(57)【要約】  ＮＦ−κＢ受容体アクチベーターリガンド（ＲＡＮＫＬ）抗体と、副甲状腺ホルモン／副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ）ペプチドを含むキメラ分子について記載する。骨疾患の治療用組成物及び方法についても記載する。
2009515903.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＲＡＮＫＬと結合する抗体；及び
（ｂ）ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含み；
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが前記抗体と機能的に連結しているＮＦ−κＢ受容体アクチベーターリガンド（ＲＡＮＫＬ）抗体−副甲状腺ホルモン／副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ）キメラ分子。
【請求項２】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドがプレプロ領域とＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域を含む請求項１のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項３】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが重鎖と機能的に連結している請求項１のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項４】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが軽鎖と機能的に連結している請求項１のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項５】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが重鎖のＮ末端と機能的に連結している請求項３のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項６】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが軽鎖のＮ末端と機能的に連結している請求項４のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項７】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが重鎖のＮ末端と融合している請求項５のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項８】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが軽鎖のＮ末端と融合している請求項６のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項９】
抗体が配列番号２に記載のアミノ酸配列又はそのフラグメントをもつ重鎖を含む請求項１のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項１０】
抗体が配列番号４に記載のアミノ酸配列又はそのフラグメントをもつ軽鎖を含む請求項１のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項１１】
抗体が重鎖と軽鎖を含み、ならびに重鎖が配列番号２に記載のアミノ酸配列又はそのフラグメントを含み、及び軽鎖が配列番号４に記載のアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む請求項１のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項１２】
抗体が単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、（Ｆａｂ’）２抗体、ドメイン抗体、ナノボディ、ミニボディ、マキシボディ及び二重特異性抗体から選択される請求項１のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項１３】
（ａ）重鎖と軽鎖を含む抗体であって、重鎖が配列番号２に記載のアミノ酸配列又はそのフラグメントを含み、及び軽鎖が配列番号４に記載のアミノ酸配列又はそのフラグメントを含み、ならびにＲＡＮＫＬと結合する、抗体；
（ｂ）第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチド；及び
（ｃ）第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチド；
を含み、第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが軽鎖と機能的に連結しており、及び第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが重鎖と機能的に連結しており、ならびに第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが同一又は異なるＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項１４】
第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが軽鎖のＮ末端と機能的に連結しており、及び第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが重鎖のＮ末端と機能的に連結している請求項１３のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項１５】
第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが軽鎖のＮ末端と融合しており、及び第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが重鎖のＮ末端と融合している請求項１３のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項１６】
（ａ）重鎖と軽鎖を含む抗体であって、重鎖が配列番号１１に記載のアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む第１の可変領域を含み、及び軽鎖が配列番号１２に記載のアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む第２の可変領域を含み、ならびにＲＡＮＫＬと結合する抗体；及び
（ｂ）ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含み；
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが重鎖又は軽鎖と機能的に連結しているＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項１７】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドがプレプロ領域とＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域を含む請求項１６のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項１８】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが重鎖と機能的に連結している請求項１６のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項１９】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが軽鎖と機能的に連結している請求項１６のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項２０】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが重鎖のＮ末端と機能的に連結している請求項１８のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項２１】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが軽鎖のＮ末端と機能的に連結している請求項１９のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項２２】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが重鎖のＮ末端と融合している請求項２０のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項２３】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが軽鎖のＮ末端と融合している請求項２１のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項２４】
重鎖と軽鎖がフレキシブルリンカーにより結合され、単鎖抗体を形成する請求項１６のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項２５】
単鎖抗体が単鎖Ｆｖ抗体である請求項２４のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項２６】
抗体がＦａｂ抗体である請求項１６のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項２７】
抗体がＦａｂ’抗体である請求項１６のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項２８】
抗体が（Ｆａｂ’）２抗体である請求項１６のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項２９】
抗体が完全ヒト型である請求項１６のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項３０】
ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子がＲＡＮＫＬとＮＦ−κＢ受容体アクチベーター（ＲＡＮＫ）の結合を阻害する請求項１６のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項３１】
（ａ）重鎖と軽鎖を含む抗体であって、重鎖が配列番号１１に記載のアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む可変領域を含み、及び軽鎖が配列番号１２に記載のアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む可変領域を含み、ならびにＲＡＮＫＬと結合する、抗体；
（ｂ）第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチド；及び
（ｃ）第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチド；
を含み、第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが軽鎖と機能的に連結しており、及び第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが重鎖と機能的に連結しており、ならびに第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが同一又は異なるＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項３２】
第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが軽鎖のＮ末端と機能的に連結しており、及び第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが重鎖のＮ末端と機能的に連結している請求項３１のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項３３】
第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが軽鎖のＮ末端と融合しており、及び第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが重鎖のＮ末端と融合している請求項３２のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項３４】
（ａ）重鎖と軽鎖を含む抗体であって、
（ｉ）重鎖が第１の可変領域を含み、第１の可変領域が配列番号１１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９２％の一致度をもつ配列を含み、及び
（ｉｉ）軽鎖が第２の可変領域を含み、第２の可変領域が配列番号１２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の一致度をもつ配列を含み、
ＮＦ−κＢ受容体アクチベーターリガンド（ＲＡＮＫＬ）と相互作用する、抗体；ならびに
（ｂ）ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチド；
を含み、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが重鎖又は軽鎖と機能的に連結しているＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項３５】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドがプレプロ領域とＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域を含む請求項３４のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項３６】
第１の可変領域が配列番号１１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の一致度をもつ配列を含み、及び第２の可変領域が配列番号１２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の一致度をもつ配列を含む請求項３４のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項３７】
第１の可変領域が配列番号１１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の一致度をもつ配列を含み、及び第２の可変領域が配列番号１２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の一致度をもつ配列を含む請求項３４のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項３８】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが式Ｉ：
ＸＮＨＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＫＸ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９ＲＸ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６Ｘ２７Ｘ２８ＸＣ（式Ｉ；配列番号１３）
（式中、
ＸＮは不在であるか又はＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７、Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７もしくはＹＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７であり；
Ｘ１からＸ７、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１４からＸ２８は各々独立して選択されたアミノ酸残基であり；
ＸＣは不在であるか又はＸ２９、Ｘ２９Ｘ３０、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５もしくはＸ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６であり；
Ｘ２９からＸ３６は各々独立して選択されたアミノ酸残基であり；
但し、Ｘ１４からＸ３６の１個以上はシステイン残基である。）
のポリペプチドから選択されるＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域を含み；及び
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドがＰＴＨ−１受容体又はＰＴＨ−２受容体と結合する請求項１、１６及び３４のいずれか一項のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項３９】
ＸＮがＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７であり；
Ｘ１が親水性又は非機能的残基であり；
Ｘ２がＶであり；
Ｘ３がＳであり；
Ｘ４がＥであり；
Ｘ５が非機能的又は塩基性残基であり；
Ｘ６がＱであり；
Ｘ７がＬであり；
Ｘ１０が酸性又は親水性残基であり；
Ｘ１１が非機能的又は塩基性残基であり；
Ｘ１２が非機能的残基であり；
Ｘ１４が塩基性又は親水性残基であり；
Ｘ１５が非機能的残基であり；
Ｘ１６が非機能的又は親水性残基であり；
Ｘ１７が酸性、親水性又は非機能的残基であり；
Ｘ１８が非機能的残基であり；
Ｘ１９が酸性又は塩基性残基であり；
Ｘ２１が非機能的又は塩基性残基であり；
Ｘ２２が親水性、酸性又は芳香族残基であり；
Ｘ２３が芳香族又は親油性残基であり；
Ｘ２４が親油性残基であり；
Ｘ２５が親水性又は塩基性残基であり；
Ｘ２６が親水性又は塩基性残基であり；
Ｘ２７が親油性、塩基性又は非機能的残基であり；及び
Ｘ２８が親油性又は非機能的残基である
請求項３８のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項４０】
ＸＣがＸ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４であり；
Ｘ２９が親水性又は非機能的残基であり；
Ｘ３０が親水性又は酸性残基であり；
Ｘ３１が親油性又は非機能的残基であり；
Ｘ３２がＨであり；
Ｘ３３がシステイン又は親水性残基であり；及び
Ｘ３４が非機能的又は芳香族残基である
請求項３９のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項４１】
ＸＣがＸ２９Ｘ３０Ｘ３１であり；
Ｘ２９が親水性又は非機能的残基であり；
Ｘ３０が親水性又は酸性残基であり；及び
Ｘ３１が親油性又は非機能的残基である
請求項３９のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項４２】
ＸＣがＸ２９Ｘ３０であり；
Ｘ２９が親水性又は非機能的残基であり；及び
Ｘ３０が親水性又は酸性残基である
請求項３９のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項４３】
ＸＣがＸ２９であり；及び
Ｘ２９が親水性又は非機能的残基である
請求項３９のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項４４】
Ｘ２７及びＸ３３の少なくとも一方がシステインである請求項３９のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項４５】
ＸＣが不在である請求項３９のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項４６】
Ｘ１がＡ、Ｓ又はＹであり；
Ｘ５がＨ又はＩであり；
Ｘ１０がＮ又はＤであり；
Ｘ１１がＬ、Ｒ又はＫであり；
Ｘ１２がＧ、Ｆ又はＷであり；
Ｘ１４がＨ又はＳであり；
Ｘ１５がＬ又はＩであり；
Ｘ１６がＱ、Ｎ、Ｓ又はＡであり；
Ｘ１７がＳ、Ｄ又はＬであり；
Ｘ１８がＭ、Ｌ、Ｖ又はＮｌｅであり；
Ｘ１９がＥ又はＲであり；
Ｘ２１がＶ、Ｍ、Ｒ又はＮｌｅであり；
Ｘ２２がＥ又はＦであり；
Ｘ２３がＷ又はＦであり；
Ｘ２５がＲ又はＨであり；
Ｘ２６がＫ又はＨであり；
Ｘ２７がＣであり；及び
Ｘ２８がＬ又はＩである
請求項３９のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項４７】
ＸＣがＸ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４であり；
Ｘ２９がＱ又はＡであり；
Ｘ３０がＤ又はＥであり；
Ｘ３１がＶ又はＩであり；
Ｘ３３がＣであり；
Ｘ３４がＮ又はＴであり；及び
Ｘ３５がＡ、Ｆ又はＹである
請求項４６のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項４８】
ＸＣがＸ２９Ｘ３０Ｘ３１であり；
Ｘ２９がＱ又はＡであり；
Ｘ３０がＤ又はＥであり；及び
Ｘ３１がＶ又はＩである
請求項４６のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項４９】
ＸＣがＸ２９Ｘ３０であり；
Ｘ２９がＱ又はＡであり；及び
Ｘ３０がＤ又はＥである
請求項４６のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項５０】
ＸＣがＸ２９であり；及び
Ｘ２９がＱ又はＡである
請求項４６のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項５１】
ＸＣが不在である請求項４６のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項５２】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが更にプレプロ領域を含む請求項３８のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項５３】
プレプロ領域が配列番号１８８から２０７から選択されるアミノ酸配列を含む請求項５２のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項５４】
プレプロ領域が配列番号１８８のアミノ酸配列を含む請求項５３のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項５５】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが式ＩＩ：
ＪＮＪ７Ｊ８ＨＮＪ１１Ｊ１２ＫＨＬＪ１６ＳＪ１８Ｊ１９ＲＪ２１ＥＷＬＲＫＫＬＪＣ（式ＩＩ；配列番号１４）
（式中、
ＪＮは不在であるか又はＪ１Ｊ２Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６、Ｊ２Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６もしくはＪ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６であり；
Ｊ１からＪ８、Ｊ１２、Ｊ１６、Ｊ１８及びＪ２１は各々独立して選択されたアミノ酸残基であり；
Ｊ１１は非機能的又は塩基性残基であり；
Ｊ１９は酸性又は塩基性残基であり；
ＪＣは不在であるか又はＪ２９、Ｊ２９Ｊ３０、Ｊ２９Ｊ３０Ｊ３１、Ｊ２９Ｊ３０Ｊ３１Ｊ３２、Ｊ２９Ｊ３０Ｊ３１Ｊ３２Ｊ３３もしくはＪ２９Ｊ３０Ｊ３１Ｊ３２Ｊ３３Ｊ３４であり；
Ｊ２９からＪ３４は各々独立して選択されたアミノ酸残基であり；
但し、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域のＪ１４からＣ末端残基の１個以上はシステイン残基である。）
のポリペプチドから選択されるＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域を含み；
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドがＰＴＨ−１受容体又はＰＴＨ−２受容体と結合する
請求項１、１６及び３４のいずれか一項のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項５６】
ＪＮがＪ１Ｊ２Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６であり；
Ｊ１が非機能的又は芳香族残基であり；
Ｊ２が非機能的残基であり；
Ｊ３が親水性残基であり；
Ｊ４が酸性残基であり；
Ｊ５が非機能的残基であり；
Ｊ６が塩基性残基であり；
Ｊ７が非機能的又は芳香族残基であり；
Ｊ８が非機能的残基であり；
Ｊ１２が非機能的又は芳香族残基であり；
Ｊ１６が非機能的又は親水性残基であり；
Ｊ１８が非機能的残基であり；
Ｊ２１が非機能的残基であり；
ＪＣがＪ２９Ｊ３０Ｊ３１Ｊ３２Ｊ３３Ｊ３４であり；
Ｊ２９が親水性又は非機能的残基であり；
Ｊ３０が親水性又は酸性残基であり；
Ｊ３１が親油性又は非機能的残基であり；
Ｊ３２が塩基性残基であり；
Ｊ３３が酸性残基であり；及び
Ｊ３４が芳香族残基である
請求項５５のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項５７】
Ｊ１がＡ、Ｓ又はＹであり；
Ｊ２がＶであり；
Ｊ３がＳであり；
Ｊ４がＥであり；
Ｊ５がＩであり；
Ｊ６がＱであり；
Ｊ７がＬ又はＦであり；
Ｊ８がＭ又はＮｌｅであり；
Ｊ１１がＬ、Ｒ又はＫであり；
Ｊ１２がＧ又はＷであり；
Ｊ１６がＮ、Ｓ又はＡであり；
Ｊ１８がＭ、Ｎｌｅ、Ｌ又はＶであり；
Ｊ１９がＥ又はＲであり；
Ｊ２１がＶ、Ｍ又はＮｌｅであり；
Ｊ２９がＱ又はＡであり；
Ｊ３０がＤ又はＥであり；
Ｊ３１がＶ又はＩであり；
Ｊ３１がＨであり；
Ｊ３３がＮであり；及び
Ｊ３４がＦ又はＹである
請求項５６のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項５８】
ＪＮがＪ１Ｊ２Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６であり；
Ｊ１が非機能的又は芳香族残基であり；
Ｊ２が非機能的残基であり；
Ｊ３が親水性残基であり；
Ｊ４が酸性残基であり；
Ｊ５が非機能的残基であり；
Ｊ６が塩基性残基であり；
Ｊ７が非機能的又は芳香族残基であり；
Ｊ８が非機能的残基であり；
Ｊ１２が非機能的又は芳香族残基であり；
Ｊ１６が非機能的又は親水性残基であり；
Ｊ１８が非機能的残基であり；
Ｊ２１が非機能的残基であり；
ＪＣがＪ２９Ｊ３０Ｊ３１であり；
Ｊ２９が親水性又は非機能的残基であり；
Ｊ３０が親水性又は酸性残基であり；及び
Ｊ３１が親油性又は非機能的残基である
請求項５５のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項５９】
Ｊ１がＡ、Ｓ又はＹであり；
Ｊ２がＶであり；
Ｊ３がＳであり；
Ｊ４がＥであり；
Ｊ５がＩであり；
Ｊ６がＱであり；
Ｊ７がＬ又はＦであり；
Ｊ８がＭ又はＮｌｅであり；
Ｊ１１がＬ、Ｒ又はＫであり；
Ｊ１２がＧ又はＷであり；
Ｊ１６がＮ、Ｓ又はＡであり；
Ｊ１８かＭ、Ｎｌｅ、Ｌ又はＶであり；
Ｊ１９がＥ又はＲであり；
Ｊ２１がＶ、Ｍ又はＮｌｅであり；
Ｊ２９がＱ又はＡであり；
Ｊ３０がＤ又はＥであり；及び
Ｊ３１がＶ又はＩである
請求項５８のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項６０】
ＪＮがＪ１Ｊ２Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６であり；
Ｊ１が非機能的又は芳香族残基であり；
Ｊ２が非機能的残基であり；
Ｊ３が親水性残基であり；
Ｊ４が酸性残基であり；
Ｊ５が非機能的残基であり；
Ｊ６が塩基性残基であり；
Ｊ７が非機能的又は芳香族残基であり；
Ｊ８が非機能的残基であり；
Ｊ１２が非機能的又は芳香族残基であり；
Ｊ１６が非機能的又は親水性残基であり；
Ｊ１８が非機能的残基であり；
Ｊ２１が非機能的残基であり；
ＪＣがＪ２９Ｊ３０であり；
Ｊ２９が親水性又は非機能的残基であり；及び
Ｊ３０が親水性又は酸性残基である
請求項５５のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項６１】
Ｊ１がＡ、Ｓ又はＹであり；
Ｊ２がＶであり；
Ｊ３がＳであり；
Ｊ４がＥであり；
Ｊ５がＩであり；
Ｊ６がＱであり；
Ｊ７がＬ又はＦであり；
Ｊ８がＭ又はＮｌｅであり；
Ｊ１１がＬ、Ｒ又はＫであり；
Ｊ１２がＧ又はＷであり；
Ｊ１６がＮ、Ｓ又はＡであり；
Ｊ１８がＭ、Ｎｌｅ、Ｌ又はＶであり；
Ｊ１９がＥ又はＲであり；
Ｊ２１がＶ、Ｍ又はＮｌｅであり；
Ｊ２９がＱ又はＡであり；及び
Ｊ３０がＤ又はＥである
請求項６０のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項６２】
ＪＮがＪ１Ｊ２Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６であり；
Ｊ１が非機能的又は芳香族残基であり；
Ｊ２が非機能的残基であり；
Ｊ３が親水性残基であり；
Ｊ４が酸性残基であり；
Ｊ５が非機能的残基であり；
Ｊ６が塩基性残基であり；
Ｊ７が非機能的又は芳香族残基であり；
Ｊ８が非機能的残基であり；
Ｊ１２が非機能的又は芳香族残基であり；
Ｊ１６が非機能的又は親水性残基であり；
Ｊ１８が非機能的残基であり；
Ｊ２１が非機能的残基であり；
ＪＣがＪ２９であり；及び
Ｊ２９が親水性又は非機能的残基である
請求項５５のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項６３】
Ｊ１がＡ、Ｓ又はＹであり；
Ｊ２がＶであり；
Ｊ３がＳであり；
Ｊ４がＥであり；
Ｊ５がＩであり；
Ｊ６がＱであり；
Ｊ７がＬ又はＦであり；
Ｊ８がＭ又はＮｌｅであり；
Ｊ１１がＬ、Ｒ又はＫであり；
Ｊ１２がＧ又はＷであり；
Ｊ１６がＮ、Ｓ又はＡであり；
Ｊ１８がＭ、Ｎｌｅ、Ｌ又はＶであり；
Ｊ１９がＥ又はＲであり；
Ｊ２１がＶ、Ｍ又はＮｌｅであり；及び
Ｊ２９がＱ又はＡである
請求項６２のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項６４】
ＪＮがＪ１Ｊ２Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６であり；
Ｊ１が非機能的又は芳香族残基であり；
Ｊ２が非機能的残基であり；
Ｊ３が親水性残基であり；
Ｊ４が酸性残基であり；
Ｊ５が非機能的残基であり；
Ｊ６が塩基性残基であり；
Ｊ７が非機能的又は芳香族残基であり；
Ｊ８が非機能的残基であり；
Ｊ１２が非機能的又は芳香族残基であり；
Ｊ１６が非機能的又は親水性残基であり；
Ｊ１８が非機能的残基であり；
Ｊ２１が非機能的残基であり；及び
ＪＣが不在である
請求項５５のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項６５】
Ｊ１がＡ、Ｓ又はＹであり；
Ｊ２がＶであり；
Ｊ３がＳであり；
Ｊ４がＥであり；
Ｊ５がＩであり；
Ｊ６がＱであり；
Ｊ７がＬ又はＦであり；
Ｊ８がＭ又はＮｌｅであり；
Ｊ１１がＬ、Ｒ又はＫであり；
Ｊ１２がＧ又はＷであり；
Ｊ１６がＮ、Ｓ又はＡであり；
Ｊ１８がＭ、Ｎｌｅ、Ｌ又はＶであり；
Ｊ１９がＥ又はＲであり；及び
Ｊ２１がＶ、Ｍ又はＮｌｅである
請求項６４のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項６６】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが更にプレプロ領域を含む請求項５５のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項６７】
プレプロ領域が配列番号１８８から２０７から選択されるアミノ酸配列を含む請求項６６のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項６８】
プレプロ領域が配列番号１８８のアミノ酸配列を含む請求項６７のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項６９】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが式ＩＩＩ：
ＯＮＬＨＯ１０Ｏ１１Ｏ１２ＫＳＩＯ１５Ｏ１６Ｏ１７ＬＲＲＲＦＯ２３ＬＨＨＬＩＯＣ（式ＩＩＩ；配列番号１５）
（式中、
ＯＮは不在であるか又はＹＯ１Ｏ２Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ１Ｏ２Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ２Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ６Ｏ７もしくはＯ７であり；
Ｏ１からＯ７、Ｏ１０からＯ１２、Ｏ１５からＯ１７及びＯ２３は各々独立して選択されたアミノ酸残基であり；
ＯＣは不在であるか又はＯ２９、Ｏ２９Ｏ３０、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２Ｏ３３、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２Ｏ３３Ｏ３４、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２Ｏ３３Ｏ３４Ｏ３５もしくはＯ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２Ｏ３３Ｏ３４Ｏ３５Ｏ３６であり；
Ｏ２９からＯ３６は各々独立してアミノ酸残基であり；
但し、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域のＯ１４からＣ末端残基の１個以上はシステイン残基である。）
のポリペプチドから選択されるＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域を含み；ならびに
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドがＰＴＨ−１受容体又はＰＴＨ−２受容体と結合する
請求項１、１６及び３４のいずれか一項のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項７０】
ＯＮがＯ７であり；
Ｏ７が非機能的残基であり；
Ｏ１０が酸性又は親水性残基であり；
Ｏ１１が塩基性又は非機能的残基であり；
Ｏ１２が芳香族又は非機能的残基であり；
Ｏ１５が親水性又は非機能的残基であり；
Ｏ１６が親水性残基であり；
Ｏ１７が酸性又は非機能的残基であり；
Ｏ２３が芳香族残基であり；及び
ＯＣが不在である
請求項６９のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項７１】
ＯＮがＯ１Ｏ２Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７であり；
Ｏ１が非機能的アミノ酸残基であり；
Ｏ２が非機能的アミノ酸残基であり；
Ｏ３が親水性アミノ酸残基であり；
Ｏ４が酸性アミノ酸残基であり；
Ｏ５が塩基性又は非機能的アミノ酸残基であり；
Ｏ６が親水性アミノ酸残基であり；
Ｏ７が非機能的残基であり；
Ｏ１０が酸性又は親水性残基であり；
Ｏ１１が塩基性又は非機能的残基であり；
Ｏ１２が芳香族又は非機能的残基であり；
Ｏ１５が親水性又は非機能的残基であり；
Ｏ１６が親水性残基であり；
Ｏ１７が酸性又は非機能的残基であり；及び
Ｏ２３が芳香族残基である
請求項６９のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項７２】
Ｏ１がＡであり；
Ｏ２がＶであり；
Ｏ３がＳであり；
Ｏ４がＥであり；
Ｏ５がＨ又はＩであり；
Ｏ６がＱであり；
Ｏ７がＬであり；
Ｏ１０がＮ又はＤであり；
Ｏ１１がＫ又はＬであり；
Ｏ１２がＧ、Ｆ又はＷであり；
Ｏ１５がＩ又はＳであり；
Ｏ１６がＱ又はＮであり；
Ｏ１７がＤ又はＬであり；及び
Ｏ２３がＦ又はＷである
請求項６９のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項７３】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが更にプレプロ領域を含む請求項６９のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項７４】
プレプロ領域が配列番号１８８から２０７から選択されるアミノ酸配列を含む請求項７３のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項７５】
プレプロ領域が配列番号１８８のアミノ酸配列を含む請求項７４のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項７６】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが配列番号１６から６７から選択される配列を含むＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域を含む請求項１、１６及び３４のいずれか一項のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項７７】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域が配列番号２２のアミノ酸配列を含む請求項７６のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項７８】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが更にプレプロ領域を含む請求項７６のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項７９】
プレプロ領域が配列番号１８８から２０７から選択されるアミノ酸配列を含む請求項７８のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項８０】
プレプロ領域が配列番号１８８のアミノ酸配列を含み、及びＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域が配列番号２２のアミノ酸配列を含む請求項７９のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項８１】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが配列番号８のアミノ酸配列を含む請求項７８のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項８２】
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列をもつ第１のポリペプチドと、配列番号８のアミノ酸配列をもつ第２のポリペプチドを含むＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列をもつ第１のポリペプチドと、配列番号４のアミノ酸配列をもつ第２のポリペプチドを含むＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子；及び
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列をもつ第１のポリペプチドと、配列番号８のアミノ酸配列をもつ第２のポリペプチドを含むＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子
から選択されるＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項８３】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが配列番号６８から８９から選択される配列を含むＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域を含む請求項１、１６及び３４のいずれか一項のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項８４】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが更にプレプロ領域を含む請求項８３のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項８５】
プレプロ領域が配列番号１８８から２０７から選択されるアミノ酸配列を含む請求項８４のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項８６】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが配列番号９０から１０７から選択される配列を含むＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域を含み、但し、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域の１４位からＣ末端の１個以上の残基はシステイン残基で置換されている請求項１、１６及び３４のいずれか一項のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項８７】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが更にプレプロ領域を含む請求項８６のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項８８】
プレプロ領域が配列番号１８８から２０７から選択されるアミノ酸配列を含む請求項８７のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。
【請求項８９】
請求項１、１６及び３４のいずれか一項のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を含む医薬組成物。
【請求項９０】
骨吸収抑制剤、骨同化剤、抗炎症剤、免疫抑制剤及び癌治療剤から選択される少なくとも１種の治療剤を更に含む請求項８９の医薬組成物。
【請求項９１】
少なくとも１種の治療剤がアナキンラ、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ及びメトトレキセートから選択される請求項９０の医薬組成物。
【請求項９２】
更に少なくとも１種の癌治療剤を含有する請求項８９の医薬組成物。
【請求項９３】
少なくとも１種の癌治療剤が放射線療法と化学療法から選択される請求項９２の医薬組成物。
【請求項９４】
少なくとも１種の癌治療剤が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ｖｅｇＦ阻害剤、ｖｅｇＦ受容体阻害剤、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／分散因子（ＳＦ）阻害剤、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤、アンギオポエチン阻害剤、Ｔｉｅ２阻害剤、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）阻害剤、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）阻害剤、ムチン様糖蛋白阻害剤、ＣＤＣ２０阻害剤及びＣＤＣ３３阻害剤から選択される請求項９２の医薬組成物。
【請求項９５】
更に少なくとも１種の治療用抗体を含有する請求項８９の医薬組成物。
【請求項９６】
少なくとも１種の治療用抗体がＨｅｒ２抗体、ＣＤＣ２０抗体、ＥＧＦＲ抗体、ｖｅｇＦ抗体、ｖｅｇＦ受容体抗体、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／分散因子（ＳＦ）抗体、インスリン様成長因子受容体（ＩＦＧＲ）抗体及びＣＤＣ３３抗体から選択される請求項９５の医薬組成物。
【請求項９７】
請求項８９の医薬組成物を投与することを含む、患者における骨減少の治療方法。
【請求項９８】
請求項８９の医薬組成物と、骨吸収抑制剤、骨同化剤、抗炎症剤、免疫抑制剤及び癌治療剤から選択される少なくとも１種の薬剤を投与することを含む、患者における骨減少の治療方法。
【請求項９９】
骨形態形成因子、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）阻害剤、ＩＬ−１ｒａ、アナキンラ、ＴＮＦα阻害剤、可溶性ＴＮＦα受容体、エタネルセプト、抗ＴＮＦα抗体、インフリキシマブ、アダリムマブ、プロスタグランジン、ビスホスホネート、アレンドロネート、フッ化物、カルシウム、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ＣＯＸ−２阻害剤、セレコキシブ、ロフェコキシブ、免疫抑制剤、メトトレキセート、レフルノミド、セリンプロテアーゼ阻害剤、分泌型白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）、ＩＬ−６阻害剤、ＩＬ−６抗体、ＩＬ−８阻害剤、ＩＬ−８抗体、ＩＬ−１８阻害剤、ＩＬ−１８結合蛋白、ＩＬ−１８抗体、インターロイキン−１変換酵素（ＩＣＥ）モジュレーター、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦモジュレーター、ＰＡＦアンタゴニスト、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ＫＧＦ関連分子、ＫＧＦモジュレーター、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）モジュレーター、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）モジュレーター、グルココルチコイド受容体のモジュレーター、グルタミン酸受容体のモジュレーター、リポ多糖（ＬＰＳ）濃度のモジュレーター、ノルアドレナリン、ノルアドレナリンミメティック及びノルアドレナリンモジュレーターから選択される少なくとも１種の治療剤を投与することを更に含む請求項９７の方法。
【請求項１００】
請求項９０の医薬組成物を投与することを含む、患者における骨減少を伴う炎症症状の治療方法。
【請求項１０１】
請求項９０の医薬組成物を投与することを含む、患者における骨減少を伴う自己免疫症状の治療方法。
【請求項１０２】
請求項９０の医薬組成物を投与することを含む、患者における関節リウマチの治療方法。
【請求項１０３】
請求項８９の医薬組成物を投与することを含む、癌に伴う骨減少の治療方法。
【請求項１０４】
請求項８９の医薬組成物と、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ｖｅｇＦ阻害剤、ｖｅｇＦ受容体阻害剤、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／分散因子（ＳＦ）阻害剤、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤、アンギオポエチン阻害剤、Ｔｉｅ２阻害剤、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）阻害剤、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）阻害剤、ムチン様糖蛋白阻害剤、ＣＤＣ２０阻害剤及びＣＤＣ３３阻害剤から選択される少なくとも１種の治療剤を投与することを含む、癌に伴う骨減少の治療方法。
【請求項１０５】
請求項８９の医薬組成物と、Ｈｅｒ２抗体、ＣＤＣ２０抗体、ＥＧＦＲ抗体、ｖｅｇＦ抗体、ｖｅｇＦ受容体抗体、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／分散因子（ＳＦ）抗体、インスリン様成長因子受容体（ＩＦＧＲ）抗体及びＣＤＣ３３抗体から選択される少なくとも１種の抗体を投与することを含む、癌に伴う骨減少の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＮＦ−κＢ受容体アクチベーターリガンド（ＲＡＮＫＬ）と結合する抗体と、副甲状腺ホルモン／副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ）ペプチドを含むキメラ分子（ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子）を提供する。骨疾患の治療用組成物及び方法についても記載する。
【背景技術】
【０００２】
骨組織は身体の支柱であり、ミネラル（例えばカルシウムやリン）と、コラーゲン性及び非コラーゲン性蛋白基質と、細胞を含む。生骨組織は骨形成（沈着と言う）と骨分解（吸収と言う）の動的平衡を示す。この平衡には骨に存在する骨細胞、骨芽細胞及び破骨細胞の３種の細胞が関与している。骨芽細胞は骨組織の形成を促進し、破骨細胞は吸収に関係がある。吸収ないし骨基質及びミネラルの溶解は骨形成に比較して迅速で効率的なプロセスであり、骨から多量のミネラルを放出する可能性がある。破骨細胞は骨格組織の正常リモデリングの調節とホルモンにより誘導される吸収に関与している。例えば、吸収は細胞外液のカルシウムイオン濃度の低下に応答する副甲状腺ホルモンの分泌により刺激される。他方、吸収の阻害はカルシトニンに依存する。更に、ビタミンＤの代謝物は副甲状腺ホルモンとカルシトニンに対する骨の応答性を変化させる。
【０００３】
ＮＦ−κＢ受容体アクチベーターリガンド（ＲＡＮＫＬ；別称オステオプロテゲリンリガンドないしＯＰＧＬ）はサイトカインのＴＮＦファミリーのメンバーであり、ＮＦ−κＢ受容体アクチベーター（ＲＡＮＫ、別称破骨細胞分化活性化受容体ないしＯＤＡＲ）と結合することにより破骨細胞形成を促進する。他方、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）はＲＡＮＫＬを阻害し、ＲＡＮＫＬとＲＡＮＫの結合を妨げることにより破骨細胞の形成を抑制する。従って、ＲＡＮＫＬとＲＡＮＫの結合量は骨沈着と吸収の平衡に相関する。
【０００４】
骨格成熟後に、骨格における骨の量は骨形成と骨吸収のバランス（又はアンバランス）を反映する。ピーク骨量は骨格成熟後で４０歳代前に生じる。４０歳代と５０歳代の間に平衡は転換し、骨吸収が優勢になる。加齢に伴う骨量の不可避的減少は男性よりも女性のほうが早期に開始し、一部の女性（主に白人及びアジア人家系）では閉経後に著しく加速する。
【０００５】
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は血中カルシウム値の低下に応答して分泌される。ＰＴＨは恐らくＰＴＨ１受容体と結合してこれを活性化することにより、破骨細胞を活性化する。ＰＴＨ１受容体活性化によりＲＡＮＫＬが分泌され、骨吸収と血清カルシウム値の増加を刺激する。
【０００６】
逆説的に言えば、ＰＴＨ又はＰＴＨ関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）の間欠投与は実際に骨密度を増加することができる。この増加は骨吸収を増加する破骨細胞の活性化に加え、骨形成を増加する骨芽細胞の活性化が生じるためである。骨芽細胞活性化が破骨細胞活性化を上回ると、最終的に骨密度が増加する。しかし、骨芽細胞の強い刺激はマウスで骨肉腫に結び付けられている。
【０００７】
骨減少症は一般に正常レベルを下回る任意骨量減少に関する症状である。このような症状は骨合成速度の低下又は骨破壊速度の増加又はその両者に起因すると考えられる。骨減少症の一般的な形態は原発性骨粗鬆症（別称閉経後及び老人性骨粗鬆症）である。この形態の骨粗鬆症は加齢に伴う普遍的な骨減少の帰結であり、正常な骨形成速度で骨吸収が増加した結果であることが多い。米国の多くの白人女性は症候性骨粗鬆症を発症している。４５歳以上の女性では骨粗鬆症と股関節、大腿骨、頸部及び転子間骨折の発生の間に直接の因果関係が存在する。５０代から７０代の高齢男性も症候性骨粗鬆症を発症する場合がある。
【発明の開示】
【０００８】
（発明の概要）
