(57)【要約】  本発明は、抗毒素がその同族の毒素と複合体を形成することを阻止するかまたは部分的に阻止する作用物質を同定する方法であって、溶液中で標識した基質と潜在的作用物質とを接触させることを含み、それにより標識の検出は、抗毒素が毒素と複合体を形成することを阻止する作用物質が存在することを示す方法を提供する。また本発明は、毒素−抗毒素複合体の形成を妨害することができる作用物質を提供する。このような作用物質は、ヒト病原性細菌に対して新しい従来にない抗生物質として機能する。
2009531034.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗毒素がその同族の毒素と複合体を形成することを阻止するかまたは部分的に阻止する作用物質を同定する方法であって、溶液中で標識した基質と潜在的作用物質とを接触させることを含み、それにより標識の検出は、抗毒素が毒素と複合体を形成することを阻止する作用物質が存在することを示す方法。
【請求項２】
ｍＲＮＡインターフェレースとして機能する作用物質を同定するために使用される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記基質が短いＤＮＡ−ＲＮＡキメラ基質を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記キメラ基質が約１２個の塩基を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記基質が、５’末端に蛍光プローブおよび３’末端にクエンチャーを結合することにより標識されたｄＧｄＡｄＴｄＡｒＵｄＡｄＣｄＡｄＴｄＡｄＴｄＧである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記蛍光プローブがＲＯＸであり、クエンチャーがＥｃｌｉｐｓｅである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記基質が切断可能なビーコン基質（ＣＢＳ−１）である請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ＭａｚＥ／ＭａｚＦ複合体形成を阻止する作用物質を同定するために使用される請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記基質が、５’末端に蛍光プローブおよび３’末端にクエンチャーを結合することにより標識されたｄＧｄＡｄＴｄＡｒＵｒＡｒＣｄＧｄＴｄＡｄＴｄＧである請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記蛍光プローブがＲＯＸであり、クエンチャーがＥｃｌｉｐｓｅである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記基質が切断可能なビーコン基質（ＣＢＳ−２）である請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ＣｈｐＢＩ／ＣｈｐＢＫ複合体形成またはＹｄｃＤ／ＹｄｃＥ複合体形成を阻止する作用物質を同定するために使用される請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記基質が、５’末端に蛍光プローブおよび３’末端にクエンチャーを結合することにより標識されたｄＧｄＡｄＴｄＡｒＵｒＡｒＣｄＣｄＴｄＡｄＴｄＧである請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
前記蛍光プローブがＲＯＸであり、クエンチャーがＥｃｌｉｐｓｅである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記基質が切断可能なビーコン基質（ＣＢＳ−３）である請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＹｄｃＤ／ＹｄｃＥ複合体形成を阻止する作用物質を同定するために使用される請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記基質が、ＧＦＰタグ付き抗毒素およびＨｉｓタグ付き毒素またはＨｉｓタグ付き抗毒素およびＧＦＰタグ付き毒素を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＧＦＰタグ付き毒素またはＧＦＰタグ付き抗毒素が、前記ＧＦＰと前記毒素の間または前記ＧＦＰと前記抗毒素の間にリンカーを含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ｍＲＮＡインターフェレースとして機能しない作用物質を検出するために使用される請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記標識したＡＴ複合体基質が解離した場合、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｂｅａｄｓを用いてＨｉｓタグ付き毒素を除去した後に、溶液中でＧＦＰタグ付き抗毒素から生成したＧＦＰ蛍光シグナルを測定することにより検出される請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記標識したＡＴ複合体基質が解離した場合、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｂｅａｄｓを用いてＨｉｓタグ付き抗毒素を除去した後に、溶液中でＧＦＰタグ付き毒素から生成されたＧＦＰ蛍光シグナルを測定することにより検出される請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法により同定される作用物質。
【請求項２３】
毒素−抗毒素複合体の形成を妨害することができる作用物質。
【請求項２４】
前記毒素−抗毒素複合体が細菌細胞中に存在する請求項２２に記載の作用物質。
【請求項２５】
１つまたは複数の異なる従来の抗生物質と組み合わせて、請求項２２に記載の１つまたは複数の異なる作用物質を含む組成物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の組成物を含み、さらに医薬賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２７】
請求項２２に記載の作用物質と微生物細胞を接触させることを含む、微生物細胞を死滅させるまたはその増殖を阻害する方法。
【請求項２８】
請求項２６に記載の医薬組成物を投与することを含む感染を治療する方法。
【請求項２９】
前記感染が結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記感染が抗生物質耐性菌により引き起こされる請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗生物質耐性菌がバンコマイシンに耐性である請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記微生物細胞がバイオテロリズムに用いられる病原体である請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２２に記載の作用物質と細胞を接触させて、前記細胞を死滅させず、前記細胞を休眠させることにより細菌細胞の休眠を調節する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、Ｉｎｏｕｙｅらによる２００６年３月２２日に出願の「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｕｉｃｉｄｅ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ」と題する米国仮出願第６０／７８４，７７６号の優先権を主張するものである。本出願のすべての開示は、参考として本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、タンパク質の産生および溶解度を増強するシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、従来の標的スクリーニング法に基づかない新たな抗生物質を検索する新規の手法に関する。本手法は、共生細菌を除くすべての細菌種に見られる細菌自殺システムを利用する。
【０００４】
一般に抗生物質は、細菌における細胞壁合成、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ合成、タンパク質合成ならびに必須の小分子合成、例えばアミノ酸、ヌクレオチドおよびコファクターなどの生合成経路を標的にする。抗生物質による標的経路の阻害により、細菌の細胞増殖は阻害され多くの場合細胞死をもたらす。
【０００５】
細菌は一般に、いわゆる毒素−抗毒素（ＴＡ）または「自殺」遺伝子システムを備えており、これは増殖調節、細胞死およびストレス条件下での休眠において重要な役割を果たすと考えられている。正常な増殖条件下で、ある毒素は同じオペロン（ＴＡオペロン）によりコードされるその同族の抗毒素（ｃｏｇｎａｔｅ  ａｎｔｉｔｏｘｉｎ）と安定な複合体を形成して、毒素はその細胞標的に作用する能力を失う。しかしストレス条件下において、不安定な抗毒素は細胞質中への遊離毒素の同時放出により急速に分解し、次いで特定の細胞標的に遊離毒素の毒性効果を及ぼす。
【０００６】
細菌ゲノム上に存在する毒素または自殺遺伝子の数は大きく変化し、大腸菌は典型的には６つの独立したＴＡオペロンを含みそれぞれは一対の抗毒素とその同族の毒素をコードしているが、結核菌は約４０のこのようなオペロンを含んでいる。現在までに配列決定されたすべての病原性細菌のゲノムは、宿主細胞と共に特定の環境だけに生存するクラミジアおよびマイコプラズマなどの細菌を除き、１つまたは複数のＴＡオペロンを含んでいる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の６つのＴＡオペロンのうち、３つはよく特徴付けられており、ＲｅｌＥはリボソームのエンドリボヌクレアーゼ活性を促進するリボソーム関連因子であり、ＭａｚＦおよびＣｈｐＢＫは、ｍＲＮＡインターフェラーゼ（ＭＩａｓｅ）と呼ばれる配列特異的エンドリボヌクレアーゼとして機能する。ＭａｚＦは誘導されたとき、ＡＣＡ配列で細胞のｍＲＮＡを切断し、これによって細胞のタンパク質合成を、したがって細胞増殖を効果的に阻害することが示された。ＭａｚＦは、その抗毒素であるＭａｚＥと安定な複合体を形成し、ＭａｚＦ−ＭａｚＥ複合体のＸ線構造が決定された。ＴＡ複合体は細胞に対して毒性でないため、これらは大腸菌で十分に発現し、非常に高い収量で容易に精製される。最近ではＲｅｌＥ−ＲｅｌＢおよびＹｏｅＢ−ＹｅｆＭ複合体のＸ線構造も決定され、毒素と抗毒素がＴＡ複合体中でどのように相互作用するかが明らかにされた。
【０００７】
大部分の細菌は、それらのゲノム中に多数の毒素または「自殺」遺伝子を含んでいる。重要なことは、これらの遺伝子から産生される毒素は、その生息場所で他の細菌を殺すことも、また感染過程で動物細胞を殺すことも意図しないことである。その代わりにこれらは細胞内で産生され、それ自体に対して毒性である。この新たな分野における最近の発展は、細菌生理学でのこれらの毒素の役割、多剤耐性の存続、病原性、バイオフィルム形成および進化に対する多くの興味深い洞察をもたらした。現在ではこれらの毒素の研究は、感染症および医科学において非常に重要な意味をもつことが明らかになっている。大部分のこれらの毒素は、オペロン中のそれらの同族の抗毒素と共に転写され（したがって、毒素−抗毒素またはＴＡオペロンと呼ばれる）、これらは正常な増殖条件下の細胞中で安定な複合体を形成するので、一般的にはこれらの毒素の毒性効果は発揮されない（Ｂａｙｌｅｓ、２００３；Ｅｎｇｅｌｂｅｒｇ−Ｋｕｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．、２００４；Ｈａｙｅｓ、２００３；Ｒｉｃｅ  ａｎｄ  Ｂａｙｌｅｓ、２００３）。しかし抗毒素の安定性はそれらの同族の毒素の安定性よりもずっと低いので、細胞の傷害または増殖阻害を生じるあらゆるストレスは、細胞における毒素と抗毒素の間の平衡に影響を及ぼし、細胞中で毒素の放出に導く。多くの議論にもかかわらず、ＴＡオペロンによりコードされるこれらの毒素は、ストレスの性質に依存する２つの異なる方法で機能すると考えるのが最も合理的である。その１つは、ＤＮＡ複製およびタンパク質合成などの特定の細胞機能を阻止することによって増殖速度を調節することである。毒素の量が抗毒素を超える大きなストレス下では、細胞増殖は完全に静止され得る。増殖調節に対するＴＡ毒素のこの役割が、この毒素の主要な機能である可能性がある。しかしこの毒素の第２の役割は自殺に導くものであり、すなわちこの毒素自体の宿主細胞を殺すことである。特定の条件下において、ＴＡ毒素は健全集団を維持するために、高度に損傷を受けた（例えば、ＤＮＡ損傷またはファージ感染）細胞を除去するように機能することができる。ＴＡオペロンは、細胞分裂後にプラスミドを喪失した細胞を殺すポスト・セグリゲーショナル・キリング（ｐｏｓｔ−ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎａｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ）として知られている現象において役割を果たすプラスミド中にしばしば見いだされる。したがってＴＡ毒素は主として静菌性であり、殺菌性ではない（Ｇｅｒｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）、しかし一定条件では細胞は復帰不能点に到達する場合があり、細胞死をもたらす（Ａｍｉｔａｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）。最近Ｅｎｇｅｌｂｅｒｇ−Ｋｕｌｋａは、大腸菌毒素の１つであるＭａｚＦは細胞死のエクセキューショナーではなく、むしろ下流のシステムを活性化するメディエーターであると提案している（Ｅｎｇｅｌｂｅｒｇ−Ｋｕｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）。
【０００８】
現在までに多数のＴＡモジュールがある程度詳細に研究されており、これらはｐｈｄ−ｄｏｃモジュールをコードするバクテリオファージ（Ｇａｚｉｔ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ、１９９９）、ｋｉｓ−ｋｉｄ（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）、ｐｅｍｌ−ｐｅｍＫ（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）およびｃｃｄＡ−ｃｃｄＢ（Ｌｏｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９）モジュールをコードするプラスミドならびに染色体にコードされたｒｅｌＢ−ｒｅｌＥ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．、２００３；Ｔａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）、ｃｈｐＢＩ−ｃｈｐＢＫ（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００５ｂ）、ｍａｚＥ−ｍａｚＦ（Ｋａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２００３；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００３ａ；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００３ｂ）および大腸菌ゲノム由来のｙｅｆＭ−ＹｏｅＢ（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００４；Ｋａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）モジュールであった。これに加えて大腸菌ゲノムはさらに２つの機能未知のＴＡモジュールであるｄｉｎＪ−ｙａｆＱおよびｈｉｐＢ−ｈｉｐＡを含んでいる。このｈｉｐＢ−ｈｉｐＡモジュールは、多剤耐性に導く存続に役割を果たすことに関与している（Ｋｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００４；Ｋｏｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。興味深いことには、すべてのＴＡオペロンが、調節の同様な様式である抗毒素および毒素と抗毒素の複合体による自動調節を得ているようである。さらにまた、様々なストレス下で産生されことが知られている（ｐ）ｐｐＧｐｐが、ＴＡオペロンの誘導に重要な役割を果たしているようである（Ｇｅｒｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００５の総説を参照のこと）。これらの毒素の１つであるＣｃｄＢは、直接ジャイラーゼＡと相互作用してＤＮＡ複製をブロックする（Ｂａｈａｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９；Ｋａｍｐｒａｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９）。Ｋｉｄは、染色体の複製および細胞増殖に必要とされるヘリカーゼであるＤｎａＢと相互作用することを提案している（Ｒｕｉｚ−Ｅｃｈｅｖａｒｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５）。ＲｅｌＥは、リボソームＡ部位でｍＲＮＡ切断を促進するリボソーム関連因子として機能しているようであり（Ｈａｙｅｓ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ、２００３）、ＰｅｍＫ（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）およびＭａｚＦ（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００３ｂ）は、分解のために遊離のｍＲＮＡを標的にするようである。
