(57)【要約】  本発明は、少なくとも一つの表面コーティング及び一つの核を含み、上記一つの表面コーティングは架橋ポリマーを含んでおり、上記一つの核は架橋ポリマー及びＧＬＰ−１ペプチド、そのフラグメント若しくは変異又はＧＬＰ−１ペプチドを含む融合ペプチド、そのフラグメント若しくは変異を発現及び分泌する、球状のマイクロカプセルを提供する。本出願はさらにこれらの球状のマイクロカプセルを製造する方法、並びに、例えば、タイプ２の糖尿病、体重疾患及び病気若しくはこれらに関連する症状、神経変性の疾患及び病気若しくはこれらに関連する症状の処置、又はアポトーシスに関連する疾患及び病気若しくは症状の処置への使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの表面コーティング、及び核を含み、
上記少なくとも一つの表面コーティングは架橋ポリマーを含み、
上記核は、架橋ポリマー、並びにＧＬＰ−１ペプチド、そのペプチドのフラグメント若しくは変異、又はＧＬＰ−１を含む融合ペプチド若しくはそのフラグメント若しくは変異
の発現及び分泌が可能な細胞を含む、球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項２】
上記核及び／又は上記少なくとも一つの表面コーティングの架橋ポリマーがバイオポリマーを含む、請求項１に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項３】
上記核及び／又は上記少なくとも一つの表面コーティングの架橋ポリマーがアルギナートを含む、請求項１又は２に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項４】
上記核及び／又は上記少なくとも一つの表面コーティングの架橋ポリマーが、化学的に同質のポリマーを、同じ又は異なる濃度にて含み、当該ポリマーは様々な分子量であってもよく、及び／又は、それぞれ架橋されていてもよい、請求項１〜３のいずれか１項に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項５】
上記核が約２０〜約２０００μｍの直径を有し、上記少なくとも一つの表面コーティングが約１０〜約２０００μｍの厚さを有している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項６】
上記マイクロカプセルが１、２、３、４、５、５〜１０又はそれ以上の表面コーティングを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項７】
上記マイクロカプセルが、ポリカチオンからなる付加的な外側の表面コーティングを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項８】
上記付加的な外側の表面コーティングがポリ−Ｌ−リジンからなる、請求項７に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項９】
上記ＧＬＰ−１ペプチドがＧＬＰ−１のａａ７−３５を含むペプチド及びこのペプチドとの相同性が少なくとも８０％を示すペプチドからなる群より選ばれるものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項１０】
上記ＧＬＰ−１ペプチドが、ＧＬＰ−１のａａ１−３５を含むペプチド、ＧＬＰ−１のａａ７−３５を含むペプチド、ＧＬＰ−１のａａ７−３６を含むペプチド、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド、化学式ＩＩ
Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７
ここで、Ｘａａ７は、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、３−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−アセチル−ヒスチジン、ａ−フルオロメチル−ヒスチジン、ａ−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン又は４−ピリジルアラニンであり、Ｘａａ８は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロブチル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボキシル酸、又は（１−アミノシクロオクチル）カルボキシル酸であって、Ｇｌｙが特に好ましく；Ｘａａ１６はＶａｌ又はＬｅｕであり；Ｘａａ１８はＳｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ１９はＴｙｒ又はＧｌｎであり；Ｘａａ２０はＬｅｕ又はＭｅｔであり；Ｘａａ２２はＧｌｙ、Ｇｌｕ又はＡｉｂであり；Ｘａａ２３はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２５はＡｌａ又はＶａｌであり；Ｘａａ２６はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２７はＧｌｕ又はＬｅｕ；Ｘａａ３０はＡｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３３はＶａｌ又はＬｙｓであり；Ｘａａ３４はＬｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＡｒｇ；Ｘａａ３５はＧｌｙ又はＡｉｂであり；Ｘａａ３６はＡｒｇ、Ｇｌｙ若しくはＬｙｓ若しくはアミド又は欠損しており；Ｘａａ３７はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、アミド又は欠損している、
に示される配列を含むペプチド、化学式ＩＩＩ
Ｘａａ７‐Ｘａａ８‐Ｇｌｕ‐Ｇｌｙ‐Ｔｈｒ‐Ｐｈｅ‐Ｔｈｒ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｐ‐Ｖａｌ‐Ｓｅｒ‐Ｘａａ８‐Ｔｙｒ‐Ｌｅｕ‐Ｇｌｕ‐Ｘａａ２２‐Ｘａａ２３‐Ａｌａ‐Ａｌａ‐Ｘａａ２６‐Ｇｌｕ‐Ｐｈｅ‐ｌｌｅ‐Ｘａａ３０‐Ｔｒｐ‐Ｌｅｕ‐Ｖａｌ‐Ｘａａ３４‐Ｘａａ３５‐Ｘａａ３６‐Ｘａａ３７
ここで、Ｘａａ７は、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−アセチル−ヒスチジン、ａ−フルオロメチル−ヒスチジン、ａ−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン又は４−ピリジルアラニンであり；Ｘａａ８はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロブチル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボキシル酸、又は（１−アミノシクロオクチル）カルボキシル酸であり；Ｘａａ１８はＳｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２２はＧｌｙ、Ｇｌｕ又はＡｉｂ；Ｘａａ２３はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２６はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３０はＡｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり;Ｘａａ３４はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３５はＧｌｙ又はＡｉｂであり；Ｘａａ３６はＡｒｇ又はＬｙｓ、アミド又は欠損しており；Ｘａａ３７はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓ、アミド又は欠損している、
に示される配列を含むペプチド、及び、これらのいずれかのペプチドと少なくとも８０％以上の相同性を示すペプチドである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項１１】
上記ＧＬＰ−１を含む融合ペプチド若しくはそのフラグメント若しくは変異が、
成分（Ｉ）として、Ｎ末端に、ＧＬＰ−１（７−３５、７−３６又は７−３７）配列、化学式ＩＩ
Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７
ここで、Ｘａａ７は、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、３−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−アセチル−ヒスチジン、ａ−フルオロメチル−ヒスチジン、ａ−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン又は４−ピリジルアラニンであり、Ｘａａ８は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロブチル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボキシル酸、又は（１−アミノシクロオクチル）カルボキシル酸であって、Ｇｌｙが特に好ましく；Ｘａａ１６はＶａｌ又はＬｅｕであり；Ｘａａ１８はＳｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ１９はＴｙｒ又はＧｌｎであり；Ｘａａ２０はＬｅｕ又はＭｅｔであり；Ｘａａ２２はＧｌｙ、Ｇｌｕ又はＡｉｂであり；Ｘａａ２３はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２５はＡｌａ又はＶａｌであり；Ｘａａ２６はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２７はＧｌｕ又はＬｅｕ；Ｘａａ３０はＡｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３３はＶａｌ又はＬｙｓであり；Ｘａａ３４はＬｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＡｒｇ；Ｘａａ３５はＧｌｙ又はＡｉｂであり；Ｘａａ３６はＡｒｇ、Ｇｌｙ若しくはＬｙｓ若しくはアミド又は欠損しており；Ｘａａ３７はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、アミド又は欠損している、
に示される配列を含むペプチド、及び化学式ＩＩＩ
Ｘａａ７‐Ｘａａ８‐Ｇｌｕ‐Ｇｌｙ‐Ｔｈｒ‐Ｐｈｅ‐Ｔｈｒ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｐ‐Ｖａｌ‐Ｓｅｒ‐Ｘａａ８‐Ｔｙｒ‐Ｌｅｕ‐Ｇｌｕ‐Ｘａａ２２‐Ｘａａ２３‐Ａｌａ‐Ａｌａ‐Ｘａａ２６‐Ｇｌｕ‐Ｐｈｅ‐ｌｌｅ‐Ｘａａ３０‐Ｔｒｐ‐Ｌｅｕ‐Ｖａｌ‐Ｘａａ３４‐Ｘａａ３５‐Ｘａａ３６‐Ｘａａ３７
ここで、Ｘａａ７は、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−アセチル−ヒスチジン、ａ−フルオロメチル−ヒスチジン、ａ−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン又は４−ピリジルアラニンであり；Ｘａａ８はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロブチル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボキシル酸、又は（１−アミノシクロオクチル）カルボキシル酸であり；Ｘａａ１８はＳｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２２はＧｌｙ、Ｇｌｕ又はＡｉｂ；Ｘａａ２３はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２６はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３０はＡｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり;Ｘａａ３４はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３５はＧｌｙ又はＡｉｂであり；Ｘａａ３６はＡｒｇ又はＬｙｓ、アミド又は欠損しており；Ｘａａ３７はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓ、アミド又は欠損している、
に示される配列を含むペプチド、
成分（ＩＩ）として、Ｃ末端に、少なくとも９個のアミノ酸の配列のペプチド若しくは機能的フラグメント又はそれらの変異
を含む融合ペプチドからなる群より選ばれるものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項１２】
上記融合ペプチドの成分（Ｉ）が配列番号１と少なくとも８０％以上の相同性を有する配列を包含する、請求項１１に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項１３】
成分（ＩＩ）が、配列番号２２（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩ）に示される配列、又は配列番号２２と少なくとも８０％以上の相同性を有する配列を包含する、請求項１１又は１２に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項１４】
成分（ＩＩ）が、配列番号２３（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬ）若しくは配列番号２４（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬ）に示される配列又は配列番号２３若しくは配列番号２４と少なくとも８０％以上の相同性を有する配列を包含する、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項１５】
成分（ＩＩ）が、配列番号２（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧ）若しくは配列番号３（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧ）に示される配列又は配列番号２若しくは配列番号３と少なくとも８０％以上の相同性を有する配列を包含する、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項１６】
成分（Ｉ）及び成分（ＩＩ）が直接に連結している又はリンカー配列を介して連結している、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項１７】
上記リンカー配列がアミノ酸１〜１０の長さを有する、請求項１６に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項１８】
上記融合ペプチドが、配列番号８（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧ）若しくは配列番号１２（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧ）に示される配列又は配列番号８若しくは１２と少なくとも８０％以上の相同性を有する配列を包含する、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項１９】
上記融合ペプチドが、成分（ＩＩ）の代わりに又は付加的に成分（ＩＩＩ）を包含し、成分（ＩＩＩ）が、成分（Ｉ）及び（ＩＩＩ）が上記融合ペプチド内に存在する場合、成分（Ｉ）のＣ末端及び／又は成分（Ｉ）のＮ末端に連結していてもよく、成分（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）が上記融合ペプチド内に存在する場合、成分（ＩＩＩ）が成分（ＩＩ）のＣ末端及び／又は成分（Ｉ）のＮ末端と連結していてもよい、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項２０】
成分（ＩＩＩ）が少なくとも４個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも１０個の付加的なアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも２０個又は３０個を含む、請求項１９に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項２１】
成分（ＩＩＩ）が、プログルカゴン中のＧＬＰ−２のＮ末端配列、ＧＬＰ−１（５−３７、６−３７又は７−３７）、化学式ＩＩ
Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７
ここで、Ｘａａ７は、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、３−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−アセチル−ヒスチジン、ａ−フルオロメチル−ヒスチジン、ａ−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン又は４−ピリジルアラニンであり、Ｘａａ８は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロブチル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボキシル酸、又は（１−アミノシクロオクチル）カルボキシル酸であって、Ｇｌｙが特に好ましく；Ｘａａ１６はＶａｌ又はＬｅｕであり；Ｘａａ１８はＳｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ１９はＴｙｒ又はＧｌｎであり；Ｘａａ２０はＬｅｕ又はＭｅｔであり；Ｘａａ２２はＧｌｙ、Ｇｌｕ又はＡｉｂであり；Ｘａａ２３はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２５はＡｌａ又はＶａｌであり；Ｘａａ２６はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２７はＧｌｕ又はＬｅｕ；Ｘａａ３０はＡｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３３はＶａｌ又はＬｙｓであり；Ｘａａ３４はＬｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＡｒｇ；Ｘａａ３５はＧｌｙ又はＡｉｂであり；Ｘａａ３６はＡｒｇ、Ｇｌｙ若しくはＬｙｓ若しくはアミド又は欠損しており；Ｘａａ３７はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、アミド又は欠損している、
に示される配列を有するペプチド、又は化学式ＩＩＩ
Ｘａａ７‐Ｘａａ８‐Ｇｌｕ‐Ｇｌｙ‐Ｔｈｒ‐Ｐｈｅ‐Ｔｈｒ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｐ‐Ｖａｌ‐Ｓｅｒ‐Ｘａａ８‐Ｔｙｒ‐Ｌｅｕ‐Ｇｌｕ‐Ｘａａ２２‐Ｘａａ２３‐Ａｌａ‐Ａｌａ‐Ｘａａ２６‐Ｇｌｕ‐Ｐｈｅ‐ｌｌｅ‐Ｘａａ３０‐Ｔｒｐ‐Ｌｅｕ‐Ｖａｌ‐Ｘａａ３４‐Ｘａａ３５‐Ｘａａ３６‐Ｘａａ３７
ここで、Ｘａａ７は、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−アセチル−ヒスチジン、ａ−フルオロメチル−ヒスチジン、ａ−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン又は４−ピリジルアラニンであり；Ｘａａ８はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロブチル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボキシル酸、又は（１−アミノシクロオクチル）カルボキシル酸であり；Ｘａａ１８はＳｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２２はＧｌｙ、Ｇｌｕ又はＡｉｂ；Ｘａａ２３はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２６はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３０はＡｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり;Ｘａａ３４はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３５はＧｌｙ又はＡｉｂであり；Ｘａａ３６はＡｒｇ又はＬｙｓ、アミド又は欠損しており；Ｘａａ３７はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓ、アミド又は欠損している、
に示される配列を有するペプチドの、少なくとも４個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも２０個の付加的なアミノ酸残基を含む、請求項１１〜２０のいずれか１項に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項２２】
成分（ＩＩＩ）が、配列番号４若しくは５に示される配列又は配列番号４若しくは配列番号５と少なくとも８０％以上の相同性を有する配列を包含する、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項２３】
上記融合ペプチドが、配列番号６、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号２６からなる群より選ばれるペプチド配列又は配列番号６、７、１０、１１若しくは２６と少なくとも８０％以上の相同性を有する配列を包含する、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項２４】
上記融合ペプチドが、運搬体タンパク、特にトランスフェリン又はアルブミンを成分（ＩＶ）として含む、請求項１１〜２３のいずれか１項に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項２５】
上記球状のマイクロカプセルの上記核内に包含される上記細胞が、ヒト間葉幹細胞、ヒト間葉幹細胞から分化した細胞、骨芽細胞を含むもの、軟骨細胞、脂肪細胞（含脂肪細胞）、又は脳細胞を含む神経様細胞から選ばれるものである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項２６】
上記球状のマイクロカプセルの上記核に包含される上記細胞が、ヒト間葉幹細胞、インビトロ又はインビボにおいて脂肪細胞（含脂肪細胞）中に分化した細胞であって、脂肪細胞への移植に適したものから（インビトロにて）選ばれるものである、請求項２５に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の球状又は非球状のマイクロカプセル及び薬学的に受容可能なキャリアを任意に含む薬学的組成物。
【請求項２８】
少なくとも一つの表面コーティング及び核を含む球状又は非球状のマイクロカプセルの製造方法であって、上記少なくとも一つの表面コーティングが架橋ポリマーを含み、上記核が、架橋ポリマー並びにＧＬＰ−１、そのフラグメント若しくは変異、又はＧＬＰ−１を含む融合ペプチド若しくはそのフラグメント若しくは変異を、発現及び分泌可能な生物学的細胞を含み、次の工程を含む方法：
（ａ）架橋ポリマー並びにＧＬＰ−１、そのフラグメント若しくは変異、又はＧＬＰ−１を含む融合ペプチド若しくはそのフラグメント若しくは変異を、発現及び分泌可能な生物学的細胞の調整；
（ｂ）架橋ポリマーを含む少なくとも一つの表面コーティングの調整。
【請求項２９】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の球状又は非球状のマイクロカプセルを製造するための請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
糖尿病タイプＩ又はタイプＩＩ、インスリン耐性、体重疾患及び病気、又はこれらに関連する症状を処置するための薬学的組成物を調製するための請求項１〜２６のいずれか１項に記載の球状又は非球状のマイクロカプセルの使用。
【請求項３１】
上記体重疾患又は関連する症状が、肥満、体重超過関連症状、満腹感による調節の欠如（ｓａｔｉｅｔｙ  ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、血漿インスリン濃度の減少、血中グルコース濃度の増加又は膵臓ベータ細胞塊の減少である、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
神経変性の疾患及び病気又はこれに関連する症状を処置するための薬学的組成物を調製するための請求項１〜２６のいずれか１項に記載の球状又は非球状のマイクロカプセルの使用。
【請求項３３】
上記神経変性の疾患及び病気又はこれに関連する症状が、アルツハイマー病（ＡＤ）、並びに、筋萎縮性側索硬化症、アレキサンダー病、アルパース病（Ａｌｐｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、毛細血管拡張性運動失調症、カナバン病、コケーン症候群、クロイツフェルト・ヤコブ病、多発性硬化症、サンドホフ病、ピック病、脊髄小脳失調症、シルダー病及びパーキンソン病、又は脳卒中、大脳内出血、くも膜下出血、副腎白質ジストロフィー（ｘ−ＡＬＤ）、又はその他の大脳白質萎縮症、他の主要な又は周辺の神経変性の症状からなる群より選ばれるものである、請求項３２の使用。
【請求項３４】
アポトーシスに関連する疾患及び病気又は症状を処置するための薬学的組成物を調製するための請求項１〜２６のいずれか１項に記載の球状又は非球状のマイクロカプセルの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、少なくとも一つの表面コーティング、及び核を含み、上記少なくとも一つの表面コーティングは架橋ポリマーを含み、上記核は、架橋ポリマー、並びにＧＬＰ−１ペプチド、そのペプチドのフラグメント若しくは変異、又はＧＬＰ−１を含む融合ペプチド若しくはそのフラグメント若しくは変異の発現及び分泌が可能な細胞を含む、球状のマイクロカプセルに関するものである。本発明はさらに、これらの球状のマイクロカプセルを製造する方法、並びに、これらのマイクロカプセルの使用であって、例えば、糖尿病タイプＩＩ、体重疾患及びそれに関連する病気若しくは症状、神経変性の疾患及びそれに関連する病気若しくは症状、又はアポトーシスに関連する疾患及び病気若しくは症状を処置するための使用を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
グルカゴン遺伝子はよく研究されている遺伝子である（例えば、非特許文献１を参照のこと）。高分子量の前駆体分子であるプレプログルカゴン分子は、膵臓α細胞並びに空腸及び大腸Ｌ細胞において合成される。プレプログルカゴンは、１８０アミノ酸長のプロホルモンであり、その配列は、グルカゴンに加えて、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）及びグルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）という、関連した構造の二つの配列を含んでいる。プレプログルカゴン分子では、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２の間に、１７アミノ酸のペプチド配列（より正確に言えば、１５アミノ酸の配列にＣ末端のＲＲ切断部位が付加したもの）の介在ペプチド２（ＩＰ２）がある。ＩＰ２の配列（上記前駆体分子において、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２の間に位置している）は、通常、ＧＬＰ−１の第３７番目のアミノ酸の後ろでタンパク質分解的に切断される。従って、プレプログルカゴン分子は、細胞及び環境に依存して、処理を受けていない形態の３７アミノ酸のペプチドであるＧＬＰ−１（１−３７）を含む、様々なペプチドに切断される。一般に、上記処理は、膵臓及び腸において行われる。ＧＬＰ−１（１−３７）の配列は、さらにタンパク質分解的に切断されて、処理された形態の３１アミノ酸である活性型ＧＬＰ−１（７−３７）、又はＧＬＰ−１（７−３６）アミドになり得る。即ち、ＧＬＰ−１（７−３７）という表示は、上記親ペプチドＧＬＰ−１のＮ末端から数えて第１番目から（第１番目を含む）第３７番目まで（第３７番目を含む）のアミノ酸残基からなる問題のフラグメントを意味する。ＧＬＰ−１（７−３６）アミド及びＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸配列は、下記式（Ｉ）により与えられる（配列番号２５）。
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｘ  （Ｉ）
上記式（Ｉ）は、ＸがＮＨ２のとき、ＧＬＰ−１（７−３６）アミドを示し、ＸがＧｌｙ−ＯＨのとき、ＧＬＰ−１（７−３７）を示す。
【０００３】
ＧＬＰ−１は、消化管ホルモンであり、β細胞においてアデニル酸シクラーゼ及びプロテインキナーゼの活性を促進する働きを有する、最も強力な内在性のインスリン分泌性因子である。生理的には、上部の腸からの胃抑制ポリペプチドとともに、血糖値を下げる内分泌ホルモンとして働く。即ち、ＧＬＰ−１は、食物の摂取に応じて分泌され、例えば、胃、肝臓、膵臓及び脳への複合的な効果を有しており、それらは一斉に血糖を調整する。その結果、グルカゴン様ペプチドＧＬＰ−１（７−３７）アミド及びそのアミド化されていない類似体であるＧＬＰ−１（７−３７）は、その炭水化物代謝への強力な作用及び糖尿病タイプＩＩを含む糖尿病の処置への適用可能性により、相当な注目を集めている。糖尿病タイプＩＩは、インスリンが存在していても細胞が適切な反応を示さないことから、インスリン抵抗性として特徴付けられている。このことは、糖尿病タイプＩよりも、より複雑な問題となる。糖尿病タイプＩＩは、その症状が典型的には軽症であり（ケトアシドーシス無し）、散発性であるために、診断されるまで、何年もの間、患者に認識されないことがある。しかし、認識されなかった糖尿病タイプＩＩは、腎不全及び冠状動脈性心臓病を含む深刻な合併症が発生し得る。これは、罹患率及び死亡率の増加を招く。
【０００４】
