(57)【要約】  本発明は、一般的に、アプタマーに、そして特に、ターゲット分子を刺激可能なアプタマーに、そして該アプタマーを用いる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高い親和性でターゲット分子に結合し、そして前記ターゲット分子を刺激する、核酸アプタマー。
【請求項２】
前記ターゲット分子が細胞表面受容体である、請求項１記載のアプタマー。
【請求項３】
前記細胞表面受容体が、Ｔ細胞表面受容体である、請求項２記載のアプタマー。
【請求項４】
前記細胞表面受容体が４−１ＢＢである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記アプタマーがモノマーである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記アプタマーがマルチマーである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記マルチマーが固体支持体に結合している、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記アプタマーの少なくとも１塩基が修飾されている、請求項１記載のアプタマー。
【請求項９】
前記アプタマーの少なくとも１塩基が２’−フルオロ修飾されている、請求項８記載のアプタマー。
【請求項１０】
前記アプタマーがマルチマー化されており、そしてＭ１２−２２である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
請求項１記載の前記アプタマーおよびキャリアーを含む、組成物。
【請求項１２】
ターゲット分子を刺激する方法であって、該ターゲット分子に高い親和性で結合し、そしてその活性を刺激する核酸アプタマーと、前記ターゲット分子を接触させることを含む、前記方法。
【請求項１３】
腫瘍増殖を阻害する必要がある患者において、腫瘍増殖を阻害する方法であって、前記患者に、前記阻害を達成するのに十分な量の請求項４記載のアプタマーを投与することを含む、前記方法。
【請求項１４】
前記アプタマーがＭ１２−２２である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記アプタマーがマルチマー化されたＭ１２−２２である、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２００５年９月１５日出願の米国仮出願第６０／７１６，９７６号の優先権を請求し、該出願の全内容は、本明細書に援用される。
技術分野
本発明は、一般的に、アプタマーに、そして特に、ターゲット分子を刺激可能なアプタマーに、そして該アプタマーを用いる方法に関する。
背景
多様な細胞表面受容体を刺激する抗体が、多くのグループによって記載されてきている。これらの刺激性抗体のいくつかは、重要な臨床的適用を有する。こうした抗体は、一般的に、２つの受容体タンパク質を互いに近接近させることによって、そのターゲット受容体を刺激する。これらは、抗体分子あたり２つのターゲット結合ドメインを含有するため、そのターゲットを「架橋」することが可能である。
【０００２】
Ｔ細胞の刺激は、多くの細胞内シグナル伝達事象を生じ、これが細胞増殖およびサイトカイン分泌の増進を導く。Ｔ細胞が最大に刺激されるには、２つの種類の受容体の活性化が必要である：Ｔ細胞受容体、および４−１ＢＢを含む、Ｔ細胞表面上に発現される多くの異なる受容体の１つであることも可能なさらなる同時刺激受容体である。抗ＣＤ３ｅ抗体でＴ細胞受容体を最適以下に刺激すると、細胞表面上に４−１ＢＢの発現が誘導される。次いで、４−１ＢＢは、樹状細胞表面上に発現されるその天然リガンドの４−１ＢＢＬで刺激されうる。４−１ＢＢに結合する抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでこの受容体を刺激することが示されてきている。腫瘍を所持する動物に投与すると、これらの抗体は、一般的に、癌細胞に対する免疫応答を増進し、いくつかの場合、腫瘍の完全なクリアランスを生じる。
【０００３】
本発明は、細胞表面受容体を含むターゲット分子を刺激する新規アプローチを提供する。本発明にしたがって、核酸アプタマーを用いて刺激を達成する。
発明の概要
