(57)【要約】日和見感染症を治療するために免疫無防備患者の免疫系を刺激する方法。本方法は、意図的にミスマッチにした同種異系細胞を注入することを含む。移植片対宿主病の合併症を予防するために、本同種異系細胞には注入前に放射線を照射することができる。本発明は特に、日和見感染症の治療法であって、感染性病原体を有する免疫無防備宿主にミスマッチ同種異系細胞の少なくとも１回の注入を提供して、前記感染性病原体に対する免疫応答を前記宿主に生じるようにすることを含む治療法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
日和見感染症の治療法であって、感染性病原体を有する免疫無防備宿主にミスマッチ同種異系細胞の少なくとも１回の注入を提供して、前記感染性病原体に対する免疫応答を前記宿主に生じるようにすることを含む、治療法。
【請求項２】
前記感染性病原体がアスペルギルス属のメンバーである、請求項１に記載の治療法。
【請求項３】
前記ミスマッチ同種異系細胞の注入によりＴｈ１サイトカインの産生がもたらされる、請求項１に記載の治療法。
【請求項４】
前記Ｔｈ１サイトカインが、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２もしくはＩＬ−１８、またはそれらのいずれかの組み合わせを主に含む、請求項３に記載の治療法。
【請求項５】
前記同種異系細胞の注入により樹状細胞の活性化がもたらされる、請求項１に記載の治療法。
【請求項６】
前記免疫応答によりＣＤ４０Ｌ表面マーカーの発現がもたらされる、請求項１に記載の治療法。
【請求項７】
前記ＣＤ４０Ｌの発現により増強樹状細胞ＩＬＩ２の産生がもたらされる、請求項６に記載の治療法。
【請求項８】
前記免疫応答がＴｈ１細胞の活性化である、請求項１に記載の治療法。
【請求項９】
前記Ｔｈ１細胞の活性化がＴｈ１サイトカインの産生によってもたらされる、請求項８に記載の治療法。
【請求項１０】
前記免疫応答により、前記宿主が生成する同種異系抗原に特異的なＴｈ１記憶細胞がもたらされる、請求項９に記載の治療法。
【請求項１１】
前記免疫応答がＮＫ細胞およびＴ細胞の活性化をもたらす、請求項１に記載の治療法。
【請求項１２】
前記同種異系細胞が注入前に放射線照射される、請求項１に記載の治療法。
【請求項１３】
前記同種異系細胞がＴｈ１リンパ球である、請求項１に記載の治療法。
【請求項１４】
Ｔｈ１サイトカインの産生をもたらす免疫無防備宿主への同種異系細胞の注入により、ナチュラルキラー細胞および樹状細胞を活性化する方法。
【請求項１５】
同種異系細胞注入が、ＣＤ４０Ｌ表面マーカーの発現をもたらす前記Ｔ細胞の活性化をもたらす、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
出会った同種異系抗原に特異的なＴｈ１記憶細胞プールの発生をもたらす、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｔｈ１記憶細胞が、ケモカイン受容体ＣＣＲ５、ＣＣＲ２もしくはＣＣＲ３、またはそれらのいずれかの組み合わせを発現する、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患を治療するための同種異系細胞注入の使用に関する。より具体的には、本発明は、免疫無防備宿主における細胞性免疫を刺激するための同種異系細胞療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト免疫系は、種々の細菌性、原虫性、真菌性およびウイルス性病原体による感染から個体を防御する能力を有する。しかし、年齢もしくは疾患（例えば、ＨＩＶ感染症）、薬剤（コルチコステロイド、化学療法）、または臓器もしくは骨髄移植患者の拒絶反応の予防治療により免疫系が弱体化すると、通常は臨床疾患を引き起こさないこれらの病原体が、感染を引き起こす可能性がある。一般的な日和見病原体には、真菌、トリ結核菌細胞、ウイルス、特にサイトメガロウイルス感染症（ＣＭＶ）、およびニューモシスチスカリニがある。ＨＩＶ感染患者、ならびに臓器および骨髄移植患者は、特に日和見感染症に感染しやすい。
【０００３】
免疫抑制者は、内因性および外因性の両微生物に感染しやすい。日和見感染症は、特に毒性の強い病原体（例えば、髄膜炎菌性髄膜炎または肺炎球菌性肺炎）の外因性獲得、内因性潜在微生物（例えば、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、帯状疱疹ウイルス（ＨＺＶもしくは帯状疱疹）または結核菌）の再活性化、および通常は共生または腐生の微生物（例えば、細菌、ウイルス、真菌もしくは原虫／寄生虫）の内因性侵入により生じる可能性がある。発生する日和見感染症の正確な型は、免疫学的変化（細胞性、体液性、食細胞性または複合的欠陥であるかを問わない）の型および程度、ならびに内外環境に存在する微生物により異なる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
日和見感染症は、抗ウイルス剤、抗真菌剤または抗生剤を使用した治療を行ったとしても致命的となることが多い。したがって、日和見感染症を治療かつ予防するために免疫無防備者の免疫系を強化する方法を開発することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、日和見感染症を治療するために免疫無防備患者の免疫系を刺激する方法を含む。本方法は、意図的にミスマッチにした同種異系細胞を注入することを含む。また、移植片対宿主病の合併症を予防するために、本同種異系細胞には注入前に放射線を照射することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
