(57)【要約】  本発明は、細胞でのプログラムされた細胞死が予防若しくは遅延されるような、組換え第ＶＩＩＩ因子を発現する細胞中で１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチドを発現することによる、プログラムされた細胞死を予防若しくは遅延することに関する。本発明はまた、細胞による組換え第ＶＩＩＩ因子の産生が増大されるような細胞中で１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチドを発現することによる、組換え第ＶＩＩＩ因子の産生を増大させることにも関する。第ＶＩＩＩ因子を産生するのに有用な組換え細胞。
2009535019.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞でのプログラムされた細胞死が予防若しくは遅延されるような１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチドを細胞中で発現することを含んでなる、組換え第ＶＩＩＩ因子を発現する細胞でのプログラムされた細胞死の予防若しくは遅延方法。
【請求項２】
1種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチドの発現が、前記１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された少なくとも１種の誘導可能な異種プロモーターにより制御されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗アポトーシスポリペプチドが真核生物細胞若しくはウイルス中で遺伝子によりコードされている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抗アポトーシスポリペプチドがＡｖｅｎおよびＥ１Ｂ−１９Ｋよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１種の抗アポトーシスポリペプチドを発現することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗アポトーシスポリペプチドがＥ１Ｂ−１９Ｋである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２種の抗アポトーシスポリペプチドを発現することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも２種の抗アポトーシスポリペプチドがＥ１Ｂ−１９ＫおよびＡｖｅｎを包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
組換え細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
組換え細胞が、ヒト細胞、マウス細胞およびげっ歯類細胞よりなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
組換え細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
組換え細胞がＢＨＫ細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
組換え細胞が小スケール、バッチ若しくは灌流細胞培養過程にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
組換え細胞が、大スケールバイオリアクター、若しくは商業生産の培養装置中にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
組換え細胞が、大スケール灌流細胞培養バイオリアクター、若しくは商業生産の灌流細胞培養装置中にある、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
細胞による第ＶＩＩＩ因子の産生が増大されるような１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチドを細胞中で発現することを含んでなる、組換え細胞による第ＶＩＩＩ因子の産生の増大方法。
【請求項１７】
１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチドの発現が、前記１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された少なくとも１種の誘導可能な異種プロモーターにより制御されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
抗アポトーシスポリペプチドが真核生物細胞若しくはウイルス中で遺伝子によりコードされている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
抗アポトーシスポリペプチドがＡｖｅｎおよびＥ１Ｂ−１９Ｋよりなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
１種の抗アポトーシスポリペプチドを発現することを含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
抗アポトーシスポリペプチドがＥ１Ｂ−１９Ｋである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも２種の抗アポトーシスポリペプチドを発現することを含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも２種の抗アポトーシスポリペプチドがＥ１Ｂ−１９ＫおよびＡｖｅｎを包含する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
組換え細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
組換え細胞が、ヒト細胞、マウス細胞およびげっ歯類細胞よりなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
組換え細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
組換え細胞がＢＨＫ細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
組換え細胞が小スケール、バッチ若しくは灌流細胞培養過程にある、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
組換え細胞が、大スケールバイオリアクター、若しくは商業生産の培養装置中にある、請求項１６に記載の方法。
【請求項３０】
組換え細胞が、大スケール灌流細胞培養バイオリアクター、若しくは商業生産の灌流細胞培養装置中にある、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
組換え細胞の産生が増大されるような、細胞中で１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチドを発現することを含んでなる、組換え第ＶＩＩＩ因子を発現する細胞の産生の増大方法。
【請求項３２】
少なくとも２種の抗アポトーシスポリペプチドを発現する若しくは発現することが可能な、第ＶＩＩＩ因子を産生するのに有用な組換え細胞。
【請求項３３】
抗アポトーシスポリペプチドが真核生物細胞若しくはウイルス中で遺伝子によりコードされる、請求項３２に記載の組換え細胞。
【請求項３４】
抗アポトーシスポリペプチドがＡｖｅｎおよびＥ１Ｂ−１９Ｋよりなる群から選択される、請求項３３に記載の組換え細胞。
【請求項３５】
１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチドの発現が、前記１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された少なくとも１種の誘導可能な異種プロモーターにより制御されている、請求項３３に記載の組換え細胞。
【請求項３６】
組換え細胞が哺乳動物細胞である、請求項３２に記載の組換え細胞。
【請求項３７】
組換え細胞が、ヒト細胞、マウス細胞およびげっ歯類細胞よりなる群から選択される、請求項３６に記載の組換え細胞。
【請求項３８】
組換え細胞がＣＨＯ細胞である、請求項３７に記載の組換え細胞。
【請求項３９】
組換え細胞がＢＨＫ細胞である、請求項３７に記載の組換え細胞。
【請求項４０】
細胞が小スケール、バッチ若しくは灌流細胞培養過程で第ＶＩＩＩ因子を産生する、請求項３３に記載の組換え細胞。
【請求項４１】
細胞が、大スケールバイオリアクター、若しくは商業生産の培養装置中で第ＶＩＩＩ因子を産生する、請求項３３に記載の組換え細胞。
【請求項４２】
細胞が、大スケール灌流細胞培養バイオリアクター、若しくは商業生産の灌流細胞培養装置中で第ＶＩＩＩ因子を産生する、請求項３３に記載の組換え細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年４月２１日出願の米国仮出願第６０／７９３，９０５号（その内容はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、細胞生存、細胞生理学およびタンパク質産生を改良するための手段としての抗アポトーシス遺伝子に関する。具体的には、本発明は、細胞中で１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチドを発現することによる、組換え第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を分泌する細胞株でのプログラムされた細胞死を阻害することに関する。
【背景技術】
【０００３】
