(57)【要約】本発明は定量的な安定化細胞対照生成物、それらの製造方法、およびそれらの使用法に関するものである。安定化細胞に結合したレセプター類、抗原類、およびリガンド類を本発明の方法によって定量できる。その後これらの定量された安定化細胞を使用して未知サンプルのレセプター、抗原、および／またはリガンド密度を測定することができる。１つの実施形態において、本発明は、安定化細胞の一集団を含む定量的参照対照生成物を提供する。この定量的参照対照生成物は、前記安定化細胞が少なくとも１つのエピトープを有し、前記エピトープはその結合特性を実質的に保持し、前記安定化細胞に定量的エピトープ結合値が割り当てられている。
2009501025.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定化細胞の一集団を含む定量的参照対照生成物であって、前記安定化細胞が少なくとも１つのエピトープを有し、前記エピトープはその結合特性を実質的に保持し、前記安定化細胞に定量的エピトープ結合値が割り当てられている、前記定量的参照対照生成物。
【請求項２】
さらに安定化細胞の第二の集団を含み、安定化細胞の各集団は少なくとも１つのエピトープを有し、前記エピトープはその結合特性を実質的に保持し、安定化細胞の各集団に定量的エピトープ結合値が割り当てられている、請求項１記載の定量的参照対照生成物。
【請求項３】
前記安定化細胞がさらに色素またはナノ粒子を含む、請求項１記載の定量的参照対照生成物。
【請求項４】
前記色素が生体核色素、親油性色素または蛍光色素である、請求項３記載の定量的参照対照生成物。
【請求項５】
前記エピトープが細胞性抗原または可溶性抗原上のエピトープである、請求項１記載の定量的参照対照生成物。
【請求項６】
前記安定化細胞が凍結乾燥細胞、アルデヒド固定細胞、またはメタノール固定細胞である、請求項１記載の定量的参照対照生成物。
【請求項７】
前記定量的参照対照生成物が定量的キャリブレータ生成物である、請求項１記載の定量的参照対照生成物。
【請求項８】
さらに安定化細胞の第三の集団を含み、安定化細胞の各集団は少なくとも１つのエピトープを有し、前記エピトープはその結合特性を実質的に保持し、安定化細胞の各集団に定量的エピトープ結合値が割り当てられている、請求項２記載の前記定量的参照対照生成物。
【請求項９】
安定化細胞の一集団を含む定量的参照対照生成物であって、前記安定化細胞が少なくとも１つのレセプターを有し、前記レセプターはその結合特性を実質的に保持し、前記安定化細胞に定量的レセプター密度値が割り当てられている、前記定量的参照対照生成物。
【請求項１０】
前記安定化細胞がさらにナノ粒子または色素を含む、請求項９記載の定量的参照対照生成物。
【請求項１１】
前記定量的参照対照生成物が定量的キャリブレータ生成物である、請求項９記載の定量的参照対照生成物。
【請求項１２】
安定化細胞の第二集団をさらに含み、安定化細胞の各集団が少なくとも１つのレセプターを有し、前記レセプターはその結合特性を実質的に保持し、安定化細胞の各集団に定量的レセプター密度値が割り当てられている、請求項９記載の定量的参照対照生成物。
【請求項１３】
（ａ）細胞の集団を選択する工程と；
（ｂ）ある量の前記細胞を安定化する工程と；
（ｃ）前記細胞と結合したエピトープまたはレセプターを定量する工程と；
（ｄ）前記安定化された細胞に定量値を割り当てる工程
とを含む定量的参照対照生成物の製造方法。
【請求項１４】
前記結合したエピトープの前記定量が前記安定化細胞で行われる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
（ｅ）ある量の前記細胞を色素またはナノ粒子で染める工程
をさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
請求項１３記載の方法により作製される定量的参照対照生成物。
【請求項１７】
請求項１３記載の方法により作製される定量的キャリブレータ生成物。
【請求項１８】
未知細胞のエピトープ密度を定量する方法であって：
（ａ）前記未知細胞の１部分のエピトープ結合シグナルを測定する工程と；
（ｂ）あらかじめ決められたエピトープ結合値を有する既知参照細胞の１部分のエピトープ結合シグナルを測定する工程と；
（ｃ）前記未知細胞の前記部分の前記エピトープ結合シグナルと、前記既知細胞の前記エピトープ結合シグナル値とを比較する工程と；
（ｄ）前記未知細胞に定量的エピトープ密度を割り当てる工程
とを含む方法。
【請求項１９】
前記割り当てがマスターロットから決定された定量値を基礎とする、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
さらに、あらかじめ決められたエピトープ値をそれぞれ有する２種類以上の異なる既知参照細胞の諸部分を含み、前記未知細胞に定量的エピトープ値を割り当てるための数学的関係を利用する、請求項１８記載の未知細胞のエピトープ密度を定量する方法。
【請求項２１】
未知細胞のレセプター密度を定量する方法であって：
（ａ）前記未知細胞の１部分のレセプター結合シグナルを測定する工程と；
（ｂ）あらかじめ決められたレセプター値を有する既知参照細胞の１部分のレセプター結合シグナルを測定する工程と；
（ｃ）前記未知細胞の前記部分の前記レセプター結合シグナルと前記既知細胞の前記レセプター結合シグナル値とを比較する工程と；
（ｄ）前記未知細胞に定量的レセプター密度を割り当てる工程
とを含む方法。
【請求項２２】
請求項２１記載の未知細胞のレセプター密度を定量する方法であって、さらに、あらかじめ決められたレセプター値をそれぞれ有する２種類以上の異なる既知参照細胞の諸部分を含み、前記未知細胞に定量的レセプター値を割り当てるための数学的関係を利用する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は定量的な細胞ベースの参照対照生成物の分野およびこれらの製造方法および使用法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
抗原およびレセプターの定量はイムノアッセイ系の基礎であり、多くの病気の臨床治療および臨床診断にとって有用である。定量は生物学的メカニズムの理解も容易にする。
【０００３】
