(57)【要約】Ｆｌｔ−１のＩｇドメイン２とＩｇドメイン３とを、またはＦｌｔ−１のＩｇドメイン２とＫＤＲのＩｇドメイン３とＫＤＲのＩｇドメイン４とを含む血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）受容体融合タンパク質、融合タンパク質をコードする遺伝子、融合タンパク質を含む薬学的組成物、ならびに融合タンパク質の薬学的使用を提供する。当該融合タンパク質は、糖尿病性網膜症のような血管形成を含む眼疾患のための処置に用いることができる。
2009531036.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれ配列番号２および４に示されるアミノ酸配列を有するＦＰ７およびＦＰ８から選択されたＶＥＧＦ受容体融合タンパク質。
【請求項２】
配列番号１および３に示されるＤＮＡ配列を有するＶＥＧＦ受容体融合タンパク質ＦＰ７およびＦＰ８をコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載のＶＥＧＦ受容体融合タンパク質ＦＰ７および／またはＦＰ８をコードする遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項４】
以下の手順：
Ｆｌｔ−１およびＫＤＲ遺伝子の増幅、上記増幅により得られた遺伝子の制限酵素消化によるＦｌｔ−１およびＫＤＲ断片の取得、ＦＬＴ−１の２番目のＩｇ様ドメインとＫＤＲの３番目のＩｇ様ドメインとＫＤＲの４番目のＩｇ様ドメインとの、もしくはＦＬＴ−１の２番目のＩｇ様ドメインとＫＤＲの３番目のＩｇ様ドメインとのライゲーション；
融合遺伝子の発現ベクターの構築；ならびに
融合タンパク質を作製するため、宿主細胞へのベクターの導入
を含む、請求項１に記載のＶＥＧＦ受容体融合タンパク質ＦＰ７およびＦＰ８の調製方法。
【請求項５】
薬学的に受容可能な任意に１以上の、および薬学的に有効量の担体中に、ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質ＦＰ７およびＦＰ８の１つまたは両者を含む、異常な血管形成に起因する眼疾患の処置に用いられる薬学的組成物。
【請求項６】
上記薬学的に受容可能な担体は、水、マンニトール、グリセロール、エタノール、ポリソルベート、およびグルコースの任意の１つまたは組み合わせである、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
融合タンパク質は、ＦＰ１、ＦＰ２、ＦＰ３、ＦＰ４、ＦＰ５、ＦＰ６、ＦＰ７、およびＦＰ８の１つまたは組み合わせから選択される、血管形成に関連する眼疾患を処置するための薬物の調製におけるＶＥＧＦ受容体融合タンパク質の使用。
【請求項８】
上記血管形成に関連した眼疾患が、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、網膜血管閉塞、処置の失敗に関する血管形成（例えば、レーザー凝固法、および外科的網膜移植）である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
眼疾患に罹患した患者に対して、ＦＰ３、ＦＰ７および／またはＦＰ８のように、ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質ＦＰ１、ＦＰ２、ＦＰ３、ＦＰ４、ＦＰ５、ＦＰ６、ＦＰ７、およびＦＰ８からなる群から選択された１つまたは組み合わせを投与することを特徴とする、血管形成に関連する眼疾患の処置方法。
【請求項１０】
上記血管形成に関連する眼疾患は、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、網膜血管閉塞、処置の失敗に関する血管形成（例えば、レーザー凝固法、および外科的網膜移植）からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は、血管形成に起因する多様な眼疾患のための、ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質、ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質を含む薬学的組成物、および関連する治療用途に関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
網膜血管および脈絡膜(chorodial)血管は、網膜の必須の構成要素である。創傷および疾患に起因する血管壁構造および血管の機能の異常な変化は、視力低下および失明を導く主な要因である。例えば、網膜血管の過形成およびそれ以後の網膜の分離をもたらす真性糖尿病を原因とする糖尿病性網膜症(diabetic retinopathy)は、失明を導く主な要因である。また、網膜血管新生は、眼の傷または手術からの回復の間に起こる。網膜血管におけるこの種の過形成は、精神的変化または失明を導く重要な要因である（Nature 438: 932-938, 2005）。
【０００３】
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は、網膜の中心領域で起こる細胞もしくは組織の分解および血管増殖を原因とする疾患である。ＡＭＤは、ウエットフォーム（浸出性形態）およびドライフォームに分類できる。ウエットＡＭＤは、脈絡膜血管新生を最も一般的に原因とし、かつ失明を導く主要な要因でもある。
【０００４】
