(57)【要約】【化１】2009501224.tif 000018  本発明は、治療的に有効量の、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）よりなる群から選択される化合物、又は製薬学的に許容できるその塩又はエステル：［式中、フェニルはフッ素、塩素、臭素及びヨウ素よりなる群から選択される１〜５個のハロゲン原子でＸにおいて置換され、そしてＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は独立して、水素及びＣ１−Ｃ４アルキルよりなる群から選択され、ここでＣ１−Ｃ４アルキルは場合によりフェニル（ここでフェニルは場合により、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アミノ、ニトロ及びシアノよりなる群から独立して選択される置換基で置換されていてもよい）で置換されていてもよい］を、治療を必要とする被験体に投与する工程を含んでなる、神経保護を提供するための方法を対象とする。
2009501224.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的に有効量の、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）：
【化１】
2009501224.tif 000013
［式中、
フェニルはフッ素、塩素、臭素及びヨウ素よりなる群から選択される１〜５個のハロゲン原子でＸにおいて置換されており、そして
Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６は独立して、水素及びＣ１−Ｃ４アルキルよりなる群から選択され、ここでＣ１−Ｃ４アルキルは場合によりフェニルで置換されていてもよい（ここでフェニルは場合により、独立してハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アミノ、ニトロ及びシアノよりなる群から選択される置換基で置換されていてもよい）］
よりなる群から選択される化合物又は製薬学的に許容できるその塩又はエステルを、神経保護薬（ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｄｒｕｇ）（ＮＰＤ）による処置の必要な患者に投与することを含んでなる、神経保護を提供するための方法。
【請求項２】
Ｘが塩素である請求項１の方法。
【請求項３】
Ｘがフェニル環のオルソ位で置換されている請求項１の方法。
【請求項４】
Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６が水素から選択される請求項１の方法。
【請求項５】
治療的に有効量の、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）：
【化２】
2009501224.tif 000014
［式中、
フェニルはフッ素、塩素、臭素及びヨウ素よりなる群から選択される１〜５個のハロゲン原子でＸにおいて置換されており、そして
Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６は独立して、水素及びＣ１−Ｃ４アルキルよりなる群から選択され、ここでＣ１−Ｃ４アルキルは場合によりフェニルで置換されていてもよい（ここでフェニルは場合により、独立してハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−
Ｃ４アルコキシ、アミノ、ニトロ及びシアノよりなる群から選択される置換基で置換されていてもよい）］、
よりなる群から選択されるエナンチオマー又は製薬学的に許容できるその塩又はエステルあるいはそこで式（Ｉ）及び式（ＩＩ）よりなる群から選択される一方のエナンチオマーが優勢であるエナンチオマー混合物を、神経保護薬（ＮＰＤ）による処置の必要な患者に投与することを含んでなる、神経保護を提供する方法。
【請求項６】
Ｘが塩素である請求項５の方法。
【請求項７】
Ｘがフェニル環のオルソ位で置換されている請求項５の方法。
【請求項８】
Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６が水素から選択される請求項５の方法。
【請求項９】
式（Ｉ）及び式（ＩＩ）よりなる群から選択される一方のエナンチオマーが約９０％以上の程度まで優勢である請求項５の方法。
【請求項１０】
式（Ｉ）及び式（ＩＩ）よりなる群から選択される一方のエナンチオマーが約９８％以上の程度まで優勢である請求項５の方法。
【請求項１１】
式（Ｉ）及び式（ＩＩ）よりなる群から選択されるエナンチオマーが、式（Ｉａ）及び式（ＩＩａ）：
【化３】
2009501224.tif 000015
［式中、
フェニルはフッ素、塩素、臭素及びヨウ素よりなる群から選択される１〜５個のハロゲン原子でＸにおいて置換されており、そして
Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６は独立して、水素及びＣ１−Ｃ４アルキルよりなる群から選択され、ここでＣ１−Ｃ４アルキルは場合によりフェニルで置換されていてもよい（ここでフェニルは場合により、独立してハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アミノ、ニトロ及びシアノよりなる群から選択される置換基で置換されていてもよい）］、
よりなる群から選択されるエナンチオマーである、請求項５の方法。
【請求項１２】
Ｘが塩素である請求項１１の方法。
【請求項１３】
Ｘがフェニル環のオルソ位で置換されている請求項１１の方法。
【請求項１４】
Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６が水素から選択される請求項１１の方法。
【請求項１５】
式（Ｉａ）及び式（ＩＩａ）よりなる群から選択される一方のエナンチオマーが約９０
％以上の程度まで優勢である請求項１１の方法。
【請求項１６】
式（Ｉａ）及び式（ＩＩａ）よりなる群から選択される一方のエナンチオマーが約９８％以上の程度まで優勢である請求項１１の方法。
【請求項１７】
式（Ｉ）及び式（ＩＩ）よりなる群から選択されるエナンチオマーが、式（Ｉｂ）及び式（ＩＩｂ）：
【化４】
2009501224.tif 000016
よりなる群から選択されるエナンチオマーである請求項５の方法。
【請求項１８】
式（Ｉｂ）及び式（ＩＩｂ）よりなる群から選択される一方のエナンチオマーが約９０％以上の程度まで優勢である請求項１７の方法。
【請求項１９】
式（Ｉｂ）及び式（ＩＩｂ）よりなる群から選択される一方のエナンチオマーが約９８％以上の程度まで優勢である請求項１７の方法。
【請求項２０】
患者に神経保護を必要にさせるニューロン損傷の１種又は複数の原因が、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）；鈍角の及び貫通性頭部外傷を包含する、ＣＮＳ又はＰＮＳに対するいずれかの種類の傷害又は外傷；ＣＮＳの感染症；酸素欠乏症；脳卒中（ＣＶＡ）；ＣＮＳに影響する自己免疫疾患、例えば狼瘡；出産傷害、例えば周産期呼吸停止；心停止；治療的又は診断的血管手術法、例えば頸動脈血管内膜切除術又は脳血管造影法；脊髄外傷；低血圧；塞栓、高潅流又は低潅流からのＣＮＳに対する傷害；代謝障害、例えば糖尿病；低酸素症；ＮＰＤに反応することが知られた障害に対して知られた遺伝的素因；ＣＮＳの空間占居病巣；脳腫瘍、例えばグリア芽腫；ＣＮＳ中又はその周囲の出血又は大出血、例えば脳内出血又は硬膜下血腫；脳水腫；熱性痙攣；高体温；物質の乱用、外傷、卒中、虚血、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病異形クロイツフェルトヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、糖尿病神経障害、オリーブ橋小脳萎縮症、癲癇、発作、低血糖、手術又は他の介入物、網膜虚血（糖尿病他）、緑内障、網膜変性、多発性硬化症、毒性及び虚血性視神経障害、黄斑変性症、毒性又は有毒物質に対するＣＮＳ又はＰＮＳの露出；薬物中毒又は禁断、例えばコカイン又はアルコール；神経変性障害又は関連状態の家族歴、痙攣重積状態の病歴；患者が神経保護薬（ＮＰＤ）による処置を要するという、代理マーカー又はバイオマーカーからの証明、例えば構造的又は機能的病理を示すＭＲＩスキャン、ニューロン分解産物の上昇した血清レベル、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）の上昇したレベル：よりなる群から選択される、請求項１又は５に請求の方法。
【請求項２１】
患者に神経保護薬を必要とさせる１種又は複数の素因が、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、鈍角の、閉鎖した及び貫通頭部外傷；手術、卒中又は他の脳−血管事故（ＣＶＡ）；痙攣重積状態及びＣＮＳの空間占居病巣：よりなる群から選択される、請求項２０の方法。
【請求項２２】
１種又は複数の素因が、鈍角の、閉鎖した又は貫通頭部外傷及び外科的介入物を包含す
る外傷性脳傷害（ＴＢＩ）である請求項２１の方法。
【請求項２３】
１種又は複数の素因が卒中又は他の脳−血管事故（ＣＶＡ）である請求項２１の方法。
【請求項２４】
素因が神経変性疾患である請求項２３の方法。
【請求項２５】
化合物（又はエナンチオマー）又は製薬学的に許容できるその塩又はエステルが、１種又は複数の他の化合物又は治療剤との組み合わせ投与で投与される請求項１又は５の方法。
【請求項２６】
患者に対して神経保護効果が提供されるように、１種又は複数の他の化合物又は治療剤が、１項又は複数の以下の特性：抗酸化作用；ＮＭＤＡ受容体拮抗性；内因性ＧＡＢＡ阻害を増強する能力；ＮＯ合成酵素インヒビター作用；鉄結合能、例えば鉄キレート化剤；カルシウム結合能、例えばＣａ（ＩＩ）キレート化剤；亜鉛結合能、例えばＺｎ（ＩＩ）キレート化剤；ナトリウム又はカルシウムイオンチャンネルブロック能；カリウム又は塩化物イオンチャンネルを開く能力；を有する化合物よりなる群から選択される、請求項２５の方法。
【請求項２７】
１種又は複数の化合物が更に、抗癲癇薬（ＡＥＤ）よりなる群から選択されることができる請求項２６の方法。
【請求項２８】
抗癲癇薬（ＡＥＤ）がカルバマゼピン、クロバザム、クロナゼパム、エトスクシミド、フェルバメート、ガバペンチン、ラモチギン、レベチラセタム、オキシカルバゼピン、フェノバルビタール、フェニトイン、プレガバリン、プリミドン、レチガビン、タラムパネル、チアガビン、トピラメート、バルプロエート、ビガバトリン、ゾニサミド、ベンゾジアゼピン、バルビツレート又は鎮静催眠剤；よりなる群から選択される、請求項２７の方法。
【請求項２９】
製薬学的有効量の、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）：
【化５】
2009501224.tif 000017
［式中、
フェニルはフッ素、塩素、臭素及びヨウ素よりなる群から選択される１個〜５個のハロゲン原子でＸにおいて置換されており、そして
Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６は独立して、水素及びＣ１−Ｃ４アルキルよりなる群から選択され、ここでＣ１−Ｃ４アルキルは場合によりフェニルで置換されていてもよく（ここでフェニルは場合により、独立してハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アミノ、ニトロ及びシアノよりなる群から選択される置換基で置換されていてもよい）］、
よりなる群から選択されるエナンチオマー又は製薬学的に許容できるその塩又はエステルあるいは、そこで式（Ｉ）及び式（ＩＩ）よりなる群から選択される一方のエナンチオマ
ーが優勢であるエナンチオマー混合物並びに製薬学的に許容できる担体又は賦形剤を含んでなる、神経保護を提供するための製薬学的組成物。
【請求項３０】
治療を要する患者に神経保護を提供するための、適当な使用のための情報又は指示書と一緒に、適当な包装物又は容器中に、請求項２９に請求される製薬学的組成物の治療的に有効な投与剤形を含んでなるキット。
【請求項３１】
治療的有効量が約０．０１ｍｇ／Ｋｇ／１回〜約１００ｍｇ／Ｋｇ／１回である請求項１又は５における方法。
【請求項３２】
患者が投与時にニューロン傷害又は機能不全の臨床的症状又は症候を発症していない、請求項１又は５に請求の方法。
【請求項３３】
患者が投与時にニューロン傷害又は機能不全を発症する危険にある、請求項１又は５に請求の方法。
【請求項３４】
患者が投与時に神経変性障害又は、ニューロン傷害の臨床的証拠を発症した、請求項１又は５に請求の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概括的に薬理学、神経学及び精神医学の分野並びに哺乳動物の中枢神経系の細胞を損傷又は傷害から保護する方法を対象とする。本発明は更に具体的には、神経保護のための特定のカルバメート化合物の使用法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
中枢神経系（ＣＮＳ）又は末梢神経系（ＰＮＳ）に対する種々の種類の傷害又は外傷は、甚大なそして長期持続性の神経学的及び／又は精神医学的症状及び障害をもたらす可能性がある。これが採ることができる１つの形態は、ニューロン又は中枢神経系（ＣＮＳ）の他の細胞の進行的死滅、すなわち神経変性又はニューロン変性である。例えばアルツハイマー病、多発性硬化症、脳−血管事故（ＣＶＡ）卒中、外傷性脳傷害、脊髄傷害、視神経の変性、例えば虚血性視神経障害又は網膜変性及び他の脳神経系の障害の結果としてのニューロン変性は、その高い発生率及び長期にわたる後遺症の頻度の両者のために甚大な医学的及び公衆衛生的問題である。動物研究及び臨床試験により、アミノ酸伝達物質（特にグルタメート）、酸化的ストレス及び炎症反応がこれらの状態における細胞死に強力に貢献することが示された。
【０００３】
傷害時又は虚血性発作時に、損傷されたニューロンが大量の神経伝達物質のグルタメートを放出し、それが周囲のニューロンに興奮毒性である（非特許文献１〜５参照）。グルタメートは哺乳動物の神経系における興奮シナプス伝達物質である陰性に帯電したアミノ酸である。グルタメートの濃度は神経末端ではミリモルの範囲に到達することができるが、その細胞外濃度は神経毒性を予防するために低レベルに維持されている。グルタメートは高濃度で提供されるとニューロンに毒性であることができることが注目された。用語の「興奮毒性」は、高用量で適用されるとグルタメート（及び他のそのような興奮性アミノ酸）がニューロン上にもつ可能性がある細胞毒性効果を表すために使用されてきた。
【０００４】
生理学的には、過剰な放出、取り込みの阻止、又はその両者がグルタメートの高レベルを達成することができる。通常、細胞外グルタメートの低濃度はニューロン及び星状細胞両者により維持される。ニューロンは細胞外貯蔵体中にグルタメートを保存し、その放出を制御する。例えば、非特許文献６を参照されたい（非特許文献６）。星状細胞は特別の運搬体により細胞外グルタメートを取り込み、グルタメートをグルタミンに転化させ、次にそれがニューロン取り込みのために放出される。非特許文献７を参照されたい（非特許文献７参照）。興奮毒性の過程において、グルタメートがニューロンにより自己永続的方法で放出されて、グルタメート受容体の過剰な又は長期の活性化をもたらす。
【０００５】
細胞外グルタメートの毒性レベルを閉じ込めるための神経支持的星状細胞の妥協した能力と一緒に、エネルギーの枯渇したニューロンに対するこのような過剰なグルタメート刺激の結合が、壊死及び細胞死によるニューロン死滅をもたらす。現在、中枢神経系の傷害及び疾患に伴なうニューロン死滅を軽減するための種々の介入物が研究されている。非特許文献８を参照されたい（非特許文献８）。このような治療は、グルタメート放出インヒビター、グルタメート受容体アンタゴニスト、Ｃａ２＋チャンネルブロッカー、ＧＡＢＡ受容体アゴニスト、ガングリオシド、神経栄養因子、カルパインインヒビター、カスパーゼインヒビター、フリーラジカル・スカベンジャー、免疫−及び細胞代謝モジュレーターを包含する。
【０００６】
例えば、幾つかの研究が、１）ハンチントン病（ＨＤ）（非特許文献９）、２）アルツハイマー病（ＡＤ）（非特許文献１０）、３）癲癇（非特許文献１１）、４）ラティリス
ム（非特許文献１２）、５）筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及びグアムのパーキンソン病様痴呆（非特許文献１３）：の病理生理学並びに、卒中、虚血及び再潅流に伴なう神経病理学（非特許文献１４）におけるグルタメートの関与を示した（非特許文献９〜１４参照）。
【０００７】
従って、ニューロンに対する傷害はグルタメート及びアスパルテートを包含する興奮性アミノ酸による受容体の過剰刺激により誘発されることができる（非特許文献１５参照）。実際、グルタメート受容体のＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）サブタイプが、シナプス伝達、学習及び記憶、並びにニューロンの発達を包含する、正常な脳機能における多数の重要な役割をもつことが示唆されている（非特許文献１５、１６参照）。しかし、グルタメート受容体のＮＭＤＡサブタイプの過剰刺激は、増加したフリーラジカル産生及びニューロン細胞死をもたらし、それは抗酸化剤により改変することができる（非特許文献１７、１８参照）。
【０００８】
更に、多数の慢性神経変性状態において、炎症及び酸化ストレスが病理の重要な要素である。これらの状態は、アルツハイマー病（ＡＤ）を包含する。アルツハイマー病（ＡＤ）は脳内の神経原繊維のもつれ及び老人斑の蓄積並びにニューロンの広範な、進行性変性を特徴として示す。老人斑は、染色体２１上に局在するＡＰＰ遺伝子によりコードされるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）が豊富である。ＡＤの病原の基礎になる一般に容認される仮説は、ＡＰＰの異常なタンパク質分解性開裂が、ニューロンに毒性であることが示されているベータ−アミロイド（Ａβ）ペプチドの過剰な細胞外蓄積をもたらすことである（非特許文献１９〜２２参照）。
【０００９】
