(57)【要約】  本発明は、生体試料における所定の配列および場合により所定の配列との相同配列の数の定量分析のための方法に関し、生体試料の規定量が、所定の配列によって包含されている少なくとも２つの互いに対して非相同の配列を増幅させるのに適合されている少なくとも１つの増幅反応が行われ、その後に得られたさまざまな増幅産物の数が測定され、かつ頻度分布と比較される。さらに、本発明は、生体試料における所定の配列の数の定量分析のためのキット、および特に本発明の方法の実施に適した装置に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料における所定の配列、および場合により前記所定の配列と相同配列の数を定量分析するための、特に細胞当たりの対立遺伝子の絶対コピー数を測定するための方法において、
ａ）生体試料の規定量を提供するステップと、
ｂ）少なくとも１つの増幅反応を行うステップであって、前記少なくとも１つの増幅反応が、所定の配列によって含まれる少なくとも２つの互いに対して非相同の配列を増幅させるように適合されているステップと、
ｃ）得られたさまざまな増幅産物の数を測定するステップと、
ｄ）前記得られたさまざまな増幅産物の数を、ステップｂ）において使用された少なくとも１つの増幅反応と同一反応を別々にそれぞれ繰返し行うことによって、かつ同じ反応条件下に、前記増幅反応において、ステップａ）において言及された量と同量の出発物質が、少なくとも２種類の標準試料とともに、使用された／使用され、前記少なくとも２種類の標準試料はそれぞれ周知の、所定の配列の互いに異なるコピー数を有するほか、さまざまな増幅産物の標準試料当たりに得られる数のその後の測定が得られた／得られる少なくとも１つの頻度分布と比較するステップと
を含んでなる方法。
【請求項２】
前記所定の配列が核酸配列、好ましくは、染色体、遺伝子、または遺伝子断片であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの増幅反応がＰＣＲ反応であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップａ）において、ＰＣＲの実行に際して「アリール・ドロップアウト（ａｌｌｅｌｉｃ  ｄｒｏｐｏｕｔ）」に至る生体試料の量が提供されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）において、提供される生体試料が１００ｐｇ未満のＤＮＡ、好ましくは、５０ｐｇ未満のＤＮＡ、特に好ましくは、１０ｐｇ未満のＤＮＡ、かつ非常に特に好ましくは、５ｐｇ未満のＤＮＡを含んでなることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップａ）において、使用される生体試料が１００個未満の細胞、好ましくは、１０個未満の細胞、特に好ましくは、５個未満の細胞、かつ特に好ましくは１個の細胞を含んでなることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記頻度分布が、所定の配列において互いに異なる規定のコピー数を有する少なくとも２つの標準試料で得られる頻度分布曲線からなり、ここで前記頻度分布曲線の各々が、規定コピー数のさまざまなＰＣＲ産物における０と理論的に可能な最大数との間にある各々の数を得るための可能性を示すことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記頻度分布が、多重測定に際して得られたさまざまＰＣＲ産物の数の所定の配列における互いに異なる規定のコピー数を有する個々の標準試料による平均値の表示、および場合により標準偏差の表示からなることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記頻度分布の測定のために、所定の配列においてそれぞれ互いに異なる周知のコピー数を有する少なくとも３個、好ましくは、少なくとも４個、特に好ましくは、４〜２０個、および非常に特に好ましくは、４〜１０個の標準試料が使用されることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｄ）において使用される頻度分布の作成のために、少なくとも１つの増幅反応が２〜１，０００回、好ましくは、１０〜２５０回、特に好ましくは、５０〜１５０回、および非常に特に好ましくは、約１００回、各々の標準試料について行われることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記頻度分布がステップａ）およびｃ）と同時に行われ、またはすでにステップａ）の前に行われたことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの増幅反応が、非コードＤＮＡ領域から少なくとも２つの互いに対して非相同の配列を増幅させるために適合されていることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの増幅反応が、少なくとも２つの互いに対して非相同の高多型の配列を増幅させるために適合されていることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの増幅反応が、ＳＴＲ配列、ＶＮＴＲ配列、ＳＮＰ配列およびその任意の組合せからなる群から選択される少なくとも２つの互いに対して非相同の配列を増幅させるために適合されていることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの増幅反応が、ドナーのゲノムにおいて対立遺伝子当たりそれぞれ１回だけ行われる少なくとも２つの互いに対して非相同の配列を増幅させるために適合されていることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの増幅反応が、２〜１００、好ましくは、２〜２０、特に好ましくは、３〜１５、および非常に特に好ましくは、５〜１２の互いに対して非相同の配列を増幅させるために適合されていることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記生体試料における所定の配列の測定すべきコピーの数が、０〜１００、好ましくは、０〜２５、特に好ましくは、０〜１０、および非常に特に好ましくは、０〜５であることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記増幅反応の方法および実施ならびに使用される生体試料の量が、前記生体試料が０、１、または少なくとも２個の細胞当たりのコピー数で、または０、１、２、または少なくとも３個の細胞当たりのコピー数で所定の配列を含有するかどうかを測定するために適合されていることを特徴とする請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ステップｂ）において、少なくとも２つの互いに対して非相同の配列を増幅させるために適合されているプライマー対の少なくとも２つの互いに対して非相同の配列の数の１つが使用される、ＰＣＲが行われることを特徴とする請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ステップａ）において、少なくとも２つの互いに対して非相同の配列の数に対応する数が生体試料のサブセットにおいて提供され、ここで各々のサブセットが同一量の生体材料を含有し、かつステップｂ）において、各々のサブセットにより、それぞれプライマー対が使用されるＰＣＲが実行され、ここでさまざまなＰＣＲの使用されるプライマー対が、少なくとも２つの互いに対して非相同の配列を増幅させるために適合されていることを特徴とする請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ステップａ）において、少なくとも２つの、ただし前記少なくとも２つの互いに対して非相同の配列の数に対応する数よりも少ない数が生体試料のサブセットにおいて提供され、ここで各々のサブセットが同一量の生体材料を含有し、かつステップｂ）において、各々のサブセットにより、それぞれ少なくとも１つのプライマー対、ただし前記少なくとも２つの互いに対して非相同の配列に対応する数よりも少ない数がプライマー対において使用され、ここでさまざまなＰＣＲの使用されるプライマー対が、少なくとも２つの互いに対して非相同の配列を増幅させるために適合されていることを特徴とする請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記生体試料が方法ステップａ）を行う前に非特異的ＰＣＲで増幅され、かつ場合によりこうして得られた反応産物がサブセットにおける必要な数に分割されることを特徴とする請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記増幅産物の存在もしくは非存在が、ゲル電気泳動を用いて、ＤＮＡアレイでのハイブリダイゼーション法、ビーズシステム、または他の光学的、電気的、または電気化学的測定を用いて行われることを特徴とする請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記増幅反応後に得られたさまざまな増幅産物の数を測定するために、前記少なくとも２つの互いに対して非相同の配列の存在もしくは非存在、ならびに前記得られた増幅産物から第２の物理的および／または化学的に測定可能なパラメータが測定されることを特徴とする請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも２つの互いに対して非相同の配列がＳＴＲ断片および／またはＶＮＴＲ断片であり、かつ第２のパラメータとして前記得られた増幅産物の長さが測定され、ここで前記得られたさまざまな増幅産物の数が異なる長さを有する前記得られた増幅産物の数に対応することを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記増幅産物の長さがキャピラリー電気泳動で測定されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも２つの互いに対して非相同の配列がＳＮＰ断片であり、かつ第２のパラメータとして前記得られた増幅産物の長さが測定され、ここで前記得られたさまざまな増幅産物の数が異なる配列を有する前記得られた増幅産物の数に対応することを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記増幅産物の配列がＤＮＡ配列決定法またはハイブリダイゼーション法によって測定されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