血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）は、特に、血管形成を媒介するタンパク質である（Am. J. Pathol. 167: 1451-1459, 2005）。ＶＥＧＦは、内皮細胞の分裂および増殖を刺激し、血管新生の開始を誘導し、かつ酸素および栄養素を組織細胞へ提供する。多くの研究は、一度栄養素の不足により網膜の光受容体細胞が変性（虚血性萎縮症）し始めると、網膜におけるＶＥＧＦの濃度が増加し始めて血管新生を促進することを示している。この過程は血管形成(angiogenesis)と呼ばれる。眼において、新たに生成された血管は、形態に関して正常の血管とは異なり、その血管内腔は、不規則であり、かつ多くの場合、その血管壁は漏れやすい。高い浸透性のまたは漏れやすい血管のこの種の異常な成長は、多くの場合、次々と視力に影響を与える網膜における傷、および分離でさえももたらす。
【０００５】
多くの研究において、ウエットＡＭＤ患者の脈絡膜組織が高レベルのＶＥＧＦ発現を示すことが示されている（Invest. Opthal. Vis. Sci 37: 855-868, 1996; Microvascular Res. 64: 162-169, 2002）。ＶＥＧＦの発現レベルとウエットＡＭＤとの間の相関関係を考慮すると、ＶＥＧＦは、ＡＭＤ診断において生化学的指標として用いることができる（Br. J. Opthalmol. 88: 809-815, 2004）。
【０００６】
いくつかのＶＥＧＦ抑制剤は、内皮細胞のＶＥＧＦとＶＥＧＦ受容体（ｆｌｔ−１、ＫＤＲなど）との間の相互作用を阻害できる。従って、上記ＶＥＧＦ抑制剤は、網膜の出血を予防しかつ止めるように、ＶＥＧＦによって媒介される情報伝達を阻害でき、かつ高レベルのＶＥＧＦ発現に起因する血管形成を阻害する。この種のＶＥＧＦ阻害剤としては、マクゲン（ペガプタニブソディウム(pegaptanib sodium)）、ルセンティス（Lucentis）、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、アバスチン（Avastin）(べバシズマブ)（bevacizumab）、およびＡｄＰＥＤＦなどが挙げられる。特に、マクゲンおよびアバスチンは米国食品医薬品庁（ＦＤＡ）により承認されており、かつ市場に流通している。
【０００７】
〔発明の要旨〕
本発明の一態様は、アミノ酸配列が配列番号２および４として示される、ＶＥＧＦを抑制する新規の融合タンパク質ＦＰ７およびＦＰ８を提供することである。
【０００８】
ＦＰ７は、ＦＬＴ−１の２番目のＩｇ様ドメインとＫＤＲの３番目のＩｇ様ドメインとＫＤＲの４番目のＩｇ様ドメインとからなる。ＦＰ８は、ＦＬＴ−１の２番目のＩｇ様ドメインとＫＤＲの３番目のＩｇ様ドメインとからなる。
【０００９】
本発明の他の態様は、ＤＮＡ配列が配列番号１および３として示される、ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質ＦＰ７およびＦＰ８をコードする遺伝子を提供することである。
【００１０】
本発明の他の態様は、ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質ＦＰ７およびＦＰ８をコードする上記遺伝子を含む発現ベクターを提供することである。上記発現ベクターは、プラスミドベクター、ファージ、ウイルスなどのような、任意の一般的なベクターであってよい。
【００１１】
本発明の他の態様は、ＶＥＧＦ抑制性融合タンパク質ＦＰ７およびＦＰ８の調製方法を提供することである。当該方法は、Ｆｌｔ−１およびＫＤＲの遺伝子増幅、制限酵素消化によるＦｌｔ−１およびＫＤＲ断片の調製、Ｆｌｔ−１の２番目のＩｇ様ドメインとＫＤＲの３番目のＩｇ様ドメインと４番目のＩｇ様ドメインとの、もしくはＦｌｔ−１の２番目のＩｇ様ドメインとＫＤＲの３番目のＩｇ様ドメインとのライゲーション；ライゲーションの結果産物を含む発現ベクターの構築；ならびに融合タンパク質を産生するための上記ベクターの宿主細胞への形質移入を含む。
【００１２】
本発明の他の態様は、眼疾患に関連する血管形成を処置するための薬学的組成物を提供することである。当該薬学的組成物は、薬学的有効量のＶＥＧＦ受容体融合タンパク質ＦＰ１、ＦＰ２、ＦＰ３、ＦＰ４、ＦＰ５、ＦＰ６、ＦＰ７、およびＦＰ８の任意の１つまたは組み合わせ（例えば、ＦＰ７および／またはＦＰ８など）、ならびに任意に１以上の薬学的に受容可能な担体（特に１以上の一般的に眼科の処置に用いられる担体）を含む。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、血管形成に関連する眼疾患の処置におけるＶＥＧＦを抑制する融合タンパク質の使用を提供することである。ここで、上述の融合タンパク質は、ＶＥＧＦに結合可能である組み換え受容体融合タンパク質である。より具体的には、上述の融合タンパク質は、中国特許出願第２００５１００７３５９５．４号明細書（抗血管形成融合タンパク質およびそれらの利用）に記載されたＦＰ１、ＦＰ２、ＦＰ３、ＦＰ４、ＦＰ５、ＦＰ６、ならびに本明細書に記載したＦＰ７およびＦＰ８からなる群より選択された任意の１つまたは組み合わせである。上記融合タンパク質の中でも、融合タンパク質ＦＰ１、ＦＰ２、ＦＰ３、ＦＰ４、ＦＰ５、ＦＰ６のアミノ酸配列は、上記中国特許出願第２００５１００７３５９５．４号明細書（上述の明細書は、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる）に開示された。