(57)【要約】  腐食した藻から単離された好塩性海洋グラム陰性菌が、κ−カラギーナンを加水分解した。効率のいい方法でκ−カラギナーゼ製造を最大化するために、新規培地を、統計的最適化方法により、最小構成成分及びその最適濃度を有するように定義した。それ故、新規耐塩性海洋細菌であるシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種により、κ−カラギナーゼ製造を促進するための新規培地組成を展開した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
κ−カラギナーゼの製造方法であって、以下のステップ：
（ｉ）１６〜７２時間、１５〜５０℃で、カラギーナン、酵母エキス、塩化ナトリウム、Ｋ2ＨＰＯ4、及びＫＨ2ＰＯ4を０．１：１．０：５０：１：０．５から３．０：１．０：１５．０：０．５：．０５の各比で含む液体培地内で、受諾番号ＭＴＣＣ５２６１を有する耐塩性海洋細菌シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を培養し、培養物を得る；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）から得られた培養物を、５０００〜８０００ｒｐｍで、２０〜４０分間遠心し、上清として細胞のない抽出物を得る；
（ｉｉｉ）３〜１５℃の温度で、硫酸アンモニウムで処理することにより、ステップ（ｉｉ）から得られた上清から粗酵素を精製し、その混合物を１２〜３６時間エイジングし、その後、５０００〜８０００ｒｐｍで３〜１５分間遠心し、κ−カラギナーゼを含むペレットを得る；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）から得られたペレットを、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー溶液中に懸濁する；そして、
（ｖ）付着した硫酸アンモニウムを除去するためにステップ（ｉｖ）で得られた懸濁液を透析し、ゲルろ過により所望の精製κ−カラギナーゼを得る、
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種細菌が、以下の特性：
ａ）好塩性；
ｂ）グラム陰性、グラム変動性を示す；
ｃ）運動性好気性桿菌；
ｄ）藻類多糖、すなわちκ−カラギーナンを分解する、
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記κ−カラギナーゼの比活性度が、タンパク質１ｍｇあたり１０〜２００ガラクトースユニットである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記κ−カラギナーゼが１２８ＫＤａの分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
本明細書の実施例、表を参照して記載される、κ−カラギーナンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、κ−カラギナーゼの製造方法に関する。より特には、本発明は、受諾番号ＭＴＣＣ５２６１である耐塩性海洋グラム陰性菌シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を使用することによるκ−カラギナーゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景及び先行技術
κ−カラギナーゼの潜在的な使用は、低分子量糖質を得るため、昆布消化のため、赤青粉形成を制御することによる生物付着の防止のため、ファインケミカルを得るため、及び藻類バイオテクノロジーのための使用である。
【０００３】
カラギーナンは、特定の種の紅藻である紅藻網（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｃｅａｅ）から得られる天然成分である（Ｇｒｅｅｒ，Ｃ．Ｗ．及びＷ．Ｙａｐｈｅ．１９８４．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｒａｇｅｅｎａｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃａｒａｇｅｅｎａｎ  ｆｒｏｍ  Ｅｕｃｈｅｕｍａ  ｎｕｄｕｍ．Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ．１１６／１１７：５６３−５６７)。カラギーナンは、１，３結合β−Ｄ−ガラクトピラノース（Ａ残基）と１，４結合α−Ｄ−ガラクトピラノース（Ｂ残基）の二糖類配列の繰り返しにより構成される線状多糖類である。カラギーナンは、カラギーナンのＢユニットがＤ体であり寒天ではＬ体である点で、寒天と区別される。カラギーナンの基本構造の正規骨格は、硫酸ヘミエステル基のある程度の秩序分布により分離される。カラギーナンは、いくつかのメトキシ基及びピルビン酸基も含み得る。カラギーナンのよくある源は、Ｃｈｏｎｄｒｕｓ、Ｅｕｃｈｅｕｍａ（Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ）、Ｇｉｇａｒｔｉｎａ、及びＩｒｉｄａｅａ種である。
【０００４】
カラギーナンの３つの基本型が入手可能である。カッパ（κ）、イオタ（ι）、及びラムダ（λ）カラギーナンは、Ｃｈｏｎｄｒｕｓ、Ｅｕｃｈｅｕｍａ、及びＧｉｇａｒｔｉｎａ種から入手され、硫酸エステル置換の数及び位置が異なる。κ及びιカラギーナンは、Ｋ+、Ｃａ2+又はＮＨ4+の存在下で温度可逆ゲルを形成するが、Ｎａ+型においてゲル化しない。
【０００５】
β１，４−結合でカラギーナンを分解する加水分解酵素は、カラギナーゼとして知られる。これらの３つの酵素、κ、ι、及びλカラギナーゼは、様々な海洋細菌から単離されている。それらの全ては、カラギーナンのβ１，４−結合を開裂する内因性加水分解酵素であり、ネオカラビオース種の生成物を産生する（Ｍｉｃｈｅｌ，G．，L．Ｃｈａｎｔｌａｔ，E．Ｆａｎｃｈｏｎ，B．Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．Ｋｌｏａｒｅｇ，及びＯ．Ｄｉｄｗｅｂｅｒｇ．２００１．Ｔｈｅ  ι−ｃａｒｒａｇｅｅｎａｓｅ  ｏｆ  Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｆｏｒｔｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７６（４３）：４０２０２−４０２０９）。κ−カラギナーゼは、ラージスケール適用であり、昨今の工業的需要がある（Ｏｓｔｇａａｒｄ，Ｋ．，Ｂ．Ｆ．Ｗａｎｇｅｎ，Ｓ．Ｈ．Ｋｎｕｔｓｅｎ，及びＩ．Ｍ．Ａａｓｅｎ．１９９３．Ｌａｒｇｅ  ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  κ−ｃａｒｒａｇｅｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃａｒｒａｇｅｅｎｏｖｏｒａ  ｆｏｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｅａｗｅｅｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１５（４）：３２６−３３３）。
