(57)【要約】  本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ある細胞集団の獲得方法に関しており、これらは必須に、カルポニンおよびＳＭ−ＭＨＣを発現している、ヒト筋生検細胞サンプルからの、もしくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて骨格筋細胞（ｈＣＭＳ）へと分化した複数のヒト筋生検細胞からの、ヒト平滑筋細胞（ｈＣＭＬ）を含んでいる。本発明は、同方法により得られる単離平滑筋細胞を、ヒトに向けられた治療組成物として含んでいる組成物も、含む。本発明は、これらの単離平滑筋細胞の、複数のＣＭＬの置き換えに向けられた治療組成物調製のための使用も、課題に持つ。特に、本発明は、これらの単離平滑筋細胞の、虚血の、癌の、もしくは、損傷された組織の再血管新生を必要としている全ての疾患の処置のための使用を、課題に持つ。最後に、本発明は、これらの単離平滑筋細胞の、活性成分による処置を必要としているヒトに向けられた治療組成物調製のための当該活性成分ベクターとしての使用を、課題に持つ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ヒト筋生検細胞サンプルからの、もしくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて骨格筋細胞（ｈＣＭＳ）へと分化したヒト筋生検細胞からの、カルポニンおよびＳＭ−ＭＨＣを発現しているヒト平滑筋細胞（ｈＣＭＬ）を本質的に含んでいる細胞集団の獲得方法であって、これらヒト筋生検細胞が、ＣＤ３１およびＣＤ１４、万一の場合、リンパ球マーカーＢおよびＴを発現しておらず、ｈＣＭＳが、ＣＤ５６、デスミン、ならびに、遺伝子ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、およびミオゲニンから構成された遺伝子群内で選択された筋発生遺伝子を発現しており、多核筋管を発生させることができ、以降のステップ：
Ａ）これら筋芽ヒト筋生検細胞を、ＶＥＧＦを含んでいる培養培地において培養していき、この培養が、膀胱組織ＣＭＬ非存在下に実施されていき；
Ｂ）ステップＡ）において得られたｈＣＭＬの回収
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
ＣＤ５６およびデスミンを発現しているｈＣＭＳが、遺伝子ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、およびミオゲニンを発現することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｈＣＭＳが、ＣＤ３４およびＣＤ１４を発現しないことを特徴とする、請求項１もしくは２に記載の方法。
【請求項４】
ｈＣＭＳが、カルポニンおよびＳＭ−ＭＨＣを発現しないことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ステップＡ）において得られたｈＣＭＬが、カルポニンおよびＳＭ−ＭＨＣを発現することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップＡ）において得られたｈＣＭＬが、遺伝子ＭｙｏＤを発現しないことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ステップＡ）において、骨格筋細胞（ｈＣＭＳ）へとｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて分化したヒト筋生検細胞から得られたｈＣＭＬが、ＣＤ５６およびデスミンを、ステップＡ）において使用された細胞ｈＣＭＳよりも、有意に重要でない量で発現することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ステップＡ）において得られたｈＣＭＬが、Ｍｙｆ５およびミオゲニンを発現することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップＡ）において使用された培養培地が更に、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＧＦ１、ＦＧＦｂ、ＨＧＦ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、ならびに、ＣＭＬの増殖もしくは分化上での役割を持ち得る全ての他の因子から構成された成長因子群内で選択された少なくとも１種の成長因子を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ｈＣＭＬが、骨格筋細胞（ｈＣＭＳ）へとｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて分化したヒト筋生検細胞サンプルから得られ、ｈＣＭＳが、以降のステップ：
ａ）該筋生検のスライス；
ｂ）前記繊維および筋細胞の酵素的解離ならびに濾過によるこれら個々の細胞の分離；
ｃ）こうして得られた筋起源細胞の、成長培地および／または分化培地存在下の接着細胞培養反応容器中での培養、次いで、万一の場合、１相もしくは複数相の拡大相；
ｄ）特異的細胞マーカー解析による、これら異なる培養段階において存在する細胞型の同定；
ｅ）探索された細胞型が、該細胞集団内で優勢な割合である間の培養段階の選択；
ｆ）ｅ）において選択された培養段階での細胞集団の回収；
ｇ）万一の場合、ステップｆ）において回収された細胞の凍結
ステップを含んでいる方法により、ヒト筋生検細胞サンプルから得られていることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｂ）において：
これらスライスの、培地Ａにおける洗浄、次いで、これらスライスの、遊離化酵素存在下での酵素的解離；
こうして得られた個々の細胞の、篩上での濾過、次いで、遠心による分離；
こうして得られた細胞滓の、培地Ｂ内での洗浄
が実施され；
ステップｃ）において：
ステップｂ）において得られた細胞の、培養プレート上での、培地Ｃにおける、合流度約２０〜５０％が得られるまでか、もしくは、第１筋管出現までの培養、次いで、これら細胞の、緩衝ＰＢＳ、ＳＶＦ、次いで、培地Ｃにおける洗浄、培地Ｃにおける、大きくされたプレート単位上での、もしくは、多段階での、培養が新たに実施され得、合流度約９０％もしくは第１筋管出現を達成し；
培養培地Ｃの除去、および、これら細胞の回収前日、これの培地Ｄによる置き換え；
こうして得られた細胞の、ＰＢＳにおける、次いで、培地Ａにおける洗浄
が実施され；
万一の場合、ステップｆ）の終わりにおいて、こうして得られた細胞の、０．５％（Ｐ／Ｖ）でのヒト血清アルブミンを用いて補完された培地Ａにおける濃縮；
ステップｇ）において、ステップｆ）においてこうして得られた細胞の、凍結が、４％（Ｐ／Ｖ）でのヒト血清アルブミンを用いて補完された培地Ａにおいて、および、７．５％（Ｖ／Ｖ）でのＤＭＳＯにおいて実施され、これらの３７℃での解凍、次いで、培地Ａにおける洗浄後、これらのこの培養培地内での懸濁；
これらのステップにおいて、これら培地Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＥが、以降：
培地Ａ：修飾ＭＣＤＢ１２０培地（Ｈａｍら、１９８８年）：Ｄ−バリンによるＬ−バリン置換；フェノール赤（レッド）およびチミジン除去；
培地Ｂ：培地Ａ＋２０％照射牛胎児血清＋抗生物質；
培地Ｃ：培地Ｂ＋ＦＧＦｂ（１０ｎｇ／ｍＬ）＋１μＭでのデキサメタゾン；
溶液もしくは培地Ｄ：燐酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）
である
ことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
