(57)【要約】  本発明は、カチオン性内側アンモニウム基および外側非毒性末端基を含んでなる修飾ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマー、該デンドリマーを含んでなる製薬学的組成物、該デンドリマーの製造方法および遺伝子治療における使用のための、特に癌の処置のための、アニオン性生物活性治療因子のトランスフェクション剤としてのそれらの使用に関する。外側末端基および内側アミン官能基を含んでなる、不完全なデンドリマーおよびその混合物もまた含んでなる、世代１、２、３、４もしくは５の修飾ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマーは：（ａ）実質的に全ての外側末端基が式（Ｉ）【化１】2009501245.tif 000040［式中、ＲはＣ１〜１０アルキル、ポリエチレングリコール基およびポリエチレングリコールガリル基の群から選択される基である］の基であり；そして  （ｂ）実質的に全ての内側アミン官能基が第四級カチオン性アンモニウム官能基であることを特徴とする。最も好ましいのは、四級化化合物ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＣＨ３）４、ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＣＨ３）８、ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＣＨ３）１６、ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＣＨ３）３２、ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＣＨ３）６４、ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＰｈ（（ＥＯ）４ＯＭｅ）３）４、ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＰｈ（（ＥＯ）４ＯＭｅ）３）８、ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＰｈ（（ＥＯ）４ＯＭｅ）３）１６、ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＰｈ（（ＥＯ）４ＯＭｅ）３）３２およびＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＰｈ（（ＥＯ）４ＯＭｅ）３）６４である。
2009501245.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）実質的に全ての外側末端基が式（Ｉ）
【化１】
2009501245.tif 000031
［式中、ＲはＣ１〜１０アルキル、式
【化２】
2009501245.tif 000032
（式中、ｎは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２である）
のポリエチレングリコール基；および式
【化３】
2009501245.tif 000033
（式中、各ｍは独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２である）
のポリエチレングリコールガリル（ｇａｌｌｙｌ）基の群から選択される基である］
の基であり；そして
（ｂ）実質的に全ての内側アミン基がカチオン性第四級アンモニウム基である
ことを特徴とする、外側末端基および内側アミン基を含んでなる、不完全なデンドリマーおよびその混合物もまた含んでなる、世代１、２、３、４もしくは５の修飾ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマー。
【請求項２】
修飾ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマーが：
（ａ）最初に外側アミン末端基および内側第三級アミン基を実質的に含んでなるポリ−（プロピレンイミン）デンドリマーを無水酢酸、ハロゲン化Ｃ１〜１０アルキル、式
【化４】
2009501245.tif 000034
（式中、ｎは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２である）
のポリエチレングリコール酸；および式
【化５】
2009501245.tif 000035
（式中、各ｍは独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２であり、そしてＸはハライドである）
のポリエチレングリコールガリルハライドの群から選択されるアシル化剤と反応させ；そして
（ｂ）段階（ａ）において得られる生成物を四級化剤と反応させる
ことにより得られることを特徴とする、不完全なデンドリマーおよびその混合物もまた含んでなる、世代１、２、３、４もしくは５の修飾ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマー。
【請求項３】
ハライドがクロライドであることを特徴とする、請求項２に記載の修飾ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマー。
【請求項４】
デンドリマーが四級化
ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＣＨ３）４、
ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＣＨ３）８、
ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＣＨ３）１６、
ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＣＨ３）３２、
ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＣＨ３）６４、
ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＰｈ（（ＥＯ）４ＯＭｅ）３）４、
ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＰｈ（（ＥＯ）４ＯＭｅ）３）８、
ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＰｈ（（ＥＯ）４ＯＭｅ）３）１６、
ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＰｈ（（ＥＯ）４ＯＭｅ）３）３２および
ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＰｈ（（ＥＯ）４ＯＭｅ）３）６４
の群から選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１つに記載の修飾ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマー。
【請求項５】
（ａ）請求項１〜４のいずれか１つに記載の修飾ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマー；および（ｂ）アニオン性生物活性治療因子を含んでなることを特徴とする、哺乳類への投与に適する製薬学的組成物。
【請求項６】
アニオン性生物活性治療因子が製薬学的活性化合物、核酸、核酸配列、ＤＮＡおよびＲＮＡのオリゴマー、ポリヌクレオチド、ＤＮＡザイム、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、ハンマーヘッド型ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、リボザイムなど；もしくはその組み合わせの群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の製薬学的組成物。
【請求項７】
アニオン性生物活性治療因子が５，０００ダルトンに等しいかもしくはそれより小さい分子量を有することを特徴とする、請求項６に記載の製薬学的組成物。
【請求項８】
アニオン性生物活性治療因子のためのトランスフェクション剤としての請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項９】
遺伝子治療における請求項５〜７のいずれか１項に記載の製薬学的組成物の使用。
【請求項１０】
肝臓、腎臓、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫、妊娠性絨毛癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、濾胞性混合型リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、横紋筋肉腫、精巣癌、ウィルムス腫瘍、肛門癌、膀胱癌、乳癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリーセル白血病、頭頸部癌、肺（小細胞）癌、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、卵巣癌、脳腫瘍（星状細胞腫）、子宮頸癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、カポジ肉腫、肺（非小細胞）癌、黒色腫、膵臓癌、前立腺癌、軟部組織肉腫、乳癌、結腸直腸癌（ＩＩＩ期）、骨肉腫、卵巣癌（ＩＩＩ期）、もしくはその組み合わせと関連する、癌腫瘍の処置のための請求項５〜７のいずれか１項に記載の製薬学的組成物の使用。
【請求項１１】
実質的に全ての外側末端基が式（Ｉ）［式中、ＲはＣ１〜１０アルキル、式
【化６】
2009501245.tif 000036
（式中、ｎは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２である）
のポリエチレングリコール基；および式
【化７】
2009501245.tif 000037
（式中、各ｍは独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２である）
のポリエチレングリコールガリル基の群から選択される基である］の基であることを特徴とする、外側末端基および内側アミン基を含んでなる、不完全なデンドリマーおよびその混合物もまた含んでなる、世代１、２、３、４もしくは５の修飾ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマー。
【請求項１２】
修飾ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマーが、最初に外側アミン末端基および内側第三級アミン基を実質的に含んでなるポリ−（プロピレンイミン）デンドリマーを無水酢酸、ハロゲン化Ｃ１〜１０アルキル、式
【化８】
2009501245.tif 000038
（式中、ｎは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２である）
のポリエチレングリコール酸；および式
【化９】
2009501245.tif 000039
（式中、各ｍは独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２であり、そしてＸはハライドである）
のポリエチレングリコールガリルハライドの群から選択されるアシル化剤と反応させることにより得られることを特徴とする、不完全なデンドリマーおよびその混合物もまた含んでなる、世代１、２、３、４もしくは５の修飾ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内側カチオン性アミン（アンモニウム）基および外側非毒性末端基を含んでなる修飾ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマー、該デンドリマーを含んでなる製薬学的組成物、該デンドリマーの製造方法ならびに遺伝子治療における使用のための、特に癌の処置のための、アニオン性生物活性治療因子のトランスフェクション剤としてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
