(57)【要約】本発明は、キャリア、好ましくは細菌チオレドキシン（Ｔｒｘ）の活性ループ部位（提示部位）内に、Ａβ４２の断片を有するＢ細胞エピトープをタンデム多量体化することにより取得される免疫原性組換え体を提供する。好ましくは介在性のアミノ酸リンカーを有する、Ａβ４２断片の複数のコピーを有するポリペプチドを構築し、アジュバントとの併用でマウスに注射した。誘導された抗体は、ＡＤ老人斑内の原繊維および／またはオリゴマーＡβに選択的に結合することが見出された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャリアを含む免疫原性構築体であって、前記キャリアがその活性ループ部位内に少なくとも１つのＡβ４２の断片を有する免疫原性構築体。
【請求項２】
前記キャリアがチオレドキシンである、請求項１に記載の免疫原性構築体。
【請求項３】
前記Ａβ４２断片がアミノ酸リンカーによってキャリアに結合されている、請求項１に記載の免疫原性構築体。
【請求項４】
前記少なくとも１つのＡβ４２断片が、３０アミノ酸残基未満のＮ末端断片であり、好ましくは、Ａβ１〜３、Ａβ１〜４、Ａβ１〜５、Ａβ１〜６、Ａβ１〜７、Ａβ１〜８、Ａβ１〜９、Ａβ１〜１０、Ａβ１〜１１、Ａβ１〜１２、Ａβ１〜１３、Ａβ１〜１４、Ａβ１〜１５からなる群から選択される、請求項２に記載の免疫原性構築体。
【請求項５】
少なくとも１つのＡβ４２断片がＡβ１〜１５である、請求項４に記載の免疫原性構築体。
【請求項６】
前記Ａβ１〜１５断片がアミノ酸リンカーによってチオレドキシンに結合されている、請求項５に記載の免疫原性構築体。
【請求項７】
前記アミノ酸リンカーがＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏである、請求項６に記載の免疫原性構築体。
【請求項８】
チオレドキシンが１つを超えるＡβ１〜１５断片を有する、請求項５に記載の免疫原性構築体。
【請求項９】
チオレドキシンが４つから１６のＡβ１〜１５断片を有する、請求項８に記載の免疫原性構築体。
【請求項１０】
チオレドキシンが４つのＡβ１〜１５断片（Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）4）を有する、請求項９に記載の免疫原性構築体。
【請求項１１】
各Ａβ１〜１５断片がアミノ酸リンカーによってチオレドキシンに結合されている、請求項８から１０のいずれか一項に記載の免疫原性構築体。
【請求項１２】
前記アミノ酸リンカーがＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏである、請求項１１に記載の免疫原性構築体。
【請求項１３】
アミロイド形成性疾患に対する治療用ワクチンとして使用するための薬学的組成物であって、キャリアを含む免疫原性構築体を含み、前記キャリアがその活性ループ部位内に少なくとも１つのＡβ４２の断片を有する組成物。
【請求項１４】
前記キャリアがチオレドキシンである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記Ａβ４２断片がアミノ酸リンカーによって前記キャリアに結合されている、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
少なくとも１つのＡβ４２断片が、３０アミノ酸残基未満のＮ末端断片であり、好ましくは、Ａβ１〜３、Ａβ１〜４、Ａβ１〜５、Ａβ１〜６、Ａβ１〜７、Ａβ１〜８、Ａβ１〜９、Ａβ１〜１０、Ａβ１〜１１、Ａβ１〜１２、Ａβ１〜１３、Ａβ１〜１４、Ａβ１〜１５からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのＡβ４２断片がＡβ１〜１５である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記Ａβ１〜１５断片がアミノ酸リンカーによってチオレドキシンに結合されている、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記アミノ酸リンカーがＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
チオレドキシンが１つを超えるＡβ１〜１５断片を有する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
チオレドキシンが４つから１６のＡβ１〜１５断片を有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
チオレドキシンが４つのＡβ１〜１５断片を有する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
各Ａβ１〜１５断片がアミノ酸リンカーによってチオレドキシンに結合されている、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記アミノ酸リンカーがＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
さらにアジュバントを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記アジュバントが、３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、サポニンＱＳ２１、ムラミールジペプチド、またはアルミニウム塩からなる群から選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記アルミニウム塩が、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、および硫酸アルミニウムからなる群から選択される、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
請求項１から１２に記載の免疫原性構築体を認識するモノクローナル抗体。
【請求項２９】
前記免疫原性構築体がＴｒｘ（Ａβ１〜１５）4である、請求項２８に記載の抗体。
【請求項３０】
アミロイド形成性疾患を予防または治療するための治療薬であって、請求項２８または２９に記載のモノクローナル抗体を活性成分として含む治療薬。
【請求項３１】
前記アミロイド形成性疾患がアルツハイマー病である、請求項３０に記載の治療薬。
【請求項３２】
キャリアを含む免疫原性構築体を調製する方法であって、
前記キャリアがその活性ループ部位内に少なくとも１つのＡβ４２の断片を有しており、
前記方法が、
（ｉ）前記キャリアを好適な細菌内で増幅することと、（ｉｉ）前記キャリアを、ｐＥＴ系によりタンパク質を発現するためのＴ７プロモーターを含む、好適なベクターに挿入することと；（ｉｉｉ）Ａβ断片のＤＮＡインサートを調製することと；（ｉｖ）前記キャリア−ベクターおよび前記Ａβ断片のＤＮＡインサートを制限切断およびライゲーションすることと、を含む方法。