探求されたｈＣＭＳ細胞型が、前記細胞集団の有意な割合である間の前記培養段階が、少なくとも５０％の一般集団を代表して、ＣＤ５６＋表現型細胞集団の出現により求められていることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも５０％の一般集団を代表している前記ＣＤ５６＋表現型細胞集団が更に、ＣＤ１０＋、ＣＤ１３＋、デスミン＋、およびクラス１ＨＬＡから構成された表現型群において選択された、少なくとも１種の表現型、好ましくは少なくとも２種、３種、および４種の表現型を保有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｈＣＭＬが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて骨格筋細胞（ｈＣＭＳ）へと分化したヒト筋生検細胞サンプルから得られ、ステップＡ）において、ＶＥＧＦを含んでいる前記培養培地が、Ｄ−バリンによるＬ−バリン置換、フェノール赤（レッド）除去、およびチミジン除去により修飾されたＭＣＤＢ１２０培地であることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｈＣＭＬが、ヒト筋生検細胞サンプルから得られ、ステップＡ）において、ＶＥＧＦを含んでいる前記培養培地が、Ｍ１９９培地であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ステップＡ）において、前記培養培地が、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｈＣＭＬが、直接得られたか、もしくは、以前ｈＣＭＳへと分化したヒト筋生検が、個体のいずれかの筋領域内で採取された生検であることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
複数の前記ｈＣＭＬが、直接得られたか、もしくは、以前ｈＣＭＳへと分化したヒト筋生検が、採取が実施されている個体の脚筋領域内で採取された生検であることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｈＣＭＬが、直接得られたか、もしくは、以前ｈＣＭＳへと分化したヒト筋生検が、採取が実施されている小児もしくは成人の個体の筋領域内で採取された生検であることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
カルポニンおよびＳＭ−ＭＨＣを発現することを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法により得られる、単離ヒト平滑筋細胞。
【請求項２１】
請求項２０に記載の、もしくは、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法により得られた、単離ヒト平滑筋細胞を、薬剤として含んでいる組成物。
【請求項２２】
ヒトに向けられた治療組成物調製のための、請求項２１に記載の組成物の使用。
【請求項２３】
生検が起源とされている個体に向けられた治療組成物調製のための、請求項２１もしくは２２に記載の組成物の使用。
【請求項２４】
ＣＭＬ置き換えに向けられた治療組成物調製のための、請求項２２もしくは２３に記載の組成物の使用。
【請求項２５】
粥状（アテローム）硬化の、動脈炎の、慢性静脈疾患の、血管悪性形成の、特に血管腫瘍の予防にもしくは処置に向けられた治療組成物調製のための、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
化学療法によるかもしくは放射線療法による抗癌処置前にもしくは同時に投与される、癌の予防にもしくは処置に向けられた治療組成物調製のための、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
特に心臓もしくは下肢の虚血の予防にもしくは処置に向けられた治療組成物調製のための、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
活性成分による処置を必要としている疾患の予防にもしくは処置に向けられた治療組成物調製のための、前記ＣＭＬが前記活性成分を含有することを特徴とする、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
静脈内によりもしくは移植により投与されるように向けられた治療組成物調製のための、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、カルポニンおよびＳＭ−ＭＨＣを発現しているヒト平滑筋細胞（ｈＣＭＬ）を本質的に含んでいる細胞集団の、ヒト筋生検サンプルからの、もしくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて骨格筋細胞（ｈＣＭＳ）へと分化したヒト筋生検サンプルからの、獲得方法に関する。本発明は、本方法により得られる単離平滑筋細胞を、ヒト用に向けられた治療成分として含んでいる組成物にも関する。本発明は更に、これら単離された平滑筋細胞の、平滑筋細胞を置き換えるように向けられた治療組成物を調製していくための使用に関する。特に、本発明は、これら単離された平滑筋細胞の、虚血の、癌の、もしくは、損傷した組織の再灌流を必要としているいずれの疾患をも処置していくための使用に関する。最後に、本発明は、これら平滑筋細胞の、これら活性成分を用いる治療を必要としているヒト用に向けられた治療組成物を調製していくための活性成分用ベクターとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
これら平滑筋細胞（ＣＭＬ）およびこれら骨格筋細胞（ＣＭＳ）が、血管、腸管、および膀胱において存在し、２タイプの細胞であり、臓器により使用され、機械的収縮機能を満たす。ＣＭＬの起源が複雑であり、これらの位置（ロケーション）に依る。実際、胚発生の間、これらＣＭＬ前駆体が、３系統：間葉細胞、神経畦細胞、もしくは、心外膜由来細胞からの起源たり得る。最近、末梢血において循環しているＣＭＬ始原細胞の存在が、観察されている。実際、異なる動物モデルが、（ｉ）新血管内膜形成、（ｉｉ）動脈移植生成もしくは粥状硬化プラーク形成を研究するのに使用されたが、骨髄細胞において含有された始原細胞が、これらのプロセスにおいて参画すること、ならびに、これらが、ＣＭＬへと分化することを示すことを可能にしている。
【０００３】
成人において、骨格筋細胞修復が、筋繊維基底層下の状況での単核筋原細胞たる衛星（サテライト）細胞集団により、実施されている。しかし、この細胞集団が、不均一であると思われる。更に、他の万能細胞が、骨格筋から、フローサイトメトリーにより、これらのＨｏｅｃｈｓｔ染料放出特性を使用しながら（１、２）、単離されたが、全ての血液細胞へと分化していくことができ、これらが、その骨髄が照射により破壊されているマウス中に移植されている場合である（２）。この細胞集団が、＜＜副集団＞＞（ＳＰ）として知られている。これが、マーカーＳｃａ１発現により、定義されている。しかしながら、これが、ＣＤ３４、ｃｋｉｔ、およびＣＤ４５を発現しない。これらの細胞が、デスミン＋筋細胞へと、適切な培養条件（１）において分化できる。他の研究が、高い細胞の＜＜可塑性＞＞特性を有する骨格筋における前駆体細胞の存在を記載する（３）。これゆえ、骨格筋が、変動した万能特性を有する幾つかのタイプの幹細胞を含有するよう思われる。
【０００４】
これらの幹細胞の分化特性およびこれらの培養におけるコントロール（制御）の画定が、これらの容易に単離された細胞を、処置、特に修復処置において使用するのを、可能とすると思われる。これらの細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて培養されたが、次いで、移植され得、血管病理（虚血後再灌流、粥状（アテローム）硬化、腫瘍血管安定化等）自家処置用細胞処置産物を構成していく。
