(57)【要約】本発明は、アミン含有除草剤（例えばグリホサートおよびグリホシネート）を分解することができる新タイプの酵素、ならびにこれらの酵素をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明は、またアミン含有除草剤活性に対して耐性である、これらの酵素を生産するトランスジェニック植物にも関する。加えて、本発明は、この新タイプの酵素の活性に依存するバイオレメディエーション法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリホサートを開裂させてグリシンを生産する、実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項２】
グリホサートのホスホノメチルＣ−３炭素と窒素の結合を開裂させる、実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項３】
単一アミノ酸鎖を含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが可溶性である、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
グリホサートの開裂の結果として、グリオキシレートが実質的に生産されない、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
グリホサートの開裂の結果として、サルコシンが実質的に生産されない、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ＧＯＸ（配列番号３）を開裂させる効率より大きいグリホサートを開裂させる効率を有する、実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項８】
５５０μｍｏｌ分-1ｍｇ-1より大きい、グリホサートの開裂についての比活性を有する、実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項９】
ｉ）配列番号１に提供されるアミノ酸配列；および
ｉｉ）ｉ）と少なくとも２５％同一であるアミノ酸配列
から選択される配列を含み、
前記ポリペプチドがアミン含有除草剤を開裂させる、
実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項１０】
前記アミン含有除草剤が、グリホサートまたはグルホシネートである、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが配列番号１と少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９または請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９または請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドはアルスロバクター属種から精製することができる、請求項１から１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記アルスロバクター属種が、アルスロバクター属種ＴＢＤである、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
少なくとも１つの他のポリペプチドに融合している、請求項１から１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
ｉ）配列番号２、
ｉｉ）請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ）ｉ）と少なくとも２５％同一であるヌクレオチドの配列、
ｉｖ）低ストリンジェンシー条件下でｉ）にハイブリダイズするヌクレオチドの配列、
ｖ）ｉ）からｉｖ）に相補的なヌクレオチドの配列
から選択される配列を有するヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
アミン含有除草剤を開裂させるポリペプチドをコードする、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記アミン含有除草剤が、グリホサートまたはグルホシネートである、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
ストリンジェントな条件下でｉ）にハイブリダイズする配列を含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
植物細胞において機能する３’ポリアデニル化配列に作動可能に連結されている、請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする構造ＤＮＡ配列に作動可能に連結されている、前記細胞において機能するプロモーターを含む、組換えポリヌクレオチドであって、前記プロモーターは、前記構造ＤＮＡ配列に対して異種であり、前記構造ＤＮＡ配列を発現して前記細胞のアミン含有除草剤に対する耐性を強化することができる組換えポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項１６から２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
請求項１６から２０のいずれか一項に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチドおよび／または請求項２１もしくは請求項２２に記載の少なくとも１つのベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
植物細胞である、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
グリホサートを開裂させ、グリシンを生産する組換え細胞。
【請求項２６】
グリホサートのホスホノメチルＣ−３炭素と窒素の結合を開裂させる導入ポリペプチドを含む組換え細胞。
【請求項２７】
請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチドを調製するためのプロセスであって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で、前記ポリペプチドをコードする請求項２３に記載の宿主細胞、または前記ポリペプチドをコードする請求項２２に記載のベクターを培養する工程、および発現されたポリペプチドを回収する工程を含む、前記プロセス。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法を用いて生産されるポリペプチド。
【請求項２９】
請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項３０】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の少なくとも１種のポリペプチド、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチド、請求項２１もしくは請求項２２に記載のベクター、請求項２３もしくは請求項２４に記載の宿主細胞、請求項２５もしくは請求項２６に記載の組換え細胞および／または請求項２９に記載の抗体と１つもしくはそれ以上の許容される担体とを含む組成物。
【請求項３１】
アミン含有除草剤を開裂させるための組成物であって、請求項１から１５のいずれか一項に記載の少なくとも一種のポリペプチドと１つまたはそれ以上の許容される担体とを含む、組成物。
【請求項３２】
金属イオンをさらに含む、請求項３０または請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記金属イオンが、Ｃｏ2+、Ｚｎ2+および／またはＭｇ2+である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
組換え細胞を検出および／または選択するための選択可能マーカーとしての、請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項３５】
組換え細胞を検出するための方法であって、
ｉ）細胞または細胞集団と、請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを、前記細胞による前記ポリヌクレオチドの取り込みを可能にする条件下で接触させる工程、および
ｉｉ）工程ｉ）からの細胞またはそれらの子孫細胞をアミン含有除草剤に曝露することによって組換え細胞を選択する工程、
を含む、前記方法。
【請求項３６】
前記ポリヌクレオチドが、請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレーム、および請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードしない第二のオープンリーディングフレームを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第二のオープンリーディングフレームが、ポリペプチドをコードする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記第二のオープンリーディングフレームが、翻訳されないポリヌクレオチドをコードする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記翻訳されないポリヌクレオチドが、触媒核酸、ｄｓＲＮＡ分子またはアンチセンス分子をコードする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞が、植物細胞、細菌細胞、真菌細胞または動物細胞である、請求項３５から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞が植物細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記アミン含有除草剤が、グリホサートまたはグルホシネートである、請求項３５から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
アミン含有除草剤を開裂させるための方法であって、アミン含有除草剤と請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチドとを接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項４４】
前記ポリペプチドが、請求項２３または請求項２４に記載の宿主細胞によって生産される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の少なくとも一種のポリペプチドをコードする外因ポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック植物。
【請求項４６】
前記ポリペプチドが、前記トランスジェニック植物の空気中で成長する部分において少なくとも生産される、請求項４５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４７】
前記ポリヌクレオチドが、前記植物のゲノムに安定して組み込まれている、請求項４５または請求項４６に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４８】
アミン含有除草剤に対する耐性が強化された植物の生産する方法であって、
ａ）ポリヌクレオチドを植物細胞のゲノムに挿入する工程であって、該ポリヌクレオチドは、植物細胞においてＲＮＡ配列を生産させるように機能するプロモーターであって、作動可能に連結されているプロモーターと；請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするＲＮＡ配列の生産を生じさせる構造ＤＮＡ配列であって、作動可能に連結されている構造ＤＮＡ配列と；植物細胞において前記ＲＮＡ配列の３’末端でポリアデニルヌクレオチドの付加を生じさせるように機能する３’非翻訳領域とを含み、前記プロモーターは、前記構造ＤＮＡ配列に対して異種であり、および前記ＤＮＡ分子で形質転換される植物細胞のアミン含有除草剤に対する耐性を強化するために十分なポリペプチドの発現を生じさせるように適合される、工程；
ｂ）形質転換植物細胞を得る工程；および
ｃ）前記形質転換植物細胞から、アミン含有除草剤に対する耐性が増された遺伝的に形質転換された植物を再生させる工程
を含む、前記方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法を用いて生産されるトランスジェニック植物。
【請求項５０】
サンプル中のアミン含有除草剤を開裂させるための方法であって、請求項４５から４７または４９のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物にサンプルを曝露する工程を含む、前記方法。
【請求項５１】
前記サンプルが土壌である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の少なくとも一種のポリペプチドをコードする外因ポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５３】
オーストラリアの国家計量研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に２００６年４月１１日にアクセッション番号Ｖ０６／０１０９６０で寄託されたアルスロバクター属種の分離株。
【請求項５４】
請求項５３に記載の株と１つまたはそれ以上の許容される担体とを含む、アミン含有除草剤を開裂させるための組成物。
【請求項５５】
請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、請求項２３もしくは請求項２４に記載の宿主細胞、請求項２５もしくは請求項２６に記載の組換え細胞、請求項４５から４７もしくは４８のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物、請求項５２に記載のトランスジェニック非ヒト動物または請求項５３に記載の株の抽出物。
【請求項５６】
請求項５５に記載の抽出物と１つまたはそれ以上の許容される担体とを含む、アミン含有除草剤を開裂させるための組成物。
【請求項５７】
アミン含有除草剤を開裂されるための方法であって、請求項５３に記載の株および／または請求項５５に記載の抽出物にアミン含有除草剤を曝露することを含む、前記方法。
【請求項５８】
請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチドを生産する、単離された細菌。
【請求項５９】
アルスロバクター属種である、請求項５８に記載の細菌。
【請求項６０】
アミン含有除草剤を開裂させるための、請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチドを生産する単離された天然に存在する細菌の使用。
【請求項６１】
ポリマー多孔質支持体上に固定された請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、アミン含有除草剤を開裂させるためのポリマースポンジまたはフォーム。
【請求項６２】
アミン含有除草剤を開裂させるための方法であって、請求項６１に記載のスポンジまたはフォームにアミン含有除草剤を曝露することを含む、前記方法。
【請求項６３】
請求項４５から４７または４９のいずれか一項に記載の植物から生産される製品。
【請求項６４】
請求項４５から４７または４９のいずれか一項に記載の植物の部分。
【請求項６５】
種子である、請求項６４に記載の植物の部分。
【請求項６６】
アミン含有除草剤を開裂させる能力が強化されたポリペプチドを生産する方法であって、
（ｉ）請求項１から１５のいずれか一項に記載の第一のポリペプチドの１つまたはそれ以上のアミノ酸を変更する工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）から得られた変更ポリペプチドの、アミン含有除草剤を開裂させる能力を判定する工程、および
（ｉｉｉ）第一のポリペプチドと比較してアミン含有除草剤を開裂させる能力が強化されている変更ポリペプチドを選択する工程
を含む、前記方法。
【請求項６７】
請求項６６に記載の方法によって生産されるポリペプチド。
【請求項６８】
アミン含有除草剤を開裂させることができる微生物についてスクリーニングするための方法であって、
ｉ）唯一の窒素源としてのアミン含有除草剤の存在下で候補微生物を培養する工程；および
ｉｉ）その微生物が増殖および／または分裂できるかどうかを判定する工程
を含む、前記方法。
【請求項６９】
請求項１から１５、２８もしくは６７のいずれか一項に記載の少なくとも１種のポリアミド、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の少なくとも一種のポリヌクレオチド、請求項２１もしくは請求項２２に記載のベクター、請求項２３もしくは請求項２４に記載の宿主細胞、請求項２５もしくは請求項２６に記載の組換え細胞、請求項２９に記載の抗体、請求項３０から３３、５４もしくは５６のいずれか一項に記載の組成物、請求項５３に記載の少なくとも１つの株、請求項５５に記載の少なくとも１つの抽出物、請求項５８もしくは請求項５９に記載の少なくとも１つの細菌、請求項６１に記載の少なくとも１つのポリマースポンジもしくはフォーム、請求項６３に記載の少なくとも１つの製品、および／または請求項６４もしくは請求項６５の一項に記載の請求項の少なくとも１つの部分を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アミン含有除草剤、例えばグリホサートおよびグルホシネート（glufosinate）を分解することができる新タイプの酵素、ならびにこれらの酵素をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明は、アミン含有除草剤活性に対して耐性である、これらの酵素を生産するトランスジェニック植物にも関する。加えて、本発明は、この新タイプの酵素の活性に依存するバイオレメディエーションの方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
有機ホスホネートは、化学的、熱的および酵素的な分解に対して相対耐性を付与する安定した炭素−リン（Ｃ−Ｐ）結合によって特徴付けられる。天然の有機ホスホネートは、リンの生物地球化学的循環において重要な役割を有し、そして合成有機ホスホネートには、化学工業での様々な応用例を有し、最も目立つところでは、除草剤、例えばグリホサート（Ｎ−ホスホノメチルグリシン）およびホスフィノトリシン（ＢａｓｔａTM）がある。
【０００３】
グリホサート（Ｎ−ホスホノメチルグリシン）は、５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）酵素、シキミ酸系路の成分を阻害するホスホネート除草剤である。植物は、必須芳香族アミノ酸およびビタミン類の生産のためにシキミ酸系路を利用し、グリホサートは、ＥＰＳＰＳによるホスホエノールピルビン酸と３−ホスホシキミ酸の５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸への変換を特異的に中断させる。
【０００４】
一旦ホスホネートが土壌に入ると、微生物の活動は、主としてそれらの除去を担当し、この微生物の活動は、以下の２つの主要な経路に分けられる：微生物が唯一のリン源としてホスホネートを利用する、ｐｈｏレギュロンによって調節されるホスフェート飢餓依存性メカニズム（Wanner, 1994）、ならびに細菌が唯一の炭素、窒素およびリンの源としてホスホネートを利用する、ホスフェート非依存性メカニズム（Ternan et al., 1998a; Ternan et al., 1998b; McGrath et al., 1998）。唯一のホスフェート源としてホスホネート（グリホサートを含む）を利用することができる真菌分離株も記載されており、幾つかの異なる経路（場合によると細菌のものに類似している）が関与し得ると仮定されている（Kryskol-Lupicka et al., 1997）。試験された真菌分離株は、すべて、グリホサートの分解からの主産物としてＡＭＰＡを生産した。これは、細菌ＧＯＸ（ＷＯ  ９２／００３７７）に類似した真菌酵素が関与することを示唆している。
【０００５】
その分子の環境的運命についての懸念と、植物中のＥＰＳＰＳレベルを増加させることにより、またはグリホサートに対して耐性を付与する修飾ＥＰＳＰＳで天然ＥＰＳＰＳを置換することにより除草剤耐性植物を工学作製するための系をさらに補足するものとしての関心との、両方に起因して、グリホサート除草剤の酵素的な分解または修飾に関心が集まっている。土壌中でのグリホサート分解は、急速であり、大規模であることが判明し、アミノメチルホスホネート（ＡＭＰＡ）が最も一般的な生成物として特定され（Wackett et al. 1987）、グリホサートを分解することができる幾つかの単一の細菌培養物が記載されている（Malik et al., 1989に総説されている）。
【０００６】
これまでに、純粋な細菌培養物における２つのグリホサート代謝経路が特性付けされている（図１）。ＡＭＰＡへの代謝およびそこからの完全な無機物化が、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）種（Balthazor and Hallas, 1986）、シュードモナス属（Pseudomonas）種（Jacob et al 1988）およびアルスロバクターアトロシアネウス（Arthrobacter atrocyaneus）（Pipke and Amrhein, 1988）について記載されており、その一方で、ｐｈｏ調節性Ｃ−Ｐリアーゼ系によるサルコシンおよび無機ホスフェート（Ｐｉ）へのグリホサートの変換が、シュードモナス(Pseudomonas)種（Shinabarger and Braymer, 1986; Kishore and Jacob, 1987）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）種株ＧＬ、ストレプトマイセス属（Streptomyces）種（Objoska et al., 1999）およびアルスロバクター（Arthrobacter）属種（Pipke et al., 1988）について記載されており、好塩菌ＶＨ１（Hayes et al., 2000）およびリゾビウムメリロチ（Rhizobium meliloti）１０２１（Liu et al., 1991）について推定されている。
