(57)【要約】本発明によって、ナノ粒子と結合している生物活性ポリペプチドを含むナノ粒子−ポリペプチド複合体が提供され、ここで、その生物活性ポリペプチドは、そのタンパク質の細胞内取り込みを容易にする化学的部分の付加によって改変される。ここで、そのポリペプチドは、タンパク質またはペプチドであり得る。いくつかの実施形態において、そのタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列は、腫瘍抑制遺伝子産物のアミノ酸配列に由来する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ナノ粒子と結合している生物活性ポリペプチド、
ｂ）該ナノ粒子、
を含み、該生物活性ポリペプチドが、該ポリペプチドの細胞内取り込みを容易にする化学的部分の付加によって改変される、ナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項２】
前記ポリペプチドは、ペプチドである、請求項１に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項３】
前記ペプチドのアミノ酸配列は、腫瘍抑制遺伝子産物のアミノ酸配列に由来する、請求項２に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項４】
前記腫瘍抑制遺伝子は、表４に列挙される遺伝子、アポトーシス促進遺伝子、または細胞傷害性遺伝子である、請求項３に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項５】
前記生物活性ペプチドは、ＦＵＳ−１ペプチド、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオボックス遺伝子（Ａｎｔｐ）ペプチド、ＨＩＶ  Ｔａｔペプチド、ヘルペスウイルスＶＰ２２ペプチド、モデル両親媒性ペプチド、トランスポータンペプチド、ＳＶ  ４０  Ｔ抗原ペプチド、またはプロテグリンＩペプチドである、請求項１に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項６】
前記生物活性ペプチドは、ＦＵＳ−１ペプチドである、請求項５に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項７】
前記ＦＵＳ−１ペプチドは、配列番号１を含む、請求項５に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項８】
前記ＦＵＳ−１ペプチドは、配列番号１である、請求項５に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項９】
前記生物活性ペプチドは、ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号２）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３）、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号４）、ＭＧＬＧＬＨＬＬＶＬＡＡＡＬＱＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５）、ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号７）、ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ（配列番号８）またはＲＲＬＳＹＳＲＲＲＦ（配列番号９）を含む、請求項５に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項１０】
前記生物活性ペプチドは、ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号２）を含む、請求項９に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項１１】
前記ペプチドは、腫瘍抑制遺伝子産物のアミノ酸配列の機能性ドメインを含む、請求項３に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項１２】
前記ペプチドは、腫瘍抑制遺伝子産物のアミノ酸配列の予想される機能性ドメインを含む、請求項３に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項１３】
前記予想される機能性ドメインは、前記腫瘍抑制遺伝子産物のアミノ酸配列のコンピュータ支援配列分析によって同定される、請求項１２に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項１４】
前記ポリペプチドは、タンパク質である、請求項１に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項１５】
前記タンパク質のアミノ酸配列は、腫瘍抑制遺伝子産物のアミノ酸配列に由来する、請求項１３に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項１６】
前記腫瘍抑制遺伝子は、表４に列挙される遺伝子である、請求項１４に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項１７】
前記腫瘍抑制遺伝子は、ＦＵＳ−１である、請求項１６に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項１８】
前記ナノ粒子は、脂質ベースのナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、ナノシェル、半導体ナノ結晶、量子ドット、ポリマーベースのナノ粒子、ケイ素ベースのナノ粒子、シリカベースのナノ粒子、金属ベースのナノ粒子、フラーレンまたはナノチューブである、請求項１に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項１９】
前記ナノ粒子は、脂質ベースのナノ粒子である、請求項１８に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項２０】
前記脂質ベースのナノ粒子は、リポソーム、中性リポソーム、ＤＯＰＣリポソームまたはＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞である、請求項１８に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項２１】
前記リポソームは、ＤＯＰＣリポソームである、請求項２０に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項２２】
前記ナノ粒子は、超常磁性ナノ粒子である、請求項１８に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項２３】
前記ナノ粒子は、超常磁性ナノ粒子であり、そして前記ナノ粒子−ポリペプチド複合体は、リポソーム内またはＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞内にある、請求項１８に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項２４】
前記リポソームは、ＤＯＰＣリポソームである、請求項２３に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項２５】
前記化学的部分は、脂肪酸である、請求項１に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項２６】
前記脂肪酸は、Ｃ４〜Ｃ１８脂肪酸である、請求項２５に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項２７】
前記脂肪酸は、ステアレートまたはミリステートである、請求項２５に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項２８】
前記化学的部分は、細胞透過性ペプチドである、請求項１に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項２９】
前記細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ  Ｔａｔ、ヘルペスウイルスＶＰ２２、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオボックス遺伝子産物に由来する、請求項２８に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項３０】
前記ナノ粒子と結合している第２の生物活性ポリペプチドをさらに含む、請求項１に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項３１】
前記第１の生物活性ポリペプチドおよび前記第２の生物活性ポリペプチドは、生物活性ペプチドであり、該生物活性ペプチドの各々は、異なる腫瘍抑制遺伝子産物に由来するアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項３２】
前記ナノ粒子−ポリペプチド複合体を組織または細胞を標的する標的化部分をさらに含む、請求項１に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項３３】
ａ）ナノ粒子と結合している生物活性ポリペプチド、
ｂ）該ナノ粒子、
を含み、該生物活性ポリペプチドが、ステアレート部分の付加によって改変され、そして該ナノ粒子が、ＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞、ＤＯＰＣリポソームまたは超常磁性ナノ粒子である、ナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項３４】
ａ）アミノ酸配列ＫＬＲＲＶＨＫＮＬＩＰＱＧＩＶＫＬＤＨＰＲ（配列番号１）；または
ｂ）その生物学的に活性な改変体；
を含む、単離されたペプチド。
【請求項３５】
前記ペプチドは、１０アミノ酸残基長〜１００アミノ酸残基長である、請求項３４に記載のペプチド。
【請求項３６】
前記ペプチドは、１０アミノ酸残基長〜７５アミノ酸残基長である、請求項３５に記載のペプチド。
【請求項３７】
前記ペプチドは、１０アミノ酸残基長〜５０アミノ酸残基長である、請求項３６に記載のペプチド。
【請求項３８】
前記ペプチドは、１０アミノ酸残基長〜２５アミノ酸残基長である、請求項３７に記載のペプチド。
【請求項３９】
前記ペプチドは、１０アミノ酸残基長である、請求項３８に記載のペプチド。
【請求項４０】
前記ペプチドは、該ペプチドの細胞内取り込みを容易にする化学的部分の付加によって改変される、請求項３４に記載のペプチド。
【請求項４１】
前記化学的部分は、脂肪酸である、請求項４０に記載のペプチド。
【請求項４２】
前記化学的脂肪酸は、Ｃ４〜Ｃ１８脂肪酸である、請求項４１に記載のペプチド。
【請求項４３】
前記脂肪酸は、ステアレートまたはミリステートである、請求項４２に記載のペプチド。
【請求項４４】
前記化学的部分は、細胞透過性ペプチドである、請求項４０に記載のペプチド。
【請求項４５】
前記細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ  Ｔａｔ、ヘルペスウイルスＶＰ２２、またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオボックス遺伝子産物に由来する、請求項４４に記載のペプチド。
【請求項４６】
ａ）請求項３４〜４５のうちのいずれか１項に記載の生物活性ペプチド、
ｂ）ナノ粒子、
を含む、ナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項４７】
前記ナノ粒子は、脂質ベースのナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、ナノシェル、半導体ナノ結晶、量子ドット、ポリマーベースのナノ粒子、ケイ素ベースのナノ粒子、シリカベースのナノ粒子、金属ベースのナノ粒子、フラーレンまたはナノチューブである、請求項４６に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項４８】
前記ナノ粒子は、脂質ベースのナノ粒子である、請求項４７に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項４９】
前記脂質ベースのナノ粒子は、リポソームまたはＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞である、請求項４８に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項５０】
前記ナノ粒子は、超常磁性ナノ粒子である、請求項４７に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項５１】
前記ナノ粒子は、超常磁性ナノ粒子であり、そして前記ナノ粒子−ポリペプチド複合体は、リポソーム内またはＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞内にある、請求項４７に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項５２】
ａ）ナノ粒子と結合しているアミノ酸配列ＫＬＲＲＶＨＫＮＬＩＰＱＧＩＶＫＬＤＨＰＲ（配列番号１）のペプチド、
ｂ）該ナノ粒子、
を含み、該ペプチドは、ステアレート部分の付加によって改変され、そして該ナノ粒子は、リポソーム、ＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞、ＤＯＰＣリポソームまたは超常磁性ナノ粒子である、ナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項５３】
疾患を処置する方法であって、被験体に、請求項１〜５２のうちのいずれか１項に記載のペプチドまたはナノ粒子−ポリペプチド複合体のうちのいずれか１つを薬学的に受容可能な希釈剤中に含む薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項５４】
前記疾患が、癌である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
化学療法剤を前記被験体に投与する工程をさらに包含する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記化学療法剤は、イマチニブである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記癌は、肺癌である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記肺癌は、ＮＳＣＬＣである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
放射線を前記被験体に適用する工程をさらに包含する、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
第２の生物活性ポリペプチドを前記被験体に投与する工程をさらに包含する、請求項５３に記載の方法。
【請求項６１】
ポリペプチドを細胞に送達する方法であって、
ａ）請求項１〜３３および請求項４６〜５２のうちのいずれか１項に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体のうちのいずれか１つを調製する工程；ならびに
ｂ）該細胞と該ナノ粒子−ポリペプチド複合体とを、該細胞による該生物活性ポリペプチドの取り込みを可能にするために十分な条件下で接触させる工程；
を包含する、方法。
【請求項６２】
被験体において腫瘍を処置する方法であって、該被験体に、請求項１〜５２に記載のペプチドまたはナノ粒子−ポリペプチド複合体のうちのいずれか１つの治療的に有効な量を投与する工程を包含し、該ナノ粒子複合体のポリペプチドが、腫瘍抑制遺伝子産物のアミノ酸配列に基づく、方法。
【請求項６３】
前記投与は、腹腔内注射である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記腫瘍は、胃腸の腫瘍である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
ナノ粒子−ポリペプチド複合体を作製する方法であって、
ａ）生物活性ポリペプチドの配列中の１個以上の機能性ドメインを同定する工程；
ｂ）該機能性ドメインのうちの少なくとも１個を含むペプチドを調製する工程；
ｃ）所望の生物学的活性を有するペプチドを選択する工程；および
ｄ）該ペプチドとナノ粒子とを結合させることによってナノ粒子−ポリペプチド複合体を調製する工程；
を包含する、方法。
【請求項６６】
前記同定する工程は、コンピュータ支援構造分析を使用する工程を包含する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記コンピュータ支援構造分析は、推定上のプロテインキナーゼ相互作用部位、推定上のミリルトイル化部位、ＰＤＺクラスＩＩドメインモチーフまたはＡキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）モチーフの同定をもたらす、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ペプチドの細胞内取り込みを容易にする化学的部分を付加することによって該ペプチドを改変する工程をさらに包含する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記機能性ドメインは、腫瘍抑制遺伝子のアミノ酸配列の予想される機能性ドメインである、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
タンパク質チロシンキナーゼを阻害する方法であって、該キナーゼと、請求項３４〜４５のうちのいずれか１項に記載のペプチドのうちの１つとを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項７１】
前記キナーゼは、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ｃＫｉｔ、ｃＡｂｌ、またはＥｒｋである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、該腫瘍細胞と、請求項３４〜４５のうちのいずれか１項に記載のペプチドのうちの１つとを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項７３】
腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、該腫瘍細胞と、請求項４６〜５１のうちのいずれか１項に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体のうちの１つとを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項７４】
請求項１〜３２および請求項４６〜５１のうちのいずれか１項に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体のうちのいずれか１つを含み、該ナノ粒子が、超常磁性ナノ粒子である、磁気共鳴画像法のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本願は、米国仮特許出願第６０／７５３，６３２号（２００５年１２月２２日出願）、および米国仮特許出願第６０／６６１，６８０号（２００５年３月１４日出願）（これらの内容および開示の全体は、権利の放棄を伴わずに本明細書中に参考として具体的に援用される）の利益を主張する。政府は、ＮＩＨからの助成金番号Ｐ５０ＣＡ７０９０７−０７、およびＤＯＤからのＤＡＭＤ１７００２−１−０７０６に準じて本発明において権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、分子生物学および癌治療の分野に関連する。
【０００３】
（関連分野の説明）
細胞内で作用するタンパク質およびペプチドの治療的使用は、癌および他の疾患の処置として非常に有望である。しかし、細胞中へのポリペプチドの効率的な導入を達成することは、困難であった。したがって、細胞中にポリペプチドを導入する新規方法が、必要とされる。
【０００４】
癌は、複数の因子の出現をもたらす。変異は、細胞増殖を増大させるプロトオンコジーンにおいて起こり得る。変異はまた、その正常な機能が細胞増殖を調節する腫瘍抑制因子において起こり得る。ＤＮＡ修復酵素における変異は、増殖する前に損傷を修復する細胞の能力を損なう。
【０００５】
腫瘍抑制遺伝子は、その欠如（損失または不活化）が癌をもたらし得る正常な遺伝子である。腫瘍抑制遺伝子は、細胞の増殖および分裂を遅くするタンパク質をコードする。腫瘍抑制遺伝子の野生型対立遺伝子は、異常な細胞増殖を抑制するタンパク質を発現する。腫瘍抑制因子タンパク質についてコードする遺伝子が、変異または欠失する場合、得られる変異体タンパク質または腫瘍抑制因子タンパク質発現の完全な欠如は、細胞増殖を正しく調節することができない可能性があり、そして異常な細胞増殖が、起こり得る（特に、既に細胞の調節機構に対して存在する損傷がある場合）。多くの十分に研究されたヒト腫瘍およびヒト腫瘍細胞株は、腫瘍抑制遺伝子を欠いているか、または非機能的な腫瘍抑制遺伝子を有することが示されている。腫瘍抑制遺伝子の例としては、網膜芽細胞腫感受性またはＲＢ遺伝子、ｐ５３遺伝子、結腸癌において欠如した（ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（ＤＤＣ）遺伝子および神経線維腫症１型（ＮＦ−１）腫瘍抑制遺伝子（非特許文献１）が挙げられるが、これらに限定されない。機能の損失または腫瘍抑制遺伝子の不活化は、かなりの数のヒト癌のイニシエーションおよび／または進行において中心的な役割を果たし得る。
【非特許文献１】Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１年，第２５４巻，ｐ．１１３８−１１４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、多くの一般的な癌の型を処置するための有効な選択肢は、あまり存在しない。所定の個体に対する処置の過程は、診断、疾患が発症した段階、ならびに患者の年齢、性別および健康状態などの因子に依存する。癌の処置の最も従来通りの選択肢は、外科手術、放射線療法および化学療法である。これらの治療の各々は、種々の副作用を伴い、そしてこれらの治療は、種々の程度の効力を有する。したがって、腫瘍抑制因子ポリペプチドに基づく治療を含む癌治療を開発し続けることに対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、ナノ粒子と結合している生物活性ポリペプチドを含むナノ粒子−ポリペプチド複合体を提供し、その生物活性ポリペプチドは、そのポリペプチドの細胞内取り込みを容易にする化学的部分の付加によって改変される。上記ポリペプチドは、タンパク質またはペプチドであり得る。いくつかの実施形態において、上記タンパク質またはペプチドのアミノ酸配列は、腫瘍抑制遺伝子産物のアミノ酸配列に由来する。例示の腫瘍抑制タンパク質は、表４に列挙される腫瘍抑制遺伝子に由来するものであり、その腫瘍抑制遺伝子としては、ＣＡＣＮＡ２Ｄ２、ＰＬ６、１０１Ｆ６、ＮＰＲ１．２、ＢＬＵ、ＲＡＳＳＦ１、ＦＵＳ１、ＨＹＡＬ２およびＨＹＡＬ１が挙げられる。
【０００８】
さらなる実施形態において、上記ペプチドは、腫瘍抑制遺伝子産物のアミノ酸配列の予想される機能性ドメイン、またはこのようなドメインの生物学的に活性な改変体を含み得る。上記予想される機能性ドメインは、腫瘍抑制遺伝子産物のコンピュータ支援配列分析によって同定され得、そしてミリルトイル化部位モチーフ、ＰＫＡキナーゼモチーフ、ＡＫＡＰ結合モチーフ、またはＰＤＺクラスＩＩドメインモチーフなどのドメインであり得る。
【０００９】
上記ナノ粒子は、脂質ベースのナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、ナノシェル、半導体ナノ結晶、量子ドット、ポリマーベースのナノ粒子、ケイ素ベースのナノ粒子、シリカベースのナノ粒子、金属ベースのナノ粒子、フラーレンまたはナノチューブであり得る。特定の実施形態において、上記ナノ粒子は、脂質ベースのナノ粒子または超常磁性ナノ粒子である。脂質ベースのナノ粒子の例としては、リポソームＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞が挙げられる。
【００１０】
いくつかの実施形態において、上記化学的部分は、脂肪酸である。好ましくは、上記脂肪酸は、Ｃ４〜Ｃ１８脂肪酸である。よりなお好ましくは、上記脂肪酸は、ステアレートまたはミリステートである。他の実施形態において、上記化学的部分は、細胞透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔ、ヘルペスウイルスＶＰ２２、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオボックス遺伝子産物、シグナル配列、融合配列、またはプロテグリンＩに由来するペプチド）である。
【００１１】
ナノ粒子−ポリペプチド複合体は、前記ナノ粒子に結合している第２の生物活性ポリペプチドを含み得る。両方のポリペプチドは、タンパク質であり得るか、または両方は、ペプチドであり得るか、または一方が、タンパク質であり得、かつ他方が、ペプチドであり得る。特定の実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの両方は、生物活性ペプチドであり、それぞれは、異なる腫瘍抑制遺伝子産物に由来するアミノ酸配列を含む。ナノ粒子−ポリペプチド複合体はまた、タンパク質とポリペプチドとの任意の組み合わせにで３種以上の生物活性ポリペプチドを含み得る。
【００１２】
また、いくつかの実施形態において、超常磁性ナノ粒子を含むナノ粒子−ポリペプチド複合体は、リポソーム内またはＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞内に封入される。
【００１３】
別の局面において、本発明は、抗癌特性を有する単離されたペプチドを提供し、その単離されたペプチドは、アミノ酸配列ＫＬＲＲＶＨＫＮＬＩＰＱＧＩＶＫＬＤＨＰＲ（配列番号１）またはその生物学的に活性な改変体を含む。
【００１４】
上記単離されたペプチドは、好ましくは１０アミノ酸残基長〜１００アミノ酸残基長であり、より好ましくは１０残基長〜７５残基長であり、よりなお好ましくは１０残基長〜５０残基長であり、よりさらに好ましくは１０残基長〜２５残基長であり、さらにより好ましくは１０残基長である。任意の単離されたペプチドは、本明細書中に記載されるように、そのペプチドの細胞内取り込みを容易にする化学的部分の付加によって改変され得る。また、任意の単離されたペプチドは、本明細書中に記載されるナノ粒子−ポリペプチド複合体のうちのいずれか１つに組み込まれ得る。
【００１５】
本発明はまた、薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、本明細書中に記載されるナノ粒子−ポリペプチド複合体のうちのいずれか１つ、またはアミノ酸配列ＫＬＲＲＶＨＫＮＬＩＰＱＧＩＶＫＬＤＨＰＲ（配列番号１）に基づくペプチドのうちのいずれか１つを、薬学的に受容可能な希釈剤中に含み得る。
【００１６】
本発明は、タンパク質を細胞に送達する方法をさらに提供する。その方法は、本明細書中に記載されるナノ粒子−ポリペプチド複合体のうちのいずれか１つを調製する工程、および上記細胞と上記ナノ粒子−ポリペプチド複合体とを、上記細胞による上記生物活性ポリペプチドの取り込みを可能にするために十分な条件下で接触させる工程を包含する。特定の実施形態において、上記細胞は、ヒトにおける細胞である。
【００１７】
被験体において腫瘍を処置する方法もまた、本発明において提供される。その方法は、上記被験体に、本明細書中に記載されるナノ粒子−ポリペプチド複合体のうちのいずれか１つの治療的に有効な量、アミノ酸配列ＫＬＲＲＶＨＫＮＬＩＰＱＧＩＶＫＬＤＨＰＲ（配列番号１）に基づくペプチドのうちのいずれか１つの治療的に有効な量を投与する工程を包含し、上記ナノ粒子複合体のポリペプチドは、腫瘍抑制遺伝子産物のアミノ酸配列に基づく。処置は、化学療法剤、放射線または第２の生物活性ポリペプチドを上記被験体に適用する工程をさらに包含し得る。
【００１８】
本発明はまた、ナノ粒子−ポリペプチド複合体を作製する方法を提供する。特定の実施形態において、その方法は、ａ）生物活性ポリペプチドの配列中の１個以上の機能性ドメインを同定する工程；ｂ）上記機能性ドメインのうちの少なくとも１個を含むペプチドを調製する工程；ｃ）所望の生物学的活性を有するペプチドを選択する工程；およびｄ）上記ペプチドとナノ粒子とを結合させることによってナノ粒子−ポリペプチド複合体を調製する工程を包含する。特定の実施形態において、上記機能性ドメインは、腫瘍抑制遺伝子産物のコンピュータ支援配列分析によって同定される。特定の実施形態において、その方法は、上記ペプチドの細胞内取り込みを容易にする化学的部分を付加することによって上記ペプチドを改変する工程を包含する。
【００１９】
本発明はまた、タンパク質チロシンキナーゼを阻害する方法を提供する。その方法は、上記キナーゼと、本明細書中に記載されるアミノ酸配列ＫＬＲＲＶＨＫＮＬＩＰＱＧＩＶＫＬＤＨＰＲ（配列番号１）に基づくペプチドのうちの１つとを接触させる工程を包含する。特定の詳細な実施形態において、上記キナーゼは、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ｃＫｉｔ、ｃＡｂｌ、またはＥｒｋである。
【００２０】
本発明は、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する方法さらに提供する。その方法は、上記腫瘍細胞と、アミノ酸配列ＫＬＲＲＶＨＫＮＬＩＰＱＧＩＶＫＬＤＨＰＲ（配列番号１）に基づく本明細書中に記載されるペプチドまたはナノ粒子−ポリペプチド複合体のうちの１つとを接触させる工程を包含する。
【００２１】
本発明はまた、磁気共鳴画像法のための組成物を提供する。その組成物は、本明細書中に記載されるナノ粒子−ポリペプチド複合体のうちのいずれか１つを含み、上記ナノ粒子は、超常磁性ナノ粒子である。
【００２２】
本発明の局面は、ナノ粒子に結合している生物活性ポリペプチドを含むナノ粒子−ポリペプチド複合体に関し、上記生物活性ポリペプチドは、上記ポリペプチドの細胞内取り込みを容易にする化学的部分の付加によって改変される。上記ポリペプチドは、ペプチドであり得る。上記ペプチドのアミノ酸配列は、腫瘍抑制遺伝子産物のアミノ酸配列に由来し得る。特定の実施形態において、上記腫瘍抑制遺伝子は、表４に列挙される遺伝子、アポトーシス促進遺伝子、または細胞傷害性遺伝子（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｇｅｎｅ）である。上記生物活性ペプチドは、ＦＵＳ−１ペプチド、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオボックス遺伝子（Ａｎｔｐ）ペプチド、ＨＩＶ  Ｔａｔペプチド、ヘルペスウイルスＶＰ２２ペプチド、モデル両親媒性ペプチド、トランスポータン（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）ペプチド、ＳＶ  ４０  Ｔ抗原ペプチド、またはプロテグリンＩペプチドであり得る。特定の実施形態において、上記生物活性ペプチドは、ＦＵＳ−１ペプチドである。上記ＦＵＳ−１ペプチドは、配列番号１を含み得る。特定の実施形態において、上記ＦＵＳ−１ペプチドは、配列番号１である。上記生物活性ペプチドは、ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号２）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３）、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号４）、ＭＧＬＧＬＨＬＬＶＬＡＡＡＬＱＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５）、ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号７）、ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ（配列番号８）またはＲＲＬＳＹＳＲＲＲＦ（配列番号９）を含み得る。上記生物活性ペプチドは、ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号２）を含み得る。
【００２３】
上記ペプチドは、腫瘍抑制遺伝子産物のアミノ酸配列の機能性ドメインを含み得る。上記ペプチドは、腫瘍抑制遺伝子産物のアミノ酸配列の予想される機能性ドメインを含む。上記予想される機能性ドメインは、腫瘍抑制遺伝子産物のアミノ酸配列のコンピュータ支援配列分析によって同定される。上記ポリペプチドは、タンパク質であり得る。上記タンパク質のアミノ酸配列は、腫瘍抑制遺伝子産物のアミノ酸配列に由来し得る。上記腫瘍抑制遺伝子は、表４に記載される遺伝子であり得る。特定の実施形態において、上記腫瘍抑制遺伝子は、ＦＵＳ−１である。
【００２４】
上記ナノ粒子は、脂質ベースのナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、ナノシェル、半導体ナノ結晶、量子ドット、ポリマーベースのナノ粒子、ケイ素ベースのナノ粒子、シリカベースのナノ粒子、金属ベースのナノ粒子、フラーレンまたはナノチューブであり得る。上記ナノ粒子は、脂質ベースのナノ粒子であり得る。上記脂質ベースのナノ粒子は、リポソーム、中性リポソーム（ｎｅｕｔｒａｌ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、ＤＯＰＣリポソームまたはＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞であり得る。上記リポソームは、ＤＯＰＣリポソームであり得る。特定の実施形態において、上記ナノ粒子は、超常磁性ナノ粒子である。特定の実施形態において、上記ナノ粒子は、超常磁性ナノ粒子であり、そして上記ナノ粒子−ポリペプチド複合体は、リポソーム内またはＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞内にある。上記リポソームは、ＤＯＰＣリポソームであり得る。上記化学的部分は、脂肪酸（例えば、Ｃ４〜Ｃ１８脂肪酸、ステアレートまたはミリステート）であり得る。上記化学的部分は、細胞透過性ペプチドであり得る。上記細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ  Ｔａｔ、ヘルペスウイルスＶＰ２２、またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオボックス遺伝子産物に由来し得る。
