(57)【要約】本発明は、複数のバイオリアクターからなるシステム関するものであり、本発明のシステムは、複数のバイオリアクター、加圧流体源、前記流体を前記バイオリアクターに分配する分配手段からなり、前記システムはさらに複数の背圧発生手段を有し、前記背圧発生手段は各バイオリアクターと前記加圧流体源の前後に配置され、各背圧発生手段は、各背圧発生手段の間を流れるときの加圧流体の流れる力より弱い抵抗力を呈する。さらに本発明は、複数のバイオリアクターからなるシステムの操作方法であって、複数のバイオリアクター、加圧流体源、前記流体を前記バイオリアクターに分配する分配手段を設置するステップ、前記ステップにおいては、前記システムは複数の背圧発生手段を有し、前記背圧発生手段は各バイオリアクターに設置されるか、あるいは、各バイオリアクターと前記加圧流体源の間に配置され、各背圧発生手段は、各背圧発生手段の間を流れるときの加圧流体の流れる力より弱い抵抗力を呈するものである、と前記システムを操作するステップからなる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のバイオリアクターからなるシステムであって、
複数のバイオリアクター、
加圧流体源、
前記流体を前記複数のバイオリアクターに分配する分配手段、
からなり、
前記システムは、複数の背圧発生手段を有し、前記背圧発生手段は各バイオリアクターと前記加圧流体源の前または後に配置され、各背圧発生手段は、各背圧発生手段の間を流れるときの加圧流体の流れる力より強い抵抗力を呈する。
【請求項２】
請求項１に係る前記システムにおいて、前記複数のバイオリアクターは前記システム内に並列に配置される。
【請求項３】
請求項１あるいは２のいずれかに係る前記システムにおいて、前記複数のバイオリアクターは膜バイオリアクターである。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに係る前記システムにおいて、前記膜バイオリアクターは単繊維型膜バイオリアクターあるいは多繊維型膜バイオリアクターである。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに係る前記システムにおいて、前記複数のバイオリアクターは少なくとも一個の中空繊維膜を有する。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに係る前記システムにおいて、前記少なくとも一個の中空繊維膜はシェルに包まれた状態の毛細管膜を有する。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに係る前記システムにおいて、前記背圧発生手段は、ノズル、あるいはフリットを有する。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれかに係る前記システムにおいて、前記背圧発生手段は、バイオリアクターである。
【請求項９】
請求項３乃至８のいずれかに係る前記システムにおいて、前記背圧発生手段は、前記膜である。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれかに係る前記システムにおいて、前記加圧流体源は気体である。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれかに係る前記システムにおいて、前記加圧流体源は空気である。
【請求項１２】
請求項１乃至１１のいずれかに係る前記システムにおいて、前記加圧流体源は液体である。
【請求項１３】
請求項１乃至１２のいずれかに係る前記システムにおいて、前記液体は培養液である。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれかに係る前記システムにおいて、前記培養液は前記中空繊維膜の前記管腔へ供給される。
【請求項１５】
請求項１乃至１４のいずれかに係る前記システムにおいて、前記培養液は前記中空繊維膜の前記管腔を通過する。
【請求項１６】
請求項１乃至１４のいずれかに係る前記システムにおいて、気体によって栄養液の供給が行われる。
【請求項１７】
