(57)【要約】  貧血症を処置する方法を開示する。本方法ではＴＰＯペプチド化合物を患者に投与する。ＴＰＯペプチド化合物及び薬学的に許容されうる担体を含んでなる薬学的組成物、並びに標識したＴＰＯペプチド化合物を用いる診断方法も更に開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のＴＰＯペプチド化合物をこれを必要とする患者に投与することを含んでなる処置後の貧血の発症の予防方法。
【請求項２】
該処置が細胞毒性剤、抗癌剤及び放射線による処置よりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
有効量のＴＰＯペプチド化合物を患者に投与することを含んでなる赤血球（red blood cell）の産生を増大させる方法。
【請求項４】
前記患者がヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＴＰＯペプチド化合物がｒｈＴＰＯ及びｒｈＩＬ−１１の１種もしくはそれ以上に対して減少した免疫源性を有する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＴＰＯペプチド化合物がｒｈＴＰＯ及びｒｈＩＬ−１１の１種もしくはそれ以上に対して向上したＰＫプロファイルを有する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該有効量が１日当たり約１μｇ〜約３００μｇ／ｋｇ（体重）である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
薬学的に許容されうる担体と混合されたＴＰＯペプチド化合物を含んでなる赤血球の産生を増大させるための薬学的組成物。
【請求項９】
有効量のＴＰＯペプチド化合物をこれを必要とする患者に投与する工程を含んでなる貧血の処置方法。
【請求項１０】
薬学的に許容されうる担体と混合されたＴＰＯペプチド化合物を含んでなる貧血を処置するための薬学的組成物。
【請求項１１】
該赤血球（red blood cell）が、系列特異的な赤血球前駆細胞、網状赤血球及び赤血球（erythrocyte）よりなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
有効量のＴＰＯペプチド化合物をこれを必要とする患者に投与することを含んでなり、該ＴＰＯペプチド化合物が以下の構造：
ＩＥＧＰＴＬＲＱ（２−Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｓａｒ）（配列番号５）を有する処置後の貧血の発症を予防する方法。
【請求項１３】
該処置が細胞毒性剤、抗癌剤、放射線による処置よりなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該有効量が１日当たり約１μｇ〜約３００μｇ／ｋｇ（体重）である請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
有効量のＴＰＯペプチド化合物を患者に投与することを含んでなり、該ＴＰＯペプチド化合物が以下の構造：
ＩＥＧＰＴＬＲＱ（２−Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｓａｒ）（配列番号５）を有する赤血球の産生を増大させる方法。
【請求項１６】
該赤血球が、系列特異的な赤血球前駆細胞、網状赤血球及び赤血球よりなる群から選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
薬学的に許容されうる担体と混合されたＴＰＯペプチド化合物を含んでなり、該ＴＰＯペプチド化合物が以下の構造：
ＩＥＧＰＴＬＲＱ（２−Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｓａｒ）（配列番号５）を有する赤血球の産生を増大させるための薬学的組成物。
【請求項１８】
有効量のＴＰＯペプチド化合物をこれを必要とする患者に投与する工程を含んでなり、該ＴＰＯペプチド化合物が以下の構造：
ＩＥＧＰＴＬＲＱ（２−Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｓａｒ）（配列番号５）を有する貧血の処置方法。
【請求項１９】
薬学的に許容されうる担体と混合されたＴＰＯペプチド化合物を含んでなり、該ＴＰＯペプチド化合物が以下の構造：
ＩＥＧＰＴＬＲＱ（２−Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｓａｒ）（配列番号５）を有する貧血を処置するための薬学的組成物。
【請求項２０】
有効量のＴＰＯペプチド化合物をこれを必要とする患者に投与することを含んでなり、該ＴＰＯペプチド化合物が以下の構造：
【化１】
2009526841.tif 000010
［式中、ＭＰＥＧは分子量が約２０，０００ダルトンのメトキシポリ（エチレングリコ
ール）である］
を含んでなる処置後の貧血の発症を予防する方法。
【請求項２１】
該処置が細胞毒性剤、抗癌剤、及び放射線による処置よりなる群から選択される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
該有効量が１日当たり約１μｇ〜約３００μｇ／ｋｇ（体重）である請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
有効量のＴＰＯペプチド化合物を患者に投与することを含んでなり、該ＴＰＯペプチド化合物が以下の構造：
【化２】
2009526841.tif 000011
［式中、ＭＰＥＧは分子量が約２０，０００ダルトンのメトキシポリ（エチレングリコ
ール）である］
を含んでなる赤血球の産生を増大させる方法。
【請求項２４】
該赤血球が系列特異的な赤血球前駆細胞、網状赤血球及び赤血球よりなる群から選択される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
薬学的に許容されうる担体と混合されたＴＰＯペプチド化合物を含んでなり、該ＴＰＯペプチド化合物が以下の構造：
【化３】
2009526841.tif 000012
［式中、ＭＰＥＧは分子量が約２０，０００ダルトンのメトキシポリ（エチレングリコ
ール）である］
を含んでなる赤血球の産生を増大させるための薬学的組成物。
【請求項２６】
有効量のＴＰＯペプチド化合物をこれを必要とする患者に投与する工程を含んでなり、該ＴＰＯペプチド化合物が以下の構造：
【化４】
2009526841.tif 000013
［式中、ＭＰＥＧは分子量が約２０，０００ダルトンのメトキシポリ（エチレングリコ
ール）である］
を含んでなる貧血を処置する方法。
【請求項２７】
薬学的に許容されうる担体と混合されたＴＰＯペプチド化合物を含んでなり、該ＴＰＯペプチド化合物が以下の構造：
【化５】
2009526841.tif 000014
［式中、ＭＰＥＧは分子量が約２０，０００ダルトンのメトキシポリ（エチレングリ
コール）である］
を含んでなる貧血を処置するための薬学的組成物。
【請求項２８】
有効量のＴＰＯペプチド化合物をこれを必要とする患者に投与することを含んでなり、該ＴＰＯペプチド化合物が以下の構造：
【化６】
2009526841.tif 000015
を含んでなる処置後の貧血の発症を予防する方法。
【請求項２９】
該処置が細胞毒性剤、抗癌剤、放射線による処置よりなる群から選択される請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
該有効量は１日当たり約１μｇ〜約３００μｇ／ｋｇ（体重）である請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
有効量のＴＰＯペプチド化合物を患者に投与することを含んでなり、該ＴＰＯペプチド化合物が以下の構造：
【化７】
2009526841.tif 000016
を含んでなる赤血球の産生を増大させる方法。
【請求項３２】
該赤血球が系列特異的な赤血球前駆細胞、網状赤血球及び赤血球よりなる群から選択される請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
薬学的に許容されうる担体と混合されたＴＰＯペプチド化合物を含んでなり、該ＴＰＯペプチド化合物が以下の構造：
【化８】
2009526841.tif 000017
を含んでなる赤血球の産生を増大させるための薬学的組成物。
【請求項３４】
有効量のＴＰＯペプチド化合物をこれを必要とする患者に投与する工程を含んでなり、該ＴＰＯペプチド化合物が以下の構造：
【化９】
2009526841.tif 000018
を含んでなる貧血を処置する方法。
【請求項３５】
薬学的に許容されうる担体と混合されたＴＰＯペプチド化合物を含んでなり、該ＴＰＯペプチド化合物が以下の構造：
【化１０】
2009526841.tif 000019
を含んでなる貧血を処置するための薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トロンボポエチン受容体（ｃ−ｍｐｌまたはＴＰＯ−Ｒ）に結合してこれを活性化するか、もしくはトロンボポエチン（ＴＰＯ）のアゴニストとして作用するペプチド化合物を提供する。本発明は、特に、生化学及び医薬品化学の分野に応用されるものであり、ヒトの疾患の処置に用いるためのＴＰＯアゴニストを提供するものである。本発明のペプチド化合物は、貧血症の処置及び／または貧血症の発症の防止及び／または赤血球の正常な産生の維持に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
ＴＰＯをコードする遺伝子はこれまでにクローニング及び同定されている（非特許文献１〜５参照）。ＴＰＯは、共通のＮ末端アミノ酸配列を有し、見かけ上の分子量が４．２Ｅ−２０ｇ（２５ｋＤａ）及び５．１Ｅ−２０ｇ（３１ｋＤａ）である少なくとも２つの型が存在する糖タンパク質である（非特許文献６参照）。ＴＰＯはＡｒｇ−Ａｒｇ切断部位と考えられる部位によって分けられた２個の異なる領域を有するものと考えられている。アミノ末端側領域はヒトとマウスで高度に保存されており、エリスロポエチン及びインターフェロン−ａ及びインターフェロン−ｂとある程度の相同性を有している。カルボキシ末端側領域は種間で大きく異なっている。
【０００３】
ヒトのＴＰＯ−Ｒ（ｃ−ｍｐｌとしても知られる）のＤＮＡ配列及びコードされたペプチド配列についてはこれまでに記載されている（非特許文献７参照）。ＴＰＯ−Ｒは、Ｎ末端側部分に４個の保存されたＣ残基を含有するとともに膜貫通領域の近傍にＷＳＸＷＳモチーフ（配列番号１）を含有する細胞外ドメインを共通の構造的特徴とするファミリーであるヘマトポエチン増殖因子受容体ファミリーの一員である（非特許文献８参照）。この受容体が造血において所定の機能的役割を担っていることの証拠としては、受容体の発現がマウスでは脾臓、骨髄、または胎児肝臓に限定して見られ（非特許文献９参照）、ヒトでは巨核球、血小板、及びＣＤ３４+細胞に限定して見られる（非特許文献１０参照）ことが挙げられる。一部の研究者は、この受容体が、Ｇ−ＣＳＦ及びエリスロポエチンの受容体と同様、ホモ二量体として機能しているものと仮説している。
【０００４】
クローニングされたＴＰＯ−Ｒの遺伝子が入手可能であることからこの重要な受容体のアゴニストの探索が容易に行えるようになっている。また組換え受容体タンパク質が入手可能であることから、各種のランダムまたはセミランダムな異種ペプチド生成系において受容体とリガンドの相互作用の研究が可能となっている。これらの系については特許文献１〜７並びに非特許文献１１により開示されている。以上の文献をいずれも本明細書に援用するものである。
【０００５】
血液中を循環している形態的に識別可能であり機能的に有能である細胞として、赤血球、好中性、好酸性及び好塩基性顆粒球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、非Ｂリンパ球、非Ｔリンパ球、及び血小板が挙げられる。これらの成熟造血細胞は、必要に応じてそれぞれの細胞系について形態的に識別可能な分裂中の前駆細胞（赤血球系では赤芽球、顆粒球系では骨髄芽球、前骨髄球及び骨髄球、血小板では巨核球）から誘導及び当該前駆細胞によって補充される。これらの前駆細胞は２つの大きなサブグループ、すなわち幹細胞と前駆細胞とに単純に分類される更なる始原細胞から誘導される（概論については、非特許文献１２参照）。
【０００６】
