(57)【要約】  遺伝子発現分析のための方法およびキットが開示される。本方法は、プローブとして元素タグ付きオリゴヌクレオチドを利用し、それらは元素分析によってその後分析される。ビーズなどの元素標識支持体を用いる生体分子の分析と、その後の元素分析のための方法およびキットも開示される。元素分析は、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）を用いて実施することができる。
2009526242.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞分析のための方法であって、
（ａ）細胞または細胞性粒子を提供するステップと、
（ｂ）細胞または細胞性粒子を固定および透過化するステップと、
（ｃ）細胞または細胞性粒子を標的核酸に特異的なプローブと一緒にハイブリダイゼーション溶液中でインキュベートするステップであって、前記プローブは特有の元素タグで標識され、前記タグの１種で標識された前記プローブの１種が、異なる種類の前記タグで標識された他の任意の種類の前記プローブと元素分析によって識別可能であるステップと、
（ｄ）ストリンジェントな洗浄条件によって、ハイブリダイズしなかったプローブを、前記標的核酸にハイブリダイズしたプローブから分離するステップと、
（ｅ）細胞または細胞性粒子を元素分析によって分析して、プローブを特定し、前記標的核酸に結合したプローブを定量するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
特異的な元素タグで標識した２つ以上の特異的なプローブを、２つ以上の標的核酸とハイブリダイズさせることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸は、細胞内核酸分子、マトリックスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、遺伝子転写物前駆体ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、トランスポートＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、染色体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、細菌ＤＮＡ、細菌ＲＮＡおよびプラスミドＤＮＡからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
表面および／または細胞内タンパク質分子の同時分析をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
表面および／または細胞内脂質分子の同時分析をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
表面および／または細胞内多糖類分子の同時分析をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ビタミン、ホルモン、ハプテンおよびヌクレオシドからなる群から選択される表面および／または細胞内の小分子の同時分析をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ヌクレオシドは、ＡＴＰ、ＡＤＰ、環状ＡＭＰおよびＮＡＤＨからなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ）の後、細胞または細胞性粒子を表面または／および細胞内タンパク質に特異的な親和性試薬と反応させ、前記親和性試薬は、元素タグの１種で標識された前記親和性試薬の１種が他の任意の種類の前記タグと元素分析によって識別可能であるように支持体分子構造に結合した１つまたは複数の元素の１つまたは複数の同位体の多数の原子の化学種を含む元素タグで標識されており、
その後、結合した親和性試薬を未結合の親和性試薬から分離することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記親和性試薬は、抗体、アプタマー、レクチンおよび小分子からなる群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）の後、細胞または細胞性粒子を表面または／および細胞内分子に特異的な親和性試薬と反応させ、前記親和性試薬は前記タグの１種で標識された前記親和性試薬の１種が他の任意の種類の前記タグと元素分析によって識別可能であるように、元素タグで標識されており、
その後、未結合の親和性試薬を結合した親和性試薬から分離することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記表面または／および細胞内分子は脂質であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記表面または／および細胞内分子は多糖類であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記表面または／および細胞内分子は小分子であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記親和性試薬は、抗体、アプタマー、レクチンおよび小分子からなる群から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞は、動物、植物、細菌または真菌の全細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞性粒子は、単離染色体、単離核、単離ミトコンドリア、単離葉緑体、単離ウイルスおよび単離細菌からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記プローブは、オリゴヌクレオチドプローブ、ロックド核酸（ＬＮＡ）分子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子、プラスミドＤＮＡ、増幅ＤＮＡもしくはその断片、増幅ＲＮＡもしくはその断片、ＲＮＡ断片およびゲノムＤＮＡ断片からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
溶液中の生体分子の均質分析のための方法であって、
（ａ）元素タグで標識された親和性試薬及び特有のタグ付き支持体とともに生体分子をインキュベートするステップであって、親和性試薬と生体分子との結合を可能にする条件下、１種の前記タグで標識された１種の前記支持体が、異なる種類の前記タグで標識された他の任意の種類の前記支持体と元素分析によって識別可能であるステップと、
（ｂ）結合した生体分子を有する支持体を未結合の支持体から分離するステップと、
（ｃ）結合した支持体を粒子元素分析によって測定するステップであって、支持体を液体中に分散させて個別の支持体の原子および同位体の組成を定量的に測定し、それによって前記支持体に結合した生体分子の種類および数が検出されるステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記支持体は、粒子、マイクロスフェアおよびビーズからなる群から選択されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記生体分子は、組織試料または細胞試料からのものであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料は、動物試料、植物試料、細菌試料および真菌試料からなる群から選択されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記生体分子は、ｍＲＮＡ、タンパク質、脂質、多糖類および小分子からなる群から選択されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記生体分子と親和性試薬との結合は、特有のタグ付きマイクロスフェアに結合したオリゴヌクレオチドとｍＲＮＡ分子とのハイブリダイゼーションを含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチドは、いくつかのデオキシチミジン三リン酸ヌクレオシドと、特有のタグ付きマイクロスフェアに結合した相補的核酸プローブとを含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記相補的核酸プローブは、オリゴヌクレオチド、ＬＮＡ、ＰＮＡおよびプラスミドＤＮＡからなる群から選択されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
生体分子を特異的小分子と結合させ、その後、元素分析により前記生体分子と前記小分子との反応を特定することをさらに含み、前記小分子は、生体分子のための親和性試薬でコーティングされた特有のタグ付き支持体に結合する元素タグで標識されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記親和性試薬は、抗体、アプタマーおよびレクチン、核酸、結合ペプチド、タンパク質受容体、リン脂質からなる群から選択されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
試料中の元素の検出および測定のためのキットであって、測定される元素は、対象の核酸に相補的な特異的プローブに結合した元素タグであり、
（ａ）相補的プローブを直接的にタグ付けするための元素タグと、
（ｂ）相補的プローブと
を含むことを特徴とするキット。
【請求項３０】
ｉ）プローブを元素タグで直接的にタグ付けし；ｉｉ）細胞または細胞性粒子を固定および透過化し；ｉｉｉ）細胞または細胞性粒子を元素タグ付きプローブと一緒にハイブリダイゼーション溶液中でインキュベートし；ｉｖ）結合したプローブを未結合のプローブから分離し；ｖ）ハイブリダイズした物質を有する細胞または細胞性粒子を溶解し；ｖｉ）元素タグ付きプローブを検出および測定するための説明書をさらに含むことを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
試料中の元素の検出および測定のためのキットであって、測定される元素は、対象の核酸に相補的な特異的プローブに結合した元素タグであり、
（ａ）元素タグでタグ付けされた相補的プローブ
を含むことを特徴とするキット。
【請求項３２】
ｉ）細胞または細胞性粒子を固定および透過化し；ｉｉ）細胞または細胞性粒子を元素タグ付きプローブと一緒にハイブリダイゼーション溶液中でインキュベートし；ｉｉｉ）結合したプローブを未結合のプローブから分離し；ｉｖ）ハイブリダイズした物質を有する細胞または細胞性粒子を溶解し；ｖ）元素タグ付きプローブを検出および測定するための説明書をさらに含むことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記検出および測定は溶液元素分析によって行われることを特徴とする請求項３０に記載のキット。
【請求項３４】
前記検出および測定は粒子元素分析によって行われることを特徴とする請求項３０に記載のキット。
【請求項３５】
多数の核酸と相補的な多数の特異的プローブと、各種類のプローブを特有に標識するための多数の特有の元素タグとをさらに含むことを特徴とする請求項２９から３４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３６】