１つの細胞における所定の核酸配列およびその相同配列の数の定量分析ための方法において、
ａ）生体試料を提供するステップであって、前記生体試料が１〜１００個の細胞、および／または１ｐｇ〜１００ｐｇの染色体ＤＮＡを含んでなるステップと、
ｂ）少なくとも１つのＰＣＲを行うステップであって、前記少なくとも１つのＰＣＲが、所定の配列によって包含され、かつＳＴＲ断片、ＶＮＴＲ断片、ＳＮＰ断片および任意のその組合せからなる群から選択されている少なくとも２つの互いに対して非相同の配列を増幅させるために適合されているステップと、
ｃ）前記得られたさまざまな増幅産物の数を測定するステップと、
ｄ）前記得られたさまざまな増幅産物の数を、ステップｂ）において使用された少なくとも１つのＰＣＲと同一のＰＣＲを別々にそれぞれ繰返し行うことによって、かつ同じ反応条件下に、前記ＰＣＲにおいて、ステップａ）において言及された量と同量の出発物質が、少なくとも２種類の標準試料とともに使用され、前記少なくとも２種類の標準試料はそれぞれ周知の、所定の配列の互いに異なるコピー数を有するほか、さまざまな増幅産物の標準試料当たりに得られる数のその後の測定が得られた少なくとも１つの頻度分布と比較するステップと
を含んでなる方法。
【請求項３０】
ステップｂ）のＰＣＲにおけるパラメータが、少なくとも２つの互いに対して非相同の配列の各々の陽性増幅反応の相対頻度がそれぞれ少なくとも実質的に同一であるように選択されることを特徴とする請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ステップｂ）のＰＣＲにおけるパラメータが、前記少なくとも２つの互いに対して非相同の配列の各々に対する少なくとも１つの増幅反応の陽性増幅反応の相対頻度が０．２〜１未満、好ましくは、０．４〜０．６、ならびに特に好ましくは、約０．５であるように選択されることを特徴とする請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ステップｂ）に記載の少なくとも１つの増幅反応と同時に増幅反応が同一の条件下に対照試料で行われることを特徴とする請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
生体試料として極体、好ましくは、第１減数分裂後の極体が使用されることを特徴とする請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
生体試料における所定の配列および場合によりその相同配列の数の定量分析、特に請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットにおいて、
ａ）少なくとも１つのＰＣＲにおいて、所定の配列によって包含されている少なくとも２つの互いに対して非相同の配列を増幅させるために適合されている少なくとも２つのプライマー対と、
ｂ）場合によりＰＣＲバッファーと、
ｃ）前記少なくとも１つのＰＣＲの実行のためのプロトコールと、
ｄ）前記プロトコールｃ）において被験生体試料のための所要の少なくとも１つの増幅反応と同一の反応を別々にそれぞれ繰返し実行することによって、かつ同じ反応条件下に、前記増幅反応において、前記プロトコールｃ）の所要量と同量の出発原料が、少なくとも２種類の標準試料とともに使用され、前記少なくとも２種類の標準試料がそれぞれ周知の、所定の配列の互いに異なるコピー数を有するほか、さまざまな増幅産物の標準試料当たりに得られる数のその後の測定が得られた少なくとも１つの頻度分布と
を含んでなるキット。
【請求項３５】
前記少なくとも２つのプライマー対が、少なくとも１つのＰＣＲにおいて、非コードＤＮＡ領域からの少なくとも２つの互いに対して非相同の配列、好ましくは、高多型の配列、特に好ましくは、ＳＴＲ配列、ＶＮＴＲ配列、ＳＮＰ配列および任意のその組合せからなる群から選択される、少なくとも２つの互いに対して非相同の配列を増幅させるために適合されていることを特徴とする請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記ａ）による少なくとも２つのプライマー対および／またはｃ）によるプロトコールが、前記少なくとも１つのＰＣＲにおいて、２〜１００、好ましくは、２〜２０、特に好ましくは、３〜１５、および非常に特に好ましくは、５〜１２の互いに対して非相同の配列を増幅させるために適合されていることを特徴とする請求項３４または３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記ａ）による少なくとも２つのプライマー対および／またはｃ）によるプロトコールが、前記少なくとも２つの互いに対して非相同の配列の各々に対する少なくとも１つのＰＣＲの陽性増幅反応の相対頻度が、０．２〜１未満、好ましくは、０．４〜０．６、ならびに特に好ましくは、約０．５であるように適合されていることを特徴とする請求項３４〜３６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３８】
前記ｄ）による少なくとも１つの頻度分布および／またはｃ）によるＰＣＲのプロトコールが、前記生体試料が０、１、または少なくとも２個の細胞当たりのコピー数で、または０、１、２、または少なくとも３個の細胞当たりのコピー数で所定の配列を含有するかどうかを測定するために適合されていることを特徴とする請求項３４〜３７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３９】
生体試料における所定の配列および場合によりその相同配列の数の定量分析、特に請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法を実施するための装置において、
ａ）固形担体、好ましくは、ガラス担体と、
ｂ）少なくとも１つのＰＣＲにおいて、所定の配列によって包含されている少なくとも２つの互いに対して非相同の配列を増幅させるために適合されている前記担体上に固定化された少なくとも２つのプライマー対と、
ｃ）少なくとも２種類の標準試料とともに少なくとも１つの増幅反応を別々にそれぞれ繰返し行うことによって、前記少なくとも２種類の標準試料はそれぞれ周知の、所定の配列の互いに異なるコピー数を有するほか、さまざまな増幅産物の標準試料当たりに得られる数のその後の測定が得られた、記憶された頻度分布、または
ｄ）前記担体上に空間的に互いに分離されて固定化された少なくとも２つの標準試料であって、前記少なくとも２種類の標準試料がそれぞれ周知の、所定の配列の互いに異なるコピー数を有する少なくとも２つの標準試料と
を含んでなる装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料における所定の配列、および場合により所定の配列との相同配列の数の定量分析、特に細胞当たりの対立遺伝子の絶対コピー数の測定のための方法、生体試料における所定の配列の数の定量分析のためのキット、ならびに特に本発明による方法の実施に適した装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子診断において、配列の定量、特に細胞当たりの核酸配列のコピー数の定量分析のための方法がつねに重要な役割を得ている。多数の部分的に重度の疾患がゲノムにおける核酸配列の正常なコピー数の異常によって引き起こされるため、コピー数の確実な測定によって特定の染色体または特定の遺伝子断片に対応する疾患がすでに発達の早期段階で確実に診断される。
【０００３】
完全な染色体のコピー数の多さが原因となる部分的に重度の奇形の例が、トリソミー１８（エドワード症候群）、トリソミー１３（パトー症候群）、ならびにトリソミー２１（ダウン症候群）である。これらの疾患の各々の場合、細胞当たりの適切な染色体１８、１３、もしくは２１のコピー数は３であるのに対して、健康な個人は細胞当たりの前述の染色体の２つのコピーのみを有する。３つのすべての場合において、当該染色体のコピー数の増加はきわめて重度の奇形に至る。トリソミー２１の保有者はその発達が大幅に阻害され、かつ部分的に重度の奇形を有するが、トリソミー１８およびトリソミー１３の保有者はほとんどの場合、１歳以内に死亡する。
【０００４】
完全な染色体のコピー数の多さがに原因となる疾患に加えて、遺伝子または遺伝子断片のコピー数の変化に基づく多数の疾患も公知である。
【０００５】
心身の能力の崩壊の増大とともに異常な不随意運動によって特徴づけられる進行性に経過する神経変性疾患であるハンチントン病の原因は、測定されたモチーフ（ＣＡＧ）の３８以上のコピーの連続接続とされるが、ここで疾患形成の素因はゲノムにおけるこのモチーフの繰返しの数とともに増大する。ヒトにおける不安定なトリヌクレオチド配列の別の例がケネディ症候群および脊髄小脳失調症−１である。
