(57)【要約】【課題】【解決手段】本発明は、インテグリン結合ＲＧＤ官能基を有する一連の新規なカチオン性リポペプチドの合成を提供する。本発明はまた、これら新規なＲＧＤリポペプチドの著しく高いＬ２７（形質転換Ｓｌ８０、マウス肉腫細胞）細胞親和性の遺伝子導入特性を提供する。Ｌ２７細胞表面は、過剰に発現したインテグリンを含むため、インテグリン結合ＲＧＤリガンドを有する本発明のリポペプチドのクラスは、（過剰に発現したインテグリンを有する）腫瘍血管系の内皮細胞に対する抗がん遺伝子／薬のターゲッティングにおける将来の適用が見込まれる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般構造Ａを有するＲＧＤリポペプチド。
【化１】
2009531409.tif 000022
式中、Ｒ1およびＲ2は、Ｒ1およびＲ2の両方が同時に水素ではないとき、それぞれ独立して水素または親油性部位であり、前記親油性部位は、それぞれ炭素数８以上のアルキル基、モノ不飽和アルケニル基、ジ不飽和アルケニル基およびトリ不飽和アルケニル基からなる群から選択され、
Ｒ3は、水素、炭素数１から５の直鎖アルキル基および炭素数１から５の分岐アルキル鎖アルキル基からなる群から選択され、
ｎは、１から７の値を有する整数であり、
Ｘは、任意にハロゲン部位であり、かつ、
Ｍは、水素、ナトリウムおよびカリウムからなる群から選択される。
【請求項２】
前記親油性部位の炭素数が８〜２２である請求項１に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項３】
Ｘが、塩素、臭素またはヨウ素である請求項１に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項４】
Ｒ1およびＲ2は、Ｒ1およびＲ2の両方が同時に水素ではないとき、それぞれ独立して水素または脂肪族炭化水素鎖である請求項１に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項５】
Ｒ1およびＲ2の両方が、脂肪族炭化水素鎖である請求項１に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項６】
Ｒ3がアルキル基であり、かつ、Ｒ1およびＲ2の両方が脂肪族炭化水素鎖である請求項１に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項７】
Ｒ3が水素原子であり、かつ、Ｒ1およびＲ2の両方が脂肪族炭化水素鎖である請求項１に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項８】
Ｒ3がアルキル基であり、かつ、Ｒ1およびＲ2が、独立して水素または脂肪族炭化水素鎖である請求項１に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項９】
炭素数が約８〜２２のＲ1基およびＲ2基の各々が、独立して炭素数８〜２２のアルキル基、または、炭素数８〜２２のモノ不飽和アルケニル基、ジ不飽和アルケニル基もしくはトリ不飽和アルケニル基である請求項１に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項１０】
Ｒ１およびＲ2基の各々の炭素数が約１６から約２２である請求項１０に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項１１】
Ｒ1およびＲ2が、独立してモノ不飽和アルケニル基である請求項１０および１１に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項１２】
Ｒ1およびＲ2の両方が同一であり、かつ、炭素数１２から１８の飽和アルキル基である請求項１に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項１３】
Ｒ1およびＲ2の両方が同一であり、かつ、炭素数１８から２２のモノ不飽和アルケニル基である請求項１に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項１４】
１種以上のポリアニオン性化合物および１種以上の生理学的に許容される添加物とともに、一般構造Ａを有するＲＧＤリポペプチドを含む抗がん薬または遺伝子の標的への運搬のための製剤。
【化２】
2009531409.tif 000023
式中、Ｒ1およびＲ2は、Ｒ1およびＲ2の両方が同時に水素ではないとき、それぞれ独立して水素または親油性部位であり、前記親油性部位は、それぞれ炭素数８以上のアルキル基、モノ不飽和アルケニル基、ジ不飽和アルケニル基およびトリ不飽和アルケニル基からなる群から選択され、
Ｒ3は、水素、炭素数１から５の直鎖アルキル基および炭素数１から５の分岐アルキル鎖アルキル基からなる群から選択され、
ｎは、１から７の値を有する整数であり、
Ｘは、任意にハロゲン部位であり、かつ、
Ｍは、水素、ナトリウムおよびカリウム原子からなる群から選択される。
【請求項１５】
補脂質（co lipid）をさらに含む請求項１４に記載の製剤。
【請求項１６】
用いられる前記補脂質が、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロールおよびコレステロールからなる群から選択される請求項１５に記載の製剤。
【請求項１７】
用いられる前記補脂質が、ステロール基、中性ホスファチジルエタノールアミンおよび中性ホスファチジルコリンからなる群から選択される請求項１５に記載の製剤。
【請求項１８】
前記補脂質が、ＤＯＰＥおよびコレステロールからなる群から選択される請求項１５に記載の製剤。
【請求項１９】
ＲＧＤリポペプチド対用いられる補脂質のモル比が、１：１から３：１の範囲である請求項１５に記載の製剤。
【請求項２０】
ＲＧＤリポペプチド対補脂質のモル比が、１：１である請求項１９に記載の製剤。
【請求項２１】
前記ポリアニオン性化合物が、治療上重要なタンパク質をコードする核酸、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質および薬剤からなる群から選択される請求項１４に記載の製剤。
【請求項２２】
用いられる前記核酸が、環状プラスミド、直鎖プラスミド、リボ核酸、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド、ＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド、ゲノムＤＮＡのポリヌクレオチド、ｃＤＮＡのポリヌクレオチドおよびｍＲＮＡのポリヌクレオチドからなる群から選択される請求項２１に記載の製剤。
【請求項２３】
前記ポリアニオンが、単独でまたは組み合わせて用いられる請求項２１に記載の製剤。
【請求項２４】
静脈内、筋肉内または腹腔内投与される請求項１４に記載の製剤。
【請求項２５】
２５から１００マイクロリットルの範囲で細胞内投与される請求項１４に記載の製剤。
【請求項２６】
５０，０００個の細胞に対して０．１から０．５マイクログラムのＤＮＡの割合で細胞に投与される請求項１４に記載の製剤。
【請求項２７】
９．０から０．３マイクログラムの範囲の両親媒質をさらに含み、かつ、両親媒質の量を、リポペプチド対ＤＮＡ電荷比０．３：１から９：１まで変化させる請求項１４に記載の製剤。
【請求項２８】
請求項１４に記載の製剤を含むトランスフェクション複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インテグリン受容体のＲＧＤトリペプチドリガンドを含む一連の新規なカチオン性両親媒質、および、その調製方法に関する。本発明は、顕著な遺伝子導入特性を有する前記両親媒質を含む新規な組成物を提供する。本発明によりもっとも恩恵を受けるであろう医学領域は、非ウイルス性がん遺伝子治療である。
【背景技術】
【０００２】
新脈管形成（新生血管形成ともいう）は、既存の脈管や内皮先祖細胞からの血管形成および分化であり、健康と疾患の両方において重要である。新脈管形成は、通常は胚形成および発達中に起こり、かつ、創傷治癒および胎盤発達中に十分に発達した組織内で起こる。これに加えて、新脈管形成は、新生血管形成による糖尿病性網膜症および黄班変性、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患といったさまざまな病理学的状態において、ならびに、新たに形成された血管が、成長中の腫瘍に酸素および栄養分を供給するがんにおいて起こる。成熟した血管の内側を覆う内皮細胞は、通常は増殖しない。血管再造形および新脈管形成中に、内皮細胞では、細胞浸潤および増殖を強める細胞表面分子の発現が増加する。いくつかの異なるアルファおよびベータサブユニットからなるヘテロダイマー膜結合タンパク質のスーパーファミリーであるインテグリンは、腫瘍血管系の増殖中の内皮細胞において上向き調節されているいくつかの細胞表面分子の一クラスであり、また、転移性メラノーマ細胞を含む種々の腫瘍細胞上にも見られる。
【０００３】
インテグリンは、細胞外基質への細胞の付着、すなわち、細胞−細胞相互作用および信号伝達にとって重要である。クルーズトリパノソーマ（Typanosoma cruzi）、アデノウイルス、エコーウイルス、口蹄疫ウイルスおよび腸病原体Ｙ仮性結核病原体を含む数多くの病原体は、我々の体細胞に進入するためにインテグリン受容体を利用する。インテグリンを介したインターナリゼーション（取り込み）過程の卓越した利点は、１〜２マイクロメートルほどの大きさの直径を有する病原細菌のような比較的大きな構造体のインターナリゼーションを可能とする食細胞のような過程により進行することである。言い換えると、非ウイルスベクターのインテグリン特異的ターゲッティングは、他の多くの受容体を介したエンドサイトーシスに共通して関わるクラスリン被覆小胞によるサイズの下限限定の回避において将来性を有する。興味深いことに、アミノ酸配列アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）は、細胞外基質タンパク質およびウイルスのキャプシドといったすべてではないが多くの天然インテグリン結合リガンドのもっとも進化の保存された特徴である。その高いインテグリン受容体親和性により、ＲＧＤドメインを含む環状ペプチドは、インテグリンターゲッティングベクターとして特に適切であることが分かっている。この理由で、（腫瘍細胞自体をターゲッティングするよりむしろ）腫瘍血管系の内皮細胞表面上に過剰に発現したインテグリン受容体に対する抗がん遺伝子／薬のＲＧＤリガンドを介したターゲッティングが、がんと闘う将来性のある抗脈管形成アプローチなのである。このために、本発明は、過剰に発現したインテグリン受容体を含む細胞への遺伝子運搬の顕著な選択的有効性を有する一連の新規で単純なＲＧＤリポペプチドの開発に関する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