【０００７】
Ｙａｋｏｌｅｖａら（１９８８）が、最初に、ホスフェート依存性Ｃ−Ｐリアーゼ活性に関与するすべての遺伝子をコードするｐｈｎオペロンを大腸菌（E.coli）から単離し、発現させた。ＷｈｉｔｅおよびＭｅｔｃａｌｆ（２００４）が、それに続いて、シュードモナススタッツェリ（Pseudomomas stutzeri）からの２つの別個のオペロン−１つは、大腸菌ｐｈｎオペロンの相同体、およびもう１つは、ホスフィット代謝に関与するハイポホスフィット−２−オキソグルタラートジオキシゲナーゼをコードするｈｔｘオペロン−を記載した。しかし、これらのいずれのＣ−Ｐリアーゼ系も、ＭｃＧｒａｔｈら（１９９５）によって記載された基質特異的ホスホノアセテートヒドロラーゼ酵素と同様に、グリホサートを開裂することはできなかった（White and Metcalf, 2004）。Ｇａｓｔｌｅおよび同僚によって発見された（Castle et al., 2004）ような、グリホサートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）酵素を使用するグリホサートのＮ−アセチル化によってもグリホサート耐性を付与することができ、彼らは、３つの異なるｇａｔ遺伝子のＤＮＡシャッフリングを利用して、ＧＡＴの酵素効率を１００００倍向上させてもいる（Castle et al., 2004; Siehl et al., 2005）。
【０００８】
このような微生物除草剤代謝または修飾酵素を利用する雑草防除の見込みは、Ｐａｄｇｅｔｔｅら（１９９６）およびＶａｓｉｌ（１９９６）によって詳細に論じられている。
【０００９】
特に、植物において発現されたときにグリホサートの分解に利用できる現在の酵素は、あまり高い活性を有さない。したがって、除草剤、例えばグリホサートを分解するために用いることができるさらなる酵素を特定する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
本発明者らは、以前に公知でないグリホサート代謝のメカニズムを利用する細菌を特定した。さらに、本発明者らは、この細菌の新規グリホサート分解性遺伝子−酵素系を単離し、特性付けした。
【００１１】
１つの態様において、本発明は、グリホサートを開裂してグリシンを生産する、実質的に精製されたポリペプチドを提供する。
【００１２】
もう１つの態様において、本発明は、グリホサートのホスホノメチルＣ−３炭素と窒素の結合（phosphonomethyl C-3 carbon to nitrogen bond）を開裂させる、実質的に精製されたポリペプチドを提供する。
【００１３】
特に好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、単一アミノ酸鎖を含む。従って、前記ポリペプチドは、グリホサートを基質として使用する際、グリシンを生産するために多数の反応を必要とする多酵素複合体の一部ではない。
【００１４】
さらなる実施形態において、前記ポリペプチドは、グリホサートをグリシンおよびオキソホスホン酸（またはそのイオン形）へと開裂させる。
【００１５】
さらなる特に好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、可溶性である。従って、前記ポリペプチドは、膜結合型ではない。
【００１６】
もう１つの実施形態において、グリオキシレートは、グリホサートの開裂の結果として、実質的に生産されない。
【００１７】
さらなる実施形態において、サルコシンは、グリホサートの開裂の結果として、実質的に生産されない。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、ＧＯＸ（配列番号３）を開裂させる効率より大きいグリホサートを開裂させる効力を有する、実質的に精製されたポリペプチドを提供する。
【００１９】
さらにもう１つの態様において、本発明は、５５０μｍｏｌ分-1ｍｇ-1より大きい、グリホサートの開裂についての比活性を有する、実質的に精製されたポリペプチドを提供する。
【００２０】
好ましくは、前記比活性は、６００μｍｏｌ分-1ｍｇ-1より大きく、さらに好ましくは７００μｍｏｌ分-1ｍｇ-1より大きく、さらにいっそう好ましくは５，０００μｍｏｌ分-1ｍｇ-1より大きい。
【００２１】
好ましい実施形態において、前記ポリペプチドの比活性は、本明細書の実施例３において概説するとおり、判定することができる。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は、
ｉ）配列番号１；および
ｉｉ）ｉ）と少なくとも２５％同一であるアミノ酸配列
から選択される配列を有するアミノ酸を含む実質的に精製されたポリペプチドを提供し、ここでこのポリペプチドは、アミン含有除草剤を開裂させる。
【００２３】
１つの実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号８または配列番号９として提供される配列を含む。
【００２４】
アミン含有除草剤の例としては、グリホサート、グルホシネート、ビラナホス（bilanafos）およびグリホシンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、前記アミン含有除草剤は、グリホサートまたはグルホシネートである。
【００２５】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、アルスロバクター属(Arthrobacter)種から精製することができる。好ましくは、前記アルスロバクター属種は、アルスロバクター属種ＴＢＤである。
【００２６】
１つの実施形態において、前記ポリペプチドは、少なくとも１種の他のポリペプチドに融合している。
【００２７】
前記少なくとも１種の他のポリペプチドは、例えば、本発明のポリペプチドの安定性を強化するポリペプチド、または前記融合タンパク質の精製を助長するポリペプチドであり得る。
【００２８】
さらなる態様において、本発明は、単離されたポリヌクレオチドを提供し、このポリヌクレオチドは、
ｉ）配列番号２、
ｉｉ）本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ）ｉ）と少なくとも２５％同一であるヌクレオチドの配列、
ｉｖ）低ストリンジェンシー条件下でｉ）にハイブリダイズするヌクレオチドの配列、
ｖ）ｉ）からｉｖ）に相補的なヌクレオチドの配列
から選択される配列を有するヌクレオチドを含む。
【００２９】
好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、アミン含有除草剤を開裂させるポリペプチドをコードする。さらに好ましくは、前記アミン含有除草剤は、グリホサートまたはグルホシネートである。
【００３０】
さらなる実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号８または配列番号９として提供する配列を含むポリペプチドをコードする。
【００３１】
好ましい実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、中等度ストリンジェンシー条件下でｉ）にハイブリダイズする配列を含む。より好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でｉ）にハイブリダイズする配列を含む。
【００３２】
もう１つの態様において、本発明は、植物細胞において機能する３’ポリアデニル化配列に作動可能に連結されている、本発明のポリペプチドをコードする構造ＤＮＡ配列に作動可能に連結されている、前記細胞において機能するプロモーターを含む、組換えポリヌクレオチドを提供し、前記プロモーターは、前記構造ＤＮＡ配列に対して異種であり、前記構造ＤＮＡ配列を発現して前記細胞のアミン含有除草剤に対する耐性を強化することができる。
【００３３】
さらなる態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００３４】
好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。
【００３５】
尚、さらなる態様において、本発明は、本発明の少なくとも一種のポリヌクレオチドおよび／または本発明の少なくとも１つのベクターを含む、宿主細胞を提供する。
【００３６】
前記宿主細胞は、いずれのタイプの細胞であってもよい。１つの実施形態において、前記宿主細胞は、植物細胞である。
【００３７】
もう１つの態様において、本発明は、グリホサートを開裂させ、グリシンを生産する、組換え細胞を提供する。
【００３８】
好ましくは、前記細胞は、本発明のポリヌクレオチドを含み、この場合の細胞は、前記ポリヌクレオチドを天然では含まない。
【００３９】
もう１つの態様において、本発明は、グリホサートを開裂させてグリシンを生産する導入ポリペプチドを含む組換え細胞を提供する。
【００４０】
さらなる態様において、本発明は、グリホサートのホスホノメチルＣ−３炭素と窒素の結合を開裂させる導入ポリペプチドを含む組換え細胞を提供する。
【００４１】
好ましくは、前記ポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドの発現により細胞によって生産される。
【００４２】
もう１つの態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で、前記ポリペプチドをコードする本発明の宿主細胞、または前記ポリペプチドをコードする本発明のベクターを培養する工程、および発現されたポリペプチドを回収する工程を含む。
【００４３】
また、本発明の方法を用いて生産されるポリペプチドも提供される。
【００４４】
さらなる態様において、本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体を提供する。
【００４５】
さらにもう１つの態様において、本発明は、本発明の少なくとも一種のポリペプチド、本発明の少なくとも一種のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の組換え細胞および／または本発明の抗体と１つまたはそれ以上の許容される担体とを含む組成物を提供する。
【００４６】
さらなる態様において、本発明は、アミン含有除草剤を開裂させるための組成物を提供し、この組成物は、本発明の少なくとも一種のポリペプチド、および１つまたはそれ以上の許容される担体を含む。
【００４７】
好ましくは、前記組成物は、金属イオンをさらに含む。好ましい実施形態において、前記金属イオンは、二価金属イオンである。より好ましくは、前記金属イオンは、Ｍｇ2+、Ｃｏ2+、Ｃａ2+、Ｚｎ2+、Ｍｎ2+、およびこれらの組み合わせから選択される。さらにいっそう好ましくは、前記金属イオンは、Ｍｇ2+、Ｚｎ2+、Ｃｏ2+、およびこれらの組み合わせから選択される。
【００４８】
本発明のポリペプチドは、組換え細胞を検出するために、選択可能マーカーとして使用することができる。従って、組換え細胞を検出および／または選択するための検出可能なマーカーとしての、本発明のポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用も提供する。
【００４９】
さらなる態様において、本発明は、組換え細胞を検出するための方法を提供し、この方法は、
ｉ）細胞または細胞集団と、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを、前記細胞による前記ポリヌクレオチドの取り込みを可能にする条件下で接触させる工程、および
ｉｉ）工程ｉ）からの細胞またはそれらの子孫細胞をアミン含有除草剤に曝露することによって組換え細胞を選択する工程
を含む。
【００５０】
好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレーム、および本発明のポリペプチドをコードしない第二のオープンリーディングフレームを含む。
【００５１】
１つの実施形態において、前記第二のオープンリーディングフレームは、ポリペプチドをコードする。第二の実施形態において、前記第二のオープンリーディングフレームは、翻訳されないポリヌクレオチドをコードする。両方の事例において、前記第二のオープンリーディングフレームは、適するプロモーターに作動可能に連結されていることが好ましい。
【００５２】
好ましくは、前記翻訳されないポリヌクレオチドは、触媒核酸、ｄｓＲＮＡ分子またはアンチセンス分子をコードする。
【００５３】
適する細胞の例としては、植物細胞、細菌細胞、真菌細胞または動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、前記細胞は、植物細胞である。
【００５４】
好ましくは、前記アミン含有除草剤は、グリホサートまたはグルホシネートである。
【００５５】
さらなる態様において、本発明は、アミン含有除草剤を開裂させるための方法を提供し、この方法は、アミン含有除草剤を本発明のポリペプチドと接触させる工程を含む。
【００５６】
１つの実施形態において、前記ポリペプチドは、本発明の宿主細胞によって生産される。
【００５７】
好ましくは、前記アミン含有除草剤は、グリホサートまたはグルホシネートである。
【００５８】
本明細書において提供されるポリペプチドは、植物において生産されて、それら宿主植物の、アミン含有除草剤（例えばグリホサート）に曝露された場合に成長する能力を、強化することができる。
【００５９】
従って、なおさらなる態様において、本発明は、本発明の少なくとも一種のポリペプチドをコードする外因ポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック植物を提供する。
【００６０】
好ましくは、前記アミン含有除草剤は、グリホサートまたはグルホシネートである。
【００６１】
１つの実施形態において、前記ポリペプチドは、前記トランスジェニック植物の空気中で成長する部分において少なくとも生産される。
【００６２】
好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、前記植物のゲノムに安定して組み込まれている。
【００６３】
アミン含有除草剤に対する耐性が強化された植物を生産する方法も提供され、この方法は、ａ）ポリヌクレオチドを植物細胞のゲノムに挿入する工程であって、該ポリヌクレオチドは、植物細胞においてＲＮＡ配列を生産させるように機能するプロモーターであって、作動可能に連結されているプロモーターと；本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡ配列の生産を生じさせる構造ＤＮＡ配列であって、作動可能に連結されている構造ＤＮＡ配列と；植物細胞において前記ＲＮＡ配列の３’末端でポリアデニルヌクレオチドの付加を生じさせるように機能する３’非翻訳領域とを含み、ここで前記プロモーターは、前記構造ＤＮＡ配列に対して異種であり、および前記ＤＮＡ分子で形質転換される植物細胞のアミン含有除草剤に対する耐性を強化するために十分なポリペプチドの発現を生じさせるように適合される、工程；
ｂ）形質転換植物細胞を得る工程；および
ｃ）前記形質転換植物細胞から、アミン含有除草剤に対する耐性が増された遺伝的に形質転換された植物を再生させる工程
を含む。
【００６４】
さらなる態様において、本発明は、本発明の方法を用いて生産されるトランスジェニック植物を提供する。
【００６５】
もう１つの態様において、本発明は、サンプル中のアミン含有除草剤を開裂させるための方法を提供し、この方法は、そのサンプルを本発明のトランスジェニック植物に曝露する工程を含む。
【００６６】
好ましくは、前記サンプルは、土壌である。そのような土壌は、野原（field）に存在し得る。
【００６７】
もう１つの態様において、本発明は、本発明の少なくとも一種のポリペプチドをコードする外因ポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【００６８】
さらなる態様において、本発明は、オーストラリア国家計量研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に２００６年４月１１日にアクセッション番号Ｖ０６／０１０９６０で寄託されたアルスロバクター属（Arthrobacter）種の分離株を提供する。
【００６９】
さらにもう１つの態様において、本発明は、アミン含有除草剤を開裂させるための組成物を提供し、この組成物は、前記本発明の株、および１つまたはそれ以上の許容される担体を含む。
【００７０】
さらなる態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを含む、本発明の宿主細胞、本発明の組換え細胞、本発明のトランスジェニック植物、本発明のトランスジェニック非ヒト動物または本発明の株の抽出物を提供する。
【００７１】
さらにもう１つの態様において、本発明は、アミン含有除草剤を開裂させるための組成物を提供し、この組成物は、前記本発明の抽出物、および１つまたはそれ以上の許容される担体を含む。
【００７２】
さらなる態様において、本発明は、アミン含有除草剤を開裂させるための方法を提供し、この方法は、本発明の株および／または本発明の抽出物にアミン含有除草剤を曝露する工程を含む。
【００７３】
また、本発明のポリペプチドを生産する、単離された細菌も提供する。
【００７４】
好ましくは、前記細菌は、アルスロバクター属（Arthrobacter）種である。
【００７５】
さらなる態様において、本発明は、アミン含有除草剤を開裂させるための、本発明のポリペプチドを生産する単離された天然に存在する細菌の使用を提供する。
【００７６】
もう１つの態様において、本発明は、アミン含有除草剤を開裂させるためのポリマースポンジまたはフォームを提供し、このフォームまたはスポンジは、ポリマー多孔質支持体に固定された本発明のポリペプチドを含む。
【００７７】
さらなる態様において、本発明は、アミン含有除草剤を開裂させるための方法を提供し、この方法は、アミン含有除草剤を本発明のスポンジまたはフォームに曝露する工程を含む。
【００７８】
もう１つの態様において、本発明は、本発明の植物から生産される製品を提供する。
【００７９】
製品の例としては、デンプン、油、野菜植物繊維、例えば綿、麦芽および小麦粉が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
さらなる態様において、本発明は、本発明の植物の一部分を提供する。例としては、種子、果実および堅果が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
本発明のポリペプチドは、変異させることができ、結果として生じた変異を、変更された活性（例えば強化された酵素活性）についてスクリーニングすることができる。このような変異は、インビトロ変異誘発およびＤＮＡシャッフリングを含む（しかし、これらに限定されない）当該分野において公知の任意の技術を用いて行うことができる。
【００８２】
従って、さらなる態様において、本発明は、アミン含有除草剤を開裂させる能力が強化されたポリペプチドを生産する方法を提供し、この方法は、
（ｉ）本発明の第一のポリペプチドの１またはそれ以上のアミノ酸を変更させる工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）から得られた変更ポリペプチドの、アミン含有除草剤を開裂させる能力を判定する工程、および
（ｉｉｉ）第一のポリペプチドと比較して、アミン含有除草剤を開裂させる能力が強化されている変更ポリペプチドを選択する工程
を含む。
【００８３】
また本発明のこの方法によって生産されるポリペプチドも提供される。
【００８４】
さらにもう１つの態様において、本発明は、アミン含有除草剤を開裂させることができる微生物をスクリーニングするための方法を提供し、この方法は、
ｉ）唯一の窒素源としてのアミン含有除草剤の存在下で候補微生物を培養する工程；および
ｉｉ）その微生物が増殖および／または分裂できるかどうかを判定する工程
を含む。
【００８５】
１つの実施形態において、前記微生物は、細菌、真菌または原生動物である。
【００８６】
好ましい実施形態において、前記微生物は、組換え微生物である。さらに、多数の異なる外来ＤＮＡ分子を含む組換え微生物の集団をスクリーニングすることが好ましい。そのような外来ＤＮＡ分子の例としては、プラスミドまたはコスミドゲノムＤＮＡライブラリが挙げられる。
【００８７】
好ましくは、前記アミン含有除草剤は、グリホサートである。
【００８８】
また、本発明の方法を用いて単離された微生物も提供される。
【００８９】
さらなる態様において、本発明は、本発明の少なくとも一種のポリペプチド、本発明の少なくとも一種のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の組換え細胞、本発明の抗体、本発明の組成物、本発明の少なくとも１つの株、本発明の少なくとも１つの抽出物、本発明の少なくとも１つの細菌、本発明の少なくとも１つのポリマースポンジもしくはフォーム、本発明の少なくとも１つの製品、および／または本発明の植物の少なくとも一部分を含むキットを提供する。
【００９０】
明らかであるが、本発明の１つの態様の好ましい特性および特徴は、本発明の多くの他の態様にあてはまる。
【００９１】
本明細書全体をとおして、語「含む（comprise）」または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」などの変化形は、述べられている要素、整数もしくは工程または要素、整数もしくは工程の群の包含を意味し、任意の他の要素、整数もしくは工程または要素、整数もしくは工程の群の排除を意味しないことが理解される。
【００９２】
以下は、後続の非限定的実施例によって、および添付の図を参照しながら、本発明を説明する。
【００９３】
配列表の略語一覧
配列番号１  −  ＧｌｏｘＡのアミノ酸配列。
配列番号２  −  ＧｌｏｘＡをコードするヌクレオチド配列。
配列番号３  −  ＧＯＸのアミノ酸配列。
配列番号４および５  −  オリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号６  −  ５’末端および３’末端に付加されたクローニング部位、ならび開始コドンの直ぐ前にＡＡＣＡを含む、植物における発現のために最適化されたＧｌｏｘＡコーディング配列。
配列番号７  −  大腸菌における発現のために最適化されたＧｌｏｘＡコーディング配列。
配列番号８  −  ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）系統ＢＬ２からのＢＯＢＬ。
