(57)【要約】  本発明は、細胞を処理するための方法であって、細胞を活性化した線維芽細胞と共培養することによって細胞の成長および／またはステータスを調節することを特徴とする方法に関する。線維芽細胞は、細胞が互いに接着して多細胞凝集塊、即ち、スフェロイド、を形成する条件下で培養することで活性化する。更に本発明は、骨髄穿刺などの細胞サンプルから細胞を選択するための装置であって、多細胞凝集塊を包含する装置も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞サンプルの処理、好ましくは診断または治療を目的とした処理、を行うための方法であって、
ａ）線維芽細胞または間葉系細胞を、細胞が互いに接着して多細胞凝集塊を形成する条件下で培養し、そして
ｂ）細胞サンプル内の細胞を、上記工程ａ）で形成された多細胞凝集塊と共培養し、それにより該細胞サンプル内の細胞の成長およびステータスの少なくとも一方を調節する
ことを包含する方法。
【請求項２】
工程ｂ）において、該細胞サンプルと該多細胞凝集塊との間に半透性メンブランを設け、該半透性メンブランはサイトカインや成長因子の交換を許容するが、間葉系細胞からなる凝集塊を該細胞サンプル内の細胞から隔離することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該細胞サンプル内の細胞が白血病細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該多細胞凝集塊との共培養に対して応答する細胞を該細胞サンプルから選択する工程ｃ）を更に包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
共培養に対して走化性運動で応答する細胞を選択することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該細胞を、治療または診断に用いるために選択することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
該細胞サンプルが患者由来サンプルであり、該多細胞凝集塊が自家間葉系細胞に由来することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該細胞サンプルが患者由来サンプルであり、該多細胞凝集塊が同種間葉系細胞に由来することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
細胞サンプルから細胞を選択するための装置であって、第１コンパートメントと第２コンパートメントを包含し、該第１コンパートメントは第２コンパートメントの内部に設けられており、該第１コンパートメントには、バッファー中に存在する線維芽細胞または間葉系細胞の多細胞凝集塊が収容されており、該第１コンパートメントは、２つのコンパートメントの間でバッファー、サイトカインや成長因子の交換を許容する半透性メンブランによって第２コンパートメントから分離されており、そして第２コンパートメントは、細胞の移動を許容する孔径を有する第２メンブランによって細胞のサンプルから分離されていることを特徴とする装置。
【請求項１０】
２つのコンパートメントと細胞のサンプルが、外部封止メンブランで囲われていることを特徴とする、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
該半透性メンブランが、２つのコンパートメント間の細胞の交換を許容しないものであることを特徴とする、請求項９に記載の装置。
【請求項１２】
該半透性メンブランの孔径が０．２〜２μｍであり、該第２メンブランの孔径が３〜８μｍであることを特徴とする、請求項９に記載の装置。
【請求項１３】
該サンプルが骨髄穿刺または末梢血サンプルであることを特徴とする、請求項９に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を処理するための方法であって、細胞を、活性化した線維芽細胞と共培養することによって細胞の成長および／またはステータスを調節することを特徴とする方法に関する。線維芽細胞は、細胞が互いに接着して多細胞凝集塊（即ち、スフェロイド）を形成する条件下で培養することで活性化する。更に本発明は、骨髄穿刺などの細胞サンプルから細胞を選択するための装置であって、多細胞凝集塊を収容してなる装置も提供する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の分化と増殖を制御するためには、複雑なパラクリンシグナルとオートクリンシグナルを空間的および時間的に組み合わせる必要がある。このようなシグナルの大部分は未成熟前駆細胞の周囲に存在する間葉系細胞から生じるものである。間葉組織における線維芽細胞は偏在するセンチネル細胞であり（Mayani et al., 1992、Torok-Storb et al., 1999）、これは細胞分化や器官形成から炎症や癌にまでおよぶ一連の発生学的および病理学的状態を制御するものである（Bhowmick et al., 2004）。間質の主な構成細胞である線維芽細胞は、造血前駆細胞の分化と増殖の制御において支配的な役割を担っている（Greenberg et al., 1988、Kubota et al., 1988、Wang and Sullivan, 1992）。培養細胞においては、線維芽細胞は正常な造血前駆細胞と悪性造血前駆細胞の両方の増殖を補助している（Rogalsky et al., 1991、Bendall et al., 1994、Buske et al., 1994、Bradstock et al., 1996）。線維芽細胞は、血液生成を支配する数種類の因子の豊富な供給源である（Silzle et al., 2004、Smith et al., 1997）。白血球の正常な成熟には、未成熟芽球の広範に渡る増殖活性の厳密な制御が必要であり、これはその周囲の間葉との可逆的且つ複雑な相互作用によってのみ達成される（Tavassoli and Friedenstein, 1983、Youn et al., 2000）。しかし、白血病細胞は、これらの制御シグナルを正しく翻訳する能力を失っており、未分化で激しく増殖する状態を維持する（Griffin and Lowenberg, 1986、Duhrsen and Hossfeld, 1996）。
【０００３】
線維芽細胞の同型細胞間接触を起こす性質を強化することで、我々は真皮線維芽細胞において生じる新しい形の生物機構を最近明らかにした（Bizik et al., 2004）。これらの細胞は、シクロオキシゲナーゼ−２遺伝子などの特定の遺伝子の高発現と、α−エノラーゼの仲介するプラスミノーゲンの活性化などのタンパク質分解活性の増加によって特徴付けられ、ネクローシスの典型的な形態学的兆候を伴って細胞死する。線維芽細胞に特徴的な自己活性化とそれに伴う細胞死に見られるユニークな特性に基づいて、我々はこの機構をネモーシス（nemosis）と命名した（Kankuri et al., 2005）。
【０００４】
次に我々は、これら細胞が大量の肝細胞成長因子／分散因子（ＨＧＦ／ＳＦ）を産生すること、そしてネモーシス線維芽細胞との接触によって腫瘍細胞の侵襲性が劇的に増大することを発見した（Kankuri et al., 2005）。我々はこの効果が、もっぱら、ＨＧＦ／ＳＦが仲介するｃ−ｍｅｔ癌原遺伝子産物（即ち、腫瘍細胞において正常なプロセッシングを受けた場合にのみ検出可能な膜受容体チロシンキナーゼｃ−Ｍｅｔ）の一時的なリン酸化によるものであることを示した（Kankuri et al., 2005）。上皮由来および間葉由来の細胞に対する分裂促進物質（Igawa et al., 1991）、モトゲン（Matsumoto et al., 1995）、およびモルフォゲン（Montesano et al., 1991）としての複数の多機能な役割の他に、ＨＧＦ／ＳＦは血液生成の調節因子としても機能する（Kmiecik et al., 1992）。
【０００５】
