(57)【要約】本発明は、抗体媒介性移植片拒絶反応を治療および予防するための組成物および方法、ならびに血液型判定を提供し、より詳細には、抗血液型抗原抗体を除去するのに有用な血液型決定基を含む組成物に関する。一態様において、本発明は、少なくとも２つの血液型抗原を含有する組成物であって、各血液型抗原が異なるコア糖鎖型上で発現される組成物を提供する。別の態様において、本発明は、被験者からのサンプルにおける血液型抗体の存在により、それぞれ異なる血液型抗原で被覆されている異なるサブタイプのマイクロビーズの集合体を提供し、この被験者からのサンプルは上記マイクロビーズの集合体に添加することによって決定される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの血液型抗原を含む組成物であって、各血液型抗原が、異なるコア糖鎖型上で発現される、組成物。
【請求項２】
前記血液型抗原が、Ａ抗原、Ｂ抗原またはＨ抗原である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記血液型抗原が、固体支持体に結合されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記コア糖鎖型が、１型、２型、３型または４型である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
請求項３に記載の組成物を構成する吸着体。
【請求項６】
被験者の血清における血液型反応性抗体の存在を決定するための方法であって、
ａ）それぞれ異なる血液型抗原で被覆されている異なるサブタイプのマイクロビーズの集合体を用意する工程、
ｂ）該マイクロビーズの集合体に、該被験者から得られた該血清を添加する工程、
ｃ）該血清中の抗血液型抗体が該血液型抗原に結合するのに十分な時間、該血清および該マイクロビーズをインキュベートする工程、
ｄ）該血液型抗原に結合した該抗血液型抗体と特異的に結合することができる少なくとも１つの標識リガンドと共に、該マイクロビーズをインキュベートする工程；
ｅ）該抗血液型抗体に結合した標識リガンドの存在を検出して、該反応性抗体の存在または非存在を決定する工程、
を含む、方法。
【請求項７】
前記血液型抗原が、異なるコア糖鎖型により保有されている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記検出が、フローサイトメトリーまたはｌｕｍｉｎｅｘによるものである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記集合体が、８つの異なる血液型Ａ／Ｂ抗原を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記マイクロビーズがラテックスである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの血液型抗原サブタイプのマイクロビーズが、異なる直径または異なる色を有するように選択されることによって、少なくとも１つの他の血液型サブタイプのマイクロビーズと異なっている、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの血液型サブタイプのマイクロビーズが、異なる標識を用いて標識されることによって、少なくとも１つの他の血液型サブタイプのマイクロビーズと異なっている、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記標識が蛍光標識である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記マイクロビーズの直径がおよそ５μｍである、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記マイクロビーズの直径が約２μｍ〜約１５μｍの範囲にある、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｄ）の前に、前記マイクロビーズ上に存在する前記血液型抗原と特異的に結合していない前記血清の成分を除去する工程を更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｅ）の前に、前記抗血液型抗体に結合していない標識リガンドを除去する工程を更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１８】
前記リガンドが、抗体またはそのフラグメントである、請求項７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体が、一価抗体フラグメントである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記一価抗体フラグメントが、ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントが、抗Ｆｃ抗体フラグメント、抗κ軽鎖抗体フラグメント、抗λ軽鎖抗体フラグメントおよび単鎖抗体フラグメントからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記鎖型が、１型、２型または３型前駆体である、請求項７に記載の組成物。
【請求項２３】
異なるサブタイプのマイクロビーズの集合体であって、各サブタイプが、異なる血液型抗原で被覆されている、集合体。
【請求項２４】
前記血液型抗原が異なるコア糖鎖型により保有されている、請求項２３に記載の集合体。
【請求項２５】
前記血液型抗原が組換えムチン上で発現される、請求項２３に記載の集合体。
【請求項２６】
前記血液型抗原の発現が多価である、請求項２５に記載の集合体。
【請求項２７】
前記コア糖鎖型が、１型、２型、３型または４型前駆体である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
血清中の血液型反応性抗体を除去するための方法であって、
ａ）それぞれ異なる血液型抗原で被覆されている異なるサブタイプのマイクロビーズの集合体を用意する工程、
ｂ）該マイクロビーズの集合体と該血清を接触させる工程、
ｃ）該血清中の抗血液型抗体が該記血液型抗原に結合するのに十分な時間、該血清および該マイクロビーズをインキュベートする工程；
ｄ）該血清から該マイクロビーズを分離することにより、該血清から該反応性抗体を除去する工程、とを含む方法。
【請求項２９】
前記血液型抗原が、異なるコア糖鎖型上で発現される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記コア糖鎖型が、１型、２型、３型または４型である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記血液型抗原が、組換えムチン上で発現される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記血液型抗原の発現が多価である、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概して、抗体媒介性移植片拒絶反応を治療または予防するための組成物および方法に関し、より詳細には、抗血液型抗原抗体を除去するのに有用な血液型決定基を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
既に移植の初期の頃に、ＡＢＯバリアを越えた腎移植の結果として、全く機能しない移植臓器の発生率が高いことが判明していたので、輸血に用いられる伝統的なＬａｎｄｓｔｅｉｎｅｒの法則を遵守することが同種移植における必須条件とみなされていた。レシピエントの事前に形成された抗Ａ／Ｂ同種凝集素は、ＡＢＯ不適合移植片の超急性拒絶反応に関与している。この超急性拒絶反応は、ドナー反応性ＨＬＡ抗体を有する、同種免疫を受けた患者において見られるものと同様である。移植におけるＡＢＯバリアを越える最初の試みは１９７０年代初頭に開始され、血液型Ａ２の死体腎をＯ型のレシピエントに移植するものであった１。１９８０年代、Ａｌｅｘａｎｄｒｅは、Ａ１型およびＢ型のドナーを用いて、最初の一連のＡＢＯ不適合生体ドナー（ＬＤ）の腎移植を行い、ＡＢＯ適合例の場合と同様の移植片生存率を得た。免疫抑制プロトコルは、抗Ａ／Ｂ抗体を除去するための前手術的な血漿分離交換法、ドナー血小板輸血、脾臓摘出および抗リンパ球／胸腺細胞グロブリンによる導入療法、ブタの胃から抽出された血液型ＡまたはＢ物質の注入、およびシクロスポリン−アザチオプリン−プレドニゾンを包含していた。それ以来、５００例を超えるＡＢＯ不適合ＬＤ腎移植が、世界各地、主に日本（１において検討）で報告されており、拒絶反応を回避するために、移植する前にレシピエントの抗Ａ／Ｂ抗体レベルを低減することの重要性も十分に文書記録されている２，３。これらの系列における移植片生存率は良好である（Ａ１型およびＢ型ドナーの場合に約８５％の１年移植片生存率）が、深刻な抗Ａ／Ｂ型抗体媒介型拒絶反応を伴う単独例のために、ＡＢＯ適合移植片の生存率より僅かに劣る４，５。抗体の除去と組み合わせた、抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ））を使用するＡＢＯ不適合腎移植に関する最近のデータは、移植片生存率に関してはるかに良好であることが示された６，７（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００３】
深刻な臓器不足の時代において、ＡＢＯ不適合ドナーからの移植片の使用増加によって、ＬＤ腎移植の実施増加が可能となろう。更に、本分野で得られた経験は、ＨＬＡ感作患者の治療前および治療後管理にも適用可能となろう８（非特許文献３）。
【非特許文献１】ＣＪ  Ｓｏｎｎｅｎｄａｙ，ＤＳ  Ｗａｒｒｅｎ，Ｍ  Ｃｏｏｐｅｒ，ｅｔ  ａｌ  Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２００４：４；１３１５−１３２２
【非特許文献２】Ｇ  Ｔｙｄｅｎ，Ｇ  Ｋｕｍｌｉｅｎ，Ｈ  Ｇｅｎｂｅｒｇ，Ｊ  Ｓａｎｄｂｅｒｇ，Ｔ  Ｌｕｎｄｇｒｅｎ，Ｉ  Ｆｅｈｒｍａｎ  Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２００５；５：１４５−１４８
【非特許文献３】ＤＳ  Ｗａｒｒｅｎ，ＡＡ  Ｚａｃｈａｒｙ，ＣＪ  Ｓｏｎｎｅｎｄａｙ，ｅｔ  ａｌ  Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２００４；４：５６１−５６８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、血漿から血液型抗原抗体を除去するための改良型組成物および方法、ならびに血液型判定方法に一部基づくものである。
【０００５】
一態様において、本発明は、少なくとも２つの血液型抗原を含有する組成物であって、各血液型抗原が異なるコア糖鎖型上で発現される組成物を提供する。好ましくは、この組成物は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１またはそれを超える血液型Ａ／Ｂ抗原を含有する。
【０００６】
別の態様において、被験者からのサンプルにおける血液型抗体の存在は、それぞれ異なる血液型抗原で被覆されている異なるサブタイプのマイクロビーズの集合体を提供し、この被験者からのサンプルを前記マイクロビーズの集合体に添加することによって決定される（例えば、血液型判定）。サンプル中の抗血液型抗体がマイクロビーズ上の血液型抗原に結合するのに十分な時間、サンプルおよびマイクロビーズをインキュベートすることにより、抗血液型抗体−マイクロビーズ複合体を形成する。この複合体をインキュベートし、例えば、血液型抗原に結合した前記抗血液型抗体と特異的に結合することができる少なくとも１つの標識リガンドと接触させ、抗血液型抗体に結合した標識リガンドの存在を検出することにより、前記反応性抗体の存在または不在を決定する。リガンドは、例えば、抗体またはそのフラグメントである。抗体は、ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントなどの一価抗体フラグメントである。例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントは、抗Ｆｃ抗体フラグメント、抗κ軽鎖抗体フラグメント、抗λ軽鎖抗体フラグメントおよび単鎖抗体フラグメントである。標識は、例えば、蛍光標識である。標識リガンドは、フローサイトメトリーまたはＬｕｍｉｎｅｘなどの当技術分野において既知の方法によって検出される。
【０００７】
サンプル中の血液型反応性抗体は、それぞれ異なる血液型抗原で被覆されている異なるサブタイプのマイクロビーズの集合体を用意することを含むことによって除去される。サンプルをマイクロビーズの集合体と接触させ、サンプル中の抗血液型抗体が血液型抗原に結合するのに十分な時間インキュベートする。マイクロビーズおよびサンプルを分離することによって、サンプルから血液型反応性抗体を除去する。
【０００８】
血液型抗原としては、Ａ抗原、Ｂ抗原およびＨ抗原が挙げられる。コア糖鎖型としては、１型、２型、３型および４型が挙げられる。血液型抗原は、遊離糖（本明細書中では、ＡＢＯオリゴ糖と呼ばれる）であるか、または、場合により、血液型抗原はムチンポリペプチド上で発現される。ムチンポリペプチドは、ムチン免疫グロブリン融合タンパク質（本明細書中では、ＡＢＯ融合タンパク質またはポリペプチドと呼ばれる）の一部である。
【０００９】
