(57)【要約】  ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドを同定するための方法を記載する。ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドは、ヘアコンディショナーマトリックスから毛髪に強く結合し、ヘアコンディショナーマトリックス中で安定である。ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドに基づく、ヘアコンディショナーおよび毛髪着色料などのペプチドをベースとする有効薬剤を記載する。ペプチドをベースとするヘアコンディショナーおよび毛髪着色料は、直接的に、あるいは任意のスペーサーを介して毛髪コンディショニング剤または着色剤と結びつけられた、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドからなる。これらのペプチドをベースとするヘアコンディショナーおよび着色料を含んでなるヘアケアおよび毛髪着色製品組成物も記載する。
2009500003.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドを同定するための方法であって、
ａ）ＤＮＡ結合型ペプチドのコンビナトリアルライブラリを提供すること、
ｂ）（ａ）のライブラリを毛髪サンプルと接触させること（ここで、毛髪が、ＤＮＡ結合型ペプチドと複合体を形成して、ＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を含んでなる反応溶液が形成される）、
ｃ）（ｂ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を反応溶液から単離すること、
ｄ）（ｃ）の単離されたＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を、濃度が最大濃度の少なくとも約１０％であるヘアコンディショナーマトリックスと接触させて、コンディショニング液を形成させること、
ｅ）（ｄ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体をコンディショニング液から単離すること、
ｆ）（ｅ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体のペプチド部分をコードするＤＮＡを増幅させること、および
ｇ）コンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドをコードする（ｆ）の増幅されたＤＮＡを配列決定すること（ここで、コンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドが同定される）
を含んでなる方法。
【請求項２】
工程（ｅ）の後、
ｉ）ＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体のペプチドが、溶離剤と接触され（それによって、一部のＤＮＡ結合型ペプチドは、毛髪から溶離され、一部のＤＮＡ結合型ペプチドは、複合体形成されたままとなる）、
ｉｉ）（ｉｉ）の溶離または複合体形成されたＤＮＡ結合型ペプチドが、工程（ｆ）および（ｇ）にかけられる
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ペプチドをコードするＤＮＡが、
ａ）ポリメラーゼ連鎖反応によって、ペプチドコード領域を含んでなるＤＮＡを増幅させること、および
ｂ）当該ペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるファージで宿主細胞を感染させて、適切な増殖培地中で前記宿主細胞を増殖させること
よりなる群から選択されるプロセスによって増幅される請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｆ）の増幅されたＤＮＡによってコードされるペプチドが、新たな毛髪サンプルと接触され、工程（ｂ）から（ｆ）が、１回もしくはそれ以上繰り返される請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｄ）が１回もしくはそれ以上繰り返される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡ結合型ペプチドのコンビナトリアルライブラリが、濃度が最大濃度の少なくとも約１０％であるヘアコンディショナーマトリックス中に提供され、毛髪サンプルと接触されて、ＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を含んでなる反応溶液が形成される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡ結合型ペプチドのコンビナトリアルライブラリが、濃度が最大濃度の少なくとも約１０％であるヘアコンディショナーマトリックス中に提供され、毛髪サンプルと接触されて、ＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を含んでなる反応溶液が形成されるが、工程（ｄ）および（ｅ）は、場合により省略される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＤＮＡ結合型ペプチドのコンビナトリアルライブラリが、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、および酵母ディスプレイよりなる群から選択される方法によって産生される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＤＮＡ結合型ペプチドのコンビナトリアルライブラリが、毛髪サンプルを接触させるよりも前に、あるいは同時に、非標的と場合により接触され、非標的と結合したペプチドが除去される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ヘアコンディショナーマトリックスの濃度が、最大濃度の少なくとも約２０％である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ヘアコンディショナーマトリックスの濃度が、最大濃度の少なくとも約５０％である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ヘアコンディショナーマトリックスの濃度が、最大濃度の少なくとも約７５％である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ヘアコンディショナーマトリックスが希釈されない請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
溶離剤が、酸、塩基、食塩水、水、エチレングリコール、ジオキサン、チオシアン酸塩、グアニジン、および尿素よりなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
ａ）ＤＮＡ結合型ペプチドのコンビナトリアルライブラリを提供する工程、
ｂ）（ａ）のライブラリを毛髪サンプルと接触させる工程（ここで、毛髪は、ＤＮＡ結合型ペプチドと複合体を形成して、ＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を含んでなる反応溶液が形成される）、
ｃ）反応溶液から（ｂ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を単離する工程、
ｄ）（ｃ）の単離されたＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を、濃度が最大濃度の少なくとも約１０％であるヘアコンディショナーマトリックスと接触させて、コンディショニング液を形成する工程、
ｅ）（ｄ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を、コンディショニング液から単離する工程、
ｆ）（ｅ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体ペプチド部分をコードするＤＮＡを増幅させる工程、および
ｇ）コンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドをコードする（ｆ）の増幅されたＤＮＡを配列決定する工程（ここで、コンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドが同定される）
を含んでなるプロセスによって同定されるヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチド。
【請求項１６】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号１２よりなる群から選択されるヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチド。
【請求項１７】
一般構造（ＨＣＰｍ）ｎ−ＢＡ（式中、
ａ）ＨＣＰは、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドであり、
ｂ）ＢＡは、有効薬剤であり、
ｃ）ｍは、１から約１００までの範囲であり、
ｄ）ｎは、１から約５０，０００までの範囲である）
で表される、ジブロック型のペプチドをベースとする毛髪有効薬剤。
【請求項１８】
一般構造［（ＨＣＰｘ−Ｓ）ｍ］ｎ−ＢＡ
（式中、
ａ）ＨＣＰは、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドであり、
ｂ）ＢＡは、有効薬剤であり、
ｃ）Ｓは、スペーサーであり、
ｄ）ｘは、１から約１０までの範囲であり、
ｅ）ｍは、１から約１００までの範囲であり、
ｆ）ｎは、１から約５０，０００までの範囲である）
で表される、トリブロック型のペプチドをベースとする毛髪有効薬剤。
【請求項１９】
有効薬剤が毛髪コンディショニング剤である、請求項１７に記載のジブロック型のペプチドをベースとする有効薬剤。
【請求項２０】
有効薬剤が毛髪コンディショニング剤である、請求項１８に記載のトリブロック型のペプチドをベースとする有効薬剤。
【請求項２１】
有効薬剤が着色剤である、請求項１７に記載のジブロック型のペプチドをベースとする有効薬剤。
【請求項２２】
有効薬剤が着色剤である、請求項１８に記載のトリブロック型のペプチドをベースとする有効薬剤。
【請求項２３】
ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドが、
ａ）ＤＮＡ結合型ペプチドのコンビナトリアルライブラリを提供する工程、
ｂ）（ａ）のライブラリを毛髪サンプルと接触させる工程（ここで、毛髪は、ＤＮＡ結合型ペプチドと複合体を形成し、ＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を含んでなる反応溶液が形成される）、
ｃ）反応溶液から（ｂ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を単離する工程、
ｄ）（ｃ）の単離されたＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を、濃度が最大濃度の少なくとも約１０％であるヘアコンディショナーマトリックスと接触させて、コンディショニング液を形成する工程、
ｅ）コンディショニング液から（ｄ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を単離する工程、
ｆ）（ｅ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体のペプチド部分をコードするＤＮＡを増幅させる工程、および
ｇ）ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドをコードする（ｆ）の増幅されたＤＮＡを配列決定する工程（ここで、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドが同定される）
を含んでなるプロセスによって単離される請求項１７〜２２のいずれか一項に記載のペプチドをベースとする有効薬剤。
【請求項２４】
ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドが、約７アミノ酸から約２５アミノ酸の長さである請求項１７〜２２のいずれか一項に記載のペプチドをベースとする有効薬剤。
【請求項２５】
ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドが、約１２アミノ酸から約２０アミノ酸の長さである請求項１７〜２２のいずれか一項に記載のペプチドをベースとする有効薬剤。
【請求項２６】
ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドが、
ａ）Ｎ末端、および
ｂ）Ｃ末端
よりなる群から選択されるペプチドの少なくとも１つの末端上に、少なくとも１つのシステイン残基をさらに含んでなる請求項１７〜２２のいずれか一項に記載のペプチドをベースとする有効薬剤。
【請求項２７】
ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドが、
ａ）Ｎ末端、および
ｂ）Ｃ末端
よりなる群から選択されるペプチドの少なくとも１つの末端上に、少なくとも１つのリジン残基をさらに含んでなる請求項１７〜２２のいずれか一項に記載のペプチドをベースとする有効薬剤。
【請求項２８】
ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号１２よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１７〜２２のいずれか一項に記載のペプチドをベースとする有効薬剤。
【請求項２９】
毛髪コンディショニング剤が、オクチルアミン、ステアリルアミン、ベヘニルアルコール、ビニル基末端シロキサン、ビニル基末端シリコーン、ビニル基末端メチルビニルシロキサン、ビニル基末端メチルビニルシリコーン、ヒドロキシル末端シロキサン、ヒドロキシル末端シリコーン、アミノ修飾シリコーン誘導体、［（アミノエチル）アミノ］プロピルヒドロキシルジメチルシロキサン、［（アミノエチル）アミノ］プロピルヒドロキシルジメチルシリコーン、アルファ−トリデシル−オメガ−ヒドロキシ−ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）、アモジメチコン、およびナノ粒子よりなる群から選択される請求項１９または２０に記載のペプチドをベースとする有効薬剤。
【請求項３０】
着色剤が、Ｄ＆Ｃイエロー（Ｄ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ）１、Ｄ＆Ｃイエロー（Ｄ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ）３、ＨＣイエロー（ＨＣ  Ｙｅｌｌｏｗ）６、ＨＣイエロー（ＨＣ  Ｙｅｌｌｏｗ）８、Ｄ＆Ｃブルー（Ｄ＆Ｃ  Ｂｌｕｅ）１、ＨＣブルー（ＨＣ  Ｂｌｕｅ）１、ＨＣブラウン（ＨＣ  Ｂｒｏｗｎ）２、ＨＣレッド（ＨＣ  Ｒｅｄ）５、２−ニトロ−パラフェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ヒドロキシエチル−２−ニトロ−フェニレンジアミン、４−ニトロ−インドール、酸化鉄、二酸化チタン、カーボンブラック、カーボンナノチューブ、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子、および有色のマイクロスフィアよりなる群から選択される請求項２１または２２に記載のペプチドをベースとする有効薬剤。
【請求項３１】
有色のマイクロスフィアが、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルトルエン、スチレン／ブタジエンコポリマー、およびラテックスよりなる群から選択される材料を含んでなり、その直径が、約１０ナノメートから約２ミクロンである請求項３０に記載のペプチドをベースとする有効薬剤。
【請求項３２】
スペーサーが、エタノールアミン、エチレングリコール、鎖長が６炭素原子であるポリエチレン、３から６の繰返し単位を有するポリエチレングリコール、フェノキシエタノール、プロパノールアミド、ブチレングリコール、ブチレングリコールアミド、プロピルフェニル、エチルアルキル鎖、プロピルアルキル鎖、ヘキシルアルキル鎖、ステリルアルキル鎖、セチルアルキル鎖、およびパルミトイルアルキル鎖よりなる群から選択される請求項１８、２０、または２２のいずれか一項に記載のペプチドをベースとする有効薬剤。
【請求項３３】
スペーサーが、プロリン、リジン、グリシン、アラニン、セリン、およびそれらの混合物よりなる群から選択されるアミノ酸を含んでなるペプチドである請求項１８、２０、または２２のいずれか一項に記載のペプチドをベースとする有効薬剤。
【請求項３４】
スペーサーが、配列番号６、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドである請求項１８、２０、または２２のいずれか一項に記載のペプチドをベースとする有効薬剤。
【請求項３５】
請求項１７または１８の有効な量のペプチドをベースとする有効薬剤を含んでなるヘアケア製品組成物。
【請求項３６】
請求項２１または２２の有効な量のペプチドをベースとする有効薬剤を含んでなる毛髪着色製品組成物。
【請求項３７】
請求項２１または２２の有効な量のペプチドをベースとする有効薬剤を含んでなる化粧品組成物。
【請求項３８】
請求項１９または２０の有効な量のペプチドをベースとする有効薬剤を含んでなる毛髪着色製品組成物。
【請求項３９】
請求項１９または２０の有効な量のペプチドをベースとする有効薬剤を含んでなる毛髪コンディショニング製品組成物。
【請求項４０】
請求項３９の組成物を毛髪に適用することと、前記保護層を形成させることを含んでなる、毛髪上にペプチドをベースとするコンディショナーの保護層を形成するための方法。
【請求項４１】
毛髪を着色するのに十分な時間、請求項３８の組成物を毛髪に適用することを含んでなる、毛髪を着色するための方法。
【請求項４２】
眉または睫毛に請求項３７の組成物を適用することを含んでなる、眉または睫毛を着色するための方法。
【請求項４３】
毛髪、眉、または睫毛を着色するための方法であって、
ａ）
ｉ）（ＨＣＰｍ）ｎ−Ｃ、および
ｉｉ）［（ＨＣＰｘ−Ｓ）ｍ］ｎ−Ｃ
（式中、
１）ＨＣＰは、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドであり、
２）Ｃは、着色剤であり、
３）ｎは、１から約５０，０００までの範囲であり、
４）Ｓは、スペーサーであり、
５）ｍは、１から約１００までの範囲であり、
６）ｘは、１から約１０までの範囲であり、
ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドは、
Ａ）ＤＮＡ結合型ペプチドのコンビナトリアルライブラリを提供する工程、
Ｂ）（Ａ）のライブラリを毛髪サンプルと接触させて（ここで、毛髪は、ＤＮＡ結合型ペプチドと複合体を形成する）、ＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を含んでなる反応溶液を形成する工程、
Ｃ）反応溶液から（Ｂ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を単離する工程、
Ｄ）（Ｃ）の単離されたＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を、濃度が最大濃度の少なくとも約１０％であるヘアコンディショナーマトリックスと接触させて、コンディショニング液を形成する工程、
Ｅ）このコンディショニング液から（Ｄ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を単離する工程、
Ｆ）（Ｅ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体のペプチド部分をコードするＤＮＡを増幅させる工程、
Ｇ）ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドをコードする（Ｆ）の増幅されたＤＮＡを配列決定する工程（ここで、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドが同定される）
を含んでなる方法によって選択される）
よりなる群から選択される毛髪着色料を含んでなる毛髪着色組成物を提供する工程、ならびに
ｂ）毛髪着色料が毛髪、眉、または睫毛に結合するのに十分な時間、毛髪、眉、または睫毛に（ａ）の毛髪着色組成物を適用する工程
を含んでなる方法。
【請求項４４】
毛髪上にペプチドをベースとするコンディショナーの保護層を形成するための方法であって、
ａ）
ｉ）（ＨＣＰｍ）ｎ−ＨＣＡ、および
ｉｉ）［（ＨＣＰｘ−Ｓ）ｍ］ｎ−ＨＣＡ
（式中、
１）ＨＣＰは、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドであり、
２）ＨＣＡは、毛髪コンディショニング剤であり、
３）ｎは、１から約５０，０００までの範囲であり、
４）Ｓは、スペーサーであり、
５）ｍは、１から約１００までの範囲であり、
６）ｘは、１から約１０までの範囲であり、
ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドは、
Ａ）ＤＮＡ結合型ペプチドのコンビナトリアルライブラリを提供する工程、
Ｂ）（Ａ）のライブラリを毛髪サンプルと接触させて（ここで、毛髪は、ＤＮＡ結合型ペプチドと複合体を形成する）、ＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を含んでなる反応溶液を形成する工程、