いくつかの実施形態では、ＮＦ−κＢ受容体アクチベーターリガンド（ＲＡＮＫＬ）抗体−副甲状腺ホルモン／副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ）キメラ分子を提供する。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子はＲＡＮＫＬと結合する抗体と、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子はＲＡＮＫＬと結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は配列番号２に記載のアミノ酸又はそのフラグメントをもつ重鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は配列番号４に記載のアミノ酸配列又はそのフラグメントをもつ軽鎖を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は配列番号１１に記載のアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む第１の可変領域を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は配列番号１２に記載のアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む第２の可変領域を含む軽鎖を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は配列番号１１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９２％の一致度をもつ配列を含む第１の可変領域を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は配列番号１２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の一致度をもつ配列を含む第２の可変領域を含む軽鎖を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は配列番号１１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の一致度をもつ配列を含む第１の可変領域を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は配列番号１２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の一致度をもつ配列を含む第２の可変領域を含む軽鎖を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は配列番号１１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の一致度をもつ配列を含む第１の可変領域を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は配列番号１２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の一致度をもつ配列を含む第２の可変領域を含む軽鎖を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、（Ｆａｂ’）２抗体、ドメイン抗体、ナノボディ、ミニボディ、マキシボディ及び二重特異性抗体から選択される抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は完全ヒト抗体であるＲＡＮＫＬ抗体を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＲＡＮＫＬ抗体と機能的に連結している。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはプレプロ領域とＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＲＡＮＫＬ抗体の重鎖と機能的に連結している。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＲＡＮＫＬ抗体の軽鎖と機能的に連結している。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＲＡＮＫＬ抗体の重鎖のＮ末端と融合している。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＲＡＮＫＬ抗体の軽鎖のＮ末端と融合している。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドは軽鎖と機能的に連結しており、第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドは重鎖と機能的に連結している。第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドは同一でも異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドは重鎖と機能的に連結している。いくつかの実施形態では、第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドは重鎖のＮ末端と機能的に連結している。いくつかの実施形態では、第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドは重鎖と融合している。いくつかの実施形態では、第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドは軽鎖と機能的に連結している。いくつかの実施形態では、第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドは軽鎖のＮ末端と機能的に連結している。いくつかの実施形態では、第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドは軽鎖と融合している。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は式Ｉ：
ＸＮＨＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＫＸ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９ＲＸ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６Ｘ２７Ｘ２８ＸＣ（式Ｉ；配列番号１３）
（式中、
ＸＮは不在であるか又はＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７、Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７もしくはＹＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７であり；
Ｘ１からＸ７、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１４からＸ２８は各々独立して選択されたアミノ酸残基であり；
ＸＣは不在であるか又はＸ２９、Ｘ２９Ｘ３０、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５もしくはＸ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６であり；
Ｘ２９からＸ３６は各々独立して選択されたアミノ酸残基であり；
但し、Ｘ１４からＸ３６の１個以上はシステイン残基である）のポリペプチドから選択されるＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域を含むＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＰＴＨ−１受容体又はＰＴＨ−２受容体と結合する。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドは更にプレプロ領域を含む。いくつかの実施形態では、プレプロ領域は配列番号１８８から２０７から選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は式ＩＩ：
ＪＮＪ７Ｊ８ＨＮＪ１１Ｊ１２ＫＨＬＪ１６ＳＪ１８Ｊ１９ＲＪ２１ＥＷＬＲＫＫＬＪＣ（式ＩＩ；配列番号１４）
（式中、
ＪＮは不在であるか又はＪ１Ｊ２Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６、Ｊ２Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６もしくはＪ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６であり；
Ｊ１からＪ８、Ｊ１２、Ｊ１６、Ｊ１８及びＪ２１は各々独立して選択されたアミノ酸残基であり；
Ｊ１１は非機能的又は塩基性残基であり；
Ｊ１９は酸性又は塩基性残基であり；
ＪＣは不在であるか又はＪ２９、Ｊ２９Ｊ３０、Ｊ２９Ｊ３０Ｊ３１、Ｊ２９Ｊ３０Ｊ３１Ｊ３２、Ｊ２９Ｊ３０Ｊ３１Ｊ３２Ｊ３３もしくはＪ２９Ｊ３０Ｊ３１Ｊ３２Ｊ３３Ｊ３４であり；
Ｊ２９からＪ３４は各々独立して選択されたアミノ酸残基であり；
但し、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域のＪ１４からＣ末端残基の１個以上はシステイン残基である）のポリペプチドから選択されるＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域を含むＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＰＴＨ−１受容体又はＰＴＨ−２受容体と結合する。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドは更にプレプロ領域を含む。いくつかの実施形態では、プレプロ領域は配列番号１８８から２０７から選択される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は式ＩＩＩ：
ＯＮＬＨＯ１０Ｏ１１Ｏ１２ＫＳＩＯ１５Ｏ１６Ｏ１７ＬＲＲＲＦＯ２３ＬＨＨＬＩＯＣ（式ＩＩＩ；配列番号１５）
（式中、
ＯＮは不在であるか又はＹＯ１Ｏ２Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ１Ｏ２Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ２Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ６Ｏ７もしくはＯ７であり；
Ｏ１からＯ７、Ｏ１０からＯ１２、Ｏ１５からＯ１７及びＯ２３は各々独立して選択されたアミノ酸残基であり；
ＯＣは不在であるか又はＯ２９、Ｏ２９Ｏ３０、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２Ｏ３３、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２Ｏ３３Ｏ３４、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２Ｏ３３Ｏ３４Ｏ３５もしくはＯ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２Ｏ３３Ｏ３４Ｏ３５Ｏ３６であり；
Ｏ２９からＯ３６は各々独立してアミノ酸残基であり；
但し、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域のＯ１４からＣ末端残基の１個以上はシステイン残基である）のポリペプチドから選択されるＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域を含むＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＰＴＨ−１受容体又はＰＴＨ−２受容体と結合する。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドは更にプレプロ領域を含む。いくつかの実施形態では、プレプロ領域は配列番号１８８から２０７から選択される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は配列番号１６から６７から選択される配列を含む調節領域を含むＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は配列番号６８から８９から選択される配列を含む調節領域を含むＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は配列番号９０から１０７から選択される配列を含む調節領域を含むＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含み、但し、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域の１４位からＣ末端の１個以上の残基はシステイン残基で置換されている。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は配列番号２のアミノ酸配列をもつ第１のポリペプチドと、配列番号８のアミノ酸配列をもつ第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は配列番号１０のアミノ酸配列をもつ第１のポリペプチドと、配列番号４のアミノ酸配列をもつ第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は配列番号１０のアミノ酸配列をもつ第１のポリペプチドと、配列番号８のアミノ酸配列をもつ第２のポリペプチドを含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子はＲＡＮＫＬとＮＦ−κＢ受容体アクチベーター（ＲＡＮＫ）の結合を阻害する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を含有する医薬組成物を提供する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は骨吸収抑制剤、骨同化剤、抗炎症剤、免疫抑制剤及び癌治療剤から選択される少なくとも１種の治療剤を更に含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物はアナキンラ、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ及びメトトレキセートから選択される少なくとも１種の治療剤を更に含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は放射線療法と化学療法から選択される少なくとも１種の癌治療剤を更に含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ｖｅｇＦ阻害剤、ｖｅｇＦ受容体阻害剤、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／分散因子（ＳＦ）阻害剤、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤、アンギオポエチン阻害剤、Ｔｉｅ２阻害剤、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）阻害剤、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）阻害剤、ムチン様糖蛋白阻害剤、ＣＤＣ２０阻害剤及びＣＤＣ３３阻害剤から選択される少なくとも１種の癌治療剤を更に含有する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は更に少なくとも１種の治療用抗体を含有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の治療用抗体はＨｅｒ２抗体、ＣＤＣ２０抗体、ＥＧＦＲ抗体、ｖｅｇＦ抗体、ｖｅｇＦ受容体抗体、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／分散因子（ＳＦ）抗体、インスリン様成長因子受容体（ＩＦＧＲ）抗体及びＣＤＣ３３抗体から選択される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、患者における骨減少の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、骨減少の治療方法はＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を含有する医薬組成物を投与する段階を含む。いくつかの実施形態では、方法はＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を含有する医薬組成物と、骨吸収抑制剤、骨同化剤、抗炎症剤、免疫抑制剤及び癌治療剤から選択される少なくとも１種の物質を投与する段階を含む。いくつかの実施形態では、方法はＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を含有する医薬組成物と、骨形態形成因子、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）阻害剤、ＩＬ−１ｒａ、アナキンラ、ＴＮＦα阻害剤、可溶性ＴＮＦα受容体、エタネルセプト、抗ＴＮＦα抗体、インフリキシマブ、アダリムマブ、プロスタグランジン、ビスホスホネート、アレンドロネート、フッ化物、カルシウム、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ＣＯＸ−２阻害剤、セレコキシブ、ロフェコキシブ、免疫抑制剤、メトトレキセート、レフルノミド、セリンプロテアーゼ阻害剤、分泌型白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）、ＩＬ−６阻害剤、ＩＬ−６抗体、ＩＬ−８阻害剤、ＩＬ−８抗体、ＩＬ−１８阻害剤、ＩＬ−１８結合蛋白、ＩＬ−１８抗体、インターロイキン−１変換酵素（ＩＣＥ）モジュレーター、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦモジュレーター、ＰＡＦアンタゴニスト、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ＫＧＦ関連分子、ＫＧＦモジュレーター、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）モジュレーター、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）モジュレーター、グルココルチコイド受容体モジュレーター、グルタミン酸受容体モジュレーター、リポ多糖（ＬＰＳ）濃度モジュレーター、ノルアドレナリン、ノルアドレナリンミメティック及びノルアドレナリンモジュレーターから選択される少なくとも１種の治療剤を投与する段階を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、骨減少を伴う炎症症状の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、骨減少を伴う自己免疫症状の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、関節リウマチの治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、癌に伴う骨減少の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法はＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を含有する医薬組成物を投与する段階を含む。
【００２８】
（いくつかの実施形態の詳細な説明）
本明細書で使用するセクションの見出しは構成上の目的に過ぎず、記載する主題を限定するものではない。本明細書に引用する全文献又は文献部分（限定しないが、例えば特許、特許出願、論文、著書及び条約）は特に参照によりその開示内容全体を全目的で本明細書に組込む。
【００２９】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、並びに組織培養及び形質転換（例えばエレクトロポレーション、リポフェクション）には標準技術を使用することができる。酵素反応及び精製技術は製造業者の仕様書又は当分野で広く実施されている方法又は本明細書に記載する方法に従って実施することができる。上記技術及び手順は一般に当分野で周知の慣用方法に従い、本明細書の随所に引用及び記載する各種一般及び特定文献に記載されているように実施することができる。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））参照。特に定義しない限り、本明細書に記載する分析化学、合成有機化学及び医薬品化学に関連して使用する命名法とその実験室手順及び技術は当分野で周知であり、広く使用されているものである。化学合成、化学分析、医薬製造、処方及び送達、並びに患者治療には標準技術を使用することができる。
【００３０】
本明細書では、特に指定しない限り、単数形の使用は複数形を含む。本明細書では、特に指定しない限り、「又は」の使用は「及び／又は」を意味する。更に、「含む」なる用語と「含み」や「含まれ」等の他の活用形の使用は非限定的である。また、「エレメント」や「成分」等の用語は特に指定しない限り、１単位からなるエレメント及び成分と、２個以上のサブ単位からなるエレメント及び成分の両者を包含する。
【００３１】
（定義）
特に指定しない限り、本明細書で使用する以下の用語は以下の意味をもつものとみなす。
【００３２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「蛋白質」なる用語は本明細書では同義に使用し、ペプチド結合又は修飾ペプチド結合により相互に結合した２個以上のアミノ酸のポリマーを意味する。これらの用語は天然アミノ酸を含むアミノ酸ポリマーと、１個以上のアミノ酸残基が非天然アミノ酸又は天然アミノ酸の化学的アナログであるアミノ酸ポリマーに適用される。アミノ酸ポリマーは翻訳後プロセシング等の１種以上の天然プロセスにより修飾された１個以上のアミノ酸残基、及び／又は当分野で公知の１種以上の化学修飾法により修飾された１個以上のアミノ酸残基を含んでいてもよい。
【００３３】
「単離ポリペプチド」なる用語は、（１）通常では共存している少なくとも一部のポリペプチドを含まないか、（２）例えば同一環境内（例えば同一細胞又は体液内）に存在する同一起源の他のポリペプチドを本質的に含まないか、（３）ポリペプチドの起源の種と異なる種の細胞により発現されるか、（４）無細胞発現系で発現されるか、（５）合成により作製されるか、又は（６）自然界に存在しない任意ポリペプチドを意味する。
【００３４】
基準ポリペプチドの「フラグメント」とは基準ポリペプチドの任意部分に由来する連続アミノ酸鎖を意味する。フラグメントは基準ポリペプチドの長さよりも短い任意長さとすることができる。
【００３５】
基準ポリペプチドの「変異体」とは基準ポリペプチドに対して１箇所以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入をもつポリペプチドを意味する。
【００３６】
基準ポリペプチドの変異体としては限定されないが、システイン変異体が挙げられる。システイン変異体としては、基準ポリペプチドの１個以上のシステイン残基が１個以上の非システイン残基で置換された変異体；及び／又は基準ポリペプチドの１個以上の非システイン残基が１個以上のシステイン残基で置換された変異体が挙げられる。いくつかの実施形態では、例えば不溶性封入体の単離後に特定ポリペプチドを生理的に活性な構造にリフォールディングする必要があるときにシステイン変異体が有用であると思われる。いくつかの実施形態では、基準ポリペプチドのシステイン変異体は基準ポリペプチドよりもシステイン残基数が少ない。いくつかの実施形態では、システイン変異体は基準ポリペプチドよりもシステイン残基数が多い。いくつかの実施形態では、基準ポリペプチドのシステイン変異体はシステインの不対合に起因する相互作用を最小限にするように同数のシステインをもつ。
【００３７】
基準ポリペプチドの変異体としては限定されないが、グリコシル化変異体が挙げられる。グリコシル化変異体としてはグリコシル化部位の数及び／又は種類が基準ポリペプチドに対して変化している変異体が挙げられる。いくつかの実施形態では、基準ポリペプチドのグリコシル化変異体は基準ポリペプチドよりも多数又は少数のＮ−結合型グリコシル化部位を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ−結合型グリコシル化部位は配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（式中、Ｘで表されるアミノ酸残基はプロリン以外の任意アミノ酸残基とすることができる）を特徴とする。いくつかの実施形態では、グリコシル化変異体としては、１個以上のＮ−結合型グリコシル化部位（限定されないが、天然グリコシル化部位）が除去され、１個以上の新規Ｎ−結合型グリコシル化部位が形成されたＮ−結合型糖鎖転位体が挙げられる。
【００３８】
基準ポリペプチドの「誘導体」とは、（１）基準ポリペプチドの１個以上のアミノ酸残基が１箇所以上修飾されているポリペプチド；及び／又は（２）１個以上のペプチド結合が１個以上の非ペプチド結合で置換されているポリペプチド；及び／又は（３）Ｎ末端及び／又はＣ末端が修飾されているポリペプチドを意味する。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは分岐及び／又は環状であり得る。環状、分岐、分岐環状ポリペプチドは翻訳後天然プロセス（限定されないが、例えばユビキチン化）により得られ、合成法により作製することもできる。
【００４０】
「ポリペプチド」なる用語はＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を包含する。いくつかの実施形態では、「ポリペプチド」なる用語は１個以上のＲＡＮＫＬ抗体と１個以上のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが単一の連続ポリペプチドを生成するように単一コーディング配列から翻訳されたＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を包含する。いくつかの実施形態では、「ポリペプチド」なる用語は１個以上のＲＡＮＫＬ抗体と１個以上のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが単一の連続ポリペプチドとして化学的に合成されたＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を包含する。いくつかの実施形態では、「ポリペプチド」なる用語は１個以上のＲＡＮＫＬ抗体と１個以上のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを別々に酵素的又は化学的に生成した後に酵素的又は化学的に相互に連結したＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を包含する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは１個以上のランダムアミノ酸及び／又はアミノ酸鎖を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは１個以上のランダムヌクレオチド及び／又はヌクレオチド鎖を含む。
【００４２】
「ランダム」なる用語はランダムに置換された残基又は残基鎖を意味する。残基鎖は２個以上の連続残基を含む。いくつかの実施形態では、ランダム置換とは特定アミノ酸位置を２個以上のアミノ酸のプールから選択されるアミノ酸でランダムに置換することを意味する。いくつかの実施形態では、特定アミノ酸位置を５個以上のアミノ酸のプールから選択されるアミノ酸でランダムに置換する。いくつかの実施形態では、特定アミノ酸位置を１０個以上のアミノ酸のプールから選択されるアミノ酸でランダムに置換する。いくつかの実施形態では、特定アミノ酸位置を１５個以上のアミノ酸のプールから選択されるアミノ酸でランダムに置換する。いくつかの実施形態では、特定アミノ酸位置を２０個以上のアミノ酸のプールから選択されるアミノ酸でランダムに置換する。いくつかの実施形態では、ファージディスプレイ法、大腸菌ディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング、化学的スクリーニング等から選択される少なくとも１種の技術を使用してランダムポリペプチドのプールから所望特徴をもつポリペプチドを選択することができる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ランダム置換とは特定ヌクレオチド位置を２個以上のヌクレオチドのプールから選択されるヌクレオチドでランダムに置換することを意味する。いくつかの実施形態では、特定ヌクレオチド位置を３個以上のヌクレオチドのプールから選択されるヌクレオチドでランダムに置換する。いくつかの実施形態では、特定ヌクレオチド位置を４個以上のヌクレオチドのプールから選択されるヌクレオチドでランダムに置換する。いくつかの実施形態では、１個以上のランダムヌクレオチド及び／又はヌクレオチド鎖をもつポリヌクレオチドが１個以上のランダムアミノ酸及び／又はアミノ酸鎖をもつポリペプチドをコードする。
【００４４】
「ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域」なる用語はＰＴＨ−１受容体及び／又はＰＴＨ−２受容体と結合するポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域は天然配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域は少なくとも１個のランダム残基及び／又は配列を含む。いくつかの代表的なＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域は表１Ａ及び２に示す文献に記載されており、あるいはこれらの文献に基づいて同定又は誘導することができる。
【００４５】
「ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ」又は「ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチド」なる用語はＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域を含むポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域以外にプレプロ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域以外にプレプロ領域の一部を含む。「ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチド」なる用語はプレプロ領域をもつＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドからこのプレプロ領域を除去するようにプロセシングすることにより得られた成熟ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを包含する。「ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチド」なる用語はプレプロ領域をもつＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドのプロセシング中に形成される任意中間体を包含し、これらの中間体はそれ以上プロセシングされなくてもよい。
【００４６】
「ＰＴＨアゴニスト」なる用語はＰＴＨ−１受容体及び／又はＰＴＨ−２受容体と結合し、１種以上のＰＴＨ活性アッセイで全長ＰＴＨと同様の応答を生じる分子を意味する。いくつかの実施形態では、「同様の応答」とは、全長ＰＴＨが同一ＰＴＨ活性アッセイで対照に比較してシグナルを増加する同一条件下でＰＴＨアゴニストがＰＴＨ活性アッセイで対照に比較してシグナルを増加することを意味する。いくつかの実施形態では、「同様の応答」とは、全長ＰＴＨが同一ＰＴＨ活性アッセイで対照に比較してシグナルを低下する同一条件下でＰＴＨアゴニストがＰＴＨ活性アッセイで対照に比較してシグナルを低下することを意味する。いくつかの代表的なＰＴＨ活性アッセイは例えば実施例５とＰＣＴ公開第ＷＯ０１／８１４１５号に記載されている。
【００４７】
「ＰＴＨアンタゴニスト」なる用語はＰＴＨ−１受容体及び／又はＰＴＨ−２受容体と結合し、全長ＰＴＨが受容体に及ぼす正常効果を阻止又は妨害する分子を意味する。いくつかの代表的なＰＴＨ活性アッセイは例えば実施例５とＰＣＴ公開第ＷＯ０１／８１４１５号に記載されている。
【００４８】
対象物に適用する「天然」なる用語は対象物が自然界に存在していることを意味する。例えば、自然界の起源から単離することができる生物（例えばウイルス）中に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチドは天然である。
【００４９】
「キメラ分子」なる用語は通常では同一分子を構成しない少なくとも２個の成分を含む分子を意味する。キメラ分子の各成分はキメラ分子の少なくとも１個の他の成分と連結されている。いくつかの実施形態では、キメラ分子の第１の成分を第１の成分と同一又は異なる第２の成分と共有結合することができる。従って、非限定的な１例として、１個のＲＡＮＫＬ抗体と同一配列をもつ２個のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含むキメラ分子では、ＲＡＮＫＬ抗体を第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと連結し、第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドも第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと連結することができる。
【００５０】
「連結」なる用語は生理的条件下で実質的に結合した状態に維持されるように共有的又は非共有的に結合した成分を意味する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを共有結合することができる。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを単一連続ポリペプチドとして翻訳することにより第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを共有結合することができる。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを単一連続ポリペプチドとして合成することにより第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを共有結合することができる。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを別々に翻訳及び／又は合成した後に、化学的及び／又は酵素的に連結することにより第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを共有結合することができる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを単一連続ポリペプチドとして翻訳するときに、第１のポリペプチドのＣ末端と第２のポリペプチドＮ末端の間にリンカー配列を挿入することができる。いくつかの実施形態では、リンカー配列は１から１００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカー配列は５から５０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカー配列は１０から３０アミノ酸長である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを共有結合する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを別々に作製した後に相互に共有結合する。いくつかの代表的なペプチド及び非ペプチド共有結合リンカーは当分野で公知及び／又は本明細書に記載の通りである。
【００５３】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを非共有的に連結する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを適切な条件下で相互に接触させたときに結合対の第１のメンバーと第２のメンバーが相互作用してポリペプチドを非共有的に連結するように、結合対の第１のメンバーを第１のポリペプチド配列に組込んだ後に結合対の第２のメンバーを第２のポリペプチド配列に組込むことにより、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを非共有的に連結する。
【００５４】
本明細書で使用する「結合対」なる用語は相互に特異的に結合する２個の分子を意味する。いくつかの代表的な結合対としてはビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、Ｈｉｓ６タグとニッケル、ヒト血清アルブミンとその結合性ペプチド、ヒト血清アルブミンと抗体フラグメント、抗体とその抗原、抗体フラグメントとその抗原、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）とその抗原、及びドメイン抗体とその抗原が挙げられる。いくつかの代表的なＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）は例えばＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０５０５３１号、ＷＯ０４／０４１８６２号、ＷＯ０４／０４１８６３号、ＷＯ０４／０４１８６５号、ＷＯ０４／０４１８６７号、ＷＯ０４／０６２５５１号、及びヨーロッパ特許出願第１４５６４１０号に記載されている。いくつかの代表的なドメイン抗体は例えば米国特許第６，６９６，２４５号、並びにＰＣＴ公開第ＷＯ０４／０５８８２１号、ＷＯ０４／００３０１９号及びＷＯ０３／００２６０９号に記載されている。
【００５５】
「機能的に連結」なる用語はその所期方法で機能できるような関係にある成分を意味する。例えば、ポリヌクレオチド配列の場合には、調節配列の機能と適合可能な条件下でコーディング配列の発現が行われるように調節配列とコーディング配列が結合しているときに調節配列はコーディング配列と「機能的に連結」している。
【００５６】
「調節配列」なる用語は結合しているコーディング配列の発現とプロセシングを実施することができるポリヌクレオチド配列を意味する。このような調節配列の種類は宿主生物により異なる。原核動物のいくつかの代表的な調節配列としては限定されないが、プロモーター、リボソーム結合配列及び転写終結配列が挙げられる。真核生物のいくつかの代表的な調節配列としては限定されないが、プロモーターと転写終結配列が挙げられる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドコーディング配列と第２のポリヌクレオチドコーディング配列が単一の連続ポリペプチドに翻訳可能な単一の連続ｍＲＮＡに転写されるときに、第１のポリヌクレオチドコーディング配列は第２のポリヌクレオチドコーディング配列と機能的に連結している。
【００５８】
ポリペプチドの場合には、連結した各ポリペプチドがその所期方法で機能できる場合に、２個以上のポリペプチドは「機能的に連結」している。別のポリペプチドと機能的に連結しているときにその所期方法で機能することが可能なポリペプチドは別のポリペプチドと機能的に連結していないときにその所期方法で機能することができてもよいし、できなくてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは非連結時にその所期方法で機能することができなくてもよいが、その所期方法で機能することが可能になるように第２のポリペプチドと連結することにより安定化することができる。あるいは、いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは非連結時にその所期方法で機能することができ、第２のポリペプチドと機能的に連結されているときにその能力を維持することができる。
【００５９】
本明細書の用語では、２個以上のポリペプチドが単一の連続ポリペプチド配列として翻訳するか又は単一の連続ポリペプチド配列として合成することにより連結されているときに、２個以上のポリペプチドは「融合」している。いくつかの実施形態では、２個以上の融合ポリペプチドは２個以上の機能的に連結したポリヌクレオチドコーディング配列からｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳させたものでもよい。いくつかの実施形態では、２個以上の融合ポリペプチドは２個以上の機能的に連結したポリヌクレオチドコーディング配列からｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳させたものでもよい。
【００６０】
本明細書の用語では、連結した各ポリペプチドがその所期方法で機能することができる場合に、２個以上のポリペプチドは「機能的に融合」している。
【００６１】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドの別個のポリペプチド単位の少なくとも１個が第２のポリペプチドと連結している限り、２個以上の別個のポリペプチド単位を含む第１のポリペプチドは第２のポリペプチドと連結しているとみなす。非限定的な１例として、いくつかの実施形態では、（ａ）第２のポリペプチドが抗体の重鎖ポリペプチドの一方と連結している場合；（ｂ）第２のポリペプチドが抗体の軽鎖ポリペプチドの一方と連結している場合；（ｃ）第２のポリペプチドの第１の分子が抗体の重鎖ポリペプチドの一方と連結しており、第２のポリペプチドの第２の分子が抗体の軽鎖ポリペプチドの一方と連結している場合；並びに（ｄ）第２のポリペプチドの第１の分子と第２の分子が抗体の第１及び第２の重鎖ポリペプチドと連結しており、第２のポリペプチドの第３の分子と第４の分子が抗体の第１及び第２の軽鎖ポリペプチドと連結している場合のいずれにおいても、抗体は第２のポリペプチドと連結しているとみなす。
【００６２】
いくつかの実施形態では、「第２のポリペプチドと連結した第１のポリペプチド」なる用語は、（ａ）第１のポリペプチドのただ１個の分子が第２のポリペプチドのただ１個の分子と連結している場合；（ｂ）第１のポリペプチドのただ１個の分子が第２のポリペプチドの２個以上の分子と連結している場合；（ｃ）第１のポリペプチドの２個以上の分子が第２のポリペプチドのただ１個の分子と連結している場合；及び（ｄ）第１のポリペプチドの２個以上の分子が第２のポリペプチドの２個以上の分子と連結している場合を包含する。いくつかの実施形態では、連結した分子が第１のポリペプチドの２個以上の分子と第２のポリペプチドのただ１個の分子を含むとき、第１のポリペプチドの全分子又は全分子未満の分子は第２のポリペプチドと共有又は非共有的に連結することができる。いくつかの実施形態では、連結した分子が第１のポリペプチドの２個以上の分子を含むとき、第１のポリペプチドの１個以上の分子は第１のポリペプチドの他の分子と共有又は非共有的に連結することができる。
【００６３】
本明細書で使用する「フレキシブルリンカー」とはその化学構造により三次元空間に固定されると予想されない任意リンカーを意味する。特定リンカーがその所期状況でフレキシブルであるか否かは当業者が予測することができる。
【００６４】
本明細書で使用する２０種の標準アミノ酸とその略語は従来の用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１）参照。いくつかの実施形態では、１個以上の非標準アミノ酸をポリペプチドに組込むことができる。「非標準アミノ酸」なる用語は２０種の標準アミノ酸以外の任意アミノ酸を意味する。「非天然アミノ酸」なる用語は自然界に存在しないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸は非標準アミノ酸のサブセットである。非標準アミノ酸としては限定されないが、２０種の標準アミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）、α−，α−ジ置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、ホモセリン、ホモシステイン、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、並びに当分野で公知の他の任意非標準アミノ酸及びイミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。非標準アミノ酸残基としては限定されないが、ペプチドミメティクス及びアミノ酸部分の他の逆転又は反転形態が挙げられる。本明細書で使用するポリペプチド表記では、標準用法及び慣例に従い、左側方向がアミノ末端方向であり、右側方向がカルボキシ末端方向である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換としては、１個以上の非標準アミノ酸残基による置換が挙げられる。いくつかの実施形態では、生体系内合成ではなく化学的ペプチド合成により非標準アミノ酸残基を組込む。
【００６６】
「酸性残基」なる用語は同一又は異なる２個の他のアミノ酸残基間でポリペプチドに組込まれているときに少なくとも１個の酸性基を含むＤ又はＬ形のアミノ酸残基を意味する。いくつかの実施形態では、酸性残基は少なくとも１個の酸性基を含む側鎖を含む。代表的な酸性残基としては限定されないが、アスパラギン酸（Ｄ）とグルタミン酸（Ｅ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、酸性残基は非標準アミノ酸とすることができる。
【００６７】
「芳香族残基」なる用語は少なくとも１個の芳香族基を含むＤ又はＬ形のアミノ酸残基を意味する。いくつかの実施形態では、芳香族残基は少なくとも１個の芳香族基を含む側鎖を含む。代表的な芳香族残基としては限定されないが、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、芳香族残基は非標準アミノ酸とすることができる。
【００６８】
「塩基性残基」なる用語は同一又は異なる２個のアミノ酸残基間でポリペプチドに組込まれているときに少なくとも１個の塩基性基を含むことができるＤ又はＬ形のアミノ酸残基を意味する。いくつかの実施形態では、塩基性残基は少なくとも１個の塩基性基を含む側鎖を含む。代表的な塩基性残基としては限定されないが、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、塩基性残基は非標準アミノ酸とすることができる。
【００６９】
「親水性残基」及び「Ｈａａ」なる用語は同一又は異なる２個のアミノ酸残基間でポリペプチドに組込まれているときに少なくとも１個の親水性基及び／又は極性基を含むＤ又はＬ形のアミノ酸残基を意味する。いくつかの実施形態では、親水性残基は少なくとも１個の親水性基及び／又は極性基を含む側鎖を含む。代表的な親水性残基としては限定されないが、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）及びスレオニン（Ｔ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、親水性残基は非標準アミノ酸とすることができる。
【００７０】
「中性親水性残基」なる用語は同一又は異なる２個のアミノ酸残基間でポリペプチドに組込まれているときに少なくとも１個の親水性基及び／又は極性基を含むが、酸性又は塩基性基を含まないＤ又はＬ形のアミノ酸残基を意味する。代表的な中性親水性残基としては限定されないが、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、中性親水性残基は非標準アミノ酸とすることができる。
【００７１】
「親油性残基」及び「Ｌａａ」なる用語は少なくとも１個の非荷電脂肪族及び／又は芳香族基をもつＤ又はＬ形のアミノ酸残基を意味する。いくつかの実施形態では、親油性残基は少なくとも１個の非荷電脂肪族及び／又は芳香族基を含む側鎖を含む。代表的な親油性側鎖としては限定されないが、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）及びチロシン（Ｙ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、親油性残基は非標準アミノ酸とすることができる。
【００７２】
「両親媒性残基」なる用語は親水性又は親油性残基であることが可能なＤ又はＬ形のアミノ酸残基を意味する。代表的な両親媒性残基としては限定されないが、アラニン（Ａ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、両親媒性残基は非標準アミノ酸とすることができる。
【００７３】
「非機能的残基」なる用語は同一又は異なる２個のアミノ酸残基間でポリペプチドに組込まれているときに酸性、塩基性及び芳香族基をもたないＤ又はＬ形のアミノ酸残基を意味する。代表的な非機能的アミノ酸残基としては限定されないが、メチオニン（Ｍ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）及びノルロイシン（Ｎｌｅ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、非機能的残基は非標準アミノ酸とすることができる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、グリシン（Ｇ）とプロリン（Ｐ）はポリペプチド鎖の向きを変化させることができるアミノ酸残基とみなされる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、保存的置換はある残基型のメンバーを同一残基型のメンバーで置換することにより実施することができる。非限定的な１例として、いくつかの実施形態では、保存的置換は酸性残基（例えばＤ）を別の酸性残基（例えばＥ）で置換することにより実施することができる。いくつかの実施形態では、非保存的置換はある残基型のメンバーを別の残基型のメンバーで置換することにより実施することができる。非限定的な１例として、いくつかの実施形態では、非保存的置換は酸性残基（例えばＤ）塩基性残基（例えばＫ）で置換することにより実施することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのこの位置にジスルフィド結合が形成されないように、システイン残基を別のアミノ酸残基で置換する。
【００７６】
いくつかの実施形態により保存的又は非保存的置換を実施する際には、アミノ酸の疎水性インデックスを考慮することができる。各アミノ酸はその疎水性及び電荷特性に基づいて以下のように疎水性インデックスを割り当てられている。イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）。
【００７７】
ポリペプチドに双方向生理機能を付与するのに疎水性アミノ酸インデックスが重要であることは文献に記載されている。例えばＫｙｔｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１（１９８２）参照。場合により、類似する疎水性インデックス又はスコアをもつ他のアミノ酸を所定アミノ酸で置換しても同様の生物活性を維持できることは知られている。疎水性インデックスに基づいて置換を行う際に、いくつかの実施形態では、疎水性インデックスが±２以内のアミノ酸の置換を含む。いくつかの実施形態では、±１以内のアミノ酸を含み、いくつかの実施形態では、±０．５以内のアミノ酸を含む。
【００７８】
本発明の場合のように特に形成される生物学的に機能的なポリペプチドを免疫態様に使用する場合には、類似アミノ酸の置換は親水性に基づいて有効に実施できることも当分野で認められている。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの最大局所平均親水性はその隣接アミノ酸の親水性に支配され、その免疫原性と抗原性即ちポリペプチドの生物学的性質と相関する。
【００７９】
これらのアミノ酸残基には以下の親水性値が割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）及びトリプトファン（−３．４）。類似する親水性値に基づいて置換を実施する際に、いくつかの実施形態では、親水性値が±２以内のアミノ酸置換を含み、いくつかの実施形態では、±１以内のアミノ酸を含み、いくつかの実施形態では、±０．５以内のアミノ酸を含む。いくつかの場合には、親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。これらの領域を「エピトープコア領域」とも言う。
【００８０】
代表的なアミノ酸置換を表１に示す。
【００８１】
【表１】
2009515903.tif 000003
2009515903.tif 000004
【００８２】
いくつかの実施形態では、当業者は周知技術を使用して基準ポリペプチドの適切な置換変異体を決定することができよう。いくつかの実施形態では、当業者は活性に重要であると考えられない領域を標的とすることにより活性を損なわずに置換可能な分子の適切な領域を同定することができる。いくつかの実施形態では、類似ポリペプチド間で保存されている分子の残基と部分を同定することができる。いくつかの実施形態では、生物活性を消失又はポリペプチド構造を悪化させずに生物活性又は構造に重要であると思われる領域に保存的アミノ酸置換を実施することができる。
【００８３】
更に、いくつかの実施形態では、当業者は活性及び／又は構造に重要な類似ポリペプチドの残基を同定する構造−機能試験を精査することができる。このような比較に鑑み、いくつかの実施形態では、類似ポリペプチドの活性又は構造に重要なアミノ酸残基に対応する特定ポリペプチドのアミノ酸残基の重要性を予測することができる。いくつかの実施形態では、当業者はこのような予測される重要なアミノ酸残基に置換する化学的に類似するアミノ酸を選択することができる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、当業者は類似ポリペプチドの構造との相関からて三次元構造及びアミノ酸配列を分析することもできる。このような情報に鑑み、いくつかの実施形態では、当業者はその三次元構造を基準に抗体のアミノ酸残基のアラインメントを予測することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの表面に存在すると予測されるアミノ酸残基は他の分子との重要な相互作用に関与している可能性があるので、当業者はこのような残基に根本的な置換を加えないように選択することができる。更に、いくつかの実施形態では、当業者は各所望アミノ酸残基に単一アミノ酸置換を含む試験変異体を作製することができる。いくつかの実施形態では、その後、当業者に公知の活性アッセイを使用して変異体をスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、適切な変異体に関する情報を収集するためにこのような変異体を使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、特定アミノ酸残基の置換の結果として活性が喪失したり、望ましくない程度まで低下したり、不適切になることが認められた場合には、このような置換をもつ変異体を避けることができる。換言するならば、このような日常的実験から収集した情報に基づき、当業者は単独又は他の突然変異と共にそれ以上の置換を回避すべきアミノ酸を容易に決定することができる。
【００８５】