【特許文献１】米国仮出願第６０／７８４，７７６号
【特許文献２】米国特許第５，６５６，４９３号
【特許文献３】米国特許第５，３３，６７５号
【特許文献４】米国特許第５，２３４，８２４号
【特許文献５】米国特許第５，１８７，０８３号
【非特許文献１】Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｚＥＦ  ａｄｄｉｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２００３）２７８、３２３００〜３２３０６頁（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００３ａ）
【非特許文献２】ＭａｚＦ  ｃｌｅａｖｅｓ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍＲＮＡｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ａｔ  ＡＣＡ  ｔｏ  ｂｌｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ（２００３）１２、９１３〜９２３頁（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００３ｂ）
【非特許文献３】Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＰｅｍＫ、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．（２００４）、２７９、２０６７８〜２０６８４頁、（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）
【非特許文献４】Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｍＲＮＡ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｂｙ  ＭａｚＦ，ａｎ  ｍＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒａｓｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）２８０、３１４３〜３１５０頁（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００５ａ）
【非特許文献５】Ｓｉｎｇｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｍＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒａｓｅ    Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ（２００５）１８、２５３〜２６１頁（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）
【非特許文献６】Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣｈｐＢＫ，ａｎ  ｍＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｋｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）２８０、２６０８０〜２６０８８頁（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００５ｂ）
【非特許文献７】Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｕａｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｍＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒａｓｅ  ＭａｚＦ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
最近の多剤耐性菌の出現は、公衆衛生にとって大きな脅威である。特にバンコマイシン耐性菌の最近の発見は、バンコマイシンは多剤耐性病原体に対する最後の手段であると考えられるので重大な問題であった。したがって新たな抗生物質の開発が、特に現在利用できる従来の抗生物質の標的としてこれまでに利用されなかった新規の細胞機能を標的にする抗生物質の開発が早急に求められている。
【００１０】
細菌性病原体はバイオテロリズムに用いることが可能なので、細菌自殺ＴＡシステムなどの新規の細胞機能を標的にする強力な従来にない抗生物質を開発することが重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、抗毒素がその同族の毒素と複合体を形成することを阻止するかまたは部分的に阻止する作用物質を同定する方法であって、溶液中で標識した基質と潜在的作用物質とを接触させることを含み、それにより標識の検出は、抗毒素が毒素と複合体を形成することを阻止する作用物質が存在することを示す方法を提供する。また本発明は、毒素−抗毒素複合体の形成を妨害することができる作用物質を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の１つの実施形態は、抗毒素がその同族の毒素と複合体を形成することができないように抗毒素を妨害する作用物質をスクリーンする方法である。このような作用物質は、細菌増殖を阻害する抗生物質として機能することができる。従来の抗生物質と異なり、毒素−抗毒素（「ＴＡ」）複合体形成を標的にする抗生物質は、主としてＴＡ複合体から毒素を遊離することにより細胞増殖に相乗的な阻害効果を生じ、その結果ＴＡオペロン発現の抑制解除に導くことが期待される。その結果さらに多くの活性毒素が細胞質中に放出され、さらに効果的な増殖阻害および最終的に細胞死を引き起こす。このことはＴＡ複合体は、抗毒素単独でより一層効率良くＴＡオペロンの転写を阻害するという事実によるものである。
【００１３】
ほとんどすべての細菌は、細胞中にその毒素と同族の抗毒素と安定なＴＡ複合体を形成する毒素を含んでおり、その結果毒素が細胞にその毒性効果を及ぼすことができない。本発明は、細胞中でＴＡ複合体を解離させて毒素を放出することができる小さな化学物質をスクリーニングするハイスループット・スクリーニングを提供する。次いで本スクリーニング技術は、本発明が包含する新規のクラスの抗生物質の検出も容易にする。
【００１４】
本発明の実施形態は、その毒素が任意のｍＲＮＡインターフェレース（ＭＩａｓｅ）として機能するＴＡシステムを含む任意のＴＡシステムに破壊的な作用物質についてのスクリーニングシステムを包含する。本発明によれば、特異的な切断可能なビーコン基質は、上記の方法に従ってそれぞれのＭＩａｓｅに対して合成される。したがって、その毒素がＭＩａｓｅとして機能する個々のＴＡシステムに特異的なスクリーニングシステムが本明細書で提供される。本発明の他の実施形態は、以下に記載のように分離のためのＨｉｓ−タグを有するＧＦＰ融合ＴＡ複合体を用いる非ＭＩａｓｅ毒素のスクリーニングシステムを包含する。
【００１５】
したがって、本発明は抗毒素がその同族の毒素と複合体を形成することを阻止するかまたは部分的に阻止する作用物質を同定する方法を提供する。本発明の作用物質は、抗毒素がその同族の毒素と複合体を形成することができないように抗毒素を妨害するのが好ましい。そのような複合体の形成を標的にすることにより、本発明の作用物質は抗生物質の新しい従来にない形態として有用である。
【００１６】
本発明の作用物質は、特定の細菌または特定のグループの細菌を特異的に標的にするものを含む。したがって本発明のスクリーニング（同定）方法は、それぞれ特定のＴＡシステムに対して極めて高感度、すなわち特異的である。
【００１７】
作用物質は任意の分子であり得て、小分子または化学物質であるのが好ましいが、本発明は小分子に限定されない。本発明により包含され得る大きな分子には、とりわけペプチド、ポリペチド、およびタンパク質が含まれる。
【００１８】
本発明の方法は、溶液中で標識した基質と潜在的作用物質とを接触させることを含む。ｍＲＮＡインターフェレースとして機能する作用物質を同定するために用いた場合、１つの実施形態ではこの基質は短いＤＮＡ−ＲＮＡキメラ基質を含むことができる。このような基質は、理想的には長さが約５〜約２０のヌクレオチド塩基であり、より好ましくは約１２ヌクレオチド塩基である。この標識した基質は、１つの特定のまたは２つ以上の特定のＴＡシステムに特異的な切断可能なビーコン基質であり得る。典型的には、ＭＩａｓｅインヒビターは、特定の重要な塩基、すなわちＭａｚＦ毒素によって切断されるｒＵ残基リボヌクレオチドを切断する。したがってこの切断可能な基質の１つの実施形態は、ｒＵとｄＡ間に切断可能部位を含む修飾された基質を用いる。潜在的な作用物質は、ＭａｚＦまたはその他の毒素として作用する場合にはその部位で切断するであろう。本発明の有効なプローブは、３’末端にクエンチャーを有する５’末端の蛍光である。好ましい方法において、蛍光プローブはＲＯＸであり、クエンチャーはＥｃｌｉｐｓｅである。切断されたとき、この蛍光プローブはクエンチャーから分離して蛍光を発する。このようなプローブまたは基質は、切断可能なビーコン基質（ＣＢＳ）と呼ばれている。当分野で知られているその他のプローブを、本発明の方法と共に用い得る。標識したプローブの検出（切断されたとき）は、抗毒素が毒素と複合体を形成することを阻止する作用物質の存在を示す。
【００１９】
１つの実施形態では、この基質はｄＧｄＡｄＴｄＡｒＵｄＡｄＣｄＡｄＴｄＡｄＴｄＧである。別の実施形態においては、この基質は切断可能なビーコン基質（ＣＢＳ−１）であり、ＭａｚＥ／ＭａｚＦ複合体形成を阻止する作用物質を同定するために使用される。
【００２０】
別の実施形態においては、この基質はｄＧｄＡｄＴｄＡｒＵｒＡｒＣｄＧｄＴｄＡｄＴｄＧである。別の実施形態においては、この基質は切断可能なビーコン基質（ＣＢＳ−２）であり、ＣｈｐＢＩ／ＣｈｐＢＫ複合体形成またはＹｄｅＤ／ＹｄｃＥ複合体形成を阻止する作用物質を同定するために使用される。
【００２１】
別の実施形態においては、この基質はｄＧｄＡｄＴｄＡｒＵｒＡｒＣｄＣｄＴｄＡｄＴｄＧである。別の実施形態においては、この基質は切断可能なビーコン基質（ＣＢＳ−３）であり、ＹｄｃＤ／ＹｄｃＥ複合体形成を阻止する作用物質を同定するために使用される。
【００２２】
非ＭＩａｓｅタイプ毒素に有効な本発明の方法の別の実施形態では、この基質は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ付き抗毒素およびＨｉｓタグ付き毒素を含む。あるいは、この基質はＨｉｓタグ付き抗毒素およびＧＦＰタグ付き毒素を含む。このＧＦＰタグ付き毒素またはＧＦＰタグ付き抗毒素は、ＧＦＰと毒素の間またはＧＦＰと抗毒素の間に位置するリンカーを含む。本発明のリンカーは、タンパク質の任意の機能を提供するタンパク質に応じて様々な長さである。ＧＦＰ融合が、ＴＡ複合体形成を阻害しないようにすべきである。適切な大きさのリンカーが、それぞれのＧＦＰ融合ＴＡ複合体に対して容易に決定され得る。
【００２３】
作用物質による基質、すなわちＴＡ複合体の解離は、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｂｅａｄｓを用いてＨｉｓタグ付き毒素の除去後に、溶液中にＧＦＰタグ付き抗毒素から生成したＧＦＰ蛍光シグナルを測定することにより検出される。あるいはＧＦＰタグが抗毒素の代わりに毒素に融合し、Ｈｉｓタグが毒素の代わりに抗毒素に結合する場合、ＴＡ複合体の解離は、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｂｅａｄｓを用いてＨｉｓタグ付き抗毒素を除去後に、溶液の中のＧＦＰタグ付き毒素から生成するＧＦＰ蛍光シグナルを測定することにより検出される。
【００２４】
さらに本発明は、本発明のいずれかの方法によって同定される作用物質を提供する。したがって発明の作用物質はＴＡ複合体の形成を妨害することができ、従来にない抗生物質として機能することができる。このＴＡ複合体は、典型的には細菌細胞に由来する。本発明の新規の抗生物質は、ヒト病原性細菌に対するのが好ましい。
【００２５】
本発明はまた、１つまたは複数の異なる従来の抗生物質と組み合わせて本発明の１つまたは複数の異なる作用物質を含む組成物を提供する。この組成物は、医薬賦形剤をさらに含む医薬組成物であり得る。
【００２６】
場合によっては１つまたは複数の従来の抗生物質と組み合わせて用いられた複数の作用物質は、そのような作用物質および／または抗生物質の付加的または相乗的効果を提供する。そのような異なる作用物質は、１つの病原性細菌において複数のＴＡ複合体（システム）に作用することができ、部分的にまたは全面的にＴＡ複合体を阻害する。
【００２７】
さらに本発明は、発明のある作用物質と病原体を接触させることを含む微生物細胞の殺傷または増殖を阻害する方法を提供する。さらに本発明は、本発明の医薬組成物のいずれかを投与することを含む感染を治療する方法を提供する。そのような感染は、結核菌、抗生物質耐性または多剤耐性菌、例えばバンコマイシン耐性菌などであり得る。本発明の方法は、バイオテロリズムに使用される病原体も包含する。
【００２８】
また本発明の作用物質と細胞を接触させて、細胞を死せる代わりに細胞を休眠させることにより調節される細菌細胞の休眠を調節する方法を提供する。
【００２９】
「病原体」、「微生物因子」、「感染因子」は、本明細書においてすべて交換可能に用いられて、その宿主に疾患または疾病を引き起こす生物学的因子を意味する。本明細書で用いる「感染」とは、外来種による宿主生物への侵入である。
【００３０】
本発明の組成物は、経口的に、経頬的に、非経口的に、経鼻的に、経直腸的に、または局所的に投与され得る。本発明の方法で用いられる製薬担体および賦形剤は、当該分野において既知のものである。
【００３１】
「インヒビター」という用語は、別の因子の作用を阻止する、低減する、ブロックする、中和するまたは打ち消す因子を表す。
【００３２】
「ｃＤＮＡ」という用語は、酵素リバーストランスクリプターゼを用いてｍＲＮＡテンプレートから合成された１本鎖の相補的ＤＮＡまたはコピーＤＮＡを表す。１本鎖ｃＤＮＡは、多くの場合ＤＮＡフラグメント中の相補的配列または所望の遺伝子を同定するプローブとして用いられる。
【００３３】
本明細書で用いる特定の核酸に関する「コードする」、「コードしている」または「コードされた」という用語は、特定のタンパク質への翻訳のために核酸中に保存された情報を表す。タンパク質をコードする核酸は、核酸の翻訳された領域内に非翻訳配列（例えば、イントロン）を含むことができるか、またはそのような介在非翻訳配列（例えば、ｃＤＮＡの場合のように）を欠失することができる。タンパク質がコードされる情報は、コドンの使用により特定されている。典型的には、アミノ酸配列は「普遍的」遺伝コードを用いる核酸によってコードされている。
【００３４】
当業者は、コードされた配列中の１つアミノ酸またはアミノ酸の少ないパーセンテージを変更、付加または欠失させる核酸、ペプチド、ポリペチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加は、「保存的に修飾された変異体」であり、この変更が化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸置換をもたらすことを認識するであろう。「保存的に修飾された変異体」という用語は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体とは、同一であるかまたは保存的に修飾されたアミノ酸配列の変異体をコードする変異体の核酸を表す。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡおよびＣＵＧは、すべてアミノ酸ロイシンをコードする。したがって、ロイシンがコドンで特定されるすべての位置において、このコドンは、コードされたポリペチドを変更することなく記載されたいずれかの対応するコドンに変更することができる。このような核酸変異は、「サイレント変異」であり、保存的に修飾された変異の１つの種を示す。またポリペチドをコードする本明細書におけるすべての核酸配列は、遺伝コードを参照することにより、その核酸のすべての起こりうるサイレント変異を記載している。当業者は、核酸のそれぞれコドン（通常はメチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファンに対する唯一のコドンであるＵＧＧを除いて）は、修飾して機能的に同一の分子を生じることができることを認識するであろう。したがって、本発明のポリペチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異は、本発明の範囲内に包含される。
