(57)【要約】  本発明は、アレルギー疾患を治療することを目的とする化合物、方法および組成物を提供する。特に、遺伝子、ｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシンに対する短鎖干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）であって、発現した標的ＲＮＡをＲＮＡ干渉機構により切断するものを提供する。かかるｓｉＲＮＡは、対象の気道炎症を軽減または予防することにより、アレルギーを治療するための薬物として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ干渉により、ｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシン遺伝子のＲＮＡを切断する単離された二本鎖短鎖干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）分子であって、（ａ）前記ｓｉＲＮＡ分子のそれぞれの鎖は約１９〜２１リボヌクレオチドの長さであり、（ｂ）前記ｓｉＲＮＡ分子の一本の鎖は、ＲＮＡ干渉により、ｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシンのＲＮＡを切断するための、前記ｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシンのＲＮＡまたはその部分に相補的なリボヌクレオチド配列を含む、前記単離された二本鎖短鎖干渉リボ核酸分子。
【請求項２】
ｓｉＲＮＡ分子が、配列番号１〜１５から選ばれる核酸配列のいずれかでコードされるＲＮＡ配列に相補的なリボヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項３】
ｓｉＲＮＡ分子がマウス由来である、請求項２に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項４】
ｓｉＲＮＡ分子が、配列番号１〜１５から選ばれる核酸配列のいずれかでコードされるＲＮＡ配列に相補的なｓｉＲＮＡ１〜１５のいずれかと少なくとも８０％同一である、請求項２に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項５】
ｓｉＲＮＡ分子が、配列番号１６〜３０のいずれかから選ばれるリボ核酸配列を含む、請求項４に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項６】
ｓｉＲＮＡ分子が、配列番号３１〜４５から選ばれる核酸配列のいずれかでコードされるＲＮＡ配列に相補的なリボヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項７】
ｓｉＲＮＡ分子がヒト由来である、請求項６に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項８】
ｓｉＲＮＡ分子が、配列番号３１〜４５から選ばれる核酸配列のいずれかでコードされるＲＮＡ配列に相補的なｓｉＲＮＡ１６〜３０のいずれかと少なくとも８０％同一である、請求項６に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項９】
ｓｉＲＮＡ分子が、配列番号４６〜６０のいずれかから選ばれるリボ核酸配列を含む、請求項８に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項１０】
薬学的に受容可能な担体において請求項２または６に記載のｓｉＲＮＡ分子を含む、アレルギー疾患を治療するための組成物。
【請求項１１】
アレルギー疾患が、花粉症、気管支喘息、副鼻腔炎、呼吸窮迫症候群またはアレルギー性鼻炎である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシンの遺伝子の発現を抑制することにより、気道炎症を緩和するため、請求項１０に記載の組成物の有効量を対象に投与することを含む、アレルギー疾患を治療する方法。
【請求項１３】
アレルギー疾患が、花粉症、気管支喘息、副鼻腔炎、呼吸窮迫症候群またはアレルギー性鼻炎である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー疾患の治療に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、ＲＮＡ干渉（RNA mediated interference、RNAi）により、気道炎症関連遺伝子の発現を抑制することでアレルギー疾患を治療することを目的とする化合物、方法および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
殆どの先進国および発展途上国において、アレルギー疾患の蔓延が益々顕著になっている。アレルギー疾患は、Ｉ型過敏症、即ちＩｇＥに媒介されるＩ型免疫反応により引き起こされる機能障害と定義される。その症状は、花粉症、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、呼吸窮迫症候群、アトピー性皮膚炎およびアナフィラキシーショックを包含する。現在、アレルギー疾患は、文明社会において、より深刻になる傾向があり、多大な費用がかかる。人々が患っているアレルギーの様々な症状のうち、アレルギー性鼻炎は最も一般的なアレルギーの形態である。更に、アレルゲンの攻撃は、致命的になる可能性もある。国立台湾大学附属病院小児科による１９９４年の統計データによると、台北市(台湾)の学生のうち、アレルギー性鼻炎の有病率は３３％を超え、喘息の有病率（１０〜１１％）の３倍に近いものである。患者数も毎年増加している。特に、幼児の患者が急速に増加している。よって、多くの研究者が、アレルギー患者の経済的・身体的負担をより一層軽減し、改良された解決策を開発しようと専念している。
【０００３】
近年、転写後遺伝子サイレンシングという新興技術、特に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を、様々な有機体における特定の遺伝子をノックアウトする道具として利用することにより（例えば、非特許文献１および非特許文献２を参照）、今では、機能遺伝子を系統的にサイレンシングすることで、細胞内シグナル伝達経路におけるタンパク質間相互作用をマッピングすることが可能になり、それによって、無数の疾患に対して治療法を開発する新しい方法を提供している。本発明者らは、長期間にわたる臨床研究および実験を行った結果、生体外または生体内において、ＲＮＡ干渉により気道炎症関連遺伝子の発現を抑制できる短い非コードＲＮＡを同定した。これらの同定された短いＲＮＡ分子は、対象の気道炎症を軽減または最小限にするアレルギーを治療するための薬物として有用である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Mello and Conte, “Revealing the world of RNA interference”, (2004) Nature 431, 338-342
【非特許文献２】Scherer and Rossi, “Approaches for the sequence-specific knockdown of mRNA”, (2003) Nature Biotechnology, 21, 1457-1465
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を用いることで、気道炎症関連遺伝子の発現を抑制する化合物、組成物および方法を提供することを目的とする。特に、本発明は、小分子ＲＮＡ、例えば、短鎖干渉二本鎖または一本鎖ＲＮＡ分子など、および、これらのｓｉＲＮＡを用いた気道炎症関連遺伝子の発現を抑制する方法を特徴とする。
【０００６】
従って、一態様において、本発明は一つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子およびその利用方法を特徴とし、前記ｓｉＲＮＡ分子は、単独または組み合わせて、気道炎症に関連するタンパク質をコードする遺伝子の発現、例えばｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシン遺伝子などの気道炎症に関連するタンパク質をコードする遺伝子の発現などを、ＲＮＡ干渉により抑制する。
【０００７】
本発明は、一実施形態において、ｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシン遺伝子などの気道炎症関連遺伝子の発現を下方制御する単離された二本鎖ｓｉＲＮＡ分子であって、前記ｓｉＲＮＡ分子が、約１９〜２１個の塩基対を含むものを特徴とする。
【０００８】