比較のための既知量の標的抗原またはレセプターを有する信頼できる参照対照生成物を使用して定量の有効性を証明することができる。可溶性抗原類を単離して定量測定し、基準および対照を得ることができる。そのような可溶性抗原はビーズなどの高重合表面に結合することができ、それらの表面に検出される抗原の量をアッセイすることができる。しかし細胞にまたは細胞内にあらわれる細胞性抗原を、高重合ビーズに結合した標準または基準物質でモデル化することは難しい。なぜならば細胞と高重合ビーズとでは光学的特性が非常に異なるからである。これらの特性として例えば屈折率およびＭｉｅ光散乱差が挙げられる。高重合物質の表面は、細胞表面で起きる相互作用とは異なる化学的相互作用に影響することもある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって本発明の目的は定量的細胞参照対照生成物を提供することである。本発明のその他の目的は本発明の定量的細胞参照対照生成物の製造方法および使用法である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の簡単な要旨）
本発明により、安定化細胞の集団を含んでなる定量的参照対照生成物が提供される。これらの安定化細胞は、抗体結合特性を実質的に保持している少なくとも１つのエピトープを有し、ある定量的エピトープ結合値がこれら安定化細胞に割り当てられる。本発明の定量的参照対照生成物は１つより多い安定化細胞集団を含むことができる。
【０００６】
本発明によって提供される定量的参照対照生成物は、結合特性を実質的に保持している少なくとも１つのレセプターを有する安定化細胞集団も含むことができ、ある定量的レセプター結合値がこれら安定化細胞に割り当てられる。本発明の定量的参照対照生成物は１つより多い安定化細胞集団を含むことができる。
【０００７】
本発明はさらに、定量的参照対照生成物の製造方法であって：（ａ）細胞の集団を選択する工程と；（ｂ）ある量の細胞を安定化する工程と；（ｃ）これら細胞と結合するエピトープを定量する工程と；（ｄ）定量的エピトープ結合値を上記安定化細胞に割り当てる工程とを含む製造方法を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、定量的参照対照生成物の製造方法であって：（ａ）細胞の集団を選択する工程と；（ｂ）ある量の細胞を安定化する工程と；（ｃ）これら細胞と結合するレセプターを定量する工程と；（ｄ）定量的レセプター結合値をこれら安定化細胞に割り当てる工程とを含む製造方法を提供する。
【０００９】
本発明はその他に、未知細胞のエピトープ密度を定量する方法であって：（ａ）未知細胞類の部分のエピトープ結合シグナルを測定する工程と；（ｂ）あらかじめ決められたエピトープ結合値で既知参照細胞類の部分のエピトープ結合シグナルを測定する工程と；（ｃ）未知細胞類の部分のエピトープ結合シグナルを既知細胞類のエピトープ結合シグナル値と比較する工程と；（ｄ）未知細胞類に定量的エピトープ密度を割り当てる工程とを含む方法も提供する。
【００１０】
本発明は、未知細胞のレセプター密度を定量する方法であって：（ａ）未知細胞類の部分のレセプター結合シグナルを測定する工程と；（ｂ）あらかじめ決められたレセプター値で既知参照細胞の部分のレセプター結合シグナルを測定する工程と；（ｃ）未知細胞類の部分のレセプター結合シグナルと既知細胞類のレセプター結合シグナル値とを比較する工程と；（ｄ）上記未知細胞類に定量的レセプター密度を割り当てる工程とを含む方法も提供する。
【００１１】
本発明の定量的参照対照生成物はキャリブレータ生成物としても使用できる。
【００１２】
エピトープ定量法とレセプター定量法とは組み合わせることもできるし、別々にすることもできることは当然である。
【００１３】
本発明のその他の目的および利点は、一部は以下の説明に示され、一部は本発明の実施によって理解される。本発明の目的および利点は添付の請求項に詳細に記載される要素および組み合わせによって実現し、達成される。
【００１４】
以上の概略的記述および下記の詳細な説明は両方とも例示に過ぎず、本発明を制限するものではない。
【００１５】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は本発明を説明するものであり、その説明と共に本発明の原理の解釈に役立つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施形態の詳細を以下に示す。本明細書に示す諸工程の順序は本発明の一実施形態を示すに過ぎない。以下の諸工程の順序は例示的なものであり、これら諸工程の順序は変えることができることは当然である。
【００１７】
細胞の安定化
安定化する細胞を選択する。例えばヒトまたは動物細胞を本発明に使用することができる。
【００１８】
抗原またはレセプターを含むほとんど全ての細胞が使用可能である。抗原／レセプターは細胞外でも細胞内でもよいし、可溶性でもよい。本発明に適切に使用できる細胞の例は、ＲＰＭＩ８２２６、Ｂａｌｌ−１、ＭＡＮＣＡ、ＥＢ−３、Ｒａｊｉ、ＦＭＮ−５９Ｂ、ＣＡ４６、Ｄａｕｄｉ、Ｒａｍｏｓ、ＣＥＭ−１、ＫＧ１ａ、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＯＬＴ−４、Ｕ９３７、ＨＬ−６０、ＴＨＰ−１などの細胞系を含む。これらの細胞系並びにその他の細胞系は文献でよく知られている。
【００１９】
本発明に用いられるその他の細胞には、線維芽細胞、マスト細胞、好中球、リンパ球、好塩基球、好酸球、単球、血小板、赤血球、メラノサイト、軟骨細胞、ケラチノサイト、心筋細胞、骨格筋細胞、上皮細胞、あらゆる種類の腫瘍細胞（特にメラノーマ、白血病細胞（例えば骨髄性およびリンパ球系白血病細胞など）および癌腫（肺、乳、子宮、結腸、腎臓、前立腺、膵臓および精巣などの癌腫））、肝細胞、腎細胞および幹細胞（例えば造血、神経、皮膚、肺、腎、肝、および筋幹細胞など）、並びに上記細胞類の前駆体が含まれる。
【００２０】
安定化細胞と結合したレセプター、抗原またはリガンドを保存できるすべての安定化プロトコルを使用することができる。
【００２１】
ここに用いられるレセプター、抗原またはリガンドは安定化細胞と結合しており、その結合は細胞内（細胞質内、核またはその他の小器官）でも、膜結合（細胞内または細胞表面）でもよく、または受動的に結合する可溶性血漿成分でもよい。受動的に結合する可溶性血漿成分とは膜コンポーネントと結合できる血漿成分である。例えば、ＴＮＦαは膜レセプターと結合し、レセプターは該レセプターに結合したＴＮＦαによって安定化するので、ＴＮＦαは受動的に結合する可溶性血漿成分である。その他の受動的に結合する可溶性血漿成分にはサイトカイン類、ヘモカイン類、リポ多糖結合蛋白（ＬＰＢ）マンノース結合蛋白（ＭＢＰ）、パターン認識分子類（ＰＲＭ）などがある。
【００２２】
