(57)【要約】本発明は少なくとも部分的には、偽遺伝子ＴＤＧＦ３（Ｃｒｉｐｔｏ−３）が細胞において発現されること、そして特にＴＤＧＦ３の過剰発現は細胞の形質転換に関連すること、例えばＴＤＧＦ３は癌細胞系統及び腫瘍組織由来細胞において過剰発現されることを発見したことに基づいている。従って、本発明は試料中のＴＤＧＦ３ポリヌクレオチド又はポリペプチドの存在を検出するための組成物、キット及び方法を提供する。本発明は更に細胞が形質転換されたかどうかを試験するため、並びに、患者が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法に対する適当な候補であるかどうかを試験するための組成物、キット及び方法を提供する。
2009535033.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のＴＤＧＦ３ポリヌクレオチド又はその部分の存在を検出するための方法であって、該方法が下記工程：
ａ）転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする核酸分子に該試料を接触させる工程であって、ここで該転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドはＴＤＧＦ３遺伝子のコーディング領域を含む、工程；及び、
ｂ）該試料中のポリヌクレオチドに核酸分子が結合するかどうか調べることにより、該試料中のＴＤＧＦ３ポリヌクレオチド又はその部分の存在を検出する工程；
を含む、方法。
【請求項２】
前記転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドを核酸分子で増幅させる工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記増幅工程がポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドへの前記核酸分子の結合が、増幅されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドを検出することにより測定される、請求項４記載の方法。
【請求項７】
転写されたポリヌクレオチドが、前記転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする少なくとも一つの核酸分子を用いて増幅される、請求項４記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも一つの核酸分子が、ＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドを増幅しない、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも一つの核酸分子が、前記転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドの一部分にハイブリダイズし、該部分はＶ７、Ｌ６８、Ｅ９２及びＡ１７８よりなる群から選択されるアミノ酸をコードするＴＤＧＦ３コーディング領域内のヌクレオチドを含む、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも一つの核酸分子が、表２及び表３に記載する配列の群から選択される配列を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
試料中のＴＤＧＦ３ポリペプチド又はその部分の存在を検出するための方法であって、該方法が下記工程：
ａ）ＴＤＧＦ３ポリペプチドに選択的に結合する試薬に該試料を接触させる工程；及び、
ｂ）該試料中のポリペプチドに該試薬が結合するかどうか調べることにより、該試料中のＴＤＧＦ３ポリペプチド又はその部分の存在を検出する工程；
を含む、方法。
【請求項１２】
前記試薬が抗体、抗体誘導体及び抗体フラグメントよりなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントが、前記ＴＤＧＦ３ポリペプチドに結合し、そしてＴＤＧＦ１ポリペプチドには結合しない、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントが、前記ＴＤＧＦ３ポリペプチドの細胞外部分に含まれるエピトープに結合する、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントがＶ７、Ｌ６８、Ｅ９２及びＡ１７８よりなる群から選択されるアミノ酸を含むエピトープに結合する、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記患者の試料が腫瘍組織試料を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍が乳腺腫瘍、結腸腫瘍および肺腫瘍よりなる群から選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記患者の試料が体液である、請求項１又は請求項１１記載の方法。
【請求項１９】
前記体液が血液、リンパ、腹水、婦人科学的体液、嚢胞液および尿よりなる群から選択される請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
試料中のＴＤＧＦ３ポリヌクレオチド又はその部分の存在を検出するための方法であって、該方法が下記工程：
ａ）転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドの一部分に選択的にハイブリダイズする核酸分子に該試料を接触させる工程であって、該部分はＶ７、Ｌ６８、Ｅ９２及びＡ１７８よりなる群から選択されるアミノ酸をコードするＴＤＧＦ３コーディング領域内のヌクレオチドを含む、工程；
ｂ）該転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチド又はその部分を、ポリメラーゼ連鎖反応により核酸分子で増幅する工程；及び、
ｂ）増幅されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドを検出することにより、該試料中のＴＤＧＦ３ポリヌクレオチド又はその部分の存在を検出する工程；
を含む、方法。
【請求項２１】
ＴＤＧＦ３ポリヌクレオチド又はその部分の試料中の存在を検出するためのキットであって、該キットはＴＤＧＦ３転写ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする核酸分子を含む、キット。
【請求項２２】
ＴＤＧＦ３ポリペプチド又はその部分の試料中の存在を検出するためのキットであって、該キットは抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントを含み、ここで抗体又はそのフラグメントはＴＤＧＦ３ポリペプチド又はその部分に特異的に結合する、キット。
【請求項２３】
細胞が形質転換されているかどうかを試験する方法であって、該方法は、
ａ）試験細胞中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベル；及び、
ｂ）対照非形質転換細胞中のＴＤＧＦ３の発現のレベル；
を比較する工程を含み、
ここで該対照非形質転換細胞中のレベルと比較して、該試験細胞中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のより高いレベルは、該試験細胞が形質転換されていることを示す、方法。
【請求項２４】
前記試験細胞中及び前記対照細胞中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベルが、転写されたポリヌクレオチド又はその部分の該試験細胞中及び該対照細胞中の存在を検出することにより試験され、ここで、該転写されたポリヌクレオチドはＴＤＧＦ３遺伝子のコーディング領域を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記転写されたポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記転写されたポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記検出の工程が更に、前記転写されたポリヌクレオチドを検出する前に、該転写されたポリヌクレオチドを増幅することを含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
前記増幅工程がポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記転写されたポリヌクレオチドが、ＴＤＧＦ３コーディング領域に選択的にハイブリダイズする少なくとも一つの核酸分子を用いて増幅される、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも一つの核酸分子が、ＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドを増幅しない、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも一つの核酸分子が、Ｖ７、Ｌ６８、Ｅ９２及びＡ１７８よりなる群から選択されるアミノ酸をコードするヌクレオチドにわたるＴＤＧＦ３コーディング領域に相当する転写されたポリヌクレオチドの一部分にハイブリダイズする、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも一つの核酸分子が、表２及び表３に記載する配列の群から選択される配列を含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記試験細胞中及び前記対照細胞中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベルが、ＴＤＧＦ３遺伝子によりコードされる蛋白の該試験細胞中及び該対照細胞中の存在を、該蛋白に特異的に結合する試薬を用いて検出することにより試験する、請求項２３記載の方法。
【請求項３４】
前記試薬が抗体、抗体誘導体及び抗体フラグメントよりなる群から選択される、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントが、前記ＴＤＧＦ３ポリペプチドに結合し、そしてＴＤＧＦ１ポリペプチドには結合しない、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントが、ＴＤＧＦ３ポリペプチドの細胞外部分に含まれるエピトープに結合する、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントが、Ｖ７、Ｌ６８、Ｅ９２及びＡ１７８よりなる群から選択される１つ以上のアミノ酸を含むエピトープに結合する、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
形質転換細胞の試料中の存在を検出するためのキットであって、該キットは抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントを含み、ここで該抗体又はそのフラグメントはＴＤＧＦ３蛋白に特異的に結合する、キット。
【請求項３９】
形質転換細胞の試料中の存在を検出するためのキットであって、該キットはＴＤＧＦ３転写ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする核酸分子を含む、キット。
【請求項４０】
患者が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法に対する適当な候補であるかどうかを試験する方法であって、該方法は、
ａ）患者試料中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベル；及び、
ｂ）対照非癌試料中のＴＤＧＦ３の発現のレベル；
を比較する工程を含み、
ここで該対照非癌試料と比較して、該患者試料中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のより高いレベルは、該患者が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法に対する適当な候補であることを示す、方法。
【請求項４１】
試料中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベルが、転写されたポリヌクレオチド又はその部分の試料中の存在を検出することにより試験され、ここで該転写されたポリヌクレオチドはＴＤＧＦ３遺伝子のコーディング領域を含む、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記転写されたポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記転写されたポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
前記検出の工程が更に、前記転写されたポリヌクレオチドを検出する前に該転写されたポリヌクレオチドを増幅することを含む、請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
前記増幅工程がポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記転写されたポリヌクレオチドが、ＴＤＧＦ３コーディング領域に選択的にハイブリダイズする少なくとも一つの核酸分子を用いて増幅される、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
前記少なくとも一つの核酸分子がＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドを増幅しない、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
前記少なくとも一つの核酸分子が、Ｖ７、Ｌ６８、Ｅ９２及びＡ１７８よりなる群から選択されるアミノ酸をコードするヌクレオチドにわたるＴＤＧＦ３コーディング領域に相当する転写されたポリヌクレオチドの一部分にハイブリダイズする、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
前記少なくとも一つの核酸分子が、表２及び表３に記載する配列の群から選択される配列を含む、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記試料中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベルが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズするか、又は転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドの一部分に選択的にハイブリダイズする核酸プローブを用いて、転写されたポリヌクレオチドの試料中の存在を検出することにより試験される、請求項４０記載の方法。
【請求項５１】
前記試料中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベルが、ＴＤＧＦ３遺伝子によりコードされる蛋白の試料中の存在を、蛋白に特異的に結合する試薬を用いて検出することにより試験される、請求項４０記載の方法。
【請求項５２】
前記試薬が抗体、抗体誘導体及び抗体フラグメントよりなる群から選択される、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントが、ＴＤＧＦ３ポリペプチドに結合し、そしてＴＤＧＦ１ポリペプチドには結合しない、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
前記抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントが、ＴＤＧＦ３ポリペプチドの細胞外部分に含まれるエピトープに結合する、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントが、Ｖ７、Ｌ６８、Ｅ９２及びＡ１７８よりなる群から選択される１つ以上のアミノ酸を含むエピトープに結合する、請求項５２記載の方法。
【請求項５６】
前記患者試料が腫瘍組織試料を含む、請求項４０記載の方法。
【請求項５７】
前記腫瘍が乳腺腫瘍、結腸腫瘍および肺腫瘍よりなる群から選択される、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
前記患者試料が体液である、請求項４０記載の方法。
【請求項５９】
前記体液が血液、リンパ、腹水、婦人科学的体液、嚢胞液および尿よりなる群から選択される、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
前記患者試料中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベルが、対照非癌試料中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベルと少なくとも約２倍異なる、請求項４０記載の方法。
【請求項６１】
前記患者試料中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベルが、対照非癌試料中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベルと少なくとも約５倍異なる、請求項４０記載の方法。
【請求項６２】
前記ＴＤＧＦ３遺伝子が前記対照非癌試料中では発現されない、請求項４０記載の方法。
【請求項６３】
患者が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法に対する適当な候補であるかどうかを試験するためのキットであって、該キットは抗体、抗体誘導体又はその抗体フラグメントを含み、ここで該抗体又はそのフラグメントはＴＤＧＦ３蛋白に特異的に結合する、キット。
【請求項６４】
患者が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法に対する適当な候補であるかどうかを試験するためのキットであって、該キットはＴＤＧＦ３転写ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする核酸分子を含む、キット。
【請求項６５】
細胞における細胞形質転換を抑制するための組成物を選択する方法であって、該方法は下記工程：
ａ）細胞を含有する試料を得る工程、及び、
ｂ）複数の試験組成物の存在下で、該試料のアリコートを別個に維持する工程；
ｃ）該アリコートの各々におけるＴＤＧＦ３遺伝子の発現を比較する工程；
ｄ）他の試験組成物と比較して、該試験組成物を含有するアリコートにおいてより低いレベルのＴＤＧＦ３遺伝子発現を誘導する試験組成物のうちの１つを選択する工程；
を含む、方法。
【請求項６６】
試験化合物の発癌潜在性を試験する方法であって、該方法が下記工程：
ａ）該試験化合物の存在下及び非存在下で、哺乳類細胞の別個のアリコートを維持する工程；及び、
ｃ）該アリコートの各々におけるＴＤＧＦ３遺伝子の発現を比較する工程；
を含み、
ｄ）ここで試験化合物非存在下で維持されたアリコートと比較して、試験化合物存在下で維持されたアリコート中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のより高いレベルは、該試験化合物が発癌潜在性を保有していることを示す、方法。
【請求項６７】
試料中のＴＤＧＦ３ポリペプチド又はその部分の存在を特異的に検出するために有用な単離されたモノクローナル抗体を作成する方法であって、該方法が下記工程：
ＴＤＧＦ３ポリペプチド又はその部分を単離する工程；
単離されたポリペプチドを用いて哺乳類を免疫化する工程；
該免疫化された哺乳類から脾細胞を単離する工程；
該単離された脾細胞を不朽化細胞系統と融合させてハイブリドーマを形成する工程；及び、
該ＴＤＧＦ３ポリペプチドに特異的に結合する抗体の産生のために個々のハイブリドーマをスクリーニングする工程；及び、
該ハイブリドーマにより産生された抗体を単離することにより、試料中のＴＤＧＦ３ポリペプチド又はその部分の存在を特異的に検出するために有用なモノクローナル抗体を単離する工程；
を含む、方法。
【請求項６８】
請求項６７の方法により産生されるモノクローナル抗体。
【請求項６９】
試料中のＴＤＧＦ１ポリヌクレオチド又はその部分の存在を検出するための方法であって、該方法が下記工程：
ａ）転写されたＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする核酸分子に該試料を接触させる工程であって、ここで転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドはＴＤＧＦ１遺伝子のコーディング領域を含む、工程；及び、
ｂ）該試料中のポリヌクレオチドに核酸分子が結合するかどうか調べることにより、該試料中のＴＤＧＦ１ポリヌクレオチド又はその部分の存在を検出する工程；
を含む、方法。
【請求項７０】
前記転写されたＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
前記転写されたＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項６９記載の方法。
【請求項７２】
前記転写されたＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドを核酸分子で増幅させる工程をさらに含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７３】
前記増幅工程がポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
前記転写されたＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドへの核酸分子の結合が、増幅されたＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドを検出することにより測定される、請求項７２記載の方法。
【請求項７５】
転写されたポリヌクレオチドが、前記転写されたＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする少なくとも一つの核酸分子を用いて増幅される、請求項７２記載の方法。
【請求項７６】
前記少なくとも一つの核酸分子がＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドを増幅しない、請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
前記前記少なくとも一つの核酸分子が、転写されたＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドの一部分にハイブリダイズし、該部分はＡ７、Ｐ６８、Ｇ９２、Ｖ１７８、Ｖ２２及びＹ４３よりなる群から選択されるアミノ酸をコードするＴＤＧＦ３コーディング領域内のヌクレオチドを含む、請求項７５記載の方法。
【請求項７８】
前記少なくとも一つの核酸分子が表２及び表３に記載する配列の群から選択される配列を含む、請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
試料中のＴＤＧＦ１ポリペプチド又はその部分の存在を検出するための方法であって、該方法が下記工程：
ａ）ＴＤＧＦ３ポリペプチドに選択的に結合する試薬に該試料を接触させる工程；及び、
ｂ）該試料中のポリペプチドに該試薬が結合するかどうか調べることにより、該試料中のＴＤＧＦ３ポリペプチド又はその部分の存在を検出する工程；
を含む、方法。
【請求項８０】
前記試薬が抗体、抗体誘導体及び抗体フラグメントよりなる群から選択される、請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
前記抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントが、前記ＴＤＧＦ３ポリペプチドに結合し、そしてＴＤＧＦ１ポリペプチドには結合しない、請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
前記抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントが、ＴＤＧＦ３ポリペプチドの細胞外部分に含まれるエピトープに結合する、請求項８０記載の方法。
【請求項８３】
前記抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントが、Ｖ７、Ｌ６８、Ｅ９２及びＡ１７８よりなる群から選択されるアミノ酸を含むエピトープに結合する、請求項８０記載の方法。
【請求項８４】
前記患者試料が腫瘍組織試料を含む、請求項６９又は請求項７９記載の方法。
【請求項８５】
前記腫瘍が乳腺腫瘍、結腸腫瘍および肺腫瘍よりなる群から選択される、請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
前記患者試料が体液である、請求項６９又は請求項７９記載の方法。
【請求項８７】
前記体液が血液、リンパ、腹水、婦人科学的体液、嚢胞液および尿よりなる群から選択される、請求項８６記載の方法。
【請求項８８】
試料中のＴＤＧＦ１ポリヌクレオチド又はその部分の存在を検出するための方法であって、該方法が下記工程：
ａ）転写されたＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドの一部分に選択的にハイブリダイズする核酸分子に該試料を接触させる工程であって、該部分はＡ７、Ｐ６８、Ｇ９２、Ｖ１７８、Ｖ２２及びＹ４３よりなる群から選択されるアミノ酸をコードするＴＤＧＦ１コーディング領域内のヌクレオチドを含む、工程；
ｂ）該転写されたＴＤＧＦ１ポリヌクレオチド又はその部分を、ポリメラーゼ連鎖反応により核酸分子で増幅する工程；及び、
ｂ）増幅されたＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドを検出することにより、該試料中のＴＤＧＦ１ポリヌクレオチド又はその部分の存在を検出する工程；
を含む、方法。
【請求項８９】
ＴＤＧＦ１ポリヌクレオチド又はその部分の試料中の存在を検出するためのキットであって、該キットはＴＤＧＦ１転写ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする核酸分子を含む、キット。
【請求項９０】
ＴＤＧＦ１ポリペプチド又はその部分の試料中の存在を検出するためのキットであって、該キットは抗体、抗体誘導体又はそのフラグメントを含み、ここで該抗体又はそのフラグメントは、ＴＤＧＦ１ポリペプチド又はその部分に特異的に結合する、キット。
【請求項９１】
ＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドを特異的に検出するための単離された核酸分子であって、ここで該核酸分子は表２及び表３に記載する配列の群から選択される、核酸分子。
【請求項９２】
ＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドを特異的に検出するための単離された核酸分子であって、ここで該核酸分子は表２及び表３に記載する配列の群から選択される、核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、「ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｒｉｐｔｏ−３」と題された２００６年４月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／７９５，８０７号の利益を請求する。上記の仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｃｒｉｐｔｏ−１（ＴＤＧＦ１によりコードされる）は形質転換成長因子アルファ及び表皮成長因子とのどう養成を有する１ドメインを含有する細胞表面関連蛋白である。ＥＧＦ−ＣＦＣファミリー蛋白は早期の発達及び癌の形成において重要な役割を果たしている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４による研究を参照）。Ｃｒｉｐｔｏにおける機能突然変異の損失はヒトにおける全前脳症、例えば前脳欠損及び発達遅延に関連している（ｄｅ  ｌａ  Ｃｒｕｚ等、２００２）。正常成人組織におけるＣｒｉｐｔｏ蛋白の発現は低値であり、正常成人組織においてこの蛋白に関する機能が存在するかどうかは不明である。１つの発現は乳腺においておこり、この場合Ｃｒｉｐｔｏの発現は腺管上皮細胞分化において役割を果たしていると疑われる（非特許文献３）。しかしながら、Ｃｒｉｐｔｏ蛋白は多くのヒトの固形腫瘍において過剰発現される（Ａｄｋｉｎｓ等、２００３；Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ等、１９９１ｂ；Ｓｈｅｎ  ２００３）。例えば、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体を用いた免疫組織化学的分析によれば、ヒト乳腺腫瘍の８０％まで並びに結腸及び肺の腫瘍のかなりの割合におけるＣｒｉｐｔｏ過剰発現が分かっている。Ｃｒｉｐｔｏ過剰発現は又腫瘍形成性でもある（ＳｕｎＹ  ２００５）。更に又Ｃｒｉｐｔｏの発現は正常マウス乳腺上皮細胞系統の形質転換をもたらすことが分かっている（Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ等、１９９１ａ）。数種の最近の報告によればモノクローナル抗体によるか、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドによるＣｒｉｐｔｏの抑制はインビボにおける癌細胞の成長を抑制している（Ａｄｋｉｎｓ等、２００３；Ｎｏｒｍａｎｎｏ等、２００４ｂ；Ｘｉｎｇ等、２００４）。
【０００３】
