(57)【要約】  本発明は、ＧＬＩＳ３遺伝子における変異の存在を検出することを含む、新生児糖尿病、先天性甲状腺機能低下症、および先天性緑内障の診断方法、並びに胚性幹細胞（ＥＳ細胞）またはヒト体性幹細胞のような、ヒト多分化性または多能性細胞を、該細胞の、インシュリンを産生する機能的膵β細胞への分化を誘導させるための有効量のＧＬＩＳ３を含む培地において培養することにより、機能的膵β細胞を調製する方法に関する。本発明は、更に、ＧＬＩＳ３を有効成分として含む医薬組成物に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フレームシフトをもたらす停止変異、欠失および挿入から選択されるＧＬＩＳ３遺伝子における変異の存在または不在を検出することを含んでなり、ここで、患者の検体または新生児の検体における前記変異の存在が、新生児糖尿病、先天性甲状腺機能低下症および先天性緑内障の指標となる、新生児糖尿病、先天性甲状腺機能低下症、および先天性緑内障の診断方法。
【請求項２】
以下の変異を検出するためのプローブの使用を含んでなる、請求項１記載の方法：
（ここで、変異は、
配列番号１に示された欠失および挿入（参照ゲノム配列上の欠失の位置（ＮＴ＿００８４１３．１６））：
．．．４２４９９１４［ＤＥＬ４２４９９１５−４３９８５７２；配列＜＜Ｉ＞＞により置換］４３９８５７３．．．
配列番号２に示された欠失および挿入（参照コンティグ上の欠失の位置（ＮＴ＿００８４１３．１６））：
．．．．４１７６０７６［ＤＥＬ：４１７６０７７−４６０１７７６］４６０１７７７．．．
変異ＢＣ０３３８９９−ｉｎｓＣ２０６７−２０６８（ｃＤＮＡ）またはＡＬ１３７０７１−ｉｎｓＣ９２３１８−９２３１９（ゲノム）：
第６２５位で始まり、第７０２位までの変更された配列（配列番号４）および第７０３位における停止（６２５ＦＳ７０３ＳＴＯＰ）を備えたフレームシフトを引き起こす、ＧＬＩＳ３遺伝子のｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＢＣ０３３８９９）のヌクレオチド２０６７および２０６８の間、あるいはヌクレオチド９２３１８−９２３１９（ゲノム）間への＜＜Ｃ＞＞の挿入）。
【請求項３】
前記プローブが、配列番号１、２、５、６、７、８および９の配列若しくはそれらの相補的な配列、または配列番号４をコードする配列の、１０個乃至３０個の連続したヌクレオチドを示す配列を含んでなり、第２０６８位における挿入されたシトシンの存在を検出するための、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記プローブが、蛍光分子または生物発光分子で標識された、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記検体から抽出されたＲＮＡについてのＲＴ−ＰＣＲ反応を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
配列番号１、２、５、６、７、８および９の配列若しくはそれらの相補配列、または配列番号４をコードする配列の１０個乃至３０個の連続したヌクレオチドを示す配列からなり、第２０６８位における挿入されたシトシンの存在を検出するための、プライマーまたはプローブ。
【請求項７】
機能的膵β細胞を生産するためのＧＬＩＳ３タンパク質（配列番号３）の使用。
【請求項８】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）またはヒト体性幹細胞のような、ヒト多分化性または多能性細胞を、該細胞のインシュリンを産生する機能的膵β細胞への分化を誘導するための有効量のＧＬＩＳ３を含んでなる培地において培養することにより、機能的膵β細胞を調製する方法。
【請求項９】
有効量のＧＬＩＳ３を含んでなる培地。
【請求項１０】
ＧＬＩＳ３を含んでなる培地中に、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）またはヒト体性幹細胞のような、ヒト多分化性または多能性細胞を含んでなる、細胞培養。
【請求項１１】
有効量のＧＬＩＳ３を、このような治療を必要としている患者に投与することを含んでなる、１型糖尿病、２型糖尿病、他の型の糖尿病、甲状腺機能低下症および緑内障の治療法。
【請求項１２】
ＧＬＩＳ３を有効成分として含んでなる医薬組成物。
【請求項１３】
ＧＬＩＳ３を発現する遺伝子療法ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＧＬＩＳ３遺伝子における変異の存在を検出することを含んでなる、新生児糖尿病、先天性甲状腺機能低下症、および先天性緑内障の診断方法、並びに胚性幹細胞（ＥＳ細胞）またはヒト体性幹細胞のような、ヒト多分化性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）または多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞を、有効量のＧＬＩＳ３を含む培地において培養し、前記細胞のインシュリンを産生する機能的膵β細胞への分化を誘発することにより、機能的膵β細胞を調製する方法に関する。本発明は、更に、ＧＬＩＳ３を有効成分として含んでなる医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
永続型新生児糖尿病は、単独または多臓器症候群と関連して起こりうる。サウジアラビアのある血縁家族において、永続型新生児糖尿病が、子宮内胎児発育遅延、先天性甲状腺機能低下症、顔面奇形、先天性緑内障、肝線維症、および多発性嚢胞腎と関連していた１。本願発明者らは、この家族、および、特筆すべき変種と共に類似の症候群に冒された、他の２つの血縁家族を研究した。（第二の家族（１患者）においては、肝臓および腎臓は正常であり、第三の家族（２患者）においては、肝臓、腎臓および眼が正常であった。）すべての患者は、新生児糖尿病、先天性甲状腺機能低下症および類似の顔面奇形を共通に抱えており、このことから本願発明者らは、これらの病気が同じ病気の存在、つまりＮＤＨ（新生児糖尿病および先天性甲状腺機能低下症（Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  Ｈｙｐｏｔｈｙｒｏｉｄｉｓｍ））によるものであると仮に考えることとなった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明に関連して、本願発明者らは、ＧＬＩＳ３遺伝子の変異が、永続型新生児糖尿病、先天性甲状腺機能低下症、および家族間で異なる他の臨床症状により特徴づけられる上記の稀な常染色体劣性症候群の原因であることを示した。また、本願発明者らは、近年同定された転写因子（Kim et al., Nucleic Acids Res 31:5513-5525, 2003）であるＧＬＩｓｉｍｉｌａｒ３をコードするＧＬＩＳ３遺伝子の構造を確定した。この遺伝子は、長い染色体領域（５２４ｋｂ）に広がり、複数の５’端および３’端、並びに選択的エクソンと共に、３２のエクソンを含み、これらのエクソンは、多種多様な転写産物を生成し、特にＮ‐およびＣ‐末端において更なる差異を有し、そして組織間での重要な差異を有するタンパク質をコードし得る。
【０００４】