しかし、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド又はＧＬＰ−１（７−３７）は血中における寿命が短い。これらのペプチドは、ジペプチジル・ペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）によって第８番目の残基と第９番目の残基との間が切断され、不活性のペプチドとなる。そのため、外から投与されたＧＬＰ−１は、処置された患者の体内で非常に短命であり、治療のための適用におけるその生理学的な効果を発揮しない。
【０００５】
自然に存在するＧＬＰ−１（ＧＬＰ−１（７−３７））の類似体であって、（ＤＰＰ−ＩＶに対して）安定しているものを合成するための様々な試みが行われている。特に、生体ではＡｌａである第８番目の残基が、他の残基、例えばＧｌｙ、Ｓｅｒ又はＴｈｒに置き換えられた（非特許文献２）。Ｇｌｙ８又はＧ８類似体は、合成された分子として、又、変異ポリペプチドを分泌するように遺伝学的に改変された細胞株により製造されたものとして、頻繁に試験された（非特許文献３）。生物学的な活性を損なわずに生体における安定性を向上させることを目的として、様々な改変がＧＬＰ−１（７−３７）に導入されている。しかし、付随する問題のために、これらの手法はいかなる治療上の有効性も獲得していない。
【０００６】
さらに、これらの手法は、生体において長期間に渡ってＧＬＰ−１を供給するものではない。これは、上述したようなタンパク質分解的な分解、ＧＬＰ−１の代謝、及び体内で典型的に起きる通常のタンパク質の分解が原因である。従って、ＧＬＰ−１を必要とする患者は、長期間、悪ければ生涯に渡って、治療が必要な疾病を患っている間、短い間隔毎に、ＧＬＰ−１又はその類似体若しくは変異体の、一回又は複合回の投与を受けなくてはならない。そして、ＧＬＰ−１の投与は、医師又は患者本人の何れかによって行われる必要がある。この問題を回避するために、ＧＬＰ−１をエンコードし、発現する核酸を含んでいる細胞を患者に提供することによって、ＧＬＰ−１を投与することもできる。そのような細胞の移植は、生体における長期のＧＬＰ−１供給を確保し、移植された細胞からのＧＬＰ−１の分泌は、ＧＬＰ−１を目的の部位へ直接供給する。
【０００７】
特許文献１は、公衆が利用可能な不死化された細胞株から、初代培養株を分化させたものまで様々なタイプの細胞に対して組み込むことができる、多量体の、ＧＬＰ−１発現カセットを作り出すための手法を開示している。実施例は、哺乳類の中枢神経系から得られた、ＥＧＦ応答性のニューロスフィア、ｂＦＧＦ応答性の神経前駆幹細胞を含んでいるが、稼働した実施例は、ハムスターの乳児の肝臓（ＢＨＫ）細胞を用いている。形質移入され、移植された細胞は、首尾よく糖尿病のマウスを処理し、糖尿病でないマウスと実質的に同等の血糖値調節が行われたと記載されている。しかし、この種の移植技術は、例えば糖尿病患者に対する日常的な治療に適合するものではない。
【０００８】
その上、例えばよく知られているように、免疫システムは、典型的には、外来の細胞を認識し、個体を外来性の物体、例えば外来の細胞から保護するために、免疫反応を引き起こす。従って、ＧＬＰ−１又はその変異体若しくは誘導体を発現することができる細胞の移植は、個体における免疫反応を導く。そのような防衛反応は、治療中における甚大且つ望ましくない副作用を引き起こす可能性があり、治療する個体に深刻な合併症又は死さえももたらす可能性がある。
【特許文献１】国際公開ＷＯ９９／５３０６４号パンフレット
【非特許文献１】Ｗｈｉｔｅ，  Ｊ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １４（１２）  ４７１９−４７３０
【非特許文献２】Ｂｕｒｃｅｌｉｎ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ４８，  ２５２−２５８
【非特許文献３】Ｂｕｒｃｅｌｉｎ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａ１  （１９９９）  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８７５：  ２７７−２８５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上をまとめると、現時点において、ＧＬＰ−１に基づき、長期間に渡って血糖値を下げることができる有効な糖尿病タイプＩＩの治療法は知られていない。言い換えれば、従来の技術は、ＧＬＰ−１ペプチドの複数回にわたる投与の必要性がなく、又例えば、移植されたＧＬＰ−１を発現する同種異系（Ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）細胞に対する望ましくない免疫反応の危険性を伴わずに、ＧＬＰ−１について知られている有益な効果、例えば、その、肥満した患者において、栄養分の血流への移行を強力に低減させる活性や、インスリンを促進する活性などを全般的に引き出した治療法を提供することに失敗している。
【００１０】
従って、本発明は、ＧＬＰ−１をベースとするペプチド分子であって、ＧＬＰ−１ペプチドを繰り返し投与する必要性、又は、望ましくない免疫反応を引き起こす危険性がなく、生体において長期間に渡って生物学的に活性なものを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の基礎を成す目的は、少なくとも一つの表面コーティング、及び（球状の）核を含み、上記少なくとも一つの表面コーティングは、架橋ポリマーからなるか、それを含み、上記（球状の）核は、架橋ポリマー、並びにＧＬＰ−１ペプチド、そのペプチドのフラグメント若しくは変異、又はＧＬＰ−１を含む融合ペプチド若しくはそのフラグメント若しくは変異の発現及び分泌が可能な細胞からなるか、それらを含む、球状のマイクロカプセルを提供することにより、解決される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
発明の球状のマクロカプセルの（球状の）核は、典型的には、架橋ポリマー、並びにＧＬＰ−１ペプチド、そのペプチドのフラグメント若しくは変異、又はＧＬＰ−１を含む融合ペプチド若しくはそのフラグメント若しくは変異の発現及び分泌が可能な細胞からなるか、それらを含んでいる。
【００１３】
本発明において、（球状の）核の架橋ポリマーは、細胞をその空洞に埋め込んでいる骨格構造を形成する。なお、上記核は、球状であってもよいし、非球状であってもよい。細胞は、上記骨格構造内に個別に埋め込まれていてもよいし、典型的には、例えば、約１０から約１００００の細胞（例えば、約１０から約５００、約１０から約１０００、又は約１０から約１００００の細胞）の凝集した細胞（のプール）のような凝集した状態で埋め込まれていてもよい。上記（球状の）核は好ましくは、上記架橋ポリマーと、ＧＬＰ−１ペプチド、そのペプチドのフラグメント若しくは変異、又はＧＬＰ−１を含む融合ペプチド若しくはそのフラグメント若しくは変異の発現及び分泌が可能な細胞とのの均質な分布を含んでいる。骨格構造及び埋め込まれた細胞を上で規定したように含んでいる上記核は、好ましくは、下に開示する方法により調製される。
【００１４】
本発明の球状のマイクロカプセルの核内において細胞は、０．５×１０７細胞／ｍｌ架橋骨格ポリマーから５×１０８細胞／ｍｌ架橋骨格ポリマーの濃度で存在し得、より好ましくは、１×１０７細胞／ｍｌ架橋骨格ポリマーから５×１０７細胞／ｍｌ架橋骨格ポリマーの濃度で存在し得、最も好ましくは、２×１０７細胞／ｍｌ架橋骨格ポリマーから４×１０７細胞／ｍｌ架橋骨格ポリマーの濃度で存在し得る。
【００１５】
好適には、本発明の球状のマイクロカプセルの核の直径は、具体的な処置に応じて適宜変化し得る。典型的には、本発明の球状のマイクロカプセルの核の直径は、約２０から約４０００μｍの範囲であり、より好ましくは、約２０から約３０００μｍの範囲であり、最も好ましくは、約２０から約２０００μｍの範囲である。
【００１６】
本発明の球状のマイクロカプセルを調製するとき、カプセル封入された（同種異系の）細胞の全体を、上記ポリマー基質に埋め込むことが非常に重要である。用語「球状」は、最も広い意味に理解される。球状の粒子は、球に似た形状を有していると理解される。また、上記形状は、対称形状であっても非対称形状であってもよい。例えば、球状のマイクロカプセルは、楕円体形状を有していてもよい。それほど好ましくない実施形態では、発明のマイクロカプセルは、上述した意味において球状ではなく、例えば、マイクロカプセルの表面上の部分が突き出ていたり、陥没していたりするといった、任意の形状であってもよい。本明細書では、「球状の」マイクロカプセルについて言及されているが、「非球状の」マイクロカプセルも又供給され、調整され、使用され得る。
【００１７】
核の周縁に配置されている（同種異系の）細胞、又は、骨格構造から突き出ている細胞は、免疫学的な問題を引き起こし得る。即ち、免疫システムは、そのようなマイクロカプセルを外来性の成分として認識するだろうし、それゆえ、それらのマイクロカプセルは、免疫システムにより攻撃されるだろう。このような作用は、細胞の濃度を低減させることにより避けることができるだろうが、本発明は、マイクロカプセルの効能を改善するために、核の細胞数を増加させることを含む。カプセル封入された細胞の濃度が高まるに従い、移植すべきそのマイクロカプセルの総量は小さくなる。核内において高濃度の細胞を用いた場合の免疫学的な問題を避けるために、本発明は、少なくとも一つの、本発明の球状のマイクロカプセルの（球状の）核上の表面コーティングを提案する。この表面コーティングは、例え、細胞が核の周縁に非常に近いところに位置していたとしても、免疫応答が生じることを防ぐ。なぜなら、表面コーティングが、障壁として働くため、宿主の免疫システムは、上記細胞に接触することができないからである。この表面コーティングは、典型的には、上記で規定した架橋ポリマーであり、細胞を伴わない。具体的な実施形態によれば、上記で規定した（球状の）核は、少なくとも一つ以上の表面コーティング、例えば、１、２、３、４、５、５〜１０又はそれ以上の表面コーティングにより覆われている。典型的には、各表面コーティングは、核の周りに一様な厚みを有している。発明のマイクロカプセルの表面コーティングの厚さは、適宜変更し得、典型的には、約１０から約４０００μｍの範囲であり、好ましくは、約１０から約３０００の範囲であり、なお好ましくは、約１０から約２０００μｍの範囲である。
【００１８】
カプセル封入のために好適である公知の任意の（架橋）ポリマーを、本発明の球状のマイクロカプセルの（球状の）核及び表面コーティングの形成のために用いることができる。好ましくは、一方で、その架橋された状態において、酸素及び栄養素を供給のための浸透性を有し、他方で、核の細胞により発現及び分泌されるペプチドを、マイクロカプセルから患者の組織又は血流へと拡散させ得るようなポリマーが用いられる。その上、架橋ポリマーは、個体の免疫システムの成分が、基質を通過して浸入することを防ぐ。一例として、例えば、選ばれたタンパク質又はタンパク質をベースとしたポリマー（例えば、コラーゲン、アルブミン等）、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸等）、多糖類及びその誘導体（例えば、カルボキシルメチルセルロース、セルロース硫酸塩、アガロース、褐藻類（例えば、コンブ（Ｌａｍｉｎａｒａｌｅｓ）種、エクトカルパレス（Ｅｃｔｏｃａｒｐａｌｅｓ）種、ヒバマタ（Ｆｕｃａｌｅｓ）種等）のアルギン酸を含むアルギン酸、カラギーナン、ヒアルロン酸、ヘパリン及び関連するグルコサミノ硫酸塩、デキストラン及びその誘導体、キトサン及びその誘導体）のような天然のポリマーから得られる合成、半合成、及び、天然の水溶性の（バイオ）ポリマーを用いることができる。又例えば、脂肪族ポリエステル（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシ酪酸塩等）、ポリアミド、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリフォスファゼン、熱可塑性ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリメチルメタクリレート、及び、ポリテトラフルオロエチレン等のような合成ポリマーも用いることができる。さらに、ブロックポリマー、即ち、上述のポリマーの二つ以上の組み合わせ由来のポリマーも同様に用いることができる。そのようなブロックポリマーは、当業者は、所望の特性、例えば、孔のサイズ、架橋の状態、毒性、ハンドリング、生体適合性等に応じて、適宜選択することができる。任意の上記ポリマーは、本発明において、「化学的に異なるポリマー」として規定される。即ち、これらの各ポリマーは、それぞれ、基本的には、他の上述のポリマーと、同一の分子量及び構造を示すことはない。対照的に、「化学的に同一のポリマー」とは、同一の分子量及び構造を有するポリマーを意味する。最後に、上記ポリマーの混合物も又同様に包含され、そのような混合物に含まれるポリマーの量は、例えば上述したような所望の特性に応じて、当業者は適宜選択することができる。この点において、ポリマーの混合物は、他のポリマーの混合物（「化学的に同一なポリマー」）と、もし、得られるポリマー混合物の全体的な分子量、及び、混合物の個々のポリマーのモル百分率が同一であれば、化学的に同一であり得る。
【００１９】
好ましくは、本発明において、アルギン酸が、その生体適合性及び架橋特性により、（球状の）核及び／又は表面コーティングの形成のためのポリマーとして用いられる。化学的な観点から見ると、アルギン酸は、β−Ｄ−マンヌロン酸及びα−Ｌ−グルロン酸のヘテロポリマー領域から分離される、両酸のホモポリマー群由来のアニオン性多糖類である。アルギン酸は、水溶性であり、ナトリウム又はカリウムのような一価の陽イオンの存在下で高粘度溶液を形成する。アルギン酸の単鎖と、二価、三価、又は多価の陽イオン（例えば、カルシウム、バリウム、又はポリリジン）との相互作用により、架橋された水に不溶のヒドロゲルが形成される。好ましくは、（例えば、本明細書において参考として援用される独国特許出願公開第ＤＥ１９８３６９６０号明細書に従って）精製されたアルギン酸、より好ましくは、生理食塩溶液に溶けたアルギン酸ナトリウム又はカリウムが、カプセル封入のために用いられる。このようなアルギン酸は、典型的には、約２０ｋＤａから約１００００ｋＤａ、より好ましくは、約１００ｋＤａから約１２００ｋＤａの平均分子量を示す。本発明の球状のマイクロカプセルの（球状の）核及び表面コーティングの形成のために用いるアルギン酸は、好ましくは、溶液、より好ましくは、水溶液として供給され得る。例えば、用いられるアルギン酸の０．１％（ｗ／ｖ）アルギン酸水溶液の粘度は、約３から約１００ｍＰａ・ｓの範囲であり、より好ましくは、約１０から約６０ｍＰａ・ｓの範囲である。
【００２０】
本発明において、アルギン酸が用いられる場合、β−Ｄ−マンヌロン酸が豊富なアルギン酸（例えば、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｖｏｌ．８，１９９７，ｐｐ．７０７〜７１３に開示されているようなもの）が好ましい。本発明の球状のマイクロカプセルを調製するために好適なアルギン酸は、これに限定するものではないが、例えば、Ｌａｍｉｎａｒａｌｅｓ、Ｅｃｔｏｃａｐａｌｅｓ、Ｆｕｃａｌｅｓ等の褐藻類及び他のアルギン酸を含有している藻類を含む、ある種の藻類から抽出することにより取得可能である。アルギン酸は、当業者において公知のアルギン酸を調製するための任意の方法に従い、新鮮な藻類の材料又は乾燥された材料から単離することができる。好ましくは、本明細書において参考として援用される欧州特許第ＥＰ１１０９８３７号明細書に従った方法が適用される。欧州特許第ＥＰ１１０９８３７号明細書に従った方法は、簡潔に言えば、以下の工程からなる：最初の藻類の材料が、まず、錯化剤の存在下において抽出される。抽出は、炭酸ナトリウム溶液中が適切である。次に、造粒剤、及び、必要であればイオン交換体（例えば、アンバーライト）を加えることにより、溶液中に存在する全ての細胞成分及び粒子を沈殿させる。続いて、溶液が濾過される。濾過は、複数の濾過工程を包含しており、各濾過工程毎に、例えば、２０μｍから０．２μｍまで、孔のサイズを減少させるようにしてもよい。アルギン酸は、好適な沈殿剤により、濾過された溶液において沈殿させられる。沈殿は、好ましくは、アルコール（例えば、エタノール）を用いて行われる。或いは、酸、又は、その他の好適な沈殿剤が、沈殿のために用いられ得る。沈殿溶液中のアルコール濃度は、典型的には、１０％（ｖ／ｖ）及び５０％（ｖ／ｖ）の間の範囲であり、好ましくは、３０％（ｖ／）及び約５０％（ｖ／ｖ）の間の範囲である。この濃度範囲内であれば、免疫学的に活性な多糖類（例えば、フコイダン）に起因する不純物は、溶液内に残存するため、アルギン酸から分離することができる。好ましくは、沈殿の間、推進体（例えば、空気）が溶液中を流れる。沈殿したアルギン酸は、注入された空気により、上方に押し上げられ、適切な器具（例えば、網、篩等）を用いることにより、溶液表面から容易に分離することができる。収集されたアルギン酸は、続いて、圧濾器を用いて乾燥され得る。上述した方法の工程は、上記のように行ってもよいし、加えて、一つかそれ以上の工程を、一回かそれ以上適宜繰り返してもよい。さらに、上述した方法の工程は、用途に応じて、部分的に改変された形態で繰り返してもよい。最後まで実行された後、高度に精製されたアルギン酸は、エタノールで洗浄され、それが適切ならば水でも洗浄され、室温にて乾燥される。最初の材料によって、精製されたアルギン酸は、マンヌロン酸及びグルロン酸におけるモノマー比率が０．１から９の範囲であり（マンヌロン酸が１％から９０％に対応）、平均分子量は、約１０ｋＤａから１０００ｋＤａ超の間である。自己免疫性糖尿病のＢＢ／ＯＫラットに移植されたこのタイプの精製されたアルギン酸は、いかなる免疫反応も引き起こさないか、移植の３週間後に、非常に弱い反応を示すのみであった。
【００２１】
本発明の球状のマイクロカプセルの（球状の）核及び少なくとも一つの表面コーティングの調製のために用いられる上記架橋ポリマーは、同一であってもよいし、異なっていてもよい。第１の実施形態において、核及び少なくとも一つの表面コーティングの調製のために用いられる架橋ポリマーは、同一又は異なる濃度の、化学的に同一なポリマーから構成され得る。好ましくは、核及び少なくとも一つの表面コーティング内に存在するポリマーは、上記で規定した任意のポリマーから選ばれた架橋していないポリマーの溶液を用いて調製される。ポリマー溶液において、架橋していないポリマーは、典型的には、架橋していないポリマーが約０．１％（ｗ／ｖ）から約８％（ｗ／ｖ）の濃度で、より好ましくは、約０．１％（ｗ／ｖ）から約４％（ｗ／ｖ）の濃度で、なお好ましくは、約０．５％（ｗ／ｖ）から約２．５％（ｗ／ｖ）の濃度で、最も好ましくは、約１％（ｗ／ｖ）から約２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。上記で開示したアルギン酸をポリマーとして用いた場合、本発明の球状のマイクロカプセルの（球状の）核及び少なくとも一つの表面コーティングの調製のためのポリマー溶液の濃度は、０．１から４％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．４から２５（ｗ／ｖ）の範囲から選択され得る。アルギン酸の異なる濃度が、本発明の球状のマイクロカプセルの（球状の）核及び少なくとも一つの表面コーティングの調製のために用いられ得る。好ましくは、核及び／又は少なくとも一つの表面コーティングの調製のために用いられる架橋されていないポリマーは、化学的に同一なポリマーであり、より好ましくは、同一の濃度であり、例えば、上記で規定した濃度の上記で規定したポリマーである。この場合、用語「％（ｗ／ｖ）」は、架橋されていないポリマーの濃度を表し、典型的には、例えば、好適な溶液に架橋していないポリマーを溶かした後に（架橋の前に）、ポリマー溶液の総容量に対するポリマーの乾燥時の信頼できる量に基づいて測定される。しかし、上記濃度は又、例えば、通常の条件下（室温、常圧等）で液状の凝縮状態で存在するポリマーを用いる場合等、それが適切であれば、対応する「％（ｖ／ｖ）」濃度によって示され得る。
【００２２】
第２の実施形態において、核及び／又は少なくとも一つの表面コーティングの調製のために用いられる架橋ポリマーは、同一又は異なる濃度の、化学的に異なるポリマーから構成され得る。濃度は、上記で規定したものから選択され得る。さらに、ポリマーは、例えば、天然のポリマー、合成のポリマー及びポリマーの組み合わせ、即ちブロックポリマーを含む、上記で規定したポリマーから選択され得る。
【００２３】
加えて、各表面コーティングのポリマーは、同一であってもよいし、異なっていてもよい。即ち、各表面コーティングの架橋ポリマーは、同一又は異なる濃度の、化学的に同一な又は異なるポリマーによって構成され得る。例えば、本発明の球状のマイクロカプセルは、上述したように、少なくとも一つの表面コーティングを有し、当該表面コーティングは、上記で規定した任意のポリマーからなり、追加の外部の表面ポリマーは、ポリ陽イオン（例えば、上記で規定したポリアミノ酸、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸等）からなる。用いられるポリマーの性質の違いはさらに、用いられるポリマーの分子量の違い、及び／又は同一のポリマーの架橋の違い等に起因することがある。
【００２４】
上述したように、本発明の球状のマイクロカプセルの核は、ＧＬＰ−１ペプチドを発現及び分泌する細胞をさらに含んでいる。これらのＧＬＰ−１ペプチドを発現し分泌する細胞は、ＧＬＰ−１を発現し分泌することができる任意のタイプの細胞から選択することができる。そのような細胞は、典型的には、上記で規定したような、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１のフラグメント若しくは変異体、又は、ＧＬＰ−１を含む融合ペプチド若しくはそのフラグメント、変異体をエンコードする核酸又はより好ましくはそのような核酸を含んだベクターを用いて細胞に安定的に形質移入することにより取得することができる。
【００２５】
好適な細胞は、全能性、多能性、又は複能性の（未分化の）幹細胞から選択され得る。この場合に用いられる幹細胞は、好ましくは、胚性幹細胞、又は、外胚葉、中胚葉、若しくは内胚葉由来の幹細胞、又は、（例えば、ヒト骨髄由来、又は脂肪組織由来の）（ヒト）間葉系幹細胞（ＭＳＣ、ｈＭＳＣ）、造血幹細胞、表皮幹細胞、神経幹細胞、皮膚由来の線維芽細胞（筋線維芽細胞）を含む、未成熟の線維芽細胞等のような成体の幹細胞から構成される。これらの（未分化の）幹細胞は、典型的には、対称的な。細胞分裂、即ち、同一のコピーを生む細胞分裂をなし得る。幹細胞は、任意のタイプの細胞になる能力を維持している。その上、幹細胞は、幹細胞のコピーとともに幹細胞のコピーから分化した他の細胞、例えば分化した細胞をもたらす非対称的な分裂を行なうことができる。
【００２６】
本発明の球状のマイクロカプセルは、又、上記幹細胞から得ることができる細胞、結合組織の細胞、（成熟した）線維芽細胞、軟骨組織の細胞（軟骨細胞）、骨の細胞（骨芽細胞／骨細胞／破骨細胞）、脂肪の細胞（脂肪細胞）、平滑筋細胞、リンパ系前駆細胞及びそれに由来する細胞を含む血球細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、若しくは、樹状細胞）、一般的な骨髄系前駆細胞及びそれに由来する細胞（例えば、樹状細胞、単球、マクロファージ、破骨細胞、好中球、好酸球、好塩基球、血小板、巨核球、若しくは、赤血球）、マクロファージ、神経細胞（星状細胞、乏突起膠細胞等を含む）、上皮細胞、又は表皮細胞のような、（分化した）細胞から選択することもできる。これらの分化した細胞は、典型的には、対称的な細胞分裂、即ち、分化した親の細胞と同一のコピーをもたらす細胞分裂をすることができる。その上、いくつかの場合において、これらの分化した細胞は、親の細胞と同一のコピーをもたらすとともに、親の細胞とは異なる他の細胞、即ち、親の細胞からさらに分化した細胞をもたらす、非対称的な細胞分裂をなすことができる。又、いくつかの場合には、上記で規定した分化した細胞は、例えば、選択的分化誘導因子を加える等により、細胞分裂を伴わずに更なる分化を行なうことも可能である。
【００２７】
さらに、本発明の球状のマイクロカプセルに埋め込まれた細胞は、処置されるべき患者本人から採取された細胞（自系細胞）、又は、同種異系の細胞（例えば、ＨＥＫ２９３株、ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞株等の、試験管内で培養されている、確立された細胞株）であり得る。本発明の球状のマイクロカプセルの核に埋め込まれた表面コーティングにより、本発明は、処置すべき患者からの如何なる望ましくない免疫応答も伴わずに、同種異系の細胞を用いることができる。
【００２８】
本発明の球状のマイクロカプセルの核には、複数のタイプの細胞の組み合わせが存在し得る。例えば、本明細書において規定される本発明の球状のマイクロカプセルの核は、一部の細胞が試験管又は生体内で上記で規定したタイプの細胞（例えば、脂肪細胞（脂肪組織への移植に好適）等）に分化されたヒト間葉系幹細胞を含み得る。以上のように、様々なタイプの細胞（例えば、特定の幹細胞由来のもの）が、例えば、系統を共有しつつ、核内に配置され得る。
【００２９】
まとめると、本発明の球状のマイクロカプセルの核を調製するための本発明に係る細胞は、分化されていない、又は分化された細胞から選択することができる。一実施形態において、上記で規定した分化されていない細胞が好適である。分化されていない細胞は、例えば、分化されていない細胞の寿命の長さに起因して、本発明の球状のマイクロカプセルの効果の延長、ＧＬＰ−１ペプチドの発現及び分泌する能力の延長といった有利な特性を付与し得る。他の実施形態において、上記で規定した分化した細胞は、典型的にはそれ以上増殖しないため、本発明の球状のマイクロカプセルの核内において、望ましくない細胞の増殖をもたらすことがないことから、本発明の球状のマイクロカプセルの核を調製するために好適である。当業者は、選択された分化誘導因子を前駆体細胞に添加することにより、公知の方法を用いて、試験管内で特定の細胞分化を実施することができる。好ましくは、本発明の球状のマイクロカプセルの核に埋め込まれた大部分の（又は、少なくとも９０％の、より好ましくは、少なくとも９５％の、最も好ましくは、すくなくとも９９％の）細胞が、同じ細胞のタイプに属するように、細胞が分化される。特に、上記で規定した間葉系幹細胞は、試験管内において、例えば、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、例えば脂肪組織の細胞、神経様細胞、例えば脳の細胞等に分化され得、本明細書の記載のように用いられる。本発明の球状のマイクロカプセルの核を調製するために、分化していない細胞、又は、分化された細胞の何れを用いるかは、処置すべき疾病の特定の必要性、例えば、苦痛の部位、投与の形態、移植のために選定された組織等に基づく。これらの基準を評価することにより、当業者は、適切な細胞を選択することができる。
【００３０】
さらに、本発明の球状のマイクロカプセルの核を調製するために用いられる細胞は、不死化された細胞でもよく、不死化されていない細胞でもよく、好ましくは、不死化された細胞であり得る。不死化された細胞が用いられた場合、好ましくは、これらの細胞は、上述したような対称的又は非対称的な細胞分裂をする能力を有している。本発明において、細胞が、通常の細胞（即ち、不死化されていない細胞）よりも二倍を超える寿命を有していた場合、その細胞は不死化されていると規定する。試験管内における通常の二倍体細胞の最大寿命は、細胞のタイプ（例えば、胎児の細胞か成体の細胞か）及び細胞の状態による。従って、通常の試験管内で培養された細胞の最大寿命は、おおよそ６０から８０集団倍化時間に及ぶ。例えば、ケラチノサイトはおよそ８０回、線維芽細胞は５０回以上、リンパ球は約２０回、それぞれ分裂する。通常の骨髄間質細胞は、３０から４０集団倍化時間の最大寿命を示し得る。好ましくは、本発明の球状のマイクロカプセルの核を調製するために用いられる細胞は、３５０集団倍化時間を超えて増殖し続け得、若い細胞に特徴的な通常の成長速度を維持し得る。
【００３１】
細胞を不死化する方法は、広く知られており、よって、本発明に適用することができる（国際公開ＷＯ０３／０１０３０５号パンフレット及び国際公開ＷＯ９８／６６８２７号パンフレットを参照のこと。これらの文献は、本明細書に参考として援用される）。典型的な方法（国際公開ＷＯ０３／０１０３０５号パンフレットに従ったもの）は、例えば、以下の工程を包含する：
（ａ）当業者間において周知慣用の標準的な細胞培養方法に従って、例えば幹細胞、特にヒトの骨髄に由来する、（例えば、ヒト）間葉系幹細胞（ＭＳＣ、ｈＭＳＣ）のような細胞を培養する；
（ｂ）以下の（ｂ１）〜（ｂ５）のステップにより、少なくともヒトテロメア反復サブユニット（ｈＴＲＴ）遺伝子又はその変異体のフラグメントを含むレトロウイルスベクターを用いて、上記培養細胞に形質導入する：
（ｂ１）レトロウイルスベクターが製造される細胞であるパッケージング細胞株（例えば、ＰＡ３１７細胞、ＰＧ１３細胞、Ｐｈｅｎｉｘ等）を培養し、
（ｂ２）少なくともヒトテロメア反復（ｈＴＲＴ）遺伝子又はその変異体の触媒的なサブユニットのフラグメント、より好ましくは、例えば、ｐＧＲＮ１４５（ゲロン社（Ｇｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｉｏｎ））の３４５２塩基対のＥｃｏＲＩフラグメント等のｈＴＥＲＴｃＤＮＡフラグメントを含む、レトロウイルスベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス由来のもの等）を構築し、
（ｂ３）上記レトロウイルスベクターを用いて上記パッケージング細胞株を形質移入し、
（ｂ４）好ましくは、細胞を上記レトロウイルスベクターとともに遠心分離することにより、形質移入した細胞を用いて、上記パッケージング細胞株に形質導入し、
（ｂ５）上記レトロウイルスベクターを含む細胞である、ステップ（ｂ４）のパッケージング細胞を用いて、ステップ（１）において上述した培養細胞に形質導入する；
（ｃ）ステップ（ａ）の細胞と比較して実質的に同一の特徴及び特性を有する不死化された細胞株を取得する。その結果として、ヒトテロメアサブユニット（ｈＴＲＴ）遺伝子由来の、挿入されたポリヌクレオチド配列が転写及び翻訳され、機能的なテロメラーゼを製造する。コドン縮退の結果、多数のポリヌクレオチド配列が、同一のテロメラーゼをエンコードすることを当業者は理解するだろう。なお、野生型のテロメラーゼポリペプチドの配列と実質的に同一の配列を有しており、野生型のテロメラーゼポリペプチドの機能を維持しているテロメラーゼ変異体（例えば、野生型のポリペプチドに対してアミノ酸の保存的に置換して得られるもの）も又含まれる。
【００３２】