Ｃｒｉｐｔｏは多くの癌細胞系統及び中においてアップレギュレートされること、及びＣｒｉｐｔｏの発現は腫瘍形成性であることは明確であるが、Ｃｒｉｐｔｏ発現がどのようにして正常及び癌組織でアップレギュレートされるかはそれほど明確ではない。更に又、どれほど多くの遺伝子が実際にＣｒｉｐｔｏ蛋白をコードしているかも明らかではない。ヒトゲノムにおいてはＴＤＧＦ１〜ＴＤＧＦ７と称される少なくとも７種のＣｒｉｐｔｏ遺伝子及び偽遺伝子が存在する。ＴＤＧＦ１は染色体３ｐ２３−２１領域上に位置しており、Ｃｒｉｐｔｏ蛋白に関する唯一の構造遺伝子であると広範にとらえられている（表１）。６偽遺伝子のうち、Ｘ染色体（Ｘｑ２８）上のＴＤＧＦ３は公開されているＣｒｉｐｔｏ−１蛋白レファレンス配列と比較して６つの異なるアミノ酸を有する予測された蛋白（Ｃｒｉｐｔｏ−３）をコードする未損傷のオープンリーディングフレームを有している（Ｓｃｏｇｎａｍｉｇｌｉｏ  Ｂ  １９９９）（図１Ａ；配列番号１）。この遺伝子は無イントロンであり、進化の途中でヒトゲノム内へのＴＤＧＦ１ｃＤＮＡの挿入から誘導されたと考えられ、そして本発明以前においては、発現されないと考えられていた。従って、偽遺伝子ＴＤＧＦ３の潜在的発現、及び、更には、ＴＤＧＦ３発現と癌のような増殖性障害の発症又は存在との間に存在するかもしれない何らかの相関を調べることが当該分野で必要とされていた。
【非特許文献１】Ｇｒｉｔｓｍａｎ  Ｋ，Ｚｈａｎｇ  Ｊ，Ｃｈｅｎｇ  Ｓ，Ｈｅｃｋｓｃｈｅｒ  Ｅ，Ｔａｌｂｏｔ  ＷＳ，Ｓｃｈｉｅｒ  ＡＦ  （１９９９）Ｔｈｅ  ＥＧＦ−ＣＦＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｎｅ−ｅｙｅｄ  ｐｉｎｈｅａｄ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｎｏｄａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｃｅｌｌ  ９７：  １２１−３２
【非特許文献２】Ｍｉｎｃｈｉｏｔｔｉ  Ｇ，Ｍａｎｃｏ  Ｇ，Ｐａｒｉｓｉ  Ｓ，Ｌａｇｏ  ＣＴ，Ｒｏｓａ  Ｆ，  Ｐｅｒｓｉｃｏ  ＭＧ  （２００１）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＧＦ−ＣＦＣ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  Ｃｒｉｐｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｎｏｄａｌ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２８：４５０１−１０
【非特許文献３】Ｓａｌｏｍａｎ  ＤＳ，Ｂｉａｎｃｏ  Ｃ，Ｅｂｅｒｔ  ＡＤ，Ｋｈａｎ  ＮＩ，Ｄｅ  Ｓａｎｔｉｓ  Ｍ，Ｎｏｒｍａｎｎｏ  Ｎ，  Ｗｅｃｈｓｅｌｂｅｒｇｅｒ  Ｃ，Ｓｅｎｏ  Ｍ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｋ，  Ｓａｎｉｃｏｌａ  Ｍ，  Ｆｏｌｅｙ  Ｓ，  Ｇｕｌｌｉｃｋ  ＷＪ，Ｐｅｒｓｉｃｏ  Ｇ（２０００）Ｔｈｅ  ＥＧＦ−ＣＦＣ  ｆａｍｉｌｙ：  ｎｏｖｅｌ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ７：１９９−２２６
【非特許文献４】Ｓｔｒｉｚｚｉ  Ｌ，Ｂｉａｎｃｏ  Ｃ，Ｎｏｒｍａｎｎｏ  Ｎ，Ｓａｌｏｍｏｎ  Ｄ（２００５）  Ｃｒｉｐｔｏ−１：ａ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００５  ２４：  ５７３１−４１
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は少なくとも部分的には、予測される偽遺伝子ＴＤＧＦ３がヒトの細胞において発現される機能的に無イントロンの遺伝子であること、そして更には、ＴＤＧＦ３の過剰発現は細胞の形質転換に関連すること、例えば（ＴＤＧＦ３は癌細胞および腫瘍組織由来細胞において過剰発現されるという発見に基づいている。従って、本発明は試料中のマーカー、例えばＴＤＧＦ３及び／又はＴＤＧＦ１、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの存在を特異的に検出するための組成物、キットおよび方法に関する。これらの組成物、キットおよび方法は腫瘍の表現型、例えば腫瘍がＴＤＧＦ１又はＴＤＧＦ３発現腫瘍であるかどうかを調べる場合に有用である。これらの組成物、キットおよび方法は細胞が形質転換されるかどうかを試験するため、例えば癌を診断するため、並びに患者が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法に対する適当な候補であるかどうかを試験する場合に有用である。従って、本発明は更に中のＣｒｉｐｔｏ発現表現型を測定するための組成物、キットおよび方法に関する。本発明は更に細胞が形質転換されるかどうかを試験するための組成物、キットおよび方法に関する。本発明は更に患者が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法に対する適当な候補であるかどうかを試験するための組成物、キットおよび方法に関する。
【０００５】
従って、本発明の１つの特徴は、試料中のＴＤＧＦ３ポリヌクレオチド又はその部分の存在を検出するための方法であって、方法が下記工程：
ａ）転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする核酸分子に試料を接触させること、ここで転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドはＴＤＧＦ３遺伝子のコーディング領域を含む工程；及び、
ｂ）試料中のポリヌクレオチドに核酸分子が結合するかどうか調べることにより試料中のＴＤＧＦ３ポリヌクレオチド又はその部分の存在を検出する工程；
を含む上記方法に関する。
【０００６】
１つの実施形態において、転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。
【０００７】
１つの実施形態において、転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドがｃＤＮＡである。
【０００８】
１つの実施形態において、方法は転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドを核酸分子で増幅させる工程をさらに含む。
【０００９】
１つの実施形態において、増幅工程はポリメラーゼ連鎖反応を含む。
【００１０】
１つの実施形態において、転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドへの核酸分子の結合が増幅されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドを検出することにより測定される。
【００１１】
１つの実施形態において、転写されたポリヌクレオチドは、転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする少なくとも一つの核酸分子を用いて増幅される。
【００１２】
１つの実施形態において、少なくとも一つの核酸分子はＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドを増幅しない。
【００１３】
１つの実施形態において、少なくとも一つの核酸分子は転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドの一部分にハイブリダイズし、その部分はＶ７、Ｌ６８、Ｅ９２及びＡ１７８よりなる群から選択されるアミノ酸をコードするＴＤＧＦ３コーディング領域内のヌクレオチドを含む。
【００１４】
１つの実施形態において、少なくとも一つの核酸分子は表２及び表３に記載する配列よりなる群から選択される配列を含む。
【００１５】
１つの特徴において、本発明は、試料中のＴＤＧＦ３ポリペプチド又はその部分の存在を検出するための方法であって、方法が下記工程：
ａ）ＴＤＧＦ３ポリペプチドに選択的に結合する試薬に試料を接触させる工程；及び、
ｂ）試料中のポリペプチドに試薬が結合するかどうか調べることにより試料中のＴＤＧＦ３ポリペプチド又はその部分の存在を検出する工程；
を含む上記方法に関する。
【００１６】
１つの実施形態において、試薬は抗体、抗体誘導体及び抗体フラグメントよりなる群から選択される。
【００１７】
１つの実施形態において、抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントはＴＤＧＦ３ポリペプチドに結合し、そしてＴＤＧＦ１ポリペプチドには結合しない。
【００１８】
１つの実施形態において、抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントはＴＤＧＦ３ポリペプチドの細胞外部分に含まれるエピトープに結合する。
【００１９】
１つの実施形態において、抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントはＶ７、Ｌ６８、Ｅ９２及びＡ１７８よりなる群から選択されるアミノ酸を含むエピトープに結合する。
【００２０】
１つの実施形態において、患者の試料は腫瘍組織試料を含む。
【００２１】
１つの実施形態において、腫瘍は乳腺腫瘍、結腸腫瘍および肺腫瘍よりなる群から選択される。
【００２２】
１つの実施形態において、患者の試料は体液である。
【００２３】
１つの実施形態において、体液は血液、リンパ、腹水（ａｓｃｅｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ）、婦人科学的体液（ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄ）、嚢胞液および尿よりなる群から選択される。
【００２４】
別の特徴において、本発明は試料中のＴＤＧＦ３ポリヌクレオチド又はその部分の存在を検出するための方法であって、方法は下記工程：
ａ）転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドの一部分に選択的にハイブリダイズする核酸分子に試料を接触させる工程、その部分はＶ７、Ｌ６８、Ｅ９２及びＡ１７８よりなる群から選択されるアミノ酸をコードするＴＤＧＦ３コーディング領域内のヌクレオチドを含む工程；
ｂ）転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチド又はその部分をポリメラーゼ連鎖反応により核酸分子で増幅する工程；及び、
ｂ）増幅されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドを検出することにより、試料中のＴＤＧＦ３ポリヌクレオチド又はその部分の存在を検出する工程；
を含む上記方法に関する。
【００２５】
別の特徴において、本発明はＴＤＧＦ３ポリヌクレオチド又はその部分の試料中の存在を検出するためのキットであって、キットはＴＤＧＦ３転写ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする核酸分子を含む上記キットに関する。
【００２６】
別の特徴において、本発明はＴＤＧＦ３ポリペプチド又はその部分の試料中の存在を検出するためのキットであって、キットは抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントを含み、ここで抗体又はそのフラグメントはＴＤＧＦ３ポリペプチド又はその部分に特異的に結合する上記キットに関する。
【００２７】
更に別の特徴において、本発明は、下記項目：
ａ）試験細胞中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベル；及び、
ｂ）対照非形質転換細胞中のＴＤＧＦ３の発現のレベル；
を比較することを含む、細胞が形質転換されているかどうかを試験する方法であって、
ここで対照非形質転換細胞中のレベルと比較して、試験細胞中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のより高いレベルは、試験細胞が形質転換されていることを示す上記方法に関する。
【００２８】
１つの実施形態において、試験細胞中及び対照細胞中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベルは、転写されたポリヌクレオチド又はその部分の試験細胞中及び対照細胞中の存在を検出することにより試験され、ここで、転写されたポリヌクレオチドはＴＤＧＦ３遺伝子のコーディング領域を含む。
【００２９】
１つの実施形態において、転写されたポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。
【００３０】
１つの実施形態において、転写されたポリヌクレオチドはｃＤＮＡである。
【００３１】
１つの実施形態において、検出の工程は更に転写されたポリヌクレオチドを検出する前に転写されたポリヌクレオチドを増幅することを含む。
【００３２】
１つの実施形態において、増幅工程はポリメラーゼ連鎖反応を含む。
【００３３】
１つの実施形態において、転写されたポリヌクレオチドはＴＤＧＦ３コーディング領域に選択的にハイブリダイズする少なくとも一つの核酸分子を用いて増幅される。
【００３４】
１つの実施形態において、少なくとも一つの核酸分子はＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドを増幅しない。
【００３５】
１つの実施形態において、少なくとも一つの核酸分子はＶ７、Ｌ６８、Ｅ９２及びＡ１７８よりなる群から選択されるアミノ酸をコードするヌクレオチドにわたるＴＤＧＦ３コーディング領域に相当する転写されたポリヌクレオチドの一部分にハイブリダイズする。
【００３６】
１つの実施形態において、少なくとも一つの核酸分子は表２及び表３に記載する配列の群から選択される配列を含む。
【００３７】
１つの実施形態において、試験細胞中及び対照細胞中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベルはＴＤＧＦ３遺伝子によりコードされる蛋白の試験細胞中及び対照細胞中の存在を蛋白に特異的に結合する試薬を用いて検出することにより試験する。
【００３８】
１つの実施形態において、試薬は抗体、抗体誘導体及び抗体フラグメントよりなる群から選択される。
【００３９】
１つの実施形態において、抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントはＴＤＧＦ３ポリペプチドに結合し、そしてＴＤＧＦ１ポリペプチドには結合しない。
【００４０】
１つの実施形態において、抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントはＴＤＧＦ３ポリペプチドの細胞外部分に含まれるエピトープに結合する。
【００４１】
１つの実施形態において、抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントはＶ７、Ｌ６８、Ｅ９２及びＡ１７８よりなる群から選択される１つ以上のアミノ酸を含むエピトープに結合する。
【００４２】
さらに別の特徴において、本発明は形質転換細胞の試料中の存在を検出するためのキットであって、キットは抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントを含み、ここで抗体又はそのフラグメントはＴＤＧＦ３蛋白に特異的に結合する上記キットに関する。
【００４３】
別の特徴において、本発明は形質転換細胞の試料中の存在を検出するためのキットであって、キットはＴＤＧＦ３転写ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする核酸分子を含む上記キットに関する。
【００４４】
別の特徴において、本発明は患者が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法に対する適当な候補であるかどうかを試験する方法であって、方法は下記項目：
ａ）患者試料中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベル；及び、
ｂ）対照非癌試料中のＴＤＧＦ３の発現のレベル；
を比較する工程を含み、
ここで対照非癌試料中と比較して、患者試料中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のより高いレベルは、患者が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法に対する適当な候補であることを示す上記方法に関する。
【００４５】
別の特徴において、試料中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベルは転写されたポリヌクレオチド又はその部分の試料中の存在を検出することにより試験され、ここで転写されたポリヌクレオチドはＴＤＧＦ３遺伝子のコーディング領域を含む。
【００４６】
１つの実施形態において、転写されたポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。
【００４７】
１つの実施形態において、転写されたポリヌクレオチドはｃＤＮＡである。
【００４８】
１つの実施形態において、検出の工程は更に転写されたポリヌクレオチドを検出する前に転写されたポリヌクレオチドを増幅することを含む。
【００４９】
１つの実施形態において、増幅工程はポリメラーゼ連鎖反応を含む。
【００５０】
１つの実施形態において、転写されたポリヌクレオチドはＴＤＧＦ３コーディング領域に選択的にハイブリダイズする少なくとも一つの核酸分子を用いて増幅される。
【００５１】
１つの実施形態において、少なくとも一つの核酸分子はＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドを増幅しない。
【００５２】
１つの実施形態において、少なくとも一つの核酸分子はＶ７、Ｌ６８、Ｅ９２及びＡ１７８よりなる群から選択されるアミノ酸をコードするヌクレオチドにわたるＴＤＧＦ３コーディング領域に相当する転写されたポリヌクレオチドの一部分にハイブリダイズする。
【００５３】
１つの実施形態において、少なくとも一つの核酸分子は表２及び表３に記載する配列の群から選択される配列を含む。
【００５４】
１つの実施形態において、試料中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベルは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、選択的に転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列にハイブリダイズする、又は転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドの一部分にハイブリダイズする核酸プローブを用いて転写されたポリヌクレオチドの試料中の存在を検出することにより試験される。
【００５５】
１つの実施形態において、試料中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベルをＴＤＧＦ３遺伝子によりコードされる蛋白の試料中の存在を蛋白に特異的に結合する試薬を用いて検出することにより試験する。
【００５６】
１つの実施形態において、試薬は抗体、抗体誘導体及び抗体フラグメントよりなる群から選択される。
【００５７】
１つの実施形態において、抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントはＴＤＧＦ３ポリペプチドに結合し、そしてＴＤＧＦ１ポリペプチドには結合しない。
【００５８】
１つの実施形態において、抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントはＴＤＧＦ３ポリペプチドの細胞外部分に含まれるエピトープに結合する。
【００５９】
１つの実施形態において、抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントはＶ７、Ｌ６８、Ｅ９２及びＡ１７８よりなる群から選択される１つ以上のアミノ酸を含むエピトープに結合する。
【００６０】
１つの実施形態において、患者の試料は腫瘍組織試料を含む。
【００６１】
１つの実施形態において、腫瘍は乳腺腫瘍、結腸腫瘍および肺腫瘍よりなる群から選択される。
【００６２】
１つの実施形態において、患者の試料は体液である。
【００６３】
１つの実施形態において、体液は血液、リンパ、腹水、婦人科学的体液、嚢胞液および尿よりなる群から選択される。
【００６４】
１つの実施形態において、患者試料中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベルは対照非癌試料中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベルと少なくとも約２倍異なる。
【００６５】
１つの実施形態において、患者試料中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベルは対照非癌試料中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベルと少なくとも約５倍異なる。
【００６６】
１つの実施形態において、ＴＤＧＦ３遺伝子は対照非癌試料中では発現されない。
【００６７】
別の特徴において、本発明は患者が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法に対する適当な候補であるかどうかを試験するためのキットであって、キットは抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントを含み、ここで抗体又はそのフラグメントはＴＤＧＦ３蛋白に特異的に結合する上記キットに関する。
【００６８】
別の特徴において、本発明は患者が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法に対する適当な候補であるかどうかを試験するためのキットであって、キットはＴＤＧＦ３転写ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする核酸分子を含む上記キットに関する。
【００６９】
別の特徴において、本発明は細胞における細胞形質転換を抑制するための組成物を選択する方法であって、方法は下記工程：
ａ）細胞を含有する試料を得る工程、及び、
ｂ）試験組成物複数の存在下に試料のアリコートを別個に維持する工程；
ｃ）アリコートの各々におけるＴＤＧＦ３遺伝子の発現を比較する工程；
ｄ）他の試験組成物と比較して、試験組成物を含有するアリコートにおいてより低いレベルのＴＤＧＦ３遺伝子発現を誘導する試験組成物のうちの１つを選択する工程；
を含む上記方法に関する。
【００７０】
別の特徴において、本発明は試験化合物の発癌潜在性を試験する方法であって、方法は下記工程：
ａ）試験化合物の存在下及び非存在下に哺乳類細胞の別個のアリコートを維持する工程；及び、
ｃ）アリコートの各々におけるＴＤＧＦ３遺伝子の発現を比較する工程；
を含み、
ｄ）ここで試験化合物非存在下に維持されたアリコートと比較して、試験化合物存在下に維持されたアリコート中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現のより高いレベルは、試験化合物は発癌潜在性を保有していることを示す、方法に関する。
【００７１】
別の特徴において、本発明は試料中のＴＤＧＦ３ポリペプチド又はその部分の存在を特異的に検出するために有用な単離されたモノクローナル抗体を作成する方法であって、方法は下記工程：
ＴＤＧＦ３又はその部分を単離する工程；
単離されたポリペプチドを用いて哺乳類を免疫化する工程；
免疫化された哺乳類から脾細胞を単離する工程；
単離された脾細胞を不朽化細胞系統と融合させてハイブリドーマを形成する工程と；及び、
ＴＤＧＦ３ポリペプチドに特異的に結合する抗体の産生のために個々のハイブリドーマをスクリーニングする工程；及び、
ハイブリドーマにより産生された抗体を単離することにより試料中のＴＤＧＦ３ポリペプチド又はその部分の存在を特異的に検出するために有用なモノクローナル抗体を単離する工程；
を含む上記方法に関する。
【００７２】
別の特徴において、本発明は本明細書の方法を用いながら製造されるモノクローナル抗体に関する。
【００７３】
１つの特徴において、本発明は試料中のＴＤＧＦ１ポリヌクレオチド又はその部分の存在を検出するための方法であって、方法は下記工程：
ａ）転写されたＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする核酸分子に試料を接触させること、ここで転写されたＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドはＴＤＧＦ１遺伝子のコーディング領域を含む工程；及び、
ｂ）試料中のポリヌクレオチドに核酸分子は結合するかどうか調べることにより試料中のＴＤＧＦ１ポリヌクレオチド又はその部分の存在を検出する工程；
を含む上記方法に関する。
【００７４】
１つの実施形態において、転写されたＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。
【００７５】
１つの実施形態において、転写されたＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドはｃＤＮＡである。
【００７６】
１つの実施形態において、転写されたＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドを核酸分子で増幅させる工程をさらに含む。
【００７７】
１つの実施形態において、増幅工程はポリメラーゼ連鎖反応を含む。
【００７８】
１つの実施形態において、転写されたＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドへの核酸分子の結合は増幅されたＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドを検出することにより測定される。
【００７９】
１つの実施形態において、転写されたポリヌクレオチドは、転写されたＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする少なくとも一つの核酸分子を用いて増幅される。
【００８０】
１つの実施形態において、少なくとも一つの核酸分子はＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドを増幅しない。
【００８１】
１つの実施形態において、少なくとも一つの核酸分子は転写されたＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドの一部分にハイブリダイズし、その部分はＡ７、Ｐ６８、Ｇ９２、Ｖ１７８、Ｖ２２及びＹ４３よりなる群から選択されるアミノ酸をコードするＴＤＧＦ３コーディング領域内のヌクレオチドを含む。
【００８２】
１つの実施形態において、少なくとも一つの核酸分子は表２及び表３に記載する配列よりなる群から選択される配列を含む。
【００８３】
１つの特徴において、本発明は試料中のＴＤＧＦ１ポリペプチド又はその部分の存在を検出するための方法であって、方法は下記工程：
ａ）ＴＤＧＦ３ポリペプチドに選択的に結合する試薬に試料を接触させること；及び、
ｂ）試料中のポリペプチドに試薬は結合するかどうか調べることにより試料中のＴＤＧＦ３ポリペプチド又はその部分の存在を検出すること；
を含む上記方法に関する。
【００８４】
１つの実施形態において、試薬は抗体、抗体誘導体及び抗体フラグメントよりなる群から選択される。
【００８５】
１つの実施形態において、抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントはＴＤＧＦ３ポリペプチドに結合し、そしてＴＤＧＦ１ポリペプチドには結合しない。
【００８６】
１つの実施形態において、抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントはＴＤＧＦ３ポリペプチドの細胞外部分に含まれるエピトープに結合する。
【００８７】
１つの実施形態において、抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントはＶ７、Ｌ６８、Ｅ９２及びＡ１７８よりなる群から選択されるアミノ酸を含むエピトープに結合する。
【００８８】
１つの実施形態において、患者の試料は腫瘍組織試料を含む。
【００８９】
１つの実施形態において、腫瘍は乳腺腫瘍、結腸腫瘍および肺腫瘍よりなる群から選択される。
【００９０】
１つの実施形態において、患者の試料は体液である。
【００９１】
１つの実施形態において、体液は血液、リンパ、腹水、婦人科学的体液、嚢胞液および尿よりなる群から選択される。
【００９２】
１つの特徴において、本発明は試料中のＴＤＧＦ１ポリヌクレオチド又はその部分の存在を検出するための方法であって、方法は下記工程：
ａ）転写されたＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドの一部分に選択的にハイブリダイズする核酸分子に試料を接触させること、その部分はＡ７、Ｐ６８、Ｇ９２、Ｖ１７８、Ｖ２２及びＹ４３よりなる群から選択されるアミノ酸をコードするＴＤＧＦ１コーディング領域内のヌクレオチドを含む工程；
ｂ）転写されたＴＤＧＦ１ポリヌクレオチド又はその部分をポリメラーゼ連鎖反応により核酸分子で増幅する工程；及び、
ｂ）増幅されたＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドを検出することにより、試料中のＴＤＧＦ１ポリヌクレオチド又はその部分の存在を検出する工程；
を含む上記方法に関する。
【００９３】
１つの特徴において、本発明はＴＤＧＦ１ポリヌクレオチド又はその部分の試料中の存在を検出するためのキットであって、キットはＴＤＧＦ１転写ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする核酸分子を含む上記キットに関する。
【００９４】
１つの特徴において、本発明はＴＤＧＦ１ポリペプチド又はその部分の試料中の存在を検出するためのキットであって、キットは抗体、抗体誘導体又は抗体フラグメントを含み、ここで抗体又はそのフラグメントはＴＤＧＦ１ポリペプチド又はその部分に特異的に結合する上記キットに関する。
【００９５】
別の特徴において、本発明はＴＤＧＦ１ポリヌクレオチドを特異的に検出するための単離された核酸分子であって、ここで核酸分子は表２及び表３に記載する配列の群から選択される上記核酸分子に関する。
【００９６】
別の特徴において、本発明はＴＤＧＦ３ポリヌクレオチドを特異的に検出するための単離された核酸分子であって、ここで核酸分子は表２及び表３に記載する配列の群から選択される上記核酸分子に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９７】
（発明の詳細な説明）