デンドリマーは、アルゴリズム的段階的方法において合成される明確な高度分岐分子構造を有する合成高分子である。繰り返される一連の反応ごとに、実質的に倍になった分子量および倍になった（分離した）数の官能末端基を有するいわゆる「より高い世代」（Ｇ）の分子が生成される。１９８５年以来、Ｔｏｍａｌｉａのポリ（アミドアミノ）ＰＡＭＡＭ−デンドリマー、Ｎｅｗｋｏｍｅのアルボロール（ａｒｂｏｒｏｌ）、Ｆｒｅｃｈｅｔのポリエーテルデンドリマー、ＭｅｉｊｅｒとＭｕｅｌｈａｕｐｔのポリ（プロピレンイミン）ＰＰＩ−デンドリマーおよびＭｏｏｒｅのフェニルアセチレンデンドリマーのような、多数の化学的に異なるタイプのデンドリマーが開発されている（非特許文献１）。デンドリマーは、それらの明確な構造、狭い多分散性、明確なナノスケールサイズおよび末端基の修飾の容易さのために、生命科学および医薬品化学における様々な機能の興味深い候補と見なされている。特に、薬剤（ｄｒｕｇ−）における結合および遊離剤としての、そして遺伝子治療における送達媒体としてのそれらの機能が調べられている（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。遺伝子治療は、治療効果を得るための細胞、好ましくは真核細胞（ヒト細胞のような）への核酸（ＤＮＡのような）の導入と定義される。この効果は、遺伝子欠損を修正することもしくは治療的に有用なタンパク質を（過剰）発現させることのいずれかに起因することができる。
【０００３】
デンドリマーの中で、ＰＡＭＡＭデンドリマーは正に荷電しそして生理的ｐＨでＤＮＡに結合することができるので、これらのデンドリマーは遺伝子送達のための潜在的なトランスフェクション剤として最も多くの注目を集めている。いくつかの他のデンドリマータイプもまた研究されている（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。Ｓｚｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．は、インビトロ試験により証明されるように、ＰＡＭＡＭデンドリマーにより成功裏に媒介されるＤＮＡトランスフェクションを提示した最初であった（非特許文献１４）。後に、ＰＡＭＡＭ−デンドリマーの会合およびトランスフェクション挙動に関する他の研究が公開されている（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３）。特に、熱処理した部分的に分解したＰＡＭＡＭ−デンドリマーは、インビトロＤＮＡキャリアとしてより良く機能することが見出されており（非特許文献２４）：これらの活性化ＰＡＭＡＭは、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（ＱｉａｇｅｎＣ）の名称で市販されている。ＰＡＭＡＭデンドリマーの成功したトランスフェクションは、約５〜２０の電荷比（電荷比は、ＤＮＡにおけるホスフェートの数に対するＰＡＭＡＭにおける末端のカチオン性アミン部位の数として定義される）について報告されており、すなわち、過剰のトランスフェクション剤が使用されなければならない（非特許文献１４、非特許文献２５）。その末端のアミンの一部がグリコール鎖で修飾されているＰＡＭＡＭデンドリマーもまた、潜在的なＤＮＡトランスフェクション剤として紹介されている（非特許文献２６）。しかしながら、この研究では、高濃度のデンドリマーがＤＮＡ結合およびトランスフェクション試験において使用されており、一方、より低い濃度で機能する薬剤の使用が要求される。ＰＡＭＡＭデンドリマーに関する最近の研究は、細胞膜とのそれらの相互作用に関する基本的情報を与えており（非特許文献２７）、また遺伝子キャリア設計における次の段階は、製造されそして研究されているターゲッティング抗体部分を有するＰＡＭＡＭと考えられており（非特許文献２８）、そしてＰＡＭＡＭはＲＮＡ分子と相互作用することができ、ある種のリボザイムの活性の阻害をもたらすことが示されている（非特許文献２９）。
【０００４】
トランスフェクション剤の有用性を決定する重要な因子は、該薬剤の毒性および効率である。あるものは（非特許文献３０）、ＰＡＭＡＭデンドリマーがそれらの世代により毒性を有することを示しており、そしてあるものは（非特許文献３１）は、ＰＡＭＡＭデンドリマーがポリリシン（ｐＬｙｓ）より毒性が低いことを示しており、他のデータは、特にアミン終端ＰＡＭＡＭデンドリマーが溶血性および細胞毒性挙動を示し、一方、末端カルボキシレート基を有するＰＡＭＡＭデンドリマーは無毒であることを示唆する（非特許文献３２、非特許文献３３）。残念なことに、高度のアミン官能基化を有するＰＡＭＡＭデンドリマーが用いられる場合に、おそらくこれは生理的ｐＨでＤＮＡ結合のためのより多くのカチオン性部位をもたらすので、トランスフェクションはより効率がよいように思われる（例えば非特許文献２４における図７を参照）。
【０００５】
ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマーは、ＤＳＭ  ＲｅｓｅａｒｃｈＣ（Ｇｅｌｅｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）（非特許文献３４）でそして独立にＭｕｅｌｈａｕｐｔのグループにおいて（非特許文献３５）開発されている特定の種類のデンドリマーである。
【０００６】
【表１】
2009501245.tif 000003
【０００７】
それらはＳｙＭＯ−ＣｈｅｍＣ（ｗｗｗ．ｓｙｍｏ−ｃｈｅｍ．ｎｌ，Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で市販されており、そして修飾目的のために出発物質として手を加えることができる。例として、第２世代ＰＰＩ−デンドリマーの分子構造を図１に表す。ＰＰＩ−デンドリマーは、それらの分子量、それらの外側アミン末端基および内側第三級アミン基を特徴とする（表１参照）。もちろん、各世代の合成における不完全な反応のために、デンドリマーは不完全である可能性があり、従って、いくつかの内側アミン官能基は第二級アミン官能基でもあり得る。本発明の文脈において、ＰＰＩ−デンドリマーは、修飾前に相当な数の内側第三級アミン基を含んでなる、不完全なデンドリマーおよびその混合物をさらに含んでなる、世代１、２、３、４もしくは５のデンドリマーをさすと理解される。
【０００８】
結合（非特許文献３６）およびトランスフェクション（非特許文献３７）測定に関する報告が出てきているが、アミン末端基を有するＰＰＩ−デンドリマーは水においてゆっくりと分解し、そしてより重要なことには、毒性が強すぎるのでＤＮＡ送達系におけるそれらの使用は可能でない。文献からのデータは、デンドリマーの末端もしくは表面基（外側）が、内側の構造にかかわらず、全樹状構造の毒性を決定することを強く示唆する（非特許文献３３）。結果として、ＰＰＩ−デンドリマーの表面は、低い毒性を有する送達系をもたらすように化学的に修飾することができ；さらに、表面修飾はまた水溶性および加水分解に対する安定性を促進することもできる。
【０００９】
外側の修飾だけでなく、カチオン性アンモニウム部位をもたらすように内側第三級アミンを四級化することによりＰＰＩもしくはＰＡＭＡＭデンドリマーの内側を修飾することもまた可能である。実際に、ＰＰＩ−デンドリマーの四級化は以前に報告されている（非特許文献３８、非特許文献３９、非特許文献４０）。Ｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献４１）は、外側における短いグリコール鎖および四級化内側部位を有するＧ２およびＧ４  ＰＰＩ−デンドリマーを提示しているが、著者等はトランスフェクション剤としてのそれらの使用に関して調べていないかもしくは報告していない。最近、カチオン修飾された内側を有するＰＡＭＡＭが同様に報告されており：ルシフェラーゼ遺伝子発現試験で測定した場合のそれらのトランスフェクション効率は、ＰＥＩもしくは非修飾ＰＡＭＡＭ基準のものより低かった（非特許文献４２）。著者等はこれに言及していないが、内側で四級化されたＰＡＭＡＭはレトロマイケル反応を示す傾向がある可能性が最も高く、これらのカチオン修飾されたデンドリマーは分解する可能性が最も高く、そして安定でないことを意味する。
【非特許文献１】Ｓｃｈｌｕｅｔｅｒ  ＤＡ，１９９９
【非特許文献２】Ｐａｔｒｉ  ＡＫ  ｅｔ  ａｌ  ２００２
【非特許文献３】Ｅｓｆａｎｄ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．２００１
【非特許文献４】Ｌｉｕ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ  １９９９
【非特許文献５】Ｓｔｉｒｉｂａ  ＳＥ  ｅｔ  ａｌ．２００２
【非特許文献６】Ｂｏｓｍａｎ  ＡＷ  ｅｔ  ａｌ  １９９９
【非特許文献７】Ｔａｎｇ  ＭＸ  ｅｔ  ａｌ  １９９７
【非特許文献８】Ｌｏｕｐ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．１９９９
【非特許文献９】Ｃｈｏｉ  ＪＳ  ｅｔ  ａｌ．２０００
【非特許文献１０】Ｏｈａｓａｋｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．２００２
【非特許文献１１】Ｓｈａｈ  ＤＳ  ｅｔ  ａｌ．２０００
【非特許文献１２】Ｌｉｕ  ＭＪ  ｅｔ  ａｌ．１９９９
【非特許文献１３】Ｊｏｅｓｔｅｒ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．２００３
【非特許文献１４】Ｈａｅｎｓｌｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．１９９３
【非特許文献１５】Ｋｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．１９９６
【非特許文献１６】ＤｅＬｏｎｇ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９７
【非特許文献１７】Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．１９９６
【非特許文献１８】Ｓｃｈｅｐｉｎｏｖ  ＭＳ  ｅｔ  ａｌ．１９９７
【非特許文献１９】Ｑｉｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９８
【非特許文献２０】Ｙｏｏ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９９
【非特許文献２１】Ｃｈｅｎｇ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．２０００
【非特許文献２２】Ｏｔｔａｖｉａｎｉ  ＭＦ  ｅｔ  ａｌ  ２０００
【非特許文献２３】Ｋｉｈａｒａ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．２００３
【非特許文献２４】Ｔａｎｇ  ＭＸ  ｅｔ  ａｌ．１９９６
【非特許文献２５】Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ  ＡＵ  ｅｔ  ａｌ．１９９９
【非特許文献２６】Ｌｕｏ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．２００２
【非特許文献２７】Ｈｏｎｇ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．２００４
