(57)【要約】ＬＥＵ２染色体遺伝子座のガラクトース誘導性プロモーターの制御下で機能的Ｂａｘポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＷ３０３ａサッカロミセス・セレヴィシエ酵母細胞、酵母細胞およびｃＤＮＡライブラリーを酵母細胞に形質転換するのに適した酵母プラスミドベクターを含むパーツのキット、Ｂａｘ媒介アポトーシスの阻害剤である又は前記阻害剤をコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする酵母細胞の使用、Ｂａｘ媒介アポトーシスを阻害し、酵母細胞でスクリーニングされるヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーから同定される遺伝子及びポリペプチド、前記ライブラリーから同定されるＢａｘ媒介アポトーシスの阻害剤を用いる細胞でＢａｘ媒介アポトーシスに対抗する方法、前記ライブラリーから同定される抗アポトーシスポリペプチドの阻害剤又は拮抗薬を用いる細胞でＢａｘ媒介アポトーシスを促進する方法、を開示する。【選択図】５３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子型ＭＡＴ−ａ、ａｄｅ２−１、ｔｒｐ１−１、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｈｉｓ３−１１、ｈｉｓ３−１５、ｕｒａ３−１およびｃａｎ１−１００を有し、かつＬＥＵ２染色体遺伝子座において組込まれたガラクトース誘導性プロモーターの制御下で機能的Ｂａｘポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する、サッカロミセス・セレヴィシエ酵母細胞。
【請求項２】
遺伝子型ＭＡＴ−ａ、ａｄｅ２−１、ｔｒｐ１−１、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｈｉｓ３−１１、ｈｉｓ３−１５、ｕｒａ３−１およびｃａｎ１−１００を有し、かつガラクトース誘導性プロモーターの制御下で機能的Ｂａｘポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、およびＬＥＵ２染色体遺伝子座における組込に適したプラスミドを組込む酵母を含有する、サッカロミセス・セレヴィシエ酵母細胞。
【請求項３】
前記酵母細胞が株Ｗ３０３−１Ａである、請求項１または２に記載のサッカロミセス・セレヴィシエ酵母細胞。
【請求項４】
前記機能的ＢａｘポリペプチドがヒトＢａｘポリペプチド、またはそのプロアポトーシス断片または変種を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のサッカロミセス・セレヴィシエ酵母細胞。
【請求項５】
前記機能的Ｂａｘポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンが酵母について最適化されている、請求項１から４のいずれか一項に記載のサッカロミセス・セレヴィシエ酵母細胞。
【請求項６】
前記機能的Ｂａｘポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが配列番号２の配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のサッカロミセス・セレヴィシエ酵母細胞。
【請求項７】
前記ガラクトース誘導性プロモーターがＧＡＬ１またはＧＡＬ１０である、請求項１から６のいずれか一項に記載のサッカロミセス・セレヴィシエ酵母細胞。
【請求項８】
前記機能的ＢａｘポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがＳＵＣ２転写ターミネーター配列によって停止される、請求項１から７のいずれか一項に記載のサッカロミセス・セレヴィシエ酵母細胞。
【請求項９】
ガラクトースの存在下における機能的Ｂａｘポリペプチドの発現の結果、細胞の死滅がもたらされる、請求項１から８のいずれか一項に記載のサッカロミセス・セレヴィシエ酵母細胞。
【請求項１０】
株Ｗ３０３ｂａｘｌｅｕである、請求項１から９のいずれか一項に記載のサッカロミセス・セレヴィシエ酵母細胞。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の酵母細胞、およびポリヌクレオチドのライブラリーを酵母細胞に形質転換するのに適した酵母プラスミドベクターを含むパーツのキット。
【請求項１２】
前記酵母プラスミドベクターが、誘導性プロモーターの制御下でポリヌクレオチドのライブラリーからポリヌクレオチドを発現させるのに適している、請求項１１に記載のパーツのキット。
【請求項１３】
前記酵母プラスミドベクターがｐＹＥＳ２（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である、請求項１１または１２に記載のパーツのキット。
【請求項１４】
酵母細胞において誘導性プロモーターの制御下にあるポリヌクレオチドの発現を誘導する薬剤をさらに含む、請求項１１から１３のいずれか一項に記載のパーツのキット。
【請求項１５】
酵母細胞におけるポリヌクレオチドの発現を誘導する薬剤がガラクトースである、請求項１４に記載のパーツのキット。
【請求項１６】
ガラクトースをさらに含む、請求項１１から１４のいずれか一項に記載のパーツのキット。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドのライブラリーがｃＤＮＡライブラリーである、請求項１１から１６のいずれか一項に記載のパーツのキット。
【請求項１８】
Ｂａｘ媒介アポトーシスの阻害剤についてポリヌクレオチドのライブラリーをスクリーニングする方法を行うための指示書をさらに含む、請求項１１から１７のいずれか一項に記載のパーツのキット。
【請求項１９】
（ａ）酵母プラスミドベクター中のポリヌクレオチドのライブラリーを提供し；
（ｂ）前記ポリヌクレオチドのライブラリーを請求項１から１０のいずれか一項に記載の酵母細胞に形質転換し；
（ｃ）酵母プラスミドベクター中の機能的Ｂａｘポリペプチドの、およびポリヌクレオチドの発現を可能とする条件下で形質転換された酵母を平板培養し；および、
（ｄ）成長する酵母コロニーを同定することを含み、
酵母コロニーの成長は、酵母プラスミドベクター中のポリヌクレオチドがＢａｘ媒介アポトーシスの阻害剤である、またはそれをコードすることを示す方法であって、Ｂａｘ媒介アポトーシスの阻害剤である、またはそれをコードするポリヌクレオチドについてスクリーニングする方法。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチドのライブラリーがヒト脳組織、糖尿病に関与する組織、癌組織、心臓組織、関節リウマチに関与する組織、細胞系、または細菌またはウイルスゲノムから生じたｃＤＮＡライブラリーである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記酵母プラスミドベクター中の前記ポリヌクレオチドのライブラリーが誘導性プロモーターの制御下にある、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記誘導性プロモーターがテトラサイクリン誘導性プロモーター、メチオニン誘導性プロモーター、ガラクトース誘導性プロモーター、ＡＤＨ２プロモーターまたはメタロチオネインプロモーターである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ガラクトース誘導性プロモーターがＧＡＬ１またはＧＡＬ１０である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記酵母プラスミドベクターがｐＹＥＳ２である、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記形質転換工程（ｂ）が高効率形質転換である、請求項１９から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記平板培養工程（ｃ）が、ガラクトースの存在下で３０℃にて平板培養された酵母細胞を少なくとも７２時間インキュベートすることを含む、請求項１９から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記工程（ｄ）で同定された酵母コロニーに存在する酵母プラスミドベクター中のポリヌクレオチドの配列を得ることをさらに含む、請求項１９から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記工程（ｄ）で同定された酵母コロニーに存在するプラスミドベクターからのポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、アポトーシスのモデルにおいてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力について再度テストすることをさらに含む、請求項１９から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記工程（ｄ）で同定された酵母コロニーに存在するプラスミドベクターからのポリヌクレオチドを修飾し、次いで、修飾されたポリヌクレオチド、または前記修飾されたポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドを、アポトーシスのモデルにおいてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力についてテストすることをさらに含む、請求項１９から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
得られた配列データに基づいてポリヌクレオチドを同定し、次いで、同定されたポリヌクレオチドに対応するポリヌクレオチド、または前記対応するピリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、アポトーシスのモデルにおいてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力についてテストすることをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記アポトーシスのモデルが酵母細胞モデル、哺乳動物細胞モデル、およびアポトーシスのインビボモデルから選択される、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
Ｂａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを医薬的に許容される組成物に処方する工程をさらに含む、請求項３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
細胞を、ＦＫＢＰ２（ＦＫＢＰ−１３）；α−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）、真核生物翻訳伸長因子１  α１（ＥＥＦ１Ａ１）；小胞結合膜タンパク質３（ＶＡＭＰ３）；シナプトソーム結合タンパク質（ＳＮＡＰ２５）；ＲＩＭＳ３；ＲＡＢ４０Ｂ；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａシンターゼ１（ＨＭＧＣＳ１）；ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ５（ＳＣＤ５）；ＡＴＰａｓｅ  Ａｔｐ２ａ２（ＡＴＰ２Ａ２）；ｈｎＲＮＰメチルトランスフェラーゼ様１（ＨＲＭＴ１Ｌ１）；および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチド、またはこれらのポリペプチドのいずれかの抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体のいずれかをコードするポリヌクレオチドと接触させることを含む方法であって、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスに対抗する方法。
【請求項３４】
インビトロで行われる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスに対抗するための医薬の調製における、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチド、またはこれらのポリペプチドのいずれかの抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体のいずれかをコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項３６】
医療で用いられる、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチド、またはこれらのポリペプチドのいずれかの抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体のいずれかをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３７】
ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチド、またはこれらのポリペプチドのいずれかの抗アポトーシス誘導体、また前記前記ポリペプチドまたは誘導体のいずれかをコードするポリヌクレオチド、および医薬的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項３８】
ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチド、またはこれらのポリペプチドのいずれかの抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体のいずれかをコードするポリヌクレオチドを患者に投与することを含む方法であって、神経変性病または疾患、心血管病、関節リウマチおよび糖尿病から選択される患者における病気または疾患に対抗する方法。
【請求項３９】
神経変性病または疾患、心血管病、関節リウマチおよび糖尿病から選択される患者において病気または疾患に対抗するための医薬調製における、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチド、またはこれらのポリペプチドのいずれかの抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体のいずれかをコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項４０】
前記神経変性病または疾患が発作、脊髄外傷、頭部負傷、脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む運動ニューロン疾患、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）およびハンチントン病（ＨＤ）から選択される、請求項３８または３９に記載の方法または使用。
【請求項４１】
細胞を、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチドの阻害剤またはアンタゴニストと接触させることを含む方法であって、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを増加させる方法。
【請求項４２】
インビトロで行われる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
患者の細胞におけるＢａｘ媒介アポトーシスを増加させるための医薬の調製における、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチドの阻害剤またはアンタゴニストの使用。
【請求項４４】
医療で用いるための、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチドの阻害剤またはアンタゴニスト、あるいは前記阻害剤またはアンタゴニストのいずれかをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４５】
ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチドの阻害剤またはアンタゴニスト、あるいは前記阻害剤またはアンタゴニストのいずれかをコードするポリヌクレオチド、および医薬的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項４６】
ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチドの阻害剤、またはアンタゴニスト、あるいは前記阻害剤またはアンタゴニストのいずれかをコードするポリヌクレオチドを患者に投与することを含む方法であって、患者において癌に対抗する方法。
【請求項４７】
患者において癌に対抗するための医薬の調製における、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチドの阻害剤またはアンタゴニスト、あるいは前記阻害剤またはアンタゴニストのいずれかをコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項４８】
前記阻害剤またはアンタゴニストが前記ポリペプチドが選択的に結合する抗体である、請求項４１から４７のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項４９】
前記阻害剤またはアンタゴニストがリボザイム、アンチセンスポリヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ分子である、請求項４１から４７のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項５０】
前記阻害剤またはアンタゴニストが請求項５１から７１に記載の方法によって同定可能なまたは同定される、請求項４１から４７のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項５１】
ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１から選択される遺伝子、およびその転写されたメッセージが配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むｃＤＮＡ配列を有する遺伝子からのプロモーターおよび／または調節部分に操作可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞を提供し、
前記細胞を候補化合物と接触させ；および、
前記レポーター遺伝子の発現を測定することを含み、
候補化合物に対する応答におけるレポーター遺伝子の発現の変化は、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１から選択される遺伝子、およびその転写されたメッセージが配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むｃＤＮＡ配列を有する遺伝子の発現を変調することができる化合物を同定する方法であって、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１から選択される遺伝子、およびその転写されたメッセージが配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むｃＤＮＡ配列を有する遺伝子の発現を変調する化合物を同定する方法。
【請求項５２】
前記レポーター遺伝子の発現を増加させる同定された化合物が、インビボにてその天然に生じるプロモーターからの各遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現を増加させることができる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記レポーター遺伝子の発現を減少させる同定された化合物が、インビボにてその天然に生じるプロモーターからの各遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現を減少させることができる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記レポーター遺伝子がβ―ＧＡＬ、ＧＦＰおよびエクオリンから選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１から選択される遺伝子、およびその転写されたメッセージが配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むｃＤＮＡ配列を有する遺伝子のプロモーター部分が、前記遺伝子の転写開始部位から５ｋｂ上流（５’）の領域を含む、請求項５１から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記プロモーターが前記遺伝子の転写開始部位から３ｋｂまたは２ｋｂまたは１ｋｂまたは５００ｂｐ上流（５’）の領域に位置する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１から選択される遺伝子、およびその転写されたメッセージが配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むｃＤＮＡ配列を有する遺伝子の調節部分が、前記遺伝子の転写開始部位から２０ｋｂ上流（５’）にある領域を含む、請求項５１から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記調節部分が前記遺伝子の転写開始部位から１０ｋｂまたは７ｋｂまたは５ｋｂまたは３ｋｂ以上、好ましくは１ｋｂだけ５’上流にある領域に位置する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
請求項５１から５８のいずれかの方法に従って、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１から選択される遺伝子、およびその転写されたメッセージが配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むｃＤＮＡ配列を有する遺伝子の発現を変調する化合物を同定し、および、
前記同定された化合物をＢａｘ媒介アポトーシス用のアッセイでテストすることを含む方法であって、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを変調する化合物を同定する方法。
【請求項６０】
前記アポトーシスのモデルが酵母細胞モデル、哺乳動物細胞モデル、およびアポトーシスのインビボモデルから選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記レポーター遺伝子の発現を増加させる化合物がＢａｘ媒介アポトーシスの阻害剤である、請求項５９または６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記レポーター遺伝子の発現を減少させる化合物がＢａｘ媒介アポトーシスのプロモーターである、請求項５９または６０に記載の方法。
【請求項６３】
誘導性プロモーターの制御下で機能的Ｂａｘポリペプチドを発現し、かつＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択させるポリペプチドを、その天然に生じるプロモーターおよび／または調節配列の制御下で発現させる細胞を提供し、
前記細胞を、機能的Ｂａｘポリペプチドの発現を誘導する条件下で候補化合物と接触させ、および、
アポトーシスアッセイを行うことを含み、
前記候補化合物と接触しなかった細胞と比較したアポトーシスのレベルの変化は、Ｂａｘ媒介アポトーシスを変調することができる化合物を示す方法であって、Ｂａｘ媒介アポトーシスを変調する化合物を同定する方法。
【請求項６４】
前記細胞が哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞が脳細胞、好ましくは海馬細胞の一次培養、またはそれに由来する細胞系からのものである、請求項６３または６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記細胞が、誘導性プロモーターの制御下で機能的Ｂａｘポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む構築体でトランスフェクトされているヒト細胞系からのものである、請求項６３から６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞が、候補化合物の不在下において、その天然に生じるプロモーターおよび／または調節配列の制御下で、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチドを発現する、請求項６３から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記アポトーシスのモデルが酵母細胞モデル、哺乳動物細胞、およびアポトーシスのインビボモデルから選択される、請求項６３から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
ポリペプチドを候補化合物と接触させ；
前記ポリペプチドおよび前記候補化合物を含有する複合体の存在を検出し；および、
場合により、前記ポリペプチドに結合したいずれかの化合物を同定することを含む方法であって、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチド、またはその適当な抗アポトーシス誘導体に結合する化合物についてスクリーニングする方法。
【請求項７０】
前記候補化合物はペプチドまたはポリペプチドである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
高スループットスクリーニングアッセイである、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記同定された化合物が、薬物様化合物、または薬物様化合物の開発のためのリード化合物である、請求項５１から７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記同定された化合物が、アポトーシスのモデルにおいて、および／または適当な病気モデルにおいてテストされる、請求項５１から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記同定された化合物が修飾されており、前記修飾された化合物がアポトーシスのモデルにおいて、および／または適当な病気モデルにおいてテストされる、請求項５１から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記同定された化合物を医薬的に許容される組成物に処方することをさらに含む、請求項５１から７４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポトーシスを調節する遺伝子およびタンパク質の同定に関する。特に、本発明は、アポトーシスのレギュレーターを同定する方法で有用な酵母株、前記酵母株を使用するスクリーニング方法、およびこのようにして同定された遺伝子およびタンパク質に関する。本発明は、さらに、同定された遺伝子およびタンパク質の医療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシス調節タンパク質の異常な発現は、しばしば、癌、関節リウマチ、神経変性および心血管病のような多様な病気の原因である。累積する証拠は、アポトーシスが種々の神経変性の関係でニューロン細胞死滅に寄与することを強く示唆する。アポトーシスは発作、脊髄外傷、頭部負傷、脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）およびハンチントン病（ＨＤ）で観察されるヒト神経変性病において中枢的な役割を果たす。
【０００３】
プロアポトーシス分子Ｂａｘは、栄養因子枯渇の状況において交感神経および運動ニューロンの死滅で必要である。さらに、成体Ｂａｘ欠乏トランスジェニックマウスは、それらの野生型カウンターパートよりも多くの運動ニューロンを有する。これらの知見は、Ｂａｘが、多くのニューロン集団において発生の間に天然で生じる細胞死滅を制御することを示唆する。また、Ｂａｘは、胚生活の間における末梢およびＣＮＳニューロンの天然に生じる死滅の臨界的メディエーターであることも観察される（Ｄａｖｉｅｓ，２０００）。
【０００４】
ある実験条件下では、公知の抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬはＢａｘの活性に逆作用する。アポトーシス事象は、プロアポトーシスタンパク質の濃度が抗アポトーシスタンパク質のそれを上回る場合に刺激されると推定されている。そのようなアポトーシス事象は、最終的には、カスパーゼと呼ばれるシステインプロテアーゼのファミリーの活性化に導くミトコンドリアの変化を含む。この結果、アポトーシスのホールマーク内からの死滅している細胞の消化がもたらされる（Ｃｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
アポトーシスを調節する遺伝子およびタンパク質、特に、アポトーシスを負に制御する（すなわち、抑制する）ものの良好な理解は、アポトーシスの不適切な活性化を妨げ、あるいは一旦開始したアポトーシスプロセスを停止する新しい処理の設計に導き得る。これらの抗アポトーシス遺伝子およびタンパク質の発見は、急性および慢性双方の神経変性病を含む不適切なアポトーシスによって特徴付けられる病気に対する新しい現実的な治療アプローチを開発するのに有益である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
神経変性におけるアポトーシスの役割
【０００７】
発作、ＡＤ、ＰＤ、ＨＤ、ＳＭＡ、およびＡＬＳを含む運動ニューロン疾患は、全て、アポトーシスと関連付けられてきた。細胞膨潤、原形質膜溶解およびかなりの細胞死滅に関連する壊死とは異なり、アポトーシスは、カスパーゼ活性化、酸化的ストレス、乱れたカルシウムホメオスタシスおよびミトコンドリア機能不全を伴う個々の細胞死滅を含む。いくつかの生存シグナルは、オキシラジカルを抑制し、かつカルシウムホメオスタシスおよびミトコンドリア機能を安定化させることによってこれに対して保護する。アポトーシスの多くの形態におけるミトコンドリアは、増大したオキシラジカル生成、それらの膜中のポアの開口、およびチトクロームｃの放出を示す。これの証拠として、酸化的ストレスおよび膜ポア形成を抑制するマンガンスーパーオキシドジスムターゼおよびサイクロスポリンＡもまた、実験モデルにおいてニューロン死滅を妨げる（Ｐｏｎｇ，２００３；Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。
【０００８】
タンパク質のＢ細胞リンパ腫−２（Ｂｃｌ−２）ファミリーはプロおよび抗アポトーシスメンバーの双方を含む。ニューロンにおける抗アポトーシスメンバーはＢｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬを含み；プロアポトーシスメンバーはＢｃｌ−２−関連Ｘ−タンパク質（Ｂａｘ）およびＢｃｌ−関連死滅プロモーター（Ｂａｄ）を含む。例えば、細胞培養およびトランスジェニックマウスにおけるＢｃｌ−２の過剰発現は、興奮毒性、代謝および酸化的損傷によって誘導された死滅に対するニューロンの耐性を増大させる。Ｂａｘを欠如するニューロンはアポトーシスに対して保護される。Ｂｃｌ−２タンパク質は、ミトコンドリアに関連するタンパク質と相互作用することによって細胞死滅を制御することができ、ミトコンドリア膜を横切ってのイオンの変化を引き起こす（Ｓｏａｎｅ  ＆  Ｆｉｓｋｕｍ，２００５；Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。
【０００９】
カスパーゼはシステインプロテアーゼである。カスパーゼ８は死滅受容体（例えば、Ｆａｓ、ｐ７５ニュートロフィン受容体）に対する応答において活性化される。これらの上流カスパーゼはエフェクターカスパーゼ（例えば、カスパーゼ３）を活性化し、ミトコンドリア改変から独立してアポトーシスを誘導することができる（Ｄａｖｉｅｓ，２０００）。エフェクターカスパーゼは、ミトコンドリア変化およびチトクロームｃ放出に対する応答においてもやはり活性化され、次いで、ＤＮａｓｅを活性化する。カスパーゼは種々のタンパク質、例えば、ＡＭＰＡ、アクチン等も切断できる。Ｐａｒ−４のレベルは迅速に増大する（Ｍｕｎｄｌｅ，２００５）。Ｐａｒ−４のカルボキシル末端におけるロイシンジッパードメインは、そのプロアポトーシス機能、およびプロテインキナーゼＣおよびＢｃｌ−２を含む他のタンパク質とのその相互作用で必須である（Ｌｅｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。
【００１０】
アポトーシスの初期相において、死滅シグナルは、オキシラジカルおよびＣａ２＋のレベルの増加、Ｐａｒ−４の生産、およびプロアポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバー（ＢａｘおよびＢａｄ）のミトコンドリア膜へのトランスローケーションに関与し得る事象の細胞内カスケードを活性化する。あるカスパーゼ（例えば、カスパーゼ８）は、ミトコンドリア変化の前の、またはそれとは独立した細胞死滅プロセスにおいて初期に作用し得る。
【００１１】
アポトーシスのエフェクター相は増大したミトコンドリアＣａ２＋およびオキシラジカルレベル、ミトコンドリア膜における浸透性転移ポアの形成、およびチトクロームｃのサイトゾルへの放出を含む。チトクロームｃはアポトーシスプロテアーゼ活性化因子１（Ａｐａｆ−１）およびカスパーゼ９とで複合体を形成する（Ｈａｊｒａ  ＆  Ｌｉｕ，２００４）。
【００１２】
アポトーシスの分解相においては、活性化されたカスパーゼ９はカスパーゼ３を活性化し、カスパーゼおよび他の酵素基質の切断に導き；原形質膜の変化が起こり（細胞表面でのホスファチジルセリンのブレブ形成および暴露）；シグナルが放出され、これはマクロファージ／小神経膠細胞による細胞ファゴサイトーシスを刺激し；および核クロマチンは凝縮するようになり、かつ断片化するようになる（Ｂｕｄｉｈａｒｄｊｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。
【００１３】
ミトコンドリア変化は、おそらくは、多くの場合において細胞死滅決定において中枢的である。
【００１４】
ニューロンにおいてアポトーシスをトリガーすることが知られているシグナルは以下のものを含む。
【００１５】
［１］神経栄養因子支持体の欠如。Ｂａｘは、ＮＧＦが枯渇した交換神経ニューロンのアポトーシス死滅で必要である。ＮＧＦ撤退後に、Ｂａｘは細胞質からこれらの細胞のミトコンドリアまで移動し、チトクロームｃの放出を誘導する。交感神経ニューロンからのＮＧＦの撤退は、ミトコンドリア由来反応性酸素種（ＲＯＳ）の増加を引き起こす。これらのＲＯＳの抑制はアポトーシスを阻害する。Ｂａｘ枯渇は、死滅をブロックし、ＲＯＳバーストを妨げ、このようにして、Ｂａｘは増大したＲＯＳから上流に存在する（Ｈｅａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。
【００１６】
［２］例えば、カルシウム流入または興奮毒性を通じてのグルタメート受容体の過剰−活性化（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，２００５）。
【００１７】
［３］増大した酸化的ストレス、例えば、フリーラジカル（例えば、スーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシルラジカル）損傷細胞脂質、タンパク質および核酸（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ  ＆  Ｗｈｉｔｅｍａｎ，２００４）。
【００１８】
［４］例えば、発作後またはエージングの間における代謝的ストレス、グルコース、酸素、およびＡＴＰ生産で必要な他の分子のレベルは減少する（Ｐｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００４）。
【００１９】
［５］環境有害物質（Ｖａｌｋｏ  ｅｔ  ａｌ，２００５；Ｓａｖｏｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９８）。
【００２０】
抗アポトーシストリガーであることが知られている因子は以下のものを含む。
【００２１】
［１］テロメラーゼは、触媒逆−転写酵素サブユニット（ＴＥＲＴ）、ＲＮＡ鋳型および調節タンパク質よりなる。テロメラーゼ活性は発生の間に増加し、次いで、ダウンレギュレートされる。テロメラーゼ活性およびＴＥＲＴは、発生ニューロン死滅および神経変性障害の実験モデルにおいてアポトーシスに対するニューロンの増大した耐性に関連付けられている。ニューロンにおけるＴＥＲＴの抗アポトーシス作用は、ミトコンドリア改変およびカスパーゼ活性化前の初期の段階で発揮される（Ｓｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。
【００２２】
［２］ストレスは神経栄養因子および熱ショックタンパク質の発現を誘導することができる。神経栄養因子は、今度は、オートクリンまたはパラクリン様式で作用して、細胞表面受容体媒介キナーゼシグナリング経路を活性化し、前記経路は抗酸化剤酵素のようなタンパク質をコードする生存−促進遺伝子の発現を誘導する。神経栄養因子（脳−由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ））、およびサイトカイン（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）および白血病抑制因子（ＬＩＦ））はニューロン死滅の実験モデルにおいてニューロンの死滅を妨げることができる（Ｚｗｅｉｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。
【００２３】
［３］熱ショックタンパク質は多くのタンパク質に対してシャペロンとして作用し、タンパク質の安定性を維持する。それらはカスパーゼと直接的に相互作用することもでき、それらの活性化を阻害する（Ｓｒｅｅｄｈａｒ  ＆  Ｃｓｅｒｍｅｌｙ，２００４）。
【００２４】
［４］カルシウム、ならびにニューロン死滅の促進もまた、４つの区別される生存経路を活性化することもできる（Ｄｉｓｔｅｌｈｏｒｓｔ  ＆  Ｓｈｏｒｅ，２００４）。
【００２５】
（ａ）カルシウム／カルモジュリン−依存性プロテインキナーゼによるプロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ／Ａｋｔ）の活性化（Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，２００５；Ｃｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。
【００２６】
（ｂ）発生細胞死滅のモデルにおいてニューロン生存を促進することができる、ストレスに対する細胞応答の調節、環状−ＡＭＰ応答エレメント−結合タンパク質（ＣＲＥＢ）を介する転写の活性化（Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，２００５；Ｒｏｕａｕｘ  ｅｔ  ａｌ，２００４）。
【００２７】
（ｃ）膜ＮＭＤＡ受容体および電圧−依存性カルシウムチャネルを通じてのカルシウム流入の抑制をもたらす、アクチン脱重合を誘導するアクチン切断タンパク質ゲルゾリンの活性化。これは、ＮＭＤＡ受容体およびカルシウムチャネルタンパク質と相互作用する中間アクチン結合タンパク質を通じて起こり得る（Ｈａｒｍｓ  ｅｔ  ａｌ，２００４；Ｂｕｒｔｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ，２００４）。
【００２８】
（ｄ）環状ＧＭＰ生産を増大させる、カルシウムおよび分泌されたアミロイド前駆体タンパク質αは、カリウムチャネルおよび転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化を誘導でき、および興奮毒性アポトーシスに対するニューロンの耐性を増加させることができる（Ｃａｒｄｏｓｏ  ＆  Ｏｌｉｖｅｉｒａ，２００３）。
【００２９】
神経変性病状態を患う患者の脳においてアポトーシスを示すのは困難である。アポトーシスは通常迅速に起こり（数時間）、従って、いずれの時点においても、古典的な特徴を示す細胞は少ない。このようにして、アポトーシスを裏付ける証拠の多くは動物および細胞培養モデルからくる。
【００３０】
ＡＤにおいては、初期の変化は海馬において、また後に皮質において観察される。カルシウム媒介タンパク質分解および酸化的ストレスのいくつかの証拠がある。増大したＤＮＡ損傷およびカスパーゼ活性、およびＢｃｌ−２ファミリーメンバー、Ｐａｒ−４およびＤＮＡ損傷応答遺伝子のようなアポトーシス関連遺伝子の発現における改変は、ＡＤを持つ患者の脳におけるアミロイド沈積に関連するニューロンで見出されている。ＡＤ患者からの脳組織試料における遺伝子の発現−プロフィール分析は、ＮＣＫＡＰ１（ＭＣＫ−関連タンパク質１）と呼ばれる抗アポトーシス遺伝子の発現の顕著な減少を示す（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ＆  Ｂｅｈｌ，２００１）。
【００３１】
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、プレセニリン１（ＰＳ１）およびプレセニリン２（ＰＳ２）遺伝子における突然変異は、初期開始ＡＤを引き起こすことが示されている。βセクレターゼ（ＢＡＣＥ）によるＡＰＰの切断の結果、４０ないし４２ペプチドＡβおよびｓＡＰＰβと呼ばれる分泌産物の生産がもたらされる。これは時間の５ないし１０％起こるに過ぎない。通常、α−セクレターゼ（メタロプロテアーゼのＡＤＡＭファミリー）はＡＰＰを切断し、Ａβは生産されず、軸索促進ｓＡＰＰαが分泌される。培養ニューロンにおけるＡβ暴露はアポトーシスを直接的に誘導し、酸化的ストレスによる死滅に対する脆弱性を増加させることができる。Ａβは、おそらくは、膜脂質過酸化によってニューロンを感受性化する。これはＡＴＰａｓｅならびにグルコースおよびグルタメートトランスポーターの機能を損ない、その結果、膜脱分極、ＡＴＰ枯渇、過剰なカルシウム流入およびミトコンドリア機能障害をもたらす。脂質過酸化を抑制する抗酸化剤、および細胞カルシウムホメオスタシスを安定化する薬物は、Ａβ誘導アポトーシスに対してニューロンを保護することができる。神経栄養因子およびサイトカインもまたＡβに対して保護することができる。ＡＰＰ、ＰＳ１およびＰＳ２における突然変異は、全て、Ａβ生産の増加を引き起こし、ある場合には、より毒性の形態Ａβ４２における増加を引き起こすことができる。
【００３２】
ＡＰＰもカスパーゼ３に対する基質である。ＡＰＰのカスパーゼ媒介切断は、アポトーシスの優れたインデューサーであるＣ３１と呼ばれるカルボキシ−末端ペプチドを放出することができる。突然変異体ＰＳ１が培養された細胞において、およびトランスジェニックかつノック−インマウスにおいて発現される場合、ニューロンは、栄養因子撤回、Ａβまたはグルタメートに対する暴露、およびエネルギー喪失を含む種々の損傷によって誘導された死滅に対して感受性となる。突然変異体ＰＳ１は、Ｐａｒ−４生産、ミトコンドリア機能障害およびカスパーゼ活性化前に初期の段階で作用する。小胞体におけるカルシウムホメオスタシスは、ニューロンが潜在的に損傷する酸化的および代謝的損傷に暴露される場合により多くのカルシウムが放出されるように阻害される。ダントロレンおよびキセストスポンジンを含む、ＥＲカルシウム放出を抑制する薬剤は、突然変異の効果に対して逆作用できる。
【００３３】
ＰＤにおいては、ドーパミンニューロンは黒質において変性する。環境および遺伝的因子は、酸化的ストレスおよびエネルギー欠損における年齢関連増加に対してドーパミンニューロンを感受性とすることができる。環境有害物質は関連付けられており、トキシン１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）へ暴露されたサルおよび人々はパーキンソン様兆候を示す。ＰＤを持つ患者からの脳組織は、アポトーシス関連ＤＮＡ損傷、およびドーパミンニューロンの死滅における遺伝子活性化を示す。Ｐａｒ−４のレベルは、その死滅前に黒質のドーパミンニューロンにおいて増加し、Ｐａｒ−４発現の抑制はドーパミンニューロンを死滅から保護する。マクロ分子合成を抑制する薬物であるカスパーゼ１阻害、および神経膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のような神経栄養因子は、ＰＤモデルにおいてドーパミンニューロンを保護することができる。稀な場合において、レビー体の成分であるα−シヌクレインの突然変異はパーキンソン病症例を引き起こす。培養された細胞における突然変異体α−シヌクレインの発現はアポトーシスを促進する。通常、パーキンおよびユビキチンはアポトーシスを介するシヌクレインの除去に関連する。もしこのプロセスが、例えば、欠陥があるパーキン遺伝子と共になくなれば、アポトーシスが起こらない。もしシヌクレインがこれらの細胞において排除されないならば、それは形成され、ドーパミンに対して毒性となる。そのような場合において、シヌクレインはレビー体に蓄積する。
【００３４】
ＰＤに罹った幾人かの患者は、増大した細胞酸化性ストレスから生じ、またはそれに寄与し得るミトコンドリア複合体Ｉの欠乏を有する。ロテノンによって引き起こされた慢性複合体Ｉ阻害は、選択的黒質線条体ドーパミン作動性変性およびα−シヌクレイン陽性封入を持つレビー体を含む、ラットにおけるＰＤの特徴を誘導する。ドーパミン作動性ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のロテノン−誘導細胞死滅において、ロテノンは、Ｂａｄタンパク質の量を変化させることなくＢａｄ脱リン酸化を誘導する。また、ロテノンは、形態学的変化を示す細胞においてα−シヌクレインの量を増加させる。ロテノンはＢａｄの減少、および１４−３−３タンパク質に結合するα−シヌクレインの増加を引き起こす。カルシニューリンによる脱リン酸化はＢａｄを活性化する。カルシニューリン阻害剤タクロリムス（ＦＫ５０６）は、ロテノン−誘導Ｂａｄ脱リン酸化およびアポトーシスを抑制する。Ｂａｄから下流で機能するカスパーゼ９の阻害は、ロテノン−誘導アポトーシスを完全に抑制する。
【００３５】
ＭＰＰ＋はミトコンドリア複合体−１およびアコニターゼの活性を阻害し、増強されたＨ２Ｏ２生成、ＴｆＲ発現およびα−シヌクレイン発現および凝集に導く。α−シヌクレインを過剰発現する細胞はＭＰＰ＋毒性を亢進し、他方、アンチセンスα−シヌクレイン処理は、オキシダントの発生に影響することなく神経芽細胞腫細胞においてＭＰＰ＋誘導アポトーシスを全くなくした。ＭＰＰ＋処理細胞におけるα−シヌクレインの増大した細胞傷害性効果は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の阻害およびプロテアソーム機能に帰せられた（Ｋａｌｉｖｅｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ，２００４）。
【００３６】
アポトーシス研究のためのツールとしての酵母
【００３７】
前記したように、少数の公知のアポトーシスのレギュレーターがあり、そのいくつかは細胞死滅を刺激し、他方、他のものはそれを妨げる。酵母サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において発現されたヒトプロアポトーシスタンパク質は、ミトコンドリア−非依存的または依存的な様式で細胞成長をブロックすることができ、機能的ミトコンドリアの存在下で細胞死滅を引き起こし得る。哺乳動物アポトーシスのホールマークの多くは死滅している酵母において発現され、公知の抗アポトーシスタンパク質はミトコンドリア依存性酵母死滅を克服することができる。従って、アポトーシスのレギュレーターのための酵母スクリーニングシステムはヒトシステムの有用なミミックを提供し、哺乳動物テストシステムに使用できない領域（例えば、ミトコンドリア−非依存性成長阻止経路）の探索を可能にする。
【００３８】
ＧＢ  ２  ３２６４１３およびＧｒｅｅｎｈａｌｆ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）において、発明者は、以前、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母株ＨＴ４４４における推定アポトーシス阻害剤に対するｃＤＮＡをスクリーニングする方法を記載した。ＧＡＬ１０プロモーター、ＳＵＣ２転写ターミネーターおよびＬＥＵ２選択マーカー遺伝子の制御下にあるヒトＢａｘタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを取り込むｐＲＳ３０５酵母をＨＴ４４４細胞に取り込んで、酵母株ＨＴ４４４＿ｂａｘを得た。ガラクトースの存在下におけるヒトＢａｘタンパク質の発現はＨＴ４４４＿ｂａｘ細胞の成長を停止させ、前記細胞を殺傷した。ＨＴ４４４＿ｂａｘ細胞を、ｂｃｌ−２およびｂｃｌ−ｘＬをコードするポリヌクレオチドを含有する酵母プラスミドで形質転換した場合、これらのタンパク質の発現はＢａｘ発現細胞において酵母細胞成長を回復することが示された。ヒト小脳ｃＤＮＡライブラリーを、このシステムを用いてスクリーニングした。