【請求項３３】
前記キャリアがチオレドキシンである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細菌が大腸菌である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記ベクターがｐＴ７Ｋａｎ−Ｔｒｘである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
請求項３２に記載の方法により取得される免疫原性構築体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Ａβ４２の断片と、キャリアとを含む免疫原性構築体であって、該断片がキャリアの活性ループ部位（提示部位）内に位置決めされていることを特徴とするキャリアとを含む免疫原性構築体、その産生方法、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アルツハイマー病（ＡＤ）などのアミロイド形成性疾患は、高齢者の認知症の主原因として認識されている。ＡＤにおける認知能力の衰えは、脳内の病理組織学的変化と関連しており、最も関連性が高いのは、アミロイド斑および神経原繊維濃縮体の形成である。
【０００３】
アミロイド斑は、多数のタンパク質を含有するが、主要成分としてアミロイド−β（Ａβ）ペプチドを有する。Ａβペプチドの形成、およびその結果であるＡβアミロイド斑は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の異常切断から生じる。
【０００４】
現在、ＡＤの進行を遅らせるまたは改善させる幾つかの薬理学的手法が開発されている。幾つかの手法はＡβペプチドの代謝産生を阻害することを対象とし、他の手法はＡＤ罹患患者の脳内でのＡβアミロイドの凝集を防止することを対象としている。
【０００５】
しかしながら、最も有望な手法は、Ａβに対する免疫応答を引き起こすことができる抗原（能動免疫）またはＡβに対する抗体（受動免疫）のいずれか一方の投与により、脳からＡβ斑の除去を促進させることを対象とする。
【０００６】
通常、抗原または免疫原は、免疫系の種々の構成要素に認識され相互作用する固有の抗原部位または「エピトープ」を含有する高分子である。通常、それらは、好適なキャリアに結合した短ペプチドなどの低分子または「ハプテン」を含む。キャリアは、典型的には、投与時に生体内で免疫応答を引き起こし得る、より高分子量のタンパク質である。
【０００７】
免疫応答において、抗体は、ヘルパーＴ（ＴＨ）細胞と協調してＢリンパ球により産生され、分泌される。ハプテン−キャリア系の大多数では、Ｂ細胞がハプテンおよびキャリアの両者に特異的な抗体を産生する。それらの場合、Ｔリンパ球は、キャリア上に特異的な結合ドメインを有するが、単独でハプテンを認識することはないであろう。ある種の相乗作用で、ＢおよびT細胞は、協調してハプテン特異的な抗体応答を誘導する。
【０００８】
したがって、効果的な抗原を構築する際に、適切なキャリアおよび適切なハプテンを選択することは、強固で選択的な免疫原性応答を保証するのに極めて重要である。抗原の安全性も極めて重要である。例えば、凝集前のＡβ４２および免疫アジュバントＱＳ−２１により構成された、有望ワクチンＡＮ−１７９２をＡＤ患者に投与すると、治療を受けた患者の約６％に重篤な髄膜脳炎を引き起こした。細胞傷害性Ｔ細胞の中枢活性化および自己免疫反応の両者が、毒性機序の可能性として提唱されている。非凝集のＡβ種は、神経活動に生理学的役割を有するため、内在性の単量体Ａβに対する免疫応答は有害であり得る。
【０００９】
それ故、非常に重要なのは、ハプテンおよびキャリアの両方を適切に選択して、有害なＡβ種に対する抗体の選択性を保証し、自己免疫毒性を防止することである。
【００１０】
ＷＯ２００５０５８９４０は、Ａβペプチドまたはその断片を含むペプチド免疫原を、タンパク質／ポリペプチドキャリアに抱合することを提唱している。
【００１１】
免疫原性構築体は、キャリアのアミノ酸残基の官能基を誘導体化する化学的方法により産生され、誘導体化されたが抱合しなかった任意のアミノ酸残基の官能基はキャッピングを経て不活性化され、それらが他の分子と反応しないようにブロックされる。そのような方法では、Ａβ断片がキャリアのアミノ酸側鎖に結合している免疫原が生じる。ＷＯ２００５０５８９４０においては、幾つかの異なるキャリアおよびハプテンが提唱されているが、それらの生体内での病理組織学的な有効性は示されていない。
【００１２】
ＫＩＭ，Ｈ．Ｄ．らは、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．第３３６巻、８４〜９２頁において、スキャフォールドされていない１１回反復したＡβ１〜６で構成される抗ＡβＤＮＡワクチンを提唱している。
【００１３】
そのような構築体は、単量体の、オリゴマーの、および原繊維のＡβ４２種を無差別に認識する抗体を産生する。
【００１４】
一般に、Ａβ４２の異なる会合状態（単量体、オリゴマー、または原繊維）に対する免疫原の選択的標的化は、これまで達成されていない。
【００１５】
上記の考察を鑑みると、ＡＤまたはダウン症などの他のアミロイド形成性疾患に罹患した患者の脳内で、Ａβアミロイドの凝集を防止する治療用ワクチン組成物に使用され得る、安全で効果的な免疫原性構築体の開発が未だに必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、Ａβ断片が、キャリアの末端に結合されるのではなく、キャリアの活性ループ部位（提示部位）内に位置決めされていることを特徴とする組換え免疫原性構築体を提供する。該ペプチドは、キャリア、好ましくはチオレドキシン（Ｔｒｘ）の活性ループ部位（提示部位）内に、Ａβ４２の断片を有するＢ細胞エピトープをタンデム多量体化することにより取得される。
【００１７】
本発明の免疫原は、アミロイド形成性疾患の最も直接的な原因物質として近年指摘されている、Ａβアミロイドの神経毒性オリゴマー種を認識する抗体を誘発することが見出された。
【００１８】
この能力は、キャリア内にＡβアミロイドを有する免疫原を構築することに関連している。そのような構成は、免疫原性タンパク質の正確な折りたたみをある程度可能にし、より効果的にＡβアミロイドを免疫系に提示する。免疫原が、１つを超えるＡβアミロイド断片、特に特定数の該断片を有するとき、Ａβアミロイドオリゴマーに対する免疫原の類似性は、選択性を向上させるだけでなく、その有効性をさらに向上させると考えられる。
【００１９】
さらに、キャリアと断片との間のリンカーは、ペプチドエピトープの会合状態の維持を支援する。
【００２０】
発明の概要