哺乳動物細胞培養物は、適正な翻訳後修飾を伴うタンパク質を産生するその能力により、多くの組換えタンパク質製造方法に選択すべき系である。製造の需要が増加すると、生成物の収量および品質を増大させるための方法の効率の改良に強い興味が存在する。アポトーシス細胞死経路の改変はこの目標を達成するのに利用可能な一手段である。アポトーシスは、細胞培養物での死の主原因（栄養素および成長因子の喪失、酸素枯渇、毒素蓄積および剪断力ストレスのような培養物の傷害の結果）と認識されている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。アポトーシスは、最大生存可能細胞密度を制限し、死細胞からの毒性代謝物の放出を促進し、そして異種タンパク質収量を潜在的に減少させる（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献２、非特許文献３；非特許文献１３）。
【０００４】
これらの問題を取り扱うため、小スケール、バッチ、および灌流細胞培養過程での抗アポトーシス遺伝子の発現を研究する多数の報告が存在した（非特許文献９；非特許文献１３：非特許文献１４；非特許文献２、非特許文献３；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８）。これらの研究の多くで、目的の抗アポトーシス遺伝子の発現は、毒性の傷害、栄養素の喪失若しくは毒素蓄積に曝露される培養物の生存率を増大させる。これらの研究のいくつかは、Ｂｃｌ−２ファミリーからの抗アポトーシス遺伝子の使用を探求した（非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献１６、非特許文献１７；非特許文献１０；非特許文献１５；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３）。他者は、アデノウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質（非特許文献２４）、カポシ肉腫関連ウイルスＫＳＢｃｌ−２タンパク質、およびエプスタイン−バーウイルスＢＨＲＦ−１タンパク質（非特許文献１８）のようなＢｃｌ−２の機能的ウイルスホモログの使用を探求した。Ｂｃｌ−２およびＥ１Ｂ−１９Ｋの配列相同性がある種の保存されたドメインに限定される（非特許文献２５；非特許文献２６）場合であっても、それらの機能は、アデノウイルス感染およびアデノウイルスＥ１Ａタンパク質発現から生じるアポトーシスの抑制において互換性である（非特許文献２７；非特許文献２５；非特許文献２８）。Ｅ１Ｂ−１９Ｋは、プロアポトーシスタンパク質Ｂａｘ、ＢａｋおよびＢｉｋ、ならびにｐ５３腫瘍抑制タンパク質に結合することによりアポトーシスを阻害する（非特許文献２９；非特許文献３０；非特許文献３１；非特許文献３２；非特許文献３３）。ｐ５３誘発性のアポトーシスの間、Ｅ１Ｂ−１９ＫはＢａｋを結合しかつＢａｘ−Ｂａｋ相互作用を阻害して、ミトコンドリアからのプロアポトーシス因子、チトクロームｃおよびＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯの放出を予防する（非特許文献３４）。
【０００５】
Ａｖｅｎは、酵母ツーハイブリッドスクリーニング（非特許文献３５）で同定された抗アポトーシスタンパク質であり、カスパーゼ活性化を阻害する。外的若しくは内的アポトーシス刺激後に、チトクロームｃがミトコンドリアの膜間腔から放出され、そこでそれは
Ａｐａｆ−１オリゴマー化を開始し、そしてこの会合がカスパーゼ−９を動員かつ活性化する（非特許文献３６；非特許文献３７）。活性化されたカスパーゼ−９は、細胞分解につながる下流のカスパーゼをさらに活性化する（非特許文献３８）。ＡｖｅｎはＡｐａｆ−１の自己会合を阻害し、そして従ってカスパーゼ−９活性化を抑制する（非特許文献３５）。ＡｖｅｎはＢｃｌ−ｘＬに結合し、カスパーゼ−１誘発性のアポトーシス後のＢｃｌ−ｘＬの抗アポトーシス特性を高める（非特許文献３５）。加えて、Ａｖｅｎ発現は、使用済み培地（ｓｐｅｎｔ  ｍｅｄｉｕｍ）および血清除去での培養を包含する多様なアポトーシス傷害に曝露されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中のＢｃｌ−ｘＬの保護効果を高める（非特許文献１２）。最近、ＡｖｅｎおよびＥ１Ｂ−１９Ｋを発現するＣＨＯ細胞が、小スケールスピナーフラスコおよび大スケール流加培養法で、より高い細胞密度まで増殖し、より長く生存し、そしてより高レベルのモノクローナル抗体を生成することが観察された。容量生産性の増大は、主に、ＡｖｅｎおよびＥ１Ｂ−１９Ｋ発現により提供される高められた細胞生存率によった（非特許文献３９）。
【０００６】
動物細胞のバッチおよび流加処理に対する一代替培養様式は灌流培養である。灌流培養の間、新鮮栄養培地を継続的に供給しかつ目的のタンパク質および代謝副生成物と一緒に連続的に馴化培地を除去しつつ、組換えタンパク質を分泌する細胞をバイオリアクター中に保持する。代謝副生成物の蓄積および栄養素の枯渇が細胞培養物の能力を制限し得るバッチ培養と異なり、灌流培養は、細胞を長期間高密度で培養させる定常状態環境を確立する（非特許文献４０；非特許文献４１；非特許文献４２；非特許文献４３；非特許文献４４）。にもかかわらず、細胞生存率の低下が灌流培養でなお観察されており、アポトーシスは、とりわけ高細胞密度および低灌流速度の条件で死亡の主原因と同定されている（非特許文献４５；非特許文献４；非特許文献４６；非特許文献４７；非特許文献４８）。組換えタンパク質を分泌する細胞中でＢｃｌ−２（非特許文献４７；非特許文献４９；非特許文献５０）およびＥ１Ｂ−１９Ｋ（非特許文献５１）のような抗アポトーシスタンパク質を発現することにより灌流培養物でのアポトーシス阻害を検討している研究が存在する。これらの報告は双方とも、親細胞培養物と比較して抗アポトーシス遺伝子を発現する細胞培養物の細胞生存率の改善および生存可能細胞密度の増大を示す。しかしながら比生産性に対する影響は相容れない。Ｂｉｅｒａｕらは、スピンフィルターおよび超音波フィルター灌流バイオリアクターで培養した、Ｂｃｌ−２を発現するハイブリドーマ細胞株での比モノクローナル抗体生産性の低下を報告している。固定床リアクターで培養した、Ｂｃｌ−２を発現するハイブリドーマ細胞株での別の研究は、比モノクローナル抗体生産性の増大を示す（非特許文献５２）。Ｅ１Ｂ−１９Ｋを発現するＮＳ０骨髄腫細胞株はキメラ抗体のより高い比生産性を示す（非特許文献１３）が、しかし、Ｂｃｌ−２を発現する別のＮＳ０細胞株はより低い比抗体生産性を提示する（非特許文献５０）。これらの以前の研究は、しかしながら、制限された数の希釈率にわたりかつ灌流速度と協働する変化する細胞密度で、細胞生存率および生産性を検査した。細胞が時間にわたり蓄積しかつ上昇する細胞密度に対応して灌流速度（１日あたりの細胞培養物の容量あたりの培地の容量）が増大したような、一研究での供給（ｆｅｅｄｉｎｇ）戦略が設計された（非特許文献５０）。別の研究で、培養を一定ＶＶＤ（１日あたりの有効細胞懸濁液容量あたりの新鮮培地の容量）で実施した一方、細胞密度はより後の段階でプラトーまで増大する（非特許文献１３）。
【０００７】
タンパク質生産性を増大させるための上述された多様なアプローチは変動する程度まで成功裏であった。にもかかわらず、とりわけ大スケール商業生産において、細胞に関係する生成物、例えば組換えタンパク質の産生の増大方法を開発することの必要性がなお存在する。加えて、プログラムされた細胞死の予防若しくは遅延方法を開発することの必要性が存在する。
【０００８】
【非特許文献１】ＣｏｔｔｅｒとＡｌ−Ｒｕｂｅａｉ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３（４）：１５０−５、１９９５
【非特許文献２】Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６７（５）：５４４−５４、２０００ａ
【非特許文献３】Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６７（５）：５４４−５４、２０００ｂ
【非特許文献４】ＭｅｒｃｉｌｌｅとＭａｓｓｉｅ、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５（１−３）：１１７−２８、１９９４
【非特許文献５】ＳａｎｆｅｌｉｕとＳｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６４（１）：４６−５３、１９９９
【非特許文献６】ＬｅｎｇｗｅｈａｓａｔｉｔとＤｉｃｋｓｏｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８０（７）：７１９−３０、２００２
【非特許文献７】Ｚａｎｇｈｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６４（１）：１０８−１９、１９９９
【非特許文献８】Ｗｏｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４（２）：３７３−８２、２００６
【非特許文献９】ＣｈｉａｎｇとＳｉｓｋ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９１（７）：７７９−９２、２００５
【非特許文献１０】Ｆｉｇｕｅｒｏａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７３（３）：２１１−２２、２００１
【非特許文献１１】Ｆｉｇｕｅｒｏａら、Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．５（４）：２３０−４５、２００３
【非特許文献１２】Ｆｉｇｕｅｒｏａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８５（６）：５８９−６００、２００４
【非特許文献１３】ＭｅｒｃｉｌｌｅとＭａｓｓｉｅ、１９９９
【非特許文献１４】ＫｉｍとＬｅｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７１（３）：１８４−９３、２０００
【非特許文献１５】Ｍｅｅｎｔｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８０（６）：７０６−１６、２００２
【非特許文献１６】Ｔｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７９（２）：１４７−５９、２０００ａ
【非特許文献１７】Ｔｅｙら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６８（１）：３１−４３、２０００ｂ
