(57)【要約】本発明は、抗体の特性を明らかにする方法であって、抗体を含む薬学的組成物のバッチリリースのための効力アッセイとして、特に該薬学的組成物に関する販売承認を申請する場合の使用において、適している方法に関する。提供されるアッセイは、FcR結合性ペプチドを含む製剤の効力を決定する方法であって、製剤のFcR結合性ペプチドの少なくとも1つの作用機序が製剤のFcR結合性ペプチドとFc受容体との結合を介している、製剤のFcR結合性ペプチドとFc受容体との結合を決定する段階を含む方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
FcR結合性ペプチドを含む製剤（drug product）の効力を決定するための方法であって、製剤のFcR結合性ペプチドの少なくとも1つの作用機序が製剤のFcR結合性ペプチドとFc受容体との結合を介している、製剤のFcR結合性ペプチドとFc受容体との結合を決定する段階を含む方法。
【請求項２】
FcR結合性ペプチドを含む製剤の効力を決定するための、請求項1記載の方法であって、以下の段階を含む方法：
（i）参照標準FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合を決定する段階；
（ii）製剤のFcR結合性ペプチドと該Fc受容体との結合を決定する段階；および
（iii）段階（ii）におけるFcR結合を段階（i）におけるFcR結合と比較し、その比較によって得られた情報を原薬（drug substance）の効力を評価するために用いる段階、
ここで、
（a）段階（ii）におけるFc受容体との結合は、段階（i）におけるFc受容体との結合と同じ様式で決定され、
（b）製剤のFcR結合性ペプチドの少なくとも1つの作用機序はFcR結合性ペプチドとFc受容体との結合を介しており、かつ
（c）参照標準FcR結合性ペプチドおよび製剤のFcR結合ペプチドは同じFcR結合性分子の2つの異なる調製物である。
【請求項３】
FcR結合性ペプチドを含む薬学的組成物を生産する方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）該FcR結合性ペプチドを含む製剤の生産の段階；
（b）該製剤を、FcR結合性ペプチドを含む製剤の効力を決定するための請求項1または請求項2記載の方法に供する段階；および
（c）段階（b）で得られた情報を、その製剤を薬学的組成物として用いることができるか否かの評価の一部として用いる段階。
【請求項４】
製剤を薬学的組成物として販売するための販売承認に関する申請の一部である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
FcR結合性ペプチドを含む製剤に関する販売承認を申請する方法であって、製剤のFcR結合性ペプチドの効力を決定するための請求項1〜4のいずれか一項記載の方法を記載する段階を含む方法。
【請求項６】
FcR結合性ペプチドを含む製剤の効力を決定する方法が、バッチリリースのための効力アッセイとして用いられる、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合が、以下の段階を含む方法の使用によって決定される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法：
（i）製剤の試料を、FcR結合性ペプチドがFc受容体と結合するのに十分な時間にわたって、Fc受容体と接触させる段階、および
（ii）Fc受容体と結合したFcR結合性ペプチドの量を検出する段階。
【請求項８】
検出が、FcR結合性ペプチドを対象とする検出抗体の使用によって行われる、請求項7記載の方法。
【請求項９】
検出抗体が標識抗体である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がELISAの使用によって決定される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がAlphaScreen（商標）アッセイの使用によって決定される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がラジオイムノアッセイの使用によって決定される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がBiacoreアッセイの使用によって決定される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がFMATの使用によって決定される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がDELFIAの使用によって決定される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
FcR結合性ペプチドの作用機序が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を誘導することである、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
FcR結合性ペプチドの作用機序がADCCの誘導または標的受容体のダウンモジュレーションを介する、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
FcR結合性ペプチドの作用機序がナチュラルキラー細胞の動員を介する、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
FcR結合性ペプチドの作用機序がナチュラルキラー細胞によるADCCの誘導を介する、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つがナチュラルキラー細胞上に発現される、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
Fc受容体が、FcγRIIIa受容体、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、請求項17〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
FcγRIII受容体が、FcγRIIIa176V受容体、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片、例えば細胞外ドメインである、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
FcR結合性ペプチドの作用機序が多形核白血球の動員を介する、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
FcR結合性ペプチドの作用機序が多形核白血球によるADCCの誘導を介する、請求項1〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
FcR結合性ペプチドの作用機序がPMN脱顆粒の誘導を介する、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
FcR結合性ペプチドの作用機序が多形核白血球による食作用の誘導を介する、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つが多形核白血球上に発現される、請求項1〜17のいずれか一項または請求項23〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
Fc受容体が、FcγRIIa受容体、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、請求項23〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
FcR結合性ペプチドの作用機序が単球またはマクロファージによるADCCの誘導を介する、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つが単球および／またはマクロファージ上に発現される、請求項1〜17または請求項29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
Fc受容体が、FcγRIIb、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、請求項1〜17、請求項29、または請求項30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
FcR結合性ペプチドの作用機序が血小板凝集を誘導することである、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
FcR結合性ペプチドの作用機序が血小板の動員を介する、請求項1〜17または請求項32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つが血小板上に発現される、請求項1〜17、請求項32、または請求項33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
Fc受容体が、FcγRIIa、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、請求項1〜17または請求項32〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
FcR結合性ペプチドの作用機序がサイトカイン産生を誘導することである、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
FcR結合性ペプチドの作用機序がナチュラルキラー細胞および／またはT細胞の動員を介する、請求項1〜17または請求項36のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つがナチュラルキラー細胞および／またはT細胞上に発現される、請求項1〜17、請求項36、または請求項37のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
Fc受容体が、FcγRIa、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、請求項1〜17のいずれか一項または請求項36〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
Fc受容体が、FcγRIIIa、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、請求項1〜17のいずれか一項または請求項36〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
FcR結合性ペプチドの作用機序が免疫複合体の排除を誘導することである、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
FcR結合性ペプチドの作用機序が単球またはマクロファージの動員を介する、請求項1〜17または請求項41のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つが単球またはマクロファージ上に発現される、請求項1〜17、請求項41、または請求項42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
Fc受容体が、FcγRIII、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、請求項1〜17のいずれか一項または請求項41〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
Fc受容体が、FcγRIIIa、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、請求項1〜17のいずれか一項または請求項41〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
Fc受容体が、FcγRIIIb、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、請求項1〜17のいずれか一項または請求項41〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７】
FcR結合性ペプチドの作用機序が抗体応答のダウンレギュレーションを誘導することである、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項４８】
FcR結合性ペプチドの作用機序がB細胞の動員を介する、請求項1〜17または請求項47のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つがB細胞上に発現される、請求項1〜17、請求項47、または請求項48のいずれか一項記載の方法。
【請求項５０】
Fc受容体が、FcγRIIb、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、請求項1〜17のいずれか一項または請求項47〜49のいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
FcR結合性ペプチドの作用機序が単球およびマクロファージのエフェクター機能の阻害を誘導することである、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項５２】
FcR結合性ペプチドの作用機序が単球および／またはマクロファージの動員を介する、請求項1〜17または請求項51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つが単球および／またはマクロファージ上に発現される、請求項1〜17、請求項51、または請求項52のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
FcR結合性ペプチドの作用機序が食作用を誘導することである、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
FcR結合性ペプチドの作用機序が多形核白血球、マクロファージ、および／または樹状細胞の動員を介する、請求項1〜17または請求項54のいずれか一項記載の方法。
【請求項５６】
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つが多形核白血球、マクロファージ、および／または樹状細胞上に発現される、請求項1〜17、請求項54、または請求項55のいずれか一項記載の方法。
【請求項５７】
Fc受容体が、FcγRIIIb、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、請求項1〜17のいずれか一項または請求項54〜56のいずれか一項記載の方法。
【請求項５８】
Fc受容体が、FcγRIIa、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、請求項1〜17のいずれか一項または請求項54〜56のいずれか一項記載の方法。
【請求項５９】
FcR結合性ペプチドの作用機序が単球またはマクロファージによる食作用の誘導を介する、請求項1〜17または請求項54のいずれか一項記載の方法。
【請求項６０】
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つが単球またはマクロファージ上に発現される、請求項1〜17または請求項59のいずれか一項記載の方法。
【請求項６１】
Fc受容体が、FcγRIIb、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、請求項1〜17、請求項59、または請求項60のいずれか一項記載の方法。
【請求項６２】
FcR結合性ペプチドの作用機序が架橋を誘導することである、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項６３】
FcR結合性ペプチドの作用機序が細胞および／または抗体の架橋を介する、請求項1〜17または請求項62のいずれか一項記載の方法。
【請求項６４】
Fc受容体が、FcγRIa、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、請求項1〜17、請求項54、または請求項63のいずれか一項記載の方法。
【請求項６５】
Fc受容体が、FcγRII、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、請求項1〜17、請求項54、または請求項63のいずれか一項記載の方法。
【請求項６６】
Fc受容体が、FcγRIII、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、請求項1〜17、請求項54、または請求項63のいずれか一項記載の方法。
【請求項６７】
FcR結合性ペプチドの作用機序が、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフを介した正のシグナル伝達を誘導することである、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項６８】
FcR結合性ペプチドの作用機序が骨髄性細胞、T細胞、および／または血小板の動員を介する、請求項1〜17または請求項67のいずれか一項記載の方法。
【請求項６９】
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つが骨髄性細胞、T細胞、および／または血小板上に発現される、請求項1〜17、請求項67、または請求項68のいずれか一項記載の方法。
【請求項７０】
Fc受容体が、FcγRIIa、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、請求項1〜17のいずれか一項または請求項67〜69のいずれか一項記載の方法。
【請求項７１】
Fc受容体が、FcγRIIc、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、請求項1〜17のいずれか一項または請求項67〜69のいずれか一項記載の方法。
【請求項７２】
FcR結合性ペプチドの作用機序が、共通のγ、β、ζ鎖を介した正のシグナル伝達を誘導することである、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項７３】
FcR結合性ペプチドの作用機序が骨髄性細胞、多形核白血球、ナチュラルキラー細胞、またはT細胞の動員を介する、請求項1〜17または請求項72のいずれか一項記載の方法。
【請求項７４】
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つが骨髄性細胞、多形核白血球、ナチュラルキラー細胞、またはT細胞上に発現される、請求項1〜17、請求項72、または請求項73のいずれか一項記載の方法。
【請求項７５】
Fc受容体が、FcγRIa、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、請求項1〜17のいずれか一項または請求項72〜74のいずれか一項記載の方法。
【請求項７６】
Fc受容体が、FcγRIIa、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、請求項1〜17のいずれか一項または請求項72〜74のいずれか一項記載の方法。
【請求項７７】
Fc受容体が、FcγRIIIa、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、請求項1〜17のいずれか一項または請求項72〜74のいずれか一項記載の方法。
【請求項７８】
FcR結合性ペプチドの作用機序が、免疫受容体チロシンベース抑制モチーフを介した負のシグナル伝達を誘導することである、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項７９】
FcR結合性ペプチドの作用機序がB細胞、マクロファージ、および／または単球の動員を介する、請求項1〜17または請求項78のいずれか一項記載の方法。
【請求項８０】
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つがB細胞、マクロファージ、および／または単球上に発現される、請求項1〜17、請求項78、または請求項79のいずれか一項記載の方法。
【請求項８１】
Fc受容体が、FcγRIIb、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、請求項1〜17または請求項78〜80のいずれか一項記載の方法。
【請求項８２】
Fc受容体が、FcγRn、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項８３】
方法に用いるためのFc受容体が1つの段階を含む調製方法によって調製されており、その段階が、そのような段階を含まない調製方法によって調製された同様のFc受容体と比較して、N結合型グリコシル化上のシアル酸の量が減少したFc受容体をもたらす、請求項1〜82のいずれか一項記載の方法。
【請求項８４】
Fc受容体が、シアリル化の原因となる機序に欠陥のある宿主細胞において発現されている、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
Fc受容体が、方法に用いられる前にシアリダーゼで処理されている、請求項83記載の方法。
【請求項８６】
FcR結合性ペプチドが抗体である、請求項1〜85のいずれか一項記載の方法。
【請求項８７】
FcR結合性ペプチドがモノクローナル抗体である、請求項86記載の方法。
【請求項８８】
FcR結合性ペプチドがヒト抗体である、請求項86または請求項87記載の方法。
【請求項８９】
FcR結合性ペプチドがヒト化抗体である、請求項86または請求項87記載の方法。
【請求項９０】
FcR結合性ペプチドがキメラ抗体である、請求項86または請求項87記載の方法。
【請求項９１】
FcR結合性ペプチドがFc結合部分を含む抗体フラグメントである、請求項86〜90のいずれか一項記載の方法。
【請求項９２】
FcR結合性ペプチドがIgG1抗体である、請求項86〜91のいずれか一項記載の方法。
【請求項９３】
FcR結合性ペプチドがIgG1 λ抗体である、請求項92記載の方法。
【請求項９４】
FcR結合性ペプチドがIgG1 κ抗体である、請求項92記載の方法。
【請求項９５】
抗体とFc受容体との結合の決定が、抗体とその抗原との結合を決定する方法と組み合わされる、請求項86〜94のいずれか一項記載の方法。
【請求項９６】
抗体とその抗原との結合が、以下の段階を含む方法の使用によって決定される、請求項95記載の方法：
（i）抗体の試料を、抗体が抗原と結合するのに十分な時間にわたって、抗原と接触させる段階、および
（ii）抗原と結合した抗体の量を検出する段階。
【請求項９７】
検出が、製剤の抗体を対象とする検出抗体の使用によって行われる、請求項96記載の方法。
【請求項９８】
検出抗体が標識抗体である、請求項97記載の方法。
【請求項９９】
抗体とその抗原との結合がELISAの使用によって決定される、請求項95〜98のいずれか一項記載の方法。
【請求項１００】
同じELISAが、抗体とFc受容体との結合を決定するためにも用いられる、請求項99記載の方法。
【請求項１０１】
抗体とその抗原との結合がAlphaScreen（商標）アッセイの使用によって決定される、請求項95記載の方法。
【請求項１０２】
AlphaScreen（商標）アッセイが、抗体とFc受容体との結合を決定するためにも用いられる、請求項101記載の方法。
【請求項１０３】
抗体とその抗原との結合がラジオイムノアッセイの使用によって決定される、請求項95記載の方法。
【請求項１０４】
ラジオイムノアッセイが、抗体とFc受容体との結合を決定するためにも用いられる、請求項103記載の方法。
【請求項１０５】
ラジオイムノアッセイが、Fc受容体および放射性ヨウ素化抗原が結合されたビーズを用いる、請求項104記載の方法。
【請求項１０６】
FcR結合性ペプチドがヒトCD4と結合する抗体である、請求項86〜105のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０７】
FcR結合性ペプチドがザノリムマブである、請求項106記載の方法。
【請求項１０８】
FcR結合性ペプチドがケリキシマブである、請求項106記載の方法。
【請求項１０９】
FcR結合性ペプチドがクレノリキシマブである、請求項106記載の方法。
【請求項１１０】
FcR結合性ペプチドがTNX 355である、請求項106記載の方法。
【請求項１１１】
FcR結合性ペプチドがTRX-1である、請求項106記載の方法。
【請求項１１２】
FcR結合性ペプチドがIOT4aである、請求項106記載の方法。
【請求項１１３】
FcR結合性ペプチドが4162W94である、請求項106記載の方法。
【請求項１１４】
FcR結合性ペプチドがヒトEGFRと結合する抗体である、請求項1〜94のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１５】
FcR結合性ペプチドがセツキシマブである、請求項114記載の方法。
【請求項１１６】
FcR結合性ペプチドがHuMax-EGFRである、請求項114記載の方法。
【請求項１１７】
FcR結合性ペプチドがヒトCD20と結合する抗体である、請求項1〜94記載の方法。
【請求項１１８】
FcR結合性ペプチドがリツキシマブである、請求項117記載の方法。
【請求項１１９】
FcR結合性ペプチドがイブリツモマブチウキセタンである、請求項117記載の方法。
【請求項１２０】
FcR結合性ペプチドがトシツモマブである、請求項117記載の方法。
【請求項１２１】
FcR結合性ペプチドがHuMax-CD20である、請求項117記載の方法。
【請求項１２２】
FcR結合性ペプチドがヒトTACと結合する抗体である、請求項1〜94のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２３】
FcR結合性ペプチドがHuMax-TACである、請求項122記載の方法。
【請求項１２４】
FcR結合性ペプチドがヒトCD3と結合する抗体である、請求項1〜94のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２５】
FcR結合性ペプチドがムロモナブである、請求項124記載の方法。
【請求項１２６】
FcR結合性ペプチドがヒトGPIIb／IIIaと結合する抗体である、請求項1〜94のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２７】
FcR結合性ペプチドがヒトCD25と結合する抗体である、請求項1〜94のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２８】
FcR結合性ペプチドがダクリズマブである、請求項127記載の方法。
【請求項１２９】
FcR結合性ペプチドがバシリキシマブである、請求項127記載の方法。
【請求項１３０】
FcR結合性ペプチドがヒトTNF-αと結合する抗体である、請求項1〜94のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３１】
FcR結合性ペプチドがインフリキシマブである、請求項130記載の方法。
【請求項１３２】
FcR結合性ペプチドがアダリムマブである、請求項130記載の方法。
【請求項１３３】
FcR結合性ペプチドがヒトRSVと結合する抗体である、請求項1〜94のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３４】
FcR結合性ペプチドがパリビズマブである、請求項133記載の方法。
【請求項１３５】
FcR結合性ペプチドがヒトHER-2／neuと結合する抗体である、請求項1〜94のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３６】
FcR結合性ペプチドがトラスツズマブである、請求項135記載の方法。
【請求項１３７】
FcR結合性ペプチドがペルツズマブである、請求項135記載の方法。
【請求項１３８】
FcR結合性ペプチドがヒトCD33と結合する抗体である、請求項1〜94のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３９】