【０００６】
Ｊｈｏｎｓｔｏｎ及びＭｃＣａｎｄｌｅｓｓは、「Ｅｎｚｙｍｉｃ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ：ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  λ−ｃａｒｒａｇｅｅｎａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃａｒｒａｇｅｅｎｏｖｏｒａ」，Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９：（１９７３）ｐ．ｐ．７７９−７８８の論文中において、シュードモナスカラゲーノボラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃａｒｒａｇｅｅｎｏｖｏｒａ）由来のカラギナーゼがカラギーナン、すなわちλ−カラギーナンのＫＣｌ溶解画分に対してのみ活性を示したと報告している。
【０００７】
彼らは、λ−カラギナーゼの収率を改善し得たが、κ−カラギナーゼの同時生産を総合的に除外できなかった。さらに、複数かつ複雑な精製ステップを使用して、達成された比活性度は、タンパク質１ｍｇあたり、たった７ガラクトースユニットであり、最適な温度とｐＨが各々２８℃と６．２だった。この研究の欠点は、カラギナーゼが酸性条件かつ温度２８℃でのみ活性であることである。それ故、アルカリ条件、並びに高温では使用できない。さらに、当該方法は、複雑な酵素精製ステップを使用したにもかかわらず、注目すべき酵素の精製を産生しなかった。
【０００８】
Ｂｅｌｌｉｏｎらは、「Ｔｈｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｕｃｈｅｕｍａ  ｓｐｉｎｏｓｕｍ  ａｎｄ  Ｅｕｃｈｅｕｍａ  ｃｏｔｔｏｎｉ  ｃａｒａｇｅｅｎａｎｓ  ｂｙ  ι  ａｎｄ  κ−ｃａｒｒａｇｅｅｎａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍａｒｉｎｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２８（７）：（１９８２）ｐ．ｐ．８７４−８８０の論文中で、海洋シュードモナスカラゲーノボラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃａｒｒａｇｅｅｎｏｖｏｒａ）由来のι−カラギナーゼ及びκ−カラギナーゼによるＥｕｃｈｅｕｍａ  ｓｐｉｎｏｓｕｍ及びＥｕｃｈｅｕｍａ  ｃｏｔｔｏｎｉｉカラギーナンの分解を報告し、その加水分解産物を同定している。当該細菌は、ＮａＣｌ  ２５ｇ／ｌ；Ｋ2ＨＰＯ4  ０．１ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ4７Ｈ2Ｏ  ５．０ｇ／ｌ；ＣａＣｌ2２Ｈ2Ｏ  ０．２ｇ／ｌ；カザミノ酸  ２．５ｇ／ｌ；カラギーナン  ２．５ｇ／ｌ；０．３％ＦｅＳＯ4（１０ｍｌ／ｌｉｔ）からなる培地中、並びに最適インキュベーション温度２２℃で培養された。欠点は、この細菌によるカラギナーゼの製造のために使用される培地が７つの構成成分からなることである。さらに、使用される最適なインキュベーション温度である２２℃は、温暖な国では、特に夏場に冷却装置がないとこの型の細菌の培養のために実行できない。
【０００９】
Ｓａｒｗａｒらは、「Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｓｅａ ｗａｔｅｒ  ｓａｌｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｒａｇｅｅｎａｓｅ  ｂｙ  ａ  ｍａｒｉｎｅ  Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐｅｃｉｅｓ」，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２９（５）：（１９８５）ｐ．ｐ．４０５−４１１、及び「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  κ−ｃａｒｒａｇｅｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｍａｒｉｎｅ  Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐｅｃｉｅｓ」，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３１（９）：（１９８７）ｐ．ｐ．８６９−８７７」において、海洋Ｃｙｔｏｐｈａｇａ種によるカラギナーゼの製造のために培地中に８つの構成成分を使用した。さらに、この培養物は、カラギナーゼ製造のためにＮａＣｌとＭｇＣｌ2の好適な組み合わせを必要とした。最適なｐＨと温度は、各々７．６と２５℃であった。複雑な精製ステップ後に達成された活性は、１ｍｇタンパク質あたりたった５．０ガラクトースユニットだった。この研究の欠点は、培地中のＮａＣｌとＭｇＣｌ2の存在がカラギナーゼ製造のために必須であり、８つの培地構成成分及び複雑な精製ステップを使用するにもかかわらず、１ｍｇタンパク質あたりたった５．０ガラクトースユニットしか酵素活性として得られないことである。この低い収率は、酵素製造を商業的に利益の上がらないものとする。
【００１０】
Ｆｌｅｕｒｅｎｃｅらは、「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｃｈｏｎｄｒｕｓ  ｃｒｉｓｐｕｓ，Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ  ａｎｄ  Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔａ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ  ７：（１９９５）３９３−３９７において、κ−カラギナーゼはｐＨ６．５〜６．８かつ４５℃において最大活性を有し、酸性及びアルカリ性条件下では低い活性であることを報告した。この研究の欠点は、酵素が中性ｐＨでのみ活性であるので酸性及びアルカリ条件のいずれにおいても使用され得ないことである。さらに、より低い温度でのわずかな活性は、その適用性をより高い温度へと限定させる。
【００１１】