請求項１乃至１６のいずれかに係る前記システムにおいて、バイオフィルムは前記中空繊維膜の壁を通過する培養液から栄養を補給しながら前記中空繊維膜の外面上で成長する。
【請求項１８】
請求項１乃至１７のいずれかに係る前記システムにおいて、バイオフィルムは過剰栄養の培養液を含めた培養液を透過し、バイオフィルムの生産物はリアクターから取り出される。
【請求項１９】
複数のバイオリアクターからなるシステムの操作方法であって、前記操作方法は、
複数のバイオリアクター、加圧流体源、前記流体を前記バイオリアクターに分配する分配手段を設置するステップであって、前記ステップにおいては、前記システムは複数の背圧発生手段を有し、前記背圧発生手段は各バイオリアクターに設置されるか、あるいは、各バイオリアクターと前記加圧流体源の間に配置され、各背圧発生手段は、各背圧発生手段の間を流れるときの加圧流体の流れる力より強い抵抗力を呈するものである、と
前記システムを操作するステップ
からなる。
【請求項２０】
明細書に記載されているか、あるいは例示されている複数のバイオリアクターからなるシステムと実質的に同等な複数のバイオリアクターからなるシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は複数のバイオリアクターからなるシステムに関する。具体的には、本発明は加圧流体を用いた複数のバイオリアクターからなるシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジー産業において、製品の多くは、バイオリアクターを用い、いくつかのバイオプロセスを経て生産される。非常に多くの処理パラメータが結果に影響を及ぼし、そのため、バイオプロセスの作業にも影響が及ぶ。処理パラメータには、生成される微生物の性質、微生物の有する成分、その成分の濃度、成長比、生産媒体、pH、その成長媒体の束一性、酸素量輸送などがある。さらには、幾種類かの異なる方式のバイオリアクターがあり、例として、連続かくはん槽型リアクター（Continually Stirred Tank Reactors, 以下、CSTRと略す）、エアリフト・リアクター（air-lift reactors）、膜バイオリアクター(membrane bioreactors)がある。膜バイオリアクターは非常に重宝するバイオリアクターである。なぜならば継続的な使用が可能であり、最適条件を提供すべく実験が長時間に渡っても培養条件を変更することが可能であり、所定の環境下でより優れた本来的な性能を発揮するからである。実験当初から最適とされる諸条件を正確に予測することは、現状、不可能であるため、プロセス最適化の大半は、経験的に確立される。このように、多くの実験においては、生成物の成長と生成に適する最適な条件を探ることが必要とされる。
【０００３】
最適な条件を探る実験が、最小限の材料を使用する小規模レベルで、しかも多くのターンアラウンド・タイム費やすことなく、平行的かつ・あるいは連続的に実施することができればよいかもしれない。一般的には、フラスコやマイクロ・タイター・プレート（micro−titre plates）が組み込まれた小規模な実験システムを用いて多面的かつ平行的な研究が行われる。しかしこのような小規模な実験システムでは、一般的に、フェッド・バッチ(fed batch)および継続的な操作が不可能であり、生産用のバイオリアクターレベルまで規模を拡大することができない。膜バイオリアクターは、固体/液（空気）界面を提供することによって微生物の自然環境をシミュレートするものであり、さらに著しいバイオプロセスの向上に寄与してきている。このように、大規模な設備をもつ研究室での実験の転用の前段階として、小規模で複数の小型リアクターを使用することは、迅速なスクリーニングや条件の最適化に非常に役立つ。小規模設備から大規模設備に変えることは容易である。そのような小型バイオリアクターの有益性が文献などで報告されている。しかし複数の小型リアクターは多チャンネル型ポンプに接続されて駆動されるものであった。この多チャンネル型ポンプが駆動すると、液側で拍動的かつ不均一な流れが生じる。また、多チャンネル型ポンプを駆動させること自体が高価である。空気の流速分布は、普通、各バイオリアクターあるいは各実験モジュールの背圧を調整するなどの試行錯誤を重ねることによって、一定に保たれる。
