(57)【要約】  本発明は、患者の肺粘液分泌のクリアランスを促進する又は容易にする方法に関する。本発明は、患者の肺粘液分泌の水和を容易にする方法にも関する。本発明は、さらに、ヒト又は他の哺乳類における肺障害又は気道機能に関する疾患又は症状を予防又は治療する方法に関する。当該方法は、治療有効量のＰ２Ｙ６受容体アゴニスト化合物を含む医薬組成物を患者に投与することを含む、ここで当該量は、肺上皮組織の管腔表面上のＰ２Ｙ６受容体を活性化するのに効果的な量である。本発明において有用なＰ２Ｙ６受容体アゴニスト化合物は、一般式（Ｉ）のモノヌクレオシド５’−二リン酸、ジヌクレオシド・モノリン酸、ジヌクレオシド二リン酸又はジヌクレオシド三リン酸、あるいは、それらの塩、溶媒和物、水和物を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺粘液分泌のクリアランスを必要とする患者の肺粘液分泌のクリアランスを促進する又は容易にする方法であって、式（Ｉ）：
【化１】
2009500354.tif 000013
［式中、
Ｂは一般式（ＩＶ）又は（Ｖ）のプリン又はピリミジン残基であり；
ｎ＋ｐの合計が０〜２であるように、ｎ及びｐ＝０又は１であり、ただし、Ａ＝Ｍのときｎ＋ｐの合計は１である；
Ｘ１、及びＸ２は、独立して、Ｏ、ＮＨ、ＣＨ２、CＨＦ、ＣＨＣｌ、ＣＦ２又はＣＣｌ２であり；
Ｔ１、Ｖ、及びＷは、独立してＯ又はＳであり；
Ｍ＝Ｈ＋、ＮＨ４＋、Ｎａ＋又は他の医薬として許容される無機又は有機対イオンであり；
Ｙ＝ＯＲ１であり；
Ｚ＝ＯＲ２であり；
Ｇ７
Ａ＝Ｍであり；あるいは、
Ａは、以下の式：
【化２】
2009500354.tif 000014
｛式中、
Ｄ＝Ｏ又はＣＨ２であり；
Ｚ’＝Ｈ又はＯＨであり；
Ｙ’＝Ｈ又はＯＨであり；
Ｂ’は、各々塩基の９−又は１−位置を介してフラノース又は炭素環の１’−位置に結合する一般式（ＩＶ）又は（Ｖ）のようなプリン又はピリミジン残基である。｝
として定義されるヌクレオシド残基であり；
Ｒ１、及びＲ２は、式（ＩＩ）：
【化３】
2009500354.tif 000015
｛式中、
Ｏは、前記フラノースの対応する２’−及び／又は３’−酸素であり；
Ｃは、炭素原子であり；
Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、式（ＩＩ）のように定義される部分がエーテルであるように、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アラルキル、アリール、置換アラルキル又は置換アリールであり；あるいは、
式（ＩＩ）のように定義される部分が非環状アセタール又はケタールであるように、Ｒ５、及びＲ６は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アラルキル、アリール、置換アラルキル又は置換アリールであり、並びにＲ７は、アルコキシ、シクロアルコキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシ、置換アラルキルオキシ又は置換アリールオキシであり；あるいは、
式（ＩＩ）のように定義される部分がエステル又はチオエステルであるように、Ｒ５とＲ６は、Ｃに二重結合する酸素又は硫黄として一緒になり、Ｒ７は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アラルキル、アリール、置換アラルキル又は置換アリールであり；あるいは、
式（ＩＩ）のように定義される部分がカルバメート又はチオカルバメートであるように、Ｒ５とＲ６は、Ｃに二重結合する酸素又は硫黄として一緒になり、Ｒ７は、置換基が、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アラルキル、アリール、置換アラルキル又は置換アリールであるアミノ又は一置換、若しくは二置換アミノであり；あるいは、
式（ＩＩ）のように定義される部分がカルボネート又はチオカルボネートであるように、Ｒ５とＲ６は、Ｃに二重結合する酸素又は硫黄として一緒になり、Ｒ７は、アルコキシ、シクロアルコキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシ、置換アラルキルオキシ又は置換アリールオキシであり；あるいは、
Ｒ７が存在せず、かつＲ５とＲ６は、Ｃに二重結合する酸素又は硫黄として一緒になり、並びにフラノースの２’−及び３’−酸素の両方がＣに直接的に結合し環状カルボネート又はチオカルボネートを形成する。｝のように炭素原子を介して、フラノースの２’−及び／又は３’−ヒドロキシルに直接的に結合する、あるいは式（ＩＩＩ）：
【化４】
2009500354.tif 000016
｛式中、
Ｏ原子は、フラノースの２’−及び３’−酸素であり；当該フラノースの２’−及び３’−酸素は、共通炭素原子（Ｃ）により連結され、環状アセタール、環状ケタール又は環状オルトエステルを形成し；
環状アセタール、及びケタールとして、Ｒ８、及びＲ９は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アラルキル、アリール、置換アラルキル、置換アリールであり、あるいは、一緒に結合し、３〜８原子、好ましくは３〜６原子からなる単素環式又は複素環式環を形成し得；
環状オルトエステルとして、Ｒ８は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アラルキル、アリール、置換アラルキル又は置換アリールであり、Ｒ９は、アルキルオキシ、シクロアルキルオキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシ、置換アラルキルオキシ又は置換アリールオキシである。｝のように共通炭素原子を介してフラノースの２つ（２’−及び３’−）のヒドロキシルに直接的に結合する残基であり；
Ｂ、及びＢ’は、独立して、９−位置を通じて連結される式（ＩＶ）のようなプリン残基、又は１−位置を通じて連結される式（Ｖ）のようなピリミジン残基であり、
【化５】
2009500354.tif 000017
【化６】
2009500354.tif 000018
｛式中、
Ｒ１０、及びＲ１３は、独立して、ヒドロキシ、オキソ、アミノ、メルカプト、アルキルチオ、アルキルオキシ、アリールオキシ、アルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、アラルキルアミノ、アリールアミノ、ジアラルキルアミノ、ジアリールアミノ又はジアルキルアミノであり、ここで、当該アルキル基は、場合により、複素環を形成するために連結される；あるいは、
Ｒ１０、及びＲ１３は、独立して、式（ＶＩ）のようなアシルアミノであり；
プリン中のＲ１０又はピリミジン中のＲ１３がその第１原子として窒素を有するとき、Ｒ１０とＲ１１又はＲ１３とＲ１４は、一緒になって、（エテノ化合物を得るため）５員融合イミダゾール環を形成し得、場合により、上記Ｒ５〜Ｒ９に記載されるように、１又は複数のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アラルキル又はアリール部分を有するエテノ環上で置換され得；
Ｒ１１は、水素、Ｏであり、又は存在せず；
Ｒ１４は、水素又はアシルであり；
Ｒ１２は、水素、塩素、アミノ、一置換アミノ、二置換アミノ、アルキルチオ、アリールチオ又はアラルキルチオであり、ここで当該硫黄上の置換基は、不飽和を有し又は有さず、かつ鎖状で置換基を有し又は有さず、最大２０炭素原子まで含む；
Ｒ１５は、水素、メチル、アルキル、ハロゲン、アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル又は置換アルキニルである。｝、
【化７】
2009500354.tif 000019
｛式中、
Ｃは、炭素原子であり；
Ｗ１は、酸素又は硫黄であり；
Ｒ１６は、式（ＶＩ）による部分がウレア又はチオウレアであるように、アミノ又は一置換、若しくは二置換アミノであり、；あるいは、
Ｒ１６は、式（ＶＩ）による部分がカルバメート又はチオカルバメートであるように、アルコキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシ、置換アラルキルオキシ又は置換アリールオキシであり；あるいは、
Ｒ１６は、式（ＶＩ）による部分がアミドであるように、置換基又はヘテロ原子を有する又は有さない、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アラルキル又はアリールである。｝。］
の化合物、あるいはそれらの医薬組成物、溶媒和物又は水和物を、粘液分泌を除去するのに十分量で、前記患者の肺に投与することを含む、上記方法。
【請求項２】
肺粘液分泌の水和を必要とする患者の肺粘液分泌の水和を促進する方法であって、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、あるいはその医薬として許容された塩、水和物又は溶媒和物を、肺分泌を水和させるのに十分量で、前記患者の肺に投与することを含む、上記方法。
【請求項３】
障害のある又は不十分な気道機能に関する疾患又は症状を予防又は治療する方法であって、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、あるいはその医薬として許容された塩、水和物又は溶媒和物を、気道上皮組織におけるＰ２Ｙ６受容体を活性化するのに有効量で、患者の肺に投与することを含む、上記方法。
【請求項４】
前記疾患が、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、気腫、嚢胞性繊維症、原発性線毛機能不全症又はアルファ１アンチトリプシン欠損症である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記疾患が、慢性気管支炎である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記疾患が、慢性閉塞性肺疾患である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記疾患が、原発性線毛機能不全症である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記疾患が、嚢胞性繊維症である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記式（Ｉ）の化合物が、式（Ｉａ）：
