(57)【要約】  本発明は、生物試料中のナイセリア・ゴノレーの選択的および特異的検出のための増幅プライマーおよび検出プローブのためのオリゴヌクレオチド配列ならびに核酸増幅法における前記プライマーおよび前記プローブの使用に関する。本発明は、淋菌感染の検出および診断のためにキットの形態にあるオリゴヌクレオチドプライマーセットおよびプライマー／プローブセットも提供する。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、ナイセリア・ゴノレーとクラミジア・トラコマティス等の他の標的生物体との同時検出のための他の特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブとともに使用されることも可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜５２、それらの活性断片、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される核酸配列を含む単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
検出可能な標識をさらに含む、請求項１に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
検出可能な標識が、オリゴヌクレオチドの５’末端で結合される蛍光部分を含む、請求項２に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
該オリゴヌクレオチドが、その３’末端で結合されたクエンチャー部分をさらに含む、請求項３に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
蛍光部分が、６−カルボキシフルオレセインを含み、クエンチャー部分が、ブラックホールクエンチャーを含む、請求項４に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
プライマーセット１、プライマーセット２、プライマーセット３、プライマーセット４、プライマーセット５、プライマーセット６、プライマーセット７、プライマーセット８、プライマーセット９、プライマーセット１０、プライマーセット１１、プライマーセット１２、プライマーセット１３、プライマーセット１４、プライマーセット１５、およびプライマーセット１６からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーセットを含み、
プライマーセット１が、配列番号１またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット２が、配列番号５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号６またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット３が、配列番号８またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号９またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット４が、配列番号１２またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号１３またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット５が、配列番号１５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号１６またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット６が、配列番号１９またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２０またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット７が、配列番号２２またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２３またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット８が、配列番号２５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２６またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット９が、配列番号２９またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３０またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット１０が、配列番号３２またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３３またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット１１が、配列番号３５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３６またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット１２が、配列番号３８またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３９またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット１３が、配列番号４１またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４２またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット１４が、配列番号４４またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４５またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット１５が、配列番号４７またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４８またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット１６が、配列番号５０またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号５１またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含む、
検査試料中のナイセリア・ゴノレーを検出するためのプライマーの収集物。
【請求項７】
プライマー／プローブセット１、プライマー／プローブセット２、プライマー／プローブセット３、プライマー／プローブセット４、プライマー／プローブセット５、プライマー／プローブセット６、プライマー／プローブセット７、プライマー／プローブセット８、プライマー／プローブセット９、プライマー／プローブセット１０、プライマー／プローブセット１１、プライマー／プローブセット１２、プライマー／プローブセット１３、プライマー／プローブセット１４、プライマー／プローブセット１５、およびプライマー／プローブセット１６からなる群より選択される少なくとも１つのプライマー／プローブセットを含み、
プライマー／プローブセット１が、配列番号１またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号３またはその活性断片を含む相補的検出プローブと、配列番号４またはその活性断片を含む逆方向相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット２が、配列番号５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号６またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号７またはその活性断片を含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット３が、配列番号８またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号９またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号１０またはその活性断片を含む相補的検出プローブと、配列番号１１またはその活性断片を含む逆方向相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット４が、配列番号１２またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号１３またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号１４またはその活性断片を含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット５が、配列番号１５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号１６またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号１７またはその活性断片を含む相補的検出プローブと、配列番号１８またはその活性断片を含む逆方向相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット６が、配列番号１９またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２０またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号２１またはその活性断片を含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット７が、配列番号２２またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２３またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号２４またはその活性断片を含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット８が、配列番号２５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２６またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号２７またはその活性断片を含む相補的検出プローブと、配列番号２８またはその活性断片を含む逆方向相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット９が、配列番号２９またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３０またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号３１またはその活性断片を含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット１０が、配列番号３２またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３３またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号３４またはその活性断片を含む検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット１１が、配列番号３５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３６またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号３７またはその活性断片を含む検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット１２が、配列番号３８またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３９またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号４０またはその活性断片を含む検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット１３が、配列番号４１またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４２またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号４３またはその活性断片を含む検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット１４が、配列番号４４またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４５またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号４６またはその活性断片を含む検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット１５が、配列番号４７またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４８またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号４９またはその活性断片を含む検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット１６が、配列番号５０またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号５１またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号５２またはその活性断片を含む検出プローブとを含む、
検査試料中のナイセリア・ゴノレーを検出するためのプライマーの収集物。
【請求項８】
検出プローブの少なくとも１つが、検出可能な標識を含む、請求項７に記載のオリゴヌクレオチドの収集物。
【請求項９】
検出可能な標識が、少なくとも１つの検出プローブに直接的に結合されている、請求項８に記載のオリゴヌクレオチドの収集物。
【請求項１０】
検出可能な標識が、少なくとも１つの検出プローブに間接的に結合されている、請求項８に記載のオリゴヌクレオチドの収集物。
【請求項１１】
検出可能な標識が、直接的に検出可能である、請求項８に記載のオリゴヌクレオチドの収集物。
【請求項１２】
検出可能な標識が、間接的に検出可能である、請求項８に記載のオリゴヌクレオチドの収集物。
【請求項１３】
検出可能な標識が、少なくとも１つの検出プローブの５’末端で結合された蛍光部分を含む、請求項８に記載のオリゴヌクレオチドの収集物。
【請求項１４】
少なくとも１つの検出プローブが、その３’末端で結合されたクエンチャー部分をさらに含む、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドの収集物。
【請求項１５】
蛍光部分が、６−カルボキシフルオレセインを含み、クエンチャー部分が、ブラックホールクエンチャーを含む、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチドの収集物。
【請求項１６】
増幅反応試薬；並びに
プライマーセット１、プライマーセット２、プライマーセット３、プライマーセット４、プライマーセット５、プライマーセット６、プライマーセット７、プライマーセット８、プライマーセット９、プライマーセット１０、プライマーセット１１、プライマーセット１２、プライマーセット１３、プライマーセット１４、プライマーセット１５およびプライマーセット１６からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーセット
を含み、
プライマーセット１が、配列番号１またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット２が、配列番号５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号６またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット３が、配列番号８またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号９またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット４が、配列番号１２またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号１３またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット５が、配列番号１５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号１６またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット６が、配列番号１９またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２０またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット７が、配列番号２２またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２３またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット８が、配列番号２５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２６またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット９が、配列番号２９またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３０またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット１０が、配列番号３２またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３３またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット１１が、配列番号３５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３６またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット１２が、配列番号３８またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３９またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット１３が、配列番号４１またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４２またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット１４が、配列番号４４またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４５またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット１５が、配列番号４７またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４８またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット１６が、配列番号５０またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号５１またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含む、