【００３９】
Ｇｒｅｅｎｈａｌｆ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）は、Ｂａｘ誘導は全ての状況下で酵母細胞成長を一定に妨げるが、それは、機能的ミトコンドリアを欠如する故に呼吸することができない「小」細胞において死滅に導かないことを証明した。これは、Ｂａｘ媒介成長阻害および細胞死滅がミトコンドリア機能および呼吸に関係していることを示した。ミトコンドリアの不在下で生存しない哺乳動物細胞とは異なり、酵母は生きた代替、発酵経路を有する。ガラクトースはグルコースよりも酵母において呼吸のより低い効率の阻害剤である。このようにして、ガラクトース誘導性プロモーター下での酵母におけるＢａｘの発現は、呼吸、および（酵母細胞が発酵を受ける場合に）グルコース誘導性プロモーター下でのＢａｘの発現よりも著しい細胞死滅に導く。
【００４０】
Ｍａｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）は、Ｂａｘ誘導成長阻止が、ミトコンドリアのチトクロームｃオキシダーゼのレベルの減少、およびミトコンドリアからサイトゾルへのチトクロームｃ放出の増加に関連すると報告した。
【００４１】
Ｌｉｇｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）は、後に、哺乳動物Ｂａｘが、哺乳動物細胞におけるアポトーシス変化に強く似た酵母におけるアポトーシス変化をトリガーすることを確認した。
【００４２】
Ｘｕ  ＆  Ｒｅｅｄ（１９９８）は、酵母株ＢＦ２６４−１５Ｄａｕにおけるガラクトース誘導性プロモーター下でＢａｘ発現を利用する機能的酵母スクリーニングシステムを用いて哺乳動物アポトーシスサプレッサー、Ｂａｘ阻害剤−１（Ｂｉ−１）を同定した。
【００４３】
ＵＳ  ２００５／０１４８０６２は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＩＮＶＳｃ１におけるＢａｘ誘導細胞死滅に際しての異なる遺伝子発現の分析のための、マウスＢａｘαタンパク質を発現するＴｙトランスポゾンベースのベクターの使用を記載した。
【００４４】
アポトーシス研究のためのツールとしての酵母の使用は、Ｍａｔｓｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）によって１９９９年に概説され、細胞死滅におけるＢａｘ／ミトコンドリア相互作用の研究用のツールとしての酵母はＰｒｉａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ（２００３）によって概説された。
【００４５】
発明者は、今回、アポトーシスを調節する遺伝子およびタンパク質を同定するための機能的スクリーニングシステムにおいて特に有用である、サッカロミセス・セレヴィシエ酵母株Ｗ３０３ｂａｘｌｅｕを開発した。後に記載するように、酵母株Ｗ３０３ｂａｘｌｅｕは、アポトーシスのレギュレーター用のスクリーニングについて前述の株のいずれかよりも優れた特性を有する。特に、Ｗ３０３ｂａｘｌｅｕを用いる偽陽性率は驚くほどに低い。事実、発明者は、酵母株Ｗ３０３ｂａｘｌｅｕが、ＢＡＸ発現カセットがＡＤＥ２、ＨＩＳ３またはＴＲＰ１遺伝子座に組込まれている他の同等なＷ３０３株よりもかなり低い偽陽性率を有することを見出した。従って、Ｗ３０３ｂａｘｌｅｕの使用は、より迅速かつ低下したコストでのいくつかの潜在的治療標的の同定に導くと予測される。事実、Ｗ３０３ｂａｘｌｅｕを用い、発明者は、そのうちいくつかが、本発明者が独立して哺乳動物細胞におけるＢａｘ媒介アポトーシスの阻害剤としての活性を有することを確認した、多数の潜在的な新しいアポトーシスレギュレーターを同定した（表１参照）。
【００４６】
本発明の第一の態様は、遺伝子型ＭＡＴ−ａ、ａｄｅ２−１、ｔｒｐ１−１、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｈｉｓ３−１１、ｈｉｓ３−１５、ｕｒａ３−１、ｃａｎ１−１００を有し、ＬＥＵ２染色体遺伝子座に組込まれたガラクトース誘導性プロモーターの制御下で機能的なＢａｘポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母細胞を提供する。
【００４７】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＡＮ１遺伝子はアルギニンパーミアーゼである。ｃａｎ１−１００突然変異は、通常、普通のｌｅｕ、ｕｒａまたはａｄｅマーカーを持つ株におけるサイレント突然変異であり、従って、ｃａｎ１−１００突然変異がそのような株に存在することに注意しない可能性がある。しかしながら、ｃａｎ１−１００突然変異は、（Ｗ３０３ａのような）Ｈｉｓ突然変異体細胞における問題を引き起こしかねない。これらの細胞は、もし外因性ヒスチジン上で成長させれば、遅い成長表現型を有する。（例えば、Ｈｉｓ３突然変異体である株において成長に絶対的に必須である）外因性ヒスチジンの存在下におけるこのゆっくりとした成長表現型は、スクリーニングにおいて助けとなり、偽陽性を排除する。理論に拘束されるつもりはないが、発明者は、（好ましくは、酵母偏りコドンを用いて合成され、場合によりＣ末端においてｃ−ｍｙｃタグを持つ）ヒトＢＡＸの一体化されたコピーと共に、ｃａｎ１−１００突然変異を担う他のＨｉｓ突然変異体酵母株は、特に、（Ｍａｔ−αとは反対に）Ｍａｔ−ａでもある株において、Ｂａｘ媒介アポトーシススクリーニングにおいて偽陽性を排除するのに助けになることを提案する。
【００４８】
本発明の第二の態様は、遺伝子型ＭＡＴ−ａ、ａｄｅ２−１、ｔｒｐ１−１、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｈｉｓ３−１１、ｈｉｓ３−１５、ｕｒａ３−１、ｃａｎ１−１００を有し、かつガラクトース誘導性プロモーターの制御下で機能的Ｂａｘポリペプチドをコードし、かつＬＥＵ２染色体遺伝子座における組み込みに適したポリヌクレオチドを含むプラスミドを組み込んだ酵母を含有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母細胞を提供する。
【００４９】
「ＬＥＵ２染色体遺伝子座における組み込みに適した」とは、我々は、ＬＥＵ２遺伝子座における標的化組み込みのためにプラスミドが設計され、構築されていることを意味する。
【００５０】
好ましくは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母細胞は（Ｗ３０３−１ＡおよびＷ３０３ａとしても知られる）Ｗ３０３  ＭＡＴａである。Ｗ３０３は周知の酵母株である。この株は、Ｗ３０１−１８Ａ（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，１９８３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２０２−２１１）をＨＯ−含有プラスミドで形質転換することによってジプロイドとした。前記ジプロイドを切り出して、同系ＭＡＴａ（Ｗ３０３−１Ａ）およびＭＡＴα（Ｗ３０３−１Ｂ）株を得た（Ｔｈｏｍａｓ  ＆  Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，１９８９，Ｃｅｌｌ  ５６：  ６１９−６３０）。
【００５１】
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｓｔｒａｉｎｔａｂｌｅ．ｓｈｔｍｌ＃Ｗ３０３に記載されているように、Ｗ３０３は以下の遺伝子型、ｌｅｕ２−３，１１２；ｔｒｐ１−１；ｃａｎ１−１００；ｕｒａ３−１；ａｄｅ２−１；ｈｉｓ３−１１，１５；［ｐｈｉ＋］を有する。Ｗ３０３−１Ａは、Ｙｂｐ１ｐ機能をなくし、酸化的ストレスに対する感受性を増大させるｙｂｐ１−１突然変異（Ｉ７Ｌ、Ｆ３２８Ｖ、Ｋ３４３Ｅ、Ｎ５７１Ｄ）を保有する（Ｖｅａｌ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。Ｗ３０３は、ハプロイドを軸および二極発芽パターンの混合物にて発芽させるｂｕｄ４突然変異も含有する（Ｖｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。加えて、元のＷ３０３株はｒａｄ５−５３５対立遺伝子を含有する（位置５３５においてＧからＲへ変化；Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４２：７４９参照）。Ｂｕｄ４およびＲａｄ５は細胞分裂周期関連遺伝子である。
【００５２】
Ｗ３０３についてのより詳細な情報は、参照により本明細書にその全体が組み込まれる、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ／Ｗ３０３．ｈｔｍｌで入手可能である。
【００５３】
機能的ヒトＢａｘポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３（図６１）にリストされる。他の適当な機能的Ｂａｘポリペプチドは当分野で周知であり、ＧＢ  ２  ３２６  ４１３、Ｇｒｅｅｎｈａｌｆ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）、  Ｍａｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）、  Ｌｉｇｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）およびＸｕ  ＆  Ｒｅｅｄ（１９９８），ｓｕｐｒａに記載されたものを含む。
【００５４】
機能的ＢａｘポリペプチドはヒトＢａｘ配列、またはプロアポトーシス断片またはその変種であり得る。ＢａｘはＢＣＬ２関連Ｘタンパク質としても知られている。
【００５５】
「機能的」Ｂａｘポリペプチドとは、我々が、以下に記載された実験条件下で酵母細胞において細胞死滅を誘導する能力を有するポリペプチドを意味する。適当な酵母細胞はＷ３０３細胞を含む。
【００５６】
もし機能的Ｂａｘポリペプチドが、以下に記載された条件下で哺乳動物細胞において細胞死滅をやはり誘導できるならば、好ましい。適当な哺乳動物細胞はＨＥＫ２９３、ＣＯＳ−１およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞である。酵母における観察は、広い数の哺乳動物系において確認することができる；ＨＥＫ２９３細胞を選択した。なぜならば、それらはニューロンの特徴を有すると主張されているからである。
【００５７】
「機能的Ｂａｘポリペプチド」とは、我々は、ヒトＢａｘ遺伝子の遺伝子産物、およびその天然に生じる変種を含む。最長イソ形態（β）をコードする、ヒトＢａｘβ転写変種のｍＲＮＡ配列は、受入番号ＮＭ＿００４３２４に見出すことができ、イソ形態βの対応するポリペプチド配列は受入番号ＮＰ＿００４３１５に見出すことができる。
【００５８】
ヒトＢａｘα転写変種は、変種βと比較した場合に区別される３’コーディング領域および３’ＵＴＲを含有する。それは、イソ形態βと比較して、より短くかつ異なるＣ末端を有するイソ形態（α）をコードする。αイソ形態をコードするα変種のｍＲＮＡ配列は、受入番号ＮＭ＿１３８７６１で見出すことができ、αイソ形態の対応するポリペプチド配列は受入番号ＮＰ＿６２０１１６に見出すことができる。ヒトＢａｘイソ形態αはイソ形態ｐｓｉに非常に似ている。
【００５９】
もし機能的Ｂａｘポリペプチドが、ほとんどの細胞に存在することが知られているαイソ形態であれば、好ましい。Ｂａｘα形態は、βおよびΔ形態よりも細胞を殺傷することにおいてより効果的である。
【００６０】
ヒトＢａｘγ転写変種は、変種βと比較した場合に、翻訳フレームシフトに導くコーディング領域内のセグメントを欠如する。得られたγイソ形態は、イソ形態βと比較して、より短くかつ区別されるＣ末端を有する。γイソ形態をコードするγ変種のｍＲＮＡ配列は受入番号ＮＭ＿１３８７６２に見出すことができ、イソ形態γの対応するポリペプチド配列は受入番号ＮＰ＿６２０１１７に見出すことができる。
【００６１】
ヒトＢａｘ  ｄａｌｔａ転写変種は、変種βと比較した場合に、コーディング領域内にセグメントを欠如し、かつ区別される３’コーディング領域および３’ＵＴＲを含有する。翻訳はインフレームのままであり、その結果、内部セグメントを失ったイソ形態（Δ）をもたらし、イソ形態βと比較した場合に、より短くかつ異なるＣ末端を有する。Δイソ形態をコードするΔ変種のｍＲＮＡ配列は受入番号ＮＭ＿１３８７６３に見出すことができ、イソ形態Δの対応するポリペプチド配列は受入番号ＮＰ＿６２０１１８に見出すことができる。
【００６２】
ヒトＢａｘ  ｅｐｓｉｌｏｎ転写変種はコーディング領域内に過剰のセグメントを含有し、変種βと比較した場合に、区別される３’コーディング領域および３’ＵＴＲを有する。過剰なセグメントは翻訳フレームシフトを引き起こし、このようにして、イソ形態βと比較して、より短くかつ区別されるＣ末端を有するイソ形態（ｅｐｓｉｌｏｎ）をもたらす。ｅｐｓｉｌｏｎイソ形態をコードするｅｐｓｉｌｏｎ変種のｍＲＮＡ配列は受入番号ＮＭ＿１３８７６４に見出すことができ、イソ形態ｅｐｓｉｌｏｎの対応するポリペプチド配列は受入番号ＮＰ＿６２０１１９に見出すことができる。
【００６３】
ヒトＢａｘ  Σ転写変種は、変種βと比較した場合、区別される３’コーディング領域および３’ＵＴＲを含有する。それは、イソ形態βと比較して、より短くかつ異なるＣ末端を有するイソ形態（Σ）をコードする。Σイソ形態をコードするΣ変種のｍＲＮＡ配列は受入番号ＮＭ＿１３８７６５に見出すことができ、イソ形態Σの対応するポリペプチド配列は受入番号ＮＰ＿６２０１２０に見出すことができる。
【００６４】
機能的Ｂａｘをコードするポリヌクレオチドは、典型的には、組換えＤＮＡ技術によって作成される。核酸のクローニング、操作、修飾および発現、および発現されたタンパク質の精製のための適当な技術は当分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（２００１）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（ｅｄｓ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されている。
【００６５】
機能的Ｂａｘポリペプチドは全長ポリペプチドである必要はなく、また、それが野生型Ｂａｘのプロアポトーシス活性の少なくともいくつかを保有する限りは、それは野生型Ｂａｘポリペプチドに対して同一の配列を有する必要はなく、すなわち、機能的Ｂａｘポリペプチドは、後に記載する条件下で、アポトーシス細胞死滅を刺激し、または細胞成長をブロックする野生型Ｂａｘの能力の少なくともいくつかを保有しなければならない。
【００６６】
このようにして、機能的Ｂａｘポリペプチドは、野生型Ｂａｘのプロアポトーシス活性の少なくともいくつかを保有する全長Ｂａｘポリペプチドの誘導体を含むことができる。適当な誘導体は、野生型Ｂａｘのプロアポトーシス活性の少なくともいくつかを保有する、全長Ｂａｘポリペプチドの変種または断片、または全長ポリペプチドの変種または断片を含む。
【００６７】
ヒトＢａｘの「断片」とは、我々は、アポトーシス細胞死滅を刺激するポリペプチドの任意の部分を意味する。これは、好ましくは、Ｗ３０３細胞でテストする場合に、本明細書中に記載した方法を用いることについてテストすることができる。典型的には、前記断片は（図６１にリストした）配列番号３の機能的Ｂａｘポリペプチドのアポトーシス活性の少なくとも３０％を有する。もし前記断片が配列番号３の機能的Ｂａｘポリペプチドのアポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、断片は配列番号３の機能的Ｂａｘポリペプチドのアポトーシス活性の１００％以上を有する。
【００６８】
全長Ｂａｘの、またはその断片の変種は、１以上の位置における、保存的または非保存的な、アミノ酸の挿入、欠失および置換を含む。「保存的置換」とは、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒのような意図された組合せである。このような修飾は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ  ２００１，ｓｕｐｒａに記載されたように、プロテインエンジニアリングおよび部位特異的突然変異誘発の方法を用いて作成することができる。好ましくは、変種Ｂａｘまたは変種Ｂａｘ断片は、全長ヒトＢａｘまたは各Ｂａｘ断片と少なくとも９０％配列同一性を保有する。より好ましくは、変種Ｂａｘまたは変種Ｂａｘ断片は、全長Ｂａｘ、または各Ｂａｘ断片に対して、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％または９５％配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する。好ましくは、変種Ｂａｘまたは変種Ｂａｘ断片は、配列番号３の機能的Ｂａｘポリペプチドのプロアポトーシス活性の少なくとも３０％を保有する。もし変種Ｂａｘまたは変種Ｂａｘ断片が、配列番号３の機能的Ｂａｘポリペプチドのプロアポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも９０％を有するのがより好ましい。最も好ましくは、変種Ｂａｘまたは変種Ｂａｘ断片は、（図６１にリストされた）配列番号３の機能的Ｂａｘポリペプチドのプロアポトーシス活性の１００％以上を有する。
【００６９】
ヒト以外の哺乳動物種からの機能的Ｂａｘポリヌクレオチドおよびポリペプチドを本発明で使用することができ、全長Ｂａｘポリペプチドの断片または変種への言及はそれに従って解釈されるべきであると認められる。
【００７０】
好ましくは、機能的Ｂａｘポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンは、当分野で周知のように酵母に最適化されている（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ  ＆  Ｈａｌｌ，１９８２）。配列番号２は、酵母について最適化されたコドンを持つ機能的Ｂａｘポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの例であり、それがコードする機能的Ｂａｘポリペプチドは配列番号３に示される（双方の配列を図６１にリストする）。
【００７１】
ガラクトース誘導性プロモーターはＧＡＬ１またはＧＡＬ１０プロモーターであり得る（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，１９８７）。
【００７２】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母細胞における機能的Ｂａｘポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ＳＵＣ２転写ターミネーター配列によって停止されるのが好ましい（Ｒｅｅｄｅｒ  ＆  Ｌａｎｇ，１９９４）。他の適当な転写ターミネーターは当分野で公知であって、ＰＨＯ５およびＡＤＨ１を含む。
【００７３】
本発明の目的では、ガラクトースの存在下でのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母細胞での機能的Ｂａｘポリペプチドの発現の結果、好ましくは、細胞の死滅がもたらされる。しかしながら、小酵母細胞では、機能的Ｂａｘポリペプチドの発現の結果、細胞の死滅ではなく成長の阻害がもたらされる。
【００７４】
本発明の好ましい実施形態において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母細胞は、後に記載するような株Ｗ３０３ｂａｘｌｅｕである。Ｗ３０３  ＭＡＲ−ａ株はＷ３０３ｂａｘｌｅｕの生産で用いられた。Ｗ３０３  ＭＡＴ−ａ（Ｗ３０３−１Ａ）はＯｐｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓからカタログ番号ＹＳＣ  １０５８として入手可能である。
【００７５】
以下に詳細に議論するように、機能的Ｂａｘポリペプチドが本発明の第一または第二の態様のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母細胞においてガラクトースの存在下で発現される場合、機能的Ｂａｘポリペプチドのアポトーシス効果は、細胞の実質的に全てを成長阻止し、殺傷するのに十分なものである。従って、これらの酵母細胞はＢａｘ媒介アポトーシスの阻害剤についてスクリーニングする方法で特に有用である。なぜならば、酵母株は例外的に低いレベルのバックグラウンド、すなわち、偽陽性を有するからである（図５３参照）。そのようなスクリーニング方法において、複数のポリヌクレオチド、典型的にはｃＤＮＡライブラリーを酵母細胞に導入し、ポリヌクレオチドの発現を誘導する。アポトーシスの推定阻害剤を含有する細胞のみが成長を示し、成長を示す各細胞はアポトーシスの推定阻害剤を含有する。ガラクトースの存在下で、ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターによって媒介される転写をダウンレギュレートするタンパク質を含有する細胞は偽陽性である。他の可能な偽陽性は、（ありそうもない）ＢＡＸの自然発生「非致死的」突然変異体を含有する細胞、および細胞をＢａｘ致死的効果に対して耐性とする特異的遺伝子において突然変異を含有する細胞を含む（例えば、酵母ＵＴＨ１遺伝子における突然変異は酵母においてＢａｘ効果をなくす）。
【００７６】
このようにして、本発明は、本発明の第一または第二の態様の酵母細胞、およびＢａｘ媒介アポトーシスの阻害剤についてのスクリーニングの方法を実行するのに有用な他の成分を含むパーツのキットを提供する。
【００７７】
典型的には、パーツのキットは、ポリヌクレオチドのライブラリーを酵母細胞に形質転換するのに適した酵母プラスミドベクターを含む。好ましくは、酵母プラスミドベクターは、誘導性プロモーターの制御下にあるライブラリーからのポリヌクレオチドを発現するのに適している。適当な酵母プラスミドベクターは、ｐＹＥＳ２（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む。当分野で知られたいずれの２−ミクロン（多数コピー）または動原体（単一コピー）酵母シャトルベクターも使用することができると認められる。
【００７８】
前記キットは、さらに、酵母細胞におけるライブラリーからのポリヌクレオチドの発現を誘導する薬剤を含み得る。多くの適当な誘導性プロモーター、およびそれらの対応するインデューサーは、酵母遺伝学の分野において公知である。例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーター、メチオニン誘導性プロモーター、およびガラクトース誘導性プロモーターは、全て、当分野で周知である。他の適当なプロモーターは（グルコースが消費しつくされ、エタノールが作成された場合に誘導された、グルコースにおいて抑制された）ＡＤＨ２アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、および（Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋の存在下で誘導された）ＣＵＰ１メタロチオネインプロモーターを含む。
【００７９】
もし酵母細胞においてポリヌクレオチドの発現を誘導する薬剤がガラクトースであれば、好ましい。いずれにせよ、キットにガラクトースを含むのは有用であり得る。なぜならば、それは機能的Ｂａｘポリペプチドの発現を誘導する必要があるからである。
【００８０】
キットは、さらに、Ｂａｘ媒介アポトーシスの阻害剤についての、典型的には、ｃＤＮＡライブラリーであるポリヌクレオチドのライブラリーをスクリーニングする方法を形成するための指示書を含むことができる。
【００８１】
実施例において後に記載するように、発明者は、本発明の第一の態様において定義されたように酵母細胞を用いて、Ｂａｘ媒介アポトーシスの阻害剤についてスクリーニングした。酵母における機能的Ｂａｘポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、グルコースの存在下ではオフであるが、ガラクトースの存在下ではオンであるガラクトース誘導性プロモーターの制御下にある。このようにして、機能的Ｂａｘポリペプチドはガラクトースの存在下で発現されるにすぎず、ガラクトースの存在下で全ての酵母細胞を殺傷する。このスクリーニング方法のための対照として、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬと機能的Ｂａｘポリペプチドとの共発現は、唯一の炭素源としてのガラクトースを含有する媒体中でＢａｘ誘導細胞死滅を妨げることが示された。ガラクトースは呼吸器系（すなわち、ミトコンドリア媒介）成長を可能とし、他方、グルコースは発酵および呼吸器系成長を共に可能にする。従って、このスクリーニングにおいてＢａｘ媒介死滅を救済する同定された遺伝子／タンパク質は、ミトコンドリアを介する死滅をなくすものである。換言すれば、これらの同定された遺伝子／タンパク質は、ミトコンドリア機能を保護すると考えられる。
【００８２】
ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーを酵母発現ベクターにおいて増幅して、１．２ｘ１０６の個々のクローンが得られ、組込まれたＢａｘ発現カセットを含有し、かつ「バックグラウンド」を与えないＷ３０３ｂａｘｌｅｕ酵母細胞に形質転換した（図５３参照）。形質転換体は、唯一の炭素源としてのガラクトースを含有するプレートにおいて直接的にスクリーニングして、グルコースにおける成長を回避し、次いで、レプリカ平板培養した。（レプリカ平板培養は重要である。なぜならば、ガラクトース上で直接的に成長する細胞は、注目するプラスミド担持抗アポトーシス遺伝子を含有すべきものであるからである）。３．８ｘ１０１０の個々の酵母形質転換体をスクリーニングした（対照実験においてグルコースプレート上で得られた形質転換体に基づいて計算して、各形質転換から得られた細胞の数を決定した）。プラスミドは、ガラクトース中で、すなわち機能的Ｂａｘポリペプチドの存在下で、成長する細胞から単離した。生成されたプラスミドをＢａｘ含有酵母細胞に形質転換し、細胞死滅の予防のために再度チェックした。酵母におけるＢａｘ媒介細胞死滅を明確に妨げ、かつ注目する抗アポトーシスポリヌクレオチドを担うプラスミドのポリヌクレオチドインサートを配列決定した。
【００８３】
実施例において記載するように、ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーについてのこのスクリーニング方法の実行の結果、酵母においてＢａｘ媒介アポトーシスおよび細胞死滅をなくす（遺伝子または部分的遺伝子に対応する）１６のポリヌクレオチドの同定をもたらした。このようにして同定された１６のポリヌクレオチドのうち、１つは、アポトーシスの公知の阻害剤であるＢｃｌ−２のホモログであるＢｃｌ−２Ａ１であった。スクリーニング方法の結果としてのＢｃ１−２Ａ１の同定は、前記方法が、Ｂａｘ媒介アポトーシスの阻害剤であり、あるいはそれをコードするポリヌクレオチドについてスクリーニングするのにかなり安定であって、効果的である明瞭な原理の証拠である。
【００８４】
このようにして、本発明の第四の態様は、
（ａ）酵母プラスミドベクター中のポリヌクレオチドのライブラリーを提供し；
（ｂ）本発明の第一または第二の態様において定義された酵母細胞へポリヌクレオチドのライブラリーを形質転換し；
（ｃ）酵母プラスミドベクター中の機能的Ｂａｘポリペプチドの、およびポリヌクレオチドの発現を可能とする条件下で形質転換酵母を平板培養し；および
（ｄ）工程（ｃ）の条件下で成長する１以上の酵母コロニーを同定する；
ことを含み、
酵母コロニーの成長は、酵母プラスミドベクター中のポリヌクレオチドがＢａｘ媒介アポトーシスの阻害剤であり、またはそれをコードする方法であって、Ｂａｘ媒介アポトーシスの阻害剤であり、またはそれをコードするポリヌクレオチドについてのスクリーニング方法を提供する。
【００８５】
好ましくは、ポリヌクレオチドのライブラリーは、ヒト脳組織、糖尿病に関与する組織または細胞、関節リウマチに関与する、または細胞系からの組織のような源から生じ得るｃＤＮＡライブラリーである。ｃＤＮＡライブラリーは癌組織、心臓組織、筋肉組織、またはウイルスまたは細菌ゲノムからも作成することができる。
【００８６】
典型的には、酵母プラスミドベクターにおけるポリヌクレオチドのライブラリーは誘導性プロモーターの制御下にある。適当には、誘導性プロモーターはテトラサイクリン誘導性プロモーター、メチオニン誘導性プロモーター、ガラクトース誘導性プロモーター、（グルコースが消費しつくされ、エタノールが作成される場合に誘導されたグルコースが抑制される）ＡＤＨ２アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、または（Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋の存在下で誘導された）ＣＵＰ１メタロチオネインプロモーターであり得る。典型的には、ガラクトース誘導性プロモーターはＧＡＬ１またはＧＡＬ１０である。
【００８７】
多くの適当な酵母プラスミドベクターは当分野で知られており、ｐＹＥＳ２（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、および当分野で知られた他の２−ミクロン（多コピー）または動原体（単一コピー）酵母シャトルベクターを含む。
【００８８】
もし形質転換工程（ｂ）が高効率形質転換であれば、好ましい。
【００８９】
典型的には、平板培養工程（ｃ）が、唯一の炭素源としてのガラクトースと共に、公知の標準酵母成長媒体の１つにおいて３０℃にて少なくとも７２時間、おそらくは７日まで、平板培養した酵母細胞をインキュベートすることを含む。明らかに、もし酵母プラスミドベクター中のポリヌクレオチドが、ガラクトース以外の薬剤によって誘導性であるプロモーターの制御下にあれば、その誘導剤も含まれる。
【００９０】
代替実施形態において、Ｂａｘポリペプチドは、例えば、（機能的ミトコンドリア無しで成長する）小体において細胞成長のＢａｘ媒介ブロックをなくすタンパク質についてスクリーニングするために、ＧＡＬプロモーターよりはむしろＡＤＨ２プロモーターの制御下とできる。
【００９１】
酵母遺伝学の分野における当業者に直ちに明らかなように、前記方法は、さらに、以下の工程、
（ｅ）工程（ｄ）で同定された酵母コロニーから酵母細胞を単離し；
（ｆ）工程（ｂ）で同定された酵母コロニーから、あるいは工程（ｅ）で単離された酵母細胞から酵母プラスミドベクターを単離し、および、
（ｇ）工程（ｆ）で単離された酵母プラスミドベクターからポリヌクレオチド（すなわち、インサート）を配列決定する；
の１以上、典型的には、全ての３つを含むことができる。
【００９２】
実施例にて後に記載するように、前記方法は、典型的には、さらに、
（ｈ）工程（ｄ）で同定された酵母コロニーに存在するプラスミドベクターからのポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドを、アポトーシスのモデルにおいてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力について再テストする；
工程を含む。
【００９３】
加えて、または別法として、前記方法は、さらに、
（ｉ）工程（ｄ）において同定された酵母コロニーに存在するプラスミドベクターからのポリヌクレオチドを修飾し、次いで、修飾されたポリヌクレオチド、または前記修飾されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、アポトーシスのモデルにおいてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力についてテストする；
工程を含むことができる。
【００９４】
さらに、前記方法は、
（ｊ）工程（ｇ）で得られた配列データに基づいて、工程（ｄ）において同定された酵母コロニーからのポリヌクレオチドを同定し、次いで、同定されたポリヌクレオチドに対応するポリヌクレオチド、または前記対応するポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドを、アポトーシスのモデルにおいてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力についてテストする；
工程も含むことができる。
【００９５】
工程（ｄ）において同定された酵母コロニーから得られたポリヌクレオチドは、同定されたポリヌクレオチド「に対応する」ポリヌクレオチドによって、全長の天然に生じるポリペプチドをコードできないので、我々は、全長の天然に生じるポリペプチドをコードする同定されたポリヌクレオチドの全長バージョンを含む。また、同定されたポリヌクレオチドに対応する遺伝子は、同定されたポリヌクレオチド「に対応する」ポリヌクレオチドによって、いくつかのポリペプチドイソ形態をコードできるので、我々は、天然に生じるポリペプチドの異なるイソ形態をコードするポリヌクレオチドを含む。加えて、同定されたポリヌクレオチドは天然に生じるポリヌクレオチド配列からの配列の差を保有できるので、典型的には、もしｃＤＮＡライブラリーが、同定されたポリヌクレオチド「に対応する」ポリヌクレオチドによって細胞系から得られたならば、我々は天然に生じるポリヌクレオチドを含む。さらに、ポリヌクレオチドは、同定されたポリヌクレオチド「に対応する」ポリヌクレオチドによって、非ヒトｃＤＮＡライブラリーから単離できるので、我々は、もう１つの種からの同定されたポリヌクレオチドのホモログ、好ましくは、ヒトホモログを含む。
【００９６】
アポトーシスの適当なモデルは酵母細胞モデル、哺乳動物細胞モデル、およびアポトーシスのインビボモデルを含む。ポリヌクレオチドが細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有するか否かをテストするための酵母細胞モデルは、ＷＴ３０３ｂａｘｌｅｕのような本発明の第一に態様において上述したものであり得る。ポリヌクレオチドが細胞においてＢａｘ媒介アポオトーシスを阻害する能力を有するか否かをテストするための哺乳動物細胞モデルは、ほとんどいずれかの哺乳動物細胞または細胞系であり得る。実施例において、後に記載するように、ＨＥＫ２９３細胞系を選択した。なぜならば、海馬ｃＤＮＡライブラリーから同定された抗アポトーシス遺伝子はニューロン細胞において効果的であると予測され、ＨＥＫ２９３はいくつかのニューロン特徴を有すると示唆されるからである（少なくとも、それは用いるのが困難な典型的なニューロン細胞の置換としてルーチン的に用いられる）。
【００９７】
例えば、細胞を、インジケーター分子をコードするレポーター遺伝子を担うインジケータープラスミドでトランスフェクトすることができ、細胞死滅またはアポトーシスの程度は発現されたインジケーター分子の検出によって測定することができる。例えば、インジケーターＥ．ｃｏｌｉ  βガラクトシダーゼを発現するインジケータープラスミドでトランスフェクトされた細胞におけるアポトーシスの程度は、製造業者の推奨に従って、βガラクトシダーゼＥＬＩＳＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）によって決定することができる。また、アポトーシス活性の程度は、顕微鏡下で、それをＸ−ｇａｌで染色した後に、βガラクトシダーゼを発現する青色細胞を視覚的にスコア取りすることによって決定することができる。もう１つの例として、緑色蛍光タンパク質を発現するインジケータープラスミドでトランスフェクトされた細胞におけるアポトーシスの程度は、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）または蛍光顕微鏡を用い、全細胞集団における蛍光細胞の画分を測定することによって決定することができる。
【００９８】
また、アポトーシスを示すＤＮＡ分解は、細胞をＣＨＸの存在下で抗Ｆａｓ抗体に暴露することによって調べることができる。その後、細胞におけるＤＮＡを抽出し、標準プロトコルを用いて精製する。後に記載する、またはＳｅｌｌｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）；Ｔｅｌｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）；およびＰｏｉｒｉｅｒ，Ｅｄ．（１９９７）Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｇｕｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡに記載されたもののような、細胞死滅またはアポトーシスを検出するいずれの方法も用いることができる。
【００９９】
アポトーシスの時間コースは、例えば、ＦＩＴＣ標識アネキシンＶで、および／またはヨウ化プロピジウムを用いる染料排除テストによって検出されるような、細胞表面のホスファチジルセリンの発現のレベルを測定することによって分析することができる。これらの２つのテストは、商業的に入手可能なキット、例えば、製造業者の推奨に従い、かつフローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）または蛍光顕微鏡を用いるＡｐｏＡｌｅｒｔアネキシンＶアポトーシスキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて行うことができる。
【０１００】
神経変性におけるアポトーシスのインビボモデルとして、（ＰＤまたはＡＤをもたらす）化学物質を用いて、マウスまたはラット脳においてアポトーシスを誘導する。癌におけるアポトーシスのインビボモデルとしては、腫瘍形成をもたらす腫瘍細胞を注入し、次いで、いずれかの薬剤がアポトーシス（すなわち、腫瘍の収縮）を誘導するかを決定する。
【０１０１】
当業者によって認識されるように、前記方法は、さらに、アポトーシスのインビボモデルにおいてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを、医薬的に許容される組成物に処方する工程を含むことができる。
本明細書に記載したように、Ｂａｘ媒介アポトーシスの阻害剤であり、またはそれをコードするポリヌクレオチドについてスクリーニングする上記方法を、ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーで行った。アポトーシスの酵母系においてＢａｘ媒介細胞死滅をなくす（遺伝子または部分遺伝子に対応する）１６のポリヌクレオチドを同定し、表１にリストする。
【０１０２】
【表１】
2009526541.tif 000003
【０１０３】
Ｂｃｌ−２Ａ１、ＳＮＣＡ、ＦＫＢＰ２（ＦＫＢＰ−１３）、ＥＥＦ１Ａ１、およびＶＡＭＰ３をアポトーシスの哺乳動物系においてテストし、各々はＢａｘ媒介アポトーシスの阻害剤としての活性を有すると確認された。Ｂｃｌ−２Ａ１は、従前に、アポトーシスの阻害剤であると報告されている。従って、前記スクリーニング方法の結果として同定された他の１１のポリヌクレオチドもまた、哺乳動物においてＢａｘ媒介アポトーシスの阻害剤である、またはそれをコードすると結論付けるのは合理的である。
【０１０４】
このようにして、本発明の第五の態様は、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスに対抗する方法を提供し、前記方法はＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチド、またはこれらのポリペプチドのいずれかの抗アポトーシスの誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体のいずれかをコードするポリヌクレオチドを細胞に投与することを含む。
【０１０５】
典型的には、前記方法はインビトロで行われる。
【０１０６】
典型的には、前記細胞はヒト細胞のような哺乳動物細胞であるが、実施例から明らかなように、前記細胞は酵母のような他の種からのものであってよい。前記細胞は樹立された細胞系、一次細胞培養、またはエクスビボにて組織に存在する細胞からのものであってよい。
【０１０７】
別法として、前記方法はインビボで行ってもよい。
【０１０８】
前記ポリペプチド、前記その抗アポトーシス誘導体、および前記ポリペプチドまたは誘導体のいずれかをコードするポリヌクレオチドは、アポトーシスの実験における研究ツールとしての明瞭な利用性を有する。また、それらは、後に記載するように、アポトーシスを変調するさらなる治療剤についてスクリーニングする方法において利用性を有する。
【０１０９】
本発明の第六の態様は、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスに対抗するための医薬の調製における、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチド、またはこれらのポリペプチドのいずれかの抗アポトーシス誘導体、または前記ポリプチドまたは誘導体のいずれかをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
【０１１０】
「細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスに対抗する」とは、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害し、または妨げることを意味する。
【０１１１】
第五の態様のポリペプチド、誘導体およびポリヌクレオチド、および本発明の第六の態様の医薬は、ミトコンドリア機能不全が起こるいずれのアポトーシスに対抗するのにも適していると認められる。なぜなら、Ｂａｘのアポトーシス効果は他のタンパク質によって、または外因性／内因性化学物質によって模倣することができるからである。例えば、スタウロスパウリンはＢａｘの効果を模倣することが知られている。このようにして、本発明の第五の態様のポリペプチド、誘導体およびポリヌクレオチド、および第六の態様の医薬は、スタウロスパウリン誘導細胞死滅に対抗するのに適し得る。
【０１１２】
任意の所与のポリペプチドの「誘導体」は、タンパク質化学技術を用い、例えば、部分的タンパク質分解（外部分解または内部分解のいずれか）を用い、またはデ・ノボ合成によって作成することができる。別法として、誘導体は組換えＤＮＡ技術によって作成することができる。核酸のクローニング、操作、修飾および発現、および発現されたタンパク質の精製のための適当な技術は当分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（２００１）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（ｅｄｓ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されている。
【０１１３】
これらのポリペプチドの適当な「抗アポトーシス誘導体」は、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有する、その断片、および全長ポリペプチドの修飾、またはその断片を含む。
【０１１４】
所与のポリペプチドの「修飾」とは、我々は、１以上の位置における保存的または非保存的なアミノ酸の挿入、欠失および置換を含む。そのような修飾は所与のポリペプチドのアナログと呼ぶことができる。「保存的置換」とは、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒのような組合せを意図する。そのような修飾は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ  ２００１，ｓｕｐｒａに記載されているように、タンパク質エンジニアリングおよび部位特異的突然変異誘発の方法を用いて作成することができる。
【０１１５】
所与のポリペプチドのさらなる修飾は、タンパク質の細胞への進入を可能とするＮＨ２またはＣＯＯＨ末端タグの付加を含む。
【０１１６】
海馬は、神経変性病においてアポトーシスに罹っていることが知られている脳の領域である。抗アポトーシスポリヌクレオチドはヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーから同定されたので、同定された抗アポトーシスポリヌクレオチド、またはそれらがコードする抗アポトーシスポリペプチドの各々は、神経変性病に対抗するにおいて利用性を有することができると結論付けるのも合理的である。
【０１１７】
このようにして、本発明の第七の態様は、医療で用いるための、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチド、またはこれらのポリペプチドのいずれかの抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体のいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０１１８】
本発明の第八の態様は、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチド、またはこれらのポリペプチドのいずれかの抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体のいずれかをコードするポリヌクレオチド、および医薬的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【０１１９】
加えて、多数の他の病気または疾患が、心血管病における心血管細胞（Ｒｅｅｖｅ  ｅｔ  ａｌ，２００５）、関節リウマチにおける滑膜細胞（Ｂａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００３）、および糖尿病における膵臓Ｂ細胞（Ｃｎｏｐ  ｅｔ  ａｌ，２００５；Ｍｉｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ，２００５）のような細胞または組織における不適切なＢａｘ媒介アポトーシスと関連付けられる。
【０１２０】
このようにして、本発明の第九の態様は、神経変性病または疾患、心血管病、関節リウマチおよび糖尿病から選択される患者において病気または疾患に対抗する方法を提供し、前記方法は、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチド、またはこれらのポリペプチドのいずれかの抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体のいずれかをコードするポリヌクレオチドを患者に投与することを含む。
【０１２１】
心血管病は世界中で死亡の主たる原因である。心筋細胞の機能の喪失または死滅は、世界中の死亡の主な原因である心血管病に対する主要な寄与因子である。心不全および心筋梗塞のような疾患における細胞の死滅はアポトーシスに関連付けられる。アポトーシス経路は非心筋細胞においてよく研究されており、同様な経路が心筋細胞に存在すると考えられる。これらの経路は、膜結合死滅受容体の連結、ミトコンドリアからのプロアポトーシス因子の放出、または小胞体におけるストレスによって開始される死滅を含む。アポトーシスの鍵となるレギュレーターはカスパーゼ（ＩＡＰ）の阻害剤、タンパク質のＢｃｌ−２ファミリー、成長因子、ストレスタンパク質、カルシウムおよびオキシダントを含む。アポトーシスシグナリングの高度に組織されたおよび予測される性質は、それが操作に使用できることを意味する。アポトーシスプロセスの徹底的な理解は、最も適した点における介入を容易とし、心筋の弱化および機能不全を軽減する（Ｒｅｅｖｅ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。
【０１２２】
患者において病気、障害または疾患に「対抗する」とは、我々は、その特定の傷害または疾患の兆候を治療し、予防し、または軽減することを意味する。
【０１２３】
本発明の治療方法および使用を用いて治療することができる神経変性病または障害は発作、脊髄外傷、頭部負傷、脊髄筋肉萎縮症（ＳＭＡ）、筋骨格萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む運動ニューロン疾患、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）およびハンチントン病（ＨＤ）を含む。
【０１２４】
このようにして、本発明の第十の態様は、神経変性病または疾患、心血管病、関節リウマチおよび糖尿病から選択される患者における病気または疾患に対抗するための医薬の調製における、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチドまたはこれらのポリペプチドのいずれかの抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体のいずれかをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
【０１２５】
ＦＫＢＰ２
【０１２６】
（ＦＫ５０６−結合タンパク質２およびＦＫＢＰ１３としても知られる）ＦＫＢＰ２は、免疫抑制薬物、ＦＫ５０６およびラパマイシンに結合するタンパク質のファミリーのメンバーである。ＦＫＢＰ２遺伝子は長さが３ｋｂであって、６つのエクソンを含有し、ヒト染色体１１ｑ１３．１−ｑ１３．３に位置する（ＤｉＬｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ，１９９２）。Ｐａｒｔａｌｅｄｉｓ  ＆  Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）は、ヒトＦＫＢＰ−１３と５７％配列同一性を有するヒトＦＫＢＰ−１３のホモログをコードするＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＫＢ２遺伝子を記載し、ＦＫＢ２／ＦＫＢ１３は小胞体（ＥＲ）におけるタンパク質トラフィッキングで役割を果たすことを示唆する。
