．０ｍｇ／ｍＬの溶液を用いて、０．１〜０．５ｍＬ／分の間の様々な流速で破過実験を行う。ローディング緩衝液は、２５ｍＭのＭＯＰＳＯ（２−ヒドロキシ−３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）から調製し、ＮａＯＨでｐＨ＝７．０に調整する。０．２０ｍＬ／分で良好で再現可能なデータが得られる。カラム飽和容量は、シトクロムＣで約１９８ｍｇ（５０．４ｍｇ／ｍＬ  マトリックス）、キモトリプシノゲンで約３７６ｍｇ（９５．７ｍｇ／ｍＬ  マトリックス）である。これらの実験において、ボトルから直接の未精製のタンパク質を用いる。
【００８１】
（置換実験）
ウシのシトクロムＣ（５．０４ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ  ＃Ｃ３１３１）およびウシのα−キモトリプシノゲンＡ（９．９６ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ  ＃Ｃ４８７９）の各溶液を、ローディング緩衝液（上記参照）中で調製する。タンパク質の濃度は、ＢＣＡ−ＣｏｐｐｅｒおよびＢｒａｄｆｏｒｄ分析を用いて決定する。これらの２つのシトクロム溶液を等容量で混合し、２０．０ｍＬの試料ループにロードし、次いで洗浄され適切に平衡化された陽イオン交換カラム（上記参照）に０．４０ｍＬ／分の定流速で６０分間、送り込む。このループをインプットフロー路外に切り換え、ローディング緩衝液を０．２０ｍＬ／分で２０分間カラムの間中に送り込む。最後に、ローディング緩衝液内の４．０ｍＭのＤＢＱ置換剤溶液を０．２０ｍＬ／分でカラムに送り込み、カラムのアウトプットを紫外／可視フロー検出器（１０μＬフローセル、２６４、２８０ｎｍでモニター）を経由してフラクションコレクターへと通過させる。画分を１．００分毎に収集する。電気伝導度フローセルおよびｐＨフローセル（上記参照）は、置換実験の経過をモニターするために、通常は紫外／可視検出器の後ろのアウトプット路にある；しかしながら、画分を収集するときは、これらの２つのセルを、置換ピーク間の移行の幅を広げないようにフロー路外に切り換える。収集されると、画分は、後のＨＰＬＣ分析のために、密封し、冷蔵する。置換実験は室温（２２℃）で実施する。この置換トレースを、図３に示す。
【００８２】
（タンパク質のＨＰＬＣ分析）
ＨＰＬＣ画分分析の詳細を以下に示す。
カラム：
内寸４．６×２００ｍｍのステンレス鋼カラム
ＰｏｌｙＬＣ（Columbia、メリーランド）社製
ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ Ａ、強陽イオン交換シリカベースマトリックス
粒子径５μｍ、細孔径３００オングストローム
緩衝溶媒：
ＨＰＬＣグレード蒸留水
溶出緩衝液：  
Ａ−２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  （ＮａＯＨでｐＨ＝６．８に調整）
Ｂ−０．５０Ｍ  ＮａＣｌ＋２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ＮａＯＨでｐＨ＝６．８に調整）
溶出緩衝液は０．２μｍフィルターを通してろ過し、粒状物を除去した。
流速：
１．０ｍＬ／分で一定。
勾配方法：
０〜２分      １００％Ａ、定組成
２〜６２分    １００％Ａから１００％Ｂ、線形勾配
６２〜７２分  １００％Ｂ、定組成
ＵＶ検出器の波長：  
２６４ｎｍ−ＤＢＱ＋タンパク質
２８０ｎｍ−タンパク質
４３０ｎｍ−シトクロム
試料調製：  
５０μＬの試料混合物をカラムに注入する。
【００８３】
１２５の収集した試料は全て上述の方法によって分析し、２６４ｎｍ、２８０ｎｍおよび４３０ｎｍからの組み合わせたデータを、図４および下記の表に示す。カラムからのタンパク質の収率は近似量（＞９７％）である。
【００８４】
【表２】
2009515164.tif 000014
【００８５】
（カラム洗浄および再生手順）
ＤＢＱのような置換剤化合物を用いた置換手順に用いる陽イオン交換カラムの洗浄および／または再生には、以下のメソッドの１以上が用いられ得る。「再生効率」は、その手順の完了後に回復される元のカラムの破過容量の割合として表す。各々のメソッドにおいて、工程は列挙された順序で行い、流速はおよそ０．６４ｍＬ／分である。
【００８６】
【表３】
2009515164.tif 000015
【００８７】
【表４】
2009515164.tif 000016
【００８８】
【表５】
2009515164.tif 000017
【００８９】
【表６】
2009515164.tif 000018
【００９０】
【表７】
2009515164.tif 000019
【００９１】
【表８】
2009515164.tif 000020
【００９２】
【表９】
2009515164.tif 000021
【００９３】
【表１０】
2009515164.tif 000022
【００９４】
【表１１】
2009515164.tif 000023
【００９５】
本明細書に記載されたおよび本願で請求された全ての組成物および方法は、本明細書の記載を考慮し、当業者の知識に基づいて、過度の実験を要することなく、当業者によって作製および実施され得る。本発明の組成物および方法は、特定の好ましい実施態様に関して記載されているが、発明の概念、趣旨、および範囲から外れることなく、本明細書に記載された組成物および／または方法および当該方法の工程もしくは工程の順序に変更が適用され得ることは、当業者に明らかである。より具体的には、本明細書に記載された薬剤の代わりに、化学的または生理学的に関連するある種の薬剤を用いて、同じかまたは類似の結果が得られるであろうことは明らかである。当業者に明らかなこのような類似の代用物および変更は全て、添付の請求の範囲に定義される、本発明の趣旨、範囲、および概念の範囲内にあると考えられる。さらに、本明細書に記載された具体的な実施態様のいずれかあるいは全ての可能な組み合わせは全て、本発明の範囲内にあると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、本発明の実施態様におけるウシのシトクロムＣとウマのシトクロムＣとの混合物の置換クロマトグラフィー期間にわたる、各種波長における紫外／可視ＨＰＬＣ検出器の出力を表したグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施形態におけるウシのシトクロムＣとウマのシトクロムＣとの混合物の置換クロマトグラフィー期間にわたって収集された画分の濃度を表したグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施態様におけるウシのシトクロムＣとウシのα−キモトリプシノゲンＡＣとの混合物の置換クロマトグラフィー期間にわたる、各種波長における紫外／可視ＨＰＬＣ検出器の出力を表したグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施態様におけるウシのシトクロムＣとウシのα−キモトリプシノゲンＡＣとの混合物の置換クロマトグラフィー期間にわたって収集された画分の濃度を表したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2009515164.tif 000032
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