検査試料中のナイセリア・ゴノレーを検出するためのキット。
【請求項１７】
増幅反応試薬；並びに
プライマー／プローブセット１、プライマー／プローブセット２、プライマー／プローブセット３、プライマー／プローブセット４、プライマー／プローブセット５、プライマー／プローブセット６、プライマー／プローブセット７、プライマー／プローブセット８、プライマー／プローブセット９、プライマー／プローブセット１０、プライマー／プローブセット１１、プライマー／プローブセット１２、プライマー／プローブセット１３、プライマー／プローブセット１４、プライマー／プローブセット１５およびプライマー／プローブセット１６からなる群より選択される少なくとも１つのプライマー／プローブセット
を含み、
プライマー／プローブセット１が、配列番号１またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号３またはその活性断片を含む相補的検出プローブと、配列番号４またはその活性断片を含む逆方向相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット２が、配列番号５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号６またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号７またはその活性断片を含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット３が、配列番号８またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号９またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号１０またはその活性断片を含む相補的検出プローブと、配列番号１１またはその活性断片を含む逆方向相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット４が、配列番号１２またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号１３またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号１４またはその活性断片を含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット５が、配列番号１５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号１６またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号１７またはその活性断片を含む相補的検出プローブと、配列番号１８またはその活性断片を含む逆方向相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット６が、配列番号１９またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２０またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号２１またはその活性断片を含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット７が、配列番号２２またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２３またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号２４またはその活性断片を含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット８が、配列番号２５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２６またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号２７またはその活性断片を含む相補的検出プローブと、配列番号２８またはその活性断片を含む逆方向相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット９が、配列番号２９またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３０またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号３１またはその活性断片を含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット１０が、配列番号３２またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３３またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号３４またはその活性断片を含む検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット１１が、配列番号３５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３６またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号３７またはその活性断片を含む検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット１２が、配列番号３８またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３９またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号４０またはその活性断片を含む検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット１３が、配列番号４１またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４２またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号４３またはその活性断片を含む検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット１４が、配列番号４４またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４５またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号４６またはその活性断片を含む検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット１５が、配列番号４７またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４８またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号４９またはその活性断片を含む検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット１６が、配列番号５０またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号５１またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号５２またはその活性断片を含む検出プローブとを含む、
検査試料中のナイセリア・ゴノレーを検出するためのキット。
【請求項１８】
検出プローブの少なくとも１つが、検出可能な標識を含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
検出可能な標識が、少なくとも１つの検出プローブに直接的に結合されている、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
検出可能な標識が、少なくとも１つの検出プローブに間接的に結合されている、請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
検出可能な標識が、直接的に検出可能である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２２】
検出可能な標識が、間接的に検出可能である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２３】
検出可能な標識が、少なくとも１つの検出プローブの５’末端で結合された蛍光部分を含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２４】
少なくとも１つの検出プローブが、その３’末端で結合されたクエンチャー部分をさらに含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
蛍光部分が、６−カルボキシフルオレセインを含み、クエンチャー部分が、ブラックホールクエンチャーを含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
ナイセリア・ゴノレー核酸を含有すると推測される検査試料を提供する段階；
前記検査試料を単離された少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと接触させ、それにより前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、検査試料中に存在する場合の前記ナイセリア・ゴノレー核酸とハイブリッド形成することが可能である段階；および
前記ナイセリア・ゴノレー核酸とハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドの検出が、前記検査試料中のナイセリア・ゴノレーの存在を示す、前記ナイセリア・ゴノレー核酸とハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドを検出する段階
を含み、
単離されたオリゴヌクレオチドが、配列番号１〜５２、それらの活性断片、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される核酸配列を含む、
前記検査試料中のナイセリア・ゴノレーを検出するための方法。
【請求項２７】
ナイセリア・ゴノレー核酸を含有すると推測される検査試料を提供する段階；
検査試料中に存在する場合、前記ナイセリア・ゴノレー核酸のすべてまたは一部が増幅され、それによりナイセリア・ゴノレー単位複製配列を生じる条件下で、前記検査試料を少なくとも１つのプライマーセットと接触させる段階；および
ナイセリア・ゴノレー単位複製配列の検出が、検査試料中でのナイセリア・ゴノレーの存在を示す、ナイセリア・ゴノレー単位複製配列を検出する段階
を含み、
前記少なくとも１つのプライマーセットが、プライマーセット１、プライマーセット２、プライマーセット３、プライマーセット４、プライマーセット５、プライマーセット６、プライマーセット７、プライマーセット８、プライマーセット９、プライマーセット１０、プライマーセット１１、プライマーセット１２、プライマーセット１３、プライマーセット１４、プライマーセット１５、およびプライマーセット１６からなる群より選択され、
プライマーセット１が、配列番号１またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット２が、配列番号５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号６またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット３が、配列番号８またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号９またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット４が、配列番号１２またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号１３またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット５が、配列番号１５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号１６またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット６が、配列番号１９またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２０またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット７が、配列番号２２またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２３またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット８が、配列番号２５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２６またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット９が、配列番号２９またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３０またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット１０が、配列番号３２またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３３またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット１１が、配列番号３５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３６またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット１２が、配列番号３８またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３９またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット１３が、配列番号４１またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４２またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット１４が、配列番号４４またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４５またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；
プライマーセット１５が、配列番号４７またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４８またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含み；および
プライマーセット１６が、配列番号５０またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号５１またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含む、
前記検査試料中のナイセリア・ゴノレーを検出するための方法。
【請求項２８】
ナイセリア・ゴノレー核酸を含有すると推測される検査試料を提供する段階；
検査試料中に存在する場合、前記ナイセリア・ゴノレー核酸のすべてまたは一部が増幅され、それによりナイセリア・ゴノレー単位複製配列を生じる条件下で、前記検査試料を少なくとも１つのプライマー／プローブセットと接触させる段階；および
ナイセリア・ゴノレー単位複製配列の検出が、前記検査試料中でのナイセリア・ゴノレーの存在を示す、ナイセリア・ゴノレー単位複製配列を検出する段階を含み、
前記少なくとも１つのプライマー／プローブセットが、プライマー／プローブセット１、プライマー／プローブセット２、プライマー／プローブセット３、プライマー／プローブセット４、プライマー／プローブセット５、プライマー／プローブセット６、プライマー／プローブセット７、プライマー／プローブセット８、プライマー／プローブセット９、プライマー／プｓローブセット１０、プライマー／プローブセット１１、プライマー／プローブセット１２、プライマー／プローブセット１３、プライマー／プローブセット１４、プライマー／プローブセット１５、およびプライマー／プローブセット１６からなる群より選択され、
プライマー／プローブセット１が、配列番号１またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号３またはその活性断片を含む相補的検出プローブと、配列番号４またはその活性断片を含む逆方向相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット２が、配列番号５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号６またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号７またはその活性断片を含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット３が、配列番号８またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号９またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号１０またはその活性断片を含む相補的検出プローブと、配列番号１１またはその活性断片を含む逆方向相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット４が、配列番号１２またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号１３またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号１４またはその活性断片を含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット５が、配列番号１５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号１６またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号１７またはその活性断片を含む相補的検出プローブと、配列番号１８またはその活性断片を含む逆方向相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット６が、配列番号１９またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２０またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号２１またはその活性断片を含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット７が、配列番号２２またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２３またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号２４またはその活性断片を含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット８が、配列番号２５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２６またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号２７またはその活性断片を含む相補的検出プローブと、配列番号２８またはその活性断片を含む逆方向相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット９が、配列番号２９またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３０またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号３１またはその活性断片を含む相補的検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット１０が、配列番号３２またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３３またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号３４またはその活性断片を含む検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット１１が、配列番号３５またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３６またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号３７またはその活性断片を含む検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット１２が、配列番号３８またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３９またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号４０またはその活性断片を含む検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット１３が、配列番号４１またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４２またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号４３またはその活性断片を含む検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット１４が、配列番号４４またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４５またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号４６またはその活性断片を含む検出プローブとを含み；
