(57)【要約】  本発明は、ペプチドを固体支持体樹脂から切断するための組成物および方法を提供する。有機水混和性溶媒中の塩酸を使用して、ペプチド−樹脂結合を切断する。場合により、トリフルオロエタノールまたはヘキサフルオロイソプロパノールを切断組成物に添加し、結果を改善し得る。本切断組成物を使用するとき、切断反応に続き、カルボキシの副生成物を除去するための蒸発または他の段階は必要ではない。切断混合物から樹脂を濾過した後、ペプチドを水で即座に沈殿させ得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相ペプチド合成中に、側鎖保護基を含むペプチドを樹脂から切断するための組成物であって、
ａ．有機水混和性溶媒；および
ｂ．０.０５Ｎないし０.５Ｎの塩酸；
を含み、該組成物は、該ペプチドを該樹脂から切断するが、該側鎖保護基を除去しない、組成物。
【請求項２】
組成物が、さらに：
ｃ．約１％ないし約１２％のフッ素化アルコール
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
フッ素化アルコールが、トリフルオロエタノールまたはヘキサフルオロイソプロパノールを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
組成物が０.１Ｎ塩酸を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
組成物が５％ないし１０％のトリフルオロエタノールを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
組成物が約１０％のトリフルオロエタノールを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
組成物が約５％ないし約１０％のヘキサフルオロイソプロパノールを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
組成物が約１０％のヘキサフルオロイソプロパノールを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
有機水混和性溶媒が、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフランまたはジオキサンを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
有機水混和性溶媒がジメチルホルムアミドを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
組成物を使用してペプチドを切断するときに、実質的に全くカルボン酸副生成物が生成されない、請求項２に記載の組成物。
【請求項１２】
固相ペプチド合成中に、側鎖保護基を含むペプチドを樹脂から切断するための組成物であって、
ａ．ジメチルホルムアミド；
ｂ．約０.１Ｎ塩酸；および
ｃ．約１０％のヘキサフルオロイソプロパノール；
を含み、該組成物は、該ペプチドを該樹脂から切断するが、該側鎖保護基を除去しない、組成物。
【請求項１３】
固相ペプチド合成方法であって、
ａ．樹脂−ペプチド結合を、
有機水混和性溶媒；
０.０５Ｎないし０.５Ｎ塩酸；および
約１％ないし約１２％のフッ素化アルコール；
を含む組成物で処理することにより、樹脂に結合した中間体ペプチドフラグメントを樹脂から切断し、かくして、樹脂に結合していない中間体ペプチドフラグメントを含む切断混合物を形成すること；
ｂ．該切断混合物を水で処理することにより、該中間体ペプチドフラグメントを沈殿させること；および、
ｃ．少なくとも２個の中間体ペプチドフラグメントを組み合わせること；
を含み、該固相ペプチド合成方法は、樹脂−ペプチド切断反応と少なくとも２個の中間体ペプチドフラグメントを組み合わせる反応との間に蒸発段階を必要としない、方法。
【請求項１４】
塩酸が０.１Ｎ塩酸である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
フッ素化アルコールが、トリフルオロエタノールまたはヘキサフルオロイソプロパノールを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
組成物が５％ないし１０％のトリフルオロエタノールを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
組成物が約１０％のトリフルオロエタノールを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
組成物が約５％ないし約１０％のヘキサフルオロイソプロパノールを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
