(57)【要約】本明細書に記載する発明は、変異体ＳＲＣキナーゼタンパク質、およびそのような変異体ＳＲＣキナーゼタンパク質を発現する細胞が関連する疾患、例えば、癌の管理に有用な診断および治療法および組成物に関する。
2009501523.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物を用いた治療に対するプロテインチロシンキナーゼ関連疾患を罹患する個体の応答性を決定する方法であって、該個体は、第一のキナーゼインヒビターで以前に治療を受けていて第一のキナーゼインヒビターに対して少なくとも部分的に耐性になっているかまたはキナーゼインヒビターを用いた治療を受けたことがなく、（ａ）該個体から生物学的試料を得；（ｂ）ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼ配列中の少なくとも１の突然変異の存在について該生物学的試料をスクリーニングすることを含み、その際、該少なくとも１の突然変異の存在が、該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物；一層高い投与量または投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物；または該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物とチューブリン安定化剤、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｔ３１５Ｉインヒビターおよび／または他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；または該１またはそれ以上の組み合わせとより高い投与量または投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物との両者のいずれかによる治療を患者が必要であることを示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
該変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼが、構成的に活性な該ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼという結果となるアミノ酸変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該プロテインチロシンキナーゼ関連疾患が、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｐｈ＋ＡＬＬ、ＡＭＬ、イマチニブ耐性ＣＭＬ、および固形腫瘍よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼが、イマチニブ耐性ＢＣＲ／ＡＢＬ突然変異またはプロテインチロシンキナーゼインヒビター耐性突然変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該イマチニブ耐性ＢＣＲ／ＡＢＬ突然変異またはプロテインチロシンキナーゼインヒビター耐性突然変異が、配列番号２の244, 250, 252, 253, 255, 315, 317, 351, 355, 359, 396および486位のアミノ酸における突然変異を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該突然変異が、配列番号２のM244V, G250E, Q252H, Q252R, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F317L, M351T, E355G, F359V H396R,およびF486Sよりなる群から選ばれたものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該生物学的試料が、組織生検、血液、血清、血漿、リンパ液、腹水、嚢胞液、尿、痰、大便、唾液、気管支吸引液、脊髄液および毛髪よりなる群から選ばれたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該生物学的試料が、組織生検細胞試料またはそれから培養した細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該生物学的試料が（ａ）血球；（ｂ）固形腫瘍から採った細胞；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）の細胞試料の溶解液よりなる群から選ばれた成員を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
プロテインチロシンキナーゼ関連疾患を罹患する個体を治療する方法であって、（ａ）該個体から生物学的試料を得；（ｂ）変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼの存在について該生物学的試料をアッセイし；ついで変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼが同定された場合は、（ｃ）治療学的有効量の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物を単独またはイマチニブと組み合わせて投与することを含む方法。
【請求項１１】
該変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼが、ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼ（配列番号２）の244, 250, 252, 253, 255, 315, 317, 351, 355, 359, 396および486位のアミノ酸における突然変異を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該突然変異が、配列番号２のM244V, G250E, Q252H, Q252R, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F317L, M351T, E355G, F359V H396R,およびF486Sよりなる群から選ばれたものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
プロテインチロシンキナーゼ関連疾患を罹患する個体を治療する方法であって、（ａ）該個体から生物学的試料を得；（ｂ）第一のキナーゼインヒビターに対する少なくとも部分的な耐性について該生物学的試料をアッセイし；（ｃ）変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼの存在について該生物学的試料をアッセイし；該生物学的試料が該第一のキナーゼインヒビターに対して少なくとも部分的に耐性であり、変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼを含むと決定された場合は、ついで（ｄ）治療学的有効量の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド、または薬理学的に許容しうるその塩または水和物；より高い投与量または投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物；または該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物とチューブリン安定化剤、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｔ３１５Ｉインヒビターおよび／または他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；または該１またはそれ以上の組み合わせとより高い投与量または投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩の両者を投与することを含む方法。
【請求項１４】
該第一のキナーゼインヒビターがＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼインヒビターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼが、配列番号２の244, 250, 252, 253, 255, 315, 317, 351, 355, 359, 396および486位のアミノ酸における突然変異を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
該突然変異が、配列番号２のM244V, G250E, Q252H, Q252R, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F317L, M351T, E355G, F359V H396R,およびF486Sよりなる群から選ばれたものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該第一のキナーゼインヒビターがイマチニブを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
プロテインチロシンキナーゼ関連疾患を罹患する個体に対する治療処方を確立する方法であって、（ａ）該個体から生物学的試料を得；（ｂ）ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼ配列における少なくとも１の突然変異の存在について該生物学的試料をアッセイし；ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼ配列において少なくとも１の突然変異が存在する場合は、（ｃ）該個体に治療処方の一部として、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド、または薬理学的に許容しうるその塩または水和物を含む医薬組成物；より高い投与量または投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物；または該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物とチューブリン安定化剤、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｔ３１５Ｉインヒビターおよび／または他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；または該１またはそれ以上の組み合わせとより高い投与量または投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩の両者を投与することを含む方法。
【請求項１９】
該少なくとも１の突然変異が、配列番号２の244, 250, 252, 253, 255, 315, 317, 351, 355, 359, 396および486位のアミノ酸における突然変異を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該医薬組成物が少なくとも１のさらなるキナーゼインヒビターを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
該突然変異が、M244V, G250E, Q252H, Q252R, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F317L, M351T, E355G, F359V H396R,およびF486Sよりなる群から選ばれたものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
プロテインチロシンキナーゼ関連疾患を罹患する個体に対する治療処方を確立する方法であって、（ａ）該個体から生物学的試料を得；（ｂ）第一のキナーゼインヒビターに対する少なくとも部分的な耐性について該生物学的試料をアッセイし；（ｃ）ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼ配列における少なくとも１の突然変異の存在について該生物学的試料をアッセイし；該生物学的試料が該第一のキナーゼインヒビターに対して少なくとも部分的に耐性であり、変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼを含むと決定された場合は、ついで（ｄ）該個体に治療処方の一部として、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド、より高い投与量または投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物；または該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物とチューブリン安定化剤、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｔ３１５Ｉインヒビターおよび／または他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；または該１またはそれ以上の組み合わせとより高い投与量または投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩の両者を投与することを含む方法。
【請求項２３】
変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼ関連疾患を罹患する個体を治療する方法であって、（ａ）該個体から生物学的試料を得；（ｂ）変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼの存在について該生物学的試料をアッセイし、その際、該変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼは構成的に活性であり；構成的に活性な変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼが該試料に存在する場合は、ついで（ｃ）該個体に、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド、より高い投与量または投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物；または該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物とチューブリン安定化剤、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｔ３１５Ｉインヒビターおよび／または他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；または該１またはそれ以上の組み合わせとより高い投与量または投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩の両者を投与することを含む方法。
【請求項２４】
治療学的有効量の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド、より高い投与量または投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物；または該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物とチューブリン安定化剤、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｔ３１５Ｉインヒビターおよび／または他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；または該１またはそれ以上の組み合わせとより高い投与量または投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩の両者を投与することを含む、変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼ関連疾患を罹患する個体を治療する方法。
【請求項２５】
プロテインチロシンキナーゼ関連疾患を罹患する個体に対する治療戦略を決定するのに用いるキットであって、（ａ）該患者からの生物学的試料において変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼを検出する手段；および任意に（ｂ）使用およびキットの結果の解釈についての説明書を含むキット。
【請求項２６】
該治療戦略が、治療学的有効量の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド、または薬理学的に許容しうるその塩または水和物、より高い投与量または投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物；または該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物とチューブリン安定化剤、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｔ３１５Ｉインヒビターおよび／または他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；または該１またはそれ以上の組み合わせとより高い投与量または投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩の両者の投与を含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼ関連疾患を罹患する個体を治療するのに用いるキットであって、（ａ）該患者からの生物学的試料からのＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼの244, 250, 252, 253, 255, 315, 317, 351, 355, 359, 396および486位のアミノ酸における突然変異を検出する手段；（ｂ）治療学的有効量の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド、または薬理学的に許容しうるその塩または水和物；より高い投与量または投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物；または該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物と、チューブリン安定化剤、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｔ３１５Ｉインヒビターおよび／または他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；またはより高い投与量または投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩の両者を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、35 U.S.C.119(e)のもと、2005年7月15日に出願された米国仮特許出願第60/699,675号の利益を主張する。この関連出願の全教示を参照のため本明細書に引用する。
【０００２】
本発明は、変異体ＳＲＣキナーゼタンパク質、およびそのような変異体ＳＲＣキナーゼタンパク質を発現する細胞が関与する疾患、例えば、癌の管理において有用な診断および治療方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌は、冠状動脈性心疾患に次いで２番目の主たるヒト死因である。世界中で何百万もの人々が毎年癌で亡くなっている。米国だけでも癌は５０万を優に超える人々の死を毎年惹き起こし、１年に１４０万ほどの人々が新たに癌と診断されている。心疾患による死は有意に減少してきているが、癌による死は一般に上昇傾向にあり、先進世界で主たる死因になると予測されている。
【０００４】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、フィラデルフィア染色体転座を特徴とする骨髄細胞増殖性疾患である（例えば、C. L. Sawyers, N. En. J. Med. 340, 1330 (1999);およびS. Faderlら、N. Engl. J. Med. 341,164 (1999)を参照）。第９染色体と第２２染色体との間での相互転座は、腫瘍形成性のＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質を生成する。ＢＣＬ−ＡＢＬタンパク質はチロシンキナーゼ活性を構成し、ＣＭＬ様疾患をマウスで引き起こすことが知られている（例えば、J. B. Konopkaら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 82, 1810 (1985); G. Q. Daleyら、Science 247, 824 (1990);およびN. Heisterkampら、Nature 344, 251 (1990)を参照）。事実、ＣＭＬの９５％はフィラデルフィア陽性（Ph+）である。ＢＣＲ−ＡＢＬ上での単一の変異がＣＭＬ疾患の発症に十分である（D.G. Savage, K. H. Antman, NEJM 346(9) (2002)）。
【０００５】
