(57)【要約】  本発明は、少なくとも３個のＣ原子を有するか、または少なくとも２個のＣ原子と少なくとも１個のＮ原子を有する少なくとも１種の有機化合物を、発酵により製造する方法に関し、該方法は、以下のステップ：    （ａ１）デンプン供給材料を粉砕し、それによりデンプン供給材料の非デンプン性固体成分の少なくとも一部分を含むミルベースを得るステップ；    （ａ２）前記ミルベースを水性液体に懸濁し、少なくとも１種のデンプン液化酵素の存在下にて水性液体中に存在するミルベースを液化し、デンプン供給材料の非デンプン性固体成分の少なくとも一部分を含む水性デキストリン含有培地（１）を得るステップ；および    （ｂ）前記有機化合物の過剰生産が可能な微生物の培養のための発酵に、前記水性デキストリン含有培地（１）を用いるステップを含み、ここで、デキストリンを単糖に加水分解する酵素を、用いるデンプン供給材料の総重量に基づき０．００１重量％未満添加するか、または添加しない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３個のＣ原子を有するか、または少なくとも２個のＣ原子と少なくとも１個のＮ原子を有する少なくとも１種の有機化合物を、発酵により製造する方法であって、以下のステップ：
（ａ１）デンプン供給材料を粉砕し、それによりデンプン供給材料の非デンプン性固体成分の少なくとも一部分を含むミルベースを得るステップ；
（ａ２）前記ミルベースを水性液体に懸濁し、少なくとも１種のデンプン液化酵素の存在下にて水性液体中に存在するミルベースを液化し、デンプン供給材料の非デンプン性固体成分の少なくとも一部分を含む水性デキストリン含有培地（１）を得るステップ；および
（ｂ）前記有機化合物の過剰生産が可能な微生物の培養のための発酵に、前記水性デキストリン含有培地（１）を用いるステップ
を含み、ここで、デキストリンを単糖に加水分解する酵素を、用いるデンプン供給材料の総重量に基づき０．００１重量％未満添加するか、または添加しない、上記方法。
【請求項２】
水性液体中のミルベースの懸濁物を、前記デンプン供給材料中に存在するデンプンのアルファ化（gelatinization）温度より高い温度まで加熱する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
加熱をデンプン液化酵素の存在下で行う、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
液化ステップの間に、ミルベースの少なくとも一部分を水性液体中に連続的にまたはバッチ方式で添加する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
得られる水性デキストリン含有培地（１）が、該培地（１）の総重量に基づき少なくとも５０重量％の乾燥物含量を有する量でミルベースを水性液体中に懸濁し、そこで液化する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
得られる水性デキストリン含有培地（１）が、該培地（１）の総重量に基づき少なくとも４０重量％のグルコース相当物濃度を有する量でミルベースを水性液体中に懸濁し、そこで液化する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物が、デキストリンを単糖に加水分解する酵素を産生する微生物から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
以下のステップ：
（ｂ１）水性発酵培地（２）中で、前記有機化合物を過剰生産することが可能な微生物を培養するステップ；および
（ｂ２）デキストリン含有培地（１）を発酵培地（２）に添加し、そこで培地（１）中に存在するデキストリンが、該有機化合物を過剰生産する微生物によって代謝されるステップ
をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ１）の発酵培地（２）が、原則として、培地（１）、前記有機化合物の過剰生産が可能な微生物、通常の培地成分、および適宜、希釈のための水を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ１）において、発酵培地（２）中の糖総含量が、グルコース相当物として計算し、かつ発酵培地（２）の総重量に基づき、６〜３０重量％の範囲となる量の培地（１）を、発酵培地（２）を作製するのに用いる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ１）のデンプン供給材料として穀粒を用いる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ミルベースが、デンプン供給材料の非デンプン性固体成分全体の少なくとも２０重量％を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
デンプン液化酵素がα−アミラーゼである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
製造される有機化合物が、ヒドロキシル基が結合していてもよく、３〜１０個の炭素原子を有するモノカルボン酸、ジカルボン酸およびトリカルボン酸、タンパク質原性アミノ酸および非タンパク質原性アミノ酸、プリン塩基、ピリミジン塩基；ヌクレオシド、ヌクレオチド、脂質；飽和および不飽和脂肪酸；４〜１０個の炭素原子を有するジオール、３個以上のヒドロキシル基を有する多価アルコール、少なくとも４個の炭素原子を有する長鎖アルコール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミン、プロビタミン、補因子、栄養補助剤、タンパク質、カロテノイド、３〜１０個の炭素原子を有するケトン、ラクトン、生体ポリマーならびにシクロデキストリンより選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
発酵に用いる微生物が、以下の代謝産物：酵素、アミノ酸、ビタミン、二糖、３〜１０個のＣ原子を有する脂肪族モノカルボン酸、ジカルボン酸およびトリカルボン酸、３〜１０個のＣ原子を有する脂肪族ヒドロキシカルボン酸、３〜１０個のＣ原子を有するケトン、４〜１０個のＣ原子を有するアルカノール、３〜８個のＣ原子を有するアルカンジオールならびにポリヒドロキシアルカノアートのうち少なくとも１つを過剰生産する天然または組み換え微生物より選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
微生物が、１種以上のアミノ酸を過剰生産するものより選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
微生物が、３〜１０個のＣ原子を有する１種以上の脂肪族モノカルボン酸、ジカルボン酸およびトリカルボン酸を過剰生産するものより選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
微生物が、１種以上の酵素を過剰生産するものより選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
微生物が、フィターゼを過剰生産するものより選択される、請求項１５または１８に記載の方法。
【請求項２０】
微生物が、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、バシラス属（Bacillus）、アッシビヤ属（Ashbya）、エシェリキア属（Escherichia）、アスペルギルス属（Aspergillus）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、アクチノバシラス属（Actinobacillus）、アネロビオスピリラム属（Anaerobiospirillum）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、クロストリジウム属（Clostridium）およびリゾプス属（Rhizopus）より選択される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
微生物が、コリネバクテリウム属（genus Corynebacterium）の株より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１種の微生物代謝産物が発酵液から枯渇するか単離され、かつ発酵液の揮発性成分が続いて実質的に除去され、固体または半固体タンパク質組成物が得られる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
発酵液の揮発性成分の少なくとも一部が、非揮発性微生物代謝産物の事前の単離または枯渇、および適宜、固体成分の事前の除去なしに除去され、非揮発性微生物代謝産物の固体調製物が得られる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも３個のＣ原子を有するか、または少なくとも２個のＣ原子と少なくとも１個のＮ原子を有する有機化合物の発酵製造に関し、該製造では、微生物を培養するために、デンプン供給材料の非デンプン性固体成分の少なくとも一部分を含むデキストリン含有培地を使用する。
【背景技術】
【０００２】
糖含有液体培地は多数の発酵プロセスの基本的な栄養供給源である；該培地中に存在する糖成分は、用いられる微生物によって代謝され、有益な有機生成物を生じさせる。このように製造される微生物代謝産物、すなわち有機化合物の範囲には、例えば、低分子量の揮発性化合物（例えばエタノール）、非揮発性代謝産物（例えばアミノ酸、ビタミンおよびカロテノイド）、および多数の他の物質が含まれる。
【０００３】
種々のプロセス条件に応じて、異なる炭素供給材料が、そのような一般に公知の微生物の発酵プロセスに利用される。それらは、ビート由来の純粋なショ糖、および高揮発度糖蜜（high-test molasses）（転化サトウキビ糖蜜（inverted sugarcane molasses））として知られるサトウキビ糖蜜から、デンプン加水分解物由来のグルコースにまでおよぶ。さらに、Ｌ−リジンの生物工学的製造のために工業規模で使用できる補基質として、酢酸およびエタノールが挙げられる（Pfefferle et al., Biotechnological Manufacture of Lysine, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol. 79 (2003), 59-112）。
【０００４】
上述の炭素供給材料に基づいて、微生物代謝産物の、糖ベースの発酵製造に関する種々の方法および手順が確立されている。例としてＬ−リジンを考慮すると、前記方法および手順は、例えばPfefferleら（上掲）によって、菌株開発、方法開発および工業的製造に関して報告されている。
【０００５】
微生物代謝産物の微生物媒介性の発酵製造のための重要な炭素供給材料はデンプンである。デンプンは、まず、先行する反応ステップで液化および糖化されなければならない。その後、炭素供給材料として発酵で利用することができる。この目的を達成するために、デンプンは、通常、天然デンプン供給材料、例えばジャガイモ、キャッサバ、穀類（例えばコムギ、トウモロコシ、オオムギ、ライムギ、ライコムギまたはイネ）から予備精製された形式で取得され、その後、酵素により液化および糖化され、続いて、実際の発酵で所望の代謝産物を製造するために用いられる。
【０００６】
そのような予備精製されたデンプン供給材料の使用に加えて、微生物代謝産物の発酵製造用の炭素供給材料の製造に、前処理されていないデンプン供給材料を使用することも報告されている。典型的には、デンプン供給材料は最初に挽いて粉砕される。そしてミルベース（Mahlgut）が液化および糖化に付される。このミルベースは、天然に、デンプンに加えて、発酵に悪影響を与える可能性がある一連の非デンプン性成分を含むため、通常、これらの成分は発酵前に除去される。除去は、粉砕直後（WO 02/077252; JP 2001-072701; JP 56-169594; CN 1218111）、液化後（WO 02/077252; CN 1173541）または糖化後（CN 1266102; Beukema et al.: Production of fermentation syrups by enzymatic hydrolysis of potatoes; potato saccharification to give culture medium (Conference Abstract), Symp. Biotechnol. Res. Neth. (1983), 6; NL8302229）に行うことができる。しかし、すべての変法には、実質的に純粋なデンプン加水分解物を発酵で使用することが含まれる。
【０００７】
有機化合物の発酵製造のためのさらに最近のプロセスは、特に、発酵前のデンプン供給材料の精製、例えば液化および糖化されたデンプン溶液の精製を含み（JP 57159500）、または再生可能資源からの発酵培地の製造を可能にすることを目的にする方法を提供する（EP 1205557）。
【０００８】
一方で、未処理のデンプン供給材料はバイオエタノールの発酵製造で大規模に使用されることが知られている。この場合、通常、穀類全粒であるデンプン供給材料は、まず、乾式製粉に付され、その後、デンプン供給材料のデンプン成分が酵素を使用して加水分解される。この場合、加水分解は、例えば撹拌容器中でバッチ方式で、あるいは例えばジェット調理器具中で連続的に実施することができる。好適な方法の説明は、例えば「The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries」, Jaques et al. (Ed.), Nottingham Univ. Press 1995, ISBN 1-8977676-735, Chapter 2, pp. 7-23, およびMcAloon et al.,「Determining the cost of producing ethanol from corn starch and lignocellulosic feedstocks」, NREL/TP-580-28893, National Renewable Energy Laboratory, October 2000に見出せる。
【０００９】
バイオエタノールの発酵製造では、蒸留によって有用な生成物が取得されるため、乾式製粉プロセス由来の予備精製されていない形態のデンプン供給材料の使用は重大な問題にはならない。しかし、他の微生物代謝産物の製造に乾式製粉法を使用する場合、糖液経由で発酵に導入される固体流（Festoffstrom）が問題になる。なぜなら、固体流は発酵に対して、例えば酸素移動速度または使用される微生物の酸素要求に関する悪影響を有するだけでなく（これに関しては、Mersmann, A. et al.: Selection and Design of Aerobic Bioreactors, Chem. Eng. Technol. 13 (1990), 357-370を参照のこと）、その後の加工をかなり複雑にする可能性がある。
【００１０】
さらに、固体導入の結果、デンプン含有懸濁液の製造中でさえ、懸濁液の粘性が臨界値に達する可能性があり、その結果、例えば３０重量％を超えるトウモロコシ粉を含有する懸濁液はもはや水中に均一に混和されない（Industrial Enzymology, 2nd Ed., T. Godfrey, S. West, 1996）。これは、従来の手順でのグルコース濃度を制限する。バイオエタノールの発酵製造では、発酵に用いられる酵母に対する生成物の毒性のために、いかなる場合においても実用的な様式で変換できない高い濃度では、このことはもはや関係がない。
【００１１】
低い糖濃度の糖含有培地を発酵に供給することは、原理的に、エタノール以外の有機代謝産物の発酵製造において不利である。なぜなら、この手順が発酵液の過度の希釈を生じさせ、その結果、達成できる目的の生成物の終濃度が低下し、それにより、まず、これらの生成物を発酵培地から取得する場合のコストが増加し、かつ空時収量が減少するからである。特に、大量のバイオエタノールの製造のために製造され、かつ通常は約３０または３３重量％以下の低い糖またはグルコース濃度を有するデンプン加水分解物を、他の化学物質の製造のための少量の二次発酵に部分的に供給することを目的にする場合に、これらの考察は重要である。
【００１２】
一方で、発酵培地中の高濃度の代謝可能な単糖は、発酵の阻害または微生物の成長の阻害を生じさせるか、または用いられる微生物の代謝の変化を導く可能性がある。例えば大腸菌（E. coli）では、過度に高濃度の遊離グルコースは有機酸（酢酸塩）の形成を生じさせ、一方、例えばサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisae）は、そのような場合に、たとえ通気された発酵槽中に十分な酸素が存在しても、発酵に切り替わる（クラブトリー効果）。したがって、発酵に供給される糖含有培地中の高濃度の代謝可能な単糖は、供給期間中に発酵に有利な効果を有しうる。供給流によって追加の糖が発酵に供給される前に、バッチ期間、すなわち発酵バッチ中での微生物の増殖期間中に、高濃度の培地を使用することもまた問題であり、なぜなら、多数の菌株がその成長に６重量％未満のグルコース濃度を必要とするからである。
【００１３】
これらの困難および制限のせいで、バイオエタノールの製造に広く用いられている乾式製粉法は、現在まで、エタノール以外の微生物代謝産物の発酵製造において特別な経済的重要性を有していない。
【００１４】
従来、乾式製粉の考え方および、この方法に関連して原理的に存在する利点を、微生物代謝産物の工業的規模の製造に応用する試みは、デンプン供給材料としてキャッサバを使用して報告されているだけである。例えばJP 2001/275693では、乾燥状態で粉砕された皮むき済みキャッサバ塊茎をデンプン供給材料として用いる、アミノ酸の発酵製造のための方法が記載されている。該方法を実施するために、ミルベースの粒径を１５０μｍ以下に調節することが必要である。この目的で用いられるろ過ステップでは、使用されるミルベースの、非デンプン含有成分を含む部分を除去した後、得られたデンプンを液化／糖化し、その後発酵させる。この方法では、中程度の糖濃度が得られる。アミノ酸含有飼料添加物の製造に関してJP 2001/309751に同様の方法が記載されている。