【非特許文献１８】Ｖｉｖｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１９（１）：８４−９、２００３
【非特許文献１９】Ｓｉｎｇｈら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．５２（１）：１６６−７５、１９９６
【非特許文献２０】Ｇｏｓｗａｍｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６２（６）：６３２−４０、１９９９
【非特許文献２１】ＡｒｄｅｎとＢｅｔｅｎｂａｕｇｈ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２（４）：１７４−８０、２００４
【非特許文献２２】Ｓｕｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２１（１）：５０−７、２００５
【非特許文献２３】Ｓａｕｅｒｗａｌｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４（２）：３６２−７２、２００６
【非特許文献２４】Ｍｅｒｃｉｌｌｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６３（５）：５１６−２８、１９９９
【非特許文献２５】Ｃｈｉｏｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８（１０）：６５５３−６６、１９９４
【非特許文献２６】Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １１（１１）：２４０３−９、１９９５ａ
【非特許文献２７】Ｒａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９（１６）：７７４２−６、１９９２
【非特許文献２８】Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．６（２）：１３１−７、１９９５ｂ
【非特許文献２９】Ｂｏｙｄら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １１（９）：１９２１−８、１９９５
【非特許文献３０】Ｆａｒｒｏｗら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７４（６５２４）：７３１−３、１９９５
【非特許文献３１】Ｈａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６（１０）：５８５７−６４、１９９６ａ
【非特許文献３２】Ｈａｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １０（４）：４６１−７７、１９９６ｂ
【非特許文献３３】Ｌｏｍｏｎｏｓｏｖａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４（４５）：６７９６−８０８、２００５
【非特許文献３４】Ｈｅｎｒｙら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１（５）：７４８−６０、２００２
【非特許文献３５】Ｃｈａｕら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ６（１）：３１−４０、２０００
【非特許文献３６】Ｓａｌｅｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（２５）：１７９４１−５、１９９９
【非特許文献３７】ＡｄａｍｓとＣｏｒｙ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４（６）：７１５−２０、２００２
【非特許文献３８】ＷｏｌｆとＧｒｅｅｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（２９）：２００４９−５２、１９９９
【非特許文献３９】Ｆｉｇｕｅｒｏａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、Ｅｐｕｂ、２００６
【非特許文献４０】Ｔｏｌｂｅｒｔら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  １７（１０）：８８５−９０、１９８１
【非特許文献４１】Ｂｕｔｌｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．６１：３５１−６３、１９８３
【非特許文献４２】Ｐｒｉｏｒら、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４３（１）：１５−２３、１９８９
【非特許文献４３】Ｏｚｔｕｒｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４８（３）：２０１−２０６、１９９５
【非特許文献４４】Ｍｉｃｈａｅｌｓら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＥＳＡＣＴ）Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、１９９９
【非特許文献４５】Ａｌ−Ｒｕｂｅａｉら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９（１−３）：８５−９７、１９９２
【非特許文献４６】ＢａｎｉｋとＨｅａｔｈ、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６１（３）：２１１−２９、１９９６
【非特許文献４７】Ｂｉｅｒａｕら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６２（３）：１９５−２０７、１９９８
【非特許文献４８】Ｔｈｒｉｆｔら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＥＳＡＣＴ）Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、２００３
【非特許文献４９】Ｆａｓｓｎａｃｈｔら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０：９５−１０５、１９９８
【非特許文献５０】Ｔｅｙら、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ９（６）：８４３−５２、２００４
【非特許文献５１】ＭｅｒｃｉｌｌｅとＭａｓｓｉｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６３（５）：５２９−４３、１９９９
【非特許文献５２】Ｆａｓｓｎａｃｈｔら、１９９９
【発明の開示】
【０００９】
＜発明の要約＞
本発明の一目的は、細胞中で１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチドを発現することによる、組換えＦＶＩＩＩを分泌する細胞株でのプログラムされた細胞死の予防若しくは遅延方法を提供することである。該方法は、細胞でのプログラムされた細胞死が予防若しくは遅延されるような、細胞中で１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチド、例えばＡｖｅｎ若しくはＥ１Ｂ−１９Ｋを発現すること若しくはそれらの発現を誘導することを包含する。
【００１０】
組換え細胞、例えば組換えＦＶＩＩＩを分泌する細胞による細胞に関係する生成物の産生の増大方法を提供することが、本発明の別の目的である。該方法は、細胞による細胞に関係する生成物の産生が増大されるような、細胞中で１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチド、例えばＡｖｅｎ若しくはＥ１Ｂ−１９Ｋを発現すること若しくはそれらの発現を誘導することを包含する。
【００１１】
本発明の別の目的は、組換え細胞、例えば組換えＦＶＩＩＩを分泌する細胞の産生の増大方法を提供することである。該方法は、組換え細胞の産生が増大されるような細胞中で１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチド、例えばＡｖｅｎ若しくはＥ１Ｂ−１９Ｋを発現すること若しくはそれらの発現を誘導することを包含する。
【００１２】
本発明の別の目的は、小スケール、バッチ若しくは灌流細胞培養過程での組換え細胞、例えば組換えＦＶＩＩＩを発現する細胞の産生の増大方法を提供することである。加えて、本発明の一目的は、大スケールバイオリアクター、若しくは商業生産の培養装置中での組換え細胞、例えば組換えＦＶＩＩＩを発現する細胞の産生の増大方法を提供することである。本発明の別の目的は、大スケール灌流細胞培養バイオリアクター、若しくは商業生産の灌流細胞培養装置中での組換え細胞、例えば組換えＦＶＩＩＩを発現する細胞の産生の増大方法を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、細胞に関係する生成物を製造するのに有用な組換え細胞、例えば組換えＦＶＩＩＩを分泌する細胞株を提供することである。該組換え細胞は少なくとも２種の抗アポトーシスポリペプチドを発現するか、若しくは発現するように誘導し得る。
【００１４】
＜発明の詳細な記述＞
本発明は組換え細胞でのプログラムされた細胞死を予防若しくは遅延することに関する。本発明は、細胞中で１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチドを発現することによる組換え細胞でのプログラムされた細胞死の予防若しくは遅延方法を提供する。本発明はまた、細胞中で１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチドを発現することによる、組換え細胞での細胞に関係する生成物の産生の増大方法も提供する。加えて、本発明は細胞に関係する生成物若しくは細胞治療薬を製造するのに有用な組換え細胞を提供する。
【００１５】