ＣＭＬは明確な臨床ステージにより進行する。最も早いステージは慢性期と呼ばれ、最終的に（terminally）分化した好中球の拡張を特徴とする。数年を経て疾患は急性転化と呼ばれる急性期（過剰な数の未分化骨髄またはリンパ系先祖細胞を伴う成熟の阻止を特徴とする）に進行する。ＢＣＲ−ＡＢＬ癌遺伝子はすべてのステージで発現されるが、急性転化は複数の追加の遺伝子および分子変化を特徴とする。
【０００６】
イマチニブメシラート（Imatinib mesylate；ＳＴＩ−５７１としても知られる）は強力なＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼインヒビターであり、今やＣＭＬ患者の標準となっている。本明細書において「イマチニブ」の語はイマチニブメシラートまたはＳＴＩ−５７１を指すものとして用いられる。イマチニブは野生型ＢＣＲ−ＡＢＬのキナーゼ活性の強力なインヒビターではあるけれども、多くの変異体ＢＣＲ−ＡＢＬイソ型は臨床的に有効な投与量のイマチニブに対して耐性である。臨床的な耐性は、主としてＢＣＲ−ＡＢＬのキナーゼドメイン内での突然変異によって、および程度は低いがＢＣＲ−ＡＢＬゲノム遺伝子座の増幅によって媒体される（M. E. Gorreら、Science 193, 876 (2001)）。イマチニブはＡＢＬのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）結合部位にその活性化ループが「閉じている」ときにのみ結合することができ、かくして該タンパク質は不活性なコンホメーションとなる。このコンホメーション特異的な要件は、イマチニブの選択性およびＣＭＬ患者で示される耐性に寄与する。
【０００７】
ＡＢＬキナーゼドメインにおける突然変異は、ＣＭＬ患者における耐性と関係付けられている（N. von Bubnoff, F. Schneller, C. Peschel, J. Duyster, Lancet 359, 487 (2002)およびS. Branfordら、Blood 99, 3472 (2002)）。今日まで、ＡＢＬキナーゼドメイン内の１７の異なるアミノ酸位が同定されている。アミノ酸置換の大部分は、キナーゼドメインの柔軟性の能力を損なうことで、ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼドメインがイマチニブの結合に必要とされる最適の不活性なコンホメーションをとることができないようにすることによって耐性を惹き起こすと考えられている（N. P. Shahら、Cancer Cell 2, 117 (2002)；参照のため本明細書に引用する）。
【０００８】
野生型ヒトＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質の１文字アミノ酸配列を図１（配列番号２；gi|177942;およびgi|M14752.1）に示す。変異体を図２に示す。ＢＣＲ−ＡＢＬの核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１〜３６８１によってコードされる（gi|177942;およびgi|M14752.1）。
【０００９】
‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-(6-(4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル)-2-メチルピリミジン-4-イルアミノ)チアゾール-5-カルボキサミドは、ＢＣＲ−ＡＢＬを含む幾つかのＳＲＣファミリーキナーゼの合成の小分子インヒビターである。構造的研究は、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドを含むプロテインチロシンキナーゼインヒビターがＡＢＬ中のＡＴＰ結合部位に結合するが、活性ループ（活性または不活性のコンホメーションであり得る）の位置に関わりなく結合することを示している（B. Nagarら、Cencer Res. 62, 4236 (2002)）。ＡＢＬキナーゼドメインへの結合に対するコンホメーションの条件が厳格でないことが、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドが多くのイマチニブ耐性変異体に対する活性を保持している一つの理由である。‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドは、細胞ベースのアッセイにおいて変異していないＢＣＲ−ＡＢＬ（ＢＣＲ−ＡＢＬ／ＷＴ）キナーゼ活性を抑制する点でイマチニブよりも強力であった。さらに、１５の異なる臨床的に関連するイマチニブ耐性のＢＣＲ−ＡＢＬイソ型のうち１４のキナーゼ活性が、低いナノモル範囲で首尾良く抑制された（N. P. Shahら、Science 305, 399 (2003)）。１〜１０ｎＭの範囲において、微妙だが極めて再現性の高い差違が、ある種のＢＣＲ−ＡＢＬ変異体イソ型の感度において存在する。例えば、F317L変異体を発現するBa/F3細胞（マウスの前Ｂリンパ球系）の増殖を抑制するには３〜１０倍高い濃度の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドが必要であるが、Q252R変異体は変異していないＢＣＲ−ＡＢＬよりも一貫して高感度である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＢＣＲ−ＡＢＬ変異体イソ型を含む細胞を用いてある種の癌で観察されるイマチニブ耐性に鑑みると、この条件に対処すべく工夫した診断および治療法および組成物に対する必要性が存在する。とりわけ、癌、肥満細胞症および変異体ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼが関与する関連疾患の治療に対する必要性が存在する。本明細書で提供される本発明はこの必要性を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
イマチニブは、ＣＭＬ患者において臨床的緩解をもたらし、従来の処置のモダリティーに比べて毒性が最小であるＢＣＲ／ＡＢＬチロシンキナーゼの小分子インヒビターである。イマチニブは今やＣＭＬに対する最前線の療法であるが、耐性に遭遇することが増えている。一つの研究によれば、イマチニブメシラートに対する耐性の２年の推定頻度は、急性転化期で８０％、移行期で４０％〜５０％、インターフェロンα療法失敗後の慢性期で１０％であった（Kantarjianら、Blood, 101(2):473-475 (2003)）。‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドは、ＡＴＰ競合性で二重のＳＲＣ／ＡＢＬインヒビターである（Lombardo, L. J.ら、J. Med. Chem., 47:6658-6661 (2004)）。注目すべきことに、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドは、イマチニブに対する臨床的耐性を獲得したＣＭＬ患者において認められるＢＣＲ−ＡＢＬイマチニブ耐性突然変異を抑制することが示された。異なるＳｒｃ突然変異、特にＢＣＲ／ＡＢＬ突然変異を有する患者が、イマチニブおよび‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドに対してそれぞれ様々な程度の耐性および／または感受性を有することの証明に基づき、本発明の発明者らは初めて、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドと他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターまたは他の薬剤との組み合わせから最も利益を受ける患者を同定する方法を記載するものである。
【００１２】
‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドの構造および抗癌剤としての使用は、Lombardo, L. J.ら、J. Med. Chem., 47:6658-6661 (2004)に記載されており、以下の米国特許および継続中の出願に記載されている：米国特許第6,596,746号（２００３年７月２２日特許；米国特許出願第10/395,503号（２００３年３月２４日出願）。
【００１３】
イマチニブの構造および抗癌剤としての使用は、B. J. Drukerら、N. Engl. J. Med. 344, 1031 (2001)およびS. G. O’Brienら、N. Engl. J. Med. 348, 994 (2003)に記載されている。
【００１４】
上記のように、ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼにおけるある種の突然変異は、イマチニブの治療効果に対する耐性を惹き起こす。増殖を抑制および／またはアポトーシスを誘発できる‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドの組み合わせまたは‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドの投与処方を用い、そのようなイマチニブ耐性ＢＣＲ／ＡＢＬ突然変異を含む癌細胞を有する患者の同定およびそのような患者の治療は、本発明の目的である。そのような細胞を有する患者においてイマチニブ治療に対して耐性の、または少なくとも部分的にイマチニブ耐性の、または少なくともプロテインチロシンキナーゼインヒビターに対して部分的に耐性の細胞株の増殖の抑制および／またはアポトーシスの誘発に有用なそのような方法が本明細書において提供される。
【００１５】
それゆえ、本発明は、１またはそれ以上のプロテインチロシンキナーゼの異常な活性と関連する疾患に罹患しているかまたは該疾患の素因を有する宿主、好ましくはヒトを診断および治療するための組成物、キットおよび方法を提供する。とりわけ、本発明は、変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼの異常な活性と関連する疾患に罹患した宿主において該ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼを同定する方法、および該変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼの同定に基づいて該宿主の改変した（tailoring）治療方法を提供する。
【００１６】
本発明は、異所性のまたは制御できない細胞増殖と関連する疾患および本明細書に記載するＳＲＣキナーゼ変異体の発現と関連する疾患をスクリーニングおよび診断するためのキットを提供する。
【００１７】
本発明は、生物学的試料、例えば、その増殖を抑制するのに用いたプロテインチロシンキナーゼインヒビターに応答しないか、または応答を停止したか、または応答の低弱した細胞をスクリーニングする方法を提供する。例えば、本発明は、イマチニブの治療を受けており、本明細書に記載するＳＲＣ突然変異の存在のためにイマチニブに応答しないか、または応答を停止したか、または応答の低弱した癌罹患個体からの細胞をスクリーニングする方法を提供する。本発明は、もしそれが存在するなら、そのような個体の治療を変更して該細胞の増殖を抑制することの根拠を提供するある種のＳＲＣ突然変異を提供する。
【００１８】
本発明は、そのアポトーシスを誘発するのに用いたキナーゼインヒビターに応答しないか、または応答を停止したか、または応答の低弱した細胞をスクリーニングする方法を提供する。例えば、本発明は、イマチニブの治療を受けており、本明細書に記載するＳＲＣ突然変異の存在のためにイマチニブに応答しないか、または応答を停止したか、または応答の低弱した癌罹患個体からの細胞をスクリーニングする方法を提供する。本発明は、もしそれが存在するなら、そのような個体の治療を変更して該細胞のアポトーシスを誘発することの根拠を提供するある種のＳＲＣ突然変異を提供する。
【００１９】
また、ＳＲＣ関連疾患、とりわけ変異体ＳＲＣ関連疾患を治療する方法であって、該疾患を罹患する患者から細胞の試料を得、本明細書に記載した１またはそれ以上のＳＲＣ突然変異などのＳＲＣ突然変異の存在について細胞をアッセイし、ついで該患者を併合処方または治療処方で治療して該細胞の増殖を抑制および／またはアポトーシスを誘発することを含む方法が提供される。
【００２０】
本発明は、癌を罹患する個体を治療する方法であって、該個体からの細胞をアッセイして該細胞中のＳＲＣキナーゼタンパク質における少なくとも１の突然変異の存在を決定し、その際、ＳＲＣキナーゼにおける該少なくとも１の突然変異は構成的に活性化された該ＳＲＣキナーゼという結果となるものであり、ついで該個体に下記よりなる群の成員の治療学的有効量を投与することを含む方法を包含する：‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとイマチニブとの組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとチューブリン安定化剤（例えば、パシタキソール、エポチロン、タキサンなど）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（例えば、化合物II）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドと他のプロテインチロシンキナーゼインヒビター、とりわけ本明細書に記載のイマチニブまたはＡＭＮ１０７などのＢＣＲ−ＡＢＬインヒビターとの組み合わせ；増大した投与頻度処方の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド；および本明細書に記載の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドを含む他の組み合わせまたは投与処方。
【００２１】
本発明はさらに、癌を罹患する個体を治療する方法であって、該個体からの細胞をアッセイして該細胞中のＳＲＣキナーゼタンパク質における少なくとも１の突然変異の存在を決定し、その際、該少なくとも１の突然変異は、配列番号２のM244V, G250E, Q252H, Q252R, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F317L, M351T, E355G, F359V H396R, およびF486Sよりなる群から選ばれたものであり、ついで該Ｓｒｃプロテインキナーゼにおける該突然変異が同定されたら、該個体に下記よりなる群の成員の治療学的有効量を投与することを含む方法を包含する：‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとイマチニブとの組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとチューブリン安定化剤（例えば、パシタキソール、エポチロン、タキサンなど）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（例えば、化合物II）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドと他のプロテインチロシンキナーゼインヒビター、とりわけ本明細書に記載のイマチニブまたはＡＭＮ１０７などのＢＣＲ−ＡＢＬインヒビターとの組み合わせ；増大した投与頻度処方の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド；および本明細書に記載の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドを含む他の組み合わせまたは投与処方。
【００２２】
本発明はさらに、癌（とりわけＳＲＣキナーゼ関連癌）を罹患する個体を治療する方法であって、該個体は該個体における癌細胞が耐性になっているかまたは少なくとも部分的に耐性になっている第一のキナーゼインヒビターの投与を受けているかまたは受けたことがあり、該個体からの細胞をアッセイして該細胞中のＳＲＣキナーゼタンパク質における少なくとも１の突然変異の存在を決定し、その際、ＳＲＣキナーゼにおける該少なくとも１の突然変異は該第一のキナーゼインヒビターに対して耐性であるかまたは少なくとも部分的に耐性である該癌細胞という結果となるものであり、ついで該ＳＲＣキナーゼタンパク質に少なくとも１の突然変異が存在するなら、下記よりなる群の成員の治療学的有効量を投与することを含む方法を包含する：‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとイマチニブ単独との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドと該第一のキナーゼインヒビターとの組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとチューブリン安定化剤（例えば、パシタキソール、エポチロン、タキサンなど）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（例えば、化合物II）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドと他のプロテインチロシンキナーゼインヒビター、とりわけ本明細書に記載のイマチニブまたはＡＭＮ１０７などのＢＣＲ−ＡＢＬインヒビターとの組み合わせ；増大した投与頻度処方の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド；および本明細書に記載の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドを含む他の組み合わせまたは投与処方。
【００２３】
本発明はさらに、癌（とりわけＳＲＣ関連癌）を罹患する個体を治療する方法であって、該個体は該個体における癌細胞が耐性になっているかまたは少なくとも部分的に耐性になっているイマチニブなどのＢＣＲ−ＡＢＬインヒビターの投与を受けているかまたは受けたことがあり、該個体からの細胞をアッセイして該細胞中のＳＲＣキナーゼタンパク質における少なくとも１の突然変異の存在を決定し、その際、ＳＲＣキナーゼにおける該少なくとも１の突然変異はイマチニブに対して耐性であるかまたは少なくとも部分的に耐性である該癌細胞という結果となるものであり、ついで該ＳＲＣキナーゼタンパク質に少なくとも１の突然変異が存在するなら、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドと他のＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター、例えば、イマチニブ単独との組み合わせ、またはタキソールや他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターを含む（これらに限られるものではない）他の薬剤との組み合わせの治療学的有効量を投与することを含む方法を包含する。本発明の方法を実施するのに有用な‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドを含む組み合わせは、米国特許出願第10/886,955号（２００４年７月８日出願）、同第11/265,843号（２００５年１１月３日出願）、および同第11/418,338号（２００６年５月４日出願）（それぞれ参照のため本明細書に引用する）に記載されている。
【００２４】
本発明はさらに、癌を罹患する個体を治療する方法であって、該個体は該個体における癌細胞が耐性になっているかまたは少なくとも部分的に耐性になっているイマチニブの投与を受けているかまたは受けたことがあり、該個体からの細胞をアッセイして該細胞中のＳＲＣキナーゼタンパク質における少なくとも１の突然変異の存在を決定し、その際、ＳＲＣキナーゼにおける該少なくとも１の突然変異はイマチニブに対して耐性であるかまたは少なくとも部分的に耐性である該癌細胞という結果となるものであり、ついで該ＳＲＣキナーゼタンパク質に少なくとも１の突然変異が存在するなら、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとイマチニブ（増大した投与量または低減した投与量を含む）単独との組み合わせ、またはタキソールや他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターを含む（これらに限られるものではない）他の薬剤との組み合わせの治療学的有効量を投与することを含む方法を包含する。本発明の方法を実施するのに有用な‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとイマチニブとの組み合わせを含む組み合わせは、米国特許出願第10/886,955号（２００４年７月８日出願）、同第11/265,843号（２００５年１１月３日出願）、および同第11/418,338号（２００６年５月４日出願）（それぞれ参照のため本明細書に引用する）に記載されている。
【００２５】
本発明はさらに、癌（とりわけＳＲＣ関連癌）を罹患する個体を治療する方法であって、該個体は該個体における癌細胞が耐性になっているかまたは少なくとも部分的に耐性になっている第一のキナーゼインヒビターの投与を受けているかまたは受けたことがあり、該個体からの細胞をアッセイして該細胞中のＳＲＣキナーゼタンパク質における少なくとも１の突然変異の存在を決定し、その際、該少なくとも１の突然変異は、配列番号２のM244V, G250E, Q252H, Q252R, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F317L, M351T, E355G, F359V H396R, およびF486Sよりなる群から選ばれたものであり、ついで該突然変異が存在するなら、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとイマチニブとの組み合わせの治療学的有効量を投与することを含む方法を包含する。