最初の家族においては、フレームシフト変異により短縮タンパク質（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が得られると予測された。不完全な症候群を抱えた２つの別の家族においては、患者に、遺伝子の最も５’側の１２個または１１個のエクソンに影響する欠失が存在した。主要な膵臓および甲状腺の転写産物が存在せず（双方の欠失）、そして眼に特異的な転写産物が存在せず（１つの欠失）、加えて、いくつかのＧＬＩＳ３転写産物の残りが発現することから、これらの患者の不完全な臨床症状が説明されると思われる。
【０００５】
次いで、本願発明者らは、β細胞新生の起こる初期発生段階（Ｅ１５．５）から成人期に、β細胞において、他の内分泌細胞および外分泌組織と比較して更に高い発現量（発現比：８：２：１）をもって、膵臓においてＧＬＩＳ３が発現することを見出した。これらの結果により、膵β細胞、甲状腺、眼、肝臓および腎臓の発生におけるＧＬＩＳ３の主要な役割が実証される。
【０００６】
従って、本願発明者らは、ＧＬＩＳ３が、膵臓の発生の際、特にβ細胞の発生の際に決定的な役割を果たすことを、本明細書において実証する。
【０００７】
総合すると、本願発明者らの研究結果は、主に以下の３つのタイプの重要な臨床および治療における重要な用途を有している：
‐新生児糖尿病、先天性甲状腺機能低下症、および先天性緑内障の診断および治療、
‐上記の症候群：１型糖尿病、２型糖尿病、他の型の糖尿病、甲状腺機能低下症および緑内障、に関連した、頻繁に起こる疾患の診断および治療、並びに、
‐糖尿病を治療するための、膵β細胞の細胞治療および再生における用途。
【発明の詳細な説明】
【０００８】
本願発明者らは、ＧＬＩＳ３遺伝子における変異が、永続型新生児糖尿病、先天性甲状腺機能低下症、および家族間で異なる他の臨床症状により特徴づけられる、稀な常染色体劣性症候群に関与していることを示した。この研究は、３つの個別の血縁家族について行った。これらの家族の一つは、Ｄｏｒｉｓ  Ｔａｈａ（Taha et al,Am J Med Genet 122:269-273,2003）により以前に記載されたように、永続型新生児インシュリン依存性糖尿病、先天性甲状腺機能低下症、肝線維症、多発性嚢胞腎、先天性緑内障および特定の顔面異形により特徴づけられるすべての症候群を示した。他の２つの家族は同様の膵臓および甲状腺の特徴を示したが、眼疾患、腎疾患および肝疾患は示さず（１家族）、そして、腎疾患および肝疾患（１家族）は示さなかった。
【０００９】
本願発明者らは、近年同定された転写因子（Kim et al., Nucleic Acids Res 31:5513-5525,2003）であるＧＬＩｓｉｍｉｌａｒ３をコードするＧＬＩＳ３遺伝子の構造を確定した。この遺伝子は、長い染色体領域（５２４ｋｂ）にわたり、複数の５’および３’端並びに選択的エクソンと共に３２のエクソンを含み、これらのエクソンは、多種多様な転写産物を生成し、特にＮ‐およびＣ‐末端において更なる差異を有し、組織間で重要な差異を有したタンパク質をコードし得る。
【００１０】
最初の家族においては、フレームシフト変異により短縮タンパク質が得られると予測された。不完全な症候群を抱えた２つの別の家族においては、患者に、遺伝子の最も５’側の１２または１１のエクソンに影響する欠失が存在した。主要な膵臓および甲状腺転写産物（双方の欠失）および眼に特異的な転写産物（１つの欠失）、並びにいくつかのＧＬＩＳ３転写産物の残りの発現が存在しないことにより、これらの患者の不完全な臨床症状が説明されると思われる。
【００１１】
β細胞新生の起こる初期発生段階（Ｅ１５．５）から成人期に、β細胞において、他の内分泌細胞および外分泌組織と比較して更に高い発現量（発現比：８：２：１）をもって、膵臓においてＧＬＩＳ３が発現する。これらの結果により、膵β細胞、甲状腺、眼、肝臓および腎臓の発生におけるＧＬＩＳ３の主要な役割が実証される。
【００１２】
診断方法
従って、本発明は、フレームシフトをもたらす停止変異、欠失および挿入について選択されたＧＬＩＳ３遺伝子における変異の存在または不在を検出することを含んでなり、ここで、患者の検体または新生児の検体における前記変異の存在が、新生児糖尿病、先天性甲状腺機能低下症および先天性緑内障の指標となる、新生児糖尿病、先天性甲状腺機能低下症、および先天性緑内障の診断方法を提供する。
【００１３】
上記の方法は、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅または検体から抽出したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ、ゲル電気泳動法、およびノーザンブロットの後にプローブを使用しＧＬＩＳ３タンパク質の変異体を同定することを含む、当該技術分野において公知のいずれの方法で行ってもよい。
【００１４】
例えば、特定の態様において、この方法は、例えば、患者ＷＲＳ１９およびＷＲＳ２５における以下の欠失および挿入；並びに患者ＷＲＳ１５における停止およびフレームシフト変異を検出するためのプローブの使用を含む。
【００１５】
患者ＷＲＳ１９（２患者）
配列ＡおよびＢは、上記欠失の両端に対応する。ある配列が、染色体９のテロメア領域を起源とする配列Ｉに対応して挿入されている。
参照ゲノム配列（ＮＴ＿００８４１３．１６）上の欠失の位置：
．．．４２４９９１４［ＤＥＬ４２４９９１５−４３９８５７２；配列＜＜Ｉ＞＞により置換］４３９８５７３．．．
欠失の大きさ：１４８６５８ｂｐ
挿入された配列Ｉの大きさ：８２ｂｐ
【００１６】
ＡＬ１６２４１９．３４（Ａ、隣接（flanking）、左）
【化１】
2009533047.tif 000003
挿入配列（Ｉ）：
【化２】
2009533047.tif 000004
ＡＬ１６２４１９．３４（Ｂ、隣接、右）：
【化３】
2009533047.tif 000005
Ａ−Ｉ−Ｂが配列番号１を形成する。
【００１７】
特に、本発明は、以下の１０個乃至３０個の連続したヌクレオチドからなるプライマーまたはプローブの使用に向けられている：
【００１８】
配列番号５−変異ＧＬＩＳ３患者ＷＲＳ１９−５’欠失−挿入ジャンクション
ヒト
【化４】
2009533047.tif 000006
【００１９】
配列番号６−変異ＧＬＩＳ３患者ＷＲＳ１９−３’欠失−挿入ジャンクション
ヒト
【化５】
2009533047.tif 000007
【００２０】
患者ＷＲＳ２５：
欠失の隣接領域：下線部はテロメア範囲（クローンＡＬ１３３２８３）、太字はセントロメア範囲（クローンＡＬ１３６２３１）である。
【００２１】
【化６】
2009533047.tif 000008
（配列番号２）
【００２２】
特に、本発明は、配列番号７の１０個乃至３０個の連続したヌクレオチドからなり、かつ、欠失の枠となる各々の部分から少なくとも1つのヌクレオチドを含んでなる、プライマーまたはプローブの使用に向けられている：
【００２３】
【化７】
2009533047.tif 000009
【００２４】
参照コンティグ（ＮＴ＿００８４１３．１６）上の欠失の位置：
．．．．４１７６０７６［ＤＥＬ：４１７６０７７−４６０１７７６］４６０１７７７．．．
欠失サイズ：４２５７００ｂｐ
【００２５】
変異（家族ＷＲＳ１５）：
変異の特質：
ＢＣ０３３８９９−ｉｎｓＣ２０６７−２０６８（ｃＤＮＡ）またはＡＬ１３７０７１−ｉｎｓＣ９２３１８−９２３１９（ゲノム）：
ＧＬＩＳ３遺伝子のｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＢＣ０３３８９９）のヌクレオチド２０６７および２０６８の間、またはヌクレオチド９２３１８−９２３１９（ゲノム）間への＜＜Ｃ＞＞の挿入。
