(57)【要約】  本発明は、タンパク尿が原因として関連しない慢性腎症およびタンパク尿が原因として関連する慢性腎症の両方の処置のための医薬の製造のためのＨ因子の使用に関する。本発明はまた、ラージスケールのＨ因子精製法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク尿が原因として関連しない抗体非依存性慢性腎症の進行の処置および／もしくは阻害ならびに／または予防のための医薬の製造のための、機能性Ｈ因子の使用。
【請求項２】
機能性Ｈ因子の用量は、治療時に患者の血漿中で超生理学的レベルの機能性Ｈ因子が達成される用量である、請求項１に記載のタンパク尿が原因として関連しない抗体非依存性慢性腎症の進行の処置および／もしくは阻害ならびに／または予防のための医薬の製造のための、機能性Ｈ因子の使用。
【請求項３】
Ｈ因子が膜への結合能を保持しつつ膜結合機能以外の機能的欠陥を有する患者における、請求項１および２に記載のタンパク尿が原因として関連しない抗体非依存性慢性腎症の進行の処置および／もしくは阻害ならびに／または予防のための医薬の製造のための、機能性Ｈ因子の使用。
【請求項４】
機能性Ｈ因子の投与が、内因性の変異型Ｈ因子のレベルを少なくとも１０％上回る血漿レベルを達成するよう行われる、請求項３に記載の機能性Ｈ因子の使用。
【請求項５】
ａＨＵＳおよび／またはＭＰＧＮ IIを処置するための、請求項１〜４のいずれかに記載のＨ因子の使用。
【請求項６】
正常なＨ因子レベルを有する患者における、タンパク尿が原因として関連する慢性腎症の進行の処置および／もしくは阻害ならびに／または予防のための医薬の製造のための、機能性Ｈ因子の使用。
【請求項７】
機能性Ｈ因子の投与が、各患者の正常な血漿中Ｈ因子濃度を少なくとも１０％上回る血漿レベルを注射後に達成するよう行われる、請求項６に記載の機能性Ｈ因子の使用。
【請求項８】
尿細管間質性線維症（ＴＩＦ）および／または進行性腎不全を処置するための、請求項６または７に記載の機能性Ｈ因子の使用。
【請求項９】
エタノールを用いるヒト血漿または血清のラージスケールの分別沈殿により得られる中間体に基づく機能性Ｈ因子の精製方法。
【請求項１０】
血漿から商業目的で得られる他の治療用タンパク質の規制認可に影響を及ぼさない、請求項９に記載のエタノールを用いるヒト血漿または血清のラージスケールの分別沈殿により得られる中間体に基づく機能性Ｈ因子の精製方法。
【請求項１１】
精製が、コーン法による８％エタノール沈殿物の上清またはオンクレー法による沈殿物IIIまたはキストラー・ニッチマン法による沈殿物Ｂに基づく、請求項９または１０に記載の機能性Ｈ因子の精製方法。
【請求項１２】
エタノールを用いるヒト血漿または血清のラージスケールの分別沈殿とクロマトグラフィ手順の組み合わせにより得られる中間体に基づく、請求項９〜１１のいずれかに記載の機能性Ｈ因子の精製方法。
【請求項１３】
抗トロンビンIIIからＨ因子を分離する溶離液からの、請求項９〜１１のいずれかに記載の機能性Ｈ因子の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク尿が原因として関連しない慢性腎症およびタンパク尿が原因として関連する慢性腎症の両方の処置のための医薬の製造のためのＨ因子の使用に関する。本発明はまた、ラージスケールのＨ因子精製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
４０以上の種々のタンパク質を含む補体系は、三つの異なる活性化経路（代替経路、レクチン経路、および古典経路；Ｒｏｔｈｅｒ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ）Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ．２nd  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９８；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）を通じて、微生物、外来物質、および変性した自己細胞の攻撃および排除を直接的または間接的に媒介する。このプロセスは、時間的・空間的に高度に制限され、自己（宿主細胞）と異物（例えば微生物）を識別できる。
【０００３】
いくつかのヒト疾患は、これらのカスケード様の活性化経路の活性化を伴うことが明らかになっており、この活性化は、阻害因子-プロテアーゼ複合体を含む補体系の初期から後期にかけての成分を含む典型的な活性化マーカーの高レベル発生に反映される。さらに、ときどき観察される細胞損傷は、通常であれば厳密な制御下にある補体系が少なくとも局所的に脱線している指標として考えられている。量的な側面では、特定のＣ３転換酵素によるＣ３のタンパク質分解的切断が補体の活性化に重要な役割を果たす。これらの転換酵素は、新たなＣ３転換酵素分子の潜在的な成分であるＣ３ｂ形態を産生し、それによってこのカスケードを刺激する。
【０００４】