ＦＰ１は、ＦＬＴ−１の２番目のＩｇ様ドメイン、ＫＤＲの３番目のＩｇ様ドメイン、およびヒト免疫グロブリンＦｃからなる。ＦＰ２は、ＫＤＲの１番目のＩｇ様ドメイン、ＦＬＴ−１の２番目のＩｇ様ドメイン、ＫＤＲの３番目のＩｇ様ドメイン、およびヒト免疫グロブリンＦｃからなる。ＦＰ３は、ＦＬＴ−１の２番目のＩｇ様ドメイン、ＫＤＲの３番目および４番目のＩｇ様ドメイン、ならびにヒト免疫グロブリンＦｃからなる。ＦＰ４は、ＦＬＴ−１の２番目のＩｇ様ドメイン、ＫＤＲの３番目のＩｇ様ドメイン、ＦＬＴ−１の４番目のＩｇ様ドメイン、およびヒト免疫グロブリンＦｃからなる。ＦＰ５は、ＦＬＴ−１の２番目のＩｇ様ドメイン、ＫＤＲの３番目から５番目のＩｇ様ドメイン、およびヒト免疫グロブリンＦｃからなる。ＦＰ６は、ＦＬＴ−１の２番目のＩｇ様ドメイン、ＫＤＲの３番目のＩｇ様ドメイン、ＦＬＴ−１の４番目から５番目のＩｇ様ドメイン、およびヒト免疫グロブリンからなる。融合タンパク質ＦＰ７およびＦＰ８のアミノ酸配列は、配列表における配列番号２および４として示される。眼疾患に関連する上述の血管形成は、限定されないが、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、網膜血管閉塞、処置（例えば、レーザー凝固法、および外科的網膜移植）の失敗に関する血管形成を含む。
【００１４】
本発明の他の態様は、処置を必要とする患者に対して、薬学的有効量のＦＰ３、ＦＰ７および／またはＦＰ８の投与を含む処置方法を提供することである。
【００１５】
本発明の他の態様は、ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質ＦＰ１、ＦＰ２、ＦＰ３、ＦＰ４、ＦＰ５、ＦＰ６、ＦＰ７、およびＦＰ８からなる群から選択した任意の１つまたは組み合わせを上記疾患に罹患した患者に対して投与することにより、血管形成に関連する眼疾患を処置する方法を提供することである。ここで、当該眼疾患は、限定されないが、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、網膜血管閉塞、処置（例えば、レーザー凝固法、および外科的網膜移植）の失敗に関する血管形成を含む。
【００１６】
上記融合タンパク質は、精製された形態において使用され得るか、またはそれらの溶媒和物、または塩、または塩の溶媒和物として使用され得る。本発明において述べられる上記融合タンパク質は、これらの全ての形態を含む。
【００１７】
本発明において述べられるＶＥＧＦ受容体融合タンパク質ＦＰ１、ＦＰ２、ＦＰ３、ＦＰ４、ＦＰ５、およびＦＰ６は、中国特許出願第２００５１００７３５９５．４号明細書に記載されており、かつ当該明細書中の方法および他の同様の方法に従って調製され得る。ＦＰ７およびＦＰ８は、新規の化合物であり、その調製は、中国特許出願第２００５１００７３５９５．４号明細書に記載された方法と同様の方法により実施され得る。そして、以降の本発明の実施例に当該調製の詳細について記載されている。
【００１８】
遺伝子組み換え技術により得られた本発明の組み換えタンパク質は、医薬品品位に精製され得、そしてそれから、所望の製剤の必要に応じて、従来の薬学的に受容可能な担体および／または他の補助剤と混合され得、かつ従来の製剤方法論に従って好適な薬学的製剤として調製され得る。これらの製剤は、静脈内投与、硝子体内投与、腹腔内投与、皮下投与、眼に局所的な投与（例えば、点眼）に関して使用され得；中でも、好ましいのは、溶液製剤、または使用前に水分補給されて溶液になり得る凍結乾燥製剤である。
【００１９】
本発明において記載されている製剤において、融合タンパク質の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１０００ｍｇ／ｍＬの間である。具体的な投与量は、製剤の形態、臨床的な必要性などに依存する。一般的なガイドラインでは、各処置ごとに０．１ｍｇ〜３０００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜２０００ｍｇを毎日、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１月に１回、または１日に数回（例えば、１日に２〜３回）投与することを提案している。
【００２０】
薬学的に受容可能な上述の担体は、本発明に記載される製剤の形態に好適な任意の担体、好ましくは以下のもの：リン酸ナトリウム(sodium phosphate)、コハク酸ナトリウム(sodium succinate)、ヒスチジン(histidine)、マンニトール(mannitol)、トレハロース無水物(trehalose dihydrate)、ポリソルベート２０(polysorbate 20)、塩化ナトリウム(sodium chloride)、スクロース(sucrose)、トロメラモル（tromeramol）、セルロース、修飾されたセルロースまたはラクトースのうちの１つ以上であり得る。