【００２５】
特定の実施形態において、上記ナノ粒子−ポリペプチド複合体は、上記ナノ粒子と結合している第２の生物活性ポリペプチドをさらに含む。上記第１の生物活性ポリペプチドおよび上記第２の生物活性ポリペプチドは、生物活性ペプチドであり得、上記生物活性ペプチドの各々は、異なる腫瘍抑制遺伝子産物に由来するアミノ酸配列を含む。上記ナノ粒子−ポリペプチド複合体は、上記ナノ粒子−ポリペプチド複合体を組織または細胞を標的する標的化部分をさらに含み得る。
【００２６】
本発明の別の局面は、ナノ粒子に結合している生物活性ポリペプチドを含むナノ粒子−ポリペプチド複合体に関し、上記生物活性ポリペプチドが、ステアレート部分の付加によって改変され、そして上記ナノ粒子が、ＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞、ＤＯＰＣリポソームまたは超常磁性ナノ粒子である。
【００２７】
本発明のさらなる局面は、アミノ酸配列ＫＬＲＲＶＨＫＮＬＩＰＱＧＩＶＫＬＤＨＰＲ（配列番号１）またはその生物学的に活性な改変体を含む単離されたペプチドに関する。上記ペプチドは、１０アミノ酸残基長〜１００アミノ酸残基長、１０アミノ酸残基長〜７５アアミノ酸残基長、１０アミノ酸残基長〜５０アミノ酸残基長、１０アミノ酸残基長〜２５アミノ酸残基長または１０アミノ酸残基長であり得る。上記ペプチドは、上記ペプチドの細胞内取り込みを容易にする化学的部分の付加によって改変され得る。上記化学的部分は、脂肪酸（例えば、Ｃ４〜Ｃ１８脂肪酸、ステアレートまたはミリステート）または細胞透過性ペプチドであり得る。上記細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ  Ｔａｔ、ヘルペスウイルスＶＰ２２、またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオボックス遺伝子産物に由来し得る。
【００２８】
本発明の別の局面は、本発明の生物活性ペプチドおよびナノ粒子を含むナノ粒子−ポリペプチド複合体に関する。上記ナノ粒子は、脂質ベースのナノ粒子（例えば、リポソームまたはＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞）、超常磁性ナノ粒子、ナノシェル、半導体ナノ結晶、量子ドット、ポリマーベースのナノ粒子、ケイ素ベースのナノ粒子、シリカベースのナノ粒子、金属ベースのナノ粒子、フラーレンまたはナノチューブであり得る。特定の実施形態において、上記ナノ粒子は、超常磁性ナノ粒子であり、上記ナノ粒子−ポリペプチド複合体は、リポソーム内またはＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞内にある。
【００２９】
本発明の別の局面は、ナノ粒子と結合しているアミノ酸配列ＫＬＲＲＶＨＫＮＬＩＰＱＧＩＶＫＬＤＨＰＲ（配列番号１）のペプチドを含むナノ粒子−ポリペプチド複合体に関し、上記ペプチドは、ステアレート部分の付加によって改変され、そして上記ナノ粒子は、リポソーム、ＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞、ＤＯＰＣリポソームまたは超常磁性ナノ粒子である。
【００３０】
本発明の別の局面は、疾患を処置する方法に関し、その方法は、被験体に、本発明のペプチドまたはナノ粒子−ポリペプチド複合体を薬学的に受容可能な希釈剤中に含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。上記疾患は、癌（例えば、肺癌、ＮＳＣＬＣ）であり得る。その方法は、化学療法剤（例えば、イマチニブ）を上記被験体に投与する工程をさらに包含し得る。その方法は、放射線または第２の生物活性ポリペプチドを上記被験体に適用する工程をさらに包含し得る。
【００３１】
本発明のさらなる局面は、ポリペプチドを細胞に送達する方法に関し、その方法は、本発明のナノ粒子−ポリペプチド複合体を調製する工程、および上記細胞と上記ナノ粒子−ポリペプチド複合体とを、上記細胞による上記生物活性ポリペプチドの取り込みを可能にするために十分な条件下で接触させる工程を包含する。
【００３２】
本発明の別の局面は、被験体において腫瘍を処置する方法に関し、上記被験体に、本発明のペプチドまたはナノ粒子−ポリペプチド複合体の治療的に有効な量を投与する工程を包含し、上記ナノ粒子複合体のポリペプチドは、腫瘍抑制遺伝子産物のアミノ酸配列に基づく。上記投与は、腹腔内注射であり得る。上記腫瘍は、胃腸の腫瘍であり得る。
【００３３】
本発明のさらなる局面は、ナノ粒子−ポリペプチド複合体を作製する方法に関し、その方法は、生物活性ポリペプチドの配列中の１個以上の機能性ドメインを同定する工程；上記機能性ドメインのうちの少なくとも１個を含むペプチドを調製する工程；所望の生物学的活性を有するペプチドを選択する工程；および上記ペプチドとナノ粒子とを結合させることによってナノ粒子−ポリペプチド複合体を調製する工程を包含する。上記同定する工程は、コンピュータ支援構造分析を使用する工程を包含し得る。上記コンピュータ支援構造分析は、推定上のプロテインキナーゼ相互作用部位、推定上のミリルトイル化部位、ＰＤＺクラスＩＩドメインモチーフまたはＡキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）モチーフの同定をもたらし得る。その方法、前記ペプチドの細胞内取り込みを容易にする化学的部分を付加することによって上記ペプチドを改変する工程をさらに包含し得る。上記機能性ドメインは、腫瘍抑制遺伝子のアミノ酸配列の予想される機能性ドメインであり得る。
【００３４】
本発明の別の局面は、タンパク質チロシンキナーゼを阻害する方法に関し、その方法は、上記キナーゼ（例えば、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ｃＫｉｔ、ｃＡｂｌ、またはＥｒｋ）と、本発明のペプチドとを接触させる工程を包含する。
【００３５】
本発明のさらなる局面は、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する方法に関し、その方法は、上記腫瘍細胞と本発明のペプチドとを接触させる工程を包含する。
【００３６】
本発明の別の局面は、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する方法に関し、その方法は、上記腫瘍細胞と本発明のナノ粒子−ポリペプチド複合体とを接触させる工程を包含する。
【００３７】
本発明の別の局面は、磁気共鳴画像法のための組成物に関し、その組成物は、本発明のナノ粒子−ポリペプチド複合体を含み、上記ナノ粒子は、超常磁性ナノ粒子である。
【００３８】
本明細書中に記載される任意の方法または組成物は本明細書中に記載される任意の他の方法または組成物に関連し得ることが、企図される。
【００３９】
語「ａ」または「ａｎ」の使用は、特許請求の範囲および／または明細書において用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と組み合わせて使用される場合、「１つ」を意味し得るが、それはまた、「１つ以上（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」、「少なくとも１つ」および「１つ以上（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ）」の意味と一致する。
【００４０】
本発明の他の対象、特徴および利点は、以下の詳細な説明によって明らかとなる。しかし、詳細な説明および特定の例は、本発明の特定の実施形態を示す一方で、例示のみを目的として与えられることが理解されるべきである。なぜならば、本発明の精神および範囲内における種々の変更および改変は、この詳細な説明によって当業者に明らかとなるからである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下の図面は、本明細書の一部を構成し、そして本発明の特定の局面をさらに示すために含まれる。本発明は、これらの図面の１つ以上を、本明細書中に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、より十分に理解され得る。
【００４２】
（例示の実施形態の説明）
（Ｉ．ナノ粒子−ポリペプチド複合体）
本発明は、ポリペプチドを細胞に送達するための組成物および方法を提供する。上記組成物および方法は、任意の生物活性タンパク質または生物活性ペプチドの一般的な有用性を有し、そして多くの型の疾患を処置するための治療用試薬を提供する。特に、本発明は、ポリペプチドを細胞の内部に送達するためのナノ粒子−ポリペプチド複合体、およびこのような複合体を使用する方法を提供する。上記複合体は、ナノ粒子と結合している生物活性ポリペプチドを含む。本明細書中で使用される場合、「結合」は、物理的結合、化学的結合またはその両方を意味する。例えば、結合は、共有結合、疎水性相互作用、被包、表面吸着などを含み得る。
【００４３】
細胞の内部で機能するタンパク質およびペプチドは、治療用薬物として実質的な価値を有する。酵素の損失によって生じる代謝病に関して、重要な酵素活性を供給するタンパク質またはペプチドの細胞内送達は、疾患を処置するために使用され得る。癌の処置はまた、腫瘍細胞中へのタンパク質薬物またはペプチド薬物の導入（例えば、オンコジーンを阻害するか、アポトーシスを促進するか、新脈管形成を妨げるか、そして／または腫瘍抑制遺伝子産物の機能を回復もしくは提供するタンパク質および／またはペプチドを導入すること）からの利益を受け得る。細胞内にポリペプチドを送達するための組成物および方法を提供することによって、本発明は、種々の疾患の処置のための有効な治療剤を提供する。
【００４４】
本発明は、疾患および障害の処置のための有効な治療剤を提供し得、それらの疾患および障害は、タンパク質の機能もしくは活性の損失、またはタンパク質活性の不適切な発現を含む。例えば、代謝病は、代謝において遺伝的欠陥が存在する１，０００より多い遺伝性障害を含む。代謝は、身体の必須成分の形成（同化）または必須身体成分の分解（異化）を含む。代謝経路の各工程は、酵素によって制御される。遺伝的欠損は、酵素活性の減少または損失をもたらす。代謝障害は、身体の任意の系および細胞に疾患を引き起こし得るが、疾患の重篤度は、変化し得、かつ予想できない。いくつかの欠損は、ほとんど問題を引き起こさないが、他の欠損は、重篤な病気および死をもたらす。本発明は、罹患した細胞に必要な酵素活性を供給し、それによって疾患状態を減少させるかまたは排除するナノ粒子−ポリペプチド複合体の形態で治療剤を提供し得る。
【００４５】
あるいは、タンパク質活性の不適切な発現を含む疾患に関して、タンパク質活性のインヒビターの使用は、実質的な利益を提供し得る。例えば、多くの疾患状態は、プロテインキナーゼ媒介性の事象によって引き起こされる異常な細胞応答に関連する。これらの疾患としては、自己免疫疾患、炎症性疾患、代謝病、神経学的疾患および神経変性性疾患、癌、心血管疾患、アレルギーおよび喘息、アルツハイマー病ならびにホルモン関連疾患などの疾患が挙げられる。酵素活性を破壊するか、またはプロテインキナーゼの細胞内における限局化を妨害するプロテインキナーゼインヒビターは、このような疾患の処置に役立つ治療剤であることが予想される。実際に、プロテインキナーゼの触媒活性を阻害するペプチド（Ｈｖａｌｂｙら、１９９４）およびプロテインキナーゼの非細胞標的化を破壊するペプチド（ＣｏｌｌｅｄｇｅおよびＳｃｏｔｔ、１９９９）が、同定されている。本発明は、これらおよび他のプロテインキナーゼ阻害性ポリペプチドを細胞に送達するために使用され得る組成物および方法を提供する。したがって、本発明は、多数の疾患を処置する一般的な方法を提供する。
【００４６】
ポリペプチドは、代表的に、細胞膜を横切ることの困難性を有する。タンパク質およびペプチドは、代表的に、荷電したアミノ酸残基および荷電していないアミノ酸残基の両方を有する。荷電した残基は、膜結合および細胞内への膜輸送を妨害し得る。本発明は、例えば、細胞内取り込みを容易にするために上記生物活性ポリペプチドに化学的部分を付加することによって、この困難性を克服する。本発明の特定の実施形態において、これは、細胞による取り込みを促進するペプチドに生物活性ポリペプチドを融合することによって達成される。
【００４７】
例えば、細胞透過性ペプチド（すなわち「タンパク質導入ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）」）が、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオボックス遺伝子（Ａｎｔｐ）の第３へリックス、ＨＩＶ  Ｔａｔ、およびヘルペスウイルスＶＰ２２（これらの全ては、アルギニン残基およびリジン残基が豊富な正に荷電したドメインを含む）から同定されている（Ｓｃｈｗａｒｚｅら、２０００；Ｓｃｈｗａｒｚｅら、１９９９）。また、シグナル配列に由来する疎水性ペプチドが、細胞透過性ペプチドとして同定されている（Ｒｏｊａｓら、１９９６；Ｒｏｊａｓら、１９９８；Ｄｕら、１９９８）。これらのペプチドをマーカータンパク質（例えば、−ガラクトシダーゼ）にカップリングすることは、細胞中へのそのマーカータンパク質の効率的な内在化を提供することが示され、そしてこれらのペプチドを含むキメラでありインフレームの融合タンパク質は、インビトロおよびインビボの両方でタンパク質を広範囲の細胞型に送達するために使用されている（Ｄｒｉｎら、２００２）。本発明に従う生物活性ポリペプチドに対するこれらの細胞透過性ペプチドの融合は、そのポリペプチドの細胞内取り込みを増強し得る。
【００４８】
他の実施形態において、細胞内取り込みは、ポリペプチドに対する脂質（例えば、ステアレートまたはミリスチレート）の付加によって促進される。脂質化は、細胞中へのペプチドの通過を増強することが示されている（ＲＥＦ）。脂質部分の付加は、本発明が細胞によるポリペプチドの取り込みを増大させる別の方法である。細胞内取り込みは、下でさらに考察される。
【００４９】
生物活性ポリペプチドの取り込みを増強することによって、本発明は、処置に必要とされるタンパク質またはペプチドの量を減少させ得る。次に、これは、顕著に、処置の費用を減少させ、そして治療剤の供給を増大させる。より低い投薬量はまた、ペプチドの潜在的な免疫原性を最小化し得、そして毒性の副作用を制限し得る。そのようにして、本発明の組成物および方法は、治療的処置に顕著な利益を提供する。
【００５０】
本発明に従って、生物活性ポリペプチドは、ナノ粒子−ポリペプチド複合体を形成するためにナノ粒子と結合され得る。いくつかの実施形態において、上記ナノ粒子は、リポソームまたは他の脂質ベースのナノ粒子（例えば、脂質ベースの小胞（例えば、ＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞））である。癌治療において使用される場合、リポソームは、腫瘍部位にてリポソームの濃度を増強するために、癌の新生血管における増大した開窓を利用する。他の実施形態において、上記ナノ粒子は、酸化鉄ベースの超常磁性ナノ粒子である。直径が約１０〜１００ｎｍの範囲の超常磁性ナノ粒子は、脾臓による封鎖を回避するのに十分な程度小さいが、肝臓による除去を回避するのに十分な程度大きい。この大きさの粒子は、非常に小さい毛細管を透通し得、そして身体組織中に有効に分布し得る。超常磁性ナノ粒子−ポリペプチド複合体は、上記生物活性ポリペプチドを取り込む細胞を同定および追跡するために、ＭＲＩ造影剤として使用され得る。特定の実施形態において、上記ナノ粒子は、半導体ナノ結晶または半導体量子ドットであり、これらの両方は、光学的画像化において使用され得る。さらなる実施形態において、上記ナノ粒子は、ナノシェルであり得、ナノシェルは、シリカのコア上の金の層を含む。ナノシェルの１つの利点は、ポリペプチドがその金の層に標準的な化学を使用して結合体化され得ることである。他の実施形態において、上記ナノ粒子は、フラーレンまたはナノチューブであり得る（Ｇｕｐｔａら、２００５）。
【００５１】
ペプチドは、腎臓によって循環から迅速に除去され、そしてペプチドは、血清中のプロテアーゼによる分解に感受性である。生物活性ペプチドとナノ粒子とを結合することによって、本発明のナノ粒子−ポリペプチド複合体は、分解から保護され得、かつ腎臓による除去を減少し得る。これは、ポリペプチドの血清半減期を増大させ、それによって有効な治療に必要なポリペプチド用量を減少させる。また、これは、処置の費用を低下させ、そして治療の免疫学的懸案事項および毒性反応を最小化する。
【００５２】
本発明に従って、ナノ粒子−ポリペプチド複合体は、特定の組織および細胞を標的とし得る。これは、細胞標的化部分を上記ナノ粒子に結合体化することによって達成され得る。上記標的化部分は、タンパク質、ペプチド、脂質、ステロイド、糖、炭水化物または合成化合物であり得るが、これらに限定されない。細胞を標的化する部分は（例えば、リガンド）は、細胞表面上の同族（ｃｏｇｎａｔｅ）レセプターを認識し、そしてそれに結合する。同様に、抗体は、細胞表面上の同族抗原を認識することによって細胞を標的化する部分として機能し得る。標的性ナノ粒子−ポリペプチド複合体を提供することによって、本発明は、疾患に対する処置の特異性を増強し得、そして標的とした細胞に進入する治療剤の量を増加させる。
【００５３】
本発明に従うポリペプチドとナノ粒子との結合は、ポリペプチドの標的性送達、ポリペプチドの強力な細胞内取り込み、処理された細胞の高感度での分子の画像化、投薬量および処置費用の減少、ならびに治療の免疫学的懸案事項および毒性作用の最小化を、非常に効率的に提供する。本発明のナノ粒子−ポリペプチド複合体は、種々の疾患を効率的かつ有効に処置する組成物および方法を提供する。
【００５４】
癌に関して、本発明は、癌の処置のための組成物および方法を提供する。
【００５５】
現在、種々の癌が、少なくとも部分的に、１種以上の遺伝子の過剰発現あるいは異常な遺伝子または変異体遺伝子の発現のいずれかをもたらす遺伝的な異常によって引き起こされることは、確立されている。例えば、多くの場合において、オンコジーンの発現は、癌の発症をもたらすことが公知である。「オンコジーン」は、遺伝的に変化した遺伝子である。変死した発現産物は、なぜか正常な細胞の機能または制御を破壊する（Ｓｐａｎｄｉｄｏｓら、１９８９）。現在までに研究されたほとんどのオンコジーンは、正常な細胞の遺伝子のコーディング領域（すなわち、「プロトオンコジーン」）における、発現したタンパク質産物中のアミノ酸置換を生じる変異の結果として、「活性化される」ことが見出されている。この変化した発現産物は、新生物形成工程の一部を担う異常な生物学的機能を示す（Ｔｒａｖａｌｉら、１９９０）。多くのオンコジーンおよびオンコジーンファミリー（ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｆｍｓ、ｊｕｎおよびａｂｌが挙げられる）は、現在、種々の程度に同定および特徴付けされている（Ｔｒａｖａｌｉら、１９９０）。
【００５６】
細胞の発癌ｒａｓ遺伝子ファミリーは、小さいＧＴＰ結合タンパク質をコードする。ｒａｓ遺伝子は、広範な種々のヒト腫瘍において変異していることが見出されている。ｒａｓタンパク質（Ｒａｓ）は、増殖および／または分化を誘導する刺激の伝達に関与する細胞内シグナリング経路における中心的な構成成分であり、ｒａｓタンパク質は、遺伝子によってコードされるセリン／トレオニンプロテインキナーゼを介して作用する。ｍｙｃは、転写因子Ｍａｘを有するＤＮＡ結合性ヘテロオリゴマーを形成する転写因子をコードする細胞のオンコジーンである。Ｓｒｃおよびｆｍｓは、ａｂｌであるようなチロシンプロテインキナーゼである。オンコジーンの活性をブロックまたは妨害するタンパク質およびペプチドは、抗癌剤として機能し得、そして本発明において具現化される。
【００５７】
上に記載したように、腫瘍抑制遺伝子は、その欠如（損失または不活化）が癌をもたらし得る正常な遺伝子である。腫瘍抑制遺伝子は、細胞の増殖および分裂を遅らせるタンパク質をコードし得る。したがって、それらの損失は、制御されていない細胞増殖および癌をもたらし得る。したがって、腫瘍抑制遺伝子産物を再活性化させるか、または腫瘍抑制遺伝子産物に関連する活性を供給するタンパク質およびペプチドは、抗腫瘍療法として使用され得る。腫瘍抑制遺伝子のタンパク質およびペプチドは、本発明と共に使用され得、そしてそれは、本発明によって包含される。
【００５８】
アポトーシスを刺激するタンパク質またはペプチドは、抗癌剤として作用し得る。アポトーシスは、細胞のプログラムされた死である。アポトーシスは、正常な胚の発生に必須の工程であり、それは、成熟した組織におけるホメオスタシスを維持し、そして発癌を抑制する（Ｋｅｒｒら、１９７２）。癌細胞においてアポトーシスを刺激するポリペプチドは、抗癌活性を提供し得、そしてそのペプチドは、本発明の一部である。
【００５９】
新脈管形成は、腫瘍の進行に必須である（ＦｏｌｋｍａｎおよびＳｈｉｎｇ、１９９２；ＦｉｄｌｅｒおよびＥｌｌｉｓ、１９９４；Ｆｏｌｋｍａｎ、１９９５；ＨａｎａｈａｎおよびＦｏｌｋｍａｎ、１９９６）。新脈管形成は、予め存在している血管からの新しい毛細管の形成である。直径が１〜２ｍｍの腫瘍は、拡散によって全ての栄養分を受容し得るが、さらなる増殖は、新脈管形成による適当な血液供給のの発達に依存する。したがって、新脈管形成のインヒビターは、抗腫瘍剤として作用し得る。新脈管形成インヒビターとして作用するポリペプチドは、本発明によって包含される。
【００６０】
特定の実施形態において、本発明は、癌の処置のためのペプチドおよびナノ粒子−ポリペプチド複合体を提供する。抗癌ペプチドは、実験的に同定されても、理論的方法によって同定されてもよい。抗癌ペプチドを実験的に同定することの非限定的な例は、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３に関して提供される。ｐ５３遺伝子は、転写因子をコードする。活性を廃絶するｐ５３遺伝子における変異は、癌をもたらす。ｐ５３転写因子のカルボキシ末端由来のアミノ酸配列を含むペプチドが特定のｐ５３変異体を再活性化し、そして細胞増殖の制御を再確立し得ることが、示されている。したがって、ｐ５３カルボキシ末端ペプチドを用いて形成されるナノ粒子−ポリペプチド複合体は、特定のｐ５３腫瘍の処置のための抗癌剤を提供する。
【００６１】
抗癌ペプチドはまた、コンビナトリアルペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって実験的に同定され得る。非限定的な例として、ペプチド−ファージライブラリーまたはペプチドライブラリーベースのコンビナトリアル化学は、オンコジーンタンパク質の活性を阻害するペプチドについてスクリーニングされ得る。他の抗癌ペプチドは、実験的に同定されてたアポトーシスペプチド（例えば、ペプチドＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ（配列番号１０））および他のアポトーシス性ペプチド（例えば、Ｅｌｌｅｒｂｙら、１９９９を参照のこと）に基づき得る。新規かまたは先に同定された抗癌ペプチドのナノ粒子−ポリペプチド複合体における使用は、癌の処置に対する本発明の一般的な適用性を示す。
【００６２】
あるいは、可能性のある抗癌ペプチドは、腫瘍抑制遺伝子産物のアミノ酸配列を、予想される機能性ドメインについて分析することによって同定され得る。次いで、予想される機能性ドメインを含むペプチドは、当該分野で周知の適切なアッセイによって、抗癌活性についてアッセイされ得る。このアプローチの例は、実施例に記載される。本発明者らは、ＦＵＳ１遺伝子産物のアミノ酸配列分析を行ない、そして予想される「Ａキナーゼアンカータンパク質」（ＡＫＡＰ）モチーフを同定した。この機能性モチーフを含むペプチドは、種々のチロシンキナーゼを阻害するその能力および病巣形成をブロックするその能力について試験された。ポジティブな活性は、このタンパク質を抗癌剤として確立する。本発明に従って、ナノ粒子−Ｆｕｓ１ペプチド複合体は、癌の処置のための治療剤として提供される。
【００６３】
この例が示すように、本発明は、腫瘍抑制遺伝子産物の予想される機能性ドメインに基づいて抗癌ペプチドおよび抗癌タンパク質を同定する方法を提供する。この方法は、治療剤として使用するための抗癌ポリペプチドおよびナノ粒子−ポリペプチド複合体を迅速に得るための迅速な方法である。
【００６４】
一旦抗癌タンパク質または抗癌ペプチドが同定されると、これらのポリペプチドの改変体は、タンパク質またはペプチドのアミノ酸配列に基づいて産生され得る。これらのポリペプチドおよびそれらの改変体の両方は、本発明と共に使用され得、そして本発明によって包含される。
【００６５】
本発明は、生物活性ポリペプチドを細胞に送達するために使用され得る。例えば、本発明は、癌を処置するための方法および組成物を提供する。上記癌は、以下の型の癌のいずれかであり得る：黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺癌、肝細胞癌、網膜芽細胞腫、星状細胞種、グリア芽細胞種、ゴム種、舌癌、白血病、神経芽細胞種、頭の癌、首の癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、骨の癌、精巣癌、卵巣癌、中皮腫、子宮頚癌、胃腸の癌、リンパ腫、脳の癌、結腸癌、または膀胱癌。特定の実施形態において、上記癌は、上皮癌細胞を含む。特定の実施形態において、上記癌は、肺癌である。
【００６６】
（Ａ．ポリペプチド）
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、タンパク質またはペプチドのいずれかを意味する。ペプチドは、３アミノ酸〜１００アミノ酸を有すると見なされる。タンパク質は、１００より多いアミノ酸を有すると見なされる。
【００６７】
特定の実施形態において、上記ポリペプチド分子の大きさは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、  ６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００またはそれより多いアミノ分子残基、およびその中から導かれ得る任意の範囲の多いアミノ分子残基を含み得るが、これらに限定されない。
【００６８】
特定の実施形態において、本発明の生物活性ポリペプチドは、３〜２５００アミノ分子残基、より好ましくは３〜１０００アミノ分子残基、より好ましくは３〜５００アミノ分子残基、より好ましくは５〜２５０アミノ分子残基、より好ましくは７〜２５０アミノ分子残基、より好ましくは１０〜１００アミノ分子残基、より好ましくは１０〜５０アミノ分子残基、より好ましくは１０〜４０アミノ分子残基、最も好ましくは１０〜３５アミノ分子残基を含み得る。
【００６９】
本明細書中で使用される場合、「アミノ分子」とは、当業者に公知であるような任意のアミノ酸、アミノ酸誘導体またはアミノ酸模倣物（ｍｉｍｉｃ）をいう。特定の実施形態において、上記ポリペプチドの残基は、そのアミノ分子残基の配列を中断する非アミノ分子を含まずに連続している。他の実施形態において、上記配列は、１個以上の非アミノ分子を含み得る。特定の実施形態において、上記ポリペプチドの残基の配列は、１個以上のアミノ分子部分によって中断され得る。
【００７０】
したがって、用語「ポリペプチド」は、天然に合成されたタンパク質における２０種の一般的アミノ酸のうちの少なくとも１種を含むアミノ分子配列、または少なくとも１種の改変されたアミノ酸もしくは通常のアミノ酸（下の表１に示されるものが挙げられるが、これらに限定されない）を含むアミノ分子配列を包含する。
【００７１】
【表１−１】
2009501237.tif 000002
【００７２】
【表１−２】
2009501237.tif 000003
特定の実施形態において、上記ナノ粒子−ポリペプチド複合体は、生体適合性ポリペプチドを含む。本明細書中で使用される場合、用語「生体適合」とは、本明細書中に記載される方法および量に従って所定の生物体に適用または投与される場合に、不利な効果をほとんどもたらさないか、または著しい効果をもたらさない物質をいう。このような不利な効果または望ましくない効果は、顕著な毒性または有害な免疫学的反応のような効果である。好ましい実施形態おいて、生体適合性ポリペプチドまたはナノ粒子−ポリペプチド複合体は、一般に、哺乳動物のタンパク質もしくはペプチドまたは合成のタンパク質もしくはペプチドであり、それらの各々は、本質的に、毒素、病原体および有害な免疫原を含まない。
【００７３】
タンパク質およびペプチドは、当業者に公知である任意の技術によって作製され得、その技術としては、標準の分子生物学的技術によるタンパク質およびペプチドの発現、天然の供給源からのタンパク質およびペプチドの単離、またはタンパク質およびペプチドの化学合成が挙げられる。種々の遺伝子についてのヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、先に記載されており、そして当業者に公知のコンピュータによるデータベースにて見出され得る。１つのこのようなデータベースは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ’ｓ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｎｄ  ＧｅｎＰｅｐｔデータベース（（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）にてワールドワイドウェブ上に見出される）である。これらの公知の遺伝子についてのコーディング領域は、本明細書中に開示されるような技術または当業者に公知であるような技術を使用して増幅および／または発現され得る。あるいは、タンパク質およびペプチドの種々の市販されている調製物は、当業者に公知である。
【００７４】
特定の実施形態において、ポリペプチドが、単離または精製され得る。一般に、「単離される」または「精製される」とは、種々の他のポリペプチドを取り除くための分別に供された特定のポリペプチド組成、および例えば、特定かまたは所望のタンパク質またはペプチドに関して当業者に公知であるようなタンパク質アッセイによって評価され得る場合、組成がその活性を実質的に維持することをいう。
【００７５】
特定の実施形態において、ポリペプチドまたはナノ粒子−ポリペプチド複合体の治療的に有効な量が、被験体において腫瘍を処置するために使用される。治療的に有効な量は、その成分が１回または時間の期間にわたって投与される場合に、活性成分が投与される状態における改善または所望の変化をもたらす量である。公知である通り、その量は、処置される状態の型、特定の活性成分、上記状態の重篤度、および患者の特徴のような事項に依存して変動する。
【００７６】
（１．改変体）
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」はまた、タンパク質またはペプチドのアミノ酸配列改変体を包含する。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、置換改変体、挿入改変体または欠失改変体であり得る。欠失改変体は、膜貫通配列を欠く内在性膜タンパク質の改変体によって例示されるように、機能または免疫原性活性に必須でないネイティブなタンパク質の１個以上の残基を欠く。欠失改変体の別の一般的な型は、二次シグナル配列または細胞の特定の部分に結合するタンパク質を指向するシグナル配列を欠くものである。挿入改変体は、代表的に、ポリペプチドの末端ではない点における物質の付加を含む。これとしては、免疫反応性エピトープまたは単なる単一の残基の挿入が挙げられ得る。融合タンパク質と称される末端付加は、下で考察される。
【００７７】
置換改変体は、代表的に、ポリペプチド内の１個以上の部位において、あるアミノ酸を別のアミノ酸に置換することを含み、そして置換改変体は、他の機能または特性の損失を伴わずに、ポリペプチドの１つ以上の特性（例えば、タンパク質分解性の切断に対する安定性）を調節するように設計され得る。この種類の置換は、好ましくは、保存的である（すなわち、あるアミノ酸は、類似の形状および電荷を有するアミノ酸によって置換される）。保存的置換は、当該分野において周知であり、そして保存的置換としては、例えば、以下の変化が挙げられる：アラニンからセリンへの変化；アルギニンからリジンへの変化；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへの変化；アスパラギン酸からグルタミン酸への変化；システインからセリンへの変化；グルタミンからアスパラギンへの変化；グルタミン酸からアスパラギン酸への変化；グリシンからプロリンへの変化；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへの変化；イソロイシンからロイシンまたはバリンへの変化；ロイシンからバリンまたはイソロイシンへの変化；リジンからアルギニンへの変化；メチオニンからロイシンまたはイソロイシンへの変化；フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニンへの変化；セリンからトレオニンへの変化；トレオニンからセリンへの変化；トリプトファンからチロシンへの変化；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへの変化；およびバリンからイソロイシンまたはロイシンへの変化。
【００７８】
用語「生物学的に機能性の等価物」は、当該分野において十分に理解されており、そしてそれはさらに、本明細書中で詳細に定義される。したがって、生物活性ポリペプチドのアミノ酸と同一であるかまたは機能的に等価であるアミノ酸を、約７０％と約８０％との間；またはより好ましくは、約８１％と約９０％との間；またはよりなお好ましくは、約９１％と約９９％との間で有する配列は、本発明の範囲内であるが、但し上記ポリペプチドの生物学的活性は、維持される。
【００７９】
用語「機能的に等価なコドン」は、同一のアミノ酸をコードするコドン（例えば、アルギニンまたはセリンに対する６種のコドン）を称するため、およびまた、生物学的に等価なアミノ酸をコードするコドンを称するために本明細書中で使用される（下の表２を参照のこと）。
【００８０】
（表ＩＩ：コドン表）
