(57)【要約】  本発明は、インフルエンザＡウイルスのゲノムのＨ５及びＮ１遺伝子にそれぞれ位置する２つの標的配列を増幅するための２対のオリゴヌクレオチドに関するものであり、該配列は長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲であり、以下の配列：−配列番号１：ＴＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＧＡＡＴＧＧＣＡ、−配列番号２：ＧＣＣＧＡＡＴＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡ、−配列番号３：ＣＧＴＧＧＡＴＴＧＴＣＴＣＣＧＡＡＡ、及び−配列番号４：ＧＧＡＡＴＧＣＴＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡ又はそれらの相補配列から派生する、連続する１０ヌクレオチドの少なくとも一つの断片を含んでなるものである。  また、本発明はインフルエンザＡウイルスのＨ５及びＮ１遺伝子の存在を検出するための増幅産物検出用オリゴヌクレオチド、これらすべての配列の使用および検出方法、および診断用キットに関する。  本発明は、特に診断の分野に適用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザＡウイルスのゲノムのＨ５遺伝子及びＨ１遺伝子にそれぞれ位置する２つの標的配列を増幅するための２対のオリゴヌクレオチドであって、Ｈ５遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチドの対は、
-長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲であり、配列番号１：ＴＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＧＡＡＴＧＧＣＡ又はその相補配列から派生する、連続する１０ヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む第一オリゴヌクレオチド、及び
−長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲であり、配列番号２：ＧＣＣＧＡＡＴＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡ又はその相補配列から派生する、連続する１０ヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む第二オリゴヌクレオチド
からなり、一方でＮ１遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチドの対は：
−長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲であり、配列番号３：ＣＧＴＧＧＡＴＴＧＴＣＴＣＣＧＡＡＡ又はその相補配列から派生する、連続する１０ヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む第一オリゴヌクレオチド、及び
−長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲であり、配列番号４：ＧＧＡＡＴＧＣＴＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡ又はその相補配列から派生する、連続する１０ヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む第二オリゴヌクレオチド
からなる２対のオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
インフルエンザＡウイルスのゲノムのＨ５遺伝子に位置する標的配列を増幅するための、
-長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲であり、配列番号１：ＴＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＧＡＡＴＧＧＣＡ又はその相補配列から派生する、連続する１０ヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む第一オリゴヌクレオチド、及び
−長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲であり、配列番号２：ＧＣＣＧＡＡＴＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡ又はその相補配列から派生する、連続する１０ヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む第二オリゴヌクレオチド
からなるオリゴヌクレオチドの対。
【請求項３】
インフルエンザＡウイルスのゲノムのＮ１遺伝子に位置する標的配列を増幅するための、
-長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲であり、配列番号３：ＣＧＴＧＧＡＴＴＧＴＣＴＣＣＧＡＡＡ又はその相補配列にから派生する、連続する１０ヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む第一オリゴヌクレオチド、及び
−長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲であり、配列番号４：ＧＧＡＡＴＧＣＴＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡ又はその相補配列から派生する、連続する１０ヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む第二オリゴヌクレオチド
からなるオリゴヌクレオチドの対。
【請求項４】
第一オリゴヌクレオチドがＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ酵素によって認識されることができるプロモーター配列を付加的に含んでなることを特徴する、請求項１から３の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドの対。
【請求項５】
ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ酵素によって認識されることができるプロモーター配列はＴ７ポリメラーゼであることを特徴とする、請求項４に記載のオリゴヌクレオチドの対。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドがＨ５遺伝子に位置する標的配列を増幅することが可能なとき、第一オリゴヌクレオチドが本質的に以下の配列：
配列番号５：ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＴＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＧＡＡＴＧＧＣＡ又はその相補配列からなることを特徴とする、請求項４及び５のどちらか一項に記載のオリゴヌクレオチドの対。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドがＮ１遺伝子に位置する標的配列を増幅することが可能なとき、第一オリゴヌクレオチドが本質的に以下の配列：
配列番号６：ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＴＧＴＣＴＣＣＧＡＡＡ又はその相補配列からなることを特徴とする、請求項４から６の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドの対。
【請求項８】
各オリゴヌクレオチドが長さ１２と３０ヌクレオチドの間の範囲であり、連続する１６ヌクレオチドの少なくとも一つの断片を含んでなり、好ましくは長さ１５と２６ヌクレオチドの間の範囲であり、連続する１８ヌクレオチドの少なくとも一つの断片を含んでなることを特徴とする、請求項１から７の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドの対。
【請求項９】
インフルエンザＡウイルスのゲノムのＨ５及びＮ１遺伝子にそれぞれ位置する２つの標的配列を検出するためのプローブとして使用するためのオリゴヌクレオチドの対であって、Ｈ５遺伝子を検出するためのプローブは：
配列番号７：ＡＣＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＡＣＴＣＣＡＡＴ又はその相補配列からなり、一方でＮ１遺伝子を検出するためのプローブは：
配列番号８：ＧＣＧＡＡＡＴＣＡＣＡＴＧＴＧＴＧＴＧＣＡＧＧＧＡ又はその相補配列からなり、各配列は少なくとも一つの標識手段を含むオリゴヌクレオチドの対。
【請求項１０】
インフルエンザＡウイルスのゲノムのＨ５遺伝子に位置する標的配列の増幅により生じた増幅された核酸配列を検出するためのプローブとして使用するオリゴヌクレオチドであって、該増幅は請求項２及び４から８の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドの対によって行われたものであり、検出プローブは長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲であり、配列番号７：ＡＣＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＡＣＴＣＣＡＡＴ又はその相補配列から派生する、連続する１０ヌクレオチドの少なくとも一つの断片を含むものであり、該配列は少なくとも１つの標識手段を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
インフルエンザＡウイルスのゲノムのＮ１遺伝子に位置する標的配列の増幅により生じた増幅された核酸配列を検出するためのプローブとして使用するオリゴヌクレオチドであって、該増幅は請求項３から８の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドの対によって行われたものであり、検出プローブは長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲であり、配列番号８：ＧＣＧＡＡＡＴＣＡＣＡＴＧＴＧＴＧＴＧＣＡＧＧＧＡ又はその相補配列から派生する、連続する１０ヌクレオチドの少なくとも一つの断片を含むものであり、該配列は少なくとも１つの標識手段を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
分子プローブからなることを特徴とする請求項９から１１の何れか一項に記載の検出プローブ。
【請求項１３】
分子プローブであり、好ましくはＨ５遺伝子を検出するための
配列番号９：[6-FAM]-ｃｇａｔｃｇａＣＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＡＣＴＣＣＡＡｔｃｇａｔｃｇ-[DabSyl]、
Ｎ１遺伝子を検出するための
配列番号１０：[6-FAM]-ｃｇａｔｃｇＧＣＧＡＡＡＴＣＡＣＡＴＧＴＧＴＧＴＧＣＡＧＧＧＡｃｇａｔｃｇ-[DabSyl]
からなる、請求項９から１２の何れか一項に記載の検出プローブ。
【請求項１４】
生物試料に存在することが疑われるインフルエンザＡウイルスのゲノムの核酸の増幅のための反応においての、又は検出用プローブとしての、請求項１から８の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドの１又は２対の使用。
【請求項１５】
請求項１から８の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドの対を使用する、増幅に必要な増幅試薬の存在下で、核酸の増幅反応を受ける試料に存在しうるインフルエンザＡウイルスの核酸の検出方法であって、関心の増幅産物の存在が検出される検出方法。