Ｃ）反応溶液から（Ｂ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を単離する工程、
Ｄ）（Ｃ）の単離されたＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を、濃度が最大濃度の少なくとも約１０％であるヘアコンディショナーマトリックスと接触させて、コンディショニング液を形成する工程、
Ｅ）このコンディショニング液から（Ｄ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を単離する工程、
Ｆ）（Ｅ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体のペプチド部分をコードするＤＮＡを増幅させる工程、
Ｇ）コンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドをコードする（Ｆ）の増幅されたＤＮＡを配列決定する工程（ここで、コンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドが同定される）
を含んでなる方法によって選択される）
よりなる群から選択されるヘアコンディショナーを含んでなるヘアケア組成物を提供する工程、ならびに
ｂ）（ａ）のヘアケア組成物を毛髪に適用して、前記保護層を形成させる工程
を含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
この特許出願は、２００５年３月１日に出願された米国仮特許出願第６０／６５７４９６号の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明はパーソナルケア製品の分野に関する。本発明は、より詳細には、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドを同定するための方法、ならびにペプチドをベースとする毛髪有効薬剤（ヘアコンディショナーおよび着色料など）におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヘアコンディショナーおよび毛髪着色料は、よく知られている頻繁に使用されるヘアケア製品である。最新のヘアコンディショナーおよび非酸化染毛剤に関する主な課題は、これらが、持続性作用に必要とされる耐久性を欠くことである。酸化染毛剤では色が持続するが、それが含有する酸化剤によって、毛髪損傷が引き起こされる。こうした組成物の耐久性を向上させるために、ペプチドをベースとするヘアコンディショナー、毛髪着色料、および他の有効薬剤が開発されている（ホワン（Ｈｕａｎｇ）ら、同時係属中の共同所有される特許文献１、および特許文献２）。ペプチドをベースとするヘアコンディショナーまたは着色料は、毛髪に対して高い結合親和性を有する特異的ペプチド配列を、それぞれコンディショニング剤または着色剤と結びつけることによって調製される。ペプチド部分は、毛髪に結合し、それによって、コンディショニング剤または着色剤は強く付着される。毛髪に対して高い結合親和性を有するペプチドは、ファージディスプレイスクリーニング技術を使用して同定されている（ホワン（Ｈｕａｎｇ）ら、上記；エステル（Ｅｓｔｅｌｌ）ら、特許文献３；マレイ（Ｍｕｒｒａｙ）ら、特許文献４；ヤンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）ら、特許文献５；およびヤンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）ら、特許文献６）。特許文献３、特許文献４、特許文献５、および特許文献６の出願は、バスジェル（ｂａｔｈ  ｇｅｌ）希薄溶液（すなわち２％水溶液）の存在下で毛髪サンプルとペプチドライブラリを接触させることと、ファージディスプレイスクリーニング中にバスジェル溶液でファージ−ペプチド−毛髪複合体を洗浄することを記載しているが、使用されるバスジェルの濃度は、バスジェル耐性の毛髪結合ペプチドを同定するには低過ぎる。
【０００４】
毛髪結合ペプチドは、ヘアコンディショナーマトリックスが存在する場合には、結合親和性が低下するので、コンディショナーマトリックスから毛髪には強く結合しない、あるいは、ヘアコンディショナーの適用によって毛髪から洗浄される。さらに、毛髪結合ペプチドは、コンディショナーマトリックス中で長い時間安定ではなく、これによって、ヘアコンディショナー製品では、時間とともにその結合親和性が低下する。
【０００５】
シャンプー耐性の毛髪結合ペプチドを同定するための方法（ホワン（Ｈｕａｎｇ）ら、同時係属中の共同所有される特許文献７、およびオブライエン（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ）ら、同時係属中の共同所有される特許文献８）、癜風菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｆｕｒｆｕｒ）の細胞表面タンパク質に結合するシャンプー耐性の抗体断片（ドルク（Ｄｏｌｋ）ら非特許文献１）、およびスキンケア組成物耐性の皮膚結合ペプチド（ワン（Ｗａｎｇ）ら、同時係属中の共同所有される特許文献９）が報告されている。しかし、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドを同定するための方法は、記載されていない。
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／００５０６５６号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／０２２６８３９号明細書
【特許文献３】国際公開第０１７９４７９号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願公開第２００２／００９８５２４号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／０１５２９７６号明細書
【特許文献６】国際公開第０４０４８３９９号パンフレット
【特許文献７】米国特許出願公開第２００５／００５０６５６号明細書
【特許文献８】米国特許出願第１１／２５１７１５号明細書
【特許文献９】米国仮特許出願第６０／６５７４９４号
【非特許文献１】「Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」７１：４４２〜４５０（２００５年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、解決されるべき課題は、ヘアコンディショナーマトリックスから毛髪に結合することが可能であり、ヘアコンディショナー中で安定である毛髪結合ペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本出願人等は、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドを同定するための方法を発見することによって、所定の課題に対処している。同定されたヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチド配列は、ヘアコンディショナーマトリックスから毛髪に結合し、コンディショナーマトリックス中での２１日の期間後も、結合活性の喪失を示さない。ヘアコンディショナーマトリックスが存在する場合でも毛髪に対して高い結合親和性を有し、ヘアコンディショナー組成物中での安定性が向上された、ヘアコンディショナーおよび着色料などのペプチドをベースとする毛髪有効薬剤を調製するために、こうした毛髪結合ペプチドを使用することができる。
【０００９】
本発明は、ヘアケア用組成物中でリンカーおよび接着剤として有用な、新規の毛髪コンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドの同定および単離のための方法を提供する。毛髪コンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドを、化学薬品またはペプチドスペーサーおよび有効薬剤（着色料および／またはコンディショナーなど）を場合により含んでなるジブロックまたはトリブロック構造に組み込むことができる。本発明の方法は、様々なコンディショニング剤の存在下での毛髪結合特性についての、コンビナトリアルに産生されたペプチドライブラリのスクリーニングに頼るものである。
【００１０】
したがって、本発明は、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドを同定するための方法であって、
ａ）ＤＮＡ結合型（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ペプチドのコンビナトリアルライブラリを提供すること；
ｂ）（ａ）のライブラリを毛髪サンプルと接触させて、ＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を含んでなる反応溶液を形成させること；
ｃ）反応溶液から、（ｂ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を単離すること；
ｄ）（ｃ）の単離されたＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を、その濃度が最大（ｆｕｌｌ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）濃度の少なくとも約１０％であるヘアコンディショナーマトリックスと接触させて、コンディショニング液を形成させること；
ｅ）コンディショニング液から（ｄ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を単離すること；
ｆ）（ｅ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体のペプチド部分をコードするＤＮＡを増幅させること；および
ｇ）コンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドをコードする（ｆ）の増幅されたＤＮＡを配列決定すること（ここで、コンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドが同定される）
を含んでなる方法を提供する。
【００１１】
場合により、工程（ｅ）の後、毛髪結合ペプチドを、溶離薬を用いて毛髪から溶離することができ、本発明の方法によって同定されたペプチドを、この方法への連続的な適用によって、さらに精製することができる。
【００１２】
さらに、本発明は、
ａ）ＤＮＡ結合型ペプチドのコンビナトリアルライブラリを提供する工程；
ｂ）（ａ）のライブラリを毛髪サンプルと接触させて、ＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を含んでなる反応溶液を形成する工程；
ｃ）反応溶液から、（ｂ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を単離する工程；
ｄ）（ｃ）の単離されたＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を、濃度が最大濃度の少なくとも約１０％であるヘアコンディショナーマトリックスと接触させて、コンディショニング液を形成する工程；
ｅ）（ｄ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体をコンディショニング液から単離する工程；
ｆ）（ｅ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体のペプチド部分をコードするＤＮＡを増幅させる工程；および
ｇ）コンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドをコードする（ｆ）の増幅されたＤＮＡを配列決定する工程（ここで、コンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドが同定される）
を含んでなるプロセスによって同定されるヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドを提供する。本発明の特異的なヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号１２で示される。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、一般構造（ＨＣＰｍ）ｎ−ＢＡで表されるジブロック型のペプチドをベースとする有効薬剤を提供する。式中、
ａ）ＨＣＰは、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドであり、
ｂ）ＢＡは、有効薬剤であり、
ｃ）ｍは、１から約１００までの範囲であり、
ｄ）ｎは、１から約５０，０００までの範囲である。
【００１４】
同様にして、本発明は、一般構造［（ＨＣＰｘ−Ｓ）ｍ］ｎ−ＢＡで表されるトリブロック型のペプチドをベースとする有効薬剤を提供する。式中、
ａ）ＨＣＰは、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドであり、
ｂ）ＢＡは、有効薬剤であり、
ｃ）Ｓは、スペーサーであり、
ｄ）ｘは、１から約１０までの範囲であり、
ｅ）ｍは、１から約１００までの範囲であり、
ｆ）ｎは、１から約５０，０００までの範囲である。
【００１５】
好ましい実施形態では、本発明は、ヘアコンディショナーおよび着色料を提供する。ここで、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドは、
ａ）ＤＮＡ結合型ペプチドのコンビナトリアルライブラリを提供する工程；
ｂ）（ａ）のライブラリを毛髪サンプルと接触させて、ＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を含んでなる反応溶液を形成させる工程；
ｃ）反応溶液から（ｂ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を単離する工程；
ｄ）（ｃ）の単離されたＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を、濃度が最大濃度の少なくとも約１０％であるヘアコンディショナーマトリックスと接触させて、コンディショニング液を形成する工程；
ｅ）コンディショニング液から（ｄ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を単離する工程；
ｆ）（ｅ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体のペプチド部分をコードするＤＮＡを増幅させる工程；および
ｇ）コンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドをコードする（ｆ）の増幅されたＤＮＡを配列決定する工程（ここで、コンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドが同定される）
を含んでなるプロセスによって単離される。
【００１６】
さらに、本発明は、有効な量の本発明のペプチド・ジブロックおよびトリブロック有効薬剤を含んでなるヘアケア製品組成物を提供する。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、毛髪上にペプチドをベースとするコンディショナーの保護層を形成するための方法であって、本発明の組成物を毛髪に適用することと、前記保護層を形成させることを含んでなる方法を提供する。同様に、本発明は、毛髪を着色するための方法であって、本発明の組成物を、毛髪を着色させるのに十分な時間、毛髪に適用することを含んでなる方法を提供する。あるいは、本発明は、眉または睫毛を着色するための方法であって、本発明の組成物を眉または睫毛に適用することを含んでなる方法を提供する。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、
ａ）
ｉ）（ＨＣＰｍ）ｎ−Ｃ；および
ｉｉ）［（ＨＣＰｘ−Ｓ）ｍ］ｎ−Ｃ
（式中、
１）ＨＣＰは、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドであり、
２）Ｃは、着色剤であり、
３）ｎは、１から約５０，０００までの範囲であり、
４）Ｓは、スペーサーであり、
５）ｍは、１から約１００までの範囲であり、
６）ｘは、１から約１０までの範囲であり、
ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドは、
Ａ）ＤＮＡ結合型ペプチドのコンビナトリアルライブラリを提供する工程；
Ｂ）（Ａ）のライブラリを毛髪サンプルと接触させて、ＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を含んでなる反応溶液を形成する工程；
Ｃ）反応溶液から（Ｂ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を単離する工程；
Ｄ）（Ｃ）の単離されたＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を、濃度が最大濃度の少なくとも約１０％であるヘアコンディショナーマトリックスと接触させて、コンディショニング液を形成する工程；
Ｅ）コンディショニング液から（Ｄ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を単離する工程；
Ｆ）（Ｅ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体のペプチド部分をコードするＤＮＡを増幅させる工程；および
Ｇ）ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドをコードする、（Ｆ）の増幅されたＤＮＡを配列決定する工程（ここで、コンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドが同定される）
を含んでなる方法によって選択される）
よりなる群から選択される、毛髪着色料を含んでなる毛髪着色組成物を提供する工程；ならびに
ｂ）（ａ）の毛髪着色組成物を、毛髪着色料が、毛髪、眉、または睫毛に結合するのに十分な時間、毛髪、眉、または睫毛に適用する工程
を含んでなる、毛髪、眉、または睫毛を着色するための方法を提供する。
【００１９】
同様に、本発明は、
ａ）
ｉ）（ＨＣＰｍ）ｎ−ＨＣＡ；および
ｉｉ）［（ＨＣＰｘ−Ｓ）ｍ］ｎ−ＨＣＡ
（式中、
１）ＨＣＰは、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドであり、
２）ＨＣＡは、毛髪コンディショニング剤であり、
３）ｎは、１から約５０，０００までの範囲であり、
４）Ｓは、スペーサーであり、
５）ｍは、１から約１００までの範囲であり、
６）ｘは、１から約１０までの範囲であり、
ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドは、
Ａ）ＤＮＡ結合型ペプチドのコンビナトリアルライブラリを提供する工程；
Ｂ）（Ａ）のライブラリを毛髪サンプルと接触させて、ＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を含んでなる反応溶液を形成する工程；
Ｃ）反応溶液から（Ｂ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を単離する工程；
Ｄ）（Ｃ）の単離されたＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を、濃度が最大濃度の少なくとも約１０％であるヘアコンディショナーマトリックスと接触させて、コンディショニング液を形成する工程；
Ｅ）コンディショニング液から（Ｄ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を単離する工程；
Ｆ）（Ｅ）のＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体のペプチド部分をコードするＤＮＡを増幅させる工程；
Ｇ）コンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドをコードする（Ｆ）の増幅されたＤＮＡを配列決定する工程（ここで、コンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドが同定される）
を含んでなる方法によって選択される）
よりなる群から選択される、ヘアコンディショナーを含んでなるヘアケア組成物を提供する工程；ならびに
ｂ）（ａ）のヘアケア組成物を毛髪に適用して、前記保護層を形成させる工程
を含んでなる、毛髪上にペプチドをベースとするコンディショナーの保護層を形成するための方法を提供する。
【００２０】
図面の簡単な説明および配列の説明
本発明は、この出願の一部をなす以下の詳細な説明、図および添付の配列説明から、より十分に理解することができる。
【００２１】