自己細胞および組織の保護は、液相におよび／または膜結合形態で存在する特定の調節因子または阻害因子により媒介される。これらの調節因子には、補体受容体１（ＣＲ１またはＣＤ３５；Ｃ３ｂおよびＣ４ｂに結合し、Ｃ３転換酵素を分解し、Ｉ因子によるＣ３ｂ／Ｃ４ｂの分解を可能にする）、崩壊促進因子（ＤＡＦまたはＣＤ５５；Ｃ３ｂに結合し、Ｃ３／Ｃ５転換酵素を分解する）、および膜補因子タンパク質（ＭＣＰまたはＣＤ４６；Ｃ３ｂおよびＣ４ｂに結合してＩ因子によるそれらの分解を可能にする）が含まれ、これらは全てもれなく膜アンカー型タンパク質である。
【０００５】
膜アンカー型の制御タンパク質に加えて、可溶性補体調節因子であるＨ因子（２０のショートコンセンサスリピート、ＳＣＲで構成される一本鎖糖タンパク質；１５５ｋＤａ；糖質約９.３％）の自己細胞の多陰イオン性表面への結合は、その阻害能を増加させることにより細胞表面を保護する強力な要素である（Ｊｏｅｚｓｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ.；Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ  ２００４；１９：２５１-８）。この保護は主として、共有結合したＣ３ｂへの結合およびＢｂの置き換えの両方によって代替のＣ３転換酵素（Ｃ３ｂＢｂ）の寿命を効果的に減少させ（崩壊の促進）、かつセリンプロテイナーゼであるＩ因子によるタンパク質分解的切断を介してＣ３ｂの恒久的不活性化を触媒（補因子活性：例えばｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃの生成；  Ｒｏｔｈｅｒ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．（２nd  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ．１９９８，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ；ｐ．２８，３４-７）することによって達成される。表層の外側相（およそ２０〜１４０ｎｍ）におけるＨ因子のプロテアーゼＩ因子に対する因子としての活性は、Ｃ末端ＳＣＲによる表面局在プロテオグリカンへのＨ因子の結合によって促進される（Ｊｏｅｚｓｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．；Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ  ２００４；１９：２５１-８）。Ｈ因子の保護能は、補体カスケードの進行を局部的に制限する。これは、上記膜アンカー型調節因子を少数しか発現しない細胞またはこれらの内因性制御タンパク質を完全に欠失する組織、例えば腎臓の糸球体基底膜にとって特に重要である（Ｈｏｇａｓｅｎ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９５；９５：１０５４-６１）。
【０００６】
特許ＥＰ  ０  ２２２  ６１１  Ｂ１は、Ｈ因子が一時的にのみ減少する免疫複合体関連疾患において補体の活性化をダウンレギュレートするためにＨ因子を使用すること、「脈管系自己免疫疾患の処置に使用するためのＨ因子および／またはＩ因子」、「全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、または糸球体腎炎の処置に使用するためのＨ因子および／またはＩ因子」、ならびに「Ｈ因子および／またはＩ因子を薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、またはアジュバントと混合することを含む、脈管系自己免疫疾患の処置に使用するための薬学的組成物の調製方法」を含む。しかしこの特許の範囲が、腎臓の内外で生じる免疫複合体（ＩＣ）の糸球体沈着／形成を伴うＩＣ媒介性腎症のような糸球体腎炎（例えばグッドパスチャー症候群）に関するものであることは明白である。ＥＰ  ０  ２２２  ６１１  Ｂ１においては、抗体非依存性の慢性腎症、例えば尿細管の間の空間（間質）における線維組織の形成を特徴とする尿細管間質性線維症（ＴＩＦ）の処置に関する教示がない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一つの実施態様は、タンパク尿が原因として関連しない抗体非依存性慢性腎症の処置のための医薬の製造のためのＨ因子の使用である。
【０００８】
機能的に活性な分子の欠失もしくはタンパク質レベルの減少または関連リガンドとの結合によりこの機能を媒介するのに重要な分子領域における各遺伝子の変異のいずれかに起因するＨ因子の欠失または有意な機能低下が、非定型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）または膜性増殖性糸球体腎炎II型（ＭＰＧＮ II）等の最終的に腎機能を害する疾患において実証されてきた。糸球体膜は内因性の調節因子を有さないので、この部位でＣ３の連続的な分解が起こり、補体活性化産物が沈着し、恐らく糸球体基底膜ならびに尿細管上皮および内皮細胞がＣ３転換酵素媒介性の損傷を受け、細胞外マトリクスならびに／または補体系成分（例えば、Ｃ３分解産物）および抗体成分の沈着を通じて膜が肥大化し、その結果、濾過不良（タンパク尿）を起こす。