本発明は、一実施形態において、ＲＮＡ干渉により、ｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシンのＲＮＡの切断を導く単離された二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を提供し、ここで、（ａ）前記ｓｉＲＮＡ分子のそれぞれの鎖は約１９〜２１ヌクレオチド長であり、かつ（ｂ）前記ｓｉＲＮＡ分子の一本の鎖は、ＲＮＡ干渉により、ｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシンのＲＮＡを切断するために、ｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシンのＲＮＡに相補的なリボヌクレオチド配列を含む。本発明の一実施形態では、単離されたｓｉＲＮＡ分子はマウス由来であって、配列番号１〜１５のいずれかから選ばれる核酸配列でコードされるＲＮＡ配列に相補的なリボヌクレオチド配列を含むものであり、ここで、配列番号１〜３は、それぞれ位置３１６〜３３６、位置１７３３〜１７５３および位置１３０６〜１３２４におけるｇａｔａ−３遺伝子のヌクレオチド配列を表し、配列番号４〜６は、それぞれ位置２６３〜２８３、位置６３６〜６５６および位置１１６６〜１１８６におけるＩＬ−５遺伝子のヌクレオチド配列を表し、配列番号７〜９は、それぞれ位置１３４〜１５２、位置２８２〜２９４および位置５８３〜５９４におけるエオタキシン遺伝子のヌクレオチド配列を表し、配列番号１０〜１２は、それぞれ位置４７〜６７、位置１８１〜２０１および位置３３６〜３５６におけるＩＬ−４遺伝子のヌクレオチド配列を表し、配列番号１３〜１５は、それぞれ位置１００〜１２０、位置１５４〜１７４および位置２３８〜２５８におけるＩＬ−１３遺伝子のヌクレオチド配列を表す。本発明の別の実施形態では、本発明の単離されたｓｉＲＮＡ分子はヒト由来であって、配列番号３１〜４５のいずれかから選ばれる核酸配列でコードされるＲＮＡ配列に相補的なリボヌクレオチド配列を含むものであり、ここで、配列番号３１〜３３は、それぞれ位置５３７〜５５７、位置１０８０〜１１００および位置１８５〜２０５におけるｇａｔａ−３遺伝子のヌクレオチド配列を表し、配列番号３４〜３６は、それぞれ位置１９６〜２１６、位置３２８〜３４８および位置４５７〜４７７におけるＩＬ−５遺伝子のヌクレオチド配列を表し、配列番号３７〜３９は、それぞれ位置７４９〜７６９、位置２６９〜２８９および位置３３５〜３５５におけるエオタキシン遺伝子のヌクレオチド配列を表し、配列番号４０〜４２は、それぞれ位置１３３〜１５３、位置３５５〜３７５および位置８７〜１０７におけるＩＬ−４遺伝子のヌクレオチド配列を表し、配列番号４３〜４５は、それぞれ位置３８９〜４０９、位置１３７〜１５７および位置４３１〜４５１におけるＩＬ−１３遺伝子のヌクレオチド配列を表す。
【０００９】
本発明は、一実施形態において、ｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシンのＲＮＡに対するＲＮＡｉ活性を有する単離されたｓｉＲＮＡ分子を特徴とする。前記ｓｉＲＮＡ分子は、生体外または生体内において、ｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシンのＲＮＡの切断をもたらすＲＮＡ干渉を媒介することができる。本発明の一実施形態では、本発明の単離されたｓｉＲＮＡ分子はマウス由来であり、標的遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み、前記標的遺伝子の核酸配列は、配列番号１〜１５のいずれかである。本発明の別の実施形態では、本発明の単離されたｓｉＲＮＡ分子はヒト由来であり、標的遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み、前記標的遺伝子の核酸配列は配列番号３１〜４５のいずれかである。配列番号１〜１５または３１〜４５で示された配列は限定的ではない。本発明の単離されたｓｉＲＮＡ分子は、連続するｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシンの遺伝子配列に相補的な任意の配列、例えば、約１９〜２１個または２２個以上の連続するｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシンのヌクレオチドに相補的な配列などを含んでもよい。本発明の好ましいマウスｓｉＲＮＡ分子は、実施例１〜６に記載の方法により調製されたｓｉＲＮＡ１〜１５のいずれかと少なくとも８０％同一である配列を含み、ここで、前記ｓｉＲＮＡ１〜１５は、それぞれ配列番号１〜１５から選ばれる標的核酸配列によりコードされるものである。本発明の好ましいヒトｓｉＲＮＡ分子は、実施例７に記載の方法により調製されたｓｉＲＮＡ１６〜３０のいずれかと少なくとも８０％同一である配列を含み、ここで、前記ｓｉＲＮＡ１６〜３０は、それぞれ配列番号３１〜４５から選ばれる標的核酸配列によりコードされるものである。
【００１０】
一実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、生体外または生体内においてＲＮＡｉ活性を媒介する一本鎖ｓｉＲＮＡであってもよく、これは、標的遺伝子のＲＮＡ配列に相補的な一本鎖ポリリボヌクレオチドを含む。前記標的遺伝子は、気道炎症関連遺伝子、例えば、ｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシン遺伝子などであってもよい。
【００１１】
別の態様では、本発明は、短鎖干渉核酸分子を使用することで、気道炎症関連遺伝子の発現、例えば、ｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシン遺伝子の発現などを抑制することにより、アレルギー、例えば、花粉症、気管支喘息、副鼻腔炎、呼吸窮迫症候群またはアレルギー性鼻炎などを治療する医薬組成物を提供する。
【００１２】
本発明の一実施形態では、薬学的に受容可能な担体において本発明のｓｉＲＮＡ分子を含む医薬組成物を特徴とする。
【００１３】
一実施形態において、本発明は、少なくとも一つの本発明のｓｉＲＮＡ分子の発現ベクターであって、対象となる標的遺伝子の一部を、前記ｓｉＲＮＡ分子を発現させ、生体外または生体内において、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、前記標的遺伝子の発現を抑制または妨害し得る形で含むものを提供する。前記標的遺伝子は、気道炎症関連遺伝子、例えば、ｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシン遺伝子などであってもよい。
【００１４】
本発明の一実施形態では、少なくとも一つのｓｉＲＮＡ分子の発現ベクターを対象に導入することにより、花粉症、気管支喘息、副鼻腔炎、呼吸窮迫症候群またはアレルギー性鼻炎などのアレルギーを患っている対象を治療する方法を特徴とし、ここで、前記ｓｉＲＮＡ分子は、気道炎症関連遺伝子ＲＮＡの一部に相補的なポリリボヌクレオチド配列を、前記ｓｉＲＮＡ分子を発現させ、生体外または生体内において、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、前記気道炎症関連遺伝子の発現を抑制し、それによって、対象のアレルギー症状を軽減および／または最小化する目的を達成し得る形で含む。
【００１５】
これらおよび他の態様および利点は、本説明が実施例と共に読まれたとき、更に明らかとなるであろう。上記の概略的な説明および以下の詳細な説明はいずれも本発明の例であり、特許請求の範囲に記載された本発明の更なる説明の提供を意図していることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
添付の図面は、本発明について更に一層の理解を提供するために含まれ、本明細書に組み入れられ、その一部を構成するものである。これらの図面は、本発明の実施形態を例証するものであり、本説明と共に、本発明の原理を説明する役目を果たす。
【図１】ｐＳＥＣ  ｈｙｇｒｏ  プラスミドおよびレンチウイルスベースのベクターにおけるマウスｇａｔａ−３  ｓｉＲＮＡの模式図であり、そのうち（Ａ）は、ｓｉＲＮＡ発現カセットの概略図、（Ｂ）は、ｓｉＲＮＡを発現する安定クローンを選択するためのハイグロマイシン選択部位を含むｐＳＥＣ  ｈｙｇｒｏ  プラスミドの概略図、および（Ｃ）は、ｓｉＲＮＡ発現レンチウイルスベクターの概略図である。
【図２Ａ】ＰＭＡ（５ｎｇ／ｍｌ）およびｃＡＭＰ（５００ｍＭ）を２４時間併用投与したＥＬ−４細胞に、ｇａｔａ−３  ｓｉＲＮＡを形質導入した後のｇａｔａ−３遺伝子発現の減少を示した図であり、ｇａｔａ−３遺伝子の発現は、リアルタイムＰＣＲにより確認した。図中、“Mock”は、Ambion社からのｓｉＲＮＡ陰性対照を含む偽形質導入対照群であり、“ｐＴＹリンカー”は、空のベクターである。ａ＊＊は、前処理無しの対照群と比べてｐ＜０．０１であり、ｂ＊＊は、ＰＭＡ  ５ｎｇ／ｍｌ＋ｃＡＭＰ  ５００ｍＭ  対照群と比べてｐ＜０．０１であり、ｃ＊＊は、ＰＭＡ  ５ｎｇ／ｍｌ＋ｃＡＭＰ  ５００ｍＭ  Mock群と比べてｐ＜０．０１であり、ｄ＊＊は、ＰＭＡ  ５ｎｇ／ｍｌ＋ｃＡＭＰ  ５００ｍＭ  ｐＴＹリンカー群と比べてｐ＜０．０１である。
