(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つの治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドを、作用物質として含有する物質の治療効果を測定する方法に関する。本発明はさらに、本発明の方法を行うためのキットおよびバイオチップに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドを作用物質として含有する物質の治療効果を測定する方法であって、以下のステップを含むことを特徴とする、方法：
（ａ）ヒトもしくは動物由来の細胞、血液、もしくは組織のサンプル、または微生物由来のサンプルを提供するステップであって、前記細胞、血液、もしくは組織のサンプル、または微生物サンプルは、予め定められた生物学的状態で存在し、少なくとも１つの治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドに関連する標的構造を有しているステップ；
（ｂ）前記少なくとも１つの治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドを、インビボでのその結合特性を維持しながら標識するステップ；
（ｃ）前記少なくとも1つの標識された、治療的に有効なタンパク質および／またはペプチドを含有する試薬溶液を前記サンプルに適用するステップであって、前記試薬溶液は、予め定められた適用条件下で、前記標識された、治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドの予め定められた濃度で適用されるステップ；
（ｄ）前記サンプルの１以上の関連する標的構造における前記治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドの結合挙動を測定するステップ；および
（ｅ）被験細胞、血液、もしくは組織のサンプル、または微生物サンプル中の、前記少なくとも１つの治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドの効果に関して、ステップ（ｄ）において測定された結合挙動を評価するステップ。
【請求項２】
少なくとも１つの前記治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドは、エファリツマブ（efalizumab）、アレファセプト（alefacept）、インフリキシマブ（infliximab）、エタネルセプト（etanercept）、バシリキシマブ（basiliximab）、ダシリツマブ（daclizumab）、ムロモナブ（muromonab）、トラスツズマブ（trastuzumab）、イブリツモマブ（ibritumomab）、ベバシズマブ（bevacizumab）、セツキシマブ（cetuximab）、リツキシマブ（rituximab）、オマリズマブ（omalizumab）、アレムツズマブ（alemtuzumab）、アダリムマブ（adalimumab）、またはポリクローナル抗体を含むことを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３】
手順ステップ（ｂ）に記載の標識は、１以上の蛍光色素の共有結合および／もしくは１以上のビオチン分子の共有結合および／もしくは１以上のジゴキシゲニン分子の共有結合によって、ならびに／または、二次標識抗体および／もしくは放射性標識による治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／もしくはペプチドに対する標識によって、行われることを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
標識に用いられる蛍光色素の少なくとも１つは、フルオレスセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を含むことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも1つのスペーサーを、前記少なくとも１つの治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドと、前記少なくとも１つの標識の間に挿入することを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
手順ステップ（ｃ）における適用条件は、担体溶液のバリエーション、温度および圧力条件を含むことを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