以下の配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１−１．８２５（「Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ」）に従い、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）、およびＥＰＯの配列リスト要件（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌｉｓｔｉｎｇ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ）、およびＰＣＴ（規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）および実施細則（Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）の第２０８節および付属書Ｃ）と整合性がある。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用される記号および形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載される規則に準拠する。
【００２２】
配列番号１〜５は、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号６は、カスパーゼ３切断部位のアミノ酸配列である。
【００２４】
配列番号７は、ファージＤＮＡを配列決定するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号８は、実施例４において対照として使用される皮膚結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号９は、実施例４に記載される通りに、Ｃ末端で蛍光タグ５−カルボキシフルオレセイン−アミノヘキシルアミダイトで誘導体化された、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドＨＣＰ．１（５−ＦＡＭ）のアミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号１０は、実施例４に記載される通りに、Ｃ末端で蛍光タグ５−カルボキシフルオレセイン−アミノヘキシルアミダイトで誘導体化された、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドＨＣＰ．６（５−ＦＡＭ）のアミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号１１は、実施例４に記載される通りに、Ｃ末端で蛍光５−カルボキシフルオレセイン−アミノヘキシルアミダイトで誘導体化された、対照の皮膚結合ペプチドであるスキン（Ｓｋｉｎ）１（５−ＦＡＭ）のアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号１２は、実施例８に記載される、システインが付着されたＨＣＰ．１毛髪結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号１３〜１５は、ペプチドスペーサーのアミノ酸配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、ヘアコンディショナーマトリックスが存在する場合でもヒト毛髪に高親和性で特異的に結合するヘアコンディショナー耐性のペプチド配列を同定するための方法を提供する。同定されたヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチド配列は、ヘアコンディショナーマトリックスから毛髪に結合し、コンディショナーマトリックス中での２１日の期間後も、結合活性の喪失を示さない。ヘアコンディショナーマトリックスが存在する場合でも毛髪に対して高い結合親和性を有し、ヘアコンディショナー組成物中の安定性が向上された、ヘアコンディショナーおよび着色料などのペプチドをベースとする毛髪有効薬剤を調製するために、こうした毛髪結合ペプチドを使用することができる。
【００３２】
以下の定義は、本明細書で使用され、特許請求の範囲および本明細書の解釈のために参照されるべきである。
【００３３】
「ＨＣＰ」は、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドを意味する。
【００３４】
「ＢＡ」は、毛髪有効薬剤を意味する。
【００３５】
「ＨＣＡ」は、毛髪コンディショニング剤を意味する。
【００３６】
「Ｃ」は、毛髪着色剤を意味する。
【００３７】
「Ｓ」は、スペーサーを意味する。
【００３８】
用語「ペプチド」は、ペプチド結合または改変されたペプチド結合によって互いに連結された２つまたはそれ以上のアミノ酸を指す。
【００３９】
用語「毛髪」は、本明細書では、ヒトの毛髪、眉、および睫毛を指す。
【００４０】
語句「ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチド」は、ヘアコンディショナーマトリックスから毛髪に強く結合し、ヘアコンディショナーマトリックス中で安定であるペプチドを指す。
【００４１】
語句「ヘアコンディショナーマトリックス」は、希釈されたあるいは希釈されていない形のヘアコンディショナー製品、または少なくとも１成分のヘアコンディショナー製品、さらに、少なくとも２成分のヘアコンディショナー製品を含んでなる混合物を含んでなる媒質を指す。ヘアコンディショナー製品の成分としては、これらに限定されないが、毛髪コンディショニング剤、酸化防止剤、保存剤、フィラー、界面活性剤、ＵＶＡおよび／またはＵＶＢ日焼け防止薬、香料、増粘剤、湿潤剤、およびアニオン性、非イオン性、または両性のポリマー；および染料または顔料が含まれる。
【００４２】
語句「最大濃度」は、それがヘアコンディショナー製品中で存在するような成分の濃度を指す。
【００４３】
用語「有効薬剤」は、毛髪に適用するためのヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドと結びつき、美容または皮膚科学的効果を提供することができる化合物または物質を指す一般的な用語である。有効薬剤としては一般的に、コンディショナー、着色料、芳香、日焼け防止薬など、その他、パーソナルケア業界で一般に使用される他の物質が含まれる。
【００４４】
用語「結びつく」および「結びつけられる」は、本明細書では、任意の化学結合を指し、共有結合的および非共有結合的な相互作用が含まれる。
【００４５】
用語「ペプチド−毛髪複合体」は、ペプチド上の結合部位を介して毛髪繊維に結合されるペプチドを含んでなる構造を意味する。
【００４６】
用語「ＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体」は、ペプチドが、同定する核酸成分と結びつけられている、毛髪とペプチドとの複合体を指す。一般的に、ＤＮＡ結合型ペプチドは、ファージディスプレイなどのディスプレイシステムの結果として生成される。このシステムでは、ペプチドは、ファージの表面に提示されるが、そのペプチドをコードするＤＮＡは、ファージの付着された糖タンパク質コート内に含有される。ファージ内のコードＤＮＡの結合を、ペプチドの同定のためのコード領域の増幅を容易にするために使用することができる。
【００４７】
用語「非標的」は、ペプチドが結合親和性を有することが所望されない基質を指す。ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドの選択については、非標的としては、これらに限定されないが、皮膚およびプラスチックが含まれる。
【００４８】
用語「ナノ粒子」は、本明細書では、平均粒子直径が１ｎｍと１００ｎｍの間である粒子と定義される。好ましくは、粒子の平均粒子直径は、約１ｎｍと４０ｎｍの間である。本明細書では、「粒径」と「粒子直径」は、同じ意味である。ナノ粒子としては、これらに限定されないが、金属、半導体、ポリマー、または他の有機または無機粒子が含まれる。
【００４９】
用語「アミノ酸」は、タンパク質またはポリペプチドの基本化学構造単位を指す。以下の省略形は、特定のアミノ酸を同定するために本明細書で使用される。
【００５０】
【表１】
2009500003.tif 000003
【００５１】
「遺伝子」は、コード配列の前にある（５’非コード配列）、およびコード配列の後にある（３’非コード配列）制御配列を含む、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。「天然の遺伝子」は、それ自体の制御配列を伴って天然に発見されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、制御配列およびコード配列（ただし、どちらも天然に見られないもの）を含んでなる、天然の遺伝子でない任意の遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源から得られる制御配列およびコード配列、あるいは、同じ供給源から得られるが、天然に見られるものとは異なる方式で配置された制御配列およびコード配列を含んでなる可能性がある。「外来の」遺伝子は、宿主生物中には通常見られず、遺伝子導入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来遺伝子は、天然でない生物に挿入された天然の遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなる可能性がある。
【００５２】
「合成の遺伝子」は、当業者に知られている手順を使用して化学的に合成されたオリゴヌクレオチド構成単位から組み立てられる可能性がある。こうした構成単位を、連結およびアニーリングさせて、遺伝子セグメントを形成し、その後、これを酵素的に組み立てて全遺伝子を構築する。「化学的に合成される」は、一連のＤＮＡに関して、構成要素のヌクレオチドがｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み立てられることを意味する。確立されている手順を使用して、ＤＮＡの手動化学合成を成し遂げることもできるし、市販品として入手できるいくつかの機械のうちの１つを使用して自動化学合成を行うこともできる。したがって、宿主細胞のコドンバイアスを反映するように、ヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために遺伝子を調整することができる。コドン利用が、ホストによって好まれるコドンに偏る場合、当業者は、好結果の遺伝子発現の可能性を認識する。好ましいコドンの決定は、配列情報が利用可能である宿主細胞から得られる遺伝子の調査に基づくものであり得る。
【００５３】
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な制御配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内、または下流（３’非コード配列）に位置し、連結されるコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、あるいは翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。制御配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造を挙げることができる。
【００５４】
「プロモーター」は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、その全体が天然の遺伝子から得られる可能性もあるし、天然に見られる異なるプロモーターから得られる異なる要素からなる可能性もあるし、合成のＤＮＡ部分を含んでなる可能性もある。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞タイプの、あるいは異なる発達段階で、あるいは異なる環境的または生理学的条件に応答して、遺伝子の発現を対象とする可能性があることを、当業者であれば理解するであろう。遺伝子を、最も多くの時間、最も多くの細胞タイプ中で発現させるプロモーターは、一般に「恒常的プロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合、制御配列の厳密な境界は、完全には定められないので、異なる長さのＤＮＡ断片が、同一のプロモーター活性を有する可能性もあることも、さらに理解されよう。
【００５５】
用語「発現」は、本明細書では、本発明の核酸フラグメントから得られるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指す可能性もある。
【００５６】
用語「形質転換」は、核酸フラグメントが宿主生物のゲノムへ移入し、遺伝的に安定な遺伝形質がもたらされることを指す、形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物は、「トランスジェニック」または「組み換え型」または「形質転換された」生物と称される。
【００５７】
用語「宿主細胞」は、形質転換されたまたは形質移入された、あるいは外因的なポリヌクレオチド配列による形質転換または形質移入が可能である細胞を指す。
【００５８】
用語「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」は、細胞の中央代謝の一部ではなく、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形の、しばしば遺伝子を運ぶ染色体外の因子を指す。こうした因子は、任意の供給源から得られる線状または環状の、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージ、またはヌクレオチド配列であり得、その中のいくつかのヌクレオチド配列は、適切な３’非翻訳配列と共に、選択された遺伝子産物のためのプロモーターフラグメントおよびＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能である特有の構築物に連結または組み換えされている。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有し、かつ外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を容易にする因子を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、かつ外来遺伝子に加えて、異種宿主におけるその遺伝子の発現の増大を可能にする因子を有する特定のベクターを指す。
【００５９】
用語「ファージ」または「バクテリオファージ」は、細菌を感染させるウイルスを指す。変化形を、本発明のために使用することができる。好ましいバクテリオファージは、Ｍ１３と呼ばれる「野生型」ファージから得られる。Ｍ１３系は、細菌内部で増殖することができるので、その結果、これは細胞を破壊せず、感染はするが、連続的に新しいファージを作らせることはない。これは、一本鎖ＤＮＡファージである。
【００６０】
用語「ファージディスプレイ」は、バクテリオファージまたはファージミド粒子の表面上の、機能性の外来ペプチドまたは低分子タンパク質の提示を指す。遺伝子工学によるファージを、その天然の表面タンパク質のセグメントとしてペプチドを提示するために使用することができる。ペプチドライブラリは、異なる遺伝子配列を有するファージの集団によって産生することができる。
【００６１】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特定のＤＮＡ部分の増幅のために使用される技術である（米国特許第４，６８３，１９５号明細書および第４，８００，１５９号明細書）。
【００６２】
本明細書で使用される標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当分野でよく知られており、サムブルック，Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ）、フリッチュ，Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ）およびマニアティス，Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ））、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、コールドスプリングハーバー研究所出版局（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９年）（以下「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）によって；シルハーヴィー，Ｔ．Ｊ．（Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．）、ベンアン，Ｍ．Ｌ．（Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．）、およびエンクヴィスト，Ｌ．Ｗ．（Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．）、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」、コールドスプリングハーバー研究所出版局（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８４年）によって；また、グリーン出版協会（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．）およびワイリーインターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）（１９８７）によって発行された、オースベル，Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」によって記載されている。
【００６３】
本発明は、ヘアコンディショナーマトリックスが存在する場合にも高親和性で毛髪に特異的に結合するヘアコンディショナー耐性のペプチド配列を同定するための方法を提供する。この方法は、毛髪がコンビナトリアルに産生されたペプチドのライブラリと接触される、標準のバイオパニング技術の変形形態である。本発明の文脈内では、得られたＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体は、しばらくの間、ヘアコンディショナーマトリックスと接触される。ＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体は、単離され、溶離剤と場合により接触され、溶離されたＤＮＡ結合型ペプチド、および毛髪に結合されたままであるＤＮＡ結合型ペプチドが提供される。溶離されたＤＮＡ結合型ペプチドおよび／または残留した結合されたＤＮＡ結合型ペプチドは、増幅および同定される。同定されたヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチド配列は、ペプチドをベースとする毛髪有効薬剤（ヘアコンディショナーおよび着色料など）を構築するために使用することができる。
【００６４】
ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドの同定
本明細書で定義する通りのヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチド（ＨＣＰ）は、ヘアコンディショナーマトリックスから特異的に毛髪に結合し、ヘアコンディショナーマトリックス中で安定であるペプチド配列である。本発明のヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドは、長さが約７アミノ酸から約４５アミノ酸、より好ましくは長さが約７アミノ酸から約２５アミノ酸、最も好ましくは長さが約１２から約２０アミノ酸である。本発明のペプチドは、ランダムに生成され、その後、後述する通りに、ヘアコンディショナーマトリックスの存在下で、毛髪に対するその結合親和性に基づいて、毛髪サンプルに対して選択される。
【００６５】
ペプチドのランダムなライブラリの産生は、よく知られており、細菌ディスプレイ（ケンプ，Ｄ．Ｊ．（Ｋｅｍｐ，Ｄ．Ｊ．）；「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」７８（７）：４５２０〜４５２４（１９８１年）、および、ヘルフマン（Ｈｅｌｆｍａｎ）ら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」８０（１）：３１〜３５、（１９８３年））、酵母ディスプレイ（チェン（Ｃｈｉｅｎ）ら、「Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ」８８（２１）：９５７８〜８２（１９９１年））、コンビナトリアル固相ペプチド合成（米国特許第５，４４９，７５４号明細書、米国特許第５，４８０，９７１号明細書、米国特許第５，５８５，２７５号明細書、米国特許第５，６３９，６０３号明細書）、およびファージディスプレイ技術（米国特許第５，２２３，４０９号明細書、米国特許第５，４０３，４８４号明細書、米国特許第５，５７１，６９８号明細書、米国特許第５，８３７，５００号明細書）を含めた様々な技術によって達成することができる。こうした生物学的ペプチドライブラリを産生する技術は、当分野でよく知られている。例示的な方法は、ダニ，Ｍ．（Ｄａｎｉ，Ｍ．）、「Ｊ．ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ＆Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．」２１（４）：４４７〜４６８（２００１年）、シドゥ（Ｓｉｄｈｕ）ら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３２８」：３３３〜３６３（２０００年）、および「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、「Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、ブライアンＫ．ケイ（Ｂｒｉａｎ  Ｋ．Ｋａｙ）、ジルウィンター（Ｊｉｌｌ  Ｗｉｎｔｅｒ）、およびジョンマッカファティ（Ｊｏｈｎ  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）編；アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９６年に記載されている。さらに、ファージディスプレイライブラリは、ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（マサチューセッツ州ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））などの市販の供給元から購入することができる。