本発明は、一般的に、アプタマーに関する。より具体的には、本発明は、アゴニストとして機能可能なアプタマーに、そして該アプタマーを用いる方法に関する。
【０００４】
本発明の目的および利点は、以下の説明から明らかであろう。
発明の詳細な説明
本発明は、核酸アプタマーがターゲット分子を刺激するように操作可能であるという立証から生じる。ＳＥＬＥＸ法を用いて、特定のターゲット（例えば受容体）に対して、本発明のアプタマーを選択してもよい（図１）（例えば、ＵＳＰ  ５，４７５，０９６および５，２７０，１６３、ならびにＷＯ  ９１／１９８１３を参照されたい）。安定性を増加させるため、選択で用いるＲＮＡの塩基を修飾（例えば２’−フルオロ修飾）してもよい。
【０００５】
本発明は、誘導性のＴ細胞同時刺激受容体である４−１ＢＢに関して、以下に例示される。しかし、本発明は、４−１ＢＢに対するＲＮＡアプタマーに限定されず、むしろ、他の受容体（例えばＴ細胞受容体）を含む他のターゲット分子を刺激するＲＮＡアプタマーを含む。刺激することが求められるターゲットに応じて、アプタマーはモノマーであってもよいし、または以下の実施例に記載するような、固体支持体（例えばビーズ）上でのマルチマー化を含む、多様なアプローチのいずれかを用いて、アプタマーをマルチマー化してもよい。
【０００６】
ターゲット分子を刺激可能な本発明のアプタマーを、多様な療法設定において、刺激性抗体および組換えタンパク質の代わりに用いてもよい。例えば、４−１ＢＢは、癌免疫療法および多様な自己免疫疾患の有望な療法ターゲットである。本明細書記載のマルチマー化アプタマーは、例えば、腫瘍増殖を阻害する際の使用に関して意図される。
【０００７】
当該技術分野に周知の方法を用いて、本発明のアプタマーを配合して組成物にしてもよい。例えば、アプタマー、ターゲット分子、および求める効果に応じて、適切なキャリアーを選択してもよい。最適投薬措置は、当業者によって容易に確立可能である。
【０００８】
図１に記載のＳＥＬＥＸ法を用いて、マウスおよびヒトの４−１ＢＢタンパク質の細胞外部分に高い親和性（Ｋｄ＜５０ｎＭ）で結合する、いくつかのＲＮＡアプタマーを同定した（図２を参照されたい）。マウスＣＤ８＋  Ｔ細胞が増殖し、そしてインターフェロン−γを分泌するよう誘導する能力に関して、これらのアプタマーをスクリーニングした。これらのスクリーニングのため、ビーズ表面上で、アプタマーをマルチマー化し、次いで細胞とインキュベーションした（図３を参照されたい）。高親和性結合剤サブセットは、細胞増殖およびインターフェロン−γ分泌の両方を誘導することが見出された（図４および５を参照されたい）。
【０００９】
本発明の特定の側面は、以下の、限定されない実施例に、より詳細に記載されうる（米国公開出願第２００３００８３２９４号および第２００３０１７５７０３号も参照されたい）。
実施例１
ＳＥＬＥＸ法を用いて、Ｔ細胞同時刺激受容体４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）に対するＲＮＡアプタマーを選択した。細胞外ＲＮアーゼからＲＮＡを保護し、そしてしたがって動物研究または療法に適したものにするため、これらの選択に用いたＲＮＡ中のピリミジンを２’−フルオロ修飾した。
【００１０】
４−１ＢＢに対する高親和性ＲＮＡアプタマーに関して、３つの選択を行った。４０のランダム化塩基を持つＲＮＡライブラリーを用いて、マウス４−１ＢＢの細胞外部分およびヒトＩｇＧ１の固定部分（Ｆｃ）の融合タンパク質で、第一の選択を行った。総数１２周期の選択を完了した。アプタマーの第１２周期プールは、およそ５０ｎＭの解離定数で、ｍ４−１ＢＢに結合する。Ｆｃに融合させたマウスおよびヒトの４−１ＢＢの両方の細胞外部分の融合タンパク質で、第二の選択を行い；マウス４−１ＢＢ融合体で６周期を行い、その後、ヒト４−１ＢＢ融合体で２周期を行い、そして次いで４つのさらなる周期を行い、各周期で、マウスおよびヒト４−１ＢＢアイソフォームを交互に用いた。この第二の選択もまた、４０のランダム化塩基を持つＲＮＡライブラリーを用いて行った。この選択から得られるアプタマーのプールは、それぞれ、およそ２３ｎＭおよび２００ｎＭの解離定数で、ｈ４−１ＢＢおよびｍ４−１ＢＢに結合する。２０のランダム化塩基を含有するＲＮＡライブラリーとともに、ヒト４−１ＢＢ−Ｆｃ融合体を用いて、第三の選択を行った。９周期後、このライブラリーから得たＲＮＡプールは、およそ２０ｎＭの解離定数で、ｈ４−１ＢＢに結合する（図６）。