【０００９】
ＭＰＧＮ IIは、「高密度沈着物性疾患（ｄｅｎｓｅ  ｄｅｐｏｓｉｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）」とも呼ばれる、糸球体毛細血管壁の基底膜における補体含有高密度沈着物ならびにそれに続く毛細血管壁の肥大化、メサンギウム細胞の増殖、および糸球体線維症により特徴付けられる稀な疾患である（Ａｕｌｔ  ＢＨ；Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２０００；１４：１０４５-５３）。
【００１０】
ＭＰＧＮ IIに加えて、ＭＰＧＮ ＩおよびＭＰＧＮ IIIと呼ばれるさらに二つのサブタイプがある。三つのサブタイプは全て、メサンギウム細胞の増殖および糸球体毛細血管壁の肥大化を伴うメサンギウムマトリクスの増加により特徴付けられる（ＭＰＧＮ Ｉ：基底膜と内皮細胞の間にメサンギウム細胞およびマトリクスが介在し二重構造が形成される；内皮下の高電子密度沈着物。ＭＰＧＮ III；内皮下および上皮下の高電子密度沈着物）。全てのサブタイプにおける沈着物にはＣ３およびその他の補体因子が含まれる。一部の患者においては、脂肪異栄養症および網膜変性等の腎外症状とＭＰＧＮの併発が見られる（Ｌｅｖｙ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．；Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  １９９８；１８：５５-６０）。
【００１１】
ＭＰＧＮは主に小児および成人（疾患発症時年齢の中央値；約１０歳）に影響する。患者の５０％はネフローゼ症候群を患い、その他は軽度のタンパク尿を、２０％は肉眼的血尿を患う。患者の３０％は、疾患の発現と共に高血圧を発症する。ＭＰＧＮを患った小児の後年の予後は好ましくなく、約８〜１６年後に末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を発症する（ＭＰＧＮ Ｉ：１５．３年；ＭＰＧＮ II：８．７年；ＭＰＧＮ III：１５．９年；Ｓｃｈｗｅｒｔｚ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ  １９９６；８５：３０８-１２）。
【００１２】
最近の知見（Ｋｌｅｉｎ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５  Ｍａｒ  １０；１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１０９５５７；Ｈａｉｎｅｓ  ＪＬ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５  Ｍａｒ  １０；１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１１０３５９）は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の危険の増加とＨ因子の変異（ショートコンセンサスリピート７番、ＳＣＲ７のアミノ酸４０２番目におけるチロシン-ヒスチジンの変化）の関連を指摘する。しかし、Ｈ因子機能の欠失（ＳＣＲ７はヘパリン、Ｃ反応性タンパク質、およびＭタンパク質との結合部位を含む）とＡＭＤの間の因果関係は未だ証明されていない。
【００１３】
Ｈ因子関連ａＨＵＳおよびＭＰＧＮ IIの患者に対して考えられる療法は、体重別処置スケジュール（体重１ｋｇあたり１０〜４０ｍＬ、隔週）に基づく新鮮な凍結血漿の投与である。この治療は、欠失した機能性Ｈ因子を正常血漿レベルまで回復させる。しかし、Ｈ因子タンパク質は減少しているのではなく、細胞膜に結合するがその崩壊促進能および／または補体系をダウンレギュレートする補因子活性を失った変異体である場合、変異Ｈ因子は、治療目的で投与された正常Ｈ因子が膜に結合するのを競合的にブロックする。従って、機能障害性Ｈ因子を膜から置き換えるためには、モル濃度ベースで機能性Ｈ因子の生理学的レベルを回復するだけでは不十分であり、Ｈ因子のレベルを正常時よりも高める用量を投与する必要がある。
【００１４】
Ｈ因子の変異は、以下の通り分類できる：（１）Ｈ因子の分泌、例えば肝細胞からの分泌をブロックして血漿中からＨ因子を完全になくす変異、（２）（ａ）このタンパク質の調節ドメイン（ＳＣＲ１〜４）、（ｂ）このタンパク質の認識ドメイン（ＳＣＲ１９〜２０）、または（ｃ）その他の機能、例えばヘパリンへの結合に影響するこのタンパク質の種々の部分におけるＨ因子機能の欠陥をもたらす変異。認識ドメインにおける変異（２ｂ）はＨ因子タンパク質が表面に結合するのを妨げ、調節ドメインにおける変異（２ａ）はそのタンパク質を表面に結合できるが機能的に欠陥のあるＨ因子を生じる。
【００１５】
ＦＦＰ注入を介したＨ因子の補充は、（１）の場合（血漿中Ｈ因子の欠失）および（２ｂ）の場合（Ｈ因子の結合に影響する変異）にのみ正常範囲の血漿レベルを達成するのに必要とされる。しかし、（２ａ）および（２ｃ）の場合（Ｈ因子の結合に影響しないがＨ因子の機能に影響する変異）の場合においては、内因性の不活性なＨ因子分子が注入された活性なＨ因子分子と表面結合部位において競合するため、正常値以上の血漿中Ｈ因子レベルが必要とされる。
