(57)【要約】本発明は、各形式が分析物の特定の1つに専用であるn個の異なる親和性アッセイ形式を行うことにより、1つまたは複数の液体試料に存在するn個の異なる分析物を定量化するための方法を提供する。特徴的性質は、(A)各形式が、少なくともn個のマイクロチャネル構造を含むマイクロ流体装置の別々のマイクロチャネル構造において行われること、ならびに(B)各形式が、該形式が専用とする分析物を定量化するために、該形式に用いられるマイクロチャネル構造のマイクロキャビティ内に置かれている固相上に形成される固定化生成物(親和性複合体)の形成および測定を含むことである。2009533653.tif 000004
2009533653.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
n個の異なる親和性アッセイ形式を行うことにより、1つまたは複数の液体試料に存在するn個の異なる分析物を定量化するための方法であって、形式のそれぞれが、分析物の特定の1つに専用であり、かつその形式が専用とする分析物の量に関係する量の親和性複合体(生成物)の量をもたらし、各形式が以下である、方法：
(A)少なくともn個のマイクロチャネル構造を含むマイクロ流体装置の別々のマイクロチャネル構造において行われ、かつ
(B)該形式が専用とする分析物を定量化するために、該形式に用いられるマイクロチャネル構造のマイクロキャビティ内に置かれている固相上に形成される固定化生成物(親和性複合体)の形成および測定を含む。
【請求項２】
n個の形式のそれぞれが、
(i)該形式に用いられるマイクロチャネル構造のマイクロキャビティにおいて、
(a)固定化された親和性捕捉体、または
(b)固定化基と反応性である固定化タグを示す固定化可能な親和性捕捉体を固着させる能力がある固定化基
を曝露する固相を提供する段階；
(ii)(a)段階(i.a)で提供された固相の固定化捕捉体を前記生成物の固定化形状へ組み入れるために該形式の親和性反応を行うこと、または
(b)固定可能な捕捉体を前記生成物の固定可能な形状へ組み入れるために該形式の親和性反応を行い、その後、固定化タグを段階(i.b)で提供された固相の固定化基と反応させることによりこの生成物を固相へ固着させること
により、マイクロキャビティ内に生成物の固定化形状を形成する段階；
(iii)段階(ii)で形成された固定化生成物の量を測定することにより、試料における分析物の量を決定する段階
を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
固相が、n個の形式の少なくとも1個について、段階(ii)中に多孔質層(porous bed)の形状をとる、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
n個の形式の少なくとも1個が、捕捉体または分析物の親和性対応物である検出可能な反応物を利用する、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
少なくとも1個の形式の1個または複数について、
(a)検出可能な反応物がAn-類似体であり、
(b)捕捉体が分析物およびAn-類似体の対応物であり、好ましくは固相に固定化され、かつ
(c)前記生成物が典型的には、検出可能な反応物および/または分析物に結合した捕捉体を含む
方法であって、
該1個または複数の形式が好ましくは阻害形式を含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
少なくとも1個の形式の1個または複数について、
(a)検出可能な反応物が分析物の対応物であり、
(b)捕捉体がAn-類似体であり、好ましくは固相に固定化され、かつ
(c)前記生成物が典型的には、検出可能な反応物に結合した捕捉体を含む
方法であって、
該1個または複数の形式が好ましくは阻害形式を含む、請求項4または5に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも1個の形式の1個または複数について、
(a)検出可能な反応物および捕捉体が分析物の対応物であり、
(b)分析物が、検出可能な反応物および捕捉体の両方の同時的結合を可能にする2つの結合部位を含み、かつ
(c)前記生成物が典型的には、捕捉体および検出可能な反応物の両方に結合した分析物を含む
方法であって、
該1個または複数の形式が好ましくはサンドイッチ形式を含み、かつ捕捉体が好ましくは固相に固定化される、請求項4〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
少なくとも1個の形式の1個または複数について、
(a)検出可能な反応物および捕捉体が分析物の対応物であり、
(b)分析物が、検出可能な反応物および捕捉体の両方が特異性を有する結合部位に関して二価であり、かつ
(c)前記生成物が、検出可能な反応物および捕捉体の両方に結合した分析物を含む
方法であって、
該1個または複数の形式が好ましくは、クラスに関係のない抗原特異的抗体アッセイなどのサンドイッチ形式を含み、かつ捕捉体が好ましくは固相に固定化される、請求項4〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
少なくとも1個の形式の1個または複数について、
(a)検出可能な反応物および捕捉体が、分析物の対応物であり、かつ分析物上の2つの異なる部位に結合特異性を有し、
(b)分析物が該2つの異なる結合部位を含み、かつ
(c)前記生成物が、検出可能な反応物および捕捉体の両方に結合した分析物を含む
方法であって、
該1個または複数の形式が好ましくは、特定のクラスまたはサブクラスの抗原特異的抗体アッセイなどのサンドイッチ形式を含み、かつ捕捉体が好ましくは固相に固定化される、請求項4〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
n個の形式の少なくとも1個がイムノアッセイである、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
n個の形式の少なくとも1個が阻害形式である、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
n個の形式の少なくとも1個が非阻害形式である、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
n個の形式の少なくとも1個がサンドイッチ形式である、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
段階(i)が、n個の形式の少なくとも1個について固定化形状の捕捉体を提供する段階を含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
n個の形式の少なくとも2個またはそれ以上が、(a)段階(i)で提供された捕捉体が固定化形状であり、かつ(b)2段階逐次形式を含む、請求項4〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
n個の形式の少なくとも2個、3個、または4個について、固定化形状の捕捉体または固定化基などの固相上の反応物と、分析物、検出可能な反応物の少なくとも1個の可溶形状、ならびに可溶形状の捕捉体、分析物、および検出可能な反応物の少なくとも1個、2個、または3個を含む可溶性親和性複合体との間の親和性反応が同時に(＝並行して)実行される、請求項4〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
n個の形式の少なくとも1個について、捕捉体が一般的な固定化親和性ペアを介して固相に固定化される、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
n個の形式の少なくとも1個について、捕捉体が、その捕捉体と同じ固定化親和性ペアを介して固定化することができるナンセンス反応物との競合中、一般的な固定化親和性ペアを介して固相へ固定化されるまたは固定化されている、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
n個の形式の少なくとも1個が阻害形式であり、該n個の形式の残りのものの少なくとも1個が非阻害形式であることと組み合わされうる、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
(A)分配マニホールドを共通に有する1セットのマイクロチャネル構造において、n個の形式の少なくとも2個の定量化を実行する段階であって、すべてのマイクロチャネル構造において分配マニホールドが、
(a)固相を含むマイクロキャビティの上流に位置しており、かつ
(b)1つの別個の体積計量マイクロキャビティを含む、
段階；ならびに
(B)下位段階である、
(1)該共通の液体試料のアリコートを分配マニホールドに提供し、かつ該試料をセットの構造1つあたりサブアリコート1つとしてサブアリコートへ分割する段階、
(2)サブアリコートを輸送して、固相を含むマイクロキャビティの入口末端でサブアリコート1を提供する段階を含む処理段階、および
(3)サブアリコート1をマイクロキャビティへ移動させる段階
を行うことにより、1つの共通の液体試料に由来するサブアリコート1を、固相を含むマイクロキャビティへセットの構造ごとに移動させる段階
を特徴とする、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
(A)(a)少なくとも1個の形式の他のものに用いられるマイクロチャネル構造の入口ポートと共通でなく、かつ
(b)下流方向において、固相を含むマイクロキャビティと、場合によっては、固相を含むマイクロキャビティと入口ポートとの間の体積計量マイクロキャビティと、流体連通している、
入口ポート
を有するマイクロチャネル構造において、n個の形式の少なくとも1個の定量化を実行する段階；
ならびに
(B)下位段階である、
(1)液体試料のアリコートを前記入口ポートで提供する段階、
(2)該アリコートを輸送して、固相を含むマイクロキャビティの入口ポートでサブアリコート2を提供する段階を含む処理段階、および
(3)サブアリコート2をマイクロキャビティへ移動させる段階
により、液体試料に由来するサブアリコート2を、固相を含むマイクロキャビティへ移動させる段階
を特徴とする、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
(A)少なくとも2個の形式の少なくとも1個におけるサブアリコート1が、該少なくとも2個の形式の他の形式に用いられるサブアリコート1の体積と比較して同じもしくは異なる体積を有し、かつ/または
(B)該少なくとも1個の形式の少なくとも1個における定量化に用いられるサブアリコート2が、該少なくとも1個の形式の他の形式に用いられるサブアリコート2の体積と比較して同じもしくは異なる体積を有する、
請求項20または21に記載の方法。
【請求項２３】
(a)サブアリコート1または2が由来する液体試料が分析物試料であり、かつ
(b)段階(ii)が下位段階(1)〜(3)を含む、
請求項20〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
(a)サブアリコート1または2が検出可能な反応物を含み、かつ
