(57)【要約】  産業的に有用で環境に優しい生物化学物質であるエタノールなどのアルコール、乳酸及びコハク酸などの一次代謝産物の生産のための最適の菌株と最適の条件を提供し、これを利用した一次代謝産物の量産方法を提供する。  本発明は、微生物の代謝経路中に特定代謝経路を遮断して他の一次代謝産物の生産を増加させる方法、前記特定代謝経路に関与する物質のコーディング遺伝子を変更して他の一次代謝産物の量産が可能な形質転換体及び、このような形質転換体の製造方法に関するものである。前記一次代謝産物は環境に優しい生物化学物質で、産業的効用性の高いエタノールなどのアルコール、乳酸またはコハク酸などであり得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）のゲノムから、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコーディングするｐｄｃ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）及び乳酸脱水素酵素をコーディングするｌｄｈＡ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２）からなる群の中で選択された１つ以上の遺伝子を除去することによって、ザイモモナス・モビリスによるエタノール、乳酸、ピルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、コハク酸、フマル酸及びマレイン酸からなる群の中で選択された１種以上の一次代謝産物の生産を増加させる方法。
【請求項２】
ｐｄｃ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）を除去してコハク酸及び乳酸からなる群の中で選択された１種以上の一次代謝産物の生産を増加させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｌｄｈＡ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２）を除去してエタノール及びコハク酸からなる群の中で選択された１種以上の一次代謝産物の生産を増加させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ｐｄｃ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）及びｌｄｈＡ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２）を全て除去してコハク酸の生産を増加させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ゲノムから、ｐｄｃ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）及びｌｄｈＡ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２）からなる群の中で選択された１つ以上の遺伝子が除去されて、エタノール、乳酸、ピルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、コハク酸、フマル酸及びマレイン酸からなる群の中で選択された１種以上の一次代謝産物の量産が可能なザイモモナス・モビリス形質転換体。
【請求項６】
ｐｄｃ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）が除去されて、コハク酸及び乳酸からなる群の中で選択された１種以上の一次代謝産物の量産が可能であることを特徴とする、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
ｌｄｈＡ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２）が除去されて、エタノール及びコハク酸からなる群の中で選択された１種以上の一次代謝産物の量産が可能であることを特徴とする、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項８】
ｐｄｃ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）とｌｄｈＡ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２）が全て除去されて、コハク酸の量産が可能であることを特徴とする、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項９】
ＫＣＴＣ１１０１２ＢＰ、ＫＣＴＣ１１０１３ＢＰ及びＫＣＴＣ１０９０８ＢＰからなる群の中で選択された株であることを特徴とする、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項１０】
ザイモモナス・モビリスのゲノムから、ｐｄｃ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）及びｌｄｈＡ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２）からなる群の中で選択された１種以上の遺伝子を除去する段階
を含む、請求項５に記載のザイモモナス・モビリス形質転換体の製造方法。
【請求項１１】
ザイモモナス・モビリスのｐｄｃ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）を有する遺伝子断片をプラスミドにクローニングし；
前記ｐｄｃ遺伝子がクローニングされたプラスミドからｐｄｃ遺伝子を除去し；
前記ｐｄｃ遺伝子が除去されたプラスミドを利用してザイモモナス・モビリスを形質転換させる段階
を含むことを特徴とする、請求項１０に記載のザイモモナス・モビリス形質転換体の製造方法。
【請求項１２】
前記ｐｄｃ遺伝子を有する遺伝子断片は、ザイモモナス・モビリスのｐｄｃ遺伝子と、その５’及び３’末端の両方に位置する相同組み換えのための１５００乃至５０００ｂｐの相同部位を有することを特徴とする、請求項１１に記載のザイモモナス・モビリス形質転換体の製造方法。
【請求項１３】
ザイモモナス・モビリスのｌｄｈＡ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）を有する遺伝子断片をプラスミドにクローニングし；
前記ｌｄｈＡ遺伝子がクローニングされたプラスミドからｌｄｈＡ遺伝子を除去し；
前記ｌｄｈＡ遺伝子が除去されたプラスミドを利用してザイモモナス・モビリスを形質転換させる段階を含むことを特徴とする、請求項１０に記載のザイモモナス・モビリス形質転換体の製造方法。
【請求項１４】
前記ｌｄｈＡ遺伝子を有する遺伝子断片は、ザイモモナス・モビリスのｌｄｈＡ遺伝子と、その５’及び３’末端の両方に位置する相同組み換えのための１５００乃至５０００ｂｐの相同部位を有することを特徴とする、請求項１３に記載のザイモモナス・モビリス形質転換体の製造方法。
【請求項１５】
ザイモモナス・モビリスのｐｄｃ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）を有する遺伝子断片をプラスミドにクローニングし；
前記ｐｄｃ遺伝子がクローニングされたプラスミドからｐｄｃ遺伝子を除去し；
前記ｐｄｃ遺伝子が除去されたプラスミドを利用してザイモモナス・モビリスを形質転換させる段階； 
ザイモモナス・モビリスのｌｄｈＡ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）を有する遺伝子断片をプラスミドにクローニングし；
前記ｌｄｈＡ遺伝子がクローニングされたプラスミドからｌｄｈＡ遺伝子を除去し；
前記ｌｄｈＡ遺伝子が除去されたプラスミドを利用してザイモモナス・モビリスを形質転換させる段階
を連続して行うことを特徴とする、請求項１０に記載のザイモモナス・モビリス形質転換体の製造方法。
【請求項１６】
ｐｄｃ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）及びｌｄｈＡ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２）からなる群の中で選択された１つ以上の遺伝子が除去されたザイモモナス・モビリス形質転換体を製作する段階；及び
前記ザイモモナス・モビリス形質転換体を３０乃至３４℃で１０乃至１４時間培養する段階を含む、
エタノール、乳酸、ピルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、コハク酸、フマル酸及びマレイン酸からなる群の中で選択された１種以上の一次代謝産物の生産方法。
【請求項１７】
前記ザイモモナス・モビリス形質転換体の培養時に、ＣＯ２気体を０．２乃至１ｖｖｍの量で添加したり、培養培地に炭酸塩を１乃至５０ｍＭの濃度で追加的に添加して培養することを特徴とする、請求項１６に記載の一次代謝産物の生産方法。
【請求項１８】
