(57)【要約】  本発明は、リウマチ性疾患を治療するための組成物に関する。組成物は、２−メトキシエストラジオールまたはその誘導体と、１つまたは複数の抗リウマチ剤とを含む。ヒトおよび動物のリウマチ性疾患を治療するための組成物の使用方法も開示される。
2009530388.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リウマチ性疾患の治療に有効な量の
ａ）構造
【化１】
2009530388.tif 000009
を有し、前記式中のＲａが−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＣＣＨ３、−ＣＨＣＨ−ＣＨ３、またはＣＨ２−ＣＨＣＨ２である治療薬と、
ｂ）１つまたは複数の抗リウマチ剤と
を、ヒトまたは動物に投与することを含む、リウマチ性疾患の治療方法。
【請求項２】
前記治療薬および前記抗リウマチ剤が、単一の製剤として投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記治療薬および前記抗リウマチ剤が、２つ以上の別々の製剤として投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗リウマチ剤が疾患修飾性抗リウマチ薬、非ステロイド系抗炎症薬、副腎皮質ステロイド、腫瘍壊死因子阻害剤、選択的Ｂ細胞阻害剤、またはインターロイキン−１阻害剤、もしくはこれらの混合物または組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗リウマチ剤が疾患修飾性抗リウマチ薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記疾患修飾性抗リウマチ薬がアロプリノール、アミトリプチリン塩酸塩、オーラノフィン（経口金剤）、アザチオプリン、クロランブシル、コルヒチン、シクロベンザプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、デュロキセチン、フルオキセチン、金チオリンゴ酸ナトリウム（注射可能な金）、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、メトトレキセート、ミノサイクリン、ミコフェノール酸モフェチル、プロベネシド、スルファサラジン、またはトラマドールである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記疾患修飾性抗リウマチ薬がメトトレキセートである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記抗リウマチ剤が非ステロイド系抗炎症薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記非ステロイド系抗炎症薬がジクロフェナクカリウム、ジクロフェナクナトリウム、ミソプロストールを伴うジクロフェナクナトリウム、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェンカルシウム、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナム酸ナトリウム、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク、またはトルメチンナトリウムである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗リウマチ剤がＣＯＸ−２阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記非ステロイド系抗炎症薬がセレコキシブ、ロフェコキシブ、またはバルデコキシブである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記非ステロイド系抗炎症薬がアスピリン、サリチル酸コリン、サルサラート、またはサリチル酸ナトリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記非ステロイド系抗炎症薬がアレンドロネート、イバンドロネート、またはリセドロネートである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗リウマチ剤がホルモン、骨形成剤、または選択的エストロゲン受容体調節因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗リウマチ剤がカルシトニン、副甲状腺ホルモン、またはラロキシフェン塩酸塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗リウマチ剤が副腎皮質ステロイドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗リウマチ剤が、ベタメタゾン、酢酸コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロンまたはプレドニゾンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗リウマチ剤が腫瘍壊死因子阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗リウマチ剤が選択的Ｂ細胞阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗リウマチ剤がインターロイキン−１阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記リウマチ性疾患が変形性関節症、線維筋痛症、脊椎関節症、痛風、多発性筋炎、滑液包炎、腱炎、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、リウマチ性多発筋痛症、強皮症、または乾癬性関節炎である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記リウマチ性疾患が関節リウマチである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記治療薬および前記抗リウマチ剤が一緒に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記治療薬および前記抗リウマチ剤が別々に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
ａ）式
【化２】
2009530388.tif 000010
を有し、前記式中のＲａが−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＣＣＨ３、−ＣＨＣＨ−ＣＨ３、またはＣＨ２−ＣＨＣＨ２から選択される化合物と、
ｂ）１つまたは複数の抗リウマチ剤と、
を含む、リウマチ性疾患を治療するための組成物。
【請求項２６】
前記抗リウマチ剤が疾患修飾性抗リウマチ薬である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記疾患修飾性抗リウマチ薬がアロプリノール、アミトリプチリン塩酸塩、オーラノフィン（経口金剤）、アザチオプリン、クロランブシル、コルヒチン、シクロベンザプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、デュロキセチン、フルオキセチン、金チオリンゴ酸ナトリウム（注射可能な金）、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、メトトレキセート、ミノサイクリン、ミコフェノール酸モフェチル、プロベネシド、スルファサラジン、またはトラマドールである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記抗リウマチ剤が疾患修飾性抗リウマチ薬、非ステロイド系抗炎症薬、副腎皮質ステロイド、腫瘍壊死因子阻害剤、選択的Ｂ細胞阻害剤、またはインターロイキン−１阻害剤、もしくはこれらの混合物または組み合わせである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２９】
前記抗リウマチ剤が非ステロイド系抗炎症薬である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３０】
前記非ステロイド系抗炎症薬がジクロフェナクカリウム、ジクロフェナクナトリウム、ミソプロストールを伴うジクロフェナクナトリウム、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェンカルシウム、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナム酸ナトリウム、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク、またはトルメチンナトリウムである、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記抗リウマチ剤がＣＯＸ−２阻害剤である請求項２５に記載の組成物。
【請求項３２】
前記抗リウマチ剤がセレコキシブ、ロフェコキシブ、またはバルデコキシブである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３３】
前記抗リウマチ剤がアスピリン、サリチル酸コリン、サルサラート、またはサリチル酸ナトリウムである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３４】
前記抗リウマチ剤がアレンドロネート、イバンドロネート、またはリセドロネートである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３５】
前記抗リウマチ剤がホルモン、骨形成剤、または選択的エストロゲン受容体調節因子である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３６】
前記抗リウマチ剤がカルシトニン、副甲状腺ホルモン、またはラロキシフェン塩酸塩である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記抗リウマチ剤が副腎皮質ステロイドである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３８】