(b)下位段階(1)〜(3)が、典型的には、段階(ii)の前に、段階(ii)の一部として、または段階(ii)の後に、実行される、
請求項20〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
請求項17または18に記載の方法と組み合わせた方法であって、
(c)固相が、固定化親和性ペアのメンバーである一般的な親和性リガンドLを含み、かつ一般的な親和性対応物として一般的な結合物質Bを有し、
(d)サブアリコート1または2が、結合物質Bと可溶形状の捕捉体との間の溶解した結合体を含み、かつ
(e)下位段階(1)〜(3)が、固相上に捕捉体を導入するために段階(ii)の前に実行される、
請求項20〜24のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、同じ起源を有する、例えば、同じ液体試料中または分析物の異なる組み合わせを有する試料(分析物試料)中に存在する異なる分析物(Ans)の量を定量化するための方法である。異なる分析物のそれぞれは、親和性複合体が試料における分析物の量を反映する量で形成される(生成物)親和性アッセイ(リガンド-受容体アッセイ)の形式によりアッセイされる。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
医者は患者と初めて会う際、患者の病歴、および診断手順へのインプット(input)としてさらに検査されうる症状に直面する。診断手順は、可能性のある診断をいずれも支援するように、実験室での研究により非常に単純化されている。
【０００３】
分散化した診断状況においては、意思決定に役立ちうる情報を生み出すことに焦点が置かれる。早急な医学的介入を必要とする生命に関わる疾患の診断における場合、または管理上の理由により、例えば、適切な診断および処置の処方のために患者に見出される診断情報を有する分子(バイオマーカー)からの診断情報を迅速に生み出すために、時間効率の良い分析手順が用いられる場合である。慣例的には、例えば、AMI(ミオグロビン、CKMB、トロポニンI、またはトロポニンT)、アレルギー診断(様々な特異性のIgE)、または薬物乱用(刺激効果を有する小分子)に関して、いくつかのバイオマーカーについての試験の組み合わされた結果が用いられる。診断手順のこの段階における有用なマーカーは、しばしば、構造、濃度などに関して本質的に異なり、それゆえに、定量化について異なるアッセイ形式を必要とする。そのため、典型的には各形式および分析物について少なくとも1つのプロセスの流れを有する、複数の異なるプロセスの流れへ、患者由来の試料を流用することがしばしば前提条件である。集中型の状況において、いくつかのプロセスの流れに関連した問題を処理するために利用可能な手段がしばしばある。類似した状況が分散型の状況に生じる場合、敏速にアッセイを行って結果を処理することは、アッセイの視点から見ると、より複雑となる。
【０００４】
例えば、臨床研究、動物研究、化合物ライブラリーのスクリーニングなどの、異なるアッセイ形式を必要とする異種の分析物をアッセイする要望がしばしば存在する、複数の他の状況もまたある。
【０００５】
イムノアッセイ、細胞に基づいたアッセイ、核酸アッセイ、酵素アッセイ、および親和性反応を利用する他の種類のアッセイに適応するマイクロ流体装置は、この20年間、診断手順および生命科学内の他の種類の調査を行うための有用なツールとみなされてきた。各装置は、典型的には、機能の点で本質的に等しい複数のマイクロチャネル構造を含んでおり、それゆえに多くの回数 - 同時または異なる時のいずれかで、専用アッセイ形式を行うのに適している。所与の分析物およびアッセイ形式に適切な免疫試薬により各マイクロチャネル構造を「オンデマンドで」機能化することができるマイクロ流体装置が、利用可能である。機能化の一般的方法は、例えば、各マイクロチャネル構造のマイクロキャビティ内に置かれるビーズの形状をとる、固相に固定化されるストレプトアビジンなどのあらかじめ導入された一般的なリガンドの使用により達成されている。一般的なリガンドの親和性対応物に結合した試薬を各構造へ導入することにより、原理上、任意の種類の試薬を固相上に容易に導入することができる。現実には、このようなシステムは、主として、装置のすべてのマイクロチャネル構造において同じアッセイ形式、典型的にはサンドイッチ形式、を行うために用いられている。例えば、WO 2004083109(特許文献1)(Gyros AB)、WO 200483108(特許文献2)(Gyros AB)、PCT/SE06/000071(特許文献3)(Gyros Patent AB)、およびPCT/SE06/000072(特許文献4)(Gyros Patent AB)を参照。同じマイクロチャネル構造において、および/または同じマイクロ流体装置の異なるマイクロチャネル構造において、異なる分析物をアッセイすることもまた示唆されている。
【０００６】
対応する米国特許および米国特許出願を含む本明細書に引用されたすべての特許公報は、参照により全体として本明細書に組み入れられる。
【０００７】
【特許文献１】WO 2004083109
【特許文献２】WO 200483108
【特許文献３】PCT/SE06/000071
【特許文献４】PCT/SE06/000072
【発明の開示】
【０００８】
発明
本発明は、同じプロセスの流れにおいて異なる形式を統合するという概念に関連する問題の解決を示唆する。すなわち、複数のn個の異なる親和性アッセイ形式の使用による、好ましくは各分析物専用の別個の一形式による、1つまたは複数の液体試料(分析物試料)における複数のn個の異なる分析物(Ans)のそれぞれの量の定量化の方法である。nは、≧2かつ典型的には≦15である整数、例えば、≦10または≦5または≦4の整数である。個々の分析物は、分析物1、分析物2、・・・分析物k・・・分析物nによって表され、分析物kは、特に文脈から明らかでない限り、任意の分析物を表す。
【０００９】
本明細書に例証されているような形式の適切な選択により、n個の選択された分析物について同じ分析物試料を同じプロセスの流れにおいてアッセイすることは、たとえそれらが異なるアッセイ形式を必要とする場合でも、可能である。類似の度合いは、測定されて試料の分析物の量に関係づけられる親和性複合体を形成するために行われる、1つ、2つ、またはそれ以上の親和性反応についての異なる形式間で高くありうる。この類似はまた、典型的には、形式間の洗浄段階、希釈段階などについての類似と組み合わせてもよい。固定化反応物(＝捕捉体)の導入のための親和性固定化の選択は、固相上の捕捉反応物の能力および密度を、特定の分析物の対応する検出範囲および最適な形式に適応させることを容易にし、それにより、本発明に従って、異なる形式によって同じ試料におけるいくつかの異なる分析物を定量化する可能性を促進する。好ましい変形型において、n個の分析物のうちの1つまたは複数を含む試料は、選択された分析物の全部についての定量化において検出の十分な精度および限界を維持しながら、実質的に希釈(1:5未満などの1:10未満、または粒子状物質および他の目詰まり物質の可能な除去を除く無希釈試料でさえも)を伴わずに用いられる。患者由来の分析物試料、および診断における革新的方法の変形型の場合において、n個の異なる分析物が異なるプロセスの流れにおいて定量化される従来のアッセイと少なくとも同じ診断感度をもたらす可能性が高い。
【００１０】
本発明は、親和性アッセイの複数のn個の異なる形式の使用による、複数のn個の異なる分析物のそれぞれの量の定量化のための方法である。異なる形式のそれぞれは、n個の分析物の特定の1つについて専用である。n個の異なる分析物は、共通の液体試料(分析物試料)に存在するか、またはいくつかの試料(分析物試料)において分析物の少なくとも1個の異なる組み合わせとして存在しうる。n個の形式のそれぞれの親和反応、およびn個の分析物のそれぞれについての親和性反応は、試料における分析物の量の関数である量での親和性複合体(＝生成物)の形成をもたらす、すなわち、形式kは、分析物kについて用いられ、結果として、生成物kを生じる。革新的方法の特徴的性質は以下である。
(A)複数個の分析物の全部が、n個のマイクロチャネル構造を含む同じマイクロ流体装置において定量化され、n個の形式のそれぞれについて別々のマイクロチャネル構造が用いられ、かつ
(B)n個の形式のそれぞれが、
(i)該形式に用いられるマイクロチャネル構造のマイクロキャビティに、
(a)該形式における親和性反応物である固定化された捕捉体k、または
(b)該形式における親和性反応物であり、かつ固定化基と反応性である固定化タグを示す固定化可能な捕捉体kを固着させる能力がある固定化基、
を曝露する固相を提供する段階；
(ii)下位段階である、
(a)段階(i.a)で提供された固定化捕捉体kを生成物kへ組み入れるために該形式の親和性反応を行う段階、または
(b)固定可能な捕捉体kを生成物kの固定可能な形状へ組み入れるために該形式の親和性反応を行い、その後、固定化タグおよび段階(i.b)で提供された固相の固定化基をお互いに反応させることによりこの生成物を固相へ固着させる段階、
により、マイクロキャビティ内に生成物kの固定化形状を形成する段階、
(iii)段階(ii)に形成された固定化生成物kの量を測定することにより試料における分析物kの量を決定する段階
を含む。
【００１１】
好ましいアッセイ形式において、段階(iii)における測定を容易にするために検出可能な反応物を用いてもよい。検出可能な反応物は典型的に、例えば、それぞれ捕捉体kの親和性対応物または分析物kの親和性対応物であることにより、固定化されたもしくは固定可能な捕捉体kおよび/または分析物kとの親和性反応を起こす能力がある。
【００１２】
「分析物」という用語は、本来または未変性の分析物が本来/未変性の分析物とは異なる実体へ、本来/未変性の試料における本来/未変性の分析物の量の関数である量で変換されるような様式で、分析物を含む液体試料を処理することにより得られた「分析物関連実体」を含む。このような処理は、本発明の方法が行われるマイクロチャネル構造/マイクロ流体装置の内側および/または外側で起こりうる。典型的な分析物関連実体は、本来の分析物の量と関係した量で、固相を含むマイクロキャビティの上流で形成される親和性複合体である。そのような複合体は、本来/未変性の分析物を含む場合も含まない場合もある。この関連における上流とは、マイクロ流体装置/マイクロチャネル構造の外側および/または内側を含む。
【００１３】
本明細書において、分析物類似体(An-類似体)は、分析物と異なるが、分析物と分析物の親和性対応物との間の親和性反応を阻害する能力がある反応物である。他に規定がない限り、「対応物」は、親和性対応物を指す。「抗」という接頭辞は、例えば、抗分析物または抗分析物抗体(抗An、抗An抗体)、抗捕捉体または抗捕捉体抗体など、本発明において抗体として用いられる対応物に用いられる。分析物の対応物は、典型的に、分析物類似体が形式に用いられる場合には、分析物類似体の対応物でもある。「抗体」という用語は、抗体の様々な種類の抗原/ハプテン結合断片および誘導体、加えて抗体模倣体を含む。
【００１４】
分析物1、分析物2、・・分析物nに加えて、試料はまた、n個の分析物と同じマイクロチャネル構造において、および/またはマイクロ流体装置の内側または外側に位置しうる他のマイクロチャネル構造において、アッセイされる他の分析物を含んでもよい。これらの他の分析物は、分析物1、分析物2、・・分析物nの1つに用いられる種類のアッセイ形式に従ってアッセイされてもよいが、他の形式に従ってアッセイされてもよい。