本発明に適切に使用できる安定化プロトコルとしては凍結乾燥、アルデヒド固定、メタノール固定、メタノール−アセトン固定、ホルムアルデヒド固定、パラホルムアルデヒド−グルテルアルデヒド固定、パラホルムアルデヒド−トリトン固定、パラホルムアルデヒド−メタノール固定、エチレングリコール−ビス−スクシンイミジルスクシネート（ＥＧＳ）固定、架橋剤による固定、タンニング法による固定、および架橋剤の存在下または不在下で酵素阻害を用いる安定化などがある。この種のプロトコルは文献によって一般に公知である。
【００２３】
例えば、凍結乾燥プロトコルはＫｏｒｔｒｉｇｈｔの米国特許第５，０５９，５１８号に示されている。これは参考として本明細書に組み込まれる。Ｋｏｒｔｒｉｇｈｔプロトコルの変法がＭａｐｌｅｓの米国特許第５，８６１，３１１号、８欄、５０−６７行に示されている。これは参考として本明細書に組み込まれる。
【００２４】
ホルムアルデヒド−アンモニウム塩安定化プロトコルはＭａｐｌｅｓの米国特許第６，９１３，９３２号に記載されている。このプロトコルは参考として本明細書に組み込まれる。
【００２５】
本発明の細胞の結合特性を安定化前または安定化後に多少変更できることは当然である。本発明の一実施形態は参照対照生成物用であるので、当然のことながら、本発明の細胞の結合特性を低減しまたは高めることが所望されることになる。これらの特性を変更することによって或るレベルの結合特性を有する対照を得ることができる。細胞の結合特性を変える方法は文献によって一般に公知である。例えばＫＧ１ａ細胞をヨードアセタミドで処理してＣＤ３４の発現を変えることができる。例えばＭａｐｌｅｓの米国特許第５，８６１，３１１号、９欄、５７行から１０欄、６行までを参照されたい。このプロトコルは参考として本明細書に組み込まれる。Ｍａｐｌｅｓの米国特許第５，７６３，２０４号に開示されているように、抗ＣＤ４結合磁気ビーズを用いると血球にはＣＤ４がなくなる。４欄、４０行から５欄２９行まで。このプロトコルは参考として本明細書に組み込まれる。その他のこの種の方法は文献により、一般に知られている。
【００２６】
安定化プロトコルの選択は少なくとも一部は対象の抗原またはレセプターに影響される。安定化プロトコルの選択は該安定化プロトコルが安定化細胞を保存する時間によっても影響される。
【００２７】
本発明は多くの異なる細胞および細胞系に適用できるので、ある安定化プロトコルがより好ましいということはない。同様に、本発明の方法によって安定化できる対象の抗原またはレセプターは数多くあるので、当然、対象の抗原またはレセプターを安定化するためにある安定化プロトコルがより好ましいということはない。
【００２８】
本発明の細胞と結合しているレセプター、抗原およびリガンドは細胞を安定化してもそれらの結合特性を実質的に保持していなければならない。これらレセプター、抗原およびリガンドは、それらが特異的結合を示す時にはそれらの結合特性を実質的に保持している。その結合は天然のレセプター、抗原、またはリガンドに比較して高いこともあるし、低いこともある。しかし、これら細胞に、安定化プロトコルに関連する損失または増加の再現性および確実性があるならば、当然のことながら、これら細胞を本発明に使用できる。ある安定化プロトコルによって一貫した数の活性結合部位が得られれば、そのプロトコルは再現性を有し、信頼できるプロトコルである。
【００２９】
本明細書で使用される抗原類について述べる。当然ながら抗原は１つ以上のリガンドを含む。リガンドがその特異的結合を保持するように保存されるならば、その抗原は保存されると考える。このため、当然ではあるが対象のリガンドが保存されているならば、たとえ抗原と結合したその他のリガンド類は保存されなくても、この抗原は保存されていることになる。
【００３０】
細胞は色素で染色できる
細胞は、ナノ粒子または色素、例えば生体核色素、親油性色素、または蛍光色素などで染色できる。色素で染色すると、染色された細胞と未染色細胞とを例えばフローサイトメトリー法などによって分離することができる。染色は安定化前、安定化中または安定化後に行うことができる。
【００３１】
本発明に適切に使用できる生体核色素は当業者には公知であり、インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（カールスバード、カリフォルニア）、カルビオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（サンジエゴ、カリフォルニア）、およびエクシトン社（Ｅｘｃｉｔｏｎ）（デイトン、オハイオ）のような供給業社から広く市販されている。このような色素の例としてはＬＤＳ−７５１（エクシトン社から入手できる）およびビスベンザミド（ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２またはＨ−３３３４２、これはカルビオケム社から入手できる）、ＳＹＴＯＸブルー、クロモマイシンＡ３、ミスラマイシン、ＹＯＹＯ−１、ＳＹＴＯＸ、臭化エチジウム、７−アミノアクチノマイシンＤ、アクリジンオレンジ、ＤＲＡＱ−５、ＴＯＴＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、チアゾールオレンジ、およびプロピジウムヨージド（ＰＩ）、ＴＯＴＯ−３、およびＴＯ−ＰＲＯ−３が含まれる。本発明の方法および生成物に１種類以上の生体核色素を使用してもよい。
【００３２】
本発明に適切に使用できる親油性色素にはＤＩＯ、ＤＩＲ、ＦＭ４−６４などがある（これらは全てモレキュラープローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）から入手できる）。
【００３３】
本発明に適切に使用できる蛍光色素は当業者には公知であり、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）（セントルイス、ミズーリ）およびシンテゲン社（Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ）（ヒューストン、テキサス）のような供給業社によって広く提供されている。本発明に適切に使用できる蛍光色素の例はフルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、ＴＡＭＲＡ−ｄＴ、カルボキシフルオレッセイン（ＦＡＭ）、ヘキサクロロフルオレッセイン（ＨＥＸ）、テトラクロロフルオレッセイン（ＴＥＴ）、ＪＯＥ、ライトサイクラーレッド６４０、カスケードブルー、ルシフェルイエロー、ライトサイクラーレッド７０５、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、アミダイト、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミン、カルボキシーＸ−ローダミン（ＲＯＸ）、クマリン、メトキシクマリン、ヒドロキシクマリン、アミノクマリン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７である。その他の適切な蛍光色素としては新規のタンデム色素類、例えばＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＡＰＣ−Ｃｙ７、およびＡＰＣ−Ｃｙ５．５が含まれる。１種類以上の蛍光色素を本発明の方法および生成物に使用してもよい。
