(57)【要約】  本発明は、サルモネラ・エンテリカおよび／または（病原性）大腸菌のような、獣医学的動物種に感染する細菌の二重弱毒化変異体株および三重弱毒化変異体株に関する。本発明の変異体株は、少なくとも１つの第１の遺伝子改変および少なくとも１つの第２の遺伝子改変を含有し、前記第１の改変は１つまたはそれより多い運動性遺伝子において、そして前記第２の改変は宿主における細菌の生存または増殖に関与する１つまたはそれより多い遺伝子においてである。本発明は、獣医学的動物種においてとりわけサルモネラ症および／または大腸菌病原体による感染を防御するための、このような変異体株に基づく弱毒化生ワクチンにさらに関する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
獣医学的動物種に感染する細菌の弱毒化変異体株であって、前記変異体は少なくとも１つの第１の遺伝子改変および少なくとも１つの第２の遺伝子改変を含有し、前記第１の遺伝子改変は１つまたはそれより多い運動性遺伝子において、そして前記第２の遺伝子改変は宿主における細菌の生存または増殖に関与する１つまたはそれより多い遺伝子においてである、弱毒化変異体株。
【請求項２】
獣医学的動物種は家禽である、請求項１に記載の変異体株。
【請求項３】
サルモネラ・エンテリカ株または大腸菌株である、請求項１または２に記載の変異体株。
【請求項４】
運動性遺伝子は、フラジェリンをコードする遺伝子である、請求項１〜３のいずれかに記載の変異体株。
【請求項５】
ｆｌｉＣおよび／またはｆｌｊＢもしくはｆｌｊＢＡ遺伝子に変異を有する、請求項４に記載の変異体株。
【請求項６】
０．４％寒天を含有するＬＢ培地で遊走できない、請求項４または５に記載の変異体株。
【請求項７】
生存に関与する遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子または毒性遺伝子である、請求項１〜６のいずれかに記載の変異体株。
【請求項８】
不活化されるハウスキーピング遺伝子は、ｇｕａＢ遺伝子である、請求項７に記載の変異体株。
【請求項９】
変異体株は、ｇｕａＢ遺伝子機能を損なう欠失変異を含有する、請求項８に記載の変異体株。
【請求項１０】
新規グアニンヌクレオチドを形成することができない、請求項８または９に記載の変異体株。
【請求項１１】
前記変異体株は、外来抗原をコードし、かつ発現する、請求項１〜１０のいずれかに記載の変異体株。
【請求項１２】
弱毒化腸炎菌株または弱毒化ネズミチフス菌株である、請求項１〜１１のいずれかに記載の変異体株。
【請求項１３】
遺伝子改変は、親株腸炎菌ファージ４型株７６Ｓａ８８に導入される、請求項１〜１２のいずれかに記載の変異体株。
【請求項１４】
弱毒化腸炎菌株ＳＭ７３は、寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２１６４２を有する、請求項１３に記載の変異体株。
【請求項１５】
遺伝子改変は、親株ネズミチフス菌１４９１Ｓ９６に導入される、請求項１〜１２のいずれかに記載の変異体株。
【請求項１６】
弱毒化ネズミチフス菌株ＳＭ８９は、寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２１６４３を有する、請求項１５に記載の変異体株。
【請求項１７】
ｇｕａＢ遺伝子における遺伝子改変およびｆｌｉＣ遺伝子における遺伝子改変を含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の変異体株。
【請求項１８】
ｇｕａＢ遺伝子における遺伝子改変およびｆｌｊＢＡ遺伝子における遺伝子改変を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の変異体株。
【請求項１９】
ｇｕａＢ遺伝子における遺伝子改変、ｆｌｉＣ遺伝子における遺伝子改変、およびｆｌｊＢＡ遺伝子における遺伝子改変を含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の変異体株。
【請求項２０】
改変は前記遺伝子における１つまたはそれより多いヌクレオチドの挿入、欠失および／または置換からなる群より選択される、請求項１〜１９のいずれかに記載の変異体株。
【請求項２１】
医薬的に有効な量、または免疫量の請求項１〜２０のいずれかに記載の変異体株；および医薬的に許容される担体または希釈剤を含む、細菌感染に対して獣医学的動物種を免疫するためのワクチン。
【請求項２２】
前記変異体株は、外来抗原をコードしかつ発現する、請求項２１に記載のワクチン。
【請求項２３】
前記変異体株は、真核細胞において外来遺伝子をコードし、かつ発現するプラスミドを含む、請求項２１または２２に記載のワクチン。
【請求項２４】
免疫量の請求項１〜２０のいずれかに記載の変異体株および／または請求項２１〜２３のいずれかに記載のワクチンを、それを必要とする獣医学的動物種に投与する工程
を含む、細菌感染に対して獣医学的動物種を免疫する方法。
【請求項２５】
獣医学的動物種は家禽である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
変異体株はサルモネラ・エンテリカまたは大腸菌である、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
変異体株および／またはワクチンは、経口、経鼻または非経口経路により投与される、請求項２４〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
獣医学的動物種、好ましくは家禽における感染の防御および／または処置のためのワクチンの調製のための、請求項１〜２０のいずれかに記載の変異体株の使用。
【請求項２９】
ワクチン接種された動物と野生型株に感染した動物との間の血清学的識別のための方法であって、ワクチン接種された動物は、フラジェリン遺伝子が不活化されている変異体株で免疫されており、前記方法は：
フラジェリンに対して産生刺激された抗体の存在に関して動物を分析する工程；および
前記抗体の存在または不存在に基づいて、感染した動物をワクチン接種された動物から識別する工程
を含む、方法。
【請求項３０】
前記抗体は、野生型株によって感染された動物によって作成されるが、請求項４〜２０のいずれかに記載の変異体株のようなフラジェリン遺伝子が不活化されている変異体株でワクチン接種されている動物によっては作成されない、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体の存在は野生型株の存在、従って感染の指標である、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
サルモネラに感染した動物は、請求項２１〜２３のいずれかに記載の弱毒化生ワクチンで免疫されている動物から識別される、請求項２９〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
動物は、ＦｌｉＣに対して産生刺激された抗体に関して分析される、請求項２９〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
動物は獣医学的動物種であり、好ましくは家禽、さらに好ましくはニワトリである、請求項２９〜３２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、弱毒化細菌変異体、とりわけ弱毒化サルモネラ・エンテリカ変異体、およびこれを含む弱毒化生ワクチンに関する。本発明の二重、三重、多重変異体により、ワクチン接種された動物と、野生型フィールドサルモネラ・エンテリカのような野生型フィールドに暴露されている（ワクチン接種されていない）動物との間で血清学的な識別が有利に可能になる。
【背景技術】
【０００２】
サルモネラは、腸内細菌科に属するグラム陰性、通性嫌気性、運動性、非ラクトース発酵性桿菌である。サルモネラは、通常、汚染された食品の摂取によりヒトに伝染し、そしてサルモネラ症を引き起こす。大腸菌は腸内細菌科の別のメンバーである。
【０００３】
サルモネラは、ウシ、ニワトリ、シチメンチョウ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ロバ、アザラシ、トカゲおよびヘビを含む多くの動物種から単離されている。
【０００４】
重要なサルモネラ病原体の９５％がサルモネラ・エンテリカに属し、サルモネラ・エンテリカ血清型ティフィムリウム（ネズミチフス菌）およびサルモネラ・エンテリカ血清型エンテリティディス（腸炎菌）が最も一般的な形態である。
【０００５】
サルモネラ感染は、全世界的に深刻な医学的および獣医学的問題であり、そして食品産業における不安材料である。汚染された食品は容易には同定することができない。
【０００６】
致死的なヒト感染の可能性および畜産業の相当な経済的損失を回避するために、サルモネラ症の制御は重要である。
【０００７】
天然のサルモネラの偏在的な存在により、感染した動物の検出および根絶のみによる疾患の制御は困難になっている。
【０００８】
競合的排除およびワクチン接種の原理に基づくいくつかの制御計画は、例えば家禽の感染を制御するために試験されている。
【０００９】
牧場動物のワクチン接種はしばしば、例えばサルモネラにより引き起こされる人畜共通感染症を防御するための最も有効な方法として考えられる。
【００１０】
全細胞死菌ワクチンおよびサブユニットワクチンを用いる動物およびヒトにおけるサルモネラ感染の防御において変動する結果が得られる。一般に不活化ワクチンはサルモネラ症に対してあまり良好な保護を提供しない。
【００１１】
弱毒化サルモネラ生ワクチンは：（ｉ）抗体応答に加えて細胞媒介の免疫を誘起するその能力；（ｉｉ）針汚染の危険性のない経口送達；（ｉｉｉ）単回用量の投与の後の有効性；（ｉｖ）複数の粘膜部位での免疫応答の誘起；（ｖ）低い生産コスト；および（ｖｉ）組換え抗原の免疫系への送達のための担体としてのその使用の可能性；のおかげで不活化調製物よりも潜在的に優れている。
【００１２】
以下の弱毒化変異体株は処置された動物における保護免疫応答を誘起するためのその有効性に関して試験されている：（１）ａｒｏ遺伝子に変異を担持する株（Ａｌｄｅｒｔｏｎら、Ａｖｉａｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３５：４３５−４４２（１９９１）；ＳｃｈｉｅｍａｎｎおよびＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２７：２９５−３０８（１９９１））、（２）ｃｙａ（アデニレートシクラーゼ）および／またはｃｒｐ（サイクリックＡＭＰ受容体）遺伝子において欠失を担持する株（米国特許第５３８９３６８号；米国特許第５８５５８７９号；米国特許第５８５５８８０号；ＨａｓｓａｎおよびＣｕｒｔｉｓｓ、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ４１：７８３−７９１（１９９７）；Ｐｏｒｔｅｒら、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３７：２６５−２７３（１９９３））ならびに（３）チフス菌のｇｕａＢＡオペロンの遺伝子に変異を担持する株（Ｗａｎｇら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６９：４７３４−４７４１（２００１）；ＷＯ９９／５８１４６号および米国特許第６１９０６６９号）。