幹細胞及び前駆細胞の定義は運用上のものであって、形態的特徴ではなく機能的特徴に拠っている。幹細胞は広範な自己更新能または自己維持能を有する（非特許文献１３）が
、これは幹細胞が存在しないか欠乏した場合に、１つ以上の細胞系が完全に枯渇し、短時間に疾患及び死に到ることから必要な能力である。幹細胞のあるものは必要に応じて分化するが、あるものは他の幹細胞を産生してこれらの細胞のプールを維持する。すなわち多分化能幹細胞は自らを維持する以外に、自己更新能がより限定されているかもしくは自己更新能がまったくない前駆細胞の複数のサブ系列へと分化する能力を有している。これらの前駆細胞は最終的には形態的に識別可能な前駆細胞を生ずる。前駆細胞は１つ以上の骨髄分化経路に沿って増殖及び分化する能力を有している（非特許文献１４）。
【０００７】
様々な感染性因子、遺伝的異常、及び環境因子によって１つ以上の造血細胞のタイプの欠乏が引き起こされる。更に癌や特定の免疫性疾患の処置に用いられる化学療法や放射線療法によって汎血球減少症、または貧血症、好中球減少症及び血小板減少症の組み合わせが引き起こされる。したがって造血細胞の増加または補充はこうした処置の成功にとってしばしば極めて重要である（血液疾患及びその原因の一般的議論については、例えば：非特許文献１５参照）。
【０００８】
多くの血液疾患並びに化学療法及び放射線療法による内在性造血細胞の破壊に対して現在行われている治療法は骨髄移植である。しかしながら骨髄移植は、一卵性双生児の兄弟がいたり、寛解状態の患者の骨髄細胞が生存状態で凍結保存されている場合を除き、完全に適合した（同じ遺伝子を有する）ドナーが見つかることが極めて稀であることから、その使用は極めて制限される。こうした自己移植的なケースを除けば、ある程度の遺伝子の不一致は不可避であり、重篤な、時として致命的な合併症を伴うこととなる。これらの合併症には二重の要因がある。第一に、他者の骨髄細胞に対する免疫拒絶反応（宿主対移植片反応）を避けるために通常、患者の免疫系を薬剤によって予め抑制する点である。第二に、移植された骨髄細胞が定着した場合、異物として認識される患者をこれらの細胞が攻撃する点である（移植片対宿主病）。適合性が高い家族がドナーである場合であっても、部分的不一致によるこうした合併症は、遺伝的に異なる個人からの骨髄移植を直接的要因とした高い死亡率及び罹病率に結びつく。
【０００９】
造血再構築を目的とした幹細胞の入手源として末梢血についても研究がなされている（非特許文献１６〜２１）。一部の研究では様々な白血病の患者（非特許文献２２〜２４、さらにまた、非特許文献２５、並びに引用文献）及びリンパ腫の患者（非特許文献２６）において有望な結果が得られている。しかしながら末梢血を用いた他の研究では造血再構築は見られなかった（非特許文献２７、２８）。胎児肝細胞移植（非特許文献２９〜３３、また、非特許文献３４、及び引用文献も参照されたい）または新生児の脾臓細胞移植（非特許文献３５）の使用についても造血再構築を目的とした幹細胞源として研究がなされている。免疫再構築を目的とした実験（immune reconstitution experiments）において新生児の胸腺細胞の移植も試みられている（非特許文献３６、３７）。
【００１０】
したがってイン・ビトロ（in vitro）で血液細胞を増殖させるための方法またはイン・ビボ（in vivo）で造血細胞の産生を増大させる治療法が強く求められていることは明らかである。
【００１１】
血中のヘモグロビン濃度の低下として定義される貧血症は、全循環赤血球量の低下に通常関連している。その原因に関係なく貧血症では血液の酸素運搬能が低下し、重篤な場合には臨床的症状及び兆候が見られる。
【００１２】
臨床的には貧血症は、皮膚及び粘膜の蒼白、並びに低酸素症、最も一般的には虚弱、疲労、倦怠感や眩暈の発現によって特徴付けられる。心筋の低酸素状態は循環亢進状態を引き起こし、心拍数と１回拍出量が増大する可能性がある。駆出性雑音（ejection type flow murmurs）が生じ、貧血症が重篤である場合には心不全が起こる場合もある。
【００１３】
貧血症は一般的には２つの分類法、すなわち病因的分類法（原因に基づいた分類）または形態学的分類法（形状、サイズの変化に基づいた分類）のいずれかによって分類される。病因的分類がより一般的に用いられている。
【００１４】
同種免疫性溶血性貧血はある個体の抗体が別の個体の赤血球（ＲＢＣ）と反応して起こる貧血症である。同種免疫性溶血性貧血は通常、ＡＢＯ不適合血液の輸血後及び新生児のＲｈ不適合の後に発症する。同種免疫性溶血性貧血は同種移植後に起こる場合もある（非特許文献３８）。
【００１５】
特定の薬剤の投与によって一過性の薬物性貧血が引き起こされる場合がある。この貧血は以下の３つの機序によって起こる：１）薬剤と赤血球細胞膜との複合体に対する抗体による場合（例、ペニシリンまたはセファロチン）、２）薬剤−タンパク質（抗原）−抗体複合体を介した赤血球表面への補体の結合による場合（例、キニジンまたはクロルプロパミド（chloropropamide）、または３）自己免疫性溶血性貧血による場合（薬剤の役割は不明）（例、メチルドーパ）である。いずれの場合にも薬物の投与が中断されて初めて貧血が改善される（ただしメチルドーパでは抗体が数ヶ月にわたって残存する）（非特許文献３９）。
【００１６】
再生不良性貧血は骨髄の形成不全に起因する汎血球減少症（貧血症、白血球減少症、及び血小板減少症）として定義される。この貧血症は異なる原発型に分類される。すなわち、先天型（ファンコーニ貧血）と明らかな増悪原因のない後天型（特発性）である。二次的原因は各種の産業性、医原性、及び感染性の原因に起因するものがある。根本原因としては、造血多能性幹細胞の数の大幅な減少及び残った幹細胞の機能不全、または幹細胞に対する免疫反応によって骨髄細胞の数を維持する程度に充分に幹細胞が分裂、分化できなくなることが考えられる（非特許文献４０）。一部のケースで、サプレッサーＴ細胞及び免疫グロブリンが生体外でエリスロポエチンを阻害したり、造血幹細胞の分化を阻害することが示されている（非特許文献４１）。
【００１７】
ニーリスら（非特許文献４２）は、ヒトの組換えＴＰＯによって、５Ｇｙの全身照射量（３００ｋＶのＸ線）に曝露したアカゲザルにおいて赤血球系の回復が刺激され、網状赤血球がプラシーボ処置した動物におけるよりも１０日早く再生を開始したことを開示している。ニーリスらは更に、比較群よりもヘモグロビン値及びヘマトクリット値が改善されたことを開示している。
【００１８】
バッサーら（非特許文献４３）は、ＰＥＧ−ｒＨｕＭＧＤＦ及びフィルガストリム（filgastrim）の投与によってカルボプラチン（６００ｍｇ／ｍ2）及びシクロホスファミド（１２００ｍｇ／ｍ2）を与えた患者の末梢血前駆細胞が増加したことを開示している。
【００１９】
パパヤノポウロウら（非特許文献４４）は、生体外で赤血球産生及び血小板産生への分化に対するＥＰＯ及びＴＰＯの影響を開示している。
【００２０】
カウシャンスキーら（非特許文献４５）は赤芽球前駆細胞を増殖させるうえでＴＰＯがＥＰＯと相乗的に作用したことを開示している。カウシャンスキーら（非特許文献４６）は、ＴＰＯによって骨髄抑制動物においてＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ及びＣＦＵ−Ｍｋ前駆細胞が増殖したことを開示している。
【００２１】
【特許文献１】米国特許第６，２５１，８６４号
【特許文献２】米国特許第６，０８３，９１３号
【特許文献３】米国特許第６，１２１，２３８号
【特許文献４】米国特許第５，９３２，５４６号
【特許文献５】米国特許第５，８６９，４５１号
【特許文献６】米国特許第６，５０６，３６２号
【特許文献７】米国特許第６，４６５，４３０号
【非特許文献１】Kuter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11104-11108（1994）
【非特許文献２】Barley et al. Cell 77:1117-1124（1994）
【非特許文献３】Kaushansky et al. Nature 369:568-571（1994）
【非特許文献４】Wendling et al. Nature 369:571-574（1994）
【非特許文献５】Sauvage et al. Nature 369:533-538（1994）
【非特許文献６】Bartley et al. Cell 77:1117-1124（1994）
【非特許文献７】Vigon et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5640-5644（1992）
【非特許文献８】Bazan Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6934-6938（1990）
【非特許文献９】Souyri et al. Cell 63:1137-1147（1990）
【非特許文献１０】Methia et al. Blood 82:1395-1401（1993）
【非特許文献１１】Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382（1990）
【非特許文献１２】Broxmeyer, H. E., 1983, "Colony Assays of Hematopoietic Progenitor Cells and Correlations to Clinical Situations," CRC Critical Review in Oncology/Hematology 1:227-257
【非特許文献１３】Lajtha, Differentiation, 14:23（1979）
【非特許文献１４】Lajtha, Blood Cells, 5:447（1979）
【非特許文献１５】"Hematology"in Scientific American Medicine, E. Rubenstein and D. Federman, eds., Volume 2, Chapter 5, Scientific American, New York（1996）
【非特許文献１６】Nothdurtt, W., et al., 1977, Scand. J. Haematol. 19:470-481
【非特許文献１７】Sarpel, S. C., et al., 1979, Exp. Hematol. 7:113-120
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【非特許文献２１】Prummer, O., et al., 1985, Exp. Hematol. 13:891-898
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【非特許文献２７】Hershko, C., et al., 1979, The Lancet 1:945-947
【非特許文献２８】Ochs, H. D., et al., 1981, Pediatr. Res. 15:601
【非特許文献２９】Cain, G. R., et al., 1986, Transplantation 41:32-25
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【非特許文献３３】Touraine, J. L., 1983, Birth Defects 19:139
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【非特許文献３６】Vickery, A. C., et al., 1983, J. Parasitol. 69（3）:478-485
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【非特許文献３８】Hoffbrand, A. V. in Essential Hematology, 3rd. ed., Blackwell Scientific Publications, 1993, p. 90
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【非特許文献４０】Hoffbrand, A. V. in Essential Hematology, 3rd. ed., Blackwell Scientific Publications, 1993, p. 121
【非特許文献４１】Andreoli, T. in Essentials of Medicine, W. B. Saunders, 1986, p. 349