【００１５】
発酵に用いられる液体培地中の高い糖濃度は、本出願人のWO 2005/116228（PCT/EP2005/005728）に記載の方法によって、糖化用の、デンプン供給材料の固体の非デンプン性成分を主に含むミルベースを使用することによって達成することができる。驚くべきことに、デンプン供給材料中に存在する固体の非デンプン性成分は発酵前に除去する必要がないことが明らかになった。上記方法は、液化デンプン供給材料のｉｎ−ｓｉｔｕ糖化中に実施することができる。穀粒より選択されるデンプン供給材料を使用する同様の方法が本出願人のPCT/EP2006/066057（先の特許出願DE 102005042541.0）に記載されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、有機化合物の発酵製造のための別の方法であって、デンプン供給材料中に存在する非デンプン性固体成分をあらかじめ、少なくとも完全には、除去する必要がない方法を提供することである。特に、該方法は比較的単純な設備しか必要とせず、かつ高い糖濃度の培地の使用を可能にするべきである。さらに、使用される培地を容易に操作できること、および発酵プロセスにおいてそれらを問題なく使用できることによって際立っていなければならない。特に、該方法は、デンプン供給材料として穀類の使用を可能にしなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
驚くべきことに、本発明者らは、有機化合物を製造するための発酵プロセスが、本質的に高い固体導入にもかかわらず、デンプン供給材料を、該デンプン供給材料の非デンプン性固体成分のすべてをあらかじめ除去することなく、粉砕および液化することによってデキストリン含有培地（１）を製造し、かつこのデキストリン含有培地を、糖化酵素を加えずに、発酵に用いることによって効率的な様式で実施できることを見出した。
【００１８】
ゆえに、本発明は、少なくとも３個のＣ原子を有するか、または少なくとも２個のＣ原子と少なくとも１個のＮ原子を有する少なくとも１種の有機化合物を、発酵により製造する方法であって、以下のステップ：
（ａ１）デンプン供給材料を粉砕し、それによりデンプン供給材料の非デンプン性固体成分の少なくとも一部分を含むミルベース（Mahlgut）を得るステップ；
（ａ２）前記ミルベースを水性液体に懸濁し、少なくとも１種のデンプン液化酵素の存在下にて水性液体中に存在するミルベースを液化し、デンプン供給材料の非デンプン性固体成分の少なくとも一部分を含む水性デキストリン含有培地（１）を得るステップ；および
（ｂ）前記有機化合物の過剰生産が可能な微生物の培養のための発酵に、前記水性デキストリン含有培地（１）を用いるステップ
を含む方法に関し、ここで、デキストリンを単糖に加水分解する酵素を、用いるデンプン供給材料の総重量に基づき０．００１重量％未満の量で添加するか、または添加しない。
【００１９】
デキストリン含有培地（１）中の、用いられるデンプン供給材料の固体の非デンプン性成分の含量にかかわらず、本発明の発酵プロセスは、効率的な様式で、糖化酵素の添加を必要とせずに実施することができる。しかし、完全な糖化を実施するために十分ではない少量の、典型的には用いるデンプン供給材料の総重量に基づき０．００１重量％未満、特に０．０００５重量％未満の糖化酵素を加えてもよい。
【００２０】
微生物を培養するためにデキストリンを使用する結果、発酵培地中の高濃度の代謝可能な糖が、バッチ期間および供給期間の両期間において達成される可能性があるが、これが、望ましくない二次反応を生じさせることはなく、発酵液の望ましくない希釈は回避される。さらに、高いミルベース濃度でのデンプン供給材料の液化中に生じうる粘性の問題は、本発明の方法によって大部分が回避される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本明細書中では、以下、用語「デキストリン含有培地」および「デキストリン含有液体」は同義語として使用される。当業者は、発酵に用いられる微生物が、糖化酵素の外部添加によってデキストリンが二糖および／または単糖に加水分解される必要なく、水性デキストリン含有培地中に存在するデキストリンを代謝可能でなければならないことを認識するであろう。デキストリンは、おそらく、菌株に本来備わっている糖化酵素、例えば菌株に本来備わっているグルコアミラーゼによって加水分解された後に、微生物によって代謝される。本発明の方法の特に有益な態様は、後者の場合に、発酵中の糖化率、特にグルコースの遊離が、第一にバイオマスの量によって、および第二に菌株に本来備わっている糖化酵素の発現レベルによって微生物の要求に自動的に適合することである。
【００２２】
本明細書中では、以下、用語「液化」とは、加水分解によりデンプンをオリゴ糖、特にデキストリンに分解することを意味する。
【００２３】
本明細書中では、以下、用語「糖化」または「糖化すること」とは、デキストリンを単糖、特にグルコース等の単糖に加水分解することを意味する。したがって、「糖化酵素」は、デキストリンを単糖に加水分解する酵素を意味すると理解される。
【００２４】
本明細書中では、以下、用語「デキストリン」は、加水分解によるデンプンの分解の結果として得られるオリゴ糖であって、一般に、３〜１８個、特に６〜１２個の単糖単位、特にグルコース単位からなるオリゴ糖を意味すると理解される。
【００２５】
用語「グルコース相当物（glucose equivalents）の含量」および「糖濃度（sugar concentration）」とは、発酵に潜在的に利用可能な、培地中の単糖、二糖およびオリゴ糖の総濃度を表す。用語「グルコース相当物」には、グルコース以外の代謝可能な糖または糖単位も含まれる。
【００２６】
本明細書中では、以下、用語「過剰生産する」または「過剰生産」は、微生物に関する場合、１以上のその代謝産物を、該微生物の増殖に必要とされる量を超える量で生産し、その結果、発酵培地中での蓄積が生じ、該蓄積が細胞外または細胞内様式で生じうる該微生物の特性を特定するために使用される。
【００２７】
本発明の方法のためのデンプン供給材料として好適であるのは、主に、乾燥穀類または種子であり、その場合、デンプン量は乾燥状態で少なくとも４０重量％、好ましくは少なくとも５０重量％になる。それらは、現在大規模に栽培されている多数の穀類植物、例えばトウモロコシ、コムギ、カラスムギ、オオムギ、ライムギ、ライコムギ、イネ、およびサトウダイコン、ジャガイモ、キャッサバおよび種々のモロコシおよびキビ種、例えばサトウモロコシおよびミロにおいて見出される。デンプン供給材料は、好ましくは、穀類のうちから、特にトウモロコシ、ライムギ、ライコムギおよびコムギ穀粒のうちから選択される。原理的に、本発明の方法は、同様のデンプン供給材料、例えば種々のデンプン含有穀類または種子の混合物を用いて実施することもできる。
【００２８】
デキストリン含有液体を製造するために、目的のデンプン供給材料をステップ（ａ１）で粉砕する。この作業は、液体、例えば水を添加するか、または添加せずに、好ましくは液体を添加せずに行う。乾式製粉を後の湿式製粉ステップと組み合わせることも可能である。
【００２９】
乾式製粉に典型的に用いられる装置は、ハンマーミル、ローターミルまたはローラーミルである；湿式粉砕に好適な装置は、パドルミキサー、撹拌ボールミル、循環ミル、ディスクミル、円環槽ミル、振動ミルまたはプラネタリーミルである。原理的に、他のミルもまた好適である。湿式粉砕に必要とされる液体の量は当業者が通常の実験で決定することができる。通常、乾燥物含量が１０〜２０重量％の範囲であるように調節される。
【００３０】
製粉では、以後のプロセスステップに好適な粒径をもたらす。これに関して、それは、ステップ（ａ１）の製粉ステップ、特に乾式製粉ステップで得られるミルベースが、１００〜６３０μｍの範囲の粒径の穀粉粒子、すなわち微粒子成分を３０〜１００重量％、好ましくは４０〜９５重量％、特に好ましくは５０〜９０重量％の量で有する場合に有利であることがわかっている。好ましくは、得られるミルベースは、１００μｍを超える粒径の、５０重量％の穀粉粒子を含む。一般に、少なくとも９５重量％の粉砕穀粉粒子は２ｍｍ未満の粒径を有する。これに関して、粒径は振動分析計を使用するスクリーン分析を用いて測定される。原理的には、高い生成物収率を得るために小さい粒径が有利である。しかし、過度に小さい粒径は、ミルベースが液化中または加工中、例えば発酵ステップ後の固体の乾燥中にスラリー化した場合に、問題を生じさせ、特に凝集塊形成／集塊に起因する問題を生じさせる可能性がある。
【００３１】
通常、穀粉は抽出率または穀粉グレードによって特徴づけられる。その互いの相関は、穀粉グレードの特性が抽出率の増加とともに高くなるというものである。抽出率は、用いるミルベースの１００重量部に基づく、得られた穀粉の重量に対応する。製粉プロセス中、最初に、例えば穀粒の内部由来の純粋な超微細穀粉が得られるが、さらなる製粉では、すなわち抽出率が増加すると、穀粉中の粗繊維の量および殻含量が増加し、デンプン含量が減少する。したがって、穀粉グレードとして知られる値に抽出率も反映される。穀粉グレードは穀粉（flours）、特に穀類の穀粉（cereal flours）を分類するための数値として使用され、穀粉の灰分含量に基づいている（灰基準として知られる）。穀粉グレードまたは型番号は、穀粉固体１００ｇが焼却された場合に後に残るｍｇ単位の灰（無機質）の量を示す。穀類の穀粉の場合、型番号が大きいほど高い抽出率を意味し、なぜなら、穀粒の核が約０．４重量％の灰を含むのに対し、殻は約５重量％の灰を含むからである。抽出率が低い場合、ゆえに穀類の穀粉は、粉砕胚乳、すなわち穀粒のデンプン成分から主に構成され；抽出率が高い場合、穀類の穀粉は、穀粒の粉砕されたタンパク質含有アリューロン層をも含み；穀粉の場合、それらは、タンパク質含有および脂肪含有胚の成分および種子殻の成分をも含み、それは生線維および灰を含む。本発明の目的では、高い抽出率、または大きい型番号の穀粉が原理的に好ましい。デンプン供給材料として穀類を使用する場合、無傷の穀粒をその殻と一緒に粉砕し、適切であればあらかじめ胚および殻を機械的に事前除去した後に、さらに加工することが好ましい。
【００３２】
本発明では、使用されるミルベースは、抽出率に対応して、粉砕される穀粒中に存在する非デンプン性固体成分の少なくとも一部分、好ましくは少なくとも２０重量％、特に少なくとも５０重量％、とりわけ少なくとも９０重量％、非常にとりわけ少なくとも９９重量％を含む。ミルベースのデンプン性成分（ゆえにデキストリン含有培地（１）中の代謝可能な糖の量）に基づき、ミルベース中の非デンプン性固体成分は、好ましくは、少なくとも１０重量％、特に少なくとも１５重量％、例えば１５〜７５重量％、とりわけ２０〜６０重量％の範囲になる。
【００３３】
ステップ（ａ２）の液化用のミルベースは、本発明にしたがって、水性液体、例えば淡水、（例えば後の発酵由来の）再循環処理水と、またはこれらの液体の混合物と混合される。一般に、これにより水性懸濁液が生じる。一般に、そのような一定量のデンプン供給材料またはミルベースは水性液体と混合され、培地（１）の総重量に基づいて少なくとも４０重量％の濃度のグルコース相当物が水性デキストリン含有培地（１）中に存在するように水性液体中で液化される。得られる培地（１）中の乾燥物含量は、典型的に、培地（１）の総重量に基づいて少なくとも５０重量％である。
【００３４】
本発明の方法を実施するために、固体のミルベースの懸濁に使用される水性液体は、例えば４０〜６０℃の範囲の、適度に高い温度にあらかじめ温めてよい。しかし、該液体を室温で用いることが好ましい。
【００３５】
ステップ（ａ２）にしたがってミルベースのデンプン部分の液化を実施するために、液化の開始前には、ミルベース全体の一部分のみを水性液体と混合し、後で、液化プロセス中、連続的にまたはバッチ方式で、ミルベースの残りを水性液体に加えることが有利であることが示されている。
【００３６】
ステップ（ａ２）に基づくミルベースの液化は、当業者が熟知している通例の方法によって行うことができ、例えば「The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries」（冒頭に記載されている）, Chapter 2, pp. 7-23に記載の方法によって行うことができる。
【００３７】
本発明では、ステップ（ａ２）の液化プロセスを少なくとも１種のデンプン液化酵素の存在下で実施する。この目的を達成するために、原理的には、すべてのデンプン液化酵素を用いることが可能であり、特にα−アミラーゼ（酵素分類EC 3.2.1.1）、例えばバシラス・リケンフォルミス（Bacillus lichenformis）またはバシラス・ステロテルモフィラス（Bacillus staerothermophilus）から得られたα−アミラーゼ、とりわけ、バイオエタノール製造のために、乾式製粉法によって取得される材料の液化に使用される酵素を用いることが可能である。液化に好適なα−アミラーゼはまた、例えばNovozymesからTermamyl 120 L, type Lの名称で；またはGenencorからSpezymeの名称で市販されている。異なるα−アミラーゼの組み合わせを液化に用いてもよい。
【００３８】
これにより、ミルベース由来の液化デンプン部分、典型的には、一般に、３〜１８個、特に６〜１２個の単糖単位を有するデキストリン、適切であれば追加のオリゴ糖、適切であれば少量の単糖および／または二糖（単糖、二糖およびオリゴ糖の総量に基づいて、一般に３０重量％未満、頻繁には２５重量％未満、２０重量％未満、特に１０重量％未満）および用いるミルベースの非デンプン性成分、特に液化に用いるミルベースの固体の非デンプン性成分を含む水性液体が得られる。
【００３９】
デンプン液化酵素およびミルベースの量は、ゲル化プロセスでの粘性が、例えば撹拌による、懸濁液の効率的な混合を可能にするために十分に低下するように好都合に選択されるであろう。ゲル化プロセス中の反応混合物の粘性は、好ましくは２０Ｐａｓを超えず、より好ましくは１５Ｐａｓを超えず、最も好ましくは８Ｐａｓを超えない。一般に、粘性は、M5測定系およびMVDIN計測手段を備えたHaake粘度計Roto Visko RV20型を使用して、温度５０℃および剪断速度２００ｓ−１で測定される。
【００４０】
α−アミラーゼ（または使用されるデンプン液化酵素）は、最初に反応容器に導入するか、あるいはステップ（ａ２）中に加えることができる。好ましくは、ステップ（ａ２）で必要とされるα−アミラーゼの一部分をステップ（ａ２）の開始時に加えるか、またはこの部分を最初に反応器に導入する。α−アミラーゼの総量は、通常、用いるデンプン供給材料の総量に基づいて、０．００２〜３．０重量％、好ましくは０．０１〜１．５重量％、特に好ましくは０．０２〜０．５重量％の範囲である。
【００４１】
液化はゲル化温度より高温または低温で実施することができる。好ましくは、ステップ（ａ２）の液化を、用いるデンプンのゲル化温度、すなわちアルファ化（gelatinization）温度より少なくとも部分的に高い温度で実施する（調理プロセスとして知られる）。目的のデンプンに必要とされる温度は当業者に公知である（「The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries」（冒頭で引用されている）, Chapter 2, p. 11を参照のこと）か、または当業者が通常の実験法によって決定することができる。一般に、選択される温度は、８０〜１６５℃、好ましくは９０〜１５０℃の範囲、特に好ましくは１００〜１４０℃の範囲であり、該温度は、一般に、ゲル化温度より少なくとも５Ｋ、好ましくは少なくとも１０Ｋ、特に好ましくは少なくとも２０Ｋ、例えば１０〜１００Ｋ、特に２０〜８０Ｋ高い。これらの温度では、デンプンの顆粒状構造は破壊され（ゲル化）、その酵素分解が可能になる。
【００４２】
α−アミラーゼ（または使用されるデンプン液化酵素）が最適に効果的であるよう、ステップ（ａ２）は、好ましくは、少なくともある期間、液化酵素の最適ｐＨで、頻繁には弱酸性範囲、好ましくは４．０〜７．０の範囲、より好ましくは５．０〜６．５の範囲のｐＨで実施される。ｐＨ調整は、通常、ステップ（ａ２）の開始前または開始時に実施される；液化プロセス中にこのｐＨを検査し、適切であれば再調整することが好ましい。ｐＨは、好ましくは、希釈鉱酸、例えばＨ２ＳＯ４もしくはＨ３ＰＯ４または希釈水酸化アルカリ水溶液、例えばＮａＯＨもしくはＫＯＨを使用して調整される。
【００４３】
ステップ（ａ２）でミルベース中のデンプン部分を液化するための好ましい実施形態では、ミルベースの少なくとも一部分を連続的にまたはバッチ方式で水性液体に加える。好ましくは、少なくとも４０重量％、特に少なくとも５０重量％、非常に特に好ましくは少なくとも５５重量％を液化プロセスの経過中に反応器に加える。添加量は、９０重量％、特に８５重量％、特に好ましくは８０重量％を超えないことが多い。好ましくは、プロセスの経過中に添加されるミルベースの部分は、液化期間中に一般的である条件下で反応器に供給される。添加は、複数の部分に分けて（該部分は、好ましくはそれぞれ液化対象のミルベースの総量の３０重量％を超えず、特に好ましくは２０重量％を超えず、例えば１〜３０重量％、特に２〜２０重量％である）バッチ方式で、すなわち少しずつ、あるいは連続的に行うことができる。この実施形態の重要な態様では、液化の開始時に、ミルベースの一部分、好ましくはミルベースの６０重量％を超えない量、特に５０重量％を超えない量、特に好ましくは４５重量％を超えない量のみが反応器中に存在し、一方、残りのミルベースは液化期間中に添加される。
【００４４】
液化は、例えば多段階反応カスケードにおいて、連続的に実施することもできる。
【００４５】