【０１２７】
Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿４７６４３３によると、ＦＫＢ２遺伝子によってコードされたタンパク質が、免疫調節、ならびにタンパク質折り畳みおよびトラフィッキングに関係する塩基性細胞プロセスにおいて役割を果たすイムノフィリンタンパク質ファミリーのメンバーである。ＦＫＢ２でコードされたタンパク質は、免疫抑制剤ＦＫ５０６およびラパマイシンに結合するシス−トランスプロリルイソメラーゼである。それはＥＲシャペロンとして機能すると考えられ、また、膜細胞骨格の成分として作用することもできる。この遺伝子は、同一イソ形態をコードする２つの交互にスプライシングされる転写体変種を有する。多数のポリアデニル化部位がこの遺伝子について記載されているが、この遺伝子の全長性質は決定されていない。ＦＫＢＰ２は（ＮＰ＿４７６４３３において定義された）残基１ないし２１においてシグナルペプチドを有し、成熟ポリペプチドは残基２２ないし１４２にある。ＦＫＢＰ２はペプチジルプロリルイソメラーゼである（ＥＣ  ５．２．１．８）。
【０１２８】
発明者の知識の及ぶ限り、ＦＫＢＰ２はアポトーシスと関連付けられていない。
【０１２９】
このようにして、本発明は、ＦＫＢＰ２ポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを細胞に投与することによって細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスに対抗することを含む。
【０１３０】
同様に、発明者の知識の及ぶ限り、ＦＫＢＰ２はいずれの神経変性障害とも関連付けられていない。事実、Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（ＯＭＩＭ，Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｎｏ．１８６９４６）によると、ＦＫＢＰ２は、いずれの病気状態とも関連付けられておらず、かつ発明者が知る限り、ＦＫＢＰ２は治療的に用いられていない。
【０１３１】
このようにして、本発明は、医療において用いられる、ＦＫＢＰ２ポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１３２】
本発明は、ＦＫＢＰ２ポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドと誘導体をコードするポリヌクレオチドを患者に投与することによって患者において神経変性病に対抗することも含む。
【０１３３】
「ＦＫＢＰ２ポリペプチド」とは、我々は、その天然に生じる変種を含む、ヒトＦＫＢＰ２遺伝子の遺伝子産物の意味を含む。ヒトＦＫＢＰ２  ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０５７０９２（変種２）およびＮＭ＿００４４７０（変種１）に見出される。コーディング領域は双方の変種において同一であるが、転写体変種２は変種１と比較して５’ＵＴＲにおいて区別されるエクソンを有する。ヒトＦＫＢＰ２ポリペプチドはＧｅｌｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿４７６４３３に見出せるアミノ酸配列、およびその天然に生じる変種を含む。
ＦＫＢＰ２の適当な「抗アポトーシス誘導体」は、ＦＫＢＰ２の抗アポトーシス断片を含む。ＦＫＢＰ２の「抗アポトーシス断片」とは、我々は、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有するＦＫＢＰ２ポリペプチドの任意の部分を意味する。典型的には、断片は全長ヒトＦＫＢＰ２の抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を有する。もし概断片が全長ヒトＦＫＢＰ２の活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。より好ましくは、前記断片は全長ヒトＦＫＢＰ２の抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０１３４】
ＦＫＢＰ２の適当な「抗アポトーシス誘導体」は、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有する全長ＦＫＢＰ２、またはその断片の修飾も含む。好ましくは、修飾されたＦＫＢＰ２または修飾されたＦＫＢＰ２断片は、全長ＦＫＢＰ２、または各ＦＫＢＰ２断片に対して少なくとも８０％、または少なくとも８５％または少なくとも９０％配列同一性を保有する。より好ましくは、修飾されたＦＫＢＰ２または修飾されたＦＫＢＰ２断片は、全長ＦＫＢＰ２、または各ＦＫＢＰ２断片に対して少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％または少なくとも９９％配列同一性を有する。好ましくは、修飾されたＦＫＢＰ２または修飾されたＦＫＢＰ２断片は、全長ヒトＦＫＢＰ２の抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を保有する。もし修飾されたＦＫＢＰ２またはＦＫＢＰ２誘導体が全長ヒトＦＫＢＰ２の活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、修飾されたＦＫＢＰ２または修飾されたＦＫＢＰ２断片は、全長ヒトＦＫＢＰ２の抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０１３５】
ＦＫＢＰ２とは、我々は、他の種からのＦＫＢＰ２遺伝子からの相同遺伝子産物も含む。「相同遺伝子産物」とは、我々は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿４７６４３３におけるヒトＦＫＢＰ２アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＦＫＢＰ２ポリペプチドを含む。より好ましくは、相同遺伝子産物は、ヒトＦＫＢＰ２に対して少なくとも８５％または少なくとも９０％配列同一性を有するＦＫＢＰ２ポリペプチドを含む。なおより好ましくは、相同遺伝子産物は、ヒトＦＫＢＰ２に対して少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％配列同一性を有するＦＫＢＰ２ポリペプチドを含む。最も好ましくは、相同遺伝子産物はヒトＦＫＢＰ２アミノ酸配列に対して少なくとも９９％配列同一性を有するＦＫＢＰ２ポリペプチドを含む。ＦＫＢＰ２が非ヒト対象に投与される用途については、ＦＫＢＰ２は、好ましくは、前記対象と同一の種からのものであると認識される。もしＦＫＢＰ２がヒト対象に投与されるならば、ＦＫＢＰ２は好ましくはヒトＦＫＢＰ２、またはその抗アポトーシス断片または変種である。
【０１３６】
ヒトおよび酵母からのＦＫＢＰ２タンパク質の間にただ４７％の配列同一性（完全なマッチ）および６９％の配列相同性（保存された残基を許容する）があるが、ヒトＦＫＢＰ２は酵母細胞におけるＦＫＢＰ２突然変異の不活化を補充することができる（データは含まず）。
【０１３７】
ＦＫＢＰ２をコードするポリヌクレオチドとは、我々は、ヒトＦＫＢＰ２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡおよびその天然に生じる変種を含む。ヒトＦＫＢＰ２  ｍＲＮＡをコードするｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０５７０９２およびＮＭ＿００４４７０に見出される。また、我々は、遺伝子暗号の縮重によって、ＦＫＢＰ２ポリペプチドもコードする他の配列を含む。
【０１３８】
発明者によって最初に同定されたＦＫＢＰ２をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）は全長断片として同定された。この遺伝子はｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって再度クローン化し、タンパク質発現のためにＣ末端をタグ化した。
【０１３９】
ＦＫＢＰ２はペプチジルプロリルイソメラーゼ（ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼとしても知られる；（ＥＣ  ５．２．１．８）である。ペプチジルプロリルイソメラーゼの３つの区別されるファミリー：シクロフィリン、ＦＫＢＰ、およびＥ．ｃｏｌｉからのパルブリンを含むもう１つのファミリーがある。３つのファミリーは構造的に関連しておらず、各々、サイクロスポリンＡ、ＦＫ−５０６および５−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノンによって阻害されることによって区別することができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／ＥＣ５／２／１／８．ｈｔｍｌ）。
【０１４０】
いずれかの理論によって拘束されるつもりはないが、発明者は、ＦＫＢＰ２がペプチジルプロリルイソメラーゼ（ペプチジル−プロリル−シス−トランスイソメラーゼとしても知られる；ＥＣ  ５．２．１．８）であるので、そのペプチジルプロリルイソメラーゼ活性はその抗アポトーシス活性に寄与する可能性があると考える。このようにして、他のぺプチジルプロリルイソメラーゼ、および特に他のＦＫＰＢ、ならびにそれらをコードするポリヌクレオチドもまた、アポトーシスに対抗するのに有用である。これは、特に予期されない。なぜならば、シクロフィリンＤ、ペプチジルプロリルイソメラーゼの過剰発現が、アポトーシスプロセスを増強することが知られているからである（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２００４）。さらに、（イミュノフィリンとしても知られる）ペプチジルプロリルイソメラーゼの阻害は、神経変性の予防のための標的として用いられてきた。
【０１４１】
α−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）
【０１４２】
ＳＮＣＡは、βおよびγシヌクレインも含むシヌクレインファミリーのメンバーである。シヌクレインは脳において豊富に発現されており、αおよびβシヌクレインはホスホリパーゼＤ２を選択的に阻害する。ＳＮＣＡはプレシナプスシグナリングおよび膜トラフィッキングを統合するように働くことができる。ＳＮＣＡにおける欠陥は、パーキンソン病（ＰＤ）の病因と関連付けられている。ＳＮＣＡペプチドは、アルツハイマー病（ＡＤ）を持つ患者の脳におけるアミロイドプラークの主な成分である。ＳＮＣＡの２つの交互にスプライシングされた転写体は同定されている。
【０１４３】
発明者の知識の及ぶ限り、ＳＮＣＡは、これまで、Ｂａｘ媒介アポトーシスの阻害剤であることは知られていなかった。
【０１４４】
このようにして、本発明は、ＳＮＣＡポリペプチド、その抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを細胞に投与することによって、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスに対抗することを含む。
【０１４５】
同様に、ＳＮＣＡはＡＤおよびＰＤ双方（ＯＭＩＭ  参照番号１６３８９０）と関連付けられているが、発明者の知識の及ぶ限り、ＳＮＣＡポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを、患者において神経変性病に対抗するのに用いる従前の示唆はなかった。事実、発明者が知る限り、ＳＮＣＡは治療で用いられていない。
【０１４６】
このようにして、本発明は、医療で用いるための、ＳＮＣＡポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１４７】
また、本発明は、ＳＮＣＡポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを患者に投与することによって、患者において神経変性病に対抗することを含む。
【０１４８】
実施形態において、本発明は、ＳＮＣＡポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを患者に投与することによって、患者において、ＰＤのＡＤ以外の神経変性病に対抗することを含む。
【０１４９】
「ＳＮＣＡポリペプチド」とは、我々は、その天然に生じる変種を含む、ヒトＳＮＣＡ遺伝子の遺伝子産物の意味を含む。異なるタンパク質イソ形態をコードする２つの代替転写体変種が、ヒトＳＮＣＡ遺伝子について記載されている。ヒトＳＮＣＡ  ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００３４５（イソ形態ＮＡＣＰ１４０）において、およびＧｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００７３０８（イソ形態ＮＡＣＰ１１２）において見出される。ＮＡＣＰ１４０転写体は、長い転写体であって、より長いＮＡＣＰ１４０イソ形態（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０００３３６）をコードする。ＮＡＣＰ１１２転写体は、変種ＮＡＣＰ１４０と比較して代替インフレームのセグメントを欠如し、その結果、イソ形態ＮＡＣＰ１４０と比較して区別されるＣ末端を有するより短いタンパク質（イソ形態ＮＡＣＰ１１２；Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００９２９２）がもたらされる。ヒトＳＮＣＡポリペプチドのアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０００３３６およびＮＰ＿００９２９２に見出される配列およびその天然に生じる変種を含む。本明細書中で記載されたスクリーニング実験で同定されたＳＮＣＡ配列はＮＡＣＰ１４０変種からのものであった。
【０１５０】
ＳＮＣＡの適当な「抗アポトーシス誘導体」は、ＳＮＣＡの抗アポトーシス断片を含む。ＳＮＣＡの「抗アポトーシス断片」とは、我々は、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有するＳＮＣＡポリペプチドの任意の部分を意味する。典型的には、前記断片は、配列番号５のＳＮＣＡのポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を有する。もし前記断片が配列番号５のＳＮＣＡポリペプチドの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％の活性を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、前記断片は配列番号５のＳＮＣＡポリペプチドの抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０１５１】
ＳＮＣＡの適当な「抗アポトーシス誘導体」は、全長ＳＮＣＡ、または細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有するその断片の修飾も含む。好ましくは、修飾されたＳＮＣＡまたは修飾されたＳＮＣＡ断片は、全長ＳＮＣＡ、または各ＳＮＣＡ断片に対して少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％の配列同一性を保有する。より好ましくは、修飾されたＳＮＣＡまたは修飾されたＳＮＣＡ断片は、全長ＳＮＣＡ、または各ＳＮＣＡ断片に対して少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。好ましくは、修飾されたＳＮＣＡまたは修飾されたＳＮＣＡ断片は、全長ヒトＳＮＣＡの抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を保有する。もし修飾されたＳＮＣＡまたはＳＮＣＡ誘導体が、全長ヒトＳＮＣＡの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％の活性を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、修飾されたＳＮＣＡまたは修飾されたＳＮＣＡ断片は、全長ヒトＳＮＣＡの抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０１５２】
ＳＮＣＡとは、我々は、他の種からのＳＮＣＡ遺伝子からの相同遺伝子産物も含む。「相同遺伝子産物」とは、我々は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０００３３６およびＮＰ＿００９２９２におけるヒトＳＮＣＡアミノ酸配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するＳＮＣＡポリペプチドを含む。より好ましくは、相同遺伝子産物は、ヒトＳＮＣＡに対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％配列同一性を有するＳＮＣＡポリペプチドを含む。なおより好ましくは、相同遺伝子産物はヒトＳＮＣＡに対して少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％配列同一性を有するＳＮＣＡポリペプチドを含む。最も好ましくは、相同遺伝子産物は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０００３３６またはＮＰ＿００９２９２におけるヒトＳＮＣＡアミノ酸配列に対して少なくとも９９％配列同一性を有するＳＮＣＡポリペプチドを含む。ＳＮＣＡを非ヒト対象に投与する適用では、ＳＮＣＡは好ましくは前記対象と同一の種からのものであると認識される。もしＳＮＣＡがヒト対象に投与されれば、ＳＮＣＡは好ましくはヒトＳＮＣＡ、またはその抗アポトーシス断片または変種である。
【０１５３】
ＳＮＣＡをコードするポリヌクレオチドとは、我々は、ヒトＳＮＣＡポリペプチドをコードするｃＤＮＡおよびその天然に生じる変種を含む。ヒトＳＮＣＡ  ｍＲＮＡをコードするｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００３４５およびＮＭ＿００７３０８に見出される。また、我々は、遺伝子暗号の縮重によって、ＳＮＣＡポリペプチドもコードする他の配列も含む。ＳＮＣＡの抗アポトーシス断片をコードするポリヌクレオチドの例は配列番号５にリストされる。
【０１５４】
発明者によって最初に同定されたＳＮＣＡをコードするポリヌクレオチド（配列番号５）は、全長断片であると考えられ、前記インサートは、３’末端から配列決定され、読みにおける最後の数個のヌクレオチドはＮであった。全長転写体を、引き続いて、スクリーニングで用いる同一の海馬ｃＤＮＡライブラリーからのＰＣＲによってクローン化し、最初に単離されたクローンの、および全長ＰＣＲ断片のＢａｘ救済能力は同一であった。
【０１５５】
ＥＥＦＩＡ
【０１５６】
真核生物伸長因子１Ａ（以前はＥＦ１αとして知られる、ｅＥＦ１Ａ）はタンパク質合成における鍵となる因子であり、そこでは、それはリボソームのＡ部位へのアミノアシル化ｔＲＮＡの移動を促進する。ｅＥＦ１Ａ−１およびｅＥＦ１Ａ−２と命名されたｅＥＦ１Ａの２つの異なって発現されたイソ形態は哺乳動物で見出される。ヒトにおいては、ｅＥＦ１Ａ−１およびｅＥＦ１Ａ−２イソ形態は９２．６％配列同一性を有する（図６７参照）。
【０１５７】
ＮＰ＿００１３９３によると、ＥＥＦ１Ａ１遺伝子は、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素送達を担う伸長因子−１複合体のαサブユニットのイソ形態をコードする。このイソ形態（α１）は、脳、胎盤、肺、肝臓、腎臓および膵臓で発現され、他方、他のイソ形態（α２）は、脳、心臓および骨格筋で発現される。α１イソ形態は、フェルティー症候群をもつ患者の６６％において自己抗原として同定される。ｅＥＦ１Ａ遺伝子はヒト染色体６ｑ１４に位置するが、そのいくつかは、全てではないが、異なる偽遺伝子を表す多くの染色体上に多数のコピーを有することが判明した。伸長因子−１（ＥＥＦ１Ａ）のαサブユニットは、アミノアシル−ｔＲＮＡの８０Ｓリボソームへの結合に関与する。プロセスの間に、ＧＴＰはＧＤＰへ加水分解される。この機能を行うためには、ＥＥＦ１Ａは、グアニンヌクレオチド、８０Ｓリボソーム、およびアミノアシル−ｔＲＮＡに結合するドメインを有する。また、ＥＥＦ１ＡはＥＥＦ１のβサブユニットと相互作用して、ＧＴＰに代えて結合したＧＤＰで交換する。ヒトＥＥＦ１Ａの一次構造はＢｒａｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ（１９８６）によって決定された。
【０１５８】
Ｄｉｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ（２０００）は、関節リウマチ、脾腫、および好中球減少症に導く好中球の末梢破壊の関連によって特徴付けられる障害であるフェルティー症候群を持つ患者の６６％において自己抗体としてＥＥＦ１Ａ１を同定した。
【０１５９】
Ｌａｍｂｅｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ（２００４）による概説によると、ＥＥＦ１Ａが（これがＥＥＦ１Ａ１またはＥＥＦ１Ａ２または双方であるかを特定することなく）アポトーシスに関与する。また、Ｌａｍｂｅｒｔｉ  ｅｔ  ａｌは、カスパーゼ３−媒介アポトーシスの保護においてＥＥＦ１Ａ２が役割を果たすことを報告する。ＥＥＦ１Ａ２の抗アポトーシス効果に基づいて、Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２００３）は、ＥＥＦ１Ａ１もまたアポトーシスを阻害し得ることを示唆する。Ｔａｌａｐａｔｒａ  ｅｔ  ａｌ（２００１）は、インターロイキン３撤去によって引き起こされるアポトーシスに対して保護する遺伝子についてのスクリーニングにおいてＥＥＦ１Ａ１を同定した。
【０１６０】
発明者の知識の及ぶ限り、ＥＥＦ１Ａ１はＢａｘ媒介アポトーシスに関連付けられていない。
【０１６１】
このようにして、本発明は、ＥＥＦ１Ａ１ポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを細胞に投与することによって、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスに対抗することを含む。
【０１６２】
同様に、発明者の知識の及ぶ限り、ＥＥＦ１Ａ１はいずれの神経変性障害とも関連付けられていない。
【０１６３】
このようにして、本発明は、ＥＥＦ１Ａ１ポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを患者に投与することによって、患者において神経変性病に対抗することも含む。
【０１６４】
「ＥＥＦ１Ａ１ポリペプチド」（真核生物翻訳伸長因子１  α１）とは、我々は、その天然に生じる変種を含む、ヒトＥＥＦ１Ａ１遺伝子の遺伝子産物の意味を含む。ヒトＥＥＦ１Ａ１  ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００１４０２に見出される。ヒトＥＥＦ１Ａ１ポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００１３９３に見出されるアミノ酸配列、およびその天然に生じる変種を含む。
【０１６５】
ＥＥＦ１Ａ１の適当な「抗アポトーシス誘導体」は、ＥＥＦ１Ａ１の抗アポトーシス断片を含む。ＥＥＦ１Ａ１の「抗アポトーシス断片」とは、我々は、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有するＥＥＦ１Ａ１ポリペプチドの任意の部分を意味する。典型的には、前記断片は全長ヒトＥＥＦ１Ａ１の抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を有する。もし前記断片が全長ヒトＥＥＦ１Ａ１の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％の活性を有するならば、より好ましい。より好ましくは、前記断片は全長ヒトＥＥＦ１Ａ１の抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０１６６】
ＥＥＦ１Ａ１の適当な「抗アポトーシス誘導体」は、全長ＥＥＦ１Ａ１の断片、または細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有するその断片の全長ポリペプチドの修飾も含む。好ましくは、修飾されたＥＥＦ１Ａ１または修飾されたＥＥＦ１Ａ１断片は、全長ＥＥＦ１Ａ１、または各ＥＥＦ１Ａ１断片に対して少なくとも９３％配列同一性を保有する。より好ましくは、修飾されたＥＥＦ１Ａ１または修飾されたＥＥＦ１Ａ１断片は、全長ＥＥＦ１Ａ１、または各ＥＥＦ１Ａ１断片に対して少なくとも９４％、または少なくとも９５％配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％配列同一性を有する。好ましくは、修飾されたＥＥＦ１Ａ１または修飾されたＥＥＦ１Ａ１断片は、全長ヒトＥＥＦ１Ａ１の抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を保有する。もし修飾されたＥＥＦ１Ａ１またはＥＥＦ１Ａ１誘導体が全長ヒトＥＥＦ１Ａ１の活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、修飾されたＥＥＦ１Ａ１または修飾されたＥＥＦ１Ａ１断片は、全長ヒトＥＥＦ１Ａ１の抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０１６７】
ＥＥＦ１Ａ１とは、我々は、他の種からのＥＥＦ１Ａ１遺伝子からの相同遺伝子産物も含む。「相同遺伝子産物」とは、我々は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００１３９３におけるヒトＥＥＦ１Ａ１アミノ酸配列に対して少なくとも９３％配列同一性を有するＥＥＦ１Ａ１ポリペプチドを含む。より好ましくは、相同遺伝子産物は、ヒトＥＥＦ１Ａ１に対して少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％の配列同一性を有するＥＥＦ１Ａ１ポリペプチドを含む。より好ましくは、相同遺伝子産物はヒトＥＥＦ１Ａ１アミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するＥＥＦ１Ａ１ポリペプチドを含む。ＥＥＦ１Ａ１が非ヒト対象に投与される適用では、ＥＥＦ１Ａ１は好ましくは対象と同一の種からのものであると認識される。もしＥＥＦ１Ａ１がヒト対象に投与されれば、ＥＥＦ１Ａ１は好ましくはヒトＥＥＦ１Ａ１、またはその抗アポトーシス断片または変種である。
【０１６８】
ＥＥＦ１Ａ１をコードするポリヌクレオチドとは、我々は、ヒトＥＥＦ１Ａ１ポリペプチドおよびその天然に生じる変種をコードするｃＤＮＡを含む。ヒトＥＥＦ１Ａ１  ｍＲＮＡをコードするｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００１４０２に見出される。また、我々は、遺伝子暗号の縮重によって、ＥＥＦ１Ａ１ポリペプチドをやはりコードする他の配列も含む。ＥＥＦ１Ａ１の抗アポトーシス断片をコードするポリヌクレオチドの例は、配列番号７にリストされる（全長ＥＥＦ１Ａ１は、引き続いて、酵母において、およびＨＥＫ２９３細胞においてその効果の確認のためにクローン化された）。
【０１６９】
ＶＡＭＰ３
【０１７０】
ＶＡＭＰ３は、小胞関連膜タンパク質（ＶＡＭＰ）／シナプトブレビーンファミリーのメンバーである。シンタキシンと共に、ＶＡＭＰ、および２５−ｋＤシナプトソーム関連タンパク質（ＳＮＡＰ２５）は、シナプス小胞とプレシナプス膜とのドッキングおよび／または融合に関与するタンパク質複合体の主な成分である。他の公知のＶＡＭＰに対するＶＡＭＰ３の高相同性、その広い組織分布、およびその細胞下局所化のため、この遺伝子によってコードされたタンパク質はヒト同等体であると考えられた。血小板において、前記タンパク質は、カルシウムまたはトロンビン刺激に際して原形質膜に導引されない区画に存在する。
【０１７１】
発明者の知識の及ぶ限り、ＶＡＭＰ３はアポトーシスに関連付けられていない。
【０１７２】
このようにして、本発明は、ＶＡＭＰ３ポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを細胞に投与することによって、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスに対抗することを含む。
【０１７３】
ＶＡＭＰ３は、初期開始劣性パーキンソン症候群に関与するヒト染色体１ｐ３６上の遺伝子座内の２５の遺伝子の１つであることが判明した（ｖａｎ  Ｄｕｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。しかしながら、ＶＡＭＰ３は、いずれの神経変性病または疾患にも直接的に関連付けられていない。事実、ＯＭＩＭ  参照番号６０３６５７によると、ＶＡＭＰ３はいずれの病気状態にも直接的に関連付けられておらず、発明者らが認識する限り、ＶＡＭＰ３は治療に用いられていない。
【０１７４】
このようにして、本発明は、医療で用いるための、ＶＡＭＰ３ポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１７５】
このようにして、本発明は、ＶＡＭＰ３ポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを患者に投与することにより、患者において神経変性病または疾患に対抗することも含む。
【０１７６】
ＶＡＭＰ３ポリペプチド（小胞−関連膜タンパク質３）とは、我々は、その天然に生じる変種を含む、ヒトＶＡＭＰ３遺伝子の遺伝子産物の意味を含む。ヒトＶＡＭＰ３  ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００４７８１に見出される。ヒトＶＡＭＰ３ポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００４７７２に見出されるアミノ酸配列、およびその天然に生じる変種を含む。
【０１７７】
ＶＡＭＰ３の適当な「抗アポトーシス誘導体」は、ＶＡＭＰ３の抗アポトーシス断片を含む。ＶＡＭＰ３の「抗アポトーシス断片」とは、我々は、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有するＶＡＭＰ３ポリペプチドのいずれかの部分を意味する。典型的には、前記断片は全長ヒトＶＡＭＰ３の抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を有する。もし前記断片が全長ヒトＶＡＭＰ３の活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、前記断片は全長ヒトＶＡＭＰ３の抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０１７８】
ＶＡＭＰ３の適当な「抗アポトーシス誘導体」は、全長ＶＡＭＰ３の断片、または細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有する、その断片の全長ポリペプチドの修飾も含む。好ましくは、修飾されたＶＡＭＰ３または修飾されたＶＡＭＰ３断片が、全長ＶＡＭＰ３、または各ＶＡＭＰ３断片に対して少なくとも９０％配列同一性を保有する。より好ましくは、修飾されたＶＡＭＰ３または修飾されたＶＡＭＰ３断片は少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％または９５％配列同一性、なおより好ましくは、全長ＶＡＭＰ３、または各ＶＡＭＰ３断片に対して少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する。好ましくは、修飾されたＶＡＭＰ３または修飾されたＶＡＭＰ３断片は、全長ヒトＶＡＭＰ３の抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を保有する。もし修飾されたＶＡＭＰ３またはＶＡＭＰ３誘導体が、全長ヒトＶＡＭＰ３の活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、修飾されたＶＡＭＰ３または修飾されたＶＡＭＰ３断片は、全長ヒトＶＡＭＰ３の抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０１７９】
ＶＡＭＰ３とは、我々は、他の種からのＶＡＭＰ３遺伝子からの相同遺伝子産物も含む。「相同遺伝子産物」とは、我々は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＭＰ＿００４７７２におけるヒトＶＡＭＰ３アミノ酸配列に対して少なくとも９０％配列同一性を有するＶＡＭＰ３ポリペプチドを含む。より好ましくは、相同遺伝子産物は、ヒトＶＡＭＰ３に対して少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％配列同一性を有するＶＡＭＰ３ポリペプチドを含む。最も好ましくは、相同遺伝子産物は、ヒトＶＡＭＰ３アミノ酸配列に対して少なくとも９９％配列同一性を有するＶＡＭＰ３ポリペプチドを含む。ＶＡＭＰ３が非ヒト対象に投与される適用では、ＶＡＭＰ３は好ましくは対象と同一の種からのものであると認識される。もしＶＡＭＰ３がヒト対象に投与されるならば、ＶＡＭＰ３は好ましくはヒトＶＡＭＰ３、またはその抗アポトーシス断片または変種である。
【０１８０】
ＶＡＭＰ３をコードするポリヌクレオチドとは、我々は、ヒトＶＡＭＰ３ポリペプチドおよびその天然に生じる変種をコードするｃＤＮＡを含む。ヒトＶＡＭＰ３  ｍＲＮＡをコードするｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００４７８１に見出される。我々は、遺伝子暗号の縮重によって、やはりＶＡＭＰ３ポリペプチドをコードする他の配列も含む。
【０１８１】
ＶＡＭＰ３の抗アポトーシス断片をコードするポリヌクレオチドの例は配列番号８にリストされる。
【０１８２】
ＶＡＭＰ３をコードするポリヌクレオチド（配列番号８）は、全長断片として酵母スクリーニングにおいて単離された。
【０１８３】
ＳＮＡＰ２５
【０１８４】
シナプス小胞膜ドッキングおよび融合は、小胞膜（ｖ−ＳＮＡＲＥ）および標的膜（ｔ−ＳＮＡＲＥ）上に位置するＳＮＡＲＥ（可溶性Ｎ−エチルマレイミド−感受性因子結合タンパク質受容体）によって媒介される。組立てられたｖ−ＳＮＡＲＥ／ｔ−ＳＮＡＲＥ複合体は、４つの螺旋の束よりなり、その１つはｖ−ＳＮＡＲＥによって供給され、他の３つはｔ−ＳＮＡＲＥによって供給される。原形質膜上のｔ−ＳＮＡＲＥについては、タンパク質シンタキシンは１つの螺旋を供給し、ＳＮＡＰ２５によってコードされるタンパク質は他の２つに寄与する。このようにして、ＳＮＡＰ２５の遺伝子産物は、神経伝達物質の放出の調節に関与するプレシナプス原形質膜タンパク質である。
【０１８５】
発明者の知識の及ぶ限り、ＳＮＡＰ２５はアポトーシスと関連付けられていない。
【０１８６】
このようにして、本発明は、ＳＮＡＰ２５ポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを細胞に投与することによって、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスに対抗することを含む。
【０１８７】
発明者の知識の及ぶ限り、ＳＮＡＰ２５はいずれの神経変性病または疾患にも関連付けられていない。事実、ＯＭＩＭ  参照番号６００３２２によると、ＳＮＡＰ２５はいいずれかの病気状態に関連付けられておらず、発明者らが認識する限り、ＳＮＡＰ２５は治療的に用いられていない。
【０１８８】
このようにして、本発明は、医療で用いるための、ＳＮＡＰ２５ポリペプチド、その抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１８９】
また、本発明は、ＳＮＡＰ２５ポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを患者に投与することによって、患者において神経変性病または疾患に対抗することも含む。
【０１９０】
ＳＮＡＰ２５（シナプトソーム関連タンパク質２５ｋＤａ）とは、我々は、その天然に生じる変種を含む、ヒトＳＮＡＰ２５遺伝子の遺伝子産物の意味を含む。異なるタンパク質イソ形態をコードする２つの代替転写体変種は、ヒトＳＮＡＰ２５遺伝子について記載されている。ヒトＳＮＡＰ２５  ｍＲＮＡ（変種１）に対応するｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００３０８１に見出される。変種１は８つのエクソンを含有し、イソ形態ＳＮＡＰ２５Ａをコードする。ヒトＳＮＡＰ２５  ｍＲＮＡ（変種２）に対応するｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿１３０８１１に見出され、転写体変種１と比較して代替エクソン５を含有する。この結果、同一長さであって、イソ形態ＳＮＡＰ２５Ａと同一のＮ−およびＣ末端を含有するが、９つのアミノ酸残基の差を内部に有するイソ形態ＳＮＡＰ２５Ｂをもたらす。ヒトＳＮＡＰ２５ＡおよびＳＮＡＰ２５Ｂポリペプチドのアミノ酸配列は、各々、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００３０７２およびＮＰ＿５７０８２４に見出される配列、およびその天然に生じる変種を含む。本明細書中に記載されるスクリーニング実験で同定されたＳＮＡＰ２５配列はイソ形態Ｂからのものであった。
【０１９１】
ＳＮＡＰ２５の適当な「抗アポトーシス誘導体」は、ＳＮＡＰ２５の抗アポトーシス断片を含む。ＳＮＡＰ２５の「抗アポトーシス断片」とは、我々は、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有するＳＮＡＰ２５ＡまたはＳＮＡＰ２５Ｂポリペプチドのいずれかの部分を意味する。典型的には、前記断片は配列番号９のポリヌクレオチドによってコードされるＳＮＡＰ２５ポリペプチド断片の抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を有する。もし前記断片がポリヌクレオチド配列番号９によってコードされるＳＮＡＰ２５ポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、前記断片はポリヌクレオチド配列番号９によってコードされるＳＮＡＰ２５ポリペプチドの抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０１９２】
ＳＮＡＰ２５の適当な「抗アポトーシス誘導体」は、全長ＳＮＡＰ２５ＡまたはＳＮＡＰ２５Ｂの修飾、あるいは細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有するその断片の修飾も含む。好ましくは、修飾されたＳＮＡＰ２５Ａ、ＳＮＡＰ２５Ｂ、またはその修飾された断片は、全長ＳＮＡＰ２５Ａ、ＳＮＡＰ２５Ｂ、またはその各断片に対して少なくとも９０％配列同一性を保有する。より好ましくは、修飾されたＳＮＡＰ２５Ａ、ＳＮＡＰ２５Ｂ、またはその修飾された断片は、全長ＳＮＡＰ２５ＡまたはＳＮＡＰ２５Ｂに対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％または９５％配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する。好ましくは、修飾されたＳＮＡＰ２５または修飾されたその断片は、ポリヌクレオチド配列番号９によってコードされるＳＮＡＰ２５ポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を保有する。もし修飾されたＳＮＡＰ２５または修飾された誘導体が、ポリヌクレオチド配列番号９によってコードされたＳＮＡＰ２５ポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。より好ましくは、修飾されたＳＮＡＰ２５またはその修飾された断片は、ポリヌクレオチド配列番号９によってコードされたＳＮＡＰ２５ポリペプチドの抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０１９３】
ＳＮＡＰ２５とは、我々は、他の種からのＳＮＡＰ２５遺伝子からの相同遺伝子産物も含む。「相同遺伝子産物」とは、我々は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００３０７２およびＮＰ＿５７０８２４におけるヒトＳＮＡＰ２５アミノ酸配列に対して少なくとも９０％配列同一性を有するＳＮＡＰ２５ポリペプチドを含む。より好ましくは、相同遺伝子産物は、ヒトＳＮＡＰ２５ＡまたはＳＮＡＰ２５Ｂに対して少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％配列同一性を有するＳＮＡＰ２５ポリペプチドを含む。最も好ましくは、相同遺伝子産物は、ヒトＳＮＡＰ２５ＡまたはＳＮＡＰ２５Ｂアミノ酸配列に対して少なくとも９９％配列同一性を有するＳＮＡＰ２５ポリペプチドを含む。ＳＮＡＰ２５が非ヒト対象に投与される適用では、ＳＮＡＰ２５は好ましくは対象と同一の種からのものであると認識される。もしＳＮＡＰ２５がヒト対象に投与されるならば、ＳＮＡＰ２５は好ましくはヒトＳＮＡＰ２５イソ形態、またはその抗アポトーシス断片または変種である。
【０１９４】
ＳＮＡＰ２５をコードするポリヌクレオチドとは、我々は、ヒトＳＮＡＰ２５ポリペプチドおよびその天然に生じる変種をコードするｃＤＮＡを含む。ヒトＳＮＡＰ２５をコードするｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００３０８１およびＮＭ＿１３０８１１に見出される。我々は、遺伝子暗号の縮重によって、やはりＳＮＡＰ２５ポリペプチドをコードする他の配列も含む。ＳＮＡＰ２５の抗アポトーシス断片をコードするポリヌクレオチドの例は、配列番号９にリストされ、これは、最初の数個のアミノ酸をコードするヌクレオチドを失ったほとんど全長の断片である。
【０１９５】
ＲＩＭＳ３
【０１９６】
ＲＩＭＳ３はＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２０００）およびＷａｎｇ  ＆  Ｓｕｄｈｏｆ（２００３）に記載されている。
【０１９７】
ＲＩＭ１はシナプスＧＴＰ−結合タンパク質であるＲａｂ３についての推定エフェクタータンパク質である。ＲＩＭ１はシナプスにおける活性なゾーン近くに位置し、そこでは、それは、シナプス小胞に位置するＲａｂ３とＧＴＰ−依存的な様式で相互作用する。ＲＩＭ２はＲＩＭ１と高度に相同であり、主として脳においても発現する。ＲＩＭ１と同様に、ＲＩＭ２は、ＧＴＰ、中央のＰＤＺドメイン、および長い交互にスプライシングされた配列によって分離される２つのＣ末端Ｃ（２）ドメインの関数として、Ｒａｂ３に結合するＮ−末端亜鉛フィンガードメインを含有する。ＲＩＭ２遺伝子の３’−末端は、ＮＩＭ２というより小さいタンパク質をコードする独立したｍＲＮＡを生じる。ＮＩＭ２は、ユニークなＮ−末端配列、続いて、ＲＩＭ２のｃ末端部分から構成される。データバングのサーチは、第三のＲＩＭ／ＮＩＭ−関連遺伝子を同定し、これは、ＮＩＭ３（ＲＩＭＳ３）というＮＩＭイソ形態をコードする。ＮＩＭは、ＲＩＭのように、エキソサイトーシスを調節する。ＲＩＭおよびＮＩＭにおける保存されたおよび可変配列の組合せは、これらのタンパク質の個々のドメインが、エキソサイトーシスの間に相互作用する分子に対する結合部位を提供することを示す。
【０１９８】
発明者の知識の及ぶ限り、ＲＩＭＳ３はアポトーシスと関連付けられていない。
【０１９９】
このようにして、本発明は、ＲＩＭＳ３ポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを細胞に投与することによって、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスに対抗することを含む。
【０２００】
発明者の知識の及ぶ限り、ＲＩＭＳ３はいずれの神経変性病または疾患にも関連付けられていない。事実、発明者が知る限り、ＲＩＭＳ３はいずれの病気状態とも関連付けられておらず、これまで治療的に用いられていない。
【０２０１】
このようにして、本発明は、医療で用いるための、ＲＩＭＳ３ポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０２０２】
このようにして、本発明は、ＲＩＭＳ３ポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを患者に投与することにより、患者において神経変性病または疾患に対抗することも含む。
【０２０３】
（Ｒａｂ−３相互作用分子３およびＮｉｍ３としても知られる；シナプス膜エクソサイトーシスを調節する）「ＲＩＭＳ３ポリペプチド」とは、我々は、その天然に生じる変種を含む、ヒトＲＩＭＳ３遺伝子の遺伝子産物の意味を含む。ヒトＲＩＭＳ３  ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０１４７４７に見出される。ヒトＲＩＭＳ３ポリペプチドはＧｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０５５５６２に見出されるアミノ酸配列、およびその天然に生じる変種を含む。
【０２０４】
ＲＩＭＳ３の適当な「抗アポトーシス誘導体」は、ＲＩＭＳ３の抗アポトーシス断片を含む。ＲＩＭＳ３の「抗アポトーシス断片」とは、我々は、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有するＲＩＭＳ３ポリペプチドの任意の部分を意味する。典型的には、前記断片は配列番号１０のポリヌクレオチドによってコードされるＲＩＭＳ３ポリペプチド断片の抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を有する。もし前記断片が、ポリヌクレオチド配列番号１０によってコードされるＲＩＭＳ３ポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、前記断片はポリヌクレオチド配列番号１０によってコードされるＲＩＭＳ３ポリペプチドの抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０２０５】
ＲＩＭＳ３の適当な「抗アポトーシス誘導体」は、全長ＲＩＭＳ３の修飾、または細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有するその断片の修飾も含む。好ましくは、修飾されたＲＩＭＳ３またはＲＩＭＳ３の修飾された断片は、全長ＲＩＭＳ３、またはその各断片に対して少なくとも９０％配列同一性を保有する。より好ましくは、修飾されたＲＩＭＳ３、またはその修飾された断片は、全長ＲＩＭＳ３、または各ＲＩＭＳ３断片に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％または９５％配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する。好ましくは、修飾されたＲＩＭＳ３またはその修飾された断片は、ポリヌクレオチド配列番号１０によってコードされたＲＩＭＳ３ポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を保有する。もし修飾されたＲＩＭＳ３または修飾された誘導体が、ポリヌクレオチド配列番号１０によってコードされたＲＩＭＳ３ポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、修飾されたＲＩＭＳ３またはその修飾された断片はポリヌクレオチド配列番号１０によってコードされたＲＩＭＳ３ポリペプチドの抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０２０６】
ＲＩＭＳ３とは、我々は、他の種からのＲＩＭＳ３遺伝子からの相同遺伝子産物も含む。「相同遺伝子産物」とは、我々は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０５５５６２におけるヒトＲＩＭＳ３アミノ酸配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するＲＩＭＳ３ポリペプチドを含む。より好ましくは、相同遺伝子産物はヒトＲＩＭＳ３に対して少なくとも８５％または少なくとも９０％配列同一性を有するＲＩＭＳ３ポリペプチドを含む。なおより好ましくは、相同遺伝子産物は、ヒトＲＩＭＳ３に対して少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％配列同一性を有するＲＩＭＳ３ポリペプチドを含む。より好ましくは、相同遺伝子産物は、ヒトＲＩＭＳ３アミノ酸配列に対して少なくとも９９％配列同一性を有するＲＩＭＳ３ポリペプチドを含む。ＲＩＭＳ３が非ヒト対象に投与される適用では、ＲＩＭＳ３は好ましくは対象と同一の種からのものであると認識される。もしＲＩＭＳ３がヒト対象に投与されるならば、ＲＩＭＳ３は好ましくはヒトＲＩＭＳ３、またはその抗アポトーシス断片または変種である。
【０２０７】