【図２Ｂ】ＰＭＡ（５ｎｇ／ｍｌ）およびｃＡＭＰ（５００ｍＭ）を２４時間併用投与したＥＬ−４細胞に、ｇａｔａ−３  ｓｉＲＮＡを形質導入した後のｇａｔａ−３遺伝子発現の減少を示した図であり、ｇａｔａ−３タンパク質の発現は、ウエスタンブロットにより確認した。図中、“Mock”は、Ambion社からのｓｉＲＮＡ陰性対照を含む偽形質導入対照群であり、“ｐＴＹリンカー”は、空のベクターである。
【図２Ｃ】ＰＭＡ（５ｎｇ／ｍｌ）およびｃＡＭＰ（５００ｍＭ）を２４時間併用投与したＥＬ−４細胞に、ｇａｔａ−３  ｓｉＲＮＡを形質導入した後のＴｈ２サイトカイン放出の減少を示した図であり、Ｔｈ２サイトカイン放出は（Ｃ）サンドイッチＥＬＩＳＡ法により検出した。図中、“Mock”は、Ambion社からのｓｉＲＮＡ陰性対照を含む偽形質導入対照群であり、“ｐＴＹリンカー”は、空のベクターである。ａ＊＊は、前処理無しの対照群と比べてｐ＜０．０１であり、ｂ＊＊は、ＰＭＡ  ５ｎｇ／ｍｌ＋ｃＡＭＰ  ５００ｍＭ  対照群と比べてｐ＜０．０１であり、ｃ＊＊は、ＰＭＡ  ５ｎｇ／ｍｌ＋ｃＡＭＰ  ５００ｍＭ  Mock群と比べてｐ＜０．０１であり、ｄ＊＊は、ＰＭＡ  ５ｎｇ／ｍｌ＋ｃＡＭＰ  ５００ｍＭ  ｐＴＹリンカー群と比べてｐ＜０．０１である。
【図３】マウス喘息モデルを作製するための本発明の一つの好適な実施形態によって使用される、ＯＶＡプロトコルのスケジュールを示した図である。
【図４】本発明の一実施形態による、ｇａｔａ−３  ｓｉＲＮＡで処置したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける（Ａ）ＩｇＥ、（Ｂ）ＩｇＧ１および（Ｃ）ＩｇＧ２ａを含むＯＶＡ特異的抗体の血清レベルを示した棒グラフである。
【図５】ＥＬＩＳＡにより測定された、実施例３．２のマウスのＢＡＬ液におけるエオタキシンのレベルを示した図である。
【図６】本発明の一実施形態による、マウスから収集されたＢＡＬＦにおける細胞プロフィルを示した図である。総細胞数は、ＨＢＳＳ  １ｍｌで測定し、そのデータは平均値±ＳＥＭとして表し、生理食塩水の対照群と比べて、ａ＊＊はｐ＜０．０１、ａ＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図７】本発明の一つの好適な実施形態による、ＯＶＡ感作したマウスにおけるＭＣｈ誘導気道反応性のｇａｔａ−３  ｓｉＲＮＡによる抑制を示した図である。ＡＨＲは、全身プレチスモグラフィにより測定し、そのデータは、３回の独立試験から得られた、ＰＢＳ噴霧後のＰｅｎｈ値に対する比率としてのＰｅｎｈ値の平均値±ＳＥＭとして表した。＊および＊＊＊は、それぞれ陰性対照群と比べてｐ＜０．０５およびｐ＜０．００１であり、ａ＊＊＊は、各々の陽性対照群と比べてｐ＜０．００１であり、ｂ＊＊＊は、各々のMock群と比べてｐ＜０．００１である。
【図８】ＰＭＡ（５ｎｇ／ｍｌ）およびｃＡＭＰ（５００ｍＭ）を２４時間併用投与したＥＬ−４細胞に、ＩＬ−５  ｓｉＲＮＡを形質導入した後のＩＬ−５遺伝子発現の減少を示した図であり、ＩＬ−５遺伝子の発現の検出は、ＥＬＩＳＡ法により確認した。図中、“ＥＬ４”は、ＰＭＡおよびｃＡＭＰで処理したＥＬ−４細胞であり、“ＳＮｅｇ”は、マウスのいずれの遺伝子にも関連がないｓｉＲＮＡ断片を含むｐＳＥＣＮｅｇをトランスフェクトしたＥＬ−４細胞であり、“Ｓ１、Ｓ４およびＳ７”は、それぞれｓｉＲＮＡ４、ｓｉＲＮＡ５およびｓｉＲＮＡ６を含むベクターをトランスフェクトしたＥＬ−４細胞である。
【図９】本発明の一つの好適な実施形態による、（Ａ）培地、または（Ｂ）ｓｉＲＮＡ７、ｓｉＲＮＡ８およびｓｉＲＮＡ９を含む合成エオタキシンｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞のいずれかにおいて発現したエオタキシンのレベルを示した図である。
【図１０】本発明の一つの好適な実施形態による、ＩＬ−５  ｓｉＲＮＡおよび／またはエオタキシンｓｉＲＮＡによる、ＯＶＡ感作したマウスにおけるＭＣｈ誘導気道反応性の抑制を示した図である。ＡＨＲは、全身プレチスモグラフィにより測定した。
【００１７】
【図１１Ａ】本発明の一実施形態による、マウスから収集したＢＡＬＦにおける、単球の細胞比を示した図である。総細胞数は、ＨＢＳＳ  １ｍｌで測定し、そのデータは、平均値±ＳＥＭとして表し、＊は、生理食塩水の対照群と比べてｐ＜０．０１である。
【図１１Ｂ】本発明の一実施形態による、マウスから収集したＢＡＬＦにおける、好中球の細胞比を示した図である。総細胞数は、ＨＢＳＳ  １ｍｌで測定し、そのデータは、平均値±ＳＥＭとして表し、＊は、生理食塩水の対照群と比べてｐ＜０．０１である。
【図１１Ｃ】本発明の一実施形態による、マウスから収集したＢＡＬＦにおける、リンパ球の細胞比を示した図である。総細胞数は、ＨＢＳＳ  １ｍｌで測定し、そのデータは、平均値±ＳＥＭとして表し、＊は、生理食塩水の対照群と比べてｐ＜０．０１である。
【図１１Ｄ】本発明の一実施形態による、マウスから収集したＢＡＬＦにおける、好酸球の細胞比を示した図である。総細胞数は、ＨＢＳＳ  １ｍｌで測定し、そのデータは、平均値±ＳＥＭとして表し、＊は、生理食塩水の対照群と比べてｐ＜０．０１である。
【図１２】ＥＬＩＳＡにより測定された、実施例４のマウスのＢＡＬ液における（Ａ）ＩＬ−５および（Ｂ）エオタキシンのレベルを示した図である。
【図１３Ａ】本発明の一実施形態による、ＩＬ−５および／またはエオタキシン  ｓｉＲＮＡで処置したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＯＶＡ特異的ＩｇＥの血清中のレベルを示した棒グラフである。
【図１３Ｂ】本発明の一実施形態による、ＩＬ−５および／またはエオタキシン  ｓｉＲＮＡで処置したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＯＶＡ特異的ＩｇＧ１の血清中のレベルを示した棒グラフである。
【図１３Ｃ】本発明の一実施形態による、ＩＬ−５および／またはエオタキシン  ｓｉＲＮＡで処置したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａの血清中のレベルを示した棒グラフである。
【図１４】本発明の一つの好適な実施形態による、ＯＶＡ感作したマウスにおける、高用量、中用量、または低用量のｓｉＲＮＡ５によるＭＣｈ誘導気道反応性の抑制を示した図である。ＡＨＲは、全身プレチスモグラフィにより測定した。図中、“Ｓ４低用量”は、低用量のｓｉＲＮＡ５（３×１０５ＩＦＵ／匹）で処置した動物、“Ｓ４中用量”は、中用量のｓｉＲＮＡ５（１．５×１０６ＩＦＵ／匹）で処置した動物、且つ、“Ｓ４高用量”は、高用量のｓｉＲＮＡ５（３×１０６ＩＦＵ／匹）で処置した動物、“ＳＮｅｇ”は、マウスのいずれの遺伝子にも関連がないｓｉＲＮＡ断片を含むｐＳＥＣＮｅｇをトランスフェクトした動物である。
【図１５】それぞれ高用量、中用量、または低用量のｓｉＲＮＡ５で処置した実施例５のマウスから収集したＢＡＬＦにおける、単球、リンパ球、好塩基球および好酸球を含む細胞プロファイルを示した図である。総細胞数は、ＨＢＳＳ  １ｍｌで測定し、そのデータは、平均値±ＳＥＭとして表し、＊および＊＊は、それぞれ対照群と比べてｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１である。
【図１６】それぞれ高用量、中用量、または低用量のｓｉＲＮＡ５で処置した実施例５のマウスから収集したＢＡＬ液におけるエオタキシンの濃度を示した図である。データは、平均値±ＳＥＭとして表し、＊は対照群と比べてｐ＜０．０１である。
【図１７】それぞれ高用量、中用量、または低用量のｓｉＲＮＡ５で処置した、実施例５のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける（Ａ）ＩｇＥ、（Ｂ）ＩｇＧ１および（Ｃ）ＩｇＧ２ａを含むＯＶＡ特異的抗体の血清中のレベルを示した棒グラフである。
【図１８】ヒトｓｉＲＮＡベクターを示す概略図であり、同ベクターにおいては、望ましいヒト遺伝子を標的とする短鎖ヘアピンＲＮＡをコードする小さなＤＮＡインサートを、このベクターのＭｌｕ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉサイトの間にクローニングすることができ、且つｓｉＲＮＡの発現のためにＨ１プロモーターを用いた。このベクターは、レポーター遺伝子としてのサンゴＧＦＰ（coral GFP、ｃＧＦＰ）、および選択のためのネオマイシン耐性遺伝子を含む。
【図１９】リポフェクタミンにより、（Ａ）空の、（Ｂ）ｓｉＲＮＡ  ２２、（Ｃ）ｓｉＲＮＡ  ２３または（Ｄ）ｓｉＲＮＡ  ２４を含むベクターをトランスフェクトし、且つＧ４１８（５００μｇ／ｍｌ）により１４日間選択したＢＥＡＳ−２Ｂ細胞における、ヒトのエオタキシン−１  ｓｉＲＮＡの導入効率を示した図である。トランスフェクトされた細胞（ＧＦＰ＋）の頻度は、ＦＡＣＳにより分析した。