【００６６】
一実施形態では、ある種の方式でペプチドと結合する、ペプチドをコードするＤＮＡを有することが特に有用である。この結合によって、スクリーニングまたはバイオパニングプロセスにおける結合ペプチドの迅速な同定が容易になる。コードＤＮＡは、ＰＣＲ増幅させる、あるいは、容易な同定のためのペプチドの発現を増大させるために、複製するホストを感染させるために使用することができる。一般的に、ＤＮＡ結合型ペプチドは、上述した通りの、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、および酵母ディスプレイという方法によって産生される。
【００６７】
ペプチドをランダムに産生する好ましい方法は、ファージディスプレイによるものである。ファージディスプレイは、ペプチドまたはタンパク質が、バクテリオファージのコートタンパク質に遺伝的に融合され、その結果、ファージビリオンの外側に、融合されたペプチドが提示されるのに対して、融合をコードするＤＮＡは、ビリオン内に存在するという、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの選択技術である。提示されたペプチドと、それをコードするＤＮＡとの間のこの物理的な連結は、巨大な数のペプチドのバリアント（各々が、「バイオパニング」と呼ばれる単純なｉｎ  ｖｉｔｒｏの選択手順によって、相当するＤＮＡ配列に連結される）のスクリーニングを可能にする。最も簡単な形態では、バイオパニングは、ファージ提示バリアントのプールを当該の標的と共に保温すること、結合していないファージを洗い流すこと、およびファージと標的の間の相互結合作用を崩壊させることによって、特異的に結合されたファージを溶離することによって実施される。溶離されたファージを、その後、ｉｎ  ｖｉｖｏで増幅させ、このプロセスを繰り返すと、最も堅く結合する配列を好んで、ファージプールが段階的に濃縮されることとなる。３またはそれ以上のラウンドの選択／増幅後、それぞれのクローンを、ＤＮＡ配列決定によって特徴づける。
【００６８】
本発明のヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドは、ファージディスプレイを使用して、ヘアコンディショナーマトリックスの存在下での毛髪に対するその結合親和性に基づいて、毛髪サンプルに対してファージペプチドを選択することによって同定することができる。毛髪およびファージペプチドは、以下に詳細に記載されている通りに、コンディショニング液を形成する様々な方法で、ヘアコンディショナーマトリックスと接触させることができる。例えば、ファージペプチドライブラリは、ヘアコンディショナーマトリックス中に溶解し、その後毛髪サンプルと接触させることができる。あるいは、ファージディスプレイライブラリと毛髪サンプルを接触させることによって形成される、ファージ−ペプチド−毛髪複合体を、その後、ヘアコンディショナーマトリックスと接触させることができる。さらに、こうしたヘアコンディショナー接触方法の任意の組み合わせを使用することができる。
【００６９】
ＤＮＡ結合型ペプチドの適切なライブラリを産生した、あるいは、市販の供給元から購入した後、このライブラリを、適切な量の毛髪サンプルと接触させて、ＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を含んでなる反応溶液を形成させる。褐色、黒、赤、およびブロンドなどの異なる色の、また、アフリカ系アメリカ人、白色人種、およびアジア人などの様々なタイプのヒト毛髪サンプルが、例えば、インターナショナルヘアインポーターズアンドプロダクツ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈａｉｒ  Ｉｍｐｏｒｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（ニューヨーク、ベルローズ（Ｂｅｌｌｅｒｏｓｅ，ＮＹ））から、市販品として入手できる。さらに、毛髪サンプルは、漂白された毛髪を得るために、例えば過酸化水素を使用して処理することができる。ＤＮＡ結合型ペプチドのライブラリは、毛髪サンプルと接触させるために、適切な溶液に溶解される。一実施形態では、ペプチドのライブラリは、界面活性剤を含有する緩衝食塩水に溶解される。適切な溶液は、０．５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）である。別の実施形態では、ペプチドのライブラリは、ヘアコンディショナーマトリックス（下記参照）に溶解され、その後毛髪サンプルと接触される。毛髪表面に対するペプチドの質量転送速度（ｍａｓｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｒａｔｅ）を増大させ、それによって、最大の結合に到達するのに必要とされる時間を短くするために、ペプチドライブラリを含有している溶液を、任意の手段によって攪拌することができる。最大の結合に到達するために必要とされる時間は、いくつかの因子（毛髪サンプルの大きさ、ペプチドライブラリの濃度、および撹拌速度など）に応じて変動する。必要とされる時間は、ルーチン試験を使用して、当業者によって容易に決定することができる。一般的に、接触時間は、１分から１時間である。場合により、非標的と結合する所望でないＤＮＡ結合型ペプチドを除去するために、ペプチドのライブラリを、毛髪サンプルと接触させるよりも前に、あるいは接触させるのと同時に、皮膚またはプラスチックなどの非標的と接触させることができる。
【００７０】
毛髪サンプルと接触すると、ランダムに産生されたいくつかのペプチドは、毛髪に結合して、ＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を形成する。いくつかのペプチドは、複合体を形成されないまま残り、また、毛髪サンプルの一部も、結合されない。複合体形成しなかったペプチドは、トリス−ＨＣｌ、トリス緩衝生理食塩水、トリス−ホウ酸、トリス−酢酸、トリエチルアミン、リン酸緩衝液、およびグリシン−ＨＣｌなどの任意の適切な緩衝液（ただし、トリス緩衝食塩水が好ましい）を使用する洗浄によって、場合により除去される可能性がある。洗浄溶液はまた、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ＤＯＣ（デオキシコール酸ナトリウム）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００およびツイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０などの界面活性剤（ただし、０．５％の濃度のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０が好ましい）を含有することができる。洗浄工程は、１回もしくはそれ以上繰り返すことができる。
【００７１】
複合体形成しなかった材料を除去した後、ＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を、しばらくの間、一般的に約１分から約３０分、ヘアコンディショナーマトリックスと接触させて、コンディショニング液を形成する。ヘアコンディショナーマトリックスは、本明細書では、希釈されたあるいは希釈されていない形のヘアコンディショナー製品、または少なくとも１成分のヘアコンディショナー製品、さらに、少なくとも２成分のヘアコンディショナー製品を含んでなる混合物を含んでなる媒質を指す。適切なヘアコンディショナー製品組成物は、当分野でよく知られている。ヘアコンディショナー製品組成物の成分は、米国特許第６，２８０，７４７号明細書にフィリップ（Ｐｈｉｌｉｐｐｅ）らによって、また米国特許第６，１３９，８５１明細書にオオムラ（Ｏｍｕｒａ）によって、また米国特許第６，０１３，２５０号明細書にカネル（Ｃａｎｎｅｌｌ）らによって（これらをすべて、参照によって本明細書に援用する）記載されている。例えば、ヘアコンディショナー組成物は、水溶液、アルコール水溶液、および油中水型（Ｗ／Ｏ）または水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルジョンであり得る。さらに、ヘアコンディショナー組成物は、これらに限定されないが、毛髪コンディショニング剤（例については以下を参照のこと）、酸化防止剤、保存剤、フィラー、界面活性剤、ＵＶＡおよび／またはＵＶＢ日焼け防止薬、香料、増粘剤、湿潤剤、およびアニオン性、非イオン性、または両性のポリマー、および染料または顔料を含めて、１つまたはそれ以上の従来の美容または皮膚科学的添加物または補助薬を含有する可能性がある。こうした補助薬は、美容の分野においてよく知られており、多くの刊行物中に記載されている。例えば、「Ｈａｒｒｙ’ｓ  Ｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃｏｌｏｇｙ」、第８版、マーティンリーガー（Ｍａｒｔｉｎ  Ｒｉｅｇｅｒ）編、ケミカルパブリッシング（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、ニューヨーク（２０００年）を参照のこと。さらに、ダヴ（Ｄｏｖｅ）（登録商標）エクストラボリュームコンディショナー（Ｅｘｔｒａ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ）（ユニリーバ（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ））、パンテーン・Ｐｒｏ  Ｖ（Ｐａｎｔｅｎｅ  Ｐｒｏ  Ｖ）（プロクターアンドギャンブル（Ｐｒｏｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｇａｍｂｌｅ））、ハーバルエッセンス（Ｈｅｒｂａｌ  Ｅｓｓｅｎｃｅ）（クレイロール（Ｃｌａｉｒｏｌ））、フィネス（Ｆｉｎｅｓｓｅ）（ヘレンカーチス（Ｈｅｌｅｎｅ  Ｃｕｒｔｉｓ））、およびトレセメ（Ｔｒｅｓｅｍｍｅ）（アルベルトカルバー（Ａｌｂｅｒｔｏ  Ｃｕｌｖｅｒ））などの、市販品として入手できるヘアコンディショナー製品も使用することができる。ヘアコンディショナーは、地域のスーパーマーケットおよび薬局で購入することができる。好ましくは、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドが最終的に用いられることとなるヘアコンディショナーマトリックスが、この方法で使用される。ヘアコンディショナー組成物は、希釈せずに使用してもよいし、特に粘着性組成物の場合には、適用を容易にするために希釈してもよい。ヘアコンディショナーマトリックスは、上述した使用可能なものなどの、水または適切な緩衝液で希釈することができる。ヘアコンディショナーマトリックスの濃度は、最大濃度の少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％である。最も好ましくは、ヘアコンディショナーマトリックスは、希釈していない形で使用される。場合によっては、ＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体は、ヘアコンディショナーマトリックスと１回もしくはそれ以上接触される可能性がある。
【００７２】
ＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体は、コンディショニング液から単離され、場合により、上述した通りの緩衝液を使用して、１回もしくはそれ以上洗浄される。ヘアコンディショナーマトリックスを、洗浄溶液として使用することもできる。その後、ＤＮＡ結合型ペプチド−毛髪複合体を、好ましくは新しい容器に移した後に、溶離剤と接触させて、毛髪からＤＮＡ結合型ペプチドを分離するが、いくらかのＤＮＡ結合型ペプチドは、この処理の後、依然として毛髪に結合されたままである可能性がある。溶離剤は、これらに限定されないが、酸（ｐＨ１．５〜３．０）；塩基（ｐＨ１０〜１２．５）；ＭｇＣｌ２（３〜５Ｍ）およびＬｉＣｌ（５〜１０Ｍ）などの高い塩濃度の食塩水；水；エチレングリコール（２５〜５０％）；ジオキサン（５〜２０％）；チオシアン酸塩（１〜５Ｍ）；グアニジン（２〜５Ｍ）；ならびに尿素（２〜８Ｍ）を含めて、任意の既知の溶離剤である可能性がある（ただし、酸を用いる処理が好ましい）。使用される溶離緩衝液が酸または塩基である場合、続いて、中和緩衝液が加えられ、溶離工程の後に、ｐＨが中性の範囲に調節される。任意の適切な緩衝液を使用することができるが、１Ｍ  トリスＨＣｌ（ｐＨ９．２）が、酸性溶離緩衝液の用途として好ましい。
【００７３】
溶離されたペプチドまたは残留する結合されたペプチドをコードするＤＮＡ、あるいは、溶離されたペプチドと残留する結合されたペプチドとの両方をコードするＤＮＡを、その後、当技術分野で知られた方法を使用して増幅させる。例えば、溶離されたペプチドおよび残留する結合されたペプチドをコードしているＤＮＡは、ホワン（Ｈｕａｎｇ）らによって記載されている通りに、所望のペプチドをコードするＤＮＡを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２７３８などの細菌の宿主細胞を感染させることによって増幅させることができる（参照により本明細書に援用される、同時係属中の共同所有される米国特許出願公開第２００５／００５０６５６号明細書）。感染させた宿主細胞を、ＬＢ（ルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ））培地などの適切な増殖培地中で増殖させ、この培養物を、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）およびＳ−Ｇａｌ（商標）（３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含むＬＢ培地などの適切な増殖培地を含有する寒天に塗る。増殖させた後、ＤＮＡ単離および配列決定のためにプラークを採集し、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチド配列をコードする配列を同定する。あるいは、溶離されたペプチドおよび残留する結合されたペプチドをコードするＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸増幅方法を使用して増幅させることができる。この手法では、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００３／０１５２９７明細書にヤンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）らによって記載される通りに、適切なプライマーを使用して、溶離されたペプチドおよび／または残留する結合されたペプチドをコードするＤＮＡに対して、ＰＣＲが実施される。
【００７４】
一実施形態では、溶離されたペプチドおよび残留する結合されたペプチドをコードするＤＮＡを、細菌宿主細胞を感染させることによって増幅させ、増幅させたＤＮＡ結合型ペプチドを、新たな毛髪サンプルと接触させ、上述の全プロセスを、１回もしくはそれ以上繰り返して、ヘアコンディショナー耐性の毛髪−結合ＤＮＡ結合型ペプチドが富化された集団を得る。所望の数のバイオパニングサイクルの後、増幅されたＤＮＡ配列が、当分野でよく知られている標準のＤＮＡ配列決定技術を使用して決定され、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチド配列が同定される。
【００７５】
ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドを、上の方法を使用して同定した。具体的には、ヘアコンディショナーマトリックスから通常の褐色毛髪に対して高い親和性を有し、ヘアコンディショナーマトリックス中で安定である、配列番号１〜５として示される結合ペプチドが単離された。
【００７６】
ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドの生成
本発明のヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドは、当分野でよく知られている標準のペプチド合成方法を使用して調製することができる（例えば、スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら、「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、ピアスケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、１９８４年；ボダンスキー（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、シュプリンガー出版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク、１９８４年；およびペニントン（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ）ら、「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、ヒューマナプレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー州トトワ（Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）、１９９４年を参照のこと）。さらに、多くの会社が、カスタムメイドのペプチド合成サービスを提供している。
【００７７】
あるいは、本発明のペプチドは、組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を使用して調製することもできる。毛髪結合ペプチドをコードする遺伝子は、異種宿主細胞中で、特に微生物宿主細胞中で産生することができる。
【００７８】
本発明の結合ペプチドの発現のための好ましい異種宿主細胞は、菌類または細菌のファミリー内に広く見られ、広範囲にわたる温度、ｐＨ値、および溶媒耐性で増殖する微生物宿主である。転写、翻訳、およびタンパク質生合成装置は、細胞の供給原料にかかわらず同じであるので、機能性の遺伝子は、細胞の生物量（ｂｉｏｍａｓｓ）を産生するために使用される炭素源に関係なく発現される。宿主株の例としては、これらに限定されないが、アスペルギルス、トリコデルマ、サッカロミセス、ピキア、カンジダ、ハンゼヌラなどの菌類または酵母種、あるいは、サルモネラ、バチルス、アシネトバクター、ロドコッカス、ストレプトマイセス、エシェリキア、シュードモナス、メチロモナス、メチロバクター、アルカリゲネス、シネコシスティス、アナベナ、チオバチルス、メタノバクテリウム、およびクレブシエラなどの細菌種が含まれる。
【００７９】
本発明のペプチドを産生するために、様々な発現システムを使用することができる。こうしたベクターとしては、これらに限定されないが、染色体、エピソーム、およびウイルス由来のベクター、例えば、細菌性プラスミドから、バクテリオファージから、トランスポゾンから、挿入因子から、酵母エピソームから、ウイルス（バキュロウイルス、レトロウイルスなど）から得られるベクター、およびこれらの組み合わせから得られるベクター（コスミドおよびファージミドなどの、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝因子から得られるものなど）が含まれる。発現システム構築物は、発現を発生および調節する調節領域を含有する可能性がある。一般に、この点に関しては、宿主細胞においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドを維持、増殖、または発現させるのに適した任意のシステムまたはベクターを、発現のために使用することができる。微生物の発現システムおよび発現ベクターは、宿主細胞の増殖に関する外来タンパク質の高レベル発現を導く制御配列を含有する。制御配列は当業者によく知られており、その例としては、これらに限定されないが、ベクター中の調節因子の存在を含めた化学または物理的な刺激に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにさせるもの、例えば、エンハンサー配列が含まれる。これらのうちのいずれかが、本発明の結合ペプチドのうちのいずれかを産生するためのキメラ遺伝子を構築するために使用される可能性がある。こうしたキメラ遺伝子を、その後、ペプチドの高レベル発現を提供するために、形質転換を介して適切な微生物に導入することができる。
【００８０】
適切な宿主細胞の形質転換のために有用なベクターまたはカセットは、当分野でよく知られている。一般的に、ベクターまたはカセットは、適切な遺伝子の転写および翻訳を導く配列、１つもしくはそれ以上の選択可能なマーカー、および自律複製または染色体組込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始制御を担う遺伝子の領域５’、および転写終結を制御するＤＮＡ断片の領域３’を含んでなる。両方の制御領域が、形質転換された宿主細胞と同じ遺伝子から得られる場合が最も好ましいが、こうした制御領域は、産生宿主として選択される特定の種に天然に存在する遺伝子から得られる必要はないことを理解するべきである。選択可能なマーカー遺伝子は、例えばＥ．ｃｏｌｉにおけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性などの、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を提供する。