本発明の球状のマイクロカプセルに含まれる細胞により発現及び分泌されるＧＬＰ−１ペプチドは、公知のＧＬＰ−１ペプチド配列から選択することができる。この場合、本発明の球状のマイクロカプセルの核に埋め込まれた細胞は、典型的には、当該核を調製する前に、当該細胞がＧＬＰ−１を発現及び分泌するようにＧＬＰ−１ペプチド等をエンコードする核酸配列によって形質移入されている。本発明の球状のマイクロカプセルに含まれる細胞によって発現及び分泌されるＧＬＰ−１ペプチドは好ましくは、ＧＬＰ−１の第７番目から第３５番目までのアミノ酸からなるペプチド、およびこのペプチドに対して、少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％の相同性を示すペプチドからなる群より選択されるものである。ＧＬＰ−１ペプチドは、より好ましくは、ＧＬＰ−１の第１番目から第３７番目までのアミノ酸からなるペプチド、ＧＬＰ−１の第７番目から第３５番目、第３６番目又は第３７番目までのアミノ酸からなるペプチド、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド、及びこれらのペプチドの何れかに対して、少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％の相同性を示す、ペプチドであり得る（改変されたペプチドを含む）。この場合、「改変されたＧＬＰ−１ペプチド」は、任意のＧＬＰ−１の変異体又はＧＬＰ−１のフラグメントが意図されており、それらの組み合わせ（例えば、変異体のフラグメント）も含まれる。変異体及びフラグメントは、例えば、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）のような、改変されていない配列の改変として特徴付けられる。本発明の範囲内において、全ての変異体及びフラグメントは機能する必要がある。例えば、変異体及びフラグメントは、改変されていない（ＧＬＰ−１）ペプチドと同一又は類似した生物学的な活性を発揮する必要がある。用語「活性」は、生物学的な活性（例えば、受領体結合、受容体の活性化、インスリン分泌性活性の発揮、即ち、インスリン分泌を促進する能力、グルカゴン分泌を低減させる能力、体重減少に影響を及ぼす能力等を含む一つ以上の生物学的な活性）であって、本明細書において規定する自然に存在するＧＬＰ−１ペプチド並びにその任意のフラグメント及び変異体と同一条件下において比較し得るものについて言及する。本明細書において規定するＧＬＰ−１ペプチドの変異体又はフラグメントは、好ましくは、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）の少なくとも２５％の活性を発揮し、より好ましくは、少なくとも５０％の（生物学的な）活性を発揮し、なお好ましくは、少なくとも６０、７０、８０又は９０％の（生物学的な）活性を発揮し、最も好ましくは、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）の少なくとも９５％又は９９％の（生物学的な）活性を発揮する。
【００３３】
他の実施形態において、本発明の球状のマイクロカプセルの核に埋め込まれた細胞により発現及び分泌されるＧＬＰ−１ペプチドは、ＧＬＰ−１融合ペプチド又はその変異体若しくはフラグメントから選択され得る。本明細書において規定されるＧＬＰ−１融合ペプチドは、例えば、成分（Ｉ）及び成分（ＩＩ）、成分（Ｉ）及び成分（ＩＩＩ）、又は、成分（Ｉ）、成分（ＩＩ）及び成分（ＩＩＩ）といった、少なくとも二つの成分を有しており、ＧＬＰ−１の生物学的な活性を発揮し、同時に、Ｃ末端の延長により、ＧＬＰ−１融合ペプチドの成分（Ｉ）に安定性を付与する。本明細書において規定するＧＬＰ−１融合ペプチドの成分（Ｉ）は、配列番号１に示される配列に対し、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、なお好ましくは、少なくとも９０％の相同性を有する配列を含んでいる。配列番号１は、哺乳動物において厳密に保存されている、ＧＬＰ−１（７−３７）（長さ３１アミノ酸）の天然のアミノ酸配列を示す。
【００３４】
本発明の球状のマイクロカプセルの核に埋め込まれた細胞により発現及び分泌されるＧＬＰ−１ペプチド（より一般的には、融合ペプチドのフラグメント又は変異体を含む任意のＧＬＰ−１ペプチド）の成分（ＩＩ）は、典型的には、少なくとも９個のアミノ酸を有するペプチド配列を含んでいる。ＧＬＰ−１融合ペプチドの成分（ＩＩ）はさらに、少なくとも一つのプロリン残基をその配列中に含み得る。プロリン残基は、βターンを形成する四量体アミノ酸配列内の共通するアミノ酸である。従って、ＧＬＰ−１融合ペプチドの成分（ＩＩ）は、βターン様構造を形成する。βターン構造は、タンパク質又はペプチドの典型的な二次構造要素である。典型的には４つのアミノ酸から形成され、ペプチド又はタンパク質の背骨となる鎖の方向を反転させる。プロリン残基は、もし存在すれば、ＧＬＰ−１融合ペプチドの成分（ＩＩ）に生じた四量体βターン配列の第２番目又は第３番目、好ましくは第２番目の位置に共通して配置されている。
【００３５】
本発明の球状のマイクロカプセルの核に埋め込まれた細胞は、典型的には、当該核を調製する前に、当該細胞がＧＬＰ−１融合ペプチドを発現及び分泌するようにＧＬＰ−１ペプチド融合ペプチド等をエンコードする核酸配列によって形質移入されている。この場合、特に好ましいのは、本明細書において規定するＧＬＰ−１融合ペプチドであって、成分（ＩＩ）が、配列番号２２に示される配列（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩ）（全てのアミノ酸配列は、一文字表記されている）、又は、配列番号２２に示される配列に対して少なくとも８０％の相同性を有している配列を含んでいるものである。配列番号２２は、ＩＰ−２（介在ペプチド２）の全長配列の部分配列であって、１５アミノ酸長の全長ＩＰ−２配列のＮ末端の１０アミノ酸を含んでいる配列を示す。本明細書において、ＩＰ−２は、成分（ＩＩ）の好ましい例である。そして、成分（ＩＩ）に含まれる、他のより好ましい配列は、ＩＰ−２の配列のより長い部分配列、例えば、ヒトに存在するＮ末の１４アミノ酸の配列（配列番号２３（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬ））若しくはそのマウスのカウンターパート（配列番号２４（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬ））又は配列番号２３若しくは２４に示される配列に対して少なくとも８０％の相同性を示す配列である。上記融合ペプチドの成分（ＩＩ）に含まれる最も好ましい因子は、自然に存在するＩＰ−２配列の１５アミノ酸の全てを有する全長ＩＰ−２配列（ヒト：配列番号２（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧ）、マウス：配列番号３（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧ））又は配列番号２若しくは３に示される配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する配列である。本発明の範囲は、ＩＰ−２の哺乳動物におけるイソ型（哺乳動物におけるＩＰ２の自然のバリエーション）のすべてを含む。例えば、ＩＰ２又はＩＰ２のフラグメント若しくは変異体の２、３、又はそれ以上の多コピーの配列が成分（ＩＩ）に含まれているものも又、供給され得る。
【００３６】
従って、本発明の球状のマイクロカプセルの核に埋め込まれた細胞により発現及び分泌されるＧＬＰ−１融合ペプチドは、配列番号８に示される配列（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧ）、即ち、ＧＬＰ−１（７−３７）が、そのＣ末端を介してマウスＩＰ−２に、リンカー配列をともなわずに連結した配列、又は、配列番号１２に示される配列（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧ）、即ち、ＧＬＰ−１（７−３７）が、そのＣ末端を介してヒトＩＰ−２に、リンカー配列をともなわずに連結した配列を好適に含む。配列番号８又は１２に示される配列又はそのフラグメント若しくは変異体に対して少なくとも８０％の相同性を有する配列も又、使用することができる。この場合、好ましいＧＬＰ−１融合ペプチドは、配列番号１３、１４、１９及び２０に示される配列をさらに含み得る。
【００３７】
移植された本発明の球状のマイクロカプセルの核に埋め込まれた細胞によって、生体内で、患者の周りの組織にＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）が分泌された場合、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）の不安定性は、その保護されていない３次元構造に起因することを、本発明者らは独自に見出した。生体内において、プロテアーゼは、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）分子を切断し、その生理学的な活性を急速に消失させる。ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）のＣ末端にペプチドの配列を連結させることにより、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）の構造は、酵素的な分解に対して安定性を獲得する。このような安定性の獲得は、Ｃ末端の付加的なペプチド配列（本発明に係る融合ペプチドの成分（ＩＩ）に含まれている）が折り曲がっている場合、例えば、βターン構造が存在するような一次構造を有しており、成分（ＩＩ）に堅牢性を付与している場合に、特に顕著となる。そのＣ末端の延長されたペプチドにより、βターン構造要素を好適には含んいる、上記で規定したようなＧＬＰ−１ペプチドは、ＤＰＰ−ＩＶによる不活性化に対して向上した抵抗性を有することが見出された。Ｃ末端のペプチドは、そのターゲットとする細胞のその受容体に作用する前には、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）配列から切断されないか、又は、生体内において、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）を形成するように酵素的に切断され得る。ＧＬＰ−１受容体の部位に結合するＧＬＰ−１ペプチドの厳密な形状によらず、上記で規定したようなＧＬＰ−１ペプチドは、活性のあるインスリン分泌性の化合物としての働きを奏する。
【００３８】
上記で規定したようなＧＬＰ−１融合ペプチドの成分（ＩＩ）に含まれるに好適と考えられるＧＬＰ−１ペプチド配列は、そのβターン要素を導く一時構造によって、例えば、分光学的な手法、円偏光二色性分析、その他の当業者に公知な方法を用いて、容易に、適宜特定することができる。
【００３９】
本発明の球状のマイクロカプセルの核に埋め込まれた細胞により発現及び分泌されるＧＬＰ−１融合ペプチドの成分（ＩＩ）及び成分（Ｉ）は、直接連結されていてもよいし、リカー配列を介して連結されていてもよい。好ましくは、両成分は、互いに直接連結されている。それらがリンカー（又はスペーサー）を介して連結されている場合、当該リンカーはペプチドリンカーであることが好ましい。ペプチドリンカーは、典型的には、１から１０のアミノ酸長を有しており、好ましくは、１から５の、なお好ましくは１から３のアミノ酸長を有しており、またいくつかの場合において、リンカー配列は、なお長い１１から５０のアミノ酸を含む配列であり得る。ペプチドリンカーは、様々な（自然に存在する）アミノ酸配列から構成され得る。好ましくは、ペプチドリンカーは、連結される成分間に構造的な柔軟性を導入する。構造的な柔軟性は、例えば、様々なグリシン又はプロリン残基を含むペプチドを用いることにより達成され、好ましくは、少なくとも３０％、より好ましくは、少なくとも４０％、なおさらに好ましくは、少なくとも６０％のプロリン及びグリシンをリンカー配列内に含む。ペプチドリンカーは、具体的な配列によらず、好ましくは、免疫学的に不活性であり得る。
【００４０】
本発明の球状のマイクロカプセルの核に埋め込まれた細胞により発現及び分泌されるＧＬＰ−１融合ペプチドは、付加的に成分（ＩＩＩ）を含み得る。一般的に、成分（ＩＩＩ）は、少なくとも４個のアミノ酸残基を含んでおり、好ましくは、少なくとも１０個の付加的なアミノ酸残基を含んでおり、より好ましくは、少なくとも２０個、又は少なくとも３０個のアミノ酸残基を含んでいる。機能の観点から言えば、成分（ＩＩＩ）は、ＧＬＰ−１の安定性をさらに増強することを目的としている。成分（ＩＩＩ）は、ＧＬＰ−１（７−３７）の生物学活性とほぼ同程度であるＧＬＰ−１融合ペプチドの生物学的活性を阻害しないことが期待されている。一般的に、上記で規定したような成分（Ｉ）のＣ末端の任意の延長は、それが、上記で規定したような成分（ＩＩ）、成分（ＩＩＩ）、又は、成分（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の組み合わせであるかによらず、成分（Ｉ）、即ち、上記で規定したようなＧＬＰ−１（７−３７）又はそのフラグメント若しくは変異体の安定性を増強する。
【００４１】
好ましくは、本発明において、本発明の球状のマイクロカプセルの核を調製するために用いられた細胞に形質移入された核酸によりエンコードされたＧＬＰ−１融合ペプチドの成分（ＩＩＩ）は、少なくとも４個の、好ましくは、少なくとも１０個の、より好ましくは、少なくとも２０個の付加的なアミノ酸残基を、例えば、配列番号４及び５に示されるマウス又はヒトのイソ型のような、任意の哺乳動物の個体のＧＬＰ−２のイソ型（他の、哺乳動物において、自然に存在するＧＬＰ−２の変異体）の配列のＮ末端に含んでいる。ＧＬＰ−２は、プログルカゴン内に存在し、炭水化物代謝に関与する。本発明において、用語「ＧＬＰ−２ペプチド」は、好ましくは、ＧＬＰ−２（１−３３、３４又は３５）を意味し、「改変されたＧＬＰ−２ペプチド」は、任意の、ＧＬＰ−２のフラグメント若しくは変異体又はＧＬＰ−２（１−３３、３４又は３５）のフラグメント若しくは変異体を意味することが意図される。変異体又はフラグメントは、改変されていない配列、例えば、ＧＬＰ−２（１−３３、３４又は３５）の改変として分類される。成分（Ｉ）に含まれる生物学的に活性な配列（ＧＬＰ−１ペプチド）と同様、成分（ＩＩＩ）は、ＧＬＰー２の自然に存在する形態の変異体又はフラグメントを含んでいてもよい。他の局面において、成分（ＩＩＩ）は、少なくとも４個の、好ましくは、少なくとも１０個の、より好ましくは、少なくとも２０個の付加的なアミノ酸残基を、同様に、全ての哺乳動物のイソ型、又は（本明細書において記載したような）、その全ての機能的なフラグメント若しくは変異体を含む、ＧＬＰ−１（７−３７）のＮ末端配列に含んでいてもよい。一般に、成分（ＩＩＩ）は、ＧＬＰ−１ペプチド、又は、本明細書において示すような、ＧＬＰ−１融合ペプチドの成分（Ｉ）に適合するような、改変されたＧＬＰ−１ペプチドの任意の形態を含んでいてもよい。さらに他の局面において、成分（ＩＩＩ）は、ＧＬＰ−１（７−３７）及びＧＬＰ−２のキメラ形態を含んでいてもよい。キメラ形態は、ＧＬＰ−１（７−３７）とＧＬＰ−２（又はそのフラグメント若しくは変異体）とを互いに結合させることにより生産することができ、続いて、このキメラ形態は成分（ＩＩＩ）としてＧＬＰ−１融合ペプチドに導入される。好ましくは、上記キメラ形態は、一つに結合したＧＬＰ−１（７−３７）の部分配列及びＧＬＰ−２の部分配列から構成される。例えば、上記キメラ形態は、ＧＬＰ−１のＮ末端の５から３０個のアミノ酸及びＧＬＰ２のＣ末端の５から３０個のアミノ酸、又はその逆の構成であり得、又例えば、ＧＬＰ−１（７−３７）の第７又は第８番目から第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７又は第２８番目までのアミノ酸、及び、ＧＬＰ−２のアミノ酸配列の第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３又は第２４から、例えばＣ末端までであり得る。
【００４２】
もし、自然に存在する形態のＧＬＰ−２又はＣＬＰ−１（７−３７）のそれぞれの改変が、成分（ＩＩＩ）に含まれていた場合、成分（ＩＩＩ）は、好ましくは、配列番号４若しくは５に示される配列か、配列番号１に示される配列か、又は、配列番号４若しくは５に示されるか、配列番号１に示される配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する配列を含んでいる。
【００４３】
他の実施形態において、本発明の球状のマイクロカプセルの核に埋め込まれた細胞により発現及び分泌されるＧＬＰ−１融合ペプチドの成分（ＩＩＩ）は、上述したような配列を複数個含んでいる。例えば、成分（ＩＩＩ）は、少なくとも二つの、好ましくは、２、３、又は４コピーのＧＬＰ−１（７−３７）及び／若しくはＧＬＰ−２、又は、少なくとも２コピーの、配列番号１、４若しくは５に示される配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する配列を含んでいてもよい。又、成分（ＩＩＩ）は、少なくとも一コピー以上の、上述したような、例えば、最終的には、ＧＬＰ−１（７−３７）及び／若しくはＧＬＰ−２又はその、少なくとも８０％の配列上の相同性を有する改変のキメラ形態のバリエーションを形成する、ＧＬＰ−１（７−３７）又はＧＬＰ−２のキメラ形態を含んでいてもよい。好ましくは、本発明において、本発明の球状のマイクロカプセルの核を調製するために用いられた細胞に形質移入された核酸によりエンコードされたＧＬＰ−１融合ペプチドは又、二つ以上の、好ましくは二つの成分（ＩＩＩ）を含んでいてもよく、それらは、例えば、（１）そのＮ末端により、成分（Ｉ）又は（ＩＩ）のＣ末端に連結されており、（２）そのＣ末端により、成分（Ｉ）のＮ末端にリンカーを介して又は直接連結されている。もし二つの成分（ＩＩＩ）が供給されている場合、それらは同一であってもよいし、それぞれ異なっていてもよい。
【００４４】
好ましい実施形態によれば、細胞（本発明の球状のマイクロカプセルの核に埋め込まれている）は、好ましくは、三つの成分（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）を含んでいるＧＬＰ−１融合ペプチドをエンコードする核酸配列によって形質移入されている。これらの全ての成分を含んでいる具体的な実施形態は、配列番号６（Ｎ−ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２（マウス）−ＲＲ−ＧＬＰ−１（７−３７）−Ｃ、本明細書においてマウスＣＭ１とも称される）、配列番号７（Ｎ−ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２（マウス）−ＲＲ−ＧＬＰ２−Ｃ、本明細書においてマウスＣＭ２とも称される）、配列番号１０（Ｎ−ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２（ヒト）−ＲＲ−ＧＬＰ−１（７−３７）−Ｃ、本明細書においてヒトＣＭ１とも称される）、若しくは配列番号１１（Ｎ−ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２（ヒト）−ＲＲ−ＧＬＰ−２−Ｃ、本明細書においてヒトＣＭ２とも称される）に示される配列、配列番号６、７、１０若しくは１１に示される配列に対して、少なくとも８０％の相同性を有する配列、又は、それらのフラグメント若しくは変異体である。配列番号６、７、１０又は１１に示される全ての配列は、ＩＰ２（成分（ＩＩ））のＣ末端にＲＲ−リンカー（二つのアルギニン残基）を有している。これは、排除されていてもよい。配列番号６、７、１０又は１１に係る各実施形態のそれぞれの成分（Ｉ）は、ＧＬＰ−１（７−３７）であり、成分（ＩＩＩ）（これらの各実施形態において、成分（ＩＩ）のＣ末端に結合されている）は、ＧＬＰ−１（７−３７）又はＧＬＰ−２である。この場合、好ましいＧＬＰ−１融合ペプチドは、配列番号１５、１６、１７、１８及び２６に示される配列をさらに含んでいる。
【００４５】
他の好ましい実施形態において、本発明の球状のマイクロカプセルの核に埋め込まれた細胞により発現及び分泌されるＧＬＰ−１融合ペプチドは、成分（Ｉ）に加えて成分（ＩＩＩ）（上記にて規定した成分（ＩＩ）を伴わず）を、成分（Ｉ）のＣ末端及び／又は成分（Ｉ）のＮ末端の何れかに結合されて、含んでいる。好ましくは、成分（ＩＩＩ）は、成分（Ｉ）のＣ末端に位置している。成分（ＩＩＩ）が、（そのＣ末端により）成分（Ｉ）のＮ末端に、又は、（そのＮ末端により）成分（Ｉ）のＣ末端に結合しているかとは関わりなく、結合は、直接又は間接的にリンカー配列を介して行われる。リンカー配列に関しては、成分（Ｉ）及び成分（ＩＩ）を結合するリンカーについての上述の開示において言及されている。
【００４６】
本発明の他の好ましい実施形態において、本発明の球状のマイクロカプセルの核に埋め込まれた細胞により発現及び分泌されるＧＬＰ−１融合ペプチドは、成分（Ｉ）及び成分（ＩＩ）に加えて成分（ＩＩＩ）を、成分（ＩＩ）のＣ末端及び／又は成分（Ｉ）のＮ末端の何れかに結合されて、含んでいる。好ましくは、成分（ＩＩＩ）は、成分（ＩＩ）のＣ末端に位置している。成分（ＩＩＩ）が、（そのＣ末端により）成分（Ｉ）のＮ末端に、又は、（そのＮ末端により）成分（ＩＩ）のＣ末端に結合しているかとは関わりなく、結合は、直接又は間接的にリンカー配列を介して行われる。リンカー配列に関しては同様に、成分（Ｉ）及び成分（ＩＩ）を結合するリンカーについての上述の開示において言及されている。
【００４７】
最後に、本発明の球状のマイクロカプセルの核に埋め込まれたＧＬＰ−１融合ペプチドは、融合ペプチドの成分の任意の上述した組み合わせ（即ち、成分（Ｉ）及び（ＩＩ）、成分（Ｉ）及び（ＩＩＩ）、又は成分（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ））に加えて、成分（ＩＶ）としてキャリアタンパク質、特にトランスフェリン又はアルブミンを含んでいてもよい。そのような成分（ＩＶ）は、融合ペプチドの成分の任意の上述した組み合わせ、即ち、成分（Ｉ）及び（ＩＩ）、成分（Ｉ）及び（ＩＩＩ）、又は成分（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）のＮ及び／又はＣ末端に、直接又は上述したリンカーを用いて結合されていてもよい。
【００４８】
ＧＬＰ−１ペプチドは、上述のように定義され、本発明に係る球状のマイクロカプセルの上記核の調製のための本発明に従って用いられる細胞の中にトランスフェクトされる核酸によってコードされており、様々な変形態様を生じうる。このような変形態様は以下に開示され、詳細に説明される。
【００４９】
本発明の球状のマイクロカプセルに埋め込まれた細胞から発現及び分泌されるＧＬＰ−１ペプチドの「フラグメント」は、上記にて説明されたＧＬＰ−１融合ペプチドを含むＧＬＰ−１ペプチドのいかなる下位集合、つまり、より短い、所望の生物学的活性を保持するペプチドについて言及される。フラグメントは、分子の両末端からアミノ酸を除去することにより、及び、分泌物としての性質の結果をテストすることにより、調製され得る。ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端のいずれかから一度にアミノ酸を除去するためのプロテアーゼは公知であり、所望の生物学的活性を保持する特定のフラグメントは、単に通常の実験操作を必要とする。最終的に、フラグメントは、ペプチド末端のアミノ酸及び又はペプチド配列の中に位置するアミノ酸の削除によって存在し得る。
【００５０】
さらに、抗タイプ２糖尿病活性を有する、ここで定義されるＧＬＰ−１ペプチドはそれ自身の融合ペプチド、それらの機能的な変異及び／又はフラグメントが存在し、ＧＬＰ−１ペプチドの側面に付加的なアミノ酸残基をも含み得る。
【００５１】
結果物の分子がそのプロテアーゼに対する抵抗性又は安定性及び分泌物としてのその活性を保持する限り、いかなるそのような側面の残基が、例えば、その膵臓細胞の効果によって、通常の実験操作によって、上記核のペプチドの基本特性に影響を及ぼすかを認定することができる。特定の配列について言及するときの、用語「実質的に構成する」は、ＧＬＰ−１ペプチドに特異的な基本的な特性に影響を及ぼさずに、付加的な側面の残基が存在し得ることを意味する。この用語は特定の配列中の置換、削除又は付加を意味しない。
【００５２】
本発明に係る球状のマイクロカプセルに埋め込まれた細胞から発現及び分泌されるＧＬＰ−１ペプチドの「変異」とは、上記にて定義される完全なＧＬＰ−１ペプチド又はそのフラグメントのいずれもについて実質的に同じ分子について言及される。変異ペプチドは本技術分野においてよく知られる方法を用いて好適に調製される。もちろん、そのようなＧＬＰ−１ペプチドの変異は、ＧＬＰ−１ペプチドが自然に起こすものに対応する例えばインスリン刺激活性等の抗糖尿病を同様に有するであろう。例えば、上記にて定義されたＧＬＰ−１ペプチドの変異のアミノ酸配列は、合成された変異をコードするＤＮＡ配列の変異させることによって調製される。そのような変異は、例えば、アミノ酸配列中の残基からの欠損、又は挿入若しくは置換が含まれる。欠損、挿入及び置換のいかなる組み合わせも、本発明の球状のマイクロカプセルに埋め込まれた細胞から発現及び分泌されるＧＬＰ−１ペプチドに保持され、所望の活性を保有する最終コンストラクトを提供する。明らかに、変異ペプチドをコードするＤＮＡに成される変異は、リーディングフレームを変えてはならず、好ましくは第二のｍＲＮＡコンストラクトを製造し得る相補的領域を作らない。
【００５３】
本発明の球状のマイクロカプセルに埋め込まれた細胞から発現及び分泌されるＧＬＰ−１ペプチドに保持されるであろう置換のタイプは、様々な種類の相同タンパク／ペプチドの間におけるアミノ酸配列の変化の頻度の解析に基づかれ得る。そのような解析に基づいて、保存的な置換は次の５つのグループのうちの一つ中の交換にて規定され得る。
【００５４】
Ｉ．小さい、脂肪族化合物の、非極性又は微小な極性を有する残基：Ａｌａ，  Ｓｅｒ，  Ｔｈｒ，  Ｐｒｏ，  Ｇｌｙ；ＩＩ．極性、負荷電の残基及びそのアミド：Ａｓｐ，  Ａｓｎ，  Ｇｌｕ，  Ｇｌｎ；ＩＩＩ．極性、正荷電の残基：Ｈｉｓ，  Ａｒｇ，  Ｌｙｓ；ＩＶ．大きい、脂肪族化合物の、非極性残基：Ｍｅｔ，  Ｌｅｕ，  Ｉｌｅ，  Ｖａｌ，  Ｃｙｓ°；Ｖ．大きい、芳香族の残基：Ｐｈｅ，  Ｔｒｙ，  Ｔｒｐ。
【００５５】
上述のグループにおいて、次の置換は「高い保存」とみなされる：Ａｓｐ／Ｇｌｕ；  Ｈｉｓ／Ａｒｇ／Ｌｙｓ；  Ｐｈｅ／Ｔｙｒ／Ｔｒｐ；  Ｍｅｔ／Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ。次いで保存的な置換は、上記（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）を含む上位グループ（Ａ）又は上記グループ（ＩＶ）及び（Ｖ）を含むグループ（Ｂ）として規定される上記グループ（Ｉ）〜（ＩＶ）の二つの間での交換として定義される。置換は遺伝的にコードされた又は天然に存在するアミノ酸にさえも限定されない。
【００５６】
一般に、上記にて定義されるＧＬＰ−１ペプチド（及びＧＬＰ−１融合ペプチド）の変異は、溶解性促進の強化（疎水性アミノ酸の親水性アミノ酸への置換）によって作り出されるアミノ酸の置換をも含み得る。
【００５７】
一実施形態において、本発明の球状のマイクロカプセルに埋め込まれた細胞から発現及び分泌される、上記にて定義された（ＧＬＰ−１融合ペプチドの成分（Ｉ）及び／又は成分（ＩＩＩ）に発生する）ＧＬＰ−１融合ペプチドを含む（改質された）ＧＬＰ−１ペプチドは、ＧＬＰ−１ペプチドの７、８、１１、１２、１６、２２、２３、２４、２５、２７、３０、３３、３４、３５、３６又は３７の位置における１又はそれ以上の置換によって特徴付けられる。例えば、次の用語［Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７−３７）］は、３４位の天然リジンがアルギニンに置換されたＧＬＰ−１の類似物を指定する。
【００５８】
特に、ＧＬＰ−１ペプチド、或いは、ここで定義されるＧＬＰ−１融合ペプチドの成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）は、例えば、Ｇｌｎ９−ＧＬＰ−１  （７−３７），  Ｄ−Ｇｌｎ９−ＧＬＰ−１（７−３７），  アセチル−Ｌｙｓ９−ＧＬＰ−１  （７−３７），  Ｔｈｒ１６−Ｌｙｓ１８−ＧＬＰ−１  （７−３７），  及びＬｙｓ１８−ＧＬＰ−１  （７−３７），  Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１  （７−３７），  Ｌｙｓ３８−Ａｒｇ２６−ＧＬＰ−１  （７−３８）−ＯＨ，  Ｌｙｓ３６−Ａｒｇ２６−ＧＬＰ−１  （７−３６），  Ａｒｇ２６，３４−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１  （７−３８），  Ａｒｇ２６，３４−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８），  Ａｒｇ２６，３４−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１  （７−３８），  Ａｒｇ２６，３４−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１  （７−３８），  Ａｒｇ２６，３４−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１  （７−３８），  Ａｒｇ２６−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８），  Ａｒｇ２６−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８），  Ａｒｇ２６−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１  （７−３８），  Ａｒｇ３４−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１  （７−３８），  Ａｌａ３７−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１  （７−３８），  及びＬｙｓ３７−ＧＬＰ−１  （７−３７）を含むＧＬＰ−１（７−３５，  ３６，  ３７  又は３８）の変異に対応する。
【００５９】
特に好ましい本発明の実施形態において、（成分（Ｉ）又は（ＩＩＩ）に関して）上記にて定義されたＧＬＰ−１融合ペプチドを含む本発明の球状のマイクロカプセルに埋め込まれた声望から発現及び分泌されるＧＬＰ−１ペプチドは、ＧＬＰ−１  （７−３５），  ＧＬＰ−１  （７−３６），  ＧＬＰ−１  （７−３６）−アミド，  ＧＬＰ−１  （７−３７）又はそのフラグメント若しくは変異から選ばれる（改質された）ＧＬＰ−１ペプチドである／含んでいる。
【００６０】
好ましくは、本発明の球状のマイクロカプセルに埋め込まれた細胞から発現及び分泌される、ＧＬＰ−１ペプチドの変異（（成分（Ｉ）又は（ＩＩＩ）に関する）ＧＬＰ−１融合ペプチドの変異を含む）は、天然アミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有しその生物学的活性を保持する、例えばＧＬＰ−１（７−３７）若しくはＧＬＰ−２又は生物学的に活性なそれらのフラグメント又はあらゆるＩＰ２イソ型の天然の配列と同じ核配列を有する。さらに好ましくは、天然の配列に対して、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、特に好ましくは９５％の同一性を示すような配列である。