【０００５】
ラットＳｋＭＳの分化が既に、Ｈｗａｎｇ  ＪＨ．らにより記載されており（４）、ＶＥＧＦ存在下に膀胱ＣＭＬとのＣＭＳの同時培養に関与している方法を使用しており、この方法は、αＳＭＡを発現している分化ＣＭＳを得るのを可能にしている。
【０００６】
番号ＷＯ０３／０２７２８１と共に公開された国際特許出願（Ｓａｋｕｒａｄａ  Ｋａｚｕｈｉｒｏら）に関するコメントも、なされ得、骨格筋間質組織を起源としている万能幹細胞集団の獲得を記載しており、神経、グリア細胞、心筋細胞、脂肪細胞、血管内皮細胞、血液細胞、骨細胞、軟骨細胞、膵細胞、および肝細胞へと分化できる。
【０００７】
番号ＷＯ０１／９４５５５と共に公開された国際特許出願（Ｊ．Ｐ．Ｍａｒｏｌｌｅａｕら）に関するコメントも、なされ得、筋起源の特徴化された細胞集団の獲得方法およびこれらの使用を記載している。この文書が特に、細胞集団を、筋組織生検から、ヒトでの使用用の細胞療法産物調製のために、特に、移植による獲得方法を記載し、その優勢な細胞型が、ＣＤ５６マーカーおよびクラスＩ  ＨＬＡマーカーを発現し、心不全の医薬処置を潜在化させる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これゆえ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、平滑筋細胞（ＣＭＬ）を本質的に含んでいる細胞集団の、特に、この集団を使用しながら処置されるべき個体もしくは患者からの筋組織サンプルからの、獲得方法を持つことが、望ましいと思われる。
【０００９】
これが正に、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
これゆえ、第１態様における、本発明が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ヒト筋生検サンプルからの、もしくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて骨格筋細胞（ｈＣＭＳ）へと分化したヒト筋生検からの、カルポニンおよび平滑筋ミオシン重鎖、ここで以後ＳＭ−ＭＨＣとして知られた、を発現しているヒト平滑筋細胞（ｈＣＭＬ）を本質的に含んでいる細胞集団の獲得方法に関し、これらヒト筋生検細胞が、ＣＤ３１およびＣＤ１４、万一の場合、リンパ球マーカーＢおよびＴを発現しておらず、ｈＣＭＳが、ＣＤ５６、デスミン、ならびに、遺伝子ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、およびミオゲニンにより構成された遺伝子群から選択された筋発生遺伝子を発現しており、多核筋管を発生させることができ、以降のステップ：
Ａ）これら筋芽ヒト筋生検細胞を、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、好ましくは、ヒトＶＥＧＦを含んでいる培養培地において培養していき、この培養が、好ましくは、膀胱ＣＭＬ非存在下に実施されていき；
Ｂ）ステップＡ）において得られたｈＣＭＬの回収
を含むことを特徴とする。
【００１１】
用語＜＜本質的に＞＞とは、表現＜＜本質的にヒト平滑筋細胞（ｈＣＭＬ）を含んでいる＞＞において使用された場合、本明細書において、特に、少なくとも、５０％、好ましくは、少なくとも、６０％、７０％、７５％、および８０％のｈＣＭＬを、得られた細胞集団全体に関して含有している集団を意味すると理解される。
【００１２】
好ましくは、本発明に従っている方法が、ＣＤ５６およびデスミンを発現しているｈＣＭＳが、遺伝子ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、およびミオゲニンを発現することを特徴としている。
【００１３】
好ましくは、本発明に従っている方法が、ｈＣＭＳが、ＣＤ３４およびＣＤ１４を発現しないことを特徴としている。
【００１４】
好ましくは、本発明に従っている方法が、ｈＣＭＳが、カルポニンおよびＳＭ−ＭＨＣを発現しないことを特徴としている。
【００１５】
好ましくは、本発明に従っている方法が、ステップＡ）において得られたｈＣＭＬが、カルポニンおよびＳＭ−ＭＨＣを発現することを特徴としている。
【００１６】
好ましくは、本発明に従っている方法が、ステップＡ）において得られたｈＣＭＬが、遺伝子ＭｙｏＤを発現しないことを特徴としている。
【００１７】
好ましくは、本発明に従っている方法が、ステップＡ）においてｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてヒト骨格筋細胞（ｈＣＭＳ）へと分化したヒト筋生検得られたｈＣＭＬが、ＣＤ５６およびデスミンを、ステップＡ）において使用されたｈＣＭＳよりも、有意に少ない量で発現することを特徴としている。
【００１８】
好ましくは、本発明に従っている方法が、ステップＡ）において得られたｈＣＭＬが、Ｍｙｆ５およびミオゲニンを発現することを特徴としている。
【００１９】
好ましくは、本発明に従っている方法が、ステップＡ）において使用された培養培地が更に、血小板由来成長因子ホモダイマーＢＢ（ホモダイマーｂｂとも。ＰＤＧＦ−ＢＢ）、１型インシュリン成長因子（ＩＧＦ１）、塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦｂ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、α腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）、ＴＧＦβ、ならびに、ＣＭＬの増殖もしくは分化における役割を持ち得る全ての他の因子からなっている成長因子群から選択された少なくとも１種の成長因子、好ましくはヒトのを含むことを特徴とする。
【００２０】
好ましくは、本発明に従っている方法が、ｈＣＭＬが、ステップＡ）において、ヒト骨格筋細胞（ｈＣＭＳ）へとｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて分化したヒト筋生検細胞サンプルから得られたことを特徴としており、ｈＣＭＳが、以降のステップ：
ａ）該筋生検のスライス；
ｂ）前記繊維および筋細胞の酵素的解離ならびに濾過によるこれら個々の細胞の分離；
ｃ）こうして得られた筋細胞を、成長培地および／または分化培地存在下の接着細胞培養反応容器中の培養中に入れ、次いで、万一の場合、１相もしくは複数相の拡大相により伴われており；
ｄ）特異的細胞マーカー解析による、これら異なる培養段階において存在する細胞型の同定；
ｅ）探索された細胞型が、該細胞集団の優勢な集団である間の培養段階を選んでいき；
ｆ）ｅ）において選択された培養段階において細胞集団を回収していき；
ｇ）万一の場合、ステップｆ）において回収された細胞の凍結
ステップを含んでいる方法により、ヒト筋生検細胞サンプルから得られていることを特徴とし、特に、該細胞療法産物調製のために選ばれるべき培養段階においてである。
【００２１】
前で言った方法の好ましいモードに従い、以降が実施される。
ステップｂ）において：
これらスライスを、培地Ａにおいて、洗浄していき、次いで、これらスライスを、遊離化酵素存在下に酵素的に解離させ；
こうして得られた個々の細胞を、篩上での濾過、次いで、遠心により、分離していき；
こうして得られた細胞滓を、培地Ｂにおいて、洗浄していき；
ステップｃ）において：
ステップｂ）において、得られた細胞を、培養プレート上で、培地Ｃにおいて、合流度約２０〜５０％が得られるか、もしくは、第１筋管出現まで培養していき、次いで、これら細胞を、燐酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、牛胎児血清（ＳＶＦ）、次いで、培地Ｃにおいて、洗浄していき、ここで、培地Ｃにおける大きくされたもしくは多段階プレート単位（ユニット）上での培養が再び、実施され得、合流度約９０％もしくは第１筋管出現を達成し；