【００１３】
今までのところ、ｃｙａおよびｃｒｐ遺伝子に欠失を担持するワクチン株Ｍｅｇａｎ（登録商標）Ｖａｃｌのみが少なくともある程度有効性を有している。この株は完全な保護を提供しない（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｇａｎｈｅａｌｔｈ．ｃｏｍ／ｍｅｇａｎｖａｃ．ｈｔｍｌ）。
【００１４】
ＭｃＦａｒｌａｎｄおよびＳｔｏｃｋｅｒ（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ３：１２９−１４１（１９８７））はＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるネズミチフス菌およびサルモネラ・ダブリンのｇｕａＡおよびｇｕａＢ  Ｔｎ１０挿入変異体の毒性に関して報告している。これらの著者は、高投薬量（２．５×１０７ＣＦＵ）で、栄養要求性株の増幅の結果である動物の有意な致死性を報告している。
【００１５】
またチフス菌のΔｇｕａＢＡ変異体は腸チフス熱に対する無事な保護のための適当な候補ではないことが判明した。それはマウスにおいて有意な残留毒性を示した（Ｗａｎｇら（２００１））。
【００１６】
従って、改善された弱毒化サルモネラ生ワクチン株および細菌感染した一般的な獣医学的動物種の改善された弱毒化生ワクチン株が依然必要とされている。
【００１７】
ワクチン接種された動物は、しばしば病原体の異なる抗原に対して抗体を生成する。問題は、そのようなワクチン接種された動物がもはやサルモネラフィールド株のような野生型フィールド株と接触している動物から識別できず、そしてそれに感染する可能性があるという点である。
【００１８】
従って、かかる識別を可能にする、弱毒化サルモネラ生ワクチン株のような改善された弱毒化生株もまた必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、二重または三重変異を有する弱毒化サルモネラ・エンテリカ株を提供することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、サルモネラ症に対する弱毒化生ワクチンおよびそれに基づいた処置の方法を提供することである。
【００２１】
本発明のさらに別の目的は、生ベクターとして、および外来抗原を発現するＤＮＡ媒介ワクチンとして有用である弱毒化サルモネラ株を提供することである。従って、かかる株は、多価ワクチンを含むワクチンの開発に非常に適切である。
【００２２】
本発明のさらに別の目的は、本発明のサルモネラ・エンテリカ欠失変異体を得る方法を提供することである。
【００２３】
さらに、本発明のさらなる目的は、ワクチン接種された動物と、ワクチン接種されていない依然感染の可能性のある動物との間の血清学的識別を可能にする弱毒化サルモネラ株を提供することである。
【００２４】
さらに、本発明のさらなる目的は、一般的な獣医学的動物種、特に家禽に感染する細菌の弱毒化株を調製するための同一材料および方法を提供することである。
【００２５】
一般的な目標は食品の安全性および動物の健康を改善することである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
ｇｕａＢ遺伝子に欠失変異を有するいくつかのΔｇｕａＢ栄養要求性サルモネラ・エンテリカ変異体は残留毒性を示した。運動性に関与する１つまたはそれより多い遺伝子におけるさらなる改変（好ましくは欠失）は、株の免疫原性能力に影響を及ぼすことなく残存する毒性を低下させることが見出された。
【００２７】
したがって本発明の第１の態様は、獣医学的動物種に感染する細菌の弱毒化変異体株、とりわけ弱毒化サルモネラ・エンテリカ変異体株に関し、該変異体株は少なくとも１つの第１の遺伝子改変および少なくとも１つの第２の遺伝子改変を含有し、該第１の改変は１つまたはそれより多い（少なくとも１つの）運動性遺伝子において、そして該第２の改変は宿主における細菌または病原体（例えばサルモネラ・エンテリカ）の生存または増殖に関与する１つまたはそれより多い（少なくとも１つの）遺伝子においてである。「獣医学的動物種に感染する細菌」なる用語は、本発明の文脈ではとりわけ獣医学的動物種に対して病原性である細菌を指し、そしてそれを前記の遺伝子改変により弱毒化することができる。獣医学的動物種に感染する細菌はグラム陰性細菌であってよい。好ましくはサルモネラ、パスツレラ、大腸菌等のような家禽に関するグラム陰性細菌である。最も好ましくはサルモネラ・エンテリカおよび（病原性）大腸菌である。「に対して病原性である」とは、細菌が弱毒化されていない場合、獣医学的動物種において感染性疾患を引き起こすことができることを意味する。
【００２８】
本発明の遺伝子改変は、有利にヌル機能を導く、換言すれば遺伝子機能を損なうかまたはそれに影響を及ぼす。本文脈での改変はまた「欠陥改変」とも称される。その改変は問題の遺伝子を不活化すると考えられる。有利には、該不活化は少なくとも変異体株が弱毒化生ワクチンにおける使用に適切である程度までの弱毒化を招く。
【００２９】
遺伝子改変は、該遺伝子における１つまたはそれより多いヌクレオチドの挿入、欠失および／または置換であってよい。かかる改変により、本発明による変異体株は、運動性遺伝子機能および病原体の生存または増殖に必要な遺伝子機能に影響を受け、そして影響を受けた遺伝子のヌル機能（機能的遺伝子生成物が形成されない）に至る。
【００３０】
挿入変異体は、復帰することがあり、それにより株の病原性を復活させることがあるので、欠失変異体が好ましい。
【００３１】
第１の改変は、１つまたはそれより多い（１、２、３、．．．）運動性遺伝子においてである。運動性に関与する遺伝子の例は、フラジェリンをコードする遺伝子である。本発明の変異体はｆｌｉＣおよび／またはｆｌｊＢもしくはｆｌｊＢＡ遺伝子の各々（ｆｌｉＣ；ｆｌｊＢ；ｆｌｊＢＡ；ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢ；ｆｌｉＣおよびＦｌｊＢＡ；．．．）に（欠陥）改変を有し得る。有利には、フラジェリンをコードする全ての遺伝子が欠失している変異体は、０．４％寒天を含有するＬＢ培地で遊走できず、そしてそれにより野生型運動性株から容易に識別することができる。
【００３２】
第２の遺伝子改変は、その宿主における病原体の生存または増殖に関与する１つまたはそれより多い（１、２、３、．．．）遺伝子においてである。かかる遺伝子はハウスキーピング遺伝子または毒性遺伝子であってよい。遺伝子機能が影響を受けた場合に弱毒化株に至り得るハウスキーピング遺伝子の例は、酵素ＩＭＰデヒドロゲナーゼをコードするｇｕａＢ遺伝子である。かかる変異体は新規グアニンヌクレオチドを形成することができない。ｇｕａＢＡオペロンにおける欠陥改変もまた可能であり、有利には適切なＩＭＰデヒドロゲナーゼ活性をコードするかまたは制御する（複数の）遺伝子のヌル機能を導く。
【００３３】
有利には、本発明の弱毒化変異体株は免疫原性である。
【００３４】
本発明は、とりわけ弱毒化腸炎菌およびネズミチフス菌株を提供することを目的とする。
【００３５】
好ましくは、本発明の遺伝子改変は親株腸炎菌ファージ４型株７６Ｓａ８８または親株ネズミチフス菌１４９１Ｓ９６に導入される。７６Ｓａ８８株は獣医農薬研究センター（Ｇｒｏｅｓｅｌｅｎｂｅｒｇ９９、Ｂ−１１８０、ウッケル、ベルギー）から入手したシチメンチョウからの臨床分離株であり、バクテリオファージラムダレッドリコンビナーゼ系をコードする温度感受性複製プラスミドｐＫＤ４６を宿す。１４９１Ｓ９６株はニワトリからの臨床分離株である。
【００３６】
本発明により得られた弱毒化腸炎菌株の１つは、寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２１６４２を有する腸炎菌株ＳＭ７３である。別の例は、寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２１６４３を有する弱毒化ネズミチフス菌株ＳＭ８９である。
【００３７】
本発明の好ましい変異体は、ｇｕａＢ遺伝子における遺伝子改変およびｆｌｉＣ遺伝子における遺伝子改変を担持するかまたは含む。
【００３８】
本発明の別の好ましい変異体は、ｇｕａＢ遺伝子における遺伝子改変およびｆｌｊＢＡ遺伝子における遺伝子改変を担持するかまたは含む。
【００３９】
本発明のさらに別の好ましい変異体は、ｇｕａＢ遺伝子における遺伝子改変、ｆｌｉＣ遺伝子における遺伝子改変、およびｆｌｊＢＡ遺伝子における遺伝子改変を担持するかまたは含む。
【００４０】
本発明の弱毒化株は弱毒化生ワクチンにおける使用に非常に適切である。本発明の変異体株は、外来抗原をコードし、かつ発現し得る。
【００４１】
本発明の別の態様は：
医薬的に有効な量、または免疫量の本発明による弱毒化変異体株；および
医薬的に許容される担体または希釈剤；
を含む、細菌感染に対して獣医学的動物種を免疫するためのワクチンに関する。
とりわけ本発明はサルモネラ・エンテリカおよび／または大腸菌の弱毒化変異体株を含むワクチンに関する。
【００４２】
一般に約１０２ｃｆｕから約１０１０ｃｆｕ、好ましくは約１０５ｃｆｕから約１０１０ｃｆｕが投与される（医薬的に有効な量、または免疫量の例）。免疫用量は投与経路により異なる。当業者は、非経口的に投与されるワクチンのための有効用量が、飲料水等を介して投与される類似のワクチンよりも少なくてもよいことを見出すことができる。
【００４３】
本発明の弱毒化株およびこれを含む医薬組成物またはワクチンは、獣医学的動物種、家畜、およびさらに特に家禽のような動物を免疫するために非常に適切である。例えば本発明の弱毒化サルモネラ株、およびこれを含む医薬組成物またはワクチンは獣医学的動物種、およびとりわけニワトリのような家禽をサルモネラ症および恐らくその他の疾患（例えば多価ワクチンの場合）に対して免疫するのに非常に適切である。本発明の弱毒化株は、問題の動物／獣医学的動物種を問題の病原体（獣医学的動物種に感染する細菌）による攻撃に対して保護するために特に適している。
【００４４】
したがって本発明のさらなる態様は動物、好ましくは獣医学的動物種、さらに好ましくはニワトリのような家禽を、獣医学的動物種に感染する細菌により引き起こされる疾患に対して免疫する方法に関し、該方法は：免疫量の本発明の弱毒化変異体株および／またはこれを含むワクチンを、それを必要とする動物または獣医学的動物種に投与し、それにより次いで動物または獣医学的動物種において保護免疫応答を惹起する工程を含む。本発明は、とりわけサルモネラ症または病原性大腸菌による感染に対して獣医学的動物種を免疫する方法に関する。
【００４５】
サルモネラ症に対して免疫される獣医学的動物種の例：ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ウズラ、ホロホロチョウ、ブタ、ヒツジ、子牛、畜牛等のような家禽、小型または大型家畜。好ましくは経口、経鼻または非経口経路により、免疫量がこれらの動物に投与される。