【０００４】
あるいは、各バイオリアクターあるいは各実験モジュールへ、個別に空気を供給する必要がある。ただし、この方法は費用的に高価である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
加圧流体源によって駆動される各バイオリアクターの状況がほぼ同一な、複数のバイオリアクターからなるシステムが待ち望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係る第一の態様によれば、複数のバイオリアクターからなるシステムであって、
・  複数のバイオリアクター、
・  加圧流体源、
・  前記流体を前記バイオリアクターに分配する分配手段、
からなり、前記システムは、複数の背圧発生手段を有し、前記背圧発生手段は各バイオリアクターと前記加圧流体源の前または後に配置され、各背圧発生手段は、各背圧発生手段の間を流れるときの加圧流体の流れる力より強い抵抗力を呈する、
ことを特徴とする複数のバイオリアクターからなるシステムが提供される。
【０００７】
前記複数のバイオリアクターは、前記システムの中に並列に配置されるのが望ましい。また、前記バイオリアクターは単繊維型膜バイオリアクター(single fibre membrane bioreactors)あるいは多繊維型膜バイオリアクター(multi-fibremembrane bioreactors) のうちいずれかの膜バイオリアクターであることが望ましい。特に、前記膜バイオリアクターは、シェルに包まれた状態の少なくとも一個の中空繊維膜、例えば毛細管膜を有するのが望ましい。
【０００８】
本発明に係る好ましい形態の実施例の例１においては、前記背圧発生手段は、流量調整弁、ノズル、あるいはフリットに相当する。しかしながら、バイオリアクター自体が背圧発生手段に相当するものと解釈できる。また、前記バイオリアクターが膜バイオリアクターである場合、その膜自体が前記背圧発生手段に相当する。理由として、例２に示すように、膜バイオリアクターの膜に対して、常に、膜と膜の間に働く抵抗力よりもはるかに大きい流体圧力の抵抗力が及んでいるからである。
【０００９】
本発明に係る好ましい形態の実施例においては、前記流体は、気体、好ましくは空気に相当する。しかしながら、前記流体は液体、例えば中空繊維膜の管腔へ供給される培養液であってもよい。培養液は中空繊維膜の管腔を通過し、バイオフィルムは中空繊維膜の壁を通過する培養液から栄養を補給しながらその中空繊維膜の外面上で成長するものであってもよい。バイオフィルムは過剰栄養の培養液を含めた培養液を透過し、バイオフィルムの生成物はリアクターから取り出すことができる。生産物は透過の際に隔離して取り出すことも可能である。栄養分はバイオフィルムの成長機構を確認するために観察されるものであってよい。本発明に係る大半の好ましい形態の実施例においては、気体によって栄養液がバイオリアクターに供給される。
【００１０】
本発明に係る第二の態様によれば、複数のバイオリアクターからなるシステムの操作方法であって、複数のバイオリアクター、加圧流体源、前記流体を前記バイオリアクターに分配する分配手段を設置するステップ、前記ステップにおいては、前記システムは複数の背圧発生手段を有し、前記背圧発生手段は各バイオリアクターに設置されるか、あるいは、各バイオリアクターと前記加圧流体源の間に配置され、各背圧発生手段は、各背圧発生手段の間を流れるときの加圧流体の流れる力より強い抵抗力を呈するものである、と前記システムを操作するステップからなる。
【００１１】
本システムは、非常に均一に近い通風、大気圧、液体圧条件のもとで多数のリアクターを並行的に操作することを可能にするものである。以下に本発明に係るシステムの利点を列挙する。
・  培養物のもたらす生物学上の効果、または、同等の条件下で数個のバイオリアクターにて長時間に渡り観察することのできる実験環境を決定できる。すなわち、多数の膜において平行して起こる変化を予定の実験実施期間を超えて観察することができる、または経時変化的な事象を見極める分析を行うために個々のバイオリアクターを犠牲にすることができる。