【００６１】
用語「配列同一性」は、ここで、配列が次の通り比較されることを意味するものと定義される。二つのアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するために、それらの配列は裁量の比較目的となるように位置合わせされ得る（例えば、最初のアミノ酸配列の配列中にギャップが導入される）。そして、アミノ酸の位置に対応するアミノ酸の位置が比較され得る。第１の配列中の位置が対応する第２のアミノ酸の同じ位置に存在するとき、それらの分子はその位置において同一である。二つの配列間の同一性パーセントは配列間に共有される同一的な位置の数の関数である。例えば、特定のペプチドが規定の長さの参照ポリペプチドに対する特定の同一性パーセントを有するといわれるところにおいて、同一性パーセントは参照ペプチドに関連する。つまり、１００アミノ酸の長さの参照ポリペプチドと５０％の同一性であるペプチドは、参照ポリペプチドの５０個のアミノ酸の位置と完全に同一な５０個のアミノ酸ポリペプチドであり得る。それはまた、その全ての長さの参照ポリペプチドと５０％同一である、１００個の長さのアミノ酸ポリペプチドであってもよい。もちろん、他のポリペプチドは同じ基準を満たすであろう。このような二つの配列の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いることにより達成され得る。好ましくは、二つの配列の比較を用いられる数学的アルゴリズム限定されない例は、Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３），  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，  ９０：５８７３−５８７７．である。このようなアルゴリズムはＮＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれており、本発明のアミノ酸配列の所望の同一性を有する配列を同定するために用いることができる。ギャップを入れた、比較目的のアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ２５：３３８９−３４０２.にて説明されているＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを活用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用するとき、各プログラム（例えばＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを用いることができる。さらに、−１２（ギャップの最初の空値）のギャップオープンペナルティ（ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）及び−４（ギャップにおける付加的で連続的な空値当たり）のギャンプエキステンションペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）としてデフォルト（ＢＬＯＳＵＭ６２）マトリクス（値−４から＋１２）を用いて、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ’ｓ  ＧＡＰ  （ｇｌｏｂａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍ）のバージョン９を用いて、配列をアラインしてもよい。アラインメントの後、要求された配列中のアミノ酸の数のパーセンテージとしてマッチする数を表すことにより同一性パーセンテージを計算する。説明した二つのアミノ酸配列の同一性パーセントの決定をする方法は核酸配列にも対応的に適用することができる。
【００６２】
本発明の球状のマイクロカプセルに埋め込まれた細胞から分泌されるＧＬＰ−１ペプチド、特に融合ＧＬＰ−１ペプチドは、上に概要を述べたタンパク質分解的切断に対して保護されていてもよい。それらは、好ましくは、ジペプチジル  アミノペプチダーゼ−ＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）に対して保護されていてもよい。ここで定義するＧＬＰ−１ペプチドは、これらのフラグメント及び変異、特にＧＬＰ−１融合ペプチドと同様に、血漿ペプチダーゼ（ＤＰＰ−ＩＶ）に抵抗性を有する、例えばＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）等のＧＬＰ−１の配列を含んでいてもよい（ＧＬＰ−１融合ペプチドの場合は成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ））。
【００６３】
ジペプチジル  アミノペプチダーゼ  ＩＶによる分解に対するペプチドの抵抗性は、例えば、次の分解評価：ペプチダーゼのサンプルを３７℃で精製したジペプチジル  アミノペプチダーゼ  ＩＶの存在下で、４〜２２時間、適当なｐＨ７〜８の緩衝液（アルブミンが存在しない緩衝液）の中でインキュベートする、により決定される。トリフルオロ酢酸の添加により止められる酵素反応、及びペプチド分解生成物はＨＰＬＣ又はＬＣ−ＭＳ分析を用いることにより分離され精製される。この分析を行なう一つの方法は次の通りである：ミクスチャーをＺｏｒｂａｘ３００ＳＢ−Ｃ１８（３０ｎｍ穴、５μｍ粒子）、１５０×２．１ｍｍカラム上に加え、流速０．５ｍｌ／分にて、０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトライルの線形勾配（０％〜１００％アセトニトライル、３０分間）によって溶出する。ペプチド及びその分解性生物は、それらの２１４ｎｍ（ペプチド結合）又は２８０ｎｍ（芳香族アミノ酸）の吸光度を計測されてもよく、それらのピーク領域の積分により定量されてもよい。分解パターンは、分離されたピークのＭＳスペクトラが決定され得るＬＣ−ＭＳを用いることにより決定され得る。一時の損傷の無い／分解された化合物のパーセンテージはペプチドＤＰＰ−ＩＶ安定性の評価に用いられる。
【００６４】
ここで定義され、本発明の球状のマイクロカプセルに埋め込まれた細胞から発現及び分泌されるＧＬＰ−１（融合）ペプチドは、一時的な損傷の無い化合物のパーセンテージに基づくＧＬＰ−１（７−３７）の非改質ペプチド配列より１０倍であるＤＰＰ−ＩＶ安定性により定義される。従って、ＤＰＰ−ＩＶ安定なＧＬＰ−１ペプチドは、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０倍、例えばＧＬＰ−１（７−３７）ペプチドより安定であることが好ましい。安定性は、例えば、ＤＰＰ−ＩＶを供試されるペプチドの溶液に加え、例えば一定の時間、分光法、ウェスタンブロット解析、抗体スクリーニングする等によってペプチドの分解の決定（上記参照）を行なう等の当業者によく知られた方法により、評価されてもよい。別途、上記にて特定されるＧＬＰ−１ペプチド（例えば、フラグメント及び／若しくは変異又はＧＬＰ−１融合ペプチド）は、例えば、そのネガティブレセプター（ＧＬＰ−１受容体）への結合によるＧＬＰ−１（７−３７）の効果を与える化合物として特定される。好ましくは、上記にて特定されるＧＬＰ−１（融合）ペプチドは、天然に存在するＧＬＰ−１ペプチドの結合特性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも５０％の、ＧＬＰ−１受容体に対する結合特性を有する。結合特性は、例えば表面プラズモン共鳴等のあらゆる適切な方法によって決定され得る。さらに、もし、ここで特定されるＧＬＰ−１（融合）ペプチドが、細胞内にシグナルを伝達するその細胞外受容体への結合によって細胞内ｃＡＭＰの形成を誘導するのであれば、それは好ましい。
【００６５】
インビトロで制御する目的のため、ここで定義されたＧＬＰ−１（融合）ペプチドは、例えば汎用の分離技術を用いて、当該ペプチドを発現する細胞から単離してもよい。例えば、細胞を、適切な条件下、例えば、支持体と栄養素とを含み、インビトロな条件下で育成して、分泌されたタンパク質、すなわち、上記定義がされたＧＬＰ−１ペプチドを細胞外培地から回収してもよい。したがって、細胞内に工作された配列は、好適には、上記定義がされたＧＬＰ−１ペプチド（下記参照）の分泌を可能にするためのシグナル（ペプチド）配列（下記参照）を含む。当該細胞は、好適には、当該シグナル配列を切断することができるプロテアーゼを、そのまま内生的に発現する、又は、遺伝子工学的手法により細胞内に導入しトランスフェクションした後に発現する。あるいは、他の選択肢として、ＧＬＰ−１ペプチドをコードする工作された遺伝子配列は、そのようなシグナル配列を含まず、そのため細胞内に発現したＧＬＰ−１ペプチドは概して分泌がなされず、細胞溶解を含む工程により細胞から回収される。この方法では、コード配列は、培地からペプチド産物を効率的に抽出するための精製用のタグを含んでよく、当該タグは、単離されたＧＬＰ−１ペプチドをリリースするために切断されてよい。しかしながら、この選択肢は、患者に移植され、かつその周囲の組織にＧＬＰ−１ペプチドを送達する要請のある、本発明のマイクロカプセルにかかる細胞としては、概して不適当である。
【００６６】
上記定義がされたＧＬＰ−１ペプチドは、上記定義がなされた細胞内で産生される。例えば、ＧＬＰ−１ペプチドは、本発明にかかる球状のマイクロカプセルの核内に埋め込んだ細胞内で発現され、分泌される。この目的のため、上記定義がなされたＧＬＰ−１ペプチド、又はその断片、又はその変異体が、これら細胞内に含まれた核酸配列によりコードされる。これら核酸配列は、細胞内にもともと存在するものであってもよく、又は、本発明の球状のマイクロカプセルを調製する前に、細胞トランスフェクション技術によって当該細胞に導入されていてもよい。本発明に関して、上記定義がされたＧＬＰ−１ペプチドをコードする、好適な如何なる核酸配列をも使用することができる。遺伝コードの縮重が起こるため、多数の核酸配列がそのようなＧＬＰ−１ペプチドをコードしうる。本発明の好適な実施形態の一つでは、ここで定義される細胞のトランスフェクションに用いる核酸配列は、上記定義がなされたＧＬＰ−１ペプチドをコードする核酸配列と、追加的な（機能性の）核酸配列と、を含んでよい。本発明は、好適には、ここで定義される細胞のトランスフェクションに用いるに好適な核酸配列であり、（ａ）完全なＧＬＰ−１アミノ酸配列（ＧＬＰ−１（１−３７）、又は機能のあるＧＬＰ−１（変異）配列（７−３５、３６又は３７）、又は他の如何なるＧＬＰ−１ペプチド、例えば上記定義がされたＧＬＰ−１融合ペプチドを含む）をコードし、（ｂ）任意に（ａ）にかかるＧＬＰ−１配列のＮ末端において、プロテアーゼ切断配列をコードし、及び、任意に（ｂ）の上流においてシグナルペプチド配列をコードしてもよいもの、を提供する。好適には、当該シグナル（ペプチド）配列は、以下に定義する配列から選択される。
【００６７】
上記定義した核酸配列はベクターに含まれていてもよい。このベクターは、本発明の球状のマイクロカプセルを調製するに好適な、ここで定義する細胞を、トランスフェクトする目的で使用されてもよい。典型的には、このベクターは、特に発現ベクターであり、少なくとも上記定義した核酸配列の一つを含む。本発明で意味する範囲内における「ベクター」とは、上記定義したＧＬＰ−１ペプチドをコードする核酸配列の一つを少なくとも含み、必要であれば、コードされたＧＬＰ−１ペプチド配列の発現を操作するに好適な追加的なエレメントをさらに含む。ここで用いるベクターのあるクラスは、動物ウイルス（ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、又はＳＶ４０等）に由来する、染色体外で独立に複製されるプラスミドを供するＤＮＡエレメントを用いるものである。ここで用いる本発明のベクターの第２のクラスでは、宿主細胞の染色体内に所望する遺伝子配列を組み込むことによるものである。
【００６８】
上記定義がされたベクターは、一般的には、少なくとも一つのＧＬＰ−１ペプチドをコードする核酸配列を、好適なベクターに挿入することで調製される。当該好適なベクターは当業者にはよく知られており、例えば、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｅｄｓ．  Ｐｏｕｗｅｌｓ  Ｐ．  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，  １９８５，  ＩＳＢＮ  ０  ４４４  ９０４０１８）内にレビューすることができる。好適なベクターには、また、プラスミド；ファージ；ＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルス、アデノウイルス、シンドビスウイルス等のウイルス；トランスポゾン；ＩＳ−エレメント；ファスミド；コスミド；直鎖状又は環状ＤＮＡ；等の、当業者に知られている如何なるベクターをも含むことを意図する。哺乳動物細胞内への組み込みには、一般的には、直鎖状ＤＮＡが用いられる。好適には、本発明にて用いられるベクターの種類は、宿主細胞特有の要求に対応したものである。市販品を入手可能な好適な発現ベクターであって、本発明の核酸配列が挿入されてよいものとしては、ｐＳＰＯＲＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ、バキュロウイルス発現ベクターｐＢｌｕｅＢａｃ、原核生物発現ベクターｐｃＤＮＡＩＩ、等が包含され、これらは全てカリフォルニア州サンディエゴにあるインビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）から入手可能である。
【００６９】
本発明の球状のマイクロカプセルの構成物として用いられ得る細胞のトランスフェクションに好適な、ここで定義されたベクターは、一般的には、ＧＬＰ−１をコードする核酸配列と他の調節エレメント（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）、例えばコードされた（本発明の）アミノ酸配列の発現を制御するもの、とを組合わせてなる。このような調節エレメントは、例えば、１）体の一組織又は一領域に特異的、２）構成的、３）グルコース反応性、及び／又は、４）誘導可能／調節可能、なものである。この調節エレメントは、好適には、調節配列及び複製起点（ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（ベクターが自律的複製をする場合には）、から選択される。本発明の範疇において、調節配列は、ＧＬＰ−１をコードする核酸配列の転写発現及び／又は翻訳発現に影響を持ち、かつ当業者に知られた如何なるエレメントであってもよい。プロモータ配列以外に、調節配列には、ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡとの相互作用を高めることにより発現の増強を導きうる、いわゆるエンハンサー配列も含まれる。さらに、本発明のベクターにかかる調節配列は、転写調節及び転写開始シグナル、いわゆる「ターミネータ配列」等である、又はこれらの部分配列である。
【００７０】
概して、自然に存在する如何なるプロモータも、本発明の球状のマイクロカプセルの調製目的で用いられる細胞のトランスフェクションに好適な発現ベクターに含まれていてもよい。このようなプロモータは、如何なる真核生物の、原核生物の、ウイルスの、バクテリアの、植物の、ヒト又は動物の、例えば哺乳動物の、プロモータから選択することができる。好適なプロモータとしては、例えば、サイトメガロウイルスプロモータ；ｌａｃＺプロモータ；ｇａｌ  １０プロモータ：及びＡｃＭＮＰＶ  ポリヘッド（ｐｏｌｙｈｅｄｒａｌ）プロモータ；例えば、ｃｏｓ−、ｔａｃ−、ｔｒｐ−、ｔｅｔ−、ｔｒｐ−ｔｅｔ−、ｌｐｐ−、ｌａｃ−、ｌｐｐ−ｌａｃ−、ｌａｃｌｑ−、Ｔ７−、Ｔ５−、Ｔ３−、ｇａｌ−、ｔｒｃ−、ａｒａ−、ＳＶ４０−、ＳＰ６、Ｉ−ＰＲ−のプロモータ；又は、グラム陰性バクテリアに優位に見出されるＩ−ＰＬ−プロモータ；を包含していてもよい。さらに、プロモータは、ａｍｙ及びＳＰＯ２等のグラム陽性バクテリアプロモータ；ＡＤＣ１、Ｍｆａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ等の、酵母のプロモータ；又は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ等の哺乳動物プロモータ；哺乳動物の筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ、哺乳動物のデスミンプロモータ、哺乳動物のトロポニンＩ（ＴＮＮＩ２）プロモータ、又は哺乳動物の骨格α−アクチン（ＡＳＫＡ）プロモータ、を包含する筋特異的プロモータ；又は肝臓型ピルビン酸キナーゼプロモータ、取り分け（−１８３から＋１２）又は（−９６から＋１２）に相当するこれらの断片（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  （１９９１）．  ２６６：８６７９−８２．；  Ｃｕｉｆら，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  （１９９２）．  １２：４８５２−６１）；ｓｐｏｔ  １４プロモータ（Ｓ１４，  −２９０から＋１８）  （Ｊｕｍｐ，ら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  （１９９０）．  ２６５：３４７４−８）；アセチル−ＣｏＡ  カルボキシラーゼ（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，ら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  （２００１）．  ２７６：１６０３３−９）；脂肪酸合成酵素（−６００から＋６５）  （Ｒｕｆｏ，ら，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  （２００１）．  ２８：２８）；及びグルコース−６−フォスファターゼ（ラット及びヒト）  （Ｓｃｈｍｏｌｌ，ら．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｆｔ，  （１９９６）．  ３８３：６３−６；  Ａｒｇａｕｄ，ら．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  （１９９６）．  ４５：１５６３−７１）；又は、ＣａＭ−キナーゼｌｌのプロモータ、Ｎｅｓｔｉｎのプロモータ、Ｌ７のプロモータ、ＢＤＮＦのプロモータ、ＮＦのプロモータ、ＭＢＰのプロモータ、ＮＳＥのプロモータ、β−グロブリンのプロモータ、ＧＦＡＰのプロモータ、ＧＡＰ４３のプロモータ、チロシン水酸化酵素のプロモータ、カイナット（Ｋａｉｎａｔ）−受容体−サブユニット１、グルタミン酸−受容体−サブユニットＢ、又はヒト・ユビキチンプロモータＢ（ヒトｕｂｉＢ）、ヒト・フェリチンＨプロモータ（ＦｅｒＨ）；等、から取得されてもよい。特に好適なプロモータはヒト又は哺乳動物起源のものである。最後に、都合に応じて合成プロモータも使用可能である。インビトロでの制御目的の��めに、（例えば、育成培地中における栄養素又は他の誘導物質の存在又は非存在により)発現の調節を可能とする目的で、本発明のベクターに含まれるプロモータ配列もまた誘導可能なものであってよい。一例として、バクテリオファージ・ラムダ・ｐｌａｃ５から取得されたＬａｃオペロンがあり、これはＩＰＴＧにより誘導することができる。最後に、上記定義がなされたプロモータは、ＧＬＰ−１をコードする核酸配列の５’上流側に位置するように、当該ＧＬＰ−１をコードする核酸配列と連結されてもよい。好適には、例えば、ヒト・ユビキチンプロモータＢ（ヒトｕｂｉＢ）、又はヒト・フェリチンＨプロモータ（ＦｅｒＨ）等の、ヒト由来のプロモータが用いられる。
【００７１】
ＧＬＰ−１をコードする核酸配列の発現をアップレギュレーションするエンハンサー配列は、好適には、上記定義がなされたベクターの他の構成物である。当該エンハンサー配列は、一般的には、ベクターの非コード３’領域内に位置する。好適には上記定義がなされた対応するプロモータと共に、上記定義がなされたベクター内に組み込まれるエンハンサー配列は、如何なる真核生物、原核生物、ウイルス、バクテリア、植物、ヒト又は動物、例えば哺乳動物の宿主、から得られたものであってもよい。本発明において最も有用なエンハンサーエレメントは、グルコース応答性、インシュリン応答性、及び／又は肝臓特異的なものである。エンハンサーエレメントとしては、例えば、ＣＭＶエンハンサー（例えば、ユビキチンプロモータ（Ｃｕｂｉ）に連結されたもの)；肝臓ピルビン酸キナーゼ（Ｌ−ＰＫ）プロモータのグルコース応答性エレメント（Ｇ１ＲＥ）（−１７２から−１４２）を包含する、一つ又はそれ以上のグルコース応答性のエレメント；及び、応答性が改良されたその改良版（Ｃｕｉｆら，  ｓｕｐｒａ；  Ｌｏｕら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  （１９９９）．  ２７４：２８３８５−９４）；補助的（ａｕｘｉｌｉａｒｙ）Ｌ３ボックス（−１７２から−１２６）を備えたＬ−ＰＫのＧ１ＲＥ（Ｄｉａｚ  Ｇｕｅｒｒａ，ら，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  （１９９３）．  １３：７７２５−３３）；補助的Ｌ３ボックスを備え、応答性が増強されたＧ１ＲＥの改良版；Ｓ１４のカルボヒドラーゼ応答性エレメント（ＣｈｏＲＥ）（−１４４８から−１４２２）、及び低グルコース濃度において活性化されるその改良版（Ｓｈｉｈ及びＴｏｗｌｅ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  （１９９４）．  ２６９：９３８０−７；Ｓｈｉｈ，ら，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  （１９９５）．  ２７０：２１９９１−７；及びＫａｙｔｏｒ，ら，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  （１９９７）．  ２７２：７５２５−３１）；隣接するＳ１４のアクセサリー因子を備えたＣｈｏＲＥ（−１４６７から−１４２２）［ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ］；アルドラーゼ（＋１９１６から＋２３２９）（Ｇｒｅｇｏｒｉら，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  （１９９８）．  ２７３：２５２３７−４３；  Ｓａｂｏｕｒｉｎ，ら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  （１９９６）．  ２７１：３４６９−７３；及び脂肪酸合成酵素（−７３８２から−６９７０）（Ｒｕｆｏ，ら，  ｓｕｐｒａ．）、さらに好適には、グルコース−６−ホスファターゼのインシュリン応答性エレメント（−７８０から−７２２）（Ａｙａｌａら，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  （１９９９）．  ４８：１８８５−９）等のインシュリン応答性エレメント；及び、プロトロンビン（９４０から−８６０）（Ｃｈｏｗら，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  （１９９１）  ２６６：  １８９２７−３３）、等の肝臓特異的エンハンサーエレメント；及び、α−１−ミクログロビン（−２９４５から−２５３９）（Ｒｏｕｅｔら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，  （１９９８）．  ３３４：５７７−８４）；哺乳動物のＭＣＫエンハンサー、哺乳動物のＤＥＳエンハンサー、及び脊椎動物のトロポニンＩ  ＩＲＥ（ＴＮＩ  ＩＲＥ：以降、ＦＩＲＥと称する）エンハンサー、等の筋特異的エンハンサー；を包含してもよい。最後に、ＳＶ４０エンハンサー配列もまた包含されてもよい。
【００７２】
エンハンサーエレメントは、上記定義がなされたプロモータと共に使用されてもよい。例えば、そのようなプロモータ／エンハンサーの組み合わせには、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータとＣＭＶエンハンサーとの組合わせ；ユビキチンプロモータ（Ｃｕｂｉ）に結合されたＣＭＶエンハンサー；ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）エンハンサー、ヒトプロトロンビン（ＨＰｒＴ）エンハンサー、α−１ミクログロブリン（Ａ１ＭＢ）エンハンサー、及びイントロン性の（ｉｎｔｒｏｎｉｃ）アルドラーゼエンハンサー、からなる肝臓特異的エンハンサーエレメントの一群であり、対応するプロモータと組合わせて使用されるもの；又は、ＣＭＶプロモータ又はＨＳＡプロモータからなる群から選択されたプロモータと組合わせて使用されるＨＡＳエンハンサー；ヒトプロトロンビン（ＨＰｒＴ）及びα−１ミクログロブリン（Ａ１ＭＢ）からなる群より選択されるエンハンサーであり、ＣＭＶプロモータと組合わせて使用されるもの；ヒトプロトロンビン（ＨＰｒＴ）及びα−１ミクログロブリン（Ａ１ＭＢ）からなる群より選択されるエンハンサーであり、α−１−アンチトリプシンプロモータと組合わせて使用されるもの；等が包含される。
【００７３】
さらに、本発明の球状のマイクロカプセルの構成物として用いられうる細胞をトランスフェクションするために好適な、上記定義がなされたベクターは、転写シグナル、及び／又は翻訳シグナルを含んでもよく、好適には、適切な宿主により認識される、例えば、転写調節シグナル及び翻訳開始シグナル等の、転写シグナル及び／又は翻訳シグナルを含んでもよい。転写シグナル及び／又は翻訳シグナルは、如何なる真核生物、原核生物、ウイルス、バクテリア、植物から取得することができ、例えば宿主が哺乳動物の場合には好適にはヒト又は動物から取得することができ、好適には、上記定義がなされた対応するプロモータと関連するものである。それゆえに、宿主の性質に応じて、広範な転写及び翻訳調節配列を使用することができる。宿主細胞が、ＧＬＰ−１をコードした核酸配列に関連する転写調節シグナル及び翻訳開始シグナルを認識できる限りにおいて、元から存在するＧＬＰ−１をコードする核酸配列に隣接する５’領域は、そのまま維持されて、かつ本発明のベクター内の転写及び翻訳の調節に用いられてもよい。この領域は、一般的には、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列、その他の、転写及び翻訳の開始に関与する配列を含む。一般的には、この領域は、少なくとも約１５０塩基対の長さがあり、さらに一般的には、約２００ｂｐの長さがあり、稀に１ｋｂを超え２ｋｂの長さがある。
【００７４】
転写開始調節シグナルは、抑制又は活性化を制御した結果、遺伝子の発現が調節されうるように選択される。このような制御可能な調節技術の一つとして、温度を変えることにより発現の抑制又は開始をするための、温度感受性の調節シグナルの使用がある。他の制御可能な調節技術として、特定の化学物質に感受性のある調節シグナルを使用することがある。転写シグナル及び／又は翻訳シグナルにはまた、例えばストップシグナル及びポリアデニル化領域などの、転写終了調節配列が包含される。好適には、転写終了調節配列は、上記定義がなされた、ＧＬＰ−１をコードする核酸配列を含んだベクターのノンコーディング３’領域に位置する。好適な終了配列は、例えば、ウシ成長ホルモンのシグナル、ＳＶ４０のシグナル、ｌａｃＺのシグナル、ＥＦ１  αのシグナル、及びＡｃＭＮＰＶポリヘッド（ｐｏｌｙｈｅｄｒａｌ）ポリアデニル化シグナル、を包含する。
【００７５】
本発明の球状のマイクロカプセルの調製のために用いることができる細胞のトランスフェクションに好適な発現ベクターは、ここで定義されるＧＬＰ−１ペプチドの最適な発現のために他の配列をさらに含むことができる。このような配列としては、シグナル（ペプチド）配列をコードする配列、例えば、分泌されたタンパク質を細胞膜へ移動又は細胞膜を通過させる、Ｎ末端に位置するペプチド配列をコードする配列；発現産物の安定性を供するための配列；制限エンドヌクレアーゼによる切断部位を供する、制限酵素認識配列；が包含される。これらの材料は全てこの技術分野では知られており、商業的に入手可能である（例えば、Ｏｋａｙａｍａ  （１９８３），  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ３：２８０、を参照)。
【００７６】
ここで定義するように「シグナル配列」とは、一般的には、発現したＧＬＰ−１（融合）ペプチドのＮ末端に位置する約１５から３０アミノ酸からなるシグナル（ペプチド）配列であり、ＧＬＰ−１ペプチドを分泌可能にする、例えば、細胞膜を通過可能にするものを指す。そのようなシグナル配列は、通常、野生型のＧＬＰ−１前駆タンパク質と関連するシグナル配列（例えば、全長プログルカゴン前駆分子のシグナル配列）、並びに、通常、これらと関連しないシグナル（ペプチド）配列、例えば、野生型のＧＬＰ−１前駆タンパク質のもの（例えば、全長プログルカゴン前駆分子のシグナル配列）とは異型のシグナル配列、を包含する。ここで定義された「シグナル配列」は、例えば、シグナルペプチド配列、又はリーダー配列（例えば、分泌シグナル（及びリーダー）配列）であってもよい。さらに、ここで定義されたシグナル（ペプチド）配列は、好適には、例えばシグナル配列プロテアーゼ等のプロテアーゼによる（ＧＬＰ−１）前駆ペプチドの切断を提供するものである。プロテアーゼにより（ＧＬＰ−１）前駆ペプチドからシグナル配列を切断することで、生物学的活性のある上記定義のなされたＧＬＰ−１ペプチドが生産される。このようなシグナル配列は、一般的に、プロテアーゼによる切断において認識される切断部位をコードする領域を含む。代わりに、プロテアーゼによる切断において認識される切断部位をコードする領域を、当該シグナル配列に導入することもできる。さらに、プロテアーゼによる切断において認識される切断部位をコードする追加的な（一つ又は一を超える）配列が、シグナル配列に付加されてもよい。
【００７７】