【化８】
2009500354.tif 000020
｛式中、
Ｂ２、及びＢ３は、独立して、ウラシル、Ｎ−メチルウラシル、５−メチルウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、４−チオウラシル、４−チオメチルウラシル、シトシン、５−メチルシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ−メチルシトシン、Ｎ−フェニルシトシン、Ｎ−ベンジルシトシン、Ｎ，Ｎ−ジメチルシトシン又はグアノシンであり；及び、
Ｑは、フェニル、置換フェニル、ベンジル、置換ベンジル、フェニルアセチレン、置換フェニルアセチレン、スチリル、置換スチリル、フェネチル又は置換フェネチルである。｝の化合物である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が、Ｐ１−（２’，３’−ベンジルアセタールウリジン５’−）Ｐ３−（ウリジン５’−）三リン酸、Ｐ１−（２’，３’−ベンジルアセタールウリジン５’−）Ｐ３−（シチジン５’−）三リン酸、Ｐ１−（２’，３’−ベンジルアセタールグアノシン５’−）Ｐ３−（ウリジン５’−）三リン酸、Ｐ１−（２’，３’−フェニルアセタールウリジン５’−）Ｐ３−（ウリジン５’−）三リン酸、Ｐ１−［２’，３’−（フェニルアセチレン）アセタールウリジン５’−］Ｐ３−（ウリジン５’−）三リン酸、及びＰ１−（２’，３’−フェニルアセタールシチジン５’−）Ｐ３−（ウリジン５’−）三リン酸からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が、Ｐ１−（２’，３’−ベンジルアセタールウリジン５’−）Ｐ３−（ウリジン５’−）三リン酸である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物が、吸入により投与される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物が、呼吸域粉塵のエアロゾル懸濁液の形状で投与される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記呼吸域粉塵が、１〜１０ミクロンの大きさを有する、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｐ２Ｙ６受容体アゴニスト化合物、並びに、ヒト、及び他の哺乳類における肺障害、及び気道機能に関する疾患又は症状の治療においてかかる化合物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｐ２受容体サブタイプであるＰ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６、及びアデノシン受容体サブタイプであるＡ２Ｂは、全て、ヒト気道において発現する。肺の中へのＡＴＰ、ＵＴＰ又はＵＤＰの点滴は、気道上皮において粘膜毛様体クリアランス過程における増大をもたらす。この細胞外ヌクレオチドに対する応答は、１又は複数のＰ２Ｙ受容体の活性化により誘発される多くのイベントを作り出し、体液及び塩化物の分泌における増大（Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、及びＰ２Ｙ６）、ナトリウム吸収の阻害（Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、及びＰ２Ｙ６）、及びムチン分泌における増大（Ｐ２Ｙ２、及びＰ２Ｙ４）をもたらす。これらのイベントは、繊毛ビート周波数の増大に合わせて、気道の天然クリアランスに関与する。Ｋｅｌｌｅｒｍａｎ，Ｃｈｅｓｔ．１２１：２０１Ｓ−２０５Ｓ（２００２）；Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：５７１−７（２００２）；Ｌｅｉｐｚｉｇｅｒ，Ａｍ  J  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８４：Ｆ４１９−３２（２００３）；Ｋｕｎｚｅｍｉａｎｎ，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８：８５７−６７（２００１)；及びＳｃｈｗｉｅｂｅｒｔ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１６１５：７−３２（２００３)を参照のこと。
【０００３】
Ｐ２Ｙ６受容体の役割は、選択的Ｐ２Ｙ６アゴニストの欠損によるＰ２Ｙ２受容体及びそれらのアゴニストの役割と同様に、明確に定義されていない。Ｐ２Ｙ６受容体の刺激は、体液分泌、塩化物分泌、及び繊毛ビート周波数の容量依存的増大を引き起こす｛Ｍｏｒｓｅ，Ａｍ．ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８０：Ｃ１４８５−４９７（２００１）｝。ＵＤＰ（Ｐ２Ｙ６受容体の天然アゴニスト）は、粘膜毛様体クリアランスの促進についてＰ２Ｙ２受容体のアゴニストより低い効果を有し、天然Ｐ２Ｙ６受容体アゴニストであるＵＤＰの低効果がその代謝負担によるものかどうかはわからない。
【０００４】
粘液クリアランスは、空気感染バクテリア、ウイルス、化学物質、及び粒子材料により引き起こされる疾患に対する肺の本来有する防御機構における土台である。慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、粘液分泌過多の如きいくつかの肺疾患において、低減クリアランス、及び炎症は、気流閉塞の一因となり、疾病率及び死亡率の増大に関連する肺実質において破壊的な変化をもたらす。これらの患者において、気道クリアランス治療は、感染を防ぐため、酸素化を増大するため、及び肺機能の衰退を防ぐために必要である。
【発明の開示】
【０００５】
本発明の概要
本発明は、患者の肺粘液分泌のクリアランスを促進する又は容易にする方法に関する。本発明は、かかる治療を必要とする患者の肺粘液分泌の水和を容易にする方法にも関する。本発明は、さらに、ヒト又は他の哺乳類における肺障害又は気道機能に関する疾患又は症状を予防又は治療する方法に関する。かかる疾患は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性気管支炎、気腫、嚢胞性繊維症、原発性線毛機能不全症（ＰＣＤ）、及びアルファ１アンチトリプシン欠損症を含む。
【０００６】
本方法は、治療有効量のＰ２Ｙ６受容体アゴニスト化合物を患者に投与することを含む、ここで当該量は、肺上皮組織の管腔表面上のＰ２Ｙ６受容体を活性化するのに効果的な量である。当該Ｐ２Ｙ６受容体アゴニスト化合物は、例えば、吸入により患者に投与される。
【０００７】
本発明において有用なＰ２Ｙ６受容体アゴニスト化合物は、Ｐ２Ｙ６受容体に対して選択的であり、そして一般式（Ｉ）のモノヌクレオシド５‘−二リン酸、ジヌクレオシド・モノリン酸、ジヌクレオシド二リン酸又はジヌクレオシド三リン酸、あるいは、それらの塩、溶媒和物、水和物を含む。本発明は、医薬担体、及び一般式（Ｉ）の化合物を含む医薬配合をさらに提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の詳細な説明
定義
存在するならば、特に定めのない限り、以下の用語は、非制限的に以下のように通常定義される。
【０００９】
アルキル基は、包括的に１〜１２個の炭素であり、直鎖又は枝分かれ鎖、ヘテロ原子を有するか有しないかのどちらかであり、より好ましくは、包括的に１〜８個の炭素であり、最も好ましくは包括的に１〜６個の炭素である。
【００１０】
アルケニル基は、包括的に１〜１２個の炭素であり、少なくとも１つの二重結合を含む直鎖又は枝分かれ鎖であるが、複数の二重結合を含むかもしれず、ヘテロ原子を有するか又は有しない。
【００１１】
アルキニル基は、包括的に１〜１２個の炭素であり、少なくとも１つの三重結合を含む直鎖又は枝分かれ鎖であるが、複数の三重結合を含むかもしれず、ヘテロ原子を有するか又は有しない。
【００１２】
シクロアルキル基は、包括的に３〜１２個の炭素であり、より好ましくは包括的に３〜１０個の炭素であり、最も好ましくは包括的に３〜６個の炭素であり、ヘテロ原子を有するか又は有しない。
【００１３】
シクロアルケニル基は、少なくとも１つの二重結合を含む包括的に４〜１２個の炭素であり、ヘテロ原子を有するか又は有しない。
【００１４】
アラルキル基は、アルキル部分における包括的に１〜８個の炭素であり、より好ましくはアルキル部分における１〜６個の炭素であり、最も好ましくはアルキル部分における包括的に１〜４個の炭素であり；上記アルキル定義に加えて、鎖が複数の炭素原子を含むとき、アラルキル基のアルキル部分は、鎖における二重結合又は三重結合の如き不飽和の１又は複数の位置を含み得；アラルキル基のアルキル部分は、１又は複数のヘテロ原子、及び／又は置換基をも含み得；アラルキル基のアリール部分は、当該アリール部分における環あたり包括的に３〜８個の炭素、より好ましくは環あたり包括的に４〜６個の炭素、最も好ましくは環あたり包括的に５〜６個の炭素の単環又は多環式部分となり得；アラルキル基のアリール部分は、１又は複数の置換基、及び／又はヘテロ原子をも有する。
【００１５】
アリール基は、単環又は多環のどちらかであり、環あたり包括的に３〜８個の炭素であり、より好ましくは、環あたり包括的に４〜６個の炭素、最も好ましくは環あたり包括的に５〜６個の炭素であり；アリール基は、置換基、及び／又はヘテロ原子をも有し得る。
【００１６】
ヘテロアラルキル基は、アルキル部分において包括的に１〜８個の炭素であり、より好ましくはアルキル部分において包括的に１〜６個の炭素であり、最も好ましくはアルキル部分において包括的に１〜４個の炭素であり；上記アルキルの定義に加えて、ヘテロアラルキル基のアルキル部分は、鎖が複数の炭素原子を含むとき、当該鎖における二重結合又は三重結合の如き１又は複数の不飽和を含み得；ヘテロアラルキル基のアルキル部分は、１又は複数のへテロ原子及び／又は置換基をも含み得；ヘテロアラルキル基のヘテロアリール部分は、ヘテロアリール部分における環あたり包括的に３〜８個の炭素の単環又は多環式部分であり、環あたり包括的に１〜４個のヘテロ原子を含み、より好ましくは、環あたり包括的に４〜６個の炭素、最も好ましくは環あたり包括的に５〜６個の炭素であり；ヘテロアラルキル基のヘテロアリール部分は、１又は複数の置換基、及び／又はヘテロ原子をも有し得る。