好ましい実施形態では、ミルベースの総量に基づいて６０重量％を超えず、好ましくは５０重量％を超えず、特に好ましくは４５重量％を超えない量の、例えば１０〜６０重量％、特に１５〜５０重量％、特に好ましくは２０〜４５重量％の部分が最初に水性液体に懸濁され、その後、液化が実施されるように、本発明の方法のステップ（ａ２）を実施する。
【００４６】
好ましい実施形態では、少なくとも１種のα−アミラーゼの存在下でミルベースの一部分を非連続的または連続的に添加、特に少しずつ添加する作業を、液体培地の粘性が２０Ｐａｓを超えず、好ましくは１５Ｐａｓを超えず、特に好ましくは８Ｐａｓを超えないように実施する。粘性の調節を支援するために、ミルベース中に存在するデンプンのアルファ化温度より高い温度で、添加するミルベースの総量の少なくとも２５重量％、好ましくは少なくとも３５重量％、特に好ましくは少なくとも５０重量％を加えることが有利であることが示されている。さらに、少なくとも１種のデンプン液化酵素、好ましくはα−アミラーゼ、および／または少なくとも１種の糖化酵素、好ましくはグルコアミラーゼを、それら自体少しずつ加えることによって粘性の調節にさらに影響を与えることもできる。
【００４７】
本発明の方法を実施するために、固体のミルベースの懸濁に使用される水性液体を、例えば４０〜６０℃の範囲の、適度に高い温度にあらかじめ温めることも可能である。しかし、該液体を室温で用いることが好ましい。
【００４８】
そして、少なくとも１種のデンプン液化酵素、好ましくはα−アミラーゼをこのミルベースの懸濁液に加える。液化期間中にミルベースの一部分のみを加えるのであれば、α−アミラーゼの一部分、例えばステップ（ａ２）で用いるα−アミラーゼ全体に基づいて１０〜７０重量％、特に２０〜６５重量％のみを開始時に加えることが有利である。期間内のこの時点で添加されるα−アミラーゼの量は、使用されるデンプン供給材料に関する反応条件下での目的のα−アミラーゼの活性に依存し、概して、用いられるデンプン供給材料の総量に基づいて０．０００４〜２．０重量％、好ましくは０．００１〜１．０重量％、特に好ましくは０．０２〜０．３重量％の範囲である。別法として、α−アミラーゼ部分を、懸濁液の作製前に、使用する液体と混合することができる。
【００４９】
好ましくは、用いられるα−アミラーゼの総量または一部分を、特に室温または、例えば２０〜３０℃の範囲の、やや高めた温度で懸濁液に加えた後に、液化に使用される温度への加熱が開始される。
【００５０】
そして、そのように作製された懸濁液を加熱し、好ましくは使用されるデンプンのゲル化温度より高い温度にする。一般に、８０〜１６５℃、好ましくは９０〜１５０℃、特に好ましくは１００〜１４０℃の範囲の温度が選択され、該温度は、通常好ましくは、ゲル化温度より少なくとも５Ｋ、好ましくは少なくとも１０Ｋ、特に好ましくは少なくとも２０Ｋ、例えば１０〜１００Ｋ、特に２０〜８０Ｋ高い。粘性をモニタリングしながら、デンプン供給材料の追加部分、例えばそれぞれの場合で、用いられるミルベース全体に基づいて１〜３０重量％、特に２〜２０重量％を、適切であれば徐々に、デンプン含有懸濁液に加える。この場合、液化ステップの経過中に添加される対象のミルベースの一部分を、少なくとも２、好ましくは少なくとも４、特に好ましくは少なくとも６フラクションに分けて反応混合物に加えることが好ましい。別法として、懸濁液の作製に用いられなかったミルベースの一部分を、この実施形態の液化ステップ中に連続的に加えることができる。好都合には、添加中の温度はデンプンのゲル化温度より高く維持されるべきである。
【００５１】
所望の温度に達した後、または、適切であれば、すべての穀粉が添加された後、反応混合物を、通常、ある時間、例えば１０〜６０分間またはそれ以上、必要に応じて、デンプンのゲル化温度より高く設定された温度で維持し、すなわち調理する。そして、一般に、反応混合物を、いくらか低いが、好ましくはゲル化温度より高い温度、例えば７０〜９０℃に冷却する。その後、適切であれば、α−アミラーゼの追加部分、好ましくは最大の部分を加える。この場合、期間内のこの時点で添加されるα−アミラーゼの量は、使用されるα−アミラーゼの反応条件下での活性に依存して、用いられるデンプン供給材料の総量に基づいて好ましくは０．００２〜２．０重量％、特に好ましくは０．０１〜１．０重量％、非常に特に好ましくは０．０２〜０．４重量％である。
【００５２】
デンプンをデキストリンに完全に分解するために、ヨウ素または、適切であれば、デンプンを検出するための別の試験によるデンプンの検出が陰性になるか、または少なくとも本質的に陰性になるまで、反応混合物を設定温度で維持するか、または、適切であれば、さらに加熱する。適切であれば、このとき、例えば、用いられるデンプン供給材料の総量に基づいて０．００１〜０．５重量％、好ましくは０．００２〜０．２重量％の範囲の、１以上の追加のα−アミラーゼ部分を反応混合物に加えることができる。
【００５３】
あるいは、デンプン部分を液化するために、最初に、ミルベースを含む水性懸濁液を、蒸気の導入によってデンプン供給材料またはミルベース中に存在するデンプンのアルファ化温度より高い温度に加熱することが可能である。典型的に、目的のアルファ化温度より少なくとも１０Ｋ、特に少なくとも２０Ｋ、例えば１０〜１００Ｋ、特に２０〜８０Ｋ高い温度で懸濁液を加熱する。特に、９０〜１５０℃の範囲、とりわけ１００〜１４０℃の範囲の温度に懸濁液を加熱する。
【００５４】
懸濁液の加熱に用いられる蒸気は、典型的に、少なくとも１０５℃、特に少なくとも１１０℃、例えば１１０〜２１０℃の温度を有する過熱蒸気である。蒸気は、好ましくは、大気圧を超える圧力（superatmospheric pressure）で懸濁液に導入される。したがって、蒸気は、好ましくは、少なくとも１．５ｂａｒ、例えば１．５〜１６ｂａｒ、特に２〜１２ｂａｒの圧力を有する。
【００５５】
一般に、懸濁液への蒸気の導入は、該蒸気が大気圧を超える圧力、好ましくは１〜１０または１１ｂａｒ、特に１．５〜５ｂａｒの大気圧を超える圧力で、好ましくは高速で懸濁液に導入されるように行われる。蒸気導入の結果、該懸濁液は、アルファ化温度より高い温度である９０℃より高い温度に直ちに加熱される。
【００５６】
蒸気での加熱は、好ましくは、連続操作デバイスで実施される。該デバイスに、懸濁液の粘性、供給速度およびデバイスの形状の結果である特定の供給圧で連続的に懸濁液を満たし、懸濁液充填ゾーン中に、調節可能なノズルを介して供給圧に基づく高い圧力で加熱蒸気を満たす。高い圧力での蒸気の供給とは、懸濁液が加熱されるだけでなく、さらに機械的エネルギーが系に導入され、この機械的エネルギーがミルベース粒子のさらなる粉砕を促進し、特に均一のエネルギー供給をもたらし、ゆえに、ミルベース中の顆粒状デンプン粒子の特に均一のアルファ化をもたらすことを意味する。これらのデバイスは、典型的に、チューブの形状を有する。蒸気は、好ましくは、チューブ状デバイスの長軸に沿って送り込まれる。一般に、懸濁液は、少なくとも４５°の角度で、または直角に供給される。調節可能領域のノズルは、典型的に、蒸気の流動方向に向かって細くなる円錐形状を有する。針、または長軸方向に移動可能なロッド上に配置されているナップ（nappe）がこのノズル内に配置される。針、またはナップは、ノズルの先端と一緒になって開口部を形成する。針、またはロッドを長軸方向に動かすことによって、開口部のサイズ、ゆえにノズルポートの断面積を単純な様式で調節することができ、それにより蒸気の供給速度を単純な様式で調節することができる。
【００５７】
これらのデバイスはまた、典型的に、混合管を備えている。懸濁液は、蒸気が供給された後に混合管へ輸送され、該管中で懸濁液はデバイスから出る。この混合管は、通常、蒸気供給に沿って、かつ材料供給に対して垂直に配置される。混合管およびノズルは一緒になって、典型的には開口部を形成し、該開口部を通して懸濁液が輸送される。この開口部の影響として、輸送プロセス中に追加の剪断力が懸濁液に対して作用し、ゆえに、懸濁液に対する機械的エネルギーの供給が増加する。混合管は、長軸方向に移動可能であるように配置することができる。混合管の移動は、開口部のサイズを調節し、ゆえにデバイス中の圧力を低下させる単純な方法である。
【００５８】
そのようなデバイスはジェット調理器の名称で先行技術から公知である。該デバイスは、例えば「The Alcohol Textbook」, Chapter 2, 上掲, Figure 13に示されているデバイスであり、例えばHYDROHEATER（登録商標）の名称でHydro Thermal Corp. Waukesha WI, USAから市販されている。
【００５９】
反応が連続的に実施される場合、一般に、蒸気で処理された懸濁液は、その後、後反応帯（after-reaction zone）へ輸送される。その目的は、デンプン成分のゲル化を継続することである。典型的には、大気圧を超える圧力、典型的に２〜８ｂａｒの範囲の絶対圧力が後反応帯にかかっている。後反応帯の温度は、典型的に、９０〜１５０℃の範囲である。この後反応帯の滞留時間は、懸濁液の温度に依存して、１分間〜４時間の範囲でありうる。後反応帯は、典型的に、チューブまたはカラムの形状を有する。一実施形態では、後反応帯は垂直に配置されたカラムの形状を有する。ここで、懸濁液は、蒸気処理デバイスから出ると、カラムの上部領域にアプライされ、下部領域に回収される。本発明の別の実施形態では、後反応帯はチューブの形状を有する。
【００６０】
懸濁液が後反応帯から出た後、一般に、圧力が解放され、その後、液化が実施される。圧力の解放は、好ましくは、フラッシュ蒸発の形式で実施される。その目的は、懸濁液を好ましくは１００℃未満、特に８５℃未満の温度に冷却することである。一般に、そのように分散されたデンプンを、その後、別の反応容器中で液化する。液化は上記のように実施することができる。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態では、デンプン液化酵素の少なくとも一部分または全体、概して少なくとも５０％、特に少なくとも８０％、あるいはすべてを水性液体中のミルベースの懸濁液に加えた後に、蒸気加熱プロセスを行う。この様式では、液化プロセスはすでに行われていて、混合物はアルファ化温度より高い温度に加熱される。蒸気での加熱、および後反応期間は適宜実施される。別の反応容器中の後の液化ステップは省くことができる。しかし、好ましくはそのような液化ステップが、デンプンからデキストリンへの分解を完全にするために実施される。
【００６２】
用いられる酵素を安定化するために、適切であれば、例えばＣａＣｌ２を使用して、Ｃａ２＋イオンの濃度を酵素特有の最適値に調節する。好適な濃度値は当業者が通常の実験で決定することができる。α−アミラーゼとして例えばTermamylが用いられる場合、液体培地中のＣａ２＋濃度を、例えば、１０〜１００ｐｐｍ、好ましくは２０〜８０ｐｐｍ、特に好ましくは約３０〜７０ｐｐｍに調節することが有利である。単位ｐｐｍは重量に基づく単位であり、ｇ／１０００ｋｇを意味する。
【００６３】
デンプンをデキストリンに完全に分解するために、ヨウ素または、適切であれば、デンプンを検出するための別の試験によるデンプンの検出が陰性になるか、または少なくとも本質的に陰性になるまで、反応混合物を設定温度で維持する。適切であれば、ここで、例えば、用いられるデンプン供給材料の総量に基づいて、０．００１〜０．５重量％、好ましくは０．００２〜０．２重量％の範囲の、１以上の追加のα−アミラーゼ部分を反応混合物に加えることができる。
【００６４】
一般に、デンプン供給材料の本質的にすべてのまたは実質的にすべての成分を含むか、または、デンプンに加えて、固体の非デンプン性成分の一部分をも含むミルベースが、デキストリン含有液体（１）の製造に用いられる（すなわちデンプン供給材料の非デンプン性固体成分が完全には除去されていない）ため、得られるデキストリン含有液体（１）もまた、該デンプン供給材料の非デンプン性固体成分の一部分または全体を含む。このことは、例えば穀類由来の、一定量のフィチン酸塩（phytate）の導入をもたらすことが多く、これは見過ごしてはならない量である。それにより生じる阻害効果を回避するために、ステップ（ａ２）で、培地（１）を発酵ステップに付する前に、該培地（１）に少なくとも１種のフィターゼを加えることが有利である。フィターゼは、個別の高温条件に対して十分に安定であれば、液化前、液化中または液化後に加えることができる。フィターゼの活性がそれぞれの場合で反応条件下でわずかにしか影響を受けない限り、いずれのフィターゼを用いてもよい。使用されるフィターゼは、好ましくは、＞５０℃、特に好ましくは＞６０℃の熱安定性（Ｔ５０）を有する。フィターゼの量は、通常、１〜１００００単位／デンプン供給材料１ｋｇ、特に１０〜４０００単位／デンプン供給材料１ｋｇである。
【００６５】
デキストリン含有液体（１）の製造中に、追加の酵素、例えばプルラナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼまたはプロテアーゼを加えることも有利であることが示されている。これらの酵素の添加は粘性に対してよい影響を有しうる。すなわち、（例えば、長鎖（long-chain）（longer-chainとも称される）グルカンおよび／または（アラビノ）キシランの切断によって）粘性を低減し、かつ代謝可能なグルコシドの遊離および（残留）デンプンの遊離をもたらす。プロテアーゼの使用は類似のよい影響を有する。すなわち、追加的に、発酵のための成長因子として作用するアミノ酸を遊離させることが可能である。
【００６６】
ステップ（ａ２）で得られるデキストリン含有液体（１）は、一般に、それぞれの場合で培地（１）の総重量に基づいて、少なくとも２０重量％（＝２００ｇ／ｋｇ）、特に少なくとも４０重量％、とりわけ少なくとも５０重量％、頻繁には３０〜７５重量％の範囲、好ましくは４０〜７０重量％の範囲、特に５０〜６５重量％の範囲のグルコース相当物の濃度を有する。
【００６７】
得られる液体（１）中の乾燥物含量は、それぞれの場合で培地（１）の総重量に基づいて、典型的に少なくとも２５重量％、好ましくは少なくとも４０重量％、特に少なくとも５０重量％、とりわけ少なくとも６０重量％であり、一般に、８０重量％を超えない。
【００６８】
得られるデキストリン含有液体（１）中に存在するグルコース相当物は、本質的に、オリゴ糖、特にデキストリンの形態で存在する。これらのオリゴ糖、またはデキストリンの主成分は典型的にはグルコースであり、また該培地は、少量の単糖および／または二糖および、他の単糖単位からなるオリゴ糖単位を含みうる。デキストリン含有培地（１）中の糖含有成分、すなわち単糖、二糖およびオリゴ糖は、典型的に、少なくとも７０重量％、頻繁には少なくとも７５重量％、特に少なくとも８０重量％、とりわけ少なくとも９０重量％のオリゴ糖、特にデキストリンを含み、すなわち単糖および二糖は、３０重量％未満、頻繁には２５重量％未満、特に２０重量％未満、とりわけ１０重量％未満を占める。
【００６９】
遊離または結合型で存在するグルコースは、通常、グルコース相当物の総量に基づいて、培地（１）のグルコース相当物の５０〜９９重量％、特に７５〜９７重量％、とりわけ８０〜９５重量％の範囲である。
【００７０】
ステップ（ａ２）で得られる水性デキストリン含有液体（１）は、本発明にしたがってステップ（ｂ）で所望の有機化合物の発酵製造に使用される。この目的を達成するために、デキストリン含有液体（１）を発酵に供給する。発酵では、該培地は、発酵に用いられる微生物を培養するために役立つ。ここで、目的の有機化合物は揮発性または非揮発性の微生物代謝産物として得られる。
【００７１】
一般に、得られる水性デキストリン含有液体（１）をステップ（ｂ）にしたがって発酵に直接用い、別途糖化槽は用いない。一般に、デキストリン含有液体（１）を、通常３２〜３７℃の範囲の発酵温度に冷却した後に、発酵に供給する。
【００７２】
発酵前に、水性デキストリン含有液体（１）を、適切であれば、滅菌することができ、通常、微生物を熱または化学処理によって破壊する。例えば、水性デキストリン含有液体（１）を、この目的のために、通常８０℃より高い温度に加熱する。細胞の破壊、すなわち溶解は、発酵直前に行うことができる。この目的を達成するために、すべてのデキストリン含有液体（１）を溶解、すなわち破壊ステップに付する。この作業は、熱処理、機械的処理または化学処理によって実施することができる。しかし、本発明の方法のために、本明細書中に記載のように、発酵の前に滅菌ステップを行う必要があるとは立証されていない；それどころか、そのような滅菌ステップを実施しないことが有利であることが示されている。したがって、本発明の好ましい実施形態は、ステップ（ａ２）で得られた培地（１）を直接、すなわちあらかじめ滅菌する前に、発酵に供給する方法に関する。
【００７３】
発酵中、デキストリンの代謝は、本発明によれば、本質的に糖化酵素を加えずに行う。この場合、デキストリンは微生物によって、おそらく、菌株に本来備わっている糖化酵素、例えば菌株に本来備わっているグルコアミラーゼによって加水分解された後に、代謝される。液化されたデンプン成分は、おそらく、微生物による糖の、特に単糖グルコースの代謝と並行して糖化される。
【００７４】
したがって好ましい実施形態では、発酵に用いられる微生物は、デキストリンを単糖に加水分解する酵素を発現し、すなわち生産する微生物のうちから、特にグルコアミラーゼを発現、すなわち生産する微生物のうちから選択される。そのような微生物は当業者に公知であるか、または通常の実験によって、例えばスクリーニング法によって、例えばグルコアミラーゼのスクリーニングによって、例えば振とうフラスコ試験で微生物を培養した後、グルコアミラーゼの酵素活性をアッセイすることによって、または実施例セクションに記載のスクリーニング法を使用し、プライマー／プローブを用いるスクリーニングによって、かつ以下のデータベースなどの酵素データベースにおけるデータベース検索を通して、実施例セクションに記載の方法にしたがって決定することができる：
−  Brenda [Schomburg I., Chang A., Hofmann O., Ebeling C., Ehrentreich F., Schomburg D. BRENDA: a resource for enzyme data and metabolic information. Trends Biochem Sci. 2002 Jan;27(1):54-6.],