【図２０】空の（Ｖ）、ｓｉＲＮＡ  ２２（ＳＥ−７４９）、ｓｉＲＮＡ  ２３（ＳＥ−２６９）またはｓｉＲＮＡ  ２４（ＳＥ−３３５）を含むベクターをトランスフェクトし、且つヒトＴＮＦ−α（５０ｎｇ／ｍｌ）およびヒトＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ）により、それぞれ２４時間または４８時間刺激したＢＥＡＳ−２Ｂ細胞における、エオタキシンを標的とするヒトｓｉＲＮＡの抑制効果を示した図である。対照群（空のベクターをトランスフェクトしたＢＥＡＳ−２Ｂ細胞）のエオタキシン−１の発現を１００％とした。＊および＊＊は、それぞれ対照群が産生したエオタキシン−１と比べてｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１である。
【図２１】Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるｓｈＲＮＡの形質導入の後の、ｇａｔａ−３、ＩＬ−４およびＩＬ−１３遺伝子発現の抑制を示した図である。５×１０５個の細胞は２４穴プレートにおいて培養し、ｇａｔａ−３、ＩＬ−４またはＩＬ−１３ｓｈＲＮＡを発現するｐＲＮＡｉｎ−Ｈ１．２／Ｒｅｔｒｏプラスミドを４時間トランスフェクトし、且つ、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）により４８時間処理した。細胞を、新たな２４穴プレートに移し、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）により４８時間処理し、その後、細胞を回収して、リアルタイムＰＣＲにより、ＲＮＡ発現を解析した。＊＊は、各々の対照群と比べてｐ＜０．０５である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
記載した実施形態、および本明細書で用いた用語は、例示的実施形態を説明することのみを目的とするものであり、限定的なものではない。本発明の範囲は、本明細書に具体的に述べられていないが、本開示を読んで、本発明を実行する当業者にとって明らかである追加の実施形態を含む。
【００１９】
本発明は、短鎖干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）分子の利用による、アレルギー疾患、例えば、花粉症、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、呼吸窮迫症候群、アトピー性皮膚炎またはアナフィラキシーショックなどを治療する新しい解決策に関する。本発明者らは、ここで、気道炎症関連遺伝子ＲＮＡなどの標的遺伝子ＲＮＡの、少なくとも一部に相補的なリボヌクレオチド配列を有する特定の単離された短鎖干渉リボ核酸が、ＲＮＡ干渉により、発現した標的遺伝子ＲＮＡの切断を導くことができることを証明する。
【００２０】
ＲＮＡ干渉は、動物における、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介された配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す（Fire et al., “Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans” (1998) Nature 391, 806-811）。配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を防ぐために用いられる進化的に保存された細胞の防御機構であると考えられている(Andrew Fire, “RNA-triggered gene silencing” (1999), Trends Genet. 15(9), 358-363)。このような外来遺伝子の発現からの保護は、ウイルス感染に由来する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の産生、または宿主ゲノムへのトランスポゾンのランダムな挿入に応答して、相同的な一本鎖ＲＮＡまたはウイルスのゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答に進化したものと思われる。細胞内のｄｓＲＮＡの存在は、未だに完全に特定できない機構を介して、ＲＮＡｉ応答を誘発する。
【００２１】
細胞におけるｄｓＲＮＡの存在は、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるリボヌクレアーゼ酵素の活性化を導く。ダイサーは、ｄｓＲＮＡの、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られているｄｓＲＮＡの短い断片へのプロセシングに関与する（Berstein et al., “Role for a bidentate ribonuclease in the initation step of RNA interference” (2001) Nature, 409, 363-366）。ダイサーの作用に由来する短鎖干渉ＲＮＡは、一般には長さ約２１〜２３ヌクレオチドであり、約１９塩基対の二本鎖を有する。ＲＮＡｉ応答はまた、一般にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる、ｓｉＲＮＡを含有するエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とし、これがｓｉＲＮＡに配列相同性を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は、前記二本鎖ｓｉＲＮＡのガイド配列に相補的な領域の中央において起こる。このように、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡ転写物との相互作用を介して、または特定の遺伝子配列との相互作用により、遺伝子サイレンシングを媒介するのに用いることができ、そのような相互作用は、転写レベル或いは転写後レベルで、遺伝子サイレンシングを導く。ＲＮＡ干渉技術の概説については、下記を参照のこと：「Mello and Conte, “Revealing the world of RNA interference”, (2004) Nature 431, 338-342; and Scherer and Rossi, “Approaches for the sequence-specific knockdown of mRNA”, (2003) Nature Biotechnology, 21, 1457-1465.」。
【００２２】
従って、一実施形態において、本発明は、一つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子を提供し、前記ｓｉＲＮＡ分子は、単独または組み合わせて、ＲＮＡ干渉により、対象の気道炎症関連遺伝子の発現を抑制し、それによって気道炎症関連遺伝子、例えばｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシン遺伝子などの発現を抑制または遅延し、対象の炎症反応を最小化および／もしくは軽減する。
【００２３】
一実施形態において、本発明は、ＲＮＡ干渉により、ｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシンのＲＮＡを切断する単離された二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を提供し、ここで、（ａ）前記ｓｉＲＮＡ分子のそれぞれの鎖は長さ約１９〜２１ヌクレオチドであり、（ｂ）前記ｓｉＲＮＡ分子の一本の鎖は、ＲＮＡ干渉により、ｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシンのＲＮＡの切断を導くため、前記ｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシンのＲＮＡに相補的なリボヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