アスペルギルスは始原型の日和見微生物であり、自然界に広く分布する汎存種の糸状菌である。この菌は一般的に土壤、植物の残骸、および室内空気環境から隔離されている。アスペルギルス症は、アスペルギルス属の菌によって引き起こされる広範な疾患である。一般的にアスペルギルスは、あらゆる糸状菌の中でも侵襲性感染症において隔離されることが最も多い菌であり、日和見真菌の中でもカンジダに次いで２番目に回復することが多い真菌である（Ｋｗｏｎ−Ｃｈｕｎｇ  １９９２）。また、アスペルギルスフミガーツスは、侵入性アスペルギルス症（ＩＡ）の最も一般的な原因でもある。
【０００７】
ＩＡは、免疫無防備患者に一般的な劇症型の高致死性感染症である（Ｂｏｄｅｙ  ａｎｄ  Ｖａｒｔｉｖａｒｉａｎ  １９８９；Ｄｅｎｎｉｎｇ  １９９８）。免疫抑制は、日和見感染症を発症しやすくする主要な要因である（Ｈｏ  ａｎｄ  Ｙｕｅｎ  ２０００）。気道定着がきわめて一般的である。この感染症は、免疫無防備患者が分生子（真菌胞子）を吸入することで発症する。健常者であれば分生子は肺から効果的に除去されるが、免疫無防備患者の場合は、分生子が発芽し、周囲組織に侵入する菌糸を形成して、重度の進行性肺炎を発症し、ひいてはこれが他の臓器にまで播種する可能性がある。この疾患の臨床症状と重症度は、患者の免疫状態により異なる（Ｂｅｎｎｅｔｔ  １９９５）。潜在的な消耗性疾患、化学療法誘発好中球減少症、正常細菌叢の分裂、または抗菌剤およびステロイドの使用による炎症反応などの要因によって宿主抵抗性が低下することにより、患者は細菌定着、侵襲性疾患、またはそれらの両方に罹患しやすくなる可能性がある（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｈａａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。
【０００８】
ＩＡの療法は、全死亡率が約６０％の不良の結果に関連する（Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｋａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。ステロイド誘発性免疫抑制および化学療法誘発性好中球減少症により、ＩＡは、骨髄移植（ＢＭＴ）後に生じる特に深刻な問題である（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，ＭｃＧｌａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．１９８３；Ｍｅｙｅｒｓ  １９９０）。
【０００９】
ＩＡの治療に認可された抗真菌剤は、３３％〜５２％の反応率を有する（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  ２００２）。現在のＩＡの療法には、ボリコナゾール（Ｈｅｒｂｒｅｃｈｔ，Ｄｅｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００２）；患者の８０％に腎毒性を引き起こすアンホテリシンＢ（Ｗｉｎｇａｒｄ，Ｋｕｂｉｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）；低腎毒性製剤であるが、肝毒性になる可能性があり、非常に高価なリポソームアンホテリシンＢ（Ｗａｌｓｈ，Ｆｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）；多くの薬物相互作用を有するイトラコナゾール（Ｃａｉｌｌｏｔ  ２００３）；梗塞組織の外科切除（Ｍａｔｔ，Ｂｅｒｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２００３）；および他の療法に対して不応性または不耐性であるＩＡ患者へのサルベージ療法として最近米国食品医薬品局に認可されたカスポファンギンが含まれる。しかし、積極的な抗真菌性療法があるにもかかわらず、ＢＭＴ患者のＩＡの予後は、依然として極めて不良であり、死亡率は９０％以上に達している（Ｄｅｎｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｅｖｅｎｓ  １９９０；Ｄｅｎｎｉｎｇ  １９９６）。
【００１０】
治療結果は依然としてＩＡに最適とまでは言えないことから、新規の治療法が必要とされており、細胞性（Ｔｈ１）免疫を刺激できる方法が、日和見ウイルス性および真菌性感染症の治療に最も効果的であると考えられる。
【００１１】
Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫
適応免疫は、応答に関与するＣＤ４＋Ｔ細胞の優勢型によって、Ｔｈ１またはＴｈ２の特徴を有する。Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞によって産生されるサイトカインの均衡が、免疫応答の特徴に影響を及ぼす主要な要因である。ＣＤ４＋リンパ球からＴｈ１およびＴｈ２サブセットへの機能的分割は、これらの細胞のサイトカインプロファイルに基づいている。Ｔｈ１細胞は、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）を産生するが、ＩＬ−４は産生しない。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４およびＩＬ−１０を産生するが、ＩＦＮ−γは産生しない（Ｍｏｓｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｃｏｆｆｍａｎ  １９８９；Ｒｏｍａｇｎａｎｉ  １９９１）。これらの２つのサブセットによって産生されるサイトカインは、相互に阻害的であり、逆交差調節を確立する。Ｔｈ１細胞はＴｈ２細胞の増殖を阻害し、Ｔｈ２細胞はＴｈ１細胞のサイトカイン産生を阻害する（Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ，Ｂｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．１９８９）。この逆交差調節により、病原体に対するＴｈ１またはＴｈ２の極性化された免疫応答がもたらされ、これによって感染症に対する宿主の抵抗性または感受性を決定することができる。Ｔｈ１細胞は、樹状細胞（ＤＣ）から分泌される（その後ＩＬ−１８によって増強される）ＩＬ−１２の存在下で分化するのに対して、Ｔｈ２細胞は、ＮＫＴ細胞、好塩基球、好酸球および肥満細胞によって産生されるＩＬ−４の影響下で分化する。また、原虫性、ウイルス性または真菌性感染症におけるＴｈ１の応答は抵抗性に関係するのに対して、同病原体に対するＴｈ２の応答は疾患に関係する（Ｋａｗａｋａｍｉ  ２００３）。