（ｉ）タンパク質、脂質、多糖類および小分子からなる群から選択される、細胞内または細胞外の生体分子のための親和性試薬と、
（ｉｉ）生体分子のための親和性試薬を標識するための元素タグと
をさらに含むことを特徴とする、請求項２９から３５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３７】
（ｉ）生体分子のための親和性試薬をタグ付けし；（ｉｉ）細胞または細胞性粒子を生体分子のための親和性試薬と一緒にインキュベートし；（ｉｉｉ）結合した生体分子のための親和性試薬を未結合の生体分子のための試薬から分離し；（ｉｖ）結合した生体分子のための試薬を検出および測定するための説明書をさらに含むことを特徴とする請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
多数の生体分子のための多数の特異的試薬と、各種類の生体分子のための各種類の親和性試薬を特有に標識するための多数の元素タグとを含むことを特徴とする請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
元素の検出および測定のためのキットであって、測定される元素は、オリゴ（ｄＴ）ｎに結合した元素タグおよび相補的プローブに結合した特有に標識された支持体の元素であり、
（ａ）オリゴ（ｄＴ）ｎを直接的にタグ付けするための元素タグと、
（ｂ）オリゴ（ｄＴ）ｎと、
（ｃ）少なくとも１つの特有に標識された支持体と、
（ｄ）多数の相補的プローブと
を含むことを特徴とするキット。
【請求項４０】
ｉ）多数の相補的プローブを特有に標識された支持体に直接的に結合させ；ｉｉ）核酸の精製を実施し；（ｉｉｉ）元素タグをオリゴ（ｄＴ）ｎに結合させ；ｉｖ）特有に標識された支持体に結合した相補的プローブを精製核酸とハイブリダイズさせ；ｉｉｉ）結合した特有に標識された支持体を金属タグ付きオリゴ（ｄＴ）ｎと反応させ；ｉｖ）未結合の核酸を結合した核酸から分離し；ｖ）結合した支持体の元素を元素分析によって検出および測定するための説明書をさらに含むことを特徴とする請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
多数の支持体が存在し、当該支持体が粒子またはビーズであることを特徴とする請求項３９または４０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４２】
前記多数の相補的プローブは、識別可能な元素タグによって直接的にタグ付けされることを特徴とする請求項３９に記載のキット。
【請求項４３】
元素の検出および測定のためのキットであって、測定される元素は、オリゴ（ｄＴ）ｎに結合した元素タグおよび相補的プローブに結合した特有の標識された支持体の元素であり、
（ａ）オリゴ（ｄＴ）ｎを直接的にタグ付けするための元素タグと、
（ｂ）オリゴ（ｄＴ）ｎと、
（ｃ）少なくとも１つの特有に標識された支持体に結合した多数の相補的プローブと
を含むことを特徴とするキット。
【請求項４４】
ｉ）核酸の精製を実施し；（ｉｉ）元素タグをオリゴ（ｄＴ）ｎに結合させ；ｉｉｉ）相補的プローブを元素タグ付きオリゴ（ｄＴ）ｎと反応させ；ｉｖ）特有に標識された支持体に結合した相補的プローブを精製核酸とハイブリダイズさせ；ｉｉｉ）結合した特有に標識された支持体を金属タグ付きオリゴ（ｄＴ）ｎと反応させ；ｉｖ）未結合の核酸を結合した核酸から分離し；ｖ）結合した支持体の元素を元素分析によって検出および測定するための説明書をさらに含むことを特徴とする請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
元素の検出および測定のためのキットであって、測定される元素は、オリゴ（ｄＴ）ｎに結合した元素タグおよび相補的プローブに結合した特有に標識された支持体の元素であり、
（ａ）元素タグで標識されたオリゴ（ｄＴ）ｎと
（ｂ）少なくとも１つの特有に標識された支持体に結合した多数の相補的プローブと
を含むことを特徴とするキット。
【請求項４６】
ｉ）核酸の精製を実施し；ｉｉ）特有に標識された支持体に結合した相補的プローブを精製核酸とハイブリダイズさせ；ｉｉｉ）結合した特有に標識された支持体を金属タグ付きオリゴ（ｄＴ）ｎと反応させ；ｉｖ）未結合の核酸を結合した核酸から分離し；ｖ）結合した支持体の元素を元素分析によって検出および測定するための説明書をさらに含むことを特徴とする、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
前記支持体はビーズであることを特徴とする請求項３９に記載のキット。
【請求項４８】
解離溶液、核酸結合膜を有するスピンカラム、生体試料からの核酸の単離および精製のための精製カラム、精製核酸の増幅のための試薬および溶液、標準、希釈緩衝液、解離緩衝液、洗浄緩衝液、ハイブリダイゼーション緩衝液ならびにアッセイ緩衝液からなる群から選択される試薬および装置をさらに含むことを特徴とする請求項２９または３９に記載のキット。
【請求項４９】
内因性の核酸は、形態学的に無傷の細胞でｉｎ  ｓｉｔｕで増幅されることを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項５０】
前記元素は質量分析計を用いて測定されることを特徴とする請求項２９から５０に記載のキット。
【請求項５１】
前記元素は同位体であることを特徴とする請求項２９から５０に記載のキット。
【請求項５２】
前記元素は、貴金属、遷移元素、希土類元素、金、銀、プラチナ、ロジウム、イリジウムおよびパラジウムからなる群から選択されることを特徴とする請求項２９から５０に記載のキット。
【請求項５３】
前記元素は複数の元素を含むことを特徴とする請求項２９から５０に記載のキット。
【請求項５４】
前記元素は複数の同位体を含むことを特徴とする請求項２９から５０に記載のキット。
【請求項５５】
前記元素は同位体の原子を複数含むことを特徴とする請求項２９から５０に記載のキット。
【請求項５６】
前記親和性生成物は、抗体、Ｆａｂ’、アプタマー、抗原、ホルモン、成長因子、受容体、タンパク質および核酸からなる群から選択されることを特徴とする請求項３６から３９に記載のキット。
【請求項５７】
粒子元素分析のための説明書が含まれることを特徴とする請求項２９から５０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、元素タグで標識された、または元素吸収支持体と結合した相補的オリゴヌクレオチドを用いる遺伝子発現分析のための、元素分析を使用する迅速で感度の良いアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
この出願は、２００６年２月１３日に出願の「ＩＣＰ−ＭＳによる金属タグ付きオリゴヌクレオチド遺伝子発現分析」という名称の米国特許仮出願第６０／７７２，５８８号明細書への優先権を主張し、その全体の内容は本明細書で参照により組み込まれる。
【０００３】
本特許文書の開示の一部は、著作権保護の対象となる内容を含む。著作権者は、それが特許商標局の特許ファイルまたは記録で公表される場合、任意の者による特許文書または特許開示の複製に異議申立をしないが、そうでない場合はいかなる全ての著作権を留保する。
【０００４】
生物学的な「試料」は、分析を必要とする生物学的性質の任意の試料を指す。例えば、試料には、動物、植物、真菌または細菌の生体分子、組織、流体および細胞が含まれてもよい。それらには、ウイルス起源の分子が含まれてもよい。一般的な試料には、それらには限定されないが、痰、血液、血液細胞（例えば、白血球）、組織または細針生検試料、尿、腹膜液および胸膜液、またはそれらからの細胞が含まれる。生体試料には、組織学的目的のためにとられる凍結切片などの組織切片も含まれてもよい。生体試料の他の一般的な源は、遺伝子発現状態を操作して遺伝子間の関係を探究することができる、ウイルスおよび動物、植物、細菌、真菌の細胞培養である。他の例は、当分野の技術者に公知である。
【０００５】
「ＲＮＡ試料」は、生体試料のリボ核酸（ＲＮＡ）調製物である。それは、成熟ｍＲＮＡだけでなく、ＲＮＡプロセシング中間体および発生期の前ｍＲＮＡ転写産物も含む。例えば、ポリ（Ｔ）カラムで精製された総ｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）テールを有するＲＮＡ分子を含む。それらのポリＡ＋ＲＮＡ分子は、成熟ｍＲＮＡ、ＲＮＡプロセシング中間体、発生期の転写産物または分解中間体でもよい。
【０００６】
本明細書で用いる「核酸」は、任意のＤＮＡまたはＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子などの、一本鎖または二本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。この用語は、それらに限定されないが、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅されたＤＮＡもしくはＲＮＡ断片、総ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡを含む、任意のＤＮＡを指す。
【０００７】
「オリゴヌクレオチド」は、長さが２から約１０００のヌクレオチド、より一般的には長さが２から約５００のヌクレオチドの一本鎖核酸である。それは、「ロック核酸」分子（ＬＮＡ）を含むこともできる。
【０００８】
「ＬＮＡ」は、リボース糖のフラノース環が、Ｏ２’，Ｃ４’−メチレン橋の導入によってＲＮＡを模倣する高次構造に化学的に閉じ込められる結果、相補的ＤＮＡおよびＲＮＡ分子に対する先例のないハイブリダイゼーション親和性がもたらされる、二環式の高親和性ＲＮＡ類似体を指す。短いＬＮＡ改変オリゴヌクレオチドの熱安定性および改善されたミスマッチ識別により、それらは、一塩基多型（ＳＮＰ）遺伝子タイピングアッセイ、アンチセンスベースの遺伝子抑制および遺伝子発現プロファイリングに役立つようになった。
【０００９】
「標的核酸」は、相補的オリゴヌクレオチドプローブが特異的にハイブリダイズする核酸（しばしば、生体試料から導かれ、したがって核酸試料とも称される）を指す。標的核酸は、任意の核酸供給源（例えば、それらに限定されないが、化学合成、増幅反応、法医学試料、その他）に由来するものとすることができる。検出するのは１つまたは複数の標的核酸の存在または非存在であり、または、定量するのは１つまたは複数の標的核酸の量である。検出する標的核酸は、それらが特異的に結合（ハイブリダイズ）する対応するオリゴヌクレオチドプローブの核酸配列に相補的であるヌクレオチド配列を優先的に有する。用語標的核酸は、プローブが特異的にハイブリダイズするより大きな核酸の特定の部分配列、または、その存在度（濃度）および／または発現レベルの検出が望まれる全体の配列（例えば遺伝子またはｍＲＮＡ）を指すことができる。この定義の他の変形形態は、当分野の技術者に公知である。
【００１０】