場合により、ＡＢＯオリゴ糖またはＡＢＯ融合タンパク質は、マイクロビーズなどの固体支持体に、例えば共有結合するかまたは非共有結合される。マイクロビーズは、例えば、ラテックスである。異なるサブタイプのマイクロビーズとは、マイクロビーズが、大きさ、色またはその両方の点で互いに異なることを意味する。直径は約２μｍ〜約１５μｍの範囲である。好ましくは、マイクロビーズの直径はおよそ５μｍである。最も好ましくは、マイクロビーズの直径はおよそ５μｍである。
【００１０】
サンプルは、例えば、全血、血清または血漿である。
【００１１】
幾つかの態様において、組成物は、全血または血漿から血液型抗体を除去するための吸収体として処方される。また、本発明により、それぞれ異なる血液型抗原で被覆されている異なるサブタイプのマイクロビーズの集合体（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）が提供される。例えば、集合体は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、２０、２５、３０、４０、５０またはそれを超える異なるサブタイプのマイクロビーズを含む。
【００１２】
特に定義されていない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における通常の技術を有する者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験に際して、本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書に記載される全ての公報、特許出願、特許および他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先される。更に、材料、方法および実施例は単に例示であり、制限を意図するものではない。
【００１３】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、血液型エピトープが、任意の遊離糖としての、またはムチン型タンパク質骨格上の、異なるコア糖鎖（例えば、１型、２型、３型または４型）によって高密度で特異的に発現され得るという発見に一部基づくものである。異なるコア糖鎖によって保有された血液型抗原を組み合わせて用いることは、移植前に血液から抗血液型抗体を除去する上でより効果的であることが発見された。更に、本発明の組成物は、被験者における血液型反応性抗体の存在を決定する上で診断および予後診断に有用である。
【００１５】
一態様において、本発明は、少なくとも２つの異なる血液型抗原を含有する組成物（すなわち、オリゴ糖）であって、各血液型抗原が異なるコア糖鎖（すなわち、グリカン前駆体）上で発現される組成物を提供する。本明細書中では、これらのオリゴ糖を「ＡＢＯオリゴ糖」と呼ぶ。血液型抗原は遊離糖である。あるいは、血液型抗原は、ムチンポリペプチド上で発現される。例えば、血液型抗原は、ムチン免疫グロブリン融合タンパク質（本明細書中では、「ＡＢＯ融合タンパク質」と呼ばれる）において発現される。ＡＢＯ融合タンパク質は、血液型決定基に特異的なエピトープを保有している。例えば、ＡＢＯ融合タンパク質は、Ａエピトープ、ＢエピトープまたはＨエピトープのいずれかを保有している。あるいは、ＡＢＯ融合タンパク質は、血液型抗原のエピトープを２つ保有している。例えば、ＡＢＯ融合タンパク質は、ＡエピトープおよびＢエピトープの両方を保有している。幾つかの態様において、ＡＢＯ融合タンパク質は３つ全てのエピトープ（すなわち、Ａ、ＢおよびＨ）を保有している。本発明のＡＢＯ融合タンパク質は、異なるグリカン前駆体、例えば、１型、２型または３型前駆体鎖上でＡ、ＢまたはＨエピトープを発現する。
【００１６】
場合により、ＡＢＯオリゴ糖またはＡＢＯ融合タンパク質は固体支持体に結合されて、血液からの血液型抗原の分離を可能にする。
【００１７】
したがって、ＡＢＯオリゴ糖およびＡＢＯ融合タンパク質は、例えばＡＢＯ不適合臓器、骨髄移植の前に、血液または血漿からレシピエントの抗血液型ＡＢＯ抗体を排除する上で、または万能ドナー血漿を作製するのに有用である。ＡＢＯオリゴ糖またはＡＢＯ融合タンパク質は、レシピエントの血液または血漿からの抗血液型ＡＢＯ抗体の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または１００％を吸収する。
【００１８】
ＡＢＯオリゴ糖は、単一コア糖鎖上で発現した血液型オリゴ糖と比較すると、抗血液型抗体を除去または結合する上で、糖質モル基準でより効果的である。ＡＢＯオリゴ糖は、単一コア糖鎖上で発現した当量の遊離糖と比較すると、２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、８０倍、１００倍またはそれを超える数の抗血液型抗体と結合する。
【００１９】
同様に、ＡＢＯ融合ペプチドは、野生型ＡＢ決定基を有する遊離糖と比較すると、抗血液型抗体を除去または結合する上で、糖質モル基準でより効果的である。ＡＢＯ融合ペプチドは、野生型ＡＢ決定基を有する当量の遊離糖と比較すると、２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、８０倍、１００倍またはそれを超える倍数の抗血液型抗体と結合する。
【００２０】
ＡＢＯオリゴ糖およびＡＢＯ融合タンパク質はまた、血液型判定方法においても有用である。本発明の方法は、異なるクラスおよびサブクラスの血液型抗体の定量化を可能とするために、現在の血液型判定方法より優れている。特に、この方法は、鎖型特異的抗体の検出を可能とする。これは臨床的に関連がある。その理由は、免疫系が、異なるコア鎖上の血液型抗原に対して特異的に応答し得るからである。更に、異なるコア鎖上の血液型抗原は、細胞および組織特異的に発現される。故に、鎖特異的抗体の検出を可能とすることにより、ＡＢＯ不適合臓器の同種移植片におけるドナー−レシピエントの交差適合試験がより良好に行われ、これにより超急性拒絶反応が低減される。
【００２１】
ＡＢＨ組織−血液型抗原
ＡＢＨ抗原は、人体のほぼ全ての細胞上において検出されるが、それらの生理的役割は、もしあるとすれば、依然として未解決の問題である。それらは糖質の性質を有し、異なるグリコシルトランスフェラーゼ、すなわち、成長するオリゴ糖鎖の非還元末端に単糖単位を順次付加する酵素により構築される。オリゴ糖は、タンパク質または脂質により保有され得るか９、または体液（例えば、母乳）中で遊離した状態で検出され得る９。
【００２２】
ＡＢＨ抗原は、内側コア糖鎖に応じてサブタイプに分割される９。例として、Ａ、ＢおよびＨ抗原はいずれも１型（Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ）、２型（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）、３型（Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα）および４型（Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ）鎖上で発現される。４型鎖のＡＢＨ抗原は、脂質に結合された状態でのみ検出される。Ｈ抗原は、末端ガラクトースを含有する異なるコア鎖に対してフコースをα１，２結合にて付加することにより産生される。Ａ抗原およびＢ抗原はいずれも、Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ａ）またはガラクトース（Ｂ）をα１，３結合にて末端ガラクトースに付加することによって、Ｈのサブタイプから産生される。Ａ抗原およびＢ抗原の生合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼは、末端Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびガラクトースのそれぞれを付加するためにα１，２−フコースの存在を必要とする。
【００２３】
２つの構造的に異なるα１，２−フコシルトランスフェラーゼにより、Ｏｒｉｏｌが最初に記載したように、Ｈ抗原の生合成が可能となる１０。一方はＨ遺伝子座（ＦＵＴ−Ｉ）によりコードされ、他方は分泌型（Ｓｅ）遺伝子座（ＦＵＴ−ＩＩ）によりコードされている。ＦＵＴ−Ｉ遺伝子産物は、赤血球でのＨ抗原の発現に関与し、主として２型鎖に作用するが、１型鎖に対する活性も示されている。対照的に、ＦＵＴ−ＩＩ遺伝子産物は、唾液腺腺房細胞ならびに消化管、生殖器官および気道（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｔｒａｃｔ）の内側を覆う上皮細胞により発現され、主に１型鎖に作用するが、おそらくは３型および４型鎖上にも作用する。
【００２４】
Ａ抗原およびＢ抗原の発現に関与する遺伝子産物は、共通の起源を有することが示されている１１。Ｂコード遺伝子産物と比較すると、Ａコード遺伝子産物における４アミノ酸残基の置換を引き起こす突然変異により、ドナー糖ヌクレオチドの選好性が、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミンからＵＤＰ−ガラクトースへとシフトする。血清学的に命名されたＯ表現型は、元来のＡ対立遺伝子におけるフレームシフト突然変異に起因してこれら両遺伝子産物の発現が欠失しているので、Ａ型決定基もＢ型決定基も発現しない１１。血液型Ａは、血清学的に別個の群に細分化されており、最もよく見られるサブグループはＡ１およびＡ２である１２。これらＡ型のサブタイプは、２つの異なるα１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼにより産生され、一方はＨ３型および４型抗原（Ａ１）に対する選好性を有し、他方はＨ１型および２型（Ａ２）抗原に対する選好性を有する。
【００２５】
多価の重要性
タンパク質−糖質相互作用は、一般には、低親和性結合を特徴とする。これは不合理に見えると思われるが、細胞受容体、抗体および他の糖質結合タンパク質およびそれらのグリコシル化リガンド間に迅速で非常に変わりやすい相互作用が起こるのを許容するので、生理学的条件下で必須である迅速なオン／オフ比の根拠となる。より高い親和性は、必要であるときには、本来、多価を用いることにより達成される。１つの生物学的実体上の幾つかの受容体が、別の実体上の幾つかの糖質リガンドに結合すると、親和性は１０〜１００００倍に増加し得る。多価相互作用の例としては、細胞表面への微生物（ウイルス、細菌または細菌毒素）の結合、細胞−細胞結合および細胞表面への多価分子（例えば、抗体）の結合が挙げられる１３。一価インヒビターによる多価相互作用の阻害は、インヒビターの結合活性が構造的に最適化されていたとしても効果がない。したがって、多数の異なる分子（例えば、ポリアクリルアミド、ペプチド、ウシ胎仔血清アルブミン、デンドリマーおよびシクロデキストリン）は、対応する受容体の多価結合を形成しようとする単糖およびオリゴ糖の多数の提示のための骨格として使用されてきた１３。代替手法としては、リポソーム、膜または他の表面における頭部基とリガンドとの非共有結合が含まれる１３。これら複合糖質の達成は様々であるが、一般に、親和性は、一価相互作用と比較すると１０倍〜１０００倍向上される。ほとんどの場合に生理的タンパク質−糖質相互作用を特徴付けるナノモル活性は、少数の例において１３、リガンド提示（すなわち、リガンド構造、価数、骨格構造およびリガンド内／間の距離）を最適化することによって達成されてきた。すなわち、糖質を提示する自然の方法が、可能な限り詳細に模倣された。
【００２６】
抗糖質抗体の効果的な吸収体としての、適合されたグリカン置換を伴う組換えムチン
ムチン型タンパク質は、通常は粘膜表面に見られ、豊富なＯ−グリカン置換（２つ〜３つのアミノ酸につき１つ）を特徴とする。それらの分子量の最大５０％は糖質の置換に起因する。ムチン−Ｉｇを有する様々なグリコシルトランスフェラーゼｃＤＮＡを共発現することにより、それらは、生物学的に有意な糖質決定基の数個のコピーを保有するように、そのＯ−グリカン構造を決定することができる。このように、血液型Ａ決定基を保有するムチンが作製され、抗血液型Ａ  Ａｂｓと高効率で結合することが示された１。実際、抗血液型Ａ抗体のムチンをベースとする吸収体は、スペーサーを介してアガロースビーズに直接結合された血液型Ａ三糖（これはＧｌｕｃｏｓｏｒｂ（登録商標）の構成である）より、抗Ａ抗体を結合する上で（血液型Ａ決定基の数について計算すると）約１００倍効果的であることが分かった。これは、Ａ決定基の数個のコピーが、１つのムチン型担体タンパク質上のＡｂ−結合に最適な間隔をもって発現されるという事実によって説明される１。同様に、糖質エピトープＧａｌα１，３Ｇａｌ（α−Ｇａｌ）を保有する組換えムチンは、抗Ｇａｌ抗体の非常に効果的な吸収体であることが分かった。主な障害は、ブタからヒトへの異種移植の成功を妨げることである１５〜１７。故に、ムチンは、生物活性糖質の最適な提示のための非常に効果的な骨格である。
【００２７】
血液型抗原サブタイプの重要性
上述のように、血液型ＡＢＨ決定基は、異なるコア糖鎖によって保有され得る。これらは、人体において細胞特異的および組織特異的分布を有しており、抗血液型ＡＢＨ抗体の標的分子としての個々のＡＢＨ抗原の重要性は知られていない。同様に、抗血液型ＡＢＨ抗体レパートリーが異種であるかどうか、すなわち、これら抗体の亜集団が、ＡＢＨ抗原の異なるサブタイプを区別することができ、かつ、実際に末端三糖より多い数の糖質鎖を結合のために必要とするかどうかは知られていない。幾つかのデータは、血液型Ａ抗原またはＢ抗原それぞれに特異的な全ての抗体を吸着するためにＡまたはＢ三糖のみを使用することが十分であることを示唆しており、このことがこれら抗体の検出についても当てはまることを示している１９〜２０。しかしながら、本発明のデータは、ＡＢＨ血液型抗原の異なるサブタイプ（すなわち、異なるコア糖鎖に保有されている）を用いてより効果的な抗体吸着および検出を行うことができることを示している。
