(57)【要約】【課題】特異的生体防御能を活性化することにより、魚類の感染症を予防することができる魚類用ワクチンを提供する。【解決手段】ワクチン抗原として不活化されたフォトバクテリウム・ダムセラ・サブスピーシズ・ピシシーダ(Photobacterium damselae subsp.piscicida)、エドワジェラ・タルダ(Edwardsiella tarda)又は他の魚病の病原細菌にアジュバントとしてフコイダンを含有することを特徴とするワクチンを提供する。これを魚類の腹腔内に注射することにより特異的な生体防御能を活性化し、該病原細菌に対する免疫効果を増強することができる。未だ有効なワクチンのないブリ属魚類の類結節症、ヒラメ及びマダイのエドワジェラ感染症に対して、初めて有効なワクチンを養殖現場に供給することが可能となった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコイダンをアジュバントとして含有する魚類の病原細菌感染を予防するための魚類用ワクチン。
【請求項２】
不活化処理された魚類の病原細菌を抗原に用いる請求項１に記載の魚類用ワクチン。
【請求項３】
病原細菌が、フォトバクテリウム属、エドワジェラ属、ラクトコッカス属、ビブリオ属又はノカルジア属に属する１種類以上の魚類病原細菌であることを特徴とする請求項１〜２に記載の魚類用ワクチン。
【請求項４】
病原細菌が、フォトバクテリウム・ダムセラ・サブスピーシズ・ピシシーダ(Photobacterium damselae subsp.piscicida)及び／又はエドワジェラ・タルダ(Edwardsiella tarda)であることを特徴とする請求項１〜３に記載の魚類用ワクチン。
【請求項５】
魚類の腹腔内に注射することを特徴とする請求項１〜４に記載の魚類用ワクチン。
【請求項６】
魚類がブリ属魚類、ヒラメ又はマダイの養殖魚である請求項１〜４に記載の魚類用ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類の病原細菌に対する発症防御に関わる。特に、養殖用の魚類であるブリ属魚類の類結節症及びヒラメ又はマダイのエドワジェラ感染症及びその他の魚病細菌感染症の予防に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ぶり属魚類やヒラメ、マダイ等の養殖場では、魚類が高い密度で飼育されているため病気が発生することが多く、大きな経済的被害をもたらしている。病気の原因は、病原性細菌やウイルス、寄生虫等による感染症が主である。例えば、養殖魚における細菌性疾病については、ブリ属魚類の類結節症や連鎖球菌症、ヒラメやマダイのエドワジェラ感染症などによる被害が大きい。
【０００３】
これらの感染症に対しては、治療薬として抗生物質や合成抗菌剤投与などの対抗手段が講じられている。しかし、これら抗菌性物質を投与する場合、養魚等への残留や耐性菌の出現が懸念され、またその効果は必ずしも満足しうるものではなかった。抗菌性物質に代わるワクチンによる予防の試みは、マダイ、スズキ等のイリドウイルス用ワクチン（特許文献１を参照。）、ヒラメのラブドウイルス感染防御のＤＮＡワクチン（特許文献２を参照。）、サケ、マスのビルナウイルス用ワクチン（特許文献３を参照。）、ハタ類のウイルス性神経壊死症用ワクチン（特許文献４を参照。）、ブリ類の腸球菌症用ワクチン（特許文献５を参照。）、フグの口白症予防ワクチン（特許文献６を参照。）、サケ、マス、アユ等の冷水病ワクチン（特許文献７を参照。）等でなされてきたが、有効なワクチンが実用化されているのは連鎖球菌症に対するもののみで（特許文献８を参照）、類結節症やエドワジェラ症に対しては未だ有効なワクチンは開発されていない。
【０００４】
また、免疫力を強化する機能性食品を混入した養魚用飼料を給餌することにより、魚介類の感染を予防する試みもある。例えばムラミルジペプチドを実質的に含有しない分子量１００００以下のペプチドグリカン（ＰＧ）を有効成分とする経口投与用免疫増強剤（特許文献９を参照。）、ビブリオ属細菌の細胞壁由来のペプチドグリカンを添加した飼料による甲殻類の免疫賦活化法（特許文献１０を参照。）、フコイダンを含有する食品の継続的摂取により免疫力強化（特許文献１１を参照。）や同じくこれを含有する養魚用飼料の給餌により魚介類の感染症予防と治療に効果があること（特許文献１２を参照。）が開示されている。しかし、これらはいずれも非特異的な疾病に対する免疫力を高める効果であり、特定の病原体に対する抗体産生あるいはその能力増強効果を開示したものではない。
【０００５】