「プローブ」は、相補的塩基対形成、通常水素結合形成を通して相補的配列の標的核酸と結合する核酸を指す。本明細書で用いるように、オリゴヌクレオチドプローブには、当業者に公知のように、天然塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、ＣもしくはＴ）または修飾塩基（例えば、それらに限定されないが、７−デアザグアノシン、イノシン、その他）が含まれてもよい。さらに、オリゴヌクレオチドプローブ中の塩基は、それがハイブリダイゼーションを妨害しない限り、ホスホジエステル結合以外の結合で結合してもよい。ゆえに、オリゴヌクレオチドプローブは、構成塩基がホスホジエステル結合ではなくペプチド結合により結合するペプチド核酸であることができる。特定の転写産物の発現は、複数のプローブ、一般的に、５、１０、１５、２０、３０または４０個のプローブによって検出することができる。各プローブは、転写産物の異なる小領域を標的にすることができる。しかし、プローブは標的領域上で重なってもよい。プローブは、マサチューセッツ工科大学（ＭＩＴ）からのＰｒｉｍｅｒ３などの選択プログラムを用いて選択または設計することができる。本発明によると、プローブは３’もしくは５’末端で、またはオリゴヌクレオチドの中央で、元素タグで標識されてもよい。一実施形態では、プローブは末端の１つを通して、支持体に固定化される。プローブの他の例は、当分野の技術者に公知である。
【００１１】
「支持体」は、例えば、それらに限定されないが、ピロール−２，５−ジオン（マレイミド）、スルホン酸アニオンまたはｐ−（クロロメチル）スチレンによって官能化された表面である。支持体は、例えば、合成膜、ビーズ（ポリスチレン、アガロース、シリカ、その他）、プラスチックマイクロウェルの平面、ガラススライド、反応管、その他であることができる（これらに限定されない）。支持体の機能は、プローブまたは標的分子の結合のための固相の働きをすることである。当業者に公知であるこの定義の他の変形形態において、支持体は、２つの異なる物質の状態、すなわち、液体および固体、固体および固体、液体および液体、液体および気体、気体および固体、その他の間の任意の表面を意味する。
【００１２】
「支持体と結合した」は、共有結合、水素結合、イオン相互作用、疎水性相互作用による結合、または、支持体、例えばビーズと結合したリガンド結合分子との特異的相互作用のためのオリゴヌクレオチドプローブの末端に結合した特異的リガンドを用いた結合を含めて、それと直接的または間接的に結合したことを意味する。例えば、そのようなシステムには、プローブがビオチン部分を運び、支持体がストレプトアビジンでコーティングされる、ビオチン−ストレプトアビジンが含まれてもよい。支持体へのオリゴヌクレオチドプローブの共有結合性化学結合は、アミドリン酸エステル結合を通して、核酸上の５’リン酸からコーティングされた支持体へかけて達成することができる。支持体への結合は、プローブの二本鎖部分および標的の間に空間を提供するための、スペーサー分子によって達成することができる（Lockhart, D. J., Chee, M., Dunderson, K., Lai, C., Wodicka, L., Cronin, M. T., Lee, D., Tran, H. M., Matsuzaki, H., Gall, G. H., Barone, A. D., Mcgall, G. H., Chaoqiang, L., and Lee, D. H. Identifying differences in nucleic acid levels between samples - using arryays comprising probe oligo:nucleotide(s) which can form hybrid duplexes with nucleic acids in the samples. AFFYMETRIX INC, Lockhart, D. J., Chee, M., Guderson, K., Lai, C., Wodiccka, L., Cronin, M. T., Lee, D. H., Tran, H. M., Matsuzaki, H., Mcgall, G. H., and Barone, A. D. ［特許文献１−９］参照）。支持体へのオリゴヌクレオチドの固定化のためのそのような方法は、当技術分野で確立されている（非特許文献１−３参照）。当業者に公知であるこの定義の他の変形形態において、支持体への結合は、２つの異なる物質の状態、すなわち、液体および固体、固体および固体、液体および液体、液体および気体、気体および固体、その他の間の境界への機能的結合を意味する。
【００１３】
「元素標識されたビーズ」は、１つもしくは多くの同位体を有する元素または多数の元素を機能的に組み込むかまたは吸収する、一種の支持体ビーズ（例えば、それらに限定されないが、ポリスチレン、アガロース、シリカ、その他）である。関連する技術分野の技術者に公知であるように、元素は化学種（chemical moiety）の原子的部分であることができる。
【００１４】
「特有に標識されたビーズ」は、元素分析により、１種の元素で標識された１種のビーズを他の任意の種類の前記元素と識別可能であるようにビーズに吸収させた、１つまたは複数の元素の１つまたは複数の同位体の多数の原子の物理的実体を指す。特有に標識された支持体のそれぞれは、特定の標的核酸と特異的にハイブリダイズすることができる類似したまたは異なる多数のオリゴヌクレオチドを有する。
【００１５】
「元素タグ」は、支持体分子構造に結合した１つまたは多くの同位体を有する１つの元素原子または多数の元素原子を含む化学種である。元素タグは、タグを基質に結合する手段も含み、その例には、（それらに限定されないが）ピロール−２，５−ジオン（マレイミド）、スルホン酸アニオンまたはｐ−（クロロメチル）スチレン（チオールに対しては、それぞれＮ末端またはＣ末端）が含まれてもよい。元素タグは、その元素組成または同位体組成が他のタグと異なるので、同じ試料中の他の多数の元素タグと識別可能であり得る。
【００１６】
「遷移元素」は、以下の原子番号、２１〜２９、３９〜４７、５７〜７９および８９を有する任意の元素を意味する。遷移元素には、希土類元素、ランタニドおよび貴金属が含まれる。（Ｃｏｔｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、１９７２）。
【００１７】
「親和性生成物」または「親和性試薬」は、それぞれの標的分子（ペプチド、抗原、小分子、その他）と高特異的非共有結合を形成することが公知である生体分子（抗体、アプタマー、レクチン、配列特異的結合ペプチド、その他）を指す。特有の元素タグで標識された親和性試薬は、独特（unique）であり、かつ同じ試料中の他の多数の元素タグと識別可能である元素タグで標識された親和性生成物である。
【００１８】
「特異的にハイブリダイズする」は、あるいは、その配列が複合混合物（例えば全細胞）のＤＮＡまたはＲＮＡに存在する場合の、ストリンジェント条件下での特定のヌクレオチド配列との核酸分子の優先的な結合、二重化またはハイブリダイゼーションを指す。ハイブリダイゼーション条件の最適化は当分野の技術者に公知であり、特許文献１５にレビューされている（Rosenberg, M., Debouck, C., and Bergsma, D. Methods and compsns. For identifying genes which are differentially expressed  - in a normal healthy animal and an animal having a selected disease or infection. SITHKLINE BEECHAM CORP.［特許文献１０−１２］参照）。用語「ストリンジェント条件」は、プローブがその標的部分配列に優先的にハイブリダイズし、他の配列にはより小さい程度でしか、または全くハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェント条件は配列依存性であって、異なる状況では異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般的に、ストリンジェント条件は、短いプローブ（例えば１０から５０個のヌクレオチド）については、ｐＨが７．０から８．３で塩濃度が少なくとも約０．０１から１．０ＭのＮａ＋（または他の塩）であり、温度が少なくとも約３０℃であるものである。当業者に公知であるように、ストリンジェント条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加で達成することもできる。
【００１９】
「ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション」は、相補的な一本鎖核酸プローブおよび内因性の標的の間のハイブリダイゼーション反応が、標的核酸の精製を伴わない特別調製の細胞または組織学的切片中で実施されるハイブリダイゼーション技術を指す。
【００２０】
「バックグラウンド信号強度」は、標的核酸および標識オリゴヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ、対照プローブ、その他）の間の非特異的結合または他の相互作用から生じるハイブリダイゼーションシグナルを指す。
【００２１】
「ミスマッチプローブ」は、プローブの目標とされる標的以外の試料中の核酸との非特異的結合またはクロスハイブリダイゼーションのための対照を提供する。
【００２２】
「オリゴ（ｄＴ）ｎ元素タグ」は、オリゴ（ｄＴ）−ＬＮＡ複合体の場合のように、（ｎ）個のデオキシチミジン三リン酸ヌクレオシドおよび追加のヌクレオシドを含む金属標識オリゴヌクレオチドであり、ｍＲＮＡのポリアデニル化領域のためのハイブリダイゼーションプローブとして用いられる。デオキシチミジン三リン酸ヌクレオシドの数は、約６から約５０の範囲内であることができる。
【００２３】
「元素分析」は、試料をその元素組成および、ある場合には同位体組成について分析する方法である。元素分析は、いくつかの方法、例えば、原子の外部電子構造を精査するフレーム原子吸光、黒鉛炉原子吸光および誘導結合プラズマ原子発光などの光学原子分光学；原子の質量を精査する誘導結合質量分析などの質量分析原子分光学；蛍光Ｘ線分析、荷電粒子励起Ｘ線分析、Ｘ線光電子分光および原子の内部電子構造を精査するオージェ電子分光法によって達成することができる。
【００２４】
「元素アナライザー」は、元素分析方法の１つを使用する、試料の原子組成の定量化のための機器である。
【００２５】
「粒子元素」分析は、液体中に分散した粒子（例えば、緩衝液中のビーズ）で構成される分析試料を、個別粒子について（例えば、ビーズ別に）原子組成を記録するように調べる方法である。分析機器の例は、質量分析計ベースのフローサイトメーターである。
【００２６】
「溶液元素分析」は、分析試料を、原子組成を試料の全量で平均するような方法で調べる方法である。
【００２７】
「内部標準」は、未知試料に加えられる、分析物と異なる既知の量の化合物と定義される。分析物からのシグナルを内部標準からのシグナルと比較し、分析物の存在量を見いだす。質量分析定量化を実施するときに、内部標準を用いることができる。内部標準は、当業者に公知である他の手段によって用いることもできる。
【００２８】
