(57)【要約】  本発明は、好ましくない免疫応答の調節に有用な、ダイレクト（directed）エピトープペプチド混合物の固相合成のための方法を含み、かかる方法は、公知のエピトープのベースまたは天然のアミノ酸を置換するアミノ酸の出現の同一性および頻度に関する一組の規則により規定される。得られる組成物は、治療的使用に関連のあるペプチドの混合物である。
2009536157.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
好ましくない免疫応答の改善に有用な指向性配列ポリマー（DSP）を含む組成物の製造方法であって、
(1) 自己免疫疾患に関連のある抗原のエピトープのアミノ酸配列である、第1のベースペプチド配列を選択する工程、
(2) 固相ペプチド合成によりDSPの第1のカセットを合成する工程であって、指向性配列ポリマーの第1のカセットのそれぞれのアミノ酸位置について、アミノ酸がDSPに組み込まれ、かかるアミノ酸が：
(i) 前記第1のペプチド配列中の対応する位置に見られるアミノ酸であって、a0の相対モル濃度でプールに存在するアミノ酸；
(ii) 選択されるアミノ酸配列中の位置に見られるアミノ酸の第1の置換であって、アミノ酸類似性に従って規定され、a1の相対モル濃度で混合物中に存在するアミノ酸の第1の置換；
(iii) 適用される場合の、前記選択されるアミノ酸配列中の前記位置に見られるアミノ酸の第2の置換であって、アミノ酸類似性に従って規定され、a2の相対モル濃度で混合物中に存在するアミノ酸の第2の置換；
(iv) 適用される場合の、前記選択されるアミノ酸配列中の前記位置に見られるアミノ酸の第3の置換であって、第3のアミノ酸類似性に従って規定され、a3の相対モル濃度で混合物中に存在するアミノ酸の第3の置換；および
(v) Aの固定相対モル濃度で混合物中に存在するA：アラニン
からなるアミノ酸の混合物からランダムに選択され、
混合物中のアミノ酸が互いに合成開始前に決定された固定モル入力比で存在し、
Aの相対モル量がDSP中の全アミノ酸濃度の50％より高く、a0およびa1のそれぞれが0.05〜50％の範囲内であり、a2およびa3のそれぞれが0〜50％の範囲内であり、a0+a1+a2+a3=100-Aである、工程
(3) (a) 工程(2)を2〜15サイクル繰り返し、同じ条件下でDSPを伸長させること；
(b) 工程(2)を2〜15サイクル繰り返し、各サイクルについて、混合物中のアミノ酸の種々の入力比を用いてDSPを伸長させること；
(c) 工程(1)および(2)を2〜15サイクル繰り返し、1つよりも多いベースペプチドに基づくカセットを使用してDSPを伸長させること；または
(d) 工程(2)の1サイクルで合成された2〜15カセットを集合させること；もしくは
(e) 工程(2)のある条件下で合成された第1のカセット、および工程(2)の第2の条件下で合成された第2およびそれ以上のカセットの2〜15カセットを集合させることにより、DSPの長さを伸長させる工程、
(4) 任意に、工程(2)および(3)を2〜15サイクル繰り返すことによってDSPをさらに伸長させる工程であって、各サイクルについてDSPの新しいカセットが工程(2)の前記サイクルによって設計した前記のカセットのいずれとも独立して設計する工程を含み、
工程(3)および(4)で選択されるサイクル数を、DSPの最終的な長さが約25〜300アミノ酸残基となるように選択する、方法。
【請求項２】
エピトープのアミノ酸配列が表Iに示される配列番号：1〜189からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
好ましくない免疫応答が移植された臓器の宿主の拒絶に由来する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
好ましくない免疫応答が自己免疫疾患である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
自己免疫疾患が、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、I型真性糖尿病、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、および尋常性天疱瘡からなる群より選択される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスである、請求項5記載の方法。
【請求項８】
自己免疫疾患がI型真性糖尿病である、請求項5記載の方法。
【請求項９】
自己免疫疾患が重症筋無力症である、請求項5記載の方法。
【請求項１０】
自己免疫疾患が慢性関節リウマチである、請求項5記載の方法。
【請求項１１】
自己免疫疾患が尋常性天疱瘡である、請求項5記載の方法。
【請求項１２】
エピトープのアミノ酸配列が、オステオポンチン、HLAタンパク質、ミエリンオリゴデンドライト糖タンパク質、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、プロテオリピドタンパク質、およびミエリン関連糖タンパク質、S100β、ヒートショックタンパク質α、βクリスタリン、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（MOBP）、ならびに2',3'サイクリックヌクレオチド3'-ホスホジエステラーゼからなる群より選択されるタンパク質の部分配列である、請求項6記載の方法。
【請求項１３】
エピトープのアミノ酸配列が配列番号：6〜32からなる群より選択される、請求項6記載の方法。
【請求項１４】
エピトープのアミノ酸配列が、hsp60、hsp70、Ro60、La、SmDおよび70-kDa U1RNPから選択されるタンパク質の部分配列である、請求項7記載の方法。
【請求項１５】
エピトープのアミノ酸配列が配列番号：92〜140からなる群より選択される、請求項7記載の方法。
【請求項１６】
エピトープのアミノ酸配列が、hsp60、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD65）、インスリノーマ抗原2（IA-2）およびインシュリンからなる群より選択されるタンパク質の部分配列である、請求項8記載の方法。
【請求項１７】
エピトープのアミノ酸配列のアミノ酸配列が配列番号：44〜91からなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１８】
エピトープのアミノ酸配列が、アセチルコリンレセプター（AChR）α-サブユニットおよび筋肉特異的レセプターチロシンキナーゼ（MuSK）からなる群より選択されるタンパク質の部分配列である、請求項9記載の方法。
【請求項１９】
エピトープのアミノ酸配列が、配列番号：1〜2からなる群より選択される、請求項9記載の方法。
【請求項２０】
エピトープのアミノ酸配列が、II型コラーゲンおよびhsp60からなる群より選択されるタンパク質の部分配列である、請求項10記載の方法。
【請求項２１】
エピトープのアミノ酸配列が、配列番号：3〜5からなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項２２】
エピトープのアミノ酸配列が、デスモグレイン3（Dsg3）からなる群より選択されるタンパク質の部分配列である、請求項11記載の方法。
【請求項２３】
エピトープのアミノ酸配列が、配列番号：33〜43からなる群より選択される、請求項11記載の方法。
【請求項２４】
アミノ酸類似性が図4に示される類似性の表に従って規定される、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
好ましくない免疫応答の改善に有用な指向性配列ポリマー（DSP）を含む組成物の製造方法であって、
(1) 自己免疫疾患に関連のある抗原のエピトープのアミノ酸配列である第1のベースペプチド配列を選択する工程、
(2) 固相ペプチド合成によりDSPの第1のカセットを合成する工程であって、指向性配列ポリマーの第1のカセットのそれぞれのアミノ酸位置について、アミノ酸がDSPに組み込まれ、かかるアミノ酸が：
(i) 前記第1のペプチド配列の対応する位置に見られるアミノ酸であって、a0の相対モル濃度でプールに存在するアミノ酸；
(ii) 選択されるアミノ酸配列の位置に見られるアミノ酸の第1の置換であって、最も有力な保存された置換であり、a1の相対モル濃度で混合物中に存在するアミノ酸の第1の置換；
(iii) 適用される場合の、前記選択されるアミノ酸配列の前記位置に見られるアミノ酸の第2の置換であって、2番目に有力な保存された置換であり、a2の相対モル濃度で混合物中に存在するアミノ酸の第2の置換；
(iv) 適用される場合の、前記選択されるアミノ酸配列の前記位置に見られるアミノ酸の第3の置換であって、3番目に有力な保存された置換であり、a3の相対モル濃度で混合物中に存在するアミノ酸の第3の置換；および
(v) Aの固定相対モル濃度で混合物中に存在するA：アラニン
からなるアミノ酸の混合物からランダムに選択され、
混合物中のアミノ酸が互いに合成開始前に決定された固定モル入力比で存在し、
Aの相対モル量がDSP中の全アミノ酸濃度の50％より高く、a0およびa1のそれぞれが0.05〜50％の範囲内であり、a2およびa3のそれぞれが0〜50％の範囲内であり、a0+a1+a2+a3=100-Aである、工程、
(3) (a) 工程(2)を2〜15サイクル繰り返し、同じ条件下でDSPを伸長させること；
(b) 工程(2)を2〜15サイクル繰り返し、各サイクルについて、混合物中のアミノ酸の種々の入力比を使用してDSPを伸長させること；
(c) 工程(1)および(2)を2〜15サイクル繰り返し、1つより多いベースペプチドに基づくカセットを使用してDSPを伸長させること；または
(d) 工程(2)の1サイクルで合成された2〜15カセットを集合させること；もしくは
(e) 工程(2)のある条件下で合成された第1のカセットおよび工程(2)の第2の条件下で合成された第2およびそれ以上のカセットの2〜15カセットを集合させることにより、DSPの長さを伸長させる工程、
(4) 任意に、工程(2)および(3)を2〜15サイクル繰り返してDSPをさらに伸長させる工程であって、各サイクルについてDSPの新しいカセットを工程(2)の前記サイクルにより設計した前記カセットのいずれとも独立して設計する工程を含み、
工程(3)および(4)で選択されるサイクル数を、DSPの最終的な長さが約25〜300アミノ酸残基となるように選択し、保存された置換をエピトープの公知のバリアントの実験データに基づいて決定する、方法。
【請求項２６】
請求項1記載の方法により製造された指向性配列ポリマー（DSP）を含む組成物。
【請求項２７】
約25〜300アミノ酸の長さを有する指向性配列ポリマー（DSP）を含む組成物であって、かかるDSPのそれぞれが2〜15のカセットを含み、各ブロックが8〜30アミノ酸を含み、
各カセットが第1のベースペプチド配列由来であり、配列が自己免疫疾患に関連する抗原のエピトープのアミノ酸配列であり、カセットの各位置のアミノ酸が：
(i) 第1のベースペプチド配列の対応する位置に見られるアミノ酸a0；
(ii) 適用される場合の、選択されるアミノ酸配列の位置に見られるアミノ酸a1の第1の置換であり、アミノ酸類似性に従って規定される第1の置換：
(iii) 適用される場合の、前記選択されるアミノ酸配列に前記位置に見られるアミノ酸a3の第2の置換であり、アミノ酸類似性に従って規定される第2の置換；
(iv) 適用される場合の、前記選択されるアミノ酸配列の前記位置に見られるアミノ酸、a4の第3の置換であり、アミノ酸類似性に従って規定される第3の置換；および
(v) A：アラニン；
からなる群より選択され、
混合物中のアミノ酸が互いに固定モル比で存在し、
Aの相対モル量がDSPを含む全アミノ酸の少なくとも20％である、組成物。
【請求項２８】
前記DSPがカセットを含み、カセットが第1のベースペプチド配列に由来するアミノ酸配列を含む、請求項27記載の組成物。
【請求項２９】
前記DSPが1つ以上のカセットを含み、カセットが第1のベースペプチド配列由来のアミノ酸配列を有する1つ以上のカセットおよび第2のエピトープの第2のベースペプチド配列由来のアミノ酸配列を有する1つ以上のカセットを含む、請求項27記載の組成物。
【請求項３０】
第1のベースペプチド配列が配列番号：1〜189から選択される、請求項27記載の組成物。
【請求項３１】
自己免疫疾患が、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、I型真性糖尿病、重症性筋無力症、慢性関節リウマチおよび尋常性天疱瘡からなる群より選択される、請求項27記載の組成物。
【請求項３２】
第1のベースペプチド配列のアミノ酸配列が：
(a) オステオポンチン、HLAタンパク質、ミエリンオリゴデンドライト糖タンパク質、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、プロテオリピドタンパク質、およびミエリン関連糖タンパク質、S100β、熱ショックタンパク質α、βクリスタリン、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（MOBP）、2',3'サイクリックヌクレオチド3'-ホスホジエステラーゼ；
(b) hsp60、hsp70、Ro60、La、SmD、および70-kDa U1RNP；
(c) グルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD65）、インスリノーマ抗原2（IA-2）、インシュリン；
(d) アセチルコリンレセプター（AChR）α-サブユニットおよび筋肉特異的レセプターチロシンキナーゼ（MuSK）；
(e) II型コラーゲン；ならびに
(f) デスモグレイン3（Dsg3）
からなる群より選択されるタンパク質の部分配列である、請求項27記載の組成物。
【請求項３３】
アミノ酸類似性が、図4に示される類似性の表に従って規定される、請求項27記載の組成物。
【請求項３４】
アミノ酸類似性が、エピトープの公知のバリアントの実験データに基づいて決定される、請求項27記載の組成物。
【請求項３５】
治療を必要とする被験体に、疾患の改善のための投与養生法の有効量のDSP組成物を投与する工程を含む、指向性配列ポリマー（DSP）組成物を投与することによる自己免疫疾患の治療方法であって、DSP組成物が請求項24〜30のいずれかから選択される、方法。
【請求項３６】
自己免疫疾患が、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、I型真性糖尿病、重症性筋無力症、慢性関節リウマチおよび尋常性天疱瘡からなる群より選択される、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
自己免疫疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項26〜34いずれか記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、2006年4月13日に出願された、米国特許仮出願第60/792,085号の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本出願は、免疫調節ペプチド混合物の改善された組成物の作製方法を提供し、好ましくない免疫応答の調節方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
免疫調節
多くの疾患状態は、少なくとも部分的に、生物の好ましくないまたは過剰な免疫応答の結果である。移植臓器の拒絶は、好ましくない免疫応答の自明の例である。移植の拒絶は、生物が免疫応答結果を調節できないことで病状となる象徴状態である。臓器移植において、移植拒絶となる好ましくない免疫応答は、(1)移植レシピエントのT細胞がT細胞レセプター(「TCR」)を直接介して、既にいくつかのペプチドを提示している移植組織上の外来主要組織適合性複合体（「MHC」)分子を認識する「直接認識」、または抗原決定基が処理され、レシピエントMHCによって提示された後にレシピエントT細胞が移植由来の抗原決定基を認識する「間接認識」；(2)移植片、より具体的に移植組織の細胞に存在するヒト白血球抗原（「HLA」）分子に対して指向された、移植片へのレシピエントの曝露によって生じる抗体の生成；および(3)移植片に対するレシピエントの循環において前形成された抗移植片抗体の結合によって誘発される。研究によって、これらの免疫応答はドナー由来抗原：MHC（直接または間接認識を介して）、副組織適合性抗原（「mH」）、および臓器由来抗原の3つの種類に関することが示された。
【０００４】
首尾よい移植は、持続性キメラ現象を含む好ましくない免疫応答の防止に依存する。持続性キメラ現象は、レシピエントが外来移植片の寛容性を発現し、免疫応答に供されることなく移植組織がレシピエント内で生存できる現象である。実験条件下で、持続性キメラ現象は、移植拒絶免疫応答を刺激するものと密接に関連するペプチドによって短時間であっても誘導することができる。(B. Murphy et al., J. Am. Soc. Nephrol., 2003, 14:1053-1065; C. LeGuern, Trends Immunol., 2003, 24:633-638)。エピトープ拡散のプロセスを介した攻撃エピトープの拡大の可能性は困難である（N. Suciu-Foca et al., Immunol. Rev., 1998, 164:241）。
【０００５】