【００１２】
自然感染対策
自然免疫および適応免疫の両機序の活性化は、真菌性感染症の宿主制御に不可欠である。自然免疫系のエフェクター機序は、ＩＡに対する主な防御機序である（Ｒｏｉｌｉｄｅｓ，Ｋａｔｓｉｆａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。感染抵抗性には、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γを産生する間質Ｔ細胞の存在だけでなく、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２が豊富なサイトカイン環境で作用する肺胞食細胞の正常な先天性抗真菌活性が必要となる（Ｃｅｎｃｉ，Ｍｅｎｃａｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。常在する肺胞マクロファージが、休眠分生胞子を摂取および殺滅するのに対して、好中球はマクロファージの監視を回避する分生胞子から発芽する菌糸を攻撃する（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，Ｄｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８２）。この免疫応答の有効性は、多くの分生胞子による攻撃を受けても免疫適格動物では疾患が発症しないという所見から明らかである（Ｄｉｘｏｎ，Ｐｏｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９）。
【００１３】
樹状細胞（ＤＣ）は、アスペルギルスを含めた病原体に対する免疫応答のイニシエーターとして認識される自然免疫細胞であり、自然免疫と適応免疫との間の橋渡しをする役割を果たす。ＤＣは、粘膜表面の病原体を監視する重要な役割を果たす（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｍａｎ  １９９８）。ＤＣの緻密なネットワークについては、すでに気道の部分で説明されている（Ｐｏｌｌａｒｄ  ａｎｄ  Ｌｉｐｓｃｏｍｂ  １９９０）。休眠状態にある気道のＤＣは、摂取やプロセシングに特化しているものの、抗原（Ａｇ）の提示には特化しておらず、後者の場合にはサイトカインの成熟シグナルが必要となる（Ｓｔｕｍｂｌｅｓ，Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。
【００１４】
気道の未熟ＤＣは、真菌を認識し、貪食する。ＴＮＦなどの炎症性サイトカインからの食作用とシグナル伝達により、ＤＣは活性化された後、成熟ＤＣとしてリンパ節に移動する（Ｂｏｚｚａ，Ｇａｚｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．２００２；Ｂａｕｍａｎ，Ｈｕｆｆｎａｇｌｅ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。次いで、副刺激分子の発現と同時に、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子との関連で真菌抗原が提示されることにより、成熟ＤＣがリンパ節内のナイーブＴ細胞を活性化する。こうしたＤＣによるサイトカインの産生により、Ｔｈ１またはＴｈ２のいずれかの適応免疫応答の発生が決定される（Ｈｕｆｆｎａｇｌｅ  ａｎｄ  Ｄｅｅｐｅ  ２００３）。
【００１５】
アスペルギルス症のマウスモデルでは、Ｔｈ１サイトカインが疾患防御と相関するのに対して、Ｔｈ２サイトカインは罹病性と相関する（Ｎａｇａｉ，Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９５；Ｃｅｎｃｉ，Ｐｅｒｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。防御適応免疫の発生は、ＩＦＮ−γを産生するＴｈ１細胞とＩＬ−１２を産生するマクロファージの活性化に関係する。この所見と一致して、Ｔｈ２のサイトカインであるＩＬ−４の中和や、Ｔｈ１のサイトカインであるＩＦＮ−γの注入により、アスペルギルス感染症に対する治療効果がもたらされるのに対して、ＩＦＮ−γの中和や、Ｔｈ２のサイトカインであるＩＬ−１０の産生増加により、症状の増加を招く（Ｎａｇａｉ，Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。また、Ｔｈ１の免疫応答は、血液悪性腫瘍患者におけるＩＡの制御が可能であることも明らかにされている（Ｈｅｂａｒｔ，Ｂｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。
【００１６】
移植後免疫