組成物が約１０％のヘキサフルオロイソプロパノールを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
有機水混和性溶媒が、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフランまたはジオキサンを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２１】
有機水混和性溶媒がジメチルホルムアミドを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
切断中に、樹脂−ペプチドを、組成物約２ｍＬないし約２２ｍＬ／樹脂−ペプチド１ｇで処理する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
切断中に、樹脂−ペプチドを、組成物約４ｍＬないし約１０ｍＬ／樹脂−ペプチド１ｇで処理する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
切断中に、樹脂−ペプチドを、組成物約４ｍＬないし約６ｍＬ／樹脂−ペプチド１ｇで処理する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
中間体ペプチドフラグメントの沈殿中に、切断混合物を少なくとも水約４ｍＬ／樹脂−ペプチド１ｇで処理する、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、ペプチド合成、および、特に、固相ペプチド合成、または、固相および液相のペプチド合成の組合せに関する。多数のペプチド合成方法が文献に記載されている（例えば、米国特許第６,０１５,８８１号; Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29: 4005-4008; Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29:  4009-4012; Kamber et al. (eds), Peptides, Chemistry and Biology, ESCOM, Leiden (1992) 525-526; Riniker et al. (1993) Tetrahedron Letters 49: 11065-11133; and Andersson et al. (2000) Biopolymers 55: 227-250 参照)。
【背景技術】
【０００２】
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）では、アミノ酸またはペプチド基を、固体支持体樹脂に結合させる。目的のペプチドが形成されるまで、支持体に結合したペプチドに次のアミノ酸を結合させる。所望のペプチドが形成された後、それを樹脂から切り離す。これには、ペプチドと樹脂の間の結合の切断、および、その後の、適する回収技法を使用する切断されたペプチドの回収が必要とされる。
【０００３】
それからペプチドが合成されるアミノ酸は、反応性側鎖の基および反応性末端を有する傾向がある。ペプチドを合成するとき、一方のペプチド上のアミン基が、他方のペプチドのカルボキシル基と反応することが重要である。側鎖の基の、または、反応物の誤った末端での望まれない反応は、望まれない副生成物をもたらす。副反応を最小限にするために、反応性の側鎖の基および反応物の末端をブロックし、確実に所望の反応が起こるように補助するのが、一般的な実務である。
【０００４】
例えば、典型的な固相合成スキームは、第１のアミノ酸を支持体樹脂に、第１のアミノ酸のカルボキシル部分を介して結合させることを含む（いくつかの合成スキームは、アミン基を介して第１のアミノ酸を結合させるが）。このことは、樹脂に結合したアミノ酸のアミン基が、さらなるアミノ酸と結合することを可能にする。従って、新しいアミノ酸のカルボキシル部分が、樹脂に結合した物質の遊離アミン基と反応する。新しいアミノ酸のアミン基を巻き込む副反応を避けるために、カップリング反応の間に、アミン基を保護基でブロックする。２つの周知のアミン保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）基および９−フルオレニルメチルカルバメート（ＦＭＯＣ）基である。多くの他のものも、文献に記載された。カップリングの後、樹脂に結合したペプチドのＮ末端の保護基（通常ＢＯＣまたはＦＭＯＣ）を除去し、さらなるアミノ酸を、成長している鎖に同様に付加させることができる。アミノ酸反応物および樹脂に結合したペプチドの反応性側鎖の基も、側鎖保護基でブロックでき、合成中ずっとブロックしたままにできる。
【０００５】