培養培地Ｃを除去し、これら細胞を回収していく前の日、これを培地Ｄにより置き換えていき；
こうして得られた細胞を、ＰＢＳにおいて、次いで、培地Ａにおいて洗浄していき；
万一の場合、ステップｆ）の終わりにおいて：
こうして得られた細胞を、０．５％（Ｐ／Ｖ）ヒト血清アルブミンを用いて補完された培地Ａにおいて濃縮していき；
ステップｇ）において：
ステップｆ）においてこうして得られた細胞の凍結が、４％（Ｐ／Ｖ）ヒト血清アルブミンを用いて補完された培地Ａにおいて、および、７．５％（Ｖ／Ｖ）ＤＭＳＯにおいて実施され、これらを３７℃において解凍していき、次いで、培地Ａにおける洗浄後、これらをこの培養培地に懸濁させていき；
これらのステップにおいて、これら培地Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤが、番号ＷＯ０１／９４５５５と共に、２００１年１２月１３日公開された国際特許出願（２４および２５ページ）において定義されたとおりの培地であり、つまり：
培地Ａ：修飾ＭＣＤＢ１２０培地（Ｈａｍら、１９８８年）：Ｄ−バリンにより置換されたＬ−バリン；フェノール赤（レッド）およびチミジン除去；
培地Ｂ：培地Ａ＋２０％照射牛胎児血清＋抗生物質；
培地Ｃ：培地Ｂ＋ＦＧＦｂ（１０ｎｇ／ｍＬ）＋１μＭデキサメタゾン；
溶液Ｄ：燐酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）
である。
【００２２】
好ましくは、使用された抗生物質がゲンタマイシンであり、特に、５０μｇ／ｍＬにおいてであり、もしくは、ペニシリンおよびストレプトマイシンの混合物である（特に、それぞれ、１００ＵＩ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬにおいて）。
【００２３】
更により好ましい実施形態において、本発明による方法が、該ｈＣＭＬが、以前ｈＣＭＳへと分化した、番号ＷＯ０１／９４５５５と共に公開された国際特許出願において記載されたような方法に従って得られたヒト筋生検細胞から得られており、本方法において、探索されたｈＣＭＳ細胞型がその細胞集団の有意な割合である間の培養段階が、少なくとも、５０％、好ましくは、少なくとも、６０％、７０％、７５％、および８０％の一般集団を代表して、ＣＤ５６＋表現型集団の出現により求められていることを特徴としている。
【００２４】
好ましくは、該ＣＤ５６＋表現型細胞集団が、少なくとも、５０％、好ましくは、少なくとも、６０％、７０％、７５％、および８０％の一般集団を代表して、更に、ＣＤ１０＋、ＣＤ１３＋、デスミン＋、クラス１ＨＬＡから構成された表現型群において選択された、少なくとも１種の表現型、好ましくは、少なくとも２種、３種、および４種の表現型を保有し、クラス２ＨＬＡを発現していない。
【００２５】
好ましい実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて本発明に従って本質的にｈＣＭＬを含んでいる細胞集団を得ていく本方法が、本方法において、当該ｈＣＭＬがｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて骨格筋細胞（ｈＣＭＳ）へと分化したヒト筋生検細胞サンプルから得られており、ステップＡ）において、その培養培地がＶＥＧＦを含んでおり、ＭＣＤＢ１２０培地（ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２４，８３３〜８４４、１９９８年）であり、Ｈａｍらにより記載されたとおりであり、Ｄ−バリンによるＬ−バリンの置換、フェノール赤（レッド）およびチミジン除去により修飾されたことを特徴としている。
【００２６】
好ましい実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて本発明に従って本質的にｈＣＭＬを含んでいる細胞集団を得ていく本方法が、本方法において、当該ｈＣＭＬがヒト筋生検細胞サンプルから得られており、ステップＡ）において、該培養培地がＶＥＧＦを含んでおり、Ｍ１９９培地（例えば、培地１９９、Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹのような）であることを特徴としている。
【００２７】
好ましい実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて本発明に従って本質的にｈＣＭＬを含んでいる細胞集団を得ていく本方法が、ステップＡ）において、該培養培地が１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを含むことを特徴としている。
【００２８】
同様に好ましい実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて本発明に従って本質的にｈＣＭＬを含んでいる細胞集団を得ていく本方法が、当該ｈＣＭＬが直接得られるかもしくは以前ｈＣＭＳへと分化したヒト筋生検が、如何なる筋肉の領域からでも採取された生検であり、好ましくは、そのサンプルが採取された小児もしくは成人個体の脚筋からであることを特徴としている。
【００２９】
もう１種別の態様において、本発明が、本発明の方法により得られる単離ヒト平滑筋細胞を含み、該単離ヒト平滑筋細胞が、カルポニンおよびＳＭ−ＭＨＣを発現することを特徴としている。
【００３０】
尚もう１種別の態様において、本発明が、ヒト筋生検サンプルからもしくは本発明の方法により骨格筋細胞へとｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて分化したヒト筋生検から得られるもしくは直接得られる単離ヒト平滑筋細胞を含んでいる組成物に関し、薬剤として使用された。
【００３１】
本発明が、ヒト筋生検サンプルからもしくは本発明の方法により骨格筋細胞へとｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて分化したヒト筋生検から得られるもしくは直接得られる単離ヒト平滑筋細胞の使用、あるいは、本発明に従いながら、ヒトでの使用用治療組成物調製のための薬剤としての本組成物の使用も含み、つまり、該方法のステップＡ）において培養された当該筋生検細胞が採取された個体を目的とした。
【００３２】
好ましい実施形態において、該治療組成物が、ＣＭＬを、ヒトにおいて置き換えもしくは移植するよう向けられており、好ましくは、自家置き換えもしくは移植である。
【００３３】
好ましくは、該治療組成物が、癌の予防もしくは処置用に向けられており、好ましくは、抗癌化学療法もしくは放射線療法処置の前もしくはと同時に投与される。
【００３４】
これは、通常血管に対して、腫瘍血管が構造的におよび機能的に異なるからである。腫瘍血管特異的マーカーの同定が、これらの血管を、通常血管系を破壊していくことなく、標的とするのを可能とすると思われる（抗血管新生療法）（５）。多くの研究が、腫瘍血管内皮細胞（ＣＥ）における機能の変化を示している。そして、最近の結果が、血管周囲細胞（周細胞もしくはＣＭＬ）が、表現型および機能の修飾（異常な形状、新たなマーカー発現、ＣＥとの低い会合、細胞質の伸びを持っており、深くその腫瘍実質中に浸透する）を、腫瘍微小環境において受け（６−８）、こうして、抗血管新生療法用の新たな標的となっていくことを示す。固形腫瘍のこれらの生理病理学的な特徴が、従来の細胞毒性療法および標的化療法のデリバリーおよび効率を妥協させる。新たな治療アプローチが、破壊していってドラッグデリバリーを容易化させる前、腫瘍血管系を通常とするものと思われる（総説に関して（９）参照）。事実、最近の結果が、これら組み合わされた治療を使用しながら、該腫瘍血管系の安定化および通常化後、腫瘍後退効率を示す（１０）。この腫瘍血管の安定化が、その腫瘍部位中にもしくは周りにＣＭＬを注入していくことにより、実施され得ると考えられる。
【００３５】