ネモーシス線維芽細胞由来ＨＧＦ／ＳＦによる上皮腫瘍細胞の進行の増大に関する知見（Kankuri et al., 2005）に基づき、我々は血液癌細胞に対するネモーシス由来因子の影響を解析した。ここで我々は、発現するタンパク質（ｃ−Ｍｅｔなど）の違いによって細胞系の表現型が異なると、線維芽細胞ネモーシスに対する応答も異なることを示す。ｃ−Ｍｅｔ陰性の細胞系は識別可能な成長停止、走化性および分化によって応答したが、ｃ−Ｍｅｔ陽性細胞の大部分が非応答性だった。
【０００６】
発明の詳細の説明 
本発明は、クラスター化または凝集した線維芽細胞や他の間葉系細胞（例えば、骨髄間葉系幹細胞）は、細胞増殖抑制性、成長阻害性および／または分化誘導性の応答を患者由来サンプルの初代細胞および細胞系（即ち、標的細胞）において誘導することが可能であり、このような誘導は、クラスター化した細胞または凝集塊の産生したサイトカインや成長因子が標的細胞の近傍に存在するか標的細胞と接触した場合、あるいは凝集塊に由来する化合物で標的細胞を処理した場合に生じるという知見に基づく。従って本発明は、細胞サンプルの処理、あるいは細胞サンプルから細胞を単離および／または濃縮するための方法であって、
ａ）線維芽細胞または間葉系細胞を、細胞同士の接触を促進または誘導して多細胞凝集塊を形成する（この現象を後述する実施例でネモーシスと言う）条件下で培養し、そして
ｂ）細胞サンプルを上記工程ａ）で形成された多細胞凝集塊と共培養し、それにより該細胞サンプル内の細胞の成長およびステータスの少なくとも一方を調節する
ことを包含する方法を提供する。
【０００７】
工程ｂ）は、多細胞凝集塊に由来する因子または多細胞凝集塊の産生した因子で細胞サンプルを処理することにより実施してもよい。
【０００８】
共培養の際には、半透性のバリアまたはメンブランを細胞サンプルと多細胞凝集塊の間に設けることが好ましく、このようなバリアは、サイトカインや成長因子の交換を許容するが、スフェロイドを細胞サンプルから物理的に隔離するものである。このような文脈において「物理的に隔離する」という表現は、多細胞凝集塊は細胞サンプル内の細胞と直接接触していないことを意味する。半透性バリアの孔径は、好ましくは０．２〜２μｍである。半透性メンブランの材質としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、セルロース混合エステルやテフロンが挙げられる。
【０００９】
細胞サンプルは、骨髄穿刺から単離した単核細胞を含有することが好ましい。白血病などの悪性疾患に罹患した患者の細胞サンプルであることがより好ましい。
【００１０】
本願において「細胞サンプル」という用語は、公知の細胞系の細胞などの培養細胞を含有する試料、または患者由来サンプル（例えば、血液サンプル）などの生物試料を意味する。他の好ましい患者由来サンプルは骨髄穿刺である。
【００１１】
上述した方法は、多細胞スフェロイドとの共培養に対して応答する細胞を細胞サンプルから選択する工程ｃ）を更に包含してもよい。通常、共培養に対して走化性運動によって応答する細胞を選択する。細胞を治療または診断用途のために選択することが好ましい。
【００１２】
本発明の他の態様は、生細胞を含むいかなるサンプルからも細胞を選択するための装置である（詳細については図５を参照）。この装置は、第１コンパートメントと第２コンパートメントを包含し、該第１コンパートメントは第２コンパートメントの内部に設けられており、該第１コンパートメントには、バッファー中に存在する線維芽細胞または間葉系幹細胞の多細胞性スフェロイドが収容されており、該第１コンパートメントは、２つのコンパートメントの間でバッファー、サイトカインや成長因子の交換を許容する半透性メンブランによって第２コンパートメントから分離されており、そして第２コンパートメントは、細胞の移動を許容する孔径を有する第２メンブランによって細胞のサンプルから分離されている。第２メンブランの孔径は３〜８μｍが好ましい。第２メンブランの材質としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、セルロース混合エステルやテフロンが挙げられる。
【００１３】
２つのコンパートメントと細胞のサンプルが、外部封止メンブランで囲われていることが好ましい。
【００１４】
半透性メンブランは、２つのコンパートメント間の細胞の交換を許容しないものが好ましい。
【００１５】
本発明の１つの好ましい態様は、細胞サンプルが患者由来サンプルであり、サンプル内の細胞をこの患者の治療に用いる場合、工程ａ）において自家線維芽細胞を使用することである。しかし、活性化線維芽細胞は細胞サンプルと直接接触しないことが好ましいため、この直接接触がない限り、同種線維芽細胞も本発明に使用することができる。
【００１６】
本明細書で引用する全ての文献については、それぞれについて個別に断らずとも、この記載を持って全ての文献の内容が参照によって本明細書に組み込まれたされたものとする。以下の実施例は、当業者が本発明とその原理および利点をよりよく理解するための助けとなるはずである。これら実施例は本発明の例証に過ぎず、何ら本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００１７】
材料と方法 
材料  −  免疫ブロット法のための抗体は、ウサギ抗ｐ３８抗体（Ａｂ）（ｓｃ−５３５）（カリフォルニア州、サンタクルス、Santa Cruz Biotechnology Inc.製）、マウス抗ｐ−ｐ３８ Ｔｙｒ１８２モノクローナル抗体（ＭＡｂ）（ｓｃ−７９７３）、ウサギ抗ＪＮＫ Ａｂ（ＣＳＴ−０２５２、マサチューセッツ州、ダンバーズ、Cell Signaling Technology製）、マウス抗ｐ−ＪＮＫ Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５ ＭＡｂ（ｓｃ−６２５４）、ウサギ抗ＥＲＫ１／２ Ａｂ（ｓｃ−９４）、マウス抗ｐ−ＥＲＫ１／２ Ｔｙｒ２０４ ＭＡｂ（ｓｃ−７３８３）、ウサギ抗Ａｋｔ Ａｂ（ＣＳＴ−９２７２）、ウサギ抗ｐ−Ａｋｔ Ｓｅｒ４７３ Ａｂ（ＣＳＴ−９２７１）、ウサギ抗ＪＡＫ１ Ａｂ（ｓｃ−７２２８）、ウサギ抗ＪＡＫ２ Ａｂ（ｓｃ−２９４）、ウサギ抗ＪＡＫ３ Ａｂ（ｓｃ−５１３）、ウサギ抗ＴＹＫ２ Ａｂ（ｓｃ−１６９）、ウサギ抗開裂カスパーゼ−３ Ａｓｐ１７５ Ａｂ（ＣＳＴ−９６６１）、マウス抗全長カスパーゼ−３ Ａｂ（ｓｃ−７２７２）、全長と活性化断片の両方を検出するマウス抗カスパーゼ−８ Ａｂ（ＣＳＴ−９７４６）、全長と３５／３７ｋＤａ開裂断片の両方を検出するウサギ抗カスパーゼ−９ Ａｂ（ＣＳＴ−９５０２）、ウサギ抗ＰＡＲＰ Ａｂ（ＣＳＴ−９５４２）、ウサギ抗ＢｃｌｘＬ Ａｂ（ｓｃ−７１９５）、ヤギ抗アクチン Ａｂ（ｓｃ−１６１５）、マウス抗Ｂａｘ ＭＡｂ（ｓｃ−７４８０）、マウス抗Ｂｃｌ−２ ＭＡｂ（ｓｃ−５０９）、ヤギ抗ＣＯＸ−１ Ａｂ（ｓｃ−１７５２）およびヤギ抗ＣＯＸ−２ Ａｂ（ｓｃ−１７４６）。インドメタシン（Ｉ７３７８）はSigma（ミズーリ州、セントルイス）製であり、ＮＳ−３９８（＃７０５９０）はCayman Chemical（ミシガン州、アン・アーバー）製である。
【００１８】