移植の医師は、日和見感染と戦う患者の能力を損なうことなく、レシピエントの免疫応答が外来として何を検知するかの存在によって生じる免疫応答を阻害する両方の必要性を長く認識していた。現在、移植患者は、患者の全体的な免疫応答および反応性を下げる免疫抑制療法でよく治療される。免疫抑制療法は、既に誘発された免疫応答への体の反応を弱めることを意図し、多くの望ましくない副作用を伴う。有意な望ましくない副作用のために、単一免疫抑制剤は移植レシピエントを治療するために連続して使用できず、治療の過程には1組の副作用を有する１つの免疫抑制剤を用いること、それぞれの免疫抑制剤へのレシピエントの曝露およびその副作用を限定するために異なる組の副作用を有する第二の免疫抑制剤、および第三のものなどに変更することが含まれる。例えば、プレドニゾンまたはメチルプレドニゾンのようなステロイドは、強力な免疫抑制剤であるが、白内障、高血糖、多毛症、挫傷、ざ瘡、骨成長抑制、および潰瘍性食道炎を誘導することがある。また、ステロイドの長期使用は骨損失と関連している。広く使用される免疫抑制剤のシクロスポリンA(CsA)は、腎毒素であり、治療期間後にタクロリマス(TAC)とよく交換される。非急性拒絶の治療のために、アザチオプリンが使用され、その副作用は白血球減少、貧血、熱、悪寒、吐き気および嘔吐を含む。どんな免疫抑制物が使用されるかに関わらず、患者を任意の種類の感染に脆弱のままにする免疫系の一般妥協に加えて、免疫抑制剤を用いた長期治療に関連する最も実質的な副作用の１つは、カポジ肉腫のような移植関連悪性物の発生である。これらの現在の最先端治療の使用を低減または止めるための一部の医師および患者の強い欲求がある。（Pharmacotherapy：A pathophysiologic Approach, 第５版 2002, McGraw Hill.）免疫抑制療法を継続せずに持続性キメラ現象の臨床目標を満たすことを説明することは困難である。
【０００６】
免疫抑制とは対照的に、免疫調節は好ましくない免疫応答の原因を標的とする。免疫調節は、免疫の体機構の標的による抗原／エピトープ非特異的な様式、または抗原／エピトープ特異的様式で試みることができる。抗原／エピトープ非特異的治療の例として、Tリンパ球またはその機能の調節を直接標的とした治療が、バイオテクノロジーツールを用いて開発されている。かかる治療に有用な治療剤としては、ムロモナブ-CD3(OKT3)、抗リンパ球グロブリン(ALG)、抗胸腺細胞グロブリン(ATG)、またはインターロイキン-2レセプターモノクローナル抗体(「mAb」)ダクリズマブまたはバシリキシマブが挙げられる。他の薬剤としては、可溶性CTLA-4、抗CD154 mAb;抗CD11a；VLA-4を阻害するヒト化mAb;抗CD2、CD3、またはCD4抗体；および抗CD152抗体が挙げられる(J.B. Matthews et al., Amer. J. Transplantation, 2003, 3:794-80)。これらの全ての治療剤は、例えばプレドニゾンと比較して移植組織に対するレシピエントの免疫系の非応答状態を副作用の減少と共に誘導してもよいが、全体リンパ球照射後のATG投与の組み合わせ治療後の免疫抑制剤回収などの制限された報告を除いて、該療法は免疫抑制治療を継続しないと持続性キメラ現象の臨床目標をなお満たさない(S. Strober et al., Transplantation, 2004 Mar 27;77(6):932-936)。さらに、これらの療法はまた、損なわれた全体免疫機能の魅力の無い副作用を被る。
【０００７】
抗原非特異的免疫調節アプローチとは対照的に、免疫系はまた、抗原／エピトープ特異的様式で再調整または調節することができる。かかる種類の免疫調節は、MHCおよび抗原によって形成された複合体のTCR認識、またはエピトープ自体のB細胞レセプター(「BCR」)認識のいずれかを介して特定の抗原決定基に対する応答を生じる（mount）免疫系の能力を増大または減少するプロセスである。特定の抗原決定基に対するが全体としての免疫系に対さないプロセスの特異性のために、抗原特異的免疫調節は、免疫系全体に影響を及ぼす免疫抑制治療のような現在の治療様相に比べて望ましくない副作用が少ないなどの利点を有する。
【０００８】
抗原決定基特異的免疫調節性治療は、宿主Tリンパ球のドナー特異的寛容の誘導によってかかる持続性キメラ現象の確立を助長することができる。これらの抗原の任意および全てに対する反応の免疫調節が、移植拒絶の減衰または緩和、および持続性キメラ現象の確立を助長することができる。研究は、特定の免疫調節ペプチドによる免疫調節作用の１つの機構が、他の場合にドナー由来抗原に結合する免疫調節ペプチドがT細胞に結合して、T細胞機能の種々の活性化となるものであってもよいことを示す。この機構は胸腺を伴う寛容を中枢で誘導することが示唆されている(G. Benichou et al. Immunol. Today, 1997, 18(2):67-72)。免疫調節による宿主Tリンパ球におけるドナー特異的寛容の誘導を介した免疫抑制治療を伴わずに持続性キメラ現象を達成するデモンストレーションが、3M KCl抽出ドナーMHC由来ペプチドからの一連の決定基の胸腺注入による次の移植への寛容を、マウスを用いて誘導した研究者グループによって行われた。2つの用量の抗T細胞抗体が循環T細胞を排除するために最初に与えられた。次にドナーMHCから抽出された8つのペプチド配列を組み合わせて送達した。処理マウスは次の移植を寛容した。対照として、研究者は、移植片拒絶を生じる胸腺切除を行った。研究は中枢誘導寛容の重要性の例である(T. Hamashima et al., Transplantation, 1994 Jul 15;58(1):105-7)。従って、T細胞に結合するT細胞刺激抗原に類似する適切なペプチドの設計が持続性キメラ現象を達成するために有益である。
【０００９】
しかし、エピトープ拡散のプロセスを介した攻撃エピトープの拡大の可能性は困難である。(N. Suciu-Foca et al., Immunol. Rev. 1998, 164:241)。従って、移植において、特定の免疫応答が好ましくない自明の例において、経時で関連抗原決定基を調節する能力の非存在下で、唯一の代替物が非特異的免疫調節療法、または免疫抑制療法であることが明らかである。
【００１０】
好ましくない免疫応答の他の例は、自己免疫疾患である。自己免疫疾患と移植拒絶との間の1つの重要な背景差異は原因(offending)抗原決定基が一般的により限定され、定義可能であるということである。自己免疫疾患の誘発は定義できず、既存因子および／または環境因子によって決定されてもよいが、病理的状態の直接原因は多くの自己免疫疾患で同定されている。自己免疫疾患は、自分の抗原(自己抗原)に対して指向される不適切な免疫応答から生じ、自己寛容の正常状態からの逸脱である。自己抗原に対して反応可能なT細胞およびB細胞の生成が初期発生または末梢での成熟後のいずれかで生じる事象によって中枢で妨げられるまたは改変されている場合に自己寛容が生じる。T細胞レセプター(TCR)を介してT細胞に処理ペプチドを結合し、かつ提示する能力によって免疫応答の調節に中心的役割を果たす細胞表面タンパク質は、クラスIおよびクラスII MHCである(J.B. Rothbard et al., Annu. Rev. Immunol., 1991, 9:527)。
【００１１】
従って、自己免疫応答の緩和のための介入の誘引点は、リンパ球表面タンパク質MHC分子セット、例えばHLA-DR、-DQおよび-DP自身を介するか、またはこれらが示すペプチドとの組み合わせである。種々のHLAアレルは、ペプチドの結合に直接関わるアミノ酸の差異のために細胞外および細胞内環境に見られるタンパク質断片の変化する親和性による抗原決定基特性を介した多様な応答を生み出す。哺乳動物集団に多数の選択的形態または対立的形態があるが、これらのうちわずかの対立的形態だけが疾患関連抗原決定基と関連する。特定の自己免疫疾患、例えばMSおよびRAに罹患した被験体のゲノムは、疾患と関連する1つ以上のかかる特徴的MHCクラスIIアレルを保有する可能性が高いことが当業者に十分に理解されている。例えば、HLA-DR2(DRB1*1501)は多発性硬化症と関連し、HLA-DR1(DRBI*0101)またはHLA-DR4(DRB1*0401)は慢性関節リウマチと関連する。
【００１２】
疾患関連抗原決定基は、自己免疫応答と単純に関連するもの、または疾患プロセス自体の原因の部分であるものとして記載されたタンパク質に由来する。ペプチドへと処理され、インタクトなHLAによって提示される場合に免疫学的寛容の生成または調節のいずれかで役割を果たし得るHLA中には高度に保存された配列がある(B. Murphy and A.M. Krensky, J. Am. Soc. Nephrol., 1999, 10:1346-55に概説される)。A. Snijdersらは、慢性関節リウマチに対して保護的であり、最も関連するペプチド部分がDERAAであるHLA-DRB1によって提示される１つの特定配列(KDILEDERAAVDTYC)を議論しているが(J. Immunol., 2001, 166:4987-93)、他のものは配列QKRAAを有するHLA-DRB1アレルを保有する個体が慢性関節リウマチにかかりやすい場合に「共有エピトープ仮説」(P.K. Gregersen et al., Arthritis Rheumatism 1987 Nov;30(11):1205-13)として公知のものを進めた。他の研究者は熱ショックタンパク質(hsp)およびこれらに由来するペプチドが免疫調節特性を有することができることを示した(S.M. Anderton et al., J. Exp. Med., 1995, 181 :943-952; J.A. van Roon et al, J. Clin. Invest., 1997, 100:459-063)。特にhsp60に由来し、p277と呼ばれる１つのペプチドVLGGGVALLRVIPALDSLTPANEDは、I型糖尿病との関係で明らかな活性を示した(I. Raz et al., Lancet, 2001, 358:1749-52)。エピトープ配列のさらなる供給源は配列DNAjP1 ペプチドまたは関連ペプチド (QKRAAYDQYGHAAFE; Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 101:4228-33; 米国特許第6,989,146号)などの哺乳動物MHCタンパク質の配列の病原体模倣物由来であってもよい。疾患関連を有し、これに由来する他のタンパク質およびペプチドは:糖尿病でグルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)(M.A. Atkinson et al. J. Clin. Invest., 1994, 94:2125-29; D.B. Wilson J. Autoimmun., 2003, 20:199-201); 多発性硬化症でミエリン塩基性タンパク質(MBP)、ミエリン関連糖タンパク質(MAG)、プロテオリピドタンパク質(PLP)、およびミエリンオリゴデンドライト糖タンパク質(MOG)などのミエリン関連タンパク質(P. Fontoura et al., Int. Rev. Immunol., 2005, 24:415-46に概説される);狼瘡でRo60、SmDおよび他のリボ核タンパク質抗原(R. Pal, et al., J. Immunol., 2005, 175:7669-77; Seshmukh et al., J. Immunol., 2000, 164:6655-61; R.R. Singh, Mol. Immunol., 2004, 40:1137-45);または重症筋無力症(MG)でアセチルコリンレセプター(AChR)(S.L. Kirshner, et al. Scand. J. Immunol., 1996, 44:512-21);または尋常性天疱瘡(PV)でデスモグレイン3(DsG3)(Wucherpfennig et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1995, 92:11935-9; Lin et al., J. Clin. Invest., 1997, 99:31-40; Veldman et al., J. Immunol., 2004 172:3883-92; Angelini el al., J. Translational Med., 2006, 4:43; 米国特許第5,874,531号; 米国特許第7,084,247号)である。
【００１３】
介入の点として多くの自己免疫疾患に関連したHLAアレルおよびその関連抗原決定基を用いることの魅力にも関わらず、本知識に基づいた治療剤は十分に開発されていない。代わりに、任意の特定の抗原決定基に特異的でない多くの免疫調節治療剤が、開発され、自己免疫疾患を治療するために使用されており、低分子量の炎症化合物の形成を妨げることができるシクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)インヒビター; TNFを隔離する抗-TNF特異的モノクローナル抗体または抗体断片、もしくは可溶性形態のTNFレセプターなどの腫瘍壊死因子(TNF)などの炎症のタンパク質メディエーターのインヒビター;および例えばCD4レセプターもしくは細胞接着レセプターICAM-1の阻害による、T細胞の表面のタンパク質を標的とし、かつ抗原提示細胞(APC)との相互作用を一般的に妨げる薬剤などの一般的な抗炎症剤が含まれる。しかし、これらの種類の抗原決定基に非特異的な免疫調節性治療剤は、慢性的な第一線の治療としてその魅力を減少する残余の免疫抑制様副作用を有する。また、治療剤として（抗体のような）天然フォールディングタンパク質を有する組成物は生成、調製、保存および送達における問題に遭遇することがある。これらのいくつかの問題は病院環境での患者への送達を必要とする。
【００１４】
合成治療ペプチドを作製するための戦略
創薬は2つの主要な要素、リード(lead)生成およびリード最適化に一般化することができる。コンビナトリアル化学(CC)の開発および探求によってまさに基本的なレベルでの合理的設計対ランダム生成の使用の相違が見られる。ある一面で、本発明者らは分子の合理的設計において研究者を補助するようなCCの使用を見出す。その例は治療目的の2つ以上の活性分子間での構造/活性相関(SAR)の発見に見ることができる。他の面で、本発明者らは、CCを用いて研究者が特異的活性に基づいて発見された新規分子の設計を研究者のために定義することを発見する。その例はリード生成に使用されるランダムライブラリーの生成であり、それによってリードが選抜され、さらに最適化される。
【００１５】
ペプチドライブラリーの合成に適用されるように、コンビナトリアル化学の技術分野の水準における熟練者のレベルが上がっており、高い多様性で非常に信頼性があり、かつ純粋なペプチドの混合物を作り出す。これらの多様なペプチドライブラリーの使用によってリード生成および最適化に焦点が当てられている。この戦略は、特定の活性を示す単一の組のペプチドまたは限定された組のペプチドを定義することを意図して、目的の標的に対するライブラリーにおける広大な数の個々のペプチド配列をスクリーニングすることを当然に伴う。次にこの単一の組のペプチド、または限定された組のペプチドは、次に標的に対する活性を増大するように改変される候補となる。このプロセスを図１Aに概略して表わす。
【００１６】
この技術分野の従業者の課題は、観察される活性の原因となる単一の組または限定された組のペプチドを解析(deconvolute)するか、または正確に定義することであった。解析に関連する困難によって、個々のペプチドの解像度およびペプチドの個々のアミノ酸の同定を固有に高める合成方法を作製するような一部の従業者に対して多くの努力が引き起こされた。
【００１７】
コンビナトリアル化学で作製されたライブラリーによって提示された多くの候補から標的ペプチドを効率的に同定するために、様々な合成方法およびアプローチが開発された。これらの合成方法は多数の候補を提供することを目的とし、陽性結果が得られる場合であっても残りから陽性種を苦労して単離する必要はなくペプチドの同定をすばやく決定することを目的とする。これに関して本技術分野の従業者によって進められた努力によって、産業全般視野の方法の究極的な有用性が示され、これらのライブラリーのランダム複雑性が所望の活性のスクリーニング法を行うことを可能にする。
【００１８】
コンビナトリアル法のサブタイプの得られた進化の例としては、複数合成、反復合成、ポジショナルスキャニング、および1化合物-1ビーズポストアッセイ同定設計が挙げられる。
【００１９】
「複数合成」は、別々の化合物が単離化合物のライブラリーを作製するように同時に合成される任意の方法を提供する。これらの化合物の同定は合成の規則で公知である。H.M. Greysen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1984, 81 :3998は複数合成方法を使用し、口蹄病ウイルスのVPIタンパク質に対して惹起された抗体に結合するペプチドを同定した。研究者は抗体によって認識されるエピトープとしてGDLQVLを同定した。この場合で著者らは96ウェルマイクロプレートアレイのピン上でVPI配列を示す108個の重複するペプチドを合成した。
【００２０】
「反復合成/スクリーニング」は、ペプチド配列の個々の残基の同定の決定を可能にするペプチド合成の方法を含む。反復合成の例はR. A. Houghten et al., Nature, 1991, 354:84-86に見ることができ、また、抗体結合エピトープを決定する。これらの研究者はELISA型アッセイ形式を用いて配列YPYDVPDYASLRSを同定した。第一ライブラリーは第一の固定2残基を有する324プールのペプチドからなり、ペプチドはO1O2XXXXとして示すことができ、式中、O1およびO2は固定残基であり、Xはランダムに選択される。該方法は固定残基としてDVを同定した。次の工程は、式中O1が再度固定残基であるDVO1XXXとして示すことができるペプチドを合成して位置3について同じことを行うことであった。該方法により3番目位置でどの残基が所望の結合を引き出すかを同定した場合に、その残基は不変の3番目残基として採用され、4番目位置が同様の様式で探索された。ネイティブ配列DVPDYAが同定されるまで方法を続けた。
【００２１】
「ポジショナルスキャニング」はそれぞれ個々のペプチドの活性の決定を可能にするペプチドの複合混合物を生成する合成方法である。スクリーニング結果に基づいて、派生ペプチドが次に最適化のために別々に合成できる。C. Pinilla et al., Biochem J., 1994, 301:847-853に見られるように、ポジショナルスキャニングライブラリーが同じYPYDVPDYASLRS-結合抗体と結合するデカペプチドを同定するために使用された。この場合に10個の異なるライブラリーがそれぞれ、ペプチドの10位置のそれぞれに規定されたアミノ酸を有する20プールを含む。15個のペプチドが同定された。
【００２２】