本発明の単離されたｓｉＲＮＡ分子は、マウス由来でもヒト由来でもよい。具体的には、本発明の単離されたマウスｓｉＲＮＡ分子は、配列番号１〜１５から選ばれる核酸によってコードされたリボヌクレオチド配列を標的とし、ここで、配列番号１〜３は、それぞれ位置３１６〜３３６、位置１７３３〜１７５３および位置１３０６〜１３２４におけるｇａｔａ−３遺伝子のヌクレオチド配列を表し、配列番号４〜６は、それぞれ位置２６３〜２８３、位置６３６〜６５６および位置１１６６〜１１８６におけるＩＬ−５遺伝子のヌクレオチド配列を表し、配列番号７〜９は、それぞれ位置１３４〜１５２、位置２８２〜２９４および位置５８３〜５９４におけるエオタキシン遺伝子のヌクレオチド配列を表し、配列番号１０〜１２は、それぞれ位置４７〜６７、位置１８１〜２０１および位置３３６〜３５６におけるＩＬ−４遺伝子のヌクレオチド配列を表し、配列番号１３〜１５は、それぞれ位置１００〜１２０、位置１５４〜１７４および位置２３８〜２５８におけるＩＬ−１３遺伝子のヌクレオチド配列を表す。本発明の単離されたヒトｓｉＲＮＡ分子は、配列番号３１〜４５から選ばれる核酸によってコードされたリボヌクレオチド配列を標的とし、ここで、配列番号３１〜３３は、それぞれ位置５３７〜５５７、位置１０８０〜１１００および位置１８５〜２０５におけるｇａｔａ−３遺伝子のヌクレオチド配列を表し、配列番号３４〜３６は、それぞれ位置１９６〜２１６、位置３２８〜３４８および位置４５７〜４７７におけるＩＬ−５遺伝子のヌクレオチド配列を表し、配列番号３７〜３９は、それぞれ位置７４９〜７６９、位置２６９〜２８９および位置３３５〜３５５におけるエオタキシン遺伝子のヌクレオチド配列を表し、配列番号４０〜４２は、それぞれ位置１３３〜１５３、位置３５５〜３７５および位置８７〜１０７におけるＩＬ−４遺伝子のヌクレオチド配列を表し、および配列番号４３〜４５は、それぞれ位置３８９〜４０９、位置１３７〜１５７および位置４３１〜４５１におけるＩＬ−１３遺伝子のヌクレオチド配列を表す。
【００２５】
本発明の好ましいマウスｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子のＲＮＡに相補的な配列、または実施例１〜６に記載の方法により調製されたｓｉＲＮＡ１〜１５（それぞれ配列番号１６〜３０で表される）のいずれかと、少なくとも８０％同一である配列を含み、前記ｓｉＲＮＡは、それぞれ配列番号１〜１５から選ばれるいずれかの核酸配列でコードされるものである。正確な配列番号１〜１５のマウス核酸配列、および配列番号１６〜３０のリボ核酸配列は、表１に記載してある。本発明の好ましいヒトｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子のＲＮＡに相補的な配列、または実施例７に記載の方法により調製されたｓｉＲＮＡ１６〜ｓｉＲＮＡ３０（それぞれ配列番号４６〜６０で表される）のいずれかと、少なくとも８０％同一である配列を含み、前記ｓｉＲＮＡは、それぞれ配列番号３１〜４５から選ばれるいずれかの核酸配列でコードされるものである。正確な配列番号３１〜４５のヒト核酸配列、および配列番号４６〜６０のリボ核酸配列は、表２に記載してある。
【００２６】
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子のＲＮＡ配列に相補的な一本鎖のポリリボヌクレオチドを含み、生体外または生体内においてＲＮＡｉ活性を媒介する一本鎖のｓｉＲＮＡであってもよい。好ましくは、前記ｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子のＲＮＡｉに係るｓｉＲＮＡと少なくとも８０％同一であり、前記標的遺伝子は、配列番号１〜１５、または配列番号３１〜４５から選ばれたいずれかの核酸配列を含む。前記標的遺伝子は、例えば、ｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシン遺伝子などの気道炎症関連遺伝子であってもよい。
【００２７】
現在、遺伝子サイレンシング研究のｓｉＲＮＡを作製するには五つの方法があり、これは、化学合成、生体外転写、リボヌクレアーゼＩＩＩファミリーの酵素による長いｄｓＲＮＡの切断、ｓｉＲＮＡ発現プラスミドまたはウイルスベクターの細胞内における発現、およびリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）に由来するｓｉＲＮＡ発現カセットの細胞内における発現を含む。前三者の方法は、生体外においてｓｉＲＮＡを調製してから、これをリポフェクション、電気穿孔法または他の技術により直接細胞に導入することを含む。後二者の方法は、細胞内においてｓｉＲＮＡを発現できる、ＤＮＡベースのベクターおよびカセットの導入による。
【００２８】
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、鋳型として選択された標的遺伝子配列を用いて、本発明の実施例に記載のＲＴ−ＰＣＲ由来の発現カセットによりクローニングした。あるいは、それらは、前述の生体外の調製および／または化学合成により、当該技術分野で既知のプロトコルにより得ることができる。このｓｉＲＮＡ分子は、その後適切なベクターに入れ、発現のために細胞内に送達される。一旦発現されると、ｓｉＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡと相互作用して、ＲＮＡ干渉反応を発生させる。
【００２９】
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、単独で、または他の治療法と組み合わせて用い、アレルギー疾患、例えば、花粉症、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、呼吸窮迫症候群、アトピー性皮膚炎およびアナフィラキシーショックなどを予防または治療できる。本ｓｉＲＮＡ分子は、対象に投与するための送達ビヒクル、例えばリポソームなど、担体、および希釈液を含んでもよく、且つ／または薬学的に受容可能な製剤で存在することができる。核酸分子を送達する方法は、当技術分野でよく知られているものであり、リポソームへのカプセル化、イオントフォレーシス、または他のビヒクル、例えば、生分解性ポリマー、ハイドロゲル、シクロデキストリンなどへの組み込みによるもの、あるいはタンパク質性のベクターによるものを含むが、これらに限らない。核酸分子の送達のより一般的なアプローチについては、例えば、米国特許第６，３９５，７１３号を参照でき、その全ての内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３０】
従って、本発明は受容可能な担体における一つまたはそれ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む医薬組成物を特徴とする。本発明のｓｉＲＮＡは、任意の標準的な手段により対象に投与および導入することができる。リポソーム送達機構を利用することを希望する場合、本発明の実施例において例証されたように、リポフェクタミンのリポソーム製剤が好ましく、標準的なプロトコルに従って投与される。
【００３１】
本発明のリボ核酸分子および組成物は、従来の無毒の薬学的に受容可能な担体、アジュバントおよび／またはビヒクルを含む投与単位製剤にて、経口投与、局所投与、非経口投与、吸入またはスプレーにより投与されてもよい。本明細書で用いられる「非経口投与」という用語は、経皮的な、皮下の、血管内の、筋肉内の、または髄腔内の注射あるいは注入技術などを含む。経口用、局所用、非経口用、および／または吸入用の組成物は、当技術分野で既知の任意の方法に従って調製することができる。好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、気道組織への核酸分子の速やかな局所的取り込みをもたらす、吸入装置、例えば、噴霧器（nebulizer）、定量噴霧式吸入器（metered dose inhaler）または吸入器（insufflator）などで使用するエアロゾルまたはスプレー製剤に製剤される。
【００３２】
別段の定義がない限り、本明細書で用いる全ての技術的および科学的な用語は、本発明の属する技術分野における当業者が通常理解しているのと同じ意味を有する。本明細書に記載したのと類似または均等の任意の方法および材料を、本発明の実験または実施に用いることができるが、好ましい方法および材料を下記に記載する。言及した全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込む。別段の言及がない限り、ここで用いるまたは意図する技術は、当業者によく知られた標準的な手法である。材料、方法および実施例は、例示的であるにすぎず、限定的ではない。
【００３３】
本明細書において、単数形である「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、文脈が特に明確に示さない限り、複数の指示対象を包含して用いられる。作業例または別段の指示がある場合を除き、本出願において用いられる、成分、反応条件などの量を表す数の全ては、用語「約」により、全ての場合において修正されると理解すべきである。従って、反対のことが示されない限り、本出願に記載された数字パラメーターは近似値であり、本発明により得ようとする所望の特性に応じて変化し得る。
［実施例］
【００３４】
以下の実施例は、本発明のいくつかの態様を例証するため、および当業者が本発明を実施する助けとなるように提供される。これらの実施例は本発明の範囲をなんら限定するものではない。
【００３５】
《統計解析》
