(57)【要約】  重症筋無力症に関与するアセチルコリン受容体の主要免疫原性領域と相補的な配列を少なくとも有する相補的ペプチドであって、８位にトリプトファンを有する配列番号１の配列を少なくとも有し、少なくとも１つの置換されていてもよい炭化水素基を保持することを特徴とする相補的ペプチド。本発明による相補的ペプチドを含む治療用組成物、及び哺乳動物における重症筋無力症の治療的又は予防的処置において使用されるワクチンを製造するためのその使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
重症筋無力症に関与するアセチルコリン受容体の主要免疫原性領域と相補的な配列を少なくとも有する相補的ペプチドであって、８位にトリプトファンを有する配列番号１の配列を少なくとも有し、少なくとも１つの置換されていてもよい炭化水素基を保持することを特徴とする、上記相補的ペプチド。
【請求項２】
前記少なくとも１つの置換されていてもよい炭化水素基が、好ましくは置換されていてもよいアリール基、又は置換されていてもよいアルキル基、特に置換されていてもよいベンジル基、より好ましくは少なくとも１つのアルコキシ基で置換されたベンジル基、最も好ましくは２，４，６−トリメトキシベンジル基である、請求項１に記載の相補的ペプチド。
【請求項３】
配列番号１の配列が前記アセチルコリン受容体の主要免疫原性領域のα鎖の残基６１〜７６と相補的である、請求項１に記載の相補的ペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載の相補的ペプチド及び少なくとも１つの担体を含む治療用組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の相補的ペプチド、及びアセチルコリン受容体のＴ細胞認識部位と相補的である配列番号２の配列を少なくとも有する相補的ペプチド、並びに少なくとも１つの担体を含む治療用組成物。
【請求項６】
配列番号２の配列が前記アセチルコリン受容体のＴ細胞認識部位のα鎖の残基１００〜１１６と相補的である、請求項５に記載の治療用組成物。
【請求項７】
第１の配合物及び第２の配合物を含み、第１の配合物が配列番号１の配列を少なくとも有する前記相補的ペプチド及び少なくとも１つの担体を含み、第２の配合物が配列番号２の配列を少なくとも有する前記相補的ペプチド及び少なくとも１つの担体を含む、請求項５に記載の治療用組成物。
【請求項８】
７５０〜２５マイクログラム、好ましくは５００〜５０マイクログラム、有利には１００〜５０マイクログラムの前記配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを、少なくとも１つのアジュバントを有する０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中に含む、請求項４に記載の治療用組成物。
【請求項９】
７５０〜２５マイクログラム、好ましくは５００〜５０マイクログラム、有利には１００〜５０マイクログラムの各相補的ペプチドを、少なくとも１つのアジュバントを有する０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中に含む、請求項５に記載の治療用組成物。
【請求項１０】
第１の配合物が７５０〜２５マイクログラム、好ましくは５００〜５０マイクログラム、有利には１００〜５０マイクログラムの配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを、少なくとも１つのアジュバントを有する０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中に含み、第２の配合物が７５０〜２５マイクログラム、好ましくは５００〜５０マイクログラム、有利には１００〜５０マイクログラムの配列番号２の配列を有する相補的ペプチドを、少なくとも１つのアジュバントを有する０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中に含む、請求項７に記載の治療用組成物。
【請求項１１】
哺乳動物における重症筋無力症の治療的又は予防的処置において使用されるワクチンを製造するための、請求項４に記載の組成物の使用。
【請求項１２】
ワクチンがＢリンパ球に応じた細胞性免疫の活性化を誘導する、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
哺乳動物における重症筋無力症の治療的又は予防的処置において使用されるワクチンを製造するための、請求項５に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
ワクチンがＢ及びＴリンパ球に応じた細胞性免疫の活性化を誘導する、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記第１及び第２の配合物が同時又は連続的に投与される、哺乳動物における重症筋無力症の治療的又は予防的処置において使用されるワクチンを製造するための請求項７に記載の組成物の使用。
【請求項１６】
ワクチンがＢ及びＴリンパ球に応じた細胞性免疫の活性化を誘導する、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
重症筋無力症の主要免疫原性領域の抗イディオタイプ抗体を検出するための、請求項１に記載の相補的ペプチドを含む検出キット。
【請求項１８】
請求項１に記載の配列番号１の配列を少なくとも有する前記相補的ペプチドを製造するための方法であって、
配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成するステップ、及び
前記配列番号１の配列中の８位に位置するトリプトファン残基を炭化水素化するステップを含む、上記方法。
【請求項１９】
重症筋無力症に施用される薬剤を製造するための方法であって、
配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成するステップ、及び
配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを少なくとも１つの担体と結合させるステップを含む、上記方法。
【請求項２０】
重症筋無力症に施用される薬剤を製造するための方法であって、
請求項１に記載の配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成するステップ、
配列番号２の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成するステップ、及び
両方の相補的ペプチドを少なくとも１つの担体と混合するステップを含む、上記方法。
【請求項２１】
重症筋無力症に施用される薬剤を製造するための方法であって、
請求項１に記載の配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成し、相補的ペプチドを少なくとも１つの担体と結合させることによって第１の配合物を製造するステップ、及び
配列番号２の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成し、相補的ペプチドを少なくとも１つの担体と結合させることによって第２の配合物を製造するステップを含む、上記方法。
【請求項２２】
請求項４から７までのいずれか一項に記載の治療用組成物を投与することを含む、哺乳動物における重症筋無力症の処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重症筋無力症のアセチルコリン受容体の主要免疫原性領域と相補的な配列を少なくとも有する相補的ペプチド、より詳細には、特にペット又はヒトにおける、重症筋無力症の治療的又は予防的処置用のそのワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
重症筋無力症（ＭＧ）は、骨格筋の衰弱及び疲労によって特徴付けられる神経筋障害である。根底にある欠陥は、抗体介在の自己免疫発作による、神経筋接合部で利用可能なアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）の数の減少である。
【０００３】
神経筋接合部では、アセチルコリン（ＡＣｈ）は運動神経末端で合成され、小胞（量子）に保存される。活動電位が運動神経に伝わり神経末端に達すると、１５０〜２００小胞からＡＣｈが放出され、シナプス後フォールディングのピークで密集しているＡＣｈＲと結合する。
【０００４】
ＡＣｈがＡＣｈＲ上の結合部位と結合すると、ＡＣｈＲ中のチャンネルが開き、カチオン、主にナトリウムの迅速な進入が可能となり、これによって筋繊維の終板領域で脱分極が生じる。脱分極が十分大きい場合、それは筋繊維に沿って伝わる活動電位を引き起こし、筋収縮を誘発する。このプロセスは、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）によるＡＣｈの加水分解及び受容体からのＡＣｈの拡散によってすぐに終了する。
【０００５】
ＭＧにおいて、根本的な欠陥は、シナプス後筋肉膜で利用可能なＡＣｈＲの数の減少である。さらに、シナプス後フォールディングは扁平状、即ち「簡素化」されている。これらの変化は、神経筋伝達の低下した有効性をもたらす。したがって、ＡＣｈは正常に放出されるが、それは筋肉の活動電位を誘発できない可能性があるわずかな終板電位を生成する。多くの神経筋接合部における伝達の失敗は、筋収縮の衰弱をもたらす。
【０００６】
ＭＧにおける神経筋の異常は、特異的抗ＡＣｈＲ抗体によって介在される自己免疫応答によってもたらされる。抗ＡＣｈＲ抗体は病原性抗体と呼ばれ、３つの異なるメカニズム：（１）受容体の架橋及び迅速なエンドサイトーシスに関与するメカニズムによるＡＣｈＲの加速的代謝回転、（２）ＡＣｈＲの活性部位、即ちＡＣｈと通常結合する部位の遮断、及び（３）補体と共同した抗体によるシナプス後筋肉膜に対する損傷によって、神経筋接合部で利用可能なＡＣｈＲの数を減少させる。病原性抗体はＩｇＧであり、Ｔ細胞依存性である。
【０００７】
自己免疫疾患であるＭＧの臨床症状は、神経筋接合部に位置するこれらの病原性抗体の存在と相関関係がある。
【０００８】
今日まで、対症療法又は免疫療法のいずれかである数個の療法のみが存在する。
【０００９】
これらの療法は長期間続き得る臨床的有益性を患者にもたらすが、相当複雑な臨床手順を必要とする。さらに、これらの現在の治療レジメンは多くの罹患患者においてごく部分的に有効な状態であり、ライフスタイルを変えることが、これらの疾患を有する多くの割合の患者にとって必要不可欠である。
【００１０】
自己免疫疾患の理想的な処置は、直接的アネルギー又は自己反応性細胞クローンの除去による免疫応答の病原性要素（即ち、病原性抗体）の選択的抑制であり得る。
【００１１】
自己免疫の主要抗原用の抗原受容体模倣体（ＡＲＭ）として設計したペプチドを用いたワクチン接種は、動物自己免疫疾患モデルに対して顕著な臨床有効性を示している（米国特許第５，２１２，０７２号参照）。
【００１２】
このような処置は、それらの異質起源、及び他の近辺の抗原に対する応答の鈍化にもかかわらず、これらの免疫優勢タンパク質に特異的な自己反応性クローンのアネルギーを誘導する。その概略が自己免疫における主要抗原の概略と非常に相補的であるペプチドワクチンの使用は、抗原特異的な、抗原受容体のクラスに無関係な抗イディオタイプ（Ｉｄ）応答をもたらす可能性があるようである。
【００１３】
相補的ペプチドと呼ばれるこれらのペプチドは、標的抗原決定基と結合することができ、ある意味で抗原（Ａｇ）受容体模倣体（ＡＲＭ）として作用することができる。したがって、ワクチンとして使用するとき、それらはいくつかの自己反応性リンパ球上の抗原の結合部位に対する、抗イディオタイプ（Ｉｄ）及び抗クローンタイプ抗体（抗体）応答を誘導する。
【００１４】
したがって、ラットにおいて重症筋無力症を試験し、その中では人為的に重症筋無力症を誘導することができる。それは実験的自己免疫性重症筋無力症（ＥＡＭＧ）である。
【００１５】
ＥＡＭＧでは、精製ＡＣｈＲで免疫処置したラットは類似の疾患を発症する。抗原と抗体は水治療法において相補性によって相互作用するという概念に基づいて、ＡＣｈＲの主要免疫原性領域（ＭＩＲ）と相補的なペプチドでワクチン接種することによって、病原性抗体に対する抗Ｉｄ免疫を誘導することが求められている。受容体ＡＣｈＲの主要免疫原性領域は、受容体ＡＣｈＲのα鎖の残基６１〜７６であることが分かってきている。相補的ペプチドはＲｈＣＡ６７〜１６と呼ばれた。キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合した相補的ペプチドＲｈＣＡ６７〜１６で、ラットをワクチン接種した。この相補的ペプチドでワクチン接種した動物由来の血清とモノクローナル抗体の調製物の両方が、病原性抗体と結合することが示され、これらのラットにおける疾患の発生率は、ＫＬＨで免疫処置した動物及び未処置対照（９０％）と比較してワクチン接種した動物では大幅に低下したが（２５％）、一方で疾患を有する動物における臨床重度値は、陽性対照における３．５と比較してワクチン接種した動物では平均で１．０であった。さらに、疾患誘導の過程でのラットへのモノクローナル抗Ｉｄ抗体の受動的投与は、ＥＡＭＧの発生率及び重度を同様に低下させた［Ａｒａｇａ  Ａら、「アセチルコリン受容体の主要免疫原性領域に関する相補的ペプチドに対するモノクローナル抗体による、実験的自己免疫性重症筋無力症の予防（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ  Ｇｒａｖｉｓ  ｂｙ  ａ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ａ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍａｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７、３８６〜３９２（１９９６）］。
【００１６】
相補的ペプチドＲｈＣＡ６７〜１６を用いたワクチン接種の前述の結果を考慮して、この免疫原は病原性抗体のパラトープと構造上類似しており、及びしたがって、このワクチンはＢ細胞Ａｇ受容体模倣体（ＡＲＭ）と考えることができると結論付けられている。
【００１７】
相補的ペプチドＲｈＣＡ６７〜１６を用いて得た結果を確認するために、第２群のＲｈＣＡ６７〜１６ペプチドが生成された。第２群のペプチドは、予想された理論上の分子量を示した。
【００１８】
第２群のＲｈＣＡ６７〜１６ペプチドがラットにおいて再度試験されたが、残念ながら、疾患の発生率に関して以前に得られた良い結果は観察されなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、哺乳動物、特にペット犬及びヒトにおける重症筋無力症の処置において有用であり得る（ＭＧはネコにおいては不確かである）、抗原作用を有するペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