天然のタンパク質リガンド由来の配列やファージディスプレイライブラリから選択される配列を含む数多くのインテグリン受容体ターゲッティング直鎖および環状ペプチドリガンドが報告されている（Pasqualiniら、Nature Biotechnology 1997; 15; 542-546、Wickhamら、J. Virology 1997; 71; 8221-8229、Arapら、Science 1998; 279; 377-380、Erbacherら、Gene Ther 1999; 6; 138-145、DeNardoら、Cancer Biother. Radiopharm 2000; 15;71-79、Muellerら、Cancer Gene Ther 2001; 8; 107-117、Janssenら、Cancer Res 2002; 62; 6146-6151、Schraaら、Int.J. Cancer 2002; 102; 469-475）。もっとも強力なＲＧＤペプチド（ＲＧＤ４Ｃ、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ）のうちの１つは、２つのジスルフィド結合により構造的に安定化した中央ＲＧＤモチーフにより構成される（Koivunenら、Biotechnology 1995; 13; 265-270）。以前、Hartらは、長さ約９００ｎｍのｆｄ線維状ファージ粒子の主要外殻タンパク質サブユニットにおいて表される環状ＲＧＤペプチドの複数のコピーが、組織培養における細胞によりインテグリンを介して効率的に取り込まれることを示した（Hartら、J.Biol.Chem 1994; 269; 12468-12474）。Hartらはまた、上皮細胞株におけるインテグリンを介した遺伝子発現を確保するために、複数のＲＧＤペプチドと共有結合したポリリシン化ペプチドを利用することに成功した（Hartら、Gene Ther 1995; 2; 552-554、1996、国際公開第９６／１５８１１号パンフレット）。より最近では、Hartらは、オリゴリシン／ＲＧＤペプチド／ＤＮＡ複合体に脂質成分を含めると、遺伝子トランスフェクションレベルが顕著に向上することを開示した（米国特許第６４５８０２６号明細書、Hartら、2002）。ごく最近では、ファージディスプレイ技術を用いて、Holigら（Hoelig, Pら、Prot. Eng. Design & Selection, 2005; 17; 433-441）が、リポソームに取り込むと、インテグリン発現細胞に対する特異的かつ効率的な結合を示した一連の新規なＲＧＤリポペプチドを単離することに成功している。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、単純なインテグリン結合ＲＧＤトリペプチド官能基を含む一連の新規なリポペプチドの開発に関する。ここに記載するこの新たなクラスのＲＧＤリポペプチドの遺伝子導入特性は、形質転換されたマウス肉腫細胞（Ｌ２７細胞）に対して顕著な細胞親和性を有する。ここに開示するＲＧＤリポペプチドの遺伝子導入有効性は、細胞が市販のインテグリン結合環状ペプチド（ＲＧＤｆＶ）でプレインキュベートされると、大幅に抑制される。これは、遺伝子導入過程が、インテグリン受容体を介したものであることを示している。したがって、本発明のＲＧＤリポペプチドのクラスは、過剰に発現したインテグリン受容体を有する腫瘍血管系に対し抗がん遺伝子／薬をターゲッティングするための抗脈管形成がん治療において将来の適用が見込まれる。
【０００６】
本発明の目的は、インテグリン結合ＲＧＤ頭基を含むカチオン性リポペプチドをベースとする遺伝子導入試薬、および、その調製方法を提供することである。
【０００７】
したがって、本発明は、一連の新規なカチオン性ＲＧＤリポペプチド、および、その合成プロセス、ならびに、さまざまな培養動物細胞におけるインテグリンを介したその遺伝子導入特性の評価に関する。
【０００８】
前記カチオン性ＲＧＤリポペプチドは、一般式Ａによって表される。
【０００９】
【化３】
2009531409.tif 000002
【００１０】
式中、Ｒ1およびＲ2は、Ｒ1およびＲ2の両方が水素ではないとき、独立して水素または炭素数８以上の親油性部位であり、かつ、炭素数８〜２２のアルキル、（炭素数８〜２２の）モノ不飽和アルケニル、ジ不飽和アルケニルおよびトリ不飽和アルケニルから任意に選択され、
Ｒ3は、独立して水素または（炭素数１〜５、直鎖または分岐）アルキルであり、
ｎは、１から７の整数であり、
Ｘは、任意にハロゲン部位であり、かつ、
Ｍは、水素、ナトリウムおよびカリウム原子からなる群から選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の別の実施形態、開示されるカチオン性脂質において、Ｒ1＝Ｒ2＝ｎ−ヘキサデシル、Ｒ3はプロトンであり、ｎ＝２、Ｍはナトリウム原子であり、かつ、Ｘ-は塩素イオンである、両親媒質ｎｏ．１。
【００１２】
【化４】
2009531409.tif 000003
【００１３】
本発明のさらに別の実施形態において、ＲＧＤリポペプチド複合体は、Ｒ1およびＲ2が、それぞれ独立して水素または脂肪族炭化水素鎖である。
【００１４】
本発明のさらに別の実施形態において、ＲＧＤリポペプチド複合体は、Ｒ1およびＲ2の両方が、脂肪族炭化水素鎖である。
【００１５】
本発明の一実施形態において、ＲＧＤリポペプチド複合体では、Ｒ3がアルキル基であり、かつ、Ｒ1およびＲ2の両方が脂肪族炭化水素鎖である。
【００１６】
本発明の別の実施形態において、ＲＧＤリポペプチド複合体では、Ｒ3が水素原子であり、かつ、Ｒ1およびＲ2の両方が脂肪族炭化水素鎖である。
【００１７】
本発明のさらに別の実施形態において、ＲＧＤリポペプチド複合体では、Ｒ3がアルキル基であり、かつ、Ｒ1およびＲ2が、独立して水素または脂肪族炭化水素鎖である。
【００１８】
本発明のさらに別の実施形態において、ＲＧＤリポペプチド複合体では、炭素数が約８〜２２のＲ1基およびＲ2基の各々が、独立して炭素数８〜２２のアルキル基、または、炭素数８〜２２のモノ不飽和アルケニル基、ジ不飽和アルケニル基もしくはトリ不飽和アルケニル基である。
【００１９】
本発明の一実施形態において、ＲＧＤリポペプチド複合体では、結合炭素数が約１６から約２２である各基が、独立して（炭素数１６〜２２の）モノ不飽和アルケニル基である。
【００２０】
本発明の別の実施形態において、ＲＧＤリポペプチド複合体では、Ｒ1およびＲ2の両方が同一であり、かつ、炭素数１２〜１８の飽和アルキル基である。
【００２１】
本発明のさらに別の実施形態において、ＲＧＤリポペプチド複合体では、Ｒ1およびＲ2の両方が同一であり、かつ、炭素数１８〜２２のモノ不飽和アルケニル基である。
【００２２】
本発明のさらに別の実施形態において、ＲＧＤリポペプチド複合体では、Ｘが、ハロゲン基から選択される。
【００２３】
本発明のさらに別の実施形態において、Ｘは、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択される。
【００２４】
本発明の一実施形態において、製剤は、１種以上のポリアニオン性化合物および１種以上の生理学的に許容される添加物とともに、一般構造Ａにより表されるＲＧＤリポペプチドを含む。
【００２５】
本発明のさらに別の一実施形態において、前記製剤は、補脂質をさらに含む。
【００２６】
本発明の別の実施形態において、前記製剤では、ＲＧＤリポペプチドが、純粋な形態で、または、補脂質と組み合わせて用いられる。
【００２７】
本発明のさらに別の実施形態において、前記製剤では、ヘルパー脂質が、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、コレステロールからなる群から選択される。
【００２８】
本発明の一実施形態において、前記製剤では、前記補脂質が、ステロール基もしくは中性ホスファチジルエタノールアミンまたは中性ホスファチジルコリンから選択される。
【００２９】
本発明の別の実施形態において、前記製剤では、前記補脂質が、ＤＯＰＥまたはコレステロールから優先的に選択される。
【００３０】
本発明のさらに別の実施形態において、前記製剤では、ＲＧＤリポペプチド対補脂質のモル比の範囲が、３：１〜１：１である。
【００３１】
本発明のさらに別の実施形態において、前記製剤では、ＲＧＤリポペプチド対補脂質の好適なモル比が、１：１である。
【００３２】
本発明の一実施形態において、前記製剤では、前記ポリアニオン性化合物が、治療上重要なタンパク質、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸および薬剤の群から選択される。
【００３３】
本発明の別の実施形態において、前記製剤では、前記核酸が、環状プラスミドもしくは直鎖プラスミドの群から選択されるか、または、リボ核酸、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド、ＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのポリヌクレオチドである。
【００３４】
本発明のさらに別の実施形態において、前記製剤では、前記ポリアニオンが、単独でまたは組み合わせて用いられる。
【００３５】
本発明のさらに別の実施形態において、前記製剤が、静脈内、筋肉内または腹腔内投与される。
【００３６】
本発明の別の実施形態において、前記製剤が、５０，０００個の細胞に対して０．１から０．５マイクログラムのＤＮＡの割合で細胞に投与される。
【００３７】
本発明のさらに別の実施形態において、前記製剤が、９．０から０．３マイクログラムの範囲の両親媒質の量を、リポペプチド対ＤＮＡ電荷比０．３：１から９：１までの範囲で含む。
【００３８】
本発明のさらに別の実施形態において、トランスフェクション複合体は、前記製剤を含む。
【００３９】
本発明の一実施形態は、上記構造Ａにより表される新規なＲＧＤリポペプチドの内皮細胞特異的遺伝子運搬特性の評価である。
【００４０】