本研究の全ての数値は、少なくとも三つの独立した実験の、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（平均値の標準誤差）である。実験群間の統計学的な有意差は、ＳＰＳＳソフトウエアを用いて、一元配置分散分析（one-way ANOVA）と、引き続くシェッフェの事後比較（Scheffe for Post Hoc comparison）により分析した。最小の有意水準は、０．０５未満のｐ値である。
【００３６】
《マウスｓｉＲＮＡの構築および気道炎症抑制におけるそれらの利用》
［実施例１］マウスＧａｔａ−３  ｓｉＲＮＡコンストラクトの作製および得られたＧａｔａ−３  ｓｉＲＮＡのＥＬ−４細胞へのトランスフェクション
＜マウスＧａｔａ−３  ｓｉＲＮＡの構築＞
ｇａｔａ−３  ｓｉＲＮＡの調製に選ばれた三つのマウスｇａｔａ−３標的配列は、位置３１６〜３３６における標的配列、ＧＡＡＧＣＴＣＡＧＴＡＴＣＣＧＣＴＧＡＣＧ（配列番号１）を用いたｓｉＲＮＡ１、位置１７３３〜１７５３における標的配列、ＣＣＡＣＴＧＡＡＴＣＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＴ（配列番号２）を用いたｓｉＲＮＡ２、および位置１３０６〜１３２４における標的配列、ＧＡＴＧＴＣＴＡＧＣＡＡＡＴＣＧＡＡＡ（配列番号３）を用いたｓｉＲＮＡ３であった。陰性対照ｓｉＲＮＡ（Ambion社、Austin、Texas.USAから提供された市販キット）は、製造者の説明書（Ambion社）に従い、ＰＣＲ由来のｓｉＲＮＡ発現カセットにより合成し、次いで、ｐＳＥＣＴＭ  ｈｙｇｒｏ  プラスミド（Ambion社）にクローニングした。ｓｉＲＮＡ発現カセット、およびマウスｇａｔａ−３  ｓｉＲＮＡのｐＳＥＣＴＭ  ｈｙｇｒｏ  プラスミドにおける構築を、それぞれ図１Ａおよび図１Ｂに示す。
【００３７】
＜合成マウスｇａｔａ−３  ｓｉＲＮＡコンストラクトをＥＬ−４細胞にトランスフェクトする＞
マウスリンパ腫細胞系であるＥＬ−４細胞（American Type Cell Cultureから取得、４×１０５細胞／ｍｌ）を６穴プレートにおいて維持および培養し、次の日に、リポフェクタミン２０００（Invitrogen社、Carlsbad、CA USA）を用いて、実施例１のプラスミドをトランスフェクトした。具体的には、マウスｇａｔａ−３  ｓｉＲＮＡを含有するｐＳＥＣＴＭ  ｈｙｇｒｏ  プラスミド５μｇおよびリポフェクタミン２０００  ９μｌを、抗生物質無添加のＤＭＥＭ培地中、室温で２５分間放置し、複合体を形成させた。次いで、６穴プレートにおいて維持および培養しているＥＬ−４細胞にこの複合体を加え、更に２４時間培養した。ｓｉＲＮＡの発現率が高い細胞を選択するために、マウスｇａｔａ−３  ｓｉＲＮＡを発現する細胞の安定したクローン、および陰性対照のｓｉＲＮＡの安定したクローンを、ハイグロマイシン５００μｇ／ｍｌを含有する培地を用いて選択し、選択されたクローンを、ハイグロマイシン２５０μｇ／ｍｌを含有する培地で維持した。ＥＬ−４細胞におけるマウスｇａｔａ−３  ｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、ＲＴ−ＰＣＲ分析によるＲＮＡレベルでの、またはＥＬＩＳＡ法によるタンパク質のレベルでのマウスｇａｔａ−３遺伝子の発現の検出によって確認した。
【００３８】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
マウスｇａｔａ−３  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＥＬ−４細胞の全ＲＮＡは、ＲＮＡｂｅｅ（AMS Biotechnology社製、Abingdon、UK）を用いて、製造者の説明書に従って単離した。ＧＡＴＡ−３とβ−アクチンの相対量を定量するために、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＮＡの逆転写は、終体積２０μｌで行った。反応チューブには、５倍の第一鎖緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２）４μｌ、１０ｍＭの４種類のデオキシヌクレオチドの混合物１μｌ、０．１Ｍのジチオトレイトール１μｌ、およびスーパースクリプト逆転写酵素１μｌが入っていた。終体積１２μｌのＲＮＡおよび脱イオン水を、１０分間７０℃で加熱し、その後、氷上で冷却した。ＲＮＡサンプルを反応チューブに添加し、５０分間４２℃でインキュベートし、１０分間、７０℃まで加熱して逆転写酵素を変性させ、次いで−２０℃で保存した。マウスＧＡＴＡ−３のプライマー配列は、センス鎖がＧＡＡＧＧＣＡＴＣＣＡＧＡＣＣＣＧＡＡＡＣ（配列番号６１）であり、アンチセンス鎖がＡＣＣＣＡＴＧＧＣＧＧＴＧＡＣＣＡＴＧＣ（配列番号６２）であり、マウスβ−アクチンの方は、センス鎖がＡＡＧＧＴＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＴＧ（配列番号６３）であり、アンチセンス鎖がＡＴＧＧＣＴＡＣＧＴＡＣＡＴＧＧＣＴＧＧ（配列番号６４）であった。ＰＣＲ反応混合物に、次の構成成分を添加した：２．５μＭのｄＮＴＰ  ０．５μｌ、センスプライマーおよびアンチセンスプライマー２．５μｌ、１０倍のＰＣＲ緩衝液２．５μｌ、ｃＤＮＡ  １μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ０．１μｌ、および脱イオン水１５．９μｌ。３分間９４℃の初期インキュベーションの後、これらのプライマーを、以下のようなサイクルにより増幅した：β−アクチンについては（１）３０秒間９４℃、（２）４５秒間５６℃、（３）４０秒間７２℃、および、ＧＡＴＡ−３については（１）１分間９４℃、（２）１分間６２℃、（３）１分間７２℃、最終インキュベーションは１０分間７２℃。
【００３９】
増幅の後に、ＰＣＲ産物を、ＴＢＥ緩衝液（８０ｍＭのＴｒｉｓ−ホウ酸、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中に調製した２％のアガロースゲルにおいて、１００ボルトで０．５時間行う電気泳動に供した。電気泳動の後に、ゲルを０．１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムで染色し、紫外線で観察し、撮影した。
【００４０】
（ＥＬＩＳＡ法）
実施例１のＥＬ−４細胞（１×１０７細胞／ｍｌ）を、氷冷リン酸緩衝食塩水で二度洗浄した。次に、それぞれのディッシュに溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１％のＮＰ−４０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍｇ／ｍｌのペプスタチン、０．５ＭのＮａＶＯ４、ｐＨ７．４）２００μｌを添加し、溶解された細胞をディッシュからスクレーピングし、次いでエッペンドルフチューブ中、３０分間４℃でインキュベートした。次に、これらのエッペンドルフチューブを１４，０００ｒｐｍの回転速度で、４℃にて２０分間遠心し、それぞれのエッペンドルフチューブから上清を収集した。収集した上清のアリコートを、４倍のタンパク質サンプル緩衝液（３１．２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、１％のＳＤＳ、２５％のβ−メルカプトエタノール、０．００６２５％のブロモフェノールブルー、および５０％(ｖ／ｖ)のグリセリン）と混合し、５分間煮沸した。タンパク質サンプルは、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけ、電気泳動したタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。次に、膜を、０．１％のツイーンを含有するトリス緩衝生理食塩水中の５％のミルクによりブロッキングし、一次抗体と共にインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体を用い、バンドを、製造者の説明書（PerkinElmer Life Science社、Boston、MA）に従って、化学発光試薬により検出した後、Ｘ線フィルムに暴露した。
［実施例２］
【００４１】
実施例１のＥＬ−４細胞におけるサイトカイン放出に対するマウスｇａｔａ−３  ＲＮＡｉの効果
ｇａｔａ−３  ｓｉＲＮＡコンストラクトのアレルギー関連Ｔｈ２サイトカイン遺伝子発現の抑制における効果を更に確認するために、実施例１のＥＬ−４細胞により分泌されたサイトカインのレベルを測定した。この目的のために、３日間の感染の後、実施例１のＥＬ−４細胞を、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ、５ｎｇ／ｍｌ）およびｃＡＭＰ（５００μＭ）の併用投与有りまたは無しで２４時間刺激し、次いで、ｇａｔａ−３遺伝子発現およびＧＡＴＡ−３タンパク質発現の測定のため、細胞の培地を実施例１に記載の手順に従って収集し、サイトカイン（ＩＬ−４およびＩＬ−５を含む）放出を以下に述べる手順に従って測定した。