前記抗リウマチ剤がベタメタゾン、酢酸コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロンまたはプレドニゾンである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３９】
前記抗リウマチ剤が腫瘍壊死因子阻害剤である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項４０】
前記抗リウマチ剤が選択的Ｂ細胞阻害剤である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項４１】
前記抗リウマチ剤がインターロイキン−１阻害剤である、請求項２５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２００６年３月２０日に出願され、参照によってその全体が本明細書中に援用される米国仮特許出願第６０／７８４，２０６号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、一般に、抗リウマチ剤と組み合わせて抗血管新生薬を含む組成物およびその使用方法に関する。より具体的には、本発明は、抗リウマチ剤と組み合わせた２−メトキシエストラジオールおよびその誘導体を含む組成物に関する。より詳しくは、本発明は、１つまたは複数の抗リウマチ剤と組み合わせて２−メトキシエストラジオールおよびその誘導体を投与することによって関節リウマチおよび関連のリウマチ性疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
リウマチ性疾患は、身体の１つまたは複数の結合または支持構造における炎症および機能の損失を特徴とする。特に影響を受ける構造は、関節、腱、靱帯、骨および筋肉、そして場合によっては内臓器官である。いくつかのリウマチ性疾患は結合組織障害に分類されており、変形性関節症、線維筋痛症、脊椎関節症、痛風、多発性筋炎、滑液包炎および腱炎が含まれる。その他のリウマチ性疾患は自己免疫疾患に分類されており、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、リウマチ性多発筋痛症、強皮症、および乾癬性関節炎が含まれる。アメリカ合衆国の推定４５００万人の人々が関節炎または他のリウマチ性状態を患っており、リウマチ性疾患は６５歳以上の成人の間で身体障害の主な原因である。疾患の原因は様々であるが、その特徴的な炎症症状は共通の炎症性メディエーターを共有することが多い。
【０００４】
関節リウマチ（ＲＡ）は、持続性の滑膜組織の炎症を特徴とするリウマチ性疾患である。時が経つと、この持続性の炎症は、骨侵食、軟骨の破壊、および関節の完全性の完全な損失を生じ得る。最終的には、多数の臓器に影響を与え得る（Ｒｉｎｄｆｌｅｉｓｈら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ（２００５年）、７２（６）：１０３７４６頁）。関節の損傷は、おそらくは自己免疫性または感染性である引き金となる出来事の後に、滑膜マクロファージおよび線維芽細胞の増殖によって開始される。この後、リンパ球および内皮細胞の増殖による血管周囲領域の浸潤が起こる。時間が経つと、炎症滑膜組織は不規則に成長し始め、浸潤性のパンヌス組織を形成する。パンヌスは、軟骨および骨に侵入して破壊する。多数のサイトカイン、インターロイキン、プロテイナーゼ、および成長因子が放出され、さらなる関節破壊および全身症状の発生が起こる。（Ｒｕｄｄｙら編、Ｋｅｌｌｙ’ｓ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、第７版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ、２００５年：９９６−１０４２頁）。
【０００５】
関節リウマチの症状は、多数の関節における痛みおよび硬直として現れる。症状は、数週間にわたって出現し、多くの場合、食欲不振、脱力、または疲労を伴う。最も一般的に影響を受ける関節は、最も高い比率で関節軟骨への滑膜を有する関節であり、手首ならびに近位指節間関節および中手指節関節が含まれる（Ｒｕｄｄｙら編、Ｋｅｌｌｙ’ｓ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  第７版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ、２００５年：９９６−１０４２頁）。関節の破壊は、症状の発生の数週間以内に始まる場合がある。疾患の進行を遅らせるには早期の治療が有効なので、早期診断が肝要である。しかしながら、現在、関節リウマチを決定的に確認することができる診断テストは存在しない。
【０００６】
関節リウマチへの対応は、通常、薬物療法および非薬物療法に基づく治療からなる。疾患の過程を逆転させることを目的とした治療は、今までのところほとんど成功していない。代わりに、治療の目的は通常、機能の保存および生活の質、痛みおよび炎症の最小化、関節保護、ならびに全身合併症の調節に焦点が合わせられている（Ｈａｒｒｉｓ、（２００５年）ａｎｄ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ（２００２年）、４６：３２８−４６頁）。一般的な治療法には、痛みを調節するための非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を投与し、経口および関節内のグルココルチコステロイドを選択的に使用し、そして１つまたは複数の疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）を開始することが含まれる。一般に使用されるＤＭＡＲＤとしては、メトトレキセート、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、およびレフルノミドを含む。治療パラダイムの最近の転換において、１つまたは複数のＤＭＡＲＤによる早期および積極的な治療が現在は好まれている。このより集中的な措置は早期に治療された場合には有望であることが示されたが、患者のほんの一部だけしか臨床活性の進行停止および／または排除という理想的な目標を達成しない（Ｍａｃｈｏｌｄら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００６年）、８：１−６頁）。多数の新しい生物製剤も関節リウマチを治療するために利用可能であり、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、キメラ腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）特異的抗体と、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、ＴＮＦ−αに競合的に結合する可溶性の二量体化ヒトｐ７２受容体／Ｆｃ融合タンパク質および、インターロイキン−１受容体遮断薬であるアナキンラとが含まれる。この新しい種類の抗リウマチ薬は置換または相補的な形態の治療として有望であることが示されたが、治療の後に感染合併症が観察されている（Ｉｍａｉｚｕｍｉら、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．（２００６年）、４８（１０）：６８５−８８頁）。
【０００７】
ＲＡの開始および進行において血管新生が果たす役割についての正しい認識が高まっている（Ｋｏｃｈ、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ（２０００年）、５９（追補Ｉ）：ｉ６５−ｉ７１頁、およびＶｅａｌｅら、Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ＆  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（２００６年）、２０（５）：９４１−４７頁）。慢性炎症および血管新生は共依存性であり、組織および炎症細胞の増殖、遊走および補充は、直接および間接的な手段により血管新生を刺激することができる。同様に、血管新生は、炎症細胞を輸送して炎症組織に栄養および酸素を供給する、慢性炎症状態を維持する新しい血管の形成を通じて炎症性の病態に寄与する（Ｊａｃｋｓｏｎら、ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ、（１９９７年）、１１：４５７−６５頁）。いくつかの血管新生誘導因子がＲＡにおける役割を有すると同定されており、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＩＬ８、ＩＬ１８、およびＩＬ１などのケモカイン、Ｅ−セレクチンおよび可溶性ＶＣＡＭ−１などの可溶性の接着分子、可溶性４Ａ１１抗原、可溶性ＣＤ１４６およびアンジオポエチン−Ｔｉｅ系などの複合糖質が含まれる（Ｋｏｃｈ、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．（２００３年）、６２（追補ＩＩ）：ｉｉ６０−ｉｉ６７）。
【０００８】
ＲＡにより影響される関節は低酸素であることが示されている。ＲＡ関節における低酸素に寄与する要因には、炎症滑膜組織の高い代謝要求および支持脈管構造よりも急速に成長する急速な滑膜増殖が含まれる（Ｔａｙｌｏｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（２００５年）、１７：２９３−９８頁）。リウマチ様関節の組織低酸素は、低酸素誘導因子−１（ＨＩＦ−１）の結合によるＶＥＧＦｍＲＮＡの安定性の増大およびＶＥＦＧ遺伝子発現の増強をもたらす（Ｒｉｃｈａｒｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９９年）、２６６：７１８−２２頁）。ＨＩＦ−１αおよびヒドロキシ炭素核輸送体（ｔｒａｎｓｃｌｏｃａｔｏｒ）（ＡＲＮＴ）で構成されるＨＩＦ−１は、ＶＥＧＦ遺伝子のような標的遺伝子内の低酸素応答エレメントを結合することによって、低酸素に対する多くの転写応答を調節する（Ｊｏｎｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｓｃｉ  Ａｍ．（１９９８年）、４：２０９−１７頁）。ＨＩＦ−１は、ＲＡのない個体からの滑膜組織と比較して、ＲＡ患者の滑膜ライニングおよびストローマ細胞において過剰発現される（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．（２００１年）、４４：１５４０−４４頁およびＧｉａｔｒｏｍａｎｏｌａｋｉら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．（２００３年）、５：Ｒ１９３−Ｒ２０１）。インターロイキン１β、ＴＧＦβ、ＦＧＦ−２、およびＴＮＦαを含む多数のサイトカインおよび成長因子が異なる細胞タイプにおいてその発現を制御するので、ＶＥＧＦは免疫制御の過程にも密接に関連している。研究によって、ＶＥＧＦ誘発における成長因子と低酸素との間の相乗的な相互作用が示されている（Ｂｒｅｎｃｈｌｅｙ、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕ  Ｄｉｓ（２００１年）、６０：ｉｉｉ７１−ｉｉｉ７４）。