上記定義がなされたベクターによりコードされうるシグナル配列の例として、例えばＧＬＰ−１又はＧＬＰ−１以外のような分泌タンパク質、サイトカイン、凝固因子、イミュノグロブリン、分泌酵素、又はホルモン（下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）／グルカゴン  スーパーファミリー、を包含する）及び血清タンパク質、に由来するシグナル配列を包含する。例えば、ここで定義されるシグナル配列は、分泌マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）由来のもの、例えば、ストロメライシンリーダー配列；分泌ヒトアルカリ性フォスファターゼ（ＳＥＡＰ）由来のもの；プロ−エクセンディン（ｐｒｏ−ｅｘｅｎｄｉｎ）、例えば、プロ−エクセンディン−４リーダー配列；プロ−ヘロデルミン（ｐｒｏ−ｈｅｌｏｄｅｒｍｉｎ）；プロ−グルコース依存性インシュリン分泌刺激ポリペプチド（ｐｒｏ−ｇｌｕｃｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  （ＧＩＰ））；プロ−インシュリン様成長因子（ｐｒｏ−ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  （ＩＧＦ１））；プレプログルカゴン（ｐｒｅｐｒｏｇｌｕｃａｇｏｎ）；α−１アンチトリプシン；インシュリン様成長因子１；ヒト因子ＩＸ；ヒトリンフォトキシンＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＢＡＡ０００６４）；又はヒトクラスタリン（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＡＡＰ８８９２７）；由来であってよい。ここで定義されるシグナル配列の特定の例としては、シグナルペプチダーゼ、フリン（ｆｕｒｉｎ）又は他のプロホルモンの変換酵素（例えば、ＰＣ３）による前駆体切断のためのシグナルをコードする領域を含む配列がある。例えば、フリン（ＰＡＣＥとしても知られる：米国特許第５，４６０，９５０号を参照）、他のズブチリシン（ＰＣ２，  ＰＣ１／ＰＣ３，  ＰＡＣＥ４，  ＰＣ４，  ＰＣ５／ＰＣ６，  ＬＰＣ／ＰＣ７ＩＰＣ８／ＳＰＣ７及びＳＫＩ−１を包含する：Ｎａｋａｙａｍａ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ３２７：６２５−６３５  （１９９７））、エンテロキナーゼ（米国特許第５，２７０，１８１号を参照）又はキモトリプシン、により切断されるシグナルが、ここで定義したシグナル配列として導入することができる。上記書類に開示された内容は、参照としてここに組込まれる。フリンは偏在的に発現しているプロテアーゼであり、ゴルジ体を貫いて（ｔｒａｎｓ−ｇｏｌｇｉ）存在しており、タンパク質の前駆体が分泌される前にそのプロセシングを行なう。フリンは、ＣＯＯＨ末端の共通認識配列、Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、又はＡｒｇ−Ｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、又は（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）−Ａｒｇ−Ｘ−（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）−Ａｒｇ、及び、例えばＡｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−ＡｒｇのようなＡｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇ、において切断する。これらのアミノ酸配列は、プロテアーゼフリンによる前駆体切断のシグナルである。したがって、これとは異種のシグナル配列もまた、シグナル配列に応じた共通配列（例えば、シグナルペプチダーゼにより切断される分泌タンパク質に応じた共通配列）から合成により得ることができる。
【００７８】
上記定義がなされた調節配列に関して追加すれば、上記定義がなされた自律的複製をするベクターは、一般的に、複製起点を含む。好適な複製起点は、これらに限定されるものではないが、例えば、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ＳＶ４０、ｐＭＰＩ（ｏｒｉ  ｐＭＰＩ）及びＭ１３等、の複製起点が包含される。
【００７９】
上記定義がなされたベクターは、好適には、追加的に、自殺遺伝子を含んでもよい。本発明において「自殺遺伝子」とは、好適には、特定の物質を投与することで、本発明のマイクロカプセルの核中に含まれる自殺遺伝子収容細胞を殺すことによって、本発明の球状のマイクロカプセルによる治療を停止させることができるものである。例えば、本発明に好適な自殺遺伝子は、ヒト又は動物の体内で通常は存在していない外因性のアクチベータを投与することで活性化されるものであってよい。この場合、通常は、自殺遺伝子は、細胞がアポトーシスを受けるようなカスケードを開始する。これに代えて、本発明に好適な自殺遺伝子は、ヒト又は動物の体内で通常は存在していない、投与された外因性かつ非毒性なプロドラッグを代謝するものであってよい。外因性かつ非毒性なプロドラッグの代謝は、好適には、当該プロドラッグを細胞毒にするものである。自殺遺伝子は、上記定義がなされたＧＬＰ−１ペプチドをコードするのと同じベクターに含まれてもよく、又は代わりに第二のベクターに含まれてもよい。さらに、自殺遺伝子は、ここで発現ベクターの構成物として言及したプロモータ、エンハンサー等、又は、元来有している制御及び調節エレメントなどの、如何なる制御及び調節エレメントにより調節されてもよい。好適には、上記した制御メカニズムの何れかを可能にするものとして、本発明に応じて自殺遺伝子は選択される。例えば、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＵＰＲＴａｓｅ）、ＨＳＶ  チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−Ｔｋ）、から選択される自殺遺伝子や、例えばバクテリアのＴｅｔ  リプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）等のようなテトラサイクリンの添加により誘導される自殺遺伝子がある。特定の例では、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）が使用されてもよい。当該シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）は、一般的には、様々な生物において存在し、５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を、一般的な化学療法剤を象徴する５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に変換することができるものである。５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）は生物にとり非常に毒性が高い一方で、そのプロドラッグである５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）は細胞に対する毒性がない。５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）は、次いで、細胞キナーゼによりリン酸化され、細胞のＲＮＡ合成を抑止することができる。したがって、プロドラッグである５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）は、特定の細胞の自殺を誘導するに優れたツールの象徴である。さらに、５−フルオロ−ｄＵＭＰは抗葉酸剤としても機能し、デオキシリボヌクレオチドの新規合成（ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）経路においてｄＵＭＰからｄＴＭＰへのメチル化を触媒する酵素チミジル酸シンターゼ（ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）を阻害する。これにより、細胞内のＤＮＡ合成の抑制が、阻害されてもよい。また、好適には、ＨＳＶ−１  チミジンキナーゼ（ＡＴＰ：チミジン−５−ホスホトランスフェラーゼ）及びその対応するプロドラッグであるガンシクロビル（ＧＣＶ）が用いられてもよい。グアノシンのアナログであるＧＣＶは特異的にリン酸化され、ＤＮＡ合成の伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）が阻害され、結果として細胞の自殺を導く。
【００８０】
本発明のマイクロカプセルの調製に用いる好適な細胞内に、上記定義がなされたベクターをトランスフェクションする、又は、これに代えて、ＧＬＰ−１ペプチドをコードする核酸そのものをトランスフェクションすることは、当業者に知られた如何なる方法にても達成することができる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ら、（２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ，  ＮＹ、を参照）。上記定義がなされた好適な細胞内にベクターがトランスフェクションされる場合、当該ベクターは、好適には、ＧＬＰ−１ペプチドをコードする核酸を持つプラスミドＤＮＡの形態で存在する。当該プラスミドＤＮＡは、好適には、環状プラスミドＤＮＡである。好適なトランスフェクションの方法は、特にこれらに限定されないが、例えば、改良型エレクトロポレーション技術を包含したエレクトロポレーション技術（例えば、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ））、例えば、リン酸カルシウム共沈法などのリン酸カルシウム技術、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法、転写介在（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）リポフェクション法等のリポフェクション法、等がある。好適には、トランスフェクションは、改良型エレクトロポレーション技術（例えば、ヌクレオフェクション）を用いて、上記定義がなされたベクターを保持したプラスミドＤＮＡにより行われる。
【００８１】
本発明の他の実施形態では、ここで定義されたＧＬＰ−１（融合）ペプチドであって、本発明の球状のマイクロカプセル内に埋め込まれた細胞から分泌されるものは、成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）として、次の式（ＩＩ）のアミノ酸配列を含んでなる修飾ＧＬＰ−１ペプチドを含む。
式（ＩＩ）：
Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７
ここで、Ｘａａ７は、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、３−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−アセチル−ヒスチジン、ａ−フルオロメチル−ヒスチジン、ａ−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン又は４−ピリジルアラニンであり、Ｘａａ８は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロブチル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボキシル酸、又は（１−アミノシクロオクチル）カルボキシル酸であって、Ｇｌｙが特に好ましく；Ｘａａ１６はＶａｌ又はＬｅｕであり；Ｘａａ１８はＳｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ１９はＴｙｒ又はＧｌｎであり；Ｘａａ２０はＬｅｕ又はＭｅｔであり；Ｘａａ２２はＧｌｙ、Ｇｌｕ又はＡｉｂであり；Ｘａａ２３はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２５はＡｌａ又はＶａｌであり；Ｘａａ２６はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２７はＧｌｕ又はＬｅｕ；Ｘａａ３０はＡｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３３はＶａｌ又はＬｙｓであり；Ｘａａ３４はＬｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＡｒｇ；Ｘａａ３５はＧｌｙ又はＡｉｂであり；Ｘａａ３６はＡｒｇ、Ｇｌｙ若しくはＬｙｓ若しくはアミド又は欠損しており；Ｘａａ３７はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、アミド又は欠損している。
【００８２】
本発明のさらに他の実施形態では、本発明の球状のマイクロカプセルに用いられる当該ＧＬＰ−１（融合）ペプチドの、本発明の成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）として、次の式（ＩＩＩ）のアミノ酸配列を含んでなる修飾ＧＬＰ−１ペプチドを含む。
式（ＩＩＩ）：
Ｘａａ７‐Ｘａａ８‐Ｇｌｕ‐Ｇｌｙ‐Ｔｈｒ‐Ｐｈｅ‐Ｔｈｒ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｐ‐Ｖａｌ‐Ｓｅｒ‐Ｘａａ８‐Ｔｙｒ‐Ｌｅｕ‐Ｇｌｕ‐Ｘａａ２２‐Ｘａａ２３‐Ａｌａ‐Ａｌａ‐Ｘａａ２６‐Ｇｌｕ‐Ｐｈｅ‐ｌｌｅ‐Ｘａａ３０‐Ｔｒｐ‐Ｌｅｕ‐Ｖａｌ‐Ｘａａ３４‐Ｘａａ３５‐Ｘａａ３６‐Ｘａａ３７
ここで、Ｘａａ７は、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−アセチル−ヒスチジン、ａ−フルオロメチル−ヒスチジン、ａ−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン又は４−ピリジルアラニンであり；Ｘａａ８はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロブチル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボキシル酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボキシル酸、又は（１−アミノシクロオクチル）カルボキシル酸であり；Ｘａａ１８はＳｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２２はＧｌｙ、Ｇｌｕ又はＡｉｂ；Ｘａａ２３はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２６はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３０はＡｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり;Ｘａａ３４はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３５はＧｌｙ又はＡｉｂであり；Ｘａａ３６はＡｒｇ又はＬｙｓ、アミド又は欠損しており；Ｘａａ３７はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓ、アミド又は欠損している。
【００８３】
特に好適な実施形態では、本発明の球状のマイクロカプセルは、ＧＬＰ−１（融合）ペプチドであって、その成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）として、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３６）−アミド、ＧＬＰ−１（７−３７）、又はこれらの変異体、アナログ、又は誘導体、から選択される（修飾）ＧＬＰ−１ペプチドを含むもの、を含むものである。好適なものとしてはまた、ＧＬＰ−１（融合）ペプチドであって、その成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）中８番目の位置にＡｉｂ残基を持つ修飾ＧＬＰ−１ペプチドを含むもの、又は、当該ＧＬＰ−１ペプチドの７番目の位置に、Ｄ−ヒスチジン、デス−アミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−アセチル−ヒスチジン、ａ−フルオロメチル−ヒスチジン、ａ−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン、及び４−ピリジルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸残基を持つものである。
【００８４】
式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）により上記定義がなされ、かつ本発明に使用可能なＧＬＰ−１（融合）ペプチドの成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）にかかる具体例は何れも、ＧＬＰ−１（融合）ペプチドにかかる上記開示と組合わせてもよい。換言すれば、一般式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）は、例えば、成分（ＩＩ）、リンカー、製造工程等にかかる上記開示と組合わせてもよい。
【００８５】
さらに、本発明のマイクロカプセルの核内に埋め込まれる細胞により発現され、分泌されるＧＬＰ−１（融合）ペプチドは、好適には、例えば、ポリアミノ酸等の、少なくとも一つの合成ポリマー又は天然ポリマーを含んでもよい。当該少なくとも一つのポリマー成分は、一般的には、融合ペプチドサブユニットと共有結合をしている。本発明において「コンジュゲートした」とは、「化学的に結合した」ことを意味することを意図している。「化学的に結合した」とは、共有結合又は非共有結合を介して結合したことを意味することを意図している。共有結合が好適である一方で、当該ポリマー成分はまた、共有結合なく複合化すること、例えば、水素結合又は静電気的な相互作用、疎水的な相互作用等、を介して、当該融合ペプチドと連結されてもよい。当該融合ペプチド及び当該ポリマーを含んだ複合体全体を、以下、「ＧＬＰ−１コンジュゲート複合体」、又は「ＧＬＰ−１コンジュゲート分子」、と称する。
【００８６】
この結果、当該ＧＬＰ−１コンジュゲート複合体は、さらに、主にタンパク質分解にかかるエンドペプチダーゼＩＶの活性を原因とする、ビボにおけるタンパク質分解から保護されてさえいる。少なくとも二つの成分（Ｉ）及び（ＩＩ）と当該合成ポリマーとからなるＧＬＰ−１（融合）ペプチドを持つ又は含んでなる、当該コンジュゲート複合体は、ＧＬＰ−１の生物学的活性を示し、同時に、Ｃ末端の伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）によりＧＬＰ−１にその成分（Ｉ）と同等の安定性を与える。それゆえに、当該融合ペプチドをポリマーにコンジュゲートすることで、そのビボでの安定性が相当に増大する。
【００８７】
ここで使用される当該ポリマーは、生理学的に受け入れ可能なポリマーであってよい。このようなポリマーには、水溶性の溶液又は懸濁液中に溶解することができ、かつ、薬学的に有効な量の当該融合ペプチドを投与したときに動物に与えるネガティブな影響、例えば、副作用等、を持たないものが包含される。本発明に関して使用される、生理学的に受け入れ可能なポリマーは特に限定されない。当該ポリマーは、合成性のもの、又は天然に生じたポリマー（天然ポリマー、例えば、タンパク質）であってもよい。
【００８８】
１、２、又は３つのポリマー成分、好ましくは１つのポリマー成分は、当該融合ペプチドサブユニットに共有結合により結合してＧＬＰ−１コンジュゲート分子を形成してもよい。しかしながら、特定の実施形態では、融合ペプチドサブユニット当たり３つ以上のポリマー成分が、供されてもよい。当該成分は、当該融合ペプチドの成分（Ｉ）又は（ＩＩ）の何れか、又は双方と、共有結合してもよい。少なくとも一つの当該ポリマー成分が、成分（ＩＩ）に結合することが好ましい。１つ又はそれを超えるポリマー成分が成分（Ｉ）に結合する場合には、当該ポリマー成分は、Ｎ末端、又は、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン又はアルギニン残基の側鎖、に結合することが好適である。好適には、成分（Ｉ）が有する、Ｔｈｒ１１、Ｔｈｒ１３、Ａｓｐ１５、Ｓｅｒ１７、Ｓｅｒ１８、Ｔｙｒ１９、Ｇｌｕ２１、Ｌｙｓ２６、Ｇｌｕ２７、Ｌｙｓ３４、Ａｒｇ３６残基の一つ又はそれを超える側鎖が、結合の目的で使用される。天然に存在するＩＰ２の配列が成分（ＩＩ）として用いられる場合、そのＡｒｇ、Ｇｌｕ、及びＡｓｐ残基の一つ又はそれを超える残基が、その側鎖において、ポリマー成分により修飾される。
【００８９】
ポリマー、特にＰＥＧをＮ末端に結合することは、当該コンジュゲート分子の精製に有益である。また、他の如何なる残基、例えば、他の如何なるリジン残基、へポリマーがランダムに結合することと比較して、ポリマーがＮ末端に結合することは、生物学的活性がよりよく保存されると考えられる。よって、好適な実施形態では、少なくとも一つのポリマー成分は、融合タンパク質のＮ末端に位置する。ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）が用いられる場合、本発明のペプチドに含まれる、末端又は側鎖のカルボキシル基、又はリジンのイプシロンアミノ基のＰＥＧ化は、酸化に対する耐性を与えるが、これもまた本発明の範疇に含まれる。
【００９０】
さらに、一般的には、本発明の球状のマイクロカプセルの核内に用いられるＧＬＰ−１（融合）ペプチドが有する合成ポリマーは、好適には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、ポリオキシエチレンポリオール（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙｏｌ）、ポリオレフィンアルコール（ｐｏｌｙｏｌｅｆｉｎｉｃ  ａｌｃｏｈｏｌ）、ポリビニルピロリドン、ポリヒドロキシアルキルメタクリルアミド、ポリヒドロキシエチレンメタクリレート等のポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリル酸塩、ポリサッカライド、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリビニルアルコール、ポリフォスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルフォリン）、ポリビニルエチルエーテル、ポリビニルアセタール、ポリ乳酸グリコール酸、ポリ乳酸、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、ポリウレタン（ｐｏｌｙｕｒｅｔｈｙｎｅ）、ポリシアル酸セルローストリアセテート（ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｔｒｉａｃｅｔａｔ）、ニトロセルロース、及び前述した如何なるもの同士の組合わせ、から選択される。好適には、天然ポリマーは、その側鎖又は末端基（アミノ基及び／又はカルボキシル基）を介してＧＬＰ−１（融合）ペプチドに結合するペプチド又はタンパク質であり、好適にはアルブミン及びトランスフェリンである。
【００９１】
上記定義がなされた本発明の球状のマイクロカプセルは、好適には、２又はそれを超える方法工程によって調製される。方法工程１）によれば、上記定義がなされた核が調製される。方法工程２）によれば、方法工程１）により調製された当該核が、表面コーティングにより被覆される。さらなる任意の工程は、追加的な表面コーティングの調製を含む。好適には、追加的な表面コーティングでは、方法工程２）と同じ工程が実行される。さらなる任意の工程は、洗浄工程を含む。
【００９２】
典型的には、上記開示がなされた核は、本発明の球状のマイクロカプセルを調製する方法工程１）によって調製される。そのような核は、架橋ポリマーと、上記開示した方法によりトランスフェクションされたＧＬＰ−１を発現し分泌する細胞と、から構成される。方法工程１）によれば、典型的には、溶解可能な形態のポリマー、例えば、溶解可能な形態のアルギナート（例えば、生理的食塩水中のカルシウムアルギナート又はナトリウムアルギナート）と、ＧＬＰ−１を発現し分泌する細胞と、の混合物（懸濁液）が調製され、好適には、ポリマー溶液１ｍｌあたりの細胞数が５×１０７個までの濃度で調製される。
【００９３】
均質化された細胞／ポリマー懸濁液（例えば、細胞／アルギナート懸濁液）は、典型的には空気注入スプレーノズルを介して押し出される。当該空気注入スプレーノズルは、内側チャネル、中間チャネル、外側チャネル（エアーリング）の３つのチャネルからなり、これらは共通の中心の周りに配された３つの同心円リングとして、同心円状に配される。好適には、５０μｍから２，０００μｍまでの内径を持つ中空針（ｈｏｌｌｏｗ  ｎｅｅｄｌｅｓ）が、内側チャネルの目的で使用される。典型的には中間チャネルは６０μｍから４，０００μｍの内径を有し、外側チャネル（エアーリング）は、好適には１００μｍから５，０００μｍの内径を有する。もっぱら内側チャネルと外側チャネル（エアーリング）とが、本発明のマイクロカプセルの核を調製するために、方法工程１）において使用される。したがって、二つのチャネル（内側及び外側チャネル）のみからなるスプレーノズルもまた、方法工程１）において使用することができる。３つのチャネルを持つ空気注入スプレーノズルを用いた場合、典型的には、中間チャネルを材料が流れることはない。細胞／ポリマー溶液の懸濁液は、典型的には、内側チャネルを通り１０μｌ/ｍｉｎから５ｍｌ/ｍｉｎの速度で押し出され、当該チャネルの出口で液滴となり、この液滴は、典型的には０．５ｌ/ｍｉｎから１０ｌ/ｍｉｎの速度で外側チャネル（エアーリング）により供給されるエアーフローにより粉砕される。細胞と架橋されていないポリマー溶液とを含む液滴は、架橋剤を含む溶液（投下槽（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｂａｔｈ））中に落ち込む。架橋剤を含む当該溶液は、典型的には、空気注入スプレーノズルの出口の下、約４ｃｍから約６０ｃｍの距離に位置する。液滴は、好適には、落下する最中に回転し、それにより実質的に幾何学的に球状な形態となる。架橋剤は、当該ポリマーにイオン性の架橋をもたらし、約２０μｍから約４，０００μｍの直径を有する本発明の球状（水溶性）マイクロカプセルの核が、はじめに形成される。本発明の球状のマイクロカプセルの核の直径は、方法工程１）にて使用される、選択したチャネルのサイズと結合構造とに依存する。ポリマーとしてアルギナートを使用する場合、架橋剤を含む当該溶液（投下槽）は、好適には二価のカチオン、例えば、カルシウムイオン又はバリウムイオン（５−１００ｍＭ）、又は他の二価又は多価のカチオン、を含んでなる。さらに、投下槽は、好適には、バッファー物質（例えば、１ｍＭ−１０ｍＭのヒスチジン）、及び塩化ナトリウム（例えば、２９０ｍＯｓｍｏｌ±５０ｍＯｓｍｏｌ）を含む。アルギナート以外のポリマーが使用された場合、当該技術分野で知られた、他の好適な架橋剤及びバッファーをここで用いることもできる。
【００９４】
方法工程１）は、架橋したポリマーと細胞とからなる本発明のマイクロカプセルの核を提供する。方法工程１）に次いで、任意の方法工程として、洗浄工程を含むことができる。本発明の球状のマイクロカプセルの核は、例えば、生理的食塩水又は他の好適な洗浄溶液により洗浄され、適用可能な場合には、当該核は、硫酸ナトリウム溶液中で、好適には、ＵＳ６，５９２，８８６に従った硫酸ナトリウム溶液中でインキュベートされる。ＵＳ６，５９２，８８６の開示は、ここに参照として組み込まれる。本発明の球状のマイクロカプセルの核を、投下槽及び／又は洗浄槽から分離することは、典型的には、遠心分離又は他の好適な方法を用いて実行される。
【００９５】
方法工程２）によって、方法工程１）により調製された本発明の球状のマイクロカプセルの核は、実質的に架橋ポリマーからなる表面コートにより被覆される。よって、工程１）により調製された、本発明の球状のマイクロカプセルの核は、上記開示をした架橋されていないポリマーを含み細胞を含まない、ポリマー溶液に加えられる。好適には、当該ポリマーは、上記定義がなされた濃度で、架橋されていない形態で供される。典型的には、当該ポリマー溶液と本発明の球状のマイクロカプセルの核とを含むこの混合物は、上記記述をした空気注入スプレーノズルの内側チャネルを通して、例えば、１５μｌ／ｍｉｎから２ｍｌ／ｍｉｎ、好適には、１０μｌ／ｍｉｎから５ｍｌ／ｍｉｎの速度で押し出される。同時に、細胞を含まない、純粋な、架橋されていないポリマー溶液、好適には、約０．１％から約４％（ｗ／ｖ）のポリマーを含む溶液、例えば、細胞を含まないアルギナート溶液は、中間チャネルを通して、典型的には１５μｌ／ｍｉｎから２ｍｌ／ｍｉｎ、好適には１０μｌ／ｍｉｎから５ｍｌ／ｍｉｎの速度で押し出される。これにより、中間チャネルの末端に、当該核と、架橋されていないポリマーからなる表面と、を含む液滴が形成される。これらの液滴は、典型的には０．５ｌ／ｍｉｎから１０ｌ／ｍｉｎの速度で外側チャネル（エアーリング）を介して供されるエアーフローにより粉砕される。本発明の球状のマイクロカプセルの核におけるポリマー濃度、本発明のマイクロカプセルの核が添加される当該ポリマー溶液におけるポリマー濃度、及び、表面コーティングにおける当該ポリマー濃度、は異なっていてもよい（上記参照）。本発明の球状のマイクロカプセルの核（方法工程２）に従い調製される）を含む液滴は、上記定義がなされた架橋剤を含む溶液（投下槽）中に落ち込む。落下する間に、好適には、当該液滴は丸まり、おおよそ幾何学的に球状な形態となる。方法工程１）に類似して、架橋剤は当該ポリマーにイオン性の架橋をもたらす。これにより、６０μｍから４，０００μｍの直径を有する、水溶性の球状のマイクロカプセルが形成される。方法工程２）で得られる本発明の球状のマイクロカプセルの直径は、ここで使用される、選択したチャネルのサイズと結合構造とに依存する。１又はそれを超える表面コーティングを持つ本発明のマイクロカプセル、例えば、上記定義がなされた核と、２、３、４、５、５−１０又はそれ以上の表面コーティングとを含んでなる本発明の球状のマイクロカプセル、を調製するために、方法工程２）を必要な頻度で反復実施してもよい。
【００９６】
方法工程２）に引き続いて、上記定義がなされた洗浄工程を任意に行ってもよい。
【００９７】
本発明のさらに他の側面によれば、本発明の球状のマイクロカプセルを投与することによる、動物の治療方法、好適にはヒトの治療方法が提供される。当該発明は、本発明の球状のマイクロカプセルを、製品の製造、例えば、医薬組成物又はキットの調製、に使用することも包含する。好適には、本発明の球状のマイクロカプセルは、グルコース代謝と関連する病気又は健康状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の治療又は予防に用いられる（医薬組成物の調製の目的で）。グルコース性不調（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）の制限されない例として、例えば、真性糖尿病タイプＩ又はタイプＩＩ、インシュリン耐性、体重不調、これらに関連する疾患又は健康状態、等が包含され、ここで、当該体重不調又は関連する健康状態には、肥満、体重超過関連症状（ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）、満腹感による調節の欠如（ｓａｔｉｅｔｙ  ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、血漿中のインシュリンレベルの低下、血中のグルコースレベルの増加、又は膵臓β細胞量の減少、が包含される。好適には、タイプＩＩ糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の治療のための、本発明の球状のマイクロカプセルの使用（医薬組成物の調製の目的で）がここで開示される。結果として、本発明は、本発明の球状のマイクロカプセルの使用（医薬組成物の調製の目的で）、例えば、患者の体重減少、患者の満腹感（ｓａｔｉｅｔｙ）の低下、食後における患者の血漿中のインシュリンレベルの増加、絶食時の患者の血中グルコースレベルの減少、患者における膵臓β細胞量の増加、又は、患者における糖尿病タイプＩ又はＩＩの治療、を目的とする使用、に言及する。