【非特許文献２８】Ｔｈｏｍａｓ  ＴＰ  ｅｔ  ａｌ．２００４
【非特許文献２９】Ｗｕ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．２００５
【非特許文献３０】Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＪＣ  ｅｔ  ａｌ．１９９６
【非特許文献３１】Ｓｚｏｋａ  ＦＣ  ｅｔ  ａｌ．１９９６
【非特許文献３２】Ｄｕｎｃａｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９６
【非特許文献３３】Ｍａｌｉｋ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００
【非特許文献３４】ｄｅ  Ｂｒａｂａｎｄｅｒ−ｖａｎ−ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ＥＭＭ  ｅｔ  ａｌ．１９９３
【非特許文献３５】Ｗｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９３
【非特許文献３６】Ｋａｂａｎｏｖ  ＶＡ  ｅｔ  ａｌ．２０００
【非特許文献３７】Ｚｉｎｓｅｌｍａｙｅｒ  ＢＨ  ｅｔ  ａｌ．２００２
【非特許文献３８】Ｅｌｉｓｓｅｎ−Ｒｏｍａｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．１９９７
【非特許文献３９】Ｐａｎ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９９
【非特許文献４０】Ｐａｎ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．２０００
【非特許文献４１】Ｋｒｅｉｄｅｒ  ＪＬ  ｅｔ  ａｌ．２００１
【非特許文献４２】Ｌｅｅ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．２００３
【発明の開示】
【００１０】
［発明の記述］
本発明によれば、修飾ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマーが提示され、ここで、ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマーは、アニオン性生物活性因子のための水溶性の加水分解に安定なそして非毒性のトランスフェクション剤をもたらす目的で外側および内側の両方で修飾される。ＰＰＩ−デンドリマーは、アミン末端基を式（Ｉ）
【００１１】
【化１】
2009501245.tif 000004
【００１２】
［式中、ＲはＣ１〜１０アルキル、ポリエチレングリコール基およびポリエチレングリコールガリル（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｇａｌｌｙｌ）基の群から選択される基である］
の基（これらの末端基は水溶性を維持し、一方、アミン末端基をブロックすることは非毒性種をもたらすことが判明しているので）に転化することにより外側で修飾されている。
【００１３】
ＰＰＩ−デンドリマーの内側は、内側（主に第三級）アミン基をヨウ化メチル、塩化メチルなどのような四級化剤と反応させることにより修飾されており、このようにして多数の第四級カチオン性部位を有する微小環境を生み出している。四級化反応が定量的に進むならば、ＰＰＩ−デンドリマーの世代により、カチオン性部位の量をそれぞれ第１および第５世代について２から６０まで変えることができる。デンドリマーの内側におけるカチオン性部位の高い局所濃度は、このタイプの樹状分子をアニオン性生物活性因子と複合体を形成することが十分にできるようにすると予想される。
【００１４】
従って、本発明は：
（ａ）実質的に全ての外側末端基が式（Ｉ）［式中、ＲはＣ１〜１０アルキル、式
【００１５】
【化２】
2009501245.tif 000005
【００１６】
（式中、ｎは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２である）
のポリエチレングリコール基；および式
【００１７】
【化３】
2009501245.tif 000006
【００１８】
（式中、各ｍは独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２である）
のポリエチレングリコールガリル（ｇａｌｌｙｌ）基の群から選択される基である］の基であり；そして
（ｂ）実質的に全ての内側アミン基がカチオン性第四級アンモニウム基である
ことを特徴とする、外側末端基および内側アミン基を含んでなる、不完全なデンドリマーおよびその混合物もまた含んでなる、世代１、２、３、４もしくは５の修飾ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマーに関する。
【００１９】
さらに、本発明は、修飾ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマーが：
（ａ）最初に外側アミン末端基および内側第三級アミン基を実質的に含んでなるポリ−（プロピレンイミン）デンドリマーを無水酢酸、ハロゲン化Ｃ１〜１０アルキル、式
【００２０】
【化４】
2009501245.tif 000007
【００２１】
（式中、ｎは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２である）
のポリエチレングリコール酸；および式
【００２２】
【化５】
2009501245.tif 000008
【００２３】
（式中、各ｍは独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２であり、そしてＸはハライドである）
のポリエチレングリコールガリルハライドの群から選択されるアシル化剤と反応させること；および
（ｂ）段階（ａ）において得られる生成物を四級化剤と反応させること
により得られることを特徴とする、不完全なデンドリマーおよびその混合物もまた含んでなる、世代１、２、３、４もしくは５の修飾ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマーに関する。
【００２４】
好ましくは、Ｃ１〜１０アルキルはメチル、エチル、イソ−プロピル、ｎ−プロピル、ｔ−ブチル、ｎ−ブチルもしくはペンチルである。最も好ましくは、Ｃ１〜１０アルキルはメチルである。
【００２５】
ハライドとして、クロライド、臭化物もしくはヨウ化物が好ましい。クロライドは特に好ましい。
【００２６】
好ましくは、ｎは３、４、５もしくは６、最も好ましくは３もしくは４である。
【００２７】
好ましくは、ｍは３、４、５もしくは６、最も好ましくは３もしくは４である。
【００２８】
四級化剤として、所望のタスク、すなわち、第三級アミン基を第四級アンモニウム基に転化することを実行することが当業者に既知である任意の薬剤を用いることができる。好ましくは、ハロゲン化メチル、最も好ましくはヨウ化メチルを用いるが、Ｃ１〜１０アルキル基を含んでなる薬剤もまた相間移動剤として用いることができる。
【００２９】
結合では、少なくとも１つのアニオン性部位を有する化学物質を少なくとも１つのカチオン性部位に可逆的に連結する任意の相互作用を意味する。
【００３０】
本発明はまた、（ａ）本発明の修飾ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマー；および（ｂ）アニオン性生物活性治療因子を含んでなることを特徴とする、哺乳類、好ましくはヒトへの投与に適当な製薬学的組成物にも関する。
【００３１】
アニオン性生物活性因子として、カチオン性部位に結合することができる任意の化学物質、特に製薬学的活性化合物、核酸、核酸配列、ＤＮＡおよびＲＮＡのオリゴマー、ポリヌクレオチド、ＤＮＡザイム、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、ハンマーヘッド型ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、リボザイムなど；もしくはその組み合わせを意味する。
【００３２】
特に好ましいのは、比較的低分子量、好ましくは５，０００ダルトン以下を有する、さらに特に比較的少数の塩基対（例えば、オリゴＤＮＡもしくはオリゴＲＮＡ）、好ましくは５０塩基対未満を有するアニオン性生物活性因子である。本願において、本発明者等は新規に提示する修飾ＰＰＩ−デンドリマーの結合およびトランスフェクション能力を調べるために核酸モデルとして３３ｍｅｒ一本鎖触媒ＤＮＡザイムを使用している。トランスフェクション試験は、インビトロならびにインビボで実施されている。
【００３３】
本発明のデンドリマー化合物は、それらの低い毒性ならびに血清および血液におけるそれらの安定性のために、トランスフェクション剤として適しており、そして該化合物を含んでなる製薬学的組成物は、最も好ましくはヒトでの、遺伝子治療における使用に、さらに特に癌の処置に特に適している。
【００３４】
最も好ましくは、癌は肝臓、腎臓、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫、妊娠性絨毛癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、濾胞性混合型リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、横紋筋肉腫、精巣癌、ウィルムス腫瘍、肛門癌、膀胱癌、乳癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリーセル白血病、頭頸部癌、肺（小細胞）癌、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、卵巣癌、脳腫瘍（星状細胞腫）、子宮頸癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、カポジ肉腫、肺（非小細胞）癌、黒色腫、膵臓癌、前立腺癌、軟部組織肉腫、乳癌、結腸直腸癌（ＩＩＩ期）、骨肉腫、卵巣癌（ＩＩＩ期）もしくはその組み合わせと関連する腫瘍である。
【００３５】
本発明はまた、実質的に全ての外側末端基が式（Ｉ）［式中、ＲはＣ１〜１０アルキル、式
【００３６】
【化６】
2009501245.tif 000009
【００３７】
（式中、ｎは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２である）
のポリエチレングリコール基；および式
【００３８】
【化７】
2009501245.tif 000010
【００３９】
（式中、各ｍは独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２である）
のポリエチレングリコールガリル基の群から選択される基である］の基であることを特徴とする、外側末端基および内側アミン基を含んでなる、不完全なデンドリマーおよびその混合物もまた含んでなる、世代１、２、３、４もしくは５の修飾ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマーにも関する。
【００４０】
さらに、本発明は、修飾ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマーが、最初に外側アミン末端基および内側第三級アミン基を実質的に含んでなるポリ−（プロピレンイミン）デンドリマーを無水酢酸、ハロゲン化Ｃ１〜１０アルキル、式
【００４１】
【化８】
2009501245.tif 000011
【００４２】
（式中、ｎは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２である）
のポリエチレングリコール酸；および式
【００４３】
【化９】
