(57)【要約】ニューロペプチドを用いて、バシラス・アンスラシスの胞子に曝露されている、又は曝露された疑いがある哺乳類を治療する。該治療は、感染による致死的影響からの用量依存的防御を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭疽菌の胞子に曝露されている又は曝露されるかもしれない哺乳動物において、炭疽病の危険又は重症度を低減する方法であって：
炭疽菌の胞子に曝露されている又は曝露されるかもしれない哺乳動物に対して、有効量のサブスタンスP、又はその類似体を投与すること、ここにおいて前記類似体は、[Met-OH11]-サブスタンスP、[Met-OMe11]-サブスタンスP、[Nle11]-サブスタンスP、[Pro9]-サブスタンスP、[Sar9]-サブスタンスP、[Tyr8]-サブスタンスP、[p-Cl-Phe7,8]-サブスタンスP、[Sar9,Met(O2)11]-サブスタンスP、及びアミノ酸骨格RPKPQQFFGLM-NH2を有する類似体からなる群から選ばれるものであり、それにより炭疽病の症状の該危険又は重症度を低減する、前記方法。
【請求項２】
サブスタンスPを投与する請求項1記載の方法。
【請求項３】
[Met-OH11]-サブスタンスPを投与する請求項1記載の方法。
【請求項４】
[Met-OMe11]-サブスタンスPを投与する請求項1記載の方法。
【請求項５】
[Nle11]-サブスタンスPを投与する請求項1記載の方法。
【請求項６】
[Pro9]-サブスタンスPを投与する請求項1記載の方法。
【請求項７】
[Sar9]-サブスタンスPを投与する請求項1記載の方法。
【請求項８】
[Tyr8]-サブスタンスPを投与する請求項1記載の方法。
【請求項９】
[p-Cl-Phe7,8]-サブスタンスPを投与する請求項1記載の方法。
【請求項１０】
[Sar9,Met(O2)11]-サブスタンスPを投与する請求項1記載の方法。
【請求項１１】
前記投与工程が前記哺乳動物の鼻にエアロゾルを投与することにより行われる、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
前記投与工程が前記哺乳動物の筋肉内への注射により行われる、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
前記投与工程が局所投与により行われる、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
前記投与工程が静脈投与により行われる、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
前記投与工程が前記哺乳動物の肺にエアロゾルを投与することにより行われる、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物がウシである、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物がイヌである、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物がネコである、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
前記ヒトが炭疽菌の胞子に曝露された、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
前記ヒトが炭疽菌の胞子に曝露されるかもしれない、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
前記ヒトが皮膚接触を介して炭疽菌の胞子に曝露された、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
前記ヒトが吸入によって炭疽菌の胞子に曝露された、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
前記ヒトが摂食により炭疽菌の胞子に曝露された、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
炭疽菌の胞子に曝露されたヒトにおいて炭疽病の危険又は重症度を低減する方法であって：
有効量の[Sar9,Met(O2)11]-サブスタンスPを該ヒトの気道に投与し、それにより炭疽病の症状の該危険又は重症度を低減する、前記方法。
【請求項２６】
前記[Sar9,Met(O2)11]-サブスタンスPがエアロゾルによって送達される、請求項25記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は細菌感染の分野に関するものである。特に本発明は、胞子形成性細菌に関する。さらに詳細には、本発明は炭疽菌に曝露されている、又は炭疽菌に曝露されるかもしれない個体の治療に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