【００４６】
本発明のさらなる態様は、医薬品としての使用のための（例えばワクチンにおける使用のための）本発明の変異体株に関する。本発明のさらに別の態様は、サルモネラ症のような病原体（獣医学的動物種に感染する細菌）により引き起こされる疾患の防御（および／または処置）のための、ワクチンのような医薬品の調製のための本発明の弱毒化変異体株の使用に関する。処置される動物または獣医学的動物種の例および推奨される用量は前記で提示されている。
【００４７】
本発明のさらに別の態様は、ワクチン接種された動物と天然に感染している、すなわち野生型株に接触し、そして感染している動物とを識別するための血清学的マーカーとしての本発明の変異体、とりわけフラジェリン変異体の使用に関する。
【００４８】
本発明は、例えばワクチン接種された動物と野生型株に感染した動物との間の血清学的識別のための方法に関し、ワクチン接種された動物は、フラジェリン遺伝子が不活化されている変異体株で免疫されており、該方法は：
フラジェリンに対して産生刺激された抗体の存在に関して動物を分析する工程；および
該抗体の存在または不存在に基づいて、感染した動物をワクチン接種された動物から識別する工程；
を含む。
【００４９】
本発明の方法は有利にはインビトロの方法である。有利には、サルモネラに感染した動物はこのように本発明による弱毒化生ワクチンで免疫されている動物から識別される。
【００５０】
家禽のような家畜およびとりわけニワトリは、フラジェリン遺伝子生成物、およびとりわけＦｌｉＣ遺伝子生成物に対して抗体を作成することが知られている。従って、問題の抗体は、野生型株に感染した動物（かかる抗体を作成する）で検出されるが、（複数の）フラジェリン遺伝子が不活化されている変異体株でワクチン接種されている動物においては検出されない。後者は例えばＦｌｉＣおよび／またはＦｌｊＢに対する抗体を作成しない。
【００５１】
該抗体の存在は、野生型株の存在、従って感染のための指標である。従って、本発明の方法は有利には、（複数の）フラジェリン遺伝子が不活化されている変異体株でワクチン接種された動物におけるサルモネラ感染の検出または診断を可能にする。かかる変異体株は本明細書にて前記された本発明の株の１つであってよい。
【００５２】
従って、ｆｌｉＣのようなフラジェリン遺伝子の不活化により、（ワクチン接種された）動物における野生型サルモネラ・エンテリカのような野生型株の存在の診断のための、例えばＦｌｉＣタンパク質の検出に基づく血清学的試験の使用が可能になる。本発明の方法では、動物をＦｌｉＣに対する抗体について分析するのが好ましい。
【００５３】
本発明の方法はとりわけ家禽、さらに好ましくはニワトリに適用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
驚くべきことに、フラジェリン変異（フラジェリンをコードする遺伝子における欠陥改変；鞭毛変異とも称される）および栄養要求性変異の組み合わせは、高免疫原性の弱毒化サルモネラ・エンテリカ株を導くことができる。本発明による変異体株は、（複数の）運動性遺伝子における１つ（少なくとも１つ）の改変およびその宿主における病原体の生存または増殖に関与する（複数の）遺伝子における１つ（少なくとも１つ）の改変を担持するかまたは含む。
【００５５】
生存または増殖に関与する遺伝子はハウスキーピング遺伝子および／または毒性遺伝子であってよい。かかるハウスキーピング遺伝子および毒性遺伝子の例を（Ｍａｓｔｒｏｅｎｉら、Ｔｈｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １６１：１３２−１６４（２０００）、参照により本明細書に組み込まれる）にて見出すことができる。ハウスキーピング遺伝子の好ましい例はｇｕａＢ遺伝子であり、さらにａｒｏ、ｐｕｒ、ｄａｐ、ｐａｂ、ｓｉｐＣ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｐａｇＣ、ｃｙａおよび／またはｃｒｐ遺伝子における改変もまた想定され得る。
【００５６】
「遺伝子」なる用語は、本明細書にて使用される際には、コード配列ならびにプロモーターおよび終止シグナルのようなその調節配列を指す。
【００５７】
遺伝子機能が損なわれる欠失により、かかる不活化を得ることができる。当業者にはかかる変異体を得る方法が知られており、そして簡単な試験により遺伝子機能が損なわれているかどうかを見分けることができる。例えば、機能的ｇｕａＢ遺伝子生成物を発現できない変異体株は、最小Ａ培地に（例えば０．３ｍＭの）グアニン、キサンチン、グアノシンまたはキサントシンが補充されなければこの培地では成長できない。
【００５８】
別の簡単な試験により、フラジェリン遺伝子機能のような運動性遺伝子機能が損なわれているかどうかを見分けることができる。これらの変異体は０．４％寒天を含有するＬＢ培地で遊走しない。
【００５９】
問題の遺伝子における改変は、好ましくは少なくとも生ワクチンにおける使用に適切である程度までの変異体株の弱毒化に至るはずである。
【００６０】
以下の実施例により、１つ（少なくとも１つ；１つまたはそれより多い）の運動性遺伝子（ｆｌｉＣ、ｆｌｊＢおよび／またはｆｌｊＢＡ）における追加的な変異は、ｇｕａＢ欠失変異体の残留病原性を有利に緩和し、そして致死用量の野生型サルモネラ・エンテリカによる抗原投与に対する免疫動物の保護を改善したことが示される。
【００６１】
サルモネラ属の全てのメンバーの鞭毛フィラメントは単一のタンパク質、フラジェリンタンパク質の多量体である（ｖａｎ  Ａｓｔｅｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７７：１６１０−１６１３（１９９５））。
【００６２】
ＦｌｉＣはフラジェリンの１相フィラメントサブユニットである（Ｃｉａｃｃｉ−Ｗｏｏｌｗｉｎｅら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６６：１１２７−１１３４（１９９８））。
【００６３】
ネズミチフス菌は、染色体の異なる部位に位置しかつ相変異を示す２つのフラジェリン遺伝子（ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢ）を有する。ｆｌｊＢのプロモーターは、部位特異的組換えにより逆位になり得る染色体フラグメントの部分を形成する。配向に依存してｆｌｊＢがｆｌｊＡと一緒に発現され、後者はｆｌｉＣ遺伝子の抑制物質をコードするか；またはｆｌｉＣが発現に至るかのいずれかである。腸内細菌科の別のメンバーである大腸菌もまた、各々サルモネラ・エンテリカのｆｌｉＣおよびｆｌｊＢ遺伝子と相同性を共有する２つのフラジェリン遺伝子を保有し得る（Ｔｏｍｉｎａｇａ、Ｇｅｎｅｓ  Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｓｔ．７９：１−８（２００４））。
【００６４】
腸炎菌におけるｆｌｉＣ遺伝子（主要な鞭毛タンパク質をコードする）の不活化は、近交系マウスＢＡＬＢ／ｃ系に投与されるワクチンの安全性および有効性の双方を増大させた。この系は全身性サルモネラ症に対して感受性が非常に高い。
【００６５】
したがって文献での多くの指摘にかかわらず、これによりとりわけフラジェリンがＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてサルモネラに対する保護免疫応答の誘導に必須の抗原ではないことが判明する。
【００６６】
腸炎菌フラジェリンは、ニワトリにおいて免疫原性であり、そしてＨ：ｇ，ｍ抗原決定基を担持する（ｖａｎ  Ａｓｔｅｎら（１９９５）；Ｗｙａｎｔら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６７：１３３８−１３４６（１９９９）；Ｏｇｕｓｈｉら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７６：３０５２１−３０５２６（２００１））。
【００６７】
グラム陰性細菌の種々の種の鞭毛（例えば腸炎菌およびチフス菌の鞭毛）は、単球を活性化して炎症誘発性サイトカイン（例えば腫瘍壊死因子アルファ）を生成し、そしてインターロイキン−１受容体関連キナーゼ（ＩＲＡＫ）の活性化を媒介するということが証明されている。
【００６８】
従って、グラム陰性細菌に対する自然免疫応答においてグラム陰性フラジェリンは、重要でありかつ以前には認識されていない役割を果たすと考えられる。ＦｌｉＣは、胃腸管の感染の経過中にとりわけ重要であり得る（Ｃｉａｃｃ−ｌ−Ｗｏｏｌｗｉｎｅら（１９９８）；Ｗｙａｎｔら（１９９９）；Ｍｏｏｒｓら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６９：４４２４−４４２９（２００１））。
【００６９】
文献では、鞭毛が家禽および／またはヒトにおける毒性に寄与する程度に関して非常に曖昧である。
【００７０】
Ｖａｎ  Ａｓｔｅｎらにより（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１８５：１７５−９（２０００））、腸炎菌のフラジェリン遺伝子の不活化はＣａｃｏ−２細胞（ヒト結腸癌細胞系）への浸潤を強く低下させる（５０倍）が、細菌付着はほとんど影響を受けなかったことが示されている。該報告はインビトロ結果に限定されている。
【００７１】
一方、ＰａｒｋｅｒおよびＧｕａｒｄ−Ｐｅｔｔｅｒにより（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０４：２８７−２９１（２００１））、ニワトリの経口抗原投与時に、ｆｌｉＣ：：Ｔｎ１０変異体が野生型と同等に毒性であったことが見出された。これは、経口抗原投与後にフラジェリンの存在が少なくとも中程度のレベルの浸潤を達成するのに必要ではなかったことを示している。皮下適用した場合、鞭毛変異体は野生型株と比較して有意に弱毒化された。
【００７２】
従って、先行技術では例えば本発明によるサルモネラ・エンテリカ二重（または三重）変異体を構築することから離れることを教示する多くの示唆がある。１つまたはそれより多い運動性遺伝子の不活化は、例えばｇｕａＢ欠失変異体の残存毒性を低減させるのを助けるが、他の利点は同様に存在する。
【００７３】
例えばｆｌｉＣ遺伝子の不活化は有利には、（ワクチン接種された）動物における野生型サルモネラ・エンテリカ、例えば腸炎菌の存在の診断のための、ＦｌｉＣタンパク質に対して指向する抗体の検出に基づいた血清学的試験の使用を可能にする。免疫検出は、ＥＬＩＳＡにより、ＲＩＡ技術および／または任意の他の公知の免疫学的試験もしくは形式により可能である。
【００７４】
ＩＤＥＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓは、腸炎菌のＦｌｉＣフラジェリンのＨ抗原決定基（Ｈ：ｇ，ｍ鞭毛エピトープ）に対する抗体を確実に検出する市販の試験を有する（ＦｌｏｃｋＣｈｅｋ（登録商標）腸炎菌抗体試験キット）。
【００７５】