【００１６】
従って本発明の一つの側面は、ａＨＵＳまたはＭＰＧＮ II等の抗体非依存性慢性腎症を、新たに加えらたＨ因子の血漿濃度を自然Ｈ因子濃度と比較して超生理学的な濃度にする用量の機能性Ｈ因子によって処置することである。好ましくは、Ｈ因子の濃度は、処置患者の正常血漿レベルより１０％以上増加した濃度である。より好ましくは、Ｈ因子の濃度は処置患者の正常血漿レベルの５０％以上、さらにより好ましくは１００％以上、またはさらにより好ましくは２００％以上、最も好ましくは３００％以上増加した濃度である。
【００１７】
本発明の別の実施態様は、タンパク尿と原因として関係する抗体非依存性慢性腎症の処置のための医薬の製造のためのＨ因子の使用である。
【００１８】
前向き無作為化臨床試験は、糸球体の不十分なタンパク質濾過がタンパク尿と関係し、間質性線維症および進行性腎不全の両方の発症および進行の大きな危険となることを示している（Ｊｅｒｕｍｓ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  Ｓｕｐｐｌ  １９９７；６３：８７-９２）。疾患における糸球体から尿細管区画への組織損傷の拡大に関与する機構についてはほとんど知られておらず、間質性線維症がどのようにして誘導されるかについて取り組まれてこなかった。
【００１９】
代替経路を通じた補体の活性化は、近位尿細管上皮細胞の部位で本質的に抗体非依存性であることが公知の機構と関連することが示されている（Ｔａｎｇ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｂｌｏｏｄ  Ｐｒｅｓｓ  Ｒｅｓ．２００２；２５：１２０-６において概説されている）。
【００２０】
別のより最近の刊行物では、補体の代替経路の抗体非依存性の活性化が急性尿細管壊死と同時に起こることが実証されている（Ｔｈｕｒｍａｎ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ２００５；６７：５２４-３０）。
【００２１】
抗体沈着の不存在下でのタンパク質過負荷は近位尿細管の頂端膜における補体成分の活性化に関連することが実証されている。提唱された機構は、終末補体カスケードを含み、Ｃ３を活性化できる求核物質であるアンモニアの腎臓内レベルの上昇（アンモニア生成）を伴うものであった（Ｉ-Ｈｏｎｇ  Ｈｓｕ  Ｓ，Ｃｏｕｓｅｒ  ＷＧ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２００３；１４：１８６-９１において概説されている）。可溶性補体受容体１、ＣＲ１、崩壊促進因子、ＤＡＦ、およびその他の分子等の様々な天然および人工補体阻害剤が、薬理学的介入のための潜在的治療標的として議論されている（同概説を参照のこと）。しかし、Ｈ因子の使用については言及されていない。
【００２２】
このように内因性の膜アンカー型調節因子を欠く細胞膜の保護のための治療剤としてのＨ因子の使用は新規なものであり、これまでインビトロまたはインビトロモデルで調査されてこなかった。一般的に、Ｈ因子の利益を享受する、タンパク尿と原因として関連する抗体非依存性慢性腎症の患者は、正常なＨ因子レベルを有する。その治療効果は、好ましくは、Ｈ因子濃度を超生理学的レベルまで引き上げることによって達成される。この特定の側面がこれまで調査されてこなかった理由は、基質のようには消費されないプロテアーゼ関連補因子としてのＨ因子の機能に起因するのであろう。
【００２３】
本発明の一つの実施態様は、その発症が抗体媒介性のＩＣ形成に依存しない、タンパク尿と原因として関連する慢性腎症の処置のためにＨ因子を提供することである。タンパク尿は、主として濾過という細胞機構に関与する構造タンパク質の変性に起因する。しかし、その後の血漿タンパク質の存在は、Ｈ因子が正常レベルであったとしても内因性膜調節因子（例えばＣＲ１、ＤＡＦ）の非存在下で起こると思われる補体媒介性、ＩＣ非依存性の細胞損傷を促進すると考えられる。タンパク尿の病態生理学的原因は以下の主要なグループに分けることができる：（１）糸球体基底膜、有足突起、またはスリット膜（ｓｌｉｔ  ｄｉａｐｈｒａｇｍ）等の「糸球体濾過ユニット」を形成する構造の遺伝的障害、（２）自己免疫プロセスに直接起因するかまたは微生物により間接的に誘発されるかのいずれかによる炎症プロセス、（３）作用因子による糸球体の損傷、または（４）最終的にネフロン全体の機能の喪失をもたらす進行性尿細管間質性傷害の最終結果として。より具体的には、本発明は、タンパク尿が最終的にＴＩＦを引き起こす事象（炎症および線維症）のカスケードを誘導する場合に尿細管上皮細胞のレベルでＴＩＦを処置するためのＨ因子の使用に関する。新たに加えられたＨ因子の血漿濃度を自然Ｈ因子濃度と比較して超生理学的な濃度にする用量のＨ因子が本発明の好ましい実施態様である。好ましくは、Ｈ因子の濃度は、患者の個々の正常血漿レベルより１０％以上増加した濃度である。より好ましくは、Ｈ因子の濃度は患者の個々の正常血漿レベルの５０％以上、さらにより好ましくは１００％以上、またはさらにより好ましくは２００％以上、最も好ましくは３００％以上増加した濃度である。