同様に、グラム陽性細菌に由来する細菌の細胞壁成分から得られるペプチドグリカンとタイコ酸の二つの物質の相乗効果により感染症を予防・治療するための薬剤（特許文献１３を参照。）及びそれらのアジュバント効果に言及した報告もある（特許文献１４を参照。）。
【０００６】
【特許文献１】特開平９−１７６０４３号公報
【特許文献２】特開２００３−１５５２５４号公報
【特許文献３】特開２００１−９７８８４号公報
【特許文献４】特開２００１−２７８８９６号公報
【特許文献５】特開平１１−３３２５５８号公報
【特許文献６】特開平６−１１３８３４号公報
【特許文献７】特開２００４−３５２６９０号公報
【特許文献８】特開２００１−１０３９６１号公報
【特許文献９】特開平１１−２５５６６４号公報
【特許文献１０】特開平１０−２２９８３１号公報
【特許文献１１】特開平１０−４１０４３号公報
【特許文献１２】特開２０００−３３６０３５号公報
【特許文献１３】特開２００１−３４２１４０号公報
【特許文献１４】特開２００１−３４２１４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
治療剤としての薬剤が魚介類に残留することは、食の安全面で問題になっており、抗菌性物質に依存しないより効果の高い新たな予防・治療剤が要望されている。しかし、養殖魚における感染症を抗菌性物質を用いることなくワクチンで予防する試みは多種なされているものの、未だ実用化されているものは少ない。ブリ属魚類の類結節症やヒラメあるいはマダイのエドワジェラ感染症などは養殖現場において重要な疾病にも拘わらずワクチンは実用化されていない。その理由として、これら不活化した病原細菌のみを含有するワクチンを魚に接種することでは感染、発病を予防する十分な免疫効果は得られないことにある。現場からは強い要望があるにも拘わらず実用化は困難な状況にあった。
【０００８】
本発明は、魚類の細菌性疾病、特に、ブリ属魚類の類結節症やヒラメあるいはマダイのエドワジェラ感染症に対して優れた予防効果を有し、育成率向上をもたらすと同時に、安価で安全性の高い魚類用ワクチンを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を達成するため鋭意研究努力の結果、フォトバクテリウム・ダムセラ・サブスピーシズ・ピシシーダ(Photobacterium damselae subsp.piscicida  以後Ｐ．ｄ．ｐ．と記す。)、エドワジェラ・タルダ(Edwardsiella tarda  以後Ｅ．ｔａｒｄａと記す。)又は他の魚病細菌と細胞性免疫賦活作用のあることが知られているフコイダンを混合して魚類の腹腔内に注射することにより、これら細菌疾病に対し特異的な抗体産生能を高め、高い発症防御能を賦与させることに成功した。
【００１０】
すなわち本発明は、不活化処理されたＰ．ｄ．ｐ．、Ｅ．ｔａｒｄａ又は他の魚病細菌にフコイダンをアジュバントとして含有させ、これら特定病原細菌に対する高い特異的免疫力を賦与することを特徴とする魚類用ワクチンを提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の第一成分であるＰ．ｄ．ｐ．、Ｅ．ｔａｒｄａ又は他の魚病細菌は、使用する株を限定しない。これらの細菌は、通常の増殖用培地で増殖させた後、ホルマリンなどで不活化したものあるいは遠心分離により回収した不活化菌体を用いるが、これに限定されるものではない。培養液中に遊離する菌体由来の物質、細胞壁断片や細胞壁抽出物も使用することができる。異なる病原菌の不活化菌体及び／又は病原菌由来の抗原を組み合わせて多価ワクチンとすることもできる。
【００１２】
一方、本発明の第二成分であるフコイダンは褐藻類のモズク、ウミウチワ、マコンブ、コンブ、ワカメ、アミジグサ等に豊富に含有されており、酸抽出法、熱水抽出法等により抽出され、人体に無害なものである。その構造は主としてフコースからなる分子量数十万前後の硫酸化多糖類で、フコースと硫酸化フコースを基本骨格とし、一部にウロン酸が結合している。本発明で使用するフコイダンは、褐藻類の種類および抽出法を特に限定しないが、アルギン酸を除いた凍結乾燥品が望ましい。フコイダン単独でも十分なアジュバント効果が得られるが、他の免疫増強剤、例えばペプチドグリカンを併用することもできる。
【００１３】
投与形態としては、Ｐ．ｄ．ｐ．、Ｅ．ｔａｒｄａ又は他の魚病細菌とフコイダンを混合し、魚類の腹腔内に注射する。これらの混合比率は、Ｐ．ｄ．ｐ．、Ｅ．ｔａｒｄａ又は他の魚病細菌１０8ＣＦＵ／ｍＬ〜１０11ＣＦＵ／ｍＬに対してフコイダンを ０.１ｗ／ｖ％〜４ｗ／ｖ％程度を混合することが好ましい。
【００１４】
投与の対象となる魚類は、養殖用海水魚であるブリ、カンパチ、ヒラマサ、マダイ、ヒラメ等が主たる対象となるが、これに限定されず観賞魚を含むすべての海水魚類を対象とすることができる。