前記炭酸塩がＮＡＨＣＯ３、ＮＡ２ＣＯ３及びＣａＣＯ３からなる群の中で選択されたことを特徴とする、請求項１７に記載の一次代謝産物の生産方法。
【請求項１９】
前記ザイモモナス・モビリス形質転換体の培養時に、水素気体を０．２乃至１ｖｖｍの量で追加的に添加して培養することを特徴とする、請求項１６乃至１８のいずれかに記載の一次代謝産物の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００６年２月１６日付で出願された韓国特許出願第１０−２００６−００１５１１６号及び２００７年２月６日付で出願された韓国特許出願第１０−２００７−００１１９５３号を優先権主張し、これら出願明細書は本明細書に言及されたことのように参照として含まれる。
【０００２】
本発明は微生物の代謝経路中の特定代謝経路を遮断して他の一次代謝産物の生産を増加させる方法、前記特定代謝経路に関与する物質のコーディング遺伝子が変更されて他の一次代謝産物の量産が可能な形質転換体及び、このような形質転換体の製造方法に関するものである。前記一次代謝産物は環境に優しい生物化学物質で、産業的効用性の高い乳酸、コハク酸またはエタノールなどのアルコールなどであり得る。
【背景技術】
【０００３】
産業革命以降、人類は石油化学工業の発達に基づいて著しい発展をなしてきたが、これに伴う副作用を見過ごした無分別な開発と濫用に伴う環境破壊という大きな問題を残し、これは必ず解決しなければならない問題となっている。
【０００４】
オゾン層の破壊など、環境破壊で現れる異常気候などに対する認識の変化によって、全世界はこれに対する自救策としてこれ以上の地球環境破壊を防止するために環境保護対策である気候変化協約及び京都議定書（Ｋｙｏｔｏ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）の採択及び発効などに努力している。しかし、このような一連の環境保護対策は全世界的にエネルギーを多く使用する石油化学工業の広範囲な発達と石油依存度の高い国家に対する経済的及び社会的波紋が大きいことと予想される。
【０００５】
現在再生資源から生産できる代替化学製品に対する研究が進められており、この中でも乳酸とコハク酸が有用な生物化学製品としてその可能性を認められている。乳酸の場合、既に生分解性プラスチックとして開発が完了して生産に突入した状態であり、今後市場を形成することが予測されている。先進国では既に政府主導下の研究が活発に進められており、米国のカーギル（Ｃａｒｇｉｌｌ）社とダウ（Ｄｏｗ）社が合作して乳酸重合体（ＰＬＡ；ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）生産技術が乳酸の発酵生産研究と共に開発され、デュポン社とＤｅｎｏｃｏｒ社が合作してＰＴＴ（ｐｏｌｙｔｒｉｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）の原料となるＰＤＯ（１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ）の生産技術が開発された。ＰＬＡは従来に開発された繊維と比較して湿気回復率、弾性回復率及び紫外線吸収面で優れた性能を有すると調査され、生分解性で環境に優しい高分子としての可能性を確保した。従来に開発された繊維として代表的なナイロンとポリエステル及び環境に優しい高分子であるＰＬＡの物性を下記の表１に示した。
【０００６】
【表１】
2009526547.tif 000003
【０００７】
前記表１に示されたように、ＰＬＡはナイロンとポリエステルなどの従来の合繊と比較して対等であるか優れた物性を有することが分かり、これはＰＬＡが化学的合繊製品を代替する代替材であることを意味する。
【０００８】
また、他の１つの有用な生物化学製品であるコハク酸ポリマーはＰＬＡより高い柔軟性を有することが知られ、２００４年米国エネルギー局（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ；ＤＯＥ）は未来のバイオマス由来の高付加価値化合物のうちの１つとして選定した（ＮＲＥＬ、２００４）。
【０００９】
コハク酸は４個の炭素からなるＴＣＡ回路の中間生成物であるジカルボン酸で、低濃度で存在するが、すべての植物細胞及び動物細胞で発見される化学物質である。コハク酸及びそれらの誘導体はプラスチック、食品、医薬品及び化粧品産業などで広範囲に利用されている。
【００１０】
コハク酸は石油化学工業の発達と共に生産が増加している合成高分子の弱点である難分解性を克服する生分解性高分子のモノマーとしての利用価値が増加している。現在使用されているプラスチックの１／３程度が比較的短期間に使用される一回包装用途で使用されているので、これら廃棄物による環境汚染問題が深刻に台頭しており、これらプラスチックの相当部分が生分解性で代替されなければならないという環境規制のために、生分解性プラスチック事業は各国の最大の関心事であった。最近、次世代生分解性高分子として思われる生分解性脂肪族ポリエステルであるポリブチレンサクシネートに対する研究が活発に進められており、その主原料がコハク酸である（Ｋｉｒｋ−ｏｔｈｅｒ、１９７９）。
【００１１】
しかし、現在生産されているコハク酸の販売単価は産業体が要求する単価と比較して高く、また生産及び精製が効率的でないのが実情である。このような要因によってコハク酸は現在大部分が化学的合成法によって生産されている。つまり、マレイン酸無水和物（ｍａｌｅｉｃａｎ ｈｙｄｒｉｄｅ）を水素化してコハク酸無水和物を生産した後、再びこれを水和化してコハク酸を生産する。しかし、既に言及したように、急変する環境規制強化に応じる工程環境の変化によって、前記のような化学的合成方法でない生物学的方法の開発が必要となり、微生物培養技術と遺伝子工学的技術方法の発達によって発酵法によるコハク酸の生産に対する研究が関心を集めている。特に、発酵法によるコハク酸生産法は使用原料が安い再生資源を利用するという点で経済的利点があり、環境に優しい清浄技術であるという長所がある。
【００１２】
発酵法によるコハク酸生産のためには高効率の菌株開発が要求される。大部分のコハク酸発酵微生物は絶対嫌気性または通性嫌気性菌株であることが知られている。このような嫌気性微生物は呼気性微生物より外部条件の変化に応じて細胞成長に非常に大きな影響を受けるだけでなく、代謝産物の生成も影響を受けるために、コハク酸生産微生物の生理学的及び環境的研究が重要である。また、このような生理学的及び環境的な研究資料に基づいてコハク酸生産代謝回路の分析を通じてコハク酸が過剰生成されるように最適の発酵条件を確立することが要求される（Ｃｙｎｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。
【００１３】
一方、２００４年米国再生アルコール協会（ＲＦＡ、Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ Ｆｕｅｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）の調査によると、米国内約８０個余りのアルコール生産企業から約３，５００，０００，０００ガロン（ｇａｌｌｏｎ）のアルコールが生産され、原料資源の豊富なブラジルでもやはり４，０００，０００，０００ガロンに至るアルコールが生産された。米国内アルコール需要のほとんどは燃料分野に使用され、その規模は約３，０００，０００，０００ガロンに至った。さらに、これら生産量の大部分はとうもろこしなどの原料物質を使用して生産された。とうもろこしなどの原料（ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ）を利用したアルコール生産が有する最も大きな長所は環境に優しい工程であることである。このような天然物質をアルコール生産原料として使用することによってアルコール生産の時に少ないエネルギーを利用して少ない二酸化炭素を発生させる。また、再生エネルギーを利用するために廃棄物処理などで発生する別途の費用負担とエネルギー消耗が少ないという利点もある。これは韓国のような高い石油依存度を有する国家であるほど必ず解決しなければならない問題として台頭している。
【００１４】
代表的なアルコール種類であるエタノールは酒類、産業用または実験室用溶媒、変性アルコール製造、医薬、化粧品製造、有機合成用基質などの多様な用途として使用することが可能であり、これに伴う需要も非常に高い。最近、エタノールはガソリン燃料のノッキング制御を改善させて排煙での一酸化炭素低減効果を有するガソリン添加剤または代替エネルギー源としてその利用性が拡大している。飲み物用アルコールを除いた大部分のエタノールは主に化学合成によって生産されたが、原油価格の上昇で製造原価が上昇して微生物による発酵生産で代替しようとする努力が必要であるのが実情である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