この目的のために、本発明は、８位にトリプトファンを有する配列番号１の配列を少なくとも有し、少なくとも１つの置換されていてもよい炭化水素基を保持することを特徴とする相補的ペプチドを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
有利なことに、このペプチドの配列はＡＣｈＲのα鎖の残基６１〜７６と相補的である。受容体ＡＣｈＲの主要免疫原性領域（ＭＩＲ）と相補的な配列を少なくとも有するペプチドは、ペプチドＲｈＣＡ６７〜１６である。この相補的ペプチドは８位にトリプトファンを含む。しかし今日まで、何故、イヌの受容体ＡＣｈＲのα鎖の残基６１〜７６を標的とする病原性抗体に対する抗Ｉｄ抗体とペプチドの結合に関して、炭化水素基が相当な重要性を有することが驚くべきことに分かったかは、十分に理解されていなかった。
【００２２】
置換されていてもよい炭化水素基は、好ましくは置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアルキル基、特に置換されていてもよいベンジル基、より好ましくは少なくとも１つのアルコキシ基で置換されたベンジル基、最も好ましくは２，４，６−トリメトキシベンジル基である。
【００２３】
イヌ及びヒトのＭＧは、主に（６８％）ＭＩＲ（ＡＣｈＲのα鎖の残基６１〜７６）に対するＡＣｈＲ抗体（病原性抗体）応答を有するとして特徴付けられるので、ＭＩＲを対象とする相補的ペプチドを提供して、哺乳動物におけるＭＧの処置に有用であり得る治療用組成物を得て、他のヒト用ワクチンを開発することが、有利である可能性があると考えられた。イヌのＭＧは、ヒトのＭＧと非常に類似している。
【００２４】
これらの類似性は障害の自然発生、ヒトとイヌの間の共有環境、類似した臨床所見、関連エピトープ特異性の特徴的なＡＣｈＲ自己抗体、及びＭＧと他の自己免疫疾患の共存症を含む。
【００２５】
したがって、本発明の他の目的は、配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチド及び少なくとも１つの担体を含む治療用組成物を提供することである。
【００２６】
本明細書で前に述べたように、イヌ及びヒトのＭＧでは、病原性抗体はＡＣｈＲのＭＩＲを標的とする。このＭＩＲと相補的なペプチドを提供することによって、相補的ペプチドを対象とする抗体（抗イディオタイプ抗体）を誘導することができるはずである。抗イディオタイプ抗体は、ペプチドがこの結合部位と相補的であるので、ＡＣｈＲのＭＩＲと類似している可能性がある抗原結合部位を有すると思われる。したがって、抗イディオタイプ抗体は病原性抗体を中和することができるはずであり、Ｂ細胞介在性の免疫応答が誘導されるはずである。
【００２７】
哺乳動物において良い結果を与え得る組成物を得るために、組成を最適化することが必要とされている。したがって、配列番号１の配列を少なくとも有するペプチドは、０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中に７５０〜２５マイクログラム、好ましくは５００〜５０マイクログラム、有利には１００〜５０マイクログラムの範囲の量で存在することが分かっている。
【００２８】
有利なことに、治療用組成物は、ＭＧの治療的又は予防的処置用のワクチン組成物として使用することが意図されている。ワクチン組成物は、免疫応答を追加刺激するためにアジュバント及びペプチド担体を含むことが好ましい。この組成物は、Ｂ細胞性の応答を増大させるように意図されているので、この目的において知られているこのようなアジュバントを使用することは有用であるはずである。このようなアジュバント及び担体は当業者によく知られている。
【００２９】
例示的なアジュバントは、油中水型アジュバント、特にＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）、ミョウバンアジュバント、フロイントアジュバントなどであってよい。
【００３０】
例示的な担体は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニンなどであってよい。
【００３１】
ラットにおけるＭＧの治療用途の、これらのアジュバント及び担体は、本明細書において参照中に組み込まれる、ＭｃＡｎａｌｌｙ  ＪＬ、Ｘｕ  Ｌ、Ｖｉｌｌａｉｎ  Ｍ、Ｂｌａｌｏｃｋ  ＪＥ．：「重症筋無力症用のペプチドワクチンの有効性におけるアジュバントの役割（Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ  ｇｒａｖｉｓ）」Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ２００１；２２６：３０７〜３１１中で詳細に論じられている。
【００３２】
Ｔ細胞免疫応答が重症筋無力症において働くことも報告されてきている。実際、病原性抗体はＩｇＧ−Ｔ細胞依存性である。したがって、Ｂ細胞介在性の免疫応答に関与するＡＣｈＲαの６１〜７６領域以外に、Ｔ細胞によって特異的に認識される受容体の他の領域が存在するはずであると考えられた。
【００３３】
ルイスラットにおける病原性抗体の生成は、ＡＣｈＲのα鎖の残基１００〜１１６に特異的なＴ細胞によって助力されることが、［Ａｒａｇａ  Ｓ．ら、「Ｔ細胞の助力を特異的に阻害することにより実験的自己免疫性重症筋無力症を予防するペプチドワクチン（Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｈａｔ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ  ｇｒａｖｉｓ  ｂｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐ）」ＦＡＳＥＢ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｖｏｌ  １４、２０００］中で報告されている。したがってＡｒａｇａ  Ｓ．らは、受容体ＡＣｈＲのα鎖の残基１００〜１１６と相補的なペプチド（これはＲｈＣＡ６１１〜００１と呼ばれた）でルイスラットを免疫処置した。生成した抗ＡＲＭ抗体／抗原受容体の相互作用は自己反応性Ｔ細胞の助力に干渉し、自己反応性Ｂ細胞をアネルギー化し、したがってＡＣｈＲ反応性自己抗体の力価を低下させ、これによって顕著な臨床的改善、低下した死亡率、及びルイスラット中の筋肉におけるＡＣｈＲレベルの維持をもたらしたことが観察された。
【００３４】
受容体ＡＣｈＲのα鎖のこれらの残基１００〜１１６と相補的なペプチドは、配列番号２の配列を少なくとも有するペプチドＲｈＣＡ６１１〜００１である。
【００３５】
このペプチドをラットにおいて試験して、受容体ＡＣｈＲのＴ細胞認識部位と相補的なペプチドを含む治療用ワクチン組成物の能力を測定した。
【００３６】
配列番号２の配列を少なくとも有する相補的ペプチドは、ＭＧ用の治療用組成物において考えられる候補であり得ることが分かっている。
【００３７】
それ故、相補的ＢペプチドＲｈＣＡ６７〜１６とＴ細胞認識部位と相補的なペプチドの組合せは、ラットにおいてＥＡＭＧの低下した発生率をもたらし得ると考えられている。
【００３８】
残念ながら、（比較例３参照）、ラットにおけるＥＡＭＧの発生率及び重度は、２つのペプチドの組合せ（連続的又は同時のいずれか）によって低下しなかった。
【００３９】
２つのペプチドを一緒に投与したとき、ラットにおいて、平均重度及び死亡率は、配列番号２の配列を少なくとも有するペプチドを用いて観察した値と同等であり、ラットにおいて２つのペプチドの相乗効果はないことが示唆された。
【００４０】
ＡＣｈＲは進化中に高度に保存されており、且つＴ細胞免疫はその代わりに非常に種依存性であるが、配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチド、及びアセチルコリン受容体のＴ細胞認識部位と相補的である配列番号２の配列を少なくとも有するペプチド、並びに少なくとも１つの担体を含む組成物は、イヌにおいてＭＧに対する改善された影響を与えることが、驚くべきことに分かった。
【００４１】
実際、Ｂ相補的ペプチドとＴ相補的ペプチドの相乗効果がイヌにおいて見られた。
【００４２】
この結果は、配列番号２の配列を少なくとも有するペプチドがラット中のＡＣｈＲのＴ細胞認識部位と相補的である事実を考慮すると、さらに一層驚くべきことである。ＡＣｈＲは進化中に高度に保存されているが、Ｔ細胞免疫はラット中とイヌ中で異なるはずである。
【００４３】
有利なことに、配列番号２の配列は、前記アセチルコリン受容体のＴ細胞認識部位のα鎖の残基１００〜１１６と相補的である。
【００４４】
病原性抗体の生成に、受容体ＡＣｈＲのα鎖の残基１００〜１１６に特異的なＴ細胞が寄与する。
【００４５】
有利なことに、ワクチン組成物は、７５０〜２５マイクログラム、好ましくは５００〜５０マイクログラム、有利には１００〜５０マイクログラムの、配列番号１及び／又は配列番号２の配列を少なくともそれぞれ有する各ペプチドを少なくとも１つのアジュバントを有する０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中に含む。
【００４６】
２つのペプチドは、同じであるか又は異なるペプチド担体と結合していることが好ましい。
【００４７】
本発明の変形実施形態によれば、２つのペプチドを含む組成物は第１の配合物及び第２の配合物を含む。
【００４８】
第１の配合物は、本発明による配列番号１の配列を少なくとも有するペプチドを含み、第２の配合物は、配列番号２の配列を少なくとも有するペプチドを含む。
【００４９】
有利なことに、第１の配合物と第２の配合物は各々、７５０〜２５マイクログラム、好ましくは５００〜５０マイクログラム、有利には１００〜５０マイクログラムの相補的ペプチドを少なくとも１つのアジュバントを有する０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中に別々に含む。
【００５０】
好ましくは、各配合物のペプチドは、適切なペプチド担体と結合すべきである。
【００５１】
哺乳動物におけるＭＧの治療的又は予防的処置用のワクチン組成物として使用する、第１の配合物及び第２の配合物を含む組成物が提供され、各配合物は同時又は連続的に投与されるものである。
【００５２】
それぞれの変形実施形態において、Ｂ及びＴリンパ球に応じた細胞性免疫の活性化を誘導するための組成物を提供する。
【００５３】
本発明は、重症筋無力症の主要免疫原性領域の抗イディオタイプ抗体を検出するために提供される、配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを含む検出キットも提供する。
【００５４】
配列番号１の配列を少なくとも有するペプチドは有利なことに、本発明による組成物で免疫処置したペット犬又はヒトの血清中での抗イディオタイプ抗体の結合に関するＥｌｉｓａ試験において、コーティング複合体として使用するためのペプチド複合体の状態である。アルカリホスファターゼで標識したヒト又はイヌ抗ＩｇＧを、Ｅｌｉｓａプレートのウェルに加えて結合が明らかになり、したがって抗体抗Ｉｄ及び発色基質を検出するはずである。
【００５５】
或いは、抗ＩｇＧはホースラディッシュペルオキシダーゼで標識することができる。
【００５６】
一変形形態では、ペプチドは直接、一方に配列番号１の配列を少なくとも有するペプチドと、他方に抗イディオタイプ抗体を検出するためのＥｌｉｓａ試験又はウエスタンブロットにおいて使用するためのアルカリホスファターゼ標識又はペルオキシダーゼ標識のような標識とを含むペプチド複合体の状態である。
【００５７】
本発明の目的はまた、配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを製造するための方法であって、
配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成するステップ、及び
前記配列番号１の配列中の８位に位置するトリプトファン残基を炭化水素化するステップを含む方法を提供することである。
【００５８】
本発明の他の目的は、重症筋無力症に施用される薬剤を製造するための方法であって、
配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成するステップ、及び
配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを少なくとも１つの担体と結合させるステップを含む方法を提供することである。
【００５９】
本発明のさらに他の目的は、重症筋無力症に施用される薬剤を製造するための方法であって、
配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成するステップ、
配列番号２の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成するステップ、及び
両方の相補的ペプチドを少なくとも１つの担体と結合させるステップを含む方法を提供することである。
【００６０】
一変形実施形態において本発明は、重症筋無力症に施用される薬剤を製造するための方法であって、
配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成し、相補的ペプチドを少なくとも１つの担体と結合させることによって第１の配合物を製造するステップ、及び
配列番号２の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成し、相補的ペプチドを少なくとも１つの担体と結合させることによって第２の配合物を製造するステップを含む方法を提供する。
【００６１】
有利なことに、本発明の目的はまた、重症筋無力症の治療的又は予防的用途を目的とする薬剤を製造するための方法であって、
配列番号１の相補的ペプチドを合成するステップ、
配列番号２の相補的ペプチドを合成するステップ、
相補的ペプチドと担体を結合させるステップ、
担体と結合した両方の相補的ペプチドを生理食塩水溶液及びアジュバントと混合するステップを含む方法に関する。
【００６２】
本発明による他の実施形態は、添付の特許請求の範囲にさらに記載する。
【００６３】
本発明はさらに、配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチド及び場合によっては配列番号２の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを含む治療用組成物を投与することを含む、哺乳動物における重症筋無力症の処置方法に関する。
【００６４】