【００１５】
n個の異なる分析物の1つまたは複数のそれぞれはまた、例えば、n個の異なる分析物に用いられるn個の形式の中で選択された、代替の形式によって定量化されてもよい。
【００１６】
本発明は、n個の形式を行うために、マイクロ流体装置上に少なくともn個のマイクロチャネル構造を必要とする。これらのマイクロチャネル構造は、典型的には、機能的に等しい、つまり、n個の形式のいずれもがすべての構造で行われうる、すなわち、n個の構造のいずれもが、例えば、入口ポート、体積規定ユニット(液体用)、分配マニホールド(液体用)、混合ユニット、反応マイクロキャビティ、検出マイクロキャビティ、液体ルーター、廃棄ユニットなどの中から選択される、本発明に従って実行される形式により必要とされる少なくとも一連の機能性を含む。「機能的に等しい」という用語は、n個のマイクロチャネル構造の1個または複数が特定の体積の液体試料(分析物試料、洗浄液体の試料、試薬試料など)を処理するために適応し、同時に他のマイクロチャネル構造が他の体積に適応していることを含む。
【００１７】
アッセイ形式
「異なる形式」という用語は、以下などの少なくとも1つ、2つ、3つ、またはそれ以上の性質に関してお互いに異なる親和性アッセイを企図する：
(a)反応物分析物、捕捉体、および検出可能な反応物(用いられる場合)が反応することが可能になる相対的順序；
(b)分析物、捕捉体、および検出可能な反応物の間の対応関係、例えば：
(i)捕捉体が、検出可能な反応物および/または分析物の親和性対応物であるかどうか
(ii)検出可能な反応物が、分析物および/または捕捉体の親和性対応物であるかどうか
(iii)検出可能な反応物および捕捉体が、同じ結合部位を利用するか、または分析物上で異なるもしくは等しくありうる2つの広く間隔をあけた結合部位(＝分析物を結合するための検出可能な反応物および捕捉体の異なるまたは等しい特異性、等しいとは、分析物が、関与する結合部位に関して少なくとも二価であることを意味する)を利用するか
(iv)対応関係の型、例えば、分析物、捕捉体、および検出可能な反応物(用いられた場合)の1つまたは複数が、これらの反応物の他のものの1つまたは複数に対する抗体または抗原/ハプテンであるかどうか
(c)一般型の親和性アッセイ、すなわち、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイなど；
(d)生成物を測定するために利用される原理、例えば、別個に導入された標識もしくは本質的に検出可能な基による、または親和性基もしくはシグナル発生基などによる、検出能；
(e)固相により分析物または検出可能な反応物を捕捉している間の固相の状態、すなわち、粒子の多孔質層(porous bed)、モノリシック多孔質層、懸濁した粒子、マイクロキャビティの内壁など；
(f)分析物もしくは検出可能な反応物などの反応物を捕捉している間の、または可溶性親和性複合体もしくは生成物を固相に付着させる時の、流動状態または静止状態；
(g)反応段階の数、例えば、分析物、捕捉体、および検出可能な反応物の使用に関する1段階または2段階形式；
(h)分析物または分析物の対応物の、限定されたまたは限定されない量/濃度。
【００１８】
典型的な親和性アッセイにおいて、未同定量の試料の分析物が、少なくとも分析物および分析物の親和性対応物を含む親和性複合体を形成することが可能になる。用いられる形式に依存して、さらなる親和性反応物を用いることができ、場合によってはまた、複合体へ組み入れうる。反応物の量および型は、関与する親和性反応が、結果として、本来もしくは未変性の試料における、または用いられた反応物の1つもしくは複数と接触した特定の試料における、分析物の量を反映する親和性複合体の量を生じるように選択される。
【００１９】
本発明の概念に従って用いられるアッセイ形式は、捕捉体の固定化形状または固定化可能な形状、および場合によっては検出可能な反応物を利用する。これらの2つの反応物は、同一であっても同一でなくてもよい。捕捉体または検出可能な反応物の一方または両方のいずれかは、親和性複合体へ完全にまたは部分的に組み入れられ、その量は、試料における分析物の量を反映する。分析物は、複合体の部分であってもそうでなくてもよい。固相への固定化は、組み入れられていない検出可能な反応物の部分からの影響を妨害することなく、試料における分析物の量を反映する親和性複合体へ組み入れられている検出可能な反応物の部分の別々の測定を容易にするために用いられる。
【００２０】
親和性アッセイ/形式は、測定される親和性複合体を形成するのに必要とされるインキュベーション(段階)の数に関して分類されうる。この関連における単一のインキュベーション/段階は、親和性反応物を、前に形成された複合体または単一反応物(追加された反応物の親和性対応物)と別々に反応させることを意味する。本発明の好ましい変形型において、n個の異なるアッセイ形式の少なくとも2個、3個、4個、またはそれ以上全部までは、分析物、検出可能な反応物(存在する場合)、および捕捉体のうちの1個、2個、または3個を含む同じ数のインキュベーション段階を有する、すなわち、1段階または2段階形式である。これらの形式のそれぞれは、さらなる反応物およびインキュベーション段階を用いてもよい。
【００２１】
1段階形式は「同時」と呼ばれる、すなわち、分析物、捕捉体、および分析物対応物が同じインキュベーション/段階において反応する。2段階形式は「逐次」形式と呼ばれる。第1段階に固定化されたまたは固定化可能な捕捉体との反応が含まれる2段階形式は「順方向」である。捕捉体が第1段階に含まれない場合には、形式は「逆方向」である。通常、逆方向形式より順方向形式が好ましい。
【００２２】
本発明に用いられる1段階および2段階形式について、分析物の量は、好ましくは、固相上の検出可能な反応物を測定することにより、固相上の複合体(生成物)の量から決定される。特定の変形型において、測定は、2段階変形型における第2段階後および1段階変形型における単一段階後の、液体中に残存する検出可能な反応物についての測定である。
【００２３】
阻害形式
阻害(＝競合的)形式において、分析物および分析物類似体は、分析物の親和性対応物への結合についてお互いに競合している。対応物は、典型的には、限定された量である。この関連における量は、濃度を含む。
【００２４】
本発明に用いられる阻害形式は、典型的には、以下である分析物対応物を利用する：
(A)分析物類似体が可溶性かつ検出可能である(＝検出可能な反応物)場合に、固定化されているまたは固定化可能であり(＝捕捉体)、かつ
(B)分析物類似体が固定化されているまたは固定化可能である(＝捕捉体)場合に、検出可能である(＝検出可能な反応物)。
【００２５】
好ましい変形型において、所望の複合体は、マイクロ流体装置内で、分析物、検出可能な反応物、および捕捉体から、2回の逐次インキュベーション(2段階形式)により、またはすべての3つの反応物が同時に存在する単一インキュベーション(1段階形式)により、達成することができ、場合によっては、形成された複合体が固定化可能でかつ固定化タグを含むならば、固定化インキュベーション(1段階形式、続いて固定化のためのインキュベーション段階)が続く。さらなる反応物が用いられる場合には、さらなる段階が必要である可能性がある。
【００２６】
変形型(B)の典型的な2段階形式は、固定化されたまたは固定化可能な分析物対応物(捕捉体)、例えば、抗An、が、(a)分析物または(b)検出可能な分析物類似体と反応する第1段階、続いて、分析物および検出可能な分析物類似体の残りの1つで形成された複合体の反応を含む第2段階を含む。選択肢(a)では、第2段階は典型的に、第1段階の後、分析物対応物(捕捉体)の残りの結合部位が、検出可能な分析物類似体との反応により評価されること(「滴定」)を含む。選択肢(b)では、選択肢(b)の第1段階は典型的に、検出可能な分析物類似体による、分析物対応物(捕捉体)の結合部位の実質的な飽和を意味し、一方、第2段階は典型的に、第1段階で形成された複合物からの分析物による、検出可能な分析物類似体の置換を含む。
【００２７】
変形型(B)の典型的な2段階形式は、分析物および検出可能な分析物対応物、例えば、抗An、が溶液中でお互いに反応する第1段階、続いて、分析物類似体(捕捉体)が固定化された固相による、分析物に対する自由結合部位を有する分析物対応物(非複合体化対応物)の捕捉段階を含む第2段階を含む。
【００２８】
変形型(A)の典型的な1段階形式は、好ましくは、固相に固定化された抗Anなどの分析物対応物(捕捉体)との反応の前に、固相を含むマイクロキャビティの上流または内側で分析物および検出可能な分析物類似体の混合を必要とする。
【００２９】
固定化可能な捕捉体、例えば、抗分析物または分析物類似体、を利用する形式は、原理上は、対応する反応物があらかじめ固定化された対応する形式と同じ(反応が溶液中で起こることを除いて)段階を含む。固定化可能な反応物(捕捉体)の固相への付着は、その後、典型的には、固定化可能な反応物を含む第1複合体が形成される段階の後に起こる。
【００３０】
阻害形式は、典型的には、低分子量を有するかつ/または分析物対応物の結合に関して一価である分析物について用いられる。従って、阻害形式における分析物は、典型的には、≦50000ダルトン、または≦10000ダルトン、または≦5000ダルトン、または≦1000ダルトンなどの比較的低い分子量を有する。分析物は、本明細書の他の箇所で一般的に反応物について記載されているように、生体高分子構造などの重合体構造を有しうるが、より頻繁には、非重合体構造、または異なるおよび/もしくは等しいアミノ酸残基、ヌクレオチド、または単糖単位などの少ない数の繰り返し単位を有しうる。この関連における少ない数は、≦500、例えば、≦1000、または≦100もしくは≦50である。
【００３１】
非阻害形式
非阻害形式(＝非競合的形式)は、典型的には、1つまたは複数の分析物の親和性対応物、典型的には抗Ans、の限定されない量を利用する。特定の変形型について、限定された量の対応物を用いてもよい。この関連における量は、濃度を含む。
【００３２】
最も重要な非競合的形式は、サンドイッチ型であり、同じ分析物分子上に広く間隔をあけている結合部位へ方向づけられる2つの分析物対応物、例えば、2つの抗Ans、の間に分析物が挟まれた、固定化されたまたは固定化可能な複合体の形成を含む(すなわち、両方の抗分析物が分析物へ同時に結合しうることを可能にする)。典型的には、分析物対応物の1つは、検出可能な反応物であり、もう一方は、固定化されたまたは固定化可能な捕捉体である。分析物上の結合部位は、典型的には異なっており、それは用いられる2つの対応物が異なる特異性をもつことを意味する。関与する結合部位は、いくつかの変形型において、用いられる2つの対応物が部位のいずれか1つと互換的に反応しうるという意味において等しく(反復性、これらの結合部位に関して少なくとも二価)、それはまた、2つの対応物が本質的に同じ結合特異性をもつことを意味する。
【００３３】
阻害形式についてと同じように、2段階形式(逐次形式)および1段階形式(同時形式)がある。
【００３４】
