(57)【要約】本教示は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を検出するための方法、組成物、およびキットを提供する。いくつかの実施形態において、上記ｍｉＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡが分解されているホルマリン固定したパラフィン包埋組織から定量される。本教示は、ほとんどのｍｉＲＮＡがインビボでそれらとＲＩＳＣとの結合の結果として分解から保護されるという観察を、利用する。したがって、分解されたメッセンジャーＲＮＡを含む保管された組織中の核酸を研究する新規方法が提供され、ここでＲＩＳＣで保護されたｍｉＲＮＡは、遊離され、そして分析される。
2009501531.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の分解されていない成熟ｍｉＲＮＡを検出する方法であって、ここで該サンプルは、実質的に分解されたメッセンジャーＲＮＡを含み、該方法は、
純粋な成熟ｍｉＲＮＡのコレクションを形成するために、該成熟ｍｉＲＮＡを遊離させる工程であるが；但し、該遊離させる工程は、洗浄剤によって処理する工程、およびカオトロピック塩によって処理する工程を包含しない、工程；
該分解されていない純粋な成熟ｍｉＲＮＡと少なくとも１つのｍｉＲＮＡ特異的逆方向プライマーとを含む反応混合物を形成する工程；
該ｍｉＲＮＡ特異的逆方向プライマーを伸長して、ｍｉＲＮＡ伸長産物を形成する工程；
該ｍｉＲＮＡ伸長産物を増幅する工程；ならびに、
該サンプル中の該分解されていない成熟ｍｉＲＮＡを検出する工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記サンプルは、ホルマリン固定したパラフィン包埋組織切片である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出する工程は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記遊離させる工程は、加熱する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記加熱する工程が、少なくとも７０℃にて５分間にわたる加熱を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記加熱する工程が、９５℃にて５分間にわたる加熱を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
サンプル中の分解されていない成熟ｍｉＲＮＡを検出する方法であって、ここで該サンプルは、実質的に分解されたメッセンジャーＲＮＡを含み、該方法は、
該サンプルを溶解する工程；
該サンプルをヌクレアーゼによって処理する工程；
該ヌクレアーゼを不活性化する工程；
該分解されていない成熟ｍｉＲＮＡをＲＩＳＣ複合体から遊離させる工程；
該分解されていない純粋な成熟ｍｉＲＮＡと少なくとも１つのｍｉＲＮＡ特異的逆方向プライマーとを含む反応混合物を形成する工程；
該ｍｉＲＮＡ特異的逆方向プライマーを伸長して、ｍｉＲＮＡ伸長産物を形成する工程；
該ｍｉＲＮＡ伸長産物を増幅する工程；および、
該サンプル中の該分解されていない成熟ｍｉＲＮＡを検出する工程；
を包含する、方法。
【請求項８】
前記遊離させる工程は、洗浄剤によって処理する工程を包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記遊離させる工程は、加熱する工程を包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記加熱する工程が、少なくとも７０℃にて５分間にわたる加熱を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記加熱する工程が、９５℃にて５分間にわたる加熱を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
サンプル中の分解されていない成熟ｍｉＲＮＡを検出する方法であって、ここで該サンプルは、実質的に分解されたメッセンジャーＲＮＡを含み、該方法は、
純粋な成熟ｍｉＲＮＡのコレクションを形成するために、該成熟ｍｉＲＮＡを遊離させる工程；
該分解されていない純粋な成熟ｍｉＲＮＡと少なくとも１つのｍｉＲＮＡ特異的逆方向プライマーとを含む反応混合物を形成する工程；
該ｍｉＲＮＡ特異的逆方向プライマーを伸長して、ｍｉＲＮＡ伸長産物を形成する工程；
該ｍｉＲＮＡ伸長産物をＰＣＲにおいて増幅する工程；および、
該サンプル中の該成熟ｍｉＲＮＡを検出する工程であって、ここで該サンプルは、ホルマリン固定したパラフィン包埋組織切片である、工程；
を包含する、方法。
【請求項１３】
前記検出する工程は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記遊離させる工程は、加熱する工程を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記加熱する工程が、少なくとも７０℃にて５分間にわたる加熱を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記加熱する工程が、９５℃にて５分間にわたる加熱を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
サンプル中の分解されていない成熟ｍｉＲＮＡを検出するためのキットであって、ここで該サンプルは、実質的に分解されたメッセンジャーＲＮＡを含み、該キットは、
（ａ）実質的に分解されたメッセンジャーＲＮＡを含む組織切片から核酸を抽出するための試薬；および、
（ｂ）ＲＮＡｓｅ；
を備える、キット。
【請求項１８】
前記実質的に分解されたメッセンジャーＲＮＡを含む組織切片から核酸を抽出するための試薬は、キシレンおよびエタノールを含み、そして該組織切片は、パラフィン包埋されている、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記ＲＮＡｓｅは、ＲＮＡｓｅ  Ｉである、請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
ＤＮＡｓｅをさらに備える、請求項１７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（分野）
本教示は、特に、分解されたメッセンジャーＲＮＡを含む組織中のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を測定する方法、およびそれをプロファイリングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（導入）
発現した核酸の分析は、少量でありかつ限られたサンプルにおいて困難であり得る。複合的な核酸を分析するアプローチは、生物医学的研究の業界において重要性を増している。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、癌を含むヒトの疾患において重要な役割を果たす核酸のクラスであると、ますます認識される（非特許文献１）。
【０００３】
処置に対する応答および臨床的結果が既に公知であるホルマリン固定したパラフィン包埋腫瘍組織の膨大な供給が、存在する。これらの保管された組織は、インサイチュ技術に使用されて遺伝子発現の局在を示し得る（例えば、非特許文献２、および非特許文献３を参照のこと）が、ＲＮＡは、しばしば古典的な定量分析法（例えば、ノーザンブロット）のためには分解されすぎている。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、培養細胞および新鮮組織または凍結組織中の遺伝子の発現を検出するために広範に使用されており、ここで最近の技術的進歩は、迅速かつ正確な定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を可能にする（非特許文献４、および非特許文献５）。さらに、ＲＴ−ＰＣＲのｍＲＮＡの非常に小さいフラグメントをアッセイする能力は、この技術を、保管された組織由来のＲＮＡの場合におけるようにＲＮＡが中程度に分解されているかまたは高度に分解されてさえいる研究に適合させる（例えば、非特許文献６、および非特許文献７を参照のこと）。サンプル調製のかなりの進歩（非特許文献８、ならびに非特許文献９を参照のこと）にもかかわらず、保管された組織中の核酸のプロファイリングは、問題を有するままである。
【０００４】
核酸の非常に小さいフラグメント（例えば、ｍｉＲＮＡ）の検出は、例えば、プライマーダイマーアーチファクトを産生する短い標的上でのプライマーの重複に起因して、従来のＰＣＲに関して困難であり得る。最近、このような短い核酸の定量を可能にする、定量的リアルタイムＰＣＲの感度、特異性、およびダイナミックレンジを利用する技術が、発明されている（例えば、Ｂｒａｎｄｉｓらに対する米国本出願第１０／８８１，３６２号、Ｌａｏらに対する米国本出願第１０／９４４，１５３号、Ｃｈｅｎらに対する米国本出願第１０／９４７，４６０号、およびＣｈｅｎらに対する米国本出願第１１／１４２，７２０号を参照のこと）。
【非特許文献１】Ｌｕら、Ｎａｔｕｒｅ、２００５年、第４３５巻、ｐ．８３４−８３８