前述のように、配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドは、重症筋無力症（ＭＧ）のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）のα鎖の残基６１〜７６の主要免疫原性領域（ＭＩＲ）と相補的である。
【００６５】
アセチルコリン受容体のα鎖の残基６１〜７６（ＡＣｈＲα６１〜７６）の配列は、以下の通りである。
ＮＨ２−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ
【００６６】
ＡＣｈＲα６１〜７６と相補的なペプチドは以下の配列を有し、ＲｈＣＡ６７〜１６と称した。
Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−ＮＨ２
【００６７】
したがって、配列番号１は以下の通りである。
ＮＨ２−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ
【００６８】
配列番号１の配列を少なくとも有するペプチドは、ｆ−ｍｏｃ化学物質を使用してＢｉｏｓｅａｒｃｈペプチド合成装置、モデル９５００で合成し、Ｄｙｎａｍａｘ  Ｃ１８  ３００オングストローム１５μカラム（１９×３００ｍｍ）、及び９０％Ｈ２Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸）／１０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）〜１０％Ｈ２Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸）／９０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）の勾配を使用して、６０分間、流速＝５ｍｌ／分、３９〜４２分である保持時間で逆相高性能液体クロマトグラフィーによって精製し、２，４，６−トリメトキシベンジルを有するペプチドの分子量は１９８８であった。
【００６９】
ＡＣｈＲα６１〜７６のＡＲＭペプチドであるＲｈＣＡ６７〜１６は、炭化水素化、好ましくはアルキル化又はアリール化されているトリプトファンを８位に含む。このような炭化水素化に適した炭化水素基は、置換されていてもよいアリール基及び置換されていてもよいアルキル基、特に置換されていてもよいベンジル基、好ましくは少なくとも１つのアルコキシ基で置換されたベンジル基、より好ましくは２，４，６−トリメトキシベンジル基からなる群において選択することができる。
【００７０】
好ましくは、炭化水素基は２，４，６−トリメトキシベンジル基であり、その化学配列は以下の通りである。
【化１】
2009530375.tif 000002
【００７１】
Ｂ細胞ペプチドを合成し、酸性条件下で（例えばトリフルオロ酢酸を用いた溶出中に）固相担体からペプチドが切り離されたときにＴｍｏｂを加えることによって、２，４，６−トリメトキシベンジル基を８位のトリプトファンに加えた。
【００７２】
ペプチドの炭化水素化、特にアリール化は、Ｔｍｏｂの存在下で酸性条件下において、固相担体からのペプチドの切断中に起こる。前に記載したように、ペプチドＲｈＣＡ６７〜１６は、担体タンパク質としてのキーホールリンペットヘマシアニン（ＫＬＨ）と結合した。ＫＬＨはグルタルアルデヒド結合体を使用してＢ細胞ペプチドと結合させて、ＫＬＨとペプチド両方の化学的、物理的及び生物学的特徴を保った。Ｂ細胞ペプチド及び担体タンパク質（ＫＬＨ）をグルタルアルデヒド溶液に加える。その反応はこの下に示す：
【化２】
2009530375.tif 000003
【００７３】
グルタルアルデヒドはその遊離形でタンパク質又はペプチドと反応しないが、不飽和ポリマーとして、結合によって安定化するイミノ結合を与える。
【００７４】
本発明によれば、担体タンパク質は前述のＫＬＨであってよいが、例えばペプチドが単独状態でなく且つ小さすぎないようにペプチドの支持体として作用する、ジフテリアトキソイド又は破傷風トキソイド又はタンパク質の性質の任意の大きな分子などの、他の担体タンパク質を使用することができることは理解されよう。それ故、担体タンパク質を有するペプチドが免疫系によってすぐに破壊されず、より免疫原性が高い。
【００７５】
当業者は、前述の事項を考慮して、２つのペプチド（Ｂ細胞ペプチド及びＴ細胞ペプチド）は、同じ又は異なる性質である同じ担体タンパク質又は異なる担体タンパク質と、結合させることが可能であることも理解するはずである。
【００７６】
本試験に関して、臨床試験はイヌで実施した。１回用量のワクチンは、０．５ｍｌの油中水型アジュバント、好ましくはＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）アジュバント（ＴｉｔｅｒＭａｘ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）中に乳化した、ペプチドＲｈＣＡ６７〜１６−ＫＬＨ結合体の０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中に５００マイクログラムを含んでいた。
【００７７】
配列番号２の配列を有するペプチドは、ＡＣｈＲのα鎖のＴ細胞エピトープ（残基１００〜１１６）と相補的である。このペプチドは、ｆ−ｍｏｃ化学物質を使用してＢｉｏｓｅａｒｃｈペプチド合成装置、モデル９５００で合成し、Ｄｙｎａｍａｘ  Ｃ１８  ３００オングストローム１５μカラム（１９×３００ｍｍ）、及び９０％Ｈ２Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸）／１０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）〜１０％Ｈ２Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸）／９０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）の勾配を使用して、６０分間、流速＝５ｍｌ／分、１８〜２０分である保持時間で逆相高性能液体クロマトグラフィーによって精製し、その分子量は２０３６である。
【００７８】
配列番号２を有する相補的ペプチドは、以下の配列を有する：
ＮＨ２−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
【００７９】
前に記載したように、本明細書でＢペプチドとも呼ぶペプチドＲｈＣＡ６７〜１６、及び本明細書でＴペプチドとも呼ぶペプチドＲｈＣＡ６１１〜００１は、ラットにおいて単独で試験した。これらの結果は、Ｂペプチド単独又はＴペプチド単独はいずれも、病原性抗体レベルの有意な低下をもたらすことを示した。ラットに関する未公開実験において試験したとき、ＢペプチドとＴペプチドを一緒にすると、Ｔペプチドのみを投与したときより、病原性抗体レベルにおいて良好な結果をもたらさなかった。これらの結果は、２つのペプチドを使用したとき、ラットにおいて相乗効果はなかったことを示した。
【００８０】
本発明は、２つのペプチドを同時投与又は連続投与のいずれかでイヌにおいて使用すると予期せぬ相乗効果があることを示す、イヌにおける結果を提供する。
【００８１】
本発明を、以下の非限定的な実施例でさらに詳述する。
【実施例】
【００８２】
（実施例１）
材料及び方法。確立された臨床的ラジオイムノアッセイによって陽性ＡＣｈＲ抗体力価（＞０．６ｎＭ）を有する自己免疫ＭＧと診断した２９匹のイヌを、試験に最初に登録した。５匹の動物（１７％）が吸引性肺炎で死に、１匹は胸腺腫の手術後、完全なワクチン接種前に急死した。本試験における死亡率は、歴史的対照群において以前に報告された６／３５（１７％）及び２／１２（１７％）に匹敵する。３匹のイヌはフォローアップを止め、４匹はノンコンプライアンスのため試験から除外し、１匹は免疫処置部位における皮膚反応のため、完全なワクチン接種前にオーナーによって試験から外された。５匹の動物は診断後、但しワクチン接種の開始前に自然に寛解した。したがって、１０匹のイヌ（５匹の雄及び５匹の雌、１〜１０才齢）が試験を終了し、これらの動物はいずれも胸腺腫を有しておらず、コルチコステロイド又は他の免疫抑制剤を服用状態であった。これらの動物に関する臨床症状の発症からＡＣｈＲ抗体アッセイを用いた確定診断までの時間は、２〜４週間であった。アセチルコリンエステラーゼ阻害剤の不在下での臨床上正常な正常範囲（＜０．６ｎＭ）への、ＡＣｈＲ抗体力価の長期の回復として寛解を定義する。一時的寛解は、ＭＧの完全な解決前の０．６ｎＭ未満であるＡＣｈＲ抗体力価の１回又は複数回の測定、及び正常値へのＡＣｈＲ抗体の長期の回復を指す。ペットのオーナーはインフォームドコンセントを与え、この試験はＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｌｏｒｉｄａによって承認された。
【００８３】
表１中に列挙した様々なワクチン組成物を、試験において使用した。
【００８４】
表１：イヌに関する試験の組成物
【表１】
2009530375.tif 000004
【００８５】
イヌに関する臨床試験では、組成物を４つの部位に最小限で皮下投与した。ワクチン接種は確定診断時に開始し、数匹の動物の診断後４カ月まで続けた。動物は免疫処置し、２週間間隔で追加刺激した。
【００８６】
本発明の目的は、ペット犬における自然発生的に得られた自己免疫ＭＧの臨床試験中の歴史的対照群（Ｓｈｅｌｔｏｎ  ＧＤら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２００１；（５７）：２１３９〜２１４１）と比較してＡＣｈＲ抗体レベルを低下させる能力に関して、前述のＴ及びＢ細胞ワクチンを評価することであった。担体タンパク質（ＡＲＭペプチド含まず）、アジュバント中で免疫処置した筋無力症のペット犬の対照群は、結合した相補的ペプチドを含まない、アジュバントを有する０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中の担体タンパク質のラットＥＡＭＧの試験（Ａｒａｇａ  Ｓら）に基づく利点がおそらくないため今回は含めなかった。
【００８７】
すべての統計分析は、Ｉｎｓｔａｔ生物統計学用ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して実施した。群間の血清抗体値及び寛解までの時間を比較するために、データセットの制約が両側不対ｔ検定及びウェルチ補正又はマンホイットニー検定の使用を示したとき以外は、両側不対ｔ検定を使用した。帰無仮説は、ワクチン接種はＡＣｈＲ抗体力価又は寛解までの時間を低下させなかったということであった。ワクチン接種前後の血清抗体力価を分析するために、両側対応ｔ検定を使用した。寛解の統計値などの終点評価のために、分割表解析をフィッシャーの直接確率検定によって実施した。
【００８８】
結果。
予想結果。
予め試験した歴史的対照群は、両性の４０匹の筋無力症のイヌからなっており、その３５匹は長期追跡し結果は周知であった。これらの動物は、突発性巨大食道症を有する１５２匹のイヌのコホートにおいてＡＣｈＲ抗体陽性として同定した。これらの動物を、その結果が周知であった我々の試験からの２０匹のイヌ（胸腺腫の手術後に死んだ動物は除く）と比較した。ＡＣｈＲ抗体アッセイは、すべてのイヌ（歴史的対照群及び本試験）に関して同じ獣医施設（ＵＣ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって実施された。
【００８９】
表２．ワクチン接種した筋無力症のイヌ及び歴史的対照群に関する予想結果
【表２】
2009530375.tif 000005
Ａ：ｐ＜０．０００１、Ｂ：ｐ＝０．００４４、Ｃ：ｐ＝０．００２２、及びＤ：ｐ＝０．５０４、いずれもフィッシャーの直接確率検定による。それぞれの比較によって、群中のすべての他のイヌに対して示した結果を有するイヌについて考える。
【００９０】
表２は、歴史的対照群と比較して、我々の集団中の吸引性肺炎又は窒息で死んだ動物の数の間には有意な差はなかったことを示す（それぞれ２５％対１７％）。我々の試験において２０匹のイヌのうち５匹が、診断後但しワクチン接種前に、正常範囲内（＜０．６ｎＭ）の長期ＡＣｈＲ抗体レベルまで自然に寛解した。したがって、２群の間の自然寛解率にも差はなかった（２５％対１７％）。これらの結果は、２つのコホートが十分合致していることを示唆する。有意な差は、安楽死させた動物の数であった。歴史的対照群中の１２匹のイヌ（３４％）は、もたらされた予後不良のために安楽死させた。本発明による臨床試験中の動物は安楽死させなかった。２群の間の全体的な長期の寛解率には、非常に有意な差があった。歴史的対照群は３５匹のイヌのうちの６匹のみ（１７％）が寛解し、ＡＣｈＲ抗体レベルが正常範囲に戻った一方で、２０匹のワクチン接種群の７５％が寛解した。吸引性肺炎又は安楽死を生き延びた動物のみを考えると、歴史的対照群は３５％（６／１７）の寛解率を有しており、且つ本試験では１００％（１５／１５）の寛解率（ｐ＜０．０００１）であった。この増大した寛解率は、ワクチン接種に際して寛解した１０匹のイヌ中１０匹にすべて相当した。我々が歴史的対照群に関する最良の可能なシナリオ及びワクチン接種動物に関する最悪の可能なシナリオを考える場合、さらに有意に増大する寛解がある。具体的には、対照群中のフォローアップを止めた５匹のイヌが寛解したと仮定し（４０匹の１１匹が寛解、２７．５％）、一方フォローアップを止めたか又は試験から除外した、我々の群中の９匹のイヌが寛解していない（２９匹の１５匹が寛解、５１．７％）と仮定した場合、ワクチン接種は寛解率の統計上有意な増大をさらに引き起こした（ｐ＝０．０４８２、フィッシャーの直接確率検定）。
【００９１】
イヌＭＧからの自然治癒と比較したとき、ワクチン接種は加速的な寛解までの時間をもたらす。
【００９２】
自然に寛解した４７匹の筋無力症のイヌからなっていた歴史的対照群はレトロスペクティブに分析し、いくつかの重要な点で１０匹のワクチン接種動物に匹敵した。２群中のイヌはコルチコステロイド又は他の免疫抑制剤で処置せず、ＡＣｈＲ抗体アッセイは同じ獣医施設によって実施され、ワクチン接種群のイヌに関する臨床的兆候から確定診断までの経過時間（２〜４週間）は、歴史的対照群に関する期間（１週間〜５カ月）の範囲にあり、且つ２群は類似した年齢範囲であるほぼ同程度の割合の雄と雌からなっており、重複する期間（歴史的対照群、１９９０〜２０００及びワクチン接種動物、１９９７〜２００３）中に試験した。
【００９３】
興味深いことに、歴史的対照群に関するデータセットを評価する際に、ＡＣｈＲ抗体レベルを観察して２つの過程の１つを追跡した。いくつかの症例では寛解をもたらしたＡＣｈＲ抗体レベルの一相性の低下があり、一方他の症例は、長期の寛解前に増大及び低下するＡＣｈＲ抗体レベルの変動パターンを示した。ワクチン接種群のイヌにおける経時的なＡＣｈＲ抗体レベルも、この同じ２群の一方又は他方に分かれた（以下参照）。したがって適切な分析によって、比較は群内で行うべきであると決定した。