プライマー／プローブセット１５が、配列番号４７またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４８またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号４９またはその活性断片を含む検出プローブとを含み；および
プライマー／プローブセット１６が、配列番号５０またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号５１またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号５２またはその活性断片を含む検出プローブとを含む、
前記検査試料中のナイセリア・ゴノレーを検出するための方法。
【請求項２９】
ナイセリア・ゴノレー核酸のすべてまたは一部が増幅される条件下で検査試料を接触させることが、適切な増幅条件下で、および適切な増幅反応試薬の存在下で実施される核酸増幅反応へ前記検査試料を提示することを含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはＴａｑ−Ｍａｎ（商標）アッセイを使用して実施される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
検査試料が、尿、精液、唾液、眼球レンズ液、リンパ液、子宮頸管内、尿道、直腸、膣、外陰部−膣、および鼻咽頭の試料からなる群より選択される体液を含む、請求項２６、２７または２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００６年４月７日に出願され、「ナイセリア・ゴノレー特異的オリゴヌクレオチド配列」と題された米国特許仮出願第６０／７９０／１９７号に由来する優先権を主張する。前記仮出願は、そのすべての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
淋病は、粘膜中で生育可能であり迅速に増殖可能である、グラム陰性菌であり、細胞内好気性双球菌であるヒト病原体ナイセリア・ゴノレー（淋菌）によって生じる性行為感染症（ＳＴＤ）である。淋菌感染は、地球規模の主要な健康問題のままであり、６千人を超えるケースが、世界中で年次報告されている（A.C. Gerbase et al., Lancet, 1998, 351 (Suppl. 3): 2-４）。疾病管理予防センター（ＣＤＣ）によると、淋病は、米国において２番目に最も頻繁に報告されているＳＴＤであり、ほぼ４００，０００件の新たなケースが毎年報告されている（CDC, "Summary of Notifiable Disease - United States. 2001", Morb. Mortal. Wkly Rep., 2001, 50: 1-108; CDC, "Sexually transmitted Disease Surveillance, 2001", U.S. Department of Health and Human Services, Atlanta, GA, 2002; CDC, "Sexually Transmitted Disease Surveillance, 2002", U.S. Department of Health and Human Services, Atlanta GA, 2003）。米国で最も流行している細菌性ＳＴＤであるクラミジアと同様、淋病は、実質的に過小報告されており、多くの新たな感染が毎年生じると概算されているものの約２倍が報告されている（H. Weinstock et al., Persp. Sex. Reprod. Health, 2004, 36: 6-10）。過小報告は、実質的に少なくとも一部であり、その理由は、淋病が、感染女性の３０〜６０％で、感染男性の１０％にも上るもので無症候性であるからである。認識されておらずかつ治療されていないナイセリア・ゴノレーが、宿主中で数ヶ月間感染したままであり得、そのことが、ナイセリア・ゴノレーの蔓延を容易にし、感染の蓄積を促進し得る。
【０００３】
前記状況が存在する場合、女性における淋菌感染の初期症状には、排尿障害、膣分泌物、月経期以外での膣出血、および異常な疼痛が含まれる。治療していないままで放置すると、淋病感染女性は、症状の存在または重度に関係なく、感染に由来する重度の合併症を発達させる危険がある。特に、淋病は、骨盤内炎症性疾患（ＰＩＤ）と呼ばれる輸卵管および卵巣の炎症をともなう疼痛のある重度の骨盤感染に至り得る（E.W. Hook III and H.H. Handsfield, in "Sexually Transmitted Diseases", K.K. Holmes et al.(Eds.), 3rd Ed., 1999, pp.451-466, McGraw-Hill: New York, NY）。ＰＩＤは、輸卵管、子宮、および周辺組織に持続的な損傷を生じ、慢性骨盤痛、不妊症、および潜在的に致死的な異所性の妊娠に至り得る（W. Cates Jr. et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 1991, 164: 1771-1781; J.Coste et al., Fertil. Steril., 1994, 62: 289-295; L. Westrom and P. Wolner-Hansen, Genitourin. Med., 1993, 69: 9-17）。男性では、最も共通した初期症状は、排尿障害および尿道からの膿性分泌物である。淋病に関する平均的な培養は、感染パートナーとの性的接触後の約２〜５日間であるが、発症には、３０日間程度かかり得る。ナイセリア・ゴノレーは、男性の尿道から生殖器系の他の部分へと伝播して、精巣上体炎、前立腺炎、および尿道周囲の膿瘍等の他の多様な状態を生じ得る。未治療の淋病によって、尿道狭窄となり得、尿道狭窄の結果、尿の流れが悪くなり、膀胱が空になるのが不完全となり、尿道が感染し、最終的には腎不全となり得る。（感染した女性の１〜３％および感染した男性のそれより低い割合で）まれに、細菌が、血液を介して広まり、関節炎、菌血症または心内膜炎を生じる（E.W. Hook III and H.H. Handsfield, "Sexually Transmitted Diseases", K.K. Holmes et al.(Eds.), 3rd Ed., 1999, pp.451-466, McGraw-Hill: New York, NY）。淋病は、主に性行為感染症として公知であるが、淋病は、感染した産道を通じて出産する間に新生児へも感染する可能性がある。このことは、赤ちゃんに対して、失明、関節感染または寿命を脅かす血液感染を生じ得る。
【０００４】
いずれかの性行為感染症を有する患者は、別のＳＴＤによる同時感染の危険性が増しているが、クラミジアおよび淋病の同時感染は、最も普遍的である（淋病に罹患している女性の４０％および男性の２０％にも上るものが、クラミジアにも感染している）。疫学的および生物学的研究によって、淋菌感染が、男性および女性の両者においてヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）の感染に対する罹患率を増大させ、前記感染を容易にするという強力な証拠が提供されている（M.S. Cohen et al., Lancet, 1997, 349: 1868-1873; D.T. Fleming and J.N. Wasserheit, Sex. Transm. Infect., 1999, 75: 3-17; K.A. Workowski and W.C. Levine, Morb. Mortal. Wkly Rep., 2002, 51 (RR06): 1-80; T.A. Farley et al., J. Acquir. Immun. Defic. Syndr., 2003, 33: 642-648）。
【０００５】
早期の検出は、淋病感染を管理するための公衆衛生プログラムの必須の要素である。早期検出および早期治療の目的には、伝染の連鎖の妨害、長期続発症の予防、および同時感染の危険を制限するための感染期間の縮小がある。早期検出は、広汎性ナイセリア・ゴノレー抗生物質耐性による主な関心事項である過剰治療も防止し得る（CDC, "Fluoroquinolone-resistance in Neisseria gonorrhoeae, Hawaii, 1999, and decreased susceptibility to azithromycin in N. gonorrhoeae, Missouri, 1999", Morb. Mortal. Wkly Rep., 2000, 49: 833-837; CDC, "Increases in fluoroquinolone-resistant Neisseria gonorrhoeae-Hawaii and California, 2001", Morb. Mortal. Wkly Rep., 2002, 51: 1041-1044; CDC, "Increases in fluoroquinolone-resistant Neisseria gonorrhoeae among men who have sex with men - United States, 2003, and revised recommendation for gonorrhea treatment, 2004", Morb. Mortal. Wkly Rep., 2004, 53: 335-338）。
【０００６】
細胞培養物中のナイセリア・ゴノレーの単離は、研究室での診断のための伝統的な方法であり、その特異性のため、法医学検体のために選択される方法でもあり続けた。しかしながら、この方法は、検体の生存率を保存するために厳密な移動条件を必要とし、所要時間は２〜３日間である。多くの背景において、細胞培養は、移動の必要がほとんどなく、同日中に結果を提供可能である直接的蛍光抗体染色による抗原検出、酵素免疫測定法、および酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）をベースにしたより迅速な検査によって置き換えられている。しかしながら、これらの方法は、なおも労力が要り、時間がかかり、より重要なことに、特に無症候性患者に対するスクリーニングアッセイとしては感度が欠けている。
【０００７】
より最近では、核酸ベースのハイブリッド形成プローブ検査が、ナイセリア・ゴノレーの直接的検出用に開発されてきた。これらの検査はより高い特異性を提供するが、感度に関しては実質的に改良されていない。さらに、これらの検査のほとんどが、侵襲的試料採取法を使用して得られる子宮頸管内または尿道の検体に関して実施される。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、または転写仲介性増幅（ＴＭＡ）技術をベースとした核酸増幅アッセイが、今では利用可能である。大気中での検体移動、計量の自動化、および迅速な処理時間に関して、非培養検査の利点をすべて提供することに加え、これらのアッセイはより高い特異性および１００％に上る感度を提供する。さらに、前記核酸増幅アッセイは、尿等の侵襲性の低い臨床検体に関して実施されることが可能である。これらの利点すべてによって、核酸増幅アッセイは、無症候性淋菌感染の検出に対して、スクリーニングツールとして特に適している。
【０００８】
しかしながら、淋病検出のための既存の核酸増幅アッセイはなおも、特定の不利な点および限界を呈している。主な関心事項には、特定の検体中での増幅阻害剤の存在によって生じる偽陰性の結果および厳密な品質管理手法が適用されていない場合の相互汚染による偽陽性の結果が含まれる。明らかに、淋菌感染の検出のための改良された核酸増幅アッセイの開発が、今なお非常に望ましい。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、生物試料中のナイセリア・ゴノレーの迅速で、選択的な特異的検出のためのシステムおよび方法に関する。特に、本発明は、淋菌感染の検出および診断のための核酸増幅検査を開発するために使用されることが可能である試薬を包含する。より具体的には、本発明は、ナイセリア・ゴノレーのオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）遺伝子、シトシンメチルトランスフェラーゼ（ｄｃｍＧ）遺伝子およびピリン反転タンパク質相同体（ｐｉｖＮＧ）遺伝子内の標的核酸配列のいずれかの鎖の検出のための増幅プライマーおよび／または検出プローブとして使用されることが可能であるオリゴヌクレオチド配列を提供する。
【００１０】
より具体的には、本発明は、配列番号１〜５２（表１参照）、それらのいずれかの活性断片、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される核酸配列を含む単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１１】
特定の態様において、本発明のオリゴヌクレオチド配列は、リアルタイムおよび／または多重の検出を包含するものを含む多様な核酸増幅アッセイのいずれかにおいて使用されることが可能であるプライマーセットまたはプライマー／プローブセットとして提供される。
【００１２】
本発明は、生物検査試料中でナイセリア・ゴノレーを検出するための方法も提供する。一般的に、前記方法は、試料中に存在する場合、本発明のオリゴヌクレオチドがナイセリア・ゴノレー核酸とハイブリッド形成することが可能であるように、ナイセリア・ゴノレー核酸を含有すると推測される検査試料を、少なくとも１つの前記オリゴヌクレオチドと接触させること、および前記ナイセリア・ゴノレー核酸とハイブリッド形成するいずれかのオリゴヌクレオチドを検出することを含む。前記ナイセリア・ゴノレー核酸との前記オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成の検出は、前記試料中でのナイセリア・ゴノレーの存在を示す。
【００１３】
本発明の他の方法は、ナイセリア・ゴノレー核酸を含有すると推測される検査試料を、本明細書に記載の少なくとも１つのプライマーセットまたはプライマー／プローブセットおよび増幅反応試薬と接触させ、反応混合物を形成することを含む。次に、反応混合物も、増幅条件下に置き、それにより、ナイセリア・ゴノレー単位複製配列（amplicon）を生じるためのプライマーセットまたはプライマー／プローブセットのプライマーを使用して、検査試料中に存在する場合、ナイセリア・ゴノレー核酸のすべてまたは一部を増幅させる。結果として生じるナイセリア・ゴノレー単位複製配列は、多様な検出技術のいずれかを使用して検出され得る。特定の態様において、ハイブリッドは、ナイセリア・ゴノレー単位複製配列と、プライマー／プローブセットの検出プローブとの間に形成され、検査試料中のナイセリア・ゴノレーの存在を示すものとして検出される。
【００１４】
本発明のオリゴヌクレオチド配列は、ナイセリア・ゴノレーおよび他の標的生物の同時検出のための核酸増幅フォーマットにおいて、他の特異的プライマーおよびプローブと組み合わせて使用されることが可能である。特定の態様において、本発明の増幅プライマーおよび検出プローブは、生物試料中でのナイセリア・ゴノレーおよびクラミジア・トラコマティス（Chlamydia trachomatiｓ）の同時検出のためのクラミジア・トラコマティス特異的プライマーおよびプローブとの組み合わせで使用される。
【００１５】
本発明は、本明細書に開示される増幅プライマー、検出プローブ、プライマーセットまたはプライマー／プローブセット、場合により、増幅反応試薬を含むキットも提供する。
【００１６】
本発明のこれらおよび他の目的、利点および特性は、以下の詳細な記述を読んだ当業者に明白となるであろう。
【００１７】
定義
明細書を通じて、以下の段落中に定義されるいくつかの用語が使用される。
【００１８】
「個体」、「対象」および「患者」という語は、本明細書において同じ意味で使用される。前記語は、ナイセリア・ゴノレーの宿主である可能性があるが、細菌によって感染されていてもよいかまたは感染されていなくてもよいヒトを指す。前記語は、特定の年齢を示すものではなく、したがって、成人、子供、新生児、および胎児を包含する。
【００１９】
本明細書で使用される「検査試料」という語は、ナイセリア・ゴノレー核酸を含有すると推測されるいずれかの液体または固体材料を指す。検査試料は、ナイセリア・ゴノレー核酸を含有し得るいずれかの生物組織もしくは液体であり得るか、または前記組織もしくは液体に由来し得る。しばしば、前記試料は、「臨床試料」、すなわち、淋菌感染に関して検査されるべき患者から得られたかまたは単離された試料であろう。前記試料には、細胞材料を含有し、細胞を含有してもよいかまたは含有していなくてもよい体液、例えば、血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、眼球レンズ液、リンパ液、羊水等；子宮頸管内、尿道、直腸、膣、外陰部−膣、鼻咽頭および肺の試料；ならびに公知の診断による保存記録試料が含まれるが、それに限定されるわけではない。検査試料は、凍結切片等の組織の切片でもあり得る。「検査試料」という語は、生物試料を加工することによって由来するいずれかの材料も包含する。由来する材料には、試料から単離された細胞（またはその子孫）、細胞構成要素、および前記試料から抽出された核酸分子が含まれるが、それらに限定されるわけではない。検査試料を得るための生物試料の加工は、濾過、蒸留、遠心分離、抽出、濃縮、希釈、精製、干渉成分の不活性化、試薬の添加等の１つ以上を包含し得る。