多数の科学刊行物が二次構造の予測について論じている。例えばＭｏｕｌｔ  Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７（４）：４２２−４２７（１９９６），Ｃｈｏｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（２）：２２２−２４５（１９７４）；Ｃｈｏｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１３（２）：２１１−２２２（１９７４）；Ｃｈｏｕら，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７：４５−１４８（１９７８）；Ｃｈｏｕら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６及びＣｈｏｕら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４（１９７９）参照。更に、二次構造予測を支援するためのコンピュータープログラムも現在入手可能である。二次構造予測方法の代表的な１例はホモロジーモデリングに基づく。例えば、いくつかの場合には、＞３０％の配列一致度又は＞４０％の類似度をもつ２個のポリペプチドは類似の構造トポロジーをもつと思われる。蛋白質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の発達により、ポリペプチドの構造内の潜在折り畳み数を含む二次構造の予測可能性は向上している。例えばＨｏｌｍら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７（１）：２４４−２４７（１９９９）参照。所与ポリペプチドの折り畳み数は限られており、臨界数の構造が分解されると、構造予測は劇的に正確になることが示唆されている。例えばＢｒｅｎｎｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３６９−３７６（１９９７）参照。
【００８６】
その他の代表的な二次構造予測方法としては限定されないが、「スレッディング」（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３７７−８７（１９９７）；Ｓｉｐｐｌら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４（１）：１５−１９（１９９６）．）、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１８３：１４６−１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４（１３）：４３５５−４３５８（１９８７）．）、及び「進化系統樹」（Ｈｏｌｍ，前出（１９９９）及びＢｒｅｎｎｅｒ，前出（１９９７）参照）が挙げられる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドの一致度及び類似度は公知方法により容易に計算することができる。このような方法としては限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）；及びＣａｒｉｌｌｏら，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されている方法が挙げられる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、試験配列間に最大マッチを与えるように一致度測定方法をデザインする。いくつかの代表的な一致度測定方法は公共入手可能なコンピュータープログラムに記載されている。２つの配列間の一致度を測定するための代表的なコンピュータープログラム法としては限定されないが、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２：３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）等のＧＣＧプログラムパッケージ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））が挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）や他のソース（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら，ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前出（１９９０））から公共入手可能である。いくつかの実施形態では、当分野で公知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも一致度を測定するために使用することができる。
【００８９】
２つのアミノ酸配列を整列させるためのいくつかのアラインメントスキームの結果、２つの配列の短い領域のみがマッチし、２つの全長配列間に有意関係がないとしても、この短い整列領域が非常に高い配列一致度をもつ場合がある。従って、いくつかの実施形態では、選択されたアラインメント法（ＧＡＰプログラム）はターゲットポリペプチドの少なくとも５０連続アミノ酸に及ぶアラインメントを行う。
【００９０】
例えば、コンピューターアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用し、夫々のアミノ酸の最適マッチが得られるように、配列一致度百分率を測定する２つのポリペプチドを整列させる（アルゴリズムにより決定される「マッチスパン」）。いくつかの実施形態では、ギャップ開始ペナルティ（平均対角線の３倍として計算；「平均対角線」は使用する比較行列の対角線の平均であり；「対角線」は特定比較行列により各完全アミノ酸マッチに割り当てられるスコア又は数である）と、ギャップ延長ペナルティ（通常はギャップ開始ペナルティの１／１０）と、ＰＡＭ２５０やＢＬＯＳＵＭ６２等の比較行列をアルゴリズムと連携して使用する。いくつかの実施形態では、標準比較行列もアルゴリズムで使用する。例えば、ＰＡＭ２５０比較行列についてはＤａｙｈｏｆｆら，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５（３）（１９７８）；ＢＬＯＳＵＭ６２比較行列についてはＨｅｎｉｋｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）参照。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列比較用パラメーターとしては、
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０）；
比較行列：Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，前出（１９９２）によるＢＬＯＳＵＭ６２；
ギャップペナルティ：１２；
ギャップ長ペナルティ：４；
類似度閾値：０が挙げられる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ＧＡＰプログラムは上記パラメーターで有用であると思われる。いくつかの実施形態では、上記パラメーターはＧＡＰアルゴリズムを使用するポリペプチド比較用デフォルトパラメーターである（末端ギャップペナルティなし）。
【００９３】
いくつかの実施形態によると、アミノ酸置換は、（１）蛋白分解感受性を低下、（２）酸化感受性を低下、（３）蛋白複合体を形成する結合親和性を改変、（４）結合親和性を改変、及び／又は（４）他の物理化学的もしくは機能的性質を前記ポリペプチドに付与もしくは改変する置換である。いくつかの実施形態によると、天然配列（いくつかの実施形態では、分子間接触を形成する領域の外側のポリペプチドの部分）に１又は複数のアミノ酸置換（いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換）を行うことができる。
【００９４】
いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換は一般に親配列の構造特徴を実質的に変化させない（例えばいくつかの実施形態では、置換アミノ酸は親配列に存在する螺旋を切断又は親配列に特徴的な他の型の二次構造を破壊しにくい）。当分野で認められているポリペプチド二次及び三次構造のいくつかの例は例えばＰｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；及びＴｈｏｒｎｔｏｎら．Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）に記載されている。
【００９５】
いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換はその位置の電荷の極性に殆ど又は全く影響を与えない。いくつかの実施形態では、「アラニンスキャニング突然変異誘発」について従来記載されているように、ポリペプチドの任意天然残基をアラニンで置換することができる。例えばＭａｃＬｅｎｎａｎら，Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５−６７（１９９８）；及びＳａｓａｋｉらＡｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１−２４（１９９８）参照。
【００９６】
「抗体」なる用語は無傷の抗体又は抗原結合について無傷の抗体と競合する抗体フラグメントを意味する。いくつかの実施形態では、抗体フラグメントは組換えＤＮＡ技術により作製される。いくつかの実施形態では、抗体フラグメントは無傷の抗体の酵素又は化学開裂により作製される。代表的な抗体フラグメントとしては限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖが挙げられる。代表的な抗体フラグメントとしては限定されないが、更にドメイン抗体、ナノボディ、ミニボディ（（ｓｃＦｖ−ＣＨ３）２）、マキシボディ（（ｓｃＦＶ−ＣＨ２−ＣＨ３）２）、二重特異性抗体（ｓｃＦｖの非共有結合二量体）が挙げられる。抗体フラグメントは場合によりＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域の１個以上を含む免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖領域と連結することができる。いくつかの実施形態では、抗体は１本以上の重鎖、１本以上の軽鎖、又は１本以上の重鎖と軽鎖の両者、あるいは抗原と結合可能なそのフラグメントを含むことができる。
【００９７】
抗原に特異的な抗体は多数の方法で作製することができる。いくつかの実施形態では、該当エピトープを含む抗原を動物宿主（例えばマウス）に導入し、このエピトープに特異的な抗体を作製することができる。いくつかの実施形態では、該当エピトープに特異的な抗体はこのエピトープに自然接触した宿主から採取した生体サンプルから得ることができる。いくつかの実施形態では、内在Ｉｇ遺伝子を不活性化したマウスにヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を導入すると、完全ヒトモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を得ることが可能になる。
【００９８】
天然抗体構造単位は一般に四量体からなる。四量体は一般に各々１本の軽鎖（いくつかの実施形態では約２５ｋＤａ）と１本の重鎖（いくつかの実施形態では約５０から７０ｋＤａ）をもつ同一の２対のポリペプチド鎖からなる。
【００９９】
「重鎖」なる用語は特定抗原に対する特異性を付与するために十分な可変領域配列をもつ重鎖ポリペプチドを意味する。従って、本明細書で使用する「重鎖」なる用語は全長重鎖とそのフラグメントを包含する。全長重鎖は一般に可変領域ドメインＶＨと、３個の定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端に位置し、ＣＨ３ドメインはカルボキシ末端に位置する。「重鎖」はＶＨドメイン又は相補性決定領域（ＣＤＲ）の１個以上を含むＶＨドメインの一部を含むことができる。「重鎖」は場合により１個以上の定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及び／又はＣＨ３を含むことができる。
【０１００】
「軽鎖」なる用語は特定抗原に対する特異性を付与するために十分な軽鎖可変領域配列をもつ任意軽鎖ポリペプチドを意味する。従って、本明細書で使用する「軽鎖」なる用語は全長軽鎖とそのフラグメントを包含する。全長軽鎖は一般に可変領域ドメインＶＬと定常領域ドメインＣＬを含む。軽鎖の可変領域ドメインはポリペプチドのアミノ末端に位置する。「軽鎖」はＶＬ又は相補性決定領域（ＣＤＲ）の１個以上を含むＶＬドメインの一部を含むことができる。「軽鎖」は場合により定常領域ドメイン（ＣＬ）を含むことができる。
【０１０１】
各鎖のアミノ末端部分は一般に約１００から１１０アミノ酸以上の可変領域（重鎖のＶＨと軽鎖のＶＬ）を含む。各軽鎖／重鎖対の可変領域は一般に抗原結合部位を形成する。各鎖のカルボキシ末端部分は一般にエフェクター機能に関与し得る定常領域（重鎖のＣＨドメインと軽鎖のＣＬ）を規定する。代表的な抗体エフェクター機能としては補体活性化とオプソニン食作用の刺激が挙げられる。天然ヒト軽鎖は一般にκ軽鎖とλ軽鎖に分類される。天然ヒト重鎖は一般にμ、δ、γ、α又はεに分類され、夫々抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥに規定する。ＩｇＧは数種のサブクラスがあり、限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が挙げられる。ＩｇＭは限定されないが、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２等のサブクラスがある。ＩｇＡは限定されないが、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２等のサブクラスがある。天然軽鎖及び重鎖内では、一般に可変領域と定常領域は一般に約１２アミノ酸以上の「Ｊ」領域により相互に結合され、重鎖は更に一般に約１０アミノ酸を上回る「Ｄ」領域を含む。例えばＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））参照。
【０１０２】
天然抗体では、可変領域は一般に相補性決定領域ないしＣＤＲと呼ぶ３個の超可変領域により結合された比較的保存度の高いフレームワーク領域（ＦＲ）からなる同一の一般構造を示す。各対の重鎖と軽鎖からのＣＤＲは一般に特定エピトープと結合できるように、フレームワーク領域により整列される。Ｎ末端からＣ末端に向かって、軽鎖及び重鎖可変領域は一般にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４ドメインを含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては一般にＫａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７  ａｎｄ  １９９１））又はＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；ＣｈｏｔｈｉａらＮａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。
【０１０３】
上記のように、数種の抗体フラグメントが存在する。Ｆａｂフラグメントは軽鎖１本と、重鎖１本のＣＨ１及び可変領域から構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。Ｆａｂ’フラグメントは２本の重鎖間に鎖間ジスルフィド結合を形成してＦ（ａｂ’）２分子を形成できるように、軽鎖１本と、ＣＨ１及びＣＨ２ドメイン間に２個以上の定常領域を含む重鎖１本を含む。Ｆａｃｂフラグメントは分子の重鎖の定常領域がＣＨ２ドメインの末端まで延びている点以外は、Ｆ（ａｂ’）２分子と同様である。
【０１０４】
Ｆｖフラグメントは重鎖と軽鎖の両者からの可変領域を含むが、定常領域をもたない。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントは抗原結合領域を形成する１本のポリペプチド鎖を形成するようにフレキシブルリンカーにより結合された重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む。代表的な単鎖抗体は例えばＷＯ８８／０１６４９と、米国特許第４，９４６，７７８号及び５，２６０，２０３号に詳細に記載されている。
【０１０５】
２価抗体は一般に２個の同一抗原結合部位をもつとみなされる。しかし、いくつかの実施形態における「二重特異性」又は「多重特異性」又は「二官能性」又は「多官能性」抗体は、２個の異なる重鎖／軽鎖対と２個の異なる抗原結合部位をもつ人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は各種方法により作製することができ、限定されないが、ハイブリドーマの融合や、Ｆａｂ’フラグメントの連結が挙げられる。例えばＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ＆  Ｌａｃｈｍａｎｎ  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０），Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）参照。
【０１０６】
「重鎖」なる用語はＲＡＮＫＬに対する特異性を付与するために十分な可変領域配列をもつ任意重鎖ポリペプチドを包含する。いくつかの実施形態では、重鎖は配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖は配列番号２の少なくとも１個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む配列番号２のアミノ酸配列のフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、重鎖は配列番号２の少なくとも２個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む配列番号２のアミノ酸配列のフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、重鎖は配列番号２の少なくとも３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む配列番号２のアミノ酸配列のフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、重鎖は抗原結合部位の重鎖部分を含む配列番号２のアミノ酸配列のフラグメントを含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は配列番号１１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖は配列番号１１の少なくとも１個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む配列番号１１のアミノ酸配列のフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、重鎖は配列番号１１の少なくとも２個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む配列番号１１のアミノ酸配列のフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、重鎖は配列番号１１の少なくとも３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む配列番号１１のアミノ酸配列のフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、重鎖は抗原結合部位の重鎖部分を含む配列番号１１のアミノ酸配列のフラグメントを含む。
【０１０８】
「軽鎖」なる用語はＲＡＮＫＬに対する特異性を付与するために十分な可変領域配列をもつ任意軽鎖ポリペプチドを包含する。いくつかの実施形態では、軽鎖は配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は配列番号４の少なくとも１個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む配列番号４のアミノ酸配列のフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は配列番号４の少なくとも２個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む配列番号４のアミノ酸配列のフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は配列番号４の少なくとも３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む配列番号４のアミノ酸配列のフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は抗原結合部位の軽鎖部分を含む配列番号４のアミノ酸配列のフラグメントを含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は配列番号１２の少なくとも１個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む配列番号１２のアミノ酸配列のフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は配列番号１２の少なくとも２個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む配列番号１２のアミノ酸配列のフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は配列番号１２の少なくとも３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む配列番号１２のアミノ酸配列のフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は抗原結合部位の軽鎖部分を含む配列番号１２のアミノ酸配列のフラグメントを含む。
【０１１０】
過剰の抗体が（当分野で公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ競合結合アッセイにより測定した場合に）ＲＡＮＫと結合するＲＡＮＫＬの量を少なくとも約２０％、４０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上低減するときに、抗体はＲＡＮＫＬとＲＡＮＫの結合を実質的に阻害する。
【０１１１】
「エピトープ」なる用語は抗体と特異的に結合することができるポリペプチド決定基を意味する。いくつかの実施形態では、エピトープ決定基としてはアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニル等の分子の化学的に活性な表面基が挙げられ、いくつかの実施形態では、特定三次元構造特徴及び／又は特定電荷特徴をもつ場合がある。エピトープは抗体と結合する抗原の領域である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド及び／又は巨大分子の複雑な混合物中でそのターゲット抗原を優先的に認識するときに、抗体は抗原と特異的に結合すると言う。いくつかの実施形態では解離定数が≦１μＭのとき、いくつかの実施形態では解離定数が≦１００ｎＭのとき、いくつかの実施形態では解離定数が≦１０ｎＭのときに、抗体は抗原と特異的に結合すると言う。
【０１１２】
「ポリヌクレオチド」なる用語は少なくとも３塩基長のポリマー形態のヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは１個以上のデオキシリボヌクレオチドと、１個以上のリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは１個以上の修飾デオキシリボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌクレオチドを含む。「ポリヌクレオチド」なる用語は単鎖形態と２本鎖形態の核酸を包含する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは少なくとも１個の検出用ラベルを含む。
【０１１３】
「単離ポリヌクレオチド」なる用語はゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成起源又はその組み合わせのポリヌクレオチドを意味する。「単離ポリヌクレオチド」は（１）「単離ポリヌクレオチド」が自然界でその中に存在するポリヌクレオチドの全部又は一部と結合していないか、（２）自然界では結合していないポリヌクレオチドと結合しているか、あるいは（３）自然界ではもっと長い配列の一部として存在していない。
【０１１４】
特に指定しない限り、単鎖ポリヌクレオチド配列の左端が５’末端である。特に指定しない限り、単鎖ポリヌクレオチド配列の右端が３’末端である。特に指定しない限り、２本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向を５’方向と言う。特に指定しない限り、２本鎖ポリヌクレオチド配列の右側方向を３’方向と言う。新生ＲＮＡ転写産物の５’→３’付加方向を転写方向と言う。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鎖の「上流配列」とはＤＮＡ鎖のポリペプチドをコードする領域の５’側の配列を意味する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鎖の「下流配列」とはＤＮＡ鎖のポリペプチドをコードする領域の３’ 側の配列を意味する。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは１個以上の天然ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは１個以上の非天然ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは１個以上の天然ヌクレオチドと、１個以上の非天然ヌクレオチドを含む。
【０１１６】
「天然ヌクレオチド」なる用語は自然界で遊離及び／又はポリヌクレオチド中に存在しているヌクレオチドを意味する。天然ヌクレオチドとしては限定されないが、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドが挙げられる。デオキシリボヌクレオチドとしては限定されないが、アデノシン、グアニン、シトシン及びチミジンが挙げられる。リボヌクレオチドとしては限定されないが、アデノシン、シトシン、チミジン及びウラシルが挙げられる。「非天然ヌクレオチド」又は「修飾ヌクレオチド」なる用語は自然界で遊離又はポリヌクレオチド中に存在していないヌクレオチドを意味する。非天然ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドとしては限定されないが、修飾又は置換糖基をもつヌクレオチドや、修飾又は置換ヌクレオチド塩基をもつヌクレオチドが挙げられる。
【０１１７】
「ポリヌクレオチド結合」及び「オリゴヌクレオチド結合」なる用語は同義に使用し、第１のヌクレオチドを対２のヌクレオチドと結合する化学部分を意味する。ポリヌクレオチド結合としては限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート及びホスホロアミデートが挙げられる。例えばＬａＰｌａｎｃｈｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９０８１（１９８６）；Ｓｔｅｃら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７（１９８４）；Ｓｔｅｉｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８）；Ｚｏｎら，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ６：５３９（１９９１）；Ｚｏｎら，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．８７−１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１））；Ｓｔｅｃら，米国特許第５，１５１，５１０号；Ｕｈｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３（１９９０）参照。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは合成により作製される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは酵素により作製される。ポリヌクレオチドのこのような酵素による作製は例えば細胞中でｉｎ  ｖｉｖｏで実施することもできるし、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施することもできる。ポリヌクレオチドを合成及び酵素により作製する代表的な方法は当分野で公知である。２個以上のポリヌクレオチドを化学的又は（例えばリガーゼを使用して）酵素により連結する代表的な方法も当分野で公知である。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドはコードされるポリペプチドの配列が変化しないように突然変異させることができる。非限定的な１例として、選択された宿主細胞に対する適合性の高いコドンにポリヌクレオチド配列を変異させることができる。いくつかの実施形態では、いくつかの細菌、哺乳動物及び昆虫宿主細胞の最適化コドンは当分野で公知である。更に、非限定的な１例として、制限部位を除去又はサイレント制限部位を挿入するようにコドンを置換し、選択された宿主細胞におけるポリヌクレオチドの安定性、発現又はプロセシングを助長することもできる。
【０１２０】
「物質」なる用語は化合物、化合物の混合物、生体分子又は生物材料から作製した抽出物を意味する。
【０１２１】
本明細書で使用する「ラベル」なる用語は検出可能な任意分子を意味する。いくつかの実施形態では、放射性標識アミノ酸の取り込みによりポリペプチドを標識することができる。いくつかの実施形態では、標識アビジン又はストレプトアビジン（例えば蛍光マーカー又は光学的方法もしくは比色法により検出可能な酵素活性を含むストレプトアビジン）により検出可能なビオチン部分をポリペプチドに付加することができる。いくつかの実施形態では、該当ポリペプチドと結合する別の試薬にラベルを組込み又は付加することができる。例えば、該当ポリペプチドと特異的に結合する抗体にラベルを組込み又は付加することができる。いくつかの実施形態では、ラベル又はマーカーも治療薬とすることができる。ポリペプチド及び糖蛋白の各種標識方法が当分野で公知であり、使用することができる。いくつかの一般分類のラベルとしては限定されないが、酵素、蛍光、化学発光及び放射性ラベルが挙げられる。ポリペプチドのラベルの例としては限定されないが、放射性同位体又は放射性核種（例えば３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光ラベル（例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ランタニド系蛍光体、フィコエリスリン（ＰＥ））、酵素ラベル（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ペニシリナーゼ、ルシフェラーゼ）、化学発光、ビオチン基、二次レポーターにより認識される所定ポリペプチドエピトープ（例えばロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合領域、エピトープタグ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、各種長さのスペーサーアームによりラベルを付加し、立体障害の可能性を減らす。
【０１２２】
本明細書で使用する「ビヒクル」なる用語は別の分子の分解の抑制；別の分子の半減期の延長；別の分子の毒性の低下；別の分子の免疫原性の低下；及び別の分子の生物活性の増加から選択される１種以上の特性をもつ分子を意味する。代表的なビヒクルとしては限定されないが、Ｆｃドメイン、直鎖ポリマー（限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリリジン及びデキストラン）、分岐鎖ポリマー（例えば、米国特許第４，２８９，８７２号；５，２２９，４９０号；及びＰＣＴ公開第ＷＯ９３／２１２５９号参照）、脂質、コレステロール基（例えばステロイド）、糖鎖又はオリゴ糖、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と関連分子、トランスサイレチン（ＴＴＲ）と関連分子、及びサルベージ受容体と結合する任意天然又は合成蛋白質、ポリペプチド又はペプチドが挙げられる。いくつかの代表的なビヒクルは当分野で公知及び／又は本明細書に記載する。
【０１２３】
「生体サンプル」なる用語は限定されないが、生体又は又はかつての生体に由来する任意量の物質を含む。このような生体としては限定されないが、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギ及び他の動物が挙げられる。このような物質としては限定されないが、血液、血清、尿、細胞、臓器、組織、骨、骨髄、リンパ節及び皮膚が挙げられる。
【０１２４】
「骨減少性疾患」なる用語は骨吸収の増加及び／又は骨量もしくは骨密度の低下を少なくとも部分的に特徴とする症状を意味する。「骨減少性疾患」なる用語は限定されないが、骨粗鬆症、骨減少症、パジェット病、骨髄炎、高カルシウム血症、骨壊死、副甲状腺機能亢進症、溶解性骨転移、歯周炎、関節リウマチ、悪液質及び食欲不振、脱毛症、並びに固定による骨減少を含む。「骨減少性疾患」なる用語は限定されないが、更に破骨細胞活性を増進し、骨吸収を誘導し、及び／又は骨量もしくは骨密度の低下をもたらす癌を含み、限定されないが、乳癌、前立腺癌及び多発性骨髄腫が挙げられ、骨にＲＡＮＫＬの過剰発現をもたらす因子を生成することが知られているいくつかの癌や、破骨細胞数及び活性の増加をもたらすいくつかの癌が挙げられる。「骨減少性疾患」なる用語は骨吸収の増加及び／又は骨量もしくは骨密度の低下を少なくとも部分的に特徴とする炎症性又は自己免疫疾患も含み、限定されないが、関節リウマチ、乾癬性関節炎、乾癬及び炎症性腸疾患が挙げられる。
【０１２５】
本明細書で使用する「医薬物質」、「薬剤」又は「治療剤」なる用語は患者に適正に投与した場合に所望治療効果を誘導することが可能な化合物又は組成物を意味する。
【０１２６】
「モジュレーター」なる用語は分子の活性又は機能を変化又は変更する化合物を意味する。例えば、モジュレーターはモジュレーターの不在下で観察される活性又は機能の強さに比較して分子のいくつかの活性又は機能の強さを増加又は低下させることができる。いくつかの実施形態では、モジュレーターは阻害剤であり、分子の少なくとも１種の活性又は機能を低下させる。分子のいくつかの代表的な活性及び機能としては限定されないが、結合親和性、酵素活性及びシグナル伝達が挙げられる。いくつかの代表的な阻害剤としては限定されないが、ポリペプチド、ペプチド、抗体、ペプチボディ、糖鎖及び有機小分子が挙げられる。ペプチボディは例えばＷＯ０１／８３５２５に記載されている。
【０１２７】
本明細書で使用する「実質的に純粋」とは対象種が主要な存在種であることを意味する（即ち組成物中の個々の他の全種よりもモル基準で多量に存在する）。いくつかの実施形態では、実質的に精製されたフラクションは対象種が存在する全巨大分子種の少なくとも約５０％（モル基準）を構成する組成物である。いくつかの実施形態では、実質的に純粋な組成物は組成物に存在する全巨大分子種の＞約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％を含有する。いくつかの実施形態では、対象種は本質的に均質まで精製され（慣用検出法では組成物中に汚染種を検出できない）、組成物は本質的に単一巨大分子種から構成される。
【０１２８】
「患者」なる用語はヒト及び非ヒト対象を含む。いくつかの実施形態では、患者はヒト又は非ヒト対象で骨量が減少しているもの、及び／又は骨量減少の危険があるもの、及び／又は骨量減少の危険を増加する可能性のある１種以上の疾患（例えば癌、炎症性疾患、自己免疫疾患）に罹患しているものである。いくつかの実施形態では、骨量が減少している患者はＴスコアが−１未満である。Ｔスコアは患者の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の尺度であり、健康な若年成人の平均からの標準偏差（ＳＤ）で表した値である。従って、いくつかの実施形態では、骨量が減少している患者はＢＭＤが平均よりも＞１ＳＤ低い。いくつかの実施形態では、患者はヒト又は非ヒト対象で骨が弱化もしくは構造的に悪化しているもの、及び／又は骨が弱化もしくは構造的に悪化する危険のあるものである。いくつかの実施形態では、患者はヒト又は非ヒト対象で骨折したことがあるもの、及び／又は通常よりも骨折の危険が高いと認められるものである。
【０１２９】
いくつかの実施形態の詳細な説明
ＲＡＮＫＬ抗体
ＮＦ−κＢ受容体アクチベーターリガンド（ＲＡＮＫＬ；別称オステオプロテゲリンリガンドないしＯＰＧＬ）に対するいくつかの抗体は例えば米国特許公開第Ｕ．Ｓ．２００４／００３３５３５Ａ１号及びＰＣＴ公開第ＷＯ２００３／００２７１３Ａ３号に記載されている。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、ヒトＲＡＮＫＬに対する完全ヒトモノクローナル抗体を提供する。いくつかの実施形態では、重鎖及び／又は軽鎖免疫グロブリン分子をコードするポリヌクレオチド配列、特に重鎖及び／又は軽鎖可変領域をコードする配列を提供する。いくつかの実施形態では、１個以上の重鎖及び／又は軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、特にＣＤＲ１からＣＤＲ３をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、重鎖及び／又は軽鎖免疫グロブリン分子に対応するポリペプチド配列、特に重鎖及び／又は軽鎖可変領域に対応するポリペプチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、１個以上の重鎖及び／又は軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、特にＣＤＲ１からＣＤＲ３に対応するポリペプチド配列を提供する。いくつかの実施形態によると、ヒトＲＡＮＫＬに対する完全ヒトモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞株も提供する。いくつかの実施形態では、ヒトＲＡＮＫＬに対する精製完全ヒトモノクローナル抗体を提供する。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、抗体はヒト以外の種に由来する１個以上の定常領域と、１個以上のヒト可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は１個以上のヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト以外の種に由来する１個以上のフレームワーク領域及び／又は定常領域を含む。このような抗体を「キメラ」抗体と言う。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体はキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体はＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント又は単鎖Ｆｖフラグメントである。
【０１３２】
ＲＡＮＫＬ抗体の作製
いくつかの実施形態によると、ＲＡＮＫＬと特異的に結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、全長ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫＬの可溶性形態又はそのフラグメントで免疫することにより抗体を作製することができる。いくつかの実施形態では、抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、及び／又は組換え抗体でもよい。いくつかの実施形態では、抗体は例えばヒト抗体を産生することが可能なトランスジェニック動物の免疫により作製されたヒト抗体である（例えば、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ９３／１２２２７号参照）。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体の軽鎖及び／又は重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を同一又は別の種に由来するフレームワーク領域（ＦＲ）にグラフトすることができる。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体の軽鎖及び／又は重鎖可変領域のＣＤＲをコンセンサスヒトＦＲにグラフトすることができる。コンセンサスヒトＦＲを作製するために、いくつかの実施形態では、数個のヒト重鎖又は軽鎖アミノ酸配列に由来するＦＲを整列させ、コンセンサスアミノ酸配列を同定する。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体重鎖及び／又は軽鎖のＦＲを別の重鎖及び／又は軽鎖に由来するＦＲで置換する。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体の重鎖及び軽鎖のＦＲの希少アミノ酸を置換せず、ＦＲアミノ酸の残余を置換する。希少アミノ酸はＦＲに通常では存在しない位置に存在する特定アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体に由来するグラフト可変領域をＲＡＮＫＬ抗体の定常領域とは異なる定常領域と併用することができる。いくつかの実施形態では、グラフト可変領域は単鎖Ｆｖ抗体の一部である。代表的なＣＤＲグラフティングは例えば米国特許第６，１８０，３７０号、５，６９３，７６２号、５，６９３，７６１号、５，５８５，０８９号及び５，５３０，１０１号に記載されている。
【０１３４】
いくつかの実施形態によると、ＲＡＮＫＬ抗体はヒト抗体産生ゲノムの実質的部分を挿入し、内在マウス抗体の産生を欠損させたトランスジェニックマウスを利用することにより作製される。このようなマウスはヒト免疫グロブリン分子及び抗体を産生することができ、マウス免疫グロブリン分子及び抗体産生能を欠損している。これを実施するために利用されるいくつかの代表的な技術は本明細書に開示する特許、出願及び文献に開示されている。いくつかの実施形態では、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ９８／２４８９３号に開示されている方法等の方法を利用することができる。Ｍｅｎｄｅｚら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）も参照。
【０１３５】
いくつかの実施形態によると、完全ヒトモノクローナルＲＡＮＫＬ抗体は以下のように作製される。ヒト免疫グロブリン遺伝子を組込んだトランスジェニックマウスに該当抗原（この場合にはＲＡＮＫＬ又はその一部）を免疫する。抗体を発現するマウスに由来するリンパ細胞（例えばＢ細胞）を採取する。このように回収した細胞を骨髄型細胞株と融合し、不死化ハイブリドーマ細胞株を作製し、このようなハイブリドーマ細胞株をスクリーニング及び選択し、該当抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定する。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の作製を提供する。
【０１３６】
代表的なＲＡＮＫＬ抗体はいくつかのハイブリドーマ株により産生され、限定されないが、例えば米国特許公開第Ｕ．Ｓ．２００４／００３３５３５Ａ１号及びＰＣＴ公開第ＷＯ２００３／００２７１３Ａ３号に記載されているＡＭＧ  ６．１、ＡＭＧ  ６．４、ＡＭＧ  ６．５、ＡＭＧ  ７．１及びＡＭＧ  ７．２が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体はＡＭＧ  ６．１、ＡＭＧ  ６．４及びＡＭＧ  ６．５から選択される少なくとも１種のハイブリドーマ株により産生される。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体は約０．２３から０．２９ｎＭ（両端間の全点を含む）の解離定数（Ｋｄ）でＲＡＮＫＬと結合する。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体は０．２３ｎＭ未満のＫｄでＲＡＮＫＬと結合する。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体はＩｇＧ２アイソタイプである。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体はヒトκ軽鎖とヒトＩｇＧ２重鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体は哺乳動物細胞で発現するようにクローニングされている。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体の可変領域をＩｇＧ２アイソタイプの定常領域以外の定常領域とライゲーションする。抗体配列のいくつかの代表的なクローニング方法は当分野で公知である。ＲＡＮＫＬ抗体のいくつかの代表的なクローニング方法は例えば米国特許公開第Ｕ．Ｓ．２００４／００３３５３５Ａ１号及びＰＣＴ公開第ＷＯ２００３／００２７１３Ａ３号に記載されている。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体はαＲＡＮＫＬ−１（別称αＯＰＧＬ−１；例えば米国特許公開第Ｕ．Ｓ．２００４／００３３５３５Ａ１号及びＰＣＴ公開第ＷＯ２００３／００２７１３Ａ３号参照）である。αＲＡＮＫＬ−１の重鎖は図２に示すアミノ酸配列（配列番号２）をもち、図１のヌクレオチド配列（配列番号１）によりコードすることができる。αＲＡＮＫＬ−１の重鎖可変領域は図２８に示すアミノ酸配列（配列番号１１）をもつ。αＲＡＮＫＬ−１の軽鎖は図４に示すアミノ酸配列（配列番号４）をもち、図３のヌクレオチド配列（配列番号３）によりコードすることができる。αＲＡＮＫＬ−１の軽鎖可変領域は図２９に示すアミノ酸配列（配列番号１２）をもつ。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、αＲＡＮＫＬ−１の重鎖及び軽鎖の１箇所以上の保存的修飾（及びコードするヌクレオチドの対応する修飾）により、αＲＡＮＫＬ−１と同様の機能的及び化学的特徴をもつＲＡＮＫＬ抗体を作製する。いくつかの実施形態では、αＲＡＮＫＬ−１の機能的及び／又は化学的特徴の改変が所望される場合には、重鎖及び／又は軽鎖配列に非保存的置換を実施することができる。いくつかの実施形態では、このような非保存的置換は例えば、（ａ）例えばシート又は螺旋構造としての置換領域のペプチド主鎖の構造、（ｂ）置換部位の分子の電荷又は疎水性、及び／又は（ｃ）置換部位の分子のサイズの維持に及ぼすその効果において被置換アミノ酸と相違する１個以上の置換アミノ酸を選択することにより実施することができる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、（保存的又は非保存的に拘わらず）所望アミノ酸置換はこのような置換が所望される時点で当業者が決定することができる。いくつかの実施形態では、αＲＡＮＫＬ−１の重要な残基を同定するためにアミノ酸置換を使用することができる。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体の親和性を増加又は低下させるためにアミノ酸置換を使用することができる。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株で抗体を発現させる。いくつかの実施形態では、適切な哺乳動物宿主細胞を形質転換するために、特定抗体をコードする配列を使用することができる。いくつかの実施形態によると、形質転換は宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための任意公知方法により実施することができる。代表的な形質転換法としては限定されないが、ウイルス（又はウイルスベクター）へのポリヌクレオチドのパッケージング及びウイルス（又はベクター）への宿主細胞の形質導入が挙げられ、更に、例えば米国特許第４，３９９，２１６号；４，９１２，０４０号；４，７４０，４６１号；及び４，９５９，４５５号に例示されているような当分野で公知のトランスフェクション法が挙げられる。いくつかの実施形態では、使用する形質転換法は形質転換する宿主により異なる。哺乳動物細胞に異種ポリヌクレオチドを導入するためのいくつかの代表的な方法は当分野で公知であり、限定されないが、デキストランによるトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿法、ポリブレンによるトランスフェクション、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム封入、及び核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが挙げられる。
【０１４２】
発現用宿主として利用可能ないくつかの代表的な哺乳動物細胞株は当分野で公知であり、限定されないが、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多数の不死化細胞株が挙げられ、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）及び他の多数の細胞株が挙げられる。いくつかの実施形態では、どの細胞株が高い発現レベルを示し、許容可能なＲＡＮＫＬ結合特性をもつ抗体を産生するかを検討することにより細胞株を選択することができる。
【０１４３】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチド
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域とプレプロ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域とプレプロ領域の一部を含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域はＰＴＨ−１受容体と相互作用することが可能である。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域はＰＴＨ−２受容体と相互作用することが可能である。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域はＰＴＨ−１受容体及びＰＴＨ−２受容体の両者と相互作用することが可能である。いくつかの代表的なＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域は例えば米国特許公開第２００３／００３９６５４号及びＰＣＴ公開第ＷＯ０１／８１４１５号に記載されている。いくつかの代表的なＰＴＨ及びＰＴＨｒＰ調節領域を表１Ａ、１Ｂ及び２に示す。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域を含み、機能的プレプロ領域を含まない。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、プレプロ領域を含むＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが細胞で発現されるとき、プレプロ領域はプロセシング中にＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドから切断され、成熟ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを形成する。いくつかの実施形態では、プレプロ領域の一部を含むＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが細胞で発現されるとき、プレプロ領域の一部はプロセシング中にＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドから切断され、成熟ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを形成する。いくつかの実施形態では、プレプロ領域の一部はプロセシング中にＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドから切断され、プロＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチド中間体を形成する。いくつかの実施形態では、プロＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチド中間体は更にプロセシングされ、成熟ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを形成する。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、基準ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドをランダムに選択し、所望活性をもつＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを選択することにより、他の代表的なＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを形成することができる。ＰＴＨ及びＰＴＨｒＰに関するいくつかの情報は例えばＭａｎｎｓｔａｄｔら（１９９９），Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２１１．５Ｐｔ  ２：Ｆ６６５−７５；及びＧａｒｄｅｌｌａ（１９９６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３３）：１９８８８−９３に記載されている。
【０１４７】