【非特許文献４２】Neelis et al., Blood, 90（1）:58-63（1997）
【非特許文献４３】Basser et al., Blood, 89（9）:3118-3128（1997）
【非特許文献４４】Papayannopoulou et al., Exp. Hematol., 24（5）:660-669（1996）
【非特許文献４５】Kaushansky et al., J. Clin. Invest., 96（3）:1683-1687（1995）
【非特許文献４６】Kaushansky et al., Exp. Hematol., 24（2）:265-269（1996）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
貧血症は重大な問題であり、貧血症の発症を予防し、貧血症を処置し、赤血球の生存を促し、及び／または赤血球の正常な産生を維持することが可能な血液増殖因子のアゴニストの探索が緊急の課題となっている。本発明はそうしたアゴニストを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、貧血症の処置における所定の低分子量ペプチド化合物の使用に関するものである。所定の低分子量ペプチド化合物は、ＴＰＯ−Ｒに対する強い結合性を示し、ＴＰＯ−Ｒを活性化し、既知のＴＰＯアゴニストと比較して副作用が潜在的に低く、イン・ビトロ（in vitro）及びイン・ビボ（in vivo）において赤血球の産生を刺激する能力を有する。本発明の低分子量ペプチド化合物は、例えば、単量体、二量体、オリゴマーといった異なる形態であってよく、及び／または親水性ポリマーによって誘導体化されたものでもよい。したがって、こうしたペプチド化合物は貧血症の処置及び／または予防における治療目的並びに貧血症の研究における診断目的で有用である。
【００２４】
処置及び／または診断目的に適したペプチド化合物は、例えばＢａｆ／３結合アッセイ（後述する）によって求められるＩＣ50値が約２ｍＭ以下であり、より好ましくは２ｎＭ以下であり、ＩＣ50値が低いほどＴＰＯ−Ｒに対する結合親和性は強くなる。医薬目的ではペプチド化合物は好ましくは約１００μＭ以下、より好ましくは約５００ｎＭ以下、より好ましくは約１００ｐｍ以下、より好ましくは約５ｐｍ以下のＩＣ50値を有する。
【００２５】
処置及び／または診断目的に適したペプチド化合物は、例えばＢａｆ／３結合アッセイ（後述する）のような公知のアッセイにおいて公知の方法を用いて求められるＥＣ50値が約２ｍＭ以下であり、より好ましくは２ｎＭ以下であり、ＥＣ50値が低いほどＴＰＯ−Ｒに対する結合親和性は強くなる。医薬目的ではペプチド化合物は好ましくは約１００μＭ以下、より好ましくは約５００ｎＭ以下、より好ましくは約１００ｐｍ以下、より好ましくは約５ｐｍ以下のＥＣ50値を有する。
【００２６】
ペプチド化合物の分子量は、約５００ダルトン〜約８，０００ダルトン、より好ましくは約９００ダルトン〜約２０００ダルトンの間のどこかに存在する。ペプチド化合物が本明細書で述べるようにオリゴマー化、二量化及び／または親水性ポリマーにより誘導体化されている場合、こうしたペプチドの分子量はより大きくなり、約１５００ダルトン〜約１２０，０００ダルトン、より好ましくは約３，０００ダルトン〜約８０，０００ダルトン、より好ましくは３０，０００ダルトン〜約５０，０００ダルトンの間のどこかに存在する。
【００２７】
好適な親水性ポリマーとしては、本明細書にその全容を援用する米国特許第５，６７２，６６２号並びに同第５，８６９，４５１号に記載されるようなポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールに代表されるポリアルキルエーテル、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース及びセルロース誘導体、デキストラン及びデキストラン誘導体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
ペプチド化合物が親水性ポリマーにて誘導体化される場合、その溶解度及び血液循環中の半減期が増大し、その免疫原性が遮蔽される。この誘導体化はペプチド化合物の結合活性をほとんどあるいはまったく低下させることなく行うことが可能である。一般にこうした親水性ポリマーの平均分子量は約５００ダルトン〜約１００，０００ダルトン、より好ましくは約２，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトン、更により好ましくは約５，０００ダルトン〜約２０，０００ダルトンの範囲である。好ましい実施形態では、こうした親水性ポリマーの平均分子量は約５，０００ダルトン、１０，０００ダルトン及び２０，０００ダルトンである。
【００２９】
本発明のペプチド化合物は、その全容を本明細書に参照として援用するザリプスキー（Zallipsky, S., Bioconjugate Chem., 6:150-165（1995））、モンファージーニら（Monfardini, C, et al., Bioconjugate Chem., 6:62-69（1995））、米国特許第４，６４０，８３５号、米国特許第４，４９６，６８９号、米国特許第４，３０１，１４４号、米国特許第４，６７０，４１７号、米国特許第４，７９１，１９２号、米国特許第４，１７９，３３７号またはＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９５／３４３２６号に記載のいずれの方法を用いても前記のポリマーにより誘導体化またはポリマーと結合させることが可能である。
【００３０】
好ましい一実施形態では、本発明のペプチド化合物をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によって誘導体化する。ＰＥＧは酸化エチレンの繰り返し単位からなる直鎖の水溶性ポリマーであり、２個の末端水酸基を有する。ＰＥＧは分子量によって分類され、分子量は通常５００ダルトン〜約４０，０００ダルトンの範囲である。好ましい一実施形態では、使用するＰＥＧの分子量は５，０００ダルトン〜約２０，０００ダルトンの範囲である。本発明のペプチド化合物に結合されるＰＥＧは分枝していてもしていなくてもよい（例えば、Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem., 6:62-69（1995）を参照されたい）。ＰＥＧはネクター・セラピューティクス（Nektar Therapeutics）社（カリフォルニア州サンカルロ（San Carlo））、シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Co.）などの企業から販売されている。こうしたＰＥＧとしては、モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ−ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール−サクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール−サクシニミジルサクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−アミン（ＭｅＰＥＧ−ＮＨ2）、モノメトキシポリエチレングリコール−トレシラート（tresylate）（ＭｅＰＥＧ−ＴＲＥＳ）、及びモノメトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル（ＭｅＰＥＧ−ＩＭ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
簡単に述べると一実施形態では、例えばＰＥＧといった使用される親水性ポリマーは、その一方の末端をメトキシまたはエトキシ基などの非反応性基にてキャップすることが好ましい。その後、シアヌル酸ハロゲン化物（例、シアヌル酸の塩化、臭化、またはフッ化物）、ジイミダゾール、無水物試薬（例、無水ジブロモコハク酸などの無水ジハロコハク酸）、アシルアジド、ｐ−ジアゾニウムベンジルエーテル（p-diazoiumbenzyl ether）、３−（ｐ−ジアゾニウムフェノキシ）−２−ヒドロキシプロピルエーテル）などの好適な活性化剤と反応させることによってポリマーを他方の末端において活性化する。次いで活性化したポリマーを本発明のペプチド化合物と反応させてポリマーで誘導体化されたペプチド化合物を得る。あるいは、ポリマーと反応させるために本発明のペプチド化合物中の１個の官能基を活性化することができ、または公知のカップリング法を用いた協奏カップリング反応で２個の官能基を結合することができる。本発明のペプチド化合物は当業者によって知られ、用いられる多くの他の反応スキームを用いてＰＥＧ誘導体化することが可能である点は直ちに認識されよう。
【００３２】
診断目的で用いられる場合、本発明のペプチド化合物は検出可能な標識によって標識されることが好ましく、したがって、こうした標識を有さないペプチド化合物は標識ペプチド化合物の製造中間体として働く。
【００３３】
好ましいペプチド化合物は、
（１）単量体、二量体またはオリゴマーであるかによらずその分子量が約８．３Ｅ−２１ｇ（５０００ダルトン）よりも小さく、
（２）ＩＣ50値によって表わされるＴＰＯ−Ｒに対する結合親和性が約１００ｍＭ以下であって、
０個以上のペプチジル［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］連鎖（結合）が、−ＣＨ2−カルバメート連鎖［−ＣＨ2−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］；ホスホネート連鎖；−ＣＨ2−スルホンアミド［−ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ−］連鎖；尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］連鎖；−ＣＨ2−２級アミン連鎖；またはアルキル化ペプチジル連鎖［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ6−］（式中、Ｒ6は低級アルキルである）のような非ペプチジル結合によって置換されており、
ペプチドのＮ末端が−ＮＲＲ1基；−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ基；−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ基；−ＮＲＳ（Ｏ）2Ｒ基；−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ基（式中、Ｒ及びＲ1は水素または低級アルキルであり、ただしＲ及びＲ1は両方とも水素であることはない）；スクシンイミド基；ベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（ＣＢＺ−ＮＨ−）基；または、低級アルキル、低級アルコキシ、塩素及び臭素からなる群から選択される１〜３個の置換基をフェニル環に有するベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−基へと誘導体化されているか、あるいは、
ペプチドのＣ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ2（式中、Ｒ2は低級アルコキシよりなる群から選択される）、及び−ＮＲ3Ｒ4（式中、Ｒ3及びＲ4は水素及び低級アルキルよりなる群から独立して選択される）へと誘導体化されている。
【００３４】
コアペプチド化合物は以下のアミノ酸配列（配列番号２）を有しうることが見出された：
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7
式中、Ｘ1はＣ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｖであり；Ｘ2はＦ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴまたはＶであり；Ｘ3はＣ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、ＶまたはＷであり；Ｘ4は遺伝子にコードされる２０種類のＬ−アミノ酸のいずれかであり；Ｘ5はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＹであり；Ｘ6はβ−（２−ナフチル）アラニン（２−Ｎａｌ）であり；及びＸ7はＣ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、ＲまたはＶである。
