(57)【要約】【課題】  標的組織の高解像度イメージングのための方法が本発明に包含される。【解決手段】  そのような方法は、標的化細胞又は組織に特異的な低解像度及び高解像度造影剤を投与することを含む。造影剤は、標的細胞に結合でき、又は、標的組織内に集積できる。標的組織内の低解像度造影剤の集積部位を特定するために低解像度イメージング法が使用される。次に、高解像度造影剤の集積部位を特定するために標的組織の高解像度画像が取得され、低解像度造影剤を単独で使用した場合に得られる画像よりも解像度が高い画像の生成が可能になる。これらの方法は、任意でエマルションに含まれるナノ粒子を造影剤として利用してもよい。【選択図】なし
2009535126.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高解像度イメージング法であって、
ａ）標的化低解像度造影剤と、前記低解像度造影剤と類似する標的を有する標的化高解像度造影剤を対象に投与し、各造影剤を標的組織内に集積させること、
ｂ）低解像度イメージング法を使用して前記低解像度造影剤の集積部位を特定し、前記標的組織を特定すること、
ｃ）高解像度イメージング法を使用して前記高解像度造影剤の集積部位を特定し、前記標的組織の高解像度画像を取得することにより、前記低解像度造影剤を単独で使用した場合に得られる画像よりも解像度の高い画像を得ること、を含む方法。
【請求項２】
前記低解像度造影剤及び前記高解像度造影剤が、低解像度モダリティ及び高解像度モダリティを使用して検出可能な同一の物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記低解像度造影剤と共にデコイ粒子が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記低解像度造影剤及び／又は高解像度造影剤がナノ粒子に封入されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記低解像度造影剤及び高解像度造影剤が同一のナノ粒子に封入されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ナノ粒子がエマルション中に含有される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ナノ粒子を包含するエマルションが、脂質コーティングで覆われた液体ハロカーボンコアを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記低解像度造影剤及び／又は高解像度造影剤が、標的特異的リガンドにより標的化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記標的特異的リガンドが、抗体、抗体断片、ペプチド、アプタマー、ペプチド模倣薬、薬剤、又は、ホルモンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
標的化造影剤を標的組織に送達する方法であって、
ａ）標的組織を含む対象に低解像度標的化造影剤を投与すること、
ｂ）前記対象に高解像度標的化造影剤を投与すること、ここで、前記高解像度造影剤は前記低解像度造影剤と類似する標的を有する、
ｃ）前記造影剤を前記標的組織内に集積させることにより、標的化造影剤を前記標的組織に送達すること、を含む方法。
【請求項１１】
前記低解像度造影剤及び／又は高解像度造影剤が、ナノ粒子に封入されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記低解像度造影剤及び高解像度造影剤が、同一のナノ粒子に封入されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ナノ粒子がエマルション中に含有されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ナノ粒子を包含するエマルションが、脂質コーティングで覆われた液体ハロカーボンコアを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記低解像度造影剤に結合した前記標的組織の画像を取得することを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的組織の高解像度画像を取得することを更に含む、請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記標的組織が、高レベルのαｖβ３−インテグリンによって特徴付けられ、かつ、前記低解像度造影剤及び／又は高解像度造影剤がαｖβ３−インテグリンに対するリガンドと結合している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
標的部分を発現する組織に標的化されたナノ粒子のエマルションを調製するためのキットであって、
前記標的部分に特異的なリガンド、及び、低解像度造影剤及び／又は高解像度造影剤と結合するための結合部分を含むナノ粒子を包含する少なくとも１つの容器、
前記低解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器、並びに、
前記高解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器を含むキット。
【請求項１９】
前記ナノ粒子が、脂質／界面活性剤のコーティングを更に含むハロカーボンベースのナノ粒子である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記標的化部分が、αｖβ３である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
前記高解像度造影剤が、少なくとも１つのＭＲＩ用造影剤を含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２２】
前記低解像度造影剤が９９ｍＴｃを含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２３】
標的部分を発現する組織を標的とするナノ粒子のエマルションを調製するためのキットであって、
前記標的部分に特異的なリガンドに結合するための結合部分を含むナノ粒子を含む少なくとも１つの容器、
前記標的部分に特異的なリガンドを含む少なくとも１つの容器、
低解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器、及び、
高解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器を含むキット。
【請求項２４】
高解像度イメージングのためのキットであって、
標的化低解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器、
高解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器、及び、
使用説明手段を含むキット。
【請求項２５】
前記造影剤のうち１つ又は両方がαｖβ３に標的化されている、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記高解像度造影剤が、ＭＲＩ剤、ＣＴ用イメージング剤、光学用イメージング剤、超音波用イメージング剤、パラＣＥＳＴ用イメージング剤、及び、これらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
標的の磁気共鳴画像を得るための方法であって、
高解像度造影剤が、ＭＲＩ剤を含み、
請求項２５に記載の組成物を前記標的に投与すること、及び、
前記標的の磁気共鳴画像を得ることを含む方法。
【請求項２８】
前記標的が、哺乳動物である対象に含まれている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記造影剤のうち１つ又は両方はナノ粒子を含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項３０】
高解像度イメージング用のキットであって、
標的部分に特異的なリガンドを含むハロカーボンベースのナノ粒子を含む少なくとも１つの容器、ここで、前記ナノ粒子は高解像度造影剤と結合している、及び、
使用説明手段を含むキット。
【請求項３１】
前記ハロカーボンベースのナノ粒子が、ＰＦＯＢを含む、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
標的組織の高解像度画像を得るための方法であって、
高解像度造影剤が、ＭＲＩ用造影剤を含み、
請求項３１に記載の組成物を対象に投与すること、
フッ素ＭＲＩを使用して標的組織内における低解像度造影剤の集積部位を特定し、標的組織を特定すること、及び、
前記標的組織の磁気共鳴画像を得て、これにより前記標的組織の高解像度画像を生成することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍のような標的組織の特定、位置特定、及び低解像度イメージングを提供するための、標的化低解像度造影剤の対象への投与に関する。当該投与と同時に、又は、投与後に、低解像度造影剤の投与が高解像度イメージングのプロセスの指標となるように、同様に標的化された高解像度イメージングを提供する組成物が投与される。本発明は、イメージング用の低解像度及び高解像度造影剤を含むエマルションの作製及び投与にも関する。
【背景技術】
【０００２】
監視・疫学及び転帰成績（Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，Ｅｐｉｄｅｍｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｅｎｄ  Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＳＥＥＲ）の癌登録おいて過去２５年間に集められたデータは、腫瘍の早期発見が、限局性乳癌又は局所浸潤性乳癌患者の５年生存率を改善するという原則を裏付けている（Ｅｌｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  １０４（６）：１１４９−１１５７）。生存率の改善は腫瘍サイズ分布の全体的な下方移動と相関しており、癌の大きさが１ｃｍに満たない患者に共通して特に有利な効果が認められている。癌の早期発見及び治療への幅広い要求から分子イメージングとゲノムプロテオミクス技術への関心が集まっており、これらの技法とがん治療の新戦略を組み合わせることで癌患者の生存率が更に改善する可能性がある。
【０００３】
小さな固形腫瘍を特定する手法の１つは、αｖβ３−インテグリンのような、新生血管内皮に固有のバイオシグネチャーを標的とした血管新生の早期発見をに関するものである。発明者らは、臨床で用いられる磁界強度（１．５Ｔ）での３０ｍｍ３の腫瘍の新生血管の検出に、αｖβ３−インテグリンを標的とする常磁性のパーフルオロカーボンエマルションが使用可能であることをこれまでに示した。パーフルオロカーボンナノ粒子は公称粒径が２５０ｎｍであり、血管内にとどまるため、血管外のマクロファージ、平滑筋、及びその他の細胞上に発現したαｖβ３−インテグリンへのアクセスは妨げられる。複数のモデルにおいて示されているように、ＭＲＩでは、結合した常磁性のナノ粒子による増強によって、たとえ微小な腫瘍であっても非常に解像度の高い画像が得られている（Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３（１８）：５８３８−５８４３；Ｓｃｈｍｉｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．５３（３）：６２１−６２７）が、臨床上この方法を用いるには、コイルの位置を決定し、撮像野を定め、画像を取得するために、腫瘍の位置を予め知っている必要がある。１つ以上の未知の場所に存在する微小な腫瘍を特定するには、広い関心領域にわたって確実に検出可能な１１１Ｉｎ又は９９ｍＴｃのような高感度の放射性核種シグナルが必要となることがある。
【０００４】
抗体、ペプチド、ペプチド模倣薬、及び、ディスインテグリンを含む数多くの放射線標識αｖβ３−インテグリン又はビトロネクチンアンタゴニストが、腫瘍血管の標的物質として検討されてきた（Ｈａｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４２：３２６−３３６；Ｈａｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０：１０６１−１０７１；Ｊａｎｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２（２１）：６１４６−６１５１；ＭｃＱｕａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１５（５）：９８８−９９６；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ３１（８）：１０８１−１０８９；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３１（１）：１１−１９；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３１（２）：１７９−１８９；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１５（１）：４１−４９；Ｏｎｔｈａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１５（２）：２３５−２４１；Ｓａｄｅｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１０（１）：８４−９０）。これらの物質は、αｖβ３−インテグリンに対して非常に高い特異性を持ちうるものの、血液循環を超えて浸透するため、内皮以外の成分から成る組織にも結合する。パーフルオロカーボンナノ粒子の細網内皮系（ＲＥＳ）器官への生体内分布は周知であり、これまでに報告もされている（ＭｃＧｏｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｒｔｉｆ．Ｃｅｌｌｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔ．Ｉｍｍｏｂｉｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：１２４３−１２５０）が、放射性核種の、より高いペイロード能、及び、脈管内に分布することから、頭部、頚部、肺、腹部、骨盤、及び、骨を含む非細網内皮系組織における初期腫瘍の迅速な特定に魅力的な物質となっている。
【０００５】
個体の体内での様々な及び／又は特定の部位及び組織への到達に有用で、かつ、コントラスト、特異性、及び、感度の向上をもたらす手法及び組成物の開発が、分子イメージング及び治療薬送達のために引き続き必要とされている。
【０００６】
本明細書において引用する全ての出版物、特許出願、及び特許は、開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、液体エマルションである組成物を提供する。該液体エマルションは、脂質及び／又は界面活性剤からなるコーティングで覆われた、液状で比較的高沸点のパーフルオロカーボンを含むナノ粒子を含有する。被覆するコーティングは、αｖβ３を標的する部分と直接結合し、又は、当該部分と任意にリンカーを介して共有結合している中間物質を封入することができる。あるいは、負に帯電したαｖβ３ターゲティング物質、例えば、一般的には核酸、特にはアプタマー等が表面に吸着されるように、コーティングはカチオン性であってもよい。
【０００８】
本発明の組成物は、標的部分を発現する組織を標的とすることを目的としており、該標的は、低解像度及び高解像度のイメージング法を用いて検出されることを目的としている。一の態様において、低解像度造影剤は、標的特異的リガンドに結合しうる放射性核種又は光学的イメージング剤を含む。必要に応じて、低解像度造影剤は、ナノ粒子のような粒子を含む。粒子のその他の種類には、リポソーム、ミセル、ガス及び／若しくはガス前駆体を含有する気泡、リポタンパク質、ハロカーボン及び／若しくは炭化水素ナノ粒子、ハロカーボン及び／又は炭化水素エマルション滴、中空粒子及び／若しくは多孔質粒子、並びに／又は、固体ナノ粒子が含まれる。一の態様において、低解像度造影剤は、例えばフッ素ＭＲＩ等で検出可能な、パーフルオロオクチルブロミド（ＰＦＯＢ）ナノ粒子のようなハロカーボンベースのナノ粒子を含む。高解像度造影剤は、標的特異的リガンド、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用の造影剤、ＣＴイメージング剤、光学的イメージング剤、超音波イメージング剤、パラＣＥＳＴイメージング剤、又は、これらの組み合わせを含み、また、必要に応じてナノ粒子のような粒子を含む。低解像度及び高解像度造影剤は、同じ粒子内に封入されてもよい。
【０００９】
標的化低解像度造影剤は、標的部分を発現する組織中に集積する。低解像度イメージング法によって、低解像度造影剤の集積が含まれる潜在的な標的組織が特定される。低解像度造影剤と類似する標的を有する標的化高解像度造影剤は、投与されると同様に潜在的標的組織中に集積する。低解像度イメージング法を使用して任意の潜在的標的組織が特定された場合は、特定された任意の潜在的標的組織を高解像度で検査するため高解像度イメージング法が使用される。
【００１０】
従って、一の態様においては、本発明は高解像度イメージングの方法に関し、本方法は、（ａ）標的化低解像度造影剤と、低解像度造影剤と類似する標的を有する標的化高解像度造影剤を投与し、標的組織中に各造影剤を集積させること、（ｂ）低解像度イメージング法を用いて標的組織を特定することにより、低解像度造影剤の集積部位を特定することを含む。低解像度イメージング法によって低解像度造影剤が集積した標的組織が特定された場合、ステップ（ｃ）が適用され、本ステップは、高解像度造影剤の集積部位を特定するために高解像度イメージング法を用いて標的組織の高解像度画像を得ることにより、低解像度造影剤を単独で用いた場合に得られる画像よりも解像度の高い画像の生成を可能にするものである。
【００１１】
別の態様において、本発明は標的化造影剤を標的組織に送達する方法に関し、本方法は、（ａ）標的化核造影剤及びハロカーボンベースのナノ粒子から選択される低解像度標的造影剤を、前記標的組織を体内に含む対象に投与すること、（ｂ）ＭＲＩ用造影剤、ＣＴ用造影剤、超音波用造影剤、光学用造影剤、パラＣＥＳＴ用造影剤、及び、これらの組み合わせからなる群から選択される高解像度標的化造影剤を対象に投与すること、ここで、高解像度造影剤は、低解像度造影剤と類似する標的を有する、並びに、（ｃ）造影剤を標的組織中に集積させることにより、標的化造影剤を標的組織に送達することを含む。標的組織に結合した低解像度造影剤の画像が得られる。別の態様において、必要に応じて、標的組織に結合した低解像度造影剤の画像が得られた後に、標的組織に結合した高解像度造影剤の画像が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、標的部分を発現する組織を標的とするナノ粒子等の粒子のエマルションを調製するためのキットを提供し、本キットは、標的部分に特異的なリガンド、及び、低解像度造影剤及び／又は高解像度造影剤と結合するための結合部分を含むナノ粒子を含む少なくとも１つの容器、前記低解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器、並びに、前記高解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器とを備える。一の態様において、標的部分はαｖβ３である。
【００１３】
標的部分を発現する組織を標的とするナノ粒子のエマルションを調製するためのキットも含まれ、本キットは、標的部分に特異的なリガンドに結合するための結合部分を含むナノ粒子を含む少なくとも１つの容器と、標的部分に特異的なリガンドを含む少なくとも１つの容器と、低解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器と、高解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器とを備える。一の態様において、標的部分はαｖβ３である。
【００１４】
本発明で使用するナノ粒子は、脂質／界面活性剤のコーティングを更に含む高沸点の液体パーフルオロカーボンベースのナノ粒子であってもよい。下記で更に詳細に説明するように、標的特異的リガンドは、特定の実施形態においてはαｖβ３特異的リガンドであり、脂質／界面活性剤コーティングの成分と共有結合していてもよい。
【００１５】
更に、本発明は高解像度イメージング用のキットに関し、本キットは、標的化低解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器と、標的化高解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器と、使用説明手段とを備える。造影剤のうちの１つ又は両方は、これに限定されすものではないが、ナノ粒子等の粒子を含むことができる。一の態様において、キットは、低解像度造影剤に結合部分を介して結合した、標的部分に特異的なリガンドを含むナノ粒子を含む少なくとも１つの容器と、高解像度造影剤に結合部分を介して結合した、標的部分に特異的なリガンドを含有するナノ粒子を含む少なくとも１つの容器とを備える。別の態様において、キットは、低解像度及び高解像度造影剤の両方が同じナノ粒子内に封入されるように、標的部分に特異的なリガンド及び高解像度造影剤を含むハロカーボンベースのナノ粒子を含む少なくとも１つの容器を備える。ハロカーボンベースのナノ粒子は、低解像度イメージング法を用いて検出可能であってもよい。例えば、低解像度イメージング法としてフッ素ＭＲＩを用いることにより、当該ナノ粒子を検出することができる。一の態様において、ナノ粒子は、対象に投与され、対象の体内の標的組織を特定するために低解像度イメージング法が使用される。更なる態様においては、その後、標的組織の画像を得るために高解像度イメージング法が使用される。一の態様において、標的部分はαｖβ３である。
【００１６】