【００９８】
他の病気又は不調にかかる患者も、同様に、本発明の球状のマイクロカプセルにより治療されうる。本発明の球状のマイクロカプセルは、神経変性不調及び疾患又はこれに関する状態の治療目的で（医薬組成物の調製のために）用いられてもよい。また、本発明の球状のマイクロカプセルは、アポトーシスに関連する不調及び疾患又は状態の治療目的で（医薬組成物の調製のために）用いられてもよい。ＧＬＰ−１を発現し分泌する細胞がその核に埋め込まれている本発明の球状のマイクロカプセルを、これら不調の治療に用いる結果、次のことが起こる。サイクリックＡＭＰセカンドメッセンジャー経路に結合するＧＬＰ−１受容体が、げっし類及びヒトの脳全体に発現する。脳における受容体の分布の化学構造（ｃｈｅｍｏａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）は、食物の摂取及び有害なストレスへの応答の制御におけるＧＬＰ−１の中心的な役割と単に相関をしているだけではない。さらに、そのＧＬＰ−１受容体におけるＧＬＰ−１結合は、向神経性（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ）の特性を発揮し、培養神経細胞におけるグルタミン酸誘導性のアポトーシス及び酸化による損傷に対する保護をも提供する。さらにＧＬＰ−１は、細胞培養において、アミロイドβタンパク質前駆体のプロセシングを調節する作用を示し、かつ、投与量依存的に（ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ）、インビボの脳におけるアミロイドβタンパク質を減少させる。ゆえに、ＧＬＰ−１はまた、中枢神経系の制御因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）としても知られる。生理学的に活性のあるＧＬＰ−１の生物学的活性を模倣したＧＬＰ−１ペプチドは、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）及び他の中枢神経又は末梢神経変性状態、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アレキサンダー（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）病、アルパース病（Ａｌｐｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、毛細血管拡張性運動失調（Ａｔａｘｉａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、カナバン（Ｃａｎａｖａｎ）病、コケーン（Ｃｏｃｋａｙｎｅ）症候群、クロイツフェルト・ヤコブ病、多発性硬化症、サントホフ（Ｓａｎｄｈｏｆｆ）病、ピック（Ｐｉｃｋ’ｓ）病、脊髄小脳失調症（Ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  Ａｔａｘｉａ）、シルダー（Ｓｃｈｉｌｄｅｒ’ｓ）病、及びパーキンソン病、並びに、脳卒中、脳出血（ＩＣＨ）、くも膜下出血、副腎白質ジストロフィー（ｘ−ＡＬＤ）又は他の白質ジストロフィー等、の治療において治療的効果（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ）を有する。
【００９９】
さらに、生理学的に活性なＧＬＰ−１は、様々な細胞に対して抗アポトーシス効果を示し、例えば、ＧＬＰ−１は新鮮な単離されたヒト・ランゲルハンス島又は他の細胞タイプの量及び機能を保存するに効果的である。すなわち、本発明の球状のマイクロカプセル（生物学的活性のあるＧＬＰ−１ペプチドを発現し分泌している）は、細胞又は組織のアポトーシスにより引き起こされる不調の治療に用いられてもよい。
【０１００】
本発明の他の側面としては、本発明の球状のマイクロカプセルを含む医薬組成物であり、これは外的に（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｌｙ）投与されてよい。そのような医薬組成物は、上記した不調を患っている患者に適用されてよい。
【０１０１】
本発明の球状のマイクロカプセルを「活性成分」として含む医薬組成物の調製は、概して、当該技術分野ではよく理解されており、例えば、米国特許第４，６０８，２５１号、第４，６０１，９０３号、第４，５９９，２３１号、第４，５９９，２３０号、第４，５９６，７９２号、及び第４，５７８，７７０号が典型例として示される。これらは全て、ここに参照として組み込まれる。
【０１０２】
本発明の医薬組成物（又は、本発明の球状のマイクロカプセル）は、患者に対して外的に投与されてよい。典型的な投与形態には、特に限定されるものではないが、注射等による、例えば、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）投与、皮内投与、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）投与、筋内投与、又は、患部における経静脈、皮膚又は皮下注射、等の非経口投与がある。前記した疾患又は不調の何れかにとり適した治療法としての他の投与形態には、本発明の医薬組成物又は球状のマイクロカプセル（好適には、例えば、好適な医薬担体の付加により、好適な形態、例えば、ゲル状、カプセル状、タブレット状等に調剤されて）の移植、が包含される。非経口投与用の本発明の医薬組成物は、例えば、ＷＯ０３／００２１３６の記載のように調製されてよい。ＷＯ０３／００２１３６における開示は、ここに参照として組み込まれる。
【０１０３】
本発明に適した投与部位には、治療を受ける患者の組織、例えば、脂肪組織、脳、肝臓、筋肉、等、並びに体液、例えば、血液、リンパ液、脳液（ｂｒａｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ）等、が包含される。本発明の医薬組成物の投与に適したデバイスには、投与形態に応じて選択される如何なる好適なデバイスも含まれ、かつ、当業者により選択されてよい。
【０１０４】
これに限定されないが、本発明の医薬組成物は、例えば、サイズが１２から２６Ｇの、より好ましくは１８から２２Ｇの注射針を持つような、適切な注射針を用いた注射等により投与されてよい。或いは、好ましくは適切な形態に調剤された本発明の医薬組成物を、例えば外科用メスや上記定義がなされた注射針などの外科デバイスを用いて移植することで、投与されてよい。これにより本発明の実施形態を限定的に解釈するべきではないが、特定の例によれば、タイプ２糖尿病、又はそれに関連する他の疾患、又はここに開示した患者であって、上記投与を必要とする者は、本発明の医薬組成物（本発明の球状のマイクロカプセルを含む）を、例えばその者の脂肪組織等に対し皮下注射又は移植を受けてもよい。本発明の球状のマイクロカプセルを含む当該本発明の医薬組成物は、上記定義がなされた細胞、例えば、インビボ又はインビトロで脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）に分化する間葉系幹細胞を含んでもよい。さらに、ここで定義がなされた神経変性疾患の患者は、本発明の医薬組成物を、脳組織、例えば脳実質（ｂｒａｉｎ  ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ）に移植を受けてもよい。
【０１０５】
典型的には、医薬組成物は、水性溶液又は懸濁液として注射可能に調製され、好適には水を含み（水性調剤（ａｑｕｅｏｕｓ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ））又は乳化されていてもよい。「水性調剤」との用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む調剤として定義付けられる。同様に、「水性溶液（ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）」との用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む溶液として定義付けられる。「水性懸濁液（ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）」との用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む懸濁液として定義付けられる。
【０１０６】
静脈、皮膚、又は皮下注射、又は患部への注射の目的では、本発明の医薬組成物は、非経口投与で受け入れ可能な水性溶液であり、発熱物質フリー（ｐｙｒｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ）でかつ適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する形態にされる。液状医薬組成物は、概して、水などの液状媒体（ｌｉｑｕｉｄ  ｖｅｈｉｃｌｅ）を含む。好適には、当該液状媒体は、生理的食塩水、デキストロース−エタノール、又は他のサッカライド溶液、又は、エチレングリコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール又はこれらの組合わせ等のグリコール類、が含まれてよい。さらに他の例では、例えばリンガー液や乳酸化リンガー液等の生理的塩類溶液等の、その他の等張性媒体を含む。
【０１０７】
本発明の医薬組成物が、本発明の球状のマイクロカプセルの水性溶液と、例えばバッファーとを含みなる場合、当該本発明の球状のマイクロカプセルは、典型的には、医薬組成物中に、０．１ｍｇ／ｍｌ又はそれを超える濃度で存在し、また、当該医薬組成物は、通常、約２．０から約１０．０のｐＨであり、好適には、約７．０から約８．５のｐＨである。
【０１０８】
本発明の医薬組成物には、他の成分が存在する場合もある。そのような追加的な成分には、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、バルク剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、ｐＨ緩衝剤（例えば、リン酸塩バッファー、クエン酸塩バッファー、マレイン酸塩バッファー）、保存剤、界面活性剤、安定化剤、強壮修飾剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）、キレート剤、金属イオン、油性媒体（ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ）、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン又はタンパク質）、及び／又は双性イオン（例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リシン及びヒスチジン等のアミノ酸）、が包含される。当該成分は、本発明の球状のマイクロカプセルの核内に埋め込まれた細胞が持つ特定の要求、例えば、当該成分は細胞毒性がなくかつ当該細胞の生存を確保できる等、に従って、熟練者により選択される。さらに、当該成分は、本発明の球状のマイクロカプセルの核内に埋め込まれた細胞により既に発現及び分泌がなされたＧＬＰ−１ペプチドを安定化してもよい。
【０１０９】
緩衝剤（ｂｕｆｆｅｒｓ）に関すれば、好適には、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リシン、アルギニン、ジヒドロゲンリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ヒドロゲンリン酸ジナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、リン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、ヘペス、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、又はこれらの混合物、からなる群より選択される。これら特定の緩衝剤はそれぞれ、本発明の他の実施形態を構成する。
【０１１０】
本発明の球状のマイクロカプセルを含む医薬組成物中に、上で言及した添加物を使用すること、特にこれらの濃度範囲、に関しては、熟練者には良く知られている。丁度よい参照として、レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）「Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  １９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９５．」がある。
【０１１１】
本発明の球状のマイクロカプセルを含む本発明の医薬組成物は、好適には、１回分の投薬量（ｄｏｓａｇｅ）処方に適合するような方法にて投与され、かつ、治療上有効な量にて投与される。本発明の医薬組成物とともに（又は、必要に応じて単独で）投与される本発明の球状のマイクロカプセルの量は、治療を受ける患者及び病気、例えば患者の病気の重症度等を含む、による。
【０１１２】
好適な１回分の投薬量の範囲は、予め予定した期間内での、本発明の球状のマイクロカプセル（本発明の医薬組成物に含まれて）により分泌された生物学的活性を有するＧＬＰ−１ペプチドの量に依存するが、典型的には、一日あたり１マイクログラムから数百マイクログラムのオーダーの範囲内である。典型的には、本発明の医薬組成物中に含まれる、本発明の球状のマイクロカプセルは、１日あたり、当該本発明の球状のマイクロカプセル１ｍｌあたり約０．５μｇのＧＬＰ−１を分泌する。従って、一回分の投薬量の範囲は、例えば、１日あたり約０．０１μｇから２０ｍｇの、生物学的活性のある分泌されたＧＬＰ−１ペプチドの範囲内であってよい（しかしながら、１−１００ｍｇの範囲内より多量の範囲内もまた考えられる）、例えば、１日あたり約０．０１μｇから１０ｍｇの範囲内であり、好適には１日あたり０．０１μｇから５ｍｇの範囲内であり、及びさらにより好適には１日あたり約０．０１μｇから１ｍｇの範囲内であり、最も好適には１日あたり約０．０１μｇから５００μｇの範囲内である。
【０１１３】
〔図面の説明〕
図１は、本発明の球状のマイクロカプセルの調製に用いられる細胞内に含まれる、特に限定されない例示のコンストラクトａ−ｍ（実施例1も参照）の概観を表す。
【０１１４】
図２は、一時的なトランスフェクション後における、ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞及びＨＥＫ２９３細胞内における異なるＧＬＰ−１コンストラクトの一時的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発現、及び活性型のＧＬＰ−１の一時的発現、の結果を描写するものである（実施例２もまた参照）。単量体性（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ）のＧＬＰ−１コンストラクト♯１０３及び♯３１７（ＧＬＰ−１（７−３７）を一コピーのみ有する）において、ごくわずかな活性型のＧＬＰ−１の発現を見ることができる。ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞及びＨＥＫ２９３細胞内の双方で、二量体性（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ）のＧＬＰ−１コンストラクト♯２１７（ＧＬＰ−１（７−３７）を成分（Ｉ）及び成分（ＩＩＩ）として有する）において、発現の非常な増加が観察された。
【０１１５】
図３は、ＧＬＰ−１分泌細胞からの細胞培養上清をウェスタンブロット解析した結果を示す（実施例３もまた参照）。レーン１：模擬（ｍｏｃｋ）トランスフェクトがなされたｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞の上清中に溶解した１００ｎｇの合成ＧＬＰ−１（７−３７）；レーン２：コンストラクト♯２１７からの二量体性のＧＬＰ−１を分泌しているｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞（クローン７９ＴＭ２１７／１３）の上清；レーン３：コンストラクト♯２１７からの二量体性のＧＬＰ−１を分泌しているＡｔＴ２０細胞（クローン８１−Ａ−２１７／３）の上清；レーンＭ：前染色されたタンパク質マーカー（ｋＤａ）；この結果は、ここで定義がなされた、ＧＬＰ−１（７−３７）及びＣ末端の付加（図３の２及び３）を含むポリペプチドは、トランスフェクトされたセルラインから分泌され、ＧＬＰ−１（７−３７）の中央分子（ｍｉｄ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）エピトープに結合する抗ＧＬＰ−１抗体を用いて検出されることを示す。
【０１１６】
図４及び図５は、本発明に従い使用されるＧＬＰ−１を用いて行なった、血漿安定性試験（インビトロ）を記述する。この目的のため、ＨＥＫ２９３細胞及びｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞は、ＧＬＰ−１（７−３７）（１）、ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２−１１アミノ酸により伸長（２）、及びＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２−ＧＬＰ−１（７−３７）（３）のコンストラクトにより、一時的にトランスフェクトされた。結果は、図４（ＨＥＫ２９３細胞）及び図５（ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞）に示す。ＨＥＫ２９３細胞及びｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞はともに、当該遺伝子コンストラクトにとり有効な宿主である（実施例４もまた参照）。
【０１１７】
図６は、下記に示すペプチドのウェスタンブロットを示す。以下の意味が付与される：配列番号１（ＩＤ１ｓｙｎ）はＧＬＰ−１（７−３７）に対応し、３１アミノ酸、３．３ｋＤである;配列番号８（ＩＤ８ｓｙｎ，ＣＭ３）はＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２に対応し、４６アミノ酸、５．１ｋＤである;配列番号７（ＩＤ７ｒｅｃ，ＣＭ２）はＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２−ＲＲ−ＧＬＰ２に対応し、８３アミノ酸、９．４ｋＤである;配列番号６（ＩＤ６ｓｙｎ，ＣＭｌ）はＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２−ＲＲ−ＧＬＰ１（７−３７）に対応し、７９アミノ酸、８．７ｋＤである（実施例５もまた参照）。
【０１１８】
図７は、インビトロでのＧＬＰ−１ペプチドの血漿安定性試験を例証する。そのままのＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号１）と対照して、そのＣ−末端が伸長されたＧＬＰ−１ペプチドである配列番号６、配列番号７、及び配列番号８は、インビトロでのヒト血漿中で相当に安定化される。コントロールとして（右手側）、ＤＰＰ−ＩＶインヒビターを添加した実験で得られた結果を示す。ＧＬＰ−１の活性は、これらのコントロール実験において完全に維持される（実施例６もまた参照）。
【０１１９】
図８は、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の産生をともなうインビトロでのバイオアッセイの結果を示す：図８より見ることができるように、１００％ｃＡＭＰ産生は、ＧＬＰ−１が不存在の場合の基礎産生に対応する。ＧＬＰ−１は、Ｇタンパク質結合受容体に結合して、ｃＡＭＰ産生を刺激する。試験したすべてのＧＬＰ−１分子（ＩＤ１ｓｙｎ、ＩＤ６ｓｙｎ、ＩＤ６ｒｅｃ、ＩＤ７ｒｅｃ、ＩＤ８ｓｙｎ）が、細胞のｃＡＭＰ産生を増加させる（実施例７もまた参照)。
【０１２０】
図９は、ここで定義がなされたＧＬＰ−１コンストラクトを用い、１１週齢のタイプＩＩ糖尿病マウス（Ｃ５７ＢＬ／Ｋｓ−Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂ，Ｈａｒｌａｎ）に対して行った、インビボにおける生物学的活性の試験の結果を例証する。テストされた全てのＧＬＰ−１（配列番号６（合成の、または、組換え型の）と配列番号７（合成の、または、組換え型の））が、多糖症に抗する効果（ａｎｔｉ−ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ  ｅｆｆｅｃｔ）を持つ。最良の結果は、組換え型の配列番号６（ＣＭ１）及び合成の配列番号８（ＣＭ３）を用いた場合に得られた（実施例８もまた参照）。
【０１２１】
図１０は、一時的かつ安定的な遺伝子発現を行なうための典型的なベクターを表す。当該ベクターは二つの別々の転写ユニットからなり、一つは対象となる遺伝子のためのもの（ＧＯＩ）であり、一つは自殺遺伝子ＨＳＶチミジンキナーゼとブラスティシジン（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）耐性遺伝子との融合のためのものである。第一の転写ユニット用に、ヒトユビキチンＢプロモータが使用され、第二の転写ユニット用に、ヒトフェリチンプロモータが使用された（実施例９もまた参照）。
【０１２２】
図１１、１２は、本発明の球状のマイクロカプセルに用いられる細胞を予め不死化した後の、当該細胞のキャラクタリゼーションを例証する。図１１から見られるように、不死化細胞はいまだに、不死化されていない対応細胞と同様に、脂肪細胞、骨細胞、及び軟骨細胞に分化することができる（図１１参照）。不死化細胞は繊維芽細胞の形態を持ち、例えば、ここで使用した一次細胞の特徴であるＣＤ４４及びＣＤ１６６エピトープマーカーを用いたフローサイトメトリーにより示されるように、致死のＭＳＣｓと同様に大きさや粒度に関してより均質である。不死化細胞は、不死化されていない対応細胞と同じＣＤマーカーを発現する（図１２を参照）。
【０１２３】
図１３、１４、１５は、異なる細胞タイプ（ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞:図１３；ＡｔＴ２０細胞：図１４；又はＨＥＫ２９３細胞：図１５)及びクローン番号を用いた、ＧＬＰ−１分泌のウェスタンブロット分析を示す。この結果は、トランスフェクトされたセルラインからＧＬＰ−１／Ｃ末端ペプチドのコンストラクトが分泌される、すなわち、当該タンパク質は予期した分子量を持つことを示す。さらに、当該タンパク質は、ＧＬＰ−１（７-３７）のＮ末端に結合する抗ＧＬＰ−１抗体に結合する。
【０１２４】
図１３Ａは、ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣセルラインからのＧＬＰ−１の分泌である（１:模擬トランスフェクトがなされたｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞の上清に溶解した１００ｎｇの合成ＧＬＰ１７−３７  ２:ＧＬＰ−１ＣＭ１分泌ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞（クローン７９ＴＭ２１７／１３）の上清，Ｍ：前染色したタンパク質マーカー［ｋＤａ］）。
【０１２５】
図１３Ｂは、ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣセルラインからのＧＬＰ−１の分泌である（Ｍ：前染色したタンパク質マーカー［ｋＤａ］，  １：ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣの細胞外培地中に溶解した１００ｎｇの合成ＧＬＰ１７−３７，  ２：アナログＧＬＰＣＭ１（Ｇ８）分泌ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞（クローン７８ＴＭ２１６／２）の上清，  ３:ＧＬＰＣＭ１分泌ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞（クローン７９ＴＭ２１７／１３）の上清)。
【０１２６】
図１４は、ＡｔＴ２０セルラインから分泌されたＧＬＰ１である（１：ＡｔＴ２０細胞が分泌するアナログＧＬＰＣＭ１（Ｇ８）（クローン８０−Ａ−２１６／１）の上清，  ２：ＡｔＴ２０細胞が分泌する野生型のＧＬＰＣＭ１（クローン８１−Ａ−２１７／３）の上清）。
【０１２７】
図１５は、一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から分泌されたＧＬＰ１である（１：ストロメライシン−ＧＬＰ１７−３７コンストラクト（＃１０３）によって一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の上清、  ２:ストロメライシン−ＧＬＰ１７−３７−ＩＰ２−１１アミノ酸により伸長されたコンストラクト（＃３１７）によって一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の上清、  ３：ストロメライシン−ＧＬＰ１ＣＭ１コンストラクト（＃２１７）によって一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の上清、  ４:ストロメライシン−ＧＬＰ１７−３７−ＩＰ２（４ｘ）コンストラクト（＃１５９）によって一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の上清)。
【０１２８】
図１６は、ＧＬＰ１ＣＭペプチドの免疫沈降を示す。抗ＧＬＰ−１補足抗体ＨＹＢ１４７−１２又はＨＹＢ１４７−１２（Ａｎｔｉｂｏｄｙｓｈｏｐ）を用いた、細胞培養上清由来のＧＬＰＣＭ１ペプチドの免疫沈降により、ＧＬＰＣＭ１ペプチドの蓄積と交差コンタミネーションするタンパク質の除去という結果が得られた。１：ＧＬＰＣＭ１分泌ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞（クローン７９ＴＭ２１７／１３）の上清、  ２：タンパク質Ｇ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ）との免疫沈降、ただし、ＧＬＰ１抗体は用いない、  ３：タンパク質Ｇ及びＧＬＰ１抗体ｓｃ−７７８２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いた免疫沈降、  ４：タンパク質Ｇ及びＧＬＰ1抗体ｓｃ−２６６３７（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いた免疫沈降、  ５：タンパク質Ｇ及びＧＬＰ１抗体ＨＹＢ１４７−１２（Ａｎｔｉｂｏｄｙｓｈｏｐ）を用いた免疫沈降，  ６：タンパク質Ｇ及びＧＬＰ１抗体ＨＹＢ１４７−０８（Ａｎｔｉｂｏｄｙｓｈｏｐ）を用いた免疫沈降、  ７：１０ｎｇの合成ＧＬＰ１７−３７，  ８：３１ｎｇの合成ＧＬＰ１７−３７，  ９：１００ｎｇの合成ＧＬＰ１７−３７，当該ＧＬＰ１、抗体ＨＹＢ１４７−０８及び抗体ＨＹＢ１４７−１２を用いた免疫沈降により、当該ＧＬＰＣＭ１ペプチドの蓄積と、それにより交差コンタミネーションしたタンパク質が上清から除去される、という結果が得られた（レーン１のクマシー染色を参照）。
【０１２９】
図１７は、本発明の球状のマイクロカプセル（細胞ビーズ（ＣｅｌｌＢｅａｄｓ）)をｄｂ／ｄｂマウスに適用した動物試験を例証する。使用したマウスモデルはタイプＩＩ糖尿病マウスＣ５７／Ｋｓ−ＲＪ  ｄｂ／ｄｂ  （レプチン受容体の劣性変異）であって、マウスＧＬＰ／ＣＭ１（配列番号６）を分泌する細胞ビーズを移植したものである。ＧＬＰ分泌セルラインはＡｔＴ２０であった。糖尿病マウスの血清中の活性型ＧＬＰを、本発明の球状のマイクロカプセル（細胞ビーズ）の移植後２日目、２２日目に、ＧＬＰ−Ｉ（活性型）  ＥＬＩＳＡ（＃ＥＧＬＰ−３５Ｋ，  Ｂｉｏｔｒｅｎｄ）を用いて測定した。カラムは次を表す。：
動物７−１０：ｄｂ／ｄｂマウスでありＧＬＰ−１ＣＭ１分泌細胞ビーズ移植の治療を受けたもの。動物１３，１５：ｄｂ／ｄｂマウスであり、細胞ビーズ（ＧＬＰ１分泌なし）移植の治療を受けたもの。動物ｄｂ／−：非糖尿病コントロールマウス、治療を受けていない。
【０１３０】
図１８は、糖尿病Ｃ５７／Ｋｓ−ＲＪ  ｄｂ／ｄｂマウス（ｄｂ／ｄｂ  ｎ＝３）の絶食時の血中グルコースレベルを示す。非糖尿病のヘテロ接合性の同腹仔（ｄｂ／−  ｎ＝１）及び糖尿病Ｃ５７／Ｋｓ−ＲＪ  ｄｂ／ｄｂマウスを、ＧＬＰＣＭ１（Ｇ８）（配列番号６ただし２番目の残基がＧ）（ｎ＝３）又はＧＬＰＣＭ１（配列番号６）（ｎ＝３）を分泌する本発明の球状のマイクロカプセル（ＧＬＰ−１  細胞ビーズ）を用いて治療し、移植後、２、９および２２日目に測定した。
【０１３１】
図１９は、糖尿病Ｃ５７／Ｋｓ−ＲＪ  ｄｂ／ｄｂマウス（ｄｂ／ｄｂ  ｎ＝３）の絶食時の血中グルコースレベルを描写する。非糖尿病のヘテロ接合性の同腹仔（ｄｂ／−  ｎ＝１）及び糖尿病Ｃ５７／Ｋｓ−ＲＪ  ｄｂ／ｄｂマウスを、その首の脂肪塊（ｆａｔ  ｐａｄ）（ｎ＝２）又は筋肉（ｎ＝２）に、ＧＬＰＣＭ１（Ｇ８）を分泌する本発明の球状のマイクロカプセル（細胞ビーズ）を移植することで治療し、移植後、２、９、および２２日目に測定した。
【０１３２】
図２０は、ＩＰＧＴＴ（ｉ．ｐグルコース負荷試験)を例証する。一晩絶食させたマウスに２０％のグルコース溶液のｉ．ｐ注射をした（グラム体重あたり１ｍｇのグルコース）。血中グルコースの測定は、注射前及び注射後の２時間に行われた。図２０は１４週齢の糖尿病Ｃ５７／Ｋｓ−ＲＪ  ｄｂ／ｄｂマウス（ｄｂ／ｄｂ  ｎ＝３）でのＩＰＧＴＴを示す。非糖尿病のヘテロ接合性の同腹仔（ｄｂ／−  ｎ＝１)及び糖尿病Ｃ５７／Ｋｓ−ＲＪ  ｄｂ／ｄｂマウスに対して、その首の脂肪塊（ｆａｔ  ｐａｄ）（ｎ＝２）又は筋肉（ｎ＝２）に、ＧＬＰＣＭ１（Ｇ８）を分泌する本発明の球状のマイクロカプセル（細胞ビーズ）を、試験を行なう９日前に移植した。
【０１３３】
本発明はここに記載する実施例においてさらに明らかにされる。しかし、本発明の範囲が以下に示される実施例の記載に限定することが意図されるものではない。