【００３５】
好ましい一実施形態では、コアペプチド化合物は以下のアミノ酸配列を有する（配列番号３）：
Ｘ8ＧＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5（２−Ｎａｌ）Ｘ7
式中、Ｘ1〜Ｘ7は上記の定義と同様であり；及び各Ｘ8残基は遺伝子にコードされる２０種類のＬ−アミノ酸、それらの立体異性体であるＤ−アミノ酸、及び非天然アミノ酸のいずれかから独立して選択される。
【００３６】
更なる好ましい実施形態では、コアペプチド化合物は以下のアミノ酸配列（配列番号４）を有する：
Ｘ9Ｘ8ＧＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5（２−Ｎａｌ）Ｘ7
式中、Ｘ9はＡ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｑ、Ｓ、ＴまたはＶであり；及びＸ8はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴまたはＶである。より好ましくは、Ｘ9はＡまたはＩであり；及びＸ8はＤ、ＥまたはＫである。
【００３７】
特に好ましいペプチド化合物は以下のものである（配列番号５）：
ＩＥＧＰＴＬＲＱ（２−Ｎａｌ）ＬＡＡＲ（Ｓａｒ）
式中、（Ｓａｒ）はサルコシンである。
【００３８】
別の実施形態では、ペプチド化合物を二量化またはオリゴマー化することによってペプチド化合物の親和性及び／または活性を高めている。特に好ましいペプチド化合物は、２個の同じ１４量体が１個のリシンアミド残基によって連結された２９量体ペプチドである。したがって特に好ましいペプチド化合物は以下のものである（配列番号６、明細書中でＴＰＯ化合物１とも称する）：
【００３９】
【化１】
2009526841.tif 000002
【００４０】
より好ましいペプチド化合物は、ＴＰＯ化合物１をＰＥＧ化したものである。ＰＥＧ化体は各Ｎ末端のイソロイシンに分子量２０，０００のＭＰＥＧ残基が共有結合したものでもよい。こうした化合物の一例の全体の分子構造を以下に詳しく示す：
【００４１】
【化２】
2009526841.tif 000003
【００４２】
（本明細書ではこの化合物をＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１と称する）。ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の完全な化学名は以下のとおりである：
メトキシポリエチレングリコール２００００−プロピニル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−グルタミル−グリシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−トレオニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−グルタミニル−Ｌ−２−ナフチルアラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−サルコシル−Ｎｅ−（メトキシポリエチレングリコール２００００−プロピニル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−グルタミル−グリシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−トレオニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−グルタミニル−Ｌ−２−ナフチルアラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−サルコシル−）−リシンアミド。
【００４３】
ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１は、１個のリシンアミド残基によって連結されたアミノ酸１４個からなる２本の同じペプチド鎖からなり、各Ｎ末端において分子量約２０，０００ダルトンのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖に結合している。ＰＥＧの結合していない親ペプチドの分子量は３，２９５ダルトンであり、２本のＰＥＧ鎖を有する場合、その分子量は約４３，２９５ダルトンである。ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の分子構造を略記すると、（ＭＰＥＧ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（２−Ｎａｌ）−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−（Ｓａｒ））2−Ｌｙｓ−ＮＨ2であり、式中、（２−Ｎａｌ）はβ−（２−ナフチル）アラニン、（Ｓａｒ）はサルコシンであり、ＭＰＥＧはメトキシポリ（エチレングリコール）（ＭＷ＝約２０，０００ダルトンである。
【００４４】
１種以上のペプチド化合物、特に、薬学的に許容されうるその均等物を含むＰＥＧ化ペプチド化合物（本明細書で「ペプチド化合物」、「ＴＰＯペプチド化合物」または「本発明のＴＰＯペプチド化合物」と総称する）は、ＴＰＯが介在する疾患の予防及び処置、特に貧血症の処置及び／または予防に有用である。したがって本発明は、貧血症を処置及び／または予防するための方法であって、貧血症の患者または貧血症を発症することが予想される患者に本発明のペプチド化合物の治療上または予防上の有効投与量または有効量を投与する方法を提供するものである。
【００４５】
本発明はまた、本明細書で述べる１種以上のペプチド化合物及び生理学的に許容されうる担体を含む薬学的組成物を提供するものである。これらの薬学的組成物は、経口投与製剤、吸入用粉末及び溶液、注射及び輸液用溶液などの様々な形態で与えられる。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
以下の定義は、本明細書で発明を記述するために用いられる様々な用語の意味及び範囲を説明、定義するためのものである。
【００４７】
「アゴニスト」とは、生物学的活性を有する相補的な受容体に結合して受容体を活性化することによって受容体に生物学的応答を引き起こすかあるいは受容体の元々の生物学的活性を高めるような生物学的活性を有するリガンドを指す。
【００４８】
「ＥＣ50」及び「５０％有効濃度」とは、特定のアゴニストに対する最大の有効応答の５０％の応答を生ずるアゴニストの濃度を指す。
【００４９】
「ＩＣ50」及び「５０％阻害濃度」とは、特定のアゴニストの特異的結合の５０％を置き換える競合するリガンドの濃度を指す。
【００５０】
「薬学的に許容されうる均等物」には、薬学的に許容されうる塩、酸付加塩、エステル、アミド、水和物、代謝物、プロドラッグ、及び等価体が特に制限なく含まれる。多くの薬学的に許容されうる均等物が、本発明のペプチド化合物として同じまたは同様のイン・ビトロ（in vitro）またはイン・ビボ（in vivo）活性を有するものと考えられる。
【００５１】
「薬学的に許容されうる塩」とは、当該技術分野において周知の方法によって調製されるナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウム、及びプロタミン亜鉛塩などの医薬品業界で一般的に用いられる無毒性アルカリ金属、アルカリ土類金属及びアンモニウム塩を指す。この語には更に、本発明のペプチド化合物を好適な有機または無機酸と反応させることによって一般に調製される無毒性の酸付加塩が含まれる。代表的な塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナプシル酸塩などが挙げられる。
【００５２】
「薬学的に許容されうる酸付加塩」とは、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸と、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、蓚酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの有機酸とから形成される、遊離塩基の生物学的効果及び性質を維持し、かつ生物学的にまたはその他の意味において有害ではない塩を指す。プロドラッグとしての薬学的に許容されうる酸付加塩については、前述のブンドガード（Bundgaard, H.）による文献を参照されたい。
【００５３】
「薬学的に許容されうるエステル」とは、エステル結合の加水分解時にカルボン酸またはアルコールの生物学的効果及び性質を維持し、かつ生物学的にまたはその他の意味において有害ではないエステルを指す。プロドラッグとしての薬学的に許容されうる酸付加塩については、ブンドガードによる文献（Bundgaard, H., ed., Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam（1985））を参照されたい。これらのエステルは通常、対応するカルボン酸とアルコールとから形成される。一般にエステルの生成は従来の合成法によって行うことができる（例えば、March Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York（1985）p. 1157、並びに引用文献；Mark et al. Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York（1980）を参照されたい）。エステルのアルコール部分は一般に、（ｉ）１個以上の二重結合を有していてもいなくてもよく、分枝炭素鎖を有していてもいなくてもよいＣ2〜Ｃ12の脂肪族アルコール、または（ｉｉ）Ｃ7〜Ｃ12の芳香族または複素芳香族アルコールからなる。本発明は、本明細書で述べるようなエステルであると同時に薬学的に許容されうるその酸付加塩でもある組成物の使用も考慮している。
【００５４】
「薬学的に許容されうるアミド」とは、アミド結合の加水分解時にカルボン酸またはアミンの生物学的効果及び性質を維持し、かつ生物学的にまたはその他の意味において有害ではないアミドを指す。プロドラッグとしての薬学的に許容されうるアミドについては、ブンドガードによる文献（Bundgaard, H., ed., Design of Prodrugs, Elsevier Science
Publishers, Amsterdam（1985））を参照されたい。これらのアミドは通常、対応するカルボン酸とアミンとから形成される。一般にアミドの生成は従来の合成法によって行うことができる（例えば、March Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York（1985）p.1152; Mark et al. Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York（1980）を参照されたい）。本発明は、本明細書で述べるようなアミドであると同時に薬学的に許容されうるその酸付加塩でもある組成物の使用も考慮している。
【００５５】
「薬学的または治療的に許容されうる担体」とは、有効成分の生物学的活性の有効性に影響せず、かつホストまたは患者に毒性を示さない担体媒質を指す。
【００５６】
「立体異性体」とは、別のものとして分類される化合物と同じ分子量、化学組成、構成を有するが、原子の配置が異なる化合物を指す。すなわち、化合物の特定の部分の空間的配置が異なっていることにより、純粋化合物では偏光面を回転させる性質を有する。ただし純粋な立体異性体の中には旋光度が非常に小さいため、現在の機器では検出不能であるものもある。本発明のペプチド化合物は１個以上の不斉炭素原子を有することから異なる立体異性体が存在する。これらすべての立体異性体は本発明の範囲に含まれるものである。
【００５７】
本発明の組成物に適用される「治療上または薬学上の有効量」とは、所望の生物学的結果を誘導するうえで充分な組成物の量を指す。こうした結果としては、疾患の兆候、症状、または原因の緩和、あるいは生物学的システムの他の任意の所望の変化が挙げられる。本発明ではこうした結果には、赤血球産生の増大が通常伴う。