【００２０】
「核酸」、「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という語は、本明細書において同じ意味で使用される。前記語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態にあるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、別段の記載がなければ、天然に発生するヌクレオチドと同様の様式で機能しうる天然ヌクレオチドの公知の類似体を包含する。前記語は、合成主鎖を有する核酸様構造および増幅産物を包含する。
【００２１】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーの短い紐を指す。オリゴヌクレオチドは、増幅プライマーおよび／または検出プローブとして使用されることが可能である。核酸配列のこのような短い紐はしばしば、化学的に合成される。当業者によって理解されるであろうように、オリゴヌクレオチドの長さ（すなわち、オリゴヌクレオチドが含有するヌクレオチドの数）は、しばしばその企図される機能または使用に応じて広範に変動することが可能である。一般的に、オリゴヌクレオチドは、約５〜約１５０のヌクレオチドを含み、好ましくは約１５〜約１００のヌクレオチド、より好ましくは約１５〜約５０のヌクレオチドを含む。
【００２２】
オリゴヌクレオチドを指す場合の「単離された」という語は、前記オリゴヌクレオチドの由来または操作によって、天然に結合しているかまたは初期的に得られるかもしくは調製される場合に結合している成分の少なくともいくつかから分離されるオリゴヌクレオチドを意味する。「単離される」によって、関心対象のオリゴヌクレオチドが、人為的に生成されるかまたは合成されることは、もう１つの方法としてまたはさらなる方法として意味される。
【００２３】
オリゴヌクレオチド（例えば、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド配列）に対する参照において本明細書で使用される「活性断片」という語は、全長のヌクレオチドよりも少ないヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列と十分に相同的であるかまたは前記ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列を含むいずれかの核酸分子を指すものであり、全配列の少なくとも１つの生物特性を保持している。典型的には、活性断片は、全長のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの活性を有する配列を含む。本発明のオリゴヌクレオチド配列の活性断片または部分は、例えば長さ１０、１５、２０、２５、３０またはそれより多くのヌクレオチドである核酸分子であり得、生物試料中でのナイセリア・ゴノレーの検出のための増幅プライマーおよび／または検出プローブとし使用されることが可能である。
【００２４】
オリゴヌクレオチドの活性断片に対する参照において本明細書で使用される場合の「十分に相同的な」という語は、前記オリゴヌクレオチドと比較して少なくとも３５％の配列相同性を有する核酸分子を指す。特定の態様において、前記配列相同性は、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれより大きい。
【００２５】
「相同性」および「同一性」という語は、本明細書において同じ意味で使用され、２つの核酸分子の間の配列類似性を指す。２つの核酸配列の％相同性または同一性の算出は、最適な比較目的のために２つの配列を整列させることによって実施されることが可能である（例えば、最適な整列化のために第一の核酸配列と第二の核酸配列のうちの１つまたは両者において、間隙を導入することが可能であり、比較目的のために、非相同性配列を無視することが可能である）。特定の態様において、比較目的のために整列化された配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％である。次に、対応するヌクレオチド位置にあるヌクレオシドが比較される。第一の配列中の１つの位置が、第二の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占有される場合、分子はその位置で同一である（かまたは相同的である）。２つの配列間の％同一性は、前記２つの配列の最適な整列化のために導入されることが必要である間隙の数および各間隙の長さを考慮すると、配列によって共有される同一の位置の数に応じている。
【００２６】
２つの配列間での配列の比較および％同一性の決定は、算術アルゴリズムを使用して達成することが可能である。例えば、２つのヌクレオチド配列間の％同一性は、ＰＡＭ１２０加重残基表（weight residue table）、１２の間隙長罰則および４の間隙罰則を使用するＡＬＩＧＮプログラム（第２．０版）に組み込まれたMeyersおよびMillerのアルゴリズム（CABIOS, 1989, 4: 11-17）を使用して決定することが可能である。あるいは、２つのヌクレオチド配列間の％同一性は、NWSgapdna. ＣＭＰマトリックスを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（http://www.gcg.comで入手可能）を使用して決定することが可能である。
【００２７】
「ハイブリッド形成」という語は、ワトソン−クリック塩基対形成または非標準塩基対形成を介して複合体を形成するのに十分に相補的なヌクレオチド配列間での複合体形成を指す。プライマーが、標的配列（テンプレート）と「ハイブリッド形成する」場合、このような複合体（またはハイブリッド）は、ＤＮＡ合成を開始するために、例えばＤＮＡポリメラーゼによって必要とされる刺激機能を供するのに十分安定である。ハイブリッド形成する配列が安定したハイブリッドを提供するのに完全な相補性を有する必要がないことは理解であろう。多くの状況において、塩基の約１０％未満がミスマッチである安定したハイブリッドが生じるであろう。したがって、本明細書で使用されるように、「相補的な」という語は、アッセイ条件下でオリゴヌクレオチドの相補体と安定した二本鎖を形成する前記オリゴヌクレオチドを指し、一般的に約９０％以上の相同性がある。当業者は、ハイブリッド条件の厳密性を概算および調整する方法を理解しており、それにより相補性の少なくとも望ましいレベルを有する配列が安定してハイブリッド形成するのに対し、より低い相補性を有する配列は、安定してハイブリッド形成しないであろう。ハイブリッド形成条件およびパラメータの例に関しては、例えば、J. Sambrook et al., "Molecular cloning: A Laboratory Manual", 1989, Second Edition, Cold Spring Harbor Press: Plainview, NY; F.M. Ausubel. "Current Protocols in Molecular Biology", 1994, John Wiley & Sons: Secaucus, NJを参照されたい。
【００２８】
本明細書で使用されるように、「増幅」という語は、試料中の特定の核酸配列の集団の提示を増大させる方法または工程を指す。（ポリメラーゼ連鎖反応またはＰＣＲ等の）増幅方法は、本分野で公知であり、以下により詳細に論じられる。
【００２９】
「標的配列」および「標的核酸」という語は、本明細書において同じ意味で使用される。前記語は、核酸配列を指し、その存在または非存在が検出されるのが望ましい。本発明の脈絡において、標的配列には好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーが複合体形成するであろう核酸配列が含まれる。標的配列には、プローブが望ましい条件化で安定したハイブリッドを形成するであろうプローブハイブリッド形成領域も含まれ得る。当業者によって認識されるであろうように、標的配列は、一本鎖または二本鎖であり得る。本発明の脈絡において、関心対象の標的配列は、ナイセリア・ゴノレーのオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）遺伝子、シトシンメチルトランスフェラーゼ（ｄｃｍＧ）遺伝子またはピリン反転タンパク質相同体（ｐｉｖＮＧ）遺伝子内に存在する。
【００３０】
「プライマー」および「増幅プライマー」という語は、本明細書において同じ意味で使用される。前記語は、核酸重合のためのヌクレオチドおよび物質の存在下で適切な条件（例えば、緩衝液、塩、温度およびｐＨ）下に置かれる場合、ＤＮＡの相補鎖であるプライマー伸長産物の合成の開始地点として作用することが可能であるオリゴヌクレオチドを指す。前記プライマーは好ましくは、増幅における最大効率のため一本鎖であるが、あるいは二本鎖であり得る。二本鎖の場合、前記プライマーがまず処理され（例えば、変性され）、その鎖を分離させた後、伸長産物を調製するのに使用され得る。このような変性段階は典型的に、熱を使用して実施されるが、それに代わるものとして、アルカリを使用した後に中和を使用することによって実施されてもよい。典型的なプライマーは、標的配列と実質的に相補的な配列の長さにおいて約１０〜約３５のヌクレオチドを含有する。しかしながら、プライマーは、さらなる配列も含有することが可能である。例えば、鎖置換増幅（ＳＤＡ）において使用される増幅プライマーには好ましくは、標的結合配列に対して５’部位で制限エンドヌクレアーゼ認識が含まれる（例えば、米国特許第５，２７０，１８４号および第５，４５５，１６６号を参照されたい）。核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）および転写仲介性増幅（ＴＭＡ）プライマーには好ましくは、プライマーの標的結合配列に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーターが含まれる。選択された増幅反応において使用するために結合している標的配列にこのような特化した配列を連結するための方法は、本分野で周知である。
【００３１】
「順方向プライマー」および「順方向増幅プライマー」という語は、本明細書において同じ意味で使用され、標的（テンプレート鎖）とハイブリッド形成する（かまたはアニールする）プライマーを指す。「逆方向プライマー」および「逆方向増幅プライマー」という語は、本明細書において同じ意味で使用され、相補的な標的鎖とハイブリッド形成する（かまたはアニールする）プライマーを指す。順方向プライマーは、逆方向プライマーに対して５’の標的配列とハイブリッド形成する。
【００３２】
本明細書で使用される「増幅条件」という語は、プライマー配列のアニーリングおよび／または伸長を促進する条件を指す。前記条件は、本分野で周知であり、選択される増幅方法に依存する。したがって、例えば、ＰＣＲ反応において、増幅条件は一般的に、熱周期、すなわち２つ以上の温度間での反応混合物の循環を含む。等温増幅反応において、増幅は、熱周期内で生じるが、初期温度の上昇は反応を開始するのに必要とされ得る。増幅条件は、温度および温度周期、緩衝液、塩、イオン強度、ｐＨ等を含むすべての反応条件を包含するが、それらに限定されるわけではない。
【００３３】
本明細書で使用されるように、「増幅反応試薬」という語は、核酸増幅反応において使用される試薬を指し、緩衝液、試薬、逆転写酵素および／またはポリメラーゼ活性またはエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素；マグネシウム又はマンガン等の酵素補助因子；ならびにデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）およびデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）等のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）が含まれ得るが、それらに限定されるわけではない。増幅反応試薬は、使用される増幅方法に依存して当業者によって容易に選択され得る。
【００３４】
「プローブ」および「検出プローブ」という語は、本明細書において同じ意味で使用され、適切な条件下で標的配列の少なくとも一部（例えば、増幅された標的配列の一部）と選択的にハイブリッド形成することが可能であるオリゴヌクレオチドを指す。一般的に、プローブ配列は、「相補的である」（すなわち、コード鎖またはセンス鎖に対して相補的である（＋））かまたは、「逆向きに相補的である」（すなわち、アンチセンス鎖に対して相補的である（−））かのいずれかとして同定される。特定の態様において、検出プローブは、検出可能な部分で標識される。
【００３５】
「標識された」および「検出可能な物質（または部分）で標識された」という語は、実体（例えば、オリゴヌクレオチド検出プローブ）が、例えば別の実体（例えば、増幅反応産物又は単位複製配列）に結合した後に可視化されることが可能であることを特定するために、本明細書で同じ意味で使用される。好ましくは、検出可能な物質または部分は、前記物質または部分が、測定可能な信号を生じ、その強度が、結合した実体の量に関連している（例えば、比例している）よう選択される。核酸分子を標識および／または検出するための広範な種類のシステムが、本分野で周知である。標識された核酸は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的または他の手段によって直接的にまたは間接的に検出可能な標識の組み込みまたは前記標識への抱合によって調製されることが可能である。検出可能な適切な物質には、放射性核種、フルオロフォア、化学発光剤、微粒子、酵素、比色標識、磁気標識、ハプテン、分子ビーコン、およびアプタマービーコンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００３６】
「フルオロフォア」、「蛍光部分」、および「蛍光色素」という語は、本明細書において同じ意味で使用される。前記語は、１つの波長で電磁照射の量子を吸収し、それに応じて異なる、典型的にはより長い波長で１つ以上の光子を放射する分子を指す。広範な種類の構造および特徴のいくつもの蛍光色素が、本発明の実施において使用するのに適している。方法および材料は、核酸分子を蛍光標識するのに公知である（例えば、R.P. Haugland, "Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 1992-1994", 5th Ed., 1994, Molecular Probes, Inc.参照）。好ましくは、蛍光部分は、高い効率で光を吸収および放射し（すなわち、使用される励起波長での高い分子吸収係数および高い蛍光量子量を有し）、光安定性である（すなわち、分析を実施するのに必要な時間内での光の励起の際に有意な分解をしない）。蛍光色素自体が直接検出可能であるよりもむしろ、いくつかの蛍光色素は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）と呼ばれる方法で、エネルギーを別の蛍光色素に転移させ、第二の色素が、検出される信号を生じる。このようなＦＲＥＴの蛍光色素対も、「蛍光部分」という語によって包含される。物理的に連結された蛍光リポーター／クエンチャー部分の使用も、本発明の範囲内である。これらの態様において、蛍光リポーターおよびクエンチャー部分が、核酸プローブの末端等で近接して保持される場合、クエンチャー部分は、リポーター部分から蛍光信号を検出するのを防止する。例えば、ＤＮＡポリメラーゼによる切断後など、２つの部分が物理的に分離されている場合、リポーター部分からの蛍光信号は、検出可能となる。
【００３７】
標識または検出可能な部分に対する参照において本明細書で使用される場合、「直接的に検出可能な」という語は、標識または検出可能な部分が、検出可能であるようさらなる反応または操作を必要としないことを意味する。例えば、蛍光部分は、蛍光分光法によって直接的に検出可能である。標識または検出可能な部分に対する参照において本明細書で使用される場合、「間接的に検出可能な」という語は、標識または検出可能な部分が、さらなる反応または操作の後に検出可能となることを意味する。例えば、ハプテンは、蛍光色素等のリポーターに結合した適切な抗体との反応後に検出可能となる。
【００３８】
特定の好ましい態様に関する詳細な記述
上述のように、本発明は、生物試料中でナイセリア・ゴノレーを検出するための方法および試薬に関する。特定の態様において、本発明の方法は、細菌細胞の少量でさえ含有する試料中でナイセリア・ゴノレーが検出可能となるナイセリア・ゴノレー特異的オリゴヌクレオチド配列および感受性のある核酸の増幅をベースとする技術を使用する。
【００３９】
Ｉ−増幅プライマーおよび検出プローブのためのオリゴヌクレオチド配列
本発明のオリゴヌクレオチド配列
一局面において、本発明は、ナイセリア・ゴノレーのオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）遺伝子、シトシンメチルトランスフェラーゼ（ｄｃｍＧ）遺伝子またはピリン反転タンパク質相同体（ｐｉｖＮＧ）遺伝子における標的配列のいずれかの鎖の特異的検出のための核酸増幅検査において使用されることが可能であるオリゴヌクレオチド配列を提供する。
【００４０】
ＯＲＦ１遺伝子は、ナイセリア・ゴノレーを他のナイセリア属と識別するために使用されることが可能である配列を含有するゲノム領域として記載されている（C.G. Miyada and T.L. Born, Mol. Cell Probes, 1991, 5: 327-335）。ナイセリア・ゴノレーのＯＲＦ１遺伝子は、シトシンメチルトランスフェラーゼ（ｄｃｍＧ）遺伝子等のシトシンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（C.G. Miyada and T.L. Born, Mol. Cell Probes, 1991, 5: 327-335）との有意な相同性を有することも報告されている（J.F. Dempsey et al., J. Bacteriol., 1991, 173: 5476-5486; J.A.F. Dempsey and J.G. Cannon, J. Bacteriol., 1994, 176: 2055-2060）。ｐｉｖＮＧ遺伝子は、ナイセリア・ゴノレー染色体上の複数のコピー中で見出されている。ナイセリア・ゴノレーＦＡ１０９０系の完全に配列決定されたゲノムのシリカ分析およびさらなるサザンブロット分析によって、ナイセリア・ゴノレー染色体の３つの別個の領域にはクラスター形成された遺伝子の８個のコピーがあることが示されている（E.P. Skaar et al., J. Bacteriol., 2005, 187: 1276-1286)。これらの複数のコピーは、転化酵素関連遺伝子と呼ばれている（ｉｒｇ１、ＮＣＢＩ座位連結番号：３２８２０１５；ｉｒｇ２、ＮＣＢＩ座位連結番号：３２８２２３６；ｉｒｇ３、ＮＣＢＩ座位連結番号：３２８１８２４；ｉｒｇ４、ＮＣＢＩ座位連結番号：３２８１８３０；ｉｒｇ５、ＮＣＢＩ座位連結番号：３２８１８５９；ｉｒｇ６、ＮＣＢＩ座位連結番号：３２８１３１４；ｉｒｇ７、ＮＣＢＩ座位連結番号：３２８１２９２；ｉｒｇ８、ＮＣＢＩ座位連結番号：３２８２５５３）。ｐｉｖＮＧ遺伝子は、ナイセリア・ゴノレーを他のナイセリア属と識別するために使用されることが可能である配列を含有することが報告されている（C.S. Carrick et al., Gene, 1998, 220: 21-29）。
【００４１】
上述のように、本発明は、ナイセリア・ゴノレーのＯＲＦ１遺伝子、ｄｃｍＧ遺伝子およびｐｉｖＮＧ遺伝子内の領域を認識するオリゴヌクレオチド配列を提供する。本発明の典型的なオリゴヌクレオチド配列は、それらの対応するマップの位置とともに、表１に呈されている（配列番号１〜５２）。これらの配列は、本発明者によって、Vector NTI（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）、ABI primer express（Applied Biosystems, Foster City, CA）、およびOligo6 Primer Analysis（Molecular Biology Insights, Inc., Cascade, CA）のソフトウェアプログラムを使用して、ＯＲＦ１遺伝子配列、ｄｃｍＧ遺伝子配列およびｐｉｖＮＧ遺伝子配列との配列整列化によって同定された。