【００８１】
【表２−１】
2009501237.tif 000004
【００８２】
【表２−２】
2009501237.tif 000005
アミノ酸配列が、さらなる残基（例えば、さらなるＮ末端アミノ酸またはＣ末端アミノ酸）を含み、そしてさらになお、本質的に、その配列が上に示される判定基準（生物学的活性の維持が挙げられる）を満たす限り本明細書中に開示される配列の１つにおいて示される通りであり得ることもまた、理解される。
【００８３】
以下は、等価であるかまたは改良すらされている第２世代分子をもたらすタンパク質のアミノ酸の変化に基づく考察である。例えば、特定のアミノ酸は、構造（例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位など）との相互作用性の結合能のかなりの損失を伴わずにタンパク質構造中の他のアミノ酸を置換し得る。それは、相互作用能およびタンパク質の生物学的に機能性の活性を規定するタンパク質の性質であるので、特定のアミノ酸の置換は、タンパク質配列において行われ得、そうであっても類似の特性を有するタンパク質を産生し得る。したがって、種々の変更が、本明細書中に記載されるポリペプチドのアミノ酸配列においてそれらの生物学的な利用性または活性のかなりの損失を伴わずに行われ得ることは、本発明によって企図される。表２は、特定のアミノ酸をコードするコドンを示す。
【００８４】
このような変更を行なうことにおいて、アミノ酸の疎水性親水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）が、考慮され得る。タンパク質に相互作用性の生物学的機能を与えることにおける疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、一般に、当該分野において理解される（Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性の特徴が得られるタンパク質の二次構造に寄与し、次にその特徴がそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定することは、受容されている。
【００８５】
類似のアミノ酸の置換が親水性に基づいて有効に行われ得ることもまた、当該分野において理解される。本明細書中に参考として援用される米国特許第４，５５４，１０１号は、タンパク質の最も大きい局所的な平均親水性（その隣接するアミノ酸の親水性によって決定されるような）がそのタンパク質の生物学的特性と相関することを記載する。米国特許第４，５５４，１０１号において詳述されるように、以下の親水性値が、アミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン＊−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【００８６】
アミノ酸が、同様の親水性値を有する別のアミノ酸で置換され得、そして依然として生物学的に等価でありかつ免疫学的に等価であるポリペプチドが、産生され得ることは、理解されている。このような変更において、親水性値が±２の範囲内であるアミノ酸の置換が好ましく、親水性値が±１の範囲内であるアミノ酸の置換が、特に好ましく、そして親水性値が±０．５の範囲内であるアミノ酸の置換が、特になおさら好ましい。
【００８７】
上で略述されるように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性（例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、大きさなど）に基づく。上述の種々の特徴を考慮した例示の置換は、当業者に周知であり、そしてそれらとしては、以下が挙げられる：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシン。
【００８８】
本発明に従うポリペプチドの調製に関する別の実施形態は、ペプチド模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃ）の使用である。模倣体は、タンパク質二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子である。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９３を参照のこと。ペプチド模倣体の使用に関する論理的根拠は、タンパク質のペプチド骨格が主に分子相互作用（例えば、抗体および抗原の相互作用）を容易にするような方法でアミノ酸側鎖に順応するように存在することである。ペプチド模倣体は、天然の分子と同様の分子相互作用を可能にすると予想される。これらの原理は、本明細書中に記載されるポリペプチドの天然の特性の多くを有するが、変更され、そして改良すらされている特徴を有する第２世代分子を設計するために、上で略述する原理と組み合わせて使用され得る。
【００８９】
別の実施形態において、ペプチドは、生物学的タンパク質において代表的に見出されるＬ−アミノ酸以外に、Ｄ−アミノ酸を含む。Ｄ−アミノ酸は、上記ペプチドの化学合成の間に置換され得る。さらに、逆（ｒｅｖｅｒｓｅ）−Ｄペプチドが、企図される。逆−Ｄペプチドは、同一の三次コンホメーションを維持し、それによってＬ−アミノ酸ペプチドと同じ活性を維持するが、インビトロおよびインビボでの酵素的な分解に対してより安定である。したがって、逆−Ｄペプチドは、元のペプチドよりも大きい治療効力を有する（ＢｒａｄｙおよびＤｏｄｓｏｎ、１９９４；Ｊａｍｅｓｏｎら、１９９４）。
【００９０】
タンパク質およびペプチドは、当該分野において周知であるように、検出のために蛍光性、化学発光性または他の型のタグまたは標識と結合体化され得る。
【００９１】
（２．融合タンパク質）
挿入改変体の特殊な種類は、融合タンパク質である。この分子は、一般に、第２のポリペプチドの全部または一部に対してＮ末端またはＣ末端にて連結した、ネイティブな分子の全部または実質的な部分を有する。例えば、融合は、異種の宿主におけるタンパク質の組換え発現を可能にするために、他の種由来のリーダー配列を使用し得る。別の有用な融合は、その融合タンパク質の精製を容易にするために、免疫学的に活性なドメイン（例えば、抗体エピトープ）の付加を含む。融合の連結部またはその近傍切断部位を含むことは、精製後の外来ポリペプチドの除去を容易にする。他の有用な融合は、機能性ドメイン（例えば、加水分解酵素などの酵素由来の活性部位）、グリコシル化ドメイン、細胞のターゲッティングシグナルまたは膜貫通領域の結合を含む。特に好ましい融合は、細胞によるポリペプチドの取り込みを促進するために、細胞透過性ペプチドをそのポリペプチドに連結することを含む。
【００９２】
例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔポリペプチド由来のペプチド、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオボックス遺伝子（Ａｎｔｐ）の第３へリックス由来のペプチド、インフルエンザウイルス赤血球凝集素由来のペプチドおよび／またはヘルペスウイルスＶＰ２２ポリペプチド由来のペプチドが、融合タンパク質を作製するために、本発明によって使用され得る。これらのタンパク質は、アルギニン残基およびリジン残基が豊富な正に荷電したドメインを含み、そしてシグナル配列由来の疎水性ペプチドおよび融合配列由来の疎水性ペプチドは、細胞透過性ペプチドとして同定されている。これらのペプチドは、インビトロおよびインビボの両方でタンパク質を広範囲の細胞型に送達するために使用され得る。本発明において、これらのペプチドは、生物活性タンパク質および生物活性ペプチドの細胞内取り込みを促進するために使用され得る。
【００９３】
（３．ポリペプチドの精製）
本明細書中で考慮されるポリペプチドを精製または単離することが、望まれ得る。タンパク質精製技術は、当業者に周知である。これらの技術は、１つの水準において、ポリペプチド分画および非ポリペプチド分画への細胞環境の粗い分別を含む。他のタンパク質およびペプチドから上記ポリペプチドが分離されると、目的のポリペプチドは、部分的かまたは完全な精製（または均一性のための精製）を達成するために、クロマトグラフィー技術および電気泳動技術を使用してさらに精製され得る。純粋なペプチドの調製について特に研究された分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィーおよびＨＰＬＣである。
【００９４】
用語「実質的に精製された」または「実質的に単離された」が使用される場合、この表示は、上記タンパク質またはペプチドがその組成の主成分を形成する組成（例えば、その組成中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％またはそれ以上を構成すること）を指す。
【００９５】
（４．細胞内取り込みの促進）
いくつかの実施形態において、上記ポリペプチドは、そのポリペプチドの細胞内取り込みを容易にする化学的部分の付加によって改変され得る。細胞内取り込みを増強するための部分の例としては、疎水性の群（例えば、脂質または脂肪酸）、細胞透過性ペプチド（例えば、米国特許第６，６１０，６５７号；Ｄｒｉｎら、２００２を参照のこと）、および特定の金属キレートが挙げられる。
【００９６】
脂肪酸は、一般に、その鎖の末端に酸性部分（例えば、カルボン酸）を有する炭素鎖を含む分子である。上記炭素鎖は、任意の長さであり得る脂肪酸の鎖であり得るが、しかし、その炭素鎖の長さは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはそれ以上、およびその中から導かれ得る任意の範囲の炭素原子の長さであることが、好ましい。特定の実施形態において、上記炭素鎖の長さは、上記脂肪酸の鎖部分において４個〜１８個の炭素原子である。特定の実施形態において、上記脂肪酸の炭素鎖は、奇数の炭素原子を含み得るが、しかし、その鎖における偶数の炭素原子は、特定の実施形態において好まれ得る。炭素鎖中に単結合のみを含む脂肪酸は、飽和と称され、一方で炭素鎖中に少なくとも１個の二重結合を含む脂肪酸は、不飽和と称される。上記脂肪酸は、分枝状であり得るが、本発明の好ましい実施形態において、その脂肪酸は、非分枝状である。特定の脂肪酸としては、リノール酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノレン酸、ステアリン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、アラキジン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
上に記載されるように、種々の細胞透過性ペプチドが、同定されている。表ＩＩＩは、これらのペプチドおよびそれらのアミノ酸配列のうちのいくつかを列挙する。特定の実施形態において、細胞透過性ペプチドは、複数の正電荷を有し、そしてその細胞透過性ペプチドは、１０アミノ酸残基〜２７アミノ酸残基の大きさの範囲である。任意のこれらのペプチドは、本発明に適用可能であることが企図される。
【００９８】
（表ＩＩＩ）
【００９９】
【表３】
2009501237.tif 000006
特定の実施形態において、ポリペプチドの生物活性（例えば、治療的）の特性を担う領域、およびタンパク質の細胞内取り込みを改良する領域の両方を含む融合タンパク質が、産生され得る。例えば、特定の実施形態において、上記融合タンパク質は、インフルエンザウイルス赤血球凝集素タンパク質の一部または全部を含み得る。
【０１００】
（Ｂ．ナノ粒子）
本明細書中で使用される場合、用語「ナノ粒子」とは、１ｎｍ〜１，０００ｎｍの範囲の寸法を有するあらゆる物質をいう。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、２ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の寸法、好ましくは２ｎｍ〜１５０ｎｍの範囲の寸法、およびよりさら好ましくは２ｎｍ〜１００ｎｍの範囲の寸法を有する。本発明において使用されるナノ粒子は、脂質ベースのナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、ナノシェル、半導体ナノ結晶、量子ドット、ポリマーベースのナノ粒子、ケイ素ベースのナノ粒子、シリカベースのナノ粒子、金属ベースのナノ粒子、フラーレンおよびナノチューブ（Ｆｅｒｒａｒｉ、２００５）のようなナノ尺度の物質を含む。ナノ粒子に対するポリペプチドの結合体化は、標的性送達、制御放出、増強した細胞内取り込みおよび細胞内輸送、ならびに治療用ペプチドのインビトロおよびインビボでの分子の画像化に対する潜在的な応用を伴う構造を提供する（Ｗｅｓｔ、２００４；Ｓｔａｙｔｏｎら、２０００；Ｂａｌｌｏｕら、２００４；Ｆｒａｎｇｉｏｎｉ、２００３；Ｄｕｂｅｒｔｒｅｔら、２００２；Ｍｉｃｈａｌｅｔら、２００５；Ｄｗａｒａｋａｎａｔｈら、２００４）。
【０１０１】
（１．超常磁性酸化鉄（「ＳＰＩＯ」）ナノ粒子）
超常磁性酸化鉄（「ＳＰＩＯ」）ナノ粒子は、磁気共鳴画像法（「ＭＲＩ」）のコントラスト増強、組織修復、イムノアッセイ、細胞の分離、および薬物送達のために実験的に使用されている（Ｇｕｐｔａ、２００４；Ｓｅｓｔｉｅｒら、１９９８；Ｗｉｌｈｅｌｍら、２００３）。
【０１０２】
本発明に使用するためのＳＰＩＯナノ粒子は、当業者に公知である任意の方法によって調製および保存され得る（Ｇｕｐｔａら、２００５）。市販の調製されたＳＰＩＯナノ粒子もまた、使用され得る。ポリペプチドの付加に関して、上記ＳＰＩＯナノ粒子は、アミド結合またはエステル結合を介してポリマー表面に結合されたポリマー性物質によってコートされ得る（例えば、ポリエチレングリコールまたはデキストラン、およびポリペプチド）。種々の化学的スキームが、ポリペプチドを結合するために使用され得、そのスキームとしては、カルボジイミド化学、ジイソシアネートリンカー、およびスクシニミジルエステルが挙げられる。ポリペプチドを結合するために使用されているリンカー分子としては、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ−スクシニミジル３−（２ピリジルジチオ）プロピオネート、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド、およびＮ，Ｎ’メチレンビスアクリルアミドが挙げられる（Ｌｅｗｉｎら、２０００；Ｒｏｂｅｒｔｓら、２００２）。
【０１０３】
例えば、ＳＰＩＯナノ粒子−ペプチド複合体は、ヘテロ二官能性リンカーを使用して２工程の手順で上記ペプチドをナノ粒子に結合体化することによって調製され得る。第１に、市販の調製されたデキストランコートしたＳＰＩＯ粒子（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ製の「Ｆｅｒｉｄｅｘ  Ｉ．Ｖ」または「Ｃｏｍｂｉｄｅｘ」、またはＧｕｅｒｂｅｔ、Ａｕｌｎａｙｓｏｕｓ−Ｂｏｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ製の「Ｅｎｄｏｒｅｍ」）は、エピクロロヒドリンを用いて架橋することによって誘導体化され、次いでアンモニアと反応してデキストランコーティング上にアミノ基を生成する。次いで上記ナノ粒子は、ＳＭＣＣによって改変されてマレイミド部分を提供する（ＳＰＩＯ−ＳＭＣＣ）。第２に、ペプチド−ヒドラゾン誘導体は、ＳＰＩＯ-ＳＭＣＣの上記マレイミド基と、ＴＣＥＰによるそのジスルフィドの還元後に得られるペプチド誘導体のチオール基との反応によってＳＰＩＯ-ＳＭＣＣに結合体化される。得られたペプチド−ＳＰＩＯ結合体化の割合は、ＵＶ-可視分光測光法によって決定され、そしてそのペプチド−ＳＰＩＯ結合体は、Ｇ−２５ゲル濾過カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製される。精製された結合体は、濃縮され、そしてさらに使用するまで−２０℃に保存される。薬物誘導体が、同様の化学によってＳＰＩＯに結合体化される。ＳＰＩＯの蛍光標識化のために、上記ＳＰＩＯデキストラン誘導体の第１級アミンは、種々の金属イオンに対する高親和性結合部位を導入するためにＤＴＰＡイソシアネートキレーター（Ｉ−２４２２１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）とカップリングされ、次いでＦｌｕｏ−３カリウム（橙赤色）（Ｆ−３７１５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）によって標識される。蛍光標識されたＦＰ−ＳＰＩＯ  ナノ粒子は、共焦点蛍光画像化法またはＦＡＣＳ分析によってインビトロおよびインビボで細胞内取り込み、細胞内輸送、および生体分布をモニタリングするために使用され得る。
【０１０４】
ポリペプチドは、リジン残基またはシステイン残基を付加するためにそのカルボキシ末端にて改変されて、ＳＰＩＯナノ粒子への結合体化のための自由（ｆｒｅｅ）な第１級アミン官能基またはチオール官能基を提供し得る。同様に、上記改変ポリペプチドは、他のナノ粒子（例えば、ナノシェル、量子ドット、フラーレンおよびナノチューブ）に結合体化され得る。
【０１０５】
例えば、リジン残基は、自動化合成機における標準的なＦｍｏｃペプチド化学を使用する合成の間にペプチドに対して付加され得る。システイン残基は、同様の様式で付加され得る。組換え方法によって調製されたポリペプチドに関して、リジンまたはシステインのコドンは、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に付加され得、そして得られたポリペプチドは、組換え発現系において発現され得る。
【０１０６】
（２．脂質ベースのナノ粒子）
脂質ベースのナノ粒子としては、リポソーム、脂質調製物および脂質ベースの小胞（例えば、ＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞）が挙げられる。脂質ベースのナノ粒子は、正に荷電していても、負に荷電していても、中性でもよい。特定の実施形態において、上記脂質ベースのナノ粒子は、中性の電荷である（例えば、ＤＯＰＣリポソーム）。
【０１０７】
（ａ．リポソーム）
「リポソーム」は、囲まれた脂質の二重層または集合体の生成によって形成された種々の単一かつ多層の脂質ビヒクルを包含する一般用語である。リポソームは、一般に、リン脂質および内部媒体（一般に、水性組成物を含む）を含む、二重層膜を有する小胞状構造を有するものとして特徴付けられ得る。本発明のリポソームとしては、非層状リポソーム、多層リポソームおよび多小胞（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ）リポソームが挙げられる。本発明のリポソームは、正に荷電していても、負に荷電していても、中性の電荷でもよい。特定の実施形態において、上記リポソームは、中性の電荷である。
【０１０８】
多層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質を有する。リン脂質を含む脂質が過剰の水溶液に懸濁される場合、その多層リポソームが、自発的に形成する。上記脂質成分は、閉じた構造を形成する前に自己再配列を行い、そして水および脂質二重層の間に溶解した溶質を捕捉する（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ、１９９１）。脂肪親和性分子または脂肪親和性領域を有する分子はまた、脂質二重層に溶解しても、脂質二重層と結合してもよい。
【０１０９】
特定の局面において、ポリペプチドは、例えば、リポソームの水性の内部に封入され得るか、リポソームの脂質二重層内に散在し得るか、そのリポソームおよびそのポリペプチドの両方と結合する連結性分子を介してリポソームに付加され得るか、リポソーム中に捕捉され得るか、リポソームと複合体形成し得る。
【０１１０】
本発明に従って使用されるリポソームは、当業者に公知であるような、異なる方法によって作製され得る。例えば、リン脂質（例えば、中性リン脂質のジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）などの）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）は、ｔｅｒｔ−ブタノールに溶解される。次いで上記脂質は、生物活性ポリペプチドおよび／または他の成分と混合される。Ｔｗｅｅｎ  ２０は、Ｔｗｅｅｎ  ２０が組成物重量の約５％であるように上記脂質混合物に添加される。過剰のｔｅｒｔ−ブタノールは、ｔｅｒｔ−ブタノールの体積が少なくとも９５％であるようにこの混合物に添加される。その混合物は、ボルテックスされ、ドライアイス／アセトンのバス中で凍結され、そして一晩凍結乾燥される。その凍結乾燥した調製物は、−２０℃にて保存され、そして３ヶ月経過するまでに使用され得る。必要とされる場合、凍結乾燥したリポソームは、０．９％食塩水中に再構成される。
【０１１１】
あるいは、リポソームは、容器（例えば、ガラスのナシ型フラスコ）において溶媒中の脂質を混合することによって調製され得る。その容器は、リポソームの予想された懸濁物の体積より１０倍大きい体積を有するべきである。ロータリーエバポレーターを使用して、上記溶媒は、陰圧の下で約４０℃にて除去される。上記溶媒は、通常、上記リポソームの所望の体積に依存して約５分〜２時間以内に除去される。その組成物は、減圧下でデシケーターにおいてさらに乾燥され得る。その乾燥した脂質は、一般に、時間経過とともに劣化する傾向にあるので、約１週間後に廃棄される。
【０１１２】
乾燥した脂質は、滅菌した発熱物質を含まない水中で、その脂質フィルムの全てが再懸濁されるまで振盪することによって、約２５〜５０ｍＭのリン脂質にて水和され得る。次いでその水性リポソームは、アリコートに分けられ、それぞれバイアル中におかれ、減圧下で凍結乾燥およびシールされる。
【０１１３】
上記のように調製された乾燥した脂質または凍結乾燥したリポソームは、脱水され、そしてタンパク質またはペプチドの溶液中に再構成され、そして適切な溶媒（例えば、ＤＰＢＳ）を用いて適切な濃度に希釈され得る。次いでその混合物は、ボルテックスミキサーにおいて激しく振盪される。封入されていないさらなる物質（例えば、ホルモン、薬物、核酸構築物などが挙げられるが、これらに限定されない因子）は、２９，０００×ｇにて除去され、そしてそのリポソームのペレットは、洗浄される。その洗浄されたリポソームは、適切な総リン脂質濃度（例えば、約５０〜２００ｍＭ）にて再懸濁される。封入されたさらなる物質または活性剤の量は、標準的な方法によって決定され得る。上記リポソーム調製物中に封入されたさらなる物質または活性剤の量の決定後、そのリポソームは、適切な濃度に希釈され得、そしてそのリポソームは、使用するまで４℃にて保存され得る。上記リポソームを含む薬学的組成物は、通常、滅菌した、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤（例えば、水または食塩水）を含む。
【０１１４】
他の代替的な方法において、リポソームは、他の公知な実験室手順によって調製され得る（例えば、Ｂａｎｇｈａｍら、１９６５；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、１９７９；ＤｅａｍｅｒおよびＵｓｔｅｒ、１９８３；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、１９７８（それぞれが、本明細書中に関連する部分において参考として援用される））。本発明に有用であり得るさらなるリポソームとしては、例えば、ＷＯ０２／１００４３５Ａ１、米国特許第５，９６２，０１６号、米国特許出願第２００４／０２０８９２１号、ＷＯ０３／０１５７５７Ａ１、ＷＯ０４０２９２１３Ａ２、米国特許第５，０３０，４５３号、および米国特許第６，６８０，０６８号（これらの全ては、権利の放棄を伴わずにその全体が本明細書に参考として援用される）に記載されるようなカチオン性リポソームが挙げられる。リポソームを作製するプロセスもまた、ＷＯ０４／００２４５３Ａ１に記載される。中性の脂質は、カチオン性リポソームに組み込まれ得る（例えば、Ｆａｒｈｏｏｄら、１９９５）。特定の実施形態において使用され得る種々の中性リポソームは、米国特許第５，８５５，９１１号（これは、本明細書中に参考として援用される）において開示される。これらの方法は、水性物質を捕捉するそれらの各々の能力およびそれらの各々の水性空間対脂質の比において異なる。
【０１１５】
リポソームの大きさは、合成の方法に依存して変動する。本発明におけるリポソームは、種々のサイズであり得る。特定の実施形態において、上記リポソームは、小さい（例えば、約１００ｎｍ未満、約９０ｎｍ未満、約８０ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、または約５０ｎｍ未満の直径）。このようなリポソームの調製において、本明細書中に記載されるか、または当業者に公知であるような任意のプロトコルが、使用され得る。リポソームの調製のさらなる非限定的な例は、米国特許第４，７２８，５７８号、同第４，７２８，５７５号、同第４，７３７，３２３号、同第４，５３３，２５４号、同第４，１６２，２８２号、同第４，３１０，５０５号、および同第４，９２１，７０６号；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１１６１号および同第ＰＣＴ／ＵＳ８９／０５０４０号；英国特許出願第ＧＢ  ２１９３０９５  Ａ号；Ｍａｙｅｒら、１９８６；Ｈｏｐｅら、１９８５；Ｍａｙｈｅｗら  １９８７；Ｍａｙｈｅｗら、１９８４；Ｃｈｅｎｇら、１９８７；およびＬｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８４（それぞれが、本明細書に参考として援用される）に記載される。
【０１１６】
（ｂ．中性リポソーム）
特定の実施形態において、上記脂質ベースのナノ粒子は、中性リポソーム（例えば、ＤＯＰＣリポソーム）である。「中性リポソーム」または「非荷電のリポソーム」は、本明細書中で使用される場合、本質的に中性の正味電荷（実質的に非荷電）を生じる１種以上の脂質成分を有するリポソームとして定義される。「本質的に中性の」または「本質的に非荷電の」によって、所与の集団（例えば、リポソームの集団）内の脂質成分は、別の成分の反対の電荷によって相殺されない電荷を含まないか、含むとしてもごく僅かである（すなわち、成分の１０％未満が、相殺されない電荷（より好ましくは、５％未満、および最も好ましくは、１％未満））ことを、意味する。特定の実施形態において、中性リポソームは、主に、生理学的条件（すなわち、約ｐＨ７）の下でそれ自体が中性である脂質および／またはリン脂質を含み得る。
【０１１７】
本発明のリポソームおよび／または脂質ベースのナノ粒子は、リン脂質を含み得る。特定の実施形態において、単一の種類のリン脂質が、リポソームの作製において使用され得る（例えば、ＤＯＰＣなどの中性のリン脂質が、中性リポソームを生成するために使用され得る）。他の実施形態において、１種類より多くのリン脂質は、リポソームを作製するために使用され得る。
【０１１８】
リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジルエタノールアミンが挙げられる；ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンは、生理学的条件（すなわち、約ｐＨ７）の下で非荷電であるので、これらの化合物は、中性リポソームを生成するのに特に有用であり得る。特定の実施形態において、リン脂質ＤＯＰＣが、非荷電のリポソームを生成するために使用される。特定の実施形態において、リン脂質ではない脂質（例えば、コレステロール）が、使用され得る。
【０１１９】
リン脂質としては、グリセロリン脂質および特定のスフィンゴ脂質が挙げられる。リン脂質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ジオレオイルホスファチジルコリン（「ＤＯＰＣ」）、卵のホスファチジルコリン（「ＥＰＣ」）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（「ＤＬＰＣ」）、ジミリストイルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（「ＤＰＰＣ」）、ジステアロイルホスファチジルコリン（「ＤＳＰＣ」）、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（「ＭＰＰＣ」）、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン（「ＰＭＰＣ」）、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン（「ＰＳＰＣ」）、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（「ＳＰＰＣ」）、ジラウリロイルホスファチジルグリセロール（「ＤＬＰＧ」）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（「ＤＰＰＧ」）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（「ＤＳＰＧ」）、ジステアロイルスフィンゴミエリン（「ＤＳＳＰ」）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＳＰＥ」）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（「ＤＯＰＧ」）、ジミリストイルホスファチジン酸（「ＤＭＰＡ」）、ジパルミトイルホスファチジン酸（「ＤＰＰＡ」）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＭＰＥ」）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＰＰＥ」）、ジミリストイルホスファチジルセリン（「ＤＭＰＳ」）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（「ＤＰＰＳ」）、脳のホスファチジルセリン（「ＢＰＳ」）、脳のスフィンゴミエリン（「ＢＳＰ」）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（「ＤＰＳＰ」）、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（「ＤＡＰＣ」）、１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（「ＤＢＰＣ」）、１，２−ジエイコセノイル（ｄｉｅｉｃｏｓｅｎｏｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（「ＤＥＰＣ」）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、パルミトイルオレオイル（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｅｏｙｌ）ホスファチジルコリン（「ＰＯＰＣ」）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「ＰＯＰＥ」）、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、およびジリノレオイルホスファチジルコリン。
【０１２０】
リン脂質は、天然または合成の供給源から得られ得る。しかし、天然の供給源由来のリン脂質（例えば、卵または大豆のホスファチジルコリン、脳のホスファチジン酸、脳または植物のホスファチジルイノシトール、心臓のカルジオリピンおよび植物または細菌のホスファチジルエタノールアミン）は、特定の実施形態において、主要なホスファチド（すなわち、全ホスファチド組成の５０％以上を構成する）として使用されない。なぜならば、これは、得られるリポソームの不安定性および漏れをもたらし得るからである。
【０１２１】
（ｃ．脂質ベースの小胞）
本発明における使用について企図される脂質ベースのナノ粒子の別の型は、脂質ベースの小胞である。脂質ベースの小胞は、上で列挙される脂質の１種以上を使用して生成され得る。
【０１２２】
特定の実施形態において、上記脂質ベースの小胞は、ＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞である。ＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞は、カチオン性脂質ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）−プロパン）とコレステロールとを混合することによって調製される。ＤＮＡを用いて調製されたベシクルは、そのＤＮＡが２つの脂質二重層の間に凝縮されるようである場合、（「サンドイッチ」と称される）構造物を形成し得る（米国特許第６，７７０，２９１号および同第６，４１３，５４４号）。
【０１２３】
ＤＯＴＡＰ：コレステロール−ポリペプチド複合体は、以下の非限定的な例におけるように調製され得る。ＤＯＴＡＰ：コレステロール（ＤＣ）ナノ粒子（５０〜１００ｎｍの大きさ）は、先に記載される通りに合成され得る（米国特許第６，７７０，２９１号および同第６，４１３，５４４号；Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ、１９９７）。簡単にいうと、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールは、クロロホルム中で１：１の比（２０μＭのＤＯＴＡＰおよび２０μＭのコレステロール）で混合され、そして氷冷したロータリーエバポレーターにおいてエバポレートされる。得られた混合物は、５５℃における超音波処理を加えた５％デキストロースに再懸濁され、そして凍結乾燥される。凍結乾燥された生成物は、５％デキストロースに溶解され、そして漸減する大きさ（１．０、０．４５、０．２、および０．１μｍ）の小型押し出し機（ｍｉｎｉ−ｅｘｔｒｕｄｅｒ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌ）を通して押し出されて５０〜１００ｎｍの平均粒径を与える。コレステロールを伴わないＤＯＴＡＰは、同様に調製される。その合成されたナノ粒子は、４℃にて保存され、そしてその合成されたナノ粒子は、ナノ粒子複合体を調製するために使用される。
【０１２４】
