(57)【要約】  本発明は、連結ペプチドによって連結されたヒトインスリン又はそのアナログのＢ鎖及びＡ鎖を含み、ヒトインスリンＢ鎖のＢ２０、Ｂ２１又はＢ２２位の少なくとも一つの天然アミノ酸残基に置換されているリジン残基がアシル化によって化学的に修飾されているアシル化単鎖インスリンに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
連結ペプチドによって連結されたヒトインスリン又はそのアナログのＢ鎖及びＡ鎖を含み、ヒトインスリンＢ鎖のＢ２０、Ｂ２１又はＢ２２位の一つの天然アミノ酸残基に置換されているリジン残基がアシル化によって化学的に修飾されているアシル化単鎖インスリン。
【請求項２】
Ｂ鎖のＢ２９位のリジンアミノ酸残基が更にアシル化されている請求項１に記載のアシル化単鎖インスリン。
【請求項３】
ヒトインスリンＢ鎖のＢ２９位の天然リジン残基が他のアミノ酸残基で置換されている請求項１に記載のアシル化単鎖インスリン。
【請求項４】
ヒトインスリンＢ鎖のＢ２９位の天然リジン残基がＡｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ又はＨｉｓで置換されている請求項３に記載のアシル化単鎖インスリン。
【請求項５】
Ｂ鎖がＢ３０アミノ酸残基を欠いている請求項１に記載のアシル化単鎖インスリン。
【請求項６】
アシル基が、少なくとも一つの遊離カルボン酸基又は中性ｐＨで負に荷電している基を含んでいてもよい約６から約３２個の炭素原子を有しているモノカルボン酸又はジカルボン酸の飽和又は不飽和で直鎖状又は分枝状の脂肪酸部分から誘導された親油性基である請求項１から５に記載のアシル化単鎖インスリン。
【請求項７】
脂肪酸部分が、６〜２４、８〜２０、１２〜２０、１２〜１６、１０〜１６、１０〜２０、１４〜１８又は１４〜１６個の炭素原子を有している請求項６に記載のアシル化単鎖インスリン。
【請求項８】
アシル基がリンカー分子を介して単鎖インスリンに結合している請求項１から７の何れか一項に記載のアシル化単鎖インスリン。
【請求項９】
連結ペプチドが、ペプチド鎖中に３から約２５、３から約２０、４から約２５、４から約２０、５から約２５、５から約２０、６から約２５、６から約２０、３から約１５、３から約１０、４から約１５、４から約１０、５から約１５、５から約１０、６から約１５又は６から約１０のアミノ酸残基を有している請求項１から８に記載のアシル化単鎖インスリン。
【請求項１０】
通常の医薬用アジュバント及び添加剤と共に先の請求項の何れか一項に記載のアシル化単鎖インスリンを含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、アシル化された単鎖インスリン並びにかかるアシル化単鎖インスリンを含有する薬学的組成物に関する。
【０００２】
(発明の背景)
現在、１型糖尿病と２型糖尿病双方の糖尿病の治療は、いわゆる強化インスリン療法に益々依存してきている。この治療法によれば、患者は、基礎インスリン必要量を補うための持続型インスリンの１日１回又は２回の注射を含む複数回の毎日のインスリン注射に、食事に関連したインスリン必要量を補うための速効型インスリンのボーラス注射が補填された治療を受ける。
持続型インスリン組成物は当該分野でよく知られている。しかして、持続型インスリン組成物の主要な一タイプは、インスリン結晶又は非晶質インスリンの注入可能な水性懸濁液を含む。これらの組成物において、典型的に利用されるインスリン化合物は、プロタミンインスリン、亜鉛インスリン又はプロタミン亜鉛インスリンである。
【０００３】
インスリン懸濁液の使用には、ある欠点がある。しかして、精確な投薬を担保するためには、定まった容量の懸濁液がバイアルから抜き出されるか又はカートリッジから放出される前に、穏やかに振盪することによって、インスリン粒子を均質に懸濁させなければならない。また、インスリン懸濁液を保存する場合は、凝集塊形成又は凝固を避けるために、温度を、インスリン溶液の場合よりも狭い範囲内に保持しなければならない。
【０００４】
持続型インスリン組成物の他のタイプは、溶液の注射の際に、ｐＨ値の上昇のためにインスリンが沈殿してしまう生理学的ｐＨより低いｐＨ値の溶液である。これらの溶液の欠点は、注射時に組織内に形成される沈殿物の粒径分布、よって医薬の放出プロファイルが、注射部位の血流と他のパラメータに些か予測不能な形で依存することである。更なる欠点は、インスリンの固形粒子が局所的刺激物として作用して、注射部位に組織の炎症を引き起こすおそれがあることである。
【０００５】
持続型又は遅延性インスリン誘導体の更なるグループはアシル化インスリン誘導体である。ヒトインスリンは３つの第１級アミノ基を有している：Ａ鎖とＢ鎖のＮ末端基、ＬｙｓＢ２９のεアミノ基である。Ｂ２６からＢ３０位の何れかのリジン残基のεアミノ基に結合した親油性置換基を含む可溶型インスリン誘導体は例えばＷＯ９５／０７９３１、ＷＯ９６／００１０７、ＷＯ９７／３１０２２、ＷＯ２００５／０１２３４７及びＥＰ８９４０９５に記載されている。これらの二本鎖インスリン誘導体は長時間にわたる作用プロファイルを有しており、生理学的ｐＨ値で可溶性である。
【０００６】
インスリンは、膵臓のβ細胞から分泌されるポリペプチドホルモンであり、二つの鎖間ジスルフィド架橋によって結合されたＡとＢの二つのポリペプチド鎖からなる。更に、Ａ鎖は一つの鎖間ジスルフィド架橋を特徴とする。
ホルモンは、プレペプチドＢ-Ａｒｇ Ａｒｇ-Ｃ-Ｌｙｓ Ａｒｇ-Ａ(ここで、Ｃは３１個のアミノ酸の連結ペプチドである)の構造の、２４のアミノ酸のプレペプチドに８６のアミノ酸を含むプロインスリンが続いてなる単鎖前駆体プロインスリン(プレプロインスリン)として合成される。Ａｒｇ-Ａｒｇ及びＬｙｓ-Ａｒｇは、Ａ及びＢ鎖から連結ペプチドを切断して二本鎖のインスリン分子を形成するための切断部位である。インスリンは正常な代謝調節の維持に必須である。
【０００７】
インスリンの二本鎖構造によりインスリンが複数の立体構造を採ることが可能になっており、幾つかの発見は、インスリンがかなりの立体構造変化の性質を有していることと、そのような変化のためのポテンシャルの制限がインスリンレセプターに対する親和性をかなり減少させることを示している。プロインスリンは、インスリンレセプターに対する親和性が天然インスリンよりも１００倍低い。
【０００８】
他方、未切断単鎖インスリン分子のより堅い構造はインスリン分子に増大した物理的及び化学的安定性を付与しうる。物理的及び化学的安定性は、インスリン製剤、利用可能なインスリン投与方法、並びに薬学的製剤の有効期間及び貯蔵条件に対して基本的なものである。インスリン投与の際の溶液の使用は、例えば高温、気液固相間変化並びに剪断力などの、例えばフィブリル化のような不可逆的立体構造変化を生じうる要因の組合せに分子をさらす。よって、インスリン分子の物理的及び化学的安定性は糖尿病のインスリン療法のための基本的な条件である。
【０００９】
改善された安定性と同時にヒトインスリンに匹敵するインスリン活性を有する単鎖インスリンがＷＯ２００５／０５４２９１に最近開示されている。他のタイプの単鎖インスリンがＥＰ１１９３２７２、ＥＰ７４１１８８、ＷＯ９５／１６７０８及びＷＯ２００５／０５４２９１に開示されている。これらの単鎖インスリンは、該Ｃペプチド中の５-１８、１０-１４又は５-１１アミノ酸残基が修飾されたＣペプチドを有していることを特徴とする。ＷＯ２００５／０５４２９１は、親単鎖インスリン分子をアシル化することによって持続型になされた単鎖インスリンを製造することを更に示唆している。
【００１０】
インスリン活性、物理的安定性及び溶解性並びに遅延性作用プロファイルの双方に関して既知の化合物よりも改善された特性を有するアシル化単鎖インスリンの選択群を提供することが本発明の目的である。
【００１１】
(発明の概要)
一側面では、本発明は、連結ペプチドによって連結されたヒトインスリン又はそのアナログのＢ鎖及びＡ鎖を含み、ヒトインスリンＢ鎖のＢ２０、Ｂ２１又はＢ２２位の一つの天然アミノ酸残基に置換されているリジン残基がアシル化によって化学的に修飾されているアシル化単鎖インスリンに関する。
一実施態様では、単鎖インスリンはヒトインスリンＢ鎖のＢ２０位のリジンアミノ酸残基がアシル化されている。
他の実施態様では、単鎖インスリンはヒトインスリンＢ鎖のＢ２１位のリジンアミノ酸残基がアシル化されている。
他の実施態様では、単鎖インスリンはヒトインスリンＢ鎖のＢ２２位のリジンアミノ酸残基がアシル化されている。
【００１２】
一実施態様では、該アシル化単鎖インスリンは、Ｂ鎖のＢ３０位のアミノ酸残基を欠いている。
本発明に係るアシル化単鎖インスリンは、Ｂ鎖のＢ２９位の天然リジンアミノ酸残基がまたアシル化されていてもよい。
しかしながら、ヒトインスリンＢ鎖のＢ２９位の天然リジン基のアシル化が望ましくない場合は、該アミノ酸残基は別のアミノ酸残基によって置き換えてもよい。適した置換アミノ酸残基はＡｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ及びＨｉｓである。あるいは、Ｂ２９位のリジンアミノ酸残基は、インスリンのＢ鎖の所望のＢ２０、Ｂ２１又はＢ２２位のリジン残基のアシル化前に、よく知られた技術によってブロックし、ついで所望の位置のアシル化後に脱ブロックしうる。
【００１３】
一実施態様では、アシル基は約６から約３２個の炭素原子を有する脂肪酸部分から誘導された親油性基である。
他の実施態様では、脂肪酸部分は６から２４、８から２０、１２から２０、１２−１６、１０−１６、１０−２０、１４−１８又は１４ー１６個の炭素原子を有している。
アシル基はアミド結合を介して当該リジン基のεアミノ基に直接結合されてもよい。アシル基はまた、アミド結合を介してアシル基と親インスリン分子に共に結合するリンカー基を介してリジン基に結合されてもよい。
一実施態様では、アシル基は、アミノ酸リンカー、例えばγ又はαグルタミルリンカーを介して、又はβ又はαアスパルチルリンカーを介して、又はαアミド-γグルタミルリンカーを介して、又はαアミド-βアスパルチルリンカーを介してリジン残基に結合されている。
【００１４】
連結ペプチドの長さは、３アミノ酸残基からヒトインスリンの天然Ｃペプチドの長さに対応する長さまで変動しうる。本発明に係るアシル化単鎖インスリン中の連結ペプチドは、しかしながら、ヒトＣペプチドよりは通常は短く、ペプチド鎖中に典型的には３から約３５、３から約３０、４から約３５、４から約３０、５から約３５、５から約３０、６から約３５又は６から約３０、３から約２５、３から約２０、４から約２５、４から約２０、５から約２５、５から約２０、６から約２５又は６から約２０、３から約１５、３から約１０、４から約１５、４から約１０、５から約１５、５から約１０、６から約１５又は６から約１０、又は６−９、６−８、６−７、７−８、７−９、又は７−１０アミノ酸残基の長さを有している。
有用な連結ペプチドの非限定的な例は配列：ＶＧＬＳＳＧＱ(配列番号１)及びＴＧＬＧＳＧＲ(配列番号２)である。
【００１５】
また更なる側面では、本発明は、本発明のアシル化単鎖インスリンと適切なアジュバント及び添加剤、例えば安定化、保存又は等張のために適した一又は複数の薬剤、例えば亜鉛イオン、フェノール、クレゾール、パラベン、塩化ナトリウム、グリセロール又はマンニトールを含有する薬学的製剤に関する。製剤の亜鉛含量は、インスリン六量体当たり０から約６個の亜鉛原子でありうる。薬学的製剤のｐＨは約４から約８．５の間、約４から約５の間、又は約６．５から約７．５の間でありうる。
更なる実施態様では、本発明は糖尿病の治療のための医薬としてのアシル化単鎖インスリンの使用に関する。
【００１６】
更なる側面では、本発明は、哺乳動物の血糖値を低減するため、特に糖尿病の治療のための医薬製剤の調製のためのアシル化単鎖インスリンの使用に関する。
更なる実施態様では、本発明は、治療を必要とする患者に本発明に係るアシル化単鎖インスリンの治療的活性用量を投与することにより哺乳動物の血糖値を低減する方法に関する。
本発明の更なる側面では、アシル化単鎖インスリンは、任意の適切な比で一又は複数種の更なる活性物質と併用されて投与される。かかる更なる活性剤は、ヒトインスリン、速効型インスリンアナログ、抗糖尿病薬、抗脂質異常症薬、抗肥満薬、抗高血圧薬、糖尿病から生じるか糖尿病に関連する合併症の治療剤から選択されうる。二つの活性成分は混合医薬製剤として投与されるか又は別個に投与されうる。
【００１７】
一実施態様では、本発明のアシル化単鎖インスリンは、速効型インスリン又はインスリンアナログと共に投与されうる。かかる速効型インスリンアナログは、Ｂ２８位のアミノ酸残基がＡｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＡｌａであり、Ｂ２９位のアミノ酸残基がＬｙｓ又はＰｒｏであるようなもの、ｄｅｓ(Ｂ２８-Ｂ３０)、ｄｅｓ(Ｂ２７)又はｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、及びＢ３位がＬｙｓでＢ２９位がＧｌｕ又はＡｓｐであるアナログでありうる。