【００３４】
本発明に適切に使用できるナノ粒子としてはＱ−Ｄｏｔｓ（クワンタムドット社（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐ．）（ヘイワード、ＣＡ））、ビオピクセルス（ビオクリスタル社（ＢｉｏＣｒｙｓｔａｌ）（ウエスタビル、ＯＨ））、およびエビタグス（エビデントテクノロジース社（Ｅｖｉｄｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（トロイ、ＮＹ））が含まれる。これらのナノ粒子は細胞にはいれるほど十分に小さく、それらは蛍光で標識化することができる。
【００３５】
本発明の方法および安定化細胞には１種類より多い色素またはナノ粒子を使用できると考えられる。さらに、生体核色素、親油性色素、蛍光色素またはナノ粒子を組み合わせて使用できると考えられる。
【００３６】
安定化細胞の再構成
本発明の方法および生成物において、安定化細胞を再構成することができる。再構成用緩衝液は文献では一般に知られている。例えば、燐酸緩衝食塩液を基礎とする溶液類が再構成用緩衝液として使用できる。水を使って細胞を再構成してもよい。その他の適切な緩衝液はトリス基礎緩衝液、ＨＥＰＥＳ基礎緩衝液、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、バイシン、クエン酸塩、カルボン酸塩、リン酸緩衝液、硼酸緩衝液、グリセリン緩衝液、および標準平衡塩溶液（リンゲル、タイロード、アール、ハンクスおよびダルベッコ）を含む。再構成用緩衝液としてはは蛋白類（アルブミンなど）、砂糖類、二価カチオン（Ｍｇ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｃｏ＋＋、Ｎｉ＋＋、Ｃａ＋＋）、キレート剤（ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ）、酵素阻害剤（アプロチン、フェニルメチルスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）、レバミゾール、またはテトラミゾール）、酵素類（ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ）、および塩類が含まれる。多くの再構成用緩衝液が市販されている。市販されているこの種の再構成用緩衝液としては、ベックマンクールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）から市販されるＩＳＯＴＯＮ（登録商標）およびＰＢＳが含まれる。
【００３７】
定量値の割り当て
定量的シグナルを発生する検出装置が本発明に適切に使用できる。この種の装置には蛍光に基づく細胞分析器がある。これらの機器は例えば蛍光機器、フローサイトメーター、血流分析器、画像分析顕微鏡などである。特殊の例として下記の血流分析器を本発明に使用できる：ＦＣ５００、Ｅｐｉｃｓ（登録商標）ＸＬ（商品名）、およびアルトラ（Ａｌｔｒａ）（これらは全てベックマンクールター社、マイアミ、ＦＬによって製造される）。シスメックスコーポレーション・オブ・アメリカ社（Ｓｙｓｍｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）（ロンググローブ、ＩＬ）からの血液分析器、例えばＳＹＳＭＥＸ−ＲＡＭＩ１  ９５００、ＳＦ−３０００およびＸＥ−２１０００、アボットラボラトリース社（Ａｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（アボットパーク、ＩＬ）からのＣＥＬＬ−ＤＹＮシリーズ機器など、ＡＢＸディアグノスティックス社（ＡＢＸ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）（モントペリエルセデックス、フランス）からのＰＥＮＴＲＡ６０および１２０Ｒｅｔｉｃ血液分析器など、またはバイエルディアグノスティックス社からのＡＤＶＩＡ７０および２０血液分析器などが本発明に使用できる。本発明に使用できる画像分析器にはＩＣ１００（ベックマンクールター社、マイアミ、ＦＬ）が含まれる。本発明に適切に使用できるその他のシステムとしてはＥＬＩＳＡ、化学ルミネッセントアッセイ、およびラジオイムノアッセイが含まれる。
【００３８】
定量値は、標準化された基準法を使用して、細胞または安定化され再構成された細胞に割り当てられる。本発明の一実施形態において、再構成された細胞類の幾つかの部分を安定化された残りの部分の代表として選択し、抗原を定量する。その際例えばその抗原のための標準化された基準法を使用する。
【００３９】
本発明のもう一つの実施形態のもとでは再構成された細胞の幾つかの部分を残る安定化部分の代表として選択して、レセプターを定量する。その際例えばそのレセプター部位に結合する物質を用い、標準化された基準法などを用いる。
【００４０】
抗原の定量およびレセプターの定量は相互に排他的ではなく、それらは同じ細胞で行うことができる。或いは、それらは少なくとも２種類の細胞の混合物で同時にまたは逐次的に行ってもよい。
【００４１】
安定化前に定量を行えることは当然である。安定化によって抗原（またはレセプター）密度測定値に確実な、再現性のある変化を示す細胞は、当然ながら安定化前に定量できる。当然ながら、その変化は損失、増加であるかも知れないし、定量値に何の変化もないかも知れない。一般に、定量値に明確な変化がある細胞類では安定化前に測定するのが適切である。細胞の定量値を、その後適正な補正因子を使って安定化細胞に割り当てる。
【００４２】