パーキンソン病（ＰＤ）は無運動、硬直、振顫及び姿勢異常よりなる運動の機能不全を特徴として示す進行性の神経変性障害である。この疾患は黒質圧縮部分（ＳＮｐｃ）中のドーパミン作動性ニューロンの実質的減少により証明されるような黒質・線条体のドーパミン作動性ニューロンの完全性及び機能の喪失（非特許文献２３参照）並びに線条体中の内容物（ｃｏｎｔｅｎｔ）、ドーパミンのシナプス及び小胞の運搬体の減少と関連付けられてきた（例えば非特許文献２４参照）。
【００１０】
外傷、多数の種類の傷害、虚血、代謝の混乱、例えば糖尿病低酸素症、トキシン又は外科的介入物の結果としての、ヒトを包含する哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）又は末梢神経系（ＰＮＳ）におけるニューロン及び支持細胞の死滅が、機能の急性及び慢性及び進行性喪失及び身体障害の双方を誘発する。従って、この変性から哺乳動物の神経系の細胞を保護することができる、すなわち神経保護的である方法及び化合物の開発が必要である。
【非特許文献１】Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８），Ｎｅｕｒｏｎ  １：６２３−６３４
【非特許文献２】Ｒｏｔｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：１８８４−１８９１
【非特許文献３】Ｃｈｏｉ  ｅｎｄ  Ｒｏｔｈｍａｎ，（１９９０），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：１７１−１８２
【非特許文献４】Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８），Ｅｘｐ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．４６：６５７−６６２
【非特許文献５】Ｄｒｅｊｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４５：１４５−１５１
【非特許文献６】Ｒｅａｇａｎ，Ｒ．Ｆ．，Ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｔｒａｕｍａ，Ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｔｒａｕｍａ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４，ｐｐ．１７３−１８１（Ｓａｌｚｍａｎ  ＳＫ，Ｆａｄｅｎ  ＡＩ，ｅｄｓ）
【非特許文献７】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｂ．＆  Ｄｏｗｄ  ＬＡ，Ａｄｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９７；３７：６９−１１５
【非特許文献８】Ｋｅｒｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ  ２９８：３８３−３９５，１９９９
【非特許文献９】Ｃｏｙｌｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｒｔｚ，（１９７６），Ｎａｔｕｒｅ  ２６３：２４４−２４６
【非特許文献１０】Ｍａｒａｇｏｓ  ｅｔ  ａｌ，（１９８７），ＴＩＮＳ  １０：６５−６８；３
【非特許文献１１】Ｎａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９７８），Ｎａｔｕｒｅ  ２７１：６７６−６７７
【非特許文献１２】Ｓｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９８６），Ｌａｎｃｅｔ  ２３９：１０６６−１０６７
【非特許文献１３】Ｃａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ，（１９８６），Ｌａｎｃｅｔ  ２：１０６７−１０７０
【非特許文献１４】Ｄｙｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ，（１９８７），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４９：１２２２−１２２８
【非特許文献１５】Ｌｉｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３０：６１３  ６２１
【非特許文献１６】Ｍｅｌｄｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１１：３７９−３８７
【非特許文献１７】Ｈｅｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７８：１３０７−１３１４
【非特許文献１８】Ｒｏｓｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．３１８：１３７−１４０
【非特許文献１９】Ｓｅｌｋｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４８７−４９８
【非特許文献２０】Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１），Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１６８：２０３−２１２
【非特許文献２１】Ｍａｔｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓ．Ｒｅｖ．１２：１−１４
【非特許文献２２】Ｆａｋｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６６７：２６９−２７２
【非特許文献２３】Ｐａｋｋｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔ．５４：３０−３３
【非特許文献２４】Ｇｕｔｔｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４８：１５７８−１５８３
【発明の開示】
【００１１】
本発明は概括的に神経保護的方法、そしてより具体的には、傷害、外傷、手術あるいは急性又は慢性疾患の経過からもたらされる哺乳動物の中枢神経系及び末梢神経系の細胞に対する障害の予防のための方法及び化合物を対象とする。
【００１２】
本発明は一部は、単独であるいは１種又は複数の他の神経保護的医薬と組み合わせたいずれかで、カルバメート化合物の１族の１種又は複数のメンバーの投与が、哺乳動物の神経系に神経保護的効果を与えるという発見に基づく。
【００１３】
本発明により提供される神経保護は、ニューロンの傷害又は損傷から、そして興奮毒性を包含する神経毒性からもたらされる損傷からの保護を包含する。従って、本発明により提供される神経保護は、卒中／虚血、外科的外傷、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、鈍角の、閉鎖又は貫通した頭部外傷、癲癇、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、糖尿
病性神経障害及び低血糖性脳障害を包含する興奮毒性、例えばグルタメート興奮毒性を伴なうことができる急性及び慢性の神経変性障害の処置に有用であろう。
【００１４】
本発明により提供される神経保護は、傷害組織又は疾病組織に対してあるいは神経の損傷に導くことが期待される事象中又はその前に予防的な方法でもたらすことができる。
【００１５】
本発明は、製薬学的に許容できる賦形剤と一緒に、単独で又はもう１種の医薬と組み合わせてのいずかで、有効量の本発明の化合物又は製薬学的に許容できるその塩又はエステルを被験体に投与することにより、治療を要する被験体において、神経保護を提供するため；細胞変性又は細胞死を阻止するため；神経変性疾患の処置又は予防のため；あるいは化合物（例えばグルタメートのような興奮性アミノ酸；トキシン；又は細胞毒性副作用を与える予防的又は治療的化合物）の細胞毒性効果を緩和するための方法を提供する。種々の態様において、本発明の方法は興奮毒性、例えばグルタメート興奮毒性に対する保護を包含する。
【００１６】
種々の態様において、被験体、例えばヒトは神経障害又は傷害を罹患しているかも知れず、あるいは物質乱用、外傷、卒中、虚血、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、異形クロイツフェルトヤコブ病、筋萎縮性又は低血糖性脳障害から選択される状態を罹患しているかも知れず；あるいは手術又は他の介入物を受けているかも知れない。被験体は神経保護により利益を得るであろう前以て既存の状態をもつかも知れず、あるいは、患者は手術又は他の介入物期間中に起るかも知れないような同時の又はその後の神経傷害の有害な効果を減少させるために処置されるかも知れない。
【００１７】
従って、本発明は、式１又は式２：
【００１８】
【化１】
2009501224.tif 000003
【００１９】
［式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３及びＲ４は独立して、水素又はＣ１−Ｃ４アルキルであり、そしてＸ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４及びＸ５は独立して水素、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素である］
を有する少なくとも１種の化合物を含んでなる、治療的に有効量の組成物を、治療を要する被験体に投与する工程を含んでなる、神経保護を提供するための方法を提供する。式１又は式２の該Ｃ１−Ｃ４アルキル基は置換されていても又は未置換でもよい。本発明の１つのアスペクトにおいて、Ｃ１−Ｃ４アルキル基はフェニル基で置換されている。フェニル基は未置換でも置換されていてもよい。特定の態様において、フェニル基は未置換であるかあるいはハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アミノ、ニトロ又はシアノで置換されている。
【００２０】
本発明において、Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４及びＸ５は水素、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素である。特定の態様において、Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４及びＸ５は独立して水素又は塩素である。本発明の好ましい態様において、Ｘ１はフッ素、塩素、臭素又はヨウ素である。１つのアスペクトにおいて、Ｘ１は塩素であり、そしてＸ２，Ｘ３，Ｘ４及びＸ５は独立して水素である。もう１つの好ましい態様において、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３及びＲ４は独立して水素である。
【００２１】
本発明は被験体に神経保護を提供するための式１又は式２のエナンチオマーを提供する。特定の態様において、式１又は式２の化合物はそれらの単一のエナンチオマーの形態にあるであろう。他の態様において、式１又は式２の化合物はその一方のエナンチオマーがもう一方のエナンチオマーに対して優勢であるエナンチオマー混合物の形態にあるであろう。１つのアスペクトにおいて、エナンチオマーは９０％以上の程度まで又は９８％以上の程度まで優勢であろう。
【００２２】
本発明はまた、そのＲ１，Ｒ２，Ｒ３及びＲ４が独立して水素又はＣ１−Ｃ４アルキルであり、そしてＸ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４及びＸ５が独立して水素、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素である、式１又は式２を有する少なくとも１種の化合物を含んでなる、神経保護的な量の組成物を被験体に投与する工程を含んでなる方法を提供する。１つの態様において、被験体に対する組成物の投与の前に、被験体がある形態の急性又は慢性神経変性あるいは神経系の傷害を罹患するか否かにつき決定されるであろう。
【００２３】
本発明はまた、急性又は慢性神経変性又は神経系の傷害を発症する危険にある患者あるいは以下に定義されるような神経保護薬（ＮＰＤ）による処置の必要な患者を識別し、そして被験体に式１又は式２を有する少なくとも１種の化合物を含んでなる組成物を投与する工程を含んでなる方法を提供する。
【００２４】
本発明の特定の態様において、神経保護を提供するための式１又は式２を有する化合物の治療的有効量は約０．０１ｍ／Ｋｇ／１回〜約１５０ｍｇ／Ｋｇ／１回である。
【００２５】
特定の態様において、本発明の１種又は複数のエナンチオマー又は製薬学的に許容できるその塩又はエステル並びに製薬学的に許容できる担体又は賦形剤を含んでなる、神経保護を提供するための治療的有効量の製薬学的組成物が、神経保護薬又はＮＰＤによる処置の必要な被験体又は患者に投与される。
【００２６】
式１又は式２を有する少なくとも１種の化合物を含んでなる製薬学的組成物が治療を必要とする被験体に投与される。特定の態様において、神経保護又はＮＰＤによる処置の必要な被験体又は患者は、中枢神経又は末梢神経の細胞に、ある形態の急性外傷又は傷害を経験した患者でもあるいは、ある形態の急性又は慢性の神経変性障害を有する患者であってもよい。１つのアスペクトにおいて、被験体又は患者は投与時に、急性又は慢性神経変性障害を発症する危険にある、すなわち神経保護薬による処置の必要な患者であることを決定されるであろう。他の態様において、処置を要する被験体は、投与時に、それらの神経系の細胞に急性の傷害又は外傷を有する被験体である。
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明のカルバメート化合物
本発明は、治療を要する患者に対する神経保護に対して、２−フェニル１，２−エタンジオールモノカルバメート及びジカルバメートを使用する方法を提供する。
【００２８】
本発明の方法に使用されるカルバメートエナンチオマーを包含するカルバメート化合物を合成し、精製する適当な方法は当業者に周知である。例えば、２−フェニル１，２−エタンジオールモノカルバメート及びジカルバメートの純粋なエナンチオマー形態及びエナンチオマー混合物は米国特許第５，８５４，２８３，５，６９８，５８８及び６，１０３，７５９号明細書に記載されており、それらの開示はそれらの全体を引用により本明細書に編入されている。
【００２９】
本発明に従う代表的カルバメート化合物は式１又は式２：
【００３０】
【化２】
2009501224.tif 000004
【００３１】
［式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３及びＲ４は独立して水素又はＣ１−Ｃ４アルキルであり、そしてＸ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４及びＸ５は独立して、水素、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素である］を有するものを包含する。
【００３２】
本明細書で使用される「Ｃ１−Ｃ４アルキル」は１〜４個の炭素原子を有する置換又は未置換脂肪族炭化水素を表す。「アルキル」の定義内に具体的に包含されるものは、場合により置換されていてもよい脂肪族炭化水素である。本発明の好ましい態様において、Ｃ１−Ｃ４アルキルは未置換でもフェニルで置換されていてもよい。
【００３３】
本明細書で使用される用語「フェニル」は単独で使用されても又はもう１つの基の一部として使用されても、６個の炭素原子を有する置換又は未置換芳香族炭化水素環基と定義される。「フェニル」の定義内に具体的に包含されるものは、場合により置換されていてもよいフェニル基である。例えば、本発明の好ましい態様において、「フェニル」基は未置換でも、あるいはハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アミノ、ニトロ又はシアノで置換されていてもよい。
【００３４】
本発明の好ましい態様において、Ｘ１はフッ素、塩素、臭素又はヨウ素でありそしてＸ２，Ｘ３，Ｘ４及びＸ５は水素である。
【００３５】
本発明のもう１つの好ましい態様において、Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４及びＸ５は独立して塩素又は水素である。
【００３６】
本発明のもう１つの好ましい態様において、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３及びＲ４はすべて水素である。
【００３７】
本発明の化合物上の置換基及び置換パターンは、化学的に安定であり、そして当業者に知られた技術並びに本明細書に提供される方法により容易に合成することができる化合物を提供するように当業者により選択されることができることは理解される。
【００３８】
代表的な２−フェニル１，２−エタンジオールモノカルバメート及びジカルバメートは例えば、以下の化合物：
【００３９】
【化３】
2009501224.tif 000005
【００４０】
【化４】
2009501224.tif 000006
【００４１】
を包含する。
【００４２】
本発明は式１及び式２の単離エナンチオマーの使用を包含する。１つの好ましい態様において、式１の単離Ｓ−エナンチオマーを含んでなる製薬学的組成物が被験体に神経保護を提供するために使用される。もう１つの好ましい態様においては、式２の単離Ｒ−エナンチオマーを含んでなる製薬学的組成物が被験体に神経保護を提供するために使用される。もう１つの態様において、式１の単離Ｓ−エナンチオマー及び式２の単離Ｒ−エナンチオマーを含んでなる製薬学的組成物が被験体に神経保護を提供するために使用されることができる。
【００４３】
本発明はまた、式１又は式２のエナンチオマーの混合物の使用を包含する。本発明の１