【００３５】
本発明は、ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペチドの活性部分、フラグメント、誘導体、変異株、および機能的変異体を、そのような活性部分、フラグメント、誘導体、および機能的変異体が、ｍＲＭＡインターフェレースの生物学的特性のいずれかを保持する程度まで含んでいる。ｍＲＮＡインターフェレース・ポリペチドの「活性部分」とは、完全長のポリペチドより短いが、測定可能な生物活性を保持するペプチドを意味する。ｍＲＮＡインターフェレースの「フラグメント」とは、少なくとも５〜７個の連続したアミノ酸、多くの場合少なくとも約７〜９個の連続したアミノ酸、典型的には少なくとも約９〜１３個の連続したアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約２０〜３０個かそれ以上の連続したアミノ酸のアミノ酸残基の領域を意味する。ｍＲＮＡインターフェレースまたはそのフラグメントの「誘導体」とは、タンパク質の様々なアミノ酸配列によって修飾された、例えばタンパク質をコードする核酸を操作することによって、またはタンパク質自体を変更することによって修飾されたポリペチドを意味する。天然のアミノ酸配列のそのような誘導体は、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、付加、欠失、または置換を含み得て、元のｍＲＮＡインターフェレースの必須な活性を変更し得る場合もあれば変更し得ない場合もある。
【００３６】
「遺伝子」という用語は、特異的な機能的産物（すなわち、タンパク質またはＲＮＡ分子）をコードするＤＮＡのセグメントの特定の位置に位置するヌクレオチドの秩序ある配列を表す。これはコーディングＤＮＡの前後の領域およびエキソン間のイントロンを含むことができる。
【００３７】
「誘導する」または「誘導性」という用語は、細胞を誘導物質または周囲状況に曝露することにより、その転写または合成が増加する遺伝子または遺伝子産物を表す。
【００３８】
「誘導物質」または「誘導因子」という用語は、リプレッサータンパク質と結合して、もはやオペレーターに結合することができない複合体を生成する低分子量化合物または物理的な因子を表す。
【００３９】
核酸を細胞に挿入することの関連において、「導入した」、「トランスフェクション」、「トランスフォーメーション」、「トランスダクション」という用語は、核酸が、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチドもしくはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれ得るか、自律的なレプリコンに変換され得るか、または一過性で発現（例えば、トランスフェクトしたｍＲＮＡ）され得る原核細胞または真核細胞への核酸の取り込みという意味を含む。
【００４０】
「単離された」という用語は、その物質が天然に存在する環境で見いだされるような、通常はその物質に付随するかまたは相互作用する成分を実質的に含まない核酸またはタンパク質などの物質を表す。単離した物質は、場合によってはその天然の環境でその物質と共に見いだされない物質を含むか、または物質がその天然の環境に存在する場合は、物質は計画的なヒトの介入によって合成的に（非天然に）変更された。例えば「単離した核酸」は、プラスミドもしくはウイルスベクターなどのベクターに挿入されたＤＮＡ分子、または原核細胞もしくは真核細胞もしくは宿主生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を含み得る。ＲＮＡに適用した場合、「単離した核酸」という用語は、上記で定義された単離したＤＮＡ分子によってコードされたＲＮＡ分子を主として表す。あるいはこの用語は、その天然の状態（すなわち、細胞または組織で）で一般に結合している他の核酸から十分に分離されているＲＮＡ分子を表し得る。単離した核酸（ＤＮＡかそれともＲＮＡ）は、さらに生物学的または合成的な方法で直接に生成され、その生成の間に存在するその他の成分から分離された分子を表し得る。
【００４１】
本明細書中で用いる「ＭａｚＥ」という用語は、本発明のＭａｚＦポリペチドの役割と一致する構造的相同性および配列相同性を有する、ＭａｚＦならびにその活性フラグメントおよび誘導体のエンドリボヌクレアーゼ活性を中和する抗毒素の一般的なクラスを表す。
【００４２】
本明細書中で用いる「ＭａｚＦ」という用語は、エンドリボヌクレアーゼの一般的なクラスを表し、特定の名前を持つ特定の酵素ならびに本発明のＭａｚＦポリペチドの役割と一致する構造的相同性および配列相同性を有するその活性フラグメントおよび誘導体を表す。
【００４３】
本発明によって包含される酵素のファミリーは、「ｍＲＮＡインターフェレース」と呼ばれる。本発明を、本発明のこの酵素のファミリーの役割と一致する構造的および機能的類似性を有する分子に拡張する。
【００４４】
本明細書で用いる「核酸」または「核酸分子」という用語は、１本鎖かまたは２本鎖の任意のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含み、１本鎖の場合、線状かまたは環状の形態のその相補的配列の分子を含む。核酸分子を論じる場合、特定の核酸分子の配列または構造は、５’から３’の方向に配列を与える通常の慣例に従って本明細書で記載され得る。他に限定しない限り、この用語は既知のアナログを包含する。
【００４５】
「オペレーター」という用語は、遺伝子（複数可）からの上流（５’）であり、これに１つまたは複数の調節タンパク質（リプレッサーまたはアクティベーター）が結合して遺伝子（複数可）の発現を制御するＤＮＡの領域を表す。
【００４６】
本明細書で用いる「オペロン」という用語は、遺伝子発現制御のために機能的に組み込まれた遺伝的ユニットを表す。これは、１つまたは複数のポリペチド（複数可）および構造遺伝子の転写を調節することによりこれらの発現を制御する隣接部位（プロモーターおよびオペレーター）をコードする１つまたは複数の遺伝子から成っている。「発現オペロン」という用語は、転写および翻訳調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどを有し得る核酸セグメントを表し、そしてこれらは宿主細胞または生物においてポリペチド・コード配列の発現を促進する。
【００４７】
「作動可能に結合された」というフレーズは、プロモーターと第２の配列間の機能的結合という意味を含み、プロモーター配列は第２の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始して媒介する。一般に作動可能に結合したとは、結合されている核酸配列は連続しおり、２つのタンパク質をコードする領域を結合することが必要な場合、連続していて同じ読み枠であることを意味する。
【００４８】
「ポリペチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーについて述べるために本明細書において交換可能に用いられる。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的アナログであるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用する。
【００４９】
「ＰＣＲ」という略語は、ＤＮＡ量を増幅する技術であり、したがってＤＮＡの分離、クローニングおよび配列決定をより容易するポリメラーゼ連鎖反応を表す。例えば米国特許第５，６５６，４９３号、第５，３３，６７５号、第５，２３４，８２４号、および第５，１８７，０８３号を参照のこと、これらの各々は参考として本明細書中に組み込まれる。
【００５０】
本明細書で用いる「プロモーター」という用語は、転写の開始からのＤＮＡ上流（５’）の領域という意味を含み、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与する。「誘導性プロモーター」という用語は、特定の化合物すなわち、誘導物質または誘導因子の存在に応答した、または規定された外部条件、例えば高い温度に応答したプロモーターの活性化を表す。
【００５１】
本明細書で用いる「調節する」という用語は、ある標準もしくは原理または抑制された、促進された、制御された、管理された、指令された、もしくは調整された状態により、阻害する、促進する、制御する、管理する、指令する、または調整する作用を表す。
【００５２】
「リプレッサー」という用語は、それをオン／オフすることによって遺伝子を調節することができる、遺伝子またはオペロンの転写開始点から上流の特異的なＤＮＡ配列（オペレーター）に結合するタンパク質または因子を含む。
【００５３】
「リボソームＲＮＡ」（ｒＲＮＡ）という用語は、すべての生きている細胞のタンパク質製造装置であるリボソームの中心的な成分を表す。これらの装置は、複数のリボソームタンパク質の存在下で、２つの入り組んだ折り畳み構造（大きいサブユニットおよび小さいサブユニット）に自己集合する。細菌、古細菌、ミトコンドリア、およびクロロプラストにおいて、小さなリボソームのサブユニットは１６ＳｒＲＮＡを含み、大きいリボソームのサブユニットは２つのｒＲＮＡ種（５Ｓおよび２３ＳのリボソームＲＮＡ）を含んでおり、ここで１６ＳのＳはＳｖｅｄｂｅｒｇ単位を示す。細菌の１６Ｓ、２３Ｓおよび５ＳｒＲＮＡ遺伝子は、典型的には一緒に転写されるオペロンとして構成されている。ゲノム中に分散したオペロンの１つまたは複数のコピーが存在し得る。真核細胞は、一般にタンデムリピートで構成されたｒＲＮＡ遺伝子の多くのコピーを有する。大部分の真核生物の１８ＳｒＲＮＡは小さなリボソームのサブユニットであり、大きいサブユニットは３つのｒＲＮＡ種（５Ｓ、５．８Ｓおよび２５Ｓ／２８ＳリボソームＲＮＡ）を含んでいる。
【００５４】
「全ＲＮＡ」という用語は、メッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」、細胞でＤＮＡからの情報をタンパク質合成のリボソーム部位へ運び、そこで情報がタンパク質に翻訳されるＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（「ｔＲＮＡ」、タンパク質翻訳の間に、特異的なアミノ酸を成長するポリペプチド鎖へ転移する小さなＲＮＡ鎖；リボソームＲＮＡ（「ｒＲＮＡ」）、および非翻訳ＲＮＡ（ＲＮＡ遺伝子または小さいＲＮＡとしても知られており、タンパク質に翻訳されないＲＮＡをコードする遺伝子を意味している）を含む。
【００５５】
「ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動」という用語はＳＤＳ−ＰＡＧＥと略される。
【００５６】
核酸の特定の配列の「変異体」、「突然変異体」および「誘導体」という用語は、特定の配列に密接に関連しているが、配列または構造において天然にかまたは設計により変化を有し得る核酸配列を表す。「密接に関連した」とは、その配列のヌクレオチドの少なくとも約６０％、しかし多くの場合は８５％を超えて、核酸配列の定義された長さに渡って整合することを意味する。密接に関連した核酸配列間の核酸配列における変化または差異は、特定の核酸配列の性質に正常な複製または複写の間に生じる配列におけるヌクレオチド変化を示し得る。その他の変化は、特定の目的のために特異的に設計し得て、配列に導入し得る。そのような特定の変化は、種々の突然変異誘発技術を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施し得る。特異的に作製されたそのような配列変異体は、本来の配列の「突然変異体」または「誘導体」として表し得る。
【００５７】
当業者は同様に１個または複数個のアミノ酸置換、欠失、付加または置き換えを有するタンパク質変異体を作製できる。これらの変異体は、とりわけ（ａ）１つまたは複数のアミノ酸残基が、保存的であるかまたは非保存的アミノ酸で置換された変異体；（ｂ）１つまたは複数のアミノ酸が添加された変異体；（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸が、置換基を含む変異体；（ｄ）１つの種由来のアミノ酸残基が、保存された位置かまたは保存されていない位置で別の種において対応する残基と置換される変異体；および（ｄ）標的タンパク質が、標的タンパク質に有用な特性、例えば抗体に対するエピトープなどを与え得る融合パートナー、タンパク質タグもしくは他の化学的部分などの別のペプチドまたはポリペチドと融合した変異体を含み得る。遺伝的（抑制、欠失、突然変異など）、化学的および酵素的技術を含むこのような変異体を得る技術は当業者に公知である。
【００５８】
本明細書中で用いる、「ベクター」および「発現ベクター」という用語は、レプリコン、すなわちキャリアまたはトランスポータとして機能する任意の因子、例えばファージ、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージまたはウイルスを表し、これに別の遺伝子配列または遺伝子因子（ＤＮＡかもしくはＲＮＡ）が複製をもたらすように結合し、配列または因子を宿主細胞へ送りむことができるようにする。
【００５９】
本明細書中および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、他に明確に記載のない限り、複数の対象を含むことに注意されたい。本明細書に用いられるすべての技術的および科学的用語は同じ意味を有する。
【００６０】
特に明記していない限り、本明細書において用いた技術および科学用語はすべて、本発明が属する当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと似たまたはそれと等価のいずれかの方法および材料を本発明の実施またはテストするのに用いることもできるが、好ましい方法および材料を記載する。本明細書において言及したすべての刊行物は、引用されている刊行物に関する方法および／または材料を開示して記載するために参照として本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００６１】
以下の実施例は、当業者に本発明の製造方法および使用方法の完全な開示および説明を提供するために示されており、本発明者らが本発明と見なす範囲を限定することを意図しないし、また本発明者らは、以下実験はすべてのまたは唯一の実施した実験であることも意図しない。用いられた数値（例えば、量、温度など）については、正確性を確実にするための努力がなされているが、いくつかの実験誤差および偏差が考慮に入れられるべきである。他に指示がない限り、部は重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、そして圧力は大気圧または大気圧付近である。
ＴＡ複合体を妨害する潜在的作用物質のスクリーンのために、大腸菌発現系を用いて容易に発現でき精製できる多数のＴＡ複合体がヒト病原体および大腸菌から使用されている。ＴＡ複合体の解離を検出するために、ｍＲＮＡインターフェレース（ＭＩａｓｅ）毒素に対するＲＮＡ基質のビーコンタイプかまたは非ＭＩａｓｅ毒素に対するＧＦＰ融合ＴＡ複合体を用いる蛍光検出に依存する、高感度のハイスループット方法を使用することができる。
【００６２】
毒素−抗毒素（ＴＡ）システム
ＭａｚＥ−ＭａｚＦ毒素−抗毒素システム
ＭａｚＥＦ  ＴＡシステム（Ａｉｚｅｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６；Ｋａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２００３；Ｍａｒｉａｎｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００１；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００３ｂ）において、ＭａｚＦ毒素は安定であり、ＭａｚＥ抗毒素／解毒剤は不安定である。ＭａｚＥの短い半減期は、ＡＴＰ依存性のセリンプロテアーゼであるＣｌｐＰＡによる分解に起因する（Ａｉｚｅｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６）。このオペロンは、ＭａｚＥによるかまたはＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体によってネガティブに自動調節される（Ｍａｒｉａｎｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｔ．、２００１；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００３ａ）。Ｅｎｇｅｌｂｅｒｇ−Ｋｕｌｋａ（Ａｉｚｅｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６）によって提案されたグアノシン−３’，５’−ビス−ピロ燐酸（ｐｐＧｐｐ）によるその制御が盛んに議論され、ｐｐＧｐｐは、ｍａｚＥＦ転写を直接には調節しないが間接的にはＭａｚＦの活性化を調節する（例えば、Ｌｏｎプロテアーゼを介して）ことがあり得るようである（Ｇｅｒｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）。ＴＡモジュールの転写および／またはｍａｚＥＦ  ｍＲＮＡの翻訳が阻害された場合、ＭａｚＥはＭａｚＦよりもはるかに不安定であるので、ＭａｚＥＦ介在性細胞成長停止が生じる。したがって、図１で示されるようにＭａｚＦは、そのＭａｚＥとの複合体から解放される。