この変異により、第６２５位で始まり、第７０２位（以下の太字参照）までの変更された配列および第７０３位における停止（６２５ＦＳ７０３ＳＴＯＰ）を備えたフレームシフトが引き起こされる：
【００２６】
ＧＬＩＳ３野生型（ＮＰ６８９８４２．２、７７５ＡＡ）−（配列番号３）：
【化８】
2009533047.tif 000010
【００２７】
変異ＧＬＩＳ３：６２５ｆｓ７０３ＳＴＯＰ（配列番号４）：
【化９】
2009533047.tif 000011
【００２８】
特に、本発明は、配列番号７または８の１０個乃至３０個の連続したヌクレオチドからなり、かつ、第２０６８位におけるＣの挿入を含んでなる、即ち以下に示されるような、プライマーまたはプローブの使用に向けられている：
【００２９】
配列番号８
【化１０】
2009533047.tif 000012
【００３０】
本発明によるプローブは、上記の配列番号１、２、５、６、７、８および９の配列、若しくはそれらに相補的な配列、または、配列番号４をコードする配列の、例えば、１０個、１２個、１５個若しくは２０個といった１０個乃至３０個の連続したヌクレオチドを示す配列を含んでなっていてよく、これにより、特にＧＬＩＳ３遺伝子の第２０６８位で挿入されたシトシンの存在が検出される。プローブは蛍光または生物発光分子で標識されていてよい。更に、本発明は、上記変異領域を含んでなるＤＮＡ配列を特異的に増幅するためのプライマーを提供する。特定の態様において、この方法は、前記プライマーを用いて前記サンプルから抽出されたＲＮＡでのＲＴ−ＰＣＲ反応を含んでなる。
【００３１】
上記方法は、新生児糖尿病、甲状腺機能低下症および緑内障を含む、その症候群に関連する先天性疾患の、出生前、前臨床および臨床診断に適用することができる。
【００３２】
上記方法は、１型糖尿病、２型糖尿病、他の型の糖尿病、甲状腺機能低下症および緑内障を含む、この症候群に関連して頻繁に起きる疾患の、診断、よりよい理解および治療にまで拡張することができる。特に、ＧＬＩＳ３遺伝子と重複している領域の遺伝的連鎖は、２型糖尿病、および２型糖尿病の発症年齢について報告されており（Duggirala et al., Am J Hum Genet 64 :1127-1140, 1999）、２型糖尿病への感受性におけるこの遺伝子の関与の可能性を示唆している。このことは、治療の性質を個別の異なる遺伝的危険度の性質に適合させることにより治療の質が改善されることと関連し得る。
【００３３】
新生児糖尿病、および頻繁に起きる糖尿病におけるＧＬＩＳ３の有力な役割に関して、本願発明者らは、この遺伝子が膵β細胞の発生および機能における役割を果たしていると考える：１）ＧＬＩＳ３機能への主な機能的影響を伴う変異により、誕生時からおよび誕生前であっても、β細胞の不完全な発生／機能がもたらされ、新生児糖尿病を引き起こされる。２）母集団中に存在し得る、この遺伝子における小さな遺伝的変異は、β細胞の数、量、生存度または機能を調節し得るため、後年になって１型または２型糖尿病の個別の危険度に影響を与え得る。
【００３４】
従って、さらなる態様において、本発明は、機能的膵β細胞を産生するためのＧＬＩＳ３タンパク質（配列番号３）の使用に関する。
【００３５】
この症候群に関係する器官、特に膵β細胞の発生および機能に関係するメカニズムをよりよく理解することにより、これらの器官（または細胞）のエクスビボ（ex vivo）またはインビボでの発生が改善され、重要な治療の結果が得られるような戦略の設計が可能となる。他の膵組織と比較して、そしてβ細胞新生の初期において、膵β細胞における増加したＧＬＩＳ３の発現を示す本願発明者らの結果は、ＧＬＩＳ３が転写因子であるという事実と共に、ＧＬＩＳ３が膵β細胞の分化、発生および機能において決定的な役割を果たしていることを強く支持する。本願発明者らの発見の一つの直接的な結果は、糖尿病治療のため、または膵臓を摘出された患者における、細胞置換療法（cell replacement therapy）または再生療法を用いた治療戦略の設計についてのものである。これには、分化に関与する要因の同定を含む膵β細胞の分化を理解することが、決定的なステップである。実際、このことは、β細胞発生、並びに糖尿病のための細胞置換療法および細胞再生療法への研究を奨励する重要な研究プログラムを展開してきた糖尿病研究の主要な基金団体（例えば、ＪＤＲＦ、ＮＩＨおよびＥＵ  ＦＰ６）により認識されてきた。本願発明者らは、この目標を達成するための２つの主要な戦略を提供する。
【００３６】
糖尿病治療のための細胞置換療法
目標は、糖尿病患者由来の欠陥のある膵β細胞を、インシュリンを発現する細胞で置き換えることにある。過去に、糖尿病の細胞置換療法を用いた有望な成果が存在するが（例えば、Shapiro et al., N Eng J Med 343:230-238, 2000）、その成功は、少なくとも、おそらく主要な適応症である1型糖尿病の場合においては、現在まで部分的であり、追跡調査からは、島の同種移植の後5年経過してもインシュリン療法を必要としない状態であった患者が１０％未満であったことが示されている(Ryan et al., Diabetes 54: 2060- 2069, 2005)。これに比べ、慢性膵炎について行われた膵切除後の膵島移植（自家移植）の場合においては、より良好な成功が収められた（Robertson et al., Diabetes 50: 47-50, 2001）。これらの戦略における現在までの主な問題は、十分な材料を獲得すること、１型糖尿病の患者（免疫抑制治療を要する）においてその材料を維持すること、および、移植後にその材料がインシュリンを生産し続けることにあった。従って、全島移植に対する代替の戦略は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）のような多分化性または多能性細胞から膵β細胞に分化させることであった。ＥＳ細胞を膵β細胞に分化させるプロセスには、必要とされる決定的な因子、および分化プロセス中にそれらの因子が働く順序を同定することが求められる。これらの因子には、ＰＤＸ１のような公知のものもある。最近、β細胞の分化のために上皮成長因子およびガストリンの組み合わせを用い、また、糖尿病のマウスモデルにおける置換療法でその組み合わせを用いることによって、成功が収められた（Suarez-Pinzon et al, Diabetes 54:2596-25601; Rooman and Bouwens, Diabetologia 47: 259-265, 2004）。本願発明者らの知見に基づけば、ＧＬＩＳ３はβ細胞の分化に必要な転写因子であり、それ故、ＥＳ細胞からインビトロで分化させるための主要な決定因子である。
【００３７】
この点については、本発明は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）またはヒト体性幹細胞のような、ヒト多分化性または多能性細胞を、前記細胞のインシュリンを産生する機能的膵β細胞への分化を誘発させるための有効量のＧＬＩＳ３を含む培地において培養することにより、機能的膵β細胞を調製する方法を意図している。また、本発明は、有効量のＧＬＩＳ３を含んでなる培地、並びにＧＬＩＳ３を含んでなる培地中に上記の細胞を含んでなる細胞培養にも関する。本発明による培養液は更にＥＧＦおよびＰＤＸ１を含んでなっていてもよい。
【００３８】
再生β細胞療法
上記したように、ＧＬＩＳ３は、多分化性細胞からβ細胞を再生すること、または存在するβ細胞の損失を減速させることができる。従って、本願発明者らは、これを目的として、インビボで必要とされる因子（すなわち、ＧＬＩＳ３）を提供するための戦略の設計を提案する。これは、患者へのタンパク質の直接投与、または、このタンパク質を合成する、遺伝子操作により設計されたベクターを用いることにより、達成され得る。