・  複数の培養基の最適化を平行的に行うことができる。このため、プロセスの進展時間が大いに削減される。
・  ろ過効率およびバイオと化学の融合性を調べるために異なる膜についてテストすることができる。
【００１２】
本発明に係るバイオリアクターにおいては、培養物の働きに関するプロセス条件を最適化するために、圧力と流動の条件を、変更することができる。特筆すべき点を以下に列挙する。
・  ある合成物の生産に用いられる一連の種または菌株を、同等な条件下で平行して比較することができる。
・  例えばスクリーニング・アプリケーションなど、小規模レベルで多数の異なる生産物を生産することが可能である。
【００１３】
本発明に係るシステムは、一般的に、以下に列記するものを有する。
・  米国特許5,945,002号に記載されているタイプの単繊維型あるいは多繊維型膜バイオリアクター。該米国特許に記載のバイオリアクターは、限られた空間あるいは材料で使用するのに適する小型のものであるのが望ましい。
・  流体（気体）圧力源。一般的にはエア・コンプレッサあるいはガス・シリンダーがこれに該当する。
・  圧力及び液体の流れを修正できるキャップが付いていて、例えば栄養液といった成長培地入りの圧力容器を含む多数の圧力容器に、加圧流体を送るマニホールド。キャップには３つの接続部があり、１つは加圧流体を取り込むためのものであり、１つは成長培地を送り出すためのものであり、もう1つは新しい媒体もしくは他の添加物を取り込むためのものである。
・  操作上の必要条件に応じ、毛細管膜の場合、バイオリアクターの管腔あるいは毛細管の外側空間（Extra Capillary Space、ECSと略す）のいずれかに対して、各圧力容器は取り付けられる。
・  各バイオリアクターは、好ましくは、流動率に関しての許容範囲内の差に応じて本質的に等価な数値範囲の抵抗力を有する一枚以上の膜を有するのが望ましい。そのような膜を備えることにより、別のバイオリアクターからの流体の流入、または抵抗力に反比例する流体の流入を、確実にする。
・  通気培養法による培養物の成長のために、圧縮空気などの空気圧力源を、膜バイオリアクターを介して分配する必要がある。通常、ここで分配される空気は、成長培地を生かしておくために供給される空気と同じである。
・  加湿が必要である場合には、好ましくは、空気供給入り口に細菌ろ過フィルターを取り付けた状態で、加湿器を空気供給口に接続することとしてもよい。細菌ろ過フィルターを取り付けた上で加湿器を使用することにより、加湿空気を送り出す特殊な空気フィルターを用いることなく、無菌状態での操作が可能となる。
・  加湿器は、乾燥空気を加圧のために送り込み、加湿空気を追い出すためのキャップ付の圧力容器であってもよい。
・  流体分配手段、例えば送気管は、空気が全てのバイオリアクターに分配されるように、マニホールドで構成されることが望ましい。
・  上記の送気管は各膜モジュールの毛細管の外側空間に接続されることとしてもよい。
・  各膜リアクターの空気の排出と生成物取り出しのための出口は、透過物回収容器に接続されていることとしてもよい。
・  上述の透過物回収容器は、圧力容器であることが望ましく、該圧力容器は３つ接続部を有するキャップを備え、１つは廃棄空気と生成物を容器内に導くためのものであり、1つは必要に応じて生成物を除去するためのものであり、もう１つは空気を排出するためのものである。
・  上述の透過物回収容器の空気排出口は、例えば流量調整容器、ノズル、あるいは所定の仕様のフリットなどに相当する背圧発生装置に接続されていることが望ましい。
・  上述のノズルは複数で使用される場合、全て同じノズルであり、同じものを使用することにより、バイオリアクター間の通気を均一にしたり、ノズルの抵抗に比例した通気を行うことができる。
・  上述のノズルの仕様は、圧力に対する空気の流量を決定付ける。
・  バイオリアクター内の膜の管腔側は液体供給容器に接続された液体供給管を備えることが望ましい。この液体供給管を通じて管腔に液体が注入され、それにより媒体を変更することが可能になる。
・  液体供給容器は２つの接続部を有するキャップを備え、１つは媒体を容器内に取り込むものであり、もう１つは媒体を容器外に排出するためのものであることが望ましい。