【００６３】
ＭａｚＦの活性化は、重度のアミノ酸またはチミン欠乏（Ｓａｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）、リファンピシンおよびクロラムフェニコールのような特定の抗生物質（Ｓａｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）、毒性タンパク質Ｄｏｃ（Ｈａｚａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）またはその他のストレス条件、例えば高い温度、酸化ストレスおよびＤＮＡ損傷（Ｈａｚａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）によって生じる。
【００６４】
ＭａｚＥおよびＭａｚＦの構造と機能
ＭａｚＦは、翻訳のインヒビターとして歴史的には分類されている。しかしこの阻害の標的は、本発明者らがＭａｚＦは配列特異的エンドリボヌクレアーゼであることを最近示したように、翻訳装置でなく実際にはｍＲＮＡである（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００３ｂ）。ＭａｚＦは、著しい基質特異性を示す。これは１本鎖ＲＮＡ（ＤＮＡまたはｄｓＲＮＡでなく）で、配列ＡＣＡの主にＡとＣ間のみを切断する。細胞のｔＲＮＡは、そのＲＮＡの多くの二次構造のため切断から保護されるようであるが、ｒＲＮＡはリボソームタンパク質とそのＲＮＡの密接な関連のためＭａｚＦによる分解を回避するようである。したがってＭａｚＦ発現は、ｍＲＮＡのほぼ完全な分解を生じ、成長停止と共にタンパク質合成の激しい減少に導く（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００３ｂ）。ＭａｚＦに配列類似性を有するタンパク質が、多くの細菌またはこれらの染色体外プラスミド上に認められる。ＰｅｍＫと呼ばれる大腸菌でＲ１００プラスミドにコードされた毒素も、ＭａｚＦの切断特異性よりも広い切断特異性を有する配列特異的エンドリボヌクレアーゼである（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）。ｍＲＮＡインターフェレース（ＭＩａｓｅｓ）としての、大腸菌および他の細菌におけるＭａｚＦおよびその機能的相対物。
【００６５】
ＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体のＸ線構造が解明された（Ｋａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。その解毒剤パートナーを伴わない２つの別の毒素の結晶構造と共に（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００２；Ｌｏｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９）、この構造により、これら毒素の異なる標的および配列にもかかわらず、かなりの構造的類似性がすべて３つの毒素間に存在することが明らかとなった。２つのＭａｚＦ二量体に対し１つのＭａｚＥ二量体の割合で、ＭａｚＦ（１１１  ａａ）はＭａｚＥ（（８２  ａａ）と安定な複合体を形成することを示す生化学的研究によるデータ（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００３ａ）と一致して、ＭａｚＥおよびＭａｚＦ複合体のＸ線結晶構造は、交互のＭａｚＥおよびＭａｚＦホモ二量体から成る２：４のヘテロ六量体で構成されている（Ｆ２−Ｅ２−Ｆ２、図２Ａ）。興味深いことには、ＭａｚＥのＣ末端領域は、高度に負に荷電していて無秩序であり、ＭａｚＦホモ二量体中の２つのＭａｚＦ分子間に形成される間隙上に広がっている。ＭａｚＥ上の荷電した伸張部は、１本鎖ＲＮＡの構造を模倣することができ、そのＲＮＡ基質結合部位をブロックすることによりＭａｚＦのエンドリボヌクレアーゼ活性を破壊することができる（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００３ｂ）。
【００６６】
ＴＡ複合体の構造的研究により、個々の毒素がその同族の抗毒素と安定な複合体を形成する仕組みについて我々の理解が非常に深まった。ＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体のＸ線構造に加えて（Ｋａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）（図２Ａ）、ＲｅｌＢ−ＲｅｌＥ複合体（Ｔａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）（図２Ｂ）およびＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体（Ｋａｍａｄａ  ａｎｄ  Ｈａｎａｏｋａ、２００５）の結晶構造が最近決定された。それぞれの複合体構造において、以下でさらに詳しく説明するように異なる方法で抗毒素はその同族の毒素と相互作用する。ＭａｚＦ−基質アナログ複合体のＮＭＲ構造およびＲｅｌＢのＮＭＲ溶液構造が最近決定された。
【００６７】
図２で示すように、それぞれＴＡシステムにおいて、毒素はＴＡ複合体に特有なユニークな方法でその同族の抗毒素と相互作用する。したがって非常にユニークな抗生物質が、特定の病原性細菌または特定の病原性細菌グループに対してのみ開発され得る。さらにまた、病原体が１つ以上のＴＡシステムを有する場合、それぞれのＴＡシステムに対する特異的な抗生物質が開発され得る。これは、病原体に及ぼす２つの異なる抗生物質の付加的または相乗的効果をもたらすことができる。さらに従来の抗生物質と共に本提案で開発された新しい抗生物質の使用は、この抗生物質が完全に異なる細胞標的を用いるので相乗的であることが予想される。
【００６８】
ＴＡ複合体形成をブロックするか、またはＴＡ複合体を解離することができる化学物質をスクリーニングするために、高感度の方法がそれぞれのＴＡシステムに対して開発されるであろう。これらの方法は、ハイスループット・スクリーニングのために用いられ得る（例えば、ＮＩＨ  ロードマップ・イニシアティブ（ＮＩＨ  Ｒｏａｄｍａｐ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ）のために設立されたＮＩＨ分子ライブラリー・スクリーニングセンター（ＮＩＨ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ））。
【００６９】
以下の刊行物（この各々は本明細書中に参照によりそれらの全体が組み込まれる）は、細菌毒素をさらに記載しており、これらはＭｏｌ．Ｃｅｌｌ．のＭａｚＦに誘導された疑似休眠（ｑｕａｓｉ−ｄｏｒｍａｎｃｙ）および単一タンパク質産生システムに関する論文を含む。
【００７０】
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｚＥＦ  ａｄｄｉｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２００３）２７８、３２３００〜３２３０６頁（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００３ａ）
【００７１】
本発明者らは、機能的なＭａｚＥＦ複合体は、２つのＭａｚＦ二量体と１つのＭａｚＥ二量体から成ることを明らかにした。この複合体は、ｍａｚＥＦオペロンに結合することが示された。ＭａｚＥはＤＮＡに直接結合することが見い出されたが、ＭａｚＦはＭａｚＥのＤＮＡ結合活性を促進した。最終的にＭａｚＥとＭａｚＦ間の結合界面が、酵母ツーハイブリッド法によって定義された。本発明者らは、ＭａｚＥはＮ末端ＤＮＡ結合ドメインおよびＭａｚＦと相互作用するＣ末端ドメインの２つのドメインから成ると結論した。これらの結果は、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体のＸ線構造と一致している（Ｋａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。
ＭａｚＦ  ｃｌｅａｖｅｓ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍＲＮＡｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ａｔ  ＡＣＡ  ｔｏ  ｂｌｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ（２００３）１２、９１３〜９２３頁（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００３ｂ）
【００７２】
無細胞系を用いて、本発明者らはＭａｚＦはタンパク質合成を阻害するが、ＤＮＡ複製またはＲＮＡ合成は阻害しないことを示した。続いて本発明者らは、ＭａｚＦは１鎖ＲＮＡのみに作用する配列特異的（ＡＣＡ）エンドリボヌクレアーゼであることを示した。ＭａｚＦはリボソームとは独立したリボヌクレアーゼとして機能し、したがってリボソーム上のＡ部位でｍＲＮＡ切断を助ける別の大腸菌毒素であるＲｅｌＥとは機能的に異なっている（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。誘導後、ＭａｚＦはほとんどすべての細胞のｍＲＮＡを切断して効率的にタンパク質合成をブロックする。精製したＭａｚＦは、原核生物のおよび真核生物無細胞系の両方でタンパク質合成を阻害した。この阻害は、ＭａｚＦに対する不安定な抗毒素であるＭａｚＥにより解除された。したがってＭａｚＦは、特異的な配列で細胞のｍＲＮＡを切断することによりｍＲＮＡの機能を妨害して迅速に細胞成長停止に導く毒性エンドリボヌクレアーゼとして機能し、本発明者らは、このタイプのエンドリボヌクレアーゼに対して「ｍＲＮＡインターフェレース」（ＭＩａｓｅ）という用語を作った。このようなエンドリボヌクレアーゼの役割は、様々な増殖条件下で細胞生理に幅広い関与を有し得る。
Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＰｅｍＫ、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．（２００４）、２７９、２０６７８〜２０６８４頁、（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）
【００７３】
ｐｅｍＩ−ｐｅｍＫ  ＴＡシステムはプラスミドＲ１００上に存在し、大腸菌集団でポスト・セグリゲーショナル・キリングによってプラスミドを維持するのに役立つ。本発明者らは、ＰｅｍＫはｍＲＮＡを切断する別のＭＩａｓｅであるがＰｅｍＩはこの活性をブロックすることを示した。ＰｅｍＫは、「ＵＡＸ（Ｘは、Ｃ、ＡまたはＵである）」配列中のＡ残基の５’または３’側で選択的に１本鎖ＲＮＡのみを切断する。ＰｅｍＫはＤｎａＢを介してＤＮＡ複製を阻害すると以前に考えられたが（Ｒｕｉｚ−Ｅｃｈｅｖａｒｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５）、本発明者らは今、明確にＰｅｍＫはＭＩａｓｅであることを示した。報告されたＣｏｌＥ１  ＤＮＡ複製阻害は、ＣｏｌＥ１  ＤＮＡ複製のためのプライマーであるＲＮＡＩＩに対するＰｅｍＫのＭＩａｓｅ活性によって容易に説明できる。さらにまたＰｅｍＫ誘導による様々な真核細胞の増殖阻害（ｄｅ  ｌａ  Ｃｕｅｖａ−Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）も、細胞のｍＲＮＡに対するＰｅｍＫのＭＩａｓｅ活性によって説明できる。
Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｍＲＮＡ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｂｙ  ＭａｚＦ，ａｎ  ｍＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒａｓｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）２８０、３１４３〜３１５０頁（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００５ａ）
【００７４】
ＸＡＣＡを含むＲＮＡ−ＤＮＡキメラ基質を用いて、ＭａｚＦはＡＣＡ配列の５’末端で基質（ＸとＡ間で）を切断し、１つの末端に２’、３’−環状リン酸と他の末端に遊離の５’−ＯＨ基を生じる。これらの基質を用いて、本発明者らは残基Ｘの２’−ＯＨ基はＭａｚＦ切断のために必要不可欠であるが、すべての他の残基はデオキシリボースであり得ることを示した。
Ｓｉｎｇｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｍＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒａｓｅ    Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ（２００５）１８、２５３〜２６１頁（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）
【００７５】
本発明者らは、ＭａｚＦによるほとんどすべての細胞のｍＲＮＡ分解の結果、大腸菌におけるＭａｚＦの誘導は完全に細胞増殖を阻害するが、細胞はなお完全に代謝的に活性であることを見いだした。これは、ＭａｚＦのＡＣＡ特異的ＭＩａｓｅ活性を利用することによって示された。本発明者らは、ＭａｚＦおよびＡＣＡを欠くｍＲＮＡをコードするように設計した標的遺伝子の同時発現は、バックグラウンドの細胞のタンパク質合成が実質的に無い状態で、持続する高レベル（９０％までの）の標的発現を生じることを見いだした。実質的に、本発明者らは大腸菌細胞を単一タンパク質を産生するバイオリアクターに変換し、このシステムを「単一タンパク質産生」（ＳＰＰ）システムと名づけた。
【００７６】
完全な細胞成長停止下で、細胞が所望の単一タンパク質をなお産生することができるというこの事実は、細胞の代謝的能力は長期間にわたり無傷であり、その結果エネルギー代謝（ＡＴＰ産生）のみならずアミノ酸およびヌクレオチドに対する生合成機能も成長が停止した細胞で完全に活性であることを示している。さらにまた、転写および翻訳機構も良好に維持され完全に機能している。したがって、ＭａｚＦに誘導された休眠中の細胞は、「疑似休眠」と呼ばれる新しい生理的状態下にある。この疑似休眠の発見は、細菌の病原性および多剤耐性の存続において重要な役割を果たす可能性がある新しい細菌生理学を研究するための刺激的な道を開くであろう。
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣｈｐＢＫ，ａｎ  ｍＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｋｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）２８０、２６０８０〜２６０８８頁（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００５ｂ）
【００７７】
ＣｈｐＢＫは、１１６個のアミノ酸性の残基から成る大腸菌ゲノムｃｈｐＢＩＫ  ＴＡモジュールでコードされる毒素である。その配列は、ＭａｚＦに対して３５％の同一性および５２％の類似性を示す。本発明者らは、ＣｈｐＢＫはＭａｚＦと同じ方法でＡＣＹ（Ｕ、ＡまたはＧ）においてｍＲＮＡを切断する別のＭＩａｓｅであることを見いだした。
未発表の予備的結果
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｕａｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｍＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒａｓｅ  ＭａｚＦ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ
カナダのトロント大学オンタリオ癌研究所の教授Ｍ．Ｉｋｕｒａ博士と共同して、本発明者らは、最近基質アナログと複合体を形成するＭａｚＦ二量体のＮＭＲ構造を決定した。本発明者らは、ＭａｚＦホモ二量体の凹界面に２つの基質結合部位が存在し、したがってＭａｚＦホモ二量体は、ｍＲＮＡプロセシングのための２つの同一の結合部位を備えた二座エンドリボヌクレアーゼであることを示した。しかし重要な点は、結合部位の１つを占める１つＭａｚＥ分子が、両方の部位の立体構造に影響を及ぼすことができ、したがってＭａｚＦ  ＭＩａｓｅ活性を効果的に妨害することができることである。
【００７８】
結核菌の複数のｍＲＮＡインターフェレース
本発明者らは、結核菌はＭａｚＦホモログ（ｍｔ１〜ｍｔ７）をコードする少なくとも７つの遺伝子を含み、大腸菌で誘導された場合これらの４つは細胞増殖阻害を生じることを示した。本発明者らはまた、ＭａｚＦ−ｍｔ１、ＭａｚＦ−ｍｔ３およびＭａｚＦ−ｍｔ６が、大腸菌ＭａｚＦと同様の配列特異的ｍＲＮＡインターフェレースとしての機能することを見いだした。これらの結果は、複数のｍＲＮＡインターフェレースの存在は、ヒト組織中でこの病原体の多方面にわたる休眠応答において重要であり得ることを示唆している。