【００２４】
Ｈ因子は、ヒト血漿もしくは血清からまたは組換えにより獲得できる。本発明において使用する場合、「Ｈ因子」は、天然のヒトＨ因子のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。「Ｈ因子」はまた、Ｈ因子の活性を実質的に保持する限り、若干修飾されたアミノ酸配列、例えばＮ末端アミノ酸の欠失または付加を含む修飾Ｎ末端を有するタンパク質を含む。上記定義内の「Ｈ因子」はまた、存在し得る、かつ個体毎に生じ得る天然の対立遺伝子変異体を含む。上記定義内の「Ｈ因子」はさらに、Ｈ因子を含む。このような変異体は野生型配列と一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が異なる。このような相違の例には、Ｎ末端および／もしくはＣ末端における一つまたはそれ以上のアミノ酸残基（例えば１〜１０個のアミノ酸残基）の短縮、またはＮ末端および／もしくはＣ末端における一つまたはそれ以上の余分な残基の付加、例えばＮ末端におけるメチオニン残基の付加、ならびに保存的アミノ酸置換、すなわち類似の特性を有するアミノ酸グループ、例えば（１）小型のアミノ酸、（２）酸性アミノ酸、（３）極性アミノ酸、（４）塩基性アミノ酸、（５）疎水性アミノ酸、（６）芳香族アミノ酸、の中で行われる置換が含まれ得る。このような保存的置換の例を以下の表に示す。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
本発明で使用する場合、「機能性Ｈ因子」は、代替Ｃ３転換酵素の崩壊促進および／またはＩ因子によるＣ３ｂの恒久的タンパク質分解を触媒する補因子活性のような、溶液中および／または細胞表面上のいずれかにおいて活性を示すＨ因子分子を含む。
【００２７】
用語「組換え」は、例えば、その変異体が遺伝子操作技術によって宿主生物において産生されていることを意味する。
【００２８】
本発明の宿主細胞は、ヒトＨ因子の産生方法において使用され得る。この方法は、（ａ）ヒトＨ因子を発現するような条件下で本発明の宿主細胞を培養し、および（ｂ）場合により宿主細胞または培養培地からヒトＨ因子を回収する、ことを含む。
【００２９】
グリコシル化またはその他の翻訳後修飾の程度および位置は、選択される宿主細胞および宿主の細胞環境の性質に依存して変化し得る。特定のアミノ酸配列を言及する場合、そのような配列の翻訳後修飾は本願に包含される。
【００３０】
適する宿主細胞において組換えタンパク質を高レベルで産生させるには、当業者に公知の方法に従う様々な発現系で繁殖できる組換え発現ベクターの効率的な転写ユニットに、上記の修飾されたｃＤＮＡを適切な調節エレメントと共に組み込むこと必要がある。効率的な転写調節エレメントは、動物細胞を天然の宿主とするウイルスまたは動物細胞の染色体ＤＮＡから誘導できる。好ましくは、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、もしくはラウス肉腫ウイルスの長い末端反復から誘導されたプロモーター・エンハンサー組、またはベータアクチンもしくはＧＲＰ７８のような動物細胞において高度に構成的に転写される遺伝子を含むプロモーター・エンハンサー組が使用できる。ｃＤＮＡから転写されるｍＲＮＡの安定な高レベルを達成するために、転写ユニットはその３’近位部分に転写終結ポリアデニル化配列をコードするＤＮＡ領域を含むべきである。好ましくは、この配列は、シミアンウイルス４０初期転写領域、ウサギベータグロビン遺伝子、またはヒト組織プラスミノゲン活性化因子遺伝子から得られる。
【００３１】
次いでｃＤＮＡをＨ因子の発現に適した宿主細胞株のゲノムに組み込む。好ましくはこの細胞株は、正確なフォールディング、Ｇｌａドメインの合成、ジスルフィド結合の形成、アルギニン結合型グリコシル化、Ｏ結合型グリコシル化、およびその他の翻訳後修飾ならびに培養培地への分泌を確実にするため脊椎動物起源の動物細胞株であるべきである。その他の翻訳後修飾の例は、新生ポリペプチド鎖の水酸化およびタンパク質分解プロセシングである。使用できる細胞株の例は、サルＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、ハムスターＢＨＫ-２１細胞、ヒト胎児腎臓２９３細胞、および好ましくはハムスターＣＨＯ細胞である。その複雑な翻訳後修飾のため、組換えＨ因子はヒト細胞株において発現させるのが好ましい。
【００３２】
対応するｃＤＮＡをコードする組換え発現ベクターは、いくつかの異なる方法で動物細胞株に導入できる。例えば、組換え発現ベクターは、種々の動物ウイルスに基づくベクターから作出できる。これらの例は、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、および好ましくはウシパピローマウイルスに基づくベクターである。
【００３３】