−  Swissprot [Boeckmann B., Bairoch A., Apweiler R., Blatter M.-C., Estreicher A., Gasteiger E., Martin M.J., Michoud K., O'Donovan C., Phan I., Pilbout S., Schneider M. The SWISS-PROT protein knowledgebase and its supplement TrEMBL in 2003 Nucleic Acids Res. 31:365-370(2003)],
−  ERGO-WIT [Overbeek R, Larsen N, Walunas T, D'Souza M, Pusch G, Selkov E Jr, Liolios K, Joukov V, Kaznadzey D, Anderson I, Bhattacharyya A, Burd H, Gardner W, Hanke P, Kapatral V, Mikhailova N, Vasieva O, Osterman A, Vonstein V, Fonstein M, Ivanova N, Kyrpides N. The ERGO(TM) genome analysis and discovery system. Nucleic Acids Res 2003 Jan 1;31(1): 164-71; Overbeek R, Larsen N, Pusch GD, D'Souza M, Selkov E Jr, Kyrpides N, Fonstein M, Maltsev N, Selkov E.  WIT: integrated system for high-throughput genome sequence analysis and metabolic reconstruction. Nucleic Acids Research, 2000; Vol. 28, No.1: 123-125],
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【００７５】
グルコアミラーゼ活性を有する好適な微生物の例は以下の微生物である：
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、アルクスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）、アッシビヤ・ゴシッピイ（Ashbya gossypii）、アスペスギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・カンジダス（Aspergillus candidus）、アスペルギルス・フォエチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachi）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・フェニシス（Aspergillus phoenicis）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、アスペルギルス・シロウサミ（Aspergillus shirousami）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、アテリア・ロルフシイ（Athelia rolfsii）、バシラス・シルクランス（Bacillus circulans）、バシラス・ステアロテルモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、ベータ・ブルガリス（Beta vulgaris）、ブラジリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）、ブルコルデリア・セノセパシア（Burkholderia cenocepacia）、ブルコルデリア・フンゴラム（Burkholderia fungorum）、ブルコルデリア・シュードマレイ（Burkholderia pseudomallei）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・アンタルクチカ（Candida antarctica）、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）、カンジダ・ツクバエンシス（Candida tsukubaensis）、カウロバクター・クレッセンタス（Caulobacter crescentus）、セファロスポリウム・シャルチコラ（Cephalosporium charticola）、セファロスポリウム・エイクホルニエ（Cephalosporium eichhorniae）、セラトシスチス・パラドクサ（Ceratocystis paradoxa）、シェトミウム・テルモフィラム（Chaetomium thermophilum）、クロロビウム・テピダム（Chlorobium tepidum）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）、クラドスポリウム・レシナエ（Cladosporium resinae）、クロストリジウム属種（Clostridium sp.）、クロストリジウム・テルモセラム（Clostridium thermocellum）、クロストリジウム・テルモサッカロリチカム（Clostridium thermosaccharolyticum）、コニホラ・プテアナ（Coniophora puteana）、コルチシウム・ロルフシイ（Corticium rolfsii）・コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、クリプトコッカス・ネオホルマンス（Cryptococcus neoformans）、デバリオミセス・ハンセニイ（Debaryomyces hansenii）、デバリオミセス・オクチデンタリス（Debaryomyces occidentalis）、エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）、エンドミセス属種（Endomyces sp.）、エンドミコプシス・フィブリゲラ（Endomycopsis fibuligera）、フザリウム・ベネナータム（Fusarium venenatum）、ハロアルクラ・マリスモルツイ（Haloarcula marismortui）、ホルモコニス・レジナエ（Hormoconis resinae）、フニコラ・グリセア（Humicola grisea）、フミコラ・ラヌギノーザ（Humicola lanuginosa）、ヒポクレア・リキシイ（Hypocrea lixii）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、レンチヌラ・エドデス（Lentinula edodes）、リポミセス・コノネンコエ（Lipomyces kononenkoae）、マグナポルテ・グリセア（Magnaporthe grisea）、メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、メタノカルドコッカス・ジャンナシイ（Methanocaldococcus jannaschii）、メタノコッカス・ジャンナシイ（Methanococcus jannaschii）、メタノ���ッカス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）、メタノサルシナ・アセチボランス（Methanosarcina acetivorans）、メタノサルシナ・バルケリ（Methanosarcina barkeri）、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）、モナスカス・ルビギノサス（Monascus rubiginosus）、モナスカス属種（Monascus sp.）、ムコール・ロウシキアヌス（Mucor rouxianus）、ミコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis）、ミコバクテリウム・レプレ（Mycobacterium leprae）、ミコバクテリウム・マリナム（Mycobacterium marinum）、ミコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、ミロテシウム属種（Myrothecium sp.）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ノストック・プンクチフォルメ（Nostoc punctiforme）、オリザ・サティバ（Oryza sativa）、ペシロミセス・バリオチイ（Paecilomyces variotii）、ペネウス・ジャポニカス（Penaeus japonicus）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、ペニシリウム・オキサリカム（Penicillium oxalicum）、ピクロフィラス・トリダス（Picrophilus torridus）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、ラルストニア・メタリデュランス（Ralstonia metallidurans）、ラナ・ジャポニカ（Rana japonica）、リゾビウム・レグミノサラム（Rhizobium leguminosarum）、リゾプス・デレマル（Rhizopus delemar）、リゾプス・ジャバニカス（Rhizopus javanicus）、リゾプス・ニベウス（Rhizopus niveus）、リゾプス・オリザエ（Rhizopus oryzae）、リゾプス属種（Rhizopus sp.）、ロドコッカス属種（Rhodococcus sp.）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ロドスピリラム・ルブラム（Rhodospirillum rubrum）、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ジアスタチカス（Saccharomyces diastaticus）、サッカリミコプシス・フィブリゲラ（Saccharomycopsis fibuligera）、サッカロミコプシス・フィブリゲラ（Saccharomycopsis fibuligera）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、シュワンニオミセス・オクチデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）、シェワネラ・オネイデンシス（Shewanella oneidensis）、スフィンゴモナス・アロマチシボランス（Sphingomonas aromaticivorans）、ストレプトミセス・コエリコロル（Streptomyces coelicolor）、スルホロバス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）、スルホロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）、タラロミセス・エメルソニイ（Talaromyces emersonii）、テルミトミセス・クリペアタス（Termitomyces clypeatus）、テルモアクチノミセス・ブルガリス（Thermoactinomyces vulgaris）、テルモアネロバクター・テングコンジェンシス（Thermoanaerobacter tengcongensis）、テルモアネロバクテリウム・テルモサッカロリチカム（Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum）、テルモアスカス・クルスタセウス（Thermoascus crustaceus）、テルモミセス・ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosus）、テルモプテウス・テナクス（Thermoproteus tenax）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トリコデルマ・レエゼイ（Trichoderma reesei）およびトリコスポロン・アデニノボランス（Trichosporon adeninovorans）。
【００７６】
発酵に用いられる微生物が菌株に本来備わっているグルコアミラーゼを発現するならば、発酵培地のｐＨをグルコアミラーゼに最適な活性範囲の値に、例えば３．５〜６．０の範囲の値に調整することができる。ｐＨは、発酵に最適な値に調整されることが多く、該値は、上述の範囲外であってよく、例えば６．０〜８．０の範囲であってよい。この作業は、このｐＨ範囲で多数のグルコアミラーゼの活性が制限されるものの、発酵に関して完全に有利でありえ、あるいは、調整されるべき発酵条件を、特に目的の微生物に対して適合させるべきであろうことに起因して必要とされる。発酵に最適なｐＨ範囲は、当業者が通常の実験によって決定することができる。
【００７７】
培地（１）を介して発酵培地に導入されるデキストリンの高度の変換を達成するために、発酵培地は、通常、例えば２〜７２時間、または適切であれば、より長く、例えば２〜９６時間、特に５〜４８時間にわたって、調節された温度で維持される。デキストリンから加水分解によって得られる単糖、特にグルコースは、典型的に、微生物によって非常に高速に代謝され、一般に、多量の単糖またはグルコース濃度は検出されない。
【００７８】
発酵は当業者に公知の通例の様式で実施することができる。この目的を達成するために、それぞれの所望の微生物を、一般に、本明細書中に記載の方法によって得られる液体培地中で培養する。
【００７９】
発酵プロセスはバッチ操作として、あるいは流加操作（fed-batch operation）（中間体の回収を伴う流加が含まれる）として実施することができ、流加操作が好ましい。
【００８０】
例えば、本発明の方法によって得られた培地（１）に、適切であれば慣用の糖供給材料、すなわち代謝可能な単糖、二糖および／もしくはオリゴ糖または、代謝可能な単糖、二糖および／もしくはオリゴ糖を含む培地とともに、適切であれば、水で希釈し、かつ慣用の培地成分（例えばバッファー、栄養塩類、窒素供給材料（例えば硫酸アンモニウム、尿素等）、アミノ酸を含む複合栄養培地成分（例えば酵母エキス、ペプトン、ＣＳＬ等））を加えた後に、所望の微生物を接種することができ、かつ微生物濃度が、発酵に望ましい定常状態に達するまで、該微生物を発酵条件下で増やすことができる。この場合、発酵培地中に存在するデキストリンは代謝され、所望の代謝産物が形成される（バッチ操作またはバッチ期間としても知られる）。
【００８１】
流加操作を実施する場合、バッチ期間後に、例えば総糖濃度が指定レベル未満に落ちたら、連続的にまたはバッチ方式で培地（１）を発酵培地に加える。
【００８２】
本発明の方法の典型的な実施形態は、以下のステップを含む流加操作である：
（ｂ１）水性発酵培地（２）中で、有機化合物の過剰生産が可能な微生物を培養するステップ；および
（ｂ２）デキストリン含有培地（１）を、適切であれば、慣用の糖供給材料とともに、発酵培地（２）に加えるステップ、その場合、培地（１）中に存在するデキストリンが、適切であれば、あらかじめ糖化された後に、有機化合物を過剰生産する微生物によって代謝される。
【００８３】
ステップ（ｂ１）では、例えば、従来の糖含有培地、通常はグルコース溶液、または本発明の液体培地（１）、または（１）と慣用の糖供給材料との混合物を、まず、水性液体、特に水で希釈することによって好適な糖濃度にすることができ、かつ発酵のために慣用の培地成分、例えばバッファー、栄養塩類、窒素供給材料（例えば硫酸アンモニウム、尿素等）、アミノ酸を含む複合栄養培地成分（例えば酵母エキス、ペプトン、ＣＳＬ等）を加える。この場合、糖と液体の量の比は、一般に、好ましくは、発酵培地（２）中の総単糖濃度が、グルコース相当物として計算され、かつ発酵培地（２）の総重量に基づき、６重量％未満、例えば０以上〜５重量％の範囲であるように選択される。このように製造された糖含有バッチ培地に所望の微生物を接種し、バッチ培地（発酵培地（２））中、発酵条件下で、微生物濃度が、発酵に望ましい定常状態に達するまで、該微生物を増殖させる。このプロセス中、発酵培地（２）とともに提供された糖が代謝され、所望の代謝産物が形成される。
【００８４】
その後の流加期間では、デキストリン含有培地（１）を発酵培地（２）に加えることによって発酵プロセスが維持され、微生物によって過剰生産された代謝産物が発酵液に蓄積し、その蓄積は細胞内あるいは細胞外形式で生じうる。添加培地（１）と、用意されたバッチ培地（微生物を含む（発酵培地（２）））の容量比は、概して、約１：１０〜１０：１の範囲、例えば１：５〜５：１の範囲、特に１：１〜５：１の範囲である。発酵培地（２）中の糖濃度は、特に培地（１）の供給速度によって制御することができる。一般に、供給速度は、総糖濃度、すなわちオリゴ糖および単糖の総量が、３０重量％、特に２０重量％の値を超えないように調節される。発酵液中の単糖濃度は、好ましくは＞０重量％〜約５重量％の範囲であり、特に３重量％を超えない。
【００８５】
好ましい実施形態では、ステップ（ｂ１）の発酵培地（２）（すなわち、ここではバッチ培地）は、本質的にデキストリン含有培地（１）、有機化合物の過剰生産が可能な微生物、培地成分（例えばバッファー、栄養塩類、窒素供給材料（例えば硫酸アンモニウム、尿素等）、アミノ酸を含む複合栄養培地成分（例えば酵母エキス、ペプトン、ＣＳＬ等））および、適切であれば、希釈用の水を含む。この目的を達成するために、デキストリン含有培地（１）は、適切であれば、グルコース相当物として計算され、かつデキストリン含有培地（１）の総重量に基づき、例えば１５〜３０重量％の範囲の、所望のデキストリン含量に希釈され、発酵培地（２）（バッチ培地）の作製に直接使用される。