2つの主要な2段階変形型は、(a)第1段階が、固定化されたまたは固定化可能な分析物対応物(捕捉体)と分析物とのインキュベーションを含み、その後、第1段階で形成された複合体と第2の分析物対応物(検出可能な反応物)とのインキュベーションを含む第2段階が続く、順方向形式、および(b)第1段階が、可溶性の検出可能な分析物対応物(検出可能な反応物)と分析物とのインキュベーションを含み、その後、第1段階で形成された複合体と固定化されたまたは固定化可能な分析物対応物(捕捉体)とのインキュベーションを含む第2段階が続く、逆方向形式である。
【００３５】
サンドイッチアッセイの同時的1段階形式は、固定化されたまたは固定化可能な分析物対応物(捕捉体)、可溶性の検出可能な分析物対応物(検出可能な反応物)、および分析物を、反応物の2つのみを含む2成分複合体を別個に前もって形成することなしに、反応物の3つすべてを含む少なくとも三元複合体の形成のために、インキュベートする段階を含む。
【００３６】
順方向形式、特に、固定化された分析物対応物(捕捉体)を利用する変形型は、本発明において好ましい。
【００３７】
サンドイッチ形式において、分析物の量は、好ましくは2段階変形型における第2段階の後、および1段階変形型における単一段階の後、固相上の検出可能な反応物を測定することにより、固相上の複合体(生成物)の量から決定されるのが好ましい。原理上、生成物の形成後の液体中に残存する検出可能な分析物対応物(検出可能な反応物)の測定は実行可能でありうる。
【００３８】
サンドイッチアッセイにおける分析物は少なくとも二価(＝多価)であり、2つの抗分析物の同時的結合を可能にするために比較的高い分子量を有する。従って、分子量は≧5000ダルトン、例えば、≧10000ダルトンまたは≧50000ダルトンでありうる。このような分析物は、典型的には、本明細書の他の箇所で反応物について一般的に記載されているように、生体高分子構造などの重合体構造を含む。異なるおよび/または等しいアミノ酸残基、ヌクレオチド、単糖単位などのサブユニットの数は、≧50、例えば、≧100または≧500である。
【００３９】
本質的に同じ結合特異性を有する2つの分析物対応物を(捕捉体および検出可能な反応物として)利用するサンドイッチ形式は、分析物上で利用される結合部位に関して少なくとも二価である分析物のアッセイに特に適応する。この条件に適合する分析物の1つの重要な型は、少なくとも二価の抗体であり、従って、関与するアッセイ形式は、クラス、サブクラス、または種に関係なく抗原特異的抗体のアッセイに用いてもよい。このようなサンドイッチ形式において、捕捉体の限定された量および/または選択された密度は、典型的には、2つの対応物の同じ分析物分子への同時的結合を保証するために有利である。これは特に、固相に結合した対応物(捕捉体)に適用される。検出可能な対応物の量の慎重な選択もまた、2つの検出可能な分析物対応物間に挟まれた分析物を含む可溶性の三元複合体の形成を妨害するのを避けるために適切である。より詳細については、PCT/SE2006/000071(Gyros Patent AB)を参照。
【００４０】
異なる結合特異性を有する、抗An1および抗An2などの2つの分析物対応物(捕捉体および検出可能な反応物として)を利用するサンドイッチ形式は、広く間隔をあけている2つの異なる結合部位を曝露する分析物に特に適応する。このような形式は、原理上は、多価であり、かつ一般的に反応物について下記で示された構造の1つまたは複数を含む任意のより大きい生体高分子を測定するために用いることができる。該形式は、各分集団が、(a)他の分集団にも存在する結合部位(共通の結合部位)、および(b)他の分集団のいずれにも存在しないもう一つの異なる結合部位を有する、一群の物質の特定の分集団を測定するのに特によく適応する。この段落で言及されるサンドイッチ形式は、(A)特定のIgクラス、Igサブクラス、種などの抗原特異的抗体(一方の対応物は抗原/ハプテンであり、他方が抗Igクラス抗体、抗Igサブクラス抗体、またはいくつかの他のIg結合性反応物)のアッセイ、(B)IgA、IgD、IgE、IgG、IgMなどのIgサブクラスまたはIgクラス(例えば、2つの異なる抗Ig抗体)、ならびに、多かれ少なかれ多型性であり、かつ/またはアイソフォームを含み、かつ/または異なる2つの広く間隔のあいた結合部位のみを含む、他の物質の個々の変異体のアッセイに関して例証することができる。
【００４１】
もう一つの非競合的変形型は、固定化されたまたは固定化可能な形状である1つの分析物対応物のみを利用する。この場合、複合体形成は、固定化された複合体、または後で固定化される可溶性複合体をもたらす。続いて、固定化された複合体それ自体を測定する。このような非阻害形式は、典型的には、1段階型である。固定化されたまたは固定化可能な対応物は、検出可能でありうる、例えば、分析物への結合の結果としてシグナルが変化するシグナル発生標識を含む(捕捉体および検出可能な反応物が同時)。
【００４２】
好ましい形式の組み合わせ
本発明の好ましい変形型において、異なる分析物/形式の数nは、2、3、4、5、またはそれ以上であり、例えば、n個の形式の全部が1段階形式または2段階形式であり、有利には順方向型でもある2段階形式が好ましい。すなわち、第1段階として、捕捉体を示す多孔質層などの固相と、企図される特定の形式における分析物または検出可能な反応物などの可溶性反応物とのインキュベーションを含む形式である。従って、1つの好ましい変形型において、第1段階は、分析物が固定化形状の捕捉体とインキュベートされることを意味し、第2段階は、第1段階で形成された固定化生成物が検出可能な反応物とインキュベートされることを意味する。さらに特に有利な態様は、同じ装置上で本発明に従って行われる2段階もしくは1段階形式の1つ、2つ、もしくはそれ以上が阻害形式である、および/または他の2段階形式もしくは他の1段階形式の1つ、2つ、もしくはそれ以上が、サンドイッチ形式などの非阻害形式であることを含む。これらのサンドイッチ形式の1つ、2つ、3つ、またはそれ以上は、含まれる場合には、好ましい変形型において、他では用いられない反応物組み合わせA〜Cの1つを利用することにより、他とは異なる：
(A)2つの分析物対応物の一方は抗原/ハプテンであり、他方は分析物に対する抗体である(分析物は特定のクラス、サブクラス、または種の抗原特異的抗体である)、
(B)2つの分析物対応物領域のそれぞれは、分析物に対する抗原である(分析物は抗原特異的抗体である)、
(C)2つの分析物対応物の両方は、分析物に対する同じまたは異なる特異性の抗体である(分析物は、例えば、IgG、IgE、トランスフェリン、および高分子量でかつ一般的に反応物について下記で示されているような構造の他のマルチエピトピック(multiepitopic)生体分子を一般的に含む、タンパク質である)。
【００４３】
反応物、特に、捕捉体、検出可能な反応物、および分析物
用いられる個々の反応物は、典型的には、(a)抗原/ハプテン、(b)抗体およびそれらの抗原/ハプテン結合断片の抗原/ハプテン結合能力を模倣する親和性反応物を含む、抗体またはそれらの抗原/ハプテン結合断片、(c)一本鎖型および二本鎖型を含む核酸、ならびにポリヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチド、および核酸の模倣体、(d)ステロイド構造またはペプチド構造などのホルモン、およびホルモン受容体、ならびに(e)酵素系のような生体触媒系などの触媒系の構成要素などの、リガンド-受容体ペアのメンバーの中から選択される。
【００４４】
本発明の関連において用いられる親和性反応物は、典型的には、以下からなる群のメンバーの中から選択される1つまたは複数の構造を示す：
(a)ポリペプチド構造およびオリゴペプチド構造などのペプチド構造などのタンパク質構造を含むアミノ酸構造、ならびにこれらの構造の模倣体および化学修飾型など；
(b)単糖およびオリゴ糖構造を含む多糖構造などの炭水化物糖構造、これらの構造の模倣体および化学修飾型など、ならびに他の糖構造；
(c)核酸構造を含むヌクレオチド構造、ならびにこれらのヌクレオチド構造の模倣体および化学修飾変形型など；
(d)ステロイド構造、トリグリセリド構造などの脂質構造、ならびにこれらの構造の模倣体および化学修飾型；
(e)薬物を含む有機または生物有機の性質の他の構造。
【００４５】
固相が存在するマイクロキャビティを含む、マイクロチャネル構造(段階(i))
本発明に用いるマイクロ流体装置のマイクロチャネル構造は、その構造において行われるアッセイ形式の段階を可能にする微小導管およびマイクロキャビティのシステムを含む。異なる流体機能を有する典型的なマイクロ流体装置およびマイクロチャネル構造は、例えば、Gyros AB/Amersham Biosciences (WO 99055827、WO 99058245、WO 02074438、WO 02075312、WO 03018198、WO 04103890、WO 05032999、WO 05094976、WO 05072872、PCT/SE2005/001887); Tecan/Gamera Bioscience (WO 01087487、WO 01087486、WO 00079285、WO 00078455、WO 00069560、WO 98007019、WO 98053311); Amic AB (WO 03024597、WO 04104585、WO 03101424など)などにより記載されている。対応する発行された米国特許および公開された米国特許出願がこのリストに含まれる。
【００４６】
固相を含むマイクロキャビティ(114a〜h)は、典型的には、≦1000μm、例えば、≦500μmまたは≦200μmである(深さおよび/または幅)少なくとも1つの断面寸法を有する。マイクロキャビティの総容積は、典型的には、低い方のμL範囲、例えば、≦20μL、例えば、≦10μLまたは≦5μLまたは≦1μLまたは≦500nLである。
【００４７】
固相を含むマイクロキャビティは、マイクロキャビティの上流に位置している1つ、2つ、またはそれ以上の混合機能と連関されてもよい、またはそれらの少なくとも1つがマイクロキャビティと部分的にもしくは完全に一致している。2つの混合機能の間、または混合機能もしくは固相を含むマイクロキャビティの間に、反応混合物を固相が含まれるマイクロキャビティに入れる前に、混合された反応物をインキュベートしてお互いを反応させることができる余分のマイクロキャビティがあってもよい。好ましい設計は、マイクロキャビティで行われる実際の反応段階に関与する反応物の物理的状態(可溶性または非可溶性、可溶性は懸濁されたものを含む)に依存する。2つの例は以下である：
(1)単一の可溶性反応物と懸濁していない固相(内壁および多孔質層)との間の反応を含む段階は、いかなる混合も必要とせず、従って、言及されたような混合機能の有無にかかわらず実行することができる。このような段階を含む典型的な形式は、第1段階において可溶性反応物(分析物または検出可能な反応物)と捕捉反応物とのインキュベーションを含む、順方向逐次アッセイである。
(2)可溶性反応物の混合物と固相上の反応物との間の反応を含む段階は、2つの反応物がマイクロ流体装置の外側で混合されない限り、固相を含むマイクロキャビティと連関する混合機能を必要とする。可溶性反応物が、固相に接触する前に、お互いに反応する場合には、混合機能と固相が含まれるマイクロキャビティとの間に余分のマイクロキャビティもあることが好ましい。
混合機能および/または余分の反応マイクロキャビティの必要性は、本明細書の他の箇所で詳細に考察された異なる形式から明らかである。