配列番号９  −  アルスロバクターアウレセンス（Arthobacter aurescens）ＴＣ１からのＧｌｏｘＤ。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】グリホサート代謝経路。Ｉ．多酵素膜結合型Ｃ−Ｐリアーゼ系によるＣ−Ｐ結合の開裂。ＩＩ．アミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ）およびグリオキシレートを生産する、Ｃ2−Ｎ結合の開裂。ＩＩＩ．ＧｌｏｘＡの推定メカニズム−グリシンおよびオキソホスホン酸を生産する、Ｃ3−Ｎ結合の開裂。
【図２】基質としてグリホサートを用いるＧｌｏｘＡにより触媒される推定反応とＧＯＸにより触媒される推定反応の比較（Ａ）およびこれらの酵素反応の結果として生ずるＨＰＬＣ反応プロフィールの比較（Ｂ）。
【図３】ＧＯＸまたはＧｌｏｘＡをコードするプラスミドＤＮＡへのＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーション。消化されたプラスミドおよびコスミドＤＮＡ構築物をＨｙｂｏｎｄＮ+膜に移し、その後、ｇｏｘ遺伝子の３２P−放射性標識ＰＣＲ産物でプローブした。
【図４】グリホサートおよびイミノ二酢酸に対する部分精製されたＧｌｏｘＡの活性とＣＯＸの活性の比較。
【図５】ＧｌｏｘＡのインプランタ（In planta）発現は、標準用量の５倍でグリホサートに対する耐性を付与する。耐性スコアを得るために、植物を、除草剤適用後８日目の葉の健康状態(health)、植物半径および開花について目視評価した。同システムのもとで、完全な健康状態の未処理対照は、７〜８のスコアであった。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
発明の詳細な説明
一般技術
特に別様に定義しない限り、本明細書において用いるすべての技術用語および科学用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学および生化学における）当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有すると解釈するものとする。
【００９６】
別の指示がない限り、本発明において利用する組換えタンパク質、細胞培養および免疫学的技術は、当業者には周知の標準的手順である。そのような技術は、以下の出典の中の著述、例えば、J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)、T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)、D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996)、およびF.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley- Interscience (1988、現在までのすべての改訂版を含む）、Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)、およびJ.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons（現在までのすべての改訂版を含む）のいたるところに記載および説明されており、これらは、本明細書において参考として援用される。
【００９７】
アミン含有除草剤
アミン含有除草剤は、植物に外因的に適用されたときに前記植物に対して有害作用を及ぼすアミン基を有する任意の分子を含む。１つの実施形態において、前記アミン含有除草剤は、有機ホスホネートである。アミン含有除草剤の例としては、グリホサート、グルホシネート、ビラナホスおよびグリホシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
本明細書において用いる場合、用語「グリホサート」は、親除草剤Ｎ−ホスホノメチルグリシン（別にグリホサート酸としても公知である）；そのイオン形；その塩もしくはエステル；または植物組織においてＮ−ホスホノメチルグリシンに変換されるか、もしくはイオン形のＮ−ホスホノメチルグリシン（別にグリホサートイオンとしても公知である）を別様に提供する化合物を集合的に指す。グリホサート塩としては、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウムおよびカリウムの塩；アンモニウム塩；Ｃ1〜16アルキルアンモニウム、例えば、ジメチルアンモニウムおよびイソプロピルアンモニウムの塩；Ｃ1〜16アルカノールアンモニウム、例えば、モノエタノールアンモニウム塩；Ｃ1〜16アルキルスルホニウム、例えば、トリメチルスルホニウム塩；およびこれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されない。グリホサート酸分子は、異なるｐＫａ値を有する３つの酸部位を有し、従って、一塩基性、二塩基性および三塩基性の塩、もしくはそれらの任意の混合物、または任意の中間的中和レベルの塩を用いることができる。グリホサートは、ＲｏｕｎｄｕｐTM（Ｍｏｎｓａｎｔｏ  Ｃｏ．）の活性成分である。グリホサートの市販製剤の例としては、Ｍｏｎｓａｎｔｏ  ＣｏｍｐａｎｙによってＲＯＵＮＤＵＰTM、ＲＯＵＮＤＵＰTMＵＬＴＲＡ、ＲＯＵＮＤＵＰTMＵＬＴＲＡＭＡＸ、ＲＯＵＮＤＵＰTMＷＥＡＴＨＥＲＭＡＸ、ＲＯＵＮＤＵＰTMＣＴ、ＲＯＵＮＤＵＰTMＥＸＴＲＡ、ＲＯＵＮＤＵＰＳ  ＢＩＡＣＴＩＶＥ、ＲＯＵＮＤＵＰTMＢＩＯＦＯＲＣＥ、ＲＯＤＥＯTM、ＰＯＬＡＲＩＳTM、ＳＰＡＲＫTMおよびＡＣＣＯＲＤTM除草剤として販売されているもの（これらのすべてが、グリホサートをそのイソプロピルアンモニウム塩として含有する）；Ｍｏｎｓａｎｔｏ  ＣｏｍｐａｎｙによってＲＯＵＮＤＵＰTMＤＲＹおよびＲＩＶＡＬTM除草剤として販売されているもの（これらは、グリホサートをそのアンモニウム塩として含有する）；Ｍｏｎｓａｎｔｏ  ＣｏｍｐａｎｙによってＲＯＵＮＤＵＰTMＧＥＯＦＯＲＣＥとして販売されているもの（これは、グリホサートをそのナトリウム塩として含有する）；ならびにＳｙｎｇｅｎｔａ  Ｃｏｒｐ  ＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎによってＴＯＵＣＨＤＯＷＮTM除草剤として販売されているもの（これは、グリホサートをそのトリメチルスルホニウム塩として含有する）が挙げられるが、これらに限定されない。グリホサートは、芳香族アミノ酸の合成のための前駆体を提供するシキミ酸系路を阻害するため、植物毒性である。グリホサートは、植物において見出される酵素５−エノールピルビル−３−ホスホシキメートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）を阻害する。
【００９９】
本明細書で用いる「グルホシネート」は、２−アミノ４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）ブタン酸ならびにそのイオン形、エステルおよび塩、特にアンモニウム塩を指す。グルホシネートは、ＢＡＳＴＡTM、ＲＥＬＹTM、ＦＩＮＡＬＥTM、ＣＨＡＬＬＥＮＧＥTMおよびＬＩＢＥＲＴＹTMの活性成分である、非選択的浸透性除草剤である。グルホシネートは、アミノ酸グルタミンの生合成経路およびアンモニア解毒に干渉する。
【０１００】
本明細書において用いる場合、「ビラナホス」は、４−ヒドロキシ（メチル）ホスフィノイル−Ｌ−ホモアラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニンならびにそのイオン形、エステルおよび塩を指す。
【０１０１】
本明細書において用いる場合、「グリホシン」は、Ｎ，Ｎ−ビス（ｐ−ホスフィノメチル）グリシンならびにそのイオン形、エステルおよび塩を指す。
【０１０２】
ポリペプチド
「実質的に精製されたポリペプチド」または「精製された」とは、ポリペプチドが１つまたはそれ以上の脂質、核酸、他のポリペプチド、またはそれがその天然の状態のときに会合している他の汚染分子から分離されていることを意味する。実質的に精製されたポリペプチドには、それが天然に会合している他の成分が少なくとも６０％ないことが好ましく、より好ましくは少なくとも７５％なく、およびより好ましくは少なくとも９０％ない。当業者である対象者には理解されるが、この精製されたポリペプチドは、組換えによって生産されたポリペプチドであってもよい。
【０１０３】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、一般に、交換可能に用いており、ならびに非アミノ酸基の付加によって修飾されていても、修飾されていなくてもよい単一ポリペプチド鎖を指す。このようなポリペプチド鎖は、他のポリペプチドもしくはタンパク質、または他の分子（例えば補因子）と会合している場合があることは理解される。本明細書において用いる場合、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書に記載するような本発明のポリペプチドの変種、変異体、修飾形、類似体および／または誘導体も包含する。
【０１０４】
本明細書において用いる場合、「可溶性」ポリペプチドは、脂質二重層（例えば細胞膜）とは会合しない。
【０１０５】
ポリペプチドの同一％は、ＧＡＰ（Needleman and Wunsch, 1970）分析（ＧＣＧプログラム）により、ギャップ生成ペナルティー＝５、およびギャップ伸長ペナルティー＝０．３で決定される。クエリー配列は、少なくとも２５アミノ酸の長さであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも２５のアミノ酸の領域全体にわたって２つの配列をアラインする。より好ましくは、クエリー配列は、少なくとも５０アミノ酸の長さであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも５０のアミノ酸の領域全体にわたって２つの配列をアラインする。より好ましくは、クエリー配列は、少なくとも１００アミノ酸の長さであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも１００のアミノ酸の領域全体にわたって２つの配列をアラインする。よりいっそう好ましくは、クエリー配列は、少なくとも２５０アミノ酸の長さであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも２５０のアミノ酸の領域全体にわたって２つの配列をアラインする。よりいっそう好ましくは、ＧＡＰ分析は、２つの配列をそれらの全長全体にわたってアラインする。
【０１０６】
本明細書において用いる場合、「生物活性」フラグメントは、全長ポリペプチドについての定義した活性を維持する、すなわち、アミン含有除草剤（特にグリホサート）を開裂させることができる、本発明のポリペプチドの一部分である。生物活性フラグメントは、それらが定義される活性を維持する限り、いずれのサイズであってもよい。好ましくは、生物活性フラグメントは、少なくとも１００アミノ酸、より好ましくは少なくとも２００アミノ酸、およびよりいっそう好ましくは少なくとも３５０アミノ酸の長さである。
【０１０７】
定義したポリペプチドに関して、上述したものより高い同一％値が好ましい実施形態をもたらすということは、理解される。従って、最低同一％値にかんがみて、あてはまる場合には、前記ポリペプチドは、関連した指定配列番号と少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、およびよりいっそう好ましくは少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【０１０８】
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を本発明の核酸に導入することにより、または所望のポリペプチドのインビトロ合成により、調製することができる。そのような変異としては、例えば、そのアミノ酸配列内の残基の欠失、挿入または置換が挙げられる。欠失、挿入および置換の組み合わせを行って、最終構築物に到達することもできるが、但し、その最終ポリペプチド産物が、所望の特性を有することを条件とする。
【０１０９】
変異（変更された）ポリペプチドは、当該分野において公知のいずれの技術を用いて調製してもよい。例えば、本発明のポリヌクレオチドをインビトロ変異誘発に供すことができる。そのようなインビトロ変異誘発技術は、適するベクターに本ポリヌクレオチドをサブクローニングすること、そのベクターを「ミューテーター」株、例えば、大腸菌ＸＬ−１レッド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換させること、およびその形質転換させた細菌を適する世代数の間、増殖させることを含む。もう１つの例では、Ｈａｒａｙａｍａ（１９９８）によっておおまかに説明されたＤＮＡシャッフリング技術に本発明のポリヌクレオチドを供す。これらのＤＮＡシャッフリング技術は、本発明のものに関連した遺伝子、例えば、細菌からの他のオキシドレダクターゼ（例えば、配列番号８をコードするポリヌクレオチド）を含む場合がある。変異／変更ＤＮＡから誘導された産物を、本明細書に記載する技術を用いてスクリーニングして、それらがアミン含有除草剤（例えばグリホサート）を開裂できるかどうかを判定することは容易にできる。
【０１１０】
アミノ酸配列変異体を設計する場合、その変異部位の位置およびその変異の性質は、修飾されることとなる特徴に依存する。変異の部位は、例えば、（１）先ず、保存アミノ酸選択物で置換し、次に、達成される結果に依存してさらにラジカルな選抜物（radical selection）で置換することによって、（２）ターゲット残基を欠失させることによって、または（３）その局在部位に隣接して他の残基を挿入することによって、個々にまたは連続して修飾することができる。
【０１１１】
アミノ酸配列欠失は、一般に、約１〜１５残基、より好ましくは約１〜１０残基、および典型的には約１〜５の連続する残基に及ぶ。
【０１１２】
置換変異は、そのポリペプチド分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その場所に別の残基が挿入されている。置換的変異誘発について非常に関心の高い部位としては、機能のために重要であると確認された部位が挙げられる。関心の高い他の部位は、様々な株または種から得られた特定の残基が確認される部位である。これらの位置は、生物活性のために重要であり得る。これらの部位、特に、少なくとも３つの他の同様に保存される部位の配列の中に含まれる部位は、比較的保存される様式で置換されることが好ましい。このような保存的置換を表１において「例示的置換」という表題の下に示す。
【表１】
2009536819.tif 000002
【０１１３】
さらに、所望される場合には、非天然アミノ酸または化学的アミノ酸類似体を、本発明のポリペプチドに置換または付加として導入することができる。このようなアミノ酸としては、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルチニン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナーアミノ酸（designer amino acid）、例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、およびアミノ酸類似体が一般に挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１４】
合成中または合成後に、例えば、ビオチン化、ベンジル化、グルコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／脱保護基による誘導体化、タンパク質分解性開裂、抗体分子または他の細胞リガンドへの連結などによって、差別的に修飾される本発明のポリペプチドも、本発明の範囲内に含まれる。これらの修飾は、本発明のポリペプチドの安定性および／または生物活性を増大させるために役立ち得る。
【０１１５】
本発明のポリペプチドは、天然ポリペプチドの生産および回収、組換えポリペプチドの生産および回収、ならびにポリペプチドの化学合成を含む様々な方法で生産することができる。１つの実施形態において、本発明の単離されたポリペプチドは、ポリペプチドを生産するために有効な条件下でそのポリペプチドを発現することができる細胞を培養し、そのポリペプチドを回収することによって生産される。培養するために好ましい細胞は、本発明の組換え細胞である。有効な培養条件としては、ポリペプチド生産を可能にする、有効な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が挙げられるが、これらに限定されない。有効な培地は、細胞が培養されて本発明のポリペプチドを生産する任意の培地を指す。このような培地は、同化可能な炭素、窒素およびリン源を有する水性培地、ならびに適切な塩、無機質、金属および他の栄養分（例えばビタミン類）を典型的に含む。本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイター皿、およびペトリ皿において培養することができる。培養は、組換え細胞に適する温度、ｐＨおよび酸素含量で行うことができる。このような培養条件は、当業者の専門技術の範囲内である。
【０１１６】
ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド
ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはこれらの組み合わせ（センスもしくはアンチセンス配向または両方の組み合わせで、１または２本鎖のもの）、ｄｓＲＮＡまたはその他を含む、「単離されたポリヌクレオチド」とは、それがその天然の状態のときに会合または連結しているポリヌクレオチド配列から少なくとも部分的に分離されているポリヌクレオチドを意味する。好ましくは、単離されたポリヌクレオチドには、それらが自然に会合している他の成分が少なくとも６０％なく、好ましくは少なくとも７５％なく、および最も好ましくは少なくとも９０％ない。当業者の対象者は知っているが、単離されたポリヌクレオチドは、例えばそのポリヌクレオチドを自然には含まないトランスジェニック生物中に存在する、外因ポリヌクレオチドである場合がある。さらに、用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書では用語「核酸」と交換可能に用いている。
【０１１７】
ポリヌクレオチドの同一％は、ＧＡＰ（Needleman and Wunsch, 1970）分析（ＧＣＧプログラム）により、ギャップ生成ペナルティー＝５、およびギャップ伸長ペナルティー＝０．３で決定する。別様に述べていない限り、クエリー配列は、少なくとも４５ヌクレオチドの長さであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも４５のヌクレオチドの領域全体にわたって２つの配列をアラインする。好ましくは、クエリー配列は、少なくとも１５０ヌクレオチドの長さであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも１５０のヌクレオチドの領域全体にわたって２つの配列をアラインする。より好ましくは、クエリー配列は、少なくとも３００ヌクレオチドの長さであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも３００のヌクレオチドの領域全体にわたって２つの配列をアラインする。よりいっそう好ましくは、ＧＡＰ分析は、２つの配列をそれらの全長全体にわたってアラインする。
【０１１８】
定義したポリヌクレオチドに関して、上述したものより高い同一％値が好ましい実施形態をもたらすということは、理解される。従って、最低同一％値にかんがみて、あてはまる場合には、本発明のポリヌクレオチドは、関連した指定配列番号と少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、およびよりいっそう好ましくは少なくとも９９．９％同一である配列を含むことが好ましい。
【０１１９】
本明細書において用いる場合、用語「遺伝子」は、その最も広い文脈で解釈するものとし、ならびに構造遺伝子のタンパク質コーディング領域を含み、且つ、５’および３’両方の末端のコーディング領域に隣接して位置する、いずれの末端においても少なくとも約２ｋｂの距離にわたる配列を含む、デオキシリボヌクレオチドを包含する。コーディング領域の５’に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列を、５’非翻訳配列と呼ぶ。コーディング領域の３’または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列を、３’非翻訳配列と呼ぶ。用語「遺伝子」は、ｃＤＮＡの形の遺伝子とゲノムの形の遺伝子の両方を包含する。用語「遺伝子」は、本明細書に記載する本発明のタンパク質のすべてまたは一部および上述のもののいずれか１つに対する相補ヌクレオチド配列をコードする合成分子または融合分子を含む。
【０１２０】
本明細書において用いる場合、「ストリンジェントな条件」という語句は、ポリヌクレオチド、プローブ、プライマーおよび／またはオリゴヌクレオチドがそのターゲット配列にハイブリダイズするが、他の配列にはしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、状況が異なれば異なる。長い配列のほうが、短い配列より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。このＴｍは、ターゲット配列に相補的なプローブの５０％が平衡でターゲット配列にハイブリダイズする（定義されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度のもとでの）温度である。典型的に、ターゲット配列は過剰で存在するので、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡に使われる。一般に、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０から８．３で約１．０Ｍナトリウムイオンより低く、一般には約０．０１から１．０Ｍナトリウムイオン（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔから５０ｎｔ）については少なくとも約３０℃、より長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドについては少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェントな条件は、不安定化因子（例えば、ホルムアミド）の添加で達成することもできる。