細胞性免疫応答障害患者は、癌や感染症に罹患しやすい傾向がある。細胞性免疫障害は、悪性もしくはウイルス性疾患の存在によって引き起こされる場合もあれば、免疫抑制剤、移植、化学療法もしくは放射線照射によって医原的に引き起こされる場合もある。細胞性免疫障害および疾患は、Ｔｈ２免疫やエフェクター機能に有利なＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインの不均衡と相関する（Ｓｈｕｒｉｎ，Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９９；Ｋｉｄｄ  ２００３）。免疫抑制状態を生成するＴｈ２応答の増強は、慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染症（Ｆａｎ，Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）、ハンセン病（Ｙａｍａｍｕｒａ  １９９２）、蠕虫、原虫およびレトロウイルス感染症（Ｇａｚｚｉｎｅｌｌｉ，Ｍａｋｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９２；Ｓｈｅｒ，Ｇａｚｚｉｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）、ＡＩＤＳ（Ｃｌｅｒｉｃｉ  ａｎｄ  Ｓｈｅａｒｅｒ  １９９３）などの感染症おいて、および老化プロセスの一部として（Ｄｅｎｇ，Ｊｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００４）見られる。
【００１７】
同種異系ＢＭＴの環境下では、同種異系細胞の注入により、Ｔｈ１免疫の増強によって媒介される移植片対腫瘍（ＧＶＴ）作用と呼ばれる抗腫瘍作用が誘発される（Ｊｕｎｇ，Ｆｏｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。また、同種異系ＢＭＴ後のＴｈ１免疫増強は、癌再発の予防または遅延に効果的な免疫監視と相関する（Ｇｕｏ，Ｑｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。しかし、この有益なＧＶＴ作用も、依然として同種異系ＢＭＴの合併症として最も多い移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が発症することで相殺されてしまうことが多い。
【００１８】
ＧＶＨＤは、宿主の外来ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）抗原を認識する同種異系反応性ドナーＴ細胞によって発症する。ＧＶＨＤの主要な原因は、サイトカインネットワークの調節異常である（Ｋｒｅｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｆｅｒｒａｒａ  １９９６）。ＧＶＨＤではＴｈ１サイトカインの放出が顕著であるのに対して（Ｒｕｓ，Ｓｖｅｔｉｃ  ｅｔ  ａｌ．１９９５；Ｏｃｈｓ，Ｂｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９６；Ｄａｓ，Ｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２００１）、Ｔｈ２細胞はＧＶＨＤの致死性を阻害する（Ｆｏｗｌｅｒ，Ｋｕｒａｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）。慢性ＧＶＨＤの療法は、きわめて免疫抑制作用が強く、長期間継続しなければならない。慢性ＧＶＨＤの治療に最も広く使用されている第一選択治療は、サイクロスポリンＡ（ＣＳＡ）およびプレドニゾンの処方である。ＣＳＡ（Ｋｉｍ，Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．２０００）およびプレドニゾン（Ｅｌｅｎｋｏｖ  ２００４）の治療はいずれも、Ｔｈ１免疫を阻害し、Ｔｈ２免疫を促進する傾向がある。
【００１９】
ＧＶＨＤの制御には、細胞性免疫機序の抑制とＴｈ２免疫の増強が必要となる。ＧＶＨＤを制御する免疫抑制によって、患者は広範な病原体に由来する日和見感染症に罹患しやすくなる。アスペルギルス感染症を含めたこれらの感染症が、ＧＶＨＤに次ぐ主要な死因であり、これに慢性ＧＶＨＤ免疫応答による進行性臓器不全が続く。
【００２０】
免疫抑制患者は、血漿中のＩＬ−１０の濃度が高い。ＩＬ−１０は、Ｔｈ２リンパ球、マクロファージ、肥満細胞およびＢ細胞によって産生され（Ｍｏｏｒｅ，Ｏ’Ｇａｒｒａ．ｅｔ  ａｌ．１９９３）、Ｔｈ２免疫応答を増強しかつＴｈ１応答の分化を阻害することができる強力な免疫抑制作用を有する（ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ  １９９５）。グルココルチコイドによるＧＶＨＤの治療によって、ＩＬ−１０産生Ｔ細胞の誘導が直接増強される。ＩＬ−１０は、ＩＬ−１２の産生、ならびにマクロファージ、単球および種々の樹状細胞によるＭＨＣクラスＩＩ抗原および副刺激分子の発現を阻害することが知られている（Ｍｏｏｒｅ，ｄｅ  Ｗａａｌ  Ｍａｌｅｆｙｔ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。さらに、ＩＬ−１０による樹状細胞の治療は、同種異系抗原活性化Ｔ細胞のアネルギー状態にも寄与する（Ｇｒｏｕｘ，Ｂｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９６；Ｓｔｅｉｎｂｒｉｎｋ，Ｗｏｌｆｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。アスペルギルスは、ＩＬ−１０の産生を直接刺激する能力を有する（Ｃｌｅｍｏｎｓ，Ｇｒｕｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。粒子状アスペルギルス抗原は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいてＴｈ２応答を誘発することが明らかにされている（Ｋｕｒｕｐ，Ｓｅｙｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）。
【００２１】
したがって、移植後ＢＭＴ環境においてＩＡやその他の日和見感染症を治療する免疫療法を計画するにあたっては、ＧＶＨＤを悪化させることなく、免疫抑制されたＴｈ２バイアス環境下で抗病原性Ｔｈ１免疫を増強する方法を計画することが課題とされている。