【００４８】
前の段落で記載されているように混合機能およびインキュベーションマイクロキャビティを有するマイクロチャネル構造、ならびに固定化可能な反応物が後で固相に固定化される固定化可能な親和性複合体の形成のために用いられる親和性アッセイにおける該マイクロチャネル構造の使用は、PCT/SE2005/001887(Gyros Patent AB)および2005年12月に出願された対応する通常の米国出願「Microfluidic assays and microfluidic devices」に開示されている。WO 02075312(Gyros AB)も参照。
【００４９】
固相は、典型的には、(A)多孔質層、例えば、粒子の充填層もしくは多孔性モノリス、または(B)マイクロキャビティの内壁、または(C)多孔質層に沈降する能力がある懸濁した粒子の形状をとる。懸濁した粒子または懸濁可能な粒子を含む多孔質層の場合、固相の形状はアッセイ中に、多孔質層から懸濁した粒子へ、およびその逆に、変化しうる。例えば、変化は、逐次アッセイにおける第1段階と第2段階の間、同時アッセイにおける単一段階の前または後、固定化段階の前または後、洗浄段階の前または後などに起こりうる。従って、これらの段階の任意の1つが懸濁形状または層形状の粒状固相に関して起こってもよく、一方、先行するまたは後に続く段階はその2つの形状のいずれかに関して起こる。遠心力と組み合わせた1つまたは複数の外部磁石は、粒子が磁性材料を含む場合には、この形状間の変化を援助することができる。例えば、いずれも全体として参照により本明細書に組み入れられている、M Gruman et al., 8th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences (Malmo, Sweden), Sept. 25-30, 2004, pp. 593-595およびSteigert et al., J. Assoc. Lab. Autom. October (2005), 331-341を参照。SE 0600557-3および2006年3月13日に並行して出願された対応する米国特許仮出願(「Enhanced magnetic particle stirring」, Per Andersson and Gerald Jesson, Gyros Patent AB)もまた参照。
【００５０】
マイクロキャビティ(114a〜h)は、典型的には、固相が、例えば多孔質層として、位置しうる特定の領域(104a〜h)を有する。この領域は、典型的には、マイクロチャネル構造の下流部分と流体連通する出口と連関して、液体および/または粒子の選択的下流輸送を可能にする。多孔質層は、典型的には、例えば≦5000nLのnL範囲、例えば、1000nLまたは≦500nL、≦100nLまたは≦50nLまたは≦25nLのnL範囲での容積を占める。
【００５１】
固相に適切な粒子は、好ましくは、球状もしくは回転楕円状(ビーズ)、または非球状である。粒子についての適切な平均直径は、典型的には、1〜100μmの区間で見出され、≧5μm、例えば、≧10μmまたは≧15μm、かつ/または≦50μmの平均直径が好ましい。例えば、平均直径が0.1μmまで下がる、より小さい粒子を用いてもよい。直径は、「流体力学的」直径を指す。用いられる粒子は、WO 02075312 (Gyros AB)においてと同じ意味で、単分散(単一サイズ)または多分散(多サイズ)であってよい。
【００５２】
固相の基材は、無機材料および/または有機材料で作られている。典型的な無機材料はガラスを含む。典型的な有機材料は、有機重合体を含む。重合体材料は、ガラスおよびシリコーンゴムなどの無機重合体、ならびに合成または生体起源の有機重合体(生体高分子)を含む。「生体高分子」という用語は、天然の生体高分子由来の重合体バックボーンがある半合成重合体を含む。適切な合成有機重合体は、典型的には、架橋結合されており、しばしば、重合可能な炭素-炭素二重結合を含む単量体の重合により得られる。適した単量体の例は、ヒドロキシアルキルアクリレート、例えば、2-ヒドロキシエチルアクリレートなどの2-ヒドロキシアルキルアクリレート、および対応するメタクリレート、アクリルアミドおよびメタクリルアミド、ビニルおよびスチリルエーテル、アルケン置換ポリヒドロキシ重合体、スチレンなどである。多くの場合の典型的な生体高分子は、例えば、アガロース、デキストラン、デンプンなど、糖構造を示す。
【００５３】
固相の粒子は、フェライトなどの磁性材料の微量の粒子が組み入れられている非磁性材料、例えば、重合体、から製造されてもよい、または粒子は、適切に表面修飾されてもよいフェライトなどの磁性粒子状材料に基づいてもよい。
【００５４】
本発明に用いられる固相は、好ましくは親水性である。多孔質層に関して、これは、層の細孔の表面が過剰の水と接触する場合に、水が層全体に渡って毛管現象により拡散するのに十分な湿潤性を有すること(吸収)を意味する。固相が、固相が配置されている領域(104a〜h)の内壁である場合には、「親水性」という用語は、主として、この位置における内部表面の水接触角が、本明細書の他の箇所で親水性(湿潤性)について特定された範囲内であることを企図する。あるいは、親水性は、いったん水がこの位置(104a〜h)の最も上流の末端に届けば、毛管現象によりこの位置(104a〜h)を水で満たすのに十分である。水性液体と接触する表面はまた、それぞれが例えば酸素および窒素の中から選択されたヘテロ原子を有する、複数の極性官能基を曝露すると考えられる。適切な官能基は、水酸基、酸化エチレン基(-X-[CH2CH2O-]n、nは＞1の整数であり、Xは窒素または酸素である)、アミノ基、アミド基、エステル基、カルボキシ基、スルホン基などの中で選択することができ、pHに関係なく、例えば、2〜12の区間内で、本質的に非荷電であるそれらの基が好ましい。
【００５５】
固相材料の基材が、疎水性であるかまたは十分には親水性ではない、例えば、スチレン(共)重合体に基づいている場合には、水性液体と接触する表面は親水化されうる。典型的なプロトコールは、上記で考察されたのと同じ型の極性官能基を示す化合物でのまたは化合物の混合物でのコーティング、酸素プラズマによる処理などを含む。
【００５６】
固相上に固定化される捕捉体を導入するための技術は、典型的には、以下の工程を含む：
(a)捕捉体の可溶形状を固相へ固着させる工程、または
(b)固定化された捕捉体を固相上へ階段状に構築する工程(固相合成)。
いずれの経路も当分野において一般的に知られている。固相材料への結合は、共有結合、親和性結合(例えば、生体特異性親和性結合)、物理吸着、静電結合などによりうる。
【００５７】
選択肢(a)は、典型的には、固相上の固定化基、および本発明の方法を実行する時に与えられる条件下で望ましくない切断に抵抗する結合の形成へお互いに反応性である捕捉体上の固定化タグを用いる。固定化基は、固定化タグとの反応の前に固相材料上に導入される。固定化基および固定化ペアは、固定化ペアを定義する。
【００５８】
変形型(a)についての共有結合固定化は、切断抵抗性結合が共有結合性であることを意味する。固定化基および固定化タグは、典型的には、それぞれ、お互いに反応性の求電子基および求核基の中から選択される。基の例は、例えば、WO 2004083109、PCT/SE06/000071、およびPCT/SE06/000072(すべてGyros AB/Gyros Patent AB)に示されている。
【００５９】
親和性結合による固定化は固定化親和性ペアを利用することができ、ここで、メンバーの一方(固定化されたリガンドL＝固定化基)は固相材料へ固着しており、他方のメンバー(固定化結合物質、B)は、結合物質B(＝固定化タグ)を含む第1部分および分析物Anへ親和性結合する能力がある結合部位を含む第2部分を含む結合体(固定化結合体)の一部である。ペアは、典型的には、n個の形式/マイクロチャネル構造の少なくとも2個、3個、4個などにおいて同じであるように、かつこれらの形式/構造の反応物の所望の結合活性を負に干渉しないように、選択される。換言すれば、結合物質Bおよび親和性リガンドLは、これらの形式/構造について一般的である。典型的な好ましい固定化親和性ペアは、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン、抗ビオチン抗体などのビオチン結合性化合物とビオチン、(b)抗ハプテン抗体と対応するハプテンまたは抗原、および(c)クラス/サブクラス特異的抗体と対応するクラス由来のIgである。
【００６０】
上記および本発明の他の関連における「結合体」という用語は、化学的結合体および組換え技術によって産生された結合体などの共有結合性結合体を指す。結合体は、リンカーを介して典型的には共有結合性に結合した少なくとも2つの部分を含む。この用語はまた、いわゆる天然の結合体、すなわち、お互いに間隔をあける2つの結合部位をそれぞれ示し、かつ2つの異なる分子実体へ向けられる親和性を有する親和性反応物を含む。従って、天然の結合体は、物理的に分離した異なる抗原決定基を有する抗原、分子の1つの部分に種特異的および/またはクラス特異的決定基を含みかつ別の部分に抗原/ハプテン結合部位を含む抗体、を含む。
【００６１】
好ましい固定化親和性ペア(LとB)は、典型的には、最大限でも、ストレプトアビジンとビオチンについての対応する親和定数と等しい、またはこの後者の親和定数より≦101倍、もしくは≦102倍、もしくは≦103倍大きい、親和定数(KL--B＝[L][B]/[L--B])を有する。これは、典型的には、それぞれ、おおよそ≦10-13モル/l、≦10-12モル/l、≦10-11モル/l、および≦10-10モル/lである親和定数を意味する。これらの親和定数範囲は、Biacore(Uppsala, Sweden)からのバイオセンサー(表面プラズモン共鳴)により、すなわち、デキストランコーティング金表面に固定化したリガンドLにより、得られる値を指す。
【００６２】
結合物質Bについての適切な結合能力の範囲、およびそのような結合能力の測定は、WO 2004083109、PCT/SE06/000071、およびPCT/SE06/000072(すべてGyros AB/Gyros Patent AB)に示されている。
【００６３】
固定化基および固定化される捕捉反応物は、WO 2004083109、PCT/SE06/000071、およびPCT/SE06/000072(すべてGyros AB/Gyros Patent AB)に記載されているように、固相上に導入されうる。
【００６４】
固相上の固定化される捕捉体の密度および量は、捕捉体の可溶形状を阻害様式で付着させることによる制御された方法で、容易に変化させることができる。この様式は、固定化基を示す固相が、固定化基と反応性である固定化タグをいずれも示す捕捉反応物およびナンセンス反応物の溶解形状を含む液体試料と接触することを意味する。これらの反応物のそれぞれの量および/またはそれらの総量は、典型的には、固相上の固定化基の量と比較して過剰であると考えられる。続いて、最終的な固相における捕捉体の実際の密度が、捕捉体およびナンセンス反応物の固定化反応の速度間の関係により決定される。このように、捕捉体の親和性対応物についての固相結合能力および/またはn個のマイクロチャネル構造のそれぞれにおける捕捉体の密度をこの構造の実際の形式および分析物へ適応させることは容易である。捕捉体のこのような導入は、代替的に、生じた固相をマイクロ流体装置の個々の構造へ後で移動させるバッチ様式で実行されてもよい。