本発明は、一連の新規なカチオン性ＲＧＤリポペプチドに関する。極性ＲＧＤ頭基を含む新規なカチオン性両親媒質は、過剰に発現したインテグリンを含む腫瘍血管系に抗がん遺伝子／薬を運搬するのに潜在的に有用である。本発明によりもっとも恩恵を受けるであろう科学分野は、抗脈管形成がん治療である。
【００４１】
本発明において開示されるカチオン性両親媒質に共通した独特の新規な構造的特徴は、（１）正に帯電した窒素原子に直接結合した疎水性基の存在、および、（２）インテグリン結合極性アルギニン−グリシン−アスパラギン酸頭基の存在を含む。これらの特有の構造的特徴は、ここに開示する新規なＲＧＤリポペプチドのインテグリンを介した遺伝子導入効率に大きく寄与すると考えられている。
【００４２】
本発明の実施によると、「カチオン性」とは、正の電荷が、４級化窒素またはプロトン付加された窒素原子のいずれかにかかっていることを意味する。本発明の両親媒質のカチオン性は、核酸のような生物学的活性分子および／または形質膜糖タンパク質のような細胞の構成成分と該両親媒質との相互作用を高めるのに寄与する可能性がある。そのようなカチオン性両親媒質と治療上活性な生物学的高分子および／または細胞膜構成成分との相互作用の高まりは、細胞へ治療用分子をうまく輸送するのに重要な役割を果たす可能性がある。
【００４３】
本発明のカチオン性ＲＧＤリポペプチドは、ある共通の構造基および官能基を有する。そこで、前記カチオン性ＲＧＤリポペプチドは、下記の一般式（Ａ）によって表すことができる。
【００４４】
【化５】
2009531409.tif 000004
【００４５】
式中、Ｒ1およびＲ2は、Ｒ1およびＲ2の両方が水素ではないとき、それぞれ独立して水素または炭素数８以上の親油性部位であり、かつ、炭素数８〜２２のアルキル、（炭素数８〜２２の）モノ不飽和アルケニル、ジ不飽和アルケニルおよびトリ不飽和アルケニルから任意に選択され、
Ｒ3は、独立して水素または（炭素数１〜５、直鎖または分岐）アルキルであり、
ｎは、１から７の整数であり、
Ｍは、水素、ナトリウムおよびカリウム原子からなる群から選択され、かつ、
Ｘは、任意にハロゲン部位である。
【００４６】
本発明のＲＧＤリポペプチドは、水溶液中での脂質複合体または凝集体の形成を促進する親油性ドメインを有する。疎水性ドメインの親油性および極性ＲＧＤ頭基ドメインの親水性は、カチオン性脂質が水溶液と出会うと、第２化合物の存在下または非存在下で脂質凝集体が形成されるようになっている。親油性Ｒ1基およびＲ2基の例としては、（１）炭素数８〜２２の飽和アルキル基および（２）１、２または３つの二重結合を含む炭素数８〜２２の不飽和アルケニル基が挙げられる。
【００４７】
本願で開示するカチオン性脂質Ｒ1＝Ｒ2＝ｎ−ヘキサデシルの好適な一実施形態において、Ｒ3はプロトンであり、ｎ＝２、Ｍはナトリウム原子であり、かつ、Ｘ-は塩素イオンである。したがって、両親媒質ｎｏ．１は、本願で説明する新規なＲＧＤリポペプチドの代表例である。
【００４８】
【化６】
2009531409.tif 000005
【００４９】
本発明はまた、一連の新規なカチオン性ＲＧＤリポペプチドの合成プロセス、および、さまざまな培養動物細胞におけるインテグリンを介したその遺伝子導入特性の評価に関する。
【００５０】
［カチオン性脂質の合成］
スキーム１
スキーム１は、本発明で説明する代表的なインテグリン結合ＲＧＤリポペプチド２を調製するために用いられる合成法を概説する。
【００５１】
【化７】
2009531409.tif 000006
【００５２】
【化８】
2009531409.tif 000007
【００５３】
ＲＧＤリポペプチド２は、スキーム１に概説したように、適切に保護されたアミノ酸誘導体とのＮ−２−アミノエチル−Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ヘキサデシルアミンの連続したＤＣＣカップリングと、その後の酸脱保護、水素添加および塩素イオン交換クロマトグラフィーにより合成した。スキーム１に示されているすべての合成中間体および最終脂質の構造は、1Ｈ  ＮＭＲにより確認した。最終脂質はさらに、そのＬＳＩＭＳにおける分子イオンピークにより特徴付けた。脂質２の純度は、２つの異なる移動相を用いた逆相分析ＨＰＬＣにより確認した。
【００５４】
［製剤］
本発明はまた、ここに開示するカチオン性ＲＧＤリポペプチド、生物学的高分子および補脂質の最適量を含む新規な製剤を提供する。１種以上の生理学的に許容される添加物質を本発明の医薬製剤に含めて、保存のために製剤を安定化するか、または、生物学的活性分子を細胞内へうまく運搬できるようにしてもよい。本発明の実施に係る補脂質は、１種以上のＲＧＤリポペプチドとの混合に有用である。コレステロールは、生物学的活性分子を細胞内へうまく運搬できるように本願で説明するＲＧＤリポペプチドと組み合わせて用いるのに優れた補脂質である。ＲＧＤリポペプチド対補脂質のモル比の好適な範囲は、１：１である。ここで、前記範囲を非常に広範に変化させることは、当該技術の範囲内である。典型的には、リポソームは、ガラス製バイアル瓶中でメタノールとクロロホルムとの混合物に適切なモル比でＲＧＤリポペプチドおよび補脂質（コレステロールまたはＤＯＰＥ）を溶解させることにより調製した。わずかな流量の水分を含まない窒素ガスとともに溶媒を除去し、次いで、乾燥した脂質フィルムを高真空下で８時間保持した。該乾燥した脂質フィルムを、ＲＧＤリポペプチド濃度１ｍＭで全体積１ｍＬの無菌脱イオン水中で最短１２時間水和した。リポソームを、１〜２分間ボルテックスして、付着している脂質フィルムがあればこれを除去し、浴超音波処理器（ＵＬＴＲＡｓｏｎｉｋ  ２８Ｘ）中で室温で２〜３分間超音波処理して、多ラメラ小胞（ＭＬＶ）を作成した。その後、ＭＬＶを（デューティサイクル１００％および２５Ｗの出力のＢｒａｎｓｏｎ４５０音波発生器を用いた）Ｔｉプローブにより１〜２分間超音波処理して、透明透光性溶液となることにより示される小型の単ラメラ小胞（ＳＵＶ）を作成した。
【００５５】
本発明のＲＧＤリポペプチドを用いて治療量を細胞内投与可能な生物学的活性分子は、治療上重要なタンパク質をコードするリボソームＲＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのポリヌクレオチド、および、抗脈管形成遺伝子／薬を含む。本発明のＲＧＤリポペプチドは、その代表の１種以上を組み合わせて用いて、前記生物学的活性分子の細胞／組織内への進入を促進するよう配合してもよい。
【００５６】
さらなる実施形態において、本発明において開示するＲＧＤリポペプチドは、純粋な形態で、または、他の脂質やコレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロールなどのヘルパー脂質と組み合わせて用いてもよい。前記治療製剤は、生物学的活性治療分子と複合体を形成するまで、０℃〜４℃で保存してもよい。調製を安定化させる試薬、例えば、低濃度のグリセロールとともに、細菌の成長を妨げ、かつ、貯蔵寿命を延ばす薬剤を含めてもよい。凍結および解凍サイクルは、製剤の効率を損なう可能性があることを特に警告する。
【００５７】
さらに別の実施形態において、ここに開示するＲＧＤリポペプチド、補脂質（コレステロールまたはＤＯＰＥ）および生物学的活性治療分子の製剤は、筋肉内および腹腔内投与などの他の経路に加えて静脈内投与されてもよい。さらに、前記製剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系において、５０，０００個の細胞に対して０．１〜０．５マイクログラムのＤＮＡの割合で細胞に投与されてもよい。両親媒質の量は、１個のＲＧＤリポペプチド分子に対する３個の正電荷および単一のヌクレオチド塩基の１個の負電荷を考慮して、リポペプチド対ＤＮＡ電荷比０．３：１から９：１まで変化させることができる。
【００５８】
本発明はさらに、本発明において開示するＲＧＤリポペプチドの分散液を調製する工程と、前記分散液を生物学的活性分子に接触させて、前記ＲＧＤリポペプチドと前記生物学的活性分子との複合体を形成する工程と、細胞を前記複合体に接触させて、前記生物学的活性分子の細胞内への導入を促進する工程とを含む前記製剤の調製プロセスを提供する。本発明はまた、生物学的活性分子の細胞内運搬を促進するさまざまな製剤を提供する。
【００５９】
［本願で説明するＲＧＤリポペプチドのインテグリン受容体特異的遺伝子運搬特性］
リポペプチド：ＤＮＡ電荷比９：１〜０．３：１にわたって、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＢＲＬ細胞、ＭＣＦ−７細胞、Ａ５４９細胞およびＬ−２７細胞におけるレポーター遺伝子としてのｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−β−ｇａｌプラスミドを用いたレポーター遺伝子発現アッセイにより、補脂質としてのコレステロールまたはＤＯＰＥのいずれかと組み合わせたＲＧＤリポペプチドＡをモル比１：１で含むリポソームのｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション有効性を評価した。ＲＧＤリポペプチドＡは、補脂質としてコレステロールを用いて調製した際に検討したすべての細胞株においてＬ−２７細胞（表面上で過剰に発現したα5β1インテグリンに形質転換したマウス肉腫細胞株）のトランスフェクションにおいて７〜７０倍近くの高い効率を示した（図１、部分Ａ〜Ｄ）。補脂質としてコレステロールを選択したのは、ＤＯＰＥを補脂質として用いた際、Ｌ−２７細胞においてＲＧＤリポペプチドＡの遺伝子導入有効性が３〜４倍近く弱められたからである（データは示さず）。ＲＧＤリポペプチドＡは、リポペプチド：ＤＮＡ電荷比９：１および３：１で、Ｌ−２７細胞のトランスフェクションにおいてもっとも効率的であった（図１、部分Ａ〜Ｄ）。
【００６０】