Ｄｙｒｓｅｔらは、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  κ−ｃａｒｒａｇｅｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａａｓ  ｃａｒｒａｇｅｅｎｏｖｏｒａ」，Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０（６）：（１９９７）ｐ．ｐ．４１８−４２３で、シュードモナスカラゲーノボラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａａｓ  ｃａｒｒａｇｅｅｎｏｖｏｒａ）の２つの株を使用するκ−カラギナーゼの製造のための醗酵方法を報告した。この試験のために使用された培地は、ＣａＣｌ2，２Ｈ2Ｏ  ０．２ｇ／ｌ；カザミノ酸  ６．８ｇ／ｌ；ＫＣｌ  ０．３ｇ／ｌ；Ｋ2ＨＰＯ4  ３．０ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ4，７Ｈ2Ｏ  ０．５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ  ２０．０ｇ／ｌ；ＮＨ4Ｃｌ  ０．７ｇ／ｌ；（ＮＨ4）2ＳＯ4  ５．０ｇ／ｌ；カラギーナン２．５ｇ／ｌを含んだ。当該培地のｐＨは７．０であり、温度は２０℃だった。この研究の欠点は、多くの構成成分、並びに高い基質濃度が培地中で必要とされ、これらの構成成分全てにおけるｐＨ７．０の維持が困難なことである。そのうえ、発酵工程は、２０℃で実施され、かかる低温を維持するための特別な装置が必要である。
【００１２】
Ａｒａｋｉｔらは、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  κ−ｃａｒｒａｇｅｅｎａｓｅ  ｆｏｒｍ  ａ  ｍａｒｉｎｅ  ｂａｃｔｅｔｒｉｕｍ  Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．ＣＡ−，１００４，Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６５（６）：（１９９９）ｐ．ｐ．９３７−９４２」にて、海洋細菌Ｖｉｂｒｏ種から誘導酵素であるκ−カラギナーゼを精製し、その分子量は３５ＫＤａであり、ｐＨ８．０かつ温度４０℃で最大酵素活性であることを特徴づけた。この研究のために使用された培地は、ペプトン  ５．０ｇ／ｌ；酵母エキス１．０ｇ／ｌ；ＮａＣｌ  ３０ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ4  ０．５ｇ／ｌ；Ｋ2ＨＰＯ4  ２．０ｇ／ｌ；ＫＨ2ＰＯ4  ０．４ｇ／ｌ；カラギーナン  １５ｇ／ｌを含んだ。得られた粗カラギナーゼの活性は、１ｍｇタンパク質あたり０．９４９ガラクトースユニットだった。この研究の欠点は、製造培地が７つの構成成分を含み、１ｍｇタンパク質あたりたった０．９４９ガラクトースユニットの活性を有するカラギナーゼを産生したことである。かかる低い活性は、この方法を必ず非経済的で実現不可能なものとさせるだろう。
【００１３】
Ｏｋｉｔａ  Ｙｕｊｉらによる日本特許番号ＪＰ２００１１３６９６１（２００１）は、「細菌のカラギナーゼ生産能を制御する方法」を記載している。ここで、カラギナーゼ産生能のない細菌の存在下でカラギナーゼ産生細菌を培養すること又はその培養製造物により、カラギナーゼ産生細菌のカラギナーゼ生産能を制御する方法が記載されている。この発明の欠点は、カラギナーゼ非産生のものの製造と共にカラギナーゼ産生のものを共培養することによってのみカラギナーゼの製造が制御されることである。
【００１４】
Ａｒａｋｉ  Ｔｏｓｈｉｙｏｓｈｉによる日本特許番号ＪＰ２０００１１６３７６（２０００）「Ｎｅｗ  κ−ｃａｒｒａｇｅｅｎａｓｅ，ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｒａｇｅｅｎａｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｕｓｅ」において、κ−カラギナーゼがκ−カラギーナンに対して分解活性を有することが開示されている。この酵素は、κ−カラギーナンをネオカラビオース、及びネオカラテトラオースに分解し、最適なｐＨは８．０である。この発明の欠点は、酵素がアルカリ性のみの最適ｐＨを有するので、酸性条件下では使用され得ないことである。
【００１５】
Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｇらによる日本特許番号ＪＰ１００６６５６（１９９８）「κ−カラギナーゼの製造」は、シュードモナスカラゲーノボラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃａｒｒａｇｅｅｎｏｖｏｒａ）、アルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）又はサイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈｏｇａ）によるκ−カラギナーゼの生産性を開示し、ここでその製造は、窒素含有塩基（アンモニウム水）が前記細菌により吸収されることにより培地のｐＨを制御することによって実質的に改良されている。このことにより、κ−カラギナーゼ製造は、≧２０ガラクトースユニット／ｍｌから４０〜６０ガラクトースユニット／ｍｌに改良され得る。この発明の欠点は、商業的に実行可能ではないｐＨに制御した後たった３回の精製で得ることである。
【００１６】
Ｈａｉｇｉｎ  Ｍらに与えられたカナダ特許番号ＣＮ１５４４６２３（２００４）「Ｃａｒｒａｇｅｅｎｉｎ  ｃａｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｔ’ｓ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」において、κ−カラギーナンを分解しオリゴカラギーナンを産生でき、かつ３０ＫＤａの分子量を有するκ−カラギーナンのベータ−１，４インジカン結合を分解できる酵素を入手した。サイトファーガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓp．）を２８〜３５℃で培養し、遠心し、粗酵素を得て、４０〜８０％の硫酸アンモニウムを使用することにより濃縮した。この方法を化学的方法と比較したところ、簡単な調整工程、高い製品収量、及び安定した質を有し、オリゴサッカリドなどの活性研究や開発などを確かなものとした。この発明の欠点は、十分に濃縮／精製されていない酵素産生物を産生する酵素を濃縮するために塩析法のみ使用したことである。
【発明の開示】
【００１７】
本発明の目的
本発明の主目的は、κ−カラギナーゼの製造方法を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、耐塩性海洋グラム陰性菌を使用することによるκ−カラギナーゼの製造方法を提供することである。
【００１９】
本発明のさらに他の目的は、最適濃度、新規培地組成中で培養する耐塩性海洋グラム陰性菌を使用することによる改良κ−カラギナーゼを提供することである。
【００２０】
本発明のさらに他の目的は、複雑さのより軽減された技術を伴う単純な方法でカラギナーゼ製造を最大化することである。
【００２１】
本発明のさらに他の目的は、優れたκ−カラギーナン加水分解活性を有するκ−カラギナーゼを提供することである。
【００２２】
本発明のさらに他の目的は、アルカリ性及び酸性条件で活性を有するκ−カラギナーゼを提供することである。
【００２３】
本発明のさらに他の目的は、高温安定性を有するκ−カラギナーゼを得ることである。
【００２４】