また、上記方法のそれぞれは酵素基質(J.H. Till et al., J. Biol. Chem., 1994, 269:7423-7428, J. Wu et al, Biochemistry, 1994, 33:14825-14833, W. Tegge et al., Biochemistry, 1995, 34:10569-10577)、または酵素インヒビター(M. Bastos et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1995, 92:6738-6742, Meldal et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1994, 91 :3314-3318), R.A. Owens et al., Biomed Biophys. Re.s Commun., 1994, 181:402-408, J. Eichler. et al., Pept. Res., 1994, 7:300-7)を同定するために使用された。これらの強力なツールによって、研究者は所望の活性を有する単一種を同定するためのコンビナトリアルペプチドライブラリーを合理的に設計できる。
【００２３】
コンビナトリアルライブラリーからの特定ペプチドの同定が強力でかつ明確であってもよいが、それ自身治療上有用でないリードペプチドの開始点および同定としてのみ働いてもよい。同定されたエピトープは、これが自己タンパク質に似ているか、または治療が軽減することを目的とするその状態をおそらく悪化させる場合に免疫系で無視されてもよい。かかるペプチドは直接的に治療上有用ではない。しかし、かかるペプチドに基づいて、好ましくない免疫応答の緩和物として作用するエピトープ反応性アナログを作製してもよい。
【００２４】
１つのかかるアプローチは改変ペプチドリガンド(APL)の作製である。 このアプローチは図1Bに概略して表わされる。APLはネイティブ免疫原性ペプチドリガンドからの少数のアミノ酸変化を含むアナログペプチドとして定義される。かかるAPLのいくつかはT細胞レセプターに対するアンタゴニストとして作用し、好ましくない免疫効果を生じる抗原による刺激結合を阻害する。Evabold et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1994 Mar 15;91(6):2300-4。しかし、ネイティブ応答の認識がアゴニスト様反応を誘導してもよいと同時に、APLは部分的アゴニスト応答を誘導してもよいか、または反応性T細胞集団のアネルギーの状態を誘導してもよい。同種異系移植片拒絶療法の背景でAPLを議論する際に、Fairchild et al., Curr. Topics Peptide Protein Res., 2004, 6:237-44は、１つのTCRのアンタゴニストとして作用するAPLが別のものについてアゴニストになってもよく、APLの合理的設計を複雑にすることを記載する。APLの開発の障害の解決は、動物系で開発された応答をヒトに置き換える点で困難である。
【００２５】
これらの挑戦にも関わらず、MPB83〜99
2009536157.tif 000003
がAPLで作製され、太字および下線アミノ酸残基「E」、「N」、「E」および「K」を置換して
2009536157.tif 000004
からなる単一ペプチド配列とすることで制限されたヒト試行に置いた。Kim el al. Clinical Immunology, 2002, 104:105-114。著者らはペプチドに対する長期免疫反応性を記載しているが、治療はMRIを用いた評価によって臨床上効果的でないと考えられた。従って、APLは、同定されると、治療剤として使用することができるが、その効果は臨床効力の観点で制限される場合がある。
【００２６】
多発性硬化症の発症の途中で、反応性エピトープは不変のままではないことが以前に観察された。つまり、MSの発症と関連する自己認識は、自己反応の多様性、可塑性、および不安定性を特徴とする発症プロセスであり、標的エピトープは経時で変化し、典型的にミエリンプロテオリピドタンパク質上のあるエピトープからアミノ酸残基を重複するが元々のエピトープのいずれかの側に1個または数個のアミノ酸をシフトするものである。この現象の結果は、免疫治療薬物がオリジナルエピトープを標的とした場合に、経時で、薬物の機構に対する耐性のためではなく単純に標的がもはや有効でないために有効でなくなるということである。J. Clin. Invest., 1997, 99:1682-1690。
【００２７】
薬物へのペプチドの混合物のような研究概念を行うことを意図した方法はペプチドデンドリマー構造である。ペプチドデンドリマーは、混合物におけるそれぞれのペプチドの一貫した比率および量の患者への送達を保証することによって部分的に可溶性ペプチド混合物の特定の製造問題を解決する。このアプローチは図1Cに概略して表わされる。
【００２８】
デンドリマーは多様である。これらは2KDaから100KDaより大きいサイズを範囲とすることができる。デンドリマーの設計は天然生物学的構造の2つの特色：球状構造および多価を模倣することを意図する。２つの包括概説に記載されるように(P. Niederhafher et al., J. Peptide Sci. 11:757-788; K. Sadler and J.P. Tam, Rev. Mol. Biotechnol., 2002, 90:195-229)、これらは放射またはくさび型様の様式で組織化された高度に分岐した構成成分を含む複合化合物であり、広範な3次元構造を有することが意図される。これらは３つの異なる構造特徴：中心コア表面機能性および２つを連結する分岐単位を有する。ペプチドデンドリマーは、遺伝子発現治療剤としてのRNAおよびDNA、診断薬としてバイオセンサーシステム、自己免疫疾患または癌転移のインヒビターの送達のためのビヒクルとして設計される。これらのそれぞれの適用の背後にある戦略は、球状多価構造を使用してリガンド：基質相互作用を増幅することである (D. Zanini and R. Roy, J. Org. Chem., 1998, 63:3468-3491; J. Haensler and F.C. Szoka, Bioconjug Chem., 1993, 4:372-379)。
【００２９】
デンドリマーはアミノ、ヒドロキシル、カルボキシ、ポリ(プロピレンイミン)、シリコンおよびポリアミノアミンコアを用いて作製されている(G.M. Dykes et al., J. Chem. Technol. Biotechnol, 2001, 76:903-918, P. Sadler and J. Jezek, Rev. Mol Biotechnol., 2002, 80:195-229,およびJ.P. Tam, Methods Org. Chemistry, 2004, Vol E22d 129-168。ペプチドデンドリマーは3つの種類:移植ペプチドデンドリマー、分岐ポリアミノ酸および複数抗原ペプチド(MAP)に分けることができる。
【００３０】
MAPの分岐戦略は広く変化する。第一世代分岐の大半はリジンを使用している。MAPの第二世代固相合成はプロリンに関心がある。その関心は生成中の反応性を低減する第二級アミンの特性および多くの細胞機能の役割の両方に由来すると言われている。
【００３１】
単純MAPは分岐(divergent)と呼ばれる種類の合成戦略により固相化学を用いて合成された。第二工程で様々な官能基に共有結合された樹状β-アラニン単位の同心殻を生成する2段階反復反応を含む合成方法が記載されている(Kojima et al., Bioconjugate Chem., 2000, 11 :910-17)。分岐戦略を用いて合成されるこれらの種類のMAPは、精製および特徴付けがより複雑なMAPで擁護できないので、必然的に数個の異なる一員を用いた単純な分岐スキームを有する。最終生成物は最終生成物に類似する特性を有する欠失化合物から精製される必要がある。精製は、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)、または電気移動法を用いて記載されている。
【００３２】
複合MAP、例えば、多数の分岐部分を有するものについて、収束合成(convergent synthesis)が好ましい合成戦略である。収束合成は断片濃縮または前精製断片のライゲーションのいずれかを用いて行うことができる。天然(真ペプチド結合が作製される)、チオール、ヒドラゾン、または他の多くの種類のライゲーションがある。収束合成戦略を用いて調製されたMAPは、最終生成物が反応副産物と明らかに異なって見える場合により容易に精製される。HPLCは収束MAPを精製するために最初に使用された(J.C. Spetzler et al., Int. J. Pept. Protein Res., 1995, 45:78-85)。
【００３３】
しかし、製造の高いコストおよび次の分析開発は、この技術が現在のところ商業的にさらに開発されることを妨げる。
【００３４】
上記全ての戦略は、治療ペプチド組成物におけるバリエーションの利点を認識するが、定義された免疫学応答を起こす1つ以上の定義ペプチド配列があるという概念に由来している。これらの戦略は、一度に行われ定義された単一変化の導入を介して調節ペプチドを増やし、かつ多様化することを試みている。
【００３５】
定義された配列ペプチド免疫治療アプローチと並んで進化した全体的に異なるアプローチは、制限されたアミノ酸多様性のランダムエピトープポリマーの使用である。ランダムシークエンスポリマー(RSP)は２つ以上のアミノ酸残基を様々な比率で含むアミノ酸コポリマーのランダムな順番の混合物として記載することができ、これらのアミノ酸残基のランダム配列結合によって、好ましくはペプチド結合を介してコポリマーを形成し、混合物は哺乳動物に投与する場合に特定の免疫学的反応を呼び出すかまたは弱めるために有用である。配列混合物の広い多様性のために、多数の治療上有効なペプチド配列が混合物に含まれるようである。また、任意の所定時に治療上有効でなく、エピトープシフトおよび拡張が生じるのと同様な効果を生じてもよいさらなるペプチドのために、治療組成物は投与養生の時間に対して効果的なままであってもよい。このアプローチは図1Dに概略して表わされる。
【００３６】
1959(P.H. Maurer et al., J. Immunol., 1959, 83:193-7)から1988,(J.L. Grun, and P.H. Maurer, Immunogenetics, 1988, 28(1): 61-3)に始まる、Maurerおよび同僚らは、ポリグルタミン酸ならびにチロシン、グルタミン酸およびアラニン(YEA)、フェニルアラニン、グルタミン酸およびアラニン(FEA)、ならびにフェニルアラニン、グルタミン酸およびリジン(FEK)からなるものなどの他のランダム配列ポリマーへの免疫応答を調査した。Teitelbaum et al., Eur. J. Immunol., 1971, 1:242-8はチロシン、グルタミン酸、アラニンおよびリジンからなるランダムコポリマーについての最初の研究報告であり、結局は以下に記載されるCOP-1を用いた多発性硬化症のためのFDA承認療法となった。1978年において、Germain and Benacerraf, J. Exp. Medicine 148:1324-37は、MHC免疫系および異種反応性へのその関連性におけるMHCの役割についてのBenacerrafの1980年ノーベル賞研究となったものにおいて、YEAへのサプレッサーT細胞応答を研究した(http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1980/ benacerraf-lecture.html)。
【００３７】
コポリマー-1(Copaxoneとしても公知、酢酸グラチラマー（glatiramer acetate）、COP-1、またはYEAKランダムコポリマー)は多発性硬化症の治療に使用されている。ランダムコポリマーは国際PCT公開番号第WO 00/05250号、第WO 00/05249号; 第WO 02/59143号、第WO 0027417号、第WO 96/32119号、第WO/2005/085323号、米国特許公開番号第2004/003888号、第2002/005546号、第2003/0004099号、第2003/0064915号および第2002/0037848号、米国特許第6,514,938号、第5,800,808号および第5,858,964号に記載されている。
【００３８】
（発明の要旨）
本発明は、好ましくない免疫応答の調節に有用な指向性エピトープペプチド混合物の固相合成の方法を含み、かかる方法は、公知のエピトープのベースアミノ酸またはネイティブアミノ酸を置換するアミノ酸の出現の同一性および頻度に関する１組の規則によって定義される。本発明の方法は開始点として公知のペプチドエピトープの配列を使用する。エピトープを構成するアミノ酸は、1組の規則によって定義された種々の関連アミノ酸の導入により連続して改変される。その結果は治療剤に有用な関連ペプチドの混合物、および治療剤としてそれ自体の混合物であり、「指向性配列ポリマー(Directed Sequence Polymer)」または「DSP」を含む組成物として本明細書に記載される。かかる組成物は「DSP組成物」として呼ばれる。DSP組成物を合成する方法は、特定長の定義ペプチド配列のアミノ酸残基の天然順序を利用および維持する。各アミノ酸位置は定義セットの規則に基づいた変化に供される。好ましい態様においてアミノ酸はKosiol et al., J. Theoretical Biol., 2004, 228:97-106)の表Xに見られる方法によって置換される。あるいは、アミノ酸はPCT/US2004/032598,ページ10〜11に記載される例示的置換に従って変化することができる。本発明の固相合成手順のために、ペプチドの所定位置のアミノ酸混合物はあらゆる比率によって定義される。合成を開始する前に、かかる比率はペプチドに沿った各位置で決定される。得られた指向性順序ペプチド混合物は多数の関連ペプチド配列を含む。
【００３９】
DSPの長さはオリジナル定義配列ペプチドのものまたはオリジナル定義配列ペプチドの30長であり得る。組み合わせ配列の長さは25〜300アミノ酸であり得る。
【００４０】
組み合わせDSPにおける全ての他のアミノ酸と比べてアラニンの割合は常に10％より大きく、90％を超えない。好ましくは、アラニンの割合は20%〜80%である。より好ましくはアラニンの割合は40%〜75%である。混合物の複雑さは、5 x 102より大きい種々のペプチドである。好ましくは混合物の複雑さは1 x 1010より大きい種々のペプチドである。より好ましくは混合物の複雑さは1 x 1015 より大きい種々のペプチドである。
【００４１】
いくつかの態様において、DSP配列が由来するベースペプチド配列は表Iに示される配列番号1〜からなる群より選択される。
【００４２】
他の態様において、かかるベースペプチド配列は多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、Ｉ型真性糖尿病、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、および尋常性天疱瘡からなる群より選択される自己免疫疾患の病状に関連するエピトープである。より具体的に、ベースペプチド配列は(a)オステオポンチン、HLAタンパク質、ミエリンオリゴデンドライト糖タンパク質、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、プロテオリピドタンパク質、およびミエリン関連糖タンパク質、SlOOβ、熱ショックタンパク質α、βクリスタリン、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質(MOBP)、2',3'サイクリックヌクレオチド3'-ホスホジエステラーゼ; (b) hsp60、hsp70、Ro60、La、SmD、および70-kDa U1 RNP;(c)グルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD65)、インスリノーマ-抗原 2 (IA-2)、インシュリン;(d)アセチルコリンレセプター(AChR)α-サブユニットおよび筋肉特異的レセプターチロシンキナーゼ(MuSK);(e)II型コラーゲン;ならびに(f)デスモグレイン3(Dsg3)からなる群より選択されるタンパク質の部分配列である。
【００４３】
本発明の一側面は、DSP組成物、任意に薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物である。好ましい態様において、DSP組成物を含むかかる医薬組成物は、被験体に投与する場合に、効果を願う被験体において好ましくない免疫応答の好ましい改変を生じる。
【００４４】
本発明の別の側面は、治療の必要がある被験体にDSP組成物を投与することによって好ましくない免疫応答を治療する方法である。好ましい態様において、急性炎症、慢性関節リウマチ、移植拒絶、喘息、炎症腸疾患、潰瘍、再狭窄、多発性硬化症、乾癬、損傷治癒、エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、および当業者によって認識できる任意の他の自己免疫または炎症障害のために、被験体はかかる投与の必要がある。他の態様において、被験体は臓器移植の場合に対移植片宿主
病（HVGD）または対宿主移植片病(GVHD)のためにかかる投与の必要がある。
【００４５】
（発明の詳細な説明）
関連ペプチドの混合物は単一ペプチドよりも治療上有効である場合があることが以前に示された。Lustgarten et al., J. Immunol. 2006, 176: 1796-1805; Quandt et al., Molec. Immunol. 2003, 40: 1075-1087。単一ペプチドに対してペプチド混合物の有効性はエピトープ拡散のプロセスを介した攻撃エピトープの拡大との相互作用の可能性である。(Immunol. Rev. 1998, 164:241) 従って、有効性を増大および維持するために、これらの以前の治療様相が改変された。例えば、APLに基づいた治療組成物はオリジナルペプチド、または他のAPLと組み合わせたAPL法によって作製された複数ペプチドを含んでいてもよい。Fairchild et al., Curr. Topics Peptide & Protein Res. 6, 2004。各APLは定義配列を有するが、治療組成物は１つよりも多い配列を有するAPLの混合物であってもよい。概念上類似する改変ペプチドリガンドを含む逆の例には、ワクチン化に潜在的に有用なペプチドの限定された多様性プールを作製するようにエピトープ配列において病原体がもたらしたまさにその変化を用いることによって、免疫認識を回避するように病原体によって作製されたバリエーションの量(経時の免疫原性エピトープのウイルス改変、例えば改変ペプチドリガンドの作製)を低減する発明者らの試みが含まれる。(米国特許第7,118,874号)。