各種実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は１個以上のＲＡＮＫＬ抗体と連結した以下のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドの１個以上を含むことができる。各種実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は１個以上のＲＡＮＫＬ抗体と連結したＰＴＨ及び／又はＰＴＨｒＰ活性をもつ他の任意ペブチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドは天然ＰＴＨ又はＰＴＨｒＰの配列の部分を含むことができる。いくつかの実施形態では、ペブチドは１個以上のランダム配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、所望活性をもつＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはファージディスプレイ法及び／又はＲＮＡ−ペプチドスクリーニング法を使用して１個以上のランダム配列をもつペプチドのプールから選択することができる。いくつかの実施形態では、当業者は所望活性をもつペプチドを選択するためにファージディスプレイ法及び／又はＲＮＡ−ペプチドスクリーニング法を実施することができる。
【０１４８】
いくつかの代表的なＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域
いくつかの代表的なＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域は式Ｉ：
ＸＮＸ８ＨＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＫＸ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９ＲＸ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６Ｘ２７Ｘ２８ＸＣ（式Ｉ；配列番号１３）
のポリペプチドから選択され、
上記式中、
ＸＮは不在であるか又はＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７、Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７もしくはＹＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７である；
Ｘ１はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ１は非機能的残基、親水性残基又は芳香族残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ１はＡ、Ｓ又はＹである；
Ｘ２はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ２は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ２はＶである；
Ｘ３はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ３は親水性残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ３はＳである；
Ｘ４はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ４は酸性残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ４はＥである；
Ｘ５はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ５は非機能的残基又は塩基性残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ５はＨ又はＩである；
Ｘ６はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ６は酸性残基又は親水性残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ６はＱ又はＥである；
Ｘ７はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ７は非機能的残基又は芳香族残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ７はＬ又はＦである；
Ｘ８はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ８は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ８はＭ又はＮｌｅである；
Ｘ１０はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ１０は酸性残基又は親水性残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ１０はＮ又はＤである；
Ｘ１１はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ１１は非機能的残基又は塩基性残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ１１はＬ、Ｒ又はＫである；
Ｘ１２はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ１２は非機能的残基又は芳香族残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ１２はＧ、Ｆ又はＷである；
Ｘ１４はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ１４は塩基性残基又は親水性残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ１４はＨ又はＳである；
Ｘ１５はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ１５は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ１５はＬ又はＩである；
Ｘ１６はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ１６は非機能的残基又は親水性残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ１６はＱ、Ｎ、Ｓ又はＡである；
Ｘ１７はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ１７は酸性残基、親水性残基又は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ１７はＳ、Ｄ又はＬである；
Ｘ１８はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ１８は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ１８はＭ、Ｌ、Ｖ又はＮｌｅである；
Ｘ１９はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ１９は酸性残基又は塩基性残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ１９はＥ又はＲである；
Ｘ２１はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ２１は非機能的残基又は塩基性残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ２１はＶ、Ｍ、Ｒ又はＮｌｅである；
Ｘ２２はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ２２は親水性残基、酸性残基又は芳香族残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ２２はＥ又はＦである；
Ｘ２３はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ２３は芳香族残基又は親油性残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ２３はＷ又はＦである；
Ｘ２４はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ２４は親油性残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ２４はＬである；
Ｘ２５はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ２５は親水性残基又は塩基性残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ２５はＲ又はＨである；
Ｘ２６はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ２６は親水性残基又は塩基性残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ２６はＫ又はＨである；
Ｘ２７はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ２７は親油性残基、塩基性残基又は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ２７はＫ又はＬである；
Ｘ２８はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ２８は親油性残基又は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ２８はＬ又はＩである；
ＸＣはアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、ＸＣは不在である。いくつかの実施形態では、ＸＣはＸ２９、Ｘ２９Ｘ３０、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５又はＸ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６である；
Ｘ２９はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ２９は親水性残基又は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ２９はＱ又はＡである；
Ｘ３０はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ３０は親水性残基又は酸性残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ３０はＤ又はＥである；
Ｘ３１はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ３１は親油性残基又は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ３１はＶ又はＩである；
Ｘ３２はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ３２は塩基性残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ３２はＨである；
Ｘ３３はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ３３は親水性残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ３３はＮ又はＴである；
Ｘ３４はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ３４は非機能的残基又は芳香族残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ３４はＡ、Ｆ又はＹである；
Ｘ３５はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ３５は酸性残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ３５はＥである；
Ｘ３６はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ３６は芳香族残基である。いくつかの実施形態では、Ｘ３６はＹである；
いくつかの実施形態では、Ｘ１４からＸ３６の１個以上はシステイン残基である。
【０１４９】
式Ｉ（配列番号１３）のポリペプチドから選択されるいくつかの代表的なＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域を表１Ａ及び１Ｂに示す。
【０１５０】
いくつかの代表的なＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域は式ＩＩ：
ＪＮＪ７Ｊ８ＨＮＬＪ１２ＫＨＬＪ１６ＳＪ１８Ｊ１９ＲＪ２１ＥＷＬＲＫＫＬＪＣ（式ＩＩ；配列番号１４）
のポリペプチドから選択され、
上記式中、
いくつかの実施形態では、ＪＮは不在である。いくつかの実施形態では、ＪＮはＪ１Ｊ２Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６、Ｊ２Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６、Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６である；
Ｊ１はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ１は非機能的残基、親水性残基又は芳香族残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ１はＡ、Ｓ又はＹである；
Ｊ２はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ２は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ２はＶである；
Ｊ３はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ３は親水性残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ３はＳである；
Ｊ４はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ４は酸性残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ４はＥである；
Ｊ５はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ５は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ５はＩである；
Ｊ６はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ６は塩基性残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ６はＱである；
Ｊ７はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ７は非機能的残基又は芳香族残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ７はＬ又はＦである；
Ｊ８はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ８は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ８はＭ又はＮｌｅである；
Ｊ１２はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ１２は非機能的残基又は芳香族残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ１２はＧ又はＷである；
Ｊ１６はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ１６は非機能的残基又は親水性残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ１６はＮ、Ｓ又はＡである；
Ｊ１８はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ１８は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ１８はＭ、Ｎｌｅ、Ｌ又はＶである；
Ｊ１９はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ１９は酸性残基又は塩基性残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ１９はＥ又はＲである；
Ｊ２１はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ２１は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ２１はＶ、Ｍ又はＮｌｅである；
いくつかの実施形態では、ＪＣは不在である。いくつかの実施形態では、ＪＣはＪ２９、Ｊ２９Ｊ３０、Ｊ２９Ｊ３０Ｊ３１、Ｊ２９Ｊ３０Ｊ３１Ｊ３２、Ｊ２９Ｊ３０Ｊ３１Ｊ３２Ｊ３３又はＪ２９Ｊ３０Ｊ３１Ｊ３２Ｊ３３Ｊ３４である；
Ｊ２９はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ２９は親水性残基又は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ２９はＱ又はＡである；
Ｊ３０はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ３０は親水性残基又は酸性残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ３０はＤ又はＥである；
Ｊ３１はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ３１は親油性残基又は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ３１はＶ又はＩである；
Ｊ３２はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ３２は塩基性残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ３２はＨである；
Ｊ３３はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ３３は酸性残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ３３はＮである；
Ｊ３４はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ３４は芳香族残基である。いくつかの実施形態では、Ｊ３４はＦ又はＹである；
いくつかの実施形態では、式ＩＩのポリペプチドのＪ１４からＣ末端残基の１個以上はシステイン残基である。
【０１５１】
式ＩＩ（配列番号１４）のポリペプチドから選択されるいくつかの代表的なＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域を下表１Ａ及び１Ｂに示す。
【０１５２】
いくつかの代表的なＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域は式ＩＩＩ：
ＯＮＬＨＯ１０Ｏ１１Ｏ１２ＫＳＩＯ１５Ｏ１６ＬＲＲＲＦＯ２３ＬＨＨＬＩＯＣ（式ＩＩＩ；配列番号１５）
のポリペプチドから選択され、
上記式中、
いくつかの実施形態では、ＯＮは不在である。いくつかの実施形態では、ＯＮはＹＯ１Ｏ２Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ１Ｏ２Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ２Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ６Ｏ７又はＯ７である；
Ｏ１はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ１は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ１はＡである；
Ｏ２はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ２は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ２はＶである；
Ｏ３はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ３は親水性残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ３はＳである；
Ｏ４はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ４は酸性残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ４はＥである；
Ｏ５はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ５は塩基性残基又は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ５はＨ又はＩである；
Ｏ６はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ６は親水性残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ６はＱである；
Ｏ７はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ７は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ７はＬである；
Ｏ１０はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ１０は酸性残基又は親水性残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ１０はＮ又はＤである；
Ｏ１１はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ１１は塩基性残基又は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ１１はＫ又はＬである；
Ｏ１２はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ１２は芳香族残基又は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ１２はＧ、Ｆ又はＷである；
Ｏ１５はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ１５は親水性残基又は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ１５はＩ又はＳである；
Ｏ１６はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ１６は親水性残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ１６はＱ又はＮである；
Ｏ１７はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ１７は酸性残基又は非機能的残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ１７はＤ又はＬである；
Ｏ２３はアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ２３は芳香族残基である。いくつかの実施形態では、Ｏ２３はＦ又はＷである；
いくつかの実施形態では、ＯＣは不在である。いくつかの実施形態では、ＯＣはＯ２９、Ｏ２９Ｏ３０、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２Ｏ３３、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２Ｏ３３Ｏ３４、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２Ｏ３３Ｏ３４Ｏ３５又はＯ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２Ｏ３３Ｏ３４Ｏ３５Ｏ３６であり；Ｏ２９からＯ３６は各々独立して選択されたアミノ酸残基である；
いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのポリペプチドのＯ１４からＣ末端残基の１個以上はシステイン残基である。
【０１５３】
式ＩＩＩ（配列番号１５）のポリペプチドから選択されるいくつかの代表的なＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域を下表２に示す。
【０１５４】
いくつかの代表的なＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域配列を下表１Ａ、１Ｂ及び２に示す。
【０１５５】
【表２】
2009515903.tif 000005
2009515903.tif 000006
2009515903.tif 000007
2009515903.tif 000008
2009515903.tif 000009
2009515903.tif 000010
2009515903.tif 000011
【０１５６】
【表３】
2009515903.tif 000012
【０１５７】
【表４】
2009515903.tif 000013
2009515903.tif 000014
2009515903.tif 000015
2009515903.tif 000016
2009515903.tif 000017
2009515903.tif 000018
2009515903.tif 000019
2009515903.tif 000020
2009515903.tif 000021
2009515903.tif 000022
2009515903.tif 000023
2009515903.tif 000024
2009515903.tif 000025
2009515903.tif 000026
2009515903.tif 000027
【０１５８】
いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域はＴＩＰ３９と呼ばれるペプチドの配列：
ＳＬＡＬＡＤＤＡＡＦＲＥＲＡＲＬＬＡＡＬＥＲＲＨＷＬＮＳＹＭＨＫＬＬＶＬＤＡＰ（配列番号１６０）
を含む。ＴＩＰ３９はＵｓｄｉｎら（１９９９），Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２（１１）：９４１−３；Ｕｓｄｉｎら（１９９６），Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３７（１０）：４２８５−９７；Ｕｓｄｉｎら（１９９５），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（２６）：１５４５５−８；Ｕｓｄｉｎら（１９９９），Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４０（７）：３３６３−７１に記載されている。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域は式Ｉ（配列番号１３）のポリペプチドから選択されるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域は式ＩＩ（配列番号１４）のポリペプチドから選択されるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域は式ＩＩＩ（配列番号１５）のポリペプチドから選択されるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域はポリペプチドが１箇所以上の保存的アミノ酸置換及び／又は１箇所以上の非保存的アミノ酸置換を含む以外は式Ｉ（配列番号１３）のポリペプチドから選択されるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域はポリペプチドが１箇所以上の保存的アミノ酸置換及び／又は１箇所以上の非保存的アミノ酸置換を含む以外は式ＩＩ（配列番号１４）のポリペプチドから選択されるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域はポリペプチドが１箇所以上の保存的アミノ酸置換及び／又は１箇所以上の非保存的アミノ酸置換を含む以外は式ＩＩＩ（配列番号１５）のポリペプチドから選択されるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域はポリペプチドの１４位からＣ末端アミノ酸の１個以上の残基がシステイン残基で置換された式Ｉ（配列番号１３）のポリペプチドから選択されるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域はポリペプチドの１４位からＣ末端アミノ酸の１個以上の残基がシステイン残基で置換された式ＩＩ（配列番号１４）のポリペプチドから選択されるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域はポリペプチドの１４位からＣ末端アミノ酸の１個以上の残基がシステイン残基で置換された式ＩＩＩ（配列番号１５）のポリペプチドから選択されるポリペプチドを含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域は（ｉ）ＴＩＰ３９のアミノ酸配列（配列番号１６０）をもつか、又は（ｉｉ）表１Ａのポリペプチドから選択されるか、又は（ｉｉｉ）表１Ｂのポリペプチドから選択されるか、又は（ｉｖ）表２のポリペプチドから選択されるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域は（ｉ）ポリペプチドが１箇所以上の保存的アミノ酸置換及び／又は１箇所以上の非保存的アミノ酸置換を含む以外はＴＩＰ３９のアミノ酸配列（配列番号１６０）をもつか、又は（ｉｉ）ポリペプチドが１箇所以上の保存的アミノ酸置換及び／又は１箇所以上の非保存的アミノ酸置換を含む以外は表１Ａのポリペプチドから選択されるか、又は（ｉｉｉ）ポリペプチドが１箇所以上の保存的アミノ酸置換及び／又は１箇所以上の非保存的アミノ酸置換を含む以外は表１Ｂのポリペプチドから選択されるか、又は（ｉｖ）ポリペプチドが１箇所以上の保存的アミノ酸置換及び／又は１箇所以上の非保存的アミノ酸置換を含む以外は表２のポリペプチドから選択されるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域は（ｉ）ポリペプチドの１４位からＣ末端アミノ酸の１個以上の残基がシステイン残基で置換されている以外はＴＩＰ３９のアミノ酸配列（配列番号１６０）をもつか、又は（ｉｉ）ポリペプチドの１４位からＣ末端アミノ酸の１個以上の残基がシステイン残基で置換されている以外は表１Ａのポリペプチドから選択されるか、又は（ｉｉｉ）ポリペプチドの１４位からＣ末端アミノ酸の１個以上の残基がシステイン残基で置換されている以外は表１Ｂのポリペプチドから選択されるか、又は（ｉｖ）ポリペプチドの１４位からＣ末端アミノ酸の１個以上の残基がシステイン残基で置換されている以外は表２のポリペプチドから選択されるポリペプチドを含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域の２７位からＣ末端アミノ酸の１個以上の残基はシステイン残基である。
【０１６２】
いくつかの代表的なプレプロ領域
いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはプレプロ領域と調節領域を含む。いくつかの実施形態では、プレプロ領域は調節領域のＮ末端側に位置する。いくつかの実施形態では、プレプロ領域と調節領域の間隔は０から３０アミノ酸である。いくつかの実施形態では、プレプロ領域と調節領域の間隔は０から１０アミノ酸である。いくつかの実施形態では、プレプロ領域と調節領域の間隔は０、１、２、３、４又は５アミノ酸である。いくつかの代表的なプレプロ領域を表３及び４に示す。
【０１６３】
【表５】
2009515903.tif 000028
【０１６４】
【表６】
2009515903.tif 000029
【０１６５】
いくつかの代表的なＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチド
いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドは限定されないが、例えば米国特許第４，４２３，０３７号；４，９６８，６６９号；５，００１，２２３号；又は６，０５１，６８６号に記載の方法等の当分野で公知の方法により製造することができる。いくつかの実施形態では、リンカーの介在下又は非介在下に２個以上のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドをタンデムに連結（即ち複数のペプチドを順次連結）することができる。いくつかの実施形態では、システイニル残基を含むＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを別のシステイン含有ポリペプチドと架橋することができる。いくつかの実施形態では、２個以上のシステイン残基をもつＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドがペプチド内ジスルフィド結合を形成することができる。いくつかの実施形態では、以下に記載するようにＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを誘導体化することができる。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換により、置換を実施する前のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと同様の機能的及び化学的特徴をもつペプチドを作製する。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドの機能的及び／又は化学的特徴の改変が所望される場合には、ペプチド配列に非保存的置換を実施することができる。いくつかの実施形態では、このような非保存的置換は例えば、（ａ）例えばシート又は螺旋構造としての置換領域のペプチド主鎖の構造、（ｂ）置換部位の分子の電荷又は疎水性、及び／又は（ｃ）置換部位の分子のサイズの維持に及ぼすその効果において被置換アミノ酸と相違する１個以上の置換アミノ酸を選択することにより実施することができる。
【０１６７】
（保存的又は非保存に拘わらず）いくつかの代表的な所望アミノ酸置換はこのような置換が所望される時点で当業者が決定することができる。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドの重要な残基を同定するため、又はＰＴＨ−１受容体及び／又はＰＴＨ−２受容体に対するＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドの親和性を増加もしくは低下させるためにアミノ酸置換を使用することができる。
【０１６８】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドのいくつかの代表的な作製方法
いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドは組換えＤＮＡ技術を使用して形質転換宿主細胞で作製することができる。従って、いくつかの実施形態では、前記ペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子を作製する。このようなＤＮＡ分子のいくつかの代表的な作製方法は当分野で公知である。いくつかの実施形態では、適切な１種以上の制限酵素を使用してペプチドをコードする配列をＤＮＡから切り出すことができる。いくつかの実施形態では、限定されないが、ホスホロアミダイト法等の化学合成技術を使用してＤＮＡ分子を合成することができる。いくつかの実施形態では、これらの技術と当分野で公知の他の技術を併用することができる。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、適切な宿主細胞でＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを発現させることが可能なベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは１個以上の適切な発現調節配列に機能的に連結したペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む。コーディングＤＮＡを１個以上の発現調節配列に機能的に連結するいくつかの代表的な方法は当分野で公知である。いくつかの代表的な発現調節配列としては限定されないが、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、並びに転写及び／又は翻訳の制御に関与する他のシグナルが挙げられる。いくつかの実施形態では、こうして得られたコーディングＤＮＡをもつベクターを使用して適切な宿主を形質転換する。各種実施形態において、当業者は選択された宿主細胞に応じて適切な形質転換法を選択することができる。
【０１７０】
各種実施形態では、多数の入手可能な周知宿主細胞の１種を使用してＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを発現させることができる。いくつかの実施形態では、当分野で公知の多数の因子に基づいて特定宿主細胞を選択し、このような因子としては限定されないが、選択される発現ベクターとの適合性、特定細胞型におけるＤＮＡ分子によりコードされるペプチドの毒性、形質転換率、発現されたペプチドの回収し易さ、発現特徴、生体安全性及びコストが挙げられる。いくつかの実施形態では、全宿主細胞が特定ＤＮＡ配列の発現に等しく有効ではないという認識のもとでこれらの因子を考慮する。代表的な有用な宿主としては限定されないが、細菌（例えば大腸菌種）、酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種や、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）並びに他の真菌類、昆虫細胞、植物及び植物細胞、培養哺乳動物（ヒトを含む）細胞、いくつかの哺乳動物（例えばヒツジ、ヤギ、ウシ及びブタ）、並びに当分野で公知の他の宿主細胞及び生物が挙げられる。発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞株としては限定されないが、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能ないくつかの不死化細胞株が挙げられ、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）等が挙げられ、場合により無血清培地での増殖に順応させることができる。いくつかの代表的な宿主細胞としては限定されないが、２９３Ｔ細胞とＣＨＯ  ＡＭ−１／Ｄ細胞が挙げられる。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、形質転換宿主を培養し、ペプチドを精製する。いくつかの実施形態では、慣用発酵条件等の当分野で公知の方法に従って宿主細胞を培養し、所望ペプチドを発現させる。いくつかの実施形態では、当分野で公知の方法に従ってペプチドを培養液から精製する。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドは合成法により作製することができる。例えば、いくつかの実施形態では、固相合成法を使用することができる。いくつかの代表的な固相合成法は当分野で公知であり、限定されないが、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７３），Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｐｐ．３３５−６１（Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｐａｎａｙｏｔｉｓ  ｅｄｓ．）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｄａｖｉｓら（１９８５），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．１０：３９４−４１４；Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ（１９６９），Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第３，９４１，７６３号；Ｆｉｎｎら（１９７６），Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄ  ｅｄ．）２：１０５−２５３；及びＥｒｉｃｋｓｏｎら（１９７６），Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄ  ｅｄ．）２：２５７−５２７に記載の方法が挙げられる。いくつかの実施形態では、固相合成法がいくつかの小ペプチドの作製方法として最も費用効果的な方法である。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、公知有機化学技術を使用して誘導体化ペプチドを作製することができる。いくつかの実施形態では、生化学法又は合成法を使用してまず未誘導体化ペプチドを作製した後に、有機化学技術を使用して誘導体化する。
【０１７４】
いくつかの代表的なリンカー
ポリペプチドが別のポリペプチドと「連結」していると言う場合には、相互に連結した分子はリンカーを含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。いくつかの実施形態では、リンカーが主に２分子間のスペーサーとして機能する場合には、その厳密な化学構造は重要ではない。いくつかの実施形態では、リンカーはペプチド結合により相互に連結したアミノ酸残基を含み、即ち、リンカーはペプチドを含む。従って、いくつかの実施形態では、リンカーは１から２０個（両端間の全数を含む）のアミノ酸残基をもつペプチドである。リンカーで使用されるアミノ酸残基は標準又は非標準アミノ酸残基とすることができる。いくつかの実施形態では、リンカーのアミノ酸残基はグリコシル化及び／又は別の方法で誘導体化することができる。いくつかの実施形態では、リンカーのアミノ酸残基はグリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリジンから選択される。いくつかの実施形態では、リンカーは立体障害のない大半のアミノ酸残基（例えばグリシン及び／又はアラニン）を含む。従って、いくつかの実施形態では、リンカーはポリグリシン（例えば（Ｇｌｙ）４、（Ｇｌｙ）５）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）及びポリアラニンから選択される。いくつかの代表的なリンカーとしては限定されないが、
（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号２０８）；
（Ｇｌｙ）３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）２（配列番号２０９）；
（Ｇｌｙ）３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号２１０）；
ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号２１１）；及び
ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＡｌａＰｒｏ（配列番号２１２）が挙げられる。
【０１７５】
上記命名法を説明すると、例えば、（Ｇｌｙ）３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）４はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを意味する。いくつかの実施形態では、リンカーはＧｌｙ残基とＡｌａ残基の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは１０個以下のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは１１から３０個（両端間の全数を含む）のアミノ酸残基を含む。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは２個のポリペプチドを単一のコーディング配列にクローニングするために使用される制限酵素部位から得られる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの一方又は両方のコーディング配列に制限酵素部位を付加する。いくつかの実施形態では、このようなリンカーのアミノ酸配列はクローニング法に選択される制限酵素部位により少なくとも部分的に決定される。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、非ペプチドリンカーを提供する。いくつかの代表的な非ペプチドリンカーとしては限定されないが、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ｓ＝２から２０）等のアルキルリンカーが挙げられる。このようなアルキルリンカーは、いくつかの実施形態では、更に置換を含み、このような置換としては限定されないが、低級アルキル（例えばＣ１−Ｃ６）、低級アシル、ハロゲン（例えばＣｌ，Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニル等の非立体障害基が挙げられる。非限定的な代表的な非ペプチドリンカーはＰＥＧリンカー
【０１７８】
【化１】
2009515903.tif 000030
（式中、ｎはリンカーが分子量１００から５０００ｋＤとなるような数である）である。いくつかの実施形態では、ｎはリンカーが分子量１００から５００ｋＤ（両端間の全点を含む）となるような数である。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、リンカーは２個のポリペプチドを相互に結合するために使用される化学的及び／又は酵素的方法により得られる。ポリペプチドを結合するためのいくつかの代表的な化学的及び／又は酵素的方法は例えばＰｉｅｒｃｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｏｇ（２００３／２００４）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に記載されている。
【０１８０】
いくつかの代表的なＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は少なくとも１個のＲＡＮＫＬ抗体と、少なくとも１個のリンカーと、少なくとも１個のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。代表的なリンカーとしては限定されないが、ペプチドリンカー、アルキルリンカー、ＰＥＧリンカー、及び２個のポリペプチドを結合するために使用される化学的又は酵素的方法から得られるリンカーが挙げられる。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域とプレプロ領域を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域を含むが、プレプロ領域を含まない。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＲＡＮＫＬ抗体は２本の全長重鎖と２本の全長軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＲＡＮＫＬ抗体は少なくとも１本の短縮型重鎖及び／又は少なくとも１本の短縮型軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＲＡＮＫＬ抗体は抗体フラグメントである。いくつかの代表的な抗体フラグメントとしては限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及び単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドのＣ末端を介して別の分子と連結することができる。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドのＮ末端を介して別の分子と連結することができる。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドは別の分子のＣ末端と連結している。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドは別の分子のＮ末端と連結している。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＲＡＮＫＬ抗体の重鎖のＮ末端又はＣ末端と連結している。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＲＡＮＫＬ抗体の軽鎖のＮ末端又はＣ末端と連結している。いくつかの実施形態では、第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＲＡＮＫＬ抗体の重鎖と連結しており、第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと同一又は異なるアミノ酸配列をもつ第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＲＡＮＫＬ抗体の軽鎖と連結している。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子はキメラ分子の２成分間にリンカーを含む。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＲＡＮＫＬ抗体の重鎖と融合している。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＲＡＮＫＬ抗体の軽鎖と融合している。いくつかの実施形態では、第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＲＡＮＫＬ抗体の重鎖と融合しており、第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと同一又は異なるアミノ酸配列をもつ第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドはＲＡＮＫＬ抗体の軽鎖と融合している。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体の重鎖は同一又は異なる配列をもつ少なくとも２個のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと融合している。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体の軽鎖は同一又は異なる配列をもつ少なくとも２個のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと融合している。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体の重鎖は同一又は異なる配列をもつ少なくとも２個の第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと融合しており、ＲＡＮＫＬ抗体の軽鎖は同一又は異なる配列をもつ少なくとも２個の第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと融合している。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、キメラ分子はＲＡＮＫＬ抗体１に対して２の比のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。いくつかの実施形態では、このようなキメラ分子はＲＡＮＫＬ抗体の第１の重鎖に連結した第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、ＲＡＮＫＬ抗体の第２の重鎖に連結した第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。いくつかの実施形態では、このようなキメラ分子はＲＡＮＫＬ抗体の第１の軽鎖に連結した第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、ＲＡＮＫＬ抗体の第２の軽鎖に連結した第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。当業者はＲＡＮＫＬ抗体１に対して２の比のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む他のキメラ分子をデザインすることができる。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、キメラ分子はＲＡＮＫＬ抗体１個当たり４個のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。いくつかの実施形態では、このようなキメラ分子はＲＡＮＫＬの第１の重鎖に連結した第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、ＲＡＮＫＬの第２の重鎖に連結した第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、ＲＡＮＫＬの第１の軽鎖に連結した第３のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、ＲＡＮＫＬの第２の軽鎖に連結した第４のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。いくつかの実施形態では、このようなキメラ分子はＲＡＮＫＬの第１の重鎖のＮ末端に連結した第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、ＲＡＮＫＬの第１の重鎖のＣ末端に連結した第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、ＲＡＮＫＬの第２の重鎖のＮ末端に連結した第３のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、ＲＡＮＫＬの第２の重鎖のＣ末端に連結した第４のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。いくつかの実施形態では、このようなキメラ分子はＲＡＮＫＬの第１の軽鎖のＮ末端に連結した第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、ＲＡＮＫＬの第１の軽鎖のＣ末端に連結した第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、ＲＡＮＫＬの第２の軽鎖のＮ末端に連結した第３のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、ＲＡＮＫＬの第２の軽鎖のＣ末端に連結した第４のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。いくつかの実施形態では、このようなキメラ分子はＲＡＮＫＬの第１の重鎖のＮ末端に連結した第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチド及び第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、ＲＡＮＫＬの第２の重鎖のＮ末端に連結した第３のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチド及び第４のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。当業者はＲＡＮＫＬ抗体１に対して４の比のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む他のキメラ分子をデザインすることができる。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、キメラ分子はＲＡＮＫＬ抗体１個当たり８個のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。いくつかの実施形態では、このようなキメラ分子はＲＡＮＫＬの第１の重鎖のＮ末端に連結した第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、ＲＡＮＫＬの第１の重鎖のＣ末端に連結した第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、ＲＡＮＫＬの第２の重鎖のＮ末端に連結した第３のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、ＲＡＮＫＬの第２の重鎖のＣ末端に連結した第４のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、第１の軽鎖のＮ末端に連結した第５のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、第１の軽鎖のＣ末端に連結した第６のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、第２の軽鎖のＮ末端に連結した第７のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、第２の軽鎖のＣ末端に連結した第８のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。いくつかの実施形態では、このようなキメラ分子はＲＡＮＫＬの第１の重鎖のＮ末端に連結した第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチド及び第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、ＲＡＮＫＬの第２の重鎖のＮ末端に連結した第３のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチド及び第４のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、ＲＡＮＫＬの第１の軽鎖のＮ末端に連結した第５のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチド及び第６のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、ＲＡＮＫＬの第２の軽鎖のＮ末端に連結した第７のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチド及び第８のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。当業者はＲＡＮＫＬ抗体１に対して８の比のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む他のキメラ分子をデザインすることができる。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子における少なくとも１個のＲＡＮＫＬ抗体はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖから選択される。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は成分の少なくとも２個の間にペプチドリンカーを含む。