【００３９】
この点については、本発明は、有効量のＧＬＩＳ３を、このような治療を必要としている患者に投与することを含んでなる、１型糖尿病、２型糖尿病、他の型の糖尿病のような糖尿病、甲状腺機能低下症および緑内障の治療方法に向けられている。また、本発明は、活性成分としてＧＬＩＳ３を含んでなる医薬組成物にも関する。あるいは、本発明は、ＧＬＩＳ３を発現する遺伝子療法ベクター、およびこのようなベクターを含んでなる医薬を目的としている。
【実施例】
【００４０】
実施例１：新生児糖尿病および機能的膵β細胞の損失に関与するＧＬＩＳ３変異の同定
１．１．患者および家族
サウジアラビアの血縁家族である、ＮＤＨ１家族が、以前に報告されている１。３番目の子供がこの家族に生れ、幼齢での死亡（１０日）に関係する可能性のある嚢胞腎疾患を有していないということを除いて、同様の臨床徴候を抱えていた。３人の患者はすべて、肺炎および呼吸不全（ＮＤＨ１−３）または敗血症（ＮＤＨ１−４および−５）により幼齢で死亡した。血液サンプルは、両親およびＮＤＨ１−４から入手することができた。ＮＤＨ２家族もまたサウジアラビアの血縁家族であった。一人の子供（ＮＤＨ２−７）は、肝臓および腎臓の欠陥がこの患者には認められず、顔面異型が顕著でないということを除いて、同様の症候群に冒されていた。この患者は生存していた（２歳）。この患者、両親、および４人の健康なきょうだいを研究に利用することができた。ＮＤＨ３家族は、同族のフランス人ジプシー家族であり、２患者は生存し、同様の徴候を示したが、肝臓および腎臓の欠陥は観察されず、緑内障も患っていなかった。すべての患者は重篤なＩＵＧＲを示し、１日齢または２日齢で新生児糖尿病の診断がなされた。
研究についての説明が、インフォームドコンセントに署名した家族の構成員になされた。ＮＤＨ３患者およびその両親は、科学論文に彼らの写真を公表することについて更なる署名をした。研究手順は地方の倫理委員会（Ｋｉｎｇ  Ｆａｉｓａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，  Ｊｅｄｄａｈ、およびＨｏｐｉｔａｌ  Ｓａｉｎｔ−Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｄｅ  Ｐａｕｌ，  Ｐａｒｉｓ）で承認された。血液サンプルが収集され、ＤＮＡ抽出が標準的な手法を用いて行われた。ＲＮＡ抽出は、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、患者ＮＤＨ２−７およびその両親、並びにＮＤＨ３−３および−４およびその両親の血液サンプルで行った。
【００４１】
表１  患者の臨床記述
【表１】
2009533047.tif 000013
【００４２】
１．２．  連鎖の研究
(http://www.cng.fr/fr/teams/microsatellite/index.html)に記載されるように、４００以上のマイクロサテライトマーカー（Ｌｉｎｋａｇｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｓｅｔ  ２、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、修飾あり）を用いて、半自動蛍光遺伝子型同定によりゲノムスキャンを行った。連鎖分析は、完全浸透性劣性モデルにおいて、ＳＩＭＷＡＬＫ２プログラムを用い、異質性が存在しないものと想定して行った。
【００４３】
１．３．  微細地図の研究
まず、連鎖の確認および微細地図の作成を、公知のマイクロサテライトマーカーですべての家族構成員の遺伝子型を同定することにより行った。３１個のジ‐、トリ‐、テトラ‐、およびペンタヌクレオチド繰り返し部分を選択することにより、更なるマイクロサテライトマーカーを作成した。これらの２８個は多型であることが判明した。ＮＤＨ２およびＮＤＨ３家族における欠失境界の正確な定義は、３３種の単純なＰＣＲ試験を用い、次に欠失領域にわたってＰＣＲを行い、得られた特異的なＰＣＲ断片の配列決定をすることにより行われた。
【００４４】
１．４  ＤＮＡ配列決定による変異のスクリーニング
ＧＬＩＳ３遺伝子のコード領域全体のシークエンシングを、ＮＤＨ１患者およびその両親において、ゲノムＤＮＡから付表２ｃに示されたプライマーを用いて生成したＰＣＲ断片について行った。配列の解釈はＧｅｎａｌｙｓソフトウェア１８を用いて行った。
【００４５】
付表２ｃ  ＮＤＨ１家族における変異スクリーニングに用いられるプライマーの配列
【表２】
2009533047.tif 000014
【００４６】
１．５  発現の研究
ノーザンブロットハイブリダイゼーション
本願発明者らは、正常な大人の組織におけるＧＬＩＳ３発現の評価のために市販のノーザンブロット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。製造元により明記されているように、各々のレーンにローディングされるＲＮＡの量を調整し、β‐アクチンプローブを用いた同様のハイブリダイゼーションシグナルを得た。ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡにおけるＰＣＲ増幅によりプローブを生成し、配列決定により確認し、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡラベリングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルした。そして、製造元の推奨に従ってハイブリダイゼーションを行い、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳバッファーにて６０℃で最終的なストリンジェント洗浄をした。
【００４７】
１．６  患者およびその家族の正常組織のＲＴ−ＰＣＲによる発現の研究
市販の正常な大人の組織（膵臓、腎臓、甲状腺、肝臓、網膜、心臓、骨格筋、胎盤、肺、脳、精巣（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））由来のＲＮＡについて、製造元の説明書に従い、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）を用いて、Ｐｏｌｙ  Ａ＋ＲＮＡ（網膜以外のすべての組織）またはｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（網膜）上でＲＴ−ＰＣＲを行った。以下のようないくつかの場合でｃＤＮＡのネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲまたはダブル（ｄｏｕｂｌｅ）ＰＣＲ増幅が用いられることを除き同様の手順を用い、ＮＤＨ２およびＮＤＨ３家族の全血ＲＮＡでＲＴ−ＰＣＲを行った。第１ラウンドのＰＣＲ混合物は５０倍に希釈され、２０サイクルのＰＣＲから成る第２ラウンドのＰＣＲ（内部プライマーを用いたネステッドＰＣＲ、または同様のプライマーを用いたダブルＰＣＲ）のための鋳型として供された。一様に発現するＰＣＢＤ１遺伝子（６−ピルボイル−テトラヒドロプテリン合成酵素／肝細胞核因子１αの二量化補足因子）に位置するプライマーを用いてコントロールＲＴ−ＰＣＲを行った。ＮＤＨ２およびＮＤＨ３家族におけるＰＣＲおよびネステッドＰＣＲに用いられたプライマーの配列は、下の付表２ｄに与えられる。