【００１７】
ヘテロアリール基は、単環又は多環式のいずれかであり、環あたり包括的に１〜４個のヘテロ原子を含み、環あたり包括的に３〜８個の原子であり、より好ましくは環あたり包括的に４〜６個の原子であり、最も好ましくは環あたり包括的に５〜６個の原子であり；ヘテロアリール基は、置換基、及び／又はヘテロ原子をも有し得る。
【００１８】
前述の基における置換基は、非制限的に、ヒドロキシ、ニトロ、メトキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、メチル、エチル、プロピル、ブチル、チオアルキル、アルコキシ、カルボキシル、カルボキシアミド、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、スルホンアミド、シアノ、アミノ、置換アミノ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、フェニル、ピリジル、イミダゾリル、シクロプロピル、シクロペンチル、及びシクロヘキシルとなり得；好ましいヘテロ原子は、酸素、窒素、及び硫黄である。
【００１９】
鎖又は環における所望の置換基（その位置での水素の代わり）は、与えられたアルキル、アリール、ハロゲン、アラルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、ヒドロキシル、アシルオキシ、アルコキシ、アリールオキシ又はアラルコキシクラスから選択されるもの又は他のクラスから選択されるものであり、それは、良好ないし極めて優れたＰ２Ｙ１２受容体結合特性を有する化合物を提供するが、配合の化学的不安定性の如き望まない特性を有する化合物、あるいは治療される哺乳類によりよく耐えられない又は特にヒトに耐えられない毒性基準を有するものを産生しない。
【００２０】
ジアステレオマーは、立体異性体（一致する組成であるが３次元構造が異なる異性体）であり、そして互いに鏡像関係を有さない。
【００２１】
医薬として許容される塩は、親化合物の所望の生物活性を保持し、かつ望まない毒性効果を与えない塩である。医薬として許容される塩の形態は、様々な多形体、並びに酸又は塩添加由来の異なる塩の非晶形を含む。酸付加塩は、無機酸又は有機酸と形成され得る。かかる酸の例示的、非制限的な例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸、安息香酸、ナフトエ（ｎａｐｔｈｏｉｃ）酸、シュウ酸、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、メシル（ｍｅｓｙｌｉｃ）酸、アジピン酸、乳酸、酒石酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、カンファースルホン酸、及びエタンスルホン酸を含む。
【００２２】
医薬として許容される塩基付加塩は、金属又は有機対イオンと形成され得、非制限的に、ナトリウム又はカリウムの如きアルカリ金属塩；マグネシウム又はカルシウムの如きアルカリ土類金属塩；及びアンモニウム又はテトラアルキルアンモニウム塩、すなわち、ＮＸ４＋（ここで、ＸはＣ１−４である。）を含む。
【００２３】
塩酸塩、臭化水素酸塩、メシル酸塩、硫酸塩、酢酸塩、酒石酸塩などの如き他の塩も、本発明中に企図される。好ましい対イオンは、ＮＨ４＋、ナトリウム、リチウム、カリウム、塩化物、臭化物の如き一価のイオンであり、ナトリウム、カリウム、塩化物との重硫酸塩及びメシル酸塩であり、そして、製造の容易さ、安定性、及び生理学的耐性によりメシル酸塩は最も好ましい。
【００２４】
溶媒は、付加錯体であり、かかる錯体中の化合物は、固定的比率にて、医薬として許容される共溶媒と混合される、共溶媒は、非制限的に、水、メタノール、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノール、１−ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチレングリコール、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、ピリジン、ジオキサン、及びジエチルエーテルを含む。水和物は、共溶媒が水である溶媒和物である。本発明の化合物の定義は、上記活性を有する全ての可能性のある水和物及び溶媒和物をいずれかの比率で含むものであることが理解される。
【００２５】
発明者らは、現在入手可能な天然又は合成アゴニストとは対照的に、より代謝的に安定性であり、より選択的であり、Ｐ２Ｙ２及びＰ２Ｙ４受容体活性を特に欠損するＰ２Ｙ６受容体アゴニストの新規クラスを予想外に発見した。通常、Ｐ２Ｙ６受容体の刺激は、Ｐ２Ｙ２受容体の刺激ほどムチン放出の増大を引き起こさない｛Ｃｏｎｗａｙ  ＪＤ，Ａｍ  J  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  ＭｏＩ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８４：Ｌ９４５−Ｌ９５４（２００３）｝。出願人らは、ある選択的Ｐ２Ｙ６受容体アゴニストは障害のある又は不十分な気道機能に関する疾患又は症状の治療において特に有用であることを発見している、ここで、増大された気道粘液産生は既に存在し、粘膜毛様体クリアランスの促進が所望される。
【００２６】
本発明は、かかる治療を必要とする患者の肺粘液分泌のクリアランス又は除去を強化する又は促進する方法に関する。肺粘液クリアランスは、気道により分泌された分泌液、イオン、界面活性剤、及び粘液の最適なバランスに依存する。肺分泌物のこれらの成分は、下気道から咽頭まで粘液層を進ませるために効果的な繊毛運動を可能とする約７μｍの厚さの繊毛液体層（ｐｅｒｉｃｉｌｉａｒｙ  ｌｉｑｕｉｄ  ｌａｙｅｒ）の表面上に浮かぶ粘液最上層からなる二重層のような気道の表面に組織化される。当該粘液層は、空気感染の病原菌、及び他の異物から、並びに分泌液の欠損から上皮組織を守る。気道中の粘液の過剰、分泌液の欠損、及び／又はイオンの不均衡は、肺粘液分泌の欠陥のあるクリアランス、再発性肺感染、及び疾病率及び死亡率における増大に関連する肺機能の全体的な低下の一因となる肺疾患を有する患者に関する顕著な特徴である。これらの患者は、粘液分泌を強化することなしに肺のクリアランスを促進するために、Ｐ２Ｙ６アゴニストによる治療の利益を得る。
【００２７】
本発明は、かかる治療を必要とする患者の肺粘液分泌の水和を促進する方法にも関する。本発明は、障害のある又は不十分な気道機能に関連する疾患又は症状を治療する方法にさらに関し、かかる疾患は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性気管支炎、気腫、慢性ぜんそく、慢性細気管支炎、嚢胞性繊維症、原発性線毛機能不全症（ＰＣＤ）、及びアルファ１アンチトリプシン欠損症を含む。
【００２８】
かかる方法は、被験者に治療有効量の選択的Ｐ２Ｙ６受容体アゴニスト化合物を投与することを含む、ここで、当該量は、好ましくは同時ムチン放出なしで、粘膜毛様体クリアランスを引き起こすための気道上皮組織の管腔表面上のＰ２Ｙ６受容体に結合するために効果的な量である。当該化合物は、塩化物及び水の分泌を刺激するために効果的であり、それ故、繊毛ビート周波数における同時増大を伴い、肺水和状態における増大に影響を与える。
【００２９】
選択的Ｐ２Ｙ６受容体アゴニスト化合物
本発明に有用な選択的Ｐ２Ｙ６受容体アゴニスト化合物は、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２又はＰ２Ｙ４受容体よりもＰ２Ｙ６受容体の選択性を有する。本発明に有用な選択的Ｐ２Ｙ６受容体アゴニスト化合物は、
式（Ｉ）：
【化１】
2009500354.tif 000002
［式中、
Ｂは一般式（ＩＶ）又は（Ｖ）のプリン又はピリミジン残基であり；
ｎ＋ｐの合計が０〜２、好ましくは１〜２となるように、ｎ及びｐ＝０又は１であり、ただし、Ａ＝Ｍのときｎ＋ｐの合計が１である；
Ｘ１、及びＸ２は、独立して、Ｏ、ＮＨ、ＣＨ２、ＣＨＦ、ＣＨＣｌ、ＣＦ２又はＣＣｌ２であり；
Ｔ１、Ｖ、及びＷは、独立してＯ又はＳであり；
Ｍ＝Ｈ＋、ＮＨ４＋、Ｎａ＋又は他の医薬として許容される無機又は有機対イオンであり；
Ｙ＝ＯＲ１であり；
Ｚ＝ＯＲ２であり；
Ａ＝Ｍであり；あるいは、
Ａは、フラノース又は炭素環の５’−位置を介してリン酸塩鎖に連結する以下の式：
【化２】
2009500354.tif 000003
｛式中、
Ｄ＝Ｏ又はＣＨ２であり；
Ｚ’＝Ｈ又はＯＨであり；
Ｙ’＝Ｈ又はＯＨであり；
Ｂ’は、各々、塩基の９−又は１−位置を介してフラノース又は炭素環の１’−位置と結合する一般式（ＩＶ）又は（Ｖ）のようなプリン又はピリミジン残基である。｝
として定義されるヌクレオシド残基であり；
Ｒ１、及びＲ２は、式（ＩＩ）：
【化３】
2009500354.tif 000004
｛式中、
Ｏは、前記フラノースの対応する２’−及び／又は３’−酸素であり；
Ｃは、炭素原子であり；
Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、式（ＩＩ）のように定義される部分がエーテルであるように、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アラルキル、アリール、置換アラルキル又は置換アリールであり；あるいは、
式（ＩＩ）のように定義される部分が非環状アセタール又はケタールであるように、Ｒ５、及びＲ６は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アラルキル、アリール、置換アラルキル又は置換アリールであり、並びにＲ７は、アルコキシ、シクロアルコキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシ、置換アラルキルオキシ又は置換アリールオキシであり；あるいは、
式（ＩＩ）のように定義される部分がエステル又はチオエステルであるように、Ｒ５とＲ６は、Ｃに二重結合する酸素又は硫黄として一緒になり、Ｒ７は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アラルキル、アリール、置換アラルキル又は置換アリールであり；あるいは、