【０１８８】
各種実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は表１Ａ、１Ｂ及び２のアミノ酸配列（配列番号１６から１８７）から選択される少なくとも１個のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域を含む。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は表３及び４のアミノ酸配列（配列番号１８８から２０７）から選択される少なくとも１個のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰプレプロ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は図８に示す配列（配列番号６）をもつ少なくとも１個のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は図２に示すアミノ酸配列（配列番号２）をもつ少なくとも１本の重鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は図２８に示すアミノ酸配列（配列番号１１）をもつ可変領域を含む少なくとも１本の重鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は図２８に示すアミノ酸配列（配列番号１１）と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％一致する可変領域を含む少なくとも１本の重鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は図４に示すアミノ酸配列（配列番号４）をもつ少なくとも１本の軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は図２９に示すアミノ酸配列（配列番号１２）をもつ可変領域を含む少なくとも１本の軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は図２９に示すアミノ酸配列（配列番号１２）と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％一致する可変領域を含む少なくとも１本の軽鎖を含む。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は１個のＲＡＮＫＬ抗体と１個のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は１個のＲＡＮＫＬ抗体と２個のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は１個のＲＡＮＫＬ抗体と３個以上のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は２個以上のＲＡＮＫＬ抗体と１個のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は２個以上のＲＡＮＫＬ抗体と２個以上のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含む。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体の軽鎖と、ＲＡＮＫＬ抗体の重鎖に融合したＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含むポリペプチドを「ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ−αＲＡＮＫＬ重鎖融合体」と言う。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体の重鎖と、ＲＡＮＫＬ抗体の軽鎖に融合したＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含むポリペプチドを「ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ−αＲＡＮＫＬ軽鎖融合体」と言う。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体の重鎖に融合した第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、ＲＡＮＫＬ抗体の軽鎖に融合した第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含み、第１のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと第２のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドが同一又は異なるポリペプチドを「ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ−αＲＡＮＫＬ重鎖＋軽鎖融合体」と言う。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体の重鎖に融合したＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドは図１２に示すアミノ酸配列（配列番号１０，ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＩｇＧ２と言う）をもつ。このポリペプチドと図４に示す配列（配列番号４）をもつ軽鎖の複合体を「ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体」又は「ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ」と言う。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体の軽鎖に融合したＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドは図１０に示すアミノ酸配列（配列番号８，ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１軽鎖又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１κと言う）をもつ。このポリペプチドと図２に示す配列（配列番号２）をもつ重鎖の複合体を「ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１軽鎖融合体」又は「ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＬＣＦ」と言う。図１２に示すアミノ酸配列をもつＲＡＮＫＬ抗体の重鎖（配列番号１０，ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＩｇＧ２と言う）に融合したＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと、図１０に示すアミノ酸配列（配列番号８，ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１軽鎖又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１κと言う）をもつＲＡＮＫＬ抗体の軽鎖に融合したＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを含むポリペプチドを「ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖＋軽鎖融合体」又は「ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣ＋ＬＣＦ」と言う。
【０１９３】
いくつかの代表的な誘導体
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を誘導体化する。いくつかの実施形態では、連結分子を作製した後に、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を誘導体化する。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を形成する前にＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子の１個以上の成分を誘導体化する。例えば、いくつかの実施形態では、キメラ分子を形成する前にＲＡＮＫＬ抗体及び／又はリンカー及び／又はＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドを誘導体化することができる。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、基準ポリペプチドを誘導体化することにより、基準ポリペプチドの溶解度、吸収性、安定性及び／又は生物学的半減期を改善する。いくつかの実施形態では、基準ポリペプチドを誘導体化することにより、基準ポリペプチドの１種以上の望ましくない副作用をｉｎ  ｖｉｖｏ低減又は除去することができる。
【０１９５】
基準ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子の誘導体は基準ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子の１個以上のアミノ酸残基が１箇所以上修飾されている。いくつかの代表的な修飾としては限定されないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ビオチン化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオシド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合による架橋形成、シスチン形成、ピログルタミン酸形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミルストイル化、酸化、蛋白分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、転移ＲＮＡによる蛋白質へのアミノ酸付加（例えばアルギン酸化）及びユビキチン化が挙げられる。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、例えばリジン残基の電荷を逆転させることが可能な琥珀酸及び／又は他のカルボン酸無水物との反応により、リジン残基及び／又はＮ末端アミン基を誘導体化することができる。第１級アミン基を誘導体することが可能ないくつかの他の試薬としては限定されないが、イミドエステル（例えばメチルピコリンイミデート）；リン酸ピリドキサル；ピリドキサル；クロロホウ水素化物；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４ペンタンジオン；及びグリオキシル酸とのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、例えばフェニルグリオキサル、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン及び／又はニンヒドリンとの反応によりアルギニル残基を誘導体化することができる。いくつかの実施形態では、アルギニル残基の誘導体化はアルカリ性条件下で実施される。いくつかの実施形態では、アルギニル残基を誘導体化することが可能な試薬はリジン、Ｎ末端アミン基及び／又はアルギニンε−アミノ基も誘導体化することが可能である。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、例えば芳香族ジアゾニウム化合物及び／又はテトラニトロメタンとの反応によりチロシル残基を誘導体化することができる。いくつかの実施形態では、１個以上のスペクトルラベルを導入するようにチロシル残基を誘導体化することができる。いくつかの実施形態では、Ｎ−アセチルイミダゾールとテトラニトロメタンを使用して夫々Ｏ−アセチルチロシル種と３−ニトロ誘導体を形成することができる。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド及び／又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルフェニル）カルボジイミド等のカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によりカルボキシル側鎖基（例えばアスパルチル又はグルタミル）を選択的に修飾することができる。いくつかの実施形態では、アスパルチル及び／又はグルタミル残基をアンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル残基とグルタミニル残基に変換することができる。
【０２００】
いくつかの実施形態では、グルタミニル残基を脱アミド化し、グルタミル残基とすることができる。いくつかの実施形態では、アスパラギニル残基を脱アミド化し、アスパルチル残基とすることができる。いくつかの実施形態では、あるいは、グルタミニル及び／又はアスパラギニル残基を例えば緩酸性条件下で脱アミド化することができる。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、システイニル残基を別の部分で置換し、ポリペプチドのこの位置とのジスルフィド結合形成を排除及び／又はポリペプチドの別の位置との架橋を安定化することができる。例えばＢｈａｔｎａｇａｒら（１９９６），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９参照。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、二官能性物質による誘導体化を使用し、ポリペプチドを別のポリペプチド及び／又は別の分子、部分、支持マトリックス及び／又は分子と架橋させることができる。いくつかの代表的な架橋剤としては限定されないが、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン；グルタルアルデヒド；Ｎ−ヒドロキシスミシンイミドエステル（例えば４−アジドサリチル酸とのエステル）；ホモ二官能性イミドエステル（例えば３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオン酸）エステル等のジスクシンイミジルエステル）；及び二官能性マレイミド（例えばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン）が挙げられる。いくつかの実施形態では、誘導体化剤は光の存在下で架橋することが可能な光活性化型中間体を生成することができる。いくつかのこのような誘導体化剤としては限定されないが、メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートが挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチド固定化用材料を利用する。いくつかのこのような材料としては限定されないが、反応性非水溶性マトリックスが挙げられ、例えば臭化シアン活性化糖鎖や、米国特許第３，９６９，２８７号；３，６９１，０１６号；４，１９５，１２８号；４，２４７，６４２号；４，２２９，５３７号；及び４，３３０，４４０号に記載の反応性基材が挙げられる。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、基準ポリペプチドの所定部位に糖鎖（オリゴ糖）基を付加することができる。いくつかの実施形態では、これらの部位はグリコシル化部位として知られている。いくつかの実施形態では、セリン（Ｓｅｒ）及び／又はスレオニン（Ｔｈｒ）残基にＯ−結合型オリゴ糖を付加する。いくつかの実施形態では、アスパラギン（Ａｓｎ）残基にＮ−結合型オリゴ糖を付加する。いくつかの実施形態では、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘはプロリン以外の任意アミノ酸である）の一部である場合にアスパラギン（Ａｓｎ）残基にＮ−結合型オリゴ糖を付加する。各種実施形態では、Ｎ−結合型及び／又はＯ−結合型オリゴ糖と各型に存在する糖残基の構造は同一でもよいし、異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、Ｎ−結合型オリゴ糖とＯ−結合型オリゴ糖の両者にＮ−アセチルノイラミン酸（別称シアル酸）をもつことができる。いくつかの実施形態では、シアル酸はＮ−結合型オリゴ糖及び／又はＯ−結合型オリゴ糖の末端残基であり、その負電荷により、グリコシル化ポリペプチドに酸性の性質を付与することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは（例えばＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳ等の哺乳動物細胞で）組換え産生中に１個以上の位置をグリコシル化される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは当分野で公知の合成又は半合成法により１個以上の位置をグリコシル化される。
【０２０４】
基準ポリペプチドのいくつかの代表的な修飾としては限定されないが、プロリン及び／又はリジンの水酸化、セリン及び／又はスレオニンの水酸基のリン酸化、システインの硫黄原子の酸化、リジン、アルギニン及び／又はヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化が挙げられる。例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ），ｐｐ．７９−８６（１９８３）参照。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、医薬用に基準ポリペプチドの誘導体を作製する。いくつかの実施形態では、基準ポリペプチドの誘導体は出発ポリペプチドと同様のいくつかの性質を維持する。いくつかの実施形態では、「ペプチドミメティック」ないし「ペブチドミメティクス」を使用して基準ポリペプチドを誘導体化する。例えばＦａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ＴＩＮＳ  ｐ．３９２（１９８５）；及びＥｖａｎｓらＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）参照。いくつかの実施形態では、コンピューター分子モデリングを利用して基準ポリペプチドのこのような誘導体を構築する。いくつかの実施形態では、類似の治療又は予防効果を生じるために、治療薬として有用なペブチドと構造的に類似するペブチドミメティックを使用することができる。いくつかの実施形態では、ペブチドミメティックを使用して作製した基準ポリペプチドの誘導体は基準ポリペプチドと構造的に類似するが、１個以上のペブチド結合が当分野で公知の方法により−ＣＨ２ＮＨ−，−ＣＨ２Ｓ−，−ＣＨ２−ＣＨ２−，−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、及び−ＣＨ２ＳＯ−から選択される少なくとも１種の結合で置換されている。いくつかの実施形態では、１個以上のアミノ酸を同一型のＤ−アミノ酸（例えばＬ−リジンをＤ−リジン）で置換し、より安定なポリペプチドを作製することができる。いくつかの実施形態では、当分野で公知の方法（例えばＲｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２）参照）により基準ポリペプチドの拘束型誘導体を作製することができ、例えば、分子内ジスルフィド結合を形成することが可能な内部システイン残基を付加すること及び／又は他の方法により基準ポリペプチドを架橋してポリペプチドを環化することにより実施できる。
【０２０６】
基準ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子のいくつかの代表的なとしては限定されないが、以下のものが挙げられる。
１．環状のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。非限定的な１例として、２個のシステイン残基を架橋して分子内ジスルフィド結合を形成することにより、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を環化することができる。
２．同一又は異なる少なくとも１個の他の分子と架橋したＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。非限定的な１例として、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は１個以上のシステイン残基を介して少なくとも１個の他の分子と架橋することができる。別の非限定的な例として、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は少なくとも１個のＣ末端を介して少なくとも１個の他の分子と架橋することができる。
３．１個以上のペプチド［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］結合が１個以上の非ペプチド結合で置換されたＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。非限定的な代表的な非ペプチド結合としては限定されないが、−ＣＨ２−カルバメート［−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］、ホスホネート、−ＣＨ２−スルホンアミド［−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−］、尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］、−ＣＨ２−第２級アミン、及びアルキル化ペブチド［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−（式中、Ｒ６は低級アルキルである）］が挙げられる。
４．少なくとも１個の誘導体化Ｎ末端をもつＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。いくつかの実施形態では、Ｎ末端をアシル化又は置換アミンに修飾することができる。非限定的な代表的なＮ末端誘導体基としては限定されないが、−ＮＲＲ１（−ＮＨ２を除く）、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１、スクシンイミド、及びベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（ＣＢＺ−ＮＨ−）が挙げられ、上記式中、Ｒ及びＲ１は各々独立して水素又は低級アルキルであり、フェニル環はＣ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、クロロ及びブロモから選択される１から３個の置換基で置換されていてもよい。
５．少なくとも１個の誘導体化Ｃ末端をもつＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。いくつかの実施形態では、Ｃ末端をエステル化又はアミド化することができる。非限定的な代表的なＣ末端誘導体基としては限定されないが、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２が挙げられ、式中、Ｒ２は低級アルコキシ又は−ＮＲ３Ｒ４であり、Ｒ３及びＲ４は独立して水素又はＣ１−Ｃ８アルキル（好ましくはＣ１−Ｃ４アルキル）である。
６．少なくとも１個のジスルフィド結合がジスルフィド結合以外の少なくとも１個の架橋性部分（例えばアルキレン）で置換されたＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。例えばＢｈａｔｎａｇａｒら（１９９６），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９；Ａｌｂｅｒｔｓら（１９９３）Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ  Ａｍ．Ｐｅｐ．Ｓｙｍｐ．，３５７−９参照。いくつかの実施形態では、架橋性部分はジスルフィド結合よりも安定である。
７．１個以上のアミノ酸残基が化学的又は酵素的に修飾されたＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子。いくつかの実施形態では、誘導体化剤は１個以上の特定アミノ酸側鎖を修飾する。
【０２０７】
いくつかの代表的なビヒクル
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を少なくとも１個のビヒクルと共有的又は非共有的に結合する。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を作製後に１個以上のビヒクルをキメラ分子と共有的又は非共有的に結合する。いくつかの実施形態では、キメラ分子を構築する前に１個以上のビヒクルをＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子の１個以上の成分と共有的又は非共有的に結合する。非限定的な１例として、１個以上のビヒクルをＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドと結合した後に、１個以上のビヒクル−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドをＲＡＮＫＬ抗体と連結し、１個以上のビヒクルを結合したＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を形成することができる。いくつかの実施形態では、（既に１個以上のビヒクルが結合している）ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子に更に他のビヒクルを結合することができる。
【０２０８】
いくつかの代表的なビヒクルとしては限定されないが、ポリペプチドと小分子（限定されないが、例えばペプチドミメティック化合物）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチド又は小分子ビヒクルはサルベージ受容体と結合することが可能である。いくつかのこのようなビヒクルは例えば米国特許第５，７３９，２７７号に記載されている。いくつかのポリペプチドビヒクルは例えばファージディスプレイ法又はＲＮＡ−ペプチドスクリーニング法によりサルベージ受容体（例えばＦｃＲｎサルベージ受容体）との結合能について選択することができる。このようなサルベージ受容体結合性ビヒクルはいくつかの実施形態では、（例えばプロテアーゼにより認識される配列を避けることにより）半減期を延長及び／又は（例えば非免疫原性配列を選択することにより）免疫原性を低下させるように選択することができる。
【０２０９】
いくつかの代表的なビヒクルとしては限定されないが、ポリマービヒクルが挙げられる。ポリマービヒクルをポリペプチドに結合するいくつかの方法は例えばＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１１９５３号に記載されている。代表的なポリマービヒクルとしては限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドをＰＥＧで修飾し、ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ効力を改善する。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドをＰＥＧで修飾し、ポリペプチドの循環半減期を延長する。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドをＰＥＧで修飾し、ポリペプチドの溶解度を増す。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドをＰＥＧで修飾し、ポリペプチドの毒性及び／又は免疫原性を低下させる。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、例えばポリペプチド−ＰＥＧ−ポリペプチド構成でＰＥＧを２個以上の治療用分子に結合することができる。いくつかの実施形態では、２個のＰＥＧ分子を治療用分子に結合する。２個のＰＥＧ分子を治療用分子に結合する場合には、いくつかの実施形態では、第１のＰＥＧ分子を第２のＰＥＧ分子と結合した後に治療用分子と結合してもよいし、第１及び第２の両方のＰＥＧ分子を治療用分子の別の位置に結合してもよい。いくつかの実施形態では、ＰＥＧをポリペプチドのシステイン側鎖に結合する。
【０２１１】
ＰＥＧビヒクルをポリペプチドに結合するためのいくつかの結合化学は当分野で公知である。いくつかの代表的な結合化学は例えばＺａｌｉｐｓｋｙ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６：１５７−１８２（１９９５）に記載されている。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分の反応基（例えばアルデヒド、アミノ、チオール又はエステル基）と分子の反応基（例えばアルデヒド、アミノ又はエステル基）を介してアシル化又は還元アルキル化によりＰＥＧを分子に結合することができる。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧをポリペプチドに結合する方法は各々相互に反応性の官能基をもつポリペプチドとＰＥＧ分子を混合する段階を含む。いくつかの実施形態では、固相合成法によりポリペプチドを作製し、特定位置を適切な官能基で「予め活性化」することができる。いくつかの実施形態では、第１の官能基と反応することが可能な第２の官能基をもつＰＥＧ分子とポリペプチドを反応させる前に、第１の官能基をもつポリペプチドを精製及び／又は特性決定することができる。いくつかの実施形態では、第１の官能基と第２の官能基の反応は水溶液中で実施する。いくつかの実施形態では、逆相分析ＨＰＬＣにより反応をモニターする。いくつかの実施形態では、反応後のＰＥＧ−ポリペプチド分子を例えば分取ＨＰＬＣにより精製及び／又は例えば分析ＨＰＬＣ、アミノ酸分析法及び／又はレーザー脱離質量分析法により特性決定することができる。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、直交保護ストラテジーを使用して１個以上のＰＥＧビヒクルを１個以上の特定アミノ基と結合させる固相合成法によりポリペプチドを作製することができる。いくつかの実施形態では、アミノ基の脱離可能な保護基とＰＥＧの結合に選択されない他の反応基を使用してポリペプチドを合成する。その後、未保護アミノ基及び／又は他の反応基を介してＰＥＧ分子を保護ポリペプチドと結合する。ＰＥＧの結合後、いくつかの実施形態では、保護基を脱離することができる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの上記選択的結合法はＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドに存在するリジン残基の１個のみにＰＥＧを結合するために有用である。従って、非限定的な１例として、ＰＴＨ（１−３４）では、１３、２６又は２７位のリジン残基の１個の側鎖を保護せずに、他のリジン残基を例えばＤｄｅ保護基で保護する。ＰＥＧの結合後、いくつかの実施形態では、５から３０分間室温で２％ヒドラジン水溶液を使用してＤｄｅ基を選択的に脱離することができる。いくつかの実施形態では、２７位のリジンをＰＥＧの結合に選択する。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、そのＣ末端にＰＥＧをもつポリペプチドを作製するために固相合成法を使用することができる。いくつかのこのような態様では、ＰＥＧはポリペプチドを固相合成用樹脂に結合することができる。ポリペプチドの合成後、ＰＥＧがポリペプチドに保持されるように、ポリペプチドとＰＥＧを樹脂から分離することができる。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧの部位特異的結合は結合異種性を最小にしながら生物活性の維持を最大にする。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの部位特異的結合は組換え蛋白質技術及び／又は選択的結合化学により実施される。非限定的な１例として、蛋白質活性に最小限の影響しか与えないと予想される１個以上の位置で反応性官能基をもつ１個以上のアミノ酸をポリペプチドに組込むために部位特異的突然変異誘発法を使用することができる。いくつかのこのような部位特異的突然変異誘発法は例えばＧｏｏｄｓｏｎら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：３４３−３４６（１９９０）及びＴｓｕｔｓｕｍｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：８５４８−８５５３（２０００）に記載されている。反応性官能基をもつ代表的なアミノ酸としては限定されないが、システインが挙げられる。いくつかの実施形態では、活性化単官能性ＰＥＧポリマーを作製及び／又は購入することができる。システインチオールと反応するいくつかの代表的な活性化ＰＥＧポリマーとしては限定されないが、ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−ビニルスルホン、ＰＥＧ−ヨードアセトアミド、ＰＥＧ−オルトピリジル−ジスルフィド及びＰＥＧ−エポキシドが挙げられる。いくつかの実施形態では、突然変異誘発ポリペプチドと結合するためにＰＥＧ−マレイミドを選択する。その後、ＰＥＧ−ポリペプチドコンジュゲートの形成を促進するのに適した反応条件下で突然変異誘発ポリペプチドを活性化ＰＥＧと混合すればよい。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ポリペプチドを精製及び／又は特性決定する。
【０２１６】
各種実施形態では、ＰＥＧビヒクルは任意分子量とすることができ、直鎖又は分岐鎖とすることができる。ＰＥＧの平均分子量はいくつかの実施形態では約２ｋＤａから約１００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの平均分子量は約５ｋＤａから約５０ｋＤａである。いくつかの実施形態ではＰＥＧの平均分子量は約５ｋＤａ、約２０ｋＤａ又は約３０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、直鎖モノメトキシＰＥＧ−マレイミドの平均分子量は約５ｋＤａから約３０ｋＤａ又は約２０ｋＤａから約３０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、分岐鎖ＰＥＧ−マレイミドの平均分子量は約４０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、４０ｋＤａ分岐鎖ＰＥＧ−マレイミドはポリペプチド結合部位と兼用するリンカーを介して結合した２本の２０ｋＤａポリマー「アーム」を含むことができる。いくつかの実施形態では、８ｋＤａ二官能性ＰＥＧ−（マレイミド）２をポリペプチド−ＰＥＧ−ポリペプチドコンジュゲートに使用する。
【０２１７】
代表的なポリマービヒクルとしては限定されないが、多糖ポリマーが挙げられる。デキストランは主にα１−６結合により連結した個々のサブユニットから構成される多糖ポリマーである。デキストランは多数の分子量で入手可能であり、限定されないが、分子量約１ｋＤａから約７０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、デキストランは分子量約１ｋＤａから約２０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、デキストランを単独ビヒクルとして使用又は別のビヒクルと併用することができる。例えばＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１１９５３号及びＷＯ９６／０５３０９号参照。治療用分子と結合したデキストランの代表的な使用法は例えばヨーロッパ特許公開第０  ３１５  ４５６号に記載されている。
【０２１８】
ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子のいくつかの代表的な使用法
いくつかの実施形態では、治療有効量のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を投与する段階を含む骨疾患の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、治療有効量のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子と少なくとも１種の他の治療剤を投与する段階を含む骨疾患の治療方法を提供する。いくつかのこのような態様では、少なくとも１種の他の治療剤の１種以上を治療有効量で投与する。いくつかの実施形態では、骨疾患は骨吸収の増加及び／又は純骨減少を少なくとも部分的に特徴とする疾患である。いくつかの実施形態では、骨吸収速度を抑制するためにＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子による治療を使用する。いくつかの実施形態では、吸収速度が正常値を上回る患者の骨吸収速度を低下させるために治療を使用することができる。いくつかの実施形態では、正常レベルを下回る患者の骨形成を補償するように骨吸収速度を正常レベルよりも低下させるために治療を使用することができる。いくつかの実施形態では、骨形成速度を増加するためにＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子による治療を使用する。いくつかの実施形態では、骨形成速度が正常値を下回る患者の骨形成速度を増加するために治療を使用することができる。いくつかの実施形態では、正常レベルを上回る患者の骨吸収速度を補償するように骨形成速度を正常レベルよりも増加するために治療を使用することができる。
【０２１９】
治療することができるいくつかの代表的な症状としては限定されないが、以下のものが挙げられる。
原発性及び続発性副甲状腺機能亢進症；
骨転移（例えば乳癌及び前立腺癌に関連する骨転移）を含む腫瘍転移；
悪液質及び食欲不振（例えば癌に伴う悪液質及び食欲不振）；
骨減少症（例えば外科手術後の骨減少症、ステロイド投与により誘発される骨減少症、大小腸疾患に伴う骨減少症、慢性肝及び腎疾患に伴う骨減少症、並びに異常ＰＴＨ受容体シグナル伝達に関連する骨減少症又はそれによって悪化する骨減少症、例えば所定形態の骨粗鬆症）；
骨粗鬆症（例えば原発性骨粗鬆症、閉経後及び加齢性骨粗鬆症、内分泌性骨粗鬆症（甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群及び末端肥大症を含む）、遺伝性及び先天性骨粗鬆症（骨形成不全症、ホモシスチン尿症、メンケス症候群、ライリー・デイ症候群を含む）、並びに四肢固定による骨粗鬆症）；
他の疾患（例えばヘモクロマトーシス、高プロラクチン血症、神経性無食欲症、甲状腺中毒症、糖尿病、セリアック病、炎症性腸疾患、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ、強直性脊椎炎、多発性骨髄腫、リンパ増殖性疾患及び全身性肥満細胞症）に続発する骨粗鬆症；
外科手術（例えば胃切除術）又は薬物療法（例えば化学療法、抗痙攣療法、免疫抑制療法及び抗凝血療法）に続発する骨粗鬆症；
いくつかの疾患（例えば関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、喘息、一過性関節炎、血管炎、慢性閉塞性肺疾患、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎及び慢性間質性肺疾患）のグルココルチコステロイド治療に続発する骨粗鬆症；
腎臓、肝臓、肺及び心臓移植等の臓器移植後の臓器拒絶反応を予防するためのグルココルチコステロイド及び／又は免疫調節治療に続発する骨粗鬆症；
宇宙旅行中に観察されるような微小重力負荷に起因する骨粗鬆症；
乳癌、前立腺癌等の悪性疾患に伴う骨粗鬆症；
成人及び若年性骨パジェット病（変形性骨炎）；
骨髄炎、即ち骨減少をもたらす感染性骨病変；
高カルシウム血症（例えば充実性腫瘍（例えば乳房、肺及び腎臓）及び血液悪性腫瘍（例えば多発性骨髄腫、リンパ腫及び白血病）に起因する高カルシウム血症、特発性高カルシウム血症、並びに甲状腺機能亢進症及び腎機能障害に伴う高カルシウム血症）；
骨壊死、即ち骨細胞死（例えば外傷に伴う骨壊死、ゴーシェ病に伴う骨壊死、鎌状赤血球貧血症に伴う骨壊死、全身性エリテマトーデスに伴う骨壊死、関節リウマチに伴う骨壊死、歯周病に伴う骨壊死、骨溶解性転移に伴う骨壊死及び他の症状に伴う骨壊死）；並びに
関節リウマチに伴う軟骨減少及び関節糜爛。
【０２２０】
ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子のいくつかの代表的な使用法
いくつかの実施形態では、骨疾患の治療にＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を単独使用又は少なくとも１種の他の治療剤と併用することができる。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を治療有効量の他の治療剤と併用する。ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子と併用投与することができるいくつかの代表的な治療剤としては限定されないが、骨吸収抑制剤、骨同化剤、抗炎症剤、免疫抑制剤及び癌治療剤が挙げられる。いくつかの代表的な治療剤としては限定されないが、更に骨形態形成因子（限定されないが、例えばＢＭＰ−１からＢＭＰ−１２）；トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）及びＴＧＦ−βファミリーメンバー；インターロイキン−１（ＩＬ−１）阻害剤（限定されないが、例えばＩＬ−１ｒａとその誘導体、Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）、及びアナキンラ）；ＴＮＦα阻害剤（限定されないが、例えば可溶性ＴＮＦα受容体、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）、エタネルセプト、抗ＴＮＦα抗体、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、インフリキシマブ、Ｈｕｍｉｒａ、アダリムマブ）；副甲状腺ホルモンとそのアナログ；副甲状腺関連蛋白とそのアナログ；Ｅ系プロスタグランジン；ビスホスホネート（例えばアレンドロネート等）；骨強化性ミネラル（限定されないが、例えばフッ化物やカルシウム）；スクレロスチンのモジュレーター；非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（限定されないが、例えばＣＯＸ−２阻害剤、限定されないが、例えばＣｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標）、セレコキシブ、Ｖｉｏｘｘ（登録商標）及びロフェコキシブ）；免疫抑制剤（限定されないが、例えばメトトレキセートやレフルノミド）；セリンプロテアーゼ阻害剤（限定されないが、例えば分泌型白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ））；ＩＬ−６阻害剤（限定されないが、例えばＩＬ−６阻害剤）、ＩＬ−８阻害剤（限定されないが、例えばＩＬ−８阻害剤）；ＩＬ−１８阻害剤（限定されないが、例えばＩＬ−１８結合性蛋白質及びＩＬ−１８抗体）；インターロイキン−１変換酵素（ＩＣＥ）モジュレーター；線維芽細胞増殖因子（限定されないが、例えばＦＧＦ−１からＦＧＦ−１０）及びＦＧＦモジュレーター；ＰＡＦアンタゴニスト；ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ＫＧＦ関連分子及びＫＧＦモジュレーター；マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）モジュレーター；一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）モジュレーター（限定されないが、例えば誘導性ＮＯＳのモジュレーター）；グルココルチコイド受容体モジュレーター；グルタミン酸受容体モジュレーター；リポ多糖（ＬＰＳ）濃度のモジュレーター；並びにノルアドレナリンとそのモジュレーター及びミメティックが挙げられる。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、各種炎症症状、自己免疫症状、癌、代謝障害及び／又は骨減少を伴う他の症状を治療するためにＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子と特定治療剤を使用する。いくつかの実施形態では、症状と所望治療レベルを考慮して、２種、３種又はそれ以上の治療剤を投与することができる。いくつかの実施形態では、このような治療剤を同一製剤に配合することにより一緒に提供することができる。いくつかの実施形態では、このような治療剤とＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を同一製剤に配合することにより一緒に提供することができる。いくつかの実施形態では、このような治療剤を治療キットに加えることにより一緒に提供することができる。いくつかの実施形態では、このような治療剤とＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を治療キットに加えることにより一緒に提供することができる。いくつかの実施形態では、このような治療剤を別々に提供することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子治療により投与する場合には、ポリペプチド剤及び／又はＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子をコードする遺伝子を同一ベクターに組込むことができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチド剤及び／又はＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子をコードする遺伝子を同一プロモーター領域の制御下におくことができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチド剤及び／又はＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子をコードする遺伝子を別個のベクターに組込むことができる。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１による疾患に伴う骨減少の治療方法はＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子と少なくとも１種のインターロイキン−１（ＩＬ−１）阻害剤を投与する段階を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＩＬ−１阻害剤の投与前、投与と同時、及び／又は投与後にＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を投与することができる。いくつかの実施形態では、組成物はＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子と、少なくとも１種のＩＬ−１阻害剤と、本明細書に記載する少なくとも１種の他の分子を含有する。いくつかの実施形態では、治療方法は少なくとも１種のＩＬ−１阻害剤及び／又は少なくとも１種のＴＮＦ−α阻害剤をＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子と併用する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１及び／又はＴＮＦαによる疾患に伴う骨減少を治療するためにＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子と少なくとも１種のＩＬ−１阻害剤及び／又は少なくとも１種のＴＮＦ−α阻害剤を併用することができる。
【０２２３】