2009501245.tif 000012
【００４４】
（式中、各ｍは独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２であり、そしてＸはハライドである）
のポリエチレングリコールガリルハライドの群から選択されるアシル化剤と反応させることにより得られることを特徴とする、不完全なデンドリマーおよびその混合物もまた含んでなる、世代１、２、３、４もしくは５の修飾ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマーに関する。
【００４５】
ここで、本発明は多数の実験で、それに限定されずに、さらに詳細に明らかにされそして説明される。
【００４６】
実験
１．修飾ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマーの合成
１．１．一般的
グリコールガレート基で修飾したポリ−（プロピレンイミン）デンドリマーの合成は、文献に記述されている（Ｂａａｒｓ，Ｍ．Ｗ．Ｐ．Ｌ．，Ｋｌｅｐｐｉｎｇｅｒ，Ｒ．，Ｋｏｃｈ，Ｍ．Ｈ．Ｊ．，Ｙｅｕ，Ｓ．Ｌ．，Ｍｅｉｊｅｒ，Ｅ．Ｗ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２０００，３９，１２８５およびこの論文への支援情報を参照）。グリコールガレート（すなわち、３個のモノメトキシテトラエチレングリコール基を施された、没食子酸もしくは３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸）の合成については、同じ参考文献を参考にすることができる。アセチルもしくはポリエチレングリコールガレート基を有する四級化ポリ（プロピレンイミン）デンドリマーは、以前に文献に報告されていない。
【００４７】
アミン末端基を有するポリ（プロピレンイミン）デンドリマーは、ＳｙＭＯ−Ｃｈｅｍ（ｗｗｗ．ｓｙｍｏ−ｃｈｅｍ．ｎｌ）から入手可能であり、そして通常はそれぞれ第１、第２、第３、第４および第５世代について、ＤＡＢ−Ａｍ−４（世代１）、ＤＡＢ−Ａｍ−８（世代２）、ＤＡＢ−Ａｍ−１６（世代３）、ＤＡＢ−Ａｍ−３２（世代４）およびＤＡＢ−Ａｍ−６４（世代５）として示される。ＤＡＢは１，４−ジアミノブタンコアを表し、Ａｍはアミン末端基を表し、そして既定の数は末端基の数を表す。
【００４８】
日常的に適用する溶媒は、ｐ．ａ．品質のものである。使用した溶媒および試薬には、メチルアルコール（Ｂｉｏｓｏｌｖｅ  ｐ．ａ．）、トルエン（Ｂｉｏｓｏｌｖｅ  ｐ．ａ．）、ジクロロメタン（Ｂｉｏｓｏｌｖｅ  ｐ．ａ．）、水（カラム上で脱塩）、トリエチルアミン（Ｆｌｕｋａ、＞９９％、ＫＯＨ−ペレット上で保存）、無水酢酸（Ａｃｒｏｓ  ｐ．ａ．）、塩化オキサリル（Ａｃｒｏｓ）およびヨウ化メチル（Ｍｅｒｃｋ、冷蔵庫において保存）が包含される。
【００４９】
容量＞１．２ｍｅｑ／ｍｌを有するＤｏｗｅｘ  １ｘ８−５０（Ａｃｒｏｓ）Ｃｌ−アニオン交換樹脂（Ａｃｒｏｓ）およびＤｏｗｅｘ  ５５０Ａ  ＯＨ（２５〜３５メッシュ）強塩基性ＯＨ−アニオン交換樹脂（Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。ヨウ化物からクロライドへのイオン交換の成功は、試験を行うことにより調べることができる。最初に、数ｍｇのデンドリマー生成物を約１ｍＬの水に溶解し、そして数滴の濃Ｈ２Ｏ２（３５％溶液、Ｍｅｒｃｋ）を加える。この段階で、Ｉ−を含有するデンドリマー溶液はいくぶん黄色に着色し、一方、Ｃｌ−を含有するデンドリマー溶液は無色のままである（わずかな着色は、Ｉ２の形成のためである）。約１ｍＬの新たに調製した澱粉溶液の添加跡に、Ｉ−を含有するデンドリマー溶液は濃青色になり、一方、Ｃｌ−を含有するデンドリマーは溶液の着色を引き起こさない。澱粉溶液は、よく攪拌した沸騰水（１００ｍＬ）に可溶性澱粉粉末（１ｇ、Ｍｅｒｃｋ）を加えることにより得られる。１分後に、溶液を冷却させ、そして試験にすぐに使用する。
【００５０】
【表２】
2009501245.tif 000013
【００５１】
表ＩＩは、合成した修飾ポリ（プロピレンイミン）デンドリマーを記載する。
【００５２】
透析膜として、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒチューブを使用した（様々なカットオフＭＷＣＯ材料を適用した）。反応は、通常、アルゴンの不活性雰囲気下で実施した。ＮＭＲ分析は、Ｖａｒｉａｎ  Ｍｅｒｃｕｒｙ  Ｖｘ  ４００ＭＨｚもしくはＶａｒｉａｎ  Ｇｅｍｉｎｉ  ３００ＭＨｚ分光計上で行った。単離後に、製造したデンドリマーは通常−２０℃でもしくは４℃で暗所において保存した。
【００５３】
１．２．ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＣＨ３）８もしくは「Ｇ２」
【化１０】
2009501245.tif 000014
【００５４】
第２世代アミン終端ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマー（６．５０ｇ；８．４０ｍｍｏｌ；ＦＷ＝７７３）をメチルアルコール（５０ｍＬ）およびトリエチルアミン（６．８ｇ；６７．２４ｍｍｏｌ）に溶解した。無水酢酸（８．２４ｇ；８０．８ｍｍｏｌ）を１分の間加えた（還流；外部冷却なし）。２．５時間攪拌した後に、溶液をロータバップ上で蒸発させ、そしてメチルアルコールで１回ストリッピングした（ｓｔｒｉｐｐｅｄ）。カラムにＤｏｗｅｘ  ５５０Ａ  ＯＨ（２５〜３５メッシュ）を充填し、そしてイオン交換樹脂を水で、そして次にメチルアルコールで（これはいくらか発熱する）洗浄した。交換過程に十分な時間を与えるためにメタノール中の粗デンドリマーを滴下して溶出した。生成物を回転蒸発およびメタノールでのストリッピング、続いてオイルポンプを用いる真空排気により単離した。透明な無色の油が得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ＝８．１（ｔ），３．２（ｔ），２．５（ｍ），１．９（ｓ），１．７（ｍ），１．５（ｍ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ＝１７３．１，５５．２，５３．３，５３．２，５２．７，３９．０，２７．７，２５．８，２４．９，２２．７．ＥＳ／ＭＳ  Ｍ＋＝１１０９．４．
【００５５】
１．３．ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＣＨ３）８＋６ＭｅＩもしくは「Ｇ２（ＭｅＩ）」
【化１１】
2009501245.tif 000015
【００５６】
アシル化第２世代ポリ（プロピレンイミン）デンドリマー（７２５ｍｇ）をメチルアルコール（２ｍＬ）およびヨウ化メチル（４．６ｇ）に溶解した。溶液をアルゴン雰囲気下で５０℃の油浴温度で２０時間攪拌した。揮発性物質の蒸発後に黄色がかった脆性粉末が得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ＝８．０（ｔ），３．９（ｂ），３．７−３．５（ｂ），３．３（ｍ），２．５（ｂ），２．２（ｂ），２．０５（ｂ），２．０（ｓ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ＝１７３．５，６２．８，６１．８，６０．２，５９．８，５０．０，３７．３，２３．９，２３．３，２０．７，１９．３．
【００５７】
１．４．ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＣＨ３）８＋６ＭｅＣｌもしくは「Ｇ２（ＭｅＣｌ）」
【化１２】
2009501245.tif 000016
【００５８】
アシル化およびヨウ化メチル四級化第２世代ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマー（３０９ｍｇ）をメチルアルコール（２ｍＬ）に溶解し、そして水およびメタノールで洗浄したＤｏｗｅｘ  １ｘ８−５０イオン交換樹脂を充填したカラムにかけた。溶出はメチルアルコールで実施した。濾液の蒸発によりＭｅＣｌ−付加物（０．２１ｇ）がもたらされた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ＝３．７（ｂ），３．６−３．４（ｂ），３．３（ｍ），２．４（ｂ），２．０（ｂ），１．９５（ｓ）．
【００５９】
１．５．ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＣＨ３）３２もしくは「Ｇ４」
【化１３】
2009501245.tif 000017
【００６０】
第４世代アミン終端ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマー（２．０２ｇ；０．５７ｍｍｏｌ；ＦＷ＝３５１４ｇ／ｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）およびトリエチルアミン（２．０５ｇ；２０．３ｍｍｏｌ）に溶解した。無水酢酸（２．１５ｇ；２１．０６ｍｍｏｌ）を１分の間滴下して加えた（発熱反応、外部冷却なし）。一晩攪拌した後に、メチルアルコール（２０ｍＬ）を加え、清澄溶液をもたらし、それをさらに３時間攪拌した。溶液を蒸発させ、そしてメチルアルコールで３回ストリッピングした。生成物のメタノール溶液をＤｏｗｅｘ  ５５０Ａ  ＯＨ（２５〜３５メッシュ）イオン交換樹脂の予洗したカラム上で溶出した。溶出液をロータバップ上で蒸発させ、メタノールで繰り返しストリッピングし、そして真空中で乾燥させ、粘性のある油（２．７ｇ）をもたらした。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ＝３．２（ｔ），２．５（ｍ），１．９（ｓ），１．７（ｍ），１．５（ｍ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ＝１７３．０，５３．５−５２．７，３９．０，２７．８，２５．０−２４．５，２２．５．
【００６１】
１．６．ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＣＨ３）３２＋３０ＭｅＩもしくは「Ｇ４（ＭｅＩ）」
【化１４】
2009501245.tif 000018
【００６２】
アシル化第４世代ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマー（ＦＷ＝４８５９ｇ／ｍｏｌ；１．０ｇ；０．２０６ｍｍｏｌ；６．１７ｍｍｏｌ内側第三級アミン）をメチルアルコール（２ｍＬ）およびヨウ化メチル（７ｍＬ）に溶解した。混合物を４５℃の油浴温度で６０時間攪拌した。２層混合物の揮発性物質を蒸発させ、黄色の粉末を生成せしめた。この生成物をメチルアルコールに溶解し、そしてよく攪拌したエーテルにおいて沈殿させた。微分化した黄色の粉末が得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ＝８．２（ｂ），４．１−３．５（ｂ），３．３（ｍ），２．８−２．５（ｂ），２．３−３．１（ｂ），２．０５（ｂ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ＝１７３．５，６１．８，６０．４，５９．７，５１．２，５０．２，３７．５，２３．９，２３．５，２０．５，１９．４．
【００６３】
１．７．ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＣＨ３）３２＋３０ＭｅＣｌもしくは「Ｇ４（ＭｅＣｌ）」
【化１５】
2009501245.tif 000019
【００６４】
