(57)【要約】固体支持物質から成る多孔性３次元支持マトリクス上、またはマトリクス内にラマン増強表面を堆積することによって、改良型検体検出器において使用するための改良型ＳＥＲＲＳ基材が提供される。支持物質は、該体積内で分散されるラマン色素を有するように構成され、色素が、該体積内に分散され、該体積内で同様に分散されるラマン増強表面の非常に近くにある結果として、色素の照射に対する反応が増強される。試料内の検体の存在、不在、または量を検出する検出器構成内で使用するための、試験用試料を導入可能な反応担体が提供される。
2009531696.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料内の検体の存在、不在、または量を検出する検出器構成内で使用するために、試験用試料を導入可能な反応担体であって、
体積を画定するように構成された固体支持物質と、
該体積内に分散され、該支持物質によって支持された金属と
を備え、
該支持物質は、色素に対し多孔性であって、該金属は、該色素の照射に対する光応答を増強するように構成されている、反応担体。
【請求項２】
前記金属は、該金属内の電子と前記色素との間の相互作用によって、照射に対する前記応答を増強するように構成されている、請求項１に記載の反応担体。
【請求項３】
検出される前記応答は、ＳＥＲＳ相互作用である、請求項１または２に記載の反応担体。
【請求項４】
検出される前記応答は、ＳＥＲＲＳ相互作用である、請求項１または２に記載の反応担体。
【請求項５】
前記支持物質は、前記体積内に分散された前記色素を有するように構成され、照射に対する前記応答は、該色素が、該体積内に分散され、該体積内に同様に分散された該金属に非常に近い結果として、増強される、請求項１から４までのいずれか一項に記載の反応担体。
【請求項６】
前記金属は、複数の分散された固体金属部分として、前記体積内に分散されている、請求項１から５までのいずれか一項に記載の反応担体。
【請求項７】
前記分散された金属部分は、金属粒子である、請求項６に記載の反応担体。
【請求項８】
前記支持物質は、１つ以上の基材粒子から構成され、前記金属は、該１つ以上の基材粒子の外部表面上に堆積されている、請求項６または７に記載の反応担体。
【請求項９】
前記金属は、前記１つ以上の基材粒子内に堆積されている、請求項６、７、または８に記載の反応担体。
【請求項１０】
前記色素は、前記体積内で、前記検体を結合可能な選択剤に付着されるが、該検体が該選択剤に結合した場合には、該色素は前記金属近傍領域に移動する、請求項１から９までのいずれか一項に記載の反応担体。
【請求項１１】
前記色素は、変位自在に前記選択剤に付着され、該選択剤によって、該金属から離れて保持される、請求項１０に記載の検出器構成。
【請求項１２】
基材粒子は、前記色素に対し多孔性である、請求項９に記載の反応担体。
【請求項１３】
基材粒子は、前記色素に対し多孔性であるが、前記検体試料内の他の物質に対しそうではない、請求項９に記載の反応担体
【請求項１４】
金属の近傍粒子間の距離は、前記色素の約平均自由行程である、請求項７に記載の反応担体。
【請求項１５】
前記支持物質は、前記色素の照射に対する前記応答の振動数範囲内の照射に対する応答を生成しない、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の反応担体。
【請求項１６】
検出される検体は、前記色素として機能する、請求項１から９のいずれかに記載の反応担体。
【請求項１７】
前記支持物質は、シリカから構成される、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の反応担体。
【請求項１８】
前記支持物質は、ＣＰＧから構成される、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の反応担体。
【請求項１９】
照射に対する前記応答は、ラマン散乱による所与の波長シフトにおける強度変化である、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の反応担体。
【請求項２０】
金属の種類は、前記色素の照射に対する応答を増強するように選択される、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の反応担体。
【請求項２１】
前記金属は、銀、金、または銅である、請求項１から２０までのいずれか一項に記載の反応担体。
【請求項２２】
前記金属粒子は、前記金属内の電子の前記約平均自由行程の寸法を有する、請求項７に記載の反応担体。
【請求項２３】
請求項１から２２までのいずれか一項に記載の反応担体と、
照射源と、
検出器と、
色素と
を備え、
該照射源は、指定波長の放射で該反応担体を照射し、検体の不在、存在、または量を示す照射に応じて、色素の不在、存在、または量を検出するように構成される、検出器構成。
【請求項２４】
前記照射源は、支持物質によって画定される体積の少なくとも一部を網羅する照射を提供するように構成される、請求項２３に記載の検出器構成。
【請求項２５】
前記照射源は、前記体積の前記一部が、該照射源の光線を含むように集束される、請求項２４に記載の検出器構成。
【請求項２６】
前記体積の前記一部は、前記照射源の焦点両側の、該照射源の光線を含む、請求項２５に記載の検出器構成。
【請求項２７】
前記金属粒子の寸法は、約１０〜２５０ｎｍである、請求項７に記載の検出器構成。
【請求項２８】
前記金属粒子の寸法と照射放射の波長とは、かなりの割合の入射放射が該金属粒子によって吸収されるようなものである、請求項７に記載の検出器構成。
【請求項２９】
前記金属粒子の空間分散と照射放射の波長とは、かなりの割合の入射放射が該金属粒子によって吸収されるようなものである、請求項７に記載の検出器構成。
【請求項３０】
前記金属粒子の前記空間分散は、前記体積内の前記照射放射の波長の半分に略等しい、請求項２９に記載の検出器構成。
【請求項３１】
前記金属粒子の前記空間分散は、前記体積内の前記照射放射の波長の半分の任意の倍数に略等しい、請求項２９に記載の検出器構成。
【請求項３２】
反応担体内の試料の検体の存在、不在、または量を検出する方法であって、
反応担体内で、体積を画定するように構成された固体支持物質と、
該体積内に分散および固定され、該支持物質によって支持される金属とを提供するステップであって、該支持物質は、色素に対し多孔性であって、該金属は、該色素の照射に対する反応を増強するように構成される、ステップと、
色素を提供するステップと、
該反応担体を指定波長の放射で照射するステップと、
該色素からの照射に対する反応を検出し、検体の存在、不在、または量を示す色素の量を判断するステップと
を含む、方法。
【請求項３３】
前記色素は、前記検体を結合可能な選択剤に付着されるが、前記検体試料が導入されると、該検体が該選択剤に結合し、該選択剤が該色素を前記金属近傍領域に移動させ得る、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記選択剤は、前記色素を剥離し、前記金属近傍領域に移動させる検体の導入まで、該色素を該金属から離して保持する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記検体試料の導入に応じて、前記検体は、前記色素を剥離し、前記支持物質内に拡散させる前記選択剤に結合し、それによって、前記金属近傍領域に移動し得る、請求項３２から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記支持物質は、１つ以上の基材粒子から構成され、前記金属は、該１つ以上の基材粒子内に堆積され、前記検体試料の導入に応じて、前記検体は、前記色素を剥離し、該１つ以上の粒子内に拡散させる前記選択剤に結合し、それによって、前記金属近傍領域に移動し得る、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記検体が前記色素を変位させる場合、該色素のみ前記支持物質内に拡散し得るように、該支持物質は、該色素に対し多孔性であるが、他の物質に対しそうではない、請求項３５から３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記支持物質は、前記色素に対し多孔性であるが、前記１つ以上の基材粒子は、前記検体に対し多孔性ではなく、それによって、該検体が該色素を変位させる場合、該色素だけが該１つ以上の基材粒子内に拡散し得る、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記色素を前記体積に侵入させる前記反応担体に前記検体試料を導入するステップを含む、請求項３２から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記検体試料を前記体積に導入するステップを含む、請求項３２から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記支持物質によって画定される前記体積の少なくとも一部を前記照射源で照射するステップを含む、請求項３２から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記照射源は、レーザーであって、前記体積の前記一部が該レーザーの光線を含むように、該レーザーを構成するステップを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記体積の前記一部は、前記レーザーの焦点の両側の前記レーザーの光線を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記色素は、前記検体を結合可能な選択剤に付着されるが、前記金属近傍領域内に保持され、前記検体試料が導入されると、該検体が該選択剤に結合し、該選択剤が該色素を該金属近傍領域から離し得る、請求項３２に記載の方法。