本発明に適切に使用できる一つの標準化された基準法は、対象の抗原／レセプターの平均蛍光強度を、市販の定量ビーズから発生する平均蛍光強度に補正することである。このようなビーズはビオサイテックス社（ＢｉｏＣｙｔｅｘ）（マルセーユ、フランス）およびバングスラボラトリース社（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（フィッシャース、インディアナ）から入手できる。
【００４３】
ビオサイテックス社は増加する既知数のマウス免疫グロブリン（ＩｇＧ）を表面にコーティングしたビーズ類の混合物を生産している。免疫グロブリンのこれら種々様々の数は、細胞上の抗原またはレセプターの数を示すものとする。蛍光標識された抗マウスＩｇＧを加えると、該蛍光抗マウス抗体はビーズに結合したＩｇＧに結合する。測定された蛍光強度（ＭＦＩ）は、報告によるとこれらの粒状ビーズ上に現れるとされるＩｇＧ分子数に直接比例すると考えられる。
【００４４】
このビオサイテックス社製品の変形物はクワンタムシンプリーセルラー（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ）（ＦＣＳＣ、バングスラボラトリーズ社）である。これらのビーズは既知量の抗マウスＩｇＧで標識されている。蛍光標識されたマウスモノクローナル抗体を加えると、それはビーズに付着し、したがってＭＦＩは粒状ビーズ上の抗ＩｇＧ抗体の数に比較する。
【００４５】
安定化細胞の使用とビーズの使用との差は、安定化細胞は測定しようとする抗原またはレセプターそのものを示すことである。ビーズは二次的比較を用いる。そのため免疫グロブリン／ビーズ系は細胞膜に起きるかも知れない抗原／抗体結合または細胞膜に起きるかも知れないレセプター／リガンド結合のいづれも示さない。その上ビーズ上では対象の抗原が、例えば細胞表面膜上とは異なる物理的および化学的特徴を示す。結合抗体（抗マウス）がビーズに結合しているクワンタムシンプリーセルラー（ＦＣＳＣ）ビーズの場合、これら結合した抗体の物理化学的性質は任意の型の細胞結合の典型的モデルを示さない。Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ３３：１３８−１４５（１９９８）およびＣｙｔｏｍｅｔｒｙ３３：１６６−１７８（１９９８）。
【００４６】
今ある市販の定量ビーズ（ＢｉｏＣｙｔｅｘまたはＦＣＳＣ）からの曲線（数学的関係）を用い、所望の抗原／抗体系に応じて凍結乾燥細胞に蛍光値を割り当てることができる。これは安定化／再構成化細胞に対する定量的抗原割り当て法の唯一の例である。
【００４７】
定量ビーズ（例えばＢｉｏＣｙｔｅｘ、ＦＣＳＣ）のスカチャード分析またはその他の統計的分析により、選択されるあらゆる基準系に関して安定化細胞に定量的抗原値を割り当てることができる。
【００４８】
飽和結合実験、競争的結合実験、および動力学的実験は全て、安定化細胞の定量値を確立するために使用できる標準的基準法である。これらのプロトコルはよく知られている。蛍光および放射性標識抗体が使用できる。
【００４９】
直接的抗原モデルは、安定化細胞の定量値を確立するために使用できるその他の標準的基準法である。例えば、正常なＣＤ４陽性リンパ球はそれらの表面上に約５０，０００のＣＤ４抗原分子を発現することが文献に報告されている。Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ３３（２）：１２３−３２（１９８８）。正常なサンプルを標識化し、分析することができる。陰性対照で補正した平均蛍光値が一般に容認された文献値５０，０００に等しくなるようにした。これらの数値を用いてＣＤ４抗原定量値を安定化細胞に割り当てることができる。その他の抗原／レセプターの同様な報告値を用いて定量値を安定化細胞に割り当てることができ、またはそれらは基準としてＣＤ４値に標準化される。
【００５０】
未知サンプルに定量値を割り当てる
アッセイされた安定化細胞を用いて未知サンプルの定量値を確立することができる。アッセイされた安定化細胞を個別に、または未知細胞と組み合わせ、または明確な可溶性被検体含有媒体と組み合わせてアッセイに含めることができ、関連するアッセイ検出系とは無関係に細胞性または可溶性抗原（またはレセプター）を定量することができる。
【００５１】
細胞表面の抗原数およびレセプターリファレンスを定量するためのアッセイされた安定化細胞および細胞系の使用範囲を広げ、媒体中の可溶性抗原の分析に適用することもできる。標準的競争的干渉法を用いると、安定化細胞への抗体またはレセプター結合の阻害は媒体中の可溶性抗原量を決定する。
【００５２】
標準的抗原検出法によってアッセイされた安定化細胞、例えば凍結乾燥細胞を使用することにより、任意の抗原検出法の使用を、未知細胞上および／または媒体中の抗原の未知量に直接関連づけることができる。
【００５３】
安定化細胞上の抗原は、別の未知細胞と結合する抗原を定量するための定量的基準対照として適切に使用できる。これら未知細胞は、安定化細胞に含まれる特異的蛍光標識および／または安定化細胞の特異的光学的または物理的特性、例えばサイズおよび／または特異的細胞マーカーに基づいて確認され、アッセイされた安定化細胞から分離できる。
【００５４】
一つの応用は、核蛍光色素で標識した安定化細胞の幾つかの部分の抗原量を測定することである。これらの細胞は未知サンプル、例えば患者のサンプルなどをアッセイするための抗原基準として使用される。このアッセイを行う例として、あらかじめ決められた量の抗原を有する安定化細胞を再構成し、別々に、または未知細胞または未知媒体と組み合わせてアッセイする。未知細胞または媒体の抗原発現のアッセイは、安定化細胞上の既知量の抗原の検出と同時に、および該検出に関連して行われる。抗原検出法は未知細胞およびアッセイされた安定化細胞の両方で同じでよい。
【００５５】
一実施形態において、アッセイ法はフローサイトメトリーによる蛍光標識モノクローナル抗体の使用である。数種の異なるアッセイされた安定化細胞であって、その各々が異なるレベルの抗原を発現し、それらを区別する異なる検出特性を有する、前記異なるアッセイされた安定化細胞がこのアッセイに使用できる。
【００５６】
安定化再構成サンプル中に同定された細胞集団または複数の細胞集団の抗原またはレセプター密度に関して、安定化細胞に或る数値が割り当てられる。この数値は標準基準法を使用して誘導された定量値と関連する。この抗原またはレセプター密度値は残りの凍結乾燥した細胞サンプル集団（類）に適用できる。これらの細胞は“既知細胞”と言われる。
【００５７】
抗原またはレセプター密度に関して割り当てられた基準値を有する再構成細胞である“既知細胞”をその後抗原またはレセプター密度が未知である細胞の存在下でアッセイする。“未知細胞”および“既知細胞”は別々に、または混合して一緒にアッセイすることができる。