【００８１】
所望の宿主細胞のキメラ遺伝子の発現を駆動するために有用である開始制御領域またはプロモーターは、非常に多く、当業者によく知られている。これらに限定されないが、以下を含めた遺伝子を駆動することが可能な実質的に任意のプロモーターが、本発明の結合ペプチドを産生するのに適切である：ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス中での発現のために有用）；ＡＯＸ１（ピキア中での発現のために有用）；およびｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌中での発現のために有用）；ならびにバチルス中での発現のために有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよび様々なファージプロモーター。
【００８２】
終結制御領域はまた、好ましい宿主に天然に存在する様々な遺伝子から得られる可能性がある。場合によっては、終結部位は不必要である可能性があるが、含まれる場合が、最も好ましい。
【００８３】
宿主が本発明のペプチドを発現することを可能にするために、上述した通りの適切なＤＮＡ配列を含有するベクター、ならびに適切なプロモーターまたは制御配列を用いて、適切な宿主を形質転換する。無細胞翻訳システムを用いて、本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを使用して、こうしたペプチドを産生することもできる。場合により、形質転換された宿主の分泌産物として当該の遺伝子産物を産生することが所望される可能性がある。増殖培地への所望のタンパク質の分泌は、簡略化された、より低コストの精製手順という利点を有する。発現可能なタンパク質の、細胞膜を横切る能動輸送を容易にすることにおいて、分泌シグナル配列がしばしば有用であることは、当分野でよく知られている。分泌が可能な形質転換された宿主の作製は、産生宿主中で機能性である分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列を組み込むことによって達成することができる。適切なシグナル配列を選択するための方法は、当分野でよく知られている（例えば欧州特許第５４６０４９号明細書および国際公開第９３２４６３１号パンフレットを参照のこと）。分泌シグナルＤＮＡまたは促進因子（ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）は、発現制御ＤＮＡと、当該の遺伝子または遺伝子フラグメントとの間に、かつ後者と同じ読み取り枠中に位置される可能性がある。
【００８４】
ペプチドをベースとする毛髪有効薬剤
本発明のペプチドをベースとする毛髪有効薬剤は、コンディショナー、着色料、芳香、日焼け防止薬などの有効薬剤（ＢＡ）とヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチド（ＨＣＰ）を結びつけることによって形成される。ペプチドをベースとする有効薬剤のヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチド部分は、ヘアコンディショナーマトリックスから毛髪に強く結合し、有効薬剤が毛髪に付着されたままになる。効果を長持ちさせるために、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドと有効薬剤との間の結合相互作用は、共有結合または非共有結合的な相互作用である可能性があり、また、後述する通りの任意のスペーサーを介するものである可能性がある。
【００８５】
ホワン（Ｈｕａｎｇ）らによって記載されている通りに、ペプチドをベースとする有効薬剤と毛髪との間の相互作用を強化するために、複数のヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドが有効薬剤に結びつけられることも望ましい可能性がある（同時係属中の共同所有される米国特許出願公開第２００５／００５０６５６号明細書）。これは、単一のヘアコンディショナー耐性の毛髪−結合配列の複数のコピーを有効薬剤に結びつけることによって、あるいは、直接的にまたはスペーサーを介して２つ以上のヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチド配列を連結して、得られたマルチコピー毛髪−結合配列を有効薬剤に結びつけることによって行うことができる。さらに、マルチコピーヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチド配列の複数のコピーを、有効薬剤に結びつけることもできる。すべてのこうしたペプチドをベースとする毛髪有効薬剤において、同じヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドの複数のコピー、または異なるヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドの組み合わせを使用することができる。
【００８６】
本発明の一実施形態では、ペプチドをベースとする有効薬剤は、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチド（ＨＣＰ）および有効薬剤（ＢＡ）からなる、一般構造が（ＨＣＰｍ）ｎ−ＢＡであるジブロック組成物である。式中、ｍは、１から約１００、好ましくは１から約１０までの範囲である。有効薬剤が分子種である場合、ｎは、１から約１００、好ましくは１から約１０までの範囲である。有効薬剤が、顔料などの粒子である場合、ｎは、１から約５０，０００、好ましくは１から約１０，０００の範囲である。
【００８７】
別の実施形態では、ペプチドをベースとする有効薬剤は、有効薬剤からヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドを隔てるスペーサー（Ｓ）を含有する。ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドの複数のコピーが、単一のスペーサー分子に結びつけられる可能性がある。あるいは、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドの複数のコピーが、様々なスペーサーによって隔てられる可能性がある。この実施形態では、ペプチドをベースとする有効薬剤は、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドと、スペーサーと、有効薬剤からなる、一般構造が［（ＨＣＰｘ−Ｓ）ｍ］ｎ−ＢＡであるトリブロック組成物である。式中、ｘは１から約１０までの範囲、好ましくはｘは１であり、ｍは、１から約１００、好ましくは１から約１０までの範囲である。有効薬剤が、染料または非粒子コンディショニング剤などの分子種である場合、ｎは、１から約１００、好ましくは１から約１０の範囲である。有効薬剤が顔料などの粒子である場合、ｎは、１から約５０，０００、好ましくは１から約１０，０００の範囲である。
【００８８】
ここで、ＨＣＰは一般記号であり、単一のヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチド配列を指すという意味ではないことを理解するべきである。上で使用される通りのｍ、ｎ、またはｘが、１よりも大きい場合、一連の異なる配列の毛髪結合ペプチドが、組成物の一部を形成し得るという状況が提供されることは、十分に本発明の範囲内である。さらに、Ｓは、一般記号であり、単一のスペーサーを指すという意味ではない。トリブロック組成物について、上で使用される通りのｍまたはｎが、１よりも大きい場合、一連の異なるスペーサーが、組成物の一部を形成し得るという状況が提供されることは、十分に本発明の範囲内である。こうした構造が、ペプチドと、有効薬剤と、任意のスペーサーとの間の共有結合に必ずしも相当するわけではないことも理解するべきである。後述する通り、ペプチドと、有効薬剤と、任意のスペーサーとの間の結合相互作用は、共有結合的である可能性もあるし、非共有結合的である可能性もある。
【００８９】
本発明のヘアコンディショナー耐性のペプチドをベースとする有効薬剤の調製は、ヘアコンディショナーおよび毛髪着色料について、後述する。これらの方法は、他の有効薬剤にも適用することができ、また、こうした他のヘアコンディショナー耐性のペプチドをベースとする有効薬剤も、本発明の範囲内であることを理解するべきである。
【００９０】
ペプチドをベースとするヘアコンディショナー
本発明のペプチドをベースとするヘアコンディショナーは、毛髪コンディショニング剤（ＨＣＡ）とヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチド（ＨＣＰ）を結びつけることによって形成される。コンディショナーのヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチド部分は、ヘアコンディショナーマトリックスから毛髪に強く結合し、したがって、コンディショニング剤が毛髪に付着されたままになる。コンディショニング効果を長持ちさせるために、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドは、上述の方法によって選択され、これらに限定されないが、配列番号１〜５および配列番号１２として提供される毛髪結合ペプチド配列が含まれる。
【００９１】
本明細書で定義される通りの毛髪コンディショニング剤は、毛髪の外観、手触り、および光沢を向上させる、また、毛髪のボリュームまたは柔軟性を増大させる薬剤である。毛髪コンディショニング剤としては、これらに限定されないが、スタイリング補助剤、毛髪矯正補助剤、毛髪強化補助剤、およびボリューム剤（ナノ粒子など）が含まれる。本発明のペプチドをベースとするヘアコンディショナーにおいては、任意の適切な毛髪コンディショニング剤を使用することができる。毛髪コンディショニング剤は、当分野でよく知られており（例えば、参照により本明細書に援用されるグリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら（国際公開第０１０７００９号パンフレット）を参照のこと）、様々な供給元から商業的に入手できる。毛髪コンディショニング剤の適切な例としては、これらに限定されないが、カチオン性ポリマー（カチオン化グアーガム、ジアリル四級アンモニウム塩／アクリルアミドコポリマー、四級化されたポリビニルピロリドン、およびそれらの誘導体など）、ならびに様々なポリクオタニウム化合物；カチオン界面活性剤（塩化ステアラルコニウム、セトリモニウムクロリド、および塩酸セパミン（Ｓａｐａｍｉｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）など）；脂肪アルコール（ベヘニルアルコールなど）；脂肪アミン（ステアリルアミンなど）；ワックス；エステル；非イオン性のポリマー（ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、およびポリエチレングリコールなど）；シリコーン；シロキサン（デカメチルシクロペンタシロキサンなど）；ポリマーエマルジョン（アモジメチコンなど）；およびナノ粒子（シリカナノ粒子およびポリマー・ナノ粒子など）が含まれる。本発明の好ましい毛髪コンディショニング剤は、後述する通りに、毛髪結合ペプチドへの結合を容易にするために、アミンまたはヒドロキシル官能基を含有する。好ましいコンディショニング剤の例は、オクチルアミン（ＣＡＳ番号１１１−８６−４）、ステアリルアミン（ＣＡＳ番号１２４−３０−１）、ベヘニルアルコール（ＣＡＳ番号６６１−１９−８、コグニス社（Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏｒｐ．）、オハイオ州シンシナティ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ））、ビニル基末端シロキサン、ビニル基末端シリコーン（ＣＡＳ番号６８０８３−１９−２）、ビニル基末端メチルビニルシロキサン、ビニル基末端メチルビニルシリコーン（ＣＡＳ番号６８９５１−９９−５））、ヒドロキシル末端シロキサン、ヒドロキシル末端シリコーン（ＣＡＳ番号８０８０１−３０−５）、アミノ修飾シリコーン誘導体、［（アミノエチル）アミノ］プロピルヒドロキシルジメチルシロキサン、［（アミノエチル）アミノ］プロピルヒドロキシルジメチルシリコーン、およびアルファ−トリデシル−オメガ−ヒドロキシ−ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）（ＣＡＳ番号２４９３８−９１−８）である。
【００９２】
本発明のペプチドをベースとするヘアコンディショナーは、ヘアコンディショナー耐性の特定の毛髪結合ペプチドを、毛髪コンディショニング剤に、直接的にあるいは任意のスペーサーを介して結びつけることによって調製される。結合の相互作用は、共有結合または非共有結合的な相互作用（水素結合、静電的な相互作用、疎水的相互作用、またはファンデルワールス相互作用）である可能性がある。非共有結合的な相互作用の場合には、ペプチドをベースとするヘアコンディショナーは、コンディショニング剤と（使用される場合）任意のスペーサーと該ペプチドを混合し、相互作用が起こるのに十分な時間放置することによって調製することができる。結合しなかった材料は、当技術分野で知られた方法、例えばゲル透過クロマトグラフィーを使用して、得られたペプチドをベースとするヘアコンディショナー付加物から分離することができる。
【００９３】
本発明のペプチドをベースとするヘアコンディショナーはまた、ホワン（Ｈｕａｎｇ）ら（同時係属中の共同所有される米国特許出願公開第２００５／００５０６５６号明細書）によって記載されている通りに、特異的なヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドを、毛髪コンディショニング剤に、直接的に、あるいはスペーサーを介して共有結合的に付着させることによって調製することができる。本発明のペプチドをベースとするヘアコンディショナーを形成するために、任意の適切な既知のペプチドまたはタンパク質の結合化学作用を使用することができる。結合化学作用は、当分野でよく知られている（例えば、ハーマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９９６年）を参照のこと）。適切な結合剤としては、これらに限定されないが、カルボジイミド結合剤、酸塩化物、イソシアネート、エポキシド、マレイミド、ならびに末端アミンおよび／またはカルボン酸基、およびペプチド上のスルフヒドリル基に対して反応性である他の機能性の結合試薬が含まれる。さらに、ペプチドをベースとするコンディショナーのための所望の構造を作り出すために、ペプチド上の反応性のアミンまたはカルボン酸基を保護することが必要である可能性がある。アミノ酸に対する保護基（ｔ−ブチロキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）など）の使用が、当分野でよく知られている（例えばスチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら、上記；ボダンスキー（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）、上記；およびペニントン（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ）ら、上記を参照のこと）。場合によっては、毛髪結合ペプチドとの結合のために、コンディショニング剤上に、カルボン酸、アルコール、アミン、イソシアネート、またはアルデヒド基などの反応性の基を導入することが必要である可能性がある。こうした修飾は、当分野でよく知られている、酸化、還元、ホスゲン化などの通常の化学作用を使用して行うことができる。
【００９４】
また、スペーサーを介して、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドを、毛髪コンディショニング剤に結びつけることが望ましい可能性もある。スペーサーは、薬剤が毛髪へのペプチドの結合を妨げないことを確実にするために、ペプチドからコンディショニング剤を隔てるために働く。スペーサーは、アルキル鎖、フェニル化合物、エチレングリコール、アミド、エステルなどの様々な分子のいずれかである可能性がある。好ましいスペーサーは、親水性であり、鎖長が１から約１００原子、より好ましくは２から約３０原子である。好ましいスペーサーの例としては、これらに限定されないが、エタノールアミン、エチレングリコール、鎖長が６炭素原子であるポリエチレン、３〜６の繰返し単位を有するポリエチレングリコール、フェノキシエタノール、プロパノールアミド、ブチレングリコール、ブチレングリコールアミド、プロピルフェニル、ならびにエチル、プロピル、ヘキシル、ステリル、セチル、およびパルミトイルアルキル鎖が含まれる。スペーサーは、上述した結合化学作用のいずれかを使用して、ペプチドおよび毛髪コンディショニング剤に共有結合的に付着させることができる。スペーサーの組み込みを容易にするために、ペプチドとコンディショニング剤との結合のために、両方の末端にスペーサーと反応性の基を含有する二官能性の架橋剤を使用することができる。適切な二官能性架橋剤は、当分野でよく知られており、これらに限定されないが、ジアミン、例えば１，６−ジアミノヘキサン；ジアルデヒド、例えばグルタルアルデヒド；ビスＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えばエチレングリコール−ビス（コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、グルタル酸ジスクシニミヂル、スベリン酸ジスクシニミヂル、およびエチレングリコール−ビス（スクシンイミジルスクシナート）；ジイソシアネート、例えばヘキサメチレンジイソシアネート；ビスオキシラン、例えば１，４ブタンジイルジグリシジルエーテル；ジカルボン酸、例えばジサリチル酸スクシニル；などが挙げられる。各末端に異なる反応性の基を含有するヘテロ二官能性架橋剤も、使用することができる。ヘテロ二官能性架橋薬剤の例には、これらに限定されないが、以下の構造を有する化合物が含まれる。
【００９５】
【化１】
2009500003.tif 000004
【００９６】
式中、Ｒ１は、Ｈまたは置換基（−ＳＯ３Ｎａ、−ＮＯ２、または−Ｂｒなど）であり、Ｒ２は、−ＣＨ２ＣＨ２（エチル）、−（ＣＨ２）３（プロピル）、または−（ＣＨ２）３Ｃ６Ｈ５（プロピルフェニル）などのスペーサーである。こうしたヘテロ二官能性架橋剤の例は、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。こうした試薬のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基は、コンディショナー上のアミンまたはアルコール基と反応するのに対して、マレイミド基は、ペプチド上に存在するチオール基と反応する。チオール基は、結合ペプチド配列の少なくとも１つの末端、すなわちＣ末端またはＮ末端に、少なくとも１つのシステイン残基を加えることによって、ペプチドに組み込むことができる。反応するチオール基を結合配列から隔てるために、いくつかのスペーサーアミノ酸残基（例えばグリシン）を、結合ペプチド配列と末端システインとの間に組み込むことができる。さらに、結合のためのアミン基を提供するために、少なくとも１つのリジン残基を、結合ペプチド配列の少なくとも１つの末端、すなわちＣ末端またはＮ末端に加えることができる。
【００９７】
さらに、スペーサーは、任意のアミノ酸を含んでなるペプチドおよびその混合物である可能性がある。好ましいペプチドスペーサーは、アミノ酸プロリン、リジン、グリシン、アラニン、およびセリン、ならびにそれらの混合物を含んでなる。さらに、ペプチドスペーサーは、特定の酵素切断部位（例えば、配列番号６によって示されるプロテアーゼ・カスパーゼ３部位）を含んでなる可能性があり、これによって、毛髪からのコンディショニング剤の酵素的除去が可能になる。ペプチドスペーサーは、長さが１から約５０アミノ酸、好ましくは１から約２０アミノ酸であり得る。ペプチドスペーサーの例としては、配列番号１３〜１５が挙げられるが、これに限定されるものではない。こうしたペプチドスペーサーは、当技術分野で知られた任意の方法によって結合ペプチド配列に連結することができる。例えば、結合ペプチド−ペプチドスペーサー−ジブロック完全体は、上述した標準のペプチド合成方法を使用して調製することができる。さらに、結合ペプチドとペプチドスペーサーブロックは、カルボジイミド結合剤（例えば、ハーマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９９６年）を参照のこと）、二酸塩化物、ジイソシアネート、ならびにペプチド上の末端のアミンおよび／またはカルボン酸基に対して反応性である他の二官能性結合試薬を使用して組み合わせることができる。あるいは、結合ペプチド−ペプチドスペーサー−ジブロック完全体は、上述した組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を使用して調製することができる。スペーサーはまた、上述した方法を使用して調製することができる、ペプチドスペーサーと有機スペーサー分子の組み合わせである可能性がある。
【００９８】