【請求項４５】
前記選択剤は、前記色素を剥離し、前記金属近傍領域から離す検体の導入まで、該金属近傍領域内に該色素を保持する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記色素は、前記体積内で、前記検体を結合可能な選択剤に付着され、前記金属近傍領域内に保持されるが、該検体が該選択剤に結合した場合には、該色素は該金属近傍領域から離れる、請求項１に記載の反応担体。
【請求項４７】
前記色素は、変位自在に前記選択剤に付着され、該選択剤によって、該金属近傍領域内に保持される、請求項４６に記載の検出器構成。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラマン分光法、表面増強ラマン分光法、および表面増強共鳴ラマン分光法に関する。
【背景技術】
【０００２】
検体分子の作用または存在を検出するための多くの技術があることは周知のことである。そのような技術の１つは、ラマン散乱（Ｒａｍａｎ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ；ＲＳ）効果を利用したものである。光が分子から散乱されると、光子のほとんどが、弾性的に散乱される。散乱光子の大部分は、入射光子と同じエネルギー（したがって、振動数および波長）を有する。しかしながら、小量の光（１０７光子中約１）は、入射光子と異なる振動数で散乱される。散乱光子が分子にエネルギーを失うと、入射光子よりも長い波長を有する（ストークス散乱と称される）。反対に、散乱光子がエネルギーを得ると、より短い波長を有する（アンチストークス散乱と称される）。ストークス散乱は、通常、より強い効果となる。
【０００３】
この非弾性散乱をもたらすプロセスは、１９２８年に初めてこれを説明したＳｉｒ  Ｃ．Ｖ．Ｒａｍａｎからとって、ラマン効果と称される。これは、分子の振動、回転、または電子エネルギーの変化に関連し、光子から分子へ伝達されるエネルギーは、通常、熱として放散される。入射光子とラマン散乱光子との間のエネルギー差は、散乱分子の振動状態の、または電子遷移のエネルギーに等しく、入射レーザーとの量子化エネルギー差における散乱光子を生じさせる。散乱光の強度対エネルギーまたは波長差をプロットしたものは、ラマンスペクトルと称され、その技術は、ラマン分光法（Ｒａｍａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ；ＲＳ）として知られている。
【０００４】
表面増強ラマン分光法（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒａｍａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ；ＳＥＲＳ）は、ＲＳ分析技術の変形例である。分子が特定の金属表面と物理的に近接する場合、この分子と金属の表面電子（プラズモン）との間のさらなるエネルギー伝達によって、ラマン信号の強度は、膨大に増加する可能性がある。ＳＥＲＳを施行するために、検体分子は原子的粗面化金属表面を備える基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）上に吸収され、増強ラマン散乱が検出される。また、ＳＥＲＳは、基材として、溶液中の銀コロイドを使用しても施行可能である。
【０００５】
数オングストロームの金属表面内の分子またはイオンからのラマン散乱は、溶液中の１０３〜１０６倍大きい可能性がある。近可視波長に対し、ＳＥＲＳは、銀上で最強であるが、金および銅上でも容易に観察され得る。最近の研究は、種々の他の遷移金属もまた、有用なＳＥＲＳ増強を提供し得ることを示している。多量の自由表面電子を有する金属である、いわゆる自由電子金属は、概して、ＳＥＲＳ増強を提供する。さらに、いわゆる金属ポリマーもまた、使用可能である。これらは、金属に似た挙動をする、電子構造を有する有機ポリマーである。金属という用語は、金属素子あるいは金属混合物または合金に制限されるものではなく、当業者が金属であると理解し得る任意の物質に適用可能であることを理解されるであろう。そのようなＳＥＲＳ増強を提供する物質は、以降ラマン増強表面またはラマン増強金属と称される。
【０００６】
本質的に、ＳＥＲＳ効果は、分子と金属表面近傍の電磁場との間の共鳴エネルギー伝達である。励起レーザーの電気ベクトルは、金属表面内に双極子を誘導し、その復元力がこの励起の共鳴振動数における振動電磁場となる。この共鳴強度および振動数は、主に、いわゆるプラズモン波長を決定する金属表面の自由電子（「プラズモン」）と、金属およびその環境の誘電率とによって決定される。表面上またはそのごく近くで吸収される分子は、非常に大きな電磁場を経験し、この電磁場は、表面に垂直である振動モードへの結合が、最も著しく増強する。これは、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＳＰＲ）効果であって、表面近傍のプラズモンと分子との間の空間を介したエネルギー伝達を可能にする。エネルギー伝達効率は、レーザー波長と金属のプラズマ波長との間の良好な一致に依るため、表面プラズモン共鳴の強度は、入射光の波長および金属表面の形態を含む、多くの要因に依存する。
【０００７】
電磁場の強度および局所密度は、種々のパラメータによって決定される。反射光の波長は、そのエネルギーを決定し、金属の組成および形態は、表面プラズモンが光子エネルギーと結合する強度および効率を決定する。また、金属および検体溶液の相対誘電特性等の他の要因も、その効果に大きく寄与する。加えて、金属表面に近傍の電磁場と任意の分子との間のエネルギー伝達効率もまた、例えば、赤外スペクトル領域の特定振動モードおよび紫外線の電子エネルギー遷移を含む、分子自体の共鳴エネルギー状態によって決定される。これは、ＳＥＲＲＳが従来のＳＥＲＳよりも優れた性能を得るメカニズムである。ＳＥＲＲＳは、発色団部分を使用して施行され、エネルギー伝達にさらなる分子共鳴寄与を提供することが可能である。
【０００８】
共鳴ラマンピークの強度は、分子の散乱断面積の２乗に比例する。そして、散乱断面積は、遷移双極子モーメントの２乗に関連し、したがって、通常、吸収スペクトルに従う。入射光子が、その吸光度スペクトル内の吸収ピークに近いエネルギーを有する場合、散乱事象が生じると、分子はより励起状態となる可能性があり、それによって、アンチストークス信号の相対強度が増す。表面と共鳴増強効果との組み合わせは、ＳＥＲＲＳが、膨大な信号増強、典型的には、従来のラマン分光法の１０９〜１０１４倍を提供可能であることを意味する。
【０００９】
ラマン散乱の共鳴増強に加え、最近、共鳴エネルギー伝達メカニズムによってラマン信号の強度を低減する、共鳴減衰について報告されている。特定条件下、着目する励起エネルギー状態にエネルギーが近い励起エネルギー状態が、ラマン散乱の低減が生じる可能性がある。この場合、ラマン強度は、断面積の合計の２乗に比例し、それらが異符号である場合、相殺的干渉が生じ、観察された共鳴減衰をもたらす。これは、ラマンベースの検出器システムにおいて使用するための代替測定基準を提供する。特定のラマン活性発色団からの信号は、この減衰効果を促進するレーザー振動数を使用して、ラマンスペクトルから選択的に除去され得る。
【００１０】
表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、およびその外延である表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）は、定量的生物分析ツールとして注目を集めている。両技術は、金属表面における移動性の伝導電子の「プラズマ」（プラズモン）と、その表面近傍の分子種との間の相互作用に大きく依存する。この相互作用は、特定振動エネルギーにおけるラマン散乱の大きな増強をもたらし、ラマン散乱光における強力なスペクトル信号を生み出す。