アシル化およびヨウ化メチル四級化第４世代ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマーをメチルアルコールに溶解し、そして水およびメタノールで洗浄したＤｏｗｅｘ  １ｘ８−５０イオン交換樹脂を充填したカラムにかけた。溶出はメチルアルコールで実施した。濾液の蒸発によりＭｅＣｌ−付加物がもたらされた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ＝８．３（ｂ），３．９−３．２（ｂ），２．７−２．４（ｂ），２．１−２．０（ｂ），２．０（ｓ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ＝１７３．５，６１．５，６０．４，６０．０，５９．６，４９．９，３７．４，２３．６，２２．９，２０．７，１８．４．
【００６５】
１．８．グリコールガリルクロリド構成単位、Ｃｌ（Ｏ）Ｃ−Ｐｈ（（ＥＯ）４ＯＭｅ）３
【化１６】
2009501245.tif 000020
【００６６】
グリコールガレート（ＨＯＯＣ−Ｐｈ（（ＥＯ）４ＯＭｅ）３）（２．０５ｇ、２．６８ｍｍｏｌ、ＦＷ＝７４１）は、真空中で粉末Ｐ２Ｏ５上で保存した。使用前に、それをトルエンで２回ストリッピングした（共蒸発させた（ｃｏ−ｅｖａｐｏｒａｔｅｄ））。次に、それを６０ｍＬの蒸留ジクロロメタンに溶解し、そして２．８ｍＬの塩化オキサリル、続いて３滴のＤＭＦを加えた。ＩＲ分析は１７１４ｃｍ−１（ＣＯＯＨ基）でピークをまだ示したので、追加分の０．２ｍＬの塩化オキサリルを１時間後に加えた。さらに１０分攪拌することにより酸クロライド（ＩＲ：１７４５ｃｍ−１）への完全な転化が得られた。ロータリーエバポレーター上での溶媒の蒸発およびトルエンでの共蒸発により生成物Ｃｌ（Ｏ）Ｃ−Ｐｈ（（ＥＯ）４ＯＭｅ）３が単離された。それをポリ−（プロピレンイミン）デンドリマーとのカップリング反応においてすぐに使用した。
【００６７】
１．９．ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＰｈ（（ＥＯ）４ＯＭｅ）３）３２もしくは「Ｇ４−ＰＥＧ」
【化１７】
2009501245.tif 000021
【００６８】
第４世代アミン終端ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマー（２７６ｍｇ；ＦＷ＝３５１４ｇ／ｍｏｌ）をトルエンで４回ストリッピングし、そして６ｍＬのジクロロメタンおよび１ｍＬのトリエチルアミンに溶解した。この溶液を６０ｍＬのジクロロメタン中の酸クロライドＣｌ（Ｏ）Ｃ−Ｐｈ（（ＥＯ）４ＯＭｅ）３の溶液（１．１ｅｑ．の酸クロライドを使用した）に３０秒以内に加えた。清澄溶液が生じた。一晩攪拌した後に、３０ｍＬの水および５５０ｍｇのＫＯＨ粉末を加え、そして全混合物を分液漏斗に移した。有機層を分離し、そして水層を５０ｍＬのジクロロメタンで抽出した。合わせたジクロロメタン層を２５ｍＬの水中２００ｍｇのＫＯＨの溶液で、そして次に２回２５ｍＬ分の水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そして濃縮して１．８５ｇの油性生成物を生成せしめた。この生成物をメタノール／水／トリエチルアミン  ５００：６０：１０（ｖ／ｖ／ｖ）で２回、そして最後にメタノール／水  ５００：２５（ｖ／ｖ）で透析した。蒸発、最後のトリエチルアミンを除くためのメタノールでの共蒸発および真空ストーブにおける乾燥後に、わずかに黄色がかった油性生成物が得られた（１．２４ｇ）。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０（ｂｓ），７．１（ｂｓ），４．１（ｂ），４．０（ｂ），３．８−３．４，３．３５（ｓ），３．３（ｓ），２．５−２．２（ｂ），２．０−１．４（ｂ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１６７．１，１５２．３，１４１．０，１２９．７，１０６．８，７２．４，７２．１，７０．８，７０．７，６９．８，６９．０，５８．９，５３−５１（ｂ），３８．６，２７．０，２４．０．
【００６９】
１．１０．ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＰｈ（（ＥＯ）４ＯＭｅ）３）３２＋ＭｅＩもしくは「Ｇ４−ＰＥＧ（ＭｅＩ）」
【化１８】
2009501245.tif 000022
【００７０】
グリコールガレート基で修飾した第４世代ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマー（５９０ｍｇ）を還流冷却器を備えた丸底フラスコにおいて４０〜４５℃（油浴温度）で５ｍＬのメタノールおよび２ｍＬのヨウ化メチル中で４０時間攪拌した。溶液をロータリーエバポレーター上で蒸発させ、そして次に生成物をメタノールで３回ストリッピングした。収量：０．６９ｇの粘性のある黄褐色の油。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ＝７．２（ｂｓ），４．２（ｂ），４．０−３．４，３．３５（ｓ），３．３（ｓ），２．８−２．４（ｂ），２．３−２．１（ｂ）．
【００７１】
１．１１．ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＰｈ（（ＥＯ）４ＯＭｅ）３）３２＋ＭｅＣｌもしくは「Ｇ４−ＰＥＧ（ＭｅＣｌ）」
【化１９】
2009501245.tif 000023
【００７２】
３．０ｇのＤｏｗｅｘ  １Ｘ８−５０（Ａｃｒｏｓ）イオン交換樹脂を有するカラムを脱塩水で、そしてメタノールで洗浄して汚染物質を除いた。ＭｅＩで四級化したグリコールガレート基を有するＧ４−デンドリマー（Ｉ−形態；２９０ｍｇ）を５ｍＬのメタノールに溶解し、そしてカラム上にのせた。画分がシリカ−６０  ＴＬＣプレート上でＵＶ活性を示さなくなるまでメタノールでの溶出を続けた。メタノール溶液をロータバップ上で蒸発させて２４７ｍｇの生成物（粘性のあるわずかに黄色の油）を生成せしめた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝８．５（ｂ），７．３（ｂｓ），４．３−４．１（ｂ），３．９−３．４，３．３５（ｓ），３．３（ｓ），２．８−２．４（ｂ），２．３−２．０（ｂ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１６７．５，１５２．３，１４０．８，１２９．０，１０６．８，７２．３，７１．８，７０．５，６９．６，６９．０，６０．４（ｂ），５８．９，４９．５−４９．０（ｂ），３７．１（ｂ），２２．５（ｂ），１７．２（ｂ）．
【００７３】
１．１２．ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＰｈ（（ＥＯ）４ＯＭｅ）３）６４もしくは「Ｇ５−ＰＥＧ」
【化２０】
2009501245.tif 000024
【００７４】
第５世代アミン終端ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマー（約２０ｗｔ％のメタノールを含有する２５１ｍｇ）をトルエンで３回ストリッピングしてメタノールを除き、そして次にジクロロメタン（４０ｍＬ）とトリエチルアミン（２５０ｍｇ）の混合物に溶解した。強く攪拌したデンドリマー溶液に２０ｍＬにおいて新たに調製した酸クロライド（Ｃｌ（Ｏ）Ｃ−Ｐｈ（（ＥＯ）４ＯＭｅ）３；第一級アミン当たり１．２ｅｑ．）を１分の間加えた。溶液はすぐに混濁した。アルゴン雰囲気下で一晩攪拌した後に、混合物をロータバップ上で濃縮した。生成物を水（５ｍＬ）および水酸化ナトリウム溶液（５ｍＬの水中３００ｍｇ）に溶解した。ＭｅＯＨ／水／トリエチルアミン（４００／４０／４０ｍＬ）に対する、そして次にＭｅＯＨ／水（５００／５０ｍＬ）に対する透析により精製を行った。蒸発および乾燥（オイルポンプ）により１．４４ｇの油性生成物がもたらされた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝８．２（ｂ），７．１（ｂｓ），４．１（ｂ），３．９（ｂ），３．８−３．４，３．３５（ｓ），３．３（ｓ），２．５−２．３（ｂ），１．８−１．３（ｂ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１６７．１，１５２．３，１４１．０，１２９．７，１０６．８，７３−６８，５９，５３−５１，３８．９，２７．０，２４．０．
【００７５】
１．１２．ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＰｈ（（ＥＯ）４ＯＭｅ）３）６４＋６２ＭｅＩもしくは「Ｇ５−ＰＥＧ（ＭｅＩ）」
【化２１】
2009501245.tif 000025
【００７６】
グリコールガレート基で修飾した第５世代ポリ−（プロピレンイミン）デンドリマー（１５０ｍｇ）を２ｍＬのメタノールに溶解した。メチルアルコール（０．５ｍＬ）中のヨウ化メチル（３６０ｍｇ）の溶液を加え、そして得られる混合物を不活性アルゴン雰囲気下で４０℃（油浴の温度）で２０時間攪拌した。揮発性物質をロータバップ上で蒸発させ、黄褐色の生成物をもたらした。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ＝７．３（ｂｓ），４．３（ｂ），３．８−３．４，３．３５（ｓ），３．３（ｓ），２．８−２．４（ｂ），２．３−２．１（ｂ）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ＝１６８．９，１５３．７，１４２．２，１３０．３，１０７．９，７３．７−７１．３，６１．８−６０．０（ｂ），５９．２，５０．７（ｂ），３８．５（ｂ），２４．２（ｂ），１９．５（ｂ）．
【００７７】
２．水性混合物における１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ  ＮＭＲおよびＳＥＣを使用する安定性測定
デンドリマーをＤ２Ｏに溶解し、そして溶液をＮＭＲチューブに移した。チューブを３５〜３９℃の間に保った油浴中に４日間置いた。毎日１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを記録し、この４日の前および後に１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを取った。ｐＨ値もまた測定中に記録し：ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＣＨ３）８は塩基性のままであり（ｐＨ＝約９）、ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＣＨ３）３２＋３０ＭｅＩは酸性のままであり（ｐＨ＝約２）、そしてＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＣＨ３）８＋ＭｅＣｌは測定中わずかに酸性のままであり（ｐＨ＝約５〜６）、一方、ＤＡＢ−ｄｅｎｄｒ−（ＮＨＣＯＣＨ３）８＋ＭｅＩはわずかに酸性（ｐＨ＝約５〜６）からより酸性（ｐＨ＝約２）まで進展した。ヨウ化メチル四級化デンドリマーを含有する溶液の酸性度は、おそらくＭｅＯＨ／ＭｅＩにおける四級化方法の間に形成したいくらかのＨＩの存在によりもたらされる。溶液のｐＨは、単に一般的なｐＨ指示紙を用いることにより毎日評価した。ＳＥＣ測定には、同様の方法を適用した。水中０．１Ｍのクエン酸および０．０５％のアジ化ナトリウムの溶離剤の０．５ｍＬ／分の流量を適用して、ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＰＸｘ１カラムを使用し；ＲＩ検出を用いた。
【００７８】
３．ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を使用するデンドリマーおよびＤＮＡの結合実験
ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ３  Ｃｅｌｌを用いてＰＡＧＥを実施した。５．７ｍＬの３０％アクリルアミドおよび２．６７％ビス−アクリルアミド溶液を１．０ｍＬのバッファー溶液（１０ｘ）、３．３ｍＬのＨ２Ｏ、そして間隔をあけたガラスプレート間にゲルを流し込む直前に、６０μＬの新しく作った１０％過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）溶液および１０μＬのＴＥＭＥＤと混合することにより１７％の架橋密度のミニゲルを調製した。ｐＨ＝４．４のゲルには、倍量のＴＥＭＥＤおよびＡＰＳ溶液を適用した。ゲルを泳動する前に、溶液を少なくとも１時間ゲル化させた。全ての場合において、１８ＭΩ水を使用した。
【００７９】
１リットル当たり１０８グラムのＴｒｉｓ（８９０ｍＭ）、５５グラムのＨ３ＢＯ３（８９０ｍＭ）および７．５グラムのＥＤＴＡ（２０ｍＭ）を含有するＴｒｉｓ／ホウ酸／ＥＤＴＡバッファー（ＴＢＥバッファー；１０ｘ）を７のｐＨで行う実験において使用した。ｐＨ＝４．４での測定には、リットル（１０ｘ）当たり１２グラムの酢酸（１９７ｍＭ）および７１．２グラムのβ−アラニン（８００ｍＭ）を含有するβ−アラニン／酢酸バッファーを用いた。ローディングバッファーは、０．２ｍＬのＨ２Ｏ中１％ブロモフェノールブルー溶液、２５ｍＬのバッファー（１ｘ）および１５ｍＬのグリセロールを含有した。ローディングサンプルは、適切に選択した容量の水中のＤＮＡ溶液、水中のデンドリマー溶液およびローディングバッファー溶液からなった。レーン当たりのＤＮＡ量が約０．４μｇであるように（他に記載されない限り）、そしてデンドリマー／ＤＮＡ電荷比（ＣＲ）が様々な調べたデンドリマー／ＤＮＡの組み合わせについて約２：１、３：２、１：１もしくは１：２であるように、ゲル上の全てのレーンに１０μＬもしくは１２．５μＬのローディングサンプルを載せた。電荷比は、デンドリマーにおける正電荷の量（すなわち、デンドリマーにおける第三級および第四級アミンの総量）をＤＮＡにおけるリン酸基の量で割ることにより計算した。使用したＤＮＡは、一本鎖非標識３３ｍｅｒであった。全てのゲル上で、基準として、１レーンを非標識ｓｓ−ＤＮＡ用に、そして１レーンをＦＩＴＣで標識したｓｓ−ＤＮＡ  ３３ｍｅｒとこのｓｓ−ＤＮＡ  ３３ｍｅｒとの混合物用に用意した。いくつかのレーンは使用しなかった。
【００８０】
ミニゲルを２００ボルトの電圧で約４５分間泳動した。標準的なＢＩＯＲＡＤキットおよび標準的なＢＩＯＲＡＤプロトコルでのＡｇ染色を用いてゲルを発色させた。全ての場合において、わずかに褐色のバックグラウンド上の白線が得られ；白色もしくは灰色がかったバックグラウンド上の黒線が得られるようにゲルの全ての写真のコントラストおよび明るさを操作した。
【００８１】
図Ａにおいて、ｐＨ＝７でのＤＮＡザイム３３ｍｅｒとデンドリマーＧ２（ＭｅＣｌ）、Ｇ４（ＭｅＩ）、Ｇ４−ＰＥＧ（ＭｅＣｌ）、Ｇ５−ＰＥＧおよびＧ５−ＰＥＧ（ＭｅＩ）との結合能力を評価することができる。
【００８２】
図Ｂにおいて、ｐＨ＝７での濃度結合研究を示し；デンドリマーＧ４−ＰＥＧ（ＭｅＩ）の示した電荷比を用いて、ＤＮＡ量は（１２．５マイクロリットルのローディング容量で）レーン当たり０．１から０．２まで０．４まで０．８マイクログラムまで増加する。
【００８３】
４．細胞、動物および材料
以下の全てヒトの細胞系を本研究において使用し：乳癌ＭＣＦ７細胞系および悪性黒色腫Ｍａｌｍｅ−３Ｍ細胞系は、両方ともダルベッコの最小必須培地において培養した。卵巣癌Ａ２７８０細胞系、結腸直腸腺癌細胞系ＨＴ２９および白血病細胞系Ｋ５６２−Ｃ１０００は、ＲＰＭＩ１６４０において培養した。これらの培養培地に５％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミンを補足した。ＭＣＦ７細胞培養培地およびＭａｌｍｅ−３Ｍ培養培地にもまた１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補足した。細胞を５％ＣＯ２で加湿インキュベーターにおいて３７℃で培養した。全ての培地および補足物は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）から購入した。
【００８４】
オスＮＭＲＩマウスをＪａｎｖｉｅｒ（Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓｔ−Ｉｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。全ての動物実験は、動物倫理委員会の承認を得て実施した。従った倫理指針は、ＵＫＣＣＣＲ指針により必要とされる基準を満たした。
【００８５】
ｘ＝３’ｄＧ５’を有する５’−フルオレセイン標識および非標識ｓｓ−ＤＮＡザイム３３ｍｅｒ（５’―標識−ＴＧＡＧＧＧＧＣＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＣＧＴＣＧＣＧＧｘ−３’）は、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（Ｓｅｒａｉｎｇ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入した。安定性を向上するために、３’−３’グアニンインバージョンを３’末端で導入した。
【００８６】
５．修飾ＰＰＩ−デンドリマーの細胞毒性
異なる世代の修飾ＰＰＩ−デンドリマー（Ｇ２、Ｇ２（ＭｅＩ）およびＧ２（ＭｅＣｌ）、Ｇ４、Ｇ４（ＭｅＩ）およびＧ４（ＭｅＣｌ）ならびにＧ５−ＰＥＧおよびＧ５−ＰＥＧ（ＭｅＩ））の毒性をＭＴＴ試験を用いて４つの細胞系（Ｍａｌｍｅ−３Ｍ、Ｋ５６２、ＨＴ２９およびＭＣＦ７）上でプロファイリングした。細胞をトランスフェクションの２４時間前に９６ウェルプレートにおいて２０００細胞／ウェルで平板培養する細胞毒性アッセイをこの目的のために使用した。デンドリマーをデンドリマーの世代により様々な濃度で細胞に加えた。第２世代デンドリマーは、５００μＭ〜１μＭの間の濃度で加えた。第４および第５世代デンドリマーは、それぞれ、１００μＭ〜０．２μＭおよび１２．５μＭ〜５０ｎＭの間の濃度で加えた。細胞をデンドリマーで４時間処理し、そして次に完全培地を新たに補給し、そしてさらに４日間インキュベーションした。このインキュベーション期間の後に、生細胞にのみ存在するミトコンドリアデヒドロゲナーゼ酵素について細胞を調べた。存在する場合、加えた黄色のＭＴＴ塩は酵素により還元されて青色のホルマザン結晶を形成し、それはＤＭＳＯに溶解しそして分光光度計（５４０ｎｍでλｍａｘ）を用いて測定することができる。次に、見出された吸収を同じ実験方法を行うがデンドリマーで未処理である細胞の吸収で割り、全ての図に示されるコントロールに対するＭＴＴ生存能力を与える。
【００８７】
一連の修飾第４世代ＰＰＩ−デンドリマーの細胞毒性をより詳細に調べる場合にもまた、ＭＴＴプロトコルに従った。濃度範囲（１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭから２０μＭまで）を用いて、増加する量の血清（１０％、２０％、３０％、４０％）も調べながら、四級化（ＭｅＩもしくはＭｅＣｌで）もしくは非四級化のいずれかの、アセチル化もしくはＰＥＧ化デンドリマーを試験した。これらのＭＴＴ試験は、我々の部門におけるインビボモデルとしてのそれらの適合性のために選択したＡ２７８０細胞上で行った。
【００８８】
６．蛍光標識したＤＮＡザイムのインビトロ送達
トランスフェクション剤として第４世代デンドリマーを用いてＦＩＴＣ標識したＤＮＡザイムの細胞の取り込みを決定するために蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析を行った。トランスフェクションの２４ｈ前に２＊１０Ｅ＋６のＡ２７８０細胞／ウェルを６ウェルプレートに接種した。デンドリマーおよびＤＮＡザイムを両方とも１μＭの最終濃度に培養培地において希釈し、複合体形成の際に約１の電荷比をもたらす。１５分のインキュベーション期間は、２つの成分の複合体形成を可能にした。次に複合体を細胞に加え、そして４時間のインキュベーション後に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理により集め、ＦＡＣＳバッファーおよびＣｅｌｌ  Ｓｃｒｕｂバッファー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）において２回洗浄した。死細胞の量比を決定するためにヨウ化プロピジウムを２０μｇ／ｍｌの最終濃度で各サンプルに加えた。最後に、細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）によりＤＮＡザイムの取り込みについて分析した。細胞の自己蛍光を決定するために非トランスフェクション細胞をベースラインコントロールとして適用した。ＤＮＡザイム単独で処理した細胞を陰性コントロールとして適用した。従って、自己蛍光およびＤＮＡザイム単独によるトランスフェクションは、全ての図におけるトランスフェクション効率の値において説明される。
【００８９】
７．蛍光標識したＤＮＡザイムのインビボ送達
７．１．顕微鏡検査
蛍光標識したＤＮＡザイムのインビボ腫瘍送達を調べるために全身撮像（ＷＢＩ）システムを用いた。この撮像システムは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（励起：４８５〜５０１ｎｍ；発光：５１０ｎｍ）および赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）（励起：５４０〜５５２ｎｍ；発光：５６８〜６４３ｎｍ）フィルターセットを備えた蛍光実体顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）ＳＺＸ１２からなる（詳細は：Ｂａｋｋｅｒ  Ａ，Ｆｌｏｒｅｎ  Ｗ，Ｖｏｅｔｅｎ  Ｊ，Ｊａｎｓｓｅｎｓ  Ｂ，Ｓｍｅｔｓ  Ｇ，Ｗｏｕｔｅｒｓ  Ｗ  ａｎｄ  Ｊａｎｉｃｏｔ  Ｍ（２００１）Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｈｏｌｅ  ｂｏｄｙ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ＧＦＰ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ａｎｉｍａｌｓ．Ｇ．Ｉ．Ｔ．Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ０３／２００１：５２−５４を参照）。（Ｊａｉ）ＣＶ−Ｍ９０  ３−ＣＣＤ  ＲＧＢカラーカメラを用いて１／６０秒で画像（７５２ｘ５８２画素）を取得し、そしてＩＭＡＱ  ＶｉｓｉｏｎソフトウェアコンポーネントおよびＬａｂＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に基づく組織内で開発したアプリケーションソフトウェアを用いて分析した。
【００９０】
細胞内ＤＮＡザイム送達は、蛍光顕微鏡検査を用いて腫瘍切片上で調べた。簡潔に言えば、各動物実験の最後に、蛍光性腫瘍を摘出し、凍結固定し、そして切片にした。１２μｍの切片をＡｘｉｏＣａｍ  ＨＲ（Ｚｅｉｓｓ）ＣＣＤカメラに連結したＡｘｉｏＰｌａｎ２（Ｚｅｉｓｓ）蛍光顕微鏡を用いて観察し、そして高解像度画像（１３００ｘ１０３０画素）を取り込み、そしてＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を用いてさらに分析した。ＦＩＴＣ（緑色）標識したＤＮＡザイムの細胞内分布は、核色素ＴＯＰＲＯ３（赤色）を用いて調べた。β−アクチン染色は、ｂｏｄｉｐｙファロイジン（青色）を用いて得られた。
【００９１】
７．２．インビボでのＤＮＡザイム投与