【００４２】
当業者によって理解されるであろうように、ナイセリア・ゴノレーの増幅、検出または定量のために本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド配列（またはその活性断片）のいずれかは、企図される使用および／またはアッセイフォーマットに依存して、検出プローブまたは増幅プライマーとして採用され得る。例えば、あるアッセイにおいて増幅プライマーとして使用される本発明のオリゴヌクレオチド配列は、異なるアッセイにおける検出プローブとして使用されることが可能である。与えられた本発明のオリゴヌクレオチド配列は、例えば、前記配列に、選択された増幅方法によって必要とされる特化した配列（例えば、プロモーター配列）を結合させることによって、または検出を容易にするために標識（例えば、蛍光色素）を結合させることによって修飾され得る。このように、本発明に従ったオリゴヌクレオチドには、スペーサーとして、リンカーとして、酵素を標識するかまたは前記酵素に結合するための配列として機能することが可能である、前記オリゴヌクレオチドに対する分解工程または望ましい他の特性に対して安定性または感受性を付加し得る１つ以上の配列が含まれ得る。
【００４３】
本発明によって提供されるオリゴヌクレオチド配列に基づいて、１つ以上のオリゴヌクレオチド類似体が調製され得る（以下参照）。前記類似体は、ペプチド核酸または「ＰＮＡ」（すなわち、天然に生じる核酸のリン酸糖主鎖の代わりに、ペプチド様主鎖を有する分子）等の代替的な構造を含有し得る。本発明の配列を呈する前記代替的な構造は同様に、本発明の一部である。同様に、本発明の配列からなるオリゴヌクレオチドが、核酸塩基の欠失、付加および／または置換を、このような変化が核酸分子の特性に対して負に影響しない程度に含有し得ることは理解される。特に、前記変化は、オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成特性の有意な低下を生じるべきではない。
【００４４】
プライマーセットおよびプライマー／プローブセット
別の局面において、本発明は、生物試料中でのナイセリア・ゴノレーの検出のための、本明細書に開示されたオリゴヌクレオチド配列の組み合わせに関する。より具体的には、本発明は、プライマーセットおよびプライマー／プローブセットを提供する。
【００４５】
本明細書で使用されるように、「プライマーセット」という語は、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、ナイセリア・ゴノレーのＯＦＲ１遺伝子、ｄｃｍＧ遺伝子またはｐｉｖＮＧ遺伝子内の標的配列）の増幅をプライムすることがともに可能である２つ以上のプライマーを指す。特定の態様において、「プライマーセット」という語は、増幅されるべき核酸配列の５’末端とハイブリッド形成する５’（上流）プライマー（または順方向プライマー）と、増幅されるべき配列の相補体とハイブリッド形成する３’（下流）プライマー（または逆方向プライマー）とを含むプライマーの対を指す。前記プライマーセットまたはプライマー対は、ＰＣＲ増幅反応において特に有用である。
【００４６】
順方向増幅プライマーと逆方向増幅プライマーとを含むプライマーセットの例には、
配列番号１（５’−ＧＣＧＧＡＴＴＣＣＣＴＴＧＴＣＡＡＧＡＴＴ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２（５’−ＧＣＣＧＣＧＣＴＣＡＣＣＣＴＣＴＡ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含むプライマーセット１；
配列番号５（５’−ＡＧＴＡＣＧＴＴＴＧＧＡＴＡＣＡＧＧＡＴＴＴＧＡＴＴＴ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号６（５’−ＡＧＣＣＧＴＴＴＴＣＧＣＣＡＧＴＴＴＣ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含むプライマーセット２；
配列番号８（５’−ＧＧＡＡＣＧＡＧＣＣＡＴＣＡＡＡＡＡＣＡＡ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号９（５’−ＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＧＡＡＧＴＧＡＴＡＧＣ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含むプライマーセット３；
配列番号１２（５’−ＡＡＧＧＴＡＴＧＡＴＴＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＡＴＣＧ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号１３（５’−ＣＧＣＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＴＴ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含むプライマーセット４；
配列番号１５（５’−ＧＣＣＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴＴＣＧＧＧＡＴＴ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号１６（５’−ＧＴＡＣＡＴＡＡＧＡＡＡＧＧＣＧＧＡＧＡＴＴＡＣＧ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含むプライマーセット５；
配列番号１９（５’−ＧＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＣＣＴＴＣＣＴＴ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２０（５’−ＣＣＡＴＧＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＴＴＧＡＡＧＴＴＴ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含むプライマーセット６；
配列番号２２（５’−ＧＣＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＣＴＧＴＴＴＴＧＧ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２３（５’−ＴＴＡＣＧＴＡＧＴＧＡＡＴＣＣＧＣＴＧＡＡＡＡＴＡ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含むプライマーセット７；
配列番号２５（５’−ＣＣＧＡＡＴＧＣＴＣＣＧＴＴＴＴＧＣ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２６（５’−ＧＴＡＡＣＧＣＣＧＴＡＧＧＡＴＴＧＧＡＴＡＴＡＴＣ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含むプライマーセット８；
配列番号２９（５’−ＴＧＡＴＣＴＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＡＡＴＣＧＴＴＧＴＣ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３０（５’−ＡＡＣＧＣＡＴＣＣＧＣＣＡＴＧＧＴ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含むプライマーセット９；
配列番号３２（５’−ＧＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＣＣＴＴＣＣＴＴ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３３（５’−ＣＣＡＴＧＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＴＴＧＡＡＧＴＴＴ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含むプライマーセット１０；
配列番号３５（５’−ＴＣＴＧＣＣＴＡＴＴＧＣＣＧＧＴＡＴＧＧＴ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３６（５’−ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＡＡＡＧＣＡＴＡＴＧＣ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含むプライマーセット１１；
配列番号３８（５’−ＡＴＴＧＣＣＧＧＴＡＴＧＧＴＴＴＣＡＡ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３９（５’−ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＡＡＡＧＣＡＴＡＴＧＣ−３’）またはその活性断片とを含む逆方向プライマーとを含むプライマーセット１２；
配列番号４１（５’−ＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＣＴＡＴＴＧＣＣＧＧＴ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４２（５’−ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＡＡＡＧＣＡＴＡＴＧＣ−３’）またはその活性断片とを含む逆方向プライマーとを含むプライマーセット１３；
配列番号４４（５’−ＴＣＴＧＣＣＴＡＴＴＧＣＣＧＧＴＡＴＧＧＴ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４５（５’−ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＡＡＡＧＣＡＴＡＴＧＣ−３’）またはその活性断片とを含む逆方向プライマーとを含むプライマーセット１４；
配列番号４７（５’−ＴＣＴＧＣＣＴＡＴＴＧＣＣＧＧＴＡＴＧＧＴ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４８（５’−ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＡＡＡＧＣＡＴＡＴＧＣ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含むプライマーセット１５；および
配列番号５０（５’−ＴＧＡＴＣＴＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＡＡＴＣＧＴＴＧＴＣ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号５１（５’−ＧＴＡＡＣＧＣＣＧＴＡＧＧＡＴＴＧＧＡＴＡＴＡＴＣ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーとを含むプライマーセット１６
が含まれる。
【００４７】
前記プライマーセットは、（以下に論議されるように）２つ以上のオリゴヌクレオチドを用いて標的配列を増幅させるいずれかの核酸増幅技術に従って使用されることが可能である。本発明のプライマーセットを使用して生じる増幅産物は、本分野で周知の多様な検出方法のいずれかを使用して検出され得る。例えば、増幅産物は、ナイセリア・ゴノレーの同一性の確認するために、アガロースゲル電気泳動ならびに臭化エチジウム染色および紫外線（ＵＶ）光への曝露による可視化を使用して、または増幅産物の配列分析によって検出され得る。
【００４８】
あるいは、プローブ配列は、均一なまたは不均一な多様な方法論を使用して増幅産物を検出することによって用いることが可能である。一般的に、このような方法において、プローブは、増幅産物（または単位複製配列）の１つの鎖とハイブリッド形成して、増幅産物／プローブハイブリッドを形成する。次に、前記ハイブリッドは、例えば、プローブ、プライマー、またはプローブとプライマーとの両者に関する標識を使用して、直接的にまたは間接的に検出することが可能である。
【００４９】
したがって、本発明は、生物試料中のナイセリア・ゴノレーを検出するためのプライマー／プローブセットを提供する。本明細書で使用されるように、「プライマー／プローブセット」という語は、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、ナイセリア・ゴノレーのＯＦＲ１遺伝子、ｄｃｍＧ遺伝子またはｐｉｖＮＧ遺伝子内の標的配列）の増幅をプライムすることがともに可能である２つ以上のプライマーと標的配列を検出できる少なくとも１つのプローブを含む組み合わせを指す。前記プローブは一般的に、増幅産物（または単位複製配列）の１つの鎖とハイブリッド形成して、検出可能である増幅産物／プローブハイブリッドを形成する。
【００５０】
本発明は、検査試料中のナイセリア・ゴノレー標的配列を特異的に増幅および検出するための核酸増幅方法に従って使用できるプライマー／プローブセットを提供する。本発明のプライマー／プローブセットは一般的に、上述のプライマーセットと、前記プライマーセットによって生じる単位複製配列とハイブリッド形成する少なくとも１つの検出プローブとを含む。検出プローブは、検出可能な部分を含んでもよい。特定の態様において、検出プローブは、５’末端に結合された蛍光部分と、３’末端に結合されたクエンチャー部分とを含む（以下参照）。
【００５１】
プライマー／プローブセットの例には、
配列番号１（５’−ＧＣＧＧＡＴＴＣＣＣＴＴＧＴＣＡＡＧＡＴＴ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２（５’−ＧＣＣＧＣＧＣＴＣＡＣＣＣＴＣＴＡ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号３（５’−ＴＴＣＣＡＴＧＡＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＣＧＧＧ−３’）またはその活性断片を含む相補的検出プローブと、配列番号４（５’−ＣＣＣＧＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＡＡＴＣＡＴＧＧＡＡ−３’）またはその活性断片を含む逆方向相補的検出プローブとを含むプライマー／プローブセット１；
配列番号５（５’−ＡＧＴＡＣＧＴＴＴＧＧＡＴＡＣＡＧＧＡＴＴＴＧＡＴＴＴ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号６（５’−ＡＧＣＣＧＴＴＴＴＣＧＣＣＡＧＴＴＴＣ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号７（５’−ＣＣＡＴＣＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＧＣＡＣＡＡ−３’）またはその活性断片を含む相補的検出プローブとを含むプライマー／プローブセット２；
配列番号８（５’−ＧＧＡＡＣＧＡＧＣＣＡＴＣＡＡＡＡＡＣＡＡ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号９（５’−ＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＧＡＡＧＴＧＡＴＡＧＣ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号１０（５’−ＴＴＧＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＴＡＣＴＴ−３’）またはその活性断片を含む相補的検出プローブと、配列番号１１（５’−ＡＡＧＴＡＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＡＡ−３’）を含む逆方向相補的検出プローブとを含むプライマー／プローブセット３；
配列番号１２（５’−ＡＡＧＧＴＡＴＧＡＴＴＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＡＴＣＧ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号１３（５’−ＣＧＣＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＴＴ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号１４（５’−ＣＧＴＡＴＧＣＡＴＣＧＧＡＡＣＧＡＧＣＣＡＴＣＡＡＡ−３’）またはその活性断片を含む相補的検出プローブとを含むプライマー／プローブセット４；
配列番号１５（５’−ＧＣＣＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴＴＣＧＧＧＡＴＴ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号１６（５’−ＧＴＡＣＡＴＡＡＧＡＡＡＧＧＣＧＧＡＧＡＴＴＡＣＧ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号１７（５’−ＡＣＧＣＣＧＡＴＴＴＧＴＡＡＣＧＣＧＡＴＧＧＡ−３’）またはその活性断片を含む相補的検出プローブと、配列番号１８（５’−ＴＣＣＡＴＣＧＣＧＴＴＡＣＡＡＡＴＣＧＧＣＧＴ−３’）またはその活性断片を含む逆方向相補的検出プローブとを含むプライマー／プローブセット５；
配列番号１９（５’−ＧＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＣＣＴＴＣＣＴＴ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２０（５’−ＣＣＡＴＧＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＴＴＧＡＡＧＴＴＴ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号２１（５’−ＡＧＧＣＴＴＣＴＣＣＧＴＣＴＧＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴ−３’）またはその活性断片を含む相補的検出プローブとを含むプライマー／プローブセット６；
配列番号２２（５’−ＧＣＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＣＴＧＴＴＴＴＧＧ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２３（５’−ＴＴＡＣＧＴＡＧＴＧＡＡＴＣＣＧＣＴＧＡＡＡＡＴＡ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号２４（５’−ＣＧＣＴＴＧＡＡＣＣＴＧＣＴＴＴＣＴＧＣＡＴＡＣＴＴＧＣ−３’）またはその活性断片を含む相補的検出プローブとを含むプライマー／プローブセット７；
配列番号２５（５’−ＣＣＧＡＡＴＧＣＴＣＣＧＴＴＴＴＧＣ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号２６（５’−ＧＴＡＡＣＧＣＣＧＴＡＧＧＡＴＴＧＧＡＴＡＴＡＴＣ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号２７（５’−ＣＣＡＴＧＧＣＧＧＡＴＧＣＧＴＴＡＡＡＧＧＴＣＡＧ−３’）またはその活性断片を含む相補的検出プローブと、配列番号２８（５’−ＣＴＧＡＣＣＴＴＴＡＡＣＧＣＡＴＣＣＧＣＣＡＴＧＧ−３’）またはその活性断片を含む逆方向相補的検出プローブとを含むプライマー／プローブセット８；
配列番号２９（５’−ＴＧＡＴＣＴＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＡＡＴＣＧＴＴＧＴＣ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３０（５’−ＡＡＣＧＣＡＴＣＣＧＣＣＡＴＧＧＴ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号３１（５’−ＡＡＣＴＴＴＧＣＣＧＡＡＴＧＣＴＣＣＧＴＴＴＴＧＣ−３’）またはその活性断片を含む相補的検出プローブとを含むプライマー／プローブセット９；