合成後、いくつかまたは全ての側鎖保護基をペプチド生成物から除去できる。実質的に全ての保護基を除去するとき、これは、包括的脱保護と呼ばれる。包括的脱保護は、切断と同時に行うことができ、あるいは、ペプチドがさらに加工、修飾、さらなるペプチドもしくは他の物質へのカップリングなどを受けるならば、後で実施することができる。いくつかの切断剤は、ペプチドを支持体樹脂から切断するのみならず、包括的脱保護も同時に起こらせる。例えば、ＢＯＣ化学に関連する強酸性の切断剤は、切断時に包括的脱保護を引き起こす傾向がある。しかしながら、ＦＭＯＣ戦略の使用は、ペプチドの樹脂からの切断を可能にする一方で、側鎖保護基は残らせ、フラグメント縮合などのさらなる反応を側鎖の基による実質的な妨害を伴わずに行うことができるようにする。かくして、ペプチドは、保護状態で切断される。
【０００６】
典型的には、固相ペプチド合成により合成されるペプチドの収量は、ペプチド鎖の長さの増加に伴い減少する。即ち、ペプチド鎖が長いほど、所望のペプチドと共に、望まれない副生成物が生成される可能性が高い。従って、特に長いペプチドのために、最終ペプチド生成物をフラグメントで生成し、次いでそれを後で組み合わせて、所望のペプチド生成物を形成させる。例えば、仮定的な７５個のアミノ酸のペプチドを、３個のペプチドフラグメントで、各フラグメントを固相ペプチド合成により別個に合成して、合成し得る。アミノ酸１−２５、アミノ酸２６−５０およびアミノ酸５１−７５からなるフラグメントを別個に合成し、次いで、フラグメント縮合段階で組み合わせ、完全な７５個のアミノ酸の最終ペプチド生成物を形成できる。
【０００７】
保護状態でペプチドを樹脂支持体から切り離す先行技術の方法は、典型的には、カルボン酸を有する副生成物を形成する。カルボン酸は、後続のフラグメント縮合反応を妨害し、望まれない副生成物を形成するであろう。先行技術の方法は、通常は切断溶液の蒸発により望まれないカルボン酸を除去するさらなる段階を切断後に含めることにより、この問題を解決した。この余分な段階および必要とされる溶媒は、さらなる時間、出費を要し、処理されなければならない廃棄物を形成し、さらなる出費を生む。従って、望まれないカルボン酸副生成物の生成を回避し、それにより、カルボン酸を除去する後続の段階を回避することにより、ペプチドを樹脂からより容易に、安価に、そして効率的に切断する方法への要望がある。
【発明の開示】
【０００８】
発明の要旨
本発明は、ペプチドを固体支持体樹脂から切断するための組成物および方法を提供する。有機水混和性溶媒中の塩酸を使用して、ペプチド−樹脂結合を切断する。場合により、トリフルオロエタノールまたはヘキサフルオロイソプロパノールを切断組成物に添加し、結果を改善し得る。本切断組成物を使用するとき、切断反応に続き、カルボキシの副生成物を除去するための蒸発または他の段階は必要ではない。切断混合物から樹脂を濾過した後、ペプチドを水で即座に沈殿させ得る。
【０００９】
詳細な説明
本発明は、ペプチドを固体支持体樹脂から切断するための組成物および方法を提供し、それは、先行技術の組成物および方法を使用すると必要とされるような、ペプチドフラグメントの縮合に先立ち切断混合物からカルボン酸を除去するための後続段階の必要性を省く。本発明は、少量および大量規模の両方のペプチド合成に関して、処理時間の短縮、収率および純度の上昇、反応剤、出発物質、溶媒、廃棄物の量の減少、並びに、他の改善を提供できる。本発明により生成されるペプチドは、当分野で周知の方法により合成でき、本発明は、いかなる特定の合成方法にも限定されない。本発明に従い、任意のペプチドを生成し得る。
【００１０】
ＦＭＯＣ合成戦略の利点は、合成されたペプチドを、実質的に完全に保護された状態で、即ち、側鎖保護基がペプチド上にあるままで、固体支持体樹脂から除去し得ることである。これは、側鎖保護基の比較的強い結合（それは、それらをペプチドから除去するために、より強い酸を必要とする）と比較して、酸に感受性であるペプチドの樹脂への結合のためである。従って、比較的低い濃度の酸を使用して、ペプチドを樹脂から切断し得、一方で、この酸溶液は側鎖保護基を切断するほど強くはないので、これらの基は依然として残ったままにすることができる。典型的には、２−クロロトリチルクロリド樹脂とペプチドとの結合は、比較的酸に感受性であるので、２−クロロトリチルクロリド樹脂を利用してこれらの利点を助長する。しかしながら、他の樹脂を使用してもよい。本発明をＦＭＯＣペプチド合成戦略に関して説明するが、他の固相ペプチド合成戦略およびシステムを本発明と組み合わせて用い得る。ＦＭＯＣ戦略は、ペプチドを大規模に合成する好ましい方法にすぎない。
【００１１】