Ａのトランスフェクション効率は、Ｌ−２７細胞においてさらに低いリポペプチド：ＤＮＡ電荷比、すなわち、１：１および０．３：１でほぼ失われる（図１、部分Ｃ〜Ｄ）。検討した電荷比すべてにわたって、本来は高度にトランスフェクト可能なＣＨＯ細胞においてＡに対するレポーター遺伝子の発現は、低いレベルであった（図１、部分Ａ〜Ｄ）。ＨｅｐＧ２細胞およびＭＣＦ−７細胞においてもまた、Ａは、低いトランスフェクション効率を示した（図１、部分Ａ〜Ｄ）。ＨｅＬａ細胞およびＢＲＬ細胞におけるＡの遺伝子導入有効性は、リポペプチド：ＤＮＡ電荷比の全範囲にわたって、ほぼ有意でなかった（図１、部分Ａ〜Ｄ）。９：１という高い脂質：ＤＮＡ電荷比でのＡ５４９細胞における穏やかな程度の遺伝子導入効率（図１、部分Ａ）は、Ａ５４９細胞表面において発現したα５β１インテグリン受容体の存在から生じているのだろう。Ｌ−２７細胞において観察された対照的に（contrastingly）高まったβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子発現レベル（図１、部分Ａ〜Ｂ）により、脂質Ａによるα5β1インテグリン過剰発現Ｌ−２７細胞のトランスフェクションが、Ａのインテグリン結合ＲＧＤ官能基を介したものである可能性が高いことが強く示される。Ｌ−２７細胞における補脂質としての等モルのコレステロールと組み合わせたＡのより優れたトランスフェクション有効性は、脂質：ＤＮＡ電荷比３：１でのＬ−２７細胞およびＣＨＯ細胞の全細胞組織化学的Ｘ−ｇａｌ染色によりさらに確認された（図２）。高度にトランスフェクト可能なＣＨＯ細胞を含む他の細胞トランスフェクションにおける脂質Ａの有効性が劣っているのは、これら細胞表面におけるインテグリン受容体のレベルがＬ−２７細胞におけるものよりはるかに低く、これら細胞へのＲＧＤリポペプチド：ＤＮＡ複合体の細胞取込みがより劣っている結果かもしれない。
【００６１】
インテグリン受容体を含むＬ２７細胞のトランスフェクションにおけるＲＧＤリポペプチドＡの有効性は、市販の効率的なインテグリン拮抗物質である環状ＲＧＤｆＶペプチドで細胞を処理する遺伝子導入実験が行われた際には、激しく弱められた（部分Ａ、図３）。したがって、図３の部分Ａの所見においてまとめられる結果により、本願のＲＧＤリポペプチドをベースとした遺伝子運搬試薬のクラスに対してインテグリン受容体が関わっていることの強力な証拠が与えられた。ＲＧＤリポペプチドＡの遺伝子導入有効性は、環状ＲＧＤｆＶリガンドより低いインテグリン結合親和性を有する別の市販のインテグリン結合リガンドである直鎖トリペプチドＲＧＤでＬ２７細胞をプレインキュベートした際に、より低減された（図３、部分Ａ）。リポペプチドＡの遺伝子導入有効性は、インテグリン受容体に対する非基質である市販の直鎖テトラペプチドＲＧＥＳでＬ２７細胞を前処理した際は、それほど有意な影響がなかった（図３、部分Ａ）。ＲＧＤペプチドは、インテグリン受容体に対するリガンドであり、ＲＧＥペプチドはそうでないので、我々は、ＲＧＤリポペプチドＡの合成のためのスキーム１において概説したのと全く同じ合成プロトコルにしたがって、代表的なＲＧＤリポペプチドＡのＲＧＥ対応物であるリポペプチド３も合成した。図３の部分Ｂに示されるように、ＲＧＥリポペプチド３は、（細胞表面に過剰に発現したインテグリンを含む）Ｌ２７細胞において大幅に低下した遺伝子導入有効性を示した。したがって、図３の部分Ａと部分Ｂとをともに考慮してまとめたトランスフェクション結果は、本願において説明するＲＧＤリポペプチドの細胞取込みにおいてインテグリン受容体が関わっていることの説得力のある裏付けとなる。
【００６２】
【化９】
2009531409.tif 000008
【００６３】
［本発明において開示する両親媒質の細胞毒性］
補脂質としてのコレステロールおよびＤＯＰＥの両方と組み合わせた本願で説明するＲＧＤリポペプチドの細胞毒性を、前に説明したＭＴＴベースの細胞増殖力アッセイ（Majeti B.K.ら、J. Med. Chem. 2005; 46; 3784-3795）により判定した。両製剤とも、９：１〜０．３：１のリポペプチド：ＤＮＡ電荷比の全範囲にわたって実質的に非毒性であることが分かった（図４）。とりわけ、両製剤とも、より高い脂質：ＤＮＡ電荷比においてさえ８０％を超える細胞増殖力を示した（図４）。したがって、Ｌ−２７細胞以外の細胞においてＲＧＤリポペプチドＡのトランスフェクション効率が劣っているのは、細胞毒性に関する要因によるものではないだろう。
【００６４】
［適用：］
本発明のプロセスは、インテグリン結合ＲＧＤ頭基を含むカチオン性リポペプチドをベースとした遺伝子導入試薬の調製に利用可能である。ＲＧＤリポペプチドの本発明は、インテグリン受容体を介した細胞内へのポリアニオン、ポリペプチドまたはヌクレオポリマーの運搬に有用である。ここで開示するカチオン性ＲＧＤリポペプチドを用いて、製造または治療用に細胞へ発現ベクターを運搬することができる。発現ベクターは、治療上有用なタンパク質を細胞へ運搬するか、または、治療上有用なタンパク質分子をコードする核酸を運搬するために遺伝子治療プロトコルにおいて用いることができる。ＲＧＤリポペプチドの発明は、ドキソルビシンといった抗がん薬剤を含むアニオン性、双性イオン性および親油性治療薬、親油性化合物とともに配合して、本発明のＲＧＤリポペプチドと治療薬とを含む複合体を得ることができる。特に、本願で開示するＲＧＤリポペプチドは、腫瘍血管系への抗がん遺伝子／薬の運搬における将来の利用見込みがある、がんと闘うための抗脈管形成治療様式である。
【００６５】
以下の実施例は、本発明の例示として示すものであるので、本発明の範囲を限定するよう解釈すべきではない。
【実施例１】
【００６６】
ＲＧＤリポペプチド２の合成（スキーム１）
工程（ａ）：固体ＨＯＳｕ（０．８１ｇ、７．０３ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ（１．４５ｇ、７．０３ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）中のＮαＢＯＣ−Ｎε−Ｚ−Ｌ−リシン（２．７ｇ、７．０３ｍｍｏｌ）の氷冷攪拌溶液に順に加えた。半時間後、乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）中に溶解した、前述のように（Majeti, B.Kら、Bioconjug Chem. 2005; 16; 676-684）調製したＮ−２アミノエチル−Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ヘキサデシルアミン（Ｉ、３．６ｇ、７．０３ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（触媒量）を、反応混合物に添加した。得られた溶液を室温で１６時間攪拌し続け、固体ＤＣＵを濾過し、濾液から溶媒を蒸発させた。残渣をエチルアセテート（１００ｍＬ）に取り込み、氷で冷却した１Ｎ  ＨＣｌ（１×１００ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム（１×１００ｍＬ）および水（２×１００ｍＬ）により順に洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液から溶媒をロータリーエバポレーションにより除去した。残渣を１２％のアセトン−ヘキサン（ｖ／ｖ）を溶離剤として用いた６０〜１２０メッシュのシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーで精製して、３．７ｇ（６０％）の純粋中間体（ＩＩ）が得られた。（ＴＬＣ展開溶媒として３０％のアセトン−ヘキサンｖ／ｖを用いたＲf＝０．５）。
【００６７】
【数１】
2009531409.tif 000009
【００６８】
工程（ｂ）：工程（ａ）において得られた中間体ＩＩ（３．４ｇ、３．９０ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解し、０℃でＴＦＡ（４ｍＬ）を添加した。得られた溶液を室温で５時間攪拌し続け、完全に脱保護した。余分なＴＦＡを窒素フラッシングにより除去した。得られた化合物をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１０ｍＬ）を添加し、室温で１５分間攪拌した。溶媒をロータリーエバポレーションにより完全に除去した。残渣をＤＣＭ（１００ｍＬ）に取り込み、水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液から溶媒をロータリーエバポレーションにより除去して、２．７６ｇ（収率９１％）が得られた。（ＴＬＣ展開溶媒として１０％のメタノール−クロロホルムｖ／ｖを用いたＲf＝０．２）。
【００６９】
【数２】
2009531409.tif 000010
【００７０】
工程（ｃ）：固体ＨＯＳｕ（０．４１ｇ、３．５７ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ（０．７４ｇ、３．５７ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＣＭ（１５ｍＬ）中のＬ−アスパラギン酸−β−ベンジルエステルから従来どおり調製された（Bodanszky, Mら、the presence of peptide synthesis springer-Verlag, Berlin Heidelberg,1984 page no:20）Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸−β−ベンジルエステル（１．１５ｇ、３．５７ｍｍｏｌ）の氷冷攪拌溶液に順に加えた。半時間後、乾燥ＤＣＭ（１５ｍＬ）中に溶解した、工程ｂにおいて得られた中間体（２．７５ｇ、３．５７ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（触媒）を、反応混合物に添加した。得られた溶液を室温で１６時間攪拌し続け、固体ＤＣＵを濾過し、濾液からの溶媒を蒸発させた。残渣をＤＣＭ（１００ｍＬ）に取り込み、水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液から溶媒をロータリーエバポレーションにより除去した。残渣を１５％のアセトン−ヘキサン（ｖ／ｖ）を溶離剤として用いた６０〜１２０メッシュのシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーで精製して、２．８５ｇ（７４．２％）の純粋中間体（ＩＩＩ）が得られた。（ＴＬＣ展開溶媒として３０％のアセトン−ヘキサンｖ／ｖを用いたＲf＝０．４）。
【００７１】
【数３】
2009531409.tif 000011
【００７２】
工程（ｄ）：工程（ｃ）において得られた中間体ＩＩＩ（２．８５ｇ、２．６５ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ（６ｍＬ）に溶解し、０℃でＴＦＡ（３ｍＬ）を添加した。得られた溶液を室温で５時間攪拌し続け、完全に脱保護した。余分なＴＦＡを窒素フラッシングにより除去した。得られた化合物をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（５ｍＬ）を添加し、室温で１５分間攪拌した。溶媒をロータリーエバポレーションにより完全に除去した。残渣をＤＣＭ（１００ｍＬ）に取り込み、水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液からロータリーエバポレーションにより溶媒を除去して、２．５８ｇ（収率９２％）が得られた。（ＴＬＣ展開溶媒として１０％のメタノール−クロロホルムｖ／ｖを用いたＲf＝０．３）。