【実施例】
【０１３４】
〔実施例１〕
遺伝子コンストラクトの作成
ＧＬＰ−１（７−３７）の配列をコードするｃＤＮＡは、図１ａに示すようにＨｉｎｃＩＩ及びＥｃｏＲＩ部位を含む配列において、合成的に合成した。別途、図１ｂに示されるように、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＩＰ２並びにＳｆｏＩ、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩの制限酵素認識部位をコードする配列を含むｃＤＮＡを合成した。ＧＬＰ−１の直接の分泌経路のために、ストレプトマイシン３の異種シグナル配列（ＡＣＣ番号  ＮＭ＿００５９４０）を用いた。それゆえ、ストレプトマイシンのシグナル及びリーダー配列をコードするこのｃＤＮＡは、ヒトＲＮＡからの逆転写酵素ＰＣＲによって増幅され、図１ａ又は図１ｂのコンストラクトと共に、図１ｃ及び図１ｄのそれぞれに示すコンストラクトを形成するために使用された。
【０１３５】
図１ｅのコンストラクトを形成するために、図１ａのコンストラクトのＨｉｎｃＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを図１ｄの配列のＳｆｏ１部位の中にクローンした。同様に図１ｆに示されるコンストラクトを製造するために、真核性の発現プラスミドのＥｃｏＲ１部位の中に図１ｄのＥｃｏＲ１フラグメントをクローンした。また、図１ｇに示されるコンストラクトを形成するために、図１ｂに示されるコンストラクトのＨｉｎｃＩＩ／ＸｂａＩフラグメントを図１ｄに示されるコンストラクトのＳｆｏＩ／ＸｂａＩ部位の中にクローンした。図１ｈは、短縮した内因性イントロン配列により遮断された、ストレプトマイシンのリーダー及びシグナル配列をコードし、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）、ＩＰ２及びＧＬＰ−２（１−３５）の配列と融合され、コドンが最適化された配列を合成したものを示す。図１ｈのコンストラクトのＤＮＡ配列は配列番号１６であり、配列番号１５も翻訳されたペプチドの配列を示している。
【０１３６】
また、図１ｉ及び１ｊの配列を合成した。そして、これらを、図１ｈの線形化したＮａｅｌ／ＢｓｓＨＩＩ配列の中に、図１ｊのＮａｅｌ／ＢｓｓＨＩＩフラグメントをクローニングすることによって、図１ｋに示される配列を形成するために用いた。図１ｋのコンストラクトのＤＮＡ配列は配列番号１４であり、配列番号１３も翻訳されたペプチドの配列を示している。図１ｈの配列のＢｓｓＨＩＩによる消化及び再連結によって図１ｌのコンストラクトを形成した。図１ｌのコンストラクトのＤＮＡ配列は配列番号１８であり、配列番号１７も翻訳されたペプチドの配列を示している。図１ｈの線形化したＡｆｅｌ／ＢｓｓＨＩＩ配列の中に、図１ｉの配列のＡｆｅｌ／ＢｓｓＨＩＩフラグメントをクローンすることによって、図１ｍのコンストラクトを形成した。図１ｍのコンストラクトのＤＮＡ配列は配列番号２０であり、配列番号１９も翻訳されたペプチドの配列を示している。
【０１３７】
上述したコンストラクトは当業者が通常の技術を用いることにより製造してもよい。
【０１３８】
〔実施例２〕
哺乳動物細胞の、トランスフェクション、栄養系選抜及びＧＬＰ−１の発現
細胞の入手先：ＨＥＫ２９３（ヒト胚腎臓細胞系、＃ＡＣＣ  ３０５、ＤＳＭＺ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ドイツ）、ＡｔＴ２０（マウスＬＡＦ１下垂体腫瘍細胞系、＃８７０２１９０２，  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  イギリス）、ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞はＫａｓｓｅｍ教授（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｏｄｅｎｓｅ、デンマーク）より供与された。
【０１３９】
１０６個の細胞をトランスフェクションするために、異なるＧＬＰ−１コンストラクトを複数含む０．５〜２μｇのプラスミドＤＮＡを用いた。このコンストラクトは実施例１の記載に従って生成した物である。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４ｆｆ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ  Ｖｏｌ２．，  Ｕｎｉｔ  ９．１）に記載されている、標準的なリン酸カルシウム共沈殿法によってＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。ＡｔＴ２０細胞のトランスフェクトには、ＦｕＧｅｎｅ  （Ｒｏｃｈｅ）を用い、ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ．  ａｌ．  １９９４ｆｆ，  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ  Ｖｏｌ  ２．，  Ｕｎｉｔ  ９．４）の記載に従った。ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞のトランスフェクションは、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ａｍａｘａ）を用い、電気的パラメータ及び細胞型特異的溶液の組み合わせに基づく非ウイルス性の方法により行なわれた。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置（プログラム  Ｃ１７）及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液ＶＰＥ−１００１を用いて、トランスフェクション効率＞６０％を達成した。細胞クローンのトランスフェクションから４８時間後、ＤＮＡの染色体中への融合を安定化させた細胞クローンの選択は、選択試薬ブラストサイジン（２μｇ／ｍｌ）を含む培地に供することにより行なわれた。１２〜１５日後、安定した、トランスフェクトされた細胞クローンは単離され、特徴付けのために拡張された。
【０１４０】
ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ及びＨＥＫ２９３細胞内における様々なＧＬＰ−１コンストラクトの一過性発現を測定した。単量のＧＬＰ−１コンストラクトの＃１０３及び＃３１７（ＧＬＰ−１（７−３７）のコピーを一つだけ有している）からは検出限界程の活性ＧＬＰ−１レベルが確認されたのに対し、二量体のＧＬＰ−１コンストラクトである＃２１７（ＧＬＰ−１（７−３７）を成分（Ｉ）及び成分（ＩＩＩ）として有している）からは、ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ及びＨＥＫ２９３細胞の両方において大量の発現が確認された。結果を図２にまとめた。ＧＬＰ−１コンストラクト＃１５９（４個のＩＰ２のコピーを成分（ＩＩ）として有している）にコンストラクトを伸張させたものについては、有意に増加しない結果となった（図示せず）。様々なコンストラクトを有するｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞のトランスフェクション後の、安定してＧＬＰ−１を発現するクローンが選択された。発現レベルを表１に示す。
【０１４１】
【表１】
2009536166.tif 000002
【０１４２】
〔実施例３〕
哺乳動物細胞から分泌された、ＧＬＰ−１ペプチドのウェスタンブロット解析
ＧＬＰ−１分泌細胞からの細胞培養上清を、１０％〜２０％の勾配ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分離して（１２０Ｖ，９０分間）、半乾燥ブロッティング（２．０ｍＡ／ｃｍ２、６０分間）ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ０、４５  μｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＩＰＶＨ  ０００１０）に転写した。メタノール固定及びブロッキング（３％  （ｗ：ｖ）  ＢＳＡ、０．１％  （ｖ：ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ）の後、膜を１μｇ／ｍｌ  ａｎｔｉ−ＧＬＰ−１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （ＨＹＢ １４７−１２， Ａｎｔｉｂｏｄｙｓｈｏｐ）４℃ｏ／ｎにて免疫ブロットした。洗浄、及び０．０２μｇ／ｍｌの検出抗体（Ａｎｔｉ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ，  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ，  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＰＣ  ２８５５−１１９７）による、室温にて４時間のインキュベーションの後、化学蛍光検出によりタンパク質の位置を明らかにした。
【０１４３】
ウェスタンブロット解析を図３に示す（１：擬似トランスフェクトされたｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞の上清に１００ｎｇの合成ＧＬＰ−１（７−３７）を溶解させたもの、２：コンストラクト＃２１７からの２両体ＧＬＰ−１を分泌するｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞（クローン７９  ＴＭ２１７／１３)の上清、３：コンストラクト＃２１７からの２量体ＧＬＰ−１を分泌するＡｔＴ２０細胞（クローン  ８１−Ａ−２１７／３）の上清；Ｍ：予め染色したタンパク質マーカー［ｋＤａ］）。この結果は、ＧＬＰ−１（７−３７）及びＣ末端に付加物（図３の２及び３）を含むペプチドが、トランスフェクトされた細胞系から分泌され、ＧＬＰ−１の分子中央のエピトープに結合する抗ＧＬＰ−１抗体により検出されることができることを示している。
【０１４４】
〔実施例４〕
ヒト細胞から分泌されたＧＬＰ−１ペプチドのインビトロ血漿安定性
ＨＥＫ２９３及びｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞を、次のペプチドをコードするＧＬＰ−１変異体に連結しており、非相同ストロメライシンシグナル配列をコードするコンストラクトにて、一過的にトランスフェクトした。
１：ＧＬＰ−１（７−３７）
２：ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２−１１ＡＡにて延長
３：ＧＬＰ１（７−３７）−ＩＰ２−ＧＬＰ１（７−３７）。
【０１４５】
細胞から分泌されるＧＬＰ−１又は合成ＧＬＰ−１（７−３７）（Ｂａｃｈｅｍ）を含む細胞培養液の上清を、ジペプチジルペプチダーゼ活性を含む血漿を多く含むヒトリンパ球と共に、３７℃で、５％のＣＯ２濃度で、３又は４時間インキュベートした。擬似トランスフェクトされた細胞からの合成ＧＬＰ−１（７−３７）は、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（＃ＤＰＰ４，  Ｂｉｏｔｒｅｎｄ）の添加によって阻害されることが示されている、ＤＰＰ−ＩＶ活性のポジティブコントロールとして用いた。活性ＧＬＰは、不活性ＧＬＰ−１（９−３７）ペプチド、ＤＰＰ−ＩＶに分解されたＧＬＰ−１（７−３７）のＮ末端のエピトープを識別して結合する抗体を用いた、ｔｈｅ  ＧＬＰ−１  （Ａｃｔｉｖｅ）  ＥＬｌＳＡ  （＃ＥＧＬＰ−３５Ｋ，  Ｂｉｏｔｒｅｎｄ）を用いて測定した。
【０１４６】
結果を図４（ＨＥＫ２９３細胞）及び図５（ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞）に示す。ＨＥＫ２９３及びｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞は共に遺伝子コンストラクトの有効なホストである。タイプ１〜３のトランスフェクトされた細胞の結果の計測は実施例３と同様に行なった（１：擬似トランスフェクトされたｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞の上清に１００ｎｇの合成ＧＬＰ−１（７−３７）を溶解させたもの、２：コンストラクト＃２１７からの２両体ＧＬＰ−１を分泌するｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞（クローン７９  ＴＭ２１７／１３)の上清、３：コンストラクト＃２１７からの２量体ＧＬＰ−１を分泌するＡｔＴ２０細胞（クローン  ８１−Ａ−２１７／３）の上清）。
【０１４７】
合成ＧＬＰ−１と同様に、コンストラクト１はＤＰＰ−ＩＶにより不活性化される野生型ＧＬＰ−１を生産する一方で、伸張されたＧＬＰ−１が形成するＣ末端（図４の２及び３、図５の３）は、分解に対してさらに抵抗性を有しており、少なくとも４０％の活性を維持する。伸張されたＧＬＰ−１ペプチドのＣ末端は、ヒト血漿中においてインビトロにて極めて安定である。２量体ＧＬＰ−１配列（３）を有するペプチドはほぼ完全にインビトロのＤＰＰ−ＩＶ分解に対して安定である。
【０１４８】
〔実施例５〕
ＧＬＰ−１ペプチドのウェスタンブロット解析
様々なＧＬＰ−１ペプチドを、固相（ｓｙｎ）にて、Ｅ．ｃｏｌｉ（ｒｅｃ）を用いた組み換えにて合成的に生産した。ＧＬＰ−１ペプチド（配列番号１を３１ｎｇ、及び配列番号６、配列番号７、配列番号８をそれぞれ１０ｎｇ）を１０％〜２０％の勾配ＳＤＳ  ＰＡＧＥにて分離し（１２０Ｖ、９０分間）、半乾燥ブロッティング（２．０ｍＡ／ｃｍ２、６０分間）によりＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  Ｍｅｍｂｒａｎ  ０．４５μｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＩＰＶＨ  ０００１０）に転写した。メタノール固定及びブロッキング（３％（ｗ：ｖ）ＢＳＡ、０．１％（ｖ：ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ）の後、膜を１μｇ／ｍｌの抗ＧＬＰ−１抗体（ＨＹＢ  １４７−１２、Ａｎｔｉｂｏｄｙｓｈｏｐ）を用いて、４℃  ｏ／ｎにて免疫ブロットした。洗浄、及び０．０２μｇ／ｍｌの検出抗体（Ａｎｔｉ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ，  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ，  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＰＣ  ２８５５−１１９７）を用いた、室温にて４時間のインキュベーションの後、化学蛍光検出にてタンパク質の位置を明らかにした。図６は表されたペプチドのウェスタンブロットを示す。次の値が得られた：配列番号１ＧＬＰ−１（７−３７）に相当する（ＩＤ１ｓｙｎ）、３１ａａ、３．３ｋＤ；ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２に相当する配列番号８、４６ａａ、５．１ｋＤ；ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２−ＲＲ−ＧＬＰ２に相当する配列番号７（ＩＤ７ｒｅｃ，  ＣＭ２）８３ａａ、９．４ｋＤ；ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２−ＲＲ−ＧＬＰ１（７−３７）に相当する配列番号６（ＩＤ６ｓｙｎ，  ＣＭ１）、７９ａａ、８．７ｋＤ。
【０１４９】
〔実施例６〕
ＧＬＰ−１ＣＭペプチドのインビトロヒト血漿安定性
合成ＧＬＰ−１ペプチド（配列番号１ｓｙｎ、配列番号６ｓｙｎ、配列番号７ｒｅｃ、配列番号８ｓｙｎ）を濃度２０ｎｇ／ｍｌにて、ヒト血漿と共に、３７℃、５％ＣＯ２にて３時間培養した。血漿のジペプチジルペプチダーゼ活性はＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（＃ＤＰＰ４，  
Ｂｉｏｔｒｅｎｄ）を用いて阻害した。活性ＧＬＰはＧＬＰ−１  （Ａｃｔｉｖｅ）  ＥＬＩＳＡ  （＃ＥＧＬＰ−３５Ｋ，  Ｂｉｏｔｒｅｎｄ）を用いて測定した。
【０１５０】
野生型のＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号１）に対して、配列番号６、配列番号７及び配列番号８の伸張されたＧＬＰ−１ペプチドのＣ末端は、有意に、ヒト血漿中において、インビトロで安定であった（図７）。コントロール（右手側）としてＤＤＰ−ＩＶ阻害剤を加えた実験から得られた結果を示す。ＧＬＰ−１活性はコントロールの実験において完全に維持されていた。
【０１５１】
〔実施例７〕
インビトロバイオアッセイ
サイクリックＡＭＰ生産
ＲＩＮ−５Ｆ（ラット島細胞腫、ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．  ９５０９０４０２）細胞を、２４穴プレートにて、４日間、７０％集密になるまで育てた。細胞をＤＭＥＭ（Ｅ１５−００９，  ＰＡＡ）で２度洗浄した後、１％  ＨＳＡ（Ａｖｅｎｔｉｓ）、０．２ｍＭ  ＩＢＭＸ  （８５８４５５，  Ｓｉｇｍａ）及び供試ペプチドを加えた０．５ｍｌＤＭＥＭ（Ｅ１５−００９，  ＰＡＡ）に加えた。２５℃で２０分間インキュベートした後、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。細胞のｃＡＭＰを０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む０．１Ｎ  ＨＣｌを加えることによって抽出した。サイクリックＡＭＰをｃＡＭＰ（低ｐＨ）ＥＩＡ（Ｃａｔ．  ＤＥ０３５５，  Ｒ＆Ｄ）を用いて定量した。刺激のために３×１０８Ｍの配列番号１、配列番号６ｓｙｎ、配列番号６ｒｅｃ、配列番号７ｒｅｃ、配列番号８ｓｙｎを用いた。
【０１５２】
結果を図８に示す。ＧＬＰ−１が存在しない状態における基本的な生産量を１００％のｃＡＭＰ生産とした。ＧＬＰ−１はＧプロテイン共役型の受動態に結合し、ｃＡＭＰ生産を刺激する。全ての供試分子において細胞ｃＡＭＰ生産が増加している。
【０１５３】
〔実施例８〕
インビトロ生物活性
１１週齢のタイプＩＩ糖尿病マウス（Ｃ５７ＢＬ／Ｋｓ−Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂ，  Ｈａｒｌａｎ）を、午前９時及び午後５時の１日に２回、５μｇのペプチドを皮下注射する処置をした（１グループあたりｎ＝５）。血中グルコースは処置前（０日）及びＧＬＰＣＭペプチドを処置した後（２日、４日、７日、１０日）、午前１０時に一晩の絶食期間の日測定した。データは０日目の血中グルコース濃度の測定値と相対的に表した。全ての供試ＧＬＰ−１ペプチド（配列番号６（合成又は組み換え）及び配列番号７（合成又は組み換え））は抗高血糖効果を有している。最も良い結果は組み替え配列番号６（ＣＭ１）及び合成配列番号８（ＣＭ３）より得られた。図９（ｙ軸）は処置の相対的な効果を示している。０日目の血中グルコースを１とした。未処置動物は血中グルコース濃度が増加し続け、ＧＬＰ−１ペプチドで処置された動物は、ここでは大雑把に表示しているが、長期にわたり血中グルコース濃度が減少し続けた。
【０１５４】
〔実施例９〕
プラスミドの作成
一過的に安定して遺伝子を発現するベクターを２つの別々の転写ユニットにより構成した。一つは（ＧＯＩ）に関与する遺伝子であり、もう一つは自殺ＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子及びブラストサイジン抵抗遺伝子を融合したものである。一つ目の転写ユニットでは、ヒトユビキチンＢプロモータを用い、二つ目の転写ユニットでは、ヒトフィリチンプロモータを用いた。プラスミドは、図１０に概略的に示す、７，９１９ｂｐの長さのｐＣＭ４プラスミドをベースとしている。
【０１５５】
図１０に示すように一つ目の転写ユニットは次の構成を含んでいる。
ＣＭＶｅｎｈ：ヒトサイトメガロウィルス極初期エンハンサー 
ｕｂｉＢ  ｈｕｍａｎ：ユビキチンプロモータＢ
Ｓｔｒｏ−ＧＬＰ：ストロメライシンのシグナルペプチド及びリーダー配列をコードする融合遺伝子
ｏｒｉ  ｐＭＢＩ：Ｅ  ｃｏｌｉの自己複製最小起源
Ｈｙｇｒｏ：ハイグロマイシンＢ抵抗遺伝子。
【０１５６】
転写ユニット２
ＳＶ  ４０  ｅｎｈ：ＳＶ４０エンハンサー
ＦｅｒＨ：ネズミＥＦＩ遺伝子と連結したヒトフェリチンＨプロモータ
Ｔｋ−ｂｌａ：単純疱疹ウィルスタイプＩチミジンキナーゼ及びブラストサイジン抵抗遺伝子をコードする融合遺伝子。
【０１５７】
一過性発現のため円形プラスミドを用いた。安定して発現する細胞を選択するため、プラスミドを線形化して、細菌の配列（ｐＭＢ１起点及びハイグロマイシン遺伝子）を除去した。
【０１５８】
〔実施例１０〕
間葉幹細胞系の製造
間葉幹細胞はＫａｓｓｅｍ教授（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｏｄｅｎｓｅ，  Ｄｅｎｍａｒｋ  （Ｓｉｍｏｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０ｍ，  ５９２−５９６にて公開））から供与され、次の特性を有している。
【０１５９】
・起源
細胞生産系は間葉幹細胞（ＭＳＣ）から成っており、健康男性ドナー（３３歳）の骨髄から吸引された物から単離された。
【０１６０】
・不死化
細胞に、テロメラーゼ逆転写酵素をコードする配列を導入することにより不死化した。レトロウィルス形質導入については、モロニーマウス白血病ウイルスのＰＧ１３の長鎖繰り返し末端にて駆動するトランス遺伝子を発現する、ＧＣｓａｍレトロウィルスベクターをパッケージングすることにより行なった。形質導入は培養の第９日目（ＰＤＬ１２）に実施された。細胞系を２６０の集団倍加レベル（ＰＤＬ）に達するまで培養した。
【０１６１】
挿入遺伝子座は蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びサザンブロットにより確認した。染色体５（５ｑ２３−３１）におけるエコトピック（ｅｃｏｔｏｐｉｃ）ｈＴＥＲＴの挿入遺伝子座は一つのみであった。解析はＰＤＬ１８６にて行なわれた。ギムザバンディング及び遺伝子ハイブリダイゼーションの比較により、ｈＭＳＣ−ＴＥＲＴが全く数的にも構造的にもＰＤＬ９６にて染色体異常を起こさず、通常の２倍体の男性核型が維持されることが明らかになった。腫瘍形成性は、６ヶ月間の皮下移植後の免疫不全マウスにより確認され、ＰＤＬ８０においてネガティブであることが分かった。
【０１６２】
・フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析
標準成長培地にて８０％集合になるまで細胞を培養した。細胞をトリプシン処理し、ＦＡＣＳｃａｎフロー血球計算機（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて大きさ及び粒度を評価した。表面のマーカーを検査するためトリプシン処理された細胞を、蛍光色素（ＦＩＴＣ−コンジュゲートマウス抗ヒトＣＤ４４モノクローナル抗体、＃ＣＢＬ１５４Ｆ、Ｃｙｍｂｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；フィコエリトリンコンジュゲートマウス抗ヒトＣＤ１６６モノクローナル抗体、＃５５９２６３、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）にコンジュゲートする抗体によって直接、３０分間、氷上で、染色した。サンプルを洗浄し、１％のパラフォルムアルデヒドでＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）による解析まで固定した。
【０１６３】
・特徴づけ
不死化細胞は、さらに、非不死化対応である含脂肪細胞、骨細胞及び軟骨細胞に分化できる（図１１に示す）。不死化細胞は、繊維芽細胞様形態を有しており、例えば、ここで用いた最初の細胞の特徴であるＣＤ４４及びＣＤ１６６エピトープマーカーを用いた、フローサイトメトリーに示されるように、モータル（ｍｏｒｔａｌ）ＭＳＣｓのように大きさ及び粒度の点でさらに均質である。不死化細胞はそれらの非不死化対応物と同じＣＤマーカーを分泌する。
【０１６４】
・培養
血清含有培地  ７％  アールスＭＥＭ
１０％  ＦＣＳ
２ｍＭ  Ｌ−グルタミン
１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム
１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン
０．１ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン
集団倍加は２６〜３０時間の間である。
【０１６５】
・トランスフェクション及びクローンの選択
１０６個の細胞のトランスフェクションのために、０．５〜２μｇのプラスミドを様々なＧＬＰ１コンストラクトと共に用いた。ＨＥＫ２９３細胞は標準的なリン酸カルシウム共沈殿法によりトランスフェクトした。ＡｔＴ２０細胞はＦｕＧｅｎｅ  （Ｒｏｃｈｅ）を用いてトランスフェクトした。
【０１６６】
ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞のトランスフェクションは、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ａｍａｘａ）を用い、電気的パラメータ及び細胞型特異的溶液の組み合わせに基づく非ウイルス性の方法により行なわれた。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置（プログラム  Ｃ１７）及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液ＶＰＥ−１００１を用いて、トランスフェクション効率＞６０％を達成した。細胞クローンのトランスフェクションから４８時間後、ＤＮＡの染色体中への融合を安定化させた細胞クローンの選択は、選択試薬ブラストサイジン（２μｇ／ｍｌ）を含む培地に供されることにより行なわれた。１２〜１５日後、安定した、トランスフェクトされた細胞クローンは単離され、特徴付けのために拡張された。
【０１６７】
・発現
ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ及びＨＥＫ２９３細胞中の様々なＧＬＰコンストラクトの一過性発現を測定した。活性ＧＬＰ１レベルは、ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ及びＨＥＫ２９３細胞共に、単量のＧＬＰコンストラクト＃１０３（Ｓｔｒｏ−ＧＬＰ１（７−３７））及び＃３１７（Ｓｔｒｏ−ＧＬＰ１（７−３７）−ＩＰ２−１１ａａにて延長）に見られ、また、２量体のＧＬＰ１コンストラクト＃２１７（Ｓｔｒｏ−ＧＬＰ１（７−３７）−ＩＰ２−ＧＬＰ１（７−３７））において大量の発現を確認できた。コンストラクト＃３１７の３量体ＧＬＰ１コンストラクト＃１５９（Ｓｔｒｏ−ＧＬＰ１（７−３７）−ＩＰ２  （４ｘ）−１１ａａ）への伸長により同様の活性が得られる結果となった（上記図２も参照のこと）。様々なコンストラクトクローンによるｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞のトランスフェクションの後、ＧＬＰ１（上記図４及び５、実施例４を参照）を安定的に発現するクローンを選択した。
【０１６８】
〔実施例１１〕
カプセル化
培養した細胞をカプセル化するために、ＰＢＳ（ＰＡＡ、オーストリア）にて洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（ＰＡＡ、オーストリア）を用いて分離した。反応を培地（細胞依存型、例えば、ＲＰＭＩ，ＰＡＡ，オーストリア）を用いて速やかに止め、細胞上清を遠心分離した（８分間で１，２００ｒｐｍ）。ペレットをＰＢＳに再度懸濁して、細胞計数を決定した。１．４×１０７細胞の所望量を再度遠心分離した（８分間で１２００ｒｐｍ）。吸引によりＰＢＳを完全に除去し、６０μｌのペレットを、空気を抜いて、８０μｌＰＢＳに再度懸濁した。この細胞上清を０．８％（ｗ／ｖ）  ５６０μｌのアルギン酸カリウム溶液（０．１％（ｗ／ｖ）で粘度約４０ｍＰａ．ｓのものを室温で用いた）中に入れた。
【０１６９】
細胞の再懸濁物とアルギナート水溶液を混合するために、水溶液をカヌーラ付きシリンジ１ｍｌに入れて、均一的に、ゆっくりと入れたり、出したりを繰り返す方法により、細胞と混ぜた。細胞濃度２×１０７ｃｅｌｌ／ｍｌとなった。このようにして、２×１０７ｃｅｌｌ／ｍｌの量が得られた。
【０１７０】
直径約４００μｍのマイクロカプセルを製造するために、内直径４００μｍのカヌーラを、３つの流路のスプレーノズルにより流路の中を空気で満たして用いた。カヌーラは内直径７００μｍの外側のノズル中に固定した。１．５ｍｍに開いたエアーリング（ａｉｒ  ｒｉｎｇ）は２つのインナーカヌーラに締め付けられた。この装置は国際公開公報００／０９５６６号パンフレットに記載された装置を適用したバージョンである。均一の細胞／アルギナート溶液ミクスチャーを上述のスプレーノズルから滴下した。このために、ミクスチャーを包含した１ｍｌシリンジを、ルアコネクター（ｌｕｅｒ  ｃｏｎｎｅｃｔｏｒ）を用いて、内側の流路に置かれた。細胞／アルギナート溶液ミクスチャーを内側の流路中に３００μｌ／ｍｉｎのスピードで押出した。気流はエアーリングの外側を２．５Ｉ／ｍｉｎのスピードで運ばれた。その結果、マイクロカプセルは、スプレーノズルより約１０ｃｍしたに設けられたバリウム含有沈殿浴（２０ｍＭ  ＢａＣｌ，５ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン，１２４ｍＭ  ＮａＣＩ，ｐＨ７．０±０．１，２９０ｍＯｓｍｏｌ±３）の中に沈殿した。それぞれのケースにおいて、バリウム含有沈殿浴内で５分間静置した後、２０ｍｌＰＢＳで５回マイクロカプセルを洗浄した。
【０１７１】