【００２８】
抗糖質抗体の効果的な吸収体としての、適合されたコア糖鎖を有するオリゴ糖
先の検討に続いて、（構造異質性を得るために）異なるコア糖鎖上にＡＢＨ決定基を保有するムチン型融合タンパク質またはオリゴ糖の混合物は、より広範な抗Ａ／Ｂ抗体のレパートリーを吸着する。グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の異なる組合せを用いて、ムチン−免疫グロブリン融合タンパク質を、規定された内側および外側コア糖鎖を有するＯ−結合型グリカンの数個のコピーを保有するように設計することができる。これらは更に、ＡＢＨ決定基を伴って伸長可能である。故に、組換え技術を使用して、構造的に様々な血液型ＡまたはＢムチンを作製することができ、これらを使用して広範な抗Ａ／Ｂ抗体のレパートリーを吸着することができる。
【００２９】
血液型抗原オリゴ糖
様々な態様において、本発明は、血液型抗原オリゴ糖を提供する。血液型抗原にはＡ、ＢおよびＯ（Ｈ）が含まれる。血液型抗原は、全ての血液型サブタイプに対して特異的である。血液型サブタイプとは、血液型抗原が異なるコア糖鎖型上で発現されることを意味する。コア糖鎖型としては、１型、２型、３型および４型グリカン前駆体が挙げられる。
【００３０】
例示的な血液型抗原オリゴ糖としては以下のものが挙げられる。
【００３１】
１型〜４型上の血液型Ａ抗原
【００３２】
【化１】
2009536150.tif 000003
１型〜４型上の血液型Ｂ抗原
【００３３】
【化２】
2009536150.tif 000004
ここで、Ｒは、血液型抗原が融合タンパク質上に保有されている際にはムチンを表し、オリゴ糖が固体支持体に結合している際には連結点を表し、または、オリゴ糖が遊離糖である際には何も表さない。
【００３４】
融合ポリペプチド
様々な態様において、本発明は、糖タンパク質の少なくとも一部分を含有する第１ポリペプチド、例えば第２ポリペプチドに作用可能に結合したムチンポリペプチドを包含する融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用するとき、「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」は、非ムチンポリペプチドに作用可能に結合したムチンポリペプチドの少なくとも一部分を包含する。「ムチンポリペプチド」は、ムチンドメインを有するポリペプチドを指す。ムチンポリペプチドは、１つ、２つ、３つ、５つ、１０、２０またはそれを超えるムチンドメインを有する。ムチンポリペプチドは、Ｏ−グリカンで置換されたアミノ酸配列を特徴とする任意の糖タンパク質である。例えば、ムチンポリペプチドは、２つ〜３つのアミノ酸ごとにセリンまたはトレオニンである。ムチンポリペプチドは分泌タンパク質である。あるいは、ムチンポリペプチドは、細胞表面タンパク質である。
【００３５】
ムチンドメインは、アミノ酸であるトレオニン、セリンおよびプロリンに富み、オリゴ糖がＮ−アセチルガラクトサミンを介してヒドロキシアミノ酸（Ｏ−グリカン）に結合している。ムチンドメインは、Ｏ−結合型グリコシル化部位を含むか、あるいはそれからなる。ムチンドメインは、１つ、２つ、３つ、５つ、１０、２０、５０、１００またはそれを超えるＯ−結合型グリコシル化部位を有する。あるいは、ムチンドメインは、Ｎ−結合型グリコシル化部位を含むか、あるいはそれからなる。ムチンポリペプチドは、その質量の５０％、６０％、８０％、９０％、９５％または１００％がグリカンに起因している。ムチンポリペプチドは、ＭＵＣ遺伝子（すなわち、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３など）にコードされた任意のポリペプチドである。あるいは、ムチンポリペプチドは、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ−１）、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ９６、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭＡｄＣＡＭまたは赤血球細胞のグリコホリンである。好ましくは、ムチンはＰＳＧＬ−１である。一方、「非ムチンポリペプチド」は、少なくともその質量の４０％未満がグリカンに起因しているポリペプチドを指す。
【００３６】
本発明のＡＢＯ融合タンパク質の範囲内で、ムチンポリペプチドは、ムチンタンパク質の全てまたは一部に相当し得る。一実施形態では、ＡＢＯ融合タンパク質は、ムチンタンパク質の少なくとも一部分を含む。「少なくとも一部分」とは、ムチンポリペプチドが少なくとも１つのムチンドメイン（例えば、Ｏ−結合型グリコシル化部位）を含有することを意味する。一実施形態において、ムチンタンパク質は、ポリペプチドの細胞外部分を含む。例えば、ムチンポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１の細胞外部分を含む。
【００３７】
第１ポリペプチドは、１つまたは複数の血液型トランスフェラーゼによってグリコシル化される。第１ポリペプチドは、２つ、３つ、５つまたはそれを超える血液型トランスフェラーゼによってグリコシル化される。グリコシル化は逐次的または連続的である。あるいは、グリコシル化は、同時的または無作為的である、つまり特定の順序はない。例えば、第１ポリペプチドは、Ｈ遺伝子またはＳｅ遺伝子にコードされたα１，２フコシルトランスフェラーゼなどのα１，２フコシルトランスフェラーゼによりグリコシル化される。例示的なα１，２フコシルトランスフェラーゼはＦＵＴ１（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ受託番号：Ｑ１０９８４；Ｏ１０９８３；Ｏ１０９８１；ＡＴ４５５０２８およびＮＭ００１４８）およびＦＵＴ２である（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ受託番号：Ｐ１９５２６；ＢＡＡ１１６３８；Ｄ８２９３３およびＡ５６０９８）。あるいは、第１ポリペプチドは、１，３Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼまたはα１，３ガラクトサミニルトランスフェラーゼによってグリコシル化される。幾つかの態様において、第１ポリペプチドは、α１，２フコシルトランスフェラーゼおよび１，３Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼまたはα１，３ガラクトサミニルトランスフェラーゼの両方によってグリコシル化される。
【００３８】
融合タンパク質の範囲内で、「作用可能に結合した」という用語は、第１および第２ポリペプチドが、第１ポリペプチドのＯ−結合型グリコシル化を許容するように、（最も典型的には、ペプチド結合などの共有結合を介して）化学的に結合していることを示すと意図される。融合ポリペプチドをコードする核酸を指すために使用するとき、「作用可能に結合した」という用語は、ムチンポリペプチドおよび非ムチンポリペプチドをコードする核酸が互いに枠内で融合していることを意味する。非ムチンポリペプチドは、ムチンポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【００３９】
更なる実施形態において、ＡＢＯ融合タンパク質は、１つまたは複数の更なる部分に結合していてもよい。例えば、ＡＢＯ融合タンパク質は更に、ＧＳＴ融合タンパク質に結合していてもよく、ここでは、ＡＢＯ融合タンパク質配列がＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合されている。このような融合タンパク質はＡＢＯ融合タンパク質の精製を促進することができる。あるいは、ＡＢＯ融合タンパク質は更に、固体支持体に結合していてもよい。様々な固体支持体が当業者に知られている。このような組成物は、抗血液型抗体の除去を促進することができる。例えば、ＡＢＯ融合タンパク質は、金属化合物、シリカ、ラテックス、ポリマー材料などから作製された粒子；マイクロタイタープレート；ニトロセルロースもしくはナイロン、またはそれらの組合せに結合している。固体支持体に結合したＡＢＯ融合タンパク質は、血液または血漿などの生体サンプルから抗血液型抗体を除去するための吸収体として使用される。
【００４０】
別の実施形態において、融合タンパク質は、異種シグナル配列（すなわち、ムチン核酸によりコードされたポリペプチドに存在しないポリペプチド配列）をそのＮ末端として含む。例えば、天然のムチンシグナル配列を除去して、別のタンパク質からのシグナル配列で置換することができる。特定の宿主細胞（例えば、哺乳類の宿主細胞）では、異種シグナル配列の使用により、ポリペプチドの発現および／または分泌が増大され得る。
【００４１】
本発明のキメラタンパク質または融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技法により産生することができる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、従来技法に従って、例えば、ライゲーションのために平滑末端またはスタガー末端を採用することによって、適切な末端を提供するための制限酵素消化によって、必要に応じて行う付着端の充填（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）によって、望ましくない結合を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理によって、および酵素的ライゲーションによって、枠内で共にライゲーションされている。別の実施形態において、自動ＤＮＡシンセタイザーなどの従来技法により、融合遺伝子を合成することができる。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続する遺伝子フラグメント間に相補的なオーバーハングを生じさせるアンカープライマーを用いて行うことができ、その後、これら遺伝子フラグメントをアニーリングおよび再増幅してキメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２年を参照）。更に、融合部分（例えば、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）をコードする多くの発現ベクターが市販されている。糖タンパク質Ｉｂαをコードする核酸を、融合部分が免疫グロブリンタンパク質に枠内で結合されるように、このような発現ベクターにクローニングすることができる。
【００４２】
ＡＢＯ融合ポリペプチドは、ダイマー、トリマーまたはペンタマーなどのオリゴマーとして存在してもよい。好ましくは、ＡＢＯ融合ポリペプチドはダイマーである。
【００４３】
第１ポリペプチドおよび／または第１ポリペプチドをコードする核酸は、ムチンをコードする配列を用いて構築することができ、当技術分野において知られている。ムチンポリペプチドおよびムチンポリペプチドをコードする核酸の好適な供給源としては、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ６６３６２５およびＮＭ１４５６５０、ＣＡＤ１０６２５およびＡＪ４１７８１５、ＸＰ１４０６９４およびＸＭ１４０６９４、ＸＰ００６８６７およびＸＭ００６８６７およびＮＰ００３３１７７７およびＮＭ００９１５１のそれぞれが挙げられ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４４】
幾つかの実施形態では、ムチンポリペプチド部分は、天然に生じるムチン配列（野生型）に突然変異を有する変異型ムチンポリペプチドとして提供され、この突然変異が（非変異型配列と比較して）糖質含有量の増加をもたらす。例えば、変異型ムチンポリペプチドは、野生型ムチンと比較して、更なるＯ−結合型グリコシル化部位を含んでいた。あるいは、変異型ムチンポリペプチドは、野生型ムチンポリペプチドと比較すると、セリン、トレオニンまたはプロリン残基の数の増加をもたらすアミノ酸配列突然変異を含む。この糖質含有量の増加は、当業者に知られている方法により、ムチンのタンパク質対糖質比を決定することにより評価することができる。
【００４５】
幾つかの実施形態では、ムチンポリペプチド部分は、天然に生じるムチン配列（野生型）に突然変異を有する変異型ムチンポリペプチドとして提供され、この突然変異が（非変異型配列と比較して）ムチン配列のタンパク質分解耐性を高くする。
【００４６】
幾つかの実施形態では、第１ポリペプチドとしては全長ＰＳＧＬ−１が含まれる。あるいは、第１ポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１の細胞外部分などの、全長より短いＰＳＧＬ−１ポリペプチドを含む。例えば、第１ポリペプチドは、４００未満のアミノ酸長、例えば、３００、２５０、１５０、１００、５０または２５以下のアミノ酸長を有する。例示的なＰＳＧＬ−１ポリペプチドおよび核酸配列としては、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＸＰ００６８６７；ＸＭ００６８６７；ＸＰ１４０６９４およびＸＭ１４０６９４が挙げられる。
【００４７】