対応するＤＮＡをコードする転写ユニットは、組換えＤＮＡがゲノムに組み込まれている特定の細胞クローンの単離を容易にするため、これらの細胞において優性選択マーカーとして機能し得る別の組換え遺伝子と共に動物細胞に導入することもできる。このタイプの優性選択マーカー遺伝子の例は、ジェネティシン（Ｇ４１８）に対する耐性を付与するＴｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンに対する耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、およびピューロマイシンに対する耐性を付与するピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼである。このような選択マーカーをコードする組換え発現ベクターは、所望のタンパク質のｃＤＮＡをコードするベクターと同一ベクターに組み込むこともできるし、宿主細胞のゲノムに同時に導入されて組み込まれ、多くの場合異なる転写ユニット間で緊密な物理的結合を形成する別ベクターにそれをコードすることもできる。
【００３４】
所望のタンパク質のｃＤＮＡと共に使用できるその他のタイプの選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）をコードする様々な転写ユニットに基づくものである。このタイプの遺伝子を内因性ｄｈｆｒ活性を欠く細胞、好ましくはＣＨＯ細胞（ＤＵＫＸ-Ｂ１１、ＤＧ-４４）に導入した後、これらをヌクレオシドを欠く培地で培養することが可能になる。このような培地の例は、ヒポキサンチン、チミジン、およびグリシンを含まないＨａｍ'ｓ  Ｆ１２である。これらのｄｈｆｒ遺伝子は、同一ベクター上で連結されたまたは異なるベクター上にある凝固因子ｃＤＮＡ転写ユニットと共に上記タイプのＣＨＯ細胞に導入し、組換えタンパク質を産生するｄｈｆｒ陽性細胞株を作出することができる。
【００３５】
上記細胞株を細胞毒性のｄｈｆｒ阻害剤であるメトトレキサートの存在下で培養する場合、メトトレキサートに耐性の新たな細胞株が出現することになる。これらの細胞株は、ｄｈｆｒおよび所望タンパク質を連結した転写ユニットの数の増加により高収率で組換えタンパク質を産生し得る。これらの細胞株を漸増濃度のメトトレキサート（１〜１００００ｎＭ）下で培養すると、所望のタンパク質を超高収率で産生する新規細胞株が獲得できる。
【００３６】
所望のタンパク質を産生する上記細胞株は、懸濁培養物または様々な固体支持体のいずれにおいてもラージスケールで培養できる。これらの支持体の例は、デキストランもしくはコラーゲンマトリクスに基づくマイクロキャリア、または中空繊維もしくは様々なセラミック材料の形態の固体支持体である。細胞懸濁培養またはマイクロキャリア下で培養する場合、上記細胞株の培養は、浴培養または長期間にわたって条件培地を連続的に生成する灌流培養のいずれかとして行うことができる。従って、本発明に従う上記細胞株は、所望の組換えタンパク質の製造のための工業的プロセスの開発に十分適している。
【００３７】
上記タイプの分泌細胞の培地に蓄積される組換えタンパク質は、所望のタンパク質とその他の細胞培養培地中の物質との間の大きさ、電荷、疎水性、溶解性、特異的親和性等の差を利用する方法を含む様々な生化学的方法およびクロマトグラフィ法によって濃縮および精製できる。
【００３８】
このような精製法の例は、固体支持体に固定されたモノクローナル抗体への組換えタンパク質の吸着である。タンパク質は脱離後に上記特性に基づく様々なクロマトグラフィ技術によってさらに精製できる。
【００３９】
本発明のＨ因子は、高分子、特に他のタンパク質および核酸の混入に関して≧６０％の純度まで精製するのが好ましく、より好ましくは≧８０％の純度まで精製され、９５％超の純度の薬学的に純粋な状態でありかつ感染因子および発熱因子を含まないことが特に好ましい。
【００４０】
ＥＰ  ０  ２２２  ６１１  Ｂ１において言及される使用可能な精製手順は全て、もっぱらヒト血漿または血清から単一のタンパク質を精製するために開発された典型的な実験室方法論であり、通常アルブミン、免疫グロブリン、および凝固因子を意識した多成分使用を基本とする工業的利用のために構築された技術を無視している。既に確立された型どおりの処理工程に適合させた工業スケールの手順は未だ存在しない。
【００４１】
従って、本発明の別の目的は、血漿由来の治療用ヒトＨ因子のラージスケールに適した生産方法を提供することである。ラージスケールは、本発明に関して、少なくとも２００Ｌの血漿、好ましくは少なくとも５００Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも２０００Ｌのヒト血漿に基づく生産手順を意味する。生産に関して、ヒト血漿から出発する本発明の方法は、例えば冷エタノールによる分別沈殿により得られる典型的な工業中間体の補助精製（ｓｕｂｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）に基づく（Ｓｃｈｕｌｔｚｅ  ＨＥ，Ｈｅｒｅｍａｎｓ  ＪＦ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ：Ｎａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １９６６，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ；ｐ．