【０００６】
さらに、特定のプロトオンコジーンが遺伝子増幅によってゲノムにおいて増殖しうることが周知である。この種の増幅は染色体組において、しばしば、いわゆる「二重微小染色体（ｄｏｕｂｌｅ  ｍｉｎｕｔｅｓ）」（Ｄ．Ｍ．）または「均質染色部位（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｌｙ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ）」（ＨＳＲ）として認識されている。遺伝子コピー数の大幅な増加に基づき、細胞において一部を成すタンパク質はきわめて大量に産生されうるが、これは―個々の遺伝子それ自体の変化なしに―細胞増殖の活性化の強化を可能にする。詳しくは、ｍｙｃ−プロトオンコジーンは増殖の影響を特にしばしば受けるとされる。
【０００７】
生体試料における配列コピーの定量化のための方法の必要に基づき、過去において多数の適切な方法が提案された。
【０００８】
核酸配列の存在および非存在に関する少なくとも１つの記載、およびこの方法の実施に依存して細胞当たりの当該核酸配列のコピー数の条件付きの推論を可能にする基本的な定量化法の１つが、いわゆるＦＩＳＨ方法（蛍光インシトゥーハイブリダイゼーション（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ））である。この方法では、被験生体試料が、適切な前処置、すなわち、ホルムアミドによる変性、ならびにプレハイブリダイゼーションの後、事前にそれぞれさまざまな蛍光色素で標識された１つもしくは複数の種類のプローブで、生体試料におけるその相同配列を有するプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下にインキュベートされる。ハイブリダイゼーション後に試料は洗浄され、ここで非特異的ハイブリダイゼーションシグナルは除去される。最後に標本の蛍光シグナルは蛍光顕微鏡で評価される。各々存在する蛍光シグナルは、適切な蛍光マーカーを備えたプローブに適切な配列の存在を示す。蛍光の強度は、生体試料における配列コピーの数の条件付きの推論を可能にしうる。他方、使用された蛍光標識プローブの１つの波長において、シグナルが得られず、または規定閾値より下方にあるシグナルのみが得られると、生体試料における適切なプローブに対応する配列の非存在が推論されうる。しかし、適切な蛍光シグナルの非存在は、証明すべき配列の適切な結合位置において突然変異および／または微小欠損が起こったこと、なぜプローブが選択されたハイブリダイゼーション条件下にもはや所定の配列に結合しないのかという点でも根拠づけられうる。前述の方法の別の欠点は、望ましくない、かつ偽結果に至る交差ハイブリダイゼーションが一度も完全に排除できていない点にある。さらに、この方法は、一方では強制的に蛍光色素を使用する必要があるため、他方では、蛍光顕微鏡などコストのかかる装置を必要とするために比較的高価である。最後に、この方法の意義は、完全に甚大な程度に使用されるプローブの品質に依存し、確実な結果は、９０％超の効率を有するプローブがそれに対応する結合位置にハイブリダイズする場合にしか得られない。したがって、プローブの誤った選択、さらに不十分なハイブリダイゼーション条件も偽結果に至る。この方法の別の欠点は、一般に評価可能な蛍光シグナルを得るために、最小量の生体試料が使用されなければならない点にある。さらに、配列は最小限の長さを超えてはならない。さらに、有効な結果には、ハイブリダイゼーションに使用できた多数の細胞を分析する必要がある。この理由からＦＩＳＨ分析は個々の細胞診断には適当ではない。
【０００９】
他の蛍光に基づく方法がＣＧＨ分析（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（比較ゲノムハイブリダイゼーション））である。この方法では被分析試料の核酸は色素１で完全に標識される。標準試料の核酸の同一量は色素２で標識される。両方の反応成分は、いっしょに拡げた分裂中期の染色体組上でハイブリダイズされるが、ここで両方の反応成分に含有される配列は結合位置の周囲で拡がった染色体に競合する。実質的にすべてのハイブリダイゼーション位置では色素１の色素２との比が１：１のように適応される。分析すべき試料が増幅された領域（標準の通常のコピー数より多く）を含有すると、色素１はこのハイブリダイゼーション位置で優勢を占める。被験試料における欠失の場合、色素２のみがこのハイブリダイゼーション位置で検出される。標準測定は分析すべき試料の配列の頻度に関する相対記載を可能にする。
【００１０】
特殊な変形がアレイＣＧＨであり、ここでは染色体ではなく、その物理的アドレスがゲノムにおいて周知である固定化配列上でハイブリダイズされる。
【００１１】
核酸配列の定量化のための別の周知の方法がリアルタイムＰＣＲ法であり、ここではＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、すなわちポリメラーゼ連鎖反応）が蛍光標識プライマーにより実施され、周期数に依存した蛍光シグナルの増大が観察される。閾値−ＰＣＲ周期（閾値周期でもある）は、蛍光シグナルが顕著に背景蛍光から際立って見えるとともにＰＣＲ産物形成が指数関数的に経過する反応時点に分類される。これは増加すべきＤＮＡ配列の開始コピーと相関する。このようにして、ＤＮＡ試料はＤＮＡ連続希釈との比較を使用して相対的に定量化される。しかし、この方法の欠点は、出発物質の量を任意に縮小できないことであるが、それは出発物質として少ない開始分子、例えば、１０〜１００コピーにより指数的関数的な増幅に基づき確率的誤りがきわめて大きくなり、これにより定量的記載が不可能になるためである。さらに、この方法でも蛍光強度の測定のためにコストのかかる高価な装置を必要とする。
【００１２】
核酸配列の定量分析のための新しい方法がＱＦ−ＰＣＲ（定量的蛍光ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ＰＣＲ）であり、この場合、ＰＣＲ成分において同時に多数のＰＣＲがさまざまな蛍光標識されたプライマーを使用して実施され、かつ蛍光標識されたＰＣＲ産物はその後に自動ＤＮＡスキャナでレーザー密度計測的に分析される。この方法の場合も相対定量化法であるが、それは同時にＰＣＲ実験で増幅される２つのＰＣＲ産物の比較が得られるからである。２つの同時に増幅されたＰＣＲ産物の有意な定量的比較が行えるために、両方のＰＣＲ部分反応が同一の効率で進行し、かつ反応産物の蛍光強度が指数関数的な産物増幅の時点で定量的に分析される必要がある。
【００１３】
羊水試料における２１番染色体、１８、１３、Ｘ、およびＹの確認可能な数的異常のためのＱＦ−ＰＣＲ法に基づく方法が、ルッチーニ（Ｌｕｃｃｈｉｎｉ）らによって「Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｅｎ（科学情報）」、２００４年９月号に記載されている。この方法は、蛍光標識されたプライマーによる繰返しおよび多型ＳＴＲ（縦列型反復配列（ｓｈｏｒｔ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔｓ））配列のインビトロＰＣＲ増幅に基づく。ＰＣＲの終了後、増幅されたＰＣＲ産物はキャピラリー電気泳動を用いて定量化される。この方法に際して染色体特異的ＳＴＲシステムが使用されると、得られたさまざまなＰＣＲ産物の数から適切な染色体のコピー数の結論が推論される。例えば、染色体特異的ＳＴＲシステムによる反応に際してキャピラリー電気泳動で３つのピークが得られ、ここでピーク高さが互いに１：１：１であると、検査された個人は適切な染色体の３種類の対立遺伝子（３対立遺伝子トリソミー）を含有する。他方、この方法に際して２つのピークが得られ、ここでピークの比が互いに２：１であると、検査された個人は細胞当たり染色体の２つの同一対立遺伝子ならびに染色体の他の対立遺伝子（２対立遺伝子トリソミー）を有する。同一のピーク高さを有する２つのピークのみが得られる場合、その個人は２つの対立遺伝子を有し、トリソミーは存在しない（ヘテロ接合性の場合）。しかし、１つのピークのみが得られる場合、この方法で、トリソミーの存在または非存在に関して記載することは不可能である。なぜなら、この結果が単一遺伝子のトリソミーの場合および単一遺伝子のダイソミー（Ｄｉｓｏｍｉｅ）の場合に得られるからである。トリソミー１３の証明のためのこの技術に基づく方法が、独国ツ特許公開第１０１０２６８７Ａ１号明細書にも開示されている。単一対立遺伝子のダイソミーと単一対立遺伝子のトリソミーとの間の区別も可能とするために、この方法では、ＰＣＲにより３種類の染色体１３特異的ＳＴＲ−ＤＮＡ領域を増幅させることが提案される。しかし、この方法も蛍光標識されたプライマーを使用しなければならないという欠点を有する。さらに、この方法でも最小量のＤＮＡの使用を必要とするが、さもなければ指数関数的な増幅に基づき確率的な誤りがきわめて大きくなり、かつ定量的記載がもはや不可能だからである。前述の方法の他の欠点は最終的に、この方法がいくらかの信頼性をもって狭いＰＣＲウィンドウでのみ機能する点にあるが、それはこのウィンドウにおいてのみピーク高さが出発物質の比率に比例しているからである。さらに、この方法も絶対蛍光強度が測定されなければならないという欠点を有する。
【００１４】