ＲＩＭＳ３をコードするポリヌクレオチドとは、我々は、ヒトＲＩＭＳ３ポリペプチドおよびその天然に生じる変種をコードするｃＤＮＡを含む。ヒトＲＩＭＳ３をコードするｃＤＮＡ配列はＧｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０１４７４７に見出される。また、我々は、遺伝子暗号の縮重によって、やはりＲＩＭＳ３ポリペプチドをコードする他の配列も含む。
【０２０８】
酵母スクリーニングにおいて単離されたＲＩＭＳ３をコードするポリヌクレオチド（配列番号１０）は全長であった。
【０２０９】
ＲＡＢ４０Ｂ
【０２１０】
ＲＡＢ４０Ｂは（ＲＡＲまたはＳＥＣ４Ｌとしても知られる）ＲＡＳ癌遺伝子ファミリーのメンバーである。ＧＴＰａｓｅのＲａｓスーパーファミリーの多くのメンバーは、成長、生存、分化、サイトカイン生産、化学走性、小胞−トラフィッキング、およびファゴサイトーシスにおける役割と共に、造血細胞の調節に関連付けられてきた。タンパク質のＲａｓスーパーファミリーは、今日、（大きなヘテロトリマーＧＴＰａｓｅ、Ｇ−プロテインから区別される）１５０を超える小さなＧＴＰａｓｅを含む。それは６つのサブファミリー、Ｒａｓ、Ｒｈｏ、Ｒａｎ、Ｒａｂ、Ａｒｆ、およびＫｉｒ／Ｒｅｍ／Ｒａｄサブファミリーを含む。それらは、特に、それらの活性化を触媒するグアニンヌクレオチド交換因子と相互作用する領域において、顕著な総じてのアミノ酸同一性を呈する。小さなＧＴＰ−結合タンパク質のＲａｂファミリーの進化はＰｅｒｅｉｒａ−Ｌｅａｌ  ＆  Ｓｅａｂｒａ（２００１）によって記載されている。
【０２１１】
エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス小胞輸送経路の調節は、欠突起膠細胞の構造および機能組織化を維持するのに必須である。小胞輸送経路は、（１）ドナー区画における担体小胞の形成；（２）細胞骨格のエレメントに沿っての小胞の移動；および（３）アクセプター区画への小胞のターゲッティングおよび融合の協調された制御によって調節される。これらの事象を調節するメカニズムは、真核生物細胞の間で保存されている。Ｒａｂタンパク質は、小胞形成、小胞移動、および小胞標的化を調節するメカニズムにおいて鍵となる成分である。Ｒａｂタンパク質ファミリーの各メンバーは、特異的小胞トラフィッキング経路を調節する。
【０２１２】
発明者の知識の及ぶ限り、ＲＡＢ４０Ｂはアポトーシスに関連付けられていない。
【０２１３】
このようにして、本発明は、ＲＡＢ４０Ｂポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを細胞に投与することによって、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスに対抗することを含む。
【０２１４】
発明者の知識の及ぶ限り、ＲＡＢ４０Ｂはいずれの神経変性病または疾患とも関連付けられていない。事実、発明者が知る限り、ＲＡＢ４０Ｂはいずれの病気状態とも関連付けられておらず、これまで、治療的に用いられていない。
【０２１５】
このようにして、本発明は、医療で用いるための、ＲＡＢ４０Ｂポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０２１６】
また、本発明は、ＲＡＢ４０Ｂポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを患者に投与することによって、患者において神経変性病または疾患に対抗することも含む。
【０２１７】
「ＲＡＢ４０Ｂポリペプチド」とは、我々は、その天然に生じる変種を含むヒトＲＡＢ４０Ｂ遺伝子の遺伝子産物の意味を含む。ヒトＲＡＢ４０Ｂ  ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００６８２２に見出される。ヒトＲＡＢ４０Ｂポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００６８１３に見出されるアミノ酸配列、およびその天然に生じる変種を含む。
【０２１８】
ＲＡＢ４０Ｂの適当な「抗アポトーシス誘導体」は、ＲＡＢ４０Ｂの抗アポトーシス断片を含む。ＲＡＢ４０Ｂの「抗アポトーシス断片」とは、我々は、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有するＲＡＢ４０Ｂポリペプチドの任意の部分を意味する。典型的には、前記断片は、配列番号１１のポリヌクレオチドによってコードされるＲＡＢ４０Ｂポリペプチド断片の抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を有する。もし前記断片がポリヌクレオチド配列番号１１によってコードされるＲＡＢ４０Ｂポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、前記断片はポリヌクレオチド配列番号１１によってコードされるＲＡＢ４０Ｂポリペプチドの抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０２１９】
ＲＡＢ４０Ｂの適当な「抗アポトーシス誘導体」は、全長ＲＡＢ４０Ｂの修飾、または細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有する、その断片の修飾も含む。好ましくは、修飾されたＲＡＢ４０ＢまたはＲＡＢ４０Ｂの修飾された断片は、全長ＲＡＢ４０Ｂ、またはその各断片に対して少なくとも９０％配列同一性を保有する。より好ましくは、修飾されたＲＡＢ４０Ｂ、またはその修飾された断片は、全長ＲＡＢ４０Ｂ、または各ＲＡＢ４０Ｂ断片に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％または９５％配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する。好ましくは、修飾されたＲＡＢ４０Ｂまたはその修飾された断片は、ポリヌクレオチド配列番号１１によってコードされるＲＡＢ４０Ｂポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を保有する。もし前記修飾されたＲＡＢ４０Ｂまたは修飾された誘導体が、ポリヌクレオチド配列番号１１によってコードされるＲＡＢ４０Ｂポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、修飾されたＲＡＢ４０Ｂまたはその修飾された断片は、ポリヌクレオチド配列番号１１によってコードされるＲＡＢ４０Ｂポリペプチドの抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０２２０】
ＲＡＢ４０Ｂとは、我々は、他の種からのＲＡＢ４０Ｂ遺伝子からの相同遺伝子産物も含む。「相同遺伝子産物」とは、我々は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００６８１３におけるヒトＲＡＢ４０Ｂアミノ酸配列に対して少なくとも９０％配列同一性を有するＲＡＢ４０Ｂポリペプチドを含む。より好ましくは、相同遺伝子産物はヒトＲＡＢ４０Ｂに対して少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％配列同一性を有するＲＡＢ４０Ｂポリペプチドを含む。最も好ましくは、相同遺伝子産物は、ヒトＲＡＢ４０Ｂアミノ酸配列に対して少なくとも９９％配列同一性を有するＲＡＢ４０Ｂポリペプチドを含む。ＲＡＢ４０Ｂが非ヒト対象に投与される適用では、ＲＡＢ４０Ｂは好ましくは対象と同一の種からのものであると認識される。もしＲＡＢ４０Ｂがヒト対象に投与されるならば、ＲＡＢ４０Ｂは好ましくはヒトＲＡＢ４０Ｂ、またはその抗アポトーシス断片、または変種である。
【０２２１】
ＲＡＢ４０Ｂをコードするポリヌクレオチドとは、我々は、ヒトＲＡＢ４０Ｂポリペプチドおよびその天然に生じる変種をコードするｃＤＮＡを含む。ヒトＲＡＢ４０ＢをコードするｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００６８２２に見出される。また、我々は、遺伝子暗号の縮重によって、やはりＲＡＢ４０Ｂポリペプチドをコードする他の配列も含む。ＲＡＢ４０Ｂの抗アポトーシス断片をコードするポリヌクレオチドの例は、配列番号１１にリストされる。しかしながら、全長ＲＡＢ４０Ｂは、配列番号１１のこの断片よりも、Ｂａｘ媒介アポトーシスからの酵母細胞を救済するにおいてより効果的である。
【０２２２】
ＨＭＧＣＳ１
【０２２３】
ＨＭＧＣＳ１（３―ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａシンターゼ１）は、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡと縮合させて、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼに対する基質であるＨＭＧ−ＣｏＡを形成する細胞質酵素である。
【０２２４】
アセチル−ＣｏＡ＋Ｈ２Ｏ＋アセトアセチル−ＣｏＡ⇔（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ＋ＣｏＡ。
【０２２５】
ＨＭＧ  ｃｏＡシンターゼは、コレステロースおよびイソプレノイドのようなステロールの合成に先立ってのＨＭＧ−ＣｏＡからのメバロン酸の生産の経路にも関与する。ミトコンドリアＨＭＧ  ｃｏＡシンターゼについての遺伝子は、ＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体））に対する標的であって、この受容体は脂肪酸によるこの遺伝子の誘導を媒介する。ヒト細胞質３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素ＡシンターゼはＲｏｋｏｓｚ（１９９４）によって記載されている。
【０２２６】
発明者の知識の及ぶ限り、ＨＭＧＣＳ１はアポトーシスと関連付けられていない。
【０２２７】
このようにして、本発明は、ＨＭＧＣＳ１ポリペプチド、その抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを細胞に投与することによって、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスに対抗することを含む。
【０２２８】
ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼおよびＡＤの間にリンクはあるが、ＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼおよびＡＤの間に知られたリンクはない。発明者の知識の及ぶ限り、ＨＭＧＣＳ１はいずれの神経変性病または疾患とも関連付けられていない。発明者の知識の及ぶ限り、ＨＭＧＣＳ１はいずれの神経変性病または疾患にも関連付けられていない。事実、ＯＭＩＭ  参照番号１４２９４０によると、ＨＭＧＣＳ１はいずれの病気状態とも関連付けられておらず、発明者が知る限り、ＨＭＧＣＳ１は治療的に用いられていない。
【０２２９】
このようにして、本発明は、医療で用いるための、ＨＭＧＣＳ１ポリペプチド、その抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０２３０】
また、本発明は、ＨＭＧＣＳ１ポリペプチド、その抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを患者に投与することによって、患者において神経変性病または疾患に対抗することも含む。
【０２３１】
ＨＭＧＣＳ１ポリペプチドとは、我々は、その天然に生じる変種を含むヒトＨＭＧＣＳ１遺伝子の遺伝子産物の意味を含む。ヒトＨＭＧＣＳ１  ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００２１３０に見出される。ヒトＨＭＧＣＳ１ポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００２１２１に見出されるアミノ酸配列、およびその天然に生じる変種を含む。
【０２３２】
ＨＭＧＣＳ１の適当な「抗アポトーシス誘導体」は、ＨＭＧＣＳ１の抗アポトーシス断片を含む。ＨＭＧＣＳ１の「抗アポトーシス断片」とは、我々は、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有するＨＭＧＣＳ１ポリペプチドの任意の部分を意味する。典型的には、前記断片は配列番号１２のポリヌクレオチドによってコードされるＨＭＧＣＳ１ポリペプチド断片の抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を有する。もし前記断片がポリヌクレオチド配列番号１２によってコードされるＨＭＧＣＳ１ポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、前記断片はポリヌクレオチド配列番号１２によってコードされるＨＭＧＣＳ１ポリペプチドの抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０２３３】
ＨＭＧＣＳ１の適当な「抗アポトーシス誘導体」は、全長ＨＭＧＣＳ１の修飾、または細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有する、その断片の修飾も含む。好ましくは、修飾されたＨＭＧＣＳ１またはＨＭＧＣＳ１の修飾された断片は、（ＮＰ＿００２１２１に定義された）全長ヒトＨＭＧＣＳ１、またはその各断片に対して少なくとも９０％配列同一性を保有する。より好ましくは、修飾されたＨＭＧＣＳ１またはその修飾された断片は、全長ＨＭＧＣＳ１、または各ＨＭＧＣＳ１断片に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％または９５％配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する。好ましくは、修飾されたＨＭＧＣＳ１またはその修飾された断片は、ポリヌクレオチド配列番号１２によってコードされるＨＭＧＣＳ１ポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を保有する。もし修飾されたＨＭＧＣＳ１または修飾された誘導体がポリヌクレオチド配列番号１２によってコードされるＨＭＧＣＳ１ポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、修飾されたＨＭＧＣＳ１またはその修飾された断片は、ポリヌクレオチド配列番号１２によってコードされるＨＭＧＣＳ１ポリペプチドの抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０２３４】
ＨＭＧＣＳ１とは、我々は、他の種からのＨＭＧＣＳ１遺伝子からの相同遺伝子産物も含む。「相同遺伝子産物」とは、我々は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００２１２１におけるヒトＨＭＧＣＳ１アミノ酸配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するＨＭＧＣＳ１ポリペプチドを含む。より好ましくは、相同遺伝子産物はヒトＨＭＧＣＳ１に対して少なくとも８５％または少なくとも９０％配列同一性を有するＨＭＧＣＳ１ポリペプチドを含む。なおより好ましくは、相同遺伝子産物は、ヒトＨＭＧＣＳ１に対して少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％配列同一性を有するＨＭＧＣＳ１ポリペプチドを含む。最も好ましくは、相同遺伝子産物はヒトＨＭＧＣＳ１アミノ酸配列に対して少なくとも９９％配列同一性を有するＨＭＧＣＳ１ポリペプチドを含む。ＨＭＧＣＳ１は非ヒト対象に投与される適用では、ＨＭＧＣＳ１は好ましくは対象と同一の種からのものであると認識される。もしＨＭＧＣＳ１がヒト対象に投与されるならば、ＨＭＧＣＳ１は好ましくはヒトＨＭＧＣＳ１、またはその抗アポトーシス断片または変種である。
【０２３５】
ＨＭＧＣＳ１をコードするポリヌクレオチドとは、我々は、ヒトＨＭＧＣＳ１ポリペプチドおよびその天然に生じる変種をコードするｃＤＮＡを含む。ヒトＨＭＧＣＳ１をコードするｃＤＮＡ配列はＧｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００２１３０に見出される。我々は、遺伝子暗号の縮重によって、やはりＨＭＧＣＳ１ポリペプチドをコードする他の配列も含む。ＨＭＧＣＳ１の抗アポトーシス断片をコードするポリヌクレオチドの例は、ＨＭＧＣＳ１の部分的３’配列である配列番号１２にリストされる。
【０２３６】
ＳＣＤ５
【０２３７】
他のステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ（ＳＣＤ；ＥＣ  １．１４．９９．５）のように、ＳＣＤ５（ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ５；以前は、アシル−ＣｏＡデサチュラーゼ４イソ形態ａ；ＡＣＯＤ４としても知られる）は、飽和脂肪酸からのモノ不飽和脂肪酸の生合成における関係する工程を触媒する。この反応は、メチレン−中断脂肪アシル−ＣｏＡのスペクトルにおける炭素９および１０の間のシス−二重結合の導入に関与する。
【０２３８】
発明者の知識の及ぶ限り、ＳＣＤ５はアポトーシスに関連付けられていない。
【０２３９】
このようにして、本発明は、ＳＣＤ５ポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを細胞に投与することにより、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスに対抗することを含む。
【０２４０】
発明者の知識の及ぶ限り、ＳＣＤ５はいずれの神経変性病または疾患にも関連付けられていない。事実、ＯＭＩＭ  参照番号  ６０８３７０によると、ＳＣＤ５はいずれの病気状態にも関連付けられておらず、発明者が知る限り、ＳＣＤ５は治療的に用いられていない。
【０２４１】
このようにして、本発明は、医療で用いるための、ＳＣＤ５ポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０２４２】
本発明は、ＳＣＤ５ポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを患者に投与することによって、患者において神経変性病または疾患に対抗することも含む。
【０２４３】
「ＳＣＤ５ポリペプチド」とは、我々は、その天然に生じる変種を含むヒトＳＣＤ５遺伝子の遺伝子産物の意味を含む。ヒトＳＣＤ５  ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＢＣ０４８９７１．１に見出される。ヒトＳＣＤ５ポリペプチドはＧｅｎｂａｎｋアクセション番号ＡＡＨ４８９７１に見出されるアミノ酸配列、およびその天然に生じる変種を含む。
【０２４４】
ＳＣＤ５の適当な「抗アポトーシス誘導体」は、ＳＣＤ５の抗アポトーシス断片を含む。ＳＣＤ５の「抗アポトーシス断片」とは、我々は、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有するＳＣＤ５ポリペプチドの任意の部分を意味する。典型的には、前記断片は配列番号１３のポリヌクレオチドによってコードされるＳＣＤ５ポリペプチド断片の抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を有する。もし前記断片がポリヌクレオチド配列番号１３によってコードされるＳＣＤ５ポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。より好ましくは前記断片はポリヌクレオチド配列番号１３によってコードされるＳＣＤ５ポリペプチドの抗アポトーシス活性の」１００％以上を有する。
【０２４５】
ＳＣＤ５の適当な「抗アポトーシス誘導体」は、全長ＳＣＤ５の修飾、または細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有する、その断片の修飾も含む。好ましくは、修飾されたＳＣＤ５またはＳＣＤ５の修飾された断片は（ＡＡＨ４８９７１において定義された）全長ヒトＳＣＤ５、またはその各断片に対して少なくとも９０％配列同一性を保有する。より好ましくは、修飾されたＳＣＤ５、またはその修飾された断片は、全長ＳＣＤ５、または各ＳＣＤ５断片に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％または９５％配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する。好ましくは、修飾されたＳＣＤ５またはその修飾された断片は、ポリヌクレオチド配列番号１３によってコードされるＳＣＤ５ポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を保有する。もし前記修飾されたＳＣＤ５または修飾された誘導体が、ポリヌクレオチド配列番号１３によってコードされるＳＣＤ５ポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、修飾されたＳＣＤ５またはその修飾された断片は、ポリヌクレオチド配列番号１３によってコードされるＳＣＤ５ポリペプチドの抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０２４６】
ＳＣＤ５とは、我々は、他の種からのＳＣＤ５遺伝子からの相同遺伝子産物も含む。「相同遺伝子産物」とは、我々は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＡＡＨ４８９７１におけるヒトＳＣＤ５アミノ酸配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するＳＣＤ５ポリペプチドを含む。より好ましくは、相同遺伝子産物はヒトＳＣＤ５に対して少なくとも８５％または少なくとも９０％配列同一性を有するＳＣＤ５ポリペプチドを含む。なおより好ましくは、相同遺伝子産物は、ヒトＳＣＤ５に対して少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％配列同一性を有するＳＣＤ５ポリペプチドを含む。最も好ましくは、相同遺伝子産物は、ヒトＳＣＤ５アミノ酸配列に対して少なくとも９９％配列同一性を有するＳＣＤ５ポリペプチドを含む。ＳＣＤ５が非ヒト対象に投与される適用では、ＳＣＤ５は好ましくは対象と同一の種からのものであると認識される。もしＳＣＤ５がヒト対象に投与されるならば、ＳＣＤ５は好ましくはヒトＳＣＤ５、または抗アポトーシス断片、またはその変種である。
【０２４７】
ＳＣＤ５をコードするポリヌクレオチドとは、我々は、ヒトＳＣＤ５ポリペプチドおよびその天然に生じる変種をコードするｃＤＮＡを含む。ヒトＳＣＤ５をコードするｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＢＣ０４８９７１．１に見出される。また、我々は、遺伝子暗号の縮重によってやはりＳＣＤ５ポリペプチドをコードする他の配列も含む。ＳＣＤ５の抗アポトーシス断片をコードするポリヌクレオチドの例は、配列番号１３にリストされる。
【０２４８】
ＡＴＰ２Ａ２
【０２４９】
（ＡＴＰ２ＢおよびＳＥＲＣＡ２としても知られる）ＡＴＰ２Ａ２は、筋肉細胞の筋小胞体または小胞体に位置する細胞内ポンプであるＳＥＲＣＡ  Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ（ＥＣ  ３．６．３．８）の１つをコードする。この酵素は、サイトゾルからのカルシウムの筋小胞体ルーメンへのトランスローテーションとカップリングしたＡＴＰの加水分解を触媒し、収縮／弛緩サイクルの調節に関与する。
【０２５０】
Ｓｈｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ（２００３）によると、原形質膜Ｃａ２＋−輸送ＡＴＰａｓｅ（ＰＭＣＡ）はＣａ２＋を細胞から押し出し、筋小胞体（小胞体）Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ）および分泌経路Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ（ＳＰＣＡ）はＣａ２＋を細胞内オルガネラに隔離する。しかしながら、個々のイソ形態の特異的生理学的機能はあまりよく理解されていない。この情報は、対応する遺伝子においてヌル突然変異を運ぶマウスおよびヒトの研究から出現し始めている。原型質膜Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅイソ形態２（ＰＭＣＡ２）における標的化または自然発生突然変異を持つマウスは、ひどく難聴であり、内耳の感覚有毛細胞におけるＰＭＣＡ２の喪失によるバランスの欠陥を有する。ヒトにおいては、ＳＥＲＣＡ１（ＡＴＰ２Ａ１）における突然変異はブローディ病、骨格筋弛緩の損傷を引き起こし；ＳＥＲＣＡ２（ＡＴＰ２Ａ２）遺伝子の１つのコピーの喪失は皮膚障害であるダリエー病を引き起こし；ＳＰＣＡ１（ＡＴＰ２Ｃ１）遺伝子の１つのコピーの喪失はもう１つの皮膚障害であるヘイリーヘイリー病を引き起こす。マウスにおいては、ＳＥＲＣＡ２ヌル突然変異体は誕生まで生存せず、ヘテロ接合性ＳＥＲＣＡ２突然変異体は損なわれた心臓性能、および偏平細胞癌の高い発生率を有する。ＳＥＲＣＡ３ヌル突然変異体は生存し、健康的に見えるが、血管平滑筋の内皮依存的弛緩は損なわれＣａ２＋シグナリングは膵臓β細胞において改変される。表現型の多様性は種々のＣａ２＋輸送ＡＴＰａｓｅイソ形態が非常に異なる生理学的機能を果たすことを示す。
【０２５１】
ダリエー病は、遺伝の常染色体優性態様を持つ稀な皮膚病である。グリース状丘疹およびプラークは脂漏性領域でおよび屈曲部で生起し、ほとんどすべての患者は爪の異常を有する。それは、表皮細胞および異常なケラチン化の間の接着の喪失によって特徴付けられ、棘細胞離開および異常角化症は典型的な組織学的知見である。根底にある欠陥は、筋小胞体／小胞体カルシウムＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ  ２）をコードする染色体１２ｑ２３−２４上のＡＴＰ２Ａ２遺伝子における突然変異の結果である。棘細胞離開は、デスモソーム破壊に由来すると考えられる（ダリエー−ホワイト病および毛包性角化症としても知られる）ダリエー病は、ハプロ不全によって引き起こされた優性遺伝病の例である。経口レチノイドは最も効果的な治療であるが、それらの有害効果は面倒である。局所的レチノイド、局所的コルチコステロイド、手術およびレーザー手術はそれらの支持者を有するが、効率についての証拠はうすい（Ｃｏｏｐｅｒ  ＆  Ｂｕｒｇｅ，２００３）。ダリエー病は、時々、双極性障害のような気分障害と共病態である（Ｋａｔｏ，２００１）。ダリエー病におけるＡＴＰ２Ａ２の役割は、Ｆｏｇｇｉａ  ＆  Ｈｏｖｎａｎｉａｎ（２００４）によって概説されている。
【０２５２】
Ｄｈｉｔａｖａｔ  ｅｔ  ａｌ（２００４）によると、ダリエー病においては、デスモソーム接着の喪失は、ケラチノサイトにおける細胞脱着によって特徴付けられるアポトーシスのタイプであるアノイキスをトリガーする。アポトーシスは、Ｃａ２＋輸送活性の変化に対して二次的であると考えられた。その仮説を裏付けるにおいて、Ｄｈｉｔａｖａｔ  ｅｔ  ａｌ  は、タプシガルギンでのＳＥＲＣＡポンプの阻害は種々の上皮細胞においてアポトーシスをトリガーするというＪａｃｋｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ（２０００）による知見に言及した。
【０２５３】
Ｐｒａｓａｄ  ｅｔ  ａｌ（２００５）は、ＡＴＰ２Ａ２のハプロ不全はマウスに偏平細胞腫瘍の素因を与えることを記載する。しかしながら、Ｄｈｉｔａｖａｔ  ｅｔ  ａｌの知見とは明らかに対照的に、Ｐｒａｓａｄ  ｅｔ  ａｌはＱｕ  ｅｔ  ａｌ（２００４）に言及し、「サプシガルギン、ＳＥＲＣＡ２阻害剤によって誘導されたＥＲストレスは、ｐ５３媒介アポトーシスを妨げることが示されている」と述べている。
【０２５４】
このようにして、発明者の知識の及ぶ限り、ＡＴＰ２Ａ２はＢａｘ媒介アポトーシスに直接的に関連付けられていない。
【０２５５】
従って、本発明は、ＡＴＰ２Ａ２ポリペプチド、その抗アポトーシス誘導体または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドの細胞に投与することによって、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスに対抗することを含む。
【０２５６】
ダリエー病と双極性障害との共罹患率にかかわらず、発明者の知識の及ぶ限り、ＡＴＰ２Ａ２はいずれの神経変性病または疾患とも直接的に関連付けられていない。事実、本発明の文脈においては、双極性障害は神経変性病または疾患であると考えられない。
【０２５７】
このようにして、本発明は、ＡＴＰ２Ａ２ポリペプチド、その抗アポトーシス誘導体または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを患者に投与することによって患者において神経変性病または疾患に対抗することも含む。
【０２５８】
「ＡＴＰ２Ａ２ポリペプチド」とは、我々は、その天然に生じる変種を含むヒトＡＴＰ２Ａ２遺伝子の遺伝子産物の意味を含む。異なるタンパク質イソ形態をコードする２つの代替転写体変種は、ヒトＡＴＰ２Ａ２遺伝子について記載されている。ヒトＡＴＰ２Ａ２  ｍＲＮＡ（変種１）に対応するｃＤＮＡ配列はＧｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿１７０６６５に見出される。ヒトＡＴＰ２Ａ２  ｍＲＮＡ（変種２）に対応するｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００１６８１に見出される。転写体変種１（ＮＭ＿１７０６６５）は、ＡＴＰ２Ａ２タンパク質のより長いイソ形態１をコードする。転写体変種２（ＮＭ＿００１６８１）は、変種１よりも早い停止コドンをもたらすコーディング領域の３’末端における代替スプライス部位を用いる。イソ形態２は、イソ形態１と比較してより短くかつ区別されるＣ末端を有する。ヒトＡＴＰ２Ａ２変種１およびＡＴＰ２Ａ２変種２ポリペプチドのアミノ酸配列は、各々、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿７３３７６５およびＮＰ＿００１６７２に見出される配列、およびその天然に生じる変種を含む。
【０２５９】
ＡＴＰ２Ａ２の適当な「抗アポトーシス誘導体」は、ＡＴＰ２Ａ２の抗アポトーシス断片を含む。ＡＴＰ２Ａ２の「抗アポトーシス断片」とは、我々は、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有する、ＡＴＰ２Ａ２ポリペプチド、イソ形態１またはイソ形態２のいずれの部分も意味する。典型的には、前記断片は配列番号１４のポリヌクレオチドによってコードされるＡＴＰ２Ａ２ポリペプチド断片の抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を有する。もし前記断片がポリヌクレオチド配列番号１４によってコードされるＡＴＰ２Ａ２ポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、前記断片はポリヌクレオチド配列番号１４によってコードされるＡＴＰ２Ａ２ポリペプチドの抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０２６０】
ＡＴＰ２Ａ２の適当な「抗アポトーシス誘導体」は、（イソ形態１またはイソ形態２であるかを問わず）全長ＡＴＰ２Ａ２の修飾、または細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有する、その断片の修飾も含む。好ましくは、修飾されたＡＴＰ２Ａ２またはＡＴＰ２Ａ２の修飾された断片は、（ＮＰ＿７３３７６５またはＮＰ＿００１６７２において定義される）全長ヒトＡＴＰ２Ａ２、またはその各断片に対して少なくとも９０％配列同一性を保有する。より好ましくは、修飾されたＡＴＰ２Ａ２、またはその修飾された断片は、全長ＡＴＰ２Ａ２、または各ＡＴＰ２Ａ２断片に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％または９５％配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する。好ましくは、修飾されたＡＴＰ２Ａ２またはその修飾された断片は、ポリヌクレオチド配列番号１４によってコードされるＡＴＰ２Ａ２ポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を保有する。もし修飾されたＡＴＰ２Ａ２または修飾された誘導体が、ポリヌクレオチド配列番号１４によってコードされるＡＴＰ２Ａ２ポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％およびより好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、修飾されたＡＴＰ２Ａ２またはその修飾された断片は、ポリヌクレオチド配列番号１４によってコードされるＡＴＰ２Ａ２ポリペプチドの抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０２６１】
ＡＴＰ２Ａ２とは、我々は、他の種からのＡＴＰ２Ａ２遺伝子からの相同遺伝子産物も含む。「相同遺伝子産物」とは、我々は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿７３３７６５またはＮＰ＿００１６７２におけるヒトＡＴＰ２Ａ２アミノ酸配列に対して少なくとも９０％配列同一性を有するＡＴＰ２Ａ２ポリペプチドを含む。より好ましくは、相同遺伝子産物はヒトＡＴＰ２Ａ２に対して少なくとも９１％または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％または少なくとも９７％、または少なくとも９８％配列同一性を有するＡＴＰ２Ａ２ポリペプチドを含む。最も好ましくは、相同遺伝子産物は、ヒトＡＴＰ２Ａ２アミノ酸配列に対して少なくとも９９％配列同一性を有するＡＴＰ２Ａ２ポリペプチドを含む。ＡＴＰ２Ａ２が非ヒト対象に投与される適用では、ＡＴＰ２Ａ２は好ましくは対象と同一の種からのものであると認識される。もしＡＴＰ２Ａ２がヒト対象に投与されるならば、ＡＴＰ２Ａ２が好ましくはヒトＡＴＰ２Ａ２、またはその抗アポトーシス断片または変種である。
【０２６２】
ＡＴＰ２Ａ２をコードするポリヌクレオチドとは、我々は、ヒトＡＴＰ２Ａ２ポリペプチドおよびその天然に生じる変種をコードするｃＤＮＡを含む。ヒトＡＴＰ２Ａ２をコードするｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿１７０６６５およびＮＭ＿００１６８１に見出される。また、我々は、遺伝子暗号の縮重によって、やはりＡＴＰ２Ａ２ポリペプチドをコードする他の配列も含む。ＡＴＰ２Ａ２の抗アポトーシス断片をコードするポリヌクレオチドの例は配列番号１４にリストされる。
【０２６３】
ＨＲＭＴ１Ｌ１
【０２６４】
ＨＲＭＴ１Ｌ１（異種核リボヌクレオタンパク質メチルトランスフェラーゼ様１；ｈｍｔ１様１；タンパク質アルギニンｎ−メチルトランスフェラーゼ２；ｐｒｍｔ２としても知られる）は、異種核リボヌクレオタンパク質のようなＲＮＡ−結合タンパク質に作用できるアルギニンメチルトランスフェラーゼである。
【０２６５】
発明者の知識の及ぶ限り、ＨＲＭＴ１Ｌ１はアポトーシスに関連付けられていない。
【０２６６】
このようにして、本発明は、ＨＲＭＴ１Ｌ１ポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを細胞に投与することによって、細胞において、Ｂａｘ媒介アポトーシスに対抗することを含む。
【０２６７】
発明者の知識の及ぶ限り、ＨＲＭＴ１Ｌ１はいずれの神経変性病または疾患にも関連付けられていない。事実、ＯＭＩＭ参照番号６０１９６１によると、ＨＲＭＴ１Ｌ１はいずれの病気状態にも関連付けられておらず、発明者が知る限り、これまで治療的に用いられていない。
【０２６８】
このようにして、本発明は、医療で用いるための、ＨＲＭＴ１Ｌ１ポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０２６９】
また、本発明は、ＨＲＭＴ１Ｌ１ポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを患者に投与することによって、患者において神経変性病または疾患に対抗することも含む。
【０２７０】
「ＨＲＭＴ１Ｌ１ポリペプチド」とは、我々は、その天然に生じる変種を含むヒトＨＲＭＴ１Ｌ１遺伝子の遺伝子産物の意味を含む。同一タンパク質のイソ形態をコードする２つの代替転写体変種は、ヒトＨＲＭＴ１Ｌ１遺伝子について記載されている。より長い転写体であるヒトＨＲＭＴ１Ｌ１  ｍＲＮＡ（変種１）に対応するｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿２０６９６２に見出される。ヒトＨＲＭＴ１Ｌ１  ｍＲＮＡ（変種２）に対応するｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００１５３５に見出される。変種２は変種１と比較して５’ＵＴＲにおいて異なる。ヒトＨＲＭＴ１Ｌ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿９９６８４５およびＮＰ＿００１５２６、およびその天然に生じる変種に見出される配列を含む。
【０２７１】
ＨＲＭＴ１Ｌ１の適当な「抗アポトーシス誘導体」は、ＨＲＭＴ１Ｌ１の抗アポトーシス断片を含む。ＨＲＭＴ１Ｌ１の「抗アポトーシス断片」とは、我々は、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有するＨＲＭＴ１Ｌ１ポリペプチドの任意の部分を意味する。典型的には、前記断片は配列番号１５のポリヌクレオチドによってコードされるＨＲＭＴ１Ｌ１ポリペプチド断片の抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を有する。もし前記断片が配列番号１５のポリヌクレオチドによってコードされるＨＲＭＴ１Ｌ１ポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、前記断片は配列番号１５のポリヌクレオチドによってコードされるＨＲＭＴ１Ｌ１ポリペプチドの抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０２７２】
ＨＲＭＴ１Ｌ１の適当な「抗アポトーシス誘導体」は、全長ＨＲＭＴ１Ｌ１の修飾、または細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有する、その断片の修飾も含む。好ましくは、修飾されたＨＲＭＴ１Ｌ１またはＨＲＭＴ１Ｌ１の修飾された断片は、（ＮＰ＿９９６８４５に定義された）全長ヒトＨＲＭＴ１Ｌ１、またはその各断片に対して少なくとも９０％配列同一性を保有する。より好ましくは修飾されたＨＲＭＴ１Ｌ１、またはその修飾された断片は、全長ＨＲＭＴ１Ｌ１、または各ＨＲＭＴ１Ｌ１断片に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％または９５％配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する。好ましくは、修飾されたＨＲＭＴ１Ｌ１またはその修飾された断片は、配列番号１５のポリヌクレオチドによってコードされるＨＲＭＴ１Ｌ１ポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を保有する。もし修飾されたＨＲＭＴ１Ｌ１または修飾された誘導体が、ポリヌクレオチド配列番号１５によってコードされるＨＲＭＴ１Ｌ１ポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、修飾されたＨＲＭＴ１Ｌ１またはその修飾された断片は、ポリヌクレオチド配列番号１５によってコードされるＨＲＭＴ１Ｌ１ポリペプチドの抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０２７３】
ＨＲＭＴ１Ｌ１とは、我々は、他の種からのＨＲＭＴ１Ｌ１遺伝子からの相同遺伝子産物も含む。「相同遺伝子産物」とは、我々は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿９９６８４５においてヒトＨＲＭＴ１Ｌ１アミノ酸配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するＨＲＭＴ１Ｌ１ポリペプチドを含む。より好ましくは、相同遺伝子産物はヒトＨＲＭＴ１Ｌ１に対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％配列同一性を有するＨＲＭＴ１Ｌ１ポリペプチドを含む。なおより好ましくは、相同遺伝子産物は、ヒトＨＲＭＴ１Ｌ１に対して少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％配列同一性を有するＨＲＭＴ１Ｌ１ポリペプチドを含む。最も好ましくは、相同遺伝子産物は、ヒトＨＲＭＴ１Ｌ１アミノ酸配列に対して少なくとも９９％配列同一性を有するＨＲＭＴ１Ｌ１ポリペプチドを含む。ＨＲＭＴ１Ｌ１が非ヒト対象に投与される適用では、ＨＲＭＴ１Ｌ１は好ましくは対象と同一の種からのものであると認識される。もしＨＲＭＴ１Ｌ１がヒト対象に投与されるならば、ＨＲＭＴ１Ｌ１は好ましくはヒトＨＲＭＴ１Ｌ１、またはその抗アポトーシス断片または変種である。
【０２７４】
ＨＲＭＴ１Ｌ１をコードするポリヌクレオチドとは、我々は、ヒトＨＲＭＴ１Ｌ１ポリペプチドおよびその天然に生じる変種をコードするｃＤＮＡを含む。ヒトＨＲＭＴ１Ｌ１をコードするｃＤＮＡ配列はＧｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿２０６９６２およびＮＭ＿００１５３５に見出される。また、我々は、遺伝子暗号の縮重によって、やはりＨＲＭＴ１Ｌ１ポリペプチドをコードする他の配列も含む。ＨＲＭＴ１Ｌ１の抗アポトーシス断片をコードするポリヌクレオチドの例は、ほとんど全長のＨＲＭＴ１Ｌ１ポリヌクレオチドである配列番号１５にリストされている。
【０２７５】
これまで知られていない機能のヒト染色体３ｐからの配列
【０２７６】
配列番号１６において定義されるようなヒト染色体３ｐからのポリヌクレオチド（図６３参照）は、クローンＲＰ１１−６０５Ｍ１マップ３ｐ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＡＣ０８７０９１）上に、およびクローンＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ３  ＢＡＣＲＰ１１−１１４Ｋ９（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＡＣ０１１６０９）上に存在する。クローンＲＰ１１−６０５Ｍ１の完全な配列の長さは１５３０１３ヌクレオチドであって、配列番号１６はヌクレオチド９１３３９−９１９５８からのものである。クローンＲＰ１１−１１４Ｋ９の完全な配列の長さは１８４６８０ヌクレオチドであって、配列番号１６はヌクレオチド７９４４３−８００６３からのものである。２つのオープンリーディングフレームは（図６３において矢印によって示された）配列番号１６内に存在する。ＯＲＦ−２は配列番号１６の位置９８ないし２１７ｂｐに見出され、ＯＲＦ−３は配列番号１６の位置２６０ないし３６１ｂｐに見出され、およびこれらのＯＲＦは以下の２つの短いポリペプチド（各々配列番号２０および２１）をコードする。
【０２７７】
タンパク質−ＯＲＦ−２：ＭＬＲＮＬＧＬＶＡＦ  ＶＬＥＫＬＦＬＥＤＥ  ＳＡＶＨＶＩＬＱＶＭ  ＷＨＬＦＦＫＬＫＭ
タンパク質−ＯＲＦ−３：ＭＣＱＥＦＫＮＶＳＹ  ＷＣＶＣＡＬＦＱＥＳ  ＴＦＳＶＦＱＬＴＡＰ  ＦＰＳ
【０２７８】
発明者の知識の及ぶ限り、配列番号１６において定義されたヒト染色体３ｐからのヌクレオチド、配列番号１６のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または配列番号１６のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチドのいずれもこれまでアポトーシスと関連付けられていない。
【０２７９】
このようにして、本発明は、配列番号１６のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または配列番号１６のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを細胞に投与することによって、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスに対抗することを含む。
【０２８０】
発明者の知識の及ぶ限り、配列番号１６において定義されたヒト染色体３ｐからのポリヌクレオチド、または配列番号１６のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または配列番号１６のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチドのいずれも、これまで、いずれの神経変性病または疾患にも関連付けられていない。事実、発明者が知る限り、そのようなポリペプチドはいずれの病気状態にも関連付けられておらず、これまで治療的に用いられていない。
【０２８１】
このようにして、本発明は、医療で用いるための、配列番号１６のポリヌクレオチド、または配列番号１６のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０２８２】
本発明は、配列番号１６のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または配列番号１６のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを細胞に投与することによって、患者において神経変性病または疾患に対抗することを含む。
【０２８３】
適当な「抗アポトーシス誘導体」は、配列番号１６のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの抗アポトーシス断片、または配列番号１６のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチドの抗アポトーシス断片、または配列番号１６を含む天然に生じるポリヌクレオチド転写体によってコードされるポリペプチドの抗アポトーシス断片を含む。「抗アポトーシス断片」とは、我々は、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有するポリペプチドの任意の部分を意味する。典型的には、前記断片は配列番号１６のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド断片の抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を有する。もし前記断片が配列番号１６のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド断片の抗アポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、前記断片は配列番号１６のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド断片の抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０２８４】
適当な「抗アポトーシス誘導体」は、配列番号１６のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの、または配列番号１６のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む全長の天然に生じるポリペプチドの、または配列番号１６を含む天然に生じるポリヌクレオチド転写体によってコードされるポリペプチドの修飾、または細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有する、その断片の修飾も含む。好ましくは、修飾された誘導体の対応するセクションは、配列番号１６のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、またはその各断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を保有する。より好ましくは、修飾された誘導体の対応するセクション、またはその修飾された断片は、配列番号１６のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、またはその各断片に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％または９５％配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する。好ましくは、修飾されたポリペプチドまたはその修飾された断片は、配列番号１６のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を保有する。もし修飾されたポリペプチドまたは修飾された断片がポリヌクレオチド配列番号１６によってコードされるポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、修飾されたポリペプチドまたはその修飾された断片は、ポリヌクレオチド配列番号１６によってコードされるポリペプチドの抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０２８５】