ＤＯＴＡＰ：コレステロール−ペプチドナノ粒子を調製するために、２０μｇのペプチドは、水中の１００μｌの５％デキストラン（「Ｄ５Ｗ」）に希釈され、そして等量の希釈したＤＯＴＡＰ：コレステロールまたはＤＯＴＡＰ単独（２０ｍＭμＭのＤＯＴＡＰ：コレステロールまたはＤＯＴＡＰ単独の４０μｌを、Ｄ５Ｗにおいて１００μｌの総容量に希釈する）と穏やかに混合され、これらは、１００ｍｇ／ｍＬのペプチドおよび４ｍＭのＤＯＴＡＰ：コレステロールまたはＤＯＴＡＰの最終濃度を与える。その処方物は、ＤＯＴＡＰ：コレステロールまたはＤＯＴＡＰに対するペプチドの割当の変動によって最適化される。得られたペプチド−ナノ粒子は、１００〜２５０ｎｍの間の平均サイズおよび＋５０ｍＶの正電荷を有し、それらは、それぞれ、Ｎ４  Ｐｌｕｓ  Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  ＳｉｚｅｒのＮ４粒径分析器およびＤｅｌｓａ  ４４０ＳＸ  Ｚｅｔａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって決定される。
【０１２５】
本発明のいくつかの実施形態において、超常磁性ナノ粒子を用いて形成されるナノ粒子−ポリペプチド複合体は、ＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞中に組み込まれる。ＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞中のペプチド−ＳＰＩＯ結合体を構築するために、ペプチド−ＳＰＩＯ結合体は、各成分の最適化されたモル比を用いた自己集合プロセスによってＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞中に封入され得る。上記ペプチド−ＳＰＩＯナノ粒子、または個々のペプチド成分およびＳＰＩＯ成分は、最初に、Ｄ５Ｗ中の５〜５０μＭ／ｍｌのペプチド−ＳＰＩＯ結合体またはＤ５Ｗ中の５〜５０μＭ／ｍｌのペプチド＋０．１〜１ｍｇ／ｍｌのＦｅ（ＳＰＩＯ）を１時間混合し、次いで等量のＤ５Ｗ中の４０〜１００ｍＭ  ＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞と合わせることによって構築される。Ｄ５Ｗ中のペプチド−ＳＰＩＯ−ＤＯＴＡＰ：コレステロールの粒子およびコロイドの安定性は、分光測光分析（４００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．）によってモニタリングされる。封入プロセスは、ｆｌｕｏ−３標識されたペプチド−ＳＰＩＯ結合体を用いてトランスフェクトされた腫瘍細胞における細胞内取り込みのＦＡＣＳ分析による決定によって最適化されるべきである。
【０１２６】
（３．ナノ粒子の標的性）
標的性の送達は、ナノ粒子のそれらのポリペプチド積載物（ｐａｙｌｏａｄ）を送達する能力を損なうことなくリガンドを付加することによって達成される。これが特定の細胞、組織および器官への送達を可能にするが、企図される。リガンドベースの送達システムの標的特異性は、異なる細胞型上のリガンドレセプターの分布に基づく。標的性リガンドは、ナノ粒子と非共有結合するか、またはナノ粒子と共有結合するかのいずれかであり得、そしてその標的性リガンドは、本明細書中で考察されるような種々の方法によってナノ粒子に結合体化され得る。
【０１２７】
ナノ粒子を標的性にするために使用され得るタンパク質またはペプチドの例としては、トランスフェリン、ラクトフェリン、ＴＧＦ−□、神経発育因子、アルブミン、ＨＩＶ  Ｔａｔペプチド、ＲＧＤペプチド、およびインスリン、ならびにその他のものが挙げられる（Ｇｕｐｔａら、２００５；Ｆｅｒｒａｒｉ、２００５）。
【０１２８】
（ＩＩ．生物活性ポリペプチド）
本発明は、ポリペプチドを細胞に送達するための、ナノ粒子−ポリペプチド複合体およびこのような複合体を使用する方法を提供する。上記複合体は、ナノ粒子と結合している生物活性ポリペプチドを含む。「生物活性」ポリペプチドは、いくつかの所望の生物学的な機能または活性を有するタンパク質またはペプチドである。例として、抗癌治療のための所望の生物学的機能としては、プロテインキナーゼの阻害、アポトーシスの促進、新脈管形成の阻害などが挙げられる。したがって、生物活性抗癌ポリペプチドは、プロテインキナーゼを阻害するか、アポトーシスを促進するか、または新脈管形成を阻害するポリペプチドであり得る。
【０１２９】
本発明に従って、ナノ粒子−ポリペプチド複合体は、生物活性ペプチドとナノ粒子とを結合することによって形成され得る。目的のタンパク質の１個以上の機能性ドメインを含む生物活性ペプチドが、特に企図される。
【０１３０】
（Ａ．生物活性ポリペプチドの作製）
本発明は、生物活性ポリペプチド（例えば、生物活性ペプチド）を同定、産生するための方法を提供する。特定の実施形態において、生物活性ポリペプチドは、ポリペプチド中の１個以上の機能性ドメインを同定することによって産生され得る。
【０１３１】
タンパク質の機能性ドメインは、当該分野において周知である分子生物学的方法および細胞生物学的方法を使用した構造−機能研究によって実験的に決定され得る。例えば、タンパク質の欠失変異体または置換変異体は、組換えＤＮＡ法によって調製され得、そしてこのような変異体タンパク質の生物学的特性が、研究され得る。あるいは、タンパク質配列中の推定上の機能性ドメインは、アミノ酸配列分析によって同定され得、そしてこれらの予想される機能性ドメインを含むペプチドが、設計され得、そして生物学的活性について試験され得る。
【０１３２】
特定の実施形態において、コンピュータ支援構造分析は、ポリペプチド中の機能性ドメインを同定するために使用され得る。代表的に、上記コンピュータ支援構造分析は、遺伝子のアミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列の評価を含む。コンピュータ支援構造分析は、例えば、プロテインキナーゼ（例えば、ＰＫＣ）の活性化部位または相互作用部位、ミリルトイル化部位、ＰＤＺクラスＩＩドメインあるいはＡキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）モチーフなどの機能性ドメインを同定するために使用され得る。コンピュータ支援構造分析は、推定上の機能性ドメインの同定をもたらし得る。推定上の機能性ドメインの同定は、生物活性ペプチドを同定するのに十分であり得る。しかし、上記機能性ドメインの活性の確認が望まれる場合、当該分野において公知である種々の生物学的アッセイが、その機能性ドメインの活性を確認するために使用され得る。コンピュータ支援構造分析を行うためのソフトウェアとしては、ＳｃａｎｓｉｔｅプログラムおよびＥｘＰＡＳｙ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｓｅｒｖｅｒにおいて見出される他の分析プログラムが挙げられる。
【０１３３】
本発明の特定の実施形態において、抗癌特性を有するペプチドが、企図される。このようなペプチドは、腫瘍抑制遺伝子産物に基づき得る。
【０１３４】
（Ｂ．腫瘍抑制遺伝子）
上記腫瘍抑制オンコジーンは、過剰な細胞増殖を阻害するように機能する。これらの遺伝子の不活化は、それらの阻害性活性を破壊し、制御されていない増殖をもたらす。
【０１３５】
１つの十分に研究された腫瘍抑制遺伝子は、ｐ５３である。変異体ｐ５３の高レベルは、化学的発癌物質、紫外線照射、および種々のウイルスによって形質転換された多くの細胞中に見出されている。ｐ５３遺伝子は、広範な種々のヒト腫瘍における変異性の不活化の頻繁な標的であり、そして一般的なヒトの癌において最も頻繁に変異した遺伝子であることが既に報告されている。それは、５０％を超えるヒトＮＳＣＬＣ（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎら、１９９１）および広範囲の他の腫瘍において変異する。
【０１３６】
ｐ５３遺伝子は、宿主タンパク質（例えば、大−Ｔ抗原およびＥ１Ｂ）と複合体を形成し得る３９３−アミノ酸リン酸化タンパク質をコードする。上記タンパク質は、正常組織および正常細胞中に見出されるが、形質転換細胞または腫瘍組織と比較して極めて小さい濃度である。
【０１３７】
野生型ｐ５３は、多くの細胞型において重要な増殖調節因子であると認識される。ミスセンス変異は、ｐ５３遺伝子に共通しており、オンコジーンの形質転換能力に必須である。点変異によって刺激される単一の遺伝的変化は、発癌性のｐ５３をもたらし得る。しかし、他のオンコジーンとは異なり、ｐ５３点変異は、少なくとも３０種の異なるコドンにおいて生じることが知られている、それは、しばしば細胞表現型のシフトをホモ接合性の減少を伴わずに生じる優性対立遺伝子をもたらす。さらに、これらのドミナントネガティブな対立遺伝子の多くは、生物体において許容され、そして生殖系列に伝播するようである。種々の変異体対立遺伝子は、最低で機能障害性から強力に浸透性までである範囲のドミナントネガティブな対立遺伝子であるようである（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、１９９１）。
【０１３８】
細胞増殖の別のインヒビターは、ｐ１６である。真核生物細胞周期の主要な移行は、サイクリン依存性キナーゼ（すなわち、ＣＤＫ）によって誘発される。１つのＣＤＫ、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）は、Ｇ１を通して進行を調節する。この酵素の活性は、Ｇ１後期においてＲｂをリン酸化することであり得る。ＣＤＫ４の活性は、活性化サブユニット、Ｄ型サイクリン、および阻害性サブユニットによって制御され、ｐ１６ＩＮＫ４は、ＣＤＫ４に特異的に結合し、そしてＣＤＫ４を阻害し、したがってＲｂリン酸化を調節し得るタンパク質として生化学的に特徴付けられている（Ｓｅｒｒａｎｏら、１９９３；Ｓｅｒｒａｎｏら、１９９５）。ｐ１６ＩＮＫ４タンパク質はＣＤＫ４インヒビターである（Ｓｅｒｒａｎｏ、１９９３）ので、この遺伝子の欠失は、ＣＤＫ４の活性を増大させ、Ｒｂタンパク質の過剰リン酸化をもたらし得る。ｐ１６はまた、ＣＤＫ６の機能を調節することが公知である。
【０１３９】
ｐ１６ＩＮＫ４は、ｐ１６Ｂ、ｐ１９、ｐ２１ＷＡＦ１、およびｐ２７ＫＩＰ１がまた挙げられるＣＤＫ阻害性タンパク質の新規に記載されたクラスに属する。ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子は、９ｐ２１（多くの腫瘍型において頻繁に欠失する染色体領域）にマッピングされる。ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子のホモ接合型の欠失および変異は、ヒト腫瘍細胞株において頻繁である。この形跡は、ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子は腫瘍抑制遺伝子であることを示唆する。しかし、この解釈は、ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子の変化の頻度が培養された細胞株よりも培養されていない一次腫瘍においてずっと低いという観察によって疑われている（Ｃａｌｄａｓら、１９９４；Ｃｈｅｎｇら、１９９４；Ｈｕｓｓｕｓｓｉａｎら、１９９４；Ｋａｍｂら、１９９４；Ｋａｍｂら、１９９４；Ｍｏｒｉら、１９９４；Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９４；Ｎｏｂｏｒｉら、１９９５；Ｏｒｌｏｗら、１９９４；Ａｒａｐら、１９９５）。プラスミド発現ベクターを用いたトランスフェクションによる野生型ｐ１６ＩＮＫ４の機能の回復は、数種のヒト癌細胞株によるコロニー形成を減少させる（Ｏｋａｍｏｔｏ、１９９４；Ａｒａｐ、１９９５）。
【０１４０】
本発明に従って使用され得る他の腫瘍抑制因子は、表ＩＶに列挙される。表ＩＶに列挙された遺伝子は、本発明で使用され得る腫瘍抑制遺伝子の非限定的な例として提供される。さらに、現在公知であるかまたはその後に見出され得る実質的にあらゆる腫瘍抑制遺伝子（例えば、アポトーシス促進遺伝子、または癌性細胞に対して細胞傷害性である遺伝子）が本発明で使用され得ることが、想起される。腫瘍阻害効果を示す実質的にあらゆるヒト遺伝子産物が抗癌生物活性ペプチドを誘導するために使用され得ることが、想起される。
【０１４１】
（表ＩＶ：腫瘍抑制遺伝子）
【０１４２】
【表４−１】
2009501237.tif 000007
【０１４３】
【表４−２】
2009501237.tif 000008
（Ｃ．ヒト染色体３ｐ２１．３に由来する腫瘍抑制遺伝子）
腫瘍抑制遺伝子（ＴＳＧ）は、ヒトの肺癌および他の癌の発病において主要な役割を果たす。肺癌細胞は、複数の公知である優性オンコジーンおよび劣性オンコジーンにおいて変異および欠失を有する（Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８；Ｖｉｒｍａｎｉら、１９９８）。公知のＴＳＧ（例えば、Ｒｂ、ｐ５３）、および推定上のＴＳＧは、染色体領域３ｐ、５ｑ、６ｐ、８ｐ、９ｐ、および１１ｐならびに他の部位において見出されている（Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８；Ｇａｚｄａｒら、１９９４；Ｍｉｎｎａ、１９９７）。新鮮な肺の腫瘍および腫瘍細胞の細胞遺伝学的研究および対立遺伝子分類（ａｌｌｅｌｏｔｙｐｉｎｇ）研究は、複数の部位における腫瘍細胞対立遺伝子の喪失を示し、これは、１種以上のこのようなＴＳＧの存在を示唆した（Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８；Ｖｉｒｍａｎｉら、１９９８；Ｇａｚｄａｒら、１９９４；Ｍｉｎｎａら、１９９７）。しかし、染色体３（３ｐ）の短腕上の細胞遺伝学的変化および対立遺伝子の喪失は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）の約９０％および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の＞５０％に最も頻繁に関与することが示されている（Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８；Ｇａｚｄａｒら、１９９４；Ｍｉｎｎａ、１９９７；Ｄａｌｙら、１９９３）。ＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣは、肺腫瘍のうちの２種の処置群であり、そして４種の組織学的な型で構成される。扁平上皮細胞癌、腺癌、および大細胞癌は、ＮＳＣＬＣ群にある。小細胞肺癌は、ＳＣＬＣ群にある。約７５％の肺腫瘍は、ＮＳＣＬＣである。転移は、ＳＣＬＣよりもＮＳＣＬＣの後に生じる。ＳＣＬＣは、大部分の転移性の固形腫瘍のうちの１種である（Ｍａｂｒｙら、１９９８）。さらに、同様の３ｐの変化は、肺に加えて数種の他の癌（例えば、腎細胞癌、乳癌、頭および首の癌、膵臓癌、腎臓癌、口腔癌、および子宮頚癌）において見られている（Ｒｏｔｈ、１９９８；Ｚｂａｒら、１９８７；Ｇａｚｄａｒら、１９９８；Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８；Ｂｕｃｈｈａｇｅｎら、１９９６；Ｇｏｒｕｎｏｖａら、１９９８；Ｈｕｇｈｓｏｎら、１９９８；Ｕｚａｗａら、１９９８；Ｋｅｒｓｅｍａｅｋｅｒｓら、１９９８；Ｗｉｓｔｕｂａら、１９９７）。さらに、肺癌におけるホモ接合型欠失によって定義されるようなＴＳＧの群は、４５０ｋｂの領域中の３ｐ２１．３に位置し、そしてその位置において単離された（Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８；Ｍｉｎｎａら、１９９７；Ｈｕｎｇら、１９９５；Ｓｅｋｉｄｏら、１９９６；Ｗｉｓｔｕｂａら、１９９９）。肺癌の前癌状態（ｐｒｅｎｅｏｐｌａｓｉａ）の研究は、３ｐ２１対立遺伝子の喪失が過形成性の病変において生じる現在までに検出された肺癌における最も初期の遺伝的異常性であることを示す；これは、１種以上の３ｐ劣性オンコジーンが肺癌を含む多くのヒトの癌の分子的発病において「門番（ｇａｔｅｋｅｅｐｅｒ）」として機能することを示し、１種以上の３ｐ劣性オンコジーンは、全ての症例の＞５０％に関与するようである（Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８；Ｍｉｎｎａら，７  １９９７；Ｈｕｎｇら、１９９５；Ｓｅｋｉｄｏら、１９９６；Ｗｉｓｔｕｂａら、１９９９；Ｋｏｈｎｏら、１９９９；Ｗｉｓｔｕｂａら、１９９９）。
【０１４４】
遺伝子の群は、ヒト染色体３ｐ２１．３の１２０ｋｂの重要な腫瘍のホモ接合欠失領域（肺癌および乳癌において見出された）において同定されている。これらの遺伝子は、ＣＡＣＮＡ２Ｄ２、ＰＬ６、１０１Ｆ６、ＮＰＲ１．２、ＢＬＵ、ＲＡＳＳＦ１、ＦＵＳ１、ＨＹＡＬ２およびＨＹＡＬ１と指定されている。研究は、数種の型のヒトＮＳＣＬＣ細胞における細胞増殖に対するこれらの遺伝子のいくつかの発現の効果を探索することを実施した。これらの研究は、ＦＵＳ１、１０１Ｆ６、ＨＹＡＬ２およびＮＰＲＬ２ならびに他の遺伝子が候補の腫瘍抑制遺伝子であることを示す（Ｊｉら、２０００）。
【０１４５】
アデノウイルスベクター媒介性またはＤＯＴＡＰ：コレステロールナノ粒子媒介性の遺伝子導入による３ｐ２１．３欠損ヒト肺癌細胞におけるｗｔ−ＦＵＳ１機能の回復は、インビトロおよびインビボでのアポトーシスの誘導および細胞動態の変化によってこれらの腫瘍細胞の増殖を阻害する（Ｉｔｏら、２００４）。これは、ＦＵＳ１の腫瘍抑制活性を示す。
【０１４６】
（ＩＩＩ．薬学的処方物）
本発明の薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアに溶解または分散した１種以上のペプチド、ナノ粒子−ポリペプチド複合体またはさらなる薬剤の有効量を含む。語句「薬学的に受容可能または薬理学的に受容可能」とは、必要に応じて動物（例えば、ヒトなど）に投与された場合に、有害、アレルギー性または他の不利な反応を生じない分子的実体および組成物をいう。少なくとも１種のペプチドまたはナノ粒子−ポリペプチド複合体あるいはさらなる活性成分を含む薬学的組成物の調製は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０（本明細書中に参考として援用される）によって例示されるような本開示に鑑みて当業者に公知である。さらに、動物（例えば、ｈｕｍａｎ）の投与に関して、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求されるような無菌性、発熱原性、一般的安全性および純度基準を満たすべきであると、理解される。
【０１４７】
本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意およびあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩類、保存剤、薬物、薬物安定化剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味料、染料、これらのような物質およびその組み合わせを含み、それらは、当業者に公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０、ｐｐ．１２８９−１３２９（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。任意の従来のキャリアが上記活性成分と不適合性である場合を除いて、治療用組成物または薬学的組成物におけるその使用が、企図される。
【０１４８】
上記薬学的組成物は、固体形態、液体形態またはエアロゾル形態で投与されるか、および注射のような投与経路のために無菌であることを必要とするか否かに依存して、異なる型のキャリアを含み得る。本発明は、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍内、眼内、経口、局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、局所（ｌｏｃａｌｌｙ）に投与されるか、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、注入、持続注入、カテーテル、クリーム、脂質組成物（例えば、リポソーム）における洗浄液による標的細胞の直接的な局所灌流バス（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｂａｔｈｉｎｇ）、または当業者に公知である他の方法または上述の任意の組み合わせで投与され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０、本明細書中に参考として援用されるを参照のこと）。
【０１４９】
特定の実施形態において、上記薬学的組成物は、腹腔内に投与される。さらなる実施形態において、上記薬学的組成物は、癌（例えば、癌性腫瘍）を処置するために腹腔内に投与される。例えば、上記薬学的組成物は、胃腸の癌を処置するために腹腔内に投与され得る。特定の実施形態において、上記薬学的組成物を腫瘍または腫瘍の近傍に投与することが、望まれ得る。
【０１５０】
特定の好ましい実施形態において、上記薬学的組成物は、癌（例えば、胃腸の癌）を処置するために経口的に投与される。
【０１５１】
患者に投与される本発明の組成物の実際の投薬量は、身体的因子および生理的因子（例えば、体重、状態の重篤度、処置される疾患の型、以前または現在の治療的介入、患者およびの特発性および投与経路）によって決定され得る。投与を担う医療関係者は、あらゆる事象において、組成物中の活性成分の濃度および個々の被験体に対する適切な用量を決定する。
【０１５２】
特定の実施形態において、薬学的組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含み得る。他の実施形態において、上記活性化合物は、約２重量％〜約７５重量％の間の単位、または約２５％〜約６０％の単位、および例えば、その中から導かれ得る任意の範囲の単位を含み得る。他の非限定的な例において、用量はまた、１回の投与につき、体重１ｋｇあたり約１マイクログラムから、体重１ｋｇあたり約５マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約２００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約３５０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約２００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約３５０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１０００ミリグラムまたはそれ以上まで、およびその中から導かれ得る任意の範囲を含み得る。本明細書中に列挙された数から導かれ得る範囲の非限定的な例において、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ〜体重１ｋｇあたり約１００ｍｇの範囲、体重１ｋｇあたり約５マイクログラム〜体重１ｋｇあたり約５００ミリグラムの範囲などが、上記の数に基づいて投与され得る。
【０１５３】
任意の場合において、上記組成物は、１種以上の成分の酸化を遅らせるために種々の抗酸化剤を含み得る。さらに、微生物の活動の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）などの保存剤によってもたらされ得る。
【０１５４】
１種以上のペプチド、ナノ粒子−ポリペプチド複合体またはさらなる薬剤は、遊離の塩基、中性形態または塩形態で組成物中に処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基によって形成されるか、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸またはマンデル酸のような有機酸によって形成されるもの）が挙げられる。遊離のカルボキシ基によって形成される塩はまた、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄など）；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンまたはプロカインのような有機塩基から誘導され得る。
【０１５５】
上記組成物が液体形態である実施形態において、キャリアは、溶媒または分散媒であり得、それらは、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム）およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。適切な流動性は、例えば、レクチンなどのコーティング剤の使用；例えば、液体のポリオールまたは脂質などキャリア中の分散による必要とされる粒径の維持；例えば、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤の使用；またはこのような方法の組み合わせによって維持され得る。多くの場合において、例えば、糖類、塩化ナトリウムまたはその組み合わせなどの等張化剤を含むことが、好ましい。
【０１５６】
他の実施形態において、本発明において目薬、点鼻溶液または点鼻スプレー、エアロゾルまたは吸入剤を使用し得る。いくつかの組成物は、一般に、標的とする組織型に適合するように設計される。非限定的な例において、点鼻溶液は、通常、液滴またはスプレーで鼻道に投与されるように設計された水性溶液である。点鼻溶液は、それらが多くの鼻分泌物と同様であり、正常な絨毛作用が維持されるように調製される。したがって、好ましい実施形態において、水性点鼻溶液は、通常、等張であるか、または約５．５〜約６．５のｐＨを維持するように僅かに緩衝化される。さらに、眼科調製物、薬物、または適切な薬物安定化剤において使用されるものと同様の抗菌性保存剤は、必要とされる場合、上記処方物中に含まれ得る。例えば、種々の市販の点鼻調製物は、公知であり、そしてそれらは、抗生物質または抗ヒスタミン剤などの薬物を含む。
【０１５７】
特定の実施形態において、１種以上のペプチドまたはナノ粒子−ポリペプチド複合体は、経口摂取などの経路によって投与するために調製される。これらの実施形態において、上記固形組成物としては、例えば、溶液、懸濁物、エマルション、錠剤、丸剤、カプセル剤（例えば、ハードシェルまたはソフトシェルのゼラチンカプセル）、徐放処方物、口腔粘膜組成物、トローチ、エリキシル、懸濁物、シロップ剤、ウェハ、またはそれらの組み合わせを含み得る。経口組成物は、食事の食物と一緒に直接取り込まれ得る。経口投与に好ましいキャリアは、不活性な希釈剤、吸収可能な食用キャリアまたはそれらの組み合わせを含む。本発明の他の局面において、経口処方物は、シロップまたはエリキシルとして調製され得る。シロップまたはエリキシルは、例えば、少なくとも１種の活性成分、甘味剤、保存剤、香味料、染料、保存料、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【０１５８】
特定の好ましい実施形態において、経口組成物は、１種以上の結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、香味料、およびそれらの組み合わせを含み得る。特定の実施形態において、組成物は、以下のうちの１種以上を含み得る：結合剤（例えば、トラガカントガム、アカシア、トウモロコシデンプン、ゼラチンまたはそれらの組み合わせなど）；賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム、マンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムまたはそれらの組み合わせなど）；崩壊剤（例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸またはそれらの組み合わせなど）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムなど）；甘味剤（例えば、スクロース、乳糖、サッカリンまたはそれらの組み合わせなど）；香味料（例えば、ペパーミント、冬緑油、サクランボ香料、オレンジ香料など）；または上述のものの組み合わせ。投薬単位形態がカプセルである場合、それは、上記の型の物質に加えて、液体キャリアなどのキャリアを含み得る。種々の他の物質は、コーティング剤として存在しても、投薬単位の物理形態を改変してもよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、シェラック、糖またはその両方によってコートされ得る。
【０１５９】
投与の他の様式に適したさらなる処方物としては、坐剤が挙げられる。坐剤は、直腸、膣または尿道を介して挿入するために種々の重量および形状の固体投薬形態である。挿入の後、坐剤は、腔の流体において軟化するか、融解するかまたは溶解する。一般的に、坐剤に関して、伝統的なキャリアとしては、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリドまたはその組み合わせが挙げられ得る。特定の実施形態において、坐剤は、例えば、約０．５％〜約１０％の範囲、そして好ましくは約１％〜約２％の範囲の活性成分を含む混合物から形成され得る。
【０１６０】
無菌の注射可能な溶液は、必要とされる量の上に記載される適切な溶媒と種々の他の成分の量とを組み込み、次いで濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散物は、基本的な分散媒および／または他の成分を含む無菌のビヒクル中に種々の滅菌した活性成分を組み込むことによって調製される。無菌の注射溶液、分散物またはエマルションの調製のための無菌粉末の場合において、調製の好ましい方法は、活性成分に任意のさらなる所望の成分を加えた粉末を先に濾過滅菌したその液体媒体から産生する真空乾燥技術または凍結乾燥技術である。上記液体媒体は、必要とされる場合、適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤が、最初に、十分な食塩水またはグルコースと一緒に注射する前に等張にする傾向にある。直接注射のための高濃度の組成物の調製がまた、企図され、溶媒としてＤＭＳＯを使用する場合は、小さい領域に高濃度の活性剤を送達する非常に迅速な新党をもたらすことが想起される。
【０１６１】
上記組成物は、製造および保存の条件下で安定であるべきであり、そして微生物（例えば、細菌および真菌）による汚染作用から保存される。エンドトキシンによる汚染が安全な水準（例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満）で最小限に維持されるべきであることが、認識される。
【０１６２】
特定の実施形態において、注射用組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、アルミニウムモノステアレート、ゼラチンまたはそれらの組み合わせなど）の使用によってもたらされ得る。
【０１６３】
（ＩＶ．磁気共鳴画像法）
磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）において、患者は、静的磁場におかれ、そして高周波（ＲＦ）パルスならびに空間的および時間的な磁場の傾斜を使用した画像化手順に供される。ＭＲＩは、核スピンの特性を使用して画像データを収集する。対ではない核子（陽子または中性子）を有する核は、ＭＲＩを行うために使用され得る０ではない磁性モーメントをもたらすスピンとして公知である特性を有する（例えば、米国特許第５，３９７，９８７号を参照のこと）。水素核は、単一の陽子を有し、そして多くのＭＲＩ技術は、水素核を利用する。なぜならば、それらは、ヒト組織に広範に存在するからである。被験体が主な磁場に置かれる場合、その核は、その磁場の方向において（すなわち、「磁化軸（ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ  ａｘｉｓ）」に沿って）配列する；その核の方向性は、磁化ベクトルによって表され得る（例えば、Ｈｏｒｏｗｉｔｚ、１９９５を参照のこと）。磁気共鳴の古典的な物理的説明において、これらのスピン核は、磁化軸の周りを円錐様式で歳差運動し得、一般に、互いに関して位相不一致である
特定の核の共鳴周波数において同相スピンを誘導するために、高出力の放射線周波数の励起パルス（多くの場合キロワットの範囲である周波数）は、その共鳴周波数において散布される。このＲＦパルスはまた、サンプル（例えば、ヒトの脳）において核をもたらして、主要な磁場によってもたらされる磁化ベクターに関して回転する（例えば、Ｈｏｒｏｗｉｔｚ、１９９５を参照のこと）。サンプルにおけるスピン核は、ＲＦシグナルを生成し、それは、時間と共に減衰する。時間変動性の傾斜磁場は、ＲＦ励起パルス後に適用されて、ＲＦシグナルを減衰する空間的分解を可能にする。したがって、上記ＲＦ励起パルスおよび時間変動性の傾斜磁場は一緒になって、サンプルに、「自由誘導減衰」（ＦＩＤ）シグナルとして公知である時間変動性のＭＲ  ＲＦシグナルを放出させる。磁気共鳴（ＭＲ）スキャナーにおけるアンテナは、これらのＦＩＤシグナルを受信し、そしてこれらのＭＲ画像化シグナルは、プロセッサーに伝達される。このプロセッサーは、これらのシグナルを使用して空間的分布またはスピン核の化学的環境を反映するＭＲ画像をもたらす。
【０１６４】
造影剤は、背景と目的の領域との間のシグナルの違いを増大させるために使用される。超常磁性ナノ粒子は、ＭＲＩにおいて造影剤として使用され得る（Ｇｕｐｔａら、２００５；Ｆｅｒｒａｒｉ、２００５）。上記粒子は、受動的かまたは標的性送達によってかのいずれかで、組織（例えば、腫瘍）に蓄積し得る（Ｍｏｒａｗｓｋｉら、２００５）。特定の組織においてこのような粒子を局在させるための磁場の使用がまた、可能である。標的化された送達はまた、上に記載されるように、特定のタンパク質（例えば、トランスフェリン）の組み込みを含み得る。
【０１６５】
本発明の超常磁性ナノ粒子−ポリペプチド複合体は、生物活性ポリペプチドを取り込む組織および細胞を同定するためにＭＲＩにいて使用され得る。
【０１６６】
使用する前に、上記ナノ粒子（例えば、ペプチド−ＳＰＩＯ−ＤＯＴＡＰ：コレステロール粒子）は、インビトロでの細胞傷害性について評価され得る。ヒト癌細胞は、インビトロでの細胞増殖およびアポトーシスの誘導に対するペプチド−ＳＰＩＯ−ＤＯＴＡＰ：コレステロール粒子の効果を評価するために使用され得る。非限定的な例として、細胞傷害性の測定は、ウェル１つあたり１×１０４個の細胞を含む９６ウェルプレートでＸＴＴアッセイによって行なわれる。細胞は、ＰＢＳによってリンスされ、そして最終濃度が約１〜１０ｍＭのペプチド−ＳＰＩＯ結合体、および４〜１０ｍＭのＤＯＴＡＰ：コレステロールになるまで無血清培地において希釈されるペプチド−ＳＰＩＯ−ＤＯＴＡＰ：コレステロール粒子とインキュベートされる。ペプチド、ＳＰＩＯ、およびＤＯＴＡＰ：コレステロール粒子は、コントロールとして、９６ウェル磁性プレート（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｂｒｏｗｎ  Ｄｅｅｒ、ＷＩ）上で３０分間使用される。過剰の結合していない粒子は、ＰＢＳによる３回のリンスによって除去される。次いで新鮮な培養培地は、そのウェルに添加される。細胞傷害性およびアポトーシスの誘導は、処理の２４時間後、４８時間後、および７２時間後に決定される。細胞の生育能は、製造業者の指示書に従いＸＴＴアッセイ（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して測定され、そしてアポトーシスは、ＴＵＮＥＬ染色を使用したＦＡＣＳ分析によって測定される。ペプチド−ＤＯＴＡＰ：コレステロール粒子は、ポジティブコントロールとして機能し得る。