【００２２】
同種異系細胞療法
移植後ＢＭＴ環境におけるＩＡや他の日和見感染症に効果的な免疫療法を開発するためには、まず自然免疫を刺激した後、免疫抑制剤のバックグラウンドに対する真菌特異性（または他の病原体に特異的な）Ｔｈ１適応免疫応答、ならびに現存しかつインプリントされた、原因病原体に対するＴｈ２バイアス免疫を誘導することが必要となる。その他の課題としては、Ｔｈ１媒介性ＧＶＨＤを同時に刺激することなく、このバックグラウンドでＴｈ１抗真菌性（またはその他の病原体に特異的な）免疫を誘発することが必要とされる。
【００２３】
一般的に、効果的なＴｈ１適応免疫応答を生成するには、厳密に制御された条件下で発生することが必要となる所定の一連の免疫学的事象が必要となる。免疫無防備宿主にＨＬＡミスマッチ同種異系細胞を注入することで、この一連の事象を引き起こす能力を有する強力な宿主同種異系認識応答が誘発される。これらの事象には、以下が含まれる：（ｉ）真菌（またはその他の）抗原（Ａｇ）の排出を引き起こす先天性エフェクター機序の活性化；（ｉｉ）肺中の樹状細胞による真菌（またはその他の）抗原の摂取およびプロセシング；（ｉｉｉ）排出リンパ節への樹状細胞の移動と、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子との関連におけるナイーブＴ細胞への真菌（またはその他の）抗原のその後の提示；（ｉｖ）Ｔｈ１エフェクター細胞の分化のためのリンパ節微環境の調整；（ｖ）プライミングされた真菌特異性（またはその他の）Ｔｈ１エフェクター細胞の感染部位への移動および溢出；ならびに（ｖｉ）エフェクター細胞の認識と、組織からの真菌（または他の病原体）の除去。これらの事象はすべて、持続性炎症性Ｔｈ１サイトカイン環境下で発生しなければならない。適切なサイトカイン環境下でこれらの事象のいずれかが発生しないと、不適切な抗真菌性（またはその他の）免疫応答が生じることになる。
【００２４】
したがって、新しくＴｈ１抗真菌性（またはその他の）免疫の発生を助長する環境を生成するためには、まずＴｈ１サイトカインの発現を誘導し、自然免疫エフェクター細胞の活性化時や、抗真菌性（またはその他の）Ｔｈ１適応免疫応答の確立まで、このサイトカイン環境を維持することが必要となる。Ｔｈ１サイトカインの存在により、既存のＴｈ２サイトカインが下方調節される。
【００２５】
真菌に感染した免疫無防備宿主における既存のＴｈ２優勢免疫環境を最初に変化させるためには、ＨＬＡミスマッチ同種異系リンパ球、好ましくは高密度のＣＤ４０Ｌを発現する活性化Ｔｈ１リンパ球を注入する。ＨＬＡミスマッチ同種異系細胞を注入することで、宿主免疫細胞からのＴｈ１サイトカインの噴出が拒絶反応の一部として誘発される。同種異系細胞の注入後にＴｈ１サイトカインの優位性が生じることが知られている（Ｃａｒａｙｏｌ，Ｂｏｕｒｈｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。さらに、混合リンパ球反応では、同種異系刺激細胞によってキラー細胞からのＴｈ１サイトカインの産生が誘発されることが発見されている（ＤｕＰｏｎｔ  ａｎｄ  Ｈａｎｓｅｎ  １９７６；Ｔｏｕｎｇｏｕｚ，Ｄｅｎｙｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。さらに、アカゲザルにおける複数のＨＬＡミスマッチによるＴ細胞の刺激により、移植レシピエントにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの炎症性Ｔｈ１様応答への極性化が促進される（Ｌｏｂａｓｈｅｖｓｋｙ，Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。また、同種異系細胞の注入により誘発されるヒトＧＶＨＤの発症では、Ｔｈ１型サイトカインの優位性も見られる（Ｄａｓ，Ｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。
【００２６】
臨床的に言えば、好中球数の減少または機能障害は、侵入性アスペルギルス症において間違いなく最も特徴的な危険因子である（Ｗａｌｄ，Ｌｅｉｓｅｎｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。同種異系細胞の注入によるＴｈ１サイトカインの産生は、他の抗真菌先天性エフェクター細胞を活性化する役割を果たす。同種異系細胞の注入とその拒絶反応により産生されるＴｈ１サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８が優勢）は、ＮＫ細胞およびＤＣなどの他の自然免疫エフェクター細胞を活性化し、さらにＴ細胞を活性化する（Ａｎｔｉｎ  ａｎｄ  Ｆｅｒｒａｒａ  １９９２）。次いで、これらの細胞が、Ｔｈ１サイトカインの産生を維持かつ増強する役割を果たすオートクラインおよびパラクリンサイトカインネットワークを生成するＴｈ１サイトカインを産生する（Ｍａｉｌｌｉａｒｄ，Ｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。活性化自然免疫細胞はＩＬ−１２およびＩＬ−１８を産生し、これらがオートクラインフィードバックループで相乗的に作用して、ＩＦＮ−γの産生を増強する（Ｍｉｃａｌｌｅｆ，Ｔａｎｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９７；Ｏｋａｍｕｒａ，Ｋａｓｈｉｗａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。活性化ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの産生は、Ｔｈ１細胞のプライミングプロセスで機能し、このプロセスがＴｈ１適応免疫応答におけるＣＤ８＋ＣＴＬの増殖およびエフェクター機能を支持する（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ  １９９５）。