【００７９】
実験計画に対する理論的根拠  −  病原性細菌を含むすべての細菌は、クラミジア、マイコプラズマおよび癩菌などの偏性（ｏｂｌｉｇａｔｅ）細胞内病原体を除き自殺遺伝子を含んでいる（Ｐａｎｄｅｙ  ａｎｄ  Ｇｅｒｄｅｓ、２００５）。特に、非常に緩慢に増殖する特定の自立性の細菌は、多数のＴＡシステムを有し、例えば結核菌は少なくとも３８のＴＡシステムを有していることに注目するのは興味深い。生物兵器として用いられ得るこれらの病原性細菌の中で、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）は１つのＭａｚＦ−ＭａｚＥ  ＴＡシステムを有し、ペスト菌は、５つの様々なＴＡシステムを有している。ボツリヌス菌のゲノム配列は利用できないが、その近縁の破傷風菌は少なくとも１つのＰｈｄ−Ｄｏｃ  ＴＡシステムを有している。これらの事実は、細菌のＴＡシステムは、現在利用可能な従来の抗生物質と際立って異なる新しい抗生物質の開発のための理想的な標的であることを非常に説得力をもって示唆している。
【００８０】
すべてのＴＡシステムは、正常な増殖条件下で毒性効果が抑制されるように毒素−抗毒素複合体の形態で、最適に増殖している細胞で発現されると考えられる。図３に示すように、これまでに毒素−抗毒素複合体の３つのＸ線構造が解明された。驚いたことに、それぞれの組は互いに異なるユニークな複合体を形成する。しかしすべてのこれらの抗毒素は細胞のこれらの同族の毒素よりはるかに不安定であり、したがってタンパク質合成がストレス条件下でブロックされるとき、抗毒素は細胞のプロテアーゼにより消化されて細胞中に毒素を放出する。その結果細胞増殖は阻害され、これは最終的に細胞死に導く。
【００８１】
したがって毒素と抗毒素の間の相互作用をブロックするあらゆる化学物質は、（１）化学物質が、その同族の毒素との複合体から抗毒素を完全にまたは部分的に放出し、放出された抗毒素は細胞のプロテアーゼによりすみやかに除去され、細胞中に遊離の毒素の放出を引き起こす、（２）毒素−抗毒素複合体は、抗毒素単独でよりもはるかに強いこれらのオペロンに対するリプレッサーであり、したがってこの化学物質の存在下でより多くの毒素および抗毒素が細胞で合成される、ならびに（３）これらの化学物質の存在下で、新たに合成された抗毒素は、これらの同族の毒素と安定な複合体を形成することができないという理由により、細菌に対する潜在的な抗生物質として役立ち得る。その結果、毒素の細胞濃度は増加して細胞増殖阻害に導くであろう。毒素−抗毒素複合体（抗毒素の除去により毒素のさらなる産生を誘導する）を標的にする抗生物質の相乗効果はユニークであり、本発明の抗生物質の特に重要な特徴である。この新しいクラスの抗生物質の別の重要な側面は、これらはそれぞれの毒素−抗毒素複合体に特異的であり得るかまたは相同のＴＡシステムのグループに対してのみ特異的であり得て、したがって特定の病原体に対して有効なユニークな抗生物質を開発することが可能である。
【００８２】
本発明者らが以下に記載のように、大腸菌由来のすべてのＴＡ複合体（ＭａｚＦ−ＭａｚＥ、ＹｏｅＢ−ＹｅｆＭ、ＹａｆＱ−ＤｉｎＪ、ＲｅｌＥ−ＲｅｌＢ、ＣｈｐＢＫ−ＣｈｐＢＩおよびＨｉｐＡ−ＨｉｐＢ）が分離されており、本発明者らの研究室で利用可能であり、それぞれのスクリーニング法の開発に用いるつもりである。さらに枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＹｄｃＥ−ＹｄｃＤ複合体（ＹｄｃＥは炭疽菌ＭａｚＦホモログと９６％同一である）、高病原性の大腸菌ＣＦＴ０７３由来のＨｉｇＢ−ＨｉｇＡ複合体、ファージＰ１由来のＤｏｃ−Ｐｈｄ複合体およびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）由来のＶａｐＣ−ＶａｐＢ複合体も精製され、本発明者らの研究室で容易に利用可能である。これらの１０個のＴＡ複合体は、細菌のほとんどすべての既知のＴＡシステムを包含しており、このいくつかはｍＲＭＡインターフェレース（ＭａｚＦ、ＣｈｐＢＫおよびＹｄｃＥ）として機能するが、他のものはリボソームの固有のエンドリボヌクレアーゼ活性（ＲｅｌＥ）を促進するか、または翻訳開始（ＹｏｅＢ）をブロックするリボソーム関連因子として機能する。毒性のメカニズムは、ＹａｆＱ、ＨｉｐＡ、Ｄｏｃ、ＨｉｇＢおよびＶａｐＣについては未だ決定されていない。本発明者らはまた、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および枯草菌からＭａｚＦ−ＭａｚＥホモログ複合体を精製し、また結核菌からはＶａｐＣ−ＶａｐＢ複合体を精製するつもりである。結核菌は、２３個もの異なるＶａｐＣ−ＶａｐＢ  ＴＡシステムを有している。
【００８３】
本発明において、部分的または全体的にＴＡ複合体形成を阻害する小さい化学物質、その他の分子または任意の作用物質であり得る作用物質の添加後、それぞれのＴＡシステムについてＴＡ複合体から毒素の解離を検出する方法が提供される。この方法は小さい化学物質の添加後にＴＡ複合体から放出される毒素または放出される抗毒素を検出するための蛍光プローブの使用に依存している。
【００８４】
毒素と抗毒素の間の相互作用は、それらの表面上の非常に広がった領域に生じて荷電および疎水性相互作用を含んでいる（図３を参照）。したがって化学物質は２つのタンパク質間の相互作用を部分的にのみ破壊することができて部分的な阻害に導く。しかし２またはそれ以上のこれらの弱いインヒビターの添加は、これらの各々が異なる部位でＴＡ複合体と相互作用する場合、劇的な相乗的阻害効果を生じ得る。したがってこれらの阻害化合物に基づき新しい化学物質を設計でき、これらの効果を組み合わすであろう。ＴＡ相互作用を直接に妨害するのではなく、むしろ毒素かそれとも抗毒素と結合してアロステリックな構造的変化を生じ、ＴＡ複合体から毒素および抗毒素の解離を生じる化学物質を見いだすことも可能である。
【００８５】
研究Ｉ
配列特異的ＭＩａｓｅ活性を検出するための高感度基質の開発
化学物質のハイスループット・スクリーニングにおいて、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体から放出されたたとえ少量のＭａｚＦでさえも検出できる高感度基質を開発するために、十分に解析がされているＭＩａｓｅであるＭａｚＦがモデルタンパク質として用いられるであろう。この目的のために本発明者らは、１２塩基の短いＤＮＡ−ＲＮＡキメラ基質、ｄＧｄＡｄＴｄＡｒＵｄＴｄＡｄＴｄＧを合成した。最近本発明者らは、ｒＵ残基がＭａｚＦにより切断されるリボヌクレオチドでなければならない重要な塩基であることを示した（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００５ａ）。ＭａｚＦ  ｍＲＮＡインターフェレース活性を検出する最も感度が高い方法を開発するために、本発明者らは５’末端に蛍光プローブおよび３’末端にクエンチャーを結合することによりこの基質を修飾した。この修飾された基質は、これがｒＵとｄＡ間で切断されてクエンチャーから蛍光プローブが取り外されない限り蛍光を発さない。本発明者らは、ｍＲＮＡインターフェレースに対するこのタイプの基質を切断可能ビーコン基質またはＣＢＳと名づける。本発明者らは、５’末端修飾のためにＲＯＸ（６−カルボキシル−Ｘ−ローダミン）を用い、３末端修飾のためにクエンチャーとしてＥｃｌｉｐｓｅを用いた（それぞれ図４ＡおよびＢ）。２つの分子間の間隔は１２塩基離れおり、この間隔はＥｃｌｉｐｓｅが５’末端ＲＯＸの蛍光を消光するために十分である。多数の蛍光プローブの中で、本発明者らは光退色に抵抗性があり、広範囲のｐＨで安定なのでＲＯＸを選んだ。本発明者らは、非常に安定でありしたがってすべてのオリゴヌクレオチド脱保護反応において安全に用いることができるため、クエンチャーとしてＥｃｌｉｐｓｅを選んだ。さらにまたＥｃｌｉｐｓｅは他のクエンチャーより実質的に多くの電子を欠損しており、したがって多様な色素の良好なクエンチングを誘導する。
【００８６】
方法
ＭａｚＦに対する切断可能ビーコン基質（ＣＢＳ）の合成  −  切断されたときにのみ（この場合はＭａｚＦによって）蛍光を発する１２塩基ＤＮＡ−ＲＮＡキメラビーコン基質（ＣＢＳ−１）は、以下の通りであった。
【化１】
2009531034.tif 000003
【００８７】
以下の通りに合成した。すなわち、３末端修飾のためにＥｐｏｃｈ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ＣＰＧ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ基質をＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（ＡＢ１３４００）で合成した。５’末端に対しては、アミノリンカー（Ｃ６）（ＡＢＩ）を用いた。ＤＮＡセグメントに対してＤＮＡアミダイト（Ｐｒｏｌｉｇｏ）、およびＲＮＡセグメント（ｒＵ残基）に対して、ＲＮＡアミダイト（Ｐｒｏｌｉｇｏ）をオリゴヌクレオチド合成のために用いた。合成後、オリゴヌクレオチドを２８％アンモニア（水で希釈した）：エタノール（３：１）を用いてＣＰＧから切断した。こうして得られた溶液を５５℃で６時間インキュベートして、それぞれ塩基から保護基を除去した。反応後、ロータリーエバポレーターを用いてサンプルを乾燥した。次いでこの産物をＴＥＡ−３ＨＦ／ＴＥＡ／１−ＮＭＰ（４：３：６）に溶解し、溶液を６５℃で６時間処理して４位のｒＵ残基の２’ＯＨ基における保護基を除去した［ＴＥＡ＝トリエチルアミン、ＴＥＡ−３ＨＦ＝トリエチルアミン−トリス−ヒドロフルオリド、および１−ＮＭＰ＝１−メチル−２−ピロリドン］。脱塩後、この産物を逆相ＨＰＬＣによって精製した。この段階での産物は、５’−ＮＨ２−ｄＧｄＡｄＴｄＡｒＵｄＡｄＣｄＡｄＴｄＡｄＴｄＧ−Ｅｃｌｉｐｓｅ−３’である。この産物を、弱アルカリ性条件でＲＯＸ−ＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で修飾した。この反応混合物を、ゲル濾過により精製して遊離のＲＯＸ色素を除去した。こうして得られた産物をＰＡＧＥを用いてさらに精製して、未修飾産物からＲＯＸ修飾産物を分離した。この最終的産物ＣＢＳ−１を、脱塩後冷凍乾燥した。
ＭａｚＦによるＣＢＳ−１切断反応  −  ＣＢＳ−１は上に示すようにｒＵとｄＡ残基間で切断されて蛍光の放出を生じることが予想される。パイロット実験で、本発明者らは少量のＣＢＳ−１を合成し、精製したＭａｚＦを用いて切断反応を実施した。ＭＩａｓｅ反応は、下記のように実施した；５μｌ（５×）のＭａｚＦ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８）、１０μｌの蒸留水および５μｌのＣＢＳ−１溶液（２ｐｍｏｌ／μｌ）を混合し、混合物を３７の℃でプレインキュベートした。異なる濃度のＭａｚＦ（５μｌ）を添加することにより反応を開始した（図５を参照）。使用した励起および発光波長は、それぞれ５５０ｎｍおよび６３５ｎｍであった。予備的な結果を図５に示し、これから以下のような多くの興味深い観察をすることができる。
１．１２塩基のＣＢＳ−１基質は、ＭａｚＦに対する適切で感度が高い基質として機能し、１２塩基ヌクレオチドの５’末端および３’末端に結合したＲＯＸおよびＥｃｌｉｐｓｅは、それぞれＭａｚＦ  ＭＩａｓｅ酵素反応をブロックしないことを示す。
２．反応の初期速度とＭａｚＦ濃度との間に直線関係がある。３．この反応で用いられたＭａｚＦは、トリガー因子（ＭａｚＦの高い発現に用いられる低温ショック分子シャペロン）に融合されている。興味深いことに、この融合タンパク質はＭａｚＦに対する抗毒素であるＭａｚＥの非存在下で発現され得る。トリガー因子と融合した場合のＭａｚＦのこの低い毒性の理由は現在知られていない。用いたタンパク質は１回の切断反応のみを示すようであり、基質を完全に切断しない可能性がある。それにもかかわらずこの実験は、本発明者らの基質は低濃度のＭａｚＦにおいてさえもＭＩａｓｅ活性を検出することができ、したがって潜在的な抗生物質のハイスループット・スクリーニングに用いるために適切であることを明らかに示している。これらの予備的な結果に基づいて、いかなる融合も伴わない精製したＭａｚＦを用いる実験が繰り返されるであろう。
その他のＭＩａｓｅに対する特異的切断可能ビーコン基質の合成  −  現在までにＭａｚＦに加えて、さらに２つのＭＩａｓｅである大腸菌Ｋ１２由来のＣｈｐＢＫ（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００５ｂ）および枯草菌由来のＹｄｃＥ（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）が特徴付けられた。本発明者らは、これらのＭＩａｓｅに対する以下の１２塩基ＣＢＳ基質を合成する；
【化２】
2009531034.tif 000004
これらのＣＢＳ基質は、上記のＣＢＳ−１に対して記載した方法に従って合成される。ＣＢＳ−２はＣｈｐＢＫおよびＹｄｃＥの両方（しかしＭａｚＦによってではなく）によって切断され得るが、ＣＢＳ−３はＹｄｃＥによってのみ切断され得る。これらの基質は特異的なＭＩａｓｅを検出するために重要であり、その特異性が特徴付けられていない未知のＭＩａｓｅの特性決定に用い得る。研究２で論じたように、本発明者らはＹｏｅＢおよびＹａｆＱの切断特異性を決定した後に、これらに対する新たなＣＢＳ基質を設計するつもりである。
本発明は、その毒素が任意のＭＩａｓｅとして機能するＴＡシステムを含む任意のＴＡシステムに破壊的な作用物質に対するスクリーニングシステムを包含する。本発明者らが研究２からさらに多くのＭＩａｓｅを見いだし、それらの特異的な切断配列を決定する場合、上記の方法に従いそれぞれのＭＩａｓｅに対して特異的な切断可能ビーコン基質を合成するつもりである。このようにして本発明者らはその毒素がＭＩａｓｅとして機能する個々のＴＡシステムに対して、特異的なスクリーニングシステムを開発することができるであろう。
【００８８】
予想される問題およびそれらの解決策
図５において、使用したタンパク質は１回の切断活性を有するので、基質は完全には加水分解されていない。上記のようにこの反応の感度は精製したＭａｚＦを用いて実験を繰り返した場合、かなり改善しそうである。しかし反応が依然として改善しない場合は、これはＭａｚＦの固有の酵素的特性であるか、または使用した基質の特性であることを意味するかもしれない。後者の場合、産物の疎水性（ＲＯＸかそれともＥｃｌｉｐｓｅ）が、ＭａｚＦの２回目の結合を妨害するかもしれない。この影響を打ち消すために、本発明者らは、酵素活性に影響を与えることなく結合した反応産物を解離させることにより、基質のアクセシビリティを促進するであろう種々のマイルドな界面活性剤を反応に組み込むつもりである。
研究２
大腸菌および他の病原性細菌からの種々のＴＡ複合体の分離
この研究において、本発明者らは非病原性および病原性細菌（表１を参照）から多数のＴＡ複合体を分離するつもりである。
１．ＴＡ複合体を小さい化学物質のスクリーニングに用いる研究３に進む前に、本発明者らは種々の細菌からクローニングした表１のそれぞれのＴＡオペロンが、大腸菌で良好に発現されることを確認するつもりである。これはスクリーニングシステムを確立するのに重要である。
２．本発明者らは、まだ特徴付けられないＴＡシステムに対する細胞標的を決定するつもりである。前の章でＭａｚＦについて記載しているように、これは本発明者らがそれぞれのＴＡシステムに対するユニークな基質を開発することを可能にするであろう。
本発明者らは、大腸菌Ｋ１２由来のすべて６つのＴＡシステム（ＭａｚＦ−ＭａｚＥ、ＣｈｐＢＫ−ＣｈｐＢＩ、ＲｅｌＥ−ＲｅｌＢ、ＹｏｅＢ−ＹｅｆＭ、ＹａｆＱ−ＤｉｎＪおよびＨｉｐＡ−ＨｉｐＢ）をクローニングし、図６（表１も参照のこと）に示すように、Ｔ７発現系を用いてこれらを発現させた。すべての場合において、ＴＡ複合体は良好に発現される。すべての毒素タンパク質はＨｉｓタグ付きなので、すべてのＴＡ複合体はＭａｚＦについて前述したように毒素をさらに精製できるＮｉ−ＮＴＡ樹脂を用いて容易に精製される（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００３ｂ）。これらの６つのＴＡシステムのうち、ＲｅｌＥ（Ｈａｙｅｓ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ、２００３；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）、ＭａｚＦ（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００３ｂ）およびＣｈｐＢＫ（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００５ｂ）が特徴付けられた（表１を参照）。本発明者らは残りの３つの毒素であるＹｏｅＢ、ＹａｆＱおよびＨｉｐＡを精製し、これらの細胞標的を同定するつもりである。さらに本発明者らは、ＨｉｇＡ−ＨｉｇＢ複合体を高病原性大腸菌ＣＦＴ０７３株から分離するつもりである。ＨｉｇＡ−ＨｉｇＢは、ペストの病原体であるペスト菌を含む細菌における最も豊富なＴＡシステムの１つである。ＹｄｃＥ−ＹｄｃＤ複合体が枯草菌から報告された。炭疽菌ＭａｚＦホモログは枯草菌のＹｄｃＥと９３％の同一性を有し、同様にＹｄｃＤはその炭疽菌の相対物と５３％の同一性を有する。したがって、ＹｄｃＥ−ＹｄｃＤ複合体形成をブロックする化学物質の全部または一部が、炭疽菌でＭａｚＦ−ＭａｚＥホモログ複合体形成も阻害するかもしれない。
【表１】
2009531034.tif 000005