【００８６】
発酵の維持に用いられるステップ（ｂ２）のデキストリン含有培地のデキストリン含量は、通常、発酵培地（２）の希釈を最小限にするために高含量であり、例えば上述の範囲である。
【００８７】
好ましくは、高いデキストリン含量、例えばグルコース相当物として計算され、かつデキストリン含有培地（１）の総重量に基づき少なくとも３０重量％、とりわけ少なくとも４０重量％、非常にとりわけ少なくとも５０重量％の含量を有するデキストリン含有培地（１）を製造する手順にしたがう。そしてこの培地（１）は、第一に、ステップ（ｂ１）に記載のように水で希釈した後にバッチ培地（発酵培地（２））の作製に使用され、第二に、ステップ（ｂ２）に記載のように発酵培地（２）への添加に使用される。
【００８８】
デキストリン含有培地（１）を使用すると、発酵によって、少なくとも３個のＣ原子を有するか、または少なくとも２個のＣ原子と１個のＮ原子を有する、揮発性および非揮発性の、特に非揮発性の微生物代謝産物を製造することが可能である。
【００８９】
これに関して、非揮発性産物とは、分解を受けずに発酵液からの蒸留によって回収することができない化合物を意味すると理解される。一般に、これらの化合物は、大気圧下で、水の沸点より高い沸点、頻繁には１５０℃より高い沸点、特に２００℃より高い沸点を有する。一般に、それらは標準条件（２９８Ｋ、１０１．３ｋＰａ）下で固体である化合物である。
【００９０】
しかし、大気圧下で、水の沸点より低い融点および／または油状の粘稠性を有する非揮発性の微生物代謝産物を製造するための発酵に、水性デキストリン含有培地（１）を用いることも可能である。
【００９１】
用語、非揮発性の微生物代謝産物は、特に、好ましくは３〜１０個の炭素原子を有し、かつ、適切であれば、それらに結合している１個以上の、例えば１、２、３または４個のヒドロキシル基を有する有機モノ−、ジ−およびトリカルボン酸、例えば酒石酸、イタコン酸、コハク酸、プロピオン酸、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、２，５−フランジカルボン酸、グルタル酸、レブリン酸（levulic acid）、グルコン酸、アコニチン酸およびジアミノピメリン酸、クエン酸；タンパク質原性および非タンパク質原性アミノ酸、例えばリジン、グルタミン酸、メチオニン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、トリプトファンおよびトレオニン；プリンおよびピリミジン塩基；ヌクレオシドおよびヌクレオチド、例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびアデノシン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）；脂質；好ましくは１０〜２２個の炭素原子を有する飽和および不飽和脂肪酸、例えばγ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸；好ましくは３〜８個の炭素原子を有するジオール、例えばプロパンジオールおよびブタンジオール；３個以上の、例えば３、４、５または６個のＯＨ基を有する多価（higher-valueとも称される）アルコール、例えばグリセロール、ソルビトール、マンニトール、キシリトールおよびアラビニトール（arabinitol）；少なくとも４個の炭素原子、例えば４〜２２個の炭素原子を有する長鎖（longer-chainとも称される）アルコール、例えばブタノール；炭水化物、例えばヒアルロン酸およびトレハロース；芳香族化合物、例えば芳香族アミン、バニリンおよびインジゴ；ビタミンおよびプロビタミン、例えばアスコルビン酸、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２およびリボフラビン、補因子および、栄養補助剤として知られるもの；タンパク質、例えば酵素、例えばアミラーゼ、ペクチナーゼ、酸性、ハイブリッドまたは中性セルラーゼ、エステラーゼ、例えばリパーゼ、パンクレアーゼ（pancreases）、プロテアーゼ、キシラナーゼおよびオキシドレダクターゼ、例えばラッカーゼ、カタラーゼおよびペルオキシダーゼ、グルカナーゼ、フィターゼ；カロテノイド、例えばリコペン、β−カロテン、アスタキサンチン、ゼアキサンチンおよびカンタキサンチン；好ましくは３〜１０個の炭素原子および、適切であれば、１個以上のヒドロキシル基を有するケトン、例えばアセトンおよびアセトイン；ラクトン、例えばγ−ブチロラクトン、シクロデキストリン、生体ポリマー、例えばポリヒドロキシアセテート、ポリエステル、例えばポリラクチド、多糖、ポリイソプレノイド、ポリアミド；および上述の化合物の前駆体および誘導体を含む。非揮発性の微生物代謝産物として好適な他の化合物はGutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), ISBN: 0818805086に記載されている。
【００９２】
用語「補因子」は、正常な酵素活性の発生に必要とされる非タンパク質性化合物を含む。これらの化合物は有機または無機化合物でありうる；好ましくは、本発明の補因子分子は有機分子である。そのような分子の例はＮＡＤおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）である；これらの補因子の前駆体はナイアシンである。
【００９３】
用語「栄養補助剤」は、植物および動物、特にヒトの健康を促進する食品添加物を含む。そのような分子の例は、ビタミン、酸化防止剤および特定の脂質、例えば多価不飽和脂肪酸である。
【００９４】
製造される代謝産物は、特に酵素、アミノ酸、ビタミン、二糖、３〜１０個のＣ原子を有する脂肪族モノ−およびジカルボン酸、３〜１０個のＣ原子を有する脂肪族ヒドロキシカルボン酸、３〜１０個のＣ原子を有するケトン、４〜１０個のＣ原子を有するアルカノールおよび３〜１０個、特に３〜８個のＣ原子を有するアルカンジオールのうちから選択される。
【００９５】
そのように発酵製造される化合物は、それぞれの場合で、用いられる微生物によって生産されるエナンチオマー型（異なるエナンチオマーが存在する場合）として得られることが当業者には明らかである。ゆえに、一般には、例えばアミノ酸の場合、それぞれのＬ−エナンチオマーが得られる。
【００９６】
発酵に用いられる微生物は、以下で詳細に記載されるように、それ自体公知の様式で、目的の微生物代謝産物に依存する。それらは天然起源であっても、遺伝子改変型であってもよい。好適な微生物および発酵プロセスの例を以下の表Ａに挙げる。
【表１】
2009517011.tif 000002
【００９７】
2009517011.tif 000003
【００９８】
2009517011.tif 000004
【００９９】
2009517011.tif 000005
【０１００】
2009517011.tif 000006
【０１０１】
2009517011.tif 000007
【０１０２】
2009517011.tif 000008
【０１０３】
本発明の好ましい実施形態では、製造される有機化合物は、モノカルボン酸、ジカルボン酸およびトリカルボン酸（ヒドロキシル基が結合していてもよく、３〜１０個のＣ原子を有する）、タンパク質原性アミノ酸および非タンパク質原性アミノ酸、プリン塩基、ピリミジン塩基；ヌクレオシド、ヌクレオチド、脂質；飽和および不飽和脂肪酸；４〜１０個のＣ原子を有するジオール、３個以上のヒドロキシル基を有する多価アルコール、少なくとも４個のＣ原子を有する長鎖アルコール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミン、プロビタミン、補因子、栄養補助剤、タンパク質、カロテノイド、３〜１０個のＣ原子を有するケトン、ラクトン、生体ポリマーならびにシクロデキストリンのうちから選択される。
【０１０４】
本発明の第１の好ましい実施形態は、酵素、例えばフィターゼ、キシラナーゼまたはグルカナーゼの発酵製造における、本発明にしたがって得ることができる糖含有液体培地の使用に関する。
【０１０５】
本発明の第２の好ましい実施形態は、アミノ酸、例えばリジン、メチオニン、トレオニンおよびグルタミン酸の発酵製造における、本発明にしたがって得ることができる糖含有液体培地の使用に関する。
【０１０６】
本発明の別の好ましい実施形態は、ビタミン、例えばパントテン酸およびリボフラビン、ならびにその前駆体および誘導体の発酵製造における、本発明にしたがって得ることができる糖含有液体培地の使用に関する。
【０１０７】
本発明の特に好ましい実施形態は以下の物質の発酵製造に関する：
−  モノ−、ジ−およびトリカルボン酸、特に３〜１０個のＣ原子を有する脂肪族モノ−、ジ−およびトリカルボン酸、例えばプロピオン酸、フマル酸、コハク酸、イタコン酸、クエン酸およびジメチルマロン酸、
−  ３〜１０個のＣ原子を有する脂肪族ヒドロキシカルボン酸、例えば乳酸および３−ヒドロキシプロピオン酸；
−  上記長鎖アルカノール、特に４〜１０個のＣ原子を有するアルカノール、例えばブタノール；
−  上記ジオール、特に３〜１０個、特に３〜８個のＣ原子を有するアルカンジオール、例えばプロパンジオール；
−  上記ケトン、特に３〜１０個のＣ原子を有するケトン、例えばアセトン；および
−  上記炭水化物、特に二糖、例えばトレハロース。
【０１０８】
別の特に好ましい実施形態では、発酵において微生物によって生産される代謝産物は、ポリヒドロキシアルカノアート、例えばポリ−３−ヒドロキシブチラートおよび他の有機ヒドロキシカルボン酸、例えば３−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシ酪酸およびSteinbuchel（上掲）に記載の他のもの（例えば長鎖（longer-chainとも称される）ヒドロキシカルボン酸、例えば３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシデカン酸および３−ヒドロキシテトラデカン酸が含まれる）とのコポリエステル、およびこれらの混合物である。発酵を実施するために、例えばS.Y. Lee, Plastic Bacteria Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria, Tibtech, Vol. 14, (1996), pp. 431-438に他の炭素供給材料に関して記載されている条件および手順と類似の条件および手順を用いてよい。
【０１０９】
したがって、好ましい実施形態では、発酵に用いられる微生物は、以下の代謝産物の少なくとも１つを過剰生産する天然または組み換え微生物のうちから選択される：
−  酵素、例えばフィターゼ、キシラナーゼまたはグルカナーゼ、特にフィターゼ；
−  アミノ酸、例えばリジン、トレオニンまたはメチオニン、特にリジンおよびメチオニン；
−  ビタミン、例えばパントテン酸およびリボフラビン；ならびにその前駆体および／または誘導体；
−  二糖、例えばトレハロース；
−  ３〜１０個のＣ原子を有する脂肪族モノ−、ジ−およびトリカルボン酸、例えばプロピオン酸、フマル酸、コハク酸、イタコン酸、クエン酸およびジメチルマロン酸；
−  ポリヒドロキシアルカノアート、例えばポリ−３−ヒドロキシブチラートおよび、３−ヒドロキシ酪酸のコポリエステル；
−  ３〜１０個のＣ原子を有する脂肪族ヒドロキシカルボン酸、例えば乳酸および３−ヒドロキシプロピオン酸；
−  ３〜１０個のＣ原子を有するケトン、例えばアセトン；
−  ４〜１０個のＣ原子を有するアルカノール、例えばブタノール；および
−  ３〜８個のＣ原子を有するアルカンジオール、例えばプロパンジオール。
【０１１０】
好適な微生物は、通常、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、バシラス属（Bacillus）、アッシビヤ属（Ashbya）、エシェリキア属（Escherichia）、アスペルギルス属（Aspergillus）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、アクチノバシラス属（Actinobacillus）、アネロビオスピリラム属（Anaerobiospirillum）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、リゾプス属（Rhizopus）およびクロストリジウム属（Clostridium）のうちから選択され、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、バシラス・サブティリス（Bacillus subtilis）、アッシビヤ・ゴシッピイ（Ashbya gossypii）、大腸菌（Escherichia coli）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）またはアスカリゲネス・ラタス（Alcaligenes latus）、アネロビオスピリラム・スクシニプロデュセンス（Anaerobiospirillum succiniproducens）、アクチノバシラス・スクシンゲネス（Actinobacillus succinogenes）、ラクトバシラス・デルブリュッキイ（Lactobacillus delbruckii）、ラクトバシラス・レイキマンニイ（Lactobacillus leichmannii）、プロピオニバクテリウム・アラビノサム（Propionibacterium arabinosum）、プロピオニバクテリウム・シェルマニイ（Propionibacterium schermanii）、プロピオニバクテリウム・フロイデンレイキイ（Propionibacterium freudenreichii）、クロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）、クロストリジウム・ホルミコアセチカム（Clostridium formicoaceticum）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、リゾプス・アリザス（Rhizopus arrhizus）およびリゾプス・オリザエ（Rhizopus oryzae）の株のうちから選択される。
【０１１１】
好ましい実施形態では、発酵に用いられる微生物はコリネバクテリウム属（genus Corynebacterium）の株であり、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）の株である。特に、それは、アミノ酸、とりわけリジン、メチオニンまたはグルタミン酸を過剰生産するコリネバクテリウム属の株であり、とりわけコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である。
【０１１２】
別の好ましい実施形態では、発酵に用いられる微生物はエシェリキア属（genus Escherichia）の株であり、特に大腸菌（Escherichia coli）の株である。特に、それは、アミノ酸、とりわけリジン、メチオニンまたはトレオニンを過剰生産するエシェリキア属の株であり、とりわけ大腸菌である。
【０１１３】
特定の好ましい実施形態では、発酵において微生物によって生産される代謝産物はリジンである。その発酵を実施するために、例えばPfefferle et al., 上掲およびUS 3,708,395に、他の炭素供給材料に関して記載されている条件および手順と類似の条件および手順を用いることができる。原理的に、連続的および非連続的（バッチまたは流加）様式の操作がともに好適であり、流加様式の操作が好ましい。
【０１１４】
別の特に好ましい実施形態では、発酵において微生物によって生産される代謝産物はメチオニンである。その発酵を実施するために、例えばWO 03/087386およびWO 03/100072に、他の炭素供給材料に関して記載されている条件および手順と類似の条件および手順を用いることができる。
【０１１５】
別の特に好ましい実施形態では、発酵において微生物によって生産される代謝産物はパントテン酸である。その発酵を実施するために、例えばWO 01/021772に、他の炭素供給材料に関して記載されている条件および手順と類似の条件および手順を用いることができる。
【０１１６】
別の特に好ましい実施形態では、発酵において微生物によって生産される代謝産物はリボフラビンである。その発酵を実施するために、例えばWO 01/011052, DE 19840709, WO 98/29539, EP 1 186 664およびFujioka, K.: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31(3), 44-48に、他の炭素供給材料に関して記載されている条件および手順と類似の条件および手順を用いることができる。
【０１１７】
別の特に好ましい実施形態では、発酵において微生物によって生産される代謝産物はフマル酸である。その発酵を実施するために、例えばRhodes et al, Production of Fumaric Acid in 20-L Fermentors, Applied Microbiology, 1962, 10 (1), 9-15に、他の炭素供給材料に関して記載されている条件および手順と類似の条件および手順を用いることができる。
【０１１８】
別の特に好ましい実施形態では、発酵において微生物によって生産される代謝産物はコハク酸である。その発酵を実施するために、例えばInt. J. Syst. Bacteriol. 26, 498-504 (1976); EP 249773 (1987) (Lemme & Datta); US 5504004 (1996) (Guettler, Jain & Soni); Arch. Microbiol. 167, 332-342 (1997); Guettler MV, Rumler D, Jain MK., Actinobacillus succinogenes sp. nov., a novel succinic-acid-producing strain from the bovine rumen. Int J Syst Bacteriol. 1999 Jan;49 Pt 1:207-16; US 5,723,322, US 5,573,931, US 5,521,075, WO99/06532, US 5,869,301またはUS 5,770,435に、他の炭素供給材料に関して記載されている条件および手順と類似の条件および手順を用いることができる。