本発明は、組換えＦＶＩＩＩを分泌する組換え細胞でのプログラムされた細胞死の予防若しくは遅延することに関する。本発明は、細胞中で１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチド例えばＡｖｅｎ若しくはＥ１Ｂ−１９Ｋを発現することによる、組換えＦＶＩＩＩを分泌する組換え細胞でのプログラムされた細胞死の予防若しくは遅延方法を提供する。本発明はまた、細胞中で１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチド
例えばＡｖｅｎ若しくはＥ１Ｂ−１９Ｋの発現による、組換えＦＶＩＩＩを分泌する組換え細胞の産生の増大方法も提供する。加えて、本発明は、細胞に関係する生成物若しくは細胞治療薬を製造するのに有用な組換え細胞を提供する。
【００１６】
遺伝子操作技術は、組込まれた遺伝子の異種タンパク質としての発現を可能にするために目的の標的遺伝子を哺乳動物ゲノム若しくは染色体外要素に組込む標準的組換えＤＮＡ技術を包含しうる。本出願に記述される技術は、細胞培養過程の間にアポトーシスが起こる哺乳動物および他の真核生物細胞株に適切でありうる。これらの細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）のような供給源から得ることができる。こうした技術は、プログラムされた細胞死を受け、そして上に列挙されたもののような目的の異種タンパク質を生成するように遺伝子操作し得る、いかなる真核生物細胞にも適切でありうる。
【００１７】
細胞中での１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチドの発現は、当業者に既知のいずれの適する手段によっても達成しうる。例えば、１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチドをコードする１種若しくはそれ以上のポリヌクレオチド構築物を導入しうる。こうした構築物は発現構築物であることができ、そして、１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された少なくとも１種の誘導可能なプロモーターを包含しうる。
【００１８】
本発明により、１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチドを発現しうる。抗アポトーシスポリペプチドは、細胞中でアポトーシスを阻害若しくは低下する活性を有するいかなるポリペプチドも包含する。例えば、抗アポトーシスポリペプチドは、真核生物細胞若しくはウイルスの遺伝子のような異種ポリヌクレオチドによりコードされうる。一態様において、抗アポトーシスポリペプチドはＡｖｅｎ若しくはＥ１Ｂ−１９Ｋである。
【００１９】
組換え細胞中で抗アポトーシスポリペプチドは単独で若しくは他者と組合せで発現しうる。例えば、Ａｖｅｎは単独で発現されても若しくはＥ１Ｂ−１９Ｋと共発現されてもよい。１種若しくはそれ以上の発現構築物を、２種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチドを発現するのに使用しうる。
【００２０】
本発明の組換え細胞は、当業者に既知かつ入手可能ないかなる適する細胞も包含する。一態様において、組換え細胞はベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）若しくはＣＨＯ細胞である。加えて、本発明の方法は、大スケールバイオリアクター若しくは商業生産の培養装置中の組換え細胞に応用しうる。
【００２１】
本発明はまた細胞に関係する生成物を製造するのに有用な組換え細胞も提供する。これらの細胞は、１種若しくはそれ以上の抗アポトーシスポリペプチドを発現するか、若しくはそれらを発現するよう誘導しうる。一態様において、これらの細胞は少なくとも２種の抗アポトーシスポリペプチドを発現する。
【００２２】
本発明がより良好に理解されうるために、以下の実施例を示す。これらの実施例は具体的説明のみの目的上であり、そして本発明の範囲をいかなる様式でも制限すると解釈されるべきでない。本明細書で挙げられる全部の刊行物はそっくりそのまま引用することにより組み込まれる。
【００２３】
＜実施例＞
単独およびＡｖｅｎ遺伝子と組合せでＥ１Ｂ−１９Ｋ遺伝子を発現するよう工作したＢＨＫ生産細胞株でのＦＶＩＩＩの発現を検査した。該細胞株は、最初に、生存率および生成物収量について小スケール振とうフラスコ培養物で分析した。その後、Ａｖｅｎおよび
Ｅ１Ｂ−１９Ｋ双方を発現する細胞株の挙動を、ある範囲の比灌流速度（１日あたりの生存可能細胞あたりの培地の容量）で作動する灌流培養での親細胞株と比較した。生存可能細胞密度を一定レベルで維持した一方、比灌流速度は、栄養素の迅速なターンオーバーを可能にする高速から、栄養培地をはるかによりゆっくりと供給しかつ使用済み培地を一致してよりゆっくりと除去した低速まで、段階的に低下させた。生存率、カスパーゼ−３活性化レベル、栄養素消費、代謝物産生、およびタンパク質生産性に対する灌流速度を変動することの影響を評価し、そして、親細胞株とＡｖｅｎおよびＥ１Ｂ−１９Ｋを発現する細胞株の間で比較した。
【００２４】
灌流系は、細胞培養のためのバイオリアクターおよび細胞保持のための沈降タンクよりなることができる。傾斜した沈降タンクで、生存可能細胞を馴化培地から分離し、そしてバイオリアクターに戻す（Ｂａｔｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．６（６）：４５８−６４、１９９０；Ｓｅａｒｌｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１０（２）：１９８−２０６、１９９４）。培養物の容量を維持するため、新鮮培地をバイオリアクターに連続的に供給する。バイオリアクター中の細胞密度を持続させるため、細胞培養物を調節したパージ速度で取り出す。こうしたバイオリアクター設定は、培養物中での比灌流速度とアポトーシスの間の関係の検査を可能にし、かつ、灌流戦略での抗アポトーシス遺伝子を用いる細胞工学のいかなる可能な利益の解明も可能にする。
【実施例１】
【００２５】
プラスミド構築
ベクターｐＢＵＤＣＥ４．１（ｐＢＵＤ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）をＡｖｅｎ（配列番号１−２）およびＥ１Ｂ−１９Ｋ（配列番号３−６）の構成的発現に使用した。該ベクターは、ｐＣＭＶプロモーターおよびｐＥＦ−１αプロモーターを使用して同時に２遺伝子の構成的発現のため設計した。Ａｖｅｎ遺伝子はＢａｍＨＩ部位を使用してｐＢＵＤＣＥ４．１ベクターにサブクローニングし、そしてＣＭＶプロモーターにより発現させた。Ｅ１Ｂ−１９Ｋ遺伝子は、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ部位を使用して同一のｐＢＵＤＣＥ４．１ベクターにサブクローニングし、そしてＥＦ−１αプロモーターにより発現させた。Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋベクターは対応するプロモーターにより発現される各遺伝子を含有する。Ｅ１Ｂ−１９Ｋベクターのみは、ＥＦ−１αプロモーターにより発現されるＥ１Ｂ−１９Ｋ遺伝子を含有する。ブランクベクターは元のｐＢＵＤＣＥ４．１ベクターを指す。
【実施例２】
【００２６】
安定細胞株の創製
組換えＦＶＩＩＩを発現するＢＨＫ−２１細胞株（ＢＨＫ−ＦＶＩＩＩ）を、製造元の説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を使用して、ブランクベクター、Ｅ１Ｂ−１９Ｋベクター若しくはＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋベクターで重複トランスフェクトした。５％ＦＢＳを補充した接着培養物中、１ｍｇ／ｍＬゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の選択下で安定細胞株を創製した。各構築物のおよそ１００クローンを単離し、そしてＦＶＩＩＩ発現レベル（配列番号７）について分析した。およそ２５個のクローン単離物を選択し、そしてＡｖｅｎの発現およびＥ１Ｂ−１９Ｋ発現をイムノブロッティングにより検出した。Ａｖｅｎおよび／若しくはＥ１Ｂ−１９Ｋの発現レベルならびにＦＶＩＩＩ生産性に基づき、各構築物の３〜６クローンをゼオシンの非存在下の無血清懸濁培養物に順応させた。抗体を伴わずに培養した細胞からのＡｖｅｎおよびＥ１Ｂ−１９Ｋ発現は、別の回のイムノブロッティングにより、安定であることが確認された（図１Ａ）。
【実施例３】
【００２７】
イムノブロッティング分析
１％ＮＰ−４０、１２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する溶解緩衝液を用いて細胞を収集した。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を使用してタンパク質濃度を測定した。等量のタンパク質をレーンあたりに負荷した。タンパク質をゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）に転写し、そして１０００倍希釈のウサギ抗Ａｖｅｎ抗体（Ｃｈａｕら、２０００）および４０倍希釈のマウス抗Ｅ１Ｂ−１９Ｋ抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州サンディエゴ）でイムノブロットした。
【実施例４】
【００２８】
振とうフラスコ培養物分析およびアポトーシス検出
細胞を５×１０６細胞／ｍＬの密度で振とうフラスコに接種し、そして３７℃および５％ＣＯ２で維持したインキュベーター中で培養した。培養物を、生存率、カスパーゼ−３活性化、アネキシン−Ｖ結合アッセイおよび栄養素測定のため２４時間ごとに検査した。細胞計数はＣｅｄｅｘ細胞計数装置（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ、独国ビーレフェルト）を使用するトリパンブルー排除アッセイにより実施した。カスパーゼ−３活性化はＧｕａｖａ  ＰＣＡ系（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州ヘイワード）を使用して検出した。細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）で固定し、そしてその後、Ｇｕａｖａ系で分析する前にＰＥ複合モノクローナル活性カスパーゼ−３抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。アネキシン−Ｖ結合アッセイのため、製造元の説明書（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従い、Ｇｕａｖａ  Ｎｅｘｉｎキットを使用して細胞を収集かつインキュベートし、そしてＧｕａｖａ  ＰＣＡ系で分析した。グルタミン、グルタミン酸、グルコースおよび乳酸の濃度をＹＳＩ分析計（ＹＳＩ  Ｌｉｆｅ