前記の要求に応じるために本発明は、産業的に有用で環境に優しい生物化学物質であるエタノールなどのアルコール、乳酸及びコハク酸などの一次代謝産物の生産のための最適な菌株と最適な条件を提供し、これを利用した一次代謝産物の量産方法を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、微生物の代謝経路中において特定経路を遮断することによって、環境に優しく産業的に有用な多様な有機酸を含む一次代謝産物を量産する技術を提供し、本発明によって量産された有機酸は従来の化学合成物質の代替として多様な分野に適用されて、費用節減効果と環境保護効果を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
後述する発明の詳細な説明によって、本発明がより詳細に説明され、本発明の完全な理解と付随的な利点がより明確になる。
【００１８】
本発明は微生物の代謝経路中において特定代謝産物の代謝経路を遮断して他の一次代謝産物の生産を増加させる方法；前記特定代謝産物の代謝経路に関与する物質のコーディング遺伝子を変更して他の一次代謝産物の量産が可能な形質転換体及び、このような形質転換体の製造方法に関するものである。前記一次代謝産物は環境に優しい生物化学物質として産業的効用性の高いアルコール、乳酸またはコハク酸であり得る。
【００１９】
本発明では一次代謝産物の量産のための菌株としてザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）を使用することができる。ザイモモナス・モビリスはアルコール発酵菌として細胞増殖に比べて産物転換率に優れた菌株として知られている。ザイモモナス・モビリスは理論上の産物生産収率が約９８％以上であり、エタノール生産性が５ｇ／ｇ／ｌで、１０ｇ／ｇ／ｈ以上のブドウ糖代謝速度で１モルのブドウ糖から２モルのエタノールを生産する。
【００２０】
ザイモモナス・モビリスの物質代謝経路を見ると、当該過程によって生成されたピルビン酸がアセトアルデヒドに転換され、再びアルコール脱水素酵素によって最終的にエタノールを生産する。このような高効率エタノール生産に関与する主な酵素はピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ｐｙｒｕｖａｔｅ Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）で、ピルビン酸からアセトアルデヒドへの転換を媒介する。したがって、このようなピルビン酸デカルボキシラーゼの生産が阻害されると、ピルビン酸からアセトアルデヒドへの転換が遮断されてアルコールが生産されず、宿主細胞はエネルギー生成のためにアルコール生産以外の他の経路を利用してアルコール以外の他の一次代謝産物を生産する。
【００２１】
前記一次代謝産物としては、Ｃ２代謝産物であるエタノール、Ｃ３代謝産物である乳酸とピルビン酸、Ｃ６代謝産物であるクエン酸、Ｃ５代謝産物であるグルタミン酸、Ｃ４代謝産物であるコハク酸、フマル酸及びマレイン酸などがある。したがって、前記のようにエタノール代謝経路が遮断されると、この他の代謝産物である乳酸、ピルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、コハク酸、フマル酸及びマレイン酸などの生産が増加し、特に乳酸とコハク酸の生産量が顕著に増加することを観察することができる。この時、乳酸生成経路において、ピルビン酸から乳酸への転換を媒介する乳酸脱水素酵素（Ｌａｃｔａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の生成を阻害して乳酸生成を遮断することによって、コハク酸の生産をより増加させることができる。
【００２２】
また、ザイモモナス・モビリスは従来に知られていない部分的な呼吸回路を有して乳酸を電子供与体に利用することが明らかになっており、乳酸生産を遮断することによって、より嫌気性発酵を誘導することで細胞増殖を促進し、エタノール生産速度を向上させることができ、さらにピルビン酸デカルボキシラーゼの基質特異性を変化させてブタンジオール（ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ）などを生産することができる。
【００２３】
このように、微生物の代謝経路中において特定代謝経路を遮断させることによって、前記特定代謝経路で生成する一次代謝産物以外の他の一次代謝産物の生産を増加させることができる。
【００２４】
このような点に基づいて、本発明はザイモモナス・モビリスでのピルビン酸デカルボキシラーゼ生成及び／または乳酸脱水素酵素の生成を阻害してアルコール生成及び／または乳酸の生産を抑制することによって、他の一次代謝産物、特に、エタノールなどのアルコール、コハク酸及び乳酸の生産を増加させる技術を提供する。
【００２５】
より具体的に、本発明はピルビン酸デカルボキシラーゼのコーディング遺伝子であるｐｄｃ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）及び／または乳酸脱水素酵素コーディング遺伝子であるｌｄｈＡ（ｌａｃｔａｔｅｄ  ｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２）を除去してピルビン酸デカルボキシラーゼ及び／または乳酸脱水素酵素の生成を阻害することによって、アルコール以外の一次代謝産物を量産する技術を提供する。
【００２６】
アルコール発酵によってエネルギーを得るザイモモナスにおいて、ｐｄｃ遺伝子は生存に必須の遺伝子として知られており、これを除去するとザイモモナス・モビリス菌株が生存できないことが予測されてきた。しかし、本発明ではｐｄｃ遺伝子を除去した場合、正常菌株と比較して約２倍程度の増殖遅延はあるが生存可能であり、アルコール以外の一次代謝産物、例えば、乳酸、ピルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、コハク酸、フマル酸及びマレイン酸の生産が増加することを確認した。
【００２７】
つまり、本発明において、ザイモモナス・モビリスのゲノムでｐｄｃ遺伝子が除去されると、エタノール生産能生が除去されて速い速度で大量蓄積されたピルビン酸を有用産物の量産に利用できる可能性を有し、エタノールでない多様な有用産物を生産できる“Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ”として開発及び活用することができる。このようにザイモモナス・モビリスが量産できる有用物質としてはピルビン酸、グリセロール及びアセチル−ｃｏＡから得られる乳酸、ヒドロキシプロピオン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ヒドロキシブタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、プロパンジオール（１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ）、グルタミン酸、ポリグルタミン酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、クエン酸、アジピン酸、ピルビン酸、グリセロール、キシリトール、ソルビトール、アラビニトル（ａｒａｂｉｎｉｔｏｌ）などがある。また、コエンザイムＱ１０、ポリプレニルジホスフェート（ｐｏｌｙｐｒｅｎｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ）及びポリテルペン（ｐｏｌｙｔｅｒｐｅｎｅ）、ジテルペン（ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ）、モノテルペン（ｍｏｎｏｔｅｒｐｅｎｅ）、トリテルペン（ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ）、セスキテルペン（ｓｅｓｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ）などのイソプレノイド化合物（ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）等の量産も可能であり、これらは化粧品、添加剤、保護剤、医薬品の前駆体などとして非常に有用である。
【００２８】
この中でもコハク酸の場合には約１００％以上の生産向上を示すことを確認した。従来のＣ２、Ｃ３、Ｃ５及びＣ６代謝産物と異なって、Ｃ４代謝産物の場合には量産菌株がほとんど開発されていないという点と、前記のようにコハク酸がプラスチック及び樹脂分野、医薬分野、食品分野、化粧品分野、農業分野、洗剤／乳化剤分野、織物分野、写真分野、触媒分野、防食分野及びメッキ分野など、多様な適用分野への適用が可能な産業上有用な物質であるという点を考慮する時、本発明におけるＣ４代謝産物のコハク酸の生産量向上は非常に意味があると言える。
【００２９】
ザイモモナス・モビリスの代謝経路は次の反応式１のようである: 
【００３０】
【化１】
2009526547.tif 000004
【００３１】