本発明者らはＭａｚＦ−ＭａｚＥホモログを、皮膚感染から生命にかかわる症状にわたる非常に多様な疾患を生じる最も一般的なヒトの病原体である黄色ブドウ球菌からも分離するつもりである。したがってまたこの病原体に対する新しい抗生物質のスクリーニングは、特にこの病原体の多剤耐性株が出現したために非常に重要である。本発明者らはまた、多数のＶａｐＣ−ＶａｐＢ複合体を一般のヒト呼吸路病原体であるインフルエンザ菌および結核菌から分離するつもりである。後者の病原体は、異常に多くの（２３個もの）ＴＡシステムを有している。これはＴＡシステムがこの最も重篤なヒト病原体の休眠に重要な役割を果たし得ることを意味している。この病原体において、ＶａｐＣ−ＶａｐＢ  ＴＡシステムの完全もしくは部分的阻害を生じる化学物質を見いだすことが可能であることに留意されたい。最後に本発明者らは、ファージＰ１からＤｏｃ−Ｐｈｄ複合体を分離するつもりであり、そのホモログは別のヒト病原体であるコレラ菌に認められている。
【００８９】
大腸菌のＹｏｅＢの細胞標的の特性決定
ごく最近、ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ（２：１）複合体のＸ線構造が決定された（Ｋａｍａｄａ  ａｎｄ  Ｈａｎａｏｋａ、２００５）。精製したＹｏｅＢを用いて、本著者らはＹｏｅＢがＡまたはＧ残基で選択的にＲＮＡを切断することを示し、ＹｏｅＢ毒性はこのエンドリボヌクレアーゼ活性に起因すると推測した。ＫａｍａｄａおよびＨａｎａｏｋａにより示されたｉｎ  ｖｉｔｒｏでのデータは、Ｇｅｒｄｅｓとその共同研究者により発表されたｉｎ  ｖｉｖｏのデータと一致している（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。しかし以下に示すように、本発明者らの結果はＹｏｅＢのこの作用はＹｏｅＢの主な機能ではないことを明らかに示している。本発明者らの予備的なデータは、ＹｏｅＢの主な標的は翻訳開始複合体であり、翻訳開始を特異的に阻害するという仮説を強く支持している。以下に記載のように、かなりの量の予備的データが得られた。
しかし追加実験により、ＹｏｅＢの正確な細胞標的およびこのタンパク質による翻訳開始阻害のメカニズムが明確に同定されるであろう。
１．ＹｏｅＢ毒性は、原核生物に特異的である  −  ＹｏｅＢは、後述するように別のＭＩａｓｅであるＹａｆＱとは対照的に酵母菌では毒性ではない（図７）。このことは、ＹｏｅＢは細菌と酵母菌間で保存されていない５０Ｓリボソームに結合するという事実と一致する。
２．ＹｏｅＢは、ＹｏｅＢの誘導直後に細胞増殖および細胞のタンパク質合成をブロックする非常に強力な毒素である  −  アラビノース誘導性ｐＢＡＤベクターを用いてＹｏｅＢ誘導後５分以内に、細胞の増殖（図示せず）およびタンパク質合成はほぼ完全に阻害される（図８）。対照的に、ＭａｚＦ（その機能がリボソームに依存していない配列特異的エンドリボヌクレアーゼ）の誘導後、長期間（少なくとも１５〜２０分）後まで細胞のタンパク質合成は阻害される（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００３ｂ）。
３．細胞のｍＲＮＡは、ＹｏｅＢ誘導後も安定である  −  ＹｏｅＢの誘導によるタンパク質合成の突然の阻害にもかかわらず、細胞のｍＲＮＡはＭａｚＦの誘導後よりもＹｏｅＢの誘導後の方がはるかに安定である（図９）。最も重要なことは、完全長のｌｐｐ  ｍＲＮＡはＭａｚＦの誘導後、非常に速く（５分以内に）消失するが、かなりの量の完全長のｌｐｐ  ｍＲＮＡがＹｏｅＢ誘導後の１時間を超えて存在する。同様の結果が、２つの無関係なｍＲＮＡであるｏｍｐＡおよびｒｐｓＡ  ｍＲＮＡを用いて得られた（データは示さず）。本発明者らはまた、結核菌のＹｏｅＢ（これもまた大腸菌で毒性が強く、大腸菌のＹｏｅＢに類似する）を用いて実験を行ったが、これは誘導後９０分でｌｐｐ  ｍＲＮＡを完全には切断しなかった。
４．ＹｏｅＢは翻訳開始複合体に結合する  −  トウプリンティング（ｔｏｅｐｒｉｎｔｉｎｇ）実験では、ＹｏｅＢの添加により、正常なトウプリンティング・バンドの上流に１１塩基シフトしたトウプリンティング・バンド（開始コドンの１３〜１４塩基下流）を生じたことを示した。このバンドはリボソームの存在下でのみ観察することができた（図１０）。注目すべきことには同じ条件下で、リボソームの非存在下でｍＲＮＡはＹｏｅＢによって切断されなかった（レーン２、図１０）。
５．ＹｏｅＢは５０Ｓリボソーム結合タンパク質である  −  ＹｏｅＢは翻訳開始複合体に結合するので（図１０）、次に本発明者らはＹｏｅＢがリボソームのサブユニットの１つに特異的に結合するかどうかを調べた。本発明者らはＹｏｅＢを過剰発現している細胞からリボソームに富む抽出物を調製してリボソームをショ糖密度勾配で精製し、ＹｏｅＢが無傷の７０Ｓリボソームを含む分画に加えて５０Ｓリボソーム・サブユニットを含む分画と共に沈降することを観察した（図１１）。したがってＹｏｅＢは、ｉｎ  ｖｉｖｏではリボソームの３０Ｓサブユニットではなく５０Ｓに特異的に結合している。さらにまた、ＹｏｅＢは７０Ｓリボソームに結合するという事実は、これは３０Ｓサブユニットと５０Ｓサブユニット間の相互作用を阻害しないことを示す。
６．ＹｏｅＢは、開始コドンの数塩基下流でｉｎ  ｖｉｖｏにおけるプライマー伸長を特異的にブロックする  −  ＹｏｅＢが翻訳開始複合体に結合することにより翻訳開始を阻害するという本発明者らの仮説は、ＹｏｅＢの誘導は完全長のｍＲＮＡの蓄積を生じ、したがってプライマー伸長はｍＲＮＡの他のいずれかの位置でなく、翻訳開始コドンの近くでブロックされるだろうということを予言している。図１２で見られるように、プライマー伸長は開始コドンの数塩基下流のｏｍｐＡおよびｏｍｐＦ  ｍＲＮＡでブロックされ、重要な点は開始コドンの上流または下流のどちらにも他のいかなるバンドも検出されなかったことである。これはＹｏｅＢは翻訳開始を実際に特異的にブロックするが、開始コドンの上流および下流の切断を示すであろうエンドリボヌクレアーゼとして機能しないことを示唆している。
要約  −  ＹｏｅＢは、原核生物においてリボソーム５０Ｓに結合する特異的なタンパク質合成インヒビターである。本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏ（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｋａｍａｄａ  ａｎｄ  Ｈａｎａｏｋａ、２００５）で観察された明白なエンドリボヌクレアーゼ活性は、ＹｏｅＢの固有の特性であり、これはＹｏｅＢの長期にわたる誘導後にだけか、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡを多量のＹｏｅＢと共にインキュベートする場合に検出されると推測した。本発明者らは、翻訳開始の阻害をもたらすリボソームとＹｏｅＢの相互作用の正確な分子メカニズムを研究し続けるつもりである。
実験設計と方法
本発明者らの結果は、ＹｏｅＢは新しいタイプの毒素であることを明らかに示している。本発明者らは、正確な細胞標的およびＹｏｅＢによる翻訳開始阻害の分子メカニズムを未だ同定していない。本発明者らはこの目的達成のために、ＹｏｅＢに取り組み続けるつもりである。
ＹｏｅＢの細胞標的の同定
本発明者らは、次の２つの異なる方法を用いるつもりである。すなわち、タンパク質とタンパク質の相互作用を同定するために、本発明者らの研究室で日常的に用いている酵母ツーハイブリッド法を、大腸菌でＹｏｅＢと相互作用している１つのタンパク質または複数のタンパク質を探索するために用いるつもりである。第２の方法では、本発明者らはクライオ電子顕微鏡法（Ｃｒｙｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）の専門家であるＤａｎｉｅｌ  Ｗｉｌｓｏｎ博士（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）と共同研究を始めるつもりであり、博士と本発明者らは現在、５０Ｓリボソーム・サブユニット上のＤｅｒ（大腸菌における重要なＧＴＰアーゼ）の位置を同定するために共同研究を行っている。さらにまた本発明者らは、大腸菌の無細胞系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ＹｏｅＢがポリＵのような明確に定義された合成ホモポリマーを用いる翻訳伸長ではなく、翻訳開始を特異的に阻害することを確認するつもりである。ポリＵは開始コドンを有していないので、ｔＲＭＡｆＭｅｔを必要としないポリフェニルアラニンを合成するためにポリＵが無細胞系で用いられる。本発明者らの仮説が正しいならば、ＹｏｅＢはポリフェニルアラニン合成を阻害しないであろう。
化学物質スクリーニングのためのＹｏｅＢ−ＹｅｆＭ複合体の使用
ＹｏｅＢ−ＹｅｆＭ複合体形成を阻害する化学物質をスクリーニングするために、本発明者らは、２つの異なる方法を用いるつもりである。すなわち、１つの方法はプリンに富む配列で切断を引き起こすその弱い固有のエンドリボヌクレアーゼ活性を利用する方法（Ｋａｍａｄａ  ａｎｄ  Ｈａｎａｏｋａ、２００５）であり、他の方法は研究３に記載のＧＦＰ融合技術を用いる方法である。前者の方法に関して、本発明者らはＫａｍａｄａとＨａｎａｏｋａより示されたプリンに富むＹｏｅＢ切断配列（Ｋａｍａｄａ  ａｎｄ  Ｈａｎａｏｋａ、２００５）を含むＣＢＳ基質を開発するつもりである。研究１に記載のＣＢＳ基質が合成されるであろう。
Ｄｏｃの細胞標的の特性決定
１．細胞のｍＲＮＡの安定化  −  Ｄｏｃ−Ｐｈｄ  ＴＡオペロンはファージＰ１からクローニングし、Ｔ７発現系を用いて良好に発現した（図６）。この複合体は大量に容易に調製されるので、本発明者らはコロンビア大学のＪｏｈｎ  Ｈｕｎｔ博士と共同で、このＸ線構造の決定を開始した。このホモログがコレラ菌のようなヒト病原体に存在する（２９％の同一性と４７％の相同性）ので、このＴＡシステムに対する化学物質のスクリーニングは重要な医学的関連を有している。さらに本発明者らの現在までの予備的な結果は、この毒素は翻訳伸長のレベルでタンパク質合成を阻害する非常に強力な増殖インヒビターであることを明らかにしている。最も重要なのは図１３に見られるように、細胞のｍＲＮＡはＤｏｃ誘導の１２０分後でさえ分解していないことである。
２．翻訳伸長の強力なインヒビター  −  Ｄｏｃはクロラムフェニコールまたはハイグロマイシンに類似した機能をするようであり、この両方はｍＲＮＡの分解をブロックすることにより細胞でポリソームを安定化することが知られている。実際にＤｏｃ誘導２時間後のポリソームパターンは、ハイグロマイシンを添加しない場合でさえも変化しなかった［図１４の右のパネル；上のパネル（ハイグロマイシンと共に）を下のパネル（ハイグロマイシン無しで）と比較する］。一方、Ｄｏｃの誘導がない状態でハイグロマイシンが添加されない場合（図１４の左側パネルの下パネル）、ポリソームは消失した。このことはＤｏｃ毒素はクロラムフェニコールおよびハイグロマイシンの方法に類似する方法で翻訳伸長を阻害することを明らかに示している。
実験設計および方法
本発明者らは、この新しいタンパク合成インヒビターをさらに研究するつもりである。本発明者らは、現在Ｄｏｃタンパク質に対して抗血清を調製しており、これはＤｏｃと相互作用するリボソーム・サブユニットの同定に用いられるであろう。Ｊｏｈｎ  Ｈｕｎｔ博士と共同でのＤｏｃ−Ｐｈｄ複合体のＸ線構造の決定は、ＤｏｃとＰｈｄ間の相互作用に関して非常に有益であり、その細胞毒性への洞察が得られるであろう。本発明者らはまた、Ｄａｎｉｅｌ  Ｗｉｌｓｏｎ博士と共同でリボソーム上のＤｏｃの相互作用する正確な部位の決定を始めるつもりである。ＹｏｅＢについて論じたように本発明者らはまた、用いたｍＲＮＡにかかわらずＤｏｃはタンパク質合成の非常に強力な伸長インヒビターであることを確認するために無細胞系を用いるつもりである。
2009531034.tif 000006
１．原核生物および真核生物の両方に対する一般的増殖インヒビター  −  興味深いことに、図７で示すようにＹａｆＱは、ＭａｚＦのように大腸菌だけでなく酵母菌に対しても増殖インヒビターとして機能するが、ＹｏｅＢまたはＲｅｌＥは原核生物に特異的な増殖インヒビターである。これらの結果はＹａｆＱはその標的が細菌から真核生物まで保存されているので、ＹｏｅＢまたはＲｅｌＥの作用メカニズムとは明白に異なる作用メカニズムを有することを示している。
２．ＹａｆＱは、配列特異的なＭＩａｓｅである  −  本発明者らの予備的データは、ＭａｚＦおよびＣｈｐＢＫに加えて、ＹａｆＱは配列特異的エンドリボヌクレアーゼである別のＭＩａｓｅであることを示している（図１５）。ＹａｆＱの誘導が対照（遺伝子の天然の染色体コピーからＹａｆＱのみを発現する）と比べ特異的な部位でｅｒａ  ｍＲＮＡの切断の増強を生じるかどうかを決定するために、大腸菌ＢＷ２５１１３細胞を非特異的遺伝子（この場合ｅｒａ遺伝子）を発現するＩＰＴＧ誘導性プラスミドと共にアラビノース誘導性ＹａｆＱプラスミドを用いて同時トランスフォームした。以下示した結果は、ＭａｚＦと同様にＹａｆＱはＡＣＡ配列を認識するが、このＭＩａｓｅがその他の特異的配列を認識するかどうかを決定することがなお残されていることを示している。
３．ＤｉｎＪおよびＹａｆＱは複合体を形成する  −  本発明者らは、アフィニティークロマトグラフィーを用いてＹａｆＱがＤｉｎＪと安定な複合体を形成することを示した（図１６）。この発現系は現在、本発明者らの共同研究者のＪｏｈｎ  Ｈｕｎｔ博士（コロンビア大学）によってＸ線結晶解析サンプルを調製するために使用されている。
実験設計および方法
本発明者らはＭａｚＦに対して実施したように、種々の天然のｍＲＮＡおよび合成ＲＮＡを用いて詳細な実験を実施してＹａｆＱ  ＭＩａｓｅ活性の正確な特異性を決定するつもりである（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００５ａ）。このように決定された切断特異性に基づき、本発明者らはＹａｆＱに対するＣＢＳ基質を合成するつもりである。
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ＨｉｐＡは、その高分子量のために非常に変わった毒素である。すべての他の毒素は約１００個のアミノ酸残基から成っているが、大腸菌Ｋ１２由来のＨｉｐＡは４４０個の残基から成っている。このｈｉｐＢ−ｈｉｐＡモジュールは、多剤耐性に導く存続性において役割を果たすことに結びつけられている。野生型大腸菌細胞集団の特定の部分が、薬剤耐性遺伝子が存在しない場合でさえもペニシリンを含む多数の抗生物質に対して耐性であることが知られている。「細菌の存続（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ）」と呼ばれるこの現象は、抗生物質で患者を治療する際の重大な医学的問題と考えられている。表現型の転換が正常に増殖している細胞と低下した増殖速度を有する「存続（ｐｅｒｓｉｓｔｅｒ）」細胞間に生じるので、存続性は（遺伝的に同一である）細菌集団における先在する不均一性と連関している。興味深いことにｈｉｐＡ突然変異株（ｈｉｐＡ  ７、Ｇ２２ＳおよびＤ２９１Ａ）は、多くの異なる抗生物質に対する「存続」細胞表現型を増加させる（Ｍｏｙｅｄ  ａｎｄ  Ｂｅｒｔｒａｎｄ、１９８３）。ＨｉｐＡに対する細胞標的の同定は、存続表現型の分子メカニズムに対する重要な洞察を与える可能性がある。
実験設計および方法
ＨｉｐＡ−ＨｉｐＢ複合体は、すでに本発明者らの研究室において大腸菌で良好に発現している（図６）。この複合体のＸ線構造解析を開始した（コロンビア大学のＪｏｈｎ  Ｈｕｎｔ博士と共同で）。ＨｉｐＡの細胞標的を同定するために、本発明者らは最初に酵母ツーハイブリッド法を用いて、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂上でＨｉｓタグ付きＨｉｐＡを用いるプルダウン試験によってＨｉｐＡと相互作用し得る細胞因子（複数可）の分離も試みるつもりである。ＨｉｐＡのさらなる特性決定は、上記で同定された細胞標的によって決まるであろう。ＨｉｐＡ７変異タンパク質は細胞に致死効果を及ぼさないので、本発明者らはさらなる生化学的特性決定のために、この変異タンパク質を発現して精製するつもりである。本発明者らは、特に大腸菌におけるＨｉｐＡの誘導により生じた細胞のフィラメンテーション（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｉｌａｍｅｎｔａｔｉｏｎ）の表現型に興味を持っており、これはＨｉｐＡが細胞分裂と直接的または間接的に（例えばＤＮＡ複製を阻害することによって）関連している可能性があることを示唆している。本発明者らは、現在研究室で作製しているＨｉｐＡに対する抗血清を用いて、ＨｉｐＡの細胞内局在も測定するつもりである。これらの実験から得られる結果は、ＨｉｐＡが細胞増殖に及ぼす有毒性効果により、正確な分子機構を解明するさらなる実験的方法の重要な基礎を提供すると思われる。
2009531034.tif 000008
ＨｉｇＢ−ＨｉｇＡ複合体は、すでに発現されていた（図６）。本発明者らは、直ちにＹｏｅＢ、Ｄｏｃ、ＹａｆＱおよびＨｉｐＡについて前述した方法によりＨｉｇＢの細胞標的の同定を続けるつもりである。このシステムは原核生物における主要なＴＡシステムの１つであるので、ＨｉｇＢ−ＨｉｇＡ複合体は研究３に記載の小分子のスクリーニングに関しても含まれるであろう。