【００６５】
固定化親和性ペアは好ましい。
【００６６】
分析物の量と関係する親和性複合体(生成物)の形成についての反応(段階(ii))
これらの反応は、固相を含むマイクロキャビティの上流および/または内側で行われ、本来/未変性の試料における本来または未変性の分析物の量の関数である量で固定化形状の生成物を生じるために、固定化可能な形状および/または固定化された形状で分析物および捕捉体を含む。多くの形式において、これはまた、用いられる反応物の少なくとも1つの消費が分析物の量の関数であることも意味する。生成物は最初は可溶形状であるが、後で固定化される固定化可能な形状で形成されうる。検出可能な反応物が、生成物の量の測定を容易にするために含まれてもよい(本明細書の他の箇所を参照)。
【００６７】
生成物の固定化された/固定化可能な特徴は、典型的には、捕捉体が段階(i)において、固定化されたまたは固定化可能な形状で提供されるという事実に存在する。上記で考察されているように、固定化可能な反応物および/または生成物は、典型的には、固定化タグを有する。このタグは、固相上の固定化基と反応性である。上記参照。
【００６８】
分析物の量の測定(段階(iii))
段階(iii)において、マイクロチャネル構造のマイクロキャビティに形成された生成物の量が測定され、得られた値は、本来の試料における分析物の量と関係する。測定は、形成された生成物の量の測定、または生成物の形成に関与する反応物の消費量、例えば、後者の反応物残存量の測定であってよい。
【００６９】
測定された値と分析物の量の間の関係を見出すために、典型的には、測定された値を、1つまたは複数の標準試料について得られている対応する値と比較することによる、公知の原理が適用される。この比較は、典型的には、(a)様々な既知の量の分析物を含む一連の1つ、2つ、またはそれ以上の試料、(b)例えば、同じまたは異なる個体からより早い時に得られた1つまたは複数の試料、(c)健康な個体または特定の疾患状態を有する個体から得られた1つまたは複数の試料などの比較である。定量化は、典型的には、例えば濃度のように絶対的である。定量化はまた、相対的であってもよい、例えば、反応が起こるマイクロキャビティに入る液体または本来の試料のある種の成分に対して、より早いもしくはより遅い時にかつ/または同一個体もしくはもう一人の個体から採取されたもう一つの試料に対して、相対的であってもよい。
【００７０】
特定のマイクロチャネル構造/マイクロキャビティ/固相の、中/上での生成物の形成の段階(iii)において測定を容易にするために、好ましくは、生成物へ組み入れられた後でそれ自体測定可能である、および/または別の方法で生成物の測定を可能にする、分析的に測定可能な反応物が用いられる。検出可能な反応物を利用する分析物/アッセイ形式/マイクロチャネル構造の数は、典型的には、≧1、例えば、≧2または≧3または≧4であり、かつ常に≦n(n＝複数のn個の分析物について用いられるアッセイ形式の総数)である。これは、検出可能な反応物がまた、n個の分析物の中に含まれない分析物/形式/マイクロチャネル構造について用いてもよいことを排除しない。検出可能な反応物は、特定の形式において、固定化されたもしくは固定化可能な形状の捕捉体、または分析物でありうる。
【００７１】
検出可能な反応物は、分析物/マイクロチャネル構造/形式の1つ、2つ、またはそれ以上について、段階(ii)における分析物の(a)導入の前に、(b)導入と同時に、または(c)導入の後に、固相を含むマイクロキャビティへ導入されうる。検出可能な反応物の導入について、および/または該反応物と、捕捉体などの固相へ固定化されうるもしくは固定化可能でありうる親和性対応物との反応、分析物を含みかつ検出可能な反応物の導入前に形成された親和性複合体などとの反応について、n個の分析物/マイクロチャネル構造/形式のうちの2個またはそれ以上の間での、例えばすべての間での、類似が好ましい。
【００７２】
前の段落の選択肢(a)は、(I)捕捉体でもある検出可能な反応物を固相へ付着させる、または(II)固定化された捕捉体および検出可能な反応物を含む固定化された複合体をあらかじめ形成する(検出可能な反応物および捕捉体が親和性対応物であることを条件として)ために用いてもよい。これらの2個の変形型のそれぞれは、阻害形式およびサンドイッチ形式も含む非阻害形式について上記で考察されているように、1段階形式および2段階形式に適用できる。
【００７３】
選択肢(b)は、阻害形式およびサンドイッチ形式も含む非阻害形式について上記で考察されているように、1段階形式および2段階形式で用いてもよい。
【００７４】
選択肢(c)は、阻害形式およびサンドイッチ形式も含む非阻害形式について上記で考察されているように、典型的には、順方向逐次2段階形式を含む。
【００７５】
固定化可能な形状の捕捉体が、マイクロキャビティへ導入される前混合物に含まれる場合、段階(i)は段階(ii)の一部である。
【００７６】
2つの親和性対応物の間の複合体が、前混合物において本来の試料における分析物の量の関数である量で形成される場合、この複合体は分析物関連実体の例である。
【００７７】
同じ検出可能な反応物または同じ捕捉体を、複数のn個の分析物/形式/マイクロチャネル構造のうちの2個、3個、またはそれ以上について利用してもよい。
【００７８】
検出可能な反応物は、典型的には、検出可能な基がある部分1、および分析物に対してまたは固定化されたもしくは固定化可能な捕捉体に対して所望の反応性を提供する部分2を含む。検出可能な反応物は、従って、部分1および部分2が、好ましくは共有結合により、お互いに固着している結合体でありうる。この結合体は天然であっても合成であってもよい。合成結合体について、検出可能な基は「標識」と呼ばれる。
【００７９】
部分1の検出能は、典型的には、部分1が分析的に検出および定量化されうる基を含むという事実に存在する。シグナル発生基および親和性基は、典型的な例である。シグナル発生基は、放射線放出または放射線吸収基、および他の経路で、所与の放射線に干渉する基の中から選択されうる。特定のシグナル発生基は、酵素、補因子、基質、補酵素などの酵素活性基；放射性または非放射性同位元素などの特定の同位元素を含む基；蛍光および蛍光発生基；化学発光および化学発光発生基、生物発光および生物発光発生基などを含む発光および発光発生基；金属がイオン形状である基を含む金属含有基などである。この関連における親和性基は、典型的には、検出可能な親和性基の親和性対応物と、検出可能な反応物における検出可能な基とは異なり、かつ好ましくは、典型的には標識の形状をとるシグナル発生基である、第2の検出可能な基との間の結合体である第二の検出可能な反応物の使用により検出される。典型的な親和性に基づいた検出可能な基は、本明細書の他の箇所で考察された固定化親和性ペアの個々のメンバーの中から選択されうるが、ただし、親和性に基づいた検出可能な基は、そのようなペアが捕捉体の固相への固定化に用いられている場合には、本方法中、固定化結合ペアのメンバーに親和性結合する能力がないと考えられるということが条件である。
【００８０】
他の変形型において、反応物の検出能は、シグナル発生基または親和性基の存在以外の特徴に存在する。従って、検出能/測定能は、固相上に形成された親和性複合体に反応物が追加する体積または質量の増加に存在しうる。このように、この変形型における反応物は、検出可能な基を定義する。例えば、WO 03102559(Gyros AB)参照。
【００８１】
実際の測定は、典型的には、固定化された形状で生成物が形成されるマイクロキャビティにおいて実行される。あるいは、実際の測定は、このマイクロキャビティの下流で、例えば、別個の検出マイクロキャビティにおいて、行われてもよい。この後者の変形型は、マイクロキャビティを通過する過剰な検出可能な反応物の測定、または段階(ii)などの固相上で形成された生成物から生じる可溶性かつ検出可能な実体の測定を含みうる。捕捉体は、例えば、切断可能な結合により固相へ付着しうる。代替的に、検出可能な反応物における検出可能な基が、反応物の他の部分に切断可能なリンカーにより結合してもよい。例えば、US 4,231,999(Pharmacia Diagnostics AB)参照。複合体の形成およびその後の洗浄後、必要に応じて、切断可能なリンカー/結合は開裂され、反応物/固相由来で検出可能な基を含む断片は、それらが測定される検出マイクロキャビティの下流へ輸送される。もう一つの代替は、検出可能な基が、測定のために下流へ輸送されうる可溶性生成物を生じる反応系における反応物であるということである。後者の代替を可能にする適切な反応系は、酵素系を含む生体触媒系などの触媒系を含み、その場合、検出可能な基は、触媒、共触媒、補因子、基質、補基質、インヒビター、エフェクターなどの触媒系の構成要素でありうる。酵素系について、関連する構成要素は、酵素、補酵素、補因子、基質、補基質、インヒビター、アクチベーター、エフェクターなどである。
【００８２】
固相に捕捉される第1のシグナル発生基を含む検出可能な反応物は、固相に捕捉された時、第1の基と協同して適切なシグナルを生じる第2のシグナル発生基を含む検出可能な反応物と組み合わせてもよい。この第2の基は、その2つの基が共に適切なシグナルを生じるように選択されうる。この変形型は、シンチレーション近接アッセイ(SPA)で例証されうる。相互作用する標識を用いる原理はまた、同一または異なりうるフルオロフォアのペアで、および蛍光-クエンチャーのペアで例証されうる。
【００８３】
なおもう一つの変形型において、捕捉体は、分析物および/または検出可能な反応物が固相に捕捉される時、例えば、捕捉体と分析物/検出可能な反応物との間の続いて起こる近接の結果として、シグナルが変化するシグナル発生基と結合している。
【００８４】
流動状態または静止状態中の反応
可溶性反応物と、反応が起こっているマイクロキャビティ(114a〜h)の特定の領域(104a〜h)に固定されている固相との間の反応は、好ましくは、流動状態下で起こる、すなわち、反応物を含む液体は、反応中、層を通って連続的に流れている。可溶性反応物は、分析物、検出可能な反応物、固定化可能な捕捉体、アッセイ中に形成される固定化可能な複合体などでありうる。固相は、典型的には、固定化された捕捉体、もしくは分析物を含む固定化された複合体、または単に固定化基を曝露する。適切な流速は、(a)捕捉体または固定化基の反応性；(b)可溶性反応物の反応性；(c)多孔質層の容積；(d)多孔質層の種類(固相材料、多孔度、層、またはコーティング内壁など)などのいくつかの因子に依存する。
【００８５】
通過する反応物または複合体の捕捉が、主にマイクロキャビティ(114a〜h)に定位置(104a〜h)をもつ多孔質層などの固相の上流部分で起こるように、典型的には、最も下流部分、すなわち、固相/領域の出口末端部では、捕捉がほとんど起こらないように、流速を設定することが何倍も好ましい。
【００８６】