本発明は、Ａβ４２の免疫優性Ｂ細胞エピトープを有する断片と、該断片がキャリアの活性ループ部位（提示部位）内に位置決めされていることを特徴とするキャリアとを含む免疫原性構築体（以下、免疫原とも記す）を提供する。キャリアは、好ましくはチオレドキシンであり、Ａβ断片は、有利には３０アミノ酸残基未満、好ましくは２０アミノ酸未満のＮ末端断片、より好ましくはＡβ１〜１５である。
【００２１】
さらにより好ましくは、免疫原性構築体は、１つを超える、好ましくは２つから１６の断片、より好ましくは４つの断片を有する。
【００２２】
本発明は、該免疫原を構築する方法も提供し、この方法は、キャリアの提示内にＡβ４２の断片、好ましくは３０アミノ酸残基未満のＮ末端断片を有するＢ細胞エピトープを、リンカーを援用してタンデム多量体化することを含む。
【００２３】
別の態様では、本発明は、アミロイド形成性疾患に対する能動ワクチン接種用の該免疫原を含む組成物を提供する。
【００２４】
さらに別の態様では、本発明は、アミロイド形成性疾患に対する受動ワクチンとして使用するために、抗体、好ましくはモノクローナル抗体を開発するための該免疫原の使用を提供する。
【００２５】
図面の説明
図１ａは、本発明に従ったＴｒｘ（Ａβ１〜１５−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｎ構築体を表す。
【００２６】
図１ｂは、Ｔｒｘ提示のＡβ１〜１５の複製を１つ、４つ、または８つ有する構築体の、金属アフィニティクロマトグラフィーによる均質化精製を表す。
【００２７】
図１ｃは、本発明の実施形態に従った免疫原によって誘発された抗Ａβ抗体量を表す。
【００２８】
図１ｄは、本発明の実施形態に従った免疫原のＴｈ２極性応答を表す。
【００２９】
図２ａ−ｂ−ｃは、本発明の実施形態に従った免疫原で免疫されたマウス由来の血清で処理されたヒトの脳切片を表す。
【００３０】
図３は、本発明の実施形態に従った免疫原の優先的結合を表すＡＦＭ画像を表す。
【００３１】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明は、少なくとも１つのＡβ４２断片を有するキャリアを含む免疫原性構築体（または免疫原）を提供する。該断片は、該断片を立体配置的に安定させるキャリアの表面露出領域（活性ループ部位または提示部位）内に位置決めされている。
【００３２】
構築体の正確なサイズおよび化学的均質性は、ゲル電気泳動法および質量分析法の両方により定期的に決定される。
【００３３】
構築体の構造は、分析的技術により決定してもよいが、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）が好ましく使用される。
【００３４】
キャリアは、好ましくはチオレドキシン（Ｔｒｘ）である。Ｔｒｘが好適なのは、サイズが小さいこと（１０９アミノ酸）と、ペプチド提示能力と、マウスＴ細胞の増殖を刺激し得る無毒性の免疫促進物質として作用する能力とを有するためである。しかしながら、他のキャリアも使用することができる。
【００３５】
Ａβアミロイド断片とは、Ｎ末端であり、有利には３０アミノ酸残基未満、好ましくは２０アミノ酸未満を有するＮ末端断片であり、より好ましくは、アミノ酸の１文字コードに従って、以下の表１に記載のＡβ１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１３、１〜１４、１〜１５からなる群から選択される。好ましくは、Ａβアミロイド断片は、Ａβ１〜１５である。
【００３６】
有利には、本発明の免疫原性構築体は、１つを超える、好ましくは２つから１６の断片、より好ましくは４つの断片を有する。
【００３７】
好ましい実施形態では、断片は、接合エピトープの形成を防止するためにリンカーを介してキャリアに結合されている。該リンカーは、短いアミノ酸配列、好ましくは１つ〜５つのアミノ酸残基で構成されるリンカー、より好ましくは、グリシン−グリシン−プロリン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）である。しかしながら、グリシン−プロリン−グリシン−プロリン−グリシン（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）またはセリン−グリシン−セリン−グリシン（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）などの他のリンカーも使用できる。
【００３８】
好ましい免疫原構築体は、４つのＡβ１〜１５断片に、随意には好適なリンカーを介して連結されたチオレドキシンからなり、以下、Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）4と記す。
【００３９】
該免疫原を構築する方法は、キャリアを好適な細菌内で増幅することと、キャリアを、ｐＥＴ系を通じてタンパク質を発現するためのＴ７プロモーターを含む好適なベクターに挿入することと；Ａβ断片のＤＮＡインサートを調製することと；キャリア−ベクターおよびＡβ断片のＤＮＡインサートを制限切断およびライゲーションすることとを含むクローニング法である。
【００４０】
好ましくは、Ａβ断片のＤＮＡインサートは、アミノ酸リンカーを含む。
【００４１】
多量体を調製するときはいつでも、Ａβ断片のＤＮＡインサートを過剰量で使用する。
【００４２】
【表１】
2009531294.tif 000002
【００４３】
本発明の好ましい免疫原性構築体は、β−アミロイド脳病理を誘導したトランスジェニックマウスに、４カ月間、月に１度注射すると、海馬および大脳皮質内のＡβ斑の数とサイズを減少させると思われる。さらに、本発明の好ましい免疫原性構築体は、Ａβ４２の特定の種を認識する抗体を誘発することを見出した。
【００４４】
該抗体は、海馬内に注射すると、トランスジェニックマウスの海馬および皮質内のＡβ４２陽性斑を除去する能力があり、該除去効果は、オリゴマーのＡβ種に特に顕著である。該抗体は、Ａβに随伴する星状細胞増加を強力に改善することも見出した（実施例２）。
【００４５】
したがって、本発明の免疫原性構築体は、アミロイド形成性疾患に対する能動および受動の両ワクチンとして使用される組成物を形成し得る。
【００４６】
能動ワクチン接種用には、本発明の免疫原性構築体を含む薬学的組成物は、有利には、アジュバントと併用して投与する。
【００４７】
アジュバントおよび／または担体の選択は、アジュバントを含有するワクチンの安定性、投与経路、服薬スケジュール、ワクチン接種される種にとってのアジュバントの有効性に依存し、ヒトでは、薬学的に許容されるアジュバントは、関連規制機関によりヒト投与が認可された、または認可され得るものである。例えば、完全フロインドアジュバントは、ヒト投与に好適ではない。好適なアジュバントには、３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）と、ムラミールジペプチドと、ＱＳ２１およびクィルＡ（Ｑｕｉｌ  Ａ）などのサポニンとが挙げられる。