・  送気管と液体供給管はそれぞれ直列に配置された無菌圧力計を備えることが望ましい。
【００１４】
本発明は、適切な改良を加えた上でパーベーパレーション(pervaporation)技術の応用に用いられる可能性があるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明について、以下の図面を参照しつつ説明する。
【００１６】
図１において、コンプレッサーによる空気供給１は、二股の送気管A、Bへ空気を送り出す。送気管A、B各々は、0.22μmフィルター３に接続された制御弁２によって送気を制御されている。送気管Bは加湿容器４に接続され、加湿空気は加湿容器４を出て圧力計５を通過する。送気管Aにも圧力計５が取り付けられている。
【００１７】
本システムは6機の単繊維型バイオリアクターから構成される。各バイオリアクターは、例えばAl2O3（酸化アルミニウム）など、毛細管物質からなる単一膜中空糸（不図示）を有する。送気管Aは６つのT型部材で繋げられ、各バイオリアクター６の媒体供給容器８に接続されている。媒体供給容器８各々は、1つのキャップを備え、該キャップは、送気管Aの入口と、媒体の出口と、成長媒体の栄養分を変更したり新たに加えたりする場合の入口とを有する。なお、栄養分の変更・追加に用いられる入口は、利用時以外はクランプ１３で締められている。流入空気により媒体供給容器８内で作り出され、媒体の表面上にかけられる圧力は、中空繊維膜、締め付け解除したクランプ１３を通って、液体供給容器７へと媒体を送り出す。液体供給容器７は１つのキャップを備え、該キャップは媒体を受け入れる入口と、クランプ１３で締められていて該液体供給容器内が満杯の場合にはクランプ１３の締め付けを解除して容器内を空にするための出口と、換気フィルター１０に接続されている空気の出口とを有する。
【００１８】
T型部材で直列に繋げられた送気管Bは、各バイオリアクター６の管腔、すなわち各中空繊維の外側に、空気を供給する。空気は、使用時以外はクランプ１３で締められている穴を通るか、もしくは生成物回収容器９に排出されるべく接続された第2出口を通って、バイオリアクターのシェルを出る。中空繊維を通って流れた（透過した）各中空繊維の外側の表面で成長しているバイオフィルム上の生成物を含む媒体と空気は、生成物回収容器９内に入る。生成物回収容器９は１つのキャップを備え、該キャップは、生成物を受け入れる入口と、使用時以外はクランプ１３で締められており生成物を生成物回収瓶へ送り出す出口と、換気フィルター１０と流量制御ノズルに接続された穴とを有する。
【００１９】
使用時、各バイオリアクターへの空気および媒体の供給は、ほぼ均一である。というのは、背圧発生手段が、2機のバイオリアクター間の圧力よりも大きい圧力を各バイオリアクターから作り出すからである。このような仕組みで、平行に設置された複数のバイオリアクターを作動させる際には、2機のバイオリアクター間ごとで変化する流量の度合いが制限される。これにより、ほぼ同質な条件（生成物の生成に有益な）下での高い処理能力および・あるいはプロセスの最適化（研究・開発活動に有効）が実現される。
【００２０】
上述した単繊維型リアクターは、多繊維型リアクターあるいは、実際に利用されている流体の供給を必要とする他のタイプのバイオリアクターに置き換えることが可能である。圧力は手動、自動のいずれの形態で制御されるものであってもよい。
【００２１】
また、各リアクターへの圧力および・あるいは流体の供給は、手動、自動いずれかの形態で制御されるものであってもよい。
【００２２】
本発明について以下に述べる例を挙げて説明する。ただし本発明は以下の例のみに限定されるものではない。
【００２３】
＜例１  （有酸素状態）＞
＜ストレプトミセス・セリカラーA３（２）によるアクチノロージンの産生のための最適化＞
例１においては、背圧発生手段は、各単繊維型リアクターの空気の出口に配置された複数のノズルがこれに相当する。