単層マイクロカプセルの５００μｌを０．８％（ｗ／ｖ）アルギナート溶液５００ｍｌに取り、核を用いて、上記と同じように均一に混ぜた。この懸濁液を１ｍｌシリンジに取り、ルアコネクター（ｌｕｅｒ  ｃｏｎｎｅｃｔｏｒ）を用いて、スプレーノズルの内側の流路（内直径：４００μｍ）に繋ぎ、５０μｌ／ｍｉｎのスピードで押出した。０．８％アルギナート溶液を入れた５ｍｌシリンジを、ルアコネクター（ｌｕｅｒ  ｃｏｎｎｅｃｔｏｒ）を用いて、第２の内側の流路（内直径：７００μｍ）に繋ぎ、２５０μｌ／ｍｉｎのスピードで押出した。気流はエアーリングの外側に２．９Ｉ／ｍｉｎのスピードで運ばれた。その結果、マイクロカプセルは、スプレーノズルより約１０ｃｍしたに設けられたバリウム含有沈殿浴（２０ｍＭ  ＢａＣｌ，５ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン，１２４ｍＭ  ＮａＣＩ，ｐＨ７．０±０．１，２９０ｍＯｓｍｏｌ±３）の中に沈殿した。それぞれのケースにおいて、バリウム含有沈殿浴内で５分間静置した後、２０ｍｌＰＢＳで４回マイクロカプセルを洗浄し、１回培養液で洗浄した。合計の直径が約６００μｍ±１００μｍ（アルギナート層を含む）であり、細胞を含む核の内側の直径が３８０μｍ±２０μｍ２層マイクロカプセルは、この方法で製造した。核内の細胞の濃度は約２〜３×１０７細胞／ｍｌアルギナートである。この結果、球のボリュームが０．０６５〜０．１８０μｌで一つの球あたり１０００個の細胞を含む本発明の球状のマイクロカプセル（ＣｅｌｌＢｅａｄｓ）が得られた。ＧＬＰ−１分泌細胞を含むＣｅｌｌＢｅａｄｓは１時間当たり平均５ｆｍｏｌの活性ＧＬＰを生産する。
【０１７２】
本発明の球状のマイクロカプセル（ＣｅｌｌＢｅａｄｓ）をカプセル化した後、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）フリーの培地（１０％のリプミン（Ｌｉｐｕｍｉｎ）を含むＬＰ０２）の中で培養することで、ＧＭＰガイドラインに従って、少なくとも６日間、活性が減ることなく生産することができる。
【０１７３】
脂肪組織に埋め込むために、カプセル化されたｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞を含脂肪細胞に分化させた（実施例１２参照）。
【０１７４】
〔実施例１２〕
含脂肪細胞への分化（Ｂｅａｄ）
インスリン、デキサメタゾン及びイソブチルキサンチンを含むＭＥＭベースの培地による、間葉幹細胞の含脂肪細胞への分化は、Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５，  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５８，  ３９３−４０２）及びＳｉｍｏｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｏｐ  ｃｉｔ．）の記載にしたがって行なわれた。これらの実験では含脂肪細胞への分化プロセスは動物成分フリーの培地の中で行なわれた。分化プロセスには２週間を要し、含脂肪細胞の収率が＞９０％であった。成分としては典型的に、次に示す動物成分フリーの培地を用いた：ＤＭＥＭ／ＨＡＭ´ｓ  Ｆ１２、ＨＥＰＥＳ、ヒドロコルチゾン、インスリン、トリイドチロニン（Ｔｒｉｉｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）、ビオチン、ＤＬ−パントテン酸、ヘミカルシウム、トログリタゾン（Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、オクタン酸（ＣＡ）、デキサメタゾン、動物成分フリー脂質ミクスチャー、イソブチルメチルキサンチン。
【０１７５】
含脂肪細胞分化のマーカーとなる細胞内トリグリセリドの蓄積（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ  ＪＳ．  Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍａｒｒｏｗ  ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  １９７９  Ｏｃｔ，  １５（１０）：８２３−８）は、親水性色素ナイルレッド（Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ  Ｐ，  Ｍａｙｅｒ  ＥＰ，  Ｆｏｗｌｅｒ  ＳＤ．  Ｎｉｌｅ  ｒｅｄ：  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｔａｉｎ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｉｐｉｄ  ｄｒｏｐｌｅｔｓ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９８５  Ｍａｒ，  １００（３）：９６５−７３）の溶液であるアジポレッド（ＡｄｉｐｏＲｅｄ）によりモニターされ得る。このモニタリングはアジポレッドアッセイ試薬（＃ＰＴ−７００９，  Ｃａｍｂｒｅｘ）の指示マニュアルに従って実行された。グリセロール−３−リン酸ジヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）は成熟含脂肪細胞において高く発現される（Ｓｏｔｔｉｌｅ  ｖ，  Ｓｅｕｗｅｎ  Ｋ．  Ａ  ｈｉｇｈ−ｃａｐａｃｉｔｙ  ｓｃｒｅｅｎ  ｆｏｒ  ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００１  Ｊｕｎ  １；  ２９３（１）：１２４−８）。この酵素活性を、グリセロール−３−リン酸ジヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）活性評価キット（＃ＭＫ４２６，  Ｔａｋａｒａ）の指示マニュアルに従って、細胞の脂質生成分化を評価することで測定した。ＦＡＢＰ４／ａＰ２は細胞内の脂肪に結合するタンパク質であり成熟含脂肪細胞にて特に発現される（Ｇｒａｖｅｓ  ＲＡ，  Ｔｏｎｔｏｎｏｚ  Ｐ，  Ｐｌａｔｔ  ＫＡ，  Ｒｏｓｓ  ＳＲ，  Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ  ＢＭ．  ｌｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆａｔ  ｃｅｌｌ  ｅｎｈａｎｃｅｒ：  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９２  Ｊｕｌ，  ４９（３）：２１９−２４）。ＦＡＢＰ４陽性細胞は成熟含脂肪細胞に分類され得る。メタノール固定及びブロッキングの後、ウサギ抗ＦＡＢＰ４ポリクローナル抗体（＃１０００４９４４，  ＩＢＬ  Ｈａｍｂｕｒｇ）及びＣｙ−３−コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ（＃１１１−１６６−００６  Ｄｉａｎｏｖａ）を用いて免疫染色を行なった。分化した含脂肪細胞の生存能力は未分化細胞と同等である。しかしながら、未分化の本発明のマイクロカプセル（ＣｅｌｌＢｅａｄｓ）培地に確認される増殖は、分化した本発明のマイクロカプセル（ＣｅｌｌＢｅａｄｓ）培地では起こらない。
【０１７６】
〔実施例１３〕
ＧＬＰ−１のウェスタンブロット解析
カプセル化し、分化し、トランスフェクトされた含脂肪細胞又は他のタイプの細胞は培地（上記参照）で成長させた。細胞培養上清は１０％〜２０％の勾配ＳＤＳ  ＰＡＧＥにて分離し（１２０Ｖ、９０分間）、半乾燥ブロッティング（２．０ｍＡ／ｃｍ２，６０分間）によりＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  Ｍｅｍｂｒａｎ  ０．４５μｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＩＰＶＨ  ０００１０）に転写した。メタノール固定及びブロッキング（３％  （ｗ／ｖ）  ＢＳＡ  ，０．１％  （ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ）の後、膜を、１ｐｇ／ｍｌ抗ＧＬＰ１抗体（ＨＹＢ  １４７−１２，  Ａｎｔｉｂｏｄｙｓｈｏｐ）を用いて４℃ｏ／ｃにて免疫ブロットした。洗浄、及び０．０２μｇ／ｍｌの検出抗体（ＨＲＰがコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＰＣ  ２８５５−１１９７）を用いた室温にて４時間のインキュベーションの後、化学蛍光検出によりタンパク質の位置を明らかにした。結果を図１３、１４及び１５に示す。これは細胞のタイプ（ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ、ＡｔＴ２０又はＨＥＫ２９３細胞）及びクローン番号を示している。この結果は、ＧＬＰ−１／Ｃ末端ペプチドのコンストラクトがトランスフェクトされた細胞から分泌されたこと、換言すれば、タンパク質が予想された分子量を有していることを示している。さらに、それはＧＬＰ−１（７−３７）のＮ末端に結合する抗ＧＬＰ−１抗体に結合する。
【０１７７】
〔実施例１４〕
ペプチドの免疫沈降
ＧＬＰ１ＣＭペプチドの免疫沈降のため、培地上清を４℃、ｏ／ｎにて、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇ−Ａｇａｒｏｓｅ（２０μｌ  アガロース／ｍｌ  上清）を用いてプレインキュベートした。タンパク質の非特異的な結合は０．２μｍフィルターを通すろ過により排除した。１μｇ／ｍｌ抗ＧＬＰ１捕獲抗体（ＨＹＢ  １４７−１２，  Ａｎｔｉｂｏｄｙｓｈｏｐ）を用いた、１２時間４℃のインキュベーションの後、１μｌ／ｍｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇ−Ａｇａｒｏｓｅを室温で２時間加えた。沈殿物にはＰＢＳによる洗浄工程を繰り返した後に遠心分離した。免疫沈降はＬａｅｍｍｌｉローディング緩衝液中で煮沸され、１０％〜２０％のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルにより分けられ、上述の方法で免疫ブロットした。
【０１７８】
細胞培養液上清からのＧＬＰＣＭ１ペプチド免疫沈降は、抗ＧＬＰ１捕獲抗体ＨＹＢ  １４７−１２又はＨＹＢ  １４７−１２（Ａｎｔｉｂｏｄｙｓｈｏｐ）を用いて行なわれ、ＧＬＰＣＭ１ペプチドの集積及びタンパク質のクロスコンタミネーションの排除という結果となった。結果を図１６Ａ及びＢに示す。
【０１７９】
〔実施例１５〕
動物試験：ｄｂ／ｄｂマウスにおける本発明の球状のマイクロカプセル（細胞ビーズ（ＣｅｌｌＢｅａｄｓ））の試験
ここで用いたマウスのモデルはタイプＩＩ糖尿病マウスＣ５７／Ｋｓ−ＲＪ  ｄｂ／ｄｂ  （レプチン受容体における劣性変異）であった。動物試験のため、本発明の球状のマイクロカプセル（細胞ビーズ）が分泌したネズミＧＬＰ／ＣＭ１（配列番号６）を１２週齢のＣ５７／ＫＳ−ＲＪ  ｄｂマウスに移植した。ＧＬＰ分泌細胞系はＡｔＴ２０であり、ネズミ下垂体分泌腺腫細胞系を上述の方法でトランスフェクトした。本発明の球状のマイクロカプセル（細胞ビーズ）を、１９Ｇニードルを介して注入した。様々な移植部位（筋肉、脂肪）及び移植量（１０μｌ、１００μｌ）にて試験した。本発明の球状のマイクロカプセル（細胞ビーズ）を移植した後、２日目及び２２日目における糖尿病マウスの血中の活性ＧＬＰの測定については、ＧＬＰ−１  （Ａｃｔｉｖｅ）ＥＬＩＳＡ（＃ＥＧＬＰ−３５Ｋ，  Ｂｉｏｔｒｅｎｄ）を用いて行なった。空腹動物の血中グルコース濃度の出力が測定され、ＩＰＧＴＴｓ（腹腔内の耐糖能試験：一晩絶食させたマウスの腹腔内にグルコースを注入し、２時間後に血中グルコース濃度を測定する）を行なった。野生型ＧＬＰ１ＣＭ１を分泌する本発明の球状のマイクロカプセル（細胞ビーズ）の移植から２日目の１５時、２２日目の１４時の平均濃度にて、移植された動物の血中における活性ＧＬＰ−１を確認した（図１７参照）。
【０１８０】
糖尿病マウスにおける絶食グルコース濃度の重要な正常化が、野生型ＧＬＰ１ＣＭ１（配列番号６）又はアナログＧＬＰ１ＣＭ１（Ｇ８）（配列番号６、但し、第２番目の残基がＧに置換されている）を、筋肉（後足）及び脂肪（首脂肪体）のいずれに本発明の球状のマイクロカプセル（細胞ビーズ）を移植したことにより達成された（図１８及び１９）。また、ＩＰＧＴＴの結果（図２０）、注入の点（ｔ＝０）におけるグルコース濃度におけるグルコース代謝の効果は通常のマウスとほぼ同じであることが確認された（糖尿病マウスの高いレベルと比較して）。また、処置したマウスは通常のマウスより濃度が上昇するにも関わらす、この濃度は通常の濃度まで比較的早く戻った。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】図１は、本発明の球状のマイクロカプセルの調製に用いられる細胞内に含まれる、特に限定されない例示のコンストラクトａ−ｍ（実施例1も参照）の概観を表す。
【図２】図２は、一時的なトランスフェクション後における、ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞及びＨＥＫ２９３細胞内における異なるＧＬＰ−１コンストラクトの一時的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発現、及び活性型のＧＬＰ−１の一時的発現、の結果を描写するものである（実施例２もまた参照）。単量体性（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ）のＧＬＰ−１コンストラクト♯１０３及び♯３１７（ＧＬＰ−１（７−３７）を一コピーのみ有する）において、ごくわずかな活性型のＧＬＰ−１の発現を見ることができる。ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞及びＨＥＫ２９３細胞内の双方で、二量体性（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ）のＧＬＰ−１コンストラクト♯２１７（ＧＬＰ−１（７−３７）を成分（Ｉ）及び成分（ＩＩＩ）として有する）において、発現の非常な増加が観察された。
【図３】図３は、ＧＬＰ−１分泌細胞からの細胞培養上清をウェスタンブロット解析した結果を示す（実施例３もまた参照）。レーン１：模擬（ｍｏｃｋ）トランスフェクトがなされたｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞の上清中に溶解した１００ｎｇの合成ＧＬＰ−１（７−３７）；レーン２：コンストラクト♯２１７からの二量体性のＧＬＰ−１を分泌しているｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞（クローン７９ＴＭ２１７／１３）の上清；レーン３：コンストラクト♯２１７からの二量体性のＧＬＰ−１を分泌しているＡｔＴ２０細胞（クローン８１−Ａ−２１７／３）の上清；レーンＭ：前染色されたタンパク質マーカー（ｋＤａ）；この結果は、ここで定義がなされた、ＧＬＰ−１（７−３７）及びＣ末端の付加（図３の２及び３）を含むポリペプチドは、トランスフェクトされたセルラインから分泌され、ＧＬＰ−１（７−３７）の中央分子（ｍｉｄ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）エピトープに結合する抗ＧＬＰ−１抗体を用いて検出されることを示す。
【図４】図４及び図５は、本発明に従い使用されるＧＬＰ−１を用いて行なった、血漿安定性試験（インビトロ）を記述する。この目的のため、ＨＥＫ２９３細胞及びｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞は、ＧＬＰ−１（７−３７）（１）、ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２−１１アミノ酸により伸長（２）、及びＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２−ＧＬＰ−１（７−３７）（３）のコンストラクトにより、一時的にトランスフェクトされた。結果は、図４（ＨＥＫ２９３細胞）及び図５（ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞）に示す。ＨＥＫ２９３細胞及びｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞はともに、当該遺伝子コンストラクトにとり有効な宿主である（実施例４もまた参照）。
【図５】図４及び図５は、本発明に従い使用されるＧＬＰ−１を用いて行なった、血漿安定性試験（インビトロ）を記述する。この目的のため、ＨＥＫ２９３細胞及びｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞は、ＧＬＰ−１（７−３７）（１）、ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２−１１アミノ酸により伸長（２）、及びＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２−ＧＬＰ−１（７−３７）（３）のコンストラクトにより、一時的にトランスフェクトされた。結果は、図４（ＨＥＫ２９３細胞）及び図５（ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞）に示す。ＨＥＫ２９３細胞及びｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞はともに、当該遺伝子コンストラクトにとり有効な宿主である（実施例４もまた参照）。
【図６】図６は、下記に示すペプチドのウェスタンブロットを示す。以下の意味が付与される：配列番号１（ＩＤ１ｓｙｎ）はＧＬＰ−１（７−３７）に対応し、３１アミノ酸、３．３ｋＤである;配列番号８（ＩＤ８ｓｙｎ，ＣＭ３）はＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２に対応し、４６アミノ酸、５．１ｋＤである;配列番号７（ＩＤ７ｒｅｃ，ＣＭ２）はＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２−ＲＲ−ＧＬＰ２に対応し、８３アミノ酸、９．４ｋＤである;配列番号６（ＩＤ６ｓｙｎ，ＣＭｌ）はＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２−ＲＲ−ＧＬＰ１（７−３７）に対応し、７９アミノ酸、８．７ｋＤである（実施例５もまた参照)。
【図７】図７は、インビトロでのＧＬＰ−１ペプチドの血漿安定性試験を例証する。そのままのＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号１）と対照して、そのＣ−末端が伸長されたＧＬＰ−１ペプチドである配列番号６、配列番号７、及び配列番号８は、インビトロでのヒト血漿中で相当に安定化される。コントロールとして（右手側）、ＤＰＰ−ＩＶインヒビターを添加した実験で得られた結果を示す。ＧＬＰ−１の活性は、これらのコントロール実験において完全に維持される（実施例６もまた参照)。
【図８】図８は、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の産生をともなうインビトロでのバイオアッセイの結果を示す：図８より見ることができるように、１００％ｃＡＭＰ産生は、ＧＬＰ−１が不存在の場合の基礎産生に対応する。ＧＬＰ−１は、Ｇタンパク質結合受容体に結合して、ｃＡＭＰ産生を刺激する。試験したすべてのＧＬＰ−１分子（ＩＤ１ｓｙｎ、ＩＤ６ｓｙｎ、ＩＤ６ｒｅｃ、ＩＤ７ｒｅｃ、ＩＤ８ｓｙｎ）が、細胞のｃＡＭＰ産生を増加させる（実施例７もまた参照)。
【図９】図９は、ここで定義がなされたＧＬＰ−１コンストラクトを用い、１１週齢のタイプＩＩ糖尿病マウス（Ｃ５７ＢＬ／Ｋｓ−Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂ，Ｈａｒｌａｎ）に対して行った、インビボにおける生物学的活性の試験の結果を例証する。テストされた全てのＧＬＰ−１（配列番号６（合成の、または、組換え型の）と配列番号７（合成の、または、組換え型の））が、多糖症に抗する効果（ａｎｔｉ−ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ  ｅｆｆｅｃｔ）を持つ。最良の結果は、組換え型の配列番号６（ＣＭ１）及び合成の配列番号８（ＣＭ３）を用いた場合に得られた（実施例８もまた参照)。
【図１０】図１０は、一時的かつ安定的な遺伝子発現を行なうための典型的なベクターを表す。当該ベクターは二つの別々の転写ユニットからなり、一つは対象となる遺伝子のためのもの（ＧＯＩ）であり、一つは自殺遺伝子ＨＳＶチミジンキナーゼとブラスティシジン（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）耐性遺伝子との融合のためのものである。第一の転写ユニット用に、ヒトユビキチンＢプロモータが使用され、第二の転写ユニット用に、ヒトフェリチンプロモータが使用された（実施例９もまた参照）。
【図１１】図１１、１２は、本発明の球状のマイクロカプセルに用いられる細胞を予め不死化した後の、当該細胞のキャラクタリゼーションを例証する。図１１から見られるように、不死化細胞はいまだに、不死化されていない対応細胞と同様に、脂肪細胞、骨細胞、及び軟骨細胞に分化することができる（図１１参照）。不死化細胞は繊維芽細胞の形態を持ち、例えば、ここで使用した一次細胞の特徴であるＣＤ４４及びＣＤ１６６エピトープマーカーを用いたフローサイトメトリーにより示されるように、致死のＭＳＣｓと同様に大きさや粒度に関してより均質である。不死化細胞は、不死化されていない対応細胞と同じＣＤマーカーを発現する（図１２を参照）。
【図１２】図１１、１２は、本発明の球状のマイクロカプセルに用いられる細胞を予め不死化した後の、当該細胞のキャラクタリゼーションを例証する。図１１から見られるように、不死化細胞はいまだに、不死化されていない対応細胞と同様に、脂肪細胞、骨細胞、及び軟骨細胞に分化することができる（図１１参照）。不死化細胞は繊維芽細胞の形態を持ち、例えば、ここで使用した一次細胞の特徴であるＣＤ４４及びＣＤ１６６エピトープマーカーを用いたフローサイトメトリーにより示されるように、致死のＭＳＣｓと同様に大きさや粒度に関してより均質である。不死化細胞は、不死化されていない対応細胞と同じＣＤマーカーを発現する（図１２を参照）。
【図１３】図１３、１４、１５は、異なる細胞タイプ（ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞:図１３；ＡｔＴ２０細胞：図１４；又はＨＥＫ２９３細胞：図１５)及びクローン番号を用いた、ＧＬＰ−１分泌のウェスタンブロット分析を示す。この結果は、トランスフェクトされたセルラインからＧＬＰ−１／Ｃ末端ペプチドのコンストラクトが分泌される、すなわち、当該タンパク質は予期した分子量を持つことを示す。さらに、当該タンパク質は、ＧＬＰ−１（７-３７）のＮ末端に結合する抗ＧＬＰ−１抗体に結合する。  図１３Ａは、ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣセルラインからのＧＬＰ−１の分泌である（１:模擬トランスフェクトがなされたｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞の上清に溶解した１００ｎｇの合成ＧＬＰ１７−３７  ２:ＧＬＰ−１ＣＭ１分泌ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞（クローン７９ＴＭ２１７／１３）の上清，Ｍ：前染色したタンパク質マーカー［ｋＤａ］）。  図１３Ｂは、ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣセルラインからのＧＬＰ−１の分泌である（Ｍ：前染色したタンパク質マーカー［ｋＤａ］，  １：ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣの細胞外培地中に溶解した１００ｎｇの合成ＧＬＰ１７−３７，  ２：アナログＧＬＰＣＭ１（Ｇ８）分泌ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞（クローン７８ＴＭ２１６／２）の上清，  ３:ＧＬＰＣＭ１分泌ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞（クローン７９ＴＭ２１７／１３）の上清)。
【図１４】図１３、１４、１５は、異なる細胞タイプ（ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞:図１３；ＡｔＴ２０細胞：図１４；又はＨＥＫ２９３細胞：図１５)及びクローン番号を用いた、ＧＬＰ−１分泌のウェスタンブロット分析を示す。この結果は、トランスフェクトされたセルラインからＧＬＰ−１／Ｃ末端ペプチドのコンストラクトが分泌される、すなわち、当該タンパク質は予期した分子量を持つことを示す。さらに、当該タンパク質は、ＧＬＰ−１（７-３７）のＮ末端に結合する抗ＧＬＰ−１抗体に結合する。  図１４は、ＡｔＴ２０セルラインから分泌されたＧＬＰ１である（１：ＡｔＴ２０細胞が分泌するアナログＧＬＰＣＭ１（Ｇ８）（クローン８０−Ａ−２１６／１）の上清，  ２：ＡｔＴ２０細胞が分泌する野生型のＧＬＰＣＭ１（クローン８１−Ａ−２１７／３）の上清）。
【図１５】図１３、１４、１５は、異なる細胞タイプ（ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞:図１３；ＡｔＴ２０細胞：図１４；又はＨＥＫ２９３細胞：図１５)及びクローン番号を用いた、ＧＬＰ−１分泌のウェスタンブロット分析を示す。この結果は、トランスフェクトされたセルラインからＧＬＰ−１／Ｃ末端ペプチドのコンストラクトが分泌される、すなわち、当該タンパク質は予期した分子量を持つことを示す。さらに、当該タンパク質は、ＧＬＰ−１（７-３７）のＮ末端に結合する抗ＧＬＰ−１抗体に結合する。  図１５は、一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から分泌されたＧＬＰ１である（１：ストロメライシン−ＧＬＰ１７−３７コンストラクト（＃１０３）によって一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の上清、  ２:ストロメライシン−ＧＬＰ１７−３７−ＩＰ２−１１アミノ酸により伸長されたコンストラクト（＃３１７）によって一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の上清、  ３：ストロメライシン−ＧＬＰ１ＣＭ１コンストラクト（＃２１７）によって一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の上清、  ４:ストロメライシン−ＧＬＰ１７−３７−ＩＰ２（４ｘ）コンストラクト（＃１５９）によって一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の上清)。
【図１６】図１６は、ＧＬＰ１ＣＭペプチドの免疫沈降を示す。抗ＧＬＰ−１補足抗体ＨＹＢ１４７−１２又はＨＹＢ１４７−１２（Ａｎｔｉｂｏｄｙｓｈｏｐ）を用いた、細胞培養上清由来のＧＬＰＣＭ１ペプチドの免疫沈降により、ＧＬＰＣＭ１ペプチドの蓄積と交差コンタミネーションするタンパク質の除去という結果が得られた。１：ＧＬＰＣＭ１分泌ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞（クローン７９ＴＭ２１７／１３）の上清、  ２：タンパク質Ｇ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ）との免疫沈降、ただし、ＧＬＰ１抗体は用いない、  ３：タンパク質Ｇ及びＧＬＰ１抗体ｓｃ−７７８２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いた免疫沈降、  ４：タンパク質Ｇ及びＧＬＰ1抗体ｓｃ−２６６３７（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いた免疫沈降、  ５：タンパク質Ｇ及びＧＬＰ１抗体ＨＹＢ１４７−１２（Ａｎｔｉｂｏｄｙｓｈｏｐ）を用いた免疫沈降，  ６：タンパク質Ｇ及びＧＬＰ１抗体ＨＹＢ１４７−０８（Ａｎｔｉｂｏｄｙｓｈｏｐ）を用いた免疫沈降、  ７：１０ｎｇの合成ＧＬＰ１７−３７，  ８：３１ｎｇの合成ＧＬＰ１７−３７，  ９：１００ｎｇの合成ＧＬＰ１７−３７，当該ＧＬＰ１、抗体ＨＹＢ１４７−０８及び抗体ＨＹＢ１４７−１２を用いた免疫沈降により、当該ＧＬＰＣＭ１ペプチドの蓄積と、それにより交差コンタミネーションしたタンパク質が上清から除去される、という結果が得られた（レーン１のクマシー染色を参照）。
【図１７】図１７は、本発明の球状のマイクロカプセル（細胞ビーズ（ＣｅｌｌＢｅａｄｓ）)をｄｂ／ｄｂマウスに適用した動物試験を例証する。使用したマウスモデルはタイプＩＩ糖尿病マウスＣ５７／Ｋｓ−ＲＪ  ｄｂ／ｄｂ  （レプチン受容体の劣性変異）であって、マウスＧＬＰ／ＣＭ１（配列番号６）を分泌する細胞ビーズを移植したものである。ＧＬＰ分泌セルラインはＡｔＴ２０であった。糖尿病マウスの血清中の活性型ＧＬＰを、本発明の球状のマイクロカプセル（細胞ビーズ）の移植後２日目、２２日目に、ＧＬＰ−Ｉ（活性型）  ＥＬＩＳＡ（＃ＥＧＬＰ−３５Ｋ，  Ｂｉｏｔｒｅｎｄ）を用いて測定した。カラムは次を表す。：動物７−１０：ｄｂ／ｄｂマウスでありＧＬＰ−１ＣＭ１分泌細胞ビーズ移植の治療を受けたもの。動物１３，１５：ｄｂ／ｄｂマウスであり、細胞ビーズ（ＧＬＰ１分泌なし）移植の治療を受けたもの。動物ｄｂ／−：非糖尿病コントロールマウス、治療を受けていない。
【図１８】図１８は、糖尿病Ｃ５７／Ｋｓ−ＲＪ  ｄｂ／ｄｂマウス（ｄｂ／ｄｂ  ｎ＝３）の絶食時の血中グルコースレベルを示す。非糖尿病のヘテロ接合性の同腹仔（ｄｂ／−  ｎ＝１）及び糖尿病Ｃ５７／Ｋｓ−ＲＪ  ｄｂ／ｄｂマウスを、ＧＬＰＣＭ１（Ｇ８）（配列番号６ただし２番目の残基がＧ）（ｎ＝３）又はＧＬＰＣＭ１（配列番号６）（ｎ＝３）を分泌する本発明の球状のマイクロカプセル（ＧＬＰ−１  細胞ビーズ）を用いて治療し、移植後、２、９および２２日目に測定した。
【図１９】図１９は、糖尿病Ｃ５７／Ｋｓ−ＲＪ  ｄｂ／ｄｂマウス（ｄｂ／ｄｂ  ｎ＝３）の絶食時の血中グルコースレベルを描写する。非糖尿病のヘテロ接合性の同腹仔（ｄｂ／−  ｎ＝１）及び糖尿病Ｃ５７／Ｋｓ−ＲＪ  ｄｂ／ｄｂマウスを、その首の脂肪塊（ｆａｔ  ｐａｄ）（ｎ＝２）又は筋肉（ｎ＝２）に、ＧＬＰＣＭ１（Ｇ８）を分泌する本発明の球状のマイクロカプセル（細胞ビーズ）を移植することで治療し、移植後、２、９、および２２日目に測定した。
【図２０】図２０は、ＩＰＧＴＴ（ｉ．ｐグルコース負荷試験)を例証する。一晩絶食させたマウスに２０％のグルコース溶液のｉ．ｐ注射をした（グラム体重あたり１ｍｇのグルコース）。血中グルコースの測定は、注射前及び注射後の２時間に行われた。図２０は１４週齢の糖尿病Ｃ５７／Ｋｓ−ＲＪ  ｄｂ／ｄｂマウス（ｄｂ／ｄｂ  ｎ＝３）でのＩＰＧＴＴを示す。非糖尿病のヘテロ接合性の同腹仔（ｄｂ／−  ｎ＝１)及び糖尿病Ｃ５７／Ｋｓ−ＲＪ  ｄｂ／ｄｂマウスに対して、その首の脂肪塊（ｆａｔ  ｐａｄ）（ｎ＝２）又は筋肉（ｎ＝２）に、ＧＬＰＣＭ１（Ｇ８）を分泌する本発明の球状のマイクロカプセル（細胞ビーズ）を、試験を行なう９日前に移植した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009536166.tif 000024
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