【００４８】
好ましい部類のアジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのアルミニウム塩（ミョウバン）である。さらに、アジュバントには、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカインが挙げられる。
【００４９】
アジュバントは、単一の組成物として免疫原と一緒に投与してもよく、または免疫原の投与前に、投与と同時に、もしくは投与後に、投与してもよい。随意には複数の異なるアジュバントを同時に使用してもよい。
【００５０】
免疫原およびアジュバントは、同一のバイアル中、または別々のバイアル中のいずれかに詰めて供給し、使用前に混合してもよい。
【００５１】
本発明の免疫原構築体を含む薬学的組成物は、他の多様な薬学的に許容される構成要素も含んでよい。「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」（第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、１９８０年）を参照。
【００５２】
好ましい薬学的形態は、目的とする投与方法および治療への応用に依存する。組成物は、所望の製剤に依存して、薬学的に許容される無毒性の担体または希釈剤も含んでよく、それらは、動物またはヒト投与用の薬学的組成物を製剤するために一般的に使用される媒体と定義される。
【００５３】
希釈剤は、その組合せの生物学的活性に影響を与えないように選択する。そのような希釈剤の例には、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス液がある。
【００５４】
非経口投与のためには、本発明の免疫原性構築体は、水、油類、食塩水、グリセロール、またはエタノールなどの滅菌液体であり得る、生理学的に許容され、薬学的担体を含む希釈剤中の物質の、注射投薬可能な溶液または懸濁液として投与できる。
【００５５】
加えて、潤滑または乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が、組成物中に存在してもよい。
【００５６】
本発明の組成物は、注射剤として、液状の溶液または懸濁液のいずれかとして調製することができ、注射前に液状媒体に溶解または懸濁するのに好適な固形物の形態を調製することもできる。
【００５７】
本発明の免疫原性構築体は、活性成分の徐放を可能にするように製剤され得るデポー剤注射または移植調製の形態で投与することができる。
【００５８】
他の投与方法に好適な製剤には、さらに、経口、経鼻、および経肺製剤と、坐剤と、経皮製剤とが挙げられる。
【００５９】
受動ワクチン接種用には、モルモットまたは他の動物種などの哺乳動物中に組成物を注射し、その結果生じる抗体を精製し、引き続きヒトに注射する。
【００６０】
好ましくは、抗体はモノクローナル抗体であり、動物をＴｒｘ（Ａβ１〜１５）4免疫原性構築体で免疫することにより産生する。該抗体は、アミロイド形成性疾患、特にアルツハイマー病の予防および治療用に使用する。
【００６１】
実施例１
様々なＴｒｘＡβ免疫原性構築体の調製および様々な抗ＴｒｘＡβ抗体の効果の生体外評価
Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）ｎの構築用に、Ｔｒｘコード配列をファージＴ７プロモーターの制御下に有する修飾された受容ベクターに対して、過剰量のＡβ１〜１５ＤＮＡインサートを使用することに基づくクローニング戦略を使用した（図１ａ）。Ｔｒｘ提示のＡβ１〜１５の複製を１つ、４つ、または８つ有する構築体を単離して、対応するポリペプチドを発現させるために使用し、次いでそれらのポリペプチドを、金属アフィニティクロマトグラフィーにより均質になるまで精製した（図１ｂ）。
【００６２】
正しく構築されたＡβ１〜１５多量体を産生する手段となるのは、介在性のＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏリンカーをコードする末端配列をＡβ１〜１５ＤＮＡに組み込み、したがって、接合性エピトープ形成を防止することだけでなく、Ｔｒｘ配列内に存在する特異ＣｐｏＩ部位（アミノ酸残基３４〜３５に対応し、５’．．．ＣＧ／ＧＴ（Ａ）ＣＣＧ．．．３’と同定される、ヌクレオチド位置９９〜１０５）の方向性およびインフレーム融合能力であった。
【００６３】
Ａβ４２全長ペプチドの単一の複製を有する第４の構築体（ＴｒｘＡβ４２）を同様に調製した。Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）ｎポリペプチドは、Ａβ１〜１５の多量体度にかかわらず全て可溶性であるが、ＴｒｘＡβ４２タンパク質のほとんどは、最終的には封入体中で不溶性の形態をとる（非図示）。それ故、Ａβ４２は、細菌細胞の不均質的状況においてはＴｒｘに融合されているときでも、可溶性が低いと思われる。
【００６４】
雄ＢＡＬＢ／ｃマウス１０匹ずつの５群を、ヒト使用に認可されたアジュバントであるミョウバンで全てを補完した、１０ｎｍｏｌの上記Ｔｒｘ（Ａβ１５）ｎポリペプチド、または当量の凝集前の合成Ａβ４２もしくはＴｒｘＡβ４２で処置した（図１ｃ）。
【００６５】
緩衝液（ＰＢＳ）のみまたはミョウバンを含まないＡβ４２を注射した追加の２群は、陰性対照の役目を果たした。４回目の注射の２週間後に血清を回収し、無作為に対で貯留し、凝集したＡβ４２を標的抗原として使用した酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で分析した。図１ｃに表したように、ＴｒｘＡβ１〜１５によっては誘発されなかったが、Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）４およびＴｒｘ（Ａβ１〜１５）８により誘発された抗Ａβ抗体の平均量は、擬似処置された対照の平均量より有意に高く（Ｐ＜０．０５；）、遊離のＡβ４２だけでなくＴｒｘＡβ４２が作用したＡβ４２処置群の平均量と類似していた。
【００６６】
Ｐとは、ベイジアン（Ｂａｙｅｓｉａｎ）または正規化標準偏差を使用し、対数変換した対照および実験データのｔ検定に関連するｐ値であり、Ｐは、統計的検定で取得された結果が、測定間に真正な関係があるためではなく偶然によるものである確率を示す。
【００６７】