【００９４】
図１（上図）は、一相性の減退を示すイヌの確定診断時に、ワクチン接種群（ｎ＝５）と歴史的対照群（ｎ＝４０）の間のＡＣｈＲ抗体レベルに統計的差異はなかったことを示す。しかしワクチン接種群は、ＡＣｈＲ抗体力価の加速的な低下率を示した。これはワクチン接種群における早い寛解率によって反映された（図１、中央図）。これは寛解を加速化させ、ワクチン接種群のイヌの中では、フィッシャーの直接確率検定（ｐ＝０．０１９）によるワクチン接種群のイヌ対対照に関する寛解の相対的確率が３．５６であった、３カ月の時間地点で最も明らかである。
【００９５】
図２は、自己抗体濃度の変動パターンを示す、歴史的対照群（２ａ）とワクチン接種動物（２ｂ）に関する確定診断後の経時的なＡＣｈＲ抗体レベルを示す。初期のＡＣｈＲ抗体力価（ｎＭ±ＳＥＭ）がワクチン接種群のイヌ（５．９８±２．３３）と歴史的対照群（４．５４±１．４）の間で有意に異なることはなかったが、診断後の期間にワクチン接種群のイヌに関して全体的な変動幅の著しい減少があったようである。対照的に、長期の寛解までの平均時間は２群に関して同じであった。したがって、疾患の期間は２群において同じであるようであるが、ワクチン接種群のイヌは疾患の過程中の寛解においてより多くの時間を費やす可能性がある。これは、２９％（２／７）の歴史的対照群と比較して１００％（５／５）のワクチン接種群のイヌが、疾患の完全な消散前に少なくとも１つの寛解期を有していたという観察によって証明された。正常なＡＣｈＲ抗体レベルへの一時的復帰を示す動物の増加は、歴史的対照群と比較したワクチン接種群のより頻繁なサンプリング（３カ月間隔でサンプリング）が原因ではなかったことを確実にするために、ＡＣｈＲ抗体レベルは診断後３カ月間隔のみで考えた。結果は、５／５のワクチン接種群のイヌ対２／７の歴史的対照群は、ワクチン接種後及び疾患の完全な消散前にＡＣｈＲ抗体に関する正常範囲（＜０．６ｎＭ）内に少なくとも１つの血液サンプルを有していたことを示した。全体として、７匹の歴史的対照群における３回の挿間期［１匹のイヌで２回、１匹のイヌで１回及び５匹のイヌで０回の挿間期］と比較して、５匹のワクチン接種動物において正常なＡＣｈＲ抗体力価の８回の挿間期が存在した［１匹のイヌで３回、１匹のイヌで２回及び３匹のイヌで１回の挿間期］。したがって、３カ月間隔毎のイヌ１匹当たりの一時的寛解の挿間期の平均数は、歴史的対照群よりワクチン接種動物において有意に多かった（ｐ＜０．０２５１、マンホイットニー検定）（図２ｄ）。
【００９６】
ＭＧの長期の消散前に、すべての入手可能な血液サンプル（単に３カ月間隔ではなく）を考慮すると、変動するレベルのＡＣｈＲ抗体を有する５匹のワクチン接種群のイヌの４匹が、２回以上の一時的寛解の挿間期（２匹の動物で３回の挿間期及び２匹の動物で２回の挿間期、合計１０回）を示し、これらはワクチン接種の過程の初期に相当した。
【００９７】
図３（上図）は、ワクチン接種過程の開始と後の寛解期の開始時期の間の非常に有意な相関関係（ｒ＝０．９５５、ｐ＜０．０００１）を示す図である。したがって時間的に、ワクチン接種は一時的寛解と非常に強く関連しており、診断に対してワクチン接種をいつ開始するかとは無関係である。重要なことに、この関係のＹ切片は２．４カ月であり、これはＡＣｈＲ抗体力価の一相性の低下を示すワクチン接種群のイヌ（図１、下図）の寛解までの平均時間（２．３５±０．９６カ月）に非常に厳密に相当する。このデータをワクチン接種と寛解の間の経過時間として分析すると、寛解までの平均時間は１．７７５±０．４３カ月（それぞれ下位及び上位９５％Ｃｌ’ｓ＝０．８０５及び２．７４５）であった。これはワクチン接種し一相性の低下を示した（図１、下図）イヌに関する寛解までの平均時間と統計上異なっていない。したがって、ＡＣｈＲ抗体レベルのパターンとは無関係に、ワクチン接種は非常に類似した寛解までの時間をもたらし、類似したメカニズムが両方の過程と関係し得ることを示唆する。
【００９８】
次のサンプリング時（第２〜４週）には１回のワクチン接種事象とＡＣｈＲ抗体レベルの低下の間には定量的相関関係も存在し、これは変動するＡＣｈＲ抗体力価を有する全５匹のイヌにおいて観察された。３５回のワクチン接種事象のうち、２８回（８０％）がＡＣｈＲ抗体力価の減少をもたらした（図３、下図）。ＡＣｈＲ抗体レベルを低下させなかった７回のワクチン接種事象は５匹の動物に分配し、３匹のイヌそれぞれに関して１回、及び２匹のイヌそれぞれを２回観察した。全体として、平均ＡＣｈＲ抗体レベルはワクチン接種前１．６３±０．２１ｎＭからワクチン接種後１．１４±０．１７ｎＭに低下した（Ｐ＝０．００１５、両側対応ｔ検定）。
【００９９】
Ｔ細胞ワクチンとＢ細胞ワクチンの併用投与は、それらの連続投与より優れている。
【０１００】
ワクチン接種プロトコルは、２つの方法のうちの１つで実施した。Ｔ細胞ワクチンとＢ細胞ワクチンは同時に与えた、或いは２週間間隔で３回のＴ細胞ワクチン投与の過程、次に２週間間隔で３回のＢ細胞ワクチン投与を続けた。一相性の低下を示した（２．３５カ月、図１）イヌに関するワクチン接種と長期の寛解の間の平均時間は、変動するＡＣｈＲ抗体レベルを有する（２．４カ月、図３）イヌに関するワクチン接種過程の開始と後の一時的寛解の間の平均時間と異なっておらず、且つこの後者の群では、診断後のワクチン接種の時間は無関係だったので、ＡＣｈＲ抗体レベルのパターンとは無関係に２つのワクチン接種プロトコルの有効性に関する比較が可能であった。図４の上図は、ワクチン接種の開始後の第１次寛解までの平均時間（長期又は一時的のいずれか）は有意な状態に近づき（ｐ＝０．０６３９、両側不対ｔ検定及びウェルチ補正）、Ｔ細胞ワクチンとＢ細胞ワクチンを連続的ではなく同時に投与したとき２．７倍速かったことを示す図である。さらに、ワクチンを７匹の動物の４匹のみに連続的に投与したとき、Ｔ細胞ワクチン単独ワクチン接種後に寛解を示した。さらに平均して、寛解を得るために、Ｔ細胞ワクチンとＢ細胞ワクチンを連続的に与えたとき（３．８６±１．０６）、同時に与えたときとは対照的に（２．６７±０．３３３）、動物１匹当たりでより多くのワクチン接種が必要とされた。我々が寛解を得るためのＴ及び／又はＢ  ＡＲＭワクチン投与の数、及び寛解までの時間を考慮するとき、ワクチンを連続的ではなく同時に投与すると、投与当たりの寛解までの時間の有意な減少がある（ｐ＝０．０１６７、両側対応マンホイットニー検定）（図４、下図）。したがって最適有効性は、両方のワクチンを一緒に投与することを必要とするようである。同じアジュバント（ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標））及び担体タンパク質（ＫＬＨ）を両方のワクチン接種プロトコルにおいて使用したので、それらがその影響を担っていたとは考えられない。そうである場合でも、２つのプロトコルの同量のワクチン後に第１次寛解までの類似した平均時間を観察すると予想したはずである。したがって、ワクチン効果はＴ及びＢ  ＡＲＭペプチドに依存しアジュバント及び担体とは無関係であり、イヌにおける自然発生ＭＧでは、Ｂ細胞ワクチンとＴ細胞ワクチンの組合せを有効に用いて、我々が観察する素早い寛解をもたらす。
【０１０１】
５０％の動物が寛解した平均時間は２カ月であった。この平均寛解時間は歴史的対照群（６．４カ月）より３．２倍速い。
【０１０２】
（実施例２）
ルイスラットにおける比較例
ルイスラットを精製ＡＣｈＲで免疫処置して、実験的自己免疫性Ｍ．Ｇ．を発症させた。次いでルイスラットを、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合したＢ及びＴペプチドで処置した。相補的ペプチドをワクチン接種した動物由来の血清と調製物の両方が、病原性抗体と結合したことを示した。Ｂペプチド組成物を用いると、疾患の発生率は、ＫＬＨ免疫処置及び未処置対照群（９０％）と比較してワクチン接種動物において大幅に低下し（２５％）、一方で疾患を有する動物における臨床重度値は、陽性対照における１．３と比較してワクチン接種動物において平均して０．２５になった。Ｔペプチド組成物を用いると、疾患の発生率は、ＫＬＨ免疫処置及び未処置対照群（８９％）と比較してワクチン接種動物においてさらに低下し（５５％）、一方で疾患を有する動物における臨床重度値は、陽性対照における２．５と比較してワクチン接種動物において平均して１．２になった。
【０１０３】
さらに、疾患誘導の過程中のラットに対するモノクローナル抗Ｉｄ抗体の受動投与は、ＥＡＭＧの発生率及び重度を同様に低下させた（Ａｒａｇａら、１９９６）。結果は表３中に示す。
【０１０４】
表３．ＥＡＭＧ用のＡＲＭワクチンに関する動物モデル試験から回収した結果
【表３】
2009530375.tif 000006
【０１０５】
（実施例３）
ルイスラットにおける比較例
Ｔペプチドを炭化水素基を有するＢペプチドと共に用いたワクチン接種が、実験的自己免疫性重症筋無力症（ＥＡＭＧ）に対して、炭化水素基を有するＢペプチド及びＴペプチドのいずれか単独又は別々の場合と異なる影響を引き起こすかどうかを評価するために、単独又は組合せのいずれかでキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）或いはＫＬＨと結合したＴペプチド又は炭化水素基を有するＢペプチドを用いて、２回ルイスラットを免疫処置した。次いで精製Ｔｏｒｐｅｄｏ  ＡＣｈＲを用いてＥＡＭＧを誘導し、疾患をモニタリングした。
【０１０６】
結果は表４中に表し、その中では、Ｔペプチド又はＢペプチドいずれか単独は、ＫＬＨで免疫処置した対照ラットと比較して、ＥＡＭＧの発生率、重度及び死亡率を低下させたことを見ることができる。ＴペプチドとＢペプチドの同時ワクチン接種は、いずれかのペプチドワクチン単独と比較してわずかで統計上有意でない利点を引き起こした。したがって、ルイスラットでは、ＴペプチドとＢペプチド両方の同時ワクチン接種は、いずれかのペプチドワクチン単独の有効性を増大も低下もさせず、これら２つのペプチドの相乗効果はラットにおいて存在しないことが示唆された。
【０１０７】
表４
【表４】
2009530375.tif 000007
【０１０８】
したがって、イヌ及びヒトのＭＧ、及びラットにおけるＥＡＭＧは、主に（６８％）ＭＩＲに対するＡＣｈＲ抗体応答性を有するとして特徴付けられる。さらに、ＭＩＲ特異的抗体は、筋無力症の表現型を受動的に伝えることができる。このこと、及びラットのＥＡＭＧにおいてＭＩＲ特異的抗体及びＢ細胞に対する抗イディオタイプ抗体応答性を誘導し、ＡＣｈＲ抗体レベルを低下させ疾患を改善するＢ細胞ワクチンの能力を考慮すると、このワクチンがイヌにおいてＡＣｈＲ抗体レベルを低下させたことは、特に驚くべきことであるとは思われない。ラットのＥＡＭＧにおけるこのような有効性、及び自然発生的に得られたイヌのＭＧは、ヒトのＭＧにおける優勢な抗ＭＩＲ抗体応答性と組み合わせて、ヒト疾患におけるＢペプチドワクチンの潜在的有用性を示唆する。実際、ＡＣｈＲ抗体に対する天然に存在する抗イディオタイプ抗体が４０％のヒトＭＧ患者において報告されてきており、且つその存在は低い抗ＡＣｈＲ抗体力価及び臨床的改善に関与する。
【０１０９】
さらに、ルイスラットに関するＡＣｈＲの優性Ｔ細胞エピトープに対して設計したワクチンは、イヌにおいて明らかに有効である。１つの考えられるシナリオは、Ｔ細胞ワクチンに対する抗クローンタイプ抗体は、それらのＴ細胞受容体との相互作用によって、新たに記載し且つ天然に存在するＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御Ｔ細胞を誘導する或いは増殖させる可能性があることである。この上記の場合、これらの細胞はＡＣｈＲα１００〜１１６と特異的に反応すると思われるが、神経筋接合部でＡＣｈＲのさらに優性エピトープに関して他の自己反応性Ｔ細胞を非特異的に抑制するはずである。このようなメカニズムから、作動する場合、ヒト及びイヌＭＧに対してワクチンが有効である可能性があることが示唆されよう。
【０１１０】
第２種におけるこれらの肯定的結果は、特別な担体／アジュバントとのヒトにおけるこれらのワクチンの最終用途に関する期待を抱かせる。これらが本試験と同じ結果を生む場合、ＡＲＭワクチンは、自己免疫疾患を長期の寛解に導くことができる新たなクラスの標的療法となる可能性がある。
【０１１１】
ヒトにおける予防的又は治療的処置用に、ヒトにおける使用に適した最良の担体及びアジュバントを決定した。
【０１１２】
すべての動物実験は、ヒトにおいて使用され、本出願の主題である同じペプチドを用いて実施した。
【０１１３】
実験中、ペプチドは異なる担体と結合させ、異なるアジュバントと組み合わせた。担体及びアジュバントは必要であるが、それらの本質は最重要ではないことが証明される。実験を実施して、ヒトにおける使用に適した担体とアジュバントの組合せは、研究室における動物実験で管理及び使用しやすい担体及びアジュバントと同等に、又はそれらよりも一層働くことを証明した（ＭｃＡｎａｌｌｙ  Ｊ．Ｌ．ら、２０００）。表５：Ｂ細胞Ａｒｍワクチン及び担体タンパク質とアジュバントの異なる組合せを用いたＥＡＭＧの予防
【０１１４】
【表５】
2009530375.tif 000008
【０１１５】
組合せＤＴ／ミョウバンはＫＬＨ／ミョウバンより素早いピーク応答性を与え、さらにそれはＥＡＭＧに対してわずかに有効であった（ＭｃＡｎａｌｌｙら、２０００）。
【０１１６】
本発明の好ましい実施形態を例示的な目的で開示してきたが、当業者は、添付の特許請求の範囲に開示した本発明の範囲及び精神から逸脱せずに、様々な変更形態、追加又は置換が可能であることを理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１Ａ】
2009530375.tif 000009
【図１Ｂ】
2009530375.tif 000010
【図１Ｃ】
2009530375.tif 000011
【図２Ａ】
2009530375.tif 000012
【図２Ｂ】
2009530375.tif 000013
【図２Ｃ】
2009530375.tif 000014
【図２Ｄ】
2009530375.tif 000015
【図３Ａ】
2009530375.tif 000016
【図３Ｂ】
2009530375.tif 000017
【図４Ａ】
2009530375.tif 000018
【図４Ｂ】
2009530375.tif 000019
【配列表】
2009530375000001.xml
【誤訳訂正書】
【提出日】平成21年3月5日(2009.3.5)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重症筋無力症に関与するアセチルコリン受容体の主要免疫原性領域と相補的な配列を少なくとも有する相補的ペプチドであって、８位にトリプトファンを有する配列番号１の配列を少なくとも有し、少なくとも１つの置換されていてもよい炭化水素基を保持することを特徴とする、上記相補的ペプチド。
【請求項２】