典型的には、流速は、多孔質層などの固相により捕捉される実体を含む液体について、≧0.010秒間、例えば、≧0.050秒間または≧0.1秒間の滞留時間を生じると考えられる。滞留時間の上限は、典型的には、2時間未満、例えば、1時間未満である。例証的な流速は、0.001〜10000nL/秒内、例えば、0.01〜1000nL/秒または0.01〜100nL/秒または0.1〜10nL/秒である。これらの流速区間は、主として、1〜1000nLの範囲、例えば、1〜200nLまたは1〜50nLまたは1〜25nLの範囲の固相体積において有用でありうる。滞留時間は、反応マイクロキャビティにおいて液体アリコートが固相を通過するのにかかる時間を指す。最適化は、典型的には、n個のマイクロチャネル構造/形式/分析物をお互いに対して平衡にする実験を必要とする。
【００８７】
固相を通過する液体の流れは、好ましくは、適応したマイクロ流体装置における流路の毛管力と組み合わされる遠心力である、例えば、動電学的または非動電学的に生じた力などの、原理上いかなる種類の力によっても作動することができる。詳しくは下記参照。
【００８８】
試料
マイクロチャネル構造において輸送および処理される液体試料は、典型的には水性であり、希釈液、洗浄液、ならびに/または、分析物などの反応物、ならびに/または固定化されたもしくは固定化可能な捕捉体および検出可能な反応物などの試薬を含む液体でありうる。輸送される固定化された反応物は、典型的には、懸濁形状であり、好ましくは、反応物が、懸濁した粒子に固定化されている。マイクロチャネル構造へ、および/または固相を含むマイクロキャビティへ導入される分析物試料は、未処理の生体液試料でありうる、またはそのような液体に由来しうる。この関連における処理は、(a)試料に存在して、固相を含むマイクロチャネル構造またはマイクロキャビティへ導入されるような分析物の形状へ本来の分析物を変換する(すなわち、分析物関連実体への変換)段階、(b)希釈する段階、(c)細胞および/または他の粒状材料の除去などを含みうる。好ましい変形型において、本明細書の他の箇所で記載されているような希釈されていない本来の分析物は、n個のマイクロチャネル構造/形式の少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上に用いられる。希釈されていない分析物試料は、血液、血清または血漿などの様々な液体血液画分、涙液、吐出された液体、尿、汗、脳脊髄液、胃液、唾液、リンパ液、または次の段落に示された他の例のいずれかでありうる。
【００８９】
「生体液」という用語は、分析物、捕捉体、および検出可能な反応物について上で示された種類の構造を示す生物有機化合物を含む任意の液体を企図する。より狭い意味において、この用語は、このような生物有機化合物を含み、かつ組成物が生きている生物材料または死んだ生物材料によって少なくとも一部分は決定されている液体に由来する液体を企図する。典型的な生体液、特に、分析物を含む試料が由来しているものには、細胞培養懸濁液、組織ホモジネート、血液、および血清または血漿などの様々な血液画分、涙液、吐出された液体、尿、汗、精液、脳脊髄液、胃液、唾液、リンパ液など、加えて、上記で考察されているような生物有機化合物を含む、およびこれらの特定の生体液由来の様々な液体調製物が挙げられる。抗体、ホルモン、細胞伝達物質、免疫調節物質などから選択される分析物について、分析物を含む液体試料は、典型的には、分析物を含む上記で考察された種類の脊椎動物体液に由来する。例えば、n個の分析物の1個が抗体、ホルモン、細胞伝達物質、免疫調節物質などである場合には、上で示された体液の選択された1つに由来する少なくとも1つの分析物試料は、すべてのn個の分析物を定量化するために用いられる。典型的な脊椎動物は、哺乳動物、鳥、両生類、爬虫類などである。典型的な哺乳動物は、クジラ、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなどである。典型的な鳥は、ニワトリ、カナリヤ、セキセイインコなどである。両生類および爬虫類の中では、ペットとして用いられるもの、または動物園で一般的なものが挙げられる。
【００９０】
マイクロ流体装置
マイクロ流体装置は、μL範囲、典型的には、ナノリットル(nL)範囲の体積を有する1つまたは複数の液体アリコート/試料が輸送および/または処理される、1つ、2つ、またはそれ以上のマイクロチャネル構造(101a〜h)を含む装置である。これらのアリコート/試料の少なくとも1つは、捕捉体、および/または検出可能な反応物、または可溶性生成物など、および/または緩衝液、および/または同様なものなどの分析物ならびに試薬の中から選択される1つまたは複数の反応物を含む。μL範囲は、≦1000μL、例えば、≦100μLまたは≦10μLの体積を企図し、5000nLの上端をもつnL範囲を含むが、多くの場合、≦1000nL、例えば≦500nLまたは≦100nLの体積に関する。nL範囲は、ピコリットル(pL)範囲を含む。マイクロチャネル構造は、≦103μm、好ましくは≦5x102μm、例えば、≦102μmの断面寸法を有する、1つもしくは複数の空洞および/または導管を含む。
【００９１】
従って、マイクロチャネル構造(101a〜h)は、以下の中から選択される1つ、2つ、3つ、またはそれ以上の機能的ユニットを含みうる：(a)例えば、入口ポート/入口開口部(105a〜b、107a〜h)を、場合によっては、体積規定ユニット(106a〜h、108a〜h)(装置内で処理される液体アリコートを計量するための)と共に含む入口装置(102、103a〜h)；(b)液体輸送のための微小導管；(c)反応マイクロキャビティ(114a〜h)；(d)混合マイクロキャビティ/ユニット；(e)液体から粒状物質を分離するためのユニット(入口装置に存在してもよい)；(f)試料における溶解または懸濁した成分を、例えば、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィーなどにより、お互いから分離するためのユニット；(g)検出マイクロキャビティ；(h)廃棄物導管/マイクロキャビティ(112、115a〜h)；(i)バルブ(109a〜h、110a〜h)；(j)環境大気への通気孔(116a〜i)；液体分流(液体ルーター)など。機能的ユニットは、いくつかの機能性を有してもよい、例えば、マイクロキャビティ(114a〜h)は、反応の実行、および測定/検出の両方に用いてもよい。
【００９２】
懸濁した粒子の形状をとるまたは多孔質層としての固相について、意図されるマイクロキャビティ(114a〜h)は、典型的には、固相が、形式に用いられる反応物の1つまたは複数、特に分析物、捕捉体、および検出可能な反応物の1つまたは複数を含む意図された反応の前、反応中、または反応の後に置かれうるまたは置かれる、領域または他の種類の場所(104a〜h)を含む。この領域または場所(104a〜h)は、典型的には、マイクロキャビティ(114a〜h)の出口末端と密接に連関する位置にある。
【００９３】
マイクロ流体装置における様々な種類の機能的ユニットは、Gyros AB/Amersham Pharmacia Biotech AB: WO 99055827、WO 99058245、WO 02074438、WO 02075312、WO 03018198、WO 04103890、WO 05032999、WO 05094976、WO 05072872、PCT/SE2005/001887；Tecan/Gamera Bioscience WO 01087487、WO 01087486、WO 00079285、WO 00078455、WO 00069560、WO 98007019、WO 98053311などにより記載されている。このリストには、対応する発行された米国特許および公開された米国特許出願が含まれる。
【００９４】
有利な形状において、親水性多孔質層のために意図されたマイクロキャビティ(114a〜h)は、それぞれが入口ポート(105a〜b、107a〜h)および少なくとも1つの体積規定ユニット(106a〜h、108a〜h)を含む、1つまたは複数の入口装置(102、103a〜h)に接続されている(上流方向)。一つの種類の入口装置(103a〜h)は、固相材料を含むように意図された唯一のマイクロチャネル構造(101a〜h)および/またはマイクロキャビティ(114a〜h)に接続されている(個々の入口)。もう一つの種類の入口装置(102)は、固相材料を含むように意図された、全部またはサブセット(100)のマイクロチャネル構造(101a〜h)および/またはマイクロキャビティ(114a〜h)に共通している。後者の変形型は、典型的にはサブセット(100)の各マイクロチャネル構造/マイクロキャビティ(101a〜h/114a〜h)について1つの体積規定ユニット/体積計量マイクロキャビティ(106a〜h)を有する分配マニホールドと組み合わされている、共通の入口ポート(105a〜b)を含む。両方の変形型において、体積計量マイクロキャビティ(106a〜h、113a〜h)を含む体積規定ユニット(106a〜h、108a〜h)のそれぞれは、そのマイクロチャネル構造(101a〜h)の下流部分、例えば、マイクロキャビティ(114a〜h)、と連通している。各体積規定ユニット/体積計量マイクロキャビティ(106a〜h、108a〜h/106a〜h、113a〜h)は、典型的には、その出口末端にバルブ(109a〜h、110a〜h)を有する。このバルブは、典型的には、例えば、親水性表面と疎水性表面の間の境界(疎水性表面破断)などの出口末端での化学的表面特性における変化(WO 99058245、WO 2004103890、WO 2004103891、およびUS SN 10/849,321 (Amersham Pharmacia Biotech ABおよびGyros AB))、および/または幾何学的/物理的表面特性における変化(WO 98007019(Gamera)))を利用する、受動バルブである。
【００９５】
規定/計量される体積は、マイクロチャネル構造においてさらに下流に輸送され処理される液体アリコートの体積である。
【００９６】
入口ポート、体積規定ユニット、分配マニホールド、バルブなどを有する典型的な入口装置は、WO 02074438、WO 02075312、WO 02075775、およびWO 02075776(すべてGyros AB)に提示されている。
【００９７】
各マイクロチャネル構造は、液体用の少なくとも1つの入口開口部(105a〜b、107a〜h)、ならびに過剰な空気用(通気孔)(116a〜i、112)および場合によってはまた液体用(廃棄物チャネルにおける環(112))の少なくとも1つの出口開口部を有する。
【００９８】
本発明に用いられるマイクロ流体装置は、上記に挙げられた少なくともn個のマイクロチャネル構造を含む。装置は、典型的には、合計で≧10個、例えば、≧25個、または≧90個、または≧180個、または≧270個、または≧360個のマイクロチャネル構造を含む。
【００９９】
機能的ユニットの2個またはそれ以上の間でマイクロ流体装置/マイクロチャネル構造内で液体を輸送するのに、異なる原理を利用してもよい。例えば、次の段落に考察されているようにディスクをスピンさせることにより、慣性力を用いてもよい。他の有用な力は、毛管力、界面動電力、毛管力、静水圧などの非界面動電力である。
【０１００】
マイクロ流体装置は、典型的には、ディスクの形状をとる。好ましい形式は、ディスク面に対して直角をなす、またはディスク面と一致する対称軸(Cn)を有し、nは≧2、3、4、または5の整数、好ましくは∞(C∞)である。換言すれば、ディスクは、正方形などの長方形、および他の多角形の形状でありうるが、好ましくは円形である。典型的にはディスク面に対して直角をなす、または平行であるスピン軸の周りに装置をスピンさせることは、必要な遠心力を生じうる。スピン軸がディスク面に対して直角をなす変形型は、WO 04050247(Gyros AB)に示されている。