【非特許文献２】Ｓｔｅｅｌｅら、Ｃｅｌｌ  Ｖｉｓ、１９９８年、第５巻、ｐ．１３−１９
【非特許文献３】Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９３年、第４３巻、ｐ．３０９−３１９
【非特許文献４】Ｌｉｅら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９８年、第９巻、ｐ．４３−４８
【非特許文献５】Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ、１９９６年、第６巻、ｐ．９８６−９９４
【非特許文献６】Ｉｎｏｕｅら、Ｐａｔｈｏｌ  Ｉｎｔ、１９９６年、第４６巻、ｐ．９９７−１００４
【非特許文献７】Ｔｙｒｒｅｌｌら、Ａｍ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｐａｔｈｏｌ、１９９５年、第１７巻、ｐ．４７６−４８３
【非特許文献８】Ｇｏｄｆｒｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、２０００年、第２巻、第２号、ｐ．８４−９１
【非特許文献９】ＬｅｗｉｓおよびＭａｕｇｈａｎ、Ｂｕｓｔｉｎ、Ａ−Ｚ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ、２００４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
いくつかの実施形態において、本教示は、サンプル中の分解されていない成熟ｍｉＲＮＡを検出する方法を提供し、ここでそのサンプルは、実質的に分解されたメッセンジャーＲＮＡを含み、この方法は；純粋な成熟ｍｉＲＮＡのコレクションを形成するために、上記成熟ｍｉＲＮＡを遊離させる工程であるが、但し、上記遊離させる工程は、洗浄剤によって処理する工程、およびカオトロピック塩によって処理する工程を包含しない、工程；上記分解されていない純粋な成熟ｍｉＲＮＡと少なくとも１つのｍｉＲＮＡ特異的逆方向プライマーとを含む反応混合物を形成する工程；上記ｍｉＲＮＡ特異的逆方向プライマーを伸長して、ｍｉＲＮＡ伸長産物を形成する工程；上記ｍｉＲＮＡ伸長産物を増幅する工程；ならびに、上記サンプル中の上記分解されていない成熟ｍｉＲＮＡを検出する工程；を包含する。いくつかの実施形態において、さらなる方法およびキットもまた、提供される。例えば、いくつかの実施形態において、本教示は、サンプル中の分解されていない成熟ｍｉＲＮＡを検出するためのキットを提供し、ここでそのサンプルは、実質的に分解されたメッセンジャーＲＮＡを含み、このキットは、（ａ）実質的に分解されたメッセンジャーＲＮＡを含む組織切片から核酸を抽出するための試薬；および、（ｂ）ＲＮＡｓｅ；を備える。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
（例示的な実施形態の説明）
上記の一般的説明および以下の詳細な説明の両方は例示かつ説明であり、そして本教示の範囲を限定することを意図しないことものであることが、理解されるべきである。本願において、単数形の使用は、別途具体的に言及されない限り、複数を包含する。例えば、「順方向プライマー」は、１つより多い順方向プライマーが存在し得ることを意味する；例えば、特定の順方向プライマー種の１つ以上のコピー、および１つ以上の異なる順方向プライマー種。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、またはそれらの基語の修飾（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）」、および「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」であるが、これらに限定されない）の使用は、限定することを意図しない。用語「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」は、前と後の用語が一緒かまたは独立して用いられ得ることを意味する。例示目的であるが、限定としてではなく、「Ｘおよび／またはＹ」は、「Ｘ」または「Ｙ」あるいは「ＸおよびＹ」を意味し得る。
【０００７】
本明細書中で使用される節の見出しは構成上の目的のためだけであり、記載された主題を限定するとして決して解釈されるべきではない。特許、特許出願、論文、書籍、学術論文およびインターネットウェブページを含む本願において引用される全ての文献および類似する資料は、明示的に、あらゆる目的のためにその全体が参考として援用される。援用された文献および類似する資料の１つ以上が、本願における用語の定義と矛盾するような様式で用語を定義または使用する事象において、本願が支配する。本教示が種々の実施形態と組み合せて記載される一方で、本教示がこのような実施形態に限定されることを意図しない。一方で、本教示は、当業者に認識されるような種々の変更、改変、および等価物を包含する。
【０００８】
（いくつかの定義）
本明細書中で使用される場合、用語「実質的に分解されたｍＲＮＡ」とは、著しい割合のｍＲＮＡが分解されている状態をいい。ｍＲＮＡの分解の測定は、分子生物学の分野の当業者に周知であり、そしてその測定としては、アガロースゲルに由来する膜上で２８Ｓ  ｒＲＮＡ対１８Ｓ  ｒＲＮＡの比を測定すること、市販のＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザー、および例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第３版において考察されるような他のアプローチが挙げられる。いくつかの実施形態において、実質的に分解されたｍＲＮＡは、対応する分解されていないサンプルと比較して、９０％より多い分解を含み得る。いくつかの実施形態において、実質的に分解されたｍＲＮＡは、対応する分解されていないサンプルと比較して、８０〜９０％の間の分解を含み得る。いくつかの実施形態において、実質的に分解されたｍＲＮＡは、対応する分解されていないサンプルと比較して、７０〜８０％の間の分解を含み得る。いくつかの実施形態において、実質的に分解されたｍＲＮＡは、対応する分解されていないサンプルと比較して、６０〜７０％の間の分解を含み得る。いくつかの実施形態において、実質的に分解されたｍＲＮＡは、対応する分解されていないサンプルと比較して、５０〜６０％の間の分解を含み得る。いくつかの実施形態において、実質的に分解されたｍＲＮＡは、対応する分解されていないサンプルと比較して、１０〜５０％の間の分解を含み得る。
【０００９】
本明細書中で使用される場合、用語「ＲＩＳＣで保護された成熟ｍｉＲＮＡ」とは、ＲＩＳＣ分子と複合体形成し、したがって分解に対して抵抗性であるｍｉＲＮＡ種のコレクションをいう。これらのＲＩＳＣで保護された成熟ｍｉＲＮＡは、既にプロセシングを受けており、そしてプリｍｉＲＮＡでもプロｍｉＲＮＡでもない。任意の特定の理論に制限されることなく、ＲＩＳＣで保護された成熟ｍｉＲＮＡは、ＲＩＳＣに直接結合され得るか、媒介物（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｒｙ）を介してＲＩＳＣに結合され得るか、またはその両方であり得る。
【００１０】
本明細書で使用される場合、用語「成熟ｍｉＲＮＡを遊離させること」とは、成熟ｍｉＲＮＡがＲＩＳＣ複合体から放出され、それによって複数の遊離の一本鎖成熟ｍｉＲＮＡを形成するプロセスをいう。遊離させるプロセスは、タンパク質から核酸を放出させることが公知である任意の種々の方法を含み得る。例えば、遊離させることは、熱を適用すること（例えば、９５℃で５分間）を含み得る。いくつかの実施形態において、遊離させることは、熱を適用すること（例えば、８０℃以上で５分間）を含み得る。当然に、慣用的な実験は、成熟ｍｉＲＮＡの熱に基づく遊離に適した他の時間および温度をもたらし得る。遊離させることは、洗浄剤（例えば、１０％  ＳＤＳ）による処理を含み得る。遊離させることはまた、例えば、グアニジニウムベースの化合物などのカオトロピック塩による処理を含み得る。
【００１１】
本明細書中で使用される場合、用語「さらなる核酸」とは、成熟ｍｉＲＮＡではない核酸のコレクションをいう。プリｍｉＲＮＡおよびプレｍｉＲＮＡ、ならびに他の非コーディングＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、およびゲノムＤＮＡなどの分子が、用語「さらなる核酸」に含まれる。
【００１２】