「固定および透過化」は、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、ホルマリン、エタノール、メタノール、その他などの剤による細胞成分の化学的架橋、および、界面活性剤による細胞膜の穴形成を指す。適当な界面活性剤は、非イオン性界面活性剤の中から容易に選択することができる。望ましくは、これらの界面活性剤は、約０．００１％から約０．１％の濃度で用いられる。用いることができる一の界面活性剤は、トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ  Ｔ９２８４）である。他の適当な界面活性剤の例には、ＩｇｅｐａｌおよびＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０が含まれる。他の適当な界面活性剤は、当業者が容易に選択することができる。
【００２９】
ヒトゲノム解析計画は、多種類のヒト疾患の診断および治療の助けとなる豊富な遺伝子配列情報へのアクセスを開放した。しかし、医療における遺伝子プロファイリングは、既存の方法の微調整および感度の良い頑健な新技術の導入を必要とする。何千もの遺伝子を一斉に監視するためのゲノムスクリーニング法には、ＤＮＡマイクロアレイ、ディファレンシャルディスプレイおよび遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）のような技術が含まれる。全てのアレイの基本原理は、試料ＲＮＡから生成された蛍光またはビオチン標識ｃＲＮＡまたはｃＤＮＡ種の、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドまたは相補的ＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーションである。現在、遺伝子チップアレイが、用いられる主なプラットホームであり、そこでは、スライドグラス表面が基質であり、蛍光が検出方法である（非特許文献４−６、Wang, D., Li, G., Ma, X., Liu, C., Zhou, Y., and Cheng, J. Detecting a target nucleic acid molecule, for use in clinical diagnosis, comprises incubating the cell lysate, without nucleic acid purification, with a nucleic acid probe, allowing hybridization. UNIV QINGHUA and CAPITAL BIOCHIP CO LTD. ［特許文献１３−１５］参照）。平面マイクロアレイに代わるものは、Ｌｕｍｉｎｅｘ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｌｌｕｍｉｎａおよび他の多くのものによって開発されているビーズアレイである。マイクロスフェアアレイは、ビーズに異なる比率の蛍光染料もしくは量子ドットの組合せを含浸させることによって、または、ビーズ表面に物理的にバーコードをエッチングすることによって作製される（非特許文献７参照）。マイクロアレイは、基本的に個々の多くの細胞からの累積シグナルを表し、単細胞に関する情報の消失を含む。異種細胞集団から得られるゲノム情報が特定の癌細胞の遺伝子プロフィールに干渉するので、試料の調製および普遍的な標準品が重要である。
【００３０】
ＤＮＡ診断法は、アッセイの感度および特異性を高めるために、通常、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の類似した増幅技術による標的配列の増幅を含む。ＰＣＲ方法（Mullis, K. B., Arnheim, N., Siki, R. K., Erlich, H. A., Horn, G. T., Scharf, S. J., Banks, Mullis, K., and Keichi, Saiki R. Process for amplifying detecting or cloning nucleic acid sequences - useful in disease diagnosis and in prepn. Of transforming vectors. CETUS CORP, HOFFMANN LA ROCHE & CO AG, and HOFFMANN LA, R. O. C. H. ［特許文献１６−４８］参照）においては、標的配列の反対側の相補鎖の上の領域に相補的な２つのプライマー配列を調製する。過剰なデオキシヌクレオシド三リン酸を、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ）とともに反応混合物に加える。標的配列が試料中に存在する場合、プライマーは標的に結合し、ポリメラーゼは、ヌクレオチドを付け加えることによって標的配列に沿ってプライマーを伸長させる。反応混合物の温度を上下させることによって、伸長したプライマーの反応生成物は標的から解離し、新しい標的になる。過剰なプライマーが標的および反応生成物に結合し、この過程は繰り返される。
【００３１】
単細胞内の核酸の多重化検出のためにいくつかの方法が存在するが、それらは、現在、定量化を大量の多重化と組み合わせていない。半定量的ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション組織化学（ＩＳＨ）は、単細胞で特定のＲＮＡ配列の存在を検出し、その相対的存在度を推定するために用いられる技術である（非特許文献８および９参照）。シグナルの可視化は、通常、色素生産性基質または蛍光色素によって達成され、多重化には容易に適合しない。細胞遺伝学者は、固定された生物構造および生細胞の両方でハイブリダイゼーションにより相補的配列を視覚化するために蛍光標識核酸を用いる、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）と呼ばれる独特の染色体特性評価方法も開発した（非特許文献１０−１２参照）。ＲＮＡ  ＦＩＳＨは、細胞の区画内でその転写部位へのｍＲＮＡの位置を特定することが目的である。高度コンピュータ蛍光顕微鏡検査法および多重オリゴマーＤＮＡプローブを使用するＬｅｖｓｋｙおよび同僚による研究（非特許文献１３参照）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養細胞の核内で１１個の遺伝子の同時ＦＩＳＨプロフィールを生成する実現可能性を証明した。さらに、経時ビデオ顕微鏡検査を用いて、生細胞で誘導可能な転写部位のアレイ、ｍＲＮＡ合成およびタンパク質生成物を視覚化することが可能であった（非特許文献１４参照）。ＲＮＡ種の定量分析のために、フーリエ分光法に基づくスペクトルの画像化（ＳＩｍ）が提案された（非特許文献１５参照）。ＲＮＡの相対量は、異なるチロシンキナーゼ遺伝子に特異的な６個の特有に標識されたｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせることによって検出され、スペクトル画像は、予め記録した参照スペクトルおよびデコンボリューションソフトウェアを用いて分析した。フローサイトメトリーと組み合わせた定量的蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｑ−ＦＩＳＨ）はフロー−ＦＩＳＨと呼ばれ、常用分析および迅速分析のために最適化された条件を用いる、白血病細胞系でのテロメア長の研究にも適用された（非特許文献１６参照）。
【００３２】
ゆえに、単細胞での遺伝子およびタンパク質発現分析のための非常に高感度の、定量的および多重システムの開発は、分子的研究および診断のための捉えどころのない目標のままである。目的特異的試薬と組み合わせ元素分析は、この目標を達成する可能性を有する。
【００３３】
マイクロスフェアまたはビーズは、イムノアッセイの界面化学を支持するための魅力的な選択肢である。９６ウェルプレートに準じた方法で、様々な組成物、コーティングまたはコンジュゲート群を構築するかまたは加え、必要とされる界面化学を提供することができる。マイクロスフェアの利点の１つは、反応混合物の容積あたりの反応表面積を増加させる能力であり、そのことは、イムノアッセイの能力およびダイナミックレンジポテンシャルを高める信頼できる手段を提供する。下記の実施例では、イムノアッセイをＩＣＰ−ＭＳ検出と結合した（非特許文献１７参照）。当初多重パラメータ細胞分析のために開発されたフローサイトメトリーも、マイクロスフェアの表面にコンジュゲートした抗原およびオリゴヌクレオチドプローブを検出するために広く使われる（非特許文献１８参照）。
【００３４】
蛍光色素発光検出に基づく従来のマイクロスフェア技術は、ゲノムおよびプロテオームの機能を精査する手段として、大きな将来性を有すると考えられる。特有に標識されたビーズの粒子元素分析は、遺伝子発現研究、臨床診断および癌研究に革命をもたらす準備が整っている。埋め込まれた金属を有するポリスチレンビーズを、薄いポリシラン層でコーティングして、結合相クロマトグラフィーで通常用いられる元素リーチングを予防する。ポリスチレンビーズは、スチレンをモノマーとして、過硫酸カリウムまたはベンゾイルペルオキシドを重合剤とする従来の乳化重合によって調製する。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（相補的プローブ）を、共有結合的に表面に固定化する。粒子は、同じ遺伝子のために、１つまたは複数（非特許文献５参照）の異なる相補的オリゴヌクレオチドプローブを運ぶことができる。ハイブリダイゼーションは、標的識別のために元素タグが添加される生体試料（標的遺伝子）から単離されたｍＲＮＡまたはＰＣＲ生成物で実施される。粒子は、１つずつフロー−元素分析、例えばフロー−ＩＣＰ−ＭＳにかけて、粒子カテゴリーを特定し、遺伝子発現レベルを定量する。１元素（Ｅｕ）を吸収させ、カルボキシル残基で誘導体化したマイクロスフェアがＳｅｒａｄｙｎ社から入手可能であり、出願人の教示で原理実験の証明として試験される。元素の化学的性質はＩＣＰ−ＭＳによるその検出にとって重要ではないので、元素タグのための要件は蛍光タグに対するものに比較して緩和されている。この方法の原理は、元素タグが、再現性のある、好ましくは、多くの数の原子の所与の同位体を含有することを必要とする。組み込まれる同一の原子の数の再現性は定量分析の基本であり、それらの原子の数の増加は感度を直線的に向上させる。
【００３５】
新規フローベースのＩＣＰ−ＭＳ機器を、粒子元素分析による単一の白血病細胞の遺伝子発現プロファイリングのために用いることができる。この目的のために、豊富なｍＲＮＡ種をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって検出することができる。多重化は、ＩＣＰ−ＭＳ機器によって特異的に特定することができる異なる希少金属元素タグでオリゴヌクレオチドプローブを標識することによって達成することができる。ＲＮＡ検出の感度は、転写産物につき３から８個のオリゴヌクレオチドプローブを用い、各プローブは所与の元素の複数のタグで標識することによって改善することができる。いくつかの遺伝子による多重化実験の前に、各転写産物を別々にハイブリダイズして、発現レベルが多重化とは無関係にあることを保証する。個々の細胞は、約１０，０００種のｍＲＮＡを発現し、総ＲＮＡ量が約１〜１０ｐｇであると推定される。白血病患者試料では、中程度に豊富な転写産物は１細胞につき２０から１００コピー数であり、非常に豊富なものは１０００コピー数を超える融合転写産物である。フロー−ＩＣＰ−ＭＳによる単細胞ＲＮＡプロファイリングと前に実施したマイクロアレイ分析との直接比較は、新規方法を検証する役目を果たすことができる。対象の遺伝子の選択は、ＮＣＢＩ（非特許文献１９）、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＩＭＡＧＥ）ＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍおよびＴｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（非特許文献２０）などの公開されているデータベースの助けを借りて実施することができる。さらに、元素タグ付き相補的オリゴヌクレオチドを用い、均一な細胞試料（培養細胞系、ブラスト危機の患者からの白血病試料）で実施されるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを溶液ＩＣＰ−ＭＳによって分析し、試料全体で平均した平均遺伝子発現プロフィールを判定することができる（略図を図２Ａで示す）。