【００２６】
本発明はさらに、癌（とりわけＳＲＣ関連癌）を罹患する個体を治療する方法であって、該個体は該個体における癌細胞が耐性になっているかまたは少なくとも部分的に耐性になっているイマチニブの投与を受けているかまたは受けたことがあり、該個体からの細胞をアッセイして該細胞中のＳＲＣキナーゼタンパク質における少なくとも１の突然変異の存在を決定し、その際、該少なくとも１の突然変異は、配列番号２のM244V, G250E, Q252H, Q252R, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F317L, M351T, E355G, F359V H396R, およびF486Sよりなる群から選ばれたものであり、ついで該突然変異が存在するなら、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとイマチニブとの組み合わせの治療学的有効量を投与することを含む方法を包含する。
【００２７】
本発明はさらに、チューブリン安定化剤（例えば、パシタキソール、エポチロン、タキサンなど）と組み合わせた；ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（例えば、化合物II）と組み合わせた；他のプロテインチロシンキナーゼインヒビター、例えば、イマチニブおよび／またはＡＭＮ１０７などのＢＣＲ−ＡＢＬのインヒビターと組み合わせた、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物を用いた治療に対するプロテインチロシンキナーゼ関連疾患を罹患する個体の応答性を決定する方法であって、該個体は、第一のキナーゼインヒビターで以前に治療を受けていて第一のキナーゼインヒビターに対して少なくとも部分的に耐性になっているかまたはキナーゼインヒビターを用いた治療を受けたことがなく、（ａ）該個体から生物学的試料を得；（ｂ）ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼ配列中の少なくとも１の突然変異の存在について該生物学的試料をスクリーニングし；ついで（ｃ）変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼが同定されたら該個体を陽性のリスポンダーに割り当てることを含む方法を包含する。
【００２８】
本発明はさらに、該変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼが、構成的に活性な該ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼという結果となるアミノ酸変異を含む応答性方法を包含する。
【００２９】
本発明はさらに、該プロテインチロシンキナーゼ関連疾患が、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｐｈ＋ＡＬＬ、および固形腫瘍よりなる群から選ばれる応答性方法を包含する。
【００３０】
本発明はさらに、該変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼがイマチニブ耐性ＢＣＲ／ＡＢＬ突然変異を含む応答性方法を包含する。
【００３１】
本発明はさらに、該イマチニブ耐性ＢＣＲ／ＡＢＬ突然変異が、配列番号２の244, 250, 252, 253, 255, 315, 317, 351, 355, 359, 396および486位のアミノ酸における突然変異を含む応答性方法を包含する。
【００３２】
本発明はさらに、該突然変異が、配列番号２のM244V, G250E, Q252H, Q252R, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F317L, M351T, E355G, F359V H396R,およびF486Sよりなる群から選ばれたものである応答性方法を包含する。
【００３３】
本発明はさらに、該生物学的試料が、組織生検、血液、血清、血漿、リンパ液、腹水、嚢胞液（cystic fluid）、尿、痰、大便、唾液、気管支吸引液、脊髄液および毛髪よりなる群から選ばれたものである応答性方法を包含する。
【００３４】
本発明はさらに、該生物学的試料が、組織生検細胞試料またはそれから培養した細胞である応答性方法を包含する。
【００３５】
本発明はさらに、該生物学的試料が血球を含む応答性方法を包含する。
【００３６】
本発明はさらに、該生物学的試料が固形腫瘍から採った細胞を含む、請求項７に記載の応答性方法を包含する。
【００３７】
本発明はさらに、該生物学的試料が該細胞試料の溶解液を含む応答性方法を包含する。
【００３８】
本発明は、プロテインチロシンキナーゼ関連疾患を罹患する個体を治療する方法であって、（ａ）該個体から生物学的試料を得；（ｂ）変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼの存在について該生物学的試料をアッセイし；変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼが同定された場合は、（ｃ）イマチニブと組み合わせた治療学的有効量の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド、または薬理学的に許容しうるその塩または水和物；より高い投与量または増大した投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物；または該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物とチューブリン安定化剤、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｔ３１５Ｉインヒビターおよび／または他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；またはより高い投与量または増大した投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩の両者を投与することを含む方法を包含する。
【００３９】
本発明は、該変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼが、ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼ（配列番号２）の244, 250, 252, 253, 255, 315, 317, 351, 355, 359, 396および486位のアミノ酸における突然変異を含む方法を包含する。
【００４０】
本発明は、該突然変異が、配列番号２のM244V, G250E, Q252H, Q252R, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F317L, M351T, E355G, F359V H396R,およびF486Sよりなる群から選ばれたものである方法を包含する。
【００４１】
本発明は、プロテインチロシンキナーゼ関連疾患を罹患する個体を治療する方法であって、（ａ）該個体から生物学的試料を得；（ｂ）第一のキナーゼインヒビターに対する少なくとも部分的な耐性について該生物学的試料をアッセイし；（ｃ）変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼの存在について該生物学的試料をアッセイし；該生物学的試料が該第一のキナーゼインヒビターに対して少なくとも部分的に耐性であり、変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼを含むと決定された場合は、ついで（ｄ）治療学的有効量の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド、または薬理学的に許容しうるその塩または水和物；より高い投与量または投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物；または該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物とチューブリン安定化剤、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｔ３１５Ｉインヒビターおよび／または他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；または該１またはそれ以上の組み合わせとより高い投与量または増大した投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩の両者を投与することを含む方法を包含する。
【００４２】
本発明は、該第一のキナーゼインヒビターがＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼインヒビターである治療方法を包含する。
【００４３】
本発明は、該変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼが、配列番号２の244, 250, 252, 253, 255, 315, 317, 351, 355, 359, 396および486位のアミノ酸における突然変異を含む治療方法を包含する。
【００４４】
本発明は、該突然変異が、配列番号２のM244V, G250E, Q252H, Q252R, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F317L, M351T, E355G, F359V H396R,およびF486Sよりなる群から選ばれたものである治療方法を包含する。
【００４５】
本発明は、該第一のキナーゼインヒビターがイマチニブを含む治療方法を包含する。
【００４６】
本発明は、プロテインチロシンキナーゼ関連疾患を罹患する個体に対する治療処方を確立する方法であって、（ａ）該個体から生物学的試料を得；（ｂ）ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼ配列における少なくとも１の突然変異の存在について該生物学的試料をアッセイし；ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼ配列において少なくとも１の突然変異が存在する場合は、（ｃ）該個体に治療処方の一部として、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド、または薬理学的に許容しうるその塩または水和物を含む医薬組成物；より高い投与量または投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物；または該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物とチューブリン安定化剤、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｔ３１５Ｉインヒビターおよび／または他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；またはより高い投与量または増大した投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩の両者を投与することを含む方法を包含する。
【００４７】
本発明は、該少なくとも１の突然変異が、配列番号２の244, 250, 252, 253, 255, 315, 317, 351, 355, 359, 396および486位のアミノ酸における突然変異を含む、治療処方を確立する方法を包含する。
【００４８】
本発明は、該医薬組成物が少なくとも１のさらなるキナーゼインヒビターを含む、治療処方を確立する方法を包含する。
【００４９】
本発明は、該突然変異が、配列番号２のM244V, G250E, Q252H, Q252R, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F317L, M351T, E355G, F359V H396R,およびF486Sよりなる群から選ばれたものである、治療処方を確立する方法を包含する。
【００５０】
本発明は、該治療処方が、治療学的有効量の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド、または薬理学的に許容しうるその塩または水和物；より高い投与量または増大した投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物；または該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物とチューブリン安定化剤、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｔ３１５Ｉインヒビターおよび／または他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；またはより高い投与量または増大した投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩の両者を含む、治療処方を確立する方法を包含する。
【００５１】
本発明はさらに、該生物学的試料が、組織生検、血液、血清、血漿、リンパ液、腹水、嚢胞液（cystic fluid）、尿、痰、大便、唾液、気管支吸引液、脊髄液および毛髪よりなる群から選ばれたものである、治療処方を確立する方法を包含する。
【００５２】
本発明はさらに、該生物学的試料が、組織生検細胞試料またはそれから培養した細胞である、治療処方を確立する方法を包含する。
【００５３】
本発明はさらに、該生物学的試料が血球を含む、治療処方を確立する方法を包含する。
【００５４】
本発明はさらに、該生物学的試料が固形腫瘍から採った細胞を含む、治療処方を確立する方法を包含する。
【００５５】
本発明はさらに、該生物学的試料が該細胞試料の溶解液を含む、治療処方を確立する方法を包含する。
【００５６】
本発明は、プロテインチロシンキナーゼ関連疾患を罹患する個体に対する治療処方を確立する方法であって、（ａ）該個体から生物学的試料を得；（ｂ）第一のキナーゼインヒビターに対する少なくとも部分的な耐性について該生物学的試料をアッセイし；（ｃ）ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼ配列における少なくとも１の突然変異の存在について該生物学的試料をアッセイし；該生物学的試料が該第一のキナーゼインヒビターに対して少なくとも部分的に耐性であり、変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼを含むと決定された場合は、ついで（ｄ）該個体に治療処方の一部として、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド、または薬理学的に許容しうるその塩または水和物を含む医薬組成物；より高い投与量または投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物；または該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物とチューブリン安定化剤、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｔ３１５Ｉインヒビターおよび／または他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；またはより高い投与量または投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩の両者を投与することを含む方法を包含する。
【００５７】
本発明は、該少なくとも１の突然変異が、配列番号２の244, 250, 252, 253, 255, 315, 317, 351, 355, 359, 396および486位のアミノ酸における突然変異を含む、治療処方を確立する方法を包含する。
【００５８】
本発明は、該治療処方が少なくとも１のさらなるプロテインキナーゼインヒビターを含む、治療処方を確立する方法を包含する。
【００５９】
本発明は、該突然変異が、配列番号２のM244V, G250E, Q252H, Q252R, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F317L, M351T, E355G, F359V H396R,およびF486Sよりなる群から選ばれたものである、治療処方を確立する方法を包含する。
【００６０】
本発明は、変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼ関連疾患を罹患する個体を治療する方法であって、（ａ）該個体から生物学的試料を得；（ｂ）変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼの存在について該生物学的試料をアッセイし、その際、該変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼは構成的に活性であり；構成的に活性な変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼが該試料に存在する場合は、ついで（ｃ）該個体に、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド、または薬理学的に許容しうるその塩または水和物を含む医薬組成物；より高い投与量または増大した投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物；または該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物とチューブリン安定化剤、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｔ３１５Ｉインヒビターおよび／または他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；またはより高い投与量または増大した投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩の両者を投与することを含む方法を包含する。
【００６１】
本発明は、治療学的有効量の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド、または薬理学的に許容しうるその塩または水和物；より高い投与量または増大した投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物；または該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物とチューブリン安定化剤、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｔ３１５Ｉインヒビターおよび／または他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；またはより高い投与量または増大した投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩の両者を投与することを含む、変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼ関連疾患を罹患する個体を治療する方法を包含する。
【００６２】
本発明は、プロテインチロシンキナーゼ関連疾患を罹患する個体に対する治療戦略を決定するのに用いるキットであって、（ａ）該患者からの生物学的試料において変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼを検出する手段；および任意に（ｂ）使用およびキットの結果の解釈についての説明書を含むキットを包含する。
【００６３】
本発明は、該説明書を含み、該治療戦略が、治療学的有効量の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド、または薬理学的に許容しうるその塩または水和物；より高い投与量または増大した投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物；または該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物とチューブリン安定化剤、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｔ３１５Ｉインヒビターおよび／または他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；またはより高い投与量または増大した投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩の両者の投与を含むキットを包含する。
【００６４】
本発明は、該変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼが、配列番号２の244, 250, 252, 253, 255, 315, 317, 351, 355, 359, 396および486位のアミノ酸における突然変異を含む、キットを包含する。
【００６５】