インターロイキン−１（ＩＬ−１）による急性及び慢性疾患としては限定されないが、急性膵炎；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ又はルー・ゲーリッグ病）；アルツハイマー病；悪液質／食欲不振（例えばＡＩＤＳにより誘発される悪液質）；喘息及び他の肺疾患；アテローム性動脈硬化症；自己免疫性血管炎；慢性疲労症候群；クロストリジウム関連疾患（例えばクロストリジウム関連下痢症）；冠動脈症状及び徴候（例えば鬱血性心不全、冠動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋不全（例えば敗血症に関連するもの）及び冠動脈バイパスグラフト）；癌（限定されないが、例えば多発性骨髄腫及び骨髄性白血病（例えばＡＭＬ及びＣＭＬ））及び腫瘍転移；糖尿病（例えばインスリン依存性糖尿病）；子宮内膜症；発熱；線維筋肉痛；糸球体腎炎；移植片対宿主病及び／又は移植拒絶反応；出血性ショック；痛覚過敏；炎症性腸疾患；関節の炎症症状（例えば変形性関節症、乾癬性関節炎及び関節リウマチ）；炎症性眼疾患（例えば角膜移植に伴うもの）；虚血（限定されないが、例えば脳虚血（限定されないが、例えば各々神経変性を生じる可能性のある外傷、癲癇、出血及び／又は脳卒中の結果としての脳損傷））；川崎病；学習障害；肺疾患（例えば急性呼吸窮迫症候群ないしＡＲＤＳ）；多発性硬化症；ミオパシー（例えば筋蛋白代謝、例えば敗血症における筋蛋白代謝）；神経中毒（例えばＨＩＶにより誘発される神経中毒）；骨粗鬆症；疼痛（例えば癌関連疼痛）；パーキンソン病；歯周病；早産；乾癬；再潅流傷害；敗血症性ショック；放射線治療の副作用；一過性顎関節病；睡眠障害；ブドウ膜炎；並びに例えば挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染又は他の疾患プロセスに起因する炎症症状が挙げられる。
【０２２４】
各種実施形態では、ＩＬ−１阻害剤は任意数のメカニズムに起因し得る細胞受容体の活性化をＩＬ−１特異的に防止することが可能な任意ポリペプチド又は分子とすることができる。代表的なメカニズムとしては限定されないが、ＩＬ−１産生のダウンレギュレーティング、遊離ＩＬ−１との結合、ＩＬ−１とその受容体の結合の妨害、ＩＬ−１受容体複合体の形成（即ちＩＬ−１受容体とＩＬ−１受容体補助蛋白の会合）の妨害、及びその受容体との結合後のＩＬ−１シグナル伝達調節の妨害が挙げられる。
【０２２５】
いくつかのインターロイキン−１阻害剤としては限定されないが、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（例えばＫｉｎｅｒｅｔ（登録商標）及びアナキンラ）、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１ｒａ変異体及びＩＬ−１ｒａ誘導体（「ＩＬ−１ｒａ」と総称する）；抗ＩＬ−１受容体モノクローナル抗体（例えば言及により全目的で本明細書に組込むＥＰ６２３６７４参照）；ＩＬ−１結合蛋白（例えば可溶性ＩＬ−１受容体）（例えば米国特許第５，４９２，８８８号、米国特許第５，４８８，０３２号、米国特許第５，４６４，９３７号、米国特許第５，３１９，０７１号、及び米国特許第５，１８０，８１２号参照）；抗ＩＬ−１モノクローナル抗体（例えばＷＯ９５０１９９７、ＷＯ９４０２６２７、ＷＯ９００６３７１、米国特許第４，９３５，３４３号、ＥＰ３６４７７８、ＥＰ２６７６１１及びＥＰ２２００６３参照）；ＩＬ−１受容体補助蛋白とその抗体（例えばＷＯ９６／２３０６７及びＷＯ９９／３７７７３参照）；ＩＬ−１β産生及び分泌を抑制するために使用可能なインターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）又はカスパーゼＩの阻害剤（例えばＷＯ９９／４６２４８、ＷＯ９９／４７５４５及びＷＯ９９／４７１５４参照）；インターロイキン−１βプロテアーゼ阻害剤；並びにＩＬ−１のｉｎ  ｖｉｖｏ合成又は細胞外放出を阻止する他の化合物及びポリペプチドが挙げられる。
【０２２６】
インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）はインターロイキン−１の天然阻害剤として作用するヒトポリペプチドであり、ＩＬ−１αとＩＬ−１βを含むＩＬ−１ファミリーのメンバーである。ＩＬ−１ｒａとその変異体及び誘導体を含むいくつかの代表的な受容体アンタゴニスト並びにその作製及び使用方法は例えば米国特許第５，０７５，２２２号；ＷＯ９１／０８２８５；ＷＯ９１／１７１８４；ＡＵ９１７３６３６；ＷＯ９２／１６２２１；ＷＯ９３／２１９４６；ＷＯ９４／０６４５７；ＷＯ９４／２１２７５；ＦＲ２７０６７７２；ＷＯ９４／２１２３５；ＤＥ４２１９６２６，ＷＯ９４／２０５１７；ＷＯ９６／２２７９３；ＷＯ９７／２８８２８；及びＷＯ９９／３６５４１に記載されている。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１受容体アンタゴニストはグリコシル化型とすることができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１受容体アンタゴニストは非グリコシル化型とすることができる。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、ＴＮＦαによる疾患に伴う骨減少の治療方法はＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子と少なくとも１種のＴＮＦα阻害剤を投与する段階を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＴＮＦα阻害剤の投与前、投与と同時、及び／又は投与後にＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を投与することができる。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子と、少なくとも１種のＴＮＦα阻害剤と、本明細書に記載する少なくとも１種の他の分子を含有する組成物を投与することができる。
【０２２８】
ＴＮＦによるいくつかの急性及び慢性疾患としては限定されないが、悪液質及び食欲不振；癌（限定されないが、例えば白血病）；慢性疲労症候群；冠動脈症状及び／又は徴候（限定されないが、例えば鬱血性心不全、冠動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋不全（限定されないが、例えば敗血症に関連するもの）及び冠動脈バイパスグラフト）；鬱病；糖尿病（限定されないが、例えば若年性１型糖尿病、糖尿病及びインスリン抵抗性（限定されないが、例えば肥満症に伴うインスリン抵抗性））；子宮内膜症、子宮内膜炎及び関連症状；線維筋肉痛及び痛覚脱失；移植片対宿主拒絶反応；痛覚過敏；炎症性腸疾患（限定されないが、例えばクローン病やクロストリジウム関連下痢症）；虚血（限定されないが、例えば脳虚血、限定されないが、例えば外傷、癲癇、出血及び／又は脳卒中の結果としての脳損傷）；肺疾患（限定されないが、例えば成人呼吸窮迫症候群、喘息及び肺線維症）；多発性硬化症；神経炎症性疾患；眼疾患及び症状（限定されないが、例えば角膜移植、眼球変性及びブドウ膜炎）；疼痛（限定されないが、例えば癌関連疼痛）；膵炎；歯周病；毛孔性紅色粃糠疹（ＰＲＰ）；前立腺炎（例えば細菌性及び非細菌性前立腺と関連症状）；乾癬及び関連症状；肺線維症；再潅流傷害；リウマチ性疾患（限定されないが、例えば関節リウマチ、変形性関節症、若年性関節炎（限定されないが、例えば若年性関節リウマチ）、血清反応陰性多発性関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群及び反応性関節炎、スティル病、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、血管炎（例えば川崎病）、脳血管炎、ライム病、ブドウ球菌による（「敗血症性」）関節炎、ショーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎及びリウマチ性多発筋痛症並びに巨細胞性動脈炎）；敗血症性ショック；放射線治療の副作用；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；一過性顎関節病；甲状腺炎；並びに組織移植及び／又は例えば挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染（例えばＨＩＶ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及び関連種）もしくは他の疾患プロセスに起因する炎症症状が挙げられる。
【０２２９】
ＴＮＦ阻害剤のいくつかの代表的な活性としては限定されないが、ＴＮＦ産生のダウンレギュレーティング又は阻害、遊離ＴＮＦとの結合、ＴＮＦとその受容体の結合の妨害、及びその受容体との結合後のＴＮＦシグナル伝達調節の妨害が挙げられる。「ＴＮＦ阻害剤」なる用語は限定されないが、Ｉ型可溶性腫瘍壊死因子受容体（ｓＴＮＦ−ＲＩ；別称ｐ５５受容体）、ＩＩ型可溶性腫瘍壊死因子受容体（別称ｐ７５受容体）、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）、エタネルセプト等の可溶化ＴＮＦ受容体；Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、インフリキシマブ、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、アダリムマブ（例えば米国特許第６，０９０，３８２号及び６，２５８，５６２号参照）等のＴＮＦ抗体；ＴＮＦ受容体抗体；ｓＴＮＦ−ＲＩ（例えばＷＯ９８／２４４６３参照）、Ａｖａｋｉｎｅ（登録商標）；ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）の阻害剤；及びＴＮＦ活性に作用する他の分子が挙げられる。
【０２３０】
ＥＰ３９３４３８及びＥＰ４２２３３９はＩ型可溶性ＴＮＦ受容体（別称ｓＴＮＦＲ−Ｉ又は３０ｋＤａ  ＴＮＦ阻害剤）及びＩＩ型可溶性ＴＮＦ受容体（別称ｓＴＮＦＲ−ＩＩ又は４０ｋＤａ  ＴＮＦ阻害剤）（ｓＴＮＦＲと総称する）のアミノ酸配列と核酸配列について記載している。ＥＰ３９３４３８及びＥＰ４２２３３９はｓＴＮＦＲ−Ｉ及びｓＴＮＦＲ−ＩＩの修飾物（限定されないが、例えばフラグメント、機能的誘導体及び変異体）についても記載している。更に、ＥＰ３９３４３８及びＥＰ４２２３３９はこれらの阻害剤をコードする遺伝子を単離し、遺伝子を適切なベクターにクローニングし、遺伝子を所定細胞種に形質転換又はトランスフェクトし、遺伝子を発現させて阻害剤を作製する方法も記載している。
【０２３１】
公開ＰＣＴ出願第ＷＯ９８／０１５５５号は短縮型のｓＴＮＦＲ−Ｉ及びｓＴＮＦＲ−ＩＩについて記載している。いくつかの代表的な短縮型ｓＴＮＦＲ−Ｉとしては限定されないが、メチオニル化型又は非メチオニル化型のｓＴＮＦＲ−Ｉ  ２．６Ｄ／Ｃ１０５、ｓＴＮＦＲ−Ｉ  ２．６Ｄ／Ｃ１０６、ｓＴＮＦＲ−Ｉ  ２．６Ｄ／Ｎ１０５、ｓＴＮＦＲ−Ｉ  ２．３Ｄ／ｄ８、ｓＴＮＦＲ−Ｉ  ２．３Ｄ／ｄ１８、ｓＴＮＦＲ−Ｉ  ２．３Ｄ／ｄ１５、並びにその変異体及び誘導体が挙げられる。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、炎症性及び／又は自己免疫疾患に伴う骨減少の治療方法はＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子と少なくとも１種のセリンプロテアーゼ阻害剤を投与する段階を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のセリンプロテアーゼ阻害剤の投与前、投与と同時、及び／又は投与後にＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を投与することができる。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子と、少なくとも１種のセリンプロテアーゼ阻害剤と、本明細書に記載する少なくとも１種の他の分子を含有する組成物を投与することができる。
【０２３３】
代表的なセリンプロテアーゼ阻害剤は分泌型白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）とそのフラグメント及びアナログである。代表的なセリンプロテアーゼ阻害剤としては限定されないが、更にアンチロイコプロテアーゼ（ＡＬＰ）、粘膜プロテアーゼ阻害剤（ＭＰＩ）、ヒト精漿阻害剤−Ｉ（ＨＵＳＩ−Ｉ）、気管支粘膜阻害剤（ＢＭＩ）及び頸管粘膜阻害剤（ＣＵＳＩ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼ阻害剤としてはＬＰＳモジュレーターも挙げられる。例えばＪｉｎら（１９９７），Ｃｅｌｌ  ８８（３）：４１７−２６参照。いくつかの実施形態では、これらの分子は軟骨に優先的に送られるので、骨減少を生じる症状で使用するのに好適である。
【０２３４】
いくつかの代表的なセリンプロテアーゼ阻害剤は例えば米国特許第４，７６０，１３０号；米国特許第５，９００，４００号；及び米国特許第５，６３３，２２７号に記載されている。上記文献に開示されている分子とその任意変異体又はアナログを「セリンプロテアーゼ阻害剤」と総称する。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、骨減少の治療方法はＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子と少なくとも１種のＩＬ−１８阻害剤を投与する段階を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のＩＬ−１８阻害剤の投与前、投与と同時、及び／又は投与後にＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を投与することができる。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子と、少なくとも１種のＩＬ−１８阻害剤と、本明細書に記載する少なくとも１種の他の分子を含有する組成物を投与する。
【０２３６】
治療することができるいくつかの代表的な症状としては限定されないが、炎症、自己免疫疾患、ＩＬ−１による疾患及びＴＮＦによる疾患が挙げられる。ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子と少なくとも１種のＩＬ−１８阻害剤で治療することができるいくつかの代表的な症状としては限定されないが、関節炎（例えば関節リウマチ）；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）；肝炎；敗血症；並びにこれらの疾患に伴う骨及び軟骨減少が挙げられる。
【０２３７】
いくつかの代表的なＩＬ−１８阻害剤としては限定されないが、ＩＬ−１８と結合する抗体；ＩＬ−１８Ｒと結合する抗体；ＩＬ−１８ＲＡｃＰ；ＩＬ−１８ｂｐ；ＩＬ−１８Ｒフラグメント（例えばＩＬ−１８受容体の可溶化細胞外ドメイン）と結合する抗体；ＩＬ−１８と結合し、ＩＬ−１８Ｒとのその相互作用を抑制又は妨害するペプチド；ＩＬ−１８Ｒと結合し、ＩＬ−１８又はＩＬ−１８ＲＡｃＰとのその相互作用を抑制又は妨害するペプチド；ＩＬ−１８ＲＡｃＰと結合し、ＩＬ−１８Ｒとのその相互作用を抑制又は妨害するペプチド；並びにＩＬ−１８産生又はＩＬ−１８、ＩＬ−１８Ｒ及びＩＬ−１８ＲＡｃＰの間の相互作用を抑制又は妨害する小分子が挙げられる。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、炎症に伴う骨減少を治療するための少なくとも１種の治療剤とＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を併用することができる。いくつかの実施形態では、免疫疾患に伴う骨減少を治療するための少なくとも１種の治療剤とＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を併用することができる。炎症及び免疫疾患のいくつかの代表的な治療剤としては限定されないが、コルチコステロイド（限定されないが、例えばプレドニソロン）；非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（限定されないが、例えば１型シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−１）及び２型シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）阻害剤）；疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）（限定されないが、例えばメトトレキセート、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、シクロスポリン、金化合物（例えばオーラノフィン、オーロチオマレート及びオーロチオグルコース）及びレフルノミド）；ＩＶ型ホスホジエステラーゼ阻害剤（限定されないが、例えばロリプラム及びペントキシフィリン）；タクロリムス（ＦＫ−５０６）；シロリムス（ラパマイシン）；ミコフェノール酸；５−リポキシゲナーゼ阻害剤（限定されないが、例えばジロートン）；インターロイキン−６（ＩＬ−６）のモジュレーター；３８ｋＤａマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ｐ３８−ＭＡＰＫ）の小分子モジュレーター；炎症経路に関与する細胞内分子（限定されないが、例えばｊｎｋ、ＩＫＫ、ＮＦ−κＢ、ＺＡＰ７０及びｌｃｋ）の小分子モジュレーターが挙げられる。いくつかの代表的な炎症治療剤は例えばＣ．Ａ．Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ａｎｄ  Ｌ．Ｌ．Ｍｏｌｄａｗｅｒ  Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：Ａ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡに記載されている。炎症及び自己免疫疾患のいくつかの代表的な治療剤としては限定されないが、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）モジュレーター；ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌのモジュレーター（例えばＯＸ４０の可溶性形態）；４−１ＢＢ／４−１ＢＢリガンドのモジュレーター（例えば４−１ＢＢの可溶性形態）；及びＢ細胞−Ｔ細胞共刺激経路のモジュレーター（限定されないが、例えば受容体リガンド対ＣＤ２８／Ｂ７、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ／Ｂ７ＲＰ１及びＡＧＰ−３／ＴＡＣＩ／ＢＡＦＦＲ（ＡＧＰ−３はＴＡＣＩ及びＢＡＦＦＲ受容体の両者と結合する）のモジュレーター）が挙げられる。Ｂ細胞−Ｔ細胞共刺激経路のいくつかの代表的なモジュレーターとしては限定されないが、ＣＤ２８、Ｂ７．１及びＢ７．２の阻害剤（例えばＢ７．１又はＢ７．２の可溶性形態とＣＴＬＡ４の可溶性形態が挙げられ、いずれも分解を低減もしくは防止及び／又は半減期を延長、毒性を低減、免疫原性を低減、又は溶解度もしくは循環半減期の増加により治療用ポリペプチドの生物活性を増進する異種ペブチド又はポリペプチドと融合することができる）；ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌの阻害剤（例えばＣＤ４０の可溶性形態が挙げられ、異種ペブチド又はポ���ペプチドと融合することができる）；ＩＣＯＳ及びＢ７ＲＰ１の阻害剤（例えばＩＣＯＳの可溶性形態が挙げられ、異種ペブチド又はポリペプチドと融合することができる）；並びにＡＧＰ−３、ＴＡＣＩ及びＢＡＦＦＲの阻害剤（例えばＴＡＣＩ及びＢＡＦＦＲの可溶性形態）が挙げられる。ＩＣＯＳ、Ｂ７ＲＰ１及びその阻害剤は例えばＷＯ００／４６２４０に記載されている。ＡＧＰ−３、ＴＡＣＩ及びＢＡＦＦＲとその阻害剤は例えばＷＯ００／４７７４０、ＷＯ０１／８５８７２、ＷＯ０２／１５２７３、ＷＯ９８／３９３６１、及びｖｏｎ  Ｂｕｌｏｗ  ａｎｄ  Ｂｒａｍ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：１３８−１４０に記載されている。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、癌に伴う骨減少を治療するためにＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を使用することができる。いくつかの実施形態では、悪性及び／又は転移性腫瘍が癌の骨浸潤を促進している癌に伴う骨減少を治療するためにＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を使用することができる。いくつかの代表的な癌としては限定されないが、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌、腎臓癌、肺癌、食道癌、直腸癌、膀胱癌、子宮頸癌、卵巣癌及び肝臓癌、並びに胃腸管の癌が挙げられる。いくつかの実施形態では、例えばいくつかの血液悪性腫瘍に伴う骨減少を治療するためにＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を使用することができる。いくつかの血液悪性腫瘍としては限定されないが、多発性骨髄腫と白血病（ホジキン病を含む）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ホルモン抑制療法に伴う骨減少を治療するためにＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は使用することができる。例えば、このような治療は乳癌や前立腺癌等のホルモン応答性癌の治療に治療することができる。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を単独で投与する。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を少なくとも１種の他の治療剤（限定されないが、例えば少なくとも１種の他の癌治療剤）と併用投与する。いくつかの代表的な癌治療剤としては限定されないが、放射線療法と化学療法が挙げられる。いくつかの代表的な化学療法としては、アントラサイクリン、タキソール、タモキシフェン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル及び当分野で公知の他の薬剤の１種以上による治療が挙げられる。いくつかの実施形態では、癌治療剤は黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＬＨＲＨアンタゴニストはペプチドアンタゴニストである。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、癌治療剤は上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、ｖｅｇＦ、ｖｅｇＦ受容体、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／分散因子（ＳＦ）、ｃ−Ｍｅｔ、アンギオポエチン、Ｔｉｅ２、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、ムチン様糖蛋白、ＣＤＣ２０及びＣＤＣ３３の１種以上の阻害剤である。阻害剤はポリペプチド、抗体、ペプチド、ペプチド−Ｆｃキメラ分子、糖鎖、脂質又は小分子とすることができる。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、癌治療剤は抗体である。いくつかの代表的な治療用抗体としては限定されないが、マウス抗体、マウス−ヒトキメラ抗体、ＣＤＲ−グラフト抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体及び合成抗体（例えば抗体ライブラリーのスクリーニングにより選択した抗体）が挙げられる。いくつかの代表的な抗体としては限定されないが、Ｈｅｒ２、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ３３、ムチン様糖蛋白、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ｖｅｇＦ、ｖｅｇＦ受容体、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／分散因子（ＳＦ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＦＧＲ）と結合し、場合により腫瘍細胞に細胞増殖抑制及び／又は細胞傷害作用を誘導するものが挙げられる。いくつかの代表的な抗体としては限定されないが、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、トラスツズマブ、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）、リツキシマブ、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、ベバシズマブ、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）、イブリツモマブチウキセタン、ＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ（登録商標）、エプラツズマブ、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）、セツキシマブ、ＩＭＣ−Ｃ２２５、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）、トシツモマブ、ヨウ素１３１トシツモマブ、パニツムマブ及びＣａｍｐａｔｈが挙げられる。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、癌治療剤は腫瘍細胞に選択的にアポトーシスを誘導するポリペプチドであり、限定されないが、ＴＮＦ関連ポリペプチドＴＲＡＩＬとＴＲＡＩＬ受容体のアゴニストが挙げられる。いくつかの実施形態では、癌治療剤の投与前、投与と同時、及び投与後の少なくとも１時点でＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を投与することができる。いくつかの実施形態では、転移性癌による骨減少の開始を予防又は緩和するためにＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を予防薬として投与することができる。いくつかの実施形態では、転移に起因する既存の骨減少症状を治療するためにＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を投与することができる。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、多発性骨髄腫に伴う骨減少を予防及び／又は治療するため及び／又は多発性骨髄腫自体を予防及び／又は治療するためにＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を使用することができる。多発性骨髄腫はＢ細胞に由来する腫瘍であり、有意疾病率及び／又は死亡率の原因となる可能性がある。いくつかの場合には、多発性骨髄腫の臨床徴候は局所性骨減少であり、局在領域における破骨細胞活性化の増加に起因すると思われる。多くの骨髄腫患者は放射線分析法により検出可能な骨病変を示し、骨格痛を伴う。いくつかの場合には、骨髄腫患者は患部骨の病的骨折を生じ易く、自然に発生する場合も損傷に起因する場合もある。いくつかの場合には、骨髄腫期間中に生じる骨格病変は骨折の原因となるのみならず、特に脊椎の変形と場合により神経圧縮を来たす。患者によっては、血清カルシウム値の病的増加（高カルシウム血症）が生じ、疾患治療中に大問題となる可能性がある。いくつかの実施形態では、骨吸収とカルシウム放出を抑制又は阻止し、骨折と脊椎変形の危険を減らすために、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を患者に投与することができる。
【０２４５】
いくつかの場合には、骨髄腫細胞は骨破壊に直接的には関与せず、破骨細胞分化及び活性化を誘導する細胞外シグナルを発生する。いくつかの場合には、破骨細胞は特に活性化されると、高レベルのサイトカインＩＬ−６を産生する。ＩＬ−６はＢ細胞増殖因子であり、マウス及びヒト両者の骨髄腫細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖に寄与する。いくつかの場合には、骨髄腫細胞は直接又は間接的にＲＡＮＫＬを産生し、その結果、骨髄スペースに食い込んだ骨髄腫細胞の周囲に局所骨溶解を生じる。いくつかの場合には、骨髄腫細胞に隣接する正常破骨細胞はＩＬ−６を産生し、腫瘍細胞の局所増殖を生じる可能性がある。いくつかの場合には、骨髄腫細胞はクローン性増殖し、不適切な骨吸収により形成される骨スペースを占有する可能性がある。
【０２４６】
齧歯類にＯＰＧを投与すると、破骨細胞集団の迅速な死を誘導することが認められている。例えばＬａｃｅｙら（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７：４３５−４４８参照。いくつかの場合には、破骨細胞数を減らすと、破骨細胞によるＩＬ−６産生増加作用を抑制し、従って、海綿骨内の骨髄腫細胞の増殖と生存を抑制することができる。従って、いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を骨髄腫患者に投与すると、骨吸収を抑制するだけでなく、腫瘍自体の増殖と生存も抑制することができる。
【０２４７】
Ｂ細胞はＲＡＮＫＬの受容体であるＲＡＮＫを発現する。骨髄腫細胞もＲＡＮＫを発現し、更にＲＡＮＫＬも産生する場合がある。いくつかの場合には、同一細胞集団でＲＡＮＫＬとＲＡＮＫの両者を発現させると、骨髄腫細胞の生存を抑制する自己分泌型刺激を生じることができる。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を投与すると、腫瘍細胞生存を抑制することにより、骨髄腫患者に見られる腫瘍の苦痛を低減又は除去することができる。
【０２４８】
ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を含有するいくつかの代表的な医薬組成物
いくつかの実施形態では、治療有効量のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子と、医薬的に許容可能な希釈剤、キャリヤー、溶解補助剤、乳化剤、防腐剤及び／又はアジュバントを含有する医薬組成物を提供する。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、治療有効量のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子と；治療有効量の少なくとも１種の他の治療剤と；医薬的に許容可能な希釈剤、キャリヤー、溶解補助剤、乳化剤、防腐剤及び／又はアジュバントを含有する医薬組成物を提供する。代表的な他の治療剤としては限定されないが、骨形態形成因子（限定されないが、例えばＢＭＰ−１からＢＭＰ−１２）；トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）及びＴＧＦ−βファミリーメンバー；インターロイキン−１（ＩＬ−１）阻害剤（限定されないが、例えばＩＬ−１ｒａとその誘導体、Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）及びアナキンラ）；ＴＮＦα阻害剤（限定されないが、例えば可溶性ＴＮＦα受容体、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）、エタネルセプト、抗ＴＮＦα抗体、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、インフリキシマブ、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）及びアダリムマブ）；副甲状腺ホルモンとそのアナログ、副甲状腺関連蛋白とそのアナログ；Ｅ系プロスタグランジン；ビスホスホネート（例えばアレンドロネート等）；骨強化性ミネラル（限定されないが、例えばフッ化物やカルシウム）；スクレロスチンのモジュレーター；非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（限定されないが、例えばＣｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標）、セレコキシブ、Ｖｉｏｘｘ（登録商標）及びロフェコキシブ等のＣＯＸ−２阻害剤）；免疫抑制剤（限定されないが、例えばメトトレキセートやレフルノミド）；セリンプロテアーゼ阻害剤（限定されないが、例えば分泌型白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ））；ＩＬ−６阻害剤（例えばＩＬ−６阻害剤）、ＩＬ−８阻害剤（例えばＩＬ−８阻害剤）；ＩＬ−１８阻害剤（例えばＩＬ−１８結合性蛋白質又はＩＬ−１８抗体）；インターロイキン−１変換酵素（ＩＣＥ）モジュレーター；線維芽細胞増殖因子（限定されないが、例えばＦＧＦ−１からＦＧＦ−１０）及びＦＧＦモジュレーター；ＰＡＦアンタゴニスト；ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ＫＧＦ関連分子又はＫＧＦモジュレーター；マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）モジュレーター；一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）モジュレーター（例えば誘導性ＮＯＳのモジュレーター）；グルココルチコイド受容体モジュレーター；グルタミン酸受容体モジュレーター；リポ多糖（ＬＰＳ）濃度のモジュレーター；並びにノルアドレナリンとそのモジュレーター及びミメティックが挙げられる。
【０２５０】
いくつかの代表的な医薬組成物は注射、経口投与、肺投与、鼻腔内投与、経皮投与及び／又は他の投与形態による投与用とすることができる。いくつかの実施形態では、許容可能な製剤材料は利用する用量と濃度でレシピエントに非毒性である。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は例えば化合物及び／又はその誘導体のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、臭い、無菌性、安定性、溶解もしくは放出速度、クリアランス速度、組成物の吸収及び／又は浸透を調節、維持及び／又は保持するための１種以上の製剤材料を添加することができる。いくつかの代表的な適切な製剤材料としては限定されないが、アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン及びリジン）；抗微生物剤；酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム及び亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝液（例えば硼酸、重炭酸、酢酸、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸、リン酸及び他の有機酸）；バルク剤（例えばマンニトール、ラクトース及びグリシン）；キレート剤（例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（例えばカフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン及びヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）；増量剤；単糖類；二糖類；及び他の糖類（例えばグルコース、マンノース及びデキストリン）；ポリペプチド（例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン）；着色剤、香味剤及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成性対イオン（例えばナトリウム）；防腐剤（例えば塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸及び過酸化水素）；溶媒（例えばグリセリン、プロピレングリコール及びポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えばマンニトール及びソルビトール）；懸濁剤；添加剤（例えば界面活性剤、湿潤剤、合成界面活性剤及び溶解補助剤）（例えばプルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、ポリソルベート（例えばポリソルベート２０、ポリソルベート８０）、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール）；安定性増進剤（例えばスクロース及びソルビトール）；張度増進剤（例えばアルキル金属ハロゲン化物、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マンニトール、ソルビトール）；送達用ビヒクル；各種緩衝液濃度、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤；ポリマー化合物（例えばポリ乳酸及びポリグリコール酸）；賦形剤及び／又は医薬アジュバントが挙げられる。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）参照。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、所定分子の生理的に許容可能な塩を提供する。生理的に許容可能な塩としては１種以上の医薬用途に適切であることが分かっているか又は新たに発見された任意塩が挙げられる。いくつかの代表的な生理的に許容可能な塩としては限定されないが、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ハロゲン化水素酸塩（例えば塩酸塩及び臭化水素酸塩）、硫酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩及び蓚酸塩が挙げられる。
【０２５３】
各種実施形態では、組成物は液体形態で製造してもよいし、乾燥形態（例えば散剤又は錠剤）でもよい。いくつかの実施形態では、組成物は経皮製剤とすることができる。いくつかの実施形態では、組成物は持続放出用に設計することができる。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、不活性材料を使用して治療剤を希釈することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物の体積を増すために不活性材料も使用できる。代表的なこのような不活性材料としては限定されないが、糖類（例えばマンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストラン及び澱粉）が挙げられる。代表的なこのような不活性材料としては限定されないが、更にいくつかの無機塩類（例えば三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウム）が挙げられる。代表的なこのような不活性材料としては限定されないが、更にＦａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ  １５００、Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ及びＡｖｉｃｅｌｌ等のいくつかの市販希釈剤が挙げられる。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を当分野で公知の半減期延長性ビヒクルと連結する。いくつかの実施形態では、別の治療剤を当分野で公知の半減期延長性ビヒクルと連結する。代表的なこのようなビヒクルとしては限定されないが、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール及びデキストランが挙げられる。このようなビヒクルは例えば米国出願第０９／４２８，０８２号及び公開ＰＣＴ出願第ＷＯ９９／２５０４４号に記載されている。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、最適医薬組成物は例えば所期投与経路、送達フォーマット及び／又は所望用量に応じて当業者により決定されよう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出参照。いくつかの実施形態では、このような組成物はＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を与えることができる。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、医薬組成物中の主ビヒクル又はキャリヤーは本来水性でも非水性でもよい。いくつかの代表的なビヒクル又はキャリヤーとしては限定されないが、注射用水、生理的食塩水又は人工脳脊髄液が挙げられ、場合により、非経口投与用組成物で広く使用されている他の材料を添加してもよい。いくつかの代表的なビヒクル又はキャリヤーとしては限定されないが、中性緩衝食塩水及び血清アルブミンを添加した食塩水が挙げられる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約ｐＨ７．０から８．５のＴｒｉｓ緩衝液を含み、更にソルビトール又は適切なその代替物を添加してもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約ｐＨ４．０から５．５の酢酸緩衝液を含み、更にソルビトール又は適切なその代替物を添加してもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の他の治療剤の共存下又は不在下にＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を含有する組成物は所望純度をもつ選択された組成物を随意製剤成分（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出）と混合することにより、凍結乾燥ケーキ又は水溶液として保存用に製造することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の他の治療剤の共存下又は不在下にＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を含有する組成物はスクロース等の適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として製剤化することができる。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、非経口送達用に医薬組成物を選択することができる。いくつかの実施形態では、組成物は吸入用又は消化管送達（例えば経口）用に選択することができる。いくつかのこのような医薬的に許容可能な組成物の製造は当業者が容易に実施可能である。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、製剤成分は投与部位に許容可能な濃度で存在する。いくつかの実施形態では、組成物を生理的ｐＨ又はやや高いｐＨ、一般に約５から約８（両端間の全点を含む）のｐＨ範囲に維持するために緩衝液を使用する。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、非経口投与用とする場合には、治療用組成物は医薬的に許容可能なビヒクル中に他の治療剤の共存下又は不在下で所望ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を含有する非経口投与に許容可能なパイロジェンフリー水溶液の形態とすることができる。いくつかの実施形態では、非経口注射用ビヒクルは滅菌蒸留水であり、少なくとも１種の他の治療剤の共存下又は不在下でＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を加え、適正に防腐処理した滅菌等張溶液として製剤化する。いくつかの実施形態では、薬剤の制御又は持続放出を可能にする物質（例えば注射用マイクロスフェア、生分解性粒子、生体ポリマー化合物（例えばポリ乳酸又はポリグリコール酸）、ビーズ又はリポソーム）を使用して所望分子を製剤化した後にデポー注射により送達することができる。いくつかの実施形態では、ヒアルロン酸を使用することができ、循環系持続期間を延ばす効果を発揮することができる。いくつかの実施形態では、所望分子を導入するために移植型薬剤送達装置を使用することができる。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、吸入用に医薬組成物を製剤化することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の他の治療剤の共存下又は不在下にＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を吸入用乾燥粉末として製剤化することができる。いくつかの実施形態では、エアゾール送達用噴射剤を使用し、少なくとも１種の他の治療剤の共存下又は不在下にＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を含有する吸入用溶液を製造することができる。いくつかの実施形態では、溶液を噴霧することができる。いくつかの代表的な肺投与はＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５に記載されており、同文献は化学的に修飾されたポリペプチドの肺送達について記載している。各種ポリペプチドのいくつかの代表的な肺投与は例えばＡｄｊｅｉら，Ｐｈａｒｍａ．Ｒｅｓ．（１９９０）７：５６５−９；Ａｄｊｅｉら（１９９０），Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ６３：１３５−４４（酢酸ロイプロリド）；Ｂｒａｑｕｅｔら（１９８９），Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３（ｓｕｐｐｌ．５）：ｓ．１４３−１４６（エンドセリン−１）；Ｈｕｂｂａｒｄら（１９８９），Ａｎｎａｌｓ  Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．３：２０６−１２（α１−アンチトリプシン）；Ｓｍｉｔｈら（１９８９），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１１４５−６（α１−プロテイナーゼ）；Ｏｓｗｅｉｎら（Ｍａｒｃｈ  １９９０），“Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．Ｒｅｓｐ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ＩＩ，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ（組換えヒト成長ホルモン）；Ｄｅｂｓら（１９８８），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３４８２−８（インターフエロン−γ及び腫瘍壊死因子α）；及びＰｌａｔｚら，米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）に記載されている。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、医薬組成物の肺投与に機械的装置を使用する。いくつかの代表的な機械的装置としては限定されないが、ネブライザー、定量噴霧式吸入器及び粉末吸入器が挙げられ、そのいくつかのものは当業者に公知である。いくつかの代表的な市販機械的装置としては限定されないが、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ製品）；Ａｃｏｒｎ  ＩＩネブライザー（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ製品）；Ｖｅｎｔｏｌｉｎ定量噴霧式吸入器（Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ製品）；及びＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ製品）が挙げられる。いくつかの実施形態では、機械的装置で分散するのに特に適した医薬組成物製剤と共に機械的装置を使用する。いくつかの実施形態では、このような製剤は前記装置で使用するのに適した噴射剤を含有する。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、遠位肺に最も有効に送達するための粒状形態で１種以上の治療剤を製造する。いくつかの実施形態では、このような粒状形態は平均粒度１０μｍ未満である。いくつかの実施形態では、このような粒状形態は平均粒度約０．５から５μｍ（両端間の全点を含む）である。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、肺投与用医薬組成物は医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する。いくつかのこのようなキャリヤーとしては限定されないが、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース及びソルビトール等の糖類が挙げられる。肺投与用医薬組成物に添加することができるいくつかの代表的なキャリヤーとしては限定されないが、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ及びＤＯＰＣ；天然及び合成界面活性剤；ＰＥＧ；デキストラン（例えばシクロデキストラン）；胆汁酸塩及び他の関連増進剤；セルロース及びセルロース誘導体；アミノ酸；リポソーム；マイクロカプセル及びマイクロスフェア；並びに封入複合体が挙げられる。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、（ジェット式又は超音波式）ネブライザー用製剤は水に溶かした１種以上の治療剤を含有する。いくつかの実施形態では、１種以上の治療剤は約０．１から２５ｍｇ／ｍｌ（両端間の全点を含む）の濃度で溶かす。いくつかのこのような製剤としては限定されないが、１種以上の緩衝液及び／又は１種以上の単糖類が挙げられる。いくつかの実施形態では、緩衝液及び／又は単糖類を添加し、ポリペプチド安定化と浸透圧調節を増進する。いくつかの実施形態では、ネブライザー製剤は１種以上の界面活性剤を含有する。いくつかの実施形態では、界面活性剤はエアゾールを形成するために溶液を噴霧することにより生じる１種以上の治療剤の表面凝集を抑制又は防止することができる。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、定量噴霧式吸入装置用製剤は界面活性剤を利用して噴射剤に懸濁した１種以上の治療剤を含有する微粉状粉末を含む。いくつかの実施形態では、噴射剤はこの目的に利用される任意慣用材料とすることができる。いくつかの代表的な材料としては限定されないが、クロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン及びハイドロカーボン（例えばトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタエタノール及び１，１，１，２−テトラフルオロエタン）、並びにその組み合わせが挙げられる。いくつかの代表的な界面活性剤としては限定されないが、トリオレイン酸ソルビタン、オレイン酸及び大豆レシチンが挙げられる。いくつかの実施形態では、吸入装置用製剤は１種以上のバルク剤を含有する。バルク剤としては限定されないが、ラクトース、ソルビトーロ、スクロース、マンニトール、トレハロース及びキシリトールが挙げられる。いくつかのこのようなバルク剤はいくつかの実施形態では製剤の５０から９０重量％（両端間の全点を含む）を構成することができ、いくつかの実施形態では、装置から粉末を分散し易くすることができる。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、鼻腔内投与用医薬組成物を製剤化することができる。いくつかの実施形態では、このような製剤はデキストラン及び／又はシクロデキストランを含有する。いくつかの実施形態では、他の粘膜輸送による送達も考えられる。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、製剤を経口投与することが考えられる。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の他の治療剤の共存下又は不在下でこのように投与されるＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子は錠剤、カプセル剤、ピル、トローチ及びロゼンジ、カシェ剤又はペレット剤等の固体剤形の配合に通常使用されているキャリヤーの存在下又は不在下で製剤化することができる。いくつかの実施形態では、リポソーム又はプロテイノイド封入を使用して組成物を製造することができる（例えば米国特許第４，９２５，６７３号に記載のプロテイノイドマイクロスフェア）。いくつかの実施形態では、バイオアベイラビリティを最大にする時点及び／又は早期全身分解を最小にする時点で胃腸管内の点に製剤の活性部分を放出するようにカプセル剤を設計することができる。いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子の吸収を助長するために少なくとも１種の添加剤を添加することができる。いくつかの実施形態では、１種以上の他の治療剤の吸収を助長するために少なくとも１種の添加剤を添加することができる。いくつかの実施形態では、他の成分を使用することができる。いくつかの他の成分としては限定されないが、希釈剤、香味剤、低融点ロウ、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤及び結合剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、リポソーム封入を使用することができる。いくつかの実施形態では、リポソームを各種ポリマーで誘導体化することができる（例えば米国特許第５，０１３，５５６号参照）。いくつかの代表的な治療薬用固体剤形については例えばＭａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（１９７９），Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓ編の第１０章に記載されている。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は錠剤の製造に適した非毒性賦形剤との混合物として、少なくとも１種の他の治療剤の共存下又は不在下で有効量のＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を含有することができる。いくつかの実施形態では、錠剤を滅菌水又は別の適切なビヒクルに溶かすことにより、単位用量形態で溶液剤を製造することができる。いくつかの代表的な賦形剤としては限定されないが、不活性希釈剤（例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ラクトース及びリン酸カルシウム）；結合剤（例えば澱粉、ゼラチン及びアラビアガム）；及び滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク）が挙げられる。