別の態様において、本発明は、高解像度イメージング用のキットに関し、本キットは、標的部分に特異的なリガンドを含有するハロカーボンベースのナノ粒子であって、高解像度造影剤と結合するナノ粒子を含む少なくとも１つの容器と、使用説明手段とを備える。ハロカーボンベースのナノ粒子は、パーフルオロオクチルブロミド（ＰＦＯＢ）を含むことができる。一の態様において、高解像度造影剤はＭＲＩ用造影剤を含む。標的組織の高解像度画像を取得するための方法において、組成物を対象に投与し、フッ素ＭＲＩを使用して標的組織を特定することにより、低解像度造影剤の集積部位を特定し、標的組織のＭＲＩ画像が取得され、標的組織の高解像度画像が生成される。
【００１７】
本発明は、高解像度イメージング用の方法を更に包含し、本方法は、（ａ）標的化低解像度造影剤、及び、低解像度造影剤と類似する標的を有する標的化高解像度造影剤を対象に投与し、各造影剤を１つ以上の標的組織に集積させること、（ｂ）低解像度イメージング法を用いて標的組織中の低解像度造影剤の集積部位を特定すること、並びに、（ｃ）高解像度イメージング法を用いて標的組織の高解像度画像を取得することにより、高解像度造影剤の集積部位を特定し、低解像度造影剤を単独で使用した場合に得られる画像よりも解像度の高い画像を生成することを含む。標的組織は哺乳動物の対象の体内に存在してもよく、好ましくはヒトの対象の体内に存在する。低解像度造影剤及び高解像度造影剤は同じ組成物中に組み込まれてもよく、本組成物は低解像度モダリティ及び高解像度モダリティを使用して検出可能である。例えば、造影剤は、フッ素ＭＲＩにより低解像度イメージング法として検出可能であり、プロトンＭＲＩにより高解像度イメージング法として検出可能な、ガドリニウム添加パーフルオロカーボンエマルションであってもよい。一の態様において、低解像度造影剤及び高解像度造影剤は、本明細書で更に説明するナノ粒子等の粒子に組み込まれている。
【００１８】
デコイ粒子を低解像度造影剤と同時に投与することも可能である。デコイ粒子は、例えば国際公開公報ＷＯ０５／０８６６３９号に記載されている。
【００１９】
低解像度造影剤を高解像度造影剤と同時に投与することも可能である。一の態様において、低解像度及び高解像度造影剤は同一のナノ粒子中に封入される。あるいは、低解像度造影剤に続いて高解像度造影剤が投与される。
【００２０】
本発明は、標的化造影剤を標的組織に送達する方法に関し、本方法は、（ａ）疑わしい標的組織を含む対象に低解像度標的化造影剤を投与すること、（ｂ）高解像度標的化造影剤を対象に投与すること、ここで、高解像度造影剤は低解像度造影剤と類似する標的を有する、並びに、（ｃ）造影剤を標的組織中に集積させることにより、標的化造影剤を標的組織に送達することを含む。標的組織に結合した低解像度造影剤の画像を得ることができる。別の態様において、必要に応じて標的組織に結合した低解像度造影剤の画像が取得された後で、標的組織に結合した高解像度造影剤の画像が取得される。
【００２１】
本発明の一の態様において、低解像度造影剤は診断用放射性核種及び標的リガンドを含む。別の態様において、低解像度造影剤は、例えばＰＦＯＢ等のハロカーボンベースのナノ粒子、又は、その他のフッ素ベースＭＲＩ用造影剤を含む。
【００２２】
更なる態様において、高解像度造影剤は、ＭＲＩ用造影剤、ＣＴ用イメージング剤、光学用イメージング剤、超音波用イメージング剤、パラＣＥＳＴ用イメージング剤、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。別の態様において、高解像度造影剤は、ＰＦＯＢ等のフッ素ベースであってもよいＭＲＩ用造影剤を含む。または、高解像度造影剤は、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、モリブデン、ルテニウム、セリウム、インジウム、プラセオジミウム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、及び、イッテルビウムからなる群から選択される常磁性金属のキレートを含むプロトンベースＭＲＩ又はパラＣＥＳＴ用造影剤である。更なる態様において、高解像度造影剤は、ヨウ素化油ナノ粒子又は封入型固体金属粒子を含むＣＴ用イメージング剤を含むことができる。
【００２３】
低解像度又は高解像度造影剤は、粒子を含む担体に封入されてもよい。「粒子」には、例えばリポソーム、ミセル、ガス及び／若しくはガス前駆体を含有する気泡、リポタンパク質、ハロカーボン及び／若しくは炭化水素ナノ粒子、ハロカーボン及び／若しくは炭化水素エマルション滴、中空粒子及び／若しくは多孔質粒子、並びに／又は、固体ナノ粒子が含まれる。粒子自体は、固体粒子、液体でコーティングされた固体粒子、液体でコーティングされた液体粒子、及び、固体又は液体でコーティングされた気体粒子を含む、様々な物理的状態であってもよい。本発明に有用な様々な粒子だけでなく、活性組成物中の当該粒子にターゲティング成分を結合させる手段が、当該技術分においてこれまで説明されている。該粒子は、例えば、米国特許第６５４８０４６号、第６８２１５０６号、第５１４９３１９号、第５５４２９３５号、第５５８５１１２号、第５１４９３１９号、第５９２２３０４号、並びに、欧州特許公開公報第７２７２２５号に記載されており、粒子の構造に関して全ての開示内容が参照として本明細書に組み込まれる。これらの文献は例に過ぎず、本発明に有用な様々な種類の粒子状担体を全て含んでいるものではない。本明細書では概してナノ粒子について述べるが、本発明の実施形態はナノ粒子に限定されず、本明細書において説明する組成物及び方法は他の種類の粒子にも同様に有用であることが理解される。
【００２４】
更に、担体として使用する粒子は、ガス気泡、又は、使用の際にガス気泡を形成する前駆体を含んでもよい。この場合、ガスは液体又は固体ベースのコーティングに包含される。
【００２５】
ターゲティング物質と共に、また必要に応じて活性成分と共に提供されてもよく、又は、担体中で使用してもよい、他の適した粒子には、米国特許第５５３６４８９号に記載の油及び水エマルション、米国特許第５５１２２９４号に記載されたようなリポソーム組成物、並びに、米国特許第５１７１７３７号に記載の油及び水エマルションが含まれる。
【００２６】
一の態様において、本明細書において更に説明するように、エマルション中に含まれていてもよいナノ粒子中に造影剤が封入される。好ましくは、ナノ粒子は脂質コーティングで覆われた液体フルオロカーボンコアを含む。
【００２７】
造影剤は、標的特異的リガンドによって標的化される。好ましい態様において、標的特異的リガンドは抗体、抗体断片、ペプチド、アプタマー、ペプチド模倣薬、薬剤、又は、ホルモンである。標的特異的リガンドはナノ粒子に結合させることができる。一の態様において、標的組織は高レベルのαｖβ３−インテグリンによって特徴付けられ、更なる態様において、低解像度及び／又は高解像度造影剤は、αｖβ３−インテグリンに対するリガンドと結合したナノ粒子を含むエマルションを備える。
【００２８】
一般的に、標的特異的リガンドと直接結合した標的化ナノ粒子は、それ自体、Ｘ線イメージング（例えば、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ））、超音波イメージング、及び／又は、治療薬の送達に有用である。また、他の成分を添加することで、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、核医学イメージング（例えば、シンチグラフィー、陽電子放射断層撮像法（ＰＥＴ）、及び、単光子放射型コンピュータ断層撮像法（ＳＰＥＣＴ））、光学的又は光イメージング（例えば、共焦点顕微鏡及び蛍光画像法）、マグネトトモグラフィー（magnetotomography）、並びに、電気インピーダンスイメージングのような他の形態の画像法に使用できる。例えば、常磁性イオンを含有するキレート剤を添加すると、粒子は磁気共鳴画像法用の造影剤として使用できる。パーフルオロカーボンナノ粒子は多量のフッ素を含むため、該粒子をＭＲＩに使用する場合、常磁性イオンの添加は必要ではなく、フルオロカーボンコアによって、１９Ｆ磁気共鳴画像法を使用し粒子の位置を追跡することができる。他の画像化モダリティの性質に応じて、１９Ｆ磁気共鳴画像法を低解像度又は高解像度イメージング法として使用することができる。更に、放射性核種を添加することで、核イメージング（例えば、シンチグラフィー、陽電子放射断層撮像法（ＰＥＴ）、及び、単光子放射型コンピュータ断層撮像法（ＳＰＥＣＴ））、若しくは、放射線療法の治療薬、又は、その両方に造影剤を使用することができる。生物活性物質を添加することで、薬物送達システムとして造影剤を使用することができる。そうした活性の複数を含んでいてもよく、従って、治療用活性物質を標的組織へ送達すると同時に、標的組織の画像を得ることもできる。
【００２９】
ハロカーボンベースのナノ粒子のエマルションは、コーティングに加えられる成分の性質に応じて様々な方法で調製可能である。典型例として、単に例示を目的とするものであるが、以下手順を示す：パーフルオロオクチルブロミド（４０％ｗ／ｖ、ＰＦＯＢ、３Ｍ）、界面活性剤混合物（２．０％、ｗ／ｖ）及び、グリセリン（１．７％、ｗ／ｖ）を調製する。ここで、前記界面活性剤混合物は、クロロホルムに溶解された、６４モル％レシチン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ）、３５モル％コレステロール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）及び１モル％ジパルミトイル−Ｌ−α−ホスファチジル−エタノールアミン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｎｃ．）が含まれる。薬剤をメタノールに懸濁し（〜２５μｇ／２０μｌ）、０．０１から５．０モル％の間、好ましくは０．２から２．０モル％の間、でタイトレーションした量を、２％界面活性剤層に添加する。クロロホルム−脂質混合液を減圧下で蒸発させ、５０℃の真空オーブン内で一晩乾燥し、超音波処理により水に分散させる。懸濁液を、蒸留水又は脱イオン水に溶解したパーフルオロオクチルブロミドと共にブレンダーカップ（Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）に移し、３０秒〜６０秒間乳化させる。乳化した混合液をＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ乳化装置（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏ．）に移し、２０，０００ＰＳＩで３分間処理を継続する。処理が完了したエマルションをバイアルに移し、窒素を封入し、使用するまでクリンプ栓で密封する。コントロール用エマルションは、界面活性剤混合物に薬剤を添加しないことで、同じ手順により調製することができる。粒子の大きさは、レーザー光散乱サブミクロン粒子サイズ解析装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ４、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．（Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ、米国マサチューセッツ州）を使用して３７℃で３回測定し、平均直径が４００ｎｍ未満のタイトかつ再現性の高いサイズ分布を示す。取り込まれなかった薬剤は透析法又は限外ろ過法で除去することができる。ターゲティングリガンドを提供するため、上述の手順において、二官能性リンカーを介してＦ（ａｂ）フラグメントをホスファチジルエタノールアミンに共有結合させる。
【００３０】
一部の例では、脂質及び／又は界面活性剤で覆うコーティングは、ターゲティング部分に直接結合することができ、若しくは、ターゲティング部分と共有結合した中間成分を封入することができる、必要に応じてリンカーを介していてもよく、又は、ビオチンのような非特異的結合物質を含有してもよい。あるいは、ターゲティング物質が静電的に表面に吸着されるようにコーティングはカチオン性又はアニオン性であってもよい。例えば、負に帯電したターゲティング物質、一般的には核酸、特にはアプタマー等を表面に吸着させるため、コーティングはカチオン性であってもよい。
【００３１】
いくつかの態様において、ナノ粒子は、その表面に存在する、イメージング及び／又は治療に有用な「補助物質」を少なくとも１つ含んでいてもよい。本補助物質は、放射性核種、ＭＲＩ若しくはＰＥＴイメージング用造影剤、光学イメージング用蛍光色素分子若しくは赤外線物質、及び／又は、生物活性化合物を含むが、これらに限定されるものではない。ナノ粒子は、それ自体、Ｘ線（例えば、ＣＴ）、フッ素ベースＭＲＩ、又は、超音波イメージング用の造影剤として使用することができる。他の態様においては、ナノ粒子は低解像度及び高解像度造影剤に結合し、これら造影剤は更にそれぞれ１つ以上の補助物質と結合していてもよい。
【００３２】
いくつかの態様においては、造影剤は、治療薬及び診断用薬として使用するために、これらに限定されるものではないが、生物活性剤、放射性薬剤、化学療法剤、及び／又は、遺伝子製剤を含むよう改良されていてもよい。
【００３３】
本発明は、本造影剤を、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、及び、ｉｎ  ｖｉｔｒｏを含む様々な応用において使用する方法を提供する。本方法は、単一モード又はマルチモードイメージング及び／又は治療法を含む。
【００３４】
従って、少なくとも１つの治療薬を封入した標的化造影剤は、選択された細胞、組織及び／又は臓器に特異的に投与した場合に、リスク／ベネフィットプロファイルが改善する病気又は疾患の治療に特に有用である。
本発明の使用法及び組成物
【００３５】
（本発明の使用法及び組成物）
エマルション及びその調製用キットは、細胞、組織及び／若しくは臓器のイメージング、並びに／又は、細胞、組織及び／若しくは臓器への治療薬の送達を含む本発明の方法に有用である。いくつかの態様において、エマルションは、その表面上に存在する、細胞及び／又は組織に指向化されたリガンドを使用することで、特定の細胞種及び／又は組織を標的化させる。エマルションは、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、及び、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞又は組織に使用することができる。
【００３６】
ターゲティングリガンドと物質（例えば、薬剤）を含有するエマルションのｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで使用することにより、例えば、特定及び／又は物質を標的化細胞への送達を行うことができる。例えば、Ｘ線イメージング法を使用してそのような細胞の特定が可能であり、細胞への物質の送達もイメージングの過程において確認できる。例えば、細胞の移植、又は、次に続く利用の前に、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、細胞、例えば幹細胞に遺伝物質を送達するために、及び／又は、細胞、例えば幹細胞を標識するために標的化エマルションを使用することができる。更に、本発明のエマルションは、溶液中の標的化細胞を特定し、及び、例えば沈降法及び／又は勾配遠心分離によって標的化細胞を溶液から回収又は単離するために使用することができる。
【００３７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで本発明のナノ粒子エマルションを使用する方法は当業者に周知である。例えば、本発明のエマルションを使用して画像化される及び／又は治療される関心部位は、これらに限定されるものではないが、心臓組織と全ての心血管系の血管、血管由来組織、心血管系の血管の任意の部分、又は、例えば、血栓、凝血塊、破裂凝血塊、血小板、筋細胞等の心血管内に入り若しくは心血管を塞栓する任意の物質若しくは細胞が含まれる心血管系組織である。本発明のエマルションを用いて画像化され及び／又は治療される病態は、病変において血管系が重要な役割を果たす任意の病態、例えば、心臓血管疾患、癌、関節リウマチを含む様々な疾患の特徴を示すことがある炎症部位、再狭窄につながる血管形成術による刺激のような刺激部位、腫瘍、アテローム性動脈硬化部位が含まれるが、これらに限定されるものではない。使用するターゲティングリガンドに応じて、本発明のエマルションは、血管及び／又は再狭窄の画像化に特に使用される。例えば、αｖβ３−インテグリンに結合するリガンドを含有するエマルションは、αｖβ３−インテグリンを高レベルに発現している組織を標的とする。αｖβ３の高レベル発現は活性化内皮細胞に典型的に認められ、新生血管の特徴であると考えられている。画像化及び／又は治療する他の組織には、特定の悪性組織及び／又は腫瘍を含有するものが含まれる。
【００３８】
所望により、標的指向性イメージング及び治療薬送達を組み合わせることで、単一の手順で、標的の特定及び薬の送達を行うことができる。薬を送達するエマルションを画像化する能力によって、薬が送達される細胞又は組織の同定及び／又は確認を行うことができる。
【００３９】
本明細書で説明する低解像度及び高解像度造影剤は、単一モードイメージング又はマルチモードイメージングに使用することができる。例えば、Ｘ線とＭＲＩイメージングの組み合わせ、又は、他の本明細書で説明するイメージングの種類の組み合わせのような、１種類より多いイメージングを可能にする補助薬を含む造影剤により、マルチモードイメージングを実施することができる。あるいは、初めに低解像度イメージング法により低解像度造影剤の局在を知り、続いて、高解像度イメージング法により高解像度造影剤の局在を知るように、１種類より多い造影剤を対象に投与することもできる。
【００４０】
一の態様において、低解像度イメージング法を用いることにより標的組織の存在場所が特定される。低解像度イメージング法の限定されない例としては、Ｘ線透視法、ＭＲ透視法、リアルタイム超音波法、核医学イメージング（例えば、シンチグラフィー、陽電子放射断層撮像法（ＰＥＴ）、並びに、光学イメージング（例えば、近赤外線法、蛍光法）及び単光子放射型コンピュータ断層撮像法（ＳＰＥＣＴ））が挙げられる。続いて、低解像度イメージング法を用いて位置が特定された標的組織の高解像度画像を得る。本明細書で用いる場合、語句「高解像度イメージング法」は、特定の態様において用いられる低解像度イメージング法よりも高解像度の画像を取得する方法を意味する。本明細書で用いる場合、語句「低解像度」は、そのイメージング法が高解像度イメージング法よりも高い感度を持つことを示す。はじめに感度の高い技法を用いることで、潜在的な標的組織をより広い範囲で検索ができ、その後、高解像度イメージングが行われることにより、特定された標的組織に関するより正確な情報を得る。イメージング法の解像度は、一般的に、スキャンされる時間／量を算出することにより決定される。使用する低解像度イメージング法は、一般的に、選択される高解像度イメージング法と比較して、与えられた量をスキャンするために要する時間が短い。高解像度イメージング法の限定されない例として、プロトン及びフッ素ＭＲＩ、ＣＴ（Ｘ線ＣＴ及び電子ビームＣＴ）、超音波法、並びに、共焦点顕微鏡がある。当業者は、低解像度及び高解像度イメージング法用に選択される解像度が、少なくとも、使用される技法、造影剤、対象の生体構造、及び、画像化される組織によることを容易に理解するであろう。
【００４１】
本発明の更なる態様において、１つ以上の組織又は目的領域における低解像度造影剤の集積部位を特定するために低解像度イメージングを使用し、次に、高解像度イメージング法が該特定領域において使用して、低解像度造影剤と類似して標的化した高解像度造影剤の集積を検出する。従って、低解像度造影剤の使用及び検出を、標的組織の高解像度画像の取得の指標として利用する。
【００４２】
Ｘ線用造影剤として使用する場合、本発明の組成物は一般的に、約１０％〜約６０％ｗ／ｖ、好ましくは約１５％〜約５０％ｗ／ｖ、より好ましくは約２０％〜約４０％ｗ／ｖの濃度のパーフルオロカーボンを有する。静脈注射によって投与される用量は、一般的に、約０．５ｍｍｏｌ／ｋｇ〜１．５ｍｍｏｌ／ｋｇ、好ましくは約０．８ｍｍｏｌ／ｋｇ〜１．２ｍｍｏｌ／ｋｇの範囲にある。イメージングは、既知の技法、好ましくはＸ線コンピュータ断層撮影法を使用して行われる。
【００４３】
本発明の超音波用造影剤は、例えば、およそ３μＬ／ｋｇ／分の注入速度での静脈注射により投与する。イメージングは、既知の超音波法を使用することにより行われる。
【００４４】
本発明の磁気共鳴画像法用造影剤は、米国特許第５１５５２１５号及び第５０８７４４０号；Ｍａｒｇｅｒｓｔａｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．３：８０８；Ｒｕｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  １６６：８３５；並びに、Ｂｏｕｓｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  １６６：６９３に記載されるような他のＭＲＩ剤と同様の方式で使用してもよい。他の薬剤として、米国特許第６８７５４１９号において説明されているような、ｐＨ感受性であり、またパルスに応じてコントラスト特性が変化可能なものを使用してもよい。概して、０．０１〜１．０ミリモル／体重ｋｇの用量で造影剤の滅菌水溶液を患者に静脈内投与する。
【００４５】
診断用放射線医薬品は、通常は生理食塩水中に含まれ、１〜１００ｍＣｉ／体重７０ｋｇの用量、又は、好ましくは５〜５０ｍＣｉの用量で静脈注射によって投与される。イメージングは、既知の手順を使用して行われる。
【００４６】
治療用放射線医薬品は、通常は生理食塩水中に含まれ、０．０１〜５ｍＣｉ／体重ｋｇの用量で、又は好ましくは０．１〜４ｍＣｉ／体重ｋｇの用量で、例えば静脈注射によって投与される。同等の治療用放射線医薬品に関しては、現在の臨床診療では、用量をＺｅｖａｌｉｎ（商標）の０．３〜０．４ｍＣｉ／ｋｇから標識ソマトスタチンペプチドであるＯｃｔｒｅｏＴｈｅｒ（商標）の１〜２ｍＣｉ／ｋｇまでの範囲に設定している。このような治療用放射線医薬品では、腫瘍細胞の殺傷と正常組織への毒性、特に放射線腎炎との間のバランスが保たれている。これらのレベルでは、そのバランスは概して腫瘍細胞への効果を重視する。これらの用量は対応する画像用アイソトープに比較して多い。
【００４７】
本明細書において、「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、ヒト、家畜、スポーツ用動物、げっ歯類、及び愛玩動物が含まれるがこれらに限定されるものではない。
【００４８】
本明細書において、物質の「有効量」又は「十分量」は、臨床結果を含む有益な又は所望の結果をもたらすのに十分量である。「有効量」は、その語句が使われる文脈に応じて異なる。有効量は、１つ以上の投与によって投与することができる。