FcR結合性ペプチドがヒトCD52と結合する抗体である、請求項1〜94のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４０】
FcR結合性ペプチドがアレムツズマブである、請求項139記載の方法。
【請求項１４１】
FcR結合性ペプチドがヒトVEGFと結合する抗体である、請求項1〜94のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４２】
FcR結合性ペプチドがベバシズマブである、請求項141記載の方法。
【請求項１４３】
FcR結合性ペプチドがヒトCTLA4と結合する抗体である、請求項1〜94のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４４】
FcR結合性ペプチドがMDX-010である、請求項143記載の方法。
【請求項１４５】
FcR結合性ペプチドを含む製剤であって、薬学的組成物としての使用が承認されており、請求項1〜144のいずれか一項記載の方法が販売承認に関する申請の一部をなしている、製剤。
【請求項１４６】
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合を決定する方法に用いるための該Fc受容体の調製の方法であって、該Fc受容体が1つの段階を含む方法によって調製されており、その段階が、その段階を含まない方法によって調製された同様のFc受容体と比較して、N結合型グリコシル化上のシアル酸の量が減少したFc受容体をもたらすような方法。
【請求項１４７】
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合が、以下の段階を含む方法の使用によって決定される、請求項146記載の方法：
（i）FcR結合性ペプチドを、FcR結合性ペプチドがFc受容体と結合するのに十分な時間にわたって、Fc受容体と接触させる段階、および
（ii）Fc受容体と結合したFcR結合性ペプチドの量を検出する段階。
【請求項１４８】
検出が、FcR結合性ペプチドを対象とする検出抗体の使用によって行われる、請求項147記載の方法。
【請求項１４９】
検出抗体が標識抗体である、請求項148記載の方法。
【請求項１５０】
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がELISAの使用によって決定される、請求項146〜149のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５１】
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がAlphaScreen（商標）アッセイの使用によって決定される、請求項146〜149のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５２】
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がラジオイムノアッセイの使用によって決定される、請求項146〜149のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５３】
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がBiacoreアッセイの使用によって決定される、請求項146〜149のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５４】
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がFMATの使用によって決定される、請求項146〜149のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５５】
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がDELFIAの使用によって決定される、請求項146〜149のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５６】
ELISAプレート上にコーティングされたhis捕捉抗体が、hisタグが付加されたFcRまたはFcRフラグメントを捕捉するために用いられる、本発明または請求項1〜155のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５７】
ポリペプチド分子によってコーティングされるのに適したプラスチック部材（plastic member）であって、プラスチック部材の表面に対するポリペプチド分子の付着が、少なくとも部分的には、ポリペプチド分子とプラスチック部材の表面との間の静電相互作用に依存し、プラスチック部材の表面が脱シアリル化ポリペプチドによってコーティングされている、プラスチック部材。
【請求項１５８】
ポリペプチド分子がFc受容体である、請求項157記載のプラスチック部材。
【請求項１５９】
マイクロタイタープレートである、請求項157または請求項158記載のプラスチック部材。
【請求項１６０】
請求項1〜144のいずれか一項記載の方法に用いるのに適している、請求項157〜159のいずれか一項記載のプラスチック部材。
【請求項１６１】
請求項1〜144のいずれか一項記載の方法に用いられる、請求項157〜159のいずれか一項記載のプラスチック部材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抗体の特性を明らかにする方法であって、抗体を含む薬学的組成物のバッチリリースのための効力アッセイとして、特に該薬学的組成物に関する販売承認を申請する場合の使用に適している方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
薬学的組成物を生産する場合には、原薬（drug substance）を製剤（drug product）へと製剤化するだけでは十分ではなく、結果として生じた製剤が、その薬学的組成物を用いようとする国の規制機関によって承認されることも不可欠である。米国では、該当する規制機関は米国食品医薬品局（FDA；United States Food and Drug Administration）（http://www.fda.gov/）であり、欧州では、それは例えば欧州医薬品審査庁（EMEA；European Agency for the Evaluation of Medicinal Products）（http://www.emea.eu.int/）である。
【０００３】
承認のプロセスは強く規制されており、医薬物開発者は、承認を得るために、製剤に関する大量の情報を規制当局に提出することを求められる。これには、製剤の効力に関する情報、およびこの効力を決定するためのアッセイが含まれうる。
【０００４】
そのような効力アッセイは、製品の特性を明らかにするため、ロット間の一貫性をモニターするため、および製品の安定性を保証するための役割を担っており、このため、製品の作用機序および機能に影響を及ぼす可能性がありその結果として臨床的に重要である可能性がある差異を検出するのに十分な感度を持つべきである。加えて、効力アッセイは、製品の推定される生理的／薬理学的活性に対して最も密接な関連性を備えることが望ましい。
【０００５】
適切な効力アッセイは、以下の一次基準を満たすべきである：
‐製品規格の範囲内にある効力値を測定する能力。
‐臨床的に重要である可能性がある差異の検出に関する高い感度。
‐製品の作用機序および推定される生理的／薬理学的活性との密接な関連性。
【０００６】
一次基準に基づいて選択された効力アッセイは、以下の二次基準も満たすべきである：
‐アッセイ内およびアッセイ間の変動が十分に低い（製品規格に対応するために必要な精度を得るために）。
‐十分な頑健性。
‐ハイスループット分析に修正可能である。
【０００７】
組換えモノクローナル抗体を作製するための手法の開発により、疾患標的を対象とするモノクローナル抗体の治療的使用についての相当な量の研究が促された。その後、世界中で、モノクローナル抗体を含むいくつかの薬学的組成物が、販売に関して承認されるか、または臨床開発中である。薬物としての抗体の治療的有用性は、抗体が抗原と結合する能力に依存するが、往々にして、抗体のFcを介した活性もその作用機序に決定的な役割を果たす。実際、一部の抗体製剤の効果は、抗体を抗原に単に結合させて、その結果、例えば抗原へのリガンドの到達を阻止することによって達成されるが、ある種の抗体製剤の効能は、さらにFc受容体の結合および／または補体活性化の誘導といったエフェクター機能にも依存しうる。
【０００８】
ザノリムマブ（HuMax-CD4としても知られる）は、ヒトCD4を対象とする、IgG1重鎖およびκ型の軽鎖（IgG1 κ）を有する完全ヒトモノクローナル抗体である（EP 0854917（特許文献１））。ザノリムマブは哺乳動物細胞（CHO）培養物中で製造され、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製される。ザノリムマブ原薬はリン酸緩衝食塩水、pH 7.4中に20mg／mlで製剤化されて、ザノリムマブ製剤となる。ザノリムマブの1つの機序は、CD4+ T細胞を枯渇させること、および／または不活性化することである。これは例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）、T細胞表面上のCD4発現のダウンモジュレーション、ならびに／またはCD4シグナル伝達、T細胞活性化、およびT細胞増殖との干渉を介して起こりうる。これらのカテゴリーの作用機序はすべて、Fabフラグメントに位置するザノリムマブの抗原結合部分によるCD4抗原との結合に依存する。加えて、ADCCおよびCD4ダウンレギュレーションは、ザノリムマブのFc領域とFc受容体との結合を必要とする。ADCCの誘導はザノリムマブの重要な作用機序として同定されている。
【０００９】
ザルツムマブ（Zalutumumab）（HuMax-EGFrとしても知られる）は、IgG1アイソタイプの重鎖およびκ型の軽鎖（IgG1 κ）を有する、ヒトEGFrを対象とするヒト抗体である（WO 02／100348（特許文献２））。ザルツムマブは現在、GSベクターシステムを用いてザルツムマブを発現する哺乳動物細胞（CHO）懸濁培養物中で製造され、特異的ウイルス非活性化および除去の手順を含む、アフィニティーおよびイオン交換の手順によって精製される。製剤であるザルツムマブ（20mg／mL）は、ザルツムマブ原薬（25mg／mL）を、50mMリン酸ナトリウム、50mM塩化ナトリウム、3％（w／v）マンニトール、0.02％（w／v）ポリソルベート80、および0.01％（w／v）EDTAを含む緩衝液中に希釈して、pH 6.0に調整することによって製剤化される。マウスにおける抗腫瘍効果は低いHuMax-EGFr受容体の占有率でも観察されており、これは免疫エフェクター機構、特にADCCの関与に基づく可能性が高い。このため、HuMax-EGFrの1つの作用機序であるADCCは、Fc-FcR相互作用を介している。
【００１０】
Fc受容体に対するFcの結合が作用機序に対して決定的な役割を果たす抗体の効力は、伝統的に、評価される効果がFc-Fc受容体結合に依存する生物学的アッセイの使用によって測定される。そのようなアッセイには、ADCC、抗体の架橋を必要とするT細胞活性化の誘導もしくは阻害、またはインターロイキン2（IL-2）の産生といったサイトカイン産生の誘導もしくは阻害が含まれうる。しかし、そのようなアッセイは比較的手間がかかり、細胞培養に起因して予期される変動のため、または初代細胞がしばしば必要であるために、変動性が大きい。後者は特に、ドナーの免疫状態の変動、発現遺伝子における多型、および細胞型の純度の変動のゆえに変動性を生じる。このため、そのような生物学的アッセイは、バッチリリースの目的には最適とはいえない。したがって、特にその作用機序がFc受容体に対する結合に依存する抗体を含む薬学的組成物の生産に用いるための、抗体製剤の作用機序および推定される生理的／薬理学的活性に対して密接な関連性を示す、迅速で効率的で感度の高い効力アッセイに対する需要がある。
【００１１】
【特許文献１】EP 0854917
【特許文献２】WO 02／100348
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明は、FcR結合性ペプチドを含む製剤の効力を決定する方法であって、製剤のFcR結合性ペプチドの少なくとも1つの作用機序が製剤のFcR結合性ペプチドとFc受容体との結合を介している、製剤のFcR結合性ペプチドとFc受容体との結合を決定する段階を含む方法を提供する。
【００１３】
配列表の簡単な説明
SEQ ID No：1‐FcγRIaECDHis
SEQ ID No：2‐FcγRIIIaECD176VHis
SEQ ID No：3‐FcγRIIIaECD176FHis
SEQ ID No：4‐プライマーP1
SEQ ID No：5‐プライマーP2
SEQ ID No：6‐プライマーP3
SEQ ID No：7‐プライマーP4
SEQ ID No：8‐プライマーP5
SEQ ID No：9‐プライマーP6
SEQ ID No：10‐プライマーP7
SEQ ID No：11‐プライマーP8
【００１４】
略号の一覧
ADCC  抗体依存性細胞傷害
CHO  チャイニーズハムスター卵巣
ELISA  酵素結合免疫吸着アッセイ
F(ab')2  抗体の可変ドメインの二量体
Fc  抗体の定常ドメイン
FcR  Fc受容体
FcγRIa  γ免疫グロブリンFc受容体I-A
FcγRIaECDHis  C末端His6タグを伴うFcγRIaの細胞外ドメイン
FcγRIIIa  γ免疫グロブリンFc領域受容体Ill-A
FcγRIIIa176V  176位にValを有するFcγRIIIa、これはプロセシングを受けた成熟タンパク質の予想開始部から数えた場合にはFcγRIII158Vとも呼ばれる
FcγRIIIaECD176FHis  C末端His6タグおよび176F多型を有するFcγRIIIaの細胞外ドメイン
FcγRIIIaECD176VHis  c末端His6タグおよび176V多型を有するFcγRIIIaの細胞外ドメイン
FcγRIII158V  上記のFcγRIIIa176Vの項を参照
Fv  抗体の可変（抗原特異的）ドメイン
IgG1 κ  κ軽鎖を有する免疫グロブリンG
IL  インターロイキン
NK  ナチュラルキラー
PBMC  末梢血単核細胞
PBS  リン酸緩衝食塩水
PBSC  2％（v／v）ニワトリ血清を含むPBS
PBST  0.05％（v／v）Tween-20を含むPBS
PBSTC  0.05％（v／v）Tween-20および2％（v／v）ニワトリ血清を含むPBS
PMN  多形核白血球
RT  室温
RZPD  ドイツゲノム研究リソースセンター
SDS-PAGE  SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動
TNF  腫瘍壊死因子
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、Fc受容体のFc結合領域と結合しうるペプチドを含む薬学的組成物のバッチリリースのための効力アッセイとして適している方法を提供する。本明細書の文脈においては、そのようなペプチドを「Fc受容体結合性ペプチド」または「FcR結合性ペプチド」と称してもよい。
【００１６】
本発明は、FcR結合性ペプチドを含む製剤の効力を決定する方法であって、製剤のFcR結合性ペプチドの少なくとも1つの作用機序が製剤のFcR結合性ペプチドとFc受容体との結合を介している、製剤のFcR結合性ペプチドとFc受容体との結合を決定する段階を含む方法を提供する。
【００１７】
この文脈におけるペプチドという用語は任意の適切なペプチドを含み、別の指定がない限り、または文脈によって否定されない限り、ポリペプチドおよびタンパク質という用語と同義に用いることができる；ただし、読む人が、各々のアミノ酸ポリマー含有分子のそれぞれの型が有意な差異を伴いうること、およびそのために本発明の個別的な態様をなしうる（例えば、複数のポリペプチド鎖から構成される抗体などのペプチドは、例えば、一本鎖抗体、ペプチドであるイムノアドヘシン、または一本鎖免疫原性ペプチドとは有意に異なる）ことを認識していることを条件とする。このため、本明細書におけるペプチドという用語は、一般に、Fc受容体と結合することのできる、任意の適切なサイズおよび組成（タンパク質分子におけるアミノ酸の数および付随する鎖の数に関して）を有する任意の適切なペプチドを指すものと理解されるべきである。さらに、本明細書に記載した本発明の方法の文脈におけるペプチドには、別の指定がない限り、または文脈によって否定されない限り、非天然および／または非L型のアミノ酸残基も含まれうる。
【００１８】
別の指定がない限り、または文脈によって否定されない限り、ペプチドという用語（ならびに、ポリペプチドおよび／またはタンパク質という用語の個別の態様として議論される場合）は、誘導体化されたペプチド分子も含む。手短に述べると、本発明の文脈において、誘導体とは、ペプチドのアミノ酸残基のうち1つまたは複数が化学的に修飾された（例えば、アルキル化、アシル化、エステル形成、またはアミド形成）、または1つもしくは複数の非アミノ酸の有機および／もしくは無機の原子もしくは分子の置換基（例えば、ポリエチレングリコール（PEG）基、親油性置換基（これは、スペーサー残基または基、例えばβ-アラニン、γ-アミノ酪酸（GABA）、L／D-グルタミン酸、コハク酸などによって、ペプチドのアミノ酸配列と連結されてもよい）、フルオロフォア、ビオチン、放射性核種、その他）を伴うペプチドのことであり、例えば、US 4766106、US 4179337、US 4495285、およびUS 4609546を参照されたい。別の指定がない限り、または文脈によって否定されない限り、FcR結合性ペプチドはさらに、または代替的に、非必須、非天然、および／または非L型のアミノ酸残基を含みうる。このようなアミノ酸残基の非限定的な例には、例えば、2-アミノアジピン酸、3-アミノアジピン酸、β-アラニン、β-アミノプロピオン酸、2-アミノ酪酸、4-アミノ酪酸、6-アミノカプロン酸、2-アミノヘプタン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノイソ酪酸、2-アミノピメリン酸、2,4-ジアミノ酪酸、デスモシン、2,2'-ジアミノピメリン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、N-エチルグリシン、N-エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロイソロイシン、N-メチルグリシン、N-メチルイソロイシン、6-N-メチルリジン、N-メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、およびスタチンハロゲン化アミノ酸が含まれる。
【００１９】
このため、この文脈におけるFcR結合性ペプチドという用語は融合タンパク質も含み、これは、Fc受容体のFc結合領域に対する結合を付与する任意の適切なアミノ酸配列または配列の組み合わせ、ならびに、Fc受容体に特異的な配列（これは例えば本明細書に記載した抗体でありうる）の単独での属性ではありえない、例えばインビボ半減期の延長、蛍光、エピトープタグの付加、特定の種類の細胞に対する標的指向性の増大といった検出可能な生物機能および／または特徴を融合タンパク質に対してもたらす、少なくとも1つの非相同的で典型的には実質的に類似していないアミノ酸配列を含みうる。そのような融合タンパク質の機能性配列を、柔軟なリンカーによって隔てることもできる。第二の配列は、細胞傷害性またはアポトーシス性ペプチドに由来してもよい。第二の配列は診断的な性質を付与してもよい。そのような配列の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼのように容易に可視化しうる酵素に由来するものが含まれる。
【００２０】
FcR結合性ペプチドはまた、Fc受容体のFc結合部分と結合しうるペプチドであって、治療的部分と結合したペプチドも範囲に含む。例えば、そのような治療的部分は、細胞毒、化学療法薬、免疫抑制薬、または放射性同位体でありうる。治療的部分が古典的な治療用化学物質に限定されるとみなす必要はなく、これには所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドも含まれうる。このようなタンパク質には、例えば、酵素活性のある毒素またはその活性断片、例えばアブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、もしくはジフテリア毒素など；タンパク質、例えば腫瘍壊死因子もしくはインターフェロン-γなど；または生物応答調節物質、例えばリンホカイン、インターロイキン-1（IL-1）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-6（IL-6）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、または他の増殖因子、およびミトコンドリアから単離されたアポトーシス誘導タンパク質が含まれる。それはまた、ホスホリパーゼ酵素、例えばホスホリパーゼCなどのように細胞表面で活性のある作用物質であってもよい。
【００２１】
FcR結合性ペプチドはまた、FcR結合性ペプチドが、例えば、以下のものと結合したものも範囲に含む：放射性同位体、放射性核種、酵素（例えば、検出のために有用な酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなど）、酵素基質、補助因子、蛍光マーカー（例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、5-ジメチルアミン-1-ナフタレンスルホニルクロリド、ランタニド燐光体など、ならびに125Eu標識、イソチオシアネート標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、o-フタルアルデヒド標識、またはフルオレサミン標識など）、化学発光マーカー（例えば、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、エクオリン標識など）、ペプチドタグ（例えば、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ、例えばロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ、その他）、磁性粒子、核酸または核酸関連分子（細胞傷害性リボヌクレアーゼ、アンチセンス核酸、抑制性RNA分子（例えば、siRNA分子）、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成性分子、外部ガイド配列、免疫刺激性核酸、例えば腫瘍抑制遺伝子の発現をコードする発現カセット、抗癌ワクチン、抗癌サイトカイン、アポトーシス性作用物質、または1つもしくは複数の細胞傷害性タンパク質）、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節物質、キレート薬、ホウ素化合物、光活性物質、色素など。
【００２２】
FcR結合性ペプチドはまた、用意された1つまたは複数の放射標識アミノ酸またはスピン標識分子を含むFcR結合性ペプチドも範囲に含む。ポリペプチド用の放射性標識の非限定的な例には、3H、14C、15N、35s、90Y、99Tc、125I、131I、および186Reが非限定的に含まれる。
【００２３】
FcR結合性ペプチドはまた、架橋されたFcR結合性ペプチド誘導体も範囲に含む。例えば、このような架橋性誘導体は、少なくとも一方がFc受容体のFc結合領域と結合することができる、2つまたはそれ以上の抗体（同じ種類のもの、または例えば二重特異性抗体を作るためには異なる種類のもの）を架橋させることによって作製することができる。
【００２４】
また、本発明の方法を、Fc受容体のFc結合領域と結合しうるペプチド模倣物の効力を決定するために用いることもできる。したがって、これらもFcR結合性ペプチドという用語に含まれる。
【００２５】
製剤とは、治療的に関心がもたれる薬物を含む組成物であって、その薬物による治療を必要とする患者に対して投与される組成物のことである。1つの態様において、製剤は、組換え的に生産された抗体医薬などの抗体を含む製剤である。組換え抗体医薬の場合には、抗体製剤は、組換えDNA手法の細胞融合のいずれかによって作製された宿主細胞において抗体をまず産生させ、続いて結果として生じた抗体を収集、精製、および製剤に製剤化することによって生産される。抗体産生のための細胞型の選択、糖質トランスフェラーゼなどの修飾酵素の同時トランスフェクション、ならびに培養および／または処理条件の違いは、当技術分野で周知であるように、結果として生じた抗体の効力に影響を及ぼす可能性がある。組換え的に生産されるペプチドの生産についても同様である。組換え抗体の収集、精製、および製剤化の方法は当技術分野で公知であり、これには、例えば清澄化、濃縮、濾過、およびクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィー）といった1つまたは複数の段階が含まれうる。製剤は、薬物に加えて、例えば精製工程の間に添加することができる薬学的使用に許容される成分である、担体、希釈剤、アジュバント、および賦形剤といった任意の数の成分を含むことができる。薬学的に許容される担体または希釈剤の例、ならびに任意の他の公知のアジュバントおよび賦形剤は、当技術分野で周知であり、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995に開示されたものであってもよい。
【００２６】
本発明の文脈における抗体という用語は、典型的な生理的条件下で、例えば半減期が少なくとも約30分、少なくとも約45分、少なくとも約1時間、少なくとも約2時間、少なくとも約4時間、少なくとも約8時間、少なくとも約12時間、約24時間またはそれ以上、約48時間またはそれ以上、約3、4、5、6、7日またはそれ以上の日数など、または任意の他の妥当な機能的に定められた期間（抗原に対する抗体結合に伴う生理的応答を誘導、促進、増強、および／または調節するのに十分な時間など）といった有意な期間にわたって抗原と特異的に結合する能力、およびFc受容体と結合する能力を有する、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の断片、またはそれらのいずれかの誘導体のことを指す。
【００２７】
免疫グロブリンという用語は、一方の対が低分子量の軽（L）鎖であって一方の対が重（H）鎖であり、典型的にはその4つすべてがジスルフィド結合によって互いに連結している、2つの対のポリペプチド鎖からなる、構造的に関連のある糖タンパク質のクラスのことを指す。免疫グロブリンの構造の特性は詳細に明らかにされている。例えば、Fundamental Immunology Ch. 7（Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)）を参照のこと。手短に述べると、それぞれの重鎖は、典型的には、重鎖可変領域（本明細書ではVHと略記）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、典型的には、CH1、CH2、およびCH3という3つのドメインから構成される。それぞれの軽鎖は、典型的には、軽鎖可変領域（本明細書ではVLと略記）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、典型的には、1つのドメインCLから構成される。VH領域およびVL領域はさらに、より保存性の高いフレームワーク領域（FR）と呼ばれる領域の間に散在し、相補性決定領域領域（CDR）とも呼ばれる、超可変性を有する領域（または構造的に規定されたループの配列および／または形態の点で超可変的でありうる超可変領域）として、細分することができる。
【００２８】