(発明の背景)
炭疽病と呼ばれる病気は、胞子形成性細菌、バシラス・アンスラシス(Bacillus anthracis)によって引き起される。胞子は、生存しがたい条件下においても生存を維持する細菌の保護された非代謝形態である。胞子は熱、寒さ、pH、及び乾燥の極限状態、並びに化学物質及び殺菌剤に対する曝露に抵抗するものである。生存しやすい条件下にあっては、該胞子は活性化(発芽)して、成長形態となり、かつ増殖を開始する。該成長形態においては１以上の毒素を産生し、一般に宿主に対し大きなダメージを引き起こす。該毒素の1つはアデニレートシクラーゼとして機能し、かつ他の毒素は亜鉛メタロプロテアーゼとして機能する。
【０００３】
該疾患、炭疽病は皮膚(皮膚反応)、肺(吸入)及び消化管(胃腸)に影響を与え得るものである。吸入炭疽病は胃腸炭疽病(25〜50％)より致死的であり(50％)、胃腸炭疽病は、皮膚炭疽病(20％)よりもさらに致死的である。該疾患はウール及び加熱不十分な肉を含む感染した動物製品を取扱い又は食すことによって引き起こされ得る。また炭疽菌の胞子は人々に対し胞子を故意に配布する兵器として使用されてきた。
【０００４】
皮膚炭疽病は小さな痛みとして現れ水疱に進展し、次いで中心部に黒い領域を伴う皮膚の腫瘍になる。胃腸炭疽病は、吐き気、食欲不振、血液を伴う下痢及び発熱を生じさせ、次いで、悪性の胃痛となる。吸入炭疽病は風邪又はインフルエンザのように現われ、喉の痛み、微熱及び筋肉痛を伴うことがある。後期の症状は咳、胸部不快、息切れ、倦怠感及び筋肉痛を伴うものである。
【０００５】
胞子それ自体は病気を生じさせない。該胞子は宿主の体内に生存しやすい場所を見つけて発芽しなければならない。この生物学的プロセスのため、症状は通常曝露後1〜６週間は発現しない。従って、もし曝露が疑われるような場合、発芽又は複製のプロセスを阻害し得る方法をとる時間があり、これにより該疾患の回避又は最小化をすることができる。
【０００６】
バシラス・アンスラシスの該胞子を形成する性質のため、かつ胞子が一般に抗生物質の効果に対し耐性であるために、推測される曝露を処置する期間は通常かなり長い。さらにワクチンもあるが、それは一般に公衆には入手しがたい。
従って、当該技術分野において炭疽菌の胞子に対し曝露された後、疾患の症状及びそれらの重症度の危険性を低減する助けとなる手段が引き続き必要とされている。
【発明の開示】
【０００７】
(本発明の概要)
本発明では、炭疽菌の胞子に曝露されている、又は曝露されるかもしれない哺乳動物において、炭疽病の危険又は重症度を低減する方法を提供する。有効量のサブスタンスP又はその類似体を、炭疽菌の胞子に曝露されている、又は曝露されるかもしれない哺乳動物に対して投与する。該類似体は[Met-OH11]-サブスタンスP、[Met-OMe11]-サブスタンスP、[Nle11]-サブスタンスP、[Pro9]-サブスタンスP、[Sar9]-サブスタンスP、[Tyr8]-サブスタンスP、[p-Cl-Phe7,8]-サブスタンスP、[Sar9,Met(O2)11]-サブスタンスP、及びアミノ酸骨格RPKPQQFFGLM-NH2(配列番号：1)を有する類似体からなる群から選ばれる。炭疽病の症状の該危険又は重症度を低減する。
本発明の他の実施態様では、炭疽菌の胞子に曝露されたヒトにおいて炭疽病の危険又は重症度を低減する方法を提供する。有効量の[Sar9,Met(O2)11]-サブスタンスPを該ヒトの気道に投与する。炭疽病の症状の該危険又は重症度をそれにより低減する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
(発明の詳細な説明)
サブスタンスP又はその生物活性類似体は、炭疽菌曝露の症状の該危険性及び／又は該重症度を低減させることができるということが本発明で見出されている。本件出願人は活性のいかなる具体的メカニズムに対しても限定する意図はないが、サブスタンスP又はその生物活性類似体の活性は、該細菌胞子の植込み又は発芽を阻害し得るものである。死の危険性は、この療法により低減される。
【０００９】