【００４６】
また、最も顕著にCOP-1でRSPを改善するアプローチがあった。Strominger et al. (WO/2003/029276)によって初めに行われた研究に見ることができ、アミノ酸Y、F、A、およびKからなるRSPを用いたRasmussen et al.(米国 2006/0194725)によってさらに発展された。アミノ酸含有量における変化以外に、長さに存在する組成(YFAKはCOP-1より短い)とアラニン含有量(YFAKはCOP-1の％と比べて60〜80％アラニンを有することが示唆される)との間の違いは、動物モデルデータにおける違いを示す(YFAKはEAEにおいて良好な効能を有する、多発性硬化症の動物モデル)。アラニン含有量に関して、Maurer (Pinchuck and Maurer, J. Exp Med 122(4), 673-9, 1965)は高いアラニン含有量(10〜60モルパーセント)を有するEAKポリマーがいかに「良好な抗原」を生成するかを記載し、Rasumussenらは 1:1:1:1の入力比のYFAKは1:1:10:6の入力比を有するYFAK調製物と比べて呼び戻し応答を引き出す点で有効でなかったことを示した。
【００４７】
COP-1で改善する別の試みはWO/2005/032482('482公開公報)に記載されている。'482公開公報の１つの解釈は、多発性硬化症の治療のための「治療オーダーペプチド」の生成により多様性の量を制限することによってより特異的なCOP-1を作製しようとする試みがあるということである。'482公開公報は実際のペプチド配列ではなくモチーフに基づいた縮重ペプチド配列を構築する。好ましいモチーフは[EYYK]であり、COP-1のアミノ酸組成にほとんど類似する(YEAK)。このモチーフの原理は、上記に議論されるMaurerの公開公報およびRasmussenらの出願に見られるアラニンの含入に置かれた相対値がより重要でないことを教示する。モチーフはそのまま使用されるか、またはアミノ酸置換によって改変できる('482公開公報のページ10〜11に定義される)。多くの本発明はモチーフのアミノ末端でのD-アミノ酸の存在にかかっている。
【００４８】
COP-1で改善するさらに別の試みがWO/2005/074579('579公開公報)に開示されている。該出願は8〜100残基長のA、E、KおよびYを含む複合ペプチド混合物を記載する。開示は混合物がAEKY、FLMY、IMQV、KRILV、FILMV、FWEF、EK、AEK、AKY、ANY、AINV、ASV、YEFW、Y、EFIVWY、EFKQ、AEKQ、AKQY、ANQY、AGNSY、AGINSV、AIQSV、IKRSVY、KHRV、HKR、PI、A、E、K、AE、AK、AY、EY、KY、AEY、EKYも含む好ましい態様を含む。また、開示は合成規則のランダム性質によって選ばれるよりむしろ特定の位置でのアミノ酸を定義する機構を束縛する多様性を含む。開示は 1:1:6:3 YEAKでCOP-1に類似するAEKY混合物のためのあらゆるアミノ酸比率を提供する。
【００４９】
これらのアプローチの欠点は、各モチーフで何が有効であるのかを定義しない性質であり、混合物中のほとんどのペプチドは全くおそらくは不活性である場合があり、活性成分の濃度を低減するかまたは悪く有害に免疫系を刺激する。また、これらの化合物はロット間の一貫性を製造し、得ることは困難である。
【００５０】
COP-1で改善するなお別の試みは明確な単一15マーペプチド配列を設計するStromingerの試行錯誤に見ることができ、そのアミノ酸組成物はCOP-1およびCOP-1関連ランダム配列ポリマーものと類似する。これらの単一配列固定ペプチドはHLA-DR2結合についてネイティブミエリン塩基性タンパク質(MBP)ペプチド85〜99と競合する能力を増大するように設計された(Stern et al., roc. Nat. Acad. Sci. USA, 102:1620-25)。この技術の欠点は、COP-1が包含するランダムさのための別々の置換を決定する試みのその性質にある。
【００５１】
本発明は、以前の治療様相の最も有用な特性を引き出し、それぞれの制限を除去する。本発明は、(1)定義エピトープペプチドの特異的な免疫学的関連、(2)APLの調節特性、(3)MAPの多価性、(4)治療剤として送達に有用な複合ダイレクトペプチドライブラリーを形成するエピトープ透過性の改変および縮重を介して指向された拡張を生成するためのRSPのアラニン含有量を利用する。アプローチは図2に概略して表わされる。
【００５２】
本発明は「指向性配列ポリマー」(DSP)に関する。DSPはベースペプチド配列に由来する配列を有するペプチドであり、限定されないが、好ましくない免疫応答に関連するネイティブエピトープであってもよい。DSPはベースペプチド配列のアミノ酸残基と異なる１つ以上のアミノ酸残基を有し、その置換は定義規則によって決定される。多数のDSPを含むDSP組成物は、アミノ酸バリエーションおよび配列の任意の所定位置でのかかるアミノ酸残基の導入の出現割合を定義する1組の合成規則をベースペプチド配列に適用することによって合成される。従って、DSPは単一ペプチドとして合成されないが、多数の関連DSPを含む組成物の一部として常に合成され、全ての混合物は再現可能であり、適用された合成規則で一貫している。ベースペプチドの選択から始まるDSP組成物を作製するための工程の概略が図3に示される。
【００５３】
I.ベースペプチド配列
意味のあるDSP組成物を作製するために、最初にDSPを派生するためのベースペプチド配列を定義する必要がある。ベースペプチド配列は多くの方法に由来することができる。この目的に有用なペプチド配列は哺乳動物の免疫応答に関連するペプチド配列である。これらのペプチド配列は、例えば、エピトープとしての特定の熱ショックタンパク質の部分配列、HLA由来ペプチドリガンド配列、臓器由来ペプチド配列、およびコンビナトリアル化学によって作製されたライブラリーのスクリーニングによるなどの実験に由来するペプチド配列である。
【００５４】
熱ショックタンパク質由来ベースペプチド配列
エピトープ配列の供給源は、任意の供給源の熱ショックタンパク質または哺乳動物熱ショックタンパク質(hsp)の配列の病原体由来模倣物に由来してもよい。HSP-60(Swiss-Prot 一次アクセッション番号P10809)、HSP-70(Swiss-Prot 一次アクセッション番号P08107)、HSP-90α(Swiss-Prot アクセッション番号 P07900)、HSP-90β(Swiss-Prot アクセッション番号 P08238)、またはそれぞれに75％のホモロジーを有する任意のタンパク質などの哺乳動物熱ショックタンパクが例である。哺乳動物熱ショックタンパク質の細菌ホモログとしてはミコバクテリアhsp65(hsp60ファミリーに属する)が挙げられる。
【００５５】
ストレスシグナルに応答して上方制御されることが公知である細胞性シャペロンとしての熱ショックタンパク質は、高い程度の潜在的病理生理学的疾患機構関与を有する。Hsp、これらに由来するペプチド、およびその交差種模倣物は統合失調症および多発性硬化症(Schwarz et al., Am. J. Psychiatry, 1999, 156:1103-4; Battistine et al., Mol. Medicine, 1995, 1:554-62)、アテローム動脈硬化症(Benagiano, et al., J. Immunol., 2005, 174:6509-17)、慢性関節リウマチ(Anderton et al., J. Exp. Med., 1995, 181 :943-52; van Roon et al., J. Clin. Invest., 1997, 100:459-63,; Quintana et al., J. Immunol., 2003, 171:3533-41)、全身性エリテマトーデス(Minota et al., J. Exp. Med., 1988, 168:1475-80)、および糖尿病(Raz et al., Lancet 358:1749-53)などの中枢神経系疾患に関係する。
【００５６】
HLA由来ベースペプチド配列
移植設定における免疫学的関連として、HLAはレシピエント抗体が指向する大部分のタンパク質を表す。HLAの遺伝子産物が移植抗原として機能することがわかっている。例えば、ミスマッチHLAアレルに関して急性対宿主移植片疾患（GVHD）の発生を分析する研究は、移植片のドナーとレシピエントとの間のHLA-DRB1およびHLA-DQB1不均等の役割を示す。Petersdorf et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 15358-15363。逆に、MHC由来ペプチドの複数の例が免疫療法に有用なものとして報告されている。研究は静止抗原提示細胞上のMHCに結合する大部分のペプチドがMHC由来であることを示し、MHCへテロダイマーの安定剤として機能する以外に、これらのペプチドは抗原性ペプチドと競合することによって免疫調節の役割を有し、それによって抗原性刺激の閾値を増大し得るという仮定がもたらされる。Murphy et al., J. Am. Soc. Nephrol., 2003, 14:1053-1065。クラスII MHCに由来するペプチドはT細胞調節因子として作用することが実際に報告されている。(LeGuern, Trends Immunol., 2003, 24:633-638)。さらに、クラスII MHCの保存領域からの合成ペプチドはAPCアポトーシスおよびT細胞超応答性を媒介することができた。Murphy, 同じ箇所。他には、クラスIIの予測されるαらせんドメインに由来するペプチドはI-Akに結合し、抗原依存性T細胞活性化を阻害した。Williams et al., Immunol. Res., 1992, 11:11-23。クラスI MHCに由来するペプチドはアネルギー、欠失、免疫逸脱、細胞周期阻害、抗原提示の破壊、およびＴ細胞活性化の阻害などの様々な機構を介した免疫系に対する効果を示すことが報告されている。Murphy and Krensky, J. Am. Soc. Nephrol., 1999, 10:1346-1355。
【００５７】
従って、MHCへの免疫応答を弱めることによって、GVHDの重篤さおよび発生を低減することが予測される。当該技術分野の上記例によって、HLA分子の様々な連続アミノ酸配列を有するペプチドを用いた免疫調節効果が示された。HLAのアミノ酸組成に基づいたDSPは広く関連する免疫モジュレーターのようなかかる欠点および機能を克服することが予測される。
【００５８】
本発明の態様において、成熟HLA分子を含む1つ以上のエピトープがDSPに組み込まれる。別の態様において、HLAのβシートを含む1つ以上のエピトープがDSPに組み込まれる。HLA-B7のβシートに由来する合成ペプチドはGVHDの異種応答を調節する免疫ドミナントT細胞エピトープであることが示されている。Freese and Zavazava (2002) Blood 99:3286-3292。これらのHLA-B7由来異種ペプチドはインビトロでHLA-B7を標的としたT細胞媒介傷害性に干渉し、HLA-A2由来異種ペプチドはインビトロでHLA-A2を標的とした細胞傷害性に干渉し、これらのペプチドの異種特異性を示した。
【００５９】
HLAのアミノ酸組成の例が本明細書に提供される。HLAタンパク質の公知のアミノ酸配列はGenBankおよびSwiss-Prot/trEMBLから得られ、http://ca.expasy.org/cgi-bin/protscale.plに見られるExPASy のProtScale機能を用いて分析された。例示的なHLA配列は、GenBank アクセッション番号. AAA36281、AAC02715、P01903(α鎖前駆体)、AAA17992、AAA59622(重鎖前駆体)、およびAAA76608である。
【００６０】
臓器由来ベースペプチド配列
寛容を誘導するのに有用であってもよい派生エピトープのさらなるカテゴリーはそれ自体移植される臓器に由来する抗原である。本明細書で定義される場合「臓器由来エピトープ」は、臓器特異的タンパク質を含むペプチドエピトープである。これらのタンパク質は臓器移植の背景において抗原として潜在的に重要である。例えば、ドナー異種ペプチドは移植片から連続的に与えられ、レシピエントT細胞によるかかるドナー異種ペプチドの間接認識となることが示された。これは慢性移植拒絶となり、持続性キメラ現象を妨げる。例えば、心臓異種移植片において、慢性拒絶は、心臓異種移植血管障害と呼ばれる、拡散および加速された形態のアテローム動脈硬化症として示される。Lee et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2001, 98: 3276-3281。MHC由来ペプチドによって使用されるものと同様な機構をおそらく誘起して、移植された臓器に由来するペプチドが移植による免疫応答の刺激を妨げることによって持続性キメラ現象を誘導してもよい。かかる異種ペプチドに対する免疫学的反応の抑制は慢性拒絶を妨げることに寄与し、持続性キメラ現象を達成することを補助してもよい。
【００６１】
その結果、本発明の別の態様において、1つ以上のエピトープが、移植に供される臓器の臓器由来タンパク質を含む。
【００６２】
他の関連臓器由来DSPは臓器特異的とみなされるタンパク質のエピトープを含んでもよい。臓器の移植に対する免疫反応を軽減し、持続性キメラ現象を促進するのに適切なDSPは、移植される臓器の臓器特異的タンパク質のエピトープに基づいて設計される。
【００６３】
肝臓:肝臓の臓器特異的抗原は、肝臓細胞に優勢的に発現すると考えられる胆汁塩輸送ポンプ(GenBankアクセッション番号 O95342)を含む。
【００６４】
心臓:心臓において特異的に見出されるタンパク質の例は心房性ナトリウム利尿ペプチド-変換酵素(pro-ANP-変換酵素)(Corin)(心臓特異的セリンプロテイナーゼATC2)(Swiss-Prot アクセッション番号Q9Y5Q5)である。
【００６５】
膵臓:ヒト膵臓の臓器特異的タンパク質の例はカルボキシペプチダーゼ B1 (GenBank アクセッション番号32880163)である。
【００６６】
腎臓:腎臓の臓器特異的タンパク質の例はクロライドチャンネルClC-6c (GenBank アクセッション番号1770380)である。
【００６７】
脾臓:脾臓特異的タンパク質の例は脾臓チロシンキナーゼ(SYK)(Swiss-Prot アクセッション番号P43405)である。
【００６８】
肺:肺特異的タンパク質の例はPlunc(口蓋  肺および鼻上皮クローンタンパク質)(肺特異的Xタンパク質)(GenBank アクセッション番号9801236)である。
【００６９】
実験に由来するベースペプチド配列
上述セクションに記載されるように、疾患状態または有害反応に対してある重要性を有するペプチド配列は関連エピトープの実験研究から同定されてもよい。これらの配列は疾患または状態を治療することに有用であると証明された非天然
ペプチド配列を含んでいてもよく、例は国際特許出願公開公報WO 2006/031727号、 米国特許第6,930,168号および関連科学刊行物Stern et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2005, 102:1620-25に見られる。
【００７０】
さらに、エピトープは、合成コンビナトリアルペプチドライブラリーのポジショナルスキャニングによる候補配列の同定によって(例えば, D. Wilson et al., 上述; R. Houghten et al.,上述; Hernandez et al., Eur J Immunol, 2004, 34:2331-41を参照)、またはエピトープが求められる疾患および種に適切なインビトロまたはインビボアッセイ系において、目的のタンパク質全体の重複ペプチド配列を作製し、免疫反応性についてペプチドを試験すること(例えば、Current Protocols in Immunology, John E Coligan, Ada M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strober NIH編, John Wiley & Sonsに記載され、かかる目的に有用な任意の読み出しアッセイを用いる)によって実験的に決定される。例えば、多発性硬化症薬物の設計のために、適切な系の例はMSを患うヒト被験体に由来する細胞を使用する。
【００７１】
候補エピトープを同定した後、ありうる組のさらなる関連エピトープは容易に利用可能な参照、例えばWO 2000/042559に記載されるモデリングおよび予測アルゴリズムを用いて生成され、例えば、WO 2005/103679、WO 2002/073193およびWO 99/45954に記載される利用可能な予測法を用いてこれらのありうるエピトープの予測結合を整列し、分析する。最高の予測活性／結合を有するペプチドから選択して、予測配列の40％をとり、各位置での任意の所定のアミノ酸の割合を獲得する。DSP合成へのアミノ酸組み込みの規則を作製するためにこれらの割合を使用する。
【００７２】
他の供給源のベースペプチド配列
上述セクションに記載される方法および結果に加えて、エピトープ配列はベースペプチド配列として使用されてもよく、免疫エピトープデータベース(National Institute of Allergy and Infectious Diseases of the National Institute of Health, USA によって資金を提供されたAlex Setteで導かれるhttp://www.immuneepitope.org/home.doで利用可能)で同定および含入されるか、または任意の配列がSan DiegoのMixtures SciencesもしくはGhent BelgiumのAlgonomicsなどの市販実体によって実施され、開示されたプロセスによって同定される。