【０１１９】
別の特に好ましい実施形態では、発酵において微生物によって生産される代謝産物はフィターゼである。その発酵を実施するために、例えばWO 98/55599に、他の炭素供給材料に関して記載されている条件および手順と類似の条件および手順を用いることができる。
【０１２０】
発酵によって発酵液が生成される。該発酵液は、所望の微生物代謝産物に加えて、本質的に、発酵中に生産されるバイオマス、液化デンプン溶液の代謝されない成分および、特に、デンプン供給材料の非デンプン性固体成分、例えば線維および利用されない糖、およびさらに利用されないバッファーおよび栄養塩類を含む。本出願では、この液体培地は発酵液とも称され、発酵液という用語は、添加されたデキストリン含有培地（１）をも含み、そこに存在する糖は部分的または不完全な発酵による変換にしか付されておらず、すなわち、そこでは、利用可能な糖（例えば単糖および二糖）の部分的または不完全な微生物による代謝しか起こっていない。
【０１２１】
微生物代謝産物の単離もしくは枯渇前または発酵液の揮発性成分の除去前に、適切であれば、上記様式で滅菌ステップが実施される。
【０１２２】
本発明の特定の実施形態（Ｉ）は、少なくとも１種の微生物代謝産物を発酵液から枯渇させるか、または単離する方法に関する。次いで、発酵液のほとんどの揮発性成分を除去し、固体または半固体のタンパク質組成物を生じさせる。そのような方法を実施するための、および得られるタンパク質組成物についてのさらに詳細な説明は、本出願人のWO 2005/116228（PCT/EP2005/005728）の対象である。該文献はさらなる詳細に関して参照される。
【０１２３】
発酵液からの代謝産物の単離または枯渇は、通常、発酵液から少なくとも１種の代謝産物が枯渇または単離され、残留する発酵液中のこの代謝産物の含量が、それぞれの場合で残留発酵液の総重量に基づいて、２０重量％を超えず、特に１０重量％を超えず、とりわけ５重量％を超えず、非常にとりわけ２．５重量％を超えない量になるように実施される。
【０１２４】
ファインケミカル（すなわち微生物代謝産物）は、１以上のステップで発酵液から単離するか、または枯渇させることができる。これに関して必須のステップは、発酵液から固体成分を除去することである。このステップは、有益な生成物の単離前または単離後に実施することができる。有益な生成物のおおまかな清浄および入念な精製のため、および製剤化のためのステップをさらに含む、当技術分野で慣用の方法は、有益な生成物の単離および固体の除去、すなわち固液相分離の両者に関して公知である（例えばBelter, P.A, Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology, John Wiley & Sons (1988), およびUllmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th ed. on CD-ROM, Wiley-VCHに記載されている）。
【０１２５】
有益な生成物を単離するために、有利には、まず、例えば遠心分離またはろ過によって、発酵液から固体成分を除去し、次いで、例えば結晶化、沈殿、吸着または蒸留によって、液相から有益な生成物を単離する手順にしたがうことができる。別法として、例えばクロマトグラフ法または抽出法を使用することによって、有益な生成物を発酵液から直接単離することもできる。特に述べる必要があるクロマトグラフ法はイオン交換クロマトグラフィーであり、その場合、有益な生成物をクロマトグラフィーカラムで選択的に単離することができる。この場合、残留する発酵液からの固体の除去は、例えばデカント、蒸発および／または乾燥によって、有利に実施することができる。
【０１２６】
揮発性または油性化合物の場合、一般に、処理中、特に乾燥中に、最高温度をモニタリングすることが必要である。これらの化合物は、それらを吸着剤上で偽固体（pseudo-solid form）に製剤化することによって有利に製造することもできる。この目的に好適な吸着剤は、例えば本出願人のWO 2005/116228（PCT/EP2005/005728）に詳述されている。この様式で好都合に製造できる化合物の例は、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸、さらにまたプロピオン酸、乳酸、プロパンジオール、ブタノールおよびアセトンである。偽固体製剤であるこれらの化合物も、本発明の目的で、固体の非揮発性の微生物代謝産物であると理解される。
【０１２７】
別の特定の実施形態（ＩＩ）は、非揮発性の微生物代謝産物をあらかじめ単離するか、または枯渇させることなく、かつ適切であれば、あらかじめ固体成分を除去することなく、発酵液の揮発性成分を実質的に除去し、非揮発性の微生物代謝産物の固体製剤を生じさせる方法に関する。そのような方法を実施するためのさらに詳細な説明は、本出願人のPCT/EP2006/066057（先の特許出願DE 102005042541.0）に見出せる。
【０１２８】
「実質的に」とは、揮発性成分が除去されて、固体または少なくとも半固体残留物が残り、半固体残留物は、適切であれば、固体を加えることによって固体生成物に変換することができることを意味する。一般に、これは、３０重量％を超えず、頻繁には２０重量％を超えず、特に１５重量％を超えない残留水分含量に至るまでの揮発性成分の除去を意味する。一般に、発酵液の揮発性成分は、有利には、発酵液から除去され、乾燥後に決定される固体成分の総重量に基づいて０．２〜３０重量％、好ましくは１〜２０重量％、特に好ましくは２〜１５重量％、非常に特に好ましくは５〜１５重量％の範囲の残留水分含量に至る。残留水分含量は、当業者が熟知している慣用の方法によって、例えば熱重量分析（Hemminger et al., Methoden der thermischen Analyse [Methods of thermal analysis], Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, 1989）を用いて、決定することができる。
【０１２９】
発酵液から固体の非揮発性代謝産物（群）を得る作業は、１、２またはそれ以上のステップで、特に１ステップまたは２ステップの手順で行うことができる。一般に、固体の代謝産物を得るための少なくとも１ステップ、特に最終ステップは、乾燥ステップを含む。
【０１３０】
１ステップの手順では、所望の残留水分含量に達するまで、発酵液の揮発性成分を、適切であれば上述の予備的な除去後に、除去する。
【０１３１】
２ステップまたは多段階の手順では、まず、例えばろ過（マイクロフィルトレーション、限外ろ過）によって、または揮発性成分の一部分を熱によって蒸発させることによって、発酵液を濃縮する。このステップで除去される揮発性成分の量は、一般に、発酵液の揮発性成分の総重量に基づいて１０〜８０重量％、特に２０〜７０重量％を占める。１以上の以後のステップでは、所望の残留水分含量に達するまで、発酵液の残りの揮発性成分を除去する。
【０１３２】
この実施形態（ＩＩ）では、有益な生成物をあらかじめ枯渇させるか、または実際に単離することなく、揮発性成分を液体培地から本質的に除去する。したがって、発酵液の揮発性成分を除去する場合、非揮発性代謝産物は、本質的に、液体培地の揮発性成分と一緒には除去されず、発酵液由来の他の固体成分の少なくとも一部分、通常そのほとんど、特にその全体とともに、得られる残留物中に残留する。しかし、そうすると、一定量（好ましくは少量）の、一般に、代謝産物の総乾燥重量に基づいて２０重量％を超えず、例えば０．１〜２０重量％、好ましくは１０を超えず、特に５重量％を超えず、特に好ましくは２．５重量％を超えず、非常に特に好ましくは１重量％を超えない量の、所望の非揮発性の微生物代謝産物を、発酵液の揮発性成分を除去する際にこれらの成分と一緒に取り出すことも可能である。非常に特に好ましい実施形態では、それぞれの場合で代謝産物の総乾燥重量に基づいて、少なくとも９０重量％、特に少なくとも９５重量％、とりわけ９９重量％、非常にとりわけ約１００重量％までの所望の非揮発性の微生物代謝産物が、揮発性成分の除去後に得られた発酵培地の固体成分の一部分と、または発酵培地のすべての固体成分と混合された固体として残留する。
【０１３３】
所望であれば、揮発性成分の除去前に、例えば遠心分離またはろ過によって、非デンプン性固体成分の一部分、例えば５〜８０重量％、特に３０〜７０重量％を発酵液から分離することができる。適切であれば、非揮発性の微生物代謝産物を含まないか、または少量しか含まない粗固体粒子を除去するために、そのような予備的分離を実施する。この予備的ろ過は、当業者に公知の慣用の方法を使用して、例えば粗いふるい、ネット、穴のあいたシート等を使用して実施することができる。適切であれば、遠心力分離装置で粗固体粒子を分離して除いてもよい。ここで用いられる設備、例えばデカンタ、遠心分離機、セジカンター（sedicanters）および分離装置も当業者に公知である。この様式では、固体または半固体（例えばペースト状）の残留物が得られ、それは、デンプン供給材料の非揮発性代謝産物および非揮発性の、概して固体の、非デンプン性成分または少なくともその大部分、頻繁には固体の非デンプン性成分の少なくとも９０重量％または全体を含む。
【０１３４】
発酵の固体成分とともに存在する乾燥代謝産物の特性は、製剤化補助剤（例えば担体）およびコーティング材料、結合剤および他の添加物の添加によって、とりわけ種々のパラメータに関して、例えば活性物質含量、粒径、粒子の形状、粉塵化傾向、吸湿性、安定性、特に保存安定性、色、匂い、流動挙動、凝集傾向、帯電、光および温度に対する感受性、機械的安定性および再分散性に関して特異的にそれ自体知られた様式で製剤化することができる。
【０１３５】
慣用の製剤化補助剤には、例えば、結合剤、担体材料、粉末化／流動補助剤、さらにまた着色顔料、殺生物剤、分散剤、消泡剤、粘性調節剤、酸、アルカリ、酸化防止剤、酵素安定化剤、酵素阻害剤、吸着剤（adsorbates）、脂肪、脂肪酸、油またはこれらの混合物が含まれる。そのような製剤化補助剤は、製剤化および乾燥方法、例えばスプレー乾燥、流動床乾燥および凍結乾燥を使用する場合に特に、乾燥助剤として有利に用いられる。さらなる詳細はPCT/EP2006/066057（先の出願DE 102005042541.0）に見出せる。
【０１３６】
上述の添加物および、適切であれば、追加の添加物、例えばコーティング材料の量は、目的の代謝産物の特定的な要求および用いられる添加物の特性に依存して、大きく変動しうる。それは、例えば、それぞれの場合で生成物またはその最終剤形の物質混合物の総重量に基づいて、０．１〜８０重量％の範囲、特に１〜３０重量％の範囲でありうる。
【０１３７】
製剤化補助剤の添加は、発酵液の加工（製品製剤化または固体設計とも称される）前、加工中または加工後に行うことができ、特に乾燥中に行うことができる。発酵液または代謝産物の加工前の製剤化補助剤の添加は、特に、加工対象の物質または生成物の加工性を改善するために有利でありうる。製剤化補助剤は、得られた固体の代謝産物に、あるいは該代謝産物を含む溶液もしくは懸濁液に、例えば発酵完了後の発酵液に直接、または加工中および最終乾燥ステップ前に得られた溶液もしくは懸濁液に加えることができる。
【０１３８】
ゆえに、例えば、補助剤を微生物代謝産物の懸濁液と混合することができる；そのような懸濁液は、担体材料に、例えばスプレーするか、または混合することによって付加することもできる。乾燥中の製剤化補助剤の添加は、例えば代謝産物を含む溶液または懸濁液がスプレーされる場合に重要でありうる。製剤化補助剤の添加は、例えばコーティング／コーティング層を乾燥粒子に付加する場合に、特に乾燥後に行う。乾燥後および追加のコーティングステップ後のいずれでも、生成物に追加の補助剤を加えることができる。
【０１３９】
発酵液からの揮発性成分の除去は、液相から固相を分離するための通例の方法によって、それ自体公知の様式で行われる。該方法には、ろ過による方法および液相の揮発性成分を蒸発させる方法が含まれる。有用な生成物をおおまかに清浄するためのステップおよび製剤化ステップを含んでもよいそのような方法は、例えばBelter, P. A, Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology, John Wiley & Sons (1988), およびUllmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th ed. on CD-ROM, Wiley-VCHに記載されている。発酵終了後の製品製剤化または加工の範囲内で用いることができる、当業者に公知の方法、設備、補助剤および一般的または特異的実施形態は、さらにまた、EP 1038 527, EP 0648 076, EP 835613, EP 0219 276, EP 0394 022, EP 0547 422, EP 1088 486, WO 98/55599, EP 0758 018およびWO 92/12645に記載されている。
【０１４０】
この実施形態（ＩＩ）の第１のバリエーションでは、非揮発性の微生物代謝産物は、液相で溶解された状態で存在すれば、例えば結晶化または沈殿によってそれを液相から固相に変換される。その後、例えば遠心分離、デカントまたはろ過によって、非揮発性固体成分（代謝産物が含まれる）を分離する。同様の様式で油性代謝産物を分離して除いてもよく、吸着剤、例えばシリカ、シリカゲル、ローム、クレイおよび活性炭の添加によって、目的の油性発酵産物が固体に変換される。
【０１４１】
この実施形態（ＩＩ）の第２のバリエーションでは、蒸発によって揮発性成分を除去する。蒸発はそれ自体公知の様式で行うことができる。揮発性成分を蒸発させるために好適な方法の例は、スプレー乾燥、流動床乾燥または流動床凝集、凍結乾燥、空気ドライヤーおよび接触ドライヤー、および押出乾燥である。上述の方法と、形状を付与する方法、例えば押し出し、ペレット化またはプリル化（prilling）の組み合わせを実施してもよい。これらの最後に記載される方法では、部分的にまたは大部分が事前乾燥済みの代謝産物含有物質混合物を用いることが好ましい。
【０１４２】
好ましい実施形態では、発酵液の揮発性成分の除去は、スプレー乾燥法または流動床乾燥法（流動床顆粒化が含まれる）を含む。この目的を達成するために、適切であれば、たとえあったにしても少量の非揮発性の微生物代謝産物しか含まない粗固体粒子を取り出すための予備的分離後に、発酵液を１種以上のスプレー乾燥または流動床乾燥装置に送り込む。固体を含む発酵液の輸送、すなわち送り込みは、便宜上、固体を含む液体のための通例の輸送デバイス、例えばポンプ、例えば偏心スクリューポンプ（例えばDelasco PCM製）または高圧ポンプ（例えばLEWA Herbert Ott GmbH製）を用いて行われる。
【０１４３】
本発明の糖含有液体培地を使用する発酵は、以下のように実施することもできる：
（ｉ）総重量に基づいて５０重量％を超えない、例えば５〜４５重量％の範囲の部分を、ステップ（ａ２）で得られたデキストリン含有培地（１）から取り出し、該部分はデンプン供給材料の非デンプン性固体成分を含み、かつ残りの部分が、第１の代謝産物（Ａ）、例えば固体の非揮発性代謝産物（Ａ）または揮発性代謝産物（Ａ）を製造するための発酵に供給され；かつ
（ｉｉ）この部分を、適切であればデンプン供給材料の非デンプン性固体成分の全体または一部分をあらかじめ除去した後に、代謝産物（Ａ）と同一であるか、または異なる第２の代謝産物（Ｂ）を製造するための発酵に供給する。
【０１４４】
（ｉｉ）の非デンプン性固体成分が分離される場合、糖を含む液体培地の残りの部分の固体含量は、好ましくは５０重量％を超えず、特に３０重量％を超えず、特に好ましくは１０重量％を超えず、非常に特に好ましくは５重量％を超えない量になる。そのような場合、第２の代謝産物（Ｂ）を製造するための発酵前に、すべての固体を分離することが特に好ましい。
【０１４５】
この手順により、（ｉｉ）の分離発酵において、例えば酸素移動速度に関して、一定の最小限の要求を満たす必要がある微生物を使用することが可能になる。（ｉｉ）の分離発酵において用いるために好適な微生物は、例えば、バシラス属の種、好ましくはバシラス・サブティリス（Bacillus subtilis）である。分離発酵においてそのような微生物によって生産される化合物は、特にビタミン、補因子および栄養補助剤、プリンおよびピリミジン塩基、ヌクレオシドおよびヌクレオチド、脂質、飽和および不飽和脂肪酸、芳香族化合物、タンパク質、カロテノイドから選択され、とりわけビタミン、補因子および栄養補助剤、タンパク質およびカロテノイドから選択され、非常にとりわけリボフラビンおよびパントテン酸カルシウムから選択される。
【０１４６】
この手順の好ましい実施形態は、２つの別個の発酵における同一の代謝産物（Ａ）および（Ｂ）の並行製造に関する。これは特に同一代謝産物の異なる適用が異なる純度要求を有する場合に有利である。したがって、第１の代謝産物（Ａ）、例えば飼料添加物として使用されるアミノ酸、例えばリジン、メチオニン、トレオニンまたはグルタミン酸を、固体含有発酵液を使用して製造し、かつ同一の第２の代謝産物（Ｂ）、例えば食品添加物として使用される同一のアミノ酸を、（ｉｉ）の固体が除去された発酵液を使用して製造する。非デンプン性固体成分の完全または部分的除去のおかげで、適用分野が高い純度要求を有する、例えば食品添加物としての代謝産物を加工する場合の精製の複雑さを低減することができる。
【０１４７】