【０２７０】
その他のいくつかの代表的な医薬組成物も当業者に自明であり、例えば持続又は制御送達製剤中に少なくとも１種の他の治療剤の共存下又は不在下でＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰペブチドキメラ分子を含有する製剤が挙げられる。持続又は制御送達ビヒクルのいくつかの代表的な製剤化技術としては限定されないが、リポソームキャリヤー、生分解性微粒子及び多孔質ビーズ、並びにデポー注射が挙げられる。このような持続又は制御送達ビヒクルのいくつかの代表的な製剤化技術は当分野で公知である。いくつかの実施形態では、拡散及び／又は浸出メカニズムにより放出を可能にする不活性マトリックスに少なくとも１種の他の治療剤の共存下又は不在下でＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を組込むことができる。いくつかの実施形態では、遅劣化性マトリックス（例えばアルギン酸塩及び／又は多糖類）も製剤に組込むことができる。いくつかの腸溶コーティングは遅延放出効果を発揮することができる。ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号も医薬組成物の送達のための多孔質ポリマー微粒子の制御放出について記載している。いくつかの実施形態では、徐放性製剤は半透過性ポリマーマトリックスを組込むことができる。いくつかの実施形態では、このような半透過性ポリマーマトリックスは水を侵入させ、浸透圧作用により単一小孔から薬剤を押し出すことができる。例えばＯｒｏｓ治療システム（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．）参照。いくつかの実施形態では、このような半透過性ポリマーマトリックスは成形品（例えばフィルム又はマイクロカプセル）の形態である。いくつかの代表的な徐放性マトリックスとしては限定されないが、ポリエステル、ハイドロゲル、ポリラクチド（Ｕ．Ｓ．３，７７３，９１９及びＥＰ０５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸γエチルエステルのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）及びＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら，前出）、及びポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。いくつかの実施形態では、徐放性組成物としては当分野で公知の数種の方法の任意のものにより製造可能なリポソームが挙げられる。例えばＥｐｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；ＥＰ０３６，６７６；ＥＰ０８８，０４６及びＥＰ１４３，９４９参照。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、経口送達を有効にするためにＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を化学的に修飾することができる。いくつかの実施形態では、経口送達を有効にするために１種以上の他の治療剤を化学的に修飾することができる。いくつかの実施形態では、化学修飾は（ａ）蛋白分解の抑制；及び／又は（ｂ）胃もしくは腸から血流への取込み；及び／又は（ｃ）治療剤の安定性の増加；及び／又は（ｄ）治療剤の体内循環時間の増加を可能にするビヒクルを治療剤に結合することにより実施される。いくつかのこのようなビヒクルとしては限定されないが、ＰＥＧ、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−チオキソカン、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリプロリンが挙げられる。例えばＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ，Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ（１９８１），Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，，ｐｐ．３６７−８３；及びＮｅｗｍａｒｋら（１９８２），Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５−９参照。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、治療剤の吸収を増進するために、Ｎ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸ナトリウム（ＳＮＡＣ）等の修飾脂肪族アミノ酸の塩をキャリヤーとして使用することができる。例えば米国特許第５，７９２，４５１号参照。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、顆粒剤やペレット剤等の微小多粒子として治療剤を製剤化することができる。いくつかの実施形態では、このような顆粒剤又はペレット剤は粒度約１ｍｍである。いくつかの実施形態では、カプセル投与用として、弱圧縮粉末プラグ又は錠剤として治療剤を製剤化することができる。いくつかの実施形態では、製剤を形成するために圧縮を使用することができる。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、医薬組成物に１種以上の着色剤及び／又は香味剤を添加することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は１種以上の治療剤を含有する飲料形態とすることができる。いくつかの実施形態では、例えばリポソーム又はマイクロスフェア封入により１種以上の治療剤を調製した後に飲料に加えることができる。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、１種以上の崩壊剤を医薬組成物に添加することができる。いくつかの代表的な崩壊剤としては限定されないが、澱粉が挙げられ、Ｅｘｐｌｏｔａｂ等の澱粉をベースとする市販崩壊剤が挙げられる。いくつかの代表的な崩壊剤としては限定されないが、澱粉グリコール酸ナトリウム、アンバーライト、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、カルボキシメチルセルロース酸、天然海綿、アルギン酸とそのナトリウム塩及びベントナイトが挙げられる。いくつかの代表的な崩壊剤としては限定されないが、不溶性カチオン交換樹脂が挙げられる。いくつかの実施形態では、寒天、カラヤガム及び／又はトラガカントガム等の粉末ガムも崩壊剤及び／又は結合剤（以下に記載）として使用することができる。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、１種以上の治療剤を例えば錠剤形態に保持するために１種以上の結合剤を使用することができる。いくつかの実施形態では、結合剤としては、例えばアカシアガム、トラガカントガム、澱粉及び／又はゼラチン等の天然物に由来する材料が挙げられる。いくつかの代表的な結合剤としては限定されないが、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、１種以上の治療剤を顆粒化するためにポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及び／又はヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）をアルコール溶液で使用することができる。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、製剤化工程中の粘着を防止するために、１種以上の治療剤の製剤に減摩剤を添加することができる。いくつかの代表的な減摩剤としては限定されないが、滑沢剤が挙げられ、限定されないが、ステアリン酸（そのマグネシウム及びカルシウム塩を含む）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、液体パラフィン、植物油及びロウが挙げられる。いくつかの代表的な減摩剤としては限定されないが、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、各種分子量のポリエチレングリコール、並びにＣａｒｂｏｗａｘ  ４０００及び６０００等の可溶性滑沢剤が挙げられる。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、流動促進剤は製剤化中に１種以上の治療剤及び／又は医薬組成物の流動性を改善することができる。いくつかの実施形態では、流動促進剤は圧縮中に再配置を助長することもできる。いくつかの代表的な流動促進剤としては限定されないが、澱粉、タルク、火成性シリカ及び水和アルミノ珪酸塩が挙げられる。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は１種以上の界面活性剤を含有する。いくつかの実施形態では、界面活性剤は湿潤剤として作用し、医薬組成物の水性環境溶解を助長することができる。いくつかの代表的な界面活性剤としては限定されないが、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホ琥珀酸ジオクチルナトリウム及びスルホン酸ジオクチルナトリウム等のアニオン性界面活性剤；塩化ベンズアルコニウムや塩化ベンズエトニウム等のカチオン性界面活性剤；ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン水素化ひまし油１０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５及び８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロース等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、化合物の取り込みを増進するために１種以上の添加剤も組成物に添加する。いくつかのこのような添加剤としては限定されないが、オレイン酸、リノール酸及びリノレン酸等の脂肪酸が挙げられる。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、１種以上のコーティングを医薬組成物に加えることができる。いくつかの代表的なコーティングとしては限定されないが、糖類、非腸溶材料（例えばメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポビドン及びポリエチレングリコール）、及び腸溶材料（例えばフタル酸エステル）が挙げられる。いくつかの実施形態では、材料混合物により最適なフィルムコーティングが得られる。各種実施形態では、フィルムコーティングはパンコーター、流動層及び／又は圧縮コーティングにより実施することができる。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与用医薬組成物は無菌である。いくつかの実施形態では、これは滅菌濾過膜で濾過することにより実施することができる。組成物を凍結乾燥するいくつかの実施形態では、この方法を使用する滅菌は凍結乾燥及び再構成の前後のいずれに実施してもよい。いくつかの実施形態では、非経口投与用組成物は凍結乾燥形態又は溶液で保存することができる。いくつかの実施形態では、非経口用組成物は一般に滅菌出口をもつ容器（例えば皮下注射針により穿孔可能なストッパーを取付けた静注溶液バッグ又はバイアル）に収容する。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、医薬組成物を製剤化後に、溶液、懸濁液、ジェル、エマルション、固体又は脱水もしくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアルに保存することができる。いくつかの実施形態では、このような製剤は即使用形態又は投与前に再構成する形態（例えば凍結乾燥）で保存することができる。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、単一用量投与単位の作製用キットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは各々乾燥ポリペプチドを収容する第１の容器と、水性製剤を収容する第２の容器を含むことができる。いくつかの実施形態では、シングル及びマルチチャンバープレフィルドシリンジ（例えば液体シリンジやリオシリンジ）を含むキットを提供する。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の他の治療剤の共存下又は不在下でＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を含有する医薬組成物の治療に利用する有効量は例えば治療状況と目的により異なる。従って、当業者に自明の通り、いくつかの実施形態によると、治療に適した用量レベルは送達する分子；少なくとも１種の他の治療剤の共存下又は不在下でＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を使用している適応症；投与経路；及び／又は患者の寸法（体重、体表面積又は臓器寸法）；及び／又は患者の条件（年齢及び一般健康状態）により異なる。いくつかの実施形態では、臨床医は患者の性別及び／又は食事及び／又は任意感染症の重篤度を考慮することができる。いくつかの実施形態では、臨床医は最適治療効果が得られるように用量を調整し、投与経路を変更することができる。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、投与頻度は使用する製剤におけるＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子の薬物動態パラメーターを考慮する。いくつかの実施形態では、投与頻度は使用する製剤における１種以上の他の治療剤の薬物動態パラメーターを考慮する。いくつかの実施形態では、臨床医は所望効果を達成する用量に達するまで組成物を投与する。従って、いくつかの実施形態では、組成物は単一用量として投与してもよいし、（同一量の所望分子を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい）２用量以上として時間をかけて投与してもよいし、移植装置、カテーテル又は他の方法で連続輸液として投与してもよい。いくつかの実施形態では、適切な用量を更に精緻化することは当業者により日常的に実施され、当業者が日常的に実施する作業の範囲内である。いくつかの実施形態では、適切な用量は適切な用量応答データを使用することにより確認することができる。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子治療はＰＴＨ単独の投与よりも投与頻度を減らすことができる。Ｆｏｒｔｅｏ（登録商標）（テラパラチド）はＰＴＨ［１−３４］を含有しており、２０μｇ用量として１日１回投与する。Ｐｒｅｏｓ（登録商標）はＰＴＨ［１−８４］を含有しており、１００μｇ用量として１日１回投与する。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ［１−３４］又はＰＴＨ［１−８４］を１日１回投与する場合と同等の効果を達成するためにＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を週１回投与する。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ［１−３４］又はＰＴＨ［１−８４］を１日１回投与する場合と同等の効果を達成するためにＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を２週間に１回、３週間に１回又は４週間に１回投与する。いくつかの実施形態では、ＰＴＨ［１−３４］又はＰＴＨ［１−８４］を１日１回投与する場合と同等の効果を達成するためにＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を１カ月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、半年に１回又は１年に１回投与する。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、典型的用量は上記因子に応じて約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ（両端間の全点を含む）又はそれ以上とすることができる。いくつかの実施形態では、用量は約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ；又は約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ；又は約５μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ；又は約０．５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ；又は約０．５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ；又は約０．５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇとすることができる。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、医薬組成物の投与経路はいくつかの公知方法に従う。いくつかの代表的な投与経路としては限定されないが、経口、静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼球内、動脈内、門脈内及び／又は病変内経路による注射；徐放システム及び／又は移植装置が挙げられる。いくつかの実施形態では、組成物はボーラス注射、連続輸液及び／又は移植装置により投与することができる。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、組成物は所望分子を吸収又は封入した膜、スポンジ又は別の適切な材料の移植により局所投与することができる。移植装置を使用するいくつかの実施形態では、装置は適切な任意組織又は臓器に移植することができ、拡散、時限放出ボーラス及び／又は連続投与により所望分子を送達することができる。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の他の治療剤の共存下又は不在下でＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を含有する医薬組成物をｅｘ  ｖｉｖｏ使用することが望ましい場合もある。このような場合には、細胞、組織及び／又は臓器を患者から摘出し、少なくとも１種の他の治療剤の共存下又は不在下でＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を含有する医薬組成物と接触させた後に、細胞、組織及び／又は臓器を患者に再移植する。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えした所定細胞を移植することにより、ＲＡＮＫＬ抗体−ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰキメラ分子を送達することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えした所定細胞を移植することにより、１種以上の他の治療剤を送達することができる。移植方法としては限定されないが、本明細書に記載する方法と当分野で公知の他の方法が挙げられる。いくつかの実施形態では、移植した遺伝子組換え細胞は特定分子を発現及び分泌する。いくつかの実施形態では、このような細胞は動物又はヒト細胞とすることができ、自家、他家又は異種とすることができる。いくつかの実施形態では、細胞は不死化することができる。いくつかの実施形態では、免疫応答の可能性を少なくするために、周囲組織の浸潤を避けるように細胞を封入することができる。いくつかの実施形態では、封入材料は一般にポリペプチド剤の放出を可能にするが、患者の免疫系又は周囲組織からの他の有害因子による細胞の破壊を防止する生体適合性の半透過性ポリマー封入物又は膜である。
【０２９３】
（実施例）
以下の実施例は実施した実験と得られた結果について記載し、例証のみを目的とし、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０２９４】
ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１軽鎖発現プラスミドの作製
図７に示す配列（配列番号５）をもつ合成オリゴヌクレオチドをＰｉｃｏｓｃｒｉｐｔ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から入手した。このオリゴヌクレオチド配列は５’ＸｂａＩ制限部位（ＴＣＴＡＧＡ）とこれに続くコザック配列（ＣＣＡＣＣ）（図７に太字で示す）を含む。このオリゴヌクレオチド配列は更にヒトプレプロ副甲状腺蛋白（プレプロＰＴＨ）の最初の６５アミノ酸の合成コーディング配列も含む。例えばＧｅｎｂａｎｋアクセション番号ＣＡＡ２３８４３参照。ヒトプレプロＰＴＨの最初の６５アミノ酸はプレプロ領域とヒトＰＴＨ調節領域のアミノ酸１−３４を含む。このオリゴヌクレオチド配列は更に螺旋リンカー配列のコーディング配列ＧＧＧＡＰも含む。このリンカーコーディング配列は更にＢＳＳＨＩＩ制限部位（ＧＣＧＣＧＣ）も含む。この合成オリゴヌクレオチドを送達前にＰｉｃｏｓｃｒｉｐｔによりプラスミドｐＣＲ４．０−ＴＯＰＯにクローニングした（オリゴ−ｐＣＲ４．０  ＴＯＰＯ）。Ｏｌｉｇｏ−ｐＣＲ４．０  ＴＯＰＯをＸｂａＩ及びＢｓｓＨＩＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｓｙｎＰＴＨコーディング配列を遊離させた。ｓｙｎＰＴＨコーディング配列をアガロースゲル電気泳動により分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。
【０２９５】
αＲＡＮＫＬ−１（別称αＯＰＧＬ−１）軽鎖をαＲＡＮＫＬ−１−κ／ｐＤＳＲα１９プラスミド（別称αＯＰＧＬ−１−κ／ｐＤＳＲα１９，ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／００２７１３号に記載）から以下のように増幅した。Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用するＰＣＲ反応でαＲＡＮＫＬ−１−κ／ｐＤＳＲα１９プラスミドＤＮＡ１０ｎｇを使用した。以下のプライマーを反応に使用した。
５’αＲＡＮＫＬ−１κＢｓｓＨＩＩプライマー（配列番号２１４）：
【０２９６】
【化２】
2009515903.tif 000031
３’ヒトκ定常領域プライマー（配列番号２１５）：
【０２９７】
【化３】
2009515903.tif 000032
【０２９８】
ＰＣＲ反応の結果、Ｎ末端にリンカー配列の３アミノ酸（ＧＡＰ）を付加したαＲＡＮＫＬ−１軽鎖のアミノ酸配列をコードする６７１塩基対ＰＣＲ産物が得られた。６７１塩基対ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。精製後に、６７１塩基対ＰＣＲ産物をＢｓｓＨＩＩとＳａｌＩで消化し、アガロースゲル電気泳動により分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。精製フラグメントを本明細書ではαＲＡＮＫＬ−１κ＋リンカーコーディング配列と言う。
【０２９９】
Ｔ４リガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を製造業者の推奨緩衝液中で使用し、ＸｂａＩとＳａｌＩで予め消化しておいたプラスミドｐＤＳＲα２０に精製ｓｙｎＰＴＨコーディング配列と精製αＲＡＮＫＬ−１κ＋リンカーコーディング配列を４℃で一晩ライゲーションした。ｐＤＳＲα２０は、２５６３位のグアノシンを部位特異的突然変異誘発法によりアデノシンに突然変異させることによりｐＤＳＲα１９（ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１４３６３号参照）から作製した。ライゲーション産物をコンピテントＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、細胞をアンピシリン耐性について選択した。陽性クローンからのプラスミドを単離し、インサートをＤＮＡシーケンシングにより確認した。インサートの配列を図９（配列番号７）に示す。この配列は図１０に示すアミノ酸配列（配列番号８）をもつポリペプチド（「ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１κ」又は「ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１軽鎖」と言う）をコードする。このポリペプチドと図２のアミノ酸配列（配列番号２）をもつポリペプチドの複合体を「ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１軽鎖融合体」又は「ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＬＣＦ」と言う。
【０３００】
発現ベクターｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１−κｐＤＳＲα２０の模式図を図１３に示す。発現ベクターは５３２６塩基対をもち、表５に示す機能的領域を含む。
【０３０１】
【表７】
2009515903.tif 000033
【実施例２】
【０３０２】
ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖発現プラスミドの作製
ｓｙｎＰＴＨコーディング配列は実施例１に上述したように作製した。
【０３０３】
αＲＡＮＫＬ−１（別称αＯＰＧＬ−１）重鎖はαＲＡＮＫＬ−１−ＩｇＧ２／ｐＤＳＲα１９プラスミド（別称αＯＰＧＬ−１−ＩｇＧ２／ｐＤＳＲα１９，ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／００２７１３号に記載）から以下のように増幅した。Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用するＰＣＲ反応でαＲＡＮＫＬ−１−ＩｇＧ２／ｐＤＳＲα１９プラスミドＤＮＡ  １０ｎｇを使用した。以下のプライマーを反応に使用した。
５’αＲＡＮＫＬ−１  ＩｇＧ２  ＢｓｓＨＩＩプライマー（配列番号２１６）：
【０３０４】
【化４】
2009515903.tif 000034
３’ヒトＩｇＧ２定常領域プライマー（配列番号２１７）：
【０３０５】
【化５】
2009515903.tif 000035
【０３０６】
ＰＣＲ反応の結果、Ｎ末端にリンカー配列の３アミノ酸（ＧＡＰ）を付加したαＲＡＮＫＬ−１重鎖のアミノ酸配列をコードする１３７２塩基対ＰＣＲ産物が得られた。１３７２塩基対ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。精製後に、１３７２塩基対ＰＣＲ産物をＢｓｓＨＩＩとＳａｌＩで消化し、アガロースゲル電気泳動により分離した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。精製フラグメントを本明細書ではαＲＡＮＫＬ−１  ＩｇＧ２＋リンカーコーディング配列と言う。
【０３０７】
Ｔ４リガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を製造業者の推奨緩衝液中で使用し、ＸｂａＩとＳａｌＩで予め消化しておいたプラスミドｐＤＳＲα２０に精製ｓｙｎＰＴＨコーディング配列と精製αＲＡＮＫＬ−１  ＩｇＧ２＋リンカーコーディング配列を４℃で一晩ライゲーションした。ライゲーション産物をコンピテントＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、細胞をアンピシリン耐性について選択した。陽性クローンからのプラスミドを単離し、インサートをＤＮＡシーケンシングにより確認した。インサートのＤＮＡ配列を図１１（配列番号９）に示し、図１１のＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドは図１２に示すアミノ酸配列（配列番号１０）をもつ。このポリペプチドを「ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＩｇＧ２」又は「ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖」と言う。このポリペプチドと図４のアミノ酸配列（配列番号４）をもつポリペプチドの複合体を「ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体」又は「ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ」と言う。
【０３０８】
発現ベクターｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１−ＩｇＧ２  ｐＤＳＲα２０の模式図を図１４に示す。発現ベクターは６３２３塩基対をもち、表６に示す機能的領域を含む。
【０３０９】
【表８】
2009515903.tif 000036
【実施例３】
【０３１０】
ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１の発現
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における発現
ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を発現させるために、リン酸カルシウム法を使用してジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損（ＤＨＦＲ−）無血清順応ＣＨＯ  ＡＭ−１／Ｄ（米国特許第６，２１０，９２４号に記載）細胞にｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１−ＩｇＧ２  ｐＤＳＲα２０とαＲＡＮＫＬ−１−κ／ｐＤＳＲα１９（別称αＯＰＧＬ−１−κ／ｐＤＳＲα１９；ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／００２７１３参照）をコトランスフェクトした。ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１軽鎖融合体を発現させるために、リン酸カルシウム法を使用してジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損（ＤＨＦＲ−）無血清順応ＣＨＯ  ＡＭ−１／Ｄ細胞にｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１−κｐＤＳＲα２０とαＲＡＮＫＬ−１−ＩｇＧ２／ｐＤＳＲα１９（別称αＯＰＧＬ−１−ＩｇＧ２／ｐＤＳＲα１９；ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／００２７１３参照）をコトランスフェクトした。
【０３１１】
ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体及びｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１軽鎖融合体の各々の発現は以下のように実施した。トランスフェクトした細胞を１０ｃｍプレートに撒き、１×非必須アミノ酸、１×ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン及び１×ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＤＭＥＭ培地に透析胎仔ウシ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、ヒポキサンチン−チミジンを添加せずに細胞を選択し、ＤＨＦＲ酵素を発現する細胞を選択した。３から４日置きに培地を交換しながら２週間選択後に、トランスフェクトしたクローンのマスタープールに生存コロニーを加えた。トランスフェクトした細胞のマスタープールからの馴化培地のアリコートをウェスタンブロットによりスクリーニングし、分泌型ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１軽鎖キメラ分子及び／又は分泌型ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖キメラ分子の発現を確認した。トランスフェクトした細胞のマスタープールをＴ１７５フラスコで分割及び培地交換しながら２から３週間増殖させ、８００ｃｍ２容ローラーボトルに１本当たり細胞２×１０７個を播種した。２日後に、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、無血清培地に移した。細胞を１週間増殖させ、培地を馴化させた。７日間馴化させた無血清培地から２から３回回収したものを合わせて組換え蛋白精製に使用した。
【０３１２】
２９３Ｔ細胞における発現
ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖＋軽鎖融合体（別称ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣ＋ＬＣＦ）を発現させるために、予め無血清培地での増殖に順応させておいた２９３Ｔ細胞にｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１−ＩｇＧ２  ｐＤＳＲα２０とｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１−κｐＤＳＲα２０をコトランスフェクトした。トランスフェクションは培養液５００ｍｌＬ又は１Ｌ中で以下のように実施した。細胞接種材料（細胞５×１０５個／ｍＬ×培養液容量）を２５００ｒｐｍで１０分間４℃にて遠心し、馴化培地を除去した。細胞を無血清ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁し、再び２５００ｒｐｍで１０分間４℃にて遠心した。洗浄液の吸引後、細胞を１Ｌ又は３Ｌ容回転フラスコで増殖培地（３：１比のＤＭＥＭ／Ｆ１２に１×インスリン−トランスフェリン−セレンサプリメント、１×ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．０１％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８を添加）に再懸濁した。回転フラスコ培養を３７℃で５％  ＣＯ２の加湿インキュベーターにて１２５ｒｐｍで撹拌下に維持した。
【０３１３】
５０ｍＬ容コニカルチューブでプラスミドＤＮＡをトランスフェクション試薬（Ｘ−ＴｒｅｍｅＧｅｎｅ  ＲＯ−１５３９；Ｒｏｃｈｅ）と以下のように複合体化した。プラスミドＤＮＡ  １μｇ／ｍＬ培養液を最終培養液容量の５％までの無血清ＤＭＥＭに加えた後に、Ｘ−ＴｒｅｍｅＧｅｎｅ  ＲＯ−１５３９（Ｒｏｃｈｅ）１μｌ／ｍＬ培養液を加えた。ＤＮＡ／トランスフェクション試薬複合体を室温で約３０分間インキュベートした後、回転フラスコ内の細胞に加えた。トランスフェクション／発現を７日間実施した後、４０００ｒｐｍで６０分間４℃にて遠心することにより馴化培地を回収した。
【実施例４】
【０３１４】
ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１の精製
ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（αＲＡＮＫＬ−１重鎖に融合したｓｙｎＰＴＨ（配列番号１０）とαＲＡＮＫＬ−１軽鎖（配列番号４）の複合体）、ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１軽鎖融合体（αＲＡＮＫＬ−１軽鎖に融合したｓｙｎＰＴＨ（配列番号８）とαＲＡＮＫＬ−１重鎖（配列番号２）の複合体）、又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖＋軽鎖融合体（αＲＡＮＫＬ−１重鎖に融合したｓｙｎＰＴＨと（配列番号１０）αＲＡＮＫＬ−１軽鎖に融合したｓｙｎＰＴＨ（配列番号８）の複合体）を宿主細胞から以下のように精製した。全精製工程は室温で実施した。
【０３１５】
ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体とｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１軽鎖融合体の精製
ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体とｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１軽鎖融合体のＣＨＯ細胞発現からの宿主細胞培養液（ＣＣＦ）をＢｅｃｋｍａｎ  ＪＳ−４．２ローターで１時間４℃にて３５００ｒｐｍで別々に遠心し、細胞破片を除去した。次にＣＣＦ上清を滅菌０．２μｍフィルターで濾過した。場合により、その後、１０ｋＤ又は３０ｋＤ分子量カットオフメンブレンを使用して濾過後のＣＣＦ上清をクロスフロー限外濾過により濃縮した。次に、ＰＢＳで平衡化しておいたＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にＣＣＦ上清をロードした。ローディング後に、フロースルーの２８０ｎｍ吸光度が基線に戻るまでカラムをＰＢＳで洗浄した。２０ｍＭ酢酸、１０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ３．２を使用してｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１をカラムから溶出させた。溶出液の２８０ｎｍの吸光度をモニターし、蛋白質を含有するフラクションを採取した。溶出液１ｍｌ当たり２０μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基，ｐＨ１１を分画管に加えた。
【０３１６】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムから溶出したｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１を５０％酢酸でｐＨ５．０に調整した後、２０ｍＭ酢酸，ｐＨ５．０で平衡化しておいたカチオン交換カラム（ＳＰＨＰクロマトグラフィー樹脂，Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に直接ロードした。ローディング後に、カラムを２０ｍＭ酢酸，ｐＨ５．０で洗浄した。次に、２０ｍＭ酢酸，ｐＨ５．０中０Ｍ塩化ナトリウム→０．５Ｍ塩化ナトリウムの直線勾配を使用してｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１を溶出させた。溶出液の２８０ｎｍの吸光度をモニターし、溶出したｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１をフラクション毎に採取した。フラクションをＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりアッセイし、ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１の予想サイズで泳動したポリペプチドを含有するフラクションを同定した。
【０３１７】
ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１軽鎖融合体を含有するフラクションを別々にプールし、０．２μ  Ｐｏｓｉｄｙｎｅフィルターで濾過し、分画した後、２０ｍＭ酢酸ナトリウム，３５０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ５．０中で４℃にて保存した。
【０３１８】
ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖＋軽鎖融合体の精製
ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖＋軽鎖融合体の２９３Ｔ細胞発現からの宿主細胞培養液（ＣＣＦ）をＢｅｃｋｍａｎ  ＪＳ−４．２ローターで１時間４℃にて３５００ｒｐｍで遠心し、細胞破片を除去した。次にＣＣＦ上清を滅菌０．２μｍフィルターで濾過した。場合により、１０ｋＤ又は３０ｋＤ分子量カットオフメンブレンを使用して濾過後のＣＣＦ上清をクロスフロー限外濾過により濃縮した。次に、ＰＢＳで平衡化しておいたＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にＣＣＦ上清をロードした。ローディング後に、フロースルーの２８０ｎｍ吸光度が基線に戻るまでカラムをＰＢＳで洗浄した。２０ｍＭ酢酸，１０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ３．２を使用してｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖＋軽鎖融合体をカラムから溶出させた。溶出液の２８０ｎｍの吸光度をモニターし、蛋白質を含有するフラクションを採取した。
【０３１９】
ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖＋軽鎖融合体を含むフラクションをプールし、１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基，ｐＨ１１でｐＨ５．０に調整し、０．２μ  Ｐｏｓｉｄｙｎｅフィルターで濾過し、分画し、２０ｍＭ酢酸ナトリウム，１０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ５．０中で４℃にて保存した。
【実施例５】
【０３２０】
ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体活性
ヒトＲＡＮＫＬ「ノックイン」マウス（ｈｕＲＡＮＫＬマウス）を以下のように作製した。
【０３２１】
ＲＡＮＫＬを含むマウスＢＡＣクローンの同定
Ｏｌｉｇｏ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０（Ｗｏｊｃｉｅｃｈ  ＆  Ｐｉｏｔｒ  Ｒｙｃｈｌｉｋ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＭＮ）を使用し、マウスＲＡＮＫＬのエキソン５に対するプライマー対２組（プライマーセットＡ及びＢ）と、マウスＲＡＮＫＬのエキソン３から４の領域のプライマー対１組（プライマーセットＣ）を作製した。プライマーセットＡ（２６９９−８１及び２６９９−８２）から２５９塩基対ＰＣＲ産物が得られる。プライマーセットＢ（２６９９−８３及び２６９９−８４）から３２６塩基対ＰＣＲ産物が得られ、プライマーセットＣ（２６９９−８６及び２６９９−８７）から２７３塩基対産物が得られる。
プライマーセットＡ：
２６９９−８１：ＧＣＡ  ＴＣＡ  ＴＧＡ  ＡＡＣ  ＡＴＣ  ＧＧＧ  ＡＡＧ  Ｃ（配列番号２１８）
２６９９−８２：ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＣＧＴ  ＣＧＣ  ＡＴＣ  ＴＴＧ  Ａ（配列番号２１９）
プライマーセットＢ：
２６９９−８３：ＧＴＴ  ＡＡＧ  ＣＡＡ  ＣＧＧ  ＡＡＡ  ＡＣＴ  ＡＡＧ  Ｇ（配列番号２２０）
２６９９−８４：ＣＡＡ  ＡＧＴ  ＡＣＧ  ＴＣＧ  ＣＡＴ  ＣＴＴ  ＧＡＴ（配列番号２２１）
プライマーセットＣ：
２６９９−８６：ＧＣＡ  ＡＧＧ  ＴＡＧ  ＧＧＴ  ＴＣＡ  ＡＣＴ  ＧＡ（配列番号２２２）
２６９９−８７：ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＴＡＴ  ＧＧＧ  ＴＧＧ  ＴＡＧ  ＴＣＴ  Ｔ（配列番号２２３）。
【０３２２】
ＥＳ細胞ＤＮＡを使用してプライマーを試験し、各プライマー対が予想サイズのバンドを増幅することを確認した。プライマーセットＡを使用して３種のゲノム等価物に相当するライブラリーであるＤｏｗｎ−ｔｏ−ｔｈｅ−Ｗｅｌｌ  Ｍｏｕｓｅ  ＥＳ  ＢＡＣ  ＤＮＡ  Ｐｏｏｌｓ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｉ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をスクリーニングした。このライブラリーを２４０μＬ皿に加え、連続３回ＰＣＲを実施することにより個々のクローンを同定できるようにこれらの皿のクローンをプールしておく。まず、プライマーセットＡ、Ｂ及びＣを使用して各々マイクロタイタープレート１０枚からのＤＮＡから構成される２４個の「アッパープール」と、陰性対照（水及び無関係ＤＮＡ）を増幅した。ＰＣＲとサーモサイクリングは標準組換えＤＮＡ技術を使用して実施した。各ＰＣＲ反応のアリコートを２％アガロース／ＴＡＥゲルで泳動させた。マイクロタイタープレート１７１−１８０に対応するプール１８は全３組のプライマーセットで強陽性であることが確認された。次にマイクロタイタープレート１７１−１８０の個々のプレートプールを増幅した処、プレートプール１７２が陽性プレートとして同定された。プライマーセットＡを使用してＤｏｗｎ−ｔｏ−ｔｈｅ−Ｗｅｌｌプールを増幅した処、ウェルＧ１０が所望ＢＡＣクローンのプレート１７２上の位置として同定された。クローンＭｕ  ＥＳ  ＢＡＣ  ＤＮＡ  １７２Ｇ１０はＧｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。プライマーセットＡ、Ｂ及びＣによるＰＣＲ反応の結果、別個のバンドが得られ、このクローンはマウスＲＡＮＫＬの所望領域を含むことが確認された。
【０３２３】
ＲＡＮＫＬノックインベクター
Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｍｕ  ＥＳ  ＢＡＣ  ＤＮＡ  １７２Ｇ１０及び以下のプライマー：
２７９６−９４：ＡＴＴＧＣＧＡＴＣＧＣＧＴＴＡＣＴＧＧＧＡＧＡＡＧＴＧＣＡＧＡＴＴＴ（配列番号２２４）
２７９６−９５：ＡＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＣＡＴＡＧＣＧＴＡＧＣＧＴＴＣＡＴＴＡＴＣＣＴ（配列番号２２５）
を使用してマウスＲＡＮＫＬゲノム遺伝子座のエキソン５の３’領域に対して相同性をもつ１．４ｋｂ  ＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅により作製した。
【０３２４】
得られたＰＣＲフラグメントは５’末端にＳｇｆＩ制限酵素部位を含み、３’末端にＡｓｃＩ制限酵素部位を含んでいた。ＰＣＲフラグメントをＳｇｆＩとＡｓｃＩで消化した。ベクターｐＡＭＧＥＮＫＯ３（Ａｍｇｅｎ有標ベクター）もＳｇｆＩとＡｓｃＩｌで消化した。Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して消化後のＰＣＲフラグメントと、消化後のｐＡＭＧＥＮＫＯ３ベクターの大フラグメントをゲル精製した。精製ＰＣＲフラグメントをｐＡＭＧＥＮＫＯ３の精製大フラグメントにライゲーションし、Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｍａｘ  ＤＨ１０Ｂコンピテント大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。コロニー１０個を釣菌し、アンピシリンを添加したＬＢプレートで４時間増殖させた。２７９６−９４及び２７９６−９５プライマーとＴａｑポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用してショートアーム陽性コロニーについて細菌をＰＣＲ分析により直接スクリーニングした。Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してショートアーム陽性コロニーからのプラスミドＤＮＡを作製した。ＳｇｆＩ及びＡｓｃＩ酵素を使用して作製したプラスミドＤＮＡで診断制限酵素分析を実施した。ショートアームＰＣＲ分析と診断制限酵素分析の両者で陽性のプラスミドを選択し、ｐＡＭＧＥＮＫＯ３−ＯＰＧＬ−ＳＡと命名した。
【０３２５】
Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＨＦ  ２  ＰＣＲキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、クローンＭｕ  ＥＳ  ＢＡＣ  ＤＮＡ  １７２Ｇ１０、及びプライマー：
２８０２−１３：ＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＧＡＣＴＴＡＣＴＣＡＡＡＣＣＴＴＣＴ
２８０２−１２：ＡＣＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＡＴＡＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＴＧ
を使用してマウスＲＡＮＫＬゲノム遺伝子座のエキソン４及びエキソン５間のイントロンに対して相同性をもつ４．９ｋｂ  ＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅により作製した。
【０３２６】
得られたＰＣＲフラグメントは５’末端にＮｏｔＩ制限酵素部位を含み、３’末端にＸｈｏＩ制限酵素部位を含んでいた。ＰＣＲフラグメントとｐＡＭＧＥＮＫＯ３−ＯＰＧＬ−ＳＡを別々にＮｏｔＩとＸｈｏＩで消化した。次にＱｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して消化後のＰＣＲフラグメントと、消化後のｐＡＭＧＥＮＫＯ３−ＯＰＧＬ−ＳＡの大フラグメントを別々にゲル精製した。精製ＰＣＲフラグメントをｐＡＭＧＥＮＫＯ３−ＯＰＧＬ−ＳＡの精製大フラグメントにライゲーションし、Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｍａｘ  ＤＨ１０Ｂコンピテント大腸菌細胞に形質転換した。コロニー６４個を釣菌し、アンピシリンを添加したＬＢプレートで４時間増殖させた。Ｔａｑポリメラーゼとプライマー：
２７９７−５６：ＴＧＣＡＡＴＣＴＧＣＧＣＣＴＣＡＧＴＣＴＴＣ（配列番号２２６）
２７９７−５７：ＡＴＴＴＣＴＣＡＣＣＧＴＣＧＧＣＡＴＣＴＣＣ（配列番号２２７）
を使用してロングアームの有無について細菌をＰＣＲ分析により直接スクリーニングした。
【０３２７】
Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してロングアーム陽性コロニーからのプラスミドＤＮＡを作製した。次に、ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ酵素を使用して作製したプラスミドＤＮＡで診断制限酵素分析を実施した。ロングアームＰＣＲ分析と診断制限酵素分析の両者で陽性のプラスミドを選択し、ｐＡＭＧＥＮＫＯ３−ＯＰＧＬ−ＳＡ−ＬＡと命名した。
【０３２８】
Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、クローンＭｕ  ＥＳ  ＢＡＣ  ＤＮＡ  １７２Ｇ１０、及びプライマー：
２７９６−８８：ＡＴＴＣＴＣＧＡＧＧＴＡＴＡＣＣＴＡＴＡＧＣＴＴＡＡＧＧＧＣＡＧＧＡＴＡＧＡ（配列番号２２８）
２７９６−８９：ＣＴＴＴＡＴＧＧＧＡＡＣＣＴＡＧＡＧＡＧＡＡＡＣ（配列番号２２９）
を使用して（ロングアームスクリーニング用に５末端に作製した）ＢｓｔＺ１７Ｉ制限部位をもつ０．２５ｋｂマウスＲＡＮＫＬフラグメントをＰＣＲ増幅により作製した。
【０３２９】
Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅとプライマー：
２７９６−９０：ＴＣＴＡＧＧＴＴＣＣＣＡＴＡＡＡＧＴＧＡＧＴＣＴＧＴ（配列番号２３０）
２７９６−９１：ＴＴＣＣＡＣＧＡＡＡＴＧＡＧＴＣＴＣＡＡＴＣＴＡＴＡＴＣＴＣＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡ（配列番号２３１）
を使用してヒトＲＡＮＫＬのエキソン５の０．４１ｋｂコーディング領域をヒトｃＤＮＡからＰＣＲ増幅により作製した。
【０３３０】
０．２５ｋｂマウスＲＡＮＫＬフラグメントは０．４１ｋｂヒトＲＡＮＫＬエキソン５フラグメントとオーバーラップするので、プライマー（２７９６−８８及び２７９６−９１）とＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して、もっと長い０．６６ｋｂフラグメントを作製した。Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、クローンＭｕ  ＥＳ  ＢＡＣ  ＤＮＡ  １７２Ｇ１０、及びプライマー：
２７９６−９２：ＧＴＴＣＧＡＧＡＴＡＴＡＧＡＴＴＧＡＧＡＣＴＣＡＴＴＴＣＧＴＧＧＡＡＣＡＴＴＡ（配列番号２３２）
２７９６−９３：ＡＴＴＧＧＣＣＧＧＣＣＣＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣ（配列番号２３３）
を使用してＲＡＮＫＬのエキソン５の１．２４ｋｂマウス３’非翻訳領域をＰＣＲ増幅により作製した。
【０３３１】
１．２４ｋｂ  ＰＣＲフラグメントは０．６６ｋｂ  ＰＣＲフラグメントとオーバーラップするので、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅとプライマー２７９６−８８及び２７９６−９３を使用して、もっと長い１．９ｋｂキメラノックインフラグメントをＰＣＲにより作製した。増幅ＰＣＲフラグメントは５’末端にＸｈｏＩ制限酵素部位を含み、３’末端にＦｓｅＩ制限酵素部位を含んでいた。ＰＣＲフラグメントとｐＡＭＧＥＮＫＯ３−ＯＰＧＬ−ＳＡ−ＬＡを別々にＮｏｔＩとＸｈｏＩで消化した。次にＱｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して消化後のＰＣＲフラグメントと、消化後のｐＡＭＧＥＮＫＯ３−ＯＰＧＬ−ＳＡ−ＬＡの大フラグメントを別々にゲル精製した。精製ＰＣＲフラグメントを精製大フラグメントにライゲーションし、Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｍａｘ  ＤＨ１０Ｂコンピテント大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。コロニー２０個を釣菌し、アンピシリンを添加したＬＢプレートで４時間増殖させた。プライマー：