【００５８】
一実施形態において、“未知細胞”を“既知細胞”の１つより多いサンプルと関連づけてアッセイする。“１つより多い”各サンプルは一般に、異なる抗原／レセプター密度を有し、相互に分離するためのおよび未知細胞から分離するための種々の手段を有する。これは、蛍光および／または抗原および／またはレセプターおよび／または光散乱特性の幾つかの組み合わせを基にした実施例から行うことができる。
【００５９】
“未知細胞（類）”サンプルのアッセイに使用する同じ試薬および試薬系を用いて“既知細胞”をアッセイすることができる。このアッセイに使用する測定系は同じ試薬類を用いてアッセイする“既知”および“未知細胞”両方に適用できる。
【００６０】
“未知”サンプルの測定値を１種類以上の“既知”細胞の測定値と比較する。この“既知細胞”は１つ以上のあらかじめ決定された抗原またはレセプター定量値を有する。
【００６１】
数学的関係を利用して定量的抗原またはレセプター定量値を“未知細胞（類）”に割り当てることができる。割り当てられる定量測定値  対  未知定量測定値の比は一例である。もう一つの例は、数種の安定化“既知”細胞の異なる割り当てられた値を用い、これらの数値間の関係をプロットし、その後この関係を利用して“未知細胞（類）”の抗原またはレセプター定量値を決めることである。
【００６２】
標準化された基準法から得た結果を１つ以上の統計的方法によって分析できる。このような方法としてはスカチャード分析、ラインウィーバー−バーク−プロット、イーディー−ホフステープロット、二重逆数プロット、ホームスプロット、半対数プロット（Ｋｌｏｔｚ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２１７：１２４７（１９８２））、ヒル式／係数、線型回帰、および非線型回帰が含まれる。このような統計的方法により、選択されたあらゆる基準系に関する定量値を安定化細胞に割り当てることができる。
【００６３】
一実施形態において、定量値が最初はマスターロットに割り当てられる。マスターロットとは、その他のロット類がそこから成長する種子ロットである。しかしマスターロットが親ロットである必要はないことは当然である。マスターロットから、それに続くロット類にそれらの定量値が直接割り当てられる。
【００６４】
こうして直接的抗原および／またはレセプター値を確立するために安定化細胞を使用する本発明は、治療および診断の改善および進歩をもたらす。
【００６５】
参照対照生成物
アッセイされた安定化細胞は参照対照生成物を確立させる。
【００６６】
本発明の参照対照生成物は抗原密度に関してあらかじめ決められた定量値を有するかも知れない。或いは、本発明の参照対照生成物はレセプター密度に関してあらかじめ決められた定量値を有するかも知れない。本発明の参照対照生成物は複数のアッセイされた安定化細胞を含むことができる。アッセイされ安定化された複数の細胞は抗原密度に関するあらかじめ決められた定量値、レセプター密度に関するあらかじめ決められた定量値、または抗原およびレセプター密度の組み合わせを有することができる。
【００６７】
一実施形態において、少なくとも２種類の細胞型が安定化され、参照対照生成物として供給される。これら少なくとも２種類の細胞を一本のバイアルに包装してもよいし、それらを別々に包装してもよい。
【００６８】
もう一つの実施形態において、少なくとも３種類の細胞が安定化され、参照対照生成物として供給される。これら少なくとも３種類の細胞を一本のバイアルに包装してもよいし、それらを別々に包装してもよい。
【００６９】
また別の実施形態において、少なくとも１種類の安定化細胞は凍結乾燥によって安定化されている。
【００７０】
基準対照が少なくとも２種類の細胞で提供される場合、それらの定量値の回帰曲線を作成し、その後未知サンプルに割り当てることができる。
【００７１】
再構成用緩衝液を本発明の参照対照生成物と共に供給することができる。少なくとも一実施形態において、安定化細胞はすぐ使用できる液体でよい。
【００７２】
キャリブレータ生成物
本発明の一実施形態において、アッセイされた安定化細胞がキャリブレータとして供給される。ここで使用されるキャリブレータは、標準からの偏差（偏り）を測定し、機器の正しい補正ファクタを確かめるために使用できる本発明のアッセイされた安定化細胞である。例えばキャリブレータは、一般的に、アッセイされた定量値を基準対照が割り当てるよりもより厳密に割り当てる。アッセイされた定量値の割り当ては、キャリブレータ生成物の調製の際の有効性確認プロセス中に行われる。標準対照生成物より厳しい標準偏差を割り当てられるこの数値は、キャリブレートされる機器に依存し、キャリブレータ固有の特性に依存する。キャリブレータを作製するための有効性確認プロセスは一般に知られている。
【００７３】
本発明のこの実施形態のようなキャリブレータは、技術者が機器の作業パラメータを実証するために使用する。そこで、割り当てられたキャリブレータの数値を用いてその機器が正しく機能していることが確認される。その機器から得られる数値がそのキャリブレータの割り当てられた数値と異なる場合には技術者は“正しい”数値になるように機器を調節する。
【実施例】
【００７４】
（実施例１）
生細胞対安定化細胞のＭＦＩの比較
下記の実施例において、細胞系ＰＲＭＩ８２２６、Ｂａｌｌ−１、ＭＡＮＣＡ、ＥＢ−３、Ｒａｊｉ、ＦＭＨ−５９Ｂ、ＣＡ４６、Ｄａｕｄｉ、Ｒａｍｏｓ、およびＫＧ１ａを、それらの細胞性抗原ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ４５について、蛍光標識抗体による直接的染色によって比較した。図１、２および３を参照。ｙ軸の蛍光強度値（ＭＦＩ）を、生（凍結乾燥しない）細胞と、Ｋｏｒｔｒｉｇｈｔの特許（米国特許第５，０５９，５１８号）に示されるプロトコルを用いて凍結乾燥し、その後ＰＢＳ緩衝液中で再構成した同じ細胞とで比較する。これら細胞系の抗原発現は凍結乾燥／再構成プロセスによって変化した。ＣＤ２０抗原の発現は凍結乾燥細胞対生細胞で異なり、時にはより高く、時にはより低かった。こうして再構成凍結乾燥細胞に数値が割り当てられた。
【００７５】
（実施例２）
生細胞対安定化細胞上におけるＣＤ４抗原のアッセイ中の発現の差
正常ドナー（ドナー）から得た生白血球上のＣＤ４抗原の発現を、安定化し（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｔｒｏｌ（商品名））凍結乾燥／再構成した組織培養細胞（ＣＥＭ−１、Ｕ９３７、およびＰ１２／Ｉｃｈｉｋａｗａ）上のＣＤ４抗原の発現と比較した。図４。