ヒトゲノムにはＴＤＧＦ１〜ＴＤＧＦ７と称される少なくとも７種のＣＲＩＰＴＯ遺伝子及び偽遺伝子が存在する。ＴＤＧＦ１は染色体３ｐ２３−２１領域上に位置し、そして本発明以前においては、Ｃｒｉｐｔｏ蛋白に関する唯一の構造遺伝子であると広範に考えられていた（表１）。
【００９８】
【表１】
2009535033.tif 000003
６種の推定偽遺伝子のうち、Ｘ染色体（Ｘｑ２８）上のＴＤＧＦ３は公開されているＣｒｉｐｔｏ−１蛋白レファレンス配列と比較して６つの異なるアミノ酸を有する予測された蛋白（Ｃｒｉｐｔｏ−３）をコードする未損傷のオープンリーディングフレームを有している（ＳｃｏｇｎａｍｉｇｌｉｏＢ１９９９）（図１Ａ；配列番号１）。この遺伝子は無イントロンであり、進化の途中でヒトゲノム内へのＴＤＧＦ１ｃＤＮＡの挿入から誘導されたと考えられる。
【００９９】
本発明は、少なくとも部分的には、多数の癌組織及び細胞系統に由来するＣｒｉｐｔｏｃＤＮＡ単離体の大多数がＴＤＧＦ１（Ｃｒｉｐｔｏ−１）遺伝子ではなくＴＤＧＦ３（Ｃｒｉｐｔｏ−３）遺伝子から誘導されていたという意外な発見に基づいている。ＴＤＧＦ１及びＴＤＧＦ３の遺伝子の両方とも多くのヒト正常及び癌組織において転写及び翻訳されている。Ｃｒｉｐｔｏ発現組織試料を検査した場合、両方の遺伝子とも僅か少数の例においては同様のレベルで発現されたが、大部分の例においてＴＤＧＦ１又はＴＤＧＦ３の何れかが優先的に発現されている。特に本発明はＴＤＧＦ１は一部の正常組織で発現される場合があるが、大部分のＣｒｉｐｔｏ発現腫瘍においてはＴＤＧＦ１ではなくＴＤＧＦ３が過剰発現されるという発見に基づいている。
【０１００】
従って、試料中の本発明のマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１の存在を、例えば試料中のマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現を特異的に検出することにより検出するための組成物、キット及び方法が本明細書において提供される。これらの組成物、キット及び方法は腫瘍の表現型、例えば腫瘍がＣｒｉｐｔｏ−１又はＣｒｉｐｔｏ−３発現腫瘍であるかどうかを調べるために有用である。細胞が形質転換されるかどうかを試験するための方法も本明細書において提供される。これらの方法では細胞におけるＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベルを対照非形質転換細胞におけるＴＤＧＦ３遺伝子発現レベルに比較する。更に又患者が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法に対する適当な候補であるかどうかを試験するための方法も提供される。これらの方法では患者試料におけるＴＤＧＦ３遺伝子の発現のレベルを対照非癌試料におけるＴＤＧＦ３遺伝子発現レベルに比較する。
【０１０１】
本発明の種々の特徴を以下のサブセクションにおいて更に詳述する。
【０１０２】
Ｉ．定義
本明細書においては、以下の用語の各は本セクションにおけるそれに関連する意味を有する。
【０１０３】
単数表記の文法的目的語は本明細書においては、１つ又は１つより多くを指すために用いる。例えば、「要素」とは１つの要素又は１つより多い要素を指す。
【０１０４】
本明細書においては、「マーカー」という用語は細胞の形質転換又は増殖性疾患、例えば癌の発症（維持、進行、血管形成及び／又は転移を包含）に関与していると考えられているマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３（ＴＤＧＦ３）及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１（ＴＤＧＦ１）を包含する。「マーカー」は細胞が形質転換されるかどうかを試験する場合に有用なマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１を包含する。マーカーは患者が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法に対する適当な候補であるかどうかを試験する場合に有用なマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１を包含する。「ＴＤＧＦ３」及び「Ｃｒｉｐｔｏ−３」という用語は本明細書においては互換的に使用する。「ＴＤＧＦ１」及び「Ｃｒｉｐｔｏ−１」という用語は本明細書においては互換的に使用する。
【０１０５】
本発明のマーカーは又増殖性疾患（例えば癌）の診断、例えば治療の前、最中、又は後における増殖性疾患の過剰又は過少な活動性、発生、発現、生育、後退、再発又は耐性の診断において有用である。本発明のマーカーは更に、腫瘍の等級、腫瘍の予後、および腫瘍の治療応答の診断のために有用である場合がある。マーカーの予測機能は例えば（１）ヒト増殖性疾患、例えば癌における過剰発現又は過少発現（例えばＩＳＨ、ノーザンブロット、又はｑＰＣＲによる）、増大又は低下した蛋白レベル（例えばＩＨＣによる）、又は増大又は低下した活性（例えばマーカーが関与する経路のモジュレーションにより測定）（例えばヒト増殖性疾患、例えば癌の約２％、３％、５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、５０％以上における）（２）生物学的試料、例えば増殖性疾患、例えば癌にり患した対象（例えばヒト対象）に由来する組織、細胞又は生物学的流体を含む試料中のその存在又は非存在、又は（３）増殖性疾患、例えば癌を有する患者の臨床サブセット（例えば特定の治療に応答性であるもの、又は耐性を発生させているもの）におけるその存在又は非存在により確認してよい。
【０１０６】
「マーカー核酸」とは例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１のような本発明のマーカーによりコードされる、又はそれに相当する核酸（例えばＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）である。例えばそのようなマーカー核酸分子はＣｒｉｐｔｏ−３遺伝子の核酸配列の全体又は一部の配列又はそのような配列の相補又はハイブリダイズフラグメントを含むＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ）を包含する。マーカー核酸分子は又Ｃｒｉｐｔｏ−３遺伝子の核酸配列の全体又は一部の配列又はそのような配列の相補対を含む例えばｍＲＮＡのようなルナを包含し、この場合すべてのチミジン残基はウリジン残基で置き換えられている。
【０１０７】
「マーカー蛋白」又は「マーカーポリペプチド」とは、例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１のような本発明のマーカーによりコードされる、又はそれに相当する蛋白である。マーカー蛋白はＣｒｉｐｔｏ−３遺伝子のポリヌクレオチド配列によりコードされる蛋白の全アミノ酸配列を含む。「蛋白」及び「ポリペプチド」という用語は本明細書においては、互換的に使用する。
【０１０８】
マーカーの本明細書において互換的に使用する「改変された量」又は「モジュレートされた量」又はマーカーの本明細書において互換的に使用する「改変されたレベル」又は「モジュレートされたレベル」という用語は、試料、例えば増殖性疾患（例えば癌）に罹患した対象に由来する試料中のマーカー遺伝子の発現レベルが、対照試料（例えば正常、非癌組織、例えば隣接する正常組織、又は増殖性疾患、例えば癌に罹患していない健常者対象由来の試料）中のマーカーの発現レベルと比較して、モジュレート、例えば増大又は低下していることを指す。マーカーの「改変された量」又は「モジュレートされた量」という用語は、試料、例えば増殖性疾患（例えば癌）に罹患した対象由来の試料中のマーカーの蛋白レベルが、正常、対照試料中のマーカーの蛋白レベルと比較して、モジュレート、例えば増大又は低下していることを指す。
【０１０９】
マーカーの「発現のモジュレートされたレベル」と本明細書において互換的に使用する「発現の改変されたレベル」という用語は、対照試料（例えば正常、非癌組織、例えば隣接する正常組織、又は増殖性疾患、例えば癌に罹患していない健常者対象由来の試料）中のマーカーの発現レベルと比較して、統計学的に有意な量、例えば発現を試験するために使用した試験法の標準誤差より高値である量、モジュレートされている、例えば高値又は低値である、試料、例えば増殖性疾患（例えば癌）に罹患した対象由来の試料中のマーカーの発現レベルを指す。好ましくは、試験試料中のマーカーの発現レベルは、対照試料中のマーカーの発現レベルよりも、少なくとも２、より好ましくは３、４、５又は１０倍以上、そして好ましくは数対照試料中のマーカーの平均発現レベルから、モジュレートされている、例えば高値又は低値である。
【０１１０】
マーカーの「過剰発現」又は「発現のより高いレベル」又は「発現の高値」とは、対照試料（例えば正常、非癌組織、例えば隣接する正常組織、又は増殖性疾患、例えば癌に罹患していない健常者対象由来の試料）中のマーカーの発現レベルと比較して、統計学的に有意な量、例えば発現を試験するために使用した試験法の標準誤差より高値である量、そして好ましくは対照試料中のマーカーの発現レベルの少なくとも２倍、より好ましくは３、４、５又は１０倍以上、そして好ましくは数対照試料中のマーカーの平均発現レベルより高値である試料中の発現レベルを指す。
【０１１１】
マーカーの「過少発現」又は「発現のより低いレベル」とは、対照試料（例えば正常、非癌組織、例えば隣接する正常組織、又は増殖性疾患、例えば癌に罹患していない健常者対象由来の試料）中のマーカーの発現レベルと比較して、統計学的に有意な量、例えば発現を試験するために使用した試験法の標準誤差より低値である量、そして好ましくは対照試料中のマーカーの発現レベルより少なくとも２倍、より好ましくは３、４、５又は１０倍以上低値、そして好ましくは数対照試料中のマーカーの平均発現レベルより低値である試料中の発現レベルを指す。
【０１１２】
試料中のマーカーの量、例えばマーカーの発現、又はマーカーの蛋白レベルは、マーカーの量が、量を試験するために使用した試験法の標準誤差より高値である量だけ、そして好ましくはその量の少なくとも２倍、より好ましくは３、４、５又は１０倍以上、対照試料中のレベルよりもそれぞれ高値又は低値である場合、対照試料（例えば正常、非癌組織、例えば隣接する正常組織、又は増殖性疾患、例えば癌に罹患していない健常者対象由来の試料）中のマーカーの量よりも「有意に」高値又は低値となる。或いは、試料中のマーカーの量は、その量が対照試料中のマーカーの量よりも少なくとも約２、そして好ましくは少なくとも約３、４、又は５倍、それぞれ高値又は低値である場合、対照試料中の量よりも「有意に」高値又は低値とみなすことができる。
【０１１３】
マーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１の「モジュレートされた活性」と本明細書において互換的に使用する「改変された活性」という用語は、正常な対照試料中のマーカーの活性と比較して、疾患状態において、例えば増殖性疾患（例えば癌）において、モジュレート、例えば増大又は低下しているマーカーの活性を指す。マーカーの改変又はモジュレートされた活性は、例えば、マーカーの改変又はモジュレートされた発現、マーカーの改変又はモジュレートされた蛋白レベル、マーカーの改変又はモジュレートされた構造、又は、例えばマーカーと同じか又は異なる経路に関与する他の蛋白との改変又はモジュレートされた相互作用、又は転写活性化物質又は抑制物質との改変又はモジュレートされた相互作用、又は改変されたメチル化状態に起因する場合がある。
【０１１４】
マーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１の「モジュレートされた構造」と本明細書において互換的に使用する「改変された構造」という用語は、正常又は野生型の遺伝子又は蛋白と比較して、マーカー遺伝子又はマーカー蛋白内の突然変異又は対立遺伝子変異体、例えば、マーカーの発現又は活性に影響する突然変異の存在を指す。例えば、突然変異は限定しないが、置換、欠失又は付加の突然変異を包含する。突然変異はマーカーのコーディング又は非コーディング領域に存在してよい。
【０１１５】
「転写されたポリヌクレオチド」とは、本発明のマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３の転写、及び場合により転写物の正常な翻訳後プロセシング（例えばスプライシング）及び転写物の逆転写により作成される成熟ＲＮＡの全て又は一部分と相補であるか相同であるポリヌクレオチド（例えばＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡ又はｃＤＮＡの１つの類縁体）である。
【０１１６】
「相補である」とは２核酸鎖の領域間、又は、同じ核酸鎖の２領域間の配列の相補性の広範な概念を指す。第１の核酸領域のアデニン残基は、第１の領域と反平行である第２の核酸領域の残基と、その残基がチミジン又はウラシルである場合は、特異的な水素結合を形成（塩基対形成）することができることが知られている。同様に、第１の核酸鎖のシトシン残基は、第１の鎖と反平行である第２の核酸鎖の残基と、その残基がグアニンである場合は塩基対形成できることが分かっている。核酸分子の第１の領域は、反平行な態様において２領域が配置している場合に第１の領域のヌクレオチド残基少なくとも１つが第２の領域の残基と塩基対形成できれば、同じか又は異なる核酸分子の第２の領域に相補である。好ましくは、第１の領域は第１の部分を含み、そして第２の領域は第２の部分を含むことにより、第１及び第２の部分が反平行の態様に配置した場合に、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％が第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対形成できる。より好ましくは、第１の部分の全てのヌクレオチド残基が第１の部分のヌクレオチド残基と塩基対形成できる。
【０１１７】
「相同性」又は「同一性」という用語は、本明細書において互換的に使用する通り、２ポリヌクレオチド配列間又は２ポリペプチド配列間の配列の同様性を指し、同一性はより厳密な比較である。「パーセント同一性又は相同性」及び「％同一性又は相同性」という表現は、ポリヌクレオチド配列２つ以上又はポリペプチド配列２つ以上の比較において観察される配列同様性のパーセンテージを指す。「配列同様性」とはポリヌクレオチド配列２つ以上の間に塩基対配列におけるパーセント同様性を指す（いずれかの適当な方法で測定した場合）。配列２つ以上は０〜１００％同様の何れか、又はその間の何れかの整数値
であることができる。同一性又は同様性は比較の目的のためにアラインしてよい各配列における位置を比較することにより測定できる。比較される配列における位置が同じヌクレオチド塩基又はアミノ酸で占有されている場合は、分子はその位置において同一である。ポリヌクレオチド配列間の同様性又は同一性の程度は、ポリヌクレオチド配列により共有されている位置における同一又はマッチしたヌクレオチドの数の関数である。ポリペプチド配列の同一性の程度は、ポリペプチド配列により共有されている位置における同一のアミノ酸の数の関数である。ポリペプチド配列の相同性又は同様性の程度は、ポリペプチド配列により共有されている位置におけるアミノ酸の数の関数である。「実質的な相同性」という用語は、本明細書においては、少なくとも５０％、より好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上の相同性を指す。
【０１１８】
「プローブ」という用語は特定の意図する標的分子、例えば本発明のマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１に選択的に結合することができるいずれかの分子を指す。プローブは当該分野で知られる通り合成するか、又は適切な生物学的調整品から誘導することができる。標的分子の検出の目的のためには、プローブは本明細書に記載する通り、標識できるように特に設計してよい。プローブとして利用できる分子の例は、限定しないがＲＮＡ、ＤＮＡ、蛋白、抗体、及び有機単量体を包含する。
【０１１９】
「核酸プローブ」又は「プライマー」は本発明のマーカーポリヌクレオチド、例えばＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチド及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズできる何れかの核酸分子を指す。「核酸プローブ」又は「プライマー」は、Ｃｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドは選択的に検出されるように、例えばＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチド、例えばＣｒｉｐｔｏ−１転写ポリヌクレオチドが低効率で検出されるか、検出されないように、Ｃｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチド、例えばＣｒｉｐｔｏ−３転写ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズできる何れかの核酸分子を包含する。「核酸プローブ」又は「プライマー」は又、Ｃｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドは選択的に検出されるように、例えばＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチド、例えばＣｒｉｐｔｏ−３転写ポリヌクレオチドが低効率で検出されるか、検出されないように、Ｃｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチド、例えばＣｒｉｐｔｏ−１転写ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズできる何れかの核酸分子を包含する。
【０１２０】
マーカー又はプローブ（例えば核酸プローブ又はプライマー）は、それが基板に共有結合的又は非共有結合的に会合しており、そしてかなりの画分のマーカーが基板から解離することなく流体（例えば標準的なクエン酸塩、ｐＨ７．４）で洗浄できれば、基板に「固定されている」。
【０１２１】
本明細書においては、「天然に存在する」核酸分子とは天然界に存在する（例えば天然に存在する蛋白をコードする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡ又はＤＮＡ分子を指す。
【０１２２】
本明細書においては、「増殖性疾患」とは望ましくない細胞増殖を伴った何れかの疾患、例えば癌を指す。増殖性疾患の限定しない例は、本明細書においては、乳がん、肺癌、結腸直腸癌、精巣癌、卵巣癌、腎臓癌、子宮癌、子宮頸癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌，胃癌、中枢神経系の癌、黒色腫、リンパ腫、及び白血病を包含する。
【０１２３】
増殖性疾患、例えば癌は、増殖性疾患の症状少なくとも１つが軽減、終了、緩徐化、又は防止されれば、「モジュレート」、例えば「抑制」される。本明細書においては、増殖性疾患、例えば癌はまた、増殖性疾患（例えば腫瘍）の回帰、再発又は転移が低減、緩徐化、遅延又は防止されれば「抑制される」。
【０１２４】
本明細書においては、「対象」とは、脊椎動物、特に哺乳類の種のメンバーを指し、そして限定しないが家畜動物、競技用動物、及び霊長類、例えばヒトを包含する。
【０１２５】
本明細書においては、「プロモーター」、「調節配列」又は「プロモーターエレメント」という用語は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結した遺伝子産物の発現のために必要な核酸配列を意味する。一部の例においてはこの配列はコアプロモーター配列出会ってよく、そして別の例においてはこの配列はエンハンサー配列および遺伝子産物の発現のために必要な他の調節エレメントも包含してよい。プロモーター／調節配列は、例えば空間的又は時間的に制限された態様において遺伝子産物を発現するものであってよい。
【０１２６】
「構成」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか、それを特定するポリヌクレオチドに作動可能に連結した場合に、細胞の大部分又は全ての生理学的条件下において細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
【０１２７】
「誘導」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか、それを特定するポリヌクレオチドに作動可能に連結した場合に、実質的にプロモーターに相当するインデューサーが細胞内に存在する場合においてのみ、細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
【０１２８】
「組織特異的プロモーター」、「空間的に制限されたプロモーター又は調節配列」又は「空間的に制限されたプロモーターエレメント」とは、遺伝子産物をコードするか、それを特定するポリヌクレオチドに作動可能に連結した場合に、実質的に細胞がプロモーターに相当する組織型の細胞である場合においてのみ、細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
【０１２９】
「時間的に制限されたプロモーター又は調節配列」又は「時間的に制限されたプロモーターエレメント」とは、遺伝子産物をコードするか、それを特定するポリヌクレオチドに作動可能に連結した場合に、実質的に細胞が特定の発達段階にあるか、プロモーターの発現を誘導する薬剤、例えばテトラサイクリン又はタモキシフェンに曝露されている場合においてのみ、生存ヒト細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
【０１３０】
キットは本発明のマーカーを特異的に検出するための少なくとも１つの試薬、例えばプローブを含む何れかの製造物（例えばパッケージ又はコンテナー）であり、その製造物は本発明の方法を実施するための単位として宣伝、流通又は販売されているものである。
【０１３１】
ＩＩ．本発明の使用
本発明は細胞の形質転換に関与するマーカー、例えば対照（例えば非罹患又は正常）細胞と比較して、増殖性疾患、例えば癌に罹患した細胞において優先的に発現されるマーカー、例えば、Ｃｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１の発見に部分的には基づいている。本発明のマーカーは正常及び罹患細胞の一方又は両方において検出されることができるＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ又はポリペプチド分子であってよい。
【０１３２】
試料中、例えば組織又は細胞、例えば腫瘍組織又は細胞を含有する試料、又は生物学的流体、例えば全血、血清、血漿、口腔スワブ、唾液、脊髄液、脳脊髄液、尿、便中のマーカーの量、構造、及び／又は活性、例えば存在、非存在、発現レベル、蛋白レベル、蛋白活性、突然変異、例えばマーカーの活性に影響する突然変異（例えば置換、欠失、又は付加の突然変異）の存在、及び／又はメチル化状態は、本明細書においては、細胞の形質転換の状態に相関付ける。
【０１３３】
即ち本発明は試料中のマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１の存在を検出するための組成物、キット及び方法を提供する。これらの組成物、キット及び方法は腫瘍の表現型、例えばＣｒｉｐｔｏ発現表現型、例えば腫瘍がＣｒｉｐｔｏ−１又はＣｒｉｐｔｏ−３を発現するかどうかを調べるために有用である。これらの組成物、キット及び方法は又、細胞の形質転換状態を試験するため、並びに患者が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法に対する適当な候補であるかどうかを試験するために有用である。
【０１３４】
本発明の組成物、キット及び方法は特に以下の用途を有する。
１）試料中のマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−１及び／又はＣｒｉｐｔｏ−３、例えばＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドを検出すること；
２）細胞が形質転換されるか、又は形質転換される危険性を有するかどうかを試験すること；
３）試料中の形質転換された、又は悪政の細胞の存在を試験すること；
４）対象における腫瘍の良性又は悪性の性質を試験すること；
５）腫瘍の表現型、例えば腫瘍がＣｒｉｐｔｏ−１又はＣｒｉｐｔｏ−３発現腫瘍であるかどうかを試験すること；
６）対象が増殖性の疾患、障害又は状態に罹患しているかどうかを試験すること；
７）腫瘍に罹患している対象が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体系の治療に対する適当な候補であるかどうかを試験すること；
８）治療、例えば抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体系治療に対する腫瘍罹患対象の応答性を予測すること；
９）Ｃｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドを検出するため、細胞が形質転換されるかどうかを試験するため、患者が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法に対する適当な候補であるかどうかを試験するため、増殖性疾患、障害又は状態を治療するため、及び／又は対象が増殖性疾患、障害又は状態に罹患しているかどうかを試験するために有用である抗体、抗体フラグメント又は抗体誘導体を作成すること；
１０）細胞の形質転換を抑制するための試験化合物１つ以上の薬効を試験すること；
１１）試験化合物の発癌潜在性を試験すること。
【０１３５】
すなわち本発明はマーカーポリヌクレオチド、例えばＣｒｉｐｔｏ−３又はＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドの試料中の存在を検出するための組成物、キット及び方法を包含する。１つの実施形態において、方法は転写されたＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする核酸分子に試料を接触させること、ここで転写されたＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドはＣｒｉｐｔｏ−３遺伝子のコーディング領域を含むものであること、及び、核酸分子が試料中のポリヌクレオチドに結合するかどうかを調べることを含む。別の実施形態においては、方法は転写されたＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする核酸分子に試料を接触させること、ここで転写されたＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドはＣｒｉｐｔｏ−１遺伝子のコーディング領域を含むものであること、及び、核酸分子が試料中のポリヌクレオチドに結合するかどうかを調べることを含む。
【０１３６】
本発明は更にマーカーポリペプチド、例えばＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチド又はＣｒｉｐｔｏ−１ポリペプチドの試料中の存在を検出するための組成物、キット及び方法を包含する。１つの実施形態において、方法はＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドに選択的に結合する試薬に試料を接触させること、及び、試料中のポリペプチドに試薬が結合するかどうか調べることを含む。別の実施形態において、方法はＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドに選択的に結合する試薬に試料を接触させること、及び、試料中のポリペプチドに試薬が結合するかどうか調べることを含む。
【０１３７】
試料中の本明細書のマーカーの存在を検出するためのこれらの組成物、キット及び方法は腫瘍の表現型、例えば腫瘍がＣｒｉｐｔｏ−３又はＣｒｉｐｔｏ−１発現腫瘍であるかどうかを調べるために有用である。本発明は又細胞が形質転換されるかどうかを試験するため、例えば、癌の診断のために有用である。これらの組成物、キット及び方法は更に患者が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体系療法に対する適当な候補であるかどうかを試験するためにも有用である。
【０１３８】
従って、本発明は細胞が形質転換されるかどうかを試験する方法を提供する。この方法は、試験試料中のマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３の量、構造、又は活性、例えば存在、非存在、発現レベル、蛋白レベル、蛋白活性、  突然変異、例えばマーカーの活性に影響する突然変異（例えば置換、欠失、又は付加の突然変異）の存在、及び／又はメチル化状態を、正常な非形質転換細胞におけるレベルと比較することを含む。正常な非形質転換細胞と比較した場合の試験細胞中のマーカーの量、構造又は活性における有意差、例えば増大は細胞が形質転換されることを示す。
【０１３９】
本発明は更に腫瘍のＣｒｉｐｔｏ発現表現型を測定する方法を提供する。この方法は腫瘍試料中のＣｒｉｐｔｏ−３の量、構造又は活性を腫瘍試料中のＣｒｉｐｔｏ−１の量、構造又は活性と比較することを含む。腫瘍試料中のＣｒｉｐｔｏ−１と比較した場合のＣｒｉｐｔｏ−３の量、構造又は活性の有意差、例えば増大は腫瘍がＣｒｉｐｔｏ−３発現腫瘍であることを示す。腫瘍試料中のＣｒｉｐｔｏ−３と比較した場合のＣｒｉｐｔｏ−１の量、構造又は活性の有意差、例えば増大は腫瘍がＣｒｉｐｔｏ−１発現腫瘍であることを示す。
【０１４０】
本発明は又、患者が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法に対する適当な候補であるかどうかを試験する方法を提供する。方法は患者試料中のマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３の、量、構造及び／又は活性、例えば存在、非存在、コピー数、発現レベル、蛋白レベル、蛋白活性、突然変異、例えばマーカーの活性に影響する突然変異（例えば置換、欠失、又は付加の突然変異）の存在、及び／又はメチル化状態を、対照非癌試料のレベルと比較することを含む。対照非癌試料中のレベルと比較した場合の患者試料中のマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３の量、構造又は活性の有意差、例えば増大は、患者が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法に対する適当な候補であることを示す。