前記により、宿主における病原体の生存または増殖に関与する遺伝子および運動性に関与する（複数の）遺伝子における（欠陥）遺伝子改変を担う、本発明の二重および／または三重サルモネラ・エンテリカ変異体は、当分野である弱毒化サルモネラ・エンテリカ株よりも有利であることが実証される。
【００７６】
本発明の変異体株は、生ベクターおよび／またはＤＮＡ媒介ワクチンとしての弱毒化生ワクチンにおける使用に非常に適切である。「ワクチン」なる用語は予防用および治療用ワクチンを含むと意図される。好ましくは、ワクチンは予防用である。
【００７７】
「生ベクター」ワクチンは、「担体ワクチン」および「生抗原送達系」とも称され、ワクチン学の刺激的かつ多目的な分野を含む（Ｌｅｖｉｎｅら、Ｍｉｃｒｏｅｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９：２３−３２（１９９０））。この研究法では、ウイルス性または細菌性生ワクチンは、それが別の微生物の保護性外来抗原を発現し、そしてこれらの抗原を免疫系に送達し、それにより保護免疫応答を刺激するように改変されている。公表されている細菌性生ベクターには、とりわけ弱毒化サルモネラが含まれる。
【００７８】
本発明の目的は、生ワクチン、おそらく多価生ワクチンで使用するための弱毒化変異体株を提供することである。「多価ワクチン」または「マルチバレント」とはとりわけ多くの異なる疾患原因生物に由来する抗原決定基を含むワクチンを意味する。
【００７９】
したがって本発明の目的の１つは：
医薬的に有効な量、または免疫量の本発明の弱毒化変異体株；および
医薬的に許容される担体または希釈剤；
を含む例えばサルモネラ症に対するワクチンを提供することである。
【００８０】
本発明の別の目的は：
医薬的に有効な量、または免疫量の本発明の弱毒化変異体株であって、該変異体が外来抗原をコードし、そして発現する変異体株；および
医薬的に許容される担体または希釈剤；
を含む生ベクターワクチンを提供することである。
【００８１】
生ベクターで用いられる特定の外来抗原は本発明にとって重要ではない。
【００８２】
本発明のなお別の目的は：
医薬的に有効な量、または免疫量の本発明の弱毒化変異体株であって、該変異体が真核細胞において外来抗原をコードし、そして発現するプラスミドを含有する変異体株；および
医薬的に許容される担体または希釈剤；
を含むＤＮＡ媒介ワクチンを提供することである。
【００８３】
ＤＮＡ媒介ワクチンの構築および使用に関する詳細は米国特許第５８７７１５９号（参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。また、ＤＮＡ媒介ワクチンに用いられる特定の外来抗原は本発明にとって重要ではない。
【００８４】
病原体において（生ベクターワクチンで真核細胞性プロモーターを用いて）または病原体により浸潤された細胞において（ＤＮＡ媒介ワクチンで真核細胞性プロモーターを用いて）外来抗原を発現するかどうかの決定は、動物実験もしくは臨床試験においてその特定の抗原に関するどのワクチン構築物により最良の免疫応答が得られるか、および／または抗原のグリコシル化がその保護免疫原性に必須であるかどうか、および／または抗原の正確な三次元立体構造が発現の１つの形態で他の形態よりも良好に達成されるかどうかに基づき得る（米国特許第５７８３１９６号）。
【００８５】
「医薬的に有効な量」とは、問題の疾患、例えばサルモネラ症を克服（防御および／または処置）するための通常よりもさらに多い量を意味する。「免疫量」とは本明細書にて使用される際には実際に、医薬組成物／ワクチンを投与される動物において（保護）免疫応答を誘起することができる量を意味する。惹起される免疫応答は体液性、粘膜性、局所および／または細胞性免疫応答であってよい。当分野において公知のように、必要量は年齢、性別、体重および多くの他の因子に依存し得る。
【００８６】
特定の医薬的に許容される担体または希釈剤は本発明にとっては重要ではなく、そして当分野で慣用技術である。希釈剤の例には：スクロースを含有するクエン酸緩衝剤（ｐＨ７．０）、重炭酸塩緩衝剤（ｐＨ７．０）単独またはアスコルビン酸、ラクトースおよび場合によってはアスパルテームを含有する重炭酸塩緩衝剤（ｐＨ７．０）のような胃で胃酸に対して緩衝するための緩衝剤が挙げられる。担体の例には：例えば脱脂粉乳に見出されるようなタンパク質；糖；例えばスクロース；またはポリビニルピロリドンが挙げられる。
【００８７】
本発明による欠失変異体は、標準的な相同組換えにより創成され、それにより第１工程で問題の（複数の）遺伝子全体または遺伝子の少なくとも部分が抵抗性遺伝子およびＦＲＴ部位をフランキングすることにより置き換えられる。
【００８８】
好ましくは、第２工程では、該抵抗性遺伝子は２つのＦＲＴ部位の間の組換えにより除去される。ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（２０００）に従って、１つのＦＲＴ部位ならびにプライミング部位Ｐ１およびＰ２は組換えの分子メカニズムにより残存し、抗生物質抵抗性遺伝子を除去する（例えば図４参照）。
【００８９】
以下の実施例および実施形態において添付の図面を参照して本発明をさらに詳細に記載する。特定の実施形態および実施例は特許請求されるように本発明の範囲がいかなるようにも限定されないと意図される。本明細書にて示されたサルモネラ・エンテリカに関する実施例の原理は、獣医学的動物種に感染する他の（グラム陰性）細菌、さらにとりわけパスツレラ、（病原性）大腸菌等のような家禽に関する他の（グラム陰性）細菌に同等に十分に適用可能である。
【００９０】
図面の簡単な記述
図１は、グアノシン一リン酸の生合成経路の図式的概観を示す。ＡＩＣＡＲ：５’−ホスホリボシル−４−カルボキサミド−５−アミノイミダゾール；ＡＴＰ：アデノシン三リン酸；Ｇ：グアニン；ＧＭＰ：グアノシン一リン酸；ＧＲ：グアノシン；Ｈｘ：ヒポキサンチン；ＨｘＲ：ヒポキサンチンリボシド（イノシン）；ＩＭＰ：イノシン一リン酸；Ｘ：キサンチン、ＸＭＰ：キサントシン一リン酸；ｇｕａＡ：ＧＭＰシンテターゼ、ｇｕａＢ：ＩＭＰデヒドロゲナーゼ；ｇｕａＣ：ＧＭＰリダクターゼ。
【００９１】
図２は、腸炎菌ゲノムのコンティグ１２９４を表す（配列番号：１９）。ｇｕａＢ遺伝子のＡＴＧ開始コドンおよびＴＧＡ終止コドンは太字である。ＮはＡ、Ｃ、ＴまたはＧであってよい。
【００９２】
図３は、ｐＵＣ１８にクローン化された腸炎菌のΔｇｕａＢフラグメントの配列を表す（配列番号：２０）。使用されたプライマーを水平矢印により示す。プライマーＧｕａＢ６−ＧｕａＢ７で作成されたフラグメントをｐＵＣ１８にクローン化した。ｇｕａＢ遺伝子のＡＴＧ開始およびＴＧＡ終止コドンならびにＣＣＣＧＧＧ  ＳｍａＩ制限部位を太字で示す。
【００９３】
図４は、プライマーＧｕａＢ１０を用いて得られたｇｕａＢ欠失を含む、腸炎菌ＰＣＲフラグメントのヌクレオチド配列を表す（配列番号：２１）。変異体ＳＭ２０の全ゲノムＤＮＡを用いてプライマーＧｕａＢ６−ＧｕａＢ７でＰＣＲフラグメントを増幅した。残存するＦＲＴ部位を太字イタリックで、そしてＰ１およびＰ２プライマーを矢印により示す（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ、ＰＮＡＳ  ９７：６６４０−６６４５（２０００））。ｇｕａＢ遺伝子のＡＴＧ開始およびＴＧＡ終止コドンを太字で示す。
【００９４】
図５は、ネズミチフス菌ＬＴ２のｇｕａＢ遺伝子、完全ゲノムのセクション２２０の１１７を示す（配列番号：２２）。ｇｕａＢ遺伝子のＡＴＧ開始およびＴＧＡ終止コドンを太字で示す。
【００９５】
図６は、プライマーＦｌｉＣ１およびＦｌｉＣ２を用いて変異体ＳＭ７３およびＳＭ８９の全ＤＮＡで、プライマーＦｌｉＣ１−ＦｌｉＣ２で増幅されたＰＣＲフラグメントを配列決定した後に得られたヌクレオチド配列を示す（配列番号：２３）。残存するＦＲＴ部位を太字イタリックで、ＡＴＧ開始およびＴＡＡ停止コドンを太字で、そしてＰ１およびＰ２を矢印で示す。
【００９６】
図７は、プライマーＦｌｊＢＡ６を用いてネズミチフス菌変異体ＳＭ４８の全ＤＮＡで、プライマーＦｌｊＢＡ６−ＦｌｊＢＡ５で増幅されたＰＣＲフラグメントを配列決定した後に得られたヌクレオチド配列を示す（配列番号：２４）。残存するＦＲＴ部位を太字で、Ｐ１およびＰ２を矢印で示す。
【００９７】
図８−１１は、ＳＭ６９、ＳＭ７３、ＳＭ８６およびＳＭ８９の各々に関する寄託受領を表す。
【実施例】
【００９８】
実施例１：ｇｕａＢ遺伝子に影響を及ぼす栄養要求性変異
挿入変異誘発により野生型腸炎菌の栄養要求性挿入変異体が得られた。０．３Ｍグアニン、キサンチン、グアノシンまたはキサントシンを補充した場合のみ、変異体株は最小Ａ培地で成長できた。
【００９９】
これらのデータにより、株の栄養要求性変異は、酵素ＩＭＰデヒドロゲナーゼをコードするｇｕａＢ遺伝子に影響を及ぼすことが強く示唆される（ＥＣ１．１．１．２０５）。図１で示されるように、この酵素はイノシン−５’−一リン酸（ＩＭＰ）をキサントシン一リン酸（ＸＭＰ）に変換する。
【０１００】
挿入変異体は復帰することがあり、それにより株の病原性を復活させることがある。これは弱毒化生ワクチンにおけるその適用性を限定し得る。その態様では欠失変異体が好ましい。したがって腸炎菌およびネズミチフス菌のｇｕａＢ欠失変異体が創成され、そして試験された。双方の血清型のｇｕａＢ遺伝子を図２および５に示す。
【０１０１】
実施例２：ｇｕａＢ欠失変異体
ｇｕａＢ欠失変異体の構築
以前に公開された大腸菌Ｋ１２のゲノムにおいて欠失変異体を作成する方法（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ、ＰＮＡＳ  ９７：６６４０−６６４５（２０００））をこの目的のために適用した。この方法はバクテリオファージλレッドリコンビナーゼ系により媒介される、ＰＣＲにより作成された直鎖状ＤＮＡフラグメントの相同組換えに頼り、ｇｕａＢ配列が抗生物質抵抗性遺伝子により置換される。この抵抗性遺伝子はＦＲＴ部位により取り囲まれ、そしてＦＬＰリコンビナーゼにより媒介される部位特異的組換えによりゲノムから切除できる。
【０１０２】
重複ＰＣＲ（Ｈｏら、Ｇｅｎｅ  ７７：５１−５９（１９８９））をｇｕａＢコード配列の８６１塩基対の内部セグメントの欠失のために適用した。原理は２つのプライマーセット、ＧｕａＢ３−ＧｕａＢ４（ｇｕａＢ遺伝子の５’末端をフランキングする）およびＧｕａＢ５−ＧｕａＢ２（ｇｕａＢ遺伝子の３’末端をフランキングする）の使用に頼る。双方のセットは、部分的に相補的であり、そしてそれにＳｍａＩ制限部位を付加したプライマー（ＧｕａＢ４およびＧｕａＢ５）を含有する。得られた相補的配列のアニーリングおよび鎖伸長の後、外向きプライマーＧｕａＢ６およびＧｕａＢ７でのＰＣＲにより、ＧｕａＢコード配列の８６１塩基対内部セグメントを置き換える６塩基対ＳｍａＩ部位を有するフラグメントを作成した。このΔｇｕａＢフラグメントをベクターｐＵＣ１８にクローン化した（図３参照）。
【０１０３】