２３６-３１７に概説されている）。このような精製の好ましい実施態様は、医薬品規制当局の管理下にある抗トロンビン（ＡＴ）または免疫グロブリンのような血漿製品の確立され承認された製造工程に影響を与えない様式での、工業スケールの血漿分画の副画分（ｓｉｄｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）からの機能性Ｈ因子の精製である。８％エタノール沈殿物の上清（コーンらの方法；上記引用文献、ｐ２５１）は、工業スケールの血漿分画から得られるＨ因子の供給源の一例である。ＡＴはＨ因子と共にヘパリン系アフィニティクロマトグラフィによってこの上清から吸着され得、Ｈ因子はＡＴを含まない溶出液の精製画分であり得る。沈殿物III（オンクレーらの方法；上記引用文献、ｐ２５３）または沈殿物Ｂ（キストラー・ニッチマンの方法；上記引用文献、ｐ２５３）は、ＡＴの吸着が型どおりに行えない場合のこのようなＨ因子の工業的供給源の他の例である。当該分野で公知の精製手順が、これらの副画分から出発してＨ因子を精製するのに使用できる。これらは、ポリエチレングリコールによる沈殿（Ｎａｇａｓａｗａ  Ｓ，Ｓｔｒｏｕｄ  ＲＭ；Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９８０；１７：１３６５-７２）、固定したヘパリンを通じたアフィニティクロマトグラフィ（前出）、イオン交換クロマトグラフィ（Ｃｒｏｓｓｌｅｙ  ＬＧ，Ｐｏｒｔｅｒ  ＲＲ；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９８０；１９１：１７３-８２）、および疎水性相互作用クロマトグラフィ（Ｒｉｐｏｃｈｅ  Ｊ，Ａｌ  Ｓａｌｉｈｉ  Ａ，Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ  Ｊ，Ｆｏｎｔａｉｎｅ  Ｍ；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９８４；２２１，８９-９６）に基づき得る。
【００４２】
本発明において記載されるＨ因子は、治療用途の薬学的製剤に処方され得る。薬学的製剤を提供するため、精製されたタンパク質は、場合により薬学的添加剤を添加され得る従来の生理学的に適合する緩衝水溶液に溶解され得る。
【００４３】
このような薬学的担体および添加剤ならびに適切な薬学的処方物は当該分野でよく知られている（例えば、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ（２０００）または“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ”，３rd  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｋｉｂｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）を参照のこと）。特に、本発明のポリペプチド変異体を含む薬学的組成物は、凍結乾燥形態または安定な溶解形態で処方され得る。ポリペプチド変異体は、当該分野で公知の様々な手順により凍結乾燥され得る。凍結乾燥処方物は、使用前に一つまたはそれ以上の薬学的に許容される希釈剤、例えば注射用滅菌水または滅菌生理的塩類溶液の添加により再構成される。
【００４４】
組成物の処方物は、任意の薬学的に適する投与手段により個体に送達される。様々な送達系が公知であり、任意の従来の経路により組成物を投与するのに使用できる。好ましくは、本発明の組成物は全身投与される。全身的使用のために、本発明のＨ因子は、従来方法に従う非経口的（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、脳内、肺内、鼻腔内、もしくは経皮的）または経腸的（例えば、経口、経膣、または直腸）送達用に処方される。最も好ましい投与経路は静脈内投与および皮下投与である。処方物は、注入により連続的にまたはボーラス注射により投与できる。一部の処方物は徐放系を包含する。
【００４５】
本発明のＨ因子は、治療有効量で患者に投与される。治療有効量は、所望の効果を生じ、処置されている状態または適応症の重症度または拡散を予防または軽減するのに十分な用量でありかつ許容できない有害な副作用を生じる用量の達していないことを意味する。正確な用量は多くの要因、例えば適応症、処方、投与様式に依存し、個々の適応症各々についての前臨床および臨床試験において決定される必要がある。
【００４６】
本発明の薬学的組成物は、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与され得る。これらの薬物は、同一薬剤の一部として包含され得る。
【実施例】
【００４７】
Ｈ因子の作用様式の実験による確認