【００１１】
最近まで、増強メカニズムの理解をめぐって議論が行われていた。化学増強メカニズムと電磁増強メカニズムとの間の１０６を上回る増強係数の分配について、２つの主要分派の意見が分かれていた。現在は１０２の増強係数に寄与すると考えられている化学増強メカニズムは、電荷移動状態が、金属と吸着質分子との間に生成されることを主張する。このメカニズムは、部位特異的かつ検体依存性である。分子は、化学増強を経験するために、表面に直接吸収されなければならない。電磁増強メカニズムは、通常のラマン散乱よりも１０４倍を上回る増強に寄与する。電磁増強を理解するためには、表面のナノスケールの粗度特性の大きさ、形状、および物質を考慮しなければならない。的確な波長の光が金属粗度特性に衝打する場合、伝導電子のプラズマは、集団的に振動するであろう。この集団振動は、電子のプラズマ表面に局在するため、局所性表面プラズモン共鳴（Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＬＳＰＲ）として知られている。ＬＳＰＲは、共鳴波長を吸収および散乱させ、粗度特性の周囲に大きな電磁場を生成する。分子が電磁場内に置かれると、増強ラマン信号が測定される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、ラマン散乱効果は、表面増強ラマン散乱（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒａｍａｎ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ；ＳＥＲＳ）を使用しても、通常散乱と比較して、小量のラマン散乱放射しか提供しない（効果的にはＳＮ比が小さい）ことが問題であると理解する。さらに、ラマン信号がノイズと比較して弱いため、ノイズからラマン信号を区別する助けとなるメカニズムを導入する必要性があることを理解する。
【００１３】
検体分子の拡散経路長を減少することが、バイオセンサ検定の速度に劇的効果を有し得ることを理解する。故に、広義において、本発明は、分光技術を使用して試験される試料の拡散経路長を減少する構成を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、参照を目的とされる請求項において定義される。
【００１５】
本発明の実施形態は、固体支持物質から成る多孔性３次元支持マトリクス上または内にラマン増強表面を堆積することによって生成される、反応領域内に位置するラマン増強体積を有する、改良型検体検出器を提供する。支持物質は、該体積内で分散される色素を有するように構成され、色素が、体積内に分散され、該体積内で同様に分散されるラマン増強表面に非常に近い結果として、色素照射に対する反応が増強される。
【００１６】
試験用試料が導入される検体検出器において使用するための反応担体は、体積を画定する固体支持物質と、該体積内に分散および固定される金属／ラマン増強表面とを有する本発明に従って生成されてもよい。金属は、検体を検出可能にする色素に対し多孔性である、支持物質によって支持される。金属は、色素照射に対する光応答を増強するように構成される。
【００１７】
記載される本発明の実施形態は、ラマン信号およびラマン分光法（特に、ＳＥＲＳおよびＳＥＲＲＳ）におけるその適用に対し提供される改良点について言及するが、本発明は、任意の形態の分光法において使用されてもよく、信号強度における改良点が、色素照射の応答を増強させるような金属表面を使用して得られ得ることを理解されたい。これは、例えば、表面吸収蛍光、または金属表面への共鳴エネルギー伝達を伴う照射に対する任意の応答を含んでもよい。
【００１８】
発色団という用語は、当業者には周知であって、特定の光学特性を有する基を網羅するものとして本明細書で使用される。用語「色素」は、ラマン放射を放出可能であって、また、連結基または表面探究基等のある種の官能性を有する発色団を示す。そのような官能性は、例えば、金属表面探究基、または検体に結合することを可能とする基を追加することから生じ得る。発色団は、表面増強に好適な波長で励起レーザーを吸収するはずである（最も使用されるラマンレーザーは、５１４ｎｍ、５３２ｎｍ、および７８５ｎｍである）。これは、赤緑可視領域内にあるため、従来の明るい有色の発色団は、特に良好なラマン活性色素の成分として認められる。
【００１９】
検体は、検出または定量化を望まれる任意の化学物質である。好適な検体の実施例は、生体分子（蛋白質、抗体、核酸、炭水化物、プロテオグリカン、脂質、またはホルモン等）、薬剤または他の治療薬およびその代謝物、乱用薬物（例えば、アンフェタミン、アヘン剤、ベンゾジアゼピン、バルビツール酸塩、カンナビノイド、コカイン、ＬＳＤ、およびその代謝物）、火薬（例えば、ＴＮＴ、ＲＤＸ、ＰＥＴＮ、およびＨＭＸを含む、ニトログリセリンおよびニトロトルエン）、および環境汚染物質（例えば、除草剤、殺虫剤）を含む。
【００２０】
検体試料は、検体の存在または量の試験に望ましい任意の試料である。検体の存在、不在、または量の試験に望ましい多くの状況がある。実施例は、臨床用途（例えば、血液または尿試料等の生体分子試料内の抗原または抗体の存在を検出するため）、乱用薬物の存在の検出（例えば、不法試料、または体液または呼気試料等の生体分子試料内において）、火薬の検出、あるいは環境汚染物質の検出（例えば、液体、気体、土壌、または植物試料において）を含む。
【００２１】
検体自体を直接検出することに加え、着目検体の存在下で、そのラマン信号の検出可能な変化を生成することが可能なレポーター分子を使用することによって、間接的にそれらを検出することも可能である。これの実施例は、検体特異抗体の抗原結合部位からの色素標識ペプチドの変位であって、それによって、自由レポーター分子が遊離され、次いで、ＳＥＲＲＳ活性金属表面と相互作用可能となる。本発明者らの目的では、そのようなレポーター分子も「検体」としてみなされ得る。
【００２２】
典型的には、レポーター分子は、レポーター色素と、選択剤結合基と、金属表面結合基とを備えるであろう。レポーター分子は、選択剤に結合され（選択剤結合基によって）、したがって、検体試料が担体に導入される前は、レポーター色素は、金属表面から離れて保持される。検体の選択剤への結合は、レポーター分子を変位させ、レポーター分子は、次いで、金属表面に結合し（金属表面結合基によって）、それによって、レポーター色素を金属表面近傍の領域に移動させる。上述の用語「色素」は、レポーター分子に同等に適用する。
【００２３】
選択剤は、検体試料の他の成分の存在下、さらに検出方法が、試料内の検体の存在（または、量）を検出可能なように実行される条件下、検体に選択的に結合する任意の剤である。当然ながら、選択剤の性質は、検体の同一性に依存するであろう。多くの場合、選択剤は、抗体であるだろう。しかしながら、他の好適な検体結合パートナーを使用してもよい。例えば、検体が抗体である場合、選択剤は、抗原、または抗体によって選択的に結合される抗原誘導体であってもよい。検体が核酸である場合、選択剤は、核酸、または検体核酸に混成する核酸類似体であってもよい。
【００２４】
色素は、検体の導入に応じて、選択剤から離脱する必要はない。代わりに、選択剤は、色素が金属により近接する新しい位置に移動するように、検体の結合に応じて構成を変化させ、それによって、ラマン信号に対し増加をもたらしてもよい。また、最初は、ＳＥＲＲＳ信号を生成するために十分な金属表面の近接位置に色素を保持することも可能であるが、検出される検体の存在下で変位させてもよく、例えば、選択剤に結合させ、そして金属表面近傍のその位置から色素を変位させてもよい。この場合、放出されるラマン放射の増加よりも、その不在、存在、または量を判断可能にするラマン放射の減少が期待される。
【００２５】
検体自体が、本質的にラマン活性であってもよい。そのような実施形態では、色素は、検体と化学的に等しくてもよく、検体の存在、不在、または量は、そのラマン信号から直接判断可能である。したがって、用語「色素」は検体を含んでもよい。
【００２６】
用語「抗体」は、抗体またはフラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、Ｆ（ａｂ′）２フラグメント、単鎖Ｆｖ分子、またはＣＤＲ領域）、あるいは検体を選択的に結合し、検体の検出を可能にする抗体またはフラグメントの誘導体を含むものとして本明細書で使用される。
【００２７】
一般に、色素の成分は、別個のリンカによって共に結合されることが予測される。当業者は、使用され得る多くの可能性のある好適なリンカがあることを理解されるであろう。リンカの同一性は、色素成分の同一性に依存することになる。選択剤結合基がペプチドを備える場合、リンカが従来のペプチド結合化学反応と適合する場合有利である。例えば、リンカは、好ましくは、ペプチドのＮ末端との反応のために単一カルボン酸基を備えてもよい。
【００２８】