つのアスペクトにおいて、一方のエナンチオマーが優勢であろう。混合物中で優勢であるエナンチオマーは、混合物中に存在するいずれかの他方のエナンチオマーよりも多い量で、例えば５０％を超える量で混合物中に存在するものである。１つのアスペクトにおいて、一方のエナンチオマーは９０％の程度まで、あるいは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％又は９８％以上の程度まで優勢であろう。１つの好ましい態様において、式１の化合物を含んでなる組成物中で優勢であるエナンチオマーは式１のＳ−エナンチオマーである。もう１つの好ましい態様において、式２の化合物を含んでなる組成物中で優勢であるエナンチオマーは式２のＲ−エナンチオマーである。
【００４４】
本発明の好ましい態様において、本発明の組成物中で単一のエナンチオマーとして又は優勢なエナンチオマーとして存在するエナンチオマーは、式中Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４，Ｘ５，Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３及びＲ４が前記のとおりに定義される式３又は式５によりあるいは式７又は式８により表される。
【００４５】
【化５】
2009501224.tif 000007
【００４６】
【化６】
2009501224.tif 000008
【００４７】
本発明は、式１及び式２により表される化合物のエナンチオマー及びエナンチオマー混合物を使用する方法を提供する。式１又は式２のカルバメートエナンチオマーはフェニル環に隣接する脂肪族炭素である、ベンジル位における不斉キラル炭素を含有する。
【００４８】
単離されるエナンチオマーは対応するエナンチオマーを実質的に含まないものである。従って、単離エナンチオマーは分離法により分離される又は対応するエナンチオマーを含まずに調製される化合物を表す。本明細書で使用される用語「実質的に含まない」は、化合物が有意により大きい割合の一方のエナンチオマーでなることを意味する。好ましい態様において、化合物は少なくとも約９０重量％の好ましいエナンチオマーを包含する。本発明の他の態様において、化合物は少なくとも約９９重量％の好ましいエナンチオマーを包含する。好ましいエナンチオマーは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びキラル塩の形成及び結晶化を包含する、当業者に知られたいずれかの方法によりラセミ混合物から単離するかあるいは、好ましいエナンチオマーを本明細書に記載の方法により調製することができる。
【００４９】
好ましいエナンチオマーの調製法は当業者に知られていると思われそして、例えばＪａｃｑｕｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１）；Ｗｉｌｅｎ，Ｓ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３３：２７２５（１９７７）；Ｅｌｉｅｌ，Ｅ．Ｌ．Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮＹ，１９６２）；及びＷｉｌｅｎ，Ｓ．Ｈ．Ｔａｂｌｅｓ  ｏｆ  Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｐ．２６８（Ｅ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ，Ｅｄ．，Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｎｏｔｒｅ  Ｄａｍｅ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｔｒｅ  Ｄａｍｅ，ＩＮ  １９７２）に記載されている。
【００５０】
更に、本発明の化合物は米国特許第３，２６５，７２８号明細書（その明細はその全体をすべての目的のために引用により本明細書に編入されている）、第３，３１３，６９２号明細書（その明細はその全体をすべての目的のために引用により本明細書に編入されている）及び前記に引用された米国特許第５，８５４，２８３号、第５，６９８，５８８号及び第６，１０３，７５９号明細書（その明細はその全体をすべての目的のために引用により本明細書に編入されている）に記載のように調製することができる。
【００５１】
神経保護の性状
中枢神経（ＣＮＳ）又は、網膜を包含する末梢神経（ＰＮＳ）系に対するいずれかの種類の傷害又は損傷を有する患者はこれらの神経保護法から利益を得ることができる。この神経系の傷害は例えば、ニューロン細胞死又は障害（ｃｏｍｏｐｒｏｍｉｓｅ）をもたらす、限定はしないが、急性傷害、低酸素虚血又はそれらの組み合わせ物を包含する急性神経変性障害におけるような神経系に対する突然の障害又は急性傷害の形態を採る可能性がある。急性傷害は限定はされないが、閉鎖した、鈍角の又は貫通した脳外傷、局所性（ｆｏｃａｌ）脳外傷、拡散脳損傷、脊髄傷害、頭蓋内又は脊柱内病巣（限定はされないが、脊髄の挫傷、貫通、剪断、圧縮又は裂傷病巣あるいは幼児の揺さぶり鞭打ち症を包含）を包含する外傷性脳傷害（ＴＢＩ）を包含する。
【００５２】
更に、概括的に酸素又は血液供給の剥奪は、限定はされないが、心血管不全、脳虚血又は脳梗塞（塞栓性閉塞症及び血栓症から発生する脳虚血又は梗塞、網膜虚血（糖尿病性他）、緑内障、網膜変性、多発性硬化症、毒性及び虚血性視神経障害、急性虚血後の再潅流、周産期低酸素−虚血傷害、心停止又はあらゆるタイプの頭蓋内出血（限定はされないが、硬膜外、硬膜下、クモ膜下又は脳内出血を包含）を包含）を包含する低酸素症及び／又は虚血におけるような急性傷害を誘発する可能性がある。
【００５３】
神経系の組織に対する外傷又は傷害はまた、限定はされないが、アルツハイマー病、ピック病、拡散レービー小体病、進行性核上麻痺（スチール・リチャードソン症候群）、多系変性（シャイ・ドレーガー症候群）、神経変性を伴なう慢性癲癇状態、運動ニューロン病（筋萎縮性側索硬化症）、多発性硬化症、変性運動失調、皮質基底変性、グアムのＡＬＳ・パーキンソン・痴呆複合物、亜急性硬化性汎脳炎、ハンチントン病、パーキンソン病、シヌクレイノパシー（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）（多系萎縮を包含）、原発性進行性失語症、線条体黒質変性症、マシャド・ジョーゼフ病又は脊髄小脳失調タイプ３及びオリーブ橋小脳変性症、延髄及び偽球麻痺、脊髄及び脊髄延髄筋萎縮（ケネディー病）、原発性側索硬化症、家族性痙性対麻痺、ウェルドニッヒ・ホフマン病、クーゲルベルグ・ウェランデル病、テイ・サックス病、サンドホフ病、家族性痙攣性疾患、ボールファルト・クーゲルベルク・ウェランデル病、痙攣性不全対麻痺、進行性多焦点白質脳症、家族性自律神経障害（ライリー・デイ症候群）あるいはプリオン病（限定はされないが、クロイツフェルトヤコブ病、ゲルストマン・ストルスラー・シャインカー病、クールー（Ｋｕｒｕ）病又は致死的家族性不眠症を包含）を包含する、長期間にわたる進行性ニューロン細胞死又は障害を伴なうもののような、より慢性で、進行性の神経変性障害の形態を採る可能性がる。
【００５４】
更に、神経系に対する外傷及び進行性傷害は、限定はされないが、双極性障害又は分裂情動性障害又は、統合失調症、衝動制御障害、強迫性衝動性障害（ＯＣＤ）、一過性大脳葉癲癇における行動の変化及び人格障害の、進行性の悪化する形態を包含する、種々の精神医学的障害に起る可能性がある。
【００５５】
１つの好ましい態様において、本発明の化合物は種々の精神医学的障害における神経系に対する外傷及び進行性傷害に関与する障害における神経保護を提供するために使用されるであろう。これらの障害は、分裂情動障害、統合失調症、衝動制御障害、強迫性衝動性
障害（ＯＣＤ）及び人格障害：よりなる群から選択されるであろう。
【００５６】
更に、外傷及び傷害は、限定はされないが、年齢関連痴呆、血管性痴呆、拡散性白質病（ビンスワンゲル病）、内分泌又は代謝源の痴呆、頭部外傷及び拡散脳損傷の痴呆、拳闘家痴呆又は、限定はされないが、ピック病を包含する前頭葉痴呆に関連する神経変性障害を包含する、明白な高度の記憶喪失を伴なう障害の形態を採る可能性がある。
【００５７】
神経傷害と関連する他の障害は、限定はされないが、網膜を包含する神経系の化学的、毒性の、感染性の及び放射線傷害と関連する障害、胎児の発育期の傷害、出生時未熟児、無酸素−虚血、肝臓、血糖、尿毒症、電解質及び内分泌源からの傷害、精神医学源の傷害（限定はされないが、精神病理、鬱病又は心配症を包含）、末梢疾患及び叢障害（ｐｌｅｘｏｐａｔｈｉｅｓ）（叢麻痺を包含）からの傷害又は神経障害からの傷害［多焦点、感覚、運動、感覚−運動、自律神経、感覚−自律神経又は脱髄神経障害（限定はされないが、ギラン−バレー症候群又は慢性炎症性脱髄多発性神経根障害を包含）から選択される神経障害あるいは感染症、炎症、免疫障害、薬物乱用、薬理学的処置、トキシン、外傷（限定はされないが、圧縮、粉砕、裂傷又は細分化外傷を包含）、代謝障害（限定はされないが、内分泌又は腫瘍随伴障害を包含）、シャルコー・マリー・ツース病（限定はされないが、タイプ１ａ、１ｂ、２、４ａ又は１−Ｘ結合を包含）、フリードライヒ運動失調、異染性白質萎縮症、レフサム病、副腎骨髄神経障害、毛細血管拡張性運動失調症、ジェリン・ソッタ（Ｄｊｅｒｉｎｅ−Ｓｏｔｔａｓ）（限定はされないが、タイプＡ又はＢを包含）、ランベルト・イートン症候群又は頭部神経の障害から発生する神経障害、から選択される神経障害を包含］を包含する。
【００５８】
従って、本明細書で使用される用語「神経保護」は、ヒトを包含する哺乳動物の中枢神経又は末梢神経系中の神経細胞、軸索又はそれらの支持細胞の機能不全、変性又は死滅の重篤度を阻止、予防、緩和又は減少すること；を意味することとする。これは、処置を要する患者における、神経変性疾患の処置又は予防；化合物（例えばグルタメートのような興奮性アミノ酸；トキシン又は、限定はされないが、細胞死の即座の又は遅れた誘発を包含する、即座の又は遅れた細胞毒的副作用を与える予防的もしくは治療的化合物）の興奮毒性に対する保護又はその細胞毒性効果を緩和することを包含する。
【００５９】
従って、本明細書で使用される用語「神経保護薬（ＮＰＤ）による処置の必要な患者」は、前記の症候又は障害のいずれか、あるいは、患者の現在の臨床状態又は予後が、いずれかの神経学的又は精神医学的障害の発症、拡大、悪化又は、処置に対する増加した抵抗；を阻止するための神経保護を提供することから利益を得ることができるであろう、いずれかの障害を、現在有する又は発症する可能性があるあらゆる患者を表すであろう。
【００６０】
用語「抗癲癇薬」（ＡＥＤ）は用語「抗痙攣剤」と互換性に使用され、そして本明細書で使用される双方の用語は、薬剤が被験体又は患者に投与される時に発作活動又は急発作発生（ｉｃｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）を阻止する（例えば予防する、遅延させる、停止する、又は逆転させる）ことができる薬剤を表す。
【００６１】
用語「薬作用発生団」は当該技術分野で知られており、そして本明細書で使用されるように、選択される生化学的効果、例えば酵素の阻害、受容体への結合、イオンのキレート化等を実施することができる分子部分を表す。選択される薬作用発生団は２種以上の生化学的効果をもつことができ、例えば１つの酵素のインヒビターであり、そして第２の酵素のアゴニストであることができる。治療剤は、同一の又は異なる生化学的作用をもつことができる１個以上の薬作用発生団を包含することができる。
【００６２】
本明細書で使用される用語「処置すること」又は「処置」は、症状の軽減；寛解；減少
のようないずれかの客観的又は主観的パラメーターを包含する傷害、病理又は状態の予防又は緩和、あるいは傷害、病理学又は状態を患者により耐容できるものにさせる；変性又は低下の速度を遅延させる；変性の最終点をより悲劇的でなくする；あるいは被験体の身体的又は精神的福利を改善する点における成功のなんらかの証拠を表す。症候の処置又は緩和は、身体検査、神経学的検査及び／又は精神医学的評価の結果を包含する、客観的又は主観的パラメーターに基づくことができる。従って、用語「処置すること」又は「処置」は神経保護を提供するための本発明の化合物又は薬剤の投与を包含する。場合によっては、本発明の化合物による処置は、ニューロンの死滅又は損傷又は脳機能不全又は脳過剰興奮性の進行を予防、阻止又は停止するための、他の神経保護化合物又はＡＥＤと組み合わせて、実施されるであろう。
【００６３】
本明細書で使用される用語「治療的効果」は、患者の中枢神経又は末梢神経系の細胞の死滅又は損傷又は機能不全を予防する又は最少にするための神経保護効果の有効な提供を表す。
【００６４】
本明細書で使用される用語「治療的有効量」は、このような神経保護処置を要する被験体又は患者における、前記に定義の治療的効果をもたらすための、十分量の、本発明の１種又は複数の化合物を意味する。
【００６５】
用語「被験体」又は「患者」は本明細書では互換性に使用され、本明細書では、限定はされないが、本発明の組成物をそれに投与することができるヒトの患者又は被験体を包含する人類を包含する、あらゆる哺乳動物を意味する。用語の哺乳動物はヒトの患者及びヒト以外の霊長類並びに、ウサギ、ラット及びマウスのような実験動物及び他の動物を包含する。
【００６６】
幾つかの態様においては、本発明の方法は、有利には、カルバメート化合物又は現在知られている神経保護化合物又はＡＥＤで有効に処置されることが当該技術分野で知られている状態を罹患していない又は罹患していることが知られている患者を処置するために使用されるであろう。これらの症例では、本発明の方法及び化合物を使用するという決定は、患者が、その用語が前記に定義されるような「神経保護薬（ＮＰＤ）による処置の必要な患者」であるか否かの決定に基づいて実施されるであろう。
【００６７】
幾つかの態様において、本発明は神経保護の方法を提供する。特定の態様において、これらの方法は、神経系の細胞に対して傷害又は損傷の明白な臨床的徴候又は症状をまだ発症してはいないが、神経系に対する傷害又は外傷のために、あるいは生化学的又は遺伝的のいずれかの何か知られた素因あるいは１種又は複数のこれらの障害の証明されたバイオマーカーの所見のために、神経障害の発症の高い危険群にあるかも知れない患者に、治療的に有効量の本発明のカルバメート化合物を投与する工程を含んでなる。
【００６８】
従って、幾つかの態様において、本発明の方法及び組成物は、神経障害を発症する危険にあるが、まだ臨床的証拠を発症してはいない被験体における神経保護を対象とする。この患者は単に、被験体又はかれらの家族におけるいずれかの因子、医学暦、身体検査あるいは、ニューロン損傷を発症する平均より高い危険度を示すテストの認識により決定されるように「より高い危険性」にある可能性がある。従って、患者がいずれかの利用可能な方法により「より高い危険度」にある可能性があるというこの決定は、患者が本発明の方法で処置されるべきであるかどうか決定するために使用することができる。
【００６９】
従って、代表的態様において、本発明の方法及び化合物による処置から利益を得ることができる被験体は、ニューロン損傷に対する危険因子を決定するための承認されたスクリーニング法を使用して識別することができる。これらのスクリーニング法は例えば、例えば閉鎖した又は貫通したいずれかの頭部外傷、細菌又はウイルス性ＣＮＳ感染症、限定はしないが卒中を包含する脳血管疾患、脳腫瘍、脳水腫、嚢尾虫症、ポルフィリン症、代謝脳症、限定はしないが鎮静催眠剤又はアルコール禁断を包含する薬物禁断、出生時無酸素症又はいずれかの種類の出生時障害を包含する異常周産期病歴、脳性麻痺、学習障害、多動症、幼児期の熱性痙攣歴、痙攣重積状態の病歴、癲癇又はいずれかの発作関連障害の家族暦、狼瘡を包含する脳の炎症性疾患、限定はしないがコカイン中毒を包含する直接的又は胎盤運搬のいずれかによる薬物中毒、両親の近親結婚並びに向精神薬投薬を包含する神経系に対して毒性である医薬による処置を包含する、危険因子を決定するための従来の処理法を包含する。
【００７０】
患者が、臨床的徴候又は症状をもたない患者における、ＮＰＤによる処置から利益を得るかも知れないという決定は、種々の「代理マーカー」又は「バイオマーカー」に基づくことができる。
【００７１】
本明細書で使用される用語「代理マーカー」及び「バイオマーカー」は互換性に使用され、ニューロン障害の現在の存在又は将来の発症と信頼性に相関させることができるいずれかの解剖学的、生化学的、構造的、電気的、遺伝的又は化学的指標又はマーカーを表す。幾つかの症例では、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）又は陽電子発射形断層撮影（ＰＥＴ）のような脳撮影法を使用して、被験体がニューロン障害の危険にあるかどうかを決定することができる。
【００７２】
本発明の方法に適するバイオマーカーは限定はしないが、海馬における梗塞、萎縮又は容量減少あるいは明白な近心の一過性梗塞（ＭＴＳ）あるいは同様な関連した解剖学的病理のＭＲＩ、ＣＴ又は他の撮影法による決定；タンパク質又は他の生化学的バイオマーカーのような分子群の患者の血液、血清又は組織中の検出、例えば毛様体の神経栄養因子（ＣＮＴＦ）の高いレベル又はニューロン分解産物の高い血清レベル；あるいは患者が神経保護薬による処置を要するという代理マーカー又はバイオマーカーからの他の証拠を包含する。
【００７３】
広範な検出法を使用する、ずっと多数のこのようなバイオマーカーが将来開発されるであろうと期待される。ニューロン損傷（この用語は本明細書に使用される）の存在又は可能な将来の発症のいずれかのこのようなマーカー又は指標を、本発明の化合物及び方法による処置の必要を決定するための本発明の方法に使用することができることが意図される。
【００７４】
被験体がニューロン障害を有する又は発症する危険にあるかも知れないという決定はまた、例えば完全な病歴、身体検査及び一連の関連血液試験を包含する医学的評価を包含するであろう。それはまた、脳波（ＥＥＧ）、ＣＴ、ＭＲＩ又はＰＥＴスキャンを包含することができる。ニューロン損傷又は傷害を発症する増加した危険の決定はまた、遺伝子発現プロファイル作成又はプロテオミック法を包含する遺伝子試験により実施することができる（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｄ．Ｒｏｇａｗｓｋｉ，Ｍ．Ａ．Ｅｐｉｌｅｐｓｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０；７１−７８（２００２）及びＬｏｓｃｈｅｒ，Ｗ，Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｄ．Ｅｐｉｌｅｐｓｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０；３−１６（２００２）を参照されたい）。