【００４８】
付表２ｄ  ＮＤＨ２およびＮＤＨ３家族におけるＲＴ−ＰＣＲ発現の研究に用いたＰＣＲアッセイ
【表３】
2009533047.tif 000015
【００４９】
付表２ｅ  ＮＤＨ３家族におけるＧＬＩＳ３の量的発現の研究のためのＲＴ−ＰＣＲアッセイ、およびＧＬＩＳ３  ＳＮＰｒｓ６４１５７８８のゲノム遺伝子型決定のためのＰＣＲアッセイ
【表４】
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【００５０】
１．７  対立遺伝子-特異的発現の定量
欠失のあるＧＬＩＳ３対立遺伝子（アレル）についてヘテロであり、かつ、ＲｅｆＳｅｑエクソン３（最終的な構造におけるエクソン１８．１）に位置する、エクソンのＳＮＰ  ｒｓ６４１５７８８についてヘテロである親、および、このＳＮＰの各々の対立遺伝子についてヘテロまたはホモである対照個体の血液ｃＤＮＡで、ＲｅｆＳｅｑエクソン３および４（最終的な構造におけるエクソン１８．１および２５、オンラインの付表２ｅ）に位置するプライマーを使用した２ラウンドのＰＣＲを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。異なるプライマーを用いて、同じ個体のゲノムＤＮＡでのＰＣＲも行った。ＳｔｙＩでの制限酵素による３７℃、１６時間の処理後、これらの２つの対立遺伝子は区別され、ＰＣＲ産物は２％アガロースゲル上で分離され、各々の対立遺伝子に特異的なバンドの強度を、ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて定量した。
【００５１】
ＧＬＩＳ３遺伝子の構造を３つの方法の組み合わせを用いて確定した：膵臓、腎臓および網膜（眼の代表的な組織として）におけるｃＤＮＡ末端の５’−および３’−高速増殖法（ＲＡＣＥ法）実験、インター‐エクソンＲＴ−ＰＣＲ、およびノーザンブロットハイブリダイゼーション。５’−および３’−端は、製造元の説明書に従い、ＢＤ  ＳＭＡＲＴ（登録商標）ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用い、腎臓および膵臓のｐｏｌｙ  Ａ＋ＲＮＡまたは網膜のｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で、５’−および３’−ＲＡＣＥを用いて決定した；本願発明者らは、ＡｃｅＶｉｅｗに参照されているすべてのエクソンに位置し、または、参照されているｍＲＮＡ若しくはスプライシングされた転写産物に位置するプライマー、並びに本研究の途中で本願発明者らが同定した新規なエクソンに位置するプライマーを用いた。同定された３’端の候補について精密に再検討を行い、転写産物におけるゲノムｐｏｌｙＡ領域または内部ｐｏｌｙＡ領域に対応するものは排除した。ＲＡＣＥ法実験に用いたプライマー配列は付表２ｆに与えられる。
【００５２】
付表２ｆ  ヒトノーザンブロットハイブリダイゼーションのためのＧＬＩＳ３プローブを生成するために用いられるプライマー
【表５】
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【００５３】
本願発明者らは、代わりとなる転写産物の同定および確認のため、５種類の組織（膵臓、甲状腺、肝臓、腎臓および網膜）のｃＤＮＡにおけるエクソン間でのＲＴ−ＰＣＲおよび長距離ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物の配列決定を行った。５種類の組織のすべてで発現しなかった転写産物は、次に、拡大された組織のパネルにおいて試験し、組織‐特異的な発現を探索した。これらの戦略を用いて得られたすべての情報、および公的に入手可能なデータ（ＮＣＢＩクローン配列および地図情報）を、特定の場所で開発されたデータベース管理プロブラム（Ｃ．Ｃ．、未出版）を用いて、統合されたデータベースおよび図式表示へと併合した。予測された転写産物は、エクソン‐特異的なプローブのノーザンブロットハイブリダイゼーションにより決定された転写産物のサイズと比較された。包括的なＧＬＩＳ３遺伝子構造が、転写産物のコード予測と共に、図６に示され、詳細なイントロン‐エクソン構造が付表３に示される。
【００５４】
付表３  ヒトＧＬＩＳ３遺伝子のエクソン-イントロン構造
【表６】
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注：
可変の５’または３’端（またはスプライシング）を備えたエクソンが、同じ先頭番号および異なる伸長で示されている：５’端（スプライシングに対する）または３’端（スプライシングからの）、５’および３’端の双方、またはスプライシングされた双方の端部（表示なし）が括弧で示される。
＊の印がある５’エクソンは、Ｇｅｎｂａｎｋで入手可能なクローンに基づく、推定上の５’エクソンに対応し、不完全であってよい。
＊＊の印がある３’エクソンは、クローンＢＣ０３３８９９に見られたが、本願発明者らのＲＡＣＥ研究では同定されなかった。
この構造は、腎臓、膵臓および網膜における本願発明者らのＲＡＣＥ法研究、および複数の組織におけるＲＴ−ＰＣＲに基づき、方法において記載されるように、Ｇｅｎｂａｎｋクローンによる情報によって完成される。
【００５５】
１．８  マウス組織、膵臓細画分、およびマウスの発生の間における発現の研究
出生後２２日齢および３５日齢での、膵臓、肝臓、腎臓および骨髄を含む全マウス組織、並びに、初期胚（Ｅ１５．５）から生体マウスまでの異なる発生段階の全マウス膵臓からＲＮＡを単離した。膵臓細画分を以下のように生成した：マウスインシュリンＩ遺伝子プロモーター（ＭＩＰ‐ＧＦＰマウス）１９）の制御下で緑色蛍光タンパク質を発現する、成体の（Ｐ３５）トランスジェニックマウスの膵臓を単離し、２０分間コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）処理した。コラゲナーゼ処理された膵臓をｈｉｓｔｏｐａｑｕｅを用いた遠心分離により分画し、島細胞および腺房細胞を単離した。次に、島細胞および腺房細胞のクラスターを立体顕微鏡下での手選により精製した。島部分を更にトリプシン（ＰＢＳ中０．１２５％）処理により分離し、単一の細胞へ遊離させた。分離した島細胞を、β細胞に特異的なＭＩＰ‐ＧＦＰ導入遺伝子のＧＦＰ蛍光に基づくＦＡＣＳソーティングにより分画し、ＧＦＰ＋（β細胞）およびＧＦＰ−（他の島細胞）を得た。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．）を用いてすべての組織および単離された細胞からＲＮＡを抽出した。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの標準的な逆転写によりｃＤＮＡを調製した。製造元の説明書に従い、標準化のためにＧｌｉｓ３に特異的なプライマーおよびＧａｐｄｈプライマーを用いて、Ｇｌｉｓ３の発現を、ＡＢＩ７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）上でリアルタイム定量ＰＣＲにより定量した。本願発明者らは、エクソン２８および２９（１組）およびエクソン８および１０（２組）中のマウスＧｌｉｓ３遺伝子に位置するプライマーの組を用いて行った３つの独立した実験のＧｌｉｓ３の平均発現量（Ｇａｐｄｈに対する）を報告する。本願発明者らは、ヒトにおけるように、エクソン８、１０、２８および２９が主要な（７．５ｋｂ）マウス転写産物に属していることを、マウスノーザンブロットのハイブリダイゼーション（表示なし）により確認した。