【０００９】
血管新生を阻害するためにいくつかの化合物が使用されている。このような１つの化合物は、２−メトキシエストラジオール（２ＭＥ２）である。２ＭＥ２はエストラジオールの天然に存在する誘導体であり、抗増殖性および抗血管新生活性を有する、経口活性で良好な耐容性の小分子であることが示されている（Ｐｒｉｂｌｕｄａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．（２０００年）、１９（１−２）：１７３−９頁）。２ＭＥ２はエストロゲン受容体、αおよびβに対して低親和性を有し、その抗増殖活性は、こられの受容体との相互作用に無関係である（ＬａＶａｌｌｅｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００２年）、６２（１３）：３６９１−７頁）。２ＭＥ２活性について、チューブリンのコルヒチン結合部位に対するその結合能力による仲介（Ｃｕｓｈｍａｎら、１９９５年、Ｄ’Ａｍａｔｏら、１９９４年）、微小管の不安定化およびＨＩＦ−１α核集積の阻害（Ｍａｂｊｅｅｓｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、（２００３年）３：３６３−７５頁）、デスレセプター５の上方制御による外因性アポトーシス経路の誘発（ＬａＶａｌｌｅｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００３年）、６３（２）：４６９−７５頁）、およびスーパーオキシドジスムターゼ酵素活性の阻害による可能性のある内因性アポトーシス経路の誘発（Ｈｕａｎｇら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００１年）、１１（８）：３４３−８頁）を含む、いくつかのメカニズムが提唱されている。
【００１０】
必要とされているのは、所望されないまたは望ましくない合併症または副作用を起こさずに、初期および後期の両段階のリウマチ性疾患の進行を停止および／または進行を逆行させることが可能な方法および組成物である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明の目的は、ヒトおよび動物のリウマチ性疾患を治療するための改善された方法および組成物を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、ヒトおよび動物の関節リウマチを治療するための改善された方法および組成物を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、所望されないまたは望ましくない副作用が少ししかないかまたは全くない、ヒトまたは動物のリウマチ性疾患を治療するための方法および組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、リウマチ性疾患を治療するための方法および組成物を含む。開示される実施形態において、組成物は、抗リウマチ剤と組み合わせた２−メトキシエストラジオールおよびその誘導体を含む。２−メトキシエストラジオールは強力な抗血管新生薬であり、その独自の抗血管新生および抗増殖能力によって他の抗リウマチ剤の効果を高めることができる。
【００１５】
別の開示される実施形態は、式
【化１】
2009530388.tif 000003
（式中、Ｒａは、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＣＣＨ３、−ＣＨＣＨ−ＣＨ３、またはＣＨ２−ＣＨＣＨ２から選択される）を有するある量の化合物と、１つまたは複数の抗リウマチ剤とをヒトまたは動物に投与することを含む、リウマチ性疾患の治療方法を含む。
【００１６】
別の実施形態は、リウマチ性疾患を治療するための組成物を含む。組成物は、式
【化２】
2009530388.tif 000004
（式中、Ｒａは、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＣＣＨ３、−ＣＨＣＨ−ＣＨ３、またはＣＨ２−ＣＨＣＨ２から選択される）を有する化合物と、１つまたは複数の抗リウマチ剤とを含む。
【００１７】
本発明のこれらおよび他の目的、特徴および利点は、開示される実施形態および添付図面の以下の詳細な説明ならびに特許請求の範囲を参照した後に明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、本明細書中に含まれる特定の実施形態の以下の詳細な説明を参照することによってより容易に理解され得る。本発明はその特定の実施形態の具体的な詳細を参照して説明されているが、このような詳細は、本発明の範囲に対する限定と見なされるべきではないと意図される。本明細書において言及される参考文献の全文は参照によってその全体が本明細書に援用される。
【００１９】
本発明は、ヒトおよび動物のリウマチ性疾患を治療するための方法および組成物を含む。本発明の開示される実施形態において、組成物は、１つまたは複数の抗リウマチ剤と組み合わせた、抗血管新生および抗増殖薬を含む。抗血管新生および抗増殖薬は、以下の式Ｉに示されるような２ＭＥ２およびその誘導体である。
【００２０】
２−メトキシエストラジオールおよびその誘導体
２ＭＥ２がその抗増殖活性および抗血管新生活性を示す過程は不明確なままであるが、多くの研究は、様々な作用メカニズムおよび細胞標的を関連させている。２ＭＥ２は、細胞周期の進行に関与する種々のタンパク質のレベルおよび活性の変化を誘発した。これらには、ＤＮＡ複製および修復の補因子、例えば増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）（Ｋｌａｕｂｅｒ，Ｎ．、Ｐａｒａｎｇｉ，Ｓ．、Ｆｌｙｎｎ，Ｅ．、Ｈａｍｅｌ，Ｅ．およびＤ’Ａｍａｔｏ，Ｒ．Ｊ．「微小管阻害剤２−メトキシエストラジオールおよびタキソールによるマウスの血管新生および乳癌の阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａｄｉｏｌ  ａｎｄ  Ｔａｘｏｌ）」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、（１９９７年）５７：８１−８６頁、Ｌｏｔｔｅｒｉｎｇ，Ｍ−Ｌ．、ｄｅ  Ｋｏｃｋ，Ｍ．、Ｖｉｌｊｏｅｎ，Ｔ．Ｃ．、Ｇｒｏｂｌｅｒ，Ｃ．Ｊ．Ｓ．およびＳｅｅｇｅｒｓ，Ｊ．Ｃ．、「１７β−エストラジオール代謝産物がＭＣＦ−７細胞周期のいくつかの制御因子に影響を及ぼす（１７β−Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ａｆｆｅｃｔ  ｓｏｍｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＣＦ−７  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ）」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、（１９９６年）１１０：１８１−１８６頁）と、細胞分裂周期キナーゼおよび制御因子、例えばｐ３４ｃｄｃ２およびサイクリンＢ（Ａｔｔａｌｌａ，Ｈ．、Ｍａｋｅｌａ，Ｔ．Ｐ．、Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚ，Ｈ．およびＡｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｌ．Ｃ．「２−メトキシエストラジオールは、チューブリンを脱重合することなく有糸分裂において細胞を停止させる（２−Ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａｄｉｏｌ  ａｒｒｅｓｔｓ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｍｉｔｏｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚｉｎｇ  ｔｕｂｕｌｉｎ）」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、（１９９６年）２２８：４６７−４７３頁、Ｚｏｕｂｉｎｅ，Ｍ．Ｎ．、Ｗｅｓｔｏｎ，Ａ．Ｐ．、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｄ．Ｒ．およびＢａｎｅｒｊｅｅ，Ｓ．Ｋ．「エストロゲン応答性ＭＣＦ−７細胞における２−メトキシエストラジオール誘発性の成長抑制および死亡率は、ｐ３４ｃｄｃ２およびサイクリンＢ１発現の下方制御によって仲介され得る（２−Ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａｄｉｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｅｔｈａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ−  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＭＣＦ−７  ｃｅｌｌｓ  ｍａｙ  ｂｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｄｏｗｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ３４ｃｄｃ２  ａｎｄ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．、（１９９９年）１５：６３９−６４６頁）と、転写因子修飾因子、例えばＳＡＰＫ／ＪＮＫ（Ｙｕｅ，Ｔ−Ｌ．、Ｗａｎｇ，Ｘ．、Ｌｏｕｄｅｎ，Ｃ．Ｓ．、Ｇｕｐｔａ，Ｌ．Ｓ．、Ｐｉｌｌａｒｉｓｅｔｔｉ，Ｋ．、Ｇｕ，Ｊ−Ｌ．、Ｈａｒｔ，Ｔ．Ｋ．、Ｌｙｓｋｏ，Ｐ．Ｇ．およ��Ｆｅｕｅｒｓｔｅｉｎ，Ｇ．Ｚ．