【００７６】
組織培養細胞（ＣＥＭ−１、Ｕ９３７、およびＰ１２／Ｉｃｈｉｋａｗａ）をＫｏｒｔｒｉｇｈｔプロトコルによって凍結乾燥し、ＰＢＳ中で再構成した。
【００７７】
ドナー細胞、安定化細胞および凍結乾燥／再構成組織培養細胞をＣＤ４−ＰＥ蛍光標識を用いて直接的に染色した。これら細胞の別の部分を未標識ＣＤ４で間接的に染色し、その後抗マウスＩｇＧ（ＦＡｂ’２）抗体−ＰＥ蛍光標識と共にインキュベートした。
【００７８】
ＣＤ４−ＰＥ蛍光標識で直接的に標識した細胞  対  抗マウスＩｇＧ（ＦＡｂ’２）抗体−ＰＥで間接的に標識した細胞においてアッセイ中の発現の差が認められた。安定化および凍結乾燥／再構成サンプルにおいて、間接的抗マウスＩｇＧ（ＦＡｂ’２）抗体−ＰＥ標識で得られたＭＦＩ値に比べて直接的ＣＤ４−ＰＥ標識の場合のＭＦＩ値は低かった。正常な非凍結乾燥ドナーでは直接的にＣＤ４−ＰＥで標識した細胞のＭＦＩ値は間接的抗マウスＩｇＧ（ＦＡｂ’２）抗体−ＰＥ標識で得られたＭＦＩ値より高かった。これは、凍結乾燥細胞上のＣＤ４発現が非凍結乾燥細胞上のＣＤ４発現とは異なっていたことを示唆する。
【００７９】
（実施例３）
ＢｉｏＣｙｔｅｘビーズを用いる線型曲線の作製
異なる濃度のＩｇＧで表面をコーティングしたＢｉｏＣｙｔｅｘビーズ（ビーズ１つにつき９６０、８６００、３００００、および６６０００部位）を別々にＦＩＴＣおよびフィコエリスリン標識抗体と共にインキュベートした。
【００８０】
ＣＤ１９−ＦＩＴＣ標識およびＣＤ２０−ＰＥ標識抗体は市販品を購入した（ベックマンクールター社、フラートン、ＣＡ）。
上記ビーズのＭＦＩをＦＣ５００を用いて測定した。その後ＭＦＩをビーズ１つあたりの部位数に対してプロットした。図５および図６を参照。ＢｉｏＣｙｔｅｘビーズを使用した場合、ＦＩＴＣ標識およびＰＥ標識抗体の両方に直線性が証明された。
【００８１】
（実施例４）
ＢｉｏＣｙｔｅｘビーズから誘導された線型曲線を用いて凍結乾燥細胞に蛍光値を割り当てる
細胞系ＲＰＭＩ８２２６、ＦＭＨ−５９Ｂ、Ｂａｌｌ−１、ＣＡ４６、ＭＡＮＣＡ、Ｄａｕｄｉ、ＥＢ−３、Ｒａｍｏｓ、Ｒａｊｉ、およびＫＧ１ａをＫｏｒｔｒｉｇｈｔプロトコルによって凍結乾燥した。
【００８２】
生細胞および凍結乾燥細胞の部分をＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ４５抗体と共にインキュベートした。抗体類はベックマンクールター社（フラートン、ＣＡ）から購入した。細胞をＦＣ５００によって分析し、それらのＭＦＩを得た。
【００８３】
既存の市販定量ビーズ（ＢｉｏＣｙｔｅｘまたはＦＣＳＣ）から得た数学的関係を利用して、所望の抗原／抗体系によって凍結乾燥細胞に蛍光値を割り当てた。これは図７に示される。１０種類の凍結乾燥−再構成細胞系にＢｉｏＣｙｔｅｘビーズに基づく定量抗原値が割り当てられた（ＢｉｏＣｙｔｅｘ部位）。図７に示すように、抗原の発現は生細胞と凍結乾燥細胞とでは異なっていた。
【００８４】
定量ビーズ（例えばＢｉｏＣｙｔｅｘ、ＦＣＳＣ）使用のスカチャード分析またはその他の変法により、選択したあらゆる基準系に関して定量的抗原値を凍結乾燥細胞に割り当てることができる。図５および図６に示した回帰曲線は、ＢｉｏＣｙｔｅｘビーズの定量的割り当てから得られた蛍光に基づいていた。１０種類の凍結乾燥細胞系には上記のビーズセットから得られた回帰曲線に基づくＣＤ２０−ＰＥおよびＣＤ１９−ＦＩＴＣの定量的抗原発現値が割り当てられた。
【００８５】
凍結乾燥細胞は測定中の同じ抗原またはレセプターをあらわすが、ビーズは二次比較を用いる。各凍結乾燥細胞型に割り当てられる抗原の実際的定量値は、使用した全ての基準法（例えばＢｉｏＣｙｔｅｘ部位、ＦＣＳＣ部位、スカチャード分析）に適切であった。
【００８６】
（実施例５）
異なる細胞間の相対的抗原定量値（または比）は基準法とは無関係である
定量値がいったん割り当てられると、異なる細胞間の相対的抗原定量値（または比）は基準法には無関係であり、アッセイ法には関係する。これは図１０において種々の細胞系を用いて示される。
【００８７】
ＣＤ２０の比の関係は例えば細胞系ＣＡ４６およびＲａｍｏｓを基礎としていた。ＣＤ１９の比の関係は例えば細胞系ＦＭＨ−５９ＢおよびＢａｌｌ−１を基礎としていた。こうして抗原定量値が凍結乾燥細胞と関係づけられれば、抗原アッセイ系を使用して、“既知”凍結乾燥細胞のアッセイ値を“未知”細胞と比較することができ、“未知”細胞に或る数値を割り当てることができる。凍結乾燥細胞の使用は未知細胞上の抗原またはレセプター発現の直接的モデルである。ビーズを基礎とする方法は二次的モデルまたは表現を使用する。凍結乾燥細胞を使用する比の測定、またはレセプターまたは抗原の異なる定量的発現を示す複数の凍結乾燥細胞系を使用して、任意のアッセイ系を用いて未知サンプル上の定量的抗原またはレセプター値を直接確立することができる。
【００８８】
（実施例６）
直接的抗原モデルに基づく、凍結乾燥細胞の使用による定量値の確立
図１１は定量値を確立するためのもう一つの応用である。この応用は直接的抗原モデルを用いて凍結乾燥細胞に定量値を割り当てた。正常ＣＤ４陽性リンパ球はそれらの表面に約５０，０００のＣＤ４抗原分子を発現する。Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ３３（２）：１２３−３２（１９９８）。正常サンプルをＣＤ４−ＦＩＴＣで標識化し、分析した。同じ正常サンプルを別にＣＤ４−ＰＥで標識し、分析した。陰性イソ型対照を用いて補正した平均蛍光値を、一般に容認される文献値５０，０００部位に匹敵するようにした。これらの数値を使用して、凍結乾燥細胞系Ｐ１２／Ｉｃｈｉｋａｗａ、Ｐ１２Ｂ、Ｕ９３７、ＣＥＭ−１、凍結乾燥正常リンパ球（Ｃｙｔｏ−Ｃｏｍｐ（商品名）細胞）および液中に保存される正常細胞（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｔｒｏｌ（商品名））にＣＤ４抗原定量値を割り当てた。
【００８９】
保存された正常細胞（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｔｒｏｌ（商品名））は正常ドナーのＣＤ４発現と同様に、ＣＤ４−ＦＩＴＣおよびＣＤ４−ＰＥの両方でＣＤ４抗原を定量的に発現する。凍結乾燥正常リンパ球（Ｃｙｔｏ−Ｃｏｍｐ）は高いＣＤ４発現を示す。凍結乾燥細胞系はＣＥＭ−１を除いて同様なＣＤ４−ＦＩＴＣおよびＣＤ４−ＰＥを有する。ＣＥＭ−１ではＣＤ４−ＦＩＴＣはＣＤ４−ＰＥより高かった。ＣＤ４−ＰＥモノクローナル抗体のサイズはＣＤ４−ＦＩＴＣモノクローナル抗体のサイズの２．５倍大きい。ＣＤ４標識化におけるこの差は、高い抗原発現では立体障害を起こす標識類のサイズの差によると考えられる。このような立体障害は細胞でもビーズでも定量には重要であるが、凍結乾燥細胞上の抗原発現だけが未知細胞上で起きる実際の物理的三次元構造のモデル化を示す。ビーズに付着した免疫グロブリンまたは抗免疫グロブリンは同様な抗原発現をモデル化しない。ビーズを用いた際、高い抗原密度で細胞表面上に起きるこの人工的立体障害は見落とすことがある。