本発明は、該突然変異が、配列番号２のM244V, G250E, Q252H, Q252R, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F317L, M351T, E355G, F359V H396R,およびF486Sよりなる群から選ばれたものである、キットを包含する。
【００６６】
本発明は、該個体から生物学的試料を得る手段をさらに含むキットを包含する。
【００６７】
本発明は、変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼ関連疾患を罹患する個体を治療するのに用いるキットであって、（ａ）該患者からの生物学的試料からのＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼの244, 250, 252, 253, 255, 315, 317, 351, 355, 359, 396および486位のアミノ酸における突然変異を検出する手段；（ｂ）チューブリン安定化剤（例えば、パシタキソール、エポチロン、タキサンなど）と組み合わせた治療学的有効量の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド、または薬理学的に許容しうるその塩または水和物；より高い投与量または投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物；または該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩または水和物と、チューブリン安定化剤、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｔ３１５Ｉインヒビターおよび／または他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；またはより高い投与量または投与頻度の該チアゾールカルボキサミドまたは薬理学的に許容しうるその塩の両者を含むキットを包含する。
【００６８】
本発明は、該突然変異が、配列番号２のM244V, G250E, Q252H, Q252R, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F317L, M351T, E355G, F359V H396R,およびF486Sよりなる群から選ばれたものである、キットを包含する。
【００６９】
本発明は、該個体から生物学的試料を得る手段をさらに含むキットを包含する。
【００７０】
特に断らない限り、本明細書に使用するすべての技術用語、表記および科学的術語は、本発明が関連する当業者によって普通に理解される意味を有することを意図している。幾つかの場合において、普通に理解される意味を有する術語について、明確のためおよび参照を容易にするために本明細書において定義しているが、そのような定義を含めることが当該技術分野において一般に理解されているものとの実質的な差違を表すものと必ずしも解釈してはならない。本明細書において記載または参照する技術および手順は、例えば、Sambrookら、1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨークおよびAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology、ウイリーインターサイエンスパブリッシャーズ(1995)に記載された広く用いられているモレキュラークローニング法のように、当業者によって一般によく理解され、常法を用いて普通に用いられているものである。適宜、市販のキットおよび試薬の使用を含む手順は、特に断らない限り、一般に製造業者の定めたプロトコールおよび／またはパラメーターに従って行う。
【００７１】
本明細書において使用する「ポリヌクレオチド」なる語は、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドまたは両タイプのヌクレオチドのいずれかの修飾形の、長さが少なくとも約１０塩基のヌクレオチドのポリマー形態を意味し、一本鎖または２本鎖の形態のＤＮＡを包含することを意味する。
【００７２】
本明細書において使用する「ポリペプチド」なる語は、少なくとも約６アミノ酸のポリマーを意味する。本明細書を通じて、アミノ酸の標準３文字または１文字表記を用いてある。
【００７３】
本明細書において、ポリヌクレオチドは、例えばＳＲＣ変異体遺伝子以外の遺伝子に対応するまたは該遺伝子をコードする混入ポリヌクレオチドまたはＳＲＣ変異体遺伝子産物またはその断片以外のポリペプチドをコードする混入ポリヌクレオチドから実質的に分離されたときに、「単離された」といわれる。本明細書において、ポリペプチドは、ＳＲＣ変異体ポリペプチドまたはその断片以外のポリペプチドに対応する混入ポリペプチドから実質的に分離されたときに、「単離された」といわれる。当業者であれば該単離されたポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを得るためのポリヌクレオチドまたはポリペプチド単離手順を容易に用いることができる。
【００７４】
本明細書においてポリヌクレオチドの文脈にて使用する「ハイブリダイズする」なる語は、通常のハイブリダイズ条件、好ましくは５０％ホルムアミド／６×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ／１００μｇ／ｍｌ ｓｓＤＮＡ（ハイブリダイゼーションの温度が３７℃以上、０.１×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ中での洗浄温度が５５℃以上）におけるハイブリダイゼーション、最も好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を意味する。
【００７５】
ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」は当業者によって容易に決定でき、一般にプローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存した経験的な計算結果である。一般に、長いプローブはより高い温度を必要とし、短いプローブはより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは一般に、ある環境に相補鎖がその融解温度未満で存在するときに、変性ＤＮＡが再アニールできる能力に依存する。プローブとハイブリダイズしうる配列との間の所望のホモロジーの度合いが高いほど、使用できる相対温度は高くなる。その結果、より高い相対温度は反応条件をよりストリンジェントにする傾向があり、一方、より低い温度はその傾向が小さいということになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーについてのさらなる詳細および説明については、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、ウイリーインターサイエンスパブリッシャーズ(1995)を参照のこと。
【００７６】
「ストリンジェント条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、当業者に知られ本明細書で定義されているものであるが、以下により同定することができる：（１）低いイオン強度および高い洗浄温度、例えば、５０℃での０.０１５Ｍ塩化ナトリウム／０.００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０.１％ドデシル硫酸ナトリウムを使用；（２）ハイブリダイゼーションの際にホルムアミドなどの変性剤、例えば、０１％ウシ血清アルブミン含有５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド／０.１％フィコール／０.１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム含有５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６.５）を４２℃で使用；または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０.７５Ｍ ＮａＣｌ、０.０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６.８）、０.１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０.１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸を４２℃で使用し、０.２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、４２℃で、および５０％ホルムアミド中、５５℃で洗浄し、ついでＥＤＴＡ含有０.１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を５５℃にて行う。
【００７７】
「中くらいにストリンジェントな条件」は、Sambrookら、1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual、ニューヨーク：コールドスプリングハーバーラボラトリープレスの記載に従って同定でき、上記で記載したものよりも低ストリンジェントな洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を包含する。中くらいのストリンジェント条件の非制限的例は、以下のもの：２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７.６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍＬの変性し破断したサケ精子ＤＮＡを含む溶液中、３７℃で一夜インキュベートし、ついでフィルターを１×ＳＳＣ中、約３７〜５０℃で洗浄することである。当業者であれば、必要に応じてプローブ長などの因子を考慮して温度、イオン強度などをいかにして適合させるかを認識するであろう。
【００７８】
本明細書において記載するＳＲＣ変異体の簡略化した表記のため、数値は配列番号２で提供されるＳＲＣポリペプチドのアミノ酸配列に沿ったアミノ酸残基の位置を指すものとして表示される。例えば、Ｍ２４４は２４４位のアミノ酸メチオニンを指す。特定の位置でのアミノ酸置換は、野生型のアミノ酸、位置の番号、およびそこで置換されるアミノ酸をこの順で記載する。例えば、Ｍ２４４Ｖは、２４４位でのメチオニンからバリンへの置換を指す。アミノ酸の同定は、アミノ酸の１文字アルファベットを使用する、すなわち、以下のとおりである。
【００７９】
【表１】
2009501523.tif 000003
【００８０】
アミノ酸配列比較の文脈において、「同一性」なる語は、同じ相対位置での同じであるアミノ酸残基のパーセントを同定および表示するのに使用する。また、この文脈において、「ホモロジー」なる語は、当該技術分野で一般に理解されているように、ＢＬＡＳＴ分析の保存されたアミノ酸基準を用い、同じ相対位置で同一かまたは同様かのいずれかであるアミノ酸残基のパーセントを同定および表示するのに使用する。例えば、同一性およびホモロジーの値は、WU-BLAST-2（Altschulら、Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996): http://blast.wustl/edu/b-last/README.html）により生成することができる。
【００８１】
本明細書において同定する配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、候補配列とＳＲＣ配列とをアラインメントし、必要ならギャップを導入して最大のパーセント配列同一性を達成した後、ＳＲＣ配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当該技術分野の範囲内である種々の方法で達成することができ、比較すべき完全長の配列にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要なアルゴリズムを割り当てることを含む、アラインメントを測定するための適当なパラメーターを用いて決定することができる。
【００８２】
当業者であれば、当該技術分野で知られているように、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータープログラム（J.D. Thompsonら、1994, Nucleic Acids Research, 2(22):4673-4680）またはＦＡＳＴＤＢ（Brutlagら、1990, Comp. App. Biosci., 6:237-245）に基づくアルゴリズムなどのアルゴリズムを用い、配列間のパーセント同一性をいかにして決定するかを知っているであろう。ＦＡＳＴＤＢアルゴリズムは典型的に配列中の内部の非マッチング欠失または付加、すなわちギャップをその計算において考慮しないが、これは手動で訂正して％同一性の過大評価を回避することができる。しかしながら、ＣＬＵＳＴＡＬＷはその同一性の計算に配列ギャップを考慮する。
【００８３】
「抗体」とは、完全な分子並びにエピトープまたは抗原決定基に結合することのできるFab, F(ab’)2, Fvなどのそのフラグメントをいう。ＳＲＣまたはＳＲＣ変異体ポリペプチドに結合する抗体は、完全なポリペプチドまたは目的とする小さなペプチドを含む断片（免疫用抗原として使用するため組換えにより調製できる）を用いて調製することができる。動物を免疫するのに用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、ＲＮＡの転移（transition）に由来するかまたは化学的に合成することができ、所望なら担体タンパク質にコンジュゲートすることができる。ペプチドに化学的に結合させるべく通常使用される担体としては、これらに限られるものではないが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、およびチログロブリンが挙げられる。結合したペプチドは、ついで動物（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）を免疫するのに用いる。
【００８４】
「抗原決定基」とは、ある分子の特定の抗体と接触させる部分をいう（すなわち、エピトープ）。タンパク質またはタンパク質の断片を用いて宿主動物を免疫した場合、該タンパク質の多数の領域が、該タンパク質上の所定の領域または三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘発する；これら領域または構造の各々が抗原決定基として言及される。抗原決定基は、抗体への結合について完全な抗原（すなわち、免疫応答を誘起するのに用いた免疫原）と競合する。
【００８５】
「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、タンパク質またはペプチドと結合分子、例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、または抗体との相互作用をいう。相互作用は、結合分子によって認識されるタンパク質の特定の構造（すなわち、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存する。本発明の目的のためには、化合物、例えば小分子を、野生型ＳＲＣおよび／または本明細書に記載のＳＲＣ変異体に特異的に結合する能力について考慮することができる。
【００８６】
「癌」、「癌性」、または「悪性」なる語は、典型的に制御できない細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理状態を言及または記載する。癌の例としては、これらに限られるものではないが、白血病、リンパ腫、芽細胞腫、癌種および肉腫が挙げられる。そのような癌のさらに具体的な例としては、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病（Ｐｈ＋ＡＬＬ）、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠芽細胞腫、胃腸癌、腎臓癌、卵巣癌、肝癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、胸腺癌、神経芽細胞腫、膵臓癌、多形グリア芽細胞腫、頸部癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌腫、および頭部および首の癌、胃癌、生殖細胞腫瘍、小児科の肉腫、節外性ＮＫ細胞リンパ腫（sinonasal natural killer）、多発性骨髄種、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、および慢性リンパ性白血病（ＣＭＬ）が挙げられる。
【００８７】
「プロリンチロシンキナーゼ関連疾患」は、異常型のチロシンキナーゼ活性の結果として発症するか、および／またはこれら酵素の１またはそれ以上の抑制によって緩和される疾患である。本発明の範囲に包含される疾患としては、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病（Ｐｈ＋ＡＬＬ）、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠芽細胞腫、胃腸癌、腎臓癌、卵巣癌、肝癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、胸腺癌、神経芽細胞腫、膵臓癌、多形グリア芽細胞腫、頸部癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌腫、および頭部および首の癌、胃癌、生殖細胞腫瘍、小児科の肉腫、節外性ＮＫ細胞リンパ腫、多発性骨髄種、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、肥満細胞症、および肥満細胞症に関連するあらゆる徴候が挙げられる。さらに、疾患として、色素性蕁麻疹、肥満細胞症、例えば、びまん性皮膚肥満細胞症、ヒトにおける孤立性肥満細胞症、並びにイヌの肥満細胞症および水疱性、紅皮症性および毛細管拡張症性の肥満細胞症などの幾つかの稀なタイプのもの、血液疾患、例えば、骨髄増殖性症候群または骨髄異形成症候群、または急性白血病を伴う肥満細胞症、肥満細胞症と関連する骨髄増殖性の疾患、および肥満細胞性白血病が挙げられる。種々の癌もまたプロテインチロシンキナーゼ関連疾患の範囲に含まれ、以下のものを包含する（これらに限られるものではない）；膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、頸部癌、甲状腺癌、精巣癌、とりわけ精巣のセミノーマ、および皮膚癌を含む癌；扁平上皮細胞癌を含む；消化管間質腫瘍（「ＧＩＳＴ」）；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、ヘアリーセルリンパ腫およびバーキットリンパ腫を含むリンパ系の造血腫瘍；急性および慢性の骨髄性白血病および前骨髄細胞性白血病を含む骨髄系の造血腫瘍；線維肉腫および横紋筋肉腫を含む間葉由来の腫瘍；黒色腫、セミノーマ、奇形癌、神経芽細胞腫および神経膠芽細胞腫を含む他の腫瘍；星状細胞種、神経芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、および神経鞘腫を含む中枢神経系および末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、および骨肉腫を含む間葉由来の腫瘍；および黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、セミノーマ、甲状腺小胞癌、奇形癌、化学療法耐性非セミノーマ性の生殖細胞腫瘍、およびカポジ肉腫を含む他の腫瘍。
【００８８】
本明細書において特定の関心の持たれるプロテインチロシンキナーゼ関連疾患は、少なくとも部分的に異常型のＳＲＣ（野生型または変異型）活性の結果として発症するか、および／またはＳＲＣ（野生型または変異型）の抑制によって緩和される疾患であり、本明細書において「ＳＲＣ関連疾患」または癌の場合は「ＳＲＣ関連癌」と呼ばれる。
【００８９】
「ＳＲＣ」、「ＳＲＣキナーゼ」、および「変異体ＳＲＣキナーゼ」は、１またはそれ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失によって野生型のＳＲＣキナーゼとは異なるアミノ酸配列を有するＳＲＣキナーゼを包含する。例えば、Ｍ２４４Ｖアミノ酸の他のアミノ酸による置換は変異体ＳＲＣキナーゼという結果となる。本発明に包含されるのは、Ｍ２４４Ｖに突然変異を含む変異体ＳＲＣキナーゼである。アミノ酸Ｍ２４４Ｖは、利用できる他のアミノ酸のいずれでも置換することができる。一つの態様において、Ｍ２４４Ｖは非極性の非酸性アミノ酸で置換される。本明細書で検討するのは、以下の突然変異の１またはそれ以上を有するものを含む幾つかの変異体ＳＲＣキナーゼである：M244V, G250E, Q252H, Q252R, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F317L, M351T, E355G, F359V H396R, およびF486S。ＳＲＣは、必然的に、ＢＣＲ／ＡＢＬ、ＡＢＬ、ｃ−ＳｒｃなどのＳＲＣファミリーキナーゼを含むＳＲＣ、ＳＲＣ／ＡＢＬ、およびＪＡＫ、ＦＡＫ、ＦＰＳ、ＣＳＫ、ＳＹＫ、およびＢＴＫを含む（これらに限られるものではない）他の形態を包含する。従って、本発明の好ましいＳＲＣキナーゼはＢＣＲ−ＡＢＬである。しかしながら、本発明は、他のＳＲＣキナーゼの関連するアミノ酸残基における同じかまたは同様のアミノ酸変化を包含する。