本明細書中で使用される場合、用語「純粋な成熟ｍｉＲＮＡ」とは、さらなる核酸を含まず、もはやＲＩＳＣと結合しておらず、そして１８〜２３ヌクレオチド長である成熟ｍｉＲＮＡのコレクションをいう。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、用語「実験的に添加された活性ヌクレアーゼ」とは、サンプル中に内因性に存在しないが、むしろ実験者によって添加される、例えば、ＲＮＡｓｅおよび／またはＤＮＡｓｅなどのヌクレアーゼをいう。そのヌクレアーゼは、それが、例えば、さらなる核酸を分解し得るので、活性である。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、用語「不活化される実験的に添加されたヌクレアーゼ」とは、サンプル中に内因性に存在しないが、むしろ実験者によって添加される、例えば、ＲＮＡｓｅおよび／またはＤＮＡｓｅなどのヌクレアーゼをいう。そのヌクレアーゼは、それが、例えば、さらなる核酸を分解し得るので、本来活性である。そのヌクレアーゼは、後に、例えば、熱および／またはプロテアーゼによる処理によって不活化される、したがって、不活化される実験的に添加されたヌクレアーゼを、生じる。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、用語「成熟ｍｉＲＮＡを遊離させることなく細胞を溶解しそしてさらなる核酸を遊離させるために十分な時間および十分な温度で加熱すること」とは、所与のサンプルに対する時間条件および温度条件の実験的に決定された設定をいい、それは、分子生物学の分野の当業者によって容易に得られる。このような条件は、例えば、遊離されることが望まれる標的核酸（メッセンジャーＲＮＡ）に対してＰＣＲを行うこと、および溶解物における標的核酸の存在および溶解前のサンプルにおける標的核酸の非存在を確認することによって測定され得る。対応して、溶解物における遊離の成熟ｍｉＲＮＡの非存在、および溶解されていないサンプルにおける遊離の成熟ｍｉＲＮＡの非存在は、増幅に基づく評価を使用して決定され得る。いくつかの実施形態において、成熟ｍｉＲＮＡを遊離させることなく細胞を溶解しそしてさらなる核酸を遊離させるために十分な時間および十分な温度で加熱することは、溶解されていないサンプルと比較してさらなる核酸の少なくとも５０％が遊離しており、かつ溶解されていないサンプルと比較して成熟ｍｉＲＮＡの２５％未満が遊離していることを、意味する。いくつかの実施形態において、成熟ｍｉＲＮＡを遊離させることなく細胞を溶解しそしてさらなる核酸を遊離させるために十分な時間および十分な温度で加熱することは、溶解されていないサンプルと比較してさらなる核酸の少なくとも７５％が遊離しており、かつ溶解されていないサンプルと比較して成熟ｍｉＲＮＡの１０％未満が遊離していることを、意味する。いくつかの実施形態において、成熟ｍｉＲＮＡを遊離させることなく細胞を溶解しそしてさらなる核酸を遊離させるために十分な時間および十分な温度で加熱することは、溶解されていないサンプルと比較してさらなる核酸の少なくとも９０％が遊離しており、かつ溶解されていないサンプルと比較して成熟ｍｉＲＮＡの５％未満が遊離していることを、意味する。いくつかの実施形態において、成熟ｍｉＲＮＡを遊離させることなく細胞を溶解しそしてさらなる核酸を遊離させるために十分な時間および十分な温度で加熱することは、溶解されていないサンプルと比較してさらなる核酸の少なくとも９９％が遊離しており、かつ溶解されていないサンプルと比較して成熟ｍｉＲＮＡの１％未満が遊離していることを、意味する。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、用語「検出プローブ」とは、増幅反応（代表的に、定量的ＰＣＲ分析またはリアルタイムＰＣＲ分析、およびエンドポイント分析のため）において使用される分子をいう。このような検出プローブは、標的ｍｉＲＮＡおよび／またはコントロール核酸（例えば、内因性のコントロールである小さい核酸および／または合成の内部コントロール）の増幅をモニタリングするために使用され得る。いくつかの実施形態において、増幅反応に存在する検出プローブは、産生されたアンプリコンの量を時間の関数としてモニタリングするのに適している。このような検出プローブとしては、５’−エキソヌクレアーゼアッセイ（本明細書中に記載されるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（米国特許第５，５３８，８４８号もまた参照のこと））、種々のステム−ループ分子ビーコン（例えば、米国特許第６，１０３，４７６号および同第５，９２５，５１７号ならびにＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０３−３０８を参照のこと）、ステムレスビーコン（ｓｔｅｍｌｅｓｓ  ｂｅａｃｏｎ）または直線状ビーコン（例えば、ＷＯ  ９９／２１８８１を参照のこと）、ＰＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｅａｃｏｎｓＴＭ（例えば、米国特許第６，３５５，４２１号および同第６，５９３，０９１号を参照のこと）、直線状ＰＮＡビーコン（例えば、Ｋｕｂｉｓｔａら、２００１、ＳＰＩＥ  ４２６４：５３−５８を参照のこと）、非ＦＲＥＴプローブ（例えば、米国特許第６，１５０，０９７号を参照のこと）、Ｓｕｎｒｉｓｅ（登録商標）／Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（登録商標）プローブ（米国特許第６，５４８，２５０号）、ステム−ループかつ二重鎖のＳｃｏｒｐｉｏｎＴＭプローブ（Ｓｏｌｉｎａｓら、２００１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９：Ｅ９６および米国特許第６，５８９，７４３号）、バルジループ（ｂｕｌｇｅ  ｌｏｏｐ）プローブ（米国特許第６，５９０，０９１号）、シュードノットプローブ（米国特許第６，５８９，２５０号）、サイクリコン（ｃｙｃｌｉｃｏｎ）（米国特許第６，３８３，７５２号）、ＭＧＢ  ＥｃｌｉｐｓｅＴＭプローブ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヘアピンプローブ（米国特許第６，５９６，４９０号）、例えば、米国特許第６，４８５，９０１号；Ｍｈｌａｎｇａら、２００１、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：４６３−４７１；Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１７：８０４−８０７；Ｉｓａｃｓｓｏｎら、２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ．１４：３２１−３２８；Ｓｖａｎｖｉｋら、２０００、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８１：２６−３５；Ｗｏｌｆｆｓら、２００１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７６６：７６９−７７１；Ｔｓｏｕｒｋａｓら、２００２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３０：４２０８−４２１５；Ｒｉｃｃｅｌｌｉら、２００２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０：４０８８−４０９３；Ｚｈａｎｇら、２００２  Ｓｈａｎｇｈａｉ．３４：３２９−３３２；Ｍａｘｗｅｌｌら、２００２、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２���：９６０６−９６１２；Ｂｒｏｕｄｅら、２００２、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：２４９−５６；Ｈｕａｎｇら、２００２、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１５：１１８−１２６；およびＹｕら、２００１、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ  １４：１１１５５−１１１６１に記載されるペプチド核酸（ＰＮＡ）ライトアップ（ｌｉｇｈｔ−ｕｐ）プローブ、自己組織化ナノ粒子プローブ、およびフェロセン改変型プローブが挙げられるが、これらに限定されない。検出プローブはまた、クエンチャーを含み得、そのクエンチャーとしては、ブラックホールクエンチャー（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（ＩＤＴ）、ＱＳＹクエンチャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ならびにＤａｂｓｙｌスルホネート／カルボキシレートクエンチャーおよびＤａｂｃｅｌスルホネート／カルボキシレートクエンチャー（Ｅｐｏｃｈ）が挙げられるが、これらに限定されない。検出プローブはまた、２つのプローブを含み得、例えば、蛍光物質（ｆｌｕｏｒ）が、一方のプローブ上にあり、そしてクエンチャーが、他方のプローブ上にあり、ここで、標的に対してその２つのプローブが一緒にハイブリダイズすることが、シグナルの消光させるか、または標的に対するハイブリダイゼーションが、蛍光の変化によってシグナルの特徴を変化させる。一方の分子がＬ−ＤＮＡでありそして他方の分子がＰＮＡである２つのプローブを含む例示的な検出プローブは、Ｌａｏらに対する米国本出願第１１／１７２，２８０号に見出され得る。検出プローブはまた、カルボキシレート基の代わりにＳＯ３を有するフルオレセイン色素のスルホネート誘導体、フルオレセインのホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）形態、ＣＹ５のホスホラミダイト形態（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍから市販されているもの）を含み得る。