アルポート症候群（ＡＳ）を模倣するＣＯＬ４α３ノックアウトマウスは、糸球体基底膜の欠陥の原因となる４型コラーゲンの欠陥性α３鎖を発現する。これにより産後４．５週で糸球体性タンパク尿および進行性尿細管間質性線維症が発症し、およそ１０週後に腎不全および死を招く。「ブレンナー仮説」（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９８２；３０７：６５２-９）によれば、管内タンパク質（ｉｎｔｒａｌｕｍｉｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が尿細管上皮細胞により再吸収され、それによってこの細胞が活性化される。活性化された上皮細胞は、（１）炎症性もしくは（２）プロフィブロティックな（ｐｒｏｆｉｂｒｏｔｉｃ）セカンドメッセンジャー経路を誘導するか、または（３）自ら「上皮間葉移行」（ＥＭＴ）を起こす。
【００４８】
上記のように、Ｈ因子は、活性化された補体系における重要な血漿／体液性調節因子である。Ｈ因子の欠損は、ａＨＵＳまたはＭＰＧＮ IIのような腎疾患の原因となることが公知である。Ｈ因子の欠損は、内皮細胞表面レベルまたは糸球体基底膜内での補体の活性化を誘導／引き起こし、少なくとも一部が糸球体のフィルターを通過し得るＨ因子の補充は、尿細管上皮細胞レベルで補体の活性化を軽減でき、従って糸球体性タンパク尿により引き起こされる慢性／進行性腎疾患の治療選択肢となり得る。
【００４９】
Ｈ因子の投与の効果は、ＣＯＬ４α３ノックアウトマウスを産後４．５週（マウスの離乳後の可能な限り最も早い時点）から、マウス血清から精製された超生理学的レベルのＨ因子で処置することによって試験できる。Ｈ因子はｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．、またはｉ．ｍ．から適用する。処置グループの結果は、媒体（ＮａＣｌ  ０.９％）処置コントロールと比較する。マウスは、死亡するまで（第一グループ）または７.５および９.５週後に屠殺するまで（第二グループ）まで処置する。第二グループの動物は麻酔し、尿サンプルおよび血液サンプルを収集し、腎臓を素早く採取し、一方の腎臓をホルムアルデヒド固定して免疫組織学に使用し、もう一方の腎臓からはＲＮＡ抽出およびその後のリアルタイムリバーストランスクリプターゼＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）分析のために皮質を単離する。
【００５０】
この結果は、慢性糸球体性タンパク尿のマウスモデルにおいて、（１）Ｈ因子による継続的処置が尿細管上皮細胞レベルで補体の活性化を軽減すること、（２）尿細管上皮細胞により開始される炎症性およびプロフィブロティックな二次経路の活性化が軽減されること、（３）細管間質性線維症の程度が軽減されること、および（４）ＣＯＬ４α３ノックアウトマウスの寿命が延びることを示す。
【００５１】
これらの結果は、一般的な慢性腎疾患の最後の共通の重要な特徴である慢性タンパク尿の処置のためのＨ因子の使用を強く支持する。
【００５２】
すでに概説したように、タンパク尿は急性的または慢性的な糸球体フィルターの機能の欠陥（例えば腎炎症候群またはネフローゼ症候群）を示すだけでなく、尿細管間質における炎症性およびプロフィブロティックプロセスの誘導を通じて慢性腎疾患の進行を促進する。誇張なしに、タンパク尿は慢性腎疾患（ＣＲＤ）の最後の共通の経路と見ることができ、タンパク尿の軽減またはタンパク尿によって誘導される作用の軽減は、慢性腎疾患の効率的な処置のための鍵であることを証明し得る。
【００５３】
尿細管上皮細胞の先端面における補体系の活性化が、タンパク尿により引き起こされるＣＲＤの事象の病原性カスケードにおける主要なメディエーターの一つであるというコンセプトの下、Ｈ因子を通じた処置（例えば、一回の処置あたり最大８０ｍｌ  ＦＦＰ／ｋｇ体重の注入または８０ｍｌ  ＦＦＰ／ｋｇ体重相当のＨ因子のｉ．ｖ．もしくはｓ．ｃ．もしくはｉ．ｍ．投与）は血漿中Ｈ因子を生理学的レベル以上（例えば２倍）に引き上げ、（ａ）尿細管上皮細胞の先端面におけるＨ因子の利用性を向上し、次いで（２）この側面における補体系の活性化を軽減する。
【００５４】
機能的欠陥を有するが細胞結合性が無傷のタンパク質の発現をもたらすＨ因子遺伝子の変異により疾患が引き起こされた患者（例えばＨ因子のＳＣＲ４の変異によるＭＰＧＮ II；Ｌｉｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ２００６）においては、血漿中Ｈ因子レベルを最大２倍または３倍に引き上げることを目的とするＦＦＰを通じた処置（例えば、一回の処置あたり最大８０〜１２０ｍｌ  ＦＦＰ／ｋｇ体重の注入または８０〜１２０ｍｌ  ＦＦＰ／ｋｇ体重相当のＨ因子のｉ．ｖ．もしくはｓ．ｃ．もしくはｉ．ｍ．投与）は、無傷のＨ因子分子の細胞表面への競合的結合およびそれに続く補体活性化の軽減をもたらす。
【００５５】
治療の成功は、（ａ）補体活性化の軽減（Ｃ３の増加、Ｃ３ｂの減少）、（ｂ）血尿およびタンパク尿の軽減（または少なくともさらなる進行の防止）、および（ｃ）腎機能の安定化-可能ならば改善により示される。
【国際調査報告】
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