【００９０】
「変異体ＳＲＣキナーゼ関連疾患」は、ＳＲＣキナーゼにおける突然変異の結果、プロテインチロシンキナーゼ関連疾患に関与する細胞が該疾患を治療するのに用いたキナーゼインヒビターによる治療に対して耐性であるかまたは耐性となった該プロテインチロシンキナーゼ関連疾患を記載するのに用いる。本明細書に記載するように、構成的に活性なＳＲＣキナーゼという結果となる突然変異が特に興味がもたれる。例えば、キナーゼインヒビター化合物が癌状態を治療するのに用いられ、該化合物は、野生型ＳＲＣの活性を抑制し、癌細胞の増殖を抑制および／または癌細胞のアポトーシスを誘起するであろう。時間が経つと、ＳＲＣをコードする遺伝子に突然変異が導入され、ＳＲＣキナーゼのアミノ酸配列を変えて癌細胞を該化合物による治療に対して耐性、あるいは少なくとも部分的に耐性にする。あるいは、プロテインチロシンキナーゼインヒビターによる治療とは無関係に遺伝的にかまたは発癌事象の結果として、ＳＲＣキナーゼをコードする遺伝子内にすでに突然変異が存在しており、このことが、これら細胞が癌状態または増殖状態に分化する傾向性となり、またこれら細胞がプロテインチロシンキナーゼインヒビターによる治療に対する感受性が低くなる一つの要因である。そのような状況は、直接または間接的に「変異体ＳＲＣキナーゼ関連疾患」という結果になると予期され、そのような状態の治療は、変異体ＳＲＣに対して少なくとも部分的に有効である、好ましくは野生型ＳＲＣおよび変異体ＳＲＣの両者に対して有効である化合物を必要とするであろう。個体がキナーゼインヒビターイマチニブに対して少なくとも部分的に耐性を呈する場合には、変異体ＳＲＣ関連疾患は、イマチニブ耐性のＳＲＣ突然変異、またはプロテインチロシンキナーゼインヒビター耐性のＳＲＣ突然変異の結果として生じるものである。
【００９１】
「イマチニブ耐性のＳＲＣ突然変異」、「プロテインチロシンキナーゼインヒビター耐性のＳＲＣ突然変異」とは、該突然変異を発現する細胞にイマチニブおよび／または他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターによる治療に対する耐性を付与する、ＳＲＣのアミノ酸配列中の特定の突然変異をいう。本明細書において検討するように、そのような突然変異はＳＲＣのＭ２４４Ｖ位での突然変異を含む。本発明の範囲内として想定されるのは、以下よりなる群から選ばれたＳＲＣ配列における突然変異である：M244V, G250E, Q252H, Q252R, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F317L, M351T, E355G, F359V H396R, およびF486S。
【００９２】
本明細書において使用する「治療する」、「治療」および「療法」とは、治療的療法、予防的療法、および疾患緩和療法をいう。
【００９３】
本明細書において使用する「哺乳動物」とは、ヒト、ウシ、ウマ、イヌおよびネコを含む、哺乳動物として分類されるあらゆる哺乳動物をいう。本発明の好ましい態様において、哺乳動物はヒトである。
【００９４】
本明細書において使用する「組み合わせ」および「‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドの組み合わせ」とは、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとイマチニブとの組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとチューブリン安定化剤（例えば、パシタキソール、エポチロン、タキサンなど）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（例えば、化合物II）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドと他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとAMN-107, PD180970, CGP76030, AP23464, SKI 606, AZD0530, APおよび／またはT315Iインヒビター（janusキナーゼインヒビター, AP23848, Jak2インヒビター, 熱ショックタンパク質90インヒビター, DMAG, VX-680, ON012380, OSU-03012, LBH589, 17-AAG, およびLBH589と17-AAGとの組み合わせを含むが、これらに限られるものではない）との組み合わせ；２００６年４月１２日に出願した同時継続中の米国特許出願第11/402,502号（参照のため本明細書に引用する）に具体的に開示された組み合わせ；および／またはDeiningerら（Blood, 105(7):2640-2653 (2005);参照のためその全体を本明細書に引用する）に開示され参照されたあらゆる化合物（以下のものを含むが、これらに限られるものではない：IFN, ポリエチレングリコール処理した（pegylated）IFN, ホモハリングトニン（homoharringtonine）, シタビン（cytabine）, ヒドロキシ尿素, ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター, ロナファルニブ（lonafarnib）, チピファミブ（tipifamib）, MEK1インヒビター, PD98059, RAF-1インヒビター, BAY43-9006, PI3キナーゼインヒビター, LY294002, mTORインヒビター, ラパマイシン（rapamycin）, サイクリン依存性キナーゼインヒビター, ファボピリドール（favopiridol））; La Roseeら、（Leukemia, 16:1213-1219 (2002)）に開示されおよび／または参照されたあらゆる化合物；または薬理学的に許容しうるその塩、および任意にその治療学的有効量をいう。
【００９５】
本明細書において使用する「より集中的な（aggressive）投与処方」、「増大した投与頻度処方（increased dosing frequency regimen）」とは、投与頻度の増大、増大したまたは急上昇した投与量、または‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドの生体利用レベルの増大という結果となる投与経路のいずれかのために、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドの基礎のおよび／または処方された投与処方を必然的に超える投与処方をいう。そのような投与処方の非制限的例は、米国特許出願第10/395,503号（２００３年３月２４日出願）；およびBlood (ASH Annual Meeting Abstracts) 2004, Volume 104: Abstract 20， ”Hematologic and Cytogenetic Responses in imatinib-Resistant Accelerated and Blast Phase Chronic Myeloid Leukemia (CML) Patients Treated with the Dual SRC/ABL Kinase Inhibitor ‘N-(2-chloro-6-methylphenyl)-2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-2-methyl-4-pyrimidinyl]amino]-5-thiazolecarboxamide: Results from a Phase I Dose Escalation Study”（Moshe Talpazらによる）；および／またはDeiningerら、Blood, 105(7):2640-2653 (2005)において概説されている投与処方を参照することで見出すことができる（参照のため本明細書に引用する）。
【００９６】
さらなる定義が明細書全体にわたって提供される。
【００９７】
本発明は、癌を治療する方法を提供するが、該癌は、原発性癌および転移性癌の両者を含み、固形腫瘍（乳癌、結腸癌、および前立腺癌など）、並びにリンパ腫および白血病（ＣＭＬ、ＡＭＬおよびＡＬＬを含む）、上皮組織の癌を含み、他の療法（イマチニブなどのキナーゼインヒビターの投与が関与する他の療法を含む）に耐性の癌を含む。詳細には、これらに限られるものではないが、本発明は、イマチニブなどのキナーゼインヒビターの投与が関与する他の療法に耐性である疾患、例えば、癌を治療するための、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとイマチニブとの組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとチューブリン安定化剤（例えば、パシタキソール、エポチロン、タキサンなど）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（例えば、化合物II）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドと他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；本明細書に記載の他の組み合わせ；増大した投与頻度処方の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド；および本明細書に記載の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドを含む他の組み合わせまたは投与処方の使用を提供する。
【００９８】
本発明は、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとイマチニブとの組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとチューブリン安定化剤（例えば、パシタキソール、エポチロン、タキサンなど）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（例えば、化合物II）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドと他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；本明細書に記載の他の組み合わせ；増大した投与頻度処方の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド；および本明細書に記載の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドを含む他の組み合わせまたは投与処方が、１またはそれ以上の抗癌剤に対して耐性であるかまたは少なくとも部分的に耐性である癌（とりわけ他の抗癌剤（特に、イマチニブおよび他のキナーゼインヒビターを含む）に対して全体としてまたは部分的に耐性である癌を含む、およびとりわけＳＲＣキナーゼにおける１またはそれ以上の突然変異が関与する癌を含む）に対して有用であることを提供する。
【００９９】
本発明はまた、治療のための個体を同定する方法であって、個体からの細胞をスクリーニングして該細胞で発現された変異体ＳＲＣキナーゼを同定し、もしも変異体ＳＲＣ変異体キナーゼが存在するなら、該変異体ＳＲＣキナーゼのインヒビターの治療学的有効量、または該変異体ＳＲＣキナーゼのインヒビターの増大した治療学的有効量を投与することを含む方法をも包含する。本発明によれば、これらに限られるものではないが、配列番号２のＳＲＣキナーゼの以下の位置での少なくとも１の突然変異の同定は、個体が治療のために選択されることを示すであろう：M244V, G250E, Q252H, Q252R, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F317L, M351T, E355G, F359V H396R, およびF486S。
【０１００】
変異体ＳＲＣキナーゼのアミノ酸配列および核酸配列を同定する方法は、当該技術分野で知られている。所定の個体の細胞でのＳＲＣ突然変異を正確に決定するには、標準分子生物学的方法が考えられる。
【０１０１】
本明細書に記載する１またはそれ以上のＳＲＣ変異体を同定するには、変異体ＳＲＣキナーゼに免疫特異的に結合する抗体を用いることができる。ここで考えられるのは、変異体ＳＲＣキナーゼには特異的に結合するが、野生型のＳＲＣタンパク質またはポリペプチドには結合しない（または弱く結合する）抗体である。抗変異体ＳＲＣキナーゼ抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体並びにこれら抗体の抗原結合ドメインおよび／または１またはそれ以上の相補性決定領域を含むフラグメントを包含する。
【０１０２】
幾つかの応用のためには、特定の変異体ＳＲＣキナーゼタンパク質および／または特定の構造ドメイン内のエピトープに特異的に結合する抗体を生成するのが望ましい。例えば、診断目的に有用な好ましい抗体は、癌細胞で発現されているＳＲＣタンパク質の突然変異した領域中のエピトープと反応するものである。例えば、M244V, G250E, Q252H, Q252R, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F317L, M351T, E355G, F359V H396R, およびF486S変異体ＳＲＣキナーゼに特異的に結合する抗体。そのような抗体は、免疫原として、本明細書に記載する変異体ＳＲＣキナーゼタンパク質を用い、またはその様々なドメインに由来するペプチドを用いて生成することができる。
【０１０３】
本発明の変異体ＳＲＣキナーゼ抗体は、とりわけ、癌（例えば、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病（Ｐｈ＋ＡＬＬ、ＧＩＳＴ））療法戦略、診断および予後アッセイ、および造影法において有用である。同様に、そのような抗体は、他の癌の診断および／または予後において、他のタイプの癌においてもそのような変異体ＳＲＣキナーゼが発現されまたは過剰発現されている程度まで、有用である。本発明は、変異体ＳＲＣキナーゼタンパク質およびポリペプチドの検出および定量に有用な種々の免疫学的アッセイを提供する。そのようなアッセイは、一般に、適宜、変異体ＳＲＣキナーゼタンパク質を認識および結合できる１またはそれ以上の変異体ＳＲＣキナーゼ抗体を含み、当該技術分野でよく知られた様々な免疫学的アッセイフォーマット（様々なタイプのラジオイムノアッセイ、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などを含むが、これらに限られるものではない）において行うことができる。さらに、癌細胞を検出できる免疫学的造影法（標識した変異体ＳＲＣキナーゼ抗体を用いた造影法を含むが、これに限られるものではない）もまた本発明により提供される。そのようなアッセイは、癌の検出、モニタリング、および予後において臨床的に用いることができる。
【０１０４】
本発明の他の側面は、変異体ＳＲＣキナーゼポリヌクレオチドおよび変異体ＳＲＣキナーゼタンパク質を検出する方法、並びに変異体ＳＲＣキナーゼを発現する細胞を同定する方法に関する。変異体ＳＲＣキナーゼの発現プロファイルは、疾患状態の診断マーカーにする。患者試料中の変異体ＳＲＣキナーゼ遺伝子産物の状態は、以下の非制限的なタイプのアッセイを含む当該技術分野でよく知られた種々のプロトコールにより分析することができる：ＰＣＲフリー遺伝子型決定法（PCR-free genotyping methods）、１工程均一法（Single-step homogeneous methods）、蛍光偏光を用いた均一検出、ピロシークエンシング（Pyrosequencing）、「標識」に基づくＤＮＡチップ系、ビーズに基づく方法、蛍光染料化学、マススペクトロメトリーに基づく遺伝子型決定アッセイ、TaqMan遺伝子型決定アッセイ、Invader遺伝子型決定アッセイ、ミクロ流体（microfluidic）遺伝子型決定アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、様々なノーザンブロット法、例えば、インシトゥハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ分析（例えば、ＬＣＭ処理した（laser capture micro-dissected）試料で）、ウエスタンブロット分析、組織アレイ分析、および当該技術分野で知られたまたは本明細書に記載の他の方法。
【０１０５】
本発明によって特に包含されるものとして、以下の非制限的な遺伝子型決定法が挙げられる：Landegren, U., Nilsson, M.およびKwok, P. 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【０１０６】
以下のさらなる遺伝子型決定法もまた本発明に包含される：米国特許第6,458,540号に記載されおよび／または特許請求された方法；および米国特許第6,440,707号に記載されおよび／または特許請求された方法。
【０１０７】
プローブおよびプライマーをそのような突然変異分析に特異的となるように割り当てることができ、野生型のＳＲＣ配列、そのセグメントおよび相補的配列に由来する。
【０１０８】
さらに、本発明は、細胞調製物などの生物学的試料中の変異体ＳＲＣキナーゼポリヌクレオチドの検出のためのアッセイを提供する。変異体ＳＲＣキナーゼポリヌクレオチドを増幅および／または検出するための多くの方法が当該技術分野でよく知られており、本発明のこの側面の実施に用いることができる。
【０１０９】
一つの態様において、生物学的試料中の変異体ＳＲＣキナーゼｍＲＮＡを検出する方法は、少なくとも１のプライマーを用いた逆転写により試料からｃＤＮＡを生成し；そのようにして生成したｃＤＮＡを、変異体ＳＲＣキナーゼポリヌクレオチドをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いて増幅して変異体ＳＲＣキナーゼｃＤＮＡを増幅し；ついで増幅した変異体ＳＲＣキナーゼｃＤＮＡの存在を検出することを含む。変異体ＳＲＣキナーゼのために提供され、この目的のために使用されるヌクレオチド配列から、いかなる数の適当なセンスプライマーとアンチセンスプライマーとの組み合わせをもデザインすることができる。
【０１１０】
本発明はまた、生物学的試料中の変異体ＳＲＣキナーゼタンパク質の存在を検出するためのアッセイをも提供する。変異体ＳＲＣキナーゼタンパク質を検出する方法もまたよく知られており、例えば、免疫沈降、免疫組織化学分析、ウエスタンブロット分析、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡなどが挙げられる。例えば、一つの態様において、生物学的試料中の変異体ＳＲＣキナーゼタンパク質の存在を検出するための方法は、まず試料を、ＳＲＣ抗体、変異体ＳＲＣキナーゼ反応性のそのフラグメント、または変異体ＳＲＣキナーゼ抗体の抗原結合領域を含む組換えタンパク質と接触させ；ついでそれへの変異体ＳＲＣキナーゼタンパク質の結合を検出することを含む。
【０１１１】
変異体ＳＲＣキナーゼを発現する細胞を同定する方法も提供される。一つの態様において、変異体ＳＲＣキナーゼ遺伝子を発現する細胞を同定するアッセイは、細胞中の変異体ＳＲＣキナーゼｍＲＮＡの存在を検出することを含む。細胞中の特定のｍＲＮＡの検出方法はよく知られており、例えば、相補的ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションアッセイ（標識した変異体ＳＲＣキナーゼリボプローブを用いたインシトゥハイブリダイゼーション、ノーザンブロットおよび関連する技術など）および種々の核酸増幅アッセイ（変異体ＳＲＣキナーゼに特異的な相補的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ、および他の増幅タイプの検出法、例えば、枝分かれＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど）が挙げられる。
【０１１２】
本発明は、異なるＳＲＣキナーゼ突然変異、とりわけＢＣＲ／ＡＢＬ突然変異を有する患者が、イマチニブおよび‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドに対してそれぞれ様々な程度の耐性および／または感受性を有するとの証明に基づく治療法を包含する。それゆえ、本発明の方法は、ある個体をチロシンキナーゼインヒビターの組み合わせ、例えば、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター（例えば、イマチニブまたはＡＭＮ１０７）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとチューブリン安定化剤（例えば、パシタキソール、エポチロン、タキサンなど）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（例えば、化合物II）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドと他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；本明細書に記載の他の組み合わせ；増大した投与頻度処方の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド；および本明細書に記載の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドを含む他の組み合わせまたは投与処方で治療すべきか否かを決定するのに用いることができる。本発明の一つの態様は、哺乳動物細胞中のＳＲＣポリヌクレオチドにおける突然変異を同定する方法であり、ここでＳＲＣポリヌクレオチドにおける突然変異はイマチニブによるＳＲＣキナーゼ活性の抑制に対する耐性と関連しており、該方法は、該哺乳動物細胞によって発現された少なくとも１のＳＲＣキナーゼポリヌクレオチドの配列を決定し、ついで該ＳＲＣキナーゼポリヌクレオチドの配列を野生型ＳＲＣキナーゼポリヌクレオチド配列と比較することを含む。本明細書に記載するように、同定したポリヌクレオチドは、野生型ＳＲＣキナーゼのアミノ酸配列とは少なくとも１のアミノ酸が異なるポリヌクレオチドをコードしている。