この遺伝子／ポリペプチドが対象に投与される適用では、特にもし対象がヒト対象ならば、それは好ましくは対象と同一の種からのものであると認識される。
【０２８６】
これまで知られていない機能のヒト染色体２２ｑ１１．２２−１２．２からの配列
【０２８７】
配列番号１７において定義されたヒト染色体２２ｑ１１．２２−１２．２からのポリヌクレオチド（図６４参照）は、クローンＣＴＡ−３７３Ｈ７（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号Ｚ９９７７４）上に存在する。クローンＣＴＡ−３７３Ｈ７の完全な配列の長さは７３２３９ヌクレオチドであって、配列番号１７はヌクレオチド４１７９８−４２４９９からのものである。４つのオープンリーディングフレームは（図６４において矢印によって示される）配列番号１７内に存在し、その内２つは４５残基のポリペプチドをコードし、他方、他の２つは３０アミノ酸残基のポリペプチドをコードする。これらの４つのＯＲＦは配列番号１７内の以下の位置に存在する。ＯＲＦ−８：１４９−２４１；ＯＲＦ−４：１５３−２９０；ＯＲＦ−９：４３１−５２３；およびＯＲＦ−５：５６５−７０２。
【０２８８】
配列番号１７は５２９２のヌクレオチド４４４５−５１４６において、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃＤＮＡ  ＦＬＪ４５３２３  ｆｉｓ、クローンＢＲＨＩＰ３００６３９０（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＡＫ１２７２５６）に対して強い相同性を有する。
【０２８９】
発明者の知識の及ぶ限り、配列番号１７において定義されたヒト染色体２２ｑ１１．２２−１２．２からのポリヌクレオチド、または配列番号１７のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または配列番号１７のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチドのいずれも、これまで、アポトーシスと関連付けられていない。
【０２９０】
このようにして、本発明は、配列番号１７のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または配列番号１７のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを細胞に投与することによって、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスに対抗することを含む。
【０２９１】
また、発明者の知識の及ぶ限り、配列番号１７において定義されたヒト染色体２２ｑ１１．２２−１２．２からのポリヌクレオチド、または配列番号１７のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または配列番号１７のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチドのいずれも、これまで、いずれの神経変性病または疾患にも関連付けられていない。事実、発明者が知る限り、そのようなポリペプチドはいずれの病気状態にも関連付けられておらず、これまで治療的に用いられていない。
【０２９２】
このようにして、本発明は医療で用いるための、配列番号１７のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または配列番号１７のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０２９３】
本発明は、配列番号１７のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または配列番号１７のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを細胞に投与することによって、患者において神経変性病または疾患に対抗することを含む。
【０２９４】
適当な「抗アポトーシス誘導体」は、配列番号１７のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの抗アポトーシス断片、または配列番号１７のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチドの抗アポトーシス断片、または配列番号１７を含む天然に生じるポリヌクレオチド転写体によってコードされるポリペプチドの抗アポトーシス断片を含む。「抗アポトーシス断片」とは、我々は、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有するポリペプチドの任意の部分を意味する。典型的には、前記断片は配列番号１７のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド断片の抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を有する。もし前記断片が配列番号１７のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド断片の抗アポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、前記断片は配列番号１７のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド断片の抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０２９５】
適当な「抗アポトーシス誘導体」は、配列番号１７のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの、または配列番号１７のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む全長の天然に生じるポリペプチドの、または配列番号１７を含む天然に生じるポリヌクレオチド転写体によってコードされるポリペプチドの修飾、または細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有する、その断片の修飾も含む。好ましくは、修飾された誘導体の対応するセクションは、配列番号１６のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、またはその各断片に対して少なくとも９０％配列同一性を保有する。より好ましくは、修飾された誘導体の対応するセクション、またはその修飾された断片は、配列番号１７のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、またはその各断片に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％または９５％配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する。好ましくは、修飾されたポリペプチドまたはその修飾された断片は、配列番号１７のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を保有する。もし修飾されたポリペプチドまたは修飾された断片がポリヌクレオチド配列番号１７によってコードされるポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、修飾されたポリペプチドまたはその修飾された断片は、ポリヌクレオチド配列番号１７によってコードされるポリペプチドの抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０２９６】
この遺伝子／ポリペプチドが対象に投与される適用では、特にもし対象がヒト対象であるならば、それは好ましくは対象と同一の種からのものであると認識される。
【０２９７】
これまで知られていない機能のヒトミトコンドリア単離体ＷＨ６９６７のゲノムからの配列
【０２９８】
Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓミトコンドリア単離体ＷＨ６９６７（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＡＹ２５５１４５）は、１６５５８ヌクレオチドの完全なゲノム長さを有する。配列番号１８において定義されたポリヌクレオチド（図６５参照）はヌクレオチド８４９２ないし９１４３からのものである。２つのオープンリーディングフレームは以下の位置：ＯＲＦ−３：２５−１６８、およびＯＲＦ−５：５３５−６５１において（図６５中の矢印によって示される）配列番号１８内に存在する。
【０２９９】
発明者の知識の及ぶ限り、配列番号１８において定義されたヒトミトコンドリア単離体ＷＨ６９６７のゲノムからのポリヌクレオチド、または配列番号１８のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または配列番号１８のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチドのいずれも、これまで、アポトーシスと関連付けられていない。
【０３００】
このようにして、本発明は、配列番号１８のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または配列番号１８のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを細胞に投与することによって、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスに対抗することを含む。
【０３０１】
あるミトコンドリアタンパク質は病気状態と関連付けられていることが知られているが、発明者の知識の及ぶ限り、配列番号１８において定義されたヒトミトコンドリア単離体ＷＨ６９６７のゲノムからのポリヌクレオチド、または配列番号１８のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または配列番号１８のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチドのいずれも、これまで、いずれの神経変性病または疾患にも関連付けられていない。事実、発明者が知る限り、そのようなポリペプチドはいずれの病気状態とも関連付けられておらず、これまで治療的に用いられていない。
【０３０２】
このようにして、本発明は、医療で用いるための、配列番号１８のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、または配列番号１８のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３０３】
このようにして、本発明は、配列番号１８のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または配列番号１８のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを細胞に投与することによって、患者において神経変性病または疾患に対抗することを含む。
【０３０４】
適当な「抗アポトーシス誘導体」は、配列番号１８のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの抗アポトーシス断片、または配列番号１８のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチドの抗アポトーシス断片、または配列番号１８を含む天然に生じるポリヌクレオチド転写体によってコードされるポリペプチドの抗アポトーシス断片を含む。「抗アポトーシス断片」とは、我々は、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有するポリペプチドの任意の部分を意味する。典型的には、前記断片は配列番号１８のポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチド断片の抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を有する。もし前記断片が配列番号１８のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド断片の抗アポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、前記断片が配列番号１８のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド断片の抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０３０５】
適当な「抗アポトーシス誘導体」は、配列番号１８のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの、または配列番号１８のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む全長の天然に生じるポリペプチドの、または配列番号１８を含む天然に生じるポリヌクレオチド転写体によってコードされるポリペプチドの修飾、または細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有する、その断片の修飾も含む。好ましくは、修飾された誘導体の対応するセクションは、配列番号１８６のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、またはその各断片に対して少なくとも９０％配列同一性を保有する。より好ましくは、修飾された誘導体の対応するセクション、またはその修飾された断片は、配列番号１８のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、またはその各断片に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％または９５％配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する。好ましくは、修飾されたポリペプチドまたはその修飾された断片は、配列番号１８のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を保有する。もし修飾されたポリペプチドまたは修飾された断片がポリヌクレオチド配列番号１８によってコードされるポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、修飾されたポリペプチドまたはその修飾された断片は、ポリヌクレオチド配列番号１８によってコードされるポリペプチドの抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０３０６】
この遺伝子／ポリペプチドが対象に投与される適用では、特にもし対象がヒト対象であれば、それは好ましくは対象と同一の種からのものであると認識される。
【０３０７】
これまで知られていない機能のヒトミトコンドリア単離体Ｓ１２１６のゲノムからの配列
【０３０８】
Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓミトコンドリア単離体Ｓ１２１６（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＡＹ２８９０９３）は、１６５６９ヌクレオチドの完全なゲノム長さを有する。配列番号１９において定義されたポリヌクレオチド（図６６参照）は、ヌクレオチド７７１７ないし８２８３からのものである。２つのオープンリーディングフレームは以下の位置：ＯＲＦ−２：１７８−２７９およびＯＲＦ−１：３５５−４６２において（図６６中の矢印によって示される）配列番号１９内に存在する。
【０３０９】
発明者の知識の及ぶ限り、配列番号１９において定義されたヒトミトコンドリア単離体Ｓ１２１６のゲノムからのポリヌクレオチド、または配列番号１９のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または配列番号１９のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチドのいずれも、これまで、アポトーシスに関連付けられていない。
【０３１０】
このようにして、本発明は、配列番号１９のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または配列番号１９のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを細胞に投与することによって、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスに対抗することを含む。
【０３１１】
ミトコンドリアゲノムはある病気状態に影響されることが知られているが、発明者の知識の及ぶ限り、配列番号１９において定義されたヒトミトコンドリア単離体Ｓ１２１６のゲノムからのポリヌクレオチド、または配列番号１９のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または配列番号１９のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチドのいずれも、これまでいずれの神経変性病または疾患にも関連付けられていない。事実、発明者が知る限り、そのようなポリペプチドはいずれの病気状態にも関連付けられておらず、これまで治療的に用いられていない。
【０３１２】
このようにして、本発明は、医療で用いるための、配列番号１９のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または配列番号１９のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３１３】
本発明は、配列番号１９のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または配列番号１９のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチド、またはその抗アポトーシス誘導体、または前記ポリペプチドまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを細胞に投与することによって、患者において神経変性病または疾患に対抗することを含む。
【０３１４】
発明者の知識の及ぶ限り、配列番号１９において定義されたヒトミトコンドリア単離体Ｓ１２１６のゲノムからのポリヌクレオチド、または配列番号１９のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、または配列番号１９のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチドのいずれも、これまで、アポトーシスに、またはいずれの神経変性障害にも関連付けられていない。
【０３１５】
適当な「抗アポトーシス誘導体」は、配列番号１９のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの抗アポトーシス断片、または配列番号１９のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む天然に生じるポリペプチドの抗アポトーシス断片、または配列番号１９を含む天然に生じるポリヌクレオチド転写体によってコードされるポリペプチドの抗アポトーシス断片を含む。「抗アポトーシス断片」とは、我々は、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有するポリペプチドの任意の部分を意味する。典型的には、前記断片は配列番号１９のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド断片の抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を有する。もし前記断片が配列番号１９のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド断片の抗アポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましいのは、前記断片は配列番号１９のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド断片の抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０３１６】
適当な「抗アポトーシス誘導体」は、配列番号１９のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの、または配列番号１９のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む全長の天然に生じるポリペプチドの、または配列番号１９を含む天然に生じるポリヌクレオチド転写体によってコードされるポリペプチドの修飾、または細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有する、その断片の修飾も含む。好ましくは修飾された誘導体の対応するセクションは、配列番号１９のポリヌクレチドによってコードされるポリペプチド、またはその各断片に対して少なくとも９０％配列同一性を保有する。より好ましくは、修飾された誘導体の対応するセクション、またはその修飾された断片は、配列番号１９のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドまたはその各断片に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％または９５％配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する。好ましくは、修飾されたポリペプチドまたはその修飾された断片は、配列番号１９のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を保有する。もし修飾されたポリペプチドまたは修飾された断片がポリヌクレオチド配列番号１９によってコードされるポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。最も好ましくは、修飾されたポリペプチドまたはその修飾された断片は、ポリヌクレオチド配列番号１９によってコードされるポリペプチドの抗アポトーシス活性の１００％以上を有する。
【０３１７】
この遺伝子／ポリペプチドが対象に投与される適用では、特にもし対象がヒト対象であれば、それは好ましくは対象と同一の種からのものであると認識される。
【０３１８】
本発明の第五ないし第十の態様で有用な前記ポリペプチドの更なる修飾は、もう１つの薬剤と共に上記のポリペプチドまたはその断片、または前記ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む化合物を含むことができる。好ましくは、前記化合物は上記の各ヒトポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも３０％を保有する。もし前記化合物が上記の各ヒトポリペプチドの抗アポトーシス活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、または１００％以上を有するならば、より好ましい。薬剤は、当分野で周知のように、前記ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに融合し、それと合わされ、それに結合し、それに連結し、またはそうでなければそれと会合することができる。
【０３１９】
有用であり得る薬剤は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを、例えば、海馬のような標的組織へ標的化することができる標的化部位を含む。適当な標的化部位はＨＩＶ−Ｔａｔ、アンテナペディア、ＰＴＤ−５およびリシンホモポリマーのようなタンパク質変換ドメインを含む。
【０３２０】
本発明の第十一の態様は細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを増加させる方法を提供し、前記方法はＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチドの阻害剤またはアンタゴニストと細胞とを接触させることを含む。
【０３２１】
典型的には、前記方法はインビトロで行われる。
【０３２２】
典型的には、実施例から明らかなように、細胞は酵母のような他の種からのものであってよいが、細胞はヒト細胞のような哺乳動物細胞である。前記細胞は樹立した細胞系、初代細胞培養、またはエクスビボにて組織に存在する細胞であってよい。
【０３２３】
別法として、前記方法はインビボで行ってもよい。
【０３２４】
本発明の第十二の態様は、患者の細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを増加させるための医薬の調製における、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチドの阻害剤またはアンタゴニストの使用を提供する。
【０３２５】
本発明の第十三の態様は、医療で用いるための、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチドの阻害剤またはアンタゴニスト、または前記阻害剤またはアンタゴニストのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０３２６】
本発明の第十四の態様は、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチドの阻害剤またはアンタゴニスト、または前記阻害剤またはアンタゴニストのいずれかをコードするポリヌクレオチド、および医薬的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【０３２７】
Ｂａｘ媒介アポトーシスの増大は、癌、特に脳腫瘍に対抗するのに有用であり得る。癌細胞は不滅である。なぜならば、正常な細胞はそれがアポトーシスを受けなければならないときにそれを受けないからである。特異的な組織からのアポトーシス阻害剤を見出すことによって、アポトーシスのプロセスを阻害するタンパク質の発現をダウンレギュレートすることによって癌を治療することができる。
【０３２８】
本発明の第十五の態様は、患者において癌に対抗する方法を提供し、前記方法はＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチドの阻害剤またはアンタゴニスト、または前記阻害剤またはアンタゴニストのいずれかをコードするポリヌクレオチドを患者に投与することを含む。
【０３２９】
本発明の第十六の態様は、患者において癌に対抗するための医薬の調製における、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチドの阻害剤またはアンタゴニスト、または前記阻害剤またはアンタゴニストのいずれかをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
【０３３０】
上記リストのポリペプチドの適当な阻害剤またはアンタゴニストは、前記ポリペプチドに選択的に結合する抗体を含む。適当な抗体は、当分野で長く樹立された技術を用いて当業者によってなすことができる。上記リストのポリペプチドの抗アポトーシス活性を阻害する抗体は抗癌治療剤のために特に好ましく、それらは、当分野で周知であり、かつ本明細書で記載された方法を用いてこの活性について選択することができる。
【０３３１】
特定のポリペプチドに選択的に結合する抗体とは、我々は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のような無関係なポリペプチドよりも大きな親和性でそのポリペプチドに抗体分子が結合することを意味する。好ましくは、抗体が無関係なポリペプチドよりも５、または少なくとも１０または少なくとも５０倍大きな親和性で特定のポリペプチドに結合する。より好ましくは、抗体分子は無関係なポリペプチドに対するよりも少なくとも１００、または少なくとも１，０００、または少なくとも１０，０００倍大きな親和性で特定のポリペプチドに結合する。そのような結合は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムの１つのような当分野で周知の方法によって決定してもよい。好ましくは、抗体分子は、身体中の他のポリペプチドに有意に結合することなく特定のポリペプチドに選択的に結合する。より高い親和性を持つ抗体がなおより好ましいが、もし抗体が少なくとも１０−８Ｍの特定のポリペプチド上のその標的エピトープに対する親和性を有するならば、それは好ましい。
【０３３２】
「抗体」または［抗体分子］とは、我々は、当分野で周知の全免疫グロブリン分子のみならず、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖのようなその断片、および抗原−結合部位を保有するその他の断片も含む。同様に、抗体という用語は、単一鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）および単離されたＶドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）のような遺伝子工学により作成された抗体の誘導体を含む。前記用語は、特定のポリペプチドに、またはその特定の領域に結合する分子のための、ファージディスプレイ技術または他のランダム選択技術を用いて生産することができる抗体様分子も含む。このようにして、抗体という用語は、天然抗体の認識部位（すなわち、エピトープまたは抗原に結合する、またはそれと組み合わされる抗体の部分）の一部である構造、好ましくはペプチド構造を含有する全ての分子を含む。その特定の結合部位を保有する抗体断片の合成に関与する技術の一般的な概説は、Ｗｉｎｔｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，２９３−２９９に見出される。
【０３３３】
「ＳｃＦｖ分子」とは、我々は、ＶＨおよびＶＬパートナードメインがフレキシブルなオリゴペプチドを介して連結される分子を意味する。ＳｃＦｖ抗体のような作成された抗体は、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ：ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｄｉｇｏｘｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，ｐｐ．５８７９−５８８３，およびＡ．Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，（１９９１）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ」，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９（６）：５４５−５１に記載された技術およびアプローチを用いて作成することができる。
【０３３４】
全抗体よりはむしろ抗体断片を用いる利点は数倍である。断片のより小さなサイズは、標的部位への良好な浸透のような改良された薬理学的特性に導くことができる。補体結合のような全抗体のエフェクター機能は除去される。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片は、全て、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、分泌することができ、このようにして、大量の断片の容易な生産を可能とする。全抗体、およびＦ（ａｂ’）２断片は「二価」である。「二価」とは、我々は、抗体およびＦ（ａｂ’）２断片が２つの抗原組合せ部位を有することを意味する。対称的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ断片は一価であり、ただ１つの抗原組合せ部位を有する。
【０３３５】
もし抗体がモノクローナル抗対であれば、好ましい。いくつかの状況において、特にもし抗体がヒト患者に反復して投与されようとしているならば、もしモノクローナル抗体がヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体であれば、好ましい。本明細書で記載されたように反応性である適当なモノクローナル抗体は公知の技術、例えば、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ｈ  Ｚｏｌａ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）および「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」，ＳＧＲ  Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８２）に開示されたものによって調製することができる。
もし抗体がヒト化抗体であれば、好ましい。適当に調製された非ヒト抗体は、例えば、マウス抗体のＣＤＲ領域をヒト抗体のフレームワークに挿入することによって、公知の方法で「ヒト化」することができる。ヒト化抗体は、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，１５３４−１５３６，およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ，（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１４（７），７７３−７８３に記載された技術およびアプローチを用いて作成することができる。完全にヒトの抗体は、組換え技術を用いて生産してもよい。典型的には、数十億の異なる抗体を含む大きなライブラリーを用いる。例えば、ネズミ抗体のキメラ化またはヒト化を使用するこれまでの技術とは対称的に、この技術は特異的抗体を作り出すのに動物の免疫化に頼らない。その代わり、組換えライブラリーは非常に多数の予め作成された抗体変種を含み、前記ライブラリーはいずれかの抗原に対して特異的な少なくとも１つの抗体を有するようである。このようにして、そのようなライブラリーを用い、所望の結合特徴を有する現存の抗体を同定することができる。ライブラリーにおいて効果的ま様式で良好なバインダーを見出すためには、表現型、すなわち、抗体または抗体断片がその遺伝子型、すなわち、コーディング遺伝子にリンクされる種々のシステムが工夫されている。最も普通に使用されるそのようなシステムはいわゆるファージディスプレイシステムであり、ここに、抗体断片は、ディスプレイされる分子をコードする遺伝的情報を同時に運びつつ、線状ファージ粒子の表面にあるファージコートタンパク質との融合として発現され、ディスプレイされる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４）。特定の抗原に対して特異的な抗体断片をディスプレイファージは、問題とする抗原への結合を介して選択することができる。次いで、単離されたファージを増幅することができ、選択された抗体可変ドメインをコードする遺伝子は、場合により、例えば、全長免疫グロブリンのような他の抗体フォーマットに移すことができ、当分野で周知の適したベクターおよび宿主細胞を用いて多量に発現させることができる。
【０３３６】
ファージ粒子上のディスプレイされた抗体の特異性のフォーマットは異なり得る。最も普通に用いられるフォーマットは、共に、抗体の可変抗原結合ドメインを含むＦａｂ（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９４．ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：３２４５−３２６０）および単一鎖（ｓｃＦｖ）（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ，１９９２，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２２７：３８１−３８８）である。単一鎖フォーマットは、フレキシブルなリンカーを介して可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に連結された可変重鎖ドメイン（ＶＨ）から構成される（米国特許第４，９４６，７７８号）。治療剤として用いる前に、抗体は可溶性フォーマット、例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖに移すことができ、それ自体分析することができる。後の工程において、望ましい特徴を有すると同定された抗体断片は、全長抗体のようななお他のフォーマットに移すことができる。
【０３３７】
ＷＯ  ９８／３２８４５およびＳｏｄｅｒｌｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．１８：８５２−８５６は、抗体ライブラリーにおける可変性の生成についての技術を記載する。このライブラリーに由来する抗体断片は、全て、同一フレームワーク領域を有し、そのＣＤＲが異なるに過ぎない。フレームワーク領域は生殖系配列のものであるので、前記ライブラリー、または同一技術を用いて作り出した同様なライブラリーに由来する抗体の免疫原生は特に低いと予測される（Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ，２０００）。この特性は治療抗体について大きな価値があり、患者が投与された抗体に対する抗体を形成する危険性を低下させ、それにより、アレルギー反応の危険性、抗体のブロックの出現を低下させ、および抗体の長い血漿中半減期を可能とする。このようにして、ヒトで用いるべき治療抗体を開発する場合、現代の組換えライブラリー技術（Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．  ＆  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．４：４０９−４１６）は、今日、より初期のハイブリドーマー技術よりも優先して用いられる。
【０３３８】
上記リストのポリペプチドの他の適当な阻害剤またはアンタゴニストは、上記リストのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して特異的であって、その発現を妨げるｓｉＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチドおよびリボザイム分子を含む。
【０３３９】
小さな干渉性ＲＮＡはＨａｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，４１８（６８９４）：２４４−５１（２００２）；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１，（２００２）；およびＳｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９，５５１５−５５２０（２００２）によって記載されている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、発現停止された遺伝子に対して配列が相同な二本鎖（ｄｓＲＮＡ）によって開始される動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスである。配列特異的ｍＲＮＡ分解のメディエーターは、典型的には、インビボにて、より長いｄｓＲＮＡからリボヌクレアーゼＩＩＩ切断によって生じさせることができる２１および２２ヌクレオチド小干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。２１−ヌクレオチドｓｉＲＮＡデュプレックスは、内因性および異種遺伝子双方の発現を特異的に抑制することが示されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８）。哺乳動物細胞においては、ｓｉＲＮＡは以下に記載する２つの相補的２１量体よりならなければならないと考えられる。なぜならば、より長い二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡはＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ）を活性化し、総じてのタンパク質合成を阻害するからである。
【０３４０】
上記リストのポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドに対して選択的なデュプレックスｓｉＲＮＡ分子は、そのｃＤＮＡ配列への参照によって容易に設計することができる。例えば、それらは上記リストのＧｅｎｂａｎｋアクセション番号におけるｃＤＮＡ配列、または実施例に記載されたスクリーニングの結果として同定されたｃＤＮＡ配列を参照することによって設計することができる（図６２ないし６６中の配列番号５ないし１９）。典型的には、イニシエイターメチオニンコドンから少なくとも１２０ヌクレオチド下流にあるＡＡジヌクレオチドで始まる最初の２１量体配列を選択する。これに対して完全に相補的なＲＮＡ配列は第一のＲＮＡオリゴヌクレオチドとなる。第二のＲＮＡ配列は、さらなるＵＵジヌクレオチドがその３’末端にある、第一のものの第一の１９残基に対して完全に相補的とすべきである。一旦設計されれば、合成ＲＮＡ分子は当分野で周知の方法を用いて合成することができる。
【０３４１】
ｓｉＲＮＡは、本明細書で記載されたもののようないずれかの適当な方法を用いて患者中の細胞に導入することができる。典型的には、例えば、適当な担体または媒体内に含有させることによって、ＲＮＡを細胞外に環境から保護する。リポソーム媒介導入が好ましい。もしオリゴフェクタミン方法を用いれば特に好ましい。
【０３４２】
上記リストしたポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドに対して選択的なアンチセンス核酸分子は、当分野で周知のように、そのｃＤＮＡまたは遺伝子配列を参照することによって容易に設計することができる。オリゴヌクレオチドのようなアンチセンス核酸は、相補的核酸配列に特異的に結合することができる一本鎖核酸である。適した標的配列へ結合することによって、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、またはＲＮＡ−ＤＮＡデュプレックスが形成される。これらの核酸はしばしば「アンチセンス」といわれる。なぜならば、それらは遺伝子のセンスまたはコーディングストランドに対して相補的だからである。近年、三重螺旋の形成が可能であることが判明し、そこではオリゴヌクレオチドはＤＮＡデュプレックスに結合している。オリゴヌクレオチドはＤＮＡ二重螺旋の主な溝中の配列を認識できることが判明した。それにより三重螺旋が形成された。これは、主な溝の水素結合部位の認識を介して二本鎖ＤＮＡに特異的に結合する配列特異的分子を合成するのが可能であることを示唆する。標的核酸に結合することによって、前記オリゴヌクレオチドは標的核酸の機能を阻害することができる。これは、例えば、転写、プロセッシング、ポリ（Ａ）付加、複製、翻訳のブロッキング、またはＲＮＡ分解の促進のような細胞の阻害性メカニズムの促進の結果であり得る。
【０３４３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは実験室で調製され、次いで、例えば、細胞培養基からの細胞へのマイクロインジェクションまたは摂取によって細胞に導入され、あるいはプラスミドまたはレトロウイルスあるいはアンチセンス遺伝子を運ぶ他のベクターでのトランスフェクションの後にそれらは細胞で発現される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、最初、ラウス肉腫ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、単純疱疹ウイルス１型、シミアンウイルス、およびインフルエンザウイルスのための細胞培養におけるウイルス複製または発現を阻害することが発見された。それ以来、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるｍＲＮＡ翻訳の阻害が、ウサギ網状赤血球溶解物および小麦胚芽抽出物を含む無細胞系において広く研究されてきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドによるウイルス機能の阻害は、ＡＩＤＳ  ＨＩＶレトロウイルスＲＮＡに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを用いてエクスビボで示された（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．１９８８「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｐｉｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５（１５），５５０７−１１）。Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄの研究は、最も効果的であったオリゴヌクレオチドはポリ（Ａ）シグナルに対して相補的であり；また効果的なものは、ＲＮＡのプライマー結合部位の隣の、およびプライマー結合部位における特にキャップおよび５Ｎ非翻訳領域であったことを示した。前記キャップ、５’非翻訳領域、およびポリ（Ａ）シグナルは、レトロウイルスＲＮＡの末端に反復した配列（Ｒ領域）内にあり、これらに相補的なオリゴヌクレオチドはＲＮＡに二回結合することができる。
【０３４４】
典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは長さが１５ないし３５塩基である。例えば、２０−量体オリゴヌクレオチドは表皮成長因子受容体ｍＲＮＡの発現を阻害することが示されており、（Ｗｉｔｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ５３：４１−５０（１９９９））、２５−量体オリゴヌクレオチドは９０％を超えて、副腎皮質ホルモンの発現を減少させることが示されている（Ｆｒａｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ９１：２６１−７（１９９９））。しかしながら、この範囲外の長さ、例えば、１０、１１、１２，１３または１４塩基、あるいは３６、３７、３８、３９、または４０塩基のオリゴヌクレオチドを用いるのが望ましいと認識される。
【０３４５】
アンチセンスポリヌクレオチドは全身投与することができる。別法として、かつ好ましくは、塩基対合に特徴的なポリヌクレオチドの固有の結合特異性は、その意図した遺伝子座へのインビボでのポリヌクレオチドの利用可能性を制限することによって増強され、より小さな用量を用いることを可能とし、全身効果を最小化させる。このようにして、ポリヌクレオチドを癌に局所適用して、所望の効果を達成することができる。もしポリヌクレオチドを全身投与すれば、所望の遺伝子座におけるポリヌクレオチドの濃度はかなり高く、治療効果は、有意により低い合計量を用いて達成することができる。ポリヌクレオチドの局所的な高い濃度は、標的化細胞の浸透を増強させ、標的核酸配列の翻訳を効果的にブロックする。
【０３４６】
アンチセンス剤は、上記リストのポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド（ｍＲＮＡまたは遺伝子）に結合するより大きな分子も含み、タンパク質の発現を実質的に妨げると認識される。このようにして、各ｍＲＮＡに対して実質的に相補的なアンチセンス分子も考えられる。
【０３４７】
より大きな分子はいずれかの適当な遺伝子構築体から発現させ、患者に送達することができる。典型的には、アンチセンス分子を発現する遺伝子構築体は、少なくとも、細胞においてアンチセンス分子を発現させることができるプロモーターに操作可能に連結されたｃＤＮＡまたは遺伝子の一部を含む。好ましくは、遺伝子構築体はヒト細胞への送達について適合される。
【０３４８】
リボザイムは、核酸を部位特異的様式で切断するＲＮＡまたはＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保有する特異的触媒ドメインを有する。例えば、非常に多数のリボザイムは、高度な特性でホスホエステル導入反応を加速させ、しばしば、オリゴヌクレオチド基質中のいくつかのホスホエステルの唯一つを切断する。この特異性は、化学反応に先立ってリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）への特異的塩基対合相互作用を介して基質が結合する要件に帰されてきた。
【０３４９】
リボザイム触媒は、核酸に関連する配列特異的切断／連結反応の一部として主として観察されてきた。例えば、米国特許第５，３５４，８５５号は、ある種のリボザイムが、公知のリボヌクレアーゼのそれよりも大きく、かつＤＮＡ制限酵素のそれに近づく配列特異性でもってエンドヌクレアーゼとして作用できることを報告する。このようにして、遺伝子発現の配列特異的リボザイム媒介阻害は治療的適用に特に適しており、先に与えたＧｅｎｂａｎｋアクセション番号にリストされたｃＤＮＡ配列を参照することによって、または配列番号５ないし１９を参照することによって設計することができる。