【０１４１】
更に又、マーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１の改変された量、構造及び／又は活性に関してより多数の対象試料を試験し、そして、試料入手元の個体対象の結果を相関付けるに従って、マーカーの改変された量、構造及び／又は活性は、癌又は腫瘍の特定の型と、又は療法、例えば抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法に対する特定の応答、例えば抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法に対する陽性又は陰性の応答を有する癌又は腫瘍と強い相関があることが確認されることになる。即ち、本発明の組成物、キット及び方法は、対象における例えば癌又は腫瘍の段階、等級、組織学的型、良性／前悪性／悪性の性質、及びその抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法への予測される応答又は転帰を特性化するために有用である。
【０１４２】
当然ながら、本発明の組成物、キット及び方法は、増殖性疾患、障害又は状態を発症する危険性が増大している対象、およびそれらの医療上の助言者に対して、特定の利用性を呈する。増殖性疾患、障害又は状態を発症する危険性が増大していると認識される対象は、例えば、増殖性疾患、障害又は状態の家族歴を有する対象、突然変異癌遺伝子（即ち少なくとも１つ対立遺伝子）を有することが発見された対象、および高齢者対象を包含する。
【０１４３】
正常（即ち非罹患）ヒト組織における例えばマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１の量、構造、及び／又は活性のモジュレーション、例えば改変は種々の方法で試験することができる。１つの実施形態において、発現の正常レベルは非罹患であることがわかっている細胞の一部分におけるマーカーのエスのレベルを試験することにより、そして、発現のこの正常レベルを、疾患を有する、又は罹患していると疑われる細胞の一部分における発現のレベルと比較することにより試験する。或いは、そして特に、本明細書に記載した方法の日常的実施の結果としてさらに情報が入手できるようになるに従い、本発明のマーカーの「正常な」量、構造、及び／又は活性に関する集団平均値を使用してよい。別の実施形態においては、マーカーの「正常な」量、構造、及び／又は活性は、非増殖性疾患、障害又は状態に罹患した対象から、対象における増殖性疾患、障害又は状態の発生が疑われる前に対象から得られた対象試料から、アーカイブの対象試料から得られる対象試料中のマーカーの量、構造、及び／又は活性を試験することにより測定してよい。
【０１４４】
本発明は試料（例えばアーカイブの組織試料又は対象から得られた試料）中の本発明のマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１の存在を検出するための組成物、キット及び方法を包含する。本発明は更に、腫瘍のＣｒｉｐｔｏ発現表現型、例えば腫瘍がＣｒｉｐｔｏ−１又はＣｒｉｐｔｏ−３発現腫瘍であるかどうかを調べるための組成物、キット及び方法を包含する。本発明は更に細胞が形質転換されるかどうかを試験するための組成物、キット及び方法を包含する。本発明は更に患者が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法に対する適当な候補であるかどうかを試験するための組成物、キット及び方法を包含する。必要に応じて、組成物、キット及び方法は試料の特定の型による使用に適合される。例えば試料がパラフィン包埋されたアーカイブのヒト組織試料である場合、それは本発明の組成物中、本発明のキットにおける、又は使用する方法において、化合物の比を調節する必要がある場合がある。そのような方法は当該分野で良く知られており、そして当業者の知る通りである。
【０１４５】
即ち本発明は、試料（例えば対象の組織試料）中の本発明のマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１の量、例えば発現を検出又は試験するためのキットを包含する。本発明は更に形質転換された細胞（例えば対象試料のような試料中）の存在を試験するためのキットを包含する。本発明は更に抗Ｃｒｉｐｔｏ抗療法に対して患者が適当な候補であるかどうかを試験するためのキットを包含する。キットは本発明のマーカーを識別する、例えば本発明のマーカーに相当する核酸又はポリペプチドに特異的に結合することができる試薬１つ以上を含んでよい。本発明のマーカーに相当するポリペプチドに結合するための適当な試薬は、抗体、抗体誘導体、抗体フラグメント等を包含する。核酸（例えばゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライシングされたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等）に結合するための適当な試薬は、相補核酸を包含する。例えば、核酸試薬は基板に固定されたオリゴヌクレオチド（標識又は未標識）、基板に結合していない標識オリゴヌクレオチド、ＰＣＲプライマー対、分子ビーコンプローブ等を包含してよい。
【０１４６】
本発明のキットは場合により本発明の方法を実施するために有用な追加的成分を含んでよい。例示すればキットは相補核酸をアニーリングするため、又は、抗体をそれが特異的に結合する蛋白に結合させるために適する流体（例えばＳＳＣ緩衝液）、試料コンパートメント１つ以上、本発明の方法の実施に関して説明する説明書、正常細胞の試料、神経膠細胞の試料等を含んでよい。
【０１４７】
本発明のキットはマーカーの蛋白レベル又は蛋白活性を測定するために有用な試薬を含んでよい。
【０１４８】
本発明は又本発明の方法及びキットにおいて有用な単離されたモノクローナル抗体を作成する方法を包含する。モノクローナル抗体は当該分野で知られた方法を用いて作成してよい。例えば本発明のマーカーに相当する蛋白又はその免疫原性の部分、例えばＣｒｉｐｔｏ−３を単離してよく（例えばそれが発現される細胞からの精製によるか、又は知られた方法を用いたインビボ又はインビトロの蛋白をコードする核酸の転写および翻訳による）、そして、脊椎動物、好ましくは哺乳類、例えばマウス、ラット、ウサギ、又はヤギを単離した蛋白を用いて免疫化する。脊椎動物は場合により（そして好ましくは）、脊椎動物が蛋白に対する頑健な免疫応答を呈するように、単離された蛋白を用いて少なくとも更に１回免疫化する。脾細胞を免疫化脊椎動物から単離し、当該分野で良く知られている種々の方法の何れかを用いて不朽化細胞系統と融合することにより、ハイブリドーマを形成する。このような態様において形成されたハイブリドーマを次に、標準的な方法を用いてスクリーニングすることにより蛋白に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ１つ以上を発見する。本発明は又この方法により作成されたハイブリドーマ、およびそのようなハイブリドーマを用いて作成された抗体も包含する。他の抗体を作成する他の方法は当該分野で知られており、後に詳述する通りである。
【０１４９】
本発明は又細胞の形質転換をモジュレート、例えば抑制することに関して、試験化合物の薬効を試験する方法を包含する。上記した通り、本発明のマーカーの量、本発明の発現のレベルの相違は、細胞の形質転換状態に相関する。本発明のマーカーの量のレベル、例えば発現における変化は細胞の形質転換状態に起因する場合があり、或いは形質転換された状態を誘導、維持及び増進する場合がある。即ち、対象における増殖性疾患、障害又は状態をモジュレート、例えば抑制する化合物は、そのマーカーに関する正常レベルの近傍のレベル（例えば非罹患細胞におけるマーカーに関する量、例えば発現）まで、変化、例えば、本発明のマーカーの発現の変化を誘発する場合がある。
【０１５０】
即ち本方法は、試験化合物存在下に維持されている第１の細胞試料中のマーカーの量、例えば発現をと試験化合物非存在下に維持されている第２の細胞試料中のマーカーの量、例えば発現を比較することを含む。マーカーの量、例えば発現における有意なモジュレーション、例えば低下は化合物が細胞の形質転換をモジュレートすることを示している。細胞試料は、例えば、対象から得られた正常細胞の単一の試料の小分量、対象から得られた正常細胞のプールされた試料、正常な細胞系統の細胞、対象から得られた罹患細胞の単一の試料の小分量、対象から得られた罹患細胞のプールされた試料、増殖性疾患、障害又は状態の動物モデル由来の細胞等であってよい。
【０１５１】
上記した通り、細胞の形質転換状態は本発明のマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３の量における変化に相関している。即ち、マーカーの増大した発現又は活性を誘導する化合物は細胞の発癌性又は増殖性の疾患、障害又は状態を誘導することができる。本発明は又試験化合物のヒト細胞発癌潜在性を試験するための方法を包含する。この方法は試験化合物の存在下又は非存在下にヒト細胞の別個の小分量を維持することを含む。小分量の各々におけるマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３の発現を比較する。試験化合物の存在下に維持されている小分量中のマーカーの量の（試験化合物非存在下に維持されている小分量と相対比較した場合の）有意なモジュレーション、例えば有意な増大は、試験化合物がヒト細胞発癌潜在性、又は増殖性の疾患、障害又は状態を誘導する能力を保有していることを示している。種々の試験化合物の相対的な疾患誘発潜在性はマーカーの量の増強の程度を比較することにより試験できる。
【０１５２】
ＩＩＩ．単離された核酸分子
本発明の１つの特徴は本発明のマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１に相当する核酸分子、例えばマーカーポリペプチド又はそのようなポリペプチドの一部分をコードする核酸に関する。本発明の核酸分子は又、マーカー遺伝子、例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１に相当する核酸分子を発見するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するために十分な核酸分子、例えばマーカーポリペプチドをコードする核酸分子、およびそのような核酸分子のフラグメント、例えば核酸分子の増幅又は突然変異のためのＰＣＲプライマーとして使用するのに適するものも包含する。本明細書においては、「核酸分子」という用語はＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）及びヌクレオチド類縁体を用いて形成されたＤＮＡ又はＲＮＡの類縁体を包含することを意図している。核酸分子は１本鎖又は２本鎖であることができる。
【０１５３】
１つの実施形態において、本発明の核酸分子は単離された核酸分子である。「単離された」核酸分子とは核酸分子の天然の原料中に存在する他の核酸分子から分離されているものである。好ましくは、「単離された」核酸分子は核酸分子の誘導元である生物のゲノムＤＮＡ中で核酸に天然にフランキングしている（即ち核酸の５’及び３’末端に位置する）配列（好ましくは蛋白コード配列）を含有しない。例えば、種々の実施形態において、単離された核酸分子は核酸分子の誘導元である細胞のゲノムＤＮＡ中で核酸に天然にフランキングしているヌクレオチド配列の約５ｋＢ、４ｋＢ、３ｋＢ、２ｋＢ、１ｋＢ、０．５ｋＢ又は０．１ｋＢ未満を含有することができる。更に又、「単離された」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、組み換え手法により製造された場合に他の細胞物質又は培地を実質的に含まないか、又は、化学合成された場合には化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まないことができる。
【０１５４】
本発明の核酸分子、例えばＣｒｉｐｔｏ−３蛋白又はそのフラグメント又はＣｒｉｐｔｏ−１蛋白又はそのフラグメントをコードする核酸分子は標準的な分子生物学の手法及び本明細書に記載したデータベースレコード中の配列情報を用いて単離できる。そのような核酸分子配列の全体又は一部分を用いながら、本発明の核酸分子は標準的なハイブリダイゼーション及びクローニング手法を用いて単離できる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載）。
【０１５５】
本発明の核酸分子は鋳型としてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡ、及び適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いながら、標準的なＰＣＲ増幅手法に従って増幅できる。このようにして増幅された核酸分子を適切なベクター内にクローニングし、ＤＮＡ配列分析により特性化することができる。更に又、本発明の核酸分子の全体又は一部分に相当するオリゴヌクレオチドを例えば自動ＤＮＡ合成装置を用いながら、標準的な合成手法により製造できる。
【０１５６】
１つの実施形態において、本発明の核酸分子はＣｒｉｐｔｏ−３遺伝子に相当する核酸のヌクレオチド配列に対して、又はＣｒｉｐｔｏ−３蛋白をコードする核酸のヌクレオチド配列に対して相補であるヌクレオチド配列を有する核酸分子を含む。別の実施形態においては、本発明の核酸分子はＣｒｉｐｔｏ−１遺伝子に相当する核酸のヌクレオチド配列に対して、又はＣｒｉｐｔｏ−１蛋白をコードする核酸のヌクレオチド配列に対して相補であるヌクレオチド配列を有する核酸分子を含む。好ましいＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドは図ＩＣに示すヌクレオチド配列（配列番号４）を有する。好ましいＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドは図ＩＢに示すヌクレオチド配列（配列番号３）を有する。所定のヌクレオチド配列に対して相補である核酸分子は、その所定のヌクレオチド配列にハイブリダイズして安定なデュプレックスを形成することができる程度に所定のヌクレオチド配列に対して十分相補であるものである。
【０１５７】
１つの実施形態において、本発明の核酸分子は、完全長の核酸配列がＣｒｉｐｔｏ−３遺伝子を含むか、Ｃｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドをコードする場合のその核酸配列の僅か一部分のみを含む。別の実施形態においては、完全長の核酸配列がＣｒｉｐｔｏ−１遺伝子を含むか、Ｃｒｉｐｔｏ−１ポリペプチドをコードする場合のその核酸配列の僅か一部分のみを含む。そのような核酸分子は例えばプローブ又はプライマーとして有用である。プローブ又はプロモーターは典型的には実質的に精製されたオリゴヌクレオチドの形態にある。オリゴヌクレオチドは典型的には本発明の核酸の少なくとも約７、好ましくは約１５、より好ましくは約２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、又は４００又はそれ以上の連続ヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドはＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチド、例えば転写されたポリヌクレオチドの約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０又はそれ以上の連続ヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【０１５８】
Ｃｒｉｐｔｏ−３核酸分子の配列に基づいた核酸プローブはＣｒｉｐｔｏ−３転写ポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを検出するために使用できる。Ｃｒｉｐｔｏ−１核酸分子の配列に基づいた核酸プローブはＣｒｉｐｔｏ−１転写ポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを検出するために使用できる。プローブは自身に結合した標識基を含むことができ、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素、又は酵素コファクターが挙げられる。そのようなプローブは試料中のＣｒｉｐｔｏ−３又はＣｒｉｐｔｏ１転写ポリヌクレオチドの存在を特異的に検出するために使用できる。そのようなプローブは又、キットの一部として、例えば対象由来の細胞の試料中のＣｒｉｐｔｏ−３転写ポリヌクレオチドのレベルを測定すること、例えばｍＲＮＡレベルを検出することにより、マーカー遺伝子を過剰発現する細胞又は組織、例えば形質転換された細胞又は腫瘍組織を発見するために使用できる。
【０１５９】
１つの実施形態において、本発明の核酸分子は少なくとも７、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５５０、６５０、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３５００、４０００、４５００、又はそれ以上のヌクレオチド長であり、そしてＣｒｉｐｔｏ−３遺伝子に相当する核酸分子、又はＣｒｉｐｔｏ−３蛋白をコードする核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。別の実施形態においては、本発明の核酸分子は少なくとも７、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５５０、６５０、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３５００、４０００、４５００、又はそれ以上のヌクレオチド長であり、そしてＣｒｉｐｔｏ−１遺伝子に相当する核酸分子、又はＣｒｉｐｔｏ−１蛋白をコードする核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【０１６０】
本明細書においては、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は相互に少なくとも６０％、６５％、７０％、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％同一であるヌクレオチド配列が相互にハイブリダイズした状態で残存するハイブリダイゼーション及び戦場の条件を説明することを意図している。そのようなストリンジェントな条件は当該分野で知られており、そしてＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９８９）のセクション６．３．１〜６．３．６に記載されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃、その後一回以上の洗浄を０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０〜６５℃で行うハイブリダイゼーションを包含する。好ましいハイブリダイゼーション条件は又Ｃｒｉｐｔｏ−１核酸の存在下でＣｒｉｐｔｏ−３核酸の特異的検出を可能にする。
【０１６１】
試料中のＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドの特異的検出のための本発明において特に有用なハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は（ｉ）１時間４２℃において予備ハイブリダイゼーション溶液（６ＸＳＳＣ、５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、１００ｕｇ／ｍｌｔＲＮＡ、０．５％ＳＤＳ）中予備ハイブリダイズ；（ｉｉ）一夜４２℃において（例えば１０６〜１０７ＣＰＭ／ｍｌの放射標識核酸プローブと共に）ハイブリダイゼーション溶液（６ＸＳＳＣ、５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、０．５％ＳＤＳ）中、核酸プローブ（例えば検出可能となるように修飾された、例えば放射標識された、例えば５’末端において３２Ｐで標識された核酸）とハイブリダイズ；及び（ｉｉｉ）例えば３回、２０分間４２℃において洗浄溶液（０．１％ＳＤＳ含有６ＸＳＳＣ）で洗浄することを含む。当業者の知る通りＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチド又はＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドの特異的検出のための最適なハイブリダイゼーション条件は使用される特定の核酸プローブにより変動する。特定の核酸プローブに対する最適なハイブリダイゼーション条件は、当該分野で知られた定型的な方法を超えない方法により当業者が決定できるものである。
【０１６２】
本発明の１つの実施形態において、核酸分子（例えばプローブ又はプライマー）は転写されたＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドの一部分にハイブリダイズし、その部分は、転写されたＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドの存在下において転写されたＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドが選択的に検出される、例えば特異的に検出されるように、Ｃｒｉｐｔｏ−１と比較してＣｒｉｐｔｏ−３にユニークである１つ以上のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、核酸分子（例えばプローブ又はプライマー）は転写されたＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドが弱く検出されるように、転写されたＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドに対しては弱くハイブリダイズする。より好ましくは、核酸分子（例えばプローブ又はプライマー）は転写されたＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドが検出されないように、転写されたＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドに対してはハイブリダイズしない。本発明の別の実施形態においては、核酸分子（例えばプローブ又はプライマー）は転写されたＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドの一部分にハイブリダイズし、その部分は、転写されたＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドの存在下において転写されたＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドが選択的に検出される、例えば特異的に検出されるように、Ｃｒｉｐｔｏ−３と比較してＣｒｉｐｔｏ−１にユニークである１つ以上のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、核酸分子（例えばプローブ又はプライマー）は転写されたＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドが弱く検出されるように、転写されたＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドに対しては弱くハイブリダイズする。より好ましくは、核酸分子（例えばプローブ又はプライマー）は転写されたＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドが検出されないように、転写されたＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドに対してはハイブリダイズしない。
【０１６３】
１つの実施形態において本発明の核酸分子（例えばプローブ又はプライマー）は少なくとも７、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０又はそれ以上のヌクレオチド長であり、そしてマーカー遺伝子に相当する核酸分子（例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１）に対し、又はマーカー蛋白をコードする核酸分子（例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１）、例えば転写されたポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに対し、選択的にハイブリダイズし、そしてマーカー核酸分子の増幅、例えばＰＣＲ増幅のために有用である。１つの好ましい実施形態においては、核酸分子（例えばプライマー）は例えばＣｒｉｐｔｏ−１核酸分子、例えばＣｒｉｐｔｏ−１転写ポリヌクレオチドの存在下において、Ｃｒｉｐｔｏ−３核酸分子、例えばＣｒｉｐｔｏ−３転写ポリヌクレオチドを選択的に増幅することができる。好ましくは、核酸分子（例えばプライマー）は転写されたＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドが弱く増幅されるように、転写されたＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドに対しては弱くハイブリダイズする。より好ましくは、核酸分子（例えばプライマー）は転写されたＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドが増幅されないように、転写されたＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドに対してはハイブリダイズしない。別の好ましい実施形態においては、核酸分子（例えばプライマー）は例えばＣｒｉｐｔｏ−３核酸分子、例えばＣｒｉｐｔｏ−３転写ポリヌクレオチドの存在下において、Ｃｒｉｐｔｏ−３核酸分子、例えばＣｒｉｐｔｏ−３転写ポリヌクレオチドを選択的に増幅することができる。好ましくは、核酸分子（例えばプライマー）は転写されたＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドが弱く増幅されるように、転写されたＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドに対しては弱くハイブリダイズする。より好ましくは、核酸分子（例えばプライマー）は転写されたＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドが増幅されないように、転写されたＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドに対してはハイブリダイズしない。
【０１６４】
１つの実施形態において、本発明の核酸分子は転写されたＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドの一部分にハイブリダイズし、その部分はＣｒｉｐｔｏ−１蛋白と比較してＣｒｉｐｔｏ−３蛋白にユニークな１つ以上のアミノ酸、例えばＶ７、Ｌ６８、Ｅ９２及びＡ１７８よりなる群から選択されるＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチド配列内の１つ以上のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含む。別の実施形態においては、本発明の核酸分子は転写されたＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドの一部分にハイブリダイズし、その部分はＣｒｉｐｔｏ−３蛋白と比較してＣｒｉｐｔｏ−１蛋白にユニークな１つ以上のアミノ酸、をコードする核酸配列を含む。１つの好ましい実施形態においては、Ｃｒｉｐｔｏ−３蛋白と比較してＣｒｉｐｔｏ−１蛋白にユニークな１つ以上のアミノ酸はＡ７、Ｐ６８、Ｇ９２、Ｖ１７８、Ｖ２２及びＹ４３よりなる群から選択される。別の好ましい実施形態においては、Ｃｒｉｐｔｏ−３蛋白と比較してＣｒｉｐｔｏ−１蛋白にユニークな１つ以上のアミノ酸はＡ７、Ｐ６８、Ｇ９２、およびＶ１７８よりなる群から選択される。
【０１６５】
Ｃｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチド又はＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドの選択的検出のための本発明において有用な核酸分子の非限定的な例は表２に示すとおりである。表２に示す核酸分子（プローブ）はＣｒｉｐｔｏＤＮＡ配列のアンチセンス又は鋳型鎖に相当する。即ち表２に示す核酸分子はＣｒｉｐｔｏ−３又はＣｒｉｐｔｏ−１ｍＲＮＡに相補であり（ｍＲＮＡはセンス又はコーディング鎖に相当する）、そして試料中のＣｒｉｐｔｏｍＲＮＡを検出するためにＣｒｉｐｔｏ−３又はＣｒｉｐｔｏ−１ｍＲＮＡにハイブリダイズするために有用である。当業者の知る通り、表２に示す核酸分子（プローブ）の相補体はＣｒｉｐｔｏ−３又はＣｒｉｐｔｏ−１ＤＮＡのセンス又はコーディング鎖に相当し、そしてこのため、試料中のＣｒｉｐｔｏｃＤＮＡを検出するためにＣｒｉｐｔｏｃＤＮＡにハイブリダイズするために有用である（ｃＤＮＡはアンチセンス又は鋳型鎖に相当する）。表２に示す核酸分子は試料中のＣｒｉｐｔｏ−３転写ポリヌクレオチドの特異的検出、又はＣｒｉｐｔｏ−１転写ポリヌクレオチドの特異的検出のための、本明細書に記載した方法の何れかにおいて有用である。表２に示す核酸分子は特に、試料中のＣｒｉｐｔｏ−３転写ポリヌクレオチド又はＣｒｉｐｔｏ−１転写ポリヌクレオチドの検出のためのノーザン及びサザンブロット分析において有用である。
【０１６６】
【表２−１】
2009535033.tif 000004
【０１６７】
【表２−２】
2009535033.tif 000005