「２−メトキシエストラジオール、内在性エストロゲン代謝産物は内皮細胞のアポトーシスを誘発し、血管新生を阻害する：ストレス活性化タンパク質キナーゼのシグナル伝達経路およびｆａｓ発現のための可能性のある役割（２−Ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａｄｉｏｌ，ａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｆａｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、（１９９７年）５１：９５１−９６２頁、Ａｔｔａｌｌａ，Ｈ．、Ｗｅｓｔｂｅｒｇ，Ｊ．Ａ．、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｌ．Ｃ．、Ａｌｄｅｒｃｒｅｕｔｚ，Ｈ．およびＭａｋｅｌａ，Ｔ．Ｐ．「２−メトキシエストラジオール誘発性のｂｃｌ−２のリン酸化：ＪＮＫ／ＳＡＰＫ活性化からの脱共役（２−Ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａｄｉｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｃｌ−２：  ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ＪＮＫ／ＳＡＰＫ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」、Ｂｉｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．、（１９９８年）２４７：６１６−６１９頁）と、細胞停止およびアポトーシスの制御因子、例えばチューブリン（Ｄ’Ａｍａｔｏ，Ｒ．Ｊ．、Ｌｉｎ，Ｃ．Ｍ．、Ｆｌｙｎｎ，Ｅ．、Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．およびＨａｍｅｌ，Ｅ．「２−メトキシエストラジオールおよび内在性哺乳類代謝産物は、コルヒチン部位における相互作用によってチューブリン重合を阻害する（２−Ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａｄｉｏｌ，ａｎｄ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｕｂｕｌｉｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ  ｓｉｔｅ）」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、（１９９４年）９１：３９６４−３９６８頁、Ｈａｍｅｌ，Ｅ．、Ｌｉｎ，Ｃ．Ｍ．、Ｆｌｙｎｎ，Ｅ．およびＤ’Ａｍａｔｏ，Ｒ．Ｊ．「２−メトキシエストラジオールおよび内在性哺乳類代謝産物と非重合チューブリンおよびチューブリンポリマーとの相互作用（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａｄｉｏｌ，ａｎｄ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ，ｗｉｔｈ  ｕｎｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄ  ｔｕｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  ｗｉｔｈ  ｔｕｂｕｌｉｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、（１９９６年）３５：１３０４−１３１０頁）と、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ｔ．およびＲｏｔｈ，Ｊ．Ａ．「メトキシエストラジオールによる野生型ｐ５３の活性化後のヒト肺癌細胞のアポトーシスの誘発（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｆｔｅｒ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｐ５３  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａｄｉ��ｌ）」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、（１９９７年）１４：３７９−３８４頁）と、ｂｃｌ−２およびＦＡＳ（Ｙｕｅら、（１９９７年）、Ａｔｔａｌｌａら（１９９８年））と、ｐ５３（Ｋａｔａｏｋａ，Ｍ．、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｇ．、Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ，Ｒ．Ｊ．、Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｎ．、Ｒｏｔｈ，Ｊ．Ａ．およびＭｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ｔ．「全身性導入遺伝子送達と結合した腫瘍抑制因子導入遺伝子産物を増大する薬剤は、生体内の転移性肺癌の成長を阻害する（Ａｎ  ａｇｅｎｔ  ｔｈａｔ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ）」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、（１９９８年）５８：４７６１−４７６５頁、Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら（１９９７年）、Ｓｅｅｇｅｒｓ，Ｊ．Ｃ．、Ｌｏｔｔｅｒｉｎｇ，Ｍ−Ｌ．、Ｇｒｏｂｌｅｒ  Ｃ．Ｊ．Ｓ．、ｖａｎ  Ｐａｐｅｎｄｏｒｐ，Ｄ．Ｈ．、Ｈａｂｂｅｒｓｅｔｔ，Ｒ．Ｃ．、Ｓｈｏｕ，Ｙ．およびＬｅｈｎｅｒｔ  Ｂ．Ｅ．「哺乳類代謝産物、２−メトキシエストラジオールは、形質転換細胞におけるｐ５３レベルおよびアポトーシス誘発に影響を与えるが、正常細胞においては与えない（Ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ，２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａｄｉｏｌ，ａｆｆｅｃｔｓ  ｐ５３  ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｃｅｌｌｓ）」、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ、（１９９７年）６２：２５３−２６７頁）とが含まれる。また、ｃＡＭＰのレベル、カルモジュリン活性およびタンパク質リン酸化に対する影響は互いに関連し得る。最近になって、２ＭＥ２は、ヒト内皮および腫瘍細胞株においてデスレセプター５およびカスパーゼ８を上方制御し（ＬａＶａｌｌｅｅ  ＴＭ、Ｚｈａｎ  ＸＨ、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＭＳ、Ｈｅｒｂｓｔｒｉｔｔ  ＣＪ、Ｓｗａｒｔｚ  Ｇ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＭＳ、Ｈｅｍｂｒｏｕｇｈ  ＷＡ、Ｇｒｅｅｎ  ＳＪ、Ｐｒｉｂｌｕｄａ  Ｖ．Ｓ．「２−メトキシエストラジオールはデスレセプター５を上方制御し、外因性経路の活性化によりアポトーシスを誘発する（２−Ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａｄｉｏｌ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ）」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００３年）６３（２）：４６８−７５頁）、微小管を不安定化してＨＩＦ−１α核集積を阻害し（Ｍａｂｊｅｅｓｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、（２００３年）３：３６３−７５頁）、さらにスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）１およびＳＯＤ２と相互作用をしてその酵素活性を阻害することが示された（Ｈｕａｎｇ，Ｐ．、Ｆｅｎｇ，Ｌ．、Ｏｌｄｈａｍ，Ｅ．Ａ．、Ｋｅａｔｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．、およびＰｌｕｎｋｅｔｔ，Ｗ．「癌細胞の選択的死滅のための���的としてのスーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ、（２０００年）４０７：３９０−５頁）。上記の全ての細胞標的は、活発に分裂する細胞における２ＭＥ２の阻害効果に対して必ずしも相互排他的でない。
【００２１】
上記のより関連のあるメカニズムは、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ａｎｇｉｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｔａｉ−Ｐｉｎｇ  ＦａｎおよびＲｏｂｅｒｔ  Ａｕｅｒｂａｃｈ編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  ＰｕｂｌｉｓｈｅｒにおけるＶｉｃｔｏｒ  Ｓ．Ｐｒｉｂｌｕｄａ、Ｔｈｅｒｅｓａ  Ｍ．ＬａＶａｌｌｅｅおよびＳｈａｗｎ  Ｊ．Ｇｒｅｅｎ、「２−メトキシエストラジオール：新規の内因性化学療法および抗血管新生（２−Ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａｄｉｏｌ：  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｄ  ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）」で広く議論されている。
【００２２】
本発明の開示される実施形態による組成物の抗血管新生および抗増殖性部分は、式Ｉ：
【化３】
2009530388.tif 000005
の化合物を含み、式中、Ｒａは、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＣＣＨ３、−ＣＨＣＨ−ＣＨ３、またはＣＨ２−ＣＨＣＨ２から選択される。立体異性体が可能である場合には、立体異性体の任意の混合物と同様にＲおよびＳ立体異性体の両方が想定される。
【００２３】