また、ペプチドをベースとするヘアコンディショナーと毛髪との間の相互作用を増強するために、毛髪コンディショニング剤に複数のヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドが結びつけられることが望ましい可能性がある。同じ毛髪結合ペプチドの複数のコピー、または異なる毛髪結合ペプチドの組み合わせを使用することができる。例えば、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドとシャンプー耐性の毛髪結合ペプチドの組み合わせを使用することができる。シャンプー耐性の毛髪結合ペプチドは、ホワン（Ｈｕａｎｇ）ら（同時係属中の共同所有される米国特許出願公開第２００５／００５０６５６号明細書）によって、また、オブライエンら（同時係属中の共同所有される米国特許出願第１１／２５１７１５号明細書）によって記載されている。マルチコピーヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドが、上述した通りの、様々なスペーサーを含んでなる可能性がある。大きなコンディショニング粒子（例えば粒子エマルジョンまたはナノ粒子）の場合、多数の毛髪結合ペプチド（すなわち約５０，０００まで）が、コンディショニング剤と結びつけられる可能性がある。より少ない数（すなわち約１００まで）の毛髪結合ペプチドは、より小さいコンディショナー分子と結びつけられる可能性がある。さらに、複数の毛髪結合ペプチド配列が、共に連結されて、コンディショニング剤と付着される可能性がある。したがって、本発明の一実施形態では、ペプチドをベースとするヘアコンディショナーは、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチド（ＨＣＰ）と毛髪コンディショニング剤（ＨＣＡ）からなる、一般構造が（ＨＣＰｍ）ｎ−ＨＣＡ（式中、ｍは１から約１００、好ましくは１から約１０の範囲である）であるジブロック組成物である。毛髪コンディショニング剤が分子種、すなわち非粒子コンディショニング剤である場合、ｎは、１から約１００、好ましくは１から約１０までの範囲である。毛髪コンディショニング剤が粒子である場合、ｎは、１から約５０，０００、好ましくは１から約１０，０００までの範囲である。
【００９９】
別の実施形態では、ペプチドをベースとするヘアコンディショナーは、上述した通りの、毛髪コンディショニング剤からヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドを隔てるスペーサー（Ｓ）を含有する。毛髪結合ペプチドの複数のコピーが、単一のスペーサー分子に結びつけられる可能性がある。さらに、ペプチドの複数のコピーが、スペーサーを介して共に連結され、スペーサーを介して毛髪コンディショニング剤に結びつけられる可能性がある。この実施形態では、ペプチドをベースとするヘアコンディショナーは、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドと、スペーサーと、毛髪コンディショニング剤からなる、一般構造が［（ＨＣＰｘ−Ｓ）ｍ］ｎ−ＨＣＡ（式中、ｘは、１から約１０までの範囲であり、好ましくはｘは１であり、ｍは、１から約１００までの範囲であり、好ましくは１から約１０である）であるトリブロック組成物である。毛髪コンディショニング剤が分子種、すなわち非粒子コンディショニング剤である場合、ｎは、１から約１００、好ましくは１から約１０までの範囲である。毛髪コンディショニング剤が粒子である場合、ｎは、１から約５０，０００、好ましくは１から約１０，０００までの範囲である。
【０１００】
ここで、ＨＣＰは一般記号であり、単一の毛髪結合ペプチド配列を指すという意味ではないことを理解するべきである。上で使用される通りのｍ、ｎ，またはｘが、１よりも大きい場合、一連の異なる配列の毛髪結合ペプチドが、組成物の一部を形成し得るという状況が提供されることは、十分に本発明の範囲内である。さらに、Ｓは、一般記号であり、単一のスペーサーを指すという意味ではない。トリブロック組成物について、上で使用される通りのｍまたはｎが、１よりも大きい場合、一連の異なるスペーサーが、組成物の一部を形成し得るという状況が提供することは、十分に本発明の範囲内である。こうした構造が、ペプチドと、毛髪コンディショニング剤と、任意のスペーサーとの間の共有結合に必ずしも相当するわけではないことも理解するべきである。上述した通り、ペプチドと、毛髪コンディショニング剤と、任意のスペーサーとの間の結合相互作用は、共有結合的である可能性もあるし、非共有結合的である可能性もある。
【０１０１】
本発明のペプチドをベースとするヘアコンディショナーは、ヘアケアのための製品中で使用することができる。ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチド自体が、毛髪のトリートメントのためのコンディショニング剤として働く可能性があることも認識するべきである。ヘアケア製品組成物は、本明細書では、これらに限定されないが、コンディショナー、ローション、エアロゾル、ゲル、ムース、および毛髪着色料を含めた毛髪のトリートメントのための組成物と定義される。一実施形態では、ヘアケア製品組成物は、毛髪コンディショニング製品である。別の実施形態では、ヘアケア製品組成物は、毛髪着色製品である。
【０１０２】
本発明のヘアケア製品組成物は、化粧品として許容される媒質中に、有効な量の、ペプチドをベースとするヘアコンディショナー、または異なるペプチドをベースとするヘアコンディショナーの混合物を含んでなる。ヘアケア製品組成物中で使用するためのペプチドをベースとするヘアコンディショナーまたは毛髪結合ペプチドの有効な量は、本明細書では、組成物の総重量を基準にして約０．０１重量％から約１０重量％、好ましくは約０．０１重量％から約５重量％と定義される。ヘアケア製品組成物のための化粧品として許容される媒質の成分は、当分野でよく知られており、その例は、フィリップ（Ｐｈｉｌｉｐｐｅ）らによって米国特許第６，２８０，７４７号明細書に、オオムラ（Ｏｍｕｒａ）らによって米国特許第６，１３９，８５１号明細書に、また、カネル（Ｃａｎｎｅｌｌ）によって米国特許第６，０１３，２５０号明細書に記載されている。
【０１０３】
ペプチドをベースとする毛髪着色料
本発明のペプチドをベースとする毛髪着色料は、着色剤（Ｃ）とヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチド（ＨＣＰ）を結びつけることによって形成される。ペプチドをベースとする毛髪着色料のヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチド部分は、毛髪に強く結合し、ヘアコンディショナーの適用によって除去されないので、着色剤は、長い時間毛髪に付着されたままとなり、毛髪着色効果が長続きする。ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドは、記載した方法によって選択され、これらに限定されないが、配列番号１〜５および配列番号１２として示される毛髪結合ペプチド配列が含まれる。
【０１０４】
本明細書で定義されるものとしての着色剤は、任意の染料、顔料、および毛髪の色を変化させるために使用することができるものなどである。本発明のペプチドをベースとする毛髪着色料において、任意の適切な着色剤を使用することができる。毛髪着色剤は、当分野でよく知られており（例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、上記、「ＣＦＴＡ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｏｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、第２版、ミセルプレス（Ｍｉｃｅｌｌｅ  Ｐｒｅｓｓ）、イギリス（Ｅｎｇｌａｎｄ）（１９９２年）、および「Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、ＵＳ食品医薬品局（ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、「ＦＤＡ／ＩＡＳ  Ｂｏｏｋｌｅｔ」（１９９２年）を参照のこと）、様々な供給元（例えば、バイエル（Ｂａｙｅｒ）、ペンシルベニア州ピッツバーグ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）；チバ−ガイギー（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ）、ニューヨーク州タリータウン（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）；ＩＣＩ、ニュージャージー州ブリッジウォーター（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）；サンド（Ｓａｎｄｏｚ）、オーストリア、ウィーン（Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）；ＢＡＳＦ、ニュージャージー州マウントオリーブ（Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ，ＮＪ）；およびヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、ドイツ、フランクフルト（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））から商業的に入手できる。適切な毛髪着色剤としては、これらに限定されないが、染料、例えば、４−ヒドロキシプロピルアミノ−３−ニトロフェノール、４−アミノ−３−ニトロフェノール、２−アミノ−６−クロロ−４−ニトロフェノール、２−ニトロ−パラフェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ヒドロキシエチル−２−ニトロ−フェニレンジアミン、４−ニトロ−インドール、ヘナ、ＨＣブルー１（ＨＣ  Ｂｌｕｅ  １）、ＨＣブルー２（ＨＣ  Ｂｌｕｅ  ２）、ＨＣイエロー４（ＨＣ  Ｙｅｌｌｏｗ  ４）、ＨＣレッド３（ＨＣ  Ｒｅｄ  ３）、ＨＣレッド５（ＨＣ  Ｒｅｄ  ５）、ディスパースバイオレット４（Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４）、ディスパースブラック９（Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｂｌａｃｋ  ９）、ＨＣブルー７（ＨＣ  Ｂｌｕｅ  ７）、ＨＣブルー１２（ＨＣ  Ｂｌｕｅ  １２）、ＨＣイエロー２（ＨＣ  Ｙｅｌｌｏｗ  ２）、ＨＣイエロー６（ＨＣ  Ｙｅｌｌｏｗ  ６）、ＨＣイエロー８（ＨＣ  Ｙｅｌｌｏｗ  ８）、ＨＣイエロー１２（ＨＣ  Ｙｅｌｌｏｗ  １２）、ＨＣブラウン２（ＨＣ  Ｂｒｏｗｎ  ２）、Ｄ＆Ｃイエロー１（Ｄ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  １）、Ｄ＆Ｃイエロー３（Ｄ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  ３）、Ｄ＆Ｃブルー１（Ｄ＆Ｃ  Ｂｌｕｅ  １）、ディスパースブルー３（Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｂｌｕｅ  ３）、ディスパースバイオレット１（Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  １）、エオシン誘導体（Ｄ＆Ｃレッド（Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ）Ｎｏ．２１など）、およびハロゲン化フルオレセイン誘導体（Ｄ＆Ｃレッド（Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ）Ｎｏ．２７、Ｄ＆Ｃレッド（Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ）Ｎｏ．２１とＤ＆Ｃオレンジ（Ｄ＆Ｃ  Ｏｒａｎｇｅ）Ｎｏ．１０を組み合わせたＤ＆Ｃレッドオレンジ（Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  Ｏｒａｎｇｅ）Ｎｏ．５など）；および顔料、例えば、Ｄ＆Ｃレッド（Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ）Ｎｏ．３６お��びＤ＆Ｃオレンジ（Ｄ＆Ｃ  Ｏｒａｎｇｅ）Ｎｏ．１７、Ｄ＆Ｃレッド（Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ）Ｎｏ．７、１１、３１、および３４のカルシウムレーキ、Ｄ＆Ｃレッド（Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ）Ｎｏ．１２のバリウムレーキ、Ｄ＆Ｃレッド（Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ）Ｎｏ．１３のストロンチウムレーキ、ＦＤ＆Ｃイエロー（ＦＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ）Ｎｏ．５の、ＦＤ＆Ｃイエロー（ＦＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ）Ｎｏ．６の、Ｄ＆Ｃレッド（Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ）Ｎｏ．２７の、Ｄ＆Ｃレッド（Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ）Ｎｏ．２１の、およびＦＤ＆Ｃブルー（ＦＤ＆Ｃ  Ｂｌｕｅ）Ｎｏ．１のアルミニウムレーキ、酸化鉄、マンガンバイオレット、酸化クロム、二酸化チタン、酸化亜鉛、酸化バリウム、ウルトラマリンブルー、クエン酸ビスマス、およびカーボンブラック粒子が挙げられる。ホワン（Ｈｕａｎｇ）らによって、同時係属中の共同所有される米国特許出願公開第２００５／０２２９３３４号明細書および第２００５／０２２９３３５号明細書（これらをどちらも、参照により本明細書に援用する）に記載されている通りに、カーボンナノチューブも、毛髪を染色するための黒色顔料として使用することができる。本発明の好ましい染料および顔料としては、Ｄ＆Ｃイエロー（Ｄ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ）１および３、ＨＣイエロー（ＨＣ  Ｙｅｌｌｏｗ）６および８、Ｄ＆Ｃブルー１（Ｄ＆Ｃ  Ｂｌｕｅ  １）、ＨＣブルー１（ＨＣ  Ｂｌｕｅ  １）、ＨＣブラウン２（ＨＣ  Ｂｒｏｗｎ  ２）、ＨＣレッド５（ＨＣ  Ｒｅｄ  ５）、２−ニトロ−パラフェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ヒドロキシエチル−２−ニトロ−フェニレンジアミン、二酸化チタン、４−ニトロ−インドール、酸化鉄、カーボンブラック、およびカーボンナノチューブが挙げられる。
【０１０５】
金属および半導体ナノ粒子も、その強い光の放射に起因して、毛髪着色剤に使用することができる（ビック（Ｖｉｃ）ら、米国特許出願公開第２００４／００１０８６４号明細書）。金属ナノ粒子としては、これらに限定されないが、金、銀、プラチナ、パラジウム、イリジウム、ロジウム、オスミウム、鉄、銅、コバルトの粒子、およびこうした金属からなる合金が挙げられる。「合金」は、本明細書では、２つまたはそれ以上の金属の均質混合物と定義される。「半導体ナノ粒子」としては、これらに限定されないが、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、硫化銀、硫化カドミウム、酸化亜鉛、硫化亜鉛、セレン化亜鉛、硫化鉛、ヒ化ガリウム、シリコン、酸化スズ、酸化鉄、およびリン化インジウムの粒子が挙げられる。ナノ粒子は、適切な有機コーティングまたは単分子層を用いることによって安定化され、水溶性となる。本明細書では、単分子層で保護されたナノ粒子は、安定化されたナノ粒子の１つのタイプである。安定化された水溶性の金属および半導体ナノ粒子の調製のための方法は、当技術分野で知られており、ホワン（Ｈｕａｎｇ）らによって、出願中の米国特許出願公開第２００４／０１１５３４５号明細書（これを、参照により本明細書に援用する）に記載されている。ナノ粒子の色は、粒子の大きさによって決まる。したがって、ナノ粒子の大きさを制御することによって、異なる色が得られる可能性がある。例えば、ＺｎＳコートされたＣｄＳｅナノ粒子は、２〜６ｎｍの、粒子サイズ範囲にわたる全可視スペクトルをカバーする。具体的には、２．３、４．２、４．８、および５．５ｎｍのコアサイズを有するＣｄＳｅナノ粒子は、それぞれ、４８５、５６５、５９０、および６２５ｎｍに集中する波長の光を発する。異なるサイズの水溶性ナノ粒子は、ホワン（Ｈｕａｎｇ）らによって記載されているサイズ分別方法を使用して、広いサイズ分布のナノ粒子から得ることができる（米国特許出願公開第２００４／０１１５３４５号明細書）。その中に記載されている方法は、電解質の存在下でのナノ粒子の溶液への水溶性有機溶媒の調節された添加を含んでなる。水溶性有機溶媒の添加を増大させることによって、サイズが低下されたナノ粒子の沈殿がもたらされる。金属および半導体ナノ粒子はまた、上述した通りに、薬剤をボリュームアップするものとして働くことができる。
【０１０６】
さらに、染料が付着、吸着、または吸収された有機および無機ナノ粒子を、毛髪着色剤として使用することができる。例えば、毛髪着色剤は、有色のポリマー・ナノ粒子である可能性がある。例示的なポリマー・ナノ粒子としては、これらに限定されないが、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルトルエン、スチレン／ブタジエンコポリマー、およびラテックスなどの材料からなるマイクロスフィアが含まれる。本発明で使用するためには、マイクロスフィアは、直径が約１０ナノメートルから約２ミクロンである。マイクロスフィアは、マイクロスフィアに任意の適切な染料（上述したものなど）を結びつけることによって色をつけることができる。染料は、マイクロスフィアの表面に結びつけることもできるし、多孔性マイクロスフィアの多孔質構造体内に吸着させることもできる。共有結合を可能にするために官能性をもたせられた、染色されたおよび染色されていないマイクロスフィアを含めた適切なマイクロスフィアは、バンラボラトリーズ（Ｂａｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（インディアナ州フィッシャーズ（Ｆｉｓｈｅｒｓ，ＩＮ））などの会社から入手できる。
【０１０７】
本発明のペプチドをベースとする毛髪着色料は、特異的なヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドを着色剤に、直接的に、あるいはスペーサーを介して結びつけることによって調製される。上述した結合方法のいずれかを使用することができる。毛髪結合ペプチドに結合させるために、着色剤上にカルボン酸、アルコール、アミン、アルデヒド、またはイソシアネート基などの反応性の基を導入することが必要である可能性がある。こうした変形形態は、当分野でよく知られている、酸化、還元、およびホスゲン化などの通常の化学作用を使用して行うことができる。例えば、カーボンブラック粒子の表面を、官能基を生み出すために、硝酸、過酸化水素などの過酸化物、または過硫酸アンモニウムなどの無機イニシエーターを使用して酸化することができる。カラスコ−マリン（Ｃａｒｒａｓｃｏ−Ｍａｒｉｎ）ら（「Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」、「Ｆａｒａｄａｙ  Ｔｒａｎｓ．」９３：２２１１〜２２１５（１９９７年））によって記載されている通り、カーボンブラック表面は、過硫酸アンモニウムを使用して酸化させることが好ましい。２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミド）−ジヒドロクロリドなどの有機イニシエーターを使用して、カーボンブラックの表面にアミノ官能基を導入することができる。無機顔料およびナノ粒子は、同様の方式で、カルボン酸またはアミノ官能基を導入するために誘導体化することができる。
【０１０８】
また、ペプチドをベースとする毛髪着色料と毛髪との間の相互作用を増強するために、着色剤に複数のヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドが結びつけられることが望ましい可能性がある。同じ毛髪結合ペプチドの複数のコピー、または異なる毛髪結合ペプチドの組み合わせを使用することができる。例えば、上述した通りに、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドとシャンプー耐性の毛髪結合ペプチドの組み合わせを使用することができる。大きな顔料粒子の場合、多数の毛髪結合ペプチド（すなわち約５０，０００まで）が、顔料と結びつけられる可能性がある。より少ない数（すなわち約１００まで）の毛髪結合ペプチドは、より小さい染料分子と結びつけられる可能性がある。さらに、複数の毛髪結合ペプチド配列が、共に連結されて、上述した通りの着色剤と結びつけられる可能性がある。したがって、本発明の一実施形態では、ペプチドをベースとする毛髪着色料は、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチド（ＨＣＰ）と着色剤（Ｃ）からなる、一般構造が（ＨＣＰｍ）ｎ−Ｃ（式中、ｍは１から約１００、好ましくはｍは１から約１０である）であるジブロック組成物である。着色剤が、染料などの分子種である場合、ｎは、１から約１００、好ましくは１から約１０までの範囲である。着色剤が顔料またはナノ粒子などの粒子である場合、ｎは、１から約５０，０００、好ましくは１から約１０，０００までの範囲である。
【０１０９】