ある状況では、使用される特定の成分に応じて、別個のリンカを使用せずに、例えば、色素の異なる成分の化学基間の反応によって、色素の２つ以上の成分を共に結合することが可能であってもよい。
【００２９】
色素成分は、任意の順番で共に結合されてもよいが、但し、色素がその金属表面結合基によって表面に結合される場合、色素は、金属表面近傍の領域内にある。
【００３０】
色素の金属表面結合基は、（典型的には、吸収によって）金属表面に優先的に結合する基であるはずである。ある状況では、金属表面結合基を金属表面に結合することは、色素を金属表面に固定するために十分強固であることが望まれる場合がある。金属表面結合基の化学的性質は、使用される金属表面に依存するだろう。好適な銀結合官能基は、オキサゾール、チアゾール、ジアゾール、トリアゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール、オキサチアゾール、チアトリアゾール、ベンゾトリアゾール、テトラゾール、ベンズイミダゾール、インダゾール、イソインダゾール、ベンゾジアゾール、またはベンズイソジアゾール等の複素環窒素を有する基を含む。他の好適な官能基は、アミン、アミド、チオール、硫酸塩、チオ硫酸塩、リン酸塩、チオリン酸エステル、水酸基、カルボニル、カルボン酸塩、およびチオカーバメートを含む。また、システイン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、またはアルギニン等のアミノ酸も銀結合を付与する。
【００３１】
反応担体という用語は、検出される検体が導入され、支持物質が位置する容器を定義するために使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
次に、付随の図面を参照して、単なる例示として本発明の実施形態が説明される。
【００３３】
記載される実施形態は、分光法で使用するための改良型基材を特色とする。本発明は、微粒子三次元支持物質内に分散される金属を使用して、ＳＥＲＳおよびＳＥＲＲＳの最適特性を有する基材を生成する。金属を溶液内の検体分子に物理的により近づけることによって、拡散経路長を減少し、検定時間の短縮を達成することが可能となると共に、所与の溶液体積内の検体分子にアクセス可能な利用可能金属表面積を増加する。加えて、ラマン照射レーザーは、２次元表面ではなく３次元体積をサンプリングし、信号強度だけではなく、集束等の工学的課題を解決する効果を有する。また、バイオセンサチップを支持する際の工学的制約も、それがセンサ性能に最も影響を及ぼす反応担体の寸法よりも、支持物質の性質であるため、幾分緩和され得る。
【００３４】
本発明の実施形態は、支持物質内の金属の一部を化学的に堆積することによって実現される。これによって達成され得るいくつかの効果は、増強感度、光解離性発色団の長期安定性、および大幅に減少した検定時間を含む。好ましい特性として、ラマン増強表面を形成する支持物質内に堆積される金属部分は、銀である。支持物質は、例えば、シリカフィルタ形態の固体であるが、これは必要条件ではなく、支持物質は、例えば、粉末またはガラス玉の形態であってもよい。支持物質の主要必要条件は、ラマン増強表面の反応担体内への固定を維持することである。
【００３５】
次に、ドイツ人化学者Ｂｅｒｎｈａｒｄ  Ｔｏｌｌｅｎｓ（１８４１−１９１８）によって開発され、現在は彼の名前が付けられている、炭水化物の分析試験に基づいて、銀堆積化学反応を使用して改良型基材を生成する方法を説明する。当業者は、これは表面上に金属を堆積する唯一の手段ではなく、他の方法も本発明の範囲内であることを理解されるであろう。さらに、銀は、分光法においてラマン増強表面として使用されるための多くの望ましい特性を示すが、例えば、金および銅等の他の物質も使用可能であることを理解されるであろう。また、これらの金属の組み合わせの使用は、本発明の柔軟性における利点を暗示し得、それらは後述される。
【００３６】
Ｔｏｌｌｅｎｓ反応は、多段階プロセスであって、アルデヒドのカルボン酸への酸化と、含水銀イオンの金属への還元とを伴う。初めに、水酸化ナトリウムと反応させることによって、硝酸銀から水酸化銀を調製する。
【００３７】
【数１】
2009531696.tif 000003
水酸化物は、通常、酸化銀も含有する黒褐色沈殿物を形成する。水酸化アンモニウムを添加し、無色溶液として、ジアミン銀錯体を生成する。
【００３８】
【数２】
2009531696.tif 000004
ジアミン錯体は、水溶液中で安定するため、必要となるまで保存可能である。銀堆積プロセスは、アルデヒドを添加することによって開始する。アルデヒドは、アルカリ溶液中で水酸基イオンと反応し、カルボン酸に酸化させ、２つの電子を放出する。
【００３９】
【数３】
2009531696.tif 000005
アルデヒドは、種々の源から得られる。従来のＴｏｌｌｅｎｓ反応では、グルコース溶液が使用される。多くの糖類同様、グルコースは、閉環または開鎖形態で存在可能である。水溶液中では、両形態は、平衡である。
【００４０】
【数４】
2009531696.tif 000006
次いで、アルデヒドの酸化によって放出された電子は、それぞれジアミン銀錯体を還元し、金属銀および遊離アンモニアを提供し得る。
【００４１】
【数５】
2009531696.tif 000007
この酸化還元反応は、以下のように集約され得る。
【００４２】
【数６】
2009531696.tif 000008
還元銀原子は、水溶液中で不安定であるため、迅速に凝集し、金属銀を提供する。適切な固体表面が利用可能な場合、金属が表面と溶液との間の界面で形成される。糖類の従来のＴｏｌｌｅｎｓ試験では、清潔なガラス表面が使用され、銀によって融合性の鏡状フィルムがわずか数分間で形成される。
【００４３】
対象検体および利用可能支持物質の性質に依存する特定反応条件に応じて、ラマン増強表面（好ましくは、銀）は、マイクロからナノメートルスケールの粒子、粒子集団、支持物質上および支持物質内に存在する任意の孔隙内に堆積された粒子の懸濁を形成し得る。
【００４４】
上述のプロセスは、本発明による支持物質を生成する１つの方法にすぎない。例えば、支持構造上または内への銀コロイドの固定を含む、他の方法も採用可能である。
【００４５】
支持物質は、ガラスの光学特性を有するように選択される微粒子、多孔性、三次元支持マトリクスであることが好ましい。例えば、支持物質は、反応担体の一部を充填するガラス玉の形態であってもよい。特に、支持物質は、蛍光性（ラマンスペクトルに対し許容不可能な電磁場干渉を提供し得る）であるべきではなく、理想的には、非常に生体適合物質であって、色素からラマン信号を遮蔽し得るので、その独自、または少なくとも色素のラマン反応の振動数範囲内ではない、実質的ラマン信号に寄与すべきではない。これらの目的のため、シリカは理想的であるが、類似特性を有する他の物質も、本発明の範囲から逸脱することなく使用可能であることを理解されたい。支持物質を形成するために使用され得る他の物質の実施例は、セラミック、プラスチック、またはエアロゲルを含む。
【００４６】
支持物質は、銀粒子が分散され得る体積を画定する。一実施形態では、銀粒子は、支持物質を備える個々の基材粒子の外側に堆積される。この実施例は、図１１および１２に見られ、体積を画定するシリカ基材粒子は、その上に堆積された銀粒子を有する。これは、銀粒子が、支持物質を備える粒子間の孔隙（１１１、１２１）内に存在することを意味する。さらなる実施例は、その上に堆積された銀を有するガラス玉の集合から成る支持物質である。隣接する玉間の空隙または孔隙、あるいは基材粒子は、多孔性であって、支持物質全体に固定される銀粒子を有する支持物質となる。
【００４７】
支持物質を備える基材粒子自体が、色素に対し多孔性であって、その内部構造内に堆積された銀粒子を有する、追加実施形態が後述される。
【００４８】
シリカ等の３次元多孔性物質は、平坦表面と比較して、より広域の内部表面積、したがって、分子吸収に利用可能なより広域表面を有する体積を提供する。また、平面表面上の点を照射する代わりに、入射レーザーは、物質内の体積を照射することによって、ラマンレーザーによって応答させられる表面積をさらに増加させる。これら両方の要因は、信号強度の結果として生じる改良に伴って、照射光線内のＳＥＲＲＳ活性分子数の大幅な増加となる。
【００４９】
図８は、本発明を具現化するマイクロ流体ＳＥＲ（Ｒ）Ｓ検出器構成を示す。検出器構成は、色素を含有する反応担体と、レーザーの形態の照射源と、検出器とから構成される。その中に堆積された金属粒子を備えるシリカ等の３次元多孔性物質は、反応担体内に提供される。レーザーは、平面ではなく体積を応答させるため、試料上への正確な集束は重要ではなくなる。代わりに、図９に示されるように、レーザー光線は、錐体内に集束され、焦点を通過し、次いで、この地点を越えた錐体内に拡大するため、焦点の直前および直後の分子は、比較的強電磁場にある。理想的な場合では、焦点が平面表面にある場合と比較して、焦点がマトリクス内にある場合、強電磁場内の分子数は２倍となり、したがって、ラマン信号も２倍となるはずである。