本発明の１つの側面は、ザイモモナス・モビリスのゲノム（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．:ＡＥ００８６９２）からｐｄｃ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）及びｌｄｈＡ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２）からなる群の中で選択された１つ以上の遺伝子を除去してザイモモナス・モビリスでの一次代謝産物の生産を増加させる方法に関するものである。前記一次代謝産物はエタノール、乳酸、ピルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、コハク酸、フマル酸及びマレイン酸からなる群の中で選択された１つ以上のものであり得る。
【００３２】
より具体的に、本発明はザイモモナス・モビリスのゲノムからｐｄｃ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）を除去してアルコールの生成経路を遮断することによって、アルコール以外の一次代謝産物の生産を向上させる方法を提供する。前記一次代謝産物は乳酸、ピルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、コハク酸、フマル酸及びマレイン酸からなる群の中で選択された１つ以上のものであってもよく、より好ましくは乳酸及びコハク酸からなる群の中で選択された１つ以上のものであってもよい。
【００３３】
前記ｐｄｃ遺伝子が除去されたザイモモナス・モビリスでの代謝経路は次の反応式２のようである: 
【００３４】
【化２】
2009526547.tif 000005
【００３５】
また、本発明はザイモモナス・モビリスのゲノムからｌｄｈＡ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２）を除去して乳酸生成経路を遮断することによって、乳酸以外の一次代謝産物の生産を向上させる方法を提供する。前記一次代謝産物はエタノール、ピルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、コハク酸、フマル酸及びマレイン酸からなる群の中で選択された１つ以上のものであってもよく、より好ましくはエタノール及び／またはコハク酸であってもよい。
【００３６】
前記ｌｄｈＡ遺伝子が除去されたザイモモナス・モビリスでの代謝経路は次の反応式３のようである: 
【００３７】
【化３】
2009526547.tif 000006
【００３８】
また、本発明はザイモモナス・モビリスのゲノムから、ｐｄｃ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）とｌｄｈＡ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２）を同時に除去してアルコール及び乳酸生成経路を全て遮断することによって、アルコール及び乳酸以外の一次代謝産物の生産を向上させる方法を提供する。前記一次代謝産物はピルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、コハク酸、フマル酸及びマレイン酸からなる群の中で選択された１つ以上のものであってもよく、より好ましくはコハク酸であってもよい。
【００３９】
前記ｐｄｃ遺伝子及びｌｄｈＡ遺伝子が全て除去されたザイモモナス・モビリスでの代謝経路は次の反応式４のようである: 
【００４０】
【化４】
2009526547.tif 000007
【００４１】
本発明のまた他の側面は、ｐｄｃ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）及びｌｄｈＡ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２）からなる群の中で選択された１つ以上の遺伝子が除去されたことを特徴とするザイモモナス・モビリス形質転換体に関するものである。
【００４２】
より具体的に、本発明はｐｄｃ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）が除去されたザイモモナス・モビリスの形質転換体を提供する。前記形質転換体は乳酸、ピルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、コハク酸、フマル酸及びマレイン酸からなる群の中で選択された１つ以上の量産が可能なものであってもよく、より好ましくは乳酸及びコハク酸からなる群の中で選択された１つ以上の量産が可能なものであってもよい。本発明の具体例において、前記ｐｄｃ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）が除去された形質転換体はＫＣＴＣ １１０１２ＢＰであり得る。
【００４３】
また、本発明はｌｄｈＡ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２）が除去されたザイモモナス・モビリスの形質転換体を提供する。前記形質転換体はエタノール、ピルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、コハク酸、フマル酸及びマレイン酸からなる群の中で選択された１つ以上の量産が可能なものであってもよく、より好ましくはエタノール、及び／またはコハク酸の量産が可能なものであってもよい。本発明の具体例において、前記ｌｄｈＡ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２）が除去された形質転換体はＫＣＴＣ １１０１３ＢＰであり得る。
【００４４】
また、本発明はｐｄｃ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）及びｌｄｈＡ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２）が全て除去されたザイモモナス・モビリスの形質転換体を提供する。前記形質転換体はピルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、コハク酸、フマル酸及びマレイン酸からなる群の中で選択された１つ以上の量産が可能なものであってもよく、より好ましくはコハク酸の量産が可能なものであってもよい。本発明の具体例において、前記ｐｄｃ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）とｌｄｈＡ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２）が除去された形質転換体はＫＣＴＣ １０９０８ＢＰであり得る。
【００４５】
本発明のまた他の側面は、ザイモモナス・モビリスのゲノムからｐｄｃ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）及びｌｄｈＡ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２）からなる群の中で選択された１つ以上の遺伝子を除去する段階を含む、前記ザイモモナス・モビリス形質転換体の製造方法を提供する。
【００４６】
より具体的に、本発明のｐｄｃ遺伝子が除去されたザイモモナス・モビリス形質転換体の製造方法は、
−ザイモモナス・モビリスのｐｄｃ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）を有する遺伝子断片を適切なプラスミドにクローニングし；
−前記プラスミドからｐｄｃ遺伝子を除去し；
−前記ｐｄｃ遺伝子が除去されたプラスミドを利用してザイモモナス・モビリス菌株を形質転換させる段階を含む。
【００４７】
前記ｐｄｃ遺伝子クローニング段階において、前記ｐｄｃ遺伝子を有する遺伝子断片は、ザイモモナス・モビリスゲノムのｐｄｃ遺伝子と、その両側に位置する相同組み換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）のための相同部位を有するものであり、前記形質転換段階が、前記相同組み換えのための相同部位による相同組み換えによって、前記ザイモモナス・モビリス菌株のｐｄｃ遺伝子含有部位を、プラスミドのｐｄｃ遺伝子が除去された部位で、代替させるものであり得る。前記相同組み換えのための相同部位は、ザイモモナス・モビリスゲノムのｐｄｃ遺伝子の両端に位置する１５００乃至５０００ｂｐのポリヌクレオチドであってもよく、本発明の具体例では、ｐｄｃ遺伝子の５'末端から上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）方向のＳａｃＩ部位までの２９３３ｂｐのポリヌクレオチドと、ｐｄｃ遺伝子の３'末端から下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）方向のＸｂａＩ部位までの２８７３ｂｐのポリヌクレオチドであってもよい。
【００４８】