【０１２１】
ストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、Ausubel et al. (supra), Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6、ならびに本明細書に記載する実施例において見出すことができる。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％相同な配列が、一般に、互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％  ＢＳＡおよび５００ｍｇ／ｍＬ  変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩バッファ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、それに続く、０．２×ＳＳＣ、０．０１％  ＢＳＡ中、５０℃での１回またはそれ以上の洗浄である。もう１つの実施形態では、配列番号２、６および／または７のヌクレオチド配列を含む核酸分子に中等度ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。中等度ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％  ＳＤＳ、１００ｍｇ／ｍＬ  変性サケ精子ＤＮＡ中、５５℃でのハイブリダイゼーション、それに続く、１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、３７℃での１回またはそれ以上の洗浄である。用いることができる他の中等度ストリンジェンシー条件は、当分野では周知であり、例えば、Ausubel et al. (supra), and Kriegler, 1990; Gene Transfer And Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYを参照のこと。さらにもう１つの実施形態では、配列番号１、６および／または７のヌクレオチド配列を含む核酸分子に低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％  ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍＬ  変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）硫酸デキストラン中、４０℃でのハイブリダイゼーション、それに続く、２×ＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％  ＳＤＳ中、５０℃での１回またはそれ以上の洗浄である。用いることができる他の低ストリンジェンシー条件は、当該分野では周知であり、例えば、Ausubel et al. (supra) and Kriegler, 1990, Gene Transfer And Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY、ならびに本明細書において提供する実施例を参照のこと。
【０１２２】
本発明のポリヌクレオチドは、天然に存在する分子と比較したとき、ヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換である１つまたはそれ以上の変異を有することができる。変異は、天然に存在する（すなわち、天然源から単離された）変異である場合もあり、または合成の（例えば、核酸に対して部位特異的変異誘発を行うことによる）変異である場合もある。
【０１２３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはいずれかの誘導体であり得る。用語ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、部分的に重なる意味を有するが、オリゴヌクレオチドは、典型的には、相対的に短い単鎖分子である。このようなオリゴヌクレオチドの最小サイズは、オリゴヌクレオチドとターゲット核酸分子上の相補配列との間に安定したハイブリッドを形成するのに必要なサイズである。好ましくは、本オリゴヌクレオチドは、少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１９ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、よりいっそう好ましくは少なくとも２５ヌクレオチドの長さである。
【０１２４】
通常、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのモノマーは、ホスホジエステル結合またはそれらに類似体によって連結されて、相対的に短いモノマー単位、例えば１２〜１８、から数百のモノマー単位のサイズにわたるオリゴヌクレオチドを形成する。ホスホジエステル連結の類似体としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート（phosphoroselenoate）、ホスホロジセレノエート（phosphorodiselenoate）、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）、ホスホラニリデート（phosphoranilidate）、ホスホラミデート（phosphoramidate）が挙げられる。
【０１２５】
本発明は、例えば核酸分子を同定するためのプローブまたは核酸分子を生産するためのプライマーとして使用することができるオリゴヌクレオチドを含む。プローブとして使用される本発明のオリゴヌクレオチドは、一般に、検出可能な標識（例えば、放射性同位体、酵素、ビオチン、蛍光分子または化学発光分子）とコンジュゲートしている。
【０１２６】
プローブおよび／またはプライマーを使用して、本発明のポリヌクレオチドの相同体を他の種からクローニングすることができる。さらに、当該分野において公知のハイブリダイゼーション技術を用いて、そのような相同体のゲノムまたはｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることもできる。
【０１２７】
組換えベクター
本発明の１つの実施形態は、本発明の少なくとも１つの単離されたポリヌクレオチド分子を含む組換えベクターを含み、このポリヌクレオチド分子は、そのポリヌクレオチド分子を宿主細胞に送達することができる任意のベクターに挿入されている。このようなベクターは、自然には本発明のポリヌクレオチド分子に隣接して見出されず、好ましくは、このポリヌクレオチド分子が由来する種以外の種に由来するポリヌクレオチド配列である、異種由来のポリヌクレオチド配列を含有する。前記ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれであってもよく、原核性または真核性のいずれであってもよく、典型的には、トランスポゾン（例えば、米国特許第５，７９２，２９４号に記載されているもの）、ウイルスまたはプラスミドである。
【０１２８】
組換えベクターの１つのタイプは、発現ベクターに作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチド分子を含む。作動可能に連結されたという語句は、ポリヌクレオチド分子が発現ベクターへ、その分子が宿主細胞に形質転換されたとき発現され得るような様式で挿入することを指す。本明細書において用いる場合、発現ベクターは、宿主を形質転換させることができ、指定のポリヌクレオチド分子を発現させることができる、ＤＮＡまたはＲＮＡのベクターである。好ましくは、前記発現ベクターは、宿主細胞の中で複製することもできる。発現ベクターは、原核性または真核性のいずれであってもよく、典型的には、ウイルスまたはプラスミドである。本発明の発現ベクターは、細菌、真菌、内部寄生生物、節足動物、動物および植物細胞を含む本発明の組換え細胞において機能する（すなわち、遺伝子発現を命ずる）任意のベクターを包含する。本発明のベクターは、無細胞発現系においてポリペプチドを生産するために使用することもでき、そのような系は、当該分野において周知である。
【０１２９】
本明細書において用いる場合、「作動可能に連結された」は、２つまたはそれ以上の核酸（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、これは、転写調節要素と転写配列との機能的関係を指す。例えば、プロモーターは、それが適切な宿主細胞においておよび／または無細胞発現系においてコーディング配列の転写を刺激または変調する場合、そのコーディング配列（例えば、本明細書において定義するポリヌクレオチド）に作動可能に連結されている。一般に、転写配列に作動可能に連結されているプロモーター転写調節要素は、その転写配列に物理的に隣接しており、すなわち、それらはシス作用性である。しかし、一部の転写調節要素（例えばエンハンサー）は、それらが転写を強化するコーディング配列に物理的に隣接している必要も、近接して位置する必要もない。
【０１３０】
特に、本発明の発現ベクターは、調節配列、例えば、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点、および前記組換え細胞と適合性があり、本発明のポリヌクレオチド分子の発現を制御する他の調節配列を含有する。特に、本発明の組換え分子は、転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写の開始、延長および停止を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、転写開始を制御するもの、例えばプロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびレプレッサー配列である。適する転写制御配列としては、本発明の組換え細胞の少なくとも１つにおいて機能することができる任意の転写制御配列が挙げられる。様々なそのような転写制御配列が当業者には公知である。好ましい転写制御配列としては、細菌、酵母、節足動物、線虫、植物または哺乳動物の細胞において機能するもの、例えば、ｔａｃ、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔｒｃ、オキシ−ｐｒｏ、ｏｍｐ／ｌｐｐ、ｒｒｎＢ、バクテリオファージラムダ、バクテリオファージＴ７、Ｔ７ｌａｃ、バクテリオファージＴ３、バクテリオファージＳＰ６、バクテリオファージＳＰ０１、メタロチオネイン、アルファ−接合因子（mating factor）、ピチア（Pichia）アルコールオキシダーゼ、アルファウイルスサブゲノムプロモーター（例えば、シンドビス（Sindobis）ウイルスサブゲノムプロモーター）、抗生物質耐性遺伝子、バキュロウイルス、ヘリオチスゼア（Heliothis zea）昆虫ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、アライグマポックスウイルス、他のポックスウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス（例えば、中間初期プロモーター）、シミアンウイルス４０、レトロウイルス、アクチン、レトロウイルス長末端反復、ラウス肉腫ウイルス、熱ショック、ホスフェートおよびニトレート転写制御配列、ならびに原核細胞または真核細胞において遺伝子発現を制御することができる他の配列が挙げられる。
【０１３１】
本発明のポリペプチドのコーディング配列は、公知の技術を用いて、特定の宿主細胞における発現を最大にするように最適化することができる。例えば、配列番号６は、植物細胞における発現増進のために構築された配列番号１をコードするオープンリーディングフレームを提供し、これに対して配列番号７は、大腸菌における発現増進のために構築された配列番号１をコードするオープンリーディングフレームを提供する。
【０１３２】
宿主細胞
本発明のもう１つの実施形態は、本発明の１つもしくはそれ以上の組換え分子で形質転換された宿主細胞を含む組換え細胞、またはそれらの子孫細胞を含む。細胞へのポリヌクレオチド分子の形質転換は、ポリヌクレオチド分子をその細胞に挿入することができる任意の方法によって達成することができる。形質転換技術としては、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、およびプロトプラスト融合が挙げられるが、これらに限定されない。組換え細胞は、単細胞のままである場合もあり、または組織、器官もしくは多細胞生物に成長する場合もある。本発明の形質転換ポリヌクレオチド分子は、染色体外のままとどまる場合もあり、またはその形質転換（すなわち、組換え）細胞の染色体内の１つもしくはそれ以上の部位に、発現されるそれらの能力が保持されるような様式で組み込まれている場合もある。
【０１３３】
形質転換に適する宿主細胞としては、本発明のポリヌクレオチドで形質転換することができる任意の細胞が挙げられる。本発明の宿主細胞は、本発明のポリペプチドを内因的に（すなわち、自然に）生産することができるか、本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチド分子で形質転換された後にそのようなポリペプチドを生産することができる。本発明の宿主細胞は、本発明の少なくとも１つのタンパク質を生産することができる任意の細胞であり得、細菌、真菌（酵母を含む）、寄生虫、線虫、節足動物、動物および植物の細胞を含む。宿主細胞の例としては、サルモネラ属（Salmonella）、エシェリキア属（Escherichia）、バシラス属（Bacillus）、リステリア属（Listeria)、サッカリミセズ属（Saccharomyces）、スポドブテラ属（Spodoptera）、マイコバクテリウム属（Mycobacteria）、キンウワバ亜科（Trichoplusia）、ＢＨＫ（仔ハムスター腎）細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）細胞、およびベロ細胞が挙げられる。宿主細胞のさらなる例としては、大腸菌（大腸菌Ｋ−１２誘導体を含む）；チフス菌（Salmonella typhi）；鼠チフス菌（Salmonella typhimurium）（弱毒株を含む）；ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）；イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）；および非腫瘍形成性マウス筋芽細胞Ｇ８細胞（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １２４６）である。特に好ましい宿主細胞は、植物細胞である。
【０１３４】
組換えＤＮＡ技術は、例えば、宿主細胞中のポリヌクレオチド分子の多数のコピー、それらのポリヌクレオチド分子を転写する効率、結果として生ずる転写産物を翻訳する効率、および後翻訳修飾の効率を操作することによって、形質転換ポリヌクレオチド分子の発現を増進させるために、用いることができる。本発明のポリヌクレオチド分子の発現を増加させるために有用な組換え技術としては、ポリヌクレオチド分子の高コピー数プラスミド（high-copy number plasmid）への作動可能な連結、ポリヌクレオチド分子の１つまたはそれ以上の宿主細胞染色体への組み込み、ベクター安定配列のプラスミドへの付加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換または修飾、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列）の置換または修飾、宿主細胞のコドン使用量に対応する本発明のポリヌクレオチド分子の修飾、および転写産物を不安定にする配列の欠失が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３５】
トランスジェニック植物
本明細書において名詞として用いる用語「植物」は、全植物を指すが、形容詞として用いる場合は、例えば植物器官（例えば、葉、幹、根、花）、単個細胞（例えば、花粉）、種子、植物細胞などにような、植物の中に存在する、植物から得られる、植物に由来る、または植物に関連した任意の物質を指す。
【０１３６】
本発明の実施の際に使用が考えられる植物は、単子葉植物と双子葉植物の両方を含む。ターゲット植物としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されない：穀物（小麦、大麦、ライ麦、エンバク、米、モロコシおよび関連作物）；ビート（テンサイおよび飼料用ビート）；梨果、核果および小果樹（リンゴ、ナシ、プラム、モモ、アーモンド、サクランボ、イチゴ、ラズベリーおよびブラックベリー）；マメ科植物（豆、レンズマメ、エンドウ、大豆）；油脂植物（ナタネ、カラシ、ケシ、オリーブ、ヒマワリ、ココナッツ、ヒマシ油料植物、カカオ豆、ラッカセイ）；キュウリ植物（ペポカボチャ（marrow）、キュウリ、メロン）；線維植物（綿、亜麻、麻、ジュート）；柑橘類果実（オレンジ、レモン、グレープフルーツ、マンダリン）；野菜（ホウレンソウ、レタス、アスパラガス、キャベツ、ニンジン、タマネギ、トマト、ジャガイモ、パプリカ）；クスノキ科（アボガド、シナモン、ショウノウ）；または植物、例えば、トウモロコシ、タバコ、堅果類、コーヒー、サトウキビ、茶、ブドウの木、ホップ、芝生、バナナおよび天然ゴムの木、ならびに装飾植物（花、低木、広葉樹および常緑樹、例えば針葉樹）。好ましくは、前記植物は、被子植物である。
【０１３７】
本発明の文脈において定義されるトランスジェニック植物は、所望の植物または植物器官において本発明の少なくとも一種のポリペプチドを生産させるように組換え技術を用いて遺伝子修飾された植物（ならびに前記植物の部分および細胞）およびそれらの子孫を含む。トランスジェニック植物は、A. Slater et al., Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003)、およびP. Christou and H. Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons (2004)に一般的に記載されているものなどの当該分野において公知の技術を用いて生産することができる。
【０１３８】
「トランスジェニック植物」は、同じ種、変種または栽培品種の野生型植物では見出すことができない遺伝子構築物（「トランスジーン」）を含有する植物を指す。本明細書において言及する「トランスジーン」は、バイオテクノロジーの分野における通常の意味を有し、ならびに組換えＤＮＡまたはＲＮＡ技術によって生産または変更され、植物細胞に導入された遺伝子配列を含む。トランスジーンは、植物細胞に由来する遺伝子配列を含む。典型的には、トランスジーンは、人的操作によって、例えば形質転換などによって植物に導入されているが、当業者が認識しているような任意の方法を用いることができる。
【０１３９】
好ましい実施形態において、トランスジェニック植物は、導入されたそれぞれのおよびすべての遺伝子（トランスジーン）に対してホモ接合性であり、そのため、それらの子孫は所望の表現型について分離しない。トランスジェニック植物は、例えば雑種種子から成長したＦ１子孫の場合のように、導入されたトランスジーンに対してヘテロ接合性である場合もある。このような植物は、当該分野において周知の利点（例えば雑種強勢（hybrid vigour））をもたらすことができる。
【０１４０】
本発明のポリヌクレオチドは、トランスジェニック植物においてすべての生育期に構成的に発現させることができる。その植物または植物器官の用途に依存して、前記ポリペプチドを期特異的に発現させることができる。さらに、前記ポリヌクレオチドを組織特異的に発現させることができる。
【０１４１】
植物において対象となるポリペプチドをコードする遺伝子を発現させることが公知であるか、またはそれが分かっている調節配列を本発明において使用することができる。使用する調節配列の選択は、対象となるターゲット植物および／またはターゲット器官に依存する。このような調節配列は、植物もしくは植物ウイルスから得ることができ、または化学的に合成することができる。そのような調節配列は、当業者には周知である。
【０１４２】
植物細胞の安定したトランスフェクションにまたはトランスジェニック植物の樹立に適する多数のベクターは、例えば、Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987；Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989；およびGelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990に記載されている。典型的には、植物発現ベクターは、例えば、５’および３’調節配列の転写制御下の１つまたはそれ以上のクローン化植物遺伝子ならびに優性選択可能マーカーを含む。このような植物発現ベクターは、プロモーター調節領域（例えば、誘導もしくは構成的、環境もしくは発育調節、または細胞もしくは組織特異的な発現を制御する調節領域）、転写開始出発部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセッシングシグナル、転写停止部位、および／またはポリアデニル化シグナルも含有し得る。
【０１４３】
植物細胞において活性である多数の構成的プロモーターが記載されている。植物における構成的発現に適するプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ゴマノハグサ（Figwort）モザイクウイルス（ＦＭＶ）３５Ｓ、サトウキビ桿状ウイルスプロモーター、ツユクサ黄色斑紋ウイルスプロモーター、リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットからの光誘導性プロモーター、米サイトゾルトリオースリン酸イソメラーゼプロモーター、アラビドプシス（Arabidopsis）のアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼプロモーター、米アクチン１遺伝子プロモーター、マンノピン（mannopine）シンターゼおよびオクトピンシンターゼプロモーター、Ａｄｈプロモーター、スクロースシンターゼプロモーター、Ｒ遺伝子複合体プロモーター、ならびにクロロフィルα／β結合タンパク質遺伝子プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。これらのプロモーターは、植物において発現されるＤＮＡベクターを作るために使用されている；例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ８４０２９１３参照。これらのプロモーターのすべてが、様々なタイプの植物発現性組換えＤＮＡベクターを作製するために使用されている。