実施例２
マウス４−１ＢＢに対するアプタマーの選択によって、高い親和性でｍ４−１ＢＢに結合する、いくつかの配列を得た。これらの高親和性結合剤がｉｎ  ｖｉｔｒｏで４−１ＢＢを刺激する能力に関して、該結合剤を試験した。アプタマーは、一般的に、アプタマー分子あたり１つのタンパク質のみと結合するため、細胞表面上の４−１ＢＢを架橋するためにアプタマーをマルチマー化した。アプタマーをマルチマー化するため、その５’端をビオチンで標識し、そして次いで、ストレプトアビジンでコーティングしたビーズに結合させた。各ストレプトアビジン・タンパク質は、最大４つのビオチン・コンジュゲート化分子に結合可能であるため、ストレプトアビジン結合工程は、ビーズの表面上でアプタマーをマルチマー化した。次いで、マウスＴ細胞上の４−１ＢＢを刺激する能力に関して、ストレプトアビジンでコーティングしたビーズに結合したアプタマーを試験した。
【００１１】
ＢＡＬＢ／Ｃマウスの脾臓からＣＤ８＋  Ｔ細胞を単離し、そして次いで、ウェルあたり１０６細胞の９６ウェル丸底プレート中で、最適以下の濃度の抗ＣＤ３ｅ（１μｇ／ｍｌ）と２０時間インキュベーションした。次いで、陽性対照として、４−１ＢＢを刺激することが知られる抗４−１ＢＢ抗体（３Ｈ３）を、いくつかのウェルに、５μｇ／ｍｌで添加して、そして陰性対照として、アイソタイプが一致した対照抗体（ラットＩｇＧ２ａ）を他のウェルに５μｇ／ｍｌで添加した。同時に、ビオチン化ＲＮＡ配列のランダム化ライブラリー、またはｍ４−１ＢＢに高い親和性（〜５０ｎＭ）で結合する個々のビオチン化アプタマーのいずれかにカップリングさせた、１．２５ｘ１０６の、ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズを、最適以下に刺激された細胞のさらなるウェルに添加した。さらに４８時間、細胞をインキュベーションした後、ＥＬＩＳＡを行って、細胞上清中のインターフェロン−γの相対的レベルを測定した。
【００１２】
抗４−１ＢＢ抗体（図７の「抗ＣＤ３＋３Ｈ３」を参照されたい）は、典型的には、アイソタイプが一致した対照抗体（図７の「抗ＣＤ３＋ラットＩｇＧ２ａ」を参照されたい）と比較して、インターフェロン−γの３〜４倍の増加を生じた。ランダム化ＲＮＡライブラリー（図７の「抗ＣＤ３＋Ｓｅｌ  Ｉ  Ｓｔｒｅｐｔ．」を参照されたい）にカップリングしたビーズは、アイソタイプが一致した陰性対照抗体と匹敵するレベルのインターフェロン−γを誘導した。試験したアプタマー配列のうち２つが、陰性対照を超える、インターフェロン−γレベルの実質的な増加を生じた。２つのうち、より有効なＭ１２−２２（図７の「抗ＣＤ３＋Ｍ１２−２２−Ｓｔｒｅｐｔ．」を参照されたい）は、ランダム化ＲＮＡライブラリーによって誘導されるものより２．７〜３倍高い、インターフェロン−γレベルを誘導した。ストレプトアビジンでコーティングしたビーズのみ（図７の「抗ＣＤ３＋Ｓｔｒｅｐｔ．」を参照されたい）は、他の陰性対照に匹敵するインターフェロン−γレベルを生じた。
【００１３】
４−１ＢＢ刺激のさらなる測定値として、上に記載するのと同じ方式で刺激したマウスＣＤ８＋  Ｔ細胞の培養において、細胞増殖もまた測定した。二重点突然変異体アプタマーである対照に比較した際、アプタマーＭ１２−２２に応答した増殖のおよそ３倍の増加が見出された。Ｍ１２−２２に応答した増殖は、抗４−１ＢＢ抗体陽性対照のものに匹敵し、一方、突然変異体アプタマーに応答した増殖は、アイソタイプが一致した対照抗体のものに匹敵した。
【００１４】
総合すると、インターフェロン−γおよび増殖アッセイによって、マルチマー化Ｍ１２−２２アプタマーが４−１ＢＢを刺激可能であることが示される。
【００１５】
上に引用するすべての文書および他の情報供給源は、本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＳＥＬＥＸ。
【図２】図２Ａ〜２Ｃ。マウス４−１ＢＢに対して高い親和性を持つＲＮＡアプタマーの同定。図２Ａ。Ｍ４−１ＢＢに対するＳｅｌ  Ｉの結合。図２Ｂ。１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中のＭ４−１ＢＢに対するＳｅｌ  Ｉおよび選択周期の結合。図２Ｃ。Ｍ４−１ＢＢ  Ｓｅｌｅｘ／第１２周期クローン。