この治療アプローチ（これら腫瘍血管を通常化させていくことに鑑みて、本発明の方法により得られるもしくは直接得られる単離ヒトＣＭＬを注入していく）が好ましくは、化学療法もしくは放射線療法との組み合わせにおいてだけ実施されるべきである。この終わりに、＜＜治療窓＞＞が定義されなくてはならないが、ＣＭＬ注入がこれら抗癌処置の最大効果を可能とすると思われる間の期間である。
【００３６】
血管＜＜通常化＞＞が、より機能的なネットワークを確かにし、こうして、これら薬剤の局所的な拡散を高めていき、より均一な供給（デリバリー）を確かにし、ある特定の薬剤が作用するのが必要な腫瘍の酸素化を確かにする。これが、当該腫瘍におけるこれら薬剤のより速くより広い作用を可能にし、こうして、投与された用量の減少が予め、２次効果（副作用）の深刻さおよび頻度を抑制していく。最後に、これら作用のスピードおよび組み合わせが急速に、その増殖を限り、こうして、その腫瘍耐性現象がしばしば観察された。
【００３７】
本明細書において提案された細胞療法が、現在の処置を置き換えるように向けられた新しいタイプの処置を構成しないが、現在提供されている化学療法もしくは放射線療法に対する補完および／または潜在的相乗効果として使用される。
【００３８】
好ましくは、また、該治療組成物が、虚血、特に、心臓もしくは下肢虚血の予防もしくは処置用に向けられている。
【００３９】
多くの研究が、マウスおよびある幾つかのヒトのプロトコールにおいて実施されたが、骨髄細胞もしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて分化した細胞を注入していった後の虚血後再灌流の向上をハイライトしている（心臓もしくは下肢虚血）。現時点において、新生血管へのこれらの細胞の本当の統合が、問題とされているよう思われるが、観察された基本の効果が、本当である。更に、これらの過程（プロセス）におけるＣＭＬの役割が、非常に重要たり得るであろう。最近の結果が、血管新生部位において、マウスへと、内皮細胞中にでなく、内皮周辺細胞中にだけ注入された骨髄細胞の分化を示す（１１）。
【００４０】
これゆえ、より具体的には、本発明の１目的が、ヒト筋生検細胞サンプルからもしくは本発明の方法によりｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて骨格筋細胞へと分化したヒト筋生検細胞から得られるもしくは直接得られる単離ヒト平滑筋細胞の、腫瘍血管系もしくは虚血後再灌流＜＜通常化＞＞用に向けられた組成物のための使用である。
【００４１】
しかしながら、これらの細胞が、粥状（アテローム）硬化、慢性静脈疾患、血管悪性形成（血管腫瘍のような）用の治療使用用に向けられた薬剤としても、使用され得るであろう。
【００４２】
この理由で、本発明の目的が、ヒト筋生検細胞サンプルからもしくは本発明の方法によりｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて骨格筋細胞へと分化したヒト筋生検細胞から得られるもしくは直接得られる単離ヒト平滑筋細胞の、粥状（アテローム）硬化、動脈炎、慢性静脈疾患、もしくは血管悪性形成、特に血管腫瘍の予防もしくは処置用に向けられた治療組成物調製のための使用でもある。
【００４３】
最後に、血管新生部位に向かってのこれらの転移特性により、これらの細胞が、薬剤、または、抗もしくは原血管新生因子のような治療活性成分をデリバリーしていくためのシャトルもしくはベクターとして使用され得る。
【００４４】
これゆえ、もう１種別の特定の態様において、本発明の更なる目的が、ヒト筋生検細胞サンプルからもしくは本発明の方法によりｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて骨格筋細胞へと分化したヒト筋生検細胞から得られるもしくは直接得られる単離ヒト平滑筋細胞の、薬剤としての、つまり、治療活性成分もしくは化合物投与用ベクターとしての使用であり：
該単離ヒト平滑筋細胞が形質転換され、こうして、該活性成分もしくは治療化合物を発現できるようになり；もしくは
該単離ヒト平滑筋細胞が修飾されており、投与されるよう必要とされている該活性成分もしくは治療化合物を含有する
ことを特徴とする。
【００４５】
本発明は、ヒト筋生検細胞サンプルからもしくは本発明の方法によりｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて骨格筋細胞へと分化したヒト筋生検細胞から得られるもしくは直接得られる単離ヒト平滑筋細胞の、活性成分もしくは治療化合物による処置を必要としている疾患の予防もしくは処置用に向けられた治療組成物調製のための使用も含み、これら細胞が、当該活性成分もしくは当該治療化合物を発現できるか、または、当該活性成分もしくは当該治療化合物を含有している。
【００４６】
好ましくは、ヒト筋生検細胞からもしくは本発明の方法によりｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて骨格筋細胞へと分化したヒト筋生検細胞から得られるもしくは直接得られる単離ヒト平滑筋細胞の、治療組成物調製のための使用が、当該組成物が、静脈内経路により、もしくは、移植により、投与されることを特徴としている。
【００４７】
続く図面および実施例のキャプションが、如何なる方法においても、その範囲を限定していくことなく、本発明を例示するよう向けられている。
【実施例】
【００４８】
方法
細胞培養
臍帯血において含有された前駆体からｅｘ  ｖｉｖｏにおいて分化したＣＭＬが得られ、上記したとおりであった（１６）。これらが、Ｉ型ラット尾コラーゲン（６０μｇ／ｍＬ、ＳＩＧＭＡ）上で、２０％の牛胎児血清（ＳＶＦ）、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）、抗生物質、抗真菌剤溶液（Ｇｉｂｃｏ）、および、１０ｎｇ／ｍＬでの組み換えｈＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて補完されたＭ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ）において、３７℃において、５％ＣＯ２を含有している雰囲気において、培養された。該培養培地が、１週に２回、変えられている。本ＣＭＳが、以前記載されたとおり（１２）培養された。筋管への細胞の分化を誘導させるために、８０〜９０％での細胞の培養培地が、２％ＳＶＦ、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ならびに、抗生物質および抗真菌剤溶液（Ｇｉｂｃｏ）を用いて補完された培地へと変えられた。
【００４９】
免疫細胞化学
これら細胞が培養において、スライド上で混合され（＜＜チャンバースライド＞＞、Ｌａｂ−Ｔｅｃｈｎ、Ｐｏｌｙ  Ｌａｂｏ、ストラスブール、フランス）、冷９０％アセトン溶液を用いて固定された。１次抗体が、使用された。マウス抗ヒトαＳＭＡモノクローナル抗体（１Ａ４、ＤＡＫＯ）およびマウス抗ヒト平滑筋ミオシン重鎖モノクローナル抗体（ＳＭＭＳ−１、ＤＡＫＯ）。（ＤＡＫＯ）ＥｎＶｉｓｉｏｎＴＭＳｙｓｔｅｍ過酸化酵素（ＤＡＢ）キットが使用され、αＳＭＡおよびＳＭ−ＭＨＣを明らかにした。これら細胞が仕上げに、ヘマトキシリンを用いて逆染色された。
【００５０】
フローサイトメトリー
ある１分取の細胞が直接、ＣＤ３１（５．６Ｅ、Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＣＤ４５／ＣＤ１４（２Ｄ１、ＭφＰ９、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＣＤ５６、およびＣＤ９０に対して向けられた抗体を用いて標識された。これら細胞が、抗デスミン抗体（Ｄ３３、ＤＡＫＯ）を用いて、浸透試薬ＩｎｔｒａｐｒｅｐＴＭ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた浸透ステップ後、標識された。標識化後、これら細胞が、１％パラホルムアルデヒドを用いて固定され、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｔａｒフローサイトメーター、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により解析された。