プライマーＰ１およびＰ２（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（２０００））ならびにプラスミドｐＫＤ３  ＤＮＡを鋳型として使用して、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子（ｃａｔ）をそのフランキングＦＲＴ配列と共に増幅した。このＰＣＲフラグメントを、クローン化されたΔｇｕａＢフラグメントのＳｍａＩ部位にライゲートした。ネステッドプライマー（ＧｕａＢ６−ＧｕａＢ７）を使用して望ましいフラグメントを作成した。バクテリオファージラムダレッドリコンビナーゼ系をコードする温度感受性複製プラスミドｐＫＤ４６を宿す腸炎菌７６Ｓａ８８に、得られたＰＣＲフラグメントをエレクトロポレーションした。最小Ａ培地および０．３ｍＭグアニンを補充した最小Ａ培地でクロラムフェニコール抵抗性形質転換体を試験した。以下のプライマーの組み合わせ：ＧｕａＢ６−ＧｕａＢ７、ＧｕａＢ６−Ｐ２、ＧｕａＢ７−Ｐ１およびＰ１−Ｐ２を使用するＰＣＲによりΔｇｕａＢ：：ｃａｔＦＲＴ変異体を確認した。
【０１０４】
腸炎菌ΔｇｕａＢ：：ｃａｔＦＲＴ変異体（ＳＭ１２）を、ＦＬＰリコンビナーゼをコードする温度感受性複製プラスミドｐＣＰ２０でエレクトロポレーションして、ｃａｔ遺伝子を除去した。得られた株腸炎菌ΔｇｕａＢをＳＭ２０と称した。変異体ＳＭ２０の全ゲノムＤＮＡおよびプライマーの組み合わせＧｕａＢ６−ＧｕａＢ７を使用して、欠失が位置するＰＣＲフラグメントが得られた。プライマーＧｕａＢ１０を使用してこのフラグメントの配列決定によりΔｇｕａＢ変異を確認した（図４参照）。
【０１０５】
前記した全てのプライマーの配列を表１に示す。
【０１０６】
レッドリコンビナーゼ系の発現により引き起こされる、可能な追加的な変異体の存在を回避するために、同質遺伝子株を構築した。
【０１０７】
変異体ＳＭ１２のΔｇｕａＢ：：ｃａｔＦＲＴ変異をＳＭ１２のバクテリオファージＰ２２  ＨＴ  ｉｎｔ−（Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  Ｄ．およびＲｏｔｈ，Ｊ．Ｒ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）ライゼートで野生型腸炎菌７６Ｓａ８８に形質導入した。プラスミドｐＣＰ２０を使用してｃａｔ遺伝子を除去した。得られた株腸炎菌ΔｇｕａＢはＳＭ６９と称され、寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２１６４１を有した。
【０１０８】
同一の手順および同一のプライマーを使用してネズミチフス菌株１４９１Ｓ９６のΔｇｕａＢ変異体を構築した。得られた株をＳＭ１９と称した。ＳＭ８６（寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２１６４６を有する）は、ＳＭ９のバクテリオファージＰ２２  ＨＴ  ｉｎｔ−ライゼートを使用するΔｇｕａＢ：：ｃａｔＦＲＴのネズミチフス菌株１４９１Ｓ９６への形質導入の後、およびｃａｔ遺伝子の切除の後に得られた同質遺伝子株である。
【０１０９】
ΔｇｕａＢ変異体ＳＭ１９、ＳＭ２０、ＳＭ６９およびＳＭ８６はバクテリオファージＰ２２  ＨＴ  ｉｎｔ−に感受性がある。これによりインタクトなリポ多糖類（ＬＰＳ）の存在が判明する。
【０１１０】
マウスにおける腸炎菌ｇｕａＢ欠失変異体ＳＭ２０を用いる毒性および保護試験
独立した２つの実験で６−８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの経口感染によりマウスにおける変異体ＳＭ２０の毒性を試験した（Ｐａｔｔｅｒｙら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３（４）：７９１−８０５（１９９９））。これらを前記したように実施した。野生型株腸炎菌７６Ｓａ８８を陽性対照として平行して試験した。腸炎菌７６Ｓａ８８  ΔａｒｏＡ変異体ＳＭ５０をワクチン対照として実験に含めた。この変異体は完全ａｒｏＡコード配列の正確な欠失を担持し、そしてＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（２０００）の方法により構築された。
【０１１１】
完全なデータを表２および３に示す。これらの結果により、マウスにおいてΔｇｕａＢ変異体ＳＭ２０が強く弱毒化されるが、この高用量で投与された場合に依然いくらかの残留病原性を示すことが実証される。高用量の対応する病原性野生型腸炎菌株７６Ｓａ８８による感染に対して、この変異体での経口免疫が保護免疫を誘起する。その保護は腸炎菌ΔａｒｏＡ変異体ＳＭ５０により付与される保護と少なくとも同等である。
【０１１２】
マウスにおける同質遺伝子ｇｕａＢ欠失変異体ＳＭ６９およびＳＭ８６での毒性および保護試験
マウスにおける変異体ＳＭ６９およびＳＭ８６の毒性を６−８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの経口感染により試験した。これらを前記したように実施した。野生型株腸炎菌７６Ｓａ８８およびネズミチフス菌１４９１Ｓ９６を陽性対照として平行して試験した。
【０１１３】
完全なデータを表６、７および１０−１３に示す。これらの結果により、マウスにおいてΔｇｕａＢ変異体ＳＭ６９およびＳＭ８６が強く弱毒化されるが、この高用量で投与された場合に、なお依然いくらかの残留病原性を示すことが実証される。高用量の対応する病原性野生株による感染に対して、変異体での経口免疫が保護免疫を誘起する。
【０１１４】
実施例３：腸炎菌およびネズミチフス菌のフラジェリン変異体
次いで運動性遺伝子（例えばフラジェリン遺伝子）における追加的な（さらなる）改変がさらにＳＭ２０のようなｇｕａＢ遺伝子における欠失変異を担持する単一の変異体において残存する残留病原性を低下させることができるかどうかを試験した。
【０１１５】
フラジェリンをコードする１個の遺伝子ｆｌｉＣのみ含有する腸炎菌株を予備実験で使用した。腸炎菌のｇｕａＢおよびｆｌｉＣ遺伝子が不活化されている二重変異体を構築した。ネズミチフス菌に関して、二重（ΔｇｕａＢΔｆｌｉＣ；ΔｇｕａＢΔｆｌｊＢＡ）および三重（ΔｇｕａＢΔｆｌｉＣΔｆｌｊＢＡ）変異体を構築した。
【０１１６】
ΔｆｌｉＣ変異体（ＳＭ２４、ＳＭ３０）の構築
鋳型プラスミドｐＫＤ３（ｃａｔＦＲＴ）またはｐＫＤ４（ｋａｎＦＲＴ）でＦｌｉＣＰ１−ＦｌｉＣＰ２プライマー組み合わせを使用するＰＣＲにより、ＦＲＴ部位およびプライミング部位Ｐ１およびＰ２と一緒に抗生物質抵抗性遺伝子を含有する組換えフラグメントを増幅し、そして伸長物はｆｌｉＣコード配列の始端５０（１−５０）および終端（１４６８−１５１８）５０ヌクレオチドに相同である。この領域ではネズミチフス菌１４９１Ｓ９６および腸炎菌７６Ｓａ８８はプライマーと各々１００％および９８％の配列同一性を示す。配列番号：２２と比較してプライマーＦｌｉＣＰ１は３７位置で追加的なＧを含有する。したがってΔｆｌｉＣ変異体アレルは１６個のアミノ酸ペプチドをコードし、その最初の１２個のアミノ酸はＦｌｉＣのアミノ末端に相当する。ｆｌｉＣコード配列（１−１５１８）の１４１６塩基対（５１−１４６７）の内部セグメントが置換される。
【０１１７】
ラムダリコンビナーゼ系をコードする得られたＰＣＲ生成物（１μｇ）を予め０．２％アラビノースで誘起されたネズミチフス菌１４９１Ｓ９６（ｐＫＤ４６）および腸炎菌７６Ｓａ８８（ｐＫＤ４６）にエレクトロポレーションした。
【０１１８】
プライマーＦｌｉＣ１およびＦｌｉＣ２ならびに変異体株および野生型株の全ＤＮＡを使用するＰＣＲにより、抗生物質抵抗性候補置換変異体を確認した。およそ同一の大きさを有するＰＣＲフラグメント間を認識するために制限分析を実施した。ＦｌｉＣ１−ＦｌｉＣ２で増幅された野生型ネズミチフス菌ＰＣＲフラグメントの制限のために酵素ＥｃｏＲＶを使用した。２つのフラグメント（４７０塩基対および１０２１塩基対）が得られた。ｆｌｉＣ置換変異体に関して増幅されたフラグメントはＥｃｏＲＶ制限部位を含有しない。腸炎菌の場合、酵素ＡｐｏＩを使用した。この酵素は腸炎菌の野生型ｆｌｉＣフラグメントを２片（３４５塩基対および１１４７塩基対）に切断する。ｆｌｉＣ置換変異体に関して得られたフラグメントはＡｐｏＩ制限部位を含有しない。
【０１１９】
０．４％寒天を含むＬＢ培地で変異体の運動性を試験した（Ｍｉｌｌｅｒ（１９９２）、Ａ  ｓｈｏｒｔ  ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ａｎｄ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）。野生型ネズミチフス菌および野生型腸炎菌はこの培地で遊走する。ネズミチフス菌ｆｌｉＣ置換変異体は、変異体にｆｌｊＢ遺伝子が依然存在するので遊走する。腸炎菌ｆｌｉＣ置換変異体はもはや遊走しない。これらの結果を顕微鏡観察により確認した。
【０１２０】
様々な変異体のエレクトロコンピテントセルを調製し、そしてエレクトロポレーションによりプラスミドｐＣＰ２０（ネズミチフス菌χ３７３０から抽出、Ｒ．Ｃｕｒｔｉｓｓ，ＩＩＩ、Ｓ．Ｍ．Ｋｅｌｌｙ、Ｐ．Ａ．Ｇｕｌｉｇ、Ｃ．Ｒ．Ｇｅｎｔｒｙ−ＷｅｅｋｓおよびＪ．Ｅ．Ｇａｌａｎ、「経口投与ワクチンとして使用するための他の病原体由来の毒性抗原を発現する毒性サルモネラ」、Ｊ．Ｒｏｔｈ（編）、Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ワシントンＤＣ（１９８８）、３１１頁）で形質転換して抗生物質抵抗性を除去した。形質転換体を４３℃でインキュベートした。これにより温度感受性ｐＣＰ２０プラスミドが排除され、そして抗生物質抵抗性遺伝子が排除されるはずである。ネズミチフス菌および腸炎菌ΔｆｌｉＣ：：ｃａｔＦＲＴ変異体における抗生物質抵抗性の喪失を確認した。
【０１２１】
プライマー組み合わせＦｌｉＣ１／ＦｌｉＣ２を使用するＰＣＲにより、クロラムフェニコール抵抗性置換変異体に由来する欠失変異体を確認した。ネズミチフス菌ΔｆｌｉＣおよび腸炎菌ΔｆｌｉＣの双方に関して１８５塩基対のフラグメントを増幅した。
【０１２２】
プライマーＦｌｉＣ３を使用して増幅されたフラグメントを配列決定することにより欠失を確認した。
【０１２３】
０．４％寒天を含有するＬＢ培地で得られた変異体を試験した：野生型ネズミチフス菌および野生型腸炎菌はこの培地で遊走し、またネズミチフス菌ΔｆｌｉＣも遊走する（ｆｌｊＢ鞭毛遺伝子は依然存在する）。腸炎菌ΔｆｌｉＣは予想されたように遊走しない。
【０１２４】
ΔｆｌｊＢＡ変異体（ＳＭ４８）の構築
ネズミチフス菌は第２のフラジェリン遺伝子、ｆｌｊＢを含有する。この遺伝子はｆｌｊＡと一緒に発現され、ｆｌｉＣの抑制物質をコードする。この場合、ｆｌｊＡおよびｆｌｊＢの双方を欠失した。ｆｌｊＢは１５２０塩基対長であり、そしてタンパク質フラジェリンをコードする。ｆｌｊＡは５３９塩基対長であり、そしてｆｌｉＣの抑制物質をコードする。欠失されたフラグメントの全長（ｆｌｊＢ）：２１２７塩基対。
【０１２５】
ｆｌｊＢＡ遺伝子の配列との５１ヌクレオチド相同性ならびに抗生物質抵抗性遺伝子およびＦＲＴ部位をフランキングする鋳型プラスミドの配列との相同性を示すプライマーを設計した。プライマーＦｌｊＢＡＰ１はｆｌｊＢの開始コドンから出発して５１塩基対下流までの配列（１−５１）と相同性を示し、そしてプライマーＦｌｊＢＡＰ２はｆｌｊＡの開始コドンから出発して５１塩基対下流までの配列（２０７６−２１２７）と相同性を示す。プライマーＦｌｊＢＡＰ１およびＦｌｊＢＡＰ２はその３’末端でＦＲＴ部位を有する抵抗性遺伝子をフランキングする鋳型プラスミドのプライミング部位Ｐ１およびＰ２部位との相同性を示す。