【００４２】
（サイトカインの測定）
サイトカインのレベルは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により検出した。簡潔に述べると、ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈した抗サイトカイン抗体（抗ＩＬ−４抗体または抗ＩＬ−５抗体）を９６穴培養ディッシュに添加し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、培養ディッシュを、室温で一時間以内に、３％ＢＳＡを含むＰＢＳで３回リンスした。次に、検査するサンプルを添加して、３７℃で２時間、または４℃で一晩反応させた。反応終了後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈したビオチン共役抗サイトカイン抗体を培養ディッシュに添加し、室温で１時間インキュベートした後に、ストレプトアビジン共役ペルオキシダーゼを添加し、更に１時間反応させた。最後に、酵素基質液（ｏ−フェニレンジアミン４ｍｇを、０．００１％Ｈ２Ｏ２を含む０．１Ｍのリン酸−クエン酸緩衝液２０ｍｌに溶解したもの）０．２ｍｌをそれぞれのウェルに添加して、室温で３０分間、暗所に放置した。各ウェルの４５０ｎｍの吸光度は、マイクロプレートオートリーダーで検出し、読み込んだ。このサンドイッチＥＬＩＳＡ法の感度は、それぞれＩＬ−４が１５ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ−５が２０ｐｇ／ｍｌであった。
【００４３】
結果を図２に示す。対照群と比べると、ｇａｔａ−３遺伝子（図２Ａ）およびＧＡＴＡ−３タンパク質（図２Ｂ）の両者のレベルは、ＰＭＡおよびｃＡＭＰの併用投与有りで著しく抑制されており、ｇａｔａ−３のＲＮＡｉが、ＰＭＡ依存的およびｃＡＭＰ依存的な遺伝子およびタンパク質の両者の発現を妨害するのに有効であることが示された。更に、ＰＭＡおよびｃＡＭＰの併用投与の刺激により放出されたＩＬ−４およびＩＬ−５の両者のレベルも、ｇａｔａ−３遺伝子の発現を介したｇａｔａ−３  ＲＮＡｉにより抑制された。
［実施例３］
【００４４】
マウス喘息モデルに対するＧａｔａ−３  ＲＮＡｉの効果
＜３．１  レンチウイルスベクターへのマウスｇａｔａ−３  ｓｉＲＮＡのクローニング＞
実施例１に記載のｓｉＲＮＡ１、ｓｉＲＮＡ２およびｓｉＲＮＡ３を含むマウスｇａｔａ−３  ｓｉＲＮＡを、ＴＡクローニング法により、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Promega社、Madison、WI）にクローニングし、制限酵素により、ｓｉＲＮＡを含むｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙベクターをＥｃｏＲＩサイトで切断した。両端にＥｃｏＲＩサイトを有するｓｉＲＮＡ断片をｐＴＹリンカー（図１Ｃ）にクローニングした。この実験に用いるレンチウイルスベクターは、Ｄｒ．Ｌｉ−Ｈｕａ  Ｈｗａｎｇ（国立台湾大学附属病院肝臓病研究センター）により提供された三代目の自己不活性化ベクター（self-inactivated vector、ＳＩＶ）であった。ｓｉＲＮＡレンチウイルスベクターは、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞のリン酸カルシウム媒介性の一過性トランスフェクションにより産生した。簡潔に述べると、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に、ヘルパーコンストラクト、エンベローププラスミド、ｔａｔプラスミド、およびレンチウイルスベクタープラスミドを含む適切な量のベクタープラスミドを同時トランスフェクトした。トランスフェクションの翌日、ウイルスを培養上清から収集し、超遠心分離法により３３倍濃縮した。ＥＬ−４における形質導入に用いた種々のウイルスベクターの濃度は、ＭＯＩ＝１．４であった。
【００４５】
＜３．２  Ｇａｔａ−３  ｓｉＲＮＡレンチウイルスのマウス喘息モデルにおける適用＞
（マウス喘息モデル）
雌のＢＡＬＢ／ｃマウスは、国立台湾大学医学部実験動物センター（台湾、Ｒ．Ｏ．Ｃ．）から購入し、そこで維持した。動物は、６〜１０週齢で使用し、各実験において年齢を一致させた。動物実験プロトコルは、国立台湾大学医学部動物委員会（台湾、Ｒ．Ｏ．Ｃ．）で認可されており、以下に簡単に述べる。第０日に、マウスを、卵白アルブミン（ＯＶＡ）（Grade V、Sigma chemical co.、St. Louis、MO）５０μｇを水酸化アルミニウム（AlumImuject、Pierce Chemical、Rockford、IL）４ｍｇに乳化して総容積２００μｌとしたものを腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射することにより感作した。全てのマウスを、それぞれ第１４日および第２８日に、水酸化アルミニウム４ｍｇに乳化した卵白アルブミン２５μｇを再度注射することにより追加免疫した。陰性対照群のマウスには、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を注射した。第３５日に、各動物の血清中のＯＶＡ−ＩｇＥを測定した。第４０日に、実施例３．１のレンチウイルスｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ１、ｓｉＲＮＡ２およびｓｉＲＮＡ３を含み、それぞれ２．２×１０６ＩＦＵ）を、麻酔した動物の気管内に（ｉ．ｔ．）送達し、第４２〜４４日に、鼻腔内でＯＶＡ（１００μｇ）によりチャレンジした。偽ウイルス（mock virus）（陰性対照のｓｉＲＮＡレンチウイルスベクター）または生理食塩水を対照として用いた。予備的な力価測定のデータ（データ示さず）により、１×１０５ＰＦＵのレンチウイルスが選択された。気管内注入のために、生理食塩水５０μｌ中のウイルスを、０．６１ｍｍ（ＯＤ）のポリエチレン管が装備されたカテーテルにより注入した。第４５日に、各動物の気道過敏性（airway hyperresponsiveness、ＡＨＲ）を測定し、第４６日に全てのマウスを出血させ犠牲にし、実験を終わらせ、肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）における細胞プロファイルおよびサイトカインレベルの測定を含む更なる分析のために、肺細胞を単離した。図３は、本研究に用いた上記のプロトコルのスケジュールを示す。
【００４６】
（ＯＶＡ特異的ＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの測定）
ＯＶＡ特異的ＩｇＥ、ＩｇＧ１（Ｔｈ２反応を示す）およびＩｇＧ２ａ（Ｔｈ１反応を示す）は、既述のように、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した（Lee et al., “Construction of single chain interleukin 12 plasmid to treat airway hyper-responsiveness in an animal model of asthma”, Human Gene Therapy (2001) 12:2065-2079）。ＯＶＡ  ２μｇ／ｍｌをＥＬＩＳＡプレートにコートし、４℃で一晩インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを、０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳにより洗浄し、希釈した血清（ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体は１０倍希釈、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体は１００倍希釈）をプレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。その後に、ビオチン共役抗ＩｇＥ、抗ＩｇＧ１および抗ＩｇＧ２ａ抗体、およびアルカリフォスファターゼ共役アビジン（Sigma社、St.Louis、MI、USA）を添加した。酵素活性は、ＴＭＢ緩衝液（KPL Gaithersburg社、MI.USA）を基質として用い、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）リーダー（MRX-TC、Dynex Technology社、Chantilly、VA.USA）を使用して評価した。４５０ｎｍでの測定値を、検量線から得た数値により、１ミリリットル当たりのナノグラムに換算した。検量線は、既知濃度の精製されたマウスＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ（Pharmingen社、San Diego、CA）を、系列希釈することで得た。結果を図４に示す。陽性対照と比べると、ｓｉＲＮＡの投与により、単独投与でも併用投与でも、ＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａを含むＯＶＡ特異的抗体の全てが同程度に誘導されたことが明らかである。