別の実施形態では、ペプチドをベースとする毛髪着色料は、上述した通りの、毛髪着色剤から結合ペプチドを隔てるスペーサー（Ｓ）を含有する。ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドの複数のコピーが、単一のスペーサー分子に結びつけられる可能性がある。さらに、ペプチドの複数のコピーが、スペーサーを介して共に連結され、スペーサーを介して着色剤に結びつけられる可能性がある。この実施形態では、ペプチドをベースとする毛髪着色料は、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドと、スペーサーと、着色剤からなる、一般構造が［（ＨＣＰｘ−Ｓ）ｍ］ｎ−Ｃ（式中、ｘは、１から約１０までの範囲であり、好ましくはｘは１であり、ｍは、１から約１００までの範囲であり、好ましくは１から約１０である）であるトリブロック組成物である。着色剤が染料などの分子種である場合、ｎは、１から約１００、好ましくは１から約１０までの範囲である。着色剤が顔料またはナノ粒子などの粒子である場合、ｎは、１から約５０，０００、好ましくは１から約１０，０００までの範囲である。
【０１１０】
ここで、ＨＣＰは一般記号であり、単一の毛髪結合ペプチド配列を指すという意味ではないことを理解するべきである。上で使用される通りのｍ、ｎ，またはｘが、１よりも大きい場合、一連の異なる配列の毛髪結合ペプチドが、組成物の一部を形成し得るという状況が提供することは、十分に本発明の範囲内である。さらに、Ｓは、一般記号であり、単一のスペーサーを指すという意味ではない。ここで、トリブロック組成物について、上で使用される通りのｍまたはｎが、１よりも大きい場合、一連の異なるスペーサーが、組成物の一部を形成し得るという状況が提供されることは、十分に本発明の範囲内である。こうした構造が、ペプチドと、着色剤と、任意のスペーサーとの間の共有結合に必ずしも相当するわけではないことも理解するべきである。上述した通り、ペプチドと、着色剤と、任意のスペーサーとの間の結合相互作用は、共有結合的である可能性もあるし、非共有結合的である可能性もある。
【０１１１】
本発明のペプチドをベースとする毛髪着色料は、毛髪を染色するための毛髪着色製品中で使用することができる。毛髪着色製品組成物は、本明細書では、化粧品として許容される媒質中に、有効量の、ペプチドをベースとする毛髪着色料、または異なるペプチドをベースとする毛髪着色料の混合物を含んでなる、毛髪の着色、染色、または脱色のための組成物と定義される。毛髪着色製品組成物中で使用するための、ペプチドをベースとする毛髪着色料の有効な量は、本明細書では、組成物の総重量を基準にして約０．００１重量％から約２０重量％の割合と定義される。毛髪着色製品組成物のための、化粧品として許容される媒質の成分は、ディアシュ（Ｄｉａｓ）らによって、米国特許第６，３９８，８２１号明細書に、また、ドゥーツ（Ｄｅｕｔｚ）らによって、米国特許第６，１２９，７７０号明細書（これらをどちらも、参照により本明細書に援用する）に記載されている。例えば、毛髪着色製品組成物は、金属イオン封鎖剤、安定剤、増粘剤、緩衝液、担体、界面活性剤、溶媒、酸化防止剤、ポリマー、およびコンディショナーを含有することができる。コンディショナーは、毛髪着色組成物の総重量を基準にして約０．０１重量％から約１０重量％、好ましくは約０．０１重量％から約５重量％の割合で、本発明のペプチドをベースとするヘアコンディショナーおよびヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドを含むことができる。
【０１１２】
本発明のペプチドをベースとする毛髪着色料はまた、これらに限定されないが、マスカラおよびペンシル型まゆずみを含めて、睫毛または眉に適用される化粧品組成物中で着色剤として使用することができる。これらは、一般に、組成物の総重量を基準にして約１０重量％から約９０重量％の割合で、脂肪物質を含有する化粧品として許容される媒質を含んでなる、無水のメイクアップ製品である（ただし、脂肪相が、少なくとも１つの液体、固体、または半固体脂肪物質を含有する）可能性がある。脂肪物質としては、これらに限定されないが、油、ワックス、ガム、およびいわゆるペースト状の脂肪物質が挙げられる。あるいは、上述した通り、こうした組成物は、油中水型または水中油型エマルジョンなどの、安定な分散液の形であり得る。こうした組成物中では、ペプチドをベースとする毛髪着色料の割合は、一般に、組成物の総重量を基準にして約０．００１重量％から約２０重量％である。
【０１１３】
毛髪を処理するための方法
別の実施形態では、本発明のペプチドをベースとするコンディショナーおよび着色料を用いて毛髪を処理するための方法が提供される。詳細には、本発明はまた、有効な量のペプチドをベースとするヘアコンディショナーを含んでなる、上述した組成物のうちの１種を毛髪に適用し、保護膜を形成させることによって、毛髪上にペプチドをベースとするコンディショナーの保護膜を形成するための方法を含んでなる。本発明の組成物は、これらに限定されないが、噴霧、はけ塗り、および手による適用を含めて、様々な手段によって毛髪に適用することができる。ペプチドをベースとするコンディショナー組成物は、保護膜を形成するのに十分な時間、好ましくは少なくとも約０．１から６０分間、毛髪と接触したままにされる。
【０１１４】
本発明はまた、上述した手段によって、有効な量のペプチドをベースとする毛髪着色料を含んでなる毛髪着色組成物を毛髪に適用することによって、毛髪を着色するための方法を提供する。毛髪着色組成物を、毛髪を着色させるのに十分な時間、好ましくは約５から約５０分間毛髪と接触させ、その後、毛髪着色組成物を、毛髪から洗い落とすことができる。
【０１１５】
本発明はまた、上述した手段によって、有効な量のペプチドをベースとする毛髪着色料を含んでなる化粧品組成物を眉および睫毛に適用することによって、眉および睫毛を着色するための方法を提供する。
【実施例】
【０１１６】
本発明を、以下の実施例でさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方、実例として示されるに過ぎないことを理解するべきである。上記説明およびこれらの実施例から、当業者であれば、この発明の本質的な特性を確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な用途および条件にそれを適合させるために、本発明の様々な改変および変形形態を作製することができる。
【０１１７】
使用される省略形の意味は、以下の通りである：「ｍｉｎ」は、分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍｌ」は、ミリリットルを意味し、「Ｌ」は、リットルを意味し、「ｎｍ」は、ナノメートルを意味し、「ｍｍ」は、ミリメートルを意味し、「ｃｍ」は、センチメートルを意味し、「μｍ」は、マイクロメートルを意味し、「ｍＭ」は、ミリモルを意味し、「Ｍ」は、モルを意味し、「ｍｍｏｌ」は、ミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」は、マイクロモルを意味し、「ｇ」は、グラムを意味し、「μｇ」は、マイクログラムを意味し、「ｍｇ」は、ミリグラムを意味し、「ｐｆｕ」は、プラーク形成単位を意味し、「ＢＳＡ」は、ウシ血清アルブミンを意味し、「ＥＬＩＳＡ」は、酵素結合免疫測定法を意味し、「Ａ」は、吸光度を意味し、「Ａ４５０」は、４５０ｎｍの波長で測定される吸光度を意味し、「ＴＢＳ」は、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝生理食塩水を意味し、「ＴＢＳＴ−Ｘ」は、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０を含有するトリス緩衝生理食塩水を意味し（ここで、「Ｘ」は、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０の重量パーセントであり）、「ＳＥＭ」は、平均値の標準誤差を意味し、「ＭＡＬＤＩ」は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化を意味し、「ＮＭＲ」は、核磁気共鳴分光法を意味する。
【０１１８】
一般方法：
これらの実施例で使用される標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当分野でよく知られており、サムブルック，Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッチュ，Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス，Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、コールドスプリングハーバー研究所出版局（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）、１９８９年によって、シルハーヴィー，Ｔ．Ｊ．（Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．）、Ｍ．Ｌ．ベンアン（Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ）、およびＬ．Ｗ．エンクヴィスト（Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ）「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）研究所、ニューヨーク、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、１９８４年によって、また、オースベル，Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、グリーン出版協会（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．）およびワイリーインターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク（Ｎ．Ｙ．）、１９８７年によって記載されている。
【０１１９】
細菌培養物の維持および増殖に適した材料および方法も、当分野でよく知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、フィリップゲルハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレイ（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クレイグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグスフィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントン（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）、１９９４年に、あるいは、トーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）による「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」第２版、シノエールアソシエーツインコーポレイティッド（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）、１９８９年に記載されている。特に明記しない限り、細菌細胞の増殖および維持のために使用される試薬および材料はすべて、アルドリッチケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、ＢＤダイアグノスティックシステムズ（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（メリーランド州スパークス（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ））、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））、またはシグマケミカルカンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から得られた。
【０１２０】
ファージディスプレイペプチドライブラリ：
以下の実施例では、３つのファージディスプレイペプチドライブラリを使用した。Ｐｈ．Ｄ．−１２（商標）ファージディスプレイペプチドライブラリは、ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（マサチューセッツ州ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））から購入した。このキットは、Ｍ１３ファージのマイナーコートタンパク質（ｐＩＩＩ）に融合されるランダムペプチド１２ｍｅｒのコンビナトリアルライブラリに基づくものである。提示されたペプチドは、ｐＩＩＩのＮ末端で発現され、その結果、シグナルペプチドが切断された後、コートタンパク質の第１の残基が、提示されたペプチドの第１の残基となる。Ｐｈ．Ｄ．−１２（商標）ライブラリは、約２．７×１０９配列からなる。
【０１２１】
２つのファージディスプレイペプチドライブラリは、１５ｍｅｒランダムペプチド配列を含有するものであり、２０ｍｅｒのランダムなペプチド配列を含有する他のものは、ケイ（Ｋａｙ）ら（「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」、第８巻：５４５〜５５１（２００５年））によって記載されている方法を使用して調製した。この方法は、シドゥ（Ｓｉｄｈｕ）ら（「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」３２８：３３３〜３６３（２０００年））によって報告される方法（ここで、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＣＪ２３６（ｄｕｔ−ｕｎｇ−）が、ウリジン含有一本鎖ファージミドＤＮＡ（Ｕ−ｓｓＤＮＡ）を産生するために使用される）の変形形態である。このＤＮＡは、オリゴヌクレオチドを使用する第２のストランド合成のための鋳型として、また第２のストランドのプライマーとしてだけでなく、ランダムなアミノ酸をコードするインサートのために使用される。第２のストランド合成終了後、二本鎖ＤＮＡを、野生株に形質転換させる。任意のＵ−ｓｓＤＮＡは、宿主細胞によって分解され、それによって、ファージ粒子を産生するための組換えストランドだけが残る。この方法は、Ｍ１３コートタンパク質に対するペプチド融合または変異をもたらすために利用することができる。ケイ（Ｋａｙ）らの方法は、遺伝子ＩＩＩの最初に、アンバー終止コドンを使用する。ＤＮＡ配列のランダム化された伸長部を含有するオリゴヌクレオチドを、ランダム化された領域が終止コドンと並ぶように、一本鎖ファージゲノムにアニーリングさせる。ｓｓＤＮＡは、酵素的に転換されて、共有結合的に閉じられた環状のｄｓＤＮＡになり、その後、Ｅ．ｃｏｌｉの非サプレッサー株に電気穿孔される。新しく合成されたＤＮＡストランド（マイナスストランド）は、宿主細胞中でプラスストランドの産生のための鋳型として働き、これは、ウイルスの遺伝子の転写／翻訳のために利用され、ウイルス粒子に包埋される。
【０１２２】
得られた１５ｍｅｒおよび２０ｍｅｒライブラリについての力価はそれぞれ、４．１×１０１２ｐｆｕ／ｍＬおよび４．２×１０１２ｐｆｕ／ｍＬであった。
【０１２３】
当該のライブラリ由来の約４×１０１０ｐｆｕのファージを含有するサンプルを、各実験において使用した。ファージライブラリのサンプルを、最初に前処理して、皮膚およびプラスチック結合クローンを除去した。皮膚結合クローンを除去するために、ファージライブラリのサンプルを、独自のブタ皮膚底の９６ウェル装置（これは、ミニフォールドＩドット−ブロットシステム（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ  Ｉ  Ｄｏｔ−Ｂｌｏｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）の９６ウェルブロック（シュライヒャー・アンド・シュル・インコーポレイティッド（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎｃ．）、ニューハンプシャー州キーン（Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ））の下に、一層のパラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）（登録商標）を適用し、パラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）（登録商標）カバーの上に無毛のブタ皮膚の層を加え、その後、装置を固定することによって作製された）中で、ブタ皮膚のサンプルと共に、室温で１時間保温した。ブタ皮膚は、地元のスーパーマーケットで購入し、−８０℃で貯蔵した。使用する前に、皮膚を脱イオン水に入れて解凍し、その後、ペーパータオルを使用して吸収乾燥させた。皮膚の表面を、９０％イソプロパノールで拭き、その後、脱イオン水で洗い落とした。ブタ皮膚への暴露の後、ファージサンプルを、ポリスチレン製の６ウェル細胞培養クラスター（コーニングインコーポレイティッド（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州アクトン（Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）；カタログ番号３５２６）に移し、室温で１時間保温して、プラスチック結合クローンを除去した。
【０１２４】
実施例１〜３
ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドの同定
これらの実施例の目的は、３つのランダムなファージディスプレイペプチドライブラリから、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドを同定する方法を実証することであった。
【０１２５】
使用される毛髪サンプルは、インターナショナルヘアインポーターズアンドプロダクツ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈａｉｒ  Ｉｍｐｏｒｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（ニューヨーク、ベルローズ（Ｂｅｌｌｅｒｏｓｅ，ＮＹ））から入手できる、ミディアムブラウンのヒト毛髪の長さ６インチ（１５ｃｍ）の断片であった。毛髪を、室温で３０分間、９０％イソプロパノールの中に入れ、その後、脱イオン水で５回（各１０分間）洗浄した。毛髪は、室温で、終夜風乾した。毛髪を１ｃｍの長さに切断し、１０〜２０の毛髪をマイクロ遠心チューブに入れた。
【０１２６】
皮膚およびプラスチック結合クローンを除去するために、上述した通りに前処理したファージサンプルを、毛髪サンプルを含有する管に加え、混合物を、１時間室温で保温した。ファージ溶液を除去し、毛髪サンプルを、希釈していないヘアコンディショナー（地元のスーパーマーケットで入手した、ダヴ（Ｄｏｖｅ）（登録商標）エクストラボリュームコンディショナー（Ｅｘｔｒａ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ）；ユニリーバ（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ））中で、室温で５分間保温した。その後、毛髪をＴＢＳＴ−０．５％緩衝液で６回洗浄した。洗浄後、毛髪を新しい管に移し、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡの０．２Ｍのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）溶液からなる溶離緩衝液を加え、毛髪を１０分間保温した。その後、この管に、１Ｍ  トリスＨＣｌ（ｐＨ９．２）からなる中和緩衝液を加えた。溶離後も依然として毛髪に結合されたファージを、新たな宿主細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２３３８）を加えることによって増幅させた。増幅および単離されたファージを、新たな毛髪サンプルと接触させ、バイオパニング手順を、各ライブラリについてさらに２回繰り返した。
【０１２７】
第３のバイオパニング・ラウンドの後、ランダムな単一のファージクローンを選択し、単一のプラーク溶解物を、製造者（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））の指示書に従って調製し、ＱＩＡｐｒｅｐスピンＭ１３キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）；カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を使用して一本鎖ファージゲノムＤＮＡを精製し、配列番号７として示される−９６  ｇＩＩＩ配列決定プライマー（５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’）を使用して、デュポンシークエンシングファシリティ（ＤｕＰｏｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で配列決定した。提示されたペプチドは、遺伝子ＩＩＩのシグナルペプチドの直後に位置される。３つのバイオパニング・ラウンドの後の、３つのファージライブラリから同定されるヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ファージ−ペプチドのアミノ酸配列を、表１に示す。
【０１２８】