【請求項１６】
使用する増幅反応がＲＴ-ＰＣＲであることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
使用する増幅反応が転写増幅技術であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
使用する増幅技術がＮＡＳＢＡ技術であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
試料中に存在しうるインフルエンザＡウイルスの２つのＨ５及びＮ１遺伝子の増幅方法であって、
−増幅バッファー中の試料を
・インフルエンザＡウイルスのＨ５遺伝子に位置する関心の領域の上流及び下流にそれぞれハイブリダイゼーションするために、一つがプロモーター配列を付加的に含み、他方がプロモーター配列を結合した該プライマーの対極である、それぞれが長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲の２つの増幅プライマーの存在下で、
・インフルエンザＡウイルスのＮ１遺伝子に位置する関心の領域の上流及び下流にそれぞれハイブリダイゼーションするために、一つがプロモーター配列を付加的に含み、他方がプロモーター配列を結合した該プライマーの対極である、それぞれが長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲の２つの増幅プライマーの存在下で
インキュベートすること、
−試料に以下の試薬：
・ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素
・ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素
・ＲＮＡ分解酵素Ｈ活性を有する酵素
・ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素
を加えること、及び
−最適な条件下で、増幅が起こるために十分な時間にわたって、前記の作られた反応混合物を維持すること
を含んでなる方法。
【請求項２０】
−請求項１から８に記載のオリゴヌクレオチドの対、
−増幅された核酸配列の少なくとも一部と実質的に相補的な核酸配列を有する、標識された又は標識されてもよい請求項９から１３の何れか一項に記載の２つのオリゴヌクレオチド、
−増幅反応を行うために必要である試薬
を含む、試料に存在しうるインフルエンザＡウイルスのＨ５及びＮ１遺伝子の検出用キット。
【請求項２１】
増幅反応を行うために必要である試薬がＮＡＳＢＡ増幅用試薬である、請求項２０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの固体支持体の存在下で核酸を標識する方法に関する。
本発明は、インフルエンザＡウイルスのゲノムのＨ５及びＮ１遺伝子にそれぞれ位置する２つの標的配列の増幅および検出のためのオリゴヌクレオチドに関する。
また、本発明は、インフルエンザＡウイルスのゲノムのＨ５及びＮ１遺伝子の存在を診断するためのこれらのオリゴヌクレオチドの使用、検出の方法、及びキットに関する。
【０００２】
インフルエンザを診断するために通常使用されている従来技術には、凝集反応、凝集反応の阻害又は寒天ゲル拡散法が挙げられる。これらの方法は一般的に使用され、インフルエンザウイルスＡの特徴づけを可能にする。
ＩＯＥ（国際獣疫事務局）のマニュアルにあるプロトコルによれば、これらの方法の可能な代替には、胚期の卵又はＭＤＣＸ細胞でのウイルス培養がある。しかしながら、判定結果を得るためには複数日が必要であり、この遅延が時には臨床上の必要性又は緊急性に適合しない。
【０００３】
また、抗体又は抗原を検出するためのＥＬＩＳＡ技術又は免疫蛍光試験は非常に発達しているが、検出のこれらの「免疫学的」方法は、従来のウイルス培養より、しばしば感度が悪く、特異性に劣る。
そのため、鳥インフルエンザウイルスの高病原性型、Ｈ５Ｎ１亜型、の最近の出現により、迅速で特異的及び高感度である診断試験への強い要求が起こっている。この理由のため、上に挙げた様々な方法は、ＲＴ-ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ鎖反応）のような「分子」技術に次第に置き換わってきている。ＲＴ-ＰＣＲはより感度がよく、試料に「生存」ウイルスが存在することを必要としないので、インフルエンザウイルスの様々な種類を、型や亜型に分けることが可能である。このリアルタイム技術の発達（「リアルタイムＲＴ-ＰＣＲ」）により、Ａ型ウイルスの診断のためのその使用が大いに促進された。
【０００４】
例えば、D.M. Whiley等は、最近の出版（Diagnostic Microbiology and Infectious Diseases (2005), 印刷中)の中で,  ５'ヌクレアーゼを含むＲＴ-ＰＣＲ反応に基づいた、臨床試料中の広範囲のインフルエンザ亜型を検出するための試験について記載している。二つのオリゴヌクレオチド及びプローブは、Ａウイルスの２３の亜型のＭ（マトリックス）タンパク質をコードする遺伝子に相同になるように選択した。したがって、この試験は臨床試料のインフルエンザＡの検出が可能であるが、しかし一方で、含まれる種類を正確に亜型に分けることは可能になっていない。
【０００５】
E.K.O. Ng等(Emerging Infectious Diseases (2005) vol. 11 (8), p. 1303-1305)はＨ５Ｎ１のＨＡ遺伝子の２つの領域を特異的に標的にするために、標識されているプローブとオリゴヌクレオチドの２セットを使用し、２工程からなるマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲに基づく試験を最近開示した。したがって、これはヒト試料でＨ５亜型を直接検出するために迅速で高感度な試験を開発することを可能にした。この試験はウイルスのＨ５Ｎ１亜型に香港とベトナムで感染した患者に由来する臨床試料で評価されたが、感染にどのウイルス亜型が関与しているかを直接的に診断することは可能になっていない。