【００３６】
ビオチンで標識したいくつかの白血病関連遺伝子（Ｇ−ＣＳＦ受容体、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−２、ｃ−Ｆｏｓ、その他）に対する既製のｃＤＮＡハイブリダイゼーションプローブが、市販元（Ｍａｘｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ＧｅｎｅＤｅｔｅｃｔ社）および研究室から得ることができる。オリゴヌクレオチドプローブは、融点（Ｔｍ）、５０％Ｇ＋Ｃ含量、プローブの所望の長さなどの、当業者に公知である最適なハイブリダイゼーションパラメータを有する配列を選択する、ソフトウェアアルゴリズム（市販および公開されている）を用いて設計される。選択過程では、プローブの間のヘアピン構造および二量体の形成を最小にし、他の標的配列との交差相同性を減少させる試みがなされる。オリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知である標準の方法によって、例えば、自動ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、その他から市販される）の使用によって合成することができる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎら（非特許文献２１参照）の方法によって合成することができる。出願人の教示では、カルボキシルまたはアミノアリルで改変したオリゴヌクレオチドは、官能化学を通して元素タグまたは特有に標識された支持体、例えばビーズに結合することができる。ＤＮＡ鎖の５’末端に官能基を置き、適当な試薬を用いて改変ＤＮＡを特異標識支持体、例えばビーズの表面に結合することは、支持体への核酸の共有結合を可能にする。例えば、アミンタグ付きＤＮＡをカルボキシル改変粒子に結合するために、カルボジイミド（ＥＤＣ）化学を用いることができる。
【００３７】
【特許文献１】欧州特許出願公開第８８０５９８号明細書
【特許文献２】国際公開第９７／２７３１７号パンフレット
【特許文献３】オーストラリア特許出願公開第９７２２５３３号明細書
【特許文献４】米国特許第６３４４３１６号明細書
【特許文献５】特表２００２−５１５７３８号公報
【特許文献６】米国特許出願公開第２００３／６４３６４号明細書
【特許文献７】米国特許第６５８７１１号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００５／１５８７７２号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２００５／１９１６４６号明細書
【特許文献１０】国際公開第９５／２１９４４号パンフレット
【特許文献１１】欧州特許出願公開第７４３９８９号明細書
【特許文献１２】特表平９−５０８８００号公報
【特許文献１３】国際公開第２００５／０１７１９３号パンフレット
【特許文献１４】オーストラリア特許出願公開第２００３２５７３７１号明細書
【特許文献１５】カナダ特許出願公開第１５８０２８３号明細書
【特許文献１６】欧州特許出願公開第２００３６２号明細書
【特許文献１７】特公平０４−０６７９５７号明細書
【特許文献１８】特公平０４−０６７９６０号明細書
【特許文献１９】欧州特許第２００３６２号明細書
【特許文献２０】オーストラリア特許出願公開第８６５５３２２号明細書
【特許文献２１】オーストラリア特許出願公開第８６５５３２３号明細書
【特許文献２２】特開昭６１−２７４６９７号公報
【特許文献２３】特開昭６２−０００２８１号公報
【特許文献２４】デンマーク特許出願公開第８６０１４４８号明細書
【特許文献２５】デンマーク特許出願公開第８６０１４４９号明細書
【特許文献２６】米国特許第４６８３１９５号明細書
【特許文献２７】米国特許第４６８３２０２号明細書
【特許文献２８】スペイン特許公開第８７０６８２２号明細書
【特許文献２９】スペイン特許公開第８７０６８２３号明細書
【特許文献３０】南アフリカ共和国特許公開第８６０２３３４号明細書
【特許文献３１】南アフリカ共和国特許公開第８６０２３３５号明細書
【特許文献３２】スペイン特許公開第８８００３５６号明細書
【特許文献３３】スペイン特許公開第８８００３５７号明細書
【特許文献３４】カナダ特許出願公開第１２３７６８５号明細書
【特許文献３５】米国特許第４８００１５９号明細書
【特許文献３６】米国特許第４６８３２０２号明細書
【特許文献３７】イスラエル特許出願公開第７８２８１号明細書
【特許文献３８】カナダ特許第１２９１４２９号明細書
【特許文献３９】イスラエル特許出願公開第７８２８４号明細書
【特許文献４０】独国特許第３６８７５３７号明細書
【特許文献４１】特開昭６０−０７１６６号公報
【特許文献４２】デンマーク特許第１７１１６０号明細書
【特許文献４３】デンマーク特許第１７１１６１号明細書
【特許文献４４】特許第２４５４６５７６号明細書
【特許文献４５】アイルランド特許第８３４５６号明細書
【特許文献４６】アイルランド特許第８３４６４号明細書
【特許文献４７】米国特許第４６８３１９５号明細書
【特許文献４８】カナダ特許第１３４０１２１号明細書
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３８】
本発明は、何十万ものｍＲＮＡ分子の迅速分析において、より高い感度および正確度を提供する。それは、ｍＲＮＡ標的の蛍光標識化を排除することによって、遺伝子発現レベルの検出の向上した効率および正確度をさらに提供し、同時に生体試料でＲＮＡレベルの定量的なハイスループット測定を確実にする。本発明は、他の核酸、例えばゲノムＤＮＡを検出するために用いることもできる。例えば、単一のＤＮＡ鎖を一方の端の元素タグに結合させ、全分子を、特有に標識された支持体（例えばビーズ）に連結した相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。
【課題を解決するための手段】
【００３９】
出願人の教示のこれらおよび他の特徴は、本明細書で示される。
【００４０】
出願人の教示の一態様は、細胞分析のための方法であって、（ａ）細胞または細胞性粒子を提供するステップと、（ｂ）細胞または細胞性粒子を固定するステップと、（ｃ）細胞または細胞性粒子を標的核酸に特異的なプローブと一緒にハイブリダイゼーション溶液中でインキュベートするステップであって、前記プローブは特有の元素タグで標識され、前記タグの１種で標識された前記プローブの１種が、異なる種類の前記タグで標識された他の任意の種類の前記プローブと元素分析によって識別可能であるステップと、（ｄ）ストリンジェントな洗浄条件によって、ハイブリダイズしなかったプローブを、標的核酸にハイブリダイズしたプローブから分離するステップと、（ｅ）細胞または細胞性粒子を元素分析によって分析して、プローブを特定し、標的核酸に結合したプローブを定量化するステップとを含む方法を提供することである。特異的な元素タグで標識した２つ以上の特異的なプローブを、２つ以上の標的核酸とハイブリダイズさせることができる。標的核酸は、細胞内核酸分子、マトリックスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、遺伝子転写物前駆体ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、トランスポートＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、染色体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、細菌ＤＮＡ、細菌ＲＮＡおよびプラスミドＤＮＡからなる群から選択することができる。本方法は、表面および／もしくは細胞内タンパク質分子、表面および／もしくは細胞内脂質分子、表面および／もしくは細胞内多糖類分子、ならびに／または表面および／もしくは細胞内小分子の同時分析をさらに含むことができる。小分子は、ビタミン、ホルモン、ハプテンおよびヌクレオシド（例えばＡＴＰ、ＡＤＰ、環状ＡＭＰおよびＮＡＤＨ）からなる群から選択することができる。
【００４１】
上の態様に加えて、細胞または細胞性粒子は、表面または／および細胞内分子に特異的な親和性試薬と反応させ、前記親和性試薬は、元素タグの１種で標識された前記親和性試薬の１種が他の任意の種類の前記タグと元素分析によって識別可能であるように、支持体分子構造に結合した１つまたは複数の元素の１つまたは複数の同位体の多数の原子の化学種を含む元素タグで標識され、その後、結合した親和性試薬から未結合の親和性試薬を分離することができる。表面または／および細胞内分子は、タンパク質、脂質、多糖類および／または小分子とすることができる。親和性試薬は、抗体、アプタマー、レクチンおよび小分子からなる群から選択することができる。細胞は、動物、植物、細菌または真菌の全細胞とすることができる。細胞性粒子は、単離染色体、単離核、単離ミトコンドリア、単離葉緑体、単離ウイルスおよび単離細菌からなる群から選択することができる。プローブは、オリゴヌクレオチドプローブ、ロックド核酸（ＬＮＡ）分子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子、プラスミドＤＮＡ、増幅ＤＮＡ、増幅、ＲＮＡ断片およびゲノムＤＮＡ断片からなる群から選択することができる。
【００４２】
出願人の教示の他の態様は、生体分子の均質分析（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ）のための方法であって、（ａ）元素タグで標識された親和性試薬及び特有のタグ付き粒子とともに生体分子をインキュベートするステップであって、親和性試薬と生体分子との結合を可能にする条件下、前記タグの１種で標識された特前記粒子の１種が、他の種類の前記タグで標識された他の任意の種類の前記粒子と元素分析によって識別可能であるステップと、（ｂ）結合した生体分子を有する粒子を未結合の粒子から分離するステップと、（ｃ）結合粒子を粒子元素分析で測定するステップであって、粒子を液体中に分散させて個別粒子の原子および同位体の組成を定量的に測定し、それによって前記粒子に結合した生体分子の種類および数が検出されるステップとを含む方法を提供することである。粒子は、ビーズとすることができる。生体分子は、組織試料または細胞試料からのものでよい。試料は、動物試料、植物試料、細菌試料および真菌試料からなる群から選択してもよい。生体分子は、ｍＲＮＡ、タンパク質、脂質、多糖類および小分子からなる群から選択することができる。生体分子と親和性試薬との結合は、特有のタグ付きマイクロスフェアに結合したオリゴヌクレオチドとｍＲＮＡ分子とのハイブリダイゼーションを含むことができる。オリゴヌクレオチドは、いくつかのデオキシチミジン三リン酸ヌクレオシドと、特有のタグ付きマイクロスフェアに結合した相補的核酸プローブとを含むことができる。相補的核酸プローブは、オリゴヌクレオチド、ＬＮＡ、ＰＮＡおよびプラスミドＤＮＡからなる群から選択することができる。生体分子は、タンパク質、脂質、多糖類および小分子からなる群から選択することができ、それらは、特有のタグ付きマイクロスフェアに結合した元素タグ付き親和性試薬と結合する。親和性試薬は、抗体、アプタマーおよびレクチン、核酸、結合ペプチド、タンパク質受容体およびリン脂質からなる群から選択することができる。