国際公開第２００４／０２７０８９号パンフレットにおいて、多くの互いに制限可能なサブセット遺伝物質を含んでなる遺伝物質の遺伝情報をＰＣＲを用いて増幅させ、かつ細胞当たりのさまざまな染色体のコピー数を測定するための方法が開示されており、ここでＰＣＲにおいて、所定の長さを有する測定すべき染色体の各々に特異的な目的配列のための蛍光標識されたプライマーで増幅される。検出すべき染色体のコピー数に関する記載を得るために、それぞれの染色体について得られたＰＣＲ産物の蛍光強度が測定され、かつ各々の染色体の目的配列について得られた強度がそれぞれ比較される。例えば、２１番染色体に特異的なＰＣＲ産物で得られた強度が、染色体１に特異的なＰＣＲ産物で得られた強度と同一、または少なくともほぼ同一であると、前述の染色体の両方が生体試料において同一のコピー数で存在すると記載される。したがって、この方法も強制的な蛍光標識プライマーの使用を前提としており、評価のために個々の得られた増幅産物の蛍光強度の定量的把握を必要とする。したがって、この方法もある程度信頼性のある狭いＰＣＲウィンドウでのみ機能するが、それはこのウィンドウでのみピーク高さが出発物質の比率に比例しているからである。
【００１５】
上述の方法のいずれによっても、例えば、生体試料に存在する所定の配列および場合によりその相同配列における１０コピー以下での正確な絶対コピー数、例えば、細胞当たりの対立遺伝子の絶対的に正確な絶対コピー数を測定することはできない。それは別として、この方法では強制的に蛍光標識プライマーもしくはプローブが使用されなければならず、その結果、評価のために高価な装置が必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の課題は、生体試料における所定の配列の数の定量分析、特に所定の配列およびその相同配列の数、例えば、細胞における対立遺伝子の数の定量分析のための方法を提供することであるが、この方法は、簡単にかつ低コストで実施可能であり、かつ被験生体試料に存在する所定の配列の数が、例えば、１０以下と少ない場合でも確実な結果を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明によれば、この課題は、生体試料における所定の配列および場合によりその相同配列の数の定量分析、特に細胞当たりの対立遺伝子のコピーの絶対数の測定のための方法によって解決され、この方法は次のステップ、すなわち、
ａ）生体試料の規定量を提供するステップと、
ｂ）少なくとも１つの増幅反応を行うステップであって、少なくとも１つの増幅反応が、所定の配列によって含まれる少なくとも２つの互いに対して非相同の配列を増幅させるように適合されているステップと、
ｃ）得られたさまざまな増幅産物の数を測定するステップと、
ｄ）得られたさまざまな増幅産物の数を、ステップｂ）において使用された少なくとも１つの増幅反応と同一の反応を別々にそれぞれ繰返し行うことによって、かつ同じ反応条件下に、増幅反応において、ステップａ）において言及された量と同量の出発物質が、少なくとも２種類の標準試料とともに、使用された／使用され、少なくとも２種類の標準試料はそれぞれ周知の、所定の配列の互いに異なるコピー数を有するほか、さまざまな増幅産物の標準試料当たりに得られる数のその後の測定が得られた／得られる少なくとも１つの頻度分布と比較するステップとを含んでなる。
【００１８】
本発明の趣旨における相同配列について、同一の増幅条件下に試料からのプライマー対で増幅可能である配列と解されるが、それに対して非相同配列は、同一の増幅条件下に試料からのプライマー対で増幅可能ではない。
【００１９】
従来技術による方法とは異なり、本発明による方法に際して、例えば、定量的ＰＣＲ、ＱＦ−ＰＣＲ、ＦＩＳＨ、およびＣＧＨに際しては、ＰＣＲ産物の絶対蛍光強度は測定されず、ならびにＦＩＳＨおよびＣＧＨの場合におけるように、対照試料もしくは標準試料の蛍光強度と比較されず、得られたさまざまなＰＣＲ産物の数が測定され、かつこれらの数が頻度分布と比較されるだけである。この点で、本発明による方法においては蛍光標識プライマーを使用する必要がない。しかし、これらが得られたさまざまなＰＣＲ産物の数の検出に使用される限り、得られた蛍光標識ＰＣＲ産物の蛍光強度は費用をかけて測定する必要がなく、使用される蛍光色素に対応する波長に際して場合により規定閾値を超えている蛍光が存在するか否かを評価する必要があるだけである。したがって、本発明による方法は、蛍光の定量的検出のためのコスト高の装置なしに簡単かつ低コストで実施される。
【００２０】
本発明による方法の原理は、少なくとも２つの標準試料の使用による少なくとも１つの増幅反応において得られるさまざまな増幅産物の数の、所定の配列で得られた頻度分布の周知の互いに異なるコピー数との比較に基づくが、ここで少なくとも２つの標準試料は、本発明による方法のステップａ）において提供された量と同量の頻度分布の受容のために、増幅反応の本発明による方法のステップｂ）におけるのと正確に同一の条件下に互いに別々にかけられたとともに、各々の増幅反応で得られたさまざまな増幅産物の数が測定された。本発明によれば、その受容のために少なくとも２つの標準試料の各々について行われた増幅反応が繰返され、例えば、１０回、もしくは１００回行われる。頻度分布の受容のための増幅反応において所定の配列の周知のコピー数を有する出発物質が使用されるため、この比較から確実に被験生体試料における所定の配列のコピー数が推論されうる。
【００２１】
本発明による方法の別の利点は、主として生体試料の出発物質の増幅条件および量に無関係であることにある。たとえ（例えば、増幅反応としてのＰＣＲの場合）不十分な増幅条件、例えば、ＰＣＲにおける少なすぎる周期数、またはプライマー結合位置に結合するプライマーの不十分な使用時になどの条件に基づく場合でも、少なくとも１つの増幅反応で理論的に得られるＰＣＲ産物の一部分のみが得られ、したがって、これは、同じパラメータが少なくとも１つの頻度分布の受容に際しても使用されたため、得られたコピー数結果を歪曲することはない。したがって、本発明による方法において、少ないＤＮＡ開始量の使用に際しても指数関数的な増幅に基づき歪曲する確率的誤りの定量的結果は決して出現しない。なぜならこの種のあり得る効果は頻度分析によって均等化されるためである。したがって、本発明による方法は、特にきわめて少量の出発物質にも適している。
【００２２】
基本的に本発明による方法は、所定の配列の種類とは無関係に生体試料における所定の配列の数の定量分析に適している。好ましくは、所定の配列は核酸配列であるが、しかし、基本的に、本発明による方法でタンパク質またはペプチドの異なる配列変化を証明することも考えうる。特に優れた結果は、所定の配列が染色体、遺伝子、または遺伝子断片である場合に得られる。
【００２３】
少なくとも１つの増幅反応の方法に関しても、本発明による方法は限定されておらず、それどころか、それにより配列変化が証明されうる考えうるすべての増幅反応が使用されうる。少なくとも１つの増幅反応としてＰＣＲを行うことが有利であると証明されたが、それはＰＣＲが簡単にかつ比較的迅速に、そして少ない技術費で行われ、かつ適切なプライマー対の選択によって任意の核酸配列が生体試料から増幅されうるからである。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明による方法において、所定の配列によって包含されている少なくとも２つの互いに対して非相同の配列を増幅させるのに適合したステップｂ）による少なくとも１つの増幅反応において、ＰＣＲを行う際「アリール・ドロップアウト」に至るような少量の生体出発物質が使用される。「アリール・ドロップアウト」について当業者は、少量のＤＮＡ出発物質を原因とするＰＣＲ増幅後の対立遺伝子のＤＮＡ断片の損失と解する。例えば、染色体ＤＮＡの試料など異種ＤＮＡ混合物において、特定の対立遺伝子がたびたび示されている。ＰＣＲは指数関数的に増幅されるので、この不均一分布はきわめて強化されうるため、低密度の対立遺伝子が高密度の対立遺伝子と比べきわめて少なく示され、これはもはや検出されない。「アリール・ドロップアウト」を回避するために、例えば、法医学検査に際しては、つねに一定のナノグラム範囲にあるＤＮＡ材料の開始量が使用され、一般に確実な結果を得る。それと異なり、本発明による方法のこの実施形態においては、以下に詳しく説明するように、かかる最小量未満の出発物質で作業することも有利である。
【００２５】
特に優れた結果は、この実施形態においては、少なくとも１つの増幅反応に、１００ｐｇ未満のＤＮＡ、例えば、染色体ＤＮＡを含有する生体試料が使用される場合に得られる。特に好ましくは、少なくとも１つの増幅反応において、５０ｐｇ未満のＤＮＡ、特に好ましくは、１０ｐｇ未満のＤＮＡ、かつ非常に特に好ましくは、５ｐｇ未満のＤＮＡが出発物質として使用され、ここで基本的に、より少ない塩基対を核酸が生体試料において含有するほど、少ないＤＮＡが使用されうるとともに使用されるべきである。逆に細胞においては、前述のＤＮＡ量は１００個未満の細胞、好ましくは、１０個未満の細胞、かつ特に好ましくは、５個未満の細胞の少なくとも１つの増幅反応における使用に対応する。詳しくは、生体出発物質としての個々の細胞の使用に際しても優れた結果が得られる。
【００２６】
例えば、法医学において使用される方法とは異なり、本発明による方法は統計的背景に基づき、少なくとも１つの増幅反応において、少なくとも２つの互いに対して非相同の配列の各々が実際に増幅されることは決して望ましくない。それどころか、まさに増幅反応のパラメータの設定、すなわち、出発物質としてきわめて少ないＤＮＡ量、場合によりプライマー結合位置に使用されるプライマーの適した小さい周期数および／またはきわめてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の使用によって、少なくとも２つの互いに対して非相同の配列の特定の割合のみが実際に増幅されることとなる。頻度分布は周知のコピー数を有する少なくとも２つの標準試料の同じ増幅条件下に増幅反応を繰返し行うことによってなされ、そこから確実に被験生体試料における所定の配列のコピー数が推論されうる統計的分布が得られる。この統計的背景は以下、ＰＣＲの例で詳しく説明される。