本実験は、栄養の供給量、栄養濃度、およびストレプトミセス・セリカラー(streptomyces coelicolor)によるアクチノロージン(Actinorhodin)産生における酸素化に関する効果を評価するためのものである。加えて、バイオフィルム形成における移植片のサイズと生産力への影響を評価するものでもある。処理パラメータの変更は、連続的あるいは同時進行的に、ストレプトミセス・セリカラーが移植された12機の単繊維型リアクター各々について実施される。
【００２４】
アクチノロージンのレベルは、完全な青色色素と記録され、「Ates（他）、1997年（E1%、１ｃｍ＝３５５）」に記載された方法に基づく標準操作手順に従って分光光度法で数値化される。
【００２５】
＜滅菌処理＞
単繊維型リアクターは、標準操作手順に基づく有酸素状態での操作を実施するために、加圧滅菌処理され、セットされる。実験を開始する前に、加圧滅菌処理された成長培地は、各媒体供給容器の中に移植される。
【００２６】
＜移植片の植え付け＞
単繊維型リアクター１〜５各々には、１０ｍｌの滅菌蒸留水に浸された寒天プレートを用いて作られた１mlの胞子懸濁液が注入される。単繊維型リアクター６〜１０各々には、２８℃で4日間フラスコ培養されたものが１ｍｌずつ注入される。移植片は、各単繊維型リアクターの毛細管の外側空間に、標準的な滅菌技術を用いて、直接注入される。毛細管膜の外表面への移植片の固定化は標準操作手順に基づき行われる。  
【００２７】
＜操作＞
単繊維型リアクターは、標準操作手順に基づき、有酸素状態で操作される。実験開始時の気圧は、およそ３０kＰaに設定されている。送気管Aと管腔側の膜導管を通って供給された媒体は、手動でセットされる。手動でセットされるのは、管腔からシェルにかけての膜表面の圧力の差を利用して、バイオフィルムに対する栄養素供給率（供給量）の調節を行うためである。透過物は毎日、透過物回収容器から回収されサンプルに供される。
【００２８】
栄養のタイプとその濃縮について最適化を行う間、古い成長培地をプライム・ボトルに排出し媒体供給容器に適切な新しいタイプの媒体を充填することにより、現状の成長培地は、新鮮な栄養源と交換される。さらに、単純に残留成長培地を加えて所望の栄養物の周知の終末濃度を作り出す方法で、単純に栄養物や添加物を実験開始時の成長培地に加えることも行われる。
【００２９】
酸素化の増加に関する効果を評価する際、圧縮空気は、市販の酸素ボンベを用いて酸素に置き換えられる。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
＜バイオフィルムの成長＞
菌糸あるいは胞子タイプの移植片を用いると、移植後２４〜２８時間以内に、移植片が膜の長手方向に沿って小さな黄色のコロニー状に成長したストレプトミセス・セリカラーとなり、バイオフィルムの成長が確認できる。コロニーは増殖し、色は黄色からオレンジ色に近い赤色に変化し、コロニー同士が繋がり（７２〜１２０時間）、わずかに先細り形状のバイオフィルムに成長するインターナル・ストレプトミセス・プロジェクト（Internal  Streptomyces  Project、以下ISPと略す）２と称する媒体を摂取することにより成長が急速に進む。バイオフィルムにおいて成長の度合いに差異が生じ始めるにつれ、光沢を帯びたオレンジ色に近い赤色は、不透明な状態に、さらに白色から灰色へと変化し、胞子が形成される（２４０〜３００時間）。全ての事例において、垂直単繊維型リアクターの上部付近の膜の数箇所の部位おいて差異が生じ始める。このような差異は媒体流量により発生するものと考えられる。媒体中のアクチノロージンを示す赤い色素の出現と胞子形成は一致する。差異が生じたバイオフィルムは濃い藍色に変化し、消費された培養液のpＨは増加し、胞子形成の増加とともに、さらに色素が放出される。消費された培養液のpＨの増加と同様に、アクチノロージンの有する指標機能により、媒体の色素は赤から青紫へと変わる。
【００３２】
菌糸が移植された単繊維型リアクター（１−５）では、胞子が移植された単繊維型リアクター（６−１０）ほどの、急速あるいはフィルムの厚みが増すバイオフィルムの成長は見られない。胞子が移植された同じDPリアクターによる操作では、より高密度のバイオフィルムの成長が進むために流速が低下する。このため、容易に膜・バイオフィルムを通って単繊維バイオリアクターに向かおうとする栄養液の流れに対するより大きな抵抗を、容易に作り出すことができる。1個のバイオフィルム中における成長の差異と色素の発現の度合いの差は、バイオフィルム（束）成長のために供給する栄養を色々変えることができる結果、生じるものであり、供給する栄養を変更できるのは、膜・バイオフィルムの抵抗力、及び・あるいは、リアクターの実験履歴に差異があるからである。同じ移植及び・あるいは培養条件下で、膜ごとの固有の抵抗力が、生成プロセスのロバスト性を決定するのに利用されることがある。