【００７５】
神経保護薬により安定化又は改善することができる精神医学的障害、例えば双極性障害、分裂情動障害、統合失調症、衝撃調節障害、等に対して、前記の試験はまた、現在の状態の検査及び、気分障害の症状及び長期にわたりそして、患者が長い間に受けてきたかも知れない他の処置に関連した精神病的症状のような患者の症状の経過の詳細な病歴、例えば生涯病歴を包含することができる。これら及び他の特別のそして定常的方法が、臨床家に、本発明の方法及び調合物を使用する治療の必要な患者を選択させる。
【００７６】
本発明の幾つかの態様において、本発明の実施における使用に適するカルバメート化合物は単独で、あるいは、少なくとも１種又は複数の他の化合物又は治療剤、例えば他の神経保護薬又は抗癲癇薬、抗痙攣薬と同時のいずれかで投与されるであろう。これらの態様において、本発明は、患者におけるニューロンの傷害を処置又は予防するための方法を提供する。該方法は、処置を必要とする患者に、神経保護を提供する又は発作もしくは癲癇発生を処置もしくは予防する能力、あるいは本発明の化合物の神経保護効果を増強する能力を有する、有効量の、１種又は複数の他の化合物又は治療剤と組み合わせて、本明細書に開示された有効量の１種のカルバメート化合物を投与する；工程を包含する。
【００７７】
本発明の化合物との、化合物、治療剤又は知られた薬剤の「同時投与」又は「組み合わせ投与」は、知られた薬剤及び化合物双方が治療的効果をもつであろう時の、薬剤及び１種又は複数の化合物の投与を意味する。場合により、この治療効果は相乗的であろう。このような同時投与は、本発明の化合物の投与に対する薬剤の同時（すなわち同じ時に）の、前の、又はその後の投与を伴なうことができる。当業者は、特定の薬剤及び本発明の化合物に対して適当な投与のタイミング、順序及び用量を決定するのに何の困難も見いださないであろう。
【００７８】
前記の１種又は複数の他の化合物あるいは治療剤は、１つ又は複数の以下の特性：抗酸化作用、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト作用、内因性ＧＡＢＡ阻害の増強、ＮＯ合成酵素インヒビター作用、鉄結合能、例えばキレート化剤、カルシウム結合能、例えばＣａ（ＩＩ）キレート化剤、亜鉛結合能、例えばＺｎ（ＩＩ）キレート化剤、患者のＣＮＳ中のナトリウム又はカルシウムイオンチャンネルを有効にブロックする能力あるいは、カリウム又は塩化物イオンチャンネルを開く能力、を有する化合物から選択することができる。
【００７９】
幾つかの好ましい態様において、１種又は複数の他の化合物あるいは治療剤は、ＮＭＤＡ受容体に結合することにより（例えばＮＭＤＡ受容体のグリシン結合部位に結合することにより）ＮＭＤＡ受容体に拮抗するであろう、そして／又はその物質はグリアのＧＡＢＡ取り込みを減少することによりＧＡＢＡ阻害を増強するであろう。
【００８０】
更に、前記の１種又は複数の他の化合物あるいは治療剤は、たとえその化合物が神経保護を提供することが知られていなくても、発作活動を抑制することが知られたいずれかの薬剤であることができる。このような薬剤は限定はされないが、当業者に知られた、又は将来発見されるいずれかの有効なＡＥＤを包含するであろう、適当な薬剤は例えば、限定はされないが、カルバマゼピン、クロバザム、クロナゼパム、エトスクシミド、フェルバメート、ガパベンチン、ラモチギン、レベチラセタム、オキシカルバゼピン、フェノバルビタール、フェニトイン、プレガバリン、プリミドン、レチガビン、タラムパネル、チアガビン、トピラメート、バルプロエート、ビガバトリン、ゾニサミド、ベンゾヂアゼピン、バルビツレート及び一般的に鎮静催眠剤を包含する。
【００８１】
更に、幾つかの態様において、本発明の化合物は、治療を要する患者又は被験体に神経保護を提供する目的のための医薬製造のために、単独で、あるいは互いに組み合わせて、あるいは前記の１種又は複数の他の治療薬又はそれらの塩もしくはエステルと組み合わせてのいずれかで使用されるであろう。
【００８２】
医薬としてのカルバメート化合物
本発明は医薬として式１及び／又は式２のエナンチオマー混合物及び単離エナンチオマーを提供する。カルバメート化合物は被験体に神経保護を提供するための医薬として調合される。
【００８３】
概括的に、本発明のカルバメート化合物は経口、舌下、局所、全身（例えば、経皮的、鼻腔内又は座薬により）、あるいは非経口（例えば、筋肉内、皮下又は静脈内注射）を包含する、治療薬を投与するための当該技術分野で知られたいずれかの方法により、製薬学的組成物として投与することができる。直接に神経系に対する化合物の投与は例えば、ポンプ装置を使用して又は使用せずに頭蓋内又は脊椎内用の針又はカテーテルを介した送達による大脳内、室内、脳室内、鞘内、槽内、脊髄内又は脊髄周囲投与経路への投与を包含することができる。
【００８４】
更に、限定はされないが、網膜虚血（糖尿病性、他）、緑内障、網膜変性、黄斑変性、多発性硬化症、毒性及び虚血性視神経障害を包含する目の疾患又は障害の症例においては、化合物の組み合わせ物を包含する本発明の化合物は目に対する直接の体外からの適用、すなわち強膜、あるいは、例えば点眼剤により、あるいは眼内移植又は、硝子体液等中への直接注入によることを包含する微細球を包含する他の遅い送達装置により投与することができる。
【００８５】
組成物は錠剤、ピル、カプセル、半固体、散剤、持続放出調合物、液剤、懸濁物、エマルション、シロップ、エリキシル、エアゾール又はいずれかの他の適当な組成物の形態を採ることができ、そして少なくとも１種の製薬学的に許容できる賦形剤と組み合わせた、少なくとも１種の本発明の化合物を含んでなることができる。適した賦形剤は当業者には周知であり、それら及び組成物の調合法は、その開示が、全体をすべての目的のために引用により本明細書に編入された、Ａｌｆｏｎｓｏ  ＡＲ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ，１９８５，のような標準参考文献中に認めることができる。特に注射液に適した液体担体は、水、生理食塩水、デキストロース水溶液及びグリコールを包含する。
【００８６】
カルバメート化合物は水性懸濁液として提供することができる。本発明の水性懸濁液は水性懸濁液の製造に適する賦形剤と混合したカルバメート化合物を含有することができる。このような賦形剤は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムアルギネート、ポリビニルピロリドン、ガムトラガカント及びガムアカシアのような懸濁剤、並びに天然に存在するホスファチド（例えばレシチン）、脂肪酸とのアルキレンオキシドの縮合生成物（例えばポリオキシエチレンステアレート）、長鎖の脂肪族アルコールとのエチレンオキシドの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、脂肪酸及びヘキシトールから誘動される部分エステルとのエチレンオキシドの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノ−オレエート）又は脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘動される部分エステルとのエチレンオキシドの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノ−オレエート）のような、分散剤又は湿潤化剤を包含することができる。
【００８７】
水性懸濁液はまた、エチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートのような１種又は複数の保存剤、１種又は複数の着色剤、１種又は複数の香り付け剤及び、スクロース、アスパルテーム又はサッカリンのような１種又は複数の甘味剤を含有することができる。調合物は浸透性に対して調整することができる。
【００８８】
本発明の方法における使用のための油懸濁物は落花生油、オリーブ油、ゴマ油又はココナツ油のような植物油、あるいは流動パラフィンのような鉱油、あるいはこれらの混合物中にカルバメート化合物を懸濁させることにより調合することができる。油懸濁物は蜜蝋、硬化パラフィン又はセチルアルコールのような増粘剤を含有することができる。グリセロール、ソルビトール又はスクロースのような甘味剤は、味のよい経口調製物を提供するために添加することができる。これらの調合物はアスコルビン酸のような抗酸化剤の添加により保存することができる。注射用油ベヒクルの１例として、Ｍｉｎｔｏ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２８１：９３−１０２，１９９７を参照されたい。本発明の製薬学的調合物はまた、水中油エマルションの形態にすることができる。油相は前記の植物油又は鉱油又はこれらの混合物であることができる。
【００８９】
適した乳化剤はアカシアガム及びトラガカントガムのような天然に存在するガム、大豆レシチンのような天然に存在するホスファチド、ソルビタンモノ−オレエートのような脂肪酸とヘキシトール無水物から誘動されるエステル又は部分エステル並びにポリオキシエチレンソルビタンモノ−オレエートのようなエチレンオキシドとのこれらの部分エステルの縮合生成物を包含する。エマルションはまた、シロップ及びエリキシルの調合物中におけるような甘味剤及び香り付け剤含有することができる。このような調合物はまた、緩和薬、保存剤又は着色剤を含有することができる。
【００９０】
単独で又は他の適当な成分と組み合わせて、選択するべき化合物は、吸入により投与されるためのエアゾール調合物に製造することができる（すなわち、それらは「噴霧」することができる）。エアゾール調合物はジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等のような加圧された許容できる噴射剤中に入れることができる。
【００９１】
例えば関節内（関節内）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内及び皮下経路によるような非経口投与に適する本発明の調合物は、水性及び非水性の、等張滅菌注射液を包含することができ、それらは抗酸化剤、バッファー、静菌剤及び、その調合物を意図される受益者の血液と等張にさせる溶質並びに、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤及び保存剤を包含することができる水性及び非水性滅菌懸濁物を含有することができる。使用することができる許容できるベヒクル及び溶媒の中には、水、リンゲル液、等張塩化ナトリウムがある。更に、滅菌不揮発性油を、溶媒又は懸濁媒質として便利に使用することができる。この目的のためには合成モノ−もしくはジグリセリドを包含するいずれかの緩和な不揮発性油を使用することができる。更に、オレイン酸のような脂肪酸も同様に注射液の調製に使用することができる。これらの液剤は滅菌され、一般に望ましくない物質を含まない。
【００９２】
化合物が十分に可溶性である場合は、それらはプロピレングリコール又はポリエチレングリコールのような適当な有機溶媒の使用を伴なって又は伴なわずに通常の生理食塩水中に直接溶解することができる。微細に粉砕された化合物の分散物はデンプン又はナトリウムカルボキシメチルセルロース水溶液あるいは落花生油のような適当な油中で構成することができる。これらの調合物は従来の、周知の滅菌法により滅菌することができる。調合物は、ｐＨ調整及びバッファー剤、毒性調整剤、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等、のような生理学的状態に似せるために必要な製薬学的に許容できる補助物質を含有することができる。
【００９３】
これらの調合物中のカルバメート化合物の濃度は広範にばらつくことができ、選択される特定の投与法及び患者の需要に従って、主として、流体の容量、粘度、体重等に基づいて選択されるであろう。静脈内投与のためには調合物は、滅菌注射水溶液又は油性懸濁物のような滅菌注射用調製物であることができる。この懸濁物は、これらの適当な分散剤又は湿潤化剤及び懸濁剤を使用して知られた当該技術に従って調合することができる。滅菌注射用調製物はまた、１，３−ブタンジオール溶液のような無毒の非経口に許容できる希釈剤又は溶媒中の滅菌注射液又は懸濁物であることができる。推奨物（ｃｏｍｍｅｎｄｓ）の調合物はアンプル及びバイアルのような単位用量又は複数用量のシール容器内に提供することができる。注射液及び懸濁物は、滅菌粉末、顆粒及び前記の種類の錠剤から調製することができる。
【００９４】
本発明の実施における使用に適するカルバメート化合物は経口投与することができ、好
ましくは経口投与される。組成物中の本発明の化合物の量は、組成物のタイプ、単位用量のサイズ、賦形剤の種類、及び当業者に周知の他の因子に応じて広範にばらつく可能性がある。概括的に、最終組成物は例えば０．０００００１重量パーセント（％ｗ）〜１０％ｗのカルバメート化合物、好ましくは０．００００１％ｗ〜１％ｗを含んでなることができ、残りは１種又は複数の賦形剤である。
【００９５】
経口投与用製薬学的調合物は、経口投与に適する投与物に当該技術分野で周知の製薬学的に許容できる担体を使用して調合することができる。このような担体は、製薬学的調合物を、患者による摂取に適した錠剤、ピル、散剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ロゼンジ、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物、等のような単位投与剤形に調合させることができる。
【００９６】
経口投与に適した調合物は（ａ）水、生理食塩水又はＰＥＧ４００のような希釈剤中に懸濁された有効量の製薬学的調合物のような溶液、（ｂ）それぞれが液体、固体、顆粒又はゼラチンのような、前以て決定された量の有効成分を含有するカプセル、分包又は錠剤、（ｃ）適当な液体中の懸濁物並びに（ｄ）適当なエマルション、よりなることができる。
【００９７】
経口使用のための製薬学的調製物は、場合により、生成される混合物を粉砕し、そして所望される場合は適当な更なる化合物を添加後に顆粒の混合物を処理して、錠剤又は糖衣錠のコアを得て、固形賦形剤との本発明の化合物の組み合わせにより得ることができる。適当な固形の賦形剤は炭水化物又はタンパク質充填剤であり、限定はされないが、ラクトース、スクロース、マニトール又はソルビトールを包含する糖；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、又は他の植物からのデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース又はナトリウムカルボキシメチルセルロースのようなセルロース；並びにアラビアゴム及びトラガカントを包含するガム並びにゼラチン及びコラーゲンのようなタンパク質、を包含する。所望される場合は、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はその塩（アルギン酸ナトリウムのような）のような崩壊剤又は溶解剤を添加することができる。錠剤形態は１種又は複数のラクトース、スクロース、マニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、微細結晶セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸及び他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤化剤、保存剤、香り付け剤、染料、崩壊剤及び製薬学的に相容性の担体を包含することができる。ロゼンジ形態は、フレーバー（例えば、スクロース）中の有効成分並びに、有効成分に加えて当該技術分野で知られた担体を含有する、ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシアエマルション、ゲル等のような不活性基剤中の有効成分を含んでなる芳香製剤を含んでなることができる。
【００９８】
本発明の化合物はまた、薬剤の直腸内投与のための座薬の形態で投与することができる。これらの調合物は、薬剤を、常温で固体であるが、直腸温度で液体であり、従って直腸内で融解して薬剤を放出するであろう、適当な刺激性のない賦形剤と混合することにより調製することができる。このような材料はココアバター及びポリエチレングリコールである。
【００９９】
座薬、吸入剤、散剤及びエアゾール調合物（例えば、ステロイド吸入剤については、Ｒｏｈａｔａｇｉ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３５：１１８７−１１９３，１９９５；Ｔｊｗａ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７５：１０７−１１１，１９９５を参照されたい）を包含する本発明の化合物はまた、鼻腔内、点眼、膣内及び直腸内経路により投与することができる。
【０１００】
本発明の化合物は経皮的に、局所経路により送達することができ、アプリケータースティック、液剤、懸濁物、エマルション、ゲル、クリーム、軟膏、ペースト、ゼリー、塗り薬、散剤及びエアゾールとして調合することができる。
【０１０１】
カプセル封入材もまた、本発明の化合物とともに使用することができ、用語「組成物」は、他の担体を伴なって又は伴なわずに、調合物としてカプセル封入材と組み合わせた有効成分を包含することができる。例えば、本発明の化合物はまた、体内における遅延放出のための微細球として送達することができる。１つの態様において、微細球を、皮下で緩徐に放出する（Ｒａｏ，Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｅｄ．７：６２３−６４５，１９９５を参照されたい）薬剤（例えば、ミフェプリストン）−含有微細球の皮内注射により；生物分解性及び注射可能なゲル調合物として（例えば、Ｇａｏ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１２：８５７−８６３，１９９５を参照されたい）；又は経口投与用微細球として（例えば、Ｅｙｌｅｓ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４９：６６９−６７４，１９９７を参照されたい）投与することができる。経皮的及び皮内経路は双方とも数週間又は数カ月間一定の送達を与える。糖衣錠もまた本発明の化合物の送達には使用することができる。