ミョウバンアジュバントに典型的な強度の抗炎症性Ｔｈ２極性応答は、イソタイプ判別（ｉｓｏｔｙｐｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）により明らかにした（図１ｄ）。Ｇクラスおよびサブクラス１の免疫グロブリン（ＩｇＧ１）の出現が全ての抗原で観察されたが、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２（Ｇクラスおよびサブクラス２の免疫グロブリン）の比率は、非抱合型Ａβ４２より、多量体型Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）ｎおよびＴｒｘＡβ４２免疫抱合体のほうが、再現性よく高かった（Ｐ＜０．０５）。
【００６８】
次に、Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）ｎに応答して産生された抗血清が、アミロイド斑に結合する能力を検討した。この特性は、現在、抗Ａβ抗体の生体内での有効性を予見する最良の指標であると考えられているが、以前に報告されている全ての抗Ａβ抗血清（例えば、ｍ２６６およびＡβ４２のＣ末端部分を標的とする他の抗体）とは共有されない。
【００６９】
図２ａ〜ｂに表されているように、４量体または８量体形態のＴｒｘ（Ａβ１〜１５）ｎで免疫されたマウス由来の血清は、１／１０００希釈まで、アミロイド斑に結合した。
【００７０】
成熟および未成熟斑の他に、大型の老人斑が、抗多量体Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）ｎ抗体によって標識された。特に老人斑の核内での広範な免疫染色が、Ａβ４０を抗原として使用しウサギ内で産生された、陽性対照の抗汎βアミロイド抗血清で観察された（非図示）。比較して、擬似処置した動物由来の血清、または単量体Ａβ１〜１５で免疫したマウス由来の血清のいずれでも、斑は検出されなかった（図２ｃ）。
【００７１】
最後に、あらかじめ決められた条件下でインビトロ(in vitro)で産生され、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）により確認されたＡβ４２の異なる会合状態（単量体、オリゴマー、および原繊維）に対する、種々の抗Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）ｎ抗体の能力を、免疫ブロット法を使って評価した。この分析の結果は、図３に示され、この図は、抗Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）８抗体は３つのＡβ４２種の全てに結合するが、抗Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）４抗体は可溶性のオリゴマーおよび原繊維の両方に選択的に結合するが、Ａβ４２単量体には結合しないことを示す。際立って対照的には、単量体ＴｒｘＡβ１〜１５抗原に対して生じた抗体は、Ａβ４２原繊維を認識しないだけでなく、結合もしないことを示した。後者の観察は、これらの抗体が、ＡＤ斑中のＡβ原繊維だけでなく、ＥＬＩＳＡ中のＡβ４２高次凝集体を認識できないことと一致している（図１ｃおよび２ｃを参照）。しかしながら、興味深いことには、抗単量体ＴｒｘＡβ１〜１５抗体は、Ａβ４２単量体およびオリゴマーに結合する（図３）。それ故、Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）４は、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）３などの中強度のアジュバントと一緒に製剤されたときでさえ、良好な免疫原性活性を有する、Ｔ細胞エピトープが欠如した可溶性アミロイドβ誘導体である。また、シナプス毒性のあるＡβ４２オリゴマーおよび原繊維には結合するが、推測される生理的な単量体Ａβ種には結合しない抗体を産生するＴｒｘ（Ａβ１〜１５）４の能力は重要である。
【００７２】
他のペプチド免疫戦略と比較したＴｒｘ−ｄＰＩの主な利点は、その時間対効果および費用対効果、細胞毒性の欠如および化学的に均質な免疫抱合体の収率、直ちに検証され得るバッチごとの一貫性である。さらに、一度「リード抗原（ｌｅａｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）」が同定されれば、追加的なペプチドエピトープの組込み、及びＤＮＡワクチン接種目的でのベクター置換を含む、さらなる修飾を容易に適用できる。
【００７３】
ＴｒｘＡβ構築体。大腸菌チオレドキシンをコードする配列は、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩの制限部位を与えるように設計されたプライマー１および２（表２）を使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。増幅した断片は、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で同時消化し、同じ２酵素で消化したｐＥＴ２８ｂ（登録商標）（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社）にライゲーションし、その結果生じたベクターは、ｐＴ７Ｋａｎ−Ｔｒｘとして設計され、ＮおよびＣ末端にＨｉｓ６タグが挿入された細菌チオレドキシンのバージョンを、カナマイシン耐性マーカーと共に内包する。
【００７４】
Ｔｒｘコード配列内に存在するＣｐｏＩの特異部位（アミノ酸残基３４〜３５に対応する、５’．．．ＣＧ／ＧＴ（Ａ）ＣＣＧ．．．３’と同定された、ヌクレオチド位置９９〜１０５）を、クローニング部位として使用した。
【００７５】
多量体を産生する手段は、ＣｐｏＩの特異部位の方向性およびインフレーム融合能力である。
【００７６】
ｐＴ７Ｋａｎ−ＴｒｘＡβ１〜１５。アミロイドベータペプチドＡβ４２のＮ末端断片であるＡβ１〜１５ペプチドをコードする配列は、末端にＣｐｏＩ認識配列を有するリン酸化オリゴヌクレオチド
５’−ＧＴＣＣＧＡＴＧＧＡＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＡＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＴＡＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＧＣＧ−３’（順行）
３’−ＧＣＴＡＣＣＴＡＣＧＴＣＴＴＡＡＧＧＣＴＧＴＡＣＴＧＡＧＴＣＣＴＡＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＡＧＴＡＧＴＴＣＣＧＣＣＡＧ−５’（逆行）
をアニーリングすることにより取得した。５７ｂｐのＤＮＡインサート（５’突出したＣｐｏＩ）は、ＣｐｏＩで消化したｐＴ７Ｋａｎ−Ｔｒｘに、１／１０のベクター／インサートのモル比でライゲーションした。
【００７７】
Ｎ−ｎ４−６ｘＨｉｓ−ｎ１０−ＴＲＸ（１〜３３）ＧＰＭＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＧＧＰＴＲＸ（３６〜１０９）−ｎ１５−６ｘＨｉｓ−Ｃ