【００７３】
【数４】
2009531409.tif 000012
【００７４】
工程（ｅ）：固体ＨＯＳｕ（０．５１ｇ、２．４６ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（０．２８ｇ、２．４６ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（触媒量）の存在下で、工程（ｃ）において上述したのと実質的に同じプロトコルにしたがって、Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−グリシン（０．４３ｇ、２．４６ｍｍｏｌ）を工程（ｄ）において得られた中間体（２．４ｇ、２．４６ｍｍｏｌ）とカップリングさせた。生じた粗生成物を石油エーテル中の３０〜３５％のアセトン（ｖ／ｖ）を溶離剤として用いた６０〜１２０メッシュのシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーで精製して、ゴム質の固体である１．５ｇ（収率５４％）の中間体（ＩＶ）が得られた。（ＴＬＣ展開溶媒として３５％のアセトン−ヘキサンｖ／ｖを用いたＲf＝０．４５）。
【００７５】
【数５】
2009531409.tif 000013
【００７６】
工程（ｆ）：工程（ｅ）において得られた中間体（ＩＶ）（０．７ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を、工程（ｂ）において上述したのと実質的に同じプロトコルにしたがって脱保護した。生じた生成物をロータリーエバポレートして、０．６ｇ（収率９３％）の中間体が得られた（ＴＬＣ展開溶媒として５％のメタノール−クロロホルムｖ／ｖを用いたＲf＝０．２）。
【００７７】
【数６】
2009531409.tif 000014
【００７８】
工程（ｇ）：固体ＨＯＳｕ（０．０６６ｇ、０．５７ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（０．１２ｇ、０．５７ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（触媒量）の存在下で、工程（ｃ）において上述したのと実質的に同じプロトコルにしたがって、Ｎα−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｎω−ニトロ−Ｌ−アルギニン（０．１８ｇ、０．５７ｍｍｏｌ）を工程（ｆ）において得られた中間体（０．５９ｇ、０．５７ｍｍｏｌ）とカップリングさせた。生じた粗生成物をＤＣＭ中の５％のメタノール（ｖ／ｖ）を溶離剤として用いた６０〜１２０メッシュのシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーで精製して、０．３５ｇ（収率４６％）の中間体Ｖが得られた。（ＴＬＣ展開溶媒として５％のメタノール−クロロホルムｖ／ｖを用いたＲf＝０．２）。
【００７９】
【数７】
2009531409.tif 000015
【００８０】
工程（ｈ、ｉ、ｊ）：工程（ｇ）において得られた中間体（０．１ｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解し、０℃でＴＦＡ（０．５ｍＬ）を添加した。得られた溶液を室温で５時間攪拌し続け、完全に脱保護した。余分なＴＦＡを窒素フラッシングにより除去した。得られた化合物をメタノール（３ｍＬ）に溶解し、これに１０％Ｐｄ／Ｃを添加した。反応混合物を、水素ガスの存在下で室温で２０時間攪拌した。次いで、反応混合物をメタノール（５０ｍＬ）で希釈し、セライトを通じて触媒を濾過した。溶媒をロータリーエバポレートし、その後、（アンバーリストＡ−２６塩素イオン交換樹脂を用いた）塩素イオン交換クロマトグラフィーを行い、アセトン中での結晶化により、０．０３７ｇ（収率５０％）の純粋な標的脂質２が得られた（ＴＬＣ展開溶媒として３５％のメタノール−クロロホルムｖ／ｖを用いたＲf＝０．１０）。
【００８１】
【数８】
2009531409.tif 000016
【実施例２】
【００８２】
ＲＧＥリポペプチド３（代表的コントロール、インテグリン結合ＲＧＤリポペプチド２の非インテグリン結合リポペプチド対応物）の合成
工程（ａ）：固体ＨＯＢｔ（０．４８８ｇ、３．６２ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ（０．６９３ｇ、３．６２ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）中のＮαＢＯＣ−Ｎε−Ｚ−Ｌ−リシン（１．１５ｇ、３．６２ｍｍｏｌ）の氷冷攪拌溶液に順に加えた。半時間後、乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）中に溶解した、前述のように（Majeti, B.Kら、Bioconjug Chem. 2005; 16; 676-684）調製したＮ−２アミノエチル−Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ヘキサデシルアミン（Ｉ、１．６７ｇ、３．２８ｍｍｏｌ）を、反応混合物に添加した。得られた溶液を室温で１６時間攪拌し続けた。溶液をクロロホルム（５０ｍＬ）に取り込み、氷で冷却した１Ｎ  ＨＣｌ（２×１００ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム（２×１００ｍＬ）およびブライン（１×１００ｍＬ）により順に洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液から溶媒をロータリーエバポレーションにより除去した。残渣を１２％のアセトン−ヘキサン（ｖ／ｖ）を溶離剤として用いた６０〜１２０メッシュのシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーで精製して、１．７２ｇ（６０％）の純粋中間体（ＩＩ）が得られた。（ＴＬＣ展開溶媒として３０％のアセトン−ヘキサンｖ／ｖを用いたＲf＝０．５）。
【００８３】
【数９】
2009531409.tif 000017
【００８４】
工程（ｂ）：工程（ａ）において得られた中間体ＩＩ（０．８５ｇ、０．９８ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解し、０℃でＴＦＡ（４ｍＬ）を添加した。得られた溶液を室温で５時間攪拌し続け、完全に脱保護した。余分なＴＦＡを窒素フラッシングにより除去した。得られた化合物をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１０ｍＬ）を添加し、室温で１５分間攪拌した。溶媒をロータリーエバポレーションにより完全に除去した。残渣をＤＣＭ（１００ｍＬ）に取り込み、水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液から溶媒をロータリーエバポレーションにより除去して、０．７０８ｇ（収率９４％）が得られた。（ＴＬＣ展開溶媒として１０％のメタノール−クロロホルムｖ／ｖを用いたＲf＝０．２）。
【００８５】
工程（ｃ）：固体ＨＯＢｔ（０．１８８ｇ、１．３８ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ（０．２６４ｇ、１．３８ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＣＭ（１５ｍＬ）中のＬ−グルタミン酸−β−ベンジルエステルから従来どおり調製されたＮ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−β−ベンジルエステル（０．４６４ｇ、１．３８ｍｍｏｌ）の氷冷攪拌溶液に順に加えた。半時間後、乾燥ＤＣＭ（１５ｍＬ）中に溶解した、工程ｂにおいて得られた中間体（０．７０８ｇ、０．９２ｍｍｏｌ）を、反応混合物に添加した。得られた溶液を室温で１６時間攪拌し続けた。溶液をクロロホルム（５０ｍＬ）に取り込み、氷で冷却した１Ｎ  ＨＣｌ（２×１００ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム（２×１００ｍＬ）およびブライン（１×１００ｍＬ）により順に洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液から溶媒をロータリーエバポレーションにより除去した。残渣を１５％のアセトン−ヘキサン（ｖ／ｖ）を溶離剤として用いた６０〜１２０メッシュのシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーで精製して、０．７ｇ（７０％）の純粋中間体（ＩＩＩ）が得られた。（ＴＬＣ展開溶媒として３０％のアセトン−ヘキサンｖ／ｖを用いたＲf＝０．４）。
【００８６】
【数１０】
2009531409.tif 000018
【００８７】
工程（ｄ）：工程（ｃ）において得られた中間体ＩＩＩ（０．７ｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ（６ｍＬ）に溶解し、０℃でＴＦＡ（３ｍＬ）を添加した。得られた溶液を室温で５時間攪拌し続け、完全に脱保護した。余分なＴＦＡを窒素フラッシングにより除去した。得られた化合物をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（５ｍＬ）を添加し、室温で１５分間攪拌した。溶媒をロータリーエバポレーションにより完全に除去した。残渣をＤＣＭ（１００ｍＬ）に取り込み、水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液から溶媒をロータリーエバポレーションにより除去して、０．６ｇ（収率９４％）が得られた。（ＴＬＣ展開溶媒として１０％のメタノール−クロロホルムｖ／ｖを用いたＲf＝０．３）。
【００８８】