本発明以前には、典型的には、所望のペプチドを固体支持体樹脂上で合成するとき、ペプチドは、ジクロロメタン（ＤＣＭ）などの溶媒中の酢酸（ＡｃＯＨ）またはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の溶液を使用して、樹脂から除去される。しかしながら、ＡｃＯＨまたはＴＦＡを使用してペプチドを切断することは、切断混合物中にカルボン酸副生成物を形成する。除去されなければ、これらのカルボン酸は、２個またはそれ以上のペプチドフラグメントを組み合わせるフラグメント縮合反応などの後続の反応を妨害するであろう。従って、カルボン酸を除去するために、合成方法における付加的段階が必要とされる。これは、通常、切断混合物の蒸発および続く再構成により達成される。この付加的段階は、より多くの時間、溶媒、廃棄物、出費を必要とし、そして、収率および純度を下げ得る。さらに、カルボン酸は、完全には除去できない。従って、トレース量が常に存在し、それは、最終ペプチド生成物純度を低下させ得る。
【００１２】
本発明は、新規切断剤および方法を利用することにより、カルボン酸副生成物の生成、および、先行技術の方法で必要とされる、高価かつ時間を消費するカルボン酸の除去段階を、実質的に排除する。ある実施態様では、切断剤は、有機水混和性溶媒中の比較的低濃度の塩酸（ＨＣｌ）である。有機水混和性溶媒の例は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびジオキサンである。しかしながら、多くの他の有機水混和性溶媒が当分野で知られている。広範囲の濃度のＨＣｌが、効果的にペプチドを樹脂から切断し、全て本発明の範囲内にある。しかしながら、特定の範囲、好ましくは、約０.０５Ｎないし約０.５ＮのＨＣｌ、最も好ましくは約０.１ＮのＨＣｌで、最良の結果が達成された。
【００１３】
本発明の他の実施態様では、本発明の切断剤は、さらに、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）またはヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）を含むがこれらに限定されないフッ素化アルコールを含む。フッ素化アルコールは、好ましくは、切断剤の約１％ないし約１２％、より好ましくは約５％ないし約１０％、最も好ましくは約１０％の範囲にある。本発明者らは、反応剤約２ｍＬないし２２ｍＬ／樹脂１ｇ、好ましくは反応剤約４ｍＬないし１０ｍＬ／樹脂１ｇ、より好ましくは反応剤約４ｍＬないし６ｍＬ／樹脂１ｇが、ペプチドを樹脂から切断するのに適当であると見出した。しかしながら、他の量の切断剤は、ペプチドを樹脂から効果的に切断すると見込まれる。
【００１４】
上記で論じた通り、本切断剤および方法を使用してペプチドを切断すると、カルボン酸副生成物が実質的に生成されないので、カルボン酸副生成物を除去するための蒸発段階は不要である。従って、本発明を使用していくつかの中間体ペプチドフラグメントを形成し、次いでフラグメント縮合段階で組み合わせ得る。本発明のある実施態様は、切断後の蒸発段階がないことを特徴とする。切断に続き、切断混合物を濾過して樹脂を除去し、場合により溶媒で洗浄し得る。かくして得られた濾液を、簡単に水で処理し、ペプチドフラグメントを沈殿させ、次いでそれを濾過し、場合により水で洗浄できる。好ましくは、冷水を使用して、好ましくは約０℃ないし約２５℃の温度範囲で、最も好ましくは約０℃で、ペプチドを沈殿させる。しかしながら、より温かい温度の水も効果的にペプチドを切断濾液から沈殿させる。本発明者らは、少なくとも約４ｍＬの水／樹脂−ペプチド１ｇが、切断されたペプチドを効果的に沈殿させると見出したが、他の量も役立つと見込まれる。
【実施例】
【００１５】
実施例：
以下の実施例は、本発明を利用するペプチドの合成を簡潔に説明する。この実施例は、エンフビルチドの合成を説明するが、説明される原理は、いかなるペプチドにも、好ましくは、クロロトリチルクロリド（ＣＴＣ）樹脂、Sieber 樹脂または Rink 樹脂などの酸に不安定な支持体上で合成されるいかなる保護ペプチドにも適用できる。そのようなペプチドの非限定的な例には、プラムリンチド、エクセナチド、エンフビリチド（enfuviritide）、カルシトニンおよびＰＹＹ−３−３６が含まれる。以下の実施例は、エンフビルチドの好ましい製造方法にすぎず、本発明をどのようにも限定することを意図しない。
【００１６】
ＦＭＯＣ−アミノ酸のＣＴＣ樹脂への負荷：
1．一般的方法
ＤＩＥＡ（１ないし１.７モル当量）を含有するＤＣＭまたはＤＭＦ＋ＤＣＭ（４：１）中のＦＭＯＣアミノ酸（０.８ないし１.５モル当量）の溶液を、予め膨潤させたＣＴＣ樹脂（１モル当量）に添加し、窒素気流下で２時間激しく撹拌した。それを排水し、ＭｅＯＨ＋ＤＩＥＡ（９：１）混合物と２０−３０分間激しく撹拌し、樹脂上の過剰の活性塩化物を破壊した。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（１ｘ３分）、ＤＣＭ（１ｘ３分）、ＩＰＡ（２ｘ３分）で洗浄し、一定重量まで乾燥した。負荷されたアミノ酸の置換密度を、重量増加法およびＤＢＵ分析法により測定した。