【００５８】
ペプチドのアミノ酸残基は、以下のように略記する：フェニルアラニンはＰｈｅまたはＦ；ロイシンはＬｅｕまたはＬ；イソロイシンはＩｌｅまたはＩ；メチオニンはＭｅｔまたはＭ；バリンはＶａｌまたはＶ；セリンはＳｅｒまたはＳ；プロリンはＰｒｏまたはＰ；トレオニンはＴｈｒまたはＴ；アラニンはＡｌａまたはＡ；チロシンはＴｙｒまたはＹ；ヒスチジンはＨｉｓまたはＨ；グルタミンはＧｌｎまたはＱ；アスパラギンはＡｓｎまたはＮ；リシンはＬｙｓまたはＫ；アスパラギン酸はＡｓｐまたはＤ；グルタミン酸はＧｌｕまたはＥ；システインはＣｙｓまたはＣ；トリプトファンはＴｒｐまたはＷ；アルギニンはＡｒｇまたはＲ；グリシンはＧｌｙまたはＧとして表わす。更に、Ｂｕはブトキシ、Ｂｚｌはベンジル、ＣＨＡはシクロヘキシルアミン、Ａｃはアセチル、Ｍｅはメチル、Ｐｅｎはペニシルアミン、Ａｉｂはアミノイソブチル酸、Ｎｖａはノルバリン、Ａｂｕはアミノブチル酸、Ｔｈｉはチエニルアラニン、ＯＢｎはＯ−ベンジル、ｈｙｐはヒドロキシプロリンを表す。
【００５９】
自然界に存在するアミノ酸のみからなるペプチド以外に、ペプチド模倣体またはペプチド類似体も提供される。ペプチド類似体は、鋳型となるペプチドと同様の性質を有する非ペプチド薬として製薬業界では一般的に用いられている。この種の非ペプチド化合物は「ペプチド模倣体（peptide mimeticsまたはpeptidomimetics）」と呼ばれている（Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29（1986）; Veber and Freidinger TINS p.392（1985）；及び Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229（1987）。これらをいずれも本明細書に援用する）。治療上有用なペプチドに構造的に類似したペプチド模倣体を用いて同等もしくは向上した治療または予防効果を得ることができる。一般にペプチド模倣体は天然受容体に結合するポリペプチドなどのパラダイムポリペプチド（すなわち、生物学的または薬理学的活性を有するペプチド）に構造的に類似しているが、必要に応じて当該技術分野では周知の下記の引用文献に更に述べられる方法によって−ＣＨ2ＮＨ−、−ＣＨ2Ｓ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ2−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−、−ＣＨ2ＳＯ−よりなる群から選択される結合によって１個以上のペプチド結合が置換されている（Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267（1983）;Spatola, A. F., Vega Data（March 1983）, Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications（概論）; Morley, Trends Pharm Sci（1980）pp. 463-468（概論）; Hudson, D.
et al., Int J Pept Prot Res 14:177-185（1979）（−CH2NH−,CH2CH2−）; Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249（1986）（−CH2−S）; Hann J. Chem. Soc Perkin Trans.
I 307-314（1982）（−CH−CH−，シス及びトランス）; Almquist et al. J. Med. Chem. 23:1392-1398（1980）（−COCH2−）; Jennings-White et al.  Tetrahedron Lett 23:2533（1982）（−COCH2−）; Szelke et al. European Appln. EP 45665 CA（1982）: 97:39405（1982）（−CH（OH）CH2−）; Holladay et al. Tetrahedron Lett 24:4401-4404（1983）（−C（OH）CH2−）；及びHruby Life Sci 31:189-199（1982）（−CH2−S−）
；これらをいずれも本明細書に援用する）。特に好ましい非ペプチド結合は−ＣＨ2ＮＨ−である。こうしたペプチド模倣体は、例えば、製造がより経済的である、化学的安定性が高い、薬理作用（半減期、吸収性、効能、薬効など）が優れている、特異性が変化している（例、生物学的活性の幅が広い）、抗原性が低減されている、など、ポリペプチドの実施形態と比較して大きな利点を有する場合がある。
【００６０】
ペプチド模倣体を標識するには、通常、定量的構造活性データ及び／または分子モデリングによって予想されるペプチド模倣体上の干渉しない部位に、直接またはスペーサ（例、アミド基）を介して１以上の標識を共有結合させることを含む。この干渉しない部位とは一般に、治療効果を得るためにペプチド模倣体が結合する巨大分子（例、免疫グロブリンスーパーファミリー分子）と直接接触することのない位置である。ペプチド模倣体の誘導体化（例、標識化）がペプチド模倣体の所望の生物学的または薬理学的活性に大きく影響することがあってはならない。一般に、受容体に結合するペプチドのペプチド模倣体は、高い親和性でその受容体に結合するとともに、検出可能な生物学的活性を有する（すなわち、受容体を介した１以上の表現形の変化に対して作動性または拮抗性を示す）。
【００６１】
コンセンサス配列の１種以上のアミノ酸を同種のＤ型アミノ酸で体系的に置換することによってより安定なペプチドを得ることができる（例、Ｌ−リシンをＤ−リシンに置換）。更に、例えばペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成する内部システイン残基を付加するといった当該技術分野において既知の方法により、コンセンサス配列またはほぼ同一のコンセンサス配列変異を有する制限ペプチドを生成することができる（Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387（1992）、これを本明細書に援用する）。
【００６２】
「検出可能な標識」とは、本発明のペプチド化合物に共有結合させた場合に、ペプチド化合物が投与された患者の体内でのペプチド化合物のイン・ビボ（in vivo）検出を可能とする物質を指す。検出可能である好適な標識は当該技術分野では周知であり、例として放射性同位体、蛍光標識（例、フルオレセイン）などが挙げられる。検出可能な標識のいずれを使用するかはさほど重要ではなく、使用する標識化合物の量や、その標識化合物の使用量における標識化合物の毒性などに基づいて選択される。こうした要因に基づいた標識の選択は当業者には自明の技術である。
【００６３】
ペプチド化合物への検出可能な標識の共有結合は、当該技術分野では周知の方法によって行うことが可能である。例えば放射性同位体である125Ｉを検出可能な標識として使用する場合、125Ｉのペプチド化合物への共有結合は、アミノ酸であるチロシンをペプチド化合物に取り込み、次いでペプチド化合物をヨウ化することによって行うことが可能である。同様に32Ｐは、従来の化学的手法を用い、例えばペプチド化合物の水酸基を介してリン酸部分としてペプチド化合物に取り込むことが可能である。
【００６４】
本発明はＴＰＯ−Ｒに結合してこれを活性化するかまたはＴＰＯのアゴニストとして作用するペプチドを提供する。これらのペプチド化合物には、「リード」ペプチド化合物、並びにリードペプチド化合物と同じまたは類似の分子構造または形状を有するように構築されているが、加水分解やタンパク質分解の受けやすさの面で、及び／または受容体に対する高い親和性などの他の生物学的性質の面でリードペプチド化合物と異なる「均等体」または「誘導体」ペプチド化合物が含まれる。本発明は更に有効量のＴＰＯアゴニスト、好ましくはペプチド化合物を含む、貧血症の処置に有用な組成物を提供する。
【００６５】
本発明のペプチド化合物は、ヒトをはじめとした恒温動物に投与することによってイン・ビボ（in vivo）でＴＰＯ−Ｒを活性化することも可能である。したがって本発明には、イン・ビボ（in vivo）でのＴＰＯ−Ｒに対するＴＰＯの効果を模倣するうえで充分な量の本発明のペプチド化合物を投与する貧血の治療処置方法が含まれる。
【００６６】
本発明のペプチド化合物の活性は、本明細書に援用しそのアッセイを本明細書で開示するマクドナルド（McDonald Am. J. of Pediatric Hematology/Oncology 14:8-21（1992））により述べられる各種のモデルのいずれかにおいて、生体内または生体外で評価することが可能である。
【００６７】
一実施形態では、本発明の組成物は骨髄移植、放射線療法、または化学療法に伴う貧血症の処置において有用である。本発明のペプチド化合物は通常、化学療法、放射線療法または骨髄移植に先立って予防措置的に投与されるか、またはこうした処置の後に投与される。
【００６８】
したがって本発明は更に、有効成分としての本発明のペプチド化合物の少なくとも１つと薬学的な担体または希釈剤とを含む薬学的組成物を提供するものである。本発明のペプチド化合物は、経口、経肺、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）または皮下注射）、吸入（微粉末製剤による）、経皮、鼻腔内、膣内、直腸内、または舌下の投与経路を介して投与することが可能であり、各投与経路に適した剤形に製剤化することができる（例えば下記を参照：バーンスタイン（Bernstein）らによる第ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９３／２５２２１号、ピット（Pitt）等によるＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９４／１７７８４号、並びにピットらによる欧州特許出願第６１３，６８３号、これらをいずれも本明細書に援用する）。
【００６９】
経口投与用の固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、及び顆粒剤が含まれる。こうした固体剤形では、ペプチド化合物をスクロース、ラクトース、デンプンなどの少なくとも１種類の不活性かつ薬学的に許容されうる担体と混合する。こうした剤形は、一般的に行われていることとして、不活性希釈剤以外の更なる物質（ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤など）を含有してもよい。カプセル剤、錠剤及び丸剤の場合には、剤形に緩衝剤を含有してもよい。錠剤及び丸剤には腸溶性コーティングを施して製剤化してもよい。
【００７０】
経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容されうる乳濁液、溶液、懸濁液、シロップ剤が含まれ、エリキシル剤としては水や生理食塩水など当該技術分野で一般的に用いられている不活性希釈剤を含有するものを用いる。こうした不活性希釈剤以外に、組成物は、湿潤剤、乳化及び懸濁化剤、甘味料、香味料及び芳香剤などの補助剤を更に含有してもよい。
【００７１】
本発明に基づく非経口投与用の製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶液、懸濁液または乳濁液が含まれる。非水性溶媒または溶解液の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油及びコーン油などの植物油、ゼラチン、並びにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルがある。こうした剤形は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤などの補助剤を更に含有してもよい。こうした製剤は、例えば細菌濾過フィルターによる濾過を行ったり、組成物に殺菌剤を添加したり、組成物に放射線を照射したり、組成物を加熱することなどによって滅菌することが可能である。こうした製剤は、滅菌水または他の注射可能な媒質を使用直前に添加して調製することもできる。
【００７２】
直腸内または膣内投与用の組成物は好ましくは坐剤であり、有効成分以外にカカオバターや坐剤ワックスなどの補形剤を含んでいてもよい。鼻腔内または舌下投与用の組成物もまた、当該技術分野では周知の標準的補形剤を添加して製剤化される。