試料中のマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３又はＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドの選択的検出のために有用な核酸分子の別の例は、マーカーポリヌクレオチドに対して特異的な、そしてマーカーポリヌクレオチドの増幅に適する核酸分子（プライマー）である。好ましくは、これらの核酸分子（プライマー）は試料中のマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３又はＣｒｉｐｔｏ−１転写ポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のためのプライマーとして特に有用である。転写されたポリヌクレオチドの増幅のために有用である核酸分子（プライマー）は一般的に、対、例えばＣｒｉｐｔｏ−３ＤＮＡ配列（例えば図１Ｃに示すＣｒｉｐｔｏ−３をコードするヌクレオチド配列）のアンチセンス又は鋳型鎖に相当する１つの核酸分子（プライマー）、及びＣｒｉｐｔｏ−３ＤＮＡ配列（例えば図１Ｃに示すＣｒｉｐｔｏ−３をコードするヌクレオチド配列）のセンス又はコーディング鎖に相当する第２の核酸分子（プライマー）を含む対において使用される。即ち、例えば表３に示すように、核酸分子又はプライマーの対は、試料中の転写されたポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを特異的に検出するための、２つの核酸プライマーによりフランキングされている、転写されたポリヌクレオチド、例えばＣｒｉｐｔｏ−３ｍＲＮＡ（ここでｍＲＮＡはセンス又はコーディング鎖に相当する）及び／又はＣｒｉｐｔｏ−３ｃＤＮＡ（ここでｃＤＮＡはアンチセンス又は鋳型鎖に相当する）の一部分の増幅のために有用である。そのような核酸分子（プライマー）の非限定的な例は表３に示す通りである。表３に示した核酸分子はフォワード及びリバースプライマーの特定の対として提示したが、当業者の知る通り、フォワード及びリバースプライマー、例えば表３のプライマー類の他の組み合わせもＣｒｉｐｔｏ−３又はＣｒｉｐｔｏ−１転写ポリヌクレオチドを特異的に増幅するために使用してよい。更に当業者の知る通り、表３に示す核酸分子が本発明の増幅方法、例えばＰＣＲ、例えば定量的ＰＣＲにおいて特に有用であるが、試料中のＣｒｉｐｔｏ−３転写ポリヌクレオチドの特異的検出のため、又は、Ｃｒｉｐｔｏ−１転写ポリヌクレオチドの特異的検出のための本明細書に記載した他の検出方法の何れかにおいても有用である。
【０１６８】
【表３】
2009535033.tif 000006
本発明は、試料中のＣｒｉｐｔｏ−３又はＣｒｉｐｔｏ−１核酸分子の存在を定量するために分子ビーコンが有用であるような、本明細書に記載した又Ｃｒｉｐｔｏ−３又はＣｒｉｐｔｏ−１核酸分子に相補である領域少なくとも１つを有する分子ビーコン核酸分子を包含する。「分子ビーコン」核酸とは、相補領域の対を含み、そして蛍光団及びそれに会合した蛍光クエンチャーを有する核酸分子である。蛍光団及びクエンチャーは、相補領域が相互にアニーリングした場合に蛍光団の蛍光がクエンチャーによりクエンチングされるような方向において核酸の異なる部分と会合している。核酸分子の相補領域が相互にアニーリングしない場合、蛍光団の蛍光のクエンチングの程度は低くなる。分子ビーコン核酸分子は例えば米国特許５，８７６，９３０に記載されている。
【０１６９】
１つの実施形態において、核酸分子は核酸の誘導元である生物のゲノムＤＮＡ中で核酸に天然にフランキングしている配列（即ち核酸の５’及び３’末端に位置する配列）を含有することができる。種々の実施形態において、単離された核酸分子は核酸分子の誘導元である細胞のゲノムＤＮＡ中で核酸分子に天然にフランキングしているヌクレオチド配列の約１００ｋＢ、５０ｋＢ、２５ｋＢ、１５ｋＢ、１０ｋＢ、５ｋＢ、４ｋＢ、３ｋＢ、２ｋＢ、１ｋＢ、０．５ｋＢ又は０．１ｋＢ未満を含有することができる。例えば種々の実施形態において、本発明の核酸分子は開始シグナル、例えば開始ＡＴＧコドンに対して近位、又は５’側である時間的及び空間的な調節エレメント（例えば特定の組織に対し、又は特定の発達段階に対して本発明のマーカーの発現を限定するエレメント）を含有する。更に又、核酸分子は組み換え手法により製造された場合に他の細胞物質又は培地を実質的に含まないか、又は、化学合成された場合には化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まないことができる。
【０１７０】
当業者の知る通り、本発明は更に、例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１のようなマーカー蛋白をコードする核酸のヌクレオチド配列とは、遺伝子コードの縮重のために異なっており、そしてそのため、同じ蛋白をコードしている核酸分子を包含する。やはり当業者の知る通り、アミノ酸配列の変化をもたらすＤＮＡ配列の多形が集団内に存在する場合がある（例えばヒト集団）。そのような遺伝子多形は天然の対立遺伝子変異のために集団内の個体の間で存在する場合がある。対立遺伝子は所定の遺伝子座において代替的に存在する遺伝子の群の１つである。更に又、当然ながら、ＲＮＡ発現レベルに影響するＤＮＡ多形であってその遺伝子の全体的発現レベルに影響する場合のあるものもまた存在する場合がある。
【０１７１】
本明細書においては、「対立遺伝子変異体」という表現は所定の遺伝子座に存在するヌクレオチド配列、又はヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを指す。
【０１７２】
本明細書においては、「遺伝子」及び「組み換え遺伝子」という用語は、Ｃｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を指す。そのような天然の対立遺伝子変異は、典型的には、所定の遺伝子のヌクレオチド配列中に１〜５％の変異をもたらすことができる。代替対立遺伝子は多くの異なる個体において目的の遺伝子を配列決定することにより発見できる。これはハイブリダイゼーションプローブを用いて種々の個体において同じ遺伝子座を発見することにより、容易に実施できる。全てのこのようなヌクレオチドの変異及びその結果として生じるアミノ酸の多形、又は天然の対立遺伝子変異の結果として生じ、機能的活性を改変しない変異は本発明の範囲に包含されることを意図している。
【０１７３】
やはり当業者の知る通り、突然変異により本発明の核酸分子内に配列変化を導入することにより、コードされた蛋白のアミノ酸配列の変化を、それによりコードされる蛋白の生物学的活性を改変することなくもたらすことができる。例えば、「非必須」アミノ酸残基においてアミノ酸置換がもたらされるヌクレオチド置換を行うことができる。「非必須」アミノ酸残基とは、「必須」アミノ酸残基が生物学的活性のために必要であるのに対し、生物学的活性を改変することなく野生型配列から改変できる残基である。例えば種々の生物種の相同体の間で保存されていない、又は半保存されているのみであるアミノ酸残基は活性のために非必須であり、従って改変の標的となりえる。或いは、種々の生物種（例えばネズミ及びヒト）の相同体の間で保存されているアミノ酸残基は活性のために必須であり、従って改変の標的となりえない。
【０１７４】
従って、本発明の別の特徴は活性のために必須ではないアミノ酸残基における変化を含有するマーカーポリペプチド、例えばＣｒｉｐｔｏ−３又はＣｒｉｐｔｏ−１ポリペプチドをコードする核酸分子に関する。そのようなポリペプチドは本発明のマーカーに相当する天然に存在する蛋白とはアミノ酸配列において異なっているが、なお生物学的活性を保持している。１つの実施形態において、そのような蛋白は本発明のマーカーに相当する蛋白の１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％同一、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１７５】
変異体蛋白をコードする核酸分子は、１つ以上のアミノ酸残基の置換、付加又は欠失がコードされた蛋白内に導入されるように、本発明の核酸のヌクレオチド配列内に１つ以上のヌクレオチドの置換、付加又は欠失を導入することにより作成できる。突然変異は標準的な手法、例えば部位指向性突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発により導入できる。好ましくは、保存的なアミノ酸の置換を１つ以上の予測される非必須アミノ酸残基において行う。「保存的アミノ酸置換」とはアミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野で知られている。これらのファミリーは塩基性の側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、未荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性の側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族の側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を包含する。或いは、突然変異はコーディング配列のすべて又は部分に渡ってランダムに、例えば飽和突然変異誘発により、導入することができ、そして得られた突然変異体を生物学的活性に関してスクリーニングすれば活性を保持している突然変異体が発見できる。突然変異誘発の後、コードされた蛋白を組み換えにより発現させることができ、そして蛋白の活性を測定できる。
【０１７６】
マーカー遺伝子の時間的及び空間的な調節エレメント、例えば時間的及び空間的なプロモーターに相当する本発明の核酸分子は組み換え発現ベクターを構築するために使用できる。時間的及び空間的な調節エレメントの発見は、誘導組み換えの部位、例えばｌｏｘ部位、例えばｌｏｘＰ部位に作動可能に連結した、そして場合により更にレポーター配列、例えばＬａｃＺ、ＧＦＰ及びＥＧＦＰに作動可能に連結した、架空の時間的及び空間的な調節エレメントを有する核酸分子を含有する組み換え発現ベクターを作成することにより実施できる。そのような組み換え発現ベクターを用いてトランスジェニック動物を作成することができ、その細胞を後にレポーター配列の時間的及び空間的制限に関して調べることにより、時間的及び空間的な調節エレメントに相当する補の核酸分子を発見することができる。
【０１７７】
上記したこのようなトランスジェニック動物は時間的及び空間的な調節エレメントを発見するために有用であるのみならず、補のマーカーポリペプチドの機能及び／又は活性を研究するため、マーカーポリペプチド活性のモジュレーターを発見及び／又は評価するため、並びに、治療薬又は診断薬の前臨床試験において有用である。更に又、そのような動物は目的の遺伝子の時間的及び空間的な制限の作用、例えば生理学的作用を調べるために有用である。例えば、トランスジーンは発達の特定の点における遺伝子の必要性のために致死性をもたらす場合がある。しかしながら、空間的及び／又は時間的に調節されたプロモーターの制御下にある同じトランスジーンを、遺伝子の損失が致死性を誘発する時点の後に、及び／又は致死性を誘発しない特定の組織内に導入してよい。或いは、ユビキタスに発現される、又は、正常細胞、例えば疾患、障害又は状態に罹患していない細胞においては低値又は検出不可能なレベルにおいて発現される遺伝子を、疾患、障害又は状態、例えば癌において優先的に過剰発現又は錯誤発現させてよい。例えばＣｒｉｐｔｏ−１蛋白は成人の多くの組織においては低値のレベルで発現されるか検出不可能であるが、乳腺の細胞において、並びに多くの癌においては、特異的に過剰発現されることが分かっている。同様に、本明細書に記載する通り、Ｃｒｉｐｔｏ−３転写ポリヌクレオチドは多くの正常な成人組織においては低地のレベルで発現されるか、検出不可能であるが、多くの癌において特異的に過剰発現される。本発明の空間的に制限されたプロモーター、例えば乳腺特異的プロモーターにＣｒｉｐｔｏ−３を作動可能に連結すること、及び、更に、誘導プロモーターを作動可能に連結することにより、特定の細胞型、例えば乳腺細胞においてＣｒｉｐｔｏ−３の制御された発現、例えば誘導発現が可能になり、これにより、増殖性の疾患、障害又は状態の進行、維持、及び／又は治療への応答の研究のために、増殖性の疾患、障害又は状態をより近似的にモデル化することができる。
【０１７８】
ＩＶ．単離された蛋白及び抗体
（ｉ）蛋白
本発明の１つの特徴はＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドに対して指向された抗体を作成するための免疫原としての使用に適する単離されたＣｒｉｐｔｏ蛋白、例えばＣｒｉｐｔｏ−３、並びにフラグメントに関する。１つの実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏ−３ポリペプチド又はそのフラグメントは標準的な蛋白精製手法を用いながら適切な精製スキームにより、細胞又は組織の原料から単離できる。別の実施形態においては、Ｃｒｉｐｔｏ−３ポリペプチド又はそのフラグメントは組み換えＤＮＡ手法により製造される。組み換え発現の代替として、Ｃｒｉｐｔｏ−３ポリペプチド又はそのフラグメントは標準的なペプチド合成手法を用いて化学的に合成できる。
【０１７９】
「単離された」又は「精製された」蛋白又はそのフラグメントは、その蛋白の誘導元である細胞又は組織の原料に由来する細胞性物質又は他の夾雑蛋白を実質的に含まないか、又は化学合成された場合は化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。「細胞性物質を実質的に含まない」という表現は、蛋白がその単離元又は組み換え製造元の細胞の細胞性成分から分離されている蛋白の調製品を包含する。即ち、細胞性物質を実質的に含まない蛋白は、異種蛋白（本明細書においては「夾雑蛋白」とも称する）の約３０％、２０％、１０％、又は５％未満を有する蛋白の調製品を包含する。蛋白又はその生物学的活性部分が組み換えにより製造されている場合、それは又好ましくは培地を実質的に含まず、即ち、培地は蛋白調製品のぼる量の約２０％、１０％、又は５％未満に相当する。蛋白が化学合成される場合は、それは好ましくは化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まず、即ち、蛋白の合成に関与する化学的前駆体又は他の化学物質から分離されている。従って蛋白のそのような調製品は化学的前駆体又は目的のポリペプチド以外の化合物の約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量による）未満を有する。
【０１８０】
好ましいＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドはず１Ａに示すアミノ酸配列を有する（配列番号２）。他の有用な蛋白はこの配列に実質的に同一（例えば少なくとも約４０％、好ましくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％）であり、そして天然のＣｒｉｐｔｏ−３蛋白の機能的活性を保持しているが、なお突然変異誘発により、又は天然の対立遺伝子変異により、アミノ酸配列において異なっている。
【０１８１】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸のパーセント同一性を測定するためには、配列を最適な比較目的のためにアラインする（例えば第１のアミノ酸配列又は核酸配列内に、第１のアミノ酸又は核酸配列との最適アライメントのためにギャップを導入できる）。次に相当するアミノ酸一又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が第２の配列における相当する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占有されていれば、分子はその位置において同一である。２つの配列の間のパーセント同一性は配列により共有されている同一の位置の数の関数である（即ち、％同一性＝同一位置の数／位置（例えばオーバーラップ位置）総数ｘ１００）。１つの実施形態において、２つの配列は同じ長さである。
【０１８２】
２つの配列の間のパーセント同一性の測定は数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。２つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７において改変されたＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムはＡｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索はＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワードレングス＝１２で実施することができ、これにより本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴ蛋白検索はＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３で実施することができ、これにより本発明の蛋白分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップを有するアライメントを得るためには、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載の通り利用することができる。或いは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いて分子間の遠い関係を検出する反復検索を実施することができる。ＢＬＡＳＴ、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ又はＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメーターを使用できる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照できる。配列の比較のために利用される数学的プログラムの別の好ましい非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ，４：１１−７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムはＧＣＧ配列アライメントソフトウエアパッケージの部分であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合は、ＰＡＭ１２０ウエイト残基表、ギャップ長ペナルティー１２及びギャップペナルティー４を使用できる。局所的配列どう養成及びアライメントの領域を発見するための更に別の有用なアルゴリズムはＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８に記載されているＦＡＳＴＡアルゴリズムである。ヌクレオチド又はアミノ酸配列を比較するためにＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用する場合は、例えばＰＡＭ１２０ウエイト残基表を２のｋ組値と共に使用することができる。
【０１８３】
２配列間のパーセント同一性はギャップを許容するかすることなく、上記したものと同様の手法を用いて測定できる。パーセント同一性を計算する場合は、厳密なマッチのみを計上する。
【０１８４】
本発明の１つの実施形態において、単離されたＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチド又はそのフラグメントはポリクローナル及びモノクローナル抗体の製造のための標準的手法を用いながら抗体を形成するための免疫原として使用することができる。完全長ポリペプチドを使用することができ、あるいは、本発明は免疫原としての使用のための抗原性ペプチドフラグメントを提供する。Ｃｒｉｐｔｏ−３蛋白の抗原性ペプチドはＣｒｉｐｔｏ−３のアミノ酸配列のアミノ酸残基少なくとも８（好ましくは１０、１５、２０、２５又は３０）個を含み、そしてペプチドに対して形成された抗体がＣｒｉｐｔｏ−３蛋白と特異的免疫複合体を形成するような蛋白のエピトープを包含する。好ましくは、Ｃｒｉｐｔｏ−３蛋白の抗原性ペプチドは、ペプチドに対して形成された抗体がＣｒｉｐｔｏ−３蛋白との免疫複合体を選択的に形成し、そしてＣｒｉｐｔｏ−１蛋白とは免疫複合体を形成しないようにＣｒｉｐｔｏ−３蛋白のエピトープを包含する。
【０１８５】
抗原性ペプチドに包含される好ましいエピトープは蛋白の表面上に位置する領域、例えば親水性領域である。疎水性配列分析、親水性配列分析、又は同様の分析を用いて親水性領域を発見することができる。抗原性ペプチドは全ドメイン、例えば細胞外ドメイン、細胞内ドメイン、ＥＧＦ様ドメイン、ｃｙｓリッチドメイン、受容体結合ドメイン等に相当してよい。Ｃｒｉｐｔｏ−３の細胞外ドメインは成熟Ｃｒｉｐｔｏ−３蛋白の約アミノ酸残基１〜約アミノ酸残基１５８に渡っている。Ｃｒｉｐｔｏ−３のＥＧＦ様ドメインは成熟Ｃｒｉｐｔｏ−３蛋白の約アミノ酸残基７５〜約アミノ酸残基１１２に渡っている。Ｃｙｓリッチドメインは成熟Ｃｒｉｐｔｏ−３蛋白の約アミノ酸残基１１４〜約アミノ酸残基１５０に渡っている。Ｃｒｉｐｔｏ−３のエピトープはアミノ酸残基の線状又は非線状の領域を含んでよい。１つの実施形態において、エピトープは、変性したＣｒｉｐｔｏ−３蛋白に対抗して、コンホーメーション的にはネイティブのＣｒｉｐｔｏ−３蛋白において形成されるエピトープである
本発明の１つの実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏ−３蛋白の抗原性ペプチドは細胞外ドメインに含まれるＣｒｉｐｔｏ−３蛋白のエピトープを包含する。好ましくは、抗原性ペプチドに包含されるエピトープはＣｒｉｐｔｏ−１と比較してＣｒｉｐｔｏ−３にユニークなアミノ酸残基、例えばＣｒｉｐｔｏ−１ポリペプチドのアミノ酸配列の相当するアミノ酸一におけるアミノ酸残基とは異なるＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸残基１つ以上を含むＣｒｉｐｔｏ−３蛋白の領域である。Ｃｒｉｐｔｏ−１ポリペプチドの相当するアミノ酸残基とは異なるＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドのアミノ酸残基は、Ｃｒｉｐｔｏ−３のアミノ酸Ｖ７、Ｌ６８、Ｅ９２及びＡ１７８を包含する。抗原性ペプチドにより包含される好ましいエピトープはＶ７、Ｌ６８、Ｅ９２及びＡ１７８よりなる群から選択されるアミノ酸少なくとも１つを含むＣｒｉｐｔｏ−３の領域である。関連する実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏ−３蛋白の抗原性ペプチドはＣｒｉｐｔｏ−３蛋白の一部分を含み、ここでその部分の二次構造又はコンホーメーションは、例えばＣｒｉｐｔｏ−１と比較してＣｒｉｐｔｏ−３にユニークなアミノ酸、例えばＶ７、Ｌ６８、Ｅ９２及びＡ１７８の１つ以上の存在のために、Ｃｒｉｐｔｏ−１と比較してＣｒｉｐｔｏ−３に独特である。
【０１８６】
免疫原は典型的には適当な（即ち免疫コンピテントな）対象、例えばウサギ、ヤギ、マウス又は他の哺乳類又は脊椎動物を免疫化することにより抗体を製造するために使用される。適切な免疫原性の調製品は例えば組み換え発現された、又は化学合成されたポリペプチドを含有できる。調製品はさらに、アジュバント、例えばフロインド完全又は不完全アジュバント、又は同様の免疫刺激性の薬剤を包含することができる。
【０１８７】
本発明は又Ｃｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドに相当するキメラ又は融合蛋白を提供する。本明細書においては、「キメラ蛋白」又は「融合蛋白」とは、非相同ポリペプチド（即ちＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチド以外のポリペプチド）に作動可能に連結したＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドの全て又は部分（好ましくは生物学的に活性な部分）を含む。融合蛋白において、「作動可能に連結した」という用語はＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチド及び非相同ポリペプチドが相互にインフレームに融合することを示すことを意図している。非相同ポリペプチドはＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端に融合できる。
【０１８８】
１つの有用な融合蛋白はＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドがＧＳＴ配列のカルボキシ末端に融合しているＧＳＴ融合蛋白である。そのような融合蛋白は組み換えＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドの精製を容易にすることができる。
【０１８９】
別の実施形態においては、融合蛋白はそのアミノ末端において非相同シグナル配列を含有する。例えばＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドのネイティブのシグナル配列を除去し、そして別の蛋白に由来するシグナル配列と置き換えることができる。例えばバキュロウイエンベロープ蛋白のｇｐ６７分泌配列を非相同シグナル配列として使用できる（Ａｕｓｕｂｅｌ等、編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｈｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９２）。真核生物の非相同シグナル配列の別の例はメリチン及びヒト胎盤アルカリホスファターゼの分泌配列を包含する（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。さらに別の例においては、有用な原核生物非相同シグナル配列はｐｈｏＡ分泌シグナル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、上出）、およびプロテインＡ分泌シグナル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を包含する。
【０１９０】
さらに別の実施形態においては、融合蛋白はＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドの全て又は部分が免疫グロブリン蛋白ファミリーのメンバーから誘導された配列に融合している免疫グロブリン融合蛋白である。本明細書の免疫グロブリン融合蛋白は医薬組成物に配合して対象に投与することによりリガンド（可溶性又は膜結合）及び細胞表面上の蛋白（受容体）との間の相互作用を抑制し、これによりインビボのシグナルトランスダクションを抑制することができる。免疫グロブリン融合蛋白はＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドの同族体リガンドの生体利用性に影響するために使用できる。リガンド／受容体相互作用の抑制は、増殖及び分化の障害を治療するため、及び細胞生存をモジュレート（例えば増進又は抑制）するための両方に治療上有用であることができる。更に又、本発明の免疫グロブリン融合蛋白は対象においてＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドに対して指向された抗体を産生するための免疫原として、リガンドを精製するため、そしてリガンドとの受容体の相互作用を抑制する分子を発見するためのスクリーニング試験において使用できる。
【０１９１】
本発明のキメラ及び融合蛋白は標準的な組み換えＤＮＡ手法により製造できる。別の実施形態において、融合遺伝子は自動ＤＮＡ合成装置を包含する従来の手法により合成できる。或いは、キメラ遺伝子配列を形成するために後にアニーリング及び再増幅することができる２つの連続遺伝子フラグメントの間の相補オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを用いて遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を実施することができる（例えばＡｕｓｕｂｅｌ等、上出参照）。更に又、既に融合部分（例えばＧＳＴポリペプチド）をコードしている多くの発現ベクターが市販されている。Ｃｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドをコードする核酸は融合部分がＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドにインフレームに連結されるように発現ベクター内にクローニングすることができる。
【０１９２】
シグナル配列は分泌蛋白又は他の目的の蛋白の分泌及び単離を容易にするために使用できる。シグナル配列は典型的には切断事象１つ以上において分泌の間に成熟蛋白から一般的には切断される疎水性アミノ酸のコア部を特徴としている。そのようなシグナルペプチドはそれらが分泌経路を通過する場合に成熟蛋白からのシグナル配列の切断を可能にするプロセシング部位を含有する。即ち、本発明はシグナル配列を有する記載したポリペプチド、並びに、シグナル配列が蛋白分解的に切断されているポリペプチド（即ち切断産物）に関する。１つの実施形態において、シグナル配列をコードする核酸配列は目的の蛋白、例えば通常では分泌されない、又は別様には単離が困難である蛋白に発現ベクター中で作動可能に連結させることができる。シグナル配列は発現ベクターが形質転換される真核生物宿主等からの蛋白の分泌を指向しており、そしてシグナル配列は後に、又は同時に切断される。次に蛋白は当該分野で知られた方法により細胞外の培地から容易に精製できる。或いは、シグナル配列はＧＳＴドメインを有するもののような精製を容易にする配列を用いながら目的の蛋白に連結することができる。
【０１９３】
本発明は又Ｃｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドの変異体に関する。そのような変異体はアゴニスト（ミメティック）又は拮抗剤の何れかとして機能することができる改変されたアミノ酸配列を有する。変異体は突然変異誘発、例えば個別の点突然変異又はトランケーションにより形成できる。好ましい変異体はＣｒｉｐｔｏ−１のものとは異なるＣｒｉｐｔｏ−３の特異的１つ以上のアミノ酸を維持しており、例えばＣｒｉｐｔｏ−３のアミノ酸Ｖ７、Ｌ６８、Ｅ９２及びＡ１７８１つ以上において改変されていない変異体が挙げられる。アゴニストは蛋白の天然に存在する型の生物学的活性の実質的に同じかサブセットを保持することができる。蛋白の拮抗剤は例えば目的の蛋白を包含する細胞シグナリングカスケードの下流又は上流のメンバーに競合的に結合することにより、蛋白の天然に存在する型の活性１つ以上を抑制できる。即ち、限定された機能の変異体を用いた治療により特定の生物学的作用を誘発することができる。蛋白の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有する変異体を用いた対象の治療は、蛋白の天然に存在する形態を用いた治療と相対比較して対象における副作用が低下している。