本発明に係るアシル化単鎖インスリンと速効型インスリン又はインスリンアナログは約９０／１０％、約７０／３０％又は約５０／５０％の比で混合されうる。
抗糖尿病薬には、インスリン、ＷＯ９８／０８８７１、ＷＯ９９／４３７０６、ＵＳ５４２４２８６及びＷＯ００／０９６６６に記載されたＧＬＰ-１(１-３７)(グルカゴン様ペプチド-１)、ＧＬＰ-２、エキセンディン-４(１-３９)、そのインスリン分泌促進断片、そのインスリン分泌促進アナログ及びそのインスリン分泌促進誘導体が含まれる。ＧＬＰ-１(１-３７)のインスリン分泌促進断片は、全配列がＧＬＰ-１(１-３７)の配列に見出すことができ、少なくとも一つの末端アミノ酸が欠失されているインスリン分泌促進ペプチドである。
【００１８】
(発明の説明)
本発明のアシル化単鎖インスリンアナログは、単鎖インスリン分子のＢ鎖のＮ末端の領域がアシル化されている。この領域はインスリン分子の表面に位置し、六量体形成に干渉しない。
単鎖インスリンは、よく知られた技術によってアシル化され、アシル基は典型的には直鎖状又は分枝状であり得、少なくとも２個の炭素原子を有するモノ又はジカルボン酸から誘導される。
アシル基は親油性基であり得、少なくとも一つの遊離カルボン酸基又は中性ｐＨで負に荷電している基を含んでいてもよい約６から約３２個の炭素原子を有しているモノカルボン酸又はジカルボン酸でありうる。
脂肪酸は更に飽和又は不飽和であり得、ＯやＳのような一又は複数のヘテロ原子と一又は複数の複素環系を含みうる。
【００１９】
モノカルボン酸脂肪酸の非限定的な例は、カプリン酸、ラウリン酸、テトラデカン酸(ミリスチン酸)、ペンタデカン酸、パルミチン酸、ヘプタデカン酸、ステアリン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、及びテトラデカン酸である。
ジカルボン酸脂肪酸の非限定的な例は、コハク酸、ヘキサン二酸、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、ヘプタデカン二酸、及びオクタデカン二酸である。
脂肪酸部分は、より典型的には、６から２４、８から２０、１２から２０、１２−１６、１０−１６、１０−２０、１４−１８又は１４−１６個の炭素原子を有している。
【００２０】
アシル基は、またＣＨ３(ＣＨ２)ｎＣＯ-(ここで、ｎは４から２４である)、例えばＣＨ３(ＣＨ２)６ＣＯ-、ＣＨ３(ＣＨ２)８ＣＯ-、ＣＨ３(ＣＨ２)１０ＣＯ-、ＣＨ３(ＣＨ２)１２ＣＯ-、ＣＨ３(ＣＨ２)１４ＣＯ-、ＣＨ３(ＣＨ２)１６ＣＯ-、ＣＨ３(ＣＨ２)１８ＣＯ-、ＣＨ３(ＣＨ２)２０ＣＯ-及びＣＨ３(ＣＨ２)２２ＣＯ-含む群から選択される親油性基でありうる。
一実施態様では、アシル基は直鎖又は分枝状のα,ωジカルボン酸である。他の実施態様では、アシル基は式ＨＯＯＣ(ＣＨ２)ｍＣＯ-(ここで、ｍは２から２４である)、例えばＨＯＯＣ(ＣＨ２)１４ＣＯ-、ＨＯＯＣ(ＣＨ２)１６ＣＯ-、ＨＯＯＣ(ＣＨ２)１８ＣＯ-、ＨＯＯＣ(ＣＨ２)２０ＣＯ-及びＨＯＯＣ(ＣＨ２)２２ＣＯ-を有しうる。
最後に、アシル基は、リトコール酸によるものでありうる。
【００２１】
アシル基はリンカー分子、例えば適当なアミノ酸残基によって単鎖インスリンに結合されうる。一側面では、リンカーは、一つが遊離カルボン酸基又は中性ｐＨで負に荷電している基を含みうるアミド結合を介して共に結合した１−４のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、リンカーはアミノ酸残基、２−４アミノ酸残基のペプチド鎖であり、又はα-Ａｓｐ；β-Ａｓｐ；α-Ｇｌｕ；γ-Ｇｌｕ；α-ｈＧｌｕ；δ-ｈＧｌｕ；-Ｎ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯ-；-Ｎ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-；-Ｎ(ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-又は-Ｎ(ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ)ＣＨ２ＣＯ-である。
【００２２】
別の実施態様では、リンカー及びアシル基は式ＨＯＯＣ(ＣＨ２)ｎＣＯＮＨ-ＣＨ(ＣＯＯＨ)-(ＣＨ２)ｐＣＯ-(ここで、ｎは４-２４の整数であり、ｐは１-３の整数である)を有し、また更なる実施態様では、リンカーとアシル基の組合せは式ＣＨ３(ＣＨ２)ｎＣＯＮＨ-ＣＨ(ＣＨ２)ｐ(ＣＯＯＨ)ＣＯ-(ここで、ｎは４-２４の整数であり、ｐは１-３の整数である)又はＨＯＯＣ(ＣＨ２)ｎＣＯＮＨ-ＣＨ((ＣＨ２)ｐＣＯＯＨ)ＣＯ-(ここで、ｎは４-２４の整数であり、ｐは１-３の整数である)を有する。
別の実施態様では、本発明は、リンカーとアシル基が式ＣＨ３(ＣＨ２)ｎＣＯＮＨ-ＣＨ(ＣＯＯＨ)-(ＣＨ２)ｐＣＯ-(ここで、ｎは４-２４、１０-２４又は８-２４の整数であり、ｐは１-３の整数である)を有するアシル化単鎖インスリンに関する。
【００２３】
更なる側面では、リンカーは、一方が４から１０の炭素原子と側鎖にカルボン酸基を有する一方、他方が２から１１の炭素原子を有するが遊離のカルボン酸基を含まない２個のアミノ酸残基からなる鎖でありうる。遊離のカルボン酸基を含まないアミノ酸残基は中性のαアミノ酸残基でありうる。かかるリンカーの例は、α-Ａｓｐ-Ｇｌｙ；Ｇｌｙ-α-Ａｓｐ；β-Ａｓｐ-Ｇｌｙ；Ｇｌｙ-β-Ａｓｐ；α-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ；Ｇｌｙ-α-Ｇｌｕ；γ-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ；Ｇｌｙ-γ-Ｇｌｕ；α-ｈＧｌｕ-Ｇｌｙ；Ｇｌｙ-α-ｈＧｌｕ；δ-ｈＧｌｕ-Ｇｌｙ；及びＧｌｙ-δ-ｈＧｌｕである。
【００２４】
更なる側面では、リンカーは、独立して４から１０の炭素原子を有し、共に側鎖中にカルボン酸基を有する２個のアミノ酸残基からなる鎖である。これらのアミノ酸残基の一方又はそれらの双方がαアミノ酸残基でありうる。かかるリンカーの例は、α-Ａｓｐ-α-Ａｓｐ；α-Ａｓｐ-α-Ｇｌｕ；α-Ａｓｐ-α-ｈＧｌｕ；α-Ａｓｐ-β-Ａｓｐ；α-Ａｓｐ-γ-Ｇｌｕ；α-Ａｓｐ-δ-ｈＧｌｕ；β-Ａｓｐ-α-Ａｓｐ；β-Ａｓｐ-α-Ｇｌｕ；β-Ａｓｐ-α-ｈＧｌｕ；β-Ａｓｐ-β-Ａｓｐ；β-Ａｓｐ-γ-Ｇｌｕ；β-Ａｓｐ-δ-ｈＧｌｕ；α-Ｇｌｕ-α-Ａｓｐ；α-Ｇｌｕ-α-Ｇｌｕ；α-Ｇｌｕ-α-ｈＧｌｕ；α-Ｇｌｕ-β-Ａｓｐ；α-Ｇｌｕ-γ-Ｇｌｕ；α-Ｇｌｕ-δ-ｈＧｌｕ；γ-Ｇｌｕ-α-Ａｓｐ；γ-Ｇｌｕ-α-Ｇｌｕ；γ-Ｇｌｕ-α-ｈＧｌｕ；γ-Ｇｌｕ-β-Ａｓｐ；γ-Ｇｌｕ-γ-Ｇｌｕ；γ-Ｇｌｕ-δ-ｈＧｌｕ；α-ｈＧｌｕ-α-Ａｓｐ；α-ｈＧｌｕ-α-Ｇｌｕ；α-ｈＧｌｕ-α-ｈＧｌｕ；α-ｈＧｌｕ-β-Ａｓｐ；α-ｈＧｌｕ-γ-Ｇｌｕ；α-ｈＧｌｕ-δ-ｈＧｌｕ；δ-ｈＧｌｕ-α-Ａｓｐ；δ-ｈＧｌｕ-α-Ｇｌｕ；δ-ｈＧｌｕ-α-ｈＧｌｕ；δ-ｈＧｌｕ-β-Ａｓｐ；δ-ｈＧｌｕ-γ-Ｇｌｕ；及びδ-ｈＧｌｕ-δ-ｈＧｌｕである。
【００２５】
更なる側面では、リンカーは、独立して４から１０の炭素原子を有する３個のアミノ酸残基からなる鎖であり、該鎖のアミノ酸残基は、中性側鎖を有する残基及び側鎖にカルボン酸基を有する残基から選択され、鎖は側鎖にカルボン酸基を有する少なくとも一つの残基を有している。一側面では、アミノ酸残基はαアミノ酸残基である。
更なる側面では、リンカーは、独立して４から１０の炭素原子を有する４個のアミノ酸残基からなる鎖であり、該鎖のアミノ酸残基は、中性側鎖を有する残基及び側鎖にカルボン酸基を有する残基から選択され、鎖は側鎖にカルボン酸基を有する少なくとも一つの残基を有している。一側面では、アミノ酸残基はαアミノ酸残基である。
リンカーは、カルボン酸又はカルボキシアミド基で置換されていてもよい一又は複数の芳香環系を含みうる。
【００２６】
一実施態様では、リンカーとアシル基は式ＣＨ３(ＣＨ２)ｎＣＯＮＨ-ＣＨ(ＣＯＯＨ)-(ＣＨ２)ｐＣＯ-(ここで、ｎは４−２４、１０−２４又は８−２４の整数であり、ｐは１−３の整数である)を有しうる。
他の実施態様では、リンカーとアシル基は式ＨＯＯＣ(ＣＨ２)ｎＣＯＮＨ-ＣＨ(ＣＯＯＨ)-(ＣＨ２)ｐＣＯ-(ここで、ｎは４−２４の整数であり、ｐは１−３の整数である)を有する。他の実施態様では、リンカーとアシル基の組合せは式ＣＨ３(ＣＨ２)ｎＣＯＮＨ-ＣＨ(ＣＨ２)ｐ(ＣＯＯＨ)ＣＯ-(ここで、ｎは４−２４の整数であり、ｐは１−３の整数である)又はＨＯＯＣ(ＣＨ２)ｎＣＯＮＨ-ＣＨ((ＣＨ２)ｐＣＯＯＨ)ＣＯ-(ここで、ｎは４−２４の整数であり、ｐは１−３の整数である)を有する。
【００２７】
本発明での使用に適したアシル基及びリンカーは、ＷＯ９５／０７９３１、ＷＯ９６／００１０７、ＷＯ９７／３１０２２、ＷＯ２００５／０１２３４７及びＥＰ８９４０９５に開示されている。
本発明に係る単鎖インスリンのアシル化は米国特許第５７５０４９７号及び同第５９０５１４０号に開示された方法と同様の方法によって製造することができる。アシル化の方法は更に実験欄に記載している。
【００２８】
上述したように、連結ペプチドはアミノ酸配列の長さと組成が変動しうる。本発明に適した連結ペプチドの非限定的な例はＷＯ２００５／０５４２９１に開示されている。
本発明に係るアシル化単鎖インスリンの非限定的な例は、
Ｂ(１-２９)-Ｂ２０Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ミリストイル)-Ｂ２９Ａ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２０Ｋ(Ｎ(α)オクタデカンジオイル)-Ｂ２９Ａ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２０Ｋ(Ｎ(α)ヘキサデカンジオイル-ｇ-Ｌ-Ｇｌｕ)-Ｂ２９Ａ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２１Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ミリスチル)-Ｂ２９Ａ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２１Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)オクタデカノジイル)-Ｂ２９Ａ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２１Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ヘキサデカンジオイル-ｇ-Ｌ-Ｇｌｕ)-Ｂ２９Ａ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ミリストイル)-Ｂ２９Ａ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)オクタデカノジイル)-Ｂ２９Ａ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ヘキサデカンジオイル-ｇ-Ｌ-Ｇｌｕ)-Ｂ２９Ａ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２０Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ミリストイル)-Ｂ２９Ａ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２０Ｋ(Ｎ(α)オクタデカンジオイル)-Ｂ２９Ａ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２０Ｋ(Ｎ(α)ヘキサデカンジオイル-ｇ-Ｌ-Ｇｌｕ)-Ｂ２９Ａ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２１Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ミリストイル)-Ｂ２９Ａ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２１Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)オクタデカノジイル)-Ｂ２９Ａ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２１Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ヘキサデカンジオイル-ｇ-Ｌ-Ｇｌｕ)-