【０３５０】
上記リストのポリペプチドのいずれかをコードする薬剤の転写を抑制する更なる遺伝子は、例えば、Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９（７）：６５６−６０（２００１））およびＵｒｎｏｖ（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，６４（５−６）：９１９（２００２））に記載された作成された転写リプレッサーを用いて設計することもできる。加えて、それらは、例えば、本発明の後の態様に記載されたスクリーニング方法を用いて選択することができる。
【０３５１】
療法（治療）はヒトまたは動物に対するものであってよい。好ましくは、本発明の方法を用いて、ヒトを治療する。
【０３５２】
本発明の第五ないし第十六の態様において上述した種々の治療剤は、典型的には、すなわち、医薬的に許容される担体または賦形剤と共に、医薬組成物として個体への投与のために処方される。
【０３５３】
「医薬的に許容される」とは、処方が滅菌されており、かつパイロジェンフリーであることが含まれる。適当な医薬担体は製剤の分野において周知である。
【０３５４】
担体は、治療剤に適合する意味で「許容できる」ものでなければならず、かつその受容者に対して有害でないというのでなければならない。典型的には、担体は、滅菌されかつパイロジェンフリーである水または生理食塩水であり；しかしながら、他の許容できる担体を用いてもよい。
【０３５５】
実施形態において、本発明の医薬組成物または処方は非経口投与のためのものであり、より特には、例えば、注射による静脈内投与のためである。非経口投与に適した処方は、処方を意図した受容者の血液と等張とする抗酸化剤、緩衝液、静菌剤および溶質を含有することができる水性および非水性滅菌注射溶液；および懸濁化剤および増粘剤を含むことができる水性および非水性滅菌懸濁液を含む。
【０３５６】
別の好ましい実施形態において、医薬組成物は、患者への局所投与に適している。
【０３５７】
好ましくは、処方は、有効成分の日用量またはユニット、日サブ用量を含有する単位用量、またはその適当な画分である。
【０３５８】
治療剤は、医薬的に許容される投与形態にて、場合により、非毒性の有機または無機の酸または塩基の付加塩の形態で、有効成分を含む医薬処方の形態で、経口またはいずれかの非経口経路によって投与してもよい。治療すべき障害および患者、ならびに投与の経路に依存して、組成物は種々の用量で投与してもよい。
【０３５９】
本明細書で用いるように、用語「治療剤」は、文脈が他のことを要求する場合を除いて、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドおよび他の分子を含む。例えば、いくつかの状況において、用語「治療剤」とは、ポリペプチドのみをいい、あるいはポリヌクレオチドのみをいい、これは文脈から明らかである。
【０３６０】
ヒト療法においては、治療剤は単独で投与することができるが、一般には、投与の意図した経路および標準的な医薬プラクティスに関して選択された適当な医薬賦形剤、希釈剤、または担体と混合して投与される。
【０３６１】
例えば、治療剤は、即時、遅延または制御放出適用のために、香味または着色剤を含有してもよい、錠剤、カプセル、卵型剤、エリキシル、溶液または懸濁液の形態で経口、バッカルまたは舌下投与することができる。本発明の化合物は洞内注射を介して投与してもよい。
【０３６２】
そのような錠剤はマイクロクリスタリンセルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウムおよびグリシンのような賦形剤、澱粉（好ましくは、トウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカ澱粉）、澱粉グリコレートナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、およびある種の複雑なシリケートのような崩壊剤、およびポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシ−プロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチンおよびアカシアのような顆粒バインダーを含有することができる。加えて、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリルおよびタルクのような滑沢剤を含んでもよい。
【０３６３】
同様なタイプの固体組成物もまたゼラチンカプセル中の充填剤として使用することができる。好ましい賦形剤は、この点に関して、ラクトース、澱粉、セルロース、乳糖または高分子量ポリエチレングリコールを含む。水性懸濁液および／またはエリキシルについては、治療剤を種々の甘味または香味剤、着色物質または色素と、乳化および／または懸濁化剤と、および水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリンおよびその組合せのような希釈剤と組み合わせてもよい。
【０３６４】
治療剤は非経口、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、クモ膜下腔内、心室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内または皮下投与することもでき、あるいはそれらは注入技術によって投与してもよい。それらは、他の物質、例えば、溶液を血液に対して等張とするための十分な塩またはグルコースを含有してもよい滅菌水性溶液の形態で最良に用いられる。水性溶液は、もし必要ならば、（好ましくは、３ないし９のｐＨに）適当に緩衝化すべきである。滅菌条件下での適当な非経口処方の調製は、当業者に周知の標準的な医薬技術によって容易に達成される。
【０３６５】
非経口投与に適当な処方は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および処方を意図した受容者の血液と等張とする溶質を含有してもよい水性および非水性滅菌注射溶液；および懸濁化剤および増粘剤を含んでもよい水性および非水性滅菌懸濁液を含む。処方は単位用量または多数用量容器、例えば、密封したアンプルおよびバイアル中で提供してもよく、滅菌液体担体、例えば、注射用水の添加のみを使用直前に要求するフリーズドライ（凍結乾燥）条件で貯蔵してもよい。即席注射溶液および懸濁液は、先に記載した種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製してもよい。
【０３６６】
ヒト患者への経口および非経口投与のためには、治療剤の日用量レベルは、通常、単一または分割用量で投与される成人当たり１ないし１００ｍｇ（すなわち、約０．０１５ないし１５ｍｇ／ｋｇ）である。
【０３６７】
このようにして、例えば、治療剤の錠剤またはカプセルは、必要に応じて、単回または一度に２回以上の投与のために１ｍｇないし１０００ｍｇの活性剤を含有してもよい。いずれにしても、医師が、任意の個々の患者について最も適した現実の用量を決定し、それは特定の患者の年齢、体重および応答に従って変化する。上記用量は、平均的場合の例示である。もちろん、より高いまたはより低い用量範囲が利点がある個々の場合があり得るが、それは本発明の範囲内にある。
【０３６８】
治療剤は鼻腔内または吸入によって投与してもよく、便宜には、適当なプロペラント、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロ−エタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４Ａ３）または１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ  ２２７ＥＡ３）のようなヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素または他の適当なガスを使用して、圧縮容器、ポンプ、スプレーまたはネビュライザーから乾燥粉末吸入剤またはエアロゾルスプレー供給の形態で送達される。圧縮エアロゾルの場合には、用量単位は、バルブを提供して、計量された量を送達することによって決定してもよい。圧縮容器、ポンプ、スプレーまたはネビュイライザーは、例えば、加えて滑沢剤、例えば、ソルビタントリオレエートを含有してもよい、溶媒としてのエタノールおよびプロペラントの混合物を用いて活性化合物の溶液または懸濁液を含有してもよい。吸入剤または吸入器で用いるための（例えば、ゼラチンから作成された）カプセルおよびカートリッジを、治療剤およびラクトースまたは澱粉のような適当な粉末基材の粉末ミックスを含有するように処方してもよい。
【０３６９】
エアロゾルまたは乾燥粉末処方は、各計量された用量または「パフ」が患者への送達用の治療剤の少なくとも１ｍｇを含有するように好ましくは配置される。エアロゾルを含む全日用量は患者間で変化し、単一用量にて、あるいはより通常には、１日にわたって分割用量にて投与してもよいことが認識される。
【０３７０】
別法として、治療剤は坐薬またはペッサリーの形態で投与することができ、あるいはそれらはローション、溶液、クリーム、軟膏またはダスティングパウダーの形態で局所投与してもよい。また、治療剤は、例えば、皮膚パッチを用いることによって経皮投与してもよい。また、それらは特に目の病気を治療するために目経路によって投与してもよい。本発明に従って治療することができる目の病気は緑内障、網膜色素変性症、白内障形成、網膜芽細胞腫、網膜虚血症および糖尿病性網膜障害を含む。
【０３７１】
眼科使用では、治療剤は等張のｐＨが調整された滅菌生理食塩水中のミクロン化懸濁液として、あるいは好ましくは場合により塩化ベンザルコニウムのような保存剤と組み合わせてもよい等張のｐＨが調整された滅菌生理食塩水中の溶液として処方することができる。別法として、それらは、ペテロラタムのような軟膏中に処方してもよい。
【０３７２】
皮膚への局所適用では、治療剤は、例えば、以下の、鉱油、液体ペテロラタム、白色ペテロラタム、プロピレングリコールポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化性ワックスおよび水のうちの１以上との混合物に懸濁または溶解させた活性化合物を含有する適当な軟膏として処方することができる。別法として、それらは、例えば、以下の、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、ステアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水の１以上の混合物に懸濁または溶解させた適当なローションまたはクリームとして処方することができる。
【０３７３】
口中への局所投与に適当な処方は香味ベース、通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガカント中の有効成分を含むロゼンジ；ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアのような不活性なベース中の有効成分を含むパスチレ；および適当な液体担体中の有効成分を含むマウスウォッシュを含む。
【０３７４】
動物使用では、治療剤は通常の動物プラクティスに従って適当に許容できる処方として投与され、動物外科医は特定の動物に最も適する投与計画および投与の経路を決定する。
【０３７５】
実施形態において、ポリペプチドは、注射持続−放出薬物送達系を用いて送達してもよい。これらは、注射の頻度を低下させるように特異的に設計される。そのような系の例は、一旦注射されると、持続時間にわたってｒｈＧＨをゆっくりと放出する生分解性マイクロスフィアー中に組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）をカプセル化するＮｕｔｒｏｐｉｎデポ剤である。
【０３７６】
ポリペプチドは、薬物を必要な部位に直接的に放出する外科的に移植されたデバイスによって投与することができる。例えば、Ｖｉｔｒａｓｅｒｔはガンシクロビールを直接的に目に放出して、ＣＭＶ網膜炎を治療する。この毒性剤の病気の部位への直接的適用は、薬物の有意な全身副作用なくして有効な療法を達成する。
【０３７７】
エレクトロポレーション療法（ＥＰＴ）システムをポリペプチドの投与の代わりに使用することもできる。パルス電場を細胞に送達するデバイスは薬物に対する細胞膜の透過性を増大させ、その結果、細胞内薬物送達の有意な増強がもたらされる。
【０３７８】
ポリペプチドはエレクトロインコーポレーション（ＥＩ）によって送達することもできる。皮膚の表面にある直径が３０ミクロンまでの小さな粒子がエレクトロポレーションで用いたのと同一または同様な電気パルスを経験する場合に、ＥＩが起こる。ＥＩにおいては、これらの粒子は角質層を通って、皮膚のより深い層まで駆動される。粒子は薬物または遺伝子が負荷、またはコートでき、あるいは単純に、それを通って薬物が進入できる皮膚中にポアを生じさせる「弾丸」として作用することができる。
【０３７９】
ポリペプチド送達の代替方法は、熱感受性であるＲｅＧｅｌ注射システムである。体温未満で、ＲｅＧｅｌは注射可能な液体であり、他方、体温においては、それは直ちにゲル貯蔵庫を形成し、それは、ゆっくりと侵食され、公知の安全な生分解性ポリマーに溶解される。活性な薬物はバイオポリマーが溶解するにつれて経時的に送達される。
【０３８０】
ポリペプチド医薬は経口送達することもできる。前記プロセスは身体中へのビタミンＢ１２の経口摂取のための天然プロセスを使用して、タンパク質およびペプチドを共送達する。ビタミンＢ１２摂取システムに乗ることによってタンパク質またはペプチドは腸の壁を通過して移動できる。複合体はビタミンＢ１２アナログ、および複合体のビタミンＢ１２部分において固有の因子（ＩＦ）に対する有意な親和性、および複合体の薬物部分の有意な生物活性双方を保有する薬物の間で合成される。
【０３８１】
ポリヌクレオチドは、任意の効果的な方法によって、例えば、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）、またはオリゴヌクレオチドが患者の血流中にアクセスし、そこで循環するのを可能とする経口、鼻腔または他の手段によって投与してもよい。全身投与されるポリヌクレオチドは、好ましくは、局所投与されるポリヌクレオチドに加えて与えられるが、局所投与の不在下においてやはり利用性を有する。成人への投与当たり約０．１ないし約１０グラムの範囲の用量は、一般には、この目的で効果的である。
【０３８２】
ポリヌクレオチドは後に記載するように適当な遺伝子構築体として投与し、患者に送達することができ、そこでそれは発現される。典型的には、遺伝子構築体中のポリヌクレオチドは細胞中で化合物を発現することができるプロモーターに操作可能に連結される。本発明の遺伝子構築体は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（２００１）において当分野で周知の方法を用いて調製することができる。
【０３８３】
ポリヌクレオチドの送達用の遺伝子構築体は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得るが、もしそれらがＤＮＡであれば、好ましい。
【０３８４】
好ましくは、遺伝子構築体はヒト細胞への送達に適合される。
【０３８５】
遺伝子構築体を動物身体中の細胞に導入する手段および方法は当分野で知られている。例えば、本発明の構築体は、任意の便宜な方法、例えば、レトロウイルスが関与する方法によって、構築体が細胞のゲノムに導入されるように細胞に導入することができる。例えば、Ｋｕｒｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ（１９９１，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃ．ａｎｄ  Ｆｕｎｃ．１６，５０３−５１０）においては、精製されたレトロウイルスが投与される。上記ポリヌクレオチドを含むレトロウイルスＤＮＡ構築体は、当分野で周知の方法を用いて作成することができる。そのような構築体から活性なレトロウイルスを生産するためには、１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を含有するダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた異所性ｐｓｉ２パッキング細胞系を用いるのが通常である。細胞系のトランスフェクションは、便宜には、リン酸カルシウム共沈殿によるものであり、適当な形質転換体は、Ｇ４１８の（レトロウイルス構築体がｎｅｏＲ遺伝子を含有すると仮定して）１ｍｇ／ｍｌの最終濃度までの添加によって選択される。独立したコロニーを単離し、拡大し、培養上清を除去し、０．４５μｍのポアサイズのフィルターを通して濾過し、−７０℃で貯蔵する。腫瘍細胞へのレトロウイルスの導入のためには、例えば、１０μｇ／ｍｌのポリブレンが加えられたレトロウイルス上清に直接注入するのが便宜である。直径が１０ｍｍを超える腫瘍では、０．１ｍｌおよび１ｍｌの間のレトロウイルス上清；好ましくは０．５ｍｌを注入するのが適している。
【０３８６】
別法として、Ｃｕｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６，１５５０−１５５２）に記載されているように、レトロウイルスを生産する細胞を注入する。そのように導入されたレトロウイルス生産細胞は、ベクターの連続的生産がインサイチュにて腫瘍塊内で起こるように、レトロウイルスベクター粒子を能動的に生産するように作成される。このようにして、増殖する表皮細胞は、もしレトロウイルスベクター生産細胞と混合されれば、首尾よくインビボにて形質導入できる。
【０３８７】
標的化レトロウイルスを本発明で用いるのにやはり利用でき；例えば、特異的結合親和性を付与する配列を予め存在するウイルスｅｎｖ遺伝子に作成することができる（遺伝子療法についてのこのおよび他の標的化ベクターの概説については、Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｖｉｌｅ（１９９５）Ｆａｓｅｂ  Ｊ．９，１９０−１９９参照）。
【０３８８】
他の方法は、限定された時間の間の、あるいはゲノムへの組込についての、より長い時間の間の、その中への発現用の細胞への構築体の単純な送達を含む。後者のアプローチの例はリポソームを含む（Ｎａｓｓａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２，６４６−６５３）。
【０３８９】
送達の他の方法は、抗体−ポリリシンブリッジを介する外部ＤＮＡを運ぶアデノウイルス（Ｃｕｒｉｅｌ（１９９３）Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．４０，１−１８参照）および担体としてのトランスフェリンポリカチオンコンジュゲート（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，３４１０−３４１４）を含む。これらの方法の最初において、ポリカチオン−抗体複合体は本発明のＤＮＡ構築体または他の遺伝子構築体とで形成され、抗体は野生型アデノウイルス、または抗体に結合する新しいエピトープが導入された変種アデノウイルスのいずれかに対して特異的である。ポリカチオン部位は、リン酸骨格との静電的相互作用を介してＤＮＡに結合する。アデノウイルスは、それが変化していない繊維およびペントンタンパク質を含有するゆえに、細胞に内部化され、本発明のＤＮＡ構築体をそれと共に細胞に運ぶ。もしポリカチオンがポリリシンであるならば、好ましい。
【０３９０】
代替方法において、受容体媒介エンドサイトーシスを用いて、ＤＮＡマクロ分子を細胞に運ぶ高効率核酸送達系を使用する。これは、鉄輸送タンパク質トランスフェリンを、核酸に結合するポリカチオンにコンジュゲートさせることによって達成される。ヒトトランスフェリン、またはニワトリホモログコナルブミンまたはその組合せを、小さなＤＮＡ結合タンパク質プロタミンに、または種々のサイズのポリリシンに、ジスルフィド結合を通じて共有結合させる。これらの修飾されたトランスフェリン分子は、それらの同族受容体に結合し、および細胞への効果的な鉄輸送を媒介するそれらの能力を維持する。トランスフェリンポリカチオン分子は、（２１キロベース対のＤＮＡに対して短いオリゴヌクレオチドから）核酸サイズとは独立して、本発明のＤＮＡ構築体または他の遺伝子構築体とで電気泳動的に安定な複合体を形成する。トランスフェリン−ポリカチオンおよび本発明のＤＮＡ構築体または他の遺伝子構築体の複合体が腫瘍細胞に供給されると、細胞中の構築対からの高レベルの発現が予想される。
【０３９１】
Ｃｏｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，６０９４−６０９８の方法によって生産された欠陥がある、または化学的に不活性化されたアデノウイルス粒子のエンドソーム破壊活性を用いる本発明のＤＮＡ構築体または他の遺伝子構築体の高効率受容体媒介送達を用いることもできる。このアプローチは、アデノウイルスが、リポソームを通じての通過なくして、かつ例えば、本発明のＤＮＡ構築体または他の遺伝子構築体に連結されたトランスフェリンの存在下での、エンドソームからのそれらのＤＮＡの放出を可能とするように適合され、構築体はアデノウイルス粒子と同一の経路によって細胞に取り込まれるという事実に依拠するように見える。このアプローチは、複雑なレトロウイルス構築体を用いる必要がなく；レトロウイルス感染で起こるようなゲノムの永久的な修飾がなく；および標的化された発現系が標的化送達系とカップリングされ、このようにして、他の細胞型に対する毒性を低下させるという利点を有する。
【０３９２】
「裸のＤＮＡ」およびカチオン性および中性脂質と複合体化したＤＮＡもまた、治療すべき個体の細胞へ本発明のＤＮＡを導入するのに有用であり得ると認識される。遺伝子治療に対する非ウイルスアプローチは、Ｌｅｄｌｅｙ（１９９５，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６，１１２９−１１４４）に記載されている。
【０３９３】
典型的には、ＤＮＡがアデノウイルス、またはアデノウイルス様粒子内に運ばれるＷＯ  ９４／１０３２３に記載された修飾されたアデノウイルス系のような、代替標的化送達系も知られている。Ｍｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２，６６０−６６８は、細胞選択性部位を繊維タンパク質に加えるためのアデノウイルスの修飾を記載している。Ｂｉｓｃｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，３７３−３７６に記載されたもののような、ｐ５３欠乏ヒト腫瘍細胞において選択的に複製する突然変異体アデノウイルスもまた、本発明の遺伝子構築体を細胞に送達するのに有用である。このようにして、本発明のさらなる態様は、本発明の遺伝子構築体を含むウイルスまたはウイルス様粒子を提供すると認識される。他の安定なウイルス、ウイルスベクターまたはウイルス様粒子は、レンチウイルスおよびレンチウイルスベクター、ＨＳＶ、アデノ援助ウイルス（ＡＡＶ）およびＡＡＶベースのベクター、ワクシニアおよびパルボウイルスを含む。
【０３９４】
患者へポリヌクレオチドを送達する方法は当業者に周知であり、イミュノリポソーム、（ワクシニア、修飾されたワクシニア、およびアデノウイルスを含む）ウイルスベクター、および例えば、遺伝子銃およびエレクトロポレーションを用いるＤＮＡの直接的送達の使用を含む。さらに、治療のために患者の標的組織にポリヌクレオチドを送達する方法もまた当分野では周知である。
【０３９５】
神経変性病の治療的処置を含む適用では、治療剤または処方を直接的に患者の脳に、または海馬のような脳の特異敵領域に投与するのが好ましい。
【０３９６】
脳を含む身体の特異的領域に直接的に治療剤を標的化し、送達する方法は当業者に周知である。例えば、米国特許第６，５０３，２４２号は、治療剤を海馬に直接的に送達するための移植されたカテーテル装置を記載する。
【０３９７】
１つの実施形態において、ベクターを含む治療剤は、脳脊髄液への注射によって、例えば腰椎穿刺によって、ＣＮＳの広い領域を通じて分布されることができる（例えば、Ｋａｐａｄｉａ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  １０：５８５−５８７参照）。別法として、脳の特異的部位への治療剤の正確な送達は、定位マイクロインジェクション技術を用いて行うことができる。例えば、治療すべき対象を定位にフレームベース（ＭＲＩ−適合）に入れ、次いで、高分解のＭＲＩを用いてイメージして、治療すべき特別な領域の三次元ポジショニングを決定することができる。次いで、ＭＲＩイメージを、適当な定位ソフトウェアを有するコンピューターに移すことができ、多数のイメージを用いて、標的部位および治療剤のマイクロインジェクション用の軌道を決定する。ソフトウェアは軌道を、定位フレームの為に正確に登録された三次元座標に翻訳する。頭蓋内送達の場合には、頭蓋骨を露出させ、穿頭穴を進入部位の上にドリルで開け、定位装置を用いて、針を位置決定し、所定の深さにおける移植を確実とする。治療剤は、海馬、脊髄の細胞、脳幹、（髄質、橋、および中脳）、小脳、間脳（視床、視床下部）、終脳（線条体、大脳皮質、または皮質内、後頭、側頭部、頭骨頭頂部または前頭葉）、またはその組合せのようなＣＮＳの領域に送達することができる。もう１つの実施形態において、治療剤は、血液−脳関門の局所化された浸透のような、局所化送達に適した他の送達方法を用いて送達される。
【０３９８】
ウイルスおよび非ウイルスベクターは、中枢神経系の細胞に送達することができる。実施形態において、本発明は、治療剤である、または治療剤をコードするポリヌクレオチドの送達のためにアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いる。ＡＡＶのベクターのようなウイルスベクターを生産する方法は当分野において周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，２００１，ｓｕｐｒａ参照）。
【０３９９】
ＡＡＶベクターは公知の技術を用いて構築して、少なくとも、転写開始領域を含む制御エレメント、治療剤である、または治療剤をコードするポリヌクレオチド、転写終止領域、および少なくとも１つの転写後調節配列の操作可能に連結された成分を提供することができる。制御エレメントは、標的化細胞において機能的であるように選択される。
【０４００】
米国特許出願第２００５００２５７４６号は、海馬、基底神経接の視床下核、メサフィラおよび視床のような、神経変性病に関連する脳の特異的領域への、治療剤をコードするアデノ関連ウイルスベクター（ＡＡＶ）の局所化送達のための送達系を記載する。
【０４０１】
神経特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター（Ｂｙｒｎｅ  ａｎｄ  Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９）および神経膠特異的プロモーター（Ｍｏｒｉｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９１）のような中枢神経系（ＣＮＳ）特異的プロモーターは、好ましくは、ＣＮＳの細胞において優先的にポリヌクレオチドの発現を指令するのに用いる。好ましくは、プロモーターは組織特異的であって、中枢神経系の外側では本質的に活性でなく、あるいはプロモーターの活性は他の細胞または組織におけるよりも中枢神経系においてより高い。例えば、骨髄、脳幹、（髄質、橋、および中脳）、小脳、間脳（視床、視床下部）、終脳（線条体、大脳皮質、または皮質内、後頭、側頭部、頭骨頭頂部または前頭葉）、またはその組合せに特異的なプロモーター。前記プロモーターはＣＮＳにおけるニューロンまたは神経膠細胞のような特別な細胞型に特異的であり得る。もしそれが神経膠細胞において活性であるならば、それは神経膠星状細胞、欠突起膠細胞、上衣細胞、シュワン細胞、または小神経膠細胞に特異的であり得る。もしそれがニューロンにおいて活性であれば、それは特別なタイプのニューロン、例えば、運動ニューロン、感覚ニューロン、または介在ニューロンに対して特異的であり得る。好ましくは、前記プロモーターは脳の特別な領域、例えば、皮質、線条体、黒質および海馬における細胞に特異的である。
【０４０２】
適当なニューロン特異的プロモーターは、限定されるものではないが、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ；Ｏｌｉｖｉａ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）；Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：Ｘ５１９５６）、およびヒトニューロフィラメント軽鎖プロモーター（ＮＥＦＬ；Ｒｏｇａｅｖ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）；Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：Ｌ０４１４７）を含む。神経膠特異的プロモーターは、限定されるものではないが、神経膠繊維状酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター（Ｍｏｒｉｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）；Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：Ｍ６５２１０）、Ｓ１００プロモーター（Ｍｏｒｉｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）；Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：Ｍ６５２１０およびグルタミンシンターゼプロモーター（Ｖａｎ  ｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）；Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：Ｘ５９８３４）を含む。好ましい実施形態において、遺伝子はニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターによって上流側（すなわち、５’側）に近接される。もう１つの好ましい実施形態において、注目する遺伝子は伸長因子１α（ＥＦ）プロモーターによって上流側（すなわち、５’側）に近接される。用いられ得る海馬特異的プロモーターは、海馬特異的グルココルチコイド受容体（ＧＲ）遺伝子プロモーターである。
【０４０３】
別法として、心血管病の治療では、Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）は、インビボでのネズミ心筋細胞における導入遺伝子の発現をもたらす、組換えアデノ関連ウイルスベクターのような、心臓親和性ベクターの心筋内注射または冠動脈内注入による心筋細胞への組換え遺伝子の送達を記載する。Ｍｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ（２００４）は、心臓病のための遺伝子および細胞ベースの療法を概説している。投与の代替の好ましい経路はカテーテルまたはステントを介するものである。ステントは局所化遺伝子送達のための魅力的な代替法を表す。なぜならば、それは延長された遺伝子溶出、および対向動脈壁の効果的な導入用のプラットフォームを提供するからである。この遺伝子送達戦略はウイルスベクターの全身拡大を減少させる能力、従って、低下した宿主免疫応答を有する。合成および天然に生じるステントコーティングの双方は、有意な有害作用なくして延長された遺伝子溶出を可能とする能力を示している（Ｓｈａｒｉｆ  ｅｔ  ａｌ，２００４）。好ましくは、抗体分子をコードするポリヌクレオチドは、動脈、好ましくは、動脈壁への抗体の発現を指令する標的化および／または調節配列に操作可能に連結している。このようにして、ポリヌクレオチドは、冒された個体内での特異的抗体の生成を可能とする。適当な標的化および調節配列は当業者に知られている。
【０４０４】
細胞中のポリヌクレオチドの発現を一時的に調節できるのは所望であり得る。このようにして、例えば、ポリヌクレオチドからの抗体の発現を（小分子が前記プロモーターの活性化または抑制を行うかに依存して）活性化し、またはよりありそうなことには、抑制するのが望ましい場合に、患者に投与することができる小分子の濃度によって調節することができるプロモーターの制御下で、ポリヌクレオチドの発現が直接的または間接的であるのが所望であり得る（後記参照）。これは、もし発現構築体が安定であれば、すなわち、少なくとも１週間、１、２、３、４、５、６、８ヶ月、または１年以上の期間、細胞において（任意の必要な調節分子の存在下で）抗体を発現することができるならば、特に有益であり得る。このようにして、ポリヌクレオチドは調節可能なプロモーターに操作可能に連結できる。調節可能なプロモーターの例は、以下の論文中で言及されているものを含む。Ｒｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６（１５），８６５７−６２（２つの別々のアデノウイルスまたはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、一つは誘導性ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）標的遺伝子をコードし、他方は二部ラパマイシン調節転写因子をコードする、を用いて経口的に利用可能な薬物であるラパマイシンによる制御）；Ｍａｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １００（１１），２８６５−７２（ラパマイシンによる制御）；Ｂｕｅｌｅｒ（１９９９）  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ３８０（６），６１３−２２（アデノ関連ウイルスベクターの概説）；Ｂｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２（５），１５１２−７（アデノ関連ベクター中のドキシサイクリンによる制御）；Ａｂｒｕｚｚｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ７４（７），３７９−９２（誘導因子、例えば、ホルモン、成長因子、サイトカイン、サイトスタティックス、放射線、熱ショックおよび関連応答エレメントの概説）。
【０４０５】
糖尿病を治療するために膵臓の細胞に、関節リウマチを治療するために滑液細胞へ、または特異的癌へ治療剤を標的化するもう１つの方法は、アポトーシス阻害性ポリペプチドを、これらの病気状態における関連細胞によって高度に生産される抗原に対して生起された抗体にコンジュゲートすることである。
【０４０６】
本発明の第十七の態様は、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１から選択される遺伝子、およびその転写されたメッセージが配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むｃＤＮＡ配列を有する遺伝子の発現を変調することができる化合物を同定する方法を提供し、前記方法は、
ＦＫＢＰ２、ＥＥＦ１Ａ１、ＳＮＣＡ、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１から選択される遺伝子およびその転写されたメッセージが配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むｃＤＮＡを有する遺伝子からのプロモーターおよび／または調節部分に操作可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞を提供し；
前記細胞を候補化合物と接触させ；および、
前記レポーター遺伝子の発現を測定することを含み、
前記候補化合物に応答してのレポーター遺伝子の発現の変化は、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１から選択される遺伝子、およびその転写されたメッセージが配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むｃＤＮＡ配列を有する遺伝子の発現を変調できる化合物を同定する。
【０４０７】
レポーター遺伝子の発現の増加は、同定された化合物が、インビボにてその天然に生じるプロモーターからの各ポリペプチドの発現を増加させることができることを示す。
【０４０８】
レポーター遺伝子の発現の減少は、同定された化合物が、インビボにてその天然に生じるプロモーターからの各ポリペプチドの発現を減少させることができることを示す。
【０４０９】
多くのレポーター遺伝子は当分野で知られており、βＧＡＬ、ＧＦＰ，および（細胞内カルシウムの増加に際して冷光を発する）エクオリンを含む。
【０４１０】
「ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１から選択される遺伝子、およびその転写されたメッセージが配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むｃＤＭＡ配列を有する遺伝子」とは、我々は、転写された場合に、ポリペプチドをコードできる天然ゲノム配列を意味する。遺伝子の天然ゲノム配列はイントロンを含有してよい。
【０４１１】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合を可能にし、転写を引き起こすＤＮＡ配列によって形成された発現制御エレメントである。遺伝子のプロモーター領域の配列を決定するための方法は当分野で周知である。プロモーター領域の存在は、公知のモチーフの同定によって決定し、同定された配列の突然変異分析によって確認することができる。好ましくは、プロモーター配列は、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１から選択される遺伝子、およびその転写されたメッセージは配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むｃＤＮＡ配列を有する遺伝子の転写開始部位および前記転写開始部位から５ｋｂ上流側（５’側）の間の領域に位置する。より好ましくは、それは、転写開始部位および前記開始部位から３ｋｂまたは２ｋｂまたは１ｋｂまたは５００ｂｐ上流側（５’側）の間の領域に位置し、なおより好ましくは、それは転写開始部位から２５０ｂｐ上流側（５’側）内に位置する。
【０４１２】
調節領域、またはエンハンサーのような転写エレメントは、遺伝子に対するその位置におけるプロモーターよりも予測性が低い。しかしながら、調節領域を示す多くのモチーフがよく特徴付けられており、関連遺伝子の転写のレベルに影響するそのような領域は、通常、これらのモチーフに基づいて同定することができる。そのような領域の機能は、突然変異分析、ならびにＤＮＡフットプリンティングおよびゲル移動度シフトアッセイを含むインビトロＤＮＡ結合アッセイのような周知の方法によって示すことができる。
【０４１３】
ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１から選択される遺伝子、およびその転写されたメッセージが配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むｃＤＮＡ配列を有する遺伝子の転写に影響する調節領域は、転写開始部位、および関連転写開始部位から２０ｋｂまたは１０ｋｂまたは７ｋｂ５ｋｂまたは３ｋｂ、またはより好ましくは１ｋｂ５’側上流の間の領域内に位置されるようであるか、あるいは遺伝子のイントロン内に位置させることができる。
【０４１４】
ヒトＳＮＣＡ遺伝子のゲノム配列はヒトＰＡＣ  ２７Ｍ０７に見出すことができ、α−シヌクレイン翻訳開始部位の上流の１０．７−ｋｂ  ＤＮＡ断片（位置１９０４０ないし２９７７６）を機能的プロモーター配列として用いることができる（Ｔｏｕｃｈｍａｎ  ｅｔ  ｅｌ，２００１）。ＳＮＣＡ遺伝子アクセション番号はＡＦ１６３８６４であって、転写開始部位はこのＰＡＣ内の位置２９７７７にある。ヒトＳＮＣＡ遺伝子からのさらなる適当なプロモーターおよび／または調節部分は、配列データ、ならびにゲノム配列内のプロモーターおよび調節領域の位置に関する上記位置情報を参照することによって容易に同定することができる。
【０４１５】
ヒトＦＫＢＰ２遺伝子（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ染色体１１ゲノムｃｏｎｔｉｇ）のゲノム配列はＧｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＴ＿０３３９０３に見出すことができ、完全なゲノム配列（エクソンおよびイントロン）はこのゲノム配列内の９３１４２０８で開始する。このようにして、ＦＫＢＰ２遺伝子からの適当なプロモーターおよび／または調節部分は、配列データ、ならびにゲノム配列内のプロモーターおよび調節領域の位置に関する上記位置情報を参照することによって容易に同定することができる。
【０４１６】
ヒトＥＥＦＩＡ１遺伝子のゲノム配列はＧｅｎｂａｎｋアクセション番号ＡＬ６０３９１０（染色体６上のクローンＲＰ１１−５０５Ｐ４からのヒトＤＮＡ配列）に見出すことができ、完全なゲノム配列（エクソンおよびイントロン）は、このゲノム配列内の位置１１３３９７（相補体）で開始する。このようにして、ヒトＥＥＦ１Ａ１遺伝子からの適当なプロモーターおよび／または調節部分は、配列データ、およびゲノム配列内のプロモーターおよび調節領域の位置に関する上記位置情報を参照することによって容易に同定することができる。
【０４１７】
ヒトＶＡＭＰ３遺伝子のゲノム配列はＧｅｎｂａｎｋアクセション番号Ｚ９８８８４（染色体１ｐ３６．２１−３６．３３上のクローンＲＰ３−４６７Ｌ１からのヒトＤＮＡ配列）に見出すことができ、転写開始部位はこのゲノム配列内の位置５０６６１にある。このようにして、ヒトＶＡＭＰ３遺伝子からの適当なプロモーターおよび／または調節部分は、配列データ、ならびにゲノム配列内のプロモーターおよび調節領域の位置に関する上記位置情報を参照することによって容易に同定することができる。
【０４１８】
ヒトＳＮＡＰ２５遺伝子のゲノム配列はＧｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＴ０１１５２０（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ染色体２２ゲノムｃｏｎｔｉｇ）に見出すことができ、完全なゲノム配列（エクソンおよびイントロン）はこのゲノム配列内の位置９３４７８１３で開始する。このようにして、ヒトＳＮＡＰ２５遺伝子からの適当なプロモーターおよび／または調節部分は、配列データ、ならびにゲノム配列内のプロモーターおよび調節領域の位置に関する上記位置情報を参照することによって容易に同定することができる。
【０４１９】
ヒトＲＩＭＳ３遺伝子のゲノム配列はＧｅｎｂａｎｋアクセション番号ＡＬ０３１２８９（染色体１ｐ３３−３４．２上のクローンＲＰ４−７３９Ｈ１１からのヒトＤＮＡ配列）に見出すことができ、完全なゲノム配列（エクソンおよびイントロン）はこのゲノム配列内の位置５６６０６で開始する。このようにして、ヒトＲＩＭＳ３遺伝子からの適当なプロモーターおよび／または調節部分は、配列データ、ならびにゲノム配列内のプロモーターおよび調節領域の位置に関する前記位置情報を参照することによって容易に同定することができる。
【０４２０】
ヒトＲＡＢ４０Ｂ遺伝子のゲノム配列はＧｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＴ＿０８６８８６（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ染色体１７ゲノムｃｏｎｔｉｇ）に見出すことができ、完全なゲノム配列（エクソンおよびイントロン）はこのゲノム配列内の位置１７６８０８８４で開始する。このようにして、ヒトＲＡＢ４０Ｂ遺伝子からの適当なプロモーターおよび／または調節部分は、配列データ、ならびにゲノム配列内のプロモーターおよび調節領域の位置に関する、上記位置情報を参照することによって容易に同定することができる。
【０４２１】
ヒトＨＭＧＣＳ１コーディング領域の上流のさらなる配列はＧｅｎｂａｎｋアクセション番号ＢＣ０００２９７に見出すことができ、これはｍＲＮＡ配列の延長である。コーディング領域はこの配列内の位置１０６で開始する。ヒトＨＭＧＣＳ１遺伝子からの適当なプロモーターおよび／または調節部分は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＢＣ０００２９７における配列の最初の１０５ヌクレオチドに位置させることができる。いずれにせよ、ヒトＨＭＧＣＳ１プロモーター領域に関するさらなる情報は、配列データ、ならびにゲノム配列内のプロモーターおよび調節領域の位置に関する上記位置情報を参照することによって当業者が容易に同定することができる。
【０４２２】
ヒトＳＣＤ５コーディング領域の上流のさらなる配列はＧｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００１０３７５８２に見出すことができ、これはｍＲＮＡ配列の延長である。コーディング領域はこの配列内の位置２３６で開始する。ヒトＳＣＤ５遺伝子からの適当なプロモーターおよび／または調節部分は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００１０３７５８２における配列の最初の２３５ヌクレオチドに位置させることができる。いずれにせよ、ヒトＳＣＤ５プロモーター領域についての更なる情報は、配列データ、ならびにゲノム配列内のプロモーターおよび調節領域の位置に関する上記位置情報を参照することによって当業者が容易に同定することができる。
【０４２３】
ヒトＡＴＰ２Ａ２遺伝子のゲノム配列はＧｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＴ＿００９７７５（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ染色体１２ゲノムｃｏｎｔｉｇ）に見出すことができる。ヒトＡＴＰ２Ａ２遺伝子からの適当なプロモーターおよび／または調節部分は、配列データ、ならびにゲノム配列内のプロモーターおよび調節領域に関する上記位置情報を参照することによって容易に同定することができる。
【０４２４】
ヒトＨＲＭＴ１Ｌ１遺伝子のゲノム配列はＧｅｎｂａｎｋアクセション番号ＡＰ００１７６１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓゲノムＤＮＡ、染色体２１ｑ）に見出すことができ、完全なゲノム配列（エクソンおよびイントロン）はこのゲノム配列内の位置５５８で始まる。このようにして、ヒトＨＲＭＴ１Ｌ１遺伝子からの適当なプロモーターおよび／または調節部分は、配列データ、ならびにゲノム配列内のプロモーターおよび調節領域の位置に関する前記位置情報を参照することによって容易に同定することができる。
【０４２５】
典型的には、レポーター遺伝子の発現の増加は、化合物がＢａｘ媒介アポトーシスの阻害剤であることを示し、他方、レポーター遺伝子の発現の減少は、化合物がＢａｘ媒介アポトーシスのプロモーターであることを示す。
【０４２６】
このようにして、本発明は、細胞においてＢａｘ媒介アポトーシスを変調することができる化合物を同定する方法を含み、前記方法は、本発明の第十七態様において記載したように、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１から選択される遺伝子、およびその転写されたメッセージが配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むｃＤＮＡ配列を有する遺伝子の発現を変調する化合物を同定し、次いで、Ｂａｘ媒介アポトーシスについてのアッセイで前記同定された化合物をテストすることを含む。アポトーシスの適当な細胞ベースのおよびインビボアッセイは上記にて、および実施例に記載されている。
【０４２７】
第十八の態様において、本発明は、Ｂａｘ媒介アポトーシスを変調することができる化合物を同定するさらなる方法を提供し、前記方法は、
誘導性プロモーターの制御下で機能的Ｂａｘポリペプチドを発現し、かつその天然に生じるプロモーターおよび／または調節配列の制御下で、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチドを発現する細胞を提供し；
機能的Ｂａｘポリペプチドの発現を誘導する条件下で前記細胞を候補化合物と接触させ；および、
アポトーシスアッセイを行うことを含み、
候補化合物と接触しなかった細胞と比較したアポトーシスのレベルの変化は、Ｂａｘ媒介アポトーシスを変調することができる化合物を示す。
【０４２８】
アポトーシスの適当な細胞ベースの、およびインビボアッセイは上記にて、および実施例で記載されている。
【０４２９】
本発明者は、アポトーシスのレベルの増加は、化合物がその天然に生じるプロモーターからのポリペプチドからの発現を阻害し、よって、プロアポトーシス化合物であることを示すと考える。アポトーシスのレベルの減少は、化合物がその天然に生じるプロモーターからのポリペプチドの発現を増強し、または促進し、よって、Ｂａｘ媒介アポトーシスの阻害剤であることを示す。
【０４３０】