全配列は：
ｍｇｓｓｈｈｈｈｈｈｓｓｇ１ｖｐｒｇｓｈＭＧＤＫＩＩＨＬＴＤＤＳＦＤＴＤＶＬＫＡＤＧＡＩＬＶＤＦＷＡＥＷＣＧＰＭＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＧＧＰＣＫＭＩＡＰＩＬＤＥＩＡＤＥＹＱＧＫＬＴＶＡＫＬＮＩＤＱＮＰＧＴＡＰＫＹＧＩＲＧＩＰＴＬＬＬＦＫＮＧＥＶＡＡＴＫＶＧＡＬＳＫＧＱＬＫＥＦＬＤＡＮＬＲｄｐｎｓｓｓｖｄｋｌａａａｌｅｈｈｈｈｈｈである。
【００７８】
ＴｒｘＡβ１〜１５構築体の主な特徴は、Ａβ１〜１５ペプチドのＮ末端にあるＭｅｔ残基（Ｍ）の存在と、Ａβ１〜１５ペプチドのＣ末端にあるＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏリンカーと、ＮおよびＣ末端にＨｉｓ6タグが挿入されたバージョンの細菌チオレドキシンをコードする配列とに関わる。
【００７９】
ｐＴ７Ｋａｎ−Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）4およびｐＴ７Ｋａｎ−Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）8。Ａβ１〜１５ペプチドのより多くの複製を有する構築体を、同様に、しかし１／１００のベクター／インサートのモル比で取得した。組換えクローンは、制限消化／ゲル電気泳動法によりスクリーニングし、Ａβ１〜１５配列の複製を４つまたは８つ有する２つのクローンを使用して、対応する組換えタンパク質Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）4およびＴｒｘ（Ａβ１〜１５）8を発現および精製した。
【００８０】
２つのＨｉｓ6タグの存在は、精製段階を支援し、リジン残基のタンデム反復の場合のように免疫原性を増加させ得る。
【００８１】
【表２】
2009531294.tif 000003
【００８２】
ＴｒｘＡβポリペプチドの発現および精製。上記の各構築体で形質転換し、３７℃で２時間継続させておいた大腸菌ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）細胞（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社)に、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより、発現を誘導した。ＴｒｘＡβ４２には、さもなければ完全に不溶性であったため、異なる大腸菌株（Ｏｒｉｇａｍｉ−ＤＥ３；ノバジェン社）および変更された発現条件（ｐＴ７−Ａｍｐ−Ｔｒｘベクター；３０℃で５時間）を使用した。細胞溶解後に、Ｈｉｓ６タグを挿入したＴｒｘＡβポリペプチドは、金属アフィニティ樹脂（タロン（Ｔａｌｏｎ）；クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社）に結合させ、製造会社の使用説明に従って精製し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して何度も透析を行った。タンパク質の濃度は、クーマシー染色法（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社）およびＵＶ吸光度により決定した。個々のポリペプチドの構成と純度は、１１％のポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上でのゲル電気泳動およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マスリンクス（ＭａｓｓＬｙｎｘ）４．０、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）社）の両方で評価した。
【００８３】
免疫化の手順。組換えＴｒｘＡβポリペプチド（ＰＢＳ中に２ｍｇ／ｍｌ）は、ろ過滅菌し、等量の各々（１０ｎｍｏｌ）を、使用直前に１ｍｇのミョウバン（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）社）と混合し、４００μｌの最終容積とした。Ａβ４２（シグマ−アルドリッチ社）は、ＰＢＳに溶解させて（２ｍｇ／ｍｌ）、免疫化の前に３７℃で一晩かけて凝集させた。無作為に組み合せた１カ月齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールズリバーラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社；各１０匹）の５群に、図１ｃに指定してあるように、１日目、１５日目、３０日目、および６０日目に、上記の抗原を皮下注射した。両方ともミョウバンを加えずに、ＰＢＳを注射および凝集させたＡβ４２を注射した２つの陰性対照群に同じ処置を施した。最終追加免疫の２週間後に血清を回収し、無作為に対で貯留した。
【００８４】
抗Ａβ４２抗体の検出。抗Ａβ４２抗体の全量は、１／２００に一定して希釈し、凝集させたＡβ４２（０．５μｇ／ウェル）を標的抗原２３として使用し、ＥＬＩＳＡで検出した。インキュベーション、洗浄、ならびに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合型抗マウス免疫グロブリン（１／５０００；シグマ−アルドリッチ社）および発色基質であるｏ−フェニレンジアミン（シグマ−アルドリッチ社）の添加に引き続き、プレートを４５０ｎｍで分光光度的に測定した。免疫グロブリンのイソタイプ決定は、１／２００に一定して希釈し、抗マウスＩｇサブクラス特異的ＨＲＰ抱合型ラット二次抗体（テクニファーム（ＴｅｃｈｎｉＰｈａｒｍ）社）を使用して実施した。５つの対になった各群由来の血清について、ＥＬＩＳＡを３重反復で実施した；第１、３、４、６、および７群中の最上位応答動物３匹に由来する血清サブセット（図１ｃ）のみをイソタイプ決定用に使用した。群間の比較は、アナライズ−イット（Ａｎａｌｙｚｅ−ｉｔ）ソフトウェアを使用して、一元配置ＡＮＯＶＡにより実施した。
【００８５】
免疫組織化学的検査。重篤なアルツハイマー病に典型的な神経病理学的および臨床的症状を呈する６８歳の患者由来のヒト脳切片中のＡβ斑への結合能力について、３つのＴｒｘＡβ１〜１５ポリペプチドの各々で免疫したマウス由来の血清をスクリーニングした。第５、６、および７群中の最上位応答動物３匹に由来する貯留血清を、種々に希釈（１／１００〜１／１０００）して分析したが、最良の結果は、１／５００希釈で得られた。血清は、ギ酸で前処理（８０％、１５分間）されたホルマリン固定の側頭皮質組織の、８μｍの連続脳切片に添加した。擬似処置（ＰＢＳ）された動物由来の血清および市販の抗Ａβ４０ポリクローナル抗体の準備（抗汎βアミロイド、バイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）社）は、それぞれ陰性対照および陽性対照として使用した。免疫標識は、製造会社の使用説明に従って、３−３’−ジアミノベンジジンを発色基質として使用し、エンビジョンプラス（ＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ）／西洋ワサビペルオキシダーゼ系（ダコ（Ｄａｋｏ）社）で、明らかにした。