上述の製剤は、０〜１００ｍＭ（例えば、１〜１００ｍＭ）の濃度、および３〜９まで変動するｐＨを有する、リン酸塩(phosphate)、クエン酸塩(citrate)、酢酸塩(acetate)、コハク酸塩(succinate)、トロメラモル(toromeramol)（トリス(Tris)）、ヒスチジン(histidine)、またはそれらの組み合わせのようなｐＨ製剤緩衝液(formulation buffer)を含むことができ；そしてまた、塩化ナトリウム(sodium chloride)（０〜２００ｍＭ、例えば１〜１００ｍＭまで変動する濃度）、ブドウ糖(dextrose)（０％〜５０％、例えば１％〜３０％まで変動する濃度）のような浸透圧調節剤を含むことができ；そして、０％〜４０％、好ましくは１％〜３０％の濃度を有する、アミノ酸(amino acid)、グリセロール(glycerol)、シクロデキストリン(cyclodextrin)、スクロース(sucrose)、トレハロース無水物(trehalose dihydrate)のような安定化剤を含むことができ；チメロサール(thimerosal)、亜硫酸水素ナトリウム(sodium bisulfite)、ベンジルアルコール(benzyl alcohol)などの保存剤を含むことができる。凍結乾燥製剤において、マンニトール(mannitol)のような賦形剤は、０％〜４０％、好ましくは０．１％〜１０％の濃度を有して含まれ得る。一方、溶液製剤において、ポリソルベート２０(polysorbate 20)またはポリソルベート８０(polysorbate 80)、ＳＤＳのような界面活性剤は、０％〜２％、好ましくは０．０１％〜１％の濃度を有して含まれ得る。また、本発明において記載した上記製剤は、保存剤、安定化剤、溶媒、共溶媒を含むことができる。好ましい溶媒は、注入のための水、エタノール、グリセロール(glycerol)のような有機溶媒、またはその他の等浸透圧溶液である。
【００２１】
驚くべきことに、本発明では、本明細書における融合タンパク質が眼疾患に関連する多様な血管形成の処置に有効であることを見出している。当該眼疾患は、例えば、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、網膜血管閉塞、処置（例えば、レーザー凝固法、および外科的網膜移植）の失敗に関する血管形成である。加えて、当該融合タンパク質は、安定性が高く、安全性が高く、副作用が小さく、効果的である。実験によって、以下の実施例において詳細が示されるとともに、本発明の利点が実証されている。
【００２２】
〔図面の簡単な説明〕
図１：本発明に記載された融合タンパク質の８つの融合タンパク質の模式図；
図２：融合タンパク質のＶＥＦＧ結合親和性の比較；
図３：虚血性萎縮症を原因とする網膜の血管形成における融合タンパク質の効果；
図４：脈絡膜血管新生における融合タンパク質の効果。
【００２３】
〔本発明を実施する最良の形態〕
以下の実施例では、本発明をさらに明確にするが、当該実施例は、本発明の保護範囲を限定ために解釈されるべきではない。
【００２４】
（実施例１．ＦＰ７の構築）
融合タンパク質ＦＰ７は、鋳型としてＨＵＶＥＣ細胞由来のｍＲＮＡ抽出物、および以下のプライマーを用いた増幅によって得られたｃＤＮＡのＦｌｔ−１遺伝子断片およびＫＤＲ遺伝子断片から構築された。
【００２５】
ＦＬＴ−１  Ｄ２（Ｆ）：5’-cctttcgtagagatgtacagtga-3’
ＦＬＴ−１  Ｄ２（Ｒ）：5’-tatgattgtattggtttgtccat-3’
ＫＤＲ  Ｄ３（Ｆ）：5’-gatgtggttctgagtccgtctca-3’
ＫＤＲ  Ｄ３−４（Ｒ）：5’-cggtgggacatacacaaccaga-3’。
【００２６】
具体的な条件は、Ｆｌｔ−１およびＫＤＲＩｇ様ドメインのＰＣＲ産物を得るための、９５℃において３０分間の変性、５６℃において４５秒間のアニーリング、７２℃において２分間の伸張の、３０サイクルのＰＣＲ増幅である。上記ＰＣＲ産物をＴＡクローニング(cloning)キットを用いて、ＰＣＲ２．１プラスミドにクローニングした。その後、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換し、白いコロニーを選択し、かつＬＢ培地で一晩培養した。上記プラスミドをキアゲン(Qiangen)プラスミド精製キットで抽出し、そしてそれから制限酵素消化および塩基配列の確認を行った。Ｆｌｔ−１断片、ＫＤＲ断片、およびＩｇＧヒンジ領域のｃＤＮＡをソーイングＰＣＲ（Sewing PCR）により共にライゲーションした。ＥｃｏＲＩ部位を末端のプライマーに導入した。ＰＣＲ産物は、キアゲンキットを用いて精製され、ＥｃｏＲＩを用いた制限酵素消化に続いて、そしてそれから、ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドにクローニングされた。上記組み換えプラスミドを使用してＥｃｏｌｉが形質転換され、続いて陽性コロニーが選択され、ＬＢ培地で一晩培養された。上記プラスミドをキアゲン(Qiagen)キットで抽出し、かつ制限酵素消化および塩基配列の確認を行った。確認したプラスミドを用いて、融合タンパク質ＦＰ７を安定して産生する細胞株を得るために、ＣＨＯ細胞がトランスフェクトされた。ＦＰ７のアミノ酸配列は、配列番号３に示されており、ＦＰ７のＤＮＡ配列は、配列番号１に示されている。ヒンジ(hinge)領域の部分は、融合タンパク質のＣ末端に維持された。
【００２７】
（実施例２．ＦＰ８の構築）
融合タンパク質ＦＰ８を鋳型としてＦＰ７、およびプライマーｆｌｔ−１  Ｄ２（Ｆ）：5’-cctttcgtagagatgtacagtga-3’を用いてＰＣＲ増幅した。後者のＤＮＡ配列は、ＫＤＲ  Ｄ３−ｈｉｎｇ（Ｒ）：5’-aggtgctgggcacagtgggcatgtgtgagttttgtctttttcatggaccctgacaaatg-3’であった。融合タンパク質ＦＰ８は、ＫＤＲの３番目のＩｇ様ドメインの相補的な配列、およびヒトＩｇＧＦｃヒンジの部分配列を含む。ＰＣＲ反応の増幅条件および遺伝子クローニングは、実施例１と同様に行った。最後に、クローニングしたＦＰ８を有するＰｃＤＮＡ３．１プラスミドを用いてＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、かつＦＰ８融合タンパク質を産生するための安定した細胞株を得た。ＦＰ８のアミノ酸配列は、配列番号４に示され、そのＤＮＡ配列は配列番号２に示される。