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前述したように、枯草菌由来のＭａｚＦホモログ（ＹｄｃＥ）および黄色ブドウ球菌由来のＭａｚＦホモログに対する小分子のスクリーニングは、炭疽菌および黄色ブドウ球菌などのグラム陽性病原体に対する新しい抗生物質の開発において重要な意味合いを有している。したがって本発明者らは、研究３のためにこれらのＴＡ複合体をクローニングして発現するつもりである。ＹｄｃＥに対するＲＮＡ切断特異性が、Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉらによって決定された（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）。黄色ブドウ球菌由来のＭａｚＦホモログのＲＮＡ切断特異性が、大腸菌のＭａｚＦに対して実施された（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００３ｂ）のと同様に決定されるであろう。
2009531034.tif 000010
本発明者らは、すでにインフルエンザ菌由来のＶａｐＣ−ＶａｐＢ複合体をクローニングして発現させた（図６）。本発明者らは、インフルエンザ菌のＶａｐＣの発現は大腸菌では致死的であることも見いだした（図示せず）。現時点ではその細胞標的は解っていない。
【００９０】
実験設計および方法
インフルエンザ菌のＶａｐＣの特性決定  −  本発明者らは、すでにインフルエンザ菌由来のＶａｐＣ−ＶａｐＢ複合体をクローニングして発現した（図６）。本発明者らは、インフルエンザ菌のＶａｐＣの発現は大腸菌に致死作用を及ぼすことも見いだした（図示せず）。しかし液体培養で細胞増殖が何世代かにわたって続き、長く延びた細胞を形成する（図示せず）。ＤＮＡ複製阻害が細胞分裂をブロックして糸状の細胞の形成を引き起こすことが知られているので、このことはＶａｐＣによりＤＮＡ複製が阻害され得ることを示唆している。この適用において本発明者らは、まず最初に本発明者らのＭａｚＦの特性決定に関する論文（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００３ｂ）に記載したように、ＲＮＡに対するウラシル、ＤＮＡに対するチミジンおよびタンパク質合成に対するメチオニンの取り込みに及ぼすＶａｐＣの誘導効果を調べることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＶａｐＣの細胞標的を同定するつもりである。本発明者らはまた、細胞でＶａｐＣと相互作用するタンパク質（複数可）を同定するために酵母ツーハイブリッド法を用いるつもりである。本発明者らは、ＶａｐＣのＣ末端にＨｉｓタグを有するＶａｐＣ−ＶａｐＢ複合体を発現させるつもりなので、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を用いるプルダウン試験によってＶａｐＣと相互作用する可能性のある細胞因子（複数可）の分離も試みるつもりである。ＶａｐＣのさらなる特性決定は、ＶａｐＣの細胞標的によって決まるであろう。
【００９１】
結核菌由来のＶａｐＣホモログ  −  結核菌は異常に多数（２３）のＶａｐＣ−ＶａｐＢホモログを有している。これらの系統発生的関係を図１８に示す。これらのモジュールは、ヒト組織におけるこの病原体の休眠に関して重要な役割を果たす可能性があるので、小分子のスクリーニングに対してこれらの複合体を標的にする価値がある。またこの病原体は９つのＭａｚＦホモログを有しており、このすべてを本発明者らの研究室でクローニングした。これらのいくつかは大腸菌で良好に発現し、そのＭＩａｓｅ活性が特徴付けられた（論文は評価中）。したがって本発明者らは、これらのＶａｐＣ−ＶａｐＢモジュールのクローニングおよび発現においていかなる問題も予見していない。本発明者らはこの系統樹の異なるブランチから、これら６つ（ｍｔ−３、ｍｔ−７、ｍｔ−１４、ｍｔ−１６、ｍｔ−１８およびｍｔ−２２）を選択するつもりであり、これらは大腸菌でクローニングされて発現するであろう。本発明者らは、上述したようにインフルエンザ菌のＶａｐＣで得られた結果に基づいてこれらの毒性を特徴付けるつもりである。これらのＴＡ複合体は、研究３に記載されているように小分子に対するスクリーニングのためのＧＦＰ融合タンパク質として発現されるであろう。
【００９２】
研究３：ＴＡ複合体の解離を検出する高感度の一般的方法の開発
小さな化学物質による毒素−抗毒素複合体の解離は、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｂｅａｄｓを用いるＨｉｓタグ付き毒素の除去後に、溶液中でＧＦＰタグ付き抗毒素から発生するＧＦＰ蛍光シグナルを測定することによって検出され得る。
【００９３】
ＧＦＰ融合技術は、生化学研究において欠くことのできない手段になっている。しかしＧＦＰ融合タンパク質は、標的タンパク質の機能を保つためにＧＦＰと標的タンパク質間に適切なリンカー配列を必要とすることが示されている。したがって融合タンパク質が最適に機能する異なる長さのリンカーを有するように設計されていることが、それぞれの融合タンパク質に不可欠である。適用に関して、ＧＦＰ融合は抗毒素と毒素の間の複合体形成を阻害してはならない。この理由のために、本発明者らは様々な長さを有するリンカーを含むリンカーライブラリを開発した。このライブラリを用いて、本発明者らはＧＦＰ融合ＴＡ複合体の各々に対して、リンカーの最適なサイズを同定することができる。
【００９４】
理論的根拠
上記の単離した大部分の毒素の細胞標的はまだ同定されていないので、本発明の方法はすべてのＴＡシステムに適用可能な一般的な方法である。高感度の方法でＴＡ複合体から解離した抗毒素を検出する条件を確立することが重要である。したがって本発明の方法はＧＦＰタグおよびＨｉｓタグを用いるスクリーニング法である。
【００９５】
実験的方法
ＮｄｅＩを欠くＧＦＰ遺伝子の構築  −  緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、自発的に蛍光を発するタンパク質である。ＧＦＰは任意の生物で発現させることができる、その特徴的な蛍光の励起および発光特性を維持する。これは極めて安定であることが示され、したがってそのＮ末端またはＣ末端のいずれにもタンパク質の融合を容易に許容できるため、これが所望のタンパク質に融合される場合、これは発現パターンをモニターするリポーター遺伝子として広く使われている。
【００９６】
プラスミドｐｃＤＮＡ３−１ＮＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯの変異したＧＦＰ遺伝子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるつもりである。その理由は、このＧＦＰ遺伝子は３サイクルのＤＮＡシャッフリングによって作製され、（１）大腸菌で高い溶解性、および（２）野生型ＧＦＰよりも＞４０倍の蛍光の増加をもたらすからである。さらにまたこのＧＦＰ遺伝子のコドンの使用は大腸菌での発現に対して最適化される。今後このＧＦＰタンパク質は、Ｃｙｃｌｅ−３−ＧＦＰと呼ぶ。Ｃｙｃｌｅ−３−ＧＦＰ遺伝子は、１つのＮｄｅＩ部位（塩基２３５〜２４０において；塩基１はＧＦＰコード配列の１番目の塩基である）を有する。本発明者らは、最初にＧＦＰ遺伝子に点突然変異を導入して、テンプレートとしてｐｃＤＭＡ３−１ＮＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯプラスミドを用いる部位特異的突然変異誘発によってそのアミノ酸配列を変更することなく、ＮｄｅＩ部位（ＣＡＴＡＴＧ→ＣＡＣＡＴＧ）を除去するつもりである。得られたプラスミドは、ｐＧＦＰ（ΔＮｄｅＩ）と呼ぶつもりである。ｐｃＤＮＡ３−１ＮＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯプラスミドのＧＦＰ遺伝子は、そのコード配列の後に終止コドンを含まないことに留意されたい。
【００９７】
ＨｉｓタグおよびＧＦＰタグを有するｐＥＴに基づくプラスミドの構築  −  ＧＦＰ遺伝子を、テンプレートとしてｐＧＦＰ（ΔＮｄｅＩ）プラスミドを用いるＰＣＲによって増幅するつもりである（図１９）。このＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＥＴ２１プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）（図２０Ａ）およびＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化したｐＥＴ２８プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）（図２０Ｂ）に導入するつもりである。得られたプラスミドをｐＥＴ２１−ＧＦＰ／ＨｉｓおよびｐＥＴ２８−Ｈｉｓ／ＧＦＰと呼ぶつもりであり、それぞれＧＦＰ配列の下流および上流にＨｉｓタグ配列を有している。終止コドン（ＴＡＡ）を、ｐＥＴ２８−Ｈｉｓ／ＧＦＰプラスミドのＧＦＰコード配列の後に導入してその翻訳を終了させるつもりであることに留意されたい。
【００９８】
Ｈｉｓタグ付き毒素遺伝子およびＧＦＰタグ付き抗毒素遺伝子またはその逆を有するｐＥＴに基づくプラスミドの構築  −  本発明者らは、別の生物に由来するいくつかのＴＡオペロンを用いてｐＥＴに基づく発現プラスミドを構築するつもりである。一般に毒素遺伝子は、それらのオペロンでそれらの抗毒素遺伝子の下流に位置している。しかしｈｉｇＡ（抗毒素）がｈｉｇＢ（毒素）の下流に位置するｈｉｇＢ−ｈｉｇＡオペロンなどの毒素−抗毒素の異なる配置を有するいくつかの例外が存在する。本発明者らは、ＨｉｓタグまたはＧＦＰタグが毒素−抗毒素複合体形成のその完全な特徴を維持する融合タンパク質を構築するために理想的であるかどうか知らないので、本発明者らは、（１）一般的なＴＡオペロン（抗毒素−毒素の順序、例えばｈｉｐＢ−ｈｉｐＡ、ｄｉｎＪ−ｙａｆＱ、ｙｅｆＭ−ｙｏｅＢ、ｒｅｌＢ−ｒｅｌＥ、ｐｈｄ−ｄｏｃ、ｖａｐＢ−ｖａｐＣ、ｙｄｃＤ−ｙｄｃＥおよび黄色ブドウ球菌のｍａｚＥ−ｍａｚＦホモログの順序で）に対して、Ｈｉｓ−抗毒素／毒素−ＧＦＰおよびＧＦＰ−抗毒素／毒素−Ｈｉｓ、ならびに（２）逆方向に配向したＴＡオペロン（毒素−抗毒素の順序、例えばｈｉｇＢ−ｈｉｇＡの順序で）に対してＨｉｓ−毒素／抗毒素−ＧＦＰおよびＧＦＰ−毒素／抗毒素−ＧＦＰを構築するつもりである。大腸菌のｍａｚＥ−ｍａｚＦ、およびｃｈｐＢＩ−ｃｈｐＢＫ遺伝子が、これらの構築から除外されていることに留意されたい（研究１を参照のこと）。
【００９９】
ＴＡオペロンのそれぞれに対して、本発明者らはＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩおよびＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ部位を有する２つのＰＣＲプライマー対を設計するつもりである。これらのプライマーを用いて、それぞれのＴＡオペロンは増幅され、それぞれＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩおよびＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩにより消化されたｐＥＴ２１−ＧＦＰ／ＨｉｓおよびｐＥＴ２８−Ｈｉｓ／ＧＦＰプラスミドの両方にクローニングされるであろう。得られたプラスミドは、これらのＴＡ複合体の精製に用いるつもりである。
【０１００】
ＴＡ複合体の精製  −  上記で構築したｐＥＴに基づくＴＡ発現プラスミドを保有するＢＬ２１（ＤＥ３）株を、合成培地で対数増殖期まで３７℃でインキュベートする。ＴＡ遺伝子を、１ｍＭのイソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて４時間誘導する。細胞を遠心分離により採取し、緩衝液Ａ［５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）］に懸濁する。細胞をフレンチプレッシャーセル（ＴｈｅｒｍｏＩＥＣ、ＭＡ）で溶解し、細胞残渣および未破壊細胞を低速遠心分離により除去する。上清を０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通過させ、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（ＱＩＡＧＥＮ）にアプライする。カラムを緩衝液Ａで十分に洗浄し、ＴＡ複合体を緩衝液Ａ中１５０ｍＭのイミダゾールで溶出する。サンプルを一緒にプールし、５０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのβ−ＭＥを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に透析する。
【０１０１】
ＧＦＰの蛍光シグナル測定による放出された毒素／抗毒素タンパク質の定量  −  ハイスループット・スクリーニング分析法を開発する前に、毒素／抗毒素に融合したＧＦＰの蛍光シグナルを検出する条件を確立することが重要である。本発明者らは、市販のＮｉ−ＮＴＡ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｂｅａｄｓ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてこれらの複合体から解離したＧＦＰタグ付き毒素／抗毒素を分離するつもりである。Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｂｅａｄｓは、磁性粒子を含み、アガロースビーズの表面に共有結合した強い金属キレート化ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基を有するアガロースビーズである。これらはニッケルでチャージ済であり、単一のチューブまたは９６ウェルマイクロプレートで精製に用いることができる。この磁性ビーズは非常に小容量で用いることができ（わずか１０μｌで１０μｇのタンパク質までの精製に使用することができ）、したがって９６ウェルフォーマットのハイスループット微小規模精製に好都合である。ＧＦＰタンパク質の蛍光特性は、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、８Ｍ尿素または１％ＳＤＳを用いる長期にわたる処理で影響を受けない。種々のプロテアーゼ、例えば１ｍｇ／ｍｌまでの濃度でトリプシン、キモトリプシン、パパイン、スブチリシン、サーモリシンおよびパンクレアチンを用いる長期にわたる（４８時間）処理では、ＧＦＰの強度を変更できなかった（Ｂｏｋｍａｎ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ、１９８１）。ＧＦＰは６５℃まで中性緩衝液中で安定であり、５．５から１２までの広範囲のｐＨ安定性を示す。
【０１０２】
それぞれのＧＦＰタグ付きタンパク質は、その非ＧＦＰタグ付き相対物と同様の方法でその同族のタンパク質と複合体を形成する。溶液中に放出されたＧＦＰ蛍光を検出するために、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂上に結合した同量のＴＡ複合体を８Ｍ尿素を用いて解離する。エッペンドルフチューブ中で、緩衝液Ａ中のＮｉ−ＮＴＡ磁性アガロースに結合したＴＡ複合体を室温度で３０分間、８Ｍ尿素で処理する。チューブを強力な磁性ＮｄＦｅＢ（ネオジム−鉄の−ホウ素）ディスク上に置き、放出されたＧＦＰタグ付きタンパク質をチューブ底部に引き寄せる（図２１）。上清を空のチューブへ移し、本発明者らは４８８ｎｍでの励起および５１５ｎｍでの発光の検出により分光光度計を用いて上清の蛍光を測定するつもりである。尿素を含まない緩衝液Ａ中のサンプルを、バックグラウンド対照として用いる。
【０１０３】
予期される問題に対する解決策
いくつかのＧＦＰタグ付き毒素／抗毒素は、ＧＦＰ融合に対してそれぞれのＴＡ複合体を適切に形成しないかもしれない。この場合、本発明者らはＧＦＰと標的タンパク質間に追加のリンカーペプチドを導入するつもりである。もう１つの留意するべき点は、ＧＦＰ融合が毒素または抗毒素を不活性化するかもしれないことである。本発明者らは、すべてのＧＦＰ融合毒素の毒性を調べることによりこれらを試験するつもりであり、これらはｐＢＡＤベクターに挿入することにより本出願において構築されるであろう。これらのｐＢＡＤ構築物でトランスフォームした細胞が添加したアラビノースに対して感受性を示す場合、本発明者らはＧＦＰ融合は毒素の毒性に影響を及ぼさないと結論付けるであろう。同様な方法で、本発明者らは毒素−ＧＦＰ融合抗毒素モジュールも同じｐＢＡＤベクターに挿入するつもりである。これらのプラスミドでトランスフォームした細胞がアラビノース感受性を示す場合、特定の抗毒素に対するＧＦＰ融合は、その同族の毒素と相互作用する抗毒素の能力を無能力化する。この方法により、本発明者らはハイスループット・スクリーニングに用いることができる毒素を選択することができるはずである。これらどちらの構築物も満足できる結果を与えない場合、本発明者らは以下の方法を試みるつもりである。すなわち、（１）本発明者らは、ＧＦＰと毒素または抗毒素の間のリンカーを拡張するつもりであり、これは毒素または抗毒素とＧＦＰの干渉を減らす可能性がある。（２）最後の手段として、本発明者らはＴＡ複合体がマレイミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの小さい蛍光分子を用いて共有結合的に修飾され得るように、毒素または抗毒素のＣ末端にシステイン残基を組み込むつもりである。
［参考文献］