【表２】
2009500003.tif 000005
【０１２９】
実施例４
ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドの特異性
この実施例の目的は、ＥＬＩＳＡ手順を使用して、実施例１〜３中で同定されたヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドの特異性を実証することであった。
【０１３０】
この実施例では、対照ペプチドである無関係の皮膚結合ペプチド、すなわち配列番号８として示されるスキン（Ｓｋｉｎ）１（ホワン（Ｈｕａｎｇ）ら、米国特許出願公開第２００５／００５０６５６号明細書）とともに、毛髪結合ペプチドＨＣＰ．１（配列番号１）およびＨＣＰ．６（配列番号４）が使用された、ペプチドはすべて、リジン残基を付加して合成され、シンペップ（ＳｙｎＰｅｐ）（カリフォルニア州ダブリン（Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）））による蛍光タグ５−カルボキシフルオレスセイン−アミノヘキシルアミダイト（５−ＦＡＭ）を用いてＣ末端で誘導体化された。誘導体化された毛髪結合ペプチドＨＣＰ．１（５−ＦＡＭ）およびＨＣＰ．６（５−ＦＡＭ）の配列はそれぞれ、配列番号９および１０として示される。誘導体化された皮膚結合ペプチドの対照スキン（Ｓｋｉｎ）１（５−ＦＡＭ）の配列は、配列番号１１として示される。
【０１３１】
このアッセイについては、ミニフォールドＩドット−ブロットシステム（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ  Ｉ  Ｄｏｔ−Ｂｌｏｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）の９６ウェルブロック（シュライヒャー・アンド・シュル・インコーポレイティッド（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎｃ．）、ニューハンプシャー州キーン（Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ））の下に、一層のパラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）（登録商標）を適用し、パラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）（登録商標）カバーの上に無毛のブタ皮膚の層を加え、その後、装置を固定することによって、独自のブタ皮膚底の９６ウェル装置が作製された。９６ウェル装置中の毛髪または皮膚サンプルは、スーパーブロック（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ）（登録商標）ブロッキング緩衝液（トリス緩衝；ピアスバイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））を用いて、室温で１時間サンプルを保温することによって最初にブロックした。次いで、毛髪または皮膚サンプルを、洗浄緩衝液（ＴＢＳＴ−０．５％）で６回洗浄した。１．０ｍｌの結合緩衝液（１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含有するＴＢＳＴ−０．５％）中の２０μＭの濃度のフルオレセイン標識されたペプチドを、各ウェルに加え、３７℃で３０分間保温した。毛髪または皮膚サンプルを、ＴＢＳＴ−０．５％で６回洗浄し、次いで、１．０ｍｌの抗フルオレセイン／マウスＩｇＧ（モレキュラープローブスインコーポレイティッド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）、オレゴン州ユージン（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））溶液（ブロッキング緩衝液で１：１０００希釈）を、ウェルごとに加えた。サンプルは、室温で１時間保温し、次いで、緩衝液で６回洗浄した。その後、１．０ｍｌの抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体（ピアスバイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））溶液（ブロッキング緩衝液で１：１０００希釈）を、各ウェルに加え、これらのサンプルを、室温で１時間保温した。これらのサンプルを、洗浄緩衝液で６回洗浄し、３００μＬのＴＭＢ基質（ピアスバイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を各ウェルに加えた。サンプルを、室温で１０分間保温し、次いで、各ウェルから１００μＬサンプルを取り出し、新しいマイクロタイタープレート中のウェルに加えた。その後、１００μＬの停止液（２Ｍ  硫酸溶液）を各ウェルに加え、各サンプルの吸光度を、４５０ｎｍの波長で測定した。
【０１３２】
結果を、二重の独立した実験（それぞれが、少なくとも３つの重複測定からなる）の平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として、表２に示す。表中のデータからわかる通り、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドＨＣＰ．１およびＨＣＰ．６は、毛髪に結合するが、皮膚には結合せず、毛髪に対するその結合特異性が実証される。予想通り、陽性の皮膚結合対照として使用されたスキン（Ｓｋｉｎ）１ペプチドは、高い皮膚結合活性と、低い毛髪結合活性を有した。
【０１３３】
【表３】
2009500003.tif 000006
【０１３４】
実施例５
ヘアコンディショナーマトリックスから毛髪へのヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドの結合
この実施例の目的は、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドが、ヘアコンディショナーマトリックスから毛髪に結合することを実証することであった。
【０１３５】
９６ウェル装置におけるウェルとしての役割り当てをせず、毛髪サンプルが束に集められたこと以外は、実施例４に記載したのと同じＥＬＩＳＡ方法を使用した。毛髪サンプルの束を調製するために、１ｃｍ長さの毛髪１００断片を集め、片方の末端を、幅の狭いテープ（スリーエム（３Ｍ）、ミネソタ州セントポール（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））で巻いた。毛髪は、実施例１〜３に記載した通りに調製し、平底ブロック（ｆｌａｔ−ｂｏｔｔｏｍ  ｂｌｏｃｋ）（キアゲンサイエンス（Ｑｉａｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、メリーランド州ジャーマンタウン（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）；カタログ番号１９５７９）に入れた。
【０１３６】
ＨＣＰ．１（５−ＦＡＭ）およびＨＣＰ．６（５−ＦＡＭ）毛髪結合ペプチドを、高剪断ミキサー（ｈｉｇｈ−ｓｈｅａｒ  ｍｉｘｅｒ）（シルバーソン（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ）モデルＬ４Ｒ７Ａ；シルバーソンマシーンズ（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ）、マサチューセッツ州イーストロングメドー（Ｅａｓｔ  Ｌｏｎｇｍｅａｄｏｗ，ＭＡ））を６分間使用して、実施例４に記載した通りに、希釈していないヘアコンディショナー（ダヴ（Ｄｏｖｅ）（登録商標）エクストラボリュームコンディショナー（Ｅｘｔｒａ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ）；ユニリーバ（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ））と別々に混合して、２０μＭの最終ペプチド濃度を得た。この毛髪サンプルを、実施例４に記載した通りにブロックし、次いで３７℃で３０分間、ペプチド−コンディショナー混合物中で保温した。毛髪サンプルを、その後洗浄し、実施例４に記載した通りに処理した。抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体の添加の後の最終の洗浄工程後、毛髪の束を新しい管に移し、ＴＭＢ基質を加えた。毛髪の束を、室温で１０分間保温し、次いで各管から１００μＬのサンプルを取り出し、マイクロタイタープレート中のウェルに加えた。その後、１００μＬの停止液（２Ｍの硫酸溶液）を各ウェルに加え、各サンプルの吸光度を、４５０ｎｍの波長で測定した。
【０１３７】
緩衝液から毛髪へのＨＣＰ．１（５−ＦＡＭ）およびＨＣＰ．６（５−ＦＡＭ）毛髪結合ペプチドの結合を、同じ手順を使用して決定した。さらに、ヘアコンディショナーおよび緩衝液中に、いずれの毛髪結合ペプチドも含ませずに、同じ手順を使用して、対照実験を行った。
【０１３８】
結果は、二重の独立した実験（それぞれが、少なくとも３つの重複測定からなる）の平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として、表３に示す。これらの結果は、緩衝液と比較した場合の、ヘアコンディショナーマトリックスからのヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドＨＣＰ．１とＨＣＰ．６の毛髪結合活性には、有意な差は存在しないことを実証する。
【０１３９】
【表４】
2009500003.tif 000007
【０１４０】
ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドがまた、シャンプー耐性でもあるかどうか決定するために、実験を行った。これらの実験については、毛髪結合ペプチド（ＨＣＰ．１またはＨＣＰ．６）と接触させた後の毛髪を、３０％シャンプー（パンテーン・Ｐｒｏ−Ｖ（Ｐａｎｔｅｎｅ  Ｐｒｏ−Ｖ）、シアーボリューム（Ｓｈｅｅｒ  Ｖｏｌｕｍｅ）、プロクターアンドギャンブル（Ｐｒｏｃｔｏｒ＆Ｇａｍｂｌｅ）、オハイオ州シンシナティ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ））を含有する溶液で洗浄し、上述したＥＬＩＳＡ方法を使用して、結合活性を決定し、緩衝液洗浄を用いて、得られたものと比較した。シャンプー洗浄によって、結合活性がほとんど喪失され、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドは、シャンプー耐性ではないことが示された。
【０１４１】
実施例６
ヘアコンディショナーマトリックス中のヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドの安定性
この実施例の目的は、ヘアコンディショナーマトリックス中のヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドの安定性を実証することであった。
【０１４２】
毛髪結合ペプチドＨＣＰ．１およびＨＣＰ．６をヘアコンディショナーに入れた別々の混合物を、実施例５に記載した通りに調製した。比較の目的で、毛髪結合ペプチドを緩衝液中に入れた溶液を使用した。すべての溶液を、室温で保管し、異なる時間で取り出されたサンプルを使用して、実施例５に記載したＥＬＩＳＡ手順を使用して、ペプチドの結合活性を決定した。毛髪結合ペプチドを含有しない緩衝液およびヘアコンディショナーを用いて対照実験も行った。
【０１４３】
ペプチドＨＣＰ．１およびＨＣＰ．６について得られる結果を、それぞれ図１および２に示す。この図の結果は、ヘアコンディショナーマトリックス中の２１日後の２つのヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドの毛髪結合活性には有意な低下がなかったことを示す。
【０１４４】
実施例７（机上実験）
ペプチドをベースとするヘアコンディショナーの調製
この予測的な実施例の目的は、ヘテロ二官能性架橋薬剤である３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用して、配列番号１２として示される、ヘアコンディショナー耐性の、毛髪に結合する、システインが付着されたＨＣＰ．１ペプチドを、オクチルアミンと結びつけることによって、ペプチドをベースとするヘアコンディショナーを調製する方法を説明することである。
【０１４５】
オクチルアミン（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）由来）を、０．３ｍｌのＤＭＦに対して１１．６ｍｇを加えることによって希釈する。この希釈された溶液を、５ｍｌの丸底フラスコ中の０．２ｍｌのＤＭＦに入れた、２５ｍｇの３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ））および５ｍｇのジイソプロピルエチルアミン（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ））を含有する撹拌された溶液に加える。反応混合物は、直ちに混濁し、数分後に透明になる。溶液を、さらに４時間撹拌する。その後、溶液を、高真空下で乾燥させる。生成物、すなわちオクチルアミンが結びつけられたマレイミドプロピオン酸塩を、シリカゲル６０（ＥＭＤケミカルズ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（かつてのＥＭサイエンス（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ））、ニュージャージー州ギブスタウン（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ））カラムおよび溶離液としてのＤＭＦ／エーテルを使用するカラムクロマトグラフィによって精製する。
【０１４６】
上の生成物のうちの約１２ｍｇを、５ｍＬの丸底フラスコに入れ、配列番号１２として示される、システインが付着された８５ｍｇのＨＣＰ．１ペプチド（シンペップ（ＳｙｎＰｅｐ）、カリフォルニア州ダブリン（Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ））、およびｐＨ７．２の０．５ｍＬの０．１Ｍ  リン酸緩衝液を加える。システインが付着されたＨＣＰ．１ペプチドは、毛髪結合ＨＣＰ．１ペプチド（配列番号１）のペプチド配列のＣ末端にシステインが付着されている。この混合物を、室温で６時間撹拌する。水／エーテルを用いる抽出によって、最終生成物を精製する。生成物を、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を使用して分析する。
【０１４７】
実施例８（机上実験）
ペプチドをベースとするヘアコンディショナーの調製
この予測的な実施例の目的は、オクタデシルアルキル鎖にヘアコンディショナー−毛髪結合ペプチドＨＣＰ．１を結びつけることによって、ペプチドをベースとするヘアコンディショナーを調製することである。
【０１４８】
オクタデシルイソシアネート（７０ｍｇ、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＣＡＳ番号１１２−９６−９）を、５ｍｌのＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、１０ｍｌのＤＭＦに溶解された（１５０ｍｇ）、配列番号１２として示される、Ｃ末端上にシステイン残基が付加された、保護されていないＨＣＰ．１ペプチド（シンペップ（ＳｙｎＰｅｐ）由来）の溶液に加える。反応を触媒するために、トリエチルアミン（３０ｍｇ）を加える。この溶液を、室温で１２０時間撹拌する。溶媒を蒸発させて、オフホワイトの結晶性の粉末生成物を生ずる。生成物を、液体クロマトグラフィーおよびＭＡＬＤＩ質量分析によって分析する。
【０１４９】
実施例９（机上実験）
ペプチドをベースとする毛髪着色料の調製
この予測的な実施例の目的は、ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドＨＣＰ．１（配列番号１）をディスパースオレンジ３（Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｏｒａｎｇｅ  ３）染料に共有結合的に付着させることによって、ペプチドをベースとする毛髪着色料を調製することである。この染料に、最初にイソシアネートを用いて官能性をもたせ、続いて、ＨＣＰ．１ペプチドと反応させる。
【０１５０】
ディスパースオレンジ３（Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｏｒａｎｇｅ  ３）の官能化：
ドライボックス中で、１４．２５ｇのディスパースオレンジ３（Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｏｒａｎｇｅ  ３）（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ））を、滴下漏斗で４００ｍｌの乾燥ＴＨＦに懸濁させる。磁気攪拌棒を含有する２リットルの４頸反応フラスコ（コーニングインコーポレイティッド（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）；パートナンバー（ｐａｒｔ  ｎｏ．）１５３３−１２）に、２００ｍｌの乾燥トルエンを装入する。このフラスコに、コールドフィンガーコンデンサー（コーニングインコーポレイティッド（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）（パートナンバー（ｐａｒｔ  ｎｏ．）１２０９−０４））、および滴下漏斗を備えた第２のコールドフィンガーコンデンサーを装着し、フード中で油浴に入れる。
【０１５１】
ホスゲン（２５．４ｍｌ）を、室温で、反応フラスコに濃縮させる。ホスゲン添加が完了した後、油浴の温度を、８０℃に上げ、反応温度およびスクラバーからのガス放電をモニタリングしながら、ディスパースオレンジ３（Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｏｒａｎｇｅ  ３）懸濁液を、２時間かけて１００ｍｌの増分で、液滴として反応フラスコに加える。温度は、添加の間中６４℃以下に維持する。添加が完了した後、反応物を、６４℃で１時間加熱し、その後、終夜撹拌しながら室温に冷却させる。
【０１５２】
反応溶媒を、中身を４０℃以下に維持しながら、真空蒸留して乾燥させ、さらなる時間真空を維持する。反応フラスコを、ドライボックスに移し、生成物を収集して終夜乾燥させる。所望の生成物を、陽子ＮＭＲによって確認する。
【０１５３】
イソシアネート官能化された染料のＨＣＰ．１毛髪結合ペプチドとの結合：
上述した通りに調製したイソシアネート官能化されたディスパースオレンジ３（Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｏｒａｎｇｅ  ３）［（２−（４−イソシアントフェニル（ｉｓｏｃｙａｎｔｏｐｈｅｎｙｌ））−１−（４−ニトロフェニル）ジアゼン］（１６ｍｇ）を、５ｍＬのＤＭＦに溶解し、１０ｍｌのＤＭＦに溶解したシンペップ（ＳｙｎＰｅｐ）からの７５ｍｇの非保護ＨＣＰ．１ペプチド（配列番号１）を含有する溶液に加える。反応を触媒するために、トリエチルアミン（３０ｍｇ）を加える。この溶液を、室温で２４時間撹拌する。溶媒を蒸発させると、濃い赤褐色の粉末生成物が生じる。この生成物を、付加物形成を確認するために、ＭＡＬＤＩ質量分析によって分析する。
【０１５４】
実施例１０（机上実験）
ヘアコンディショナーマトリックス中のペプチドをベースとする毛髪着色料を使用する毛髪の着色
この予測的な実施例の目的は、ヘアコンディショナーマトリックス中のペプチドをベースとする毛髪着色料を使用して、天然の白色の毛髪のサンプルの着色を試験する方法を説明することである。
【０１５５】
毛髪着色組成物は、実施例９に記載した通りに調製されるペプチドをベースとする毛髪着色料を、ヘアコンディショナーと混合することによって調製される。ペプチドをベースとする毛髪着色料（１００ｍｇ）を、高剪断ミキサーを使用して、１０ｍＬのダヴ（Ｄｏｖｅ）（登録商標）エクストラボリュームコンディショナー（Ｅｘｔｒａ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ）と混合する。天然の白色毛髪の束（約１００〜１０００本の毛髪）（インターナショナルヘアインポーターズアンドプロダクツインコーポレイティッド（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈａｉｒ  Ｉｍｐｏｒｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．）由来）を、ペプチドをベースとする毛髪着色料−コンディショナー混合物に、撹拌しながら１０分間浸す。その後、毛髪を、１０ｍＬの５０％  パンテーン・Ｐｒｏ  Ｖ（Ｐａｎｔｅｎｅ  Ｐｒｏ  Ｖ）シャンプーと５分間混合し、次いでシャンプーを除去するために蒸留水で洗い落とすことによって洗浄する。毛髪を室温で乾燥させ、蒸留水で少なくとも５回すすぐ。毛髪の色は、オレンジとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドＨＣＰ．１（配列番号１）のヘアコンディショナーマトリックス中での安定性を示す。
【図２】ヘアコンディショナー耐性の毛髪結合ペプチドＨＣＰ．６（配列番号４）のヘアコンディショナーマトリックス中での安定性を示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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