【００５１】
ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼチェーンリアクション）
合計ＲＮＡが、その供給元の説明書に従いながら、ＲＮＡＸＥＬ（登録商標）（ＥＵＲＯＢＩＯ、Ｌｅｓ  Ｕｌｉｓ、フランス）を用いて抽出された。そのｃＤＮＡ合成が、キット＜＜ＲＴ−ＰＣＲ（ＡＭＶ）用第１鎖ｃＤＮＡ合成キット＞＞（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用しながら、実施された。こうして、興味の対象のｃＤＮＡ断片が、ＰＣＲにより、増幅されることができた。該ＰＣＲ混合物が、１Ｘ反応緩衝液、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのデオキシヌクレオチド混合物、０．５単位のＴａｑポリメラーゼ、ならびに、０．２μＭのセンスおよびアンチセンスプライマーを含有した。以降のプライマーが、該ＲＴ−ＰＣＲに使用された：
ＧＡＰＤＨセンス（配列ＩＤ番号：１）：５’−ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＧＧＧ−３’
アンチセンス（配列ＩＤ番号：２）：５’−ＣＡＡ  ＡＧＴ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＴＧＡ  ＣＣ−３’
カルポニンセンス（配列ＩＤ番号：３）：５’−ＡＧＡ−ＡＧＴ−ＡＴＧ−ＡＣＣ−ＡＣＣ−ＡＧＣ−３’
アンチセンス（配列ＩＤ番号：４）：５’−ＴＡＧ−ＡＧＣ−ＣＣＡ−ＡＴＧ−ＡＴＧ−ＴＴＣ−ＣＧ−３’
ＳＭ２２αセンス（配列ＩＤ番号：５）：５’−ＧＣＡ−ＧＴＣ−ＣＡＡ−ＡＡＴ−ＴＧＡ−ＧＡＡ−ＧＡ−３’
アンチセンス（配列ＩＤ番号：６）：５’−ＣＴＧ−ＴＴＧ−ＣＴＧ−ＣＣＣ−ＡＴＴ−ＴＧＡ−ＡＧ−３’
ミオゲニンセンス（配列ＩＤ番号：７）：５’−ＡＧＣ−ＧＣＣ−ＣＣＣ−ＴＣＧ−ＴＧＴ−ＡＴＧ−３’
アンチセンス（配列ＩＤ番号：８）：５’−ＴＧＴ−ＣＣＣ−ＣＧＧ−ＣＡＡ−ＣＴＴ−ＣＡＧ−Ｃ−３’
ＭｙｏＤセンス（配列ＩＤ番号：９）：５’−ＣＧＧ−ＣＧＧ−ＣＧＧ−ＡＡＣ−ＴＧＣ−ＴＡＣ−ＧＡＡ−３’
アンチセンス（配列ＩＤ番号：１０）：５’−ＧＧＧ−ＧＣＧ−ＧＧＧ−ＧＣＧ−ＧＡＡ−ＡＣＴ−Ｔ−３’
Ｍｙｆ５センス（配列ＩＤ番号：１１）：５’−ＡＣＣ−ＡＴＧ−ＧＡＴ−ＣＧＧ−ＣＧＧ−ＡＡＧ−Ｇ−３’
アンチセンス（配列ＩＤ番号：１２）：５’−ＡＡＴ−ＣＧＧ−ＴＧＣ−ＴＧＣ−ＣＡＡ−ＣＴＧ−ＧＡＧ−３’
ＶＥＧＦ−Ｒ１センス（配列ＩＤ番号：１３）：５’−ＣＧＡ−ＣＣＴ−ＴＧＧ−ＴＴＧ−ＴＧＧ−ＣＴＧ−ＡＣＴ−３’
アンチセンス（配列ＩＤ番号：１４）：５’−ＣＣＣ−ＴＴＣ−ＴＧＧ−ＴＴＧ−ＧＴＧ−ＧＣＴ−ＴＴＧ−３’
ＶＥＧＦ−Ｒ２センス（配列ＩＤ番号：１５）：５’−ＡＡＣ−ＡＡＡ−ＧＴＣ−ＧＧＧ−ＡＧＡ−ＧＧＡ−３’
アンチセンス（配列ＩＤ番号：１６）：５’−ＴＧＡ−ＣＡＡ−ＧＡＡ−ＧＴＡ−ＧＣＣ−ＡＧＡ−ＡＧＡ−３’
ＦＲＳセンス（配列ＩＤ番号：１７）：５’−ＡＧＴ−ＧＴＧ−ＴＧＧ−ＧＧＧ−ＡＧＡ−ＴＴＣ−ＴＧ−３’
アンチセンス（配列ＩＤ番号：１８）：５’−ＴＣＴ−ＣＣＣ−ＴＡＧ−ＣＡＡ−ＣＡＧ−ＣＣＣ−ＴＡ−３’
【００５２】
実施例１：始原細胞もしくは分化骨格筋細胞から、大量のヒトＣＭＬを得るのを可能にしていく培養条件
Ａ）出発細胞集団：
本発明の方法は、１種の優勢な細胞型が平滑筋型細胞である細胞集団の獲得方法に関する。この方法は、直接筋生検細胞に、もしくは、ＣＭＳへの生検細胞の分化およびこれらの細胞の増幅の初期相後、適用され得る。これらの生検から筋生検およびＣＭＳを得ていく条件ならびにこれらの表現型の特徴化が、番号ＷＯ０１／９４５５５と共に公開された国際特許出願（Ｊ．Ｐ．Ｍａｒｏｌｌｅａｕら）において定義されている。更に、これら生検細胞が、ＣＤ３１およびＣＤ１４を発現しない。
【００５３】
数グラムの筋生検から開始して、数１００，０００，０００のＣＭＳを得るのが可能である。これらの細胞が、Ｍｙｆ５およびミオゲニンのような、ＣＤ５６、デスミン、および筋発生遺伝子を発現する。しかしながら、これらが、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ならびに、カルポニンおよびＳＭ−ＭＨＣのようなＣＭＬ特異的マーカーを発現しない。これらの細胞が、合着して、多核筋管を生じさせることができる。
【００５４】
Ｂ）平滑筋細胞への骨格筋細胞の分化：
該生検からの、もしくは、ＣＭＳへの分化後の細胞が、ＭＣＤＢもしくはＭ１９９培地において、ＶＥＧＦ単独存在下に、もしくは、他の成長因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＧＦ１、ＦＧＦｂ、ＨＧＦ、もしくはＴＮＦα）と共に、培養される。
【００５５】
使用された溶液および培地：
培地Ａ：
修飾ＭＣＤＢ１２０培地（Ｈａｍら、１９８８年）：Ｌ−バリンが、Ｄ−バリンにより置換、フェノール赤（レッド）およびチミジン除去。
培地Ｂ：
培地Ａ＋２０％照射牛胎児血清＋抗生物質（５０μｇ／ｍＬでのゲンタマイシンもしくはペニシリンに関して１００ＵＩ／ｍＬもしくはストレプトマイシンに関して１００μｇ／ｍＬ）。
培地Ｃ：
培地Ｂ＋ＦＧＦｂ（１０ｎｇ／ｍＬ）＋１μＭデキサメタゾン。
溶液Ｄ：
燐酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（番号ＷＯ０１／９４５５５と共に公開された国際特許出願２４および２５ページ参照）。
培地Ｅ：
Ｍ１９９。
培地Ｆ：
Ｍ１９９＋２０％補体除去牛胎児血清＋Ｈｅｐｅｓ（Ｈｅ’ｐｅｓ、２５ｍＭ）＋抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン）。そして、万一の場合、抗真菌剤（２５μｇ／ｍＬでのフンギゾンのような、もしくは、上で指し示したとおり）。
培地Ｇ：
培地Ｆ（Ｍ１９９＋ＳＶＦ＋Ｈｅｐｅｓ＋抗生物質）＋ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）。
培地Ｈ：
培地Ｂ（ＭＣＤＢ＋ＳＶＦ＋抗生物質＋デキサメタゾン）＋ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）
異なる成長因子を含有している培地が、上記された。
【００５６】
ＣＭＳもしくはＣＭＬへの分化と関連した遺伝子発現が、培養の間、逆転写後ポリメラーゼチェーンリアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）、フローサイトメトリー、および免疫細胞化学により、解析された。これゆえ、ＶＥＧＦを含有している培地Ｍ１９９もしくはＭＣＤＢ１２０における１ヶ月の培養後、これらの細胞が、メッセンジャーＲＮＡ、および、ＣＭＬに特異的な蛋白を発現する。こうして、これらが、カルポニンおよびＳＭ−ＭＨＣを発現する。平行して、これらが、デスミンおよびＣＤ５６を、遙かに弱く発現し、もはや全く、ＭｙｏＤを発現しない。しかしながら、転写因子Ｍｙｆ５およびミオゲニンの発現が、残る。
【００５７】
本発明者らが、これらの表現型の修飾が、異なる機能特性に至ることも、示している。
【００５８】
実施例２：平滑筋細胞への骨格筋細胞の分化：