【００７３】
天然の完全長タンパク質またはかかるエピトープと類似する活性を有すると同定された合成ペプチドの部分として同定されたエピトープの例は、以下の表に示される。
【００７４】
2009536157.tif 000005
2009536157.tif 000006
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【００７５】
II.指向性配列ポリマーの合成規則
DSPの作製工程は以下のものを連続的に包含する:
【００７６】
(a) 病状と関連すると公知であるかまたは考えられるタンパク質の同定。
【００７７】
(b)それぞれが病原と関連し、免疫学的に関連する固定配列を有する１つのペプチドまたは複数のペプチドのタンパク質からの選択。ペプチドが記載されない場合、目的の病状の治療に有用なペプチドが作製される。１つの代表的な方法は目的のタンパク質の全長に集合的に広がるペプチドのライブラリーを作製することである。これは、例えば、部分エンドペプチダーゼ消化またはペプチド合成によって行われてもよい。ライブラリーは標的病状を有する患者の血清に検出される抗体を用いた結合親和性決定などの適切な検出法を用いて免疫学的関連ペプチドについてスクリーニングされる。ペプチドはインビトロまたはインビボ実験系における病状の治療に有用な免疫原性についてさらに調べられてもよい。
【００７８】
(c)アミノ酸置換は定義または実験の２組のいずれかの規則に基づいて決定され、以下に示される。
【００７９】
(d) 該規則によるDSP固相合成が行われ、薬学的に許容できる製剤DSPが治療剤として送達される。
【００８０】
DSPを含む組成物の合成規則は以下に概略される。要するに、DSPはベースペプチド配列と同じ長さまたはその複数の長さのいずれかである定義された長さを有するポリペプチドとして想定されてもよい。ベースペプチド配列の各残基位置について、1つ以上の置換残基が定義される。合成規則はオリジナルベースペプチド残基中の第一置換残基、第二置換残基、第三置換残基、およびアラニンの位置の割合を任意の所定の残基位置を占有するように定義する。
【００８１】
置換残基は(1)オリジナル残基の関連特徴と置換残基のものとの類似性の合理的比較および発見、または(2)ベース配列から少しのバリエーションを有する実際のペプチドの相対活性について報告された実験結果の比較のいずれかに従って定義される。これら2つのアプローチのいずれかで定義される置換残基は本明細書で「保存された置換」と呼ばれる。
【００８２】
類似性の合理的比較および発見の例はKosiol et al., J. Theoretical Biol., 2004, 228:97-106に記載される方法である。アミノ酸は、マトリックスと共にグループ化され、そこでPAM置換マトリックスと呼ばれる。図4は、参照の表Xに示されるようにサイズ、電荷、疎水性などの残基の特性に基づいたKosiolによるアミノ酸類似性およびグループ化を示す表である。図4において、共にグループ化されたアミノ酸は、群の中で共通の特性を保持する高い可能性によって交換可能と考えられる。
【００８３】
また、ベース配列から少しのバリエーションを有するペプチドの相対活性を示す実験結果の比較は置換の規則の基礎として使用できる。観察される変化に重要なペプチド配列が整列され、新しいアミノ酸の種類および存在割合が示される。ペプチドの任意の所定の位置で１つより多くのアミノ酸置換がある場合に、オリジナル配列と比較したアミノ酸の出現の頻度および活性変化の大きさが優勢な置換の順序を決定するために考慮される。DSP合成の規則生成をもたらす方法全体の例は、ライブラリーを用いて(Molec. Immunol. 40:1047-1055; Molec. Immunol. 40:1063-74; J Autoimmunity 20:199-201;およびJ. Immunol 163:6424-34)、目的のタンパク質全体を示す重複ペプチドの改変ペプチドリガンドを作製することで(Atkinson et al., J. Clin. Invest. 94:2125-29; Meini et al., J. Clin. Invest. 92:2633-43)またはデノボで(米国特許第7,058,515号;第6,376,246号;第6,368,861号;第7,024,312号;第6,376,246号; 第7,024,312号;第6,961,664号;第6,917,882号)見出すことができる。要するに、目的の細胞物質が、呼掛けるペプチドの免疫反応性をランク付けするアッセイ系として選ばれる。かかるアッセイ系はインビトロまたはインビボ系のいずれかであり得、適合性または先天性の免疫反応を含むことができる。アッセイ系の読み出しは活性状態のタンパク質の状態の上方または下方調節、タンパク質の局在の変化、タンパク質をコードするmRNAの発現、タンパク質の相対濃度、特定の細胞種類の生成の変化、細胞表現型の変化、細胞活性の変化、細胞数の変化、器官サイズまたは機能の変化、動物行動または表現型の変化であり得る。１つのアッセイまたは複数のアッセイが行われると、結果は保存置換として任意の特定のアミノ酸の優勢を決定するために分析される。ペプチド配列の所定の位置で3つより多くの残基が免疫学的機能の変化を生成するものとして同定される場合、トップの3残基は第一に呼掛けペプチドにおける提示の頻度で、第二に引き起こされる変化の大きさで同定される。選ばれると、残基の相対量が定義される。図5に示されるように、各カセット「y」は、ベース(a)、一次変化(b)、二次変化(c)、および三次変化(d)について約0〜100の範囲を有するが、アラニン(e)は約5〜1000の比を有する1組のあらゆるアミノ酸比率を有する。DSP合成規則は前記載の順序のカセットの組み合わせで続く。同じブロックは連続的に繰り返すことができるかまたは別のブロックによって分離することができる。カセット配列のいずれかの側にN-末端修飾およびC-末端修飾がある。カセット数は、25アミノ酸より長く300アミノ酸より短いことが必要とされるDSPの最終長さの要件によって決められる。
【００８４】
図6に記載されるように、本発明は、別々のカセットと定義され、連続的に合成された複数エピトープを構想する。同じDSPのカセット比率は異なる比率のアミノ酸を有してもよい。さらに、3つより少ないアラニンでないアミノ酸置換がある場合、「欠けている」置換の比率がベース配列に付加される。さらに、カセットはDSP合成全体における多数出現により任意の順序で配置されてもよい。N-およびC-末端修飾がそれぞれ、DSPカセットの全体の前におよびその後にある。図7に見られるように、単一ベースペプチド配列はこの例でy1、y2、およびy3の別々のカセットとして定義される１より大きい比を有してもよい。個々のカセットは図7Bに見られるようにDSP合成全体における多数出現により任意の順序で配置することができる。図8Aおよび8Bに見られる合成規則は別々のカセットとして定義される１より大きい比を有する単一ベースペプチド配列の部分を有する本発明のDSPを記載する。
【００８５】
図9はどのように本発明が特定位置のアミノ酸の実験に由来する比率を構想するかを示す。例はトランスジェニックNOD.BCD2.5マウスに由来する糖尿病状態に近いT細胞を用いてT細胞活性化アッセイに由来するデータを使用する(J. Immunol. 166:908-17; J. Autoimmunity 20:199-201)。細胞は、阻害活性を有する多くの異なるペプチドとなるコンビナトリアル10マーライブラリーに呼掛ける。最高の活性を有するペプチドは各位置でのアミノ酸およびあらゆる異なるアミノ酸の比率を生成するために使用された。
【００８６】
カセットは１回よりも多く繰り返されてもよい。所望の数の多数のカセットの後に、所望の長さのDSPが達成されない場合に、DSP配列は、おそらくオリジナル、置換、第二置換、およびアラニン残基の中で異なる比率を用いて、同じプロセスを適用することによってさらに定義される。
【００８７】
NまたはC-末端DSP修飾が合成規則に付加されてもよい。かかる修飾の目的は、限定されないが、標的部分として使用されるRDG-ベースアミノ酸配列(米国特許第5,773,412号;第5,770,565号)の場合の特異的タンパク質、またはDR-標的部分としてAKAVAAWTLK AAAなどの多様なHLA-DR種に結合することが公知であるペプチド(米国出願公開番号第2006/0018915号)への結合の増大を含む。かかる修飾は持続性放出送達系を含む送達系への錯体化を高める部分を含んでもよい。修飾はPLGAなどの吸収性マトリックス構築物/合成可能な骨格であり得る。修飾はD-アミノ酸などのプロテアーゼ耐性部分であり得る。
【００８８】
従って、任意の所定のベースペプチド配列について、1組の合成規則は再現性があり、かつ一貫したDSPの混合物を含む組成物を生じるために適用される。
【００８９】
III.ペプチド合成法
例えばMerrifield(J. Am. Chem. Soc., 1963, 85:2149)に元々記載されるようなペプチド合成に適切な任意の公知の固相合成および任意のそのバリエーションが、DSPを含む組成物を合成するために使用されてもよい。より具体的に、合成はFmoc保護アミノ酸を用いた固相ペプチド合成(SPPS)アプローチによる複数工程で行われる。SPPSは、適切な側鎖保護と共に保護アミノ酸誘導体のポリマー支持体(ビーズ)への連続付加に基づいている。塩基が変化しやすいFmoc基はN-保護に使用される。保護基の除去後に(ピペリジン加水分解を介して)、次のアミノ酸混合物はカップリング試薬(TBTU)を用いて付加される。最終アミノ酸がカップリングされた後に、N-末端がアセチル化される。
【００９０】
得られたペプチド(C-末端を介してポリマー支持体に結合される)はTFAで切断され粗ペプチドを生じる。この切断工程中に、側鎖保護基の全ても、切断される。ジイソプロピルエーテルでの沈澱後に、固形物は濾過され、乾燥される。得られたペプチドが分析され、2〜8℃で保存される。
【００９１】
また、ペプチド配列の任意の所定の位置において調整された比率での１つより多くのアミノ酸種を取り込んで合成を可能にする任意のペプチド合成法は本発明での使用に適切である。さらに、以下に記載されるように、DSPはペプチド模倣物であってもよく、または非天然または改変アミノ酸を含み、かかる化学種のその点までに合成されたポリマーへの付加を可能にするような適合を要する。
【００９２】
合成は非天然アミノ酸またはアミノ酸アナログを含んでいてもよい。いくつかの態様において、DSPは天然および合成誘導体、例えば、セレノシステインからなる。アミノ酸はアミノ酸アナログをさらに含む。アミノ酸「アナログ」は異なる配向を有する化学的に関連する形態のアミノ酸、例えば、アイソマー、またはL-配向よりむしろD-配向、またはアミノ酸のおよそのサイズおよび形状を有する有機分子、またはポリペプチドに重合される場合にプロテアーゼ耐性であるようにペプチド結合に関わる原子への改変を有するアミノ酸である。
【００９３】
本発明における使用のためのDSPは、L-またはD-アミノ酸またはその混合物から構成することができる。当業者に公知なように、L-アミノ酸はほとんどの天然タンパク質で生じる。しかし、D-アミノ酸は市販であり、本発明のDSPを作製するために使用されるいくつかまたは全てのアミノ酸を置換することができる。本発明はD-およびL-アミノ酸の両方を含むDSP、および本質的にL-またはD-アミノ酸のいずれかからなるDSPを企図する。
【００９４】
特定の態様において、本発明のDSPは、種々の化学部分の置換または添加によってさらに改変されるかかる線形DSPを含む。１つの態様において、かかる改変は、残基の位置にあり、被験体におけるDSPのタンパク質分解を阻害するのに十分な量である。例えば、アミノ酸改変は配列において少なくとも１つのプロリン残基に存在してもよく;残基は少なくとも1つのカルボキシ末端およびアミノ末端に存在する;さらに、プロリンは少なくとも１つのカルボキシ末端およびアミノ末端の４つの残基内で存在することができる。さらに、アミノ酸改変はD-アミノ酸の存在であってもよい。
【００９５】
特定の態様において、主題DSPはペプチド模倣物である。ペプチド模倣物は、ペプチドおよびタンパク質に基づくか、またはこれらに由来する化合物である。本発明のDSPペプチド模倣物は、例えば、1つ以上の非天然アミノ酸、コンフォメーション拘束、異性体置換等を用いて典型的に1つ以上のネイティブアミノ酸残基の構造改変によって得ることができる。主題ペプチド模倣物は、ペプチド合成構造と非ペプチド合成構造との間での連続の構造空間を構成する。
【００９６】
かかるペプチド模倣物は加水分解できないような属性(例えば、プロテアーゼまたは対応ペプチドDSPを分解する他の生理学的条件に対する増大した安定性)、増大した特異性および／または潜在力を有することができる。例示的目的として、本発明のペプチドアナログは、例えば、ベンゾジアゼピン(例えば、Freidinger et al. "Peptides: Chemistry and Biology," G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988を参照)、置換γラクタム環(Garvey et al. " Peptides: Chemistry and Biology," G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988, p123)、C-7模倣物(Huffman et al. " Peptides: Chemistry and Biology," G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988, p.105)、ケト-メチレン偽ペプチド(Ewenson et al. J. Med. Chem., 1986, 29:295;およびEwenson et al. " Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium)," Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985)、β-ターンジペプチド コア(Nagai et al., Tetrahedron Lett., 1985 26:647;およびSato et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1986,1:1231)、β-アミノアルコール(Gordon et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1985, 126:419; and Dann et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1986, 134:71)、ジアミノケトン(Natarajan et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1984, 124:141)、およびメチレンアミノ改変(Roark et al. " Peptides: Chemistry and Biology," G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988, p134)を用いて生成することができる。また、一般的に、 Session III: Analytic and synthetic methods, " Peptides: Chemistry and Biology," G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988を参照。
【００９７】
DSP組成物の分子量はポリペプチド合成中にまたはDSPが合成された後に調整することができる。ポリペプチド合成中に分子量を調節するために、合成条件またはアミノ酸の量が調節され、その結果合成はポリペプチドが所望のおよその長さに達する場合に停止する。合成後に、所望の分子量を有するポリペプチドは任意の利用可能なサイズ選択法、例えば、分子量サイズカラムまたはゲルでのポリペプチドのクロマトグラフィー、および所望の分子量範囲の回収によって得ることができる。本ポリペプチドはまた、例えば酸または酵素加水分解によって、高分子量種を除去するように部分的に加水分解でき、次に酸または酵素を除去するために精製される。
【００９８】
１つの態様において、所望の分子量を有するDSPは、保護ポリペプチドと、臭化水素酸とを反応させて、所望の分子量プロフィールを有するトリフルオロアセチル-ポリペプチドを形成する工程を含む方法によって調製されてもよい。反応は、1つ以上の試験反応によって予め決定された時間および温度で行われる。試験反応中に、時間および温度は変化し、所定のバッチの試験ポリペプチドの分子量範囲が決定される。該バッチのポリペプチドの最適分子量範囲を提供する試験条件がバッチに使用される。従って、所望の分子量プロフィールを有するトリフルオロアセチル-ポリペプチドは保護ポリペプチドと、臭化水素酸とを試験反応で予め決定された時間および温度で反応させる工程を含む方法によって生成することができる。所望の分子量プロフィールを有するトリフルオロアセチル-ポリペプチドは次にピペリジン水溶液でさらに処理され、所望の分子量を有する低毒性ポリペプチドを形成。
【００９９】
１つの好ましい態様において、所定のバッチからの保護ポリペプチドの試験試料は、約20〜28℃の温度で約10〜50時間臭化水素酸と反応させる。そのバッチの一番の条件はいくつかの試験反応を運転することによって決定される。例えば、１つの態様において、保護ポリペプチドは、約26℃の温度で約17時間臭化水素酸と反応させる。
【０１００】
IV.医薬組成物
本発明の１つの側面は、DSP組成物を含む医薬組成物である。本発明の側面として治療方法に以下で記載されるように、本発明の方法によって生成したDSP組成物は、被験体の自己免疫疾患および移植拒絶などの好ましくない免疫応答の治療に有用である。
【０１０１】