【００４９】
本明細書において、単数形「ある」及び「その」は、別段の記載がない限り複数の指示対象を含む。例えば「ある」標的細胞は、１つ以上の標的細胞を含む。
【００５０】
本発明の方法においては、任意の低解像度又は高解像度造影剤を用いることができる。
【００５１】
本明細書において「造影剤」は、例えば、ＣＴ又はＭＲＩスキャン等の画像において身体の内部構造の可視性を高めるために用いられる化合物を意味する。本明細書において、語句、造影剤は、イメージング剤ともいう。例えば、非経口注射（例えば、静脈内、動脈内、髄腔内、腹腔内、皮下、筋肉内）、経口的（例えば、錠剤若しくはドリンク剤として）、経直腸的、又は、吸入によって造影剤を対象に投与することができる。
【００５２】
例えば、Ｘ線用造影剤は、硫酸バリウムを含むことができ、又は、有機（非イオン）化合物中又はイオン化合物中にヨードを含むことができる。有機ヨード造影剤の例としては、イオヘキソール、イオジキサノール、イオベルソル、イオパミドール、及び、これらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されるものではない。イオン性造影剤の例には、ヨーダミドメグルミン、イオタラム酸メグルミン、ジアトリゾ酸メグルミン、アミドトリゾ酸メグルミン、ジアトリゾ酸ナトリウム、イオキサグル酸メグルミンナトリウム、イオタラム酸ナトリウム、イオタラム酸メグルミンナトリウム、ジアトリゾ酸メグルミンナトリウム、及び、これらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されるものではない。
【００５３】
別の態様において、ＭＲＩ用造影剤は常磁性造影剤（例えば、ガドリニウム化合物）、超常磁性造影剤（例えば、酸化鉄ナノ粒子）、反磁性物質（例えば、硫酸バリウム）、及び、これらの組み合わせを含むことができる。
【００５４】
更なる態様においては、ＣＴ用造影剤はヨード（イオン性又は非イオン性製剤）、バリウム、硫酸バリウム、ガストログラフィン（ジアトリゾ酸メグルミン及びジアトリゾ酸ナトリウム溶液）、及び、これらの組み合わせを含むことができる。
【００５５】
別の態様において、ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴ用造影剤は、金属キレートを含むことができる。
【００５６】
本発明は、本明細書において使用される造影剤が、標的化造影剤であってもよいことを意図するものである。本明細書において、語句「標的化」は、本明細書において更に説明するように、目的とする分子に対する標的特異的リガンドの使用を意味するものである。
【００５７】
本発明の一の態様において、低解像度及び／又は高解像度造影剤はパーフルオロカーボンエマルションを含む。使用可能なパーフルオロカーボンエマルションは、米国特許第４９２７６２３号、第５０７７０３６号、第５１１４７０３号、第５１７１７５５号、第５３０４３２５号、第５３５０５７１号、第５３９３５２４号、及び、第５４０３５７５号において開示されている。使用可能なパーフルオロカーボンエマルションは、パーフルオロカーボン化合物が、パーフルオロデカリン、パーフルオロオクタン、パーフルオロジクロロオクタン、パーフルオロ−ｎ−オクチルブロミド、パーフルオロヘプタン、パーフルオロデカン、パーフルオロシクロヘキサン、パーフルオロモルホリン、パーフルオロトリプロピルアミン、パーフルオロトリブチルアミン、パーフルオロジメチルシクロヘキサン、パーフルオロトリメチルシクロヘキサン、パーフルオロジシクロヘキシルエーテル、パーフルオロ−ｎ−ブチルテトラヒドロフラン、並びに、これらの化合物と構造的に類似し、部分的若しくは完全にハロゲン化された（少なくとも数個のフッ素置換基を含む）化合物、又は、パーフルオロアルキル化エーテル、ポリエーテル若しくはクラウンエーテルを含む部分的若しくは完全にパーフルオロ化された化合物を含む。
【００５８】
乳化剤、例えば界面活性剤は、エマルションの形成を促進し、かつ、その安定性を向上させるために用いられる。通常は、水中油型エマルションの形成を促進するために水相界面活性剤が用いられてきた。界面活性剤は、親水部分と疎水部分の両方を含む任意の物質である。水又は溶媒に添加された場合、界面活性剤は表面張力を弱める。
【００５９】
ナノ粒子（所望の化合物を表面に結合させるための、結合したリガンド又は封入された試薬を含んでいてもよい）上の外層コーティングを形成するために使用される脂質／界面活性剤には、天然又は合成リン脂質、脂肪酸、コレステロール、リゾ脂質、スフィンゴミエリン、トコフェロール、糖脂質、ステアリルアミン、カルジオリピン、プラズマロゲン、エーテル又はエステル結合脂肪酸を持つ脂質、及び、重合脂質が含まれる。一部の例では、脂質／界面活性剤は、脂質結合ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含んでいてもよい。Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、Ｔｒｉｔｏｎ等を含む市販の各種のアニオン性、カチオン性、及び、非イオン性界面活性剤を使用することもできる。いくつかの態様において、好ましい界面活性剤はリン脂質及びコレステロールである。
【００６０】
油に溶解して乳化するフッ素化界面活性剤も使用することができる。好ましいフッ素系界面活性剤は、パーフルオロヘキサン酸及びパーフルオロオクタン酸のようなパーフルオロ化アルカン酸、並びに、アミドアミン誘導体を含む。これらの界面活性剤は、通常、約０．０１〜５．０重量％の量、好ましくは約０．１〜１．０％の量で用いられる。他の適切なフッ素系界面活性剤には、パーフルオロ化アルコールリン酸エステル及びその塩；パーフルオロ化スルホンアミドアルコールリン酸エステル及びその塩；パーフルオロ化アルキルスルホンアミド；アルキレン四級アンモニウム塩；Ｎ，Ｎ（カルボキシル置換低級アルキル）パーフルオロ化アルキルスルホンアミド；及び、その混合物が含まれる。本明細書において、語句「パーフルオロ化」は、界面活性剤が少なくとも１つのパーフルオロアルキル基を有することを意味する。
【００６１】
適切なパーフルオロ化アルコールリン酸エステルは、モノ−及びビス（１Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈパーフルオロアルキル）ホスフェートのジエタノールアミン塩の遊離酸を含む。商標名ＺＯＮＹＬ  ＲＰ（Ｄｕｐｏｎｔ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）として市販されているリン酸塩は、既知の方法を用いて対応する遊離酸に変換される。適切なパーフルオロ化スルホンアミドアルコールリン酸エステルは、米国特許第３０９４５４７号に記載されている。適切なパーフルオロ化スルホンアミドアルコールリン酸エステルとその塩には、パーフルオロ−ｎ−オクチル−Ｎ−エチルスルホンアミドエチルホスフェート、ビス（パーフルオロ−ｎ−オクチル−Ｎ−エチルスルホンアミドエチル）ホスフェート、ビス（パーフルオロ−ｎ−オクチル−Ｎ−エチルスルホンアミドエチル）ホスフェートのアンモニウム塩、ビス（パーフルオロデシル−Ｎ−エチルスルホンアミドエチル）ホスフェート、及び、ビス（パーフルオロヘキシル−Ｎ−エチルスルホンアミドエチル）ホスフェートを含む。好ましい製剤は、ホスファチジルコリン、誘導体化ホスファチジルエタノールアミン、及び、コレステロールを脂質界面活性剤として使用する。
【００６２】
その他、例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８、ＨＡＭＰＯＳＹＬ  Ｌ３０（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ  Ｃｏ．，米国ニューハンプシャー州ナシュア）、ドデシル硫酸ナトリウム、Ａｅｒｏｓｏｌ  ４１３（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ  Ｃｏ．，米国ニュージャージー州ウェーン）、Ａｅｒｏｓｏｌ  ２００（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ  Ｃｏ．）、ＬＩＰＯＰＲＯＴＥＯＬ  ＬＣＯ（Ｒｈｏｄｉａ  Ｉｎｃ．，米国ニュージャージー州Ｍａｍｍｏｔｈ）、ＳＴＡＮＤＡＰＯＬ  ＳＨ１３５（Ｈｅｎｋｅｌ  Ｃｏｒｐ．，米国ニュージャージー州ティーネック）、ＦＩＺＵＬ  １０−１２７（Ｆｉｎｅｔｅｘ  Ｉｎｃ．，米国ニュージャージー州エルムウッドパーク）、及び、ＣＹＣＬＯＰＯＬ  ＳＢＦＡ３０（Ｃｙｃｌｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ．，米国フロリダ州マイアミ）等の既知の界面活性剤添加剤、；例えば、商標名Ｄｅｒｉｐｈａｔ（商標）１７０（Ｈｅｎｋｅｌ  Ｃｏｒｐ．）、ＬＯＮＺＡＩＮＥ  ＪＳ（Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．）、ＮＩＲＮＯＬ  Ｃ２Ｎ−ＳＦ（Ｍｉｒａｎｏｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，米国ニュージャージー州Ｄａｙｔｏｎ）、ＡＭＰＨＯＴＥＲＧＥ  Ｗ２（Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．）、及び、ＡＭＰＨＯＴＥＲＧＥ  ２ＷＡＳ（Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．）で販売されている両性剤等の両性剤；並びに、例えば、商標名ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８（ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ，米国ミシガン州ワイアンドット）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−１２７（ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ）、ＢＲＩＪ３５（ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ，米国デラウェア州ウィルミントン）、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ  Ｃｏ．，米国ペンシルバニア州フィラデルフィア）、ＢＲＩＪ５２（ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ）、ＳＰＡＮ２０（ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ）、ＧＥＮＥＲＯＬ  １２２ＥＳ（Ｈｅｎｋｅｌ  Ｃｏｒｐ．）、ＴＲＩＴＯＮ  Ｎ−４２（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ  Ｃｏ．）、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｎ−１０１（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ  Ｃｏ．）、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−４０５（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ  Ｃｏ．）、ＴＷＥＥＮ８０（ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ）、ＴＷＥＥＮ８５（ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ）、及び、ＢＲＩＪ５６（ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ）として販売されている非イオン剤等の非イオン剤を、単独で又は組み合わせて、０．１０〜５．０重量％の量で使用し、エマルションを安定させてもよい。
【００６３】
脂質封入エマルションは、粒子表面に核酸やアプタマーのようなリガンドを取り込ませ又は付着させるカチオン性脂質を界面活性剤層中に含有させて製剤化してもよい。一般的なカチオン性脂質は、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）；ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）；ＤＯＴＢ（１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチル−アンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール、１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン；ＤＡＰ（１，２−ジアシル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン）；ＴＡＰ（１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン）；１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール−３−エチルホスホコリン、３β−［Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモル］コレステロール−ＨＣｌ、ＤＣ−コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；及び、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）を含んでいてもよい。一般的に、脂質界面活性剤単層中のカチオン性脂質の非カチオン性脂質に対するモル比は、例えば１：１０００〜２：１であってもよく、好ましくは２：１〜１：１０であり、より好ましくは１：１〜１：２．５の範囲であり、最も好ましくは１：１である（カチオン性脂質のモル量の非カチオン性脂質、例えばＤＰＰＣのモル量に対する比）。様々な脂質は、上述のものに加えて、エマルション界面活性剤の非カチオン性脂質成分、特にジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、又は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを含んでもよい。上述のカチオン性脂質の代わりに、ポリリシン又はポリアルギニンのようなカチオン性ポリマーを有する脂質を脂質界面活性剤に加えて、エマルション粒子の外層に負に帯電した治療薬、例えば遺伝物質又はその類似体を結合させてもよい。いくつかの態様において、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用されるエマルションの安定性をもたらすため、脂質は架橋していてもよい。架橋結合した脂質を有するエマルションは、本明細書で説明するイメージング方法にとって特に有用であり得る。
【００６４】
特定の態様において、脂質／界面活性剤コーティングは、標的特異的リガンド及び／又はイメージング又は治療に有用な補助物質を結合するのに使用可能な反応基を有する成分を含む。いくつかの態様において、１以上の所望の成分の非常に多数をナノ粒子に結合させるための担体となる脂質／界面活性剤コーティングが好ましい。下記で説明するように、脂質／界面活性剤成分は、脂質／界面活性剤成分に含まれる官能性を介してこれらの反応基に結合してもよい。例えば、ホスファチジルエタノールアミンを、アミノ基を介して所望の部分に直接結合させてもよく、又は、下記で説明するようにカルボキシル基、アミノ基若しくはスルフヒドリル基を備える短鎖ペプチドのようなリンカーに結合させてもよい。あるいは、マレイミドのような標準的な結合剤を用いてもよい。ナノ粒子にターゲティングリガンドや補助物質を結合させるのに様々な方法を用いることができ、該方法は、例えばポリエチレングリコール又はペプチドのようなスペーサー基の使用を含んでいてもよい。
【００６５】
一般的に脂質／界面活性剤でコーティングされたナノ粒子は、懸濁液中でコアを形成する油と外層を形成する脂質／界面活性剤混合物との混合液を、水性溶媒中でミクロ流動化してエマルションを生じさせることで形成される。本方法において、脂質／界面活性剤は、ナノ粒子に乳化された時点で、既に追加のリガンドと結合していてもよく、又は、単にその後の結合に使用する反応基を含んでいてもよい。あるいは、脂質／界面活性剤層に加えられる成分は、補助物質の溶解度特性によって単に層に可溶化されていてもよい。水性溶媒中の脂質／界面活性剤の懸濁液を得るため、超音波処理又はその他の技法が必要であってもよい。一般的には、脂質／界面活性剤の外層中の物質の少なくとも１つの物質は、付加する所望成分の結合に有用なリンカー若しくは官能基を含み、又は、エマルションが調製された時点で成分がすでに物質に結合していてもよい。
【００６６】
標的特異的リガンド又はその他の有機部分（例えば、常磁性金属用のキレート剤）の外層の成分への共有結合による結合のため、各種の結合剤及び連結剤を使用してもよい。当該結合を形成するのに用いられる一般的な方法は、カルボジアミドを使用したアミドの形成、又は、マレイミドのような不飽和成分を使用したスルフィド結合の形成を含む。その他の結合剤には、例えば、グルタルアルデヒド、プロパンジアール又はブタンジアール、２−イミノチオレンハイドロクロリド、例えば、ジスクシンイミジルスベリン酸、ジスクシンイミジル酒石酸、及び、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン等の二官能性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、Ｎ−（５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシ）スクシンイミド、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、及び、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート等のヘテロ二官能性試薬、例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロジフェニルスルホン、４，４’−ジイソチオシアノ−２，２’−ジスルホン酸スチルベン、ｐ−フェニレンジイソチオシアネート、カルボニルビス（Ｌ−メチオニン  ｐ−ニトロフェニルエステル）、４，４’−ジチオビスフェニルアジド、及び、エリトリトールビスカーボネート等のホモ二官能性試薬、並びに、例えば、ジメチルアジピミデートハイドロクロリド、ジメチルスベリミデート、ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオニミデートハイドロクロリドの二官能性イミドエステル等が含まれる。アシル化、スルホン化、還元的アミノ化等によって結合してもよい。所望のリガンドを外層の１つ以上の成分に共有結合させる多くの手法が当該技術分野で周知である。その特性が適していれば、リガンド自体を界面活性剤層に加えてもよい。例えば、リガンドが高親油性部分を含む場合、それ自体が脂質／界面活性剤コーティング中に封入されてもよい。更に、リガンドがコーティングに直接吸着され得る場合、当該吸着もリガンドの結合に影響する。例えば、核酸は負に帯電しているために、カチオン性界面活性剤に直接吸着する。
【００６７】
リガンドは直接ナノ粒子に結合してもよい、即ち、リガンドはナノ粒子自体に結合する。あるいは、例えば加水分解性脂質アンカー等の加水分解性アンカーを用いて、ターゲティングリガンド又はその他の有機部分をエマルションの脂質／界面活性剤コーティングに結合させる間接的な結合も有用である。リガンドに対して、ビオチン／アビジンによってもたらされるような間接的結合を用いてもよい。例えば、ビオチン／アビジンを介する標的化では、ターゲティングリガンドはエマルションに結合せず、ビオチン化された形で標的化組織に結合する。
【００６８】
造影剤に結合されてもよい補助物質には放射性核種が含まれる。放射性核種は、治療用又は診断用のいずれかであってよく、該核種を使用する診断用イメージングは周知であり、放射性核種を所望の組織に標的化することによる治療上の有効性も認識されている。診断用イメージング用の放射性核種は、多くの場合ガンマ放出体（例えば９６Ｔｃ）を含み、治療目的に使用される放射性核種は、多くの場合アルファ放出体（例えば２２５Ａｃ）とベータ放出体（例えば９０Ｙ）を含む。典型的な診断用放射性核種は、９９ｍＴｃ、９６Ｔｃ、９５Ｔｃ、１１１Ｉｎ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、２０１Ｔｌ、７９Ｋｒ、及び、１９２Ｉｒを含み、治療用核種は、２２５Ａｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１４９Ｐｍ、９０Ｙ、２１２Ｂｉ、１０３Ｐｄ、１０９Ｐｄ、１５９Ｇｄ、１４０Ｌａ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、１３３Ｘｅ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、６７Ｃｕ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、及び、１９２Ｉｒを含む。様々な方式により、予め形成したエマルションに核種を供給することができる。例えば、９９Ｔｃ−過テクネチウム酸は、過剰量の塩化第一スズと混合し、予め形成したナノ粒子のエマルションに封入してもよい。オキシン酸第一スズを塩化第一スズの代わりに使用することができる。更に、市販のキット、例えばＣｅｒｅｔｅｋ（登録商標）としてＮｙｃｏｍｅｄ  Ａｍｅｒｓｈａｍより販売されているＨＭ−ＰＡＯ（ｅｘａｍｅｔａｚｉｎｅ）キットを使用することができる。本発明の造影剤に様々な放射性リガンドを結合させる手段は当該技術分野で周知である。
【００６９】
磁気共鳴画像法に使用される金属イオンを含有するキレート剤も補助物質として使用することができる。一般的には、常磁性金属又は超常磁性金属を含有するキレート剤は、ナノ粒子上のコーティングの脂質／界面活性剤と結合し、超音波処理される最初の混合物に封入される。キレート剤は、コーティング層の１以上の成分に直接結合してもよい。適切なキレート剤は、大環状又は直鎖状キレート剤であり、ＥＤＴＡ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ等を含む様々な多座配位化合物を包含する。該キレート剤は、例えばホスファチジルエタノールアミン、オレイン酸塩、又は、その他任意の合成天然又は官能化脂質又は脂溶性化合物等に含まれる官能基に直接結合させることができる。あるいは、これらのキレート剤は、結合基を介して結合していてもよい。