【０００６】
S. Payungporn等（Viral Immunology (2004) vol. 17 (4), p. 588-593 and Journal of Virological Methods (2005), 印刷中)は、単一工程で、リアルタイムマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲに基づいた、Ｈ５Ｎ１亜型のＭ、Ｈ５及びＮＩ配列を同時に検出するための方法を記載する。Ｍ、Ｈ５およびＮＩ配列に対応するオリゴヌクレオチドと、３つの蛍光シグナルを同時に検出するために様々に標識されたＴａｑＭａｎプローブが選択され、試験に使用された。Ｈ５及びＮ１オリゴヌクレオチド配列はＨ５Ｎ１ウイルスに特異的な５０以上の既知配列をカバーする不変領域から選択された。しかしながら、このＲＴ−ＰＣＲ法は非等温であり、時にはコンタミネーションを起こしやすいことに注意が必要である。
【０００７】
感染因子の存在を検出するために使用できる別の分子方法は、ＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）技術である。例えば、R.A. Collins等(Journal of Virological Methods (2002) vol. 103, p. 213-225 及び Avian Diseases (2003) vol. 47 (3), p. 1069-1074)は、ＥＣＬ（電気化学発光）検出システムと組み合わせたＮＡＳＢＡ技術を使用する鳥インフルエンザのＨ５亜型の検出（高病原性および低病原性亜型の検出）を記載する。ＮＡＳＢＡ技術は様々な酵素活性を含む核酸の等温増幅の方法であり、Ｈ５ウイルスの迅速な検出を可能にする。この方法による核酸の増幅は、増幅反応中に直接的に逆転写工程を導入する利点から、インフルエンザイウイルスの遺伝子のようなＲＮＡ遺伝子に適している。それにもかかわらず、この文献に記載されている方法では、高病原性系統から低病原性系統を検出し区別することが可能になっているにもかかわらず、ウイルスのＨ５Ｎ１型の特異的な同定が可能となっていない。
【０００８】
そのため、転写増幅技術を使用してＨ５Ｎ１の種類のインフルエンザＡウイルスを同定するための試験であり、ＲＮＡウイルスの増幅及び検出に特に適しているものは、まだ待たれている。加えて、マルチプレックス試験、すなわちＨ５及びＮ１遺伝子の２つを同時に増幅し検出することを可能にする試験、ＮＡＳＢＡのような転写増幅技術である増幅技術は、特に有利である。
【０００９】
そのため、本発明はインフルエンザＡウイルスのゲノムのＨ５遺伝子及びＨ１遺伝子に、それぞれ位置している２つの標的配列を増幅するための２対のオリゴヌクレオチドであって、Ｈ５遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチドの対は：
−長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲であり、配列番号１：ＴＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＧＡＡＴＧＧＣＡ又はその相補配列から派生する、連続する１０ヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む第一オリゴヌクレオチド、及び
−長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲であり、配列番号２：ＧＣＣＧＡＡＴＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡ又はその相補配列から派生する、連続する１０ヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む第二オリゴヌクレオチド
からなり、一方でＮ１遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチドの対は：
−長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲であり、配列番号３：ＣＧＴＧＧＡＴＴＧＴＣＴＣＣＧＡＡＡ又はその相補配列から派生する、連続する１０ヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む第一オリゴヌクレオチド、及び
−長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲であり、配列番号４：ＧＧＡＡＴＧＣＴＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡ又はその相補配列から派生する、連続する１０ヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む第二オリゴヌクレオチド
からなる２対のオリゴヌクレオチドに関するものである。
【００１０】
また、本発明は、インフルエンザＡウイルスのゲノムのＨ５遺伝子に位置する標的配列を増幅するための、
−長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲であり、配列番号１：ＴＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＧＡＡＴＧＧＣＡ又はその相補配列から派生する、連続する１０ヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む第一オリゴヌクレオチド、及び
−長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲であり、配列番号２：ＧＣＣＧＡＡＴＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡ又はその相補配列から派生する、連続する１０ヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む第二オリゴヌクレオチド