第２ポリペプチドは、好ましくは溶解性である。幾つかの実施形態では、第２ポリペプチドは、第２ムチンポリペプチドとＡＢＯ融合ポリペプチドとの連結を促進する配列を包含する。好ましい実施形態では、第２ポリペプチドは、少なくとも免疫グロブリンポリペプチドの領域を包含する。「少なくともある領域」とは、軽鎖、重鎖、ＦＣ領域、Ｆａｂ領域、Ｆｖ領域またはその任意のフラグメントなどの免疫グロブリン分子の任意部分を包含することを意味する。免疫グロブリン融合ポリペプチドは、当技術分野において知られており、例えば、米国特許第５，５１６，９６４号、第５，２２５，５３８号、第５，４２８，１３０号、第５，５１４，５８２号、第５，７１４，１４７号および第５，４５５，１６５号に記載されている。
【００４８】
幾つかの実施形態では、第２ポリペプチドは、全長免疫グロブリンポリペプチドを含む。あるいは、第２ポリペプチドは、全長未満の免疫グロブリンポリペプチド、例えば、重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、ＦｖまたはＦｃを含む。好ましくは、第２ポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの重鎖を包含する。より好ましくは、第２ポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域を包含する。
【００４９】
本発明の別の態様では、第２ポリペプチドは、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域のエフェクター機能より劣るエフェクター機能を有する。Ｆｃエフェクター機能としては、例えば、Ｆｃ受容体結合、補体結合およびＴ細胞除去活性が挙げられる（例えば、米国特許第６，１３６，３１０号を参照）。Ｔ細胞除去活性、Ｆｃエフェクター機能および抗体安定性を分析する方法は、当技術分野において知られている。一実施形態では、第２ポリペプチドは、Ｆｃ受容体に対する親和性が低いか、またはない。代替実施形態では、第２ポリペプチドは、補体タンパク質Ｃｌｑに対する親和性が低いか、またはない。
【００５０】
本発明の別の態様は、ムチンポリペプチドをコードする核酸、またはその誘導体、フラグメント、類似体もしくは相同体を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに属する。様々な態様では、ベクターは、免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸、またはその誘導体、フラグメント、類似体もしくは相同体に作用可能に結合したムチンペプチドをコードする核酸を含有する。更に、ベクターは、α１，２フコシルトランスフェラーゼ、α１，３Ｎアセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼまたはその任意の組合せなどの血液型トランスフェラーゼをコードする核酸を含む。血液型トランスフェラーゼは、ＡＢＯ融合タンパク質のムチン部分のペプチド骨格上への血液型決定基の付加を促進する。本明細書中で使用するとき、「ベクター」という用語は、結合している別の核酸を輸送できる核酸分子を指す。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは、更なるＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二重鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、更なるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされ得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自己複製することができる（例えば、細菌由来の複製を有する細菌ベクターおよび哺乳類のエピソームベクター）。他のベクター（例えば、哺乳類の非エピソームベクター）は、宿主細胞内に導入されると、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクターは、作用可能に結合した遺伝子の発現を導くことができる。このようなベクターは、本明細書中では「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技法において有用な発現ベクターは、プラスミド形態であることが多い。本明細書中では、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるので、「プラスミド」および「ベクター」を互換的に使用することができる。しかしながら、本発明は、ウイルスベクター（例えば、複製欠失レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）などの他の形態の発現ベクターを包含することを意図し、これらのベクターも同等の機能を果たす。
【００５１】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内での核酸の発現に適した形態をなす本発明の核酸を含み、これは、組換え発現ベクターが、発現に使用されるべき宿主細胞に基づいて選択され、発現されるべき核酸配列に作用可能に結合している１つまたは複数の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターの範囲内では、「作用可能に結合した」とは、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現（例えば、インビトロ転写／翻訳系内、または、ベクターが宿主細胞に導入される際には宿主細胞内）を許容するように１つまたは複数の調節配列に結合していることを意味することを意図する。
【００５２】
「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を包含することが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、１９９０年に記載されている。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を導くもの、および特定の宿主細胞内のみでのヌクレオチド配列の発現を導くものが挙げられる（例えば、組織特異的調節配列）。当業者であれば、発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要因に依存できることを認識されよう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入されることにより、本明細書に記載されるような、核酸にコードされる融合タンパク質またはペプチド（例えば、ＡＢＯ融合ポリペプチド、ＡＢＯ融合ポリペプチドの変異形態）などのタンパク質またはペプチドを産生することができる。
【００５３】
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞におけるＡＢＯ融合ポリペプチドの発現用に設計することができる。例えば、ＡＢＯ融合ポリペプチドは、大腸菌、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞または哺乳類細胞などの細菌細胞で発現し得る。好適な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、１９９０年で更に検討されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写および翻訳され得る。
【００５４】
原核生物におけるタンパク質の発現は、ほとんどの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質の発現を導く構成プロモーターまたは誘導プロモーターを含有するベクターを有する大腸菌内で行われる。融合ベクターは、多数のアミノ酸を、そこにコードされたタンパク質、通常は組換えタンパク質のアミノ末端、に付加する。このような融合ベクターは、典型的には３つの目的を果たす：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増大させること；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解性を増大させること；および（ｉｉｉ）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより、組換えタンパク質の精製を支援すること。多くの場合、融合発現ベクターでは、タンパク質分解的切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入され、それにより、融合タンパク質の精製の後で、融合部分から組換えタンパク質を分離することができる。このような酵素およびそれらの同族（ｃｏｇｎａｔｅ）認識配列には、因子Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；  ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９８８年、Ｇｅｎｅ  ６７、３１〜４０頁）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、これらはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡのそれぞれを標的組換えタンパク質に融合させる。
【００５５】
好適な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら、１９８８年、Ｇｅｎｅ  ６９、３０１〜３１５頁）およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．、１９９０年、６０〜８９頁）が挙げられる。
【００５６】
大腸菌での組換えタンパク質の発現を最大にする１つの方策は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が低下した宿主細菌においてタンパク質を発現することである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．、１９９０年、１１９〜１２８頁を参照されたい。別の方策は、発現ベクターに挿入されるべき核酸の核酸配列を、各アミノ酸に対する個々のコドンが大腸菌内で好ましく利用されるように改変することである（例えば、Ｗａｄａら、１９９２年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０、２１１１〜２１１８頁を参照）。本発明の核酸配列のこのような改変は、標準のＤＮＡ合成技法により行うことが可能である。
【００５７】
別の実施形態では、ＡＢＯ融合ポリペプチド発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉら、１９８７年、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６、２２９〜２３４頁）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、１９８２年、Ｃｅｌｌ  ３０、９３３〜９４３頁）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９８７年、Ｇｅｎｅ  ５４、１１３〜１２３頁）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）およびｐｉｃＺ（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【００５８】
あるいは、ＡＢＯ融合ポリペプチドは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞で発現され得る。培養された昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）でのタンパク質の発現に使用できるバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃ系（Ｓｍｉｔｈら、１９８３年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３、２１５６〜２１６５頁）およびｐＶＬ系（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、１９８９年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０、３１〜３９頁）が挙げられる。
【００５９】
更に別の実施形態では、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞で発現される。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ、１９８７年、Ｎａｔｕｒｅ  ３２９、８４０頁）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、１９８７年、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６、１８７〜１９５頁）が挙げられる。哺乳類細胞で使用するとき、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節要素によって提供される場合が多い。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０由来のものである。原核細胞および真核細胞についての他の好適な発現系に関しては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの１６章および１７章、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年を参照されたい。