【００７０】
本発明のＭＲＩ用造影剤に有用な常磁性及び超常磁性金属には、希土類金属が含まれ、マンガン、イッテルビウム、テルビウム、ガドリニウム、ユウロピウム等を挙げることができる。鉄イオンを使用することもできる。
【００７１】
特に好ましいＭＲＩ用キレート剤セットは、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）及びその誘導体、特に、メトキシベンジル誘導体（ＭＥＯ−ＤＯＴＡ）、及び、イソチオシアネート官能基を含むメトキシベンジル誘導体（ＭＥＯ−ＤＯＴＡ−ＮＣＳ）を含み、次にホスファチジルエタノールアミンのアミノ基又はそのペプチド誘導体形に結合する。この種の誘導体は、米国特許第５５７３７５２号に記載され、他の適切なキレート剤は米国特許第６０５６９３９号に開示されている。
【００７２】
ＤＯＴＡイソシアネート誘導体は、直接、又は、ペプチドスペーサー、例えばｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙスペーサーを介して脂質／界面活性剤に結合してもよい。直接的な結合には、結合産物を得るために、ＭＥＯ−ＤＯＴＡ−ＮＣＳをホスホエタノールアミン（ＰＥ）と反応させる。ペプチドを用いる場合、例えば、トリグリシル結合の場合、まずＰＥをｔ−ｂｏｃ保護されたトリグリシンと結合させる。例えば、ジイソプロピルカルボジイミド（又はそれと同等のもの）と、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）又はヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＴ）のいずれかとを用いて、ｔ−ｂｏｃ−トリグリシンの遊離酸の活性化エステルを形成するような標準的な結合法を使用し、ｔ−ｂｏｃ−トリグリシン−ＰＥを精製する。
【００７３】
その他の補助物質には蛍光色素分子（例えばフルオレセイン、ダンシル、量子ドット等）及び赤外色素が含まれ、又は、光学又は光イメージング（例えば共焦点顕微鏡及び蛍光イメージング）に金属が用いられてもよい。ＰＥＴイメージングのような核医学イメージングでは、トシル化及び１８Ｆフッ素化化合物が補助物質としてナノ粒子と結合していてもよい。
【００７４】
いくつかの態様において、生物活性物質がエマルションナノ粒子のコアに封入される。
【００７５】
本発明のいくつかの態様において、ナノ粒子の表面に生物活性物質を含む。これらの生物活性物質の種類は多岐にわたり、タンパク質、核酸、医薬品等が含まれる。従って、適切な医薬品には、抗腫瘍薬、ホルモン、鎮痛薬、麻酔薬、神経筋遮断薬、抗菌剤又は抗寄生虫剤、抗ウイルス薬、インターフェロン、抗糖尿病薬、抗ヒスタミン薬、鎮咳薬、抗凝固剤等が含まれる。
【００７６】
本発明の標的化エマルションは、イメージング剤と併用される治療薬を提供するのに用いてもよい。そのようなエマルションは、例えば、ある部位における治療の進行のモニタリング、及び、その後当該部位に送達する容量又は治療薬の所望の調整を目的とした当該部位の画像化を可能にする。従って、本発明は、慣用のイメージングシステムを使用しながら、例えば、患者の血栓、感染症、癌及び梗塞の検出及び治療のための非侵襲的手段を提供する。
【００７７】
上述の全ての例において、結合部位がターゲティングリガンドであろうと、又は、補助物質であろうと、限定部分は、脂質／界面活性剤層と非共有結合していてもよく、脂質／界面活性剤層成分と直接結合していてもよく、又は、該成分とスペーサー部分を介して間接的に結合していてもよい。
【００７８】
イメージング及び／又は治療用標的は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの標的であってよく、好ましくは生物学的物質であってもよいが、標的が生物学的物質である必要はない。標的は、造影物質が結合する表面、又は、三次元構造であって、造影物質が通過し、表面の下にある標的部分に結合する構造で構成されていてもよい。
【００７９】
好ましくは、イメージング及び／又は治療の標的におけるエマルションナノ粒子の半減期を停止し又は延長するために、リガンドを造影用エマルションに封入する。能動的標的化を可能にするため、リガンドは所望のターゲットに特異的であってもよい。能動的標的化とは、細胞の表面膜上、あるいは、細胞外又は細胞内マトリックス内に存在する分子エピトープ、即ち、受容体、脂質、ペプチド、細胞接着分子、ポリサッカライド、バイオポリマー等への局在化及び結合による、細胞、組織、又は臓器への、リガンド指向性の部位特異的な物質の集積を意味する。抗体、抗体断片、小さいオリゴペプチド、大きいポリペプチド又は三次元構造を持つタンパク質のようなポリペプチド、ペプチド模倣薬、ポリサッカライド、アプタマー、脂質、核酸、レクチン、又は、これらの組み合わせを含む多種多様なリガンドを用いることができる。通常は、リガンドは細胞のエピトープ又は受容体に特異的に結合する。
【００８０】
本明細書で用いる場合、語句「リガンド」は、エマルション粒子自体から分離し又は区別される、生物学的標的である別の分子に特異的に結合するターゲティング分子を意味することを意図する。反応は、配位錯体の金属原子と配位共有結合を形成するために電子対を供与し又は受容する分子を必要とするものでもないし、排除するものでもない。従って、リガンドは、ナノ粒子表面に、直接的な結合として共有結合していてもよいし、間接的な結合として非共有結合していてもよい。
【００８１】
いくつかの態様において、例えばｉｎ  ｖｉｖｏでの使用の場合、その特異的標的に対するリガンドの結合親和性は約１０−７Ｍ以上である。いくつかの態様において、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用の場合、その特異的ターゲットに対するリガンドの結合親和性は約１０−７Ｍ未満であってもよい。
【００８２】
アビジン−ビオチンの相互作用は、多くの生物学的及び解析システムに取り入れられ、ｉｎ  ｖｉｖｏでの応用に選択されている、極めて有用な非共有結合ターゲティングシステムである。アビジンは、ビオチンに対して高い親和性を持ち（１０−１５Ｍ）、生理学的条件下で迅速かつ安定した結合が容易である。本手法を利用するいくつかの標的化システムは、製剤に応じて２又は３ステップで行われる。これらのシステムにおいては、一般的に、モノクローナル抗体のようなビオチン化されたリガンドをまず投与し、固有の分子エピトープを「プレ標的化」する。次に、アビジンを投与し、「プレ標的化」されたリガンドのビオチン部分に結合させる。最後に、ビオチン化エマルションを添加し、アビジン上に残された占有されていないビオチン−結合部位に結合させ、リガンド−アビジン−エマルションの「サンドイッチ」構造を完成させる。アビジン−ビオチンによる手法は、表面上に抗体が存在することから続いて起こる、促進された早期の細網内皮系による標的化物質のクリアランスを避けることができる。更に、アビジンは、４つの独立したビオチン結合部位を持ち、シグナルを増幅し、検出感度を向上させる。
【００８３】
本明細書で用いる場合、語句「ビオチンエマルション」、又は、ビオチンエマルション若しくはビオチン物質への結合に関する「ビオチン化」は、ビオチン、ビオシチン、並びに、その他のビオチン誘導体及び類似体、例えば、ビオチンアミドカプロエートＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ビオチン４−安息香酸アミド、ビオチンアミドカプロイルヒドラジド、及び、その他のビオチン誘導体及び複合体を含むことを意図している。その他の誘導体は、ビオチン−デキストラン、ビオチン−ジスルフィドＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ビオチン−６  アミドキノリン、ビオチンヒドラジド、ｄ−ビオチン−Ｎヒドロキシスクシンイミドエステル、ビオチンマレイミド、ｄ−ビオチン  ｐ−ニトロフェニルエステル、ビオチン化ヌクレオチド、及び、Ｎ，ε−ビオチニル−ｌ−リシン等のビオチン化アミノ酸を含む。語句「アビジンエマルション」、又は、アビジンエマルション若しくはアビジン物質への結合に関する「アビジン化」は、アビジン、ストレプトアビジン、並びに、その他のアビジン類似体、例えば、ストレプトアビジン若しくはアビジン複合体、高度に精製され分画されたアビジン種若しくはストレプトアビジン、及び、非アミノ酸若しくは部分的アミノ酸のバリアント、遺伝子組み換え、又は、化学的に合成されたアビジンを含むことを意図している。
【００８４】
粒子表面の性質に応じて、様々な方法でエマルションのナノ粒子表面にターゲティングリガンドを化学的に結合してもよい。使用するリガンドに応じて、エマルション粒子を形成する前又は後に結合を行ってもよい。タンパク性物質に対するリガンドの直接的な化学的結合は、表面に元々存在する多数のアミノ基（例えばリシン）を利用することが多い。あるいは、粒子が形成された後に、ピリジルジチオプロピオナート、マレイミド、又は、アルデヒドのような機能的に活性な化学基をリガンド結合のための化学的「フック」として表面に組み込んでもよい。他の一般的な後処理としては、リガンドを添加する前に、表面のカルボン酸塩をカルボジイミドで活性化する方法がある。選択する共有結合方法は、主にリガンドの化学的性質によって決定する。抗体及びその他の大きなタンパク質は、厳しい処理条件下では変性することがあるが、炭水化物、短いペプチド、アプタマー、薬剤、又は、ペプチド模倣薬の生物活性は多くの場合で保持される。高いリガンド結合の完全性を確保し、標的化粒子の結合活性を最大化するために、活性化された表面官能基とターゲティングリガンドの間に、柔軟性のあるポリマーのスペーサーアーム、例えば、ポリエチレングリコール又は単純なカプロン酸による架橋を挿入することも可能である。該スペーサーによる伸長は、１０ｎｍ以上とすることができ、かつ、粒子表面の相互作用によるリガンド結合への干渉を最小限に抑えることができる。
【００８５】
抗体、特にモノクローナル抗体は、病理学的分子エピトープを含む広範な分子エピトープのあらゆるエピトープに対する部位ターゲティングリガンドとして用いることができる。能動的、部位特異的な標的化を行うため、免疫グロブリン−γ（ＩｇＧ）クラスのモノクローナル抗体を、リポソーム、エマルション、及び、その他の微小気泡粒子に結合している。通常は、これらのタンパク質は、同一対の重鎖及び軽鎖からなる左右対称の糖タンパク質（ＭＷｃａ．１５０，０００ダルトン）である。２本のアームそれぞれの端部にある超可変領域は、同一の抗原結合部位として働く。様々な大きさの分岐炭水化物ドメインは補体活性化領域に結合し、ヒンジ部は特に利用しやすい鎖間ジスルフィド結合を含み、当該結合により、より小さい断片とすることもできる。
【００８６】
好ましくは、本発明の抗体組成物において、モノクローナル抗体を使用する。細胞表面上の選択された抗原に特異的なモノクローナル抗体は、慣用法を用いて容易に作製することができる（例えば、米国再発行特許第３２０１１号、米国特許第４９０２６１４号、第４５４３４３９号、及び、第４４１１９９３号参照）。抗原特異的に反応する抗体を作製するため、免疫化学的にハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、モノクローナル抗体を単離することができる。モノクローナル抗体の作製は、その他の技法を利用することもできる（例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｓａｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：５７２８−５７３２；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ３：１−９参照）。
【００８７】
本発明の文脈においては、抗体は、必ずしもこれに限定されるわけではないが、天然型抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗原結合特異性を維持する抗体断片（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２）、及び、遺伝子組み換えによって作製された、結合パートナー、単一ドメイン抗体、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体等を含む様々な種類の抗体を包含するものとして理解される。通常は、抗体が１０７Ｍ−１以上か同等の親和性（結合定数）で結合する場合、該抗体は細胞の選択された抗原に対して反応性を有するものとして理解される。エマルションと共に使用するための選択された抗原に対する抗体は、商業的供給源から入手してもよい。
【００８８】
本発明において部位ターゲティングリガンドして使用する様々な種類の抗体については、本明細書中、特に本セクションの後半において更に説明する。
【００８９】
本発明のエマルションには、抗体又はその断片以外のリガンドであるターゲティング物質も利用する。例えば、抗体等のポリペプチドは、標的化造影剤のためのベクター分子として使用するため、高い特異性とエピトープ親和性を有していてもよい。例えば、５〜２０のアミノ酸を有し、固有の受容体配列（例えば、血小板ＧＩＩｂＩＩＩａ受容体のＲＧＤエピトープ等）に特異的な小さいオリゴペプチド、又は、コレシストキニン等のより大きい生物活性を有するホルモンであってもよい。より短いペプチドは、本来、非ヒト化マウス抗体に比べて低い免疫原性を有する可能性がある。ペプチド、又は、細胞接着分子、サイトカイン、セレクチン、カドヘドリン（cadhedrins）、Ｉｇスーパーファミリー、インテグリン等のペプチド（非ペプチド）類似体を、標的化イメージング及び／又は治療薬送達に利用してもよい。
【００９０】
一部の例では、リガンドは、米国特許第６１３０２３１号（例えば、式１に記載）、第６１５３６２８号、第６３２２７７０号、及び、国際公開第０１／９７８４８号に記載されているような非ペプチド有機分子である。一般に「非ペプチド」部分は、遺伝子によりコードされ又はコードされていないアミノ酸の単純なポリマーである化合物以外のものである。従って、「非ペプチドリガンド」は、高分子の特徴を持たず、アミノ酸ポリマー以外の中心構造を要することにより特徴付けられる、一般的に「低分子」と呼ばれる部分である。本発明において有用な非ペプチドリガンドは、ペプチドと結合していてもよく、又は、標的部位に対する親和性を担うリガンド部分に結合したペプチドを含んでいてもよいが、その結合能を担うのはリガンドの非ペプチド領域である。例えば、αｖβ３インテグリンに特異的な非ペプチドリガンドは、米国特許第６１３０２３１号及び第６１５３６２８号に記載されている。
【００９１】
例えば米国特許第４３１０５０５号に記載されているように、炭水化物を有する脂質を、エマルションの標的化に用いてもよい。
【００９２】
アシアログリコプロテインは、肝細胞上に特異的に存在するアシアログリコプロテイン受容体に対して高い親和性を持つことから、肝臓に特化した用途に用いられている。原発性又は続発性肝臓腫瘍、及び、肝炎等の良性びまん性肝疾患を検出するため、アシアログリコプロテイン指向性物質（主に、酸化鉄に結合された磁気共鳴用物質）が用いられている。肝細胞上のアシアログリコプロテイン受容体は、凡そ５００，０００個／細胞と豊富であり、素早く取り込んだ後、細胞表面に戻る。肝細胞標的にエマルションを局在化させるため、アラビノガラクタンのようなポリサッカライドを利用してもよい。アラビノガラクタンは、肝のアシアログリコプロテイン受容体に高い親和性を示す複数の末端アラビノース基を有する。
【００９３】
アプタマーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ法（ＳＥＬＥＸ：ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）によって産生される、高親和性、高特異性ＲＮＡ又はＤＮＡベースリガンドである。アプタマーは、２０〜３０ヌクレオチドのランダム配列から生成され、分子抗原又は細胞に対する吸着により選択的にスクリーニングされ、高親和性結合リガンドを特異的に精製するため濃縮される。ｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性と実用性を高めるため、アプタマーは、通常、ヌクレアーゼ分解を阻害し、薬剤、標識、又は、粒子との結合を容易にするように化学的に修飾される。その他、より単純な化学架橋法により、リガンドとの相互作用に具体的に関与しない核酸を置換する。溶液中において、アプタマーは構造をとらないが、折り畳み、標的エピトープを取り囲むことが可能であり、それにより特異的に認識する。エピトープ周囲における核酸の特異的な折り畳みは、水素結合、静電作用、スタッキング、形状相補性を介する識別力のある分子間接触をもたらす。タンパク質ベースのリガンドと比較して、一般に、アプタマーは安定であり、加熱滅菌の伝導性が高く、免疫原性が低い。アプタマーは、現在、血管形成、活性化血小板、固形腫瘍を含む多くの臨床的に意義のある病変を標的として使用されており、その使用は増加している。イメージング及び／又は治療用エマルション粒子におけるターゲティングリガンドとしてアプタマーを使用する場合、その臨床的な有用性は、クリアランス率に対する、核酸のリン酸基により付与される表面の負電荷強度に依存することもある。脂質ベースの粒子を用いた以前の研究は、負のゼータ電位がリポソームの血中半減期を著しく低下させる一方、中性又はカチオン性粒子は、共通して、より長い間全身で持続することを示している。
【００９４】
いくつかの応用において、特異的結合種をエマルションに結合させるため、「前処理物質（ｐｒｉｍｅｒ  ｍａｔｅｒｉａｌ）」と呼ばれるものを使用することができる。本明細書で用いる場合、「前処理物質」は、粒子とターゲティングリガンド又はターゲティングリガンドのサブユニット等のターゲティングリガンド成分との間に共有結合を形成するために化学的に利用可能な、エマルションの脂質界面活性剤層に封入された、あらゆる構成要素又は誘導体化された構成要素を意味する。
【００９５】
従って、特異的結合種（即ちターゲティングリガンド）は、油／水界面への直接吸着により又は前処理物質を使用して、封入化脂質単分子層上に固定化してもよい。前処理物質は、特異的結合種又はターゲティング種と化学的に結合し、又は、当該種を吸着するように粒子に封入された、界面活性剤に適合するいかなる化合物であってもよい。水連続相を持つエマルション及び連続相と不連続層の界面で前処理物質に吸着され又は結合する、生物活性リガンドを形成することにより好ましい結果を得ることができる。アミン基、カルボキシル基、メルカプト基、又は、結合剤及び高電荷ポリマーと特異的に反応し得るその他の官能基を持つ、天然又は合成ポリマーを結合プロセスにおいて用いてもよい。特異的結合種（例えば、抗体）は、直接吸着又は化学的結合によって、Ｚ番号が大きい原子のエマルション粒子表面に結合した油上に固定化してもよい。直接吸着により固定化し得る特異的結合種の例は、小ペプチド、ペプチド模倣薬、又は、ポリサッカライドベースの物質が含まれる。該エマルションを作製するため、エマルション形成の前に、特異的結合種を水相に懸濁又は溶解してもよい。あるいは、特異的結合種をエマルションの形成後に添加し、ｐＨ７．０の緩衝剤（通常はリン酸緩衝食塩水）中で穏やかに攪拌しながら、室温（約２５℃）で１．２〜１８時間インキュベーションしてもよい。
【００９６】
特異的結合種を前処理物質に結合させる場合は、慣用の結合法を用いてもよい。特異的結合種は、当該技術分野で既知の方法に従い、結合剤によって前処理物質と共有結合させてもよい。前処理物質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、Ｎ−カプロイルアミン−ＰＥ、ｎ−ドデカニルアミン、ホスファチジルチオエタノール、Ｎ−１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチルアミド］、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−カルボキシレート］、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート］、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ［ＰＤＰ（ポリエチレングリコール）２０００］、Ｎ−スクシニル−ＰＥ、Ｎ−グルタリル−ＰＥ、Ｎ−ドデカニル−ＰＥ、Ｎ−ビオチニル−ＰＥ、又は、Ｎ−カプロイル−ＰＥを含んでいてもよい。添加する結合剤は、例えば、カルボジイミド、又はエチレン性不飽和結合若しくは複数のアルデヒド基のいずれかを有するアルデヒドの使用を含む。使用に適した他の結合剤に関しては、本明細書において、特に本セクションの後半で詳細に記載する。
【００９７】
特異的結合種の前処理物質との共有結合は、本明細書で開示する試薬を用いて、慣用の周知の反応、例えば、中性ｐＨの水溶液中、２５℃未満の温度で１時間から一晩反応させることにより実施することができる。非ペプチドリガンドを含むリガンドの結合に用いられるリンカーの例は、当該技術分野で既知である。
【００９８】
エマルションと共に乳化剤及び／又は可溶化剤も使用してよい。当該薬剤は、アカシア、コレステロール、ジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセリン、ラノリンアルコール、レシチン、モノ−及びジ−グリセリド、モノ−エタノールアミン、オレイン酸、オレイルアルコール、ポロキサマー、ピーナッツ油、パルミチン酸、ポリオキシエチレン５０ステアレート、ポリオキシル３５ヒマシ油、ポリオキシル１０オレイルエーテル、ポリオキシル２０セトステアリルエーテル、ポリオキシル４０ステアラート、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、プロピレングリコールジアセテート、プロピレングリコールモノステアラート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、ステアリン酸、トロラミン、及び、乳化ワックスを含むがこれらに限定されるものではない。植物又は動物由来の脂質に認められる飽和又は不飽和炭化水素脂肪酸の代わりにパーフルオロ脂肪酸を脂質成分として持つ全ての脂質を使用することができる。エマルションと共に使用できる懸濁化剤及び／又は増粘剤は、アカシア、寒天、アルギニン酸、アルミニウムモノステアレート、ベントナイト、マグマ、カルボマー９３４Ｐ、カルボキシメチルセルロース、カルシウム及びナトリウム及びナトリウム１２、カラゲナン、セルロース、デキストリン、ゼラチン、グアーガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ケイ酸アルミニウム・マグネシウム、メチルセルロース、ペクチン、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポピドン、アルギン酸プロピレングリコール、二酸化ケイ素、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、及び、キサンタンガムを含むが、これらに限定されるものではない。