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）用の抗体は、Beckman Coulter Company（フロリダ州、マイアミ）製であり、それらは、抗ＣＤ１ａ−ＰＥ（ＩＭ１９４２）、抗ＣＤ３−ＰＥ（ＩＭ１２８２）、抗ＣＤ１０−ＰＥ（ＩＭ１９１５）、抗ＣＤ１１ａ−ＦＩＴＣ（ＩＭ０８６０）、抗ＣＤ１１ｂ−ＰＥ（ＩＭ２５８１）、抗ＣＤ１１ｃ−ＰＥ（ＩＭ１７６０）、抗ＣＤ１３−ＰＥ（ＩＭ１４２７）、抗ＣＤ１４−ＦＩＴＣ（ＩＭ０６４５）、抗ＣＤ１５−ＦＩＴＣ（ＩＭ１４２３）、抗ＣＤ１６−ＦＩＴＣ（ＩＭ０８１４）、抗ＣＤ２８−ＦＩＴＣ（ＩＭ１２３６）、抗ＣＤ３３−ＰＣ５（ＩＭ２６４７）、抗ＣＤ３４−ＰＣ５（ＩＭ２６４８）、抗ＣＤ３８−ＦＩＴＣ（ＩＭ０７７５）、抗ＣＤ４０−ＰＥ（ＩＭ１９３６）、抗ＣＤ４１−ＦＩＴＣ（ＩＭ０６４９）、抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣ（ＩＭ０７８２）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＦＩＴＣ（ＩＭ０５８４）、抗ＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ（ＩＭ１３０７）、抗ＣＤ４９ｄ−ＦＩＴＣ（ＩＭ１４０４）、抗ＣＤ４９ｅ−ＦＩＴＣ（ＩＭ１８５４）、抗ＣＤ５１−ＦＩＴＣ（ＩＭ１８５５）、抗ＣＤ５４−ＰＥ（ＩＭ１２３９）、抗ＣＤ６１−ＦＩＴＣ（ＩＭ１７５８）、抗ＣＤ８０−ＦＩＴＣ（ＩＭ１８５３）、抗ＣＤ８３−ＰＣ５（ＩＭ３２４０）、抗ＣＤ８６−ＰＥ（ＩＭ２７２９）、抗ＣＤ１１７−ＰＣ５（ＩＭ２６５７）、抗ＣＤ１５２−ＰＥ（ＩＭ２２８２）および抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＦＩＴＣ（ＩＭ１６３８）である。抗ＣＤ６８−ＦＩＴＣ（ＧＭ−４１５２）はCaltag Laboratories（カリフォルニア州、バーリンゲーム）製である。
【００１９】
培養細胞  −  培養した包皮由来ヒト線維芽細胞であるＨＦＳＦ−１３２は、Bizik et al., 2004に記載されている継代数７〜１５のものを使用した。ＫＧ−１、ＴＨＰ−１、Ｕ−９３７、Ｋ５６２、JurkatおよびRajiはアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、バージニア州、マンサス）から入手した。全ての細胞を、ＲＰＭＩ １６４０培地（スコットランド国、ペイズリー、Life Technologies製）に１０％牛胎児血清（Life Technologies製）、１００Ａｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１００単位／ｍｌのペニシリンを添加したもので培養した。
【００２０】
スフェロイド形成の開始は、Bizik et al., 2004の記載に従った。簡単に説明すると、丸底９６穴プレート（マサチューセッツ州、ケンブリッジ、Costar製）を、滅菌水で調製した０．８％のＬＥアガロース（メイン州、ロックランド、BioWhittaker製）で処理し、薄いフィルム状の非接着表面を形成した。線維芽細胞をトリプシン／ＥＤＴＡを用いて培養皿から剥がし、単一細胞懸濁液（４×１０4細胞／ｍｌ）を完全培地で調製した。スフェロイド形成を開始するために、２５０ｍｌ等量を個別のウェルに植え付け、プレートを５％ＣＯ2雰囲気下、＋３７℃でインキュベートした。
【００２１】
共培養とネモーシス刺激実験のために、白血病細胞と２４時間処理後線維芽細胞スフェロイドとの培養を、白血病細胞：線維芽細胞比が１：１の条件下で様々な培養時間で行った。成長曲線を概算する際には、ブルカーチャンバー内で細胞数を計測することで細胞数を評価した。免疫ブロット法、ＦＡＣＳおよび接着試験の際は、残存スフェロイドを重力示差沈降法よって共培養細胞から除去した。
【００２２】
共培養の９６時間後の白血病細胞の形態を、位相差顕微鏡で評価した。線維芽細胞スフェロイドと９６時間共培養した後の白血病細胞について、その接着率を評価した。その後、等量の細胞系を標準的な細胞培養皿に植えつけ、２４時間培養した。培養細胞を洗浄し、トリプシン処理によって接着細胞を回収して計数し、接着細胞のパーセンテージを計算した。
【００２３】
白血病細胞の走化性測定は、２４時間処理後線維芽細胞スフェロイドと共培養したナイーブ白血病細胞系と同様に、アガロース処理済の６穴プレートで行った。スフェロイドを中心とし、スフェロイドの直径の２倍の長さを半径とする範囲内に存在する白血病細胞数を、接眼レンズ用グリッドを用いて１ウェル当たり１５個のスフェロイドについて測定した。
【００２４】
細胞周期の解析  −  ＤＮＡヒストグラムと細胞周期解析のために、白血病細胞を２４時間処理後線維芽細胞スフェロイドと９６時間共培養し、沈降法によって線維芽細胞クラスターから分離した。この細胞をＰＢＳで洗浄し、１％ パラホルムアルデヒドで固定し、ＲＮＡ分解酵素（１００μｇ／ｍｌ）で処理した後、そのＤＮＡをヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌ）で染色し、ＦＡＣＳで解析した。
【００２５】
免疫ブロット法  −  完全ミニプロテアーゼ阻害剤混合物タブレット（Complete Mini-protease inhibitor mixture tablets））（ドイツ国、マンハイム、Roche製）を添加した、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルローディングバッファー（６２．５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ ＳＤＳ、２０％ グリセリン、５％ β−メルカプトエタノールと０．００５％ ブロモフェノールブルー）中で細胞サンプルを直接溶解し、５分間煮沸した。溶解物を１４，０００ｒｐｍで１５分遠心して、粒状の不溶性物質を沈殿させた。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５〜１５％の濃度勾配を有するポリアクリルアミドと３．５％の濃縮ゲル）で分離した。ゲルからタンパク質を電気泳動的にニトロセルロースメンブラン（ドイツ国、ダッセル、Schleicher and Schuell製）に転写し、転写効率をポンソーＳ染色で確認した。メンブランをＴＢＳ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌと０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５）で調製した２．５％の低脂肪粉末牛乳溶液でブロッキングした後、特異的な一次抗体とインキュベートし、次にアルカリホスファターゼ結合二次抗体（ウィスコンシン州、マディソン、Promega製）とインキュベートした。タンパク質のバンドは製造者の推奨する方法で可視化した。
【００２６】
フローサイトメトリー  −  フローサイトメトリーによる解析のために、白血病細胞を特定の時間に渡って共培養し、スフェロイドを除去するための示差沈降法の後、抗原特異的抗体または対照となるアイソタイプ適合抗体と共に氷上でインキュベートし、１％ パラホルムアルデヒドで固定した。ＦＡＣＳ解析はEXPO32解析プログラムを用いたEPICS ALTRAフローサイトメーター（いずれもカリフォルニア州、フラートン、Beckman Coulter Inc.製）で行った。
【００２７】
酵素結合免疫測定法によるサイトカイン濃度の測定  −  線維芽細胞スフェロイド条件培地を、スフェロイド形成開始から９６時間後に９６穴プレートから回収した。ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、オンコスタチンＭおよびＴＮＦ−αの濃度は、市販のＥＬＩＳＡキットと試薬を製造者の説明書に従って使用して定量した。ヒト ＩＬ−１β、ヒト ＩＬ−１１、ヒト ＬＩＦ、ヒト ＴＮＦ−αおよびヒト オンコスタチンＭに使用したＥＬＩＳＡはR and D Systems（ミネソタ州、ミネアポリス）製であり、ヒト ＩＬ−６とヒト ＩＬ−８に使用したＥＬＩＳＡはオランダ赤十字の中央研究所（Central Laboratory of the Netherlands Red Cross）（アムステルダム、ＣＬＢ）より入手した。ネモーシス線維芽細胞条件培地中のサイトカインの定量には、ヒト由来のＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）およびＴＮＦ−αを、Bio-Plex ヒト サイトカイン Ｔｈ１／Ｔｈ２パネル（カリフォルニア州、ハーキュリーズ、Bio-Rad Laboratories Incのカタログ番号１７１−Ａ１１０８１）を用い、Luminex 100システム（テキサス州、オースチン、Luminex Corporation製）で行った。
【００２８】
結果 