配列番号３２（５’−ＧＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＣＣＴＴＣＣＴＴ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３３（５’−ＣＣＡＴＧＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＴＴＧＡＡＧＴＴＴ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号３４（５’−ＡＧＧＣＴＴＣＴＣＣＧＴＣＴＧＣＴＣＴ−３’）またはその活性断片を含む検出プローブとを含むプライマー／プローブセット１０；
配列番号３５（５’−ＴＣＴＧＣＣＴＡＴＴＧＣＣＧＧＴＡＴＧＧＴ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３６（５’−ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＡＡＡＧＣＡＴＡＴＧＣ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号３７（５’−ＡＧＧＣＴＴＣＴＣＣＧＴＣＴＧＣＴＣＴ−３’）またはその活性断片を含む検出プローブとを含むプライマー／プローブセット１１；
配列番号３８（５’−ＡＴＴＧＣＣＧＧＴＡＴＧＧＴＴＴＣＡＡ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号３９（５’−ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＡＡＡＧＣＡＴＡＴＧＣ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号４０（５’−ＡＧＧＣＴＴＣＴＣＣＧＴＣＴＧＣＴＣＴ−３’）またはその活性断片を含む検出プローブとを含むプライマー／プローブセット１２；
配列番号４１（５’−ＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＣＴＡＴＴＧＣＣＧＧＴ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４２（５’−ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＡＡＡＧＣＡＴＡＴＧＣ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号４３（５’−ＴＧＣＡＴＣＣＡＡＴＣＡＧＡＴＴＴＣＣＴＴＴＣＧ−３’）またはその活性断片を含む検出プローブとを含むプライマー／プローブセット１３；
配列番号４４（５’−ＴＣＴＧＣＣＴＡＴＴＧＣＣＧＧＴＡＴＧＧＴ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４５（５’−ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＡＡＡＧＣＡＴＡＴＧＣ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号４６（５’−ＧＣＴＴＣＡＣＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＣＡＧＴＴＡ−３’）またはその活性断片を含む検出プローブとを含むプライマー／プローブセット１４；
配列番号４７（５’−ＴＣＴＧＣＣＴＡＴＴＧＣＣＧＧＴＡＴＧＧＴ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号４８（５’−ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＡＡＡＧＣＡＴＡＴＧＣ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号４９（５’−ＴＣＡＣＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＣＡＧＴＴＡ−３’）またはその活性断片を含む検出プローブとを含むプライマー／プローブセット１５；
配列番号５０（５’−ＴＧＡＴＣＴＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＡＡＴＣＧＴＴＧＴＣ−３’）またはその活性断片を含む順方向プライマーと、配列番号５１（５’−ＧＴＡＡＣＧＣＣＧＴＡＧＧＡＴＴＧＧＡＴＡＴＡＴＣ−３’）またはその活性断片を含む逆方向プライマーと、配列番号５２（５’−ＣＣＡＴＧＧＣＧＧＡＴＧＣＧＴＴＡＡＡＧＧＴＣＡＧ−３’）またはその活性断片を含む検出プローブとを含むプライマー／プローブセット１６
が含まれる。
【００５２】
オリゴヌクレオチドの調製
本発明のオリゴヌクレオチドは、本分野で周知の多様な方法のいずれかによって調製され得る（例えば、J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, 2nd Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press: New York, NY; "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", 1990, M.A. Innis (Ed.), Academic Press: New York, NY; P. Tijssen "Hybridization with Nucleic Acid Probes - Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (Parts I and II)", 1993, Elsevier Science; "PCR Strategies", 1995, M.A. Innis (Ed.), Academic Press: New York, NY;および"Short Protocols in Molecular Biology", 2002, F.M. Ausubel (Ed.), 5th Ed., John Wiley & Sons: Secaucus, NJ参照）。例えば、オリゴヌクレオチドは、例えば、S.A. Narang et al., Meth. Enzymol. 1979, 68: 90-98; E.L. Brown et al., Meth. Enzymol. 1979, 68: 109-151; E..S. Belousov et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25: 3440-3444; D. Guschin et al., Anal. Biochem. 1997, 250: 203-211; M.J. Blommers et al., Biochemistry, 1994, 33: 7886-7896; およびK. Frenkel et al., Free Radic. Biol. Med. 1995, 19: 373-380；ならびに米国特許第４，４５８，０６６号に記載されているテンプレートをベースとした化学合成および重合化によって調製され得る。
【００５３】
例えば、オリゴヌクレオチドは、ホスホラミダイトのアプローチをベースとした自動化固相法を使用して調製され得る。このような方法において、各ヌクレオチドは、３’末端で固体支持体に結合されている、伸長するオリゴヌクレオチド鎖の５’末端に個々に付加される。付加されたヌクレオチドは、５’の位置でジメトキシトリイル（またはＤＭＴ）基によって保護される三価の３’−ホスホラミダイトの形態にある。塩基により誘導されるホスホラミダイト共役の後、五価のホスホトリエステル中間体を付与する穏やかな酸化およびＤＭＴの除去によって、オリゴヌクレオチド伸長のための新たな部位が提供される。次に、オリゴヌクレオチドは、固体支持体から切り離され、ホスホジエステル基および環外のアミノ基が、水酸化アンモニウムで脱保護される。Perkin Elmer/Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA)、DuPont (Wilmington, DE)またはMilligen(Bedford, MA)から市販されているものなどのオリゴ合成装置において、これらの合成は実施され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、例えば、Midland Certified Reagent Company(Midland, TX)、ExpressGen, Inc.(Chicago, IL)、Operon Technologies, Inc.(Huntsville, AL)、BioSearch Technologies, Inc.(Novato, CA)、および多くの他社を含む、本分野で周知の多様な商業源から作製および発注される特注品であり得る。
【００５４】
本発明のオリゴヌクレオチドの精製は、必要な場合または望ましい場合、本分野で周知の多様な方法のいずれかによって実施され得る。オリゴヌクレオチドの精製は、未変性アクリルアミドゲル電気泳動によって、例えば、J.D. PearsonおよびF.E. Regnier(J. Chrom., 1983, 255: 137-149）によって記載されている陰イオン交換ＨＰＬＣによってまたは逆相ＨＰＬＣ（G.D. McFarland and P.N. Borer, Nucleic Acids Res., 1979, 7: 1067-1080）によってのいずれかで典型的に実施される。
【００５５】
オリゴヌクレオチドの配列は、化学分解（A.M. Maxam and W. Gilbert, Methods of Enzymology, 1980, 65: 499-560）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（MALDI-TOF）質量分析（U. Pieles et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21: 3191-3196）、アルカリホスファターゼとエキソヌクレアーゼ消化との組み合わせ後の質量分析（H. Wu and H. Aboleneen, Anal. Biochem., 2001, 290: 347-352）等を含むがそれらに限定されるわけではない適切ないずれかの配列決定方法を試用して確認することが可能である。
【００５６】
上述に既に記載されているとおり、修飾されたオリゴヌクレオチドは、本分野で公知のいくつもの手段のいずれかを使用して調製され得る。このような修飾に関する限定しない例には、メチル化、「キャッピング」、天然にある１つ以上のヌクレオチドの類似体による置換、および例えば荷電されていない結合（例えば、リン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホロアミダート、カルバマート等）、または荷電されている結合（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等）を有するものなどのヌクレオチド間修飾が含まれる。オリゴヌクレオチドは、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリＬリジン等）、干渉物質（例えば、アクリジン、ソラレン等）、キレート剤（例えば、金属キレート、放射活性キレート、酸化金属など）およびアルキル化剤等の１つ以上のさらなる共有結合部分を含有し得る。オリゴヌクレオチドは、メチルもしくはエチルホスホトリエステルの形成またはアルキルホスホラミダートの結合によって誘導体化もされ得る。さらに、本発明のオリゴヌクレオチド配列は、標識によっても修飾され得る。
【００５７】
オリゴヌクレオチド配列の標識化
特定の態様において、検出プローブもしくは増幅プライマーまたはプローブおよびプライマーの両者は、検出可能な物質または部分で標識された後、増幅／検出アッセイにおいて使用される。いくつかの態様において、検出プローブは、検出可能な物質で標識される。検出可能な物質の役割は、増幅された標的配列（単位複製配列）の可視化および検出を可能にすることである。好ましくは、測定されることが可能であり、かつその強度が、分析される試料中の増幅産物の量に関連している（例えば、比例している）信号を、検出可能な物質が生じるよう、前記物質が選択される。
【００５８】
オリゴヌクレオチド（例えば、検出プローブ）と検出可能な物質との間の会合は、共有結合性であるかまたは非共有結合性であり得る。標識された検出プローブは、検出可能な部分の組み込みまたは前記部分への抱合によって調製され得る。標識は、核酸配列へ直接的にまたは間接的に（例えば、リンカーを通じて）結合され得る。多様な長さのリンカーまたはスペーサーアームは、本分野で公知であり、市販されており、立体障害を低下させるよう、または結果として生じる標識された分子に対して有用なまたは望ましい他の特性を付与するよう選択され得る（例えば、E.S. Mansfield et al, Mol. Cell Probes, 1995, 9: 145-156参照）。
【００５９】
核酸分子を標識するための方法は、本分野で周知である。本分野における標識プロトコール、標識検出技術、および最新の開発に関する総説については、例えば、L.J. Kricka, Ann. Clin. Biochem. 2002, 39: 114-129; R.P. van Gijlswijk et al., Expert Rev. Mol. Diagn. 2001, 1: 81-91；およびS.Joos et al., J. Biotechnol. 1994, 35: 135-153を参照されたい。標準的な核酸標識法には、放射活性物質の組み込み、染色色素（L.M. Smith et al., Nucl. Acids Res., 1985, 13: 2399-2412）または酵素（B.A. Connoly and O. Rider, Nucl. Acids. Res., 1985, 13: 4485-4502）の直接的な結合、核酸分子を免疫化学的に検出可能にするかまたは他の親和性反応による化学的修飾（T.R. Broker et al., Nucl. Acids Res. 1978, 5: 363-384; E.A. Bayer et al., Methods of Biochem. Analysis, 1980, 26: 1-45; R. Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78: 6633-6637; R.W. Richardson et al., Nucl. Acids Res. 1983, 11: 6167-6184; D.J. Brigati et al., Virol. 1983, 126: 32-50; P. Tchen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1984, 81: 3466-3470; J.E. Landegent et al., Exp. Cell Res. 1984, 15: 61-72;およびA.H. Hopman et al., Exp. Cell Res. 1987, 169: 357-368）およびランダムプライミング、ニックトランスレーション、ＰＣＲおよび末端転移酵素によるテーリング等の酵素仲介性標識法（酵素標識に関する総説については、例えば、J. Temsamani and S. Agrawal, Mol. Biotechnol. 1996, 5: 223-232参照）が含まれる。より最近開発された核酸標識システムには、単反応性シスプラチン誘導体の、ＤＮＡ中のグアニン部分のＮ７との反応に基づいたＵＬＳ（普遍的連結システム）（R.J. Heetebrij et al., Cytogenet. Cell. Genet. 1999, 87: 47-52）、核酸中に介入し、ＵＶ照射の際、ヌクレオチド塩基に共有結合するソラレン−ビオチン（C. Levenson et al., Methods Enzymol. 1990, 184: 577-583;およびC. Pfannschmidt et al., Nucleic Acids Res. 1996, 24: 1702-1709）、光反応性アジ化物誘導体（C. Neves et al., Bioconjugate Chem. 2000, 11: 51-55）、およびＤＮＡアルキル化剤（M.G. Sebestyen et al., Nat. Biotechnol. 1998, 16: 568-576）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００６０】
広範な種類の検出可能な物質のいずれかが、本発明の実施において使用することが可能である。検出可能な適切な物質には、多様なリガンド、（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等の）放射性核種、（典型的な特異的蛍光色素のための）蛍光色素（以下参照）、（例えば、アクリジニウムエステル、安定化されたジオキセタン等の）化学発光剤、スペクトル分解可能な無機蛍光半導体ナノ結晶（すなわち、量子ドット）、金属ナノ粒子（例えば、金、銀、銅および白金）またはナノクラスター、（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて使用されるもの、すなわち、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ等の）酵素、（例えば、色素、金コロイド等の）比色標識、（例えば、Dynabeads（商標）等の）磁気標識、ならびにビオチンジオキシゲニンまたは他のハプテンが含まれるが、それらに限定されるわけではなく、抗血清またはモノクローナル抗体に対するタンパク質が利用可能である。
【００６１】
特定の態様において、本発明の検出プローブは、蛍光標識される。広範な化学構造および物理的特徴に関して公知のいくつもの蛍光色素が、本発明の実施において使用するのに適している。適切な蛍光色素には、フルオレセインおよびフルオレセイン色素（例えば、フルオレセインイソチオシアニンまたはＦＩＴＣ、ナフトフルオレセイン、４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセインまたはＦＡＭ）、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル色素、オキソノール色素、フィトエリスリン、エリスロシン、エオシン、ローダミン色素（例えば、カルボキシテトラメチルローダミンまたはＴＡＭＲＡ、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシＸローダミン（ＲＯＸ）、リサミンローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミンまたはＴＭＲ）、クマリンおよびクマリン色素（例えば、メトキシクマリン、ジアルキルアミノクマリン、ヒドロキシクマリンおよびアミノメチルクマリンまたはＡＭＣＡ）、オレゴングリーン色素（例えば、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４）、テキサスレッド、テキサスレッドＸ、スペクトルレッド（商標）、スペクトルグリーン（商標）、シアニン色素（例えば、Ｃｙ−３（商標）、Ｃｙ−５（商標）、Ｃｙ−３．５（商標）、Ｃｙ−５．５（商標））、アレクサフルオロ色素（例えば、アレクサフルオロ３５０、アレクサフルオロ４８８、アレクサフルオロ５３２、アレクサフルオロ５４６、アレクサフルオロ５６８、アレクサフルオロ５９４、アレクサフルオロ６３３、アレクサフルオロ６６０およびアレクサフルオロ６８０）、ＢＯＤＩＰＹ色素（例えば、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665）、ＩＲＤ色素（例えば、IRD40、IRD700、IRD800）等が含まれるが、それらに限定されるわけではない。適切な蛍光色素および蛍光色素を核酸分子へ連結または組み込むための方法に関するより多くの例については、例えば、「The Handbook of Fluorescent Probes and Research Products」、第9版、Molecular Probes, Inc., Eugene, ORを参照されたい。蛍光色素は、標識キットと同様、例えば、Amersham Biosciences, Inc.(Piscataway, NJ)、Molecular Probes Inc.(Eugene, OR)、およびNew England Biolabs Inc.(Berverly, MA)から市販されている。