ＵＲＬ
NCBI AceView: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Acembly/
Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号
ヒトＧＬＩＳ３のｃＤＮＡ：ＮＭ＿１５２６２９．２（ＲｅｆＳｅｑ）、ヒトＳＬＣｌＡｌのｃＤＮＡ：ＮＭ＿００４１７０．４（ＲｅｆＳｅｑ）、ＧＬＩＳ３染色体領域のヒトゲノムＤＮＡ：ＮＴ＿００８４１３．１６、ヒトＧＬＩＳ３タンパク質：ＮＰ＿６８９８４２．２（ＲｅｆＳｅｑ）。この研究において生成された配列は、アクセス番号ＤＱ４３８８７７からＤＱ４３８９０７の下、ＧｅｎＢａｎｋに提出された。
【００５６】
２．結果
本願発明者らは、ゲノム全域にわたる連鎖スキャンをすべての利用可能な家族構成員について行い、完全透過性劣性モデルの下、染色体９ｐ上の単一染色体領域との連鎖の示唆的な証拠を得、次いで本願発明者らは、更なるマーカー（図１ａ）を用いて７．３ｃＭ領域（ＬＯＤ＝４．６７）と連鎖していることを確認した。３１種の新たに作成したマイクロサテライトおよび３３種の単純ＰＣＲアッセイを用いて、本願発明者らは家族ＮＤＨ２およびＮＤＨ３における２つの異なる欠失を同定し（図１ｂ）、そして、本願発明者らは、欠失領域にわたるＰＣＲおよびシークエンシングにより欠失断端を決定した（図２ａ）。ＮＤＨ２患者は４２６ｋｂのホモ欠失を保因し、この欠失には、ＮＣＢＩ  ＡｃｅＶｉｅｗ予測（http://www.ncbi.nih.gov/IEB/Research/Acembly/）に規定されるように、ニューロン／上皮性高親和性グルタミン酸トランスポーター（ＳＬＣ１Ａ１）をコードする遺伝子、およびＧＬＩ  ｓｉｍｉｌａｒ  ３（ＧＬＩＳ３）をコードする遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の一部が含まれている。ＮＤＨ３患者は１４９ｋｂのホモ欠失を保因し、この欠失にはＧＬＩＳ３の５’非翻訳領域の一部のみが含まれていた。双方の欠失に共通する領域はＧＬＩＳ３の公知の開始コドンから１３４ｋｂだけ５’側に位置していた（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ）。ＧＬＩＳ３は５個のＫｒｕｅｐｐｅｌ様のジンクフィンガードメインを含む最近同定された転写因子であり、ＧＬＩジンクフィンガータンパク質と高いホモロジーを共有し、発生の間、種々の細胞過程の調節において決定的な役割を果たしているとみなされてきた２。その推定される機能、ＮＤＨ２およびＮＤＨ３の欠失に共通する領域においてＧＬＩＳ３エクソンの存在、およびＮＤＨ３患者においてＳＬＣ１Ａ１の関与が存在しないことに基づき、ＧＬＩＳ３はこの症候群の原因となる遺伝子である可能性があるものと思われた。本願発明者らは、ＮＤＨ１家族におけるＧＬＩＳ３のすべてのコードエクソン（coding exon）のシークエンシングを行い、Ｃ‐末端のプロリンに富むドメインが変化する、フレームシフトおよび短縮タンパク質（６２５ＦＳ７０３ＳＴＯＰ）を引き起こすホモ挿入（２０６７ｉｎｓＣ；図５）を同定した（図２ｂ）。マウスＧｌｉｓ３のＴｈｒ７１３（ヒトではＴｈｒ７０８）のＣ末端領域に影響を与える欠失は、インビトロでＧＬＩＳ３の活性をほとんど完全に失わせることを示してきた２。従って、６２５ＦＳ７０３ＳＴＯＰ変異により非機能性のタンパク質が得られると期待される。この変異は１７５人の正常なコーカサス人個体には見いだされなかった。ＮＤＨ１患者におけるＳＬＣ１Ａ１遺伝子には変異は同定されなかった（データ表示なし）。これらの結果は、ＧＬＩＳ３に影響のあるフレームシフト変異（ＮＤＨ１）および欠失（ＮＤＨ２およびＮＤＨ３）がこの症候群の原因であることを支持する。
【００５７】
ＧＬＩＳ３のコード配列（ＲｅｆＳｅｑに従う）がＮＤＨ２およびＮＤＨ３患者において無傷であったため、これらの患者においては、いくつかの発現およびコードする能力は保持されているかもしれない。本願発明者らは、ＲＴ‐ＰＣＲを用いて、ＮＤＨ２およびＮＤＨ３患者および親の全血から抽出したＲＮＡにおいてＧＬＩＳ３の発現を探索した（図２ｃ）。単純なＲＴ−ＰＣＲの後、ホモ欠失を保因する患者においてはＧＬＩＳ３の発現は検出されなかったが、ヘテロの親と正常な対照個体においてはＧＬＩＳ３が発現された；しかし、ネステッドＰＣＲの後、これらの患者においていくつかの発現が検出された。本願発明者らは、エクソンのＧＬＩＳ３  ＳＮＰについてヘテロであったＮＤＨ３の親における、正常対立遺伝子および「欠失」対立遺伝子からＧＬＩＳ３の相対的な発現を定量した。「欠失」対立遺伝子の発現は、正常対立遺伝子の発現の８％および５％（平均：６％）に減少した一方、双方の対立遺伝子は対照個体において同様の発現レベルを示した（平均発現比＝０．９８、図２ｄ）。対照的に、ＳＬＣ１Ａ１はＮＤＨ３患者において通常の発現をした（図２ｃ）。
【００５８】
ＮＤＨ２患者におけるＳＬＣ１Ａ１の完全な欠失は、無傷のＳＬＣ１Ａ１遺伝子を保因しているＮＤＨ１患者と比較すると、更なる臨床徴候とは関連していなかった。ＳＬＣ１Ａ１は主にニューロン、腎臓、および小腸で発現する３。Ｓｌｃ１ａ１ノックアウトマウスはジカルボキシルアミノ酸尿症を有するが、表現型的に正常である４。アミノ酸尿症のパターンはＮＤＨ２およびＮＤＨ３患者において正常であったが、このことは、ＳＬＣ１Ａ１の欠失による病理学的な結果はヒトにはもたらされないか、または検出されないことを示唆した。これらの観察により、ＳＬＣ１Ａ１の欠失は、家族間の表現型の変異性の原因としては排除される。
【００５９】
ＲｅｆＳｅｑに規定されるようなコード領域および５’エクソンが存在するにもかかわらず、ＮＤＨ２およびＮＤＨ３患者における血液中のＧＬＩＳ３転写産物の発現が極端に減少するため、本願発明者らは、ＮＤＨ２およびＮＤＨ３患者において欠失している遠位領域がＧＬＩＳ３の発現に決定的な配列を含むとの仮説を立てた。この仮説を探索するために、本願発明者らは、ＧＬＩＳ３遺伝子の構造を確定し、関連する組織におけるその発現を試験した。
【００６０】
報告されたすべてのＧＬＩＳ３の転写産物に存在する２つのコードエクソンを含むｃＤＮＡプローブを用い、本願発明者らは、ノーザンブロットハイブリダイゼーションにおいて複数の転写産物を検出した（図３）。これらの転写産物は、種々のサイズおよび発現レベルで、ほとんどの組織に発現する。主要な転写産物のサイズは、約７．５ｋｂおよびそれより小さいもの（０．８‐２．０ｋｂ）であった。より低い強度の更なるバンドも見られた。より小さな転写産物に対する７．５ｋｂの転写産物の比率は、組織に依存して多種多様であった。より小さな転写産物は、肝臓、腎臓、心臓および骨格筋において強い発現を示し、７．５ｋｂでは膵臓、甲状腺および腎臓において強い発現を示し、膵臓および甲状腺における７．５ｋｂの転写産物の発現に極端に偏っていた。本願発明者らはＧＬＩＳ３遺伝子の構造を確定し（付表３）、代替の転写産物の性質決定を行い、タンパク質産物を予測した（図６）。本願発明者らは１２個のエクソンに位置する２５の推定される転写開始部位、および４つのエクソンに位置する４つの転写終了部位を同定した；クローンの４つの更なる５’端（３つの更なるエクソンを含む）および１つの３’端は配列データベースに存在した（ＧｅｎＢａｎｋ）。転写開始部位のいくつかは組織‐特異的であるようであった。特に、エクソン１２に位置する５’端は網膜のみに見出された。複数の５’端および３’端、並びに別のスプライシングを受けたエクソンが見出されることは、組織に依存して質および量の異なる発現をする複数の転写産物が観測されることと矛盾しない。