【００７３】
本発明の組成物は、例えばタイス（Tice）及びビビ（Bibi）の方法（Treatise on Controlled Drug Delivery, ed. A. Kydonieus, Marcel Dekker, N.Y.（1992）, pp. 315-339
）によってマイクロカプセル化することも可能である。
【００７４】
本発明のペプチド化合物を含有する組成物は予防処置及び／または治療処置として投与することができる。治療的用途では、既に疾患に苦しむ患者に、上述したように疾患を治癒させるか少なくともその症状及び合併症を部分的に抑制するうえで充分な量の組成物を投与する。この目的のために適当な量を「治療上の有効量」と定義する。こうした用途での有効量は、疾患の重篤度及び患者の体重や一般的状態によって変わる。
【００７５】
予防的用途では、特定の疾患に罹患しやすいかまたは特定の疾患のリスクを有する患者に本発明のペプチド化合物を含有する組成物を投与する。その量を「予防上の有効量」と定義する。こうした用途においても、正確な量はやはり患者の健康状態及び体重に応じて変わる。
【００７６】
効果的治療に必要な本発明のＴＰＯアゴニストの量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態及び他の投与薬剤などの多くの異なる要因に依存する。したがって処置用の用量は滴定によって安全性及び効果が最適化されるように決定すべきである。一般に、イン・ビトロ（in vitro）で用いられる用量はこれらの薬剤をイン・サイチュ（in situ）投与するうえで有用な量に関する有用な指標を与える場合がある。特定の疾患の処置における有効量について動物試験を行うことでヒトにおける用量の更なる予測的指標が与えられる。これに関して様々な所見が開示されている（Gilman et al.（eds）, Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press（1990）; and Remington's Pharmaceutical Sciences, 7th ed., Mack Publishing Co., Easton,
Pa.（1985）；これらをいずれも本明細書に援用する）。
【００７７】
本発明のペプチド化合物は、１日当たり約１μｇ〜約３００μｇ／ｋｇ（体重）の範囲の用量で投与される場合に貧血症の処置に有効である。用いられる特定の用量は、投与経路によって、並びに症状の重篤度、患者の年齢及び一般的状態などの要因に応じた臨床医の判断によって、調整される。
【実施例】
【００７８】
動物モデル
カルボプラチンで処置したマウスにおけるＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の効果を調べた。本明細書で述べるすべての実施例では、原液としてＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の１０ｍｇ／ｍＬ溶液を滅菌生理食塩水を用いて調製した。混合を行うため、この調製物を旋回式振とう器に１５分間、２００ｒｐｍでかけた。この方法を用いてＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１を泡立てることなく溶解させた。ＧＶ  Ｍｉｌｌｅｘ（０．２２μｍ）フィルターを用いて原液を濾過した。次いでこの原液から滅菌生理食塩水を用いて投与用溶液を調製した。原液及び投与用溶液は使用する日に新しく調製した。
【００７９】
実施例１
カルボプラチン処置後のマウスにおける貧血状態の持続時間及び重篤度に対するＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の影響を、ヘモグロビン濃度、赤血球数、及びヘマトクリット値の変化によって求め、観察した。この実験では、カルボプラチン投与の１日後にＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の量を徐々に増やして投与し、異なる赤血球パラメータに関して用量依存的効果が見られるかどうかを調べた。
【００８０】
下記に詳述するように、複数群のマウスを腹腔内投与によりカルボプラチンまたは溶解液（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）にて−２日目及び−１日目に処置した。ＢＡＬＢ／ｃ系のマウスに血小板減少症を誘発させるのに用いたカルボプラチンの最適用量は予め求めた量を用い、全体で１２０ｍｇ／ｋｇの用量を２回の注射（すなわち、２×６０ｍｇ／
ｋｇ）で連続した２日間で分割して投与した。表１に示すように、カルボプラチンの２回目の投与の１日後に、複数群のマウスを静脈内（ボーラス）注射（ＩＶ）によりＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１または溶解液（滅菌生理食塩水、ＳＳ、防腐剤を添加していない０．９％塩化ナトリウム溶液）にて処置した。各投与では単位体重当たりの量を投与した（１００μＬ／１０ｇ（体重））。
【００８１】
【表１】
2009526841.tif 000004
【００８２】
５、７、９及び１１日目に各試験群のマウス５匹の体重を測定し、ＣＯ2による窒息及び心穿刺による放血によって安楽死させた。各血液サンプルを別々の血液学的評価用のＥＤＴＡ（ラベンダー色のキャップ）マイクロコンテナに移した。対照群のマウス（５匹）を５日目及び１１日目に処分した。結果を図１〜４に示す。データはグラフで群平均値＋ＳＥＭとして表わした。
【００８３】
カルボプラチン単独で処置したマウスではマウスの血中ヘモグロビン濃度は１１日目までに約２０％低下した。この低下はすべての用量のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１による処置において阻害された。カルボプラチン処置では赤血球数及びヘマトクリット値に若干の低下が見られ、この効果はＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１による処置によって阻害されたが、この効果について統計学的評価は行わなかった。カルボプラチン単独またはカルボプラチン及び異なる用量のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１による処置を行ったすべての群のマウスで、０日目に測定した体重と比較して５、７及び９日目に体重の減少が認められた。１１日間の実験期間にわたってマウスのサブセットにおける体重の測定値を分析したところ、観察された体重の減少はカルボプラチン処置単独によって引き起こされるものであり、ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１は試験を行ったすべての用量で減少した体重の回復を促すことが示唆された。
【００８４】
カルボプラチン単独で処置したマウスでは５日目までに外観及び行動に変化が認められた。一部のマウスでは背中が丸まり、弛緩した外観を呈した。多くのマウスで肛門性器部に汚れが認められた。ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１による処置によってこれらの症状の発症、頻度、重篤度が用量依存的に低下した。
【００８５】
実施例２
ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１によってマウスの骨髄造血幹細胞がカルボプラチン処置の毒性に対して感作される可能性を検証した。この実験では、カルボプラチン投与の７日前またはカルボプラチン処置の直後に所定の用量のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１をマウスに投与した。別の１群を、カルボプラチン投与の前後の両方でＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１で処置した。これらの投与レジメンが血液学的パラメータに及ぼす影響も調べた。
【００８６】
下記に詳述するように、複数群のマウスを腹腔内投与によりカルボプラチンまたは溶解液（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）にて７日目及び８日目に処置した。ＢＡＬＢ／ｃ系のマウスに血小板減少症を誘発させるのに用いたカルボプラチンの最適用量は予め求めた量を用い、全体で１２０ｍｇ／ｋｇの用量を２回の注射（すなわち、２×６０ｍｇ／ｋｇ）で連続した２日間で分割して投与した。表２に示すように、１回目のカルボプラチン投与の７日前またはカルボプラチンの２回目の投与の１時間後に、複数群のマウスを静脈内（ボーラス）注射（ＩＶ）によりＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１（３００μｇ／ｋｇ）または溶解液（滅菌生理食塩水、ＳＳ、防腐剤を添加していない０．９％塩化ナトリウム溶液）にて処置した。別の１群をカルボプラチン投与の前（０日目）及び後（８日目、ｔ＝１ｈ）の両方でＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１で処置した。全ての投与で単位体重当たりの量を投与した（１００μＬ／１０ｇ（体重））。
【００８７】
【表２】
2009526841.tif 000005
【００８８】
１４、１８、２２及び２６日目に各試験群のマウス５匹の体重を測定し、ＣＯ2による窒息及び心穿刺による放血によって安楽死させた。各血液サンプルを別々の血液学的評価用のＥＤＴＡ（ラベンダー色のキャップ）マイクロコンテナに移した。対照群のマウス（５匹）を１４日目及び２６日目に処分した。結果を図５〜８に示す。データはグラフで群平均値＋ＳＥＭとして表わした。
【００８９】
カルボプラチン単独による処置により、対照群と比較して１８日目及び２２日目までに生存マウスにおいてヘモグロビン濃度、赤血球数、ヘマトクリット値の低下（約１８％）が認められた。これらの値の低下は８日目のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の投与（２回目のカルボプラチン処置の１時間後）によって、０日目のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の投与の有無に関わらず防止されたが、０日目のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の投与（のみ）の場合には、カルボプラチンによって引き起こされるこれらの赤血球パラメータの変化に影響は認められなかった。
【００９０】
対照群のすべてのマウスで、７日目〜２６日目の間に正常な体重増加が認められたが、カルボプラチン単独で処置したすべてのマウスでは同じ期間に若干の体重減少（平均で約４％）が見られた。カルボプラチンに加えてＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１による異なる処置を行ったすべての群のマウスで７日目〜２６日目の間に体重は維持されるかまたは正常な体重増加が見られた。全実験期間にわたって体重の測定値を分析したところ、観察された体重減少の主要因はカルボプラチン処置であり、ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１による同時処置によってこの体重減少が防止されることが示唆されたが、統計学的分析は行わなかった。７日目（カルボプラチンの投与前）〜２６日目（実験終了時）の間に見られた体重の変化を
図８に示す。
【００９１】
対照群のすべてのマウスは実験期間全体を通じて正常であった。カルボプラチン単独で処置したマウスでは、既に１２日目で外観及び行動に変化が認められ、背中が丸まる症状が頻繁に見られ、毛並みも悪くなった。カルボプラチンを投与したマウスの多くで（ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１処置の有無によらず）実験期間の後半に背中が丸くなり、毛並みの悪化が認められた。８日目のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１による処置は０日目の更なる処置の有無によらず、これらの症状の発症を遅らせ、０日目及び８日目の処置によっても同様に症状の程度と持続期間の減少が認められたが、体系的な観察に基づく、これらの処置が及ぼす効果の詳細な分析は行わなかった。
【００９２】
実施例３