本発明のさらに他の目的は、高い基質特異性を有するκ−カラギナーゼを得ることである。
【００２５】
本発明のさらに他の目的は、長期保存安定性を有するκ−カラギナーゼを得ることである。
【００２６】
本発明のさらに他の目的は、カッパフィカスアルベレッチー（Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ  ａｌｖａｒｅｚｉｉ）のプロトプラストを産生する能力を有するκ−カラギナーゼを得ることである。
【００２７】
本発明の概要
本発明は、高活性κ−カラギナーゼの製造のために有用な新規耐塩性海洋細菌であるシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種（受託番号ＭＴＣＣ５２６１）に関する。単純な方法におけるκ−カラギナーゼの製造を最大化するために、新規培地組成を、統計的最適化法を使用し、最小の構成成分及び最適濃度であるように定義し、実験の数を減少させ、時間や化学品を節約し、酵素製造に影響を与える全ての因子の複合効果を観察することにより結果物のより高い信頼性を向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明の詳細説明
本発明は、κ−カラギナーゼの製造方法であって、以下のステップ：
（ｉ）１５〜５０℃で、１６〜７２時間、カラギーナン、酵母エキス、塩化ナトリウム、Ｋ2ＨＰＯ4、及びＫＨ2ＰＯ4を０．１：１．０：５０：１：０．５〜３．０：１．０：１５．０：０．５：．０５の各比で含む液体培地内で、受諾番号ＭＴＣＣ５２６１を有する耐塩性海洋細菌シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を培養し、培養物を得る；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）から得られた培養物を、５０００〜８０００ｒｐｍで、２０〜４０分間遠心し、上清として細胞のない抽出物を得る；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）から得られた上清を、３〜１５℃の温度で、硫酸アンモニウムで処理することにより、粗酵素を精製し、その混合物を１２〜３６時間熟成させ、その後、５０００〜８０００ｒｐｍで３〜１５分間遠心し、κ−カラギナーゼを含むペレットを得る；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）から得られたペレットを、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー溶液中に懸濁する；そして、
（ｖ）付着した硫酸アンモニウムを除去するためにステップ（ｉｖ）で得られた懸濁液を透析し、その後、ゲルろ過により所望の精製κ−カラギナーゼを得る、
を含む、上記方法を提供する。
【００２９】
本発明の態様において、上記細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種は、以下の特性：ａ）好塩性；ｂ）グラム陰性、グラム変動性を示す；ｃ）運動性好気性桿菌；ｄ）藻類多糖、すなわちκ−カラギーナンを分解する、を有する。
【００３０】
本発明の他の態様において、上記κ−カラギナーゼは、セファロースＣＬ−４Ｂに関するゲルろ過技術を使用して精製される。
【００３１】
さらに本発明の他の態様において、前記κ−カラギナーゼの比活性度は、タンパク質１ｍｇあたり１０〜２００ガラクトースユニットである。
【００３２】
さらに本発明の他の態様において、前記κ−カラギナーゼは、１２８ＫＤａの分子量を有する。
【００３３】
さらに本発明の他の態様において、前記κ−カラギナーゼは、優れたκ−カラギーナン加水分解活性を有する。
【００３４】
さらに本発明の他の態様において、前記κ−カラギナーゼは、アルカリ性及び酸性条件において活性を有する。
【００３５】
さらに本発明の他の態様において、前記κ−カラギナーゼは、高温安定性を有する。
【００３６】
さらに本発明の他の態様において、前記κ−カラギナーゼは、基質特異性を有する。
【００３７】
さらに本発明の他の態様において、前記κ−カラギナーゼは、長期保存安定性を有する。
【００３８】
さらに本発明の他の態様において、前記κ−カラギナーゼは、カッパフィカスアルベレッチー（Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ  ａｌｖａｒｅｚｉｉ）のプロトプラストを産生する能力を有する。
【００３９】
本発明は、改良κ−カラギナーゼの製造のための過程、及びそれらの製造方法を提供し、ここでそれらは海水、及び紅藻類や腐食されたカラギーナン原藻（ｃａｒｒａｇｅｅｎｏｐｈｙｔｅ）付近の堆積物からの海洋細菌培養物の単離を含む。これらの細菌を、唯一の炭素源としてカラギーナンを含む固体培養培地上で成長させた。上記固体培地上にピットや穴を作成する細菌のコロニーを、さらに精製し、最大のくぼみを産生する細菌をさらなる試験のために選択した。
【００４０】
次いで、その精製された細菌を、培養のために、好ましくは、（ｉ）カラギーナン  ０．００５〜６．０（ｇ／１００ｍｌ）、（ｉｉ）酵母エキス  ０．００５１〜３．０（ｇ／１００ｍｌ）、（ｉｉｉ）塩化ナトリウム  ０．１〜２０．０（ｇ／１００ｍｌ）、（ｉｖ）Ｋ2ＨＰＯ4  ０．００１〜１．５（ｇ／１００ｍｌ）、（ｖ）ＫＨ2ＰＯ4  ０．００１〜０．１（ｇ／１００ｍｌ）の濃度範囲における構成成分を含む液体培地内でインキュベートした。植菌された液体培地を、κ−カラギナーゼ製造のために、１２〜９０時間、１０〜６０℃で、ロータリーシェーカー上でインキュベートした。培養された懸濁培養物を、次いで、遠心（好ましくは４０００〜１００００ｒｐｍで２０〜７０分間）し、上清として粗細胞外κ−カラギナーゼを得た（細胞フリーの抽出物）。
【００４１】
その細胞外粗酵素（上清）を、次いで、３〜１０℃の温度で、好ましくは１０〜１００％（ｗｔ／ｖｏｌ）の濃度の硫酸アンモニウムを使用する塩析法によりある程度精製し、１２〜３６時間、混合物をエイジングし、望まないタンパク質不純物の大半を除去した。この硫酸アンモニウム沈殿タンパク質を含む懸濁液を、好ましくは、３〜１０℃、４０００〜１００００ｒｐｍで遠心し、主にκ−カラギナーゼを含むペレットを得て、他のタンパク質不純物を含む上清を捨てた。遠心により得たペレット（主にκ−カラギナーゼを含む）を、好ましくは５〜４０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液の最小量に再懸濁した。余分な硫酸アンモニウム、及びタンパク質を含む他の低分子量の不純物の除去のため、ある程度精製されたκ−カラギナーゼ溶液を、１２，０００分子量カットオフを有する透析バッグを使用して、０．０２ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液に透析した。
【００４２】
硫酸アンモニウム沈殿κ−カラギーナンのさらなる精製のため、セファロースＣＬ−４Ｂのゲル濾過技術を使用し、ＴｒｉｓＨｃｌ緩衝液を（好ましくは５〜５０ｍＭの濃度範囲で）使用して溶出することによりκ−カラギナーゼの豊富な画分を回収した。精製されたκ−カラギナーゼ画分の分子量を、繰り返しのゲル濾過法により測定し、その溶出体積（Ｖｅ）を記録し、Ｖｅ／Ｖｏ（Ｖｏはそのカラムの空隙用量である）を計算し、そして、それを標準分子量タンパク質マーカーの、分子量対Ｖｅ／Ｖｏのｌｏｇのプロットと比較した。