表現型特性および成長特性、ならびに細胞周期解析  −  白血病細胞系によるＨＧＦ／ＳＦ受容体ｃ−Ｍｅｔの発現の解析においては、正常なプロセッシングを受けた形態がＵ−９３７細胞系、Jurkat細胞系、Raji細胞系およびＫ５６２細胞系に見られたが、ＴＨＰ−１細胞やＫＧ−１細胞では見られなかった（図１のＡ）。全ての細胞をネモーシス線維芽細胞と共培養し、成長特性のスクリーニングを行った。ｃ−Ｍｅｔ陽性細胞系は、その増殖速度に顕著な変化は見られなかったが、ｃ−Ｍｅｔ陰性細胞系であるＴＨＰ−１とＫＧ−１は認識可能な成長停止によって応答した。ネモーシス線維芽細胞による刺激に関する後の実験には、ｃ−Ｍｅｔ陰性であるＴＨＰ−１細胞系とＫＧ−１細胞系およびｃ−Ｍｅｔ陽性であるＵ−９３７細胞系を選択した。これら細胞のネモーシスによる刺激は、ｃ−Ｍｅｔの発現レベルに何の影響も与えなかった（図１のＢ）。ＴＨＰ−１細胞及びＫＧ−１細胞とＵ−９３７細胞との対比においても、接着班キナーゼ（ＦＡＫ）とシクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）の発現における違いがあった（図１のＢ）。しかし、これら細胞系から誘導性ＣＯＸ−２アイソフォームを検出することはできなかった（データは示さない）。
【００２９】
ＫＧ−１細胞、ＴＨＰ−１細胞およびＵ−９３７細胞の細胞周期解析  −  共培養においてネモーシス線維芽細胞は、ｃ−Ｍｅｔ欠損細胞に対して劇的な成長阻害を誘導したが、ｃ−Ｍｅｔ陽性細胞系に対しては、成長阻害を全く、若しく殆ど誘導しなかった。図２のＡ〜Ｃに、これら細胞系を線維芽細胞ネモーシスに付した時の成長応答を示す。ネモーシス処理による成長の低下は、ＫＧ−１細胞においては共インキュベーションの７２時間後に明らかになったが、ＴＨＰ−１細胞系においては、４８時間後に既に明らかになっており、この結果は、後者の細胞がネモーシスに対してより迅速な応答と反応性を示すことを表している。９６時間のインキュベーションの後、Ｕ−９３７細胞においては、増殖に対するわずかな遅延効果が見られただけだった。応答性細胞系のネモーシスによる増殖停止は研究の間持続しており、その間に対照集団は対数増殖期後の成長平坦域に達していた。１６８時間後には対照細胞は成長平坦域に達しており、この間にネモーシスが阻害した細胞系の増殖は、ＫＧ−１細胞で６７％、ＴＨＰ−１細胞で８３％、そしてＵ−９３７細胞で６％だった。
【００３０】
図２のＤ〜Ｅは、ＤＮＡヒストグラムで評価した白血病細胞系の細胞周期分布を示す。ネモーシスで処理すると、ＫＧ−１細胞集団の３０．２％およびＴＨＰ−１細胞集団の３１．３％がＧ０Ｇ１期に蓄積された。Ｍ期とＳ期からの集団変化は、分化に伴う細胞周期の停止を表している。Ｕ−９３７細胞はその細胞周期特性を維持しており、集団変化といった、線維芽細胞ネモーシスに対する目立った応答は見られなかった。更に、クラスター化した線維芽細胞を非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）であるＮＳ−３９８およびインドメタシンで処理してプロスタグランジンの産生を防止しても（Bizik et al., 2004）、ネモーシスによる増殖阻害に影響を与えなかった（データは示さない）。
【００３１】
ネモーシスに対する白血病細胞の応答に見られる、形態学的および機能的な特性  −  Ｇ０Ｇ１期における細胞周期の停止は分化誘導と関連しているため（Liu et al., 1996）、ネモーシスに対する応答による白血病細胞のおける形態学的特性と接着性の変化を評価した。ここでも、ネモーシス応答性のＫＧ−１およびＴＨＰ−１と、対照となる非応答性細胞系Ｕ−９３７との差は歴然としていた。ＫＧ−１細胞とＴＨＰ−１細胞においては、ネモーシスによって接着細胞の割合が１９．８％と３１．６％も増加した（図３のＡ）。これらの細胞は、細胞の伸長と星状仮足を有する樹状細胞様の表現型に見られる形態学的特性を示したが（図３のＢ）、Ｕ−９３７細胞がネモーシスに対する応答として、その形態や接着パターンを変化させることはなかった（図３のＢ）。ネモーシス応答性細胞系における接着性表現型の誘導は、細胞間接着因子−１（ＩＣＡＭ−１）の発現増加と関連していることを確認した（図３のＣ）。
【００３２】
ネモーシスによるＫＧ−１細胞およびＴＨＰ−１細胞の接着増加は、クラスター化した線維芽細胞が細胞の運動性と走化性に影響する因子も産生することを示唆している。そこで、ネモーシス線維芽細胞との共培養におけるＫＧ−１細胞、ＴＨＰ−１細胞およびＵ−９３７細胞の走化性応答を評価した。分析した細胞系の応答を比較すると、ＫＧ−１とＴＨＰ−１は共にネモーシス中の線維芽細胞クラスターに向かって走化性を示したが、Ｕ−９３７細胞は非応答性であった（図３のＤ）。ネモーシスはＫＧ−１細胞とＴＨＰ−１細胞を引き寄せ、これらの細胞は、線維芽細胞クラスターの周囲に、Ｕ−９３７細胞と比較して高密度（それぞれ、Ｕ−９３７細胞の密度の１１培および２２倍）で蓄積された。
【００３３】
単球の成熟と分化はマクロピノサイトーシスによる抗原取り込みの低下と関連しているため（Austyn, 1996）、機能的スケールにおける分化のパラメーターとして、ネモーシスのピノサイトーシス活性に対する影響を検討した。白血病細胞系がＦＩＴＣ標識デキストランに対して反発する能力を、白血病細胞とネモーシススフェロイドとの共インキュベーションから２４時間後および９６時間後に測定した。ネモーシスで細胞系を刺激し、続いてＦＩＴＣ−デキストランとインキュベートすると、フローサイトメトリーによって明確なＦＩＴＣ−デキストランの取り込み阻害がネモーシス処理済のＫＧ−１細胞（平均強度変化は−１１．９２）およびＴＨＰ−１細胞（平均強度変化は−３．８６）が観察された。一方、Ｕ−９３７細胞では、０．９１の強度増加が観察された（データは示さない）。このデータは、接着性の誘導と樹状細胞様仮足の存在に代表されるネモーシス応答性のＫＧ−１細胞およびＴＨＰ−１細胞の形態学的特性と一致する。
【００３４】
ネモーシス刺激済細胞系における表面抗原発現の変化  −  ネモーシス処理済細胞の表現型を更に特徴づけるために、細胞表面抗原のＦＡＣＳ解析を付属の表に示したように行い、対照の抗原強度をネモーシス処理済細胞のものと比較した。この解析によって、５種の細胞表面マーカーの明確な誘導パターンが得られた。興味深いことに、そして他の細胞応答と同様に、これらの抗原はＫＧ−１細胞とＴＨＰ−１細胞においてのみ誘導された。表面抗原の誘導はＵ−９３７細胞では見られず、この細胞はわずかな全体的な発現の下方制御によって応答した。
【００３５】
このアプローチによって、ネモーシス応答性細胞系による、以下の因子の誘導を同定した：  樹状細胞マーカーＣＤ１１ｃ、白血球共通抗原ＣＤ４５ＲＡ、接着性分子ＣＤ５４、樹状細胞関連Ｔ細胞共刺激分子ＣＤ８６、および膜ぺプチダーゼＣＤ１３。時間依存的なＣＤ８６誘導（図４）は、ＫＧ−１細胞およびＴＨＰ−１細胞における成長停止と同様の応答動力学を示し、後者の細胞系はこのパラメーターについてもより迅速に反応した。白血病細胞との共培養の前に、線維芽細胞クラスターをＮＳ−３９８またはインドメタシンの存在下で形成しても、ＣＤ８６の誘導に対する影響はなかった（データは示さない）。
【００３６】
更に、種々の系統および分化ステージにおけるＣＤ４５の異なる発現（Stelzer et al., 1993）に基づく集団解析を実施した。ＣＤ４５ゲーティング法を実施することで、（高い散乱光測定値によって定義される）高粒状性を有する新規な亜集団をネモーシス処理済のＫＧ−１細胞およびＴＨＰ−１細胞から同定した。しかし、Ｕ−９３７細胞に特徴的な亜集団においては、ネモーシスに対する応答による変化はなかった。発生した集団は、全てのネモーシス誘導化マーカー、特にＣＤ１１ｃとＣＤ１３に陽性であったが、対照的に、Ｕ−９３７細胞の類似したＣＤ４５陽性集団は非応答性だった。ネモーシスは、ＫＧ−１細胞およびＴＨＰ−１細胞のＳＳＣ値の低いＣＤ４５陽性集団においてＣＤ８６陽性性を高めた。上記を総合すると、これらの結果は、応答性細胞系においてネモーシスは、樹状細胞の特性と共に抗原提示およびＴ細胞刺激に関与する抗原の発現を誘導することを示唆している。