それぞれのVHおよびVLは典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって次の順序に並んだ、3つのCDRおよび4つのFRから構成される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4（Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)も参照）。典型的には、この領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)に記載された方法によって行われる（本明細書において、KabatにおけるようなまたはKabatに従った「可変ドメイン残基の番号付け」などの語句は、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに対するこの番号付け方式のことを指す）。この番号付け方式を用いると、ペプチドの実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのFRまたはCDRの短縮またはそれへの挿入に対応して、より少数または付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインは、VH CDR2の残基52の後に単一のアミノ酸挿入（Kabatによる残基52a）、および重鎖FRの残基82の後に挿入残基（例えば、Kabatによる残基82a、82b、および82cなど）を含みうる。残基のKabat番号は、任意の抗体に関して、抗体の配列と「標準的な」Kabat番号付けがなされた配列との、相同性のある領域でのアラインメントによって決定することができる。
【００２９】
抗体において、免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメイン（Fvフラグメント）を含む。抗体（Ab）の定常領域が、Fc受容体および古典的補体系の第一成分（C1q）を介して、免疫グロブリンと、免疫系の種々の細胞（エフェクター細胞など）を含む宿主の組織または因子との結合を媒介することもある。
【００３０】
本発明に用いるための抗体が、二重特異性抗体または類似の分子であってもよい。実際に、二重特異性抗体などは、本来の抗原の一部分に加えて、それらがFc受容体と結合しうる部分を保っている限り、任意の適切な標的と結合しうる。
【００３１】
上述した通り、本明細書における抗体という用語は、別の指定がない限り、または文脈によって明らかに否定されない限り、抗原およびFc受容体に対して特異的に結合する能力を保っている、抗体の断片、誘導体、変異体（欠失変異体を含む）を含む。さらに、Fvフラグメントの2つのドメインであるVLおよびVHは別個の遺伝子によってコードされるものの、それらを組換え法を用いて、VL領域およびVH領域の対が一価分子を形成した一本鎖タンパク質（一本鎖抗体または一本鎖Fv（scFv）として知られる；例えば、Bird et al., Science 242, 423-426 (1988)およびHuston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)を参照）として作製することを可能にする合成リンカーによって連結することもできる。このような一本鎖抗体は、別の指定がない限り、または文脈によって明らかに示されない限り、抗体という用語の範囲に含まれる。他の形態の一本鎖抗体、例えばWO 2005037989に記載された分子なども、抗体という用語の範囲に含まれる。そのような断片は一般に抗体の意味に含まれるが、それらは一括的に、かつそれぞれ独立に、異なる生物学的性質および有用性を呈する、本発明の独特な特徴である。
【００３２】
また、抗体という用語が一般に、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体など、ならびに抗体様ポリペプチドを含むことも理解されるべきである。抗体は特定のアイソタイプのものであってよく、これは重鎖定常領域遺伝子によってコードされる免疫グロブリンのクラス、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE、またはIgMのことを指す。それぞれのアイソタイプは特有のアミノ酸配列を有し、それらを互いに区別する特有のアイソタイプエピトープのセットを有する。
【００３３】
抗体の治療効果は、抗体の超可変領域と抗原との結合、および抗体のFc領域とFc受容体との結合によって達成される。治療用ペプチドはまた、Fc受容体との結合によってもその治療効果を提供しうる。
【００３４】
Fc受容体は、免疫グロブリンの定常領域内のある種のアミノ酸に対して特異的な受容体のファミリーである。個々の細胞上でのそれらの発現は、受容体の種類に依存する。ほぼすべての免疫グロブリンのクラスに対する受容体が記載されている。それらはFcγR（IgGクラスに対して）、FcαR（IgAクラスに対して）、およびFcεR（IgEクラスに対して）と呼ばれる。IgGと結合する親和性およびIgGアイソタイプと結合する相対的親和性が異なる複数のFcγRが同定されている；FcγR受容体に関するさらなる情報に関しては、van Sorge NM et al., Tissue Antigens. 61(3), 189-202 (2003)を参照のこと。本発明に用いるためのFc受容体は、完全長Fc受容体でもよく、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片、例えば細胞外ドメインであってもよい。本発明に用いるためのFc受容体はまた、野生型Fc受容体でもよく、または、その機能がFcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の機能と相関するような、その任意のアロタイプもしくは突然変異体であってもよい。本発明に用いるためのFc受容体が、天然のFc受容体（またはその断片もしくは誘導体）ではないペプチドであって、抗体のFc部分のFcR結合領域と結合することができ、FcR結合性ペプチドとFc結合性ペプチドとの結合が、FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の機能と相関するようなペプチドであってもよい。
【００３５】
本発明に用いるためのFc受容体は、例えば、実施例の項に記載したように宿主細胞における一過性発現によって産生させることもでき、または安定的にトランスフェクトされた細胞系において、または当技術分野で公知の任意の他のやり方で産生させることもできる。それらはまた、膜貫通ドメインを含むFc受容体の発現を可能にする核酸によるトランスフェクションを受けた真核細胞、例えば酵母細胞または哺乳動物細胞などの細胞の表面に存在してもよい。「宿主細胞」（または組換え「宿主細胞」）という用語は、本明細書で用いる場合、内部に組換え発現ベクターが導入された細胞を指すことを意図している。このような用語は、特定の対象細胞のみではなく、そのような細胞の子孫も指すことを意図していることが理解されるべきである。突然変異または環境的影響のいずれかのために後の世代には何らかの変化が生じる可能性があるため、このような子孫は実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、それでも本明細書で用いる「宿主細胞」という用語の範囲には含まれる。組換え宿主細胞には、例えば、CHO細胞、NS／0細胞、およびリンパ球細胞などのトランスフェクトーマが含まれる。
【００３６】
本明細書に示すように、その作用機序に関してFc受容体を発現する細胞の動員に依存するペプチドを含む製剤がFc受容体と結合する能力と、それを必要とする患者に投与された時のペプチド製剤の治療効果との間には、強い相関がある。
【００３７】
製剤の効力は、特定のアッセイにおいて、治療有効性が評価されていると思われる製剤の参照標準の活性を基準とした活性の尺度である。抗体などのペプチド、とりわけFc受容体と結合することによって作用するものに関しては、本発明による方法は、ペプチドとFc受容体との結合がペプチドの作用機序の直接的な指標であることから、ペプチド製剤の効力の決定に用いるのに適している。このため、本発明による方法の使用は、IL-2の産生またはADCCの誘導の決定といった手間のかかるバイオアッセイを用いずに、FcR結合性ペプチドの効力を決定することを可能にし、この際、効力の決定は細胞を利用したアッセイにおけるFcR結合性ペプチドとFc受容体との結合の効果の測定に依存し、本発明による方法の使用は、FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合を単に測定することによって効力の決定を可能にする。
【００３８】
本発明はまた、FcR結合性ペプチドを含む製剤の効力を決定する方法であって、以下の段階を含む方法も提供する：
（i）参照標準FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合を決定する段階；
（ii）製剤のFcR結合性ペプチドと前記Fc受容体との結合を決定する段階；および
（iii）段階（ii）におけるFcR結合を段階（i）におけるFcR結合と比較し、その比較によって得られた情報を原薬の効力を評価するために用いる段階、
ここで、
（a）段階（ii）におけるFc受容体との結合は、段階（i）におけるFc受容体との結合と同じ様式で決定され、
（b）製剤のFcR結合性ペプチドの少なくとも1つの作用機序はFcR結合性ペプチドとFc受容体との結合を介しており、かつ
（c）参照標準FcR結合性ペプチドおよび製剤のFcR結合ペプチドは同じFcR結合性分子の2つの異なる調製物である。
【００３９】
この方法は、例えば、所定のFcR結合性ペプチドの生産によって得られる種々のバッチを分析するために有用である。製剤のFcR結合性ペプチドとFc受容体との結合を参照標準FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合と比較し、製剤のFcR結合性ペプチドの治療有効性を、それが参照標準FcR結合性ペプチドと同じまたは実質的に同じ度合いでFc受容体と結合する能力から評価する。参照標準FcR結合性ペプチドの効力を、例えば、参照標準FcR結合性ペプチドが実際に所望の治療活性を有することを実証するために、細胞を利用した方法またはIL-2産生の阻害などの他の方法の使用によって実証することもできる。本発明によれば、参照標準FcR結合性ペプチドのFcR結合プロフィールは参照標準FcR結合性ペプチドの効力に関する適切な指標であり、参照標準FcR結合性ペプチドと同じまたは実質的に同じFcR結合プロフィールを示す任意のFcR結合性ペプチドは、参照標準FcR結合性ペプチドと同じまたは実質的に同じ治療活性を有するとみなされる。製剤のFcR結合性ペプチドのFcR結合プロフィールと参照標準FcR結合性ペプチドのFcR結合プロフィールとが異なる度合いをケース毎に実証してもよく、例えばしかるべき規制機関と連携して決定することもできる。
【００４０】
FcR結合を信頼性および一貫性のある様式で決定することを可能とするためには、製剤のFcR結合性ペプチドおよび参照標準FcR結合性ペプチドとのFcR結合を、同じアッセイ、例えば本明細書の別の箇所に記載したようなアッセイを用いて行うべきである。FcR結合性ペプチドの以後の任意のバッチと比較することのできる基準を確立するために、典型的には、参照標準FcR結合性ペプチドの結合の決定が最初に行われる。しかし、参照標準FcR結合性ペプチドの結合の決定を、製剤のFcR結合性ペプチドとのFcRの結合の決定と同時にまたはその後に行うこともできる。
【００４１】
本発明はまた、FcR結合性ペプチドを含む薬学的組成物の生産の方法であって、以下の段階を含む方法も提供する：
（a）前記FcR結合性ペプチドを含む製剤の生産の段階；
（b）前記製剤を、FcR結合性ペプチドを含む製剤の効力を決定するための上記の方法に供する段階；および
（c）段階（b）で得られた情報を、その製剤を薬学的組成物として用いることができるか否かの評価の一部として用いる段階。
【００４２】
製剤の生産は、当該の製剤および／またはペプチドにとって望ましいおよび／または適切な任意の様式で行うことができる。続いて、製剤を、製剤のペプチドとFc受容体との結合をアッセイする方法に供する。ここで、該方法の結果は、製剤を薬学的組成物として用いることができるか否か、すなわち、患者へ注射される製剤が、その製剤の注射が行われうる国の規制当局が認めた基準を満たすか否かの指標とみなされるべきである。
【００４３】
本発明はまた、前記製剤を薬学的組成物として販売するための販売承認に関する申請の一部である、上記の方法も提供する。  
【００４４】
本発明はまた、FcR結合性ペプチドを含む製剤に関する販売承認を申請する方法であって、製剤のFcR結合性ペプチドの効力を決定するための上記の方法を記載する段階を含む方法も提供する。
【００４５】
1つの態様において、FcR結合性ペプチドを含む製剤の効力を決定するための本発明による方法は、バッチリリースのための効力アッセイとして用いられる。
【００４６】
引き続く任意の製剤生産は、結果として、医薬として発売される製品の異なるバッチの生産となる。生産における重要な特徴は、異なるバッチが同じ規格を満たすことを保証することである。この規格は典型的には、規制機関との連携の下で設定される。典型的には、販売が承認されるのに十分な品質をバッチが有することを保証するために、数多くのさまざまなアッセイによって各バッチの試験および検査を行う。そのようなアッセイの一つは、製剤が求められる効力を有することを決定するための効力アッセイであってよく、多くの場合はそうである。組換え抗体などの組換えペプチドを含む製剤の場合には、そのような効力は多くの場合、組換え的に生産されたペプチドの品質に依存する。Fc受容体との結合を介して効果を媒介する抗体の場合には、この点に関する抗体の品質は、多くの場合、抗体のFc部分のグリコシル化に依存する。しかし、抗体のFc部分のグリコシル化を決定すること、および効力を決定するための他の公知の方法、例えば、製剤がADCCを惹起する能力の測定、またはT細胞シグナル伝達の阻害（例えば、活性化マーカーのアップレギュレーションならびに／またはオートクリン因子の増殖および産生の測定）の直接的または間接的な測定といった方法は、多くの場合は、手間がかかるか、または生産工程において効率性および信頼性を伴って用いるには変動が大きい。しかし、本明細書の他の箇所に記載したように、本発明による方法は、抗体製剤の効力の決定に用いるのに適しており、したがって、バッチリリースのための効力アッセイとして用いるのに適したアッセイである。
【００４７】
1つの態様において、FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合は、以下の段階を含む方法によって決定される：
（i）製剤の試料を、FcR結合性ペプチドがFc受容体と結合するのに十分な時間にわたって、Fc受容体と接触させる段階、および
（ii）Fc受容体と結合したFcR結合性ペプチドの量を検出する段階。
【００４８】
さらなる1つの態様において、検出は、FcR結合性ペプチドを対象とする検出抗体の使用によって行われる。さらなる1つの態様において、検出抗体は標識抗体である。
【００４９】
1つの態様において、抗体などのFcR結合性ペプチドとFc受容体との結合は、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）の使用によって決定される；例えば、Margulies D.H. 199. Induction of immune responses. In Current Protocols in Immunology（Coligan, J.E., Kruisbeek, A.M., Margulies, D.H., Shevach, E.M., Strober, W., eds. pp 2.1.2-2.1.20 John Wiley & Sons, New York）を参照。
【００５０】
1つの態様において、抗体などのFcR結合性ペプチドとFc受容体との結合は、AlphaScreen（商標）アッセイの使用によって決定される。手短に述べると、FcRタンパク質を固定化するためにアクセプタービーズを用い、ドナービーズには関心対象の抗原（例えばsCD4）をコーティングする。異なるコーティング系を用いてもよく、アクセプタービーズとドナービーズは互換可能であってよい。アクセプタービーズとドナービーズは、被験抗体とFc受容体および抗原との生物学的結合の結果として近接する（約200nm未満）と考えられる。680nmで励起させると、ドナービーズ中の光感作物質は周囲酸素を一重項状態に変換させると考えられる。一重項酸素分子は拡散してアクセプター中のチオキセン誘導体と反応し、その結果として化学発光を生じる。この化学発光はアクセプタービーズ中のフルオロフォアを活性化し、それは520〜620nmの発光を引き起こす（http://www.perkinelmer.co.jp/tech/tech_ls/protocol_collection/asc-001.pdf）。
【００５１】
1つの態様において、抗体などのFcR結合性ペプチドとFc受容体との結合は、ラジオイムノアッセイの使用によって決定される（Cooper, H.M., and Paterson, Y. Determination of the specific antibody titer. In Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A, and Struhl, K, eds.) pp11.17.1-11.17.13 John Wiley & Sons, New York, 1993）。
【００５２】
1つの態様において、抗体などのFcR結合性ペプチドとFc受容体との結合は、BIAcoreアッセイによって決定される。BIAcoreは表面プラズモン共鳴（SPR）の原理によって動作し、これは表面での屈折率の変化の測定を可能にする。手短に述べると、1つの相互作用物（リガンド、例えばFc受容体）を、センサーチップの表面に固定化する。結合パートナーの可能性があるもの（製剤の抗体）を含む溶液を固定化表面の上に通過させ、結合を、表面での屈折率の経時的な変化（応答単位（RU））として可視化する（D.G. Myszka and R.L. Rich, Implementing surface plasmon resonance biosensors in drug discovery, Pharm. Sci. Technol. Today 3, 310-317 (2000)）。1つの態様において、抗体などのFcR結合性ペプチドとFc受容体との結合は、Akubio（情報については：www.akubio.com/）などの音響バイオセンサーによって決定される。
【００５３】
1つの態様において、抗体などのFcR結合性ペプチドとFc受容体との結合は、FMAT、例えばFLISA（蛍光結合免疫吸着アッセイ）の使用によって決定される。手短に述べると、ビーズを用いてFcRタンパク質を固定化し（例えば、ビオチン化-FcRを有するストレプトアビジンビーズ）、抗体を添加して、Cy5結合抗IgGを用いて検出し、それをFMATによって読み取る。異なるコーティングおよび検出の系を用いることもできる（Miraglia, S. et al, J Biomol Screen. 4, 193-204 (1999)）。
【００５４】
1つの態様において、抗体などのFcR結合性ペプチドとFc受容体との結合は、DELFIAの使用によって決定される。手短に述べると、時間分解蛍光イムノアッセイとしても知られるDELFIAアッセイでは、抗体をマイクロタイタープレートに対して捕捉させ（例えば抗ヒトIgGを用いて）、ビオチン化FcRを添加し、これを例えばEu-（ユーロピウム）標識ストレプトアビジンで検出することによってFcRの結合を測定する。増感溶液を利用した増感段階を用い、その後にDelfia用蛍光光度計、例えばVICTOR装置を用いて計数する。VICTOR装置は、タンパク質の直接定量のために必要な蛍光法、ルミネセンス法、時間分解蛍光法、蛍光偏光法、およびUV吸光法を含む、広範囲にわたる技術を用いて動作する。多くのオプションおよび組み合わせを用いることができる。細胞および微生物アッセイ、結合試験、ならびにDELFIAアッセイ用の発光性または吸光性マーカーの定量的検出のためのVICTOR3多重標識マイクロプレートリーダー（http://www.gmi-inc.com/BioTechLab/Wallac%20Delfia%201234%20Fluorometer.htm）。
【００５５】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を誘導することである。ADCCとは、抗体などのFcR結合性ペプチドが、標的細胞を覆うことにより、それらがNK細胞、PMN、または単球／マクロファージを非限定的に含む免疫細胞による溶解の誘導を受けやすくなるようにする免疫応答のことである。
【００５６】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、すなわち、内部取込み、剥奪（stripping）、キャッピング、またはFcR架橋に影響を及ぼす細胞表面上の受容体の再編成を他の形態で変化させることを介して、標的受容体のダウンモジュレーションを誘導することである。
【００５７】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、ナチュラルキラー細胞の動員を介する。ナチュラルキラー細胞（NK細胞）は、別の細胞に対して、それに対する事前の感作がなくても反応して、それを破壊することができる細胞であり、一定の状況下では特異的な抗原を認識する必要がない。しかし、NK細胞を、その抗原結合ドメインが標的細胞上の抗原と結合している抗体Fc領域によって、ADCCを誘導するように活性化することもできる。
【００５８】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、NK細胞によるADCCの誘導を介する。 
【００５９】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などが、インビボで結合するFc受容体の少なくとも1つは、NK細胞上に発現される。
【００６０】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、多形核白血球（PMN）の動員を介する。
【００６１】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、PMNによるADCCの誘導を介する。
【００６２】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、PMN脱顆粒の誘導を介する。
【００６３】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、PMNによる食作用の誘導を介する。
【００６４】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などが、インビボで結合するFc受容体の少なくとも1つは、PMN上に発現される。
【００６５】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、血小板凝集を誘導することである。
【００６６】
本発明の1つの態様において、FcR結合性ペプチドの作用機序は、血小板の動員を介する。
【００６７】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などが、インビボで結合するFc受容体の少なくとも1つは、血小板上に発現される。
【００６８】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、サイトカイン産生を誘導することである。
【００６９】
1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの治療活性は、ナチュラルキラー細胞および／またはT細胞の動員を介する。
【００７０】
1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などが、インビボで結合するFc受容体の少なくとも1つは、ナチュラルキラー細胞および／またはT細胞上に発現される。
【００７１】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、免疫複合体の排除を誘導することである。
【００７２】
1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、単球またはマクロファージの動員を介する。
【００７３】
1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などが、インビボで結合するFc受容体の少なくとも1つは、単球またはマクロファージ上に発現される。
【００７４】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、抗体応答のダウンレギュレーションを誘導することである。
【００７５】
1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、B細胞の動員を介する。
【００７６】
1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などが、インビボで結合するFc受容体の少なくとも1つは、B細胞上に発現される。
【００７７】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、単球およびマクロファージのエフェクター機能の阻害を誘導することである。
【００７８】
1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、単球および／またはマクロファージの動員を介する。
【００７９】
1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などが、インビボで結合するFc受容体の少なくとも1つは、単球および／またはマクロファージ上に発現される。
【００８０】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、単球またはマクロファージによるADCCの誘導を介する。
【００８１】
1つの態様において、FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つは、単球および／またはマクロファージ上に発現される。
【００８２】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、食作用を誘導することである。
【００８３】
1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、多形核白血球、マクロファージ、および／または樹状細胞の動員を介する。
【００８４】
1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などが、インビボで結合するFc受容体の少なくとも1つは、多形核白血球、マクロファージ、および／または樹状細胞上に発現される。
【００８５】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、単球またはマクロファージによる食作用の誘導を介する。
【００８６】
1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などが、インビボで結合するFc受容体の少なくとも1つは、単球またはマクロファージ上に発現される。
【００８７】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、架橋を誘導することである。
【００８８】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、細胞および／または抗体の架橋を介する。
【００８９】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフを介した正のシグナル伝達を誘導することである。
【００９０】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、骨髄性細胞、T細胞、および／または血小板の動員を介する。
【００９１】
1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などが、インビボで結合するFc受容体の少なくとも1つは、骨髄性細胞、T細胞、および／または血小板上に発現される。
【００９２】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、共通のγ、β、ζ鎖を介した正のシグナル伝達を誘導することである。
【００９３】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、骨髄性細胞、多形核白血球、ナチュラルキラー細胞、またはT細胞の動員を介する。
【００９４】
1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などが、インビボで結合するFc受容体の少なくとも1つは、骨髄性細胞、多形核白血球、ナチュラルキラー細胞、またはT細胞上に発現される。