手順ステップ（ｄ）に記載の、治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドの、サンプルの１以上の関連する標的構造での結合挙動の測定は、標識されたタンパク質および／またはペプチドの少なくとも１つの標識パターンの検出を含むことを特徴とする、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの治療的に有効な、１以上の標的構造に結合している生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドの有効性を定量化するために、標識パターンの信号強度を測定し、前記信号強度を、同じ実験条件で測定された少なくとも１つの参照サンプルの標識パターンの信号強度と比較することを特徴とし、前記参照サンプルは、前記被験サンプルと比較可能な細胞、血液、もしくは組織のサンプル、または微生物由来のサンプルである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記参照サンプルは、前記被験サンプルの状態と比較可能な生物学的状態で存在することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記参照サンプルは、前記被験サンプルの状態とは異なる、さらに別の生物学的状態で存在することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物学状態は、細胞、血液、もしくは組織のサンプル、または微生物サンプルの、健康な生物学的状態または疾患に関連する生物学的状態を表すことを特徴とする、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞または組織サンプルは、乾癬、炎症性皮膚疾患、皮膚腫瘍に罹患した皮膚組織、炎症組織、または腫瘍組織であり、前記参照サンプルは、正常で健康な皮膚組織であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞、血液、もしくは組織のサンプル、または微生物由来のサンプル、および／または参照サンプルの、関連する標的構造は、参照溶液を繰り返し適用することによる自動化された方法によって測定され、そのそれぞれは少なくとも１つの標識分子を含み、少なくとも１つの標識パターンが参照溶液に曝露後各ケースにおいて自動的に検出されることを特徴とし、前記検出された標識パターンを組み合わせて、前記細胞、血液、もしくは組織のサンプル、および／または参照サンプルの複合的な分子の組み合わせパターンを形成する、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチド、ならびに少なくとも１つの標識分子を含み、前記標識分子は、タンパク質および／またはペプチドのインビボの結合特性に影響を及ぼさない、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の方法を行うためのキット。
【請求項１５】
前記標識分子は、蛍光色素および／またはビオチン分子および／またはジゴキシゲニン分子、ならびに二次抗体を含むことを特徴とする、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのタンパク質および／またはペプチドは、エファリツマブ（efalizumab）、アレファセプト（alefacept）、インフリキシマブ（infliximab）、エタネルセプト（etanercept）、バシリキシマブ（basiliximab）、ダシリツマブ（daclizumab）、ムロモナブ（muromonab）、トラスツズマブ（trastuzumab）、イブリツモマブ（ibritumomab）、ベバシズマブ（bevacizumab）、セツキシマブ（cetuximab）、リツキシマブ（rituximab）、オマリズマブ（omalizumab）、アレムツズマブ（alemtuzumab）、アダリムマブ（adalimumab）、またはポリクローナル抗体を含むことを特徴とする、請求項１４または１５に記載のキット。
【請求項１７】
ヒトまたは動物由来の細胞、血液、または組織のサンプル、または微生物由来のサンプルを含み、前記サンプルは、予め定められた生物学的状態で存在し、少なくとも１つの治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドのための関連する標的構造を有している、請求項１乃至１３のいずれかに記載の方法を行うためのバイオチップ。 
【請求項１８】