【０１４４】
植物の源組織（例えば葉、種子、根または幹）における発現の目的のために、本発明において利用するプロモーターは、これらの特定の組織において相対的に高い発現を有することが好ましい。この目的のために、組織または細胞に特異的な発現または組織または細胞で強化された発現を伴う遺伝子に対して多数のプロモーターから選択することができる。文献に報告されているそのようなプロモーターの例としては、エンドウからのクロロプラストグルタミンシンセターゼＧＳ２プロモーター、小麦からのクロロプラストフルクトース−１，６−ビスホスファターゼプロモーター、ジャガイモからの核光合成ＳＴ−ＬＳ１プロモーター、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）からのセリン／トレオニンキナーゼプロモーターおよびグルコアミラーゼ（ＣＨＳ）プロモーターが挙げられる。アメリカカラマツ（Ｌａｒｉｘ  ｌａｒｉｃｉｎａ）からのリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼプロモーター、マツからのＣａｂ遺伝子、Ｃａｂ６、のためのプロモーター、小麦からのＣａｂ−１遺伝子のためのプロモーター、ホウレンソウからのＣａｂ−１遺伝子のためのプロモーター、米からのＣａｂ  １Ｒ遺伝子のためのプロモーター、トウモロコシ（Zea mays）からのピルベートオルトホスフェートキナーゼ（ＰＰＤＫ）プロモーター、タバコＬｈｃｂ１*２遺伝子のためのプロモーター、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）Ｓｕｃ２スクロース−Ｈ30共輸送プロモーター、およびホウレンソウからのチラコイド膜タンパク質遺伝子（ＰｓａＤ、ＰｓａＦ、ＰｓａＥ、ＰＣ、ＦＮＲ、ＡｔｐＣ、ＡｔｐＤ、Ｃａｂ、ＲｂｃＳ）からのプロモーターも、光合成活性組織において活性であると報告されている。
【０１４５】
クロロフィルα／β結合タンパク質のための他のプロモーター、例えば、シロガラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ）からのＬｈｃＢ遺伝子およびＰｓｂＰ遺伝子のためのプロモーターも本発明に利用することができる。植物細胞におけるＲＮＡ結合タンパク質遺伝子の発現には、（１）熱、（２）光（例えば、エンドウＲｂｃＳ−３Ａプロモーター、トウモロコシＲｂｃＳプロモーター）、（３）ホルモン、例えばアブシジン酸、（４）創傷（例えば、ＷｕｎＩ）、または（５）化学物質、例えばメチルジャスミナート（methyl jasminate）、サリチル酸、ステロイドホルモン、アルコール、Ｓａｆｅｎｅｒｓ（ＷＯ  ９７０６２６９）によって調節されるプロモーターを含む、環境、ホルモン、化学および／または発育のシグナルに応答して調節される様々な植物遺伝子プロモーターも使用することができ、または（６）器官特異的プロモーターを利用するのも有利であり得る。
【０１４６】
植物のシンク組織、例えば、ジャガイモ植物の塊茎、トマトの実、または大豆、カノーラ、綿、トウモロコシ（Zea mays）、小麦、米および大麦の種子における発現の目的のために、本発明において利用するプロモーターは、これらの特定の組織において相対的に高い発現を有することが好ましい。塊茎特異的または塊茎で強化された発現を伴う遺伝子のための多数のプロモーターが公知であり、それらとしては、クラスＩパタチンプロモーター、ジャガイモ塊茎ＡＤＰＧＰＰ遺伝子のためのプロモーター、大サブユニットと小サブユニット両方、スクロースシンターゼプロモーター、２２ｋＤタンパク質複合体およびプロテイナーゼ阻害剤を含む、大塊茎タンパク質のプロモーター、顆粒結合デンプンシンターゼ遺伝子（ＧＢＳＳ）のためのプロモーター、ならびに他のクラスＩおよびＩＩパタチンプロモーターが挙げられる。他のプロモーターを使用して、特定の組織（例えば種子または果実）においてタンパク質を発現させることもできる。β−コングリシニンのためのプロモーターまたは他の種子特異的プロモーター（例えばナピン（napin）およびファセオリン（phaseolin）プロモーター）を使用してもよい。トウモロコシ（Zea mays）内胚乳発現のために特に好ましいプロモーターは、米からのグルテリン遺伝子のためのプロモーター、さらに特にはＯｓｇｔ−１プロモーターである。小麦における発現に適するプロモーターの例としては、ＡＤＰグルコースピロシンターゼ（ＡＤＰＧＰＰ）サブユニット、顆粒結合型および他のデンプンシンターゼ、分枝および脱分枝酵素（branching and debranching enzyme）、胚発生で豊富なタンパク質（embryogenesis-abundant protein）、グリアジン、ならびにグルテニンのためのプロモーターが挙げられる。米におけるそのようなプロモーターの例としては、ＡＤＰＧＰＰサブユニット、顆粒結合型および他のデンプンシンターゼ、分枝酵素、脱分枝酵素、スクロースシンセターゼおよびグルテリンのためのプロモーターが挙げられる。特に好ましいプロモーターは、米グルテリン、Ｏｓｇｔ−１遺伝子のためのプロモーターである。大麦のためのそのようなプロモーターの例としては、ＡＤＰＧＰＰサブユニット、顆粒結合および他のデンプンシンターゼ、分枝酵素、脱分枝酵素、スクロースシンセターゼ、ホルデイン、胚グロブリン、およびアリューロン特異的タンパク質のためのものが挙げられる。
【０１４７】
根特異的プロモーターも使用することができる。そのようなプロモーターの一例は、酸キチナーゼ遺伝子のためのプロモーターである。根組織における発現は、同定されているＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの根特異的サブドメインを利用することによって達成することができる。
【０１４８】
５’非翻訳リーダー配列は、本発明のポリヌクレオチドの異種遺伝子配列を発現させるために選択されるプロモーターに由来するものであり得、所望される場合には、ｍＲＮＡの翻訳を増加させるように特異的に修飾することができる。トランスジーンの発現の最適化についての総説については、Koziel et al. (1996)を参照のこと。そのような最適化リーダー配列の一例は、配列番号６に含まれている。その５’非翻訳領域は、植物ウイルスＲＮＡ（とりわけ、タバコモザイクウイルス、タバコエッチウイルス、トウモロコシ萎縮モザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルス）から、適する真核遺伝子、植物遺伝子（小麦およびトウモロコシクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子リーダー）から、または合成遺伝子配列から、得ることもできる。本発明は、非翻訳領域が、プロモーター配列を伴う５’非翻訳配列に由来する場合の構築物に限定されない。リーダー配列は、無関係なプロモーターまたはコーディング配列に由来する場合もある。本発明に関連して有用なリーダー配列は、トウモロコシＨｓｐ７０リーダー（米国特許第５，３６２，８６５号および同第５，８５９，３４７号）およびＴＭＶオメガ要素を含む。
【０１４９】
転写の停止は、キメラベクターにおける対象となるポリヌクレオチドに作動可能に連結された３’非翻訳ＤＮＡ配列によって達成される。組換えＤＮＡ分子の３’非翻訳領域は、植物においてそのＲＮＡの３’末端にアデニル化ヌクレオチドを付加させるように機能する、ポリアデニル化シグナルを含有する。この３’非翻訳領域は、植物細胞において発現される様々な遺伝子から得ることができる。ノパリンシンターゼ３’非翻訳領域、エンドウ小サブユニットＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子からの３’非翻訳領域、大豆７Ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子からの３’非翻訳領域を、一般に、この能力に関して用いることができる。アグロバクテリウム（Agrobacterium）腫瘍誘導性（Ｔｉ）プラスミド遺伝子のポリアデニル化シグナルを含有する３’転写非翻訳領域も適する。
【０１５０】
細胞への遺伝子の直接送達のための４つの一般的な方法が記載されている：（１）化学的方法（Graham et al., 1973）；（２）物理的方法、例えば、マイクロインジェクション（Capecchi, 1980）；エレクトロポレーション（例えば、ＷＯ  ８７／０６６１４、米国特許第５，４７２，８６９号、同第５，３８４，２５３号、ＷＯ  ９２／０９６９６およびＷＯ  ９３／２１３３５参照);遺伝子銃（例えば、米国特許第４，９４５，０５０号および同第５，１４１，１３１参照）；（３）ウイルスベクター（Clapp, 1993；Lu et al., 1993；Eglitis et al., 1988）；および（４）受容体媒介メカニズム（Curiel et al., 1992；Wagner et al., 1992）。
【０１５１】
使用することができる加速(acceleration)法としては、例えば、マイクロプロジェクタイルボンバードメントなどが挙げられる。形質転換を起こさせる核酸分子を植物細胞に送達するための方法の一例は、マイクロプロジェクタイルボンバードメント（microprojectile bombardment）である。この方法は、Yang et al., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, England (1994)によって総説されている。非生物粒子（マイクロプロジェクタイル）に核酸をコーティングし、推進力によってそれらを細胞に送達することができる。例示的粒子としては、タングステン、金、白金などから成るものが挙げられる。マイクロプロジェクタイルボンバードメントの特別な利点は、単子葉植物を繁殖可能に形質転換させる有効な手段であることに加えて、プロトプラストの単離も、アグロバクテリウム(Agrobacterium)感染に対する感受性も必要としないことである。加速によってトウモロコシ（Zea mays）細胞にＤＮＡを送達するための方法の実例となる実施形態は、ＤＮＡをコーティングした粒子を、スクリーン（例えば、ステンレス鋼またはＮｙｔｅｘスクリーン）を通って、懸濁液中で培養されているトウモロコシ細胞で覆われたフィルター表面へと進ませるために使用することができる、バイオリスティック(biolistics)  α粒子送達システムである。本発明とともに使用するために適する粒子送達システムは、Bio-Rad Laboratoriesから入手できるヘリウム加速ＰＤＳ−１０００／Ｈｅガンである。
【０１５２】
ボンバードメントのために、懸濁液中の細胞をフィルターで濃縮することができる。ボンバードメントに付される細胞を含有するフィルターを、マイクロプロジェクタイル停止用プレートの下の適切な距離に配置する。所望される場合には、ガンとボンバードメントに付される細胞との間に１つまたはそれ以上のスクリーンも配置する。
【０１５３】
あるいは、未成熟胚または他のターゲット細胞を固体培養媒体上に配列してもよい。ボンバードメントに付される細胞を、マイクロプロジェクタイル停止用プレートの下の適切な距離に配置する。所望される場合には、加速装置とボンバードメントに付される細胞との間に１つまたはそれ以上のスクリーンも配置する。ここで述べる技術の使用により、マーカー遺伝子を一過的に発現する細胞の１０００までまたはそれ以上の細胞増殖巣（foci）を得ることができる。ボンバードメントの４８時間後に外因遺伝子産物を発現する１細胞増殖巣内の細胞数は、多くの場合、１〜１０の範囲であり、平均１〜３の範囲である。
【０１５４】
ボンバードメント形質転換では、最大数の安定した形質転換体を生ずるようにボンバードメント前培養条件およびボンバードメントパラメータを最適化することができる。ボンバードメントの物理的パラメータと生物学的パラメータの両方が、この技術では重要である。物理的因子は、ＤＮＡ／マイクロプロジェクタイル沈着物の操作に関係するもの、またはマクロプロジェクタイルもしくはマイクロプロジェクタイルいずれかの飛行および速度に影響を及ぼすものである。生物学的因子としては、ボンバードメントの前および直後の細胞の操作に関係するすべての工程、ボンバードメントに付随する損傷の緩和を助長するためのターゲット細胞の浸透圧調整、およびまた、形質転換ＤＮＡ（例えば線形化ＤＮＡまたはインタクトなスーパーコイル化プラスミド）の性質が挙げられる。ボンバードメント前操作は、未成熟胚の形質転換成功のために特に重要であると考えられる。
【０１５５】
もう１つの代替実施形態では、プラスミドを安定して形質転換させることができる。高等植物におけるプラスミド形質転換について開示されている方法としては、選択可能マーカーを含有するＤＮＡの粒子ガン送達、および相同組換えによるプラスミドゲノムへのＤＮＡのターゲッティングが挙げられる（米国特許第５，４５１，５１３号、同第５，５４５，８１８号、同第５，８７７，４０２号、同第５，９３２４７９号、およびＷＯ  ９９／０５２６５）。
【０１５６】
従って、小規模な試験でボンバードメントパラメータの様々な態様を調節してそれらの条件を十分に最適化することを望むことができると考えられる。特に、物理的パラメータ、例えば、ギャップ距離、飛行距離、組織距離およびヘリウム圧を調節すること望むことができる。レシピエント細胞の生理状態に影響を及ぼし、従って、形質転換および組み込みの効率に影響を及ぼし得る条件を修飾することによって、外傷低減因子（trauma reduction factor）を最小にすることもできる。例えば、浸透圧状態、組織水和、およびレシピエント細胞の二次培養段階または細胞周期を、最適な形質転換のために調整することができる。他のルーチンな調整の実行は、本開示に鑑みて当業者には公知である。
【０１５７】
アグロバクテリウム媒介移入（Agrobacterium-mediated transfer）は、ＤＮＡを植物全体の組織に導入することができ、それによって、プロトプラストからインタクトな植物に再生させる必要を回避することができるため、植物細胞への遺伝子の導入に広範に適用できるシステムである。植物細胞にＤＮＡを導入するためのアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介植物組み込みベクターの使用は、当該分野において周知である（例えば、米国特許第５，１７７，０１０号、同第５，１０４，３１０号、同第５，００４，８６３号、同第５，１５９，１３５号参照）。さらに、Ｔ−ＤＮＡの組み込みは、ほとんど再配列を生じさせない比較的精密なプロセスである。移入されることとなるＤＮＡの領域は、境界配列（border sequence）によって規定され、介在ＤＮＡは、通常、その植物のゲノムに導入される。
【０１５８】
最新のアグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換ベクターは、大腸菌およびアグロバクテリウム（Agrobacterium）において複製することができ、そのため、記載されているような適便な操作が可能となる（Klee et al., In: Plant DNA Infectious Agents, Hohn and Schell, eds., Springer- Verlag, New York, pp. 179-203 (1985)）。さらに、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介遺伝子移入のためのベクターに関する技術的進歩は、前記ベクター内の遺伝子および制限部位の配列を改善して、様々なポリペプチドコーディング遺伝子を発現することができるベクターの構築を助長する。記載されているベクターは、挿入されたポリペプチドコーディング遺伝子の直接発現のためのプロモーターおよびポリアデニル化部位に隣接する適便な多リンカー（multi-linker）領域を有し、本目的に適する。加えて、アームを有するＴｉ遺伝子とアームを有さないＴｉ遺伝子の両方を含有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）は、形質転換に利用することができる。アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換が有効である植物品種において、これは、遺伝子移入の容易で定義された性質のため選択される方法である。
【０１５９】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換法を用いて形成されたトランスジェニック植物は、典型的には、１つの染色体上に単一の遺伝子座を含有する。そのようなトランスジェニック植物は、付加遺伝子に対してヘミ接合性であると言うことができる。付加された構造遺伝子に対してホモ接合性であるトランスジェニック植物、すなわち、２つの付加遺伝子（染色体対のそれぞれの染色体上の同じ座に１つの遺伝子）を含有するトランスジェニック植物がより好ましい。ホモ接合型トランスジェニック植物は、単一付加遺伝子を含有する独立した分離系トランスジェニック植物（segregant transgenic plant）を有性交配（自家受精(selfing)）させ、生産された種子の一部を発芽させ、結果として生じた植物を対象となる遺伝子について分析することによって得ることができる。
【０１６０】
２つの異なるトランスジェニック植物を交配させて、２つの独立した分離外因遺伝子を含有する子孫を生産することができることも理解される。適切な子孫からの自家受精は、両方の外因遺伝子に対してホモ接合性である植物を生産することができる。親植物への戻し交配および非トランスジェニック植物との他配(out-crossing)も考えられ、栄養繁殖も考えられる。異なる形質および作物のために一般に用いられる他の繁殖法の説明は、Fehr, In: Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987)において見出すことができる。
【０１６１】
植物プロトプラストの形質転換は、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーション、およびこれらの処理の組み合わせに基づく方法を用いて達成することができる。異なる植物品種へのこれらのシステムの適用は、プロトプラストからその特定の植物系統に再生する能力に依存する。プロトプラストからの穀物への再生についての実例となる方法が記載されている（Fujimura et al, 1985; Toriyama et al, 1986; Abdullah et al, 1986）。
【０１６２】
他の細胞形質転換法も用いることができ、それらとしては、花粉への直接ＤＮＡ移入によって、植物の生殖器官へのＤＮＡの直接注入によって、または未成熟胚の細胞へのＤＮＡの直接注入、その後の乾燥胚の再水和によって、植物へＤＮＡを導入することが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６３】
単一植物プロトプラスト形質転換体からのまたは様々な形質転換外植体からの植物の再生、発生および栽培（培養  cultivation）は、当該分野において周知である（Weissbach et al., In: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, Calif., (1988)）。この再生および成長プロセスは、一般に、形質転換細胞の選択の工程、それらの個々に区別された細胞を、通常の胚発育期を経て根付き苗木期まで栽培する工程を含む。トランスジェニック胚および種子は、同様に再生される。その後、それらの結果として生ずるトランスジェニック根付き新芽を適切な植物成長培地（例えば土壌）に植える。
【０１６４】
外来、外因遺伝子を含有する植物の発生または再生は、当該分野において周知である。好ましくは、再生植物を自家受粉させて、ホモ接合型トランスジェニック植物を得る。そうでなければ、再生植物から得た花粉を、農学的に重要な系統の種子から育つ植物（seed-grown plant）に交配する。逆に、これらの重要な系統の植物からの花粉を用いて、再生植物に受粉する。所望の外因核酸を含有する本発明のトランスジェニック植物は、当業者に周知の方法を用いて栽培される。
【０１６５】
主としてアグロバクテリウムツメファシエンス（Agrogacterium tumefaciens）の使用による、双子葉植物を形質転換させるための方法およびトランスジェニック植物を得るための方法が、綿（米国特許第５，００４，８６３号、同第５，１５９，１３５号、同第５，５１８，９０８号）；大豆（米国特許第５，５６９，８３４号、同第５，４１６，０１１号）；アブラナ属（Brassica）（米国特許第５，４６３，１７４号）;ラッカセイ（Cheng et al., 1996）；およびエンドウ（Grant et al., 1995）について公表されている。
【０１６６】
外因核酸の導入により植物に遺伝変異を導入するための小麦および大麦などの穀物植物の形質転換方法、およびプロトプラストまたは未成熟植物胚からの植物の再生方法は、当該分野において周知であり、例えば、カナダ特許出願第２，０９２，５８８号、オーストラリア特許出願第６１７８１／９４号、オーストラリア特許第６６７９３９号、米国特許第６，１００，４４７号、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１０６２１、米国特許第５，５８９，６１７号および同第６，５４１，２５７号を参照のこと。他の方法は、特許明細書ＷＯ９９／１４３１４に記載されている。好ましくは、トランスジェニック小麦または大麦植物をアグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）媒介形質転換手順によって生産する。所望の核酸構築物を有するベクターを、再生可能な小麦細胞の組織培養植物もしくは外植体、または適する植物系（例えばプロトプラスト）に導入することができる。
【０１６７】
前記再生可能な小麦細胞は、好ましくは、未成熟胚の胚板、成熟胚の胚板、これらから誘導されたカルス、または分裂組織に由来するものである。
【０１６８】
本発明のポリペプチドを発現する植物は、ＵＳ２００５００２２２６１号に記載されている方法を用いて生産することができ、この場合、ＧＯＸまたはＥＰＳＰＳタンパク質をコードする核酸の代わりに、本発明のポリヌクレオチドを用いる。
【０１６９】