【００９５】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、免疫受容体チロシンベース抑制モチーフを介した負のシグナル伝達を誘導することである。
【００９６】
本発明の1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などの作用機序は、B細胞、マクロファージ、および／または単球の動員を介する。
【００９７】
1つの態様において、製剤のFcR結合性ペプチド、例えば抗体などが、インビボで結合するFc受容体の少なくとも1つは、B細胞、マクロファージ、および／または単球上に発現される。
【００９８】
1つの態様において、Fc受容体は、FcγRIa受容体、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片、例えば細胞外ドメインである。FcγRIa受容体は、細網内皮系の細胞上、ならびに単球、マクロファージ、および樹状細胞を含む単核食細胞上に構成的に発現されており、多形核好中球上に誘導することもできる。
【００９９】
1つの態様において、Fc受容体は、FcγRIIa受容体、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片、例えば細胞外ドメインである。FcγRIIa受容体は、FcγRII受容体のいくつかの公知のアイソフォームの中の一つである。FcγRIIaは最も広く分布しているアイソタイプであり、血小板を含む、事実上すべての骨髄性細胞上に発現される。
【０１００】
1つの態様において、Fc受容体は、FcγRIIb受容体、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片、例えば細胞外ドメインである。FcγRIIb受容体の発現は食細胞およびB細胞に限定される。
【０１０１】
1つの態様において、Fc受容体は、FcγRIIc受容体、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片、例えば細胞外ドメインである。FcγRIIc受容体はNK細胞上に発現される。
【０１０２】
1つの態様において、Fc受容体は、FcγRIIIa受容体、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片、例えば細胞外ドメインである。さらなる1つの態様において、FcγRIII受容体は、FcγRIIIa176V受容体、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片、例えば細胞外ドメインである。FcγRIIIa受容体は、FcγRIII受容体の2種類の公知のアイソフォームの中の一つである。FcγRIIIaは、単球、マクロファージ、NK細胞、およびγ／δ T細胞上に存在する。FcγRIIIaの遺伝子多型は176位に存在する（PheまたはVal）。この変異体であるFcγRIIIa176V（プロセシングを受けた成熟タンパク質の予想開始部から数えた場合にはFcγRIII158Vとも呼ばれる）は、Koene HR et al., Blood 90, 1109-1114 (1997)およびWu J, et al., J Clin Invest. 100, 1059-1070 (1997)に記載されている。
【０１０３】
1つの態様において、Fc受容体は、FcγRIIIb NA1受容体、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片、例えば細胞外ドメインである。1つの態様において、Fc受容体は、FcγRIIIb NA2受容体、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片、例えば細胞外ドメインである。FcγRIIIb受容体は、好中球上に構成的に発現されており、好酸球上に誘導することもできる。
【０１０４】
1つの態様において、Fc受容体は、FcγRn受容体、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片、例えば細胞外ドメインである。FcγRn受容体は広く分布しており、内皮細胞上に発現される。
【０１０５】
本発明の1つの態様において、本発明による方法に用いるためのFc受容体は1つの調製方法によって調製されており、その調製方法は1つの段階を含み、その段階は、そのような段階を含まない調製方法によって調製された同様のFc受容体と比較して、N結合型グリコシル化上のシアル酸の量が減少したFc受容体をもたらす。
【０１０６】
そのような脱シアリル化は、さまざまなやり方で実現することができる。Fc受容体は例えば、シアリル化の原因となる機序に欠陥のある宿主細胞における組換え発現によって調製することができる。そのような、シアリル化に欠陥のある細胞における、通常はある程度のシアル酸グリコシル化と考えられるポリペプチドの発現は、それ以外の点では同じ種類である、シアリル化に欠陥のない細胞（シアリル化の機序に欠陥のない細胞）において発現されたポリペプチドと比べて、N結合型グリコシル化上のシアル酸がより少ないポリペプチド産物をもたらすと考えられる。シアリル化に欠陥のある細胞の例には、例えば、シアリルトランスフェラーゼの発現に欠陥のある細胞（その例にはCHO Lec2細胞がある）、シアリル化のアクセプターとなる単糖、例えばガラクトースなどの発現に欠陥のある細胞（例えば、CHO Lec1細胞およびCHO Lecl9細胞）、またはシアル酸の合成に関与する酵素、例えばUDP-GlcNAc-2エピメラーゼなどの発現に欠陥のある細胞（例えば、CHO Lec3細胞）が含まれる。RNAiなどの他の干渉手法を、シアル酸の合成に関与する酵素（例えば、UDP-GlcNAc-2エピメラーゼ）、シアリル化それ自体に関与する酵素（例えば、α2,3-シアリルトランスフェラーゼまたはα2,6-シアリルトランスフェラーゼ）、またはシアル酸アクセプターであるガラクトースを含む複合型のN結合型グリカンの合成に関与する酵素（例えばN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼI）の発現に欠陥のある細胞を作製するために用いることもできる。このような手法は、SP2/0、CHO、BHK、HEK-293、NSO、JURKATなどを含む、種々の細胞に対して適用されている。あるいは、N結合型グリカンを付加しない（細菌）またはシアル酸をN結合型グリカンに付加しない（真菌または酵母での発現がそうである）細胞である、細菌細胞、酵母細胞、または真菌細胞において、タンパク質を発現させることもできる。
【０１０７】
また、例えばシアリル化に欠陥のない細胞における組換え発現の結果として生じた、N結合型グリコシル化上にシアル酸を有するFc受容体を、例えば前記方法における使用の前に、シアリダーゼによる処理などによる、シアル酸の量を減少させる方法の使用によって脱シアリル化することもできる。そのようなシアリダーゼの例には、例えば、アルスロバクター-ウレアファシエンス（Arhrobacter ureafaciens）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、コレラ菌（Vibrio Cholera）、ニューカッスル病ウイルス、ヒッチナー（Hitchner）B1株、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、またはウェルシュ菌（Clostridium perfringens）由来のノイラミニダーゼがある。このような酵素は、それらの内因性の源から、または大腸菌などの他の宿主における組換え発現の後に入手することができる。脱シアリル化の段階は、脱シアリル化に欠陥のない細胞における受容体の発現後にそのまま、すなわち精製の前に行うことができる。あるいは、脱シアリル化を、精製のために用いる樹脂に受容体を結合させた時点で、または受容体の精製の後に行うこともできる。あるいは、シアリダーゼのDNA配列を含む発現プラスミドを、受容体をコードする発現プラスミドとともに同時トランスフェクトしてもよく、その場合には、トランスフェクトされた細胞がノイラミニダーゼおよび受容体の両方を高レベルで分泌し、組換え的に産生されたシアリダーゼによるインサイチューでの受容体の脱シアリル化が生じると考えられる。
【０１０８】
シアリル化に欠陥のない細胞における組換え発現の結果として生じたFc受容体を、精製時に、シアル酸を含む画分とシアル酸を含まない画分に分離することもできる。このような分離は、MAA（イヌエンジュ（Maackia amurensis）凝集素）およびSNA（セイヨウニワトコ（Sambucus nigra）I凝集素）といった、シアル酸に対して特異的なレクチンを用いて行うことができる。また、分離を、例えばDAEAセファロース、Sepharose Q、またはResource Qを用いる陰イオン交換クロマトグラフィーを利用して行うこともできる。
【０１０９】
また、WO 9639488に記載されたように、受容体を発現する細胞を培養し、酪酸ナトリウムなどのアルカン酸を細胞培養物に添加することによって、Fc受容体を脱シアリル化することもできる。
【０１１０】
本発明の1つの態様において、FcR結合性ペプチドは抗体である。
【０１１１】
本発明の1つの態様において、FcR結合性ペプチドはモノクローナル抗体である。
【０１１２】
本発明の1つの態様において、抗体は二重特異性抗体である。
【０１１３】
本発明の1つの態様において、抗体は、少なくともFc結合部分を含むIgG様分子である。
【０１１４】
本明細書で用いるモノクローナル抗体とは、単一の分子組成を有する抗体分子の調製物のことを指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有し、単一の結合特異性を示す抗体のことを指す。ヒトモノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物または染色体移入された（transchromosomal）非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたB細胞を不死化細胞と融合させたものを含むハイブリドーマによって産生される。
【０１１５】
1つの態様において、製剤の抗体はヒト抗体である。
【０１１６】
ヒト抗体とは、本明細書で用いる場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図している。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってはコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的な突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含みうる。しかし、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で用いる場合、マウスなどの哺乳動物種の生殖系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含むことは意図していない。
【０１１７】
本明細書で用いる場合、ヒト抗体は、その抗体が、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを免疫処置することによって、またはヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって、ヒト免疫グロブリン配列を用いて系から得られ、かつ、選択されたヒト抗体が、生殖系列VHまたはVL可変領域遺伝子セグメントによってコードされるアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列に関する同一性が少なくとも90％である、例えば少なくとも95％などである、例えば少なくとも96％、例えば少なくとも97％などである、例えば少なくとも98％、例えば少なくとも99％などである場合に、特定の生殖系列配列に「由来する」という。典型的には、特定のヒト生殖系列VHまたはVL可変領域遺伝子セグメント配列に由来するヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して、10アミノ酸を上回る違いを示さない、例えば、5アミノ酸を上回るというような違い、例えば4、3、2、または1アミノ酸を上回る違いを示さないと考えられる。
【０１１８】
1つの態様において、製剤の抗体はヒト化抗体である。
【０１１９】
ヒト化抗体とは、非ヒト種に由来する抗体であって、ヒトにおける免疫応答を回避または無効化するように重鎖および軽鎖のフレームワークドメインおよび定常ドメイン内のいくつかのアミノ酸が突然変異している抗体のことである。ヒト化型の非ヒト種（例えば、ネズミ科動物）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む。大部分においてヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、その中で、レシピエントの超可変領域由来の残基が、特異性、親和性といった所望の抗原結合特性を有するマウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長動物などの非ヒト種の超可変領域由来の残基（ドナー抗体）によって置き換えられている。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク（FR）残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体が、レシピエント抗体にもドナー抗体にも認められない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗原結合性をさらに最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含むと考えられ、その中の超可変ループのすべてまたは実質的にすべては非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR領域のすべてまたは実質的にすべてはヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、任意で、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれをも含むと考えられる。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986), Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988)およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596 (1992)を参照されたい。
【０１２０】
ヒト化抗体にはまた、ヒトFRへの非ヒト由来CDRのCDR移植がCDR修復を用いて行われるような抗体も含まれる（Mark Dennis, Genentech、Twelvth International conference on Human Antibodies  and Hybridomas, 10-12 May 2006, San Diego, USAで提示）。
【０１２１】
1つの態様において、製剤の抗体はキメラ抗体である。
【０１２２】
典型的には、キメラ抗体とは、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であり、鎖の残りの部分が、別の種に由来する、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにそのような抗体の断片における対応する配列と同一または相同であって、さらにそれらが所望の生物活性を示すような抗体のことを指す（例えば、US 4,816,567およびMorrison et al., PNAS USA 81，6851-6855 (1984)を参照）。キメラ抗体は、当技術分野において周知の組換え工程によって作製される（例えば、Cabilly et al., PNAS USA 81, 3273-3277 (1984), Morrison et al., PNAS USA 81, 6851-6855 (1984), Boulianne et al., Nature 312, 643-646 (1984), EP 125023、Neuberger et al., Nature 314, 268-270 (1985), EP 171496、EP 173494、WO 86／01533、EP 184187、Sahagan et al., J. Immunol. 137, 1066-1074 (1986), WO 87／02671、Liu et al., PNAS USA 84, 3439-3443 (1987), Sun et al., PNAS USA 84, 214-218 (1987), Better et al., Science 240, 1041-1043 (1988)およびHarlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)を参照のこと）。
【０１２３】
1つの態様において、抗体は一価抗体または多価抗体の形式を含む。この抗体形式は単量体であってもよく、これはH鎖がジスルフィド結合によってL鎖と会合して形成された二量体（HL）のことを意味する。通常の抗体は二価であり、2つのHL二量体が少なくとも1つのジスルフィド結合によって会合して形成された四量体（H2L2）である。多価抗体を、例えば、凝集するCH領域（例えば、IgM H鎖、またはμ鎖からのもの）を使用することによって作製することもできる。そのような抗体はキメラであってもよく、または1つの種に由来してもよい。
【０１２４】
1つの態様において、抗体は、Fc領域内にフレームワークの変更を含み、その変更は、抗体の機能的または薬物動態学的性質を変化させるといったような有利な性質を伴う。例えば、フレームワーク領域または定常ドメインにおける置換または他の修飾（挿入、欠失、末端配列の付加、またはそれらの任意のものの組み合わせ）は、親抗体に比して変異抗体の半減期の延長を伴うことがあり、または親抗体に比して変異抗体の免疫原性を変化させるため、別の分子に対する共有的もしくは非共有的な結合のための部位を提供するため、または補体結合など性質を変化させ、例えばその結果としてC1q結合およびCDCもしくはFcγR結合および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）の増大または低下を生じさせるために、それを行うこともできる。置換を例えば、重鎖定常領域のアミノ酸残基234、235、236、237、297、318、320、および322のうちの1つまたは複数に行い、それによって、非修飾抗体と比較して、抗原に対する結合性を保ちながらエフェクター機能の変化を引き起こすことができる。US 5624821およびUS 5648260を参照。さらなる参照を以下に対して行うこともできる：WO 94／29351、WO 99／54342、WO 00／42072、WO 03／011878、WO 03／085119、WO 04／29207、WO 04／063351、WO 04／065540、WO 04／99249、WO 05／018669、WO 05／044859、US 6121022およびUS 6737056。さらに、Shields et al., J. Biol. Chem. 276, 6591-6604（2001）は、FcγRIII結合性を改良した組み合わせ変異体、例えばT256A／S298A、S298A／E333A、およびS298A／E333A／K334Aについて教示している。
【０１２５】
1つの態様において、抗体は、特定のエフェクター機能を強化するためにFc受容体に対する結合性が最適化された突然変異Fc領域を含む。
【０１２６】
1つの態様において、抗体は、特定の糖質トランスフェラーゼ（FUT-8など）の活性が欠如もしくは低下するように、または特定の糖質トランスフェラーゼを余分に含む、もしくはそれを過剰発現するように改変された細胞系において産生されたFc糖質を含む。
【０１２７】
本発明の1つの態様において、製剤の抗体はIgG1抗体である。1つの態様において、抗体はIgG1 κ抗体である。1つの態様において、抗体はIgG1 λ抗体である。
【０１２８】
本発明の1つの態様において、ペプチドは抗体であり、製剤の抗体とFc受容体との結合の決定は、製剤の抗体とその抗原との結合を決定する方法と組み合わされる。
【０１２９】
1つの態様において、製剤の抗体と抗原との結合は、以下の段階を含む方法の使用によって決定される：
（i）製剤の試料を、抗体が抗原と結合するのに十分な時間にわたって、抗原と接触させる段階、および
（ii）抗原と結合した抗体の量を検出する段階。
【０１３０】
さらなる1つの態様において、前記検出は、製剤の抗体を対象とする検出抗体の使用によって実施される。さらなる1つの態様において、前記検出抗体は標識抗体である。
【０１３１】
1つの態様において、抗体とその抗原との結合は、ELISAの使用によって決定される。1つの態様において、抗体とFc受容体との結合を決定するために用いられるELISAは、抗体とその抗原との結合を決定するためにも用いられる。
【０１３２】
1つの態様において、抗体とその抗原との結合は、AlphaScreen（商標）アッセイの使用によって決定される。1つの態様において、抗体とFc受容体との結合を決定するために用いられるAlphaScreen（商標）アッセイは、抗体とその抗原との結合を決定するためにも用いられる。
【０１３３】
1つの態様において、抗体とその抗原との結合は、ラジオイムノアッセイの使用によって決定される。1つの態様において、抗体とFc受容体との結合を決定するために用いられるラジオイムノアッセイは、抗体とその抗原との結合を決定するためにも用いられる。さらなる1つの態様において、ラジオイムノアッセイは、Fc受容体および可溶性放射性ヨウ素化抗原が結合されたビーズを用いる。
【０１３４】
前述したように、本発明による方法に用いるための抗体の抗原特異性は、抗体がFc受容体と結合する能力に影響を及ぼさない。このため、本発明の方法は、抗体の抗原特異性にかかわらず、抗体の少なくとも1つの作用機序が抗体とFc受容体との結合を介する、すべての抗体（および他のFcR結合性ペプチド）に対して有用である。しかし、いくつかの態様は、特定の抗原特異性を有する抗体を対象とする。
【０１３５】
本発明の1つの態様において、製剤の抗体は、ヒトCD4と結合する抗体である。1つの態様において、抗体は、WO 9713852に記載されたような、ヒトCD4と結合する抗体である。1つの態様において、抗体は、US 5871732に記載されたような、ヒトCD4と結合する抗体である。1つの態様において、抗体は、US 6309880またはWO 9012868に記載されたような、ヒトCD4と結合する抗体である。1つの態様において、抗体は、WO 02102853に記載されたような、ヒトCD4と結合する抗体である。1つの態様において、抗体は、US 2001051709またはWO 9110722に記載されたような、ヒトCD4と結合する抗体である。1つの態様において、抗体は、US 6056956またはUS 5670150に記載されたような、ヒトCD4と結合する抗体である。1つの態様において、抗体はザノリムマブである。1つの態様において、抗体はケリキシマブ（IDEC-CE9.1、Biogen IDEC）である。1つの態様において、抗体はクレノリキシマブ（IDEC-151、Biogen IDEC）である。1つの態様において、抗体はTNX-355（Hu-5A8、Tanox／Biogen IDEC）である。1つの態様において、抗体はTRX-1（TolerRx/Genentech）である。1つの態様において、抗体はIOT4a（13B8.2、Immunotech）、プリリキシマブ（cM-T412、Centocor）である。1つの態様において、抗体は4162W94（Glaxo Wellcome）である。
【０１３６】
本発明の1つの態様において、製剤の抗体は、ヒトEGFRと結合する抗体である。1つの態様において、抗体は、WO 9640210に記載されたような、ヒトEGFRと結合する抗体である。1つの態様において、抗体は、WO 04056847またはWO 02100348に記載されたような、ヒトEGFRと結合する抗体である。1つの態様において、抗体はセツキシマブ（Erbitux（登録商標））である。1つの態様において、抗体はザルツムマブ（HuMax-EGFR）（Genmab A/S）である。
【０１３７】
本発明の1つの態様において、製剤の抗体は、ヒトCD20と結合する抗体である。1つの態様において、抗体は、WO 94／11026に記載されたような、ヒトCD20と結合する抗体である。1つの態様において、抗体は、WO 04／035607またはWO出願 PCT／DK2005／00270に記載されたような、ヒトCD20と結合する抗体である。さらなる1つの態様において、抗体はリツキシマブ（Rituxan（登録商標）、MabThera（登録商標））である。1つの態様において、抗体はイブリツモマブチウキセタン（Zevalin（登録商標））である。1つの態様において、抗体はトシツモマブ（Bexxar（登録商標））である。1つの態様において、抗体はHuMax-CD20（オファツムマブ）（Genmab A/S）である。
【０１３８】
本発明の1つの態様において、製剤の抗体は、ヒトTAC（CD25）と結合する抗体である。1つの態様において、抗体は、WO 04／045512に記載されたような、ヒトTACと結合する抗体である。1つの態様において、抗体はHuMax-TAC（AB12）である。
【０１３９】
本発明の1つの態様において、製剤の抗体は、ヒトCD3と結合する抗体である。1つの態様において、抗体はムロモナブ（Orthoclone OKT（登録商標）3）である。
【０１４０】
本発明の1つの態様において、製剤の抗体は、ヒトGPIIb／IIIaと結合する抗体である。
【０１４１】
本発明の1つの態様において、製剤の抗体は、ヒトCD25（IL-2R）と結合する抗体である。1つの態様において、抗体はダクリズマブ（Zenapax（登録商標））である。1つの態様において、抗体はバシリキシマブ（Simulect（登録商標））である。
【０１４２】
本発明の1つの態様において、製剤の抗体は、ヒトTNF-αと結合する抗体である。1つの態様において、抗体はインフリキシマブ（Remicade（登録商標））である。1つの態様において、抗体はアダリムマブ（Humira（登録商標））である。
【０１４３】
本発明の1つの態様において、製剤の抗体は、ヒトRSVと結合する抗体である。1つの態様において、抗体はパリビズマブ（Synagis（登録商標））である。
【０１４４】
本発明の1つの態様において、製剤の抗体は、ヒトHER-2／neuと結合する抗体である。1つの態様において、抗体はトラスツズマブ（Herceptin（登録商標））である。1つの態様において、抗体はペルツズマブ（Omnitarg（商標））である。
【０１４５】
本発明の1つの態様において、製剤の抗体は、ヒトCD33と結合する抗体である。
【０１４６】
本発明の1つの態様において、製剤の抗体は、ヒトCD52と結合する抗体である。1つの態様において、抗体はアレムツズマブ（Campath-1H（登録商標））である。
【０１４７】
本発明の1つの態様において、製剤の抗体は、ヒトVEGFと結合する抗体である。1つの態様において、抗体はベバシズマブ（Avastin（登録商標））である。
【０１４８】
本発明の1つの態様において、製剤の抗体は、ヒトCTLA4と結合する抗体である。1つの態様において、抗体はMDX-010（Medarex, Inc.）である。
【０１４９】
本発明はまた、FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合を決定する方法に用いるための前記Fc受容体の調製の方法であって、前記Fc受容体が1つの段階を含む方法によって調製されており、その段階が、その段階を含まない方法によって調製された同様のFc受容体と比較して、N結合型グリコシル化上のシアル酸の量が減少したFc受容体をもたらすような方法も提供する。
【０１５０】
1つの態様において、FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合は、以下の段階を含む方法によって決定される：
（i）FcR結合性ペプチドを、FcR結合性ペプチドがFc受容体と結合するのに十分な時間にわたって、Fc受容体と接触させる段階、および
（ii）Fc受容体と結合したFcR結合性ペプチドの量を検出する段階。
【０１５１】