式（ＩＩ）のように定義される部分がカルバメート又はチオカルバメートであるように、Ｒ５とＲ６は、Ｃに二重結合する酸素又は硫黄として一緒になり、Ｒ７は、置換基がアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アラルキル、アリール、置換アラルキル又は置換アリールであるアミノ又は一置換、若しくは二置換アミノであり；あるいは、
式（ＩＩ）のように定義される部分がカルボネート又はチオカルボネートであるように、Ｒ５とＲ６は、Ｃに二重結合する酸素又は硫黄として一緒になり、Ｒ７は、アルコキシ、シクロアルコキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシ、置換アラルキルオキシ又は置換アリールオキシであり；あるいは、
Ｒ７が存在せず、かつＲ５とＲ６は、Ｃに二重結合する酸素又は硫黄として一緒になり、並びにフラノースの２’−及び３’−酸素の両方がＣに直接的に結合し環状カルボネート又はチオカルボネートを形成する。｝のように炭素原子を介して、フラノースの２’−及び／又は３’−ヒドロキシルに直接的に結合する、あるいは式（ＩＩＩ）：
【化４】
2009500354.tif 000005
｛式中、
Ｏ原子は、フラノースの２’−及び３’−酸素であり；当該フラノースの２’−及び３’−酸素は、共通炭素原子（Ｃ）により連結され、環状アセタール、環状ケタール又は環状オルトエステルを形成し；
環状アセタール、及びケタールとして、Ｒ８、及びＲ９は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アラルキル、アリール、置換アラルキル、置換アリールであり、あるいは、一緒に結合し、３〜８原子、好ましくは３〜６原子からなる単素環式又は複素環式環を形成し得；
環状オルトエステルとして、Ｒ８は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アラルキル、アリール、置換アラルキル又は置換アリールであり、Ｒ９は、アルキルオキシ、シクロアルキルオキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシ、置換アラルキルオキシ又は置換アリールオキシである。｝のように共通炭素原子を介してフラノースの２つ（２’−及び３’−）のヒドロキシルに直接的に結合する残基であり；
Ｂ、及びＢ’は、独立して、９−位置を通じて連結される式（ＩＶ）のようなプリン残基、又は１−位置を通じて連結される式（Ｖ）のようなピリミジン残基であり、
【化５】
2009500354.tif 000006
【化６】
2009500354.tif 000007
｛式中、
Ｒ１０、及びＲ１３は、独立して、ヒドロキシ、オキソ、アミノ、メルカプト、アルキルチオ、アルキルオキシ、アリールオキシ、アルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、アラルキルアミノ、アリールアミノ、ジアラルキルアミノ、ジアリールアミノ又はジアルキルアミノであり、ここで、当該アルキル基は、場合により、複素環を形成するために連結される；あるいは、
Ｒ１０、及びＲ１３は、独立して、式（ＶＩ）のようなアシルアミノであり；
プリン中のＲ１０又はピリミジン中のＲ１３がその第１原子として窒素を有するとき、Ｒ１０とＲ１１又はＲ１３とＲ１４は、一緒になって、（エテノ化合物を得るため）５員融合イミダゾール環を形成し得、場合により、上記Ｒ５〜Ｒ９に記載されるように、１又は複数のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アラルキル又はアリール部分を有するエテノ環上で置換され得；
Ｒ１１は、水素、Ｏであり（アデニン１−オキシド誘導体）又は存在せず（アデニン誘導体）；
Ｒ１４は、水素又はアシル（例えば、置換基を有する又は有さない、アセチル、ベンゾイル、フェニルアシル）であり；
Ｒ１２は、水素、塩素、アミノ、一置換アミノ、二置換アミノ、アルキルチオ、アリールチオ又はアラルキルチオであり、ここで当該硫黄上の置換基は、不飽和を有し又は有さず、かつ鎖状で置換基を有し又は有さず、最大２０炭素原子まで含む；
Ｒ１５は、水素、メチル、アルキル、ハロゲン、アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル又は置換アルキニルである。｝、
【化７】
2009500354.tif 000008
｛式中、
ＮＨは、プリン中のＣ−６位置でのアミノ残基、又はピリミジン中のＣ−４位置でのアミノ残基であり；
Ｃは、炭素原子であり；
Ｗ１は、酸素又は硫黄であり；
Ｒ１６は、式（ＶＩ）による部分がウレア又はチオウレアであるように、アミノ又は一置換、若しくは二置換アミノであって、さらなる置換基、不飽和またはヘテロ原子を有する又は有さない、当該アミノ置換基がアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アラルキル又はアリールであり；あるいは、
Ｒ１６は、式（ＶＩ）による部分がカルバメート又はチオカルバメートであるように、アルコキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシ、置換アラルキルオキシ又は置換アリールオキシであり；あるいは、
Ｒ１６は、式（ＶＩ）による部分がアミドであるように、置換基又はヘテロ原子を有する又は有さない、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アラルキル又はアリールであり；Ｒ５〜Ｒ９における類似の基として上記定義されるようなアルキル、シクロアルキル、アラルキル又はアリール基の定義を有する。｝。］の化合物、あるいはそれらの医薬組成物、溶媒和物又は水和物を含む。
【００３０】
Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７が同じでないとき、又はＲ８、及びＲ９が同じでないとき、式（Ｉ）の化合物は、いくつかのジアステレオマー型として存在し得る。式（Ｉ）の一般構造は、特に特定しない場合、かかる材料の全ジアステレオマー型を含む。式（Ｉ）は、式（Ｉ）の化合物の混合物も含み、いずれかの比率における、エナンチオマー、ジアステレオマー、及び／又は他の異性体の混合物を含む。
【００３１】
式（Ｉ）におけるリボシル部分は、示されるようなＤ配置であるが、Ｌ−、あるいはＤ−及びＬ−ともなり得る。Ｄ配置は、リボシル部分のために好ましい。
【００３２】
式（Ｉ）の化合物は、以下の特徴：（ａ）モノヌクレオシド５’−二リン酸、ジヌクレオシド・モノリン酸、ジヌクレオシド二リン酸又はジヌクレオシド三リン酸である；（ｂ）Ｙ＝ＯＲ１でありＺ＝ＯＲ２である；及び（ｃ）Ｙ’＝Ｈ又はＯＨであり、かつＺ’＝Ｈ又はＯＨである（ｂとｃを記載するためにいずれかのいい方法又は代替的方法がある。）を有する。化合物がジヌクレオチドであるとき、２つのヌクレオシドを連結するポリリン酸塩は、当該化合物がＰ２Ｙ２又はＰ２Ｙ４受容体に対する著しい活性を有さないように、四リン酸塩、五リン酸塩、六リン酸塩などとはなり得ない。化合物がジヌクレオチドであるとき、当該化合物がＰ２Ｙ６受容体に対する活性を保持するために、１つのヌクレオシドは置換されたＹとＺの両方を有さなければならず、すなわち、ＹとＺはＯＨ又はＨではなくＯＲでなければならず；もう片方のヌクレオシドは置換されたＹ’とＺ’のいずれかを有してはならない、すなわち、Ｙ’とＺ’はＯＨ又はＨのいずれかでなければならない。式（Ｉ）の化合物が他のＰ２Ｙ受容体を超えてＰ２Ｙ６受容体の選択性を有することがこれらの特徴である。
【００３３】
好ましい式（Ｉ）は、以下の式（Ｉａ）：
【化８】
2009500354.tif 000009
｛式中、
Ｂ２、及びＢ３は、独立して、ウラシル、Ｎ−メチルウラシル、５−メチルウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、４−チオウラシル、４−チオメチルウラシル、シトシン、５−メチルシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ−メチルシトシン、Ｎ−フェニルシトシン、Ｎ−ベンジルシトシン、Ｎ，Ｎ−ジメチルシトシン又はグアノシンであり；及び、
Ｑは、フェニル、置換フェニル、ベンジル、置換ベンジル、フェニルアセチレン、置換フェニルアセチレン、スチリル、置換スチリル、フェネチル又は置換フェネチルである。｝である。式（Ｉａ）は、いずれかの比率におけるエナンチオマー、ジアステレオマー、及び／又は他の異性体の混合を含む、式（Ｉａ）の化合物の混合物を含む。
【００３４】
ある態様において、Ｐ２Ｙ６受容体アゴニスト化合物は、Ｐ１−（２’，３’−ベンジルアセタールウリジン５’−）Ｐ３−（ウリジン５’−）三リン酸、Ｐ１−（２’，３’−ベンジルアセタールウリジン５’−）Ｐ３−（シチジン５’−）三リン酸、及びＰ１−（２’，３’−ベンジルアセタールグアノシン５’−）Ｐ３−（ウリジン５’−）三リン酸である。
【００３５】
他の態様において、Ｐ２Ｙ６受容体アゴニスト化合物は、Ｐ１−（２’，３’−フェニルアセタールウリジン５’−）Ｐ３−（ウリジン５’−）三リン酸、Ｐ１−［２’，３’−（フェニルアセチレン）アセタールウリジン５’−］Ｐ３−（ウリジン５’−）三リン酸、及びＰ１−（２’，３’−フェニルアセタールシチジン５’−）Ｐ３−（ウリジン５’−）三リン酸である。
【００３６】
好ましいＰ２Ｙ６受容体アゴニスト化合物は、Ｐ１−（２’，３’−ベンジルアセタールウリジン５’−）Ｐ３−（ウリジン５’−）三リン酸である。その構造を以下に示す。
【化９】
2009500354.tif 000010
【００３７】
医薬製剤
本発明は、式（Ｉ）の化合物、及び医薬として許容される担体を含む医薬製剤をさらに提供する。医薬として許容される担体は、慣習的な基準を使用して、当業者により選択され得る。医薬として許容される担体は、非制限的に、食塩水、水性電解質溶液、等張性修飾剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）、ポリエチレングリコールの如き水性ポリエーテル、ポリビニルアルコール及びポビドンの如きポリビニル、メチルセルロース及びヒドロキシプロピル・メチルセルロースの如きセルロース誘導体、カルボキシポリメチレン・ゲルの如きアクリル酸のポリマー、デキストランの如きポリサッカリド、及びヒアルロン酸ナトリウムや塩化ナトリウム及び塩化カリウムの如き塩の如きグリコサミノグリカンを含む。