本発明のDSPは、薬学的に有効な量のDSPおよび許容できる担体および／または賦形剤を含む組成物として被験体に投与されてもよい。薬学的に許容できる担体としては、生理学的に適合性である任意の溶媒、分散媒体、またはコーティングが挙げられる。好ましくは、担体は経口、直腸、経粘膜(吸引によるものを含む)、非経口、静脈、筋肉内、腹腔、皮内、経皮、局所、または皮下投与に適切である。１つの例示的な薬学的に許容できる担体は生理学的食塩水である。他の薬学的に許容できる担体およびそれらの処方は周知であり、一般的に例えば、Remington's Pharmaceutical Science (18th Ed., ed. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990)に記載される。様々な薬学的に許容できる賦形剤は当該技術分野で周知であり、例えば、Handbook of Pharmaceutical Excipients (4th ed., Ed. Rowe et al. Pharmaceutical Press, Washington, D.C.)に見ることができる。組成物は溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、カプセル、錠剤、または他の適切な形態として調製できる。コポリマーを含む活性成分は標的部位の活性に達する前に環境による不活性化から保護するために物質でコートされてもよい。本発明の医薬組成物は好ましくは、送達時に滅菌および非発熱性であり、好ましくは製造および保存の条件下で安定である。望まれる場合に、組成物は、粒子が非経口、肺、鼻および経口を含む様々な投与の経路のための保護コーティング、プロテアーゼインヒビターまたは透過性エンハンサーを形成するように、安定性、透過性、および／または生物利用可能性を高める成分をさらに含む。
【０１０２】
経口投与のために、医薬調製物は液体形態でもよく、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液であってもよく、使用前に水または他の適切なビヒクルを用いた再構成のための薬物生成物として存在してもよい。かかる液体調製物は、懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂肪);乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア);非水性ビヒクル(例えば、アーモンド油、油状エステル、もしくは画分された植物油);および保存剤(例えば、メチルまたはプロピル-p-ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸)などの薬学的に許容できる添加剤を用いた従来手段によって調製されてもよい。医薬組成物は、例えば、結合剤(例えば、前ゼラチン化されたメイズスターチ、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース);増量剤(例えば、ラクトース、微結晶セルロースもしくはリン酸水素カルシウム);潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ);崩壊剤(例えば、ジャガイモ澱粉もしくはグリコール酸ナトリウムスターチ);または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)などの薬学的に許容できる賦形剤を用いた従来手段で調製された錠剤またはカプセルの形態をとってもよい。錠剤は当該技術分野で周知の方法によって被覆されてもよい。
【０１０３】
一態様において、経口組成物は腸溶性であるようにコートされる。腸コーティングの使用は当該技術分野に周知である。例えば、Lehman（1971）は、Eudragit SおよびEudragit Lなどの腸コーティングを教示する。また、Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第2版は、Eudragit SおよびEudragit Lの応用を教示する。本発明に使用され得る、あるEudragitはL30D55である。経口投与のための製剤は、活性化合物の制御放出をもたらすように適切に調製され得る。
【０１０４】
また、該組成物は、例えばココアバターまたはその他のグリセリドなどの従来の坐剤ベースを含む、坐剤または停留浣腸などの直腸組成物内に調製され得る。
【０１０５】
吸引による投与について、本発明による使用のための組成物は、加圧式パックまたはネブライザーからのエーロゾルスプレー提示（aerosol spray presentation）の形態で、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の適切なガスなどの適切なプロペラントの使用により、都合よく送達される。加圧式エーロゾルの場合、投与単位は、一定量を送達するためのバルブを設けることで決定され得る。吸入器または吹き入れ器での使用のためのゼラチンなどのカプセルおよびカートリッジは、化合物およびラクトースやデンブンなどの適切な粉末ベースの粉体混合物を含むように調製されてもよい。
【０１０６】
組成物は、注射による投与、例えば非経口、静脈内、腹腔内、筋内、または皮下様式でボーラス注射、または連続輸液による投与用に調製されてもよい。注射用の製剤は、単位投与形態で、例えばアンプル中または複数回投与コンテナ中に保存剤を添加して存在してもよい。組成物は、懸濁液、溶液、または油中もしくは水性ビヒクル中エマルジョンなどの形態であってもよく、懸濁剤、安定化剤および/または分散剤などの製剤を含んでもよい。あるいは、活性成分は、使用前に、滅菌された発熱源を含まない水などの適切なビヒクルで再構成されるように粉末形態であってもよい。
【０１０７】
好ましい態様において、DSP組成物を含む組成物は、ヒトへの静脈内投与に適用される医薬組成物と同様に常套的な手順で調製される。通常、静脈投与用組成物は滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射部位の痛みを和らげるためにリグノカイン等の局所麻酔を含んでもよい。一般的に、成分は別々に配合されるかまたは一緒に混合される。組成物が点滴により投与される場合、投与間の間隔は24時間、32時間より長く、またはより好ましくは36もしくは48時間より長く、滅菌医薬等級水または生理食塩水を含む点滴容器で投与することができる。組成物が注射で投与される場合、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができるので、成分は投与前に混合されてもよい。
【０１０８】
本発明の他の態様において、医薬組成物は制御放出製剤であるかまたは徐放性製剤である。本発明のDSP組成物は、コポリマーの近隣の環境への放出速度を制御する生体適合性のポリマーまたはマトリクスと混合されてもよい。制御放出組成物または徐放性組成物は、親油性貯蔵物（depot）（例えば、脂肪酸、ワックス、オイル）中の製剤を含む。徐放性製剤の一態様は経皮パッチである。
【０１０９】
本発明のいくつかの態様において、医薬組成物は、オイルおよび乳化剤を配合されて油注水微粒子および/またはエマルジョンを形成するDSPを含む。オイルは、室温ないしおよその体温で液体である、ベニバナ油、ダイズ油、コーン油およびキャノーラ油などの食用植物油、またはミネラルオイルなどの任意の非毒性疎水性物質であり得る。化学的に定義された、ラウリルグリコール等の油状物質を使用してもよい。この態様に有用な乳化剤としては、Span 20（モノラウリル酸ソルビタン）およびホスファチジルコリンが挙げられる。いくつかの態様において、DSP組成物は水溶液として調製され、95〜65％のミネラルオイルなどのオイルおよび5〜35％のSpan 20などの乳化剤中に分散される油中水エマルジョン中に調製される。本発明の別の態様において、エマルジョンはオイルや乳化剤ではなくミョウバンむしろ形成される。これらのエマルジョンおよび微粒子はDSPの吸収速度が遅く、制御送達が達成される。
【０１１０】
別の態様において、制御送達および/または徐放性送達は、徐放性製剤でコートされた移植可能な医療デバイスまたは活性成分の徐放性放出に適した移植可能な医薬製剤により達成される。
【０１１１】
本発明のいくつかの態様において、医薬組成物は、被験体中でポリペプチドとして発現するDSP組成物をコードする1組の核酸ベクターを含む。該ベクターは、産生されるDSP組成物のタイミングおよびレベルを制御し得るように転写および/または翻訳制御因子を含んでもよい。
【０１１２】
いくつかの態様において、ベクターはまた、治療的に有用なポリペプチド、または第1のDSP組成物のメンバーではない第2の異なるDSPの組成物をコードする1つ以上のさらなるコーディング配列を含む。代替的な態様において、医薬組成物は、それぞれが第1のDSP組成物のDSPのDNA配列、または第1のDSP組成物のメンバーではない第2のDSP組成物のDSPのDNA配列もしくは治療に有効なポリペプチドをコードする1つ以上のベクターを含む。かかる治療に有効なポリペプチドは、例えば免疫調節サイトカインまたは成長因子であり得る。
【０１１３】
本発明のいくつかの態様は、本発明のDSP組成物の標的送達のための医薬組成物である。かかる態様において、医薬組成物は標的部分と複合体化したDSP組成物を含む。標的部分は、DSP組成物が被験体中の所望の位置または微小環境に局所的に送達されることを可能にする。標的部分は、ビオチンもしくは単純な糖、種々の長さの一本鎖もしくは二本鎖DNA配列、種々の長さの一本鎖もしくは二本鎖RNA配列、種々の長さのペプチド、一本鎖抗体、Fab'もしくは修飾抗体を含む抗体、脂質、または糖脂質などの化学官能基または機能性を含む群を含み、それらから選択されてもよい。かかる部分の1つより多くを同時に組み合わせて使用してもよい。標的部分の例については、米国特許第6,268,488号、米国特許出願公開公報第2003/0190676号参照、および例えば、www.covx.com/tech_creating.htmlを参照。
【０１１４】
本発明の一態様において、複合体は、被験体中で溶解されるまで本発明の薬学活性を発揮しないDSP組成物を生じるプロドラッグの特性を有する。別の態様において、該複合体はDSP組成物の活性に影響しない。
【０１１５】
本発明の複合体および標的部分を生成するために、当業者に一般的に公知である任意の方法を使用してもよい。標的部分は、共有結合、イオン結合、疎水性結合、またはファンデルワールス力であり得る化学結合により、直接または別の化学物質を介してDSPに複合体化され得る。あるいは、標的部分は、DSP組成物が含まれる生体適合性樹脂などの一般的な媒体を介して、DSPと共局在し得る。複合体を形成する様式はまた、組み合わせて存在しながら本発明の活性状態および永久的な複合体または一過的な複合体が望まれるかどうかに基づいて選択される。
【０１１６】
いくつかの態様において、医薬組成物はまた、さらなる治療的に活性な薬剤を含む。このようなさらなる成分は、少なくとも、異なる標的に結合するさらなるDSP組成物、望ましくない炎症分子に結合する抗体、またはインターロイキン6、インターロイキン8、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子および腫瘍壊死因子αなどのサイトカイン；プロテアーゼインヒビターアプロチニンもしくはシクロオキシゲナーゼインヒビターなどの酵素インヒビター；アモキシリン、リファンピシン、エリスロマイシンなどの抗生物質；アシクロビルなどの抗ウイルス剤；グルココルチコイドなどのステロイド性抗炎症剤；アスピリン、イブプロフェン、もしくはアセトアミノフェンなどの非ステロイド性抗炎症剤；またはインターロイキン4もしくはインターロイキン10などの非炎症性サイトカインであり得る。インターフェロンβ、腫瘍壊死因子、抗血管形成因子、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、インターロイキン類、成熟因子、走化性タンパク質、およびそれらのバリアントなどの他のサイトカインおよび成長因子ならびに同様の生理的活性を保持する誘導体も、さらなる成分として使用してもよい。
【０１１７】
さらに、ビタミンDを受容する被験体内で生物学的に活性であるかまたは活性になるビタミンDの形態もさらなる成分として使用され得る。ビタミンDの2種類の主要な形態は、日光もしくは紫外線を浴びた後に皮膚で形成されるビタミンD3またはコレカルシフェロール、および植物もしくは植物物質もしくは食物の照射により得られるエルゴカルシフェロールまたはビタミンD2である。この違いは側鎖中にある。ビタミンD3は、ニシンおよびサバなどの脂肪の多い魚などの天然の供給源から得てもよい。体内では、二種類の異なるビタミンD3を見ることができる。ビタミンD3は肝臓内で25ヒドロキシビタミンD3（25(OH)D）にヒドロキシル化され、その後腎臓で腸のカルシウム吸収を刺激する活性代謝産物である1,25-ジヒドロキシビタミンD3（1,25(OH)2D）にヒドロキシル化される（Feldman et al., 2005）。1,25(OH)2Dが充分に利用可能である場合、24,25-ジヒドロキシビタミンD（24,25(OH)2D）が腎臓で形成され、さらに異化される。
【０１１８】
さらなる薬剤と同様に治療的に活性な薬剤の別の群は、複数の系統になり得る細胞から一般的なリンパ球前駆体（CLP）の産生を増加する免疫ブースターである。かかる薬剤の例は、ProMetic、Quebec、Canadaにより開発されたPBI-1402である。
【０１１９】
いくつかの態様において、さらなる活性な治療活性剤は、抗乾癬クリーム、スルファサラジン、グルココルチコイド、プロピルチオウラシル、メチマゾール、I131、インシュリン、IFN-β1a、IFN-β1b、グルココルチコイド、ACTH、アボネックス、アザチオプリン、シクロホスファミド、UV-B、PUVA、メトトレキサート、カルシピトリオール（calcipitriol）、シクロホスファミド、OKT3、FK-506、シクロスポリンA、アザチオプリン、およびミコフェノール酸モフェチルからなる群より選択される。
【０１２０】
本発明のDSP組成物との組合せに有用な治療剤の別の群は、抗肥満薬、例えばリピトールである。抗肥満薬としてはP-3アゴニスト、CB-1アンタゴニスト、食欲抑制剤、例えばシブトラミン（Meridia）など、およびリパーゼインヒビター、例えばオルリスタット（Xenical）などが挙げられる。本発明のコポリマーはまた、一般的に糖尿病患者の脂質障害の治療に使用される薬物と組み合わせて本発明の方法に使用してもよい。かかる薬物としては、HMG-CoAレダクターゼインヒビター、ニコチン酸、胆汁酸金属イオン封鎖剤、およびフィブリン酸誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。本発明のポリペプチドは、例えば、βブロッカー、カテプシンSインヒビターおよびACEインヒビターなどの抗高血圧薬と組み合わせて使用してもよい。βブロッカーの例は、アセブトロール、ビソプロロール、エスモロール、プロパノロール、アテノロール、ラベタロール、カルベジロールおよびメトプロロールである。ACEインヒビターの例は、カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、トランドラプリル、およびモエキシプリルである。
【０１２１】
特定の態様において、本発明の医薬組成物の投与により治療される疾患は、多発性硬化症、I型糖尿病、橋本甲状腺炎、クローン病、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（SLE）、胃炎、自己免疫性肝炎、溶血性貧血、自己免疫性血友病、自己免疫性リンパ球増殖症候群（ALPS）、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、糸球体腎炎、ギヤンバレー症候群、乾癬、重症筋無力症、自己免疫性脳脊髄炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、腫瘍随伴性天疱瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体による強皮症、混合結合組織病、悪性貧血、多発性筋炎、特発性アジソン病、自己免疫関連不妊症、水胞性類天疱瘡、ショーグレン症候群、特発性粘液水腫および大腸炎からなる群より選択される。
【０１２２】
本発明はさらに、(i) DSPをコードするDNAを含むDSP組成物またはDNA送達ビヒクルを含む組成物および(ii) 組成物投与の必要のある被験体に、24時間より長い、より好ましくは36時間より長い間隔で、自己免疫疾患などの疾患を治療するための組成物を投与するための指示書を含むキットを提供する。一態様において、自己免疫疾患は多発性硬化症である。好ましい態様において、DSP組成物は、約24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234もしくは240時間よりも長く、またはそれらの任意の中間の間隔での投与のための投与量で調製される。本明細書に記載されるキットの別の態様において、指示書は、DSPが約24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234もしくは240時間ごとに、またはその間の任意の間隔で投与され得ることを示す。キットは、パッケージ、指示書および皮下シリンジなどのコポリマーの投与のための1つ以上の装置などのさらなる構成要素を含んでもよい。
【０１２３】
V. 治療方法
本発明は、ペプチド免疫療法の効果を改善する必要において、さらなる改善を提供する。該改善は、低レベルもしくは高レベルのいずれかで抗化合物抗体を産生しながら、TH1免疫態勢、またはTH2免疫態勢のいずれかを生じつつ、該化合物が持続的キメラ現象、または能動もしくは受動のいずれかで免疫調節を達成する能力に基づいて、化合物を動的に投与することが可能な形態をとる。ランダム配列コポリマーの動的投与は、投与量、養生法、投与経路、および/または配合の任意の組合せからなる。この動的免疫調節は、特定の患者において任意の多段階疾患で高い有効性、ならびに複数の病原性抗原決定基に関連のない疾患をより効果的に治療する能力を提供する。
【０１２４】