当業者は、本発明が、与えられた定義および特許請求の範囲内の、記載される特性を有する他の２−メトキシエストラジオール類似体にも及ぶことを認識するであろう。これらの特徴は、当該技術分野において既知のアッセイを用いてそれぞれの試験化合物について決定することができる。
【００２４】
抗リウマチ剤
本発明の開示される実施形態と共に使用され得る抗リウマチ剤には、疾患修飾性抗リウマチ薬、非ステロイド系抗炎症薬、副腎皮質ステロイド、腫瘍壊死因子阻害剤、選択的Ｂ細胞阻害剤、インターロイキン−１阻害剤およびこれらの混合物または組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。これらの抗リウマチ剤はそれぞれ、以下でさらに議論される。
【００２５】
疾患修飾性抗リウマチ薬
本発明の開示される実施形態と共に使用され得る疾患修飾性抗リウマチ薬には、アロプリノール、アミトリプチリン塩酸塩、オーラノフィン（経口金剤）、アザチオプリン、クロランブシル、コルヒチン、シクロベンザプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、デュロキセチン、フルオキセチン、金チオリンゴ酸ナトリウム（注射可能な金）、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、メトトレキセート、ミノサイクリン、ミコフェノール酸モフェチル、プロベネシド、スルファサラジン、トラマドール、およびこれらの混合物または組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００２６】
非ステロイド系抗炎症薬
本発明の開示される実施形態と共に使用され得る非ステロイド系抗炎症薬には、ジクロフェナクカリウム、ジクロフェナクナトリウム、ミソプロストールを伴うジクロフェナクナトリウム、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェンカルシウム、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナム酸ナトリウム、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク、およびトルメチンナトリウムなどの従来のＮＳＡＩＤＳと、セレコキシブ、ロフェコキシブ、およびバルデコキシブなどのＣＯＸ−２阻害剤と、アスピリン、サリチル酸コリン、サルサラート、およびサリチル酸ナトリウムなどのサリチレートと、アレンドロネート、イバンドロネート、およびリセドロネートなどのビスホネートとが含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
副腎皮質ステロイド
本発明の開示される実施形態と共に使用され得る副腎皮質ステロイドには、ベタメタゾン、酢酸コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾンおよびこれらの混合物または組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
腫瘍壊死因子阻害剤
本発明の開示される実施形態と共に使用され得る腫瘍壊死因子阻害剤には、アダリムマブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、アバタセプトおよびこれらの混合物または組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
選択的Ｂ細胞阻害剤
本発明の開示される実施形態と共に使用され得る選択的Ｂ細胞阻害剤には、リツキシマブが含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
インターロイキン−１阻害剤
本発明の開示される実施形態と共に使用され得るインターロイキン−１阻害剤には、アナキンラが含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
投与
本発明によると、式Ｉの化合物は、単一の製剤内に、１つまたは複数の抗リウマチ剤と混合されてもよい。式Ｉの化合物および抗リウマチ剤は、別々に処方されて到達されてもよい。
【００３２】
本明細書において記載される組成物は、既知の技法を用いて生理学的に許容可能な製剤として提供され、製剤は、標準経路によって投与することができる。通常、式Ｉの化合物および抗リウマチ剤は、局所、経口、直腸のまたは非経口（例えば、静脈内、皮下または筋肉内の）経路によって投与することができる。加えて、組成物をポリマー内に取り込んで持続放出を可能にすることができ、ポリマーは、送達が所望されるところの近く、例えば炎症部位もしくは罹患した関節内またはその近くに植え込まれるか、または、例えば、皮下または筋肉内に植え込まれるか、もしくは静脈内または腹腔内に送達されて、式Ｉの化合物および／または抗リウマチ剤の全身性送達をもたらすこともできる。本発明において有用な治療薬の制御長期放出のための他の製剤は米国特許第６，７０６，２８９号明細書に開示されており、参照によって本明細書中に援用される。
【００３３】
本発明による製剤は、錠剤、カプセル、ロゼンジ、カシェ剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、粉末、エアロゾル、坐薬、スプレー、トローチ、軟膏、クリーム、ペースト、フォーム、ゲル、タンポン、ペッサリー、顆粒、ボーラス、口腔洗浄薬、または経皮パッチの形態で投与することができる。
【００３４】
製剤には、経口、直腸、経鼻、吸入、局所（皮膚、経皮、頬側および舌下を含む）、膣、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、眼内、気管内、および硬膜外を含む）または吸入投与に適切なものが含まれる。製剤は、都合よく単位剤形で与えることができ、そして従来の製薬技法によって調製することができる。このような技法は、活性成分と、医薬品担体または賦形剤とを調合する工程を含む。通常、製剤は、活性成分と、液体担体または微粉化した固体担体もしくは両方とを均一および密接に調合し、次に必要であれば、製品を成形することによって調製される。
【００３５】
経口投与に適した本発明の製剤は、カプセル、カシュ剤または錠剤などの個別の単位に、それぞれが所定の量の活性成分を含む粉末または顆粒として、水性液体または非水性液体中の溶液または懸濁液として、もしくは水中油液体エマルジョンまたは油中水エマルジョンなどとして与えることができる。
【００３６】
錠剤は、任意で１つまたは複数の副成分と共に、圧縮または成形によって製造することができる。圧縮錠剤は、任意で結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、界面活性剤または分散剤と混合された粉末または顆粒などの自由に流動する形態の活性成分を適切な機械で圧縮することによって調製することができる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤に浸した粉末状化合物の混合物を適切な機械で成形することによって製造することができる。錠剤は、任意で、被覆されたり刻み目がつけられたりしてもよく、その中の活性成分の遅延または制御放出を提供するように処方され得る。
【００３７】
口腔内の局所投与に適した製剤には、フレーバーベースの成分、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカントを含むロゼンジと、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性ベースの活性成分を含む香錠と、適切な液体担体中で投与される成分を含む口腔洗浄薬とが含まれる。
【００３８】
皮膚への局所投与に適した製剤は、薬学的に許容可能なキャリア中で投与される成分を含む軟膏、クリーム、ゲルおよびペーストとして与えることができる。一実施形態では、局所送達系は、投与すべき成分を含む経皮パッチである。
【００３９】
直腸投与のための製剤は、例えば、ココアバターまたはサリチレートを含む適切な基剤を有する坐薬として与えることができる。
【００４０】
担体が固体である経鼻投与に適した製剤は、例えば２０〜５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末を含み、これは、嗅ぎ薬が摂取されるようなやり方、すなわち鼻に接近して保持された粉末の容器から鼻腔を通る急速な吸入によって投与される。例えば経鼻スプレーまたは経鼻ドロップとして投与するための担体が液体である適切な製剤は、活性成分の水性または油性溶液を含む。
【００４１】
膣内投与に適した製剤は、活性成分に加えて当該技術分野において適切であることが分かっている担体などの成分を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレー製剤として与えることができる。
【００４２】
吸入に適した製剤は、活性成分に加えて当該技術分野において適切であることが分かっている担体などの成分を含むミスト、ダスト、粉末またはスプレー製剤として与えることができる。
【００４３】
非経口投与に適した製剤には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌薬、および意図されるレシピエントの血液と製剤とを等張にする溶質を含み得る水性および非水性無菌注射溶液および、懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性無菌懸濁液が含まれる。非経口投与に適した製剤には、米国特許出願第１０／３９２，４０３号明細書（米国特許出願公開第２００４／００３３２６７号明細書）、米国特許出願第１０／４１２，６６９号明細書（米国特許出願公開第２００３／０２１９４９０号明細書）、米国特許第５，４９４，６８３号明細書、米国特許出願第１０／８７８，６２３号明細書（米国特許出願公開第２００５／０００８７０７号明細書）、米国特許第５，５１０，１１８号明細書、米国特許第５，５２４，２７０号明細書、米国特許第５，１４５，６８４号明細書、米国特許第５，３９９，３６３号明細書、米国特許第５，５１８，１８７号明細書、米国特許第５，８６２，９９９号明細書、米国特許第５，７１８，３８８号明細書、および米国特許第６，２６７，９８９号明細書（これらは全てその全体において参照によって本明細書に援用される）に開示される多数の方法によって製造されるナノ粒子製剤も含まれるが、これらに限定されない。製薬技術の再検討は、参照によってその全体が本明細書中に援用されるＲｏｎｇ  Ｌｉｕ編、１−６３３頁（２０００年）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣによる「水に不溶性の薬の製剤（Ｗａｔｅｒ  Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  Ｄｒｕｇ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」において提供されている。