【００３３】
しかしながら、同様のΔPが2機の単繊維型リアクターのバイオフィルム上に生成物を生成する際に用いられることがあったとしても、より遅い流速の影響を受けることがある。差異や色素の発現を再現しても、流速やリアクターの実験履歴によって差異が生じるものと考えられる。
【００３４】
＜生産性＞
360時間（移植片の移植から14日）以上に及ぶ、アクチノロージン濃縮物と単繊維型リアクターの容積生産性の記録は下の表2の通りである。平均すると、菌糸を移植した単繊維型リアクターでは、比較的急速にバイオフィルム形成が進み、比較的容易にアクチノロージン産生が発現するのが観察された一方で、胞子を移植し、空気圧６０kＰａの条件下で操作が行われた単繊維型リアクターにおいては、全体に及ぶ、より広範囲なアクチノロージン産生が観察された。バイオフィルムを純酸素にさらすことにより、アクチノロージン産生が誘発される。しかしながら、増殖したアクチノロージンのレベルは維持されない。選択した３つの成長培地のうち、４g/lグルコースを含有するISP2成長培地を用いたものの生産性が最も高かった。
【００３５】
【表２】
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【００３６】
単繊維型リアクターの動態解析は、増殖したアクチノロージン産生ではpＨレベルがより高く、かつ、グルコースあるいはリン酸のレベルがより低くなる傾向が見られることを示している（例：図２を参照）。この傾向は、統計分析によって確認できる。しかしながら、このような相関関係は重要でない（表3）。
【００３７】
【表３】
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【００３８】
＜例２  （有酸素状態）＞
＜乳酸連鎖球菌におけるベータ・ラクタマーゼ産生のための最適化＞
例１においては、背圧発生手段は、複数の膜そのものに相当する。
【００３９】
本実験は、単繊維型リアクターにおけるｐHおよび組み換えタンパク質産生の安定化確立手段として、成長培地において増強されたバッファ濃度の効果を評価するためのものである。加えて、バイオフィルム形成における移植片のサイズが及ぼす効果と、栄養をリアクターに供給する際に、リアクターの上部もしくは下部から媒体を供給する構成とする場合の構成上の影響と、利便性とについて、評価するものでもある。
【００４０】
ベータ・ラクタマーゼの活性は「ニトロセフィン法（Oxoid社）」に記載された方法に基づく標準操作手順に従って分光光度法で数値化されている。
【００４１】
＜滅菌処理＞
単繊維型リアクターは、標準操作手順に基づく有酸素状態での操作を実施するために、加圧滅菌処理されセットされる。実験を開始する前に、フィルター滅菌媒体は、各媒体供給容器の中に移植される。
【００４２】
＜移植片の植え付け＞
単繊維型リアクター各々には、３０℃で16時間、M17−G１５成長培地内で培養された１mlの１Xあるいは50分の１の乳酸連鎖球菌（L.  lactis）  PRA２９０（ベータ・ラクタマーゼ）であって、移植片として未完成のものが注入される。移植片は、各単繊維型リアクターの毛細管の外側空間に、標準的な滅菌技術を用いて、直接注入される。追加の移植媒体は、一晩、気圧８kＰa環境で各単繊維型リアクターに供給される。
【００４３】
＜操作＞
6機の単繊維型リアクターは、それぞれのバンクがマニホールドで接続された状態で接続されている。各単繊維型リアクターには各々の供給容器から媒体が供給される。各バンク内では、２００mＭもしくは４００mＭのK−PO４バッファ（ｐH7.2）を含有するLM5-V100-G75が、ガラス製のマニホールド上部もしくは下部に備えられた媒体入り口から、単繊維型リアクターに供給される。流量、pＨ、およびベータ・ラクタマーゼの活性度は、新鮮なサンプルを用いて評価される。グルコースとタンパク質のレベルは、サンプルを抽出するのではなく、全体的なものとして観察される。