【００５０】
平面金属表面は、鏡として作用してもよく、焦点前の分子は、増強ＥＭ電磁場（入射光線およびその反射の両方から）内にあるだろう。光線が建設的に干渉する場合、分子は、２倍の強度の電磁場内にあるだろう。ラマン強度は、電磁場強度の２乗に比例するため、２倍の電磁場内の分子は、ラマン信号を４倍放出する。しかしながら、分子の半分は、電磁場が破壊的に干渉する領域内にあるため、ラマン信号に対し寄与しないだろう。したがって、ラマン散乱強度は、全体として、反射面がない場合の２倍となるだろう。しかしながら、この信号は、２倍の電磁場内の分子から来るため、その結果、高率で光分解することになるだろう。光分解は、発色団が、光子誘発励起および後続の共有結合的修飾のため恒久的に損傷を受ける場合に生じる。励起一重項状態から励起三重項状態への遷移に応じて、発色団は、別の分子と相互作用し、不可逆的共有結合的修飾を生成する可能性が高い。三重項状態は、一重項状態に対し比較的に長寿命であって、それによって、励起分子の環境内の成分との化学反応時間を大幅に長くする。したがって、所与の表面積に対し、マトリクス内集束構成は、反射面と同一強度のラマン信号を提供可能であるが、発色団の低下した光分解率の効果を付与する。表面が非反射である場合、マトリクス構成は、増強信号を提供するであろう。
【００５１】
微粒子三次元支持マトリクスは、シリカフィルタフリットの形態であることが可能であって（図１０の横断面に示される）、円形のシリカ粒間に数十マイクロメータの孔隙を備える多孔性構造を有する。化学的に堆積された銀のための支持表面として使用される場合、シリカ粒子は、図１１および、図式的に図１２に示されるように、粒子状金属銀で被膜される。
【００５２】
マトリクス孔隙１１１／１２１は、典型的には、全長約５０〜８０μｍであって、拡散経路２５〜４０μｍとなってもよい。典型的１００ｋＤａ蛋白質検体に対し、これは、約３０秒以内の９９％結合となるであろう。３次元マトリクスは、マイクロ流体系の反応速度の利点を付与すると共に、同時に、レーザー集束上の緩和された必要条件のため、ミリメートル以上のスケールでの検出体積を可能にする。
【００５３】
堆積された金属部分は、２つの形態を有する。第１の形態は、直径約２５０ｎｍを有する略球状粒子の融合線状鎖である、図１３に示されるフィラメント状ストランドを備える。これらのフィラメントは、図１４に示されるように、数十〜数百ナノメートル径範囲のより小さい遊離粒子の第２の形態によって囲繞される。異なる方法から形成される他の形態も作用し得ることを理解されたい。
【００５４】
図１４は、約１２ｎｍ〜約２２０ｎｍの範囲の直径を有する５１０の略球状銀粒子を示す。この堆積を生成するために必要とされる方法は、Ｔｏｌｌｅｎｓ反応混合物内にフィルタフリットを完全に浸漬することを伴う。
【００５５】
フリットが、反応混合物の表面上に浮遊可能である場合、銀粒子は、図１５に示されるように、単位面積当たりの密度が非常に高い状態で堆積される。図１５は高粒子表面密度（図１４の５１０と比較して、図１５では９７６）を呈するが、粒度分布を重ね合わせたプロット（図１６）から分かるように、フィルタフリットの完全沈殿によって生成されるものと非常に類似した粒度分布を有する。フィルタフリットの部分沈殿は、方法１の約２倍の単位表面積当たり粒子を生成し、したがって、高ラマン信号を提供する。
【００５６】
２つの方法を使用してシリカフィルタ上、および平坦表面上で調製された粒子の例示的ＳＥＲＲＳスペクトルが、図１７に示される。すべての場合において、同一ＳＥＲＲＳ活性化合物が、濃度１０−５Ｍ、積分時間１秒で使用された。濾過方法１は、フリットが反応混合物中に完全に沈殿した場合を示す。方法２は、フリットが表面上に浮遊可能である場合を示す。
【００５７】
浮遊フリットを使用して調製された表面上の銀粒子数は約２倍であるが、ＳＥＲＲＳ信号は、方法１の約３倍である。これは、信号強度が、表面における粒子数に線形的に依存していないためである。粒子は、同一粒度分布をとるため、比例的でなく増加するＳＥＲＲＳ信号は、単純に利用可能な銀表面の増加に起因することはあり得ず、粒子間の相互作用による余剰寄与因子を有しているはずであって、より高充填密度によってさらなるＳＥＲＲＳ増強につながる。粒子は、その中の伝導電子の同期運動によって生成される電磁場を介して相互作用し、この相互作用は、粒子間の距離に依存すると概して認められている。
【００５８】
本発明のさらなる実施形態では、支持物質自体を備える基材粒子の構造内に銀粒子を堆積することによって、検体分子の平均的拡散経路長をさらに減少することが可能である。これは、支持物質が多孔性である場合に達成可能である。この場合における多孔性という用語は、物質を構成する粒子が検体を検出するために使用される色素に対し多孔性であるような径の孔を含有する物質を示す。本実施形態では、支持物質自体の粒子が孔隙または孔を有し、完全にアクセス可能な内部構造となる。
【００５９】
マイクロ多孔性粒子から成る支持物質の良好な実施例は、細孔ガラス（ＣＰＧ）であって、シリカから形成可能である。マイクロ多孔性は、孔が、約数ミクロンまたは数十ミクロン径を有するという事実を示す。ＣＰＧを生成する一方法は、ガラスの１つは、酸による腐食を受けるが、他は受けない、ガラス混合物の酸エッチングによるものである。その生成物は、完全にアクセス可能な内部構造を特徴とするガラス／シリカ物質であって、個々のシリカ粒子は、そこに接着する銀粒子の利用可能内部表面積を増加させる役割を果たす、ナノメートルスケールの孔隙を有する。そのような物質の実施例は、図１８−２１に示される。
【００６０】
図１８は、個々の粒子が確認可能なＣＰＧの拡大図を示す。図１９は、単一粒子の表面を示し、相互接続される多くの孔隙で特徴付けられ、完全にアクセス可能な内部構造を提供する表面が認められる。図２０は、孔隙径（この場合、数百ｎｍ）を成すＣＰＧ粒子表面のより高拡大倍率図を示し、図２１は、孔隙内に堆積され得る金属粒子を示す。ＣＰＧ等の物質内での使用に好適な典型的金属粒径は、約５０〜１５０ｎｍである。
【００６１】
ＣＰＧは、化学合成用支持マトリクスとして広く使用される。数段階の異なる粒径（ＣＰＧは、通常、微粒子粉末として扱われる）、孔隙径（典型的には、約１００ｎｍ〜約１μｍ）、および表面誘導体化（表面への化学的付着を促進するための種々の官能基）が利用可能である。ＣＰＧは、広域内部表面積（最大１００ｍ２／ｇ以上）を有し、化学的に不活性（その金属結合または粒子播種特性を向上させるために誘導体化されない限り）であって、さらにスペクトル干渉を生じ得る実質的ラマンピークを引き起こさないため、バイオセンサ支持マトリクスとして特に好適である。
【００６２】
孔隙は、色素が侵入し、また、金属部分／粒子を収容するために十分な大きさであるべきである。典型的色素は、約１〜５ｎｍ、検体は、５〜１００ｎｍの径を有する。約５０ｎｍ径の金属粒子を使用する場合、これは、孔隙径が約１５０ｎｍ以上であるべきであることを意味する。
【００６３】
実施例として、銀ベースの基材を作製するための一方法は、ＣＰＧ存在下Ｔｏｌｌｅｎｓ反応を行うことである。アルデヒド、アルコール、またはカルボキシレート基によるＣＰＧの表面誘導体化は、この方法に特に好適である。
【００６４】
本発明の全実施形態では、支持物質は、検出される検体に対し多孔性であり、検出化学反応（検体によるレポーター分子または色素の変位等）は、支持構造自体内で生じ得る。しかしながら、これは、本発明の必要条件ではない。支持物質は、検出される検体に応じて色素に対してのみ多孔性であって、検体または試料内の他の物質に対し多孔性でなくてもよい。他の物質は、検出に望ましくない、または照射される部分から離した方が望ましい試料内の任意のものを含み得る。実施例は、血液細胞、またはラマン信号を歪ませ得る化学物質を含み得る。検体は、支持物質の外部表面における色素を変位可能であって、次いで、色素は、支持物質内に拡散し、ラマン増強金属粒子と相互作用してもよい。最小必要条件は、支持物質が色素に対し多孔性であることである。さらに、基材粒子は、色素に対し多孔性であるが、検体試料内の他の物質に対しそうではなくてもよい。検体は、支持物質の外部表面、または支持物質内であるが、基材粒子外の色素を変位させることが可能であって、次いで、色素は、基材粒子内に拡散し、ラマン増強金属粒子と相互作用する。
【００６５】
支持構造または基材粒子が色素に対してのみ多孔性である場合、検体は、支持物質または基材粒子の外部表面における選択剤から色素を変位させてもよい。次いで、色素は、支持物質または基材粒子内に拡散し、その中に分散される銀粒子と相互作用するであろう。当然ながら、検体もまた、色素自体である場合、別個の色素の必要はなく、支持物質または基材粒子は、検体自体に対し多孔性となるであろう。検体は、反応担体内に導入される場合、支持物質または基材粒子内に拡散し、銀粒子と相互作用するであろう。