【００２８】
（実施例３．融合タンパク質のＶＥＧＦに対する結合親和性実験）
本発明において、ＶＥＧＦの量を測定するることで、多くの融合タンパク質のＶＥＧＦに対する親和力を決定した。実験において、既知量のＶＥＧＦ（１０ＰＭ）を試験管に添加し、そしてそれから異なる程度まで希釈された融合タンパク質（図２に示されている）を等しい量にして、添加し、そして混合して、３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、試験管における遊離ＶＥＧＦの量をＶＥＧＦ分析キット(VEGF assay Kit)（Ｒ＆Ｄ systems）を用いて決定した。分析後のアッセイの結果を図２に示す（ＦＰ１、ＦＰ３、ＦＰ７、およびＦＰ８は、それぞれ１１．２ＰＭ、４．３ＰＭ、４．１ＰＭ、および１１．２ＰＭのＩＣ５０として示される親和性を有して、ＶＥＧＦと効率的に結合できることを実証している）。この実験は、ＦＰ３およびＦＰ７が、インビトロにおいてＶＥＧＦに対する同様の親和性を有し、一方、ＦＰ８およびＦＰ１が、同様であるが、前者の２つよりも低い親和性であることを証明している。ＦＰ１〜ＦＰ６のＶＥＧＦ親和性は、実施例３に記載した中国特許出願第２００５１００７３５９５．４号明細書に既に記載されている。
【００２９】
この実験は、ＫＤＲの４番目のＩｇ様ドメインのアミノ酸配列が、融合タンパク質のＶＥＧＦ結合能をさらに増強できることを示している。
【００３０】
（実施例４．網膜虚血萎縮症に起因する血管形成を阻害する融合タンパク質の実験結果）
７日齢の新生マウスを、高酸素分圧（７５％±２％）、２３±２℃に制御された温度、および日照条件を有するインキュベーターに置いた。数日後には、網膜の中心に血管新生が起こっておらず；さらに５日後、上記幼いマウスを正常の酸素分圧のインキュベーターに戻した。比較的低い酸素分圧にに起因する、マウスの網膜における低酸素状態のために、虚血性萎縮症に起因する糖尿病性網膜症およびその他の網膜の変性における血管形成成長と同様に、血管形成成長が誘導された。
【００３１】
モデルを用いて、３つの融合タンパク質（ＦＰ１、ＦＰ２、およびＦＰ７）を、網膜虚血萎縮症と関連する血管形成への抑制性の影響について評価した。
【００３２】
高酸素分圧を有するインキュベーターに５日間おいた後、幼いマウスを正常の酸素分圧のインキュベーターに戻した。幼いマウスは、各１０匹ずつ５群に分けれら、かつそれから、１日後に３０ｍｇ／ｋｇの融合タンパク質を腹腔内に投与された。上記投与を、２日に１回、計４回行った。コントロール群におけるマウスは、同量のＦｃタンパク質を用いて注射された。処置の後、各群からの６匹のマウスは、蛍光ＦＡＭの心臓注入を受けた。１０分後、幼いマウスの網膜が取り出されて、血管形成成長を分析した。蛍光顕微鏡下において、網膜を水らにし、かつ血管形成および蛍光の漏れについて観察した。各群の他の４匹のマウスについては、眼を取り出してパラフィンで包埋した。そしてそれから、切片化してＨ＆Ｍで染色した。顕微鏡下において、血管内皮細胞核の数を数えて、血管形成に対する融合タンパク質の影響を分析した（Investigative Ophthalomogy Visual Science 43, 1994-2000, 2002）。その結果を図３に示す。Ｆｃタンパク質の注入を受けた幼いマウスの網膜は、いくつもの病変を示している。多くの不規則な血管が脈絡膜上に観察され得る。融合タンパク質の注入を受けた幼いマウスの網膜は、明らかな血管形成を全く示していない（図３に示されている）。中でも、ＦＰ３は最も有効であり、かつＦＰ１およびＦＰ７も効果的であった（Ｆｃ領域の不足が、おそらくこれらの安定性に影響を及ぼしている）。
【００３３】
一方で、我々は、硝子体内投与したこれらの融合タンパク質の抗血管形成効果について試験している。同じ動物モデルにおいて、正常酸素分圧のインキュベーターに戻した１日後、各眼について０．５μｇの融合タンパク質の硝子体内投与を１動物につき１回だけ行った。処置の７日後、動物の網膜を上述のように回収し、かつ処置した。血管形成に対するこれらの融合タンパク質の効果を図３に示す。その結果は、これらの融合タンパク質が、硝子体内投与後、血管形成に対する顕著な抑制を示すことを示している。硝子体内投与は、腹腔内投与と比べてよりよい有効性を示している。一方、我々は、これらの実験において、ＦＰ７はＦＰ３同様であることをこれらの実験において観察しており、かつ両者ともＦＰ１よりより良好であった。この実験では、硝子体内投与のために、ＦＰ７は血液循環に入る必要がなく、従って、血液の循環におけるその低い安定性は、その有効性にに影響を与えなかった。
【００３４】
（実施例５．レーザー誘導脈絡膜血管新生に対する融合タンパク質の影響）