本発明は、疾患に罹患しているかまたは罹患していることが疑われる被験体、好ましくはヒトにおける疾患を治療または予防する方法を提供する。本発明の別の態様は、例えば自己免疫疾患を発症する危険のある被験体を、DSP組成物を投与することで予防的に治療する方法である。危険性のある被験体は、例えば自己免疫疾患に関連のあるHLAのアレルおよび/または家族性病歴に基づくHLAのアレル、またはかかる自己免疫疾患に関連のある他の遺伝的マーカーを試験して、自己免疫疾患に対する遺伝的感受性を決定することにより同定される。あるいは、危険性のある被験体は、臓器移植を有する予定をしているかまたは有していた被験体である。このような予防的治療は、治療される疾患又は症状に関連のある第2のHLA分子に結合するDSP組成物をさらに含んでもよい。第2のHLA分子はHLA-DQ分子またはHLA-DR分子であり得る。
【０１２５】
本発明の一局面は、疾患を治療または予防する方法を提供し、該方法は、DSP組成物で治療される疾患の緩和のために有効量のDSP組成物の投与養生法を前記被験体に投与する工程を含み、前記有効量は24時間、36時間より長い、より好ましくは48時間より長い間隔で前記被験体に送達される。本発明の関連のある局面は、DSP組成物で治療可能な疾患の緩和のために有効量のDSP組成物の投与養生法を被験体に投与する工程を含む、治療の必要のある被験体の治療のための方法を提供し、前記有効量はDSP組成物を少なくとも2日、少なくとも4日、または少なくとも6日にわたり投与する徐放性製剤を使用して被験体に送達されるが、ここで有効量とは毎日送達された場合に有効である量のことである。
【０１２６】
特定の態様において、本発明の方法は、多発性硬化症、I型糖尿病、橋本甲状腺炎、クローン病、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（SLE）、胃炎、自己免疫性肝炎、溶血性貧血、自己免疫性血友病、自己免疫性リンパ増殖症候群（ALPS）、自己免疫性ブドウ膜炎、糸球体腎炎、ギヤンバレー症候群、乾癬、重症筋無力症、自己免疫性脳脊髄炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、腫瘍随伴性天疱瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体による強皮症、混合結合組織病、悪性貧血、多発性筋炎、特発性アジソン病、自己免疫関連不妊症、水胞性類天疱瘡、ショーグレン症候群、特発性粘液水腫および大腸炎からなる群より選択される疾患の治療に有効である。
【０１２７】
いくつかの態様において、本発明の方法の疾患は、T細胞、特にTH1細胞またはTH1免疫態勢を伴う細胞に媒介されるか、または炎症性サイトカインの過剰により悪化する疾患である。一局面において、本願は、上述のDSP組成物を含む組成物を投与することにより免疫応答を調節する方法に関する。いくつかの態様において、該疾患としては特に限定されることなく、急性炎症、慢性関節リウマチ、移植片拒絶、喘息、炎症性腸疾患、ブドウ膜炎、再狭窄、多発性硬化症、乾癬、傷の治癒、エリテマトーデス、アレルギー、アトピー性皮膚炎、および神経保護、ならびに当業者が理解し得る任意のその他の自己免疫性または炎症性障害が挙げられる。
【０１２８】
本発明の好ましい態様は、治療の必要のある被験体にDSP組成物を含む組成物を投与することによる治療可能な疾患の治療方法であり、ここで該疾患は、アレルギー、喘息、アトピー性皮膚炎、および神経保護からなる群より選択される。本発明は、どのような特定のDSP組成物または投与形態にも限定されない。
【０１２９】
本発明の一局面は、上述のDSP組成物を含む組成物を投与することにより、臓器移植の場合に対移植片宿主病（HVGD）または対宿主移植片病（GVHD）を予防、治療、または緩和するための免疫応答を調節するための方法、および自己免疫障害を予防、治療、または緩和する方法を提供する。従って、別の局面において本願は、臓器移植の際の持続的キメラ現象を誘導する方法に関する。さらに、本願は、移植片に対するT細胞応答を選択的に阻害し、結果的に、移植片の生存の可能性を高める方法に関する。
【０１３０】
臓器移植および骨髄再形成などの移植系は、多くの生命を脅かす疾患に対して重要かつ効果的な治療法となっている。しかしながら、免疫拒絶は依然として移植の成功についての大きな障壁である。このことは、臓器移植の場合において機能的な悪化および移植片拒絶に示される（対移植片宿主病、またはHVGD）。病理学的免疫反応の別の発現は、およそ30％の骨髄移植のレシピエントで生じるGVHDである。GVHDを発症したこれらの患者のおよそ半数がこの疾患の過程で死亡し得る。この高い罹患率および死亡率はGVHDを制御または予防する可能性において継続的な目的をもたらす。臨床病理学的に、GVHDの2種類の形態が認識されている。急性GVHDは骨髄移植後、最初の3ヶ月以内に発症し、皮膚、肝臓および胃腸管の障害を特徴とする。慢性GVHDは、移植後3ヶ月から3年までの間に起こる複数の臓器の自己免疫様疾患であり、全身性エリテマトーデス（SLE）および強皮症などの自然に生じる自己免疫障害に共通の特徴を有する。本明細書に記載される方法は急性および慢性の両GVHDを治療するために使用されてもよい。
【０１３１】
本明細書に記載される方法の特定の態様において、GVHDを発症する臓器移植の全ての場合においてGVHDを予防および治療するために、適用可能な臓器由来またはHLA由来の天然のペプチド配列に基づくDSP組成物が使用されてもよい。本発明の特に適切な応用は、同種異系の骨髄移植におけるものである。治療養生法は、移植の2日前から始まり、24、30、36、42または48時間より長く、60日間までの間隔の、ランダムコポリマーの投与を含み得る。DSP組成物と共にシクロスポリン、メトトレキサートおよびプレドニゾンなどのその他の免疫抑制薬を投与してもよい。
【０１３２】
本発明の方法はまた、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性非リンパ芽球性白血病（ANLL）、急性骨髄性白血病（AML）および慢性骨髄性白血病（CML）などの白血病、重症複合型免疫不全症候群（SCID）、大理石骨病、再生不良性貧血、ゴーシェ病、サラセミアならびにその他の先天的もしくは遺伝的に決定された造血または代謝異常などの、骨髄移植により治療可能な疾患に苦しむ患者の骨髄移植の経過において、GVHDの予防および治療に適用されてもよい。
【０１３３】
本発明の一局面は、DSPの投与により治療される症状またはDSPの投与により治療される症状を伴うか、もしくはそれと同時に生じる症状の治療に有効なその他の治療剤と組み合わせた、治療を必要とする上述のような被験体へのDSP組成物の投与である。さらなる治療活性剤により、DSP組成物と同様もしくは関連のある疾患を治療してもよいか、または皮内注射の部位の膨潤の減少のようなDSP組成物の投与の望ましくない副作用の治療を目的としてもよい。あるいは、その他の治療剤は、DSP組成物の活性を高める。このようなさらなる治療剤は、例えば、ステロイド、免疫ブースター、代謝拮抗物質、可溶性サイトカインレセプター、およびビタミンDまたは循環ビタミンDのレベルを増加する薬剤を含む、抗体、サイトカイン、成長因子、酵素インヒビター、抗生物質、抗ウイルス剤、抗炎症剤である。さらなる治療活性剤は、コポリマー1などの疾患に関連するHLA分子に結合するコポリマーまたは別のDSP組成物も含む。HLA分子はHLA-DQ分子またはHLA-DR分子であり得る。酵素インヒビターはプロテアーゼインヒビターまたはシクロオキシゲナーゼインヒビターであり得る。DSP組成物と組み合わせて投与される治療活性剤の例は、セクションIV、「医薬組成物」セクションに記載されるが、これらの薬剤の投与は単一組成物としての共投与には限定されない。さらなる治療剤は、さらなる治療剤の効果およびDSP組成物の効果がいくつかの時点で重複するように、DSP組成物の投与の前、同時、または後に投与されてもよい。
【０１３４】
特に、本発明の方法はさらに、前記被験体に抗リンパ球治療を施す工程を含む。かかる態様において、本発明のDSP組成物を自己免疫疾患の患者に投与し、その後抗リンパ球治療（例えば、抗T細胞または抗B細胞）を続ける。一態様において、抗T細胞治療は、Campath-1H（登録商標）（アレムツズマブ；抗CD52）、OKT3（抗CD3）、サイモグロブリン（抗胸腺グロブリン）、または抗IL2R抗体（例えば、ダクリズマブおよびバシリキシマブ）などの抗体を使用し得る。あるいは、抗T細胞治療は、フルダラビン、外部ビーム照射療法（XRT）、およびシクロホスファミドなどの化学療法剤を使用し得る。一態様において、抗リンパ球治療剤は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体からなる群より選択される。特定の態様において、ポリクローナル抗体は抗胸腺細胞ガンマグロブリン（ATGAM）である。他の態様において、抗体は、アレムツズマブ（Campath（登録商標））、ムロモナブ（OKT（登録商標）3）、ダクリズマブ、およびバシリキシマブからなる群より選択されるモノクローナル抗体である。別の態様において、本発明の方法は、前記被験体に抗B細胞療法を施すことを含む。一態様において、抗B細胞療法は、抗体リツキサン（リツキシマブ）などの抗CD-20抗体である。被験体に投与される上述のさらなる治療の投与量は、治療される症状の正確な性質および治療のレシピエントにより変化する。ヒト投与についての用量のスケール調整は当該技術の慣例に従って実施することが可能である。例えば、Campath-1H（登録商標）の用量は、一般的に成人患者につき1〜約100mgの範囲であり、通常1〜30日間毎日投与される。好ましい毎日の投与量は1日当たり1〜10mgであるが、いくつかの例において1日当たり40mgまでのより多くの用量が使用されてもよい（例えば、米国特許第6,120,766号参照）。何らかの特定の機構または理論に限定されることは望まないが、かかる組合せ治療は長期的な毒性を何ら有することなく治療効果を高めることが可能であると考えられている。例示するために、免疫抑制の最初の誘導についてCampath-1H（登録商標）を患者に導入する。その後、Campath-1H（登録商標）の非存在下で、患者に本発明のコポリマーを投与する。
【０１３５】
好ましい態様において、本発明のDSP組成物はビタミンDを受容する被験体の体内で生物学的に活性であるかまたは活性になる形態のビタミンDと共に投与することができる。ビタミンDの古典的な役割はカルシウム恒常性の制御を伴うことである。末梢血単核球上にビタミンDレセプター（VDR）が発見されて以降、特定の自己免疫疾患の疾病原因の役割における関心が増大した。ビタミンD欠乏では多発性硬化症（MS）の実験的モデルの罹病率が上昇し、ビタミンD処理によりこれらのMSの実験モデルが抑制されることが示された。さらなる研究は、T細胞上のVDRシグナル伝達の制限によりTh1エフェクター細胞が増加し、VDRシグナリングの増加により制御性T細胞が増加することを示した。従って、本明細書に記載されるものなどの免疫調節治療の経過の際にビタミンDを任意に増加させることは、ビタミンDが治療の調節成分の増加を補助するのと同様にに治療の効果の増加をもたらす、潜在的に相乗的な効果を有し、免疫療法に基づくペプチドは適応免疫応答に対してエピトープ特異的な関連性を提供する。
【０１３６】
特に、ビタミンDは免疫学的現象において役割を果たす、M.T. Cantorna, Progress in Biophys. Molec. Biol. 2006 Sep;92(1):60-4. Epub 2006 Feb 28.) およびSpach and Hayes, J. Immunol. 2005, 175:4199-4126、参照。
【０１３７】
本明細書に記載される方法の一態様において、投与経路としては、経口、腹腔内、経皮、皮下、静脈内注射もしくは筋内注射、吸入、局所、病変内、または点滴であり得；リポソーム媒介送達；鞘内、歯肉ポケット、腸、腟内、気管支内、鼻腔、経粘膜、小腸、眼もしくは耳送達、または当業者が容易に認め得る公知の任意の他の方法が可能である。投与は全身性または局所が可能である。この事象において、1つより多くのDSP組成物は同時にまたは重複して被験体に投与されており、このようなさらなる治療剤はDSP組成物の投与とは異なる経路で投与されてもよい。
【０１３８】
一般的に、本発明の態様は、例えば症状を緩和するなどの治療効果を生じるための最小有効用量である適切な用量の治療用DSP組成物を投与することである。好ましくは、治療用DSP組成物は被験体当りの用量で投与され、適切な最小開始用量として少なくとも約2mg、少なくとも約5mg、少なくとも約10mg、または少なくとも約20mg、または約x g（xは1〜20の整数）の一日当りの用量に相当する。本明細書に記載される方法の一態様において、約0.01〜約500mg/kgの用量を投与することができる。一般的に、本発明のDSP組成物の有効用量は、約50〜約400マイクログラムの組成物/被験体kg/日である。ある特定の態様において、用量が投与される頻度に関係なく、1日当りの投与等量は、約5〜100、またはより好ましくは約10〜40、またはより好ましくは約20mg/日である。別の特定の態様において、治療養生法における個々の投与量は、約5〜100、またはより好ましくは約10〜40、またはより好ましくは約20mg/用量である。
【０１３９】
しかしながら、本発明のDSP組成物の用量は、被験体および使用される特定の投与経路により変更されることが当業者には理解されよう。用量を個々の被験体に合わせて調整することは、当該技術分野において常套的である。さらに、有効量は、その他の事象の中で特にDSPの大きさ、DSPの生分解性、DSPの生物活性およびDSPの生物学的利用能に基づき得る。DSP用量が迅速に分解されない場合には、DSPが天然には存在しないアミノ酸を含むかペプチド模倣物である場合などが予想され、DSPは生物学的に利用可能でかつ高度に活性であり、有効であるためにはより少ない量が必要とされる。被験体に適した実際の用量は、常套的な慣例として、当業者、例えば一般的な開始点を与える医師や獣医師が容易に決定することができる。例えば、医師や獣医師は、所望の治療効果の達成、および所望の効果が得られるまでの時間での投与量の増加のために必要とされるよりも低いレベルで、医薬組成物に使用される本発明のDSP組成物の投与を開始することができた。DSP組成物の用量は、患者が現在の投与量レベルに対して有意に応答しない場合には増加してもよく、障害の症候または疾患状態の緩和が観察されるか、障害もしくは疾患状態が除去されるか、または開始用量で許容され得ない副作用が見られる場合には減少されてもよい。
【０１４０】
一態様において、治療有効量のDSP組成物は、投与間に少なくとも36時間、またはより好ましくは48時間の間隔を含む治療養生法において、被験体に投与される。別の態様において、DSP組成物は、少なくとも54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234もしくは240時間の間隔または数日間の等量で投与される。ある態様において、DSP組成物は一日おきに投与されるが、他の態様においてDSP組成物は週ごとに投与される。2種類の異なるDSP組成物、または別の治療剤を有するDSP組成物が被験体に投与される場合、かかる投与は同時などの同じ時間、または連続など実質的にほぼ同じ時間に行なわれてもよい。あるいは、これらの投与は時間をずらしてもよい。例えば、互いに48時間ごとに投与される2種類のDSP組成物は、共に同日に投与されてもよいか、あるいは1日目に1種類を投与して翌日にもう1種類を投与するなど、交互の様式で投与してもよい。
【０１４１】
結果的に全DSP曝露量はしばしば低いものになるが、より長い投与間隔での治療養生法は、DSP自身に対する抗体のより低い力価を誘導し、依然として所望の保護効果を誘導することが予想される。抗体が中和されることなくDSP組成物がその効果を持続することを補助する可能性があると考えられ、このことはアナフィラキシーショックのリスクの減少と関連し、疾患の治療に安全性を提供するので、中和抗体のこのような減少が望ましい。より長い間隔の養生法はまた、DSPによるこれらの疾患の治療についての作用様式であると見なされるTH2応答の傾向を強めるためにいくつかの疾患の治療において望ましい。
【０１４２】
他の態様において、DSP組成物は少なくとも1つの一様でない時間間隔を含む治療養生法において投与され、時間間隔の少なくとも1つは、少なくとも24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234もしくは240時間、または等量の数日間である。
【０１４３】
一態様において、DSP組成物は、投与間に少なくとも2回の間隔があるように、1回の治療養生法の間に少なくとも3回被験体に投与される。これらの間隔はI1およびI2と表される場合がある。DSP組成物が4回投与される場合、投与の所定の回数「n」についての間隔の数がn-1となるように、3回目と4回目の投与の間にさらなる間隔、I3が存在する。従って、一態様において、投与間の少なくとも1つの時間間隔は、約24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234または240時間よりも長い。別の態様において、合計n-1回の時間間隔の少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または95%は、少なくとも約24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234または240時間である。
【０１４４】
さらに別の態様において、投与間の平均時間間隔（(I1+I2 +...+In-1)/n-1）は少なくとも24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234もしくは240時間、または少なくとも2週間である。
【０１４５】