【００６０】
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に属する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書中では互換可能に使用される。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫または潜在的子孫も指すと理解される。突然変異または環境の影響に起因して特定の修飾が後代で起こり得るので、このような子孫は実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、やはり本明細書中で使用される用語の範囲内に包含される。
【００６１】
宿主細胞は、任意の原核細胞でも真核細胞でもよい。例えば、糖タンパク質Ｉｂα融合ポリペプチドは、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞（例えば、ヒト、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）で発現され得る。他の好適な宿主細胞は、当業者に知られている。
【００６２】
ベクターＤＮＡを、従来の形質転換技法またはトランスフェクション技法により、原核細胞または真核細胞内へ導入することができる。本明細書中で使用されるとき、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞内へ導入するための当技術分野で認められている様々な技法を指すものと意図されており、これには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションなどが含まれる。宿主細胞を形質転換するため、またはトランスフェクトするための好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年を参照）および他の研究所マニュアルに見出すことができる。
【００６３】
哺乳類細胞の好適なトランスフェクションに関して、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション技法に応じて、僅かな細胞のみがそれらのゲノム内に外来ＤＮＡを組み込み得ることが知られている。これらのインテグラントを同定し、かつ選択するために、一般には、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性）をコードする遺伝子が、目的遺伝子と共に宿主細胞内に導入される。様々な選択マーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与するものが含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、宿主細胞内の、糖タンパク質Ｉｂα融合ポリペプチドをコードするものと同じベクター上に導入することができ、または、別個のベクター上に導入することもできる。導入された核酸を安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択により同定することができる（例えば、選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存し、他の細胞は死滅する）。
【００６４】
本発明の宿主細胞、例えば培養した原核または真核宿主細胞を使用してＡＢＯ融合ポリペプチドを産生（すなわち、発現）することができる。したがって、本発明は更に、本発明の宿主細胞を用いてＡＢＯ融合ポリペプチドを産生するための方法を提供する。一実施形態において、本方法は、好適な培地内で本発明の宿主細胞（ＡＢＯ融合ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入されたもの）を培養することにより、ＡＢＯ融合ポリペプチドを産生することを含む。別の実施形態では、本方法は更に、培地または宿主細胞からＡＢＯポリペプチドを単離することを含む。
【００６５】
抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの従来条件に従って、ＡＢＯ融合ポリペプチドを単離し、精製してもよい。例えば、免疫グロブリン融合タンパク質は、融合タンパク質のＦｃ部分と選択的に結合する固定化プロテインＡまたはプロテインＧを含有するカラムに溶液を通すことによって精製してもよい。例えば、Ｒｅｉｓ，  Ｋ．Ｊ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２巻、３０９８〜３１０２頁、１９８４年；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ８７／００３２９号を参照されたい。カオトロピック塩による処理によって、または含水酢酸（１Ｍ）による溶出によって融合ポリペプチドを溶出させてもよい。
【００６６】
あるいは、本発明によるＡＢＯ融合ポリペプチドは、当技術分野において知られている方法を用いて化学的に合成することができる。ポリペプチドの化学合成は、例えば、記載されている。ぺプチドシンセサイザーを使用した合成を含めた様々なタンパク質合成方法が当技術分野において一般的である。例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ、Ｂｏｄａｓｎｓｋｙ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９８８年；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２、２４１〜２４７頁、１９８６年；Ｂａｒａｎｙら、Ｉｎｔｌ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  ３０、７０５〜７３９頁、１９８７年；Ｋｅｎｔ、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５７、９５７〜９８９頁、１９８８年；およびＫａｉｓｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３、１８７〜１９８頁、１９８９年を参照されたい。ポリペプチドは、化学前駆体や他の化学物質を実質的に含まないように、標準のペプチド精製技法を用いて精製される。「化学前駆体や他の化学物質を実質的に含まない」という語句は、ペプチド合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離されているペプチドの調製を包含する。一実施形態では、「化学前駆体や他の化学物質を実質的に含まない」という語句は、約３０％（乾燥重量による）未満の化学前駆体または非ペプチド化学物質、より好ましくは約２０％未満の化学前駆体または非ペプチド化学物質、更に好ましくは約１０％未満の化学前駆体または非ペプチド化学物質、および最も好ましくは約５％未満の化学前駆体または非ペプチド化学物質を有するペプチドの調製を包含する。
【００６７】
ポリペプチドの化学合成は、Ｄ−アミノ酸および他の有機小分子などの修飾アミノ酸または非天然アミノ酸の組込みを促進する。ペプチド中の１つまたは複数のＬ−アミノ酸を、対応するＤ−アミノ酸のアイソフォームで置換することにより、酵素加水分解に対するペプチドの耐性が増大し、かつ、生物学的に活性なペプチドの１つまたは複数の特性、すなわち、受容体結合、機能的能力または作用の持続時間などが向上し得る。例えば、Ｄｏｈｅｒｔｙら、１９９３年、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３６、２５８５〜２５９４頁；Ｋｉｒｂｙら、１９９３年、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３６、３８０２〜３８０８頁；Ｍｏｒｉｔａら、１９９４年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３５３、８４〜８８頁；Ｗａｎｇら、１９９３年、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  ４２、３９２〜３９９頁；ＦａｕｃｈｅｒｅおよびＴｈｉｕｎｉｅａｕ、１９９２年、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．  ２３、１２７〜１５９頁を参照されたい。
【００６８】
ペプチド配列への共有結合架橋の導入は、配座的かつトポグラフィー的にペプチド骨格を制限することができる。この方策を採用して、能力、選択性および安定性が増大した融合ポリペプチドのペプチド類似体を開発することができる。環状ペプチドの配座エントロピーは直鎖ペプチドより低いので、非環状類似体に関するエントロピーの低下より環状類似体に関するエントロピーの低下の方が少ない特定の立体配座が採用され、それにより、結合のための自由エネルギーがより好ましいものになり得る。大環状化は、ペプチドのＮ−末端およびＣ−末端間、側鎖およびＮ−またはＣ−末端間［例えば、ｐＨ８．５のＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６により］（Ｓａｍｓｏｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３７巻、５１８２〜５１８５頁、１９９６年）または２つのアミノ酸側鎖間にアミド結合を形成することによって達成される場合が多い。例えば、ＤｅＧｒａｄｏ、Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  ３９、５１〜１２４頁、１９８８年を参照されたい。ジスルフィド架橋も直鎖配列内に導入され、それらの柔軟性を低下させる。例えば、Ｒｏｓｅら、Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  ３７、１〜１０９頁、１９８５年；Ｍｏｓｂｅｒｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １０６巻、５０５〜５１２頁、１９８２年を参照されたい。更に、システイン残基をペニシラミン（Ｐｅｎ、３−メルカプト−（Ｄ）バリン）で置換することにより、幾つかのオピオイド−受容体相互作用の選択性が増大された。ＬｉｐｋｏｗｓｋｉおよびＣａｒｒ、「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｇｕｔｔｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２８７〜３２０頁、１９９５年。
【００６９】
組成物およびキット
また、それぞれ異なるコア糖鎖型上で発現される少なくとも２つの血液型抗原を含有する組成物（例えば、ＡＢＯオリゴ糖）も本発明に包含される。血液型抗原は、Ａ抗原、Ｂ抗原またはＨ抗原である。コア糖鎖型は、１型、２型、３型または４型である。組成物は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたはそれを超える異なる血液型抗原を含有する。
【００７０】
例示的な血液型抗原には、上述のものが含まれる。
【００７１】
場合により、ＡＢＯオリゴ糖またはＡＢＯ融合タンパク質は、固体支持体に結合されている。この結合は共有結合である。あるいは、結合は非共有結合である。
【００７２】
固体支持体は、例えば、ビーズ、樹脂、膜もしくはディスク、または本発明の方法に適する任意の固体支持体材料でもよい。好ましくは、固体支持体は、ビーズ、例えばマイクロビーズである。ビーズの大きさは重要ではない。典型的には、ビーズの直径は少なくとも１μｍ〜５０μｍであり、１μｍ〜１０μｍの粒子径が好ましい。最も好ましくは、ビーズの直径は約４μｍ〜１０μｍである。例えば、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、４０μｍまたは５０μｍの直径である。
【００７３】
ビーズは、金属化合物、シリカ、ラテックス、ポリマー材料、または金属もしくは金属化合物で被覆されたシリカ、ラテックスもしくはポリマー核で作製されていてもよい。
【００７４】
固体支持体は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基またはアミノ基などの官能基を保有していてもよい。支持体は、正に帯電しているか、負に帯電しているか、または疎水性でもよい。本発明で使用するための官能化された被覆支持体は、支持体の修飾によって調製されてもよい。例えば、被覆されていない支持体を、ポリウレタンなどの１つの官能基またはこのような複数の官能基を保有するポリマーでもって、ヒドロキシル基を与えるポリグリコール、もしくはヒドロキシル基を与えるセルロース誘導体、カルボキシル基を与えるためのアクリル酸もしくはメタクリル酸のポリマーもしくはコポリマー、またはアミノ基を与えるアミノアルキル化ポリマーと共に処理してもよい。米国特許第４，６５４，２６７号には、多くの表面コーティングの導入について記載されている。
【００７５】