【００４３】
出願人の教示の他の態様は、試料中の元素の検出および測定のためのキットであって、測定される元素は、対象の核酸に相補的な特異的プローブに結合した元素タグであり、（ａ）相補的プローブを直接的にタグ付けするための元素タグと、（ｂ）相補的プローブとを含むキットである。キットは、ｉ）プローブを元素タグで直接的にタグ付けし；ｉｉ）細胞または細胞性粒子を固定および透過化し；ｉｉｉ）細胞または細胞性粒子を元素タグ付きプローブと一緒にハイブリダイゼーション溶液中でインキュベートし；ｉｖ）結合したプローブを未結合のプローブから分離し；ｖ）ハイブリダイズした物質を有する細胞または細胞性粒子を溶解し；ｖｉ）元素タグ付きプローブを検出および測定するための説明書をさらに含むことができる。検出および測定は、容積元素分析または粒子元素分析によって行うことができる。
【００４４】
出願人の教示の他の態様は、試料中の元素の検出および測定のためのキットであって、測定される元素は、対象の核酸に相補的な特異的プローブに結合した元素タグであり、（ａ）元素タグでタグ付けされる相補的プローブ、を含むキットを提供することである。キットは、ｉ）細胞または細胞性粒子を固定および透過化し；ｉｉ）細胞または細胞性粒子を元素タグ付きプローブと一緒にハイブリダイゼーション溶液中でインキュベートし；ｉｉｉ）結合したプローブを未結合のプローブから分離し；ｉｖ）ハイブリダイズした物質を有する細胞または細胞性粒子を溶解し；ｖ）元素タグ付きプローブを検出および測定するための説明書をさらに含むことができる。
【００４５】
上記のキットは、多数の核酸と相補的な多数の特異的プローブと、各種類のプローブを特有に標識するための多数の特有の元素タグとをさらに含むことができる。上記のキットは、（ａ）タンパク質、脂質、多糖類および小分子からなる群から選択される細胞内または細胞外の生体分子のための親和性試薬と、（ｂ）生体分子のための親和性試薬を標識するための元素タグとをさらに含むことができる。キットは、（ｉ）生体分子のための親和性試薬をタグ付けし；（ｉｉ）細胞または細胞性粒子を生体分子のための親和性試薬と一緒にインキュベートし；（ｉｉｉ）結合した生体分子のための親和性試薬を未結合の生体分子のための試薬から分離し；（ｉｖ）結合した生体分子のための試薬を検出および測定するための説明書を含むことができる。最後に、キットは、多数の生体分子に特異的な多数の試薬と、各種類の生体分子のための各種類の親和性試薬を特有に標識するための多数の元素タグとを含むことができる。
【００４６】
出願人の教示の他の態様は、元素の検出および測定のためのキットであって、測定される元素は、識別可能な元素標識された粒子に結合したオリゴ（ｄＴ）ｎに結合した元素タグであり、（ａ）オリゴ（ｄＴ）ｎを直接的にタグ付けするための元素タグと、（ｂ）オリゴ（ｄＴ）ｎと、（ｃ）多数の識別可能な元素標識された粒子と、（ｄ）多数の相補的プローブとを含むキットを提供することである。キットは、ｉ）多数の相補的プローブを識別可能な元素標識された粒子に直接的に結合させ；ｉｉ）核酸の精製を実施し；（ｉｉｉ）元素タグをオリゴ（ｄＴ）ｎに結合させ；ｉｖ）相補的プローブを元素タグ付きオリゴ（ｄＴ）ｎと反応させ；ｖ）識別可能な元素標識された粒子に結合した元素タグ付きオリゴ（ｄＴ）ｎに結合した相補的プローブを溶液中で標的核酸とハイブリダイズさせ；ｖｉ）結合した粒子を未結合の粒子から分離し；ｖｉｉ）結合した粒子を粒子元素分析によって検出および測定するための説明書をさらに含むことができる。粒子は、ビーズとすることができる。多数の相補的プローブは、識別可能な元素タグで直接的にタグ付けすることができる。
【００４７】
出願人の教示の他の態様は、元素の検出および測定のためのキットであって、測定される元素は識別可能な元素標識された粒子に結合したオリゴ（ｄＴ）ｎに結合した元素タグであり、（ａ）オリゴ（ｄＴ）ｎを直接的にタグ付けするための元素タグと、（ｂ）オリゴ（ｄＴ）ｎと、（ｃ）多数の識別可能な元素標識された粒子に結合した多数の相補的プローブとを含むキットを提供することである。キットは、ｉ）核酸の精製を実施し；（ｉｉ）元素タグをオリゴ（ｄＴ）ｎに結合させ；ｉｉｉ）相補的プローブを元素タグ付きオリゴ（ｄＴ）ｎと反応させ；ｉｖ）識別可能な元素標識された粒子に結合した元素タグ付きオリゴ（ｄＴ）ｎに結合した相補的プローブを溶液中で標的核酸とハイブリダイズさせ；ｖ）結合した粒子を未結合の粒子から分離し；ｖｉ）結合した粒子を粒子元素分析によって検出および測定するための説明書をさらに含むことができる。
【００４８】
出願人の教示の他の態様は、元素の検出および測定のためのキットであって、測定される元素は、オリゴ（ｄＴ）ｎに結合した元素タグおよび相補的プローブに結合した特有に標識された粒子の元素であり、（ａ）元素タグで標識されたオリゴ（ｄＴ）ｎと、（ｂ）多数の特有に標識された粒子に結合した多数の相補的プローブとを含むキットである。キットは、ｉ）核酸の精製を実施し；ｉｉ）特有に標識された粒子に結合した相補的プローブを精製核酸とハイブリダイズさせ；ｉｉｉ）特有に標識された粒子を金属タグ付きオリゴ（ｄＴ）ｎと反応させ；ｉｖ）結合した粒子を未結合の粒子から分離し；ｖ）結合した粒子の元素を粒子元素分析によって検出および測定するための説明書をさらに含む。
【００４９】
さらなる態様において、粒子は固体支持体で置換することができる。例えば、支持体は平らな（例えばガラスもしくはプラスチック）プレート、ウェルプレート、プローブ（試料中に挿入されたもの）または他の固体材料でもよいであろう。この場合、その位置（プレートまたはウェルプレート上の）がそれに結合した相補的プローブの同一性を示すことができるであろうから、固体表面は必ずしも元素標識する必要はない。説明書は上記の（ｉ）から（ｖ）と同様であるが、この場合、オリゴ（ｄＴ）ｎに結合した元素だけを測定する。
【００５０】
上記のキットは、解離溶液、核酸結合膜を有するスピンカラム、生体試料からの核酸の単離および精製のための精製カラム、精製核酸の増幅のための試薬および溶液、標準、希釈緩衝液、解離緩衝液、洗浄緩衝液、ハイブリダイゼーション緩衝液ならびにアッセイ緩衝液からなる群から選択される、試薬および装置をさらに含むことができる。内因性の核酸は、形態学的に無傷の細胞で、ｉｎ  ｓｉｔｕで増幅することができる。元素は、質量分析計を用いて測定することができる。元素は、同位体またはイオンであってもよい。元素は、遷移元素、貴金属、ランタニド、希土類元素、金、銀、プラチナ、ロジウム、イリジウムおよびパラジウムからなる群から選択することができる。元素には、複数の元素および／または複数の同位体および／または同位体の複数の原子が含まれてもよい。親和性生成物は、抗体、Ｆａｂ’、アプタマー、抗原、ホルモン、成長因子、受容体、タンパク質および核酸からなる群から選択することができる。キットは、粒子元素分析のための説明書を含むこともできる。
【００５１】
当業者は、以下に記す図面は図解だけが目的であることを理解するであろう。図面は、出願人の教示の範囲をいかようにも限定するものではない。本発明は、例示的であって限定的なものではない図面で図示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
本発明は、元素タグの使用を含む。出願人の教示の方法で使用する元素の選択は、好ましくは、調査試料中でのその自然存在度および、その元素が調査試料に毒性であるかどうかに基づいて選択される。
【００５３】
遷移および希土類群のほとんどの金属は、出願人の教示での使用が予想される。細胞傷害性が低いかまたは無細胞傷害性であり、増殖培地および生体試料中の存在度が低い元素を選択することが賢明である。例えば、バナジウムおよび水銀はある細胞に毒性となりうるが、Ｆｅ、ＣｕおよびＺｎは一部の細胞培地中に高濃度で存在することがある。他方、例えばＰｒ、Ｈｏ、Ｔｂ、Ｌａに対しては、哺乳動物細胞は通常十分耐えることができ、しかも環境中に豊富に存在しない。
【００５４】
試料中に天然に存在する元素とタグ物質とを区別するために、タグ元素の普通でない同位体組成物を用いることができる。タグ元素の相対的な存在度が、所与の分析試料中の元素の相対的な存在度と十分に異なることが有利である。「十分に異なる」は、本発明の方法の下で、分析試料中に含まれるバックグラウンド元素を超えて標的元素タグを検出することが可能なことを意味する。実際、試料を分析するために有利に用いることができるものは、タグ付け用元素および試料マトリックスの元素間比の差である。
【００５５】
分析の間に干渉シグナルを生成しない（すなわち、同じ質量を有することによる重複シグナルを有しない）、元素タグを選択することが可能である。したがって、１つの試料で２つ以上の分析的測定を同時に実施することができる。さらに、同じ原子の多くのコピーを含有する元素タグを作製することができるので、測定するシグナルを大幅に増幅することができる。
【００５６】
出願人の教示の態様は、本教示の範囲をいかようにも限定するものと解釈されてはならない以下の実施例に照らして、さらに理解することができる。
【００５７】
（実施例１）
ワークフローチャートを図５で提示する一実施形態では、ＩＣＰ−ＭＳ検出のためのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、先ず、標的の染色体および染色体外の核酸を相補的プローブとのハイブリダイゼーションに利用できるようにするような方法で組織または細胞試料を処理し（固定／透過化処理）；次に、試料を、異なる元素タグで標識し、対象の遺伝子に相補的なプローブまたは複数のプローブに曝露させ；第３に、試料を洗浄して過剰な未結合の非特異的に相互作用するプローブを除去し；最後に、試料を粒子または溶液元素分析にかけることによって実施される。
【００５８】
（実施例２）
ＩＣＰ−ＭＳによる元素標識されたビーズ遺伝子分析（ワークフローチャートを図６で示す）のために、総ＲＮＡを生体試料から単離し、オリゴヌクレオチドプローブにコンジュゲートした特有に標識されたビーズとハイブリダイズさせ、元素タグ付きオリゴ（ｄＴ）２０プローブを混合物に加え、最後に、ビーズを単一粒子ＩＣＰ−ＭＳ分析にかける。
【００５９】