グリホサート耐性小麦は、ＵＳ２００４０１３３９４０号に記載されている方法を用いて生産することができ、この場合、ＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡの代わりに、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を用いる。あるいは、グリホサート耐性小麦は、ＵＳ２００３０１５４５１７号に記載されている方法を用いて、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子構築物を小麦細胞に導入することによって、生産することができる。
【０１７０】
トランスジェニック細胞およびトランスジェニック植物においてトランスジーンの存在を確認するために、当業者には公知の方法を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅またはサザンブロット分析を行うことができる。トランスジーンの発現産物は、その産物の性質に依存して、ウエスタンブロットおよび酵素アッセイを含む、様々な方法のいずれで検出してもよい。タンパク質発現を定量するためにおよび異なる植物組織における複製を検出するために特に有用な方法は、レポーター遺伝子（例えばＧＵＳ）の使用である。一旦トランスジェニック植物が得られたら、それらを成長させて、所望の表現型を有する植物の組織または部分を生産することができる。その植物組織または植物部分を収穫してもよいし、および／またはその種子を回収してもよい。この種子は、所望の特徴を有する組織または部分を伴うさらなる植物を成長させるための源として役立ち得る。
【０１７１】
本明細書に記載する方法を用いて生産された植物は、ＵＳ２００５００２２２６１号またはＵＳ２００６００５９５８１号に一般に概説されている手順を用いて、除草剤（例えばグリホサート）に対する耐性について試験することができる。
【０１７２】
本発明のトランスジェニック植物は、アミン含有除草剤に対する植物の許容度／耐性を強化する、本発明のもの以外の、さらなるトランスジーンを含む場合がある。例としては、グリホサートへのより低い親和性を有し、それ故、グリホサートの存在下でそれらの触媒活性を保持する、細菌ＥＰＳＰＳ変異体および植物ＥＰＳＰＳ変異体の発現（米国特許第５，６３３，４３５号、同第５，０９４，９４５号、同第４，５３５，０６０、および同第６，０４０，４９７号）、ならびにＧＯＸ（これもグリホサートを分解する）の発現（米国特許第５，７７６，７６０号）が挙げられる。
【０１７３】
トランスジェニック非ヒト動物
「トランスジェニック非ヒト動物」は、同じ種または品種の野生型動物において見出されない遺伝子構築物（「トランスジーン」）を含有する、ヒト以外の動物を指す。本明細書において言及する「トランスジーン」は、バイオテクノロジーの分野での通常の意味を有し、ならびに組換えＤＮＡまたはＲＮＡ技術によって生産または変更され、動物細胞に導入される遺伝子配列を含む。トランスジーンは、動物細胞に由来する遺伝子配列を含むことができる。典型的には、トランスジーンは、人的操作によって、例えば形質転換などによって動物に導入されているが、当業者が認識しているような任意の方法を使用することができる。
【０１７４】
トランスジェニック動物を生産するための技術は、当該分野において周知である。この主題に関する有用な一般教科書は、Houdebine, Transgenic animals - Generation and Use (Harwood Academic, 1997)である。
【０１７５】
異種ＤＮＡを、例えば受精した哺乳動物卵子に導入することができる。例えば、全能細胞または多能性幹細胞をマイクロインジェクション、リン酸カルシウム媒介沈殿、リポソーム融合、レトロウイルス感染または他の手段によって形質転換させ、その後、その形質転換細胞を胚に導入し、その後、その胚をトランスジェニック動物へと発育させることができる。非常に好ましい方法では、発生中の胚を、所望のＤＮＡを含有するレトロウイルスに感染させ、その感染させた胚からトランスジェニック動物を生じさせる。しかし、最も好ましい方法では、適切なＤＮＡを、好ましくは単細胞期にある胚の前核または細胞質に共注入し、それらの胚を成体トランスジェニック動物へと発育させる。
【０１７６】
トランスジェニック動物を生産するために用いられるもう１つの方法は、標準的な方法による前核期卵子への核酸のマイクロインジェクションを含む。その後、注入された卵子を培養した後、偽妊娠レシピエントの卵管に移入する。
【０１７７】
トランスジェニック動物は、核移入技術によって生産することもできる。この方法を用いて、ドナー動物からの線維芽細胞を、調節配列の制御のもと、対象となる結合ドメインまたは結合パートナーのコーディング配列が組み込まれているプラスミドで、安定的にトランスフェクトする。その後、安定したトランスフェクタントを除核卵母細胞に融合させ、培養し、雌レシピエントに移入する。
【０１７８】
組成物
本発明の組成物は、「許容される担体」を含むことができる。そのような許容される担体の例としては、水、食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、ハンク溶液、および他の生理的平衡塩水溶液が挙げられる。非水性ビヒクル（例えば、固定油、ゴマ油、オレイン酸エチル、またはトリグリセリド）を使用することもできる。「許容される担体」の正確な性質は、その組成物の使用に依存する。本明細書に記載する使用およびその組成物中の本発明の成分の性質を考慮することにより、当業者は、特定の使用に適する「許容される担体」を容易に決定することができる。
【０１７９】
ポリペプチド、および／またはそれらをコードする発現構築物は、アミン含有除草剤に曝露された患者（例えば人間、動物および魚）を処置するために使用することができる。従って、本発明の組成物は、「医薬組成物」を製造するために「医薬的に許容される担体」を含むことができる。医薬的に許容される担体は、当該分野において周知である（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th Edition (1995)参照）。
【０１８０】
本発明のポリペプチドは、アミン含有除草剤の分解速度および／または分解度を向上させる、もしくはそのポリペプチドの安定性を増大させる組成物中に提供され得る。例えば、本ポリペプチドは、ポリウレタンマトリックス上に固定することができ（Gordon et al., 1999）、または適切なリポソームに封入することができる（Petrikovics et al., 2000a and b）。前記ポリペプチドは、フォーム（例えば消火活動（fire-fighting）の際に常例的に使用されているもの）を含む組成物に組み込むこともできる(LeJeune et al., 1998)。
【０１８１】
当業者の対象者には理解されるが、本発明のポリペプチドは、ＷＯ  ００／６４５３９（この内容は、それら全体が本明細書において参考として援用される）に開示されているようなスポンジまたはフォームにおいて容易に使用することができる。
【０１８２】
本発明の１つの実施形態は、動物、植物、動物もしくは植物の材料、または環境（土壌および水サンプルを含む）に本発明のポリペプチドをゆっくりと放出することができる制御放出製剤である。本明細書において用いる場合、制御放出製剤は、制御放出ビヒクル中に本発明の組成物を含む。適する制御放出ビヒクルとしては、生体適合性ポリマー、他のポリマーマトリックス、カプセル、マイクロカプセル、微粒子、ボーラス調製物、浸透圧ポンプ、拡散デバイス、リポソーム、リポスフェア（liposphere）および経皮送達システムが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい制御放出製剤は、生分解性（すなわち、生体内分解性（bioerodible））である。
【０１８３】
本発明の好ましい制御放出製剤は、アミン含有除草剤（特にグリホサート）を噴霧した領域内に存在する土壌または水に本発明の組成物を放出することができる。この製剤は、好ましくは、約１〜約１２ヶ月に及ぶ期間にわたって放出される。本発明の好ましい制御放出製剤は、少なくとも約１ヶ月間、より好ましくは少なくとも約３ヶ月間、よりいっそう好ましくは少なくとも約６ヶ月間、よりいっそう好ましくは少なくとも約９ヶ月間、およびよりいっそう好ましくは少なくとも約１２ヶ月間、処理を行うことができる。
【０１８４】
アミン含有除草剤を分解するために有効な組成物を製造するために必要となる、本発明のポリペプチド、ベクターまたは宿主細胞などの濃度は、防染すべきサンプルの性質、そのサンプル中のアミン含有除草剤の濃度、およびその組成物の配合に依存する。当業者には理解されるが、前記組成物中のポリペプチド、ベクターまたは宿主細胞などの有効濃度は、実験に基づいて容易に決定することができる。
【０１８５】
抗体
本発明は、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、またはそれらのフラグメントも提供する。従って、本発明は、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の生産のためのプロセスをさらに提供する。
【０１８６】
用語「特異的に結合する」は、本発明の少なくとも一種のポリペプチドに結合するが、他の公知タンパク質には結合しない抗体の能力を指す。
【０１８７】
本明細書において用いる場合、用語「エピトープ」は、抗体によって結合される本発明のポリペプチドの領域を指す。エピトープを動物に投与してそのエピトープに対する抗体を産生させることができるが、好ましくは、本発明の抗体は、ポリペプチド全体の文脈において、そのエピトープ領域に特異的に結合する。
【０１８８】
ポリクローナル抗体が所望される場合、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）を本発明の免疫原性ポリペプチドで免疫する。その免疫された動物から血清を採取し、公知の手順に従って処理する。ポリクローナル抗体含有血清が、他の抗原に対する抗体を含有する場合、それらのポリクローナル抗体を免疫アフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。ポリクローナル抗血清の生産および処理技術は、当該分野において公知である。このような抗体を作ることができるように、本発明は、動物において免疫原として使用するための別のポリペプチドにハプテン化（haptenised）された本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントも提供する。
【０１８９】
本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体も、当業者には容易に生産することができる。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作るための一般的方法論は、周知である。不死抗体生産細胞系統は、細胞融合によって、および他の技術（例えば、発癌性ＤＮＡでのＢリンパ球の直接形質転換、またはエプスタイン−バーウイルスでの形質転換）によっても作ることができる。生産されたモノクローナル抗体のパネルを様々な特性について、すなわち、アイソタイプおよびエピトープ親和性について、スクリーニングすることができる。
【０１９０】
代替技術は、例えば、ファージが、非常に様々な相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するそれらのコートの表面でｓｃＦｖフラグメントを発現する、ファージディスプレイライブラリのスクリーニングを含む。この技術は、当該分野において周知である。
【０１９１】
本発明の目的のために、用語「抗体」は、相反する指定がない限り、ターゲット抗原に対するそれらの結合活性を保持する全抗体のフラグメントを含む。そのようなフラグメントとしては、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメントおよびＦ（ａｂ’）2フラグメント、ならびに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。さらに、抗体およびそれらのフラグメントは、例えばＥＰ−Ａ−２３９４００号に記載されているような、ヒト化抗体であってもよい。
【０１９２】
本発明の抗体は、固体支持体に結合させることができ、および／または適する試薬、対照、説示などとともに適する容器内のキットに包装することができる。
【０１９３】
１つの実施形態では、本発明の抗体を検出可能に標識する。抗体結合を直接測定し得る例示的な検出可能標識としては、放射性標識、発蛍光団、染料、磁気ビーズ、化学発光体、コロイド粒子などが挙げられる。結合の間接的測定を可能にする標識の例としては、その基質が着色生成物または蛍光生成物をもたらすことができる酵素が挙げられる。追加の例示的な検出可能標識としては、適する基質の付加後に検出可能な生成物シグナルを生じさせることができる共有結合型酵素が挙げられる。コンジュゲートでの使用に適する酵素の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼなどが挙げられる。市販されていない場合は、そのような抗体−酵素コンジュゲートは、当業者に公知の技術によって容易に製造することができる。さらなる例示的な検出可能標識としては、アビジンまたはストレプトアビジンに高親和性で結合するビオチン；蛍光活性化細胞選別機で使用することができる蛍光色素（例えば、フィコビリプロテイン、フィコエリトリンおよびアロフィコシアニン；フルオロセインおよびテキサスレッド）；ハプテンなどが挙げられる。好ましくは、前記検出可能標識は、プレート照度計で直接測定が可能なもの、例えばビオチンである。そのような標識抗体を当該分野において公知の技術で使用して、本発明のポリペプチドを検出することができる。
【０１９４】
微生物寄託の詳細
アルスロバクター属種ＴＢＤ（Arthrobacter sp. TBD）は、２００６年４月１１日、オーストラリア国家計量研究所（National Measurement Institute,51-65 Clarke Street,South Melbourne,Victoria 3205,Australia）にアクセッション番号Ｖ０６／０１０９６０で寄託された．
【０１９５】
この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約（Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure）およびそのもとでの規則の規定に従って行われた。これは、寄託の日から３０年間、生存培養物の保存を保障する。関連特許の発行の際にその培養物の子孫を永久におよび拘束なく公的に利用可能であることを保障するブタペスト条約の約定に従って、前記国家計量研究所はそれらの生物を利用できるようにする。
【０１９６】
本出願の譲受人は、培養寄託物が、適する条件下で培養された場合に死滅したまたは喪失または破壊されたなら、通知に対して速やかに同じ培養物の生存試料を再寄託することに同意している。寄託株の利用可能性を、任意の政府の支配下でその特許法に従って許可される権利に反して本発明を実施するためのライセンスとみなしてはならない。
【実施例】
【０１９７】
実施例１−グリホサート分解細菌の単離
材料および方法
化学物質
Ｎ−（ホスホノメチル）グリシン（グリホサート）は、ＩＣＮまたはＳｉｇｍａから入手した。すべての他の分析用試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。
【０１９８】
培地
別様に述べていなければ、窒素源のない最小培地は、Ｍ９塩［６ｇ  Ｎａ2ＨＰＯ4、３ｇ  ＫＨ2ＰＯ４、１ｇ  ＮａＣｌ］、微量元素（金属イオンおよびビタミン類を含む）、２００μＭ  ＭｇＣｌ2、２００μＭ  ＣａＣｌ2、および、炭素源としての１％グルコースを含む。
【０１９９】
グリホサート分解細菌の単離
様々な土壌分離菌および本発明者らの実験室用菌株貯蔵物（bank）を、液体培養において唯一の窒素源としてグリホサートを利用する能力について試験した。分離菌を濃い液体培地（栄養ブロス（Ｍｅｒｃｋ）またはＬｕｒｉａブロス（例えば、Sambrook et al., 1989におけるもの）のいずれか）中、適切な温度で一晩培養し、その後、唯一の窒素源として０．２％（１１．８ｍＭ）グリホサートを含有する最小培地で０．０１のＯＤ600nmに希釈した。Softmax Pro Platereader（Molecular Devices）でフレキシプレート（BD Biosciences）内の２００μＬの培養物のＯＤ600nmを測定することにより、増殖を評価した。
【０２００】
アルスロバクター属種ＴＢＤ（Arthrobacter sp. TBD）の同定
アルスロバクター属種ＴＢＤ（Arthrobacter sp. TBD）から抽出したゲノムＤＮＡおよびユニバーサルプライマーを使用して１６ＳｒＤＮＡをＰＣＲ増幅し、得られた１．３５ｋｂ産物の塩基配列を決定した。
【０２０１】
分析方法
ＨＰＬＣ分析によるグリホサートおよびＡＭＰＡの検出は、Ｔｏｍｉｔａら（１９９１）の方法の修正バージョンを用いて行った（カラム：Ｃ１８  ４．６ｕＭ、５Åカラム）。移動相：０．２Ｍ  Ｋ2ＨＰＨＯ４，１５％アセトニトリル）。分析物を塩化トシルで誘導体化し、２４０ｎｍの波長で検出した。１ｍＬの反応上清を０．５ｍＬの０．４Ｍ  ＮａＨＰＯ4（ｐＨ１１．０）と混合し、その後、２００μＬ  塩化トシル溶液（アセトニトリル中、１０ｍｇｍＬ-1のｐ−トルエンスルホニルクロライド［Ｓｉｇｍａ］）を添加した。５０℃で５分間のインキュベーションの後、２０μＬの濾過した反応生成物を分析のためにＨＰＬＣに注入した。
【０２０２】
結果
唯一の窒素源としてグリホサートを利用することができるいくつかの細菌が、土壌濃縮物からも、本発明者らの実験室用農薬分解微生物コレクションのスクリーニングからも同定された。これらの分解細菌は、単離アルスロバクター属種株ＴＢＤ（Arthrobacter sp. strain TBD）を含んでおり、これは、唯一の窒素源としてグリホサートを利用して液体最小培地中で急速に増殖してコンフルエントになることができることが判明した。
【０２０３】
Ribosomal DataBank（Cole et al., 2005）およびＢＬＡＳＴ（McGinnis and Madden, 2004）での前記全長１６ＳｒＤＮＡ配列の比較は、前記細菌単離株がアルスロバクター属種株ｃ１３８（Arthrobacter sp. strain c138）（Futamata et al., 2005）に最も類似しており、塩基配列決定した１．３５ｋｂ  １６ＳｒＤＮＡ遺伝子に対して９９．４９％のヌクレオチド同一性を有することを示した。
【０２０４】
培養上清のＨＰＬＣ分析により、アルスロバクター属種ＴＢＤ（Arthrobacter sp. TBD）が、７２時間以内に培養培地中のグリホサートの７０％（８．２８ｍＭ）を除去し得ることが判明した。
【０２０５】
実施例２−アルスロバクター属種ＴＢＤ（Arthrobacter sp. TBD）のグリホサート分解活性の原因である遺伝子の単離
材料および方法
アルスロバクター属種ＴＢＤ（Arthrobacter sp. TBD）のゲノムＤＮＡライブラリの調製およびスクリーニング
Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）の方法を用いて、細菌細胞を培養して、唯一の窒素源としてのグリホサートで飽和された状態にし、ゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡをＳａｕ３Ａ１で部分的に消化し、ＢａｍＨＩで消化されたｐＷＥＢ：：ＴＮＣ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）ベクターを使用してコスミドライブラリを作った。そのライブラリをＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換させ、個々のプラスミドを、溶液Ｃを補足した最小培地中で唯一の窒素源としてグリホサートを利用して増殖をもたらすの能力についてスクリーニングした。
【０２０６】
陽性コロニーを選択し、その後、３７℃で振盪しながら増殖させた１０ｍＬの培養物において、唯一の窒素源としてグリホサートを用いて増殖をもたらす能力を確認した。その培養物の上清画分をＨＰＬＣによって分析して、培地からのグリホサートの除去を確認した。
【０２０７】
ＧｌｏｘＡをコードする遺伝子の単離
コスミドｐＷＥＢ：：Ａ１１２をＥｃｏ  Ｒ１で消化し、生じた６つのバンドを調製したベクターｐＫ１８にサブクローニングした。ベクター調製中、ｐＫ１８をＥｃｏ  Ｒ１（ＮＥＢ）で線形化し、エビアルカリホスファターゼを製造業者の説示（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って用いて脱リン酸化した。そのコスミドからのＥｃｏ  Ｒ１フラグメントのミニライブラリを、上で説明したような活性についてスクリーニングし、９ｋｂフラグメントが大腸菌細胞に対してグリホサート分解活性をもたらすことが判明した。その後、この構築物からの共有フラグメントのショットガンライブラリを、６倍の適用範囲の標準物質（standard of 6 times coverage）（ＡＧＲＦ、オーストラリア）に対して配列した。配列分析およびヌクレオチドとタンパク質データベースの比較は、Vector NTI Advance 9.0（Informax、Invitrogen）およびNCBI BLAST（Altschul et al., 1997, 2004）を使用して行った。
【０２０８】
ＧｌｏｘＡに関するバイオインフォマティック分析
Vectror NTI v.9（Informax Inc.USA;Invitrogen,Australia）およびＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ（Altshul et al, 1997）を使用して、配列データおよび予測アミノ酸配列を分析し、コンプライし、注釈をつけ、データベースと比較した。ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋおよびその保存ドメインデータベースＣＤＤが、比較に用いた主データベースであった。
【０２０９】
結果
ＧｌｏｘＡをコードする遺伝子の単離
アルスロバクター属種ＴＢＤ（Arthrobacter sp. TBD）からのゲノムＤＮＡのコスミドライブラリのスクリーニングにより、唯一の窒素源としてグリホサートを利用して増殖する能力をもたらすことができる唯一のコスミドが判明し、ｐＷＥＢ：：Ａ１１２と名づけた。この構築物からの６つのＥｃｏＲ１制限酵素フラグメントをスクリーニングし、グリホサート分解活性は、構築物ｐＫＷＥ１Ｃ１２では、９．５ｋｂ  ＥｃｏＲ１フラグメントに位置した。この９５２０ｂｐ領域の完全配列により、グリホサートを開裂させる能力を有する唯一の予測タンパク質（ＯＲＦ  ９によってコードされる推定オキシドレダクターゼ）が判明した。