【００２７】
同種異系細胞の注入に応答して産生されるＴｈ１サイトカインによるＮＫ細胞およびＤＣの活性化は、Ｔｈ１ステアリング環境においてｄｅ−ｎｏｖｏ真菌性抗原の排出やＴ細胞への提示を引き起こす上で不可欠な要素である。ＮＫ細胞は、ウイルス、寄生虫、細菌および真菌に対する防御に不可欠である（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ  １９８９）。免疫無防備宿主では、肺へのＮＫ細胞の補充が、ＩＡに対する効果的な防御機序であることが明らかにされている（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。ＤＣは肺の全体的な抗真菌性免疫耐性を調整することから、アスペルギルスに対するＴｈ１応答の活性化に不可欠であることもｉｎ  ｖｉｖｏ（Ｂｏｚｚａ，Ｇａｚｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．２００２）、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｇｒａｚｚｉｕｔｔｉ，Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００１）で発見されている。
【００２８】
ＤＣは、Ｔｈ１サイトカインの存在下で活性化される。その後、活性化されたＤＣは、真菌性抗原の摂取後に排出リンパ節へ移動する。これらのＤＣは、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ経路を介してこれらの病原体の抗原産物をＴ細胞へ提示する能力が増強される。活性化されたＤＣは、真菌性抗原への曝露後にＩＬ−１２を産生する能力を有しており、また、ＤＣによりＩＬ−１２が産生されることで、Ｔｈ１免疫が誘発されることが明らかにされている（Ｈｅｕｆｌｅｒ，Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。さらに、同種異系細胞の拒絶反応により生じるＴｈ１サイトカインによって活性化される宿主Ｔ細胞は、ＣＤ４０Ｌ表面マーカーを発現することも仮定される。ＣＤ４０Ｌは、活性化されたＴ細胞の表面に発現される。ＣＤ４０Ｌ発現Ｔ細胞によるＤＣのＣＤ４０ライゲーションは、ＤＣによるＩＬ−１２産生の増強を引き起こし、副刺激分子の上方調節と抗原提示能力を増強する（Ｃｅｌｌａ，Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９６；Ｋｅｌｓａｌｌ，Ｓｔｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの相互作用は、Ｔｈ１細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＬ−１２依存性プライミングにきわめて重要な作用である（Ｋｅｌｓａｌｌ，Ｓｔｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。
【００２９】
注入された同種異系細胞によって発現した外来ＭＨＣ抗原は、従来の自らＭＨＣを制限した方法で宿主ＡＰＣにより取り込まれるか（間接的同種異系反応性）、宿主Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって注入細胞の表面で直接認識されるか（直接的同種異系反応性）、それらの両方が行われる。いずれかの機序による宿主の同種異系応答によって、注入細胞の拒絶反応や、同種異系抗原に特異的なＴｈ１適応免疫の確立が生じる（Ｃｉｕｂｏｔａｒｉｕ，Ｔｓａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。アジュバントＴｈ１サイトカインの存在下においては、同種異系抗原に特異的なＴｈ１記憶細胞プールが宿主内で発生することが仮定される。その後、同種異系細胞を注入することで、これらの発生した同種異系抗原に特異的な記憶細胞が活性化される。活性化された記憶細胞は、肺内皮の接着受容体の上方調節を刺激するケモカイン受容体ＣＣＲ５、ＣＣＲ２またはＣＣＲ３を発現し、局所性真菌感染部位への溢出を可能にする（Ｓａｌｌｕｓｔｏ，Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。活性化されたＴｈ１記憶細胞の真菌感染部位における非特異的な浸潤とサイトカインの産生は、真菌に応答する局所的な自然免疫細胞や適応免疫細胞に対して強力な促進作用を及ぼす。
【００３０】
所与の病原体抗原に特異的な高頻度の記憶細胞によって免疫系にバイアス生じると、無関係の病原体への感染時にこれらの細胞が活性化されることで、無関係の感染症の除去を大幅に増強することができる（Ｓｅｌｉｎ，Ｖａｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。肺のウイルス感染症の病因は、無関係の病原体に対する宿主の経験に関係することが明らかにされている（Ｃｈｅｎ，Ｆｒａｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。この免疫学的機序は、「異種免疫」として知られている（Ｓｅｌｉｎ，Ｖａｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；Ｃｈｅｎ，Ｆｒａｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。したがって、同種異系細胞を複数回注入することで記憶プールが生成され、この記憶プールが、同じまたは類似の機序によって抗真菌性（またはその他の日和見微生物）免疫を増強する。
【００３１】