【０１１３】
治療処方は、本明細書に記載する１またはそれ以上の変異体ＳＲＣキナーゼの存在に基づいて確立することができる。例えば、本発明は、キナーゼインヒビターで一般に治療される疾患を罹患しているかもしれないまたは罹患している個体からの細胞をスクリーニングすることを包含する。そのような疾患には、骨髄性白血病またはその関連疾患、または本明細書に記載する癌が含まれる。個体からの細胞を、当該技術分野で知られた方法を用いてＳＲＣキナーゼ中の突然変異の同定のためにスクリーニングする。興味のもたれる突然変異は、構成的に活性化したＳＲＣキナーゼという結果となるものである。特定の突然変異としては、配列番号２のM244V（244位のメチオニンがバリンで置換）、G250E（250位のグリシンがグルタミン酸で置換）、Q252H（252位のグルタミンがヒスチジンで置換）、Q252R（252位のグルタミンがアルギニンで置換）、Y253F（252位のチロシンがフェニルアラニンで置換）、Y253H（252位のチロシンがヒスチジンで置換）、E255K（255位のグルタミン酸がリシンで置換）、E255V（255位のグルタミン酸がバリンで置換）、T315I（315位のトレオニンがイソロイシンで置換）、F317L（317位のフェニルアラニンがロイシンで置換）、M351T（315位のメチオニンがトレオニンで置換）、E355G（355位のグルタミン酸がグリシンで置換）、F359V（359位のフェニルアラニンがバリンで置換）、H396R（396位のヒスチジンがアルギニンで置換）、およびF486S（486位のフェニルアラニンがセリンで置換）が挙げられる。
【０１１４】
もしも活性化するＳＲＣキナーゼ突然変異が該個体からの細胞で認められたら、治療処方を適当に開発することができる。例えば、同定した突然変異は、該細胞が一般に使用しているキナーゼインヒビターに対して耐性であるかまたは耐性になることを示しているかもしれない。そのようなインヒビターとしては、キナーゼインヒビターイマチニブが挙げられる。もしも個体における細胞がイマチニブなどのキナーゼインヒビターを用いた治療に対して耐性であるかまたは耐性になることが予期されるなら、本明細書に記載するように、治療は、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとイマチニブとの組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとチューブリン安定化剤（例えば、パシタキソール、エポチロン、タキサンなど）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（例えば、化合物II）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドと他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；本明細書に記載の他の組み合わせ；増大した投与頻度処方の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド；および本明細書に記載の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドを含む他の組み合わせまたは投与処方を含むべきである。
【０１１５】
さらに、投与処方は、ＳＲＣキナーゼ中の特定のアミノ酸突然変異の存在に基づいて確立することができる。本明細書に記載するように、ＳＲＣキナーゼ中の特定のアミノ酸突然変異は、該変異体ＳＲＣキナーゼを他のアミノ酸置換よりもキナーゼインヒビターによる治療に対して一層感受性にする。本明細書に記載するように、Q252R変異体ＳＲＣキナーゼを示す細胞は、F317L変異体ＳＲＣキナーゼを示す細胞よりも‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドによる治療に対して一層感受性である。この知見は、その細胞がそのような突然変異を示す個体の投与処方を決定するうえで有用である。例えば、細胞がQ252R変異体ＳＲＣキナーゼを示す場合は、インヒビター‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドのより集中的でない投与処方を用いることができる；代わりに、細胞がF317L変異体ＳＲＣキナーゼを示す場合は、インヒビター‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドのより集中的な投与処方を単独または本明細書に開示した他の薬剤と組み合わせて用いることができる。一つの態様において、ダサチニブ（dasatinib）の増大したまたは低減したレベルは、特定の適応症についてまたは個体について典型的なダサチニブの投与量よりも約10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90,または95％多い、または特定の適応症についてまたは個体について典型的なダサチニブの投与量よりも約1.5×, 2×, 2.5×, 3×, 3.5×, 4×, 4.5×,または5×多いダサチニブである。
【０１１６】
治療学的有効量の化合物Ｉは、化合物Ｉの酸塩として経口投与することができる。実際に使用する投与量は、患者の条件や治療しようとする状態の重篤度に応じて変わってよい。特定の状況のために適した投与量の決定は、当業者が適宜なし得る範囲である。化合物Ｉ（および化合物Ｉの塩）の有効量は当業者が決定でき、１日当たり化合物Ｉの約0.05〜約100mg/kgの成人ヒトの例示的な投与量を包含し、これを単回投与にて、または例えば１日に1, 2, 3,または4回などの個々の分割投与にて投与してよい。一つの態様において、化合物Ｉは、70mgを１日に２回投与する。あるいは、50, 70, 90, 100, 110,または120BIDにて、または１日に１回100, 140,または180にて投与することができる。特定の個体に対する特定の投与量レベルおよび投与頻度は変わってよく、使用した特定の化合物の活性、該化合物の代謝的安定性および作用時間、患者の種、年齢、体重、一般的健康状態、性別および食事、投与方法および時間、排出頻度、医薬の組み合わせ、および特定の状態の重篤度を含む様々な因子によるであろうことが理解されるであろう。治療のための好ましい患者としては、タンパク質チロシンキナーゼ関連疾患に罹患しやすい動物、最も好ましくは哺乳動物種、例えば、ヒト、およびイヌ、ネコなどの家畜が挙げられる。化合物IIまたは化合物Ｉと化合物IIとの組み合わせ、または本明細書に開示するあらゆる組み合わせも同様である。
【０１１７】
上記に記載した方法において、哺乳動物細胞はヒト癌細胞であってよい。ヒト癌細胞はイマチニブによる治療を受けた個体からのものであってよい。場合により、該ヒト癌細胞で発現されたＳＲＣポリペプチドにおけるアミノ酸置換は、イマチニブによるチロシンキナーゼ活性の抑制に対する耐性を付与する。
【０１１８】
タンパク質チロシンキナーゼ関連疾患を罹患する個体のキナーゼインヒビターの組み合わせ、例えば、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとイマチニブとの組み合わせに対する応答性を決定する方法もまた本明細書において開示される。例えば、変異体ＳＲＣキナーゼの存在に基づいて、ある個体がある種のキナーゼインヒビターに対して陽性のリスポンダーである（または該個体からの細胞が一定の程度の感受性を有することが予期される）と決定することができる。本明細書に開示するように、ＳＲＣキナーゼ、とりわけ配列番号２の250, 252, 253, 255, 315, 317, 351, 355, 359, 396および486位のアミノ酸に突然変異を示す細胞は、イマチニブに対する耐性を生じる。それゆえ、その細胞がそのような突然変異を示すタンパク質チロシンキナーゼ関連疾患を罹患する個体は、イマチニブによる治療に対して陰性のリスポンダーであるかまたは陰性のリスポンダーとなることが予期される。その細胞が本明細書に開示する変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼを示す個体は、イマチニブに対する陰性のリスポンダーにも拘わらず、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとイマチニブとの組み合わせ、または本明細書に開示する他の組み合わせに対して陽性のリスポンダーとして同定される。ついで、そのような個体に対する治療処方がしかるべく確立される。
【０１１９】
変異体ＳＲＣキナーゼの存在に基づく治療処方もまた本明細書で提供される。治療処方は、タンパク質チロシンキナーゼ関連疾患を罹患する個体に投与される一連の療法であり、１またはそれ以上のキナーゼインヒビターによる治療、並びに放射線および／または他の薬剤などの他の療法を含む。１を超える療法を投与する場合は、該療法は同時にまたは連続して投与してよい（例えば、１を超えるキナーゼインヒビターを一緒にまたは異なる時点で、異なるスケジュールで投与してよい）。１を超える療法の投与は、異なる時点で（すなわち、連続的に）、しかもなお同じ治療処方の一部であってよい。本明細書に開示するように、タンパク質チロシンキナーゼ関連疾患を罹患する個体からの細胞は、イマチニブに対する耐性を生じることが認められる。そのような細胞は‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとイマチニブとの組み合わせに対して感受性であるとの本発明の知見に基づき、この組み合わせを単独療法としてか、または他のキナーゼインヒビターとの組み合わせとしてまたは本明細書に開示する他の薬剤との組み合わせとして用いる治療を含む治療処方を確立することができる。さらに、この組み合わせを、放射線または他の既知の治療とともに投与することができる。
【０１２０】
それゆえ、本発明は、タンパク質チロシンキナーゼ関連疾患を罹患する個体に対して治療処方を確立する方法であって、（ａ）該個体からの細胞の試料を用意し；（ｂ）ＳＲＣキナーゼ配列中の少なくとも１の突然変異の存在について細胞の該試料をスクリーニングし；ついで（ｃ）該個体に治療処方の一部として、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとイマチニブとの組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとチューブリン安定化剤（例えば、パシタキソール、エポチロン、タキサンなど）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（例えば、化合物II）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドと他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；本明細書に記載の他の組み合わせ；増大した投与頻度処方の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド；および本明細書に記載の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドを含む他の組み合わせまたは投与処方を含む医薬組成物を投与することを含む方法を包含する。タンパク質チロシンキナーゼ関連疾患を罹患する個体からの細胞をスクリーニングする場合には、ＳＲＣキナーゼをコードする核酸配列中の突然変異、またはその結果としてのＳＲＣキナーゼのアミノ酸配列中の突然変異を探せばよい。
【０１２１】
「‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド」（例えば、化合物Ｉ）の語を本明細書で用いる場合はいつでも、（特に断らない限り）下記構造（Ｉ）：
【化１】
2009501523.tif 000004
を有する化合物‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド、並びに薬理学的に許容しうる全てのその塩を意図していることが理解される。化合物（Ｉ）はまた、ＩＵＰＡＣ命名法に従えばN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-((6-(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル)-2-メチル-4-ピリミジニル)アミノ)-1,3-チアゾール-5-カルボキサミドとも称される。この語の使用は、（特に断らない限り）化合物（Ｉ）の溶媒和物（水和物を含む）および多形またはその塩（例えば、２００５年２月４日に出願されたUSSN11/051,208（参照のため本明細書に引用する）に記載された（Ｉ）の一水和物など）を包含する。‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドの医薬組成物は、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドと１またはそれ以上の希釈剤、ビヒクルおよび／または賦形剤とを含むすべての薬理学的に許容しうる組成物、例えば、２００６年４月１２日に出願されたUSSN11/402,502（参照のため本明細書に引用する）に記載された組成物を包含する。
【０１２２】
本明細書においてファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（例えば、化合物II）なる語に関して、該化合物は式（II）を有することが理解される（特に断らない限り）。(R)-2,3,4,5-テトラヒドロ-1-(1H-イミダゾール-4-イルメチル)-3-(フェニルメチル)-4-(2-チエニルスルホニル)-1H-1,4-ベンゾジアゼピン-7-カルボニトリル、塩酸塩は、抗癌剤である。式（II）の化合物は、非増殖性の癌細胞を優先的に殺すことが知られている細胞障害性のＦＴインヒビターである。式（II）の化合物はさらに幹細胞を殺すのに有用である。
【化２】
2009501523.tif 000005
【０１２３】
式（II）の化合物、その調製、およびその使用は、米国特許第6,011,029号（参照のため本明細書に引用する）に記載されている。式（II）の化合物はまた、２００４年２月１９日に公開されたWO2004/015130（参照のため本明細書に引用する）にも記載されている。
【０１２４】
本明細書に記載の本発明の多くの側面を実施するに際して、生物学的試料は、組織生検（細胞試料またはそれから培養した細胞；骨髄または固形組織からの生検、例えば、固形腫瘍からの細胞を含む）、血液、血球（赤血球または白血球）、血清、血漿、リンパ液、腹水、尿、痰、大便、唾液、気管支吸引液、ＣＳＦまたは毛髪などの多くの採取源から選ばれてよい。試料からの細胞を用いることができ、あるいは細胞試料の溶解液を用いることができる。
【０１２５】
本明細書に記載する変異体ＳＲＣキナーゼの発現の分析もまた、変異体ＳＲＣキナーゼをコードする核酸配列の発現を変調する因子、例えば、変異体ＳＲＣキナーゼの発現を阻止するアンチセンスまたはｓＲＮＡｉポリヌクレオチドを同定および評価するためのツールとしても有用である。変異体ＳＲＣキナーゼ活性を抑制することのできた生物学的因子の分子の同定は、治療上の価値を有する。突然変異がM244V, G250E, Q252H, Q252R, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, F317L, M351T, E355G, F359V, H396R,およびF486Sよりなる群から選ばれたＳＲＣをコードする核酸に特異的に結合する因子は治療上の価値を有する。
【０１２６】
本発明において使用するための医薬組成物は、所期の目的を達成するのに有効な量の変異体ＳＲＣキナーゼのインヒビターの組み合わせを含む組成物を包含する。本発明の医薬組成物の有効投与量の決定は、十分に当業者が決定できる範囲内である。治療学的有効投与量とは、徴候または状態を改善する活性成分の量をいう。治療効能および毒性は、細胞培養または実験動物における標準製薬手順、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療学的に有効な投与量）およびＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な投与量）により決定してよい。
【０１２７】
本発明を実施するうえで有用な‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドを含む投与処方は、２００３年３月２４日に出願された米国特許出願第10/395,503号；およびMoshe TalpazらによるBlood (ASH Annual Meeting Abstracts) 2004, Volume 104:要約20, ”Hematologic and Cytogenetic Responses in imatinib-Resistant Accelerated and Blast Phase Chronic Myeloid Leukemia (CML) Patients Treated with the Dual SRC/ABL Kinase Inhibitor ‘N-(2-chloro-6-methylphenyl)-2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-2-methyl-4-pyrimidinyl]amino]-5-thiazolecarboxamide: Results from a Phase I Dose Escalation Study.”（参照のため本明細書に引用する）に記載されている。
【０１２８】
変異体ＳＲＣキナーゼのインヒビターの「治療学的有効量」は、存在する突然変異の関数であってよい。例えば、Shahらは、ＳＲＣキナーゼにおけるある種の突然変異を有する細胞株が異なるＳＲＣキナーゼ突然変異を有する細胞株に比べて‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドに対して一層感受性であることを開示している。本明細書において開示するように、ＳＲＣキナーゼにおいてF317L突然変異を含む細胞は、Q252R突然変異を発現する細胞株よりも３〜５倍高い濃度の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドを必要とする。当業者であれば、変異体ＳＲＣキナーゼ細胞の感受性の差違を評価し、治療学的有効投与量をしかるべく決定するであろう。
【０１２９】
様々なインビトロ生化学アッセイ（細胞増殖アッセイ、ＢＣＲ−Ａｂｌチロシンリン酸化アッセイ、ペプチド基質リン酸化アッセイ、および／または自己リン酸化アッセイを含む）において野生型のＳＲＣキナーゼと比較した‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドに対するＳＲＣキナーゼ変異体の相対的感受性に基づいて保証された‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドの予測された治療学的有効投与量の例。‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドのおよその治療学的有効投与量は、典型的な投与量に、各ＳＲＣキナーゼ変異体についてのこれらアッセイのいずれか１またはそれ以上における感受性の倍数変化を掛けることに基づいて計算できる。O’Hareら（Cancer Research, 65(11):4500-5 (2005)；参照のためその全体を本明細書に引用する）は、幾つかの臨床的に関連するＳＲＣキナーゼ変異体を用いて‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドの相対的な感受性の分析を行った。例えば、E255V変異体は、GST-Ablキナーゼアッセイでは「１」の倍数変化を有したが、この同じ変異体が細胞増殖アッセイでは「１４」の倍数変化を有した。それゆえ、この突然変異を有する患者に対する‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドの治療学的に有効な投与量は、典型的な投与量よりも１〜１４倍のどこかの数値だけ高い範囲であってよい。従って、ＳＲＣキナーゼ変異体のいずれかに対する‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドの治療学的に有効な投与量は、処方した投与量よりも1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250,または300倍高いものであってよい。あるいは、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドの治療学的に有効な投与量は、処方した投与量の0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02,または0.01であってよい。
【０１３０】