【０２１０】
このグリホサート分解タンパク質をＧｌｏｘＡと呼び、ｇｌｏｘＡの発現ベクターへのサブクローニングおよびグリホサート分解活性についてのアッセイにより、組み換えＧｌｏｘＡを発現する細胞はグリホサートを分解することができることが確認され、結果として生じた細胞の生体触媒性アッセイは、３００μモル分-1ｍｇ湿潤細胞質量-1（μmol min-1 mg wet cell mass-1）のグリホサート分解活性を有し、粗酵素抽出物は、８４１μモル分-1ｍｇ全タンパク質の活性を有した（表２）。重要なのは、グリシンがＧｌｏｘＡの分析のこの期での産物として検出されなかったことであり、大腸菌休止細胞に含有される他の酵素および粗酵素抽出調製物によって急速に代謝されていると推定される。
【表２】
2009536819.tif 000003
【０２１１】
ＧｌｏｘＡは、約５２．５ｋＤａの分子量、５．７８の予測等電点およびｐＨ７で約１１．６１の電荷を有する、４７３アミノ酸タンパク質（配列番号１）である。そのコーディング配列を配列番号２として提供する。特に、開始コドンは、細菌遺伝子には一般的でない、バリン残基をコードする、ＧＴＧである。開始ＶａｌのＭｅｔでの置換は、その酵素のグリホサート分解活性を大きくは変えなかった（表３）。
【表３】
2009536819.tif 000004
【０２１２】
バイオインフォマティクス分析
ＧｌｏｘＡの推定アミノ酸配列（配列番号１）は、ストレプトマイセスコエリコロル（Streptomyces coelicolor）Ａ３（アクセッション番号ＣＡＡ２０２１８）からの推定オキシドレダクターゼと５６％アミノ酸配列同一性（７２％類似性）を共有する。このアミンオキシダーゼフラボプロテインは、アミノ酸、ならびに第一アミンおよび第二アミン（特に、単量体サルコシンオキシダーゼと基質特異性を共有するもの）の酸化的脱アミノ化を触媒すると予測される（Mortl et al., 2004）。アミンオキシダーゼは、定義された代謝的役割を有さないが、低い反応速度効率で小さいアミンに対する広い基質特異性を示す。
【０２１３】
実施例３−ＧｌｏｘＡの酵素的活性
材料および方法
酵素アッセイ
大腸菌細胞からの粗酵素抽出物を、次のとおり調製した。細胞を回収し、細胞ペレットを１ｍＬ溶解バッファ（１ｍｇｍＬ-1  リゾチームを含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５）に再懸濁させ、氷上での音波処理によって溶解した（Ｂｒａｎｓｏｎ音波発生器、６０％デューティサイクル、３０秒実行、３０秒停止を１０回反復）。可溶性画分を５分間の５０００ｇでの遠心分離によって回収し、Ｂｉｏｒａｄタンパク質染料結合アッセイ（ＢＩＯＲＡＤ）を用いてタンパク質含量を測定した。Ｓ−プロテインアガロース（Ｎｏｖａｇｅｎ）、Talon HIS-tag Purification System（BD Biosciences）を製造業者の説示に従って使用する可溶性ＣＦＥからのＳタグ付またはＨＩＳタグ付のＧｌｏｘＡタンパク質の精製によって、部分的に精製された抽出物を調製した。ローディングバッファ中の３Ｍ  ＭｇＣｌ2または２．５ｍＭ  イミダゾールのいずれかを使用してカラムから部分的に純粋なＧｌｏｘＡを溶出させた。２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＦＡＤ、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２中の５００μＬ  粗酵素抽出物または２５０μＬ  部分的に精製された酵素抽出物（〜１０μｇ  タンパク質溶解産物）を含有する酵素反応物を調製した。３７℃で２分間のプレインキュベーションの後、１ｍＭ  グリホサートをその反応物に添加し、その後、それをさらに１０〜６０分間、振盪しながらインキュベートした。必要反応時間の後、上で説明したように、反応物を塩化トシルで誘導体化し、ＨＰＬＣによって分析した。すべての酵素アッセイは、三重反復で行い、少なくとも２回繰り返してデータを確認した。見掛けの動態パラメータを決定するために、基質濃度を適する範囲にわたって変化させ、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）またはＨｙｐｅｒ  １．１（Ｊ．Ｓ．Ｅａｓｔｅｒｂｙ）を使用して指数方程式の合計にそれらのデータを当てはめた。
【０２１４】
結果
文献の中の大部分の以前の報告に相反して、本発明者らは、ＧｌｏｘＡによるグリホサートからのＡＭＰＡの生産を検出しなかった。グリシンは、粗抽出物と部分的に精製されたＧｌｏｘＡタンパク質の両方のグリホサートとの反応から検出される最も豊富な生成物であった。このことおよびＧｌｏｘＡの予測アミノ酸配列と他のオキシドレダクターゼフラボプロテインとの相同性から、本発明者らは、ＧｌｏｘＡは、グリホサートのホスホノメチルＣ−３炭素と窒素の結合を開裂させてグリシンとオキソホスホン酸を生じさせるために酸化還元メカニズムを利用する可能性が高いと結論付けた。オキソホスホン酸は、反応上清中では検出されないが、水性条件下で急速に酸化されると予想される。
【０２１５】
グリシンは、細菌増殖培養物の固相ＮＭＲ分析によって同定されたようなシュードモナス属種株ＰＧ２９８２（Pseudomonas sp. strain PG2982）（Kent-Moore et al., 1983; Jacob et al., 1985; Fizgibbon and Braymer, 1990）およびシュードモナス属種株ＬＢｒ（Pseudomonas sp. strain LBｒ）（Jacob et al., 1988）において見出されるグリホサートの開裂の副産物でもある。アルスロバクター属種株ＧＬＰ−１０（Arthrobacter sp. strain GLP-10）もグリホサートからグリシンを生じさせると報告されているが、これは、Ｃ−Ｐリアーゼ多酵素複合体によりグリホサートにおけるＣ−Ｐ結合を開裂させてサルコシンを生成し、その後、グリシンに変換されることに由来する（Kishore and Jacob, 1987）（図１参照）。このＣ−Ｐリアーゼ反応は、少なくとも４つの異なるタンパク質（これらはいずれもＧｌｏｘＡとアミノ酸類似性を共有しない）が関与する複合膜結合タンパク質系によって触媒される（Metcalf and Wanner, 1993）。従って、無細胞様式でグリホサートをグリシンに開裂させるＧｌｏｘＡの活性は、グリホサートの開裂についての新規メカニズムを意味する（図２）。
【０２１６】
最大ＧｌｏｘＡ活性のための正確な反応条件は、これら２つの成分が不在の状態であるときのＧｌｏｘＡの相対比活性に基づいて、金属イオンおよびことによると、補因子としてのＦＡＤの使用を含むようである（表２）。
【０２１７】
部分的に精製された組換えＧｌｏｘＡ酵素の基質範囲を表４に提供する。特に、ＧｌｏｘＡは、ＢａｓｔａTMにおいて見出される除草剤であるグリホシネートも開裂させることができる。
【表４】
2009536819.tif 000005
【０２１８】
表５は、これらの化合物を分解するいくつかの他の公知酵素と比較した、グリホサートおよびグルホシネートに対するＧｌｏｘＡの酵素活性の比較を提供するものである。利用した条件のもと、ＧｌｏｘＡは、前記公知酵素と比較したとき、優れたグリホサート分解活性を有した。
【表５】
2009536819.tif 000006
【０２１９】
上記の表２は、Ｍｇ2+およびＦＡＤの存在を試験した条件のものが最高の活性を生じさせたことを示している。さらに、二価金属イオンを試験し（表６）、金属イオンまたはＦＡＤが不在の状態で酵素活性が観察された。反応へのＣｏ2+の追加は、試験した他の条件と比較したとき、最大活性を生じさせた。
【表６】
2009536819.tif 000007
【０２２０】
実施例４−ＧｌｏｘＡとＧＯＸの比較
材料および方法
ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーション
ゲノムＤＮＡ、プラスミドおよびコスミド構築物を適切な制限酵素で完全に消化し、ＨｙｂｏｎｄＮ+ ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ、現ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、その製造業者により説明されたとおりのアルカリ転写を用いて転写した。
【０２２１】
放射性標識プローブは、４μＬ  ５Ｘ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨｉＦｉｄｅｌｉｔｙ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）バッファ；１２．５ｐｍｏｌ  アンチセンスプライマー（ＣＧＯＸ１Ｂ；ＡＴＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＡＡＡＡＡＧＴＡＧ）（配列番号４）；  ０．１ｐｍｏｌ  センスプライマー（ＣＧＯＸ２Ｂ；ＴＴＡＡＣＴＴＧＣＣＧＧＡＣＣＣＧＴＴＴＧＣＴＴＧ）（配列番号５）；ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ａＧＴＰのそれぞれについて２００μＭ；５μＭ  ｄＡＴＰ；０．３３μＭ  α−32Ｐ−ｄＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）および２ＵのＥｘｐａｎｄ  ＨｉＦｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を含有する反応物中の３０ｎｇ  テンプレートＤＮＡ（ｐＬＳＧＯＸ）を使用して、非対称ＰＣＲ（asymmetric PCR）によって生成した。反応を９４℃で３分間サイクリングし、その後、３０サイクルの（９４℃で４５秒間、４８℃で４５秒間、７２℃で３０秒間）、最後に７２℃で５分間の伸長を行った。得られた放射性標識ＰＣＲ産物を、ＱＩＡ  Ｑｕｉｃｋ  ＤＮＡ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、３０μＬ  滅菌水に溶出させた。６５℃で（Ｈｙｂａｉｄオーブンにおいて）２時間インキュベートした６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．１％ピロリン酸ナトリウム（ＮａＰＰｉ）、０．５％ＳＤＳを含有する溶液中で膜をプレハイブリダイズし、その後、５μＬ（約５０μＣｉ）の放射性標識プローブをそのハイブリダイゼーションボトルに添加した。その後、そのハイブリダイゼーションを一晩（１８時間）、６５℃（ストリンジェントな条件）または４２℃（低ストリンジェンシー条件）で反応を進行させた。Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）によって記載されたように様々なストリンジェンシーの洗浄を行った。
【０２２２】
ＧＯＸ発現
酵素間の直接比較の目的のために、米国特許第５，７７６，７６０号からの配列番号１７に基づくＧＯＸ遺伝子をコードする合成構築物を作った。その合成構築物をｐＬＳＧＯＸ（カナダのＴｏｐｇｅｎｅによって製造された特注品）から発現ベクターｐＥＴ２９ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＥｃｏ  Ｒ１部位にサブクローニングして、Ｎ−末端−Ｓタグを有する酵素を生じさせた。ＧＯＸの可溶性タンパク質発現を様々な温度およびＩＰＴＧ条件下で最適化し、Coomasie染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によってＧＯＸタンパク質発現を検出し、ＧｌｏｘＡについて上で説明したようにＧＯＸ酵素活性をアッセイし、上記の分析法に従って活性のＨＰＬＣ分析を用いてグリホサートの除去およびＡＭＰＡの生産について検出した。
【０２２３】
結果
上で説明したグリホサート分解構築物についての全遺伝子配列を得る前に、単離されたＤＮＡとｇｏｘ遺伝子の相同性をＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションによって試験した。結果として得たサザンブロットは、標準条件下でも、ストリンジェントでない条件下でも、そのＤＮＡ構築物とｇｏｘ遺伝子との間の検出可能な特異的結合を示さなかった（図３）。
【０２２４】
グリホサートオキシドレダクターゼ（ＧＯＸ）は、単一の酵素的工程でグリホサートを開裂させることができる、文献に報告されている唯一の他の酵素であり、主張によると、還元されたフラビンを再び酸化して、グリホサートのＣ２−炭素−窒素結合を破壊してＡＭＰＡおよびグリオキシレートを生じさせることによりグリホサートからＡＭＰＡを生じさせる（ＷＯ  ９２／００３７７；米国特許第５，７７６，７６０号）。ＧＯＸ変異体ｖ．２４７の比活性は、野生型ＧＯＸの１５ｎｍｏｌ分-1ｍｇ-1より３〜４倍高く、６０ｎｍｏｌ分-1ｍｇ-1の近似的活性であると米国特許第５，７７６，７６０号に記載されている。ＧｌｏｘＡについての本発明者らの最初の粗酵素活性データは、ＧｌｏｘＡがＧＯＸよりはるかに高い比活性を有することを示した（表３、８４１μｍｏｌ分-1ｍｇ-1）。
【０２２５】
これを確認するには直接比較が必要であり、そのため、本発明者らは、本発明者らのＧｌｏｘＡ変異体と同じ方法で合成ＧＯＸ構築物の粗抽出物を調製し、２つの酵素を並行してアッセイした。これらの条件下で、グリホサートに対するＧｌｏｘＡの比活性は、ＧＯＸよりほぼ２倍高かった（図４）が、イミノ二酢酸に対してはＧＯＸと同様であった（０．９倍未満、図４）。ＷＯ  ９２／００３７７のデータと本発明者らのものと間の活性の差は、おそらく、幾つかの要因（本発明者らの場合では、酵素が部分的にしか精製されていないこと、ならびに使用した発現系および条件の差）に関する。
【０２２６】
両方の酵素がイミノ二酢酸に対して有意に高い活性を示し、両方がグリシンおよびグリオキシレートを生成した。これは、ＧＯＸについてのＣ２−炭素−窒素結合開裂の優先性、およびＧｌｏｘＡについてのＣ３−炭素−窒素結合開裂優先性と矛盾しない。これは、両方の開裂反応が、イミノ二酢酸からグリオキシレートおよびグリシンを生成させるからである（図２参照）。
【０２２７】
実施例５−ＧｌｏｘＡと他の相同タンパク質の比較
材料および方法
ＢＬＡＳＴＩＮおよびＢＬＡＳＴＰ（Altschul et al., 1997）をそれぞれ使用して、ＧｌｏｘＡヌクレオチドおよびアミノ酸配列を非重複性ヌクレオチドおよびタンパク質ＮＣＢＩデータベースと比較した。その後、選択した推定ＧｌｏｘＡ様相同タンパク質を発現させ、グリホサート分解活性についてアッセイした。選択した推定相同体のヌクレオチドコーディング配列は、商業用に合成されており（Ｇｅｎｅａｒｔ，ＧｍＢＨ）、Champion pET200D/TOPO.Expression System（Invitrogen）を、製造業者の説示に従って使用して、クローニングして発現させた。AlphaImager 2200視覚化およびドキュメンテーションシステム（Alpha Innotech）を使用して、Coomasie染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびスポットデンシトメトリーにより、組換えタンパク質発現を確認および定量した。
【０２２８】
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．２中の１００μｇ  完全無細胞タンパク質（〜１０μｇ  酵素抽出物）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  グリシンを含有する１ｍＬ量中の可溶性無細胞タンパク質抽出物（部分的に精製されたタンパク質）を用いて、グリホサート分解を評価するために酵素的アッセイを行った。陰性対照は、発現ベクターを含有せず、また挿入物を伴わないｐＥＴ２００Ｄ／ＴＯＰＯを含有する、大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒからの無細胞抽出物を含むものであった。
【０２２９】
結果
ＧｌｏｘＡは、以前には説明されていないが、アルスロバクターアウレセンスＴＣ１（Arthrobacter aurescens TC1）の完全ゲノムアノテーションから近ごろ予測された推定オキシドレダクターゼタンパク質に最も類似しており（８６％  アミノ酸同一性；ＮＣＢＩアクセッション番号ＣＰ０００４７４．１）、およびまた、ＤａｄＡファミリーのアミンオキシダーゼタンパク質と推定保存タンパク質ドメインを共有する（ＣＤＤ  ＣＯＧ０６６５）。
【０２３０】
Ｇｌｏｘ  Ａは、前記非重複性タンパク質データベース内の幾つかの他のタンパク質とタンパク質配列同一性を共有する。それらの相同体は、ブレビバクテリウム属系統ＢＬ２（Brevibacterium linens BL2）のゲノムのアノテーションから予測された推定グリシンオキシダーゼタンパク質（ＮＣＢＩアクセッション番号ＺＰ＿００３８１１８６）を含み、それがグリホサートを開裂させてグリシンを生じさせることができることも本発明者らは立証した（表７）。
【表７】
2009536819.tif 000008
【０２３１】
実施例６−アラビドプシス（Arabidopsis）におけるＧｌｏｘＡの発現
植物発現のために最適化されたＧｌｏｘＡをコードするＤＮＡ（配列番号６）。配列番号６に提供する配列は、５’末端および３’末端に付加されたクローニング部位、ならびに開始コドンの直前にＡＡＣＡを含む。このコーディング配列は、配列番号６のヌクレオチド１６から１４３２にわたる。ＧｌｏｘＡをコードするＤＮＡを、アグロバクテリウム(Agrobacterium)トランスファーベクター、ｐ２７７（オーストラリア、キャンベラのＣＳＩＲＯ  Ｐｌａｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙから入手したもの）にクローニングした。このベクターは、ｐＡＲＴ７からのＮｏｔＩフラグメントをｐＡＲＴ２７に挿入することによって構築された（Gleave,1992）。このｐ２７７ベクターは、植物発現のためのＣａＭＶ  ３５ＳプロモーターおよびＯＣＳターミネーター、抗生物質選択のためのマーカー、ならびに植物細胞形質転換に必要な配列を含有する。その構築物をＰＣＲによって合成し、ｐ２７７トランスファープラスミドに一方向にクローニングした。
【０２３２】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）株ＧＶ３１０１の形質転換は、三親交配(triparental mating)方法を用いて達成した。これは、非選択的ＬＢプレート上へのＡ．ツメファシエンス（A. tumefasciens）ＧＶ３１０１の培養物、ヘルパープラスミド（ＲＫ２０１３）を有する大腸菌の培養物、および所望の組換えｐ２７７プラスミドを有する大腸菌の培養物の共線条接種（co-streaking）を含む。２８℃での一晩のインキュベーションによって、混合培養物を得、それを回収し、ＬＢプレートに希釈線条接種し、ｐ２２７組換えプラスミドを有するＡ．ツメファシエンス（A. tumefasciens）ＧＶ３１０１についてを選択した。
【０２３３】
アラビドプシス(Arabidopsis)植物を、２３℃、１日１８時間の点灯時間で、標準的な方法によって培養した。アラビドプシス(Arabidopsis)植物の形質転換は、花の浸漬によって行った。植物を週齢３〜５週まで成長させる（この場合、多くの花茎が発生の種々の段階において花を呈した）。形質転換Ａ．ツメファシエンス（A. tumefasciens）ＧＶ３１０１の一晩培養物をペレットにし、湿潤剤Ｓｉｌｗｅｔ−７７を含有する５％スクロースに再び懸濁させる。花を細菌懸濁液に浸漬し、ささっと動かす動作（sweeping motion）を用いることによって完全に湿潤させた。それらの植物をプラスチックフィルムでラップし、一晩、室温でベンチトップの上に放置し、その後、ラップを外し、２１℃に維持された植物成長キャビネットに戻した。１〜２週間後に浸漬を繰り返して、形質転換種子の数を増加させた。浸漬の３〜４週間後に種子を回収し、それぞれの生態型（ecotype）に適する時間長、種子袋（seed envelope）の中で乾燥させ、その後、滅菌し、選択的抗生物質および抗真菌剤を含有するＮｏｂｌｅ寒天プレートで発芽させた。
【０２３４】
陽性形質転換体をＡｒａｓｙｓｔｅｍポット（Ｂｅｔａｔｅｃｈ）に移植し、Ａｒａｃｏｎシステムのスリーブ内で成熟するまで成長させ、その種子を慎重に回収した。形質転換アルビドプシス(Arabidopsis)植物（Ｔ１世代）をＰＣＲおよび逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によってスクリーニングして、組換え遺伝子の存在および発現を確認した。Extract-N-Amp Plant PCRおよびExtract-N-Amp Reagent kits（Sigma）を使用して、前記構築物で形質転換させた植物の葉からゲノムＤＮＡを抽出した。ＧｌｏｘＡをコードする配列に特異的なプライマーを使用して、それらの抽出物に関するＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲについては、前記構築物で形質転換させた約８の植物を分析のためにランダムに選択した。これらの植物からの葉を瞬間冷凍し、乳鉢と乳棒を使用して液体窒素中で粉砕する。RNeasy Plant kit（Qiagen）を使用して、ＲＮＡを単離する。iScript cDNA Synthesis kit（Bio-Rad）を使用してそのＲＮＡからｃＤＮＡを調製する。１μＬのｃＤＮＡ、組換え体Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５４℃のアニーリング温度、およびＧｌｏｘＡ特異的プライマーを使用して、ＰＣＲを行った。それぞれの２５μＬ ＰＣＲ反応物の３μＬを、１．２％アガロースゲルで可視化する。アラビドプシス(Arabidopsis)ハウスキーピング遺伝子ａｒａＰＴＢ（ＴＡＩＲアクセッション番号ＡＴ３Ｇ０１１５０）を参照遺伝子として用い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７０００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステムを使用して、定量的ＰＣＲを行った。選択したカナマイシン耐性Ｔ２およびＴ３植物は、前記参照遺伝子より３０から１００倍大きい範囲にわたるレベルでＧｌｏｘＡ  ｍＲＮＡを発現した（表８）。
【表８】
2009536819.tif 000009
【０２３５】