Ｂ２９Ａ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ミリストイル)-Ｂ２９Ａ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)オクタデカノジイル)-Ｂ２９Ａ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ヘキサデカンジオイル-ｇ-Ｌ-Ｇｌｕ)-Ｂ２９Ａ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２０Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ミリストイル)-Ｂ２９Ｈ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２０Ｋ(Ｎ(α)オクタデカンジオイル)-Ｂ２９Ｈ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２０Ｋ(Ｎ(α)ヘキサデカンジオイル-ｇ-Ｌ-Ｇｌｕ)-Ｂ２９Ｈ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２１Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ミリスチル)-Ｂ２９Ｈ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２１Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)オクタデカノジイル)-Ｂ２９Ｈ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２１Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ヘキサデカンジオイル-ｇ-Ｌ-Ｇｌｕ)-Ｂ２９Ｈ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ミリストイル)-Ｂ２９Ｈ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)オクタデカノジイル)-Ｂ２９Ｈ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ヘキサデカンジオイル-ｇ-Ｌ-Ｇｌｕ)-Ｂ２９Ｈ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２０Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ミリストイル)-Ｂ２９Ｈ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２０Ｋ(Ｎ(α)オクタデカンジオイル)-Ｂ２９Ｈ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２０Ｋ(Ｎ(α)ヘキサデカンジオイル-ｇ-Ｌ-Ｇｌｕ)-Ｂ２９Ｈ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２１Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ミリストイル)-Ｂ２９Ｈ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２１Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)オクタデカノジイル)-Ｂ２９Ｈ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２１Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ヘキサデカンジオイル-ｇ-Ｌ-Ｇｌｕ)-Ｂ２９Ｈ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ミリストイル)-Ｂ２９Ｈ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)オクタデカノジイル)-Ｂ２９Ｈ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ヘキサデカンジオイル-ｇ-Ｌ-Ｇｌｕ)-Ｂ２９Ｈ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２０Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ミリストイル)-Ｂ２９Ｑ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２０Ｋ(Ｎ(α)オクタデカンジオイル)-Ｂ２９Ｑ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２０Ｋ(Ｎ(α)ヘキサデカンジオイル-ｇ-Ｌ-Ｇｌｕ)-Ｂ２９Ｑ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２１Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ミリスチル)-Ｂ２９Ｑ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２１Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)オクタデカノジイル)-Ｂ２９Ｑ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２１Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ヘキサデカンジオイル-ｇ-Ｌ-Ｇｌｕ)-Ｂ２９Ｑ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ミリストイル)-Ｂ２９Ｑ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)オクタデカノジイル)-Ｂ２９Ｑ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ヘキサデカンジオイル-ｇ-Ｌ-Ｇｌｕ)-Ｂ２９Ｑ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２０Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ミリストイル)-Ｂ２９Ｑ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２０Ｋ(Ｎ(α)オクタデカンジオイル)-Ｂ２９Ｑ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２０Ｋ(Ｎ(α)ヘキサデカンジオイル-ｇ-Ｌ-Ｇｌｕ)-Ｂ２９Ｑ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２１Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ミリストイル)-Ｂ２９Ｑ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２１Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)オクタデカノジイル)-Ｂ２９Ｑ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２１Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ヘキサデカンジオイル-ｇ-Ｌ-Ｇｌｕ)-Ｂ２９Ｑ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ミリストイル)-Ｂ２９Ｑ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)オクタデカノジイル)-Ｂ２９Ｑ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン；
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ヘキサデカンジオイル-ｇ-Ｌ-Ｇｌｕ)-Ｂ２９Ｑ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)ヒトインスリン
である。
【００２９】
親単鎖インスリンは、例えば欧州特許第１６９２１６８号又は米国特許第６５００６４５号に開示されたようなよく知られた技術によって適当な宿主細胞中で当該単鎖インスリンをコードするＤＮＡ配列を発現させることによって製造される。単鎖インスリンは、直接又はＢ鎖にＮ末端伸展を有する前駆体分子として発現される。このＮ末端伸展は直接発現される産物の収率を増大させる機能を有している場合があり、１５アミノ酸残基長まででありうる。Ｎ末端伸展は培養ブロスからの単離後にインビトロで切断されることになり、従ってＢ１の隣に切断部位を有している。本発明に適したタイプのＮ末端伸展は米国特許第５３９５９２２号及び欧州特許第７６５３９５Ａ号に開示されている。
【００３０】
単離されたインスリン前駆体は、当該分野でよく知られているように所望の位置でアシル化でき、そのようなインスリンアナログの例は、例えば公開番号ＥＰ２１４８２６、ＥＰ３７５４３７及びＥＰ３８３４７２を有する欧州特許出願に記載されている。
各インスリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、確立された標準的な方法、例えばBeaucage等 (1981) Tetrahedron Letters 22:1859-1869に記載されているホスホラミダイト法、又はMatthes等 (1984) EMBO Journal 3:801-805に記載されている方法によって、合成的に調製することができる。ＤＮＡコンストラクトを調製する現在の好ましい方法はポリメラーゼ連鎖反応法(ＰＣＲ)による。
【００３１】
ポリヌクレオチド配列はまたゲノム、ｃＤＮＡ、及び合成の混合由来であってもよい。例えば、リーダーペプチドをコードするゲノム又はｃＤＮＡ配列を、Ａ鎖及びＢ鎖をコードするゲノム又はｃＤＮＡ配列に結合させた後、よく知られた手順に従って相同組換えのために所望のアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを挿入し、又は好ましくは適当なオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲによって所望の配列を生産することによって、ＤＮＡ配列を改変させることができる。
【００３２】
選択された微生物又は宿主細胞中で複製可能であり、当該インスリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を担持する組換えベクターは、自己複製ベクター、例えばプラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体でありうる。ベクターは自己複製を確実にする任意の手段を含みうる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されたときに、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものでありうる。ベクターは直鎖又は閉環状プラスミドでありうる。
一実施態様では、組換え発現ベクターは酵母中で複製可能である。ベクターを酵母中で複製させることができる配列の例は酵母プラスミド２μｍ複製遺伝子ＲＥＰ１−３及び複製起点である。
【００３３】
ベクターは、形質転換細胞の選択を容易にする一又は複数の選択可能マーカーを含みうる。細菌性選択可能マーカーの例は、枯草菌(Bacillus subtilis)又はバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)由来のｄａｌ遺伝子、あるいはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を付与するマーカーである。酵母宿主細胞のための好適なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、及びＵＲＡ３である。酵母によく適した選択可能マーカーはシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pompe)ＴＰＩ遺伝子(Russell (1985) Gene 40:125-130)である。
【００３４】