からなるオリゴヌクレオチドの対に関する。
【００１１】
同様に、本発明はインフルエンザＡウイルスのゲノムのＮ１遺伝子に位置する標的配列を増幅するための、
−長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲であり、配列番号３：ＣＧＴＧＧＡＴＴＧＴＣＴＣＣＧＡＡＡ又はその相補配列にから派生する、連続する１０ヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む第一オリゴヌクレオチド、及び
−長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲であり、配列番号４：ＧＧＡＡＴＧＣＴＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡ又はその相補配列にから派生する、連続する１０ヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む第二オリゴヌクレオチド
からなるオリゴヌクレオチドの対もまた含む。
【００１２】
上の３つの態様において、オリゴヌクレオチドの対では、第一オリゴヌクレオチドは付加的に、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ酵素によって認識されることができるプロモーター配列を含んでなる。
より具体的には、そのＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ酵素によって認識されることができるプロモーター配列はＴ７ポリメラーゼである。
【００１３】
上の２つの場合に関して、プロモーター配列が付加されたこのオリゴヌクレオチドが、Ｈ５遺伝子に位置する標的配列を増幅することが可能な場合、本質的に以下の配列：
配列番号５：ａａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｇＴＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＧＡＡＴＧＧＣＡ又はその相補配列からなる。この配列の小文字である部分はＴ７プロモーター配列に対応する。
上と同様にして、このオリゴヌクレオチドがＮ１遺伝子に位置する標的配列を増幅することが可能なとき、本質的に以下の配列：
配列番号６：ａａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｇＣＧＴＧＧＡＴＴＧＴＣＴＣＣＧＡＡＡ又はその相補配列からなる。
【００１４】
すべての態様において、各オリゴヌクレオチドが、長さ１２と３０ヌクレオチドの間の範囲であり、連続する１６ヌクレオチドの少なくとも一つの断片を含んでなり、好ましくは長さ１５と２６ヌクレオチドの間の範囲であり、連続する１８ヌクレオチドの少なくとも一つの断片を含んでなる。
【００１５】
また、本発明はインフルエンザＡウイルスのゲノムのＨ５及びＮ１遺伝子にそれぞれに位置する２つの標的配列を検出するためのプローブとして使用するためのオリゴヌクレオチドの対であって、Ｈ５遺伝子を検出するためのプローブは：
配列番号７：ＡＣＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＡＣＴＣＣＡＡＴ又はその相補配列からなり、一方でＮ１遺伝子を検出するためのプローブは：
配列番号８：ＧＣＧＡＡＡＴＣＡＣＡＴＧＴＧＴＧＴＧＣＡＧＧＧＡ又はその相補配列からなり、各配列は少なくとも一つの標識手段を含むオリゴヌクレオチドの対に関する。
【００１６】
また、本発明は、インフルエンザＡウイルスのゲノムのＨ５遺伝子に位置する標的配列の増幅から生じた増幅された核酸配列を検出するためのプローブとして使用するオリゴヌクレオチドであって、該増幅は上記のオリゴヌクレオチドの対によって行われたものであり、検出プローブは長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲であり、配列番号７：ＡＣＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＡＣＴＣＣＡＡＴ又はその相補配列から派生する連続する１０ヌクレオチドの断片を少なくとも一つを含むものであり、その配列は少なくとも１つの標識手段を含んでなるオリゴヌクレオチドに関する。
【００１７】
インフルエンザＡウイルスのゲノムのＮ１遺伝子の検出が求められる時、本発明はこのＮ１遺伝子に位置する標的配列の増幅から生じた増幅した核酸配列を検出するためのプローブとして使用するオリゴヌクレオチドを提案するものであり、該増幅は上記のオリゴヌクレオチドの対によって行われたものであり、検出プローブは長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲であり、配列番号８：ＧＣＧＡＡＡＴＣＡＣＡＴＧＴＧＴＧＴＧＣＡＧＧＧＡ又はその相補配列から派生する連続する１０ヌクレオチドの断片を少なくとも一つを含むものであり、その配列は少なくとも１つの標識手段を含んでなる。
【００１８】