【００６１】
これらの転写産物の予測された翻訳産物は種々のＧＬＩＳ３タンパク質をコードし、そのほとんどは５つの無傷のジンクフィンガードメイン（ＺＦＤ）を含み、Ｎ‐およびＣ‐末端領域に変異を有し（図６）、これらの変異は、Ｋｉｍら２により以前に示されているように、コードされたタンパク質の機能に影響を与えるかもしれない。特に、７．５ｋｂの転写産物によりコードされた予測されたタンパク質は、エクソン１８から開始するものと比較して更に４９２個のＮ末端アミノ酸を含む（９３０対４３８アミノ酸）。いくつかの転写産物は、コード能力を有していないか、または限定されたコード能力しか有しておらず、そして制御的機能を有しているかもしれない。
【００６２】
最も５’端の７つの開始部位および１つの３’端はＮＤＨ２およびＮＤＨ３患者の双方の欠失に共通する領域に位置し、そしてエクソン１２における複数の開始部位はＮＤＨ３の欠失に特異的な領域に位置する。従って、これらの転写産物には、７．５ｋｂの変異体を含み、ホモ欠失を保因する患者には存在しないであろうものもあれば一方、エクソン１８において開始するものを含み、存在するものもある。そして、エクソン１２において開始する網膜‐特異的な転写産物はＮＤＨ２には存在しないが、ＮＤＨ３には存在するであろう。ＮＤＨ２およびＮＤＨ３患者においては、肝臓および腎臓ではなく、主要な転写産物が７．５ｋｂの変異体である膵臓および甲状腺が影響を受ける。このことは、この転写産物が膵臓および甲状腺の発生または機能に必要とされる一方、他のＧＬＩＳ３転写産物が他の器官において十分であることを示唆している。同様に、エクソン１２で開始する網膜‐特異的な転写産物は、緑内障を有していないＮＤＨ３患者に存在すると予測されるが、先天性緑内障を有するＮＤＨ２患者には存在しない、長いＮ‐末端のタンパク質をコードし、このことはこれらの転写産物が眼の発生において決定的な役割を果たしていることを示唆している。また、ＮＤＨ１患者におけるより重篤な臨床表現型は、コードされた欠陥のあるＧＬＩＳ３産物の特性により部分的に説明することができ、臨床的な変動性も、変更遺伝子および環境要因のような他の要因に依存し得る。
【００６３】
ＮＤＨ症候群に関与するメカニズムに対する洞察を得るために、本願発明者らは、発生の間のマウスの膵臓、および成体の膵臓の細画分におけるＧｌｉｓ３の転写産物の発現を研究した。ヒトと同様、Ｇｌｉｓ３はマウスの膵臓において、他の組織と比較して高いレベルで発現する（図４ａ）。Ｇｌｉｓ３は、マウスにおいて、７．５ｋｂの主要な転写産物として発現する（Ｋｉｍら２。データ表示なし）。マウスの発生の間、Ｇｌｉｓ３は膵β細胞の新生の時期であるＥ１５．５の胚期に発現し、その発現量は出生後増加する（図４ｂ）。本願発明者らは、顕微解剖した島および腺房において、精製したβ細胞において、並びに他の内分泌細胞において、Ｇｌｉｓ３転写産物を定量した。図４ｃに示されるように、Ｇｌｉｓ３はすべての膵組織で発現しているが、その発現量が、β細胞において、他の島細胞および腺房と比較して増加している（発現比：８：２：１）。それ故、Ｇｌｉｓ３は、膵臓の発生の間、特にβ細胞の発生の間に決定的な役割を果たしているようである。
【００６４】
膵β細胞でのＧｌｉｓ３の強い発現、β細胞新生の初期からの膵臓でのその発現、外分泌膵でのより低い発現、そして患者に外分泌膵の機能障害が存在しないことに基づけば、この症候群に観察される新生児糖尿病は、膵臓発育不全を伴う新生児糖尿病において観察されるような内分泌膵および外分泌膵の双方に影響を与える一般的な欠陥５，６、または糖尿病と関連する外分泌膵の１次欠陥７というよりも、むしろ膵β細胞の欠陥に起因するようである。ＧＬＩＳ３転写産物およびコードされたタンパク質の複雑なパターン、組織間でそれらが多様であること、およびＧＬＩＳ３が転写抑制因子または転写活性化因子の双方として機能し得るという事実２は、いくつかの器官における発生および機能に必要とされる微調整（fine-tuning）に寄与し得る。
【００６５】
先天性緑内障は、ＧＬＩＳ３遺伝子座と重なる染色体９ｐの遠位末端の一染色体性の不平衡転座のいくつかのケースで報告されている８−１０。先天性甲状腺機能低下症および先天性緑内障の遺伝子は現在までこの領域に位置付けられていなかったが１０、１１、本願発明者らの結果は、これらの先天性障害においてＧＬＩＳ３を更に調査することの正当な理由となる。
【００６６】
これは、胚発生の間役割を果たすＧＬＩＳ遺伝子ファミリーに関連する疾患の最初の報告である２、１２、１３。膵臓およびβ細胞の発生において役割を果たす他の転写因子、ＩＰＦ１およびＰＴＦ１Ａにおけるホモ変異は、ヒトにおいては新生児糖尿病を引き起こし５、６、マウスにおいては膵臓発育不全におけるＴｃｆ２（Ｈｎｆ１ｂｅｔａ）の欠乏を引き起こす１４ことが示されている。ＧＬＩ  Ｋｒｕｐｐｅｌ−様ジンクフィンガータンパク質のメンバーであるＧＬＩＳ３における変異は、種々の先天性欠損症候群の原因であり１５、ＧＬＩタンパク質は、種々の発生および細胞分化のプロセスに関わるヘッジホッグシグナル経路における下流の転写制御因子として働く１５、１６。この経路は膵臓の適切な発生および機能に必須である１６、１７ため、ＧＬＩタンパク質と同様、ＧＬＩＳ３がこの経路の一部であり、故に、ＧＬＩＳ３が膵臓および他の器官の発生および機能に寄与し得るとの推測は自然である。
【００６７】
参考文献
2009533047.tif 000020
2009533047.tif 000021
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】３つのＮＤＨ家族における連鎖地図および微細地図  ａ．家族間で分離するハプロタイプを示す染色体９ｐマーカーの遺伝子型。赤字のホモ領域は各々の家族の連鎖の間隔を示す。角括弧は３つの家族の研究に基づく連鎖の領域を示す。ｂ．家族ＮＤＨ２およびＮＤＨ３（右側の染色体スケッチ中、黒で示される）におけるホモ欠失を同定する、更なるマイクロサテライトマーカー（ＲＰＴコード）および単純ＰＣＲアッセイ（ＰＣＲコード）を用いた微細地図。ＲＰＴおよびＰＣＲマーカーの詳細はオンラインの付表２ａ、ｂに与えられる。
【図２】ＮＤＨ患者における変異および欠失の性質決定  ａ．ＮＤＨ２およびＮＤＨ３患者における欠失の位置を示す、染色体９ｐ領域の略図。黒のボックスはＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ遺伝子（ＧＬＩＳ３：ＮＭ＿１５２６２９．２，ＳＬＣｌＡｌ：ＮＭ＿００４１７０．４）に対応し、灰色のボックスはＡｃｅＶｉｅｗ予測（ＧＬＩＳ３）に基づく更なる潜在的なエクソンに対応する。欠失に隣接する配列（太字）、および染色体９ｑの領域由来の介在配列（ボックス内）と共に、白のボックス（ｏｐｅｎ  ｂｏｘ）はＮＤＨ２およびＮＤＨ３患者に認められる欠失の位置（Ｄｅｌ  ＮＤＨ２およびＤｅｌ  ＮＤＨ３）を表している。ＮＤＨ３においては１４９ｋｂの欠失したセグメントが染色体９ｑのテロメア領域（９８％ホモロジー）由来の８２ｂｐにより置換されていた。ＮＴ＿００８４１３．１６上の欠失断端（ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ）の地図上の位置は：ＮＤＨ２：．．．４１７６０７６［ＤＥＬ：４１７６０７７−４６０１７７６］４６０１７７７．．．ＮＤＨ３：．．．４２４９９１４［ＤＥＬ：４２４９９１５−４３９８５７２；８２ｂｐにより置換（ボックス内）］４３９８５７３．．．である。  ｂ．