ベクター中において、ポリヌクレオチド配列は適切なプロモーター配列に作用可能に結合している。プロモーターは、変異、切断、及びハイブリッドプロモーターを含む選択宿主細胞中で転写活性を示す任意の核酸配列であり得、宿主細胞に相同か又は異種性である細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。酵母宿主では、有用なプロモーターは、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)Ｍａ１、ＴＰＩ、ＡＤＨ又はＰＧＫプロモーターである。
ポリヌクレオチドコンストラクトはまた典型的には適切なターミネーターに作用可能に連結される。酵母において、適切なターミネーターはＴＰＩターミネーター(Alber等(1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:419-434)である。
【００３５】
かかるポリヌクレオチド配列を含むベクターを、ベクターが染色体組み込み体として又は先に記載されたように自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞中に導入する。「宿主細胞」なる用語は、複製中に生じる変異のために親細胞と同一ではない親細胞の任意の子孫を包含する。宿主細胞は典型的には酵母細胞である。本発明の方法において使用される酵母生物は、培養で多量の本発明の単鎖インスリンを生産する任意の適切な酵母生物でありうる。適切な酵母生物の例は、酵母種サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、サッカロミセス・ウバルム(Sacchoromyces uvarum)、 クリベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピキア・クルイベリ(Pichia kluyveri)、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、カンジダ属(Candida sp.)、トルラ酵母(Candida utilis)、カンジダ・カカオイ(Candida cacaoi)、ゲオトリクム属(Geotrichum sp.)、及びゲオトリクム・フェルメンタンス(Geotrichum fermentans)から選択される株である。
【００３６】
酵母細胞の形質転換は、例えば原形質形成と続く形質転換によりそれ自体知られている形でなされうる。細胞を培養するのに使用される培地は酵母生物を増殖させるのに適した任意の一般的培地であり得る。分泌されるインスリンポリペプチドは、その有意な割合が正しくプロセシングされた形態で培地中に存在するが、遠心分離、濾過による培地からの酵母細胞の分離、又はイオン交換マトリックス又は逆相吸収マトリックスによるインスリン前駆体の捕捉、例えば硫酸アンモニウムのような塩による上清又は濾液のタンパク質性成分の沈殿と、続く例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のような様々なクロマトグラフィー法による精製を含む、一般的な手順により培地から回収されうる。
【００３７】
医薬組成物
この発明のアシル化単鎖インスリンを含む医薬組成物は、インスリンに感受性である状態の治療に使用することができる。よって、該組成物は、１型糖尿病、２型糖尿病及び例えば重篤に傷害を被った人及び大手術を受けた人にしばしば見られる高血糖症の治療に使用することができる。任意の患者に対する最適な用量レベルは、用いられる特定のインスリン誘導体の効能、年齢、体重、身体活動性、及び患者の食事を含む様々な要因、他の薬剤との併用の可能性、治療される状態の重篤度に依存する。この発明のアシル化単鎖インスリンの毎日の投薬量が、既知のインスリン組成物に対するものと同様の方法で当業者によって各個々の患者に対して決定されることが推奨される。
【００３８】
本発明に係るアシル化単鎖インスリンを含む医薬組成物は、かかる治療を必要とする患者に非経口的に投与されうる。非経口投与は、シリンジによる皮下、筋肉内又は静脈内注射によって実施することができる。通常は、医薬組成物は皮下的に投与される。しかしながら、本発明のアシル化単鎖インスリンはまた肺投与用に製剤化することもできる。
他の実施態様では、医薬製剤は、予め充填された使い捨てのものであってもよいペン状注射器で使用することができ、あるいはインスリン調製物は、取り除くことができる容器から供給されうる。ペン状注射器の非限定的な例は、FlexPen(登録商標)、InnoLet(登録商標)、InDuoＴＭ、Innovo(登録商標)である。
【００３９】
この発明のアシル化単鎖インスリンは、乾燥パウダー吸入器又はスプレーにより送達させることができる。
投与に適した商業的に入手可能な吸入装置の他の例は、TurbohalerTM(Astra)、Rotahaler(登録商標)(Glaxo)、Diskus(登録商標)(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)、Inhale Therapeuticsから市販されている装置、Ultravent(登録商標)ネブライザー(Mallinckrodt)、Acorn II(登録商標)ネブライザー(Marquest Medical Products)、Ventolin(登録商標)定量吸入器(Glaxo)、Spinhaler(登録商標)パウダー吸入器(Fisons)等である。
【００４０】
本発明のアシル化単鎖インスリンの注射用組成物は、所望する最終生成物が得られるように成分を溶解し混合することを含む製薬工業の常套的な技術を使用して調製することができる。よって、一手順によれば、本発明に係るアシル化単鎖インスリンは、調製される組成物の最終容量よりも幾分少ない量の水に溶解される。必要に応じて、等張剤、保存料及びバッファーが添加され、必要ならば、塩酸等の酸、又は水酸化ナトリウム水等の塩基を使用して、溶液のｐＨ値が調節される。最後に、溶液の容量は、所望の濃度の成分が得られるように水で調節される。
【００４１】
本発明のアシル化単鎖インスリンの医薬組成物は通常のアジュバント及び添加剤を含み、好ましくは水溶液として製剤化される。水性媒体は、例えば塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム又はグリセロールを用いて等張にされる。更に、水性媒体は亜鉛イオン、バッファー及び保存料を含みうる。組成物のｐＨ値は所望値に調節され、当該単鎖インスリンの等電点ｐＩに応じて約４から約８．５の間、好ましくは７から７．５の間でありうる。
従って、この発明はまた本発明のアシル化単鎖インスリン及び場合によっては安定化、保存又は等張に適した一又は複数種の薬剤、例えば亜鉛イオン、フェノール、クレゾール、パラベン、塩化ナトリウム、グリセロール又はマンニトールを含む医薬組成物にも関する。本発明の製剤の亜鉛含量はインスリン六量体当たり０から約６個の亜鉛原子でありうる。単鎖インスリンはまたＷＯ２００３０２７０８１に開示されたＩＦＤリガンドを用いて製剤化することもできる。
【００４２】
本発明に係る医薬調製物に使用されるバッファーは、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン(bicine)、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、又はそれらの混合物からなる群から選択されうる。
【００４３】
薬学的に許容可能な保存料は、フェノール、ｏ-クレゾール、ｍ-クレゾール、ｐ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ-ヒドロキシ安息香酸プロピル、２-フェノキシエタノール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸ブチル、２-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びチオメロサール(thiomerosal)、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(３ｐ-クロロフェノキシプロパン-１,２-ジオール)又はそれらの混合物からなる群から選択され得る。本発明の更なる実施態様では、保存料は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明の更なる態様では、保存料は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明の更なる態様では、保存料は５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明の更なる態様では、保存料は１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。これらの特定の保存料の各一が本発明の別の態様を構成する。医薬組成物に保存料を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【００４４】
等張剤は、塩(例えば塩化ナトリウム)、糖又は糖アルコール、アミノ酸(例えば、Ｌ-グリシン、Ｌ-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン)、アルジトール(例えばグリセロール(グリセリン)、１,２-プロパンジオール(プロピレングリコール)、１,３-プロパンジオール、１,３-ブタンジオール)ポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ４００)、又はそれらの混合物からなる群から選択され得る。任意の糖、例えば単糖類、二糖類又は多糖類、又は水溶性グルカン類、例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、及びカルボキシメチルセルロース-Ｎａを使用することもできる。一実施態様では、糖添加剤はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも一の-ＯＨ基を有するＣ４-Ｃ８炭化水素と定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール(galactitol)、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールを含む。一実施態様では、糖アルコール添加剤はマンニトールである。上述の糖又は糖アルコールは、個々に又は組合せて使用することができる。糖又は糖アルコールが液状調製物に可溶性であり、本発明の方法を使用して達成される安定化効果に悪影響を与えない限りは、使用量に決まった限界はない。一実施態様では、糖又は糖アルコールの濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌである。本発明の更なる実施態様では、等張化剤は１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明の更なる実施態様では、等張剤は１ｍｇ／ｍｌ〜７ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明の更なる実施態様では、等張剤は８ｍｇ／ｍｌ〜２４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明の更なる実施態様では、等張剤は２５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。これらの特定の等張化剤の各一が本発明の別の実施態様を構成する。医薬組成物に等張化剤を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【００４５】
医薬組成物は、約１２０ｎｍｏｌ／ｍｌ〜２４００ｎｍｏｌ／ｍｌ、約４００ｎｍｏｌ／ｍｌ〜約２４００ｎｍｏｌ／ｍｌ、約４００ｎｍｏｌ／ｍｌ〜約１２００ｎｍｏｌ／ｍｌ、約６００ｎｍｏｌ／ｍｌ〜約２４００ｎｍｏｌ／ｍｌ、約６００ｎｍｏｌ／ｍｌ〜約１２００ｎｍｏｌ／ｍｌの本発明に係るアシル化単鎖インスリン、又は速効型インスリンアナログと本発明に係るアシル化単鎖インスリンの混合物を含む溶液でありうる。
この発明のアシル化単鎖インスリンが他の治療形態と組み合わされるときはいつでも、この投与は、治療される患者内にその組合せた作用を生じるのに効果的な形で、同時又は連続でありうる。
【００４６】
一実施態様では、アシル化単鎖インスリンは、ヒトインスリン又は上述のヒトインスリンの速効型アナログと併用されて、予め混合された調製物として、又は二つの別個の調製物の実質的に同時の投与によって、又は連続的投与(つまり投与が時間的に分離)によって、投与されうる。薬剤は、その組み合わせた存在とその組み合わせた作用を生じるのに効果的な量と効果的な時間に提供されるであろう。
本発明に係るアシル化単鎖インスリンはまたチアゾリジンジオン、メトホルミンのような経口抗糖尿病薬及び経口治療のための他の２型糖尿病医薬製剤との併用治療に使用することもできる。