前記少なくとも１つのタンパク質および／またはペプチドは、エファリツマブ（Efalizumab）、アレファセプト（alefacept）、インフリキシマブ（infliximab）、エタネルセプト（etanercept）、バシリキシマブ（basiliximab）、ダシリツマブ（daclizumab）、ムロモナブ（muromonab）、トラスツズマブ（trastuzumab）、イブリツモマブ（ibritumomab）、ベバシズマブ（bevacizumab）、セツキシマブ（cetuximab）、リツキシマブ（rituximab）、オマリズマブ（omalizumab）、アレムツズマブ（alemtuzumab）、アダリムマブ（adalimumab）、またはポリクローナル抗体を含むことを特徴とする、請求項１７に記載のバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドを、作用物質として含有する物質の治療効果を測定する方法に関する。特に、本発明は、少なくとも１つの治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドを、作用物質として含有する物質の治療効果を測定する方法であって、下記のステップを含む方法に関する。（ａ）ヒトもしくは動物由来の細胞、血液、もしくは組織のサンプル、または微生物由来のサンプルを提供するステップであって、前記細胞、血液、もしくは組織のサンプル、または微生物サンプルは、予め定められた生物学的状態で存在し、少なくとも１つの治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドに関連する標的構造を有しているステップ；（ｂ）前記少なくとも１つの治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドを、インビボでのその結合特性を維持しながら標識するステップ；（ｃ）前記少なくとも1つの標識された、治療的に有効なタンパク質および／またはペプチドを含有する試薬溶液を前記サンプルに適用するステップであって、前記試薬溶液は、予め定められた適用条件下で、前記標識された、治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドの予め定められた濃度で適用されるステップ；（ｄ）前記サンプルの１以上の関連する標的構造における前記治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドの結合挙動を測定するステップ；および（ｅ）被験細胞、血液、もしくは組織のサンプル中、または微生物サンプル中の、前記少なくとも１つの治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドの効果に関して、ステップ（ｄ）において測定された結合挙動を評価するステップ。本発明は、さらに本発明にかかる方法を行うためのキットおよびバイオチップに関する。
【技術分野】
【０００２】
自己免疫疾患は、人々の間に広がり、多くの形態で顕在化している。ドイツでは、人口の約１％が、炎症性のリウマチ性疾患の中で最も一般的な疾患であるリウマチ性関節炎で苦しんでいる。また、例えば、アトピー性皮膚炎（神経皮膚炎）や乾癬のような皮膚疾患も広く流行している。中欧では、人口の約２〜３％が乾癬に罹患しており、米国ではさらに多く４〜５％が罹患している。乾癬は、皮膚の慢性炎症であり、表皮細胞の異常な増殖（過形成）と皮膚の血流の増加、また指の爪へ影響を特徴とし、さらに、多くの患者において関節の疾患、いわゆる乾癬性関節炎を引き起こしている。個々の患者の疾患の発生によって処置が選択され、いくつかの医薬品を組み合わせる必要があることが多い。紫外線放射のような理学療法の他に、発病の時点の違いで、タールまたは栄養軟膏から、ビタミンＡまたはＤ誘導体の投与（例えば、Zorac（登録商標）、Daivonex（登録商標））およびホルモン類の投与にわたる複数の製剤が存在する。これらの処置、特に長期適用に伴う副作用によって、ときに個々の患者に対する投与の可能性が制限され、代替的な治療法が必要となる。一方、種々の研究結果によれば、当該疾患の病態生理学におけるＴ細胞の中心的な関与が示唆されている。このことから、乾癬やその他の自己免疫疾患の処置において、いわゆる「生物学的製剤」が適用されるようになった。生物学的製剤は、治療効果のある生物工学的に調製されたタンパク質を主に含有する比較的新しいクラスの医薬である。したがって、生物学的製剤は、臓器系内部で抗体、リガンド、またはレセプターとして機能することができる。現在の治療形態に比べてそれらが非常に有利なのは、定義された分子標的構造と非常に特異的な相互作用を行う点である。生物学的製剤を適用することによって、一方では、他のすべての治療方法がうまくいかなかった場合に、さらなる治療の可能性を提供する医薬を提供することができるようになる。また一方で、他の形体の治療を用いた場合にしばしば起こる副作用を大いに回避することができる。エファリツマブ（efalizumab）（登録商標名：ラプティバ（Raptiva））は、とりわけ、乾癬の処置に用いられる生物学的製剤である。前記生物学的製剤は、分子ＣＤ１１ａに対するヒト化モノクローナルＩｇＧ１抗体である。それがＣＤ１８（β２インテグリン）と非共有結合した後、ＣＤ１１ａ（α−Ｌインテグリン）がヘテロ二量体ＬＦＡ−１（リンパ球機能関連抗原−１）を形成し、最終的にＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）と結合する。ＬＦＡ−１は、リンパ球、単球、および好中球上に発現し、細胞間接着プロセスにおいて決定的な役割を果たす。臨床研究においては、エファリツマブによって、患者の３０〜４０％で１２週間以内に、疾患の有意な改善が認められており、少なくとも一部の患者にとって、新規な有望な治療法となった。