カルボプラチン処置後の異なる時点でＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１を投与する投与レジメンにしたがってＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１が貧血の持続時間及び重篤度に及ぼす効果を調べた。この実験では、カルボプラチン投与の１時間後、１日後、または４日後に所定量のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１をマウスに投与した。
【００９３】
下記に詳述するように、複数群のマウスを腹腔内投与によりカルボプラチンまたは溶解液（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）にて−１日目及び０日目に処置した。ＢＡＬＢ／ｃ系のマウスに血小板減少症を誘発させるのに用いたカルボプラチンの最適用量は予め求めた量を用い、全体で１２０ｍｇ／ｋｇの用量を２回の注射（すなわち、２×６０ｍｇ／ｋｇ）で連続した２日間で分割して投与した。表３に示すように、２回目のカルボプラチン投与の１時間（０日目）後、１日（１日目）後または４日（４日目）後に複数群のマウスを静脈内（ボーラス）注射（ＩＶ）によりＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１（３００μｇ／ｋｇ）または溶解液（滅菌生理食塩水、ＳＳ、防腐剤を添加していない０．９％塩化ナトリウム溶液）にて処置した。各用量は単位体重当たりの量を投与した（１００μＬ／１０ｇ（体重））。
【００９４】
【表３】
2009526841.tif 000006
【００９５】
６、８、１０及び１２日目に各試験群のマウス５匹の体重を測定し、ＣＯ2による窒息及び心穿刺による放血によって安楽死させた。各血液サンプルを別々の血液学的評価用のＥＤＴＡ（ラベンダー色のキャップ）マイクロコンテナに移した。対照群のマウス（５匹）を６日目及び１２日目に処分した。結果を図９〜１２に示す。データはグラフで群平均値＋ＳＥＭとして表わした。
【００９６】
カルボプラチン単独による処置により、対照群と比較して１２日目までに生存マウス（２匹）においてヘモグロビン濃度、赤血球数、ヘマトクリット値の大幅な低下（約４７％
）が認められた。これらの値の低下は０日目（カルボプラチン処置の１時間後）及び１日目のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の投与によって防止されたが、４日目のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の投与では、カルボプラチンによって引き起こされるこれらの赤血球パラメータの変化に影響は認められなかった。
【００９７】
カルボプラチン単独、またはカルボプラチン及び異なる用量のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１による処置を行ったすべての群のマウスで−１日目に測定した体重と比較して６、８、１０及び１２日目に体重の減少が認められた。実験期間を通じた体重の測定値の分析によって、観察された体重減少の主要因はカルボプラチン処置であることが示唆された。０日目、１日目または４日目のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の投与によってカルボプラチン処置に伴う体重減少に影響は見られないようであったが、統計的分析は行わなかった。−１日目〜１０日目に観察された体重の減少を図１１に示す。
【００９８】
対照群のすべてのマウスは実験期間全体を通じて正常であった。カルボプラチン単独で処置したマウスでは、既に２日目で外観及び行動に変化が認められ、背中が丸まる症状が頻繁に見られ、弛緩した外観を呈した。カルボプラチンを投与したマウスの多くで（ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１処置の有無によらず）実験期間の後半に背中が丸くなり、弛緩した外観が認められた。これらのマウスの一部では肛門性器部に汚れが認められた。他の数少ない症状としては、るい痩、眼瞼の下垂、異常ゲート（an abnormal gate）などが認められた。ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１による処置によって、これらの症状の発症、頻度、または重篤度に大きな影響は見られないようであったが、詳細な分析は行わなかった。
【００９９】
化学療法の２４時間以内にＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１を動物に投与した場合にカルボプラチン誘発貧血の防止効果が認められる。このデータは、ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１が巨核球系列に限定されない骨髄保護効果を有することを示唆するものである。
【０１００】
実施例４
カルボプラチン処置マウスにおけるＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の巨核球及び赤血球細胞系の生存因子としての能力を血液学的パラメータの変化によって求め、観察した。先の実験で、ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１は３００μｇ／ｋｇ程度の用量でカルボプラチンによって誘発される貧血を防止することが示された。この実験では、より低用量（すなわち、３０、１００及び３００μｇ／ｋｇ）のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１が赤血球系の生存率に及ぼす作用を調べ、この作用の用量−応答関係をキャラクタライズした。
【０１０１】
下記に詳述するように、複数群のマウスを腹腔内投与によりカルボプラチンまたは溶解液（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）にて−１日目及び０日目に処置した。ＢＡＬＢ／ｃ系のマウスに血小板減少症を誘発させるのに用いたカルボプラチンの最適用量は予め求めた量を用い、全体で１２０ｍｇ／ｋｇの用量を２回の注射（すなわち、２×６０ｍｇ／ｋｇ）で連続した２日間で分割して投与した。表４に示すように、カルボプラチンの２回目の投与の約１時間後に、複数群のマウスを静脈内（ボーラス）注射（ＩＶ）によりＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１または溶解液（滅菌生理食塩水、ＳＳ、防腐剤を添加していない０．９％塩化ナトリウム溶液）にて処置した。各用量は単位体重当たりの量を投与した（１００μＬ／１０ｇ（体重））。
【０１０２】
【表４】
2009526841.tif 000007
【０１０３】
６、８及び１２日目に各試験群のマウス５匹の体重を測定し、ＣＯ2による窒息及び心穿刺による放血によって安楽死させた。各血液サンプルを別々の血液学的評価用のＥＤＴＡ（ラベンダー色のキャップ）マイクロコンテナに移した。対照群のマウス（５匹）を６日目及び１２日目に処分した。結果を図１３及び１４に示す。
【０１０４】
カルボプラチン単独で処置したマウスではマウスの血中ヘモグロビン濃度は１２日目までに２５％よりも大きく低下した。この低下はすべての用量のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１による処置において完全に阻害された。ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１はカルボプラチン処置によって引き起こされる赤血球数及びヘマトクリット値の低下も効果的に阻害した。
【０１０５】
カルボプラチン単独、またはカルボプラチン及び異なる用量のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１による処置を行ったすべての群のほぼすべてのマウスで−１日目に測定した体重と比較して６、８及び１２日目に体重の減少が認められた。１３日間の実験期間を通じた体重の測定値の分析によって、観察された体重減少はカルボプラチン処置単独によって引き起こされたものであることが示された。ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１はこの実験における体重の減少または回復に影響しないようであった。
【０１０６】
カルボプラチン単独で処置したマウスでは４日目までに外観及び行動に変化が認められた。一部のマウスでは背中が丸まり、毛並みも悪くなった。また、多くのマウスで便の軟化が認められた。弛緩状態の外観を呈したマウスはほとんどおらず、血便を認めたマウスもほとんどいなかった。ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１による処置によってこれらの症状の発症、頻度、重篤度が用量依存的に低下した。
【０１０７】
ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１はカルボプラチン処置マウスにおいて、末梢血の血小板数及び他の血液学的パラメータによって求められる赤血球系の生存率を維持する作用を示した。ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１はすべての用量で１２日目にカルボプラチンによって誘発した貧血を完全に防止することが示された。これらの結果は、巨核球及び赤血球系がＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の「生存率維持」効果に対して異なる感受性／応答性を示すことを示唆するものである。
【０１０８】
実施例５
下記に詳述するように複数群のマウスに、各ラウンドが連続した２日間のカルボプラチン投与からなる２ラウンドの化学療法剤（カルボプラチン）投与を１０日間隔で行って処置した（すなわち、−１日目及び０日目と、１０日目及び１１日目に１日当たり７０ｍｇ／ｋｇを投与）。これらの生存実験で用いたカルボプラチンの用量は、マウスの最大許容
用量（すなわち、１２０ｍｇ／ｋｇ、ただし、１日当たり６０ｍｇ／ｋｇを連続した２日間投与）を上回るものであった。下記に詳述するように、各ラウンドの２回目のカルボプラチン投与（すなわち、０日目及び１１日目）の１時間後にマウスを静脈内（ボーラス）注射（ＩＶ）によりＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１（１００μｇ／ｋｇ）または溶解液（滅菌生理食塩水、ＳＳ、防腐剤を添加していない０．９％塩化ナトリウム溶液）にて処置した。各用量は単位体重当たりの量を投与した（１００μＬ／１０ｇ（体重））。
【０１０９】
【表５】
2009526841.tif 000008
【０１１０】
７、１０、１８、２１及び２８日目に各試験群のマウス５匹（２５匹／群）を、ＣＯ2による窒息及び心穿刺による放血によって安楽死させた。各血液サンプルを別々の血液学的評価用のＥＤＴＡ（ラベンダー色のキャップ）マイクロコンテナに移した。溶解液単独で処置した対照群のマウスを同様に処分した。結果を図１５に示す。２ラウンドのカルボプラチンで処置したマウスでは１０日目〜２１日目に中程度の貧血が見られたのに対し、２ラウンドのカルボプラチン及びＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１で処置したマウスではこの期間全体を通じて対照群と同様のヘマトクリット値が維持された。興味深い点として、血液学的評価に使用されなかったマウスのうち、カルボプラチン単独で処置した群の７匹が４日目〜１８日目に死んだのに対し、複合療法を行った群で死んだのは同じ期間で１匹のみであり、死亡したマウスの多くは貧血状態の期間に死亡した。これらの結果は、カルボプラチン誘発貧血が高濃度の化学療法を行ったマウスの死亡に寄与しており、ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１が貧血の発症を防止することによってマウスの生存率を高める働きをしている可能性を示唆するものである。
【０１１１】
実施例６
機構を解明する実験を行うため、複数群のマウスを溶解液または増加する量のカルボプラチン（すなわち、６０、７０または８０ｍｇ／ｋｇ）で連続する２日間（−１日目及び０日目）処置した。表５に示すように、２回目のカルボプラチン投与の約１時間後に複数群のマウスを静脈内（ボーラス）注射（ＩＶ）によりＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１（１００μｇ／ｋｇ）または溶解液（滅菌生理食塩水、ＳＳ、防腐剤を添加していない０．９％塩化ナトリウム溶液）にて処置した。