工程（ｅ）：固体ＨＯＢｔ（０．２４６ｇ、１．８２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．３４８ｇ、１．８２ｍｍｏｌ）の存在下で、工程（ｃ）において上述したのと実質的に同じプロトコルにしたがって、Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−グリシン（０．３１８ｇ、１．８２ｍｍｏｌ）を工程（ｄ）において得られた中間体（０．６ｇ、０．６１ｍｍｏｌ）とカップリングさせた。生じた粗生成物を石油エーテル中の３０〜３５％のアセトン（ｖ／ｖ）を溶離剤として用いた６０〜１２０メッシュのシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーで精製して、ゴム質の固体である０．３８２ｇ（収率５５％）の中間体（ＩＶ）が得られた。（ＴＬＣ展開溶媒として３５％のアセトン−ヘキサンｖ／ｖを用いたＲf＝０．４５）。
【００８９】
【数１１】
2009531409.tif 000019
【００９０】
工程（ｆ）：工程（ｅ）において得られた中間体（ＩＶ）（０．３８２ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を、工程（ｂ）において上述したのと実質的に同じプロトコルにしたがって脱保護した。得られた生成物をロータリーエバポレートして、０．３２ｇ（収率９２％）の中間体が得られた（ＴＬＣ展開溶媒として５％のメタノール−クロロホルムｖ／ｖを用いたＲf＝０．２）。
【００９１】
工程（ｇ）：固体ＨＯＢｔ（０．０３９ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．０５６ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）の存在下で、工程（ｃ）において上述したのと実質的に同じプロトコルにしたがって、Ｎα−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｎω−ニトロ−Ｌ−アルギニン（０．０９３ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を工程（ｆ）において得られた中間体（０．２４ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）とカップリングさせた。生じた粗生成物をＤＣＭ中の５％のメタノール（ｖ／ｖ）を溶離剤として用いた６０〜１２０メッシュのシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーで精製して、０．１６ｇ（収率５０％）の中間体Ｖが得られた。（ＴＬＣ展開溶媒として５％のメタノール−クロロホルムｖ／ｖを用いたＲf＝０．２）。
【００９２】
【数１２】
2009531409.tif 000020
【００９３】
工程（ｈ、ｉ、ｊ）：工程（ｇ）において得られた中間体（０．１ｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解し、０℃でＴＦＡ（０．５ｍＬ）を添加した。得られた溶液を室温で５時間攪拌し続け、完全に脱保護した。余分なＴＦＡを窒素フラッシングにより除去した。得られた化合物をメタノール（３ｍＬ）に溶解し、これに１０％Ｐｄ／Ｃを添加した。反応混合物を、水素ガスの存在下で室温で２０時間攪拌した。次いで、反応混合物をメタノール（５０ｍＬ）で希釈し、セライトを通じて触媒を濾過した。溶媒をロータリーエバポレートし、その後、（アンバーリストＡ−２６塩素イオン交換樹脂を用いた）塩素イオン交換クロマトグラフィーを行い、アセトン中での結晶化により、０．０３７ｇ（収率５０％）の純粋な標的脂質３が得られた（ＴＬＣ展開溶媒として３５％のメタノール−クロロホルムｖ／ｖを用いたＲf＝０．１０）。
【００９４】
【数１３】
2009531409.tif 000021
【実施例３】
【００９５】
［ｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子導入有効性の評価。］
トランスフェクション１８〜２４時間前に、９６ウェルプレートの各ウェルあたり２００００個の密度で細胞を播種した。０．３μｇのプラスミドＤＮＡを、平らなＤＭＥＭ培地（全体積１００μＬまでとした）中で３０分間さまざまな量（０．４５〜７．２ｎｍｏｌ）のＲＧＤリポペプチドと複合体形成した。リポペプチド：ＤＮＡ電荷比（＋／−）は、０．３：１から９：１まで変化させた。次いで、ＲＧＤリポペプチド：ＤＮＡ複合体を細胞に加えた。４時間のインキュベーション後、２０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ１００μＬを細胞に加えた。２４時間後に培地を１０％完全培地に変え、４８時間後にレポーター遺伝子活性を判断した。細胞をＰＢＳで２回（各回１００μｌ）洗浄し、５０μｌの溶解緩衝液［０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．５％ＮＰ４０］に溶解した。完全に溶解するよう注意を払った。９６ウェルプレート中の溶解産物に５０μｌの２Ｘ基質溶液［１．３３ｍｇ／ｍｌのＯＮＰＧ、０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．３）および２ｍＭ塩化マグネシウム］を添加することにより、各ウェルあたりのβ−ガラクトシダーゼ活性を判断した。純粋な商用β−ガラクトシダーゼ酵素により構築された較正曲線を用いて、４０５ｎｍにおける吸光度をβ−ガラクトシダーゼ単位に変換した。同日のアッセイによる同内容の三実験におけるβ−ガラクトシダーゼ単位の値のばらつきは、２０％未満であった。
【００９６】
トランスフェクション実験は、同内容で３回行った。図１Ａに示すトランスフェクション効率値は、同日に行われた同内容の三実験の平均値である。各トランスフェクション実験を２回繰り返したところ、平均トランスフェクション効率の日ごとのばらつきは、２倍以内であることが分かった。別々の日に得られたトランスフェクショングラフは、同一であった。
【実施例４】
【００９７】
［トランスフェクトされたＬ２７細胞およびＣＨＯ細胞の全細胞組織化学的Ｘ−ｇａｌ染色によるトランスフェクションアッセイ］
β−ガラクトシダーゼを発現するトランスフェクトされたＬ２７細胞およびＣＨＯ細胞を、前に説明したように（Majeti, B.K.ら、2005）、基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）で組織化学的に染色した。９６ウェルプレート中のＲＧＤリポペプチド：ＤＮＡ複合体でのトランスフェクション４８時間後、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、２ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４）により２回（２×１００μＬ）洗浄し、ＰＢＳ（２２５μＬ）中の０．５％グルタルアルデヒドで固定化した。室温で１５分間インキュベートした後、細胞を再度ＰＢＳにより３回（３×２５０μＬ）洗浄し、その後、３７℃で２〜４時間、５．０ｍＭ  Ｋ3［Ｆｅ（ＣＮ）6］ならびに５．０ｍＭ  Ｋ4［Ｆｅ（ＣＮ）6］および１ｍＭ  ＭｇＳＯ4を含むＰＢＳ中の１．０ｍｇ／ｍＬのＸ−ｇａｌで染色した。光学顕微鏡（ライカ、ドイツ）により青色細胞を確認した。図２は、リポペプチド：ＤＮＡ電荷比９：１でＡがトランスフェクトされたＬ２７細胞およびＣＨＯ細胞の組織化学的全細胞Ｘ−ｇａｌ染色を示す。図２においてまとめられるＸ−ｇａｌ染色結果により、過剰に発現したインテグリンを有するＬ２７細胞は、表面のインテグリンがかなりの量欠如しているＣＨＯ細胞より、ＲＧＤリポペプチドＡの遺伝子導入有効性が顕著に優れているということが説得力をもって示されている。
【実施例５】
【００９８】
［細胞増殖力パーセント］
ＤＯＰＥとコレステロールの両方と組み合わせた３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）還元アッセイにより、リポペプチドＡの細胞毒性を評価した。本アッセイは、トランスフェクション実験において用いられたのと同じＡの量に対する細胞数の比率を維持しつつ、９６ウェルプレートにて行った。Ａを細胞に添加した３時間後に、ＭＴＴを添加した。増殖力パーセント＝［Ａ540（処理済細胞）−バックグラウンド／Ａ540（未処理細胞）−バックグラウンド］×１００として結果を表した。
【００９９】
［発明の利点：］
１．インテグリン結合ＲＧＤリポペプチドは、遺伝子導入試薬として有用である。
【０１００】
２．ＲＧＤリポペプチドは、細胞へのポリアニオン、ポリペプチドまたはヌクレオポリマーの運搬に有用である。
【０１０１】
３．ＲＧＤリポペプチドは、抗がん薬剤を含む治療薬とともに配合可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１Ａ−Ｂ】図１（部分Ａ〜Ｄ）は、リポペプチド：ＤＮＡ電荷比９：１〜０．３：１にわたって、ＣＨＯ細胞、ＭＣＦ−７細胞、Ａ５４９細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＲＬ細胞およびＬ２７細胞を含む複数の培養細胞における、本発明で開示するＲＧＤリポペプチド１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子運搬有効性グラフの概要である。
【図１Ｃ−Ｄ】図１（部分Ａ〜Ｄ）は、リポペプチド：ＤＮＡ電荷比９：１〜０．３：１にわたって、ＣＨＯ細胞、ＭＣＦ−７細胞、Ａ５４９細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＲＬ細胞およびＬ２７細胞を含む複数の培養細胞における、本発明で開示するＲＧＤリポペプチド１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子運搬有効性グラフの概要である。
【図２】図２は、脂質：ＤＮＡ電荷比９：１でＲＧＤリポペプチド１がトランスフェクトされたＣＨＯ細胞およびＬ２７細胞の全細胞組織化学的Ｘ−ｇａｌ染色図である。
【図３】図３の部分Ａは、環状ＲＧＤｆＶおよび直鎖ＲＧＤトリペプチドといった市販のインテグリン拮抗物質、ならびに、市販の非インテグリンリガンドＲＧＥにより細胞をプレインキュベートした際に、Ｌ２７細胞におけるＲＧＤリポペプチド１の遺伝子導入が低下したことを示すグラフの概要である。図３の部分Ｂは、Ｌ２７細胞において、インテグリン結合ＲＧＤリポペプチド１が非インテグリン結合ＲＧＥリポペプチド２より顕著に優れた遺伝子導入特性を有することを示している。