【００３７】
ネモーシス線維芽細胞によるサイトカインの産生  −  本発明者らは、ネモーシス線維芽細胞はｃ−ＭｅｔリガンドであるＨＧＦ／ＳＦに富んだ因子源であることを以前報告した。我々のデータとＮＳＡＩＤが何の影響も及ぼさないことに基づくと、ネモーシス応答性白血病細胞系におけるｃ−Ｍｅｔの欠失が、成長停止の誘導においてＨＧＦ／ＳＦが何らかの役割を果たしているという可能性を打ち消すことが明らかであると考えられた。更に、走化性応答は、化学誘引物質の関与を示唆している。そこで、走化性および白血病細胞増殖の調節と関連があることが知られているサイトカインのパターンを評価した。インターロイキン（ＩＬ）−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および白血病阻害因子（ＬＩＦ）の明確な誘導がネモーシススフェロイドにおいて明らかであり、一方、対応する単層培養細胞においてこれら因子が放出されたのは、培養開始から９６時間後だった（図６）。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、インターフェロン−γ、オンコスタチンＭおよびＴＮＦ−αのレベルは低いか検出不能のままであり、細胞培養法の影響を受けなかった。スフェロイドによって最も多量に産生されるサイトカインはＩＬ−６とＩＬ−８であり、誘導量（スフェロイドによる平均産生量）は、対応する単層培養細胞の３．７倍（２５．４ｎｇ／ｍｌ）と８．０倍（１５８．７ｎｇ／ｍｌ）だった。線維芽細胞スフェロイドにおいては、産生するＩＬ−１βとＬＩＦの誘導倍率は１８．３と３．８だった。ネモーシス線維芽細胞は、単層培養細胞では検出不能なＧＭ−ＣＳＦも産生した（図６）。これらの結果は、線維芽細胞のクラスター形成によって誘導されたネモーシスは、単球の機能を制御する一連のサイトカインおよび成長因子の基本源であることを示唆している。
【００３８】
白血病細胞系における、ネモーシスによるアポトーシス関連細胞内変化  −  腫瘍細胞成長の阻害は、通常、アポトーシスの誘導を伴う。そこで、ＴＨＰ−１細胞およびＫＧ−１細胞のネモーシスに対する成長停止と分化応答における公知のアポトーシス経路を評価した。図７のＡにおいては、いくつかのアポトーシス関連タンパク質の発現によって、一般的なアポトーシス実行因子であるカスパーゼ−３の開裂した活性型がネモーシス応答性細胞系においてのみネモーシスに対する応答として生じることが明らかになった。非応答性Ｕ−９３７は何の影響も示さないということは、ネモーシス応答性細胞におけるアポトーシスの活性化を示唆している。開始因子であるカスパーゼ−８とカスパーゼ−９の活性開裂型の発現の変化はいずれの細胞系からも検出されなかったが、ＴＨＰ−１細胞およびＫＧ−１細胞においてネモーシスは全長カスパーゼ−８の発現を誘導した。この場合も、Ｕ−９３７細胞は何の影響も示さなかった。しかし、カスパーゼ−３の開裂とカスパーゼ−８発現の増加は、アポトーシス調節タンパク質であるＢｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２またはＢａｘの発現には反映されておらず、この作用がアポトーシス非関連機構であることを示唆している。
【００３９】
ＴＨＰ−１細胞およびＫＧ−１細胞においては、ネモーシスによって生じる活性型カスパーゼ−３の明白な開裂と発現増加が見られることから、ＤＮＡ損傷、アポトーシスおよびカスパーゼ−３活性と関連のあるポリＡＤＰリボース−ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の開裂（Ame et al., 2004）の程度を評価した。図７のＡは、ネモーシスに付した白血病細胞系における、全長ＰＡＲＰ（ｐ１１６）とその開裂不活性型ｐ８９の発現パターンを示す。ネモーシス処理はＴＨＰ−１細胞およびＫＧ−１細胞におけるＰＡＲＰ開裂を阻害したが、Ｕ−９３７細胞は非応答性のままであった。この結果は、これら細胞系においては、カスパーゼ−３開裂の増加はＰＡＲＰの不活化に基づくアポトーシス誘導とは関連がないことを示唆した。
【００４０】
白血病細胞系における、ネモーシスのキナーゼカスケードに対する影響  −  分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の制御不全は、白血病細胞の高増殖性表現型と関連付けて考えられてきた（Platanias, 2003）。白血病細胞のネモーシスに対する応答性について、ＭＡＰＫであるｃ−ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、細胞外シグナル調節キナーゼｐ４４／ｐ４２（ＥＲＫ１／２）およびｐ３８の関与を評価した（図７のＢ）。全てのナイーブ白血病細胞系において、これらの有糸分裂活性表現型を反映する上記キナーゼの構造的なリン酸化が見られた。成長停止と分化によってネモーシスに応答するＫＧ−１細胞系およびＴＨＰ−１細胞系においては、ｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化は劇的に抑制されており、一方、Ｕ−９３７細胞系においては、ｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化がネモーシスによって変化することはなかった。類似しているが、より程度の低いリン酸化阻害がＥＲＫ１／２について明確であり、Ｕ−９３７細胞はここでもネモーシスに対して非応答性だった。全ての細胞系において、ＪＮＫのリン酸化と発現のレベルの変化は比較的少なかった。Ｕ−９３７細胞がｐ３８ ＭＡＰＫ、ＪＮＫおよびＥＲＫ１／２のリン酸化について、ＴＨＰ−１細胞系およびＫＧ−１細胞系と比べて高いネモーシス非応答性レベルを示し、更にネモーシスの影響を受けないＡｋｔの持続性リン酸化を考え合わせると、表現型が異なるこれら白血病細胞の高増殖活性は、それぞれ異なる経路を使用することを示唆している。ネモーシス応答性細胞においては、ｐ３８とＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫの下方制御が成長停止と分化と関連していることも示唆している。
【００４１】
更に、単球と白血病細胞の分化と関連があることが知られているJanusタンパク質チロシンキナーゼファミリー（ＪＡＫ）のメンバー（ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３およびＴＹＫ２）（Rane et al., 2002、Mangan et al., 2004）について、それらの発現を評価した。線維芽細胞ネモーシスによって分化するように誘導したＫＧ−１細胞およびＴＨＰ−１細胞において、ＪＡＫ１とＪＡＫ３の発現が増加した。非応答性のＵ−９３７細胞系において、ＪＡＫ１の発現はネモーシスによって下方制御され、ＪＡＫ３の発現は観察されなかった（図７のＢ）。Ｕ−９３７細胞と、ネモーシス応答性のＫＧ−１細胞およびＴＨＰ−１細胞との表現型の違いは、ＴＹＫ２の発現のみならず、ＪＡＫ３の発現にも反映されていた。ＪＡＫ２の発現については、成長停止及び分化のいずれとの相関関係も見られなかった（図７のＢ）。
【００４２】
考察 
クラスター化した線維芽細胞は、細胞増殖抑制性、成長阻害性および分化性の応答をｃ−Ｍｅｔ陰性白血病細胞系であるＴＨＰ−１とＫＧ−１で誘導することが可能であるが、ｃ−Ｍｅｔ陽性Ｕ−９３７細胞系では何の効果も示さないことを示すデータを提示する。更に、ネモーシス線維芽細胞は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、ＬＩＦおよびＧＭ−ＣＳＦなどの血液生成と分化の調節に関与するサイトカインや成長因子（Lotem and Sachs, 2002、Zhu and Emerson, 2002）を豊富に産生するものであることを示す。これらの結果は、我々の過去のデータ（Bizik et al., 2004、Kankuri et al., 2005）と一致し、ネモーシス線維芽細胞は大量のパラクリン仲介因子を産生することが可能であり、その効力の大部分は標的細胞の表現型と受容体発現プロファイルによって決定付けられることを示唆している。