【０１１２】
【表６】
2009526841.tif 000009
【０１１３】
１５日目にすべての処置群のマウスをＣＯ2による窒息及び心穿刺による放血によって安楽死させた。各血液サンプルを別々の血液学的評価用のＥＤＴＡ（ラベンダー色のキャップ）マイクロコンテナに移した。更に、対照群のマウス及び２×７０ｍｇ／ｋｇのカルボプラチンで処置したマウス（ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１による処置を行わなかったものと行ったもの）から複数の臓器（脳を含む）を単離して組織学的検査用に処置した。これらの組織の切片をフィブリノゲン／フィブリンについて免疫組織化学的に処置した。
【０１１４】
増大する量のカルボプラチン単独によるマウスの処置によって、１５日目に２×７０ｍｇ／ｋｇを投与したマウスでは血小板数が劇的に減少し、６０及び７０ｍｇ／ｋｇのカルボプラチン（単独）で処置したマウスではヘマトクリット（ＨＣＴ）値が用量依存的に減少した。カルボプラチンによって引き起こされる血小板及び赤血球数のこうした減少はＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１による処置によって完全に阻害された。２×８０ｍｇ／ｋｇのカルボプラチン（単独）で処置したマウスはすべて死亡したか、実験終了前に安楽死させられた（瀕死状態であった）点は注意を要する。２×８０ｍｇ／ｋｇのカルボプラチン及びＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１で処置したマウスは、予定した実験終了時まで生存し、１５日目に血小板減少症も貧血も認められなかった点は興味深い。
【０１１５】
対照群のマウスの脳を組織学的に評価したところ、小血管の状態は正常のようであった。多くの血管に赤血球が含まれ、フィブリノゲンについて薄く染色された。フィブリノゲンは血漿に通常含まれる成分であることからこれらの対照マウスにおいてフィブリノゲン／フィブリンに対する薄い血管内染色は予想されたものである。カルボプラチン単独（２×７０ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスの脳切片には、フィブリノゲン／フィブリンについて強い陽性に染色される物質によって完全に閉塞された小血管が含まれていた。こうした微小血栓はこの投与群のすべてのマウスの組織切片で頻繁に認められた。カルボプラチン及びＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１で処置したマウスの脳切片の小血管は正常な外観を呈するか、対照群と比較してわずかに濃くフィブリノゲン／フィブリン染色された。この投与群全体で１例の微小血栓が見られた。
【０１１６】
この実験の結果は化学療法によって微小血栓が誘発されることを示すものであり、微小血栓は赤血球の機械的溶解に寄与すると考えられることから、これらの血管症状は化学療法誘発貧血症に寄与している可能性が高い。更にこうした血栓の発症を防止するＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の能力は、この物質が化学療法によって誘発される貧血の発症を防止する機序の一要素をなすものと思われる。最後に、微小血栓は、高用量の化学療法を行った動物の死亡率にも寄与していた可能性がある。したがってこうした血栓の発症を防止するＰ
ＥＧ化ＴＰＯ化合物１の能力は、高用量の化学療法及びＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１を投与した動物における高い生存率の要因である可能性がある。
【０１１７】
図１８（Ａ）及び図１８（Ｂ）は、ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１による処置が、カルボプラチン処置マウスの血小板及びヘマトクリット値に及ぼす効果を示したものである（実施例６で述べた）。
【０１１８】
図１９は、実施例６で述べたように、ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の投与によってカルボプラチン処置マウスの脳切片においてフィブリノゲンの沈着及び血液凝固が減少することを示したものである。
【０１１９】
予想される作用機序
図１６は、ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の抗貧血効果の作用機序と考えられるものを示したものである。図１６に示されるように、化学療法は小血管の内皮の損傷を誘発し、造血を抑制する。ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の非存在下では、変性した内皮によって血液循環中の血小板が活性化され、小血管の血管壁に沈着するにしたがって血小板減少症が急速に発症する。機能低下した骨髄によって産生される変性した血小板がこの過程に寄与する。活性化された血小板は損傷した血管の内部へのフィブリンの沈着を誘発し、微小血管血栓が生じる。こうした微小血管血栓は赤血球の機械的破壊を媒介し、化学療法誘発貧血の発症に寄与する。ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１との同時処置によって、化学療法により血管の内皮に誘発される損傷が阻害され、並びに／または血液循環中の血小板の抗血栓性及びフィブリン溶解亢進性（profibrinolytic qualities）が促進される。その結果、微小血管血栓は生じず、赤血球の構造も維持される。骨髄の巨核球前駆細胞に対するＰＥＧ化ＴＰＯ化合物の作用によって正常な血小板の産生が促進される。止血が維持され、貧血が防止される。
【０１２０】
図１７はＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の造血細胞に対する系列分化効果の一部と考えられるものを示したものである。
【０１２１】
実施例７
結合アッセイ
本発明のペプチド化合物の活性は標準的な相対発光単位アッセイ法を用いて求めることができる。このアッセイでは、例えば、ヒトＴＰＯ受容体を安定して発現するように操作されたマウス細胞、及びｆｏｓプロモーターによって制御されるルシフェラーゼレポーターコンストラクトを用いる。アッセイは以下のようにして行ってもよい：ヒトＴＰＯ受容体ｃ−ｍｐｌ（ｈＴＰＯｒ）及びルシフェラーゼレポーターコンストラクトを発現している無血清下で培養したＢａｆ／３  ｈＴＰＯｒ  ｆｏｓ／ｌｕｘ細胞を、増加する濃度のｒｈＴＰＯまたはペプチド化合物に約１８時間曝露する。次いで細胞をルシフェラーゼの基質を含む培地でインキュベートし、細胞の発光をルミノメーターで測定する。
【０１２２】
図２０に示されるように、ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１は、ヒトＴＰＯ−Ｒを発現している組換えＢａｆ／３細胞を用量依存的に活性化した。図２１に示されるように、細胞をＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１で刺激した場合、同じ濃度のＴＰＯで刺激した場合よりもＴＰＯ−Ｒは強く活性化された。ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１のＥＣ50値は約５ｐＭであった。
【０１２３】
本発明の好適な実施形態のみを上記に具体的に説明したが、発明の趣旨及び意図する範囲から逸脱することなく発明の改変、変更が可能であることは了承されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】実施例１に記載のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の処置がヘモグロビン濃度に及ぼす効果を示す図。
【図２】実施例１に記載のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の処置が赤血球数に及ぼす効果を示す図。
【図３】実施例１に記載のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の処置がヘマトクリット値に及ぼす効果を示す図。
【図４】実施例１に記載のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の処置が体重に及ぼす効果を示す図。
【図５】実施例２に記載のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の処置がヘモグロビン濃度に及ぼす効果を示す図。
【図６】実施例２に記載のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の処置が赤血球数に及ぼす効果を示す図。
【図７】実施例２に記載のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の処置がヘマトクリット値に及ぼす効果を示す図。
【図８】実施例２に記載のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の処置が体重に及ぼす効果を示す図。
【図９】実施例３に記載のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の処置がヘモグロビン濃度に及ぼす効果を示す図。
【図１０】実施例３に記載のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の処置が赤血球数に及ぼす効果を示す図。
【図１１】実施例３に記載のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の処置がヘマトクリット値に及ぼす効果を示す図。
【図１２】実施例３に記載のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の処置が体重に及ぼす効果を示す図。
【図１３】実施例４に記載のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の処置がヘマトクリット値に及ぼす効果を示す図。
【図１４】実施例４に記載のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の処置が体重に及ぼす効果を示す図。
【図１５】実施例５に記載のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の処置が体重に及ぼす効果を示す図。
【図１６】ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の抗貧血作用の作用機序と考えられるものを示す図。
【図１７】ＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の造血細胞に対する系列分化効果の一部と考えられるものを示す図。
【図１８Ａ】実施例６に記載のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１による処置がカルボプラチン処置マウスの血小板に及ぼす効果を示す図。
【図１８Ｂ】実施例６に記載のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１による処置がカルボプラチン処置マウスのヘマトクリット値に及ぼす効果を示す図。
【図１９】実施例６に記載のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１の処置によるカルボプラチン処置マウスの脳切片におけるフィブリノゲンの沈着及び血液凝固への効果を示す図。
【図２０】実施例７に記載のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１がＢａｆ／３細胞のヒトＴＰＯ−Ｒの活性化に及ぼす効果を示す図。
【図２１】実施例７に記載のＰＥＧ化ＴＰＯ化合物１がヒトＴＰＯ−Ｒを発現している組換えＢａｆ／３細胞を用量依存的に活性化した結果を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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