【００４４】
２−メトキシエストラジオールナノ粒子を形成することによって、本明細書に開示される組成物は、増大した生物学的利用能を有することが示されている。好ましくは、粒子は式Ｉの化合物および／または抗リウマチ剤だけで、もしくは副成分と組み合わせて構成されるか、あるいは持続放出のためのポリマー中で構成される。本発明の化合物の粒子は、当業者によく知られた光散乱法、顕微鏡法、または他の適切な方法によって測定される場合に約２ミクロン未満、約１９００ｎｍ未満、約１８００ｎｍ未満、約１７００ｎｍ未満、約１６００ｎｍ未満、約１５００ｎｍ未満、約１４００ｎｍ未満、約１３００ｎｍ未満、約１２００ｎｍ未満、約１１００ｎｍ未満、約１０００ｎｍ未満、約９００ｎｍ未満、約８００ｒｕｎ未満、約７００ｎｍ未満、約６００ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満、約４００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約２５０ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、約１５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約７５ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満の有効平均粒径を有する。粒径は平均粒径であり、実際の粒径は任意の特定の製剤において変化し得ることが理解される。多くの場合、安定なナノ粒子を形成するために表面安定剤が使用されるが、このナノ粒子の形成方法は、有効なナノ粒子組成物を形成する多くの様々な方法のうちの１つにすぎない。製剤は例えば密封アンプルおよびバイアル中などの単位用量また多用量の容器で提供され、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵され、使用の直前に例えば水などの注射のための無菌液体担体の添加が必要なだけであろう。即時注射溶液および懸濁液は、既に記載した種類の無菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
【００４５】
一実施形態では、式Ｉの化合物および抗リウマチ剤は同時に投与することができる。別の実施形態では、これらは別々に投与することができる（すなわち、式Ｉの化合物の投薬が朝であり、抗リウマチ剤の投薬が夜である）。当然ながら、２つ以上の抗リウマチ剤の混合物を投与することが可能である。実際には、多くの場合、混合物の使用、あるいはリウマチ性疾患を治療するための異なる抗リウマチ剤、特に異なる種類の抗リウマチ剤の連続投与が望ましい。
【００４６】
２−メトキシエストラジオール製剤および抗リウマチ剤が連続的に投与される場合、２−メトキシエストラジオール製剤の投与と、抗リウマチ剤の投与の間の時間は、２−メトキシエストラジオール製剤が宿主の循環系に完全に取り込まれるのに要する時間や、宿主の体内における２−メトキシエストラジオール製剤の保持時間などの因子に依存するであろう。一実施形態では、２−メトキシエストラジオールの製剤は、参照によってその全体が本明細書中に援用される２００５年１１月２９日に出願された米国特許出願第１１／２８８，９８９号明細書に開示されている。
【００４７】
抗リウマチ剤は、治療的に有効な量で投与される。この量は個別の基準で決定され、少なくとも部分的に、宿主のサイズ、治療すべき特定の疾患、治療すべき症状の重症度、求められる結果、および他のこのような考慮事項の考慮に基づくであろう。有効量は、このような因子を用い、通常の実験を使用して当業者によって決定することができる。
【００４８】
上記で特に言及した成分に加えて、本発明の製剤が、問題の製剤の種類を考慮して当該技術分野における従来の他の薬剤も含み得ることは理解されるべきであり、例えば、経口投与に適した製剤は香味料を含んでもよく、そしてナノ粒子製剤（例えば、平均断面において２０００ナノメートル未満、好ましくは１０００ナノメートル未満、最も好ましくは５００ナノメートル未満）は、粒子の凝集を防止するために選択される１つまたは複数の賦形剤を含んでもよい。
【００４９】
医薬品
また、開示される実施形態による製剤、またはそのプロドラッグ、もしくは参照によって含まれる他の化合物で構成される埋込錠または他のデバイス（ここで、薬物またはプロドラッグは、持続放出のために生分解性のまたは非生分解性ポリマー中に処方される）も本発明によって考慮される。非生分解性ポリマーは、ポリマー自体は分解することなく物理的または機械的な工程を通して管理された方法で薬物を放出する。生分解性ポリマーは体内の自然作用で徐々に加水分解または可溶化されるように設計され、混合薬物またはプロドラッグを徐々に放出することが可能になる。薬物またはプロドラッグは、ポリマーに化学的に結合させることもでき、あるいは混合によってポリマー内に取り込ませることもできる。生分解性ポリマーおよび非生分解性ポリマーの両方、ならびに薬物が制御放出のためにポリマー内に取り込まれる工程は当業者によく知られている。このようなポリマーの例は、Ｂｒｅｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ７４、４４１−４４６頁（１９９１年）などの多くの参考文献において見出すことができる。これらの埋込錠またはデバイスは、送達が所望されるところの近く、例えば腫瘍または狭窄の部位に埋め込むことができる。あるいは薬剤の全身性送達をもたらすように導入することもできる。
【００５０】
体内で天然成分として形成されないものはどれも、血栓形成または攣縮による血管の閉鎖などの極度のおよび予想外の応答を誘発し得るので、および血管ステントの挿入行為による血管の損傷は血管表面に対して極度および過度に有害であり得るので、このような事象から保護するのが懸命である。再狭窄は、血管形成術またはステント処置などの治療が既に行われた同一部位における動脈の再狭小化または閉塞である。再狭窄が動脈内に配置されたステント内で生じれば、技術的に「ステント内再狭窄」と呼ばれ、最終的には血液の流れを遮断する物質の蓄積によって生じる動脈の狭小化が最終結果である。本発明の一部である化合物は、血管ステントを被覆して再狭窄を防止するのに特に有用である。コーティングは、好ましくは、本発明の化合物の遅延放出を可能にすることにより再狭窄事象を防止する生分解性または非生分解性のポリマーでなければならない。
【００５１】
また本発明は、複合プロドラッグおよびその使用にも関する。より具体的には、本発明は、式Ｉの化合物などのステロイド化合物の複合体と、リウマチ性疾患または関連の炎症性疾患に関連する状態の予防または治療におけるこのような複合体の使用とに関する。本発明は、本発明のプロドラッグを含む組成物にも関する。
【００５２】
一態様では、本発明は、生物活性改変剤に複合化されたエストラジオール化合物、好ましくは式Ｉの化合物の複合プロドラッグを提供する。
【００５３】
あるいは、本発明による複合プロドラッグは、ペプチド部分と複合化された式Ｉの化合物を含む。
【００５４】
疾患に依存して活性化されるプロドラッグ内への式Ｉの化合物などのエストラジオール化合物の取り込みは、この抗血管新生薬の効力および選択性の大幅な改善を可能にする。
【００５５】
当業者は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１７版などの標準テキストを参照することによって、製剤がどのようにして製造され、これらがどのようにして投与され得るかを決定できるであろう。
【００５６】
本発明のさらなる態様では、リウマチ性疾患の予防または治療のための薬物の調製を目的とした、本発明による抗リウマチ剤と組み合わせた式Ｉの化合物、またはそのプロドラッグの使用が提供される。
【００５７】
本発明のさらなる態様では、リウマチ性疾患の予防または治療方法が提供され、前記方法は、このような予防または治療を必要としている患者に、有効量の式Ｉの化合物またはそのプロドラッグを本明細書中に記載される開示される実施形態による抗リウマチ剤と組み合わせて投与することを含む。前記状態の予防または治療は前記状態の改善を含むことが理解されるべきである。
【００５８】
式Ｉの化合物またはそのプロドラッグの薬学的に許容可能な塩は、例えば遊離塩基および酸から従来の方法で調製することができる。生体内で加水分解可能なエステル、アミドおよびカルバメート、ならびに他の許容可能な式Ｉのプロドラッグは、従来の方法で調製することができる。
【００５９】
１００％純粋な異性体が本発明により考慮されるが、立体化学異性体（αまたはβ、もしくはＲまたはＳに分類される）は、任意の比率の両方の混合物でもよく、当業者によって化学的に可能である。また、ＰａｔａｎｉおよびＬａｖｏｉｅ（「生物学的等価性：薬物設計における合理的アプローチ（Ｂｉｏ−ｉｓｏｓｔｅｒｉｓｍ：  ａ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｓｉｇｎ）」Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．（１９９６年）３１４７−３１７６頁）によって記載されるような古典的および非古典的の両方の生物学的等価性の原子および置換基の置換も本発明によって考慮され、当業者によく知られている。このような生物学的等価性の置換には、例えば、＝Ｏに対する＝Ｓまたは＝ＮＨの置換が含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
本発明において特に有用な製剤は、２００３年３月２０日に出願された米国特許出願第１０／３９２，４０３号明細書（その開示は参照によって本明細書中に援用される）に開示される２−メトキシエストラジオールのナノ粒子液体懸濁液である。この製剤は、メリーランド州ロックビルのＥｎｔｒｅＭｅｄ，Ｉｎｃ．から商品名Ｐａｎｚｅｍ（登録商標）ＮＣＤで入手可能である。
【００６１】
本発明に従って使用される既知の化合物および本発明による新規化合物の前駆体は、例えばＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ  ｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｌｕｓから購入することができる。本発明による他の化合物は、公に入手可能な前駆体から既知の方法に従って合成することができる。