【００２７】
本発明による方法により、例えば、測定される染色体、例えば、２１番染色体が、細胞において、０、１、もしくは２以上のコピー数で存在するかどうかを測定される。このために、３種類の標準試料の使用により頻度分布が受容され、ここで第１の標準試料として２１番染色体のコピーを含有しない細胞、第２の標準試料として２１番染色体の１つのコピーを含有する細胞、および第３の標準試料として２１番染色体の２つの同一コピーを含有する細胞が使用される。標準試料の各々はそれぞれ同じプライマー対により、かつ同一のＰＣＲ条件下にＰＣＲをかけ、ここで各々のＰＣＲにおいて８種類のプライマー対が使用されるが、ここで８つのプライマー対は、２１番染色体からそれぞれ１つの異なる特異的配列を増幅させるために適合されている。すべてのＰＣＲは、それぞれ正確に同一の条件下で行われ、ここで３つの標準試料の各々についてそれぞれ１００の実験が行われる。各々のＰＣＲ後、得られたさまざまなＰＣＲ産物の数が測定され、例えば、次の頻度分布が得られる。
【００２８】
【表１】
2009508500.tif 000002
【００２９】
個々のＰＣＲにおいて、２１番染色体からの８種類の特異的配列を増幅させるのに適合されているそれぞれ８種類のプライマー対が使用されたので、ｎ＝０、すなわち、２１番染色体がない細胞の場合の得られたさまざまなＰＣＲ産物の理論的に可能な最大数は０であり、ｎ＝１、すなわち、１つの２１番染色体を有する細胞の場合、８であり、かつｎ＝２、すなわち、２１番染色体の２つの同一のコピーを有する細胞の場合（ホモ接合性の場合）、同じく８である。ヘテロ接合性の場合、２倍体の細胞における増幅物の理論的に可能な最大数は１６であり、それによって、このシステムでは大幅な情報の回復が得られる。しかし、この思考例において、各々のＰＣＲにおける頻度分布受容の受容に際して、１つの細胞のみが、したがって、ＰＣＲの実施に際して「アリール・ドロップアウト」に至る量が使用されたため、生体標準試料に含有する対立遺伝子のいくつかは増幅されない。さらに、プライマー配列ならびに周期数の選択によって、個々のＰＣＲの各々の効率は１の理論的に達成可能な限界未満の値に設定される。この理由により、表１に再現された頻度分布において、２１番染色体の１つのコピーを有する試料（ｎ＝１）でも２１番染色体の２つのコピーを有する試料（ｎ＝２）でもさまざまな増幅物の理論的に最大限可能な数が得られない。それどころか、ｎ＝１、すなわち、コピー数１を有する標準試料の場合、１００回実施されたＰＣＲのうち２回で全く増幅産物が得られず、１００回実施されたＰＣＲのうち１３回で１つのみのＰＣＲ産物、１００回実施されたＰＣＲのうち２４回で２種類のＰＣＲ産物、１００回実施されたＰＣＲのうち５７回で３種類のＰＣＲ産物、１００回実施されたＰＣＲのうち３回で４種類のＰＣＲ産物、かつ１００回実施されたＰＣＲのうち１回で５種類のＰＣＲ産物が、理論的に最大限８種類のＰＣＲ産物の代わりに得られる。したがって、この場合（ｎ＝１）、３種類のＰＣＲ産物の最大値を有するガウス分布に類似した頻度分布曲線が生じる。類似の頻度分布曲線は、染色体の２つのコピー（ｎ＝２）を有する標準試料が得られた場合にも得られるが、頻度分布曲線の最大はより高い値に、すなわち、ｎ＝１の場合の３種類の増幅物からｎ＝２の場合の５〜６種類のＰＣＲ産物へ移動している。２１番染色体のコピーが０である標準試料が使用された第３のケースについては、そのケースの９８％においても増幅物は得られず、かつそのケースの２％においてのみ１つの増幅物が得られる。最後に挙げたケースにおいて、試料には２１番染色体が含有されていなかったので、ＰＣＲ産物が得られたこの２％がアーチファクトでなければならない。
【００３０】
頻度分布の受容後、本発明による方法は２１番染色体の未知のコピー数を有する生体試料で実施される。このために最初に細胞が提供され、その後にこれがＰＣＲに使用されるが、これは、例えば、キャピラリー電気泳動により生体試料によるＰＣＲにおいて得られたさまざまなＰＣＲ産物の数が測定される前に、頻度分布の受容に際してのＰＣＲと全く同じ条件下に実施される。最後に得られたさまざまなＰＣＲ産物の測定された数が表１に再現された頻度分布と比較される。
【００３１】
ＰＣＲにおける被験細胞によりＰＣＲ産物が得られないと、表１による頻度分布から、試料におけるコピー数が９５％より多い可能性が０であることが推定される。ＰＣＲにおいて２もしくは３種類のＰＣＲ産物が得られる限りでは、被験試料における２１番染色体のコピー数は要求される確実性で１であるのに対し、５個以上のＰＣＲ産物が得られる場合のコピー数は要求される確実性で２である。ＰＣＲにおいて１つもしくは４種類のＰＣＲ産物が得られる場合においてのみ、この具体的な思考例において、要求される信頼性で、いくつのコピーが試料における２１番染色体に含有されているか決定されず、１つのＰＣＲ産物の場合に２１番染色体の０または１つのコピーが存在し、かつ４種類のＰＣＲ産物の場合に１つまたは２つのコピーが存在することのみ記載される。この場合にも要求される確実性で決定できることが望まれると、ＰＣＲプロトコールの変更によって、またはさまざまなＰＣＲの数の増加によって、個々の頻度分布曲線を互いに分離することができる。
【００３２】
前述の実施形態において、頻度分布は、規定の、所定の配列、この場合、２１番染色体の互いに異なるコピー数を有する３つの標準試料で得られた頻度分布曲線からなるが、ここで３つの頻度分布曲線の各々は、規定のコピー数に対する０と理論的に可能な最大数との間にあるさまざまなＰＣＲ産物の各々を得るための可能性を示す。当業者が認めるように、頻度分布は、例えば、所定の配列の０および１つのコピーを有する標準試料で得られた２つのみの頻度分布曲線も包含し、または４つの頻度分布曲線もしくはそれ以上も包含しうる。特に優れた結果は、頻度分布の測定のために、所定の配列のそれぞれ互いに異なる周知のコピー数を有する４〜２０個および特に好ましくは、４〜１０個の標準試料が使用される場合に得られる。
【００３３】
前述の実施形態の代わりに、頻度分布は個々の標準試料により多重測定に際して得られたさまざまなＰＣＲ産物の数の平均値の表示からもなりうる。前述の表１に関して示されたケースについては以下となりうる。
【００３４】
【表２】
2009508500.tif 000003
【００３５】
好ましくは、この実施形態による頻度分布において標準偏差も平均値で示される。
【００３６】
本発明による方法は統計的方法であるため、理論的に可能なさまざまな増幅産物のすべてが実際には得られず、かつ評価が被験生体試料で得られる結果の統計的頻度分布との比較によって行われ、本発明による方法のステップｄ）による少なくとも１つの頻度分布の受容のために、標準試料当たりの少なくとも１つの増幅反応は好ましくは、２〜１，０００回、特に好ましくは、１０〜２５０回、非常に特に好ましくは、５０〜１５０回、およびきわめて好ましくは、約１００回行われることが望ましい。頻度分布の標準試料当たりの行われた増幅反応の数が多いほど、統計的確実性が高いが、実験費用も高くなる。したがって、好ましくは、ステップｄ）において使用される頻度分布の作成のために、所定の配列の周知の数を有する標準試料当たりの少なくとも１つの増幅反応は、５０〜１５０回行われ、これにより高い統計的確実性が保証され、かつ他方では実験費用が比較的少ない。
【００３７】
頻度分布の測定は、方法ステップａ）〜ｃ）の実施前に行われるか、またはそれと同時にも行われうる。
【００３８】
説明されているように、本発明による方法は、例えば、特殊な遺伝子または染色体の所定の配列の数を生体試料において測定するために適しているだけではなく、特に細胞当たりの所定の配列ならびにその相同配列の数の測定にも適しているが、ここで相同配列は、好ましくは、対立遺伝子である。本発明の最後に挙げた実施形態では、ステップｂ）による少なくとも１つの増幅反応において、少なくとも１つの対立遺伝子特異的配列を増幅させることが必要であるが、この配列については、２つの対立遺伝子間で高度に類似もしくは相同であるが、同一ではない配列と解される。ステップｃ）において得られたさまざまなＰＣＲ産物の数が測定され、かつそれによってさまざまな対立遺伝子の数が結果に影響を及ぼすので、頻度分布との比較によって、個々の対立遺伝子のコピー数が測定されうる。したがって、ステップｂ）における少なくとも１つの増幅反応は、好ましくは、非コードＤＮＡ領域からの少なくとも２つの互いに対して非相同の配列が増幅されるように解される。もちろん、非コードＤＮＡ領域は実質的にコーディング領域よりも多型であり、そこで対立遺伝子特異的配列を増幅させる可能性は大きい。
【００３９】
発明思考の展開において、少なくとも１つの増幅反応は、少なくとも２つの互いに対して非相同の高多型の配列を増幅させるために適合されることが提案される。
【００４０】