【００９９】
本明細書で記載するように、本発明のエマルションは、生物活性物質（例えば、薬剤、プロドラッグ、遺伝物質、放射性同位体、又はこれらの組み合わせ）を天然型で、又は、ナノ粒子への取り込み又は吸着を高めるために疎水性部分又は荷電部分を用いて誘導体化された形で封入してもよい。特に、生物活性物質は、本発明の標的化エマルションに組み込まれていてもよい。生物活性物質は、例えば、Ｓｉｎｋｙｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６４：１８１−２１０、Ｋｏｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８０：１７１８−１７２５、米国特許第６０９０８００号及び第６０２８０６６号に記載されているプロドラッグを含むプロドラッグであってもよい。
【０１００】
本治療用エマルションは、抗腫瘍薬、放射性医薬品、タンパク質及び非タンパク質天然産物又はそれらの類似体／模倣薬、例えば、ホルモン、鎮痛薬、筋肉弛緩剤、麻薬作動薬、麻薬作動薬拮抗薬、麻薬拮抗薬、非ステロイド系抗炎症剤、麻酔薬及び鎮静薬、神経筋遮断薬、抗菌剤、駆虫薬、抗マラリア薬、抗寄生虫剤、抗ウイルス薬、抗ヘルペス薬、抗高血圧薬、抗糖尿病薬、痛風関連薬、抗ヒスタミン剤、抗潰瘍薬、抗凝固剤、及び、血液製剤を含んでいてもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１０１】
遺伝物質は、例えば、天然由来又は合成由来いずれかの核酸、ＲＮＡ及びＤＮＡを含み、例えば、遺伝子組み換えＲＮＡ及びＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ、ハンマーヘッド型ＲＮＡ、リボザイム、ハンマーヘッド型リボザイム、抗遺伝子核酸、一本鎖及び二本鎖両方のＲＮＡ及びＤＮＡ並びにそれらの類似体、免疫賦活性核酸、リボオリゴヌクレオチド、アンチセンスリボヌクレオチド、デオキシリボオリゴヌクレオチド、及びアンチセンスデオキシリボオリゴヌクレオチドを含む。使用できるその他の種類の遺伝物質には、例えば、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体、欠損ウイルス又は「ヘルパー」ウイルスのような発現ベクター上に存在する遺伝子、抗遺伝子核酸、一本鎖及び二本鎖両方のＲＮＡ及びＤＮＡ並びにそれらの類似体、例えば、ホスホロチオエート及びホスホロジチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを含む。更に、例えば、遺伝物質は、タンパク質又はその他のポリマーと組み合わされてもよい。
【０１０２】
使用に適した治療薬に関しては、本明細書中、特に本セクションの後半で更に詳細に記載する。
【０１０３】
本明細書において記載するように、エマルションナノ粒子は、これらに限定されるものではないが、ガドリニウム、マグネシウム、鉄、マンガンを含む、常磁性又は超常磁性要素を、天然型又は化学的に錯体化した形で粒子上に封入してもよい。同様に、天然型又は化学的に錯体化した形の、ポジトロン放出体、ガンマ放出体、ベータ放出体、アルファ放出体を含む放射性核種が、粒子上又は粒子内に組み込まれてもよい。当該部分を添加することで、追加の複数の臨床的画像モダリティを使用できるようになる。
【０１０４】
例えば、発色団（例えば、ある波長で光を吸収する物質）、蛍光色素分子（例えば、ある波長で光を放出する物質）、光線感作物質（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで組織の壊死及び／又は細胞死を引き起こす物質）、蛍光物質、リン光性物質等を含む、光活性物質、即ち光に活性がある、又は光に反応する化合物又は物質を診断用又は治療上の用途に使用してもよい。「光」は、スペクトルの紫外（ＵＶ）領域、可視領域及び／又は赤外（ＩＲ）領域を含む全ての光源を意味する。本発明に使用してもよい適切な光活性物質は、他の研究者らによって開示されている（例えば、米国特許第６１２３９２３号）。使用に適した光活性物質に関しては、本明細書中、特に本セクションの後半で更に詳細に説明する。
【０１０５】
更に、ある種のリガンド、例えば、抗体、ペプチド断片、又は生物活性リガンドの模倣薬は特定のエピトープに結合した際に、拮抗薬又は作動薬のいずれかとして元来備わっている治療効果に貢献する場合がある。一例として、新生血管の内皮細胞上に存在するαｖβ３インテグリンに対する抗体は、固形腫瘍の増殖及び転移を一時的に抑制することが示されている。αｖβ３インテグリンに指向化された治療用エマルション粒子は、粒子によって組み込まれ、送達される治療薬の効果に加えて、ターゲティングリガンドの向上した拮抗作用により有効であってもよい。
【０１０６】
有用なエマルションは、様々な公称粒径であってよく、例えば、約０．０１μｍの小さいものから１０μｍの大きいものまで、好ましくは約５０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、より好ましくは約５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、一部の例では約５０ｎｍ〜約３００ｎｍ、一部の例では約１００ｎｍ〜約３００ｎｍ、一部の例では約２００ｎｍ〜約２５０ｎｍ、一部の例では約２００ｎｍ、一部の例では約２００ｎｍ未満である。通常は、サブミクロン粒子等の小さいサイズの粒子は、大きい粒子よりも長く循環し、安定性が高い傾向がある。
【０１０７】
本明細書の他の箇所で説明したものに加えて、本発明のエマルションにおいて、及び／又は、本発明のエマルションと共に、部位ターゲティングリガンドとして使用するために適した各種の抗体を以下に詳細に記載する。
【０１０８】
二価のＦ（ａｂ’）２及び一価のＦ（ａｂ）断片は、リガンドとして使用可能であり、これらは、それぞれペプシン又はパパイン消化による完全抗体の選択的切断によって得られる。慣用法を使用して抗体を断片化することができ、完全抗体について上記と同様の手法で、断片（「Ｆａｂ」断片を含む）の有用性をスクリーニングすることができる。「Ｆａｂ」領域とは、重鎖及び軽鎖の分岐部を含む配列とほぼ等しく又は類似し、特定の抗原に対する免疫学的結合を示すことが確認されている、重鎖及び軽鎖の部分を意味し、当該部分はエフェクターであるＦｃ部分を持たない。「Ｆａｂ」は、１本の重鎖と１本の軽鎖の集合体（一般的にＦａｂ’として知られる）だけでなく、２本の重鎖と２本の軽鎖を含む四量体（Ｆ（ａｂ）２と呼ばれる）を含み、指定された抗原又は抗原ファミリーと選択的に反応することができる。抗体のＦａｂ断片を作製する方法は当該技術分野で既知であり、例えば、タンパク質分解や遺伝子組み換え法による合成が含まれる。例えば、ペプシンで抗体を処理することによりＦ（ａｂ’）２断片を作製することができる。得られたＦ（ａｂ’）２断片について、ジスルフィド結合を還元する処理をしてＦａｂ’断片を作製することができる。「Ｆａｂ」抗体は、本明細書で説明するものに類似するサブセット、即ち「ハイブリッドＦａｂ」、「キメラＦａｂ」、及び「改変Ｆａｂ」に分類してもよい。Ｆｃ領域の除去は、分子の免疫原性を大幅に低下させ、結合した炭水化物に続いて起こる非特異的な肝臓での取り込みを低下させ、かつ、補体活性化及び結果として起こる抗体依存性の細胞毒性を低下させる。補体結合及び関連する細胞傷害性は、標的化部位が保存されなくてはいけない場合は有害であり得、又は、宿主のキラー細胞の動員及び標的細胞の破壊が望ましい場合（例えば抗腫瘍薬）は有益であり得る。
【０１０９】
多くのモノクローナル抗体はマウス由来であり、他の種において、様々な程度の免疫原性を本質的に有している。遺伝子工学によるマウス抗体のヒト化により、生体適合性が高く、血中半減期が長いキメラリガンドの開発がもたらされた。本発明で使用される抗体は、ヒト化された抗体、又は、投与される個体への適合性が高まるよう改変された抗体を含む。一部の例では、標的化分子エピトープに対する遺伝子組み換え抗体の結合親和性を、結合イディオタイプの選択的な部位特異的突然変異誘発法によって向上させることができる。抗体分子のそのような遺伝子操作に用いられる方法及び技法は当該技術分野で既知である。「ヒト化」とは、ヒトに投与された場合に、ヒト化抗体に対して生じる抗体及び／又は免疫反応が減少するように、抗体のアミノ酸配列を改変することを意味する。ヒト以外の哺乳動物で抗体を使用する場合は、抗体はその種のフォーマットに変更されてもよい。
【０１１０】
抗体産生動物を使用せずに広範な種類の抗原に対する遺伝子組み換えヒトモノクローナル抗体断片を作製するために、ファージディスプレイ法を用いてもよい。一般的に、「逆転写酵素」という酵素を使用して、ヒトＢリンパ球の全メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から導かれ、合成される、対応するＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖の大規模な遺伝子ライブラリがクローニングによって作成される。一例として、免疫グロブリンのｃＤＮＡ鎖は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅され、ある抗原に特異的な軽鎖及び重鎖がファージミドベクターに導入される。該ファージミドベクターを適切な細菌にトランスフェクションすると、バクテリオファージの表面にｓｃＦＶ免疫グロブリン分子が発現する。所望の抗原（例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、及び、糖）に対する、免疫吸着／ファージ増殖サイクルを繰り返すことで、特定の免疫グロブリンを発現するバクテリオファージを選択する。標的抗原に厳格に特異的なバクテリオファージを適切なベクター（例えば、大腸菌、酵母、細胞）に導入し、発酵によって増幅させて、一般的に天然型抗体と非常に類似した構造を有する、多量のヒト抗体断片を産生させる。ファージディスプレイ法は、当該技術分野で既知であり、この技法によって標的化及び治療上の応用に用いられる固有のリガンドの産生が可能である。
【０１１１】
選択された抗原に対するポリクローナル抗体は、ウマ、ウシ、各種家禽類、ウサギ、マウス、又はラットのような様々な温血動物から当業者によって容易に作製される。一部の例では、選択された抗原に対するヒトポリクローナル抗体はヒトを由来として精製してもよい。
【０１１２】
本明細書で用いる場合、「単一ドメイン抗体」（ｄＡｂ）は、指定された抗原と免疫学的に反応する、ＶＨドメインを備える抗体である。ｄＡｂは、ＶＬドメインを含まないが、抗体中に存在することが知られるその他の抗原結合ドメイン、例えば、κ及びλドメインを含んでいてもよい。ｄＡｂを作製する方法は当該技術分野で既知である。例えば、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６を参照することができる。抗体は、ＶＨドメイン及びＶＬドメイン、更にその他の既知の抗原結合ドメインで構成されてもよい。この種の抗体及びその作製方法の例は、当該技術分野で既知である（例えば、米国特許第４８１６４６７号参照）。
【０１１３】
更なる典型的な抗体は、「一価抗体」を含み、これは第二の重鎖のＦｃ（即ち定常）領域に結合した重鎖／軽鎖二量体からなる集合体である。この種の抗体は通常、免疫原性修飾を免れる。例えば、Ｇｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９５：７１２−７１４を参照することができる。
【０１１４】
「ハイブリッド抗体」は、一対の重鎖及び軽鎖が、第１の抗体中におけるものと相同であるが、もう一対の重鎖及び軽鎖は異なる第２の抗体中におけるものと相同である抗体である。一般的に、これらの２つの対のそれぞれは、特に異なる抗原上に存在する、異なるエピトープと結合する。これにより、「二価」の特性、即ち二つの抗原に同時に結合する能力がもたらされる。本明細書において説明するように、キメラ鎖を用いてそのようなハイブリッドを形成してもよい。
【０１１５】
本発明は「改変抗体」も包含し、これは脊椎動物の抗体中の天然型のアミノ酸配列が変化した抗体を意味する。所望の特性を得るために、遺伝子組み換えＤＮＡ法を利用して、抗体のデザインを変更することができる。可能なバリエーションは多く、１つ以上のアミノ酸の変更から、例えば定常領域等の領域の完全なデザイン変更まで様々である。抗原結合特性を変更するために、可変領域を変化させることができる。特定の細胞又は組織部位へのエマルションの特異的送達を容易にするために、抗体の改変を行ってもよい。分子生物学分野で既知の技法、例えば、遺伝子組み換え法、部位特異的突然変異誘発法、及び、その他の技法を用いて所望の改変を行うことができる。
【０１１６】
「キメラ抗体」は、重鎖及び／又は軽鎖が融合タンパク質である抗体である。通常は、鎖の定常領域は１つの特定の種及び／又はクラスに由来し、可変領域は異なる種及び／又はクラスに由来する。本発明は、キメラ抗体誘導体、即ちヒト以外の動物の可変領域とヒトの定常領域が組み合わされた抗体分子を含む。例えば、キメラ抗体分子は、マウス、ラット、又は、その他の種の抗体由来の抗原結合ドメインを、ヒトの定常領域と共に含むことができる。キメラ抗体を作製するための様々な手法が開示されており、標的化細胞及び／又は組織の表面上に存在する選択された抗原を認識する免疫グロブリンの可変領域を含むキメラ抗体を作製するために使用可能である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２；米国特許第４８１６５６７号及び第４８１６３９７号、欧州特許第１７１４９６号及び第１７３４９４号；並びに、英国特許第２１７７０９６（Ｂ）号を参照することができる。
【０１１７】
二重特異性抗体は、抗標的部位抗体の可変領域及び脂質で覆われたエマルションの表面上の少なくとも１つの抗原に特異的な可変領域を含んでいてもよい。他の例では、二重特異性抗体は、抗標的部位抗体の可変領域及びリンカー分子に特異的な可変領域を含んでいてもよい。例えば、体細胞交雑によってハイブリッドハイブリドーマを形成することで二重特異性抗体を得てもよい。ハイブリッドハイブリドーマは、例えば、Ｓｔａｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：１４５３）及びＳｔａｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ７：２４１）に開示されているような、当該技術分野で既知の手順を用いて作製してもよい。体細胞交雑は、２つの確立されたハイブリドーマの融合によるクアドローマの作製（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５４０）又は１つの確立されたハイブリドーマと第二の抗原で免疫したマウス由来のリンパ球の融合によるトリオーマの作製（Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０４０：１−１１）を含む。ハイブリッドハイブリドーマは、特定の薬剤耐性マーカーに耐性を示す各ハイブリドーマ細胞株を作製することによって（Ｄｅ  Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１７：１−８）、又は各ハイブリドーマを異なる蛍光色素で標識し、ヘテロ蛍光細胞を選別すること（Ｋａｒａｗａｊｅｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９６：２６５−２７０）により選択される。
【０１１８】
二重特異性抗体は、Ｓｔａｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：６２８及びＰａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１６：３５４によって説明されるような手順を用いて、化学的手段によって作製してもよい。化学的結合は、例えば、Ｅアミノ基又はヒンジ領域のチオール基との、ホモ−及びヘテロ二官能性試薬を基本的に使用してもよい。５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＮＴＢ）のようなホモ二官能性試薬は、２つのＦａｂの間にジスルフィド結合を生成し、Ｏ−フェニレンジマレイミド（Ｏ−ＰＤＭ）は２つのＦａｂの間にチオエーテル結合を生成する（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４０：１８３−１９０，Ｇｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７−２３７５）。Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）のようなヘテロ二官能性試薬は、クラス又はアイソタイプに関係なく、抗体の露出したアミノ基とＦａｂ断片を連結する（Ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４４：７３８−７４３）。
【０１１９】
二重官能性抗体は、遺伝子工学法によって作製されてもよい。遺伝子工学は、抗体の特定の断片をコードするＤＮＡ配列をプラスミドにライゲーションし、遺伝子組み換えタンパク質を発現させる、遺伝子組み換えＤＮＡを基本とする技術の使用を含む。二重特異性抗体は、リンカーを使用して２つの一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）断片を連結することにより、単一の共有構造物として（Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９）、転写因子ｆｏｓ及びｊｕｎ由来の配列を共発現するロイシンジッパーとして（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３）、ｐ５３の相互作用領域を共発現するへリックスターンへリックスとして（Ｒｈｅｉｎｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：２９８９−２９９７）、又はダイアボディとして（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−６４４８）作製することができる。
【０１２０】
本明細書の他の箇所で記載したものに加えて、前処理物質と、例えば、特異的結合又はターゲティングリガンドとの結合に使用することに適した結合剤を以下に詳細に記載する。他の結合剤は、１−エチル−３−（３−Ｎ，Ｎジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロリド又は１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメチル−ｐ−トルエンスルホネートのようなカルボジイミドを使用する。その他の適切な結合剤は、アクロレイン、メタクロレイン若しくは２−ブテナールのようなエチレン性不飽和結合を持ち、又は、グルタルアルデヒド、プロパンジアール若しくはブタンジアールのような複数のアルデヒド基を持つ、アルデヒド結合剤を含む。その他の結合剤は、２−イミノチオラン塩酸塩、例えば、ジスクシンイミジル基質、ジスクシンイミジル酒石酸、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン、ジスクシンイミジルプロピオナート、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシナート）等の二官能性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル；例えば、Ｎ−（５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシ）スクシンイミド、ｐ−アジドフェニルブロミド、ｐ−アジドフェニルグリオキサル、４−フルオロ−３−ニトロフェニルアジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドベンゾアート、ｍ−マレイミドベンゾイルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、メチル−４−アジドフェニルグリオキサル、４−フルオロ−３−ニトロフェニルアジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドベンゾエートハイドロクロリド、ｐ−ニトロフェニル２−ジアゾ−３，３，３−トリフルオロプロピオナート、Ｎ−スクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノアート、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート、Ｎ−スクシンイミジル（４−アジドフェニルジチオ）プロピオナート、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート、Ｎ−（４−アジドフェニルチオ）フタルアミド等のヘテロ二官能性試薬；例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロジフェニルスルホン、４，４’−ジイソチオシアノ−２，２’−ジスルホン酸スチルベン、ｐ−フェニレンジイソチオシアナート、カルボニルビス（Ｌ−メチオニン  ｐ−ニトロフェニルエステル）、４，４’−ジチオビスフェニルアジド、エリトリトールビスカルボナート等のホモ二官能性試薬；並びに、例えば、ジメチルアジピミデートハイドロクロリド、ジメチルスベリミデート、ジメチル  ３，３’−ジチオビスプロピオンイミデートハイドロクロリド等の二官能性イミドエステル等が含まれる。
【０１２１】