【００４３】
この酵素の潜在的使用は以下の通りである。
多糖の物理学的特性を改良するため、オリゴ糖への転換が最も良い選択となり得る。カラギーナンの酵素分解は、高い生物活性を有する新規生成物を産生させる。
海洋微生物により製造される酵素は、赤青粉（ｒｅｄ  ａｌｇａｌ）汚染を効果的に制御し得るだろう。それ故、それは、複合多糖層に作用することにより、水中の海洋面又は海底管の生物付着を防ぐ。
これらの酵素は、紅藻類細胞壁の構造、及び会合を研究するための重要な道具である（Ｇａｌｌ，Ｙ．Ｌ．，Ｊ．Ｐ．Ｂｒａｕｄ  ａｎｄ  Ｂ．Ｋｌｏａｒｅｇ．１９９０．Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｏｎｄｒｕｓ  ｃｒｉｓｐｕｓ  ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｅｓ（Ｇｉｇａｒｔｉｎａｌｅｓ，Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．８：５８２−５８５）。
これらの酵素は、昆布消化に有用である（Ｓａｒｗａｒ，Ｇ．，H．Ｏｄａ，Ｔ．Ｓａｋａｔａ，ａｎｄ  Ｄ．Ｋａｋｉｍｏｔｏ．１９８５．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｓｅａ  ｗａｔｅｒ  ｓａｌｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｒａｇｅｅｎａｓｅ  ｂｙ  ａ  ｍａｒｉｎｅ  Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２９（５）：４０５−４１１）。この消化された産生物は、次々に、細菌の成長のための炭素源として使用され得る。それらは、藻からの精密化学製品の抽出のためにも使用される。
【００４４】
多くの紅藻は、高レベルのタンパク質（１０〜３０％乾燥重量）を有する（Ｍｏｒｇａｎ，Ｃ，Ｊ．Ｌ．Ｃ．Ｗｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓｉｍｐｓｏｎ．１９８０．Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｄ  ａｌｇａ  Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔｅ（ｄｕｌｓｅ）．Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｂｏｔａｎｙ．３４：２７−５０；Ｍａｂｅａｕ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｊ．Ｆｌｅｕｒｅｎｃｅ．１９９３．Ｓｅａｗｅｅｄ  ｉｎ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｆｏｏｄｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．４：１０３−１０７)。これらのタンパク質は、カラギナーゼのような加水分解酵素により抽出され得る（Ｆｌｅｕｒｅｎｃｅ，Ｊ．，Ｌ．Ｍａｓｓｉａｎｉ，Ｏ．Ｇｕｙａｄｅｒ，ａｎｄ  Ｓ．Ｍａｂｅａｕ．１９９５．Ｕｓｅ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｃｈｏｎｄｒｕｓ  ｃｒｉｓｐｕｓ，Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ  ａｎｄ  Ｐａｌｍａｒｉａ  ｐａｌｍａｔｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ．７：３９３−３９７）。例えば、加水分解酵素による細胞壁多糖類の分解は、エクステンシン（高等植物の細胞壁多糖類に結合するタンパク質）の単離のために使用される（Ｌａｍｐｏｒｔ，Ｄ．Ｔ．Ａ．１９６９．Ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｄｙｐｒｏｌｉｎｅ  ｒｉｃｈ  ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｅｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  ｅｎｚｙｍｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３：１１５５−１１６３）。
【００４５】
それらは、プロトプラストの単離のために使用され得、改良藻類株の製造のための遺伝子工学実験のために使用され得る（Ｃｈｅｎ，Ｌ．Ｃ．M．，J．Ｓ．Ｃｒａｉｇｉｅ，ａｎｄ  Ｚ．Ｋ．Ｘｉｅ．１９９４．Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｌｉｎｅａｒｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ａｇａｒａｓｅ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ．６：３５−３９）。
それらは、藻類コロイドの存在下で生じる重大な分離問題を防ぐために分子生物学において使用される。それらは、薬学及び免疫学のために定義済みの藻類コロイドオリゴ糖の製造のためにも使用される（Ｄｙｒｓｅｔ，Ｎ．，Ｋ．Ｑ．Ｌｙｓｔａｄ，ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｌｅｖｉｎｅ．１９９７．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  κ−ｃａｒａｇｅｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃａｒｒａｇｅｅｎｏｖｏｒａ．Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０（６）：４１８−４２３）。
カラギナーゼは、自己会合硫酸化多糖類を分解する加水分解酵素の構造−機能相関を調査するための機会を提供する（Ｍｉｃｈｅｌ，Ｇ．，Ｌ．Ｃｈａｎｔｌａｔ，Ｅ．Ｆａｎｃｈｏｎ，Ｂ．Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．Ｋｌｏａｒｅｇ，ａｎｄ  Ｏ．Ｄｉｄｗｅｂｅｒｇ．２００１．Ｔｈｅ  ι−ｃａｒａｇｅｅｎａｓｅ  ｏｆ  Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｆｏｒｔｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７６（４３）：４０２０２−４０２０９）。
【００４６】