２８１７−８７：ＣＣＡＡＣＡＴＧＡＣＴＴＴＴＡＧＣＡＡＴＧ（配列番号２３４）
２７９７−５５：ＴＣＣＴＣＴＣＣＡＧＡＣＣＧＴＡＡＣＴＴＡ（配列番号２３５）
を使用して細菌を直接スクリーニングした。
【０３３２】
Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＰＣＲ陽性コロニーからのプラスミドＤＮＡを作製した。ＸｈｏＩとＦｓｅＩで制限酵素消化後に１％アガロースゲル電気泳動を使用し、インサートの存在を確認した。陽性ＤＮＡをシーケンシングにより確認した。最終ノックインターゲティングベクターをｐＡＭＧＥＮＫＯ３−ＯＰＧＬ−ＫＩと命名した。
【０３３３】
Ｑｉａｇｅｎ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａキットを使用してｐＡＭＧＥＮＫＯ３−ＯＰＧＬ−ＫＩターゲティング構築物の大プラスミド構築物を作製した。ｐＡＭＧＥＮＫＯ３−ＯＰＧＬ−ＫＩ  ２００μｇをＮｏｔＩで直鎖化した後に、７．５Ｍ酢酸アンモニウム０．５容量とフェノール／クロロホルム（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）１容量を加え、ボルテックス混合し、５分間１０，０００ｒｐｍで遠心することにより精製した。水層を清浄な管に移し、クロロホルム（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）１容量を加えた。次に混合物をボルテックス混合し、２分間１０，０００ｒｐｍで遠心した。水層を清浄な管に移し、１００％エタノール２．５容量を加えた。次に管を数回転倒させ、１０分間１０，０００ｒｐｍ遠心することにより混合した。上清を除去し、管底部のＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬと１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０緩衝液に再懸濁した。
【０３３４】
胚性幹細胞ターゲティングとノックインマウスの作製
１５％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０３単位／ｍｌ白血病阻害因子（ＬＩＦ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び０．１μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＧＳ−１胚性幹（ＥＳ）細胞（１２９ＳｖＪ；Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を増殖させた。１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２ｍＭグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でマウス線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞をを増殖させた。ＭＥＦは１３から１４日齢ネオマイシン耐性マウス胎仔外植片に由来するものとした。ＥＳ細胞のフィーダー層として使用する前に、１０μｇ／ｍｌマイトマイシンＣ（Ｒｏｃｈｅ）で２から３時間処理することによりＭＥＦを不活性化した。ＭＥＦ細胞とＥＳ細胞のいずれも３７℃，５％  ＣＯ２で増殖させた。
【０３３５】
ターゲティングのために、ＧＳ−１  ＥＳ細胞（１２９ＳｖＪ；Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）１０７個を直鎖化ｐＡＭＧＥＮＫＯ３−ＯＰＧＬ−ＫＩ  ２５μｇと混合し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒを使用して２５０Ｖ，５００μＦでエレクトロポレーションした。ネオマイシン耐性ＭＥＦフィーダー細胞でＧ４１８（活性成分２１０μｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＦＩＡＵ（終濃度０．２μＭ）（Ｍｏｒａｖｅｋ）中でトランスフェクトクローンを選択した。７日間選択後にクローンを釣菌し、トリプシン処理し、９６ウェル３組に撒いた。プレート２組を１０％  ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）、１０％  ＦＢＳ及びＤＭＥＭから構成される凍結培地で凍結させた。次にウェルを滅菌鉱油（Ｓｉｇｍａ）層で覆い、密閉したプレートをＳｔｙｒｏｆｏａｍボックスに入れ、−８０℃で凍結させた。３組目のプレートをＰＣＲとサザン分析に使用した。細胞をＰＢＳでリンスし、溶解用緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．５％サルコシル及び１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）で６０℃にて一晩インキュベートした。７．５Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃを使用してプレートからＤＮＡを沈殿させた後、７０％エタノールで数回洗浄し、最後にＴＥ，ｐＨ８．０に再懸濁した。
【０３３６】
ショートアーム側の相同組換えについてスクリーニングするために、ネオマイシン耐性カセットにアニールするＰＣＲプライマーと、ショートアームの外側のゲノム領域にアニールするＰＣＲプライマー：
２８１８−３５：ＧＡＴＣＴＣＴＣＧＴＧＧＧＡＴＣＡＴＴＧＴＴ（配列番号２３６）
２８１８−３６：ＡＡＣＣＣＡＣＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＴ（配列番号２３７）
をＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）と併用してＥＳ細胞クローンからのＤＮＡをスクリーニングした。
【０３３７】
更に、プライマー２８１７−８７及び２７９７−５５を使用してＰＣＲによりヒトＲＡＮＫＬエキソン５の有無を検討した。ＰＣＲ陽性ＤＮＡについては、サザンブロット分析を使用し、ロングアーム側の相同組換えを以下のように確認した。ゲノムＤＮＡをＢｓｔＺ１７Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で一晩消化し、１×ＴＡＥ緩衝液中で０．９％アガロースゲル電気泳動により一晩分離した（標的対立遺伝子の１２ｋｂフラグメントに対して野生型対立遺伝子は１６ｋｂフラグメントを生じる）。ゲルを０．５Ｍ  ＮａＯＨ／１．５Ｍ  ＮａＣｌで１５分間処理することにより２回変性させた後、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０／１．５Ｍ  ＮａＣｌで１５分間処理することにより２回中和させた。次に、Ｒａｐｉｄ  Ｄｏｗｎｗａｒｄ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）を使用して消化後のＤＮＡをＮｙｔｒａｎ  Ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅ  Ｎｙｌｏｎメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）に２０×ＳＳＣ中で一晩転写させ、ＵＶ  Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ  ２４００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して架橋させた。メンブレンをＥｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と６０℃で３時間プレハイブリダイズさせ、放射性標識ロングアームプローブ１．５×１０６ｃｐｍ／ｍｌを加えたＥｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ緩衝液に６０℃で３時間転写させた。プローブはランダムプライマー標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用してα３２Ｐ  ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）で標識し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（ｃａｔ．＃１２７３９６５，Ｒｏｃｈｅ）で精製した。ハイブリダイゼーションメンブレンを室温にて１５分間２×ＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳで１回洗浄した後、６０℃にて２０分間０．１×ＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳで１回洗浄した。次にハイブリダイゼーションメンブレンをイメージングフィルムに（シグナルの強度に応じて）数日間露光した。野生型対立遺伝子はサザンブロット上に１６ｋｂバンドとして出現し、標的対立遺伝子は１２ｋｂバンドであった。
【０３３８】
相同組換え後のＥＳクローンをＰＣＲとサザンブロット分析により同定した後、（上記の）予め凍結しておいたストックを解凍し、２．５日齢Ｃ５７ＢＩ／６（Ｔａｃｏｎｉｃ）胚盤胞に注入した。注入した胚盤胞を次に擬似妊娠雌に導入し、キメラを伝達する生殖細胞系を同定した。これらのキメラの子孫をＰＣＲにより遺伝子型決定し、ターゲティングイベントにヘテロ接合性のマウスを同定し、これらのヘテロ接合性マウス性を相互に交配し、ホモ接合性ノックインマウスを得た。
【０３３９】
ヘテロ接合性及びホモ接合性ノックインマウスのスクリーニング
ＤＮｅａｓｙ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してマウスからのテールＤＮＡを単離し、ｐｕＲｅｔａｑ  Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と以下のプライマー：
３１５１−５２：ＣＡＴＧＧＡＡＣＴＴＧＧＧＡＧＴＧＡＣＴＴＴ（配列番号２３８）
３１５１−５３：ＴＣＡＡＧＧＴＴＣＴＣＡＧＴＧＧＣＡＣＡＴ（配列番号２３９）
を使用してＰＣＲによりスクリーニングした。
【０３４０】
Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＰＣＲ産物を精製し、ＢｓｔＺ１７Ｉで切断した。得られたフラグメントを１％アガロースゲルで分離した処、野生型対立遺伝子は１．５ｋｂバンドとして出現し、標的対立遺伝子は０．９ｋｂ及び０．６ｋｂバンドとして出現した。従って、１．５ｋｂバンド単独が野生型マウスに相当し、０．９ｋｂ及び０．６ｋｂバンドの混合物がホモ接合性ノックインマウスに相当し、１．５ｋｂ、０．９ｋｂ及び０．６ｋｂバンドの混合物がヘテロ接合性マウスに相当する。
【０３４１】
ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体の生物活性
ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体の活性を以下のように測定した。
【０３４２】
プロトコール
１０カ月齢雌ヒトＲＡＮＫＬノックインマウス（ｈｕＲＡＮＫＬマウス）と野生型マウスを試験に供した（各群ｎ＝６）。ｈｕＲＡＮＫＬマウスの頸部にビヒクル（ＰＢＳ）、ヒトＰＴＨ（１−３４）（１００μｇ／ｋｇ，５日／週）、αＲＡＮＫＬ−１（２又は１０ｍｇ／ｋｇ，週１回；αＲＡＮＫＬ−１は配列番号２のアミノ酸配列をもつ重鎖と、配列番号４のアミノ酸配列をもつ軽鎖を含む；別称αＯＰＧＬ−１，ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／００２７１３号参照）又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（２又は１０ｍｇ／ｋｇ，週１回）を皮下（ＳＣ）注射した。野生型マウスにビヒクル（ＰＢＳ）又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（２ｍｇ／ｋｇ，週１回）を投与した。ＰＴＨ（１−３４）は０．００１Ｎ  ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び２％ウシ血清アルブミンで希釈し、αＲＡＮＫＬ−１とｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１はＰＢＳで希釈した。
【０３４３】
基線（投与開始前）と、投与後１週目、２週目及び３週目に骨ミネラル密度を分析した。血液サンプルも基線と、２時間、６時間、２４時間、４８時間及び７２時間後とその後、毎週採取した。血液サンプルは全血中イオン化カルシウム分析、オステオカルシン分析及びＴＲＡＰ−５ｂ分析に使用した。試験後に、動的及び静的組織形態計測のために脛骨を採取した。全動物はフィルタートップケージで飼料と水を自由に摂取させ、１２時間明暗サイクルで飼育した。
【０３４４】
骨回転の生化学的マーカー
基線と、投与後２時間、６時間、２４時間、４８時間及び７２時間に血中イオン化カルシウム値を以下のように測定した。マウスをイソフルラン（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）で麻酔し、ヘパリン処理したキャピラリーチューブ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に眼窩後方から血液サンプルを採取した。投与前（基線）と３日目と５日目にＭｏｄｅｌ  ６３４  Ｃａ＋＋／ｐＨ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ）を使用して全血中イオン化カルシウム値を測定した。ｐＨ７．１からのｐＨ変動を考慮するように測定カルシウム値を調整した。
【０３４５】
図１５はビヒクル（ＰＢＳ）、１００μｇ／ｋｇヒトＰＴＨ（１−３４）を週５回、２ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１を週１回、１０ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１を週１回、２ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回又は１０ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスのイオン化カルシウム値（ｍｍｏｌ／Ｌ）を示す。この実験では、ｈｕＲＡＮＫＬマウスの血中イオン化カルシウム値は週５回ＰＴＨ（１−３４）注射に応答して有意に増加した。２ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１を週１回注射すると、ｈｕＲＡＮＫＬマウスの血中イオン化カルシウム値は僅かに低下し、αＲＡＮＫＬ−１の抗骨吸収効果に一致する。２ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回注射すると、軽度高カルシウム血症を生じた。１０ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回注射すると、僅かに重度の高カルシウム血症を生じたが、ヒトＰＴＨ（１−３４）を週５回注射した場合に認められる高カルシウム血症ほどで重度ではなかった。
【０３４６】
図１５はビヒクル又は２ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与した野生型マウスのイオン化カルシウム値も示す。αＲＡＮＫＬ−１抗体はマウスＲＡＮＫＬを中和しないので、ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体はＰＴＨ単独と同様に挙動すると予想される。実際に、この実験では、２ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体は同等用量でｈｕＲＡＮＫＬマウスよりも野生型に有意に重度の高カルシウム血症を生じた。これらの結果から、αＲＡＮＫＬ−１のＲＡＮＫＬ中和作用はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を投与したマウスで骨異化を抑制し、高カルシウム血症を緩和するのに重要であったと思われる。
【０３４７】
骨吸収に及ぼす各種治療の効果を評価するために、基線、１週目、２週目及び３週目に血清ＴＲＡＰ−５ｂ値を以下のように測定した。イソフルランで麻酔したマウスの眼窩後方から各時点でＭｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）血清分離管（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に採血した。血液を室温で約３０分間放置した後にＴＯＭＹ  ＴＭＡ−６２４−ウェルローターを取付けたＴＯＭＹ高速マイクロ遠心機ＭＲＸ−１５２で４℃にて１０分間１４，０００ｒｐｍで遠心した。次に、血清を別のエッペンドルフチューブに移し、分析時まで−８０℃フリーザーで保存した。マウスＴＲＡＰ５ｂ（ＳＢＡ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）に特異的な固相免疫固定酵素活性アッセイを使用して血清ＴＲＡＰ−Ｓｂ値を測定した。製造業者のプロトコールに従って血清サンプルを２本ずつアッセイした。
【０３４８】
図１６はビヒクル（ＰＢＳ）、１００μｇ／ｋｂヒトＰＴＨ（１−３４）を週５回、２ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１を週１回、１０ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１を週１回、２ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回又は１０ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスの血清ＴＲＡＰ−５ｂ値を示す。図１６はビヒクル（ＰＢＳ）又は２ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与した野生型マウスの血清ＴＲＡＰ−５ｂ値も示す。この実験から明らかなように、ヒトＰＴＨ（１−３４）を週５回注射すると、ｈｕＲＡＮＫＬマウスのＴＲＡＰ−５ｂ値は有意に増加した。同様に、２ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回注射すると、上記のようにαＲＡＮＫＬ−１抗体により中和されないマウスＲＡＮＫＬしかもたない野生型マウスのＴＲＡＰ−５ｂ値も有意に増加した。
【０３４９】
他方、図１６から明らかなように、αＲＡＮＫＬ−１を週１回注射すると、ｈｕＲＡＮＫＬマウスのＴＲＡＰ−５ｂ値は迅速且つ有意に低下した。同様に、ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回注射した場合も、血清ＴＲＡＰ−５ｂ値は迅速且つ有意に低下し、キメラ分子のαＲＡＮＫＬ−１部分はＴＲＡＰ−５ｂ値に及ぼすｓｙｎＰＴＨの作用を阻止できることが示唆された。
【０３５０】
骨形成に及ぼす各治療の効果を評価するために、基線、１週目、２週目及び３週目に血清オステオカルシン値を以下のように測定した。ＴＲＡＰ−５ｂ値の測定について上述したように採血し、血清を単離した。無傷のマウスオステオカルシン（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｐｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｃｌｅｍｅｎｔｅ，ＣＡ）に特異的な免疫放射定量法（ＩＲＭＡ）を使用して血清オステオカルシン値を測定した。分析は製造業者のプロトコールに従って実施した。
【０３５１】
図１７はビヒクル（ＰＢＳ）、１００μｇ／ｋｂヒトＰＴＨ（１−３４）を週５回、２ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１を週１回、１０ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１を週１回、２ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回又は１０ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスの血清オステオカルシン値を示す。図１７はビヒクル（ＰＢＳ）又は２ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与した野生型マウスの血清オステオカルシン値も示す。
【０３５２】
この実験では、１００μｇ／ｋｂヒトＰＴＨ（１−３４）を週５回注射すると、ｈｕＲＡＮＫＬマウスのオステオカルシンは少量ではあるが、有意に増加した。αＲＡＮＫＬ−１を週１回注射すると、ｈｕＲＡＮＫＬマウスの血清オステオカルシンは少量ではあるが、有意に低下し、これは恐らく骨吸収抑制に続発するフィードバック抑制に起因すると思われる。２ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回注射すると、ｈｕＲＡＮＫＬマウスの血清オステオカルシン値は殆ど又は全く増加しなかったが、１０ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回注射すると、ｈｕＲＡＮＫＬマウスの血清オステオカルシンは最大の増加を生じた。この増加は１００μｇ／ｋｂヒトＰＴＨ（１−３４）をｈｕＲＡＮＫＬマウスに注射した場合の増加よりも大きかった。
【０３５３】
骨ミネラル密度
腰椎（Ｌ１−Ｌ５）、大腿骨／脛骨（全大腿骨と脛骨の近位２分の１）及び近位脛骨の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）をｈｕＲＡＮＫＬ及び野生型マウスで基線と投与後１週、２週及び３週目に測定した。二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）（ＧＥ  Ｌｕｎａｒ  Ｐｉｘｉｍｕｓｌｌ，ＧＥ  Ｌｕｎａｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用し、イソフルランで麻酔したマウスでＢＭＤを測定した。
【０３５４】
実験からのデータは平均±標準偏差（ＳＥＭ）として表す。一元配置分散分析後にダネットの比較を使用し、ＰＢＳを投与したマウスとｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１を投与したマウスと比較することにより治療効果を検討した。ＰＢＳを投与したマウスとｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１を投与したマウスの両者について基線からのＢＭＤの変化百分率を計算し、ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１を投与したマウスの変化百分率と、ＰＢＳを投与したマウスの変化百分率を比較した。確率＜０．０５を有意とみなした。
【０３５５】
図１８はビヒクル（ＰＢＳ）、１００μｇ／ｋｂヒトＰＴＨ（１−３４）を週５回、２ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１を週１回、１０ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１を週１回、２ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回又は１０ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスの腰椎のＢＭＤ変化百分率を示す。図１８はビヒクル（ＰＢＳ）又は２ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与した野生型マウスの腰椎のＢＭＤ変化百分率も示す。データは基線ＢＭＤ（投与前）に比較した３週目のＢＭＤの変化百分率として表す。ビヒクル（ＰＢＳ）又はヒトＰＴＨ（１−３４）を週５回又はαＲＡＮＫＬ−１を週１回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスのＢＭＤに統計的に有意な変化はなかった。他方、ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスに認められたＢＭＤの増加は統計的に有意であった。予想通り、ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与した野生型マウスはこの実験でＢＭＤの増加を示さず、これはマウスＲＡＮＫＬがαＲＡＮＫＬ−１により中和されないためであると思われる。
【０３５６】
図１９はビヒクル（ＰＢＳ）、１００μｇ／ｋｂヒトＰＴＨ（１−３４）を週５回、２ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１を週１回、１０ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１を週１回、２ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回又は１０ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスの全脚のＢＭＤを示す。図１８はビヒクル（ＰＢＳ）又は２ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与した野生型マウスの全脚のＢＭＤ変化百分率も示す。データは基線ＢＭＤ（投与前）に比較した３週目のＢＭＤの変化百分率として表す。ビヒクル（ＰＢＳ）又はヒトＰＴＨ（１−３４）を週５回又はαＲＡＮＫＬ−１を週１回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスのＢＭＤに統計的に有意な変化はなかった。２ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与した場合に認められた増加はこの実験では統計的に有意ではなかった。他方、１０ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスに認められたＢＭＤの増加は統計的に有意であった。予想通り、ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与した野生型マウスはこの実験でＢＭＤの増加を示さず、これはマウスＲＡＮＫＬがαＲＡＮＫＬ−１により中和されないためであると思われる。
【０３５７】
図１８及び１９に示すデータによると、加齢マウスのＢＭＤは１００μｇ／ｋｇ  ＰＴＨ（１−３４）を毎日又は２もしくは１０ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１単独を週１回投与しても統計的に有意な増加を示さないと思われる。他方、１０ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与すると、腰椎及び全脚の両者でＢＭＤの統計的に有意な増加が生じた。２ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与した場合にもＢＭＤは増加すると思われる。
【０３５８】
骨組織形態計測
３週間の試験後に、ビヒクル（ＰＢＳ）、１００μｇ／ｋｂヒトＰＴＨ（１−３４）を週５回、２ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１を週１回、１０ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１を週１回、２ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回又は１０ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスと、ビヒクル（ＰＢＳ）又は２ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与した野生型マウスを屠殺し、統計的及び動的組織形態計測用に脛骨を採取した。
【０３５９】
脛骨を７０％エタノールで固定し、筋肉と軟組織を除去した。各脛骨の前部を縦方向に切り取り、エタノール濃度を増加させながら脛骨を脱水した後にメタクリル酸メチルに包埋した。Ｌｅｉｃａ  Ｍｏｄｅｌ  ２０６５ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＧｍｂＨ）を使用して前部切片（４μｍ及び８μｍ）を切断した。ＯｓｔｅｏＭｅａｓｕｒｅ（登録商標）骨分析ソフトウェア（Ｏｓｔｅｏｍｅｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＧＡ）を使用して組織形態計測分析を実施した。脛骨の近位骨幹端部切片を分析した。視野寸法３５０×３５０μｍ（０．１２２５ｍｍ２／視野）を使用して各脛骨から４視野を２０倍で分析した。従って、合計分析面積は各切片で０．４９ｍｍ２であった。
【０３６０】
静的分析には脛骨のマッソン・トリクロム染色切片を使用した。海綿骨体積を測定した後に、Ｋｏｓｔｅｎｕｉｋら，Ｂｏｎｅ  ３４：６５６（２００４）に記載の方法により合計組織体積に正規化した。破骨細胞数と骨芽細胞数を顕微鏡で計数し、Ｋｏｓｔｅｎｕｉｋら，Ｂｏｎｅ  ３４：６５６（２００４）に記載の方法により海綿骨表面積に正規化した。
【０３６１】
図２０はｈｕＲＡＮＫＬマウスにおける脛骨近位骨幹端部の海綿骨体積測定値を示す。１０ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスはこの実験で統計的に有意な海綿骨体積増加を示した。
【０３６２】
図２１はｈｕＲＡＮＫＬマウスにおける脛骨近位骨幹端部の破骨細胞表面積測定値を示す。１００μｇ／ｋｂヒトＰＴＨ（１−３４）を週５回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスはビヒクル（ＰＢＳ）を投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスに比較して統計的に有意な破骨細胞表面積百分率の増加を示した。ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスはＰＴＨ（１−３４）を投与したマウスに比較して統計的に有意な破骨細胞表面積百分率低下を示し、αＲＡＮＫＬ−１はＰＴＨ（１−３４）の破骨細胞刺激作用を阻止できることが示唆された。１０ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスはチューキー・クレーマー又はダネットの検定により測定した場合に、ビヒクル（ＰＢＳ）単独に比較して統計的に有意な破骨細胞表面積百分率低下を示さなかった。
【０３６３】
図２２はｈｕＲＡＮＫＬマウスにおける脛骨近位骨幹端部の骨芽細胞表面積測定値を示す。１００μｇ／ｋｂヒトＰＴＨ（１−３４）を週５回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスはビヒクル（ＰＢＳ）、αＲＡＮＫＬ−１又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスに比較して統計的に有意な骨芽細胞表面積百分率増加を示した。
【０３６４】
動的分析には脛骨の未染色切片を使用した。テトラサイクリン及びカルシンラベル長と間隔を測定した。Ｐａｒｆｉｔｔら，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓ．２：５９５−６１０（１９８７）に記載の方法を使用してテトラサイクリン及びカルシンラベル長と間隔の測定値から骨形成速度を計算した。
【０３６５】
図２３はｈｕＲＡＮＫＬマウスの骨形成速度を示す。１００μｇ／ｋｂヒトＰＴＨ（１−３４）を週５回又は１０ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスはビヒクル（ＰＢＳ）単独を投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスに比較して統計的に有意な骨形成速度増加を示した。２ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１を週１回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスはビヒクルに比較して骨形成速度の低下を示したが、２ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与したマウスはビヒクルに比較して統計的に有意な骨形成速度増加も低下も示さなかった。これらの結果から、１０ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与すると、１００μｇ／ｋｂヒトＰＴＨ（１−３４）を週５回投与した場合と同等の骨形成の増加が得られると思われる。他方、１００μｇ／ｋｂヒトＰＴＨ（１−３４）を週５回投与した場合とは異なり、１０ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を投与しても破骨細胞又は骨芽細胞表面百分率は有意に増加しない。図２１及び２２参照。
【０３６６】
マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）
ｈｕＲＡＮＫＬ及び野生型マウスの大腿骨中軸の断面における皮質空隙を分析した。図２４はビヒクル（ＰＢＳ）、１００μｇ／ｋｂヒトＰＴＨ（１−３４）を週５回、１０ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１を週１回又は１０ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスと、ビヒクル（ＰＢＳ）又は２ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与した野生型マウスの大腿骨軸のマイクロＣＴを示す。ヒトＰＴＨ（１−３４）を投与すると、ｈｕＲＡＮＫＬマウスに皮質内空隙が出現した（図２４の左側パネルに矢印で示す）が、αＲＡＮＫＬ−１又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与しても、ｈｕＲＡＮＫＬマウスに皮質内空隙は出現しなかった。他方、野生型マウスにｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与すると、皮質内空隙が出現した（図２４の右側パネルに矢印で示す）。この結果は、αＲＡＮＫＬ−１がマウスＲＡＮＫＬを中和できないため、ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体がヒトＰＴＨ（１−３４）単独と同様に作用することに起因すると思われる。これらの結果から、ＰＴＨ単独では皮質空隙が生じ、骨強度の低下につながると思われる。これらの結果から更に、αＲＡＮＫＬ−１はＰＴＨに起因する皮質空隙を抑制又は防止すると思われる。
【０３６７】
Ｌ６椎骨、左脛骨及び左大腿骨をｅＸｐｌｏｒｅ  ＭＳ  Ｍｉｃｒｏ−ＣＴ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｗａｕｋｅｓｈａ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）で試験した。密度ファントム（ＳＢ３；ｅＸｐｌｏｒｅ  ＭＳ  Ｍｉｃｒｏ−ＣＴ  Ｓｙｓｔｅｍ同梱）と共に骨を２ｍｌ容クライオチューブに入れ、チューブにＰＢＳを充填し、骨をチューブ内でゲージにより安定化させた。Ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  Ｃｏｎｅｂｅａｍ技術を利用するｅＸｐｌｏｒｅ  ＭＳ  Ｍｉｃｒｏ−ＣＴ  Ｓｙｓｔｅｍを使用し、密度ファントムで校正しながら８０ｋＶｐ及び８０μＡで０．５°ずつ２００°の回転角で骨をスキャンした。データを再構成し、ボクセルサイズ１８μｍ×１８μｍ×１８μｍの画像を得た。
【０３６８】
分析ソフトウェア（ＧＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏ  Ｖｉｅｗ）を使用して該当領域を皮質及び海綿骨形態計測及び密度パラメーターについて分析した。大腿骨骨幹部の中心１０％（長さ）の皮質骨基質ミネラル密度（ＢＭＭＤ）と平均皮質面積を分析した。Ｉｍａｇｅ−Ｊ（ＮＩＨ）を使用して中央部に骨内膜及び骨膜周囲を描画した。Ｌ６椎骨、近位脛骨及び遠位大腿骨からの海綿骨領域を単離し、ＢＭＤと立体パラメーター（骨体積率（ＢＶ／ＴＶ）を含む）を分析した。
【０３６９】
全スキャンの画像は各スキャンの密度ファントムに基づく閾値（海綿骨では骨模倣密度の３０％（３２０ｍｇ／ｍｌ）、皮質骨では骨模倣密度の６０％（６４０ｍｇ／ｍｌ））で３Ｄ表面レンダリングを使用して描画した。これらの閾値レベルはソフトウェア（ＧＥＭＳ  ＭｉｃｒｏＶｉｅｗ）内の組織形態計測技術を使用して決定し、個々のスキャンからバイアスを除去した。
【０３７０】
図２５はビヒクル（ＰＢＳ）、１００μｇ／ｋｂヒトＰＴＨ（１−３４）を週５回、１０ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１を週１回又は１０ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスに由来するＬ６椎骨のマイクロＣＴ結果を示す。１０ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１を週１回又は１０ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスはビヒクル（ＰＢＳ）を投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスに比較して海綿骨量の増加を示す。
【０３７１】
図２６はビヒクル（ＰＢＳ）、１００μｇ／ｋｂヒトＰＴＨ（１−３４）を週５回、１０ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１を週１回又は１０ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスに由来する左近位脛骨のマイクロＣＴ結果を示す。１０ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスはビヒクル（ＰＢＳ）を投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスに比較して骨密度の有意増加を示した。１００μｇ／ｋｂヒトＰＴＨ（１−３４）を週５回又は１０ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１を週１回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスはビヒクル（ＰＢＳ）を投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスに比較して海綿骨量の中度増加を示した。
【０３７２】
図２７はビヒクル（ＰＢＳ）、１００μｇ／ｋｂヒトＰＴＨ（１−３４）を週５回、１０ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１を週１回又は１０ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスに由来する左遠位大腿骨のマイクロＣＴ結果を示す。１０ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体を週１回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスはビヒクル（ＰＢＳ）を投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスに比較して骨密度の有意増加を示した。１０ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１を週１回投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスはビヒクル（ＰＢＳ）を投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスに比較して海綿骨量の中度増加を示した。
【図面の簡単な説明】
【０３７３】
【図１】αＲＡＮＫＬ−１（別称αＯＰＧＬ−１）抗体重鎖をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。このｃＤＮＡ配列はＨｉｎｄＩＩＩ部位から開始し、ＳａｌＩ部位で終了する。開始コドンはヌクレオチド１４から開始し、停止コドンはヌクレオチド１４１５から開始する。
【図２】αＲＡＮＫＬ−１（別称αＯＰＧＬ−１）抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。重鎖シグナルペプチドを下線で示す。可変領域は下線なしの大文字で示す。定常領域は小文字で示す。
【図３】αＲＡＮＫＬ−１（別称αＯＰＧＬ−１）抗体軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号３）を示す。このｃＤＮＡ配列はＸｂａＩ部位から開始し、ＳａｌＩ部位で終了する。開始コドンはヌクレオチド１２から開始し、停止コドンはヌクレオチド７１７から開始する。
【図４】αＲＡＮＫＬ−１（別称αＯＰＧＬ−１）抗体軽鎖のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。κシグナルペプチドを下線で示す。可変領域は下線なしの大文字で示す。定常領域は小文字で示す。
【図５】αＲＡＮＫＬ−１κ軽鎖発現プラスミドαＲＡＮＫＬ−１−κ／ｐＤＳＲａ１９（別称αＯＰＧＬ−１−κ／ｐＤＳＲａ１９；例えば米国特許公開第Ｕ．Ｓ．２００４／００３３５３５Ａ１号及びＰＣＴ公開第ＷＯ２００３／００２７１３Ａ３号参照）の模式図を示す。
【図６】αＲＡＮＫＬ−１  ＩｇＧ２重鎖発現プラスミドαＲＡＮＫＬ−１−ＩｇＧ２／ｐＤＳＲａ１９（別称αＯＰＧＬ−１−ＩｇＧ２／ｐＤＳＲａ１９；例えば米国特許公開第Ｕ．Ｓ．２００４／００３３５３５Ａ１号及びＰＣＴ公開第ＷＯ２００３／００２７１３Ａ３号参照）の模式図を示す。
【図７】ｓｙｎＰＴＨをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号５）を示す。ＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）部位とコザック配列（ＣＣＡＣＣ）を太字で示す。プレプロ領域を下線で示す。代表的ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節領域を普通文字で示す。ＧＧＧＡＰリンカーをコードする配列を斜体で示す。ＢｓｓＨＩＩ部位（ＧＣＧＣＧＣ）はリンカー配列内に位置する。
【図８】ｓｙｎＰＴＨのアミノ酸配列（配列番号６）を示す。プレプロ領域を下線で示す。代表的調節領域を普通文字で示す。ＧＧＧＡＰを斜体で示す。
【図９】ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１軽鎖（別称ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１κ；配列番号７）をコードするｃＤＮＡ配列を示す。配列の最初にＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）部位とコザック配列（ＣＣＡＣＣ）を太字で示す。プレプロ領域を下線で示す。ＧＧＧＡＰリンカーをコードする配列を斜体で示す。停止コドンはヌクレオチド８６７から開始する。配列の最後にＳａｌＩ部位を太字で示す。
【図１０】ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１軽鎖（別称ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１κ；配列番号８）のアミノ酸配列を示す。プレプロ領域を下線で示す。ＧＧＧＡＰリンカーを斜体で示す。
【図１１】ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖（別称ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＩｇＧ２；配列番号９）をコードするｃＤＮＡ配列を示す。配列の最初にＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）部位とコザック配列（ＣＣＡＣＣ）を太字で示す。プレプロ領域を下線で示す。ＧＧＧＡＰリンカーをコードする配列を斜体で示す。停止コドンはヌクレオチド１５６６から開始する。配列の最後にＳａｌＩ部位を太字で示す。
【図１２】ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖（別称ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＩｇＧ２；配列番号１０）のアミノ酸配列を示す。プレプロ領域を下線で示す。ＧＧＧＡＰリンカーを斜体で示す。
【図１３】ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１（κ）軽鎖発現プラスミドｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１−κ／ｐＤＳＲａ２０の模式図を示す。
【図１４】ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１（ＩｇＧ２）重鎖発現プラスミドｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１−ＩｇＧ２／ｐＤＳＲａ２０の模式図を示す。
【図１５】実施例５の手順による加齢ｈｕＲＡＮＫＬマウスと加齢野生型マウスの血中イオン化カルシウム値を示す。ｈｕＲＡＮＫＬマウスにビヒクル、１００μｇ／ｋｂヒトＰＴＨ（１−３４）、２ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１、１０ｍｇ／ｋｇ  αＲＡＮＫＬ−１、２ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）又は１０ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）を投与した。野生型マウスにビヒクル又は２ｍｇ／ｋｇ  ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）を投与した。投与前と投与後２時間、６時間、２４時間、４８時間及び７２時間に血中イオン化カルシウム値を測定した。
【図１６】実施例５の手順によりビヒクル（ＰＢＳ）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、αＲＡＮＫＬ−１又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）を投与した加齢ｈｕＲＡＮＫＬマウスと、ビヒクル（ＰＢＳ）又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）を投与した加齢野生型マウスの血清ＴＲＡＰ−５ｂ値を示す。
【図１７】実施例５の手順によりビヒクル（ＰＢＳ）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、αＲＡＮＫＬ−１又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）を投与した加齢ｈｕＲＡＮＫＬマウスと、ビヒクル（ＰＢＳ）又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）を投与した加齢野生型マウスの血清オステオカルシン値を示す。
【図１８】実施例５の手順によりビヒクル（ＰＢＳ）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、αＲＡＮＫＬ−１又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）を投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスと、ビヒクル（ＰＢＳ）又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）を投与した加齢野生型マウスにおける腰椎の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の変化を示す。
【図１９】実施例５の手順によりビヒクル（ＰＢＳ）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、αＲＡＮＫＬ−１又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）を投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスと、ビヒクル（ＰＢＳ）又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）を投与した加齢野生型マウスにおける全脚の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の変化を示す。
【図２０】実施例５の手順によりビヒクル（ＰＢＳ）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、αＲＡＮＫＬ−１又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）を投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスと、ビヒクル（ＰＢＳ）又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）を投与した加齢野生型マウスにおける近位脛骨骨幹端部の骨体積の変化を示す。
【図２１】実施例５の手順によりビヒクル（ＰＢＳ）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、αＲＡＮＫＬ−１又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）を投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスと、ビヒクル（ＰＢＳ）又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）を投与した加齢野生型マウスにおける破骨細胞表面積の変化を示す。
【図２２】実施例５の手順によりビヒクル（ＰＢＳ）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、αＲＡＮＫＬ−１又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）を投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスと、ビヒクル（ＰＢＳ）又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）を投与した加齢野生型マウスにおける骨芽細胞表面積の変化を示す。
【図２３】実施例５の手順によりビヒクル（ＰＢＳ）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、αＲＡＮＫＬ−１又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）を投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスと、ビヒクル（ＰＢＳ）又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）を投与した加齢野生型マウスにおける骨形成速度を示す。
【図２４】実施例５の手順によりビヒクル（ＰＢＳ）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、αＲＡＮＫＬ−１又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）を投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスと、ビヒクル（ＰＢＳ）又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）を投与した加齢野生型マウスに由来する大腿骨軸のマイクロコンピューター断層撮影像（マイクロＣＴ）を示す。
【図２５】ビヒクル（ＰＢＳ）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、αＲＡＮＫＬ−１又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）を投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスに由来するＬ６椎骨のマイクロコンピューター断層撮影像（マイクロＣＴ）を示す。
【図２６】ビヒクル（ＰＢＳ）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、αＲＡＮＫＬ−１又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）を投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスに由来する左脛骨のマイクロコンピューター断層撮影像（マイクロＣＴ）を示す。
【図２７】ビヒクル（ＰＢＳ）、ヒトＰＴＨ（１−３４）、αＲＡＮＫＬ−１又はｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１重鎖融合体（ｓｙｎＰＴＨ−αＲＡＮＫＬ−１  ＨＣＦ）を投与したｈｕＲＡＮＫＬマウスに由来する左大腿骨のマイクロコンピューター断層撮影像（マイクロＣＴ）を示す。
【図２８】αＲＡＮＫＬ−１抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１１）を示す。
【図２９】αＲＡＮＫＬ−１抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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