公開文献（American Journal Pathology 153, 1641-1646, 1998）に従って、我々は、眼におけるレーザー誘導新血管新生による、ＡＭＤモデルをラットにおいて確立している。約１５０匹のラットを４群に分け、その中のコントロール群におけるラット１０匹は、Ｆｃタンパク質（２０ｍｇ／ｋｇ）の皮下注射を受け、一方、各試験群におけるラット１０匹は、レーザー処置の前日、およびレーザー処置の３、６、９および１２日後に、計５回の２０ｍｇ／ｋｇのＦＰ１、ＦＰ３およびＦＰ７の皮下注射を受けた。レーザー処置の１５日後、上記ラットは、５０ｍｇの蛍光標識したデキストランを受け取った。麻酔処置下で眼球を取り出した後、脈絡膜新血管新生（ＣＮＶ）病変を分析するために、速やかに脈絡膜を分離し、かつ平坦化するかまたは凍結切片化し、かつそれから蝋を用いて包埋した。図４に示されるように、結果は、融合タンパク質処置を受けたラットにおいて、コントロール群に由来するＣＮＶ領域と比べてＣＮＶ領域が小さかった（中でも、ＦＰ３の有効性は、ＦＰ１またはＦＰ７の有効性よりも良好であった）ことを示している。ＦＰ７およびＦＰ１のＣＮＶに対する抑制効果は同程度であった。
【００３５】
（実施例６．眼疾患処置における融合タンパク質の応用）
これらの融合タンパク質は、血管形成に関連する多様な眼疾患を処置するために、硝子体内投与および静脈内投与のような好適な製剤形態によって投与され得る。上記眼疾患としては、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症(diabetic retinopathy)、糖尿病性黄斑浮腫(diabetic macular edema)、網膜血管閉塞(central retinal vein occlusion)が挙げられる。一方、これらの融合タンパク質は、血管形成に起因する治療の失敗の危険を減らすために、光線感作物質またはレーザー治療（光凝固）(photocoagulation)のような他の治療法と組み合わせて利用され得る。また、これらの融合タンパク質は手術（例えば、網膜移植後に、血管形成のために当該手術が失敗することもあり得る）と組み合わせられ得る。例えば、当該手術の時点においてこれらの融合タンパク質の処置を受けている場合、患者は、網膜移植の成功率を向上できることもあり得る。ＡＭＤ患者は、所定の眼の検査の後、視力の基準を設定され得、かつそれからこれらの融合タンパク質（例えば、ＦＰ３またはＦＰ７）を硝子体内投与によって受け取ればよい。処置後、ＡＭＤに対するこれらの融合タンパク質の影響を記録するために、患者は、病院で観察および検査を受けた。代表的に、検査を、処置の１、２、６、１４、３０、および９０日後のそれぞれ１回を起こす。一方、患者は、２〜８週間毎にそれぞれの注入の複数の処置を受けてもよい。各注入投与量は、眼ごとに１０μｇから５ｍｇまで変動し得る。
【００３６】
ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫の患者からの臨床提供者に由来して、融合タンパク質ＦＰ３、ＦＰ７は、対照実験と比較されている。
【００３７】
（Ｉ）ＡＭＤ
１．融合タンパク質ＦＰ３の有効性
コントロール群は、光凝固治療を受け；一方、試験群はＦＰ３を受けた。
【００３８】
【表１】
2009531036.tif 000003
【００３９】
評価基準は、中国保健省（Chinese Department of Health）「従来の中国製医薬品および新規医薬品によるＡＭＤ処置の臨床検査指針」の有効性評価基準に従った。
【００４０】
（１）顕著に有効である：（i）変視症などの顕著な症状改善；（ii）中心の視野が、少なくとも４ラインだけ向上される；（iii）小さな収縮または視野中央の中心暗点の明らかな菲薄化；（iv）黄斑浸出物および出血の明らかな吸着、神経性上皮細胞および色素上皮細胞の分離の消失もしくはまたは明らかな収縮；（v）蛍光眼底血管造影法により分析した網膜の血管形成の進行がないことまたは低下；蛍光の浸出の大幅な減少；コントラスト感度の若干の改善。
【００４１】
上述の条件の４つを満たせば、顕著な有効性という評価がつけられる。
【００４２】
（２）有効である：(i)変視症などの症状改善；（ii）中心の視野が少なくとも２ラインだけ改善する；（iii）視野中央の中心暗点の菲薄化；（iv）黄斑浸出物および出血の部分的な吸着、神経性上皮および色素上皮細胞の分離のいくらかの収縮；（v）網膜血管造影法における減少した蛍光色素の浸出；コントラスト感度の若干の改善。
【００４３】
上記条件の２〜３つを満たせば、有効という評価がつけられる。
【００４４】
（３）無効である：有効な基準を満たさない。
【００４５】
結果は、融合タンパク質ＦＰ３がＡＭＤの処置に関して顕著な有効性を示すことを示している。
【００４６】
２．ＦＰ７の有効性
コントロール群に光凝固治療を受け；一方、試験群はＦＰ７を受けた。
【００４７】
【表２】
2009531036.tif 000004
【００４８】
評価基準は上述のものと同じである。
【００４９】
結果は、ＡＭＤ処置に関する融合タンパク質ＦＰ７の有効性が、光凝固処置と同じか、より良好であるとを示している。
【００５０】
（ＩＩ）糖尿病性網膜症
コントロール群は網膜光凝固を受け；一方、試験群はＦＰ３を受けた。
【００５１】
【表３】
2009531036.tif 000005
【００５２】
【表４】
2009531036.tif 000006
【００５３】
有効性評価基準は、「従来の中国製医薬品および新規医薬品の臨床検査指針」の糖尿病性網膜症の有効性評価基準に従った。上記評価基準は、４段階の有効性：ＳＥ（顕著に有効である）、Ｅ（有効である）、ＩＥ（無効である）、およびＷ（悪化する）を含む。
【００５４】
１．顕著に有効である（ＳＥ）：
（１）視力が、少なくとも４ラインだけ改善するか、または１．０以上に良い。
【００５５】