いくつかの実施形態において、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、およびＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）などのインターカレーションする標識が、使用され、それによってリアルタイム、またはエンドポイントにおける、検出プローブの非存在下での増幅産物の可視化を可能にする。いくつかの実施形態において、リアルタイムの可視化は、インターカレーションする検出プローブおよび配列ベースの検出プローブの両方を使用し得ることを含み得る。いくつかの実施形態において、検出プローブは、増幅反応において相補配列にハイブリダイズしない場合に、少なくとも部分的に消光され、そして増幅反応において相補配列とハイブリダイズする場合に、少なくとも部分的に消光されない。いくつかの実施形態において、プローブは、所望の熱力学的特性をさらに提供するために副溝結合因子（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ）（例えば、米国特許第６，４８６，３０８号を参照のこと）のような種々の改変をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、検出プローブは、同定する部分、または同定する部分の相補体に対応し得、それは、ジップ−コード（ｚｉｐ−ｃｏｄｅ）とも称される。同定する部分は、とりわけ、米国特許第６，３０９，８２９��（その中で「タグセグメント」とも称される）；同第６，４５１，５２５号（その中で「タグセグメント」とも称される）；同第６，３０９，８２９号（その中で「タグセグメント」とも称される）；同第５，９８１，１７６号（その中で「グリッドオリゴヌクレオチド」とも称される）；同第５，９３５，７９３号（その中で「同定因子タグ」とも称される）；およびＰＣＴ公開第ＷＯ  ０１／９２５７９号（その中で「アドレス可能な支持体特異的配列（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ｓｕｐｐｏｒｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とも称される）において見出され得る。
【００１７】
本教示のプライマーおよびプローブは、従来のヌクレオチドおよび任意の種々のアナログを含み得る。例えば、本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド」とは、糖（例えば、リボース、アラビノース、キシロース、およびピラノース、ならびにそれらの糖アナログ）のＣ−１’炭素に連結されたヌクレオチド塩基を含む化合物をいう。用語「ヌクレオチド」はまた、ヌクレオチドアナログを包含する。上記糖は、置換されていても置換されていなくてもよい。置換されたリボース糖としては、炭素原子（例えば、２’炭素原子）の１つ以上が１つ以上の同じであるかまたは異なる、Ｃｌ基、Ｆ基、−Ｒ基、−ＯＲ基、−ＮＲ２基またはハロゲン基によって置換されているリボースが挙げられるが、これに限定されず、各Ｒは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ５−Ｃ１４アリールである。例示のリボースとしては、２’−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシリボース、２’−（Ｃ５−Ｃ１４）アリールオキシリボース、２’，３’−ジデヒドロリボース、２’−デオキシ−３’−ハロリボース、２’−デオキシ−３’−フルオロリボース、２’−デオキシ−３’−クロロリボース、２’−デオキシ−３’−アミノリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシリボースおよび２’−デオキシ−３’−（Ｃ５−Ｃ１４）アリールオキシリボース、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’−ハロリボース、２’−フルオロリボース、２’−クロロリボース、および２’−アルキルリボース（例えば、２’−Ｏ−メチル）、４’−α−アノマーヌクレオチド、１’−α−アノマーヌクレオチド、２’−４’−連結型および３’−４’−連結型の二環性糖改変ならびに他の「ロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）」二環性糖改変または「ＬＮＡ」二環性糖改変（例えば、ＰＣＴ出願公開ＷＯ  ９８／２２４８９、ＷＯ  ９８／３９３５２、およびＷＯ  ９９／１４２２６；ならびにＢｒａａｓｃｈおよびＣｏｒｅｙ、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：１−７、２００１を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド内の例示のＬＮＡ糖アナログとしては、以下の構造が挙げられるが、これらに限定されない：
【００１８】
【化１】
2009501531.tif 000003
Ｂは、任意のヌクレオチド塩基である。
【００１９】
リボースの２’位または３’位における改変としては、水素、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロおよびブロモが挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、天然のＤ光学異性体形態、およびＬ型光学異性体形態を含むが、これらに限定されない（Ｇａｒｂｅｓｉ（１９９３）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：４１５９−６５；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ（１９９０），Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：７４３５；Ｕｒａｔａ（１９９３），Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒ．Ｎｏ．２９：６９−７０）。ヌクレオチド塩基がプリン（例えば、ＡまたはＧ）であるとき、リボース糖はヌクレオチド塩基のＮ９位に結合する。ヌクレオチド塩基がピリミジン（例えば、Ｃ、ＴまたはＵ）であるとき、ペントース糖がウラシルヌクレオチド塩基のＣ５位に結合するプソイドウリジンを除いて、ペントース糖はヌクレオチド塩基のＮ１位に結合する（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，（１９９２）ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第２版，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）。
【００２０】
ヌクレオチドのペントース炭素の１個以上は、式：
【００２１】
【化２】
2009501531.tif 000004
を有するリン酸エステルによって置換され得る。
【００２２】
αは０〜４の整数である。特定の実施形態において、αは２であり、リン酸エステルがペントースの３’位または５’位の炭素に結合する。特定の実施形態において、ヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基が、プリン、７−デアザプリン、ピリミジン、またはそれらのアナログであるヌクレオチドである。「ヌクレオチド  ５’−三リン酸」とは、５’位に三リン酸エステル基を有するヌクレオチドをいい、そして時として、特にリボース糖の構造的特徴を指摘するために「ＮＴＰ」、または「ｄＮＴＰ」および「ｄｄＮＴＰ」と示される。三リン酸エステル基は、種々の酸素に対する硫黄置換を含み得る（例えば、α−チオ−ヌクレオチド  ５’−三リン酸）。ヌクレオチド化学の概説については、Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．およびＢｏｇｄａｎｏｖ，Ａ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、ＶＣＨ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４を参照のこと。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、他の用語は、文脈に基づく意味を有し、そして分子生物学の分野の当業者の理解に鑑みてさらに理解され得る。当該分野の状態を記載する例示的な教示は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第３版に見出され得る。
【００２４】