【０００３】
公知の診断および予測方法は、個々の患者のゲノムにおける特異的な多型性を測定するための遺伝学的方法を用いる。いくつかのケースにおいて、こうして得られた結果を用いて、問題の疾患に対する個々の患者の感受性を導き出すことができる。ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ２００５／１１２５６８号により、Ｔ細胞還元医薬品を用いた処置に対する患者の反応性を診断および予測する方法が公知である。こうして前記方法の助けを借りて、異なるハプロタイプが同定された。これは、アルファセプト（Alefacept）（Amevive(登録商標)）を用いた処置が有望であることを示唆するものである。アルファセプトも生物学的製剤に属し、乾癬の処置に用いることができる。しかしながら、ＤＮＡベースの方法には、複雑であること、Ｔ細胞関連疾患に限定されることといった欠点がある。さらに、生物学的製剤は、すべての患者に同じ効果を示すわけではない。これまで、個々の患者での理論的効果を予測することはほとんど不可能であり、試行錯誤を繰り返しながら行われてきた。したがって個々の症例における最適用量を決定し、処置に先立つ治療を適切にモニターすることはこれまでのところ不可能であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
免疫抑制剤としての生物学的製剤の使用が重大な副作用を引き起こす可能性があることから、有効性のない治療を適用することを避けるために、信頼できる予測方法を開発することは極めて重要である。
【０００５】
したがって、本発明の課題は、少なくとも１つの治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドを、作用物質として含有する物質(生物学的製剤)の治療効果を測定する方法を提供することである。前記方法によって、１以上の治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドの個々の患者における基本的効果について治療前に説明することができるようになり、治療的処置のクールをモニターすることが可能になる。
【０００６】
また、本発明の方法を行うためのキットおよびバイオチップを提供することも本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題は、請求項１の特徴を有する方法、請求項１４の特徴を有するキット、および請求項１７の特徴を有するバイオチップによって解決される。
【０００８】
本発明の有利な実施態様は、それぞれについて関連するサブクレームに記載している。
【実施例１】
【０００９】
少なくとも１つの治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドを、作用物質として含有する物質の治療効果を測定する本発明による方法は、下記のステップを含む。（ａ）ヒトもしくは動物由来の細胞、血液、もしくは組織のサンプル、または微生物由来のサンプルを提供するステップであって、前記細胞、血液、もしくは組織のサンプル、または微生物サンプルは、予め定められた生物学的状態で存在し、少なくとも１つの治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドに関連する標的構造を有しているステップ；（ｂ）前記少なくとも１つの治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドを、インビボでのその結合特性を維持しながら標識するステップ；（ｃ）前記少なくとも1つの標識された、治療的に有効なタンパク質および／またはペプチドを含有する試薬溶液を前記サンプルに適用するステップであって、前記試薬溶液は、予め定められた適用条件下で、前記標識された、治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドの予め定められた濃度で適用されるステップ；（ｄ）前記サンプルの１以上の関連する標的構造における前記治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドの結合挙動を測定するステップ；および（ｅ）被験細胞、血液、もしくは組織のサンプル中、または微生物サンプル中の、前記少なくとも１つの治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドの効果に関して、ステップ（ｄ）において測定された結合挙動を評価するステップ。