1つの態様において、検出は、FcR結合性ペプチドを対象とする検出抗体の使用によって行われる。さらなる1つの態様において、検出抗体は標識抗体である。
【０１５２】
1つの態様において、FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合は、ELISAの使用によって決定される。
【０１５３】
1つの態様において、FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合は、AlphaScreen（商標）アッセイの使用によって決定される。
【０１５４】
1つの態様において、FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合は、ラジオイムノアッセイの使用によって決定される。
【０１５５】
1つの態様において、FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合は、Biacoreアッセイの使用によって決定される。
【０１５６】
1つの態様において、FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合は、FMATの使用によって決定される。
【０１５７】
1つの態様において、FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合は、DELFIAの使用によって決定される。
【０１５８】
本発明はまた、ポリペプチド分子によってコーティングされるのに適したプラスチック部材（plastic member）であって、プラスチック部材の表面に対するポリペプチド分子の付着が、少なくとも部分的には、ポリペプチド分子とプラスチック部材の表面との間の静電相互作用に依存し、プラスチック部材の表面が脱シアリル化ポリペプチドによってコーティングされている、プラスチック部材も提供する。
【０１５９】
1つの態様において、ポリペプチド分子はFc受容体である。Fc受容体の例は、本明細書の別の箇所に記載されている。
【０１６０】
1つの態様において、プラスチック部材は、96ウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイタープレート、または例えばGreinerプレートなどの当技術分野で周知の類似のプレートである。
【０１６１】
1つの態様において、コーティングされたプラスチック部材は、FcR結合性ペプチドを含む製剤の効力を決定するための本発明による方法に用いるのに適している。
【０１６２】
1つの態様において、コーティングされたプラスチック部材は、FcR結合性ペプチドを含む製剤の効力を決定するための本発明による方法に用いられる。
【０１６３】
以下は、本発明の選択された態様の一覧である。
【０１６４】
態様1
FcR結合性ペプチドを含む製剤の効力を決定する方法であって、製剤のFcR結合性ペプチドの少なくとも1つの作用機序が製剤のFcR結合性ペプチドとFc受容体との結合を介している、製剤のFcR結合性ペプチドとFc受容体との結合を決定する段階を含む方法。
【０１６５】
態様2
FcR結合性ペプチドを含む製剤の効力を決定するための、態様1記載の方法であって、以下の段階を含む方法：
（i）参照標準FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合を決定する段階；
（ii）製剤のFcR結合性ペプチドと前記Fc受容体との結合を決定する段階；および
（iii）段階（ii）におけるFcR結合を段階（i）におけるFcR結合と比較し、その比較によって得られた情報を原薬の効力を評価するために用いる段階、
ここで、
（a）段階（ii）におけるFc受容体との結合は、段階（i）におけるFc受容体との結合と同じ様式で決定され、
（b）製剤のFcR結合性ペプチドの少なくとも1つの作用機序はFcR結合性ペプチドとFc受容体との結合を介しており、かつ
（c）参照標準FcR結合性ペプチドおよび製剤のFcR結合ペプチドは同じFcR結合性分子の2つの異なる調製物である。
【０１６６】
態様3
FcR結合性ペプチドを含む薬学的組成物を生産する方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）前記FcR結合性ペプチドを含む製剤の生産の段階；
（b）前記製剤を、FcR結合性ペプチドを含む製剤の効力を決定するための態様1または態様2記載の方法に供する段階；および
（c）段階（b）で得られた情報を、その製剤を薬学的組成物として用いることができるか否かの評価の一部として用いる段階。
【０１６７】
態様4
製剤を薬学的組成物として販売するための販売承認に関する申請の一部である、態様1〜3のいずれか記載の方法。
【０１６８】
態様5
FcR結合性ペプチドを含む製剤に関する販売承認を申請する方法であって、製剤のFcR結合性ペプチドの効力を決定するための態様1〜4のいずれか記載の方法を記載する段階を含む方法。
【０１６９】
態様6
FcR結合性ペプチドを含む製剤の効力を決定する方法が、バッチリリースのための効力アッセイとして用いられる、態様1〜5のいずれか記載の方法。
【０１７０】
態様7
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合が、以下の段階を含む方法によって決定される、態様1〜6のいずれか記載の方法：
（i）製剤の試料を、FcR結合性ペプチドがFc受容体と結合するのに十分な時間にわたって、Fc受容体と接触させる段階、および
（ii）Fc受容体と結合したFcR結合性ペプチドの量を検出する段階。
【０１７１】
態様8
検出が、FcR結合性ペプチドを対象とする検出抗体の使用によって行われる、態様7記載の方法。
【０１７２】
態様9
検出抗体が標識抗体である、態様8記載の方法。
【０１７３】
態様10
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がELISAの使用によって決定される、態様1〜9のいずれか記載の方法。
【０１７４】
態様11
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がAlphaScreen（商標）アッセイの使用によって決定される、態様1〜6のいずれか記載の方法。
【０１７５】
態様12
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がラジオイムノアッセイの使用によって決定される、態様1〜6のいずれか記載の方法。
【０１７６】
態様13
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がBiacoreアッセイの使用によって決定される、態様1〜6のいずれか記載の方法。
【０１７７】
態様14
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がFMATの使用によって決定される、態様1〜6のいずれか記載の方法。
【０１７８】
態様15
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がDELFIAの使用によって決定される、態様1〜6のいずれか記載の方法。
【０１７９】
態様16
FcR結合性ペプチドの作用機序が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を誘導することまたは標的受容体のダウンモジュレーションによるものである、態様1〜15のいずれか記載の方法。
【０１８０】
態様17
FcR結合性ペプチドの作用機序がADCCの誘導を介する、態様1〜15のいずれか記載の方法。
【０１８１】
態様18
FcR結合性ペプチドの作用機序がナチュラルキラー細胞の動員を介する、態様1〜17のいずれか記載の方法。
【０１８２】
態様19
FcR結合性ペプチドの作用機序がナチュラルキラー細胞によるADCCの誘導を介する、態様1〜18のいずれか記載の方法。
【０１８３】
態様20
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つがナチュラルキラー細胞上に発現される、態様1〜19のいずれか記載の方法。
【０１８４】
態様21
Fc受容体が、FcγRIIIa受容体、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、態様17〜20のいずれか記載の方法。
【０１８５】
態様22
FcγRIII受容体が、FcγRIIIa176V受容体、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片、例えば細胞外ドメインである、態様21記載の方法。
【０１８６】
態様23
FcR結合性ペプチドの作用機序が多形核白血球の動員を介する、態様1〜17のいずれか記載の方法。
【０１８７】
態様24
FcR結合性ペプチドの作用機序が多形核白血球によるADCCの誘導を介する、態様1〜23のいずれか記載の方法。
【０１８８】
態様25
FcR結合性ペプチドの作用機序がPMN脱顆粒の誘導を介する、態様1〜24のいずれか記載の方法。
【０１８９】
態様26
FcR結合性ペプチドの作用機序が多形核白血球による食作用の誘導を介する、態様1〜25のいずれか記載の方法。
【０１９０】
態様27
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つが多形核白血球上に発現される、態様1〜17のいずれかまたは態様23〜26のいずれか記載の方法。
【０１９１】
態様28
Fc受容体が、FcγRIIa受容体、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、態様23〜27のいずれか記載の方法。
【０１９２】
態様29
FcR結合性ペプチドの作用機序が単球またはマクロファージによるADCCの誘導を介する、態様1〜17のいずれか記載の方法。
【０１９３】
態様30
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つが単球および／またはマクロファージ上に発現される、態様1〜17または態様29のいずれか記載の方法。
【０１９４】
態様31
Fc受容体が、FcγRIIb、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、態様1〜17、態様29、または態様30のいずれか記載の方法。
【０１９５】
態様32
FcR結合性ペプチドの作用機序が血小板凝集を誘導することである、態様1〜17のいずれか記載の方法。
【０１９６】
態様33
FcR結合性ペプチドの作用機序が血小板の動員を介する、態様1〜17または態様32のいずれか記載の方法。
【０１９７】
態様34
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つが血小板上に発現される、態様1〜17、態様32、または態様33のいずれか記載の方法。
【０１９８】
態様35
Fc受容体が、FcγRIIa、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、態様1〜17または態様32〜34のいずれか記載の方法。
【０１９９】
態様36
FcR結合性ペプチドの作用機序がサイトカイン産生を誘導することである、態様1〜17のいずれか記載の方法。
【０２００】
態様37
FcR結合性ペプチドの作用機序がナチュラルキラー細胞および／またはT細胞の動員を介する、態様1〜17または態様36のいずれか記載の方法。
【０２０１】
態様38
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つがナチュラルキラー細胞および／またはT細胞上に発現される、態様1〜17、態様36、または態様37のいずれか記載の方法。
【０２０２】
態様39
Fc受容体が、FcγRIa、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、態様1〜17のいずれかまたは態様36〜38のいずれか記載の方法。
【０２０３】
態様40
Fc受容体が、FcγRIIIa、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、態様1〜17のいずれかまたは態様36〜38のいずれか記載の方法。
【０２０４】
態様41
FcR結合性ペプチドの作用機序が免疫複合体の排除を誘導することである、態様1〜17のいずれか記載の方法。
【０２０５】
態様42
FcR結合性ペプチドの作用機序が単球またはマクロファージの動員を介する、態様1〜17または態様41のいずれか記載の方法。
【０２０６】
態様43
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つが単球またはマクロファージ上に発現される、態様1〜17、態様41、または態様42のいずれか記載の方法。
【０２０７】
態様44
Fc受容体が、FcγRIII、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、態様1〜17のいずれかまたは態様41〜43のいずれか記載の方法。
【０２０８】
態様45
Fc受容体が、FcγRIIIa、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、態様1〜17のいずれかまたは態様41〜43のいずれか記載の方法。
【０２０９】
態様46
Fc受容体が、FcγRIIIb、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、態様1〜17のいずれかまたは態様41〜43のいずれか記載の方法。
【０２１０】
態様47
FcR結合性ペプチドの作用機序が抗体応答のダウンレギュレーションを誘導することである、態様1〜17のいずれか記載の方法。
【０２１１】
態様48
FcR結合性ペプチドの作用機序がB細胞の動員を介する、態様1〜17または態様47のいずれか記載の方法。
【０２１２】
態様49
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つがB細胞上に発現される、態様1〜17、態様47、または態様48のいずれか記載の方法。
【０２１３】
態様50
Fc受容体が、FcγRIIb、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、態様1〜17のいずれかまたは態様47〜49のいずれか記載の方法。
【０２１４】
態様51
FcR結合性ペプチドの作用機序が単球およびマクロファージのエフェクター機能の阻害を誘導することである、態様1〜17のいずれか記載の方法。
【０２１５】
態様52
FcR結合性ペプチドの作用機序が単球および／またはマクロファージの動員を介する、態様1〜17または態様51のいずれか記載の方法。
【０２１６】
態様53
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つが単球および／またはマクロファージ上に発現される、態様1〜17、態様51、または態様52のいずれか記載の方法。
【０２１７】
態様54
FcR結合性ペプチドの作用機序が食作用を誘導することである、態様1〜17のいずれか記載の方法。
【０２１８】
態様55
FcR結合性ペプチドの作用機序が多形核白血球、マクロファージ、および／または樹状細胞の動員を介する、態様1〜17または態様54のいずれか記載の方法。
【０２１９】
態様56
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つが多形核白血球、マクロファージ、および／または樹状細胞上に発現される、態様1〜17、態様54、または態様55のいずれか記載の方法。
【０２２０】
態様57
Fc受容体が、FcγRIIIb、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、態様1〜17のいずれかまたは態様54〜56のいずれか記載の方法。
【０２２１】
態様58
Fc受容体が、FcγRIIa、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、態様1〜17のいずれかまたは態様54〜56のいずれか記載の方法。
【０２２２】
態様59
FcR結合性ペプチドの作用機序が単球またはマクロファージによる食作用の誘導を介する、態様1〜17または態様54のいずれか記載の方法。
【０２２３】
態様60
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つが単球またはマクロファージ上に発現される、態様1〜17または態様59のいずれか記載の方法。
【０２２４】
態様61
Fc受容体が、FcγRIIb、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、態様1〜17、態様59、または態様60のいずれか記載の方法。
【０２２５】
態様62
FcR結合性ペプチドの作用機序が架橋を誘導することである、態様1〜17のいずれか記載の方法。
【０２２６】
態様63
FcR結合性ペプチドの作用機序が細胞および／または抗体の架橋を介する、態様1〜17または態様62のいずれか記載の方法。
【０２２７】
態様64
Fc受容体が、FcγRIa、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、態様1〜17、態様54、または態様63のいずれか記載の方法。
【０２２８】
態様65
Fc受容体が、FcγRII、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、態様1〜17、態様54、または態様63のいずれか記載の方法。
【０２２９】
態様66
Fc受容体が、FcγRIII、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、態様1〜17、態様54、または態様63のいずれか記載の方法。
【０２３０】
態様67
FcR結合性ペプチドの作用機序が、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフを介した正のシグナル伝達を誘導することである、態様1〜17のいずれか記載の方法。
【０２３１】
態様68
FcR結合性ペプチドの作用機序が骨髄性細胞、T細胞、および／または血小板の動員を介する、態様1〜17または態様67のいずれか記載の方法。
【０２３２】
態様69
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つが骨髄性細胞、T細胞、および／または血小板上に発現される、態様1〜17、態様67、または態様68のいずれか記載の方法。
【０２３３】
態様70
Fc受容体が、FcγRIIa、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、態様1〜17のいずれかまたは態様67〜69のいずれか記載の方法。
【０２３４】
態様71
Fc受容体が、FcγRIIc、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、態様1〜17のいずれかまたは態様67〜69のいずれか記載の方法。
【０２３５】
態様72
FcR結合性ペプチドの作用機序が、共通のγ、β、ζ鎖を介した正のシグナル伝達を誘導することである、態様1〜17のいずれか記載の方法。
【０２３６】
態様73
FcR結合性ペプチドの作用機序が骨髄性細胞、多形核白血球、ナチュラルキラー細胞、またはT細胞の動員を介する、態様1〜17または態様72のいずれか記載の方法。
【０２３７】
態様74
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つが骨髄性細胞、多形核白血球、ナチュラルキラー細胞、またはT細胞上に発現される、態様1〜17、態様72、または態様73のいずれか記載の方法。
【０２３８】
態様75
Fc受容体が、FcγRIa、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、態様1〜17のいずれかまたは態様72〜74のいずれか記載の方法。
【０２３９】
態様76
Fc受容体が、FcγRIIa、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、態様1〜17のいずれかまたは態様72〜74のいずれか記載の方法。
【０２４０】
態様77
Fc受容体が、FcγRIIIa、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、態様1〜17のいずれかまたは態様72〜74のいずれか記載の方法。
【０２４１】
態様78
FcR結合性ペプチドの作用機序が、免疫受容体チロシンベース抑制モチーフを介した負のシグナル伝達を誘導することである、態様1〜17のいずれか記載の方法。
【０２４２】
態様79
FcR結合性ペプチドの作用機序がB細胞、マクロファージ、および／または単球の動員を介する、態様1〜17または態様78のいずれか記載の方法。
【０２４３】
態様80
FcR結合性ペプチドがインビボで結合するFc受容体の少なくとも1つがB細胞、マクロファージ、および／または単球上に発現される、態様1〜17、態様78、または態様79のいずれか記載の方法。
【０２４４】
態様81
Fc受容体が、FcγRIIb、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、態様1〜17のいずれかまたは態様78〜80のいずれか記載の方法。
【０２４５】
態様82
Fc受容体が、FcγRn、またはFc領域と結合する能力を保っているその断片である、態様1〜17のいずれか記載の方法。
【０２４６】
態様83
方法に用いるためのFc受容体が1つの段階を含む調製方法によって調製されており、その段階が、そのような段階を含まない調製方法によって調製された同様のFc受容体と比較して、N結合型グリコシル化上のシアル酸の量が減少したFc受容体をもたらす、態様1〜82のいずれか記載の方法。
【０２４７】
態様84
Fc受容体が、シアリル化の原因となる機序に欠陥のある宿主細胞において発現される、態様83記載の方法。
【０２４８】
態様85
Fc受容体が、方法に用いられる前にシアリダーゼで処理されている、態様83記載の方法。
【０２４９】
態様86
FcR結合性ペプチドが抗体である、態様1〜85のいずれか記載の方法。
【０２５０】
態様87
FcR結合性ペプチドがモノクローナル抗体である、態様86記載の方法。
【０２５１】
態様88
FcR結合性ペプチドがヒト抗体である、態様86または態様87記載の方法。
【０２５２】
態様89
FcR結合性ペプチドがヒト化抗体である、態様86または態様87記載の方法。
【０２５３】
態様90
FcR結合性ペプチドがキメラ抗体である、態様86または態様87記載の方法。
【０２５４】
態様91
FcR結合性ペプチドがFc結合部分を含む抗体フラグメントである、態様86〜90のいずれか記載の方法。
【０２５５】
態様92
FcR結合性ペプチドがIgG1抗体である、態様86〜91のいずれか記載の方法。
【０２５６】
態様93
FcR結合性ペプチドがIgG1 λ抗体である、態様92記載の方法。
【０２５７】
態様94
FcR結合性ペプチドがIgG1 κ抗体である、態様92記載の方法。
【０２５８】
態様95
抗体とFc受容体との結合の決定が、抗体とその抗原との結合を決定する方法と組み合わされる、態様86〜94のいずれか記載の方法。
【０２５９】
態様96
抗体とその抗原との結合が、以下の段階を含む方法によって決定される、態様95記載の方法：
（i）抗体の試料を、抗体が抗原と結合するのに十分な時間にわたって、抗原と接触させる段階、および
（ii）抗原と結合した抗体の量を検出する段階。
【０２６０】
態様97
検出が、製剤の抗体を対象とする検出抗体の使用によって行われる、態様96記載の方法。
【０２６１】
態様98
検出抗体が標識抗体である、態様97記載の方法。
【０２６２】
態様99
抗体とその抗原との結合がELISAの使用によって決定される、態様95〜98のいずれか記載の方法。
【０２６３】
態様100
同じELISAが、抗体とFc受容体との結合を決定するためにも用いられる、態様99記載の方法。
【０２６４】
態様101
抗体とその抗原との結合がAlphaScreen（商標）アッセイの使用によって決定される、態様95記載の方法。
【０２６５】
態様102
AlphaScreen（商標）アッセイが、抗体とFc受容体との結合を決定するためにも用いられる、態様101記載の方法。
【０２６６】
態様103
抗体とその抗原との結合がラジオイムノアッセイの使用によって決定される、態様95記載の方法。
【０２６７】
態様104
ラジオイムノアッセイが、抗体とFc受容体との結合を決定するためにも用いられる、態様103記載の方法。
【０２６８】
態様105
ラジオイムノアッセイが、Fc受容体および放射性ヨウ素化抗原が結合されたビーズを用いる、態様104記載の方法。
【０２６９】
態様106
FcR結合性ペプチドがヒトCD4と結合する抗体である、態様86〜105のいずれか記載の方法。
【０２７０】
態様107
FcR結合性ペプチドがザノリムマブである、態様106記載の方法。
【０２７１】
態様108
FcR結合性ペプチドがケリキシマブである、態様106記載の方法。
【０２７２】
態様109
FcR結合性ペプチドがクレノリキシマブである、態様106記載の方法。
【０２７３】
態様110
FcR結合性ペプチドがTNX 355である、態様106記載の方法。
【０２７４】
態様111
FcR結合性ペプチドがTRX-1である、態様106記載の方法。
【０２７５】
態様112
FcR結合性ペプチドがIOT4aである、態様106記載の方法。
【０２７６】
態様113
FcR結合性ペプチドが4162W94である、態様106記載の方法。
【０２７７】
態様114
FcR結合性ペプチドがヒトEGFRと結合する抗体である、態様1〜94のいずれか記載の方法。
【０２７８】
態様115
FcR結合性ペプチドがセツキシマブである、態様114記載の方法。
【０２７９】
態様116
FcR結合性ペプチドがHuMax-EGFRすなわちザルツムマブである、態様114記載の方法。
【０２８０】
態様117
FcR結合性ペプチドがヒトCD20と結合する抗体である、態様1〜94記載の方法。
【０２８１】
態様118
FcR結合性ペプチドがリツキシマブである、態様117記載の方法。
【０２８２】
態様119
FcR結合性ペプチドがイブリツモマブチウキセタンである、態様117記載の方法。
【０２８３】
態様120
FcR結合性ペプチドがトシツモマブである、態様117記載の方法。
【０２８４】
態様121
FcR結合性ペプチドがHuMax-CD20すなわちオファツムマブである、態様117記載の方法。
【０２８５】
態様122
FcR結合性ペプチドがヒトTACと結合する抗体である、態様1〜94のいずれか記載の方法。
【０２８６】
態様123
FcR結合性ペプチドがHuMax-TACである、態様122記載の方法。
【０２８７】
態様124
FcR結合性ペプチドがヒトCD3と結合する抗体である、態様1〜94のいずれか記載の方法。
【０２８８】
態様125
FcR結合性ペプチドがムロモナブである、態様124記載の方法。
【０２８９】
態様126
FcR結合性ペプチドがヒトGPIIb/IIIaと結合する抗体である、態様1〜94のいずれか記載の方法。
【０２９０】
態様127
FcR結合性ペプチドがヒトCD25と結合する抗体である、態様1〜94のいずれか記載の方法。
【０２９１】
態様128
FcR結合性ペプチドがダクリズマブである、態様127記載の方法。
【０２９２】
態様129
FcR結合性ペプチドがバシリキシマブである、態様127記載の方法。
【０２９３】
態様130
FcR結合性ペプチドがヒトTNF-αと結合する抗体である、態様1〜94のいずれか記載の方法。
【０２９４】
態様131
FcR結合性ペプチドがインフリキシマブである、態様130記載の方法。
【０２９５】
態様132
FcR結合性ペプチドがアダリムマブである、態様130記載の方法。
【０２９６】
態様133
FcR結合性ペプチドがヒトRSVと結合する抗体である、態様1〜94のいずれか記載の方法。
【０２９７】
態様134
FcR結合性ペプチドがパリビズマブである、態様133記載の方法。
【０２９８】
態様135
FcR結合性ペプチドがヒトHER-2/neuと結合する抗体である、態様1〜94のいずれか記載の方法。
【０２９９】
態様136
FcR結合性ペプチドがトラスツズマブである、態様135記載の方法。
【０３００】
態様137
FcR結合性ペプチドがペルツズマブである、態様135記載の方法。
【０３０１】
態様138
FcR結合性ペプチドがヒトCD33と結合する抗体である、態様1〜94のいずれか記載の方法。
【０３０２】
態様139
FcR結合性ペプチドがヒトCD52と結合する抗体である、態様1〜94のいずれか記載の方法。