【００４４】
各バンクへの媒体供給は、圧力制御弁を用いて制御される。単繊維型リアクターは、移植片の移植後、2時間ごとに観察される。透過物質のpＨ変化の数値は移植片の成長を観察するのに用いられると同時に、流量の調整の基礎的判断材料としても用いられる。気圧は、以下の表の通りに調節される。
【００４５】
【表４】
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【００４６】
＜バイオフィルムの成長＞
移植片の移植から50時間経過すると、均一な厚みのヨーグルトからなる高濃度のバイオフィルムが、全ての単繊維型リアクターで観察される。指数関数的に成長する乳酸連鎖球菌細胞が保持されることにより、このようなバイオフィルムが形成されると考えられる。バイオフィルムが成長するにつれ、流れに対する抵抗が高くなる。実験の終盤においては、気圧は１００kＰａ近くに設定され、流量は流体を移動できなくする臨界点よりも低い流量に減らされ、その結果、プランクトン様の成長が観察されるようになる。
【００４７】
＜生産性＞
より小さなサイズの移植片を用いて単繊維型リアクターで培養された培養物は、単繊維型リアクターでの移植の制御をする場合（図３参照）と比較すると、４〜６時間後（図２参照）までに、pＨの下降速度とベータ・ラクタマーゼ産生の速度が鈍化する。酵素の最大活性、産生の安定性のいずれについても、際立った差異は、異なる移植片を用いて培養した単繊維型リアクターの間で観察できない。
【００４８】
初期の成長は、４００mＭのK-PO4で調製された媒体によって抑制されているものと考えられる。これらの単繊維型リアクターにおける酵素の産生は、移植片の移植後１２〜２２時間から変化し、複製が始まる。複製の開始は媒体が底部から供給される単繊維型リアクターにおいて観察できるということが、ほぼ断定されている（図３および図４を参照）。しかしながら、高バッファ濃縮の条件では、最大レベルのベータ・ラクタマーゼが記録されている（２００００−２４０００U.L-1）。
【００４９】
以下に示す文献は、本出願の内容を含むものとして考慮されるべきものである。
１．プロセス・バイオケミ３２の273-278頁に掲載「バッチおよびフェッド・バッチ培養によるストレプトミセス・セリカラーの産生」（1997年）S.エーテス、M.エリボル、F.マビトゥーナ共著。
２．J.バクテリオル178の2238-2248頁に掲載「アクチノロージンに関連する“青色色素”の産生」（1996年）L.V.ビストリク、M.A.フェルナンデス・モレノ、J.K.エッレーナ、F.マルパリダ、D.A.ホップウッド、L.ディジュイゼン共著。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明に係る複数のバイオリアクターからなるシステムの概略図である。
【図２】pＨ、グルコースと、アクチノロージンの産生量に対する透過物質のリン酸レベルとの関係を示すグラフである。
【図３】２００mM のKPO4バッファ、pH 7.2、50分の１の濃度の条件で、LM5-V100-G75を用いて培養された場合の単繊維型リアクター（Single Fibre Reactors、ＳＦＲsと略す）内における経時変化を表すグラフである。
【図４】媒体をマニフォールドの上部あるいは下部の入り口から供給し、２００mMのKPO4バッファ、pH 7.2の条件で、LM5-V100-G75を用いた上で、１Xの移植片が培養された場合の単繊維型リアクター内における経時変化を表すグラフである。
【図５】媒体をマニフォールドの上部あるいは下部の入り口から供給し、４００mMのKPO4バッファ、pH 7.2の条件で、LM5-V100-G75を用いた上で、１Xの移植片が培養された場合の単繊維型リアクター内における経時変化を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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