筋生検細胞がまず、培養において、拡大のために、ＦＧＦｂを含有している培地において置かれ、上記されたとおりであった（１２）。これらの細胞の表現型を特徴化させるために、フローサイトメトリーを使用しながらの解析（ＦＡＣＳ）、逆転写ポリメラーゼ鎖反応（チェーンリアクション）（ＲＴ−ＰＣＲ）、および、免疫細胞化学が、実施された。ＦＡＣＳ解析が、殆どのこれらの細胞が、ＣＤ５６（８０．３０＋１９．５０％）、デスミン（９２．３０＋８．４８％）、およびＣＤ９０（９１．３２＋１０．１９％）に関して陽性であり、内皮マーカーＣＤ３１、単球マーカーＣＤ１４、および白血球マーカーＣＤ４５に関して陰性であることを示した（図１Ａ）。ＲＴ−ＰＣＲ解析が、これら細胞が、Ｍｙｆ５、ＭｙｏＤ、およびミオゲニンのような筋原性細胞に関連したマーカーを発現することを示した（図１Ｂ）。これら細胞が、平滑筋細胞特異的マーカーＳＭ２２α（図１Ｂ）およびαＳＭＡ（図１Ｃ）も発現する。しかし、ある特定のアイソフォームの平滑筋細胞が、骨格筋細胞を発達もしくは再生させていくことにおいて、検出されている（１４、１５）。これらの細胞が、カルポニン（図１Ｂ）およびＳＭ−ＭＨＣ（図１Ｃ）のような分化平滑筋細胞マーカーを発現しない。
【００５９】
これら細胞が次いで、培養において、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を含有している培地において、置かれた。７日後、細胞形態における変化が、観察された（図２Ａ）。ＲＴ−ＰＣＲ手法が使用され、遺伝子発現の変化を、培養の間、骨格筋細胞と平滑筋細胞との間で、比較した。この解析が、細胞から、培養において置いて後、０、６、１１もしくは１２、および３０日に得られたＲＮＡに関して実施され、その結果が、図２Ｂにおいて与えられている。これら培養条件がどうであれ、この培養期間全体を通して、ＳＭ２２α、ミオゲニン、およびＭｙｆ５をコードしている遺伝子が、同様のレベルにおいて発現されたことが、観察された。培養においてＦＧＦｂと共に置かれた骨格筋細胞（ＣＭＳ）が全く、カルポニン発現を示さない。しかし、ＶＥＧＦを用いた培養１ヶ月後、これらの細胞が、カルポニンｍＲＮＡを発現し、同時にもはや、ＭｙｏＤを発現しない（図２Ｂ）。ＳＭ−ＭＨＣ発現が、これらの細胞が、平滑筋細胞表現型を採ったことを確かめる（図２Ｃ）。平滑筋細胞（ＣＭＬ）における構造遺伝子発現における可変性により、受け入れられた意見は、細胞が分化ＣＭＬとして特徴化されるには、平滑筋と関連した幾つかのアイソフォームの構造遺伝子発現が、実証されている必要があるということである。これゆえ、ＣＭＳにおける、ＳＭ２２α、カルポニン、およびＳＭ−ＭＨＣ発現が、その培養におけるある特定の細胞が、分化ＣＭＬのアイデンティティを採ったことの強い示唆である。最良の培養条件を画定させるために、ＣＭＬの分化もしくは増殖を誘導させると知られた他の成長因子が、テストされた。これゆえ、ＰＤＧＦ  ＢＢ  および／または  ＦＧＦｂ  および／または  ＨＧＦ  および／または  ＴＧＦβ  および／または  ＩＧＦ１  が、ＶＥＧＦに加えられた培養条件が、テストされた。しかし、ＣＭＬへのＣＭＳの分化への、もしくは、これらの増殖への有意な効果が全く、観察されなかった。
【００６０】
Ｆｒｉｄ  Ｍ．Ｇ．ら（１３）が、成熟牛内皮が細胞を含有し、これがｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＣＭＬ表現型を、分化転換過程により、獲得できることを示している。ここで、ＦＡＣＳ解析により、培養における細胞が、内皮細胞（ＣＥ）により混入されていないことが、確認されている。これらが、ＣＤ３１（図１Ａ）のような内皮細胞に関連したマーカーを発現しない。更に、この観察された現象が、外部源からのＣＭＬによる単純な混入でないとの仮説が、肯定され得る。これは、全てのテストされた生検が、骨格筋ミオゲニン、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、およびデスミンに関連した遺伝子発現を示すが、平滑筋へと分化していくからである。
【００６１】
実施例３：機能テスト
平滑筋細胞マーカーの獲得が必ずしも、これらの細胞が、成熟ＣＭＬへと分化できることを意味しない。
【００６２】
Ａ）Ｉ型コラーゲンゲルにおける培養（３Ｄにおける培養）
プロトコル：
Ｉ型コラーゲンゲルにおける培養（３Ｄにおける培養）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）が、その供給元の推奨に従いながら、実施されたが、つまり、０．５ｍＬの１ｍｇ／ｍＬのＩ型ラット尾コラーゲン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）が、３５ｍｍ直径の培養皿（Ｎｕｎｃ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｌａｎｃｏｕｒｔ、Ｆｒａｎｃｅ）中に注がれ、１時間３７℃において、重合するよう放置された。合計４００，０００細胞（内皮細胞が筋細胞と混合されている場合、２００，０００の各型の細胞）が次いで、該ゲルの表面上で培養され、培養において２４時間、異なる培養条件下に置かれた。血管ネットワーク形成が次いで、位相差顕微鏡および＜＜電荷組み合わせ＞＞ビデオカメラＫａｐｐａ  ＣＦ１１ＤＳＰを用いて観察された。
【００６３】
結果（図３Ａ〜３Ｃ参照）：
それら自体を３Ｄコラーゲン構造において組織化させることができるこれら細胞の能力が次いで、解析された。これら内皮細胞（ＣＥ）およびＣＭＬが、互いと相互作用し、毛管型ネットワークを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、３Ｄ培養において、形成することが、示された。ＣＥと会合して毛管ネットワークをｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて形成できる、ＦＧＦｂを用いて培養されたＣＭＳ、および、ＶＥＧＦを用いて培養されたＣＭＳの能力が、比較された。ＶＥＧＦを用いて培養されたＣＭＳが、ＣＥと相互作用でき、コンパクトな管状ネットワークを形成していく一方（図３Ｃ）、ＦＧＦｂを用いて培養されたＣＭＳが、同一条件においてＣＥと相互作用せず、全く血管ネットワークを形成しない（図３Ｂ参照）ことが、観察された。
【００６４】
Ｂ）マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）モデル
ＮＯＤ−ＳＣＩＤ免疫抑制マウスにおけるマトリゲル移植モデルにおける管型血管構造を形成できる各細胞型、ＦＧＦｂを有するかもしくはＶＥＧＦを有するＣＭＳの能力が、テストされた。
プロトコル：
Ｊ０：０．２ｍＬのＭａｔｒｉｇｅｌ移植片（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（０．５ｍｇ／ｍＬ  ＦＧＦｂ含有）が、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ免疫抑制マウスの背中において、皮下注射された。
Ｊ１：午前中、これらマウスが、致死量を下回り、照射された（３２５ｒａｄ）。午後、５００，０００細胞が、尾静脈経由で、静脈内注射された。
Ｊ１０：これら動物が、犠牲にされ、該移植片が、回収され、パラフィン中において埋められた。ＨＥＳ（ヘマリン、エオシン、サフラニン）染色が、なされ、審査された（拡大率４倍、４０倍）。
【００６５】
結果（図４Ａ〜４Ｃ参照）：
これらの結果が、３人の異なる患者起源の、もしくは、５人の異なる患者の生検からの、ＣＭＳに関して得られ、再現された。
【００６６】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ移植において、ＶＥＧＦを用いて培養された、ＣＥとＣＭＬとの、もしくは、ＣＥとＣＭＳとの投与が、多くの管型の構造体形成に至り、赤血球の存在が、光の下にショーアップされ、機能的な血管構造の存在を実証している（図４Ｂおよび４Ｃ）。逆に、ＦＧＦｂと共に培養されたＣＥとＣＭＳとの投与が、如何なる管型構造形成にも至らず、非組織化された細胞凝集形成を引き起こす（図４Ａ）。