サブスタンスP(RPKPQQFFGLM-NH2; 配列番号：1)は、グリシン−延長前躯体として合成され、かつ翻訳後的に転換されて該生物学的活性、C-末端アミドとなる。サブスタンスP.又はその生物学的活性類似体、例えばSar9,Met(O2)11-サブスタンスPを投与して、B.アンスラシスの胞子に曝露されている、又は曝露された疑いがある個人を治療することができる。該生物活性類似体は、[Met-OH11]-サブスタンスP、[Met-OMe11]-サブスタンスP、[Nle11]-サブスタンスP、[Pro9]-サブスタンスP、[Sar9]-サブスタンスP、[Tyr8]-サブスタンスP、Sar9、Met(O2)11-サブスタンスP、及び[p-Cl-Phe7,8]-サブスタンスPからなる群から選択することができる。同様に機能する他の化合物を、そのレセプター(NK-1)との結合又は該NK-1レセプターに拮抗するその能力に関し、サブスタンスPと競合する能力によって同定することができる。サブスタンスPと同じアミノ酸骨格を有する化合物をルーチン的に修飾することができ、レセプターアゴニスト活性について試験することができる。該活性についてのルーチンアッセイは、当該技術分野で公知であり、使用され得る。
【００１０】
該サブスタンスP又は類似体を、エアロゾル吸入を含む当該技術分野における公知のすべての方法で投与することができる。また、リポソーム配合物、標的とする分子（例えば、抗体、レクチン類）との抱合体、及びステント、移植物若しくは他の物理的送達ビヒクルへの組み込みなどの、標的化又は有効性における改良を確かなものとする機序を用いる配合物を使用することができる。また、静脈内投与、局所投与、気管内投与、気管支内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、皮下投与、舌下投与、及び経口投与を用いることもできる。サブスタンスP又はその生物学的活性類似体の適当な濃度範囲は、エアロゾル投与において1μM及び5000μMの間で、50μM〜500μM、1〜10μM、50〜100μM、500〜1000μM、及び1000〜5000μMとする。次に示すように、投与量依存応答は、30、100、300、及び1000μMで観察された。該サブスタンスP又は類似体を、単独で又は炭疽病を治療又は予防するための他の薬剤と組み合わせて投与することができる。特に、該サブスタンスP又はその類似体を用いて、他の薬剤の活性を強化することができる。ワクチンまたは他の免疫学的治療及び予防を、アジュバントとして該サブスタンスP又は類似体を使用することで、増強することができる。該アジュバントは、前記ワクチン又は他の免疫学的治療を行うと同時に、又はその前に、又はその後に投与することができる。
【００１１】
本発明の方法は、ヒト、ウマ、ヒツジ、霊長類(サル、類人猿、テナガザル、チンパンジーなど)、げっ歯類(マウス、ラット、モルモット、ハムスターなど)、及び有蹄類(雌ウシなど)を含む、すべての哺乳類に適用することができる。胞子に対する曝露は、例えば農業的な周囲環境において、ウールから、工場のような工業的周囲環境において、又は調理されていない若しくは十分に調理されていない感染肉を食べることから生じ得る。対象は、例えば吸入、皮膚接触、及び／又は注射を介して胞子に曝露され得る。また曝露は、兵器化した胞子、故意の又は不慮の散布からも生じ得る。不慮の曝露は、研究若しくは臨床の研究所的な環境、又は臨床的状況において生じ得る。すべての実際の又は予期される曝露は、本発明の治療適用となり得る。
【００１２】
炭疽病に対するビプロベックス(Viprovex)の予防的有効性の知見がさらなる研究で確認され、かつ他の有意な効果が明らかとなった。ビプロベックスは炭疽菌で前処理したマウスにおいて生存率の増加をもたらすという有効性が見出された。すなわちビプロベックスは動物モデルにおいて予防的有効性を発現させるだけでなく、治療的有効性もまた示すのである。感染24時間前にビプロベックスで処置することで、生存率が240％増加するという結果が明らかになった(未処置で28.6％であるのに対し、処置することで68.8％になったことに対比した)。感染4時間前にビプロベックスで処置することで、同様の結果が得られた(処置することで生存率が62.5％であるのに対し、処置で28.6％であることと対比した)。要約するとビプロベックスは、マウスのモデルにおいて炭疽菌曝露に対する治療的曝露後処置の有効性を示している。
【００１３】
これらの結果を支持する科学的理論は、現時点において完全に確立されたものではない。理論的にはビプロベックスによる生来の免疫系活性は炭疽菌感染に対する防御に帰与し得る。粘膜はこの感染に対する最初の(生来の)物理的バリアを提供し、かつ外来物質に対するマクロファージ活性／食菌作用は該生来の免疫系の二次的成分を提供する。該Toll様レセプター(TLR)は炎症性免疫反応を仲介し、かつ炭疽菌に対する応答に関与すると見られており、かつ本発明者らはビプロベックスに対する応答におけるTLR上方制御に関与する予備的な証拠を有している。