【０１６７】
インビトロでの細胞内取り込みおよびペプチド−ＳＰＩＯナノ粒子を評価するために、上記のように処理された腫瘍細胞は、ＦＡＣＳ分析によってペプチド−ＳＰＩＯ濃度の関数としてｆｌｕｏ−３標識したペプチド−ＳＰＩＯナノ粒子の取り込みを定量的に測定するために使用され得る。上記細胞内取り込みはまた、磁気共鳴（ＭＲ）によって定量的に決定および分析され得る。非限定的な例として、ペプチド−ＳＰＩＯトランスフェクトＨ１２９９細胞は、４２℃にて１ｍｌあたり０、３１５、６２５、１２５、２５００、５０００、および１００００個の細胞の種々の細胞濃度で１５％ゼラチンに懸濁され、次いで１．５ｍｌ微量遠心プラスチックチューブにおいてゼラチン細胞ブロックを形成するように室温まで冷却される。ファントムのＴ２加重ＭＲ画像は、４．７−Ｔ  Ｂｒｕｋｅｒ  ＭＲを使用することによって得られる。３Ｄ傾斜磁場配列は、データ獲得のために使用される。配列パラメータは：ＴＲ２５ｍｓｅｃ、ＴＥ５．１ｍｓｅｃ、およびＡＣ１２８である。３Ｄスラブは、次元と矢状に得られる：ＦＯＶ６３２．４ｃｍ、マトリックス２５６１２８９６。次いで斜位方向撮影（磁石軸に関して）は、解剖学的に関連する平面を得るためにＰａｒａｖｉｓｉｏｎ獲得および処理ソフトウェアパッケージ（Ｂｒｕｋｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内で再構築される。ペプチド−ＳＰＩＯトランスフェクトＨ１２９９細胞を含むファントムは、異なる幾何学を用いた同様の配列によって測定される：ＦＯＶ６ｃｍ、マトリックス２５６２５６、切片の厚さ１ｍｍ。いくつかの場合において、１つのみの切片は、ファントムＭＲの場合において測定される。細胞中のペプチド−ＳＰＩＯの濃度は、ＭＲ１４６によって、溶液におけるペプチド−ＳＰＩＯ−ＤＯＴＡＰ：コレステロール粒子の系列希釈からもたらされる検量線に基づいて算出される。Ｆｌｕｏ−３標識されたペプチド−ＳＰＩＯナノ粒子はまた、細胞外の蛍光を消去するトリパンブルー消光アッセイを使用すること、およびペプチド−ＳＰＩＯ結合体の内在化を可視化する共焦点蛍光顕微鏡を使用することによって、内在化を評価するために使用され得る。
【０１６８】
磁力駆動性の標的性送達およびナノ粒子（例えば、ペプチド−ＳＰＩＯ−ＤＯＴＡＰ：コレステロールまたはペプチド−ＳＰＩＯ−ＤＯＰＣ）の治療効力インビボを評価するために、ヒト癌マウスが、全身投与による磁気的な標的性送達およびペプチド−ＳＰＩＯナノ粒子の治療効力の評価のために使用され得る。非限定的な例として、腫瘍細胞は、先に記載されるような胸内注射によってヌードマウスに接種される。腫瘍細胞接種の７〜１０日後、マウスは、約５ｍＭのペプチド−ＳＰＩＯ結合体、４ｍＭのＤＯＴＡＰ：コレステロールの濃度にて１００ｍｌのペプチド−ＳＰＩＯ−ＤＯＴＡＰ：コレステロール粒子を注射され、そしてペプチド−ＤＯＴＡＰ：コレステロールおよびＳＰＩＯ−ＤＯＴＡＰ：コレステロール粒子は、コントロールとして使用され、そしてＰＢＳ単独は、モックコントロールとして使用される。３体の動物が、各処置群について使用され、注射の５〜３０分後に腫瘍部位は、所定の磁場強度ならびに肺腫瘍部位における１０〜３０分間のＭＲＩに基づく定位の距離および領域を伴う傾斜磁場に供される。ＭＲＩは、処置計画、位置決定、ならびにペプチド−ＳＰＩＯ分布および４．７  Ｔ，４０  ｃｍ  Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｅｃ  ＭＲ機器を使用した処置後の治療効力のモニタリングのために使用される。
【０１６９】
（Ｖ．併用療法）
本発明のペプチドまたはナノ粒子−ポリペプチド複合体の効力を増加させるために、これらの組成物と目的の疾患の処置に有効な他の薬剤とを組み合わせることが、望まれ得る。
【０１７０】
非限定的な例として、癌の処置は、他の抗癌剤を伴う本発明の抗癌生物活性ペプチドまたはナノ粒子−ポリペプチド複合体によって行われ得る。「抗癌」剤は、例えば、癌細胞を殺すこと、癌細胞においてアポトーシスを誘導すること、癌細胞の増殖速度を減少させること、転移の発生または数を減少させること、腫瘍の大きさを減少させること、腫瘍増殖を阻害すること、腫瘍細胞または癌細胞に対する血液供給を減少させること、癌細胞または腫瘍に対する免疫応答を促進すること、癌の進行を予防または阻害すること、あるいは癌を有する被験体の寿命を増大させることによって被験体において、癌に対してネガティブに作用し得る。より一般に、これらの他の組成物は、細胞を殺すか、または細胞の増殖を阻害するのに有効な組み合わせた量で提供される。このプロセスは、細胞と、上記抗癌ペプチドまたはナノ粒子−ポリペプチド複合体および上記薬剤または複数の因子とを同時に接触させることを含み得る。これは、細胞と、単一の組成物または両方の薬剤を含む薬理学的処方物とを接触させること、または細胞と、２つの異なる組成物または処方物とを同時に接触させることによって達成され得、一方の組成物は、上記抗癌ペプチドまたはナノ粒子−ポリペプチド複合体を含み、そして他方の組成物は、第２の薬剤を含む。特定の実施形態において、抗癌ペプチドが、一方の薬剤であり得、そして抗癌ナノ粒子−ポリペプチド複合体が、他方の薬剤であり得る。
【０１７１】
上記抗癌ペプチドまたはナノ粒子−ポリペプチド複合体による処置は、分から週の範囲の間隔で他の薬剤による処置が前後に行われ得る。他の薬剤および上記抗癌ペプチドまたはナノ粒子−ポリペプチド複合体が細胞に対して別々に適用される実施形態において、一般に、かなりの時間が、その薬剤および抗癌ペプチドまたはナノ粒子−ポリペプチド複合体が依然として細胞に対して有利な併用効果を発揮し得るように各送達の時間の間に経過しないことを、確保する。このような例において、細胞と両方の治療とを、互いの約１２〜２４時間以内および、より好ましくは互いの約６〜１２時間以内に接触させ得ることが、企図される。いくつかの状況において、処置のための時間を顕著に延長することが望まれ得、数日間（例えば、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間または７日間）〜数週間（例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間または８週間）が、それぞれの投与の間に経過する。
【０１７２】
種々の組み合わせが、使用され得、上記抗癌ペプチドまたはナノ粒子−ポリペプチド複合体は、「Ａ」であり、そして第２の因子（例えば、放射線療法または化学療法）は、「Ｂ」である：
【０１７３】
【化１】
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本発明の治療用抗癌ペプチドまたは治療用ナノ粒子−ポリペプチド複合体の患者に対する投与は、毒性を考慮して、化学療法剤（存在する場合、ベクター）の投与のための一般的なプロトコルに従う。必要な場合、処置周期が繰り返されることが、予想される。種々の標準的な治療、ならびに外科手術による介入が、記載された過剰増殖性細胞の治療と組み合わせて適用され得ることもまた、企図される。
【０１７４】
（ａ．化学療法）
癌治療はまた、化学療法ベースの処置および放射線ベースの処置の両方を伴う種々の併用療法を含む。併用化学療法としては、例えば、ゲフィチニブ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲンレセプター結合剤、タキソール、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｅｎ）、ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼインヒビター、トランスプラチナム（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、Ｇｌｅｅｖａｃ（メシル酸イマチニブ）、およびメトトレキセート、または上述のアナログもしくは誘導改変体が挙げられる。特定の実施形態において、本発明は、ゲフィチニブと組み合わせて使用され得る。他の実施形態において、本発明は、Ｇｌｅｅｖａｃと組み合わせて実施され得る（例えば、約４００〜約８００ｍｇ／日のＧｌｅｅｖａｃが、患者に投与され得る）。特定の実施形態において、１種以上の化学療法剤が、本発明と組み合わせて使用され得る。
【０１７５】
（ｂ．放射線療法）
ＤＮＡの損傷を引き起こしそして広範に使用されている他の因子は、γ線、Ｘ線として一般的に公知であるものおよび／または腫瘍細胞に対する放射性同位体の指向性送達を含む。ＤＮＡ損傷因子の他の形態もまた、企図される（例えば、マイクロ波照射およびＵＶ照射）。これらの因子の全ては、ほぼ、ＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体の集合および維持に対する広範な損傷に影響するようである。Ｘ線に関する投与線量の範囲は、長期間（３〜４週間）にわたる１日あたり５０〜２００レントゲンの線量から、２０００〜６０００レントゲンの単一の線量までの範囲である。放射性同位体の投与線量範囲は、広範に変化し、そして同位体の半減期、放出される放射線の強度および型、ならびに腫瘍性細胞による取り込みに依存する。
【０１７６】
用語「接触される（ｃｏｎｔａｃｔｅｄ）」および「曝される（ｅｘｐｏｓｅｄ）」は、細胞に適用される場合、治療用組成物および化学療法剤または放射線療法剤が標的細胞に送達されるか、または標的細胞と直接隣接しておかれるプロセスを記載するために本明細書中で使用される。細胞の殺傷または静止を達成するために、両方の薬剤は、細胞を殺傷するか、または細胞の分裂を妨げるのに有効な組み合わせた量で細胞に送達される。
【０１７７】
（ｃ．免疫療法）
免疫療法剤は、一般に、癌細胞を標的とし、そして癌細胞を破壊する免疫エフェクター細胞および免疫エフェクター分子の使用による。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。上記抗体単独は、治療のエフェクターとして機能し得るか、またはそれは、実際に細胞の殺傷を達成する他の細胞を漸増し得る。上記抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に結合体化され得、そして単に標的性薬剤として機能し得る。あるいは、上記エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的かまたは間接的のいずれかで相互作用する表面分子を保有するリンパ球であり得る。種々のエフェクター細胞としては、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が挙げられる。
【０１７８】
したがって、免疫療法は、本発明のペプチドまたはナノ粒子−ポリペプチド複合体と組み合わせて、併用療法の一部として使用され得る。併用療法に関する一般的アプローチは、下で考察される。一般に、上記腫瘍細胞は、標的化に従う（すなわち、大部分の他の細胞上の存在しない）いくつかのマーカーを有さなければならない。多くの腫瘍マーカーが、存在し、そしてこれらのうちの任意のものは、本発明の状況（ｃｏｎｔｅｘｔ）における標的性に適切であり得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、癌胎児抗原、前立腺特異抗原、尿の腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲンレセプター、ラミニンレセプター、ｅｒｂ  Ｂおよびｐ１５５が挙げられる。
【０１７９】
（ｄ．遺伝子治療）
なお別の実施形態において、二次的処置は、治療用ポリヌクレオチドが治療用組成物の前、その後、またはそれと同時に投与される遺伝子治療である。遺伝子産物の発現のためのウイルスベクターは、当該分野において周知であり、そしてそれらとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルスを含むポックスウイルス、およびＳＶ４０を含むパピローマウイルスなどの真核生物発現系が挙げられる。あるいは、発現構築物の投与は、リポソームまたはＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞などのベクターに基づく脂質によって達成され得る。これらの全ての方法は、当該分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９８；Ａｕｓｕｂｅｌ、１９９６を参照のこと）。
【０１８０】
以下の遺伝子産物のうちの１つをコードするベクターの送達は、標的組織に対する組み合わせられた抗過剰増殖効果を有する。種々のタンパク質は、本発明の範囲内に含まれ、それらのうちのいくつかは、下に記載される。
【０１８１】
（ｉｉ．細胞増殖のインヒビター）
上に記載されるように、上記腫瘍抑制オンコジーンは、過剰な細胞増殖を阻害するように機能する。これらの遺伝子の不活化は、それらの阻害活性を破壊し、制御されていない増殖をもたらす。
【０１８２】
本発明に従う二次的処置として使用され得る遺伝子としては、ｐ５３、ｐ１６、Ｒｂ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ｚａｃ１、ｐ７３、ＶＨＬ、ＭＭＡＣ１／ＰＴＥＮ、ＤＢＣＣＲ−１、ＦＣＣ、ｒｓｋ−３、ｐ２７、ｐ２７／ｐ１６融合体、ｐ２１／ｐ２７融合体、抗血栓遺伝子（例えば、ＣＯＸ−１、ＴＦＰＩ）、ＰＧＳ、Ｄｐ、Ｅ２Ｆ、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｆｍｓ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ａｂｌ、Ｅ１Ａ、ｐ３００、新脈管形成に関与する遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、トロンボスポンジン、ＢＡＩ−１、ＧＤＡＩＦ、またはそれらのレセプターｓ）、ＭＣＣおよび表ＩＶに列挙される他の遺伝子が挙げられる。
【０１８３】
（ｉｉ．細胞自己死の調節因子）
アポトーシス、または細胞自己死は、通常の胚の発生、成熟した組織におけるホメオスタシスの維持、および発癌の抑制に必須である（Ｋｅｒｒら、１９７２）。Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質およびＩＣＥ様プロテアーゼは、他の系において重要な調節因子およびアポトーシスのエフェクターであることを示した。濾胞性リンパ腫に関連して見出されたＢｃｌ−２タンパク質は、アポトーシスの制御、およびアポトーシス刺激を誘導する応答における細胞の生存の増強において顕著な役割を果たす（Ｂａｋｈｓｈｉら、１９８５；ＣｌｅａｒｙおよびＳｋｌａｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２（２１）：７４３９−４３、１９８５；Ｃｌｅａｒｙら、１９８６；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏら、１９８５；ＴｓｕｊｉｍｏｔｏおよびＣｒｏｃｅ、１９８６）。ここで、進化において保存されたＢｃｌ−２タンパク質は、死のアゴニストまたは死のアンタゴニストとして分類され得る関連するタンパク質のファミリーのメンバーであると認識される。
【０１８４】
その知見に次いで、Ｂｃｌ−２は種々の刺激によって誘発される細胞死を抑制するように作用することが示された。また、現在、共通の構造および配列相同性を共有するＢｃｌ−２細胞死調節タンパク質のファミリーが存在することが、明らかである。これらの異なるファミリーメンバーは、Ｂｃｌ−２と同様の機能を有する（例えば、ＢｃｌＸＬ、ＢｃｌＷ、ＢｃｌＳ、Ｍｃｌ−１、Ａ１、Ｂｆｌ−１）か、またはＢｃｌ−２機能と反対に作用し、そして細胞死を促進する（例えば、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｈａｒａｋｉｒｉ）かのいずれかであることが、示されている。
【０１８５】
（ｅ．外科手術）
癌を有する者の約６０％は、いくつかの型の外科手術を受け、それとしては、予防的外科手術、診断的外科手術または病期分類的外科手術、治療的外科手術および待機的外科手術が挙げられる。治療的外科手術は、他の治療（例えば、本発明の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法および／または代替療法）と組み合わせて使用され得る癌処置である。
【０１８６】
治療的外科手術は、癌性組織の全部または一部が物理的に除去されるか、切除されるか、そして／または破壊される切除を含む。腫瘍の切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去をいう。腫瘍の切除に加えて、外科手術による処置としては、レーザー外科手術、冷凍外科手術、電気外科手術、および顕微鏡で制御された外科手術（Ｍｏｈｓ’外科手術）が挙げられる。本発明が皮相の癌、前癌、または偶発的な量の正常組織の除去と組み合わせて使用され得ることが、さらに企図される。
【０１８７】
全ての癌性細胞、癌性組織、または癌性腫瘍の一部の切除の際に、腔が、その身体において形成され得る。処置は、灌流、直接の注射またはさらなる抗癌治療を伴う領域の局所適用によって達成され得る。このような処置は、例えば、１日毎、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、または７日毎、または１週間毎、２週間毎、３週間毎、４週間毎、および５週間毎、または１ヵ月毎、２ヵ月毎、３ヵ月毎、４ヵ月毎、５ヵ月毎、６ヵ月毎、７ヵ月毎、８ヵ月毎、９ヵ月毎、１０ヵ月毎、１１ヵ月毎、または１２ヵ月毎に繰り返され得る。これらの処置は、変動する投薬量の処置でもあり得る。
【０１８８】
（ｆ．他の因子）
他の因子が処置の治療効力を改善するために本発明と組み合わせて使用され得ることが、企図される。これらのさらなる因子としては、免疫調節剤、細胞表面レセプターおよびＧＡＰジャンクションのアップレギュレートに影響する薬剤、増殖抑制剤および分化剤（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）、細胞接着のインヒビター、または過剰増殖性細胞のアポトーシス誘導因子に対する感受性を増強させる薬剤を含む。免疫調節剤としては、腫瘍壊死因子；インターフェロンα、インターフェロンβ、およびインターフェロンγ；ＩＬ−２および他のサイトカイン；Ｆ４２Ｋおよび他のサイトカインアナログ；またはＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、および他のサイトカインが挙げられる。細胞表面レセプターまたはそれらのリガンド（例えば、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４またはＤＲ５／ＴＲＡＩＬ）のアップレギュレートが過剰増殖性細胞に対するオートクラインまたはパラクラインの効果を確立することによって本発明のアポトーシス誘導性能を増強するが、さらに企図される。ＧＡＰジャンクションの数を上昇させることによる細胞間シグナリングの増加は、隣接する過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増大させる。他の実施形態において、増殖抑制剤および分化剤が、上記処置の抗過剰増殖効力を改善するために本発明と組み合わせて使用され得る。細胞接着のインヒビターは、本発明の効力を改善することが企図される。細胞接着インヒビターの例は、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）インヒビターおよびロバスタチンである。過剰増殖性細胞のアポトーシスに対する感受性を増大させる他の薬剤（例えば、抗体ｃ２２５）が、処置効力を改善するために、本発明と組み合わせて使用され得ることは、さらに企図される。
【０１８９】
ホルモン療法もまた、本発明または先に記載された任意の他の癌治療と組み合わせて使用され得る。ホルモンの使用は、特定のホルモン（例えば、テストステロンまたはエストロゲン）のレベルを低下させるか、そのホルモンの効果をブロックするために、特定の癌（例えば、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、または子宮頚癌）において使用され得る。この処置は、しばしば、処置の選択肢として少なくとも１つの他の癌治療と組み合わせて使用されるか、または転移の危険性を減少させるために使用される。
【０１９０】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。以下の実施例に開示される技術が、本発明の実施において良好に機能する本発明者らによって見出された技術を表し、したがってその実施の好ましい様式を構成すると見なされ得ることは、当業者によって認識されるべきである。しかし、当業者は、本開示に鑑みて、多くの変更が開示されかつ本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を依然として得る特定の実施形態においてなされ得ることを認識するべきである。
【実施例】
【０１９１】
（実施例１）
ＦＵＳ１は、多くのヒトの癌において頻繁に変化または欠失し、かつＡｐａｆ１が関連したアポトーシス経路における重要なメディエーターとして機能することが示されている、ヒト染色体３ｐ２１．３領域において同定された新規の腫瘍抑制遺伝子（ＴＳＧ）であり、そしてＦＵＳ１は、インビトロおよびインビボでの強力な腫瘍抑制因子である。ＦＵＳ１タンパク質の発現の損失および翻訳後修飾の欠損は、大部分のＮＳＣＬＣおよびほぼ全てのＳＣＬＣにおいて見出されている。アデノウイルスベクター媒介性またはＤＯＴＡＰ：コレステロールナノ粒子媒介性の遺伝子導入による３ｐ２１．３欠損ヒト肺癌細胞におけるｗｔ−ＦＵＳ１機能の回復は、インビトロおよびインビボでのアポトーシスの誘導および細胞動態の変化によってこれらの腫瘍細胞の増殖を阻害する。この研究において、本発明者らは、Ｆｕｓ１タンパク質のコンピュータ支援構造分析を使用し、そしてＦｕｓ１タンパク質配列においていくつかの可能性のあるＰＫＣ活性化／相互作用部位およびＡキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）相互作用モチーフを見出した。機能性ドメインの予測に基づいて、本発明者らは、ｗｔ−Ｆｕｓ１タンパク質配列に直接由来するペプチドの群を開発した、そのペプチドの群は、ｗｔ−Ｆｕｓ１アミノ酸配列（ｗｔ−ＦＰ）または機能的変異（ｍｔ−ＦＰ）を含むペプチドを含む。変異体Ｆｕｓ１タンパク質の１つにおいて欠失した領域由来のｗｔ−ＦＰは、いくつかの肺癌細胞株において検出され、そして可能性のあるＡＫＡＰシグナリング／相互作用配列モチーフの研究を含む。生体機能に重要な疎水性の微小環境を変化させるようにいくつかの高度に疎水性のアミノ酸残基が親水性残基によって置換される機能障害性ｍｔ−ＦＰを、ｗｔ−ＦＰ活性に対する制御として使用されるように設計する。１８−Ｃステアレート飽和脂肪酸鎖を、各ペプチドのＮ末端に付加して、それを細胞透過性にし、そしてまた正常細胞において見出された元のミリストイル化ｗｔ−ＦＵＳ１タンパク質の機能的完全性を維持した。
【０１９２】
本発明者らは、ｗｔ−ＦＰインビトロの生物学的機能を評価し、そしてステアレート−ｗｔ−ＦＰ（ｓｔ−ｗｔ−ＦＰ）が、強力なタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）インヒビターとして機能し、ＮＳＣＬＣ細胞およびＳＣＬＣ細胞において数種の重要な発癌性ＰＴＫ（例えば、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−Ｋｉｔ、ｃ−Ａｂｌ、Ｅｒｋ）の活性に対して阻害効果を示したことを見出した。腫瘍細胞増殖の顕著な阻害およびアポトーシスの誘導もまた、同じ濃度でコントロールペプチドによって処理したものと比較して、ｓｔ−ｗｔ−ＦＰによって処理した種々の肺癌細胞において観察され、ＩＣ５０値は、５〜２０μＭの範囲であった。本発明者らは、化学療法抵抗性を克服するために、ＰＴＫインヒビター（例えば、ゲフィチニブおよびＧｌｅｅｖｅｃ）の化学療法剤の能力を増強するための調節因子としてのｗｔ−ＦＰの使用を、それぞれ、ゲフィチニブ感受性およびゲフィチニブ抵抗性ならびにＧｌｅｅｖｅｃ感受性およびＧｌｅｅｖｅｃ抵抗性のＮＳＣＬＣ細胞およびＳＣＬＣ細胞の両方において探索した。本発明者らは、ｗｔ−ＦＵＳ１の処置がゲフィチニブまたはＧｌｅｅｖｅｃによる処理に対する応答を著しく感作し得ることを見出した。有意な増殖阻害およびアポトーシスが、ｗｔ−ＦＰによって処理したＳＣＬＣ細胞において観察された。増強した増殖阻害を、いずれかの薬剤単独によって処理したものと比較して、ｗｔ−ＦＰとｇｌｅｅｖｅｃとの組み合わせによって処理したｇｌｅｅｖｅｃ抵抗性のＨ６９Ｒ細胞およびＮ４１７細胞において検出した。リン酸化ｃ−Ａｂｌタンパク質およびリン酸化ｃ−Ｋｉｔタンパク質の活性は、免疫沈降したホスホ−ｃ−Ａｂｌタンパク質またはホスホ−ｃ−Ｋｉｔタンパク質を使用した免疫ブロット分析および活性アッセイの両方によって示される通り、ｗｔ−ＦＰ単独またはｇｌｅｅｖｅｃとの組み合わせによって処理したＳＣＬＣ細胞において有意に阻害された。
【０１９３】
本発明者らはまた、治療用ペプチドのインビトロおよびインビボでの送達のために、ＦＰおよび他の非特異的コントロールペプチド（ＮＳＰ）と、ＤＯＴＡＰまたはＤＯＴＡＰ：コレステロールナノ粒子との複合体形成によるＦＰ−ナノ粒子の調製のための方法およびプロトコルを開発した。上記ペプチドの細胞内取り込みは、蛍光標識したペプチドを使用した蛍光画像化分析によって決定したところ、複合体形成していないペプチドによって処理したものと比較して、ＦＰ−ナノ粒子によって処理した細胞において劇的に増大する。アポトーシスの有意な誘導はまたは、処理しなかったか、あるいは複合体形成していないｗｔ−ＦＰコントロール、ＮＳＰコントロールまたはＮＳＰ−ナノ粒子コントロールによって処理したものと比較して、ｗｔ−ＦＰ−ナノ粒子によって処理したＮＳＣＬＣ細胞において観察される。
【０１９４】
この結果は、インビトロおよびインビボにおけるＮＳＣＬおよびＳＣＬＣに対するＦＰ−ナノ粒子の治療効力を示し、そして肺癌および他のヒト癌の効率的な処置のための、ＦＰ−ナノ粒子単独または他の化学療法剤との組み合わせの全身投与を使用する並進適用（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を示唆する。
【０１９５】
（結果）
（１．ＦＵＳ１ペプチドの設計および合成）
Ｆｕｓ１タンパク質のコンピュータ支援構造分析は、Ｆｕｓ１タンパク質配列において、図１に示したようないくつかの可能性のあるＰＫＣ活性化／相互作用部位およびＡキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）相互作用モチーフを示す。この分析を、Ｓｃａｎｓｉｔｅプログラム（Ｏｂｅｎａｕｅｒら、２００３）および（ｓｃａｎｓｉｔｅ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）およびＥｘＰＡＳｙ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｓｅｒｖｅｒ（ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）において利用可能な他の配列分析プログラムを使用して行なった。これらの機能性ドメインの予測に基づいて、本発明者らは、ｗｔ−Ｆｕｓ１タンパク質配列からペプチドの群を直接調製し、、そのペプチドの群は、ｗｔ−Ｆｕｓ１アミノ酸配列（ｗｔ−ＦＰ）または機能的変異（ｍｔ−ＦＰ）を含むペプチドを含んだ。１８−Ｃステアレート飽和脂肪酸鎖を、各ペプチドのＮ末端に付加して、それを細胞透過性にし、また正常細胞において見出された元のミリストイル化（１４−Ｃ飽和脂肪酸）ｗｔ−ＦＵＳ１タンパク質の機能的完全性を維持した。上記ステアレート側鎖はまた、ミリステートがｗｔ−ＦＵＳ１腫瘍抑制活性が対するように、チロシンキナーゼ活性の阻害におけるその生物学的活性に必須である。
【０１９６】
ＦＵＳ１ペプチド（「ＦＰ」）を、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｃｏｒｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒにより、支持体としてＣＬＥＡＲ樹脂、およびカップリング試薬としてＨＢＴＵ−ＨＯＢＴを使用してＲａｉｎｉｎ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙ  Ｑｕａｒｔｅｔ自動化ペプチド合成機において合成した。各カップリング工程は、３時間にわたり、そしてそのカップリング工程を、５倍過剰の試薬を用いて２回繰り返した。切断を、ＣＦ３ＣＯ２Ｈ−アニソールと水（９５％−２．５％−２．５％）とのカクテルを使用して３時間行なった。その粗ペプチドを、４０分間にわたって水中の０〜７０％アセトニトリルの線形勾配を使用してＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。各溶媒は、０．１％トリフルオロ酢酸を含んだ。
【０１９７】
ステアリン酸との結合体化を、５倍過剰の試薬を用いて、上記アミノ酸カップリングと同一の手順を使用して行なった。撹拌器を、試薬の良好な混合のために使用した。切断条件は、ＦＰに対するものと同一であった。粗ステアレート−ＦＰを、Ｖｙｄａｃ半分取（ｓｅｍｉｐｒｅｐａｒａｔｏｒｙ）ジフェニルカラム（ＲＰ  ２１９ＴＰ５１０）を使用してＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【０１９８】
本発明者らは、変異体Ｆｕｓ１タンパク質の１つにおいて欠失した領域由来のｗｔ−ＦＰがいくつかの肺癌細胞株において検出され、そして可能性のあるプロテインキナーゼ（ＰＫＡ、ＰＫＣ、およびタンパク質チロシンキナーゼ）シグナリング／相互作用配列モチーフを含むことを見出した。生体機能に重要な疎水性の微小環境を変化させるようにいくつかの高度に疎水性のアミノ酸残基が親水性残基によって置換される機能障害性ｍｔ−ＦＰを、ｗｔ−ＦＰ活性（図２）に対する制御として使用されるように設計するが、しかし、これらのペプチドは、ほぼ非荷電であり、生理条件下において同様の溶解性および利用性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）であると考えられ得る（図３）。１８−Ｃステアレート飽和脂肪酸鎖を、各ペプチドのＮ末端に付加して、それを細胞透過性にし、そしてまた正常細胞において見出された元のミリストイル化（１４−Ｃ飽和脂肪酸）ｗｔ−ＦＵＳ１タンパク質（図１）の機能的完全性を維持した。プロテインキナーゼ活性に対して効果を示さない非特異的コントロールペプチド（ＮＳＰ）をまた合成し、そしてコントロールとして使用した（図１、ＡＫＡＰ−ＮＳＰ）。上記ミリステート−ペプチドは、上記ステアレート−ペプチドとの比較のために合成されたものである。
【０１９９】
（２．ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ複合体化ＦＵＳ１ペプチドナノ粒子の合成および調製）
ＤＯＴＡＰ：コレステロール（「ＤＣ」）ナノ粒子（５０〜１００ｎｍの大きさ）を、記載される通りに合成した（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ、１９９７）。簡単にいうと、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールを、クロロホルム中で１：１の比（２０μＭのＤＯＴＡＰおよび２０μＭのコレステロール）で混合し、そして氷冷したロータリーエバポレーターにおいてエバポレートする。得られた混合物を、５５℃における超音波処理を加えた５％デキストロースに再懸濁し、そして凍結乾燥する。凍結乾燥された生成物を、５％デキストロースに溶解し、そして漸減する大きさ（１．０μｍ、０．４５μｍ、０．２μｍ、および０．１μｍ）の小型押し出し機（Ａｖａｎｔｉ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌ）を通して押し出して５０〜１００ｎｍの平均粒径を与える。コレステロールを伴わないＤＯＴＡＰを、インビトロでトランスフェクション剤として使用するために同様に調製する。なぜならば、ＤＣによって媒介されるトランスフェクションが、インビトロで効率的ではなく、そしてＤＯＴＡＰが、インビトロのトランスフェクションに最も適していたことが周知であったからである。その合成したナノ粒子を、４℃にて保存し、そしてその合成したナノ粒子を、ＤＮＡナノ複合体を調製するために使用する。
【０２００】
ＤＣ−ＤＮＡナノ粒子：遺伝子発現プラスミドＤＮＡを含むナノ複合体を調製するために、１５０μｇのプラスミドＤＮＡを、３００μｌの容量で２０ｍＭ  ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌナノ粒子と混合して、１５０μｇのＤＮＡおよび４ｍＭのナノ粒子の最終濃度を得る。上記ＤＮＡ−ナノ複合体の平均粒径は、Ｎ４粒径分析器（Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）を使用して決定したところ３００ｎｍと３２５ｎｍとの範囲であり、＋４５ｍＶの正電荷を有した。
【０２０１】
ＤＣ−ペプチドナノ粒子：ペプチド−ナノ粒子を調製するために、２０μｇのペプチドを、水中の１００μｌのＤ５Ｗに希釈し、そして等量の希釈したＤＯＴＡＰ：コレステロール（ＤＣ）またはＤＯＴＡＰ（Ｄ）（２０ｍＭのＤＣまたはＤの４０μｌを、Ｄ５Ｗにおいて１００μｌの総容量に希釈する）と穏やかに混合され、これらは、１００ｍｇ／ｍＬのペプチドおよび４ｍＭのＤＣまたはＤの最終濃度を与える。その処方物は、ＤＣまたはＤに対するペプチドの割当の変動によって最適化される。ペプチド−ナノ粒子の構造を、図４および図５に示す。得られたペプチド−ナノ粒子は、１００〜２００ｎｍの間の平均サイズおよび＋５０ｍＶの正電荷を有し、それらは、それぞれ、Ｎ４  Ｐｌｕｓ  Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  ＳｉｚｅｒのＮ４粒径分析器およびＤｅｌｓａ  ４４０ＳＸ  Ｚｅｔａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって決定される。