Ｓｉｃｅｎｃｅｓ、オハイオ州イエロースプリングス）により測定した。
【実施例５】
【００２９】
ＦＶＩＩＩ定量化
第ＶＩＩＩ因子を色素生産性アッセイキット（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、伊国・ミラノ）および凝固アッセイを使用して定量した。色素生産性アッセイにおいて、ＦＶＩＩＩ量は第Ｘ因子の第Ｘａ因子への活性化の因子刺激により測定した。第Ｘ因子で該反応を実施し、また、第ＩＸａ因子を過剰に提供した。活性化された第Ｘａ因子が色素生産基質を切断して色変化をもたらした。４０５ｎｍでの吸光度を測定し、そしてＦＶＩＩＩ活性を標準曲線に対し決定した。凝固アッセイは、ＦＶＩＩＩ不足血漿にサンプルを添加した後のフィブリン塊発生の速度からＦＶＩＩＩ活性を測定した。該反応は、活性化部分トロンボプラスチン試薬およびＣａＣｌ２により促進した。
【実施例６】
【００３０】
バイオリアクター評価
２個の１２Ｌバイオリアクターに、親細胞株若しくはＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株を１×１０６細胞／ｍＬの密度で接種した。細胞は、細胞密度が２０×１０６細胞／ｍＬに達するまで蓄積し、その後、細胞廃棄速度を調節することにより細胞密度を２０×１０６細胞／ｍＬで一定に維持した。溶解酸素濃度は５０％空気飽和で維持した。ｐＨは６．８の設定点で制御し、また、温度は３５．５℃で維持した。細胞生存率、生存可能細胞密度および細胞径をＣｅｄｅｘ細胞計数装置（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ、独国ビーレフェルト）により測定した。グルタミン、グルタミン酸、グルコースおよび乳酸の濃度をＹＳＩ分析計（ＹＳＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、オハイオ州イエロースプリングス）により測定した。酸素取り込み速度は、１００％であると想定した０．５灌流速度でのその初期値のパーセントとして計算した。相対酸素取り込み速度は、物質移動速度および面積（ｋＬａ）値、リアクター容量ならびに平均の生存可能細胞密度が培養の経過にわたり一定に留
まったことを想定しつつ、シリコーンチューブおよびリアクター中の酸素の部分圧の差違から決定した。
【実施例７】
【００３１】
高細胞密度振とうフラスコ培養物中の細胞生存率
Ｅ１Ｂ−１９Ｋを発現する５細胞株、Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋを発現する６細胞株、ブランクベクター細胞株および親細胞株を、高密度（５×１０６細胞／ｍＬ）で振とうフラスコに接種した。図１Ｂおよび１Ｃに示されるとおり、Ｅ１Ｂ−１９ＫおよびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋを発現する細胞株の生存率を、対照の親およびブランクベクター細胞株に対し比較した。６日後、最良に機能するＥ１Ｂ−１９Ｋクローン（＃６）の生存率は４８％でであり、最良に機能するＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋクローン（＃２２）は６５％生存可能であった。ブランクベクター細胞株の生存率は１２％であり、そして親細胞株のものは１０％でであった。多様な時点での各クローン単離物の生存率測定値の若干の変動性が観察された。抗アポトーシス遺伝子を発現する細胞株は、２種の対照細胞株に比較して一般により高い生存率を維持した。Ｅ１Ｂ−１９ＫおよびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋの構築物が細胞生存率に対する影響を有したことを確認するため、細胞株の平均細胞生存率および標準偏差を決定しかつプロットした（図１Ｄ）。Ｅ１Ｂ−１９Ｋを発現するＢＨＫ−ＦＶＩＩＩ細胞は、第３日に対照の平均１８パーセント点上、および第６日に対照の２３パーセント点上に生存率を維持した。ＡｖｅｎおよびＥ１Ｂ−１９Ｋ双方を発現するＢＨＫ−ＦＶＩＩＩ細胞の平均はなおより高かった生存率レベルを呈した。すなわち、第３日に対照の平均３５パーセント点上、および第６日に対照の平均３６パーセント点上。Ｅ１Ｂ−１９Ｋの発現は細胞生存率を対照細胞株に関して改良し、また、ＡｖｅｎおよびＥ１Ｂ−１９Ｋ発現の組合せは、高密度で接種したバッチ細胞培養物について細胞生存をさらに改良した。
【実施例８】
【００３２】
振とうフラスコ培養物中のアポトーシス
細胞死の様式を検査するために、細胞をカスパーゼ−３活性化およびアネキシン−Ｖ表面染色について分析した。カスパーゼ−３の活性化は、他のカスパーゼの活性化につながる「復帰不能点」に至るアポトーシスカスケード中の主事象である（Ａｄａｍｓ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７（２０）：２４８１−９５、２００３；ＤａｎｉａｌとＫｏｒｓｍｅｙｅｒ、Ｃｅｌｌ  １１６（２）：２０５−１９、２００４）。カスパーゼ−３活性化およびアネキシン−Ｖアッセイを、第２日（生存率は６６％から８９％まで多様であった）、および多数の死細胞が明らかになる前に実施した。図２Ａに示されるとおり、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株の１種以外（＃６、＃８、＃１１、＃５）およびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株の全部が、親若しくはブランクベクタークローンよりも低い割合のカスパーゼ−３が活性化された細胞を示した。
【００３３】
アポトーシスカスケードの早期段階で、ホスファチジルセリンが原形質膜の内部小葉（ｉｎｎｅｒ  ｌｅａｆｌｅｔ）から外部小葉に移動される。アネキシン−Ｖはホスファチジルセリンに対する高結合親和性を有し、そして従ってアポトーシス細胞に結合する。死細胞での膜の完全性の喪失が、内部小葉中でホスファチジルセリンを露出して、アネキシン−Ｖ結合も同様に可能にする（Ｖａｎ  Ｅｎｇｅｌａｎｄら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ３１（１）：１−９、１９９８）。７−ＡＡＤのような膜浸透性ＤＮＡ染色の使用はアポトーシス細胞を死細胞と識別する。生存可能、アポトーシス、および死細胞を、アネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤ染色を使用して識別した。図２Ｂに示されるとおり、７−ＡＡＤ陰性でもまたあったアネキシン−Ｖ陽性細胞の割合は、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株＃６、＃８、＃１１および＃１５、ならびに全Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株でより低かった。カスパーゼ−３アッセイでのように、より高い割合のアネキシン−Ｖ陽性／７−ＡＡＤ陰性細胞が、親、ブランクベクターおよびＥ１Ｂ−１９Ｋ細胞株＃２０で見出された。Ｅ１Ｂ−
１９Ｋ  ＃２０細胞株は非常に低レベルのＥ１Ｂ−１９Ｋを発現した（図１Ａ）がしかし、細胞生存率の何らかの改良が高細胞密度培養物で観察された（図１Ｂ）。アポトーシス細胞の割合は、Ｅ１Ｂ−１９Ｋクローンの大多数に比較してＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋクローンの大部分で第２日により低かった。アポトーシス細胞のこの減少は、図１ＤでのＥ１Ｂ−１９Ｋクローンに関してのＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋクローンの生存率の改良と相関した。
【実施例９】
【００３４】
細胞生存率と発現レベルの間の相関
相対発現レベルＡｖｅｎおよびＥ１Ｂ−１９Ｋを、デンシトメーターを使用して測定したイムノブロットバンド強度から推定し（図１Ａ）、そして高細胞密度振とうフラスコの第６日での細胞生存率に対しプロットした（図１Ｂおよび１Ｃに示される）。６種のＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株を、細胞生存率とＡｖｅｎ発現の間の関係について検査した。図３Ａに示されるとおり、生存率パーセントとＡｖｅｎの発現レベルの間に明瞭な相関が存在しなかった。Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株＃１２および＃２２は高生存率およびより高発現レベルを包含したが、しかしＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋクローン＃１０は高Ａｖｅｎ発現レベルにもかかわらずより低い生存率を有した。生存率パーセントとＥ１Ｂ−１９Ｋの発現レベルの間の関係を図３Ｂおよび３Ｃに示す。Ｅ１Ｂ−１９Ｋ発現レベルは、中程度のＥ１Ｂ−１９Ｋレベルを発現するこれらの細胞株について、第６日のＥ１Ｂ−１９ＫおよびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株の生存率パーセントに比較的比例した（図３Ｂ）。高生存率を呈した細胞株は増大したレベルのＥ１Ｂ−１９Ｋを発現することが見出され（Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ  ＃２２、Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ  ＃１２、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ  ＃８）、そして細胞死に対する制限された保護を伴う細胞株はより低い発現レベルを表した。非常に高い発現レベルを伴う２種のＥ１Ｂ−１９Ｋ細胞株（＃６および＃１１）は、複数倍より低い発現レベルを伴うクローンに関して高密度細胞培養物の第６日での生存のいかなる有意の改良も呈さず（Ｅ１Ｂ−１９Ｋクローン＃６、４８％生存可能；Ｅ１Ｂ−１９Ｋクローン＃１１、３３％生存可能）、また、ＡｖｅｎおよびＥ１Ｂ−１９Ｋ双方を発現するクローンのいくつかより低い生存率を表した（図３Ｃ）。