本発明によって達成し得る利点は、とりわけ、本発明の方法が、インビトロの研究との組み合わせに基づいて、生物学的製剤の臓器系内部における作用および副作用といったインビボでの実際の特性に関する詳細な理解ができ、それによって個々の患者のため、および直接的管理（conduction）のために、問題の１以上の生物学的製剤を含有する医薬の効果を予測すること、ならびに該医薬の有効性が証明されている場合には治療をモニターすることの両方が可能になることである。予測が可能なので、さらに薬理学的/薬学的開発プロセスは、有利な方法で有意に短縮することができる。また、それは動物実験や臨床試験を減らすことができる。ここで、本発明の方法の有利な実施態様においては、手順ステップ（ｃ）の適用条件は、担体溶液のバリエーション、温度および圧力条件を含む。少なくとも１つの治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドは、次の群から選択される：エファリツマブ（efalizumab）、アレファセプト（alefacept）、インフリキシマブ（infliximab）、エタネルセプト（etanercept）、バシリキシマブ（basiliximab）、ダシリツマブ（daclizumab）、ムロモナブ（muromonab）、トラスツズマブ（trastuzumab）、イブリツモマブ（ibritumomab）、ベバシズマブ（bevacizumab）、セツキシマブ（cetuximab）、リツキシマブ（rituximab）、オマリズマブ（omalizumab）、アレムツズマブ（alemtuzumab）、アダリムマブ（adalimumab）、またはポリクローナル抗体。ポリクローナル抗体は、例えば、ウマ由来の抗Ｔ細胞免疫血清またはウサギ由来の抗ヒトＴ細胞免疫血清である��とができる。さらに有利なことに、処置に先行する有効な医薬の予測および選択、ならびにそれらの治療的適用の正確な制御が可能になれば、この分野のコストを有意に減少させることにつながる。
【実施例２】
【００１０】
本発明の方法の別の有利な実施態様において、標識は、1以上の蛍光色素の共有結合および／もしくは１以上のビオチン分子の共有結合および／もしくは１以上のジゴキシゲニン分子の共有結合によって、ならびに／または、治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／もしくはペプチドに対する二次標識抗体および／もしくは放射性標識による標識によって、手順ステップ（ｂ）に記載のように行われる。フルオレスセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）は、例えば、標識に好適な蛍光色素である。
【実施例３】
【００１１】
本発明の方法の別の有利な実施態様において、治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドを直接標識することが困難な場合、またはそのインビボでの結合特性と干渉してしまう場合、少なくとも1つのスペーサーを、少なくとも１つの治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドと、少なくとも１つの標識の間に挿入する。  
【実施例４】
【００１２】
本発明の方法の別の有利な実施態様において、手順ステップ（ｄ）に記載の、治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドの、サンプルの１以上の関連する標的構造での結合挙動の測定は、標識されたタンパク質および／またはペプチドの少なくとも１つの標識パターンの検出を含む。ここで、標的構造に結合した少なくとも１つの治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドの有効性を定量化するために、標識パターンの信号強度を測定し、同じ条件で測定された少なくとも１つの参照サンプルの信号強度と比較する。参照サンプルは、被験サンプルと比較可能な細胞、血液、もしくは組織のサンプル、または微生物由来のサンプルである。ここで、参照サンプルは、被験サンプルの状態と比較可能な生物学的状態、または、被験サンプルの状態とは異なるさらに別の生物学的状態で存在することができる。したがって、生物学的状態は、細胞、血液、もしくは組織のサンプル、または微生物サンプルの健康な状態または疾患に関連する状態を含む。例としては、細胞もしくは組織サンプルは、乾癬、炎症性皮膚疾患、皮膚腫瘍に罹患した皮膚組織、炎症組織、または腫瘍組織であり、参照サンプルは、正常で健康な皮膚組織である。
【実施例５】
【００１３】
本発明の方法のさらに別の有利な実施態様において、細胞、血液、もしくは組織のサンプル、および／または参照サンプルの関連する標的構造は、参照溶液を繰り返し投与することによる自動化された方法によって測定される。そのそれぞれは少なくとも１つの標識分子を含んでいる。参照溶液に曝露後、少なくとも１つの標識パターンを各ケースにおいて自動的に検出する。そこでは検出された標識パターンを組み合わせて、細胞、血液、もしくは組織のサンプル、または微生物サンプル、および／または参照サンプルの複合的な分子の組み合わせパターンを形成する。そのような方法は、欧州特許出願第０８１０４２８号またはドイツ特許出願第１９７ ０９ ３５８号に記載がある。