【０１０２】
もう１つの態様において、本発明の化合物は、細胞膜と融合する又はエンドサイトーシスされるリポソームの使用により、すなわちエンドサイトーシスをもたらす細胞の表面膜タンパク質受容体に結合するリポソームに付着したリガンドを使用することにより、送達することができる。リポソームを使用することにより、特にリポソームの表面が標的細胞に特異的なリガンドを担持する、あるいは特異的な器官に優先的に導かれる場合に、インビボの標的細胞中にカルバメート化合物の送達を集中させることができる（例えば、Ａｌ−Ｍｕｈａｍｍｅｄ，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１３：２９３−３０６，１９９６；Ｃｈｏｎｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：６９８−７０８，１９９５；Ｏｓｔｒｏ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．４６：１５７６−１５８７，１９８９を参照されたい）。
【０１０３】
本発明の製薬学的調合物は塩として提供することができ、そして限定はされないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、等を包含する多数の酸により形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態である水性又は他のプロトン溶媒中に、より可溶性の傾向がある。他の場合には、好ましい調製物は凍結乾燥粉末であることができ、それは例えば、使用前にバッファーと合わせる、ｐＨ範囲４．５〜５．５の、以下：１ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン、０．１％〜２％のスクロース、２％〜７％のマニトールのいずれか又はすべてを含有することができる。
【０１０４】
製薬学的に許容できる塩及びエステルは、製薬学的に許容でき、そして所望の薬理学的特性をもつ塩及びエステルを意味する。このような塩は、化合物中に存在する酸性プロトンが無機又は有機塩基と反応することができる場合に形成することができる塩を包含する。適当な無機塩は、アルカリ金属、例えばナトリウム及びカリウム、マグネシウム、カルシウム及びアルミニウムとともに形成されるものを包含する。適当な有機塩は、アミン塩基、例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミン、等のような有機塩基とともに形成されるものを包含する。製薬学的に許容できる塩はまた、親化合物中のアミン部分の、無機酸（例えば塩酸及び臭化水素酸）及び有機酸（例えば酢酸、クエン酸、マレイン酸、並びにメタンスルホン酸及びベンゼンスルホン酸のようなアルカン−及びアレン−スルホン酸）との反応から形成される酸付加塩を包含することができる。製薬学的に許容できるエステルは、化合物中に存在するカルボキシ、スルホニルオキシ及びホスホノキシ基から形成されるエステルを包含する。２個の酸性基が存在する時は、製薬学的に許容できる塩又はエステルはモノ−酸−モノ−塩又はエステルあるいはジ−塩又はエステルであることができ、そして同様に、２個を超える酸性基が存在する場合には、このような基の幾つか又はすべてが塩になり、又はエステル化されることができる。
【０１０５】
本発明中で名前を挙げた化合物は非塩化又は非エステル化形態、あるいは塩化及び／又はエステル化形態で存在することができ、そしてこのような化合物の命名は元来の（非塩化及び非エステル化）化合物及び製薬学的に許容できるその塩及びエステル双方を包含することが意図される。本発明は式１及び式２の製薬学的に許容できる塩及びエステル形態を包含する。式１又は式２のエナンチオマーの２種以上の結晶形態が存在する可能性があり、従って、それらも本発明に包含される。
【０１０６】
本発明の製薬学的組成物は、カルバメート化合物に加えて、場合により、神経保護を提供することに関連する疾患又は状態の処置に有用な、少なくとも１種の他の治療剤を含有することができる。
【０１０７】
製薬学的組成物を調合する方法は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ．第２版．改定及び増刷、１−３巻，編集  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  等；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ．１−２巻，  Ａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ編集；及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．１−２巻，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  等編集；Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ発行、のような多数の発刊物に記載されており、それらの明細はそれらの全体をすべての目的のために引用により本明細書に編入されている。
【０１０８】
製薬学的組成物は概括的に滅菌された、実質的に等張として、そして米国食品医薬品局の適正製造基準（ＧＭＰ）規制に完全に準拠して調合される。
【０１０９】
投与計画
本発明はカルバメート化合物を使用して哺乳動物における神経保護を提供する方法を提供する。神経保護を提供するために要するカルバメート化合物の量は治療的又は製薬学的有効量と定義される。この使用に有効な投与計画及び量、すなわち、投与量又は投与計画は、疾患の段階、患者の身体状態、年齢等を包含する種々の因子に左右されるであろう。患者に対する投与計画を計算する際、投与方法も考慮に入れる。
【０１１０】
当業者は、必要以上の実験を伴なわずに、その技術及び本明細を参考にして、本発明の実施のための特定の置換カルバメート化合物の治療的に有効量を決定することができるであろう（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（Ｖｏｌｓ．１−３，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ，１９９９，Ｔｈｅ  ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ；及びＰｉｃｋａｒ，１９９９，Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓを参照されたい）。治療的有効量はまた、そこで有効物質のあらゆる毒性又は有害な副作用が、臨床的な意味で治療的に有益な効果により打ち負かされるものである。更に、各特定の被験体に対して、個体の需要及び化合物を投与する又は投与を監督する人の職業的判断に従って、特別の投与計画が長期にわたり評価され、調整されるべきであることに注意しなければならない。
【０１１１】
処置の目的のためには、本明細書に開示された組成物又は化合物は、１回のボーラス送達で、長期間にわたる連続的送達により、又は反復投与プロトコール（例えば、１時間、１日又は毎週１回の反復投与プロトコールにより）で被験体に投与することができる。本発明の製薬学的調合物は例えば、１日１回又は数回、毎週３回又は毎週１回で投与することができる。本発明の１つの態様において、本発明の製薬学的調合物は毎日１回又は２回
経口投与される。
【０１１２】
本発明の化合物による処置計画は例えば、被験体が脳損傷傷害又は他の初回発作を罹患した後に、しかし被験体が癲癇又はニューロン傷害の他の徴候をもつと診断される前に開始することができる。１つの態様において、ニューロン傷害を発症する高い危険性にあると識別される被験体又は、ニューロン傷害を発症している危険性を伴なう疾患、例えば新生児低酸素症を有する被験体は、本発明のカルバメート化合物による処置計画を開始することができる。
【０１１３】
特定の態様において、カルバメート化合物は脳損傷傷害又は初回発作の発生後、一定の期間（週、月、年）にわたり毎日投与することができる。担当医は、例えば患者の臨床検査により、あるいは血液又は脳脊髄液中の薬剤レベルを測定することにより、カルバメート化合物が治療的に有効レベルに達したことを、いかにして決定するかを知るであろう。
【０１１４】
これに関して、１種又は複数の生物学的に活性な物質の治療的に有効な投与量は、神経保護を提供するために臨床的に有意な結果をもたらすであろう長期の処置計画内の反復投与量を包含することができる。これに関する有効量の決定は、典型的には動物モデルの研究とその後のヒトの臨床試験に基づき、そして被験体における標的とされる露出症状又は状態の発生又は重篤度を有意に減少する有効な用量及び投与プロトコールを決定することにより誘導される。これに関する適当なモデルは例えばネズミ、ラット、ブタ、ネコ、ヒト以外の霊長類及び当該技術分野で知られた他の許容される動物モデル被験体を包含する。あるいはまた、有効量はインビトロモデル（例えば、免疫学的及び組織病理学的アッセイ）を使用して決定することができる。このようなモデルを使用して、典型的にはごく通常の計算及び調整が必要とされて、１種又は複数の生物学的に活性な物質の治療的有効量（例えば、所望の反応を誘発するための鼻腔内投与で有効な、経皮的投与で有効な、静脈内投与で有効な、又は筋肉内投与で有効な量）を投与するために適当な濃度及び用量を決定する。
【０１１５】
本発明の代表的態様において、標準の投与計画のための、化合物の単位投与剤形が調製される。この方法で、組成物は医師の指示により、より少量の用量に容易に準分割することができる。例えば、単位用量は分包散剤、バイアル又はアンプルに、そして好ましくはカプセル又は錠剤形態に構成することができる。
【０１１６】
組成物のこれらの単位投与剤形中に存在する有効化合物は、患者の特定の需要に従って毎日１回又は複数回の投与に対し、例えば約１０ｍｇ〜約１グラム以上の量で存在することができる。約１グラムの最低１日量により処置計画を開始することにより、カルバメート化合物の血中レベルを使用して、より大量又は少量の用量を適用するか否かを決定することができる。
【０１１７】
本発明のカルバメート化合物の有効な投与は例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／１回〜約１５０ｍｇ／ｋｇ／１回の経口又は非経口用量で投与することができる。好ましくは、投与は約０．１ｍｇ／ｋｇ／１回〜約２５ｍｇ／ｋｇ／１回、より好ましくは約０．２〜約１８ｍｇ／ｋｇ／１回であろう。従って、本明細書に記載の投与単位当たりに含有される有効成分の治療的有効量は例えば、７０ｋｇの平均体重をもつ被験体に対して、例えば約１ｍｇ／日〜約７０００ｍｇ／日であることができる。
【０１１８】
本発明の方法はまた、神経保護を提供する際に使用のためのキットを提供する。治療的利益をもつ１種又は複数の他の化合物の可能な添加とともに、本発明の１種又は複数のカルバメート化合物を含んでなる製薬学的組成物が適当な担体中に調合された後に、それを適当な容器に入れて、神経保護提供のためのラベルを貼ることができる。更に、神経保護
提供、癲癇発生、癲癇又は、ニューロン傷害と関連するもう１つの障害又は状態の処置に有用な少なくとも１種の他の治療剤を含んでなるもう１つの医薬も同様にその容器内に入れて、適用疾患の処置用にラベルを貼ることができる。このようなラベル貼付は、例えば各医薬の投与の量、頻度及び方法に関する指示書を包含することができる。
【０１１９】
以上の発明は、理解の明確化の目的のために、例を挙げて、詳細に説明されてきたが、特定の変更及び修飾は、開示により理解され、そして限定しない具体化により提示される付記の請求項の範囲内で、不必要な実験なしで実施することができることは当業者に明白であろう。以下の実施例は本発明の特別のアスペクトを具体的に示すために提供され、限定を意味しない。
【０１２０】
実施例
神経保護を提供する際に使用のための式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の化合物の活性を以下の実験的実施例において評価した。実施例１及び２において、本明細書で「試験化合物」ＴＣと呼ばれる式１の単離Ｓ−エナンチオマー（例えば、式７）の活性を、ラットにおいてリチウム及びピロカルピンにより誘発された一過性大脳葉癲癇のモデルにおける神経保護に対する、そして癲癇発生の処置における化合物の効果を決定するために、誘発された癲癇のラットモデルにおいて評価した。これらの実施例は本発明の種々の態様を具体的に示す方法であることが意図され、どんな方法でも本発明を限定することは意図されない。
【実施例１】
【０１２１】
一過性大脳葉癲癇のリチウム−ピロカルピンモデル
リチウムと結合されたピロカルピン（Ｌｉ−Ｐｉｌｏ）によりラットに誘発されるモデルはヒトの一過性大脳葉癲癇の臨床的及び神経生理学的特徴の大部分を再現する（Ｔｕｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｓｙｎａｐｓｅ  ３：１５４−１７１；Ｃａｖａｌｈｅｉｒｏ，１９９５，Ｉｔａｌ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ  １６：３３−３７）。成熟ラットにおいて、ピロカルピンの全身投与は痙攣重積状態（ＳＥ）をもたらす。死亡率は最初の数日で３０〜５０％に達する。生存動物において、ニューロン損傷は海馬体、梨状皮質及び内側嗅皮質、視床、扁桃体、新皮質及び黒質内に優勢である。この急性発作期間の次に、１４〜２５日間の平均期間継続する「沈黙した」発作不在相が続き、次いですべての動物が１週間に２〜５回の通常の頻度で自然発生の反復痙攣発作を示す（Ｔｕｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｓｙｎａｐｓｅ  ３：１５４−１７１；Ｃａｖａｌｈｅｉｒｏ，１９９５，Ｉｔａｌ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ  １６：３３−３７；Ｄｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １６７：２２７−２４１）。
【０１２２】
リチウム−ピロカルピン及び試験化合物による処置
Ｊａｎｖｉｅｒ  飼育センター（Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓｔ−ｌｓｔｅ，Ｆｒａｎｃｅ）により提供される、２２５〜２５０ｇの雄のウィスターラットを調整標準条件下（明／暗周期、７．００ａ．ｍ．〜７．００ｐ．ｍ．点灯下）で飼料及び水を自由に与えて飼育した。すべての動物実験を１９８６年１１月２４日の欧州共同体協議会指令（８６／６０９／ＥＥＣ）及びフランス農業省（Ｌｉｃｅｎｓｅ  Ｎ°  ６７−９７）の規則に準拠して実施した。電極の移植のためにラットを２．５ｍｇ／ｋｇのジアゼパム（ＤＺＰ，Ｖａｌｉｕｍ，Ｒｏｃｈｅ，Ｆｒａｎｃｅ）及び１ｍｇ／ｋｇのケタミンクロルヒドレート（Ｉｍａｌｇｅｎｅ  １０００，Ｒｈｏｎｅ  Ｍｅｒｒｉｅｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）の腹腔内注射により麻酔した。４個の単接点記録電極を片側に２個ずつ、頭蓋上の頭頂外皮上に置いた。
【０１２３】
痙攣重積状態の誘発
試験化合物による処置及び自然発生の反復発作（ＳＲＳ）の発生
すべてのラットが塩化リチウム（３ｍｅｑ／ｋｇ，腹腔内，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕ
ｉｓ，Ｍｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を投与され、約２０時間後に、基底線の皮質のＥＥＧを記録するために、動物をプレクシグラスの箱中に入れた。メチルスコポラミンブロミド（１ｍｇ／ｋｇ、皮下，Ｓｉｇｍａ）を投与して、痙攣剤の末梢効果を限定した。メチル−スコポラミンの３０分後にピロカルピン塩酸（２５ｍｇ／ｋｇ、皮下，Ｓｉｇｍａ）を注射することによりＳＥを誘発した。ＳＥの全期間中、両側のＥＥＧ皮質活性を記録し、行動の変化に注目した。
【０１２４】
試験化合物の漸増用量の効果を３群のラットで研究した。第１群の動物はＳＥの開始の１時間後に１０ｍｇ／ｋｇの試験化合物（ｐｉｌｏ−ＴＣ１０）の腹腔内投与を受け、他方第２群及び３群の動物はそれぞれ、３０及び６０ｍｇ／ｋｇの試験化合物（ｐｉｌｏ−ＴＣ３０及びｐｉｌｏ−ＴＣ６０）を受けた。
【０１２５】
もう１つの群は、ＳＥの開始の１時間後に２ｍｇ／ｋｇのジアゼパム（ＤＺＰ、筋肉内）を注射された。これはＳＥ後の動物の生存を改善するための標準的処置である（ｐｉｌｏ−ＤＺＰ）。対照群はピロカルピン及び試験化合物の代りに生理食塩水を受けた（生理食塩水−生理食塩水）。次に、ＳＥ生存ｐｉｌｏ−試験化合物ラットは最初の試験化合物注射の約１０時間後に、同量の試験化合物の第２の腹腔内注射を受け、更に６日間、試験化合物による１日２回の処置下で維持された。Ｐｉｌｏ−ＤＺＰラットはＳＥの日の第１の注射の約１０時間後に１ｍｇ／ｋｇのＤＺＰの第２の注射を受けた。その後、Ｐｉｌｏ−ＤＺＰラット及び生理食塩水−生理食塩水ラットは同量の生理食塩水を１日２回受けた。
【０１２６】
ＥＥＧに対する、そしてＳＲＳの発生に対する潜伏期に対する試験化合物の効果を、毎日１０時間、動物の毎日のビデオ記録及び８時間の毎週２回のエレクトログラフ活性の記録により研究した。
【０１２７】
細胞密度の定量
８匹のｐｉｌｏ−ＤＺＰ、８匹のｐｉｌｏ−ＴＣ１０、７匹のｐｉｌｏ−ＴＣ３０、７匹のｐｉｌｏ−ＴＣ６０及び６匹の生理食塩水−生理食塩水ラットにつきＳＥ後の６日目に、細胞密度の定量を実施した。ＳＥの１４日後に、動物を１．８ｇ／ｋｇのペントバルビタール（Ｄｏｌｅｔｈａｌ（Ｒ），Ｖｅｔｏｑｕｉｎｏｌ，Ｌｕｒｅ，Ｆｒａｎｃｅ）で深く麻酔した。次に脳を切除し、凍結した。２０μｍの連続切片をクリオスタット中で切断し、チオニン染色の前に数日間空気乾燥した。
【０１２８】