【実施例１０】
【００３５】
タプシガルジンにより誘発されるアポトーシス
哺乳動物細胞中の組換えＦＶＩＩＩは低い分泌効率を有することが示されている（Ｋａｕｆｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（１３）：６３５２−６２、１９８８）。細胞内ＦＶＩＩＩの大多数は、ＢｉＰ（Ｄｏｒｎｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５（６  Ｐｔ  １）：２６６５−７４、１９８７）、カルネキシンおよびカルレティキュリン（Ｐｉｐｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（１４）：８５３７−４４、１９９８）を包含するタンパク質シャペロンとの複合体中で小胞体（ＥＲ）に見出された。タプシガルジンは、ＥＲへのカルシウム取り込みを阻害することにより細胞内カルシウム恒常性を破壊する化学物質である（Ｌｙｔｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（２６）：１７０６７−７１、１９９１）。タプシガルジンでの細胞の処理は、アポトーシスをもたらすＥＲストレスおよびカスパーゼ−１２活性化を誘導する（Ｎａｋａｇａｗａら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０３（６７６５）：９８−１０３、２０００）。
【００３６】
工作された細胞株Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ  ＃２２およびＥ１Ｂ−１９Ｋ  ＃６を、ブランクベクターおよび親細胞株に加えて、振とうフラスコ培養物中タプシガルジンで処理した。ＤＭＳＯ中の２μＭタプシガルジン溶液での処理４８時間後に、対照（ブランクベクターおよび親）は、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ  ＃６およびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ  ＃２２について観察されたものよりはるかに低い生存率を表した（図４Ａ）。Ｅ１Ｂ−１９Ｋ  ＃６およびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ  ＃２２の生存率は８５％より上であり、また、該２対照の生存率は５０％より下であった。陰性対照として、未処理細胞若しくはＤＭＳＯ
で処理したものは、いかなる細胞株についても生存率の有意の喪失を表さなかった。アポトーシス誘導を検査するため、カスパーゼ−３活性化をタプシガルジン処理２４時間後に評価した。対照細胞株のおよそ２０％がカスパーゼ−３活性化を表し、また、抗アポトーシス工作した細胞株の５％未満がカスパーゼ−３活性化を示した（図４Ｂ）。未処理およびＤＭＳＯ処理細胞はより低レベルのカスパーゼ−３活性を表し、タプシガルジン処理がカスパーゼ−３の刺激の原因であったことを示した（図４Ｂ）。カスパーゼ−３活性が、対照細胞と抗アポトーシス遺伝子を発現する細胞株の間で有意差を示した場合であっても、２４時間時点で生存率の差違が存在しなかった。
【実施例１１】
【００３７】
連続継代培養物での発現
細胞株を、細胞の能力を評価するために至適条件で培養した。高増殖速度を維持しかつ親細胞株に匹敵する比生産性を有した細胞株を選択した。該細胞を振とうフラスコ懸濁培養物で２日ごとに継代し、そして増殖速度およびＦＶＩＩＩ生産性についてモニターした。高細胞密度バッチ培養物でより高い生存率を維持した細胞株を評価した（Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ  ＃１２、Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ  ＃２２、Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ
＃２４およびＥ１Ｂ−１９Ｋ  ＃６）。これらの細胞株の増殖速度は親の８１％と９２％の間までわずかに低下した（図５Ａ）。これらのクローンの比生産性は親の８３％と１３０％の間で変動することが見出された（図５Ｂ）。工作されたクローン単離物の大部分は親細胞株よりわずかにより低い生産性を有した一方、Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ  ＃２２細胞株は、細胞あたりに基づき、親細胞株よりおよそ３０％より多いＦＶＩＩＩを産生した。これらの小スケール研究から、Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株＃２２を、高細胞密度培養物での高生存率、わずかに低下された増殖速度（８１％）および親細胞株より優れた生産性（１３０％）により、最終クローンとして選択した。
【実施例１２】
【００３８】
灌流培養物での生存率およびアポトーシスに関する共発現
親ＢＨＫ−ＦＶＩＩＩ細胞株およびＢＨＫ−ＦＶＩＩＩ  Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ  ＃２２細胞株を１２Ｌ連続灌流バイオリアクター中で評価した。バイオリアクターに接種し、そして細胞を２×１０７細胞／ｍＬの細胞密度が達成されるまで蓄積し、その時点で細胞を系からパージすることにより密度を維持した。比灌流速度は当初０．５ηＬ／細胞／日で設定し、そしてその後、以下の順序すなわち０．５、０．３、０．２および０．１５で低下させ、次いで、低灌流速度での稼働後に細胞が回復することが可能であったかどうかを観察するために０．５にまで増大させた。サンプルをバイオリアクターから毎日採取して、細胞生存率、アポトーシス状態、栄養素および代謝物濃度ならびにＦＶＩＩＩ濃度を測定した。溶解酸素、温度および培地組成を包含する他のパラメータは一定に保った。
【００３９】
図６Ａは、親細胞株の生存可能細胞密度および生存率の時間プロファイルを示す。細胞密度は、細胞がバイオリアクター中で蓄積していたところの最初の７日にわたり増大した。２×１０７細胞／ｍＬの生存可能細胞密度は第７日に達せられ、その時点で培養様式を細胞蓄積から擬似定常状態に切り替えた。擬似定常状態は、生存可能細胞密度を２×１０７細胞／ｍＬの一定レベルで維持するために、培養物を調節された速度でバイオリアクターから抜くことにより達成した。バイオリアクター中の細胞の生存率は、０．５ηＬ／細胞／日の比灌流速度での初期稼働の間、９７％で比較的一定のままであった。第１７日に灌流速度を０．３に低下させ、そして親細胞株の生存率はこの期間の間９４％と９７％の間に留まった。灌流速度を第２３日に０．２に再度低下させた場合、平均生存率は０．２灌流速度での稼働の次の７日間にわたり９１％に低下した。灌流速度をなおさらに０．１５に低下させた場合、生存率はおよそ８０％まで比較的堅調に低下した。第３７日に灌流速度を０．５に戻し、そして細胞生存率は培養期間の終了時に９４％に回復した。アポト
ーシスが存在したかどうかを検査するため、カスパーゼ−３活性化アッセイを毎日実施した（図６Ｂ）。カスパーゼ−３が活性化された細胞の割合は、０．５の初期比灌流速度の間、基準線にあり、そして０．３の灌流速度でわずかにのみより高かった。該割合は、灌流速度が０．２であった場合に５％に増大し、これは９４％から９１％までの平均細胞生存率の低下に対応する。０．１５灌流速度で、カスパーゼ−３が活性化された細胞の割合は、細胞生存率が堅調に下落していた同一期間で１５％より上の活性化を示すように迅速に増大した。アネキシン−Ｖ染色を実施し、そしてカスパーゼ−３活性化パターンに類似のプロファイルを示した。低灌流速度での細胞生存率の低下は、少なくとも部分的に、アポトーシスを受ける細胞によった。
【００４０】
Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞を類似の細胞密度（２×１０７細胞／ｍＬ）まで増殖させ、そして灌流速度の類似の段階的低下にかけた（図６Ｃおよび６Ｄ）。稼働条件は類似であったとは言え、Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ培養物の生存率プロファイルは、親細胞について観察されたものとかなり異なった。Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞の生存率は灌流速度の範囲全体にわたり約９４％でほぼ一定のままであった（図６Ｃ）。灌流速度を０．１５ηＬ／細胞／日に低下させた場合、生存率の低下は観察されず、親培養物の平均８０％と比較して約９４％で一定のままであった。細胞生存率は、０．１５という計画された少なくともの比灌流速度でＡｖｅｎ／Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株で減少しなかったため、比灌流速度を第２７日に０．１５から０．１までさらに低下させ、そしてこの最小速度で４日間運転した。この低灌流速度ででさえ、細胞生存率は、４日間全体にわたり平均９４％で上昇されたまま留まった。対照的に、親細胞培養物の灌流は、培養物からの生存可能細胞の完全な喪失の危険により、０．１５という水準より下に低下し得なかった。アポトーシス分析は培養期間全体でＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ培養物でもまた実施し、そして、該細胞が、培養期間の大部分の間、基礎レベルのカスパーゼ−３活性化を維持したことを示した（図６Ｄ）。０．１０灌流速度で稼働するＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞について、平均２％までのカスパーゼ−３活性細胞の割合のわずかなしかし持続的な上昇が存在した。アネキシン−Ｖ陽性細胞の割合はこれらの灌流速度での類似の低い活性化レベルを示した。Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株は高生存率を維持し、そして、親細胞株に悪影響を及ぼすことが示された非常に低い比灌流速度で培養された場合でさえ、有意のレベルのアポトーシスを受けなかった。