この時、ｐｄｃが除去されたザイモモナス・モビリス形質転換体の選別を容易にするために、前記ｐｄｃ遺伝子除去段階において、ｐｄｃ遺伝子を除去し、その位置に適切な選別マーカを代替させることができる。前記選別マーカとしてクロラムフェニコール抵抗遺伝子（ｃｍＲ）、テトラサイクリン抵抗遺伝子（ｔｅｔＲ）、アンピシリン抵抗遺伝子（ａｍｐＲ）またはカナマイシン抵抗遺伝子（ｋｍＲ）を使用することができる。
【００４９】
本発明の１つの具体例によるｐｄｃ遺伝子が除去されたザイモモナス・モビリス形質転換体の製造方法を図１に模式的に示した。
【００５０】
また、本発明のｌｄｈＡ遺伝子が除去されたザイモモナス・モビリス形質転換体の製造方法は
−ザイモモナス・モビリスのｌｄｈＡ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:２）を有する遺伝子断片を適切なプラスミドにクローニングし；
−前記プラスミドからｌｄｈＡ遺伝子を除去し；
−前記ｌｄｈＡ遺伝子が除去されたプラスミドを利用してザイモモナス・モビリス菌株を形質転換させる段階を含む。
【００５１】
前記ｌｄｈＡ遺伝子クローニング段階において、前記ｌｄｈＡ遺伝子を有する遺伝子断片は、ザイモモナス・モビリスゲノムのｌｄｈＡ遺伝子とその両側に位置する相同組み換えのための相同部位を有するものであり、前記形質転換段階が、前記相同組み換えのための相同部位による相同組み換えによって、前記ザイモモナス・モビリス菌株のｌｄｈＡ遺伝子含有部位を、プラスミドのｌｄｈＡ遺伝子が除去された部位で、代替させるものであり得る。前記相同組み換えのための相同部位は、ザイモモナス・モビリスゲノムのｌｄｈＡ遺伝子の両端に位置する１５００乃至５０００ｂｐのポリヌクレオチドであってもよく、本発明の具体例では、ｌｄｈＡ遺伝子の５'末端から上流方向のＳａｃＩ部位までの４８７９ｂｐのポリヌクレオチドと、ｌｄｈＡ遺伝子の３'末端から下流方向のＸｂａＩ部位までの４９８４ｂｐのポリヌクレオチドであってもよい。
【００５２】
この時、ｌｄｈＡが除去されたザイモモナス・モビリス形質転換体の選別を容易にするために、前記ｌｄｈＡ遺伝子除去段階において、ｌｄｈＡ遺伝子を除去し、その位置に適切な選別マーカを代替させることができる。前記選別マーカとしてクロラムフェニコール抵抗遺伝子、テトラサイクリン抵抗遺伝子、アンピシリン抵抗遺伝子またはカナマイシン抵抗遺伝子を使用することができる。
【００５３】
本発明の１つの具体例によるｌｄｈＡ遺伝子が除去されたザイモモナス・モビリス形質転換体の製造方法を図４に模式的に示した。
【００５４】
また、本発明は前記ｐｄｃ遺伝子が除去されたザイモモナス・モビリス形質転換体の製造方法とｌｄｈＡ遺伝子が除去されたザイモモナス・モビリス形質転換体の製造方法を連続行って、ｐｄｃ遺伝子及びｌｄｈＡ遺伝子が全て除去されたザイモモナス・モビリス形質転換体を製造する方法を提供する。
【００５５】
また、本発明は前記ｐｄｃ遺伝子及び／またはｌｄｈＡ遺伝子が除去されたザイモモナス・モビリス形質転換体を培養してエタノール、乳酸、ピルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、コハク酸、フマル酸及びマレイン酸からなる群の中で選択された１つ以上の一次代謝産物を量産する方法を提供する。この時、培養温度は３０乃至３４℃にし、培養時間は１０乃至１４時間程度にするのが好ましい。
【００５６】
本発明の量産方法は、前記ザイモモナス・モビリス形質転換体を培養する時、培養培地にＣＯ２供給源を追加的に添加して、前記一次代謝産物への転換時に炭素供給源として作用して一次代謝産物の生産量を増加させることができる。例えば、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓのコハク酸生産は主にリンゴ酸酵素（ｍａｌｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）によって行われるが、ピルビン酸（Ｃ３）からマレイン酸（Ｃ４）が生成されるためにはカルボキシル化されなければならないので、炭素を供給することによってコハク酸生産効率増加効果を得ることができる。
【００５７】
前記炭素供給源としてＣＯ２気体または炭酸塩などを使用することができる。前記炭酸塩としては通常のすべての炭酸塩を使用することができ、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３及びＣａＣＯ３からなる群の中で選択されたものであってもよい。代謝経路における、前記一次代謝産物とのトランスフェラーゼの効果的な作用を考慮する時、ＣＯ２気体の場合には０．２乃至１ｖｖｍ（ａｅｒａｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ／ｍｅｄｉｕｍ ｖｏｌｕｍｅ／ｍｉｎｕｔｅ）、炭酸塩の場合には１乃至５０ｍＭ、好ましくは５乃至２０ｍＭの量で添加することができる。
【００５８】
また、炭素源（ＣＯ２）供給と共に水素供給もまたコハク酸などの一次代謝産物の生産に重要な要素である。水素供給は細胞内電子伝達を促進させてフマル酸還元酵素（ｆｕｍａｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）によるコハク酸などの一次代謝産物の生産効率を増加させる役割を果たす。例えば、ザイモモナス・モビリスは嫌気性細菌であり、細胞内ＮＡＤＨを利用してＡＴＰを生成することができないので、細胞内ＮＡＤＨ（ＮＡＤＨ+Ｈ+）は大部分ＮＡＤＨ脱水素酵素によってＮＡＤに酸化され、この時に生成されたプロトン（Ｈ+）はΔｐＨ維持に使用され、電子はキノン（ｑｕｉｎｏｎｅ）、シトクローム（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）などの電子伝達経路を経てフマル酸に伝達され、フマル酸還元酵素によってコハク酸が生成される。外部から供給された水素（Ｈ２）は細胞膜に存在するキノンを通って細胞内に流入するが、キノンは細胞膜でキノン回路を通じて水素をプロトンと電子に変えながら電子伝達中継の役割を担当して、水素からプロトンを細胞内に供給し、電子をシトクロームに伝達する。したがって、培養培地に水素を供給することは、ＮＡＤＨがＮＡＤに酸化しながら生成されるプロトン（Ｈ+）の供給と同一な効果を得ることができるので、電子伝達促進によるコハク酸などの一次代謝産物の生産効率を増進させる効果を得ることができる。この時、水素はガス状態で添加することができ、０．２乃至１ｖｖｍ（ａｅｒａｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ／ｍｅｄｉｕｍ ｖｏｌｕｍｅ／ｍｉｎｕｔｅ）の量で添加するのが好ましい。
【００５９】
本発明の具体例において、前記ザイモモナス・モビリス形質転換体をＲＭ培地（グルコース、５０ｇ／ｌ；酵母抽出物、１０ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４、１ｇ／ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／ｌ；ｐＨ５．２）にＮａＨＣＯ３１０ｍＭを添加したり、ＣＯ２気体１ｖｖｍを添加して、３０℃で１４時間培養して、より増加されたコハク酸生産効果を得ることができる。このような場合、コハク酸の生産効率が最大５ｇ／ｇ／ｈまで向上する。
【００６０】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。但し、これは例として提示されるものに過ぎず、これによって本発明が制限されるわけではない。
【実施例】
【００６１】
（実施例１:ｐｄｃ遺伝子が除去されたザイモモナス・モビリス形質転換体の製造）
図１に示された方法によって、ｐｄｃ遺伝子が除去されたザイモモナス・モビリス形質転換体を製造した。以下、図１を参照して説明する。
【００６２】
［１−１．ｐｄｃ遺伝子クローニング］
ザイモモナス・モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のゲノム遺伝子（ＡＥ００８６９２）からｐｄｃ遺伝子を含んで７５１３ｂｐに該当する遺伝子断片をポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）方法を利用して得た。これに使用されたプライマーは次の通りである。
【００６３】
正方向プライマー（ｐｄｃＦ）:
５−ＣＣＴＧＡＡＴＡＧＣＴＧＧＡＴＣＴＡＧＡＧＣＣＣＧＴＣＡＡＡＧＣ−３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７）
逆方向プライマー（ｐｄｃＲ）:
５−ＣＴＧＡＴＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣＴＣＧＧＣＣＴＣＣＡＡＧＣ−３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８）
【００６４】