【００６６】
支持物質または基材粒子の孔／孔隙径は、物質全体のラマン増強粒子の分布と、色素が移動し、ラマン増強表面と相互作用するための移動距離とを制御する。その結果、支持構造全体の孔隙／孔径は、使用される色素の平均自由行程と同じオーダーの大きさであるはずである。必要とされる径は、図３に示される拡散係数から判断してもよい。
【００６７】
孔隙内のラマン増強粒子の分布は、好ましい特性として、近傍金属粒子間の距離が、ラマン反応が検出される色素の平均自由行程と同じオーダーの大きさとなるようにあるべきである。
【００６８】
広域内部表面積を有するＣＰＧ等の物質が使用される場合、分子が拡散し、粒子内の孔が１００ｎｍから最大１０，０００ｎｍであり得るため、金属粒子と相互作用する距離は、大きくなる可能性がある。結晶化または堆積等の方法を使用して、そのような構造内に金属を堆積する場合、金属粒子の分布は、動径分布関数をとる。さらに構造内に進む程、色素と相互作用する金属粒子が少なくなる。しかしながら、色素もまた、類似方法で拡散し、したがって、色素分子の大部分が、高濃度金属粒子を有する領域に内に見られるであろう。
【００６９】
本発明による３次元多孔性支持は、レーザーによって照射される場合、２つのレベルの共鳴を経験する。第１に、個々の金属粒子によって経験される表面プラズモン共鳴である。加えて、誘電媒体（試料および支持物質）内に載置される金属から本質的に生じる大規模共鳴である。しかしながら、この第２の共鳴レベルは、光結晶構造内の共鳴と類似性を共有するが、支持構造内の金属粒子全体の拡散は均一ではなく、したがって、直接比較は困難である。
【００７０】
銀添ＣＰＧ等、その中に分散および固定される金属を有する支持構造は、合理的推定（計算目的のみに対し）において、物理的に固定されたコロイド分散と同等であるとみなされてもよい。ＣＰＧおよび孔隙内の試料溶液は、懸濁内のコロイド粒子と同等であるＣＰＧ内部孔隙壁の内側を覆う金属ナノ粒子を有する誘電媒体に近似する。孔隙の寸法および孔隙壁上のナノ粒子の空間分散は、コロイド類似体の濃度を決定する。
【００７１】
コロイド粒子の任意特性は、広範囲に研究されている。コロイドの吸収スペクトルは、Ｍｉｅ理論から計算可能である。小球状粒子に対しては、単位体積当たりＮ粒子の分散の吸光度Ａは、Ｍｉｅ総和の双極子項のみに依存し、以下のように計算可能である。
【００７２】
【数７】
2009531696.tif 000009
ここで、Ｃおよびｌは、それぞれ吸収横断面と光路長である。粒子寸法が伝導電子の平均自由行程よりも小さい場合、これらの電子は、粒子壁と「衝突」し、バルク物質よりも低い有効平均自由行程を提供する。
【００７３】
２πＲ＜λ（ここで、Ｒは、粒径、λは、周囲媒体内の光の波長である）の制限下では、断面積は、以下のように表すことができる。
【００７４】
【数８】
2009531696.tif 000010
ここで、Ｖは、球状粒子の体積、λは、入射波長（振動数ωに対応）、およびεｍは、媒体の誘電率である。バルク金属の複素相対誘電率は、以下のように求められる。
【００７５】
【数９】
2009531696.tif 000011
銀等の自由電子金属に対し、ε１（ω）およびε２（ω）は、よく知られている場合が多く、ある範囲の波長にわたって実験的に決定されている。上述の式より、最大値は、ε１（ω）＝−２εｍの場合の吸光度において生じることが分かる。ε１（ω）＝−２εｍの場合の値ε２（ω）および波長に伴う変化率ε１（ω）は、結果として生じる吸収バンドの高さおよび幅を決定する要因である。
【００７６】
伝導電子（Ｌ）の平均自由行程に相当する径を有する金属粒子に対し、自由電子と粒子壁との衝突率は、かなりのものとなる。電子運動は、効果的に減衰され、金属の誘電特性の変化へとつながる。この表面効果を考慮するために、第２項を誘電関数の虚数部の計算に付加する必要がある。
【００７７】
【数１０】
2009531696.tif 000012
ここで、ε２’（ω）は、小粒子に対し補正された誘電パラメータである。
【００７８】
上述したように、典型的な銀粒子は、本発明によって提供される支持物質上および内に分散され得る場合、直径数十ナノメートルである。銀中の電子の平均自由行程Ｌの一般的に許容される値は、約５７ｎｍである。銀、ガラス、および水（試料に近似）に対する複合誘電関数の波長依存値は、当技術分野においてよく知られている。これらのデータを使用して、銀添ＣＰＧのＵＶ／可視吸収スペクトルが予測可能である。
【００７９】
理論と実験結果との比較は、図２５に示されるが、短波長における実験値吸光度は、予測値よりも低い。この差は、以下の形のＧａｕｓｓｉａｎ関数を減算することによって容易に補正可能である。
【００８０】
【数１１】
2009531696.tif 000013
以下に示される実験データに対する最適適合は、ａ＝７ｘ１０−６、ｂ＝３．３４ｘ１０−７、およびｃ＝３．５ｘ１０−８によって求められる。
【００８１】
パラメータａは、単に、倍率である。パラメータｂおよびｃは、それぞれ、Ｇａｕｓｓｉａｎピークの位置および幅を決定する。このＧａｕｓｓｉａｎ関数を減算することによって、光学スペクトルに「ノッチ」フィルタを提供する効果を有する。この効果は、銀添ＣＰＧが、約３３４ｎｍにおいてバンドギャップが排除された光結晶と同様に挙動する場合、合理化することが可能である。実験データは、公称波長５３２ｎｍ（真空中）のレーザーを使用して収集された。公称対見掛け波長の率（５３２／３３４）は、銀添ＣＰＧ「光結晶」に対する有効屈折率１．５９３を提供する。この公称波長でのガラス、水、および銀の屈折率は、それぞれ約１．５２０、１．３３６、０．００２である。したがって、銀添ＣＰＧは、その成分物質とは異なる特性を有するメタマテリアルとして作用している。
【００８２】
ＣＰＧ内の銀粒子の幾何学的分散は、規則的結晶格子ではなく、したがって、光結晶を説明する従来の理論は必ずしも当てはまらない。しかしながら、孔隙径およびＣＰＧ構造内の孔隙間間隔によって主に決定される、粒子分散にある程度の局所的規則性がある。本状況は、粒子が均一誘電媒体によってではなく、試料（少なくとも、検出される色素、そして恐らく検体、および検出されない他の化学物質を含有する、不確定誘電特性をもった希釈水溶液）で充填された孔隙と、この場合、ガラスを備える孔隙間物質の組み合わせによって、離間されるという事実によってさらに複雑になる。このような物質の正確な誘電特性は、ＣＰＧ孔隙の正確な形状および空間構成に大きく依存し、一般的分析説明を導出することは困難である。しかしながら、銀添ＣＰＧマトリクスの挙動は、有限要素解析またはメッシュフリー法等の数値的技術を使用して予測可能である。
【００８３】
したがって、検知物質の光学的挙動は、２つの基本的メカニズムによって決定される。第１の表面プラズモン共鳴は、金属粒子自体の径、組成、および形状によって、主に影響を受ける。第２の大規模共鳴は、支持マトリクスの組成および空間分布（それは、金属粒子が分散される空間分布および誘電環境を決定する）によって影響を受ける。金属粒子自体の光学特性は、上述の数学的技術を使用して予測可能である（それによって、合理的に設計される）。金属添マトリクス物質の光学特性は、構造の複雑性に応じて、分析または数値的アプローチによって決定可能である。支持物質および試料の異なる屈折率および誘電特性は、入射放射の最大吸光度を保証するために必要とされる金属粒子間の最適間隔を決定する。金属粒子の平均的間隔は、理想的には、入射放射の波長の半分であるが、しかしながら、波長は、放射が通過する物質に依存する。支持物質の壁厚に対する孔隙直径率は、好ましくは、孔隙を充填する溶液の屈折率と支持物質の屈折率との率に等しく、その場合、両物質における励起光子の実際の波長が同一となり得る。その結果、ＣＰＧメタマテリアル内の孔隙／壁構造の寸法は、好ましくは、孔隙を備える支持物質の体積と固体支持物質を備える体積との差を考慮して、加重平均として選択されるべきである。入射放射の波長の半分の倍数の金属粒子の間隔は、さらなる共鳴調波も提供するであろう。
【００８４】
ラマン分光法で使用されるレーザーは、典型的には、焦点域約１００μｍを有するが、これは、５００μｍの大きさまで拡大してもよい。図１８は、ＣＰＧ粒子径が全長約１００ミクロンであってもよいことを示す。したがって、本発明による支持物質は、その中に固定および分散される金属との多孔性構造を有する、単一基材粒子を含むことが可能であることを理解されたい。理想的には、多くの粒子は試料濃度を効果的に希釈するので、可能な限り少ない粒子が使用される。便宜的により多くの粒子を使用して、本発明を組み込む検出器の設計／構成を単純化してもよい。
【００８５】
典型的には、レーザーがラマン分光法で使用されるが、唯一の必要条件は、照射源が、指定波長を有する単色であることである。照射源がコヒーレントである必要はない。
【００８６】