好ましくは、異なるＡＢＯオリゴ糖またはＡＢＯ融合タンパク質の各々は、異なるサブタイプのマイクロビーズ上にある。サブタイプとは、各マイクロビーズが、例えば、大きさの違いによってまたは識別可能な標識によって検出可能に識別できることを意味する。このような大きさが異なるマイクロビーズ、または蛍光体などで標識されたマイクロビーズを使用することにより、例えば、フローサイトメトリーなどによって様々なビーズを同定および／または分離することができる。
【００７６】
本発明は更に、本発明の方法により、血液型反応性抗体をサンプルから分離するためまたは同定するためのキットを提供する。このキットは、異なるサブタイプのマイクロビーズの集合体を含有し、各サブタイプは異なるＡＢＯオリゴ糖またはＡＢＯ融合タンパク質で被覆されている。場合により、キットは、抗血液型抗原抗体と特異的に結合することができる少なくともオープンな標識リガンドを含有する。例えば、リガンドは、抗体またはそのフラグメントである。抗体またはそのフラグメントはモノクローナル抗体である。あるいは、抗体またはそのフラグメントはポリクローナル抗体である。場合により、抗体は組換え抗体である。抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントなどの抗体フラグメントである。「特異的に結合」または「と免疫反応する」は、抗体が、所望する抗原の１つまたは複数の抗原決定基とは反応するが、他のポリペプチドとは反応（すなわち、結合）しないか、または他のポリペプチドと非常に低い親和性（Ｋｄ＞１０−６）で結合することを意味する。
【００７７】
抗体は一価である。
【００７８】
標識は、標的の同定および／または定量化を促進するために使用される任意の物質である。標識は、直接的に観察もしくは測定されるか、または間接的に観察もしくは測定される。標識としては、例えば、放射線計測装置で測定することができる放射性標識、分光光度計で視覚的に観察または測定することができる顔料、染料または他の色原体、スピン標識分析器で測定することができるスピン標識、および、好適な分子付加物の励起により出力シグナルが生成される場合、染料に吸収される光による励起によって視覚化することができるか、または標準的な蛍光光度計または撮像システムを用いて測定することができる蛍光部分が挙げられるが、これらに限定されない。標識は、蛍光体または蛍光色素（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎ）などの発光物質、生物発光物質、シグナル化合物の化学的修飾により出力シグナルが生成される場合には化学発光物質、金属含有物質、または、無色物質からの着色生成物の形成などの、シグナルの酵素依存型二次生成が生じる場合には酵素でもよい。標識はまた、化学物質もしくは生化学物質、または不活性粒子の形態を取り得るものであり、これにはコロイド金、微小球、量子ドット、またはナノ結晶もしくは蛍光体などの無機結晶が含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｂｅｖｅｒｌｏｏら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２０３、３２６〜３４頁、１９９２年を参照）。標識という用語は、後に付加されると、検出可能なシグナルを生成するために使用されるような標識分子に対して特異的に結合し得る「タグ」またはハプテンを指すこともできる。例えば、ビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンをタグとして使用し、次いでセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のアビチンまたはストレプトアビジン結合体を使用して前記タグに結合させ、次いで発色基質（例えば、テトラメチルベンジジン）またはＡｍｐｌｅｘ  ＲｅｄまたはＡｍｐｌｅｘ  Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）などの蛍光発生基質を使用してＨＲＰの存在を検出することができる。同様に、タグは、ハプテンまたは抗原（例えば、ジゴキシゲニン）でもよく、酵素的に、蛍光的にまたは放射活性物質で標識した抗体を使用してこのタグに結合させることができる。多数の標識は、当業者に知られており、粒子、蛍光染料、ハプテン、酵素およびそれらの発色性基質、蛍光発生基質および化学発光基質、ならびに、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ」、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．  Ｈａｕｇｌａｎｄ著、第６版、１９９６年、および１９９９年１１月および２００１年５月にそれぞれＣＤ−ＲＯＭで発行された後続の第７版および第８版の最新版（これらの内容は、参照により組み込まれる）、ならびに他の出版された情報源に記載される他の標識が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
蛍光体は、２８０ｎｍを超える最大吸収量を示し、標識試薬に共有結合するとそのスペクトル特性を保持する任意の化学的部分である。蛍光体には、ピレン（米国特許第５，１３２，４３２号に開示された対応するあらゆる誘導体化合物を含む）、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドールまたはベンズインドール、オキサゾールまたはベンズオキサゾール、チアゾールまたはベンズチアゾール、４−アミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、シアニン（米国特許出願第０９／９６８，４０１号および第０９／９６９，８５３号に記載の対応するあらゆる化合物を含む）、カルボシアニン（米国特許出願第０９／５５７，２７５号；第０９／９６９，８５３号および第０９／９６８，４０１号；米国特許第４，９８１，９７７号；第５，２６８，４８６号；第５，５６９，５８７号；第５，５６９，７６６号；第５，４８６，６１６号；第５，６２７，０２７号；第５，８０８，０４４号；第５，８７７，３１０号；第６，００２，００３号；第６，００４，５３６号；第６，００８，３７３号；第６，０４３，０２５号；第６，１２７，１３４号；第６，１３０，０９４号；第６，１３３，４４５号およびＰＣＴ国際公開ＷＯ０２／２６８９１、ＷＯ９７／４０１０４、ＷＯ９９／５１７０２、ＷＯ０１／２１６２４、欧州特許出願公開第１０６５２５０（Ａ１）号における対応するあらゆる化合物を含む）、カルボスチリル、ポルフィリン、サリチレート、アントラニレート、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、ボラポリアザインダセン（米国特許第４，７７４，３３９号；第５，１８７，２８８号；第５，２４８，７８２号；第５，２７４，１１３号および第５，４３３，８９６号に開示された対応するあらゆる化合物を含む）、キサンテン（米国特許第６，１６２，９３１号；第６，１３０，１０１号；第６，２２９，０５５号；第６，３３９，３９２号；第５，４５１，３４３号および米国特許出願第０９／９２２，３３３号に開示された対応するあらゆる化合物を含む）、オキサジン（米国特許第４，７１４，７６３号に開示された対応するあらゆる化合物を含む）またはベンズオキサジン、カルバジン（米国特許第４，８１０，６３６号に開示された対応するあらゆる化合物を含む）、フェナレノン、クマリン（米国特許第５，６９６，１５７号；第５，４５９，２７６号；第５，５０１，９８０号および第５，８３０，９１２号に開示された対応するあらゆる化合物を含む）、ベンゾフラン（米国特許第４，６０３，２０９号および第４，８４９，３６２号に開示された対応するあらゆる化合物を含む）およびベンズフェナレノン（米国特許第４，８１２，４０９号に開示された対応するあらゆる化合物を含む）ならびにそれらの誘導体が制限なく含まれる。本明細書中で使用するとき、オキサジンは、レゾルフィン（特許第５，２４２，８０５号に開示された対応するあらゆる化合物を含む）、アミノオキサジノン、ジアミノオキサジンおよびそれらのベンゾ置換類似体を含む。
【００８０】
場合により、キットは、陽性対照もしくは陰性対照またはその両方、キット使用説明書（書面、テープ、ＶＣＲ、ＣＤ−ＲＯＭなど）、サンプル収集手段を含む。サンプル収集手段は、当業者に周知である。例えば、サンプル収集手段はＣＰＴバキュテイナー（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）管である。
【００８１】
試薬は、別個の容器に包装されており、例えば、ＡＢＯオリゴ糖またはＡＢＯ融合タンパク質（固体マトリックスに結合されているか、または、それらをマトリックスに結合するための試薬と共に別個に包装されている）、対照試薬（陽性および／または陰性）、および／または標識リガンドである。
【００８２】
抗体媒介性移植片拒絶反応を治療または予防するための方法
抗体媒介性移植片拒絶反応（ＡＭＲ）、例えば臓器移植の拒絶反応を治療または予防する方法も本発明に包含される。このような移植には、腎臓、肝臓、皮膚、膵臓、角膜または心臓が含まれるが、これらに限定されない。ＡＭＲは、レシピエントによる抗体媒介性移植片拒絶反応を包含することを意味する。この方法は、被験者からの生体サンプルを本発明のＡＢＯオリゴ糖またはＡＢＯ融合ペプチドと接触させることを含む。生体サンプルは、例えば、血液、すなわち、全血または血漿である。サンプルは、抗体、例えば抗血液型抗体を含むことが知られているか、またはそのように考えられている。幾つかの態様では、生体サンプルは、このサンプルをＡＢＯオリゴ糖またはＡＢＯ融合ポリペプチドと接触させる前に、被験者から抽出される。生体サンプルを、ＡＢＯオリゴ糖またはＡＢＯ融合ペプチド−抗血液型抗体複合体の形成を許容するような条件下で、ＡＢＯオリゴ糖またはＡＢＯ融合ペプチドと接触させる。ＡＢＯオリゴ糖またはＡＢＯ融合ペプチド複合体は、存在する場合、抗血液型抗体を排除するために生体サンプルから分離され、生体サンプルは被験者に再び注入される。
【００８３】
ＡＭＲはまた、本発明のＡＢＯ融合ポリペプチドを被験者に投与することによって治療または予防される。
【００８４】
被験者は、例えば任意の哺乳類であり、例えばヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタである。治療薬は、被験者がＡＢＯ不適合性移植を受ける前に投与される。あるいは、治療薬は、被験者がＡＢＯ不適合性移植を受けた後に投与される。
【００８５】
当業者に知られている方法によって、生体サンプルをＡＢＯオリゴ糖またはＡＢＯ融合タンパク質と接触させる。例えば、血漿分離交換法または体外免疫吸収法である。
【００８６】
本質的には、抗体媒介性反応に病因学的に関連するいかなる疾患も予防または治療できる可能性があるものと考えられている。ＡＭＲは、移植臓器の生存率が、本発明の方法によって治療されていない移植臓器より大きいときに治療または予防される。移植臓器の生存率とは、移植臓器がレシピエントに拒絶されるまでの時間を意味する。例えば、ＡＭＲは、移植臓器が移植後少なくとも１週間、２週間、４週間、または８週間生存するときに、治療または予防される。移植臓器が３カ月、６カ月、１３カ月生存するのが好ましい。移植臓器が２年間、３年間、５年間またはそれを超える年数生存するのがより好ましい。
【００８７】
サンプルから抗血液型抗体を除去する方法
サンプルから抗血液型抗体を除去するまたは枯渇させる方法も本発明に包含される。サンプルは、血液または血漿などの生体液である。あるいは、サンプルは、心臓組織、肝臓組織、皮膚または腎臓組織などの生体組織である。本方法は、本発明のＡＢＯオリゴ糖またはＡＢＯ融合ペプチドとサンプルとを接触させることを含む。ＡＢＯオリゴ糖またはＡＢＯ融合ペプチド−抗血液型抗体複合体の形成を許容するような条件下で、サンプルをＡＢＯ融合ペプチドと接触させる。ＡＢＯ融合ペプチド−抗体複合体は、存在する場合、抗血液型抗体を除去するまたは枯渇させるために生体サンプルから分離される。
【００８８】
本方法は、万能ドナー血漿を産生するのに有用である。
【００８９】
血液型判定方法
被験者の血液型を判定する方法も本発明に包含される。被験者から採取した血漿または全血などのサンプルを、異なるサブタイプのマイクロビーズの集合体と接触させることによって被験者の血液型を判定する。各サブタイプは、異なる血液型抗原を含有する。血液型抗原は、異なるコア糖鎖型上で発現される。サンプル中に存在する抗血液型抗体が、マイクロビーズ上の血液型抗原に結合する、例えば、血液型抗原−抗体複合体を形成するのに十分な時間、マイクロビーズおよびサンプルを接触させる、例えば、インキュベートする。
【００９０】
複合体が形成されたら、場合によりサンプルを１回または複数回洗浄して未結合の血漿成分を除去する。あるいは、マイクロビーズをサンプルから除去する分離工程を行うことによって、未結合の血漿成分をマイクロビーズから分離する。分離は、遠心分離などの当技術分野で知られている方法によって行われる。更に、マイクロビーズに結合されている抗血液型抗体と特異的に結合する標識試薬とマイクロビーズを接触させる。場合によりマイクロビーズを１回または複数回洗浄して未結合の標識試薬を除去する。次いで、標識試薬を検出することにより、サンプル中の抗血液型抗体の存在または不在を決定する。検出は、フローサイトメトリーまたはＬｕｍｉｎｅｘなどの当技術分野で知られている方法によって行われる。
【００９１】