【図４】図４は、リポペプチド：ＤＮＡ電荷比が９：１〜０．３：１にわたって、補脂質としてのＤＯＰＥとコレステロールの両方と組み合わせて用いられたＲＧＤリポペプチド１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性グラフを示す。
【図１Ａ−Ｂ】
2009531409.tif 000024
【図１Ｃ−Ｄ】
2009531409.tif 000025
【図２】
2009531409.tif 000026
【図３】
2009531409.tif 000027
【図４】
2009531409.tif 000028
【手続補正書】
【提出日】平成20年1月29日(2008.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般構造Ａを有するα5β1インテグリン受容体特異的ＲＧＤリポペプチド。
【化１】
2009531409.tif 000029
式中、Ｒ1およびＲ2は、Ｒ1およびＲ2の両方が同時に水素ではないとき、それぞれ独立して水素または親油性部位であり、前記親油性部位は、それぞれ炭素数８以上のアルキル基、モノ不飽和アルケニル基、ジ不飽和アルケニル基およびトリ不飽和アルケニル基からなる群から選択され、
Ｒ3は、水素、炭素数１から５の直鎖アルキル基および炭素数１から５の分岐アルキル鎖アルキル基からなる群から選択され、
ｎは、１から７の値を有する整数であり、
Ｘは、任意にハロゲン部位であり、かつ、
Ｍは、水素、ナトリウムおよびカリウムからなる群から選択される。
【請求項２】
前記親油性部位の炭素数が８〜２２である請求項１に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項３】
Ｘが、塩素、臭素またはヨウ素である請求項１に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項４】
Ｒ1およびＲ2は、Ｒ1およびＲ2の両方が同時に水素ではないとき、それぞれ独立して水素または脂肪族炭化水素鎖である請求項１に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項５】
Ｒ1およびＲ2の両方が、脂肪族炭化水素鎖である請求項１に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項６】
Ｒ3がアルキル基であり、かつ、Ｒ1およびＲ2の両方が脂肪族炭化水素鎖である請求項１に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項７】
Ｒ3が水素原子であり、かつ、Ｒ1およびＲ2の両方が脂肪族炭化水素鎖である請求項１に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項８】
Ｒ3がアルキル基であり、かつ、Ｒ1およびＲ2が、独立して水素または脂肪族炭化水素鎖である請求項１に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項９】
炭素数が約８〜２２のＲ1基およびＲ2基の各々が、独立して炭素数８〜２２のアルキル基、または、炭素数８〜２２のモノ不飽和アルケニル基、ジ不飽和アルケニル基もしくはトリ不飽和アルケニル基である請求項１に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項１０】
Ｒ１およびＲ2基の各々の炭素数が約１６から約２２である請求項１０に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項１１】
Ｒ1およびＲ2が、独立してモノ不飽和アルケニル基である請求項１０および１１に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項１２】
Ｒ1およびＲ2の両方が同一であり、かつ、炭素数１２から１８の飽和アルキル基である請求項１に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項１３】
Ｒ1およびＲ2の両方が同一であり、かつ、炭素数１８から２２のモノ不飽和アルケニル基である請求項１に記載のＲＧＤリポペプチド。
【請求項１４】
１種以上のポリアニオン性化合物および１種以上の生理学的に許容される添加物とともに、一般構造Ａを有するＲＧＤリポペプチドを含む抗がん薬または遺伝子の標的への運搬のための製剤。
【化２】
2009531409.tif 000030
式中、Ｒ1およびＲ2は、Ｒ1およびＲ2の両方が同時に水素ではないとき、それぞれ独立して水素または親油性部位であり、前記親油性部位は、それぞれ炭素数８以上のアルキル基、モノ不飽和アルケニル基、ジ不飽和アルケニル基およびトリ不飽和アルケニル基からなる群から選択され、
Ｒ3は、水素、炭素数１から５の直鎖アルキル基および炭素数１から５の分岐アルキル鎖アルキル基からなる群から選択され、
ｎは、１から７の値を有する整数であり、
Ｘは、任意にハロゲン部位であり、かつ、
Ｍは、水素、ナトリウムおよびカリウム原子からなる群から選択される。
【請求項１５】
補脂質（co lipid）をさらに含む請求項１４に記載の製剤。
【請求項１６】
用いられる前記補脂質が、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロールおよびコレステロールからなる群から選択される請求項１５に記載の製剤。
【請求項１７】
用いられる前記補脂質が、ステロール基、中性ホスファチジルエタノールアミンおよび中性ホスファチジルコリンからなる群から選択される請求項１５に記載の製剤。
【請求項１８】
前記補脂質が、ＤＯＰＥおよびコレステロールからなる群から選択される請求項１５に記載の製剤。
【請求項１９】
ＲＧＤリポペプチド対用いられる補脂質のモル比が、１：１から３：１の範囲である請求項１５に記載の製剤。
【請求項２０】
ＲＧＤリポペプチド対補脂質のモル比が、１：１である請求項１９に記載の製剤。
【請求項２１】
前記ポリアニオン性化合物が、治療上重要なタンパク質をコードする核酸、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質および薬剤からなる群から選択される請求項１４に記載の製剤。
【請求項２２】
用いられる前記核酸が、環状プラスミド、直鎖プラスミド、リボ核酸、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド、ＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド、ゲノムＤＮＡのポリヌクレオチド、ｃＤＮＡのポリヌクレオチドおよびｍＲＮＡのポリヌクレオチドからなる群から選択される請求項２１に記載の製剤。
【請求項２３】
前記ポリアニオンが、単独でまたは組み合わせて用いられる請求項２１に記載の製剤。
【請求項２４】
静脈内、筋肉内または腹腔内投与される請求項１４に記載の製剤。
【請求項２５】
２５から１００マイクロリットルの範囲で細胞内投与される請求項１４に記載の製剤。
【請求項２６】
５０，０００個の細胞に対して０．１から０．５マイクログラムのＤＮＡの割合で細胞に投与される請求項１４に記載の製剤。
【請求項２７】
９．０から０．３マイクログラムの範囲の両親媒質をさらに含み、かつ、両親媒質の量を、リポペプチド対ＤＮＡ電荷比０．３：１から９：１まで変化させる請求項１４に記載の製剤。
【請求項２８】
請求項１４に記載の製剤を含むトランスフェクション複合体。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、α5β1インテグリン受容体のＲＧＤトリペプチドリガンドを含む一連の新規なカチオン性両親媒質、および、その調製方法に関する。本発明は、顕著な遺伝子導入特性を有する前記両親媒質を含む新規な組成物を提供する。本発明によりもっとも恩恵を受けるであろう医学領域は、非ウイルス性がん遺伝子治療である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
抗がん薬の開発は、概ね、αvβ3インテグリンおよびαvβ5インテグリンの選択的拮抗物質の設計を中心に行われてきた（Richard O. Hynes、Nature Med 2002; 8; 918-921、Brooksら、Science 1994; 264; 569-571、Brooksら、Cell 1994; 79; 1157-1164、Brooksら、J. Clin. Invest. 1995; 96; 1815-1822、Friedlanderら、Science 1995; 270; 1500-1502、Friedlanderら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93; 9764-9769、Hammesら、Nature Med 1996; 2; 529-533）。しかしながら、αvβ3インテグリンおよびαvβ5インテグリンの一方または両方がないマウスは、腫瘍の成長が高まり、かつ、新脈管形成が広範にわたることが示されている（Reynoldsら、Nature Med. 2002; 8; 27-34、Baderら、Cell 1998; 95; 507-519）。２４種類の異なるインテグリン受容体のうち、フィブロネクチン受容体α5β1が、もっとも確実な前脈管形成インテグリン受容体のようである（Anneら、Cancer Research 2006; 66; 6002-6007、Curleyら、Cell Mol. Life Sci. 1999; 56; 427-441、Francisら、Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002; 22; 927-933）。α5β1インテグリン受容体は、新脈管形成中の内皮細胞において過剰に発現しているので、抗脈管形成がん治療における新たな標的となるだろう（Kitaら、Cancer Research 2001; 61; 7985-7991）。共有結合グラフトＲＧＤ官能基を含む立体的ステルスリポソームの設計（Xiao-Bing Xiongら、Pharmaceutical Research 2005; 22; 933-939）およびＲＧＤ官能基を含むカチオン性ポリマーをベースとした非ウイルス性遺伝子運搬系の設計（Pascale Belguise-Valladierら、Cytotechnology 2001; 35; 197-201）が、これまでに報告されている。しかしながら、これまでに報告されたこれらの遺伝子導入試薬はいずれも、α5β1インテグリン受容体を何ら特定して示していなかった。このために、本発明は、α5β1インテグリン受容体を介した遺伝子／薬剤運搬のための一連の新規で単純なＲＧＤリポペプチドの開発に関する。