前記少なくとも１つの置換されていてもよい炭化水素基が、好ましくは置換されていてもよいアリール基、又は置換されていてもよいアルキル基、特に置換されていてもよいベンジル基、より好ましくは少なくとも１つのアルコキシ基で置換されたベンジル基、最も好ましくは２，４，６−トリメトキシベンジル基である、請求項１に記載の相補的ペプチド。
【請求項３】
配列番号１の配列が前記アセチルコリン受容体の主要免疫原性領域のα鎖の残基６１〜７６と相補的である、請求項１に記載の相補的ペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載の相補的ペプチド及び少なくとも１つの担体を含む治療用組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の相補的ペプチド、及びアセチルコリン受容体のＴ細胞認識部位と相補的である配列番号２の配列を少なくとも有する相補的ペプチド、並びに少なくとも１つの担体を含む治療用組成物。
【請求項６】
配列番号２の配列が前記アセチルコリン受容体のＴ細胞認識部位のα鎖の残基１００〜１１６と相補的である、請求項５に記載の治療用組成物。
【請求項７】
第１の配合物及び第２の配合物を含み、第１の配合物が配列番号１の配列を少なくとも有する前記相補的ペプチド及び少なくとも１つの担体を含み、第２の配合物が配列番号２の配列を少なくとも有する前記相補的ペプチド及び少なくとも１つの担体を含む、請求項５に記載の治療用組成物。
【請求項８】
７５０〜２５マイクログラム、好ましくは５００〜５０マイクログラム、有利には１００〜５０マイクログラムの前記配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを、少なくとも１つのアジュバントを有する０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中に含む、請求項４に記載の治療用組成物。
【請求項９】
７５０〜２５マイクログラム、好ましくは５００〜５０マイクログラム、有利には１００〜５０マイクログラムの各相補的ペプチドを、少なくとも１つのアジュバントを有する０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中に含む、請求項５に記載の治療用組成物。
【請求項１０】
第１の配合物が７５０〜２５マイクログラム、好ましくは５００〜５０マイクログラム、有利には１００〜５０マイクログラムの配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを、少なくとも１つのアジュバントを有する０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中に含み、第２の配合物が７５０〜２５マイクログラム、好ましくは５００〜５０マイクログラム、有利には１００〜５０マイクログラムの配列番号２の配列を有する相補的ペプチドを、少なくとも１つのアジュバントを有する０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中に含む、請求項７に記載の治療用組成物。
【請求項１１】
哺乳動物における重症筋無力症の治療的又は予防的処置において使用されるワクチンを製造するための、請求項４に記載の組成物の使用。
【請求項１２】
重症筋無力症の主要免疫原性領域の抗イディオタイプ抗体を検出するための、請求項１に記載の相補的ペプチドを含む検出キット。
【請求項１３】
請求項１に記載の配列番号１の配列を少なくとも有する前記相補的ペプチドを製造するための方法であって、
配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成するステップ、及び
前記配列番号１の配列中の８位に位置するトリプトファン残基を炭化水素化するステップを含む、上記方法。
【請求項１４】
重症筋無力症に施用される薬剤を製造するための方法であって、
配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成するステップ、及び
配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを少なくとも１つの担体と結合させるステップを含む、上記方法。
【請求項１５】
重症筋無力症に施用される薬剤を製造するための方法であって、
請求項１に記載の配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成するステップ、
配列番号２の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成するステップ、及び
両方の相補的ペプチドを少なくとも１つの担体と混合するステップを含む、上記方法。
【請求項１６】
重症筋無力症に施用される薬剤を製造するための方法であって、
請求項１に記載の配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成し、相補的ペプチドを少なくとも１つの担体と結合させることによって第１の配合物を製造するステップ、及び
配列番号２の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成し、相補的ペプチドを少なくとも１つの担体と結合させることによって第２の配合物を製造するステップを含む、上記方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】重症筋無力症の治療的又は予防的処置用のワクチン
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重症筋無力症のアセチルコリン受容体の主要免疫原性領域と相補的な配列を少なくとも有する相補的ペプチド、より詳細には、特にペット又はヒトにおける、重症筋無力症の治療的又は予防的処置用のそのワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
重症筋無力症（ＭＧ）は、骨格筋の衰弱及び疲労によって特徴付けられる神経筋障害である。根底にある欠陥は、抗体介在の自己免疫発作による、神経筋接合部で利用可能なアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）の数の減少である。
【０００３】
神経筋接合部では、アセチルコリン（ＡＣｈ）は運動神経末端で合成され、小胞（量子）に保存される。活動電位が運動神経に伝わり神経末端に達すると、１５０〜２００小胞からＡＣｈが放出され、シナプス後フォールディングのピークで密集しているＡＣｈＲと結合する。
【０００４】
ＡＣｈがＡＣｈＲ上の結合部位と結合すると、ＡＣｈＲ中のチャンネルが開き、カチオン、主にナトリウムの迅速な進入が可能となり、これによって筋繊維の終板領域で脱分極が生じる。脱分極が十分大きい場合、それは筋繊維に沿って伝わる活動電位を引き起こし、筋収縮を誘発する。このプロセスは、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）によるＡＣｈの加水分解及び受容体からのＡＣｈの拡散によってすぐに終了する。
【０００５】
ＭＧにおいて、根本的な欠陥は、シナプス後筋肉膜で利用可能なＡＣｈＲの数の減少である。さらに、シナプス後フォールディングは扁平状、即ち「簡素化」されている。これらの変化は、神経筋伝達の低下した有効性をもたらす。したがって、ＡＣｈは正常に放出されるが、それは筋肉の活動電位を誘発できない可能性があるわずかな終板電位を生成する。多くの神経筋接合部における伝達の失敗は、筋収縮の衰弱をもたらす。
【０００６】
ＭＧにおける神経筋の異常は、特異的抗ＡＣｈＲ抗体によって介在される自己免疫応答によってもたらされる。抗ＡＣｈＲ抗体は病原性抗体と呼ばれ、３つの異なるメカニズム：（１）受容体の架橋及び迅速なエンドサイトーシスに関与するメカニズムによるＡＣｈＲの加速的代謝回転、（２）ＡＣｈＲの活性部位、即ちＡＣｈと通常結合する部位の遮断、及び（３）補体と共同した抗体によるシナプス後筋肉膜に対する損傷によって、神経筋接合部で利用可能なＡＣｈＲの数を減少させる。病原性抗体はＩｇＧであり、Ｔ細胞依存性である。
【０００７】
自己免疫疾患であるＭＧの臨床症状は、神経筋接合部に位置するこれらの病原性抗体の存在と相関関係がある。
【０００８】
今日まで、対症療法又は免疫療法のいずれかである数個の療法のみが存在する。
【０００９】
これらの療法は長期間続き得る臨床的有益性を患者にもたらすが、相当複雑な臨床手順を必要とする。さらに、これらの現在の治療レジメンは多くの罹患患者においてごく部分的に有効な状態であり、ライフスタイルを変えることが、これらの疾患を有する多くの割合の患者にとって必要不可欠である。
【００１０】
自己免疫疾患の理想的な処置は、直接的アネルギー又は自己反応性細胞クローンの除去による免疫応答の病原性要素（即ち、病原性抗体）の選択的抑制であり得る。
【００１１】
自己免疫の主要抗原用の抗原受容体模倣体（ＡＲＭ）として設計したペプチドを用いたワクチン接種は、動物自己免疫疾患モデルに対して顕著な臨床有効性を示している（米国特許第５，２１２，０７２号参照）。
【００１２】
このような処置は、それらの異質起源、及び他の近辺の抗原に対する応答の鈍化にもかかわらず、これらの免疫優勢タンパク質に特異的な自己反応性クローンのアネルギーを誘導する。その概略が自己免疫における主要抗原の概略と非常に相補的であるペプチドワクチンの使用は、抗原特異的な、抗原受容体のクラスに無関係な抗イディオタイプ（Ｉｄ）応答をもたらす可能性があるようである。
【００１３】
相補的ペプチドと呼ばれるこれらのペプチドは、標的抗原決定基と結合することができ、ある意味で抗原（Ａｇ）受容体模倣体（ＡＲＭ）として作用することができる。したがって、ワクチンとして使用するとき、それらはいくつかの自己反応性リンパ球上の抗原の結合部位に対する、抗イディオタイプ（Ｉｄ）及び抗クローンタイプ抗体（抗体）応答を誘導する。
【００１４】
したがって、ラットにおいて重症筋無力症を試験し、その中では人為的に重症筋無力症を誘導することができる。それは実験的自己免疫性重症筋無力症（ＥＡＭＧ）である。
【００１５】
ＥＡＭＧでは、精製ＡＣｈＲで免疫処置したラットは類似の疾患を発症する。抗原と抗体は水治療法において相補性によって相互作用するという概念に基づいて、ＡＣｈＲの主要免疫原性領域（ＭＩＲ）と相補的なペプチドでワクチン接種することによって、病原性抗体に対する抗Ｉｄ免疫を誘導することが求められている。受容体ＡＣｈＲの主要免疫原性領域は、受容体ＡＣｈＲのα鎖の残基６１〜７６であることが分かってきている。相補的ペプチドはＲｈＣＡ６７〜１６と呼ばれた。キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合した相補的ペプチドＲｈＣＡ６７〜１６で、ラットをワクチン接種した。この相補的ペプチドでワクチン接種した動物由来の血清とモノクローナル抗体の調製物の両方が、病原性抗体と結合することが示され、これらのラットにおける疾患の発生率は、ＫＬＨで免疫処置した動物及び未処置対照（９０％）と比較してワクチン接種した動物では大幅に低下したが（２５％）、一方で疾患を有する動物における臨床重度値は、陽性対照における３．５と比較してワクチン接種した動物では平均で１．０であった。さらに、疾患誘導の過程でのラットへのモノクローナル抗Ｉｄ抗体の受動的投与は、ＥＡＭＧの発生率及び重度を同様に低下させた［Ａｒａｇａ  Ａら、「アセチルコリン受容体の主要免疫原性領域に関する相補的ペプチドに対するモノクローナル抗体による、実験的自己免疫性重症筋無力症の予防（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ  Ｇｒａｖｉｓ  ｂｙ  ａ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ａ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍａｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７、３８６〜３９２（１９９６）］。
【００１６】
相補的ペプチドＲｈＣＡ６７〜１６を用いたワクチン接種の前述の結果を考慮して、この免疫原は病原性抗体のパラトープと構造上類似しており、及びしたがって、このワクチンはＢ細胞Ａｇ受容体模倣体（ＡＲＭ）と考えることができると結論付けられている。
【００１７】
相補的ペプチドＲｈＣＡ６７〜１６を用いて得た結果を確認するために、第２群のＲｈＣＡ６７〜１６ペプチドが生成された。第２群のペプチドは、予想された理論上の分子量を示した。
【００１８】
第２群のＲｈＣＡ６７〜１６ペプチドがラットにおいて再度試験されたが、残念ながら、疾患の発生率に関して以前に得られた良い結果は観察されなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、哺乳動物、特にペット犬及びヒトにおける重症筋無力症の処置において有用であり得る（ＭＧはネコにおいては不確かである）、抗原作用を有するペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
この目的のために、本発明は、８位にトリプトファンを有する配列番号１の配列を少なくとも有し、少なくとも１つの置換されていてもよい炭化水素基を保持することを特徴とする相補的ペプチドを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
有利なことに、このペプチドの配列はＡＣｈＲのα鎖の残基６１〜７６と相補的である。受容体ＡＣｈＲの主要免疫原性領域（ＭＩＲ）と相補的な配列を少なくとも有するペプチドは、ペプチドＲｈＣＡ６７〜１６である。この相補的ペプチドは８位にトリプトファンを含む。しかし今日まで、何故、イヌの受容体ＡＣｈＲのα鎖の残基６１〜７６を標的とする病原性抗体に対する抗Ｉｄ抗体とペプチドの結合に関して、炭化水素基が相当な重要性を有することが驚くべきことに分かったかは、十分に理解されていなかった。
【００２２】
置換されていてもよい炭化水素基は、好ましくは置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアルキル基、特に置換されていてもよいベンジル基、より好ましくは少なくとも１つのアルコキシ基で置換されたベンジル基、最も好ましくは２，４，６−トリメトキシベンジル基である。
【００２３】
イヌ及びヒトのＭＧは、主に（６８％）ＭＩＲ（ＡＣｈＲのα鎖の残基６１〜７６）に対するＡＣｈＲ抗体（病原性抗体）応答を有するとして特徴付けられるので、ＭＩＲを対象とする相補的ペプチドを提供して、哺乳動物におけるＭＧの処置に有用であり得る治療用組成物を得て、他のヒト用ワクチンを開発することが、有利である可能性があると考えられた。イヌのＭＧは、ヒトのＭＧと非常に類似している。
【００２４】