【００４７】
更に、本発明に係るアシル化単鎖インスリンは、一又は複数の抗肥満薬又は食欲調節剤と併用されて投与されうる。
そのような薬剤は、ＣＡＲＴ(コカインアンフェタミン調節転写)アゴニスト、ＮＰＹ(神経ペプチドＹ)アンタゴニスト、ＭＣ３(メラノコルチン３)アゴニスト、ＭＣ４(メラノコルチン４)アゴニスト、オレキシンアンタゴニスト、ＴＮＦ(腫瘍壊死因子)アゴニスト、ＣＲＦ(コルチコトロピン放出因子)アゴニスト、ＣＲＦ ＢＰ(コルチコトロピン放出因子結合タンパク質)アンタゴニスト、ウロコルチンアゴニスト、β３アドレナリン作動性アゴニスト、例えばＣＬ-３１６２４３、ＡＪ-９６７７、ＧＷ-０６０４、ＬＹ３６２８８４、ＬＹ３７７２６７又はＡＺ-４０１４０、ＭＳＨ(メラノサイト刺激ホルモン)アゴニスト、ＭＣＨ(メラノサイト集中ホルモン)アンタゴニスト、ＣＣＫ(コレシストキニン)アゴニスト、セロトニン再摂取インヒビター(フルオキセチン、セロザット又はシタロプラム)、セロトニン及びノルエピネフェリン再摂取インヒビター、５ＨＴ(セロトニン)アゴニスト、ボンベシンアゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、成長ホルモン、成長因子、例えばプロラクチン又は胎盤ラクトゲン、成長ホルモン放出化合物、ＴＲＨ(チロトロピン放出ホルモン)アゴニスト、ＵＣＰ２又は３(脱共役タンパク質２又は３)モジュレーター、レプチンアゴニスト、ＤＡ(ドーパミン)アゴニスト(ブロモクリプチン、ドプレキシン)、リパーゼ／アミラーゼインヒビター、ＰＰＡＲモジュレーター、ＲＸＲモジュレーター、ＴＲβアゴニスト、アドレナリン作動性ＣＮＳ刺激薬、ＡＧＲＰ(アグーチ関連タンパク質)インヒビター、ヒスタミンＨ３受容体アンタゴニスト、例えばＷＯ００／４２０２３、ＷＯ００／６３２０８及びＷＯ００／６４８８４(出典明示によりここに援用する)に開示されているもの、エキセンジン(exendin)-４、ＧＬＰ-１アゴニスト、毛様神経栄養因子、及びオキシントモジュリンからなる群から選択することができる。更なる抗肥満薬は、ブプロピオン(抗うつ薬)、トピラメート(抗けいれん薬)、エコピパム(ecopipam)(ドーパミンＤ１／Ｄ５アンタゴニスト)及びナルトレキソン(オピオイドアンタゴニスト)である。
【００４８】
一実施態様では、抗肥満薬はレプチン、セロトニン及びノルエピネフリン再摂取インヒビター、例えばシブトラミン、リパーゼインヒビター、例えばオルリスタット、アドレナリン作動性ＣＮＳ刺激薬、例えばデキサアンフェタミン、アンフェタミン、フェンテルミン、マジンドール、フェンジメトラジン、ジエチルプロピオン、フェンフルラミン又はデキシフェンフルラミンである。
【００４９】
食事制限及び／又は運動、上述の化合物の一又は複数及び場合によっては一又は複数の他の活性物質とアシル化単鎖インスリンの任意の適切な組合せが本発明の範囲内であると考えられることが理解されなければならない。
【００５０】
ここで使用される「インスリン」とは、ＣｙｓＡ７とＣｙｓＢ７の間と、ＣｙｓＡ２０とＣｙｓＢ１９の間にジスルフィド架橋を、またＣｙｓＡ６とＣｙｓＡ１１の間に内部ジスルフィド架橋を有するヒトインスリン、ブタインスリン、及びウシインスリンを意味する。
ここで使用される「インスリンアナログ」とは、天然インスリン中に生じる少なくとも一つのアミノ酸残基を欠失させ、及び／又は置換することにより、及び／又は］少なくとも一つのアミノ酸残基を付加することによって、天然に生じるインスリン、例えばヒトインスリンの構造から形式的には誘導することができる分子構造を有するポリペプチドを意味する。付加された及び／又は置換されたアミノ酸残基は、コード可能なアミノ酸残基又は他の天然に生じるアミノ酸残基又は純粋に合成のアミノ酸残基の何れかでありうる。
【００５１】
単鎖インスリンとは、ＢがヒトＢインスリン鎖又はそのアナログ又は誘導体であり、ＡがヒトインスリンＡ鎖又はアナログ又は誘導体であり、ＣがＢ鎖中のＣ末端アミノ酸残基(通常はＢ３０)をＡ１に連結するペプチド鎖である一般構造Ｂ−Ｃ−Ａのポリペプチド配列を意味する。Ｂ鎖がｄｅｓＢ３０鎖である場合、連結ペプチドはＢ２９をＡ１に連結する。単鎖インスリンは、ＣｙｓＡ７とＣｙｓＢ７の間及びＣｙｓＡ２０とＣｙｓＢ１９の間にあるヒトインスリンにおけるように正しく位置決めされたジスルフィド架橋(３つ)及びＣｙｓＡ６とＣｙｓＡ１１の間の内部ジスルフィド架橋を含む。
【００５２】
Ｂ鎖のアナログは、Ｂ１中のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基、例えばＡｓｐ又はＧｌｙで置換され又は欠失されているようなものでありうる。またＢ３位のＡｓｎはＴｈｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ又はＡｓｐで変異されうる。Ｂ鎖はまたＮ末端伸展を含みうる。また、Ｂ３０アミノ酸残基は欠失されうる。
Ａ鎖のアナログは、Ａ１８位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基、例えばＧｌｎで置換されているようなものでありうる。また、Ａ２１位のＡｓｎがＡｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌ、特にＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒで、好ましくはＧｌｙで変異されうる。
【００５３】
ｄｅｓＢ３０又はＢ(１−２９)とは、Ｂ３０アミノ酸残基を欠く天然インスリンＢ鎖又はそのアナログを意味し、Ａ(１−２１)は天然インスリンＡ鎖又はそのアナログ又はその誘導体を意味する。アミノ酸残基は３文字アミノ酸記号又は１文字アミノ記号で示される。
Ｂ１、Ａ１等とは、それぞれインスリンのＢ鎖の１位(Ｎ末端から数える)のアミノ酸残基及びインスリンのＡ鎖の１位(Ｎ末端から数える)のアミノ酸残基を意味する。
【００５４】
単鎖インスリンは次の規則に従って命名される：配列はＢ鎖で始まり、Ｃペプチドで続き、Ａ鎖で終了する。アミノ酸残基はヒトインスリン中のその各対応物に因んで命名され、変異及びアシル化が明示的に記載される一方、Ａ鎖及びＢ鎖中の未変化アミノ酸残基は言及されない。例えば、ヒトインスリンと比較して次の変異：Ａ２１Ｇ、Ａ１８Ｑ、Ｂ２０Ｋ、ｄｅｓＢ３０及びＣ末端Ｂ鎖とＮ末端Ａ鎖を連結する連結ＴＧＬＧＳＧＲ(配列番号２)を有するインスリンは、Ｂ(１−２９)−Ｂ２０ＫＴＧＬＧＳＧＲ−Ａ(１−２１)−Ａ１８Ｑ−Ａ２１Ｇヒトインスリンと命名される。
【００５５】
アシル化は、アミノ基又はヒドロキシル基の水素がアシル基と交換される化学反応と理解される。
脂肪酸とは、少なくとも２個の炭素原子を有し飽和又は不飽和である直鎖状又は分枝状カルボン酸を意味する。
脂肪二酸とは、少なくとも２個の炭素原子を有し飽和又は不飽和である直鎖状又は分枝状ジカルボン酸を意味する。
【００５６】
速効型インスリンとは、通常の又は定型的なヒトインスリンよりも作用発生が速いインスリンを意味する。
持続性インスリンとは、通常の又は定型的なヒトインスリンよりも作用の期間が長いインスリンを意味する。
連結ペプチドとは、Ｂ鎖のＣ末端アミノ酸残基をＡ鎖のＮ末端アミノ酸残基に連結するペプチド鎖を意味する。
ここで使用される基礎インスリンなる用語は、８時間を超え、特に少なくとも９時間の作用時間を有するインスリンペプチドを意味する。好ましくは、基礎インスリンは少なくとも１０時間の作用時間を有する。基礎インスリンはよって９から１５時間の範囲の作用時間を有しうる。
【００５７】
親インシュリンとは、本発明に係るアミノ酸残基組成中に改変を有する単鎖インスリンペプチド骨格を意味する。
インスリン活性を有する単鎖インスリンとは、例えば静脈内又は皮下投与による適切な投与後に、ラット、ウサギ又はブタモデルでありうる適切な動物モデルで測定して、哺乳動物中の血糖値を低下させる能力を有する単鎖インスリンを意味する。
中性ｐＨで可溶性とは、０．６ｍＭの単鎖インスリンが中性ｐＨで可溶性であることを意味する。
高い物理的安定性とは、フィブリル化の傾向がヒトインスリンのものの５０％未満であることを意味する。フィブリル化は与えられた条件でフィブリル形成が開始される前の遅延時間によって記述することができる。
【００５８】
親油性という用語は、当該生成物が脂質に溶解し得ることを意味する。
フィブリル化とは、部分的に折り畳まれていないインスリン分子が互いに相互作用して直鎖状の凝集体を形成する物理プロセスを意味する。
インスリンレセプター及びＩＧＦ-１レセプター親和性を有するポリペプチドは、適当な結合アッセイにおいてインスリンレセプター及びＩＧＦ-１レセプターと相互作用し得るポリペプチドである。このようなレセプターアッセイは当該分野でよく知られている。
【００５９】
ペプチドを指すここで使用されるアナログなる用語は、ペプチドの一又は複数のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換され、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基がペプチドから欠失させられ、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基がペプチドに付加された修飾ペプチドを意味する。アミノ酸残基のそのような付加又は欠失はペプチドのＮ末端及び／又はペプチドのＣ末端で生じうる。一実施態様では、アナログは、天然ペプチドに対して５未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。他の実施態様では、アナログは、天然ペプチドに対して４未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。他の実施態様では、アナログは、天然ペプチドに対して３未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。他の実施態様では、アナログは、天然ペプチドに対して２未満の修飾(置換、欠失、付加)を含む。他の実施態様では、アナログは、天然ペプチドに対して一つのみの修飾(置換、欠失、付加)を含む。
【００６０】
本文脈において、単位「Ｕ」は６ｎｍｏｌに対応する。
「シグナルペプチド」なる用語は、タンパク質の前駆体においてＮ末端配列として存在するプレ-ペプチドを意味するものと理解される。シグナルペプチドの機能は、異種タンパク質の小胞体への転位置を容易にすることである。シグナルペプチドはこのプロセスの過程で通常は切断される。シグナルペプチドはタンパク質を生産する酵母生物に対して異種性又は相同的でありうる。本発明のＤＮＡコンストラクトで使用されうる多くのシグナルペプチドには、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３(ＹＡＰ３)シグナルペプチド、又は任意の機能的アナログ(Egel-Mitani等、(1990) YEAST 6:127-137及びUS5726038)、ＭＦａ１遺伝子のα因子シグナル(Thorner(1981)、The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae, Strathern等編, pp 143-180, Cold Spring Harbor Laboratory, NY、及びUS487000)が含まれる。
【００６１】
「プロ-ペプチド」なる用語は、その機能が、発現されたポリペプチドを小胞体からゴルジ体へ、更には培地中への分泌のために分泌小胞へ向けることを可能にすることであるポリペプチド配列を意味する(すなわち、ポリペプチドは、酵母細胞のペリプラズム空間中に細胞壁又は少なくとも細胞膜を通って出て行く)。プロ-ペプチドは酵母α因子プロ-ペプチドであってもよい。ＵＳ４５４６０８２及び４８７０００８を参照。あるいは、プロ-ペプチドは、合成プロ-ペプチド、つまり天然には見出されないプロ-ペプチドでありうる。適切な合成プロ-ペプチドはＵＳ５３９５９２２；５７９５７４６；５１６２４９８及びＷＯ９８／３２８６７に開示されているものである。プロ-ペプチドは、Ｌｙｓ-Ａｒｇ配列又はその任意の機能的アナログのような、Ｃ末端にエンドペプチダーゼプロセシング部位を含む。
【００６２】
本文脈において、アミノ酸の３文字又は１文字標記を、次に示すようにその一般的な意味で使用した。明示的に示さない限り、ここに述べるアミノ酸はＬアミノ酸である。更に、ペプチドのアミノ酸配列の左及び右端は、別に示さない限り、それぞれＮ末端及びＣ末端である。
【００６３】
アミノ酸の略語は次の表の通りである。
2009530242.tif 000002
【００６４】
次の略語が明細書及び実施例で使用される：
Ｂｚｌ＝Ｂｚ：ベンジル
ＤＩＥＡ：      Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：        Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド
ｔＢｕ：        tert-ブチル
Ｇｌｕ：        グルタミン酸
ＴＳＴＵ：      テトラフルオロホウ酸Ｏ-(Ｎ-スクシンイミジル)-１,１,３,３-テトラメチルウロニウム
ＴＨＦ：        テトラヒドロフラン
ＥｔＯＡｃ：    酢酸エチル
ＤＩＰＥＡ：    ジイソプロピルエチルアミン
ＨＯＡｔ：      １-ヒドロキシ-７-アザベンゾトリアゾール
ＮＭＰ：        Ｎ-メチルピロリジン-２-オン
ＴＥＡ：        トリエチルアミン
Ｓｕ：          スクシンイミジル＝２,５-ジオキソ-ピロリジン-１-イル
ＴＦＡ：        トリフルオロ酢酸
ＤＣＭ：        ジクロロメタン
ＤＭＳＯ：      ジメチルスルホキシド
ＲＴ：          室温
ｃｙａｎｏ：    α-シアノ-４-ヒドロキシ桂皮酸
【００６５】
本発明を、請求項記載の発明の範囲を決して限定することを意図するものではない次の実施例において更に詳細に記載する。ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、その全内容がここに記載されているかの如く、その全体が出典明示によりその全内容がここに援用される(法律により許容される最大範囲)。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的に使用され、決して本発明を限定するものと解してはならない。
ここに提供される任意かつ全ての例、又は例示的言語(例えば「等」)の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図しており、特に請求項に記載がない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる語句も請求項に記載していない要素が本発明の実施に必須であることを示しているものと解してはならない。
ここでの特許文献の引用及び援用は単に便宜上なされているもので、そのような特許文献の有効性、特許性、及び／又は権利行使性についての見解を反映させるものではない。
【実施例】
【００６６】
一般的方法
アシル化
以下の実施例及び一般的手順は、明細書において同定された中間化合物及び最終生成物に言及する。あるいは、ここに開示されているか又は他に一般的な他の反応が、本発明の対応する化合物の調製に適用されるであろう。全ての調製方法において、全ての出発物質は既知であるか、又は既知の出発物質から容易に調製することができる。全ての温度は摂氏で記載されており、別の定義をしない限りは、全ての部及びパーセントは、収率に関しては重量であり、全ての部は、溶媒及び溶離液に関しては容量である。
【００６７】
本発明の化合物は、当該分野で典型的な次の手順の一又は複数を使用することにより精製することができる。これらの手順は、必要ならば、勾配、ｐＨ、塩、濃度、流量、カラム等に関して修正することができる。当該問題の種々のインスリンの不純物プロファイル、溶解度等の要因に応じて、これらの変更は容易に認識可能であり、また当業者によってなされるであろう。
酸性ＨＰＬＣ又は脱塩後に、化合物は純粋フラクションの凍結乾燥によって分離される。
中性ＨＰＬＣ又はアニオン交換クロマトグラフィー後に、化合物を脱塩し、等電ｐＨで沈殿させ、又は酸性ＨＰＬＣで精製する。
【００６８】
典型的な精製手順：
ＨＰＬＣシステムは次のものからなるＧｉｌｓｏｎシステムである：モデル２１５液体ハンドラー、モデル322-H2ポンプ及びモデル155 UV検出器。ＵＶ検出は典型的には２１０ｎｍ及び２８０ｎｍである。
Akta精製FPLCシステム(Amersham Biosciences)は次のものからなる：モデルP-900ポンプ、モデル UV-900 UV検出器、モデルpH/C-900 pH及び伝導度検出器、モデルFrac-950フラクション収集器。UV検出は典型的には２１４ｎｍ、２５４ｎｍ及び２７６ｎｍである。
酸性HPLC:
カラム: Macherey-Nagel SP 250/21 Nucleusil 300-7 C4
流量： ８ml/分, 
バッファー A: アセトニトリル中0.1% TFA
バッファー B:      水中0.1% TFA
勾配:              0.0 - 5.0分:          10% A
5.00 - 30.0分:        10% Aから90% A
30.0 - 35.0分:        90% A
35.0 - 40.0分:       100% A
中性ＨＰＬＣ：
カラム:            Phenomenex, Jupiter, C4 5μm 250 x 10,00 mm, 300A
流量：             6 ml/分
バッファー A：     5 mM TRIS, 7.5 mM (NH4)2SO4, pH = 7.3, 20 % CH3CN
バッファー B:     60% CH3CN, 40%水
勾配:              0 - 5分：     10% B, 
5 - 35分： 10-60 % B 
35 - 39分:     60% B, 
39 - 40分：     70% B
40 - 43.5分:     70% B
アニオン交換クロマトグラフィー：
カラム：           Ressource Q, 6 ml
流量:              6 ml/分
バッファー A: 0.09% NH4HCO3, 0.25% NH4OAc, 42.5% エタノール pH 8.4
バッファー B: 0.09% NH4HCO3, 2.5% NH4OAc, 42.5% エタノール pH 8.4
勾配:             100% Aから100% B、30カラム体積
脱塩:
カラム:            HiPrep 26/10
流量:              10 ml/分, 6カラム体積
バッファー         10 mM NH4HCO3
【００６９】
分析手順：
方法１：
２台のWaters 510 HPLCポンプ
Waters 2487 Dualλ吸光度検出器
バッファー A:     アセトニトリル中0.1% TFA
バッファー B:      水中0.1% TFA
流量：             1.5 ml/分
勾配:     1-17分: 25% Bから85% B, 17-22分：85% B, 22-23分: 85% Bから25% B, 23-30分25% B, 30-31分 25%B 流量:0.15 ml/分。
カラム:         C4 5μ  150x4_60mm 「phenomenex, Jupiter」。
検出:           UV 214 nm。
【００７０】
方法２：
２台のWaters 510 HPLCポンプ
Waters 2487 Dual λ吸光度検出器
バッファー A:      0.1% TFA, 10% CH3CN, 89.9%水。
バッファー B:      0.1% TFA, 80% CH3CN, 19.9%水。
流量:              1.5 ml/分。
勾配:     0-17分： 20%-90% B, 17-21分 90% B。
カラム：       C4 5μ 150x4_60mm 「phenomenex, Jupiter」,40℃に維持。
検出:             UV 214 nm。
【００７１】
方法３：
２台のWaters 510 HPLCポンプ
Waters 486 Tunable吸光度検出器
Waters 717自動サンプラー
カラム:         C4 5μ  150x4_60mm 「phenomenex, Jupiter」。
注入：           20 μl。
バッファーA:       80% 0,0125 M Tris, 0,0187 M (NH4)2SO4 pH = 7, 20% CH3CN.
バッファーB:       80% CH3CN, 20%水。
流量:             1.5 ml/分。
勾配:     0分 5% B -> 20分 55% B -> 22分 80% B -> 24分 80% B -> 25分 5% B 32分 5% B。
検出:     UV 214 nm。
【００７２】
方法４：
２台のWaters 510 HPLCポンプ
Waters 2487 Dual l吸光度検出器
カラム:     C4 5μ  150x4_60mm 「phenomenex, Jupiter」
注入:       20 μl
バッファーA:      80% 0,0125 Mトリス, 0,0187 M (NH4)2SO4 pH = 7,  20% CH3CN
バッファーB:     80% CH3CN, 20%水
流量:         1.5 ml/分
勾配:   0分10 % B ->20分 50% B -> 22分 60 % B -> 23分 10 % B -> 30分 10 % B -> 31分 10 % B 流量0.15分  
検出:       214 nm
【００７３】
方法５：
Waters 2695分離モジュール
Waters 996フォトダイオードアレイ検出器
カラム:     C4 5μ  150x4_60mm 「phenomenex, Jupiter」
注入:     25 μl
バッファーA:   80% 0,01 M Tris, 0,015 M (NH4)2SO4 pH = 7.3; 20% CH3CN
バッファーB:   20% 水; 80% CH3CN
流量:       1.5 ml/分
勾配:   1-20分: 5-50% B, 20-22分: 50-60% B, 22-23分: 60-5% B, 23- 30分 5-0%B 30-31分 0-5%B,流量:0,15 ml/分。
検出:       214 nm
【００７４】
方法６：
Waters 2795分離モジュール
Waters 2996フォトダイオードアレイ検出器
Waters Micromass ZQ 4000 エレクトロスプレー質量スペクトル計
LC-法:
カラム:     Phenomenex, Jupiter 5μ C4 300A 50 x 4,60 mm
バッファーA:     水中0.1% TFA
バッファー B:     CH3CN
流量：             1 ml/分
勾配：       0-7.5 分: 10-90% B
7.5-8.5分: 90-10%B
8.5-9.5分 10% B 
9.5-10.00分 10% B, 流量： 0.1 ml/分
【００７５】
MS法：         質量:  500 - 2000 ES+
コーン電圧 60V
スキャン時間 1
インタースキャンディレイ: 0.1
【００７６】
方法７：
Agilent 1100シリーズ
カラム:           GraceVydac Protein C4, 5um 4,6x250mm (Cat# 214TP54)
バッファーA:     水中10 mM Tris, 15 mM (NH4)2SO4, 20% CH3CN pH 7.3
バッファーB:     CH3CN中20%水
流量:             1.5 ml/分
勾配:             1-20分: 10% Bから50% B, 20-22分: 50% Bから60% B, 22-23分: 60% B から10% B, 23-30分10% B 30-31分10%B, 流量0.15ml/分。
検出:             214 nm
MALDI-TOF-MSスペクトルを、窒素レーザー及び陽イオン検出を使用して線形モードで操作するBruker Autoflex II TOF/TOFに記録した。加速電圧：２０ｋＶ。
【００７７】
中間体の調製
ミリスチン酸Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステルは、B. Faroux-Corlay等, J. Med. Chem. 2001, 44, 2188-2203に従って調製することができる。
【００７８】
ヘキサデカンジオイル-Ｌ-Ｇｌｕ(ＯＳｕ)-ＯＨの調製:
2009530242.tif 000003