（２）網膜の微細動脈瘤の数が（＋＋＋）から（＋＋）に減少するか、または（＋＋）から（＋）に減少するか、または（＋）から消失する；網膜の出血が、（＋＋＋）から（＋）に減少するか、または（＋＋）から消失する；浸出物が（＋＋＋）から（＋＋）に減少するか、または（＋＋）から（＋）に減少するか、または（＋）から消失することが、眼底試験において示される。微細動脈瘤、出血、および浸出物の少なくとも２つが上述した要求を満たす。
【００５６】
（３）平均血液循環時間が顕著に減少し、黄斑浮腫が顕著に緩和し、網膜の毛細血管の非灌流領域が減少し、血管の漏れが明らかに低減することが、蛍光眼底血管造影法によって示される。上述の基準の少なくとも２つを、少なくとも２０％の向上の度合いを有して、満たすべきである。
【００５７】
２．有効である（Ｅ）：
（１）視力が少なくとも２ライン改善する。
【００５８】
（２）網膜の微細動脈瘤の数が（＋＋＋）から（＋＋）に減少するか、または（＋＋）から（＋）に減少するか、または（＋）から消失する；網膜の出血が（＋＋＋）から（＋）に減少するか、または（＋＋）から消失する；浸出物が（＋＋＋）から（＋＋）に減少するか、または（＋＋）から（＋）に減少するか、（＋）から消失する。微細動脈瘤、出血、および浸出物の少なくとも１つが上述の要求を満たすべきである。
【００５９】
（３）平均血液循環時間が減少し、黄斑浮腫が緩和し、網膜の毛細血管の非灌流領域が減少し、、血管の漏れが明らかに低減することが、蛍光眼底血管造影法によって示される。上述の基準の少なくとも２つを、少なくとも１０％の向上の度合いを有して、満たすべきである。
【００６０】
３．無効である（ＩＥ）：上述に示される要求を満たさない。
【００６１】
４．悪化する（Ｗ）：
（１）視力が２ライン以上悪くなる。
【００６２】
（２）眼底のカラー撮影法が、血管形成のような増殖性の変化を示す。
【００６３】
（３）網膜の毛細血管の非灌流領域が増加し、黄斑浮腫が悪化し、および血管の漏れが増加することが、蛍光眼底血管造影法によって示される。
【００６４】
注釈：
（１）視力試験は、標準の視力表を用いて行われる（１の目盛）。０．１よりも低い場合は、０．０２毎に１ラインとして数える。
【００６５】
（２）眼底の変化は、検眼鏡またはカラー撮影法に従って評価され、かつ微細動脈瘤は、蛍光眼底血管造影法の陰性によって評価された。
【００６６】
（３）（＋）は、多くないもしくは数えられる微細動脈瘤、出血、または浸出物を示；（＋＋）は、多くのもしくは数えることが困難な微細動脈瘤、出血、または浸出物を示す；（＋＋＋）は、多くの数えることができない微細動脈瘤ならびに顕著な出血および顕著な浸出物、ならびに同時に融合したものを表す。
【００６７】
（４）有効性を評価する場合、視力、眼底の変化、および蛍光観察法の少なくとも２つがに注意しなければならない。
【００６８】
結果は、融合タンパク質ＦＰ３は、糖尿病性網膜症の処置において、レーザー光凝固と同様の有効性を有することを示している。
【００６９】
（ＩＩＩ）糖尿病性黄斑浮腫
コントロール群は光凝固を受け、試験群はＦＰ３を受けた。
【００７０】
【表５】
2009531036.tif 000007
【００７１】
【表６】
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【００７２】
有効性の評価基準は、Ren Lianerによる「糖尿病性網膜症に関するアルゴンレーザー凝固の臨床試験」（Journal of Ophthalmology, 1998, 7 (2): 86-88）に従った。
【００７３】
視力の評価基準は標準の視力表に従った。顕著に有効である（ＳＥ）という評価は、処置後に視力が少なくとも２ライン向上した場合に、つけられた。無効である（ＩＥ）という評価は、視力が少なくとも２ライン悪化した場合に、つけられ；その他は、視力の変化無し（Ｅ）という評価がつけられた。処置前に、視力が０．１以下である場合、≧±０．０２の変化が、視力の向上または悪化として評価され、その他は、変化無しとみなされた。
【００７４】
黄斑浮腫の低減の程度は、レーザーの光凝固の前または後に、眼底蛍光血管造影法に従って評価された。有効である（Ｅ）という評価は、黄斑の領域に浸出物が無いか、または浸出物が少なくとも領域の４分の１に縮小した場合に、つけられた。無効である（ＩＥ）評価は、浸出物が顕著に減少しなかったか、または増加でもした場合につけられた。
【００７５】
結果は、ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質の硝子体内投与が、黄斑浮腫の患者における処置後に、短期（３ヶ月）または比較的長期（６ヶ月）の両者においてレーザー光凝固よりも有効性が高いことを示している。
【００７６】
（ＩＶ）網膜静脈閉塞
コントロール群は、光凝固を受け；一方、試験群はＦＰ３を受けた。
【００７７】
【表７】
2009531036.tif 000009
【００７８】
有効性は、Zhang Huirongによる「網膜静脈閉塞の評価」（Journal of Beijing Medical College, 1982, 14: 118）に従って評価された。
【００７９】
（実施例７．眼科系凍結乾燥製剤における融合タンパク質ＦＰ３の調製）