【０２０２】
蛍光色素によるペプチドの標識化：タンパク質−蛍光標識化キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を使用して、造業者の指示書に従ってＡｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５（Ｃｙ３−ＮＨＳエステル、橙赤色）蛍光色素によってペプチドを標識した。Ｃｙ３標識されたペプチドは、インビトロおよびインビボでの蛍光画像化分析によってペプチド−ナノ粒子の細胞内取り込みおよび生体分布をモニタリングするために使用する。簡単にいうと、約５００ｍｇのペプチドを、１００ｍｌの０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８．３）緩衝液に溶解した（５ｍｇペプチド／ｍｌの最終濃度）。Ｃｙ３−スクシニミジルエステル（Ｃｙ３−ＮＨＳ）をＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度で溶解する。１００ｍｌのペプチド溶液を１０ｍｌのＣｙ３−ＮＨＳ溶液と混合し、そしてその混合物を、室温にて１時間（または４℃にて一晩）回転させながらインキュベートする。結合体化した生成物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを通して流すことによって精製し、そして標識化の効率を、２８０ｎｍおよび５５５ｎｍにてＯＤを測定することによって決定し、製造業者によって記載された方程式を使用して計算した。
【０２０３】
ペプチドと超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）ナノ粒子との結合体化：本発明者らはまた、ＮＨＳエステル−アミン反応を使用して上記ペプチドをデキストランコートしたＳＰＩＯナノ粒子（ＳＰ）に直接結合体化し、次いでそのＳＰ−ナノ粒子を、ＤＣを用いて封入した。
【０２０４】
ＦＰ−ヒドラゾン誘導体の合成：ＦＰのＣ末端におけるカルボン酸基を、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によって活性化し、次いで公開された方法に従って３−（２−ピリジニルジチオ）プロパン酸ヒドラジド（ＰＰＡ）（ＰｒｏＣｈｅｍ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）と３日間反応させて＞９０％の収率でＦＰ−ヒドラゾン誘導体生成物を得た。反応の進行を、Ｚｏｒｂａｘ  Ｒｘ  Ｃ１８カラム（２５ｃｍ×４．６ｍｍ）、ＣＨ３ＯＨ−Ｈ２Ｏ（７：３）（ｐＨ４．７）中の１０ｍＭ（ＮＨ４）（Ｈ２ＰＯ４）の均一濃度勾配、および１ｍｌ／分の流速を使用してＨＰＬＣによって追跡する。ＦＰ-ヒドラゾン、遊離のＦＰおよびヒドラジドを、ＵＶ（２８０ｎｍ）によって検出する。Ａｌｄｒｉｃｈ。
【０２０５】
ＦＰとＳＰＩＯとの結合体化：ＦＰを、ヘテロ二官能性リンカーを使用して２工程の手順によってＦＰに結合体化する。第１に、市販の調製されたデキストランコートしたＳＰＩＯ粒子Ｆｅｒｉｄｅｘ  Ｉ．Ｖ．またはＣｏｍｂｉｄｅｘ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）あるいはＥｎｄｏｒｅｍ（Ｇｕｅｒｂｅｔ、Ａｕｌｎａｙｓｏｕｓ−Ｂｏｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を、エピクロロヒドリンを用いて架橋することによって誘導体化し得、次いでアンモニアと反応させてデキストランコーティング上にアミノ基を生成し、次いでＳＭＣＣによって改変してマレイミド部分を提供する（ＳＰＩＯ−ＳＭＣＣ）。第２に、ＦＰ誘導体を、ＳＰＩＯ−ＳＭＣＣの上記マレイミド基と、ＴＣＥＰによるそのジスルフィドの還元後に得られるＦＰ誘導体のチオール基との反応によってＳＰＩＯ-ＳＭＣＣに結合体化する。得られたＦＰ−ＳＰＩＯ結合体化の割合を、ＵＶ-可視分光測光法によって決定し、そしてそのＦＰ−ＳＰＩＯ結合体を、Ｇ−２５ゲル濾過カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製する。精製した結合体を、濃縮し、そしてさらに使用するまで−２０℃に保存する。薬物誘導体を、同様の化学によってＳＰＩＯに結合体化する。ＳＰＩＯの蛍光標識化のために、上記ＳＰＩＯデキストラン誘導体の第１級アミンを、種々の金属イオンに対する高親和性結合部位を導入するためにＤＴＰＡイソシアネートキレーター（Ｉ−２４２２１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）とカップリングし、次いでＦｌｕｏ−３カリウム（橙赤色）（Ｆ−３７１５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）によって標識する。蛍光標識したＦＰ−ＳＰＩＯナノ粒子を、共焦点蛍光画像化法またはＦＡＣＳ分析によってインビトロおよびインビボで細胞内取り込み、細胞内輸送、および生体分布をモニタリングするために使用し得る。
【０２０６】
ＤＣ−ＳＰ−ナノ粒子（ＤＣ−ＳＰＮ）を、治療用ペプチドの全身送達、およびインビボでＭＲ造影剤としてＳＰＩＯを用いるＭＲによる非侵襲性の画像化のために使用する（図５）。
【０２０７】
（３．ＮＳＣＬＣ細胞およびＳＣＬＣ細胞におけるＦｕｓ１由来ペプチドおよびＧｌｅｅｖｅｃによる腫瘍細胞増殖の阻害）
細胞株。本発明者らは、ＣＤＤＰ、Ｔａｘｏｌ、Ｇｅｍｃｉｔａｂｌｉｎｅ、ゲフィチニブ、Ｇｌｅｅｖｅｃ、および他のＰＴＫインヒビターなどの種々の化学療法薬に対して種々の感受性を有するＮＳＣＬＮ細胞株およびＳＣＬＣ細胞株の収集物を有する。これらの細胞株は、天然の薬物感受性または薬物抵抗性を臨床的に生じたか、または感受性の親株から特定の薬物に対して選択することによって確立されたかのいずれかであった。各薬物に対するＩＣ５０値、重要なＴＳＧ（例えば、３ｐ２１．３遺伝子およびｐ５３）および発癌性ＰＴＫ（例えば、ＥＧＦＲ）の遺伝的状態および発現状態、ならびにこれらの細胞株におけるインビボ（マウス）での腫瘍形成能などの特徴を、決定した。ＦＵＳ１またはＦＰと、ゲフィチニブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）を含むＰＴＫインヒビターとの組み合わせた効果を、腫瘍細胞増殖およびアポトーシスにおけるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔの阻害のためのＥＧＦＲおよびＬＹ２９４００２（ＣｏｍＣｈｅｍ）のブロックについて評価するために、４種のヒトゲフィチニブ抵抗性ＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ１２９９、Ｈ４６０、Ｈ３５８、およびＡ５４９、ならびに２種のゲフィチニブ感受性ＮＳＣＬＣ株ＨＣＣ８２７（ＥＧＦＲの機能獲得型変異を有する）およびＨ１８１７（ＥＧＦＲの活性化増幅を有する）を、インビトロで使用する。ヒトＳＣＬＣ細胞株のｇｌｅｅｖｅｃ感受性であるＨ６９およびＨ１２８、ならびにｇｌｅｅｖｅｃ抵抗性のＨ６９ＲおよびＮ４１７を、Ｆｕｓ１ペプチド、ＦＰ−ナノ粒子単独またはｇｌｅｅｖｅｃと他の低分子化学療法薬との組み合わせによる処理を評価するために使用する。
【０２０８】
ｗｔ−ＦＰを用いた処理による腫瘍細胞増殖の阻害。ｗｔ−ＦＰの生物学的活性を評価するために、本発明者らは、ステアレート−ｗｔ−ＦＰの直接適用による腫瘍細胞増殖に対するｗｔ−ＦＰの効果を、ＸＴＴアッセイによって分析した。本発明者らは、機能的変異体Ｆｕｓ１ペプチドｍｔ−ＦＰ２およびｍｔ−ＦＰ５、ならびに非特異的コントロールペプチド（ＮＳＰ）（図６）によって処理した細胞と比較して、ｗｔ−ＦＰがＮＳＣＬＣ  Ｈ１２９９細胞およびＮＳＣＬＣ  Ａ５４９細胞の増殖に対して有意な阻害効果を示したこと見出した（図６）。本発明者らはまた、ＮＳＣＬＣ  Ｈ１２９９細胞（ＩＣ５０＝１２．７μＭ）およびＮＳＣＬＣ  Ａ５４９細胞（ＩＣ５０＝６．９μＭ）ならびに増殖因子の補充を伴わずに増殖し得る正常な気管支上皮ＣＣＤ１６細胞（ＩＣ５０＝６０μＭ）におけるｓｔ−ｗｔ−ＦＰのＩＣ５０値を決定した（図７）。有意な細胞傷害性は、全ての他のＮＳＣＬＣ細胞に対するＩＣ８０用量におけるｓｔ−ｗｔ−ＦＰによって処理した正常細胞において観察されず、これは、治療用ＦＰの腫瘍細胞選択性を示唆した。同様に、腫瘍細胞増殖に対する顕著な阻害（図８Ａおよび８Ｂ）およびアポトーシスの増強した誘導（図８Ｃおよび８Ｄ）が、ｍｔ−ＦＰ処理した細胞または処理していない細胞コントロールのいずれかと比較して、ｗｔ−ＦＰ処理したＳＣＬＣ  Ｈ１２８細胞（図８Ａおよび８Ｃ）およびｗｔ−ＦＰ処理したＳＣＬＣ  Ｈ１４６細胞（図８Ｂおよび８Ｄ）において観察された。これらの予備的結果は、ｗｔ−ＦＰを肺癌に対する抗腫瘍治療剤として使用することの可能性を示す。
【０２０９】
ｗｔ−ＦＰと低分子薬物ＰＴＫインヒビターとの併用処理による腫瘍細胞増殖に対する増強した阻害効果。ＦＵＳ１−ナノ粒子またはＦｕｓ１−ペプチドにＰＴＫインヒビターを加えた種々の組み合わせによる併用効果を、本発明者らの研究室において開発されたアイソボログラムモデリングおよび統計学的方法を使用して、インビトロで定量的かつ統計的に分析した。Ｆｕｓ１とＰＴＫインヒビターとの間の相互作用は、相乗作用、相加作用、および拮抗作用に関して特徴付けられ得る。上記細胞を、最大のトランスフェクション効率と仮定して固定した用量におけるｈＴＭＣ−ＦＵＳ１−ナノ粒子を用いてトランスフェクトし得るか、または種々の濃度のＦＰによって処理し、そして種々の用量のＰＴＫインヒビターと合わせ得る。細胞増殖に対する効果を、所定の時点にてＸＴＴアッセイによって決定した。組み合わせた治療剤の腫瘍細胞増殖に対する効果を、観察された実験データを対応するアイソボログラムに対してプロットすることによって定量的かつ統計的に分析した。Ｗｉｌｃｏｘｏｎの符号付き検定を、観察されたデータの平均値を相加性について予測された最小値または最大値と比較して行った。観察されたデータの平均値が予想された最大値と等しいかまたはそれより小さいが、予想された最小値と等しいかまたはそれより大きい場合、組み合わせの効果を、相加的と見なした。観察されたデータの平均値が予想された最大値より小さい場合、組み合わせの効果を、相乗的と見なし；予想された最大値より大きい場合、拮抗的と見なし、Ｐ＃０．０５を、有意と見なした。全ての統計分析を、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａソフトウェア（ＳｔａｔＳｏｆｔ  Ｉｎｃ．、Ｔｕｌｓａ、Ｏｋｌａｈｏｍａ）を使用して行った。これらのインビトロ実験からの知見は、本発明者らに、ＦＵＳ１とＰＴＫインヒビターとの併用処理によって与えられた相乗効果の統計的に検定した定量的確認を提供し、そして本発明者らの前臨床試験および臨床試験において併用処理の設計を誘導するためにデータベースとして機能する。
【０２１０】
ｗｔ−ＦＵＳ１遺伝子産物またはｗｔ−ＦＵＳ１由来のＦＵＳ１ペプチドの、化学療法剤の効力を増強し、そして肺癌細胞における薬物抵抗性を克服するための化学療法薬の調節因子としての可能性を探索するために、本発明者らは、ゲフィチニブ感受性ＮＳＣＬＣ細胞およびゲフィチニブ抵抗性ＮＳＣＬＣ細胞において腫瘍細胞増殖に対するｗｔ−ＦＰ＋ゲフィチニブによる併用処理の効果を評価した。本発明者らは、３ｐ欠損でありかつゲフィチニブ抵抗性のＮＳＣＬＣ  Ｈ１２９９細胞、Ｈ３５８細胞、およびＨ４６０細胞におけるｗｔ−ＦＰの再活性化がゲフィチニブ処理に対するこれらの細胞の応答を有意に感作したことを見出し、これは、腫瘍細胞増殖に対する相加的な阻害効果よりも大きいことを示した（図９Ａ）。ＥＧＦＲ発現に対する顕著な阻害はまた、ウェスタンブロット分析によって示されるように、ｗｔ−ＦＰおよびゲフィチニブによって同時処理したＨ３２２細胞およびＨ４６０細胞において検出された（図９Ｂ）。これらの予備的結果は、ｗｔ−ＦＰが化学療法剤（例えば、ＤＮＡ損傷性薬剤シスプラチンおよびＰＴＫ  ＥＧＦＲインヒビターゲフィチニブ）に対する腫瘍細胞の感受性の調節において中心的な役割を果たし得ることおよびＦＵＳ１−ナノ粒子媒介性の分子的治療とこれらの低分子化学療法剤との併用処置が肺癌に対する効率的な処置ストラテジーであり得ることを示唆する。
【０２１１】
さらに、本発明者らはまた、単独の処理あるいは非特異的ペプチド（ＮＳＰ）またはｍｔ−ＦＰコントロール（図１０）との組み合わせのいずれかと比較して、それぞれ、ｗｔ−ＦＰによって４８時間および９６時間にわたって同時処理した場合に、ＳＣＬＣのＧｌｅｅｖｅｃ感受性Ｈ６９−Ｓ細胞（図１０）およびＧｌｅｅｖｅｃ抵抗性Ｈ６９−Ｒ細胞（図１０）のＧｌｅｅｖｅｃによる処理に対する増強した感受性を検出した。これらの予備的知見は、Ｆｕｓ１腫瘍抑制タンパク質の活性の１つがＰＴＫ機能を妨害するものであり得ることを示唆する。ＰＴＫインヒビターＧｌｅｖｅｅｃにＦＵＳ１−ナノ粒子またはＦｕｓ１由来ペプチドを加えた併用処理は、肺癌においてＧｌｅｖｅｅｃの抗癌効力を増強し、そしてＧｌｅｖｅｅｃ抵抗性を克服するための有用なストラテジーであり得る。
【０２１２】
（４．ＮＳＣＬＣ細胞およびＳＣＬＣ細胞におけるＦｕｓ１−ペプチドによるＰＴＫ活性の阻害）
タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、細胞増殖、分化、代謝およびアポトーシスを制御するシグナル伝達経路において中心的な役割を果たす。ＰＴＫによるタンパク質のリン酸化は、これらの生物学的機構の調節に必須であり、そしてこれらの経路における欠損は、多くのヒトの疾患（癌を含む）をもたらし得る。細胞の調節におけるこれらの酵素の重要な局面は、多数のキナーゼに対して、対応するウイルスオンコジーン産物が同定されているという事実によって強調される。タンパク質チロシンキナーゼ活性は、しばしば、膜レセプタータンパク質チロシンキナーゼ（例えば、ＥＧＦ−、ＰＤＧＦ−、ＣＦＳ−、ＩＧＦ−１またはインスリンレセプター）および可溶性非レセプターチロシンキナーゼ（例えば、ｐ６０ｃ−Ｓｒｃ、ｙｅｓ、ｌｃｋ、ｌｙｎ、ｆｙｎ）と関連する。ＰＴＫ活性をアッセイすることは、タンパク質チロシンキナーゼの特徴付け、それらの生物学的機能の解明および特定のＰＴＫインヒビターの開発における支援を可能にする。
【０２１３】
本発明者らは、製造業者の指示書に従ってＴｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙキット（ＣＨＥＭＩＣＯＮ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）を使用して、ＦＰ処理したＮＳＣＬＣ  Ｈ１２９９細胞およびＦＰ処理したＮＳＣＬＣ  Ａ５４９細胞におけるｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ活性を分析した。簡単にいうと、１×１０７個のＮＳＣＬＣ  Ｈ１２９９細胞またはＮＳＣＬＣ  Ａ５４９細胞を、５μＭのｗｔ−ＦＰまたはｍｕｔ−ＦＰによって６時間処理したか、または１０μｇのｗｔ−ＦＵＳ１発現プラスミドＤＮＡ−ＤＯＴＡＰナノ粒子によって２４時間トランスフェクトした。細胞溶解物を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、１％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０、０．１％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ、および完全プロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）を含むＲＩＰＡ緩衝液中で調製した。１ｍｇのタンパク質溶解物を、マウス抗ｃ−Ａｂｌ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）タンパク質との免疫沈降（ＩＰ）を行うために使用した。免疫沈降した複合体を、５ｍＭ  ＡＴＰ、ＴＢＳ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）（ｐＨ７．２）中の５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１％のチメロサール、および完全プロテアーゼインヒビターを含む５０μｌのＰＴＫアッセイ緩衝液に再懸濁した。ｃ−Ａｂｌ  ＩＰ複合体を、次いで、複数のチロシン残基を含み、そして広範なＰＴＫによってリン酸化され得る合成ビオチン化基質（ポリ［Ｇｌｕ：Ｔｙｒ、４：１］）と一緒に３０℃にて４５分間インキュベートした。その反応を、５００ｍＭ  ＥＤＴＡの添加によって停止させた。上記リン酸化基質および脱リン酸化基質を、ストレプトアビジンでコートしたプレートに対する結合によって固定化する。リン酸化基質の分画を、ＨＲＰに結合体化したホスホチロシンモノクローナル抗体を使用し、次いで発色基質反応を行うことによって可視化した。チロシンキナーゼ基質に組み込まれたリン酸の量を、ホスホペプチド検量線を利用して決定した。ｃ−Ａｂｌ活性の顕著な阻害が、処理しなかったコントロールまたはｍｕｔ−ＦＰまたはＧｌｅｅｖｅｃによって処理した細胞と比較して、ｗｔ−ＦＰを用いた処理によってか、またはｗｔ−ＦＵＳ１−ナノ粒子によってトランスフェクトしたＡ５４９細胞（活性化（リン酸化）ｃ−Ａｂｌタンパク質の高レベルの発現（データ示さず）を示した）において検出された（図１１）。ｃ−Ａｂｌタンパク質の活性はまた、Ａ５４９細胞よりも低いレベルのｃ−Ａｂｌタンパク質の発現を有するＨ１２９９におけるｗｔ−ＦＰを用いた処理によって阻害された。
【０２１４】
同様に、本発明者らはまた、ＳＣＬＣ  Ｎ４１７においてモノクローナル抗ホスホ−ａｂｌ（Ｔｙｒ−３２３−ｐ）抗体を使用した最適なチロシンキナーゼペプチド基質のチロシンリン酸化によって測定したところ、ｗｔ−ＦＰペプチドによる処理およびｗｔ−Ｆｕｓ１タンパク質の外来発現による処理の両方がｃ−ａｂｌチロシンキナーゼ活性を強力に阻害したことを観察した（図１２）。さらに、ｃ−ａｂｌおよびｃ−ｋｉｔを含む数種のＰＴＫの活性に対するｗｔ−ＦＰの阻害効果をまた、抗ｃ−ａｂｌ抗体または抗ｃ−ｋｉｔ抗体との免疫沈降（ＩＰ）および抗ホスホ−Ｔｙｒ（ｐＹ２０）抗体による免疫ブロット（ＩＢ）を使用した分析によって示される通り、ｗｔ−ＦＰ単独またはＧｌｅｅｖｅｃとの組み合わせ（ｗｔ−ＦＰ＋Ｇ）のいずれかによって４８時間処理したＳＣＬＣ  Ｎ４１７細胞およびＳＣＬＣ  Ｈ６９細胞において検出した。
【０２１５】
さらに、リン酸化したＥＧＦＲタンパク質、ＥＲＫタンパク質およびＡｋｔタンパク質の顕著な阻害をまた、ホスホ−ＥＧＦＲ特異的抗体、ホスホ−ＥＲＫ特異的抗体またはホスホ−Ａｋｔ特異的抗体を用いたウェスタンブロット分析によって示される通り、ゲフィチニブ感受性のＮＣＣ８２７細胞およびＨ１８１９細胞の両方において、ＦＵＳ１−ナノ粒子またはｗｔ−ＦＰ単独あるいはゲフィチニブとの組み合わせによって処理した細胞において検出した。しかし、全ＰＴＫタンパク質のレベルに対する効果は、検出されず、これは、ＦＰが活性化した発癌性ＴＰＫを特異的に阻害し、ＥＧＦＲの変異または異常な増幅に起因して高度に活性化したＰＴＫ活性を伴う腫瘍細胞増殖の阻害およびこれらの細胞におけるアポトーシスをもたらすことを示唆した。
【０２１６】
（５．インビトロでのペプチド−ナノ粒子の増強した細胞内取り込み）
本発明者らは、ＮＳＣＬＣ  ｈ１２９９細胞においてＣｙ３−ｆｌｕｏｒ標識したペプチドを使用した蛍光画像化分析によって、複合体形成していないペプチドの細胞内取り込みをペプチド−ナノ粒子の細胞内取り込みと比較した。弱い細胞取り込み（かすかな蛍光）は、ｓｔ−Ｐ処理した細胞において観察されたが、非ステアレートペプチド処理した細胞において観察されなかった。劇的に増強した細胞内取り込みが、同じ濃度のペプチドにおける複合体形成していないペプチドによって処理した細胞と比較して、ペプチド−ナノ粒子で処理した細胞およびステアレート−ペプチド（ｓｔ−ｐ）−ナノ粒子で処理した細胞の両方において観察され、これは、高い効率の細胞取り込みがペプチド−ナノ粒子によって媒介されたことを示した。
【０２１７】
（６．Ｈ１２９９細胞におけるＦＰ−ナノ粒子を用いた処理による腫瘍細胞増殖の阻害）
本発明者らはＦｕｓ１ペプチド（ＦＰ）−ナノ粒子を使用して、ＮＳＣＬＣ  Ｈ１２９９細胞における腫瘍細胞増殖に対するその効果を評価した。腫瘍細胞増殖の有意な阻害が、コントロールによって処理した細胞と比較して、ＦＰ−ナノ粒子で処理した細胞において観察された。腫瘍細胞増殖の有意に増強した阻害をまた、より低い用量のペプチド（ＦＰのＩＣ２０レベル）におけるＦＰによって処理した細胞と比較して、ＦＰ−ナノ粒子で処理した細胞において検出した。
【０２１８】
（７．インビトロでのＦＰ−ナノ粒子を用いた処理によるアポトーシスの誘導）
本発明者らは、ＴＵＮＥＬ反応によるインサイチュアポトーシス分析を使用した蛍光画像化およびＦＡＣＳ分析によって、Ｈ１２９９細胞においてＦＰ単独またはＦＰ−ナノ粒子のいずれかを用いた処理によるアポトーシスの誘導を評価した。アポトーシスの有意な誘導を、非特異的コントロールによって処理した細胞およびｍｔ−ＦＰ−ナノ粒子コントロールによって処理した細胞と比較して、ＦＰ−ナノ粒子によって処理した細胞において検出した（図１４）。ＦＰ−ナノ粒子で処理したＨ１２９９細胞におけるアポトーシスの誘導を、インサイチュＴＵＮＥＬ染色（２μＭのペプチド、７２時間）を用いた蛍光画像化分析によって観察した。これらの結果は、インビトロでのＦＰ−ナノ粒子の生物学的有効性を明確に示す。全身投与による細胞内取り込みおよびＦＰ−ナノ粒子の治療効力の評価のための実験を、ヒト腫瘍を有するマウスにおいて行っている。
【０２１９】
（８．ＤＣ−ナノ粒子における治療用遺伝子および治療用ペプチドの封入）
本発明者らは、治療用遺伝子またはレポーター遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡおよびペプチドの両方をＤＣナノ粒子またはＤナノ粒子中に封入して、複数の治療剤を送達するために単一のナノ粒子を使用することの可能性および潜在性を探索した。本発明者らは、ＧＦＰを発現するｐＤＮＡおよびＣｙ３標識したＦＰペプチドの両方を封入した（ＧＦＰ−ＦＰ−ナノ粒子と称する）。ＧＦＰ発現（緑色蛍光）およびペプチド取り込み（橙赤色）の両方を、同じ細胞において同時に検出し得、これは、ＤＮＡおよびペプチドの両方が単一のナノ粒子によって有効に送達されたこと示した。Ｈ１２９９細胞におけるＧＦＰ  ＤＮＡ／ＮＳＰペプチド−ナノ粒子の細胞内取り込みを、２時間および２４時間にて測定した（ＮＳＰ最終濃度＝４μＭ）。
【０２２０】
（実施例２）
ＦＵＳ１は、肺癌に関与する腫瘍抑制遺伝子である。本発明者らは、Ｆｕｓ１ペプチドがインビトロでｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼを阻害することを見出した。興味深いことに、その阻害配列は、いくつかの肺癌細胞株において検出される変異体Ｆｕｓ１タンパク質の１種において欠失した領域に由来した。重要なことに、このペプチドのステアリン酸改変形態は、阻害に必要とされた。このステアリン酸−ｆｕｓ１ペプチドはまた、活性化ｃ−Ａｂｌタンパク質によって腫瘍形成的（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ）に形質転換された線維芽細胞において病巣形成を阻害した。これらの知見は、Ｆｕｓ１腫瘍抑制タンパク質の活性の１つがｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ機能を妨害するものであることを示唆する。
【０２２１】
小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の両方における染色体腕３ｐの一方の対立遺伝子の頻繁な損失は、この染色体領域における腫瘍抑制遺伝子（ＴＳＧ）の存在についての強力な証拠を提供する。これらの候補のＴＳＧのうちの１つであるＦＵＳ１は、あらゆる公知の遺伝子と相同性を示さなかった。それは、肺癌においてごく僅かの変異を有し、そして通常、肺癌においてｍＲＮＡレベルで発現されることが見出された。数種のＮＳＣＬＣは、異常なｍＲＮＡスプライシングによって生じる同じナンセンス変異を有した。この異常性は、ＦＵＳ１のＣ末端近傍に欠けた配列を形成する、これは、野生型タンパク質についての１１０アミノ酸と比較して、８２アミノ酸の切断された予想タンパク質を生じた（Ｋｏｎｄｏら、２００１）。
【０２２２】
ｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼは、全ての組織において一様に発現される。ｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼは、それがレトロウイルスのＧａｇ配列およびＢｃｒ配列に融合する場合、発癌性タンパク質になる（Ｂｅｎ−Ｎｅｒｉａｈら、１９８６）。ｃ−ＡＢＬ遺伝子は、チロシンキナーゼをコードする。ｃ−ＡＢＬ遺伝子の一部は、Ａｂｅｌｓｏｎ白血病ウイルスと称される複製欠損マウスレトロウイルスによって獲得された。正常のｃ−Ａｂｌのチロシンキナーゼ活性は、核（Ｗａｎｇ、２０００）および細胞質（Ｂｕｔｔｕｒｉｎｉら、１９９６）に存在するインヒビターによって高度に調節される。ｃ−Ａｂｌタンパク質は、核および細胞質の両方において見出される。核のｃ−Ａｂｌ機能は、ＤＮＡの損傷に対する応答を含む（Ｗａｎｇ、２０００）。ｃ−Ａｂｌの細胞質の機能は、細胞遊走機能および細胞接着機能を含む。重要なことに、細胞質のｃ−Ａｂｌタンパク質の活性化は、発癌活性をもたらす。例えば、Ｇａｇ−Ａｂｌタンパク質は、Ａｂｅｌｓｏｎ白血病ウイルスに感染したマウスにおいて白血病を引き起こすことに関与する強力な腫瘍性タンパク質である。さらに、Ｂｃｒ−Ａｂｌ腫瘍性タンパク質は、数種のヒト白血病における原因因子である。Ｇａｇ−ＡｂｌおよびＢｃｒ−Ａｂｌの両方は、高レベルのチロシンキナーゼ活性を有する（Ｋｌｏｅｔｚｅｒら、１９８５）。
【０２２３】
しかし、ｃ−ＡＢＬ遺伝子は、他の型の癌に関係していない。興味深いことに、ｃ−Ｃｒｋ（ｃ−Ａｂｌの主要な基質）の過剰発現は、肺腺癌における攻撃的な表現型と関連している（Ｍｉｌｌｅｒら、２００３）。別の研究において、ｃ−Ｃｒｋ−ｌｌの免疫組織化学的分析は、ｃ−Ｃｒｋ−ｌｌのレベルが、肺癌および結腸癌において有意に上昇されたことを示す（Ｎｉｓｈｉｈａｒａら、２００２）。これらの知見は、Ｆｕｓ１（腫瘍抑制タンパク質）がｃ−Ａｂｌをダウンレギュレートし得るという本発明者らの知見に鑑みて興味深い。それとともに、これらの観察は、ｃ−Ａｂｌ経路が特定の肺癌において活性化され得ることを示唆する。
【０２２４】
（方法および結果）
ｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼは、Ｆｕｓ１ペプチドによって阻害される。本発明者らは、Ｆｕｓ１ペプチドを使用し、そして数種のアッセイにおいて、Ｆｕｓ１ペプチドが、最適な基質のチロシンリン酸化によって測定したところ、Ａｂｌチロシンキナーゼ強力に阻害したことを観察した。詳細な分析は、Ｆｕｓ１ペプチドがｃ−Ａｂｌを用量依存様式で阻害したことを示した。ｏｆ市販のＡｂｌによるＣｒｋリン酸化のＦｕｓ−１ペプチド阻害を、観察した；コントロール群は、ペプチド、ＤＭＳＯ、および（ＤＭＳＯ＋ステアリン酸）を含んだ。ＩＣ５０を、３０ｕＭであると推定した。このペプチドは、配列-ステアリン酸−ＫＬＲＲＶＨＫＮＬＩＰＱＧＩＶＫＬＤＨＲ（配列番号１１）を有した。本発明者らは、ステアリン酸部分は阻害に必要とされるが、ステアリン酸自体は阻害効果を有さなかったこと見出した。非ステアレートＦＵＳ１ペプチドは、市販のＡｂｌによるＧｓｔ−Ｃｒｋのリン酸化を阻害しなかった。
【０２２５】
Ｆｕｓ１ペプチドは、ｃ−Ａｂｌによって形質転換されたＲａｔ−１細胞における病巣形成を阻害する。本発明者らは、活性化ｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼによって形質転換したＲａｔ−１細胞を使用して病巣形成に対するこのＦｕｓ１ペプチドの効果を試験した。本発明者らは、ステアリン酸−Ｆｕｓ−１ペプチドが病巣形成をブロックしたこと見出した。ステアリン酸は、効果を有さなかった。興味深いことに、ＡＢＬ形質転換細胞の増殖は、ＦＵＳ１ペプチドによって阻害されず、病巣形成をもたらす発癌活性のみが、阻害された。
【０２２６】
ｃ−Ａｂｌがヒト肺癌細胞株において活性化される形跡。本発明者らは、ＦＵＳ１遺伝子における変化を有する２種の肺癌細胞株を分析し、そしてそれらを活性化ｃ−Ａｂｌの形跡について分析した。この実験において、本発明者らは、ヒトＡｂｌ（ｐ６Ｄ）を検出するモノクローナル抗Ａｂｌ抗体による免疫沈降を行った。このモノクローナル抗体を、アミノ酸５２〜６４を含むヒトＡｂｌペプチドに対して調製した（Ｓｕｎら、２００１）。その免疫複合体を、抗ホスホチロシン抗体、抗Ａｂｌ（８Ｅ９）抗体およびｐ６Ｄ抗体によってブロットした。３２Ｄ  Ｐ２１０を、ポジティブコントロールとして使用し、そしてＣＣＤ１６正常肺線維芽細胞を、ネガティブコントロールとして使用した。ＮＳＣＬＣ細胞のＨ１２９９およびＡ５４９は、活性なｃ−Ａｂｌを示した。この結果は、Ａ５４９細胞株が約１１０ｋＤａの大きさを有する活性化Ａｂｌ関連タンパク質を含んだことを示した。それは、２種の異なる配列特異的ＡＢＬ抗体（抗Ａｂｌ  ８Ｅ９（ＳＨ２ドメインに特異的）およびｐ６Ｄ抗Ａｂｌモノクローナル抗体）を用いたブロッティングによって検出された。興味深いことに、このＡｂｌ関連タンパク質は、真性のｃ−Ａｂｌタンパク質（１４５ｋＤａ）よりも小さい大きさである。重要なことに、このＡｂｌ関連タンパク質は、抗ホスホチロシンによって検出され、このことは、それが活性なキナーゼであり得ることを示した。アミノ末端近傍に配列を含むｃ−Ａｂｌの短縮形態の存在（ｐ６Ｄ抗体による認識）は、それがＣ末端にて切断され得ることを示唆する。これは、インタクトなｃ−ＡｂｌがＣ末端配列によってアクチン線維と結合するので、重要であり得る（Ｗｏｏｄｒｉｎｇら、２００３）。さらに、ｃ−Ａｂｌと結合したアクチン線維は、減少したチロシンキナーゼ活性を有し（Ｗｏｏｄｒｉｎｇら、Ｊ２００３）、これは、アクチン線維の結合がｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼを阻害することを示唆する。したがって、ｃ−ＡｂｌのＣ末端の除去は、ｃ−Ａｂｌを活性化する１つの方法であり得る。
【０２２７】
図２７、図１６、図１７、図１８および図１９は、他の実験の結果を示す。
【０２２８】
ステアリン酸化Ｆｕｓ１ペプチドＫＬＲＲＶＨＫＮＬＩＰＱＧＩＶＫＬＤＨＲ（配列番号１１）による市販のｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼの阻害を示す他の実験において、そのステアリン酸化Ｆｕｓ１ペプチドを、ＳＨ２ドメインおよびＳＨ１ドメインのみを含む切断した市販（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ）のｃＡｂｌチロシンキナーゼ（４５ｋＤ）、ＧＳＴ−ＣＲＫ（Ａｂｌの好ましい基質）および３２Ｐ−ＡＴＰと混合した。３０℃にて３０分間インキュベートした後、サンプルを、２×ＳＤＳサンプル緩衝液と一緒に煮沸し、そして８％  ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上で電気泳動した。そのゲルを、乾燥し、そしてホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）に曝した。レーン１は、０ペプチドコントロールであり、そしてレーン２〜５は、それぞれ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、および４０μＭのペプチドであった。図２０は、上記ペプチドがＧＳＴ−ＣＲＫのｃ−Ａｂｌチロシンリン酸化を阻害することを示す。上記ペプチドによるｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼの濃度依存性の阻害もまた、観察された。０ペプチドコントロール、ＤＭＳＯコントロール、ＤＭＳＯにステアリン酸を加えたコントロール、ならびに２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭおよび５５μＭのペプチドを、評価した。図２１は、上記ペプチドによるｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼの線形阻害を示す。その曲線は、ＧＳＴ−ＣＲＫリン酸化の阻害を示す。図２２は、ＤＭＳＯおよびステアリン酸がｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ活性に影響しないことを示す。
【０２２９】
他の実験において、ヒト肺癌細胞株は、Ａｂｌ関連チロシンリン酸化タンパク質を含むことが示された。Ｒａｔ−１、Ｒａｔ１  ＳＨ２（活性化Ａｂｌチロシンキナーゼ）、Ｈ１２９９（ｐ５３ネガティブ）およびＡ５４９（ｐ５３ポジティブ）ヒト肺癌細胞株を、異なる緩衝液において溶解した。抗Ａｂｌ  Ｐ６Ｄ  モノクローナル抗体を使用して、Ａｂｌタンパク質を免疫沈降させた。プロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを使用して、その免疫複合体を引き出した。タンパク質を、そのビーズから溶出させ、次いでＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上で電気泳動した。ブロッティングおよびブロッキングの後、その膜を、抗Ａｂｌ  ８Ｅ０（抗Ａｂｌ  ＳＨ２ドメイン）抗体によって処理した。活性なＡｂｌを、８Ｅ９抗体、４Ｇ１０抗体およびＰ６Ｄ抗体を使用してＡ５４９細胞において観察した。免疫ブロット法を、抗ホスホチロシン抗体（４Ｇ１０）を用いて行った。膜（８Ｅ９抗体の場合）をストリップし、Ｐ６Ｄ抗Ａｂｌ抗体によって再度プローブした。
【０２３０】
さらなる実験において、ｃ−Ａｂｌによって誘導された病巣形成に対するＦｕｓ１ペプチドの効果を、研究した。Ｒａｔ−１  ＳＨ２細胞を、細胞がコンフルエントになった後、ステアリン酸化Ｆｕｓ１ペプチド（病巣が観察されるまで２日毎に交換した培地を伴う１０μＭ  Ｆｕｓ１ペプチド）によって処理した。Ｒａｔ−１  ＳＨ２細胞は、ＧＦＰをマーカーとして発現する。蛍光写真を、ペプチドによって処理した緑色蛍光を発するＲａｔ−１  ＳＨ２細胞について撮影した。視野の位相差写真を、作成した。処理していないＲａｔ−２  ＳＨ２細胞の蛍光写真を、作成し、そして位相差写真を、作成した。（Ｒａｔ−１  ＳＨ２＋Ｍ７４）および（Ｒａｔ−１  ＳＨ２＋ステアリン酸）を、画像化した。ＤＭＳＯ（０．２％）およびステアリン酸（３０μＭ）は、病巣形成に対して効果を有さなかった。