オスＮＭＲＩマウスに２６ＧＡ注射器（ＢＤ、２６ＧＡ  ３／８  １ｍｌ）を用いて１０７のＡ２７８０卵巣癌細胞／２００μｌ無血清培地を鼠径部に注射した。１４日後に腫瘍はＷＢＩ測定に適当なサイズに達した。マウスの第一群のうち、コントロールマウス（ｎ＝５）を１ｍｇのＦＩＴＣ結合ｃ−ｍｙｃ  ＤＮＡザイム（ＦＩＴＣ−ＤＮＡザイム）でＩｖ．処理し、一方、１のＣＲ（すなわち、マウスにおける約２ｍＬの血液容量への希釈を仮定する場合に、マウスにおける５０μＭのＤＮＡおよびデンドリマーの最終濃度）をもたらす１ｍｇのＦＩＴＣ−ＤＮＡザイムおよび約３ｍｇのＧ４−ＰＥＧ（ＭｅＩ）を含有するデンドリマー−ＤＮＡザイム複合体製剤で試験マウス（ｎ＝５）を処理した。静脈内（ｉ．ｖ．）注射は、〜２００μｌ／１０秒の注入速度で尾静脈を介して与えた。マウス（ｎ＝１０）を４５’（分）で殺し、そして腫瘍をＴｉｓｓｕｅＴｅｋ（Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）においてすぐに凍結固定した。これらの処理したマウス（ｎ＝１０）に加えて、数匹の未処理のマウスを陰性コントロールとして用いた。マウスの第二群（ｎ＝１０）に同じＤＮＡザイム−デンドリマー複合体を注射し、そしてＷＢＩを用いて腫瘍における蛍光について２４ｈの期間の後に調べた。２４ｈ後にこの第二群のマウスを殺し、そして内部を蛍光について調べた。ｉ．ｖ．注射後のＤＮＡザイムクリアランスは、注射後５’（分）、１５’、３０’および４５’で（第一群のマウスについて）そして２４時間で（第二群のマウスについて）ＷＢＩによりモニターした。
【００９２】
結果および説明
１．核酸の樹状トランスフェクション剤の合成および特性化
ポリ（プロピレンイミン）トランスフェクション剤の合成を第２世代デンドリマーの転化段階を説明する図２において要約する。他の世代のＰＰＩ−デンドリマーは、同様にして転化した。第一段階において、第一級アミン末端基を活性化カルボン酸誘導体「ＲＣＯＯＨ」（無水酢酸もしくはガリルクロリド誘導体のいずれかがここでは使用されている；他のタイプの活性化カルボン酸もまた可能である、例えばＫｒｅｉｄｅｒ  ＪＬ  ｅｔ  ａｌ．２００１を参照）との反応によりアミド化する。第二段階において、内側第三級アミンをヨウ化メチルとの反応により四級化する。第三段階において、ヨウ化物対アニオンをクロライドと交換する。
【００９３】
全ての製造したデンドリマーは水およびアルコールに可溶性であり、そしてそれらの大部分はまたクロロホルムのようなより無極性の溶媒にも可溶性である。記録された１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲデータは、指定構造と一致する。ＣＤＣｌ３においてそしてＣＤ３ＯＤにおいて、デンドリマー内部からの全てのプロトンおよび炭素は、特により高い世代のデンドリマーについて、かなりブロードである。メチル化（四級化）の際に、第三級アミンに隣接するメチレンプロトンからの２．２〜２．５ｐｐｍ辺りのブロードなシグナルは、アセチル化デンドリマーについては３．５〜４．０ｐｐｍにそしてＰＥＧ化デンドリマーについては約２．７〜２．９ｐｐｍにシフトする。１３Ｃ  ＮＭＲにおいて、これらのメチレン炭素は約５０〜５５ｐｐｍから約６０ｐｐｍにシフトし、一方、導入したメチル基について余分のシグナルが約５０ｐｐｍに現れることが両方のタイプのデンドリマーについて見られる。Ｄ２Ｏにおいて、第三級もしくは第四級アミンに隣接するメチレンのシグナルは、それほどブロードでない。全てのＮＭＲデータは、他の四級化デンドリマーに関する前に報告された結果と一致する。
【００９４】
ＮＭＲデータは四級化がかなり進行していることを証明するが、それらはメチル化が完全に起こっていることを証明せず、すなわち、必ずしも全ての第三級アミンが四級化カチオン性部位に転化されているとは限らないことに留意すべきである。より低い世代の非四級化デンドリマーに関する質量データを取得することは可能であるが、四級化デンドリマーのＭＳ分析は、おそらく樹状分子上の多数の電荷のために、これまでのところうまくいっていない。便宜上、本書類における全ての描画構造は完全なすべてメチル化された種である（図２）。
【００９５】
最終特性化手段として、高分子の分子量（分布）を調べるために用いられる技術、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて製造したデンドリマーを分析することが可能である。ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＰＷｘ１カラムを適用し、そして最適なｐＨで水性溶離剤（例えば、より低いｐＨ値で０．１Ｍクエン酸バッファー）を用いて、非四級化および四級化の両方の全ての製造したＰＰＩ−デンドリマーを分析することができる。この技術は、製造したデンドリマーの安定性を評価するために適用されている（次の節を参照）。
【００９６】
２．水における修飾ＰＰＩ−デンドリマーの安定性
設計しそして製造したデンドリマーは、生理的条件下でのそれらの安定性が保証される場合に限りトランスフェクション剤として有用であることができる。従って、約３７℃で４日間保ったこれらのデンドリマーのＤ２Ｏ溶液の１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを毎日モニターすることによりデンドリマーのセレクションを試験した。スペクトルを第２世代デンドリマーＧ２、Ｇ２（ＭｅＩ）およびＧ２（ＭｅＣｌ）、ならびに第４世代デンドリマーＧ４（ＭｅＩ）について記録した。全てのデンドリマーは、４日の試験期間の前、間そして後に同様のスペクトル特性を示し、従って、デンドリマーの有意な加水分解は模擬生理的条件下で示されない。
【００９７】
（四級化）デンドリマーの安定性に関するさらに強い証拠は、ＳＥＣを適用して第４世代デンドリマーＧ４−ＰＥＧおよびＧ４−ＰＥＧ（ＭｅＣｌ）の３７℃で保った水溶液をモニターすることにより得られた。全てのＳＥＣデータを図３において説明する。数日の実験中に、サンプルのＳＥＣクロマトグラムはそれらの形状を全く変えず、従って、形成されるより低い分子量の物質をもたらすはずである分解の証拠は見出されなかった。ＳＥＣトレースは、クロマトグラムのより高い分子量（左）側でショルダーを示す。おそらく、このショルダーは限られた量の二量化デンドリマー種の存在を表す。ショルダーはまた、合成の出発点である第４世代アミン終端デンドリマーのＳＥＣにも存在することに留意すべきである。
【００９８】
３．ＰＡＧＥを用いるデンドリマー−ＤＮＡザイム結合実験
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）は、タンパク質および核酸の分析において頻繁に用いられる技術である。研究中の種の溶出は、そのサイズにそしてその電荷により決まる。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ゲルバッファーへのドデシル硫酸ナトリウムの添加）は、（非フォールディング）タンパク質の分子量を評価するために適用される。
【００９９】
ここでは、ＤＮＡザイム分子へのいくつかのポリ（プロピレンイミン）デンドリマー構造の結合特性を調べるためにＰＡＧＥを行った（詳細は実験の節を参照）。溶出および染色後に遊離のＤＮＡザイムはゲル上の単一バンドとして現れる。別の種とＤＮＡザイムとの混合の際に結合が起こる場合、混合物中のＤＮＡザイムの溶出挙動は、ＤＮＡ種の容量および／もしくは電荷が変化しているので、遊離のＤＮＡザイムのものと比較して変わる。これは同じ位置のしかしより低い強度（ＤＮＡの一部が複合体形成している）を有するＤＮＡバンド、ゲル上の別の位置のバンドもしくはバンドの完全な消失をもたらす。製造したデンドリマーのセットの結合能力を評価するために、ＤＮＡザイムおよびデンドリマーを異なる電荷比で混合し、ここで、電荷比はＤＮＡ上の負に荷電したリン酸基の数で割ったデンドリマーにおける第三級＋第四級アミンの数として定義される。
【０１００】
表２に示す異なるデンドリマーとＤＮＡザイム分子との結合を調べた。ここで、結果を説明するために３枚のゲルを選択しそして以下の図４に示す；ゲルは、ｐＨ＝７のＴＢＥバッファーにおいて調製しそして泳動した。補足情報において、より多くの記録したＰＡＧＥゲルを収集する。
【０１０１】
ゲルＡは、アシル化およびヨウ化メチル四級化デンドリマーＧ２（ＭｅＩ）とＧ４（ＭｅＩ）間の比較を示す。明らかに、第４世代デンドリマーは、調べた濃度で結合を誘導するように思われない第２世代対応物よりよくＤＮＡザイムに結合する。この結果は、Ｇ４（ＭｅＩ）デンドリマーが分子当たり２倍のカチオン性部位を保有し（１４に対して３０）、従って、その設計はＤＮＡザイムにおける３３の負電荷により整合することにより説明することができる。ゲルＢは、四級化される（Ｇ４（ＭｅＣｌ））かもしくはされない（Ｇ４）アシル化第４世代デンドリマーを比較する。両方のデンドリマーはかなり効果的にＤＮＡザイムに結合することができるが、四級化Ｇ４（ＭｅＣｌ）種は、１／２デンドリマー−ＤＮＡ電荷比でさえほとんど全てのＤＮＡが結合しているので、より強力である。最後に、ゲルＣは、四級化される（Ｇ４−ＰＥＧ（ＭｅＩ））かもしくはされない（Ｇ４−ＰＥＧ）グリコールガレート修飾第４世代デンドリマーを比較する。同様に、四級化種はＤＮＡザイムによりよく結合することは明らかであるが、効果的にＤＮＡザイムを結合するためにより高過剰のＰＥＧ化デンドリマーが必要であるので、これらの結果はまた、アシル化Ｇ４−デンドリマー（ゲルＢ参照）がＰＥＧ化Ｇ４−デンドリマーよりＤＮＡへの優れた結合を与えることも示す。
【０１０２】
酢酸／β−アラニンバッファーを用いる４．４のｐＨ値でのデンドリマーの結合特性もまた調べた（ゲルは示さない）。ｐＨ＝７での測定と比較して、調べた非四級化デンドリマーはよりよく結合するように思われ、一方、四級化デンドリマーはいくらかより少ない程度にＤＮＡに結合する。この結果は、より低いｐＨ値での非四級化デンドリマーのプロトン化により説明することができ、従って、これらのデンドリマーもまたそれらの内側に多数のカチオン性部位を有し、ＤＮＡザイムへの結合を促進する。
【０１０３】
最後に、Ｇ４−ＰＥＧ（ＭｅＩ）を濃度範囲結合研究に選択した。１２．５マイクロリットル中０．１、０．２、０．４、０．８および１．６マイクログラムのレーン当たりのＤＮＡ量を用い、一方、電荷比を２：１から３：２まで１：１まで変えた（過剰のデンドリマー）。当然、ＰＡＧＥ研究は、より低い濃度で結合が減少されることを示し：０．１マイクログラムの量でＤＮＡはほとんど完全に結合しておらず、一方、０．８マイクログラム以上の量で全てのＤＮＡは１：１の最も低い電荷比でさえ結合している（この濃度結合研究の得られるＰＡＧＥゲルについては補足情報を参照）。
【０１０４】
これらの結果は、それらの内側に多数のカチオン性部位を有する合成したデンドリマーがｍＬ当たり約４０マイクログラムのＤＮＡの濃度で（約４μＭのモル濃度に対応する）そして約２：１〜１：１（わずかに過剰のデンドリマー）の電荷比でｓｓ−ＤＮＡザイム３３−オリゴマーに結合できることを示す。文献に報告されるトランスフェクション剤は、通常、ＤＮＡゲストとの効率のよい複合体形成を可能にするためにより高い濃度および／もしくはより高い電荷比を必要とする（例えばＨａｅｎｓｌｅｒ  Ｊ  １９９３を参照、ここで、いくつかの結合試験は２００μｇ／ｍＬのＤＮＡ濃度で実施されている）。さらに、Ｇ４−ＰＥＧ（ＭｅＩ）種に関する濃度範囲結合研究は、デンドリマーとＤＮＡザイム間の結合が可逆的であり、複合体の解離およびＤＮＡザイムの遊離を可能にすることを示す。
【０１０５】
５．修飾ＰＰＩ−デンドリマーのインビトロ毒性
遺伝子トランスフェクション剤としてのそれらの適合性を評価するために、修飾ＰＰＩ−デンドリマーのセレクションの毒性をＭＴＴ試験を用いて４つの異なる細胞系、ＭＣＦ７、Ｍａｌｍｅ−３Ｍ、ＨＴ２９およびＫ５６２−Ｃ１０００上で調べた。第２世代アシル化デンドリマーＧ２、Ｇ２（ＭｅＩ）およびＧ２（ＭｅＣｌ）は、１００μＭの濃度未満で４つ全ての細胞系に毒性を及ぼさず、一方、第４世代アシル化デンドリマーＧ４、Ｇ４（ＭｅＩ）およびＧ４（ＭｅＣｌ）は、これらの細胞に２０μＭのレベル未満で毒性の徴候を示さない。最後に、第５世代デンドリマーＧ５−ＰＥＧおよびＧ５−ＰＥＧ（ＭｅＩ）は、調べた最も高いレベル（２．５μＭ）で非毒性である。これらの濃度は、それぞれの第２、第４および第５世代デンドリマーでの標準的なインビトロトランスフェクション実験に使用したレベルより２０、２０そして５倍高い。