【０３０３】
態様140
FcR結合性ペプチドがアレムツズマブである、態様139記載の方法。
【０３０４】
態様141
FcR結合性ペプチドがヒトVEGFと結合する抗体である、態様1〜94のいずれか記載の方法。
【０３０５】
態様142
FcR結合性ペプチドがベバシズマブである、態様141記載の方法。
【０３０６】
態様143
FcR結合性ペプチドがヒトCTLA4と結合する抗体である、態様1〜94のいずれか記載の方法。
【０３０７】
態様144
FcR結合性ペプチドがMDX-010である、態様143記載の方法。
【０３０８】
態様145
FcR結合性ペプチドを含む製剤であって、薬学的組成物としての使用が承認されており、態様1〜144のいずれか記載の方法が販売承認に関する申請の一部をなしている、製剤。
【０３０９】
態様146
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合を決定する方法に用いるための前記Fc受容体の調製の方法であって、前記Fc受容体が1つの段階を含む方法によって調製されており、その段階が、その段階を含まない方法によって調製された同様のFc受容体と比較して、N結合型グリコシル化上のシアル酸の量が減少したFc受容体をもたらすような方法。
【０３１０】
態様147
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合が、以下の段階を含む方法の使用によって決定される、態様146記載の方法：
（i）FcR結合性ペプチドを、FcR結合性ペプチドがFc受容体と結合するのに十分な時間にわたって、Fc受容体と接触させる段階、および
（ii）Fc受容体と結合したFcR結合性ペプチドの量を検出する段階。
【０３１１】
態様148
検出が、FcR結合性ペプチドを対象とする検出抗体の使用によって行われる、態様147記載の方法。
【０３１２】
態様149
検出抗体が標識抗体である、態様148記載の方法。
【０３１３】
態様150
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がELISAの使用によって決定される、態様146〜149のいずれか記載の方法。
【０３１４】
態様151
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がAlphaScreen（商標）アッセイの使用によって決定される、態様146〜149のいずれか記載の方法。
【０３１５】
態様152
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がラジオイムノアッセイの使用によって決定される、態様146〜149のいずれか記載の方法。
【０３１６】
態様153
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がBiacoreアッセイの使用によって決定される、態様146〜149のいずれか記載の方法。
【０３１７】
態様154
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がFMATの使用によって決定される、態様146〜149のいずれか記載の方法。
【０３１８】
態様155
FcR結合性ペプチドとFc受容体との結合がDELFIAの使用によって決定される、態様146〜149のいずれか記載の方法。
【０３１９】
態様156
ELISAプレート上にコーティングされたhis捕捉抗体が、hisタグが付加されたFcRまたはFcRフラグメントを捕捉するために用いられる、本発明または態様1〜155のいずれか記載の方法。
【０３２０】
態様157
ポリペプチド分子によってコーティングされるのに適したプラスチック部材であって、プラスチック部材の表面に対するポリペプチド分子の付着が、少なくとも部分的には、ポリペプチド分子とプラスチック部材の表面との間の静電相互作用に依存し、プラスチック部材の表面が脱シアリル化ポリペプチドによってコーティングされている、プラスチック部材。
【０３２１】
態様158
ポリペプチド分子がFc受容体である、態様157記載のプラスチック部材。
【０３２２】
態様159
マイクロタイタープレートである、態様157または態様158記載のプラスチック部材。
【０３２３】
態様160
態様1〜144のいずれか記載の方法に用いるのに適している、態様157〜159のいずれか記載のプラスチック部材。
【０３２４】
態様161
態様1〜144のいずれか記載の方法に用いられる、態様157〜159のいずれか記載のプラスチック部材。
【０３２５】
以下の実施例によって本発明をさらに例示するが、これらは本発明をさらに限定するものとはみなされるべきでない。
【０３２６】
実施例
実施例1
オリゴヌクレオチドプライマーおよびPCR増幅
指定されたプライマーをH2O中に溶解して100pmol／μlとし、-20℃で保存した。PCRのためには、PfuTurbo（登録商標）Hotstart DNAポリメラーゼ（Stratagene, Amstersham, The Netherlands；製品番号600322）を製造元の指示に従って用いた。それぞれの反応混合物には、200μMの混合dNTP（Roche Diagnostics, Almere, The Netherlands；製品番号1814362）、いずれも6.7pmolの順方向および逆方向プライマー、約1ngのテンプレートDNA、ならびに1単位のPfuTurbo（登録商標）Hotstart DNAポリメラーゼを、PCR反応用緩衝液（ポリメラーゼとともに供給）中に総容積20μlとして含めた。PCR反応は、TGradient Thermocycler 96（Whatman Biometra, Goettingen, Germany；製品番号050-801）を30サイクルのプログラムで用いて行った：95℃で2分間の変性；95℃で30秒間、45〜65℃の勾配（または別の特定のアニーリング温度）30秒間、および72℃で2分間を30サイクル；最終伸長を72℃で10分間。適宜、PCR混合物は、さらに分析または処理を行うまで4℃で保存した。
【０３２７】
実施例2
PCRによる細菌コロニーのスクリーニング
細菌コロニーを、HotStarTaq Master Mix Kit（Qiagen；製品番号203445）ならびに指定された順方向および逆方向プライマーを用いるコロニーPCRにより、所望の配列を含むベクターの存在に関してスクリーニングした。選択したコロニーを20μlピペットの先端で軽く触れ、小規模培養のために2mlのLB（ルリア培地）に短時間触れた後に、PCR混合物中に再懸濁させた。PCRは、TGradient Thermocycler 96を35サイクルのプログラムで用いて行った：95℃で15分間の変性；94℃で30秒間、55℃で30秒間、および72℃で2分間を35サイクル；その後に最終伸長段階を72℃で10分間。適宜、PCR混合物は、アガロースゲル電気泳動による分析を行うまで4℃で保存した。
【０３２８】
実施例3
FcγRIaECDHisの作製
pEE13.4FcγRIaECDHisの構築
RZPDクローンIRATp970F1154D6（Deutsche Ressourcen-zentrum fur Genomforschung（RZPD, Berlin, Germany））からプラスミドDNAを単離し、ヒトFcγRIaの細胞外コードドメイン（aa 1-292）を増幅するとともに、pEE13.4（Lonza Biologics, Slough, UK）中へのクローニング用の適切な制限部位、理想的Kozak配列（GCCGCCACC）、およびC末端His6-タグを導入する、プライマーP1（SEQ ID No：4）およびP2（SEQ ID No：5）を、実施例1に記載した手順に従って用いるPCRにおけるテンプレートとして用いた。PCR断片をゲル精製し、pEE13.4中にクローニングした。このために、PCR産物をPfl23IIおよびXmaIで消化して精製した。pEE13.4ベクターをPfl23IIおよびXmaIで消化し、ベクター断片を精製した。FcγRIa断片とpEE13.4Pfl23II-XmaIベクターを連結し、コンピテントDH5αT1R細胞（Invitrogen）に形質転換導入した。8個のコロニーを、実施例2に記載した手順に従ったコロニーPCR（プライマーP3（SEQ ID No：6）およびP4（SEQ ID No：7）を用いる）によって調べたところ、2つのコロニーが正しいサイズの挿入物を含んでいた。この2つの陽性コロニーから、2mlの培養物を増殖させた。プラスミドDNAを単離し、構築物の一方を挿入物の配列解析によって調べたところ、正しいことが見いだされた。この最終的なベクターをpEE13.4FcγRIaECDHisと命名した。
【０３２９】
Hek-293F細胞におけるFcγRIaECDHisの一過性発現
Freestyle（商標）293-F（浮遊増殖用および化学的に規定されたFreestyle培地用に順化されたHEK-293サブクローン、例えばHEK-293F）細胞をInvitrogenから入手し、製造元のプロトコールに従って293fectin（lnvitrogen）を用いて、pEE13.4FcγRIaECDHisをトランスフェクトした。このトランスフェクタントを製造元のプロトコールに従って培養し、1リットルの細胞上清を下記の通りの精製のために用いた。
【０３３０】
BD TALONspin（0.5ml）Talonカラム上でのFcγRIaECDHisの精製
BD TALONspinカラムをClontech（Mountain View, CA, USA）から入手した。ビーズをカラムから取り出して、ビーズを1×平衡化／洗浄用緩衝液 pH 7.0（50mMリン酸ナトリウムおよび300mM NaCl）を用いて平衡化した。このビーズを1リットルの細胞培養上清とともに4℃で一晩インキュベートした。FcγRIaECDHisを溶出させた（1×溶出用緩衝液（50mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、および150mMイミダゾール）pH 5.0を用いて）後に、樹脂を再び平衡化し、以前の精製の流出液（flow through）に添加した。さらに一晩インキュベートした後に、FcγRIaECDHisを再び溶出させた。1回目および2回目の溶出画分をプールし、プールしたFcγRIaECDHisをPD-10カラムで緩衝液をPBSに交換して脱塩させた。最終産物の容積は3.7mlであった。280nmでの吸光度を決定することによって濃度を測定したところ、117μg／mlであることが見いだされ、433μgのFcγRIaECDHis（SEQ ID No：1）が得られた。この最終産物はSDS-PAGEによる判断では純度が約95％であった。
【０３３１】
実施例4
FcγRIIIaECD176VHisの作製
pEE13.4FcγRIIIaECD176VHisの構築
RZPDクローンIRAKp961H1749Q2（Deutsche Ressourcenzentrum fur Genomforschung（RZPD, Berlin, Germany））からプラスミドDNAを単離し、ヒトFcγRIIIaの細胞外コードドメイン（aa 1-200）を増幅するとともにpEE13.4中へのクローニング用の適切な制限部位、理想的Kozak配列（GCCGCCACC）、およびC末端His6-タグを導入する、プライマーP5（SEQ ID No：8）およびP6（SEQ ID No：9）を実施例1に記載した手順に従って用いるPCRにおけるテンプレートとして用いた。PCR断片をゲル精製し、pEE13.4中にクローニングした。このために、PCR産物をEcoRIおよびXmaIで消化して精製した。pEE13.4ベクターをEcoRIおよびXmaIで消化し、ベクター断片を精製した。FcγRIIIa断片とpEE13.4EcoRI-XmaIベクターを連結し、コンピテントDH5αT1R細胞に形質転換導入した。4個のコロニーを、実施例2に記載した手順に従ったコロニーPCR（プライマーP3およびP4を用いる）によって調べたところ、2つのコロニーが正しいサイズの挿入物を含んでいた。この2つの陽性コロニーから、2mlの培養物を増殖させた。プラスミドDNAを単離し、構築物の一方を挿入物の配列解析によって調べたところ、正しいことが見いだされた。挿入物はFcγRIIIaの176Vアロタイプであった。この最終的なベクターをpEE13.4FcγRIIIaECD176VHisと命名した。
【０３３２】
Hek-293F細胞におけるFcγRIIIaECD176VHisの一過性発現
Freestyle（商標）293-F（浮遊増殖用および化学的に規定されたFreestyle培地用に順化されたHEK-293サブクローン、例えばHEK-293F）細胞をInvitrogenから入手し、製造元のプロトコールに従って293fectin（lnvitrogen）を用いて、pEE13.4FcγRIIIaECD176VHisをトランスフェクトした。このトランスフェクタントを製造元のプロトコールに従って培養し、200mlの細胞上清を下記の通りの精製のために用いた。
【０３３３】
BD TALONspin（0.5ml）Talonカラム上でのFcγRIIIaECD176VHisの精製
BD TALONspinカラムをClontechから入手した。ビーズをカラムから取り出して、ビーズを1×平衡化／洗浄用緩衝液 pH 7.0（50mMリン酸ナトリウムおよび300mM NaCl）を用いて平衡化し、200mlの細胞培養上清とともにインキュベートした。非特異的な結合タンパク質を除去するためにビーズを1×平衡化／洗浄用緩衝液で洗浄し、Hisタグが付加されたタンパク質を、1×溶出用緩衝液（50mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、および150mMイミダゾール）pH 5.0で溶出させた。FcγRIIIaECD176VHisの溶出（1×溶出緩衝液（50mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、および150mMイミダゾール）pH 5.0を用いて）の後に、樹脂を再び平衡化し、以前の精製の流出液に添加した。1回目および2回目の溶出画分をプールした。プールした画分を、PD-10カラムでPBSに対して脱塩させた。精製されたタンパク質の収量は、FcγRIIIaECD176VHisのアミノ酸配列（SEQ ID No：2）から計算した理論的吸光度係数を用いた上で、280nmでの吸光度を測定することによって決定した。精製後の収量は200ml当たり2.5mgであり、濃度は771μg／mlであった。SDS-PAGEでは、このタンパク質は、1つの幅広いバンド（これは非常に異種混交的なグリコシル化タンパク質を意味する）およびより高分子量の2つのより小さなバンドとして移動した。純度は約90％と評価された。
【０３３４】
実施例5
FcγRIIIaECD176FHisの作製
pEE13.4FcγRIIIaECD176FHisを構築するためのPEE13.4FcγRIIIaECD176VHisの突然変異誘発
pEE13.4FcγRIIIaECD176VHisベクター中のFcγRIIIa176VのVal176のコドンをPheに変化させるために、位置指定突然変異誘発法を用いた。位置指定突然変異誘発反応は、QuickChange II XL位置指定突然変異誘発キット（Stratagene, Amsterdam, The Netherlands）を製造元の指示に従って用いて行った。この方法は、突然変異誘発の成功をスクリーニングするためのサイレント性の余剰なHpy188III部位の導入を含んでいた。手短に述べると、5μlの10×反応用緩衝液、1.25μlのオリゴヌクレオチドP7（100ng／μl）（SEQ ID No：10）、1.25μlのオリゴヌクレオチドP8（125ng／μl）（SEQ ID No：11）、1μlのdNTP混合物、3μlのQuicksolution、1μlのプラスミドpEE13.4FcγRIIIaECD176VHis（50ng／μl）、および1μlのPfuUltra HF DNAポリメラーゼを総容積50μlとして混合し、TGradient Thermocycler 96（Whatman Biometra, Goettingen, Germany；製品番号050-801）を18サイクルのプログラムを用いて増幅させた：95℃で1分間の変性；95℃で50秒間、60℃で50秒間、および68℃で10分間を18サイクル。PCR混合物はさらに処理を行うまで4℃で保存した。次に、ベクターを消化するためにPCR混合物を1μlのDpnIとともに37℃で60分間インキュベートし、さらに処理を行うまで4℃で保存した。2μlの反応混合物を、One Shot DH5α-T1Rコンピテント大腸菌細胞に対して、製造元の指示（Invitrogen）に従って形質転換導入した。
【０３３５】
16個のコロニーをコロニーPCRおよびHpy188III消化（サイレント性の余剰なHpy188III部位を突然変異誘発の際に導入した）によってスクリーニングしたところ、16個のコロニーのうち15個が正しいヌクレオチド変化を含むように思われた。正しい突然変異が導入されたことを確かめるために、2つの陽性コロニーを一晩増殖させてプラスミドDNAを単離し、シークエンシングを行った。どちらも正しい配列を含んでおり、その一方をさらなる増殖のために用い、pEE13.4FcγRIIIaECD176FHisと命名した。突然変異誘発過程における余分な突然変異の導入の可能性を否定するために、pEE13.4FcγRIIIaECDl76FHisのFcγRIIIaコード領域全体を再びシークエンシングしたところ、余分な突然変異は見いだされなかった。この最終的なベクターをpEE13.4FcγRIIIaECD176FHisと命名した。
【０３３６】
Hek-293F細胞におけるFcγRIIIaECD176FHisの一過性発現
Freestyle（商標）293-F（浮遊増殖用および化学的に規定されたFreestyle培地用に順化されたHEK-293サブクローン、例えばHEK-293F）細胞をInvitrogenから入手し、製造元のプロトコールに従って293fectin（lnvitrogen）を用いて、pEE13.4FcγRIIIaECD176FHisをトランスフェクトした。トランスフェクタントを製造元のプロトコールに従って培養し、200mlの細胞上清を下記の通りの精製のために用いた。
【０３３７】
BD TALONspin（0.5ml）Talonカラム上でのFcγRIIIaECD176FHisの精製
BD TALONspinカラムをClontechから入手した。ビーズをカラムから取り出して、ビーズを1×平衡化／洗浄用緩衝液 pH 7.0（50mMリン酸ナトリウムおよび300mM NaCl）を用いて平衡化し、200mlの細胞培養上清とともにインキュベートした。非特異的な結合タンパク質を除去するためにビーズを1×平衡化／洗浄用緩衝液で洗浄し、Hisタグが付加されたタンパク質を1×溶出用緩衝液（50mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、および150mMイミダゾール）pH 5.0で溶出させた。FcγRIIIaECD176VHisの溶出（1×溶出緩衝液を用いて）の後に、樹脂を再び平衡化し、以前の精製の流出液に添加した。プールした画分を、PD-10カラムでPBSに対して脱塩させた。精製されたタンパク質の収量は、FcγRIIIaECD176FHisのアミノ酸配列（SEQ ID No：3）から計算した理論的吸光度係数を用いた上で、280nmでの吸光度を測定することによって決定した。精製後の収量は200ml当たり1.5mgであり、結果として得られた濃度は613μg／mlであった。SDS-PAGEでは、単一の純粋なグリコシル化タンパク質を意味する1つのバンドが認められた。
【０３３８】
実施例6
複数の異なるザノリムマブのバッチのグリコシル化レベル
重鎖グリコシル化のレベル
重鎖のCH2ドメインにおけるN結合型グリコシル化基の存在について検討するために、重鎖グリコシル化に違いがある可能性のあるザノリムマブのいくつかのバッチ（MEV001、MEV004、MEV005、MRS-CD4-001、BN078、BO118）を、SDS-PAGEおよび高pH陰イオン交換-パルスドアンペロメーター検出法（HPAEC-PAD；）によって分析した。比較のために、対照バッチを調製した：脱グリコシル化ザノリムマブのバッチUNG-MRS-CD4、偽性脱グリコシル化バッチMOCK-MRS-CD4（MRS-CD4-001から直接的に導き出された）ならびに混合バッチ（脱グリコシル化参照バッチと完全グリコシル化参照バッチの混合物）であるM90-MRS-CD4［重鎖の90％がグリコシル化］およびM50-MRS-CD4［重鎖の50％がグリコシル化］）。
【０３３９】
非還元SDS-PAGEによる判定では、UNG-MRS-CD4を含むすべてのバッチが損なわれていないように思われた（図1）。還元SDS-PAGEによる判定で、バッチUNG-MRS-CD4は完全に脱グリコシル化されていることが確かめられた（図2）。
【０３４０】
バッチMRS-CD4-001およびBN078は、少量の非グリコシル化重鎖（10％未満）を含んでおり、バッチBO118は約10％の非グリコシル化重鎖を含んでいた。MEV001も少量の非グリコシル化重鎖を含んでいた。バッチMEV004およびMEV005は非グリコシル化重鎖を含み、MEV004が最も多くの量を含んでおり（約30％）、次がMEV005（約15％）であった。
【０３４１】
重鎖グリコシル化のタイプ
重鎖グリコシル化のタイプについて検討するために、ザノリムマブのバッチをHPAEC-PADによって分析した（表1）。いずれのバッチも荷電グリカンを有意な量としては含まなかった。2個のガラクトース（G2またはG2F）を有する複合型グリカンはほとんど検出不能であった。
【０３４２】
MRS-CD4-001（これは参照バッチとして設定した）およびバッチMEV005は同程度の量のオリゴマンノース-5型グリカン（M5）を含んでいたが、MEV005はMRS-CD4-001と比較して非コアフコシル化グリカンをより少量しか含まなかった。バッチMEV005はまた、ガラクトースを伴わないコアフコシル化グリカン（G0F）をすべてのバッチの中で最も高いパーセンテージで含み、それは参照バッチMRS-CD4-001よりも約20％多かった。
【０３４３】
バッチBN078は、G0F、1個のガラクトースを有するコアフコシル化グリカン（G1F）、および非コアフコシル化グリカンの量が同程度であるという点で参照バッチMRS-CD4-001と類似していたが、バッチBN078はM5をより多く含んでいた。バッチBO118は、MRS-CD4-001と比較してG0Fの量が多く、非コアフコシル化グリカンの量が少ないことを特徴とした。
【０３４４】
MRS-CD4-001およびMOCK-MRS-C04は、予想された通り、非常に類似していた（MOCK-MRS-CD4は参照バッチMRS-CD4-001から直接的に導き出される）。バッチUNG-MRS-CD4はグリカンを含まないことが確かめられた（非提示データ）。
【０３４５】
（表１）HPAEC-PADによって判定したザノリムマブのバッチのグリカンプロフィールの概要
2009501913.tif 000002
A：中性グリカンのパーセンテージ
B：ガラクトースを伴わないコアフコシル化グリカンのパーセンテージ（G0F；総ピーク面積のパーセンテージ）
C：1個のガラクトースを有するコアフコシル化グリカンのパーセンテージ（G1F；総ピーク面積のパーセンテージ）
D：オリゴマンノース5型構造のパーセンテージ（M5、総ピーク面積のパーセンテージ）
E：非コアフコシル化グリカンのパーセンテージ（総ピーク面積のパーセンテージ）。非コアフコシル化グリカンは以下の式：G0／［G0＋G0F'］）*100に従って算出し、式中、G0は非コアフコシル化グリカンのパーセンテージであり、G0F'はβ-ガラクトシダーゼ処理後のコアフコシル化グリカンのパーセンテージ（G0F＋G1F）である。
Ns  示していない
Nt  検査していない
【０３４６】
実施例7
グリコシル化の違いとADCC活性との相関I
いくつかのザノリムマブのバッチ（実施例6参照）が初代CD4+ T細胞のNK細胞媒介性ADCCを誘導する能力をフローサイトメトリーによって検討した（図3）。
【０３４７】
ヒト末梢血は健常志願者（インフォームドコンセントを得た後に）から静脈穿刺によって収集され、バッフィコートの形態で提供された（Sanquin, Utrecht, The Netherlands）。滅菌PBSをヒト血液に添加し、末梢血単核細胞（PBMC）をlymphoprep密度勾配遠心法（Lymphocyte Separation Medium；BioWhittaker、これをCambrex Verviers, Belgiumに使用；製品番号17-829E）により20秒で800×gを20分間（ブレーキ0）かけて分離した。勾配境界部にあるPBMCを取り出してPBSで3回洗浄し（400×gで7分間、ブレーキ3）、その後にRPMI中に再懸濁させた。CD4+ T細胞を、Dynal（登録商標）CD4+ T-Cell Negative Isolation Kit（Dynal Biotech GmbH, Hamburg, Germany；製品番号113.11）を製造元のプロトコールに従って用いる陰性選択によって単離した。NK細胞は、Dynal（登録商標）CD4+T-Cell Negative Isolation Kit（Dynal Biotech GmbH, Hamburg, Germany；製品番号113.15）を製造元のプロトコールに従って用いる陰性選択によって単離した。単離したCD4+ T細胞を、蛍光性細胞膜標識PKH26（PKH26標識キット, Sigma-Aldrich Chemie，Zwijndrecht, The Netherlands；製品番号PKH26-GL）を製造元のプロトコールに従って用いて標識した。続いて、PKH26で標識されたCD4+ T細胞を、96ウェル丸底プレートに50μl中に2.5〜5*104個／ウェルとなるように移した（単離後のNK細胞の収量に依存。1ウェル当たりのT細胞の量は、エフェクター細胞：標的細胞の比が10：1となるように調整）。次に、希釈したザノリムマブのバッチ（希釈の範囲はグラフ中に表記）を50μlとして添加し、4℃で10分間インキュベートした。その後に、100μlのNK細胞を2.5〜5*105個／ウェルとなるように添加し、細胞を遠心沈降させた後に、ペレット化された細胞を37℃で4時間インキュベートした。自然溶解に関しては、標的細胞をNK細胞の存在しない培地とともにインキュベートした。次に、細胞を分析の直前にTO-PRO（登録商標）-3（透過性細胞を染色する；Molecular Probes, Leiden, The Netherlands；製品番号T3605；最終希釈度1：100,000）で染色した。細胞に付随する蛍光を、FACSCalibur（商標）およびCell Quest Proソフトウエア（Becton Dickinson）を適切な補正設定下で用いるフローサイトメトリーによって評価した。細胞の溶解率は、PKH26+細胞集団内のTO-PRO（登録商標）-3+細胞の数をPKH26+細胞の総数で除算することによって算出した。
【０３４８】
さまざまな上限レベルを可能にする4パラメーターロジスティック分析により、すべての曲線が同程度の上限レベルに到達するわけではないことが示されたため、バッチの活性および相対活性（効力の代わりに）を、下限固定曲線（bottom-fixed curve）のEC50値を用いて算出した。
【０３４９】
バッチBN078、BO118、MOCK-MRS-CD4、およびM90-MRS-CD4は、ADCC誘導活性に関してMRS-CD4-001（これは参照バッチとして用いた）と類似しているように思われた。バッチMEV005、M50-MRS-CD4は、参照バッチMRS-CD4-001よりも低い効率でNK細胞媒介性ADCCを誘導するように思われた。
【０３５０】
参照バッチおよび対照バッチを用いた結果を検討したところ、グリコシル化重鎖のレベルとADCCを誘導する能力との間には明らかな相関が存在するように思われた。完全グリコシル化参照バッチが最大のADCC活性を示し、一方、バッチM50-MRS-CD4（非グリコシル化ザノリムマブを50％含む）ははるかに低いADCC誘導活性を示した。バッチM90-MRS-CD4（非グリコシル化ザノリムマブを10％含む）は、参照と同程度のADCCの誘導能力を示した。
【０３５１】
被験バッチを用いた結果は、ある程度の量の非グリコシル化重鎖を含むバッチMEV005およびBO118がADCC誘導能力の低下を示したという点で、これに合致する。
【０３５２】