本発明において、κ−カラギーナンを低分子量物質に分解する潜在性を有する、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）類として識別される、常在新規耐塩性海洋細菌を提供する。本発明は、以下の物理化学的特性を有する、κ−カラギナーゼの製造を最大化するために使用される新規培地組成にも関する：（１）最適基質濃度：０．０２％；（２）最適温度：４０℃；（３）熱安定性：２０〜５０℃；（４）最適ｐＨ：５．６及び７．７；（５）基質特異性：κ−カラギーナンに対する高特異性、λ及びιカラギーナン、並びにＬＭＰアガロースを加水分解しない；（６）保存安定性：−２０℃で保存されたとき１５日間；凍結融解に敏感（７）溶解度：水に溶解する；（８）分子量：分子量をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳＰＡＧＥ）により測定したところ、分子量は１２８ＫＤａである。かかる高分子量を有するκ−カラギナーゼに関する有用な報告は入手できない。
【００４７】
本発明に関して、さらに、κ−カラギナーゼを使用するカッパフィカスアルベレッチー（Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ  ａｌｖａｒｅｚｉｉ）のプロトプラストを製造するための方法を提供する。
【００４８】
本発明において、初めて、インドの西海岸から、κ−カラギナーゼを製造する潜在性を有する新規耐塩性海洋細菌シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）類を単離した。κ−カラギナーゼ製造を最大化するために、統計的最適化法を使用して、最小の構成要素、及びそれらの最適濃度を有するように新規培地組成を定義した。下記の統計的最適化により、粗κ−カラギナーゼの比活性度を３２倍まで増大することが可能であった。
【００４９】
本発明における進歩性は、（ｉ）本発明の方法が酵素の精製のための多段階ステップの必要性を軽減すること；（ｉｉ）本発明の４〜１０のｐＨ範囲がκ−カラギナーゼの高い比活性度を達成するのにふさわしいこと；（ｉｉｉ）培地が複数成分である必要性がないこと；（ｉｖ）本発明の方法において、酵素誘導に必須な培地中における基質の最小濃度を利用すること；（ｖ）本発明の方法において、κ−カラギナーゼの最大回収のために低温（２０℃）の必要性がないこと；（ｖｉ）２５℃〜５０℃の広範囲な温度で最大のκ−カラギーナンが回収され得ること；（ｖｉｉ）本発明における培地中の構成成分において、κ−カラギナーゼ製造を制御するために、カラギナーゼを製造しないものとカラギーナンを製造するものとの共培養の必要性がないことである。
【００５０】
以下の実施例は、本発明の例証を目的として記載され、本発明の範囲を制限すると解釈すべきではない。
【実施例】
【００５１】
実施例１
単離されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を、ｐＨ６．３で、カラギーナン０．００３（ｇ／１００ｍｌ）、酵母エキス０．０１（ｇ／１００ｍｌ）、塩化ナトリウム０．３（ｇ／１００ｍｌ）、リン酸水素二カリウム０．０４（ｇ／１００ｍｌ）、及びリン酸二水素カリウム０．００３（ｇ／１００ｍｌ）を含む１００ｍｌの液体培地を含む２５０ｍｌ三角フラスコ中に植菌した。これを、ロータリーシェーカー上で、１８０ｒｐｍ（ｒｅｖ／ｍｉｎ）、２８時間、３０℃でインキュベートした。その懸濁液を８０００ｒｐｍで１５分間遠心後、細胞フリーの抽出物として、粗カラギナーゼを得た。この粗カラギナーゼを、４℃で、５０％硫酸アンモニウム（ｗｔ／ｖｏｌ）による処理によってある程度精製し、そしてその混合物を２４時間エイジングした。インキュベーション後、その溶液を、４℃、８０００ｒｐｍで、１５分間、遠心し、沈殿したタンパク質のペレットを得た。得られたペレットを、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に再懸濁し、同じ緩衝液に対して透析した。ある程度精製されたこの酵素を、ゲルろ過技術を使用してさらに精製し、１ｍｇタンパク質あたり９．２ガラクトースユニットの比活性度を産生した。
【００５２】
実施例２
単離されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を、ｐＨ８．４で、カラギーナン０．０３（ｇ／１００ｍｌ）、酵母エキス０．０１（ｇ／１００ｍｌ）、塩化ナトリウム０．３（ｇ／１００ｍｌ）、リン酸水素二カリウム０．００４（ｇ／１００ｍｌ）、及びリン酸二水素カリウム０．０３（ｇ／１００ｍｌ）を含む１００ｍｌの液体培地を含む２５０ｍｌ三角フラスコ中に植菌した。これを、ロータリーシェーカー上で、１８０ｒｐｍ（ｒｅｖ／ｍｉｎ）、２８時間、３０℃でインキュベートした。その懸濁液を８０００ｒｐｍで１５分間遠心後、細胞フリーの抽出物として、粗カラギナーゼを得た。この粗カラギナーゼを、４℃で、４０％硫酸アンモニウム（ｗｔ／ｖｏｌ）による処理によってある程度精製し、そしてその混合物を２４時間エイジングした。インキュベーション後、その溶液を、４℃、８０００ｒｐｍで、１５分間、遠心し、沈殿したタンパク質のペレットを得た。得られたペレットを、１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に再懸濁し、同じ緩衝液に対して透析した。ある程度精製されたこの酵素を、ゲルろ過技術を使用してさらに精製し、１ｍｇタンパク質あたり８．４ガラクトースユニットの比活性度を産生した。
【００５３】
実施例３
単離されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を、ｐＨ５．１で、カラギーナン０．０３（ｇ／１００ｍｌ）、酵母エキス０．１（ｇ／１００ｍｌ）、塩化ナトリウム０．３（ｇ／１００ｍｌ）、リン酸水素二カリウム０．００４（ｇ／１００ｍｌ）、及びリン酸二水素カリウム０．００３（ｇ／１００ｍｌ）を含む１００ｍｌの液体培地を含む２５０ｍｌ三角フラスコ中に植菌した。これを、ロータリーシェーカー上で、１８０ｒｐｍ（ｒｅｖ／ｍｉｎ）、２８時間、３５℃でインキュベートした。その懸濁液を８０００ｒｐｍで１５分間遠心後、細胞フリーの抽出物として、粗カラギナーゼを得た。この粗カラギナーゼを、４℃で、５５％硫酸アンモニウム（ｗｔ／ｖｏｌ）による処理によってある程度精製し、そしてその混合物を２４時間エイジングした。インキュベーション後、その溶液を、４℃、８０００ｒｐｍで、１５分間、遠心し、沈殿したタンパク質のペレットを得た。得られたペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に再懸濁し、同じ緩衝液に対して透析した。ある程度精製されたこの酵素を、ゲルろ過技術を使用してさらに精製し、１ｍｇタンパク質あたり２４．２ガラクトースユニットの比活性度を産生した。
【００５４】
実施例４