ＮＤＨｌ  変異：予測された短縮タンパク質。示された配列はＧＬＩＳ３  ＲｅｆＳｅｑ（ＮＭ＿１５２６２９．２）に対応する。十字模様のボックス：ジンクフィンガードメイン、左斜線ボックス：セリンに富むドメイン、右斜線ボックス：プロリンに富むドメイン、灰色のボックス：核局在シグナル（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ（ＮＬＳ））、ドット模様のボックス：フレームシフト翻訳。ｃ．ＮＤＨ２およびＮＤＨ３家族における発現の研究。ＧＬＩＳ３については、家族の構成員においてシングルＰＣＲ（矢印ＧＬＩＳ３（ａ））およびネステッドＰＣＲ（矢印ＧＬＩＳ３（ｂ））を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った；ＳＬＣ１Ａ１については、ネステッドＰＣＲを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い；一様に発現するＰＣＢＤ１遺伝子に位置するプライマーを用いてコントロールＲＴ−ＰＣＲを行った。ｄ．対立遺伝子特異的なＧＬＩＳ３発現の定量。ＧＬＩＳ３対立遺伝子は、全血からネステッドＰＣＲにより増幅されたＧＬＩＳ３転写産物上、およびゲノムＤＮＡ上で（シングルＰＣＲ）、ＧＬＩＳ３  ＲｅｆＳｅｑエクソン３に位置するエクソンＳＮＰ  ｒｓ６４１５７８８に対応するＳｔｙＩ  ＲＦＬＰを用いて定量化された。４５５ｂｐバンド（「欠失」対立遺伝子に対応するＣ−対立遺伝子（Ｃ−アレル））および３６５ｂｐバンド（正常対立遺伝子に対応するＡ−対立遺伝子（Ａ−アレル））の相対強度が、対照個体およびヘテロの親（ＮＤＨ３−１および２）に対して測定された。断片長を調節した後、Ａアレルに対するＣアレルの比が示される。同様の対照、および完全なＮＤＨ３家族の遺伝子型が、異なるプライマーおよびＳｔｙＩ処理を用いたＰＣＲにより、ゲノムＤＮＡについて決定された（Ｃアレル：５６７ｂｐ、Ａアレル：３８７ｂｐ）。実験は一度繰り返され、同様の結果が得られた。プライマー配列は、オンラインの付表２ｄ、ｅに与えられる。
【図３】複数種の組織を用いたノーザンブロットにおける、ヒトＧＬＩＳ３遺伝子発現の研究  ＧＬＩＳ３プローブを用いた、ヒトの複数種の組織のノーザンブロットハイブリダイゼーション。アミノ酸５１３−６０４を含むＧＬＩＳ３  ＲｅｆＳｅｑエクソン６および７に位置するプライマーを用いて、２７５ｂｐのｃＤＮＡプローブを腎臓ｃＤＮＡ上で生成し、２つのノーザンブロットに同時にハイブリダイズさせた。このプローブを生成するために用いられたプライマー配列は、オンラインの付表２ｈに与えられる。組織は：１：心臓、２：脳、３：胎盤、４：肺、５：肝臓、６：骨格筋、７：腎臓、８：膵臓、９：胃、１０：甲状腺、１１：脊髄、１２：リンパ節、１３：気管、１４：副腎、１５：骨髄である。遺伝子の異なる領域をカバーする他のＤＮＡプローブはノーザンブロットハイブリダイゼーションにおいても用いられ、遺伝子構造を規定するのに役立つ（図示せず）。
【図４】マウスの膵臓および他の組織、膵臓の細画分、並びにマウスの発生期間中のＧｌｉｓ３発現の研究  Ｇｌｉｓ３発現を、以下におけるリアルタイム定量ＰＣＲにより定量した。ａ）２２日齢（白のボックス）および３５日齢（黒のボックス）の４種の組織、ｂ）初期胚（Ｅ）から出生後（Ｐ）段階から摘出した全膵、ｃ）成体マウスの膵臓の細画分：腺房、島、β細胞、および他の島細胞（方法を参照）。本願発明者らは、Ｇａｐｄｈに基準化し、ファクター１，０００を乗じて、Ｇｌｉｓ３の相対発現量を示す。膵臓の細画分の高い純度が、膵臓の遺伝子のリアルタイム定量ＰＣＲによって確認され、発現比は以下の通りである：インシュリンＩおよびＩＩ（島／腺房：２０５：１）、アミラーゼ（腺房／島：２７８：１）、インシュリンＩおよびＩＩ（β細胞対他の島細胞：３５：１）、グルカゴン、ポリペプチドＰ、およびソマトスタチン（他の島細胞対β細胞：それぞれ、３９９：１、８６：１、および１７：１）。
【図５】ＮＤＨ１患者における変異  示された配列は、ＧＬＩＳ３  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿１５２６２９．２に対応する。
【図６】ヒトＧＬＩＳ３遺伝子構造：代替の転写産物および予測されたタンパク質  左：ＧＬＩＳ３転写産物。黒矢印：５’ＲＡＣＥ法を用いた実験により確認される転写開始部位；灰色矢印：公的に入手可能な配列（Ｇｅｎｂａｎｋ）中に観察できる、転写産物の更なる５’端であろう部分；黒の四角：ＲＡＣＥ法を用いた実験により確認される転写産物の３’端、および灰色の四角：公的に入手可能な配列（Ｇｅｎｂａｎｋ）に基づく転写産物の３’端。「ｋ」の印が付けられたエクソンは、本願発明者らのＲＴ−ＰＣＲおよび配列決定実験に基づき、いくつかの転写産物において、異なったスプライシングがなされていることが判明した。ＺＦＤをコードするエクソンの領域が十字模様のボックスで示されている。予測された転写産物におけるコード領域は黒で示される。エクソンは、任意のエクソン間距離で、一定の尺度で描かれている。エクソンにおける代替の５’、３’またはスプライシングが一般構造の下に示されており、その順序は、付表３に示されたコードに対応する。エクソン１３、１９、２０および２４の５’端は公的に入手可能な配列中に見出され、これらは不完全であってもよい：エクソン１３：ＢＣ０３３８９９（精巣）、エクソン１９：ＢＸ４９２８８０（ＥＳＴ、表示なし）、エクソン２０：ＢＸ４９３２１９（ニューロン）、エクソン２４：ＡＫ０９６３１８（ＥＳＴ、表示なし）。エクソン３２における内部の３’端は公的に入手可能な配列（ＢＣ０３３８９９）に見出された。１２の異なる開始部位が、エクソン１２の種々の位置に見出された。この場合、および、複数の５’端が同定されたエクソンの他の場合においては、これらの内部の部位のいくつかは、２次部分構造に対応する。本願発明者らの組織特異性の探索に基づけば（方法参照）、「Ｒ」の印が付けられたエクソン１２は、網膜に特異的であり、代替のエクソン４および５は精巣に特異的であった。いくつかの他のエクソンまたはエクソンの変異体もまた、同様の組織特異性を示した：７、１０、１１、１３、１４、１５、１６、１９、２０、２２、２３、２４、２６および３０。完全長で示された転写産物は、ＲＴ−ＰＣＲ、５’から３’へのＲＴ−ＰＣＲまたはＲＡＣＥ法と共に、ノーザンブロットハイブリダイゼーションにより確認された。ノーザンブロットハイブリダイゼーションにおいて用いられるＤＮＡプローブの位置は遺伝子構造の上の黒いバーで表わされる。すべての転写産物の全構造は決定されておらず、いくつかの転写産物の５’端または３’端のみが示されている。同様の予測されたＮ−端タンパク質領域をコードするいくつかの転写産物の代替の５’エクソンが、角括弧で示されている。転写産物の更なる３’端は、Ｇｅｎｂａｎｋクローンにおいて見出されるか、または３’ＲＡＣＥ法を用いた実験で得られ、ここで、これらの３’端は、ゲノムのＡ−ｒｉｃｈ領域に対応し、表示されていない。  右：異なる転写産物によりコードされた予測されたタンパク質の構造。１６０個以下のアミノ酸を有した、予測されたＯＲＦを備えるタンパク質は示されていない。特異的なタンパク質のドメインは、図２ｂのレジェンドに記載されているように表わされる。  点線は、不完全な転写産物、または予測されたタンパク質の端部である。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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