【０１９４】
アゴニスト（ミメティック）又は拮抗剤の何れかとして機能する本発明の蛋白の変異体は、アゴニスト又は拮抗剤活性に関して本発明の蛋白の突然変異体、例えばトランケーション突然変異体のコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることにより発見できる。１つの実施形態において、変異体の多様化されたライブラリは核酸レベルにおけるコンビナトリアルな突然変異誘発により形成でき、そして多様化された遺伝子ライブラリによりコード化される。変異体の多様化されたライブラリは例えば潜在的蛋白配列の縮重セットが個々のポリペプチドとして、又は、より大きい融合蛋白のセット（例えばファージディスプレイの場合）として発現可能であるように、遺伝子配列内に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的にライゲーションすることにより製造できる。縮重オリゴヌクレオチド配列から本発明のポリペプチドの潜在的変異体のライブラリを作成するために使用できる種々の方法がある。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当該分野で知られている（例えばＮａｒａｎｇ，１９８３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ等、１９８４、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ等、１９８４、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅ等、１９８３、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７参照）。
【０１９５】
更に又、Ｃｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドのコーディング配列のフグのライブラリを用いてスクリーニング及びその後の変異体選択のためのポリペプチドの多様化された集団を作成できる。例えば、コーディング配列フラグメントのライブラリは、分子当たり約一回ニック形成が起こる条件下でヌクレアーゼで目的のコーディング配列の可溶性鎖ＰＣＲフラグメントを処理すること、２本鎖ＤＮＡを変成すること、異なるニック化産物由来のセンス／アンチセンス対を包含できる２本鎖ＤＮＡを形成するためにＤＮＡを再生（ｒｅｎａｔｕｒｅ）すること、Ｓ１ヌクレアーゼで処理することにより再形成されたデュプレックスから１本鎖部分を除去すること、および得られたフラグメントライブラリを発現ベクター内にライゲーションすることにより作成できる。この方法により、目的の蛋白の種々のサイズのアミノ末端及び内部のフラグメントをコードする発現ライブラリを誘導することができる。
【０１９６】
点突然変異又はトランケーションにより作成したコンビナトリアルなライブラリの遺伝子産物をスクリーニングするため、および、選択された特性を有する遺伝子産物に関してｃＤＮＡをスクリーニングするための数種の手法が当該分野で知られている。大型の遺伝子ライブラリをスクリーニングするための高スループット分析に適合したもっとも広範に使用されている手法は典型的には複製可能な発現ベクター内に遺伝子ライブラリをクローニングすること、得られたベクターライブラリを用いて適切な細胞を形質転換すること、及び所望の活性の検出が自身の産物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下においてコンビナトリアルな遺伝子を発現させることを包含する。帰納的合同突然変異誘発（ＲＥＭ）、即ちライブラリ中の機能的突然変異体の頻度を増大させるための手法をスクリーニング試験と組み合わせて使用することにより、本発明の蛋白の変異体を発見できる（Ａｒｋｉｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｒｖａｎ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅ等、１９９３、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（３）：３２７−３３１）。
【０１９７】
更に又、本明細書に記載した方法はＣｒｉｐｔｏ−１と特異的な免疫複合体を形成する、例えばＣｒｉｐｔｏ−３とは免疫複合体を形成しない抗体を製造するために使用してよいことも意図している。好ましくは、Ｃｒｉｐｔｏ−１蛋白の抗原性ペプチドは、ペプチドに対抗して作成された抗体がＣｒｉｐｔｏ−１蛋白と免疫複合体を選択的に形成し、そしてＣｒｉｐｔｏ−３蛋白とは免疫複合体を形成しないように、Ｃｒｉｐｔｏ−１蛋白のエピトープを包含する。好ましくは、抗原性ペプチドにより包含されるエピトープはＣｒｉｐｔｏ−３と比較してＣｒｉｐｔｏ−１にユニークなアミノ酸残基、例えばＣｒｉｐｔｏ−３のポリペプチド配列の相当するアミノ酸一におけるアミノ酸残基とは異なるＣｒｉｐｔｏ−１のポリペプチド配列におけるアミノ酸残基１つ以上を含むＣｒｉｐｔｏ−１蛋白の領域である。Ｃｒｉｐｔｏ−３ポリペプチド内の相当するアミノ酸とは異なるＣｒｉｐｔｏ−１ポリペプチドにおけるアミノ酸残基はアミノ酸Ａ７、Ｐ６８、Ｇ９２、Ｖ１７８、Ｖ２２及びＹ４３を包含する。抗原性ペプチドにより包含される好ましいエピトープはアミノ酸Ａ７、Ｐ６８、Ｇ９２及びＶ１７８の少なくとも１つを含むＣｒｉｐｔｏ−１の領域である。関連の実施形態においては、Ｃｒｉｐｔｏ−１蛋白の抗原性ペプチドはＣｒｉｐｔｏ−１蛋白の一部分を含み、ここで部分の二次構造又はコンホーメーションは、例えばＣｒｉｐｔｏ−３と比較した場合のＣｒｉｐｔｏ−１にユニークなアミノ酸、例えばＡ７、Ｐ６８、Ｇ９２及びＶ１７８の１つ以上の存在のために、Ｃｒｉｐｔｏ−３と比較してＣｒｉｐｔｏ−１にユニークなものとなる。
【０１９８】
（ｉｉ）抗体
本発明の別の特徴はＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドに対して指向された抗体に関する。本明細書において互換的に使用する「抗体」及び「抗体物質」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち本発明のＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドのような抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。Ｃｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドに特異的に結合する分子はＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドには結合するが、天然にはポリペプチドを含有する試料、例えば生物学的試料中の他の分子には実質的に結合しない分子である。好ましくは、Ｃｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドに特異的に結合する分子は、Ｃｒｉｐｔｏ−１ポリペプチドには実質的に結合しない。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例はペプシンのような酵素で抗体を処理することにより形成できるＦ（ａｂ）及びＦ（ａｂ’）２フラグメントを包含する。本発明はポリクローナル及びモノクローナル抗体を提供する。「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は本明細書においては、特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位の唯一の物質種を含有する抗体分子の集団を指す。
【０１９９】
ポリクローナル抗体は免疫原としての本発明のポリペプチドで適当な対象を免疫化することにより上記した通り製造できる。免疫化された対象における抗体力価を標準的な手法により、例えば固定化されたポリペプチドを用いた酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）により経時的にモニタリングすることができる。所望により、抗体分子を対象から（例えば対象の血液又は血清から）採集、又は単離し、そしてよく知られた手法、例えばプロテインＡクロマトグラフィーにより精製することによりＩｇＧ画分が得られる。免疫化後の適切な時間において、例えば特定の抗体力価が最高値になった時点において、抗体産生細胞を対象から採取し、そして標準的な手法、例えば最初にＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７に記載されたハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ手法（Ｋｏｚｂｏｒ等、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２参照）、ＥＢＶハイブリドーマ手法（Ｃｏｌｅ等、ｐｐ．７７−９６、Ｍｏｎｏｃｈｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５参照）又はトリオーマ手法によりモノクローナル抗体を製造するために使用する。ハイブリドーマを製造するための技術は当該分野で良く知られている（一般的にＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ等編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４参照）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的なＥＬＩＳＡ試験を用いながら目的のポリペプチドに結合する抗体が存在するかどうか、ハイブリドーマ培養上澄みをスクリーニングすることにより検出される。
【０２００】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを製造する代わりに、本発明のＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドに対して指向されたモノクローナル抗体は目的のポリペプチドを用いて理子コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリ（例えば抗体ファージディスプレイライブラリ）をすりすることにより発見及び単離することができる。ファージディスプレイライブラリを作成してスクリーニングするためのキットは市販されている（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．２７−９４００−０１；及びＳｔｒａｔｆａｇｅｎｅ  ＳｕｒＺＡＰ．Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．２４０６１２）。更に又抗体ディスプレイライブラリを作成してスクリーニングする場合の使用に特に適合している方法及び試薬の例は、米国特許５，２２３，４０９；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９２／１８６１９；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９１／１７２７１；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９２／２０７９１；ＰＣＴ公開９２／１５６７９；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９３／０１２８８；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９２／０９６９０；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓ等（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ等（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ等（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４に記載されている。
【０２０１】
更に又、標準的な組み換えＤＮＡ手法を用いて作成できるヒト及び非ヒトの部分を含む組み換え抗体、例えばキメラ及びヒト化モノクローナル抗体、は本発明の範囲に包含される。そのようなキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は当該分野で知られた組み換えＤＮＡ手法により、例えばＰＣＴ公開ＷＯ８７／０２６７１；欧州特許出願１８４，１８７；欧州特許出願１７１，４９６；欧州特許出願１７３，４９４；ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１５３３；米国特許４，８１６，５６７；欧州特許出願１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒ等（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕ等（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ等（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ等（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ等（１９８７）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ等（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；ａｎｄ  Ｓｈａｗ等（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ等（１９８６）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；米国特許５，２２５，５３９；Ｊｏｎｅｓ等（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ等（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４；ａｎｄ  Ｂｅｉｄｌｅｒ等（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記載されている方法を用いながら、製造することができる。
【０２０２】
完全にヒト型の抗体はヒト対象の施療的治療のために特に望ましい。そのような抗体は内因性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子を発現できないが、ヒト重鎖及び軽鎖の遺伝子は発現できるトランスジェニックマウスを用いて製造できる。トランスジェニックマウスは選択された抗原、例えば本発明のマーカーに相当するポリペプチドの全て又は一部分を用いて通常の態様において免疫化する。抗原に対して指向されたモノクローナル抗体は従来のハイブリドーマ手法を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスにより保有されるヒト免疫グロブリントランスジーンはＢ細胞分化の間に再配列し、そしてその後クラススイッチ及び体細胞突然変異を起こす。即ち、このような手法を用いながら、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥ抗体を製造することができる。ヒト抗体を製造するためのこの技術に関する考察は、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ（１９９５）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３を参照できる。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を製造するためのこの技術及びそのような抗体を製造するためのプロトコルの詳細な考察は、例えば米国特許５，６２５，１２６；米国特許５，６３３，４２５；米国特許５，５６９，８２５；米国特許５，６６１，０１６；及び米国特許５，５４５，８０６を参照できる。更に又、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）のような企業が上記したものと同様の技術を用いて選択された抗原に対して指向されたヒト抗体を提供することに従事している。
【０２０３】
選択されたエピトープを認識する完全ヒト型の抗体は「誘導選択」と称される手法を用いて作成できる。この方策においては、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばネズミ抗体を用いて同じエピトープを認識する完全ヒト型抗体の選択を誘導する（Ｊｅｓｐｅｒｓ等、１９９４、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３）。
【０２０４】
増殖性障害、例えば癌においてモジュレートされるＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドに特異的に結合する抗体、抗体誘導体又はそのフラグメントはＣｒｉｐｔｏ−３の活性を抑制するために使用してよく、そしてこのため、対象における増殖性障害、例えば癌を治療、抑制又は防止するために対象に投与してよい。更に又、コンジュゲートした抗体も又、対象における癌を治療、抑制又は防止するために使用してよい。コンジュゲートした抗体、好ましくはモノクローナル抗体又はそのフラグメントは薬剤、毒素又は放射性原子に結合した抗体であり、そして癌細胞に直接これらの物質を送達するための送達ベヒクルとして使用される。抗体、例えばＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドに特異的に結合する抗体は対象に投与され、そしてマーカーに結合し、これにより罹患細胞に対して毒性物質を送達し、身体の他の部分における正常細胞に対する損傷を最小限とする。
【０２０５】
コンジュゲートされた抗体は又「タグ付された」、「標識された」又は「負荷された」と称される。結合した化学療法剤を有する抗体は一般的に化学標識されたと称される。結合した放射性粒子を有する抗体は放射標識されたと称され、そしてこの型の療法は放射性免疫療法（ＲＩＴ）として知られている。癌を治療するために使用されることの他に、放射標識抗体は身体に拡張している癌の区域を検出するためにも使用できる。毒素に結合している抗体は免疫毒素と称される。
【０２０６】
免疫毒素は毒素（例えば植物又は最近由来の毒性物質）をモノクローナル抗体に結合することにより作成する。免疫毒素はモノクローナル抗体を細菌毒素、例えばジフテリア毒素（ＤＴ）又はシュードモナス細菌体外毒素（ＰＥ４０）に、又は植物毒素、例えばリシンＡ又はサポリンに結合させることにより製造してよい。
【０２０７】
Ｃｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドに対して指向された抗体（例えばモノクローナル抗体）はアフィニティークロマトグラフィー又は免疫沈降のような標準的手法によりポリペプチドを単離するために使用できる。更に又、そのような抗体はポリペプチドの発現のレベル及びパターンを評価するためにポリペプチド（例えば細胞溶解物、又は細胞上澄み中）を検出するために使用できる。抗体は又例えば所定の治療用法の薬効（例えば抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法の薬効）を調べるための臨床試験操作法の部分として組織又は体液中（例えば卵巣関連体液中）の蛋白のレベルをモニタリングするために診断的に使用できる。検出は検出可能な物質に抗体をカップリングさせることに容易になる。検出可能な物質の例は、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、ルミネセント物質、バイオルミネセント物質、および放射性物質を包含する。適当な酵素の例は、セイヨウワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを包含し；適当な補欠分子団複合体の例はストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンを包含し；適当な蛍光物質の例はウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリスリンを包含し；ルミネセント物質の例はルミノールを包含し；バイオルミネセント物質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンを包含し、そして適当な放射性物質の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ又は３Ｈを包含する。
【０２０８】
更に又、本明細書に記載した方法の何れもＣｒｉｐｔｏ−１ポリペプチドに特異的に結合する、例えばＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドには結合しない分子、例えば抗体、例えばモノクローナル抗体の製造のために使用してよいことを意図している。Ｃｒｉｐｔｏ−１ポリペプチドに特異的に結合する分子は、Ｃｒｉｐｔｏ−１ポリペプチドには結合するが、ポリペプチドを天然に含有する試料、例えば生物学的試料中の他の分子とは実質的に結合しない分子である。好ましくはＣｒｉｐｔｏ−１ポリペプチドに特異的に結合する分子はＣｒｉｐｔｏ−３ポリペプチドには特異的に結合しない。
【０２０９】
ＩＶ．検出及び診断試験
本発明は試料中の本発明のマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１に相当するポリペプチド又は核酸の量、構造、及び／又は活性を測定するための検出試験又は診断試験に関する。そのような検出試験は腫瘍の表現型、例えばＣｒｉｐｔｏ−３又はＣｒｉｐｔｏ−１発現腫瘍であるかどうかを調べるために有用である。そのような試験は又、細胞（例えば患者試料由来の細胞）が形質転換されるかどうかを試験するため、例えば癌を診断するため、及び、患者が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法のための適当な候補であるかどうかを試験するためにも有用である。好ましい実施形態においては、本発明のマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３の発現レベルは、細胞、例えば患者試料由来の細胞が形質転換されるかどうかを試験するための方法として試験することができる。本発明のマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３の発現レベルは更に、増殖性の疾患、障害又は状態、例えば癌、又は増殖性の疾患、障害又は状態を発症する危険性の診断のための方法として試験できる。更に又、本発明のマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３の発現レベルは、患者が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法のための適当な候補であるかどうかを試験するための方法として試験できる。
【０２１０】
１．遺伝子発現の検出のための方法
本発明のマーカーの発現は転写されたポリヌクレオチド又は蛋白の発現を検出するためのよく知られた方法の広範な種類の何れかにより試験してよい。そのような方法の非限定的な例は核酸ハイブリダイゼーション法、核酸逆転写法、及び核酸増幅法、分泌された、細胞表面の、細胞質性の、又は核の蛋白の検出のための方法、蛋白精製方法、及び蛋白機能又は活性の試験を包含する。
【０２１１】
好ましい実施形態においては、特定のマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１の発現は、遺伝子転写物（例えばｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）の尺度により、翻訳された蛋白の量の尺度により、又は遺伝子産物の活性の尺度により、特徴づけられる。マーカー発現は種々の方法において、例えばｍＲＮＡレベル、蛋白レベル又は蛋白活性の検出によりモニタリングすることができ、これらの何れも標準的な手法を用いて測定できる。検出は、遺伝子発現のレベル（例えばｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、蛋白又は酵素の活性）の定量を包含するか、又は、特に対照レベルとの比較における遺伝子発現のレベルの定性的試験であることができる。検出されるレベルの型は関連において明確化される。
【０２１２】
核酸ハイブリダイゼーション手法を用いた遺伝子転写物（それから作成したｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）を検出及び／又は定量する方法は当該分野で知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、上出、参照）。例えば、ｃＤＮＡの存在、非存在又は量を評価するための１つの方法ではサザン転移を行う。慨すれば、ｍＲＮＡを単離（例えば酸グアニジニウム−フェノール−クロロホルム抽出法、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、上出）し、そして逆転写してｃＤＮＡを形成する。次にｃＤＮＡを場合により消化し、緩衝液中でゲル上を泳動させ、メンブレンに転移させる。次に標的ｃＤＮＡに特異的な核酸プローブを用いてハイブリダイゼーションを実施する。
【０２１３】
そのような検出試験又は診断及び余語の試験の一般的原理は、マーカー及びプローブ（例えば核酸プローブ又はプライマー）を含有する反応混合物の試料をマーカーとプローブが相互作用して結合することにより反応混合物中で除去及び／又は検出できる複合体を形成するために適切な条件下及び十分な時間において製造することを包含する。これらの試験は種々の方法において実施できる。
【０２１４】
例えばそのような試験を実施する１つの方法は、基板とも称される固相支持体上にマーカー又はプローブをアンカリングすること、及び反応終了時に固相上にアンカリングされた標的マーカー／プローブを検出することを包含する。そのような方法の１つの実施形態において、マーカーの存在及び／又は濃度に関して試験すべき対象由来の試料を担体又は固相支持体上にアンカリングすることができる。別の実施形態においては、逆の状況が可能であり、その場合、プローブを固相にアンカリングし、そして対象由来の試料を試験の非アンカリング成分と反応させることができる。
【０２１５】
固相に試験成分をアンカリングさせるための多くの方法が確立されている。これらには限定しないがビオチン及びストレプトアビジンのコンジュゲート形成を介して固定化されているマーカー又はプローブの分子が包含される。そのような美越智似るか試験の成分は当該分野で知られた手法（例えばビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いながらビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から製造でき、そしてストレプトアビジンコーティング９６穴プレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル中に固定化できる。特定の実施形態においては、固定化された試験成分を有する表面を予め製造して保存しておくことができる。
【０２１６】
このような試験のための他の適当な担体又は固相支持体はマーカー又はプローブが所属する分子のクラスを結合できる何れかの物質を包含する。よく知られた支持体又は担体は限定しないが、ガラス、ポリスチレン、ナイロン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエチレン、デキストラン、アミラーゼ、天然及び修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、ハンレイ岩及び磁鉄鉱を包含する。
【０２１７】
上記した手順により試験を実施するためには、非固定化成分を固相に添加し、その上に第２の成分をアンカリングする。反応終了後、形成された複合体は全て固相上に固定化された状態で残存するような条件下で未複合体化成分を除去（例えば洗浄による）してよい。固相にアンカリングしたマーカー／プローブ複合体の検出は本明細書に記載した多くの方法において実施できる。
【０２１８】
好ましい実施形態においては、プローブ（例えば核酸プローブ又はプライマー）は、それが未アンカリングの試験成分である場合は、検出及び試験の読み取りの目的のために、直接又は間接的に、本明細書に記載した、そして当該分野で良く知られている検出可能な標識で標識することができる。
【０２１９】
更に又、例えば蛍光エネルギー転移の手法を利用することにより、何れかの成分（マーカー又はプローブ）の操作又は標識を更に行うことなく、マーカー／プローブ複合体形成を直接検出することも可能である（例えばＬａｋｏｗｉｃｚ等、米国特許５，６３１，１６９；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ等、米国特許４，８６８，１０３参照）。第１の「ドナー」分子上の蛍光団標識は、適切な波長の入射光による励起時に、その発光蛍光エネルギーが第２の「アクセプター」分子上の蛍光標識により吸収され、それが次に吸収エネルギーにより蛍光発生性となり得るに選択される。或いは、「ドナー」の蛋白分子は単にトリプトファン残基の天然の蛍光エネルギーを利用してもよい。「アクセプター」分子の標識が「ドナー」のものとは示差的であるように異なる波長の光を発射する標識を選択する。標識間のエネルギー転移の効率は分子を隔てる距離に関連するため、分子間の空間的関係を試験することができる。分子間に結合が生じる状況においては、試験における「アクセプター」分子標識の蛍光の発射は最大となるはずである。ＦＥＴ結合事象は当該分野で良く知られている標準的な蛍光測定検出手段を介して好都合に測定できる（例えば蛍光計を用いる）。
【０２２０】