最初に、製剤緩衝液(formulation buffer)（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ヒスチジン、９％  トレハロース無水物、および０．０５％  ポリソルベート２０（ｐＨ６．０）を含む）が調製され、それからＦＰ３の好適な製剤原料(drug substance)が溶解され、所要のタンパク質濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）にまで上記製剤緩衝液を用いてそれが希釈され、そしてそれによって薬学的組成物が得られた。滅菌ろ過後、所要量の薬学的組成物がピペッターまたは分配器によって無菌バイアル（規格：０．５ｍＬ／２ｍＬ）に分配され、かつ当該バイアルは、無菌のブチルラバーの栓を用いて付けられた（半分締めた状態）。上記バイアルが凍結乾燥機に置かれ、それから、好適な凍結乾燥の手順（凍結前、凍結、真空ポンプ、、時間、温度、真空度の項目などを含む）を設定することによって凍結乾燥された。凍結乾燥の完成後、栓が完全に締められ、それからバイアルが凍結乾燥機から取り出され、かつアルミニウム蓋を用いて封がされた。標識した後、当該バイアルは、紙箱に収納され、かつ好適な温度下に保存され得る。
【００８０】
（実施例８．眼への利用のため溶液中の融合タンパク質ＦＰ３の精製）
最初に、製剤緩衝液(formulation buffer)（５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ニナトリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌ  クエン酸、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウム、２０％  スクロース、および０．１％  ポリソルベート２０（ｐＨ６．０）を含む）が調製され、それから、ＦＰ３の好適な製剤原料溶解され、かつ所要のタンパク質濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）にまで製剤緩衝液を用いてそれを希釈され、そしてこれらによって薬学的組成物が得られた。滅菌ろ過後、所要量の薬学的組成物が、ピペッターまたは分配器によって無菌バイアル（規格：５ｍＬ／２０ｍＬ）に分配された。上記バイアルは、無菌のブチルラバーの栓を用いてしっかりと付けられ、、アルミニウムの蓋を用いて封をされ、バイアルに対して標識され、かつ好適な温度で紙箱に保存された。
【００８１】
（実施例９．眼への利用のため溶液中の融合タンパク質ＦＰ３の精製）
最初に、製剤緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  コハク酸ナトリウム、９％  トレハロース無水物、および０．１％  ポリソルベート２０（ｐＨ６．０）を含む）が調製され、それからＦＰ３に好適な製剤原料(drug substance)が溶解され、所要のタンパク質濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）にまで製剤緩衝液を用いてそれが希釈され、そしてそれによって薬学的組成物が得られた。滅菌ろ過後、所要量（≦１００μｌ）の薬学的組成物が無菌バイアル（規格：０．５ｍＬ）にピペッターによって分配された。当該バイアルは、無菌のブチルラバーの栓を用いてしっかりと付けられ、アルミニウムの蓋を用いて封をされ、バイアルに対して標識された。また、当該薬学的組成物がシリンジ（１ｍＬ、灰色のゴムピストンおよび内径２７の針）に所要量（≦１００μｌ）導入され、ゴム栓がピストンに付けられ、かつ灰色のゴムの覆いおよび硬質プラスチックさやを針に順に付けられた。それから、当該シリンジがアルミニウム袋を用いて封をされ（加えて、プラスチックのねじ込みプランジおよび白いフランジ継ぎ手が別のアルミニウム袋に封入された）。それらは、好適な温度下で紙箱に保存された。
【００８２】
（実施例１０．眼製剤用の融合タンパク質ＦＰ１の精製）
融合タンパク質ＦＰ３に代えて融合タンパク質ＦＰ１を用いたこと以外は、全ての材料および方法は実施例９の場合と同じである。
【００８３】
（実施例１１．眼製剤用の融合タンパク質ＦＰ２の精製）
融合タンパク質ＦＰ３に代えて融合タンパク質ＦＰ２を用いたこと以外は、全ての材料および方法は実施例９の場合と同じである。
【００８４】
（実施例１２．眼製剤用の融合タンパク質ＦＰ４の精製）
融合タンパク質ＦＰ３に代えて融合タンパク質ＦＰ４を用いたこと以外は、全ての材料および方法は実施例９の場合と同じである。
【００８５】
（実施例１３．眼製剤用の融合タンパク質ＦＰ５の精製）
融合タンパク質ＦＰ３に代えて融合タンパク質ＦＰ５を用いたこと以外は、全ての材料および方法は実施例９の場合と同じである。
【００８６】
（実施例１４．眼製剤用の融合タンパク質ＦＰ６の精製）
融合タンパク質ＦＰ３に代えて融合タンパク質ＦＰ６を用いたこと以外は、全ての材料および方法は実施例９の場合と同じである。
【００８７】
（実施例１５．眼製剤用の融合タンパク質ＦＰ４の精製）
融合タンパク質ＦＰ３に代えて融合タンパク質ＦＰ７を用いたこと以外は、全ての材料および方法は実施例９の場合と同じである。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】図１は、本発明に記載した８つの融合タンパク質の模式図である。
【図２】図２は、融合タンパク質のＶＥＧＦ結合親和性の比較を示す。
【図３】図３は、虚血性萎縮症を原因とする網膜の血管形成における融合タンパク質の効果を示す。
【図４】図４は、脈絡膜血管新生における融合タンパク質の効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009531036.tif 000016
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