本発明者らは、生理学的条件下の細胞において、ほとんどのｍｉＲＮＡがＲＩＳＣ複合体と緊密に結合し、小さい比率、そしておそらく３％未満のみがＲＩＳＣの外部に存在することを示した。米国仮特許出願第６０／７８０，９２７号に基づく優先権を主張する、Ｌａｏらに対する同時出願の米国本出願「Ｐｕｒｅ  ｍｉＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ」を参照のこと。本発明者らの知見に関して、これは、内因性ｍｉＲＮＡが生理学的条件下においてインビボでＲＩＳＣと緊密に結合されることを初めて示した。これらの観察は、ｍｉＲＮＡが細胞中で非常に安定である理由を説明し得、そしてそれはまた、ｍｉＲＮＡが非常に長い半減期を示す理由を説明する。さらに、これらの観察は、本教示に基礎を提供する。種々の組織サンプルにおいて、メッセンジャーＲＮＡは、分解される。このようなサンプルを研究する要望が、存在する。本教示は、インビボでのＲＩＳＣとの結合の効力によるｍｉＲＮＡの安定性を利用することによって、メッセンジャーＲＮＡが分解されているサンプルを分析する方法を提供する。
【００２５】
（細胞中のほとんどの成熟ｍｉＲＮＡがＲＩＳＣで保護されることを示す実験の説明）
本発明者らは、細胞中の内因性ｍｉＲＮＡを検出するために、ステム−ループ逆転写リアルタイムＰＣＲアッセイ（米国特許出願第１０／９４７，４６０号およびＣｈｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００５年１１月２７日；３３（２０）：ｅ１７９を参照のこと）を使用した。要約すると、所与のｍｉＲＮＡと相補的な一本鎖標的特異的領域を含む逆方向プライマーが、使用される。その逆方向プライマーはまた、二本鎖のステム、および一本鎖のループを含む。このステム−ループプライマーは、逆転写反応において伸長される。その後、ＰＣＲが、行なわれる。そのＰＣＲにおける逆方向プライマーは、ステム−ループプライマーのループにコードされ、そしてそのＰＣＲにおける順方向プライマーは、標的特異的領域、および非相補的な尾部（ｔａｉｌ）を含む。そのＰＣＲにおける反応生成物の蓄積は、５’ヌクレアーゼ検出プローブを使用して測定される。
【００２６】
これらの研究は、このアッセイが成熟ｍｉＲＮＡに特異的であり、そしてそれが成熟ｍｉＲＮＡと、ｍｉＲＮＡが生じるゲノムＤＮＡと、一次ｍｉＲＮＡ（プリｍｉＲＮＡ）と、前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）との間を容易に識別し得ることを確認した。さらに、そのアッセイは、それが全ＲＮＡサンプルのｐｇ量のｍｉＲＮＡを検出し得るので、非常に感度が高い。したがって、このアプローチは、ｍｉＲＮＡの内因的レベルを直接的でありかつ改変を伴わずに検出する特有の機会を提供する。ｍｉＲＮＡの部分が生理学的条件下で細胞においてインビボでＲＩＳＣと結合されること見出すためにこのリアルタイムＰＣＲベースの方法を使用した結果として、本教示は、ｍｉＲＮＡを研究するための新規の方法、組成物およびキットを提供する。
【００２７】
最初に、本発明者らは、細胞から全てのｍｉＲＮＡを放出させる条件を確立した。一連の試験の後、本発明者らは、細胞の９５℃における５分間の処理がＥＳ細胞から全てではないがほとんどのｍｉＲＮＡを放出させ得ることを見出した。ＭｉｒＶａｎａは、ｍｉＲＮＡを含む小さいＲＮＡの細胞または組織からの単離に関して非常に効率的である周知の試薬である。９５℃における５分間の処理およびＭｉｒＶａｎａは、細胞からのｍｉＲＮＡの放出に関して同様の効率を示した。
【００２８】
第２に、本発明者らは、細胞からＲＮＡを完全に放出させ得るが、安定なタンパク質複合体を破壊しない、より穏和な条件を確立することを模索した。本発明者らの研究から、本発明者らは、細胞を３回の凍結−解凍周期に供することがＥＳ細胞を溶解した（ほとんどの細胞がこの処理の後に溶解されたことを示した顕微鏡実験によって確認した）ことを見出した。次いで、本発明者らは、ハウスキーピング遺伝子（細胞中で高度に発現されるＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡの放出について確認し、そしてほとんどのＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡが凍結−解凍後にＥＳ細胞から放出されたことを見出した。サンプルの９５℃における５分間のさらなる処理は、さらなるｍＲＮＡを全く放出させなかった。これが事実であったことを確認するために、本発明者らはまた、ＥＳ細胞からのほとんどの１８ｓ  ｒＲＮＡの放出を確認したこの処理後の１８ｓ  ｒＲＮＡの放出について確かめた。これらのデータは、３回の凍結−解凍周期が細胞に存在する遊離のＲＮＡのほとんどを放出させ得ることを示す。
【００２９】
次に、本発明者らは、ステム−ループＲＴ−ＰＣＲによって細胞中のＲＩＳＣ複合体と結合される内因性ｍｉＲＮＡのレベルを調べた。ｍｉＲ−１６およびｍｉｒ−２０は、ＥＳ細胞中の２つの高度に発現されるｍｉＲＮＡである。本発明者らが、９５℃における５分間の処理後に放出されたｍｉＲ−１６のレベルと３回の凍結−解凍周期後に検出されたレベルとを比較したとき、本発明者らは、第１の処理後に少なくとも３０倍よりも多いｍｉＲＮＡを見出した。したがって、ＥＳ細胞中の遊離のｍｉＲ−１６のレベルは、ＥＳ細胞に存在する全ｍｉＲ−１６の３％未満であると考えられる。換言すると、生理学的条件下で、ほとんどのｍｉＲ−１６は、ＲＩＳＣ複合体と安定して結合される。同様に、本発明者らは、別の細胞株（ＮＩＨ／３Ｔ３細胞）および初代マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）中のｍｉＲ−１６のレベルを確認した。本発明者らは、遊離のｍｉＲ−１６のレベルが最大でＮＩＨ／３Ｔ３細胞およびＭＥＦに存在する全てのｍｉＲ−１６のほんの１〜２％を占めたことを見出した。本発明者らの分析におけるあらゆる配列特異的なバイアスを排除するために、本発明者らはまた、ｍｉＲ−２０（別の高度に発現されたｍｉＲＮＡ）のレベルを調べ、そして再び、遊離のｍｉＲＮＡ対結合されたｍｉＲＮＡの同様の比を見出した。したがって、本発明者らは、生理学的条件下においてインビボで、ほとんどのｍｉＲＮＡがＲＩＳＣ複合体と緊密に結合され、そしておそらく、存在する場合にほんの１〜３％が細胞中で遊離していると結論付ける。
【００３０】
凍結−解凍周期によって放出されたｍｉＲＮＡが実際に遊離のｍｉＲＮＡであることを確認するために、本発明者らは、サンプルをＲＮａｓｅ  Ｉによって処理した。ＲＮａｓｅ  Ｉは、任意のＲＮＡをモノヌクレオチドとジヌクレオチドとトリヌクレオチドとの混合物へと分解することが公知である。第１に、本発明者らは、３７℃における５分間のＲＮａｓｅ  Ｉ処理が遊離のｍｉＲＮＡを実際に完全に分解し得ることを確認した。細胞の９５℃における５分間の処理後に得られたｍｉＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｉ処理は、実際に、全てのｍｉＲＮＡをバックグラウンドレベルまで分解しなかった。第２に、本発明者らは、３回の凍結−解凍周期後に得られたサンプルが、５分間にわたってＲＮａｓｅ  Ｉで処理された場合に、ＲＩＳＣと結合したｍｉＲＮＡを劇的に分解しなかったことを見出した。最後に、本発明者らは、インタクトなＲＩＳＣを含む細胞溶解物（３回の凍結−解凍周期後）を、９５℃で５分間にわたって処理（ＲＩＳＣ複合体を破壊）されたサンプルと比較した。これらのサンプルのＲＮａｓｅ  Ｉ処理は、後者のサンプルと比較して１％未満のｍｉＲＮＡが第１の処理後にサンプルにおいて分解されたことを示した。これは、ほぼ全てのｍｉＲＮＡが細胞中でＲＩＳＣ複合体と緊密に結合され、ｍｉＲＮＡの僅かな比率のみが生理学的条件下においてインタクトな細胞中で遊離していることを示す。
【００３１】
本発明者らは、次に、本発明者らが細胞中の遊離のｍｉＲＮＡを過小評価している可能性があるという考えられ得る議論を考察した。なぜならば細胞溶解物中の任意の内因性ＲＮａｓｅ（しかし、生細胞中のものではない）は、遊離のｍｉＲＮＡを劇的に分解し得るからである。この可能性を排除するために、本発明者らは、精製した全ＲＮＡ（成熟ｍｉＲＮＡを含む）を、３回の凍結−解凍周期後に得られた細胞溶解物に添加した。本発明者らの分析は、細胞溶解物中の成熟ｍｉＲＮＡをインキュベートすることがそれらの分解を任意の著しい程度にしなかったことを示した。これは、細胞溶解物中のｍｉＲＮＡのレベルが本発明者らのアッセイにおいて過小評価されないという証拠を提供する。
【００３２】
次に、本発明者らは、ｍｉＲＮＡとＲＩＳＣ複合体との結合の安定性を決定することを試みた。これを試験するために、本発明者らは、異なる温度にてＥＳ細胞を処理し、そしてｍｉＲ−１６が６０℃にて５分間処理した後でさえＲＩＳＣ複合体と安定して結合されたことを見出した。ほとんどのｍｉＲ−１６がＲＩＳＣ複合体から放出されたのは、サンプルの８０℃における５分間の処理後のみであった。これらの観察は、ほとんどの内因性ｍｉＲＮＡが細胞中でＲＩＳＣ複合体と緊密に結合されることを示唆する。
【００３３】
ｓｉＲＮＡは２．５Ｍ  ＮａＣｌ、２．５Ｍ  ＫＣｌ、または１Ｍ尿素の存在下でさえＲＩＳＣ複合体に安定して結合し得ることが、先に報告されている。本発明者らは、内因性ｍｉＲ−１６が２．５Ｍ  ＮａＣｌまたは２．５Ｍ  ＫＣｌによる処理後かあるいはＥＳ細胞溶解物においてでさえＲＩＳＣと安定して結合されたことを見出した。３回の凍結−解凍周期の後に得られたＥＳ細胞溶解物を２．５Ｍ  ＮａＣｌまたは２．５Ｍ  ＫＣｌによって処理することは、ｍｉＲＮＡの放出の劇的な増加を示さなかった。これらのデータは、内因性ｍｉＲＮＡが細胞中でＲＩＳＣに緊密に結合されることを示唆し、このことは、インビトロでのｓｉＲＮＡ／ＲＩＳＣ間の安定な結合に類似する。