当技術分野で公知である方法を用いて、総ＲＮＡを所与の試料から単離する。例えば、哺乳動物の組織からのＲＮＡの単離のために、酸性のグアニジウム−フェノール−クロロホルム抽出方法を用いることができ、または、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの市販試薬を用いることができる。さらに、メッセンジャーＲＮＡは、オリゴｄＴカラムクロマトグラフィーによって、または、（ｄＴ）ｎ磁性ビーズを用いることにより単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献２２）、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献２３）を参照）。都合のよいことに、総ＲＮＡは、例えば、ＲＮｅａｓｙ総ＲＮＡ単離キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて哺乳動物細胞から単離することができる。Ｒｎｅａｓｙ総ＲＮＡ単離キットを用いるＴＲＩｚｏｌ抽出のエタノール沈殿工程の後の第２のクリーンアップは、有益であることができる。１ラウンドのＲＮＡ増幅が、必要とされよう（Ａｍｂｉｏｎキット）。これはアンチセンス（ａＲＮＡ）プールを提供することを、当業者は理解する。アンチセンスＲＮＡを標的核酸として用いる場合、オリゴヌクレオチドプローブは、アンチセンス核酸の部分配列に相補的なものが選択される。反対に、標的核酸プールがセンス核酸のプールである場合、オリゴヌクレオチドプローブは、センス核酸の部分配列に相補的なものが選択される。最後に、核酸プールが二本鎖である場合、標的核酸はセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含むので、プローブはセンスまたはアンチセンスのいずれかでよい。
【００６０】
発現レベル対照は、生体試料で構成的に発現される遺伝子と特異的にハイブリダイズするプローブであり、標準化のために用いられる。構成的に発現される実質的にいかなる遺伝子も、発現レベル対照に適当な標的を提供する。一般的に、発現レベル対照プローブは、それらに限定されないが、β−アクチン遺伝子、転移受容体遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＨＰＲＴ、ＣＰＢ、Ｇ６ＰＤ、２８Ｓ  ｒＲＮＡなどを含む、構成的に発現される「ハウスキーピング遺伝子」の部分配列に相補的な配列を有する。
【００６１】
本発明の方法は、細菌の同定、法科学および遺伝子およびタンパク質発現の同時分析のためのタンパク質検出と一緒に、核酸検出のために用いることができる。
【００６２】
当業者に公知であるように、本方法は、ビーズまたは粒子の代わりに支持体を、例えばスライド、プレートまたはウェルを用いることもできる。
【００６３】
この方法の変形形態では、生体分子（例えば、それらに限定されないが、タンパク質、脂質、多糖類）は、生体分子に対して「親和性試薬」でコーティングされた特有のタグ付き支持体と結合する元素タグで標識される特異的小分子（例えば、それらに限定されないが、薬剤、ホルモン、フェロモン、糖）と結合する。次に、支持体を元素分析によって分析して、前記生体分子と小分子（例えば、受容体結合の場合、成長因子）との反応を特定する。この場合、小分子は直接的にタグ付けされており、小分子分析物の認識は、元素標識されたビーズへの親和性試薬を通してのそれらの結合によるものであり、ビーズ元素のサインと小分子のタグサインとの併存は、小分子を確認および定量する。
【００６４】
（実施例３）
他の実施形態では、第１の一連の実施例を、検出器として従来のＩＣＰ−ＭＳ測定器を用い、および市販の金属（ランタニド）含有親和性試薬を用いて実施した。他の金属を用いることができること、および、元素分析のための他の機器を用いることができることを理解されたい。ヒト白血病細胞の特定の疾患関連遺伝子とｉｎ  ｓｉｔｕでハイブリダイズするように設計されたビオチン化アンチセンスオリゴヌクレオチドプローブを使用した実験を用いた。プローブは、ランタニド標識ストレプトアビジンとの結合によって特定した（図２Ａを参照）。
【００６５】
ＩＣＰ−ＭＳ検出でｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施することの可能性を、モデルヒト白血病細胞系で試験し、図１で示すように結果をフローサイトメトリーと比較した。実験は、その後ＩＣＰ−ＭＳ遺伝子発現分析のために用いた懸濁細胞のための最適な固定および透過化条件およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションパラメータを定めるために実施した。図１（凡例）で示すようにＫＧ−１Ａ細胞を固定し、次に、５００ｎｇ／ｍｌのビオチン化２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブ（５’−ビオチン−ＡＴＣＣＡＡＣＧＣＴＴＧＧＴＧＡＡＴＴＣ−３’、ヒト２８ＳリボソームＲＮＡ  ＧＩ：３３７３８１）またはナンセンスビオチン化プローブ（Ｂ／Ａ；陰性対照）を有するハイブリダイゼーション溶液でインキュベートした。洗浄およびブロッキングの後、ストレプトアビジン−ＰｅｒＣＰ（ペリジンクロロフィル−ａタンパク質で標識したストレプトアビジン）を加えた。図１Ａは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターで得られた蛍光強度のヒストグラムを示す。図１Ｂは、ＩＣＰ−ＭＳ容量一括分析を示す。ハイブリダイズさせた細胞をストレプトアビジン−Ｔｂ（ＤＥＬＦＩＡ）と反応させ、洗浄し、１ｐｐｂのＩｒ（イリジウム内部標準）を含む濃ＨＣｌで溶解した。フローサイトメトリー（ＦＣＭ）およびＩＣＰ−ＭＳによって検出されるヒト２８Ｓ  ｒＲＮＡには、明白なハイブリダイゼーションシグナルがある。ゆえに、金属で標識した第２の親和性試薬（ストレプトアビジン−Ｔｂ）を用いて、ＩＣＰ−ＭＳによって白血病細胞で非常に豊富な構成的転写産物を首尾よく特定するための実験条件を確立した。
【００６６】
（実施例４）
次の実施形態は、ＩＣＰ−ＭＳ検出によるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが、中程度に豊富な白血病特異的遺伝子種を検出するのに十分高感度であることを証明する。この目的のために、ｂ３ａ２遺伝子によってコードされるＢＣＲ／Ａｂｌ発癌性キナーゼを発現することが知られているヒト慢性骨髄性白血病細胞系（Ｋ５６２）およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた。実験の概略図を図２Ａに示す。我々は、５’−ビオチン化ＢＣＲ／Ａｂｌ特異的アンチセンスプローブ（ＢＣＲ／ＡＢＬ）、５’−ビオチン化２８Ｓ  ｒＲＮＡプローブ（陽性対照）およびビオチン化ナンセンスプローブ（Ｂ／Ａ）を用いて、Ｋ５６２細胞およびＫＧ−１Ａ細胞（急性骨髄性白血病モデル細胞系、ＢＣＲ／Ａｂｌ転写産物を発現しない）でｂ３ａ２融合遺伝子の発現を比較した。図１で記載されているように細胞を固定、透過化し、次に、別々の細胞試料を、ビオチン化ＢＣＲ／Ａｂｌ、２８Ｓ  ｒＲＮＡ、ナンセンスプローブまたはプローブなしを含有するハイブリダイゼーション溶液でインキュベートした。洗浄およびブロッキングの後、ストレプトアビジン−Ｔｂを加えた。標識細胞をＨＣｌ／Ｉｒで溶解し、全試料（試料につき０．３ｅ６  ＫＧ１ａ細胞および３ｅ６  Ｋ５６２細胞）を従来のＩＣＰ−ＭＳ機器による元素分析にかけた、溶液元素分析によって分析を行った。結果を図２Ｂに示す。左のグラフは、ＫＧ−１ａ細胞の２８Ｓ  ｒＲＮＡのレベルは非常に高いが、ＢＣＲ／Ａｂｌプローブからのシグナルはナンセンス（Ｂ／Ａ）および陰性対照（ｃｔｒｌ）応答のレベルにあることを証明する。他方、Ｋ５６２細胞（図２Ｂの右のグラフ）は、ＢＣＲ／Ａｂｌプローブと強くハイブリダイズし、その強さは２８Ｓ  ｒＲＮＡとよりも約１４倍弱い。ゆえに、ＩＣＰ−ＭＳは、Ｋ５６２細胞でＢＣＲ／Ａｂｌ遺伝子レベルを確実に検出する。
【００６７】
（実施例５）
他の実施形態では、粘着性Ａ４３１ヒト表皮癌細胞を用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験を実施した。これらの細胞は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を過剰発現させることが知られている。細胞を組織培養グレードの９６多重ウェルプレートに播種し、２日間付着および増殖させた（ウェルにつき約７５ｅ３細胞）。図１の凡例の方法（４）に従って細胞を固定、透過化し、洗浄し、ビオチン、２８Ｓ  ｒＲＮＡ、ＥＧＦＲ、Ｄ−サイクリンおよびＢ／Ａで５’標識したアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとウェル内でハイブリダイズさせた。各プローブのために、３反復のウェルを設定した。プローブを、ストレプトアビジン−Ｔｂと反応させた。洗浄後、細胞をＨＣＬ／Ｉｒで溶解し、溶液ＩＣＰ−ＭＳによって分析した。図３から明白であるように、Ａ４３１細胞は大量のＥＧＦＲ  ｍＲＮＡ、相当低いレベルのＤ−サイクリン（全ての細胞が増殖したわけではない）を発現させ、陽性プローブ２８Ｓ  ｒＲＮＡに対して頑健な応答を示す。
【００６８】
（実施例６）
以下の実験は、同じ細胞でタンパク質および遺伝子の発現を同時に検出する出願人の教示の特異な能力を例示する（図７を参照）。この目的のために、高レベルのｐ２１０  ＢＣＲ／Ａｂｌタンパク質を発現させるＫ５６２モデル細胞系を用いた。ＢＣＲ／Ａｂｌタンパク質を認識する一次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．社）またはアイソタイプ対照ＩｇＧを、ＰｅｒｍＦｌｏｗ溶液（ＩｎＶｉｒｉｏｎ社）で固定、透過化した細胞に適用した。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、二次的抗ウサギＥｕコンジュゲート体（ＤＥＬＦＩＡ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）と反応させた（図４Ｂを参照）。免疫標識後、細胞をＤＡＫＯ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション溶液（ＤＡＫＯ社）でプレハイブリダイズさせ、５’−ビオチン化−２８ＳリボソームＲＮＡアンチセンスプローブと、または陰性対照として５’−ビオチン化−Ｂ／Ａナンセンスプローブと室温で２時間ハイブリダイズさせた。非特異的ハイブリダイゼーションを最小にするために、４×ＳＳＣ、２×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣおよびＰＢＳによるストリンジェントな洗浄を実施した。最後に、細胞をストレプトアビジン−Ｔｂコンジュゲート体（ＤＥＬＦＩＡ）と一緒にインキュベートし、ＨＣｌ／Ｉｒで溶解した（図４Ａ）。図４Ａおよび図４Ｂの比較から明白であるように、ＢＣＲ／Ａｂｌタンパク質発現（Ｅｕ）のために染色し、リボソーム遺伝子発現（Ｔｂ）のために探査した細胞は、ＩｇＧ対照およびＢ／Ａプローブのために染色した細胞よりも有意に強いシグナルを与えた。
【００６９】
キット：
本発明は、本発明の方法を実施するための成分を含むキットも提供する。
【００７０】