【００６２】
組成物および方法は以下の非限定的な実施例によってさらに説明され、決してその範囲に対して制限を課すと解釈されてはならない。一方、この手段が、本発明の精神から逸脱することなく本明細書の説明を読んだ後で当業者にそれ自体を暗示し得る様々な他の実施形態に対するその修正および等価物を有し得ることは明確に理解されるべきである。
【実施例】
【００６３】
実施例および以下の表において与えられるデータは、２ＭＥ２は広範な抗リウマチ剤と組み合わせて使用できることを示す。２ＭＥ２および式Ｉの化合物の特徴は、最大耐容性または最大有効性の抗リウマチ剤の用量および計画でこれらを抗リウマチ剤と組み合わせることができることである。いくつかの実施形態では、２ＭＥ２との組み合わせを用いて、抗リウマチ剤の用量を低減しながら有効性を保持することができる。このような用量の低減は、抗リウマチ剤の毒性の低減もしくは任意の許容できない効果または副作用の低減をもたらすことができる。
【００６４】
【表１】
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【００６５】
以下の実施例は上記の表１のＤａｌｈｏｕｓｉｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  研究  １および２において使用される手順の詳細な説明を提供し、２ＭＥ２の疾患修飾特性を単独および他の抗リウマチ剤と組み合わせて評価する際に使用される一般的な手順を代表する。
【００６６】
実施例１：臨床関節炎重症度における２ＭＥ２治療の効果
アジュバント関節炎は、６〜８週齢のオスの近交系ルイスラット（１７５〜２００ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｃａｎａｄａ、ケベック州セント・コンスタント）の尾の付け根のそれぞれの側の２箇所に０．０５ｍＬの鉱油中０．５ｍｇのマイコバクテリウム・ブチリクム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ、ミシガン州デトロイト）を皮下注射する免疫化によって誘発させた。Ｔａｕｒｏｇら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８８年）、１６２：３３９−５５頁）に記載される膨脹、紅斑および運動制限の重症度に基づいて、関節炎を脚および尾について０〜４点で臨床的にスコア化した。
【００６７】
ＡＡの発生における２段階で２ＭＥ２を用いてラットを治療した。２ＭＥ２は、ＥｎｔｒｅＭｅｄ，Ｉｎｃ．（メリーランド州ロックビル）より提供された。治療を免疫化の６日（ｄ）後に開始し、３０ｍｇ／ｋｇ／日または１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量か、もしくは体積０．５ｍｌの賦形剤を腹腔内に投与のいずれかで、全部で８日間、すなわち免疫化後１４日目まで行った。この手順を用いて、免疫応答の開始後、臨床関節炎の発生（通常、９日目または１０日目までに発生する）前に２ＭＥ２治療を開始した。臨床関節炎の最初の兆候（通常後足で始まる発赤および跛行）に相当する免疫化後１０日目に開始して、２ＭＥ２（１００ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内）で追加グループの動物を治療した。治療を１４日目まで続け、動物を屠殺した免疫化の１５日後までに全ての測定を終了した。
【００６８】
ルイスラットでは、鉱油中の死滅Ｍ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（またはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）による免疫化の９〜１０日後に、一般的に後肢において最も重篤である多発関節炎が発生した。関節炎は急速に進行し、免疫化の１４〜１５日後までに最高の臨床関節炎重症度スコアに到達する。賦形剤で治療したラットは関節炎を発生し、臨床スコア１１に到達した。賦形剤治療したグループは、未治療のラットと同じ速度および最大重症度で関節炎を発生した。３０ｍｇ／ｋｇ／日または１００ｍｇ／ｋｇ／日の２ＭＥ２で治療したラットは免疫化の６日後に始まり、賦形剤治療したグループよりも１４日目までの関節炎重症度が著しく低かった（それぞれ、平均＝７．４および６．５）。さらに、免疫化の１０日後の臨床関節炎の開始時に始めたより高い用量の２ＭＥ２（１００ｍｇ／ｋｇ／日）で治療したラットも関節炎重症度の減弱を有し、これは前臨床段階の間（６日目）に治療を開始したグループに匹敵した。しかしながら、免疫化の１０日後に開始されたより低い用量の２ＭＥ２（３０ｍｇ／ｋｇ／日）を受け取るグループにおける関節炎重症度の変化は統計的有意性に到達せず、臨床関節炎が一度発生したらより高い用量が必要とされることが示唆された。
【００６９】
実施例２：関節炎の関節および皮膚の炎症反応への好中球遊走に対する２ＭＥ２治療の効果
大腿静脈に挿入されたニードルを通して行われるヒドロキシエチルデンプン（Ｈｅｓｐａｎ、Ｄｕｐｏｎｔ  Ｍｅｒｃｋ、デラウェア州ウィルミントン）交換輸血によって、ドナー関節炎ラットからラット血液ＰＭＮＬを単離した。交換された血液をヘパリンおよびクエン酸デキストロース（ＡＣＤ、式Ａ、Ｆｅｎｗａｌ−Ｔｒａｖｅｎｏｌ、オンタリオ州マルトン）中に採取し、１ｇの赤血球の沈降中に白血球が豊富な血漿を収集した。次に、１０％自己血漿ならびに懸濁媒体のバランスのためのカルシウムおよびマグネシウムを含まないタイロード液（ＴｙＳ−ｌ−）を用いる７４％パーコール上の６３％パーコールの不連続パーコール密度勾配における遠心分離によってＰＭＮＬを単離した。遠心分離（３５０×ｇ、２２℃で３０分）の後、７４％血漿−パーコールクッションの上の層から精製ＰＭＮＬ（＞９５％）を収集し、ＴｙＳ−ｌ−−１０％血漿で洗浄した後、７５μＣｉ／５×１０７細胞のＮａ２５１ＣｒＯ４（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、ケベック州Ｂａｉｅ  ｄ’Ｕｒｆｅ）で細胞を放射標識化した。細胞を洗浄後、一匹あたり１０７の５１Ｃｒ標識化ＰＭＮＬ（およそ１〜２×１０５ｃｐｍを有する）の用量でラットに静脈内注射した。ラットを屠殺にする前に、これらの細胞を２時間循環および遊走させた。
【００７０】
放射標識化ＰＭＮＬの静脈内注射と同時に、指示される用量で屠殺の２時間前に投与されるＣ５ａｄｅｓＡｒｇ．２２の源としてラットＴＮＦ−α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ロッキーヒル）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内毒素（ＬＰＳ、Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カリフォルニア州カンベル）、またはザイモサン活性化血清（ラット）を皮内（ｉ．ｄ．）注射（０．０５ｍｌ）することにより局所炎症を誘発し、関節炎ラットの皮膚部位のＰＭＮＬ蓄積を測定した。これらの部位におけるＰＭＮＬの蓄積は、動物の屠殺の後に行われる１２ｍｍのパンチ生検を用いて、注射部位の生検により定量した。
【００７１】
ラットを殺した際、血中白血球カウントならびに白血球および血漿に関連する放射活性を測定するために心臓の血液を得た。既に報告されている（Ｉｓｓｅｋｕｔｚら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９１年）、６４：６５６−６３頁およびＩｓｓｅｋｕｔｚら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．（２００１年）、４４：１４２８−３７頁）ように、関節を解剖し、分析のために手根、中手骨、距骨および中足骨の関節を含むように肢のセグメントを区分化した。関節内ならびに皮膚部位および内臓器官内の５１Ｃｒの含有量は、Ｗａｌｌａｃ  ＬＫＢ  １２８０ガンマカウンタ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、オンタリオ州ネピアン）を用いて決定した。組織内に蓄積した同位体は、ｃｐｍ／１０６ｃｐｍ静脈内注射で表した。
【００７２】
ＡＡを患うラットの放射標識化された血中ＰＭＮＬの関節への遊走が、免疫化後の第２週の間に急速に発生し、１４〜１５日目に最大になることは既に示しており、これは、後肢の関節、すなわち距骨および中足骨の関節において最も強く、前肢の手根および中手関節では蓄積がより少ない（Ｉｓｓｅｋｕｔｚら（１９９１年））。１００または３０ｍｇ／ｋｇ／日のいずれかで６日目に前臨床段階中に開始された２ＭＥ２治療は、最も強く関連される後肢関節における５１Ｃｒ標識化ＰＭＮＬの蓄積を大幅に低下させ、前肢関節においてはより低い程度でいくらかより可変的に低下させた。しかしながら、関節炎が臨床的に発生し始めた１０日目に遅延２ＭＥ２治療を受けたグループでは、低下の傾向はあったが、これは有意性に到達しなかった。
【００７３】
同じラットにおいて、放射標識化ＰＭＮＬ注射の際に開始した皮膚炎症反応へのＰＭＮＬの遊走を測定した。従って、遊走は、病変部の最初の２時間の間の急性反応を定量化した。２ＭＥ２治療は、補体走化因子Ｃ５ａｄｅｓ−ａｒｇまたは大腸菌ＬＰＳへのＰＭＮＬ遊走に影響を与えなかった。対照的に、ラットＴＮＦ−αが注射された部位へのＰＭＮＬ遊走は、免疫化の６日後に開始されるいずれかの試験用量で２ＭＥ２治療されたラットにおいて、およそ５０％阻害された。治療が１０日目まで遅延されたグループでは２ＭＥ２による阻害の傾向は見られたが、有意差には到達しなかった。ＡＡを患うラットは、著しい好中球増多症と共に白血球増多症を発生したことに注意すべきである（Ｔａｕｒｏｇ（１９８８年）およびＩｓｓｅｋｕｔｚ（１９９１年））。この応答は、いずれかの試験用量で６日目または１０日目のいずれかに開始された２ＭＥ２治療による影響を受けなかった。従って、観察された効果は、血中ＰＭＮＬカウントの差に起因し得なかった。さらに、いずれのグループ間でも、２時間の遊走期間中に循環している放射標識化５１ＣｒＰＭＮＬのレベルの違いは見られなかった。
【００７４】
実施例３：関節組織構造および軟骨損傷に対する２ＭＥ２治療の効果