本発明は、本発明の実施の現在の好ましい様式を含む具体的な例に関連して記載されているが、当業者であれば、添付の請求の範囲に記載されている発明の概念及び範囲内に入る先に記載されたシステム及び技術の多くの変形及び置換があることが理解されるであろう。
【実施例】
【００１４】
(実施例１)
A/J系マウスを、エアロゾル化した単一用量のホムスペラ(Homspera(商標))(Sar9,Met (O2)11-サブスタンスP)に曝露し、一日後、B.アンスラシススターン胞子(B. anthracis Sterne spores)に、その約LD50濃度で曝露した。ホムスペラの投与(噴霧器により送達される30、100、300及び1000μMの溶液)は、死亡率を用量依存的に抑制した。対照動物(6匹)は、8日までにすべて死亡したが、1000μMのホムスペラで処置したマウスは、11日間にわたって、処置したマウスの6匹中2匹しか死亡せず、中間用量はこれらの値間の分布を示し、100μMでは処置したマウスの6匹中1匹が生存し、300μMでは処置したマウスの6匹中3匹が生存する結果となった。
実験マウス(A/J系マウス)パラダイムにおいて、予防的に(最長一日)、又は細菌曝露後にマイクロモル(μM)濃度のビプロベックス(Radilex、sar9....)で処置することにより、炭疽菌誘発性死が一部防御されることが示された。
【００１５】
ビプロベックス噴霧による処置開始4時間前から開始24時間後に、(曝露後20日で70%の動物が死亡する)約LD70/20用量の炭疽菌の胞子に曝露された動物は、未処置の動物と比較して高い生存率を示した。生存率の範囲は、処置しなければ死亡した動物の約20〜70％であった。ビプロベックス曝露の間に対照動物において毒性を観察することはなかったので、完全生存率(処置しなければ死亡した動物の100％)は、より高い用量で達成できるであろう。
該防御機構は不確実ではあるが、炭疽菌の胞子に曝露される前に処置した動物は、曝露後早ければ5日で明らかに死から防御され、該防御はこの調査(21日)を通して継続した。炭疽菌に曝露された後に処置した動物は、早期死亡率と同様であるように見えたが、約10日以降も生存は続き、このことは炭疽菌吸入の防御における複数のビポラベックス活性機構を示唆した。
【００１６】
生来の免疫反応を強化するような機構は、ビプロベックスによるより積極的な前処置効果を説明するかもしれないが、炭疽菌による刺激作用から生じる免疫応答機構の強化が、後の応答に関与するかもしれない。
リアルタイムPCR(Real Time PCR)のインビトロ研究は、サイトカイン、インターロイキン、TLR、デフェシン、及びビプロベックスに応答する免疫監視の他の成分が増加することを示し、治療可能性に対する多次元応答へのさらなる支持を加える。
【００１７】
本発明者らは、B.アンスラシス曝露前の様々な前処置の間隔を評価し、末梢血液サイトカインレベル及び肺細胞機能メディエーター、並びにホムスペラ曝露 +/- B.アンスラシス曝露後の免疫系監視機構の尺度を評価している。特異的に、末梢血液を、マルチプレックスフローサイトメトリー分析を用いて、つまりルミネックス社のテクノロジー(Luminex technology)を介して評価した17サイトカインの発現の変化で評価する。さらに、フローサイトメトリーを用いて、CD4、CD8、NK及び幹(CD34+)細胞を含む、異なるグループの比較的大量の免疫細胞の変化を測定する。6匹のマウスのグループを、ホムスペラの2、4、24及び72時間後に評価する。対比のために用いる対照グループは、噴霧器を介してホムスペラビヒクルを受け取り、処置したグループと同じ時間で、屠殺される。１つの擬似グループは処置を受けないが、その他は全く同様に扱われる。他の処置したグループは同等のモル濃度のSPを受け取るか、又は選択されたNK1レセプターアンタゴニストを受け取り、該ホムスペラ活性がNK1-レセプターで仲介されていることを証明する。
【００１８】
(実施例2)
(IL-6を優先的に増加させない免疫賦活薬活性及び影響)
ビプロベックス(商標)は、インフルエンザウィルスに感染した動物モデルにおいて治療的有効性を提供する。潜在的機構を考察する研究は、宿主免疫系細胞成分を調査し、動物及び培養細胞の両方において、ビプロベックス(商標)が生来の免疫系成分の活性化差異を引き起こすことを見出し、動物のすべての調査結果を立証し、かつビプロベックス(商標)が、H5N1インフルエンザ(「鳥インフルエンザ」)の高い死亡率の根底となるおそれがある免疫系過剰刺激を阻止出来る可能性を示唆している。
【００１９】