別の態様において、投与養生法は、2つ以上の異なる間隔設定からなる。例えば、投与養生法の第1の部分は、毎日、2日ごと、または3日ごとに、例えば約22mgコポリマー/被験体の体表面積m2で被験体に投与され、ここで被験体はヒトである。本発明のいくつかの態様において、投与養生法は、1日おき、3日ごと、毎週、隔週、または毎月で被験体に投与して開始される。1日おきまたは3日ごとの投与の用量は、約65mg/m2および110mg/m2のいずれかまでであってもよい。ランダムコポリマーの毎週投与を含む投与養生法について、用量は約500mg/m2までを含み、ランダムコポリマーの隔週または毎月投与を含む投与養生法については、1.5g/m2までが投与されてもよい。投与養生法の第1の部分は30日間まで、例えば7、14、21、または30日間投与されてもよい。通常より低い曝露量（段階的減少投与量）で毎週、14日ごと、または毎月投与される種々のより長い間隔の投与を有する投与養生法の次の第2の部分は、任意に、例えば毎週500mg/体表面積m2で、最大で約1.5g/体表面積m2で毎週の投与が続いてもよく、4週間〜2年、例えば4、6、8、12、16、26、32、40、52、63、68、78または104週続く。あるいは、疾患が緩和するかまたは一般的に改善する場合、用量は、最大用量、例えば毎週140mg/体表面積m2よりも低く保たれるかまたは一定に維持され得る。段階的減少投与養生法の間に疾患症状が再発する場合は、第1の投与養生法は効果が見られるまで再開され、第2の投与養生法が実行されてもよい。このサイクルは必要に応じて複数回繰り返され得る。
【０１４６】
本発明の他の態様において、DSP組成物を含む徐放性製剤を使用して本発明の方法のいずれかが実施されてもよい。徐放性製剤を使用して本発明のDSP組成物を投与する場合、DSPに対する全体的な曝露は、一般的にボーラス投与よりも低い。例えば、投与養生法の第1の部分は、毎日、1日おき、または2日おきで、例えば約22mg DSP/被験体体表面積m2で被験体に投与され、ここで被験体はヒトである。本発明のいくつかの態様において、投与養生法は、徐放性製剤を使用して1日おき、2日おき、毎週、隔週または毎月で被験体に投与されるので、コポリマーはインターバルの間に放出される。1日おきまたは2日おきの投与の用量は、約35mg/m2および65mg/m2のいずれかであり得る。DSP組成物の毎週投与を含む投与養生法について、用量は、約140mg/m2までの用量を含み、DSP組成物の隔週または毎月投与を含む投与養生法について、750mg/m2までが投与されてもよい。投与養生法の第1の部分は、30日間まで、例えば7、14、21または30日間投与され得る。通常より低い曝露量（段階的減少投与量）で毎週、14日ごとまたは毎月投与される、種々のより長い間隔の投与を有する投与養生法の次の第2の部分は、任意に、その後、例えば毎週140mg/体表面積m2、最大で約1.5g/体表面積m2までを続けてもよく、例えば4、6、8、12、16、26、32、40、52、63、68、78または104週の4週〜2年まで続く。あるいは、疾患が緩和するかまたは一般的に改善する場合、用量は最大量、例えば毎週140mg/体表面積m2より低く保たれるかまたは一定に維持されてもよい。段階的に減少する投与養生法の間に、疾患症状が再発した場合、効果が見られるまで第1の投与養生法が再開されてもよく、第2の投与養生法が実行されてもよい。このサイクルは必要に応じて複数回繰り返されてもよい。
【０１４７】
かかる徐放性投与について、かかる方法は、徐放性経皮パッチを適用する工程または徐放性放出カプセルもしくは移植可能コート医療用デバイスを埋め込む工程を含むので、本発明の治療有効用量のコポリマーは一定の時間間隔でかかる方法の被験体に送達される。本発明のDSP組成物は、長期にわたりDSPの制御放出を可能にするカプセルを介して送達されてもよい。制御または徐放性放出組成物は、脂肪親和性の蓄積物（例えば、脂肪酸、ワックス、オイル）中の製剤を含む。また、本発明にはポリマーでコートされた粒子組成物（例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン）も包含される。特定の態様において、DSP組成物の供給源は、自己免疫の攻撃を受ける領域内またはその近位、例えばIDDMの治療について膵臓の近くに、定位に提供される。
【０１４８】
DSP組成物の投与の結果としての、疾患に罹患した被験体の症候の改善は、投与の開始後の期間の、疾患症候の発現の再発の頻度の減少、症候の重症度の減少、および再発の消失により表される。好ましくは、治療有効量は、1つ以上の症候の少なくとも約20％、例えば少なくとも約40％、少なくとも約60％、少なくとも約80％、または約100％の消失、あるいは未治療被験体と比較して自己免疫疾患の再発の消失により、症候および再発の頻度を減少させる。期間は少なくとも約1月、少なくとも約6ヵ月または少なくとも約1年であり得る。
【０１４９】
例えば、関節炎または関節の炎症を生じる任意の他の自己免疫障害に罹患した被験体の症候の改善は、1つ以上の関節の水腫の減少、1つ以上の関節の炎症の減少、または1つ以上の関節の可動性の増加により表され得る。好ましくは、治療有効用量は、関節炎症および水腫を減少し、未治療被験体と比較して、少なくとも約20％、より好ましくは少なくとも約40％、さらに好ましくは少なくとも約60％、なお好ましくは少なくとも約80％で可動性を改善する。
【０１５０】
（定義）
用語「関連のある」は、「共存する」または「相関する」を意味する。該用語は必ずしも因果関係を示さないが、このような関係が存在してもよい。
【０１５１】
用語「結合」とは、例えば生理学的条件下での共有結合、静電結合、疎水性結合、イオン結合および/または水素結合相互作用による2分子間の直接的な結合のことであり、塩架橋および水架橋などの相互作用を含む。
【０１５２】
用語「HLA分子」は、任意のクラスII主要組織適合性複合体糖タンパク質を意味する。
【０１５３】
用語「免疫調節」は、免疫系が、主要組織適合性複合体（「MHC」）および抗原により形成された複合体のT細胞レセプター（「TCR」）認識を介して特定の抗原決定基に対する応答を開始する能力を増加または減少するプロセスを意味する。
【０１５４】
用語「免疫抑制」は、臓器または骨髄同系異種移植のレシピエントにおける免疫応答および反応性の落ち込みを意味する。
【０１５５】
用語「MHC活性」とは、MHC分子が、例えばT細胞活性化により免疫応答を刺激する能力のことをいう。MHC活性のインヒビターはこの活性を抑制することができるので、MHCによるT細胞の活性化を阻害することができる。好ましい態様において、目的のインヒビターは特定のクラスII MHCアイソタイプまたはアロタイプにより活性化を選択的に阻害する。かかるインヒビターは、生物中の全てのMHC活性を妨害することなく、特定の好ましくないMHC活性を抑制することができ、それにより、一般に動物の免疫応答を損なうことなく、哺乳動物、好ましくはヒトなどの動物における好ましくない免疫応答を選択的に治療することができる。
【０１５６】
用語「器官特異的タンパク質」または「器官特異的抗原」は、特定の器官を含む細胞により優性または独占的に発現されるタンパク質を意味する。
【０１５７】
用語「患者」とは、動物、好ましくは哺乳動物、例えばヒトならびに家畜およびその他の獣医学被験体のことをいう。
【０１５８】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、未修飾アミノ酸鎖のことをいい、リン酸化、糖化および脂質修飾などの小さな修飾も含む。用語「ペプチド」および「ペプチド模倣物」は、互いに相容れないものではなく、実質的な重複を含む。
【０１５９】
「ペプチド模倣物」としては、リン酸化、キャッピング、脂肪酸修飾などのアミノ酸鎖の任意の修飾形態が挙げられ、天然には存在しない主鎖および/または側鎖構造を含む。以下に記載するように、ペプチド模倣物は1つのアミノ酸鎖と非ペプチド小分子の構造連続体を含む。一般的に、ペプチド模倣物は、認識可能なペプチド様ポリマー単位構造を保持する。従って、ペプチド模倣物は、自己免疫疾患に苦しむ患者において、自己反応性T細胞を活性化する複合体を形成するHLAタンパク質に結合する機能を保持する。
【０１６０】
用語「アミノ酸残基」は当該技術分野に公知である。一般的に、アミノ酸および保護基を表すために本明細書において使用される略語は、生化学命名法のIUPAC-IUB委員会の推奨に基づく（Biochemistry (1972) 11 :1726-1732、参照）。特定の態様において、本発明の適用に使用されるアミノ酸は、タンパク質中に見られる天然に存在するアミノ酸、またはアミノ基およびカルボキシル基を含むかかるアミノ酸の天然に存在する同化産物または異化産物である。特に適切なアミノ酸側鎖としては、以下のアミノ酸：グリシン、アラニン、バリン、システイン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、メチオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンから選択される側鎖が挙げられる。
【０１６１】
用語「アミノ酸残基」はさらに、本明細書に言及される任意の特定のアミノ酸のアナログ、誘導体および同種物、ならびにC末端またはN末端保護アミノ酸誘導体（例えば、N末端またはC末端保護基で修飾されたもの）を含む。例えば、本発明は、環状化のためのカルボキシル、アミノまたはその他の反応性前駆体官能基を提供しながらも側鎖が伸長または短縮されたアミノ酸アナログ、ならびに適切な官能基を伴うバリアント側鎖を有するアミノ酸アナログの使用を意図する）。例えば、本発明の化合物として、例えばシアノアラニン、カナバニン、ジエンコル酸、ノルロイシン、3-ホスホセリン、ホモセリン、ジヒドロキシ-フェニルアラニン、5-ヒドロキシトリプトファン、1-メチルヒスチジン、3-メチルヒスチジン、ジアミノピメリン酸、オルニチンまたはジアミノブチル酸などのアミノ酸アナログを挙げることができる。その他の天然に存在するアミノ酸代謝産物または本明細書に適切な側鎖を有する前駆体が当業者により認識され、本発明の範囲に含まれる。
【０１６２】
本発明のDSPに使用されるアミノ酸のほとんどは、特定の幾何異性体または立体異性体の形態で存在してもよい。好ましい態様において、本発明のDSPを形成するために使用されるアミノ酸は(L)-異性体であるが、(D)-異性体も非アンカー位置においてなどのDSPまたはDSPのペプチド模倣物形態の場合に含まれてもよい。
【０１６３】
本明細書で使用される場合、「予防する」は、例えば障害また症状の1つ以上の症候の開始を遅らせるかまたは妨げることを意味する。
【０１６４】
本明細書で使用される場合、「治療する」は、例えば障害または症状の1つ以上の症候の重症度を少なくとも軽減するかまたは影響を少なくとも緩和することを意味する。
【０１６５】
本明細書で使用される場合、「治療養生法」は、1つ以上のDSP組成物を含む1つ以上の組成物の投与の治療的、緩和的および予防的様式を包含する。特定の治療養生法は、特定の投与パターンにおいて一定期間持続し得るが、特定の疾患または障害の性質、その重症度および患者の全体的な状態に依存して変化し、一日に1回、またはより好ましくは36時間または48時間以上ごとに1回から一月または数ヶ月に1回に延ばされてもよい。
【０１６６】
用語「構造活性相関」または「SAR」とは、薬物の分子構造の変化がレセプター、酵素等の相互作用を変化する様式のことをいう。
【０１６７】
本発明の実施は、適切な場合、および他の場合で示されない場合、当該技術分野に含まれる細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、ウイルス学、組換えDNA、および免疫学の従来技術を使用する。このような技術は参考文献に記載される。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版、Sambrook and Russell編、(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 2001)；学術論文、Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.)；Using Antibodies, 第2版、Harlow and Lane編, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999；Current Protocols in Cell Biology, Bonifacino, Dasso, Lippincott-Schwartz, Harford, and Yamada編, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999；およびPCR Protocols, Bartlett et al.編, Humana Press, 2003；PHARMACOLOGY A Pathophysiologic Approach、Josehp T. DiPiro, Robert Talbert, Gary, Yee, Gary Matzke, Barbara Wells, and L. Michael Posey編, 第5版、2002 McGraw Hill；Pathologic Basis of Disease. Ramzi Cotran, Vinay Kumar, Tucker Collins. 第6版、1999. Saundersを参照のこと。
【０１６８】
（実施例）
実施例1. 架空のベースペプチドからのDSP組成物の調製
例示として容易に理解するために、公知のエピトープを示す2種類の架空のペプチド配列由来のDSP組成物の調製が図6に示される表に記載され示される。この例示において、カセットは、5つのアミノ酸、それぞれ（x1、x2、x3、x4、x5=y1のTHMCEおよびy2のPWKNA）からなる。THMCEは、入力比a=7、b=1、c=1、d=1、e=10を有するように規定される。PWKNAは、入力比a=1、b=3、c=3、d=3、e=20を有するように規定される。合成のために、各ペプチドについての各アミノ酸位を占めるアミノ酸の群の同一性は、図4に示されるように、Kosiol et al., J. Theoretical Biol. 228:97-106, 2004に記載されるアミノ酸置換の好ましい方法（またはそれより好適ではないがアミノ酸の規則的な変形の同等の手段）を使用して決定され、得られる集合的なDSP組成物においてかかる位置のそれぞれを占める全アミノ酸の比は先に示される。それぞれのカセット、y1およびy2は、2回ずつ繰り返され、y1 y1 y2y2 y1 y1 y2 y2の順番を生じる。Nnは、カセット内の配列が繰り返される回数であり、発明者らの仮想の例はN=2である。MNは修飾部分の任意の種類であり得る。MNは固相合成方法に柔軟でなければならない。この仮想の例について、DSPを被験体の特定の位置に標的化するアミノ酸の修飾部分は、αVβ3などの特定のインテグリンのRGDベース配列モチーフのように選択される。この例において、C末端修飾基はまた、RGDベースモチーフであるが、Dアミノ酸からなる。
【０１６９】
上述のDSP組成物は、本明細書の他の箇所に記載される固相ペプチド合成法を用いて調製される。
【０１７０】
実施例2. MBP（83〜99）由来のDSP組成物の調製
ミエリン塩基性タンパク質は多発性硬化症の病因に関連し、いくつかのエピトープが同定され該疾患の症候および進行に関連することが明らかにされている。かかるエピトープの一つは、ミエリン塩基性タンパク質のアミノ酸残基83〜99（MBP(83〜99)）に存在する。COP-1は、MBP(83〜99)と同じHLAの結合ポケットを標的化すると考えられる。DSP組成物は、ベースペプチド配列としてMBP(83〜99)を使用して規定され、調製される。
【０１７１】
得られるペプチドのそれぞれの位置に対するアミノ酸の同一性を規定するための方法および規則は、上述の実施例1に記載される。かかる規則の実際の応用は図8A〜Bの表に例示される。実施例1と同様に、DSP組成物は固相ペプチド合成法を使用して合成される。
【０１７２】
以下の参照は、ベースペプチド配列として有用なエピトープの典型的な情報源である。番号は表1の参照番号である。
【０１７３】
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【０１７４】
本願のいずれかの箇所において参照される任意の特許、特許出願、特許公開公報または科学文献の内容は、その全体において本明細書中に援用される。
【０１７５】
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【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】図1A〜Dは合成ペプチドベース治療剤を設計する方法を記載する概略である。パネルA:ペプチドライブラリーがどのようにエピトープ発見に使用されるか;パネルB:改変ペプチドリガンドベース治療を生成する概念工程; パネル C:多価ペプチド提示のデンドリマーの概略; パネルD: ランダムシークエンスポリマー生成。
【図２】図２は指向性配列ポリマーを生成する概念工程の概略である。
【図３】図３は指向性配列ポリマーの調製の工程を示す。
【図４】図４はエピトープ透過性の指向された拡張のための好ましく定義された置換規則を示す。
【図５】図５は一般的な規則構造およびDSP合成の置換の範囲を示す。
【図６】図６はモック供給ペプチドを用いたDSP合成規則の応用の例を示す。
【図７Ａ】図7Aは供給ペプチドとしてミエリン塩基性タンパク質(a.a.残基83〜99)を用いたDSP合成規則の応用の例を示す。
【図７Ｂ】図7Bは供給ペプチドとしてミエリン塩基性タンパク質(a.a.残基83〜99)を用いたDSP合成規則の応用の例を示す。
【図８Ａ】図8Aは供給ペプチドとしてHLA由来ペプチドおよびHLA模倣物由来ペプチドを用いたDSP合成規則の応用の例を示す。
【図８Ｂ】図8Bは供給ペプチドとしてHLA由来ペプチドおよびHLA模倣物由来ペプチドを用いたDSP合成規則の応用の例を示す。
【図８Ｃ】図8Cは供給ペプチドとしてHLA由来ペプチドおよびHLA模倣物由来ペプチドを用いたDSP合成規則の応用の例を示す。
【図９Ａ】図9Aは供給ペプチドとしてGAD65由来エピトープペプチドを用い、実験で決定された置換規則を適用したDSP合成規則の応用の例を示す。
【図９Ｂ】図9Bは供給ペプチドとしてGAD65由来エピトープペプチドを用い、実験で決定された置換規則を適用したDSP合成規則の応用の例を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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