【００１７】
２．フラグメント−１：ＡＣ−ＡＡ（１−１６）−ＣＴＲの合成
２５０ｍｌの反応器中で、ＦＭＯＣ−Ｇｌｎ−ＣＴＲ１７.５ｇ（ｓｕｂ.＝０.６０ｍｍ／ｇ）で開始し、ＦＭＯＣ−をベースとするＳＰＰＳを使用して、手動で合成を実施した。ＦＭＯＣ基をＮＭＰ中の２０％ピペリジンにより除去し（２ｘ２０分）、全てのＦＭＯＣ−アミノ酸のカップリングを、ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴ法により、ＮＭＰ＋ＤＣＭ（３：１）中のＤＩＥＡ（各１.５当量）の存在下で実施し、但し、位置１５のＦＭＯＣ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）は例外とし、それは、２.５モル当量の反応剤を使用して行った。全てのアミノ酸を単一のカップリングにより導入し、但し、Ａｓｎ（ｔｒｔ）１４、Ｇｌｎ（ｔｒｔ）１３およびＳｅｒ（ｔＢｕ）１２は例外とし、ここでは、二重カップリングが必要とされた。最後のアミノ酸のＦＭＯＣ基の除去後、樹脂をＮＭＰ中の５モル当量の無水酢酸およびピリジンで１時間処理し、アセチル基をＮ末端に導入した。完全に保護されたペプチド−樹脂の収量は、理論的収量の４８ｇと比較して、３４.９ｇ（７２.８％）であった。ＨＰＬＣによると、ペプチドの純度は＞８９.１％（２６２ｎｍで）であった。
【００１８】
３．フラグメント−２：ＦＭＯＣ−ＡＡ（１７−２６）−ＣＴＲの合成
ＦＭＯＣ−Ｌｅｕ−ＣＴＲ２５ｇ（ｓｕｂ.＝０.８ｍｍ／ｇ）を用い、ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴ（１.５モル当量）カップリング法を使用して、合成を開始した。ＮＭＰ＋ＤＣＭ（３：１）をカップリング溶媒として、ＤＩＥＡ（１.５モル当量）を塩基として使用する単一のカップリングにより、全てのアミノ酸（１.５モル当量）を導入した。カップリングの完全性は、Kaiser 試験により監視した。ＦＭＯＣ基の除去は、ＤＭＣ中の２０％ピペリジンにより達成した（２ｘ２０分）。保護されたペプチジル樹脂の収量は、理論的収量の６２.９ｇと比較して、５８.７ｇ（９３.４％）であった。ＨＰＬＣによると、ペプチドの純度は＞９７.１％（２６２ｎｍで）であった。
【００１９】
４．フラグメント−３：ＦＭＯＣ−ＡＡ（２７−３５）−ＣＴＲの合成
ＦＭＯＣ−Ｔｒｐ（ＢＯＣ）−ＣＴＲ３７.５ｇ（ｓｕｂ.＝０.７ｍｍ／ｇ）を用い、ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴカップリング方法を使用して、溶媒としてのＮＭＰ＋ＤＣＭ（３：１）中で、合成を開始した。全てのアミノ酸を単一のカップリングで結合させ、但し、最後のアミノ酸ＦＭＯＣ−Ａｓｐ（ｏｔＢｕ）を例外とし、それは、２回（２ｘ２時間）結合させ、続いてアセチル化した。１.５倍過剰のアミノ酸および反応剤をカップリングに使用し、カップリングの完了を Kaiser 法により監視した。ペプチド樹脂の収量は、理論的収量の８１.８ｇと比較して、７３ｇ（８９.３％）であった。ＨＰＬＣによると、ペプチドの純度は＞８０.６５％（２２０ｎｍで）であった。
【００２０】
５．保護フラグメントの支持体からの切断
ａ．フラグメント−１：Ａｃ−ＡＡ（１−１６）−ＯＨの切断
Ａｃ−ＡＡ（１−１６）−ＣＴＲ１０.０ｇ（２ｍｍ）を、ＤＭＦ中の０.１Ｎ ＨＣｌ１００ｍｌと４.５時間室温で撹拌し、濾過し、続いてＤＭＦで洗浄した。合わせた濾液を０℃の撹拌した水に添加し、沈殿した固体を濾過し、続いて水で洗浄し、乾燥し、理論的収量７.２ｇと比較して、保護ペプチド５.６２ｇ（７８.５％）を得た。ＨＰＬＣによると、純度は＞８５.６４％（ＩＰＡ系）であった。ペプチド樹脂を、１０％ＴＦＥを含有するＤＭＦ中の０.１Ｎ ＨＣｌで切断すると、保護ペプチドの収量は９２％であり、ＨＰＬＣ純度＞９６.８６％（ＩＰＡ系）であった。
【００２１】
ｂ．フラグメント−２：ＦＭＯＣ−ＡＡ（１７−２６）−ＯＨの切断
保護ペプチド樹脂（５ｇ、１.７ｍｍ）のサンプルを、ＤＭＦ中の０.１Ｎ ＨＣｌ５０ｍｌと４.５時間激しく撹拌し、濾過し、続いてＤＭＦで洗浄した。濾液を０℃の撹拌した水に添加し、沈殿した固体を濾過し、水で洗浄し、乾燥し、保護ペプチド２.９ｇ（７４.２％）を得た。ＨＰＬＣによると、ペプチドの純度は＞９０.１％（ＡＣＮ系）および＞８１％（ＩＰＡ系）であった。ペプチド樹脂の切断を、１０％ＴＦＥを含有するＤＭＦ中の０.１Ｎ ＨＣｌで実施すると、ペプチドの収率は９１.６％であり、ＨＰＬＣ純度は＞９６.６６％（ＩＰＡ系）であった。