本発明のこの態様において、細胞は、典型的には、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である。前記細胞は、好ましくは、誘導性または構成的プロモーターの制御下で機能的Ｂａｘポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む構築体でトランスフェクトされている細胞系からのものである。もし前記細胞が脳細胞、より好ましくは海馬細胞であれば、好ましい。適当な細胞系はＳＨ−ＳＹ５ＹおよびＰＣ３細胞を含む。加えて、ラットおよびマウス海馬由来初代細胞は商業的に入手可能である。
【０４３１】
もし前記細胞が、候補化合物の不在下で、その天然に生じるプロモーターおよび／または調節配列の制御下で、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチドを発現するならば、好ましい。このように、ポリペプチドの発現は候補化合物によってアップレギュレート、またはダウンレギュレートすることができ、各々、Ｂａｘ媒介アポトーシスのレベルの減少または増加に導く。
【０４３２】
別法として、前記細胞は、候補化合物の不在下においては、その天然に生じるプロモーターおよび／または調節配列の制御下で、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチドを発現することができない。このように、候補化合物によるポリペプチドの発現のアップレギュレーションのみを検出することができ、このようにして、Ｂａｘ媒介アポトーシスを阻害する化合物が同定される。
【０４３３】
本発明の第十九の態様は、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチド、またはその適当な抗アポトーシス誘導体に結合する化合物についてスクリーニングする方法を提供し、、前記方法は、
前記ポリペプチドを候補化合物と接触させ；
前記ポリペプチドおよび前記候補化合物を含有する複合体の存在を検出し；および、
所望により、前記ポリペプチドに結合したいずれの化合物も同定することを含む。
【０４３４】
好ましくは、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２およびＨＲＭＴ１Ｌ１ポリペプチド、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、前記したようにヒトポリペプチドである。これらのポリペプチドの適当な抗アポトーシス誘導体もまた上記のとおりである。
【０４３５】
ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチド、またはその適当な抗アポトーシス誘導体に結合する化合物は、ポリペプチドの活性を変調することができると認識される。典型的には、ポリペプチドに結合する化合物は、ポリペプチドの活性を阻害し、またはそれに拮抗する。しかしながら、いくつかの場合において、ポリペプチドに結合する化合物はポリペプチドの活性を増強し、または促進する。
【０４３６】
好ましい実施形態において、候補化合物は、それ自体、ペプチドまたはポリペプチドである。
【０４３７】
これらのポリペプチドに結合する適当なペプチドまたはポリペプチドは当分野で知られた方法を用いて同定することができる。Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，３８６−３９０およびＣｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，６３７８−６３８２によって開示された１つの方法は、Ｍ１３またはｆｄのようなフィラメント状バクテリオファージの膨大なライブラリーのスクリーニングを含み、ライブラリーの各メンバーはバクテリオファージの表面にあるタンパク質に融合した異なるペプチドを有する。反復結合プロトコルを用い、ペプチドに結合するライブラリーのそれらのメンバーを選択し、一旦、最も密に結合するファージが精製されたならば、さらに、ペプチドの配列は、表面タンパク質融合をコードするＤＮＡを配列決定することによってペプチドの配列を簡単に決定することができる。用いることができるもう１つの方法は、Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，５９７  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１から商業的に入手可能なＮｏｖａＴｏｐｅ（ＴＭ）システムである。前記方法は、その各々が、結合ペプチドが存在すると考えられる候補タンパク質に由来する小さなペプチドを安定に発現する細菌クローンのライブラリーの創造に基づく。前記ライブラリーは、プローブとして抗体または他の結合剤を用いる標準的なリフト方法によってスクリーニングされる。陽性クローンをＤＮＡ配列決定によって直接的に分析して、結合ペプチドの正確なアミノ酸配列を決定することができる。
【０４３８】
Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４，８２−８４によって開示されたペプチドの個々の種にコンジュゲートしたビーズのライブラリー、またはＨｏｕｇｈｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４，８４−８６によって開示された合成ペプチドコンビナトリアルライブラリー、または米国特許第５１４３８５４号においてＰｉｒｒｕｎｇ  ｅｔ  ａｌによって開示された固体支持体上の個々の合成ペプチド配列のマトリックスを用いるさらなる方法を用いて、結合するペプチドを同定することもできる。
【０４３９】
高スループット操作が可能なスクリーニングアッセイは特に好まれると認識される。その例は、細胞ベースのアッセイおよびタンパク質−タンパク質結合アッセイを含むことができる。ＳＰＡベースの（シンチレーション近接アッセイ（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）システムを用いてもよい。例えば、プロテインキナーゼの活性を変調することができる化合物を同定するためのアッセイは以下のように行うことができる。シンチラント、およびリン酸化することができるポリペプチドを含むビーズを調製することができる。前記ビーズを、プロテインキナーゼおよび３２Ｐ−ＡＴＰまたは３３Ｐ−ＡＴＰを含む試料と、およびテスト化合物と混合することができる。便宜には、これは９６ウェルフォーマットで行われる。次いで、３２Ｐまたは３３Ｐ  ＳＰＡアッセイのための既知のパラメーターを用い、適当なシンチレーションカウンターを用いてプレートをカウントする。シンチラントに近接する、３２Ｐまたは３３Ｐのみ、すなわち、ポリペプチドに結合するもののみが検出される。例えば、ポリペプチドが抗体への結合を介してシンチラントビーズ上に固定化されるそのようなアッセイの変形を用いてもよい。
【０４４０】
ポリペプド／ポリペプチド相互作用を検出する他の方法は、イオンスプレー質量分析／ＨＰＬＣ方法、または他の物理的および分析的方法を備えた限外濾過を含む。例えば、当業者に周知の蛍光エネルギー共鳴移動（ＦＲＥＴ）方法を用いることができ、ここに、相互に近接する場合の蛍光レベルの相互作用を測定することによって、二つの蛍光標識体の結合を測定することができる。
【０４４１】
マクロ分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質およびリン脂質へのポリペプチドの結合を検出する代替方法は、例えば、Ｐｌａｎｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ａｎａｌｙｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２２６（２），３４２−３４８に記載された表面プラズモン共鳴アッセイを含む。方法は、例えば、放射性または蛍光標識で標識されたポリペプチドを利用することができる。
【０４４２】
ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドから選択されるポリペプチド、またはその適当な抗アポトーシス誘導体に結合することができる化合物を同定するさらなる方法は、ポリペプチドが化合物に暴露され、かつ前記化合物の前記ポリペプチドへのいずれの結合も検出され、および／または測定されるものである。前記化合物のポリペプチドへの結合についての結合定数は測定することができる。ポリペプチドへの化合物への結合を検出し、および／または測定する（定量する）ための適当な方法は当業者に周知であり、例えば、高スループット操作が可能な方法、例えば、チップベースの方法を用いて行うことができる。より新しいＶＬＳＩＰＳＴＭ技術は、数十万以上の異なる分子プローブを含有する極端に小さなチップの生産を可能とした。これらの生物学的チップまたはアレイはアレイ中に配置されたプローブを有し、各プローブには特異的位置が割り当てられている。各位置が、例えば、１０ミクロンのスケールを有する生物学的チップが生産されている。前記チップを用いて、候補化合物がチップ上のプローブのいずれかと相互作用するか否かを決定することができる。選択されたテスト条件下でアレイを候補化合物に暴露したのち、走査デバイスはアレイ中の各位置を調べ、候補化合物がその位置においてプローブと相互作用したか否かを決定することができる。
【０４４３】
生物学的チップまたはアレイは、プローブまたは候補化合物いずれかについての情報を得るための種々のスクリーニング技術で有用である。例えば、ペプチドのライブラリーをプローブとして用いて、薬物についてスクリーニングすることができる。ペプチドを受容体に暴露でき、受容体に結合するプローブを同定することができる（米国特許第５，８７４，２１９号）。
【０４４４】
これらのポリペプチドに結合し、その活性を変調するタンパク質を標的化するもう１つの方法は酵母２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ  ＆  Ｓｏｎｇ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６）であり、ここに、本発明のポリペプチドを用いて、結合タンパク質を「捕獲」することができる。
【０４４５】
インビボにて、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチドの活性を変調することができる化合物を同定するのが望ましい。このようにして、本発明で用いる試薬および条件は、インビボにて、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチド、またはその適当な抗アポトーシス誘導体、および相互作用ポリペプチドの間の相互作用が、天然に生じるポリペプチドおよび天然に生じる相互作用ポリペプチドの間と実質的に同一であるように、選択することができるのが理解される。
【０４４６】
別法として、前記方法は「ライブラリースクリーニング」方法として用いることができ、前記用語は当業者に周知である。このようにして、例えば、本発明のスクリーニング方法を用いて、インビボにて、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチドのポリペプチドアクチベーターを発現することができるポリヌクレオチドを検出し、（場合により同定）することができる。適当なベクター中の発現ライブラリーのアリコットを、必要な結果を与える能力についてテストすることができる。
【０４４７】
本明細書に記載されたスクリーニング方法において、同定された化合物は薬物様化合物、または薬物様化合物の開発のためのリード化合物であってよいと認識される。
【０４４８】
用語「薬物様化合物」は当業者に周知であり、例えば、医薬中の有効成分としての、医療で用いるのに適するようにすることができる特徴を有する化合物の意味を含むことができる。このようにして、例えば、薬物様化合物は、有機化学の技術によって、より好ましくはないが、分子生物学または生化学の技術によって合成することができる分子であってよく、好ましくは、５０００ダルトン未満であってよく、かつ水溶性であってもよい小さな分子である。薬物様化合物は、加えて、特定のタンパク質または複数タンパク質との選択的相互作用の特徴を呈することができ、かつ生体から入手でき、および／または標的細胞膜を透過することができるが、これらの特徴は必須ではないと認識される。
【０４４９】
用語「リード化合物」は、同様に、当業者に周知であり、前記化合物は、（例えば、その意図した標的に対してわずかに優れているに過ぎず、その作用において非選択的であり、不安定であり、貧溶解性であり、合成するのが困難であり、または貧弱な生物学的利用性を有するゆえに）薬物として用いるのにそれ自体は適していないが、より所望の特徴を有することができる他の化合物の設計のための出発点を提供することができるという意味を含むことができる。
【０４５０】
よって、本発明のスクリーニング方法の実施形態は、インビボにて、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ２５、ＲＩＭＳ３、ＲＡＢ４０Ｂ、ＨＭＧＣＳ１、ＳＣＤ５、ＡＴＰ２Ａ２、ＨＲＭＴ１Ｌ１、および配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから選択されるポリペプチドの活性を変調する薬物様化合物、または薬物様化合物の開発のためのリード化合物を同定する方法を提供し、前記方法はポリペプチドまたはその適当な抗アポトーシス変種とテスト化合物とを接触させ、ポリペプチドの活性が、テスト化合物の不在下におけるポリペプチドまたはその抗アポトーシス誘導体の活性と比較して変化したかを決定することを含む。
【０４５１】
本発明の第十七、第十八、および第十九の態様のスクリーニング方法は、さらに、アポトーシスのモデルにおいて、または適当な病気モデルにおいて、Ｂａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力について同定された化合物をテストする事を含むことができる。
【０４５２】
加えて、または別法として、本発明の第十七、第十八、および第十九の態様のスクリーニング方法は、さらに、同定された化合物を修飾し、次いで、アポトーシスのモデルにおいて、または適当な病気モデルにおいて修飾された化合物をテストすることを含むことができる。
【０４５３】
アポトーシスの適当なモデルは上記にて、および実施例に記載されている。
【０４５４】
薬物効率をスクリーニングし、テストするのに用いることができるアルツハイマー病の動物モデルからの細胞培養は、米国特許出願第２００５０１７２３４４号に記載されている。神経学的病気、特にＡＤを刺激する動物モデルは、米国特許出願第２００５０１０２７０８号に記載されている。アルツハイマー病の動物モデル、ハンチントン病の動物モデル、パーキンソン病のげっ歯類および霊長類モデル、および遺伝的／非遺伝的髄鞘形成不全モデルを含む、神経変性病のさらなる動物モデルは、Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｉ：Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ：０−８９６０３−２０８−６）においてＢｏｕｌｔｏｎ，Ｂａｋｅｒ  ＆  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ（１９９２）によって記載されている。
【０４５５】
糖尿病、癌および心血管病についての適当な動物モデルは当分野で周知であり、化学的に誘導された糖尿病モデル；マウスまたはヒト癌細胞が動物に注入される癌のためのヌードマウスおよびＳＣＩＤマウスモデル；および心血管病のための心室肥大圧過剰負荷モデルを含む。
【０４５６】
当業者によって認識されるように、前記方法は、さらに、アポトーシスのモデルにおいて、特に、インビボモデルにおいてＢａｘ媒介アポトーシスを阻害する能力を有する化合物を医薬的に許容される組成物に処方することを含むことができる。
【０４５７】
同様に、前記方法は、さらに、病気モデル、特に、インビボモデルにおいて治療的利用性を有する化合物を医薬的に許容される組成物に処方することを含むことができる。
【０４５８】
本明細書において言及した全ての書類は参照によりその全体を本明細書に組み込む。
【０４５９】
本明細書においての先に公開された書類のリストまたは議論は、前記書類が技術水準の一部であるかまたは、共通の一般的知識であることを認めるものと必ずしも判断されるべきではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０４６０】
ここで、以下の図面および実施例の助けを借りて本発明をより詳細に記載する。
【０４６１】
実施例１：ＤＮＡ構築体の生成
【０４６２】
プロアポトーシスＢａｘの発現を可能とするＤＮＡ構築体の生成
【０４６３】
異なる染色体遺伝子座からの酵母におけるＢａｘの誘導性発現のための構築体
【０４６４】
（選択マーカーとしてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＬＥＵ２遺伝子を持つ）酵母組込ベクターｐＲＳ３０５、（選択マーカーとしてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＤＥ２遺伝子を持つ）ｐＲＳ４０２、および（選択マーカーとしてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＲＰ１遺伝子を持つ）ｐＲＳ４０４はＡＴＣＣ（ＬＧＣ  Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，ＵＫ）から購入される。
【０４６５】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＡＬ１遺伝子プロモーター断片、およびｃ−ｍｙｃ  Ｔａｇ断片（Ｍ）が先行するＳＵＣ２遺伝子ターミネーター断片（Ｓ）を含有するＸｈｏＩ−ＳａｃＩ  ＧＡＬ１ｐ−ＭＳ断片は、構築体ｐＢＧＡＬ１ＭＳ（ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）誘導体；図１；図６１中の配列番号１として示されたＧＡＬ１ＭＳの配列）から単離され、ＬＥＵ２、ＡＤＥ２、ＴＲＰ１およびＨＩＳ３染色体遺伝子座における組込みを可能とするＸｈｏＩ−ＳａｃＩ消化ｐＲＳ３０５、ｐＲＳ４０２およびｐＲＳ４０４ベクターに連結する。４つの得られたプラスミドｙＩＰＬＥＵＧ１（図２）、ｙＩＰＡＤＥＧ１（図３）、ｙＩＰＴＲＰＧ１（図４）およびｙＩＰＨＩＳＧ１（図５）は、ＧＡＬ１プロモーターの３’末端、およびＳＵＣ２ターミネーターに連結されたｃ−ｍｙｃタグの５’末端の間においてユニークなＢａｍＨＩ、ＳｐｅＩおよび／またはＸｂａＩ制限部位を有する。
【０４６６】
プラスミドｙＩＰＬＥＵＧ１（図２）、ｙＩＰＡＤＥＧ１（図３）、ｙＩＰＴＲＰＧ１（図４）およびｙＩＰＨＩＳＧ１（図５）をＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩで消化し、プラスミドｐＵＣ１９Ａ／ＢａｘＭＳから単離されるＢａｘ遺伝子のＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ断片に個々に連結する（ここに、ＢＡＸ遺伝子、配列番号２、は酵母バイアスドコドンを用いて合成されている（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ  ＆  Ｈａｌｌ，１９８２））。得られたＢＡＸ担持プラスミドはｉＬＥＵＢＡＸ（図６）、ｉＡＤＥＢＡＸ（図７）、ｉＴＲＰＢＡＸ（図８）およびｉＨＩＳＢＡＸ（図９）と命名される。全ての４つのプラスミドは、各染色体遺伝子座への組込のためのこれらのプラスミドの線状化を可能とするそれらの酵母選択マーカー中にユニークな制限部位を有する。
【０４６７】
哺乳動物細胞におけるＢａｘの構成的発現用の構築体
【０４６８】
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）におけるＳＨＳＹ−５Ｙ神経芽細胞腫細胞から単離されたＢＡＸ遺伝子のサブクローニング
【０４６９】
ＢＡＸ遺伝子のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を、逆−転写酵素媒介（ＲＴ）ＰＣＲを用いて、ヒト神経芽細胞腫細胞系ＳＨＳＹ−５Ｙから単離された全ｍＲＮＡからクローン化する。単離されたＢＡＸ遺伝子の配列は、翻訳に際して、ＮＣＢＩデータベースに報告されたＢａｘαタンパク質に正確に対応する。この断片は、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）におけるさらなるサブクローニングで用いて、プラスミドｐＫＳ（＋）／ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ／Ｂａｘを得る。
【０４７０】
開始および停止コドンを含む全長ＢＡＸ遺伝子をコードするＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ  Ｂａｘ遺伝子インサートは、構築体ｐＫＳ（＋）／ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ／Ｂａｘから単離され、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ−消化ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）に連結して、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｂａｘ（図１０）を得る。
【０４７１】
ｐＩＲＥＳ２−ＧＦＰにおけるＳＨＳＹ−５Ｙ神経芽細胞腫細胞から単離されたＢＡＸ遺伝子のサブクローニング
【０４７２】
プラスミドｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）は、（蛍光顕微鏡によってモニターされた）ＥＧＦＰを発現する実質的に全てのトランスフェクトされた細胞がやはりＢａｘタンパク質を発現するように、選択マーカー、増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）と共にヒトＢａｘタンパク質を発現する陽性クローンの迅速かつ効果的な選択を可能とするビシストロニックベクターである。ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクターは、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有し、これは、１つのメッセンジャーＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からの２つのオープンリーディングフレームの翻訳を可能とする。リボソームは、５’末端においてビシストロニックｍＲＮＡに進入して、ＢＡＸを翻訳することができ、あるいはＥＣＭＶ  ＩＲＥＳにおいて進入して、選択マーカーＥＧＦＰを翻訳することができる。
【０４７３】
ＳＨＳＹ−５Ｙ（１．１．２．１参照）から単離された全長ＢＡＸ遺伝子をコードし、開始（ＡＴＧ）および停止（ＴＡＧ）コドンを含むＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ  ＢＡＸ遺伝子インサートを構築体ｐＫＳ（＋）／ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ／Ｂａｘから単離し、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ−消化ベクターｐＳＰ７３（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結して、プラスミドｐＳＰ７３／ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ／Ｂａｘを得る。
【０４７４】
ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ  ＢＡＸ遺伝子断片をｐＳＰ７３／ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ／Ｂａｘから単離し（ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩの上流にあるＢｇｌＩＩ部位はｐＳＰ７３におけるＸｂａＩの下流にあり）、ＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩ−消化ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクターに連結する。得られたプラスミドｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ／Ｂａｘ（図１１）は、ＢａｘおよびＥＧＦＰの同時発現を可能とする。
【０４７５】
抗アポトーシスタンパク質の発現を可能とする酵母アポトーシススクリーニング（ＹＡＳ）のための他のＤＮＡ構築体の生成
【０４７６】
ＧＡＬ１ｐ−ＭＳ断片のＸｈｏＩ−ＳａｃＩ−断片（すなわち、停止コドンで終了するｃ−ｍｙｃタグ配列が先行するＳＵＣ２ターミネーター断片と共にＧＡＬ１プロモーター）およびＰＧＫｐ−ＭＳ断片（すなわち、停止コドンで終了するｃ−ｍｙｃタグ配列が先行するＳＵＣ２ターミネーター断片と共にＰＧＫ１プロモーター）を構築体ｐＢＧＡＬ１ＭＳ（図１）およびｐＳＹＩ２１４（図１２）から単離する。断片をＸｈｏＩ−ＳａｃＩ消化ベクターｐＲＳ４１６およびｐＲＳ４２６（双方のプラスミドはＡＴＣＣから得られる）に連結して、プラスミドｐＲＳ４２６／ＧＡＬ１ＭＳ（図１３）、ｐＲＳ４２６／ＰＧＫＭＳ（図１４）、ｐＲＳ４１６／ＧＡＬ１ＭＳ（図１５）およびｐＲＳ４１６／ＰＧＫＭＳ（図１６）を得る。プラスミドｐＲＳ４１６は単一コピー動原体ベクターであり、ここに、ｐＲＳ４２６はマルチコピー２−ミクロンベクターである。
【０４７７】
プラスミドｐＳＰ７３／ＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ／Ｂｃｌ２およびｐＳＰ７３／ＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ／Ｂｃｌ−ｘＬから単離されたヒトＢｃｌ−２およびヒトＢｃｌ−ｘＬ遺伝子をコードするＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ−消化断片を、ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ−消化ｐＲＳ４２６／ＧＡＬ１ｐＭＳまたはｐＲＳ４２６／ＰＧＫｐＭＳに連結して、プラスミド４２６ＧＡＬ／Ｂｃｌ２（図１７）、４２６ＧＡＬ／Ｂｃｌ−ｘＬ（図１８）、４２６ＰＧＫ／Ｂｃｌ２（図１９）、４２６ＰＧＫ／Ｂｃｌ−ｘＬ（図２０）を得る。
【０４７８】
同様に、ヒトＢｃｌ−２およびヒトＢｃｌ−ｘＬ遺伝子をコードするＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ−消化断片をＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ−消化ｐＲＳ４１６／ＧＡＬ１ｐＭＳまたはｐＲＳ４１６／ＰＧＫｐＭＳに連結して、プラスミド４１６ＧＡＬ／Ｂｃｌ２（図２１）、４１６ＧＡＬ／Ｂｃｌ−ｘＬ（図２２）、４１６ＰＧＫ／Ｂｃｌ２（図２３）、４１６ＰＧＫ／Ｂｃｌ−ｘＬ（図２４）を得る。
【０４７９】
実施例２：ヒト海馬からの新規な抗アポトーシス遺伝子の選択のための酵母スクリーニングシステム（ＹＡＳ）の最適化
【０４８０】
酵母成長条件
【０４８１】
ＹＰＤ（１％バクト酵母抽出物、２％バクトペプトンおよび２％グルコース）は、豊富な培地である。合成最小培地（ＳＣ）は０．６７％酵母窒素塩基（Ｄｉｆｃｏ）および２％グルコース（ＳＤ）または２％ガラクトース（ＳＧ）よりなる。適当な成長補充物（アデニン、ヒスチジン、リシン、ロイシン、ウラシルまたはトリプトファン）を、株によって運ばれるプラスミドに依存して、特異的株の成長のためにＳＤまたはＳＧに加える。補充物をストック溶液として維持し、適した容量にて培地に加える。以下に掲げるのは、１リットルの培地を調製するのに必要なストックの濃度および溶液およびストック溶液の容量である。アデニン、ウラシル、トリプトファン、ヒスチジンについての最終濃度は２０ｍｇ／ｌであり、リシン、チロシンは３０ｍｇ／ｌであって、ロイシンは１００ｍｇ／ｌである。
【０４８２】
酵母抗アポトーシススクリーニングシステムの樹立
【０４８３】
多数の平行した実験を行って、酵母アポトーシススクリーニング（ＹＡＳ）のための最良な酵母株を選択した。
【０４８４】
Ｂａｘ取込み株
【０４８５】
４つの酵母サッカロミセス・セレヴィシエ株を、酵母ゲノムの異なる染色体遺伝子座において、酵母バイアスドコドンを用いて化学的に合成されたヒトＢＡＸ遺伝子（配列番号２）を取り込むのに用いた。酵母株は、
（１）ＨＴ４４４（ＭＡＴ−ａ，ｌｅｕ２−３，ｌｅｕ２−２，１１２  ｈｉｓ４−５１９，ｕｒａ３，ｌｙｓ２）、  
（２）Ｗ３０３ａ（ＭＡＴ−ａ，ａｄｅ２−１，ｔｒｐ１−１，ｌｅｕ２−３，ｌｅｕ２−１１２  ，ｈｉｓ３−１１，ｈｉｓ３−１５，ｕｒａ３−１）、  
（３）Ｗ３０３α（ＭＡＴ−α，ａｄｅ２−１，ｔｒｐ１−１，ｌｅｕ２−３，ｌｅｕ２−１１２  ，ｈｉｓ３−１１，ｈｉｓ３−１５，ｕｒａ３−１）および
（４）ＪＬ２０（ＭＡＴ−ａ，ｌｅｕ２−３，ｌｅｕ２−２，ｌｅｕ２−１１２，ｈｉｓ４−５１９，ａｄｅ１−１００，ｕｒａ３−５２）  
である。
【０４８６】
異なる染色体遺伝子座における組込で用いるプラスミドは、
（１）ｉＬＥＵＢＡＸ（図６）
（２）ｉＡＤＥＢＡＸ（図７）
（３）ｉＴＲＰＢＡＸ（図８）
（４）ｉＨＩＳＢＡＸ（図９）
である。
【０４８７】
組込みは、ＬＥＵ２、ＡＤＥ２、ＴＲＰ１およびＨＩＳ３遺伝子が天然で位置する酵母染色体遺伝子座における、誘導性ＧＡＬ１プロモーター制御下での、ＢＡＸ発現カセットの単一コピーを生じる。
【０４８８】
組込後に得られた、酵母株を表２にリストする。
【０４８９】
【表２】
2009526541.tif 000004
【０４９０】
スクリーニングのための最適ＢＡＸ担持株についてのスクリーニング
【０４９１】
理想的には、全ての株はＳＤ（すなわち、適した成長サプリメントと共にグルコースを含有する最小成長培地）中で成長すべきであるが、ＳＧ（適した成長補充物と共にガラクトースを含有する最小成長培地）中で増殖すべきではない。なぜならば、ガラクトースはＢａｘタンパク質発現を誘導し、それにより、細胞の成長を停止させ、酵母細胞を殺すからである。表２にリストした全ての株は、〜１０６細胞を１０ｃｍ直径のプレート上で平板培養する場合に、通常の成長条件（３０℃における７２時間）下でガラクトース中で（空のプラスミドを担うが、ＢＡＸを担わない）対照株程はよく成長しない。しかしながら、いずれかの選択したヒト組織から作成されたｃＤＮＡライブラリーからの潜在的抗アポトーシス遺伝子をスクリーニングするためのストリンジェントな選択系を有するためには、スクリーニング手法の間に行われるように、比較的多数の細胞を平板培養し（すなわち、＞１０８細胞を１０ｃｍ直径のプレート上で平板培養し）、３０℃にて７２時間インキュベートする場合に、いずれの成長も示さない株を有しなければならない。予期せぬことに、株Ｗ３０３ｂａｘｌｅｕは、表３中の結果から示されるようにスクリーニングに理想的に適することが分かる。それは、３０℃における７日間の＞１０８細胞のインキュベーション後にさえガラクトース中で成長を示さない。
【０４９２】
【表３】
2009526541.tif 000005
【０４９３】
Ｂａｘ媒介酵母細胞殺傷の救済
【０４９４】
ヒトＢｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−２は公知の抗アポトーシスタンパク質である。ヒトＢｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬ遺伝子は、ＧＡＬ１（強力な誘導性）およびＰＧＫ１（強力な構成的）プロモーターの制御下で、動原体（単一−コピー）および２−ミクロン（マルチ−コピー）ベクターにサブクローンされている（図１７ないし２４に描かれたプラスミド）。全てのプラスミドは酵母での選択のためにＵＲＡ３遺伝子を運ぶ。プラスミドはＢａｘ担持株、Ｗ３０３ｂａｘｌｅｕおよび、また、Ｗ３０３αに形質転換される。後者の形質転換は接合実験の目的のみで行われ、ここに、ＢＡＸ遺伝子はＭａｔ−ａ接合型を持つ株に保有され、他方、救済抗アポトーシス遺伝子Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬは反対のＭａｔ−α接合型のもう１つの株によって担持される。
【０４９５】
抗アポトーシス遺伝子担持プラスミドのＢＡＸ担持酵母株への直接的な形質転換のために、Ｗ３０３ｂａｘｌｅｕ株の５ｘ１０７細胞を収穫し、細胞ペレットを洗浄して、一晩の培養で用いたＹＰＤ培地を除去する。１００μｇ変性サケ精子ＤＮＡ（Σ）および０．５μｇプラスミドＤＮＡ（抗アポトーシス遺伝子Ｂｃｌ−２またはＢｃｌ−ｘＬを担持；図１７ないし２４を参照）をペレット化された細胞に加え、続いて、５００μｌのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）−３５００溶液（４０％ＰＥＧ；０．１Ｍ酢酸リチウムｐＨ７．５；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ７．５；１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．５）を加え、ＤＭＳＯを５％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで加える。２５℃での４００ｒｐｍにおける１５分間のサーモ−ミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）でのインキュベーションの後に、細胞を１０％エタノール（最終濃度）中で４２℃にて１５分間熱ショックを与える。同一容量のＴＥで２回洗浄した後、細胞を５００μｌのＴＥ  ｐＨ７．５に再懸濁する。２００μｌの再懸濁した細胞を、必要なアミノ酸およびヌクレオチド補充物を運ぶＳＤおよびＳＧプレート上に直接的に広げる。プレートを３０℃にて３日間（ＳＤ）および２０日程度（ＳＧ）インキュベートする。
【０４９６】
ヒトＢｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬ遺伝子を担うプラスミド（図１７ないし２４）を、形質転換体をＷ３０３ｂａｘｌｅｕ細胞と接合でき、それにより、接合後のＢＡＸのそれらの救済能力を測定することができるように、Ｗ３０３α（Ｍａｔ−α）酵母株に形質転換する。Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬ担持プラスミド（ＵＲＡ３＋）の形質転換体を、まず、ロイシン、ヒスチジン、アデニンおよびトリプトファンを含有するＳＤ倍地中で３０℃にて３日間成長させる。各形質転換からの６つの個々のコロニーからの細胞の小さなループ分を１００μｌ  ＴＥに混合する。Ｗ３０３ｂａｘｌｅｕ（Ｍａｔ−ａ，ＢＡＸ＋）からの同様な数の細胞をＭａｔ−α細胞ミックス（Ｂｃｌ−２＋またはＢｃｌ−ｘＬ＋）に加え、徹底的に混合する。混合物をＹＰＤプレート上で平板培養し、３０℃にて２４時間インキュベートし、次いで、ヒスチジン、アデニンおよびトリプトファンのみを含有するＳＤプレート上で選択する。
【０４９７】
全ての形質転換体（直接的または接合後）を、細胞成長のＢａｘ媒介阻害をなくすそれらの能力についてテストする。株を、（ａ）それらの救済効率、および（ｂ）成長スピードに関して比較する。結果を表４および図２５に示す。
【０４９８】
【表４】
2009526541.tif 000006
【０４９９】
実施例３：ヒト海馬における抗アポトーシス遺伝子のスクリーニング
【０５００】
ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーの樹立および増幅
【０５０１】
ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーはＢｉｏＣａｔ  ＧｍｂＨ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって慣用的に合成された。ｃＤＮＡライブラリーは全ヒト成人正常脳海馬ｍＲＮＡから作成される。第一のストランドｃＤＮＡ合成は、オリゴ（ｄＴ）−ＮｏｔＩプライマーおよびＭ−ＭＬＶ−ＲＮａｓｅ  Ｈ−逆転写酵素を用いて行う。第二ストランド合成は、ランダムリンカープライマーおよびクレノウＥｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼで行う。方向的クローニングでは、平滑−末端ｃＤＮＡをまずＮｏｔＩで消化し、次いで、１．３％アガロースゲルでサイズ−分画する。０．６ｋｂよりも大きなｃＤＮＡの溶出に続き、ｃＤＮＡをＮｏｔＩおよびＢｓａＢＩ消化酵母発現ベクターｐＳＹＥ２２４に連結した（図３９）。プラスミドｃＤＮＡライブラリーがグリセロールストックとして得られる。このライブラリーの全ての遺伝子情報を維持するために、半固体増幅を用いる方法を使用する。１０００ｍｌのオートクレーブ処理した２×ＬＢアガロース（二重−蒸留下Ｈ２Ｏ、０．２７％ＳｅａＰｒｅｐアガロース（ＦＭＣ）、２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）を３７℃の水浴中で２時間冷却する。０．２ｇアンピシリンと共に（グリセロールストック溶液を表す）１．２２×１０６初代ｃＤＮＡ形質転換体を加え、スターラープレート上で２分間徹底的に混合する。氷上での１時間のインキュベーションの後に、培養瓶を３０℃に設定された重力流インキュベーターに温和に移動させ、乱すことなく４５分間インキュベートする。次いで、ＱＩＡＧＥＮプラスミドＭａｘｉ−ｐｒｅｐキットを用いて、細胞を収穫して、精製されたＤＮＡを調製する。グリセロールストック溶液をＤＮＡ精製前に維持する。
【０５０２】
海馬ｃＤＮＡライブラリーの高効率形質転換、およびＢａｘ耐性形質転換体についてのスクリーニング
【０５０３】
中期−対数相における（ヒスチジン、アデニン、ウラシルおよびトリプトファンを含有する）ＳＤ液体培地中の酵母株Ｗ３０３ｂａｘｌｅｕの培養を収穫し、１００ｍＭ酢酸リチウム溶液で洗浄する。１×１０９細胞を含有するペレットに、形質転換ミックスを加える。形質転換ミックスは２４０μｌ  ＰＥＧ−３５００（５０％ｗ／ｖ，Σ）、３６μｌ１．０Ｍ酢酸リチウム、５０μｌの一本鎖ＤＮＡ（新たに沸騰、２．０ｍｇ／ｍｌ、Σ），３３μｌの滅菌二重−蒸留Ｈ２Ｏおよび１μｌ（１μｇ／μｌ）ｃＤＮＡライブラリーＤＮＡを含有する。混合物を使用前に徹底的に混合する。細胞懸濁液を震盪しつつ３０℃にて３０分間インキュベートする。形質転換体を収穫し、ロイシンおよびウラシルを欠如するが、ヒスチジン、アデニンおよびトリプトファンを含有するガラクトース含有合成脱落培地（すなわち、ＳＧ＋ＨＡＷ）上で直接的に選択する。形質転換混合物のアリコットをやはりＳＤ＋ＨＡＷプレート上に広げ、形質転換の効率を決定する。このＳＤ＋ＨＡＷプレート上の形質転換体を、四角のピースに切断された滅菌ベルベットクロスを用いるレプリカ平板培養によって、ＳＧ＋ＨＡＷ上で後にスクリーニングする。元のｃＤＮＡライブラリーに存在する代表的なクローンの数の３倍を超える個々の形質転換体が得られるまで、形質転換を数回反復する。このようにして、ｃＤＮＡライブラリーに存在する全てのｃＤＮＡを酵母アポトーシスアッセイ（ＹＡＳ）中でスクリーニングしたかを確認することができる。ＳＧ＋ＨＡＷプレートからのＢａｘ耐性コロニーを個々に収集する。
【０５０４】
Ｂａｘ耐性形質転換体からのプラスミドＤＮＡ単離
【０５０５】
ＳＧ＋ＨＡＷプレートからのＢａｘ耐性コロニーを拾い、１ｍｌＹＰＤ液体培地中で３０℃にて一晩成長させる。ミクロ遠心機中での遠心によって細胞を収穫し、５００μｌの１Ｍソルビトール、０．１Ｍ  Ｎａ２ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）に再懸濁させる。２０μｌの２．５ｍｇ／ｍｌのザイモリーアーゼ１００Ｔ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）との３７℃における１時間のインキュベーションの後、細胞を遠心し、５０μｌの１０％ＳＤＳを含む５００μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡに再懸濁させる。混合物を３００ｒｐｍにおいて震盪しつつ６５℃にて３０分間インキュベートする。２００μｌの５Ｍ酢酸カリウムの添加後に、細胞を氷上で１時間更にインキュベートする。次いで、細胞を１３，０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上清を１容量の１００％イソプロパノール中で沈殿させる。風乾したペレットを３００μｌのＴＥ（ｐＨ７．５）に再懸濁し、７５μｇのＲＮａｓｅと共にインキュベートし、続けて、３０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２００μｌの１００％イソプロパノールを加える。ペレット化されたＤＮＡを３０μｌのＴＥ（ｐＨ７．５）に再懸濁させ、コンピテントＤＨ５α細菌細胞に形質転換する。このようにして、Ｂａｘ救済遺伝子を担う、全ての酵母コロニーからのプラスミドＤＮＡを、細菌細胞を介して増幅させ、ＱＩＡＧＥＮプラスミドＭｉｎｉ−ｐｒｅｐキットを用いて精製する。これらのプラスミドは、理論的には、ヒト海馬に存在する新規なＢａｘアンタゴニスト（すなわち、新規な抗アポトーシス遺伝子）を担うはずである。
【０５０６】
Ｂａｘ救済スクリーニングからの偽陽性の排除
【０５０７】
前記実施例２に記載されたように、Ｂａｘ耐性酵母細胞から単離された全てのプラスミドをＷ３０３ｂａｘｌｅｕに逆形質転換し、ＳＤ＋ＨＡＷプレート上で平板培養する。ＳＤ＋ＨＡＷおよびＳＧ＋ＨＡＷプレートへの各形質転換からの１０の個々のコロニーからの〜１００細胞を平板培養することによって、形質転換体をそれらの真正なＢａｘ救済能力についてテストする。プレートを３０℃にて２日ないし５日間インキュベートする。ＳＤおよびＳＧプレート双方上で成長するプラスミド形質転換細胞はスポット−テスト陽性であると考えられ、従って、Ｂａｘ媒介細胞成長阻害を真正に救済するプラスミドを担持する。スポットテスト陰性プラスミドは偽陽性として処理する。これらのプラスミドは、Ｂａｘを救済しない遺伝子を担い、従って、実験から排除される。
【０５０８】
ＳＧプレート上で生存する酵母細胞を、Ｂａｘ遺伝子の存在についてチェックして、スポット−テスト陽性プラスミドが、事実、抗アポトーシス遺伝子を含有することを絶対的に確認する。ＰＣＲ、１００ピコモルの各プライマー、０．８ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および２．５Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼ（ＡＢＧ）を含有する１００μｌの反応容量で行う。９９℃における７分の初期変性期間の後に、１分間の９５℃における変性、１分３０秒の間の６０℃におけるアニーリング、および７２℃における３分間の伸長よりなる３０サイクルを行う。２５μｌの反応を１％ＴＡＥアガロースゲルに負荷し、臭化エチジウム染色によって可視化する。Ｂａｘを同定するのに用いるプライマーは、
５’プライマー：５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＡＣＧＧＴＴＣＣＧＧＴＧＡＡＣＡＡ−３’（配列番号２４）
３’プライマー：５’−ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＡＣＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡＴＧＧＴＣ−３’（配列番号２５）
である。
【０５０９】
抗アポトーシス遺伝子の配列決定
【０５１０】
Ｂａｘ救済機能を示す２３のプラスミドを、ＡＢＩのＢｉｇＤｙｅターミネーター配列決定化学（ＰＮＡＣＬ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を用いるＤＮＡ配列決定反応に付す。ｐＳＹＥ２２４（図３９）クローンにおいて同定された、インサートを配列決定するのに用いるプライマーは、
５’プライマー：５’ＣＣＴＣＴＡＴＡＣＴＴＴＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＡＧ−３’（配列番号２６）
３’プライマー：５’ＣＧＴＧＡＡＴＧＴＡＡＧＣＧＴＧＡＣＡＴＡＡＣ−３’（配列番号２７）
である。
【０５１１】
ＤＮＡ配列の相同性は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／におけるＴｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）によって支持されるプログラムであるＢＬＡＳＴを用いて決定する。
【０５１２】
結果
【０５１３】
Ｂａｘ耐性コロニーを同定するＹＡＳスクリーニングにおいて、３．８０８×１０６形質転換体のうち１０６のコロニーはＳＧプレートで生存する。擬陽性を同定するための再テストの後に、依然としてＢａｘ救済機能を示す２３のプラスミド（２１．７０％）が残った。遺伝子を表１にて先にリストする。
【０５１４】
タンパク質＃１ないし＃５のＨＡ標識されたＤＮＡ配列は、酵母および哺乳動物細胞における発現でさらに用いられてきた。
【０５１５】
Ｂｃｌ−２Ａｌは公知のＢａｘアンタゴニストである。我々は、表１にリストされた他の遺伝子のいずれかが抗アポトーシス機能を有するといういずれの報告も知らない。
【０５１６】
実施例４：ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーから同定された新規な抗アポトーシス遺伝子についての発現構築体
【０５１７】
ＨＡ−タグを含有する基本的なプラスミド
【０５１８】
基本的プラスミドＢｌｕＫＳ／ｐ２１−ＨＡ（図２６）は、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１遺伝子（以下、ｐ２１）およびＨＡ−タグをコードするＤＮＡ配列を含有するＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片を、ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ−消化ｐＢｌｅｕＳｃｒｉｐｔＫＳ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローンすることによって作成される。ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１遺伝子を、ＳａｌＩ制限部位によってＨＡ−タグ配列に連結する。ＨＡ−タグ配列に続いて、停止コドンがある。
【０５１９】
前記プラスミドＢｌｕＫＳ／ｐ２１−ＨＡをＳｐｅＩ−ＳａｌＩまたはＢａｍＨＩ−ＳａｌＩで消化して、３’−末端においてＨＡ  ＤＮＡ配列をタグとしてそれらが付されるのを可能とする注目するＳｐｅＩ−ＳａｌＩまたはＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ抗アポトーシス遺伝子断片（すなわち、新規な遺伝子、または対照として用いる公知の遺伝子Ｂｃｌ−ｘＬ）をサブクローンする。前記遺伝子断片は３’停止コドンを含有しない。停止コドンはＨＡ配列の３’末端にある。
【０５２０】
哺乳動物／酵母発現構築体
【０５２１】
ヒトＢｃｌ−２Ａ１、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ（α−シヌクレイン）、ＶＡＭＰ３およびＥＥＦ１Ａ１の全長ＳｐｅＩ−ＸｈｏＩ断片を、それらが抗アポトーシス遺伝子配列であると元来それから同定された同一ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって増幅される。増幅された断片を、ｐ２１を欠如するＳｐｅＩ−ＳａｌＩ−消化ＢｌｕＫＳ／ｐ２１−ＨＡベクターにクローン化する。ＰＣＲのために用いたセンスプライマーは、コーディング配列の５’末端に対して相補性の６コドン、ＳｐｅＩ制限部位およびコンセンサス翻訳開始配列（すなわち、Ｋｏｚａｋ配列、ＧＣＣＡＣＣ）を含有する。ＰＣＲで用いたアンチセンスプライマーは、コーディング配列の３’末端に対して相補的な６コドン、およびＸｈｏＩ制限部位を含有する。全てのプライマーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）によって合成され、それを表５にリストする。
【０５２２】
制限酵素消化に続き、ＳｐｅＩ−ＸｈｏＩ  ＰＣＲ断片を、まずＳｐｅＩおよびＳａｌＩで消化されたＢｌｕＫＳ／ｐ２１−ＨＡベクターにクローン化し、次いで、ｐ２１を欠如するベクターを単離する。結果として得られたプラスミドをＢｌｕ／Ｂｃｌ２Ａ１−ＨＡ（図２７）、Ｂｌｕ／ＦＫＢＰ２−ＨＡ（図２８）、Ｂｌｕ／ＳＮＣＡ−ＨＡ（図２９）、Ｂｌｕ／ＶＡＭＰ３−ＨＡ（図３０）およびＢｌｕ／ＥＥＦ１Ａ１−ＨＡ（図３１）と命名する。全長ヒトＢｃｌ−ｘＬをコードするＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ消化インサートを構築体ｐＳＰ７３／ＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ／Ｂｃｌ−ｘＬから単離し、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ−消化ＢｌｕＫＳ／ｐ２１−ＨＡベクター断片に連結して、プラスミドＢｌｕ／ＢｃｌｘＬ−ＨＡ（図３２）を得る。
【０５２３】