【００９０】
（実施例７）
凍結乾燥細胞系の抗体結合部位の測定、抗体の放射性標識
ＣＤ２０抗体をクロラミン−Ｔ法によって放射性標識した。Ｈｕｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，Ｎａｔｕｒｅ１９４：４９５−４９６（１９６２）；Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ８９：１１４−１２３（１９６３）を参照されたい。この方法は抗体の活性を保存する。
【００９１】
２８０ｎｍにおける吸収（Ａ２８０）を用いて非標識抗体および標識抗体の濃度を測定した。吸光係数１．０を用いてＡ２８０値をｍｇ／ｍＬに変換した。標準を用いて、分光光度系がキャリブレートされていることを確認した。比放射能は約６６Ｃｉ／ｍｍｏｌであった。
【００９２】
放射性標識抗体をストック濃度０．１ｍｇ／ｍＬに希釈し、その後０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで逓減希釈した。抗体希釈液を１回の試験につき２００μＬ用い、結合アッセイ中に細胞懸濁液１００μＬに加えた。
【００９３】
細胞の懸濁および計数
Ｋｏｒｔｒｉｇｈｔプロトコルによって凍結乾燥した凍結乾燥細胞（ＲＰＭＩ８２２６、Ｒａｍｏｓ、およびＣＡ４６）を０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ１．０ｍＬに再懸濁した。細胞濃度をＦｌｏｗ−Ｃｏｕｎｔ（商品名）フルオロスフェア（ベックマンクールター社）を用いて測定した。細胞懸濁液１００μＬに、ＰＢＳ１ｍＬを加えた。Ｆｌｏｗ−Ｃｏｕｎｔ１００μＬを加え、ボルテックスし、ＦＣ５００分析器で計数した。Ｆｌｏｗ−Ｃｏｕｎｔのロットではキャリブレーション・ファクタ、１．０４１、を使用した。ストック懸濁液の細胞数を２５００，０００／ｍＬに調節した。各結合アッセイに、０．１ｍＬ（２５０，０００細胞）を用いた。
【００９４】
結合アッセイ
放射性標識抗体希釈液をマイクロヒュージ−チューブに等分し、その後細胞懸濁液を各チューブに等分し、室温で少なくとも１時間インキュベートした。
【００９５】
ＰＢＳ／ＢＳＡを各チューブに加え、それらチューブを遠心分離にかけた。最初の上澄液を別の標識チューブに取り、ガンマカウンティングした。細胞をＰＢＳ／ＢＳＡで２回以上洗った。
【００９６】
ＰＢＳ／ＢＳＡ１．０ｍＬに再懸濁した後、Ｆｌｏｗ−Ｃｏｕｎｔ１００μＬを各チューブに加えた。１部分を別のチューブに取り、ガンマカウンティングした。上澄液の残りをフローサイトメトリーによって分析した。
【００９７】
フローサイトメトリー
ＦＳおよびＳＳパラメータを用いるＦＣ５００サイトメーターに細胞を入れた。細胞集団の周囲にゲートを張り、ビーズ集団（ＣＡＬ）の周囲に別のゲートを張った。少なくとも１０，０００のＦｌｏｗ−Ｃｏｕｎｔ事象を集めた。
【００９８】
平衡
この実施例ではインキュベーションを４℃で一晩行った。これにより結合は平衡に達する。遠心分離後、上澄液の放射能を測定した。結合リガンドの量は多分１０％より大きいから、最初の上澄液をガンマカウンティングのために取り、遊離濃度の測定値を得た。
【００９９】
非特異的結合
図１２および１３はそれぞれ蛍光および放射能で標識したＣＤ２０−ＰＥから作製した結合曲線である。これらの図から、ＲＰＭＩ８２２６細胞系では非特異的結合があるように見える。
【０１００】
非特異的結合を測定する目的で、放射性標識したＣＤ２０−ＰＥを添加する前に冷抗体（４０μｇ／１００，０００細胞）を細胞と共にインキュベートした。この実験からＲＰＭＩ８２２６細胞の非特異的結合レベルは測定された放射能の総量の約８％、または０．５ｃｐｍ／細胞であった。この結果は人為的に低かった。これはこのアッセイにおいて数えた細胞数が少なく、または使用した冷抗体が少量であったためかも知れない。
【０１０１】
本発明のその他の実施形態は本明細書に開示された明細書および実際面を考慮すると当業者には明らかである。この明細書および実施例は添付の請求項によって示される本発明の実際の範囲および精神の下に、単なる説明に過ぎないと考えるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は細胞性抗原ＣＤ１９を用いる生細胞系対凍結乾燥細胞系の平均蛍光強度の比較である。
【図２】図２は細胞性抗原ＣＤ２０を用いる生細胞系対凍結乾燥細胞系の平均蛍光強度の比較である。
【図３】図３は細胞性抗原ＣＤ４５を用いる生細胞対凍結乾燥細胞系の平均蛍光強度の比較である。
【図４】図４は直接的および間接的染色法を用いて、安定化または凍結乾燥／再構成組織培養細胞上のＣＤ４抗原の発現  対  生正常ドナー上のＣＤ４抗原の発現を比較したものである。
【図５】図５はＢｉｏＣｙｔｅｘビーズに対するＦＩＴＣ標識抗体の結合の直線カーブを示す。
【図６】図６はＢｉｏＣｙｔｅｘビーズに対するＰＥ標識抗体の結合の直線カーブを示す。
【図７】図７は、生細胞および凍結乾燥細胞に関して既存の市販の定量ビーズ（ＢｉｏＣｙｔｅｘまたはＦＣＳＣ）から得られた数学的関連性を示す表である。
【図８】図８は、１０種類の凍結乾燥細胞系のＣＤ２０ＰＥ抗原への直線的結合カーブを示す。
【図９】図９は、１０種類の凍結乾燥細胞系のＣＤ１９ＦＩＴＣ抗原への直線的結合カーブを示す。
【図１０】図１０は、異なる細胞間の相対的抗原量（または比）が基準法には無関係であり、アッセイ法に関連することを示す表である。
【図１１】図１１はＣＤ４部位の正常値５０，０００を用いて細胞類に割り当てられた定量的ＣＤ４値を示す。
【図１２】図１２は３種類の凍結乾燥細胞系で蛍光標識されたＣＤ２０−ＰＥから作製された結合曲線を示す。
【図１３】図１３は３種類の凍結乾燥細胞系で放射性標識されたＣＤ２０−ＰＥから作製された結合曲線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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