２世代を経た種子のためにＴ１実生を移植および栽培して、最終的にホモ接合型Ｔ３種子を単離することができる。その後、シロイヌナズナ変異体（A. thaliana var.）、Ｃｏｌｕｍｂｉａではなく、Ｌａｎｄｓｂｅｒｇを用い、および２．５〜２５ｋｇ  ａ．ｉ．ｈａ-1の範囲の処理用量を用いたが、本質的にはＪａｎｄｅｒら（２００３）によって記載された方法を用いて、Ｔ２およびＴ３植物をグリホサートに対する耐性増大についてスクリーニングした。図５に与えるスコアは、予想Ｉ100用量の５倍の用量（１２．５ｋｇ  ａ．ｉ．ｈａ-1）についてのものである。
【０２３６】
全植物タンパク質の抽出（例えば、Pierce P-PER Plant Protein Extraction Kitを使用する）、ならびにウエスタンブロット抗体検出システムと酵素抽出アッセイの両方を使用する植物細胞内のＧｌｏｘＡタンパク質発現の評価によって、期Ｔ１〜Ｔ３からのトランスジェニック植物の葉も分析することができる。ウエスタンブロット分析については、先ず、植物タンパク質抽出物を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．２で１０倍に希釈し、その後、Biorad Protein Dye（Biorad）によって定量した。等量の植物タンパク質を１０％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのそれぞれのウエルにローディングし、電気泳動によって分離した。その後、Ｍｉｎｉ−Ｂｌｏｔ装置（例えば、Ｂｉｏｒａｄ）を製造業者の説示に従って使用して、それらのタンパク質をニトロセルロース膜にブロットした。その後、精製組換えＧｌｏｘＡタンパク質に対して調製した一次抗体（例えば、オーストラリア、アデレードのInstitute of Veterinary and Medical Scienceによって調製された、精製ポリクローナルウサギＩｇＧ）を使用して、Western Breeze Chemiluinescent Detection Kit（Invitrogen）の説示に従って、免疫検出を進めることができる。ＧｌｏｘＡを発現するトランスジェニックアラビドプシス（Arabidopsis）の葉の細胞において（図５）、０．８ｎｇ／（ｕｇ  全タンパク質）以下のレベルで、ＧｌｏｘＡタンパク質が検出された。
【０２３７】
１００μｇの全タンパク質（ウエスタンブロットデータから８０ｎｇ  ＧｌｏｘＡと推定された）を２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．２、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２と合わせることにより、トランスジェニック植物タンパク質抽出物のＧｌｏｘＡ活性についてもアッセイした。３７℃で２分間のプレインキュベーションの後、１ｍＭ  グリホサートをその反応物に添加し、その後、それを振盪させながらさらに６０〜１２０分間、インキュベートした。必要な反応時間の後、上で説明したように、反応物を塩化トシルで誘導体化し、ＨＰＬＣによって分析した。すべての酵素アッセイは、三重反複で行い、少なくとも２回繰り返してデータを確認した。ＧｌｏｘＡ  ｍＲＮＡ（ｑＰＣＲデータに基づく）およびタンパク質（ウエスタンブロットデータに基づく）を発現するＴ２植物の葉から、有意な活性を検出することができた。
【表９】
2009536819.tif 000010
【０２３８】
実施例７−ＧｌｏｘＡを発現するトランスジェニックトウモロコシの生産
配列番号１をコードするｃＤＮＡを、そのｃＤＮＡフラグメントの５’に位置するトウモロコシユビキチンプロモーター（欧州特許第３４２  ９２６号）およびそのｃＤＮＡフラグメントの３’に位置する１０ｋＤ  ゼイン３’末端に対してセンス配向で含むキメラ遺伝子を構築することができる。この遺伝子のｃＤＮＡフラグメントは、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するそのｃＤＮＡクローンのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により作製することができる。消化されたベクターｐＭＬ１０３（ＡＴＣＣアクセッション番号９７３６６）に挿入したとき、ＤＮＡフラグメントの正しい配向が得られるように、そのｃＤＮＡの増幅に使用するオリゴヌクレオチドにクローニング部位（それぞれ、ＰｃｉＩおよびＳｍａＩ）を組み込むことができる。その後、標準的なＰＣＲ反応で増幅を行う。その後、その増幅されたＤＮＡを適切な制限酵素ＰｃｉＩおよびＳｍａＩで消化し、アガロースゲルで分画する。そのゲルから適切なバンドを単離し、プラスミドｐＭＬ１０３と合わせることができる。ｐＭＬ１０３からのＤＮＡセグメントは、標準的な技術を用いてトウモロコシユビキチンプロモーターと置換される、トウモロコシ２７ｋＤ  ゼイン遺伝子の１．０５ｋｂ  ＳａｌＩ−ＮｃｏＩプロモーターフラグメント、およびベクターｐＧｅｍ９Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ）中のトウモロコシ１０ｋＤ  ゼイン遺伝子の３’末端からの０．９６ｋｂ  ＳｍａＩ−ＳａｌＩフラグメントを含有する。標準的な手順を用いて、ベクターおよび挿入ＤＮＡを１５℃で一晩、ライゲートすることができる。その後、そのライゲートされたＤＮＡを使用して、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換させることができる。プラスミドＤＮＡの制限酵素消化、およびジデオキシチェーンターミネーション法を用いる限定ヌクレオチド配列分析によって、細菌形質転換体をスクリーニングすることができる。得られたプラスミド構築体は、トウモロコシユビキチンゼインプロモーターを５’から３’への方向でコードするキメラ遺伝子、ＧｌｏｘＡをコードするｃＤＮＡ、および１０ｋＤ  ゼイン３’領域を含む。
【０２３９】
その後、上で説明したキメラ遺伝子を、以下の手順によってコーン細胞に導入することができる。コーン近交系Ｈ９９およびＬＨ１３２の交配に由来する発育中の穀果から未成熟コーン胚を切り離すことができる。それらの胚は、１．０から１．５ｍｍの長さになると、受粉から１０から１１日後に単離する。その後、それらの胚を、軸側が下に向き、アガロース凝固Ｎ６倍地（Chu et al., 1975）に接触した状態にする。それらの胚を２７℃の暗所で保持する。胚柄構造上に担持された体細胞性前胚様体（proembryoid）および胚様体を有する細胞の未分化の塊から成るもろい胚形成カルスが、これらの未成熟胚の胚盤から増殖する。一次外植体から単離した胚形成カルスをＮ６倍地で培養し、２〜３週ごとにこの培地で二次培養することができる。
【０２４０】
カルス培養細胞に遺伝子を移入するためにパーティクルボンバードメント法（Klein et al., 1987）を使用することができる。この方法によると、以下の技術を用いて金粒子（直径１μｍ）をＤＮＡでコーティングする。１０μｇのプラスミドＤＮＡを、５０μＬの金粒子懸濁液（１ｍＬあたり６０ｍｇ）に添加する。塩化カルシウム（５０μＬの２．５Ｍ溶液）およびスペルミジン不含塩基（２０μＬの１．０Ｍ溶液）をそれらの粒子に添加する。これらの溶液の添加の間、その懸濁液をボルテックス攪拌する。１０分後、それらのチューブを短時間、遠心分離（１５，０００ｒｐｍで５秒間）し、上清を除去する。それらの粒子を２００μＬの無水エタノールに再び懸濁させ、再び遠心分離し、上清を除去する。エタノールリンスを再び行い、それらの粒子を最終体積３０μＬのエタノールに再び懸濁させる。ＤＮＡがコーティングされた金粒子のアリコート（５μＬ）をＫａｐｔｏｎTMフライングディスク(flying disc)（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｓ）の中央に置くことができる。その後、１０００ｐｓｉのヘリウム圧、０．５ｃｍのギャップ距離および１．０ｃｍの飛行距離を用い、ＢｉｏｌｉｓｔｉｃTMＰＤＳ−１０００／Ｈｅ（カリフォルニア州、ハーキュリーズのＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、コーン組織の方へそれらの粒子を加速する。
【０２４１】
ボンバードメントのために、胚形成組織をアガロース凝固Ｎ６培地上の濾紙の上に置く。組織を薄い芝生のように配置し、直径約５ｃｍの円形領域を覆う。その組織が入っているペトリ皿を、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅのチャンバ内の停止スクリーンから約８ｃｍに配置することができる。その後、そのチャンバ内の空気をＨｇ２８インチの真空まで排気する。衝撃波管内のＨｅ圧が１０００ｐｓｉに達すると、破裂する破断膜を使用して、マクロキャリアをヘリウム衝撃波で加速する。
【０２４２】
ボンバードメントの７日後、グリホサートを含有するＮ６培地に組織を移すことができる（１リットル当たり２ｍｇ）。さらに２週間後、グリホサートを含有する新たなＮ６培地に組織を移すことができる。６週間後、グリホサートを補足した培地が入っているプレートの幾つかで、活発に成長しているカルスの直径約１ｃｍの領域を識別することができる。これらのカルスは、選択培地上で二次培養すると、成長し続けることができる。
【０２４３】
先ず、Ｎ６培地に組織のクラスタを移すことにより、植物をトランスジェニックカルスから再生させることができる。２週間後、組織を再生用培地（Fromm et al., 1990）に移すことができる。
【０２４４】
実施例８−ＧｌｏｘＡを発現するトランスジェニック大豆の生産
カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Odell et al., 1985）と豆インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）からの種子貯蔵タンパク質ファセオリンのβサブユニットをコードする遺伝子からの転写ターミネーターで構成される発現カセットを、形質転換大豆におけるインスタント酵素（instant enzyme）の発現のために使用することができる。
【０２４５】
本発明の酵素をコードするｃＤＮＡフラグメントは、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成することができる。発現ベクターに挿入したとき、そのＤＮＡフラグメントの正しい配向が得られるように、そのオリゴヌクレオチドにクローニング部位を組み込むことができる。その後、上で説明したように増幅を行い、単離されたフラグメントを、前記発現カセットを有するｐＵＣ１８ベクターに挿入する。
【０２４６】
その後、大豆胚を前記発現ベクターで形質転換させることができる。体性胚を誘発するために、大豆栽培品種Ａ２８７２の表面滅菌した未成熟種子から切除した長さが３〜５ｍｍの子葉を、明所または暗所で、適切な寒天培地上、２６℃で６〜１０週間、培養することができる。その後、二次胚を生産する体性胚を摘出し、適する液体培地に配置する。初期球形期の胚として増殖させた体性胚のクラスタを繰り返し選択した後、懸濁液を下で説明するように維持した。
【０２４７】
大豆胚形成用懸濁培養物は、１６：８時間の昼／夜スケジュールで蛍光灯を用い、２６℃で、ロータリーシェーカー、１５０ｒｐｍを用いて、３５ｍＬの液体培地中で維持することができる。３５ｍＬの液体培地に約３５ｍｇの組織を植え付けることによって、２週間ごとに培養物を二次培養する。
【０２４８】
その後、大豆胚形成懸濁培養物をパーティクルガンボンバードメント法（米国特許第４，９４５，０５０号）によって形質転換させることができる。これらの形質転換には、ＤｕＰｏｎｔ  ＢｉｏｌｉｓｔｉｃTMＰＤＳ１０００／ＨＥ装置（ヘリウムレトロフィット）を使用することができる。
【０２４９】
大豆形質転換を助長するために使用することができる選択可能マーカー遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルスからの３５Ｓプロモーターと、プラスミドｐＪＲ２２５（大腸菌からのもの）からのヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子と、アグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡからのノパリンシンターゼ遺伝子の３’領域から構成されるキメラ遺伝子である。その発現カセットを制限フラグメントとして単離することができる。その後、このフラグメントを、マーカー遺伝子を有するベクターの固有制限部位に挿入することができる。
【０２５０】
６０ｍｇ／ｍＬ  １μｍ  金粒子懸濁液の５０μＬに、５μＬ  ＤＮＡ（１μｇ／μＬ）、２０μＬ  スペルミジン（０．１Ｍ）および５０μＬ  ＣａＣｌ2（２．５Ｍ）をこの順序で添加する。その後、その粒子調製物を３分間攪拌し、小型遠心機で１０秒間回転させ、上清を除去する。その後、ＤＮＡがコーティングされたそれらの粒子を４００μＬ  ７０％  エタノール中で１回洗浄し、４０μＬの無水エタノールに再び懸濁させる。そのＤＮＡ／粒子懸濁液を３回、それぞれ１秒間、音波処理することができる。その後、ＤＮＡがコーティングされた５μＬの金粒子を、それぞれのマクロキャリアディスクにローディングする。
【０２５１】
約３００〜４００ｍｇの週齢２週の懸濁培養物を空の６０×１５ｍｍペトリ皿に入れ、その組織から残留液をピペットで除去する。それぞれの形質転換実験について、通常、約５〜１０枚の組織プレートをボンバードメントに付す。膜破断圧を１１００ｐｓｉに設定し、そのチャンバを排気して２８インチ水銀の真空にする。保持スクリーンから約３．５インチ離して組織を配置し、３回、ボンバードメントに付す。ボンバードメントの後、組織を半分に分割し、液体に戻し、上で説明したように培養することができる。
【０２５２】
ボンバードメントの５から７日後、液体培地を新たな培地と交換し、そしてボンバードメントの１１から１２日後、５０ｍｇ／ｍＬ  ヒグロマイシンを含有する新たな培地と交換することができる。この選択培地は、毎週、新しくしてもよい。ボンバードメントの７から８週間後、形質転換されていない壊死性胚形成クラスタから増殖する、緑色の形質転換組織を観察することができる。孤立緑色組織を移し、個々のフラスコに植え付け、新規のクローン増殖した形質転換胚形成懸濁培養物を生じさせる。それぞれの新規系統を独立した形質転換事象として処理することができる。その後、これらの懸濁物を二次培養し、未成熟胚のクラスタとして維持してもよいし、または個々の体性胚の突然変異および発芽によって植物全体へと再生させてもよい。
【０２５３】
植物を、グリホサートに曝露された場合に成長する能力について試験する。
【０２５４】
実施例９−ＧｌｏｘＡを発現するトランスジェニック綿の生産
綿におけるＧｌｏｘＡの生産のために、本発明のタンパク質のコーディング配列をサブタレニアンクローバー矮化ウイルス（subterranean clover stunt virus）プロモーター（Ｓ７；ＷＯ  ９６／０６９３２）に作動可能に連結させることができる。前記キメラ遺伝子を選択可能マーカー遺伝子に作動可能に連結させ、Ｔ−ＤＮＡベクターに導入する。アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介形質転換技術を用いて、綿植物を形質転換させる。グリホサートに候補の形質転換体を曝露することによって、トランスジェニック綿系統を特定する。
【０２５５】
実施例１０−ＧｌｏｘＡを発現するトランスジェニック小麦の生産
小麦においてＧｌｏｘＡを生産するために、サブタレニアンクローバー矮化ウイルスプロモーターが小麦細胞において遺伝子転写を駆動できるように、配列番号６として提供するようなヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドをｐＰｌｅｘベクター（Schunmann et al., 2003）にサブクローニングする。
【０２５６】
栽培品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ  ２６からの小麦胚の形質転換は、Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｅｓｃｈｉら（２００２）の方法に従って行う。生産された植物が前記構築体を含有することを確認するために、ＦａｓｔＤＮＡ（登録商標）キット（米国、カリフォルニア州、ヴィスタのＢＩＯ  １０１  Ｉｎｃ．）を供給業者の説示に従って使用して、葉から抽出したゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ分析を行う。ＤＮＡを１００μＬ  滅菌脱イオン水に溶出し、１μＬをＰＣＲで使用する。
【０２５７】
植物を、グリホサートに曝露された場合の成長する能力について試験する。
【０２５８】
実施例１１−ＧｌｏｘＡを発現するトランスジェニックカノーラの生産
セイヨウアブラナ（Brassica napus）の実生を５ｃｍポットに定着させる。それらを成長チャンバにおいて２４℃、１６／８時間の光周期で成長させる。２．５週間後、それらを１５ｃｍポットに移植し、成長チャンバにおいて１５／１０℃の昼／夜温度、１６／８時間の光周期で成長させる。
【０２５９】
薹立ちの直前の、または薹立ちの過程だが開花前の植物から４つの末端節間を除去し、７０％  ｖ／ｖ  エタノール中で１分間、２％  ｗ／ｖ  次亜塩素酸ナトリウム中で２０分間、表面を滅菌し、滅菌脱イオン水で３回リンスする。葉が付いている幹を、滅菌前に７２時間以下の間、湿ったプラスチックバッグの中に入れて冷凍してもよい。６から７つの幹切片を、基部末端の向きを維持しながら５ｍｍディスクに切断する。
【０２６０】
配列番号６を発現するアグロバクテリウム（Agrobacterium）を、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン、２４ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールおよび１００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンを含有する２ｍＬのＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ中、２４℃で、回転器を用いて一晩増殖させる。１：１０希釈を行って、１ｍＬ当たり約９×１０8の細胞にする。これを６６０μｍでの光学密度読み取りで確認する。幹ディスク（外植体）に１．０ｍＬのアグロバクテリウム（Agrobacterium）を接種し、過剰分をそれらの外植体から吸引する。
【０２６１】
１／１０×標準ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン類、３％スクロース、０．８％寒天、ｐＨ５．７、１．０ｍｇ／Ｌ  ６−ベンジルアデニン（ＢＡ）が入っているペトリプレートに、それらの外植体を基部側を下にして配置する。ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン類、３％スクロース、ｐＨ５．７、４．０ｍｇ／Ｌ  Ｐ−クロロフェノキシ酢酸、０．００５ｍｇ／Ｌ  カイネチンを含有する１．５ｍＬの培地をそれらのプレートの上に積層し、滅菌濾紙で覆う。
【０２６２】
２〜３日の共培養の後、選択のため、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン類、３％スクロース、８％寒天、ｐＨ５．７、１ｍｇ／Ｌ  ＢＡ、５００ｍｇ／Ｌ  カルベニシリン、５０ｍｇ／Ｌセフォタキシム、２００ｍｇ／Ｌカナマイシンまたは１７５ｍｇ／Ｌゲンタマイシンが入っている深皿ペトリプレートにそれらの外植体を移した。それぞれのプレートに７つの外植体を配置する。３週間後、それらを新たな培地に、１プレート当たり５つの外植体で移す。外植体を成長室において２５℃、連続照明（Ｃｏｏｌ  Ｗｈｉｔｅ）で培養する。
【０２６３】
植物を、グリホサートに曝露された場合の成長する能力について試験する。
【０２６４】
実施例１２−ＧｌｏｘＡを発現するトランスジェニック大麦の生産
大麦においてＧｌｏｘＡを生産するために、サブタレニアンクローバー矮化ウイルスプロモーターが大麦細胞において遺伝子転写を駆動できるように、配列番号６として提供するようなヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドをｐＰｌｅｘベクター（Schunmann et al., 2003）にサブクローニングする。
【０２６５】
大麦胚の形質転換は、一般にはＰｅｌｌｅｇｒｉｎｅｓｃｈｉら（２００２）によって記載されたような方法に従って行う。生産された植物が前記構築体を含有することを確認するために、ＦａｓｔＤＮＡ（登録商標）キット（米国、カリフォルニア州、ヴィスタのＢＩＯ  １０１  Ｉｎｃ．）を供給業者の説示に従って使用して、葉から抽出したゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ分析を行う。ＤＮＡを１００μＬ  滅菌脱イオン水に溶出し、１μＬをＰＣＲで使用する。
【０２６６】
植物を、グリホサートに曝露された場合の成長する能力について試験する。
【０２６７】
広範囲にわたって記載された本発明の趣旨または範囲を逸脱することなく、非常に多数の変型および／または修飾が、具体的な実施形態において示される本発明に対してなされ得ることは、当業者には明らかである。従って、本発明の実施形態は、すべての点で、例証となるものとみなすべきであり、限定するものとみなすべきでない。
【０２６８】
本明細書において論じたおよび／または参照したすべての出版物は、それら全体が本明細書において援用される。
【０２６９】
本出願は、ＵＳ  ６０／７４７，１５１号（この全内容は、本明細書において参考として援用される）の優先権を主張するものである。
【０２７０】
本明細書に含まれている文献、行為、材料、デバイス、物品またはこれらに類するものについてのいずれの論述も、単に、本発明の背景を提供する目的のためのものである。これを、これらの事のいずれかまたはすべてが、先行技術の基礎部分を形成し、ならびに本出願のそれぞれの請求項の優先日より前に存在したために本発明に関連した分野における共通の一般知識であったということの是認と解釈すべきでない。
【表１０】
2009536819.tif 000011
【表１１】
2009536819.tif 000012
【図１】
2009536819.tif 000013
【図２】
2009536819.tif 000014
【図３】
2009536819.tif 000015
【図４】
2009536819.tif 000016
【図５】
2009536819.tif 000017
【配列表】
2009536819000001.app
【国際調査報告】
2009536819.tif 000018
2009536819.tif 000019
2009536819.tif 000020
2009536819.tif 000021