続いて、本発明の好都合な実施形態において、検出プローブは、分子プローブとして既知である「分子指標」から成る。分子プローブは、当業者はよく知っているステムループ構造を有する一本鎖オリゴヌクレオチドの形態の検出プローブである。そのループは標識配列（通常は増幅産物）に相補的なプローブ配列を含み、そのステムはプローブの両端にそれぞれ位置するアームを形成する２つの配列のハイブリダイゼーションによって形成される。蛍光物質は、２つのアームの一方の端に共有結合で結合され、クエンチャー（蛍光吸収体）は他方のアームの端に共有結合で結合される。分子プローブは、それらが溶液中で遊離しているとき、蛍光を発しない。しかしながら、相補的な増幅産物の存在下で、これらの標的にハイブリダイゼーションする時には、蛍光を発しうる構造転換を起こす。標的の不存在下では、ステムはクエンチャーのすぐ近くに蛍光物質を保ち、それによって蛍光物質からクエンチャーへの蛍光の移動が誘導される。該クエンチャーは、蛍光から受け取ったエネルギーを熱として散らす無蛍光色基である。プローブが分子標的に遭遇した時、プローブ-標的のハイブリダイゼーションが形成され、このハイブリダイゼーションはステムの２つのアームによって作られるハイブリダイゼーションよりも、より長くより安定である。プローブ-標的のハイブリダイゼーションの堅固性と長さはステムハイブリダイゼーションの同時存在を妨げる。必然的に、分子プローブは自発的に、ステムハイブリダイゼーションを分離させるように強制し、蛍光物質とクエンチャーをお互いから遠ざける構造上の再構成を生じ、それによって蛍光を復活させる。
【００１９】
より具体的には、検出プローブは、好ましくは、Ｈ５遺伝子を検出するための、
配列番号９：[6-FAM]-ｃｇａｔｃｇＡＣＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＡＣＴＣＣＡＡＴｃｇａｔｃｇ-[DabSyl]、
Ｎ１遺伝子を検出するための、
配列番号１０：[6-FAM]-ｃｇａｔｃｇＧＣＧＡＡＡＴＣＡＣＡＴＧＴＧＴＧＴＧＣＡＧＧＧＡｃｇａｔｃｇ-[DabSyl]
からなる分子プローブからなる。
【００２０】
実施が望まれる試験がＨ５及びＮ１遺伝子の検出が同時に１つの容器で実施されるマルチプレックス試験である時、２つの異なる標識の使用が推奨される。挙げることのできる蛍光標識には、
−  フルオレセイン（ＦＡＭ）
−  テトラクロロ-6-カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）  
−  テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）
−  5-カルボキシローダミン６Ｇ（ＲＨＤ）  
−  カルボキシローダミン（ＲＯＸ），及び
−  シアニン５（ＣＹ５）
があるが、これに限定されるものではない。
【００２１】
上の配列番号９及び１０の２つの配列のそれぞれに、これらの標識の一つが与えられ、そのため使用される２つの標識は検出するシグナルを識別できるようにお互いに異なったものが使用される。
また、本発明は、生物試料に存在することが疑われるインフルエンザＡウイルスのゲノムの検出用プローブとしての、又は核酸の増幅のための反応においての、上記のオリゴヌクレオチドの１又は２対の使用を提供する。
また、本発明は、増幅に必要な増幅試薬の存在下で、上記のオリゴヌクレオチドの対を使用する、核酸の増幅反応を受ける試料に存在しうるインフルエンザＡウイルスの核酸の検出方法であって、関心の増幅産物の存在が検出される検出方法に関する。
この検出方法はＲＴ-ＰＣＲ増幅反応に基づいてもよい。
あるいは、この検出方法は転写増幅技術に基づいてもよい。好ましくは、この技術はＮＡＳＢＡ技術である。
【００２２】
また、本発明は試料中に存在しうるインフルエンザＡウイルスの２つのＨ５及びＮ１遺伝子の増幅方法に関するものであって、以下の工程を含む：
−増幅バッファー中の試料を
・インフルエンザＡウイルスのＨ５遺伝子に位置する関心の領域の上流及び下流にそれぞれハイブリダイゼーションするために、一つがプロモーター配列を付加的に含み、他方がプロモーター配列を結合した該プライマーの対極である、それぞれが長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲の２つの増幅プライマーの存在下で、
・インフルエンザＡウイルスのＮ１遺伝子に位置する関心の領域の上流及び下流にそれぞれハイブリダイゼーションするために、一つがプロモーター配列を付加的に含み、他方がプロモーター配列を結合した該プライマーの対極である、それぞれが長さ１０と５０ヌクレオチドの間の範囲の２つの増幅プライマーの存在下で
インキュベートすること、
−試料に以下の試薬：
・ ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素
・ ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素
・ ＲＮＡ分解酵素Ｈ活性を有する酵素
・ ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素
を加えること、及び
−最適な条件下で、増幅が起こるために十分な時間にわたって、このように作られた反応混合物を維持すること。
【００２３】
４つの酵素を上に挙げたが、上述の活性の２つ又は３つさえも有する１つの酵素の使用させることは全く可能であり、この場合、３つ又はたとえ２つの酵素の使用は可能なままであり、本発明の範囲に含まれる。さらに、ヌクレオチドのような増幅を確立するために必要な他の要件は必須である。そのような要件は当業者によく知られている。
【００２４】
最後に、本発明は
−関心のＨ５及びＮ１の２つの領域の増幅を実行するための上記２対の増幅オリゴヌクレオチド又はプライマー、
−増幅したＨ５及びＮ１核酸配列の少なくとも一部と実質的に相補的な核酸配列を有する、標識された又は標識されてもよい上記２つのオリゴヌクレオチド
−増幅反応を行うために必要である試薬
を含む、試料に存在しうるインフルエンザＡウイルスのＨ５及びＮ１遺伝子の検出用キットを提供する。
【００２５】
「実質的に相補的」なる用語は、標識された又は標識されてもよいオリゴヌクレオチドであって他には検出プローブと呼ばれるものと、増幅した核酸配列又は増幅産物の少なくとも一部の間で、ハイブリダイゼーションが可能であることを意味するものであるとし、このハイブリダイゼーションは関心の増幅産物の検出を可能にするために十分に特異的で選択的である。
さらに、増幅反応を可能にするために必要な試薬は、ＮＡＳＢＡ増幅用試薬である。
【００２６】
「検出可能な標識」は検出可能なシグナルを直接的に発生させることが可能な少なくとも一つの標識を意味するものであるとする。例えば、ビオチンの存在は、標識ストレプトアビジンと実質的に結合する可能性があっても検出可能なので、直接標識であるとみなされる。挙げることのできるこれらの標識は非限定的に以下のものである：