【００３８】
本発明の医薬製剤は、水、好適なイオン又は非イオン等張化修飾剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）、好適な緩衝剤、及び式（Ｉ）の化合物を含む水溶液を提供する。ある態様において、当該化合物は、０．００５〜１０％ｗ／ｖ、好ましくは０．０１〜６％ｗ／ｖであり、当該水溶液は、２００〜４００ｍＯｓｍ／ｋＧの張度、及び４〜９のｐＨである。
【００３９】
前記医薬製剤は、滅菌品質のフィルター、好ましくは０.２２ミクロンの公称孔径のものを通じて当該製剤を濾過することにより滅菌され得る。当該医薬製剤は、オートクレーブ処理の如き熱処理又は放射線滅菌を非制限的に含む１又は複数の滅菌技術を使用する、あるいは滅菌製剤を製造するためのパルス光を使用する末端滅菌によっても滅菌され得る。ある態様において、前記医薬製剤は、活性成分の濃縮溶液である；当該製剤は、全身投与の前に適切な許容される滅菌希釈剤を使用して、連続的に希釈され得る。
【００４０】
ある態様において、前記等張化修飾剤は、例えば０．５〜０．９％ｗ／ｖ、好ましくは０．６〜０．９％ｗ／ｖの量において、ＮａＣｌの如きイオンを含む。
【００４１】
他の態様において、前記等張化修飾剤は、少なくとも２％、又は少なくとも２．５％、又は少なくとも３％、かつ７．５％以下の量で；例えば、３〜５％、好ましくは３．５〜５％、さらに好ましくは４．２〜５％ｗ／ｖの範囲において、マンニトール、デキストロースの如き非イオン性である。
【００４２】
前記式（Ｉ）化合物は、超臨界流体のよく知られた技術を使用して、乾燥粉末又は等価吸入粉末にも製造され得る。かかる場合において、当該式（Ｉ）化合物は、好適な賦形剤と混合され、好適な溶媒又はアジュバントを使用して均質な塊に挽かれる。これに続いて、この塊は超臨界流体技術を使用して混合に供され、そして好適な粒径の配分に達する。前記製剤中の粒子は、好適な吸入技術を使用して当該粒子が直接的に吸入され得るように、あるいは人工呼吸器を介して肺に導入され得るように、所望の粒径範囲のものとなる必要がある。あるいは、製剤は、前記粒子が充分な大きさであり、その結果、一緒に混合されたときに好適な体液中で完全に溶解するために、又は肺に噴霧する前に十分溶解するために十分な表面積を提供するように設計され得る。
【００４３】
式（Ｉ）化合物の粒径の成長を防ぐため、及び結晶成長を最小化するために、ある態様は、微粒材料よりよい空力的特性を有するスプレー乾燥された粒子の使用を含む。これは、親水性分子を疎水性材料の１又は複数の層で被膜するためにさらに伸長され得る。
【００４４】
この組成物の他の態様は、式（Ｉ）化合物の凍結乾燥した製品又は凍結乾燥品を含む。当該凍結乾燥品は、乾燥粉末吸入器の形態として使用され得、あるいは乾燥粉末吸入器又はネブライザー製剤として使用するために他の好適なアジュバントと混合される。
【００４５】
投与経路
局部投与、及び全身投与を含む、肺の内腔へ式（Ｉ）化合物をデリバリーする方法は、本発明に好適である。
【００４６】
本発明の好ましい態様は、局部投与である。局部投与は、吸入、局所適用又は標的薬物デリバリーを含む。吸入方法は、液体点滴、定量吸入器又は装置を介する加圧流体品のような点滴、又は（好ましくは）ネブライザーを介するエアロゾル化された溶液の吸入、（より好ましくは）乾燥粉末の吸入、及び（さらにより好ましくは）機械的人工換気における気流中の直接的可溶性又は乾燥材料を含む。
【００４７】
標的薬物デリバリーの例は、リポソームの中への式（Ｉ）化合物の同封であり、ここでかかるリポソームは、標的とされた肺組織に発現される抗原に対する特異的抗体でコートされる。あるいは、リポソーム製剤は、リポソームのコアが式（Ｉ）化合物を含み、かつ当該リポソーム製剤の外表面が、肺胞表面を行き来し当該肺胞表面に結合するカチオン荷電された部分を含むように設計され得る。
【００４８】
式（Ｉ）化合物の制御されたデリバリーシステムを理解することは有意義なことである、なぜならば、かかる吸入された製品は、活性部位を標的とし、着目の化合物を少量の厳格に管理された量にし、そして望まない副作用を低減／最小化するからである。制御された放出デリバリーシステムの有効性に対していくつかの制限がある、なぜならば、いくつかの材料の肺の中への長時間の残留は、長期毒性問題を引き起こすからである。
【００４９】
デリバリーシステムの他の例は、式（Ｉ）化合物のナノ粒子の又は微粒子の組成物を含む。かかる場合において、式（Ｉ）化合物は、ナノ懸濁液として配合される、ここで担体は、式（Ｉ）化合物と共にロードされ、次いでかかる製剤は細かい多孔質膜又は好適なろ過媒体を通してろ過され又は溶媒交換にさらされ、ナノ粒子を製造する。かかるナノ粒子製剤は、凍結乾燥され得、あるいは水性又は生理学的に混合可能な媒体中の懸濁液中に保持され得る。そのように得られた製剤は、好適な手段により吸入され得る。
【００５０】
好適な製剤の他の例は、再構成製剤を含む。この場合、前記式（Ｉ）化合物は、生理学的に混合可能とさせる必要なアジュバントを含むように製剤中に配合される。かかる製剤は、注入のための水又は好適な生理液の添加により再構成され得、単純な撹拌により混合され、そして上記好適な技術を使用して吸入される。
【００５１】
この吸入方法は、活性成分を含む呼吸域粉塵のエアロゾル懸濁液を含み、患者が吸引する。当該呼吸域粉塵は、吸入に関する口、及び喉頭を通過するのに十分小さい粒径を有する液体又は固体となり得る。一般的に、約１〜１０ミクロン、好ましくは１〜５ミクロンの大きさを有する粒子は、呼吸に適するとみなされる。
【００５２】
吸入投与のために、デリバリーされた活性化合物の表面濃度は、化合物に従って変化し得るが、通常、１×１０−１０〜１×１０−４モル／リットルであり、好ましくは１×１０−８〜１×１０−５モル／リットルである。
【００５３】
活性化合物は、Ｐ２Ｙ６アゴニストの細胞外濃度が塩化物及び水分泌、並びに繊毛ビート周波数の刺激を導くのに十分となるように、必要とする患者の標的部位に全身的にも投与され得る。本明細書中に使用される用語「全身的」は、皮下注射、静脈、筋肉内、基質内注射、硝子体内注射、注入、吸入、経皮投与、経口投与、直腸投与、及び手術中の点滴を含む。
【００５４】
注射、及び注入の如き全身投与について、医薬製剤は、滅菌媒体中で製造される。使用される媒体、及び濃度に依存する活性成分は、当該媒体中に懸濁されるか溶解され得る。局部麻酔薬、保存料、及び緩衝剤の如きアジュバントは、当該媒体中にも溶解され得る。滅菌注射可能製剤は、非毒性の許容される希釈剤又は溶剤における滅菌注射可能溶液又は懸濁液となり得る。許容される媒体及び溶剤の中で、使用され得るものは、滅菌水、食塩水、リンガー溶液である。
【００５５】
活性化合物の全身投与の他の方法は、経口投与を含み、その際、活性化合物を含む医薬組成物は、タブレット、トローチ剤、水性又は油性懸濁液、粘性のあるゲル、チュアブルガム、分散性粉末又は顆粒、エマルジョン、ハード又はソフトカプセル、あるいはシロップ又はエリキシリル剤形態である。
【００５６】
経口使用について、水性懸濁液を、分散剤又は湿潤剤、懸濁化剤、１又は複数の保存料、及び他の賦形剤を有する分散性粉末及び顆粒への水の添加により作製する。懸濁化剤は、例えば、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム、メチルセルロース、及びアルギン酸ナトリウムを含む。分散剤又は湿潤剤は、天然に生ずるリン脂質、アリレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、エチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール由来の部分エステルとの縮合生成物、及びエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール無水物（ａｎｙｄｒｉｄｅｓ）との縮合生成物を含む。保存料は、例えば、エチル、及びｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエイトを含む。他の賦形剤は、甘味剤（例えば、ショ糖、サッカリン）、香料添加剤、及び着色剤を含む。当業者は、多くの特異的な賦形剤、及び湿潤剤が上記のような一般的記載により含まれることを理解するだろう。
【００５７】
経口投与のために、タブレットは、前記活性化合物とタブレットの製造のために好適な非毒性の医薬として許容される賦形剤とを混合することにより製造される。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウムの如き不活性希釈剤；例えば、コーンスターチ又はアルギン酸の如き造粒剤及び崩壊剤；あるいは、例えば、スターチ、ゼラチンの如き結合剤；並びに、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又は滑石の如き平滑剤である。
【００５８】
タブレットはコートされず、あるいは既知の技術によりコートされ得、胃腸管内における崩壊及び吸収を遅らせ、その結果、長期に渡る持続活性を提供する。例えば、グリセリル・モノステアラート又はグリセリル・ジステアラートの如き時間遅延材が使用され得る。経口使用のための製剤は、ハードゼラチンカプセルとしても存在し得る、ここで、活性成分は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリンの如き不活性固体希釈剤と混合される、あるいは、ソフトゼラチンとしても存在し得、ここで活性成分は、ピーナッツ油、流動パラフィン又はオリーブ油の如き水又は油媒体と混合される。経口使用のための製剤は、活性成分が噛むことによりゆっくりと放出されるように、ガム内に活性成分を埋め込むことにより、チュアブルガムとしても存在し得る。
【００５９】
患者の肺への前記活性化合物の全身的投与のさらなる手段は、治療有効量の化合物が体内吸収及び循環を介して標的部位に到達するように、当該活性化合物の坐薬形態を含むだろう。
【００６０】
直腸投与のために、坐薬形態における組成物は、前記活性成分と常温では固体だが直腸温度では液体となり、それ故直腸で溶けて化合物を放出する好適な刺激性の少ない賦形剤を混合することにより作製され得る。かかる賦形剤は、ココアバター、及びポリエチレングリコールを含む。
【００６１】