本明細書の別の箇所に記載したものに加えて、本発明のナノ粒子上、及び／又はナノ粒子内に組み込まれてもよい治療薬を以下に更に記載する。通常は、治療薬を脂溶性にし、又は、脂質への溶解度を高めることにより、治療薬がエマルションの脂質層中及び／又は標的細胞の脂質膜中で保持されることを高めるため、治療薬は、脂質アンカーを用いて誘導体化することができる。当該治療用エマルションはまた、例えば、白金化合物（例えば、スピロプラチン、シスプラチン、及びカルボプラチン）、メトトレキサート、フルオロウラシル、アドリアマイシン、マイトマイシン、アンサマイトシン、ブレオマイシン、シトシンアラビノシド、アラビノシルアデニン、メルカプトポリリシン、ビンクリスチン、ブスルファン、クロラムブシル、メルファラン（例えば、ＰＡＭ、Ｌ−ＰＡＭ、又はフェニルアラニン・マスタード）、メルカプトプリン、ミトタン、塩酸プロカルバジンダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、タキソール、プリカマイシン（ミトラマイシン）、アミノグルテチミド、リン酸エストラムスチンナトリウム、フルタミド、酢酸ロイプロリド、酢酸メゲストロール、クエン酸タモキシフェン、テストラクトン、トリロスタン、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アスパラギナーゼ（Ｌ−アスパラギナーゼ）エルウィナ（Ｅｒｗｉｎａ）アスパラギナーゼ、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、テニポシド（ＶＭ−２６）、硫酸ビンブラスチン（ＶＬＢ）、硫酸ビンクリスチン、ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、メトトレキサート、アドリアマイシン、アラビノシル、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、ダカルバジン、例えばエトポシド及びその他のビンカアルカロイド類等の分裂抑制剤等の抗腫瘍薬；例えば、これに限定されるものではないが、放射性ヨード、サマリウム、ストロンチウム、コバルト、イットリウム等の放射性医薬品；例えば、これに限定されるものではないが、成長ホルモン、ソマトスタチン、プロラクチン、甲状腺ホルモン、ステロイド、アンドロゲン、プロゲスチン、エストロゲン、及び、抗エストロゲン等のホルモン類を含む、タンパク質又は非タンパク質天然産物又はその類似体／模倣薬；これに限定されるものではないが、例えば、オーラノフィン、メトトレキサート、アザチオプリン、スルファサラジン、レフルノミド、ヒドロクロロキン、及び、エタネルセプト等の抗リウマチ薬を含む鎮痛薬；例えば、バクロフェン、ダントロレン、カリソプロドール、ジアゼパム、メタキサロン、シクロベンザプリン、クロルゾキサゾン、チザニジン等の筋肉弛緩剤；例えば、コデイン、フェンタニル、ヒドロモルホン、レボルファノール、メペリジン、メタドン、モルヒネ、オキシコドン、オキシモルホン、プロポキシフェン等の麻薬作動薬；例えば、ブプレノルフィン、ブトルファノール、デゾシン、ナルブフィン、ペンタゾシン等の麻薬作動薬拮抗薬；例えば、ナルメフェン及びナロキソン等の麻薬拮抗薬；ＡＳＡ、アセトミノフェン、トラマドール、又は、これらの組み合わせ等のその他の鎮痛薬；これに限定されるものではないが、セレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプ��フェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、ナプロキセン、オキサプロキセン（oxaproxen）、ロフェコキシブ、サルサレート、サルディンダック（suldindac）、トルメチンを含む非ステロイド系抗炎症剤；例えば、エトミデート、フェンタニル、ケタミン、メトヘキシタール、プロポフォール、スフェンタニル、チオペンタール等の麻酔薬及び鎮静薬；例えば、これに限定されるものではないが、パンクロニウム、アトラクリウム、シサトラクリウム、ロクロニウム、スクシニルコリン、ベルクロニウム（vercuronium）等の神経筋遮断薬；アミノグリコシドを含む抗菌剤；アムホテリシンＢ、クロトリマゾール、フルコナゾール、フルシトシン、グリセオフルビン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ナイスタチン、及び、テルビナフィンを含む抗真菌薬；駆虫薬；例えば、クロロキン、ドキシサイクリン、メフロキン、プリマキン、キニーネ等の抗マラリア薬；ダプソン、エタンブトール、エチオナミド、イソニアジド、ピラジナミド、リファブチン、リファンピン、リファペンチンを含む抗抗酸菌薬；アルベンダゾール、アトバクオン、ヨードキノール、イベルメクチン、メベンダゾール、メトロニダゾール、ペンタミジン、プラジカンテル、ピランテル、ピリメタミン、チアベンダゾールを含む抗寄生虫剤；アバカビル、ジダノシン、ラミブジン、スタブジン、ザルシタビン、ジドブジン、及び、例えば、インジナビル及び関連化合物等のプロテアーゼ阻害剤を含む抗ウイルス薬；これに限定されるものではないが、シドフォビル、ホスカルネット、及びガンシクロビルを含む抗ＣＭＶ薬；アマンタジン、リマンタジン、ザナミビルを含む抗ヘルペス薬；インターフェロン、リバビリン、レベトロン；カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、及び、アズトレオナム、クロラムフェニコール、ホスホマイシン、フラゾリドン、ナリジクス酸、ニトロフラントイン、バンコマイシン等のその他の抗菌剤；硝酸塩、利尿薬、β遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、アンギオテンシン受容体拮抗薬、抗アドレナリン作動薬、抗不整脈薬、抗高脂血症薬、抗血小板化合物、昇圧薬、血栓溶解薬を含む抗高血圧薬；座瘡治療薬；乾癬治療薬；コルチコステロイド；アンドロゲン、アナボリックステロイド、ビスホスホネート；スルホニル尿素、及びその他の抗糖尿病薬；痛風関連薬；抗ヒスタミン剤、鎮咳薬、うっ血除去薬、及び去痰薬；制酸薬、５−ＨＴ受容体拮抗薬、Ｈ２−拮抗薬、ビスマス化合物、プロトンポンプ阻害薬、緩下薬、オクトレオチド及びその類似体／模倣薬を含む抗潰瘍薬；抗凝固剤；免疫抗原、免疫グロブリン、免疫抑制剤、抗痙攣薬、５−ＨＴ受容体作動薬、その他の片頭痛治療法；抗コリン作用薬、及びドーパミン作動薬を含むパーキンソン病治療薬；エストロゲン、ＧｎＲＨ作動薬、プロゲスチン、エストロゲン受容体モジュレータ、子宮収縮抑制薬、子宮収縮薬、例えばヨード生成物及び抗甲状腺薬等の甲状腺物質；例えば、非経口用鉄、ヘミン、ヘマトポルフィリン及びその誘導体等の血液製剤も含んでいてもよいが、これらに限定されるも���ではない。
【０１２２】
本明細書の他の箇所で記載したものに加えて、本発明のナノ粒子を光イメージングで使用する場合に適した他の光活性物質を以下に詳細に記載する。適切な光活性物質は、例えば、フルオレセイン、インドシアニングリーン、ローダミン、トリフェニルメチン、ポリメチン、シアニン、フラーレン、オキサテルラゾール（oxatellurazole）、バーディン（verdin）、ロジン、ポルフィセン、サフィリン、ルビリン、コレステリル  ４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ，−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノアート、コレステリル  １２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）ドデカノアート、シス−パリナリン酸コレステリル、コレステリル  ３−（（６−フェニル）−１，３，５−ヘキサトリエニル）フェニル−プロピオナート、コレステリル  １−ピレンブチレート、コレステリル−１−ピレンデカノアート、コレステリル  １−（ピレンヘキサノアート）、２２−（Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）−２３，２４−ビスノル−５−コレン−３β−オール、２２−（Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）−２３，２４−ビスノル−５−コレン−３β−イル  シス９−オクタデセノアート、１−ピレンメチル  ３−ヒドロキシ−２２，２３−ビスノル−５−コレナート、１−ピレン−メチル  ３β−（シス−９−オクタデセノイルオキシ）−２２，２３−ビスノル−５−コレナート、アクリジンオレンジ  １０−ドデシルブロミド、アクリジンオレンジ  １０−ノニルブロミド、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−テトラデシルアンモニウム）−メチル−７−ヒドロキシクマリン）クロリド、５−ドデカノイルアミノフルオレセイン、５−ドデカノイルアミノフルオレセイン−ビス−４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジルエーテル、２−ドデシルレゾルフィン、フルオレセインオクタデシルエステル、４−ヘプタデシル−７−ヒドロキシクマリン、５−ヘキサデカノイルアミノエオシン、５−ヘキサデカノイルアミノフルオレセイン、５−オクタデカノイルアミノフルオレセイン、Ｎ−オクタデシル−Ｎ’−（５−（フルオレセイニル））チオウレア、オクタデシルローダミンＢクロリド、２−（３−（ジフェニルヘキサトリエニル））−プロパノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、６−Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）ヘキサン酸、１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチル−インドカルボシアニンパークロレート、１２−（９−アントロイルオキシ）オレイン酸、５−ブチル−４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ノナン酸、Ｎ−（リサミン（商標）ローダミンＢスルホニル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩、フェニルグリオキサルモノハイドレート、ナフタレン−２，３−ジカルボキシアルデヒド、８−ブロモメチル−４，４−ジフル��ロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン、ｏ−フタルジアルデヒド、リサミン（商標）ローダミンＢスルホニルクロリド、２’，７’−ジフルオロフルオレセイン、９−アントロニトリル、１−ピレンスルホニルクロリド、４−（４−（ジヘキサデシルアミノ）−スチリル）−Ｎ−メチルピリジニウムヨウ化物、例えば、クロリン、クロリンｅ６、ボネリン、モノ−Ｌ−アスパルチルクロリンｅ６、メソクロリン、メソテトラフェニルイソバクテリオクロリン及びメソテトラフェニルバクテリオクロリン等のクロリン類、ヒポクレリンＢ、例えば、オクタエチルプルプリン、亜鉛（ＩＩ）エチオプルプリン、スズ（ＩＶ）エチオプルプリン及びスズエチルエチオプルプリン等のプルプリン、ルテチウムテキサフィリン、フォトフリン、金属ポルフィリン、プロトポルフィリンＩＸ、スズプロトポルフィリン、ベンゾポルフィリン、ヘマトポルフィリン、フタロシアニン、ナフトシアニン、メロシアニン、ランタニド錯体、シリコンフタロシアニン、亜鉛フタロシアニン、アルミニウムフタロシアニン、Ｇｅオクタブチルオキシフタロシアニン、メチルフェオホルビド−α−（ヘキシル−エーテル）、ポルフィセン、ケトクロリン、スルホン化テトラフェニルポルフィン、δ−アミノレブリン酸、例えば、１，２−ジニトロ−４−ヒドロキシ−５−メトキシベンゼン、１，２−ジニトロ−４−（１−ヒドロキシヘキシル）オキシ−５−メトキシベンゼン、４−（１−ヒドロキシヘキシル）オキシ−５−メトキシ−１，２−フェニレンジアミンを含むテキサフィリン、及び、金属としてＹ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、及びランタニド金属類Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｄｙ（ＩＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）、Ｌａ（ＩＩＩ）、Ｌｕ（ＩＩＩ）、及びＴｂ（ＩＩＩ）を含むテキサフィリン−金属キレート、クロロフィル、カロチノイド、フラボノイド、ビリン、フィトクロム、フィコビリン、フィコエリトリン、フィコシアニン、レチン酸、レチノイン、レチノイン酸、あるいは、上記物質の任意の組み合わせを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２３】
上記の化合物のうち、例えば、蛍光物質及び／又は光線感作物質は、当業者が容易に理解し又は容易に判定することができる。リサミンは、Ｎ−エチル−Ｎ−［４−［［４−［エチル［（３−スルホフェニル）メチル］アミノ］フェニル］（４−スルホフェニル−１）−メチレン］−２，５−シクロヘキサジエン−１−イリデン］−３−スルホベンゼン−メタンアミニウム水酸化物、内塩、ジナトリウム塩及び／又はエチル［４［ｐ［エチル（ｍ−スルホベンジル）アミノ］−α−（ｐ−スルホフェニル）ベンジリデン］−２，５−シクロヘキサジエン−１−イリデン］（ｍ−スルホベンジル）アンモニウム水酸化物内塩ジナトリウム塩の商標である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（米国オレゴン州ユージーン）より販売されている）。本発明で使用する適したその他の光活性物質は、米国特許第４９３５４９８号に記載されているもの、例えば、４，５，９，２４−テトラエチル−１６−（１−ヒドロキシヘキシル）オキシ−１７メトキシペンタアザペンタシクロ−（２０．２．１．１３，６．１８，１１．０１４，１９）−ヘプタコサ−１，３，５，７，９，１１（２７），１２，１４，１６，１８，２０，２２（２５），２３−トリデカエンのジスプロシウム錯体、及び、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−６−（４，５，９，２４−テトラエチル−１７−メトキシペンタアザペンタシクロ−（２０．２．１．１３，６．１８，１１．０１４，１９）−ヘプタコサ−１，３，５，７，９，１１（２７），１２，１４，１６，１８，２０，２２（２５），２３−トリデカエン−１６−（１−オキシ）ヘキシルホスホルアミダイトのジスプロシウム錯体を含む。
【０１２４】
組成物の調製方法
様々な技法を用いて本発明のエマルションを調製してもよく、詳細は国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２５４８４号に記載されている。本発明のエマルションの調製に用いられる一般的な手順では、パーフルオロカーボンと脂質／界面活性剤コーティング成分を水性溶媒中で流動化してエマルションを形成する。表層の機能成分は、元のエマルションに含まれていてもよく、又は、後からナノ粒子エマルションの形成に続いて表層に共有結合させてもよい。例えば、核酸ターゲティング物質又は薬剤が含まれる特定の例では、コーティングはカチオン性界面活性剤を用いてもよく、粒子が形成された後に表面に核酸が吸着される。
【０１２５】
通常は、乳化プロセスには、お互いに衝突しあって粒子サイズと分布が狭いエマルションが産生されるように、水溶液、前処理物質又は特異的結合種、パーフルオロカーボン、及び界面活性剤（もしあれば）を含有する混合液の流れに高い圧力を加えるステップが含まれる。好ましいエマルションを作製するためにＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＺＥＲ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、米国マサチューセッツ州ニュートン）を使用することができる。本装置は、超音波処理又はその他の従来法を用いて作製したエマルションの後処理にも使用することができる。ＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＺＥＲ装置にエマルション滴の流れを送入すると、サイズが小さく、サイズ分布が狭い製剤が産生される。
【０１２６】
エマルションの作製に用いられる他の方法は、パーフルオロカーボンと適切な前処理物質及び／又は特異的結合種を含有する水溶液の超音波処理を含む。通常は、当該混合液は界面活性剤を含む。乳化している混合液を冷却し、界面活性剤の濃度を最小に抑え、緩衝食塩水で緩衝することで、一般的に、前処理物質の特異的結合特性と結合能の両方が最大限保存される。本方法によって、吸着された前処理物質又は特異的結合種の単位ごとに高い活性を有する、優れたエマルションがもたらされる。
【０１２７】
高濃度の前処理物質又は特異的結合種を脂質エマルションにコーティングする場合、超音波処理の間は混合物を温める必要があり、また混合物のイオン強度は比較的低く、中等度から低いｐＨである必要がある。イオン強度が低すぎたり、ｐＨが低すぎたり、又は温めすぎる場合、特異的結合種の有用な結合特性又は前処理物質の結合能の全てが低下し又は失われることがある。乳化条件を注意深く管理し、変化させることで、高濃度のコーティングを得ると同時に、前処理物質又は特異的結合種の特性を最適化することができる。投与の前に、当該技術分野で既知の技法、例えば最終段階での蒸気滅菌により当該製剤を滅菌してもよい。
【０１２８】
乳化法と化学成分を変化させることで、エマルション粒子の大きさをコントロールし、変化させることができる。粒子サイズを測定するための技法及び機器は、当該技術分野で既知であり、レーザー光散乱法及び粒子によるレーザー光の散乱を測定するための分析装置を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２９】
適切に調製された場合、補助物質を含むナノ粒子は、多数のそうした機能性物質を外層に含有し、ナノ粒子は一般的に、数十、数百、又は数千の生物活性物質、ターゲティングリガンド、放射性核種、ＭＲＩ用造影剤及び／又はＰＥＴ用造影剤の分子を含有する。ＭＲＩ用造影剤に関しては、ナノ粒子に結合される成分のコピー数は、通常は１粒子につき約５，０００コピーを上回り、より好ましくは１粒子につき約１０，０００コピーを上回り、更により好ましくは１粒子につき３０，０００コピーを上回り、更により好ましくは１粒子につき約５０，０００〜１００，０００コピー以上である。１粒子当たりのターゲティング物質の数は通常は更に少なく、およそ数百程度であり、同様にＰＥＴ用造影剤、蛍光色素分子、放射性核種、及び生物活性物質の濃度を変えることができる。
【０１３０】
ナノ粒子は補助物質を含有しなくてもよい。一般に、粒子はパーフルオロカーボンコアを持つことから、本明細書に記載する他の機能と併用して、粒子の位置を追跡するためにＸ線イメージング、一部の例では超音波イメージング、を使用することができる。また、ターゲティングリガンドと結合したそのような粒子は、それ自体がイメージング用造影剤として特に有用である。更に、複数のその他の成分を含むことにより、本明細書に記載したようなその他の点においても使用することができる。例えば、常磁性イオンを含有するキレート剤を加えると、エマルションがＭＲＩ用造影剤として有用になる。生物活性物質を加えると、薬物送達システムとして使用することができる。放射性核種を加えると、放射線治療用の治療薬として、又は、イメージングのための診断用薬として使用することができる。その他のイメージング剤は、フルオレセイン又はダンシルのような蛍光色素分子が含まれる。生物活性物質を含んでいてもよい。多くの活性が含まれていてもよく、従って、標的化組織の画像を、活性物質がそれらに送達されると同時に得ることができる。
【０１３１】
コーティングに含有させる成分の性質に応じて、エマルションは、様々な方法で調製することができる。
【０１３２】
例を示すものに過ぎないが、一例において、以下の手順を記載する：パーフルオロオクチルブロミド（ＰＦＯＢ、２０％ｖ／ｖ）、界面活性剤コミクスチャー（１．５％ｗ／ｖ）、グリセリン（１．７％ｗ／ｖ）、及び、バランスに相当する水を調製する。ここで、界面活性剤コミクスチャーは、９７．９モル％のレシチン、０．１モル％のＰＥＧ２０００−ホスファチジルエタノールアミンと結合したビトロネクチン拮抗薬、及び、１モル％の脂溶性キレート（メトキシ−ＤＯＴＡ−カプロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＭｅＯ−ＤＯＴＡ−ＰＥ）を含む。界面活性剤成分は、これまでに開示されているように調製され（Ｌａｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９４：３３３４−４０）、ＰＦＯＢ及び蒸留脱イオン水と混合され、２０，０００ＰＳＩで４分間乳化される。２％界面活性剤層の０．０１から５０モル％の間、２％界面活性剤層の０．０１から２０モル％の間、２％界面活性剤層の０．０１から１０モル％の間、２％界面活性剤層の０．０１から５．０モル％の間、好ましくは２％界面活性剤層の０．２から２．０モル％の間のタイトレーション量で薬剤を添加することができる。クロロホルム−脂質混合液を減圧下で蒸発させ、５０℃の真空オーブン内で一晩乾燥し、超音波処理によって水に分散させる。懸濁液を、蒸留水又は脱イオン水に溶解したヨード化油と共にブレンダーカップ（例えば、Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａより販売されているもの）に移し、３０秒〜６０秒間乳化させる。乳化した混合液をＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ乳化装置に移し、２０，０００ＰＳＩで４分間処理を継続する。処理が完了したエマルションをバイアルに移し、窒素を封入し、使用するまでクリンプ栓で密封する。コントロール用エマルションは、界面活性剤コミクスチャーに薬剤を添加せず、同じ手順により調製することができる。レーザー光散乱サブミクロン粒子サイズ解析装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ４、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ、米国マサチューセッツ州サウスボロ）を使用して粒子の大きさを３７℃で３回測定すると、タイトかつ再現性の高いサイズ分布示され、平均直径は２００ｎｍ未満である。取り込まれなかった薬剤は透析又は限外ろ過法で除去することができる。ターゲティングリガンドを提供するため、例えば、本明細書で記載の手順において、二官能性リンカーを介して、ホスファチジルエタノールアミンに、抗体又は抗体断片又は非ペプチドリガンドを共有結合させる。
【０１３３】
キット