【００６２】
直接的に検出可能なもの自体よりもむしろ、いくつかの蛍光基（ドナー）は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の方法で、エネルギーを別の蛍光基（アクセプター）に転移させ、第二の基が、検出可能な蛍光信号を生じる。これらの態様において、オリゴヌクレオチド検出プローブは、例えば、増幅された標的配列にハイブリッド形成される場合、検出可能となり得る。本発明において使用するのに適したＦＲＥＴアクセプター／ドナー対の例には、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／ＦＩＴＣ、ＩＡＥＤＡＮＳ／５−（ヨードアセトアミド）フルオレセイン、Ｂ−フィコエリトリン／Ｃｙ−５、およびＥＤＡＮＳ／Ｄａｂｃｙｌが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００６３】
物理的に連結された蛍光リポーター／クエンチャー分子対の使用も、本発明の範囲内である。（例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、第５，８０４，３７５号、第５，４８７，７９２号および第６，２１４，９７９号に記載されている）ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイにおけるこのようなシステムの使用または（例えば、S. Tyagi and F.R. Kramer, Nature Biotechnol. 1996, 14: 303-308; S. Tyagi et al., Nature Biotechnol. 1998, 16: 49-53; L.G. Kostrikis et al., Science, 1998, 279: 1228-1229; D.L. Sokol et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95: 11538-11543; S.A. Marras et al., Genet. Anal. 1999, 14: 151-156；および米国特許第５，８４６，７２６号、第５，９２５，５１７号、第６，２７７，５８１号および第６，２３５，５０４号に記載されている）分子ビーコンとしてのこのようなシステムの使用は、本分野で周知である。増幅反応の産物は、ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイフォーマットを使用して、いわゆる「リアルタイム」の様式で形成される場合、検出可能である。結果として、増幅産物／プローブハイブリッドは、反応混合物が増幅条件下にある間、形成および検出される。
【００６４】
本発明のいくつかの態様において、ＰＣＲ検出プローブは、５’末端で蛍光部分を使用して、３’末端でクエンチャー部分を使用して標識されたＴａｑＭａｎ（商標）様プローブである。ＴａｑＭａｎ（商標）様プローブとともに使用するための適切なフルオロフォアおよびクエンチャーは、米国特許第５，２１０，０１５号、第５，８０４，３７５号、第５，４８７，７９２号および第６，２１４，９７９号ならびに国際公開第０１／８６００１号に開示されている（それらの各々は、そのすべての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる）。クエンチャーの例には、ＤＡＢＣＹＬ（すなわち、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）−安息香酸）スクシンイミジルエステル、ジアリールローダミンカルボン酸、スクシンイミジルエステル（またはＱＳＹ−７）、および４’，５’−ジニトロフルオレセインカルボン酸、スクシンイミジルエステル（またはＱＳＹ−３３）（すべて例えば、Molecular Probesから入手可能）、クエンチャー１（Q1:Epoch Biosciences, Bothell, WAから入手可能）、または「ブラックホールクエンチャー（Black Hole Quencher）」BHQ-1、BHQ-2、およびBHQ-3(BioSearch Technologies, Inc., Novato, CAから入手可能）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。特定の態様において、ＰＣＲ検出プローブは、５’末端でＦＡＭを使用して、３’末端でブラックホールクエンチャーを使用して標識されたＴａｑＭａｎ（商標）様プローブである。
【００６５】
正常なまたは修飾されたヌクレオチドの「尾部」も、検出目的のためオリゴヌクレオチドプローブへ付加され得る、尾部と相補的であり、１つ以上の検出可能な標識（例えば、フルオロフォア、酵素または放射性標識された塩基等）を含有する核酸との第二のハイブリッド形成によって、単位複製配列／プローブのハイブリッドの可視化が可能となる（例えば、Enzo Biochem. Inc., New York, NYから市販されているシステム参照）。本発明のオリゴヌクレオチドが有用であるアッセイの別の例は、（そのすべての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる）米国特許第５，１２４，２４６号に記載されているなどのシグナル増幅法である。前記方法において、シグナルは、増幅多量体の使用、オリゴヌクレオチドプローブへ付加される「尾部」に特異的にハイブリッド形成する第一のセグメントを含有するよう構築されたポリヌクレオチド、および標識されたプローブに特異的にハイブリッド形成する同一の第二のセグメントの多重度を通じて増幅される。増幅の程度は、第二のセグメントの反復数に理論上比例する。多量体は、直鎖または分岐鎖のいずれかであり得る。分岐鎖多量体は、フォーク状またはコーム状であり得る。
【００６６】
具体的な核酸標識技術の選択は、状況に依存するであろうし、標識法の簡便さおよび経費、望ましい試料標識の質、ハイブリッド形成反応に及ぼす（例えば、ハイブリッド形成過程の速度および／または効率に及ぼす）検出可能な部分の効果、使用される増幅法の性質、検出システムの性質、検出可能な標識によって生じるシグナルの性質および強度等のいくつもの因子によって左右されるであろう。
【００６７】
本発明のプライマーを使用するナイセリア・ゴノレー標的配列の増幅
検査試料中のナイセリア・ゴノレー標的配列を増幅するための本発明のオリゴヌクレオチド配列の使用は、いずれかの具体的な核酸増幅技術またはいずれかの具体的なその変法に限定されるわけではない。実際、本発明のオリゴヌクレオチド配列は、本分野で周知の多様な核酸増幅法のいずれかにおいて採用されることが可能である（例えば、A.R. Kimmel and S.L. Berger, Methods Enzymol. 1987, 152: 307-316; J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, 2nd Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press: New York, NY; "Short Protocols in Molecular Biology", F.M. Ausubel (Ed.), 2002, 5th Ed., John Wiley & Sons: Secaucus, NJ参照）。
【００６８】
このような核酸増幅法には、ポリメラーゼ連鎖反応（またはＰＣＲ、例えば、そのすべての内容が全体として参照により本明細書に各々組み入れられる"PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", M.A. Innis (Ed.), 1990, Academic Press: New York; "PCR Strategies", M.A. Innis (Ed.), 1995, Academic Press: New York; "Polymerase chain reaction: basic principles and automation in PCR: A Practical Approach", McPherson et al. (Eds.), 1991, IRL Press: Oxford; Saiki et al., Nature, 1986, 324: 163;ならびに米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および第４，８８９，８１８号に記載）；ならびにＴａｑＭａｎ（商標）ベースのアッセイ（Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1991, 88: 7276-7280）および逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（またはＲＴ−ＰＣＲ、例えばそのすべての内容が全体として参照により本明細書に各々組み入れられる米国特許第５，３２２，７７０号および第５，３１０，６５２号に記載）を含むその変法が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００６９】
ＰＣＲにおいて、プライマー一対が、標的核酸の相補鎖にハイブリッド形成するよう過剰量で採用される。プライマーは、標的配列をテンプレートとして使用するＤＮＡポリメラーゼによって各々伸長される。伸長産物は、もとの標的鎖から解離（変性）した後、それ自体標的となる。次に、新たなプライマーが、ポリメラーゼによってハイブリッド形成および伸長され、周期は、単位複製配列のコピー数を指数関数的に増大させるよう反復される。ＰＣＲ反応においてプライマー伸長産物を長じることのできるＤＮＡポリメラーゼの例には、イー・コリ（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、多様な源（例えば、Perkin Elmer）から入手可能なサーマス・アクアチクス（Thermus aquaticus）（Ｔａｑ）、サーマス・サーモフィラス（United States Biochemicals）、バチルスステレオサーモフィラス（Bacillus stereothermophilus）（Bio-Rad）、またはサーモコッカス・リトラリス（「ベント」ポリメラーゼ、New England Biolabs）から単離された、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが含まれるが、それらに限定されるわけではない。ＲＮＡ標的配列は、ｍＲＮＡをｃＤＮＡへ逆転写した後、上述のとおりＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施することによって増幅され得る。あるいは、単一の酵素が、（そのすべての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる）米国特許第５，３２２，７７０号に記載されるように、両段階に使用され得る。
【００７０】
上述の酵素熱増幅法に加え、等温酵素増幅反応が、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してナイセリア・ゴノレー標的配列を増幅するために採用可能である（S.C. Andras et al., Mol. Biotechnol., 2001, 19: 29-44）。これらの方法には、転写仲介性増幅（またはＴＭＡ、例えば、D.Y. Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86: 1173-1177;C. Giachetti et al., J. Clin. Microbiol., 2002, 40: 2408-2419；および米国特許第５，３９９，４９１号に記載）、自己持続型配列複製（または３ＳＲ、例えば、J.C. Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 1874-1848;およびE. Fahy et al., PCR Methods and Applications, 1991, 1: 25-33に記載）、核酸配列ベースの増幅（またはＮＡＳＢＡ、例えば、T. Kievits et al., J. Virol., Methods, 1991, 35: 273-286；および米国特許第５，１３０，２３８号に記載）および鎖置換増幅（またはＳＤＡ、例えば、G.T. Walker et al., PNAS, 1992, 89: 392-396；欧州公開特許第０５００２２４号に記載）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。本段落において引用される参考文献は各々、そのすべての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【００７１】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、制限エンドヌクレアーゼの標的ＤＮＡの修飾されていない鎖に切れ目を入れる前記制限エンドヌクレアーゼの能力と、切り目で３’末端を伸長し、固定した温度で下流のＤＮＡ鎖を置換するエキソヌクレアーゼ欠失ＤＮＡポリメラーゼの作用とを組み合わせる（G.T. Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89: 392-396）。ＳＤＡにおいて使用されるプライマーには、５’部位にあり標的結合配列に対する制限エンドヌクレアーゼ認識部分が含まれる（そのすべての内容が全体として参照により本明細書に各々組み入れられる米国特許第５，２７０，１８４号および第５，３４４，１６６号）。
【００７２】
核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）は、低い等温の温度、一般的には４１℃で一斉に作用する３つの酵素（例えば、RNase H、トリ骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ）逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）を使用する（J. Compton, Nature, 1991, 350: 91-92; A.B. Chan and J.D. Fox, Rev. Med. Microbiol., 1999, 10: 185-196）。ＮＡＳＢＡ反応の生成物は、主として一本鎖ＲＮＡである。自己持続型配列複製（３ＳＲ）反応は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の等温増幅のための非常に効率的な方法である。３ＳＲシステムは、ＡＭＶ逆転写酵素、イー・コリRNase H、およびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）の集約的な活性を包含する。転写仲介性増幅（ＴＭＡ）は、ＲＮＡポリメラーゼを使用して、プライマー領域において駆動されるプロモーターからＲＮＡを作製し、逆転写酵素を使用して、ＲＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡを作製し、ＲＮａｓｅ  Ｈを使用してｃＤＮＡからＲＮＡを除去する（J.C. Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 1874-1878）。
【００７３】
ＮＡＳＢＡ、３ＳＲ、およびＴＭＡプライマーは、プライマーの標的結合配列に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーターを必要とする。プライマー中に組み込むためのプロモーターまたはプロモーター配列は、前記配列を認識し、前期配列に結合し、転写課程を開始し、それによりＲＮＡ転写産物が生じるＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識される（天然に生じるか、合成で生じるかまたは制限消化の産物のいずれかである）核酸配列である。有用なプロモーターの例には、バクテリオファージＴ３、Ｔ７もしくはＳＰ６由来のものなどの特定のバクテリオファージポリメラーゼによって認識されるものまたはイー・コリ由来のプロモーターが含まれる。
【００７４】
増幅されたナイセリア・ゴノレー標的配列の検出
本発明の特定の態様において、オリゴヌクレオチドプローブ配列は、増幅反応によって生じた増幅産物（すなわち、増幅されたナイセリア・ゴノレー標的配列）を検出するために使用される。本発明のプローブ配列は、多様な周知の均一なまたは不均一な方法論を使用して採用可能である。
【００７５】
均一な検出方法には、プローブへ結合し、標的配列の存在下でシグナルを放射するＦＲＥＴ標識の使用、分子ビーコン（S. Tyagi and F.R. Kramer, Nature Biotechnol. 1996, 14: 303-308; S. Tyagi et al., Nature Biotechnol. 1998, 16: 49-53; L.G. Kostrikis et al., Science, 1998, 279: 1228-1229; D.L. Sokol et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95: 11538-11543; S.A. Marras et al., Genet. Anal. 1999, 14: 151-156；ならびに米国特許第５，８４６，７２６号、第５，９２５，５１７号、第６，２７７，５８１号および第６，２３５，５０４号）、およびいわゆるＴａｑＭａｎ（商標）アッセイ（米国特許第５，２１０，０１５号、第５，８０４，３７５号、第５，４８７，７９２号および第６，２１４，９７９号ならびに国際公開第０１／８６００１号）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。これらの検出技術を使用して、増幅反応の産物は、前記産物が形成されるにつれ、すなわち、いわゆるリアルタイムの様式で検出可能である。結果として、増幅産物／プローブハイブリッドは、反応混合物が増幅条件下にある間、形成および検出される。
【００７６】
特定の態様において、本発明の検出プローブは、ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイにおいて使用される。蛍光発生的５’ヌクレアーゼアッセイとしても公知であるＴａｑＭａｎ（商標）アッセイは、強力であり、万能な、核酸標的のためのＰＣＲベースの検出システムである。分析は、蛍光シグナルの発生をモニターすることよって、温熱周期とともに実施される。アッセイシステムは、標的コピー数の決定が可能となる定量的データを生じることが可能である。例えば、標準曲線は、ナイセリア・ゴノレーの既に定量化された懸濁液の連続希釈を使用して生じ得、前記連続希釈に対して、未知の試料が比較可能である。ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイは、例えば、内在性５’ヌクレアーゼ活性を有するＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用して、上述のように蛍光リポーター色素およびクエンチャー部分の両者で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを消化することで簡便に実施される。アッセイ結果は、プローブが消化するにつれて増幅周期中に生じる蛍光の変化を測定し、蛍光部分とクエンチャー部分とを脱共役し、標的配列の増幅に比例する蛍光シグナルの増大を生じさせることによって得られる。
【００７７】
均一な検出方法の他の例には、ハイブリッド形成保護アッセイ（ＨＰＡ）が含まれる。前記アッセイにおいて、プローブは、非ヌクレオチドベースのリンカーアーム化学反応（米国特許第５，５８５，４８１号および第５，１８５，４３９号）を使用して、化学発光性の高い分子であるアクリジニウムエステル（ＡＥ）で標識する（Weeks et al., Clin. Chem., 1983, 29: 1474-1479; Berry et al., Clin. Chem., 1988, 34: 2087-2090）。化学発光は、後に光子の放射で不活性化する励起されたＮ−メチルアクリドンを生じるアルカリ性過酸化水素によるＡＥ加水分解によって惹起される。標的配列のない状態で、ＡＥ加水分解は迅速である。しかしながら、ＡＥ加水分解の速度は、プローブが標的配列に結合すると著しく低下する。したがって、ハイブリッド形成されたおよびハイブリッド形成されていないＡＥ標識されたプローブは、物理的な分離を必要とせずに溶液中で直接検出可能である。  