前記活性化合物は、経皮パッチ又はパットを使用して、皮膚による吸収を介して患者の肺に全身的にも投与され得る。前記活性化合物は、皮膚を通じて血流中に吸収される。活性化合物の血しょう濃度は、異なる濃度の活性化合物を含むパッチを使用することにより制御され得る。
【００６２】
ある全身性方法は、前記活性化合物を含む呼吸域粉塵のエアロゾル懸濁液を含み、それを患者が吸入する。当該活性化合物は、肺を介して血流中に吸収されるだろう。当該呼吸域粉塵は、吸入に関する口、及び喉頭を通過するのに十分小さい粒径を有する液体又は固体となり得る。一般的に、約１〜１０ミクロン、好ましくは１〜５ミクロンの大きさを有する粒子は、呼吸に適するとみなされる。
【００６３】
患者の肺への活性化合物を全身的に投与する他の方法は、点眼剤又は洗顔剤、あるいは液体製剤の点鼻薬、あるいは患者が吸入する呼吸息粉塵のスプレー式点鼻薬形態において、液体又は液体懸濁液を投与することを含む。スプレー式点鼻薬、あるいは点眼又は点鼻薬を作製するための活性化合物の液体医薬組成物は、当業者に知られた方法によって当該活性化合物と滅菌されたピロゲンフリーの水又は滅菌食塩水の如き好適な媒体を混合することにより製造される。
【００６４】
全身投与のために、デリバリーされた活性化合物の血しょう濃度は、化合物に従って変化し得るが、通常、１×１０−１０〜１×１０−４モル／リットルであり、好ましくは１×１０−８〜１×１０−５モル／リットルである。
【００６５】
パッケージング
選択的Ｐ２Ｙ６アゴニスト化合物は、実施者が必要に応じ医薬組成物内に配合可能であるようにパッケージングされ得る。あるいは、当該医薬組成物自体がパッケージされ得、その結果、実施者により最小の製剤を必要とする。いずれかの場合において、当該パッケージングは、合理的に可能な範囲まで、効果、及び治療剤又は医薬組成物の化学的、及び審美的な整合性を維持すべきである。
【００６６】
パッケージングの可能な方法は、ブリスター包装、単位容量バイアルの包装、ブロー充てんのプラスチックバイアルにおける包装、加圧容器への充てん、２つの区分の内容物が投与前に機械的撹拌により混合され、その内容物が特定の期間内に使用される２つのシステム区分における包装を含む。プラスチックバイアル中に充填することにより材料をパッケージすることは（ここで、その内容物は容易に開けられ、内容物が投与され、そして空の容器が再使用又は汚染を防ぐために処理される）、利点があるとみなされる。最も好ましいパッケージング方法は、ブリスターパッケージングシステム中に製剤をパッケージすることである、ここで内容物は、熱、光、及び他の環境的極値から守られ保持される。
【００６７】
治療材料が吸入のためにパッケージされた際、当該医薬組成物は、エアロゾルスプレーキャニスター中にパッケージされ得るか、あるいはネブライザー又は人工呼吸器との使用のためにパッケージされ得る。これは、冷却充填又は加圧システム下での充填の周知技術を使用して容器を直接的に充填すること、あるいは無菌環境における重力送り条件下で製剤を単純に充填することにより達成され得る。これは、最終製剤の性質に依存し、冷却充填技術により達成され得る、ここで組成物は、クリーンルーム環境における高圧条件下、好ましくは無菌条件下、エアロゾルキャニスター中にパッケージされる。
【００６８】
あるいは、もし前記組成物が単純溶液、均質液又はよく混合された懸濁製品であれば、前記製剤は、重力送り条件下、単位容量のブロー充填シールバイアルに充填され得るか、あるいはブリスターパックに充填され得る、ここで、当該製剤は、単位キャビティーに充填され、そして環境的極値から守るために好適なホイル又は等価のパッケージングで閉じる。この操作は、無菌条件下、好ましくは、環境的極値を有さないかほとんど有さない、大気温度又は準大気温度下で実施されることが好ましい。かかる充填及びパッケージング操作は最小限の微生物学的量である比較的微粒子フリーの環境（特に、シュードモナス菌、及び他の類似の病原菌のない環境）において実施されること、及び直接的なヒト接触面への最小の暴露で実施されることが望ましい。ブリスターパッケージングは、冷却充填パッケージングにより最適に実施され得る。製品組成物は、直接定量移動（重量測定又は容量分析のいずれか）により、選択された最終容器内に直接的に充填され得、そして好適な密封システムで密封状態に固定され得る。
【００６９】
本発明は、以下の実施例によりさらに例証されるが、当該実施例に記載された特定の実施に本発明の範囲を限定するように解釈されない。
【実施例】
【００７０】
実施例１
Ｐ１−（２’，３’−ベンジルアセタールウリジン５’−）Ｐ３−（ウリジン５’−）三リン酸、アンモニウム塩の製造
ウリジン５’−二リン酸、トリブチルアンモニウム塩（ＵＤＰ．ＮＢｕ３）
ウリジン５’−二リン酸、ジナトリウム塩（ＵＤＰ．２Ｎａ）を、１０分間、水中で、Ｄｏｗｅｘ５０Ｈ＋又は同等のもの（５ｇ  樹脂／ｇ  ＵＤＰ．２Ｎａ）と撹拌することにより、遊離酸に転換した。当該樹脂をろ過し、そしてろ液をトリブチルアミン（１．５ｅｑ）と混合した。混合物を１５分間激しく撹拌し、水層のｐＨを８超のままにした。当該溶液を＜３５℃で蒸発させ、残留物を、＜４０℃で、乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３×）と共蒸発させた。残留物を、乾燥ガラス状発泡体まで一晩凍結乾燥した。
【００７１】
ウリジン５’−一リン酸、トリブチルアンモニウム塩（ＵＭＰ．ＮＢｕ３）
ウリジン５’−一リン酸、遊離酸（ＵＭＰ）を、水中、トリブチルアミン（１．５ｅｑ．）で処理することにより、モノ−トリブチルアンモニウム塩に転換した。溶媒除去、そして乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドとの共蒸発の後、当該生成物を一定の重さまで一晩凍結乾燥した。
【００７２】
Ｐ１，Ｐ３−ジ（ウリジン５’−）三リン酸、トリアンモニウム塩
ＵＭＰ．ＮＢｕ３（３８０ｍｇ、０．７４７ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ．）を、乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）、及び少しずつ添加された１，１’−カルボニルジイミダゾール（２４２ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ．）に溶解した。この溶液を、室温で１時間撹拌した。３１Ｐ  ＮＭＲがイミダゾリドへのほとんど完全な転換を示し、そしてメタノール（５５μＬ、２ｅｑ．）を添加して、余分なＣＤＩを急冷した。３０分間の撹拌後、ＵＤＰ．ＮＢｕ３（４００ｍｇ、０．６７９ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）を固体として添加した。この反応混合物を、２４時間４５℃で、ＨＰＬＣモニタリングしながら、撹拌した（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＰＲＰ−Ｘ１００カラム、２５０×４．１ｍｍ、１０μｍ、３０又は６０分に渡る水から９０％の１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３／１０％のＡＣＮまでのグラジエント、２ｍＬ／分、２６０ｎｍでモニター）。反応の最後で、ＨＰＬＣは、所望の生成物が総ヌクレオチド含量の約４５％を構成することを示した。水（５００μＬ）を添加していずれかの残りの活性種を冷却し、そして溶媒を、＜４０℃及び＜５ｍｍＨｇで蒸発させた。残留物を水中で再構成し、その生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＰＲＰ−Ｘ１００カラム、２５０×５０ｍｍ、１２−２０μｍ、３０分に渡る水から９０％１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３／１０％ＡＣＮまでのグラジエント、１００ｍＬ／分、２６０ｎｍでモニター）で単離した。表題の化合物の産生は１４０ｍｇだった（２７％）。
【００７３】
Ｐ１−（２’，３’−ベンジルアセタール・ウリジン５’−）Ｐ３−（ウリジン５’−）三リン酸、アンモニウム塩
Ｐ１，Ｐ３−（ウリジン５’−）三リン酸、トリアンモニウム塩（１．０ｇ、１．３１ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）を９８％ギ酸（５ｍＬ）及びフェニルアセトアルデヒドに溶解し、ジメチルアセタール（０．４３５ｍＬ、２．６２ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）を添加した。反応混合物を、３日間、室温で撹拌し、その時点で、ＨＰＬＣ（Ｃ１８）は、望まないジアセタールの１４％に加えて、所望のモノアセタール生成物への４３％転換を示した。ギ酸を、蒸発によりできる限り除去し、そして残留物を１Ｍの重炭酸ナトリウム（３０ｍＬ）でｐＨ８に中和した。当該水溶液を酢酸エチルで洗浄し（２×２０ｍＬ）、余分なアルデヒドを除去し、１２ｍＬに濃縮した。この生成物を、分取ＨＰＬＣ｛ＮｏｖａＰａｋ  Ｃ１８カラム、２５×２００ｍｍ、２５分間に渡る０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．９）からメタノールまでのグラジエント、２６０ｎｍでモニター｝で単離した。表題の化合物の収量は０．５３３ｇ（４７％）であった。
【化１０】
2009500354.tif 000011
【００７４】
実施例２
ＵＤＰ、ＵＰ３Ｕ、及びモノ−ベンジルアセタールＵＰ３Ｕの選択性
Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、及びＰ２Ｙ６を発現しているヒト星状細胞腫（１３２１Ｎ１）を、９６穴プレートにおいて、密集状態まで育てた。細胞を、１０ｍＭのＫＣｌ、１１８ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのグルコース、ｐＨ７．４からなるアッセイバッファー中のＦｌｕｏ−３ＡＭ（２．５μＭ最終濃度）の溶液と共にロードした。２５℃でＦｌｕｏ−３  ＡＭと共に６０分間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、そして、ウリジン５’−二リン酸（ＵＤＰ）、Ｐ１，Ｐ３−（ジウリジン５’−）三リン酸（ＵＰ３Ｕ）又はＰ１（２’，３’−ベンジルアセタール・ウリジン５’−）Ｐ３−（ウリジン５’−）三リン酸（モノ−ベンジルアセタール  ＵＰ３Ｕ）の化合物の連続する希釈濃度で刺激した。細胞内カルシウム値を、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して蛍光強度における変化を測定することにより、各穴において、同時に測定した。このアッセイの結果を表１に示す。表１における化合物ＵＤＰ、ＵＰ３Ｕ、及びモノ−ベンジルアセタールＵＰ３Ｕの値を、最大可能反応の５０％を産生するアゴニストの濃度に対応するＥＣ５０値として示す。モノ−ベンジルアセタールＵＰ３Ｕは、Ｐ２Ｙ６受容体でのみ活性を有し、反応を導くために最も低い濃度を必要とするので、これらの結果は、モノ−ベンジルアセタールＵＰ３ＵがＰ２Ｙ６受容体に対して有力であり選択的であることを示す。別の実験において、ジ−ベンジルアセタールＵＰ３U（モノ−ベンジルアセタールＵＰ３Ｕの類似物であり、ここで、２つの残余ヒドロキシル基は、Ｙ、Ｙ’、Ｚ、及びＺ’が全てＯＲであるように、ベンジルアセタール部分とも置換される。）は、Ｐ２Ｙ６で反応なしであることを示した。
【００７５】
【表１】
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【００７６】
実施例３
ヒト鼻腔細胞における塩化物分泌
生体内の塩化物分泌の誘導は、患者がかかる分泌の動員、及びクリアランスから利益を得るだろう疾患において、粘度の高い気道粘液の分泌の水和を促進する。先端の非ＣＦＴＲ塩素チャネルの活性化は、肺分泌物を再水和することを助ける塩素イオン及び水の流出を導く（Ｂｏｕｃｈｅｒ，米国特許第５，２９２，４９８号、及びＢｏｕｃｈｅｒ，米国特許第５，６３５，１６０号、及びそれらの引用文献）。
【００７７】
気道上皮組織細胞を分散し、新たに切除されたヒト鼻外科標本から単離する｛Ｙａｎｋａｓｋａｓ他，Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐ  Ｄｉｓ  １３２，１２８１−１２８７（１９８５）｝。融合性単層を、Ｆ−１２ホルモン添加培地における透過性コラーゲン基質支持体において培養する｛Ｗｕ他  Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐ  Ｄｉｓ  １３２，３１１−３２０（１９８５）｝。細胞を、３７℃でインキュベートし、密集状態まで育てる。経上皮組織抵抗の発達をモニターし、細胞間の密着結合の形成を測定する。密着結合の形成が確認された後、培養物を含む基質支持体を、改良Ｕｓｉｎｇチャンバーにのせた。
【００７８】
培養されたヒト気道上皮組織を、Ｋｒｅｂｓ  Ｂｉｏｃａｒｂｏｎａｔｅ  Ｒｉｎｇｅｒの粘膜下溶液｛ＫＢＲ（ｍＭ）、１４０Ｎａ＋、１２０Ｃｌ−、５．２Ｋ＋、２５ＨＣＯ３−、２．４ＨＰＯ４２−、０．４ＨＰＯ４−、１．１Ｃａ２＋、１．２Ｍｇ２＋、及び５．２グルコース、ｐＨ７．４｝を有するＵｓｉｎｇチャンバーにのせる。管腔表面を、ＫＢｒにより、又は高Ｋ＋、低Ｃｌ−Ｒｉｎｇｅｒ｛（ｍＭ）、４０Ｎａ＋、１００Ｋ＋、４．５Ｃｌ−、１２０グルコナート、２５ＨＣＯ３−、２．４ＨＰＯ４２−、０．４ＨＰＯ４−、１．１Ｃａ２＋、１．２Ｍｇ２＋、及び５．２グルコース、ｐＨ７．４｝により浸す。
【００７９】
短絡回路電流（Ｉｓｃ）、経上皮電位差、及び抵抗を含む生体電気特性を測定する。Ｉｓｃを、デジタル電圧計で測定し、そして、ストリップチャート式記録計にプロットする。開路電位を定期的に記録し、コンダクタンスを、１０ｍＶ電圧パルスに応答する電流偏差により電圧固定法で測定する。Ｉｓｃにおける増大は、液体輸送、及び気道の粘膜毛様体クリアランスの促進を導くイオン輸送の活性の指標である。
【００８０】
Ｉｓｃの安定基準を記録し、アミロイド（１００μＭ）を、溶液に添加し、ナトリウム吸収をブロックするために先端面を浸す。これらの条件下で測定された残留Ｉｓｃは、塩化物分泌によく似ている｛Ｂｏｕｃｈｅｒ，他，J．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７８：１２４５（１９８６）；Ｗｉｌｌｕｍｓｅｎ，他，Ａｍ  J  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２５６：Ｃ２２６−Ｃ２３３；Ｃ１０３３−Ｃ１０４４；Ｃ１０４５−Ｃ１０５３（１９８９）｝。安定基準を記録した後、モノ−ベンジルアセタールＵＰ３Ｕの如き化合物に対する選択的Ｐ２Ｙ６の溶液を、上皮組織培養物の先端面を浸すチャンバーに添加する。Ｉｓｃにおける変化を記録する。濃度反応曲線を、０．５ｌｏｇステップにおいて試験化合物のより高い濃度の累積加法により得る。
【００８１】
化合物に対するＰ２Ｙ６アゴニストは、用量依存的に短絡回路電流（Ｉｓｃ）を増大し、塩化物の分泌、及び水の増大を示し、それ故、気道の水和を促進する。
【００８２】
実施例４
繊毛ビート周波数
繊毛に関するモノ−ベンジルアセタールＵＰ３Ｕの如き選択的Ｐ２Ｙ６アゴニストの効果を、既に記載された技術を使用して、ヒト個人の繊毛鼻上皮組織細胞について測定する（Ｇｅａｒｙ他，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６８，Ｌ１０２１−８（１９９５）；Ｍｏｒｓｅ他，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８０：Ｃ１４８５−４９７（２００１）｝。簡潔に、上皮組織細胞を、ヒト鼻甲介のプロテアーゼ消化物から回収し、正常な被験者から、並びに嚢胞性繊維症、慢性気管支炎、原発性線毛機能不全症、及びＣＯＰＤの如き肺疾患を有する患者から入手する。当該細胞を、３００，０００細胞個／ｃｍ２の密度で１２−ｍｍのＣｏｓｔａｒ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−Ｃｏｌ細胞培養支持体に蒔き、空気の大気（５％ＣＯ２）中、３７℃で、ホルモン添加培養培地｛Ｇｒａｙ他，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  １４：１０４−１１２（１９９６）｝中で一晩インキュベートし、その後、非接着性細胞を洗浄して取り除き、基質に接着している繊毛細胞の少量の塊として、表層上皮の少量の組織片を明らかにする。これらの作成物を４日間以に使用する。上皮組織片を有するＴｒａｎｓｗｅｌｌ−Ｃｏｌ細胞培養支持体を、倒立顕微鏡のステージ上のチャンバーに乗せ、管腔的に表面かん流し、そして既に記載されているように（Ｍｏｒｓｅ他，２００１）暖める（３５℃）。対照表面かん流、及びしょう液は、以下の組成：１２５ｍＭのＮａＣｌ、５．２ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１．２ｍＭのＣａＣｌ２、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのＴＥＳ、５ｍＭのグルコース（５％ＣＯ２を有する気体のときｐＨ７．４）を有するＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ重炭酸塩（ＫＲＢ）である。
【００８３】
移植された天然繊毛細胞を、Ｚｅｉｓｓ  ＩＭ顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）及び３２×対物を使用する位相差顕微鏡により見て、そしてその画像をＤａｇｅ７２モノクロ電荷結合素子ビデオカメラ（Ｄａｇｅ−ＭＴＩ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｃｉｔｙ，ＩＮ）で観察する。繊毛ビート周波数（ＣＢＦ）を、既に記載されたように（Ｍｏｒｓｅ他，２００１）、繊毛のビートを検出するために、ビデオモニターの表面上の個々の細胞の画像上に位置付けられる光検出器を使用して測定する。全試験において、培養物を、ＫＲＢを有する表面かん流の１．５時間で平衡にする。次いで、各作成物を、試験化合物の可変濃度と共に、次いで、１００μＭのＵＤＰと共に、２つの１０分間基準、及びアゴニスト刺激期間に供する。データを、ＣＢＦの測定のために毎分記録する。３０分間のＫＲＢのウォッシュアウト期間により、その後の第２基準期間から試験化合物チャレンジを分離する。各試験の高速フーリエ変換分析の後、得られたＣＢＦデータを、各平均基準ＣＢＦに標準化する。試験化合物濃度反応研究のために、頂点に達するＣＢＦを得て、１００μＭのＵＤＰ入手されたものと比較する。データを、基準と相対的に、頂点に達する反応の平均±Ｓ．Ｅ．として記録する。３又はそれより多い患者の組織由来の培養物を使用する。
【００８４】
Ｐ２Ｙ６アゴニスト化合物は、用量依存的に、正常な被験者から単離された繊毛、及び嚢胞性繊維症、慢性気管支炎、原発性線毛機能不全症、及びＣＯＰＤの如き肺疾患を有する患者から単離された繊毛のビート周波数を増大し、粘膜毛様体クリアランスに関する改良を示す。
【００８５】
実施例５
ムチン分泌
レチノイン酸の存在下で凍結保存され出荷される、正常なヒト気管／気管支上皮細胞（ドナー特異的、非喫煙者）を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ；ＣＣ−２５４０）から入手する。当該細胞を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−Ｃｌｅａｒ培養インサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ  ３４６０；Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、最初に蒔き、気管支上皮成長培地（ＢＥＧＭ）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ；ＣＣ−３１７０  ＢＥＧＭ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ  ベース培地、プラス補給剤）において培養する。２〜３日間の培養後、細胞を、Ｇｒａｙ他（１９９６）により既に記載されているように、気／液界面（ＡＬＩ）培養条件に交換する。腹水（カリフォルニア大学，Ｄａｖｉｓ）からプロテインＧカラム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で精製された１７Ｑ２ムチン抗体を、ＥＺ−Ｌｉｎｋマレイミド活性化アルカリホスファターゼキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、アルカリホスファターゼに連結する。