【０１２６】
プライマーＦｌｊＢＡＰ１およびＦｌｊＢＡＰ２（表１の配列）ならびに鋳型ＤＮＡ  ｐＫＤ３（ｃａｔＦＲＴ）またはｐＫＤ４（ｋａｎＦＲＴ）を使用するＰＣＲにより望ましい長さのフラグメントを増幅した。
【０１２７】
ｐＫＤ４６またはｐＫＤ２０で形質転換されたネズミチフス菌にＰＣＲ生成物１μｇをエレクトロポレーションした。選択されたカナマイシンおよびクロラムフェニコール抵抗性形質転換体をＰＣＲにより確認した。
【０１２８】
０．４％寒天を含有するＬＢ培地で変異体を試験した。野生型ネズミチフス菌、ネズミチフス菌ΔｆｌｊＢＡ：：ｋａｎＦＲＴおよびネズミチフス菌ΔｆｌｊＢＡ：：ｃａｔＦＲＴは遊走する（ｆｌｉＣは依然存在する）。３つの株の運動性を顕微鏡観察により確認した。
【０１２９】
様々な変異体のエレクトロコンピテントセルをｐＣＰ２０プラスミド（ネズミチフス菌ＬＴ２制限変異体χ３７３０に由来する）でエレクトロポレーションして抗生物質抵抗性遺伝子を除去した。２８℃で２時間インキュベートした後、カルベニシリンを含むＬＢ培地に培養物をプレーティングした。ＬＢ上４３℃で形質転換体をインキュベートした後、それをプラスミドおよび抗生物質抵抗性遺伝子の喪失に関して試験した。フラグメントのＰＣＲおよび配列決定の手段により欠失変異体を確認した。
【０１３０】
プライマー組み合わせＦｌｊＢＡ６／ＦｌｊＢＡ５（表１の配列）を使用するＰＣＲにより、野生型ネズミチフス菌に関して２１１２塩基対のフラグメント、およびネズミチフス菌ΔｆｌｊＢＡ変異体ＳＭ４８に関して１８５塩基対のフラグメントを増幅した。
【０１３１】
プライマーＦｌｊＢＡ６−ＦｌｊＢＡ５（図７）を使用して得られたＰＣＲフラグメントに関してプライマーＦｌｊＢＡ６を使用して配列決定することにより、変異体ＳＭ４８における欠失を確認した。
【０１３２】
ネズミチフス菌１４９１Ｓ９６ΔｆｌｊＢＡΔｆｌｉＣ二重変異体（ＳＭ２３）の構築
ネズミチフス菌ΔｆｌｊＢＡ：：ｋａｎＦＲＴ（ｐＫＤ４６）株を使用して二重変異体を構築した。２８℃の温度でエレクトロコンピテントセルを調製した（温度感受性プラスミドｐＫＤ４６）。エレクトロコンピテントセルを組換えｆｌｉＣフラグメントでエレクトロポレーションし、ここでｆｌｉＣ遺伝子はクロラムフェニコール抵抗性遺伝子で置換されている（先行の実施例を参照）。候補変異体をスクリーニングおよび確認するために、ｆｌｉＣ変異体の構築に使用された手順は以下のとおりであった。望ましい遺伝子型：ネズミチフス菌ΔｆｌｊＢＡ：：ｋａｎＦＲＴ  ΔｆｌｉＣ：：ｃａｔＦＲＴ。抗生物質抵抗性遺伝子を排除するための、以前に記載されたプロトコールは以下のとおりであった。ネズミチフス菌ΔｆｌｊＢＡ  ΔｆｌｉＣ（ＳＭ２３）における欠失をＰＣＲにより確認した。
【０１３３】
二重変異体ネズミチフス菌ΔｆｌｊＢＡ  ΔｆｌｉＣ（ＳＭ２３）は予想されたように０．４％寒天を含むＬＢ培地で運動しなかった。株の非運動性を顕微鏡観察により確認した。
【０１３４】
栄養要求性および鞭毛変異の組み合わせ
Ｐ２２−形質導入（Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  Ｄ．およびＲｏｔｈ，Ｊ．Ｒ．（１９８０）、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）を使用して変異を組み合わせた。置換変異体のＰ２２−ライゼートを使用して組み合わされた欠失変異体を構築した。ＰＣＲにより形質導入を確認した（以前の確認と同一のプロトコールおよびプライマーを使用した）。抗生物質抵抗性遺伝子の排除のために、ｐＣＰ２０ヘルパープラスミドを使用する以前に記載されたプロトコールを使用した。ＰＣＲにより欠失を確認した。この方式で構築された変異体は：ネズミチフス菌ΔｆｌｉＣ  ΔｇｕａＢ（ＳＭ３２）、ネズミチフス菌ΔｆｌｊＢＡ  ΔｇｕａＢ（ＳＭ３５）、ネズミチフス菌ΔｆｌｉＣ  ΔｆｌｊＢＡ  ΔｇｕａＢ（ＳＭ２７）および腸炎菌ΔｆｌｉＣ  ΔｇｕａＢ（ＳＭ２１）である。
【０１３５】
同質遺伝子欠失変異体の構築
欠失変異体の構築のためのＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（２０００）により記載された方法を専ら使用して、追加的な未知の変異体（それは株の弱毒化に及ぼす影響を有し得る）が候補ワクチン株に存在する可能性を排除するために、同質遺伝子欠失変異体を構築した。Ｐ２２ファージ形質導入により、変異を野生型バックグラウンドに形質導入した（Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  Ｄ．およびＲｏｔｈ，Ｊ．Ｒ．（１９８０）、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）。抗生物質抵抗性置換変異体をドナー株として使用した。抗生物質抵抗性遺伝子の排除および欠失の確認のために、以前の実験と同一のプロトコールを使用した。
【０１３６】
構築された変異体：腸炎菌ΔｇｕａＢ（ＳＭ６９、寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２１６４１を有する）；腸炎菌ΔｆｌｉＣ（ＳＭ７１）；ネズミチフス菌ΔｇｕａＢ（ＳＭ８６、寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２１６４６を有する）；ネズミチフス菌ΔｆｌｉＣ（ＳＭ９１）；ネズミチフス菌ΔｆｌｊＢＡ（ＳＭ９０）、腸炎菌ΔｇｕａＢ  ΔｆｌｉＣ（ＳＭ７３、寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２１６４２を有する）；ネズミチフス菌ΔｇｕａＢ  ΔｆｌｉＣ（ＳＭ１０４）；ネズミチフス菌ΔｇｕａＢ  ΔｆｌｊＢＡ（ＳＭ８７）；ネズミチフス菌ΔｆｌｊＢＡ  ΔｆｌｉＣ（ＳＭ８３）；ネズミチフス菌ΔｇｕａＢ  ΔｆｌｊＢＡ  ΔｆｌｉＣ（ＳＭ８９、寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２１６４３を有する）。
【０１３７】
実施例４：腸炎菌ワクチン株での毒性および保護実験
腸炎菌ワクチン株の毒性に及ぼすｆｌｉＣ遺伝子の不活化の影響
腸炎菌ワクチン株の免疫原性に及ぼすｆｌｉＣ遺伝子の不活化の影響を研究するために、２つの独立した毒性および保護試験を７週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＳＭ２０（ΔｇｕａＢ）およびＳＭ２１（ΔｇｕａＢ  ΔｆｌｉＣ）の双方の変異体を用いて実施した（表４および５）。
【０１３８】
毒性分析のために、野生型株のＬＤ５０のおよそ１０５倍に相当する約１０８ＣＦＵの用量でマウスを経口感染した（Ｐａｔｔｅｒｙら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３３：７９１−８０５（１９９９））。マウスを２１日間観察した。野生型腸炎菌株７６Ｓａ８８を接種された全てのマウスは感染後９日以内に死亡したが、非感染対照マウスは２１日間の観察期間中健常なままであった。最初の実験では、腸炎菌ΔｇｕａＢ変異体ＳＭ２０に感染したマウスは典型的な病徴（活動性低下、毛並みの乱れおよび背の曲がり）を示し、そして１０匹中１匹が死亡した。第２の実験では、ＳＭ２０で病徴は観察されなかった。腸炎菌ΔｇｕａＢ  ΔｆｌｉＣ変異体ＳＭ２１は双方の実験で無症候性であった。
【０１３９】
保護を付与するための変異体ＳＭ２０およびＳＭ２１の有効性：保護試験
野生型腸炎菌株７６Ｓａ８８の約１０５ＬＤ５０（ＬＤ５０＝１０３ＣＦＵ）での経口抗原投与による初期免疫の３週後に、保護を付与するための変異体ＳＭ２０およびＳＭ２１の有効性を試験した。マウスを２１日間観察した。全ての非免疫マウスは抗原投与後死亡した。第２の実験では、ＳＭ２０でワクチン接種された３匹のマウスのうち１匹が死亡した。全ての他のワクチン接種されたマウスは病徴を観察されずに抗原投与を生き延びた。これらのデータにより、双方の変異体が弱毒化され、そして対応する野生型株での抗原投与に対して保護を付与することが示される。
【０１４０】
候補ワクチン株の弱毒化に寄与し得る付加的な未知の変異が存在しないことを確かめるために、Ｐ２２形質導入により、選択可能な抵抗性遺伝子を含有する変異を野生型バックグラウンドに移入した（Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  Ｄ．およびＲｏｔｈ，Ｊ．Ｒ．（１９８０）、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）。
【０１４１】
腸炎菌の毒性に及ぼすｆｌｉＣ遺伝子の不活化の影響：同質遺伝子株での毒性および保護試験
ＰＣＲによる確認および先に記載されたような表現型特徴付けの後、ＢＡＬＢ／ｃマウスでの毒性および保護試験を同質遺伝子株ＳＭ６９（ΔｇｕａＢ）、ＳＭ７１（ΔｆｌｉＣ）およびＳＭ７３（ΔｇｕａＢ  ΔｆｌｉＣ）を用いて繰り返した。この毒性分析では、腸炎菌の毒性に及ぼすｆｌｉＣ遺伝子の不活化の影響を研究するためにΔｆｌｉＣ変異体を含めた。毒性および抗原投与実験のために前記したものと類似の条件を使用した。形質導入体ＳＭ６９およびＳＭ７３に関して得られたデータ（表６および７）により、先の実験で成された観察を確認した。
【０１４２】
双方のｇｕａＢ欠失変異体間の比較により、腸炎菌ΔｇｕａＢ  ΔｆｌｉＣ二重変異体ＳＭ７３が、野生型株の高用量での抗原投与に対して、腸炎菌ΔｇｕａＢ単一変異体ＳＭ６９よりもさらに弱毒化され、そしてより良好な保護を付与することが示される。腸炎菌ΔｆｌｉＣ変異体ＳＭ７１で実施された毒性分析により、この変異体が、適用された条件下で野生型株と同程度の毒性を残存することが示された。
【０１４３】
免疫学的応答および抗体生成
第１の実験での初期免疫の５４日後、マウスの尾動脈から血液試料を収集した。腸炎菌ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）をコーティングに用いる酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、抗リポ多糖類（ＬＰＳ）ＩｇＧ力価を決定した。ＳＭ２０およびＳＭ２１で免疫したマウスの血清間の比較により、双方の場合で抗ＬＰＳ血清ＩｇＧ応答が引き出され、そして力価に有意差は測定されないことが示された。第２および第３の用量での経口免疫により、初期免疫後６６および９５日に血清中の抗ＬＰＳ  ＩｇＧレベルは増強されなかった（データは示していない）。
【０１４４】
実施例５：ネズミチフス菌形質導入体での毒性および保護実験
７週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて形質導入体を用いて毒性および保護実験を実施した。およそ１０８細胞でマウスを経口により接種した。マウスを２１日間毎日観察した。この期間の後、マウスを野生型病原性株１０８細胞で抗原投与し、そしてマウスを２１日間観察した。