詳しくは、少なくとも１つの増幅反応が、ＳＴＲ配列、ＶＮＴＲ配列、ＳＮＰ配列およびその任意の組合せからなる群から選択される少なくとも２つの互いに対して非相同の配列を増幅させるために適合されている場合、優れた結果が得られる。ＳＴＲもしくは縦列型反復配列は高多型の配列であり、これらは２〜４ｂｐの長さの繰返し単位のみよりなり、かつ個々の個人間で高いばらつきを有する。それと異なり、ＶＮＴＲ配列もしくは反復配列の可変ランバー（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌａｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｚｅｎ）は約１５〜３０ｂｐの長さで構成された繰返しＤＮＡ断片からなるが、その全長はこの基本単位の繰返しの数によって規定されている。ＶＮＴＲ配列も通常、高多型であり、すなわち、それぞれの繰返し単位の数は、さまざまな個人間できわめてしっかり区別される。ＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）は、相同配列が塩基のみによって区別される最も単純な多型である。これらも本発明による方法の実施に大いに適している。しかし、それは別として、他のすべての高多型配列も本発明による方法のマーカーとして適している。
【００４１】
さらに、好ましくは、少なくとも１つの増幅反応は、少なくとも２つの互いに対して非相同の配列を増幅させるために適合されているが、これらの反応はドナーのゲノムにおいてそれぞれ対立遺伝子当たり１回だけ行われる。
【００４２】
少なくとも２つの互いに対して非相同の配列の数によって、頻度分布の個々の頻度分布曲線の長さおよびある程度の幅も設定されうる。好ましくは、少なくとも１つの増幅反応は、２〜１００の互いに対して非相同の配列を増幅させるために適合されており、ここで特に２〜２０の互いに対して非相同の配列、特に好ましくは、３〜１５の互いに対して非相同の配列、および非常に特に好ましくは５〜１２の互いに対して非相同の配列の増幅のための適合により特に優れた結果が得られる。増幅すべき互いに対して非相同の配列の数が、例えば、５〜８であると、０、１、もしくはそれ２以上の細胞当たりの所定の配列のコピー数の優れた区別を可能にする頻度分布曲線が得られるのに対して、８〜１２の互いに対して非相同の配列での適合は、所定の配列、例えば、測定された染色体、または測定された遺伝子が、細胞当たり、０、１、２、もしくは３以上のコピー数で存在するかどうかの確実な記載を可能にする。
【００４３】
発明思考の展開において、生体試料における所定の配列の測定すべきコピーの数が０〜１００、好ましくは、０〜２５、特に好ましくは、０〜１０、および非常に特に好ましくは、０〜５を選択することが提案される。
【００４４】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、本発明による方法のステップｂ）においてＰＣＲのみが実行されるが、そのＰＣＲにおいては、少なくとも２つの互いに対して非相同の配列を増幅させるために適合されている少なくとも２つの互いに対して非相同の配列の数に対応する数のプライマー対が使用される。この実施形態の利点は、頻度分布の受容およびステップｂ）における増幅反応を行うためにＰＣＲのみが必要であり、そのため本方法が迅速に、かつ高額なピペット操作費なしに実施されうる点にある。適した方法を実施するための例がマルチプレックス−ＰＣＲであるが、少なくとも２つの互いに対して非相同の増幅すべき配列が同時に１つの反応で増幅されうる他のどの増幅反応でも使用されうる。
【００４５】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、少なくとも２つの増幅すべき互いに対して非相同の配列の各々のために独自のＰＣＲが行われ、各々のＰＣＲにおいて１つのプライマー対のみが使用される。この実施形態の実現化のために、本発明による方法のステップａ）においては、生体試料の少なくとも２つの互いに対して非相同の配列の数に対応する数のサブセットが提供され、ここで各々のサブセットは、そのサブセットが個々のＰＣＲに使用される前に同量の生体材料を含有する。この方法の実施の利点は、個々の増幅が相互に影響を及ぼし得ない点にある。この実施形態では、特に、少量の生体試料のみ、例えば、１つの細胞のみが提供される場合に、生体試料を本発明による方法の実施前に非特異的ＰＣＲで増幅させ、かつこうして得られた反応産物を必要な数のサブセットに分割することが必要でありうる。もちろん、この方法の実施に際しては、標準試料は頻度分布の受容のために均一に事前増幅され、かつサブセットに分割される必要がある。
【００４６】
最後に、本発明の別の好ましい実施形態によれば、ＰＣＲにおいて少なくとも２つの互いに対して非相同の増幅すべき配列の一部分、および別々のＰＣＲ（ここでこのＰＣＲではそれぞれ１つのプライマー対のみが使用される）においてそれぞれ少なくとも２つの互いに対して非相同の増幅すべき配列の他の部分を増幅させることが意図されている。したがって、この方法の実施で問題となるのは、前記の方法形態の混合形態である。
【００４７】
本発明による方法の特別な利点は、増幅成分当たりのさまざまなＰＣＲ産物の数の測定におけるステップｃ）において、増幅成分当たりそれぞれ２つの情報、すなわち、一方では適切なＰＣＲ産物の存在もしくは非存在、ならびに他方では第２の、個々のＰＣＲ産物を互いに区別するパラメータ、例えば、ＰＣＲ産物の長さまたは配列に関する情報を考慮し、個々の得られたＰＣＲ産物の存在および非存在のみが考慮される適切な方法と比べて、意外に明確な頻度分布が得られる理由が考慮される点にある。少なくとも２つの増幅すべき互いに対して非相同の配列の存在もしくは非存在を測定するために、各々の当業者にはこの目的に適した方法が使用されうるが、ここでは例えば、ゲル電気泳動、従来のハイブリダイゼーション法、例えば、ＤＮＡアレイ上でのハイブリダイゼーション法、ビーズシステム、ならびに他の光学的、電気的、または電気化学的測定が挙げられている。この場合、使用される検出方法によって閾値を規定することが適切であり得、閾値より上でＰＣＲ産物の存在、かつそれ未満でＰＣＲ産物の非存在が考えられる。第２の、個々のＰＣＲ産物を互いに個別化するパラメータの種類は、実質的に、少なくとも２つの増幅すべき互いに対して非相同の配列の種類に依存する。例えば、ＰＣＲプライマーが少なくとも１つの増幅反応において、ＳＴＲ断片および／またはＶＮＴＲ断片が互いに対して非相同の配列として増幅されるように選択されると、第２のパラメータもしくは個々のＰＣＲ産物の特徴として、好ましくは、個々のＰＣＲ産物の長さが選択され、ステップｃ）により得られたさまざまな増幅産物の数の測定は、ＰＣＲ産物の存在もしくは非存在の試験、ならびに個々のＰＣＲ産物の長さの測定を含んでなり、ここで得られたさまざまな増幅産物の数は異なる長さを有する得られた増幅産物の数に対応する。これに適した方法が、例えば、キャピラリー電気泳動である。
【００４８】
他方で少なくとも１つの増幅反応において、少なくとも２つの互いに対して非相同のＳＮＰ配列を増幅させるのに適合されているＰＣＲプライマーが使用されると、第２の特徴もしくは第２のパラメータは、好ましくは、ＳＮＰ断片において通常ヌクレオチドに限定されている区別される配列の測定である。このために当業者に周知のすべての方法が利用されうるが、ここでは例えば、ＤＮＡ配列決定または周知のハイブリダイゼーション法のみを挙げておく。したがって、この実施形態において、得られたさまざまな増幅産物の数は、異なる配列を有する得られた増幅産物の数に対応する。
【００４９】
別の好ましい実施形態によれば、本発明は、細胞における所定の核酸配列およびその相同配列のコピー数の定量分析のための方法に関し、これは次のステップ、すなわち、
ａ）生体試料を提供するステップであって、この生体試料が１〜１００個の細胞、および／または１ｐｇ〜１００ｐｇの染色体ＤＮＡを含んでなるステップと、
ｂ）少なくとも１つのＰＣＲを行うステップであって、少なくとも１つのＰＣＲが、所定の配列によって包含され、かつＳＴＲ断片、ＶＮＴＲ断片、ＳＮＰ断片および任意のその組合せからなる群から選択されている少なくとも２つの互いに対して非相同の配列を増幅させるために適合されているステップと、
ｃ）得られたさまざまな増幅産物の数を測定するステップと、
ｄ）得られたさまざまな増幅産物の数を、ステップｂ）において使用された少なくとも１つのＰＣＲと同一のＰＣＲを別々にそれぞれ繰返し行うことによって、かつ同じ反応条件下に、ＰＣＲにおいて、ステップａ）において言及された量と同量の出発物質が、少なくとも２種類の標準試料とともに使用され、少なくとも２種類の標準試料はそれぞれ周知の、所定の配列の互いに異なるコピー数を有するほか、さまざまな増幅産物の標準試料当たりに得られる数のその後の測定が得られた少なくとも１つの頻度分布と比較するステップとを含んでなる。
【００５０】
本発明による方法は統計的方法であるため、開始量およびＰＣＲ条件は、特に温度管理、周期数、およびプライマーの結合親和性に関して、個々の同時に行われるＰＣＲ反応が０より大きいが１よりも小さい陽性結果の相対頻度で進行するように設定することが有利である。これによって、最小限の実験費用で、得られた結果の最大に可能な確実性および信頼性とともに統計的評価が達成されることが保証される。したがって、個々のＰＣＲプライマーの結合親和性をそのプライマー結合位置に、ならびにＰＣＲのその他のパラメータ、特に周期数および温度管理を、増幅すべき少なくとも２つの互いに対して非相同の配列の各々少なくとも１つの増幅反応の陽性増幅反応の相対頻度が、０．２〜１未満、特に好ましくは、０．４〜０．６、ならびに非常に特に好ましくは、約０．５であるように設定することが好ましい。
【００５１】
詳しくは、頻度分布が本発明による方法のステップａ）〜ｃ）の前に受容された場合、ステップｂ）による少なくとも１つの増幅反応と同時に、同一の条件下の増幅反応を対照試料で行うことが適切であると証明されたが、ここで対照試料は、好ましくは、さまざまな増幅産物の周知の数となる。したがって、簡単な方法で、ステップｂ）による少なくとも１つの増幅反応が適切に進行しているか、あるいは、サーモサイクラーの欠陥によって、この反応が全く行われなかったか、もしくは満足に行われなかったかを確認することができる。