「ネイチャー」(Kobasa D らの論文, (2007) Nature 445: 319-323)の報告によると、ミネトバ、ウィニーペッグのカナダ公衆衛生局の科学者たちは、数種のインフルエンザウィルスが致命的になり得る発現機序の可能性があるものについて報告している。世界中で推定4000万〜1億人が死亡した世界的流行病を引き起こした1918年のインフルエンザウィルス(スペイン風邪)、及び威嚇的な鳥インフルエンザウィルスは、いずれも感染者において「サイトカインストーム」を引き起こすようである。通常、侵入ウィルスの存在下で、該免疫系細胞は炎症を引き起こし、より多くの免疫系細胞を誘引し、かつ該侵入ウィルスを攻撃する細胞および抗体の発現を刺激する化学物質(例えば、サイトカイン及びケモカイン)を放出する。サイトカインストームが発現するのは、免疫応答が致命的になるには有益でないウィルスに対して、感染者の免疫系が活性化を維持している場合である。高度に上昇したレベルのサイトカインは、免疫系に過剰な刺激を与え、広範囲な肺炎症及び体液貯留、血管機能不全、並びに結果的にショック及び死をもたらす。サイトカインストームでは、体の免疫系は、何とかそれ自体から該ウィルスを取り除こうとするが、なぜか過度の免疫系がその保有者を死亡させないようにする正常な制御から逸脱する。
【００２０】
「ネイチャー」誌に記載される通り、機能亢進性免疫系が関与する他の病状があり、これらの病状を治療するための開発中の薬品は、サイトカインストームを誘発する可能性がある汎発性インフルエンザ感染の治療に有益であるかもしれない。サイトカインインターロイキン6(IL-6)は、免疫応答制御ポイントとして特異的に言及されており、リンパ球を活性化し、かつ抗体産生を増加させるのに役立つ。サイトカインインターロイキン6は、免疫系、炎症、及び造血発生を制御する中枢として同定されている(Nishimoto N 及び Kishimoto T の論文、(2006) Nature Clinical Practice 2:11; 619-626)。
IL-6の正常産生及び放出が免疫系及び造血系を機能させるのに不可欠かもしれないが、過剰産生は、抗アポトーシス性であり、かつ未制御の細胞増殖をもたらすと報告されており、血液癌悪性骨髄腫と特異的に関連している。
【００２１】
免疫系タンパク質をコードする細胞遺伝子を、PCRを使って定量化した；ビプロベックス(商標)は、複数の宿主免疫系成分、中でもIL-Iβ、IL-6、IL-10、TNF-α、及びToll様レセプター(TLR)などの様々な細胞センサー、及びヌクレオチド結合オリゴマー形成ドメイン(NOD)などの細胞内病原体認識分子、及びSOCS(サイトカインシグナル抑制因子)などの制御因子を上昇させることがわかった。インターロイキンmRNAの上昇は、IL-1及びIL-10がIL-6よりも28倍及び21倍増加する点で注目に値した。
【表１】
2009536919.tif 000002
【００２２】
ビプロベックス(商標)で処置した(かつ、H3N2/Wuhamインフルエンザウィルスの影響に対してより抵抗性がある)動物の肺では、IL-6レベルが有意に増加しないことが、コットンラットにおける動物試験で確認される。
【表２】
2009536919.tif 000003
【表３】
2009536919.tif 000004
【００２３】
対照的に、他の免疫賦活性サイトカインは有意に上昇した。
これらのマクロファージ様細胞、及びビプロベックス(商標)で処置した動物における、他の免疫賦活性サイトカインに対するIL-6の相対的低発現は、ビプロベックス(商標)が、サイトカインストームを誘発するのにより低い傾向をもたらす免疫系を優先的に刺激することを示している。
【手続補正書】
【提出日】平成20年12月25日(2008.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
炭疽菌の胞子に曝露されている又は曝露されるかもしれない哺乳動物において、炭疽病の危険又は重症度を低減する方法であって：
炭疽菌の胞子に曝露されている又は曝露されるかもしれない哺乳動物に対して、有効量のサブスタンスP、又はその類似体を投与すること、ここにおいて前記類似体は、[Met-OH11]-サブスタンスP、[Met-OMe11]-サブスタンスP、[Nle11]-サブスタンスP、[Pro9]-サブスタンスP、[Sar9]-サブスタンスP、[Tyr8]-サブスタンスP、[p-Cl-Phe7,8]-サブスタンスP、[Sar9,Met(O2)11]-サブスタンスP、及びアミノ酸骨格RPKPQQFFGLM-NH2（配列番号：1）を有する類似体からなる群から選ばれるものであり、それにより炭疽病の症状の該危険又は重症度を低減する、前記方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009536919000001.app
【国際調査報告】
2009536919.tif 000005
2009536919.tif 000006
2009536919.tif 000007