別の好ましい実施形態では、この手順を例えば以下のように実施することができる。代謝産物Ａ、例えばアミノ酸、例えばリジン、メチオニン、グルタミン酸またはトレオニン、クエン酸またはエタノールの製造のための好ましくは大量発酵は、例えばWO 2005/116228（PCT/EP2005/005728）またはPCT/EP2006/066057（先の特許出願DE 102005042541.0）に記載の方法にしたがって、またはバイオエタノールの発酵製造についての公知の方法にしたがって実施される。（ｉ）では、ステップ（ａ２）で得られる培地（１）の一部分を取り出す。（ｉ）にしたがって取り出された部分は、（ｉｉ）にしたがって、通例の方法、例えば遠心分離またはろ過によって固体を完全にまたは部分的に除去することができ、それはＢを製造するための発酵において必要とされるものに依存する。このように得られた培地（１）（適切であれば完全にまたは部分的に固体が除去されている）は、（ｉｉ）にしたがって、代謝産物Ｂを製造するための発酵に供給される。（ｉ）にしたがって分離された固体流は、有利には、大量発酵の培地（１）の流れに戻される。
【０１４８】
大量発酵において製造される微生物代謝産物（Ａ）がエタノールである場合、ステップ（ｉｉ）にしたがって製造される培地（１）は、エタノール（バイオエタノール）の発酵製造において通例の、例えば２０〜３３重量％の範囲のオリゴ糖濃度を有する。ここで再び、ステップ（ｉｉ）の固体の除去は、目的の代謝産物Ｂを製造するための発酵に必要とされるものに依存する。
【０１４９】
上述の手順の好ましい実施形態では、発酵において微生物によって生産される代謝産物Ｂはリボフラビンである。その発酵を実施するために、例えばWO 01/011052, DE 19840709, WO 98/29539, EP 1186664およびFujioka, K.: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31(3), 44-48に、他の炭素供給材料に関して記載されている条件および手順と類似の条件および手順を用いることができる。
【０１５０】
方法のこのバリエーションを実施するために、上記のように、代謝産物Ａ、例えばアミノ酸、例えばリジン、メチオニンまたはグルタミン酸、またはクエン酸またはエタノールを製造するための、好ましくは大量発酵を実施する。（ｉ）にしたがって、ステップ（ａ２）で得られた培地（１）の一部分を取り出し、（ｉｉ）にしたがって、通例の方法、例えば遠心分離またはろ過によって、完全にまたは部分的に固体を除去する。得られた、本質的に完全にまたは部分的に固体が除去されている培地（１）を、（ｉｉ）にしたがって、代謝産物Ｂ（この場合、リボフラビン）を製造するための発酵に供給する。（ｉｉ）にしたがって分離された固体流は、有利には、大量発酵の培地（１）の流れに戻される。
【０１５１】
そのように作製されたリボフラビン含有発酵液は、例えばDE 4037441, EP 464582, EP 438767およびDE 3819745に、他の炭素供給材料に関して記載されている条件および手順と類似の条件および手順によって加工することができる。細胞集団の溶解後、好ましくはデカントによって、結晶状態で存在するリボフラビンを分離する。固体を分離する他の方法、例えばろ過もまた可能である。その後、好ましくはスプレー乾燥機および流動床乾燥機を用いて、リボフラビンを乾燥する。別法として、（ｉｉ）にしたがって製造されたリボフラビン含有発酵混合物を、例えばEP 1048668およびEP 730034に記載の条件および手順と類似の条件および手順によって加工することができる。低温殺菌後、発酵液を遠心分離し、残留する固体含有フラクションを鉱酸で処理する。形成されたリボフラビンをろ過によって水性酸性培地から取り出し、適切であれば洗浄し、次いで乾燥する。
【０１５２】
この手順の別の好ましい実施形態では、発酵において微生物によって生産される代謝産物Ｂはパントテン酸である。その発酵を実施するために、例えばWO 01/021772に、他の炭素供給材料に関して記載されている条件および手順と類似の条件および手順を用いることができる。
【０１５３】
この方法のバリエーションを実施するために、リボフラビンに関して上に記載されるような手順にしたがってよい。（ｉ）にしたがって予備的精製に付され、かつ好ましくは固体が本質的に除去されている培地（１）を、パントテン酸の製造のために、（ｉｉ）にしたがって発酵に供給する。ここで、固体含有液体培地と比較して粘性が低減されることが特に有利である。分離された固体流は、好ましくは、大量発酵の糖含有液体培地（１）の流れに戻される。
【０１５４】
（ｉｉ）にしたがって製造されたパントテン酸含有発酵液は、例えばEP 1 050 219およびWO 01/83799に、他の炭素供給材料に関して記載されている条件および手順と類似の条件および手順によって加工することができる。すべての発酵液を低温殺菌した後、例えば遠心分離またはろ過によって、残留する固体を分離する。固体分離において得られた透明な流出液を、部分的に蒸発させ、適切であれば塩化カルシウムで処理し、乾燥、特にスプレー乾燥する。
【０１５５】
分離して除かれた固体は、並行大量発酵法の範囲内で、それぞれの所望の微生物代謝産物（Ａ）とともに得ることができる。
【０１５６】
乾燥および／または製剤化後、全粒または粉砕された穀粒、好ましくはトウモロコシ、コムギ、オオムギ、キビ、ライコムギおよび／またはライムギを製品製剤またはタンパク質組成物に加えてよい。
【０１５７】
以下に挙げる実施例は、本発明の個別の態様を説明するためのものであり、決して限定的であると理解すべきではない。
【実施例】
【０１５８】
Ｉ．  デンプン供給材料の粉砕
以下で用いられるミルベースを次のように製造した。ローターミルを使用して全粒トウモロコシ穀粒を完全に粉砕した。異なるビーター、製粉経路またはスクリーン要素を使用して、３つの異なる程度の粉末度を得た。実験室用振動スクリーン（振動分析計：Retsch Vibrotronic type VE1；スクリーニング時間５分、振幅：１．５ｍｍ）を用いるミルベースのスクリーン分析では、表１に列挙される結果が得られた。
【表２】
2009517011.tif 000009
【０１５９】
ＩＩ．  酵素によるデンプンの液化およびデンプンの糖化
ＩＩ．１．  糖化ステップでフィターゼを用いない場合
ＩＩ．１（ａ）  酵素によるデンプンの液化
３２０ｇの乾式製粉トウモロコシ粉（maize meal）（Ｔ７１／０３）を４８０ｇの水に懸濁し、連続撹拌によって３１０ｍｇの塩化カルシウムと混合した。全実験期間中、撹拌を継続した。Ｈ２ＳＯ４でｐＨを６．５にし、混合物を３５℃に加温した後、２．４ｇのTermamyl 120L type L（Novozymes A/S）を加えた。４０分間の経過中、反応混合物を８６．５℃の温度に加熱し、適切であれば、ＮａＯＨでｐＨを再調整し、あらかじめ設定した値にした。３０分以内に、さらに４００ｇの乾式製粉トウモロコシ粉（Ｔ７１／０３）を加え、該プロセス中に、温度を９１℃に上げた。反応混合物をこの温度で約１００分間維持した。次いで、さらに２．４ｇのTermamyl 120Lを加え、温度を約１００分間維持した。実験中、ヨウ素デンプン反応を使用して液化の進行をモニタリングした。温度を最終的に１００℃に上げ、反応混合物をさらに２０分間煮沸した。期間中のこの時点で、デンプンはもはや検出できなかった。反応器を３５℃に冷却した。
【０１６０】
ＩＩ．３  酵素によるデンプンの液化のための別のプロトコル
ＩＩ．３（ａ）  トウモロコシ粉
３６０ｇの脱イオン水を反応容器に導入した。１．５４ｍｌのＣａＣｌ２原液（１００ｇ ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ／ｌ）をマッシュに加えて、Ｃａ２＋の終濃度を約７０ｐｐｍにした。継続撹拌しながら２４０ｇのトウモロコシ粉を前記水にゆっくり流し込んだ。５０重量％強度のＮａＯＨ水溶液を使用してｐＨを６．５にした後、４．０ｍｌ（＝２重量％酵素／乾燥物）のTermamyl 120 L type L（Novozymes A/S）を加えた。次いでマッシュを８５℃まで急速に加熱した。このプロセス中、常にｐＨをモニタリングし、かつ、適切であればｐＨを調整することが必要であった。
【０１６１】
最終温度に達した後、追加の穀粉（まず５０ｇの穀粉）を加えた。さらに、０．１３ｍｌのＣａＣｌ２原液をマッシュに加え、Ｃａ２＋濃度を７０ｐｐｍで維持した。添加中、温度を８５℃で一定に維持した。少なくとも１０分間経過させて確かに完全な反応が起こるようにした後、追加の部分（５０ｇの穀粉および０．１３ｍｌのＣａＣｌ２原液）を加えた。２つの部分の添加後、１．６７ｍｌのTermamylを加え；その後、２つの追加の部分（それぞれ５０ｇの穀粉および０．１３ｍｌのＣａＣｌ２原液）を加えた。５５重量％の乾燥物含量が得られた。添加後、温度を１００℃に上げ、マッシュを１０分間煮沸した。
【０１６２】
サンプルを採取し、室温に冷却した。サンプルを脱イオン水で希釈（約１：１０）した後、一滴の濃縮ルゴール液（１リットルあたりヨウ素５ｇおよびヨウ化カリウム１０ｇの混合物）を加えた。強い青色呈色が残留デンプンの存在を示し；すべてのデンプンが加水分解されると褐色呈色が観察された。試験で残留デンプンの一部分が存在することが示された場合、温度を再び８５℃に下げて、一定に保った。ヨウ素デンプン反応が陰性になるまで、さらに１．６７ｍｌのTermamylを加えた。
【０１６３】
ＩＩ．３（ｂ）  ライムギ粉（セルラーゼ／ヘミセルラーゼでの前処理を含む）
３６０ｇの脱イオン水を反応容器に導入した。継続撹拌しながら１５５ｇのライムギ粉を前記水にゆっくり流し込んだ。温度を５０℃で一定に維持した。５０重量％強度のＮａＯＨ水溶液を使用してｐＨを５．５にした後、３．２１ｍｌ（＝２．５重量％酵素／乾燥物）のViscozyme L（Novozymes A/S）を加えた。３０分後、追加の穀粉を加えた。まず５５ｇの穀粉を加えた。さらに３０分後、さらに５０ｇの穀粉を加え；３０分後、さらに４０ｇの穀粉を加えた。最終添加の３０分後、液化を開始させることができた。
【０１６４】
１．７ｍｌのＣａＣｌ２原液（１００ｇ ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ／ｌ）を加えた。５０重量％のＮａＯＨ水溶液を使用してｐＨを６．５に調整した後、５．０ｍｌ（＝２重量％酵素／乾燥物）のTermamyl 120 L type L（Novozymes A/S）を加えた。次いでマッシュを８５℃に急速に加熱した。このプロセス中、ｐＨを継続してモニタリングし、適切であれば調整した。
【０１６５】
最終温度に達した後、追加の穀粉（まず６０ｇの穀粉）を加えた。さらに、０．１３ｍｌのＣａＣｌ２原液をマッシュに加え、Ｃａ２＋濃度を７０ｐｐｍで維持した。添加中、温度を８５℃で一定に維持した。少なくとも１０分間経過させて確かに完全な反応が起こるようにした後、追加の部分（４０ｇの穀粉および０．１ｍｌのＣａＣｌ２原液）を加えた。１．１ｍｌのTermamylを加え；その後、追加の部分（４０ｇの穀粉および０．１ｍｌのＣａＣｌ２原液）を加えた。５５重量％の乾燥物含量に達した。添加後、温度を１００℃に上げ、マッシュを１０分間煮沸した。
【０１６６】
サンプルを採取し、室温に冷却した。サンプルを脱イオン水で希釈（約１：１０）した後、一滴の濃縮ルゴール液（１リットルあたりヨウ素５ｇおよびヨウ化カリウム１０ｇの混合物）を加えた。強い青色呈色が残留デンプンの存在を示し；すべてのデンプンが加水分解されると褐色呈色が観察された。試験で残留デンプンの一部分が存在することが示された場合、温度を再び８５℃に下げて、一定に保った。ヨウ素デンプン反応が陰性になるまで、さらに１．１ｍｌのTermamylを加えた。
【０１６７】
ＩＩ．３（ｃ）  コムギ粉（キシラナーゼでの前処理を含む）
３６０ｇの脱イオン水を反応容器に導入した。前記水を５５℃に加熱し、５０重量％強度のＮａＯＨ水溶液を使用してｐＨを６．０に調整した。温度およびｐＨを調節した後、３．２１ｍｌ（＝２．５重量％酵素／乾燥物）のShearzyme 500L（Novozymes A/S）を加えた。継続撹拌しながら１５５ｇのコムギ粉を前記溶液にゆっくり流し込んだ。温度およびｐＨを一定に保った。３０分後、追加の穀粉を加えた。まず５５ｇの穀粉を加えた。さらに３０分後、５０ｇの穀粉を加え；３０分後、さらに４０ｇの穀粉を加えた。最終添加の３０分後、液化を開始させることができた。
【０１６８】
ＩＩ．３（ｂ）に記載のように液化を実施した。
【０１６９】
ＩＩＩ．  菌株
ATCC13032 lysCfbr
以下のいくつかの実施例では、改変コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）株（WO 05/059144にATCC13032 lysCfbrの名称で記載されている）を用いた。
【０１７０】
ＩＶ：  グルコアミラーゼ発現／産生株の同定
ＩＶ（ａ）  遺伝子データベースのスクリーニング
グルコアミラーゼ産生株の検索
１．  グルコアミラーゼ（Glycoamylase）（１，４−α−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ）は以下の酵素番号EC 3.2.1.3 [1]によって分類される。
【０１７１】
２．  クエリEC 3.2.1.3での検索を以下のデータベース：Brenda, Swissprot, ERGO-WIT, CAZYおよびPIRで実施し、それぞれの場合でEC 3.2.1.3を有するタンパク質のリストを得た。
【０１７２】
３．  それぞれの結果のリストを統合し、分類学上の界であるアーケア（Archaea）、細菌および真菌のヒットに関してフィルターし、種名によって分類した。
【０１７３】
４．  段落３のフィルター基準に適合し、かつ、それに関して、段落２に記載の少なくとも１つのデータベースにグルコアミラーゼエントリが見出された種は、グルコアミラーゼの生産が可能である可能性が非常に高い。具体的には、それらは以下の種である：
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、アルクスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）、アッシビヤ・ゴシッピイ（Ashbya gossypii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・カンジダス（Aspergillus candidus）、アスペルギルス・ホエチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachi）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・フェニシス（Aspergillus phoenicis）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、アスペルギルス・シロウサミ（Aspergillus shirousami）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、アテリア・ロルフシイ（Athelia rolfsii）、バシラス・シルクランス（Bacillus circulans）、バシラス・ステアロテルノフィラス（Bacillus stearothermophilus）、ベータ・ブルガリス（Beta vulgaris）、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）、ブルコルデリア・セノセパシア（Burkholderia cenocepacia）、ブルコルデリア・フンゴラム（Burkholderia fungorum）、ブルコルデリア・シュードマレイ（Burkholderia pseudomallei）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・アンタルクチカ（Candida antarctica）、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）、カンジダ・ツクバエンシス（Candida tsukubaensis）、カウロバクター・クレセンタス（Caulobacter crescentus）、セファロスポリウム・シャルチコラ（Cephalosporium charticola）、セファロスポリウム・エイキホルニエ（Cephalosporium eichhorniae）、セラトシスチス・パラドクサ（Ceratocystis paradoxa）、ケトミウム・テルモフィラム（Chaetomium thermophilum）、クロロビウム・テピダム（Chlorobium tepidum）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）、クラドスポリウム・レジナエ（Cladosporium resinae）、クロストリジウム属種（Clostridium sp.）、クロストリジウム・テルモセラム（Clostridium thermocellum）、クロストリジウム・テルモサッカロリチカム（Clostridium thermosaccharolyticum）、コニオフォラ・プテアナ（Coniophora puteana）、コルチシウム・ロルフシイ（Corticium rolfsii）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、デバリオミセス・ハンセニイ（Debaryomyces hansenii）、デバリオミセス・オクチデンタリス（Debaryomyces occidentalis）、エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）、エンドミセス属種（Endomyces sp.）