【０１０１】
好ましい装置は、典型的には、通常のCDの形と類似したサイズおよび/または形状を有する、例えば、通常のCD直径(12cm)をもつ円形ディスクの10%から300%までの幅のサイズを有するディスク型である。
【０１０２】
マイクロチャネル構造における内部表面の「湿潤性の」(親水性)および「湿潤性でない」(疎水性)という用語は、表面が、それぞれ、水接触角≦90°または≧90°を有することを企図する。マイクロチャネル構造の異なる機能的部分の間における液体の効率的な輸送を促進するために、個々の部分の内部表面は、第一に湿潤性であると考えられ、好ましくは、接触角が≦60°、例えば、≦50°または≦40°または≦30°または≦20°である。これらの湿潤性値は、内壁または微小導管の少なくとも1個、2個、3個、または4個にあてはまる。内壁の1つまたは複数がより高い水接触角を有する、例えば、疎水性である場合、これは、他の内壁の1つまたは複数のより湿潤性の表面で代償されうる。湿潤性、特に入口装置における湿潤性は、用いられる水性液体が、いったん液体がマイクロキャビティ/微小導管に入り始めると、毛管現象(自己吸引)によって意図されたマイクロキャビティ/微小導管を満たすことができるように適応すると考えられる。マイクロチャネル構造における親水性内部表面は、例えば、受動性バルブ、抗ウィッキング手段、主に環境大気への通気孔として機能する通気孔などを導入するために、親水性内壁において1つまたは複数の局所的な疎水性表面の断絶を含んでもよい(図1における長方形)。例えば、WO 99058245、WO 02074438、US 20040202579、WO 2004105890、WO 2004103891(すべてGyros AB)参照。
【０１０３】
試料における分析物の量の関数である量で固定化可能な親和性複合体を生成するための可溶性反応物の混合および/またはインキュベーションを含む形式についての典型的なマイクロチャネル構造(固定化可能な形式における捕捉体、検出可能な反応物、分析物、および他の反応物)は、2005年12月に出願されたPCT/SE2005/001887(Gyros Patent AB)および対応する通常の米国出願「Microfluidic assays and microfluidic devices」に記載されている。WO 02075312(Gyros AB)も参照(図1および2参照)。このようなマイクロチャネル構造において、典型的には、固相を含むマイクロキャビティの上流での第一の混合機能、およびそれらの間に、場合によっては、第一の混合機能と少なくとも部分的に一致するまたは一致しない第一のインキュベーションマイクロキャビティがある。混合機能は、混合される液体および/または反応物の数に依存して1つ、2つ、またはそれ以上の入口を含みうる。得られた混合物は、場合によっては、混合物における反応物がお互いに反応して、親和性複合体を固定化できる固相を含むマイクロキャビティへ輸送する前に親和性複合体を形成することができる第一のインキュベーションマイクロキャビティを経由して、固相を含むマイクロキャビティの下流へ輸送される。第一の混合機能の上流で、かつこの混合機能の入口の1つまたは複数と流体連通した、1つまたは複数のさらなる混合機能がある場合があり、それらのそれぞれは、第一の混合機能が第一のインキュベーションマイクロキャビティと連関しているのと同じ様式でインキュベーションマイクロキャビティと連関していてもしていなくてもよい。場合によっては第一の混合機能と固相を含むマイクロキャビティとの間、例えば、第一のインキュベーションマイクロキャビティの上流および/または下流の流路に接続したインキュベーションマイクロキャビティと組み合わされる、さらなる混合機能もあってもよい。これらのさらなる混合機能/インキュベーションマイクロキャビティは、典型的には、固相を含むマイクロキャビティと第一の混合機能との間の流路の分岐として存在する。このようなマイクロチャネル構造の入口は、典型的には、構造内で処理される液体アリコートを装置上で計量するために、それらの入口に体積規定ユニットを有する。体積規定ユニットは、個々の入口に、または例えば分配マニホールドにおける2つまたはそれ以上の構造に共通した入口に連関してもよい。図1における入口装置(103a〜h)と(102)をそれぞれ比較されたい。
【０１０４】
実施例
この実施例は、喘息(アレルゲン関連喘息または内因性喘息)の症状をもつ患者の血清において、4個の分析物のパネルを定量化することを示唆する。
【０１０５】
分析物およびアッセイ形式
2009533653.tif 000003
【０１０６】
さらなる分析物、例えば、プロスタグランジンEをパネルに追加することができる。これらのさらなる分析物は、上記に示された4つの形式のうちの1つもしくは複数により、または他の形式により、定量化されうる。
【０１０７】
マイクロ流体装置および計測手段
マイクロ流体装置は、WO 04083108(Gyros AB)およびWO 04083109(Gyros AB)に示されたものと同じである。固相は、フェニルデキストランでコーティングされたポリスチレン粒子であり、それにストレプトアビジンが固定化され、マイクロキャビティ(114a〜h)の最も下流の領域(104a〜h)の層/カラムにパッキングされている。処理に用いられる器械は、いずれも、Gyros AB Uppsala, Swedenの製品である、レーザー蛍光検出器を備えたGyrolab Workstation、およびマイクロ流体ディスクBioaffy CDマイクロラボラトリーである。
【０１０８】
試薬の調製：
固定化可能な捕捉体：
試薬は、抗IgE(分析物1について)、アレルゲン/抗原(分析物(分析物1および2について))、抗炎症マーカー(分析物4について)、およびウシ血清アルブミン(ナンセンス固定化反応物について)のビオチン化形態である。ビオチン化および検査は、過剰なビオチンの除去に十分な注意を払って、本質的にはWO 0483108、WO 0483109、PCT/SE2006/000071(すべてGyros AB/Gyros Patent AB)においてビオチン化試薬について記載されているように行われる。
【０１０９】
検出可能な試薬：
試薬は、抗IgE(分析物1について)、アレルゲン/抗原(分析物2および3について)、および炎症マーカー(分析物4について)のフルオロフォア標識型である。Alexaフルオロフォア647での標識および検査は、過剰なフルオロフォアの除去に十分な注意を払って、本質的にはWO 0483108、WO 0483109、PCT/SE2006/000071(すべてGyros AB/Gyros Patent AB)において標識について記載されているように行われる。重合体担体が、炎症マーカーなどの低分子量分析物について好ましい可能性が最も高く、好ましくは、PCT/SE2005/001887(Gyros AB/Gyros Patent AB)に概略が述べられているように用いられる。
【０１１０】
限定された量の固定化捕捉体の最適化：
競合物質としてBSA-ビオチンを用いる競合条件は、本質的にPCT/SE2006/000071(Gyros Patent AB)に記載されているとおりである。
【０１１１】
アッセイ手順
活性化段階1：
捕捉体を、ビオチン化試薬の個々の入口ポート(107a〜h)への導入(過剰ビオチン化抗IgEを107a〜bへ、過剰ビオチン化アレルゲン/抗原を107c〜dへ、最適化混合ビオチン化アレルゲン/抗原およびビオチン化BSA(過剰のビオチン)を107e〜fへ、ならびに最適化混合のビオチン化炎症マーカーおよびビオチン化BSA(過剰のビオチン)を107g〜hへ)により、マイクロキャビティ(114a〜h)におけるカラム(104a〜h)上へ固定化する。その後、ディスクをスピンさせ、それにより、試薬をマイクロキャビティ(114a〜h)へ移動させて固相(104a〜h)を通過させ、それによりそれらのそれぞれの上に捕捉体を導入する。
【０１１２】
段階1：分析物の捕捉
希釈されていない血清試料を共通の入口ポートへ導入して、分配マニホールドにおける体積規定ユニット(106a〜h)を満たす。その後、ディスクをスピンさせ、それにより、各体積規定ユニットにおける液体をその下流のマイクロキャビティ(114a〜h)へ移動させて、分析物が捕捉される対応カラム(104a〜h)を通過させる。
【０１１３】
段階2：段階2において捕捉された分析物の量の測定
フルオロフォア標識反応物を、個々の入口ポート(107a〜h)を経由して導入する。フルオロフォア標識抗IgEは、入口ポート(107a〜b)経由、フルオロフォア標識アレルゲン/抗原は入口ポート(107c〜f)経由、およびフルオロフォア標識炎症マーカーは入口ポート(107g〜h)経由である。カラム由来の蛍光は、フルオロフォア標識試薬の導入前ならびに導入および洗浄の後に、3つの異なるPMT設定で測定される。試薬または分析物を含む液体のそれぞれを追加する前、間、および後に別々の洗浄段階もあると考えられる。次の段落に示されたスピンプロトコールを参照。
【０１１４】
スピン段階および検出/測定段階は以下でありうる。
最初のニードル洗浄：粒子洗浄1、粒子洗浄スピン1、粒子洗浄2構造、粒子洗浄2共通、および粒子洗浄スピン2
捕捉試薬付加構造：捕捉試薬スピン、捕捉試薬洗浄1
分析物付加共通：分析物スピン、分析物洗浄1、分析物洗浄スピン1、分析物洗浄2、および分析物洗浄スピン2
CDアラインメント1：検出バックグラウンドPMT1%、検出バックグラウンドPMT5%、および検出バックグラウンドPMT25%、スピンアウト
検出試薬付加構造：検出試薬スピン、検出試薬洗浄1、検出試薬洗浄スピン1、検出試薬洗浄2、検出試薬洗浄スピン2、検出試薬洗浄3、検出試薬洗浄スピン3、検出試薬洗浄4、検出試薬洗浄スピン4
CDアラインメント2：検出PMT1%、検出PMT5%、検出PMT25%
【０１１５】
本発明の特定の革新的な局面は、添付された特許請求の範囲により詳細に定義されている。本発明およびその利点は詳細に記載されているが、添付された特許請求の範囲により定義されている本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更、置換、および改変が本明細書に対してなされうることは理解されるはずである。さらに、本出願の範囲は、本明細書に記載された過程、機械、製造、組成物、手段、方法、および段階の特定の態様に限定されることを意図しない。当業者にとって本発明の開示から容易に明らかであるように、本明細書に記載された対応する態様と、実質的に同じ機能を実行する、または実質的に同じ結果を達成する、現行のまたは今後開発される予定である過程、機械、製造、組成物、手段、方法、または段階が、本発明に従って利用されうる。従って、添付された特許請求の範囲は、そのような過程、機械、製造、組成物、手段、方法、または段階をその範囲内に含むことが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】示された実施例に用いられることが示唆される1セットのマイクロチャネル構造を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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