【００６７】
Ｃ）ＶＥＧＦ存在下に培養されたＣＭＳがもはや、多核筋管において合着しない（図５Ａ〜５Ｆ参照）
多核筋管への個々の筋芽細胞の合着が、ＣＭＳ終末分化を構成する。筋管形成が、ＣＭＳをＦＧＦｂもしくはＶＥＧＦと共に同一初期濃度において培養していき、次いで、これら培養条件を、２％牛胎児血清を有する培地に関して変更していくことにより、審査された。これらの条件において、筋管が、培養中に入れた１０日後、現れた。ＦＧＦｂと共に培養されたＣＭＳに対して（図５Ｂ）、ＶＥＧＦと共に培養されたＣＭＳ（図５Ｄ）が、ＣＭＬ（図５Ｆ）のように、多核筋管へと合着していくことが、できない。こうして、これらの細胞が、多核筋管を形成できる能力を失ってしまった。
【００６８】
Ｄ）ＶＥＧＦが、血清応答因子ＦＲＳ（＜＜ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ＞＞に関してＳＲＦとも命名）発現を増加させていくことにより、ＣＭＬ表現型へのＣＭＳ表現型の遷移を誘導していくことにおいて、関与している
ＶＥＧＦが、体の成長の間および成人における血管形成の主要なレギュレーターである。ＶＥＧＦに関する考えられるシグナル伝達経路を探るために、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２受容体発現が、ＣＭＳおよびＣＭＬにおいて解析された。ＲＴ−ＰＣＲ解析が、ＣＭＳが、大量のＶＥＧＦＲ２を発現することを示した。しかし、これらの細胞が、ＶＥＧＦを含有している培地において培養されている場合、ＶＥＧＦＲ２発現の減少が、観察された（図６）。そして、これら培養条件が、何であれ、我々が、ＶＥＧＦＲ１発現の検出を示していない。これゆえ、これらの結果が、ＶＥＧＦにより刺激されたＣＭＬへのＣＭＳの分化転換の媒介におけるＶＥＧＦＲ２の役割を、示唆する。ＦＲＳが、細胞成長および分化において関与していると知られている多くの細胞の早期応答遺伝子の、鍵となるレギュレーターである。ある幾つかの結果が、ＣＭＳもしくはＣＭＬ株に拘束された１種もしくは複数種のＦＲＳ共因子が、ＦＲＳと一緒に機能し得、株特異的遺伝子の転写を活性化させることを示唆する。ＣＭＬへのＣＭＳの分化において参画している作用機序（メカニズム）を理解するために、ＦＲＳ発現が、ＶＥＧＦ添加前後、これら細胞において比較された。ＣＭＳが、ＶＥＧＦを含有している培地において培養されている場合、ＦＲＳｍＲＮＡ発現が、上昇したことが、観察された（図６）。
【００６９】
【表１】
2009508511.tif 000002
【００７０】
【表２】
2009508511.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１−１】ＦＧＦｂを含有している培地において培養された骨格筋細胞の特徴化。（図１Ａ）フローサイトメトリー解析が、これらの細胞が、ＣＤ５６、デスミン、およびＣＤ９０を発現するが、ＣＤ３１、ＣＤ１４、およびＣＤ４５を発現しないことを示す。各ヒストグラムにおいて、その黒い線が、ネガティヴコントロールの抗体を用いて標識された細胞に対応する。その破線が、各ヒストグラムに関して指し示されたマーカーに対して特異的な抗体を用いて標識された細胞に対応する。これらのヒストグラムが、６サンプルの代表である。（図１Ｂ）ＲＴ−ＰＣＲ解析。（図１Ｃ）免疫細胞化学解析による培養骨格筋細胞の特徴化。これら細胞が、抗ＩｇＧコントロール抗体、抗αＳＭＡ抗体、もしくは抗ＳＭ−ＭＨＣを用いて標識され、次いで、過酸化酵素を用いてカップリングされた２次抗体を用いて標識化している。
【図１−２】ＦＧＦｂを含有している培地において培養された骨格筋細胞の特徴化。（図１Ａ）フローサイトメトリー解析が、これらの細胞が、ＣＤ５６、デスミン、およびＣＤ９０を発現するが、ＣＤ３１、ＣＤ１４、およびＣＤ４５を発現しないことを示す。各ヒストグラムにおいて、その黒い線が、ネガティヴコントロールの抗体を用いて標識された細胞に対応する。その破線が、各ヒストグラムに関して指し示されたマーカーに対して特異的な抗体を用いて標識された細胞に対応する。これらのヒストグラムが、６サンプルの代表である。（図１Ｂ）ＲＴ−ＰＣＲ解析。（図１Ｃ）免疫細胞化学解析による培養骨格筋細胞の特徴化。これら細胞が、抗ＩｇＧコントロール抗体、抗αＳＭＡ抗体、もしくは抗ＳＭ−ＭＨＣを用いて標識され、次いで、過酸化酵素を用いてカップリングされた２次抗体を用いて標識化している。
【図２】（図２Ａ）ＦＧＦｂもしくはＶＥＧＦを含有している培地における骨格筋細胞（ＣＭＳ）の形態学。（図２Ｂ）ＦＧＦｂもしくはＶＥＧＦを含有している培地において培養されたＣＭＳにおける、骨格筋および平滑筋細胞特異的遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ解析。これら培養が回収され、ＲＮＡを、指し示された異なる時間において調製した。ＲＴ−ＰＣＲが、実施され、そのＰＣＲ産物が、臭化エチジウムを含有しているアガロースゲル上で解析された。（図２Ｃ）ＶＥＧＦを用いて１ヶ月間培養されたＣＭＳにおける免疫標識化によるＳＭ−ＭＨＣ発現の検出。これら細胞が、抗ＩｇＧコントロール抗体もしくは抗ＳＭ−ＭＨＣ抗体を用いて標識化され、次いで、過酸化酵素（ペルオキシダーゼ）とカップリングされた２次抗体を用いて標識化された。
【図３】位相差顕微鏡を用いて撮られた写真。これら内皮細胞（ＣＥ）およびこれら筋細胞が一緒に、コラーゲンゲル表面上で培養されている。２４〜４８時間後、ＣＥが、ＣＭＬと相互作用し、臍帯血前駆体の分化を起源としており（図３Ａ）、もしくは、これら骨格筋細胞を培養していった後得られたＣＭＬであり（図３Ｃ）、ネットワークを形成する。対照的に、ＣＭＳが、ネットワークを、これらの条件において、形成できない（図３Ｂ）。
【図４】マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）セクション（区画）、ＨＥＳ標識化。骨格筋細胞から得られたＣＥおよびＣＭＬの同時注入が、移植片における血管の溶血の形成に至り（図４Ｂ）、赤血球存在下である（全ての点が、これら矢印のレベルであり、図４Ｃが、より大きい拡大率である）。反対に、これらの同一条件において、ＣＭＳが、機能的な血管ネットワークを形成しない（図４Ａ）。
【図５】位相差顕微鏡を用いて撮られた、２０％牛胎児血清（ＳＶＦ）（図５Ａ、５Ｃ、および５Ｅ）もしくは２％ＳＶＦ（図５Ｂ、５Ｄ、および５Ｆ）を含有している培地において培養されたＣＭＳ（図５Ａ〜５Ｄ）およびＣＭＬ（図５Ｅおよび５Ｆ）の写真。筋管への細胞形成を誘導させるために、８０〜９０％合流に届いている細胞の培養培地が、２％ＳＶＦを用いて補完された培地に変えられている。筋管形成停止が、該培地へのＶＥＧＦの添加に関している（図５Ｃ〜５Ｆ）。ＶＥＧＦ存在下に培養されたＣＭＳが、多核筋管へと合着できない（図５Ｄ）。
【図６】ＣＭＬの分化の度合いが、ＶＥＧＦＲ２の発現の減少および血清応答因子（ＦＲＳ）の発現の増加と相関されている。ＦＧＦｂもしくはＶＥＧＦ存在下に培養されたＣＭＳの３種の異なるサンプルのＲＴ−ＰＣＲ解析（１、２、および３）。内皮始原細胞（ＣＰＥ）が、（１６）において記載されたとおり得られたが、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）発現に関するポジティヴコントロールとして、ＦＲＳに関するネガティヴコントロールとして、使用されている。培養条件が何であれ、ＣＭＳおよびＣＭＬが、ＶＥＧＦＲ１を発現しない。ＣＭＳにおいて、ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦＲ２発現を減少させるが、ＦＲＳｍＲＮＡ発現を刺激する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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