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【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】ｍａｚＥ−ｍａｚＦオペロンの調節。ＭａｚＥおよびＭａｚＦ  ｍＲＮＡは、同じオペロンから合成される。１つのＭａｚＥ二量体が２つのＭａｚＦ二量体に結合してＭａｚＦエンドリボヌクレアーゼ活性を阻害することができ、生じたヘテロ六量体はＴＡオペロンをネガティブに自動調節する。ＭａｚＥ二量体はＣｌｐＰＡにより切断を受けて、ＴＡオペロン転写を自動調節することもできるが、ＭａｚＥ−ＭａｚＦヘテロ六量体複合体に比べはるかに弱い。ＭａｚＦ二量体は、ＭａｚＥが結合していない場合ＭＩａｓｅとして機能してＡＣＡ配列で特異的にｍＲＮＡを切断する（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００３ｂ）。このＭａｚＦエンドリボヌクレアーゼ活性は、細菌細胞の成長停止および最終的には細胞死をもたらす。またすべての他のＴＡシステムも、同様の方法でネガティブに自動調節されるようである。
【図２】毒素−抗毒素複合体のＸ線構造。Ａ．ＭａｚＦ−ＭａｚＥ複合体。１つのＭａｚＥ（色が薄いグレー（右側）の場合はシアン）が、２つのＭａｚＦホモ二量体（色がダークグレーおよび非常に薄いグレーの場合は、ブルーおよび淡いブルー）に結合している（Ｋａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。Ｂ．ＲｅｌＥ−ＲｅｌＢ複合体。２つのＲｅｌＢ単量体（色が最も薄いグレー（左側）および非常に薄いグレー（右側）の場合は、イエローおよび淡いブルー）が、ＲｅｌＥ二量体（色がグレー（左側）およびダークグレー（右側）の場合は、グリーンおよびブルー）に結合している。ＲｅｌＥに結合している場合、ＲｅｌＢは拡がった高次構造の単量体として存在する（Ｔａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）。Ｃ．ＹｏｅＢ−ＹｅｆＭヘテロ六量体複合体。２つのＹｅｆＭ単量体のそれぞれ（色が底部に向かってダークグレー／最も薄いグレーおよび上部に向かって薄いグレー／グレーの場合は、ブルー／淡いブルーおよびシアン／グリーン）が、１つのＹｏｅＢ単量体とヘテロ三量体複合体（色が淡いグレー（左上側）および右側下に向かって中間のグレーの場合は、淡いグリーンおよびオレンジ）を形成する（Ｋａｍａｄａ  ａｎｄ  Ｈａｎａｏｋａ、２００５）。
【図３】様々な毒素−抗毒素複合体のＸ線構造［Ｂｕｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．３０、６７２〜６７９頁から改変］。（ａ）ＭａｚＦ−ＭａｚＥ（４：２）ヘテロ六量体複合体。ＭａｚＦに結合した場合（グレー−ホワイト表面）、ＭａｚＥは拡がった高次構造を有する２つのＣ末端ＭａｚＦ認識ドメイン（色がダークグレー（左側）およびグレー（右側）の場合は、ダークブルーおよびレッド）にはさまれた球状二量体化ドメイン（色が薄いグレーおよびより薄いグレーの場合は、淡いブルーおよびピンクである）から成る。ＭａｚＦが存在しない場合、ＭａｚＥのＣ末端ドメインは秩序付けられていないＫａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。（ｂ）ＹｏｅＢ−ＹｅｆＭ（１：２）ヘテロ三量体複合体。２つのＹｅｆＭ単量体は、１つのＹｏｅＢ単量体とヘテロ三量体の複合体を形成する。１つのＹｅｆＭ単量体において、Ｎ末端のドメインは、完全に秩序付けられており（色がダークグレー（左側）の場合は、ダークブルー）、ＹｏｅＢ（グレー−ホワイト表面表示）に結合して触媒部位で立体配置の変化を誘導する。第２のＹｅｆＭ単量体の対応する部分（色がグレーの場合はレッド、色が無い場合は、中間色のレッド）は、第２の結合したＹｏｅＢ単量体が存在しない場合は部分的にしか順序づけられていない（Ｋａｍａｄａ  ａｎｄ  Ｈａｎａｏｋａ、２００５）。（ｃ）ＲｅｌＥ−ＲｅｌＢ（２：２）ヘテロ四量体の複合体。ＲｅｌＥに結合した場合、ＲｅｌＢは拡がった高次構造を有する単量体として存在する。その毒素パートナーが存在しない場合、これは折り畳まれていないと推測される。２つのＲｅｌＢ単量体（色がダークグレー（ブルー）（左側）およびグレー（レッド）（右側）である場合はレッドおよびブルー）は、ＲｅｌＥ二量体（グレー表面）に結合する（Ｔａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）。
【図４】蛍光プローブおよびクエンチャーの構造。Ａ．ＲＯＸ、６−カルボキシル−Ｘ−ローダミンの構造。Ｂ．Ｅｃｌｉｐｓｅクエンチャーの構造。この化合物は、４００から６５０ｎｍまでの広い波長範囲にわたって蛍光をクエンチする非蛍光性分子である。
【図５】ＣＢＳ−１を用いているＭａｚＦ活性のアッセイ。Ａ．ＣＢＳ−１の切断。反応はテキストに記載したように実施した。蛍光は５５０ｎｍにおける励起を用いて６３５ｎｍで測定した。用いたＭａｚＦの量を図の左側にピコモルで示す。Ｂ．Ａからのデータに基づく時間に対するＭＩａｓｅの反応速度。
【図６】ＢＬ２１（ＢＥ３）株におけるＴ７発現系を用いる毒素と抗毒素の同時発現。対数期まで増殖した細胞培養を、１ｍＭのＩＰＴＧの存在下で３７℃で４〜５時間インキュベートした。全細胞タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後、クーマシー・ブリリアント・ブルー染色に付した。Ｍ、タンパク質マーカー；レーン１、ＩＰＴＧが存在しない場合；レーン２、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ｐｈｄ−ｄｏｃ；レーン３、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ｈｉｐＢ−ｈｉｐＡ；レーン４、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ｄｉｎＪ−ｙａｆＱ；レーン５、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ｍａｚＥ−ｍａｚＦ；レーン６、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ｙｅｆＭ−ｙｏｅＢ；レーン７、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ｈｉｇＢ−ｈｉｇＡ；レーン８、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ｃｈｐＢＩ−ｃｈｐＢＫ；レーン９、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ｖａｐＢ−ｖａｐＣ、およびレーン１０、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ｒｅｌＢ−ｒｅｌＥ。すべてのオペロンに対する３’末端の遺伝子産物、例えばＤｏｃ、ＨｉｐＡ、ＹａｆＱ、ＭａｚＦ、ＹｏｅＢ、ＨｉｇＢ、ＣｈｐＢＫ、ＶａｐＣおよびＲｅｌＥに、そのＮ末端に融合したＨｉｓタグを有するＨｉｇＢを除き、そのＣ末端にＨｉｓタグを付けた。毒素および抗毒素に対応するバンドを、それぞれ緑の三角形および赤い円形で示している。ＭａｚＥおよびＨｉｓ−ＭａｚＦ（レーン５）が、この条件下で同じ位置に共に移動したことに注意すべきである。
【図７】酵母細胞における、ＹｏｅＢまたはＲｅｌＥでなく、ＹａｆＱの発現は細胞死または成長停止を引き起こす。２−□ｍ発現プラスミドｐＹＥＳ２（ガラクトースを用いて毒素発現の誘導を可能にする）を含む等量の野生型酵母細胞を、ＳＣ−ｕｒａプレート上にスポットして発現プラスミドの選択を持続した；細胞は左から右に連続希釈（１：２）した。
【図８】ＹｏｅＢ発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける新たなタンパク質合成を阻害する。パネルＡ．ＹｏｅＢの誘導を伴う場合と伴わない場合の、指数増殖期の大腸菌細胞への［３５Ｓ］メチオニンの取り込み。等しい培養量に由来する等量の細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、オートラジオグラフィーに付した。パネルＢ．大腸菌抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加えて次第に増量する組み換え型ＹｏｅＢを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの翻訳。分子量マーカーの位置を中心のレーンに示す：２１６、１３２、７８、４５．７、３２．５、１８．４および７．６ｋＤａ。
【図９】ＹｏｅＢは、ＭａｚＦと比べ明確に異なる反応速度論でｍＲＮＡを分解する。ｌｐｐ（主要な外膜リポタンパク質）ｍＲＮＡの安定性は、結核菌（ＭＴｂ；上部パネル）または大腸菌（中間パネル）または大腸菌ＭａｚＦ（下部パネル）由来のいずれのＹｏｅＢの誘導後、続いてノーザン分析を実施した。
【図１０】７０ＳリボソームとＹｏｅＢとの相互作用は、ｍＲＮＡテンプレート上のリボソームの位置をシフトする。ＹｏｅＢの翻訳開始複合体に及ぼす効果を測定するトウプリンティング・アッセイ（Ｔｏｅｐｒｉｎｔｉｎｇ  ａｓｓａｙ）。ｍａｚＧ由来の１４０ｎｔの５’ｍＲＮＡフラグメントをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼにより作製し、示したように７０Ｓリボソームおよび／または開始複合体の他の成分をアセンブルするために用いた。適切な産物の位置を左に示す。「リボソーム」とは、７０Ｓリボソームを意味し、「ｔＲＮＡ」とは、ｔＲＮＡｆＭｅｔを意味する。ｍａｚＧの対応するフラグメントのＤＮＡ塩基配列決定ラダーを、プライマーが伸長を停止した配列の決定に用いて産物間の距離を測定した。
【図１１】ＹｏｅＢは、大きい５０Ｓリボソーム・サブユニットと結合している。リボソーム分画を、アラビノースによって媒介されるＹｏｅＢ発現（１０分）を伴うまたは伴わない指数増殖期の細胞から採取し、ショ糖密度勾配遠心分離によって分離した。下部パネルは、ウエスタンブロット分析によりすぐその上のプロフィールにおいて代表的な分画で検出されるＹｏｅＢタンパク質量を反映している。右側の高いピークはショ糖勾配の上部に沈降するｔＲＮＡおよび可溶タンパク質を示す。
【図１２】ｏｍｐＡおよびｏｍｐＦ  ｍＲＮＡを用いるｉｎ  ｖｉｖｏでのプライマー伸長実験。アラビノースの存在下でＹｏｅＢを２時間誘導した後、全ＲＮＡをプライマー伸長実験のために抽出した。示したように、プライマー伸長は開始コドン下流のｏｍｐＡ  ｍＲＮＡに対して３塩基およびｏｍｐＦ  ｍＲＮＡに対して６塩基でブロックされた。他のいかなるバンドも観察されなかった。開始コドン（ＧＴＡ）およびシャイン−ダルガルノ配列（ＧＧＡＧ）はグレーで示されている（色付きの場合は、開始コドンはレッドで、シャイン−ダルガルノはブルーである）。
【図１３】Ｄｏｃ誘導後のノーザンブロット分析。アラビノース添加によりｐＢＡＤベクターを用いてｄｏｃ遺伝子を誘導した。ゲルの上部に示した誘導後の時間に、全細胞ＲＮＡを抽出して、ｏｍｐＡ、ｔｕｆＡおよびｏｍｐＦ  ｍＲＮＡについてノーザンブロットにより分析した。
【図１４】ｐＢＡＤｄｏｃを保有する細胞を用いるＤｏｃ誘導を伴わない場合（左パネル）または伴う場合（右のパネル）の細胞のポリソームパターン。図１１に記載されているように、アラビノース添加によるＤｏｃ誘導を伴う場合と伴わない場合のポリソームパターンを分析した。翻訳伸長反応をブロックする抗生物質であるハイグロマイシンの存在下（上部パネル）または非存在下で、ポリソームパターンを分析した。
【図１５】ＹａｆＱは、ｉｎ  ｖｉｖｏで部位特異的エンドリボヌクレアーゼ活性を示す。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける一部のｅｒａ遺伝子のプライマー伸長分析で、ＹａｆＱによる切断の促進が認められた（ＹａｆＱ誘導時点は、ｅｒａプラスミドを含むがＹａｆＱプラスミド（ＹａｆＱサンプルに隣接する、０、９０、１２０分レーン）を含まない野生型大腸菌ＢＷ２５１１３細胞に対する赤線下の５分から１２０分レーンである）。時間は０．２％アラビノースを用いるｐＢＡＤにおけるＹａｆＱ誘導の分を示す。ｅｒａ  ｍＲＮＡは、ＹａｆＱ誘導前３０分にＩＰＴＧを用いて誘導された。左側の最も遅く移動するバンドは、完全長プライマー伸長産物を示し、他の３つのバンドはｅｒａ  ｍＲＮＡ中の二次構造に起因する未熟終止を示す。真正のＹａｆＱ認識部位は、対照に比べて時間と共に増加するその分解産物として示される。別のＹａｆＱ切断部位がゲル上でさらに上部に認められるが、切断部位を決定するために別のｅｒａプライマーの使用を必要とする。ＹａｆＱに対する明白な切断部位は、ＡＣＡのようである（配列決定ラダー上に示されたその相補体）。
【図１６】ＤｉｎＪはＹａｆＱと安定な複合体を形成する。ｄｉｎＪ−ｙａｆＱモジュールを、Ｈｉｓ６タグをＹａｆＱのカルボキシ末端のみに添加できるようにｐＥＴ発現ベクターにクローニングした。左側および右側のパネルのサンプルを、示した時間誘導し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付してクーマシーブルーで染色した。左側のパネル由来サンプルのアフィニティークロマトグラフィー後、右側のパネルはＤｉｎＪはＹａｆＱと同時精製することを示す。精製ＤｉｎＪ−ＹａｆＱバンドが、ＭＡＬＴＩ−ＴＯＦ質量分析法によって現在確認されている。
【図１７】大腸菌ＭａｚＦとの、枯草菌、炭疽菌、および黄色ブドウ球菌由来のＭａｚＦホモログの配列アラインメント。同一の残基は黒色のバックグラウンドであり、相同な残基はグレーのバックグラウンドである。
【図１８】２３の結核菌ＶａｐＣ（ｍｔ−１〜ｍｔ−２３）の系統学的関係。ディチェロバクター・ノドサス（Ｄｉｃｈｅｌｏｂａｃｔｅｒ  ｎｏｄｏｓｕｓ）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）およびサルモネラ・ダブリン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｄｕｂｌｉｎ）由来のＶａｐＣも、推定上のその他の結核菌毒素であるＭａｚＪ（ｍｔ−ｌ）およびＭａｚＪ（ｍｔ−２）と共に含まれる。
【図１９】サイクルＧＦＰ（ΔＮｄｅＩ）遺伝子のクローニング。ＧＦＰフラグメントは、ｐＧＦＰ（ΔＮｄｅＩ）プラスミドを用い、５’ＡＴＣＡＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＧＧＡＧＡＡ３’および５’ＡＡＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＣＴＴＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴＣＧＴＣ３’または５’ＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＧＧＡＧＡＡ３’および５’ＡＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＣＴＴＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴＣＧＴＣ３’を用いるＰＣＲによって増幅される（下線を付した配列は、制限酵素の認識部位に対応する）。
【図２０】ｐＥＴ２１−ＧＦＰ／ＨｉｓおよびｐＥＴ２８−Ｈｉｓ／ＧＦＰプラスミドの図式的マップ。（Ａ）ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩならびに（Ｂ）ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩが、標的遺伝子のクローニングに用いられる。星印で示された制限酵素は特有な部位でない。
【図２１】Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグ付きＴＡ複合体間の相互作用。このタンパク質を移したとき、磁性ビーズはチューブの底部に引き寄せられ、蛍光を測定するＧＦＰタグ付きタンパク質を放出する。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年12月2日(2008.12.2)
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2009531034.tif 000036
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０】
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【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１８】
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【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１９】
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【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２０】
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【国際調査報告】
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