【００３４】
次に、本発明者らは、ｍｉＲＮＡとＲＩＳＣ複合体との間の結合の動力学を評価しようとした。これを試験するために、本発明者らは、０．５ｕＭの合成プレｍｉＲＮＡまたは合成成熟ｍｉＲＮＡをＥＳ細胞溶解物に負荷し、そしてそのサンプルを３０分間インキュベートした。次いで、本発明者らは、細胞溶解物中でＲＩＳＣと結合したｍｉＲ−１６の量を確認した。本発明者らは、Ｌｅｔ−７ａのプレｍｉＲＮＡを添加しても成熟ｍｉＲＮＡを添加してもＲＩＳＣ複合体からｍｉＲ−１６を放出できないことを見出した。０．５ｕＭの合成一本鎖成熟ｍｉＲＮＡを添加することは、ＲＩＳＣ複合体中の内因性ｍｉＲＮＡを置換できず、このことは、ｍｉＲＮＡの相対的な豊富さが最初の一次ｍｉＲＮＡ転写物の量によって決定されることを示す。０．５ｕＭの合成ヘアピン前駆体Ｌｅｔ−７ａ（プレＬｅｔ−７ａ）を添加することもまた、それらのＲＩＳＣ複合体から内因性ｍｉＲＮＡを置き換えることができなかった。任意の特定の理論に制限されることを意図しないが、これらのデータは、以下の可能性を示唆する。第１に、その置換の動態は、非常に緩徐であり得、そしてそれは、効果が現れるまで数時間以上を必要とし得る。第２に、前駆体は、生細胞中の他のタンパク質複合体によってＲＩＳＣ複合体へと「輸送（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）」され得る。このことは、ｍｉＲＮＡ／ＲＩＳＣの結合が非常に安定であり、そして遊離のｍｉＲＮＡがＲＩＳＣ複合体に既に存在するｍｉＲＮＡを顕著に置換できないことを示唆する。
【００３５】
最近、新規の化学的に改変されたオリゴヌクレオチド（「ａｎｔａｇｏｍｉｒ」と称される）が、相補ｍｉＲＮＡを、それらの分解を促進することによってノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）し得ることを示した（Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔら、Ｎａｔｕｒｅ、４３８、６８５−６８９）。本発明者らは、この機構についての１つの可能性が、ａｎｔａｇｏｍｉｒ分子がＲＩＳＣ内の標的ｍｉＲＮＡに結合し得、そして標的ｍｉＲＮＡをこの複合体から解離させ得ることであると、提唱した。次いで、ＲＮａｓｅが、細胞の細胞質中に放出された解離したｍｉＲＮＡ／ａｎｔａｇｏｍｉｒハイブリッド（ｍｉＲＮＡ鎖）を分解し得る。この可能性を試験するために、本発明者らは、上に記載された３回の凍結−解凍周期後に得られたＥＳ細胞溶解物を、０．５ｎＭ〜５０ｎＭのｍｉＲ−１６のａｎｔａｇｏｍｉｒ（ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１６）と一緒に３０分間インキュベートした。次いで、そのサンプルは、ＲＩＳＣ複合体から放出され得たｍｉＲ−１６を分解するためにＲＮＡｓｅ  Ｉによって処理された。最後に、ＲＮａｓｅ  Ｉは、不活化され、そして残りのＲＩＳＣ結合型ｍｉＲＮＡは、そのＥＳ細胞溶解物の９５℃における５分間の処理によって放出され、そしてそれらのレベルは、ＲＴ−ＰＣＲによって推定された。本発明者らは、サンプルと５ｎＭのａｎｔａｇｏｍｉｒ−１６とのインキュベーションがＥＳ細胞溶解物中のｍｉＲ−１６の９０％を分解し得ることを見出した（ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１６がステム−ループＲＴ−ＰＣＲ反応をブロックする効果は、０．５〜５０ｎＭのａｎｔａｇｏｍｉｒのデータに対して同量の合成ｍｉＲ−１６を比較することによって補正された）。そのａｎｔａｇｏｍｉｒに対するコントロールとして、本発明者らは、アンチセンスｍｉＲ−１６  ＲＮＡ分子、または無関係のａｎｔａｇｏｍｉｒ−ｌｅｔ−７ａを使用したが、それらのいずれもが、凍結−解凍ＥＳ細胞溶解物中のＲＩＳＣからのｍｉＲ−１６の放出およびその後の分解を促進できなかった。本発明者らはまた、ＭＥＦ由来の同様の溶解物においてａｎｔａｇｏｍｉｒの効果を確認し、そして同様の結果を得た。任意の特定の理論に制限されることなく、したがって、そのデータは、ａｎｔａｇｏｍｉｒがＲＩＳＣからの特定のｍｉＲＮＡの解離を促進し、これにそれらの次なる分解が続くという認識と適合する。
【００３６】
最後に、本発明者らは、ステム−ループＲＴ−ＰＣＲが、成熟ｍｉＲＮＡに特異的であり、そして成熟ｍｉＲＮＡをそれらの前駆体から明確に識別し得ることを確認した。この目的のために、本発明者らは、Ｄｉｃｅｒを欠くＭＥＦにおけるｍｉＲ−１６発現を測定した。このようなＤｉｃｅｒヌル細胞では、成熟ｍｉＲＮＡが存在せず、プリｍｉＲＮＡおよびプレｍｉＲＮＡの蓄積が存在することが、公知である（Ｋａｎｅｌｌｏｐｏｕｌｏｕら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１９、４８９−５０１、およびＭｕｒｃｈｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０２、１２１３５−１２１４０）。本発明者らは、実際に、野生型ＭＥＦと比較して実際に検出可能なｍｉＲ−１６が存在しないことを、見出した。これらのデータは、ステム−ループＲＴ−ＰＣＲが、成熟ｍｉＲＮＡを特異的に検出し、そして対応するゲノムの座（ｌｏｃｕｓ）も、プレｍｉＲＮＡも、プレｍｉＲＮＡも検出しないというさらなる証拠を提供する。
【００３７】
一般に、これらのデータは、生理学的条件下の細胞では、ほとんどのｍｉＲＮＡがＲＩＳＣ複合体と緊密に結合し、小さい比率、そしておそらくほんの３％未満がＲＩＳＣの外部に存在することを示した。本発明者らの知見に関して、これは、内因性ｍｉＲＮＡが生理学的条件下においてインビボでＲＩＳＣと緊密に結合されることを初めて示した。これらの観察は、ｍｉＲＮＡが細胞中で非常に安定である理由を説明し得、そしてそれはまた、ｍｉＲＮＡが非常に長い半減期を示す理由を説明する。本発明者らの研究はまた、ａｎｔａｇｏｍｉｒがｍｉＲＮＡをＲＩＳＣから有効かつ特異的に置換し得、これに、それらの次なる分解が続くことを示す。
【００３８】
（本教示のいくつかの応用）
図１は、本教示のいくつかの実施形態に従う１つのワークフローを示す。ここで、マイクロスライドガラス（ｍｉｃｒｏｓｌｉｄｅ  ｓｌｉｄｅ）（１）は、３つの組織サンプル（２、３、４）（例えば、ホルマリン固定したパラフィン包埋組織スライス）を含むことが示される（この図に関して、その組織サンプルは、保管され、かつ古いものであり、その結果、メッセンジャーＲＮＡが、分解されている）。これらの組織サンプルのうちの１つ（４）は、拡大されて示され、ここで冠状脳切片（６）は、細胞の核（７）（おそらく扁桃の中心核を含むことが示される。さらに、細胞のこの核（７）は、拡大されて示され、ここで、４つの異なる細胞が、存在している（９、１０、１１、１２）。Ｌａｓｅｒ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（Ａｒｃｔｕｒｕｓから市販されているようなＬＣＭ）は、その４つの細胞（９、１０、１１、および１２）の各々を単離するために使用され得る。その４つの細胞の各々は、反応容器中におかれ得る（この時点で、その組織切片がホルマリン固定したパラフィン包埋切片である場合、そのサンプルは、キシレンおよび１００％エタノールと一緒にインキュベートすることによって脱パラフィン化（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚｅ）され得、次いで得られた組織ペレットの乾燥が、行なわれ得る（脱パラフィン化するためのこのような手順は、慣用的であり、そして例えば、Ｓｔｅｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、第８巻、第１号、２００６年２月、ならびにＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｐａｒａｆｆｉｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅから市販されている）、およびＲｅｃｏｖｅｒＡＩＩ  ＴＭキット（Ａｍｂｉｏｎから市販されている）についての説明書の１月１００６バージョンに記載されていることが見出され得る））。次に、分解されていない成熟ｍｉＲＮＡは、例えば、９５℃で５分間にわたって加熱することによって遊離され得る。その後、４つの反応容器の各々は、例えば、標的特異的ステム−ループＲＴプライマーを使用してＰＣＲ増幅を受け得る。その増幅の結果は、リアルタイムにおいてか、またはエンドポイントとしてかのいずれかでシグナルを生成し得る。ｍｉＲＮＡが逆転写されそしてｍｉＲＮＡ特異的プライマーによってＰＣＲ増幅されたそれらの細胞（９、１０、１１）において、シグナルが生じ、したがって、特定のｍｉＲＮＡの定量を可能にする。しかし、細胞１２に対応する反応容器では、メッセンジャーＲＮＡを検索（ｑｕｅｒｙ）するプライマーが、使用される。最初の組織切片におけるメッセンジャーの分解に起因して、シグナルは生じない（当然に、最初の組織切片中の任意の分解されていないメッセンジャーＲＮＡは、成熟ｍｉＲＮＡの遊離によって破壊されるようである）。
【００３９】