【００２２】
ｃ．フラグメント−３：ＦＭＯＣ−ＡＡ（２７−３５）−ＯＨの切断
ペプチジル樹脂のサンプル２.５ｇ（０.８ｍｍ）を、１０％ＴＦＥを含むＤＭＦ中の０.１Ｎ ＨＣｌ２５ｍｌと、室温で４.５時間撹拌し、濾過した。濾液を０℃の撹拌した水に添加し、得られる固体を濾過により回収し、続いて水で洗浄した。終夜乾燥した後、ＨＰＬＣ純度８４％の所望のペプチド７２.４％（１.２８ｇ）を得た。ペプチド樹脂の切断を、５％ＴＦＥを含有するＤＭＦ中の０.１Ｎ ＨＣｌを用いて行うと、保護ペプチドの収量は、６７.９ｇ（１.２ｇ）であり、純度は８８.２％であった。
【００２３】
６．溶液中のフラグメント縮合による保護エンフビルチドの合成
ａ．フラグメント−３のＰｈｅ−ＮＨ２とのＦＭＯＣ−ＡＡ（２７−３６）−ＮＨ２へのカップリング
フラグメント−３（２.６２ｇ、１当量）、Ｐｈｅ−ＮＨ２（０.２４ｇ、１.２当量）およびＨＯＡＴ（０.２ｇ、１.２当量）の混合物を、ＤＭＦ３０ｍｌと、ＤＩＥＡ（０.４３ｍｌ；２.１当量）の存在下で撹拌し、溶液をＨＢＴＵ（０.５５ｇ、１.２当量）で、０℃で１５−２０分間処理し、次いで室温で７０−８０分間処理した。反応の進行をＴＬＣ（ＣＭ−１０）およびＨＰＬＣにより監視した。反応混合物を０℃で冷却し、水２０−３０ｍｌで処理し、析出した無色固体を濾過し、続いて水で洗浄し、乾燥し、ＦＭＯＣＡＡ（２７−３６）−ＮＨ２ ２.７６ｇ（９８.６％）を得た。ＨＰＬＣによると、ペプチドの純度は＞８８.１５％であった。実験を数回繰り返し、得られる収量は、９７ないし１００％の範囲にあり、純度は８２.６ないし８８.２％であった。
【００２４】
ｂ．ＦＭＯＣ−ＡＡ（２７−３６）−ＮＨ２のＨ−ＡＡ（２７−３６）−ＮＨ２フラグメント−４への脱保護
ＤＭＡ中の５％ピペリジン５ｍｌ中のＦＭＯＣ−ＡＡ（２７−３６）−ＮＨ２（１.１６ｇ、０.５ｍｍ）の溶液を、２時間室温で撹拌し、次いで、水１５ｍｌで、０℃で、撹拌しながら希釈した。析出した無色固体を濾過し、続いて水で洗浄し、乾燥した。それをエーテルおよびヘキサンで洗浄し（１回ずつ）、ＨＰＬＣ純度８５.８５％（ＡＣＮ系）の生成物０.９１ｇ（８６.７％）を得た。
【００２５】
ｃ．フラグメント−２および４のＦ−ＡＡ（１７−３６）−ＮＨ２へのカップリング
［Ａ］ＨＢＴＵ／ＨＯＡＴ法
ＤＩＥＡ（０.２ｍｌ、１.２ｍｍ）を含有するＤＭＦ２３ｍｌ中のフラグメント−２（１.８０ｇ、０.８ｍｍ、１当量）、フラグメント−４（１.６８ｇ＝０.８ｍｍ）、ＨＢＴＵ（０.３ｇ、０.８ｍｍ）およびＨＯＡＴ（０.１６ｇ、１.２ｍｍ、１.５当量）の溶液を、０−５°で１５−２０分間、そして室温で２時間撹拌し、反応の進行をＣＭＡ（９０：８：２）中のＴＬＣおよびＨＰＬＣにより監視した。それを冷水２３ｍｌで、０−５℃で処理し、３０分間撹拌した後、それを濾過し、続いて水で洗浄し、乾燥し、生成物３.５３ｇ（１０１.２％）を純度７９.４％で得た。９５％ＩＰＡ／Ｈ２０による結晶化後、収率は７４.５％であり、純度は８９.９６％であった。それには、トレース量のフラグメント−２（０.２４％）およびフラグメント−４（０.１５％）（ＩＰＡ系）が混入していた。
【００２６】
［Ｂ］ＴＢＴＵ／ＨＯＡＴ法
ＤＭＡ溶媒中、ＴＢＴＵを上記と同じモル比率で使用して、カップリング反応を実施し、収量は、純度７０.２％で３.５６ｇ（１０１.９５％）であった。９５％ＩＰＡ／Ｈ２０による結晶化後、収率は７４.５％（２.６ｇ）であり、ＨＰＬＣ純度８８.４％（ＩＰＡ系）であった。
【００２７】
それをＤＭＡ中のピペリジン（１０当量）で脱保護し、水で単離し、ＨＰＬＣ純度８５.３％（ＩＰＡ系）で生成物９３.３％を得た。
【００２８】
ｄ．フラグメント−１のＨ−ＡＡ（１７−３６）−ＮＨ２との保護エンフビルチドへのカップリング
ＤＭＡ８ｍｌ中でフラグメント−１（０.４ｇ、１当量）、ＨＯＡＴ（０.０３ｇ、１.５当量）およびＤＩＥＡ（０.０３ｍｌ、１.５当量）を撹拌して透明な溶液をもたらし、次いでそれを０.５℃で撹拌した。ＴＢＴＵ（０.０４ｇ、１当量）を添加し、溶液を０℃で１５−２０分間撹拌し、次いでＤＭＡ中のＨ−ＡＡ（１７−３６）−ＮＨ２（０.５ｇ、１当量）の溶液を添加し、撹拌を０℃で３０分間、次いで室温で２時間継続した。冷水（〜１５ｍｌ）を０℃で添加し、分離した固体を濾過し、続いて水で洗浄し、乾燥し、保護エンフビルチドを収率９７.３％（０.９ｇ）で、ＨＰＬＣ純度＞６６.９３％（ＩＰＡ系）で得た。９５％ＡＣＮ／Ｈ２０による結晶化後、収率は５５.３％であり、ペプチドの純度は＞７２.８％であった（スキーム−１）。
【００２９】
７．その場でのフラグメントのカップリング
ａ．Ｆ−ＡＡ（２７−３５）−ＯＨのそのＣＴＣ樹脂からの放出