別の実施形態においては、プローブ（例えば核酸プローブ又はプライマー）がマーカーを認識する能力の測定は試験成分（プローブ又はマーカー）の何れを標識することもなく、リアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）のような技術を利用することにより行うことができる（例えばＳｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．ａｎｄ  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．，１９９１，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５及びＳｚａｂｏ等、１９９５、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５参照）。本明細書においては、「ＢＩＡ」又は「表面プラズモン共鳴」とは相互作用物質の何れも標識することなくリアルタイムで生体特異的な相互作用を検討するための技術である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ）。結合表面における質量の変化（結合事象を示す）は表面近傍の光の屈折率の変化（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象）をもたらし、生物学的分子の間のリアルタイムの反応の指標として使用できる検出可能なシグナルを与える。
【０２２１】
或いは、別の実施形態においては、類似の診断及び予後の試験を液相中の溶質としてのマーカー及ぶプローブにより実施できる。そのような試験において、複合体化されたマーカー及びプローブは多くの標準的手法の何れか、例えば限定しないが示差的遠心分離、クロマトグラフィー、電気泳動及び免疫沈降により、未複合体化成分から分離される。示差的遠心分離においては、マーカー／プローブ複合体は一連の遠心分離工程を介して、その異なる大きさ及び密度に基づいた複合体の異なる沈降平衡により、未複合体化試験成分から分離される（例えばＲｉｖａｓ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｍｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．，１９９３，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．１８（８）：２８４−７参照）。標準的なクロマトグラフィー手法も又、複合体化分子を未複合体化のものから分離するために利用してよい。例えばゲル濾過クロマトグラフィーは大きさに基づいて分子を分離し、そして適切なゲル濾過樹脂をカラムフォーマット中で使用することを介し、例えば相対的に大型の複合体を相対的に小型の未複合体化成分から分離してよい。同様に、未複合体化成分と比較した場合のマーカー／プローブ複合体の相対的に異なる電荷特性を利用することにより、例えばイオン交換クロマトグラフィー樹脂の利用を介して複合体を未複合体化成分から差別化してよい。そのような樹脂及びクロマトグラフィー手法は当該分野で良く知られている（例えばＨｅｅｇａａｒｄ，Ｎ．Ｈ．，１９９８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｎｇｎｉｔ．Ｗｉｎｔｅｒ  １１（１−６）：１４１−８；Ｈａｇｅ，Ｄ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｔｗｅｅｄ，Ｓ．Ａ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ  １９９７Ｏｃｔ  １０；６９９（１−２）：４９９−５２５参照）。ゲル電気泳動もまた未結合の成分から複合体化試験成分を分離するために使用してよい（例えばＡｕｓｕｂｅｌ等編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７−１９９９参照）。本手法において、蛋白又は核酸の複合体は例えば大きさ又は電荷に基づいて分離される。電気泳動過程における結合相互作用を維持するためには、非変性ゲルマトリックス物質及び還元剤免疫組織化学存在下の条件が典型的には好ましい。特定の試験及びその成分に対する適切な条件は当該分野で良く知られている。
【０２２２】
特定の実施形態において、マーカーに相当する転写されたポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡのレベルは、当該分野で知られた方法を用いて生物学的試料中でインサイチュ又はインビトロのフォーマットの何れかにより測定できる。「生物学的試料」という用語は、対象から単離された組織、細胞、生物学的流体及びその単離物、並びに対象内に存在する組織、細胞及び流体、例えば腫瘍細胞を包含することを意図している。
【０２２３】
本発明の発現検出方法は単離されたＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを使用できる。インビトロの方法のためには、ｍＲＮＡの単離に相反して選択することのないいずれかのＲＮＡ単離手法を細胞からのＲＮＡの単離のために利用できる（例えばＡｕｓｕｂｅｌ等編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８７−１９９９参照）。更に又、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ（１９８９、米国特許４，８４３，１５５）の単一工程ＲＮＡ単離プロセスのような当該分野で良く知られている手法を用いながら多数の組織試料を容易に処理することができる。インサイチュの方法のためには、ｍＲＮＡは検出の前に細胞から単離する必要はない。そのような方法において、細胞又は組織試料は知られた組織学的方法を用いて製造／処理する。次に試料を支持体、典型的にはスライドガラス上に固定化し、次に、マーカーをコードするｍＲＮＡにハイブリダイズできるプローブに接触させる。
【０２２４】
本発明のマーカーに相当する単離された転写されたポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡ又はｃＤＮＡは、ハイブリダイズ又は増幅試験、例えば限定しないが、サザン又はノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析及びプローブアレイにおいて使用できる。
【０２２５】
ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡレベルの検出のための１つの診断方法では単離されたｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを、検出すべきマーカーによりコードされるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡにハイブリダイズできる核酸分子（プローブ）に接触させる。核酸プローブは、例えば、完全長ｃＤＮＡ、又はその１部分、例えば少なくとも７、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００ヌクレオチド長以上の、そして本発明のマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１をコードする転写されたポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡ又はｃＤＮＡにストリンジェントな条件下に特異的にハイブリダイズするために十分なオリゴヌクレオチドであることができる。１つの実施形態において、核酸プローブは、核酸プローブが転写されたＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドにハイブリダイズしないように転写されたＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする。別の実施形態においては、核酸プローブは転写されたＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドにハイブリダイズしないように転写されたＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする。本発明の方法において使用するための他の適当な核酸プローブ又はプライマーは本明細書に記載する通りである。転写されたポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのプローブ又はプライマーとのハイブリダイゼーションは問題となっているマーカーが発現されていることを示す。
【０２２６】
１つのフォーマットにおいて、転写されたポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを固体表面上に固定化し、そしてプローブと接触させるが、これは例えば単離されたｍＲＮＡ又はｃＤＮＡをアガロースゲル上で泳動させ、そしてｍＲＮＡ又はｃＤＮＡをゲルからメンブレン、例えばニトロセルロースに転移させることにより行う。代替のフォーマットにおいては、プローブを固体表面上に固定化し、そしてｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイにおいて、プローブと接触させる。本発明のマーカーによりコードされるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのレベルを検出する場合における使用のための知られたｍＲＮＡ及び／又はｃＤＮＡの検出方法は当業者が容易に適用できるものである。
【０２２７】
プローブは蛋白をコードする核酸配列の完全長又は完全長未満のものであることができる。より短いプローブは特異性に関して実験的に試験される。好ましくは核酸プローブは１０、１５、２０塩基長以上である（例えば核酸ハイブリダイゼーションに使用するための核酸プローブ配列の選択の方法に関してはＳａｍｂｒｏｏｋ等を参照）。ハイブリダイズされた部分のハイブリダイゼーションはｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの存在又は非存在の定性的測定を可能にする。
【０２２８】
本発明の１つの実施形態において、本発明のマーカー、例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１に相当する転写されたポリヌクレオチドのレベルの測定は、転写されたポリヌクレオチドの増幅のプロセスと、その後の当該分野で良く知られている手法を用いた増幅分子の検出を包含する。核酸増幅のための方法は当該分野で知られており、そして限定しないが例えばＰＣＲ、ｒｔＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７米国特許４，６８３，２０２に記載の実験実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１８９−１９３）、自己持続性配列複製Ｇｕａｔｅｌｌｉ等、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ等、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ等、１９８８、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、ローリングサイクル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ等、米国特許５，８５４，０３３）又は当該分野で知られた何れかの他の核酸増幅方法を包含する。蛍光発生性のｒｔＰＣＲもまた本発明の方法において使用してよい。蛍光発生性ｒｔＰＣＲにおいては、定量は蛍光シグナル、例えばＴａｑＭａｎ及びｓｙｂｒグリーンの量に基づいている。これらの検出スキームは核酸分子が極めて少数しか存在しない場合に、そのような分子の検出のために特に有用である。本発明の好ましい増幅方法はＰＣＲ、例えばｒｔＰＣＲを包含する。
【０２２９】
一般的に、増幅プライマーとして使用できる核酸分子は約１０〜５０（例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０以上）ヌクレオチド長であり、約２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１００００、２００００ヌクレオチド長以上の領域にフランキングしている。適切な条件下及び適切な試薬を用いれば、そのようなプライマーはプライマーによりフランキングされたヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。
【０２３０】
１つの実施形態において、核酸分子（プライマー）は、プライマーが転写されたＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドを選択的に増幅し、そして転写されたＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドを増幅しないように、転写されたＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする。その様な核酸分子（プライマー）の一例は転写されたＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドの一部分にハイブリダイズする核酸分子（プライマー）であり、その部分はＣｒｉｐｔｏ−１と比較してＣｒｉｐｔｏ−３にユニークなアミノ酸、例えば、Ｃｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチド配列における相当するアミノ酸とは異なるＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチド配列中のアミノ酸残基、例えばＶ７、Ｌ６８、Ｅ９２及びＡ１７８よりなる群から選択されるアミノ酸をコードするヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、核酸分子（プライマー）は、プライマーが転写されたＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドを選択的に増幅し、そして転写されたＣｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチドを増幅しないように、転写されたＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする。その様な核酸分子（プライマー）の一例は転写されたＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチドの一部分にハイブリダイズする核酸分子（プライマー）であり、その部分はＣｒｉｐｔｏ−３と比較してＣｒｉｐｔｏ−１にユニークな１つ以上のアミノ酸、例えば、Ｃｒｉｐｔｏ−３ポリヌクレオチド配列における相当するアミノ酸とは異なるＣｒｉｐｔｏ−１ポリヌクレオチド配列中の１つ以上のアミノ酸残基、例えばＡ７、Ｐ６８、Ｇ９２、Ｖ１７８、Ｖ２２及びＹ４３よりなる群から選択される１つ以上のアミノ酸をコードするヌクレオチドを含む。好ましい実施形態においては、Ｃｒｉｐｔｏ−３蛋白と比較してＣｒｉｐｔｏ−１蛋白にユニークな１つ以上のアミノ酸はＡ７、Ｐ６８、Ｇ９２及びＶ１７８よりなる群から選択される。
【０２３１】
マーカーの絶対的な発現レベルに基づいて測定を行うことの代わりに、測定はマーカーの規格化された発現レベルに基づいてよい。発現レベルは、マーカーの絶対的な発現レベルを、マーカーではない遺伝子、例えば構成的に発現されるハウスキーピング遺伝子の発現にその発現を比較することにより補正すれば、規格化される。規格化のための適当な遺伝子はハウスキーピング遺伝子、例えばアクチン遺伝子、又は上皮細胞特異的遺伝子である。この規格化により、１つの試料、例えば対象の試料を別の試料、例えば正常な非癌性の試料に対して、又は異なる原料に由来する試料の間で、発現レベルを比較することが可能になる。
【０２３２】
或いは、発現レベルは相対的発現レベルとして提示できる。マーカーの相対的発現レベルを測定するためには、マーカーの発現レベルを正常ｖｓ癌細胞単離体の１、２、３、４、５、１０試料以上、好ましくは５０試料以上に関して測定した後に、問題の試料に関する発現レベルを測定する。多数の試料において試験した遺伝子の各々の平均の発現レベルを求め、そしてこれをマーカーに関するベースライン発現レベルとして使用する。次に、試験試料に関して測定したマーカーの発現レベル（発現の絶対的レベル）をそのマーカーに関して得られた平均の発現値で割る。これにより相対的発現レベルが得られる。
【０２３３】
Ｃｒｉｐｔｏ−３の発現レベルは試料中のＣｒｉｐｔｏ−１の発現レベルに対する相対的発現レベルとして提示できることも意図している。１つの実施形態において、本発明は患者が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法に対する適当な候補であるかどうかを試験する方法を提供し、方法は、患者試料、例えば腫瘍試料中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現レベルと患者試料中のＴＤＧＦ１遺伝子の発現レベルを比較する工程を含み、ここで患者試料中のＴＤＧＦ１遺伝子の発現レベルと比較した場合に患者試料中のＴＤＧＦ３遺伝子の発現レベルがより高値であることは患者が抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法に対する適当な候補であることを示す。好ましくは、ベースライン測定において使用する試料は同じ組織型の癌細胞又は正常細胞に由来するものとなる。細胞の原料の選択は相対的発現レベルの使用に依存する。平均発現スコアとして正常組織中で観察される発現を使用することにより、試験しているマーカーが細胞の誘導元の組織に特異的であるかどうか（ｖｓ正常細胞）を確認する場合に参考になる。更に又、データがより多く蓄積するに従って、平均発現値を見直すことができ、蓄積データに基づいた向上した相対的発現値が得られる。正常細胞由来の発現データは形質転換された状態、例えば癌の状態の重症度を等級づけるための手段を提供する。
【０２３４】
本発明の組成物、キット及び方法は本発明のマーカーの発現レベルの相違の検出に依存しているため、マーカーの発現のレベルは正常細胞及び癌性の細胞の少なくとも１つにおける発現を試験するために使用される方法の最低検出限界より有意に高値である。
【０２３５】
別の好ましい実施形態においては、マーカーの発現は対象試料中の細胞に由来するゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ（即ち転写されたポリヌクレオチド）を製造することにより、そしてマーカーを含むポリヌクレオチド及びそのフラグメントの相補体であるレファレンスポリヌクレオチドとゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ／ｃＤＮＡをハイブリダイズすることによりにより試験される。ｃＤＮＡは場合によりレファレンスポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの前に種々のポリメラーゼ連鎖反応法の何れかを用いて増幅できる。１つ以上のマーカーの発現も同様に定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を用いることにより検出することができ、これによりマーカーの発現のレベルを試験できる。或いは、本発明のマーカーの突然変異又は変異体（例えば１ヌクレオチド多形、欠失等）を検出するための多くの知られた方法の何れかを使用して対象における突然変異したマーカーの存在を検出してよい。
【０２３６】
別の実施形態においては、マーカーの発現を試験するための方法の組み合わせを利用する。
【０２３７】
２．発現された蛋白の検出のための方法
本発明のマーカー蛋白、例えばＣｒｉｐｔｏ−３及び／又はＣｒｉｐｔｏ−１の活性又はレベルは又、発現されたポリペプチドを検出又は定量することにより、検出及び／又は定量することができる。ポリペプチドは当該分野で良く知られている多くの集団の何れかにより検出及び定量できる。これらは分析的生化学的方法、例えば電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高拡散クロマトグラフィー等、又は種々の免疫学的方法、例えば流体又はゲルの沈降反応、免疫拡散法（単一又は二重）、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光試験、ウエスタンブロット等を包含してよい。当業者であれば、細胞が本発明のマーカーを発現するかどうかを測定する場合の使用に対して既知の蛋白／抗体検出方法を容易に適合できる。
【０２３８】
本発明のポリペプチドを検出するための好ましい薬剤は、本発明のマーカーに相当するポリペプチドに結合できる抗体、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体はポリクローナル、或いは、より好ましくはモノクローナルであることができる。未損傷の抗体又はそのフラグメント（例えばＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２）を使用できる。プローブ又は抗体に関する場合の「標識された」という用語は、プローブ又は抗体に検出可能な物質をカップリング（即ち物理的に連結）することによるプローブ又は抗体の直接の標識、並びに、直接標識される別の試薬との反応性によるプローブ又は抗体の間接的標識を包含することを意図する。間接的標識の例は、蛍光標識された二次抗体を使用した一次抗体の検出、及びビオチンを用いてそれが蛍光標識されたストレプトアビジンで検出できるようにしたＤＮＡプローブの末端標識を包含する。
【０２３９】
好ましい実施形態においては、抗体は標識された、例えば放射標識された、発色団標識された、蛍光団標識された、又は酵素標識された抗体である。別の実施形態においては、抗体誘導体（例えば基板又は蛋白又は蛋白−リガンド対｛例えばビオチン−ストレプトアビジン｝のリガンドとコンジュゲートされた抗体）、又はマーカーに相当するオープンリーディングフレームによりコードされた蛋白、又は自身の翻訳後修飾の全て又は一部分を起こしている蛋白のようなマーカーに相当する蛋白に特異的に結合する抗体フラグメント（例えば単鎖抗体、単離された抗体の超可変ドメイン等）を使用する。
【０２４０】
細胞由来の蛋白は、当該分野で良く知られている手法を用いて単離できる。使用される蛋白単離方法は例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されているものなどであることができる。
【０２４１】
１つのフォーマットにおいて、抗体又は抗体フラグメントは発現された蛋白を検出するためのウエスタンブロット又は免疫蛍光手法のような方法において使用できる。そのような用途において固体支持体上に抗体又は蛋白の何れかを固定化することが一般的に好ましい。適当な固相支持体又は担体は抗原又は抗体を結合できる何れかの支持体を包含する。良く知られた支持体又は担体はガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、ハンレイ岩及び磁鉄鉱を包含する。
【０２４２】
当業者であれば抗体又は抗原を結合するための多くの他の適当な担体を知っており、そして本発明と共に使用するためにこのような支持体を適合することができる。例えば、細胞から単離した蛋白はポリアクリルアミドゲル電気泳動上で泳動し、そしてニトロセルロースのような固相指示体上に固定化することができる。次に支持体を適当な緩衝液で洗浄し、その後、検出可能に標識された抗体で処理することができる。次に固相支持体を緩衝液で再度洗浄し、未結合の抗体を除去することができる。次に固体支持体上の結合標識の量を従来の手段により検出できる。電気泳動法を用いて蛋白を検出する手段は当該分野で良く知られている（一般的に、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ（１９８２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．を参照できる）。
【０２４３】
別の好ましい実施形態においては、ウエスタンブロット（イムノブロット）分析を用いて試料中のポリペプチドの存在を検出及び定量する。この手法は一般的に分子量に基づいてゲル電気泳動により試料蛋白を分離すること、分離された蛋白を適当な固体支持体（例えばニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター又は誘導体化ナイロンフィルター）に転移させること、及びポリペプチドに特異的に結合する抗体と共に試料をインキュベートすることを含む。抗ポリペプチド抗体は固体支持体上のポリペプチドに特異的に結合する。これらの抗体は直接標識するか、或いは、抗ポリペプチドに特異的に結合する標識された抗体（例えば標識されたヒツジ抗マウス抗体）を用いて後に検出してよい。
【０２４４】
より好ましい実施形態においては、ポリペプチドはイムノアッセイを用いて検出する。本明細書においては、イムノアッセイとは分析対象に特異的に結合するために抗体を利用する試験である。即ちイムノアッセイは分析対象を単離し、ターゲティングし、そして定量するために他の物理的及び化学的な特性を使用することとは異なり、抗抗体へのポリペプチドの特異的結合の検出を特徴とする。
【０２４５】
ポリペプチドは多くの良く知られた免疫学的結合試験の何れかを用いて検出及び／又は定量する（例えば米国特許４，３６６，２４１；４，３７６，１１０；４，５１７，２８８；及び４，８３７，１６８参照）。一般的なイムノアッセイの考察は、Ａｓａｉ（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ３７：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓ＆Ｔｅｒｒ（１９９１）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎも参照できる。
【０２４６】
免疫学的結合試験（又はイムノアッセイ）は典型的には分析対象（ポリペプチド又は配列）に特異的に結合し、そして頻繁にはこれを固定化するために「キャプチャー剤」を使用する。キャプチャー剤は分析対象に特異的に結合する部分である。好ましい実施形態においては、キャプチャー剤はポリペプチドに特異的に結合する抗体である。抗体（抗ペプチド）は当該分野で良く知られている多くの手段の何れかにより製造してよい。
【０２４７】
イムノアッセイは頻繁には、キャプチャー剤と分析対象により形成される結合複合体に特異的に結合してこれを標識するために標識剤を利用する。標識剤はそれ自体が抗体／分析対象複合体を含む部分の１つであってよい。即ち、標識剤は標識されたポリペプチド又は標識された抗抗体であってよい。或いは、標識剤は抗体／ポリペプチド複合体に特異的に結合する別の抗体のような第３の部分であってよい。
【０２４８】
１つの好ましい実施形態においては、標識剤は標識を担持した第２のヒト抗体である。或いは、第２の抗体は標識を欠いていてよいが、その代わりに、第２の抗体の誘導元の種の抗体に特異的な標識された第３の抗体により結合されてよい。第２のものは酵素標識ストレプトアビジンのような第３の標識された分子が特異的に結合できる検出可能な部分、例えばビオチンにより修飾されていることができる。
【０２４９】
プロテインＡ又はプロテインＧのような免疫グロブリン定常領域に特異的に結合できる他の蛋白も又、標識剤として使用してよい。これらの蛋白は連鎖球菌の細胞壁の通常の構成要素である。これらは種々の種に由来する免疫グロブリン定常領域に対して強力な非免疫原性の反応性を示す（一般的にＫｒｏｎｖａｌ等（１９７３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１１：１４０１−１４０６及びＡｋｅｒｓｔｒｏｍ（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５：２５８９−２５４２を参照できる）。
【０２５０】
上記した通り、ポリペプチドの検出及び／又は定量のためのイムノアッセイは当該分野で良く知られている広範な種類のフォーマットをとることができる。
【０２５１】
ポリペプチドを検出するための好ましいイムノアッセイは競合的又は非競合的のいずれかである。非競合的なイムノアッセイはキャプチャーされた分析対象の量を直接測定する
試験である。１つの好ましい「サンドイッチ」試験においては、例えば、キャプチャー剤（抗ペプチド抗体）は固体基板に直接結合され、そこでそれらは免疫化されることができる。次にこれらの固定化された抗体が試験試料中のポリペプチドをキャプチャーする。このようにして固定化されたポリペプチドは次に、標識剤、例えば標識を担持している第２のヒト抗体に結合される。
【０２５２】
競合的試験の場合は、試料中に存在する分析対象（ポリペプチド）の量は、試料中に存在する分析対象によりキャプチャー剤（抗ペプチド抗体）から退去させられた（又は競合的に排除された）添加された（外来の）分析対象の（ポリペプチド）の量を測定することにより間接的に測定される。１つの競合的試験において、既知量の、この場合はポリペプチドを試料に添加し、そして次に試料をキャプチャー剤と接触させる。抗体に結合したポリペプチドの量は試料中に存在するポリペプチドの濃度に反比例する。
【０２５３】
１つの特に好ましい実施形態においては、抗体は固体基盤上に固定化される。抗体に結合したポリペプチドの量はポリペプチド／抗体複合体中に存在するポリペプチドの量を測定することにより、又は残存する未複合体化ポリペプチドの量を測定することにより、測定してよい。ポリペプチドの量は標識されたポリペプチドを供することにより検出してよい。
【０２５４】
本発明の試験は当該分野で良く知られている標準的な方法に従って採点される（陽性又は陰性又はポリペプチドの量）。採点の特定の方法は試験フォーマット及び選択された標識に依存することになる。例えば、ウエスタンブロット試験は酵素標識により生成された着色生成物を可視化することにより採点できる。正しい分子量における明確に目視できる着色されたバンド又はスポットは陽性の結果と採点され、そして明確に目視できるスポット又はバンドが存在しないことは陰性と採点される。バンド又はスポットの強度はポリペプチドの定量的尺度を与えることができる。
【０２５５】
本明細書に記載した種々のイムノアッセイにおける使用のための抗体は上記した通り製造できる。
【０２５６】
別の実施形態において、レベル（活性）は遺伝子産物の酵素的活性を測定することにより試験される。酵素活性を試験する方法は当該分野で良く知られている。
【０２５７】
バイオマーカー蛋白の検出のためのインビボの手法は、蛋白に対して指向された標識抗体を対象内に導入することを包含する。例えば抗体は、対象内の自身の存在及び位置が標準的な画像化手法により検出できる放射性マーカーで標識できる。
【０２５８】