したがって、いくつかの実施形態において、本教示は、サンプル中の分解されていない成熟ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を検出する方法を提供し、ここで上記サンプルは、実質的に分解されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含み、この方法は、以下を包含する：純粋な成熟ｍｉＲＮＡのコレクションを形成するために、上記成熟ｍｉＲＮＡを遊離させる工程であるが、但し、この遊離させる工程は、洗浄剤によって処理する工程、およびカオトロピック塩によって処理する工程を包含しない、工程；上記分解されていない純粋な成熟ｍｉＲＮＡと少なくとも１つのｍｉＲＮＡ特異的逆方向プライマーとを含む反応混合物を形成する工程；上記ｍｉＲＮＡ特異的逆方向プライマーを伸長して、ｍｉＲＮＡ伸長産物を形成する工程；上記ｍｉＲＮＡ伸長産物を増幅する工程；ならびに、上記サンプル中の上記分解されていない成熟ｍｉＲＮＡを検出する工程。
【００４０】
いくつかの実施形態において、上記サンプルは、ホルマリン固定したパラフィン包埋  組織切片である。いくつかの実施形態において、上記検出する工程は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を包含する。いくつかの実施形態において、上記遊離させる工程は、加熱する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記加熱する工程は、少なくとも７０℃にて５分間にわたる加熱を含む。いくつかの実施形態において、上記加熱する工程は、９５℃にて５分間にわたる加熱を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本教示は、サンプル中の分解されていない成熟ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を検出する方法を提供し、ここで上記サンプルは、実質的に分解されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含み、この方法は、以下を包含する：上記サンプルを溶解する工程；上記サンプルをヌクレアーゼによって処理する工程；上記ヌクレアーゼを不活性化する工程；上記分解されていない成熟ｍｉＲＮＡをＲＩＳＣ複合体から遊離させる工程；上記分解されていない純粋な成熟ｍｉＲＮＡと少なくとも１つのｍｉＲＮＡ特異的逆方向プライマーとを含む反応混合物を形成する工程；上記ｍｉＲＮＡ特異的逆方向プライマーを伸長して、ｍｉＲＮＡ伸長産物を形成する工程；上記ｍｉＲＮＡ伸長産物を増幅する工程；および、上記サンプル中の上記分解されていない成熟ｍｉＲＮＡを検出する工程。いくつかの実施形態において、上記遊離させる工程は、洗浄剤によって処理する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記遊離させる工程は、加熱する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記加熱する工程は、少なくとも７０℃にて５分間にわたる加熱を含む。いくつかの実施形態において、上記加熱する工程は、９５℃にて５分間にわたる加熱を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本教示は、サンプル中の分解されていない成熟ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を検出する方法を提供し、ここで上記サンプルは、実質的に分解されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含み、この方法は、以下を包含する：純粋な成熟ｍｉＲＮＡのコレクションを形成するために、上記成熟ｍｉＲＮＡを遊離させる工程；上記分解されていない純粋な成熟ｍｉＲＮＡと少なくとも１つのｍｉＲＮＡ特異的逆方向プライマーとを含む反応混合物を形成する工程；上記ｍｉＲＮＡ特異的逆方向プライマーを伸長して、ｍｉＲＮＡ伸長産物を形成する工程；上記ｍｉＲＮＡ伸長産物をＰＣＲにおいて増幅する工程；および、上記サンプル中の上記成熟ｍｉＲＮＡを検出する工程であって、ここで上記サンプルは、ホルマリン固定したパラフィン包埋組織切片である、工程。いくつかの実施形態において、上記検出する工程は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を包含する。いくつかの実施形態において、上記遊離させる工程は、加熱する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記加熱する工程は、少なくとも７０℃にて５分間にわたる加熱を含む。いくつかの実施形態において、上記加熱する工程は、９５℃にて５分間にわたる加熱を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態において、上記分解は、少なくとも１つのヌクレアーゼによる処置を含む。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つのヌクレアーゼは、ＲＮＡｓｅである。ＲＮＡｓｅは、例えば、ＲＩＳＣと結合されていない前駆体マイクロＲＮＡ、ならびに例えば、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、および種々の非コーディングＲＮＡなどの細胞溶解物中の他のＲＮＡの分解に有益であり得る。いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡｓｅは、ＲＮＡｓｅ  Ｉである。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つのヌクレアーゼは、ＤＮＡｓｅである。ＤＮＡｓｅは、例えば、上記細胞溶解物に存在するゲノムＤＮＡの分解に有益であり得る。いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡｓｅは、ＤＮＡｓｅ  Ｉである。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つのヌクレアーゼは、ＲＮＡｓｅおよびＤＮＡｓｅを含む。当然に、任意の種々のヌクレアーゼは、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入できる通り、市販されており、そして本教示において使用され得る。種々のヌクレアーゼ、および望ましくない核酸の分解におけるそれらの使用のさらなる説明は、例えば、米国特許出願第１０／９８２，６１９号、および米国特許第６，７９７，４７０号に見出され得る。
【００４４】
いくつかの実施形態において、本教示の方法は、ホルマリン固定したパラフィン包埋組織サンプルである分解されたメッセンジャーＲＮＡを含む組織サンプル由来のｍｉＲＮＡの定量を提供し、ここでこの定量は、分解されたメッセンジャーＲＮＡを含まずそして／またはホルマリン固定したパラフィン包埋組織サンプルである実験的に対応した組織サンプル（例えば、新鮮な凍結組織サンプル）において見出されるかまたは見出され得るものとほぼ同一の測定されたｍｉＲＮＡのレベルを提供する。
【００４５】
分子生物学の実験者にとって容易に利用可能であるような種々の逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶおよびｒＴｔｈ、ならびにＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｍｂｉｏｎ、およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能な種々の市販の逆転写酵素を含む）は、本教示によって得られたｍｉＲＮＡを逆転写する場合に使用され得る。
【００４６】
いくつかの実施形態において、検出の感度は、１分子の標的ｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、検出の感度は、５分子以下の標的ｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、検出の感度は、２５分子以下の標的ｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、検出の感度は、５０分子以下の標的ｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、検出の感度は、１００分子以下の標的ｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、検出の感度は、１０００分子以下の標的ｍｉＲＮＡである。
【００４７】
いくつかの実施形態において、定量されたｍｉＲＮＡ由来の少なくとも２つのシグナルのダイナミックレンジは、少なくとも３対数単位（ｌｏｇ  ｕｎｉｔ）である。いくつかの実施形態において、定量されたｍｉＲＮＡ由来の少なくとも２つのシグナルのダイナミックレンジは、少なくとも４対数単位である。いくつかの実施形態において、定量されたｍｉＲＮＡ由来の少なくとも２つのシグナルのダイナミックレンジは、少なくとも４対数単位である。いくつかの実施形態において、定量されたｍｉＲＮＡ由来の少なくとも２つのシグナルのダイナミックレンジは、少なくとも５対数単位である。いくつかの実施形態において、定量されたｍｉＲＮＡ由来の少なくとも２つのシグナルのダイナミックレンジは、少なくとも６対数単位である。いくつかの実施形態において、定量されたｍｉＲＮＡ由来の少なくとも２つのシグナルのダイナミックレンジは、６対数単位よりも大きい。