孔隙径は、孔隙径が使用される光の波長と略同一である場合、光の照射に影響を及ぼし得る。光の波長よりも十分に小さい孔隙径を使用することによって、これらの課題は低減される。
【００８７】
粒子径および形状は、その表面における伝導電子のプラズマ（プラズモン）との共鳴を介して、入射レーザーと結合する金属粒子の能力に劇的な影響を有する。これの実験的証拠は、図２２に示される（２００５年５月ＭＲＳ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ（３０）のＨａｅｓらから抜粋）。
【００８８】
図２２は、所与の径および形状の粒子で被覆された表面のＵＶ／可視吸光度プロファイルを示す。ＵＶ／可視および赤外線領域の両方を網羅する、現在利用可能な最も完全なデータセットは、三角形粒子に対するものあって、以下の表に示される。
【００８９】
【表１】
2009531696.tif 000014
非線形回帰モデルを三角形粒子データに適用することによって、λｍａｘと粒子幅および高さとの関係を示す実験式が以下のように導出され得る。
【００９０】
【数１２】
2009531696.tif 000015
これは、測定値に対しプロットされた計算値λｍａｘを示す図２３に示されるように、実験データに対し合理的に良好な適合を提供する。
【００９１】
この関係は、厳密には、三角形粒子のみに当てはまり、比較的に少数の実験データ点に基づいており、したがって、より多くの観察結果が利用可能であれば、その正確性は、非常に改良されるであろう。特に、その正確性は、実験的に観察された範囲から大幅に外れる幅と高さの組み合わせに対しては非常に低くなるであろう。しかしながら、これらの点を考慮し、種々の幅および高さの銀粒子に対する推定λｍａｘ値を予測することが可能である。図２４のプロット内の暗色曲線は、一般的に使用される５３２ｎｍレーザーへのより優れた結合を示す。
【００９２】
図２４は、観察された粒子系が、２次元平面アレイ粒子に関するため、幅および高さに対し対称的ではない。粒子場は、面外方向ではなく、表面の平面内において著しく相互作用し、したがって、「幅」は、粒子の面内寸法に、「高さ」は、平面に垂直なその径に関する。
【００９３】
望ましくないことに、λｍａｘが５３２ｎｍを上回る粒子幅（約１００ｎｍ）が存在する。比較的狭い幅（＜約５０ｎｍ）の粒子は、λｍａｘに対し望ましくなく低い予測値を有する。約１００ｎｍを上回る粒子幅に対し、５３２ｎｍレーザーによる共鳴の最適高は、（高さ≒２５＋０．４２ｘ幅）である。幅約７５ｎｍの粒子は、５０ｎｍを下回る最適高を有し、７５ｎｍを下回る幅の粒子は、５３２ｎｍ未満の準最適λｍａｘ値を有する。したがって、表面に付着される特定の径の粒子が、指定のレーザー波長に対し良好な光減衰を示すであろう寸法は狭い範囲となる。
【００９４】
Ｔｏｌｌｅｎｓ反応を使用する堆積によって形成される粒子は、ある範囲の異なる径を有し、これらの径は、フラクタル分散によって分散される。そのような範囲の径の利点の１つは、放射からの照射に対する色素の応答に増強を提供するために、適切な径を有する一定の割合の粒子が存在することが保証されることである。ラマン分光法では、これは、入射放射の波長に一致するプラズモン波長によって作用する。しかしながら、必要とされる径の粒子のみ基材の表面上に均一に分散される場合、表面増強ラマン効果をさらに増加させるだろう。銀コロイドを支持物質内に固定することによって達成可能である。これは、そのようなコロイド径が、堆積技術を通して生成される銀粒子よりも大幅に制御可能であるからである。
【００９５】
Ｔｏｌｌｅｎｓ反応によって堆積された粒子が、ａ＝ｂ＝観察直径である粒子に近似すると仮定すると、図２４に示される粒度分布を有する母集団からの表面増強ラマン信号は、大部分は、粒子のわずか０．６％によってもたらされると推測可能である。この数は、１％未満とみなされる、いわゆる「ホットパーティクル」の実験的に観察された発生率と十分一致している。しかしながら、上述の最適値に近似する径を有する均一母集団は、ホットパーティクルの割合が非常に高く、その結果、所与の量の銀に対するラマン信号の著しい向上を呈することに留意されたい。
【００９６】
（理論的根拠の説明）
図１は、既知のマイクロ流体ＳＥＲ（Ｒ）Ｓセンサを示す。照射レーザーは、マイクロ流体チップ上のチャンバ内の平面銀表面上に集束され、それによって、画定される表面パッチをサンプリングする。この領域内の表面上に吸収される分子は、ラマンメカニズムによって光子を散乱し、一定の割合の散乱光は、スペクトルを記録する分光計に戻る。表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）に対し、ラマン散乱分子の吸光度ピークと一致する入射レーザーが選択され、それによって、ラマン信号を生成する効率が向上する。安価かつ容易に利用可能であるため、波長５３２ｎｍのレーザーの使用が典型的である。
【００９７】
マイクロ流体系によって付与される重要な効果の１つは、関連分子の拡散経路長に匹敵する寸法の体積内での反応に物理的に制限することによる、反応時間の劇的減少である。
【００９８】
液体媒体を通って拡散する分子の能力は、その拡散係数Ｄによって説明され、Ｓｔｏｋｅｓ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎの式を使用して、以下のように予測可能である。
【００９９】
【数１３】
2009531696.tif 000016
ここで、ｋは、Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ定数、Ｔは、絶対温度である。このモデルは、分子が連続溶媒内を自由に拡散する半径Ｒの球体であって、分子径は、溶媒径の少なくとも５倍であって、液体は、低粘度（η）を有すると仮定する。
【０１００】
蛋白質は完璧な球形ではないが、その見掛けストークス半径は、実験的に判断可能である。典型的実施例は、以下の表に示される。
【０１０１】
【表２】
2009531696.tif 000017
これらのデータは、その分子量から蛋白質のストークス半径を予測するための経験的方法を導出するために使用可能である。
【０１０２】
図２は、分子量に対しプロットされたストークス半径のプロットを示す。実験的に求められた点は、関係Ｒ＝１．２７１９ｌｎ（分子量）−１．６９０８に従う対数曲線上にある。この式を使用して、Ｒの予測値をＳｔｏｋｅｓ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎの式において使用し、その分子量のみに基づく任意の蛋白質の拡散係数を予測することが可能である。分子量に対しプロットされた計算拡散係数を示すプロットは、図３に見ることができる。
【０１０３】
マイクロ流体系における典型的拡散制限時間スケール（ｔＤ）を予測するための一般的方法は、以下の式を使用する。
【０１０４】
【数１４】
2009531696.tif 000018
ここで、ｌは、系の特性長である。ｌ＝１ｃｍを有するマクロスケール系内の質量１００ｋＤａの典型的蛋白質に対し、ｔＤは、約２３０時間である。ｌ＝１００μｍを有するマイクロ流体系内の同一蛋白質に対し、ｔＤは、約８４秒である。
【０１０５】
「典型的時間スケール」計算は、マイクロ流体バイオセンサが検定時間において多大な効果を付与することが可能であることを示すが、但し、反応の検知は、分子成分の拡散経路に匹敵する寸法を有する反応チャンバ内で実行される。しかしながら、この計算は、分子センサの表面における結合事象を伴う分子成分の減少を考慮しない。バイオセンサのより現実的モデルは、濃度勾配による粒子フラックスｊに対する拡散のＦｉｃｋの第１法則を使用して求められ得る。
【０１０６】
【数１５】
2009531696.tif 000019
図４は、バイオセンサモデルの略図を示し、検体分子はＳｔｏｋｅｓ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎモデルによって流体内に拡散し、それらは高さｈの反応チャンバ内に密閉され、その選択剤（抗体または核酸オリゴマー等の結合パートナーとしても知られる）は１つの壁に付着されると仮定される。また、右から放出するのと同じくらい多くの分子が左から画定領域に侵入するため（厳密には、チャンバ側壁から大幅に離れた領域に対してのみ当てはまる仮定）、側方拡散は重要ではないと仮定される。計算を単純にするために、選択剤への結合は不可逆的であって、過剰な結合パートナーが存在し、それぞれ個々の結合事象は瞬間的であると仮定される。
【０１０７】
高さｘおよび時間ｔにおける検体濃度は、ｃ（ｘ，ｔ）として定義される。初期状態（ｔ＝０）は、ｃ（ｘ，ｔ）＝Ｃ０（初期濃度）を有し、結合壁における減少は、ｃ（ｈ，ｔ）＝０である（ここで、ｘ＝ｈ）。その進行に伴って、結合反応が、結合壁に近接する検体の濃度を減少させる。これは、濃度勾配が形成され、経時的に、チャンバが検体分子の減少となるため、この壁方への検体分子の拡散フラックスを含む。