細胞密度の定量を、ラット脳アトラスの定位座標に従って冠状断面上で１０×１０ボックスの１ｃｍ２の顕微鏡グリッドにより実施した（Ｐａｘｉｎｏｓ  ａｎｄ  Ｗａｔｓｏｎ，１９８６，Ｔｈｅ  Ｒａｔ  ｂｒａｉｎ  ｉｎ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。細胞計数をブラインド法で２回実施し、各個々の動物において、２枚の連接切片からの少なくとも３種の値の平均であった。計数は１０μｍを超える細胞のみを伴ない、より小さいものはグリア細胞であると考えられた。
【０１２９】
Ｔｉｍｍ染色
自然発生の反復発作の開始の２カ月後に、試験化合物又はＤＺＰに暴露された慢性期のラット及び３匹の生理食塩水−生理食塩水ラットにおいて、苔状繊維の萌芽を検査した。動物を深く麻酔し、生理食塩水で、次に１００ｍｌの１．１５％（ｗ／ｖ）のＮａ２Ｓ（０．１Ｍのリン酸バッファー中）及び１００ｍｌの４％（ｖ／ｖ）のホルムアルデヒド（０．１Ｍのリン酸バッファー中）により心臓を経て潅流した。脳を頭蓋から外し、３〜５時間４％ホルムアルデヒド中に後固定し、４０μｍの切片をスライドビブラトーム上で切断し、ゼラチンコートスライド上に固定した。
【０１３０】
翌日、切片を４０〜４５分間、５０％（ｗ／ｖ）のアラビアゴム（１６０ｍｌ）、クエン酸ナトリウムバッファー（３０ｍｌ）、５．７％（ｗ／ｖ）のヒドロキノン（８０ｍｌ）及び１０％（ｗ／ｖ）の硝酸銀（２．５ｍｌ）の２６℃の溶液中で暗所で現像した。次に切片を少なくとも４５分間４０℃の水道水ですすぎ、蒸留水で急速にすすぎ、乾燥させた。それらをエタノール中で脱水し、ガラスでカバーした。
【０１３１】
前記の標準に従って、背側海馬における苔状繊維萌芽を評価し（Ｃａｖａｚｏｓ  ｅｔ
ａｌ．，１９９１，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １１：２７９５−２８０３．）、それは以下：０−ＤＧのチップ（ｔｉｐｓ）とクレスト（ｃｒｅｓｔ）間に顆粒状物なし；１−ＤＧのチップとクレスト間に寄せ集めの分布の顆粒上領域に散発的顆粒；２−ＤＧのチップとクレスト間に連続的分布のより多数の顆粒；３−チップとクレスト間の合流した顆粒のまばらなパッチを伴なう、チップとクレスト間に連続的パターンの顕著な顆粒；４−チップとクレスト間に合流して密集した層状帯を形成する顕著な顆粒；並びに５−内部分子層中に延伸する顆粒の合流して密集した層状帯、である。
【０１３２】
データ分析
ｐｉｌｏ−生理食塩水及びｐｉｌｏ−試験化合物投与動物におけるＳＥの特徴の比較のために非対スチューデントｔ−テストを使用した。両群で発作を起こすラット数の間の比較を、Ｃｈｉ平方テストにより実施した。ニューロン損傷に対しては、群の間の統計分析は、ＡＮＯＶＡ、次にＳｔａｔｖｉｅｗソフトウエア（Ｆｉｓｈｅｒ  ＲＡ，１９４６ａ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｗｏｒｋｅｒｓ（１０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｏｌｉｖｅｒ  ＆  Ｂｏｙｄ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ；Ｆｉｓｈｅｒ  ＲＡ，１９４６ｂ，Ｔｈｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ（４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｏｌｉｖｅｒ  ＆  Ｂｏｙｄ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ）を使用する多数の比較のためのＦｉｓｈｅｒのテストを使用して実施した。
【０１３３】
リチウム−ピロカルピン痙攣重積状態の行動的及びＥＥＧの特徴
２５０〜３３０ｇ体重の全Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットをＬｉ−Ｐｉｌｏ誘発ＳＥに暴露した。ＳＥの行動的特徴はｐｉｌｏ−生理食塩水及びｐｉｌｏ−試験化合物群双方において同様であった。ピロカルピン注射後５分以内に、ラットは下痢、立毛及びコリン作動性刺激の他の徴候を示した。その後の１５〜２０分間に、ラットは頭部上下運動、引っ掻き運動、咀嚼及び探索行動を示した。ピロカルピン投与の約１５〜２０分後に反復性発作が開始した。立ち上がり及び転倒を伴なう頭部及び両側前肢のミオクローヌスのエピソードを伴なうこれらの発作（ｓｅｉｚｕｒｅ）は、前記（Ｔｕｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｂｅｈａｖ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ９：３１５−３３５）のようにピロカルピン投与の約３５〜４０分後にＳＥに発展した。
【０１３４】
ＳＥ期間中のＥＥＧパターン
薬理学的処置の不在時のＳＥの第１時間中は、ＥＥＧの振幅は徐々に増加し、他方周波数は減少した。ピロカルピン注射の５分以内に、正常な背景ＥＥＧ活動が皮質中の低電圧の急速な活性と置き換わり、他方シータリズム（５〜７Ｈｚ）が海馬中に現れた。１５〜２０分までに、高電圧の急速な活性が海馬のシータリズムに重なり、孤立した高電圧スパイクが海馬でのみが記録され、他方、皮質の活性は実質的に変化しなかった。
【０１３５】
ピロカルピン注射の３５〜４０分後までに、動物は海馬及び皮質の双方に存在する高電圧の急速な活性を伴なう典型的なエレクトログラフ発作を発症し、それらは最初に、発作に先駆ける活性の突発として起り、そしてＤＺＰ又は試験化合物の投与まで継続する、一続きの連続的高電圧スパイク及びポリスパイクが続いた。ＳＥの約３〜４時間目に、海馬のＥＥＧは、ｐｉｌｏ−ＤＺＰ及びｐｉｌｏ−１０群において、海馬及び皮質双方におけ
る周期的エレクトログラフ放電（ＰＥＤ、約１回／秒）を特徴として示した。ＥＥＧの背景活性の振幅はｐｉｌｏ−ＴＣ６０動物において低かった。ＳＥの６〜７時間までに、スパイク活性はＤＺＰ−及びＴＣ１０−処置ラットにおける皮質及び海馬中にはまだ存在し、他方、ＥＥＧの振幅はＴＣ３０ラットの海馬及びＴＣ６０処置ラットの両構造物中において減少し、そして基底線レベルまで戻った。ＴＣ１０、ＴＣ３０及びＴＣ６０群間に差異はなかった。ＳＥの９時間までに、試験化合物−処置ラットの海馬及び、時々は皮質に、孤立スパイクがまだ記録された。その時点で背景活性は両構造物において非常に低い振幅を有した。
【０１３６】
ＳＥに誘発される死亡率
ＳＥ後の最初の４８時間中、ｐｉｌｏ−ＤＺＰラット（２３％，５／２２）、ｐｉｌｏ−ＴＣ１０ラット（２６％、６／２３）及びｐｉｌｏ−ＴＣ３０ラット（２０％、５／２５）において死亡率は同様であった。死亡率はｐｉｌｏ−ＴＣ６０ラットにおいて著しく減少し、それは４％（１／２３）のみに達した。その差は統計的に有意であった（ｐ＜０．０１）。
【０１３７】
沈黙相のＥＥＧ特徴及び自然発生反復性発作の発生
沈黙期中のＥＥＧパターンはｐｉｌｏ−ＤＺＰ及びｐｉｌｏ−ＴＣ１０、−ＴＣ３０又は−ＴＣ６０ラットにおいて同様であった。ＳＥ後の２４時間及び４８時間目に、基底線のＥＥＧはまだ、その上に大きな波又はスパイクが重なることができる、ＰＥＤの発生の特徴を示した。試験化合物又はベヒクル注射後の１〜８時間の間は、ｐｉｌｏ−ＤＺＰ又はｐｉｌｏ−ＴＣ１０群に変化はなかった。ＴＣ３０及びＴＣ６０ラットにおいて、ＰＥＤの周波数及び振幅は注射の１０分後にすぐに減少し、ＴＣ３０群では大きな振幅のスパイクにより、そしてＴＣ６０群では低い振幅のスパイクにより置き換わった。注射の４時間後までに、ＥＥＧは後者の２群においては基底線レベルに戻った。ＳＥの６日後までに、ＥＥＧはピロカルピン注射前よりもまだ低い振幅を示し、大部分の群においてスパイクはｐｉｌｏ−ＤＺＰ、−ＴＣ１０及び−ＴＣ３０ラットにおいて時々は、まだ記録することができた。ｐｉｌｏ−ＴＣ６０ラットにおいて、大きい振幅のスパイクの周波数はすべての他の群より高かった。ＴＣ化合物又はベヒクル注射後に、ＥＥＧ記録はｐｉｌｏ−ＤＺＰ及びｐｉｌｏ−ＴＣ１０群においては注射により影響を受けなかった。ｐｉｌｏ−ＴＣ３０ラットにおいては、注射は海馬及び皮質双方のＥＥＧ上に遅い波の発生並びにｐｉｌｏ−ＴＣ６０ラットにおいては、スパイクの減少した周波数を誘発した。
【０１３８】
慢性相が同様な潜伏期を伴うＳＲＳを発症するまで、すべてのラットがＤＺＰ、ＴＣ１０及びＴＣ３０に暴露され、研究された。潜伏期はｐｉｌｏ−ＤＺＰラットにおいて１８．２±６．９日（ｎ＝９）、ｐｉｌｏ−ＴＣ１０ラットにおいて１５．４±５．１日（ｎ＝７）、ｐｉｌｏ−ＴＣ３０ラットにおいて１８．９±９．０日（ｎ＝１０）であった。ＴＣ６０に暴露されたラット群において、ラットの１サブグループは他の群のものと類似の潜伏期、すなわち１７．６±８．７日（ｎ＝７）を伴なって癲癇になり、他方もう１つの群のラットはＳＥ−後１０９〜１９１日の範囲のずっと長い遅延を伴なって癲癇になり（１４９．８±３６．０日、ｎ＝４）、そして１匹のラットはＳＥ後９カ月の遅延で癲癇になっていない。ｐｉｌｏ−ＤＺＰ、ｐｉｌｏ−ＴＣ１０、ｐｉｌｏ−ＴＣ３０及びｐｉｌｏ−ＴＰＭ６０ラットの第１のサブグループ間のＳＲＳに対する潜伏期の相異は統計的に有意ではなかった。生理食塩水−生理食塩水ラット（ｎ＝５）はどれもＳＲＳを発症しなかった。
【０１３９】
ピロカルピン暴露ラットにおけるＳＲＳの頻度を計算するために、発作の重篤度及び顕著な段階ＩＩＩ（顔面筋肉及び前肢の間代性発作）及び段階ＩＶ〜Ｖの発作（立ち上がり及び転倒）を考慮した。ｐｉｌｏ−ＤＺＰ及びｐｉｌｏ−試験化合物ラットにおける１週間当たりの段階ＩＩＩのＳＲＳの頻度は群間でばらついていた。それは最初の３週間は、
ｐｉｌｏ−ＤＺＰ及びｐｉｌｏ−ＴＣ６０（早期のＳＲＳ開始を伴った）群で低く、一定であり、ｐｉｌｏ−ＤＺＰ群においては第４週中に消失した。段階ＩＩＩのＳＲＳの頻度はｐｉｌｏ−ＴＣ１０群でより高く、それは３週と４週の間中、ｐｉｌｏ−ＤＺＰの値より有意に増加した。より重篤な段階ＩＶ〜ＶのＳＲＳの頻度は大部分の群で第１週中に最高であったが、例外はｐｉｌｏ−ＴＣ３０及び−ＴＣ６０で遅い発作開始を伴ない、そこでＳＲＳの頻度はＴＣ３０群では全４週間にわたり一定であり、そして、ｐｉｌｏ−ＴＣ６０群においては、段階ＩＶ〜Ｖの発作をもたない、遅いＳＲＳ開始を伴なって最初の２週間は一定であり、第２週後には発作は記録されなかった。段階ＩＶ〜ＶのＳＲＳの頻度は第１週間中において、ｐｉｌｏ−ＤＺＰ群（１１．３ＳＲＳ／週）に比較して、ＴＣ１０、ＴＣ３０及びＴＣ６０（早期ＳＲＳ開始を伴なう）群において有意に減少した（２．３〜６．１ＳＲＳ／週）。２〜４週の間中は、段階ＩＶ〜ＶのＳＲＳの頻度は、２〜６回の発作／週の値に到達した第１週に比較して、すべての群で減少したが、例外は、早期ＳＲＳ開始を伴なうｐｉｌｏ−ＴＣ６０群であって、その発作の頻度は、ＳＲＳの頻度が３．３〜５．８の範囲であったｐｉｌｏ−ＤＺＰ群に比較して、０．６〜０．９回の発作／週に有意に減少した。
【０１４０】
海馬、視床及び皮質における細胞密度
生理食塩水−生理食塩水ラットに比較してｐｉｌｏ−ＤＺＰラットにおいて、細胞数は、海馬のＣＡ１領域において大規模に減少し（錐体細胞層において７０％の細胞減少）、他方ＣＡＳ領域は比較的損傷が少なかった（ＣＡ３ａにおいて５４％の細胞減少、そしてＣＡ３ｂにおいて３１％の減少）。歯状回においては、ｐｉｌｏ−ＤＺＰラットは門において顕著な細胞減少を経験し（７３％）、他方顆粒細胞層は可視的損傷を示さなかった。同様な損傷が腹側海馬に認められたが、この領域では細胞計数を実施しなかった。側面視床核には顕著な損傷が記録されたが（９１％の細胞減少）、中間背側の視床核はより軽度に損傷された（５６％）。梨状皮質においては、細胞減少は層ＩＩＩ〜ＩＶにおいて全体的であり、もはや可視的ではなく、ｐｉｌｏ−ＤＺＰラットにおいては層ＩＩにおいて５３％に達した。背側内側嗅皮質において、層ＩＩ及びＩＩＩ〜ＩＶは僅かな損傷を受けた（それぞれ９％及び１５％）。腹側内側嗅皮質の層ＩＩは全体的に保存されたが、他方層ＩＩＩ〜ＩＶは４４％の細胞減少を受けた。
【０１４１】
ｐｉｌｏ−試験化合物投与動物の海馬において、細胞減少はＣＡ１錐体層においてｐｉｌｏ−ＤＺＰラットに比較して軽減され、そこで細胞減少はｐｉｌｏ−ＤＺＰにおいて７５％に達し、ｐｉｌｏ−ＴＣ３０又はｐｉｌｏ−ＴＣ６０動物においてそれぞれ３５％及び１６％であった。この差は２種の試験化合物用量において統計的に有意であった。ＣＡＳ錐体層において、試験化合物はＣＡ３ａ領域に何の保護をも与えたかったが、６０ｍｇ／ｋｇの試験化合物用量はＣＡ３ｂにおいて有意に神経保護的であった。歯状回において、門の細胞減少はｐｉｌｏ−試験化合物（６９〜７２％）及びｐｉｌｏ−ＤＺＰ動物（７３％）で同様であった。２種の視床核において６０ｍｇ／ｋｇの用量はまた、側面及び中間背側核においてそれぞれ６５％及び４２％だけニューロン損傷軽減において保護的であった。大脳皮質において、試験化合物による処置は、最高用量、６０ｍｇ／ｋｇにおいてのみＤＺＰに比較してニューロンの保護を与えた。２種の低い用量、１０ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇにおいては梨状皮質の層ＩＩＩ〜ＩＶに認めた総細胞減少及び組織破壊はｐｉｌｏ−ＤＺＰラットとｐｉｌｏ−試験化合物ラットにおいて同様であり、どちらの群においても計数できなかった。梨状皮質の層ＩＩ及びＩＩＩ〜ＩＶにおいて、ＴＣ６０の処置はｐｉｌｏ−ＤＺＰラットに記録されたニューロン損傷をそれぞれ４１及び４４％減少した。腹側内側嗅皮質における神経保護は、層ＩＩＩ〜ＩＶにおいてＴＣ６０投与により誘発され、ｐｉｌｏ−ＤＺＰラットに比較して、３１％に達した。内側嗅皮質においては、ｐｉｌｏ−ＤＺＰラットに比較してｐｉｌｏ−ＴＣ１０ラットにおいて、背側内側嗅皮質の層ＩＩＩ〜ＩＶにおいて（２８％多い損傷）、そして腹側内側嗅皮質の層ＩＩＩ〜ＩＶにおいて（３５％多い損傷）細胞減少の僅かな悪化をみた。試験化合物の他の用量においては、内側嗅皮質の細胞減少はｐｉｌｏ−ＤＺＰラットに記録されたものと同様であった。
【０１４２】
海馬における苔状繊維萌芽
ｐｉｌｏ−ＤＺＰ及びｐｉｌｏ−ＴＰＭ群でＳＲＳを示すすべてのラットが歯状回の内部分子層にＴｉｍｍ染色の同様な強度を示した（２〜４点）。Ｔｉｍｍ染色は歯状回の上部及び下部のブレード双方の上に存在した。上部ブレードにおけるＴｉｍｍ評価の平均値はｐｉｌｏ−ＤＺＰラット（ｎ＝９）において２．８±０．８に達し、ｐｉｌｏ−ＴＣ１０ラット（ｎ＝７）において１．５±０．６、ｐｉｌｏ−ＴＣ３０ラット（ｎ＝１０）において２．６±１．０そしてｐｉｌｏ−ＴＣ６０ラット（ｎ＝１１）の全群において１．５±０．７に達した。ｐｉｌｏ−ＴＣ６０群がＳＲＳに対する潜伏期に従って準分割されると、早期ＳＲＳ発生を伴なうサブグループは１．８±０．６（ｎ＝６）のＴｉｍｍスコアを示し、ＳＲＳの遅い発生又は不在を伴なうラットのサブグループは１．２±０．６（ｎ＝５）のＴｉｍｍスコアを有した。ｐｉｌｏ−ＤＺＰラットで記録された値はｐｉｌｏ−ＴＣ１０（ｐ＝０．０３２）及び遅い発作を伴った又は発作をもたないｐｉｌｏ−ＴＣ６０サブグループ（ｐ＝０．０１６）における値と統計的に有意に異なっていた。
【０１４３】
考察及び結論
本研究の結果は、ＳＥの開始の１時間後に開始する試験化合物による７日間の処置が、ある脳領域、例えばＣＡ１及びＣＡ３ｂ領域の錐体細胞層、中間背側視床、梨状皮質のＩＩ及びＩＩＩ〜ＩＶ層及び腹側内側嗅皮質の層ＩＩＩ〜ＩＶにおいてニューロン損傷から保護することができるが、試験化合物の最高用量、すなわち６０ｍｇ／ｋｇにおいてのみであったことを示す。試験化合物の後者の用量はまた、少なくとも動物の１つのサブグループにおいてＳＲＳの発生を遅らせることができ、そこでは動物の他の群におけるより約９倍長い、平均遅延を伴なって癲癇になり、そして１匹はＳＥ後９カ月間遅れて癲癇にならなかった。
【０１４４】
これらの結果は、大部分の抗癲癇の市販薬の古典的な特性である、発作抑制性をもつ１つの化合物はまた、癲癇発生を遅らせる、すなわち癲癇発生抑制的であることができることを示す。本研究のデータはまた、使用される用量に拘わらず、試験化合物の処置は、それが主として発生の第１週間中に、そしてＴＣの処置に伴う４週間の全観察期間中に、段階ＩＶ〜Ｖの発作数を減少するので、癲癇の重症度を減少することを示す。更に、ＴＣ１０群において、ｐｉｌｏ−ＤＺＰ群におけるより多数である、重症度の低い段階ＩＩＩの発作発生の増加に移行する。
【実施例２】
【０１４５】
本プロジェクトの目的は、一過性大脳葉癲癇のリチウム−ピロカルピン（Ｌｉ−Ｐｉｌｏ）モデルにおける試験化合物（ＴＣ）の潜在的神経保護及び癲癇発生抑制の特性の研究を追跡することであった。本研究は、ＴＣが、Ｌｉ−Ｐｉｌｏ痙攣重積状態（ＳＥ）により誘発されるニューロン損傷から、海馬の領域ＣＡ１及びＣＡ３、梨状及び腹側内側嗅皮質を保護することができることが示された実施例１に記載の第１の研究の続きである。大部分のこれらの神経保護特性は、研究された最高用量、６０ｍｇ／ｋｇで起り、そしてその処置はラットの３６％（１１中４において）に自然発生発作の発生を遅延させることができた。本研究においては、ニューロン損傷及び癲癇発生に対する、より高い用量のＴＣによる処置の結果を研究することを提案する。
【０１４６】
一過性大脳葉癲癇のリチウム−ピロカルピンモデル
リチウムと結合されたピロカルピン（Ｌｉ−Ｐｉｌｏ）によりラットに誘発される癲癇のモデルは、ヒトの一過性大脳葉癲癇の大部分の臨床的及び神経生理学的特徴を再現する（Ｔｕｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｃａｖａｌｈｅｉｒｏ，１９９５）。成熟ラ
ットにおいて、ピロカルピンの全身投与は２４時間まで継続する可能性があるＳＥをもたらす。死亡率は最初の数日間に３０〜５０％に達する。生存動物におけるニューロン損傷は、海馬体、梨状皮質及びに内側嗅皮質、視床、扁桃体、新皮質及び黒質内に優勢である。この急性発作期間の次に、１４〜２５日間の平均期間中継続する「沈黙した」発作不在相が続き、その後すべての動物が１週間に２〜５回の通常の頻度で自然発生の反復痙攣発作を示す（Ｔｕｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｃａｖａｌｈｅｉｒｏ，１９９５；Ｄｕｂe  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。近年の抗癲癇薬は癲癇発生を予防せず、反復発作に対して一過性に有効なだけである。
【０１４７】