これらの類似性は障害の自然発生、ヒトとイヌの間の共有環境、類似した臨床所見、関連エピトープ特異性の特徴的なＡＣｈＲ自己抗体、及びＭＧと他の自己免疫疾患の共存症を含む。
【００２５】
したがって、本発明の他の目的は、配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチド及び少なくとも１つの担体を含む治療用組成物を提供することである。
【００２６】
本明細書で前に述べたように、イヌ及びヒトのＭＧでは、病原性抗体はＡＣｈＲのＭＩＲを標的とする。このＭＩＲと相補的なペプチドを提供することによって、相補的ペプチドを対象とする抗体（抗イディオタイプ抗体）を誘導することができるはずである。抗イディオタイプ抗体は、ペプチドがこの結合部位と相補的であるので、ＡＣｈＲのＭＩＲと類似している可能性がある抗原結合部位を有すると思われる。したがって、抗イディオタイプ抗体は病原性抗体を中和することができるはずであり、Ｂ細胞介在性の免疫応答が誘導されるはずである。
【００２７】
哺乳動物において良い結果を与え得る組成物を得るために、組成を最適化することが必要とされている。したがって、配列番号１の配列を少なくとも有するペプチドは、０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中に７５０〜２５マイクログラム、好ましくは５００〜５０マイクログラム、有利には１００〜５０マイクログラムの範囲の量で存在することが分かっている。
【００２８】
有利なことに、治療用組成物は、ＭＧの治療的又は予防的処置用のワクチン組成物として使用することが意図されている。ワクチン組成物は、免疫応答を追加刺激するためにアジュバント及びペプチド担体を含むことが好ましい。この組成物は、Ｂ細胞性の応答を増大させるように意図されているので、この目的において知られているこのようなアジュバントを使用することは有用であるはずである。このようなアジュバント及び担体は当業者によく知られている。
【００２９】
例示的なアジュバントは、油中水型アジュバント、特にＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）、ミョウバンアジュバント、フロイントアジュバントなどであってよい。
【００３０】
例示的な担体は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニンなどであってよい。
【００３１】
ラットにおけるＭＧの治療用途の、これらのアジュバント及び担体は、本明細書において参照中に組み込まれる、ＭｃＡｎａｌｌｙ  ＪＬ、Ｘｕ  Ｌ、Ｖｉｌｌａｉｎ  Ｍ、Ｂｌａｌｏｃｋ  ＪＥ．：「重症筋無力症用のペプチドワクチンの有効性におけるアジュバントの役割（Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ  ｇｒａｖｉｓ）」Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ２００１；２２６：３０７〜３１１中で詳細に論じられている。
【００３２】
Ｔ細胞免疫応答が重症筋無力症において働くことも報告されてきている。実際、病原性抗体はＩｇＧ−Ｔ細胞依存性である。したがって、Ｂ細胞介在性の免疫応答に関与するＡＣｈＲαの６１〜７６領域以外に、Ｔ細胞によって特異的に認識される受容体の他の領域が存在するはずであると考えられた。
【００３３】
ルイスラットにおける病原性抗体の生成は、ＡＣｈＲのα鎖の残基１００〜１１６に特異的なＴ細胞によって助力されることが、［Ａｒａｇａ  Ｓ．ら、「Ｔ細胞の助力を特異的に阻害することにより実験的自己免疫性重症筋無力症を予防するペプチドワクチン（Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｈａｔ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ  ｇｒａｖｉｓ  ｂｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐ）」ＦＡＳＥＢ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｖｏｌ  １４、２０００］中で報告されている。したがってＡｒａｇａ  Ｓ．らは、受容体ＡＣｈＲのα鎖の残基１００〜１１６と相補的なペプチド（これはＲｈＣＡ６１１〜００１と呼ばれた）でルイスラットを免疫処置した。生成した抗ＡＲＭ抗体／抗原受容体の相互作用は自己反応性Ｔ細胞の助力に干渉し、自己反応性Ｂ細胞をアネルギー化し、したがってＡＣｈＲ反応性自己抗体の力価を低下させ、これによって顕著な臨床的改善、低下した死亡率、及びルイスラット中の筋肉におけるＡＣｈＲレベルの維持をもたらしたことが観察された。
【００３４】
受容体ＡＣｈＲのα鎖のこれらの残基１００〜１１６と相補的なペプチドは、配列番号２の配列を少なくとも有するペプチドＲｈＣＡ６１１〜００１である。
【００３５】
このペプチドをラットにおいて試験して、受容体ＡＣｈＲのＴ細胞認識部位と相補的なペプチドを含む治療用ワクチン組成物の能力を測定した。
【００３６】
配列番号２の配列を少なくとも有する相補的ペプチドは、ＭＧ用の治療用組成物において考えられる候補であり得ることが分かっている。
【００３７】
それ故、相補的ＢペプチドＲｈＣＡ６７〜１６とＴ細胞認識部位と相補的なペプチドの組合せは、ラットにおいてＥＡＭＧの低下した発生率をもたらし得ると考えられている。
【００３８】
残念ながら、（比較例３参照）、ラットにおけるＥＡＭＧの発生率及び重度は、２つのペプチドの組合せ（連続的又は同時のいずれか）によって低下しなかった。
【００３９】
２つのペプチドを一緒に投与したとき、ラットにおいて、平均重度及び死亡率は、配列番号２の配列を少なくとも有するペプチドを用いて観察した値と同等であり、ラットにおいて２つのペプチドの相乗効果はないことが示唆された。
【００４０】
ＡＣｈＲは進化中に高度に保存されており、且つＴ細胞免疫はその代わりに非常に種依存性であるが、配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチド、及びアセチルコリン受容体のＴ細胞認識部位と相補的である配列番号２の配列を少なくとも有するペプチド、並びに少なくとも１つの担体を含む組成物は、イヌにおいてＭＧに対する改善された影響を与えることが、驚くべきことに分かった。
【００４１】
実際、Ｂ相補的ペプチドとＴ相補的ペプチドの相乗効果がイヌにおいて見られた。
【００４２】
この結果は、配列番号２の配列を少なくとも有するペプチドがラット中のＡＣｈＲのＴ細胞認識部位と相補的である事実を考慮すると、さらに一層驚くべきことである。ＡＣｈＲは進化中に高度に保存されているが、Ｔ細胞免疫はラット中とイヌ中で異なるはずである。
【００４３】
有利なことに、配列番号２の配列は、前記アセチルコリン受容体のＴ細胞認識部位のα鎖の残基１００〜１１６と相補的である。
【００４４】
病原性抗体の生成に、受容体ＡＣｈＲのα鎖の残基１００〜１１６に特異的なＴ細胞が寄与する。
【００４５】
有利なことに、ワクチン組成物は、７５０〜２５マイクログラム、好ましくは５００〜５０マイクログラム、有利には１００〜５０マイクログラムの、配列番号１及び／又は配列番号２の配列を少なくともそれぞれ有する各ペプチドを少なくとも１つのアジュバントを有する０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中に含む。
【００４６】
２つのペプチドは、同じであるか又は異なるペプチド担体と結合していることが好ましい。
【００４７】
本発明の変形実施形態によれば、２つのペプチドを含む組成物は第１の配合物及び第２の配合物を含む。
【００４８】
第１の配合物は、本発明による配列番号１の配列を少なくとも有するペプチドを含み、第２の配合物は、配列番号２の配列を少なくとも有するペプチドを含む。
【００４９】
有利なことに、第１の配合物と第２の配合物は各々、７５０〜２５マイクログラム、好ましくは５００〜５０マイクログラム、有利には１００〜５０マイクログラムの相補的ペプチドを少なくとも１つのアジュバントを有する０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中に別々に含む。
【００５０】
好ましくは、各配合物のペプチドは、適切なペプチド担体と結合すべきである。
【００５１】
哺乳動物におけるＭＧの治療的又は予防的処置用のワクチン組成物として使用する、第１の配合物及び第２の配合物を含む組成物が提供され、各配合物は同時又は連続的に投与されるものである。
【００５２】
それぞれの変形実施形態において、Ｂ及びＴリンパ球に応じた細胞性免疫の活性化を誘導するための組成物を提供する。
【００５３】
本発明は、重症筋無力症の主要免疫原性領域の抗イディオタイプ抗体を検出するために提供される、配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを含む検出キットも提供する。
【００５４】
配列番号１の配列を少なくとも有するペプチドは有利なことに、本発明による組成物で免疫処置したペット犬又はヒトの血清中での抗イディオタイプ抗体の結合に関するＥｌｉｓａ試験において、コーティング複合体として使用するためのペプチド複合体の状態である。アルカリホスファターゼで標識したヒト又はイヌ抗ＩｇＧを、Ｅｌｉｓａプレートのウェルに加えて結合が明らかになり、したがって抗体抗Ｉｄ及び発色基質を検出するはずである。
【００５５】
或いは、抗ＩｇＧはホースラディッシュペルオキシダーゼで標識することができる。
【００５６】
一変形形態では、ペプチドは直接、一方に配列番号１の配列を少なくとも有するペプチドと、他方に抗イディオタイプ抗体を検出するためのＥｌｉｓａ試験又はウエスタンブロットにおいて使用するためのアルカリホスファターゼ標識又はペルオキシダーゼ標識のような標識とを含むペプチド複合体の状態である。
【００５７】
本発明の目的はまた、配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを製造するための方法であって、
配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成するステップ、及び
前記配列番号１の配列中の８位に位置するトリプトファン残基を炭化水素化するステップを含む方法を提供することである。
【００５８】
本発明の他の目的は、重症筋無力症に施用される薬剤を製造するための方法であって、
配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成するステップ、及び
配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを少なくとも１つの担体と結合させるステップを含む方法を提供することである。
【００５９】
本発明のさらに他の目的は、重症筋無力症に施用される薬剤を製造するための方法であって、
配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成するステップ、
配列番号２の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成するステップ、及び
両方の相補的ペプチドを少なくとも１つの担体と結合させるステップを含む方法を提供することである。
【００６０】
一変形実施形態において本発明は、重症筋無力症に施用される薬剤を製造するための方法であって、
配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成し、相補的ペプチドを少なくとも１つの担体と結合させることによって第１の配合物を製造するステップ、及び
配列番号２の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを合成し、相補的ペプチドを少なくとも１つの担体と結合させることによって第２の配合物を製造するステップを含む方法を提供する。
【００６１】
有利なことに、本発明の目的はまた、重症筋無力症の治療的又は予防的用途を目的とする薬剤を製造するための方法であって、
配列番号１の相補的ペプチドを合成するステップ、
配列番号２の相補的ペプチドを合成するステップ、
相補的ペプチドと担体を結合させるステップ、
担体と結合した両方の相補的ペプチドを生理食塩水溶液及びアジュバントと混合するステップを含む方法に関する。
【００６２】
本発明による他の実施形態は、添付の特許請求の範囲にさらに記載する。
【００６３】
本発明はさらに、配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチド及び場合によっては配列番号２の配列を少なくとも有する相補的ペプチドを含む治療用組成物を投与することを含む、哺乳動物における重症筋無力症の処置方法に関する。
【００６４】
前述のように、配列番号１の配列を少なくとも有する相補的ペプチドは、重症筋無力症（ＭＧ）のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）のα鎖の残基６１〜７６の主要免疫原性領域（ＭＩＲ）と相補的である。
【００６５】
アセチルコリン受容体のα鎖の残基６１〜７６（ＡＣｈＲα６１〜７６）の配列は、以下の通りである。
ＮＨ２−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ
【００６６】
ＡＣｈＲα６１〜７６と相補的なペプチドは以下の配列を有し、ＲｈＣＡ６７〜１６と称した。
Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−ＮＨ２
【００６７】
したがって、配列番号１は以下の通りである。
ＮＨ２−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ
【００６８】
配列番号１の配列を少なくとも有するペプチドは、ｆ−ｍｏｃ化学物質を使用してＢｉｏｓｅａｒｃｈペプチド合成装置、モデル９５００で合成し、Ｄｙｎａｍａｘ  Ｃ１８  ３００オングストローム１５μカラム（１９×３００ｍｍ）、及び９０％Ｈ２Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸）／１０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）〜１０％Ｈ２Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸）／９０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）の勾配を使用して、６０分間、流速＝５ｍｌ／分、３９〜４２分である保持時間で逆相高性能液体クロマトグラフィーによって精製し、２，４，６−トリメトキシベンジルを有するペプチドの分子量は１９８８であった。
【００６９】