O’hareらによれば、M244V変異体は、GST-Ablキナーゼアッセイで「1.3」の倍数、自己リン酸化アッセイで「1.1」の倍数、および細胞増殖アッセイで「2」の倍数の変化を有していた；G250E変異体は、GST-Ablキナーゼアッセイで「0.5」の倍数、自己リン酸化アッセイで「3」の倍数、および細胞増殖アッセイで「2」の倍数の変化を有していた；Q252H変異体は、細胞増殖アッセイで「4」の倍数の変化を有していた；Y253F変異体は、GST-Ablキナーゼアッセイで「0.6」の倍数、自己リン酸化アッセイで「4」の倍数、および細胞増殖アッセイで「4」の倍数の変化を有していた；Y253H変異体は、GST-Ablキナーゼアッセイで「3」の倍数、自己リン酸化アッセイで「2」の倍数、および細胞増殖アッセイで「2」の倍数の変化を有していた；E255K変異体は、GST-Ablキナーゼアッセイで「0.3」の倍数、自己リン酸化アッセイで「2」の倍数、および細胞増殖アッセイで「7」の倍数の変化を有していた；F317L変異体は、GST-Ablキナーゼアッセイで「1.5」の倍数、自己リン酸化アッセイで「1.4」の倍数、および細胞増殖アッセイで「9」の倍数の変化を有していた；M351T変異体は、GST-Ablキナーゼアッセイで「0.2」の倍数、自己リン酸化アッセイで「2」の倍数、および細胞増殖アッセイで「1.4」の倍数の変化を有していた；F359V変異体は、GST-Ablキナーゼアッセイで「0.8」の倍数、自己リン酸化アッセイで「2」の倍数、および細胞増殖アッセイで「3」の倍数の変化を有していた；H396R変異体は、GST-Ablキナーゼアッセイで「1.3」の倍数、自己リン酸化アッセイで「3」の倍数、および細胞増殖アッセイで「2」の倍数の変化を有していた。
【０１３１】
T315I突然変異を有する患者については、より高い投与量の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド、または‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとイマチニブとの組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとチューブリン安定化剤（例えば、パシタキソール、エポチロン、タキサンなど）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（例えば、化合物II）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドと他のプロテインチロシンキナーゼインヒビターとの組み合わせ；本明細書に記載の他の組み合わせ；増大した投与頻度処方の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド；および本明細書に記載の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドを含む他の組み合わせまたは投与処方の投与が保証できる。あるいは、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとT315Iインヒビターとの組み合わせもまた保証できる。
【０１３２】
それゆえ、本発明は、ＳＲＣ関連疾患（例えば、ＳＲＣ関連癌）などのタンパク質チロシンキナーゼ関連疾患を罹患する個体の治療方法（ここで、そのような個体は、キナーゼインヒビターによる治療に対してナイーブであるか（すなわち、それまでにそのような治療を受けていない）または１またはそれ以上のキナーゼインヒビターによる治療を受けている（例えば、イマチニブによる治療を受けている））であって、（ａ）該個体から生物学的試料を得（現状のままかまたはアッセイを容易にするために例えば操作して（例えば、溶解して））；（ｂ）該生物学的試料を１またはそれ以上の変異体ＳＲＣキナーゼの存在についてアッセイし；ついで、１またはそれ以上の変異体ＳＲＣキナーゼが該試料に存在するなどの該アッセイの結果に基づき、（ｃ）該個体に、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドを好ましくは医薬組成物中の活性成分として該アッセイに基づいて（例えば、野生型ＳＲＣキナーゼと比較したそのような変異体の感受性に基づいて）選択した投与量および／または投与頻度にて、および／または他のチロシンキナーゼインヒビター（イマチニブＡＭＮ１０７を含むが、これらに限られるものではない）と、チューブリン安定化剤（例えば、パシタキソール、エポチロン、タキサンなど）と、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（例えば、化合物II）と、および／または本明細書に開示する該タンパク質チロシンキナーゼ関連疾患の治療に適した他の薬剤と組み合わせて投与する（その際、該他のキナーゼインヒビターおよび／または他の薬剤は、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドの投与と同時または連続して投与する）ことを含み、その際、例えば、これらに限られるものではないが、
（１）‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドによる抑制に対して少なくとも部分的に感受性である少なくとも１の変異体ＳＲＣキナーゼの同定を用い、キナーゼインヒビター単独かまたは他のキナーゼインヒビターのいずれかよりも優先して、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとイマチニブとの組み合わせによる治療を任意に選択することができる（例えば、この組み合わせが、キナーゼインヒビター単独かまたはそのような他のキナーゼインヒビターのいずれかの投与量よりも患者によって一層良好に許容される治療学的に有用な投与量にて該変異体に対して有効である場合）；
（２）少なくとも１の変異体ＳＲＣキナーゼの同定を用い、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとイマチニブとの組み合わせの投与量（個々の薬剤の増大したまたは低減した投与量を含む）および／または投与処方の頻度（‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドに対してナイーブな個体または‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドによる治療を受けている個体のいずれかについて）を任意に選択することができる（例えば、変異体ＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼが、野生型のＳＲＣキナーゼと比較して、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドおよび／またはイマチニブにより、それぞれ、より低い程度またはより高い程度で抑制される場合）；
（３）少なくとも１の変異体ＳＲＣキナーゼの同定を用い、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとチューブリン安定化剤（例えば、パシタキソール、エポチロン、タキサンなど）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（例えば、化合物II）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドと他のプロテインチロシンキナーゼインヒビター（例えば、ＢＣＲ／ＡＢＬのインヒビター、例えば、イマチニブおよび／またはＡＭＮ１０７など）との組み合わせ；本明細書に記載の他の組み合わせを含む（これらに限られるものではない）、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドと組み合わせて該チロシンキナーゼ関連疾患の治療に適した他の薬剤の同時投与を任意に選択することができ；および／またはそのようなＳＲＣキナーゼの他の形態と比較して‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドに対する感受性が低減した少なくとも１の変異体ＳＲＣキナーゼの同定を用い、そのようなＳＲＣキナーゼのそのような他の形態に適した治療処方と比較して‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドの増大した投与量または増大した投与頻度処方の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドの投与処方；および本明細書に開示する他の組み合わせまたは‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドを含む投与処方を任意に選択することができる
を特徴とする方法を提供する。
【０１３３】
上記で記載または示唆した診断および治療への応用に使用するため、キットもまた本発明により提供される。そのようなキットは、バイアル、チューブなどの１またはそれ以上の容器手段を密に詰め込んで（in close confinement）受領すべく区画化した担体手段を含み、その際、各容器手段は、本発明の方法に使用する別々の要素の一つを含む。例えば、容器手段の一つは、検出可能に標識したまたは標識できるプローブを含んでいてよい。そのようなプローブは、それぞれ、変異体ＳＲＣキナーゼタンパク質または変異体ＳＲＣキナーゼ遺伝子もしくはメッセージに特異的な抗体またはポリヌクレオチドであってよい。キットが核酸ハイブリダイゼーションを利用して標的核酸を検出する場合は、キットはまた、標的核酸配列の増幅のためのヌクレオチドを含む容器および／またはリポーター分子（酵素標識、蛍光標識、放射性同位体標識など）に結合したビオチン結合性タンパク質（アビジンまたはストレプトアビジンなど）などのリポーター手段を含む容器をも含んでいてよい。
【０１３４】
本発明のキットは、典型的に上記の容器および商業的および使用者の観点から望ましい材料（緩衝液、希釈液、フィルター、注射針、注射器、および使用説明書の付いたパッケージインサート（package insert）を含む）を入れた１またはそれ以上の容器を含むであろう。ラベルが、組成物が特定の療法または非療法の応用に用いられることを示すために容器上に存在していてよく、また、上記に記載したようなインビボかまたはインビトロのいずれかの使用の指示を示してよい。
【０１３５】
本明細書に開示する治療方法を実施するのに有用なキットはまた、変異体ＳＲＣキナーゼを抑制することのできる化合物を含んでいてよい。本発明によって特に想起されるのは、変異体ＳＲＣ関連疾患を罹患する哺乳動物を治療するうえで有用な、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとチューブリン安定化剤（例えば、パシタキソール、エポチロン、タキサンなど）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（例えば、化合物II）との組み合わせ；‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドと他のプロテインチロシンキナーゼインヒビター（例えば、これらに限られるものではないが、イマチニブおよび／またはＡＭＮ１０７など）との組み合わせ；そのようなＳＲＣキナーゼのそのような他の形態（例えば、野生型）に適した治療処方と比較して増大した投与量および／または投与頻度処方の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド；および本明細書に記載の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドを含む他の組み合わせまたは投与処方を含むキットである。例えば、イマチニブまたは他のタンパク質チロシンキナーゼインヒビターに対して完全にまたは部分的に耐性であるかまたは完全なまたは部分的な耐性を生じた、癌を罹患する哺乳動物患者（例えば、ヒト）において変異体ＳＲＣキナーゼを同定するのに有用なキットであって、該キットはまた、治療学的有効量の上記組み合わせまたは増大した投与量または投与処方を含むものが本発明により想起される。
【０１３６】
以下の代表的実施例は、さらなる重要な情報、例示およびガイダンスを含んでおり、本発明の様々な態様およびその等価物において本発明の実施に適合させることができる。これら実施例は本発明を説明するのに役立てることを意図したものであって、本発明の範囲を限定することを意図したものではないし、そのように解釈してはならない。
【０１３７】
実施例
実施例１：ＳＲＣキナーゼ突然変異の検出
‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドおよびイマチニブは、ＣＭＬおよび固形腫瘍を治療するのに有効な２つの強力なＳＲＣキナーゼインヒビターである。本明細書で提供するのは、イマチニブや他のキナーゼインヒビターなどのタンパク質チロシンキナーゼインヒビター剤に対して耐性の癌（とりわけＳＲＣキナーゼにおける１またはそれ以上の突然変異が関与する癌を含む）を治療するのに有用な組み合わせ療法および投与処方である。
【０１３８】
この組み合わせ療法の重要な側面は、ＳＲＣキナーゼにおける突然変異の検出である。もしも本発明の変異体ＳＲＣキナーゼが患者に存在するなら、そのことは個体を組み合わせ療法、または一層集中的な投与処方（例えば、一層高いおよび／またはより高頻度の投与量）、または集中的な投与処方と組み合わせ療法との組み合わせのために選択できることを示している。さらに、特定のＳＲＣキナーゼ変異体が検出されたら、処方の治療効果を促進するためにインヒビターのいずれかまたは両者の量を増大または低減することができる。
【０１３９】
癌患者、とりわけＣＭＬ患者において変異体ＳＲＣキナーゼを検出するために用いることのできる幾つかの方法がある。これら方法には、ＳＲＣキナーゼポリヌクレオチドおよびＳＲＣキナーゼタンパク質を検出する方法並びにＳＲＣキナーゼを発現する細胞を同定する方法が含まれる。患者における変異体ＳＲＣキナーゼの検出は、そのような患者がイマチニブ療法に対して少なくとも部分的に耐性であるかまたは耐性になるであろう点で診断的であろう。以下で詳細に検討するように、患者試料におけるＳＲＣキナーゼ遺伝子産物の状態は、例えば、免疫組織分析、インシトゥハイブリダイゼーションを含む様々なノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ分析（例えば、ＬＣＭ処理した試料で）、ウエスタンブロット分析、組織アレイ分析、マイクロアレイ分析、遺伝子型決定法、およびマススペクトロメトリー法を含む当該技術分野でよく知られた様々なプロトコールにより分析できる。
【０１４０】
変異体ＳＲＣキナーゼの核酸およびアミノ酸を同定する方法は当該技術分野で知られている。
【０１４１】
一つの実験戦略は、ＢＣＲおよびＡＢＬに特異的なプライマーを用いたＰＣＲを行ってＢＣＲ−ＡＢＬ転写物の所定の領域を増幅し、この生成物をサブクローニングし、ついで少なくとも１０の独立のクローンを両方向でシークエンシングすることである。この戦略は、同一患者からの異なるクローンでのゆらぎを経時的に定量化することを可能にする。そのようなプロトコールのための典型的な方法を以下に記載する。
【０１４２】
血液試料は、ＣＭＬの治療における臨床試験に参加した患者から得ることができる。ついでＲＮＡをTriAgentまたはTriAzolを用いて抽出する。ＭＭＴＶ逆転写酵素を用いてｃＤＮＡの合成を行う。プライマーCM10（5'-GAAGCTTCTCCCTGACATCCGT-3'）（配列番号３）および3'AblKD（5'-GCCAGGCTCTCGGGTGCAGTCC-3'）（配列番号４）を用い、複製連鎖反応（ＰＣＲ）を行ってｃＤＮＡを増幅させる。プライマー5'AblKD（5'-GCGCAACAAGCCCACTGTCTATGG-3'）（配列番号５）および3'AblKDを用い、２回目のＰＣＲを行ってキナーゼドメインを単離する。ついで得られた0.6Kbの断片を、EcoRVで消化したpBluescriptIIKS+中にライゲートする。細菌形質転換体をアンピシリンおよびX-galを含有する培地にプレーティングする。ｃＤＮＡ当たり１０の白色コロニーを培地に植え、ミニプレップＤＮＡを単離する。ついで、M13ユニバーサルフォアウォードプライマー（CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC；配列番号５）およびM13リバースプライマー（AGCGGATAACAATTTCACACAGGA；配列番号６）を用いて各クローンのシークエンシングを行う。２回の増幅を行うので、患者当たり少なくとも２つの独立したクローンの両鎖（both strands）で検出された場合には突然変異が存在すると考えられた。
【０１４３】
別法として、変異体ＳＲＣキナーゼに免疫特異的に結合する抗体を用いて試料中の変異体ＳＲＣキナーゼの存在を検出することができる。まず、変異体ＳＲＣキナーゼを部位特異的突然変異誘発により生成する。ついで、これら変異体ＳＲＣキナーゼイソ型を発現する細胞株を創生する。つぎに、変異体ＳＲＣキナーゼイソ型に対する抗体を製造する。ＳＲＣキナーゼおよびその変異体イソ型の発現は、ウエスタンブロット分析により記録する。
【０１４４】
具体的には、部位特異的突然変異誘発を用いてＳＲＣキナーゼ突然変異を創生し（QuickChange Kit, ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア）、すべての突然変異を二方向シークエンシング（bidirectional sequencing）により確認する（O'Farrell, A. M.ら、Blood, 101:3597-3605 (2003)）。レトロウイルス形質導入を行い、変異体ＳＲＣキナーゼイソ型を安定的に発現するBa/F3細胞株をG418耐性およびIL-3非依存性増殖についての二重選択により生成する（Yee, K. W.ら、Blood, 100:2941-2949 (2002); Yee, K. W.ら、Blood, 104:4202-4209 (2004); Tse, K. F.ら、Leukemia, 14:1766-1776 (2000); Schittenhelm, M. M.ら、manuscript submitted (2005)）。リポフェクチンアッセイ（Gibco-Invitrogen、カールスバード、カリフォルニアから購入したLipofectAMINE-キット）を用い、ＳＲＣキナーゼ野生型（「ＷＴ」）または変異体イソ型によるＣＨＯ−Ｋ１チャイニーズハムスター細胞株の一過性のトランスフェクションを行う。トランスフェクションの２４時間後に細胞を‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドで処理する（Heinrich, M. C.ら、Journal of Clinical Oncology, 21:4342-4349 (2003)）。あるいは、本明細書に記載の組み合わせのいずれかで細胞を処理してよく、または増大したレベルの‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドを用いてもよい。
【０１４５】
抗ＳＲＣキナーゼウサギポリクローナル抗体、抗ＳＴＡＴ３マウスモノクローナル抗体（ともにSanta Cruz Biotechnology, サンタクルス、カリフォルニア）、抗ＡＫＴ（ポリクローナル）ウサギ抗体（Cell Signaling Technology, ビバリー、マサチューセッツ）および抗ＭＡＰキナーゼ１／２（Ｅｒｋ１／２）ウサギモノクローナル抗体（Upstate Biotechnology, レイクプラシッド、ニューヨーク）を1:5000〜1:2000希釈で用いることができる。抗ホスホチロシンＳＲＣ抗体（Tyr568/570およびTyr703）、抗ホスホトレオニン／チロシンＭＡＰキナーゼ（Thr202/Tyr204）抗体、抗ホスホトレオニン（Thr308）および抗セリン（Ser473）ＡＫＴ抗体、抗ホスホチロシン（Tyr705）ＳＴＡＴ３抗体および非特異的な抗ホスホチロシン抗体（クローンpY20）を1:100〜1:2000希釈で用いることができる（すべてCell Signaling Technology, ビバリー、マサチューセッツ）。ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウス抗体およびヤギ抗ウサギ抗体は、それぞれ、1:5000および1:10,000希釈で用いる（BioRad; ハーキュールズ、カリフォルニア）。Protein A/G PLUS-Agarose免疫沈降試薬は、Santa Cruz Biotechnology（サンタクルス、カリフォルニア）から購入する。イマチニブ、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド、pacliaチューブリン安定化剤（例えば、パシタキソール、エポチロン、タキサンなど）、および‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドと組み合わせて有用な他の薬剤は、ＤＭＳＯ中に溶解して10mMのストック溶液を生成し、-20℃で貯蔵する。
【０１４６】
ウエスタンブロットアッセイは以下のようにして行うことができる。〜5×107細胞を種々の濃度の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドに暴露し、5%CO2雰囲気下、３７℃で９０分間培養する。細胞のペレットを100〜150μLのタンパク質溶解緩衝液（50mM Tris, 150mM NaCl, 1%NP-40, 0.25%デオキシコール酸に、インヒビターアプロチニン、AEBSF、ロイペプチン、ペプスタチン、オルトバナジン酸ナトリウム、およびピルビン酸ナトリウムを添加）で溶解する。以前にHoatlin, M. E.ら、Blood, 91:1418-1425 (1998)によって記載されているように、細胞溶解液からの500〜2000μｇのタンパク質を免疫沈降実験に用い、細胞溶解液からの75〜200μｇのタンパク質をウエスタンイムノブロットアッセイによる全細胞タンパク質分析に用いる。