・西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はグルコース-6-リン酸脱水素酵素のような、例えば比色分析、蛍光、発色によって検出できるシグナルを発生する酵素、
・蛍光、発色又は染料化合物のような発色団、
・電子顕微鏡によって、又は伝導率、電流測定、ボルタンメトリー、インピーダンスのような電気的性質によって検出することが可能な高電子密度基（electron dense groups）、
・検出可能である基、例えば物理的及び／又は化学的特性の検出可能な修飾を誘導するために充分なサイズである分子；この検出は、回折、表面プラスモン共鳴、表面変化、接触角変化または物理的方法（例えば原子分光法またはトンネル効果）のような光学的方法によって行ってもよい、
・３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉのような放射性分子。
好ましくは、これらの標識に付随する安全性の問題を回避するために、標識は放射性分子ではない。
本発明の特別の態様において、標識は電気化学的に検出可能であり、特に標識はフェロセンのような鉄錯体の誘導体である。
【００２７】
「核酸」なる用語は、少なくとも２つのデオキシヌクレオチド又はリボヌクレオチドの連なりを意味し、任意に少なくとも一つの修飾されたヌクレオチドを含み、それは例えばイノシン、メチル-5-デオキシシチジン、ジメチルアミノ-5-デオキシウリジン、デオキシウリジン、ジアミノ-2,6-プリン又はブロモ-5-デオキシウリジン又はハイブリダイゼーションを可能にするその他の修飾塩基ような修飾塩基を含む少なくとも一つのヌクレオチドである。また、このポリヌクレオチドは、例えば、ホスホロチオエート、Ｈ−ホスホネート又アルキルホスホン酸のようなヌクレオチド間結合のレベルで、又はアルファ-オリゴヌクレオチド(FR 2 607 507)又はＰＮＡ(M. Egholm等, J.Am. Chem. Soc., 114, 1895-1897, 1992)又は2'-0-アルキルリボース及びＬＮＡ (BW. Sun等, Biochemistry, 4160-4169, 43, 2004)のような骨格のレベルで修飾されてもよい。核酸は天然又は合成、オリゴヌクレオチド、ポリオリゴヌクレオチド、核酸断片、リボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、転位ＲＮＡ、又は以下のような酵素的増幅技術によって得られた核酸でありうる：
・特許US-A-4,683,195、US-A-4,683,202及びUS-A-4,800,159に記載のＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）、及びその派生的なＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）であって、特に特許EP-B-0,569,272に記載のワンステップ型のもの、
・例えば特許出願EP-A-0,201,184号に開示のＬＣＲ(ライゲーズ鎖反応)、
・例えば特許出願WO-A-90/01069に記載のＲＣＲ（修復鎖反応）
・特許出願WO-A-90/06995の３ＳＲ（自己維持配列増幅法）
・特許出願WO-A-91/02818のＮＡＳＢＡ（核酸ベース増幅法）
・特許US-A-5,399,491のＴＭＡ（転写仲介増幅法）、および
・ＲＣＡ（ローリングサークル型増幅法）(US-6,576,448)。
増幅産物なる用語は、酵素的増幅技術によって生成される核酸を示すために使用される。
これらの修飾の何れも、組合わせることが出来る。
【００２８】
上に開示した増幅工程と検出工程には、精製工程が先行してもよい。「精製工程」なる用語は、特に、核酸精製の前に行われる細胞溶解工程で放出される細胞構成要素と微生物の核酸の間の分離を意味するものとする。
【００２９】
これらの細胞溶解工程はよく知られており、その具体例としては、以下の特許出願に記載されている細胞溶解方法を使用することができる：
−国際公開WO-A-00/60049の超音波破砕による細胞溶解、
−国際公開WO-A-00/05338の混合磁気式及び機械的細胞溶解、
−国際公開WO-A-99/53304の電気的細胞溶解、及び
−国際公開WO-A-99/15621の機械的細胞溶解。
【００３０】
当業者は、熱ショック、浸透圧ショック又はカオトロピック剤（例えば、グアニジニウム塩（特許US-A-5,234,809））のような他のよく知られた方法を使用することができる。
この工程は、一般に核酸を濃縮することが可能である。具体的には、磁性粒子（これに関しては、特許US-A-4,672,040及びUS-A-5,750,338を参照のこと）のような固体支持体を使用することができ、従ってこれらの磁性粒子に付着した核酸は、洗浄工程によって精製することができる。後に該核酸の増幅が所望される場合には、この核酸精製工程は特に有利である。これらの磁性粒子の特に有利な態様は、特許出願WO-A-97/45202及びWO-A-99/35500に記載されている。
【００３１】
本出願で使用する「固体支持体」なる用語は、核酸が付着することができる全ての物質を含む。合成物質または天然物質であって、任意に化学的に修飾されているものを固体支持体として使用することができ、特に多糖類であって、例えばセルロースを主成分とする物質、例えば、紙、酢酸セルロースおよびニトロセルロースまたはデキストランのようなセルロース誘導体；ポリマー、コポリマー、特にスチレン型モノマーを主成分とするもの、綿のような天然繊維、及びナイロンのような合成繊維；シリカ、クォーツ、ガラス、セラミック、ラテックスのような鉱物の物質；磁性粒子；金属誘導体、ゲルなどである。固体支持体は、マイクロタイタープレート、メンブレン、粒子の形状、又は実質的に板ガラス又はシリコンプレートの形状又はその類であってもよい。