ＡＣｈＲα６１〜７６のＡＲＭペプチドであるＲｈＣＡ６７〜１６は、炭化水素化、好ましくはアルキル化又はアリール化されているトリプトファンを８位に含む。このような炭化水素化に適した炭化水素基は、置換されていてもよいアリール基及び置換されていてもよいアルキル基、特に置換されていてもよいベンジル基、好ましくは少なくとも１つのアルコキシ基で置換されたベンジル基、より好ましくは２，４，６−トリメトキシベンジル基からなる群において選択することができる。
【００７０】
好ましくは、炭化水素基は２，４，６−トリメトキシベンジル基であり、その化学配列は以下の通りである。
【化１】
2009530375.tif 000021
【００７１】
Ｂ細胞ペプチドを合成し、酸性条件下で（例えばトリフルオロ酢酸を用いた溶出中に）固相担体からペプチドが切り離されたときにＴｍｏｂを加えることによって、２，４，６−トリメトキシベンジル基を８位のトリプトファンに加えた。
【００７２】
ペプチドの炭化水素化、特にアリール化は、Ｔｍｏｂの存在下で酸性条件下において、固相担体からのペプチドの切断中に起こる。前に記載したように、ペプチドＲｈＣＡ６７〜１６は、担体タンパク質としてのキーホールリンペットヘマシアニン（ＫＬＨ）と結合した。ＫＬＨはグルタルアルデヒド結合体を使用してＢ細胞ペプチドと結合させて、ＫＬＨとペプチド両方の化学的、物理的及び生物学的特徴を保った。Ｂ細胞ペプチド及び担体タンパク質（ＫＬＨ）をグルタルアルデヒド溶液に加える。その反応はこの下に示す：
【化２】
2009530375.tif 000022
【００７３】
グルタルアルデヒドはその遊離形でタンパク質又はペプチドと反応しないが、不飽和ポリマーとして、結合によって安定化するイミノ結合を与える。
【００７４】
本発明によれば、担体タンパク質は前述のＫＬＨであってよいが、例えばペプチドが単独状態でなく且つ小さすぎないようにペプチドの支持体として作用する、ジフテリアトキソイド又は破傷風トキソイド又はタンパク質の性質の任意の大きな分子などの、他の担体タンパク質を使用することができることは理解されよう。それ故、担体タンパク質を有するペプチドが免疫系によってすぐに破壊されず、より免疫原性が高い。
【００７５】
当業者は、前述の事項を考慮して、２つのペプチド（Ｂ細胞ペプチド及びＴ細胞ペプチド）は、同じ又は異なる性質である同じ担体タンパク質又は異なる担体タンパク質と、結合させることが可能であることも理解するはずである。
【００７６】
本試験に関して、臨床試験はイヌで実施した。１回用量のワクチンは、０．５ｍｌの油中水型アジュバント、好ましくはＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）アジュバント（ＴｉｔｅｒＭａｘ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）中に乳化した、ペプチドＲｈＣＡ６７〜１６−ＫＬＨ結合体の０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中に５００マイクログラムを含んでいた。
【００７７】
配列番号２の配列を有するペプチドは、ＡＣｈＲのα鎖のＴ細胞エピトープ（残基１００〜１１６）と相補的である。このペプチドは、ｆ−ｍｏｃ化学物質を使用してＢｉｏｓｅａｒｃｈペプチド合成装置、モデル９５００で合成し、Ｄｙｎａｍａｘ  Ｃ１８  ３００オングストローム１５μカラム（１９×３００ｍｍ）、及び９０％Ｈ２Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸）／１０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）〜１０％Ｈ２Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸）／９０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）の勾配を使用して、６０分間、流速＝５ｍｌ／分、１８〜２０分である保持時間で逆相高性能液体クロマトグラフィーによって精製し、その分子量は２０３６である。
【００７８】
配列番号２を有する相補的ペプチドは、以下の配列を有する：
ＮＨ２−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
【００７９】
前に記載したように、本明細書でＢペプチドとも呼ぶペプチドＲｈＣＡ６７〜１６、及び本明細書でＴペプチドとも呼ぶペプチドＲｈＣＡ６１１〜００１は、ラットにおいて単独で試験した。これらの結果は、Ｂペプチド単独又はＴペプチド単独はいずれも、病原性抗体レベルの有意な低下をもたらすことを示した。ラットに関する未公開実験において試験したとき、ＢペプチドとＴペプチドを一緒にすると、Ｔペプチドのみを投与したときより、病原性抗体レベルにおいて良好な結果をもたらさなかった。これらの結果は、２つのペプチドを使用したとき、ラットにおいて相乗効果はなかったことを示した。
【００８０】
本発明は、２つのペプチドを同時投与又は連続投与のいずれかでイヌにおいて使用すると予期せぬ相乗効果があることを示す、イヌにおける結果を提供する。
【００８１】
本発明を、以下の非限定的な実施例でさらに詳述する。
【実施例】
【００８２】
（実施例１）
材料及び方法。確立された臨床的ラジオイムノアッセイによって陽性ＡＣｈＲ抗体力価（＞０．６ｎＭ）を有する自己免疫ＭＧと診断した２９匹のイヌを、試験に最初に登録した。５匹の動物（１７％）が吸引性肺炎で死に、１匹は胸腺腫の手術後、完全なワクチン接種前に急死した。本試験における死亡率は、歴史的対照群において以前に報告された６／３５（１７％）及び２／１２（１７％）に匹敵する。３匹のイヌはフォローアップを止め、４匹はノンコンプライアンスのため試験から除外し、１匹は免疫処置部位における皮膚反応のため、完全なワクチン接種前にオーナーによって試験から外された。５匹の動物は診断後、但しワクチン接種の開始前に自然に寛解した。したがって、１０匹のイヌ（５匹の雄及び５匹の雌、１〜１０才齢）が試験を終了し、これらの動物はいずれも胸腺腫を有しておらず、コルチコステロイド又は他の免疫抑制剤を服用状態であった。これらの動物に関する臨床症状の発症からＡＣｈＲ抗体アッセイを用いた確定診断までの時間は、２〜４週間であった。アセチルコリンエステラーゼ阻害剤の不在下での臨床上正常な正常範囲（＜０．６ｎＭ）への、ＡＣｈＲ抗体力価の長期の回復として寛解を定義する。一時的寛解は、ＭＧの完全な解決前の０．６ｎＭ未満であるＡＣｈＲ抗体力価の１回又は複数回の測定、及び正常値へのＡＣｈＲ抗体の長期の回復を指す。ペットのオーナーはインフォームドコンセントを与え、この試験はＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｌｏｒｉｄａによって承認された。
【００８３】
表１中に列挙した様々なワクチン組成物を、試験において使用した。
【００８４】
表１：イヌに関する試験の組成物
【表１】
2009530375.tif 000023
【００８５】
イヌに関する臨床試験では、組成物を４つの部位に最小限で皮下投与した。ワクチン接種は確定診断時に開始し、数匹の動物の診断後４カ月まで続けた。動物は免疫処置し、２週間間隔で追加刺激した。
【００８６】
本発明の目的は、ペット犬における自然発生的に得られた自己免疫ＭＧの臨床試験中の歴史的対照群（Ｓｈｅｌｔｏｎ  ＧＤら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２００１；（５７）：２１３９〜２１４１）と比較してＡＣｈＲ抗体レベルを低下させる能力に関して、前述のＴ及びＢ細胞ワクチンを評価することであった。担体タンパク質（ＡＲＭペプチド含まず）、アジュバント中で免疫処置した筋無力症のペット犬の対照群は、結合した相補的ペプチドを含まない、アジュバントを有する０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中の担体タンパク質のラットＥＡＭＧの試験（Ａｒａｇａ  Ｓら）に基づく利点がおそらくないため今回は含めなかった。
【００８７】
すべての統計分析は、Ｉｎｓｔａｔ生物統計学用ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して実施した。群間の血清抗体値及び寛解までの時間を比較するために、データセットの制約が両側不対ｔ検定及びウェルチ補正又はマンホイットニー検定の使用を示したとき以外は、両側不対ｔ検定を使用した。帰無仮説は、ワクチン接種はＡＣｈＲ抗体力価又は寛解までの時間を低下させなかったということであった。ワクチン接種前後の血清抗体力価を分析するために、両側対応ｔ検定を使用した。寛解の統計値などの終点評価のために、分割表解析をフィッシャーの直接確率検定によって実施した。
【００８８】
結果。
予想結果。
予め試験した歴史的対照群は、両性の４０匹の筋無力症のイヌからなっており、その３５匹は長期追跡し結果は周知であった。これらの動物は、突発性巨大食道症を有する１５２匹のイヌのコホートにおいてＡＣｈＲ抗体陽性として同定した。これらの動物を、その結果が周知であった我々の試験からの２０匹のイヌ（胸腺腫の手術後に死んだ動物は除く）と比較した。ＡＣｈＲ抗体アッセイは、すべてのイヌ（歴史的対照群及び本試験）に関して同じ獣医施設（ＵＣ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって実施された。
【００８９】
表２．ワクチン接種した筋無力症のイヌ及び歴史的対照群に関する予想結果
【表２】
2009530375.tif 000024
Ａ：ｐ＜０．０００１、Ｂ：ｐ＝０．００４４、Ｃ：ｐ＝０．００２２、及びＤ：ｐ＝０．５０４、いずれもフィッシャーの直接確率検定による。それぞれの比較によって、群中のすべての他のイヌに対して示した結果を有するイヌについて考える。
【００９０】
表２は、歴史的対照群と比較して、我々の集団中の吸引性肺炎又は窒息で死んだ動物の数の間には有意な差はなかったことを示す（それぞれ２５％対１７％）。我々の試験において２０匹のイヌのうち５匹が、診断後但しワクチン接種前に、正常範囲内（＜０．６ｎＭ）の長期ＡＣｈＲ抗体レベルまで自然に寛解した。したがって、２群の間の自然寛解率にも差はなかった（２５％対１７％）。これらの結果は、２つのコホートが十分合致していることを示唆する。有意な差は、安楽死させた動物の数であった。歴史的対照群中の１２匹のイヌ（３４％）は、もたらされた予後不良のために安楽死させた。本発明による臨床試験中の動物は安楽死させなかった。２群の間の全体的な長期の寛解率には、非常に有意な差があった。歴史的対照群は３５匹のイヌのうちの６匹のみ（１７％）が寛解し、ＡＣｈＲ抗体レベルが正常範囲に戻った一方で、２０匹のワクチン接種群の７５％が寛解した。吸引性肺炎又は安楽死を生き延びた動物のみを考えると、歴史的対照群は３５％（６／１７）の寛解率を有しており、且つ本試験では１００％（１５／１５）の寛解率（ｐ＜０．０００１）であった。この増大した寛解率は、ワクチン接種に際して寛解した１０匹のイヌ中１０匹にすべて相当した。我々が歴史的対照群に関する最良の可能なシナリオ及びワクチン接種動物に関する最悪の可能なシナリオを考える場合、さらに有意に増大する寛解がある。具体的には、対照群中のフォローアップを止めた５匹のイヌが寛解したと仮定し（４０匹の１１匹が寛解、２７．５％）、一方フォローアップを止めたか又は試験から除外した、我々の群中の９匹のイヌが寛解していない（２９匹の１５匹が寛解、５１．７％）と仮定した場合、ワクチン接種は寛解率の統計上有意な増大をさらに引き起こした（ｐ＝０．０４８２、フィッシャーの直接確率検定）。
【００９１】
イヌＭＧからの自然治癒と比較したとき、ワクチン接種は加速的な寛解までの時間をもたらす。
【００９２】
自然に寛解した４７匹の筋無力症のイヌからなっていた歴史的対照群はレトロスペクティブに分析し、いくつかの重要な点で１０匹のワクチン接種動物に匹敵した。２群中のイヌはコルチコステロイド又は他の免疫抑制剤で処置せず、ＡＣｈＲ抗体アッセイは同じ獣医施設によって実施され、ワクチン接種群のイヌに関する臨床的兆候から確定診断までの経過時間（２〜４週間）は、歴史的対照群に関する期間（１週間〜５カ月）の範囲にあり、且つ２群は類似した年齢範囲であるほぼ同程度の割合の雄と雌からなっており、重複する期間（歴史的対照群、１９９０〜２０００及びワクチン接種動物、１９９７〜２００３）中に試験した。
【００９３】
興味深いことに、歴史的対照群に関するデータセットを評価する際に、ＡＣｈＲ抗体レベルを観察して２つの過程の１つを追跡した。いくつかの症例では寛解をもたらしたＡＣｈＲ抗体レベルの一相性の低下があり、一方他の症例は、長期の寛解前に増大及び低下するＡＣｈＲ抗体レベルの変動パターンを示した。ワクチン接種群のイヌにおける経時的なＡＣｈＲ抗体レベルも、この同じ２群の一方又は他方に分かれた（以下参照）。したがって適切な分析によって、比較は群内で行うべきであると決定した。
【００９４】
図１（上図）は、一相性の減退を示すイヌの確定診断時に、ワクチン接種群（ｎ＝５）と歴史的対照群（ｎ＝４０）の間のＡＣｈＲ抗体レベルに統計的差異はなかったことを示す。しかしワクチン接種群は、ＡＣｈＲ抗体力価の加速的な低下率を示した。これはワクチン接種群における早い寛解率によって反映された（図１、中央図）。これは寛解を加速化させ、ワクチン接種群のイヌの中では、フィッシャーの直接確率検定（ｐ＝０．０１９）によるワクチン接種群のイヌ対対照に関する寛解の相対的確率が３．５６であった、３カ月の時間地点で最も明らかである。
【００９５】
図２は、自己抗体濃度の変動パターンを示す、歴史的対照群（２ａ）とワクチン接種動物（２ｂ）に関する確定診断後の経時的なＡＣｈＲ抗体レベルを示す。初期のＡＣｈＲ抗体力価（ｎＭ±ＳＥＭ）がワクチン接種群のイヌ（５．９８±２．３３）と歴史的対照群（４．５４±１．４）の間で有意に異なることはなかったが、診断後の期間にワクチン接種群のイヌに関して全体的な変動幅の著しい減少があったようである。対照的に、長期の寛解までの平均時間は２群に関して同じであった。したがって、疾患の期間は２群において同じであるようであるが、ワクチン接種群のイヌは疾患の過程中の寛解においてより多くの時間を費やす可能性がある。これは、２９％（２／７）の歴史的対照群と比較して１００％（５／５）のワクチン接種群のイヌが、疾患の完全な消散前に少なくとも１つの寛解期を有していたという観察によって証明された。正常なＡＣｈＲ抗体レベルへの一時的復帰を示す動物の増加は、歴史的対照群と比較したワクチン接種群のより頻繁なサンプリング（３カ月間隔でサンプリング）が原因ではなかったことを確実にするために、ＡＣｈＲ抗体レベルは診断後３カ月間隔のみで考えた。結果は、５／５のワクチン接種群のイヌ対２／７の歴史的対照群は、ワクチン接種後及び疾患の完全な消散前にＡＣｈＲ抗体に関する正常範囲（＜０．６ｎＭ）内に少なくとも１つの血液サンプルを有していたことを示した。全体として、７匹の歴史的対照群における３回の挿間期［１匹のイヌで２回、１匹のイヌで１回及び５匹のイヌで０回の挿間期］と比較して、５匹のワクチン接種動物において正常なＡＣｈＲ抗体力価の８回の挿間期が存在した［１匹のイヌで３回、１匹のイヌで２回及び３匹のイヌで１回の挿間期］。したがって、３カ月間隔毎のイヌ１匹当たりの一時的寛解の挿間期の平均数は、歴史的対照群よりワクチン接種動物において有意に多かった（ｐ＜０．０２５１、マンホイットニー検定）（図２ｄ）。