【００４３】
細胞生存率と細胞死のバランスが崩れている腫瘍細胞は、未成熟なまたは未分化の表現型を獲得している（Bishop, 1991、Wang and Chen, 2000）。その持続性は、適応性免疫システムによる認識を避ける能力によって更に促進されている（Zou, 2005）。白血病細胞は白血球の未分化表現型を有し、樹状細胞様形態への分化を誘導することは、治療的な抗白血病性Ｔ細胞応答を刺激する（Charbonnier et al., 1999、Choudhury et al., 1999、Cignetti et al., 1999、Fujii et al., 1999、Claxton et al., 2001、Mohty et al., 2002、Cignetti et al., 2004）。よって新生細胞の分化は、血液癌において治療的利点をもたらすことができる（Reiss et al., 1986）。
【００４４】
成長停止の誘導に加え、ネモーシス線維芽細胞が形態学的特性、機能的応答および表面抗原発現に基づく、白血病細胞の表現型依存的分化も促進することを示した。ネモーシスに対する応答としてのＴＨＰ−１細胞およびＫＧ−１細胞の分化は、ＦＡＣＳで更に特徴付けたように、接着性の成熟抗原提示細胞様の型をはっきりと示した。フローサイトメトリーによる評価および細胞集団に基づく特徴づけにＣＤ４５ゲーティング法を用いた。ＣＤ４５とＣＤ４５ＲＡは成熟赤血球とその中間前駆細胞以外の全ての造血細胞で発現されており、これら抗原レベルの増加は分化の程度と相関する（Hermiston et al., 2003）。その結果、これらの発現もリンパ球と骨髄細胞の成熟度を臨床的に特定するために有用である（van Lochem, 2004）。ＣＤ４５のＦＡＣＳゲーティングによって、散乱光値に基づく顆粒性が高く、細胞表面抗原であるＣＤ１１ｃ、ＣＤ８６、ＣＤ５４およびＣＤ１３の発現の高い新しい集団をネモーシス応答性細胞系から見出した。ネモーシス線維芽細胞と接触させると、これら細胞の中のＳＳＣ値の低い集団においてさえも、特異的樹状細胞マーカーＣＤ１１ｃおよびＴ細胞共刺激性ＣＤ８６の増加が明確であった。
【００４５】
骨髄樹状細胞のマーカーであるβ２インテグリンＣＤ１１ｃ（Osugi et al., 2002）の発現増加は、分化及び成熟と関連があり（Corbi and Lopez-Rodriguez, 1997、Noti and Reinemann, 1995）、我々はこのマーカーがネモーシス応答細胞における共刺激分子ＣＤ８６の誘導と連係していることを見出した。ＣＤ１１ｃは、細胞−細胞相互作用および細胞−マトリクス相互作用を仲介する接着分子として働く（Shelley et al., 2002）。一方、ＣＤ８６（Ｂ７−２）は、共刺激シグナル伝達を仲介するＴ細胞上のＣＤ２８分子およびＣＴＬＡ−４分子と結合し（Collins et al., 2002)、Ｔ細胞の増殖、活性化およびクローンの増大を促進する（Coyle et al., 2001）。Ｔ細胞ＣＴＬＡ−４の刺激は、抗腫瘍活性を促進し、ＣＤ２８の刺激は、細胞傷害性Ｔリンパ球の仲介する腫瘍の破壊を促進する（Zheng et al., 1998）。ＣＤ１１ｃと同様に、白血病細胞上のＣＤ８６の発現は樹状細胞様表現型と関連付けて考えられている（Re et al., 2002）。
【００４６】
我々の研究は、ＫＧ−１細胞系とＴＨＰ−１細胞系は線維芽細胞ネモーシスに対する応答として、より接着性の表現型を獲得することを示す。この現象は、我々のＦＡＣＳ解析によると、これら細胞におけるＣＤ１１ｃの誘導のみならず、接着性相互作用を仲介する造血系細胞と非造血細胞の両方で発現されているＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）に対する陽性反応の増加によって説明することができる。ＩＣＡＭ−１は、例えば、β２サブファミリーインテグリンであるＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ−１）やＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８（Ｍａｃ−１）に結合することによって、接着性相互作用を仲介する（Marlin and Springer, 1987、Roebuck and Finnegan, 1999）。ＣＤ１１ｃと同様に、ＩＣＡＭ−１は白血球の血管外遊走を仲介し、ＣＤ８６と同様に、ＩＣＡＭ−１の結合は抗原提示におけるＴ細胞活性化の共刺激シグナルとして機能する（Zuckerman et al., 1998、Grakoui et al., 1999、Hubbard and Rothlein, 2000）。
【００４７】
表現型を決定することによって、ネモーシス処理が標的細胞表現型依存的に白血病細胞系における表面抗原の樹状細胞様発現を誘導するという証拠を発見した。更に我々の研究結果が示唆するところによると、ネモーシスによって獲得した表現型は、マクロピノサイトーシスの活性が低い、成熟抗原提示細胞を想起させるものであった。抗原提示細胞との関連性は、主要組織適合性複合体クラスＩＩ分子の提示のためにペプチドを開裂し、抗原処理に参加するアミノペプチダーゼであるＣＤ１３が増加するという知見によって更に強化された（Larsen et al., 1996）。
【００４８】
我々のデータを分子細胞内レベルまで広げるために、成長停止と分化に関連する２つの主要な経路、即ち、アポトーシスカスケードにおいて鍵となる因子の活性化、およびいくつかのＭＡＰキナーゼシグナル経路のリン酸化の関与について調査した。我々が知見したのは、実行因子カスパーゼ−３が集中的に開裂したことと、それと対照的に、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−２ＸLおよびＢａｘの発現に変化がなく、それに伴って開始因子カスパーゼ−８とカスパーゼ−９の開裂にも変化がなかったことである。実行因子カスパーゼが活性化にタンパク質分解性開裂を必要とするのに対し、開始因子は開裂なしに、オリゴマー化または２量体化することでも活性化される（Salvesen and Abrams, 2004）。従って、開裂の兆候を伴わない未開裂全長カスパーゼ−８レベルの増加は、ネモーシス応答性細胞系であるＴＨＰ−１およびＫＧ−１におけるカスパーゼ−８の活性化の可能性を排除するものではない。驚くべきことに、アポトーシスと、開裂によるカスパーゼ−３の活性化との間に明確な関連が存在するにもかかわらず、ＰＡＲＰ（ＤＮＡ修復に関連するカスパーゼ−３の基質）のタンパク質分解性プロセッシングの増加は起こらなかった。これは、カスパーゼ−３とカスパーゼ−８のアポトーシス非関連性分化機能を示唆している。
【００４９】
ＰＡＲＰにはいくつかの機能があり、その活性および発現の増加は、ＤＮＡの損傷とＤＮＡ修復、細胞増殖と分化、ならびに転写制御と関連している（Ame et al., 2004）。アポトーシスの引き金となるエフェクターとしてのＰＡＲＰの役割は不確かである（Leist et al., 1997）。我々はＢａｘ、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−２ＸLのタンパク質レベルの増加がＰＡＲＰ発現の低下と関連付けられるという知見を得たことはなく、これはＰＡＲＰの下方制御におけるアポトーシス非関連機構を示唆している。細胞分化が進行するとＰＡＲＰの活性と発現は低下する（D'Amours et al., 1999、Virag and Szabo, 2002）ということは、我々の観察したＰＡＲＰ発現と開裂の低下が、成長停止のみならず、細胞分化と代謝阻害を反映することを示唆している。例えば、全トランス型レチノイン酸誘導性ＮＢ４細胞の好中球性分化に対する応答としてＰＡＲＰは劇的に下方制御され（Bhatia et al., 1995）、この効果はＰＡＲＰの過剰発現によってブロックされた（Bhatia et al., 1996）。分化の引き金となる効果が考えられるものの、我々の研究結果から、ＰＡＲＰ発現とその活性は白血病細胞の高い有糸分裂速度を反映するという推測が導かれた。これは、成長停止後の白血病細胞は、有糸分裂の際に開かれた壊れやすいＤＮＡを保護するための核内ＰＡＲＰ発現とその活性をあまり必要としないためである（D'Amours et al., 1999）。