バッチMEV005およびBO118の分析は、これらのバッチも高レベルのフコシル化を有することを示しており、このことは、フコシル化がこれらのバッチがADCCを誘導する能力が低下していることの一因である可能性を示唆する（Shields, R.L. et al., J Biol Chem 277, 26733 (2002)、およびOkazaki, A. et al., J Mol Biol 336, 1239 (2004)）。
【０３５３】
実施例8
グリコシル化の違いとADCC活性との相関II
いくつかの脱グリコシル化混合バッチが初代CD4+ T細胞のNK細胞媒介性ADCCを誘導する能力をフローサイトメトリーによって検討した（実施例7参照）。3回の実験のうち1つの代表的なものの結果（図4のデータを参照）が、ある濃度範囲にわたる（部分的）脱グリコシル化バッチの存在下におけるCD4+ T細胞の比溶解（specific lysis）として示されている（単一データポイント）。カーブフィッティングは、下限を共通の値に固定した上で、4パラメーターロジスティックフィッティングを用いて行った（図4A）。さらに、カーブフィッティングを、下限レベル、上限レベル、および傾きを制約した上での4パラメーターロジスティックフィッティングを用いても行った（図4B）。上限、下限、および傾きが固定された曲線のEC50値を用いて、MRS-CD4-001の相対的効力を算出した。さらに、親GMP#3バッチ（脱グリコシル化バッチおよび混合バッチを調製するために用いたバッチ）を基準とした相対的効力も算出した（表2）。MRS-CD4-001バッチと比較して、GMP#3バッチ、および偽性脱グリコシル化GMP#3バッチであるMOCK-GMP#3-CD4は、幾分上昇したADCC活性を有していた。脱グリコシル化GMP#3をそれぞれ50％、30％、および10％含む、M50-GMP#3-CD4、M70-GMP#3-CD4、およびM90-GMP#3混合バッチ（脱グリコシル化GMP#3バッチとグリコシル化GMP#3バッチの混合物）は、GMP#3を基準とした相対的効力が0.31、0.59、および0.87であり、このことはグリコシル化重鎖の量が減少するに伴ってADCC活性が低下することを示している。以上をまとめると、グリコシル化重鎖のレベルとADCCを誘導する能力との間には明らかな相関が存在するように思われると結論される。
【０３５４】
（表２）脱グリコシル化混合バッチがADCCを誘導する能力
2009501913.tif 000003
* これらの被験バッチが導き出された由来であるバッチGMP#3を基準とした効力。
参照バッチMRS-CD4-001を基準とした相対的効力（下限レベル、上限レベル、および傾きに対して制約が設定された曲線のEC50値から導き出される）および平均がSD（標準誤差）を伴って示されている。括弧内には親バッチGMP#3を基準とした相対的効力が提示されている。
【０３５５】
実施例9
FcγRIIIa176V結合性ELISAおよびADCCとの相関I
ザノリムマブのいくつかのバッチ（実施例6参照）を、FcγRIIIa176Vに対する結合に関して検討した。
【０３５６】
Greinerプレートを100μlの2.5μg／ml FcγRIIIa176V（実施例4に記載した通りに調製）でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートを、200μlのPBST（0.05％Tween-20（Sigma-Aldrich Chemie B.V., Zwijndrecht, NL；カタログ番号63158）を含むPBS）および100μlの系列希釈ザノリムマブ試料（ザノリムマブの濃度は300、75、18.75、4.69、0.29、1.17、0.07、および0.02μg／ml）で3回洗浄した。プレートを振盪条件下にて室温で60分間インキュベートし、続いて200μlのPBSTで3回洗浄し、その後に1：4000に希釈した結合物であるペルオキシダーゼ結合affinipure F(ab')2フラグメントG-a-Hu-IgG、F(ab')2フラグメント特異物（（Jackson ImmunoResearch, Brunschwig Chemie B.V., Amsterdam, The Netherlands）を添加した。プレートを再び振盪条件下にて室温で60分間インキュベートし、続いて200μlのPBSTで3回洗浄した。100μlのABTS（Roche、カタログ番号1112597）を添加し、プレートを振盪条件下で30分間インキュベートした。反応を100μlの2％シュウ酸の添加によって停止させ、405nmでの吸光度を測定した。その結果は図5に示されている。
【０３５７】
さまざまな上限レベルを可能にする4パラメーターロジスティック分析により、すべての曲線が同程度の上限レベルに到達することが示されたため、バッチの活性および相対活性を、下限レベル、上限レベル、および傾きを固定した曲線のEC50値を用いて算出した。
【０３５８】
バッチBN078およびMOCK-MRS-CD4は、プレートに結合したFcγRIIIa176Vに対して、参照バッチMRS-CD4-001と同程度に結合した。バッチMEV001、MEV005、BO118、M50-MRS-CD4、およびM90-MRS-CD4は、プレートに結合したFcγRIIIa176Vに結合する効力がより低いように思われた。バッチMEV001、MEV005、BO118、およびM50-MRS-CD4は、プレートに結合したFcγRIIIa176Vとの結合に関して類似しており、相対的効力は0.4〜0.5であった。M90-MRS-CD4は予想とは異なる挙動を示し、約0.7の相対的効力で結合した（予想されたのは0.9であった）。
【０３５９】
参照バッチおよび対照バッチを用いた検討からは、グリコシル化重鎖のレベルとFcγRIIIa176Vと結合する能力との間には明らかな相関が存在するように思われた。完全グリコシル化参照バッチは最大のFcγRIIIa176V結合性を示し、一方、バッチM50-MRS-CD4ははるかに低い結合性を示し、バッチM90-MRS-CD4は中間的な結合性を示した。
【０３６０】
被験バッチを用いた結果は、非グリコシル化重鎖を30％および10％含むバッチMEV005およびBO118がはるかに低いFcγRIIIa176V結合性を示したという点で、これに合致する。予想外であったのはバッチMEV001も、このバッチはSDS-PAGEによる検出では非グリコシル化重鎖を含まないように思われたものの、はるかに低いFcγIIIa176V結合性を示したことであった。
【０３６１】
全体的には、ADCCの誘導（図3）と精製FcγRIIIa176Vに対する結合性（図5）との間には相関が存在すると結論することができる。
【０３６２】
実施例10
FcγRIIIa176V結合性ELISAおよびADCCとの相関II
ザノリムマブのいくつかの脱グリコシル化混合バッチ（実施例8参照）がFcγRIIIa176Vと結合する能力について検討した。
【０３６３】
Greinerプレートを100μlの2.5μg／ml FcγRIIIa176V（実施例4に記載した通りに調製）でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートを、200μlのPBSTおよび100μlの系列希釈したザノリムマブ試料（ザノリムマブの濃度は300、75、18.75、4.69、0.29、1.17、0.07、および0.02μg／ml）で3回洗浄した。プレートを振盪条件下にて室温で60分間インキュベートし、続いて200μlのPBSTで3回洗浄し、その後に1：4000希釈した結合物であるペルオキシダーゼ結合affinipure F(ab')2フラグメントG-a-Hu-IgG、F(ab')2フラグメント特異物（Jackson lmmunoResearch, Brunschwig Chemie B.V., Amsterdam, The Netherlands）を添加した。プレートを再び振盪条件下にて室温で60分間インキュベートし、続いて200μlのPBSTで3回洗浄した。100μlのABTS（Roche、カタログ番号1112597）を添加し、プレートを振盪条件下で30分間インキュベートした。反応を100μlの2％シュウ酸の添加によって停止させ、405nmでの吸光度を測定した。その結果は図6に示されている。
【０３６４】
カーブフィッティングは、下限レベル、上限レベル、および傾きを制約した上で、4パラメーターロジスティックフィッティングを用いて行った（図6）。下限レベル、上限レベル、および傾きを固定した曲線のEC50値を用いて、MRS-CD4-001の相対的効力を算出した。さらに、親GMP#3バッチ（脱グリコシル化バッチおよび混合バッチを調製するために用いたバッチ）を基準とした相対的効力も算出した（表3）。
【０３６５】
（表３）プレートに結合したFcγRIIIa176Vに対するザノリムマブのバッチの結合
2009501913.tif 000004
参照バッチMRS-CD4-001を基準とした相対的効力（下限レベル、上限レベル、および傾きに対して制約が設定された曲線のEC50値から導き出される）および平均がSDを伴って示されている。括弧内には親バッチGMP#3を基準とした相対的効力が提示されている。
【０３６６】
MRS-CD4-001バッチと比較して、GMP#3バッチ、および偽性脱グリコシル化GMP#3バッチであるMOCK-GMP#3-CD4は、FcγRIIIa176V結合性が幾分高かった。脱グリコシル化GMP#3をそれぞれ50％、30％、および10％含むM50-GMP#3-CD4、M70-GMP#3-CD4、およびM90-GMP#3混合バッチ（脱グリコシル化GMP#3バッチとグリコシル化GMP#3バッチの混合物）は、GMP#3を基準とした相対的効力が0.49、0.71、および0.93であり、このことはグリコシル化重鎖の量が減少するに伴ってFcγRIIIa176V結合性が低下することを示している。以上より、グリコシル化重鎖のレベルとFcγRIIIa176Vと結合する能力との間には明らかな相関が存在するように思われると結論される（図7）。
【０３６７】
同じく、ADCCとFcγRIIIa176V結合性との間にも明らかな相関が存在する（図8）。
【０３６８】
実施例11
抗原の結合I
ザノリムマブのバッチと精製CD4タンパク質との結合をELISAによって検討した（図9）。sCD4（Immuno Diagnostics, Woburn, MA, USA、カタログ番号7001-10）を、0.5μg／ml（100μl／ウェル）を含むPBSとして、4℃での一晩のインキュベーションにより、平底96ウェルプレート（Greiner, Alphen a／d Rijn, NL、カタログ番号655092）にコーティングした。プレートを空にして、残留性の非特異的結合部位を、200μl／ウェルのPBSC（2％（v／v）ニワトリ血清（Invitrogen, Breda, NL、カタログ番号16110-082）を含むPBS）により、振盪機上にて室温で1時間にわたりブロックした。PBSTC（0.05％（v／v）Tween-20（Sigma-Aldrich Chemie B.V., Zwijndrecht, NL；カタログ番号63158）および2％（v／v）ニワトリ血清を含むPBS）中への4倍系列希釈による、2000ng／mlから0.49ng／mlまでの範囲にわたるザノリムマブのバッチの希釈物を調製した。プレートを空にした後に、100μlの希釈物をコーティングされたプレートに添加し、振盪機上にて室温で2時間インキュベートした。プレートを空にして、PBST 1×（200μl／ウェル）で3回洗浄した。結合物であるヤギ抗HuIgG F(ab')2spec-HRP（Jackson lmmunoResearch）をPBSTC 1×中に1：10.000に希釈し、1ウェル当たり100μlずつ添加した。プレートを振盪機上にて室温で1時間インキュベートした。プレートを空にして、PBST 1×（200μl／ウェル）で3回洗浄した。残留性のすべての液体を除くためにプレートを吸収紙に軽く当てた。1錠のABTS基質（50mg Roche Diagnostics NL, Almere, NL、カタログ番号1122422）を50mlのABTS緩衝液（Roche、カタログ番号1112597）中に溶解させ、1ウェル当たり100μlを添加した。プレートをアルミホイルで包み、振盪機上にて室温で30分間インキュベートした。反応は100μl／ウェルの2％シュウ酸（SigmaAldrich Chemie B.V.）によって停止させた。分光光度計（ELISA-EL808, Beun de Ronde, Abcoude, NL）で405nmでの吸光度を読み取った。
【０３６９】
さまざまな上限レベルを可能にする4パラメーターロジスティック分析により、すべての曲線が同程度の上限レベルに到達することが示されたため、バッチの活性および相対活性を、下限レベル、上限レベル、および傾きを固定した曲線のEC50値を用いて算出した。
【０３７０】
参照バッチMRS-CD4-001と比較して、他のすべてのバッチが、バッチのグリコシル化に明らかな違いがあるにもかかわらず、プレートに結合したsCD4と同程度に結合した。このアッセイにおける変動は比較的大きかったことに注意すべきである。
【０３７１】
実施例12
抗原の結合II
ザノリムマブ混合バッチ（実施例8参照）と精製CD4タンパク質との結合をELISAによって検討した（図10）。
【０３７２】
Greinerプレートを100μlの2.0μg／ml sCD4（Immuno Diagnostics, Woburn, MA, USA、製品番号7001-10）によってコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートを200μlのPBSTおよび100μlの系列希釈したザノリムマブ試料（ザノリムマブの濃度は1000、250、62.5、15.62、3.9、0.98、0.24、および0.06ng／ml）で3回洗浄した。プレートを振盪条件下にて室温で60分間インキュベートし、続いて200μlのPBSTで3回洗浄し、その後に結合物である1：20000希釈したペルオキシダーゼ結合affinipure G-a-Hu-IgG、F(ab')2フラグメント特異物（Jackson lmmunoResearch, Brunschwig Chemie B.V., Amsterdam, The Netherlands）を添加した。プレートを再び振盪条件下にて室温で60分間インキュベートし、続いて200μlのPBSTで3回洗浄した。100μlのABTS（Roche、カタログ番号1112597）を添加し、プレートを振盪条件下で30分間インキュベートした。反応を100μlの2％シュウ酸の添加によって停止させ、405nmでの吸光度を測定した。
【０３７３】
さまざまな上限レベルを可能にする4パラメーターロジスティック分析により、すべての曲線が同程度の上限レベルに到達することが示されたため、バッチの活性および相対活性を、下限レベル、上限レベル、および傾きを固定した曲線のEC50値を用いて算出した（表4）。
【０３７４】
（表４）プレートに結合したCD4に対するザノリムマブの脱グリコシル化混合バッチの結合
2009501913.tif 000005
参照バッチMRS-CD4-001を基準とした相対的効力（下限レベル、上限レベル、および傾きに対して制約が設定された曲線のEC50値から導き出される）および平均がSDを伴って示されている。GMP#3は特許品バッチである。
【０３７５】
参照バッチMRS-CD4-001と比較して、他のすべてのバッチが、バッチのグリコシル化に明らかな違いがあるにもかかわらず、プレートに結合したsCD4に対して同程度に結合した。
【０３７６】
実施例13
IL-2産生の阻害
ザノリムマブのバッチ（実施例6参照）が、活性化PBMCによるIL-2の産生を阻害する能力を、U-CyTech（Utrecht, The Netherlands；製品番号CT202）またはBD Biosciences（Alphen aan de Rijn, The Netherlands；製品番号550611）から入手したヒトIL-2サイトカインELISAキットを製造元の指示に従って用いるネステッド（nested）アッセイ（T細胞活性化アッセイに続いてIL-2 ELISAを行う）によって検討した。
【０３７７】
PBMC（1ウェル当たり105個）を、96ウェル平底プレート内で、抗体参照または被験試料の系列希釈物（または選択された系列）の存在下で、プレートに結合させた抗CD3（100ng／ml）および可溶性抗CD28（100ng／ml）によって刺激した。38〜42時間後に、無細胞上清を収集し、希釈用緩衝液で希釈した上で96ウェルELISAプレートに移した。IL-2標準物質を含むヒトIL-2 ELISAキットを用いるELISAにより、IL-2濃度をpg／ml単位で決定した。
【０３７８】
さまざまな上限レベルを可能にする4パラメーターロジスティック分析により、すべての曲線が同程度の上限レベルに到達することが示されたため、バッチの活性および相対活性を、下限レベル、上限レベル、および傾きを固定した曲線のEC50値を用いて算出した；UNG-MRS-CD4は同じ下限レベルに到達しなかったため、このバッチはこの分析から除外した。相対的効力を、2つのMRS-CD4-001曲線の平均EC50を用いて算出した。算出はそれぞれの個々のプレートに関して行った。
【０３７９】
ザノリムマブのバッチがIL-2産生を阻害する能力を上記の通りに検討した。結果は、2つずつの試料の上清中のIL-2のレベルとして示されている。一団のザノリムマブのバッチの全体を4つのプレートを用いて検査し、1つの実験当たり2回ずつ検査した。2回の実験の一方を示している（図11）。
【０３８０】
ザノリムマブのバッチがIL-2産生を阻害する能力を上記の通りに検討した。参照バッチMRS-CD4-001（2つのMRS-CD4-001曲線の平均EC50）を基準とした相対活性（下限固定曲線のEC50値から導き出される）を、2回の実験に関して示している（表5）。
【０３８１】
（表５）IL-2産生を阻害するザノリムマブ能力
2009501913.tif 000006
【０３８２】
対照バッチUNG-MRS-CD4を除く、検討したすべてのザノリムマブのバッチがIL-2産生を阻害した。バッチMOCK-MRS-CD4、M90-MRS-CD4、BN078、およびMEV005は参照バッチMRS-CD4-001と同程度の様式で阻害した。バッチBO118はより高度に阻害し、バッチM50-MRS-CD4およびMEV001はより低い程度で阻害した。実験間および実験内部には高度の変動が存在した。参照バッチおよび対照バッチを用いた結果を検討すると、グリコシル化重鎖のレベルは活性化T細胞によるIL-2産生を阻害する能力とある程度相関するように思われた。完全グリコシル化参照バッチは最大の活性を示し、バッチM50-MRS-CD4はIL-2産生を阻害する能力がはるかに低かった。バッチM90-MRS-CD4はIL-2産生を阻害する能力が参照と同程度であった。
【０３８３】
非グリコシル化重鎖を30％含む被験バッチMEV005はIL-2産生を阻害する能力の低下を示した。しかし、非グリコシル化重鎖を含まないと思われるバッチMEV001もIL-2産生を阻害する能力の低下を示し、一方、非グリコシル化重鎖を10％含むバッチBO118はIL-2産生を十分に阻害することができ、参照をある程度上回るほどでさえあった。
【０３８４】
実施例14
AlphaScreen（商標）を利用したアッセイによる、いくつかのザノリムマブのバッチのFcR結合性およびCD4結合性に関するスクリーニング
ザノリムマブのいくつかのバッチ（実施例8参照）を、単一のAlphaScreen（商標）を利用したアッセイを用いて、FcγRIIIa176VおよびCD4に対する結合に関して検討した。
【０３８５】
Hisタグが付加されたFcγRIIIa176VをNi-アクセプタービーズと結合させた。非結合性のHisタグ付加FcγRIIIa176Vを除去するためにビーズを洗浄した。sCD4-ビオチンをSA-ドナービーズと結合させた。非結合性のsCD4-ビオチンを除去するためにビーズを洗浄した。ある範囲にわたる希釈度の参照バッチMRS-CD4-001およびH-IgG を調製した（範囲：90、30、3、1、0.3、0.03、および0μg／ml）。さまざまな容積のHisタグ付加FcγRIIIa176V-Ni-アクセプタービーズを384ウェルoptiplateのウェルに入れ、続いて一定容積のザノリムマブまたはH-IgGおよび一定容積のsCD4-ビオチン-SA-ドナービーズを添加した。暗所にて室温で1時間インキュベートした後に、ビーズ／抗体混合物を、EnVision（商標）装置を「alphascreen標識」とともに用いて分析した。
【０３８６】
図12は、相対的な結合能がどちらの実験に関しても同程度であることを確かめている。M50-MRS-CD4バッチは予想の通り、参照バッチの53％の平均能力を示した。M90-MRS-CD4バッチは75％前後の能力を示し、これは予想されたよりも幾分低かった。バッチBO118およびBN078は同程度の結合能（88％および89％）を示した。バッチMEV005およびMOCK-MRS-CD4は結合能が幾分低かった（84％および81％）。
【０３８７】
実施例15
細胞に結合したFcγRIに対する結合
ザノリムマブのいくつかのバッチ（実施例8参照）を、細胞に結合したFcγRIに対する結合に関して検討した。
【０３８８】
IIA1.6およびIIA1.6-FcγRI細胞（Ms. L. Bevaart,（Dept. of Immunotherapy, University Medical Centre Utrecht, Utrecht, The Netherlands）により寄贈）を収集し、トリパンブルー排除によって計数した。細胞を室温で500g、5分間の遠心で沈降させて、上清を廃棄し、細胞を染色用緩衝液（1％v／v BSA（Roche, Almere, NL）および0.01％v／vアジド（Sigma-Aldrich Chemie B.V.）を含むPBS）中に1ml当たり1×106個として再懸濁させ、96ウェルV底プレートに100μl／ウェルで移した（Greiner, Frickenhausen, Germany、カタログ番号651101）。染色用緩衝液中への2倍系列希釈により、10000ng／mlから9.8ng／mlまでの範囲にわたるザノリムマブのバッチの希釈物を調製した。100μlの試料、陰性対照IgG2（結合部位、Birmingham, UK、カタログ番号BP080）または染色用緩衝液を細胞に添加し、4℃で30分間インキュベートした。1ウェル当たり150μlの染色用緩衝液で細胞を3回洗浄し、室温で500g、5分間の遠心によって沈降させた。1ウェル当たり100μlのF(ab')2-Gt-抗Hu-IgG-F(ab')2-FITC（Jackson, Pennsylvania, USA、カタログ番号109-096-097；染色用緩衝液中に1：100に希釈）を細胞ペレットに添加し、4℃で30分間インキュベートした。細胞を150μlの染色用緩衝液で3回洗浄し、室温で500g、5分間の遠心によって沈降させた。細胞を150μlの染色用緩衝液中に再懸濁させ、1.3mlチューブに移した。細胞をFACSCalibur（商標）（BD）またはFACScan（商標）（BD）を用いて分析した。
【０３８９】
参照バッチMRS-CD4-001と比較して、大部分のバッチは、バッチのグリコシル化に違いがあるにもかかわらず、細胞に結合したFcγRIに対して幾分少ない量として結合した。このアッセイにおける変動が比較的大きかったことに注意すべきである。さらに、グリコシル化重鎖を50％しか含まないバッチM50-MRS-CD4は結合能がより低かった。バッチUNG-MRS-CD4は、プレートに結合したFcγRIに対してほとんど結合しなかった（図13）。
【０３９０】
実施例16
プレートに結合したFcγRIに対する結合
ザノリムマブのいくつかのバッチ（実施例8参照）をプレートに結合したFcγRIに対する結合に関して検討した。
【０３９１】
Hisタグが付加された組換えFcγRI（Genmab B.V., Utrecht, NL、バッチ番号EX2005-0403-016-TVE）を、1.5μg／ml（100μl）を含むPBSとして、4℃での一晩のインキュベーションにより、平底96ウェルプレート（Greiner, Alphen a／d Rijn, NL、カタログ番号655092）にコーティングした。プレートをPBSで3回洗浄し、空にして、残留性の非特異性結合部位を、200μl／ウェルのPBSCにより室温で1時間にわたりブロックした。PBSTC中への2倍系列希釈により、4000ng／mlから31.25ng／mlまでの範囲にわたるザノリムマブのバッチの希釈物を調製した。100μlの希釈試料を添加し、室温で2時間インキュベートした。プレートを空にして、PBST 1×（200μl／ウェル）で3回洗浄した。結合物であるヤギ［F(ab')2フラグメント］-抗HuIgG F(ab')2 spec-HRP（Jackson、カタログ番号109-096-097）（EX2005-0505-008-MVO中にて、結合物ヤギ-抗HuIgG F(ab')2spec-HRP、Jacksonカタログ番号109-035-097を用いた）をPBSTC 1×中に1：10.000に希釈し、1ウェル当たり100μlの結合物を添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを空にして、PBST 1×（200μl／ウェル）で3回洗浄した。残留性のすべての液体を除くためにプレートを吸収紙に軽く当てた。1錠のABTS基質（50mg（Roche Diagnostics NL, Almere, NL、カタログ番号1122422））を50mlのABTS緩衝液（Roche、カタログ番号1112597）中に溶解させ、1ウェル当たり100μlを添加した。プレートをアルミホイルで包み、室温で30分間インキュベートした。反応は100μl／ウェルの2％シュウ酸［Sigma-Aldrich Chemie B.V.］によって停止させた。分光光度計［ELISA-EL808, Beun de Ronde, Abcoude, NL］で405nmでの吸光度を読み取った。
【０３９２】
参照バッチMRS-CD4-001と比較して、大部分のバッチは、バッチのグリコシル化に違いがあるにもかかわらず、細胞に結合したFcγRIに対して幾分少ない量として結合した。このアッセイにおける変動が比較的大きかったことに注意すべきである。さらに、グリコシル化重鎖を50％しか含まないバッチM50-MRS-CD4は結合能がより低かった。バッチUNG-MRS-CD4は、プレートに結合したFcγRIに対して高度の結合を示さなかった（図14）。
【０３９３】
実施例17
ザノリムマブのバッチがADCCを誘導する能力と、CD4に対する、FcγRIに対する、FcγRIIIa176Vに対する結合、またはCD4およびFcγRIIIa176V結合性の組み合わせに関して測定された相対的効力との相関
ザノリムマブのいくつかのバッチ（実施例8参照）を、プレートに結合したFcγRIに対する結合に関して検討した。
【０３９４】
参照バッチおよびザノリムマブ混合バッチ（重鎖のグリコシル化の点で異なる）を、存在するグリコシル化重鎖のレベル、およびいくつかのアッセイとの相関の可能性に従ってランク付けした。
【０３９５】
参照バッチMRS-CD4-001と比較して、バッチUNG-MRS-CD4、M50-MRS-CD4、およびM90-MRS-CD4はいずれもCD4に対して同程度に結合した（図15B；同じく図9も）が、FcγRI（図15C；同じく図13および14も）およびFcγRIIIa176V（図15D；同じく図5も）に対する結合には違いがあり、それは重鎖グリコシル化のレベルと相関する。AlphaScreen（商標）アッセイ（図15E；図12）および機能的ADCC（図15A；同じく図3も）においても、この相関は存在する。
【０３９６】
これらのデータは、FcγRに対する結合が、その作用機序において決定的な役割を果たす、抗体Fcを介した活性と相関することを示している。
【０３９７】
実施例18
FcγRIIIa176Vの脱シアリル化はFcγRIIIa176V結合性ELISAの成績を改善する
CHO-K1SV細胞に由来するFcγRIIIa176Vの2つのバッチを、プレートに結合したFcγRIIIa176V結合性ELISAにおける適合性に関して検討した（上記の通り）。Greinerプレートを100μlの2.5μg／ml FcγRIIIa176Vバッチ646-005-EPまたは655-015-EPでコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートを200μlのPBST（0.05％Tween-20を含むPBS）で3回洗浄し、系列希釈した100μlのザノリムマブ試料（ザノリムマブの濃度は300、75、18.75、4.69、0.29、1.17、0.07、および0.02μg／ml）を添加した。プレートを振盪条件下にて室温で60分間インキュベートし、続いて200μlのPBSTで3回洗浄し、その後に結合物である1：4000に希釈したペルオキシダーゼ結合affinipure F(ab')2フラグメントG-抗Hu-IgG、F(ab')2フラグメント特異物（（Jackson lmmunoResearch, Brunschwig Chemie B.V., Amsterdam, The Netherlands）を添加した。プレートを再び振盪条件下にて室温で60分間インキュベートし、続いて200μlのPBSTで3回洗浄した。100μlのABTS（Roche、カタログ番号1112597）を添加し、プレートを振盪条件下で30分間インキュベートした。反応を100μlの2％シュウ酸の添加によって停止させ、405nmでの吸光度を測定した。その結果は図16に示されている。