単離されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を、ｐＨ８．０で、カラギーナン０．０３（ｇ／１００ｍｌ）、酵母エキス０．１（ｇ／１００ｍｌ）、塩化ナトリウム３．０（ｇ／１００ｍｌ）、リン酸水素二カリウム０．００４（ｇ／１００ｍｌ）、及びリン酸二水素カリウム０．００３（ｇ／１００ｍｌ）を含む１００ｍｌの液体培地を含む２５０ｍｌ三角フラスコ中に植菌した。これを、ロータリーシェーカー上で、１８０ｒｐｍ（ｒｅｖ／ｍｉｎ）、２８時間、４０℃でインキュベートした。その懸濁液を８０００ｒｐｍで１５分間遠心後、細胞フリーの抽出物として、粗カラギナーゼを得た。この粗カラギナーゼを、４℃で、７０％硫酸アンモニウム（ｗｔ／ｖｏｌ）による処理によってある程度精製し、そしてその混合物を２４時間エイジングした。インキュベーション後、その溶液を、４℃、８０００ｒｐｍで、１５分間、遠心し、沈殿したタンパク質のペレットを得た。得られたペレットを、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に再懸濁し、同じ緩衝液に対して透析した。ある程度精製されたこの酵素を、ゲルろ過技術を使用してさらに精製し、１ｍｇタンパク質あたり１０．５ガラクトースユニットの比活性度を産生した。
【００５５】
実施例５
単離されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を、ｐＨ８．４で、カラギーナン０．００３（ｇ／１００ｍｌ）、酵母エキス０．１（ｇ／１００ｍｌ）、塩化ナトリウム３．０（ｇ／１００ｍｌ）、リン酸水素二カリウム０．０４（ｇ／１００ｍｌ）、及びリン酸二水素カリウム０．００３（ｇ／１００ｍｌ）を含む１００ｍｌの液体培地を含む２５０ｍｌ三角フラスコ中に植菌した。これを、ロータリーシェーカー上で、１８０ｒｐｍ（ｒｅｖ／ｍｉｎ）、２８時間、２５℃でインキュベートした。その懸濁液を８０００ｒｐｍで１５分間遠心後、細胞フリーの抽出物として、粗カラギナーゼを得た。この粗カラギナーゼを、４℃で、３０％硫酸アンモニウム（ｗｔ／ｖｏｌ）による処理によってある程度精製し、そしてその混合物を２４時間エイジングした。インキュベーション後、その溶液を、４℃、８０００ｒｐｍで、１５分間、遠心し、沈殿したタンパク質のペレットを得た。得られたペレットを、１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に再懸濁し、同じ緩衝液に対して透析した。ある程度精製されたこの酵素を、ゲルろ過技術を使用してさらに精製し、１ｍｇタンパク質あたり１６．２ガラクトースユニットの比活性度を産生した。
【００５６】
実施例６
単離されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を、ｐＨ７．１で、カラギーナン０．０３（ｇ／１００ｍｌ）、酵母エキス０．０１（ｇ／１００ｍｌ）、塩化ナトリウム３．０（ｇ／１００ｍｌ）、リン酸水素二カリウム０．０４（ｇ／１００ｍｌ）、及びリン酸二水素カリウム０．０３（ｇ／１００ｍｌ）を含む１００ｍｌの液体培地を含む２５０ｍｌ三角フラスコ中に植菌した。これを、ロータリーシェーカー上で、１８０ｒｐｍ（ｒｅｖ／ｍｉｎ）、２８時間、２５℃でインキュベートした。その懸濁液を８０００ｒｐｍで１５分間遠心後、細胞フリーの抽出物として、粗カラギナーゼを得た。この粗カラギナーゼを、４℃で、４０％硫酸アンモニウム（ｗｔ／ｖｏｌ）による処理によってある程度精製し、そしてその混合物を２４時間エイジングした。インキュベーション後、その溶液を、４℃、８０００ｒｐｍで、１５分間、遠心し、沈殿したタンパク質のペレットを得た。得られたペレットを、１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に再懸濁し、同じ緩衝液に対して透析した。ある程度精製されたこの酵素を、ゲルろ過技術を使用してさらに精製し、１ｍｇタンパク質あたり１４．８ガラクトースユニットの比活性度を産生した。
【００５７】
実施例７
単離されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を、ｐＨ９．０で、カラギーナン０．０３（ｇ／１００ｍｌ）、酵母エキス０．１（ｇ／１００ｍｌ）、塩化ナトリウム０．３（ｇ／１００ｍｌ）、リン酸水素二カリウム０．０４（ｇ／１００ｍｌ）、及びリン酸二水素カリウム０．０３（ｇ／１００ｍｌ）を含む１００ｍｌの液体培地を含む２５０ｍｌ三角フラスコ中に植菌した。これを、ロータリーシェーカー上で、１８０ｒｐｍ（ｒｅｖ／ｍｉｎ）、２８時間、４０℃でインキュベートした。その懸濁液を８０００ｒｐｍで１５分間遠心後、細胞フリーの抽出物として、粗カラギナーゼを得た。この粗カラギナーゼを、４℃で、７５％硫酸アンモニウム（ｗｔ／ｖｏｌ）による処理によってある程度精製し、そしてその混合物を２４時間エイジングした。インキュベーション後、その溶液を、４℃、８０００ｒｐｍで、１５分間、遠心し、沈殿したタンパク質のペレットを得た。得られたペレットを、３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に再懸濁し、同じ緩衝液に対して透析した。ある程度精製されたこの酵素を、ゲルろ過技術を使用してさらに精製し、１ｍｇタンパク質あたり８．９ガラクトースユニットの比活性度を産生した。
【００５８】
実施例８
単離されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を、ｐＨ７．１で、カラギーナン０．００３（ｇ／１００ｍｌ）、酵母エキス０．１（ｇ／１００ｍｌ）、塩化ナトリウム３．０（ｇ／１００ｍｌ）、リン酸水素二カリウム０．００４（ｇ／１００ｍｌ）、及びリン酸二水素カリウム０．０３（ｇ／１００ｍｌ）を含む１００ｍｌの液体培地を含む２５０ｍｌ三角フラスコ中に植菌した。これを、ロータリーシェーカー上で、１８０ｒｐｍ（ｒｅｖ／ｍｉｎ）、２８時間、３０℃でインキュベートした。その懸濁液を８０００ｒｐｍで１５分間遠心後、細胞フリーの抽出物として、粗カラギナーゼを得た。この粗カラギナーゼを、４℃で、６５％硫酸アンモニウム（ｗｔ／ｖｏｌ）による処理によってある程度精製し、そしてその混合物を２４時間エイジングした。インキュベーション後、その溶液を、４℃、８０００ｒｐｍで、１５分間、遠心し、沈殿したタンパク質のペレットを得た。得られたペレットを、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に再懸濁し、同じ緩衝液に対して透析した。ある程度精製されたこの酵素を、ゲルろ過技術を使用してさらに精製し、１ｍｇタンパク質あたり１１．４ガラクトースユニットの比活性度を産生した。
【００５９】
実施例９
単離されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を、ｐＨ６．３で、カラギーナン０．０３（ｇ／１００ｍｌ）、酵母エキス０．０１（ｇ／１００ｍｌ）、塩化ナトリウム３．０（ｇ／１００ｍｌ）、リン酸水素二カリウム０．０４（ｇ／１００ｍｌ）、及びリン酸二水素カリウム０．００３（ｇ／１００ｍｌ）を含む１００ｍｌの液体培地を含む２５０ｍｌ三角フラスコ中に植菌した。これを、ロータリーシェーカー上で、１８０ｒｐｍ（ｒｅｖ／ｍｉｎ）、２８時間、３０℃でインキュベートした。その懸濁液を８０００ｒｐｍで１５分間遠心後、細胞フリーの抽出物として、粗カラギナーゼを得た。この粗カラギナーゼを、４℃で、５５％硫酸アンモニウム（ｗｔ／ｖｏｌ）による処理によってある程度精製し、そしてその混合物を２４時間エイジングした。インキュベーション後、その溶液を、４℃、８０００ｒｐｍで、１５分間、遠心し、沈殿したタンパク質のペレットを得た。得られたペレットを、１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に再懸濁し、同じ緩衝液に対して透析した。ある程度精製されたこの酵素を、ゲルろ過技術を使用してさらに精製し、１ｍｇタンパク質あたり１１．８ガラクトースユニットの比活性度を産生した。