ヘキサデカン二酸(２００ｇ，０．７ｍｏｌ)及びＤｏｗｅｘ５０  ＷＸ２−１００イオン交換樹脂(７００ｇ)にｎ−オクタン(３．６Ｌ)を加え、混合物をギ酸ベンジル(９５ｇ，０．７ｍｏｌ)に加えた。混合物を９１℃まで加熱し、更にギ酸ベンジル(３４０ｇ，２．５ｍｏｌ)を９時間の間、滴下して加えた。９１℃での加熱を２日間継続し、室温まで冷却させた。混合物を濾過し、固形物をｎ−オクタン(２．３Ｌ)で洗浄し、吸引して乾燥させた。固形物をアセトン(３Ｌ)に懸濁させ、４０℃まで３０分間加熱した。混合物を濾過し、イオン交換樹脂をアセトン(１．５Ｌ)で洗浄した。組み合わせた濾液及び洗浄物(およそ５Ｌ)をロータリエバポレータでの蒸発によって約１．５Ｌまで濃縮した。形成された懸濁液を濾過し、固形物を冷(−１８℃)アセトン(０．８Ｌ)で洗浄し、乾燥させて、未変化のヘキサデカン二酸で汚染された１６０ｇの粗物質を得た。これにジクロロメタン(２Ｌ)及びHyflo Super Cel Celite ５４５(１２０ｇ)を加え、混合物を３０分間撹拌した。混合物を濾過し、固形物をジクロロメタン(１Ｌ)で洗浄した。組み合わせた濾液及び洗浄物を真空蒸発させ、残留物を２-プロパノール(９００ｍＬ)から再結晶させた。これにより７３ｇ(２７．８％)のヘキサデカン二酸モノベンジルエステルを得た。１Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)：δ＝１．２３(１８Ｈ，ｓ)，１．５０(４Ｈ，ｍ)，２．１８(２Ｈ，ｔ)，２．３４(２Ｈ，ｔ)，５．０８(２Ｈ，ｓ)，７．３６(５Ｈ，ｍ)，１２．０(１Ｈ，ｂｓ)。
【００７９】
ヘキサデカン二酸モノベンジルエステル(７１ｇ，０．１８８ｍｏｌ)を酢酸エチル(１Ｌ)中に懸濁させ、Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルエチルアミン(３４ｇ，０．２６ｍｏｌ)，Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(２８．１ｇ，０．２４ｍｏｌ)，及び１-エチル-３-(３'-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(４６．８ｇ，０．２４ｍｏｌ)を連続して加え、混合物を室温で５日間撹拌した。混合物を酢酸エチル(６００ｍＬ)に加え、水性硫酸水素カリウム(０．５Ｍ，１Ｌ)で洗浄した。飽和塩化ナトリウム水溶液(７００ｍＬ)を加え、相を分離させた。有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(１Ｌ)と飽和塩化ナトリウム水溶液(８００  ｍＬ)で連続して洗浄した。有機相を乾燥(ＭｇＳＯ４)させ、真空蒸発させて、８９．９ｇの粗物質を得た。これをヘプタン(３．５Ｌ)から再結晶させて、７７．４(８７％)のヘキサデカン二酸ベンジルエステルＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステルを得た。１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)：１．２３(１８Ｈ，ｍ)，１．３４(２Ｈ，ｍ)，１．５３(２Ｈ，ｍ)，１．６１(２Ｈ，ｍ)，２．３４(２Ｈ，ｔ)，２．６４(２Ｈ，ｔ)，２．８０(４Ｈ，ｓ)，５．０８(２Ｈ，ｓ)，７．３５(５Ｈ，ｍ)。
【００８０】
Ｌ−グルタミン酸α−ベンジルエステル(Ｈ−Ｇｌｕ−ＯＢｚｌ，４０．１ｇ，０．１７ｍｏｌ)をＮ−メチル２−ピロリジノン(１  Ｌ)に懸濁させた。トリエチルアミン(２８ｍＬ，０．２ｍｏｌ)とヘキサデカン二酸ベンジルエステルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(７６．３ｇ，０．１６ｍｏｌ)を加え、混合物を５０℃で２．５時間撹拌した。混合物を酢酸エチル(８００ｍＬ)に加え、冷却しながら(２２℃以下の内部温度)硫酸水素カリウム水溶液(０．５Ｍ，８００ｍＬ)を少しずつ加えた。水性相を酢酸エチル(４００ｍＬ)で抽出した。組み合わせた有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液(３ｘ６００ｍＬ)で洗浄し、乾燥させ(ＭｇＳＯ４)、真空濃縮して１０８．７ｇ(１１３％)のベンジルヘキサデカンジオイル-Ｌ-Ｇｌｕ-ＯＢｚｌを、ＮＭＲで見て幾らかのＮ-メチル２-ピロリジノン及び酢酸エチルを含んでいる油として得た。１Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)，選択ピーク：δ＝１．２２(２０Ｈ，ｓ)，５．０８(２Ｈ，ｓ)，５．１１(２Ｈ，ｓ)，７．３５(１ｏＨ，ｍ)，８．２０(１Ｈ，ｄ)，１２．２(１Ｈ，ｂｓ)。
【００８１】
ベンジルヘキサデカンジオイル-Ｌ-Ｇｌｕ-ＯＢｚｌ(１０７ｇ，０．１６ｍｍｏｌ)を酢酸エチル(１．１Ｌ)に溶解させ、Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルエチルアミン(３５ｍＬ，０．２１ｍｏｌ)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(２１．８ｇ，０．１９ｍｏｌ)，及び１-エチル-３-(３'-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(３９．３ｇ，０．２１ｍｏｌ)を連続して加え、混合物を室温で１６時間撹拌した。混合物を酢酸エチル(５００ｍＬ)に加え、硫酸水素カリウム水溶液(０．５Ｍ，０．７５Ｌ)で洗浄した。飽和塩化ナトリウム水溶液(４５０ｍＬ)を加え、相を分離させた。有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(４５０ｍＬ)と飽和塩化ナトリウム水溶液(２ｘ４５０ｍＬ)で連続して洗浄した。有機相を乾燥(ＭｇＳＯ４)させ、約５００ｍＬまで真空濃縮した。残留物にヘプタン(４００ｍＬ)を加え、混合物を室温で１６時間撹拌した。更にヘプタンを加え(８００ｍＬ)、混合物を濾過し、固形物を、酢酸エチルとヘプタンの混合物(１：３，５０ｍＬ)で洗浄し、乾燥させて、９７．６ｇ(二工程で８９％)のベンジルヘキサデカンジオイル-Ｌ-Ｇｌｕ(ＯＳｕ)-ＯＢｚｌを得た。１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)：δ＝１．２２(２０Ｈ，ｓ)，１．４７−１．５４(４Ｈ，ｍ)，２．０９(１Ｈ，ｍ)，２．１１(３Ｈ，ｍ)，２．３３(２Ｈ，ｔ)，２．７−２．８(２Ｈ，ｍ)，２．８１(４Ｈ，ｓ)，４．３７(１Ｈ，ｍ)，５．０８(２Ｈ，ｓ)，５．１２(２Ｈ，ｓ)，７．３５(１０Ｈ，ｍ)，８．２７(１Ｈ，ｄ)。
【００８２】
ベンジルヘキサデカンジオイル-Ｌ-Ｇｌｕ(ＯＳｕ)-ＯＢｚｌ(９９ｇ，０．１４ｍｏｌ)を、トリフルオロ酢酸(０．１％)を含むアセトン(１．９Ｌ)に溶解させた。装置に窒素ガスとカーボンブラック上のパラジウム(１０％，ドライ，１９．８ｇ)を流した。混合物を室温及び大気圧下で水素化した(水素消費：６．９Ｌ)。窒素下で、混合物を濾過し、濾液をヘプタン(３Ｌ)に加え、０−５℃まで冷却した。混合物を濾過し固形物をヘプタン(３ｘ２００ｍＬ)で洗浄し、乾燥させて、６９．５ｇ(９８％)のヘキサデカンジオイル-Ｌ-Ｇｌｕ(ＯＳｕ)-ＯＨを得た。１Ｈ-ＮＭＲ(アセトン-ｄ６,トリフルオロ酢酸含有)，選択ピーク：δ＝１．２９(２０Ｈ，ｓ)，１．４−１．６(４Ｈ，ｍ)，２．８８(４Ｈ，ｓ)，４．６１(１Ｈ，ｍ)，７．５２(２Ｈ，ｍ)。
【００８３】
本発明の単鎖インスリンのアシル化のための一般的手順
一般的手順(Ａ)
単鎖インスリン(０．０１３ｍｍｏｌ)を炭酸ナトリウム水溶液(１００ｍＭ，３．５ｍＬ)に溶解させ、Ｎ-メチル２-ピロリジノン(１ｍＬ)及びテトラヒドロフラン(０．５ｍＬ)の混合物に溶解させたヘキサデカンジオイル-Ｌ-Ｇｌｕ(ＯＳｕ)-ＯＨ(１６ｍｇ，０．０３２ｍｍｏｌ)に加えた。水酸化ナトリウム水溶液(１Ｎ)を加えてｐＨ１１にし、得られた混合物を室温に４５分間維持した。Ｎ-メチル２-ピロリジノン(１ｍＬ)及びテトラヒドロフラン(０．５ｍＬ)の混合物に溶解させたヘキサデカンジオイル-Ｌ-Ｇｌｕ(ＯＳｕ)-ＯＨ(１６ｍｇ，０．０３２ｍｍｏｌ)を更に加え、得られた混合物を室温に１時間維持した。ｐＨを塩酸(１Ｎ)で５．６に調節し、混合物を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、デカントさせた。上に示されたようにアニオン交換クロマトグラフィー及び／又は分取ＨＰＬＣによる精製と続く凍結乾燥によって本発明のアシル化化合物を得た。
【００８４】
一般的手順(Ｂ)
あるいは、アシル化は、二本鎖インスリンに対してＷＯ２００５０１２３４７に記載されたものと同様にして、関連したtert-ブチル保護試薬を使用し、ついで中間に保護されたアシル化単鎖インスリンのＴＦＡ媒介脱保護で実施することができる。
【００８５】
一般的手順(Ｃ)
単鎖インスリン(０．０１６ｍｍｏｌ)を炭酸ナトリウム水溶液(１００ｍＭ，２．２ｍＬ)に溶解させ、アセトニトリル(１ｍＬ)及びテトラヒドロフラン(０．６ｍＬ)の混合物中のミリスチン酸Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル(７．６ｍｇ，２３ｍｍｏｌ)の溶液に添加した。得られた混合物を室温で４０分維持した。必要ならば、更にミリスチン酸Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル(アセトニトリル(１ｍＬ)及びテトラヒドロフラン(０．６ｍＬ)の混合物中に３．８ｍｇ)を加える。得られた混合物を室温で６０分間維持する。混合物を水で希釈し凍結乾燥させる。上に示されたようにアニオン交換クロマトグラフィー及び／又は分取ＨＰＬＣよる精製とその後の凍結乾燥により本発明のアシル化化合物が得られる。
【００８６】
組換え法
全ての発現プラスミドは、ＥＰ１７１１４２に記載されたものと同様のＣ-ＰＯＴタイプであり、これは、プラスミド選択とサッカロミセス・セレビシエ中の安定化のためにシゾサッカロミセス・ポンベ・トリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝子(ＰＯＴ)を含むことを特徴としている。該プラスミドはまたサッカロミセス・セレビシエ・トリオースホスフェートイソメラーゼプロモーター及びターミネーターを含む。これらの配列は、リーダーとインスリン産物の融合タンパク質をコードするＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片の配列を除く全ての配列が、プラスミドｐＫＦＮ１００３中の対応する配列(ＷＯ９０／１０００７５に記載)に同様である。異なった融合タンパク質を発現させるために、ｐＫＦＮ１００３のＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩ断片を、対照のリーダー−インスリン融合体をコードするＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩ断片によって単に置き換える。かかるＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩ断片は、標準的な技術による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲを使用して合成することができる。
酵母形質転換体は宿主株サッカロミセス・セレビシエ株ＭＴ６６３(MATa/MATa pep4-3/pep4-3 HIS4/his4 tpi::LEU2/tpi::LEU2 Cir+)の形質転換によって調製した。酵母株ＭＴ６６３はＷＯ９２／１１３７８の出願に関連してDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託し、寄託番号ＤＳＭ６２７８が与えられている。
【００８７】
ＭＴ６６３は、６００ｎｍで０．６のＯ．Ｄ．までＹＰＧａＬ(１％Ｂａｃｔｏ酵母抽出物，２％Ｂａｃｔｏペプトン，２％ガラクトース，１％ラクテート)で増殖させた。１００ｍｌの培養物を遠心分離により収集し、１０ｍｌの水で洗浄し、再遠心分離し、１．２Ｍソルビトール，２５ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ ｐＨ＝８．０及び６．７ｍｇ／ｍｌのジチオトレイトールを含む１０ｍｌの溶液中に再懸濁させた。懸濁液を３０℃で１５分間インキュベートし、遠心分離し、細胞を、１．２Ｍのソルビトール，１０ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ，０．１Ｍクエン酸ナトリウム，ｐＨ０  ５．８，及び２ｍｇ  ＮｏｖｏｚｙｍＲ２３４を含む１０ｍｌの溶液に再懸濁させた。懸濁液を３０℃で３０分間インキュベートし、細胞を遠心分離によって収集し、１０ｍｌの１．２Ｍソルビトール及び１０ｍｌのＣＡＳ(１．２Ｍソルビトール，１０ｍＭ  ＣａＣｌ２，１０ｍＭ  トリスＨＣｌ(トリス＝トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)ｐＨ＝７．５)で洗浄し、２ｍｌのＣＡＳに再懸濁させた。形質転換のために、１ｍｌのＣＡＳ懸濁細胞を約０１ｍｇのプラスミドＤＮＡと混合し、室温に１５分間置いた。１ｍｌの(２０％ポリエチレングリコール４０００，１０ｍＭ ＣａＣｌ２，１０ｍＭ トリスＨＣｌ，ｐＨ＝７．５)を加え、混合物を更に３０分間室温に置いた。混合物を遠心分離し、ペレットを０．１ｍｌのＳＯＳ(１．２Ｍソルビトール，３３％ｖ／ｖ ＹＰＤ，６．７ｍＭ ＣａＣｌ２)に再懸濁し、３０℃で２時間インキュベートした。ついで、懸濁液を遠心分離し、ペレットを  ０．５ｍｌの１．２Ｍソルビトールに再懸濁させた。ついで、１．２Ｍソルビトールと２．５％の寒天を含む５２℃の６ｍｌのトップアガー(Sherman等(1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor LaboratoryのＳＣ培地)を加え、懸濁液を、同じ寒天固化ソルビトール含有培地を含むプレートの上に注いだ。発現プラスミドで形質転換されたサッカロミセス・セレビシエ株ＭＴ６６３を３０℃でＹＰＤ中で７２時間増殖させた。