ＦＭＯＣ−ＡＡ（２７−３５）−ＣＴＲ５.０ｇ（１.６２ｍｍ）を、ＤＭＦ中の０.１Ｎ ＨＣｌ２５ｍｌと４時間撹拌し、濾過し、続いてＤＭＦ１０ｍｌで１回洗浄した。ＤＭＦ中のＦＭＯＣ−ＡＡ（２６−３５）−ＯＨの総量＝３５ｍｌ（１.６２ｍｍ、推定）。
【００３０】
ｂ．ＦＭＯＣ−ＡＡ（２７−３６）−ＮＨ２→Ｈ.ＡＡ（２７−３６−ＮＨ２の製造
上記の溶液（段階＃１より）を、０℃で撹拌し、ＤＩＥＡでｐＨ〜７に中和した。１.２倍過剰のＰｈｅ−ＮＨ２（０.３２ｇ、１.９４ｍｍ）、ＨＯＡＴ（０.２６ｇ）、ＨＢＴＵ（０.７４ｇ）および２.１倍過剰のＤＩＥＡ（０.６ｍｌ、３.４ｍｍ）を添加し、混合物を０℃で０.５時間、室温で２時間撹拌した。反応の完了をＴＬＣ（ＣＭ−１０）により監視した。ここで、ＤＢＵ（１０当量）を添加し、撹拌をさらに２時間継続し、脱保護の進行をＴＬＣ（ＣＭ−１０）およびＨＰＬＣにより監視した。
【００３１】
ｃ．ＦＭＯＣ−ＡＡ（１７−２６）の支持体からの放出およびそのＨ−ＡＡ（２７−３６）−ＮＨ２とのＦＭＯＣ−ＡＡ（１７−３６）−ＮＨ２→Ｈ.ＡＡ（１７−３６）−ＮＨ２へのカップリング
ＦＭＯＣ−ＡＡ（１７−２６）−ＣＴＲ４.７ｇ（１.６２ｍｍ）を、ＤＭＦ中の０.１Ｎ ＨＣｌ２５ｍｌと４時間撹拌し、濾過し、続いてＤＭＦ１０ｍｌで洗浄し（総体積＝３５）、溶液を０℃で撹拌した。それをＨ−ＡＡ（２７−３６）−ＮＨ２（段階＃２）の溶液で処理し、混合物のｐＨを７に調節した。ＨＯＡＴ、ＨＢＴＵ（各１モル当量）およびＤＩＥＡ（１.８モル当量）を添加し、混合物を０℃で０.５時間、室温で２時間ないし終夜撹拌した。反応の進行をＴＬＣ（ＣＭ−１０）およびＨＰＬＣにより監視した。ここで、混合物をＤＢＵ（１０当量）で２時間処理し、Ｎ末端のＦＭＯＣ基を除去する（混合物の体積＝７０ｍｌ）。次の反応で使用するために、それをｐＨ〜７に０℃で中和した。
【００３２】
ｄ．Ａｃ−ＡＡ（１−１６）−ＯＨの支持体からの放出およびそのＨ−ＡＡ（１７−３６）−ＮＨ２とのＡＣ−ＡＡ（１−３６）−ＮＨ２へのカップリング
ＡＣ−ＡＡ（１−１６）−ＣＴＲ８.３ｇ（１.６２ｍｍ）を、ＤＭＦ中の０.１Ｎ ＨＣｌ４０ｍｌで、４時間、上記の通りに切断し、濾過した溶液のｐＨを７に０℃で調節した。次いで、それをＨＯＡＴ（１.５当量）、ＤＩＥＡ（１.５当量）およびＨＢＴＵ（１当量）で順番に処理し、０℃で１５−２０分間撹拌した後、脱保護された溶液（段階＃３）を添加し、撹拌を０.５時間０℃で、そして２時間ないし終夜室温で継続した。ここで、それを撹拌した水（〜３００ｍｌ）に添加し、その間に固体が沈殿した。１時間撹拌した後、固体を濾過し、続いて水で洗浄し、乾燥した。乾燥した固体をヘキサンで洗浄し、生成物１０.９ｇ（９１.２％）を得た。ＨＰＬＣによると、生成物純度は３２.７１％のみであり、約２６％の未反応のフラグメント−１を含有した。
【００３３】
従って、それを、５０％量のＨ−ＡＡ（１７−３６）−ＮＨ２、ＨＯＡＴ、ＤＩＥＡおよびＨＢＴＵを使用して再度反応させ、通常通りに後処理し、生成物１３.２ｇ（１１０％）を得た。ＨＰＬＣによると、ペプチド純度は４５.７％であった。
【００３４】
ＤＭＦ中の単離したフラグメント−１（０.９８ｇ、０.３ｍｍ）の０℃の撹拌した溶液を、ＤＢＵ脱−ＦＭＯＣ化され、かつ中和された、ＤＭＦ中の単離ＦＭＯＣ−ＡＡ（１７−３６）−ＮＨ２（１.３１ｇ、０.３ｍｍ）の溶液と、１.５モル当量のＨＯＡＴ、ＤＩＥＡおよび１モル当量のＨＢＴＵと縮合すると、単離された生成物の収率は、９１.９％（２ｇ）であり、ＨＰＬＣ純度＞６２.１％であった。
【００３５】
同様に、単離したＨ−（１７−３６）−ＮＨ２を未単離のフラグメント−１と結合させると、ペプチドの収率および純度は、各々９５.７％および３３.６％であった。
【手続補正書】
【提出日】平成21年3月24日(2009.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相ペプチド合成中に、側鎖保護基を含むペプチドを樹脂から切断するための組成物であって、
ａ．有機水混和性溶媒；および
ｂ．０.０５Ｎないし０.５Ｎの塩酸；
を含み、該組成物は、該ペプチドを該樹脂から切断するが、該側鎖保護基を除去しない、組成物。
【請求項２】
組成物が、さらに：
ｃ．約１％ないし約１２％のフッ素化アルコール
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
フッ素化アルコールが、トリフルオロエタノールまたはヘキサフルオロイソプロパノールを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
組成物が０.１Ｎ塩酸を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
組成物が５％ないし１０％のトリフルオロエタノールを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