【０１４５】
病徴および生存率を表１０−１３に記す。単一および二重鞭毛変異体は経口投与された場合、高度に毒性のままであり、全マウスが死亡した。ｇｕａＢ変異体を接種されたマウスは穏やかな病徴を示した（マウスは闘争的であり、２匹のみが生存した）。組み合わされたΔｇｕａＢ  ΔｆｌｊＢＡ、ΔｇｕａＢ  ΔｆｌｉＣおよびΔｇｕａＢ  ΔｆｌｉＣΔｆｌｊＢＡ変異体は高度に弱毒化された。ワクチン接種後２１日間の観察期間中に病徴は観察されなかった。これらの変異体は高用量の野生型株での抗原投与後に良好な保護を付与した。抗原投与後にマウスの活動性低下のみが観察され得る。
【０１４６】
またこれらの結果により、ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与された場合、鞭毛変異は株の免疫原性能力に影響を及ぼさないことも示された。鞭毛変異はワクチン株と野生型株との間の識別のための血清学的マーカーとして有用であり得る。栄養要求性変異と（複数の）鞭毛変異との組み合わせにより、マウスにおける変異体の毒性の低下および対応する野生型株に対する保護に関して最良の結果が得られる。
【０１４７】
ネズミチフス菌ΔｇｕａＢ  ΔｆｌｉＣΔｆｌｊＢＡ三重欠失変異体ならびにネズミチフス菌二重欠失変異体ΔｇｕａＢ  ΔｆｌｊＢＡおよびΔｇｕａＢ  ΔｆｌｉＣの弱毒化は同程度であった。
【０１４８】
実施例６：腸炎菌ワクチン株の安全性評価
気管内または経口経管経路により１日齢で接種されたニワトリにおけるＳＭ６９安全性評価
この研究の目的は、１日齢のニワトリにおける腸炎菌ΔｇｕａＢ変異体株ＳＭ６９マスターシードの安全性を評価することであった。安全性の決定のための一次的なパラメータとして死亡率を用いた。
【０１４９】
１日齢のニワトリの脚にバンドを付け、そして４つの処置群の各々に無作為に配した（第１群：ＳＭ６９−ＩＴ、第２群：ＳＭ６９−ＯＧ、第３群：ＰＢＳ−ＩＴおよび第４群：ＰＢＳ−ＯＧ）。マスターシード接種の後、第１および第２群からのトリを１つの隔離飼育器に、そして第３および第４群のトリを別の隔離飼育器に配した。
【０１５０】
第１および第２群のニワトリに各々気管内（ＩＴ）経路または経口経管（ＯＧ）経路により、ＳＭ６９マスターシードを、トリあたりの実際の力価１．３×１０８ＣＦＵ／０．２ｍｌで接種した。第３および第４群のニワトリに各々気管内経路または経口経管経路により、トリあたり０．２ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を投与した。
【０１５１】
ＳＭ６９またはＰＢＳの接種の後、ニワトリ死亡率を接種後３８日まで毎日観察した。表８に全４群に関する死亡率の結果をまとめる。第１群では接種中に接種外傷のために１羽のトリが死亡した。接種後（ＤＰＩ）２日に２羽のトリが死亡した。３日目から１３日目までに３羽のトリが死亡した（各々３、５および１３ＤＰＩ）。従って、第１群では全部で６羽のトリが死亡した。第２群では全部で２羽のトリが死亡した。１羽は接種外傷のために死亡し、そして１羽は接種後５日に死亡した。ＰＢＳ処置群では気管内経路でも経口経管経路でも死亡したトリはなかった。
【０１５２】
この研究により、腸炎菌ΔｇｕａＢ変異体株ＳＭ６９は１日齢のトリあたり１．３×１０８ＣＦＵで気管内経路または経口経管経路により投与された場合に安全ではないことが示される。
【０１５３】
気管内経路または経口経管経路により２週齢で接種されたニワトリにおけるＳＭ６９の安全性評価
次いで腸炎菌ΔｇｕａＢ変異体株ＳＭ６９の安全性を２週齢ＳＰＦニワトリにおいて気管内経路または経口経管経路により評価した。安全性の決定のために死亡率を一次基準として、および体重を二次基準として用いた。
【０１５４】
２週齢のトリの脚にバンドを付け、そして４つの処置群の各々に無作為に配した：ＳＭ６９−ＩＴ、ＳＭ６９−ＯＧ、Ｐｏｕｌｖａｃ  ＳＴ−ＩＴおよびＰＢＳ−ＩＴ。第１群の１０羽のトリに気管内経路によりＳＭ６９を接種し；第２群の１０羽のトリに経口経管によりＳＭ６９を接種し；第３群の１０羽のトリに気管内経路によりネズミチフス菌ＡｒｏＡ−ワクチン（Ｐｏｕｌｖａｃ（登録商標）ＳＴ）を接種し；そして第４群の５羽のトリに気管内経路によりＰＢＳを接種した。
【０１５５】
第１および第２群のニワトリに各々気管内経路または経口経管経路により、ＳＭ６９マスターシードをトリあたりの実際の力価２．３×１０８ＣＦＵ／０．２ｍｌで接種した。第３群のニワトリに気管内経路により、Ｐｏｕｌｖａｃ（登録商標）ＳＴをトリあたり２．２×１０８ＣＦＵ／０．２ｍｌで投与した。第４群のニワトリに気管内経路によりトリあたり０．２ｍｌのＰＢＳを投与した。
【０１５６】
接種後、処置第１および第２群からのトリを１つの隔離飼育器に、そして第３および第４群のトリを別の隔離飼育器に配した。
【０１５７】
接種に続いて、接種後２１日まで死亡率を毎日観察した。全てのトリの体重もまた研究期間（２１日間）の最後に記録した。Ｐｏｕｌｖａｃ（登録商標）ＳＴおよびＰＢＳを気管内手順の対照として使用した。
【０１５８】
２１日の観察期間中にＳＭ６９気管内処置群（第１群）の１羽のトリが卵黄嚢感染から死亡した。死亡率はＳＭ６９に関連せず、それはＳＭ６９株が気管内経路および経口経管経路により、試験された力価、トリあたり２．３×１０８ＣＦＵで安全であることを示している。予想されたように、トリあたり２．２×１０８ＣＦＵの力価でＰｏｕｌｖａｃ（登録商標）ＳＴ処置されたトリ、またはＰＢＳ処置されたトリのいずれでも死亡は観察されず、それはこの研究が正当であったことを示している（表９）。
【０１５９】
従属変数として体重、および独立変数として含められた処置を用いる分散（ＡＮＯＶＡ）モデルの分析で体重を群間で比較した。多重比較のためにチューキー検定を使用して群比較を行った。有意性のレベルをｐ＜０．０５に設定した、対照ニワトリ（ＰＢＳ対照群）は健常のままであり、そして研究の間中臨床病徴または死亡はなかったので、研究は正当であると考えられた。
【０１６０】
気管内接種または経口経管接種によるＳＭ６９、Ｐｏｕｌｖａｃ（登録商標）ＳＴまたはＰＢＳを投与されたニワトリにおける最終体重に有意差はなかった（表９）。１日齢の各群のトリのベースラインは確立されなかったが、トリは無作為に４つの処置群の各々に配されたので、４群間の初期体重に有意差があったとは考えられなかった。
【０１６１】
本実験から、ＳＭ６９は気管内経路または経口経管経路のいずれかにより、２週齢でトリあたり２．３×１０８ＣＦＵの試験された力価で投与された場合、安全であると結論づけることができる。
【０１６２】
気管内経路または経口経管経路により１日齢で接種されたニワトリにおけるＳＭ７３の安全性評価
腸炎菌欠失変異体株ＳＭ７３（ΔｇｕａＢ  ΔｆｌｉＣ）の安全性を気管内経路および経口経管経路により評価した。安全性の決定のために、死亡率を一次基準として、および体重を二次基準として用いた。
【０１６３】
全てのトリの脚にバンドを付け、そしてこの研究に含められたトリの４群の１つに無作為に割り当てた（第１群：ＳＭ７３−ＩＴ、第２群：ＳＭ７３−ＯＧ、第３群：Ｐｏｕｌｖａｃ  ＳＴ−ＩＴおよび第４群：ＰＢＳ−ＩＴ）。第１群の１０羽のトリに気管内経路によりＳＭ７３を接種し；第２群の１０羽のトリに経口経管によりＳＭ７３を接種し；第３群の１０羽のトリに気管内経路によりネズミチフス菌ＡｒｏＡ−ワクチン（Ｐｏｕｌｖａｃ（登録商標）ＳＴ）を接種し；そして第４群の５羽のトリに気管内経路によりＰＢＳを接種した。全部で４つの隔離飼育器（各群に１個）を使用し、そこでニワトリを研究期間中飼育した。
【０１６４】
１日齢のニワトリに接種した。第１および第２群のニワトリに各々気管内経路または経口経管経路により、ＳＭ７３マスターシードをトリあたりの実際の力価２．５×１０７ＣＦＵ／０．２ｍｌで接種した。第３群のニワトリに気管内経路により、Ｐｏｕｌｖａｃ（登録商標）ＳＴをトリあたり２．１×１０７ＣＦＵ／０．２ｍｌで投与した。第４群のニワトリに気管内経路によりトリあたり０．２ｍｌのＰＢＳを投与した。
【０１６５】
ＳＭ６９に関して前記で記載したように死亡率を観察し、そして体重を記録した。Ｐｏｕｌｖａｃ（登録商標）ＳＴおよびＰＢＳを再度気管内手順の対照として使用した。
【０１６６】
２１日の観察期間中に、いずれのトリでも死亡は全く観察されなかった。ＰＢＳ−ＩＴ、Ｐｏｕｌｖａｃ  ＳＴ−ＩＴおよびＳＭ７３−ＯＧ接種されたトリの最終体重にはさらに差異はなかった。ＳＭ７３−ＩＴ群の平均体重はＳＭ７３−ＯＧ群と比較して有意に低かった（ｐ＝０．０００９）が、これはほぼ確実に実験誤差による。
【０１６７】
本実験から、ＳＭ７３は１日齢で気管内経路または経口経管経路により、トリあたり２．５×１０７ＣＦＵの試験された力価で投与された場合、安全であると結論づけることができる。
【０１６８】
以下の微生物に関してＢＣＣＭ／ＬＭＧカルチャーコレクション、（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ  ｖｏｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ、Ｋ．Ｌ．Ｌｅｄｅｇａｎｃｋｓｔｒａａｔ３５、Ｂ−９０００、ゲント（ベルギー））でブダペスト条約に従って寄託を行っている：寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２１６４１の下で腸炎菌ＳＭ６９（寄託日：２００２年８月９日）；寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２１６４２の下で腸炎菌ＳＭ７３（寄託日：２００２年８月９日）、寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２１６４６の下でネズミチフス菌ＳＭ８６（寄託日：２００２年８月２８日）および寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２１６４３の下でネズミチフス菌ＳＭ８９（寄託日：２００２年８月９日）。寄託はＰｒｏｆ．Ｊ．−Ｐ．Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓ（旧住所：Ｖｒｉｊｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ  Ｂｒｕｓｓｅｌ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ  Ｇｅｎｅｔｉｓｃｈｅ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｅ，Ｐａａｒｄｅｎｓｔｒａａｔ  ６５，Ｂ−１６４０  Ｓｉｎｔ−Ｇｅｎｅｓｉｕｓ−Ｒｈｏｄｅ、現住所：Ｖｒｉｊｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ  Ｂｒｕｓｓｅｌ，Ｏｎｄｅｒｚｏｅｋｓｇｒｏｅｐ  Ｇｅｎｅｔｉｓｃｈｅ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｅ，Ｐｌｅｉｎｌａａｎ  ２，Ｂ−１０５０  ブリュッセル、ベルギー）の名の下で行われた。