【実施例１３】
【００４１】
灌流培養物でのＦＶＩＩＩ比生産性および増殖速度に関する共発現
灌流バイオリアクター環境での親およびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ  ＃２２細胞株の生産性を比較するため、ＦＶＩＩＩのレベルを多様な灌流速度で測定した。０．５ηＬ／細胞／日の灌流速度での親対照のＦＶＩＩＩ生産性の関数としての２細胞株の細胞あたりに基づく比生産性を図７Ａに示す。０．５灌流速度での各培養物の１００％値に関する低下する灌流速度での各培養物の生産性の低下を図７Ｂに示す。双方の培養物は、灌流速度が累進的に低下された際に生産性の低下を表した。全部の比灌流速度で、Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ  ＃２２細胞株の生産性はより高かった（図４Ｂを参照されたい）。生産性を初期レベルのパーセントとして検査した場合（図７Ｂ）、ＡｖｅｎおよびＥ１Ｂ−１９Ｋを発現することの効果は明白であった。０．５から０．３への灌流速度低下後、親およびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ双方の培養物の比生産性は１００％から８０％に低下した。比灌流速度を０．２および０．１５に低下した場合、生産性の低下は親細胞株について有意により急勾配であった。親生産性は０．２でその初期値のおよそ２３％、および０．１灌流速度でおよそ１０％に低下し、また、Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ  ＃２２細胞株はその同一間隔にわたりその初期生産性レベルの５６％および３２％を維持した。回復期間（終了時に０．５灌流速度）の間、親生産性はその元の値の３７％に回復したのみであり、新鮮な栄養素の灌流の重度の減少により引き起こされる親細胞の能力に対する傷害の量を反映する。対照的に、Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株は初期生産性の８０％まで回復するこ
とが可能であった。
【００４２】
比灌流速度を低下させることの別の結果は増殖速度の低下であった。図７Ｃは、０．５比灌流速度で運転する親培養物の関数としてプロットした細胞の比増殖速度を示す。図７Ｄは、親およびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ双方の細胞株の初期増殖速度のパーセントとして増殖速度を示す。０．５の灌流速度でのＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株の比増殖速度は、その同一の灌流速度の親細胞株の増殖速度のおよそ半分であった（図７Ｃ）。灌流速度が低下した際に、親細胞の増殖速度は同様に累進的に低下した（図７Ｄ）。親細胞の増殖速度は、灌流速度の各低下後に１００％から８０％、５２％および３１％に低下した。増殖速度のこの低下は、より低い灌流速度が栄養素の利用可能性を低下させたために期待された。親細胞増殖速度は、灌流速度を０．１５に低下させた後に０．５に増大させた場合に、その最高すなわち開始値の１３４％でであった（図７Ｄ）。対照的に、Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株は、灌流速度を低下させた際に、はるかに異なる増殖速度パターンを表した。Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ培養物の増殖速度は、０．３、０．２、０．１５のより低い灌流速度で１００％から１０９％、８４％および８４％にわずかに変化し、そして０．１の灌流速度で３１％に急激に低下した（図７Ｄ）。０．１５の灌流速度で、Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株の増殖速度は、０．５灌流速度でのその値のなお８４％でであった一方、親対照の増殖速度は０．５灌流速度での該値のわずか３０％であった。Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株の増殖速度は、灌流速度を０．５に戻した場合にもう一度増大したが、しかし、そのレベルは、親対照について観察されたものよりその元の増殖速度にはるかにより近かった（図７Ｄ）。
【実施例１４】
【００４３】
灌流培養物での栄養素代謝に関する共発現
栄養素および代謝物濃度に対する多様な灌流速度での細胞代謝の影響を検査するため、グルタミン、グルコース、溶解酸素および乳酸濃度をバイオリアクター中で毎日測定した。比消費および産生速度（１日あたりに細胞あたり消費若しくは産生される栄養素の量）を図８Ａ〜８Ｄに示す。バイオリアクター中のグルコースおよびグルタミン濃度を図８Ｅおよび８Ｆに示す。増殖速度で観察されるとおり、親細胞株のグルコース（図８Ａ）およびグルタミン（図８Ｂ）消費速度は、減少する灌流速度とともに低下し、そしてその後０．５回復期間の間初期値より上の濃度に跳ね返る傾向があった。バイオリアクター中で利用可能なグルコースはいずれの場合も制限せず（図８Ｅ）；利用可能なグルタミンは、親およびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ双方の細胞株についてより低い灌流速度（０．３、０．２、０．１５および０．１）で低かった（図８Ｆ）。全灌流速度にわたり、Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株は、親よりも一貫してより低い比グルコースおよびグルタミン消費速度を有した（図８Ａおよび８Ｂ）。比栄養素消費速度のこの低下は、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ（ＭｅｒｃｉｌｌｅとＭａｓｓｉｅ、１９９９）およびＢｃｌ−２（Ｂｉｅｒａｕら、１９９８）を発現する細胞株について、灌流培養物で以前に観察されている。加えて、累進的により低い灌流速度でのグルタミン消費の減少は、親に比較してＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株についてより少なく明らかであった。０．１５灌流速度でのＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株のグルタミン消費速度は０．５でのその値の２４％であった一方、０．１５での親細胞株のグルタミン消費は０．５でのその値の１０％であった。親細胞株は、培養の終了時に灌流速度を０．５に戻すことに際して、グルコースおよびグルタミン消費のはるかにより急激な増大を表した。
【００４４】
比乳酸産生速度はＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株についてより低く（図８Ｃ）、これらの細胞が細胞あたりに基づきより少ない解糖代謝物を産生したこと、ならびに異なる灌流速度で親細胞株より少ない栄養素を消費することを示唆する。乳酸産生速度は親およびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ双方の細胞株についてより低い灌流速度で低下したが、しかし該低下はＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株についてそれほど重大でなかった。グルコース
およびグルタミンの消費傾向と異なり、親細胞株の酸素取り込み速度は、０．５から０．１５までの低下する灌流速度とともに１００％から１２２％に増大し、また、Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ酸素取り込み速度は９２％から１０３％まで比較的一定に留まった（図８Ｄ）。灌流速度をＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ培養物で０．１に低下させた場合、酸素取り込み速度は増大した。
【実施例１５】
【００４５】
細胞径
図９は、多様な灌流速度で作動するバイオリアクター中の親およびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株の平均細胞径を示す。親細胞株の細胞径は、０．５灌流速度で１７．９μｍから、０．３、０．２および０．１５灌流速度でそれぞれ１７．７、１６．６および１５．８μｍまで低下した。この低下はより低い灌流速度での低下された生存率と相関する（図６Ａ）。細胞容量の減損すなわち細胞縮小はアポトーシスの主要な特質の１つであり（ＢｏｒｔｎｅｒとＣｉｄｌｏｗｓｋｉ、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．９（１２）：１３０７−１０、２００２）；従って、細胞径のこの減少はアポトーシス誘導に関するかもしれない。対照的に、Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株は、０．５灌流速度で１８．５μｍから、０．３、０．２、０．１５および０．１灌流速度でそれぞれ１７．８、１７．７、１７．５および１７．１μｍまでの細胞径のより小さい減少を示した。親およびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株の細胞径は、灌流速度を最終的に０．５に増大させた場合に初期レベルもしくはそれ以上に増大した。
【００４６】
Ｅ１Ｂ−１９Ｋの発現は、高細胞密度振とうフラスコ培養物でアポトーシスを受けることからＢＨＫ−ＦＶＩＩＩ細胞を遅らせ、また、ＡｖｅｎおよびＥ１Ｂ−１９Ｋの共発現は、親およびブランクベクター双方の細胞株に関してなおさらに保護を高めた。従って、抗アポトーシス遺伝子の発現は、はるかにより低い灌流速度でより効率的な生存およびタンパク質産生を見込む。これらの効果は、生物工学における灌流細胞培養の応用のためのより確実かつ生産性の細胞株につながり得る利益を提供する。
【００４７】