組成物が約１０％のトリフルオロエタノールを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
組成物が約５％ないし約１０％のヘキサフルオロイソプロパノールを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
組成物が約１０％のヘキサフルオロイソプロパノールを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
有機水混和性溶媒が、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフランまたはジオキサンを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
有機水混和性溶媒がジメチルホルムアミドを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
組成物を使用してペプチドを切断するときに、実質的に全くカルボン酸副生成物が生成されない、請求項２に記載の組成物。
【請求項１２】
固相ペプチド合成中に、側鎖保護基を含むペプチドを樹脂から切断するための組成物であって、
ａ．ジメチルホルムアミド；
ｂ．約０.１Ｎ塩酸；および
ｃ．約１０％のヘキサフルオロイソプロパノール；
を含み、該組成物は、該ペプチドを該樹脂から切断するが、該側鎖保護基を除去しない、組成物。
【請求項１３】
固相ペプチド合成方法であって、
ａ．樹脂−ペプチド結合を、
有機水混和性溶媒；
０.０５Ｎないし０.５Ｎ塩酸；および
約１％ないし約１２％のフッ素化アルコール；
を含む組成物で処理することにより、樹脂に結合した中間体ペプチドフラグメントを樹脂から切断し、かくして、樹脂に結合していない中間体ペプチドフラグメントを含む切断混合物を形成すること；
ｂ．該切断混合物を水で処理することにより、該中間体ペプチドフラグメントを沈殿させること；および、
ｃ．少なくとも２個の中間体ペプチドフラグメントを組み合わせること；
を含み、該固相ペプチド合成方法は、樹脂−ペプチド切断反応と少なくとも２個の中間体ペプチドフラグメントを組み合わせる反応との間に蒸発段階を必要としない、方法。
【請求項１４】
塩酸が０.１Ｎ塩酸である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
フッ素化アルコールが、トリフルオロエタノールまたはヘキサフルオロイソプロパノールを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
組成物が５％ないし１０％のトリフルオロエタノールを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
組成物が約１０％のトリフルオロエタノールを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
組成物が約５％ないし約１０％のヘキサフルオロイソプロパノールを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
組成物が約１０％のヘキサフルオロイソプロパノールを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
有機水混和性溶媒が、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフランまたはジオキサンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
有機水混和性溶媒がジメチルホルムアミドを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
切断中に、樹脂−ペプチドを、組成物約２ｍＬないし約２２ｍＬ／樹脂−ペプチド１ｇで処理する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
切断中に、樹脂−ペプチドを、組成物約４ｍＬないし約１０ｍＬ／樹脂−ペプチド１ｇで処理する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
切断中に、樹脂−ペプチドを、組成物約４ｍＬないし約６ｍＬ／樹脂−ペプチド１ｇで処理する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
中間体ペプチドフラグメントの沈殿中に、切断混合物を少なくとも水約４ｍＬ／樹脂−ペプチド１ｇで処理する、請求項１５に記載の方法。
【国際調査報告】
2009535402.tif 000002
2009535402.tif 000003
2009535402.tif 000004