【００８６】
モノ−ベンジルアセタールＵＰ３Ｕの如き選択的Ｐ２Ｙ６アゴニスト化合物の既知の量を、培養物の先端面に添加し、３７℃で２時間インキュベートする。インキュベーションの終わりに、ムチン含有細胞上清を先端区画から除去し、−７０℃で保存する。ムチン産生物の見積もりを、既に記載された抗原／抗体酵素結合免疫アッセイ｛Ｗｒｉｇｈｔ他，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７１：Ｌ８５４−ｌ８６１（１９９６）｝を使用して実施する。
【００８７】
実施例６
気管粘液速度
試験の前に、実験動物の人道的な配慮及び使用を確約するために、Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの許可を得る。成体雌羊、体重２５〜４５ｋｇを、改良ショッピングカートに適合させた特別の体用装着帯により立位で抑制する。動物の頭を固定し、鼻腔の局部麻酔を２％リドカインで導入する。２％リドカイン溶液による鼻腔の局所麻酔後、当該ヒツジに、直径７．５ｃｍの気管内チューブ（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を鼻に挿管する、そしてそれは６ｃｍまで縮む。チューブのカフを声帯（蛍光透視法により確認）のちょうど下に置き、気管表面領域の最大暴露を可能とする。挿管後、当該動物を、気管粘液速度（ＴＭＶ）の測定を始める前に、２０分間、環境に順応させ得る。一連の試験の間、Ｂｅｎｎｅｔｔ加湿器（Ｐｕｒｉｔａｎ−Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）を使用して、吸気を暖め、加湿する。気管内チューブカフの膨張により生ずるＴＭＶの可能性のある機能障害を最小化するため、当該カフを、薬物デリバリーの期間を除き、試験を通じて収縮させる。当該ヒツジに定期的に水道水を補給し、脱水を避ける（Ｓａｂａｔｅｒ他，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ８７：２１９１−２１９６（１９９９）｝。ＴＭＶを、既に記載されている｛Ｓａｂａｔｅｒ他，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １５４：３４１−３４５（１９９６）、Ｓａｂａｔｅｒ他，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ８７：２１９１−２１９６（１９９９）｝Ｘ線撮影技術により、生体内で測定する。直径１ｍｍ、厚さ０．８ｍｍ、及び重さ１．８ｍｇの、１０〜１２放射線不透過テフロン（登録商標）／ビスマス・トリオキシドディスクを、気管中に吹き入れる。３〜４ｌ／分の流量での連続的圧縮空気の源に連結された改良吸引カテーテルを、気管内チューブ経由で粒子を導入するために使用する。気管表面への接触がないように、カテーテルを気管内チューブのみの中に維持する。各ディスクの頭部軸速度を、ポータブル画像増強ユニットからビデオテープに記録する。各ディスク速度を、１分間の観察期間の各ディスクによる走行距離を測定することにより計算する。各ランについて、全ての各ディスク速度の平均値を計算する。既知の長さのＸ線不透過性指示マーカーを含むカラーを、試験の間、前記ヒツジに付け、標準として使用し、蛍光透視ユニットにおける固有の拡大効果を修正する。
【００８８】
基準ＴＭＶを得た後、モノ−ベンジルアセタールＵＰ３Ｕの如き化合物に対するＰ２Ｙ６のいくつかの濃度又はプラセボの４ｍｌアリコートを、無菌食塩水における噴霧により投与する。剤は、呼吸を経由し、Ｐａｒｉ  ＬＣ  Ｓｔａｒネブライザー（Ｐａｒｉ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  ＶＡ）で、動物にデリバリーされる。ネブライザーを８ＬＰＭの流速で大気により推進し、そして乾燥に達するまでに時間は、約１０〜１２分間である。ＴＭＶを、薬物投与後すぐ（０時間）、並びに処置後０．２５、０．５、１、２、４、６、及び８時間で測定する。
【００８９】
Ｐ２Ｙ６アゴニスト化合物は、薬物依存的にヒツジ気管からＸ線不透過性粒子の頭部軸移動の速度を増大し、当該化合物が気道のクリアランスを増大することを示す。
【００９０】
実施例７
原発性線毛機能不全症の治療
モノベンジルアセタールＵＰ３Ｐの如き選択的Ｐ２Ｙ６アゴニスト化合物を原発性線毛機能不全症（ＰＣＤ）（鼻の生体検査からの繊毛超微細構造欠陥の電子顕微鏡分析により確認される。）と診断された患者に投与する。有効性Ｐ２Ｙ６受容体アゴニストを、ガンマカメラを使用する核医学検査技術により肺からの吸入放射性標識粒子のクリアランスを測定することにより測定する。各患者は、テクネチウム９９ｍ（９９Ｔｃ−Ｆｅ２Ｏ３）で標識された酸化鉄のエアロゾルを吸入する。患者は、約５分間、当該エアロゾルを吸入する。次いで、患者をガンマカメラの前に座らせ、そしてさらに約２０分間、当該患者は、生理食塩水対照か有効濃度のＰ２Ｙ６受容体アゴニスト（０．１〜１００ｍｇ／ｍＬ）のいずれかを無作為に吸入する。この吸入後、患者はガンマカメラの前に２時間座ったままとなり、放射性標識された酸化鉄のクリアランスを測定する。原発性線毛機能不全症を治療する際のＰ２Ｙ６受容体アゴニストの効果を、生理食塩水担体のみと比較して、９９Ｔｃ−Ｆｅ２Ｏ３の咳クリアランスにおける改善により測定する。
【００９１】
実施例８
慢性気管支炎の治療
モノベンジルアセタールＵＰ３Ｐの如き選択的Ｐ２Ｙ６アゴニスト化合物を慢性気管支炎（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｏｒａｃｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｙの定義に基づくと、少なくとも連続２年間の内のその年の少なくとも３ヶ月間のほとんどの期間、過剰な粘液作製が生じている。）と診断された患者に投与する。Ｐ２Ｙ６受容体アゴニストの有効性を、ガンマカメラを使用する核医学検査技術により肺からの吸入放射性標識粒子のクリアランスを測定することにより測定する。各患者は、テクネチウム９９ｍ（９９Ｔｃ−Ｆｅ２Ｏ３）で標識された酸化鉄のエアロゾルを吸入する。患者は、約５分間、当該エアロゾルを吸入する。次いで、患者をガンマカメラの前に座らせ、そしてさらに約２０分間、当該患者は、生理食塩水対照か有効濃度のＰ２Ｙ６受容体アゴニスト（０．１〜１００ｍｇ／ｍＬ）のいずれかを無作為に吸入する。この吸入後、患者はガンマカメラの前に２時間座ったままとなり、放射性標識された酸化鉄のクリアランスを測定する。いくつかの試験は、この期間の間、対照とされた咳をする患者を含み、そして痰を集め、重さを量り、そして試験を通じて量を記録し、痰レオロジー又は鉄含量の更なる分析のために保管する。患者は、試験における好適な薬剤量に応じて、この実施を次の日も繰り返す。慢性気管支炎を治療する際の吸入Ｐ２Ｙ６受容体アゴニストの効果を、生理食塩水担体のみと比較して、９９Ｔｃ−Ｆｅ２Ｏ３の咳クリアランスにおける改善により測定する。
【００９２】
各吸入暴露の約２４時間後、患者を、肺の残留放射能の３０分間のスキャンに供する。この時間の間、当該患者は、ガンマカメラの前に引き続き座る。
【００９３】
安全性データを、全投与期間において、吸入前、吸入中、吸入後に、心拍数、ＥＣＧ、血圧、パルス酸素濃度計による酸化ヘモグロビン飽和度を測定することにより回収する。当該試験の全期間に渡り、全患者について、試験薬物の吸入から始まり２４時間後の３０分間のスキャニング後で終わる各投与期間、いずれかの副作用について測定する。
【００９４】
実施例９
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療
モノベンジルアセタールＵＰ３Ｐの如き選択的Ｐ２Ｙ６アゴニスト化合物を慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）と診断された患者であって、完全に可逆的ではない気道収縮を有する患者に投与する。当該気道収縮は、通常、進行性であり、有毒な粒子又は気体に対する肺の異常な炎症反応に関連する。患者は、咳、痰作製又は呼吸困難（努力呼吸又は苦しい呼吸）、及び／又は疾患へのリスク要因への暴露歴の症状を有する。診断を、肺活量測定（肺機能、及び肺気量の測定）、並びに呼吸の異常な短さや増大した努力呼気時間の如き臨床症状及び兆候により確固たるものとする。Ｐ２Ｙ６受容体アゴニストの有効性を、ガンマカメラを使用する核医学検査技術により肺からの吸入放射性標識粒子のクリアランスを測定することにより測定する。各患者は、テクネチウム９９ｍ（９９Ｔｃ−Ｆｅ２Ｏ３）で標識された酸化鉄のエアロゾルを吸入する。患者は、約５分間、当該エアロゾルを吸入する。次いで、患者をガンマカメラの前に座らせ、そしてさらに約２０分間、当該患者は、生理食塩水対照か有効濃度のＰ２Ｙ６受容体アゴニスト（０．１〜１００ｍｇ／ｍＬ）のいずれかを無作為に吸入する。この吸入後、患者はガンマカメラの前に２時間座ったままとなり、放射性標識された酸化鉄のクリアランスを測定する。いくつかの試験は、この期間の間、対照とされた咳をする患者を含み、そして痰を集め、重さを量り、そして試験を通じて量を記録し、痰レオロジー又は鉄含量の更なる分析のために保管する。患者は、試験における好適な薬剤量に応じて、この実施を次の日も繰り返す。ＣＯＰＤを治療する際の吸入Ｐ２Ｙ６受容体アゴニストの効果を、生理食塩水担体のみと比較して、９９Ｔｃ−Ｆｅ２Ｏ３の咳クリアランスにおける改善により測定する。
【００９５】
各吸入暴露の約２４時間後、患者を、肺の残留放射能の３０分間のスキャンに供する。この時間の間、当該患者は、ガンマカメラの前に引き続き座る。
【００９６】
安全性データを、全投与期間において、吸入前、吸入中、吸入後に、心拍数、ＥＣＧ、血圧、パルス酸素濃度計による酸化ヘモグロビン飽和度を測定することにより回収する。当該試験の全期間に渡り、全患者について、試験薬物の吸入から始まり２４時間後の３０分間のスキャニング後で終わる各投与期間、いずれかの副作用について測定する。
【００９７】
本発明は、目下好ましい態様を参照して記載されるけれども、本発明の範囲を逸脱することなく様々な改良が可能であることを理解すべきである。
【国際調査報告】
2009500354.tif 000021