本発明はまた、サンプル中の複数の抗血液型抗体の検出を提供する。複数の抗血液型抗体とは、各血液型（すなわち、ＡＢＨ）に対して特異的な抗体だけでなく、異なるオリゴ糖コア鎖型の血液型抗原に対して特異的な抗体も意味する。上述の方法を用いて、生体サンプルを更なる検出試薬と接触させ、次いで、更なる検出試薬に特異的な更なる標識試薬と接触させることによって複数の標的を同定する。例えば、例えばコアオリゴ糖鎖型によって区別される血液型抗原などの別個の血液型抗原を用いて、マイクロビーズのサブセットを調製する。次いで、制御した比率で含有する生体サンプルにマイクロビーズのサブセットを付加する。
【００９２】
代替方法では、発光スペクトルによって区別される蛍光体（例えば、緑色のスペクトルで発光するものや赤色のスペクトルで発光するもの）などの別個の標識を用いて標識試薬のサブセットを調製する。次いで、検出試薬−標的複合体を制御された比率で含有する生体サンプルに標識試薬のサブセットを付加する。その比率は、例えば、標的結合抗体ごとに、一方の標識試薬（例えば、緑色発光）２量であり、他方の標識試薬（例えば、赤色発光）１量である。このように、免疫標識された複合体を使用して標的を検出することができる。別の免疫標識された複合体をサンプルに付加する場合、元来の標的は、その後に検出された標的と区別可能である。
【００９３】
場合により、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはそれを超える血液型抗原がサンプル中で検出される。
【００９４】
サンプルは、血液型抗原を含有し得るあらゆる材料を包含するものと定義される。典型的には、サンプルは、全血、血清または血漿である。
【００９５】
本発明の方法は、既存の血液型判定技術より著しい利点を奏する。特定的には、本方法により、血液型抗原のサブタイプの検出が可能になる。更に、本方法により、決定されるべきサンプル中の異なる血液型抗原のサブタイプの認定が可能になる。
【００９６】
検出試薬は、マイクロビーズに結合された血液型抗体と特異的に結合することができる化合物である。検出試薬は、所望の標的に応じて選択される。検出試薬は、例えば、標的特異的抗体またはそのフラグメントなどのポリペプチドである。本明細書中で使用するとき、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を指す。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられる。「特異的に結合する」または「〜と免疫反応する」は、抗体が、所望する抗原の１つまたは複数の抗原決定基とは反応するが、他のポリペプチドとは反応（すなわち、結合）しないか、または他のポリペプチドと非常に低い親和性（Ｋｄ＞１０−６）で結合することを意味する。
【００９７】
モノクローナル抗体は、本発明の方法を実施する上で特に有利である。一般に、モノクローナル抗体は、ポリクローナル抗体より感受性が高く、かつより特異的である。更に、抗体を産生する動物の寿命に左右されるポリクローナル抗体とは異なり、モノクローナル抗体の供給は無限である。しかしながら、モノクローナル抗体のほぼ大半がＩｇＧ１サブクラスであるので、ポリクローナル抗体は、複数のアイソタイプを有する抗体を使用することが必要であるときに有用である。
【００９８】
本明細書中で使用されるとき、「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」という用語は、免疫グロブリン分子と、この免疫グロブリンが特異的である抗原との間に生じるタイプの非共有結合な相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）によって表すことができ、より小さいＫｄは、より大きな親和性を示す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野において周知の方法を用いて定量化される。１つのこのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離の速度を測定することを伴い、それらの比率は、複合する相手方の濃度、相互作用の親和性、および前記速度に対して両方向に等しく影響を与える幾何学的パラメーターに左右される。したがって、「オン速度定数」（Ｋｏｎ）および「オフ速度定数」（Ｋｏｆｆ）はいずれも、濃度ならびに会合および解離の実際速度を算出することによって決定することができる。（Ｎａｔｕｒｅ  ３６１、１８６〜８７頁、１９９３年を参照されたい。）Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ比により、親和性に関係しない全てのパラメーターを破棄することができ、この比は解離定数Ｋｄに等しい。（概して、Ｄａｖｉｅｓら、１９９０年、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５９、４３９〜４７３頁を参照されたい）。
【００９９】
本発明は、以下の非限定的な実施例において更に説明される。
【実施例】
【０１００】
（実施例１）
発現ベクターの構築
Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１／マウスＩｇＧ２ｂ（ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ）ｃＤＮＡを保有する発現ベクターを、エンテロキナーゼ（ＥＫ）開裂部位を含有するように改変した。この部位は、マウスＩｇＧ２ｂ部分の下流放出のために使用することができる。
【０１０１】
ヒト血液型Ａ遺伝子は、ＭＫＮ−４５細胞系から単離した全ＲＮＡから作製したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅ｃＤＮＡであり、血液型Ｂ遺伝子は、ＨｕＴｕ８０細胞系から単離した全ＲＮＡから作製したＰＣＲ増幅ｃＤＮＡであった。
【０１０２】
安定なトランスフェクタントを生成するために使用される発現ベクターは二方向性である。概略図を参照されたい。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ発現ベクターは、ポリリンカーの上流にＥＦ１αプロモーターと、スプライス供与および受容部位と、ＳＶ４０の二方向性ポリ（Ａ）付加シグナルとを有する。反対方向からのポリ（Ａ）付加シグナルを使用して、この転写ユニットと配向が反対であるのは、ＨＳＶ  ＴＫプロモーターと、それに続くピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＣ）のコード配列とからなる第２転写ユニットである。同様に、β１，６ＧｌｃＮＡｃＴ（コア２酵素）発現ベクターは、ＥＦ１αプロモーターと、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）のコード配列とを含有する。ＦＵＴ２（Ｓｅ遺伝子）発現ベクターは同じベクター骨格を含有するが、ＣＭＶプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子とを有する。ＧａｌＮＡｃＴ（Ａ遺伝子）およびＧａｌＴ（Ｂ遺伝子）発現ベクターは、ＣＭＶプロモーターと、ブラシクチジン（ｂｌａｓｉｃｔｉｄｉｎ）耐性遺伝子（Ｂｓｄ）と、ＦＵＴ１（Ｈ遺伝子）とを含有し、β１，３ＧｌｃＮＡｃＴ６（コア３酵素）は、ＣＭＶプロモーターと、ゼオシン耐性遺伝子とを含有し、ＧａｌＴ５発現ベクターは、ＣＭＶプロモーターと、グアノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＧＰＴ）とを含有する。
【０１０３】
これら発現ベクターのＤＮＡ配列を自動配列分析によって検証した。
【０１０４】
（実施例２）
ウェスタンブロット法および間接的免疫蛍光法を用いたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２Ｂ発現の決定
細胞培養上澄み液中でのＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂの発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット法を用いて測定した。ＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中４％〜１２％の勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にサンプルを載せ、分離したタンパク質をニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上へ電気泳動的にブロットした。０．２％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の３％ウシ胎仔血清アルブミン（ＢＳＡ）において１時間ブロックした後、ブロッキング緩衝液で１：４０００に希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて室温で１時間膜をプローブ処理した。０．２％のＴｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳで膜を３回洗浄し、製造業者の指示に従ってＥＣＬキット（Ａｍｅｒｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて化学発光法により結合抗体を視覚化した。
【０１０５】
間接的免疫蛍光法によりＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂの細胞局在を決定した。６ウェルプレートのカバースリップ上に播種したＣＨＯ−Ｋ１細胞に、製造業者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ発現ベクターを一時的にトランスフェクトした。トランスフェクトしてから４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、３０％アセトン／ＭｅＯＨ中に固定した。ＰＢＳ中１％ＢＳＡにおいて３０分間ブロックした後、ブロッキング緩衝液で１：２００に希釈したＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体（ｓｉｇｍａ）を用いてＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂタンパク質を検出した。４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で細胞核を染色した。Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を伴うカバースリップをスライドの上に載せた。ＤＭＲＸＡ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｃｏｒｐ．）を用いてスライドを検査し、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｃ４８８０−４０  ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｎｏｒｄｅｎ  ＡＢ）、Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェアパッケージ（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）およびＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアを用いてデジタル撮影した（図面を参照）。
【０１０６】
（実施例３）
無血清培地へのＣＨＯ−Ｋ１細胞の適合
製造業者の指示に従って、無血清培地Ｅｘ−ｃｅｌｌ  ３０２（ＪＨＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）に対してＣＨＯ−Ｋ１細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）を適合させた。
【０１０７】
（実施例４）
ＤＮＡトランスフェクションおよびクローン選択
無血清培地に適合させたＣＨＯ−Ｋ１細胞を７５ｃｍ２のフラスコに播種し、製造業者の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２００  ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、動物由来でない処方物を用いて、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ発現ベクターを前記細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトしてから４８時間後、ピューロマイシン含有選択培地（６μｇ／ｍＬ）において細胞をインキュベートした。選択培地は３日ごとに交換した。およそ２週間後、製造業者の指示に従って、Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｍｏｖａｌ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、死細胞を除去した。生細胞を９６ウェルプレートにおいて単細胞クローニングし、およそ２週間、選択培地内で増殖させた。細胞培養上澄み液を採取し、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって（下記のプロトコルを参照）、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いてｈＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂの濃度を評価した。ｈＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂが最も高く発現した細胞クローンを選択して増殖させた。