【００８６】
画像は、デジタルカメラを使って、５０から４００Ｘまでの範囲の倍率で取り込んだ。
【００８７】
ドットブロットアッセイおよびＡＦＭ画像処理。ドットブロット分析用のＡβ４２種は、本技術分野において既に公知である手順（例えば、J．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７８巻、１１６１２〜１１６２２頁中のＳｔｉｎｅ，Ｗ．Ｂ．らを参照）に従って調製した。簡潔に言えば、２ＭのＤＭＳＯに溶解させたＡβ４２（終濃度は１ｍＭ）を、単量体形態の供給源として使用した；冷却したハムＦ１２Ｋ培地（フェノールレッド無添加；バイオソース社）中に、ＤＭＳＯストック溶液を１００μＭの終濃度になるように希釈し、その後、２４時間４℃でインキュベーションして、可溶性オリゴマーを調製した；同じストック溶液を１００μＭの終濃度になるように１０ｍＭのＨＣｌ中に希釈し、２４時間３７℃でインキュベーションして、Ａβ４２原繊維を産生した。可溶性オリゴマー溶液からの原繊維の非存在と同様に、種々のＡβ種の同定も、ＡＦＭによって検証した。そのために、上記のＡβ４２溶液を、２０μｌの沈着緩衝液（４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中に、終濃度１０μＭになるように１０倍希釈し、劈開したばかりのルビーマイカ上に、室温で直ちに沈着させた。５分後に、円盤状のマイカをミリＱ級の水ですすぎ、流動する窒素下でゆっくりと乾燥させた。画像は、タッピングモードで作働させたナノスコープ（Ｎａｎｏｓｃｏｐｅ）III顕微鏡（デジタルインスツルメンツ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）社）で、市販のダイビングボード型シリコンカンチレバー（マイクロマッシュ（ＭｉｋｒｏＭａｓｃｈ））社）を使用して収集した。０．１ｐｍｏｌまたは１ｐｍｏｌのＡβ４２ペプチドのいずれか一方に対応した、各Ａβ種の一定量を、真空作働式ドットブロット装置（９６ウェル；バイオラッド社）を使用して、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．８％ＮａＣｌ（ＴＢＳ）で事前に湿潤させたニトロセルロース膜（ＧＥヘルスケアライフサイエンス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）社）上にスポッティングした。ドットブロットは、それぞれ８枚の膜単位で調製し、乾燥させて４℃で保管し、２週間以内に使用した。ドットブロット分析用の抗血清は、製造会社の使用説明に従って、プロテイン−Ａミニカラム（ディアセバ（Ｄｉａｔｈｅｖａ）社）上でアフィニティ精製した。全免疫グロブリンの濃度をクーマシー染色法で決定した後、精製した免疫グロブリンは、０．７５μｇ／ｍｌの終濃度でドットブロットアッセイ用に使用した。ブロットは、０．０５％のトウィーン２０で補完したＴＢＳ（ＴＢＳＴ）中の５％脱脂粉乳を使って室温でブロッキングした後、３つのＴｒｘＡβ１〜１５一次抗体の各々と共に、粉乳−ＴＢＳＴ中で１．５時間インキュベーションし、ＴＢＳＴで３×１０分間洗浄し、その後、スーパーシグナルウエストフェムト（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  ｋｉｔ）キット（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）社）を使って、製造会社の指定通りに、マウス免疫グロブリンを検出した。各群の最上位応答貯留からの抗血清で、独立した技術的再現を３回行った。
【００８８】
実施例２
抗Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）4抗体の、Ｔｇ２５７６トランスジェニック成体マウスの脳β−アミロイド病理に対する生体内効果の評価
方法
スウェーデン変異のヒトＡＰＰ（１）を発現する雌トランスジェニックＡＤ（Ｔｇ２５７６）マウスは、ボストン大学アルツハイマー病センター（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）のマウス群体から取得した。この群体の創始は、Ｋａｒｅｎ  Ｈｓｉａｏ−Ａｓｈｅ博士（神経学学科、ミネソタ大学医学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ））によりもたらされた。ＡＰＰ  Ｔｇ２５７６マウスは、行動的異常性を呈し、早くは８カ月から、随伴する星状細胞増加と共に、脳Ａβ沈着の組織学的な証拠を斑として示す。尾部ＤＮＡの標準化ＰＣＲアッセイを行ってマウスの遺伝子型を同定し、各ゲージに４匹ずつ収容し標準的条件下で餌および水を自由に摂取させた。１２時間の明暗スケジュールに置いた１４カ月齢のＡＰＰマウス６匹（各３２〜３４ｇ）を手術に使用した。ケタミンＨＣｌ／キシラジンの腹腔内注射（１００ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび１０ｍｇ／ｋｇのキシラジン；１００μｌ／体重１０ｇ）でマウスに麻酔をかけ、マウス頭部アダプタを使って定位固定装置（コフ（Ｋｏｐｈ）社）に位置決めした。手術中、体温調節は加温パッドを使用して３７℃に維持し、呼吸を監視した。頭皮を正中線で切開して矢状縫合を露出させ、両脳半球の定位座標を決定した（２）。ブレグマを基準点（２．０ｍｍ）として使用し、左および右の横座標の接合点（１．７５ｍｍ）で頭蓋冠にドリルで孔を開けた。アフィニティ精製した抗Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）4抗体は、ＰＢＳ処置したマウス由来の擬似免疫グロブリンと共に（各２μｌ）、鈍針の１０μｌ注射器（ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）社）を使用して、定位的に左および右海馬（腹側２．０ｍｍ）に注射した。注射器をあてがった際に２分間の滞留時間があり、その後に４分間の注入時間があり、注射器を引き抜く前にさらに２分間の滞留時間があった。９ｍｍのオートクリップを使用して切開部を閉じる際に、局所的防腐薬を投与した。マウスは、完全に回復するまで加温パッド上で飼育した。