【００８８】
実施例１、一般的手順(Ｃ)
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ((ｅｐｓ)ミリストイル)-Ｂ２９Ａ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)-Ａ１８Ｑヒトインスリン
2009530242.tif 000004
配列番号３
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ：(ＳＡ)；ｍ／ｚ：６４５７．計算値：６４５７。
ＨＰＬＣ(方法１)：Ｒｔ＝１２．７２分，９３．８％純度
ＨＰＬＣ(方法４)：Ｒｔ＝１５．４５分，９６．３％純度
アッセイ(Ｉ)に従って測定したインスリンレセプター結合性はヒトインスリンのものの４６％であった。
【００８９】
実施例２、一般的手順(Ｂ)
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)オクタデカンジオイル)-Ｂ２９Ａ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)-Ａ１８Ｑヒトインスリン
2009530242.tif 000005
配列番号３
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ：(マトリックス：ＳＡ)；ｍ／ｚ：６５４２．計算値：６５４３。
ＨＰＬＣ(方法１)：Ｒｔ＝１１．４５分，１００％純度
ＨＰＬＣ(方法４)：Ｒｔ＝１５．１３分
アッセイ(Ｉ)に従って測定したインスリンレセプター結合性はヒトインスリンのものの１６％であった。
【００９０】
実施例３、一般的手順(Ａ)
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ヘキサデナンジオイル-ｇＧｌｕ)-Ｂ２９Ａ-ＶＧＬＳＳＧＱ-Ａ(１-２１)-Ａ１８Ｑヒトインスリン
2009530242.tif 000006
配列番号３
ＨＰＬＣ(方法１)：Ｒｔ＝１０．９５分，９９．７％純度
ＨＰＬＣ(方法３)：Ｒｔ＝９．９４分，１００％純度
ＨＰＬＣ(方法６)：Ｒｔ＝４．４４分，ｍ／ｚ＝１６６１(Ｍ＋４)／４。計算値：１６６１。
アッセイ(Ｉ)に従って測定したインスリンレセプター結合性はヒトインスリンのものの６４％であった。
【００９１】
実施例４、一般的手順(Ａ)
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ((ｅｐｓ)ヘキサデカンジオイル-ｇＧｌｕ)-Ｂ２９Ｈ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)-Ａ１８Ｑ-Ａ２１Ｇヒトインスリン
2009530242.tif 000007
配列番号４
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ(マトリックス：ＳＡ)；ｍ／ｚ：６６５１；計算値：６６５３
ＨＰＬＣ(方法１)：Ｒｔ＝１０．１７分，９９．２％純度
ＨＰＬＣ(方法５)：Ｒｔ＝６．６７分
アッセイ(Ｉ)に従って測定したインスリンレセプター結合性はヒトインスリンのものの４６％であった。
【００９２】
実施例５、一般的手順(Ａ)
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ((ｅｐｓ)ヘキサデカンジオイル-ｇＧｌｕ)-Ｂ２９Ｑ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)-Ａ１８Ｑ-Ａ２１Ｇヒトインスリン
2009530242.tif 000008
配列番号５
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ(マトリックス：ＳＡ)；ｍ／ｚ：６６４０；計算値：６６４４
ＨＰＬＣ(方法１)：Ｒｔ＝１０．２８分，９７．６％純度
ＨＰＬＣ(方法５)：Ｒｔ＝６．９９分，１００％純度
アッセイ(Ｉ)に従って測定したインスリンレセプター結合性はヒトインスリンのものの１５４％であった。
【００９３】
実施例６、一般的手順(Ｂ)
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ヘキサデカンジオイル-ｇ-Ｌ-Ｇｌｕ-アミド)-Ｂ２９Ｈ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)-Ａ１８Ｑ-Ａ２１Ｇヒトインスリン
2009530242.tif 000009
配列番号４
ＨＰＬＣ(方法５)：Ｒｔ＝９．５１分，７９．２純度
ＬＣ-法(ｌｏｎｇ)：Ｒｔ＝８．５６分，ｍ／ｚ：１６６３(ｚ＝４)
アッセイ(Ｉ)に従って測定したインスリンレセプター結合性はヒトインスリンのものの１０５％であった。
【００９４】
実施例７、一般的手順(Ｂ)
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ヘプタデカンジオイル)-Ｂ２９Ｈ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)-Ａ１８Ｑ-Ａ２１Ｇヒトインスリン
2009530242.tif 000010
配列番号４
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ(マトリックス：ＳＡ)；ｍ／ｚ：６５３６．６；計算値：６５３７．６
ＨＰＬＣ(方法１)：Ｒｔ＝１０．９７分，９９．２％純度
ＨＰＬＣ(方法５)：Ｒｔ＝１０．４１分，１００％純度
アッセイ(Ｉ)に従って測定したインスリンレセプター結合性はヒトインスリンのものの１１９％であった。
【００９５】
実施例８、一般的手順(Ｂ)
Ｂ(１-２９)-Ｂ２２Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)ヘプタデカンジオイル-ｇ-Ｌ-Ｇｌｕ)-Ｂ２９Ｈ-ＴＧＬＧＳＧＲ-Ａ(１-２１)-Ａ１８Ｑ-Ａ２１Ｇヒトインスリン
2009530242.tif 000011
配列番号４
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ(マトリックス：ＳＡ)；ｍ／ｚ：６６６６．１；計算値：６６６６．７
ＨＰＬＣ(方法１)：Ｒｔ＝１０．５１分
ＨＰＬＣ(方法５)：Ｒｔ＝７．５１分，１００％純度
アッセイ(Ｉ)に従って測定したインスリンレセプター結合性はヒトインスリンのものの５３％であった。
【００９６】
薬理学的方法
アッセイ(Ｉ)
アシル化単鎖インスリンのインスリンレセプター結合性
ヒトインスリンレセプターに対するアシル化単鎖インスリン体の親和性は、ＳＰＡアッセイ(シンチレーション近接アッセイ)マイクロタイタープレート抗体捕捉アッセイにより測定され得る。ＳＰＡ-ＰＶＴ抗体-結合ビーズ、抗マウス試薬(Amersham Biosciences、カタログ番号 PRNQ0017)を、２５ｍｌの結合バッファー(１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８；１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、０．０２５％のトゥイーン(Tween)-２０)と混合する。単一のPackard Optiplate(Packard No.6005190)用の試薬混合物は、２．４μｌの１：１５０００に希釈された精製組換えヒトインスリンレセプター-エクソン１１、１００μｌの試薬混合物当たり５００ｃｐｍに相当するＡ１４Ｔｙｒ[１２５Ｉ]-ヒトインスリンの所定量の保存溶液、１２μｌの１：１０００に希釈されたＦ１２抗体、３ｍｌのＳＰＡ-ビーズ、全体を１２ｍｌにする結合バッファーからなる。ついで、全体で１００μｌを添加し、希釈群を適切なサンプルから作製する。ついで、希釈群に１００μｌの試薬混合物を加え、ゆっくりと振盪させつつ、サンプルを１６時間インキュベートする。ついで、１分間遠心分離することにより相分離させ、プレートをトップカウンターで計測する。GraphPad Prism 2.01(GraphPad Software, San Diego、CA)における非線状回帰アルゴリズムを使用し、結合データを適合させる。
【００９７】
アッセイ(ＩＩ)
ヒトインスリンに対するアシル化単鎖インスリンの有効性
静脈内ボーラス投与でＳＣＩの血糖値低下効果を試験するためにウィスターラットを使用する。ＳＣＩかヒトインスリンの投与後に、血糖濃度をモニターする。
【００９８】
アッセイ(ＩＩＩ)
アシル化単鎖インスリンのＴ５０％のブタにおける定量
Ｔ５０％は、試験されるインスリンのＡ１４Ｔｙｒ[１２５Ｉ]標識された誘導体の注射量の５０％が、外部γ計測器を用いて測定して、注射部位から消失した時間である。
実験用動物ケアの原則に従った。薬物動態及び薬力学的研究のために、特定の病原菌を持たないＬＹＹＤ、糖尿病ではない雌のブタ、デンマーク在来種、ヨークシャー及びデュロックの交雑種を使用した(Holmenlund, Haarloev, Denmark)。ブタは意識があり、４−５ヶ月の年齢、７０−９５ｋｇの体重であった。実験前に動物を８時間絶食させた。
１２５Ｉを有するＴｙｒＡ１４で標識されたインスリン誘導体の処方された調製物を、先に記載したブタに皮下注射した(Ribel, U.,  Jorgensen, K, Brange, J、及びHenriksen, U. The pig as a model for subcutaneous insulin absorption in man. Serrano-Rios, M and Lefebvre, P. J.  891-896. 1985. Amsterdam; New York; Oxford, Elsevier Science Publishers. 1985 (Conference Proceeding))。
【００９９】
実験の開始時に、本発明のインスリン誘導体(被験化合物)６０ｎｍｏｌ用量とインスリンデテミール６０ｎｍｏｌ用量(双方ともＴｙｒ Ａ１４において１２５Ｉ標識された)を、各ブタの頸部の２つの別々の部位に注射した。
皮下注射部位から放射性標識が消失するのを、伝統的な外部ガンマ-計測法の修正法を使用し、モニターした(Ribel, U. Subcutaneous absorption of insulin analogues. Berger, M. 及びGries, F. A. 70-77 (1993). Stuttgart; New York, Georg Thime Verlag (Conference Proceeding))。この修正法を用いると、コードレスポータブル装置を使用して、数日間、皮下沈着物から放射活性が消失するのを、連続して測定することができる(Scancys Laboratorieteknik, Varlose, DK-3500, Denmark)。測定を１分間隔で実施し、計測された値をバックグラウンド活性に対して修正した。
【０１００】
アッセイ(ＩＶ)
ラットへのインスリン誘導体の肺送達
被験物質は、滴下法により肺経路で投与されるであろう。簡単に述べると、雄ウィスターラット(約２５０ｇ)を、６．６ｍｌ／ｋｇの皮下プライミング用量として、続いて３０分の間隔を開けて３．３ｍｌ／ｋｇの保持用量を３回付与する約６０ｍｌのフェンタニル／デヒドロデンズペリドール／-ドルミカムで麻酔した。麻酔誘導の１０分後、基本サンプルを尾静脈(ｔ＝−２０分)から得、続いて被験物質の投与直前(ｔ＝０)、基本サンプルを得た。ｔ＝０において、被験物質を一方の肺に気管内的に投与した。丸くなった端部を有する特定のカニューレを、２００μｌの空気と被験物質(１ｍｇ／ｋｇ)を含有するシリンジに搭載する。オリフィスを介してカニューレを気管に導入し、二分枝部を丁度通過するように主気管支の一方に送る。挿入中、頸部を外側から触診し、気管内部の位置を確認する。シリンジの内容物を注射し、２秒中断する。その後、カニューレをゆっくりと引き抜く。試験中(４時間までの血液サンプル)、ラットは麻酔がかかったままであり、実験後、安楽死させる。
【配列表】
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【国際調査報告】
2009530242.tif 000015
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