ＳａｃＩ制限酵素（ＮＥＢ、ニューイングランドバイオラボ社）とＸｂａＩ制限酵素（ＮＥＢ、ニューイングランドバイオラボ社）を用いて、ＰＣＲによって得られた遺伝子断片を切断し、その後、同一の制限酵素で処理されたｐＨＳＧ３９８ベクター（コアバイオシステム、ＴＡＫＡＲＡ）にリガーゼ（ＮＥＢ、 ニューイングランドバイオラボ社）を使用して挿入した。図１の段階ａ）から分かるように、前記遺伝子断片は、ｐｄｃ遺伝子（１７０７ｂｐ）、前記ｐｄｃ遺伝子の５'末端側に５'末端から上流方向のＳａｃＩ部位までのポリヌクレオチド（上流相同部位、２９３３ｂｐ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３）及び前記ｐｄｃ遺伝子の３'末端側に３'末端から下流方向のＸｂａＩ部位までのポリヌクレオチド（下流相同部位、２８７３ｂｐ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４）を有する。前記５'相同部位と３'相同部位は、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ菌株の形質転換時に、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓのゲノムとの相同組み換えに使用される。
【００６５】
［１−２．ｐｄｃ遺伝子がｔｅｔＲ遺伝子に置換された（Δｐｄｃ::ｔｅｔＲ）プラスミド製作］
前記段階１−１で得られたプラスミドに、ＫｐｎＩ制限酵素（ＮＥＢ、ニューイングランドバイオラボ社）とＭｌｕＩ制限酵素（ＮＥＢ、ニューイングランドバイオラボ社）を用いて処理した後、ｐＢＲ３２２ベクター（コアバイオシステム、ＴＡＫＡＲＡ）からポリメラーゼ連鎖反応で増幅されたｔｅｔＲ遺伝子（Ｊ０１７４９）を、リガーゼ（ＮＥＢ、ニューイングランドバイオラボ社）を使用して挿入して、ｐｄｃ遺伝子がｔｅｔＲ遺伝子に置換されたプラスミドを製作した。
【００６６】
［１−３．Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓの形質転換］
前記段階１−２で得られたプラスミドを使用して、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓＺＭ４（ＡＴＣＣ３１８２１）を 電気穿孔法（エレクトロぽレーション）で形質転換した。Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓＺＭ４をＲＭ液体培地（グルコース、５０ｇ／ｌ；酵母抽出物、１０ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４、１ｇ／ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／ｌ；ｐＨ５．２）で１０時間培養した後、新たなＲＭ液体培地に移して６００ｎｍ可視光線で０．３〜０．４の吸光度を有するように４時間培養する。培養液を２０分間氷に放置し、遠心分離（５０００ｒｐｍ、５分）して上澄液を除去して１０％のグリセロールで洗浄した。３回の洗浄過程を経た後、１００μｌの体積で濃縮されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓＺＭ４を前記プラスミドに形質転換した。遺伝子導入システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用し、使用された電気穿孔法条件は３．０ｋＶ、２５μＦ、そして４００Ωであり、時間定数は８．８〜９．９であった。
【００６７】
形質転換時に、前記プラスミドに含まれた５'相同部位及び３'相同部位と、これに対するＺ．ｍｏｂｉｌｉｓＺＭ４ゲノムのそれぞれの相同部位間の相同組み換えによって、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓＺＭ４ゲノムのｐｄｃ遺伝子が除去され、その代わりに前記プラスミドに存在するｔｅｔＲ遺伝子が挿入されて、ｐｄｃ遺伝子がｔｅｔＲ遺伝子で置換されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓΔｐｄｃ::ｔｅｔＲ形質転換体が得られた。このように得られたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓΔｐｄｃ::ｔｅｔＲ形質転換体を２００６年１０月２６日付で大韓民国大田市儒城区魚隠洞に所在する韓国生命工学研究院内生物資源センターに寄託して、寄託番号ＫＣＴＣ １１０１２ＢＰを受けた。
【００６８】
［１−４．Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓΔｐｄｃ::ｔｅｔＲ形質転換体の選別及び確認］
前記段階１−３で得られた形質転換体を、テトラサイクリンとエタノールを含むＲＭ固体培地（エタノール、２０ｇ／ｌ；グルコース、５０ｇ／ｌ；酵母抽出物、１０ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４、１ｇ／ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／ｌ；ｐＨ５．２）で３０℃で５日間培養した後、生存細胞を収集した。
【００６９】
前記で収集された生存細胞がＺ．ｍｏｂｉｌｉｓΔｐｄｃ::ｔｅｔＲ形質転換体であることを確認するために、図２に示された方法を利用した。図２から分かるように、ｐｄｃ遺伝子を含む野生型Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓゲノムの場合、ｐｄｃ遺伝子の上流側に位置するプライマー（ｐｒ−ｐｄｃＦ）部位とｐｄｃ遺伝子の下流側に位置するプライマー（ｄｎ−ｐｄｃＲ）部位間の塩基の長さが、２５３６ｂｐである一方で、前記ｐｄｃ遺伝子がｔｅｔＲ遺伝子に置換されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ形質転換体の場合には、前記プライマー間の塩基の長さが２６４２ｂｐとなる。したがって、収集された生存細胞のゲノムを前記プライマーを利用してポリメラーゼ連鎖反応で増幅された長さを確認すると、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓΔｐｄｃ::ｔｅｔＲ形質転換体の有無を確認することができる。
【００７０】
これを具体的に説明すると、前記収集された生存細胞からＤＮＡ Ｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＬＲＳ  Ｌａｂｓ，ＱＩＡＧＥＮ）を利用して製造社の方法によってゲノムＤＮＡを分離した。生存細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として次のようなプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った。
【００７１】
正方向プライマー（ｐｒ−ｐｄｃＦ）:
５'−ＧＡＧＧＧＡＡＡＧＧＣＴＴＴＧＴＣＡＧＴＧＴＴＧＣＧ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９）
逆方向プライマー（ｄｎ−ｐｄｃＲ）:
５'−ＴＧＡＣＧＣＧＧＴＴＡＣＣＧＴＴＡＡＴＴＴＣＡＧＣＧＣ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１０）
【００７２】
対照群として、野生型Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓを同一に処理した。前記結果を図３に示した。
【００７３】
図３において、ＷＴは対照群の野生型Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓを示し、Ｍ１及びＭ２は本発明のＺ．ｍｏｂｉｌｉｓΔｐｄｃ::ｔｅｔＲ形質転換体を示す。図３から分かるように、本発明の場合に２５３６ｂｐヌクレオチド断片が得られ、これを通じてｐｄｃ遺伝子が除去されたことを確認することができた。
【００７４】
（実施例２:ｌｄｈＡ遺伝子が除去されたザイモモナス・モビリス形質転換体の製造）
図４に示された方法によって、ｌｄｈＡ遺伝子が除去されたザイモモナス・モビリス形質転換体を製造した。以下、図４を参照して説明する。
【００７５】
［２−１．ｌｄｈＡ遺伝子クローニング］
ザイモモナス・モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のゲノム遺伝子（ＡＥ００８６９２）からｌｄｈ遺伝子を含んで１０８５９ｂｐに該当する遺伝子断片をポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）方法を利用して得た。使用されたプライマーは次の通りである。
【００７６】
正方向プライマー（ｌｄｈＡＦ）:
５−ＴＧＧＣＡＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＴＡＧＡＴＣＧＡＡＧＧＴＧＣ−３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１１）
逆方向プライマー（ｌｄｈＡＲ）:
５−ＧＴＧＡＴＣＴＧＡＣＧＧＴＧＡＧＣＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧＧ−３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１２）
【００７７】
ＳａｃＩ制限酵素（ＮＥＢ、ニューイングランドバイオラボ社）とＸｂａＩ制限酵素（ＮＥＢ、ニューイングランドバイオラボ社）を用いて、ＰＣＲによって得られた遺伝子断片を切断し、その後、同一な制限酵素で処理されたｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｓｅｏｕｌｉｎ Ｂｉｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）にリガーゼ（ＮＥＢ、ニューイングランドバイオラボ社）を使用して挿入した。図１の段階ａ）から分かるように、前記遺伝子断片は、ｌｄｈＡ遺伝子（９９６ｂｐ）、前記ｌｄｈＡ遺伝子の５'末端側に５'末端から上流方向のＳａｃＩ部位までのポリヌクレオチド（上流相同部位、４８７９ｂｐ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:５）及び前記ｌｄｈＡ遺伝子の３'末端側に３'末端から下流方向のＸｂａＩ部位までのポリヌクレオチド（下流相同部位、４９８４ｂｐ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:６）を有する。前記５'相同部位と３'相同部位は、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ菌株の形質転換時に、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓのゲノムとの相同組み換えに使用される。
【００７８】
［２−２．ｌｄｈＡ遺伝子がｃｍＲ遺伝子に置換された（ΔｌｄｈＡ::ｃｍＲ）プラスミド製作］
前記段階２−１で得られたプラスミドを鋳型としてｌｄｈＡ上流及び下流側のみを同時に増幅するプライマーを製作してポリメラーゼ連鎖反応で遺伝子断片を得た。使用されたプライマーは次の通りである。
【００７９】
正方向プライマー（ｌｄｈＡ−ＰｍｅＩ−２Ｆ）:
５−ＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＡＣＡＡＧＡＧＣＧＡＡＧＡＡＴＡＧＣＡＡＡＧＡＡＴ−３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１３）
逆方向プライマー（ｌｄｈＡ−ＰｍｅＩ−２Ｒ）:
５−ＣＴＣＴＴＧＴＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＴＧＧＣＡＴＡＧＧＣＴＡＴＴＡＣＧ−３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１４）
【００８０】
前記遺伝子断片をＰｍｅＩ制限酵素（ＮＥＢ、ニューイングランドバイオラボ社）処理した後、ｐＨＳＧ３９８ベクター（コアバイオシステム、ＴＡＫＡＲＡ）からポリメラーゼ連鎖反応で増幅されたｃｍＲ遺伝子（Ｕ０８４６１）を、リガーゼ（ＮＥＢ、ニューイングランドバイオラボ社）を使用して挿入して、ｌｄｈＡ遺伝子がｃｍＲ遺伝子に置換されたプラスミドを製作した。
【００８１】
［２−３．Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓの形質転換］
前記段階２−２で得られたプラスミドを使用して、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓＺＭ４（ＡＴＣＣ３１８２１）を形質転換した。Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓＺＭ４をＲＭ液体培地（グルコース、５０ｇ／ｌ；酵母抽出物、１０ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４、１ｇ／ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／ｌ；ｐＨ５．２）で１０時間培養した後、新たなＲＭ液体培地に移して６００ｎｍの可視光線で０．３‘０．４の吸光度を有するように４時間培養する。培養液を２０分間氷に放置し、遠心分離（５０００ｒｐｍ、５分）して上澄液を除去し、１０％のグリセロールで洗浄した。３回の洗浄過程を経た後、１００μｌの体積で濃縮されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓＺＭ４を前記プラスミドに形質転換した。
【００８２】
形質転換する時、前記プラスミドに含まれた５'相同部位及び３'相同部位と、これに対するＺ．ｍｏｂｉｌｉｓＺＭ４ゲノムのそれぞれの相同部位間の相同組み換えによってＺ．ｍｏｂｉｌｉｓＺＭ４ゲノムのｌｄｈＡ遺伝子が除去され、その代わりに前記プラスミドに存在するｃｍＲ遺伝子が挿入されてｌｄｈＡ遺伝子がｃｍＲ遺伝子に置換されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓΔｌｄｈＡ::ｃｍＲ形質転換体が得られた。このように得られたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓΔｌｄｈＡ::ｃｍＲ形質転換体を２００６年１０月２６日付で大韓民国、大田市、儒城区魚隠洞に所在する韓国生命工学研究院内生物資源センターに寄託して寄託番号ＫＣＴＣ １１０１３ＢＰを受けた。
【００８３】
［２−４．Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓΔｌｄｈＡ::ｃｍＲ形質転換体の選別及び確認］
前記段階１〜３で得られた形質転換体を、クロラムフェニコールを含むＲＭ固体培地（グルコース、５０ｇ／ｌ；酵母抽出物、１０ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４、１ｇ／ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／ｌ；クロラムフェニコール、７５μｇ／ｍｌ；ｐＨ５．２）で３０℃で５日間培養し、クロラムフェニコールに抵抗性を示す生存細胞を収集した。
【００８４】
前記で収集された生存細胞がＺ．ｍｏｂｉｌｉｓΔｌｄｈＡ::ｃｍＲ形質転換体であることを確認するために、図５に示された方法を利用した。クロラムフェニコールに抵抗性を示す生存細胞をＲＭ液体培地（グルコース、５０ｇ／ｌ；酵母抽出物、１０ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４、１ｇ／ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／ｌ；クロラムフェニコール、７５μｇ／ｍｌ；ｐＨ５．２）に３０℃で１６時間培養し、遠心分離（１０、０００×ｇ、５分）して上澄液を除去した後、細胞を収集した。図５から分かるように、ｌｄｈＡ遺伝子を含む野生型Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓゲノムの場合、ｌｄｈＡ遺伝子の上流側に位置するプライマー（ｐｒ−ｌｄｈＡＦ）部位とｌｄｈＡ遺伝子の下流側に位置するプライマー（ｄｎ−ｌｄｈＡＲ）部位間の塩基の長さが、１８６１ｂｐである一方で、前記ｌｄｈＡ遺伝子がｃｍＲ遺伝子に置換されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ形質転換体の場合には、前記プライマー間の塩基の長さが１４９３ｂｐとなる。したがって、収集された生存細胞のゲノムを前記プライマーを利用してポリメラーゼ連鎖反応で増幅された長さを確認すると、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓΔｌｄｈＡ::ｃｍＲ形質転換体の有無が確認できる。
【００８５】
これを具体的に説明すると、前記収集された生存細胞からＤＮＡ Ｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＬＲＳ  Ｌａｂｓ、ＱＩＡＧＥＮ）を利用して製造会社の方法によってゲノムＤＮＡを分離した。生存細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として次のようなプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った。
【００８６】
正方向プライマー（ｎｐｒ−ｌｄｈＡＦ）:
５'−ＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＧＡＴＣＴＧＴＣＴＧＧＣＧＡＴＣＧ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１５）
逆方向プライマー（ｄｎ−ｌｄｈＡＲ）:
５'−ＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＴＧＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣＴＡＡＧＣＡＡＧＧ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１６）
【００８７】
対照群として野生型Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓを同一に処理した。
【００８８】
前記結果を図６に示した。図６において、ＷＴは対照群の野生型Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓを示し、Ｍ１、Ｍ２、そしてＭ３は本発明のＺ．ｍｏｂｉｌｉｓΔｌｄｈＡ::ｃｍＲ形質転換体を示す。図６から分かるように、本発明の場合に１４９３ｂｐヌクレオチド断片が得られ、これを通じてｌｄｈＡ遺伝子が除去されたことを確認することができた。
【００８９】
（実施例３:ｐｄｃ遺伝子及びｌｄｈＡ遺伝子が全て除去されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ形質転換体の製造）
前記実施例１と実施例２の過程を連続的に行って、ｐｄｃ遺伝子とｌｄｈＡ遺伝子が全て除去されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓΔｐｄｃ::ｔｅｔＲ／ΔｌｄｈＡ::ｃｍＲ形質転換体を製造した。このように得られたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓΔｐｄｃ::ｔｅｔＲ／ΔｌｄｈＡ::ｃｍＲ形質転換体を２００６年２月１５日付で大韓民国、大田市、儒城区魚隠洞に所在する韓国生命工学研究院内生物資源センターに寄託して寄託番号ＫＣＴＣ １０９０８ＢＰを受けた。
【００９０】
（実施例４:一次代謝産物の生産性試験）
前記実施例１乃至３で製造されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ形質転換体を利用して、これらの一次代謝産物生産能力を試験した。対照群として野生型Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓＺＭ４を使用した。
【００９１】
野生型Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓＺＭ４（ＡＴＣＣ ３１８２１）、実施例１乃至３で製造されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓΔｐｄｃ::ｔｅｔＲ形質転換体、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓΔｌｄｈＡ::ｃｍＲ形質転換体及びＺ．ｍｏｂｉｌｉｓΔｐｄｃ::ｔｅｔＲ／ΔｌｄｈＡ::ｃｍＲ形質転換体を、ＮａＨＣＯ３１０ｍＭが添加されたＲＭ液体培地（グルコース、５０ｇ／ｌ；酵母抽出物、１０ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４、１ｇ／ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／ｌ；テトラサイクリン、１５μｇ／ｍｌ；ｐＨ５．２）で３０℃で１６時間培養した。前記培養された培養液から細胞を除去し、得られた培養上澄液をＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を利用して代謝産物を測定した。前記測定において、日立ＨＰＬＣシステム（モデルＤ−７０００）が使用され、ＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７Ｈコラムで代謝産物を分離した。有機酸はＵＶ検出器（日立Ｄ−４２００）で、糖とエタノールはＲＩ（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）検出器（Ｄ−３３００）で、確認及び定量した。０．００２５Ｎの硫酸を移動相（溶媒）として使用し、カラム温度は６０℃であり、流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎであった。
【００９２】
前記方法を３回行って得られた結果値の平均を、下記の表２と図７Ａ乃至１０Ｂに示した。
【００９３】
【表２】
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【００９４】
前記表２から分かるように、本発明の実施例１乃至３で製作された形質転換体は、野生型と比較して増加したコハク酸生産能力を示した。
【００９５】
また、ΔｌｄｈＡ::ｃｍＲ形質転換体は、非常に優れたエタノール生産能力を示し、Δｐｄｃ::ｔｅｔＲ形質転換体は、非常に優れたコハク酸及び乳酸生産能力を示すことが明らかになった。
【００９６】
（実施例５:細胞増殖率及び一次代謝産物の生産性試験）
【００９７】
前記実施例４と同様な方法で培養して、時間に応じた菌体増殖及び産物生産を示す尺度として活用するために動力学分析を行い、指数増殖期、つまり、最大菌体増殖及び産物生産区間で測定された数値から次のような方法で得た。
【００９８】
【数１】
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【００９９】
【数２】
2009526547.tif 000010
【０１００】
【数３】
2009526547.tif 000011
【０１０１】
【数４】
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【０１０２】
【数５】
2009526547.tif 000013
【０１０３】
【数６】
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【０１０４】
このように得られた野生型（ＺＭ４）、Δｐｄｃ形質転換体及びΔｐｄｃ／ΔｌｄｈＡ形質転換体の動力学分析（ｋｉｎｅｔｉ ｃａｎａｌｙｓｉｓ）結果を下記の表３に示し、細胞増殖、糖消耗量及び代謝産物生産量を、各図１１Ａ乃至図１１Ｃに示した。
【０１０５】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】本発明の実施例１及び３におけるザイモモナス・モビリスＺＭ４でのｐｄｃ遺伝子の除去過程を示す模式図である。
【図２】本発明の実施例１で製作されたＺＭ４形質転換体でのｐｄｃ遺伝子除去を確認するためのプライマー設計を示す模式図である。
【図３】本発明の実施例１で製作されたＺＭ４形質転換体と野生型ＺＭ４菌株に対する電気泳動結果を示す図面である。
【図４】本発明の実施例２及び３におけるザイモモナス・モビリスＺＭ４でのｌｄｈＡ遺伝子の除去過程を示す模式図である。
【図５】本発明の実施例２で製作されたＺＭ４形質転換体でのｌｄｈＡ遺伝子除去を確認するためのプライマー設計を示す模式図である。
【図６】本発明の実施例２で製作されたＺＭ４形質転換体と野生型ＺＭ４菌株に対する電気泳動結果を示す図面である。
【図７Ａ】水素供給なく培養した場合の、ｐｄｃ遺伝子が除去された形質転換体（Δｐｄｃ）の増殖率（菌体量:ｇ／Ｌ）と一次代謝産物生成能力を、野生型ＺＭ４菌株と比較して示すグラフで、図７Ａは増殖率を、図７Ｂは一次代謝産物生成能力を比較すると示す。
【図７Ｂ】図７Ａ参照。
【図８Ａ】水素供給なく培養した場合のｐｄｃ遺伝子が除去された形質転換体の増殖率（菌体量:ｇ／Ｌ）と一次代謝産物生成能力を、ｐｄｃ遺伝子とｌｄｈＡ遺伝子が全て除去された形質転換体と比較して示すグラフで、図８Ａは増殖率を、図８Ｂは一次代謝産物生成能力を比較して示す。
【図８Ｂ】図８Ａ参照。
【図９Ａ】水素供給して培養した場合と水素供給のない場合の、ｐｄｃ遺伝子が除去された形質転換体（ＫＣＴＣ １１０１２ＢＰ）の増殖率（菌体量:ｇ／Ｌ）と一次代謝産物生成能力を比較して示すグラフである。
【図９Ｂ】図９Ａ参照。
【図１０Ａ】水素供給して培養した場合と水素供給のない場合の、ｐｄｃ遺伝子とｌｄｈＡ遺伝子が除去された形質転換体（ＫＣＴＣ １０９０８ＢＰ）の増殖率（菌体量:ｇ／Ｌ）と一次代謝産物生成能力を比較して示すグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ａ参照。
【図１１Ａ】ｌｄｈＡ遺伝子が除去された形質転換体の細胞増殖、糖消耗及び代謝産物生産能力を、ザイモモナス・モビリスＺＭ４と比較して示すグラフで、図１１Ａは細胞増殖を、図１１Ｂは糖消耗量を、図１１Ｃは代謝産物生産能力を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａ参照。
【図１１Ｃ】図１１Ｂ参照。
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図４】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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