【０１０６】
第４世代デンドリマーはそれらの第２世代対応物より効果的にＤＮＡザイムに結合することが見出されているので（上記のＰＡＧＥ試験を参照）、第４世代デンドリマーの毒性を特に調べた。６つの調べたデンドリマー（すなわち、Ｇ４、Ｇ４（ＭｅＩ）、Ｇ４（ＭｅＣｌ）、Ｇ４−ＰＥＧ、Ｇ４−ＰＥＧ（ＭｅＩ）およびＧ４−ＰＥＧ（ＭｅＣｌ））の各々について、様々なデンドリマー（１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭおよび２０μＭ）および血清濃度（１０％、２０％、３０％および４０％のウシ胎仔血清）を適用しながら、ＭＴＴ試験を用いて細胞毒性を評価した。図５に示されるように、１〜５μＭの濃度で、６つ全てのデンドリマーは特定の毒性を及ぼさず、そして＞７０％の細胞が４日の処理後に生存する。しかしながら、より高い濃度で、特にＧ４−ＰＥＧ（ＭｅＩ）は、細胞生存率が明らかに５０％未満に減少するので明確な毒性を示す。他のデンドリマーはそれでも１０μＭの濃度で約３０％の低い細胞死、そして２０μＭで３０〜６０％の部分的毒性を示す。Ｇ４−ＰＥＧ（ＭｅＣｌ）は、２０μＭのレベルでさえその低い毒性を保持する。図６は、デンドリマーごとに分類したそしてより高い濃度で増加した毒性を示す、他の方法における同じＭＴＴ試験データを表す。１０％の血清レベルを図５および図６に示すデータにおいて使用した。
【０１０７】
６つのＧ４−デンドリマーの各々はまた、１０％〜４０％のレベルを適用する、血清の増加する量の存在下でその毒性について試験した。全てのデンドリマーは、より高い量の血清を使用する場合により低い細胞毒性を及ぼす（図７）。驚くべきことに、２０％〜４０％の血清を使用する場合、デンドリマーの毒性は使用する濃度に（ほとんど）依存しないように思われ；２０μＭのレベルでさえ、細胞生存は、１０μＭを上回る濃度で有毒になるデンドリマーＧ４−ＰＥＧ（ＭｅＩ）を除いて、全てのデンドリマーについて明らかに５０％を上回る。
【０１０８】
ほとんど全ての設計しそして製造したＰＰＩ−デンドリマーは、低レベルの毒性を示すことが本明細書に記述するＭＴＴ毒性試験から結論付けることができる。低い毒性もしくは毒性がないことは、特に遺伝子治療において、ヒトでの成功した使用のための必須条件であるので、本発明の化合物のこの特性は非常に重要である。四級化デンドリマーにおける対アニオンは種の毒性をある程度決定するかもしれず、そしてヨウ化物の代わりにクロライド対アニオンを使用することは好ましいように思われる。
【０１０９】
６．修飾Ｇ４  ＰＰＩ−デンドリマーを使用するＤＮＡザイムのインビトロトランスフェクション
送達剤として第４世代修飾ＰＰＩ−デンドリマーを用いるＤＮＡザイムのトランスフェクションをＦＡＣＳ分析を適用してＡ２７８０卵巣癌細胞上で調べた。低レベルの毒性のままであるように（上記に提示するＭＴＴ毒性試験を参照）、そしてＤＮＡとデンドリマー間の結合が予想される濃度範囲にとどまるように（上記に提示するＰＡＧＥ結合試験を参照）ＣＲ＝１のデンドリマー−ＤＮＡザイム電荷比および１μＭの濃度を全てのトランスフェクション試験において使用する。インビボ条件を模倣するために培地中の血清の増加するレベルを調べた（１０％、２０％、３０％および４０％のＦＣＳ）。
【０１１０】
６つ全てのデンドリマーは通常は８０％を上回る高いトランスフェクション効率を示し、アセチル化四級化デンドリマーＧ４（ＭｅＩ）およびＧ４（ＭｅＣｌ）は最もよい結果を示す（図８）。驚くべきことに、ＰＥＧ化デンドリマーの種類において（図８Ｂ）、非四級化系Ｇ４−ＰＥＧを四級化系Ｇ４−ＰＥＧ（ＭｅＩ）およびＧ４−ＰＥＧ（ＭｅＣｌ）と比較する場合に効率の違いがほとんどない。最後に、トランスフェクション試験は、培地中の血清の量がインビトロ送達の効率にほとんど影響を及ぼさないことを示す。遊離のＤＮＡザイム（すなわち、デンドリマートランスフェクション剤を使用しない）は、コントロール実験において確定されるように、５〜１０％のみの効率でトランスフェクションする。毒性試験の確認において、ヨウ化プロピジウム染色により明らかなように、約１５％の細胞毒性がこれらのインビトロ送達試験において見出された。
【０１１１】
デンドリマー系について見出されたトランスフェクション効率は、カチオン性リポソームトランスフェクション剤、ＤＯＴＡＰＲ（ＲｏｃｈｅＣ）を使用する場合に（ＭＷ＝約７００）同じ設定において見出されるものと同様である。しかしながら、このリポソームは分子当たり１個の負電荷を中和することができるだけであり、従って、１のＣＲに達するために必要な量は、トランスフェクションミックスの毒性が高いほどである。最終的に、ＤＯＴＡＰ送達方法の使用は、インビボで使用不可能であるように思われる。
【０１１２】
７．修飾Ｇ４  ＰＰＩ−デンドリマーを用いるＤＮＡザイムのインビボ送達
本明細書に提示する予備インビボ実験は、Ｇ４−ＰＥＧ（ＭｅＩ）デンドリマーを用いて実施した。最も納得のいくインビトロトランスフェクション能力を示すアセチル化四級化デンドリマーＧ４（ＭｅＩ）およびＧ４（ＭｅＣｌ）は、インビボ研究用のサンプルを調製するために必要とされる濃度でＤＮＡザイムと混合した場合に不溶性沈殿物を生成するので（例えば、Ｇ４（ＭｅＩ）およびＤＮＡザイムは、上記の結合、毒性もしくはインビトロトランスフェクション試験において使用したものよりはるかに高い濃度、約７００μＭの濃度で混合した場合に白色の沈殿物を与える）、それらはこの目的のためには却下された。
【０１１３】
マウスをデンドリマー／ＦＩＴＣ標識したＤＮＡザイム複合体で静脈内処理した後に、全身撮像（ＷＢＩ）を用いて蛍光を視覚化した。５分後に蛍光は体のあらゆる所で可視である。４５’後に、蛍光は死後解剖後に視覚化されたように十二指腸の始まりにおいて局所的に蓄積していたが、蛍光はＷＢＩを用いて５匹のマウスのうち３匹においてもはや外的に検出可能ではない。しかしながら、５匹のマウスのうち２匹は、腫瘍の近くに弱い外的に可視の蛍光を示す。ＷＢＩで認められる蛍光が実際に細胞内共局在化しているかどうかを決定するためにこれら２つのサンプルを共焦点顕微鏡検査を用いて分析した。注射後２４ｈで蛍光は死後に外的にも内的にも見ることはできない。
【０１１４】
ＦＩＴＣ標識の外的に可視の蓄積を示す２つのサンプルにおいて、腫瘍を切片にし、そして切片を共焦点顕微鏡検査によって分析することにより組織におけるＦＩＴＣ標識の強いまだら様蓄積がもたらされる。このまだら様パターンのそして核における大きい蓄積の理由はまだ不明である。ＦＩＴＣ標識が核に存在することを示唆するＴＯＰＲＯ３（赤色）色素との高い共局在化がある。追加の染色（Ｂｏｄｉｐｓｙファロイジン（青色））は、細胞のβ−アクチンレベルを観察するために行った。
【０１１５】
処理したマウスから摘出した腫瘍より調製した切片において、大きな腔様の穴が見られ、そして蓄積したＦＩＴＣ標識の大部分の近くに存在するように見える。未処理のマウスからの腫瘍より得られる切片は、これらの腔様構造を有さなかった。これらの腔がどのようにしてそしてなぜ存在するかに関してもまた、まだ不明である。それらがオリゴＤＮＡのトラップとして働くかどうかまたはそれらがデンドリマー−ＤＮＡザイム複合体もしくはいったん分離した複合体の一部（デンドリマー単独）により生み出されるかどうかは、さらなる研究を必要とする。未処理のサンプルは、核の周囲にはるかに良いβ−アクチン染色を有する。しかしながら、これは処理したサンプルにおいてＦＩＴＣ標識を含有する領域ではほとんど検出できない。
【０１１６】
結論
転写後遺伝子抑制の分野は新規の追加プレーヤーｅ．ａ．低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡおよびミクロ（ｍｉ）ＲＮＡとともに絶えず進歩しているので、薬剤送達の分野はオリゴヌクレオチド治療における必要性に対応するためにより良いそしてより安全なトランスフェクション剤を提示するますます多くの圧力を受けている。市販されている大部分の送達剤は多数の細胞タイプにおける高いトランスフェクション効率および低い毒性を達成すると主張するが、現在のところいずれも優れたインビボ薬剤送達手段としてそれら自体をプロファイリングしていない（ｐｒｏｆｉｌａｔｅｄ）。
【０１１７】
本願において、容易に製造することができそして遺伝子治療におけるトランスフェクション剤として働くことができる修飾ＰＰＩ−デンドリマーが記述されており、そのいくつかは以前に報告されていない。設計しそして製造したＰＰＩ−デンドリマーは水性環境において安定であり、そしてこれらのデンドリマーは、低い細胞毒性しか引き起こさずに、卵巣癌細胞へのｓｓ−ＤＮＡザイムオリゴマーのインビトロ送達を可能にすることが示された。ＤＮＡザイムの結合およびトランスフェクションは低い濃度および低い電荷比（すなわち、低過剰のデンドリマーはなおトランスフェクションを可能にする）で進むことができるので、送達は効率がよい。さらに、予備インビボ実験は、送達が実現可能であることを示す。最後に、最初のＰＡＧＥ結合研究は、二本鎖ｓｉＲＮＡ（４４ヌクレオチド）もまた本明細書に記述するＰＰＩ−デンドリマーに結合することを示しており、従って、核酸の結合およびトランスフェクションは、モデルとして本願において使用しているｓｓＤＮＡザイムモデルに限定されないように思われる。
【０１１８】
【表３】
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【０１１９】
【表４】
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【０１２０】
【表５】
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【０１２１】
【表６】
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【０１２２】
【表７】
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【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】第２世代ＰＰＩ−デンドリマーの分子構造。
【図Ａ】ｐＨ＝７でのＤＮＡザイム３３ｍｅｒとデンドリマーＧ２（ＭｅＣｌ）、Ｇ４（ＭｅＩ）、Ｇ４−ＰＥＧ（ＭｅＣｌ）、Ｇ５−ＰＥＧおよびＧ５−ＰＥＧ（ＭｅＩ）との結合能力。
【図Ｂ】ｐＨ＝７での濃度結合研究。
【図２】第２世代デンドリマーの転化段階を説明する、ポリ（プロピレンイミン）トランスフェクション剤の合成。
【図３】水における修飾ＰＰＩ−デンドリマーの安定性（ＳＥＣデータ）。
【図４】ＰＡＧＥを用いるデンドリマー−ＤＮＡザイム結合実験。
【図５】修飾ＰＰＩ−デンドリマーのインビトロ毒性：電荷比ごとに分類した、ＭＴＴ試験データ。
【図６】修飾ＰＰＩ−デンドリマーのインビトロ毒性：デンドリマーごとに分類した、ＭＴＴ試験データ。
【図７】血清の増加する濃度の存在下での修飾ＰＰＩ−デンドリマーのインビトロ毒性：電荷比ごとにそしてデンドリマーごとに分類した、ＭＴＴ試験データ。
【図８】修飾ＰＰＩ−デンドリマーのインビトロトランスフェクション効率：デンドリマーごとに分類した、ＦＡＣＳ分析。
【図１】
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【図Ａ】
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【図Ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８】
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【国際調査報告】
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