本発明は、単純なインテグリン結合ＲＧＤトリペプチド官能基を含む一連の新規なリポペプチドの開発に関する。ここに記載するこの新たなクラスのＲＧＤリポペプチドの遺伝子導入特性は、形質転換されたマウス肉腫細胞（Ｌ２７細胞）に対して顕著な細胞親和性を有する。ここに開示するＲＧＤリポペプチドの遺伝子導入有効性は、細胞が市販のインテグリン結合環状ペプチド（ＲＧＤｆＶ）でプレインキュベートされると、大幅に抑制される。これは、遺伝子導入過程が、インテグリン受容体を介したものであることを示している。したがって、本発明のＲＧＤリポペプチドのクラスは、過剰に発現したインテグリン受容体を有する腫瘍血管系に対し抗がん遺伝子／薬をターゲッティングするための抗脈管形成がん治療において将来の適用が見込まれる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本発明の目的は、α5β1インテグリン結合ＲＧＤ頭基を含むカチオン性リポペプチドをベースとする遺伝子導入試薬、および、その調製方法を提供することである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
したがって、本発明は、一連の新規なカチオン性ＲＧＤリポペプチド、および、その合成プロセス、ならびに、さまざまな培養動物細胞におけるα5β1インテグリンを介したその遺伝子導入特性の評価に関する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
［本願で説明するＲＧＤリポペプチドのα5β1インテグリン受容体特異的遺伝子運搬特性］
リポペプチド：ＤＮＡ電荷比９：１〜０．３：１にわたって、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＢＲＬ細胞、ＭＣＦ−７細胞、Ａ５４９細胞およびＬ−２７細胞におけるレポーター遺伝子としてのｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−β−ｇａｌプラスミドを用いたレポーター遺伝子発現アッセイにより、補脂質としてのコレステロールまたはＤＯＰＥのいずれかと組み合わせたＲＧＤリポペプチドＡをモル比１：１で含むリポソームのｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション有効性を評価した。ＲＧＤリポペプチドＡは、補脂質としてコレステロールを用いて調製した際に検討したすべての細胞株においてＬ−２７細胞（表面上で過剰に発現したα5β1インテグリンに形質転換したマウス肉腫細胞株）のトランスフェクションにおいて７〜７０倍近くの高い効率を示した（図１、部分Ａ〜Ｄ）。補脂質としてコレステロールを選択したのは、ＤＯＰＥを補脂質として用いた際、Ｌ−２７細胞においてＲＧＤリポペプチドＡの遺伝子導入有効性が３〜４倍近く弱められたからである。ＲＧＤリポペプチドＡは、リポペプチド：ＤＮＡ電荷比９：１および３：１で、Ｌ−２７細胞のトランスフェクションにおいてもっとも効率的であった（図１、部分Ａ〜Ｄ）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
インテグリン受容体を含むＬ２７細胞のトランスフェクションにおけるＲＧＤリポペプチドＡの有効性は、市販の効率的なインテグリン拮抗物質である環状ＲＧＤｆＶペプチドで細胞を処理する遺伝子導入実験が行われた際には、激しく弱められた（部分Ａ、図３）。したがって、図３の部分Ａの所見においてまとめられる結果により、本願のＲＧＤリポペプチドをベースとした遺伝子運搬試薬のクラスに対してインテグリン受容体が関わっていることの強力な証拠が与えられた。ＲＧＤリポペプチドＡの遺伝子導入有効性は、環状ＲＧＤｆＶリガンドより低いインテグリン結合親和性を有する別の市販のインテグリン結合リガンドである直鎖トリペプチドＲＧＤでＬ２７細胞をプレインキュベートした際に、より低減された（図３、部分Ａ）。リポペプチドＡの遺伝子導入有効性は、インテグリン受容体に対する非基質である市販の直鎖テトラペプチドＲＧＥＳでＬ２７細胞を前処理した際は、それほど有意な影響がなかった（図３、部分Ａ）。ＲＧＤペプチドは、インテグリン受容体に対するリガンドであり、ＲＧＥペプチドはそうでないので、我々は、ＲＧＤリポペプチドＡの合成のためのスキーム１において概説したのと全く同じ合成プロトコルにしたがって、代表的なＲＧＤリポペプチドＡのＲＧＥ対応物であるリポペプチド３も合成した。図３の部分Ｂに示されるように、ＲＧＥリポペプチド３は、（細胞表面に過剰に発現したインテグリンを含む）Ｌ２７細胞において大幅に低下した遺伝子導入有効性を示した。したがって、図３の部分Ａと部分Ｂとをともに考慮してまとめたトランスフェクション結果は、本願において説明するＲＧＤリポペプチドの細胞取込みにおいてインテグリン受容体が関わっていることの説得力のある裏付けとなる。
最後に、本願で説明するＲＧＤリポペプチドが何らかの特定のインテグリン受容体に対して選択性を有するか否かを調べるために、α5β1インテグリン受容体、αvβ3インテグリン受容体およびαvβ5インテグリン受容体に対する市販のモノクローナル抗体でプレインキュベートしたＬ２７細胞のトランスフェクションにおいてＲＧＤリポペプチド１の効率を評価した。図３の部分Ｃに示すように、ＲＧＤリポペプチド１のトランスフェクション効率は、細胞をα5β1インテグリン受容体に対するモノクローナル抗体で前処理したときのみ有意な影響を受け、インテグリン受容体αvβ3およびαvβ5に対するモノクローナル抗体で前処理したときは影響を受けなかった。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
【化９】
2009531409.tif 000031
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
［適用：］
本発明のプロセスは、インテグリン結合ＲＧＤ頭基を含むカチオン性リポペプチドをベースとした遺伝子導入試薬の調製に利用可能である。ＲＧＤリポペプチドの本発明は、α5β1インテグリン受容体を介した細胞内へのポリアニオン、ポリペプチドまたはヌクレオポリマーの運搬に有用である。ここで開示するカチオン性ＲＧＤリポペプチドを用いて、製造または治療用に細胞へ発現ベクターを運搬することができる。発現ベクターは、治療上有用なタンパク質を細胞へ運搬するか、または、治療上有用なタンパク質分子をコードする核酸を運搬するために遺伝子治療プロトコルにおいて用いることができる。ＲＧＤリポペプチドの発明は、ドキソルビシンといった抗がん薬剤を含むアニオン性、双性イオン性および親油性治療薬、親油性化合物とともに配合して、本発明のＲＧＤリポペプチドと治療薬とを含む複合体を得ることができる。特に、本願で開示するＲＧＤリポペプチドは、腫瘍血管系への抗がん遺伝子／薬の運搬における将来の利用見込みがある、がんと闘うための抗脈管形成治療様式である。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
市販のインテグリン拮抗物質（例えば、環状ＲＧＤｆＶおよび直鎖ＲＧＤＳ、図３の部分Ａ）により前処理した細胞を用いたトランスフェクション実験用に、（最終濃度１５０μＭの拮抗物質を用いて）希釈インテグリン拮抗物質で細胞をプレインキュベートした。α5β1インテグリン受容体、αvβ3インテグリン受容体およびαvβ5インテグリン受容体の市販のモノクローナル抗体によりプレインキュベートしたＬ２７細胞を用いたトランスフェクション実験の場合は、２５倍に希釈した（ｖ／ｖ）モノクローナル抗体を用いて細胞を前処理した。
トランスフェクション実験は、同内容で３回行った。図１Ａに示すトランスフェクション効率値は、同日に行われた同内容の三実験の平均値である。各トランスフェクション実験を２回繰り返したところ、平均トランスフェクション効率の日ごとのばらつきは、２倍以内であることが分かった。別々の日に得られたトランスフェクショングラフは、同一であった。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１（部分Ａ〜Ｄ）は、リポペプチド：ＤＮＡ電荷比９：１〜０．３：１にわたって、ＣＨＯ細胞、ＭＣＦ−７細胞、Ａ５４９細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＲＬ細胞およびＬ２７細胞を含む複数の培養細胞における、本発明で開示するＲＧＤリポペプチド１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子運搬有効性グラフの概要である。
【図２】図２は、脂質：ＤＮＡ電荷比９：１でＲＧＤリポペプチド１がトランスフェクトされたＣＨＯ細胞およびＬ２７細胞の全細胞組織化学的Ｘ−ｇａｌ染色図である。
【図３Ａ−Ｂ】図３の部分Ａは、環状ＲＧＤｆＶおよび直鎖ＲＧＤトリペプチドといった市販のインテグリン拮抗物質、ならびに、市販の非インテグリンリガンドＲＧＥにより細胞をプレインキュベートした際に、Ｌ２７細胞におけるＲＧＤリポペプチド１の遺伝子導入が低下したことを示すグラフの概要である。図３の部分Ｂは、Ｌ２７細胞において、インテグリン結合ＲＧＤリポペプチド１が非インテグリン結合ＲＧＥリポペプチド２より顕著に優れた遺伝子導入特性を有することを示している。
【図３Ｃ】図３の部分Ｃは、ＲＧＤリポペプチド１：ＤＮＡ複合体の細胞取込みが、α5β1インテグリン受容体を介したものであることを示している。
【図４】図４は、リポペプチド：ＤＮＡ電荷比が９：１〜０．３：１にわたって、補脂質としてのＤＯＰＥとコレステロールの両方と組み合わせて用いられたＲＧＤリポペプチド１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性グラフを示す。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ−Ｂ】
2009531409.tif 000032
【図１Ｃ−Ｄ】
2009531409.tif 000033
【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【国際調査報告】
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