【０１４７】
一定の状況の場合には、本明細書において検討した機能性ドメインの一つなどのＳＲＣキナーゼ中の特定の領域を増幅するのが望ましい。例えば、ＳＲＣのＡＴＰ結合ポケットおよび活性化ループドメインに対応する領域が、イマチニブの選択性にとって重要であり、最もイマチニブ耐性でタンパク質チロシンキナーゼインヒビター突然変異を内包することが知られている領域である。この領域のシークエンシングが、患者のＣＭＬ臨床プロファイル、それゆえ適切な組み合わせ療法および／または投与処方を、最も有効に暴露できる。簡単に説明すると、TriReagent-LS（Molecular Research Center, Inc.,シンシナチ、オハイオ）を用い、精製した末梢血または骨髄細胞からＲＮＡを抽出する。全ＲＮＡを、上記と同じプロトコールおよびプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲに供する。ＰＣＲ生成物をpCR2.1TAクローニングベクター（Invitrogen, カールスバード、カリフォルニア）中にクローニングする。579-bp領域の両鎖を、ABIプリズム377自動ＤＮＡシークエンサー（PE Applied Biosystems, フォスターシティー、カリフォルニア）上、それぞれ1327-bpおよび579-bp断片に対する5'ABLプライマーとM13フォアウォードプライマーまたはM13フォアウォードおよびリバースのプライマーセットを用いてシークエンシングする。ついで、ClustalWアラインメントアルゴリズムを用いて配列分析を行う。ついで、検出されたいかなる突然変異もゲノムＤＮＡの分析により確認する。簡単に説明すると、QiaAMP Blood Mini Kit (Qiagen, Inc., バレンシア、カリフォルニア）を用いてゲノムＤＮＡを精製骨髄または末梢血球から抽出する。361-bpのＤＮＡ断片を、それぞれＡＢＬエクソン３の５'側および３'側イントロン配列に特異的な２つのプライマー（5'-GCAGAGTCAGAATCCTTCAG-3'（配列番号７）および5'-TTTGTAAAAGGCTGCCCGGC-3'（配列番号８））を用いたＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲ生成物をクローニングし、シークエンシングする。
【０１４８】
変異体ＳＲＣキナーゼを検出する別の方法は、O’Hareら（Cancer Research, 65(11):4500-5 (2005)；参照のためその全体を本明細書に引用する）に開示されている。
【０１４９】
実施例２：組み合わせ療法の効能を評価する方法
‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとイマチニブとの組み合わせは、イマチニブ耐性またはタンパク質チロシンキナーゼインヒビター耐性でＳＲＣ依存性の疾患のマウスモデルで調べることができる。一連のそのような薬動力学的実験は、異なるＳＲＣイソ型に対して最適の投与処方をインビボで決定する手助けとなるであろう。薬動力学的実験は当該技術分野でよく知られており、当業者であればそのような実験を適宜改変して既存の条件を変えることができる。簡単に説明すると、重症複合免疫不全症マウスに、異なるＳＲＣ野生型または変異体イソ型並びにホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現するBa/F3細胞を静注する。変異していないまたはイマチニブ耐性のＳＲＣ変異体を発現するBa/F3細胞を有する未処置マウスは、肥大した（massive）肝臓および脾臓浸潤を伴うびまん性（aggressive）の疾患を生じることが予期され、典型的に死に至る。ＳＲＣをインビボで抑制する組み合わせ療法または改変した投与処方の効能を評価するため、経口洗浄による‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとイマチニブとの組み合わせの１リットル当たり0, 0.5, 1, 5, および10μモルの種々の単回投与量の投与後の種々の時点で調製した脾臓細胞溶解液中のＳＲＣキナーゼ活性を評価する。公知のＢＣＲ−ＡＢＬ基質（T. Odaら、J. Biol. Chem. 269, 22925 (1994)）であるアダプタータンパク質ＣＲＫＬのリン酸化をモニターして組み合わせ療法の効能を測定する。一連のそのような薬動力学的実験に基づき、組み合わせの適切な投与量を効能研究のために選択する。ついで、投与の前後にマウスをバイオルミネセンス造影により記録する。一連のそのような薬動力学的実験に基づき、最適の投与処方および／または組み合わせ療法を同定することができる。Ba/F3細胞の注射後３日目に始まって２週間、マウスに組み合わせまたはビヒクル単独を洗浄により投与し、ついで疾患負荷（disease burden）をバイオルミネセンス造影により評価する。ビヒクル処置したすべてのマウスは、進行性の疾患を発症することが予期される。対照的に、非変異体ＳＲＣまたは臨床的に一般的なイマチニブ耐性およびタンパク質チロシンキナーゼインヒビター耐性の突然変異を有する、組み合わせ処置したマウスは、進行性の疾患をより少なく発症するかまたは発症しないことが予期される。また、異なるＳＲＣイソ型に対して異なる最適の投与処方が同定されることが予期される。そのような投与の差違は、既知のＳＲＣ突然変異を有する患者の治療において考慮することができる。
【０１５０】
実施例３：タンパク質チロシンキナーゼ組み合わせ療法および／または改変投与処方の安全性および効能を評価する方法
以前に知見は、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドおよびイマチニブがともに、白血病の造血細胞と正常な造血細胞とに対して極めて選択的であることを示している（B. J. Drukerら、Nature Med. 2. 561 (1996)およびN. P. Shahら、Science 305. 399 (2004)）。そのような高い選択性は、これらインヒビターの高い安全性と効能、およびそれらの組み合わせで予測される効能を示している。ヒト骨髄前駆細胞に対する組み合わせの効能を評価するため、化合物をインビトロにてコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイで試験した。一連の濃度の‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとイマチニブとの組み合わせ、または本明細書に開示する他の組み合わせを、健常な志願者から、またはイマチニブ感受性（非変異体ＳＲＣ）もしくはイマチニブ耐性のいずれかの疾患を罹患するＣＭＬ患者から単離した骨髄前駆細胞に適用する。さらに、ＣＭＬ患者骨髄試料からの幼若化単位−赤芽球（blast−forming unit−erythroid（ＢＦＵ−Ｅ）およびＣＦＵ−顆粒球−単球（ＣＭ）コロニーを、これらの白血病骨髄試料中に存在する稀な正常前駆細胞の増殖に対する選択の感受性を検出するために、複製連鎖反応（ＰＣＲ）分析により分析する。簡単に説明すると、骨髄を臨床患者から採取する。生きた凍結したフィコール−ハイパック（Ficoll-Hypaque）精製した単核細胞を解凍し、10%ウシ胎仔血清、l-グルタミン、pen-strep、および幹細胞因子（100μg/ml）を添加したIscove培地中で5×105/mlの密度に一夜増殖した。２４時間後、生きた細胞を定量し、5nMの‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドまたはビヒクルの存在下、プレート当たり1×104および1×105細胞にてMethocult培地（Cell Signal Technologies, ビバリー、マサチューセッツ）にプレーティングした。実験３回行った。第１１日目に赤芽球幼若化単位（ＢＦＵ−Ｅ）および顆粒球−マクロファージコロニー形成因子（ＣＦＵ−ＧＭ）を定量する。第１４日目にコロニーをピペットの先端で単離し、ＲＮＡをQiagen Rneasyキットを用いて単離する。ＢＣＲ／ＡＢＬのｍＲＮＡ接合部（junction）の約２００ヌクレオチド下流のＡＢＬの領域に相補的なプライマー（5’-CGGCATTGCGGGACACAGGCCCATGGTACC；配列番号９）は、精製ＲＮＡにアニールする。ｃＤＮＡをマウスモロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素を用いて合成し、ＢＣＲ（5’-TGACCAACTCGTGTGTGAAACT；配列番号１０）またはＡＢＬＩａ型５'プライマー（GGGGAATTCGCCACCATGTTGGAGATCTGCCTGA；配列番号１１）のいずれかをＲＮＡの品質のための対照として用いた４０サイクルのＰＣＲに供する。
【０１５１】
実施例４：Ｃｒｋｌのホスホチロシン含量によるＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼ活性の測定方法
本発明の組み合わせ療法または一層集中的な投与処方がイマチニブ耐性を有効に克服し、ＢＣＲ−ＡＢＬ活性を抑制し、またはＢＣＲ−ＡＢＬ変異体活性を抑制する能力は、ＣＭＬ細胞中のＢｃｒ−Ａｂｌによって特異的かつ構成的にリン酸化されるアダプタータンパク質であるＣｒｋｌのホスホチロシン含量を用いることができる（例えば、J. ten Hoeveら、Blood 84, 1731 (1994); T. Odaら、J. Biol. Chem. 269, 22925 (1994);およびG. L. Nicholsら、Blood 84, 2912 (1994)を参照）。Ｃｒｋｌのホスホチロシン含量は、臨床試料で再現可能にかつ定量的に測定されることが示されている。ＣｒｋｌはＢｃｒ−Ａｂｌに直接結合し、キナーゼシグナルを下流のエフェクター経路に連結することによってＢｃｒ−Ａｂｌ形質転換において機能的な役割を果たす（例えば、K. Senechalら、J. Bio. Chem. 271, 23255 (1996)を参照）。リン酸化されると、ＣｒｋｌはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中を変化した移動度で移動し、濃度分析を用いて定量することができる。Sawyersら（２００２年６月１６日に出願した米国特許出願第10/171,889号；参照のため本明細書に引用する）は、原発性ＣＭＬ患者の細胞におけるＣｒｋｌリン酸化は、ＳＴＩ−５７１に暴露されたときに用量依存的に抑制され、Ｂｃｒ−Ａｂｌの脱リン酸化と相関関係があることを示した。同様に、本発明者らもまた、Ｃｒｋｌリン酸化が、‘N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドに暴露されたときに用量依存的に抑制されることを示した（データは示していない）。それゆえ、そのようなＣｒｋｌアッセイは、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の酵素活性の再現可能かつ定量的な仕方での評価を可能とし、本発明の組み合わせ療法または一層集中的な投与処方がイマチニブ耐性を有効に克服し、ＢＣＲ−ＡＢＬ活性を抑制し、またはＢＣＲ−ＡＢＬ変異体活性を抑制する能力を評価する有用な手段となるであろう。
【０１５２】
簡単に説明すると、細胞をプロテアーゼおよびホスファターゼインヒビターとともに1%Triton X-100緩衝液中で溶解する（例えば、A. Gogaら、Cell 82, 981 (1995)を参照）。等しい量のタンパク質（BioRad DCタンパク質アッセイ（Bio-RadLaboratories, ハーキュールズ、カリフォルニア）により決定）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに移し、ホスホチロシン抗体（4G10, Upstate Biotechnologies, レイクプラシッド、ニューヨーク）、Abl抗体（pex5, 例えば、A. Gogaら、Cell 82, 981 (1995)を参照）、β−アクチン抗体（Sigma Chemicals, セントルイスと、ミズーリ）またはＣｒｋｌ抗血清（Santa Cruz Biotechnology, サンタクルス、カリフォルニア）でイムノブロッティングする。免疫反応性のバンドをＥＣＬ（Amersham Pharmacia Biotech, ピスカタウエイ、ニュージャージー）により可視化する。シグナル強度の線型範囲を確実にすべく、幾つかの暴露を得る。最適の暴露を、ImageQuantソフトウエア（Molecular Dynamics, サニーベール、カリフォルニア）を用いた濃度分析により定量する。
【０１５３】
実施例５：哺乳動物細胞におけるＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子の増幅を調べる方法
本発明の組み合わせ療法または一層集中的な投与処方がイマチニブ耐性を有効に克服し、ＢＣＲ−ＡＢＬ活性を抑制し、またはＢＣＲ−ＡＢＬ変異体活性を抑制する能力を評価するための別の方法を提供する。具体的には、二色の（dual-color）蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）実験を行って、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子増幅が有効に低減しているか否かを決定できる。後者は、イマチニブ耐性およびタンパク質チロシンキナーゼインヒビター耐性の患者ではＢＣＲ−ＡＢＬ増幅が観察されるとの当該技術分野における認識に基づいている。間期および中期の細胞を調製し（例えば、E. Abruzzeseら、Cancer Genet. Cytogenet. 105, 164 (1998)を参照）、Locus Specific Identifier（LSI）ＢＣＲ−ＡＢＬ二色 転座プローブ（dual color translocation probe）（Lysis, Inc., ダウナーズグローブ、イリノイ）を用いて調べる。中期の並び（metaphase spreads）の細胞遺伝学的およびＦＩＳＨの特徴を観察して、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子の介在性（interstitial amplification）の増幅を伴う逆位した２本鎖フィラデルフィア染色体（inverted duplicate Ph-chromosome）が存在するか否かを評価できる。
【０１５４】
別法として、患者から得たゲノムＤＮＡの定量的ＰＣＲ分析を用いてＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子増幅が存在するか否かを評価することができる。簡単に説明すると、QiaAMP Blood Mini Kit（Qiagen, Inc., バレンシア、カリフォルニア）を用い、精製骨髄または末梢血球からゲノムＤＮＡを抽出する。10ngの全ゲノムＤＮＡを、iCycler iQシステム（Bio-Rad Laboratories, ハーキュールズ、カリフォルニア）を用いたリアルタイムＰＣＲ分析に供する。ＡＢＬエクソン３を含む361-bpのｃＤＮＡ断片を、それぞれＡＢＬエクソン３の５'側および３'側イントロン配列に特異的な２つのプライマー（5'-GCAGAGTCAGAATCCTTCAG-3'（配列番号７）および5'-TTTGTAAAAGGCTGCCCGGC-3'（配列番号８））を用いて増幅する。ＰＣＲ生成物をクローニングし、シークエンシングする。グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の472-bpのｃＤＮＡ断片を、それぞれＧＡＰＤＨのエクソン５およびエクソン８中の配列に特異的な２つのプライマー（5'-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3'（配列番号１２）および5'-CAGGAAATGAGCTTGACAAA-3'（配列番号１３））を用いて増幅する。ＡＢＬコピー数の倍数増加は、各試料についてのＡＢＬおよびＧＡＰＤＨの蛍光強度が検出され始めるＰＣＲサイクル数（threshold cycle numbers；ＤＣｔ）の差違を計算することによって決定できる。対照を参照試料として用いることができ、各試料からのＤＣｔを対照のＤＣｔから差し引いてＤ（ＤＣｔ）を決定する。ついで、倍数増加を、２−Ｄ（ＤＣｔ）として計算する。
【０１５５】
実施例６：ＢＣＲ−ＡＢＬ変異体の酵素学的および生物学的特性を測定するための当該技術分野で受け射られた方法
Ａｂｌなどのプロテインキナーゼの酵素学的特性を測定するための様々な方法が当該技術分野で知られており、例えば、Konopkaら、Mol Cell Biol. November 1985; 5(11):3116-23; Davisら、Mol Cell Biol., January 1985;5(1):204-13;およびKonopkaら、Cell. Jul. 1, 1984;37(3):1035-42（参照のため本明細書に引用する）に記載されているものなど。そのようなアッセイを用いて当業者は、変異体ＢＣＲ−Ａｂｌプロテインキナーゼの酵素学的特性を測定し、本発明の組み合わせ療法または一層集中的な投与処方がイマチニブ耐性を有効に克服し、ＢＣＲ−ＡＢＬ活性を抑制し、またはＢＣＲ−ＡＢＬ変異体活性を抑制する能力を評価することができる。
【０１５６】
Ａｂｌなどのプロテインキナーゼの形質転換活性を測定するための様々なバイオアッセイが当該技術分野で知られており、例えば、Lugoら、Science. Mar. 2, 1990;247(4946) :1079-82; Lugoら、Mol Cell Biol. March1989;9(3):1263-70; Klucherら、Blood. May 15, 1998;91(10):3927-34; Renshawら、Mol Cell Biol. March 1995; 15(3):1286-93; Sitardら、Blood. Mar. 15, 1994;83(6):1575-85; Laneuvilleら、Cancer Res. Mar. 1, 1994;54(5):1360-6; Laneuvilleら、Blood. Oct. 1, 1992;80(7):1788-97; Mandanasら、Leukemia. August 1992;6(8):796-800;およびLaneuvilleら、Oncogene. February 1991; 6(2):275-82（参照のため本明細書に引用する）に記載されているものなど。そのようなアッセイを用いて当業者は、変異体ＢＣＲ−Ａｂｌプロテインキナーゼの表現型を測定することができる。
【０１５７】
さらに別の方法が、O’Hareら（Cancer Research, 65(11):4500-5 (2005)；参照のため本明細書に引用する）に開示されている。
【０１５８】
発明の背景技術、詳細な説明、図面の簡単な説明、および実施例に引用した各文献（特許、特許出願、雑誌記事、要約、実験室マニュアル、書籍、ジーンバンクアクセッション番号、SWISS-PROTアクセッション番号、その他の開示を含む）の全体の開示は、参照のためその全体を本明細書に引用する。さらに、本願とともに提出した配列表のハードコピーは、その対応のコンピューター読み取り可能なデータに加えて、参照のためその全体を本明細書に引用する。
【０１５９】
本発明は、本明細書に開示した態様（本発明の個々の側面の単一の例示を意図するにすぎない）によって範囲が限定されることはなく、機能的に等価ないかなるものも本発明の範囲に包含される。本発明のモデルおよび方法に対する様々な改変は、本明細書に記載したものに加えて、上記の記載および教示から当業者には明らかであり、同様に本発明の範囲に包含されることを意図している。そのような改変およびその他の態様は、本発明の真の範囲および精神から逸脱することなく実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】図１Ａ〜Ｅは、野生型ＢＣＲ−ＡＢＬポリペプチドのポリヌクレオチド配列（配列番号１）およびそれから導かれたアミノ酸配列（配列番号２）を示す。導かれたアミノ酸配列を示すため、アミノ酸の標準１文字略記を用いた。ポリヌクレオチド配列は、１１３０アミノ酸のポリペプチド（配列番号２；gi|177942；およびgi|M14752.1）をコードする３３９３ヌクレオチドの配列（配列番号１；gi|177942；およびgi|M14752.1）を含む。
【０１６１】
【図２】図２は、本発明の診断法に有用な配列番号２のアミノ酸配列のＳｒｃキナーゼ変異の要約を提供する。
【図１Ａ】
2009501523.tif 000006
【図１Ｂ】
2009501523.tif 000007
【図１Ｃ】
2009501523.tif 000008
【図１Ｄ】
2009501523.tif 000009
【図２】
2009501523.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月17日(2008.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009501523000001.app
【国際調査報告】
2009501523.tif 000011
2009501523.tif 000012
2009501523.tif 000013
2009501523.tif 000014