【００１４】
上記方法を行うための本発明によるキットは、少なくとも１つの治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドおよび少なくとも１つの標識分子を含む。該標識分子は、タンパク質および／またはペプチドのインビボ結合特性に影響を及ぼさない。ここで、該標識分子は、蛍光色素および／またはビオチン分子および／またはジゴキシゲニン分子、ならびにさらなる二次抗体を含む。ここで治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドは、下記の群から選択される：エファリツマブ（efalizumab）、 アレファセプト（alefacept）、インフリキシマブ（infliximab）、エタネルセプト（etanercept）、バシリキシマブ（basiliximab）、ダシリツマブ（daclizumab）、ムロモナブ（muromonab）、トラスツズマブ（trastuzumab）、イブリツモマブ（ibritumomab）、ベバシズマブ（bevacizumab）、セツキシマブ（cetuximab）、リツキシマブ（rituximab）、オマリズマブ（omalizumab）、アレムツズマブ（alemtuzumab）、アダリムマブ（adalimumab）、またはポリクローナル抗体。ポリクローナル抗体は、例えば、ウマ由来の抗Ｔ細胞免疫血清またはウサギ由来の抗ヒトＴ細胞免疫血清であることができる。
【００１５】
さらに、上記方法を行うためのバイオチップを提供することも本発明に含まれる。ここで、該バイオチップは、細胞、血液、または組織のサンプル、または微生物由来のサンプルを含み、該サンプルは、予め定められた生物学的状態で存在し、少なくとも１つの治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドに関連する標的構造を有している。ここで治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドは、次の群から選択される：エファリツマブ（efalizumab）、 アレファセプト（alefacept）、インフリキシマブ（infliximab）、エタネルセプト（etanercept）、バシリキシマブ（basiliximab）、ダシリツマブ（daclizumab）、ムロモナブ（muromonab）、トラスツズマブ（trastuzumab）、イブリツモマブ（ibritumomab）、ベバシズマブ（bevacizumab）、セツキシマブ（cetuximab）、リツキシマブ（rituximab）、オマリズマブ（omalizumab）、アレムツズマブ（alemtuzumab）、アダリムマブ（adalimumab）、またはポリクローナル抗体。ポリクローナル抗体は、例えば、ウマ由来の抗Ｔ細胞免疫血清またはウサギ由来の抗ヒトＴ細胞免疫血清であることができる。
【産業上の利用可能性】
【００１６】
さらなる詳細および適用領域は、本発明の方法にかかるいくつかの実施態様についての以下の記載から導くことができる。
【００１７】
好ましい実施態様において、治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドはエファリツマブであり、細胞および組織サンプルは、関連する標的構造を保存しながら固定された皮膚サンプルである。皮膚サンプルの予め定められた生物学的状態は、急性の乾癬である。エファリツマブは、インビボでの結合特性を維持しながらフルオレスセイン−５−ｅｘ−スクシンイミジルエステルで共有的に標識される。該標識されたエファリツマブを溶解する。ここで実験条件は、臓器系内部のインビボ の状況にできる限り相当するように選択する。自動化された方法によって、種々の細胞タイプおよび／または細胞外マトリックスの構造成分および／または細胞増殖、活性化および接着を特徴とする構造に対して向けられた、溶解し、標識されたエファリツマブ、ならびに任意に少なくとも１つのさらに溶解した標識分子を、皮膚サンプルに連続的に適用する。蛍光標識パターンをサイクルごとに検出する。個別の標識パターンをデジタル化し、処理する。ここで、検出された信号のデジタル化および定量化は、例えば、欧州特許出願第１１８１５２５号に記載のような方法で行われる。
【００１８】
まず、皮膚組織の相造影を行う。続いて、シングルエピトープおよび／またはマルチエピトープの分子パターンの自動検出を行う。前記画像は、コンピュータ支援アプリケーションの前記デジタル化によってアクセス可能である。蛍光画像を記録する前に検出される相造影の対応する蛍光画像を用いて、対応する蛍光画像の正確な、画素的に正確なオーバーレイを行う。このように配列された画像は、第２のステップにおいて背景および不完全な曝露の補正を行い、第３のステップにおいて、潜在的に存在するアーティファクトおよび／または、欠陥のあるピクセルを最終的に除去する。これは、欠陥のある信号を無効のものとして標識し、続く評価から除外するというマスク操作を適用することによって行う。