【図３】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで４−１ＢＢを刺激するための戦略。
【図４】ＣＤ８＋  Ｔ細胞培養の上清を用いたインターフェロン−γ  ＥＬＩＳＡ。
【図５】図５Ａ〜５Ｇ。ＣＤ８＋  Ｔ細胞を用いたＣＦＳＥ増殖アッセイ。図５Ａ。第２日。未処理。図５Ｂ。第４日、＋Ｈａｍｓ  ＩｇＧ。図５Ｃ。第４日、＋抗ＣＤ３、＋ＲＩｇＧ２ａ。図５Ｄ。第４日、＋抗ＣＤ３、および抗４−１ＢＢ。図５Ｅ。第４日、抗ＣＤ３、＋Ｍ１２−１２。図５Ｆ。第４日、＋抗ＣＤ３、＋ｍｕｔ  Ｍ１２−１２。図５Ｇ。第４日、＋Ｈａｍｓ  ＩｇＧ、＋Ｍ１２−１２。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｅ。図６Ａ。Ｍ４−１ＢＢ  ｓｅｌｅｘの第１２周期の４０ｂｐランダム化領域。図６Ｂ。Ｍ４−１ＢＢ  ｓｅｌｅｘの第１０周期の４０ｂｐランダム化領域。図６Ｃ。Ｔｏｇｇｌｅ  ４−１ＢＢ  ｓｅｌｅｘの第１２周期の４０ｂｐランダム化領域。図６Ｄ。Ｔｏｇｇｌｅ  ４−１ＢＢ  ｓｅｌｅｘの第１０周期の４０ｂｐランダム化領域。図６Ｅ。全長アプタマーの５’端に隣接する配列。
【図６−２】図６Ａ〜６Ｅ。図６Ａ。Ｍ４−１ＢＢ  ｓｅｌｅｘの第１２周期の４０ｂｐランダム化領域。図６Ｂ。Ｍ４−１ＢＢ  ｓｅｌｅｘの第１０周期の４０ｂｐランダム化領域。図６Ｃ。Ｔｏｇｇｌｅ  ４−１ＢＢ  ｓｅｌｅｘの第１２周期の４０ｂｐランダム化領域。図６Ｄ。Ｔｏｇｇｌｅ  ４−１ＢＢ  ｓｅｌｅｘの第１０周期の４０ｂｐランダム化領域。図６Ｅ。全長アプタマーの５’端に隣接する配列。
【図７】インターフェロンγ  ＥＬＩＳＡ。
【図１】
2009508491.tif 000002
【図２】
2009508491.tif 000003
【図３】
2009508491.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６−１】
2009508491.tif 000007
【図６−２】
2009508491.tif 000008
【図７】
2009508491.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月22日(2008.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高い親和性でターゲット分子に結合し、そして前記ターゲット分子を刺激する、核酸アプタマー。
【請求項２】
前記ターゲット分子が細胞表面受容体である、請求項１記載のアプタマー。
【請求項３】
前記細胞表面受容体が、Ｔ細胞表面受容体である、請求項２記載のアプタマー。
【請求項４】
前記細胞表面受容体が４−１ＢＢである、請求項３記載のアプタマー。
【請求項５】
前記アプタマーがモノマーである、請求項１記載のアプタマー。
【請求項６】
前記アプタマーがマルチマーである、請求項１記載のアプタマー。
【請求項７】
前記マルチマーが固体支持体に結合している、請求項６記載のアプタマー。
【請求項８】
前記アプタマーの少なくとも１塩基が修飾されている、請求項１記載のアプタマー。
【請求項９】
前記アプタマーの少なくとも１塩基が２’−フルオロ修飾されている、請求項８記載のアプタマー。
【請求項１０】
前記アプタマーがマルチマー化されており、そしてＭ１２−２２である、請求項１記載のアプタマー。
【請求項１１】
請求項１記載の前記アプタマーおよびキャリアーを含む、組成物。
【請求項１２】
ターゲット分子を刺激する方法であって、該ターゲット分子に高い親和性で結合し、そしてその活性を刺激する核酸アプタマーと、前記ターゲット分子を接触させることを含む、前記方法。
【請求項１３】
腫瘍増殖を阻害する必要がある患者において、腫瘍増殖を阻害する方法であって、前記患者に、前記阻害を達成するのに十分な量の請求項４記載のアプタマーを投与することを含む、前記方法。
【請求項１４】
前記アプタマーがＭ１２−２２である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記アプタマーがマルチマー化されたＭ１２−２２である、請求項１４記載の方法。
【国際調査報告】
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2009508491.tif 000011