常在感染に対する既存のＴｈ２免疫のＴｈ１免疫への切り替えを引き起こす、こうした上述のような、同種異系抗原に対するＴｈ１免疫の増強による日和見病原体に対する免疫の機序に関する背景情報は、いくつかの所見から裏付けが得られている。例えば、Ｔｈ２免疫応答を誘発するマンソン住血吸虫感染症では、これとは逆の変化が生じる。この応答は、既存のＴｈ１応答の下方調節と、無関係の外来免疫原に対するＴｈ２応答の上昇を引き起こす（Ｋｕｌｌｂｅｒｇ，Ｐｅａｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）。疾患マウスモデルにおけるＴｈ１媒介性病変は、Ｔｈ２免疫を誘発する無関係な寄生虫への同時感染によって改善することができる（Ｗｈａｒｙ  ａｎｄ  Ｆｏｘ  ２００４）。転移細胞が腫瘍抗原を認識できない場合でも、養子免疫療法により、Ｔｈ１サイトカインの産生を介して抗腫瘍活性を誘導することができる。例えば、非免疫原性腫瘍に罹患するマウスにポリクローナルＴｈ１細胞を注入すると、腫瘍の６０〜９０％に拒絶反応が生じた。治癒した動物は、腫瘍に特異的な記憶を生じ、同じ腫瘍の再発を拒絶することができた（Ｓａｘｔｏｎ，Ｌｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。同様に、転移性腫瘍マウスモデルにＰＰＤ特異性Ｔｈ１クローンとＰＰＤ抗原とを同時に注入することで、抗転移作用と抗腫瘍活性が生じた（Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ，Ｈａｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。
【００３２】
真菌に対するＴｈ１免疫を免疫抑制宿主で誘導できることは、アスペルギルスフミガーツスの複数回注入によりコルチゾン免疫抑制マウスの免疫処置を行うことで、Ｔｈ１サイトカイン産生の増大に伴う致死量の分生胞子による再発に対して防御作用がもたらされるという所見（Ｃｅｎｔｅｎｏ−Ｌｉｍａ，Ｓｉｌｖｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００２）によって裏付けられている。さらに、Ｔｈ１免疫は維持することができ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．２００３）、またキメラ宿主でも誘発することができる（Ｉｌｄｓｔａｄ，Ｗｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８５；Ｒｕｅｄｉ，Ｓｙｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８９）。
【００３３】
結論として、ＨＬＡミスマッチ同種異系細胞、好ましくは高密度ＣＤ４０Ｌを発現する活性化Ｔｈ１細胞を、日和見感染症に感染した免疫無防備宿主に複数回注入することで、自然免疫および適応免疫の両免疫系の活性化細胞が、病原体に対するｄｅ−ｎｏｖｏ  Ｔｈ１免疫応答を引き起こす背景の役割を果たすＴｈ１サイトカインの噴出が生じる。
【００３４】
同種異系細胞注入剤は、好ましくはＨＬＡミスマッチ供与体由来の活性化Ｔｈ１細胞である。移植やＧＶＨＤを予防するためには、免疫無防備患者への注入前に、同種異系細胞に放射線を照射しなければならない。
【００３５】
好ましいプロトコルは、１×１０６〜１×１０１０個の同種異系細胞を静脈内注入することによって最初に患者をプライミングするプロトコルである。そして少なくとも７日後に、病原体由来の抗原源（好ましくは凍結／解凍させた微生物）と混合した追加の同種異系細胞を注入し、その混合物を皮内に注入する。必要に応じて、同種異系抗原源のみか、または病原体抗原源と混合した同種異系抗原源のいずれかを、ブースター注射として追加的に皮内または静脈内注入することができる。
【実施例】
【００３６】
動物モデル
アスペルギルスフミガーツスをポテトデキストロース寒天斜面で、２７℃にて５日間継代培養した。０．１％のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を使用して、分生子を培養物から採取した。分生子懸濁液を１３，０００×ｇにて２分間遠心分離し、上清を取り除き、細胞数を数えた。２０μＬ容量の滅菌ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ  ２０でマウス１匹当たり１０７または１０８個の分生子を注入するように、濃度を調節した。酢酸コルチゾン２５０ｍｇ／ｋｇを以下のように４回腹腔内注入することにより、マウスを免疫抑制した：（ａ）感染３日前、（ｂ）感染日、および（ｃ）感染２日後および４日後。アスペルギルスフミガーツス分生子の高接種に感染したコルチゾン治療マウスが致命的感染を発症したのに対して、同接種物に感染した免疫適格性マウスは真菌を制御することができた。
【００３７】
同種異系Ｔｈ１細胞
Ｂａｌｂ／ｃマウスからＴｈ１細胞を調製した。同マウスから脾臓細胞を採取し、ＡＣＫを溶解させた。１０％のＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、および２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０完全培地で、２０ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−２、２０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−７、１０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスＩＬ−１２、１０μｇ／ｍＬの抗マウスＩＬ−４  ｍＡｂ、および３．３ｍＭのＮ−アセチル−システインとともに、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（ＣＤ３／ＣＤ２８）でコーティングされた電磁ビーズをビーズ対Ｔ細胞比３：１で使用して、Ｔｌ細胞を生成した。０．２〜１．０×１０６個／ｍＬに細胞濃度を維持するために、サイトカイン含有完全培地を２日目〜６日目に毎日添加した。ただし、ｒｍＩＬ−１２は、培養日当日にのみ添加した。培養５日後に、細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８でコーティングされた生体磁性粒子（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）と混合し、６日目に使用するために採取した。