【００１９】
デジタル化され、処理された画像は、当業者の監督のもとで二値化される。検出された各エピトープの二値化画像のオーバーレイを行うことで、デジタル化された可視領域の各画素のブール論理（１＝ｙｅｓ／真、０＝ｎｏ／偽）に従った２進法コードに対応する分子信号のマトリックスが得られる。２０倍の光学ズームを持つ面積４５０×４５０ｎｍ２の領域の場合、１画素は、局在的マイクロユニット（ＴＭＵ）を表す。こうした条件下では、デジタル化された可視領域の面積はせいぜい２０００×２０００画素である。検出された組み合わせ標識パターンの発生する画素信号の周波数を、皮膚サンプルの水平方向の幅に関連付ける。このようにして、遷移、成長および分化の状態にある組織に対して正規化された被験皮膚サンプルの垂直方向の勾配を考慮することができる。エピトープの発現および共発現を定量化するための好適なパラメータとして、「水平方向の皮膚幅に正規化された画素事象」を取得する。これを以下においてＰＥＮと呼ぶ。  
【００２０】
皮膚サンプルの関連標的構造を、主に真皮区画に位置づける。この区画における標識されたエファリツマブの結合挙動を測定するために、検出され、デジタル化され、処理された標識パターンを用いる。実際の臓器関係におけるインビボでのエファリツマブの効果に関する決定された結合挙動の評価は、測定されたエファリツマブ結合構造のインビトロの同定および定量化データと、エファリツマブに反応性を示す急性乾癬皮膚で典型的な同定および定量化データとを比較することによって行う。ここで、さらに別の標識分子の支援によって限定される定量値の範囲は、ＭＰＯの１．１×１０３ＰＥＮから、ｐａｎ−ＣＫおよびＣＤ１３８の１１５×１０３ＰＥＮの間の範囲である。急性乾癬皮膚サンプルでのエファリツマブ結晶構造の発現は、急性乾癬に罹患している患者からの非罹患皮膚サンプルと比較すると最大１５倍高く、健康な皮膚と比較すると３２倍高い。定量値は、約３９．６９７±１０．２６３ＰＥＮである。健康な皮膚と比較してＰＥＮの定量値が高い結合構造を有するエファリツマブ結合構造の存在は、個々の患者におけるエファリツマブの基本的な効果を示すものであり、個別に調節された最適用量を、定量化データを介して測定することをさらに可能にするものである。
【００２１】
本発明のさらなる応用において、前記治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドは、エファリツマブであり、前記細胞または組織サンプルは、関連する標的構造を保存しながら固定された皮膚サンプルである。該皮膚サンプルの予め定められた生物学的状態は、急性の乾癬に罹患している患者から採取した非罹患皮膚サンプルである。エファリツマブの基本的効果によれば、健康な参照皮膚と比較して最大３倍のエファリツマブ結合構造の量的増加が、急性乾癬患者から採取した非罹患皮膚サンプルに認められた。ＰＥＮ値は、２．５９８±２．４４８である。
【００２２】
本発明のさらなる応用において、前記治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドは、エファリツマブであり、前記細胞または組織サンプルは、関連する標的構造を保存しながら固定された皮膚サンプルである。該皮膚サンプルの予め定められた生物学的状態は、乾癬に罹患していない患者から採取した健康な皮膚サンプルである。健康な皮膚におけるエファリツマブ結合構造を定量的に測定したところ、１．２０５±８７３ＰＥＮの値が得られた。
【００２３】
本発明のさらなる応用において、前記治療的に有効な、生物工学的に生成されたタンパク質および／またはペプチドは、エファリツマブであり、前記細胞または組織サンプルは、関連する標的構造を保存しながら固定された皮膚サンプルである。該皮膚サンプルの予め定められた生物学的状態は、急性乾癬皮膚サンプルである。関連する細胞標的構造は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＬＡ、およびＣＤ４５Ｒ０に陽性のＴリンパ球のサブ集団にある。エファリツマブ結合構造の局在化をＴＭＵに基づいて測定すると、ＣＤ３＋Ｔリンパ球で最大８４％、ＣＤ８＋Ｔリンパ球で最大８０％、ＣＤ４＋∩ＣＤ３＋Ｔリンパ球で最大９３％、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔリンパ球で最大５４％、ＣＬＡ＋Ｔリンパ球で最大７３％、そしてＣＤ４５Ｒ０＋Ｔリンパ球で最大８７％の値の共局在値が導かれる。このように、特定の患者におけるエファリツマブの基本的効果は、治療的適用中、エファリツマブの標的構造としての特異的なＴリンパ球の特性を介して測定することができる。
【国際調査報告】
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