【００５２】
発明思考の展開において、生体試料として極体、好ましくは、第１減数分裂後の極体を使用することが提案される。本発明による方法は、０、１、もしくは２以上、または０、１、２、もしくは３以上の特に細胞当たりの所定の配列およびその相同配列のコピー数の定量分析、特に細胞当たりの対立遺伝子のコピー数の定量分析に適しているため、これは、極体分析によって、その極体が取出された適切な卵細胞のゲノムを推論するために顕著に適している。これは、したがって、それによりあり得る染色体異常がすでにインビトロ受精前に認識されうるのに対して、他の周知の方法、例えば、羊水穿刺などでは、適切な染色体誤分裂はかなり遅い時点で初めて確認されうるため出生前診断において大きな意味がある。
【００５３】
卵細胞の成熟の間、最初に２倍体の卵細胞の染色体組は１倍対の染色体組に削減される。第１減数分裂に際して相同染色体が分離され、ここで１倍体の染色体組は卵細胞に留まり、その他は極体の形で排出されるのに対して、第２減数分裂に際しては卵細胞に留まっている染色体の個々の染色分体の分離が行われ、ここで染色分体の組が第２の極体の形で卵細胞から排出されるのに対して、他の染色分体の組は卵細胞に留まる。両方の減数分裂の間に卵細胞から卵細胞の卵黄周囲分裂へ移された両方の極体は、したがって、その遺伝的構造において細胞に対応するが、最小限の細胞質部分しか有さない。第１の極体は排卵の間に生じるが、第２の極体は卵細胞への精子の侵入後３〜４時間で初めて排出される。極体は決して機能を有さず、かつ早期胚発達においていずれにせよ吸収されるため、卵細胞からの極体の取出しは、一方では、卵細胞の損傷なしに、および別の発達の悪影響の恐れなしに可能であり、かつさらに極体のドイツ胚保護法に従って第１減数分裂後に許可される。全体として、極体検査は、したがって、すでにきわめて早期の段階、すなわち卵細胞の受精前に、卵細胞における可能な染色体誤分裂を診断する可能性を提供する。
【００５４】
本発明による方法により、第１減数分裂後にそれから取出される極体の検査を経て卵細胞において迅速に、簡単に、かつ確実に染色体の誤分裂を診断することが可能である。このために、例えば、個々の極体がＰＣＲにかけられ、ここでＰＣＲは、例えば、８種類のプライマー対が使用されるマルチプレックス−ＰＣＲとして配置されるが、これらは、被験染色体、例えば、２１番染色体に含有されている８つの互いに対して非相同のＳＴＲ配列を増幅させるのに適合されている。その代わりに、もちろん、８つの互いに対して非相同のＳＴＲ配列をそれぞれ個別に８種類のＰＣＲにおいて増幅させることも可能である。２１番染色体に関して卵細胞の遺伝子配列について次の可能性が示されている。すなわち、
１）細胞は３つの同一対立遺伝子を含有し（単一対立遺伝子トリソミー）、
２）細胞は２つの同一対立遺伝子およびそれと異なった対立遺伝子を含有し（２対立遺伝子トリソミー）、
３）細胞は３つの異なる対立遺伝子を含有し（３対立遺伝子トリソミー）、
４）細胞は２つの同一遺伝子を含有し（単一対立遺伝子ダイソミー［健康なホモ接合性細胞］）、
５）細胞は２つの異なる対立遺伝子を含有し（２対立遺伝子ダイソミー［健康なヘテロ接合性細胞］）、または
６）細胞は２１番染色体の対立遺伝子を含有しない。
【００５５】
本発明によれば、最初に少なくとも２つのさまざまな標準試料により頻度分布が作成され、ここで各々の標準試料により、例えば、それぞれ１００回、例えば、８つの互いに対して非相同のＳＴＲ配列の増幅に適したプライマー対でＰＣＲが実施される。標準試料として、例えば、それぞれ前述の遺伝子配列の１つを有する６種類の極体が使用されうる。単一対立遺伝子のダイソミーと２対立遺伝子のダイソミーとの間のみ区別されると、もちろん、頻度分布の製作のために２つの適切な標準試料を使用するだけで十分である。その後に、または頻度分布曲線の受容と同時に、被験極体を同じマルチプレックス−ＰＣＲにかけることができ、かつさまざまなＰＣＲ産物で得られた数の頻度分布との比較によってコピー数が確認されうる。
【００５６】
すでに示されているように、方法条件、例えば、増幅させる互いに対して非相同の配列の数およびＰＣＲ周期の数の適合によって頻度分析の解明は所望の値に設定され、関心領域における頻度分布曲線の重複は回避されうる。
【００５７】
これは次の思考実験の例で説明することにする。表１を参照して前述されているのと同様に説明が行われるが、ただし、標準試料および被験生体試料によるＰＣＲが互いに対して非相同のＳＴＲ配列の増幅に適した、それぞれ８個ではなく１２個のプライマー対で実施されることを除く。例えば、次の頻度分布が得られる。
【００５８】
【表３】
2009508500.tif 000004
【００５９】
表３からわかるように、被験試料について得られた結果の各々のこの頻度分布により明白に配列コピーの数が確認されうる。したがって、増幅すべき非相同配列の数が８から１２へ増加することによって、個々の頻度分布曲線の拡大が個々の頻度分布曲線の部分的な重複を回避しながら達成されたが、これは表１を参照して結果について記載された思考実験において１つもしくは４つの異なるＰＣＲ産物がそのケースである。
【００６０】
頻度分布の分析に影響を及ぼす別の重要なパラメータが、少なくとも１つのＰＣＲにおいて使用される周期数である。例えば、表３を参照して示される前述の思考実験においてその他の点では同一の標準試料およびＰＣＲ条件ではＰＣＲの周期数は３０から２５に削減され、例えば、表４に再現された頻度分布が得られる。
【００６１】
【表４】
2009508500.tif 000005
【００６２】
表３に再現された頻度分布と比べ、表４における個々の頻度分布曲線は互いに近い位置にあり、かつ少なくとも部分的に交差している。したがって、この思考実験は、被験細胞により、０個のＰＣＲ産物、２〜５種類のＰＣＲ産物、または７個もしくはそれ以上のＰＣＲ産物が得られる場合にのみ明らかな記載が可能であり、ここで０個のＰＣＲ産物では生体試料における２１番染色体のコピー数は必要な確実性により０であり、２〜５種類のＰＣＲ産物でのコピー数は１であり、かつ７もしくはそれ以上の種類のＰＣＲ産物ではコピー数は２である。他方、被験試料について１もしくは６種類のＰＣＲ産物が得られると、試料が２１番染色体におけるコピーを実際にどれだけ含有するかについて明らかに述べることは不可能である。
【００６３】
当業者が認めるように、ＰＣＲ条件の設定および増幅させる少なくとも２つの互いに対して非相同配列の数の確定によって、頻度分布曲線の幅およびさまざまな頻度分布曲線の距離は互いにほぼ任意に設定される。
【００６４】
本発明の別の対象が、本発明による方法の実施に適している生体試料における所定の配列および場合によりその相同配列の数の定量分析のためのキットである。本発明によれば、このキットは、
ａ）少なくとも１つのＰＣＲにおいて、所定の配列によって包含されている少なくとも２つの互いに対して非相同の配列を増幅させるために適合されている少なくとも２つのプライマー対と、
ｂ）場合によりＰＣＲバッファーと、
ｃ）少なくとも１つのＰＣＲの実行のためのプロトコールと、
ｄ）プロトコールｃ）において被験生体試料のための所定の少なくとも１つの増幅反応と同一の反応を別々にそれぞれ繰返し行なうことによって、かつ同じ反応条件下に、増幅反応において、プロトコールｃ）において言及された量と同量の出発原料が、少なくとも２種類の標準試料とともに使用され、少なくとも２種類の標準試料がそれぞれ周知の、所定の配列の互いに異なるコピー数を有するほか、さまざまな増幅産物の標準試料当たりに得られる数のその後の測定が得られた少なくとも１つの頻度分布と
を含んでなる。
【００６５】
本発明に記載のキットの好ましい実施形態によれば、少なくとも２つのプライマー対は、少なくとも１つのＰＣＲにおいて、非コードＤＮＡ領域からの少なくとも２つの互いに対して非相同の配列を増幅させるのに適合されている。詳しくは、互いに対して非相同の配列が高度の多型であると、優れた結果が得られる。特に好ましくは、少なくとも２つのプライマー対は、ＳＴＲ配列、ＶＮＴＲ配列、ＳＮＰ配列およびその任意の組合せからなる群から選択される互いに対して非相同の配列を増幅させるために適合されている。
【００６６】
発明思考の展開において、少なくとも２つのプライマー対および／またはプロトコールは、ＰＣＲにおいて、２〜１００、特に好ましくは、２〜２０、完全に好ましくは、３〜１５、かつ最も好ましくは、５〜１２の互いに対して非相同の配列が増幅されるように適合されていることが提案される。
【００６７】
すでに示した理由から、さらに好ましくは、少なくとも２つのプライマー対および／またはプロトコールは、少なくとも２つの互いに対して非相同の配列の各々に対する少なくとも１つのＰＣＲの相対頻度が０．２〜１未満、特に好ましくは、０．４〜０．６、および非常に特に好ましくは、約０．５であるように適合されている。
【００６８】
さらに、ＰＣＲのプロトコールおよび／または少なくとも１つの頻度分布が、生体試料が０、１、または少なくとも２個の細胞当たりのコピー数で、または０、１、２、または少なくとも３個の細胞当たりのコピー数で所定の配列を含有するかどうかを測定するために適合されていることが有利であると証明された。
【００６９】
さらに、本発明は、特に本発明による方法の実施に適した、
ａ）固形担体、好ましくは、ガラス担体と、
ｂ）少なくとも１つのＰＣＲにおいて、所定の配列によって包含されている少なくとも２つの互いに対して非相同の配列を増幅させるために適合されている担体上に固定化された少なくとも２つのプライマー対と、