、エンドミコプシス・フィブリゲラ（Endomycopsis fibuligera）、フザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、ハロアルクラ・マリスモルツイ（Haloarcula marismortui）、ホルモコニス・レジナエ（Hormoconis resinae）、フミコラ・グリセア（Humicola grisea）、フミコラ・ラヌギノーザ（Humicola lanuginosa）、ヒポクレア・リキシイ（Hypocrea lixii）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、レンチヌラ・エドデス（Lentinula edodes）、リポミセス・コノネンコエ（Lipomyces kononenkoae）、マグナポルテア・グリセア（Magnaporthe grisea）、メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、メタノカルドコッカス・ジャナスキイ（Methanocaldococcus jannaschii）、メタノコッカス・ジャナスキイ（Methanococcus jannaschii）、メタ���コッカス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）、メタノサルシナ・アセチボランス（Methanosarcina acetivorans）、メタノサルシナ・バルケリ（Methanosarcina barkeri）、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）、モナスカス・リビギノサス（Monascus rubiginosus）、モナスカス属種（Monascus sp.）、ムコール・ロウキシアナス（Mucor rouxianus）、ミコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis）、ミコバクテリウム・レプレ（Mycobacterium leprae）、ミコバクテリウム・マリナム（Mycobacterium marinum）、ミコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、ミロテシウム属種（Myrothecium sp.）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ノストック・プンクチフォルメ（Nostoc punctiforme）、オリザ・サティバ（Oryza sativa）、ペシロミセス・バリオチイ（Paecilomyces variotii）、ペネウス・ジャポニカス（Penaeus japonicus）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、ペニシリウム・オキサリカム（Penicillium oxalicum）、ピクロフィラス・トリダス（Picrophilus torridus）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、ラルストニア・メタリデュランス（Ralstonia metallidurans）、ラナ・ジャポニカ（Rana japonica）、リゾビウム・レグミノサラム（Rhizobium leguminosarum）、リゾプス・デレマル（Rhizopus delemar）、リゾプス・ジャバニカス（Rhizopus javanicus）、リゾプス・ニベウス（Rhizopus niveus）、リゾプス・オリザエ（Rhizopus oryzae）、リゾプス属種（Rhizopus sp.）、ロドコッカス属種（Rhodococcus sp.）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ロドスピリラム・ルブラム（Rhodospirillum rubrum）、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ジアスタチカス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミコプシス・フィブリゲラ（Saccharomycopsis fibuligera）、サッカロミコプシス・フィブリゲラ（Saccharomycopsis fibuligera）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、シュワンニオミセス・オクチデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）、シェワネラ・オネイデンシス（Shewanella oneidensis）、スフィンゴモナス・アロマチシボランス（Sphingomonas aromaticivorans）、ストレプトミセス・コエリコロル（Streptomyces coelicolor）、スルホロバス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）、スルホロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）、タラロミセス・エメルソニイ（Talaromyces emersonii）、テルミトミセス・クリペアタス（Termitomyces clypeatus）、テルモアクチノミセス・ブルガリス（Thermoactinomyces vulgaris）、テルモアネロバクター・テングコンゲンシス（Thermoanaerobacter tengcongensis）、テルモアネロバクテリウム・テルモサッカロリチカム（Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum）、テルモアスカス・クルスタセウス（Thermoascus crustaceus）、テルモミセス・ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosus）、テルモプロテウス・テナクス（Thermoproteus tenax）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トリコデルマ・レエゼイ（Trichoderma reesei）およびトリコスポロン・アデニノボランス（Trichosporon adeninovorans）。
【０１７４】
ＩＶ（ｂ）  振とうフラスコ試験によるスクリーニングおよびその後の酵素活性アッセイ
振とうフラスコ試験においてグルコアミラーゼ活性に関して種々の微生物を調べる。この目的に好適な培地は、生物の成長に好適で、かつグルコアミラーゼの発現を生じさせる任意の慣用の培地である。好適な培地は市販されているか、または公開されているプロトコル（例えばAmerican Type Culture Collectionのカタログに記載のプロトコル）にしたがって調製することができる。
【０１７５】
例えば、異なる鎖長のグルコースオリゴマーの混合物を合成培地（defined medium）中の単一の炭素供給材料として用いることができる。発酵条件下ではオリゴ糖の熱による加水分解が生じないため、グルコアミラーゼおよび／またはマルターゼ活性を有する菌株のみがこの培地中で成長可能である。好適な基質の例はMaldex 150（Amylum Group）である。種々の発酵条件（ｐＨ、温度）下でスクリーニングを実施する。
【０１７６】
グルコアミラーゼとマルターゼの活性を区別するために、実験前に混合物のオリゴ糖組成を、例えばＨＰＬＣを使用して分析する。例えば、Maldex 150は以下の組成を有する（表２を参照のこと）。
【表３】
2009517011.tif 000010
【０１７７】
この分析にしたがってマルトースおよびグルコースを含む対照培地を作製する。そして、この対照から得られる値を超える、オリゴ糖培地中の成長およびリジン生産は、グルコアミラーゼ活性に明らかに起因すると考えることができる。
【０１７８】
スクリーニングのための炭素供給材料として用いることができるマルトデキストリン混合物の代替物は、純粋なマルトテトラオース（maltotetraose）、マルトペンタオース（maltopentaose）等である。培養停止後、バイオマスを遠心分離して除き、上清をろ過する。
【０１７９】
透明な上清をグルコアミラーゼ活性のアッセイに用いる（CHEN et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 51, 175-181 (2005)）。このために、０．２ｍｌの５０ｍＭ酢酸塩／酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）および０．５％の可溶性デンプンおよび０．２ｍｌの上清の反応混合物をこの目的で用いる。６０℃で１０分間の反応時間後、１００℃で１０分間煮沸することによって反応を停止させる。グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ法（Bergmayer and Bernt, 1974）を活用して、遊離したグルコースの量を決定する。これに関して、１単位のグルコアミラーゼ活性を、現行の反応条件下で可溶性デンプンから毎分１μｍｏｌのグルコースを遊離させる酵素の量として定義する。
【０１８０】
ＩＶ（ｃ）  プライマー／プローブを活用するスクリーニング
グルコアミラーゼコード配列に関して研究対象の生物を検査するための代替法は、前記配列に特異的なプライマーまたはプローブを利用するスクリーニングである。
【０１８１】
（ｉ）  既知のグルコアミラーゼ遺伝子の保存領域から出発して、種々の生物から、グルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を特定およびクローニングするためのプローブを構築する。特に、所望の生物のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションにそのようなプローブを利用することができ、次いで所望の遺伝子を特定するためにサザンブロットを標準的方法によって実施する。
【０１８２】
当業者は、特に教科書「The DIG System Users Guide for Filter Hybridization」, Boehringer Mannheim GmbH（Mannheim, Germany, 1993）およびLiebl et al.（International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260）に、ハイブリダイゼーションによってＤＮＡ配列を特定するための手引きを見出せる。
【０１８３】
（ｉｉ）  既知のグルコアミラーゼ遺伝子の保存領域から出発して、ＰＣＲプライマーを合成する。研究対象の生物のＤＮＡを用いるＰＣＲ反応において前記プライマーを用いる。プライマーの好適な結合部位、すなわちグルコアミラーゼコード遺伝子が存在すれば、その後に実施されるゲル電気泳動によって、対応する増幅オリゴヌクレオチドを特定することができる。当業者は、特にGaitによる教科書: Oligonucleotide sythesis: a practical approach（IRL Press, Oxford, UK, 1984）およびNewton and Graham: PCR（Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994）に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用してＤＮＡ配列を増幅するための手引きを見出せる。
【０１８４】
実施例１
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）を使用する振とうフラスコ実験に、液化トウモロコシ粉加水分解物を用いた。
【０１８５】
（Ｉ）  液化
３６０ｇの脱イオン水を反応容器に導入した。継続撹拌しながら２４０ｇのトウモロコシ粉を前記水にゆっくり流し込んだ。５０％強度のＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨを５．８にした後、４．０ｍｌ（＝２重量％酵素／乾燥物）のLiquozyme SC（Novozymes A/S製）を加えた。次いでマッシュを８５℃に急速に加熱した。このプロセス中、ｐＨを継続して検査し、適切であれば、調整した。
【０１８６】
最終温度に達した後、追加の穀粉（まず５０ｇの穀粉）を加えた。添加中、温度を８５℃で一定に維持した。少なくとも１０分間経過させて確かに完全な反応が起こるようにした後、追加の部分（５０ｇ）の穀粉を加えた。２つの部分の添加後、１．６７ｍｌのLiquozymeを加え；その後、２つの追加の部分（それぞれ５０ｇ）の穀粉を加えた。５５重量％の乾燥物含量が得られた。添加後、温度を１００℃に上げ、マッシュを１０分間煮沸した。
【０１８７】
サンプルを採取し、室温に冷却した。サンプルを脱イオン水で希釈（約１：１０）した後、一滴の濃縮ルゴール液（１リットルあたりヨウ素５ｇおよびヨウ化カリウム１０ｇの混合物）を加えた。強い青色呈色が残留デンプンの存在を示し；すべてのデンプンが加水分解されると褐色呈色が観察される。混合物がデンプンに関して陰性であることが検査されたら、熱いうちに滅菌容器に充填し、冷却後、４℃で保存した。
【０１８８】
（ＩＩ）  コリネバクテリウム・グルタミカムを用いる発酵
菌株
フィードバック調節が解除されたアルパルトキナーゼを有する、改変された野生型であるATCC13032 lysCfbrを使用した。
【０１８９】
種菌の調製
細胞を滅菌ＣＭ＋ＣａＡｃ寒天（組成：表３を参照のこと；１２１℃で２０分）上にストリークし、次いで３０℃で一晩インキュベートした。その後、細胞をプレートからかきとり、生理食塩水に再懸濁した。２つのバッフルを備えた２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中の２５ｍｌの培地（表４を参照のこと）に、それぞれ、６１０ｎｍでの光学濃度がＯＤ６１０値０．５に達する量の、得られた細胞懸濁液を接種した。
【表４】
2009517011.tif 000011
【０１９０】
発酵液の調製
フラスコ培地の組成は表４に示される通りである。実験を３回実施した。
【表５】
2009517011.tif 000012
【０１９１】
接種後、フラスコを３０℃で３日間、加湿シェーカー中で振とう（２００ｒｐｍ）しながらインキュベートした。発酵終了後、ＨＰＬＣによってリジン含量を決定した。Agilent 1100 series LC systemを用いてＨＰＬＣ分析を実施した。Agilent 1100 series LC System HPLCでの高圧液体クロマトグラフィーによってアミノ酸濃度を決定した。オルトフタルアルデヒドでのプレカラム誘導体化により、形成されたアミノ酸の定量化を可能にし；Agilent Hypersil AAカラムを使用してアミノ酸混合物を分離する。
【０１９２】
その結果を表５にまとめる。
【表６】
2009517011.tif 000013
【０１９３】
実施例２
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）を使用する振とうフラスコ実験に、液化トウモロコシ粉加水分解物を用いた。
【０１９４】
（Ｉ）  液化
実施例１の項目（Ｉ）に記載のように液化を実施した。
【０１９５】
（ＩＩ）  アスペルギルス・ニガーを用いる発酵
菌株
ｇｌａＡプロモーターの制御下にアスペルギルス・フィクウム（Aspergillus ficuum）由来の６コピーのｐｈｙＡ遺伝子を有するアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）フィターゼ産生株を、WO98/46772に詳細に記載されているNP505-7の製造と同様に作製した。３つの改変ｇｌａＡアンプリコン（ISO505に類似）を有するが、ｐｈｙＡ発現カセットが組み込まれていない菌株を対照として使用した。
【０１９６】
種菌の調製
１バッフルを備えた１００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中の２０ｍｌの前培養培地（表６を参照のこと）に、それぞれ、１００μｌの凍結培養物を接種し、加湿シェーカー中で振とう（１７０ｒｐｍ）しながら、３４℃で２４時間インキュベートする。
【表７】
2009517011.tif 000014
【０１９７】
１バッフルを備えた２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍｌの本培養培地（表７を参照のこと）に、それぞれ、５ｍｌの前培養を接種する。
【０１９８】
発酵液の調製
フラスコ培地の組成は表７に示される通りである。各サンプルについて２フラスコを準備した。
【表８】
2009517011.tif 000015
【０１９９】
接種後、フラスコを３４℃で６日間、加湿シェーカー中で振とう（１７０ｒｐｍ）しながらインキュベートした。発酵停止後、２５０ｍＭ酢酸／酢酸ナトリウム／Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．１重量％）、ｐＨ５．５バッファー中で、フィチン酸を基質として使用して、好適なフィターゼ活性レベル（標準：０．６Ｕ／ｍｌ）でフィターゼ活性を決定した。アッセイをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）での使用に標準化した。１０μｌの酵素溶液を、２５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．５中の６．４９ｍＭフィチン酸塩溶液（フィチン酸塩：フィチン酸のドデカナトリウム塩）１４０μｌと混合した。３７℃で１時間のインキュベーション後、等容量（１５０μｌ）のトリクロロ酢酸を加えて反応を停止させた。この混合物の１アリコート（２０μｌ）を、０．３２Ｎ Ｈ２ＳＯ４、０．２７重量％のモリブデン酸アンモニウムおよび１．０８重量％のアスコルビン酸を含む溶液２８０μｌに移した。その後、５０℃で２５分間インキュベートした。青色溶液の吸収を８２０ｎｍで測定した。その結果を表８にまとめる。
【表９】
2009517011.tif 000016
【国際調査報告】
2009517011.tif 000017
2009517011.tif 000018
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