前記ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ−由来プラスミド（図２７ないし３２）をＳｐｅＩ−ＸｈｏＩで消化し、ＨＡ標識された全長Ｂｃｌ−２Ａ１、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＶＡＭＰ３、ＥＥＦ１Ａ１およびＢｃｌ−ｘＬ遺伝子断片を単離する。それらをＮｈｅＩ−ＸｈｏＩ消化哺乳動物細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）にサブクローンする。得られたプラスミドはｐｃＤ／Ｂｃｌ２Ａ１−ＨＡ（図３３）、ｐｃＤ／ＦＫＢＰ２−ＨＡ（図３４）、ｐｃＤ／ＳＮＣＡ−ＨＡ（図３５）、ｐｃＤ／ＶＡＭＰ３−ＨＡ（図３６）、ｐｃＤ／ＥＥＦ１Ａ１−ＨＡ（図３７）およびｐｃＤ／ＢｃｌｘＬ−ＨＡ（図３８）と命名される。
【０５２４】
ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ−由来プラスミド（図２７ないし３２）をＳｐｅＩ−ＸｈｏＩで消化し、ＨＡ標識された全長Ｂｃｌ−２Ａ１、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＶＡＭＰ３、ＥＥＦ１Ａ１およびＢｃｌ−ｘＬ遺伝子断片を単離する。また、それらをＳｐｅＩ−ＸｈｏＩ消化２−ミクロンのマルチコピー酵母発現ベクターｐＳＹＥ２２４（図３９）、ｐＳＹＥ２３９（図４０）にサブクローンする。プラスミドｐＳＹＥ２２４およびｐＳＹＥ２３９は、各々、ＧＡＬ１プロモーター（ＧＡＬ１ｐ）およびＰＧＫ１プロモーター（ＰＧＫ１ｐ）を含有する。双方のプラスミドは栄養要求性選択マーカーとしてＵＲＡ３遺伝子を含有する。
【０５２５】
ＧＡＬ１プロモーターの制御下でＨＡ標識された抗アポトーシス遺伝子を担うｐＳＹＥ２２４（図３９Ａ）に由来するプラスミドを２２４／Ｂｃｌ２Ａ１−ＨＡ（図４１）、２２４／ＦＫＢＰ２−ＨＡ（図４２）、２２４／ＳＮＣＡ−ＨＡ（図４３）、２２４／ＶＡＭＰ３−ＨＡ（図４４）、２２４／ＥＥＦ１Ａ１−ＨＡ（図４５）および２２４／ＢｃｌｘＬ−ＨＡ（図４６）と命名する。
【０５２６】
ＰＧＫ１プロモーターの制御下でＨＡ標識された抗アポトーシス遺伝子を担うｐＳＹＥ２３９（図４０）に由来するプラスミドを２３９／Ｂｃｌ２Ａ１−ＨＡ（図４７）、２３９／ＦＫＢＰ２−ＨＡ（図４８）、２３９／ＳＮＣＡ−ＨＡ（図４９）、２３９／ＶＡＭＰ３−ＨＡ（図５０）、２３９／ＥＥＦ１Ａ１−ＨＡ（図５１）および２３９／ＢｃｌｘＬ−ＨＡ（図５２）と命名する。
【０５２７】
ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎベクターｐＹＥＳ２（図３９Ｂ）はｐＳＹＥ２２４の代わりに用いることができると認識される。我々は、我々のｃＤＮＡライブラリーのｐＳＹＥ２２４への一方向クローニングのためにＳｐｅＩ−ＮｏｔＩ部位を用いた。ＮｏｔＩは（５’突出を有する）８−ｂｐ制限部位および稀なカッターである。我々は、ＮｏｔＩのようにやはり稀なカッターである（３’突出を有する）８−ｂｐ  ＰａｃＩ制限部位を、一方向クローニング目的のためにｐＹＥＳ２に導入することを意図する。その後、ＰａｃＩ部位を、６−ｂｐ制限部位ＳｐｅＩの代わりに一方向クローニングで用いる。
【０５２８】
【表５】
2009526541.tif 000007
【０５２９】
実施例５：酵母における選択された遺伝子の抗アポトーシス機能
【０５３０】
全長ヒトＢｃｌ−２Ａ１、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＶＡＭＰ３、およびＥＥＦ１Ａ１を、同一のヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって増幅して、ＧＡＬ１プロモーターの制御下にある（図４１ないし４５）またはＰＧＫ１プロモーターの制御下にある（図４７ないし５１）ＨＡ−タグとしての全ての遺伝子を含有する図４１ないし４５および図４７ないし５１に表されるプラスミドを構築する。これらのプラスミドを前記実施例２に記載したようにＷ３０３ｐａｘｌｅｕに形質転換して、酵母におけるそれらの抗アポトーシス機能を分析する。
【０５３１】
５つの新規な遺伝子のＢａｘ救済能力
【０５３２】
スポットテスト
【０５３３】
新規な遺伝子を保有する個々のコロニー（すなわち、形質転換体）からの細胞の小さなスプーン分を２００μｌの水に再懸濁し、これらの形質転換体の５μｌのアリコットを、適した補充物を含有するＳＤおよびＳＧプレート上にスポットする。
【０５３４】
新規な遺伝子によるＢａｘに対する増大したコロニー−形成能力
【０５３５】
新規な抗アポトーシス遺伝子はＢａｘ媒介死滅から酵母の生存を可能とする。
【０５３６】
全長遺伝子をヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーから増幅し、酵母発現プラスミドｐＳＹＥ２２４（図３９）およびｐＳＹ２３９（図４０）中のＧＡＬ１およびＰＧＫ１プロモーターの下流に挿入する。全ての遺伝子はそれらの３’−末端にＨＡ−タグを有する。ＧＡＬ１プロモーターによって駆動される遺伝子についての代表的な結果を図５３に示す（すなわち、ｐＳＹＥ２２４誘導体；図４１ないし４６）。同様な結果はｐＳＹＥ２３９誘導体で得られる（すなわち、図４７ないし５２）。
【０５３７】
実施例６：哺乳動物細胞における選択された遺伝子の抗アポトーシス機能
【０５３８】
哺乳動物細胞培養アッセイ
【０５３９】
細胞
【０５４０】
ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ２９３，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３，ＬＧＣ  Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，ＵＫ）を、２５または７５ｃｍ２組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ  １４８３１，ＵＳＡ）中で、３７℃における５％ＣＯ２の湿潤雰囲気にて、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ；Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）および２ｍＭのＬ−グルタミンを補足したダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）中で成長させる。タンパク質の安定な発現の分析のために、細胞を、１ｍｇ／ｍｌの濃度をＧ４１８（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を含有する同一培地中で培養して、トランスフェクトされた細胞について選択した。免疫細胞化学分析のために、細胞をカバーグラス上で２４ないし４８時間成長させる。
【０５４１】
トリプシン処理
【０５４２】
細胞を、３７℃のリン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ）中の０．０５％トリプシン、０．０４％  ＥＤＴＡでの、７０ないし８０％密集において、継代培養またはＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ−媒介トランスフェクション（Ａｍａｘａ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のために脱着させる。５分後、トリプシン処理を２倍量の成長培地で停止させ、カバーグラスを備えた新しいフラスコまたは６−ウェルプレートに移す。
【０５４３】
一過性トランスフェクション
【０５４４】
製造業者の指示に従い、ＱＩＡＧＥＮエンドトキシン−フリーのプラスミドＭａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃ−１２３６２，Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ，ＵＫ）を用いて、トランスフェクションのためのＤＮＡを調製した。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ−媒介トランスフェクションのために、親ＨＥＫ２９３細胞、または注目する遺伝子を安定に発現するそのトランスフェクタントいずれかをＰＢＳで洗浄し、吸引して、ＰＢＳを捨てる。成長培地を吸引し、培養した接着性細胞をリン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ）で１回洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡで直ちに脱着させ、１７０ｘｇにおいて５分間遠心する。１×１０６細胞を１００μｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｖ（Ａｍａｘａ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に再懸濁させる。その後、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）ベクターＤＮＡ、またはＢａｘの断片を含有するベクター（図１０、図１１）のいずれかの５μｇを加え、混合物をエレクトロポレーションキュベットに移し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒデバイス（Ａｍａｘａ）に入れる。Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｑ−０１をトランスフェクションで用いる。（さらなる詳細はＡｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙの私物の情報である）。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎの直後に、懸濁液を、４ｍｌの予め温めた培養基を含有するＴ−２５（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移す。培地を１５ないし２０時間後に交換する。２４時間後に、１０のランダムに選択された場において蛍光顕微鏡下でｅＧＦＰについて陽性の細胞の数をカウントすることによって、トランスフェクトされた細胞の効率を決定する。
【０５４５】
ヒトＢｃｌ−２Ａ１、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＶＡＭＰ３、ＥＥＦ１Ａ１およびＢｃｌ−ｘＬを安定に発現する細胞系の樹立
【０５４６】
Ｇ４１８耐性によるクローン選択
【０５４７】
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）に由来し、かつＨＡ標識された全長Ｂｃｌ−２Ａ１、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＶＡＭＰ３、ＥＥＦ１Ａ１およびＢｃｌ−ｘＬ遺伝子断片を運ぶプラスミドＤＮＡ（図３３ないし３８）およびｐｃＤＮＡ３．１ベクターをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトする（実施例２参照）。トランスフェクタントを、８ｍｌの予め温めた培養基を含有する１００−ｍｍ組織培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に蒔く。２日間のインキュベーション後に、トランスフェクトされた細胞を、１  ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する培地中でＧ４１８耐性について選択する。１０ないし１５日後に、生存する単一コロニー（Ｇ４１８−耐性コロニー）をクローニングリングを用いて拾い、２００ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含有する培地中でさらに選択しつつ２４−ウェル皿に移す。ヒトＢｃｌ−２Ａ１、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＶＡＭＰ３、ＥＥＦ１Ａ１およびＢｃｌ−ｘＬの発現を、免疫細胞化学を用い、抗ＨＡ−フルオレセイン（Ｒｏｃｈｅ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて決定する。トランスフェクタントの均一性は、反復サブクローニングによって確認する。
【０５４８】
安定なクローンの単離
【０５４９】
一過性トランスフェクション効率は、各々、典型的には９０％である。
【０５５０】
安定な形質転換体はＨＥＫ２９３／Ｂｃｌ２Ａ１、ＨＥＫ２９３／ＦＫＢＰ２、ＨＥＫ２９３／ＳＮＣＡ、ＨＥＫ２９３／ＶＡＭＰ３、ＨＥＫ２９３／ＥＥＦ１Ａ１およびＨＥＫ２９３／Ｂｃｌ−ｘＬと命名され、これは、各々、ＨＡ標識されたＢｃｌ−２Ａ１、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＶＡＭＰ３、ＥＥＦ１Ａ１およびＢｃｌ−ｘＬを発現する。モック対照として、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）をＨＥＫ２９３に導入し、ＨＥＫ２９３ｐｃ０と命名する（表６）。
【０５５１】
【表６】
2009526541.tif 000008
【０５５２】
免疫細胞化学
【０５５３】
免疫細胞化学（ＩＣＨ）は、細胞における、および組織におけるタンパク質の同定のための重要な方法である。ほぼ２４ないし４８時間後、トランスフェクトされた細胞を、０．００１％ポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ）で予め被覆した滅菌カバーグラスを含有する６−ウェルプレートに蒔き、細胞を予め温めたＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（Ｓｉｇｍａ）／ＰＢＳで３７℃にて１５分間固定する。細胞を２回洗浄し、０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／１０  ｍＭリン酸ナトリウム／０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を用いて室温にて５分間浸透させる。次いで、細胞を、ＨＡ標識された組換えタンパク質に対するフルオレセイン共役モノクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（１：５０希釈））と共に１時間インキュベートする。１０μｇ／１００ｍｌ  ＤＡＰＩを含有するＰＢＳ中の室温での５分間の洗浄の後に、グリセロール中の抗フェード接地培地（０．１％Ｐ−フェニレンジアミン（ＰＰＤ）（Ｓｉｇｍａ））を用い、カバーグラス上の細胞をスライドグラス上に設置する。次いで、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ５．５Ｂソフトウエアを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７０蛍光顕微鏡によってスライドグラスを分析し、Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓデジタルイメージングカメラによってイメージを捕獲する。細胞をＤＡＰＩ逆染色して、核ＤＮＡを同定する。代表的な写真を図５４に示す。
【０５５４】
表６は、ＨＡ標識されたタンパク質の存在を確認する免疫細胞化学から得られた結果をまとめる。
【０５５５】
ウェスタンブロッティング
【０５５６】
細胞溶解物からの２０μｇの全タンパク質を、１０％ＰＡＧＥを用いて分画する。ＨＡ−タグを認識するモノクローナル抗体を用いて、ＨＡ標識されたタンパク質を照射する。
【０５５７】
表６は、ＨＡ標識されたタンパク質の存在を確認するウェスタンブロッティングから得られた結果をまとめる。
【０５５８】
ＨＥＫ２９３におけるＢａｘ媒介細胞死滅
【０５５９】
プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｂａｘ（図１０）およびｐＩＲＥＳＥＧＦＰ／Ｂａｘ（図１１）を用いるＢａｘのＨＥＫ２９３へのトランスフェクションの後に、トリパンブルー排除アッセイを用いて細胞生存率を決定して、Ｂａｘ媒介細胞死滅を検出する。
【０５６０】
実験
【０５６１】
ＨＥＫ２９３細胞をｐｃＤＮＡ３．１／Ｂａｘ（図１０）、対照プラスミドｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＩＲＥＳＥＧＦＰ／Ｂａｘ（図１１）および対照プラスミドｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でトランスフェクトする。各トランスフェクションを６−ウェルプレートの６ウェル上で同等に平板培養する。正確に同一量の細胞およびプラスミドＤＮＡを各トランスフェクションで利用する。トランスフェクタントを前記実施例６に記載したようにインキュベートする。培地を１５ないし２０時間後に交換する。トランスフェクション後最初の５日間、毎日、全ての６ウェルの同一トランスフェクタントを個々に収穫する。細胞をすすぎ、温和に掻き取り、遠心によってペレット化し、０．１％トリパンブルーを含有する５００μｌの培養基に再懸濁し、ヘマトサイトメーターに負荷し、光学顕微鏡によって調べる。次いで、生きたおよび生きていない（青色細胞）細胞をカウントし、得られたスコアは、全細胞のパーセンテージとしての死滅した細胞を示す。相対的生存（すなわち、生きた）率も計算する。この実験を３回反復する。
【０５６２】
結果
【０５６３】
細胞死滅はＢａｘトランスフェクション後にＨＥＫ２９３において起こる。生きた細胞によるトリパンブルー染色の排除は、Ｂａｘ含有プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｂａｘ（図１０）およびｐＩＲＥＳＥＧＦＰ／Ｂａｘ（図１１）の一過性トランスフェクション後に、ヘマトサイトメーターを用いて光学顕微鏡下で評価する。結果は、細胞生存率の減少を明瞭に示す。培養された細胞を収穫し、カウントして、Ｂａｘトランスフェクション後の示された時間の間における死滅した細胞のパーセンテージを決定する（図５５、パネルＡ）。細胞を第１日ないし第５日の間にカウントする。結果を、空のベクターでトランスフェクトされた細胞と比較する（すなわち、ｐｃＤＮＡ３．１およびｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ）。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｂａｘ（図１０）およびｐＩＲＥＳＥＧＦＰ／Ｂａｘ（図１１；ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ／Ｂａｘとして図５５では標識する）でトランスフェクトされた細胞は、死滅した細胞のパーセンテージの増加を示す（Ｐ＜０．００１）。細胞死滅は用いたベクターから独立しているように見える（Ｐ＞０．０５）。パネルＢ（図５５）は、Ｂａｘまたはベクタートランスフェクション後の第３日目の生きた細胞の相対的パーセンテージを示す。
【０５６４】
ＹＡＳによって選択された新規な遺伝子のヒト細胞における抗アポトーシス機能
【０５６５】
新規な遺伝子から発現されたタンパク質によるＢａｘ媒介死滅の阻害
【０５６６】
同様なトリパンブルー排除アッセイを用いて、Ｂａｘ媒介死滅からＨＥＫ２９３を保護するＢｃｌ−２Ａ１、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＶＡＭＰ３、ＥＥＦ１Ａ１およびＢｃｌ−ｘＬタンパク質の能力を決定する。
【０５６７】
ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ／ＢａｘをＢｃｌ−２Ａ１、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＶＡＭＰ３、ＥＥＦ１Ａ１  Ｂｃｌ−ｘＬおよびベクターでトランスフェクトした安定な細胞系にトランスフェクトする。ベクター−トランスフェクションを陰性対照として行う。正確な同一量の細胞およびプラスミドＤＮＡを各トランスフェクションで利用する。トランスフェクタントを実施例６にて前記したようにインキュベートする。培地を１５ないし２０時間後に交換し、トランスフェクション効率を計算する。３日間のインキュベーションの後に、生きた細胞を前記したようにカウントする。得られたスコアから、Ｂａｘ媒介死滅を受ける細胞のパーセンテージが得られ、以下の式に従って計算する。実験は６回反復し、結果を図５６に示す。
【０５６８】
Ｂａｘ媒介細胞死滅（％）＝［（Ｖ０−ＶＢａｘ）／（Ｆｔ×Ｖ０）］×１００％
【０５６９】
Ｖ０は、Ｂａｘ無しの、すなわち、ベクター−トランスフェクション後の生きた細胞の数を表し；ＶＢａｘはＢａｘ単独でのトランスフェクション後の生きた細胞の数を表し；Ｆｔは平均トランスフェクション効率を表す。
【０５７０】
ＴＵＮＥＬアッセイによるＤＮＡ断片化の検出
【０５７１】
ＦＡＣＳ（蛍光−活性化細胞ソーティング）分析を用いるＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ［ＴｄＴ］−媒介ｄＵＴＰニック末端標識）によって、Ｂａｘ誘導アポトーシスを定量する。
【０５７２】
ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ／Ｂａｘを、ヒトＢｃｌ−２Ａ１、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＶＡＭＰ３、ＥＥＦ１Ａ１およびＢｃｌ−ｘＬを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトする。３日間のインキュベーションの後、トランスフェクタントを収穫し、ＰＢＳ中で洗浄する。次いで、細胞を、ＰＢＳ中の新たに調製された２％パラホルムアルデヒドで１５ないし２５℃にて６０分間固定する。ＰＢＳで再度洗浄した後、細胞を、氷上で、１％クエン酸ナトリウム中の１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で２分間浸透させ、続いて、ＰＢＳで２回洗浄する。次いで、ＰＢＳ中の最終洗浄、およびＰＩ／ＲＮａｓｅ溶液（ＰＢＳ中０．００１％ヨウ化プロピジウム、０．０５％  ＲＮａｓｅ  Ａ）中への再懸濁の前に、製造業者の指示に従い、暗所中の湿潤雰囲気にて、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼおよびＦＩＴＣ−ｄＵＴＰを含有するＡｐｏｔａｇ（Ｒｏｃｈｅ，Ｅａｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ，ＵＫ）酵素反応混合物と共に、細胞を３７℃にて６０分間インキュベートする。次いで、光源としての４８８ｎｍアルゴンレーザーを備えたＢｅｃｋｍａｎｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒフローサイトメーター（Ｅｐｉｃ−Ａｌｔｒａ）を用いてＦＡＣＳ分析を行う。ヨウ化プロピジウム（ＤＮＡ）は、（細胞の合計数を決定する）６２３ｎｍにおいて蛍光を発し、およびＦＩＴＣは（アポトーシス細胞を決定する）５２０ｎｍにおいてである。注目する合計１０，０００事象を分析する。結果を図５７に示す。
【０５７３】
インサイチュ免疫蛍光によるミトコンドリアからのチトクロームｃ放出の決定
【０５７４】
プロアポトーシスＢａｘはミトコンドリアからチトクロームｃを放出して、アポトーシスを誘導することが示されている。酵母スクリーニングを用いてヒト海馬からの新たに発見された抗アポトーシスタンパク質は、もしそれが真に抗アポトーシスであれば、ヒト細胞においてチトクロームｃ放出を妨げるはずである。
【０５７５】
ｐｃＤＮＡ３．１／Ｂａｘは、ヒトＢｃｌ−２Ａ１、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＶＡＭＰ３、ＥＥＦ１Ａ１、Ｂｃｌ−ｘＬおよび空のベクターを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトする（前記参照）。０．００１％ポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ）で予めコートされた、滅菌カバーグラスを含有する６−ウェルプレートに、ある量のトランスフェクトされた細胞を直接的に蒔く。３日間のインキュベーションの後、製造業者の指示に従い、ＳｅｌｅｃｔＦＸ（商標）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ（登録商標）４８８  Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いてチトクロームｃを標識する。簡単に述べれば、細胞をカバーグラス上で成長させ、予め温めたＰＢＳで２回洗浄し、新たに調整された４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（Ｓｉｇｍａ）／ＰＢＳで３７℃にて１５分間固定する。細胞を２回洗浄し、０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／１０  ｍＭリン酸ナトリウム／０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を用いて、室温にて５分間浸透させる。試料をブロッキング溶液（ＰＢＳで２回洗浄した後における、ＰＢＳ中の１０％加熱−不活化ヤギ血清）でブロックする。初代抗チトクロームｃマウスＩｇＧ１はこのブロッキング溶液中で５００倍希釈し、湿潤ボックス中のスライドグラス上で細胞と共に室温にて１時間インキュベートする。試料をブロッキング溶液で２回すすぎ、暗所中にて、Ａｌｅｘａ４８８ヤギ抗マウス二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共に室温にて３０分間インキュベートする。試料をＰＢＳ中で３回すすぎ、抗フェード接地培地（グリセロール中０．１％Ｐ−フェニレンジアミン（ＰＰＤ）（Ｓｉｇｍａ））を用いてスライドグラス上に設置する。次いで、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７０蛍光顕微鏡によってスライドを分析し、Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓデジタルイメージングカメラによってイメージを捕獲する。結果を図５８に示す。
【０５７６】
ミトコンドリア膜ポテンシャルの測定
【０５７７】
ヨウ化３，３’ジヘキシルオキサカルボシアニン［ＤｉＯＣ６（３）］−染色細胞を用いるフローサイトメトリー分析によって、ミトコンドリア膜ポテンシャル（DYｍ）を定量する。アッセイは、負のミトコンドリア膜ポテンシャルによってミトコンドリアに輸送され、かくして、ミトコンドリアマトリックス内に濃縮される親油性のカチオン性蛍光色素［ＤｉＯＣ６（３）］を利用する。減少したミトコンドリア膜ポテンシャルは、低下した細胞蛍光に導く。
【０５７８】
ｐｃＤＮＡ３．１／Ｂａｘを、ヒトＢｃｌ−２Ａ１、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＶＡＭＰ３、ＥＥＦ１Ａ１、Ｂｃｌ−ｘＬおよび空のベクターを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトする。０．００１％ポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ）で予めコートされた、滅菌カバーグラスを含有する６−ウェルプレートにある量のトランスフェクトされた細胞を直接蒔く。細胞をＤｉＯＣ６（３）（ＰＢＳ中４０ｎＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）で３７℃にて１５分間染色し、ＰＢＳで１回洗浄し、続いて、フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃ−Ａｌｔｒａ；４８８ｎｍにおける励起、５２５ｎｍにおける発光）で分析する。結果を図５９に示す。
【０５７９】
反応性酸素種（ＲＯＳ）の細胞内生成
【０５８０】
蛍光色素、２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセイン二酢酸（Ｈ２ＤＣＦＤＡ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）を用い、Ｂａｘ媒介ＲＯＳ生産をモニターする。この色素は、細胞に容易に拡散し、ＤＣＦＨを生じる安定な非極性化合物である。ペルオキシダーゼの存在下で、細胞内Ｈ２Ｏ２または他の低分子量ペルオキシドは、ＤＣＦＨを高度に蛍光性の化合物ＤＣＦまで酸化する。かくして、ＤＣＦによって発せられた蛍光は、細胞の総じての酸化的状態を直接的に反映する（Ｗａｎｇ  ＆  Ｊｏｓｅｐｈ，１９９９）。
【０５８１】
ｐｃＤＮＡ３．１／Ｂａｘを、ヒトＢｃｌ−２Ａ１、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＶＡＭＰ３、ＥＥＦ１Ａ１、Ｂｃｌ−ｘＬおよび空のベクターを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトする。Ｂａｘトランスフェクション後第４日に、培地を吸引し、培養された細胞を生理学的緩衝液（１４０  ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，１．２ｍＭ  ＮａＨＰＯ４，５ｍＭグルコースおよび２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ  ７．４）で２回洗浄し、直ちに、トリプシン／ＥＤＴＡで脱着し、次いで、５％ＣＯ２／９５％空気中にて、ＦＢＳを含まないが５μＭ  Ｈ２ＤＣＦＤＡを含有する２ｍｌの細胞培養基中で３７℃にて３０分間インキュベートする。細胞をＰＢＳで２回洗浄して、過剰の細胞Ｈ２ＤＣＦＤＡを除去する。次いで、１×１０６を１ｍｌのＰＢＳに再懸濁させる。１００μｌの各処理からの細胞を、黒色スライドグラスを供えた９６−ウェルプレートに負荷する。細胞蛍光を４９２ｎｍ（励起）および５２０ｎｍ（発光）の波長で検出する。Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）ＨＴ  Ｍｕｌｔｉ−Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，Ｖｅｒｍｏｎｔ，ＵＳＡ）を用い、相対的蛍光−強度をモニターする。１０の独立した測定からの値を、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（登録商標）ＫＣ４ソフトウェアを用いて計算して、平均値を得る。結果を図６０に示す。
【０５８２】
前記実験において、特記しない限り、データは平均±ＳＤとして表す。我々は、全ての統計学的計算のためにＳＰＳＳ１２．０ソフトウェアを用いる。全てのテストにおいて、同一実験を少なくとも３回（ｎ3３）反復し、差は、もしｐ値が＜０．０５であれば統計学的に有意であると考えられる。
【０５８３】
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【図面の簡単な説明】
【０５８４】
【図１】図１は構築体ｐＢＧＡＬ１Ｍの模式図である。
【図２】図２は構築体ｙＩＰＬＥＵＧ１の模式図である。
【図３】図３は、構築体ｙＩＰＡＤＥＧ１の模式図である。
【図４】図４は、構築体ｙＩＰＴＲＰＧ１の模式図である。
【図５】図５は、構築体ｙＩＰＨＩＳＧ１の模式図である。
【図６】図６は、構築体ｉＬＥＵＢＡＸの模式図である。
【図７】図７は、構築体ｉＡＤＥＢＡＸの模式図である。
【図８】図８は、構築体ｉＴＲＰＢＡＸの模式図である。
【図９】図９は、構築体ｉＨＩＳＢＡＸの模式図である。
【図１０】図１０は、構築体ｐｃＤＮＡ３．１／Ｂａｘの模式図である。
【図１１】図１１は、構築体ｐＩＲＥＳＥＧＦＰ／ＢＡＸの模式図である。
【図１２】図１２は、構築体ｐＳＹＩ２１４の模式図である。
【図１３】図１３は、構築体ｐＲＳ４２６／ＧＡＬ１ＭＳの模式図である。
【図１４】図１４は、構築体ｐＲＳ４２６／ＰＧＫＭＳの模式図である。
【図１５】図１５は、構築体ｐＲＳ４１６／ＧＡＬ１ＭＳの模式図である。
【図１６】図１６は、構築体ｐＲＳ４１６／ＰＧＫＭＳの模式図である。
【図１７】図１７は、構築体４２６／ＧＡＬＢｃｌ２の模式図である。
【図１８】図１８は、構築体４２６／ＧＡＬＢｃｌ−ｘＬの模式図である。
【図１９】図１９は、構築体４２６／ＰＧＫＢｃｌ２の模式図である。
【図２０】図２０は、構築体４２６／ＰＧＫＢｃｌ−ｘＬの模式図である。
【図２１】図２１は、構築体４１６ＧＡＬ／Ｂｃｌ２の模式図である。
【図２２】図２２は、構築体４１６ＧＡＬ／Ｂｃｌ−ｘＬの模式図である。
【図２３】図２３は、構築体４１６ＰＧＫ／Ｂｃｌ２の模式図である。
【図２４】図２４は、構築体４１６ＰＧＫ／Ｂｃｌ−ｘＬの模式図である。
【図２５Ａ】２−ミクロンおよび動原体プラスミドで生じたＢｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬによる細胞成長のＢａｘ媒介阻害の救済の比較（図１７ないし２４）。Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬ遺伝子は、形質転換によって、または接合を介して、異なるＢａｘ株に導入される（表４参照）。異なる観察が異なるＢａｘ株、プラスミド、およびそれらの組合せでなされる。パネルＡ：ＳＤまたはＳＧでのスポットテストパネルＢ：「成長」についてのスコアは（バックグラウンド時間−成長時間）／成長時間を介して得られ、ここに、「成長時間」は、全ての陽性スポットがＳＧ培地で観察される日である。「バックグラウンド」は、空のプラスミドで形質転換された株を意味する（図１３ないし１６）。「バックグラウンド時間」は、最初の偽陽性コロニーが観察される日によってスコア取りされる。  他の株と比較して、Ｗ３０３ｂａｘｌｅｕは低いバックグラウンドおよび高い成長を有する。２つの異なるプロモーターＧＡＬ１およびＰＧＫ１は、これらの株のいずれにおいてもいずれの有意な差を生じない、Ｐ＞０．０５。
【図２５Ｂ】２−ミクロンおよび動原体プラスミドで生じたＢｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬによる細胞成長のＢａｘ媒介阻害の救済の比較（図１７ないし２４）。Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬ遺伝子は、形質転換によって、または接合を介して、異なるＢａｘ株に導入される（表４参照）。異なる観察が異なるＢａｘ株、プラスミド、およびそれらの組合せでなされる。パネルＡ：ＳＤまたはＳＧでのスポットテストパネルＢ：「成長」についてのスコアは（バックグラウンド時間−成長時間）／成長時間を介して得られ、ここに、「成長時間」は、全ての陽性スポットがＳＧ培地で観察される日である。「バックグラウンド」は、空のプラスミドで形質転換された株を意味する（図１３ないし１６）。「バックグラウンド時間」は、最初の偽陽性コロニーが観察される日によってスコア取りされる。  他の株と比較して、Ｗ３０３ｂａｘｌｅｕは低いバックグラウンドおよび高い成長を有する。２つの異なるプロモーターＧＡＬ１およびＰＧＫ１は、これらの株のいずれにおいてもいずれの有意な差を生じない、Ｐ＞０．０５。
【図２６】図２６は、構築体ＢｌｕＫＳ／ｐ２１−ＨＡの模式図である。
【図２７】図２７は、構築体Ｂｌｕ／Ｂｃｌ２Ａ１−ＨＡの模式図である。
【図２８】図２８は、構築体Ｂｌｕ／ＦＫＢＰ２−ＨＡの模式図である。
【図２９】図２９は、構築体Ｂｌｕ／ＳＮＣＡ−ＨＡの模式図である。
【図３０】図３０は、構築体Ｂｌｕ／ＶＡＭＰ３−ＨＡの模式図である。
【図３１】図３１は、構築体Ｂｌｕ／ＥＥＦ１Ａ１−ＨＡの模式図である。
【図３２】図３２は、構築体Ｂｌｕ／Ｂｃｌｘｌ−ＨＡの模式図である。
【図３３】図３３は、構築体ｐｃＤ／Ｂｃｌ２Ａ１−ＨＡの模式図である。
【図３４】図３４は、構築体ｐｃＤ／ＦＫＢＰ２−ＨＡの模式図である。
【図３５】図３５は、構築体ｐｃＤ／ＳＮＣＡ−ＨＡの模式図である。
【図３６】図３６は、構築体ｐｃＤ／ＶＡＭＰ３−ＨＡの模式図である。
【図３７】図３７は、構築体ｐｃＤ／ＥＥＦ１Ａ１−ＨＡの模式図である。
【図３８】図３８は、構築体ｐｃＤ／ＢｃｌｘＬ−ＨＡの模式図である。
【図３９Ａ】図３９（Ａ）は、構築体ｐＳＹＥ２２４の模式図である。
【図３９Ｂ】図３９（Ｂ）は、構築体ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の模式図である。
【図４０】図４０は、構築体ｐＳＹＥ２３９の模式図である。
【図４１】図４１は、構築体２２４／Ｂｃｌ２Ａ１−ＨＡの模式図である。
【図４２】図４２は、構築体２２４／ＦＫＢＰ２−ＨＡの模式図である。
【図４３】図４３は、構築体２２４／ＳＮＣＡ−ＨＡの模式図である。
【図４４】図４４は、構築体２２４／ＶＡＭＰ３−ＨＡの模式図である。
【図４５】図４５は、構築体２２４／ＥＥＦ１Ａ１−ＨＡの模式図である。
【図４６】図４６は、構築体２２４／ＢｃｌｘＬ−ＨＡの模式図である。
【図４７】図４７は、構築体２３９／Ｂｃｌ２Ａ１−ＨＡの模式図である。
【図４８】図４８は、構築体２３９／ＦＫＢＰ２−ＨＡの模式図である。
【図４９】図４９は、構築体２３９／ＳＮＣＡ−ＨＡの模式図である。
【図５０】図５０は、構築体２３９／ＶＡＭＰ３−ＨＡの模式図である。
【図５１】図５１は、構築体２３９／ＥＥＦ１Ａ１−ＨＡの模式図である。
【図５２】図５２は、構築体２３９／ＢｃｌｘＬ−ＨＡの模式図である。
【図５３】Ｂａｘ株Ｗ３０３ｂａｘｌｅｕへの形質転換の後、これらの遺伝子の救済能力をテストする。スポットテストは、５μｌのアリコット（すなわち、同一数の細胞）をＳＤおよびＳＧプレート上にスポットすることによって行う。新規な遺伝子およびＢＡＸを共発現する細胞は、ＳＧプレート上で異なる程度まで成長する。これは、ＢＡＸのみを保有するが、空のベクターを含有する細胞とは対照的である。予測されるように、これらの細胞は全く成長しない。同様な結果が、ＧＡＬ１およびＰＧＫ１プロモーターの制御下で発現される新規な遺伝子で得られる。
【図５４】図５４は、ＨＡ標識されたタンパク質の存在についての免疫細胞化学の代表的な写真である。
【図５５】パネルＡは、Ｂａｘトランスフェクション後の示された時間の間における死滅した細胞のパーセンテージを示す。パネルＢが、Ｂａｘまたはベクタートランスフェクション後の第３日における生きた細胞の相対的パーセンテージを示す。
【図５６】新規なタンパク質によるＢａｘ媒介死滅から救済する能力。救済タンパク質を含む、または含まない生きた細胞（トリパンブルー陰性細胞）は、ヘマトサイトメーターを用い、Ｂａｘトランスフェクション後に光学顕微鏡下でカウントする。Ｂａｘ媒介死滅は、上述した式に従って計算される。ベクター単独を含有する細胞系と比較して、新たに見出された抗アポトーシス遺伝子を発現する細胞は、Ｂａｘ媒介死滅の有意な減少を示す（Ｐ＜０．０１）。新たに見出された抗アポトーシス遺伝子の存在下または不存在下において、Ｂａｘ媒介死滅を受けている各細胞系における細胞のパーセンテージを図面に示す。
【図５７】Ｂａｘトランスフェクション後にヒトＢｃｌ−２Ａ１、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＶＡＭＰ３、ＥＥＦ１Ａ１およびＢｃｌ−ｘＬを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞でのアポトーシスの定量的ＴＵＮＥＬ−ＦＡＣＳ分析。細胞を培養し、実施例６に記載されたようにアッセイし、（アポトーシスをもたらす）ＤＮＡ断片化をフローサイトメトリーによって検出する。新たに見出された抗アポトーシスタンパク質の不存在下および存在下にて、アポトーシスを受けた細胞のパーセンテージを図面に示すＨ２Ｏ２処理細胞を陽性対照として採用する。というのは、Ｈ２Ｏ２は全ての真核細胞においてかなりのアポトーシスを誘導することが知られているからである。ｙ−軸はＦＩＴＣ−ｄＵＴＰの蛍光強度を表し、他方、ｘ−軸はＤＮＡ含有量を現す。
【図５８】新規な遺伝子はＢａｘ誘導チトクロームｃ放出を阻害する。トランスフェクション後３日目に細胞を抗チトクロームｃモノクローナル抗体、続いて、Ａｌｅｘａ４８８−共役ヤギ抗マウスＩｇＧで標識する。標識された細胞をＦＩＴＣ特異的フィルターを用いて蛍光顕微鏡によって可視化する。点状チトクロームｃ標識パターンはチトクロームｃのミトコンドリア局所化を表し、他方、散漫な標識パターンはそのサイトゾル局所化を表す。サイトゾルチトクロームｃの強い標識は、Ｂａｘ救済タンパク質を含有しないＢａｘトランスフェクション後の細胞で観察される。他方、Ｂａｘと共にＢｃｌ−２Ａ１、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＶＡＭＰ３、ＥＥＦ１Ａ１またはＢｃｌ−ｘＬを共発現する細胞系は、サイトゾルのチトクロームｃ局所化パターンの減少を呈する。
【図５９】新規なＢａｘ救済遺伝子はＢａｘ誘導DYｍ喪失を阻害する。Ｂａｘを、新規な遺伝子発現の有りまたは無しにて、ＨＥＫ２９３細胞系にトランスフェクトする。トランスフェクタントを記載したように７２時間インキュベートする。DYｍはＤｉＯＣ６（３）染色を伴うフローサイトメトリーによって評価する。Ｈ２Ｏ２で処理したＨＥＫ２９３は陰性または陽性対照をトリガーする。フロー−サイトメトリープロフィールにおいて、ｙ−軸は分析された事象を表し（１０，０００）；ｘ−軸は蛍光強度のｌｏｇをいい；パーセンテージとはDYｍ喪失をいう。
【図６０】新規な遺伝子はＢａｘ誘導細胞内ＲＯＳを減少させる。Ｂｃｌ−２Ａ１、ＦＫＢＰ２、ＳＮＣＡ、ＶＡＭＰ３、ＥＥＦ１Ａ１およびＢｃｌ−ｘＬの発現は、空のべクター（Ｖｅｃｔｏｒ）と共にＢａｘのみを発現する細胞と比較して減少した蛍光−強度に導く。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）でトランスフェクトされた親ＨＥＫ２９３細胞は陰性対照であって、１００％（ＣＴＬ）として表され、他方、Ｈ２Ｏ２−処理ＨＥＫ２９３は陽性対照である。
【図６１Ａ】ＧＡＬ１ＭＳ構築体、ＸｈｏＩ−ＳａｃＩ断片のポリヌクレオチド配列（配列番号１）；酵母バイアスドコドンを用いて合成されたヒトＢａｘα  ＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ断片（配列番号２）；およびヒトＢａｘα  ＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ断片によってコードされたポリペプチド配列（配列番号３）。
【図６１Ｂ】ＧＡＬ１ＭＳ構築体、ＸｈｏＩ−ＳａｃＩ断片のポリヌクレオチド配列（配列番号１）；酵母バイアスドコドンを用いて合成されたヒトＢａｘα  ＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ断片（配列番号２）；およびヒトＢａｘα  ＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ断片によってコードされたポリペプチド配列（配列番号３）。
【図６２Ａ】Ｂａｘ媒介アポトーシスの阻害剤についての酵母スクリーニングから得られた「ｈｉｔｓ」のポリヌクレオチドの配列。リストされた配列はＳＣＮＡ（配列番号５）、ＦＫＢＰ２（配列番号６）、ＳＮＡＰ２５（配列番号９）、ＥＥＦ１Ａ１（配列番号７）、ＶＡＭＰ３（配列番号８）、ＲＩＭＳ３（配列番号１０）、ＲＡＢ４０Ｂ（配列番号１１）、ＨＭＧＣＳ１（配列番号１２）、ＳＣＤ５（配列番号１３）、ＡＴＰ２Ａ２（配列番号１４）およびＨＲＭＴ１Ｌ１（配列番号１５）である。ＡＴＰ２Ａ２では、単離された断片は、部分的にのみ配列決定された〜３２００ｂｐであった。５’および３’プライマーを用いて得られた配列は、示した領域における参照データベース配列にマッチする。
【図６２Ｂ】Ｂａｘ媒介アポトーシスの阻害剤についての酵母スクリーニングから得られた「ｈｉｔｓ」のポリヌクレオチドの配列。リストされた配列はＳＣＮＡ（配列番号５）、ＦＫＢＰ２（配列番号６）、ＳＮＡＰ２５（配列番号９）、ＥＥＦ１Ａ１（配列番号７）、ＶＡＭＰ３（配列番号８）、ＲＩＭＳ３（配列番号１０）、ＲＡＢ４０Ｂ（配列番号１１）、ＨＭＧＣＳ１（配列番号１２）、ＳＣＤ５（配列番号１３）、ＡＴＰ２Ａ２（配列番号１４）およびＨＲＭＴ１Ｌ１（配列番号１５）である。ＡＴＰ２Ａ２では、単離された断片は、部分的にのみ配列決定された〜３２００ｂｐであった。５’および３’プライマーを用いて得られた配列は、示した領域における参照データベース配列にマッチする。
【図６２Ｃ】Ｂａｘ媒介アポトーシスの阻害剤についての酵母スクリーニングから得られた「ｈｉｔｓ」のポリヌクレオチドの配列。リストされた配列はＳＣＮＡ（配列番号５）、ＦＫＢＰ２（配列番号６）、ＳＮＡＰ２５（配列番号９）、ＥＥＦ１Ａ１（配列番号７）、ＶＡＭＰ３（配列番号８）、ＲＩＭＳ３（配列番号１０）、ＲＡＢ４０Ｂ（配列番号１１）、ＨＭＧＣＳ１（配列番号１２）、ＳＣＤ５（配列番号１３）、ＡＴＰ２Ａ２（配列番号１４）およびＨＲＭＴ１Ｌ１（配列番号１５）である。ＡＴＰ２Ａ２では、単離された断片は、部分的にのみ配列決定された〜３２００ｂｐであった。５’および３’プライマーを用いて得られた配列は、示した領域における参照データベース配列にマッチする。
【図６２Ｄ】Ｂａｘ媒介アポトーシスの阻害剤についての酵母スクリーニングから得られた「ｈｉｔｓ」のポリヌクレオチドの配列。リストされた配列はＳＣＮＡ（配列番号５）、ＦＫＢＰ２（配列番号６）、ＳＮＡＰ２５（配列番号９）、ＥＥＦ１Ａ１（配列番号７）、ＶＡＭＰ３（配列番号８）、ＲＩＭＳ３（配列番号１０）、ＲＡＢ４０Ｂ（配列番号１１）、ＨＭＧＣＳ１（配列番号１２）、ＳＣＤ５（配列番号１３）、ＡＴＰ２Ａ２（配列番号１４）およびＨＲＭＴ１Ｌ１（配列番号１５）である。ＡＴＰ２Ａ２では、単離された断片は、部分的にのみ配列決定された〜３２００ｂｐであった。５’および３’プライマーを用いて得られた配列は、示した領域における参照データベース配列にマッチする。
【図６２Ｅ】Ｂａｘ媒介アポトーシスの阻害剤についての酵母スクリーニングから得られた「ｈｉｔｓ」のポリヌクレオチドの配列。リストされた配列はＳＣＮＡ（配列番号５）、ＦＫＢＰ２（配列番号６）、ＳＮＡＰ２５（配列番号９）、ＥＥＦ１Ａ１（配列番号７）、ＶＡＭＰ３（配列番号８）、ＲＩＭＳ３（配列番号１０）、ＲＡＢ４０Ｂ（配列番号１１）、ＨＭＧＣＳ１（配列番号１２）、ＳＣＤ５（配列番号１３）、ＡＴＰ２Ａ２（配列番号１４）およびＨＲＭＴ１Ｌ１（配列番号１５）である。ＡＴＰ２Ａ２では、単離された断片は、部分的にのみ配列決定された〜３２００ｂｐであった。５’および３’プライマーを用いて得られた配列は、示した領域における参照データベース配列にマッチする。
【図６２Ｆ】Ｂａｘ媒介アポトーシスの阻害剤についての酵母スクリーニングから得られた「ｈｉｔｓ」のポリヌクレオチドの配列。リストされた配列はＳＣＮＡ（配列番号５）、ＦＫＢＰ２（配列番号６）、ＳＮＡＰ２５（配列番号９）、ＥＥＦ１Ａ１（配列番号７）、ＶＡＭＰ３（配列番号８）、ＲＩＭＳ３（配列番号１０）、ＲＡＢ４０Ｂ（配列番号１１）、ＨＭＧＣＳ１（配列番号１２）、ＳＣＤ５（配列番号１３）、ＡＴＰ２Ａ２（配列番号１４）およびＨＲＭＴ１Ｌ１（配列番号１５）である。ＡＴＰ２Ａ２では、単離された断片は、部分的にのみ配列決定された〜３２００ｂｐであった。５’および３’プライマーを用いて得られた配列は、示した領域における参照データベース配列にマッチする。
【図６３】配列番号１６において定義された従前に知られていない機能のヒト染色体３ｐからのポリヌクレオチドの配列。矢印によって示されたように、２つのオープンリーディングフレームは配列番号１６内に存在する。制限酵素部位も示される。
【図６４】配列番号１７において定義された従前に知られていない機能のヒト染色体２２ｑ１１．２２−１２．２からのポリヌクレオチドの配列。矢印によって示されたように、４つのオープンリーディングフレームは配列番号１７内に存在する。制限酵素部位も示される。
【図６５】配列番号１８に定義された従前に知られていない機能のヒトミトコンドリア単離体ＷＨ６９６７からのポリヌクレオチドの配列。矢印によって示されるように、２つのオープンリーディングフレームは配列番号１８内に存在する。制限酵素部位も示される。
【図６６】配列番号１９において定義された従前に知られていない機能のヒトミトコンドリア単離体Ｓ１２１６からのポリヌクレオチドの配列。矢印によって示されるように、２つのオープンリーディングフレームは配列番号１９内に存在する。制限酵素部位も示される。
【図６７】ヒトＥＥＦ１Ａ１のアミノ酸配列（配列番号２２）および９２．６％配列同一性を示すヒトＥＥＦ１Ａ２（配列番号２３）の比較。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１Ａ】
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【図６１Ｂ】
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【図６２Ａ】
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【図６２Ｂ】
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【図６２Ｃ】
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【図６２Ｄ】
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【図６２Ｅ】
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【図６２Ｆ】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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