本発明のエマルションは、本発明の方法において直接調製及び使用してもよく、又は、エマルションの成分はキットの形で提供されてもよい。キットは、所望の補助物質の全てを、緩衝液又は凍結乾燥状態で含有する非標的化組成物を含んでもよい。キットは、全ての所望の補助物質及びターゲティング物質を緩衝液又は凍結乾燥状態で含有する調製済み標的化組成物を含んでもよい。あるいは、キットは、個別に提供されるターゲティング物質を含まないエマルションの形態を含んでもよい。このような条件下では、一般的に、エマルションがターゲティング物質と混合されたときに、エマルション自体へのターゲティング物質の結合を生じさせるような、マレイミド基のような反応基をエマルションが含む。結合の達成に有用な更なる試薬が個別の容器によって提供されてもよい。あるいは、エマルションは、それ自体が反応基を含み、個別に提供される所望の成分に結合したリンカーと結合する反応基を含んでもよい。適切なキットを構成するための各種様々な手法が想定されうる。従って、最終的なエマルションを構成する個々の成分は個別の容器で提供されてもよく、又は、キットそのものとは別に提供されるその他の材料と併用するための試薬だけをキットが含んでいてもよい。
【０１３４】
組み合わせの限定的なリストは、脂質−界面活性剤層中に蛍光色素分子又はキレート剤のような補助成分、及び、ターゲティング物質と結合するための反応部分を包含するエマルション製剤；エマルションがターゲティング物質と結合し、補助物質と結合するための反応基を包含する製剤；ターゲティング物質及びキレート剤を両方含み、キレートされる金属がキットで提供され、又は、ユーザーによって個別に提供されるエマルション；脂質層中の物質が異なる反応基、即ちターゲティングリガンドに対する反応基セット、及び、補助物質に対するもう１つの反応基セットを含む界面活性剤／脂質層を含むナノ粒子の製剤；結合剤によって反応基が供給される、上述の組み合わせのいずれかを含むエマルションの製剤を含んでいてもよい。
【０１３５】
一の態様において、αｖβ３を発現する組織を標的とするナノ粒子のエマルションの調製用のキットは、αｖβ３に特異的なリガンド、及び、低解像度造影剤及び／又は高解像度造影剤と結合するための結合部分を含むナノ粒子を含む少なくとも１つの容器、前記低解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器、並びに、前記高解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器とを含む。
【０１３６】
別の態様において、αｖβ３を発現する組織を標的とするナノ粒子のエマルション調製用キットは、αｖβ３に特異的なリガンドに結合するための結合部分を含むナノ粒子を含む少なくとも１つの容器、αｖβ３に特異的なリガンドを含む少なくとも１つの容器、低解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器、並びに、高解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器を備える。
【０１３７】
本発明は、高解像度イメージング用のキットにも関し、本キットは、低解像度造影剤に結合部分を介して結合したαｖβ３に特異的なリガンドを含むナノ粒子を含む少なくとも１つの容器と、高解像度造影剤に結合部分を介して結合したαｖβ３に特異的なリガンドを含むナノ粒子を含む少なくとも１つの容器を備える。
【０１３８】
別の態様において、高解像度イメージング用のキットは、標的部分に特異的なリガンドを含むハロカーボンベースのナノ粒子を含む少なくとも１つの容器を含み、ここで、ナノ粒子は高解像度造影剤に結合する。
【０１３９】
本発明のキットは、対象への造影剤の投与に関する使用説明手段を更に含むことができる。使用説明手段は、対象へ造影剤を投与することにより、低解像度イメージング法によって標的組織の位置を特定し、更に高解像度イメージング法によって可視化することを指示する、書面による添付物、録音テープ、視聴覚テープ、又は、他のあらゆる手段であってもよい。
【０１４０】
以下の実施例は例を示すことを目的としており、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０１４１】
（αｖβ３標的化１１１Ｉｎナノ粒子の調製）
２０％（ｖ／ｖ）パーフルオロオクチルブロミド、１．５％（ｗ／ｖ）の界面活性剤コミクスチャー、１．７％（ｗ／ｖ）のグリセリン、及び、バランス用の水を乳化させることによって、αｖβ３標的化１１１Ｉｎパーフルオロカーボンナノ粒子を調製した（Ｌａｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９４：３３３４−３３４０；Ｆｌａｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４（１１）：１２８０−１２８５；Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３（１８）：５８３８−５８４３）。界面活性剤コミクスチャーは、通常、９７．９モル％のレシチン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．）、０．１モル％のＰＥＧ２０００−ホスファチジルエタノールアミンと結合したビトロネクチン拮抗薬（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．）（Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３（１８）：５８３８−５８４３）、及び１モル％の脂溶性キレート（メトキシ−ＤＯＴＡ−カプロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＭｅＯ−ＤＯＴＡ−ＰＥ）、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｍａｇｎ．Ｍａｔｅｒ．２９３（１）：５４０−５４５）を含んでいた。界面活性剤成分をこれまでに開示されているように調製し（Ｌａｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９４：３３３４−３３４０）、ＰＦＯＢ及び蒸留脱イオン水と混合し、２０，０００ＰＳＩで４分間乳化（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）した。
【０１４２】
レーザー光散乱サブミクロン粒子解析装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ４，Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して３７℃で測定した結果、公称粒径は２４２ｎｍであった（多分散性指数は０．２３１）。これまでに報告されているように（Ｓｃｈｍｉｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．５３（３）：６２１−６２７）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでビトロネクチン細胞接着アッセイを使用してαｖβ３−インテグリン標的化ナノ粒子の生物活性を確認した。
【０１４３】
加水分解が一定でなく金属が沈殿することから、直接的な結合方法を用いて複数の１１１Ｉｎをナノ粒子へ効率的に固相結合させるのは困難であることが示された。複数の直接的結合標識法を、０．１Ｍの酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ５．５、０．２Ｍの炭酸ナトリウム溶液、０．２Ｍ水酸化ナトリウム、又は１０％ｖ／ｖトリエチルアミン緩衝液中で６５℃にて３０分間加熱して実施したが、遊離金属の著しい加水分解のために結果は概して不良であり又は一定でなかった。コントロール用エマルション（即ちホーミングリガンド又はＤＯＴＡを持たない）と１１１Ｉｎを併せてインキュベーションした後、ＤＴＰＡを添加してＴＬＣプロファイルを得た。標識のおよそ４０％が起始部に残っている（ｒｆ＝０）。
【０１４４】
弱いキレート剤であるクエン酸塩を、１１１Ｉｎと一時的に錯体化するシャトルとして利用し、加水分解を最小に抑えることでこの問題を解決した。０．５Ｍのクエン酸ナトリウムの存在下で、水酸化１１１Ｉｎの沈殿は２％未満に低下した。強力なキレート剤であるメトキシ−ベンジルＤＯＴＡを表面に豊富に含むαｖβ３−インテグリン標的化ナノ粒子を続いて添加すると、クエン酸塩由来の１１１Ｉｎと順調に競合し、再現性の高い標識がもたらされた。
【０１４５】
実質的に化学量論的な正確さで溶液中の遊離ＤＯＴＡキレートへの１１１Ｉｎの結合が達成されたが、ナノ粒子上のメトキシベンジルＤＯＴＡへの１１１Ｉｎの固相結合の結果は、表面のキレートが著しく多量であったにもかかわらず不良であった。しかし、本研究で非常に高い比放射能（〜１０１１１Ｉｎ／ナノ粒子）が常に得られた。
【０１４６】
通常は、０．０４ＭのＨＣｌ中で２５０μｌの０．５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．７）を、４０ＭＢｑの１１１ＩｎＣｌ３と混合した（２５０μｌ）。インジウム−クエン酸塩緩衝液を、それぞれ〜１又は〜１０の核種を有する粒子が生じるような割合でαｖβ３−インテグリンナノ粒子と混合した。〜４０℃の振盪槽（５０ＲＰＭ）内で一晩インキュベーションした後、遊離放射性核種を除去するため反応混合液に遊離ＤＴＰＡを５分間添加した。
【０１４７】
環境温度にて、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を使用して結合を評価した。シリカゲルがコーティングされたろ紙に上記の混合液の一定量を添加し、０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．５）：メタノール：水（２０：１００：２００、ｖ／ｖ）で展開した。１ｃｍ片を自動ガンマカウンター（Ｗｉｚａｒｄ３」  ｍｏｄｅｌ１４８０，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で計数した。放射性ナノ粒子のペイロードを、それらの公称粒径とパーフルオロカーボン濃度に基づいて、エマルション１μｌ当たりの粒子の数に対する、ナノ粒子に結合したＴＬＣで解析したμｌ当たりの放射能の割合として算出した。ナノ粒子への１１１Ｉｎの結合効率は、高いもの（１０核種／粒子）では〜５０から〜７０％、１核種／粒子の製剤では〜８５％から〜９０＋％であった。高特異活性注射液に非標識、非標的化エマルションを添加することで、治療間で等しいナノ粒子の総投与量を維持した。
【実施例２】
【０１４８】
（放射性標識ナノ粒子の薬物動態）
Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｃｈｏｏｌのＡｎｉｍａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコル及び手順に従って、これらの研究全体を通して動物を管理し、生理学的なモニタリングを行った。
【０１４９】
１０１１１Ｉｎ／粒子を有するαｖβ３標的化１１１Ｉｎナノ粒子を耳静脈からボーラス注入法で投与した（１１ＭＢｐ／ｋｇ）６匹のＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ  ｒａｂｂｉｔにおいて、放射性標識ナノ粒子の基本的な薬物動態パラメータを評価した。ベースライン時、及び注射の２、５、１０、２０、３０、４５、６０、９０、及び１２０分後に別の静脈アクセスから血液を採取し、重量を量り、オートウェルガンマカウンター（Ｗｉｚａｒｄ  １４８０，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定し、若干の量の差について結果を標準化した。各動物について、単純なｂｉｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｍｏｄｅｌ、ｙ＝Ａ０ｅ−αｔ＋Ｂ０ｅ−βｔをデータに適合し、これから分布容積、消失速度、及びクリアランスの推定値を、２−コンパートメントオープンモデル用の標準的な動力学モデリング公式を用いて導いた（Ｏ’Ｆｌａｈｅｒｔｙ  ＥＪ．Ｔｏｘｉｃａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇｓ：ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｄｙｎａｍｉｃｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８１）。
【０１５０】
全ての変数は平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。ＳＡＳ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用したＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定及びＡＮＯＶＡをはじめとする通常の線形モデルを連続変数の解析に使用した。０．０５のα水準での分離手段として最小有意差法（ＬＳＤ）を使用した。
【０１５１】
１１１Ｉｎαｖβ３ナノ粒子（〜１０１１１Ｉｎ／ＮＰ）の薬物動態を、６匹のウサギにおいて定義した。図１ａは、最初の２時間の間に１匹のウサギから得られたデータの２−コンパートメントモデリングを示す。これらのデータから得られた係数及び速度の推定値に基づいて、ナノ粒子のβ相の消失半減期（ｔ１／２β）を３０９分±１３６分（ＳＤ）と推定した。分布容積（ＶＤ）とクリアランス（Ｃｌ）を、これらの若年のウサギにおいてそれぞれ３８０ｍｌ±６６ｍｌ（ＳＤ）と０．６８ｍｌ／分±０．１２ｍｌ／分（ＳＤ）と算出した。データは、任意の血管受容体に到達し飽和するのに十分以上である、十分な血中半減期をパーフルオロカーボンナノ粒子が示すことを示唆する。分布容積は循環血液量の推定値のおよそ２倍であり、これは細網内皮系による取り込みとクリアランスを反映していた。
【実施例３】
【０１５２】
（αｖβ３標的化１１１Ｉｎナノ粒子の生体内分布）
０．２５ｍｌ／ｋｇ（ｎ＝３）、０．５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３）、及び１．０ｍｌ／ｋｇ（ｎ＝３）の用量を静脈経路で無作為に投与したＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ  ｒａｂｂｉｔにおいて、αｖβ３標的化パーフルオロカーボンナノ粒子の生体内分布を注射の３時間後に測定した。ウサギを安楽死させ、主要な特定クリアランス臓器（即ち、肺、脾臓、肝臓、リンパ節、骨髄、腎臓）を切除し、重量を測定し、パーフルオロカーボン解析用に処理した。
【０１５３】
水素炎イオン化検出器（Ｍｏｄｅｌ  ６８９０，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（米国デラウェア州ウィルミントン））を使用し、ガスクロマトグラフィーによってパーフルオロカーボン濃度を測定した。重量を測定した組織の一定量をエタノール中の１０％水酸化カリウムに抽出した。２ｍｌの内部標準液（０．１％オクタンを含むＦｒｅｏｎ）を添加し、混合液を血清バイアルに密封した。密封したバイアルの内容物をボルテックスで激しく攪拌した後、振盪機上で３０分間攪拌を続けた。抽出層の下層をシリカゲルカラムで濾過し、解析用に４〜６℃で保存した。ＧＣカラムの温度はまず３０℃とし、１０℃／分で１４５℃まで上昇させた。全てのサンプルの解析を２回行い、結果を％ＩＤ／ｇ±ＳＤで表した。
【０１５４】
図１ｂに示すように、％ＩＤ／ｇ組織としてのパーフルオロカーボンの量は脾臓で最も多く、０．２５ｍｌ／ｋｇ、０．５ｍｌ／ｋｇ、及び１．０ｍｌ／ｋｇのエマルション用量で、それぞれ１．０±１．１％ＩＤ／ｇ、３．０±２．８％ＩＤ／ｇ、及び３．７±０．８％ＩＤ／ｇに濃度が上昇した。１．０ｍｌ／ｋｇのエマルション用量レベルでは、肝臓のパーフルオロカーボン量は、脾臓で測定された量の１５％（０．６±０．１％ＩＤ／ｇ）であった。概して、残りの組織のパーフルオロカーボン濃度はこれより低かった。
【実施例４】
【０１５５】
（αｖβ３標的化１１１Ｉｎナノ粒子を使用した腫瘍の標的化）
雄のＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ  Ｒａｂｂｉｔ（〜２．５ｋｇ）にケタミンとキシラジンを筋肉内投与（それぞれ６５及び１３ｍｇ／ｋｇ）して麻酔をかけた。各動物の左後肢の毛を刈り、消毒し、膝窩の上側に小切開を作成する前にマーカイン（商標）を局所的に浸潤させた。２×２ｍｍの大きさのＶｘ−２癌腫瘍（ＮＣＩ  ｔｕｍｏｒ  ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）をドナー動物から新たに採取し、膝窩内におよそ０．５ｃｍの深さに移植した。解剖面を接合し、１本の吸収性縫合糸で固定し、皮膚の切開部を皮膚用接着剤Ｄｅｒｍａｂｏｎｄ（商標）で閉鎖した。腫瘍移植の手順後、キシラジンの効果をヨヒンビンで減弱し、動物を覚醒させた。
【０１５６】
Ｖｘ−２の移植から１２〜１６日後に、１％〜２％のイソフルラン（商標）でウサギを麻酔し、挿管して酸素を供給し、単一の３ｍｍ開口部を備える高エネルギー用ピンホール型コリメータの下側３ｃｍに設置し、平面モードで作動するｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｓｙｓガンマカメラ（Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）にマウントした。静脈及び動脈カテーテルを各ウサギの両側の耳に留置してナノ粒子の全身注射と動脈血の採取／生理学的モニタリングに使用した。Ｃａｐｉｎｔｅｃ  ＣＲＣ−１５Ｒウェルカウンターで、標識ナノ粒子の用量を使用する直前に較正した。
【０１５７】
２２ＭＢｑ／ｋｇの：１）〜１０１１１Ｉｎ／ＮＰのαｖβ３−インテグリン−標的化ＮＰ（ｎ＝３）、２）〜１１１１Ｉｎ／ＮＰのαｖβ３−インテグリン−標的化ＮＰ（ｎ＝４）、３）αｖβ３−インテグリン−標的化非放射性ＮＰと共に投与された〜１０１１１Ｉｎ／ＮＰのαｖβ３−インテグリン−標的化ナノ粒子（３：１）（即ち競合グループ、ｎ＝３）、４）〜１０１１１Ｉｎ／ＮＰの非標的化ＮＰ（ｎ＝３）、又は５）〜１１１１Ｉｎ／ＮＰの非標的化ＮＰ（ｎ＝３）が投与されるよう無作為化した１６匹のＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  ｒａｂｂｉｔにおいて、〜１２ｄのＶｘ−２腫瘍内の血管新生のｉｎ  ｖｉｖｏでの検出を行った。
【０１５８】
静脈注射後、ベースライン時、及び約２時間の間連続して１５分毎に、１７０ｋｅＶと２４４ｋｅＶに中心を持つ２つの２０％ウインドウを使用して動的放射線画像（マトリックス：１２８×１２８）を得た。ＤＩＣＯＭ画像をＵｎｉｘ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにエクスポートし、後からＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ．ｇｏｖ）で解析した。解剖学的ランドマークを各フレーム上で特定し、平均ピクセル活性を決定するために、同等の大きさの関心領域（ＲＯＩ）を腫瘍シグナル、筋肉、及び背景領域の周辺に手動で設定した。
【０１５９】
Ｖｘ−２腫瘍を移植した追加の８匹のウサギに、〜１０１１１Ｉｎ／ＮＰのαｖβ３−インテグリン−標的化（ｎ＝４）又は非標的化（ｎ＝４）ＮＰを投与し、１８時間後（ｎ＝４）又は４８時間後（ｎ＝４）にイメージングを行った。１８時間後の時点で、１５分毎に２時間の間、ウサギの動的スキャンを行った。４８時間後の時点では、１５分での画像取得を１度行った。
【０１６０】
イメージング後に動物を安楽死させ、腫瘍を切除し、重量を測定し、ルーチンの組織病理学と特定の免疫組織化学的検討用にホルマリン固定するか、又はＯＣＴ内ですばやく凍結した。２匹の動物では、精索内で継続的に発生する新生血管の確認用に、精巣を陽性対照として切除した。アセトン固定の凍結組織を薄切し（５μｍ）、ヘマトキシリン・エオシン染色で通常通り染色を行い、及び／又は、αｖβ３−インテグリン（ＬＭ−６０９，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）で免疫染色を行った。Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して免疫組織化学を行い、Ｖｅｃｔｏｒ（登録商標）ＶＩＰキットで発色した。Ｎｉｋｏｎ  Ｅ８００研究用顕微鏡で顕微鏡画像を取得し、Ｎｉｋｏｎ  ＤＸＭ１２００カメラでデジタル化した。
【０１６１】
別の動物集団では（ｎ＝２）、血管内皮用の一般的な染色であるローダミンとＦＩＴＣ−レクチン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で標識したαｖβ３−標的化ナノ粒子（０．１ｍｌ／ｋｇ）を静脈投与した。核医学イメージングのプロトコルに従って、αｖβ３−標的化ローダミンナノ粒子（０．１ｍｌ／ｋｇ）を、ＦＩＴＣ−レクチンの２時間前に投与し、安楽死させる約１５分前に蛍光レクチンを投与した。凍結切片作成及び顕微鏡観察用に腫瘍をＯＣＴに包埋する前に、結合していない蛍光標識を除去するため、組織を採取する前にウサギを食塩水で勢いよくかん流を行った。
【０１６２】
全ての変数は平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。ＳＡＳ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用したＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定及びＡＮＯＶＡをはじめとする通常の線形モデルを連続変数の解析に使用した。０．０５のα水準での分離手段として最小有意差法（ＬＳＤ）を使用した。
【０１６３】
静脈注射後２時間にわたって動的イメージングを実施し、〜１０１１１Ｉｎ／ＮＰの１１１Ｉｎαｖβ３−ナノ粒子を投与されたウサギにおける平均ピクセル強度の腫瘍対筋肉比を、３倍の競合用量の非標識αｖβ３−ナノ粒子と共に１１１Ｉｎαｖβ３−ナノ粒子を投与された動物と比較した（図２ａ）。１１１Ｉｎαｖβ３−ナノ粒子は、注射１５分以内に高い腫瘍対筋肉比（ＴＭＲ）コントラスト（６．４６±０．７８）をもたらし、これは２時間にわたって持続し、平均は６．３±０．０７であった。非標識αｖβ３−ナノ粒子によるインテグリン受容体の占有によって、１５分後の時点でのＴＭＲコントラストは４．５３±０．７７まで低下し、この差は連続イメージングを行った２時間の間持続し、平均は４．１１±０．０８であった（ｐ＜０．０５）。非標的化１１１Ｉｎナノ粒子（図２ｂ）は、１５分後の時点（３．８２±０．３２）、並びに２時間にわたって（３．７４±０．０５）、インテグリン標的化製剤が示した値より低いＴＭＲコントラストを示した（ｐ＜０．０５）。非標的化及び競合的治療の腫瘍コントラスト反応に差はなかった（ｐ＞０．０５）。２時間後の時点で、１１１Ｉｎαｖβ３−ナノ粒子を投与されたウサギの腫瘍部位における％注入用量（％ＩＤ）は１．２０％ＩＤ±０．１８％ＩＤであり、これは同等量の非標的化ナノ粒子を投与された動物において保持された用量、０．６０％ＩＤ±０．０８％ＩＤより高かった（ｐ＜０．０５）。総合すると、これらの結果は、αｖβ３−インテグリン標的化によってより優れたコントラスト増強が得られることを裏付けるものであり、血管新生の受動的標的化が、初期の腫瘍対筋肉の総コントラスト比に著しく寄与する可能性を示唆する。