例えば、試料中の元素の検出および測定のためのキットであって、測定される元素は、対象の核酸に相補的な特異的プローブに結合した元素タグであり、（ａ）相補的プローブを直接的にタグ付けするための元素タグと、（ｂ）相補的プローブとを含むキットが提供される。キットは、ｉ）プローブを元素タグで直接的にタグ付けし；ｉｉ）細胞または細胞性粒子を固定および透過化し；ｉｉｉ）細胞または細胞性粒子を元素タグ付きプローブと一緒にハイブリダイゼーション溶液中でインキュベートし；ｉｖ）結合したプローブを未結合のプローブから分離し；ｖ）ハイブリダイズした物質を有する細胞または細胞性粒子を溶解し；ｖｉ）元素タグ付きプローブを検出および測定するための説明書をさらに含むことができる。検出および測定は、溶液元素分析または粒子元素分析によって行うことができる。
【００７１】
試料中の元素の検出および測定のためのキットであって、測定される元素は、対象の核酸に相補的な特異的プローブに結合した元素タグであり、（ａ）元素タグでタグ付けされた相補的プローブを含むキットも提供される。キットは、ｉ）細胞または細胞性粒子を固定および透過化し；ｉｉ）細胞または細胞性粒子を元素タグ付きプローブと一緒にハイブリダイゼーション溶液中でインキュベートし；ｉｉｉ）結合したプローブを未結合のプローブから分離し；ｉｖ）ハイブリダイズした物質を有する細胞または細胞性粒子を溶解し；ｖ）元素タグ付きプローブを検出および測定するための説明書をさらに含むことができる。
【００７２】
上記のキットは、多数の核酸に相補的な多数の特異的プローブと、各種類のプローブを特有に標識するための多数の特有の元素タグとをさらに含むことができる。上記のキットは、（ａ）タンパク質、脂質、多糖類および小分子からなる群から選択される細胞内または細胞外の生体分子のための親和性試薬と、（ｂ）生体分子のための親和性試薬を標識するための元素タグとをさらに含むことができる。キットは、（ｉ）生体分子のための親和性試薬をタグ付けし；（ｉｉ）細胞または細胞性粒子を生体分子のための親和性試薬と一緒にインキュベートし；（ｉｉｉ）結合した生体分子のための親和性試薬を未結合の生体分子のための試薬から分離し；（ｉｖ）結合した生体分子のための試薬を検出および測定するための説明書を含むことができる。最後に、キットは、多数の生体分子に特異的な多数の試薬と、各種類の生体分子のための各種類の親和性試薬を特有に標識するための多数の元素タグとを含むことができる。
【００７３】
元素の検出および測定のための他のキットであって、測定される元素は、オリゴ（ｄＴ）ｎに結合した元素タグおよび特有に標識された粒子の元素であり、（ａ）オリゴ（ｄＴ）ｎを直接的にタグ付けするための元素タグと、（ｂ）オリゴ（ｄＴ）ｎと、（ｃ）多数の特有に標識された粒子と、（ｄ）多数の相補的プローブと、を含むキットが提供される。キットは、ｉ）多数の相補的プローブを特有に標識された粒子に直接的に結合させ；ｉｉ）核酸の精製を実施し；（ｉｉｉ）元素タグをオリゴ（ｄＴ）ｎに結合させ；ｉｖ）特有に標識された粒子に結合した相補的プローブを精製核酸とハイブリダイズさせ；ｉｉｉ）結合した特有に標識された粒子を金属タグ付きオリゴ（ｄＴ）ｎと反応させ；ｉｖ）結合した粒子を未結合の粒子から分離し；ｖ）結合した粒子の元素を粒子元素分析によって検出および測定するための説明書をさらに含むことができる。粒子は、ビーズとすることができる。さらなる態様で、粒子は固体支持体で置換することができる。例えば、支持体は平らな（例えばガラスもしくはプラスチック）プレート、ウェルプレート、プローブ（試料中に挿入されたもの）または他の固体材料でもよいであろう。この場合、（プレートまたはウェルプレート上の）その位置がそれに結合した相補的プローブの同一性を示すことができるであろうから、固体表面は必ずしも元素標識する必要はない。説明書は上記の（ｉ）から（ｖ）に類似するが、この場合、オリゴ（ｄＴ）ｎに結合した元素だけを測定する。
【００７４】
元素の検出および測定のための他のキットであって、測定される元素は、識別可能な元素標識された粒子に結合したオリゴ（ｄＴ）ｎに結合した元素タグであり、（ａ）オリゴ（ｄＴ）ｎを直接的にタグ付けするための元素タグと、（ｂ）オリゴ（ｄＴ）ｎと、（ｃ）多数の識別可能な元素標識された粒子に結合した多数の相補的プローブと、を含むキットが提供される。キットは、ｉ）核酸の精製を実施し；（ｉｉ）元素タグをオリゴ（ｄＴ）ｎに結合させ；ｉｉｉ）相補的プローブを元素タグ付きオリゴ（ｄＴ）ｎと反応させ；ｉｖ）識別可能な元素標識された粒子に結合した元素タグ付きオリゴ（ｄＴ）ｎに結合した相補的プローブを、溶液中で標的核酸とハイブリダイズさせ；ｖ）結合した粒子を未結合の粒子から分離し；ｖｉ）結合した粒子を粒子元素分析によって検出および測定するための説明書をさらに含むことができる。
【００７５】
さらなる態様において、粒子は固体支持体で置換することができる。例えば、支持体は平らな（例えばガラスもしくはプラスチック）プレート、ウェルプレート、プローブ（試料中に挿入されたもの）または他の固体材料でもよい。この場合、（プレートまたはウェルプレート上の）その位置がそれに結合した相補的プローブの同一性を示すことができるであろうから、固体表面は必ずしも元素標識する必要はない。説明書は上記の（ｉ）から（ｖ）に類似するが、この場合、オリゴ（ｄＴ）ｎに結合した元素だけを測定する。
【００７６】
上記のキットは、解離溶液、核酸結合膜を有するスピンカラム、生体試料からの核酸の単離および精製のための精製カラム、精製核酸の増幅のための試薬および溶液、標準、希釈緩衝液、解離緩衝液、洗浄緩衝液、ハイブリダイゼーション緩衝液ならびにアッセイ緩衝液からなる群から選択される、試薬および装置をさらに含むことができる。内因性の核酸は、形態学的に無傷の細胞で、ｉｎ  ｓｉｔｕで増幅することができる。元素は、質量分析計を用いて測定することができる。元素は、同位体またはイオンとすることができる。元素は、貴金属、ランタニド、希土類元素、金、銀、プラチナ、ロジウム、イリジウムおよびパラジウムからなる群から選択することができる。元素には、複数の元素および／または複数の同位体および／または同位体の複数の原子が含まれてもよい。親和性生成物は、抗体、Ｆａｂ’、アプタマー、抗原、ホルモン、成長因子、受容体、タンパク質および核酸からなる群から選択することができる。キットは、粒子元素分析のための説明書を含むこともできる。
【００７７】
キットは、次の成分を含むことができる。
（ａ）ｉｎ  ｓｉｔｕ増幅試薬
（ｂ）核酸精製試薬およびデバイス
（ｃ）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション緩衝液
（ｄ）固定および透過化溶液
（ｅ）洗浄溶液
（ｆ）溶解試薬
【００７８】
出願人の教示は、上で開示される方法を提供する。本方法は、
（ａ）多重化
（ｂ）タンパク質および遺伝子の発現の同時分析
（ｃ）増幅ステップを含む、または含まない方法
（ｄ）高コストのポリメラーゼ酵素が不要の低コスト分析
（ｅ）単細胞の遺伝子分析
（ｆ）遺伝子発現の絶対定量化
を可能にする。
【００７９】
本開示で引用した全ての参考文献は、その全体において本明細書で参照により組み込まれる。
【００８０】
出願人の教示が様々な実施形態とともに記載されるが、出願人の教示がそのような実施形態に限定されることを意図するものではない。それに反し、当分野の技術者が理解するように、出願人の教示は様々な代替形態、改変形態および同等物を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】（Ａ）３つの異なる条件下でビオチン化アンチセンスオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）を用いた、２８Ｓ  ｒＲＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよびフローサイトメトリー検出を示す図。（１）−ナンセンスビオチン化オリゴヌクレオチド（「オリゴ」）とハイブリダイズさせた陰性対照細胞に対応する、（２）−４％パラホルムアルデヒドにより１５分間固定し、その後、プロテイナーゼＫ（５Ｕ／ｍｌ）により室温で１５分間処理し、２８Ｓ  ｒＲＮＡオリゴとハイブリダイズさせた細胞、（３）−４％パラホルムアルデヒドにより１５分間およびプロテイナーゼＫ（５Ｕ／ｍｌ）により３７℃で１５分間処理し、２８Ｓ  ｒＲＮＡオリゴとハイブリダイズさせた細胞、（４）−４％パラホルムアルデヒドにより１５分間固定し、次に０．３％トリトンＸ１００で、次にプロテイナーゼＫ（５Ｕ／ｍｌ）により３７℃で１５分間処理し、２８Ｓ  ｒＲＮＡオリゴとハイブリダイズさせた細胞。（４）によって表される条件は、追加実験のために選択された。（Ｂ）フローサイトメトリー（左グラフ）およびＩＣＰ−ＭＳ（右グラフ）によって分析した２８Ｓ  ｒＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの比較を示す図。
【図２】ＩＣＰ−ＭＳによる白血病細胞におけるＢＣＲ／Ａｂｌ（破過点クラスター領域／アベルソン白血病）遺伝子発現分析を示す図。（Ａ）固定化／透過化細胞とＢＣＲ／Ａｂｌ融合遺伝子のためのビオチン化オリゴヌクレオチドプローブとのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの概略図。ビオチンは、テルビウム（Ｔｂ）で標識したストレプトアビジン（ＳｔｒＡｖ）によって特定される。細胞ペレットをＨＣｌで溶解し、溶液元素ＩＣＰ−ＭＳ分析によって分析する。（Ｂ）ＢＣＲ／Ａｂｌアンチセンス、２８Ｓ  ｒＲＮＡ（陽性対照）およびナンセンスオリゴプローブ（Ｂ／Ａ）およびゼロプローブ（ｃｔｒｌ）とハイブリダイズさせたＫＧ−１ａ細胞（左グラフ）およびＫ５６２細胞（右グラフ）の実験結果、バックグラウンドおよびナンセンスプローブ応答値は差し引いた。試料は、３反復で実施した。データは、テルビウム（Ｔｂ）対イリジウム（Ｉｒ）内部標準シグナルの標準化比として提示する。
【図３】ＩＣＰ−ＭＳによる接着性癌細胞における上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子発現分析を示す図。Ａ４３１細胞を、ＥＧＦＲ、Ｄ−サイクリン、２８Ｓ  ｒＲＮＡ（陽性対照）およびナンセンス陰性対照Ｂ／Ａに対する遺伝子特異プローブとハイブリダイズさせた。（Ｂ／Ａは、陰性対照として用いるランダムな名称を有するランダムなオリゴである）試料は、３反復で実施した。データは、テルビウム（Ｔｂ）対イリジウム（Ｉｒ）内部標準シグナルの標準化比として提示する。
【図４】ＩＣＰ−ＭＳによるＫ５６２白血病細胞におけるタンパク質および遺伝子発現同時分析を示す図。（Ａ）２８Ｓ  ｒＲＮＡおよびナンセンスオリゴプローブ（Ｂ／Ａ）とのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、（Ｂ）ＢＣＲ／Ａｂｌタンパク質の免疫標識およびハイブリダイゼーションの間の陰性対照ＩｇＧ値。試料は、３反復で実施した。データは、ユーロピウム（Ｅｕ）またはテルビウム（Ｔｂ）対イリジウム（Ｉｒ）内部標準シグナルの標準化比として提示する。
【図５】ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよびＩＣＰ−ＭＳによる遺伝子発現分析のワークフローチャートを示す図。
【図６】粒子元素分析による元素標識されたビーズ遺伝子発現分析のワークフローチャートを示す図。
【図７】ＩＣＰ−ＭＳによる遺伝子およびタンパク質発現同時分析のワークフローチャートを示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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