【０１０８】
計算は、図５に図式で示される２つの段階で行われる。段階１では、ｘ＝ｈである壁に近接する減少領域があって、チャンバの残りの部分からの分子の拡散によって継続的に補充される。段階２では、この減少領域は、チャンバ全体を含むまでに成長する。計算において使用されるさらなる推定の１つは、濃度勾配が線形プロファイルを有すると仮定することである。
【０１０９】
第１のステップは、段階１に要する時間を計算することである。Ｆｉｃｋの法則から、結合壁に対する拡散は、線形プロファイルを有すると仮定した、減少領域にわたる拡散勾配によって導出される。
【０１１０】
【数１６】
2009531696.tif 000020
チャンバ内の時刻ｔにおける自由検体分子の数ｎは、以下によって求められる。
【０１１１】
【数１７】
2009531696.tif 000021
次いで、変化率（すなわち、フラックス）は、以下となる。
【０１１２】
【数１８】
2009531696.tif 000022
境界条件ｘ（０）＝０を使用すると、以下となる。
【０１１３】
【数１９】
2009531696.tif 000023
時刻ｔ１で生じる段階１の最後に、ｘ（ｔ１）＝ｈとなり、したがって、以下となる。
【０１１４】
【数２０】
2009531696.tif 000024
段階２の計算は同様である。再び、結合壁に対する拡散を考慮するが、今回は、減少領域を考慮する必要があるだけである。
【０１１５】
【数２１】
2009531696.tif 000025
次いで、自由検体分子の数が、以下によって与えられる。
【０１１６】
【数２２】
2009531696.tif 000026
したがって、フラックスは、以下となる。
【０１１７】
【数２３】
2009531696.tif 000027
境界条件ｃ（０，０）＝Ｃ０を使用すると、以下が求められる。
【０１１８】
【数２４】
2009531696.tif 000028
これは、指数関数的減衰であるため、ゼロに達するまで検体濃度に対し無限時間をとることになる。しかしながら、検体の一定の割合ｐの結合に要する時間を計算可能である（０＜ｐ＜１）。これをｔ２と呼ぶ。
【０１１９】
【数２５】
2009531696.tif 000029
したがって、以下となる。
【０１２０】
【数２６】
2009531696.tif 000030
段階２に指数関数的減衰式を使用すると、以下であることが分かる。
【０１２１】
【数２７】
2009531696.tif 000031
次いで、検体分子の割合ｐの結合に要する時間ｔｐは、以下のように与えられる。
【０１２２】
【数２８】
2009531696.tif 000032
すなわち、
【０１２３】
【数２９】
2009531696.tif 000033
この式をマイクロ流体系に対し容認される「典型的時間スケール」式と比較すると、以下となる。
【０１２４】
【数３０】
2009531696.tif 000034
チャンバ高ｈが、特性長ｌとなり、検体減少のため系に導入される指数関数的減衰を説明する追加項が存在することは明白である。
【０１２５】
典型的１００ｋＤａ蛋白質に対し、異なる高さのマイクロ流体反応チャンバの９９％最大結合を達成するために要する時間は、計算可能であって、９９％結合が生じる時間に対するチャンバ高のプロットは、図６に示される。
【０１２６】
図６のプロットは、両軸の数値域が数桁にわたるため、ｌｏｇ−ｌｏｇスケールを使用する。約４０μｍを下回るチャンバ高に対し、結合は、数秒で完了する。４０〜３１０μｍ間の高さに対し、９９％結合は、数分で達成され、３１０μｍを越える高さに対し、結合は数時間要する。典型的マイクロタイタープレートは、１０時間を超える結合時間に対応する数ミリメートルの長さスケールを有するが、これは、プレートが、結合の間、プロセスを大幅に加速し得る振動または撹拌を受けないことを仮定する。
【０１２７】
典型的１００ｋＤａ蛋白質の実施例の１時間にわたる計算された結合の時間経過が、異なるチャンバ高で図７に示される。長さスケールを減少する効果は、明白である。高さ１ｃｍの「マクロスケール」に対し、５％結合未満は、１時間後に達成されるが、チャンバ高１００μｍでは、結合は約６分後に本質的に完了する。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図１は、従来のマイクロ流体ＳＥＲ（Ｒ）Ｓセンサを示す。
【図２】図２は、種々の蛋白質の分子量に対しプロットされたストークス半径のプロットを示す。
【図３】図３は、分子量に対しプロットされた種々の蛋白質の計算拡散係数を示す。
【図４】図４は、公知のバイオセンサモデルの略図を示す。
【図５】図５は、図４のバイオセンサモデルにおける種々の深度で、検体の濃度を計算するために使用されるプロットを示す。
【図６】図６は、結合パートナーへの検体の９９％結合の生じる時間に対するチャンバ高のプロットを示す。
【図７】図７は、異なるチャンバ高に対する典型的１００ｋＤａ蛋白質の１時間にわたる計算結合量を示す。
【図８】図８は、本発明を具現化するマイクロ流体ＳＥＲ（Ｒ）Ｓセンサを示す。
【図９】図９は、図８の本発明の実施形態において使用され得る、鏡（左）上および体積（右）内に集束されるレーザーの集束特性を示す。
【図１０】図１０は、フィルタフリット形態の微粒子三次元支持マトリクスを示す。
【図１１】図１１は、図８等の本発明の実施形態で採用され得る、粒子状金属銀で被膜されるフィルタフリットのシリカ粒子を示す。
【図１２】図１２は、粒子状金属銀で被膜される図１１のフィルタフリットのシリカ粒子を図式的に示す。
【図１３】図１３は、本発明の側面による第１の堆積方法によって形成されるフィラメント状ストランドを備える、堆積された銀の形態を示す。
【図１４】図１４は、堆積された銀の第２の形態を示す。
【図１５】図１５は、本発明のさらなる側面による第２の堆積方法によって得られる、増加した単位面積当たりの銀堆積を示す。
【図１６】図１６は、２つの堆積方法によって得られた銀粒径のプロットを共に重ねて示す。
【図１７】図１７は、２つの異なる方法を使用する図１１に示されるような、シリカフィルタ上で調製された粒子からの例示的ＳＥＲＲＳスペクトルを示す。
【図１８】図１８は、約８０〜１２０μｍ径の細孔ガラス粒子を示す。
【図１９】図１９は、単一の細孔ガラス粒子表面の拡大図を示す。
【図２０】図２０は、図１９よりも高倍率での単一の細孔ガラス粒子表面の拡大図であって、孔隙寸法約２００〜５００ｎｍを示す。
【図２１】図２１は、図２０に示される孔隙内に堆積され得る金属粒子を示す。
【図２２】図２２は、所与の径および形状の粒子で被覆される表面のＵＶ／可視吸光度プロファイルを示す。
【図２３】図２３は、測定値に対しプロットされた計算値λｍａｘを示す。
【図２４】図２４は、種々の幅および高の銀粒子の予測λｍａｘ値を示す。
【図２５】図２５は、所与の放射波長に対し理論値と比較される、本発明の実施形態による支持物質の吸光度を示す。
【図２６】図２６は、理論計算で追加項が使用された、図２５のプロットを示す。
【図１】
2009531696.tif 000035
【図２】
2009531696.tif 000036
【図３】
2009531696.tif 000037
【図４】
2009531696.tif 000038
【図５】
2009531696.tif 000039
【図６】
2009531696.tif 000040
【図７】
2009531696.tif 000041
【図８】
2009531696.tif 000042
【図９】
2009531696.tif 000043
【図１０】
2009531696.tif 000044
【図１１】
2009531696.tif 000045
【図１２】
2009531696.tif 000046
【図１３】
2009531696.tif 000047
【図１４】
2009531696.tif 000048
【図１５】
2009531696.tif 000049
【図１６】
2009531696.tif 000050
【図１７】
2009531696.tif 000051
【図１８】
2009531696.tif 000052
【図１９】
2009531696.tif 000053
【図２０】
2009531696.tif 000054
【図２１】
2009531696.tif 000055
【図２２】
2009531696.tif 000056
【図２３】
2009531696.tif 000057
【図２４】
2009531696.tif 000058
【図２５】
2009531696.tif 000059
【図２６】
2009531696.tif 000060
【国際調査報告】
2009531696.tif 000061
2009531696.tif 000062
2009531696.tif 000063
2009531696.tif 000064
2009531696.tif 000065