【０１０８】
（実施例５）
上澄み液中のＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２Ｂ濃度の、ＥＬＩＳＡを用いた定量化
細胞を２５ｃｍ２のフラスコに播種した（〜１×１０６細胞／ｍＬ）。細胞培養上澄み液を４日後に採取した。細胞クローンにより産生されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂの濃度を、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって評価した。９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔｅｒ  ３５９０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、アフィニティー精製したヤギ抗ｍＩｇＧ  Ｆｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）で１０μｇ／ｍＬの濃度にて２時間被覆した。ＰＢＳ中１％ＢＳＡで２時間、プレートをブロックした。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂを含有する上澄み液をブロッキング緩衝液で連続希釈し、２時間インキュベートした。洗浄した後、ブロッキング緩衝液で１：４０００に希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いてプレートを２時間インキュベートした。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンジヒドロクロリド（Ｓｉｇｍａ）により、結合したペルオキシダーゼ結合抗体を視覚化した。２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、自動マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）において４５０ｎｍでプレートを読み取った。精製したｍＩｇＧ  Ｆｃフラグメント（Ｓｉｇｍａ）の希釈系を標準として使用して、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ濃度を評価した。下記のように、最も多く産生している細胞クローン（〜２５μｇ／ｍＬ）を選択し、更なるトランスフェクションを行った。
【０１０９】
（実施例６）
血液型Ａ／Ｂ３型抗原で置換したＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２Ｂの生成
上述のように、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂが最も高く発現した安定なＣＨＯ−Ｋ１細胞系にＦＵＴ２（Ｓｅ遺伝子）発現ベクターをトランスフェクトし、Ｇ４１８含有培地内で選択した（４００μｇ／ｍＬ）。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ上での血液型Ｈ３型抗原の相対数が最も高い細胞クローンに、ＧａｌＮＡｃＴ（Ａ遺伝子）またはＧａｌＴ（Ｂ遺伝子）発現ベクターのいずれかをトランスフェクトし、ブラスチシジン含有培地内で選択することにより、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ上に血液型ＡおよびＢそれぞれの３型抗原を産生する細胞系が生成された（トランスフェクションスキームを参照）。
【０１１０】
（実施例７）
血液型Ａ／Ｂ２型抗原で置換したＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２Ｂの生成
ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂが最も高く発現した安定なＣＨＯ−Ｋ１細胞系にβ１，６ＧｌｃＮＡｃＴ１（コア２酵素）およびＦＵＴ１（Ｈ遺伝子）発現ベクターをトランスフェクトし、Ｇ４１８含有培地内で選択した（４００μｇ／ｍＬ）。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ上でのＨ２型抗原の相対数が最も高い細胞クローンに、α１，３ＧａｌＮＡｃＴ（Ａ遺伝子）またはα１，３ＧａｌＴ（Ｂ遺伝子）発現ベクターのいずれかをトランスフェクトし、ブラスチシジン含有培地内で選択することにより、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ上に血液型ＡおよびＢそれぞれの２型抗原を産生する細胞系が生成された（トランスフェクションスキームを参照）。
【０１１１】
（実施例８）
血液型Ａ／Ｂ１型抗原で置換したＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２Ｂの生成
ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ上での血液型Ｈ３型抗原の相対数が最も高い細胞クローンに、β１，３ＧａｌＮＡｃＴ（コア３酵素）およびＧａｌＴ５発現ベクターをトランスフェクトし、ゼオシン含有培地内で選択した。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ上での血液型Ｈ１型抗原の相対数が最も高いクローンに、α１，３ＧａｌＮＡｃＴ（Ａ遺伝子）またはα１，３ＧａｌＴ（Ｂ遺伝子）発現ベクターのいずれかをトランスフェクトし、ブラスチシジン含有培地内で選択することにより、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ上に血液型ＡおよびＢそれぞれの１型抗原を産生する細胞系が生成された（トランスフェクションスキームを参照）。
【０１１２】
（実施例９）
組換えｈＰＳＧＬ−１／ＥＫ／ｍＩｇＧ２Ｂの精製
遠心分離によって細胞培養上澄み液をデブリから回収し、ヤギ抗マウスＩｇＧ（全分子）アガロース（Ｓｉｇｍａ）を含有するカラムに通す。ＰＢＳでの洗浄後、結合したｈＰＳＧＬ−１／ＥＫ／ｍＩｇＧ２ｂを３Ｍ  ＮａＳＣＮで溶出し、蒸留水で透析分離する。低分子量の汚染物質を除去するために、ＨｉＰｒｅｐ  １６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００  ＨＲカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上にてゲル濾過によりｈＰＳＧＬ−１／ＥＫ／ｍＩｇＧ２ｂを更に精製してもよい。
【０１１３】
セファロースへの共有結合およびカラム充填
標準的なバイオコンジュゲーション化学を用いて、精製した血液型ＡおよびＢムチンをセファロース高速流動（ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ）ビーズに共有結合する。結合後、実際のカラムを構成するプラスチック容器にセファロースを充填する。
【０１１４】
原型カラムの吸着効率および生体適合性試験
プールしていた血液型Ｏ血漿の吸着前後の抗血液型ＡＢＯ抗体の力価を、赤血球凝集を含む標準的な血液貯蔵技法および間接的な抗グロブリンテストによって評価する。免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ）、補体因子／フラグメント（Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｄ、Ｃ４およびｓＣ５ｂ−９）、免疫複合体および凝固因子（ＦＶＩＩＩ、プロトロンビン、フィブリノーゲン、フィブリン分解産物）を含む血漿タンパク質全てを標準の技法により測定する。規定のコア糖鎖上に血液型Ａ／Ｂ抗原を保有する組換えムチンを用いるＥＬＩＳＡによって、または、精製され、かつ構造的に規定された血液型ＡおよびＢ糖脂質を使用する薄層クロマトグラフィーに基づくオーバーレイアッセイによって、吸着されかつ溶出したＡＢＯ抗体と、吸着されていないＡＢＯ抗体との特異性を決定する。
【０１１５】
（実施例１０）
抗体力価を決定するための、大きさおよび色が異なるビーズの生成
大きさおよび色が異なるビーズを生成し（ｍｉｃｒｏｍｏｄ  Ｐａｒｔｉｋｅｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｒｏｓｔｏｃｋ、Ｇｅｒｍａｒｙ）、異なる型の血液型抗原に結合させた。フローサイトメトリーによってビーズを分析すると、大きさおよび色のいずれに関しても良好な分解能を示した（表５を参照）。この方法を用いると、多数の結合ビーズの混合物を使用することが可能であり、各々の大きさ−色強度の組合せは、特定のコア構造上で発現された特定の血液型抗原を表している。
【０１１６】
（実施例１１）
血液型抗体の検出
血清サンプルを、０．５％ヒトアルブミンを含むＰＢＳで１：１０に希釈し、血液型抗原オリゴ糖を保有するラテックスマイクロビーズ（４．６μｍ；１８μｇ乾燥重量）と混合する。血清およびマイクロビーズを室温で３０分間インキュベートし、次いで、０．５％ＨＡＳ／ＰＢＳで洗浄する。ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＭおよびＰＥ標識ＩｇＧを、洗浄したマイクロビーズに付加し、フローサイトメトリーによって分析する。
【０１１７】
（参考文献）
【０１１８】
【表１】
2009536150.tif 000005
【０１１９】
【表２】
2009536150.tif 000006
（他の実施形態）
詳細な説明と関連して本発明を説明してきたが、前記説明は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を例証するものであって、制限することを意図するものではない。他の態様、利点および変更も、添付の特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１−１】血液型抗原を保有する融合タンパク質を産生するのに使用されるベクターの概略図である。
【図１−２】血液型抗原を保有する融合タンパク質を産生するのに使用されるベクターの概略図である。
【図１−３】血液型抗原を保有する融合タンパク質を産生するのに使用されるベクターの概略図である。
【図２】ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂの細胞局在が間接的免疫蛍光法によって決定されたことを示す写真である。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂタンパク質は、ブロッキング緩衝液で１：２００に希釈したＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて検出した。細胞核は、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。
【図３】血液型Ａ決定基を保有する異なる外側コア鎖を示すウェスタンブロットの写真である。
【図４】異なるグリカン前駆体上でＡＢＯ融合タンパク質を産生するためのＡＢＨトランスフェクションスキームの概略図である。
【図５−１】５個の異なる大きさおよび色強度を有するビーズから得られたフローサイトメトリーの結果を示すグラフであり、多くの大きさ−色の組合せのビーズを使用することが可能であることを明らかに示している。上述の大きさおよび色の組合せを用いると、それぞれ独特の血液型抗原を発現する最大２５個の異なるビーズの混合物を作製することができる。
【図５−２】５個の異なる大きさおよび色強度を有するビーズから得られたフローサイトメトリーの結果を示すグラフであり、多くの大きさ−色の組合せのビーズを使用することが可能であることを明らかに示している。上述の大きさおよび色の組合せを用いると、それぞれ独特の血液型抗原を発現する最大２５個の異なるビーズの混合物を作製することができる。
【図６】血液型抗原の外側コア構造の概略図である。
【図７】血液型ＡＢＨ抗原の概略図である。
【図８】血清中の抗血液型抗体を同定するフローサイトメトリー結果のグラフ図である。
【図９】Ａ型、Ｂ型およびＯ型の個体から得られた血清中のＩｇＧおよびＩｇＭ血液型Ａ抗体を示す一連の散布図である。
【図１−１】
2009536150.tif 000007
【図１−２】
2009536150.tif 000008
【図１−３】
2009536150.tif 000009
【図２】
2009536150.tif 000010
【図３】
2009536150.tif 000011
【図４】
2009536150.tif 000012
【図５−１】
2009536150.tif 000013
【図５−２】
2009536150.tif 000014
【図６】
2009536150.tif 000015
【図７】
2009536150.tif 000016
【図８】
2009536150.tif 000017
【図９】
2009536150.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成20年12月8日(2008.12.8)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009536150000001.app
【国際調査報告】
2009536150.tif 000019
2009536150.tif 000020
2009536150.tif 000021
2009536150.tif 000022
2009536150.tif 000023