われわれの以前の研究において、われわれは、単独治療で投与されるＴＣの漸増用量の潜在的な神経保護性及び癲癇発生抑制効果を研究し、大部分高い死亡率を妨げるために投与される、われわれの標準のジアゼパム（ＤＺＰ）処置に比較した。これらのデータは、ＳＥの開始の１時間後に開始する１０、３０又は６０ｍｇ／ｋｇのＴＣによる７日間の処置がニューロン損傷からある脳領域を保護することができることを示す。この効果は、ＣＡ１及びＣＡ３ｂ領域の錐体細胞層、中間背側視床、梨状皮質の層ＩＩ及びＩＩＩ〜ＩＶ並びに腹側内側嗅皮質の層ＩＩＩ〜ＩＶにおいて統計的に有意であるが、ＴＣの最高用量、すなわち６０ｍｇ／ｋｇにおいてのみである。更に、ＴＣの後者の用量はまた、動物の少なくとも１つのサブグループにおいてＳＲＳの発生を遅らせることができた唯一の用量であるように見え、そこでは動物の他の群におけるより約９倍長い平均遅延を伴って癲癇になり、そして１匹はＳＥ後９カ月の遅れを伴なって癲癇にならなかった。
【０１４８】
本研究において、ＴＣの異なる用量、すなわち３０、６０、９０及び１２０ｍｇ／ｋｇ（ＴＣ３０、ＴＣ６０、ＴＣ９０及びＴＣ１２０）の効果を前研究と同様な計画を使用して試験した。処置はＳＥの開始の１時間後に開始し、動物を同量の薬剤の２回目の注射で処置した。ＳＥの早期のこの処置の次に６日間のＴＣ処置を続けた。この報告はＳＥの１４日後の海馬、傍海馬皮質、視床及び扁桃において評価されるニューロン損傷並びに自然発生癲癇発作に対する潜伏期及びその頻度に対する４種の異なる用量のＴＣの効果を対象とする。
【０１４９】
動物
Ｊａｎｖｉｅｒ  飼育センター（Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓｔ−ｌｓｔｅ，フランス）により提供される、成熟雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを２０−２２°Ｃの、調整された、混雑しない標準条件下（明／暗周期、７．００ａ．ｍ．〜７．００ｐ．ｍ．点灯）で飼料及び水を自由に与えて飼育した。すべての動物実験を１９８６年１１月２４日の欧州共同体協議会指令（８６／６０９／ＥＥＣ）及びフランス農業省（Ｌｉｃｅｎｓｅ
Ｎ°  ６７−９７）の規則に準拠して実施した。
【０１５０】
痙攣重積状態の誘発、ＴＣ処置及びＳＲＳの発生
すべてのラットが塩化リチウム（３ｍｅｑ／ｋｇ，腹腔内，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を投与され、約２０時間後に、すべての動物がまた、痙攣剤の末梢効果を限定するために投与されるメチルスコポラミンブロミド（１ｍｇ／ｋｇ、皮下，Ｓｉｇｍａ）を投与された。メチルスコポラミンの３０分後にピロカルピン塩酸（２５ｍｇ／ｋｇ、皮下，Ｓｉｇｍａ）を注射することによりＳＥを誘発した。ＴＣ（ＲＷＪ）の漸増用量の効果を５群のラットで研究した。動物はＳＥ開始の１時間後に２．５ｍｇ／ｋｇのＤＺＰ、筋肉内、又は、３０、６０、９０又は１２０ｍｇ／ｋｇのＴＣ（ＴＣ３０、ＴＣ６０，ＴＣ９０、ＴＣ１２０）腹腔内いずれかの投与を受けた。対照群はピロカルピン及びＴＣの代りにベヒクルを投与された。ＳＥ生存ラットは次に、第１のＴＣ注射の約１０時間後に、ＤＺＰ群に対しては第２の１．２５ｍｇ／ｋｇのＤＺＰの腹腔内注射を、又は朝と同量のＴＣを注射され、更に６日間、１日２１回のＴＣ処置（皮下）で維持され、他方ＤＺＰラットはベヒクル注射を受けた。
【０１５１】
癲癇発生に対するＤＺＰ及び４用量のＴＣの効果を毎日、１０時間、動物の１日のビデオ記録により研究した。ビデオ記録は第１の発作が認められた４週間実施され、並びに全期間にわたり発作の総数を記録した。次に動物をビデオ記録システムから外し、更に４週間、われわれの動物施設に飼育し、次に全８週間の癲癇期間後に殺戮した。発作を示さなかったラットはビデオ記録の５カ月後に殺戮した。
【０１５２】
細胞密度の定量
細胞密度の定量はＳＥ後に２回実施した：第１群はＳＥの１４日後に研究し、７匹のＤＺＰ、８匹のＴＣ３０、１１匹のＴＣ６０、１０匹のＴＣ９０、８匹のＴＣ１２０及びＳＥに暴露されなかった８匹の対照ラットからなった。ＳＲＳに対する潜伏期の研究のために使用された第２群は、第１のＳＲＳの８週後又は、ＳＲＳがその遅延に認めることができない場合は５カ月後に殺戮され、１４匹のＤＺＰ、８匹のＴＣ３０、１０匹のＴＣ６０、１１匹のＴＣ６０、９匹のＴＣ１２０ラットにより構成された。現在、ニューロン計数は癲癇発生につき研究された動物の第２群においてはまだ進行中であり、長期の計数及び研究のその部分に関するデータは本報告には包含されないであろう。
【０１５３】
ニューロン計数のためには、動物を１．８ｇ／ｋｇのペントバルビタール（Ｄｏｌｅｔｈａｌ（Ｒ），Ｖｅｔｏｑｕｉｎｏｌ，Ｌｕｒｅ，Ｆｒａｎｃｅ）で深く麻酔した。次に脳を切除し、凍結した。２０μｍの連続切片をクリオスタット中で切断し、チオニン染色の前に数日間空気乾燥した。細胞密度の定量を、ラット脳アトラスの定位座標に従う冠状断面上で１０×１０ボックスの１ｃｍ２の顕微鏡グリッドにより実施した（Ｐａｘｉｎｏｓ  ａｎｄ  Ｗａｔｓｏｎ，１９８６）。計数用グリッドを問題の脳構造物の十分に規定された領域に配置し、各単一の脳構造物に規定される２００−又は４００−倍の顕微鏡拡大により計数を実施した。細胞計数を、動物の処置を知らされていない一人の観察者により、各領域に対し、３枚の隣接切片の両側で２回実施した。各脳構造物中の１２種の計数領域で得られた細胞数を平均した。この方法を使用して、細胞数の過剰算定をもたらす二重計数からもたらされる可能性がある潜在的な誤差を最小にした。グリッドの内部及び右端に接するニューロンは計数しなかった。計数は１０μｍを超える細胞体をもつニューロンのみを伴なった。小細胞体をもつ細胞はグリア細胞と考えられ、計数されなかった。
【０１５４】
データ分析
ニューロン損傷及び癲癇発生に対する、群間の統計的分析は一元配置分散分析、次にＳｔａｔｉｓｔｉｃａソフトウエアを使用するＤｕｎｎｅｔｔ又はＦｉｓｈｅｒテストにより実施された。
【０１５５】
結果
リチウム−ピロカルピン痙攣重積状態の行動の特徴
２５０−３３０ｇ体重の総数１４３匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットをリチウム−ピロカルピン（Ｌｉ−ｐｉｌｏ）誘発ＳＥに暴露した。この数字中、１０匹はＳＥを発症せず、他方１３３匹のラットは完全な特徴的Ｌｉ−ｐｉｌｏＳＥを発症した。ＳＥの行動的特徴はｌｉ−ｐｉｌｏ−ＤＺＰ及びｌｉ−ｐｉｌｏ−ＴＣ群の両方で同様であった。ピロカルピン注射の５分以内に、ラットは下痢、立毛及びコリン作動性刺激の他の徴候を発症した。その後の１５〜２０分間に、ラットは頭部上下運動、引っ掻き運動、咀嚼及び探索行動を示した。ピロカルピン投与の約１５〜２０分後に反復性発作が開始した。立ち上がり及び転倒を伴なう頭部及び両側前肢のミオクローヌスのエピソードを伴なうこれらの発作（ｓｅｉｚｕｒｅ）は、前記（Ｔｕｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｄｕｂe  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｎｄｒe  ｅｔ  ａｌ．，２００３）のようにピロカルピン投与の約３５〜４０分後にＳＥに発展した。ＳＥに暴露させず、リチウム及び生理食塩水を受けた対照群は２０匹のラットから構成された。
【０１５６】
ＳＥの１４日後に細胞計数に使用された５７匹の動物の群において、総数１３匹のラットはＳＥ後の最初の４８時間中に死亡した。死亡率の程度は処置とともに変動し：ＤＺＰラットの３６％（４／１１）、ＴＣ３０ラット３３％（４／１２）、ＴＣ６０ラット８％（１／１２）、ＴＣ９０ラット０％（０／１０）及びＴＣ１２０ラット３３％（４／１２）が死亡した。ＤＺＰ群において、４匹のラットがＳＥ後の最初の２４時間以内に死亡した。ＴＣ３０ラットの群において、１匹のラットはＳＥの当日に死亡し、１匹はＳＥ後の２４時間までに死亡し、そして２匹は４８時間までに死亡した。ＴＣ６０ラット群においては、１匹がＳＥ後の４８時間目に死亡した。ＴＣ１２０ラットの群では、２匹がＳＥ後の２４時間までに、そして２匹が４８時間までに死亡した。
【０１５７】
ＳＲＳに対する潜伏期の研究及び最近の細胞計数に使用された５５匹の動物群において、ＳＥ後の最初の４８時間以内の死亡率の度合いは以下であった：ＤＺＰラットの７％（１／１４）、ＴＣ３０ラットの２７％（３／１１）、ＴＣ６０ラットの０％（０／１０）、ＴＣ９０ラットの０％（０／１１）そしてＴＣ１２０ラットの０％（０／９）が死亡した。ＤＺＰラットの群においては、ＳＥ後の２４時間以内に１匹のラットが死亡した。ＴＣ３０の群においては、２匹のラットがＳＥ後の２４時間までに、そして４８時間までに１匹が死亡した。
【０１５８】
早期相（ＳＥの１４日後）における海馬及び皮質の細胞密度
対照ラットに比較してＤＺＰラットにおいては、ニューロン数は海馬のＣＡ１領域で膨大に減少し（錐体細胞層において８５％低下）、他方ＣＡ３領域は損傷が少なかった（４０％の低下）（表１及び図１）。歯状回においては、ＤＺＰラットは門において顕著なニューロン減少を経験した（６５％）が、顆粒細胞層は明白な損傷を示さなかった。損傷の同様な分布が腹側海馬に認められたが、この領域で細胞計数は実施されなかった。
【０１５９】
視床においては、ニューロン減少は中間背側の中心及び側面、背側の側面の中間背側及び中心の中間核に軽度であり（それぞれ、１８、２４、４０及び３４％の低下）、中間背側の核（４９％）でより顕著であり、そして背側の側面核の腹側の側面部（９０％）で主要であった（以下の表１及び図２）。
【０１６０】
【表１】
2009501224.tif 000009
【０１６１】
扁桃において、ニューロン減少は中間腹側後方核（３８％）において軽度であり、基底側面及び中間腹側の前方核（それぞれ７３％及び５３％の低下）においてより著明であっ
た。中心核にニューロン損傷はなかった（表１及び図３）。
【０１６２】
梨状皮質において、ニューロン減少はほとんど全体的に層ＩＩＩ（９４％）にあり、それはもはや実際に可視的ではなく、対象の生理食塩水処置ラットに比較してＤＺＰラットにおいて背側及び腹側の層ＩＩにおいてそれぞれ６６％及び８９％に達した。背側の内側嗅皮質において、層ＩＩ及びＩＩＩ−ＩＶは僅かな損傷（それぞれ１８％及び２４％）を受け、そして腹側の層ＩＩ及びＩＩＩ−ＩＶにおいて損傷はそれぞれ２２％及び７４％に達した（表１及び図４）。
【０１６３】
ＴＣ処置動物の海馬において、細胞減少はＣＡ１錐体細胞層においてＤＺＰラットに比較して有意に減少した。この減少はＴＣ３０、６０又は９０のラットで顕著であり（３６〜４７％の細胞減少）、ＴＣ１２０群で明らかであった（１２％細胞減少）。すべてのＴＣ用量で統計的に有意差があった（表１及び図１）。ＣＡ３錐体層において、１２０ｍｇ／ｋｇ用量においてのみＲＷＪにより誘発された僅かな神経保護の傾向があったが、ＤＺＰ群との相異は有意ではなかった。歯状回においては、門における細胞減少はＤＺＰ及びＴＣ３０、６０及び９０群において同様であり（６１〜６６％の低下）、ＴＣ１２０群においてはＤＺＰ動物（６６％の低下）に比較して減少された損傷の僅かな傾向があった（５３％ニューロン減少）。これらの差はいずれも統計的に有意ではなかった。
【０１６４】
視床においては、ニューロン減少はＤＺＰ及びＴＣ３０及びＴＣ６０ラットで同様であった。ＴＣは背側の側面の中間背側核において６０ｍｇ／ｋｇ用量で、そして２種の大量用量、９０及び１２０ｍｇ／ｋｇにおいては、すべての視床核で有意に保護的であったが、その差は、ＴＣ９０ラットにおける中間背側の中心及び中心の中間核においては有意に達しなかった。ＴＣ１２０ラットにおいては、ニューロン低下はＤＺＰラットに比較してかなり減少した。それは４〜１９％の範囲にあり、ニューロン数は背側の側面の中間背側核を除いて対照動物と有意差はなかった（表１及び図２）。扁桃においては、ＴＣは基底側面核において３０ｍｇ／ｋｇ用量で、そして６０ｍｇ／ｋｇ用量においては中間背側前方核においてもまた、有意に保護的であった。最高用量において、ＴＣは著しく神経保護的であり、ニューロン数は対照のレベルともはや有意には異ならず、すべての扁桃核において対照のレベルの８６〜９９％に達した（表１及び図３）。
【０１６５】
大脳皮質においては、ＴＣによる処置は、３０ｍｇ／ｋｇの用量において、ＤＺＰ処置に比較していずれの皮質領域をも有意に保護しなかった。６０ｍｇ／ｋｇにおいて、ＴＣは背側の梨状皮質の層ＩＩ中にのみニューロン減少を有意に低下させた（ＤＺＰ群の６６％に比較して２５％の低下）。９０及び１２０ｍｇ／ｋｇにおいては、ＴＣは、ＤＺＰ処置に比較して梨状皮質のすべての３領域で有意に保護し、そしてＴＣの最高用量、１２０ｍｇ／ｋｇで、梨状皮質の、背側の層ＩＩ及び層ＩＩＩにおいてもニューロン密度は対照レベルの７８〜９６％に達し、そこではＤＺＰ群ではニューロン数はほとんど全体に消耗された。背側及び腹側内側嗅皮質のすべての層において、ＴＣの２種の最低用量、３０及び６０ｍｇ／ｋｇは何の神経保護をも与えなかった。ＴＣの９０ｍｇ／ｋｇ用量は腹側内側嗅皮質の層ＩＩ及びＩＩＩ／ＩＶを有意に保護した（ＤＺＰ群における１９及び７３％に比較して、背側部分の層ＩＩ及びＩＩＩ／ＩＶ及び腹側部分の層ＩＩに４及び１７％の損傷が残った）。ＴＣの最大用量、１２０ｍｇ／ｋｇにおいて、内側嗅皮質のすべての部分、背側及び腹側両方が保護され、これらの領域のニューロン数は対照のレベルと有意差はなかった（ＤＺＰ群の２７〜８１％に比較して、ニューロンの８５〜９４％が生存した）。
【０１６６】
反復発作に対する潜伏期及びその頻度
自然発生発作に対する潜伏期はＤＺＰ群（１４ラット）において１５．５±２．３日の平均値に達し、ＴＣ３０群（８ラット）と同様であった（１１．６±２．５日）。ＴＣの
より大量濃度において、動物は短い潜伏期及び長い潜伏期をもつサブグループに準分類することができるであろう。短い潜伏期はＳＥ後４０日より短い期間と考えられた。何匹かのラットは、ＤＺＰ及びＴＣ群で記録されたものと同様な、最初の自然発生発作に対する潜伏期を示したが、この短い潜伏期の値を示すラット数は、ＴＣ濃度の増加とともに徐々に減少した。従って３０ｍｇ／ｋｇにおいて、ラットの７０％（７／１０）が発作に対し短い潜伏期を有し、他方９０及び１２０ｍｇ／ｋｇにおいては、この率はそれぞれ３６％（４／１１）及び１１％（１／９）に達した（以下の表２及び図５）。
【０１６７】
【表２】
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【０１６８】
ＴＣ６０、９０及び１２０群において、長い潜伏期をもつラットの平均値は同様であり、５２〜８５日の範囲にあった。最後にＴＣの２種の大量用量においては、ＳＥ後１５０日の期間にわたり、どんな発作をも発症しなかったある割合のラットを確認することができた。非癲癇ラットの率は双方のＴＣ用量で４５％に達した。
【０１６９】
自然発生発作の頻度は記録の４週間にわたり同様であった。それはＤＺＰ及びＴＣ３０群でより高い傾向を示し、他方ＴＣ６０、９０及び１２０群でより低かった（図６）。これらの相異は、各個々の毎週の頻度レベルにおいては統計的に有意差に達しなかったが、４週間にわたる発作の総数又は平均数に対しては有意差に達した。
【０１７０】
発作数はまた最初の自然発生発作に対する潜伏期間に従ってプロットされた。短い潜伏期をもつ動物は長い潜伏期をもつラットよりも、記録の４週間にわたり、２〜３倍多い発
作を示す傾向を示した。恐らくＴＣ１２０動物の短い潜伏期のサブグループには唯一匹の動物が存在したために、ＡＮＯＶＡが何の有意差をも示さなかったので、統計的分析は実施することができなかった（図７）。しかし、すべての潜伏期の値を発作数に対してプロットすると、−０．４の相関係数をもつ直線をもたらす有意な逆相関が存在した（図８）。
【０１７１】
この分析を最終化するために、２件の更なる測定を実施する必要がある。第１は、最初の自然発生発作後２カ月間ビデオで記録されて追跡された、又は脳損傷の程度及び位置と、自然発生発作の発生及び／又はそれに対する潜伏期間の間の潜在的な相関を研究するために５カ月目に殺戮された動物に対する細胞計数である。第２のものは、５カ月目に「非癲癇」であると宣言される動物が発作を起こさないままでいるかどうかを研究するために、ラットの群の発作発生の１年間の追跡を実施することであろう。
【０１７２】
本研究の結果は、Ｌｉ−ｐｉｌｏ誘発ＳＥの開始１時間後に開始するＴＣによる処置が海馬のＣＡ１錐体細胞層並びに腹側及び背側の梨状及び内側嗅皮質のすべての層中で神経保護性を有することを示す。ＴＣはまた、視床及び扁桃核を保護する。しかしＴＣは、ＣＡ１における、１例の視床及び１例の扁桃核を除き、３０ｍｇ／ｋｇの用量では保護的でない。６０ｍｇ／ｋｇの用量では、背側の梨状皮質の層ＩＩ及び第２の扁桃核もまた保護される。９０及び１２０ｍｇ／ｋｇにおいては、薬剤は、海馬のＣＡ３及び歯状回の門を除き、研究された大部分の脳領域を保護する。後者の２つの構造物プラス背側の側面の腹側背側の視床核が、ニューロン数が１２０ｍｇ／ｋｇのＴＣ用量において対照と有意差をもったままの唯一の領域である。これらのデータから、ＴＣの極めて強力な神経保護性が明らかに見える。該分子はＬｉ−ｐｉｌｏにより誘発される辺縁系の癲癇の回路に属する大部分の領域、すなわち海馬、視床、扁桃及び傍海馬皮質におけるニューロン死滅を予防するように思われる。これらはすべて、われわれがＬｉ−ｐｉｌｏ処置ラットで癲癇発生の経過中ＭＲＩ信号を検出した領域である（Ｒｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ）。ＴＣにより有効に保護されない唯２種の領域は、ＣＡ３錐体細胞層及び、歯状回の門である。後者の領域は急速な、膨大な細胞損傷を受け（Ａｎｄｒe  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｒｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ）、そして以前の研究に使用された神経保護のいずれもこの構造物を保護することができなかった。確認された以前の研究に基づき、この構造物はＬｉ−ｐｉｌｏモデルにおける癲癇発作の開始及び維持におけるキー領域として識別された（Ｄｕｂe  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。本データは明らかに、損傷がこの領域に極めて顕著に残る場合ですら、癲癇発生を予防することができることを示す。ビデオ記録された動物群に対する長期の細胞計数は、この領域の損傷の程度がこのモデルにおける癲癇発生に対して決定的であるか（ｃｒｉｔｉｃａｌ）どうかを示すことができるであろう。