【００３８】
（実施例１）
免疫抑制Ｃ５７ＢＬ／６マウスに致死量（分生子１０７個）の真菌を接種した。これらのマウスを未治療対照群、同種異系細胞単回注入群およびワクチン接種群に分けた（各群８匹）。
【００３９】
同種異系細胞単回注入群には、接種後７日目に活性化同種異系ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞（放射線照射済）１×１０６個を静脈内に注入した。
【００４０】
ワクチン接種群には、接種後７日目にプライミング量の活性化同種異系ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞（放射線照射済）１×１０６個を注入した。そして１４日目には、あらかじめ冷凍・解凍サイクルを２回受けた１０６個の分生子に由来する上清と混合した活性化同種異系ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞１×１０４個をマウスの後肢に皮内注入した。
【００４１】
免疫抑制マウスが感染すると、５〜７日後に１００％の死亡率が記録されたのに対して、免疫適格性感染マウスはすべて生存した。死亡マウスの臓器を死体解剖したところ、真菌の侵入や、観察した臓器（脳、肺および腎臓）の破壊が明らかになった。
【００４２】
単回注入を受けたマウスは、感染後に平均２２日（１２〜２８日）間生存した。
【００４３】
ワクチン接種を受けたマウス８匹中５匹は、感染の兆候もなく３０日以上生存した。
【００４４】
これらのデータにより、同種異系細胞を注入することで、真菌の抑制やマウスの生存がもたらされることが実証される。
【００４５】
以上において本発明を好ましい実施形態を参照しながら説明してきたが、本発明の趣旨および適用範囲から逸脱することなく、形式や詳細が変更される場合があることを、当業者であれば理解するであろう。
【手続補正書】
【提出日】平成20年12月11日(2008.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染性病原体を有する免疫無防備宿主における日和見病原体感染症の治療のための、ミスマッチ同種異系細胞を含む組成物であって、前記感染性病原体に対する免疫応答を前記宿主に生じるようにすることを特徴とする、組成物。
【請求項２】
前記感染性病原体がアスペルギルス属のメンバーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ミスマッチ同種異系細胞の注入によりＴｈ１サイトカインの産生がもたらされ；必要に応じて、前記Ｔｈ１サイトカインが、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２もしくはＩＬ−１８、またはそれらのいずれかの組み合わせを主に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記同種異系細胞の注入により樹状細胞の活性化がもたらされる、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記免疫応答によりＣＤ４０Ｌ表面マーカーの発現がもたらされ、必要に応じて、前記ＣＤ４０Ｌの発現により増強樹状細胞ＩＬＩ２の産生がもたらされる、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記免疫応答がＴｈ１細胞の活性化であり、必要に応じて、前記Ｔｈ１細胞の活性化がＴｈ１サイトカインの産生によってもたらされ、必要に応じて、前記免疫応答により、前記宿主が生成する同種異系抗原に特異的なＴｈ１記憶細胞がもたらされる、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記免疫応答がＮＫ細胞およびＴ細胞の活性化をもたらす、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記同種異系細胞が注入前に放射線照射されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記同種異系細胞がＴｈ１リンパ球である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
免疫無防備宿主におけるナチュラルキラー細胞および樹状細胞を活性化するための、同種異系細胞の注入物を含む組成物であって、Ｔｈ１サイトカインの産生をもたらすことを特徴とする、組成物。
【請求項１１】
同種異系細胞注入が、ＣＤ４０Ｌ表面マーカーの発現をもたらす前記Ｔ細胞の活性化をもたらすことを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
出会った同種異系抗原に特異的なＴｈ１記憶細胞プールの発生をもたらす、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記Ｔｈ１記憶細胞が、ケモカイン受容体ＣＣＲ５、ＣＣＲ２もしくはＣＣＲ３、またはそれらのいずれかの組み合わせを発現する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
免疫無防備宿主におけるナチュラルキラー細胞および樹状細胞を活性化するための同種異系細胞注入物であって、Ｔｈ１サイトカインの産生をもたらすことを特徴とする、注入物。
【請求項１５】
免疫無防備宿主における日和見病原体感染症の治療のためのミスマッチ同種異系細胞であって、前記感染性病原体に対する前記宿主による免疫応答を生じさせることを特徴とする、ミスマッチ同種異系細胞。
【国際調査報告】
2009533430.tif 000002