関節を含む組織サンプルを、１０％リン酸緩衝ホルマリンまたはＡＦＡ固定液（７５％エチルアルコール、２％ホルマリン、５％氷酢酸、２０％水）中（後者は免疫染色のため）に固定した。次にサンプルをギ酸または酢酸中で脱灰して、パラフィン包埋した。通常の技法を用いて、切片（５μｍ）をヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）により染色した。軟骨プロテオグリカンを染色するために、既に記載されている（Ｉｓｓｅｋｕｔｚ、（２００１年））ように、別の切片をサフラニンＯ（Ｄｉｆｃｏ、ミシガン州デトロイト）で１分間染色した。滑膜中の微小血管密度を評価するために、ウサギ抗マウスラミニンポリクローナルＩｇＧ抗体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、オンタリオ州ホーンビー）を用いて血管を際立たせ、検出は、製造業者の推奨に従ってビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体およびアビジン−ビオチンのＨＲＰＯとの複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ｋｉｔ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｃａｎａｄａ  Ｉｎｃ．、オンタリオ州バーリントン）を用いた。
【００７５】
賦形剤治療したラットからの関節は、滑膜が顕著に厚くなり、著しい滑膜の膨脹と共に白血球によって激しく浸潤されることを示した。Ｈ＆Ｅ染色によっても、軟骨損傷は関節表面および周縁部において明白である。これは、著しい局所プロテオグリカンの損失および断片化と共にサフラニンＯ染色によってより意味深く説明される。免疫化の６日後に開始された１００ｍｇ／ｋｇ／日を受けた２ＭＥ２治療ラットは、明らかに滑膜の浸潤および膨脹が生じたが、賦形剤治療と比較した場合に滑膜の白血球浸潤があまり激しくないことを示した。しかしながら、最も注目すべきは、関節軟骨表面の保存およびプロテオグリカン染色である。６日目から３０ｍｇ／ｋｇ／日で治療されたラットにおいて同様の変化を観察したが、２ＭＥ２治療を１０日目まで遅延したラットでは、滑膜内の白血球の細胞性はあまり大きく影響されなかった。それにもかかわらず、軟骨の保存はまだ観察された。
【００７６】
実施例４：滑膜の血管分布に対する２ＭＥ２治療の効果
滑膜の血管分布および血管新生を評価するために、切片をラミニンに対する免疫染色をして、微小血管および中程度のサイズの血管を確実に描写した。激しい白血球浸潤がある領域では微小血管は明らかに存在するにもかかわらずフォンウィルブランド因子の染色は低下するかあるいは存在しないことが観察されたので、この技法はフォンウィルブランド因子（因子ＶＩＩＩ関連抗原）に対する染色よりも確実であることが分かった。他の一般に使用される内皮細胞マーカー、ＣＤ３１も滑膜組織において評価した。ラットＣＤ３１に対するモノクローナル抗体は血管内皮を明らかに染色したが、ＣＤ３１は浸潤している白血球上にも存在し、解釈を複雑にした。本明細書で使用されるマウスラミニンに対する抗体は、特に、毛細血管サイズおよびそれより大きい血管を染色し、恐らく基底膜ラミニンと反応する。賦形剤治療ラットの滑膜の免疫組織化学は、白血球浸潤滑膜の激しい血管分布を明らかにする。免疫化後６日目に開始する１００ｍｇ／ｋｇ／日の２ＭＥ２で治療したラットの滑膜の血管分布は、白血球の滑膜内への浸潤はあまり激しくないが、滑膜の血管分布はまだ顕著であることを示した。この血管分布は、様々な手順で治療したラットからの滑膜において定量化し、賦形剤治療した動物と比較した。小さい（１〜２ＲＢＣ直径）、中程度（３〜５ＲＢＣ直径）および大きい（５ＲＢＣ直径よりも大きい、すなわち３０μｍよりも大きい直径）血管について滑膜を検査した。断面の血管だけをスコア化した。任意の血管サイズにおける様々な治療グループの間で、０．８ｍｍ２あたりの血管密度に大きな違いはなかった。これによって、白血球浸潤は２ＭＥ２治療により減弱されるが、新血管新生にはあまり変化がないという免疫組織化学染色からの所見が確認された。
【００７７】
実施例５：最低および最適の成長条件下での内皮細胞増殖に対する２ＭＥ２治療の効果
滑膜血管新生に対する２ＭＥ２治療の明らかな効果がないので、関節炎の間に生体内で滑膜に存在する可能性がある最適な内皮細胞成長刺激性条件下で、生体外の内皮細胞増殖に対する２ＭＥ２の効果を検査した。２ＭＥ２の内皮阻害効果は通常、内皮成長に対する２ＭＥ２の効果を最適に観察する手段として、制限された血清および成長因子の条件下で評価されている。２ＭＥ２による内皮細胞増殖の阻害は、制限された血清および成長因子の条件下で用量依存性であり、０．２５μｇ／ｍＬの２ＭＥ２で著しい阻害を有する。最適な血清および内皮細胞成長補充の条件下で、２ＭＥ２はまだ内皮細胞増殖を用量依存性で阻害することができたが、これはおよそ２倍の高濃度の２ＭＥ２を必要とした。これらの最適成長条件下で、ＩＣ５０は、約０．５μｇ／ｍＬ（約１．５×１０−６Ｍ）であった。生体内治療中の関節炎滑膜における血管新生に対して観察される効果は少ししかないようであるという事実にもかかわらず、これらの発見は２ＭＥ２が最適成長条件下でも内皮細胞増殖を阻害することを実証する。
【００７８】
実施例６：脾腫に対する２ＭＥ２治療の効果
ラットにおけるＡＡの経過で、脾腫は、脾炎、リンパ過形成、そしてさらに膿瘍形成による卓越した特徴である。従って、このパラメータに対する２ＭＥ２の任意の効果についてこれらの動物の脾臓腫大を監視した。賦形剤で治療したラットでは、脾臓重量が著しく増大し、ほぼ３倍まで増大した。これは、免疫化の６日目に高用量で開始された２ＭＥ２治療によって完全に阻害されたが、３０ｍｇ／ｋｇ／日のより中程度の用量でも阻害された。さらに、ＡＡ発生の後期、すなわち１０日目に２ＭＥ２治療が開始された場合でも、脾臓腫大はまだ著しく阻害された。
【００７９】
異なるグループにおいて脾臓の組織学的検査を行った。正常なラット脾臓（Ａ）および賦形剤治療した脾臓（Ｂ）の外観。後者は赤色髄そしてさらに被膜を含む深刻な脾炎を示す。さらに、脾臓は、膿瘍形成およびいくらかの細胞壊死と共に、広範なＰＭＮＬおよび単核細胞の蓄積を実証した。また、白色髄における多核巨細胞の数およびリンパ過形成も増大していた。免疫化後６〜１４日目に２ＭＥ２（３０ｍｇ／ｋｇ／日）で治療したラットでは、巨細胞または膿瘍形成は増大せず、軽度の脾炎が現れただけであり、リンパ過形成は全く観察されなかった。
【００８０】
実施例７：分裂促進因子および抗原へのリンパ球応答に対する２ＭＥ２治療の効果
関節炎重症度およびＡＡ中の脾臓における応答、分裂促進因子へのＴリンパ球の反応性に対する２ＭＥ２治療の効果のために、マイコバクテリア精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）抗原を評価した。リンパ節細胞は、免疫化後１４日目に収集した末期のＡＡを患うラットからのＣｏｎＡ、ＰＨＡおよびＰＰＤへの増殖応答を示した。未治療の非免疫化ラットからのリンパ球は、培地対照より上のＰＰＤへの著しい増殖応答は有さなかった。しかしながら、ＡＡを患うラットからのリンパ球は、３Ｈ−チミジンの取り込みにより測定して、３日で分裂促進因子への強い増殖応答を有し、同様に６日でＰＰＤへの応答を有した。この増殖応答に対する様々な濃度の２ＭＥ２の生体外での効果を評価した。開始日に培養物に２ＭＥ２を添加すると、約０．３μｇ／ｍＬのＩＣ５０で、ＰＰＤのリンパ球応答を用量依存的に阻害した。また２ＭＥ２は無刺激培養における自発性増殖も低下させた。分裂促進因子に誘発される増殖に対して、生体外で２ＭＥ２の同程度の阻害効果が観察された。全ての培養物における生存率（≧８５％の生細胞）は同程度であったので、生存率に対する効果はなかった。リンパ球の応答性に対する２ＭＥ２の効果をさらに評価するために、免疫化の６〜１４日後に２ＭＥ２（３０ｍｇ／ｋｇ／日）で治療したラットから収集したリンパ節細胞を、ＰＰＤおよび分裂促進因子、ＣｏｎＡおよびＰＨＡへの増殖応答について試験し、賦形剤治療動物からのリンパ球と比較した。賦形剤治療ラットではＤＮＡの取り込みは、ほぼ５倍に増大した。この応答は、２ＭＥ２治療を受けたラットからのリンパ球では大幅に低下した。対照的に、ラットを２ＭＥ２で治療した場合、ＣｏｎＡまたはＰＨＡにより誘発された増殖には違いは観察されず、培養物は添加した２ＭＥ２を含まなかった。これは、２ＭＥ２が生体内で抗原応答性に対する免疫調節性効果を有したことを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】ＲＡのＡｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ（登録商標）モデルにおいて、２ＭＥ２の投与が関節炎スコアを低下させることを示すグラフである。
【図２】対照および１００ｍｇ／ｋｇ治療の２枚の写真であり、ＲＡのＡｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ（登録商標）モデルにおいて、２ＭＥ２の投与が滑膜炎症を阻害することを示す。
【図３】対照および１００ｍｇ／ｋｇ治療の２枚の写真であり、ＲＡのＡｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ（登録商標）モデルにおける２ＭＥ２による関節周囲の炎症性浸潤および線維症の阻害を示す。
【図４】対照および１００ｍｇ／ｋｇ治療の２枚の写真であり、２ＭＥ２が、関節軟骨中のプロテオグリカンの損失および破骨細胞活性の誘発を防止することを示す。
【図５】ＲＡのＡｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ（登録商標）モデルにおいて、２ＭＥ２の投与がＲＡ進行の重症度を阻害できることを示す一連のグラフである。
【図６】ＲＡのＡｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ（登録商標）モデルにおける２ＭＥ２治療の後の組織形態計測的な変化の評価を示す表である。
【図７】メトトレキセートと組み合わせた２ＭＥ２の投与が、ＲＡのＡｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ（登録商標）モデルの関節炎スコアの阻害率の予想外の増大をもたらすことを示すグラフおよび表である。
【図８】ＲＡのＡｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ（登録商標）モデルにおける２ＭＥ２の抗リウマチ効果のＸ線検査による証拠を示す２枚の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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