【０３９８】
バッチ646-005-EPは上限値の高い優れた用量反応曲線を示したが、バッチ655-015-EPは上限値がより低いはるかに緩やかな曲線を示した。以前に、これらのバッチは、ネイティブゲル電気泳動によって描出されているように、負電荷の点で違いがあることが指摘されており、すなわち、バッチ655-015-EPはバッチ646-005-EPよりも多くの負電荷を含むように思われる（図17）。加えて、この2つのバッチは還元SDS-PAGE上では異なる移動度を示すものの、それらは酵素的脱グリコシル化の後では同じ位置に移動した（図18）。このことは、分子量の違いがN結合型グリコシル化の違いによって引き起こされたことを示している。シアル酸をバッチ655-015-EPから除去し、脱シアリル化受容体をFcγRIIIa176V結合性ELISAにおいて非処理受容体と比較した。
【０３９９】
シアル酸を除去するためには、バッチ655-015-EP（リン酸緩衝食塩水中）をアルスロバクター ウレアファシエンスのシアリダーゼ（Roche、カタログ番号10269611001；約1mgのFcγRIIIa176Vに対して80mUシアリダーゼ）とともに37℃で72時間インキュベートした。インキュベーション後に、脱シアリル化受容体をTALON（商標）ビーズを用いて精製し、実施例5に記載した通りにPD-10カラムを用いて緩衝液をリン酸緩衝食塩水に交換し、濃度が0.45mg／mlである1.2mlの精製脱シアリル化FcγRIIIa176Vを得た（バッチ403-041-EP）。
【０４００】
次に、非処理バッチ655-015-EPおよび脱シアリル化バッチ403-041-EPをSDS-PAGE（図19）およびネイティブゲル電気泳動（図20）によって分析した。脱シアリル化バッチの負電荷は非処理FcγRIIIa176Vと比較してはるかに小さく、分子量も非処理FcγRIIIa176Vと比較して幾分低いように思われた。これにより、受容体の脱シアリル化が首尾良く行われたことが示唆された。
【０４０１】
脱シアリル化性および非処理性のFcγRIIIa176Vをプレート結合FcγRIIIa176V結合性ELISAにおいて比較した。両方の調製物をプレートに対して濃度2.5μg／mlでコーティングし、ザノリムマブによる結合を上記の通りに行わせた。図21は、受容体の脱シアリル化がプレート結合による結合アッセイの成績を有意に改善させることを明らかに示している。
【０４０２】
これが脱シアリル化FcγRIIIa176Vのプレートに対する結合の改善によって説明されるか否かを明らかにするために、脱シアリル化FcγRIIIa176V（バッチ403-041-EP）および非処理FcγRIIIa176V（655-015-EP）の2倍系列希釈をプレートにコーティングした。出発濃度は10μg／mlとした。プレートをPBTSで洗浄し、結合したFcγRIIIa176Vを、マウス抗CD16-FITC（BD Biosciences、カタログ番号555406）に続いてヒツジ抗FITC-HRP（Roche、カタログ番号11426356910）を用いることで検出した。プレートをABTSにより現像した。図22は、実際に脱シアリル化FcγRIIIa176Vが、非処理FcγRIIIa176Vと比較して、プレートに対する結合の改善を示したことを示している。
【０４０３】
実施例19
ELISAプレートにコーティングされたhis捕捉抗体を介したhisタグ付加FcγRIIIa176Vの捕捉は、ELISAの感度を高める
his捕捉抗体を介したhisタグ付加FcγRIIIaECD176VHisの捕捉を、ELISAプレートに対するhisタグ付加FcγRIIIaECD176VHisの直接コーティングと比較した。
【０４０４】
Greinerプレートを、100μlの1μg／ml FcγRIIIa176Vバッチ番号0646-005-EPまたは抗ポリヒスチジンmAb（マウス-抗ポリヒスチジン、IgG1 mAbクローンAD1.1.10、R&D、製品番号MAB050、PBS／5％トレハロース中に0.5mg／ml、ロット番号AEJ 175031）でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートを200μlのPBST（0.05％Tween-20を含むPBS）で3回洗浄し、1％BSAを含むPBSにより60分間にわたりブロックした。抗ポリヒスチジンmAbでコーティングされたプレートをさらに100μlの1μg／ml FcγRIIIa158Vバッチとともに振盪条件下にて室温で60分間インキュベートし、その後に200μlのPBSTで3回洗浄した。両方のタイプのコーティングされたプレートを、100μlの系列希釈したHuMax-EGFr試料（HuMax-EGFrの濃度は300、75、18.75、4.69、0.29、1.17、0.07、および0.02μg／ml；バッチ1 #095-03-01Fおよびバッチ2 #P247740）とともに振盪条件下にて室温で60分間インキュベートし、その後に200μlのPBSTで3回洗浄し、続いて、結合物である1：10,000に希釈したペルオキシダーゼ結合affinipure F(ab')2フラグメントG-抗Hu-IgG、F(ab')2フラグメント特異物（Jackson lmmunoResearch, Brunschwig Chemie B.V., Amsterdam, The Netherlands）を添加した。プレートを振盪条件下にて室温で60分間インキュベートし、200μlのPBSTで3回洗浄した。100μlのABTSを添加し、プレートを振盪条件下にて約20分間インキュベートした。反応を100μlの2％シュウ酸の添加によって停止させ、405nmでの吸光度を測定した。
【０４０５】
図23には、直接的に（上のパネル）またはhis捕捉mAbを介して（下のパネル）コーティングされたFcγRIIIa176Vに対する、抗体HuMax-EGFrの2つのバッチの結合曲線が提示されている（データは平均±SDである、n＝3）。his-捕捉を介したコーティングは、HuMax-EGFr-FcγRIIIa176V相互作用に関してより高い親和性をもたらし、直接的にコーティングされたFcγRIIIa176Vと比較して親和性が約4倍の高さであった。より高い親和性は、解離がより遅い点からも好都合である。したがって、his捕捉抗体を介したhisタグ付加FcγRIIIa176Vの捕捉は、結合性ELISAの感度を高める。注目されることに、2つの被験HuMax-EGFrバッチのEC50比はどちらのELISA形式についても同じであり（平均で約2）、このことはアッセイ形式が相対的効力の判定に関して同等であることを示している。
【０４０６】
実施例20
ザノリムマブによるCD4+ T細胞のCD4受容体のFc依存性ダウンモジュレーション
ザノリムマブがエフェクター細胞の存在下でCD4をダウンレギュレートする能力を、PBMC由来のCD4+ T細胞（単離については実施例7参照）またはSUP-T1細胞を用いて、PBMC由来の単球（単離はDynal（登録商標）monocyte Negative Isolation Kitのプロトコールに従った）またはTPH-1細胞の添加の有無別に検討した。PBMC細胞またはSUP-T1細胞を、ある濃度範囲にわたるザノリムマブ、ザノリムマブ-F(ab')2フラグメント（SUP-T1）、ザノリムマブ-Fab（SUP-T1）、または陰性対照HuMab-KLHとともにインキュベートした。適宜、エフェクター細胞を、エフェクター細胞：標的細胞の比が10：1、5：1、または4：1となるように添加した。IFN-γ（濃度は125〜1000μg／mlの範囲）を添加し、細胞を一晩インキュベートした。その後に、細胞を、蛍光色素標識MT477（BDからの非競合性Ab）によりCD4に関して、および標的細胞選択マーカー（標的細胞を他の細胞と区別するため）に関して染色した。細胞に付随する蛍光をフローサイトメトリーによって評価した。
【０４０７】
図24には、新たに単離したCD4+ T細胞またはSUP-T1 T細胞を用いて、ザノリムマブがCD4ダウンレギュレーションを誘導する能力が、非競合性CD4モノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーによって示されている。ザノリムマブは、精製された初代CD4+ T細胞（図4A）またはSUP-T1 T細胞（図4B）からのCD4を用量依存的にダウンレギュレートし、それはそれぞれ単球または単球性細胞系の存在を必要とした。これらの結果により、18〜24時間後にはCD4の発現レベルが50〜80％低下することが示された。F(ab')2フラグメントとのインキュベーションは補助細胞の存在下でも非存在下でもCD4発現の低下をもたらさなかったため、ダウンモジュレーションはFc依存的であるように思われた（図4B）。mAbが高濃度であると、可溶性ザノリムマブはCD4をダウンレギュレートすることができず、これはおそらく単量体結合が生じ、結果として架橋の減少が引き起こされたためと考えられる。固定化されたザノリムマブを介した架橋またはプレートに結合したIgG-架橋Abと可溶性ザノリムマブとのプレインキュベーションもCD4をダウンレギュレートした（非提示データ）。
【０４０８】
本明細書中に引用された、刊行物、特許出願、および特許を含むすべての参考文献は、それぞれの参考文献が参照により組み入れられることが個別的および特定的に示されている場合、およびその全体が本明細書中に述べられる場合と同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【０４０９】
すべての見出しおよび小見出しは、本明細書において便宜のみのために用いられており、本発明をいかなる意味でも制限するものとはみなされるべきではない。
【０４１０】
そのすべての可能な変形物における、上記の要素の任意の組み合わせは、本明細書において別の指定がない限り、または文脈によって他の様式で明らかに否定されない限り、本発明に含まれる。
【０４１１】
「1つの（a）」および「1つの（an）」および「その（the）」ならびに本発明を説明する文脈における類似の指示物は、本明細書において別の指定がない限り、または文脈によって他の様式で明らかに否定されない限り、単数形および複数形の両方を範囲に含むものとみなされるべきである。
【０４１２】
本明細書における値の範囲に関する記述は、本明細書において別の指定がない限り、それぞれの別個の値がその範囲に収まることを個別的に指すための簡潔な方法としての役割を果たすことを単に意図しており、それぞれの別個の値は、それらが本明細書において個別的に記述されるのと同程度に本明細書に組み入れられる。別の指定がない限り、本明細書中に提供されたすべての厳密な値は、対応する大まかな値の代表物であり（例えば、特定の因子または測定値に関して提供されるすべての例示的な厳密な値は、「約」によって適宜修飾される、対応する大まかな測定値を提供するものともみなすことができる）。
【０４１３】
本明細書中に記載したすべての方法は、本明細書において別の指定がない限り、または文脈によって他の様式で明らかに否定されない限り、任意の適切な順序で行うことができる。
【０４１４】
本明細書中に提供される、任意およびすべての例または例示的な言葉（例えば、「など（such as）」）は、本発明をより良く例示することのみを意図しており、別の指定がない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言葉も、明示的に記述されていない限りは、いずれかの要素が本発明の実施のtまえに必須であることを示すものとみなされるべきではない。
【０４１５】
本明細書における特許文書の引用および組み入れは、便宜のためにのみ行われており、そのような特許文書の妥当性、特許性、および／または権利行使可能性に関するいかなる見方を反映するものでもない。
【０４１６】
1つまたは複数の要素に言及しての、「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」または「含む（containing）」などの用語を用いた、本発明の任意の態様の本明細書における記述は、本明細書において別の指定がない限り、または文脈によって他の様式で明らかに否定されない限り、その特定の1つまたは複数の要素「からなる（consists of）」、「から本質的になる（consists essentially of）」、または「から実質的になる（substantially consists of）」本発明の類似の態様に対する支持を提供することを意図している（例えば、特定の要素を含むとして本明細書中に記載された組成物は、別の指定がない限り、または文脈によって明らかに否定されない限り、その要素からなる組成物も記載するものと理解されるべきである）。
【０４１７】
本発明は、準拠法によって許容される最大限の程度にわたり、本明細書中に提示された態様において記述された対象のすべての変更物および等価物を含む。
【０４１８】
本明細書中に引用された、すべての特許、出願中の特許出願および他の刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０４１９】
【図１】ザノリムマブのバッチの非還元性SDS-PAGE。MEV001、MEV005、MRS-CD4-001、BN078、およびBO118は、重鎖グリコシル化に違いのあるザノリムマブのバッチである。UNG-MRS-CD4は脱グリコシル化ザノリムマブのバッチ（抗体Fc中のAsn 297に通常付着している糖質を欠く）であり、MOCK-MRS-CD4は偽性（sham）脱グリコシル化バッチであり、M90-MRS-CD4およびM50-MRS-CD4は、それぞれ重鎖の90％および重鎖の50％がグリコシル化されている混合バッチ（脱グリコシル化参照バッチと完全グリコシル化参照バッチの混合物）である。
【図２】ザノリムマブのバッチの還元性SDS-PAGE。MEV001、MEV004、MEV005、MRS-CD4-001、BN078、およびBO118は、重鎖グリコシル化に違いのあるザノリムマブのバッチである。UNG-MRS-CD4は脱グリコシル化ザノリムマブのバッチであり、MOCK-MRS-CD4は偽性脱グリコシル化バッチであり、M90-MRS-CD4およびM50-MRS-CD4は、それぞれ重鎖の90％および重鎖の50％がグリコシル化されている混合バッチ（脱グリコシル化参照バッチと完全グリコシル化参照バッチの混合物）である。
【図３】ザノリムマブのバッチがADCCを誘導する能力。参照バッチMRS-CD4-001を基準としたバッチの相対活性（下限固定曲線のEC50値から導き出される）および幾何平均が95％信頼区間とともに示されている。
【図４】脱グリコシル化混合バッチがADCCを誘導する能力。参照バッチMRS-CD4-001、MOCK-MRS-CD4偽性脱グリコシル化バッチ、ならびに混合バッチ（脱グリコシル化GMP#3バッチとグリコシル化GMP#3バッチの混合物）、M50-GMP#3-CD4（50％が脱グリコシル化GMP#3）、M70-GMP#3-CD4（30％脱グリコシル化GMP#3）、およびM90-GMP#3（10％脱グリコシル化GMP#3）。3回の実験のうち1つの代表的なものの結果（表2の結果も参照）が、ある濃度範囲にわたる（部分的）脱グリコシル化バッチの存在下におけるCD4+ T細胞の比溶解として示されている（単一データポイント）。図4A：カーブフィッティングは、下限を共通の値に固定した上で、4パラメーターロジスティックフィッティングを用いて行った。図4B：カーブフィッティングは、下限レベル、上限レベル、および傾きを制約した上で、4パラメーターロジスティックフィッティングを用いて行った。GMP#3は特許品バッチである。
【図５】ザノリムマブのバッチと、プレートに結合したFcγRIIIaECD176VHisとの結合。参照バッチMRS-CD4-001を基準とした相対的効力および幾何平均が95％信頼区間とともに示されている。MEV001、MEV005、BN078、およびBO118は、重鎖グリコシル化に違いのあるザノリムマブのバッチである。MOCK-MRS-CD4は偽性脱グリコシル化バッチであり、M90-MRS-CD4およびM50-MRS-CD4は、それぞれ重鎖の90％および重鎖の50％がグリコシル化されている混合バッチ（脱グリコシル化参照バッチと完全グリコシル化参照バッチの混合物）である。
【図６】ザノリムマブの脱グリコシル化混合バッチと、プレートに結合したFcγRIIIaECD176VHisとの結合。参照バッチMRS-CD4-001、MOCK-MRS-CD4は偽性脱グリコシル化バッチであり、M50-GMP#3-CD4、M70-GMP#3-CD4、およびM90-GMP#3は混合バッチ（脱グリコシル化GMP#3バッチとグリコシル化GMP#3バッチの混合物）である。2回の実験のうち1つの代表的なものの結果（表3のデータも参照）が、ある濃度範囲にわたる（部分的）脱グリコシル化バッチの存在下におけるFcγRIIIa176Vとの結合として示されている（三つ組のデータポイント）。カーブフィッティングは、下限レベル、上限レベル、および傾きを制約した上で、4パラメーターロジスティックフィッティングを用いて行った。GMP#3は特許品バッチである。
【図７】ザノリムマブのバッチの重鎖グリコシル化と、FcγRIIIaECD176VHisと結合する能力との関係。図6および表3に記載されたバッチを、グリコシル化重鎖の含有率に従って（左から右に）ランク付けした。結果は、親バッチGMP#3を基準とした、FcγRIIIaECD176VHisと結合する相対的効力として示されている（n＝2回の実験の平均±SD）。
【図８】ザノリムマブのバッチがADCCを誘導する能力と、FcγRIIIaECD176VHisと結合する能力との相関。表2に記載されたザノリムマブのバッチがADCCを誘導する相対的効力と、図6および表3に記載されたザノリムマブのバッチがFcγRIIIaECD176VHisと結合する相対的効力を、x軸およびy軸に対してプロットした（親バッチGMP#3を基準とした効力）。相関係数はプロット中に示されている。
【図９】ザノリムマブのバッチと、プレートに結合したCD4との結合。参照バッチMRS-CD4-001を基準とした相対的効力および幾何平均が95％信頼区間とともに示されている。MEV001、MEV005、BN078、およびBO118は、重鎖グリコシル化に違いのあるザノリムマブのバッチである。UNG-MRS-CD4は非グリコシル化ザノリムマブであり、MOCK-MRS-CD4は偽性脱グリコシル化バッチであり、M90-MRS-CD4およびM50-MRS-CD4は、それぞれ重鎖の90％および重鎖の50％がグリコシル化されている混合バッチ（脱グリコシル化参照バッチと完全グリコシル化参照バッチの混合物）である。
【図１０】ザノリムマブの脱グリコシル化混合バッチと、プレートに結合したCD4との結合。参照バッチMRS-CD4-001、MOCK-MRS-CD4偽性脱グリコシル化バッチ、ならびに混合バッチ（脱グリコシル化GMP#3バッチとグリコシル化GMP#3バッチの混合物）、M50-GMP#3-CD4（50％脱グリコシル化GMP#3）、M70-GMP#3-CD4（30％脱グリコシル化GMP#3）およびM90-GMP#3（10％脱グリコシル化GMP#3）。2回の実験のうち1つの代表的なものの結果（表4のデータも参照）が、ある濃度範囲にわたる（部分的）脱グリコシル化バッチの存在下におけるCD4との結合として示されている（三つ組のデータポイント）。カーブフィッティングは、下限レベル、上限レベル、および傾きを制約した上で、4パラメーターロジスティックフィッティングを用いて行った。GMP#3は特許品バッチである。
【図１１】ザノリムマブがIL-2産生を阻害する能力。MEV001、MEV005、MRS-CD4-001、BN078、およびBO118は、重鎖グリコシル化に違いのあるザノリムマブのバッチである。MOCK-MRS-CD4は偽性脱グリコシル化バッチであり、M90-MRS-CD4およびM50-MRS-CD4は、それぞれ重鎖の90％および重鎖の50％がグリコシル化されている混合バッチ（脱グリコシル化参照バッチと完全グリコシル化参照バッチの混合物）である。
【図１２】AlphaScreen（商標）を利用したアッセイによる、いくつかのザノリムマブのバッチのFcγRIIIaECD176VHis結合およびCD4結合のスクリーニング。参照バッチMRS-CD4-001を基準とした相対的効力および幾何平均が95％信頼区間とともに示されている。MEV005、BN078、およびBO118は、重鎖グリコシル化に違いのあるザノリムマブのバッチである。UNG-MRS-CD4は脱グリコシル化ザノリムマブのバッチであり、MOCK-MRS-CD4は偽性脱グリコシル化バッチであり、M90-MRS-CD4およびM50-MRS-CD4は、それぞれ重鎖の90％および重鎖の50％がグリコシル化されている混合バッチ（脱グリコシル化参照バッチと完全グリコシル化参照バッチの混合物）である。
【図１３】ザノリムマブが、細胞に結合したFcγRIと結合する能力。参照バッチMRS-CD4-001を基準とした相対的効力および幾何平均が95％信頼区間とともに示されている。MEV005、BN078、およびBO118は、重鎖グリコシル化に違いのあるザノリムマブのバッチである。UNG-MRS-CD4は脱グリコシル化ザノリムマブのバッチであり、MOCK-MRS-CD4は偽性脱グリコシル化バッチであり、M90-MRS-CD4およびM50-MRS-CD4は、それぞれ重鎖の90％および重鎖の50％がグリコシル化されている混合バッチ（脱グリコシル化参照バッチと完全グリコシル化参照バッチの混合物）である。
【図１４】ザノリムマブが、プレートに結合したFcγRIと結合する能力。参照バッチMRS-CD4-001を基準とした相対的効力および幾何平均が95％信頼区間とともに示されている。MEV001、BN078、およびBO118は、重鎖グリコシル化に違いのあるザノリムマブのバッチである。UNG-MRS-CD4は脱グリコシル化ザノリムマブのバッチであり、MOCK-MRS-CD4は偽性脱グリコシル化バッチであり、M90-MRS-CD4およびM50-MRS-CD4は、それぞれ重鎖の90％および重鎖の50％がグリコシル化されている混合バッチ（脱グリコシル化参照バッチと完全グリコシル化参照バッチの混合物）である。
【図１５】ザノリムマブのバッチによってADCCが誘導される能力と、いくつかのアッセイにおける相対的効力との相関。ザノリムマブのバッチを、存在するグリコシル化重鎖のレベルに従ってランク付けし、いくつかの指定されたアッセイの結果との潜在的な相関について提示している。15A：ADCCアッセイ（図3）。15B：CD4結合アッセイ（図9）。15C：FcγRI結合アッセイ（図13および14）。15D：FcγRIIIaECD176VHis結合（図5）。15E．sCD4およびFcγRIIIaECD176VHis結合（図12）。
【図１６】プレートに結合したFcγRIIIaECD176VHisとの結合に関するELISAにおける、2つのCHO-K1SV由来FcγRIIIaECD176VHisバッチの比較。2つの異なるFcγRIIIaECD176VHisバッチ（646-005-EPおよび655-015-EP）をプレートにコーティングし、これらのバッチに対するHuMax-CD4の結合を比較した。
【図１７】実施例18に記載されたFcγRIIIaECD176VHisバッチ646-005-EPおよび655-015-EPのネイティブ電気泳動。
【図１８】非処理および脱グリコシル化FcγRIIIa176Vの4〜10％還元性Nupage Bis-Tris分析。レーン1：非処理FcγRIIIaECD176VHisバッチ646-005-EP；レーン2：脱グリコシル化FcγRIIIaECD176VHisバッチ646-005-EP；レーン3：非処理FcγRIIIaECD176VHisバッチ655-015-EP；レーン4：脱グリコシル化FcγRIIIaECD176VHisバッチ655-015EP。マーカーの移動度（kDa）は左に表示されている。
【図１９】非処理および脱シアリル化FcγRIIIaECD176VHisの4〜10％還元性Nupage Bis-Tris分析。レーン1：非処理FcγRIIIaECD176VHisバッチ655-015-EP；レーン2：脱シアリル化FcγRIIIaECD176VHisバッチ403-041-EP。マーカーの移動度（kDa）は左に表示されている。
【図２０】非処理および脱シアリル化FcγRIIIaECD176FHisのネイティブ電気泳動。レーン1：脱シアリル化FcγRIIIaECD176VHisバッチ655-015-EP；レーン2：非処理FcγRIIIaECD176VHisバッチ403-041-EP。マーカーの移動度（kDa）は左に表示されている。
【図２１】プレートに結合したFcγRIIIaECD176VHisとの結合に関するELISAにおける、脱シアリル化および非処理FcγRIIIaECD176VHisの比較。脱シアリル化FcγRIIIaECD176VHis（バッチ403-041EP）および非処理FcγRIIIaECD176VHis（655-015-EP）をプレートに同じ濃度でコーティングし、これらのバッチに対するザノリムマブの結合を比較した。
【図２２】脱シアリル化および非処理FcγRIIIa176Vのコーティング効率の比較。脱シアリル化および非処理FcγRIIIa176Vの系列希釈物をプレートにコーティングし、結合した受容体をマウス-抗CD16によって検出した。
【図２３】直接的に（A）（上のパネル）、またはhis捕捉（抗ポリヒスチジン）抗体（B）（下のパネル）を介してコーティングされたFcγRIIIaECD176VHisに対する、抗体HuMax-EGFrの2つのバッチの結合曲線を提示している（データは平均±SDである、n＝3）。
【図２４】ザノリムマブはCD4+ T細胞上のCD4発現をダウンモジュレートする。（A）IFNγを伴うか伴わずにインキュベートした単球の存在下または非存在下において可溶性ザノリムマブとともに18時間インキュベートした精製血液CD4+ T細胞を用いて実施した、CD4発現に関する用量反応プロット。（B）THP-1細胞の存在下または非存在下において可溶性ザノリムマブ、ザノリムマブのF(ab')2フラグメント、または対照抗体HuMab-KLHとともに18時間インキュベートしたCD4+ CEM-NKr細胞を用いて実施した、CD4発現に関する用量反応プロット。CD4発現は非競合性の抗CD4抗体MT-477を用いて測定した。
【図２５】配列表。
【図１】
2009501913.tif 000007
【図２】
2009501913.tif 000008
【図３】
2009501913.tif 000009
【図４】
2009501913.tif 000010
【図５】
2009501913.tif 000011
【図６】
2009501913.tif 000012
【図７】
2009501913.tif 000013
【図８】
2009501913.tif 000014
【図９】
2009501913.tif 000015
【図１０】
2009501913.tif 000016
【図１１】
2009501913.tif 000017
【図１２】
2009501913.tif 000018
【図１３】
2009501913.tif 000019
【図１４】
2009501913.tif 000020
【図１５】
2009501913.tif 000021
【図１６】
2009501913.tif 000022
【図１７】
2009501913.tif 000023
【図１８】
2009501913.tif 000024
【図１９】
2009501913.tif 000025
【図２０】
2009501913.tif 000026
【図２１】
2009501913.tif 000027
【図２２】
2009501913.tif 000028
【図２３】
2009501913.tif 000029
【図２４】
2009501913.tif 000030
【図２５−１】
2009501913.tif 000031
【図２５−２】
2009501913.tif 000032
【配列表】
2009501913000001.app
【国際調査報告】
2009501913.tif 000033
2009501913.tif 000034
2009501913.tif 000035
2009501913.tif 000036