【００４８】
ｍｉＲＮＡの安定性のさらなる説明は、米国仮特許出願第６０／７１６，６３３号および米国仮特許出願第６０／７８０，９２７号に基づく優先権を主張する、Ｌａｏに対する同時出願の米国本出願に見出され得る。本教示を伴って、当業者は、ｍｉＲＮＡをそれらの増幅のために調製するための時間および温度の範囲をさらに洗練するために、慣用的な実験を使用し得る。核酸（特に、メッセンジャーＲＮＡ）の調製のためのさらなる教示は、（Ｇｏｄｆｒｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、２０００、２：２、８４−９１）に見出され得る。
【００４９】
逆転写反応および増幅反応を最適化する特定の方法は、当業者に公知である。例えば、ＰＣＲがアニーリング、重合、および変性についての時間および温度を変えること、ならびに反応組成において緩衝液、塩、および他の試薬を変更することによって最適化され得ることは、公知である。最適化はまた、使用される増幅プライマーの設計によって影響を受け得る。例えば、プライマーの長さ、およびＧ−Ｃ：Ａ−Ｔの比は、プライマーのアニーリング効率を変化させ得、したがって増幅反応を変化させる。増幅の最適化の説明は、とりわけ、Ｊａｍｅｓ  Ｇ．Ｗｅｔｍｕｒ、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｓ，Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｐｐ．６０５−８（Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ編、１９９５）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、特に、第４章；Ｒａｐｌｅｙ；およびＰｒｏｔｏｃｏｌｓ  ＆  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｇｕｉｄｅ、ｒｅｖ．９／０４、Ｐｒｏｍｅｇａに見出され得る。いくつかの実施形態において、本教示は、６０／６９９，９６７に基づく優先権を主張するＬａｏらに対する同時出願の米国本出願「Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ」、および６０／６９９，９３０に基づく優先権を主張するＬａｏらに対する同時出願の米国仮特許出願「Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＭｉＲＮＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘｔｕｒｅ」に関して種々の文脈において適用され得る。
【００５０】
いくつかの実施形態において、本教示は、例えば、Ｍｏｈａｍｅｄら、（２００４）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３０：１５０−１５６において考察されるような、単一チューブ（ｓｉｎｇｌｅ−ｔｕｂｅ）ＲＴ−ＰＣＲアプローチを企図する。
【００５１】
いくつかの実施形態において、本教示は、例えば、Ｌａｏらに対する米国本出願第１１／４２１，４６０号、およびＢｌｏｃｈらに対する米国本出願第１１／４２１，３１９号において考察されるような、種々のサイクリング逆転写（ｃｙｃｌｉｎｇ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）反応アプローチを企図する。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本教示の逆転写産物は、例えば、ＡｎｄｅｒｓｅｎおよびＲｕｆｆに対するＷＯ２００４／０５１２１８、Ｘｔｒａｎａに対する米国特許第６，６０５，４５１号、ならびにＡｎｄｅｒｓｅｎらに対する米国本出願第１１／０９０，８３０号、およびＬａｏらに対する米国本出願第１１／０９０，４６８号に記載されるような、多重化されたプレ増幅ＰＣＲ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ＰＣＲ）および次なる複数のより低い多重化の解読ＰＣＲ（ｌｏｗｅｒ−ｐｌｅｘ  ｄｅｃｏｄｉｎｇ  ＰＣＲ）において増幅され得る。
【００５３】
いくつかの実施形態において、本教示の方法は、ｍｉＲＮＡを定量するために定量的リアルタイムＰＣＲの感度、特異性、およびダイナミックレンジを利用する最近開発された技術を使用し得る（例えば、Ｂｒａｎｄｉｓらに対する米国本出願第１０／８８１，３６２号、Ｌａｏらに対する同第１０／９４４，１５３号、Ｃｈｅｎらに対する同第１０／９４７，４６０号、およびＣｈｅｎらに対する同第１１／１４２，７２０号を参照のこと）。例えば、いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ特異的な「ステム−ループ」逆方向プライマーが、プライマー伸長反応において使用され、次いでリアルタイムＰＣＲにおいて使用され、ここでそのステム−ループプライマーは、例えば、Ｃｈｅｎらに対する米国本出願第１０／９４７，４６０号に記載されるような自己相補的ステム、ループ、および一本鎖のｍｉＲＮＡ標的特異的領域を含み、いくつかの実施形態において、本教示によって回収されたｍｉＲＮＡは、例えば、Ｌａｏら、米国特許出願第１１／４２１，４４９号において教示されるような、高度に多重化されたＲＴ−ＰＣＲ反応においてさらに分析され得る。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本教示に従って組織サンプルから回収されたｍｉＲＮＡは、例えば、Ｃａｓｔｏｌｄｉら、２００６年５月；１２（５）：９１３−２０．Ｅｐｕｂ  ２００６年５月１５日において教示されるようなマイクロアレイ（例えば、ＬＮＡベースのマイクロアレイ）において分析され得る。
【００５５】
（特定の例示的なキット）
本教示はまた、特定の本開示の方法の実施を促進するように設計されたキットを提供する。キットは、本方法を実施するために必要とされる２つ以上の成分を集合させることによって特定の開示された方法の達成を促進するように機能し得る。特定の実施形態において、キットは、エンドユーザーによる測定に対する必要性を最小限にするために、予め測定された単位量で成分を含む。いくつかの実施形態において、キットは、本開示の方法の１つ以上を実施するための説明書を備える。好ましくは、上記キットの成分は、互いと組み合わせて操作するために最適化される。
【００５６】
したがって、いくつかの実施形態において、本教示は、サンプル中の分解されていない成熟ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を定量するためのキットを提供し、ここで上記サンプルは、実質的に分解されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含み、このキットは、以下を備える：（ａ）実質的に分解されたメッセンジャーＲＮＡを含む組織切片から核酸を抽出するための試薬；（ｂ）ＲＮＡｓｅ。いくつかの実施形態において、上記実質的に分解されたメッセンジャーＲＮＡを含む組織切片から核酸を抽出するための試薬は、キシレンおよびエタノールを含み、そして上記組織切片は、パラフィン包埋されている。いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡｓｅは、ＲＮＡｓｅ  Ｉである。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本教示は、サンプル中の分解されていない成熟ｍｉＲＮＡを検出するためのキットを提供し、ここで上記サンプルは、実質的に分解されたメッセンジャーＲＮＡを含み、このキットは、以下を備える：（ａ）実質的に分解されたメッセンジャーＲＮＡを含む組織切片から核酸を抽出するための試薬；および、（ｂ）ＲＮＡｓｅ。いくつかの実施形態において、上記実質的に分解されたメッセンジャーＲＮＡを含む組織切片から核酸を抽出するための試薬は、キシレンおよびエタノールを含み、そして上記組織切片は、パラフィン包埋されている。いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡｓｅは、ＲＮＡｓｅ  Ｉである。いくつかの実施形態において、このキットは、ＤＮＡｓｅを備える。
【００５８】
開示された教示が、種々の適用、方法、およびキットを参照して説明されたが、種々の変更および改変が本明細書中の教示から逸脱することなくなされ得ることが認識される。前述の実施例は、本教示をより良好に説明するために提供され、そして本明細書中の教示の範囲を制限することは意図されない。本教示の特定の局面は、添付の特許請求の範囲を考慮してさらに理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、本教示のいくつかの実施形態に従う１つのワークフローを示す。
【図１】
2009501531.tif 000005
【国際調査報告】
2009501531.tif 000006