【００６０】
実施例１０
単離されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を、ｐＨ５．１で、カラギーナン０．００３（ｇ／１００ｍｌ）、酵母エキス０．１（ｇ／１００ｍｌ）、塩化ナトリウム０．３（ｇ／１００ｍｌ）、リン酸水素二カリウム０．０４（ｇ／１００ｍｌ）、及びリン酸二水素カリウム０．０３（ｇ／１００ｍｌ）を含む１００ｍｌの液体培地を含む２５０ｍｌ三角フラスコ中に植菌した。これを、ロータリーシェーカー上で、１８０ｒｐｍ（ｒｅｖ／ｍｉｎ）、２８時間、３５℃でインキュベートした。その懸濁液を８０００ｒｐｍで１５分間遠心後、細胞フリーの抽出物として、粗カラギナーゼを得た。この粗カラギナーゼを、４℃で、３５％硫酸アンモニウム（ｗｔ／ｖｏｌ）による処理によってある程度精製し、そしてその混合物を２４時間エイジングした。インキュベーション後、その溶液を、４℃、８０００ｒｐｍで、１５分間、遠心し、沈殿したタンパク質のペレットを得た。得られたペレットを、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に再懸濁し、同じ緩衝液に対して透析した。ある程度精製されたこの酵素を、ゲルろ過技術を使用してさらに精製し、１ｍｇタンパク質あたり１７．３ガラクトースユニットの比活性度を産生した。
【００６１】
実施例１１
単離されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を、ｐＨ４．５で、カラギーナン０．００３（ｇ／１００ｍｌ）、酵母エキス０．０１（ｇ／１００ｍｌ）、塩化ナトリウム３．０（ｇ／１００ｍｌ）、リン酸水素二カリウム０．００４（ｇ／１００ｍｌ）、及びリン酸二水素カリウム０．０３（ｇ／１００ｍｌ）を含む１００ｍｌの液体培地を含む２５０ｍｌ三角フラスコ中に植菌した。これを、ロータリーシェーカー上で、１８０ｒｐｍ（ｒｅｖ／ｍｉｎ）、２８時間、４０℃でインキュベートした。その懸濁液を８０００ｒｐｍで１５分間遠心後、細胞フリーの抽出物として、粗カラギナーゼを得た。この粗カラギナーゼを、４℃で、７０％硫酸アンモニウム（ｗｔ／ｖｏｌ）による処理によってある程度精製し、そしてその混合物を２４時間エイジングした。インキュベーション後、その溶液を、４℃、８０００ｒｐｍで、１５分間、遠心し、沈殿したタンパク質のペレットを得た。得られたペレットを、３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に再懸濁し、同じ緩衝液に対して透析した。ある程度精製されたこの酵素を、ゲルろ過技術を使用してさらに精製し、１ｍｇタンパク質あたり５．９ガラクトースユニットの比活性度を産生した。
【００６２】
実施例１２
単離されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を、ｐＨ５．１で、カラギーナン０．００３（ｇ／１００ｍｌ）、酵母エキス０．０１（ｇ／１００ｍｌ）、塩化ナトリウム０．３（ｇ／１００ｍｌ）、リン酸水素二カリウム０．００４（ｇ／１００ｍｌ）、及びリン酸二水素カリウム０．００３（ｇ／１００ｍｌ）を含む１００ｍｌの液体培地を含む２５０ｍｌ三角フラスコ中に植菌した。これを、ロータリーシェーカー上で、１８０ｒｐｍ（ｒｅｖ／ｍｉｎ）、２８時間、３５℃でインキュベートした。その懸濁液を８０００ｒｐｍで１５分間遠心後、細胞フリーの抽出物として、粗カラギナーゼを得た。この粗カラギナーゼを、４℃で、４０％硫酸アンモニウム（ｗｔ／ｖｏｌ）による処理によってある程度精製し、そしてその混合物を２４時間エイジングした。インキュベーション後、その溶液を、４℃、８０００ｒｐｍで、１５分間、遠心し、沈殿したタンパク質のペレットを得た。得られたペレットを、１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に再懸濁し、同じ緩衝液に対して透析した。ある程度精製されたこの酵素を、ゲルろ過技術を使用してさらに精製し、１ｍｇタンパク質あたり１７．４ガラクトースユニットの比活性度を産生した。
【００６３】
実施例１３
単離されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を、ｐＨ５．６で、カラギーナン０．３（ｇ／１００ｍｌ）、酵母エキス０．０４（ｇ／１００ｍｌ）、塩化ナトリウム３．０（ｇ／１００ｍｌ）、リン酸水素二カリウム０．０３（ｇ／１００ｍｌ）、及びリン酸二水素カリウム０．０１（ｇ／１００ｍｌ）を含む１００ｍｌの液体培地を含む２５０ｍｌ三角フラスコ中に植菌した。これを、ロータリーシェーカー上で、１８０ｒｐｍ（ｒｅｖ／ｍｉｎ）、２８時間、３５℃でインキュベートした。その懸濁液を８０００ｒｐｍで１５分間遠心後、細胞フリーの抽出物として、粗カラギナーゼを得た。この粗カラギナーゼを、４℃で、６０％硫酸アンモニウム（ｗｔ／ｖｏｌ）による処理によってある程度精製し、そしてその混合物を２４時間エイジングした。インキュベーション後、その溶液を、４℃、８０００ｒｐｍで、１５分間、遠心し、沈殿したタンパク質のペレットを得た。得られたペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に再懸濁し、同じ緩衝液に対して透析した。ある程度精製されたこの酵素を、ゲルろ過技術を使用してさらに精製し、１ｍｇタンパク質あたり１８８．８ガラクトースユニットの比活性度を産生した。
【００６４】
利点
本発明の主な利点は下記の通りである。
１．単純な方法においてκカラギナーゼの製造を最大化するために、新規細菌の増殖のための新規培地組成を、統計的最適化方法を使用して最小の構成成分及び最適濃度を有するように定義し、酵素製造に影響を与える全因子への複合効果を観察することによって、試験数を低減し、時間と化学品を節約し、及び結果のより高い信ぴょう性を改善する。
２．本発明は、１ｍｇのタンパク質あたり２００までのガラクトースユニットの高比活性度を有するκ−カラギナーゼを提供する。
３．本発明のκ−カラギナーゼは、１２８ＫＤａの分子量を有する。
４．本発明のκ−カラギナーゼは、優れたκ−カラギーナン加水分解活性を有する。
５．本発明のκ−カラギナーゼは、アルカリ性及び酸性条件で活性を有する。
６．本発明のκ−カラギナーゼは、より高い温度での安定性を有する。
７．本発明のκ−カラギナーゼは、高い基質特異性を有する。
８．本発明のκ−カラギナーゼは、長期保存安定性を有する。
９．本発明のκ−カラギナーゼは、カッパフィカスアルベレッチー（Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ  ａｌｖａｒｅｚｉｉ）のプロトプラストを産生する能力を有する。
【国際調査報告】
2009531055.tif 000002
2009531055.tif 000003
2009531055.tif 000004