【０２３１】
（実施例３）
（ＦＵＳ１−ナノ粒子とゲフィチニブとの併用処理によるＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性およびＮＳＣＬＣ細胞増殖の相乗的な阻害）
遺伝子導入によって腫瘍の抑制およびアポトーシス経路において欠損遺伝子および遺伝子産物の機能を回復し、そして重要なシグナリング経路において特異的かつ頻繁に生じる分子の変化に対してタンパク質チロシンキナーゼインヒビター（ＰＴＫＩ）などの「洗練された薬物（ｓｍａｒｔ  ｄｒｕｇ）」によって標的するように設計された新規の癌処置は、癌治療を基本的に変え、そして肺癌処置に有望であり続ける。ＦＵＳ１は、多くのヒト癌において頻繁に変化または欠失するヒト染色体３ｐ２１．３領域において同定された新規の腫瘍抑制遺伝子（ＴＳＧ）であり、Ａｐａｆ１関連性のアポトーシス経路において重要なメディエーターとして機能し、そしてインビトロおよびインビボで強力な腫瘍抑制因子として機能することが示されている。ＦＵＳ１媒介性のＰＴＫ阻害ならびにＦＵＳ１と、ＰＴＫおよびＡｐａｆ１タンパク質との直接的な相互作用おける本発明者らの最近の観察と一緒に、ＮＳＣＬ患者におけるゲフィチニブ応答者におけるＥＧＦＲ遺伝子の変異の活性化ならびに細胞生存シグナリングの選択的な活性化およびアポトーシス促進経路のブロックにおけるこれらの変異の役割についての他の研究者による最近の知見に鑑みて、この研究において、本発明者らは、ゲフィチニブの化学療法剤の効力を増強し、細胞の生存シグナリングおよび増殖シグナリングを同時に不活化することによるゲフィチニブ抵抗性を克服し、そしてゲフィチニブ感受性ＮＳＣＬＣ細胞およびゲフィチニブ抵抗性ＮＳＣＬＣ細胞の両方においてアポトーシス促進経路を活性化するために、多機能性ＦＵＳ１を調節因子として使用する可能性を探索した。本発明者らは、ＦＵＳ１−ナノ粒子媒介性の遺伝子導入によるｗｔ−ＦＵＳ１の再活性化または３ｐ欠損でありかつゲフィチニブ抵抗性のＮＳＣＬＣ  Ｈ１２９９細胞、ＮＳＣＬＣ  Ｈ３５８細胞、およびＮＳＣＬＣ  Ｈ４６０細胞におけるｗｔ−ＦＵＳ１由来ペプチド（ｗｔ−ＦＰ）による処理が、腫瘍細胞増殖に対する相加を超える阻害効果およびアポトーシスの相乗的な誘導によって示される通り、ゲフィチニブ処理に対するこれらの細胞の応答を有意に感作したことを見出した。増強した増殖阻害をまた、ＦＵＳ１−ナノ粒子と非常に低い用量（ＩＣ１０のレベル）のゲフィチニブとで同時処理したゲフィチニブ感受性のＨＣＣ８２７細胞（ＥＧＦＲの活性化変異を有する）およびＨ１８１９細胞（ＥＧＦＲの増幅を有する）において観察した。リン酸化したＥＧＦＲタンパク質およびＥｒｋタンパク質の活性に対する顕著な阻害をまた、ホスホ−ＥＧＦＲ特異的抗体またはホスホ−Ｅｒｋ特異的抗体によるウェスタンブロット分析によって示される通り、ＦＵＳ１−ナノ粒子またはｗｔ−ＦＰ単独あるいはゲフィチニブとの組み合わせによって処理した細胞において検出した。本発明者らの結果は、ｗｔ−ＦＰが化学療法剤（例えば、ＰＴＫＩ）に対する腫瘍細胞の感受性の調節において重要な役割を果たし得ることおよびＦＵＳ１−ナノ粒子媒介性の分子的治療とこれらの低分子化学療法剤との併用処置が肺癌に対する効率的な処置ストラテジーであり得ることを示唆する。
【０２３２】
（実施例４）
（インビトロおよびインビボでのＦＵＳ１−ナノ粒子とＧｌｅｅｖｅｃとの併用処理によるｃ−Ａｂｌ活性およびｃ−Ｋｉｔ活性の阻害ならびにＳＣＬＣ細胞増殖の阻害）
ＦＵＳ１は、９５％より多いＳＣＬＣ細胞においてＬＯＨを有するか、またはいくつかのＳＣＬＣにおいてホモ接合型で欠失するかのいずれかである重要なヒト染色体３ｐ２１．３領域において同定された新規の腫瘍抑制遺伝子である。ＦＵＳ１タンパク質の発現は、試験した全てのＳＣＬＣ細胞において喪失し、そしてＦＵＳ１欠損肺癌細胞におけるｗｔ−ＦＵＳ１の再活性化は、アポトーシスの誘導によってそれらの増殖を阻害する。一方で、ＢＣＲ−Ａｂｌ、ｃ−ＫｉｔおよびＰＤＧＦＲなどのタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、ＳＣＬＣにおいて頻繁に変化および増幅し、そして重要な治療標的である。低分子薬物ｇｌｅｅｖｅｃは、インビトロでｃ−Ｋｉｔ／ＳＣＦ経路を標的することによってＳＣＬＣ細胞増殖を阻害するが、動物モデルまたはヒト臨床試験のいずれかにおいて有意な治療効力を示さないことが示されている。本発明者らは、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ複合体ＦＵＳ１−ナノ粒子とｇｌｅｅｖｅｃとの併用処理ストラテジーが発癌性ＰＴＫシグナリングの不活化およびアポトーシス促進経路の活性化を同時に行うことによってＳＣＬＣ増殖に対する相乗的な阻害を促進し得ると仮定した。有意な増殖阻害およびアポトーシスが、ＧＦＰ−ナノ粒子コントロールまたはペプチドコントロールによって処理した細胞と比較して、ＦＵＳ１−ナノ粒子またはｗｔ−ＦＵＳ１由来ペプチド（ｗｔ−ＦＰ）のいずれかによって７２時間処理したＳＣＬＣ  Ｈ６９細胞、ＳＣＬＣ  Ｈ１２８細胞、ＳＣＬＣ  Ｈ１４６細胞、およびＳＣＬＣ  Ｎ４１７細胞において観察されたが、ＦＵＳ１タンパク質またはＦＵＳ１ペプチドの機能障害性変異体によって処理した細胞において検出されなかった。増強した増殖阻害を、いずれかの薬剤単独によって処理した細胞と比較して、ＦＵＳ１−ナノ粒子またはｗｔ−ＦＰとｇｌｅｅｖｅｃとの組み合わせによって処理したｇｌｅｅｖｅｃ抵抗性のＨ６９Ｒ細胞およびＮ４１７細胞において検出した。リン酸化したｃ−Ａｂｌタンパク質およびｃ−Ｋｉｔタンパク質の活性はまた、免疫沈降したホスホ−ｃ−Ａｂｌタンパク質またはホスホ−ｃ−Ｋｉｔタンパク質を使用した免疫ブロット分析および活性アッセイの両方によって示される通り、ＦＵＳ１−ナノ粒子またはｗｔ−ＦＰ単独、あるいはｇｌｅｅｖｅｃとの組み合わせによって処理したＨ６９細胞およびＮ４１７細胞において有意に阻害された。本発明者らは、ヌードマウスにおいて胸膜内ＳＣＬＣ  Ｎ４１７腫瘍異種移植片モデルを開発し、そして非侵襲性でありかつ定量的なＭＲ画像化分析によって、ＦＵＳ１−ナノ粒子を用いた全身処置およびＧｌｅｅｖｅｃを用いた経口投与の治療効力を評価した。本発明者らは、ＭＲ画像化および体積分析によって示される通り、Ｎ４１７腫瘍異種移植片の増殖が、２週間未満の処置で、ＦＵＳ１−ナノ粒子単独またはｇｌｅｅｖｅｃとの組み合わせによって処置したマウスにおいて有意（Ｐ＜０．００１）に阻害されたが、有意な効力がｇｌｅｅｖｅｃ単独によって処置したマウスにおいて検出されなかったことを見出した。本発明者らの結果は、インビトロおよびインビボにおけるＳＣＬＣに対するＦＵＳ１−ナノ粒子の治療効力を明確に示し、そしてＳＣＬＣ治療のた��の、ＦＵＳ１−ナノ粒子単独または他の化学療法剤およびＭＲＩとの組み合わせの全身適用を使用する並進適用に関係する。
【０２３３】
（実施例５）
（ＦＵＳ１ハプロ不全の非小細胞肺癌における活性化ｃ−Ａｂｌ）
Ａｂｌタンパク質は、全ての組織において幅広く発現されるが、腫瘍形成的に活性化した形態のｃ−Ａｂｌは、造血器悪性疾患（例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合体を含むフィラデルフィア染色体＋慢性骨髄性白血病）に限られる。ｃ−Ａｂｌタンパク質は、細胞質および核の両方に位置する厳密に調節されたチロシンキナーゼである。核形態のｃ−Ａｂｌタンパク質は、ＤＮＡの損傷に応じて活性化されることが公知である。細胞質のｃ−Ａｂｌは、増殖因子レセプターシグナリング、細胞の移動性、および細胞接着に関連する。Ｂｃｒタンパク質は、ｃ−Ａｂｌ腫瘍性タンパク質およびＢｃｒ−Ａｂｌ腫瘍性タンパク質のネガティブな調節因子であることが公知である（Ｌｉｎら、２００１；Ｌｉｎｇら、２００３）。さらに、ＰＡＧは、ＳＨ３ドメインとの相互作用によってｃ−Ａｂｌをダウンレギュレートする（ＷｅｎおよびＶａｎ  Ｅｔｔｅｎ、１９９７）。肺癌において、染色体腕３ｐの一方の対立遺伝子の頻繁な損失が、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の両方において見られ、これは、この染色体領域における腫瘍抑制遺伝子（ＴＳＧ）の形跡を提供する（Ｋｏｎｄｏら、２００１；Ｕｎｏら、２００４）。ＦＵＳ１遺伝子は、この重要な染色体領域において同定されており、そして新規の腫瘍抑制遺伝子と見なされる。Ｆｕｓ１腫瘍抑制因子活性の機構は、未知である。本発明者らは、Ｆｕｓ１ペプチドがインビトロでｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼを阻害すること（ＩＣ５０  ３５μＭ）を見出した。その阻害配列は、いくつかの肺癌細胞株において検出された変異体Ｆｕｓ１タンパク質の１種において欠失した領域に由来した。重要なことに、このペプチドのステアリン酸（Ｃ１８脂肪酸）改変形態は、阻害に必要とされたが、ステアリン酸単独は、阻害性ではなかった。興味深いことに、ｃ−Ａｂｌのアミノ末端セグメントに結合したミリステート（Ｃ１４）脂肪酸は、ｃ−Ａｂｌの自己阻害に関与すると考えられる（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌら、２００３）。本発明者らは、活性化ｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼを用いて形質転換したＲａｔ−１細胞を使用して病巣形成に対するＦｕｓ１ペプチドの効果を試験した。本発明者らは、ステアリン酸−Ｆｕｓ−１ペプチド（４０μＭ）が病巣形成をブロックしたことを見出した。これらの知見は、Ｆｕｓ１腫瘍抑制タンパク質の活性の１つがｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ機能を妨害するものであることを示唆する。この３ｐ２１．３領域における対立遺伝子の損失（ＦＵＳ１遺伝子においてハプロ不全を生じる）を有する２種の肺癌細胞株の分析は、活性化ｃ−ＡｂｌがＦＵＳ１欠失型肺癌において役割を果たし得ることを示唆する。免疫沈降／ｐＴｙｒウェスタンブロット研究およびインビトロＡｂｌキナーゼアッセイは、Ａ５４９細胞株およびＨ１２９９細胞株が活性化ｃ−Ａｂｌタンパク質を含んだことを示した。さらなる研究は、Ｆｕｓ１／Ａｂｌ相互作用の調査、およびｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害に重要であるＦＵＳ１内の配列の同定について進行中である。
【０２３４】
（実施例６）
（ＦＵＳ１−ナノ粒子とゲフィチニブとの併用処理による非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）におけるＥＧＦＲチロシンキナーゼおよび腫瘍細胞増殖の相乗的な阻害）
ＦＵＳ１は、Ａｐａｆ１関連性のアポトーシス経路において機能するヒト染色体３ｐ２１．３領域において同定された新規の腫瘍抑制遺伝子（ＴＳＧ）であり、そして強力な腫瘍抑制因子である。本発明者らは、ゲフィチニブの化学療法剤の効力を増強し、そしてゲフィチニブ感受性ＮＳＣＬＣ細胞およびゲフィチニブ抵抗性ＮＳＣＬＣ細胞の両方においてゲフィチニブ抵抗性を克服するために、ＦＵＳ１の使用を探索した。
【０２３５】
（方法および結果）
本発明者らは、ＦＵＳ１欠損でありかつゲフィチニブ抵抗性のＮＳＣＬＣ  Ｈ１２９９細胞、ＮＳＣＬＣ  Ｈ３５８細胞、およびＮＳＣＬＣ  Ｈ４６０細胞におけるＦＵＳ１−ナノ粒子媒介性の遺伝子導入によるｗｔ−ＦＵＳ１の発現が、腫瘍細胞増殖に対する相加を超える阻害効果およびアポトーシスの相乗的な誘導によって示される通り、ゲフィチニブ処理に対する応答を有意に感作したことを見出した。増強した増殖阻害がまた、ＦＵＳ１−ナノ粒子と低い用量（ＩＣ１０）のゲフィチニブとで同時処理したゲフィチニブ感受性のＨＣＣ８２７細胞（ＥＧＦＲ変異体）およびＨ１８１９細胞（ＥＧＦＲ増幅）において観察された。リン酸化ＥＧＦＲタンパク質の顕著な阻害をまた、ホスホ−ＥＧＦＲ特異的抗体を用いたウェスタンブロット分析によって示される通り、ＦＵＳ１−ナノ粒子単独またはゲフィチニブとの組み合わせによって処理した細胞において検出した。腫瘍増殖の有意な阻害（Ｐ＜０．００１）を、ＭＲ画像化および体積分析によって示される通り、処理なかった細胞またはＧＦＰ−ナノ粒子によって処理した細胞と比較して、２週間未満のＦＵＳ１−ナノ粒子によって処置した動物において検出した。アポトーシスの誘導をまた、冷凍組織サンプルにおけるＴＵＮＥＬ染色を用いたインサイチュアポトーシスアッセイによって、ＦＵＳ１−ナノ粒子によって処置したマウスの腫瘍細胞において検出した。本発明者らは、化学療法において進行した第ＩＶ期ＮＳＣＬＣ患者に静脈内に与えられる単剤ＦＵＳ１−ナノ粒子の進行中の第Ｉ相研究を有する。上記処置は、１７＋ヶ月の生存期間の中央値を伴うデータに入る７人の患者において十分に許容される。
【０２３６】
（結論）
本発明者らの結果は、ｗｔ−ＦＵＳ１がタンパク質チロシンキナーゼインヒビターに対する腫瘍細胞の感受性の調節において重要な役割を果たし得ることを示唆する。
【０２３７】
（実施例７）
本発明者らの先の実験は、いくつかの肺癌細胞株由来のＦｕｓ１において欠失することが公知であるＦｕｓ１配列に由来する合成ペプチドが市販のＡｂｌのキナーゼ活性を阻害することを示した。本発明者らは、抗Ａｂｌ免疫沈降（ＩＰ）／ｐＴｙｒウェスタンブロッティングによって２種のヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株、Ａ５４９およびＨ１２９９をスクリーニングし、そして活性化ｃ−Ａｂｌタンパク質を検出した。ＦＵＳ１欠失型ＮＳＣＬＣ細胞株におけるｃ−Ａｂｌの活性化を確認するために、インビトロキナーゼアッセイを、ｃ−Ａｂｌ抗体ＩＰを使用して行った。Ａ５４９およびＨ１２９９の両方は、活性化ｃ−Ａｂｌに関してポジティブであり、一方でＣＣＤ１６、正常ヒト肺線維芽細胞の細胞株は、ネガティブであった。
【０２３８】
ＮＳＣＬＣ細胞株におけるｃ−Ａｂｌの活性をさらに調査するために、メシル酸イマチニブ（ＳＴＩ−５７１またはＧｌｅｅｖｅｃとしても公知である）、公知のインヒビターまたはｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼを、Ｈ１２９９細胞の軟寒天コロニーアッセイにおいて使用した。イマチニブ（１０μＭ）による細胞の処理は、処理していないコントロールと比較して、コロニーの数のほぼ完全な減少をもたらした。イマチニブの存在下で形成したコロニーは、処理していない細胞と比較して、大きさが減少した。
【０２３９】
細胞内部のｃ−Ａｂｌに対するＦｕｓ１の直接的な効果を決定するために、ｃ−Ａｂｌ  ｃＤＮＡを、野生型ＦＵＳ１またはｃ末端欠失ＦＵＳ１あるいは空ベクターのいずれかを用いてＣＯＳ−１細胞に同時トランスフェクトした。本発明者らのデータは、野生型Ｆｕｓ１の同時発現に関連するｃ−Ａｂｌのチロシンリン酸化の減少が存在するが、この減少は、Ｆｕｓ１ペプチドの阻害性ペプチド配列を欠くＦＵＳ１欠失変異体によって見られなかったことを示す。
【０２４０】
本明細書中に開示され、そして特許請求される組成物および方法の全ては、本開示に鑑みて過度な実験を伴わずに行われ、そして達成され得る。本発明の組成物および方法が、好ましい実施形態に関して記載されている一方で、バリエーションが組成物および方法ならびに本明細書中に記載される方法の工程または工程の順序に、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく適用され得ることは、当業者に明らかである。より具体的に、化学的および生理学的に関連する特定の薬剤が本明細書中に記載される薬剤を置換し得る一方で、同一または類似の結果が達成されることは、明らかである。全てのこのような類似の置換および改変は、当業者に明らかであり、それは、添付の特許請求の範囲に規定されるような本発明の精神、範囲、および概念の範囲内であると見なされる。
【０２４１】
（実施例８）
（中性リポソームナノ粒子によるＦＵＳ−１ペプチドの送達）
この実施例において使用した送達系は、中性ナノ粒子（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）ベースのリポソームおよびペプチド（Ｆｕｓ  １）からなる。ＤＯＰＣストック（２０ｍｇ／ｍｌ）を、ｔ−ブタノールにおいて調製し、蒸留水において希釈（１：１０００）したｔｗｅｅｎ−２０（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆａｉｒｌａｗｎ、ＮＪ）と９０％：１０％（ｖ／ｖ）（ＤＯＰＣ：Ｔｗｅｅｎ  ２０）の比で混合した。その混合物を、過剰な無水ｔ−ブタノール（９５％  ｔ−ブタノール、５％脂質、ｖ／ｖ）に添加し、そして一晩凍結乾燥した。乾燥脂質混合物を、既に蒸留水に溶解したペプチドと混合した。この実験において使用したＤＯＰＣおよびペプチドの比は、１０：１（モル比（ＤＯＰＣ：ペプチド））であった。１００μＭペプチドを含むｄｄ水を、希釈し、そして肺癌細胞（Ｈ１２９９）の処理に使用した。カチオン性脂質、ＤＯＴＡ、およびペプチドを、ポジティブコントロール（ＤＯＴＡＰ：ペプチド（１：１）、Ｍ／Ｍ）として使用した。
【０２４２】
肺癌細胞（５０００個／ウェル）を、漸増用量の空リポソームおよびｆｕｓ  １ペプチド（１μＭ、５μＭ、１０μＭ、および２０μＭのペプチド）を含むリポソーム、または色素標識したペプチド（１μＭ、５μＭ、１０μＭ、および２０μＭ）を含むリポソームを用いて４８時間処理した。リポソームの取り込みを、２０時間および４８時間の時点にて蛍光顕微鏡を使用して観察した。細胞を、形態学および生存率について、処理の２０時間および４８時間にて撮影した。空リポソーム（コントロール）によって処理した細胞およびペプチドを含むリポソームによって処理した細胞を、４８時間後に細胞生存率について計測し、そして所見を、プロットした（図２３）。
【０２４３】
（実施例９）
（必要に応じてＦＵＳ−１ペプチドを含むＤＯＰＣナノ粒子およびＤＯＴＡＰ：コレステロールナノ粒子の毒性の分析）
Ｃ３Ｈマウスに、ペプチド（ＦＵＳ−１ペプチドまたは非特異的ペプチドのいずれか）を含むナノ粒子を注射し、次いで種々の毒性学的パラメータを、注射の１週間後、２週間後および３週間後に分析した。コントロールマウス（「群ＩＸ」）に、ＰＢＳを注射した。評価した毒性学的パラメータは、血液学的パラメータ（すなわち、赤血球数「ＲＢＣ」および白血球数「ＷＢＣ」）、肝機能の分析（すなわち、ＡＳＴ、ＡＬＴ、および総ビリルビン分析）および腎機能の分析（すなわち、クレアチニンレベルの評価）を含んだ。ＤＯＴＡＰ：コレステロールナノ粒子またはＤＯＰＣ（中性リポソーム）ナノ粒子のいずれかを、使用した。Ｃ３Ｈマウスに投与した投与したペプチド含有ナノ粒子は、２ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇで変化した。これらの研究を、表Ｖにおいて下に要約する。
【０２４４】
（表Ｖ．ナノ粒子の毒性分析）
【０２４５】
【表５】
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注釈：１．第１週目におけるいくつかの血液学的パラメータは、サンプルの重篤な溶血に起因して利用できない。
２．ＦＰ−ナノ粒子を、尾静脈を介して１日おきに３回注射し、各投薬の総用量は、２００μｌであった。
３．血液回収についての時点は、最後の処置からの時間を表す。
４．ＤＣ：ＤＯＴＡＰ／コレステロール−ナノ粒子、ＦＰ：ＦＵＳ１ペプチド、ＮＳＰ：非特異的ペプチド。
【０２４６】
（実施例１０）
（腫瘍抑制遺伝子産物Ｆｕｓ１によるｃ−Ａｂｌの阻害：ＦＵＳ１発現を欠く非小細胞肺癌細胞におけるｃ−Ａｂｌの発癌性の活性化）
ステアレート−Ｆｕｓ１ペプチドは、ｃ−Ａｂｌのチロシンキナーゼ活性を阻害する。Ｆｕｓ１は、ＮＳＣＬＣに関連する腫瘍抑制遺伝子である（Ｊｉら、２００２；ＬｅｒｍａｎおよびＭｉｎｎａ、２０００；Ｋｏｎｄｏら、２００１）。ＦＵＳ１のＣ末端欠失変異体を、肺癌腫瘍細胞株から単離し（Ｋｏｎｄｏら、２００１）、この変異体は、１１０アミノ酸の野生型Ｆｕｓ１タンパク質の最初の８０アミノ酸（Ｋｏｎｄｏら、２００１）をコードする。本発明者らは、ＫＬＲ配列（表ＶＩを参照のこと）を除いて、欠けたＦｕｓ１（１−８０）である配列から生じるステアレート−Ｆｕｓ１ペプチド（ＫＬＲＲＶＨＫＮＬＩＰＱＧＩＶＫＬＤＨＲ；配列番号１１）を合成した。このペプチドは、細菌から精製したＡｂｌキナーゼを使用したＡｂｌチロシンキナーゼアッセイにおいて強力に阻害性であった（図２４Ａ）。驚くべきことに、ステアレートＮ末端部分を欠くＦｕｓ１ペプチドは、Ａｂｌキナーゼインヒビターとして不活性であった（図２４Ｂ）。ステアレート単独はまた、阻害性ではなかった。ステアレートＢｃｒペプチドは、Ａｂｌキナーゼインヒビターとして不活性であった；ステアレートＦｕｓ１ペプチドとほぼ同じ数のアミノ酸であるステアレートＢｃｒペプチドは、細菌から精製したＡｂｌキナーゼに対して全く阻害効果を有さなかった。それとともに、これらの結果は、ステアレート部分およびＦｕｓ１ペプチド内のアミノ酸配列の両方がｃ−Ａｂｌキナーゼの阻害に必要であったことを示す。
【０２４７】
図２４Ａにおいて示す通り、ステアリン酸Ｆｕｓ１ペプチドを、ＳＨ２ドメインおよびＳＨ１ドメインのみを含む切断した市販のｃＡｂｌチロシンキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ）（４５ｋＤ）、ＧＳＴ−ＣＲＫ（Ａｂｌの好ましい基質）、１００ｕＭ非放射性ＡＴＰ、および３２Ｐ  ＡＴＰと混合した。３０℃にて３０分間インキュベートした後、サンプルを、２×ＳＤＳサンプル緩衝液と一緒に煮沸し、そして８％  ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上で電気泳動した。そのゲルを、乾燥し、そしてホスホイメージャーに曝した。
【０２４８】
図２４Ｂは、ステアリン酸Ｆｕｓ１ペプチドによるＡｂｌチロシンキナーゼの線形阻害を示す。その曲線は、ＧＳＴ−ＣＲＫリン酸化の阻害を表す。非ステアリン酸改変Ｆｕｓ１ペプチドは、Ａｂｌチロシンキナーゼ活性を阻害しなかった（図２４Ｃ）。４５ｋＤのＡｂｌチロシンキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を、０〜６０ｕＭの非ステアレートＦｕｓ１ペプチド、１００ｕＭ非放射性ＡＴＰ、および３２Ｐ  ＡＴＰ、およびＧＳＴ−Ｃｒｋと一緒にインキュベートした。ＧＳＴ−Ｃｒｋリン酸化を、ホスホイメージャーを使用して定量した。
【０２４９】
Ｆｕｓ１アミノ酸配列およびステアレート−Ｆｕｓ１ペプチド配列を、表ＶＩにおいて下に示す。下で下線付きのアミノ酸配列は、Ｆｕｓ１ペプチドが由来する領域である。ＫＬＲ  Ｎ末端を除いたペプチド配列は、いくつかのＮＳＣＬＣ細胞株（Ｋｏｎｄｏら、２００１）において発現されるＦＵＳ１の変異体切断形態［ＦＵＳ１（１−８０）］において欠けた領域に位置する。
【０２５０】
（表ＶＩ）
【０２５１】
【表６】
2009501237.tif 000011
ｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼは、ＮＳＣＬＣ細胞株において活性化される。数種のＮＳＣＬＣ細胞株を、活性化ｃ−Ａｂｌの存在について調べた（表ＶＩＩ）。Ａ５４９細胞株およびＨ１２９９細胞株は、抗Ａｂｌ  Ｐ６Ｄを用いて行った免疫複合体キナーゼアッセイによって決定したところ、チロシンキナーゼ−活性ｃ−Ａｂｌタンパク質を含んだ。これらの細胞株の細胞溶解物由来の抗Ａｂｌ免疫複合体はまた、チロシン−リン酸化ｃ−Ａｂｌタンパク質を含んだ。
【０２５２】
（表ＶＩＩ．減少したＦＵＳ１発現は、ＮＳＣＬＣ細胞株における活性化ｃ−Ａｂｌ活性に相関する）
【０２５３】
【表７】
2009501237.tif 000012
ＮＳＣＬＣ細胞株は、活性化ｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼを含むことが示された。Ｂｃｒ−Ａｂｌポジティブ細胞株（３２Ｄ  Ｐ２１０）、正常肺線維芽細胞（ＣＣＤ１６）、およびＮＳＣＬＣ細胞株（Ｈ１２９９およびＡ５４９）に由来する全細胞溶解物を、抗ｃ−Ａｂｌ抗体Ｐ６Ｄと一緒にインキュベートした（Ｌｉｎｇら、２００３）。Ｐ６Ｄ、および免疫複合体を、プロテインＡ  Ｓｅｐｈｏｒｏｓｅビーズによって引き出した。プロテインＡビーズを、２μＣｉ  ３２Ｐ□ＡＴＰと一緒に氷上で２０分間インキュベートした。上清を、２×ＳＤＳサンプル緩衝液中で煮沸し、そして８％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。正常Ｒａｔ  １細胞、ｃ−Ａｂｌ形質転換Ｒａｔ  １細胞、ＡＢＬ形質転換Ｒａｔ１細胞（Ｌｉｎｇら、２００３）、およびＮＳＣＬＣ細胞（Ｈ１２９９およびＡ５４９）に由来する全細胞溶解物を、抗ｃ−Ａｂｌ抗体Ｐ６Ｄと一緒にインキュベートした。Ｐ６Ｄ免疫複合体を、プロテインＡ  Ｓｅｐｈｏｒｏｓｅビーズを用いて回収した。プロテインＡビーズを、２×ＳＤＳサンプル緩衝液中で煮沸し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥｌによって分析した。ｂブロットを、抗ｃ−Ａｂｌ抗体８Ｅ９（Ｇｕｏら、１９９４）によってプローブした。次いでブロットを、ストリップし、そしてホスホチロシン抗体４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ）を用いてプローブした。
【０２５４】
ＣＯＳ１細胞におけるＦＵＳ１およびｃ−ＡＢＬの同時発現は、ｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ活性を阻害する。活性化ｃ−Ａｂｌを阻害するＦｕｓ１の能力を評価するために、本発明者らは、ＣＯＳ１細胞においてこれらのｃＤＮＡを同時発現させ、そしてチロシン−リン酸化ｃ−Ａｂｌのレベルを測定した。ｃ−ＡＢＬとＦＵＳ１との同時発現は、チロシン残基におけるｃ−Ａｂｌのリン酸化を阻害した（図２５Ａ）。対照的に、ＦＵＳ（１−８０）とｃ−ＡＢＬとの同時発現は、ｃ−Ａｂｌチロシンリン酸化に対する阻害効果をほとんど有さなかった（図２５Ａ）。興味深いことに、Ｆｕｓ１とＮ末端Ｆｕｓ１抗体との免疫沈降は、Ｆｕｓ１と一緒にｃ−Ａｂｌを同時に沈殿させ、これは、Ｆｕｓ１がｃ−Ａｂｌに結合することを示唆する。ｃ−Ａｂｌのチロシン４１２のリン酸化は、ｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ活性化の尺度である。したがって、本発明者らは、ＦＵＳ１の同時発現後のｃ−Ａｂｌにおけるホスホチロシン４１２配列のレベルを評価した（図２５Ｂ）。ｃ−Ａｂｌを伴うＦＵＳ１同時発現は、ｃ−Ａｂｌタンパク質におけるホスホチロシン４１２のレベルを強力に阻害した。対照的に、ＦＵＳ（１−８０）とｃ−ＡＢＬとの同時発現は、チロシン４１２のリン酸化を阻害できなかった（図２５Ｂ）。研究は、Ｆｕｓ１のミリルトイル化がＮＳＣＬＣにおけるその腫瘍抑制活性に必要とされることを示した。ＣＯＳ１細胞におけるｃ−ＡＢＬとＦＵＳ１のミリルトイル化欠損変異体との同時発現は、野生型ＦＵＳ１とｃ−ＡＢＬとの同時発現と比較した場合、ホスホチロシンｃ−Ａｂｌの最小限の減少をもたらした（図２５Ｃ）。したがって、この結果は、Ｆｕｓ１とｃ−Ａｂｌとの相互作用が、自己リン酸化の結果としてか、または別の上流キナーゼ（例えば、ｃ−Ｓｒｃ（Ｐｌａｔｔｎｅｒら、１９９９））によるＡｂｌ活性化によってかのいずれかでそのチロシンキナーゼ活性化をブロックすることを示す。
【０２５５】
図４ａにおいて、ＣＯＳ１細胞を、ｃ−ＡＢＬと、野生型ＦＵＳ１またはＦＵＳ（１−８０）のいずれかとによって同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を、回収し、そして溶解物を、Ｎ末端Ｆｕｓ１抗体と一緒にインキュベートした。プロテインＡビーズによって回収したＦｕｓ１免疫複合体を、２×ＳＤＳサンプル緩衝液中で煮沸し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。そのブロットを、抗ホスホチロシン抗体４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ）を用いてプローブした。そのブロットを、ストリップし、そして抗ｃ−Ａｂｌ抗体８Ｅ９を用いて再度プローブした。図４ｂにおいて、ＣＯＳ１細胞を、ｃ−Ａｂｌと、空ベクター、ＦＵＳ（１−８０）、または野生型ＦＵＳ１のいずれかとによって同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、その細胞を、回収し、そして溶解物を、図４ａにあるように、抗ｃ−Ａｂｌ、Ｐ６Ｄと一緒にインキュベートした。そのブロットを、ｃ−Ａｂｌ抗ホスホチロシン４１２（Ａｂｃａｍ）を用いてプローブした。次いで、そのブロットを、ストリップし、そして抗ｃ−Ａｂｌ抗体８Ｅ９によって再度プローブした。
【０２５６】
イマチニブは、ＮＳＣＬＣ細胞のコロニー形成を阻害する。メシル酸イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ（Ｄｒｕｋｅｒら、１９９６）の活性化チロシンキナーゼ活性を阻害するその能力について広く知られている。したがって、本発明者らは、軟寒天におけるＨ１２９９細胞のコロニー形成に対するイマチニブの効果を試験した（図２６Ａ〜２６Ｃ）。イマチニブ処理は、Ｈ１２９９細胞のコロニー形成能力を用量依存様式で強力に阻害した；コロニーの数および大きさの両方が、阻害された（図２６Ａ〜２６Ｃ）。１〜１０ｕＭのイマチニブを、先の研究がこれらの濃度にてｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の強力な阻害を示したので（Ｚｉｐｆｅｌら、２００４）、これらのアッセイにおいて使用した。
【０２５７】
考察。先の研究は、ＦＵＳ１の抗腫瘍活性を示した（Ｋｏｎｄｏら、２００１；Ｕｎｏら、２００４）が、ＦＵＳ１遺伝子の標的は、現在までに同定されていない。本発明者らの研究において、ｃ−Ａｂｌは、Ｆｕｓ１タンパク質によってネガティブに調節されることが見出された。いくつかのＮＳＣＬＣ患者において見られる変異体ＦＵＳ１（１−８０）（Ｋｏｎｄｏら、２００１）において欠けた配列に由来するＦＵＳ１ペプチドを使用して、本発明者らは、Ｃｒｋ（ｃ−Ａｂｌ（１７）の通常の標的）をリン酸化するｃ−Ａｂｌキナーゼの能力を阻害し得た（図２４Ａ〜２４Ｃ）。興味深いことに、ＦＵＳ１ペプチドのステアリン酸改変形態のみが、ｃ−Ａｂｌキナーゼに対する阻害効果を有した（図２４Ａ〜２４Ｃ）。ＦＵＳ１のミリストイル化がＦＵＳ１の腫瘍抑制効果をもたらすのに必要とされることは、示されている（Ｐｌａｔｔｎｅｒら、１９９９）。興味深いことに、ｃ−Ａｂｌ（アイソフォーム１ｂ）のＮ末端はまた、ミリステート残基を含み、このミリステート残基は、ｃ−Ａｂｌの自己阻害に関係している（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌら、２００３）。野生型Ｆｕｓ１とｃ−Ａｂｌとの相互作用が、ＣＯＳ１細胞における同時発現アッセイよって細胞培養物において示された（例えば、図２５Ａ〜２５Ｃ）。チロシン４１２のリン酸化は、ｃ−Ａｂｌキナーゼの活性化をもたらす重要な工程である（ＢｒａｓｈｅｒおよびＣａｎ  Ｅｔｔｅｎ、２０００）。野生型ＦＵＳ１とｃ−ＡＢＬとの同時発現は、ｃ−ＡｂｌをいくつかのＮＳＣＬＣ細胞株（Ｗａｎｇ、２０００）において見出される切断されたＦＵＳ１（阻害性ペプチド配列を欠く）、または空ベクターのいずれかと同時発現させる場合のいずれかのシグナルの非常にごく小さい減少と比較して、ｃ−Ａｂｌの全ホスホチロシンレベルおよびホスホチロシン４１２含量のレベルの両方における有意な減少をもたらす（図２５Ａ〜２５Ｃ）。これらの知見は、Ｆｕｓ１タンパク質によるｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼの直接の阻害についての強力な証拠を提供する。
【０２５８】
これらの結果は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株がチロシンキナーゼ−活性ｃ−Ａｂｌを発現することを示す（図２４Ａ〜２４Ｃ）。この結果は、ｃ−Ａｂｌは厳密に調節されたチロシンキナーゼであり、そしてその発癌性が、通常、白血病細胞におけるキメラタンパク質、Ｂｃｒ−Ａｂｌに関連していることを考慮すると興味深い。ＮＳＣＬＣ株におけるｃ−Ａｂｌの活性化を示すこれらの知見の支持において、ＮＳＣＬＣ細胞株のイマチニブによる処理は、ｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼを阻害することが公知である用量にて、軟寒天におけるコロニー形成を用量依存様式で強力に阻害した（図２６Ａ〜２６Ｃ）。したがって、本発明者らの知見は、ｃ−Ａｂｌを、腫瘍抑制遺伝子産物ＦＵＳ１の可能な標的として同定し、そしてｃ−Ａｂｌがいくつかの形態のＮＣＳＬＣの発癌性に顕著に寄与する因子であり得ることを示す。したがって、周知のｃ−ＡｂｌインヒビターであるイマチニブがＮＳＣＬＣを首尾よく処置する可能性を有し得るであろうことが、考えられる。
【０２５９】
（参考文献）
以下の参考文献は、それらが例示的な手順の詳細または本明細書中に示されるものに対して補足する他の詳細を提供する程度に、具体的に本明細書中に参考として援用される。
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Ｍｉｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，８４９−８５７，１９９７．
Ｍｏｒａｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１６，８９−９２，２００５．
Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４（１３）：３３９６−３３９７，１９９４．
Ｎｉｓｈｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒ，１８０（１）：５５−６１，２００２．
Ｎｏｂｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３６８：７５３−７５６，１９９５．
Ｏｂｅｎａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１（１３）：３６３５−３６４１，２００３．
Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１（２３）：１１０４５−１１０４９，１９９４．
Ｏｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５４（１１）：２８４８−２８５１，１９９４．
Ｏｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，１５（１）：１７−２４，１９９４．
ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１１６１号
ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ８９／０５０４０号
ＰＣＴ出願公開ＷＯ  ０２／１００４３５Ａ１
ＰＣＴ出願公開ＷＯ  ０３／０１５７５７Ａ１
ＰＣＴ出願公開ＷＯ  ０４／００２４５３Ａ１
ＰＣＴ出願公開ＷＯ  ０４０２９２１３Ａ２
Ｐｕｒｅ  ＆  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，６３（３）：４２７−４６３，１９９１
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”  １５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ  １０３５−１０３８  ａｎｄ  １５７０−１５８０，１９９０．
Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．，５４（４）：４５９−４７６，２００２．
Ｒｏｊａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２７４５６−２７４６１，１９９６．
Ｒｏｊａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３７０−３７５，１９９８．
Ｒｏｔｈ，Ｆｏｒｕｍ，８：３６８−３７６，１９９８．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９
Ｓｃｈｗａｒｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：１５６９−１５７２，１９９９．
Ｓｃｈｗａｒｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０：２９０−２９５，２０００．
Ｓｅｋｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ．Ａｃｔａ，１３７８：Ｆ２１−Ｆ５９，１９９８．
Ｓｅｋｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１６：３１５１−３１５７，１９９８．
Ｓｅｋｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：４１２０−４１２５，１９９６．
Ｓｅｒｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６６：７０４−７０７，１９９３．
Ｓｅｒｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６７（５１９５）：２４９−２５２，１９９５．
Ｓｅｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９：１２２０−１２２６，１９９８．
Ｓｐａｎｄｉｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，９（２）：３８３−３８６，１９８９．
Ｓｔａｙｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，６５：２０３−２２０，２０００．
Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，６０（１）：６１−７５，２００１．
Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：６４７−６５２，１９９７．
Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：６４７−６５２，１９９７．
Ｔｒａｖａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，４（１４）：３２０９−３２１４，１９９０．
Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｃｒｏｃｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３（１４）：５２１４−５２１８，１９８６．
Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８（４７０６）：１４４０−１４４３，１９８５．
Ｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６４：２９６９−２９７６，２００４．
Ｕｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．，１０７：１２５−１３１，１９９８．
Ｖｉｒｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍ  Ｃａｎｃｅｒ，２１：３０８−３１９，１９９８．
Ｗａｎｇ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９（４９）：５６４３−５６５０，２０００．
Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４（５０３５）：１１３８−１１４６，１９９１．
Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１１３８−１１４６，１９９１．
Ｗｅｎ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｅｔｔｅｎ，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１：２４５６−２４６７，１９９７．
Ｗｅｓｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２３８：１１３−１２２，２００４．
Ｗｉｌｈｅｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４：１００１−１０１１，２００３．
Ｗｉｓｔｕｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７：３１５４−３１５８，１９９７．
Ｗｉｓｔｕｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９：１９７３−１９７９，１９９９．
Ｗｉｓｔｕｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８：６４３−６５０，１９９９．
Ｗｏｏｄｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１６（Ｐｔ．１３）：２６１３−２６２６，２００３．
Ｚｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２７：７２１−７２４，１９８７．
Ａｒｌｉｎｇｈａｕｓ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１：８５６０−８５６７，２００２．
Ｂｒａｓｈｅｒ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｅｔｔｅｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：３５６３１−３５６３７，２０００．
Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１４０５３−１４０５８，２００２．
Ｄｒｕｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，２：５６１−５６６，１９９６．
Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８３：３６２９−３６３７，１９９４．
Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１２：８４５−９５７，２００３．
Ｈｅｉｓｔｅｒｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４４：２５１−２５３，１９９０．
Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６２：２７１５−２７２０，２００２．
Ｋｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０：６２５８−６２６２，２００１．
Ｌｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｉｎｎａ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６０：６１１６−６１３３，２０００．
Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６３：２９８−３０３，２００３．
Ｐｌａｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．，１３：２４００−２４１１，１９９９．
Ｔａａｇｅｐｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：７４５７−７４６２，１９９８．
Ｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６４：２９６９−２９７６，２００４．
Ｗａｎｇ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９：５６４３−５６５０，２０００．
Ｗｅｎ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｅｔｔｅｎ，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．，１１：２４５６−２４６７，１９９７．
Ｗｏｏｄｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１６５：４９３−５０３，２００４．
Ｚａｂａｒｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１：６９１５−６９３５，２００２．
Ｚｉｐｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌ．，１４：１２２２−１２３１，２００４．
【図面の簡単な説明】
【０２６０】
【図１】図１：Ｆｕｓ１タンパク質構造の概略的分析、および実施例において使用されるＦｕｓ１ペプチドの一覧。
【図２】図２：種々のペプチドの疎水性定数。
【図３】図３：Ｆｕｓ１ペプチドの予想される極性。
【図４】図４：ＳＰＩＯナノ粒子−ペプチド複合体の概略図。
【図５】図５：ペプチド−ＤＯＴＡＰ：コレステロールナノ粒子、およびペプチド−ＳＰＩＯ−ＤＯＴＡＰ：コレステロール粒子を示す概略図。
【図６】図６：細胞増殖に対するＦｕｓ１ペプチドの効果。
【図７】図７：細胞におけるＦｕｓ１ペプチドのＩＣ５０値。
【図８】図８：細胞増殖およびアポトーシスに対するＦｕｓ１ペプチドの効果。
【図９】図９：Ｆｕｓ１ペプチドとゲフィチニブとの併用処置の効果。
【図１０】図１０：Ｇｌｅｅｖｅｃ感受性細胞およびＧｌｅｅｖｅｃ抵抗性細胞に対するＦｕｓ１ペプチドの効果。
【図１１】図１１：細胞中のｃ−Ａｂｌ活性に対するＦｕｓ１ペプチドの効果。
【図１２】図１２：ペプチド処理細胞におけるｃ−Ａｂｌの相対活性。
【図１３】図１３：Ｆｕｓ１ペプチド−ナノ粒子複合体による腫瘍細胞増殖の阻害。
【図１４】図１４：Ｆｕｓ１ペプチド−ナノ粒子複合体によって処理された細胞におけるアポトーシスの誘導。
【図１５】図１５：異なる細胞株におけるチロシンのリン酸化。
【図１６】図１６：ＳＴＩ（メシル酸イマチニブ；ＳＴＩ−５７１またはＧｌｅｅｖｅｃとしても公知である）によるＲａｔ−１  ＳＨ２細胞の処理の結果。
【図１７】図１７：ステアリン酸化Ｆｕｓ１ペプチドによるＲａｔ−１  ＳＨ２細胞の処理の結果。
【図１８】図１８：軟寒天におけるＳＴＩ−５７１による細胞の処理の結果。
【図１９】図１９：軟寒天におけるＳＴＩ−５７１による細胞の処理の結果。
【図２０】図２０：Ｆｕｓ１ペプチドによるリン酸化の阻害。
【図２１】図２１：Ｆｕｓ１ペプチドによるｃ−Ａｂｌキナーゼの線形阻害。
【図２２】図２２：ＤＭＳＯまたはステアリン酸によるｃ−Ａｂｌキナーゼの効果の欠如。
【図２３】図２３：非小細胞肺癌細胞（Ｈ１２９９細胞）の増殖に対するＦｕｓ１ペプチドを含むＤＯＰＣベースのリポソームおよびＤＯＴＡＰベースのリポソームの、４８時間における効果。
【図２４】図２４Ａ〜Ｃ：ステアリックＦｕｓ１ペプチドによるＡｂｌチロシンキナーゼの濃度依存的阻害。図２４Ａ；ステアリン酸改変型Ｆｕｓ１ペプチドによる市販のＡｂｌチロシンキナーゼの阻害。図２４Ｂ；ステアリン酸Ｆｕｓ１ペプチドによるＡｂｌチロシンキナーゼの線形阻害。図２４Ｃ；非ステアリン酸改変型Ｆｕｓ１ペプチドは、Ａｂｌチロシンキナーゼ活性を阻害しない。
【図２５】図２５Ａ〜Ｃ：ＦＵＳ１発現は、ｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ活性を阻害する。
【図２６】図２６Ａ〜Ｃ：図２６Ａ；１０００  Ｈ１２９９細胞を、０ｕＭ、１ｕＭ、または５ｕＭのいずれかのイマチニブ含む３５％軟寒天にプレートした。細胞を、それぞれの濃度のイマチニブを含む培地を２日毎に交換しながら１８日間増殖させた。図２６Ｂ；イマチニブによる軟寒天におけるＨ１２９９コロニー形成の用量依存的阻害。図２６Ｃ；１０００  Ｈ１２９９細胞を、１０ｕＭのイマチニブを含むか、または未処理のいずれかの．３５％軟寒天にプレートした。細胞を、それぞれの濃度のイマチニブを含む培地を２日毎に交換しながら１８日間増殖させた。
【図１】
2009501237.tif 000013
【図２】
2009501237.tif 000014
【図３】
2009501237.tif 000015
【図４】
2009501237.tif 000016
【図５】
2009501237.tif 000017
【図６】
2009501237.tif 000018
【図７】
2009501237.tif 000019
【図８】
2009501237.tif 000020
【図９】
2009501237.tif 000021
【図１０】
2009501237.tif 000022
【図１１】
2009501237.tif 000023
【図１２】
2009501237.tif 000024
【図１３】
2009501237.tif 000025
【図１４】
2009501237.tif 000026
【図１５】
2009501237.tif 000027
【図１６】
2009501237.tif 000028
【図１７】
2009501237.tif 000029
【図１８】
2009501237.tif 000030
【図１９】
2009501237.tif 000031
【図２０】
2009501237.tif 000032
【図２１】
2009501237.tif 000033
【図２２】
2009501237.tif 000034
【図２３】
2009501237.tif 000035
【図２４】
2009501237.tif 000036
【図２５】
2009501237.tif 000037
【図２６】
2009501237.tif 000038
【配列表】
2009501237000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月14日(2007.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）生物活性ポリペプチド、
ｂ）ナノ粒子、
を、該生物活性ポリペプチドがナノ粒子と結合している状態で含み、該生物活性ポリペプチドが、該ポリペプチドの細胞内取り込みを容易にする化学的部分の付加によって改変される、ナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項２】
前記ポリペプチドは、ペプチドである、請求項１に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項３】
前記ペプチドのアミノ酸配列は、腫瘍抑制遺伝子産物のアミノ酸配列に由来する、請求項２に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項４】
前記腫瘍抑制遺伝子は、表４に列挙される遺伝子、アポトーシス促進遺伝子、または細胞傷害性遺伝子である、請求項３に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項５】
前記生物活性ペプチドは、ＦＵＳ−１ペプチド、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオボックス遺伝子（Ａｎｔｐ）ペプチド、ＨＩＶ  Ｔａｔペプチド、ヘルペスウイルスＶＰ２２ペプチド、モデル両親媒性ペプチド、トランスポータンペプチド、ＳＶ  ４０  Ｔ抗原ペプチド、またはプロテグリンＩペプチドである、請求項１に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項６】
前記生物活性ペプチドは、ＦＵＳ−１ペプチドである、請求項５に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項７】
前記ＦＵＳ−１ペプチドは、配列番号１を含む、請求項５に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項８】
前記ＦＵＳ−１ペプチドは、配列番号１である、請求項５に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項９】
前記生物活性ペプチドは、
ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号２）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３）、
ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号４）、
ＭＧＬＧＬＨＬＬＶＬＡＡＡＬＱＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５）、
ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６）、
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号７）、
ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ（配列番号８）または
ＲＲＬＳＹＳＲＲＲＦ（配列番号９）
を含む、請求項５に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項１０】
前記生物活性ペプチドは、ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号２）を含む、請求項９に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項１１】
前記ペプチドは、腫瘍抑制遺伝子産物のアミノ酸配列の機能性ドメインを含む、請求項３に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項１２】
前記ペプチドは、腫瘍抑制遺伝子産物のアミノ酸配列の予想される機能性ドメインを含む、請求項３に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項１３】
前記予想される機能性ドメインは、前記腫瘍抑制遺伝子産物のアミノ酸配列のコンピュータ支援配列分析によって同定される、請求項１２に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項１４】
前記ポリペプチドは、タンパク質である、請求項１に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項１５】
前記タンパク質のアミノ酸配列は、腫瘍抑制遺伝子産物のアミノ酸配列に由来する、請求項１３に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項１６】
前記腫瘍抑制遺伝子は、表４に列挙される遺伝子である、請求項１４に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項１７】
前記腫瘍抑制遺伝子は、ＦＵＳ−１である、請求項１６に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項１８】
前記ナノ粒子は、脂質ベースのナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、ナノシェル、半導体ナノ結晶、量子ドット、ポリマーベースのナノ粒子、ケイ素ベースのナノ粒子、シリカベースのナノ粒子、金属ベースのナノ粒子、フラーレンまたはナノチューブである、請求項１に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項１９】
前記ナノ粒子は、脂質ベースのナノ粒子である、請求項１８に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項２０】
前記脂質ベースのナノ粒子は、リポソーム、中性リポソーム、ＤＯＰＣリポソームまたはＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞である、請求項１８に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項２１】
前記リポソームは、ＤＯＰＣリポソームである、請求項２０に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項２２】
前記ナノ粒子は、超常磁性ナノ粒子である、請求項１８に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項２３】
前記ナノ粒子は、超常磁性ナノ粒子であり、そして前記ナノ粒子−ポリペプチド複合体は、リポソーム内またはＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞内にある、請求項１８に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項２４】
前記リポソームは、ＤＯＰＣリポソームである、請求項２３に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項２５】
前記化学的部分は、脂肪酸である、請求項１に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項２６】
前記脂肪酸は、Ｃ４〜Ｃ１８脂肪酸である、請求項２５に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項２７】
前記脂肪酸は、ステアレートまたはミリステートである、請求項２５に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項２８】
前記化学的部分は、細胞透過性ペプチドである、請求項１に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項２９】
前記細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ  Ｔａｔ、ヘルペスウイルスＶＰ２２、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオボックス遺伝子産物に由来する、請求項２８に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項３０】
前記ナノ粒子と結合している第２の生物活性ポリペプチドをさらに含む、請求項１に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項３１】
前記第１の生物活性ポリペプチドおよび前記第２の生物活性ポリペプチドは、生物活性ペプチドであり、該生物活性ペプチドの各々は、異なる腫瘍抑制遺伝子産物に由来するアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項３２】
前記ナノ粒子−ポリペプチド複合体を組織または細胞を標的する標的化部分をさらに含む、請求項１に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項３３】
ａ）生物活性ポリペプチド、
ｂ）ナノ粒子、
を、該生物活性ポリペプチドがナノ粒子と結合している状態で含み、該生物活性ポリペプチドが、ステアレート部分の付加によって改変され、そして該ナノ粒子が、ＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞、ＤＯＰＣリポソームまたは超常磁性ナノ粒子である、ナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項３４】
ａ）アミノ酸配列ＫＬＲＲＶＨＫＮＬＩＰＱＧＩＶＫＬＤＨＰＲ（配列番号１）；または
ｂ）その生物学的に活性な改変体；
を含む、単離されたペプチド。
【請求項３５】
前記ペプチドは、１０アミノ酸残基長〜１００アミノ酸残基長である、請求項３４に記載のペプチド。
【請求項３６】
前記ペプチドは、１０アミノ酸残基長〜７５アミノ酸残基長である、請求項３５に記載のペプチド。
【請求項３７】
前記ペプチドは、１０アミノ酸残基長〜５０アミノ酸残基長である、請求項３６に記載のペプチド。
【請求項３８】
前記ペプチドは、１０アミノ酸残基長〜２５アミノ酸残基長である、請求項３７に記載のペプチド。
【請求項３９】
前記ペプチドは、１０アミノ酸残基長である、請求項３８に記載のペプチド。
【請求項４０】
前記ペプチドは、該ペプチドの細胞内取り込みを容易にする化学的部分の付加によって改変される、請求項３４に記載のペプチド。
【請求項４１】
前記化学的部分は、脂肪酸である、請求項４０に記載のペプチド。
【請求項４２】
前記化学的脂肪酸は、Ｃ４〜Ｃ１８脂肪酸である、請求項４１に記載のペプチド。
【請求項４３】
前記脂肪酸は、ステアレートまたはミリステートである、請求項４２に記載のペプチド。
【請求項４４】
前記化学的部分は、細胞透過性ペプチドである、請求項４０に記載のペプチド。
【請求項４５】
前記細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ  Ｔａｔ、ヘルペスウイルスＶＰ２２、またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオボックス遺伝子産物に由来する、請求項４４に記載のペプチド。
【請求項４６】
ａ）請求項３４〜４５のうちのいずれか１項に記載の生物活性ペプチド、
ｂ）ナノ粒子、
を含む、ナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項４７】
前記ナノ粒子は、脂質ベースのナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、ナノシェル、半導体ナノ結晶、量子ドット、ポリマーベースのナノ粒子、ケイ素ベースのナノ粒子、シリカベースのナノ粒子、金属ベースのナノ粒子、フラーレンまたはナノチューブである、請求項４６に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項４８】
前記ナノ粒子は、脂質ベースのナノ粒子である、請求項４７に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項４９】
前記脂質ベースのナノ粒子は、リポソームまたはＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞である、請求項４８に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項５０】
前記ナノ粒子は、超常磁性ナノ粒子である、請求項４７に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項５１】
前記ナノ粒子は、超常磁性ナノ粒子であり、そして前記ナノ粒子−ポリペプチド複合体は、リポソーム内またはＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞内にある、請求項４７に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項５２】
ａ）アミノ酸配列ＫＬＲＲＶＨＫＮＬＩＰＱＧＩＶＫＬＤＨＰＲ（配列番号１）のペプチド、
ｂ）ナノ粒子、
を、該ペプチドがナノ粒子と結合している状態で含み、該ペプチドは、ステアレート部分の付加によって改変され、そして該ナノ粒子は、リポソーム、ＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞、ＤＯＰＣリポソームまたは超常磁性ナノ粒子である、ナノ粒子−ポリペプチド複合体。
【請求項５３】
疾患を処置するための薬学的組成物であって、請求項１〜５２のうちのいずれか１項に記載のペプチドまたはナノ粒子−ポリペプチド複合体のうちのいずれか１つを薬学的に受容可能な希釈剤中に含む、薬学的組成物。
【請求項５４】
前記疾患が、癌である、請求項５３に記載の薬学的組成物。
【請求項５５】
化学療法剤をさらに含む、請求項５３に記載の薬学的組成物。
【請求項５６】
前記化学療法剤は、イマチニブである、請求項５５に記載の薬学的組成物。
【請求項５７】
前記癌は、肺癌である、請求項５４に記載の薬学的組成物。
【請求項５８】
前記肺癌は、ＮＳＣＬＣである、請求項５７に記載の薬学的組成物。
【請求項５９】
放射線とともに前記被験体に投与するために適していることを特徴とする、請求項５３に記載の薬学的組成物。
【請求項６０】
第２の生物活性ポリペプチドをさらに含む、請求項５３に記載の薬学的組成物。
【請求項６１】
ポリペプチドを細胞に送達するための組成物であって、
請求項１〜３３および請求項４６〜５２のうちのいずれか１項に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体のうちのいずれか１つ；
を含み、該ナノ粒子−ポリペプチド複合体が、該細胞による該生物活性ポリペプチドの取り込みを可能にするために十分な条件下で該細胞と接触させるために適していることを特徴とする、組成物。
【請求項６２】
被験体において腫瘍を処置するための組成物であって、
請求項１〜５２に記載のペプチドまたはナノ粒子−ポリペプチド複合体のうちのいずれか１つの治療的に有効な量
を含み、該ナノ粒子複合体のポリペプチドが、腫瘍抑制遺伝子産物のアミノ酸配列に基づく、組成物。
【請求項６３】
前記組成物は、腹腔内注射による投与のために適していることを特徴とする、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
前記腫瘍は、胃腸の腫瘍である、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６５】
ナノ粒子−ポリペプチド複合体を作製する方法であって、
ａ）生物活性ポリペプチドの配列中の１個以上の機能性ドメインを同定する工程；
ｂ）該機能性ドメインのうちの少なくとも１個を含むペプチドを調製する工程；
ｃ）所望の生物学的活性を有するペプチドを選択する工程；および
ｄ）該ペプチドとナノ粒子とを結合させることによってナノ粒子−ポリペプチド複合体を調製する工程；
を包含する、方法。
【請求項６６】
前記同定する工程は、コンピュータ支援構造分析を使用する工程を包含する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記コンピュータ支援構造分析は、推定上のプロテインキナーゼ相互作用部位、推定上のミリルトイル化部位、ＰＤＺクラスＩＩドメインモチーフまたはＡキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）モチーフの同定をもたらす、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ペプチドの細胞内取り込みを容易にする化学的部分を付加することによって該ペプチドを改変する工程をさらに包含する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記機能性ドメインは、腫瘍抑制遺伝子のアミノ酸配列の予想される機能性ドメインである、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
タンパク質チロシンキナーゼを阻害する方法であって、該キナーゼと、請求項３４〜４５のうちのいずれか１項に記載のペプチドのうちの１つとを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項７１】
前記キナーゼは、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ｃＫｉｔ、ｃＡｂｌ、またはＥｒｋである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、該腫瘍細胞と、請求項３４〜４５のうちのいずれか１項に記載のペプチドのうちの１つとを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項７３】
腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、該腫瘍細胞と、請求項４６〜５１のうちのいずれか１項に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体のうちの１つとを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項７４】
請求項１〜３２および請求項４６〜５１のうちのいずれか１項に記載のナノ粒子−ポリペプチド複合体のうちのいずれか１つを含み、該ナノ粒子が、超常磁性ナノ粒子である、磁気共鳴画像法のための組成物。
【国際調査報告】
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