【０１６９】
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【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】グアノシン一リン酸の生合成経路の図式的概観を示す。
【図２】腸炎菌ゲノムのコンティグ１２９４を表す（配列番号：１９）。
【図３】ｐＵＣ１８にクローン化された腸炎菌のΔｇｕａＢフラグメントの配列を表す（配列番号：２０）。
【図４】プライマーＧｕａＢ１０を用いて得られたｇｕａＢ欠失を含む、腸炎菌ＰＣＲフラグメントのヌクレオチド配列を表す（配列番号：２１）。
【図５】ネズミチフス菌ＬＴ２のｇｕａＢ遺伝子、完全ゲノムのセクション２２０の１１７を示す（配列番号：２２）。ｇｕａＢ遺伝子のＡＴＧ開始およびＴＧＡ終止コドンを太字で示す。
【図６】プライマーＦｌｉＣ１およびＦｌｉＣ２を用いて変異体ＳＭ７３およびＳＭ８９の全ＤＮＡで、プライマーＦｌｉＣ１−ＦｌｉＣ２で増幅されたＰＣＲフラグメントを配列決定した後に得られたヌクレオチド配列を示す（配列番号：２３）。
【図７】プライマーＦｌｊＢＡ６を用いてネズミチフス菌変異体ＳＭ４８の全ＤＮＡで、プライマーＦｌｊＢＡ６−ＦｌｊＢＡ５で増幅されたＰＣＲフラグメントを配列決定した後に得られたヌクレオチド配列を示す（配列番号：２４）。
【図８−１】ＳＭ６９に関する寄託受領を表す。
【図８−２】ＳＭ６９に関する寄託受領を表す。
【図８−３】ＳＭ６９に関する寄託受領を表す。
【図８−４】ＳＭ６９に関する寄託受領を表す。
【図９−１】ＳＭ７３に関する寄託受領を表す。
【図９−２】ＳＭ７３に関する寄託受領を表す。
【図９−３】ＳＭ７３に関する寄託受領を表す。
【図９−４】ＳＭ７３に関する寄託受領を表す。
【図１０−１】ＳＭ８９に関する寄託受領を表す。
【図１０−２】ＳＭ８９に関する寄託受領を表す。
【図１０−３】ＳＭ８９に関する寄託受領を表す。
【図１０−４】ＳＭ８９に関する寄託受領を表す。
【図１１−１】ＳＭ８６に関する寄託受領を表す。
【図１１−２】ＳＭ８６に関する寄託受領を表す。
【図１１−３】ＳＭ８６に関する寄託受領を表す。
【図１１−４】ＳＭ８６に関する寄託受領を表す。
【配列表フリーテキスト】
【０１７１】
配列番号１は、ＧｕａＢ２プライマーの配列である。
配列番号２は、ＧｕａＢ３プライマーの配列である。
配列番号３は、ＧｕａＢ４プライマーの配列である。
配列番号４は、ＧｕａＢ５プライマーの配列である。
配列番号５は、ＧｕａＢ６プライマーの配列である。
配列番号６は、ＧｕａＢ７プライマーの配列である。
配列番号７は、ＧｕａＢ１０プライマーの配列である。
配列番号８は、Ｐ１プライマーの配列である。
配列番号９は、Ｐ２プライマーの配列である。
配列番号１０は、ＦｌｉＣＰ１プライマーの配列である。
配列番号１１は、ＦｌｉＣＰ２プライマーの配列である。
配列番号１２は、ＦｌｉＣ１プライマーの配列である。
配列番号１３は、ＦｌｉＣ２プライマーの配列である。
配列番号１４は、ＦｌｉＣ３プライマーの配列である。
配列番号１５は、ＦｌｊＢＡＰ１プライマーの配列である。
配列番号１６は、ＦｌｊＢＡＰ２プライマーの配列である。
配列番号１７は、ＦｌｊＢＡ５プライマーの配列である。
配列番号１８は、ＦｌｊＢＡ６プライマーの配列である。
配列番号２０は、ｐＵＣ１８にクローン化された腸炎菌のΔｇｕａＢフラグメントの配列である。
配列番号２１は、プライマーＧｕａＢ１０を用いて得られたｇｕａＢ欠失を含む、腸炎菌ＰＣＲフラグメントのヌクレオチド配列である。
配列番号２３は、プライマーＦｌｉＣ１およびＦｌｉＣ２を用いて変異体ＳＭ７３およびＳＭ８９の全ＤＮＡで、プライマーＦｌｉＣ１−ＦｌｉＣ２で増幅されたＰＣＲフラグメントを配列決定した後に得られたヌクレオチド配列である。
配列番号２４は、プライマーＦｌｊＢＡ６を用いてネズミチフス菌変異体ＳＭ４８の全ＤＮＡで、プライマーＦｌｊＢＡ６−ＦｌｊＢＡ５で増幅されたＰＣＲフラグメントを配列決定した後に得られたヌクレオチド配列である。
【図１】
2009531029.tif 000018
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年2月20日(2009.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
獣医学的動物種に感染する細菌の弱毒化変異体株であって、前記変異体は少なくとも１つの第１の遺伝子改変および少なくとも１つの第２の遺伝子改変を含有し、前記第１の遺伝子改変は１つまたはそれより多い運動性遺伝子において行われ、そして前記第２の遺伝子改変は宿主における細菌の生存または増殖に関与する１つまたはそれより多い遺伝子において行われる、弱毒化変異体株。
【請求項２】
獣医学的動物種は家禽である、請求項１に記載の変異体株。
【請求項３】
サルモネラ・エンテリカ株または大腸菌株である、請求項１または２に記載の変異体株。
【請求項４】
運動性遺伝子は、フラジェリンをコードする遺伝子である、請求項１〜３のいずれかに記載の変異体株。
【請求項５】
ｆｌｉＣおよび／またはｆｌｊＢもしくはｆｌｊＢＡ遺伝子に変異を有する、請求項４に記載の変異体株。
【請求項６】
０．４％寒天を含有するＬＢ培地で遊走できない、請求項４または５に記載の変異体株。
【請求項７】
生存に関与する遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子または毒性遺伝子である、請求項１〜６のいずれかに記載の変異体株。
【請求項８】
不活化されるハウスキーピング遺伝子は、ｇｕａＢ遺伝子である、請求項７に記載の変異体株。
【請求項９】
変異体株は、ｇｕａＢ遺伝子機能を損なう欠失変異を含有する、請求項８に記載の変異体株。
【請求項１０】
新規グアニンヌクレオチドを形成することができない、請求項８または９に記載の変異体株。
【請求項１１】
前記変異体株は、外来抗原をコードし、かつ発現する、請求項１〜１０のいずれかに記載の変異体株。
【請求項１２】
弱毒化腸炎菌株または弱毒化ネズミチフス菌株である、請求項１〜１１のいずれかに記載の変異体株。
【請求項１３】
遺伝子改変は、親株腸炎菌ファージ４型株７６Ｓａ８８に導入される、請求項１〜１２のいずれかに記載の変異体株。
【請求項１４】
弱毒化腸炎菌株ＳＭ７３は、寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２１６４２を有する、請求項１３に記載の変異体株。
【請求項１５】
遺伝子改変は、親株ネズミチフス菌１４９１Ｓ９６に導入される、請求項１〜１２のいずれかに記載の変異体株。
【請求項１６】
弱毒化ネズミチフス菌株ＳＭ８９は、寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２１６４３を有する、請求項１５に記載の変異体株。
【請求項１７】
ｇｕａＢ遺伝子における遺伝子改変およびｆｌｉＣ遺伝子における遺伝子改変を含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の変異体株。
【請求項１８】
ｇｕａＢ遺伝子における遺伝子改変およびｆｌｊＢＡ遺伝子における遺伝子改変を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の変異体株。
【請求項１９】
ｇｕａＢ遺伝子における遺伝子改変、ｆｌｉＣ遺伝子における遺伝子改変、およびｆｌｊＢＡ遺伝子における遺伝子改変を含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の変異体株。
【請求項２０】
改変は前記遺伝子における１つまたはそれより多いヌクレオチドの挿入、欠失および／または置換からなる群より選択される、請求項１〜１９のいずれかに記載の変異体株。
【請求項２１】
医薬的に有効な量、または免疫量の請求項１〜２０のいずれかに記載の変異体株；および医薬的に許容される担体または希釈剤を含む、細菌感染に対して獣医学的動物種を免疫するためのワクチン。
【請求項２２】
前記変異体株は、外来抗原をコードしかつ発現する、請求項２１に記載のワクチン。
【請求項２３】
前記変異体株は、真核細胞において外来遺伝子をコードし、かつ発現するプラスミドを含む、請求項２１または２２に記載のワクチン。
【請求項２４】
免疫量の請求項１〜２０のいずれかに記載の変異体株および／または請求項２１〜２３のいずれかに記載のワクチンを、それを必要とする獣医学的動物種に投与する工程
を含む、細菌感染に対して獣医学的動物種を免疫する方法。
【請求項２５】
獣医学的動物種は家禽である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
変異体株はサルモネラ・エンテリカまたは大腸菌である、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
変異体株および／またはワクチンは、経口、経鼻または非経口経路により投与される、請求項２４〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
獣医学的動物種、好ましくは家禽における感染の防御および／または処置のためのワクチンの調製のための、請求項１〜２０のいずれかに記載の変異体株の使用。
【請求項２９】
ワクチン接種された動物と野生型株に感染した動物との間の血清学的識別のための方法であって、ワクチン接種された動物は、フラジェリン遺伝子が不活化されている変異体株で免疫されており、前記方法は：
フラジェリンに対して産生刺激された抗体の存在に関して動物を分析する工程；および
前記抗体の存在または不存在に基づいて、感染した動物をワクチン接種された動物から識別する工程
を含む、方法。
【請求項３０】
前記抗体は、野生型株によって感染された動物によって作成されるが、請求項４〜２０のいずれかに記載の変異体株のようなフラジェリン遺伝子が不活化されている変異体株でワクチン接種されている動物によっては作成されない、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体の存在は野生型株の存在、従って感染の指標である、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
サルモネラに感染した動物は、請求項２１〜２３のいずれかに記載の弱毒化生ワクチンで免疫されている動物から識別される、請求項２９〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
動物は、ＦｌｉＣに対して産生刺激された抗体に関して分析される、請求項２９〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
動物は獣医学的動物種であり、好ましくは家禽、さらに好ましくはニワトリである、請求項２９〜３２のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
2009531029.tif 000050
2009531029.tif 000051
2009531029.tif 000052
2009531029.tif 000053