全プロトコル（試料採取からハイブリダイゼーションするために用意した増幅産物まで）を一つの同じチューブで実施することができ、手作業で又は自動化された機械で処理することができる。
【００３２】
後の実施例は、特定の態様を代表するものであり、本発明の範囲を限定するものとみなされることは出来ない。
複数の対照が、これらの実施例で実施された。まずはじめに、水による陰性対照では、この場合Ｈ５とＮ１のどちらに対してもシグナルは検出されなかった。２番目に、インフルエンザＨ３Ｎ２  ＲＮＡによる特異性対照では、Ｈ５とＮ１のどちらに対してもシグナルは検出されなかった。
【実施例１】
【００３３】
アジアの臨床試料に起源するＨ５Ｎ１ ＲＮＡにおいてＨ５Ｎ１プライマーを評価するための実験：
オリゴヌクレオチドの対（Ｎ１_Ｐ１及びＮ１_Ｐ２をＮ１配列の増幅及び検出に使用し、Ｈ５_Ｐ１及びＨ５_Ｐ２をＨ５配列の増幅及び検出に使用する）及び分子プローブの形態で存在する検出プローブの配列を以下に示す：
2009517013.tif 000002
太字で示した配列はＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるＴ７プロモーター配列に対応し、ＮＡＳＢＡ技術を実施するためのＰ１オリゴヌクレオチドにある。
試料は、miniＭＡＧシステムを使用して作業プロトコルに記載の通りに処理する。
使用するキットは、
− ニュ−クリセンス細胞溶解バッファー、ビオネリュウＢ.V.(Boxtel、オランダ)、バッチ番号200295、及び
− ニュ−クリセンス磁性抽出試薬、ビオネリュウＢ.V.、バッチ番号200297
である。
【００３４】
（検出試験のための作業プロトコル）
ニュ−クリセンスＥａｓｙＱベーシックキット（ビオネリュウＢ.V.、Boxtel、オランダ、バッチ番号285006）に従って、２つの反応混合物、Ｈ５配列を増幅及び検出するために供されるものと（「Ｈ５混合物」）、Ｎ１配列を増幅及び検出するために供される（「Ｎ１混合物」）もう一つを調整した。簡潔には、１１μｌの水、１３μｌのＫＣｌ（１．２Ｍ）、各４μｌのオリゴヌクレオチド（Ｈ５_Ｐ１とＨ５_Ｐ２、又はＮ１_Ｐ１とＮ１_Ｐ２の１０μＭストック溶液）を６４μｌの希釈液に加えた。その後、各混合物の１０μｌの体積を５μｌのＲＮＡ標的に加えた。平行して、酵素の溶液を調製し、５μｌのこの溶液を反応液に加えて、最終体積２０μｌにした。その後、等温ＮＡＳＢＡ技術（Kievits, T等. J. Virol. Methods (1991) vol. 35(3), p.273-286）によって関心の配列の増幅と検出を可能にするために、ニュークリセンスＥａｓｙＱベーシックキットが推奨する反応条件下に置いた。この検出試験を確認するために、使用するＲＮＡ標的は以下である：
−Ｈ５Ｎ１：インフルエンザＡ亜型Ｈ５Ｎ１ベトナム１１９４/２００４
−インフルエンザＡ：Ｈ３Ｎ２亜型
−Ｈ５対照ＲＮＡ：Ｈ５Ｎ３亜型
−インフルエンザＢ。
【００３５】
試験は、好ましい（陽性及び陰性）対照を含むものであった。
ニュークリセンスＥａｓｙＱシステムによる増幅と検出後、以下の結果を得た：
2009517013.tif 000003
これらの結果は、Ｈ５Ｎ１検出プローブ及びオリゴヌクレオチドがそれらの各標的Ｈ５及びＮ１に特異的であり、実際に検出することを示す。
【実施例２】
【００３６】
マルチプレックス試験により検出プローブ及びプライマーを評価する実験
マルチプレックスの場合、使用する分子プローブＮ１はＣＹ５で標識され、一方分子プローブＨ５はＦＡＭで標識されるものとなる。
情報として、マルチプレックス試験で本発明の配列の機能性を証明するために、使用する標的は組換えＨ５Ｎ１  ＲＮＡから構築された合成転写産物である。それは、Ｈ５およびＮ１領域のみを含むＲＮＡである。Ｈ５及びＮ１用の本発明の増幅プライマー及び検出プローブのパフォーマンス水準を評価するための参照ＲＮＡとして使用した（合成転写産物であるので、大量に調製可能であり、それによって非常に貴重である組換えＨ５Ｎ１  ＲＮＡを使用する必要がないことを意味する）。
【００３７】
ニュークリセンスＥａｓｙＱベーシックキット（ビオネリュウＢ.V.、Boxtel、オランダ、バッチ番号285006）の指示書に従って、Ｈ５遺伝子及びＮ１遺伝子を同時に検出するための単一の反応混合物を調製する。簡潔には、１１μｌの水、１３μｌのＫＣｌ（１．２Ｍ）、８μｌのオリゴヌクレオチド溶液および分子プローブ（５μＭのＨ５用オリゴヌクレオチドＨ５_Ｐ１とＨ５_Ｐ２、２０μＭのＮ１用オリゴヌクレオチドＮ１_Ｐ１とＮ１_Ｐ２、２μＭの分子プローブＨ５-ＦＡＭ及２μＭの分子プローブＮ１-ＣＹ５）を６４μｌの希釈液に加えた。その後、混合物の１０μｌの体積を５μｌのＲＮＡ標的（１０００コピー/ＮＡＳＢＡのＨ５Ｎ１転写産物）に加えた。
Ｈ５プライマーとＮ１プライマーの間の濃度の違いは、感度の違いにおよそ反比例である。すなわち、Ｈ５プライマーの濃度は、Ｎ１プライマーのそれより４倍低い。
平行して、酵素の溶液を調製し、５μｌのこの溶液をチューブの反応混合物に加えて、最終体積２０μｌにした。その後、等温ＮＡＳＢＡ技術（Kievits, T等. J. Virol. Methods (1991) vol. 35(3), p.273-286）によって関心の配列の増幅と検出を可能にするために、ニュークリセンスＥａｓｙＱベーシックキットが推奨する反応条件下に置いた。
結果は図１に示す通りである。これらの結果は、単一のチューブでのＨ５とＮ１の同時検出が合成転写産物において非常に上手く機能したことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】１０００コピーのＨ５Ｎ１転写産物に対するＨ５及びＮ１のマルチプレックス検出
【図１】
2009517013.tif 000004
【配列表】
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【国際調査報告】
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