【００１５】
感染症とは、魚類における類結節症、エドワジェラ感染症、連鎖球菌症、ビブリオ病、ノカルディア症等すべての細菌感染症を示す。
【００１６】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１７】
ブリ属魚類の類結節症発症防御に対するＰ．ｄ．ｐ．とフコイダンの併用効果を検討した。
【００１８】
(供試菌)
本実施例では、類結節症で死亡したブリ幼魚から分離、培養し、Ｐ.ｄ.ｐと確認した株を用いた。Ｐ．ｄ．ｐ．は１.５ｗ/ｖ％ＮａＣｌ加トリプトース・ホスフェイト・ブロスで２５℃、２４時間培養後ホルマリンで不活化し、遠心分離により抗原量を不活化前生菌数１０9ＣＦＵ/ｍＬに調整した。
【００１９】
(供試魚)
平均魚体重約５０ｇのブリ２００尾(各試験区５０尾)を試験に供した。２００Ｌ循環式水槽当たり５０尾の幼魚を入れ、分散器を通して空気を補給しながら水温２５℃で飼育した。試験開始前２週間、馴化のため幼魚を水槽内で事前に飼育し、感染のないことを確認した。
【００２０】
(注射材料)
１）Ｐ．ｄ．ｐ．１０9ＣＦＵ/ｍＬに対してフコイダンを２ｗ/ｖ％混合したもの
２）Ｐ．ｄ．ｐ．１０9ＣＦＵ/ｍＬ
３）２ｗ/ｖ％フコイダン溶液
【００２１】
(試験方法)
各注射材料０.１ｍＬ/尾をそれぞれ５０尾の腹腔内に注射し、残り１群を対照群とした。注射後３週目に各群１０尾を採血、残り４０尾にはＰ.ｄ.ｐ強毒株２.３×１０1ＣＦＵ/尾を腹腔内に注射して、２週間観察した。
【００２２】
【表１】
2006312595.tif 000002
免疫期間中の臨床所見を表１に示す。その結果、各群とも臨床的な異常を認めなかった。
【００２３】
【表２】
2006312595.tif 000003
免疫３週目の凝集抗体価を表２に示す。その結果、Ｐ．ｄ．ｐ．とフコイダンの混合注射群は、それぞれの単独注射群に比べて有意に高い凝集抗体価を示した。
【００２４】
攻撃後の生存率の推移を図１に示す。その結果、Ｐ．ｄ．ｐ．とフコイダンの混合注射群は、それぞれの単独注射群に比べて類結節症の感染による死亡を顕著に予防できた。
【００２５】
なお、カンパチについて、上記と同じ条件で試験を実施したが、カンパチについても表１〜表２及び図１とほぼ同様の結果が得られた。
【実施例２】
【００２６】
ヒラメのエドワジェラ症発症防御に対するＥ．ｔａｒｄａとフコイダンの併用効果を検討した。
【００２７】
(供試菌)
本実施例では、エドワジェラ症で死亡したヒラメ幼魚から分離、培養し、Ｅ．ｔａｒｄａと確認した株を用いた。Ｅ．ｔａｒｄａはトリプトース・ホスフェイト・ブロスで２５℃、２４時間培養後ホルマリンで不活化し、遠心分離により抗原量を不活化前生菌数１０10ＣＦＵ/ｍＬに調整した。
【００２８】
(供試魚)
平均魚体重約４０ｇのヒラメ２００尾(各試験区５０尾)を試験に供した。２００Ｌ循環式水槽当たり５０尾の幼魚を入れ、分散器を通して空気を補給しながら水温２３℃で飼育した。試験開始前２週間、馴化のため幼魚を水槽内で事前に飼育し、感染のないことを確認した。
【００２９】
(注射材料)
１）Ｅ．ｔａｒｄａ １０10ＣＦＵ/ｍＬに対してフコイダンを２ｗ/ｖ％混合したもの。
２）Ｅ．ｔａｒｄａ １０10ＣＦＵ/ｍＬ。
３）２ｗ/ｖ％フコイダン溶液。
【００３０】
(試験方法)
各注射材料０.１ｍＬ/尾をそれぞれ５０尾の腹腔内に注射し、残り１群を対照群とした。注射後３週目に各群１０尾を採血、残り４０尾にはＥ．ｔａｒｄａ強毒株３.５×１０2ＣＦＵ/尾を腹腔内に注射して、３週間観察した。
【００３１】
【表３】
2006312595.tif 000004
免疫期間中の臨床所見を表４に示す。その結果、各群とも臨床的な異常を認めなかった。
【００３２】
【表４】
2006312595.tif 000005
免疫３週目の凝集抗体価を表５に示す。その結果、Ｅ．ｔａｒｄａとフコイダンの混合注射群は、それぞれの単独注射群に比べて有意に高い凝集抗体価を示した。
【００３３】
攻撃後の生存率の推移を図２に示す。その結果、Ｅ．ｔａｒｄａとフコイダンの混合注射群は、それぞれの単独注射群に比べてエドワジェラ症の感染による死亡を顕著に予防できた。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】フォトバクテリウム・ダムセラ・サブスピーシズ・ピシシーダとフコイダンを使用したワクチン効果を攻撃試験による生存率で示す。
【図２】エドワジェラ・タルダとフコイダンを使用したワクチン効果を攻撃試験による生存率で示す。
【図１】
2006312595.tif 000006
【図２】
2006312595.tif 000007