上の明細で挙げられた全部の刊行物および特許は引用することにより本明細書に組み込まれる。本発明の記述された方法の多様な改変および変形が、本発明の範囲および技術思想から離れることなく当業者に明らかであろう。本発明は特定の態様に関して記述されたとは言え、特許請求されるところの本発明はこうした特定の態様に不当に制限されるべきでないことが理解されるべきである。事実、生化学の分野若しくは関連分野の当業者に明らかである本発明を実施するための前述の様式の多様な改変は、以下の請求の範囲の範囲内にあることを意図している。当業者は、わずかに関連の実験を使用して、本明細書に記述される本発明の特定の態様に対する多くの同等物を認識するであろうか、若しくは確認することが可能であろう。こうした同等物は以下の請求の範囲により包含されることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１Ａ】Ｅ１Ｂ−１９Ｋ発現を確認するための５種のＥ１Ｂ−１９Ｋ細胞株ならびにＡｖｅｎおよびＥ１Ｂ−１９Ｋ発現を確認するための６種のＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株のイムノブロット結果を描く。
【図１Ｂ】振とうフラスコ懸濁培養物に５×１０６細胞／ｍＬで接種した後のブランクベクターおよび親細胞株と比較したＥ１Ｂ−１９Ｋ細胞株の生存率を描く。各データ点は、５％若しくはより小さい標準偏差を伴う１６種の細胞数を表した。
【図１Ｃ】振とうフラスコ培養物に５×１０６細胞／ｍＬで接種した後のブランクベクターおよび親細胞株と比較したＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株の生存率を描く。各データ点は、５％若しくはより小さい標準偏差を伴う１６種の細胞数を表した。
【図１Ｄ】振とうフラスコ培養物に５×１０６細胞／ｍＬで接種した後のＥ１Ｂ−１９ＫおよびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株の平均生存率の比較を描く。Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株は、対照としてのブランクベクターおよび親細胞株を伴い、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株により後に続かれる平均生存率の最大の改良を示した。
【図２Ａ】振とうフラスコ培養物に５×１０６細胞／ｍＬで接種した後第２日のカスパーゼ−３が活性化された細胞の割合を描く。
【図２Ｂ】振とうフラスコ培養物に５×１０６細胞／ｍＬで接種した後第２日のアネキシン−Ｖ陽性細胞（アネキシン−Ｖ陽性７−ＡＡＤ陰性）の割合を描く。生存可能、アポトーシスおよび死細胞はアネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤ染色を使用して識別した。
【図３Ａ】振とうフラスコ培養物に５×１０６細胞／ｍＬで接種した後第６日のＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ細胞株のＡｖｅｎ発現レベルと生存率パーセントの間の相関を描く。Ａｖｅｎ発現レベルは図１Ａのイムノブロットから定量化した。
【図３Ｂ】振とうフラスコ培養物に５×１０６細胞／ｍＬで接種した後第６日のＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９ＫおよびＥ１Ｂ−１９Ｋ細胞株のＥ１Ｂ−１９Ｋ発現レベルと生存率パーセントの間の相関を描く。ＡｖｅｎおよびＥ１Ｂ−１９Ｋ発現レベルは、図１Ａのイムノブロットから定量化した。
【図３Ｃ】図２Ｂに類似の、しかし高Ｅ１Ｂ−１９Ｋ発現クローン（＃６、＃１１）を包含する、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ発現レベルと生存率パーセントの間の相関を描く。
【図４Ａ】未処理、タプシガルジンを送達するのに使用される同一容量のＤＭＳＯで処理、若しくは２μＭタプシガルジンで処理した、親、ブランクベクター、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ  ＃６、およびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ＃２２細胞株を描く。処理４８時間後の生存率を評価した。各値は同一処理を用いる３個の細胞培養フラスコの平均生存率である。
【図４Ｂ】未処理、タプシガルジンを送達するのに使用される同一容量のＤＭＳＯで処理、若しくは２μＭタプシガルジンで処理した、親、ブランクベクター、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ  ＃６、およびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ  ＃２２細胞株を描く。処理２４時間後のカスパーゼ−３が活性化された細胞の割合を評価した。
【図５Ａ】２日ごとに継代することにより至適条件で培養しかつ増殖速度および生産性についてモニターした場合の細胞株の成績を描く。細胞株の正規化した増殖速度を、１００％として親細胞株の値を使用して計算した。増殖速度は継代（２日ごと）時点での生存可能細胞密度から計算した。
【図５Ｂ】２日ごとに継代することにより至適条件で培養しかつ増殖速度および生産性についてモニターした場合の細胞株の成績を描く。細胞株の正規化した比生産性を、１００％として親細胞株の値を使用して計算した。比生産性は、色素生産性アッセイにより測定されるところの培養物中の分泌されたＦＶＩＩＩ量を使用して決定した。
【図６Ａ】灌流速度の段階的低下で稼働する１２Ｌバイオリアクター中の細胞培養物の時間プロファイルを描く。親培養物の生存可能細胞密度（□）および生存率パーセント（▲）。
【図６Ｂ】灌流速度の段階的低下で稼働する１２Ｌバイオリアクター中の細胞培養物のプロファイルを描く。親培養物のカスパーゼ−３が活性化された細胞の割合。
【図６Ｃ】灌流速度の段階的低下で稼働する１２Ｌバイオリアクター中の細胞培養物のプロファイルを描く。Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ培養物の生存可能細胞密度（□）および生存率パーセント（▲）。
【図６Ｄ】灌流速度の段階的低下で稼働する１２Ｌバイオリアクター中の細胞培養物のプロファイルを描く。Ａｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ培養物のカスパーゼ−３が活性化された細胞の割合。
【図７Ａ】灌流速度の段階的低下で稼働する１２Ｌバイオリアクター中の親およびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ培養物の間の比較を描く。０．５灌流速度での親培養物の値に関する比生産性。
【図７Ｂ】灌流速度の段階的低下で稼働する１２Ｌバイオリアクター中の親およびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ培養物の間の比較を描く。各培養物の初期レベルのパーセントとしてプロットした比生産性。
【図７Ｃ】灌流速度の段階的低下で稼働する１２Ｌバイオリアクター中の親およびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ培養物の間の比較を描く。０．５灌流速度での親の値に関する増殖速度。
【図７Ｄ】灌流速度の段階的低下で稼働する１２Ｌバイオリアクター中の親およびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ培養物の間の比較を描く。初期増殖速度のパーセントとしての増殖速度。該値は、それぞれの灌流速度で稼働する培養物の毎日の測定から計算した平均である。
【図８Ａ】灌流速度の段階的低下の間の親およびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ培養物の間の比較を描く：比グルコース消費速度。
【図８Ｂ】灌流速度の段階的低下の間の親およびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ培養物の間の比較を描く：比グルタミン消費速度。
【図８Ｃ】灌流速度の段階的低下の間の親およびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ培養物の間の比較を描く：比乳酸産生速度。
【図８Ｄ】灌流速度の段階的低下の間の親およびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ培養物の間の比較を描く：初期レベルのパーセントとしての比酸素取り込み速度。
【図８Ｅ】灌流速度の段階的低下の間の親およびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ培養物の間の比較を描く：バイオリアクター中のグルコース濃度。
【図８Ｆ】灌流速度の段階的低下の間の親およびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ培養物の間の比較を描く：バイオリアクター中のグルタミン濃度。
【図９】低下する灌流速度で運転する親およびＡｖｅｎ−Ｅ１Ｂ−１９Ｋ培養物の平均細胞径を描く。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
2009535019.tif 000005
【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
2009535019.tif 000009
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2009535019.tif 000011
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９】
2009535019.tif 000030
【配列表】
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【国際調査報告】
2009535019.tif 000031
2009535019.tif 000032
2009535019.tif 000033