【００５０】
カスパーゼ−３およびカスパーゼ−８は、単球のみならず、骨格筋細胞や骨芽細胞の分化過程の重要な調節因子である（Launay et al., 2005）。血液学的および他の種類の悪性細胞において、カスパーゼ−８の下方制御は、アポトーシスに抗する手段として働く（Hopkins-Donaldson et al., 2003、Yang et al., 2003）。カスパーゼ−８の上方制御は、ここで示した白血病細胞に対する線維芽細胞ネモーシスの活動のように、ネモーシス応答性細胞においては上記とは逆の（より良性の）働きをすることが示唆された。更に、ネモーシス処理後に細胞数の低下は検出されず、代わりに有糸分裂の劇的な停止を観察したという事実は、成長停止と、２種の細胞系の驚くほど類似した表現型との相関性をより一層強く示唆するものである。これは、ネモーシス応答性表現型において、分化はアポトーシスによる細胞死よりも好まれることを意味する。
【００５１】
ＪＮＫ、ＥＲＫおよびｐ３８の関与するＭＡＰＫカスケードの変化は、悪性細胞の増殖、分化および細胞死と関連付けて考えられてきた（Platanias, 2003）。我々の試験した細胞系においてはネモーシスに対する応答としてＪＮＫの発現やリン酸化が変化したものはなかった。しかし、ｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化と、より低レベルであるがＥＲＫ１／２のリン酸化は、ネモーシスに対して分化と成長停止で応答する細胞系、即ち、ＴＨＰ−１細胞およびＫＧ−１細胞、において顕著に抑制された。文献によると、細胞死および分化におけるｐ３８ ＭＡＰＫの役割は不可解であり（Platanias, 2003）、正常なおよび悪性の細胞における活性は別々に調節されているのかもしれない（Engelberg, 2004）。しかし、蓄積されていくデータは、活性化ｐ３８ ＭＡＰＫは細胞の生存に対してエンハンサーとして機能することを示唆している（Villunger et al., 2000）。更に、ｐ３８はJurkat Ｔ細胞のアポトーシスを防止すること（Nemoto et al., 1998）、そして急性前骨髄性白血病細胞系の１種において全トランス型レチノイン酸誘導性分化を阻害する（Alsayed et al., 2001）という報告がある。
【００５２】
この結果は、キナーゼ活性を反映するｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化に対する阻害は、ネモーシスに対して分化と成長停止で応答する細胞においてのみ生じるという我々のデータと一致する。従ってこの結果は、高増殖性表現型は活性化ｐ３８ ＭＡＰＫと関連があることを示唆し、これら細胞における、変化した若しくは構成性的に活性化されたｐ３８経路の存在を示す。更に、応答性細胞系を線維芽細胞ネモーシスに付すと、ＪＡＫキナーゼであるＪＡＫ１とＪＡＫ３の誘導が生じる。これは、造血系の調節と分化において、ＪＡＫ３（Rane and Reddy, 1994、Mangan et al., 2004）と、より低いレベルではあるがＪＡＫ１（Rodig et al., 1998）の発現制御が生じるという一般的な見解と一致する。ネモーシス応答性細胞系におけるＪＡＫの誘導は、分化の効果を仲介する際のＩＬ−６とＧＭ−ＣＳＦの関与を示唆している。
【００５３】
腫瘍細胞由来因子によって誘導されるように（Kankuri et al., 2005）、線維芽細胞において細胞クラスターが誘導したネモーシスシグナルは、独特な種類の間質に固有の活性化能を提供する。血液学的起源の腫瘍細胞の分化に対する直接的な効果を通じて、ネモーシスは免疫系の応答を悪性化するような影響を与える（図８）。白血病細胞の樹状細胞系への分化はＴ細胞の抗白血病作用を刺激するので（Charbonnier et al., 1999、Choudhury et al., 1999、Cignetti et al., 2004)、このような分化は免疫療法として提案することができる（Claxton et al., 2001、Mohty et al., 2002、Buchler et al., 2003）。我々の研究結果は、ネモーシスに至る同型間質細胞−細胞相互作用は新生成長を調節し、抑制するのに十分なシグナルを提供するという始めてのin vitroの証拠を提供する。
【００５４】
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【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１−１】白血病細胞系におけるｃ−Ｍｅｔ発現、およびネモーシスに付すために選択した細胞系の成長特性。  Ａ：白血病細胞系ＫＧ−１、ＴＨＰ−１、Ｕ−９３７、Jurkat、RajiおよびＫ５６２におけるｃ−Ｍｅｔ受容体の発現。矢印は、正常なプロセシングを受けたｃ−Ｍｅｔ（１４５ｋＤａ）の位置を示す。
【図１−２】Ｂ：白血病細胞系ＫＧ−１、ＴＨＰ−１およびＵ−９３７の増殖動力学。ネモーシス線維芽細胞スフェロイドとの共培養によって刺激した場合と刺激しない場合を示した。図示した時点における処理の間のｐ値：  ＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１。
【図１−３】Ｃ：白血病細胞系ＫＧ−１、ＴＨＰ−１およびＵ−９３７を細胞周期Ｇ０Ｇ１期、Ｇ２期およびＳ期に分けた時のＤＮＡヒストグラムデータおよびパーセンテージ。ネモーシス線維芽細胞スフェロイドと９６時間共培養することによって刺激した場合（塗りつぶしたバー）と刺激しない場合（白抜きのバー）を示した。
【図２−１】レンチウイルスベクターを用いた、ｃ−ＭｅｔによるＴＨＰ−１細胞のトランスダクション。  Ａ：白血病細胞系ＫＧ−１、ＴＨＰ−１およびＵ−９３７におけるｃ−Ｍｅｔの発現。ネモーシス線維芽細胞スフェロイドで９６時間刺激した場合（＋）と刺激しない場合（−）を示した。  Ｂ：対照ＧＦＰでトランスダクションしたＴＨＰ−１細胞およびｃ−ＭｅｔでトランスダクションしたＴＨＰ−１細胞の、図示した時点におけるｃ−Ｍｅｔ発現の動力学。
【図２−２】Ｃ：対照ＧＦＰ−レンチウイルスベクターでトランスダクションしたＴＨＰ−１細胞およびｃ−Ｍｅｔ−レンチウイルスベクターでトランスダクションしたＴＨＰ−１細胞の増殖動力学。ネモーシス線維芽細胞スフェロイドとの共培養によって刺激した場合と刺激しない場合を示した。図示した時点における処理間のｐ値：  ＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１。
【図３−１】白血病細胞のネモーシスに対する、接着性、形態および走化性による応答。  Ａ：白血病細胞系ＫＧ−１、ＴＨＰ−１およびＵ−９３７について、細胞集団内の全細胞数に対して、ネモーシス線維芽細胞との共培養による刺激後に培養皿に接着した細胞数のパーセンテージを、未刺激細胞の場合と比較した結果。＊＊＊は、対応する対照細胞と比較した際のｐ＜０．００１。
【図３−２】Ｂ：ネモーシス線維芽細胞スフェロイドによる刺激有りまたは刺激なしの条件における、接着細胞の形態。細胞の伸長および仮足の存在は刺激したＫＧ−１細胞およびＴＨＰ−１細胞では明らかだったものの、Ｕ−９３７細胞は刺激後もその表現型を維持していた。  Ｃ：ＫＧ−１細胞、ＴＨＰ−１細胞およびＵ−９３７細胞による細胞間接着因子−１（ＩＣＡＭ−１）の発現。ネモーシス線維芽細胞スフェロイドとの共培養によって刺激した場合（＋）と刺激しない場合（−）を示した。ネモーシス応答性細胞系であるＫＧ−１とＴＨＰ−１におけるＩＣＡＭ−１発現の増加は、細胞培養皿への接着増加と関連付けられた。  Ｄ：白血病細胞（ＫＧ−１、ＴＨＰ−１とＵ−９３７）の、共培養における線維芽細胞クラスターに対する走化性運動の定量および形態。ＫＧ−１細胞およびＴＨＰ−１細胞の走化性蓄積の増加が、ネモーシススフェロイドの周辺に観察されたが、Ｕ−９３７細胞は非応答性だった。＊＊＊はＵ−３９７細胞に対するｐ＜０．００１。