全ての動物実験は、国立衛生研究所動物実験に関する指針（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）と、復員軍人援護局（Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）およびボストン大学（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の両動物実験委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）とに従って実施した。注射７日後、マウスを深い麻酔にかけ、２％のパラホルムアルデヒド緩衝液（１００ｍｌ）を経心的にかん流させた。脳を２時間、後固定し、一連のグリセリン勾配で凍結保護した後、凍結薄切した（５０μｍ）。連続して切断したマウス組織切片をニッスル物質用に染色し、抗Ａβ４２（カタログ番号、３４４；バイオソースインターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社）、抗Ａβオリゴマー（Ａ１１；バイオソースインターナショナル社）、およびグリア繊維性抗原タンパク質（ＧＦＡＰ；ダコ社）抗体で免疫染色し、成熟したＡβ斑を同定するためのキャンベル−スウィッツアー法（Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｓｗｉｔｚｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用して銀染色した。両耳間：１．６８ｍｍ／ブレグマ：−２．１２ｍｍから始まり、両耳間：２．１６ｍｍ／ブレグマ：−１．６４ｍｍまでの、Ａβ４２で免疫染色された海馬内冠状組織の連続切断切片を、定量的に分析した。バイオビジョン（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）（３）およびニューロルシダ（Ｎｅｕｒｏｌｕｃｉｄａ）ソフトウェアプログラム（マイクロブライトフィールド（ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔＦｉｅｌｄ）社、Ｗｉｌｌｉｓｔｏｎ、ＶＴ）を使用して、抗Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）4処置された脳半球内およびＰＢＳ処置された反対側の脳半球内の同一脳区域の高解像度画像から、Ａβ４２陽性斑を定量化した。バイオビジョンは、神経網の基礎環境から斑を区別してカウントし、ニューロルシダは、バイオビジョン画像からデータを抽出し、統計分析用にエクセル（マイクロソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）社、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）にエクスポートする。
【００８９】
結果
次に、抗Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）4の免疫療法の可能性は、この抗体を、１４カ月齢のＡＰＰトランスジェニックＡＤ（Ｔｇ２５７６）マウスの海馬に、定位的に注射することにより評価した。反対側の海馬に注射され、ＰＢＳのみで処置したマウス由来の擬似免疫グロブリンは、この実験の内部対照の役割を果たした。注射７日後、病理組織学的検査によって、擬似注射した脳半球とは対照的に、抗Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）4抗体を与えたマウスの海馬および騎乗新皮質内で、Ａβ免疫染色の顕著な減少が明らかになった。Ａβ陽性斑は、注射部位に存在しなかっただけでなく、注射境界域内（注射部位の２ｍｍ前側／後側）でも著しく縮小した。
【００９０】
これは、抗Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）4抗体が、生体内で、原繊維および低オリゴマーだけでなく高次オリゴマーも標的にすることを示唆する。これらの知見が、抗Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）4および抗Ａβ一次抗体間の競合の結果でないことを検証するために、本発明者らは、グリア繊維性抗原タンパク質（ＧＦＡＰ）免疫染色法およびキャンベル−スウィッツアー銀染色法を使用して、代替的な病理組織学的分析を実施し、星状細胞増加およびＡＤ斑を検出した。星状細胞増加およびグリアに随伴する斑は、擬似注射した反対側の脳半球と比較して、抗Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）4抗体の注射境界域内で顕著に減少した。加えて、キャンベル−スウィッツアー銀染色法によって明らかにされたように、抗Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）4を注射した脳半球内の斑は、擬似注射した脳半球内と比較して極めて少なかった。両所見は、抗Ａβ抗体検出で取得した免疫染色データと一致している。定量的な観点からは、ＰＢＳ処置した脳半球と比較して、抗Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）4処置した脳半球内のＡβ４２陽性斑の数は著しく減少した（ＰＢＳ処置した脳半球：３．３４×１０3±０．５８；抗Ｔｒｘ（Ａβ１〜１５）4処置した脳半球：０．９７×１０3±０．２７、Ｐ＜０．０１）。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１ａ】本発明に従ったＴｒｘ（Ａβ１〜１５−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｎ構築体を表す。
【図１ｂ】Ｔｒｘ提示のＡβ１〜１５の複製を１つ、４つ、または８つ有する構築体の、金属アフィニティクロマトグラフィーによる均質化精製を表す。
【図１ｃ】本発明の実施形態に従った免疫原によって誘発された抗Ａβ抗体量を表す。
【図１ｄ】本発明の実施形態に従った免疫原のＴｈ２極性応答を表す。
【図２】本発明の実施形態に従った免疫原で免疫されたマウス由来の血清で処理されたヒトの脳切片を表す。
【図３】本発明の実施形態に従った免疫原の優先的結合を表すＡＦＭ画像を表す。
【図１ａ】
2009531294.tif 000004
【図１ｂ】
2009531294.tif 000005
【図１ｃ】
2009531294.tif 000006
【図１ｄ】
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【図２】
2009531294.tif 000008
【図３】
2009531294.tif 000009
【配列表】
2009531294000001.app
【国際調査報告】
2009531294.tif 000010
2009531294.tif 000011
2009531294.tif 000012