【００７８】
不均一な検出システムは、本分野で周知であり、一般的に、反応混合物中で、増幅された配列を他の材料から分離するための捕捉剤を採用する。捕捉剤は典型的に、１つ以上の特異的結合配列でコーティングされた固体支持材料（例えば、マイクロタイターウェル、ビーズ、チップ等）を含む。結合配列は、本発明のオリゴヌクレオチドプローブに付加された尾部配列と相補的であり得る。あるいは、結合配列は、それ自体が本発明のオリゴヌクレオチドプローブの尾部配列と相補的な配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドの配列と相補的であり得る。捕捉剤に結合した増幅産物／プローブハイブリッドを残りの反応混合物から分離した後、増幅産物／プローブハイブリッドは、本明細書に記載されているものなどのいずれかの検出方法を使用して検出可能である。
【００７９】
ＩＩ−検査試料中のナイセリア・ゴノレーの検出の方法
別の局面において、本発明は、検査試料中のナイセリア・ゴノレーの存在を検出するための方法を提供する。本発明の方法は、淋菌感染もしくはその続発症の症状を呈し得るかまたは呈し得ない患者を検査し、および／または危険性のある集団をスクリーニングするために使用され得る。
【００８０】
典型的に、本発明の方法は、ナイセリア・ゴノレー核酸（例えば、ナイセリア・ゴノレーのオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）遺伝子、シトシンメチルトランスフェラーゼ（ｄｃｍＧ）遺伝子またはピリン反転タンパク質相同体（ｐｉｖＮＧ）遺伝子内の配列を含む核酸）を含有すると推測される検査試料を提供する段階、検査試料を本明細書に開示される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと接触させ、それにより前記オリゴヌクレオチドが、検査試料中に存在する場合のナイセリア・ゴノレー核酸とハイブリッド形成可能である段階、およびナイセリア・ゴノレー核酸とハイブリッド形成したいずれかのオリゴヌクレオチドを検出する段階を含み、ナイセリア・ゴノレー核酸とのオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成の検出は、検査試料中のナイセリア・ゴノレーの存在を示す。
【００８１】
本発明の他の方法は、ナイセリア・ゴノレー核酸を含有すると推測される検査試料を、本明細書に開示される少なくとも１つのプライマーセットまたはプライマー／プローブセット及び増幅反応試薬と接触させ、反応混合物を形成することを含む。次に、反応混合物は、検査試料中に存在する場合のナイセリア・ゴノレー核酸を増幅し、増幅産物を生じるよう増幅条件下に配置される。結果として生じる増幅産物は、多様な検出技術を使用して検出され得る。特定の態様において、増幅産物／プローブハイブリッドは、本発明の検出プローブを使用して形成され、前記ハイブリッドの検出は、検査試料中のナイセリア・ゴノレーの存在を示す。
【００８２】
試料の調製
本発明の方法によると、検査試料中のナイセリア・ゴノレーの存在は、ナイセリア・ゴノレーのオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）遺伝子、シトシンメチルトランスフェラーゼ（ｄｃｍＧ）遺伝子またはピリン反転タンパク質相同体（ｐｉｖＮＧ）遺伝子内の配列を含むいずれかのナイセリア・ゴノレー核酸を検出することによって決定可能である。したがって、このようなナイセリア・ゴノレー標的配列を含むと推測されるいずれかの液体または固体の生物材料は、適切な検査試料であり得る。特定の態様において、好ましい検査試料には、尿（例えば、第一排尿）、精液、唾液、眼球レンズ液、リンパ液、子宮頸管内、尿道、直腸、膣、外陰部−膣、鼻咽頭の試料が含まれる。好ましい他の検査試料には、ＰＡＰＳ−スメア検体が含まれる。
【００８３】
検査試料はしばしば、ナイセリア・ゴノレーに感染していると推測される患者から得られるかまたは単離されるであろう。既に記載のとおり、検査試料は、単離後にさらに処理せずに使用され得るか、または代わりに、分析前に加工され得る。例えば、検査試料は、ナイセリア・ゴノレー核酸を含有する細胞からナイセリア・ゴノレー核酸を放出するよう処理され得る。核酸抽出の方法は、本分野で周知であり、化学的方法、温度法、および機械的方法を含む（例えば、J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, 2nd Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press: New York, NY参照)。例えば、Amersham Biosciences(Piscataway, NJ)、BD Biosciences Clontech(Palo Alto, CA)、Epicentre Technologies(Madison, WI)、Gentra Systems, Inc(Minneapolis, MN)、MicroProbe Corp.(Bothell, WA)、Organon Teknika(Durham, NC)、およびQiagen Inc.(Valencia, CA）から市販されている生物試料から核酸を抽出するのに使用可能な数多くの様々な多用途のキットもある。従われるべきプロトコールを非常に詳細に記載しているユーザー用説明書は通常、これらのキットすべてに含まれる。感度、処理時間および経費は、キットによって異なり得る。当業者は、具体的な状況に最も適したキットを容易に選択することが可能である。
【００８４】
抽出前に、ナイセリア・ゴノレーを含有する細胞は、精製され、濃縮されまたは別の方法で、もとの生物試料の他の成分から、例えば濾過もしくは遠心分離によって分離され得る。
【００８５】
試料の分析
当業者によって理解されるであろうように、本発明の方法に従ったナイセリア・ゴノレー標的配列の増幅および増幅されたナイセリア・ゴノレー核酸の検出は、本明細書に記載されるなどのいずれかの増幅／検出方法を使用して実施され得る。特定の態様において、検査試料中のナイセリア・ゴノレーの検出は、ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイを使用して実施され、増幅産物の形成は、蛍光によってリアルタイムの様式でモニターされる。これらの態様において、本明細書に記載のとおり、５’末端で蛍光リポーターを使用して、３’末端でクエンチャー部分を使用して標識されたプローブが使用されるであろう。ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイフォーマットに適した増幅条件の最適化および増幅反応試薬の選択は、本分野の技術内である。
【００８６】
特定の態様において、内部コントロールまたは内部標準物質は、生物試料（または前記生物試料から抽出された精製された核酸）へ添加され、抽出および／または標的増幅のためのコントロールとして機能する。内部コントロールには一般的に、標的配列とは異なる配列が含まれ、標的のナイセリア・ゴノレー核酸を増幅するのに使用されるプライマーによって増幅可能である。内部コントロールの使用によって、抽出過程、増幅反応、および検出、ならびにアッセイ性能の管理をモニターできる。増幅されたコントロールおよび増幅された標的は典型的に、コントロールおよび標的の検出のための（例えば、検出可能な異なる物質で標識された）異なるプローブを使用することによって検出工程で識別される。
【００８７】
検査試料中のナイセリア・ゴノレーの存在は、同一の生物検査試料の異なる一定分量を使用して、または異なる検査試料（例えば、分析される第一試料が尿試料である場合の子宮頸部スワブ、または異なる時間で回収された尿試料）を使用して、本発明に従ったアッセイを反復することによって確認され得る。確認検査は、本発明のプライマーの異なるセットを使用して、ナイセリア・ゴノレー染色体の異なる領域を標的とすることによっても実施可能である。あるいはまたはそれに加えて、検査試料中のナイセリア・ゴノレーの存在は、異なるアッセイ（すなわち、異なる方法論に基づいたアッセイ）を実施することによって確認され得る。例えば、第一分析が、ＴａｑＭａｎアッセイを使用して実施される場合、第二分析は、転写仲介性増幅（ＴＭＡ）反応を使用して実施され得る。
【００８８】
あるいはまたはそれに加えて、検査試料中のナイセリア・ゴノレーの存在は、異なるアッセイ（例えば、細胞培養物からの単離）によって確認され得る。
【００８９】
ＩＩＩ−ナイセリア・ゴノレーおよび他の生物体の同時検出のための多重アッセイ
既に記載のとおり、本発明のプライマー／プローブセットは、ナイセリア・ゴノレー特異的である。したがって、本発明は、少なくとも２つのプライマーセットまたはプライマー／プローブセットの組み合わせ（すなわち、本明細書に開示されるナイセリア・ゴノレー特異的セットから選択されたもの、および検査されるべき他の生物体に特異的なセットから選択された別のもの）を使用して、検査試料中のナイセリア・ゴノレーおよび別の生物体の存在を同時に検出するための方法も提供する。
【００９０】
ナイセリア・ゴノレーと同時に検出可能な他の生物体には、表４に列挙される生物体のいずれかが含まれるが、それらに限定されるわけではない。特定の態様において、ナイセリア・ゴノレーと同時に検査されるべき他の生物体は、クラミジア・トラコマティスである。
【００９１】
特に、本発明は、を含む検査試料中のナイセリア・ゴノレーおよび／またはクラミジア・トラコマティスの検出のための方法を提供する。ナイセリア・ゴノレー核酸および／またはクラミジア・トラコマティス核酸を含有すると推測される検査試料を提供する段階、試料中に存在する場合のナイセリア・ゴノレー核酸のすべてまたは一部を増幅する条件下で、前記検査試料を本明細書に開示されたプライマー／プローブセットと接触させ、ナイセリア・ゴノレー単位複製配列を生じる段階、試料中に存在する場合のクラミジア・トラコマティス核酸のすべてまたは一部を増幅させる条件下で、前記検査試料をクラミジア・トラコマティスに特異的な少なくとも１つのプライマー／プローブセットと接触させ、クラミジア・トラコマティス単位複製配列を生じる段階、ならびにいずれかのナイセリア・ゴノレー単位複製配列およびいずれかのクラミジア・トラコマティス単位複製配列を検出する段階を含み、ナイセリア・ゴノレー単位複製配列の検出が、前期検査試料中のナイセリア・ゴノレーの存在を示し、クラミジア・トラコマティス単位複製配列の検出が、前記検査試料中のクラミジア・トラコマティスの存在を示す。
【００９２】
特定の好ましい態様において、クラミジア・トラコマティスに特異的なプライマー／プローブセットは、（そのすべての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる、Siemens Medical Solutions Diagnosticsに対する）国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／４３３９４号に記載されているものである。
【００９３】
ＩＶ−キット
別の局面において、本発明は、本明細書に記載される方法に従った淋菌感染の検出に有用な材料を含むキットを提供する。本発明のキットは、診断研究室、実験研究室、または開業医によって使用され得る。
【００９４】
本発明に従ったナイセリア・ゴノレーの検出に必要とされる基本的な材料および試薬は、キット中に互いに組み合わせられ得る。特定の態様において、キットは、少なくとも１つの本発明のプライマーセットまたはプライマー／プローブセット、および場合により、増幅反応試薬を含む。各キットは好ましくは、方法を特異的にする試薬を含む。したがって、ＮＡＳＢＡとともに使用するのに適したキットは好ましくは、標的結合配列に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するプライマーを含有するのに対し、ＳＤＡとともに使用するのに適したキットは好ましくは、標的結合配列に対して５’の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むプライマーを含有する。同様に、キットが、ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイ等の５’ヌクレアーゼアッセイにおいて使用するのに適している場合、検出プローブは好ましくは、少なくとも１つの蛍光リポーター部分と少なくとも１つのクエンチャー部分とを含有する。
【００９５】
適切な増幅反応試薬には、例えば、増幅反応を実施するのに適した緩衝液、試薬、逆転写酵素および／またはポリメラーゼ活性またはエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、マグネシウムまたはマンガン等の酵素補助因子、塩、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）およびデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）等のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）のうちの１つ以上が含まれる。例えば、ＮＡＳＢＡとともに使用するのに適したキットは、逆転写酵素、ＲＮａｓｅ  ＨおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの適切な量を含有し得る。ＮＡＳＢＡ等の転写増幅反応に適したキットには、例えば、増幅反応を亢進させることが公知であるＤＭＳＯを含有する緩衝液が含有され得る。
【００９６】
方法に依存して、キットはさらに、洗浄用緩衝液および／または試薬、ハイブリッド形成用緩衝液および／または試薬、標識用緩衝液および／または試薬、ならびに検出手段を含み得る。緩衝液および／または試薬は好ましくは、キットの企図する具体的な増幅／検出技術に最適化されている。方法の様々な段階を実施するためにこれらの緩衝液および試薬を使用するためのプロトコールも、キット中に含まれ得る。
【００９７】
さらに、キットは、増幅方法に関するチェックとしての内部コントロールを提供し、増幅方法における失敗による偽陰性検査結果を生じるのを防止し得る。最適なコントロール配列は、（上述のように）増幅反応において標的核酸配列と競合しないであろうような方法で選択される。
【００９８】
キットは、増幅前に生物検体から核酸を単離するための、および／または核酸抽出前にナイセリア・ゴノレーを精製または分離するための試薬も含有し得る。
【００９９】
試薬は、固体（例えば、凍結乾燥されたもの）または液体の形態で供給され得る。本発明のキットは、場合により、各個々の緩衝液および／または試薬のための異なる容器（例えば、バイアル、アンプル、検査チューブ、フラスコまたは瓶）を含み得る。各成分は一般的に、その個々の容器中に分注されるのに適しているかまたは濃縮された形態で提供されるであろう。増幅／検出アッセイの特定の段階を実施するのに適した他の容器も提供され得る。個々の容器は好ましくは、市販のための厳重な管理下で維持される。
【０１００】
キットは、本明細書に記載される増幅反応試薬およびプライマーセットまたはプライマー／プローブを使用するための説明書も含み得る。本発明の１つ以上の方法に従ってキットを使用するための説明書は、生物試料を処理し、核酸分子を抽出し、および／または検査を実施するための説明書、得られた結果を解釈するための説明書、ならびに医薬品または生物製品の製造、使用または販売を管理する政府機関（例えば、米国食品医薬品局）によって指示された形態にある注意書きを含み得る。
【実施例】
【０１０１】
以下の実施例は、本発明を為しおよび実施する好ましい様式のいくつかを記載する。しかしながら、本実施例が、説明目的のみのためであり、本発明の範囲を制限するよう意味されるものではないことは理解されるべきである。さらに、実施例における記載が、過去形で表されていない限り、明細書の残りのような文は、実験が実際に実施されたかまたはデータが実際に得られたことを示唆するよう企図されるものではない。
【０１０２】
実施例１：クラミジア・トラコマティス／ナイセリア・ゴノレー多重アッセイの特異性
多重ＴａｑＭａｎ  ｋＰＣＲアッセイを使用して、１５個の異なるクラミジア・トラコマティス（ＣＴ）血清型（すなわち、Ａ、Ｂ、Ｂａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３）ならびに４６個の異なるナイセリア・ゴノレー（ＧＣ）単離物を検査した。
【０１０３】
StratageneのＭｘ３０００Ｐ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Stratagene Inc., San Diego, CA）を使用して、単一の密封された反応ウェル中での増幅および検出を実施した。これらの実験において使用されるアッセイのマスターミックス（master mix）は、Applied Biosystems(Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA)製またはQIAGEN(Hilden, Germany）製のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、参照色素（ＲＯＸ）、およびＭｇＣｌ２、AmpErase（商標）ＵＮＧ（１単位／μＬ）を含有し、本発明のＴａｑＭａｎ（登録商標）オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを、研究室内で合成したかまたはBioSearch Inc.から購入した。ｋＰＣＲ反応混合物は、マスターミックス２５μＬおよび精製されたＤＮＡ２５μＬを含んだ。
【０１０４】
表４に報告される得られた結果は、ＣＴ／ＧＣ多重アッセイが、ＣＴ血清型およびＧＣ単離物の広範な範囲を検出することが可能であることを示している。
【０１０５】
ＣＴ／ＧＣ多重ＰＣＲマスターミックスは、（表３に列挙される）７４個の密接に関連した生物体由来のゲノムＤＮＡ１０７コピーにも挑戦され、交差反応性のないことを示した。
【０１０６】
他の態様
本発明の他の態様は、本明細書に開示される本発明の明細または実施に関する考慮から、当業者に明白であろう。本発明の真の範囲が、上述の特許請求の範囲によって示されるとともに、明細および実施例が、典型的なものとしてのみ考慮されるべきであることは企図される。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１−１】表１（部分１および２）は、ナイセリア・ゴノレーのオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）遺伝子、シトシンメチルトランスフェラーゼ（ｄｃｍＧ）遺伝子およびピリン反転タンパク質相同体（ｐｉｖＮＧ）遺伝子配列に由来する本発明の特異的なオリゴヌクレオチド配列の例を示す。各オリゴヌクレオチドのマップの位置および配列番号は、表に示されている。
【図１−２】表１（部分１および２）は、ナイセリア・ゴノレーのオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）遺伝子、シトシンメチルトランスフェラーゼ（ｄｃｍＧ）遺伝子およびピリン反転タンパク質相同体（ｐｉｖＮＧ）遺伝子配列に由来する本発明の特異的なオリゴヌクレオチド配列の例を示す。各オリゴヌクレオチドのマップの位置および配列番号は、表に示されている。
【図２】表２は、表１に記載されている増幅プライマーおよび検出プローブの９個のセットを使用する単一（single-plex）ＴａｑＭａｎ  ｋＰＣＲアッセイの結果を示す。プライマー／プローブセットはすべて、ナイセリア・ゴノレー（ＧＣ）を検出するのに効率的であることが見出され、クラミジア・トラコマティス（ＣＴ）標的ＤＮＡとの交差反応を示さなかった。
【図３】表３は、本発明のいくつかのプライマー／プローブセットの交差反応性を検査するのに使用されたナイセリア・ゴノレーと密接に関連する７４個の生物のリストである。
【図４】表４は、１５個の異なるクラミジア・トラコマティス（ＣＴ）血清型および４６個の異なるナイセリア・ゴノレー（ＧＣ）単離物を検査するのに使用された多重（multiplex）ＴａｑＭａｎ  ｋＰＣＲアッセイの結果を示す。
【配列表】
2009533023000001.app
【国際調査報告】
2009533023.tif 000002
2009533023.tif 000003