【０１６４】
図２ｃでは、２時間の間の、〜１０１１１Ｉｎ／ＮＰの１１１Ｉｎαｖβ３−ナノ粒子の筋肉に関してのシグナル増強は、〜１１１１Ｉｎ／ＮＰで製剤化された粒子（５．０９±０．０４）より高かった（ｐ＜０．０５）。しかし、活性の低い物質で得られた平均コントラストは、〜１１１１Ｉｎ／ＮＰを有する非標的化製剤で得られたシグナルと差はなかった（ｐ＞０．０５）（データ示さず）。
【０１６５】
標的化核シグナルの持続性を評価するため、別のウサギ８匹の集団で１８時間後（〜３血中半減期）及び４８時間後（〜８血中半減期）に検討を行った。図３は、等量の放射活性用量の１１１Ｉｎナノ粒子が投与され、筋肉細胞のバックグラウンド数が同等であった２匹のウサギ（１匹は標的化：図３ｂ、１匹は対照：図３ａ）の１８時間後の画像を示す。インテグリン標的化製剤のコントラストは、非標的化薬に比べて高かった。１１１Ｉｎαｖβ３−ナノ粒子を投与された動物では、腫瘍部位での平均％注入用量は、非標的化対照物質を投与された動物において残存していたもの（０．１０％ＩＤ±０．０４％ＩＤ／ｋｇ）より４倍多かった（ｐ＜０．０５、０．４８％ＩＤ±０．０４％ＩＤ）。注射４８時間後では、腫瘍と筋肉からのシグナルは著しく低下し、グループ間で識別できなかった（ｐ＞０．０５）。
【０１６６】
αｖβ３−インテグリン発現の組織学的解析によって、αｖβ３−インテグリンの発現は、腫瘍と結合組織内の血管構造、並びに血管外膜の間の組織界面に沿って非対称に起こることが明らかになった。αｖβ３−インテグリンの発現の亢進は、腫瘍被膜を越えて拡がり、筋膜に付随する近傍の血管構造中にも認められた（図４ａ〜ｃ）。αｖβ３−インテグリンの血管発現は、成熟精巣上体（組織学的に確認された）及び大腿骨及び脛骨の骨端軟骨領域をはじめとする他の臓器でも検出された。αｖβ３−インテグリンを豊富に有するマクロファージはＲＡＭ−１１染色で確認され、腫瘍中心部に密集して分布していた（図５ａ及びｂ）が、腫瘍周囲の結合組織ではまばらであった。
【０１６７】
αｖβ３−標的化ローダミンナノ粒子と、血管内皮マーカーであるＦＩＴＣ−レクチンの静脈経路での同時投与によって、二つのマーカーの密接な空間的相関が明らかになった。図７Ａ〜Ｃに示すように、ＦＩＴＣ−レクチンは新生血管を含む脈管系全体に認められた。ローダミンナノ粒子は、小血管内に主に分布し、ＦＩＴＣ−レクチンと共局在していた。
【実施例５】
【０１６８】
（αｖβ３標的化蛍光ナノ粒子の調製）
カプロイル−ホスファチジルエタノールアミンに結合したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８を界面活性剤に０．５モル％の割合で組み込むことで蛍光ナノ粒子を調製した。７．８μモルのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８カルボキシルスクシンイミジルエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、１．４ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、それと１０μモルのカプロイルアミンホスファチジルエタノールアミン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を２００μｌのクロロホルム中で３７℃にて１時間混合することで、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−カプロイル−ホスファチジルエタノールアミンを合成した。２００μｌのクロロホルムを添加した後、反応温度を５０℃に上昇させ、一晩継続した。
【０１６９】
複合体産物をモニタリングし、未結合のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ色素から精製するために、炭化水素（Ｃ１８）が結合したシリカゲルの逆相と、２０：１００：２００の割合の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）：メタノール：水で構成される移動相を使用してＴＬＣを実施した。赤色蛍光の脂質を起始部で回収し、クロロホルム：メタノール（３；１）で抽出し、使用するまで蒸発乾固した。
【０１７０】
腫瘍内及び腫瘍周囲のナノ粒子の顕微鏡画像上の局在を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８シアン色素が界面活性剤中に封入されたαｖβ３−標的化ナノ粒子を投与した（０．１ｍｌ／ｋｇ）別の集団のＶｘ−２移植ウサギ（ｎ＝２）において検討した。新生血管内の受動的集積を最小に抑えるために、１０倍過剰量の非標的化、非標識ナノ粒子と共に蛍光ナノ粒子を投与し、１時間循環させた。動物を殺し、腫瘍を取り出してリン酸緩衝液で繰り返しすすいだ後、ＯＣＴ剤中で凍結した。核を識別するために腫瘍の凍結切片（４μｍ）をＤＡＰＩで対比染色した。他の細胞成分に対する造影剤の分布を評価するため、緑色のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒナノ粒子とＤＡＰＩ標識核の顕微鏡写真を重ね合わせた。マクロファージの腫瘍内分布を明らかにするために隣接切片をＲＡＭ−１１（Ｄａｋｏ，Ｉｎｃ．）で染色した。
【０１７１】
凍結腫瘍組織を蛍光顕微鏡で観察すると、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ粒子が近傍の筋肉との間の被膜界面内に存在しており（図６ａ）、これはαｖβ３−インテグリン陽性血管の分布と一致していた（図６ｂ）。αｖβ３−標的化ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ナノ粒子で前処理を行ったウサギにおけるαｖβ３−インテグリン陽性血管のＬＭ６０９による免疫組織学的共染色は、結合した粒子による受容体によって競合的に阻害された。αｖβ３−標的化ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ナノ粒子の分布と、ＲＡＭ−１１で染色されたマクロファージとの関連性はなかった。
【０１７２】
要約すると、αｖβ３−標的化１１１Ｉｎナノ粒子を開発し、発生期の腫瘍における血管形成に対する高感度の指標としての使用について検討を行った。腫瘍の新生血管は標的化ナノ粒子を使用して迅速に特定されたが、受動的に取り込まれたナノ粒子が血液プール中で存在し続けウォッシュアウト時間が長かったため、クリアランスが起こるのが一晩遅れた。この結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管形成の検出にαｖβ３−標的化１１１Ｉｎナノ粒子が臨床的に確実かつ迅速な指標をもたらす可能性を示唆するものであり、これは腫瘍の早期発見及び治療の一助となるかもしれない。
【０１７３】
従って、腫瘍の新生血管内の放射性標識ナノ粒子からの低解像度シグナルを、潜在的な関心領域を迅速に特定するために、またＭＲ又はＣＴイメージングのような高解像度の二次イメージングの指標とするために使用することが可能である。更に、目的部位の位置を特定するのに最小用量の粒子を単独で使用し、その後、非造影イメージング、又は１Ｈ及び／又は１９Ｆのそれぞれについて、常磁性標識した、又はしないαｖβ３ナノ粒子を使用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】図１Ａは、薬物動態プロファイルであり、〜１０１１１Ｉｎ／ＮＰを有するαｖβ３−標的化１１１Ｉｎナノ粒子（ＮＰ）の分布と血流からのクリアランスを示す。１匹の動物について、最初の２時間の血液中の％注入用量（ＩＤ）対注射後の時間を示している。各動物から得られたデータに対して２−コンパートメント２指数関数モデルを適用した。β脱離の消失半減期、分布容積、及びクリアランスの推定値を算出した後で、平均±標準偏差で表した（ｎ＝６）。図１Ｂは、ナノ粒子エマルションを、０．２５ｍｌ／ｋｇ、０．５ｍｌ／ｋｇ、及び１．０ｍｌ／ｋｇの用量（ｎ＝３／用量）で注射したウサギにおける、パーフルオロカーボンナノ粒子の生体内分布を示す。組織内パーフルオロカーボン量をガスクロマトグラフィーで直接測定した後、結果を％ＩＤ／ｇ組織±標準偏差として表す。
【図２】図２Ａ、Ｂ、及びＣは、腫瘍対筋肉のシグナル比を示す。Ｖｘ−２を移植したウサギにおいて、２２ＭＢｑ／ｋｇ（静脈内投与）のＡ）〜１０１１１Ｉｎ／ＮＰのαｖβ３−標的化１１１Ｉｎナノ粒子（ＮＰ）対αｖβ３−標的化未標識（競合）；Ｂ）〜１０１１１Ｉｎ／ＮＰのαｖβ３−標的化又は非標的化１１１Ｉｎナノ粒子；Ｃ）〜１０１１１Ｉｎ／ＮＰのαｖβ３−標的化１１１Ｉｎナノ粒子対〜１１１１Ｉｎ／ＮＰを投与した後に、造影剤注射直後、及び、１５分毎に連続して腫瘍対筋肉のシグナル比を測定した。表示されている値は、２時間の平均±ＳＥＭを示し；＊はｐ＜０．０５を表す。
【図３】図３Ａ及びＢは、〜１２日前にＶｘ−２腫瘍を移植したウサギに、２２ＭＢｑ／ｋｇ（静脈内投与）の〜１０１１１Ｉｎ／ＮＰを有する非標的化（Ａ）又はαｖβ３−標的化（Ｂ）１１１Ｉｎナノ粒子（ＮＰ）を投与後、１８時間の１１１Ｉｎプラナー画像（１５分スキャン、マトリックスは１２８×１２８）を示す。
【図４】図４Ａは、αｖβ３−インテグリンで染色した筋肉に隣接するＶｘ−２腺癌の顕微鏡画像（４倍）を示し、介在する結合組織内に濃い茶色（紫）の筋（白い矢印）として認められる。図４Ｂ及びＣは、最初の画像で特定されたαｖβ３−インテグリン陽性新生血管の、比較的まばらな領域（Ｂ）と密集した領域（Ｃ）の高倍率画像（２０倍）である。
【図５】図５Ａは、マクロファージ特異的なバイオマーカーであるＲＡＭ１１で染色したＶｘ−２腺癌の顕微鏡画像（４倍）を示し、腫瘍の中心部では散在性の濃い茶色（紫）の集積として認められるが、周囲の被膜にはあまり認められない。図５Ｂは、Ａの拡大視野であり、腫瘍の中心部におけるマクロファージの分布（白い矢印）が明らかである。
【図６】図６Ａは、Ｖｘ−２腺癌と被膜の光学顕微鏡画像（４倍）を示す。中心部に向かって広がる壊死と、腫瘍の周辺部で細胞増殖が起きている。図６Ｂは、Ａで示した腫瘍の被膜領域の蛍光顕微鏡画像（２０倍）を示す。被膜内のαｖβ３−インテグリン標的化ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ナノ粒子を保持する血管が緑のシグナルとして認められる。青のＤＡＰＩ染色は、結合組織内の細胞核を表す。
【図７】図７Ａ〜Ｃは、αｖβ３−インテグリン標的化ローダミンナノ粒子（Ｂ）及びＦＩＴＣ−レクチン（Ａ）の蛍光顕微鏡画像、並びに、腫瘍被膜領域（Ｃ）から得られたマージ画像を示す。（Ｃ）に示すように、αｖβ３−インテグリン標的化ローダミンナノ粒子及びＦＩＴＣ−レクチンは空間的に共局在している。ローダミンナノ粒子は、腫瘍又は被膜の血管外領域では認められなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年12月19日(2008.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的化低解像度造影剤及び前記低解像度造影剤と類似する標的を有する標的化高解像度造影剤を包含する高解像度イメージング用の組成物であって、前記標的化低解像度造影剤及び前記標的化高解像度造影剤が、
ａ）投与されると標的組織内に集積し、
ｂ）低解像度イメージング法を使用して前記低解像度造影剤の集積部位を特定すると前記標的組織が特定され、
ｃ）高解像度イメージング法を使用して前記標的組織の高解像度画像を取得すると前記高解像度造影剤の集積部位が特定され、ここで、前記高解像度造影剤を使用した場合に得られる画像は前記低解像度造影剤を単独で使用した場合に得られる画像よりも解像度の高い画像が得られることを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記低解像度造影剤と前記高解像度造影剤が、低解像度モダリティおよび高解像度モダリティを使用することにより検出可能な同一の物質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記低解像度造影剤が、デコイ粒子と共に投与するための低解像度造影剤であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記低解像度造影剤及び／又は高解像度造影剤がナノ粒子に封入されていることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記低解像度造影剤及び高解像度造影剤が同一のナノ粒子に封入され、該ナノ粒子がエマルション中に含有されていることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ナノ粒子が、脂質コーティングで覆われた液体ハロカーボンコアを含むことを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記低解像度造影剤及び／又は高解像度造影剤が、抗体、抗体断片、ペプチド、アプタマー、ペプチド模倣薬、薬剤、又は、ホルモンである標的特異的リガンドによって標的化されていることを特徴とする、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記標的組織が、高レベルのαｖβ３−インテグリンによって特徴付けられる組織であり、かつ、前記低解像度及び／又は高解像度造影剤が、αｖβ３−インテグリンに対するリガンドと結合していることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
標的部分を発現する組織に標的化されたナノ粒子のエマルションを調製するためのキットであって、
前記標的部分に特異的なリガンドと、低解像度造影剤及び／又は高解像度造影剤と結合するための結合部分を含むナノ粒子を含む少なくとも１つの容器、
前記低解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器、及び、
前記高解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器を備えるキット。
【請求項１０】
標的部分を発現する組織に標的化されたナノ粒子のエマルションを調製するためのキットであって、
前記標的部分に特異的なリガンドに結合するための結合部分を含むナノ粒子を含む少なくとも１つの容器、
前記標的部分に特異的なリガンドを含む少なくとも１つの容器、
低解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器、及び、
高解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器を備えるキット。
【請求項１１】
標的部分を発現する組織に標的化されたナノ粒子のエマルションを調製するためのキットであって、
標的化低解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器、
標的化高解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器、及び、
使用説明手段を備えるキット
【請求項１２】
標的部分を発現する組織に標的化されたナノ粒子のエマルションを調製するためのキットであって、
標的部分に特異的なリガンドを含むハロカーボンベースのナノ粒子を含む少なくとも１つの容器、ここで、当該ナノ粒子は高解像度造影剤と結合している、及び、
使用説明手段を備えるキット。
【請求項１３】
前記ナノ粒子が、脂質／界面活性剤のコーティングを含むハロカーボンベースのナノ粒子である、請求項９〜請求項１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１４】
前記標的部分がα、ｖβ３−インテグリンである、請求項９〜請求項１３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１５】
前記低解像度造影剤が、９９ｍＴｃを含む、請求項９〜請求項１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１６】
前記高解像度造影剤が、ＭＲＩ用造影剤、ＣＴ用イメージング剤、光学イメージング剤、超音波イメージング剤、パラＣＥＳＴイメージング剤、及び、これらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９〜請求項１５のいずれか１項に記載のキット。
【手続補正書】
【提出日】平成20年12月24日(2008.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的化低解像度造影剤及び前記低解像度造影剤と類似する標的を有する標的化高解像度造影剤を包含する高解像度イメージング用の組成物であって、前記標的化低解像度造影剤及び前記標的化高解像度造影剤が、
ａ）投与することにより標的組織内に集積し、
ｂ）低解像度イメージング法を使用して前記低解像度造影剤の集積部位を特定することにより前記標的組織が特定され、
ｃ）高解像度イメージング法を使用して前記高解像度造影剤の集積部位を特定することにより前記標的組織の高解像度画像が取得され、ここで、前記高解像度造影剤を使用した場合に得られる画像は前記低解像度造影剤を単独で使用した場合に得られる画像よりも解像度の高い画像が得られることを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記低解像度造影剤と前記高解像度造影剤が、低解像度モダリティおよび高解像度モダリティを使用することにより検出可能な同一の物質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記低解像度造影剤が、デコイ粒子と共に投与するための低解像度造影剤であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記低解像度造影剤及び／又は高解像度造影剤がナノ粒子に封入されていることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記低解像度造影剤及び高解像度造影剤が同一のナノ粒子に封入され、該ナノ粒子がエマルション中に含有されていることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ナノ粒子が、脂質コーティングで覆われた液体ハロカーボンコアを含むことを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記低解像度造影剤及び／又は高解像度造影剤が、抗体、抗体断片、ペプチド、アプタマー、ペプチド模倣薬、薬剤、又は、ホルモンである標的特異的リガンドによって標的化されていることを特徴とする、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記標的組織が、高レベルのαｖβ３−インテグリンによって特徴付けられる組織であり、かつ、前記低解像度及び／又は高解像度造影剤が、αｖβ３−インテグリンに対するリガンドと結合していることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
標的部分を発現する組織に標的化されたナノ粒子のエマルションを調製するためのキットであって、
前記標的部分に特異的なリガンドと、低解像度造影剤及び／又は高解像度造影剤と結合するための結合部分を含むナノ粒子を含む少なくとも１つの容器、
前記低解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器、及び、
前記高解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器を備えるキット。
【請求項１０】
標的部分を発現する組織に標的化されたナノ粒子のエマルションを調製するためのキットであって、
前記標的部分に特異的なリガンドに結合するための結合部分を含むナノ粒子を含む少なくとも１つの容器、
前記標的部分に特異的なリガンドを含む少なくとも１つの容器、
低解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器、及び、
高解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器を備えるキット。
【請求項１１】
標的部分を発現する組織に標的化されたナノ粒子のエマルションを調製するためのキットであって、
標的化低解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器、
標的化高解像度造影剤を含む少なくとも１つの容器、及び、
使用説明手段を備えるキット
【請求項１２】
標的部分を発現する組織に標的化されたナノ粒子のエマルションを調製するためのキットであって、
標的部分に特異的なリガンドを含むハロカーボンベースのナノ粒子を含む少なくとも１つの容器、ここで、当該ナノ粒子は高解像度造影剤と結合している、及び、
使用説明手段を備えるキット。
【請求項１３】
前記ナノ粒子が、脂質／界面活性剤のコーティングを含むハロカーボンベースのナノ粒子である、請求項９〜請求項１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１４】
前記標的部分がα、ｖβ３−インテグリンである、請求項９〜請求項１３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１５】
前記低解像度造影剤が、９９ｍＴｃを含む、請求項９〜請求項１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１６】
前記高解像度造影剤が、ＭＲＩ用造影剤、ＣＴ用イメージング剤、光学イメージング剤、超音波イメージング剤、パラＣＥＳＴイメージング剤、及び、これらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９〜請求項１５のいずれか１項に記載のキット。
【国際調査報告】
2009535126.tif 000010