【０１７３】
処置は３０ｍｇ／ｋｇの用量において、最初の自然発生発作に対する潜伏期に影響を与えなかった。３種のより高い用量においては、ある割合の動物がＤＺＰ又はＴＣ３０ラットと同様に早く癲癇を発症したが、このサブグループの相対的重要性は使用されるＴＣ用量に逆相関した。サイズ（２〜４匹／群）の一定なもう１つのサブグループは４〜６倍長い潜伏期後に癲癇を発症したが、他方、薬剤の２種の最高用量においては、４〜５匹のラットは５カ月後、すなわち短い潜伏期間の約１０倍、そして長い潜伏期間の２〜３倍の期間の後にも癲癇にならなかった。癲癇の発症のこの遅延は、動物の基底皮質中で保護されたニューロン数と相関するかも知れない。この推定は、ＳＥの１４日後に短期のニューロン計数にかけた動物の基底皮質中の神経保護の程度に、ある均一性が認められた事実に基づく。しかし、現在のところ、癲癇発生の研究に使用された動物においてニューロン計数は実施されておらず、従って基底皮質中に生存しているニューロン数と、癲癇発生の率又は発生との潜在的な相関に対する結論を出すことはできない。
【０１７４】
本研究で得たデータは、６０ｍｇ／ｋｇ用量のＴＣがニューロン損傷から海馬及び基底皮質を保護し、そして反復発作の発生を遅らせた（以前の報告、２００２を参照されたい）ことを報告する本グループの以前の研究と一致する。それらは、基底皮質の保護が、癲癇のリチウム−ピロカルピンモデルにおいて、疾患改変効果を誘発するキー因子である可能性があることを確証する。癲癇過程の開始物としての基底皮質の重要な役割は、リチウム−ピロカルピンモデルにおいてわれわれのグループにより以前に示された（Ａｎｄｒe  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｒｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ，ｂ）。
結論として、本研究の結果は、試験化合物（ＴＣ）が非常に有望な癲癇発生抑制効果を有することを示す。
【０１７５】
実施例２に対する引用文献
Ａｎｄｒe  Ｖ，Ｍａｒｅｓｃａｕｘ  Ｃ，Ｎｅｈｌｉｇ  Ａ，Ｆｒｉｔｓｃｈｙ  ＪＭ（２００１）（海馬のＧＡＢＡ作動系の変更は、一過性大脳葉癲癇のリチウム−ピロカルピンモデルにおける自然発生の反復発作の発症の原因である。）Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  １１：４５２−４６８．
Ａｎｄｒe  Ｖ，Ｒｉｇｏｕｌｏｔ  ＭＡ，Ｋｏｎｉｎｇ  Ｅ，Ｆｅｒｒａｎｄｏｎ  Ａ，Ｎｅｈｌｉｇ  Ａ（２００３）（長期プレガバリン処置は基底皮質を保護し、そしてラットのリチウム−ピロカルピンモデルにおける自然発生発作の発生を遅らせる）Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ  ４４：８９３−９０３．
Ｃａｖａｌｈｅｉｒｏ  ＥＡ（１９９５）（癲癇のピロカルピンモデル）Ｉｔａｌ  Ｊ
Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ  １６：３３−３７．
Ｄｕｂe  Ｃ，Ｍａｒｅｓｃａｕｘ  Ｃ，Ｎｅｈｌｉｇ  Ａ（２０００）（リチウム−ピロカルピン誘発癲癇発生期間中の未成熟及び成熟ラット脳に発生する可塑的変化の理解に対する代謝的及び神経病理学的方法）Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ  ４１（Ｓｕｐｐｌ  ６）：Ｓ３６−Ｓ４３．
Ｄｕｂe  Ｃ，Ｂｏｙｅｔ  Ｓ，Ｍａｒｅｓｃａｕｘ  Ｃ，Ｎｅｈｌｉｇ  Ａ（２００１）（未成熟及び成熟ラットにおける癲癇のリチウム−ピロカルピンモデルの慢性相期間中の、ニューロン減少と発作間のグルコース代謝の間の相関）Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １６７：２２７−２４１．
Ｐａｘｉｎｏｓ  Ｇ，Ｗａｔｓｏｎ  Ｃ（１９８６）（定位座標におけるラット脳），２ｎｄ  ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ．
Ｒｏｃｈ  Ｃ，Ｌｅｒｏｙ  Ｃ，Ｎｅｈｌｉｇ  Ａ，Ｎａｍｅｒ  ＩＪ（２００２ａ）（成熟ラットにおける一過性大脳葉癲癇のリチウム−ピロカルピンモデルの研究に対する磁気共鳴画像の寄与）Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ  ４３：３２５−３３５．
Ｒｏｃｈ  Ｃ，Ｌｅｒｏｙ  Ｃ，Ｎｅｈｌｉｇ  Ａ，Ｎａｍｅｒ  ＩＪ（２００２ｂ）（生後Ｐ２１日ラットにおける一過性大脳葉癲癇の発症に対する皮質傷害の予測的価値：リチウム−ピロカルピンモデルを使用するＭＲＩ法）Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ  ４３：１１２９−１１３６．
Ｔｕｒｓｋｉ  Ｌ，Ｉｋｏｎｏｍｉｄｏｕ  Ｃ，Ｔｕｒｓｋｉ  ＷＡ，Ｂｏｒｔｏｌｏｔｔｏ  ＺＡ，Ｃａｖａｌｈｅｉｒｏ  ＥＡ（１９８９）（総論：コリン作動機序及び癲癇発生。ピロカルピンにより誘発される発作：手に負えない癲癇の新規実験モデル）Ｓｙｎａｐｓｅ  ３：１５４−１７１．
【実施例３】
【０１７６】
ＰＣ１２細胞血清除去モデル
血清除去（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）は、神経細胞を包含する培養細胞株並びに種々の組織源の一次細胞における細胞死をもたらす細胞毒性の環境的チャレンジである。とりわけ褐色細胞腫（ＰＣ）１２細胞は広範な神経変性及び細胞死関連障害に対するインビトロのニューロン細胞モデルとして広く使用されてきた（Ｍｕｒｉｅｌ，ｅｔ  ａｌ，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｆｒｅｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｌｅｖｅｌｓ（Ｒｈｏｄ−２  ｆｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）ａｎｄ  ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｎａｌｌｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ＰＣ１２  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｒａｍｉｄｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ（セラミド−依存性細胞死期間のミトコンドリアを含まないカルシウムレベル（Ｒｈｏｄ−２
蛍光）及びニューロンとして分化されたＰＣ１２細胞の超構造的変化），Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２０００，４２６（２），２９７−３１５；Ｄｅｒｍｉｔｚａｋｉ，ｅｔ  ａｌ，Ｏｐｉｏｉｄｓ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｓｈｏｒｔ  ｐｅｒｉｏｄｓ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ（オピオイドは、短期間の血清除去後の細胞死機序の活性化を一時的に抑制する），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，２０００，７４（３），９６０−９６９；Ｃａｒｌｉｌｅ，ｅｔ  ａｌ，Ｒｅｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ：ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ  ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｔｏ  ａ  ｄｉｍｅｒ（神経増殖因子及び血清除去後に減少する細胞死：四量体のグリセロアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼの二量体への転化），Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０００，５７（１），２−１２）。ＰＣ１２細胞は１０％の熱不活性化ウマ血清及び５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加された滅菌培地（ＲＰＭＩ１６４０）中で培養した。培養培地はまた、ペニシリン−ストレプトマイィン−ネオマイシンの抗生物質（それぞれ５０．ｍμ．ｇ、５０．ｍμ．ｇ、１００．ｍμ．ｇ）を含有した。培地は１日おきに交換され、細胞は密集に近いｌｏｇ相中を通過させた（ｃｅｌｌｓ  ｗｅｒｅ  ｐａｓｓｅｄ  ｉｎ  ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ  ｎｅａｒ  ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）。
【０１７７】
対照の細胞はいずれの処置も伴なわずに、通常の培地中で培養した。式７又は式８のエナンチオマー（１０．ｍμ．Ｍ）を培地中で十分に混合し、次に細胞に適用した。２日間のアッセイのために、式７又は式８のエナンチオマー（１０．ｍμ．Ｍ）を血清除去時に１回細胞に適用したのみである。７日間のアッセイに対し、式７又は式８のエナンチオマー（１０．ｍμ．Ｍ）を血清除去時に細胞に適用し、その後４８時間毎に細胞を新鮮な新たな血清非含有培地と交換した。血清除去群においては、細胞を式７又は式８のエナンチオマーを更に添加することなく、血清非含有培地中で培養した。細胞生存率を、血清除去の２日又は７日後に３−（４，５−ジメチルチアゾルー２−イル）−５−（３−カルボキシ−メトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム分子内塩（ＭＴＳ）アッセイにより決定した。
【０１７８】
実験の最後に、細胞を新鮮培地で洗浄し、湿潤化された３７℃の５％  ＣＯ２のインキュベーター中で１．５時間ＭＴＳ溶液とともにインキュベートした。インキュベート期間後、細胞をＳｏｆｔｍａｘ  プログラム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して即座に分析した。ＭＴＳアッセイはある実験設定における変動する細胞数を決定する熱量測定法である。該アッセイはテトラゾリウム塩、ＭＴＳの、組織培養培地中に可溶性のホルマザンへの細胞の転化に基づき、９６−ウエルアッセイプレート中で４９０ｎｍにおいて直接測定される。その吸収は培地中の生存細胞数に正比例する。対照細胞中の任意の吸収値が１００％生存率としてあらわされる。
【０１７９】
表３はＰＣ１２細胞の血清除去モデルにおける式７及び式８の経口投与エナンチオマーの細胞生存率に対する効果を表すデータを記載する。
【０１８０】
【表３】
2009501224.tif 000011
【実施例４】
【０１８１】
一過性脳虚血ラットモデル
式７のエナンチオマー（試験化合物）を１０及び１００ｍｇ／ｋｇ（静脈内）において雄のウイスターラットを使用して、一過性脳虚血中間脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）ラットのモデル（Ｎａｇａｓａｗａ  Ｈ．ａｎｄ  Ｋｏｇｕｒｅ  Ｋ．，Ｓｔｒｏｋｅ，１９８９，２０，１０３７；及び，Ｚｅａ  Ｌｏｎｇａ  Ｅ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｐ．Ｒ．，Ｃａｒｌｓｏｎ  Ｓ．ａｎｄ  Ｃｕｍｍｉｎｓ  Ｒ．，Ｓｔｒｏｋｅ，１９８９，２０，８４中に記載）において研究した。ＭＫ  ８０１（ジゾシルピン・マレエート；ＣＡＳ  登録番号７７０８６−２２−７，市販の神経保護化合物）を正の対照（３ｍｇ／ｋｇ，腹腔内）として使用した。
【０１８２】
ラット（ｎ＝１２）を４つの実験群の１つにランダムに指定し、麻酔した。この方法により中間脳動脈中への内部頸動脈、前方脳動脈及び後方脳動脈からの血流をブロックした。ブロックの１時間後に、動物を、ベヒクル（１時間にわたり静脈内投与された）、対照（１時間の開始時に１回の腹腔内投与として投与された）及び式７のエナンチオマーの２回量投与（ｔｗｏ  ｄｏｓｅｓ）（１時間にわたる静脈内投与）で１時間にわたり処置した。ブロックの２時間後、再潅流を実施した。
【０１８３】
動物を殺戮し、各脳の２０ｍｍ−厚さの冠状切片を調製した。脳病巣の程度を定量するために、前頭皮質から後頭皮質への４０枚の切片毎に１枚（すなわち、８００ｎＭ毎）を使用した。クレシルバイオレットで染色した（Ｎｉｓｓｌ法に従って）切片を使用してスライドを調製し、光学顕微鏡下で検査した。
【０１８４】
個々のラットの冠状断面の局所的虚血表面積を、形態学的変化をもつ細胞の存在に従って決定した。ニューロン傷害又は梗塞面積を測定し、次に積算した。皮質及び線条体の容量を各動物につき計算した（総虚血表面積×０．８ｍｍ（厚さ））。
【０１８５】
ＭＣＡＯ  モデルの分析
４実験群にランダムに指定された各動物に対する平均容量（．＋−．Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を、一元配置ＡＮＯＶＡ（一元配置ＡＮＯＶＡは３種以上の非対群を比較する統計法である）、次にＤｕｎｎｅｔｔ’の  ｔ−テストを使用して比較した（両方の方法はＳｔａｔｖｉｅｗ  ５１２＋ソフトウエア，ＢａｒｉｎＰｏｗｅｒ，Ｃａｌａｂａｓａｓ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡに取り込まれている）。
【０１８６】
以下の表４に示されるように、ベヒクル群に比較してｐ値が＜０．０５である時に、結果は有意であると考えられた（１ｐ＜０．０１；２ｐ＜０．０５）。
【０１８７】
【表４】
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【０１８８】
引用文献
本明細書に引用されたすべての文献は、あたかも個々の刊行物又は特許又は特許出願物がそれぞれ、特別にそして個別にすべての目的のためにその全体を引用により編入されることが示されるものと同程度に、その全体をすべての目的のために引用により本明細書に編入されている。
【０１８９】
本明細書の文献の考察はそれらの著者により実施された主張を単に要約することが意図され、どんな文献も先行技術を構成することは承諾されていない。出願者は引用文献の精度及び妥当性を問題にする（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）権利を保持する。
【０１９０】
本発明は、本発明の個々のアスペクトの単一の具体例として意図される、本出願書に記載の特定の態様に関して限定されない。本発明の多数の修飾物及び変更物は、当業者に明白であろうように、その精神及び範囲から逸脱せずに実施することができる。本明細書に列挙されたものに加え、本発明の範囲内の、機能的に同等な方法及び装置は、以上の説明及び付記の図面から当業者に明白であろう。このような修飾物及び変更物は付記の請求項の範囲内に入ることが意図される。本発明は、このような請求項がそれに対して権利をもつ全範囲の同等物とともに、付記の請求項の条件によってのみ限定されることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１９１】
【図１】ｌｉ−ｐｉｌｏＳＥの１４日目に計数された、海馬の異なる領域中のニューロン数に対するＴＣの漸増用量の効果を示すグラフである。値は問題の各領域中のニューロン細胞体の数±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表される。
【図２】ｌｉ−ｐｉｌｏＳＥの１４日後に計数された、扁桃の異なる核中のニューロン数に対するＴＣの漸増用量の効果を示すグラフである。値は問題の各領域中のニューロン細胞体の数±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表される。
【図３】ｌｉ−ｐｉｌｏＳＥの１４日後に計数された、視床の異なる核中のニューロン数に対するＴＣの漸増用量の効果を示すグラフである。値は問題の各領域中のニューロン細胞体の数±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表される。
【図４】ｌｉ−ｐｉｌｏＳＥの１４日後に計数された、皮質の異なる領域中のニューロン数に対するＴＣの漸増用量の効果を示すグラフである。値は問題の各領域中のニューロン細胞体の数±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表される。
【図５】最初の自然発生発作に対する潜伏期に対するＴＣの漸増用量の効果を示すグラフである。値は各群に対する平均潜伏期の日数±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表される。
【図６】４週間の期間にわたりビデオ記録された自然発生発作の頻度に対するＴＣの漸増用量の効果を示すグラフである。値は発作の平均数±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表される。総量はビデオ記録の４週間の期間中に認めた発作の総数を表し、平均は１週間当たりの平均発作数を表す。Ａｎｏｖａテストは、発作の総数（ｐ＝０．０４５）及び１週間当たりの平均発作数（ｐ＝０．０４５）に対する処置の効果を示した。
【図７】最初の自然発生発作に対する潜伏期に従ってプロットした、４週間にわたりビデオ記録された発作の総数を示す（ＳＬ＝短い潜伏期、ＬＬ＝長い潜伏期）。値は各サブグループに対する平均発作数±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表される。ＡＮＯＶＡテストは処置のなんの有意な効果をも示さなかった。
【図８】最初の自然発生発作に対する潜伏期と、その後４週間に認めた発作の総数との間の相関を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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