【００９６】
ＭＧの長期の消散前に、すべての入手可能な血液サンプル（単に３カ月間隔ではなく）を考慮すると、変動するレベルのＡＣｈＲ抗体を有する５匹のワクチン接種群のイヌの４匹が、２回以上の一時的寛解の挿間期（２匹の動物で３回の挿間期及び２匹の動物で２回の挿間期、合計１０回）を示し、これらはワクチン接種の過程の初期に相当した。
【００９７】
図３（上図）は、ワクチン接種過程の開始と後の寛解期の開始時期の間の非常に有意な相関関係（ｒ＝０．９５５、ｐ＜０．０００１）を示す図である。したがって時間的に、ワクチン接種は一時的寛解と非常に強く関連しており、診断に対してワクチン接種をいつ開始するかとは無関係である。重要なことに、この関係のＹ切片は２．４カ月であり、これはＡＣｈＲ抗体力価の一相性の低下を示すワクチン接種群のイヌ（図１、下図）の寛解までの平均時間（２．３５±０．９６カ月）に非常に厳密に相当する。このデータをワクチン接種と寛解の間の経過時間として分析すると、寛解までの平均時間は１．７７５±０．４３カ月（それぞれ下位及び上位９５％Ｃｌ’ｓ＝０．８０５及び２．７４５）であった。これはワクチン接種し一相性の低下を示した（図１、下図）イヌに関する寛解までの平均時間と統計上異なっていない。したがって、ＡＣｈＲ抗体レベルのパターンとは無関係に、ワクチン接種は非常に類似した寛解までの時間をもたらし、類似したメカニズムが両方の過程と関係し得ることを示唆する。
【００９８】
次のサンプリング時（第２〜４週）には１回のワクチン接種事象とＡＣｈＲ抗体レベルの低下の間には定量的相関関係も存在し、これは変動するＡＣｈＲ抗体力価を有する全５匹のイヌにおいて観察された。３５回のワクチン接種事象のうち、２８回（８０％）がＡＣｈＲ抗体力価の減少をもたらした（図３、下図）。ＡＣｈＲ抗体レベルを低下させなかった７回のワクチン接種事象は５匹の動物に分配し、３匹のイヌそれぞれに関して１回、及び２匹のイヌそれぞれを２回観察した。全体として、平均ＡＣｈＲ抗体レベルはワクチン接種前１．６３±０．２１ｎＭからワクチン接種後１．１４±０．１７ｎＭに低下した（Ｐ＝０．００１５、両側対応ｔ検定）。
【００９９】
Ｔ細胞ワクチンとＢ細胞ワクチンの併用投与は、それらの連続投与より優れている。
【０１００】
ワクチン接種プロトコルは、２つの方法のうちの１つで実施した。Ｔ細胞ワクチンとＢ細胞ワクチンは同時に与えた、或いは２週間間隔で３回のＴ細胞ワクチン投与の過程、次に２週間間隔で３回のＢ細胞ワクチン投与を続けた。一相性の低下を示した（２．３５カ月、図１）イヌに関するワクチン接種と長期の寛解の間の平均時間は、変動するＡＣｈＲ抗体レベルを有する（２．４カ月、図３）イヌに関するワクチン接種過程の開始と後の一時的寛解の間の平均時間と異なっておらず、且つこの後者の群では、診断後のワクチン接種の時間は無関係だったので、ＡＣｈＲ抗体レベルのパターンとは無関係に２つのワクチン接種プロトコルの有効性に関する比較が可能であった。図４の上図は、ワクチン接種の開始後の第１次寛解までの平均時間（長期又は一時的のいずれか）は有意な状態に近づき（ｐ＝０．０６３９、両側不対ｔ検定及びウェルチ補正）、Ｔ細胞ワクチンとＢ細胞ワクチンを連続的ではなく同時に投与したとき２．７倍速かったことを示す図である。さらに、ワクチンを７匹の動物の４匹のみに連続的に投与したとき、Ｔ細胞ワクチン単独ワクチン接種後に寛解を示した。さらに平均して、寛解を得るために、Ｔ細胞ワクチンとＢ細胞ワクチンを連続的に与えたとき（３．８６±１．０６）、同時に与えたときとは対照的に（２．６７±０．３３３）、動物１匹当たりでより多くのワクチン接種が必要とされた。我々が寛解を得るためのＴ及び／又はＢ  ＡＲＭワクチン投与の数、及び寛解までの時間を考慮するとき、ワクチンを連続的ではなく同時に投与すると、投与当たりの寛解までの時間の有意な減少がある（ｐ＝０．０１６７、両側対応マンホイットニー検定）（図４、下図）。したがって最適有効性は、両方のワクチンを一緒に投与することを必要とするようである。同じアジュバント（ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標））及び担体タンパク質（ＫＬＨ）を両方のワクチン接種プロトコルにおいて使用したので、それらがその影響を担っていたとは考えられない。そうである場合でも、２つのプロトコルの同量のワクチン後に第１次寛解までの類似した平均時間を観察すると予想したはずである。したがって、ワクチン効果はＴ及びＢ  ＡＲＭペプチドに依存しアジュバント及び担体とは無関係であり、イヌにおける自然発生ＭＧでは、Ｂ細胞ワクチンとＴ細胞ワクチンの組合せを有効に用いて、我々が観察する素早い寛解をもたらす。
【０１０１】
５０％の動物が寛解した平均時間は２カ月であった。この平均寛解時間は歴史的対照群（６．４カ月）より３．２倍速い。
【０１０２】
（実施例２）
ルイスラットにおける比較例
ルイスラットを精製ＡＣｈＲで免疫処置して、実験的自己免疫性Ｍ．Ｇ．を発症させた。次いでルイスラットを、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合したＢ及びＴペプチドで処置した。相補的ペプチドをワクチン接種した動物由来の血清と調製物の両方が、病原性抗体と結合したことを示した。Ｂペプチド組成物を用いると、疾患の発生率は、ＫＬＨ免疫処置及び未処置対照群（９０％）と比較してワクチン接種動物において大幅に低下し（２５％）、一方で疾患を有する動物における臨床重度値は、陽性対照における１．３と比較してワクチン接種動物において平均して０．２５になった。Ｔペプチド組成物を用いると、疾患の発生率は、ＫＬＨ免疫処置及び未処置対照群（８９％）と比較してワクチン接種動物においてさらに低下し（５５％）、一方で疾患を有する動物における臨床重度値は、陽性対照における２．５と比較してワクチン接種動物において平均して１．２になった。
【０１０３】
さらに、疾患誘導の過程中のラットに対するモノクローナル抗Ｉｄ抗体の受動投与は、ＥＡＭＧの発生率及び重度を同様に低下させた（Ａｒａｇａら、１９９６）。結果は表３中に示す。
【０１０４】
表３．ＥＡＭＧ用のＡＲＭワクチンに関する動物モデル試験から回収した結果
【表３】
2009530375.tif 000025
【０１０５】
（実施例３）
ルイスラットにおける比較例
Ｔペプチドを炭化水素基を有するＢペプチドと共に用いたワクチン接種が、実験的自己免疫性重症筋無力症（ＥＡＭＧ）に対して、炭化水素基を有するＢペプチド及びＴペプチドのいずれか単独又は別々の場合と異なる影響を引き起こすかどうかを評価するために、単独又は組合せのいずれかでキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）或いはＫＬＨと結合したＴペプチド又は炭化水素基を有するＢペプチドを用いて、２回ルイスラットを免疫処置した。次いで精製Ｔｏｒｐｅｄｏ  ＡＣｈＲを用いてＥＡＭＧを誘導し、疾患をモニタリングした。
【０１０６】
結果は表４中に表し、その中では、Ｔペプチド又はＢペプチドいずれか単独は、ＫＬＨで免疫処置した対照ラットと比較して、ＥＡＭＧの発生率、重度及び死亡率を低下させたことを見ることができる。ＴペプチドとＢペプチドの同時ワクチン接種は、いずれかのペプチドワクチン単独と比較してわずかで統計上有意でない利点を引き起こした。したがって、ルイスラットでは、ＴペプチドとＢペプチド両方の同時ワクチン接種は、いずれかのペプチドワクチン単独の有効性を増大も低下もさせず、これら２つのペプチドの相乗効果はラットにおいて存在しないことが示唆された。
【０１０７】
表４
【表４】
2009530375.tif 000026
【０１０８】
したがって、イヌ及びヒトのＭＧ、及びラットにおけるＥＡＭＧは、主に（６８％）ＭＩＲに対するＡＣｈＲ抗体応答性を有するとして特徴付けられる。さらに、ＭＩＲ特異的抗体は、筋無力症の表現型を受動的に伝えることができる。このこと、及びラットのＥＡＭＧにおいてＭＩＲ特異的抗体及びＢ細胞に対する抗イディオタイプ抗体応答性を誘導し、ＡＣｈＲ抗体レベルを低下させ疾患を改善するＢ細胞ワクチンの能力を考慮すると、このワクチンがイヌにおいてＡＣｈＲ抗体レベルを低下させたことは、特に驚くべきことであるとは思われない。ラットのＥＡＭＧにおけるこのような有効性、及び自然発生的に得られたイヌのＭＧは、ヒトのＭＧにおける優勢な抗ＭＩＲ抗体応答性と組み合わせて、ヒト疾患におけるＢペプチドワクチンの潜在的有用性を示唆する。実際、ＡＣｈＲ抗体に対する天然に存在する抗イディオタイプ抗体が４０％のヒトＭＧ患者において報告されてきており、且つその存在は低い抗ＡＣｈＲ抗体力価及び臨床的改善に関与する。
【０１０９】
さらに、ルイスラットに関するＡＣｈＲの優性Ｔ細胞エピトープに対して設計したワクチンは、イヌにおいて明らかに有効である。１つの考えられるシナリオは、Ｔ細胞ワクチンに対する抗クローンタイプ抗体は、それらのＴ細胞受容体との相互作用によって、新たに記載し且つ天然に存在するＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御Ｔ細胞を誘導する或いは増殖させる可能性があることである。この上記の場合、これらの細胞はＡＣｈＲα１００〜１１６と特異的に反応すると思われるが、神経筋接合部でＡＣｈＲのさらに優性エピトープに関して他の自己反応性Ｔ細胞を非特異的に抑制するはずである。このようなメカニズムから、作動する場合、ヒト及びイヌＭＧに対してワクチンが有効である可能性があることが示唆されよう。
【０１１０】
第２種におけるこれらの肯定的結果は、特別な担体／アジュバントとのヒトにおけるこれらのワクチンの最終用途に関する期待を抱かせる。これらが本試験と同じ結果を生む場合、ＡＲＭワクチンは、自己免疫疾患を長期の寛解に導くことができる新たなクラスの標的療法となる可能性がある。
【０１１１】
ヒトにおける予防的又は治療的処置用に、ヒトにおける使用に適した最良の担体及びアジュバントを決定した。
【０１１２】
すべての動物実験は、ヒトにおいて使用され、本出願の主題である同じペプチドを用いて実施した。
【０１１３】
実験中、ペプチドは異なる担体と結合させ、異なるアジュバントと組み合わせた。担体及びアジュバントは必要であるが、それらの本質は最重要ではないことが証明される。実験を実施して、ヒトにおける使用に適した担体とアジュバントの組合せは、研究室における動物実験で管理及び使用しやすい担体及びアジュバントと同等に、又はそれらよりも一層働くことを証明した（ＭｃＡｎａｌｌｙ  Ｊ．Ｌ．ら、２０００）。表５：Ｂ細胞Ａｒｍワクチン及び担体タンパク質とアジュバントの異なる組合せを用いたＥＡＭＧの予防
【０１１４】
【表５】
2009530375.tif 000027
【０１１５】
組合せＤＴ／ミョウバンはＫＬＨ／ミョウバンより素早いピーク応答性を与え、さらにそれはＥＡＭＧに対してわずかに有効であった（ＭｃＡｎａｌｌｙら、２０００）。
【０１１６】
本発明の好ましい実施形態を例示的な目的で開示してきたが、当業者は、添付の特許請求の範囲に開示した本発明の範囲及び精神から逸脱せずに、様々な変更形態、追加又は置換が可能であることを理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【配列表フリーテキスト】
【０１１８】
配列番号１
＜２２３＞  重症筋無力症に関与するアセチルコリン受容体の主要免疫原性領域の残基６１−７６に対する相補的ペプチド
＜２２３＞  ８位のトリプトファンは置換されていてもよい炭化水素基、好ましくは置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアルキル基、特に２，４，６−トリメトキシベンジル基を含む
配列番号２
＜２２３＞  重症筋無力症に関与するアセチルコリン受容体のα鎖の残基１００−１１６に相補的な合成ペプチド
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  CuraVac, Inc.
<120>  Vaccine for a therapeutic or a prophylactic treatment of 
Myasthenia Gravis
<130>  PA-36984
<160>  2     
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  16
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  complementary peptide to the residues 61-76 of the major 
immunogenic region of the acetyl choline receptor involved in 
Myasthenia gravis
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (8)..(8)
<223>  the tryptophan in position 8 comprise an optionally substituted 
hydrocarbon group, preferably an optionally substituted aryl 
group or an optionally substituted alkyl group, particularly a 
2,4,6-trimethoxybenzyl group
<400>  1
Phe Asn Ser Thr Ile Ile Gly Trp Ile Pro Ala Lys Pro His Ile Asn 
1               5                   10                  15      
<210>  2
<211>  17
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  synthetic peptide complementary to the residues 100-116 of the 
alpha chain of the acetyl choline receptor involved in Myasthenia
gravis
<400>  2
Tyr Phe Ser Arg Ile Ile Gln Lys Gln Phe Gly His Val Asn Asn Gly 
1               5                   10                  15      
Lys 
【国際調査報告】
2009530375.tif 000028
2009530375.tif 000029