ｃ）少なくとも２種類の標準試料とともに少なくとも１つの増幅反応をそれぞれ繰返し行うことによって、少なくとも２種類の標準試料はそれぞれ周知の、所定の配列の互いに異なるコピー数を有するほか、さまざまな増幅産物の標準試料当たりに得られる数のその後の測定が得られた１つの頻度分布、例えば電気的に記憶された頻度分布、または
ｄ）担体上に空間的に互いに分離されて固定化された少なくとも２つの標準試料であって、少なくとも２種類の標準試料がそれぞれ周知の、所定の配列の互いに異なるコピー数を有する少なくとも２つの標準試料と
を含んでなる装置に関する。
【００７０】
好ましくは、プライマー対および／または標準試料は担体上で非化学的結合によって固定化されている。
【００７１】
以下、本発明の発明思考を説明するが、これらを限定しない例を使用して説明する。
【実施例】
【００７２】
（頻度分布の作成）
ａ）ＰＣＲ反応の実施
個人の個々のリンパ球を顕微鏡制御下に標準試料として、平行自動化ＰＣＲ反応を行うためにアドバリティックス株式会社（Ａｄｖａｌｙｔｉｘ  ＡＧ）から市販されているガラスストライプであるアンプリグリッド（ＡｍｐｌｉＧｒｉｄ）ガラス担体の個々の増幅アンカー上に置くが、ここで増幅アンカーが、例えば、流体が好ましくはその上に滞留するように前処理された部分表面である。この場合、増幅アンカー当たり１〜６個のリンパ球を置き、ここでさらにいくつかのアンカーにはリンパ球を含まない体液からなる陰性対照を配置した。この場合、それぞれ多重測定を実施したが、ここでリンパ球を含まない２１の陰性対照、それぞれ１個のリンパ球を含む２７個の試料、それぞれ２個のリンパ球を含む４２個の試料、それぞれ３個のリンパ球を含む３５個の試料、それぞれ４個のリンパ球を含む３１個の試料、それぞれ５個のリンパ球を含む１７個の試料、およびそれぞれ２個のリンパ球を含む６個の試料、したがって合計１７５個の試料をガラス担体上に配置した。
【００７３】
その後、試料を備えたＰＣＲ−マスターミックス（Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ）からの個々の増幅アンカーへ次の組成物のサブセット１μｌをピペットで取った。
【００７４】
【表５】
2009508500.tif 000006
【００７５】
その後、個々のＰＣＲ滴をそれぞれ鉱油（被覆溶液（Ｃｏｖｅｒｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、アドバリティックス株式会社）５．２μｌでコーティングした。このために、ＰＣＲ滴のこの滴と触れる前に、鉱油を最初に滴の形でピペットの先端に付着するように、鉱油の滴が均一にコーティングされるまでピペットで取った。
【００７６】
さらにその後、個々の試料により次の温度プロフィールを有するＰＣＲを行った。
【００７７】
【表６】
2009508500.tif 000007
【００７８】
増幅後、個々の反応物の総量に水（再蒸留）４μｌを添加した。それによって、水は試料の水相と混ざった。次いで、鉱油を含む総反応量をマイクロタイターのさまざまな容器に移した。
【００７９】
ｂ）得られたさまざまなＰＣＲ産物の数の測定
マイクロタイタープレートの個々の反応量をそれぞれ１９μｌのホルムアミド＋１μｌのＩＬＳ６００（内部蛍光標準、アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））で迅速に変性させ、かつ標準条件でキャピラリーシーケンサＡＢＩ３１００（アプライド・バイオシステムズ社）において電気泳動的に分離した。結果を遺伝子型プロファイルの形で記録したが、ここで関連シグナルおよびその標準との関連性の認識が自動的にジェノタイパー（Ｇｅｎｏｔｙｐｅｒ）ソフトウェア（アプライド・バイオシステムズ社）によって行われた。もちろん、蛍光シグナルはつねに蛍光の背景に対して測定されるが、ここで各々の測定におけるようにシグナル／雑音比が決定される。これはソフトウェアによって示されない。関連シグナルの下限（閾値）としてこの実験では５００の相対発光単位が確定された。
【００８０】
自動的に認識される対立遺伝子がすべてのシステムに対する増幅ごと数えられ、陽性反応の数が細胞数に関して確定された。
【００８１】
それによって次の結果が得られた。
【００８２】
【表７】
2009508500.tif 000008
【００８３】
表中の意味：
リンパ球細胞／アンカー：  増幅アンカー当たりの配置された細胞の数。２倍体のリンパ球の場合、これは細胞当たり正確に相同配列の２つのコピーである。これら両方のコピーはＰＣＲのために開始テンプレートとして提供され、かつ両方が増幅されうる。両方のコピーが配列一致であると、キャピラリー電気泳動において正確にピークが把握される。両方のコピーが長さの点で区別されると（ヘテロ接合性の場合）、相同配列の２種類の長さが増幅されうる。したがって、２つのピークが生じる。ここで分析された群０、１、２、３、４、５、６は、開始コピーの数の点で、したがって、それぞれ２つのコピーについて区別される（１つの細胞：２つのコピー、２つの細胞：４つのコピー等）。
Ｎ：  規定の細胞数で開始された個々の反応の数。細胞は偶然に配置されたので、さまざまなサンプル規模が存在する。「６細胞」の場合は２回だけ、「５細胞」の場合は１７回提示される等である。統計的分析ではこれが考慮される。
平均：  陽性シグナル（ソフトウェア支援で自動的に確認されたピーク）の数の平均値、すなわち、さまざまなＰＣＲ産物の数の平均値。
標準偏差：  平均値の分散のための尺度としての前述の平均値の標準偏差。次に記載した分散分析（ＡＮＯＶＡ）ではこれら３つの値が使用され、統計的有意差を計算し、かつ平均値が実際に区別されるかどうかについて述べる。統計的に言えば、例えば、「２細胞提示」および「４細胞提示」のサンプルがさまざまな集団であるかどうかの仮説の試験が望まれる。
【００８４】
「０コピー提示」の場合については、２１の実験において１回、個々のピークが検出されたケースがあった。これは偽陽性結果であるが、これは
ａ．ヒトＤＮＡとの混成によって、ただし、パワープレックスキットでは１つの反応において１６種類までの配列断片が把握される。混成は唯一の配列（物理的に、例えば、染色体）とも起こりうるが、これはきわめて可能性が低く、または、
ｂ．キャピラリー電気泳動が誤ってシグナルを示したことによって起こりうるが、これは電気泳動中の電圧パルスであり、またはピークと解される不明起源の蛍光粒子によるゲル中の不純物でありうる。
【００８５】
したがって、いずれにしても「０コピー提示」の場合には陽性の値および陽性の標準偏差が生じる。偽陽性シグナルがなければ平均値および標準偏差は０となる。
【００８６】
最終行の「合計」は前述の値の合計である。
【００８７】
ｃ）すべてのデータに関する分散分析
前述のデータにより分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実行した。分散分析は、群内（ｗｉｔｈｉｎ  ｇｒｏｕｐｓ）の分散（または標準偏差）の群間（ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｒｏｕｐｓ）の分散との比較に基づく。この場合、次の結果が得られた。
【００８８】
【表８】
2009508500.tif 000009
【００８９】
これによって示されるのは、
２乗の和  偏差２乗の和、
ＤＦ  自由度（ｄｅｇｒｅｅｓ  ｏｆ  ｆｒｅｅｄｏｍ）の数、および
平均２乗  平均２乗偏差の和。
Ｆ値は最終的に郡内および群間の偏差を関係づける（１２７３，０３５／３３，３３＝３８，１９４）。自由度の測定された数の値が群間の有意差を示すかどうかは、表において参照される（例えば、Ｊ．ボルツ（Ｂｏｒｔｚ）：社会科学のための統計（Ｓｔａｔｉｓｔｉｋ  ｆｕｅｒ  Ｓｏｚｉａｌｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｌｅｒ）、シュプリンガー・フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ））。この場合、差はきわめて有意（Ｐ＝０．０００）である。
【００９０】
この結果は、さまざまな細胞数のさまざまな群間に高い有意差があることを示す。
【００９１】
ｄ）シェッフェ（Ｓｃｈｅｆｆｅ）試験
どの群間に差が実際にあるかを述べるために、得られた結果によりシェッフェ試験を実行した。シェッフェによる試験の結果は、どの群間に対比較で有意差があるかを示す。また、２群間の平均差（平均差Ｉ−Ｊ）およびその標準誤差（Ｓｔｄ．Ｅｒｒｏｒ）を示した。０．０５の有意限界を選択した。
【００９２】
次の結果が得られた。
【００９３】
【表９】
2009508500.tif 000010
【００９４】
表は次のように解される。すなわち、
「有意性」が０．０５未満である群間の群は互いに有意に区別されているのに対し、他の群は選択された有意水準での区別は不可能である。
【００９５】
例えば、「０細胞」群は他のすべてから有意に区別されている（第１のブロック）。質的決定も可能である（他のすべての場合に対する０コピー）。
【００９６】
「１細胞」群は「０細胞」、「３細胞」、「４細胞」、「５細胞」、および「６細胞」群と区別される。１細胞／２細胞の区別が他方では、これらの群間の「有意性」が０．２６４であるため不可能である。
【００９７】
ＰＣＲ条件、特に周期数の変更によって、かつ個々の群は、これらが互いに有意に区別されている要求に対応して互いに分離されうる。
【国際調査報告】
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