当然ながら、対象の試料、例えば組織又は細胞、例えば腫瘍組織又は細胞を含有する試料、例えば全血、血清、血漿、口腔スワブ、唾液、脊髄液、脳脊髄液、尿、糞便は特に細胞が癌性である場合、そして更にとりわけ癌が転移中である場合そこに細胞を含有する場合があり、そしてこのため、本発明の方法において使用してよい。細胞試料は当然ながら、試料中のマーカーの発現レベルの試験前に種々の良く知られた収集後の調整及び保存の手法（例えば核酸及び／又は蛋白の抽出、固定化、保存、凍結、限外濾過、濃縮、蒸発、遠心分離等）に付すことができる。即ち、本発明の組成物、キット及び方法は自身を発現する細胞の表面上にディスプレイされる部分少なくとも１つを有する蛋白に相当するマーカーの発現を検出するために使用できる。何れかの特定のマーカーに相当する蛋白が細胞表面蛋白を含むかどうかを調べることは当業者にとっては簡単なことである。例えば、免疫学的方法を用いて全細胞上のそのような蛋白を検出してよく、又はよく知られたコンピューター系の配列分析方法（例えばＳＩＧＮＡＬＰプログラム；Ｎｉｅｌｓｅｎ等、１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：１−６）を用いて少なくとも１つの細胞外ドメインの存在を予測してよい（即ち分泌蛋白および少なくとも１つの細胞表面ドメインを有する蛋白の両方を包含する）。自身を発現する細胞の表面上にディスプレイされる部分少なくとも１つを有する蛋白に相当するマーカーの発現は必ずしも細胞を溶解することなく検出してよい（例えば蛋白の細胞表面ドメインに特異的に結合する標識された抗体を使用する）。
【０２５９】
本発明は又、生物学的試料、例えば組織又は細胞、例えば腫瘍組織又は細胞を含有する試料、又は生物学的流体、例えば全血、血清、血漿、口腔スワブ、唾液、脊髄液、脳脊髄液、尿、糞便中の本発明のマーカーに相当するポリペプチド又は核酸の存在を検出するためのキットを包含する。そのようなキットは細胞が形質転換されているかどうかを調べるために使用できる。そのようなキットは抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体療法に対して対象が適当な候補であるかどうかを試験するためにも使用できる。例えば、キットは生物学的試料中の本発明のマーカーに相当するポリペプチド又はポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出することができる標識された化合物又は薬剤、及び試料中のポリペプチド又はｍＲＮＡの量を測定するための手段（例えばポリペプチドに結合する抗体、又はポリペプチドをコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合する核酸分子（プローブ又はプライマー））を含むことができる。キットは又、キットを用いて得られた結果を解釈するための説明書を包含できる。
【０２６０】
抗体系キットに関しては、キットは、例えば（１）本発明のマーカーに相当するポリペプチドに結合する第１の抗体（例えば固体支持体に結合）；及び場合により（２）ポリペプチド又は第１の抗体の何れかに結合し、検出可能な標識にコンジュゲートされた第２の異なる抗体、を含むことができる。
【０２６１】
核酸分子系キットに関しては、キットは、例えば（１）本発明のマーカーに相当するポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリダイズする核酸分子（プローブ）、例えば検出可能に標識された核酸分子、又は（２）本発明のマーカーに相当する核酸分子を増幅するために有用な核酸分子対（プライマー）、を含むことができる。キットは又、例えば緩衝剤、保存料又は蛋白安定化剤も含むことができる。キットは更に検出可能な標識（例えば酵素又は基質）を検出するために必要な成分も含むことができる。キットは又試験して試験試料と比較することができる対照試料又は一連の対照試料も含有できる。キットの各成分は個別の容器内に封入することができ、そして、種々の容器の全ては、キットを使用して実施された試験の結果を解釈するための説明書と共に単一のパッケージ内に包含されることができる。
【０２６２】
本発明は以下の実施例により更に説明するが、それらは限定的とみなしてはならない。本出願全体を通して引用された全ての参考文献、図面、表、添付資料、アクセッション番号、特許及び公開特許出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２６３】
実施例１：ＴＤＧＦ３（Ｃｒｉｐｔｏ−３）遺伝子発現分析
Ａ．材料及び方法
ヒトゲノムＤＮＡ及びＲＮＡの試料。健常対照ヒトゲノムＤＮＡをＳｉｇｍａ（ＨＲＣ１パネル）及びＣｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓから購入した。ヒト癌ゲノムＤＮＡ及びＲＮＡはＢｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ９４５４５）から購入するか、又はヒト組織（Ａｓｔｅｒａｎｄ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ４８２０２）及び細胞培養物から製造した。全てのヒト癌細胞系統はＮＣＩ−ＤＣＴＤ腫瘍レポジトリーから入手したＫＭ２０Ｌ２を除き、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。ＤＮＡはＤＮｅａｓｙキット（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で製造した。ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌで製造し、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）でフォローアップした。「ゲノムＤＮＡ非含有」ＲＮＡ中でいかなる残存ゲノムＤＮＡ夾雑物も排除するため、各ＲＮＡ試料１μｇをｃＤＮＡ合成前に室温で１５又は３０分間ＤＮａｓｅＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１単位で消化した。ｃＤＮＡはＣｒｉｐｔｏ−１イントロン特異的オリゴプライマー：（ＣＧＣＴＴＡＣＡＧＧＡＡＴＴＧＣＣＣＴＴＧＣ（配列番号４５）；及びＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧＣＴＡＴＣＧＣＡＧＣ（配列番号４６））を用いたＰＣＲによりｇＤＮＡ夾雑に関して確認した。
【０２６４】
ｃＤＮＡ製造及びＴＡクローニング。ｃＤＮＡはＳＭＡＲＴｃＤＮＡ合成キット（ＢＤＣｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）を用いて、製造元のプロトコルに従って合成した。ゲノムＤＮＡを含有しない全ＲＮＡの０．３μｇを各試料に関して使用した。各試料由来のｃＤＮＡを鋳型として用いることにより、ＴＤＧＦ１及びＣｒｉｐｔｏ−３ｃＤＮＡの完全長又はフラグメントを、両方の遺伝子について共通である以下のオリゴプライマー：
ＧＧＣＴＧＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＧ（ＦＬ、フォワード）（配列番号４７）及び、
ＧＴＡＴＴＴＣＴＧＧＡＡＡＴＡＧＧＴＣＡＡＴＧＴＣＧ（ＦＬ、リバース）（配列番号４８）；
ＧＧＣＴＧＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＧ（部分、フォワード）（配列番号４７）及び、
ＴＧＴＧＡＴＴＴＧＧＡＴＣＡＴＧＧＣＣＡ（部分、リバース）（配列番号４９）、
を用いて増幅した。ＰＣＲ産物はｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングし、各組織試料由来の多数の単離体を配列決定した。
【０２６５】
ピロシーケンサーによる遺伝子タイピング。標的ＤＮＡフラグメントを０．４μｌのチタニウムＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を含有する２０μｌの反応容量中２０ｎｇのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件は以下の通り、即ち初期変性９５℃１分、変性９４℃４５秒、アニーリング６４℃４５秒、伸長７２℃０．５分、及び反復回数３８サイクルとした。プライマーの配列は以下の通りであった。
ＣＴＣＡＴＧＴＴＴＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣ（フォワード）（配列番号５０）、
ＣＡＴＣＧＡＡＧＴＣＡＧＧＣＡＧＴＴＣＴＴＡＣ（リバース、５’末端でビオチニル化）（配列番号５１）；
ＧＡＴＣＡＴＧＧＣＣＡＴＴＴＣＴＡＡＡＧ（Ｖ／Ａ２２に対する配列決定プライマー）（配列番号５２）；
ＧＡＡＴＴＴＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＣＴＣＧＧＧＧＡ（Ｙ／Ｄ４３に対する配列決定プライマー）（配列番号５３）。
約３〜８μｌのＰＣＲ産物をＰＳＱ９６ＨＳ機材（Ｂｉｏｔａｇｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上で製造元により示唆されたプロトコルに従って遺伝子タイピングのために使用した。
【０２６６】
Ｃｒｉｐｔｏ−１及びＣｒｉｐｔｏ−３特異的ＰＣＲ。ＰＣＲ条件は以下の通り、即ち初期変性９５℃１分、変性９４℃４５秒、アニーリング６４℃（Ｃｒｉｐｔｏ−３特異的）又は６６℃（Ｃｒｉｐｔｏ−１特異的）４５秒、伸長７２℃１分、及び反復回数３５サイクルとした。プライマーの配列は以下の通りであった。
Ｃｒｉｐｔｏ−１に対するフォワードオリゴヌクレオチド：ＧＣＴＡＣＧＡＣＣＴＴＣＴＧＧＧＧＡＡＡＡＣＧ（配列番号３６）；
Ｃｒｉｐｔｏ−１に対するリバースオリゴヌクレオチド：ＣＴＧＧＴＣＡＴＧＡＡＡＴＴＴＧＣＡＴＧ（配列番号３７）；
Ｃｒｉｐｔｏ−３に対するフォワードオリゴヌクレオチド：ＧＣＧＴＧＴＧＣＴＧＣＣＣＡＴＧＧＧＡ（配列番号２７）；
Ｃｒｉｐｔｏ−３に対するリバースオリゴヌクレオチド：ＣＧＧＧＴＣＡＴＧＡＡＡＴＴＴＧＣＡＴＡ（配列番号２８）。
ＰＣＲ産物の予測される大きさはＣｒｉｐｔｏ−１フラグメントでは７７６ｂｐ、及びＣｒｉｐｔｏ−３フラグメントでは４３１ｂｐ以下であった。
【０２６７】
Ｃｒｉｐｔｏ蛋白のＦＡＣＳ検出。細胞を抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体１０μｇ／ｍｌと共にインキュベートし、抗マウスＩｇＧＰＥコンジュゲート二次抗体で染色した。約１０，０００個の細胞をＦＡＣＳカリバー及びＦｌｏｗＪｏソフトウエアを用いながらフローサイトメトリーにより分析した。
【０２６８】
Ｂ．結果
Ｃｒｉｐｔｏ−３遺伝子発現。Ｃｒｉｐｔｏ−３遺伝子がヒト腫瘍組織及び腫瘍細胞系統において発現されるかどうかを調べるために、ヒト腫瘍組織試料及び腫瘍細胞系統に由来するＣｒｉｐｔｏｃＤＮＡをＣｒｉｐｔｏ−１とＣｒｉｐｔｏ−３に共通のプライマーを用いて増幅した（図２Ｂ）。次にＰＣＲ生成物をクローニングし、そして各試料由来の多数のクローンを配列決定した。Ｃｒｉｐｔｏ−３は無イントロンの遺伝子であるため、そのゲノムコーディング配列はｃＤＮＡ配列と同一である。即ち、如何なるゲノムＤＮＡ夾雑ＲＮＡ調製品も増幅され、そしてＣｒｉｐｔｏ−３ｃＤＮＡとして誤解釈される可能性がある。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）夾雑を排除するために、ＲＮＡ調製品をＤＮａｓｅＩで十分処理した後に逆転写し、そしてＣｒｉｐｔｏ−１イントロンに特異的なプライマーを用いたＰＣＲを実施することによりｃＤＮＡがゲノムＤＮＡ夾雑のないことを確認した（図２）。意外なことに、癌試料由来のｃＤＮＡクローンの全ての単離体がＣｒｉｐｔｏ−３遺伝子から誘導され、そしてＣｒｉｐｔｏ−３ｃＤＮＡは又試験した８癌細胞系統のうち５系統において観察された（表４）。
【０２６９】
【表４】
2009535033.tif 000007
ＴＡがコーディング潜在性を有さないｍＲＮＡを起源とするｃＤＮＡフラグメントをクローニングした可能性に関する対照とするために、別の癌組織試料由来の完全長ＴＤＧＦｃＤＮＡをＣｒｉｐｔｏ−１とＣｒｉｐｔｏ−３に共通のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。全てのＴＤＧＦ陽性癌試料に由来する完全長ｃＤＮＡクローン単離体はＣｒｉｐｔｏ−３遺伝子から誘導されることがわかった（表５）。Ｃｒｉｐｔｏ−３ｃＤＮＡも又、１正常乳腺、２正常結腸及び３正常肺試料中に存在していた（表５）。Ｃｒｉｐｔｏ−１ｃＤＮＡは乳腺試料６点中３点、及び肺試料６点中２点を包含する健常組織から増幅されたのみであった（表５）。１点の正常肺試料のみがＣｒｉｐｔｏ−１及びＣｒｉｐｔｏ−３遺伝子の両方から誘導されたｃＤＮＡクローンをもたらした（表５及び表４）。
【０２７０】
【表５】
2009535033.tif 000008
転写物特異的ＰＣＲ。Ｃｒｉｐｔｏ−１とＣｒｉｐｔｏ−３に共通のプライマーを用いたＰＣＲは一方の遺伝子転写物に対してもう一方よりも偏ったデータを生じさせた可能性がある。ＴＤＧＦ発現に関する独立した実験データを得るために、２遺伝子の間で固定されたヌクレオチド相違を利用しながら上記と同じセットのｃＤＮＡに対して転写物特異的ＰＣＲを実施した。２蛋白間には４種の固定されたアミノ酸相違、即ちＣｒｉｐｔｏ−１においてはアラニン７（Ａ７）、プロリン６８（Ｐ６８）、グリシン９２（Ｇ９２）及びバリン１７８（Ｖ１７８）であるのに対し、Ｃｒｉｐｔｏ−３においてはバリン７（Ｖ７）、ロイシン６８（Ｌ６８）、グルタミン酸９２（Ｅ９２）及びアラニン１７８（Ａ１７８）が存在する。これらのユニークなアミノ酸の１つ以上をコードするヌクレオチド配列に特異的なプライマーを用いてＣｒｉｐｔｏ−１又はＣｒｉｐｔｏ−３転写物を特異的に増幅した。図３Ａに示す通り、３種の正常乳腺及び２種の正常肺の試料はＣｒｉｐｔｏ−１を発現した。これとは対照的に、本実験において試験した癌試料の全てはＣｒｉｐｔｏ−３に関して陽性であるか、又は陰性のＲＴ−ＰＣＲ結果を有していた。
【０２７１】
ＳＡＧＥデータベース検索。次に、公的なＳＡＧＥデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＳＡＧＥのウエブサイト参照）をＣｒｉｐｔｏ−３発現の独立した証拠に関して検索した。検索において使用したＴＤＧＦ１特異的タグは配列：ＴＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＡＧＧＴＣＴであった。検索に使用したＣｒｉｐｔｏ−３特異的タグは配列：ＣＴＣＴＴＣＡＧＡＡであった。ＳＡＧＥライブラリの２つの非重複セットはＣｒｉｐｔｏ−１又はＣｒｉｐｔｏ−３タグの何れかに対して陽性であった。１０Ｃｒｉｐｔｏ−１タグ陽性ライブラリのうち９点はＥＳ細胞由来、１つは胎児脳由来であった。５Ｃｒｉｐｔｏ−３陽性ライブラリのうち４点は癌試料由来であった。これらのデータはＣｒｉｐｔｏ−３が癌組織中で発現されるという結論をさらに裏付けている。
【０２７２】
アフィメトリックス遺伝子発現データ。次に、腫瘍におけるＣｒｉｐｔｏ−１ではなくＣｒｉｐｔｏ−３の発現を裏付ける別の独立した証拠がアフィメトリックス遺伝子発現データから誘導された。ヒトＵ９５Ａｖ２アフィメトリックスチップ上のプローブセット４０３８６＿ｒ＿ａｔをＣｒｉｐｔｏ−１特異的としてアノテーションした。しかしながら、これらのプローブセットにおける１６プローブのうち僅か１つのみがＣｒｉｐｔｏ−１に対して特異的であり、他のプローブは全てＣｒｉｐｔｏ−１とＣｒｉｐｔｏ−３の両方に共通している。「Ｃｒｉｐｔｏ−１」発現はこのプローブセットを用いて４２点の人悪性結腸試料中２８点において検出された。Ｃｒｉｐｔｏ−１特異的オリゴヌクレオチドプローブは、シグナルがほぼ常時「非存在」であったため、一貫してセット中の全プローブの最低強度を有していた（ｐ＜０．０１）。これらの実験においてＣｒｉｐｔｏ−１特異的プローブに由来するシグナルが欠如していたことはＣｒｉｐｔｏ−１メッセージよりはむしろＣｒｉｐｔｏ−３からＣｒｉｐｔｏシグナルが誘導されていることと合致している。
【０２７３】
配列変異分析。最後に、観察されたｃＤＮＡ配列がＣｒｉｐｔｏ−１における多形又は突然変異から誘導される可能性があるかどうかを試験するために、Ｃｒｉｐｔｏ−１及びＣｒｉｐｔｏ−３における配列の変異を９６健常者対照、７２癌試料、及び３２細胞系統に由来するＤＮＡにおいて分析した。Ｃｒｉｐｔｏ−１に関しては２つのあらかじめ報告されているＳＮＰ、ｒｓ１１１３００９７及びｒｓ２２９３０２５は、ｄｓＳＮＰにおいて報告されている健常者集団に由来するものと同様の対立遺伝子頻度を示した。Ｃｒｉｐｔｏ−１はＣｒｉｐｔｏ３においては単形である２つの部位において多形であった。特に、Ｃｒｉｐｔｏ−１はアミノ酸残基２２、例えばＶ／Ａ２２（ヌクレオチド位３１２においてＴ／Ｃ）、そしてアミノ酸残基４３、例えばＹ／Ｄ（ヌクレオチド位３７４においてＴ／Ｇ）において多形であることが観察された。Ｃｒｉｐｔｏ−３はこれらの位置において単形であることがわかり、その場合、Ｃｒｉｐｔｏ−３配列における特定のアミノ酸は、例えばＡ２２及びＤ４３のようなＣｒｉｐｔｏ−１配列における２つの変異体の１つにおけるその位置におけるアミノ酸と同じである。即ちアミノ酸Ｖ２２及びＹ４３はＣｒｉｐｔｏ−１にユニークである。Ｖ２２に関する推定対立遺伝子頻度は白人（９４個体を遺伝子タイピング）において約４７％、そしてアフリカ系アメリカ人（８６個体を遺伝子タイピング）において約５７％である。Ｄ４３に関する推定対立遺伝子頻度は白人（９４個体を遺伝子タイピング）において４％、そしてアフリカ系アメリカ人（９６個体を遺伝子タイピング）において１％である。その他に関しては、Ｃｒｉｐｔｏ−１とＣｒｉｐｔｏ−３が異なる部位においてＳＮＰや突然変異は観察されなかった。Ｃｒｉｐｔｏ−３に関しては、全コーディング配列をこれらの２０４試料において配列決定し、そしてヌクレオチド変異は観察されず、全配列は本明細書に記載するＣｒｉｐｔｏ−３ｃＤＮＡクローンに関して観察されたものと同一であった。
【０２７４】
Ｃｒｉｐｔｏ−３蛋白発現。次の疑問点はＣｒｉｐｔｏ−３ｍＲＮＡが細胞内で翻訳され、そして生じたＣｒｉｐｔｏ−３蛋白が細胞表面にまで輸送されるかどうかであった。２つの抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体、Ｂ３．Ｆ６及びＡ６．Ｃ１２を用いて蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によりＣｒｉｐｔｏ−３蛋白を測定した。ＢＴ４７４、即ちＣｒｉｐｔｏ−３ｃＤＮＡのみが良好にＰＣＲ増幅できた細胞系統は、Ｃｒｉｐｔｏ−１  ＲＴ−ＰＣＲのみに対して陽性である細胞系統ＮＣＣＩＴと同じ染色パターンを示した（図４Ａ）。同様の結果がＣｒｉｐｔｏ−１又はＣｒｉｐｔｏ−３の何れかを発現するプラスミドでトランスフェクトされている細胞系統Ｔ４７Ｄ（内因性Ｃｒｉｐｔｏ発現については陰性）からえられた（ず４Ｂ）。これらの結果はＣｒｉｐｔｏ−３遺伝子が転写されるのみならず、Ｃｒｉｐｔｏ−３蛋白が翻訳されてこれらの細胞の細胞表面に輸送されたことを示している。
【０２７５】
Ｃｒｉｐｔｏ−３発現の調節。本明細書に記載した通り一部の癌においてＣｒｉｐｔｏ−３の発現が観察されたため、この遺伝子がこれらの細胞においてどのようにして脱調節されるかという疑問が生じる。Ｃｒｉｐｔｏ−３発現が癌において脱調節される機序として考えられるものは、限定しないが、（ｉ）Ｃｒｉｐｔｏ−３遺伝子座の増幅；（ｉｉ）Ｃｒｉｐｔｏ−３のプロモーター／調節領域における突然変異；（ｉｉｉ）Ｃｒｉｐｔｏ−３発現を調節する転写因子のアップレギュレーション又はダウンレギュレーション；及び（ｉｖ）Ｃｒｉｐｔｏ−３プロモーターのメチル化状態の変化を包含する。ゲノムワイドの発現プロファイルのマイニングにより発現パターンがＴＤＧＦと正の相関にある数種の遺伝子、例えばＡＳＣＬ２、ＤＨＣＲ７、ＥＰＨＢ３、ＧＰＳＭ２、ＮＯＸ１、Ｃ１３ｏｒｆ２３およびＮＵＦＩＰ１が判明した。特にＡＳＣＬ２はＥ−Ｂｏｘ配列フラグメントのクラスターに結合する転写因子をコードしている。Ｃｒｉｐｔｏ−３転写開始部位の上流３００ヌクレオチド領域内にＥ−Ｂｏｘ６個が存在するのに対し、Ｃｒｉｐｔｏ−１転写開始部位の上流３００ヌクレオチドフラグメント内にはＥ−Ｂｏｘ僅か１個が存在するのみである。これらのデータはＡＳＣＬ２転写因子とＣｒｉｐｔｏ−３遺伝子発現の間に関連性がある可能性があることを示唆している。更にゲノム分析を行うことによりいかにしてＣｒｉｐｔｏ−３遺伝子発現が癌においてモジュレートされるかが解明し易くなり、癌治療のためにＣｒｉｐｔｏ又はその相互作用蛋白をどのようにターゲティングすればよいかに関する情報が更にもたらされると考えられる。
【０２７６】
Ｃ．考察
Ｃｒｉｐｔｏ−１とＣｒｉｐｔｏ−３のレファレンス配列の間には６つのアミノ酸相違が存在し、そのうち４つは固定された相違であり、２つはＣｒｉｐｔｏ−１において多形である部位にある。図１に示す通り、固定されたアミノ酸相違はＡ７Ｖ、Ｐ６８Ｌ、Ｇ９２Ｅ、Ｖ１７８Ａ（Ｃｒｉｐｔｏ−１配列をはじめに示す）である。これらのアミノ酸相違の機能的意味は現時点では不明であるが、６８位におけるロイシンによるプロリンの非保存的置換は注目すべきである。やはり注目すべき点は、ヒトゲノム内のＴＤＧＦ偽遺伝子の全てのうち、Ｃｒｉｐｔｏ−３がそのオープンリーディングフレーム内に維持されている唯一の偽遺伝子である点である。更に又、本明細書において試験した試料においては突然変異やＳＮＰは観察されなかった。チンパンジーＸ染色体（レファレンス配列コンティーグＮＷ１２２１１８．１）上の無イントロンＴＤＧＦ偽遺伝子の存在は、Ｃｒｉｐｔｏ−３が少なくともヒト種と同様に古いことを示している。従って、Ｃｒｉｐｔｏ−３遺伝子は低減した変異を有するゲノムの一部分にあるか、及び／又は精製選択に付されていると考えられる。Ｃｒｉｐｔｏ−３上での集中的な精製選択は、Ｃｒｉｐｔｏ−３が機能的役割も癌において遺伝子が果たす何れかの役割に追加的に有していることと合致している。
【０２７７】
本発明に先だって、ＴＤＧＦ発現に関する全ての公開された研究はＣｒｉｐｔｏ−１とＣｒｉｐｔｏ−３を区別しない方法を使用している。ＩＨＣ、ノーザンブロット分析及びゲノムワイドのオリゴヌクレオチドチップの結果は、単にＣｒｉｐｔｏ−３がイントロン欠如のような偽遺伝子の一部の目印を担持しているという理由から、Ｃｒｉｐｔｏ−１に起因するとされていた。しかしながら、無イントロン遺伝子の発現は稀ではなく；ヒト遺伝子の約５％が無イントロンと推定される。１５Ｃｒｉｐｔｏ−３からＣｒｉｐｔｏ−１を区別するための十分な配列特異性を有する唯一の公的に入手されるデータはＳＡＧＥであるが、癌におけるＣｒｉｐｔｏ−３発現を示すデータは見落とされている。
【０２７８】
出願人等は推定偽遺伝子Ｃｒｉｐｔｏ−３は機能的な無イントロン遺伝子であること、及びＣｒｉｐｔｏ−３が有意な数量のＴＤＧＦ陽性癌組織において検出可能なレベルで発現される唯一のＣｒｉｐｔｏ遺伝子であることの証拠を最初に提示した。Ｃｒｉｐｔｏ−１は早期の胚の発生の間に重要な役割を果たすこと、及びＣｒｉｐｔｏ−１の操作された過剰発現は腫瘍形成性であることは明白である。Ｃｒｉｐｔｏ−３が癌組織において発現されること、及びＣｒｉｐｔｏ−３はＣｒｉｐｔｏ−１と同様のコーディング配列を有することを観察したことは、Ｃｒｉｐｔｏ−３発現も又腫瘍形成性であることを強力に示唆している。即ち、Ｃｒｉｐｔｏ−１は胚発生及び乳腺発達の間に重要な役割を果たすべく進化したと考えられるが、Ｃｒｉｐｔｏ−１又はＣｒｉｐｔｏ−３の何れかが高レベルで成人組織において発現することは腫瘍形成性であると予測される。
【０２７９】
実施例２：Ｃｒｉｐｔｏ−Ｎｏｄａｌシグナリング試験におけるＴＤＧＦ３（Ｃｒｉｐｔｏ−３）機能
Ａ．材料及び方法
マウスＣｒｉｐｔｏに関してヌルであるマウス奇形癌Ｆ９Ｃｒｉｐｔｏ−／−細胞（２４穴プレート中２ｘ１０５個／ウェル）を５０ｎｇの（ｎ２）７−ルシフェラーゼレポーターコンストラクト、１００ｎｇのフォークヘッドアビジンシグナルトランスデューサー（ＦＡＳＴ）転写因子、及び１００ｎｇの完全長ヒトＣｒｉｐｔｏ−１又はヒトＣｒｉｐｔｏ−３発現プラスミドと共にリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いながらトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＬｕｃＬｉｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で溶解し、ルシフェラーゼ活性をルミネセントのメーター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）において測定した。
【０２８０】
Ｂ．結果
ひとＣｒｉｐｔｏ−１及びヒトＣｒｉｐｔｏ−３がＮｏｄａｌを介してシグナリングする能力について、ＦＡＳＴ転写因子依存性（ｎ２）７−ルシフェラーゼレポーター試験において試験した。活性はマウスＣｒｉｐｔｏ遺伝子座（Ｆ９Ｃｒｉｐｔｏ−／−）の不活性化に関してターゲティングされたマウスＦ９誘導胚性癌腫細胞系統遺伝子において試験した。これらの細胞は内因性Ｎｏｄａｌを含有するが、Ｃｒｉｐｔｏに関してはヌルであり、即ちＣｒｉｐｔｏ依存性シグナリングに関してはヌルである。対照と比較した場合にＣｒｉｐｔｏ−３及びＣｒｉｐｔｏ−１トランスフェクト細胞においてはルシフェラーゼ活性の４〜６倍増大が観察された（図５）。これらの結果はヒトＣｒｉｐｔｏ−１及びヒトＣｒｉｐｔｏ−３が両方ともＮｏｄａｌを介してシグナリングできることを示している。
【０２８１】
参考文献
【０２８２】
【表６−１】
2009535033.tif 000009
【０２８３】
【表６−２】
2009535033.tif 000010
等価物
当業者であれば、定型的な実験を超えることなく本明細書に記載した本発明の特定の実施形態と等価である多くのものを認識、又は確認することができる。そのような等価物は添付請求項に包含されることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０２８４】
【図１Ａ】図１Ａ−ＣはＣｒｉｐｔｏ−１及びＣｒｉｐｔｏ−３をコードするヌクレオチド配列及びポリペプチド配列を示す。（Ａ）ＴＤＧＦ１及びＴＤＧＦ３によりコードされる蛋白のペプチド配列アライメント。上側の線はＣｒｉｐｔｏ１配列（配列番号１）であり下側の線はＣｒｉｐｔｏ３配列（配列番号２）である。共通の配列は中央にある。２蛋白間の異なるアミノ酸残基の位置は点で示す。ＴＤＧＦ１におけるＳＮＰにより誘発されたＣｒｉｐｔｏ１における可変アミノ酸部位はアスタリスクで示し、２蛋白間の固定されたアミノ酸相違を有する部位は箱で囲む。シグナルペプチドは太字で示す。潜在的フコシル化部位には下線を付す。
【図１Ｂ】図１Ａ−ＣはＣｒｉｐｔｏ−１及びＣｒｉｐｔｏ−３をコードするヌクレオチド配列及びポリペプチド配列を示す。（Ｂ）Ｃｒｉｐｔｏ−１をコードする核酸配列（配列番号３）。
【図１Ｃ】図１Ａ−ＣはＣｒｉｐｔｏ−１及びＣｒｉｐｔｏ−３をコードするヌクレオチド配列及びポリペプチド配列を示す。（Ｃ）Ｃｒｉｐｔｏ−３をコードする核酸配列（配列番号４）。
【図２Ａ】図２Ａ−２ＢはＴＤＧＦｃＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅の結果を示す。（Ａ）ｃＤＮＡ純度試験。ＴＤＧＦ１遺伝子に対して相対的なオリゴの位置及びｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲからの予測される結果を示す。レーン１〜４：４乳腺腫瘍由来のｃＤＮＡ；レーン５〜８：４結腸腫瘍由来のｃＤＮＡ；レーン９〜１２：４肺腫瘍由来のｃＤＮＡ；レーン１３：１００ｂｐのＤＮＡマーカー；レーン１４〜２５：レーン１〜１２と同じセットの組織試料に由来するゲノムＤＮＡ。
【図２Ｂ】図２Ａ−２ＢはＴＤＧＦｃＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅の結果を示す。（Ｂ）エキソン間ＰＣＲ。ＴＤＧＦ遺伝子に対して相対的なオリゴの位置及び転写物、並びにｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲからの予測される結果を示す。１３７４ｂｐのＤＮＡフラグメントはＴＤＧＦ１遺伝子由来であり、ゲノムＤＮＡから増幅された２８６ｂｐのＤＮＡフラグメントはＴＤＧＦ３遺伝子由来であり、そしてｃＤＮＡから増幅された２８６ｂｐＤＮＡフラグメントは、ｃＤＮＡ鋳型はゲノムＤＮＡ夾雑がないため、ＴＤＧＦ１及び／又はＴＤＧＦ３ｃＤＮＡ由来である。
【図３Ａ】図３Ａ−３Ｂは転写物特異的ＰＣＲの結果を示す。（Ａ）ＴＤＧＦ１転写物特異的オリゴ対を用いたＰＣＲの結果。
【図３Ｂ】図３Ａ−３Ｂは転写物特異的ＰＣＲの結果を示す。（Ｂ）ＴＤＧＦ３転写物特異的オリゴ対を用いたＰＣＲの結果。レーン１：正常乳腺＃１；レーン２：正常乳腺＃３；レーン３：正常乳腺＃４；レーン４：肺＃；レーン５：正常肺＃４；レーン６〜１２：乳癌；レーン１３；正常結腸；レーン１４〜１５：結腸癌；レーン１６〜１８：正常肺；レーン１９：正常マッチ肺；レーン２０〜２１：肺癌；レーン２２：ｇＤＮＡ対照；レーン２３：１００ｂｐＤＮＡマーカー。
【図４】図４Ａ−４Ｂは細胞表面上のＣｒｉｐｔｏ１及びＣｒｉｐｔｏ３のＦＡＣＳ分析から得られた結果を示す。（Ａ）Ｃｒｉｐｔｏに対する抗体を用いたＴＤＧＦ１及びＴＤＧＦ３陽性細胞系統のＦＡＣＳ分析。（ａ）ＮＣＣＩＴ細胞（ＴＤＧＦ１陽性）；（ｂ）ＢＴ４７４細胞（ＴＤＧＦ３陽性）；（ｃ）及び（ｄ）抗マウスＩｇＧによる陰性対照。結果はＣｒｉｐｔｏ１及びＣｒｉｐｔｏ３蛋白両方が細胞表面上に存在し、そして抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体により検出できることを示している。（Ｂ）ＴＤＧＦ１又はＴＤＧＦ３でトランスフェクトした細胞のＦＡＣＳ分析。（ａ）ＴＤＧＦ１遺伝子でトランスフェクトしたＴ４７Ｄ細胞；（ｂ）ＴＤＧＦ３遺伝子でトランスフェクトしたＴ４７Ｄ細胞；（ｃ）及び（ｄ）抗マウスＩｇＧによる陰性対照。結果はトランスフェクトされた遺伝子ＴＤＧＦ１及びＴＤＧＦ３によりコードされるＣｒｉｐｔｏ１及びＣｒｉｐｔｏ３が細胞表面上で発現され、そして抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体により認識されることを示している。
【図５】図５はＦ９細胞のＮｏｄａｌを介してＣｒｉｐｔｏ−１及びＣｒｉｐｔｏ−３がシグナルできることを示す結果を示す。Ｆ９ｃｒｉｐｔｏ−／−細胞を（ｎ２）７−ルシフェラーゼを発現するプラスミド、ＦＡＳＴ及び無添加（コラム１）、又はヒトＣｒｉｐｔｏ−１（コラム２）又はヒトＣｒｉｐｔｏ−３（コラム３）添加によりトランスフェクトした。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
2009535033.tif 000019
【配列表】
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【国際調査報告】
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