【図４−１】ＣＤ８６表面抗原発現の時間依存性。ネモーシス線維芽細胞スフェロイドと共培養した白血病細胞系ＫＧ−１、ＴＨＰ−１およびＵ−９３７のＣＤ８６発現を図示した時点にＦＡＣＳで評価した。
【図４−２】ＣＤ８６表面抗原発現の時間依存性（図４−１の続き）。
【図５】患者由来サンプルから細胞を分離するための装置。
【図６】線維芽細胞のスフェロイドクラスターおよび単層からの、血液生成関連サイトカインの放出。スフェロイドまたは単層として培養した線維芽細胞が、スフェロイド形成後の対応する時間（９６時間目）に産生するサイトカイン（インターロイキンＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および白血病阻害因子（ＬＩＦ））の解析。＊＊＊はグループ間のｐ＜０．００１。
【図７−１】白血病細胞のアポトーシス関連タンパク質および細胞内シグナルタンパク質のイムノブロット解析。  Ａ：白血病細胞系ＫＧ−１、ＴＨＰ−１およびＵ−９３７によるアポトーシス関連分子の発現。ネモーシス線維芽細胞スフェロイドで９６時間刺激した場合（＋）と刺激しない場合（−）を示した。ネモーシス応答性細胞系であるＫＧ−１とＴＨＰ−１においては、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−８の活性関連開裂が明らかだった。カスパーゼ−９の開裂産物や、開裂型ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の発現減少は観察されなかった。上記のネモーシス応答性細胞系とネモーシス非応答性細胞系Ｕ−９３７との表現型の差異は、アポトーシス促進性Ｂａｘタンパク質の発現レベルから明らかである。
【図７−２】Ｂ：白血病細胞系ＫＧ−１、ＴＨＰ−１およびＵ−９３７における、分裂促進物質−活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）であるｐ３８、ＪＮＫ、ＥＲＫ１／２およびＡｋｔキナーゼのリン酸化産物発現量と全発現量の、JanusキナーゼファミリーのＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３およびＴＹＫ２との比較。ネモーシス線維芽細胞スフェロイドで刺激した場合（＋）と刺激しない場合（−）を示した。ネモーシス応答性細胞系ＫＧ−１とＴＨＰ−１においては、ｐ３８とＥＲＫ１／２の脱リン酸化の増加が、ＪＡＫ１とＪＡＫ３の発現増加と共に明らかだった。ネモーシス非応答性細胞系Ｕ−９３７はこれらタンパク質の発現の変化を示さなかった。
【図８】ネモーシス由来シグナルの固形腫瘍細胞および造血腫瘍細胞に対する効果をまとめた模式図。線維芽細胞ネモーシスの効果と、上皮性腫瘍細胞の侵襲性と共に、白血病細胞の成長停止および分化誘導を標的細胞表現型依存的に誘導する仲介物質を模式的に示した。破線は、このカスケードに関連した起こりうる生物学的および病因学的なプロセスを示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
2009531047.tif 000012
【図７−１】
2009531047.tif 000013
【図７−２】
2009531047.tif 000014
【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年4月30日(2004.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞サンプルの処理、好ましくは診断または治療を目的とした処理、を行うための方法であって、
ａ）間葉系細胞を、細胞が互いに接着して多細胞凝集塊を形成する条件下で培養し、そして
ｂ）細胞サンプル内の細胞を上記工程ａ）で形成された多細胞凝集塊または条件培地と共培養し、該細胞サンプル内の細胞の成長およびステータスの少なくとも一方を調節する
ことを包含する方法。
【請求項２】
工程ｂ）において、該細胞サンプルと該多細胞凝集塊との間に半透性メンブランを設け、該半透性メンブランはサイトカインや成長因子の交換を許容するが、間葉系細胞からなる凝集塊を該細胞サンプル内の細胞から隔離することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該細胞サンプル内の細胞が白血病細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該多細胞凝集塊との共培養に対して応答する細胞を該細胞サンプルから選択する工程ｃ）を更に包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
共培養に対して走化性運動で応答する細胞を選択することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該細胞を、治療または診断に用いるために選択することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
該細胞サンプルが患者由来サンプルであり、該多細胞凝集塊が自家間葉系細胞に由来することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該細胞サンプルが患者由来サンプルであり、該多細胞凝集塊が同種間葉系細胞に由来することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
細胞サンプルから細胞を選択するための装置であって、第１コンパートメントと第２コンパートメントを包含し、該第１コンパートメントは第２コンパートメントの内部に設けられており、該第１コンパートメントには、バッファー及び該バッファー中に存在する線維芽細胞または間葉系細胞の多細胞凝集塊が収容されており、該第１コンパートメントは、２つのコンパートメントの間でバッファー、サイトカインや成長因子の交換を許容する半透性メンブランによって第２コンパートメントから分離されており、そして第２コンパートメントは、細胞の移動を許容する孔径を有する第２メンブランによって細胞のサンプルから分離されていることを特徴とする装置。
【請求項１０】
２つのコンパートメントと細胞のサンプルが、外部封止メンブランで囲われていることを特徴とする、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
該半透性メンブランが、２つのコンパートメント間の細胞の交換を許容しないものであることを特徴とする、請求項９に記載の装置。
【請求項１２】
該半透性メンブランの孔径が０．２〜２μｍであり、該第２メンブランの孔径が３〜８μｍであることを特徴とする、請求項９に記載の装置。
【請求項１３】
該サンプルが骨髄穿刺または末梢血サンプルであることを特徴とする、請求項９に記載の装置。
【請求項１４】
白血病細胞サンプルの処理、好ましくは診断または治療を目的とした処理、を行うための方法であって、
ａ）線維芽細胞または間葉系細胞を、細胞が互いに接着して多細胞凝集塊を形成する条件下で培養し、そして
ｂ）白血病細胞サンプル内の細胞を上記工程ａ）で形成された多細胞凝集塊または条件培地と共培養し、それにより該白血病細胞サンプル内の白血病細胞の成長およびステータスの少なくとも一方を調節する
ことを包含する方法。
【国際調査報告】
2009531047.tif 000016
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2009531047.tif 000018
2009531047.tif 000019
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2009531047.tif 000021