【００４７】
（サイトカインの測定）
実施例３．２の動物から収集したＢＡＬＦにおけるサイトカインのレベルは、実施例２に記載の手順に従って、ＥＬＩＳＡ法により検出した。結果は図５に示す。ｇａｔａ−３  ｓｉＲＮＡ２またはｇａｔａ−３  ｓｉＲＮＡ３を投与した動物において、単独投与でも併用投与でも、エオタキシンのレベルは、陽性対照群の動物のエオタキシンのレベルより顕著に低かった（図５）。
【００４８】
（ＢＡＬＦにおける細胞プロファイルの測定）
実施例３．２の動物から収集したＢＡＬＦにおける、マクロファージ、好酸球、好中球およびリンパ球を含む細胞プロファイルは、劉氏染色法（Lee et al., “Administration of IL-12 exerts therapeutic instead of longterm preventive effect on Der p1 allergen-induced animal model of airway inflammation”. (1999) Immunology  97: 232-240.）により確認し、結果は図６に示す。ｇａｔａ−３  ｓｉＲＮＡ２またはｇａｔａ−３  ｓｉＲＮＡ３を投与された動物において、単独投与でも併用投与でも、好酸球の数が顕著に減少しており、それは、実施例３．１のｓｉＲＮＡが、炎症の指標となる好酸球の活性化をうまく抑制したことを示している。
【００４９】
（ＡＨＲの測定）
バロメトリック全身プレチスモグラフィ（barometric whole body plethysmography）（Buxco、Troy、NY.USA）により、無拘束の動物のＡＨＲを測定した。簡潔に述べると、マウスをメインチャンバーに置いて、ベースライン値を取得し、３分間平均化した。漸増濃度のエアロゾル化したＰＢＳまたはメタコリン（ＭＣｈ）（３．１２５〜２５ｍｇ／ｍｌ）を、メインチャンバーの入口から３分間噴霧し、毎回の噴霧後、測定値を取得し、３分間平均化した。毎分の呼吸回数を決定するために、十呼吸毎の記録値を外挿した。気道反応性は、増大する休止（enhanced pause、Ｐｅｎｈ）として表現され、データは、Ｈｏｇａｎらが記載した手順（“Aeroallergen-induced eosinophilic inflammation, lung damages and airway hyper-reactivity in mice can occur independently of IL-4 and allergen-specific immunoglobulins”, (1997) J. Clin, Invest. 99:1329-1339.）により、３回の独立実験から得られたＰｅｎｈＭＣｈ値のＰｅｎｈＰＢＳ値に対する比率として表した。
【００５０】
結果を、図７に示す。対照動物と比べると、ｓｉＲＮＡ１、ｓｉＲＮＡ２またはｓｉＲＮＡ３を投与した動物では、ＭＣｈ誘導ＡＨＲが顕著に減少していることがわかり、ＩＬ−５およびエオタキシン遺伝子の発現の抑制が、アレルギー関連症状を緩和するのに有効であることを更に確認した。
［実施例４］
【００５１】
マウスＲＮＡｉによるＩＬ−５およびエオタキシンの発現の抑制
実施例１に記載したのと同様の手順によって、ＩＬ−５ＲＮＡｉおよびエオタキシンＲＮＡｉの標的配列を選択して合成した。具体的には、マウスＩＬ−５ｓｉＲＮＡの産生のために、位置２６３〜２８３における標的配列、ＡＡＧＡＡＴＣＡＡＡＣＴＧＴＣＣＧＴＧＧＧ（配列番号４）を用いたｓｉＲＮＡ４、位置６３６〜６５６における標的配列、ＡＡＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＴＡＧＣＧＣＡＧＧ（配列番号５）を用いたｓｉＲＮＡ５、および位置１１６６〜１１８６における標的配列、ＡＡＴＣＡＧＡＣＴＧＴＧＣＣＡＴＧＡＣＴＧ（配列番号６）を用いたｓｉＲＮＡ６を含む、ＩＬ−５の三つの標的配列を選択した。位置１３４〜１５２における標的配列、ＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴＡＴＣＡＴ（配列番号７）を用いたｓｉＲＮＡ７、位置２８２〜２９４における標的配列、ＧＴＧＧＧＴＣＣＡＧＧＡＴＧＣＣＡＣＡ（配列番号８）を用いたｓｉＲＮＡ８、および位置５８３〜５９５における標的配列、ＣＡＣＡＡＴＧＧＧＡＣＧＡＧＴＴＡＧＧ（配列番号９）を用いたｓｉＲＮＡ９を含む、エオタキシンの三つの標的配列が、マウスエオタキシンｓｉＲＮＡの産生のために、選択され使用された。
【００５２】
選ばれたマウスｓｉＲＮＡ（即ち、ｓｉＲＮＡ４、ｓｉＲＮＡ５およびｓｉＲＮＡ６）による、ＥＬ−４細胞におけるＩＬ−５の発現の抑制は、実施例２に記載した手順に従って、ＥＬＩＳＡにより検出し、結果は図８に示す。ＩＬ−５の発現は、合成されたマウスｓｉＲＮＡのいずれかにより顕著に抑制された。
【００５３】
同様に、ｓｉＲＮＡ（即ち、ｓｉＲＮＡ７、ｓｉＲＮＡ８およびｓｉＲＮＡ９）によるエオタキシンの発現の抑制を図９に示す。簡潔に述べると、雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスの初代培養肺細胞を調製し、４８穴プレートで培養し、３７℃でインキュベートした。次いで、培養肺細胞に、エオタキシンｓｉＲＮＡを含むベクターをトランスフェクトし、発現したエオタキシンをＥＬＩＳＡにより検出した。その結果は、エオタキシン／ＩＬ４の発現が、両方とも、選ばれた合成マウスエオタキシンｓｉＲＮＡにより顕著に抑制されたことを示した。
【００５４】
ＩＬ−５ＲＮＡｉおよびエオタキシンＲＮＡｉに係るｓｉＲＮＡは、実施例３．１の手順に従って、レンチウイルスベクターにクローニングし、次いで、実施例３．２のマウス喘息モデルに、同様の方法で適用し、ＡＨＲ、ＢＡＬＦにおける細胞集団、およびサイトカインレベルを、実施例３．２に記載した手順に従って測定した。結果は、図１０〜１３に示す。
【００５５】
図１０は、気道過敏性のＩＬ−５／エオタキシンｓｉＲＮＡによる影響を示す。図１１は、ＩＬ−５／エオタキシンｓｉＲＮＡで前処置した動物から収集したＢＡＬＦにおける、単球（図１１Ａ）、好中球（図１１Ｂ）、リンパ球（図１１Ｃ）および好酸球（図１１Ｄ）を含む細胞集団を示す。図１２は、ＩＬ−５／エオタキシンｓｉＲＮＡで前処置した動物から収集したＢＡＬＦにおける、ＩＬ−５（図１２Ａ）およびエオタキシン（図１２Ｂ）を含むサイトカインの濃度を示す。図１３は、ＩＬ−５／エオタキシンｓｉＲＮＡで前処置した動物における、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａを含むＯＶＡ特異的抗体の血清レベルを示す。
［実施例５］
【００５６】
ＩＬ−４およびＩＬ−１３ＲＮＡｉのためのマウスｓｉＲＮＡの単離、および気道炎症の抑制におけるそれらの利用
実施例１に記載したのと同様の手順に従って、ｓｉＲＮＡを産生するために、ＩＬ−４ＲＮＡｉおよびＩＬ−１３ＲＮＡｉの標的配列を選び、用いた。具体的には、マウスＩＬ−４ｓｉＲＮＡの産生のために、位置３３６〜３５６における標的配列、ＡＡＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＧＡＧＴＣ（配列番号１０）を用いたｓｉＲＮＡ１０、位置１８１〜２０１における標的配列、ＡＡＣＡＣＣＡＣＡＧＡＧＡＧＴＧＡＧＣＴＣ（配列番号１１）を用いたｓｉＲＮＡ１１、および位置４７〜６７における標的配列、ＡＡＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＧＣＣＡＴＡＴＣＣ（配列番号１２）を用いたｓｉＲＮＡ１２を含む、三つのＩＬ−４配列を用いた。位置２３８〜２５８における標的配列、ＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＡＣＡＧＧＡＣＣＣＡＧ（配列番号１３）を用いたｓｉＲＮＡ１３、位置１５４〜１７４における標的配列、ＡＡＣＧＧＣＡＧＣＡＴＧＧＴＡＴＧＧＡＧＴ（配列番号１４）を用いたｓｉＲＮＡ１４、および位置１００〜１２０における標的配列、ＡＡＧＧＡＧＣＴＴＡＴＴＧＡＧＧＡＧＣＴＧ（配列番号１５）を用いたｓｉＲＮＡ１５を含む、三つのＩＬ−１３のマウスｓｉＲＮＡを合成した。
【００５７】
単離されたマウスＩＬ−４および／またはＩＬ−１３ｓｉＲＮＡは、上記と同様の方法で試験し、その結果により、これらの単離されたマウスＩＬ−４および／またはＩＬ−１３ｓｉＲＮＡが、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３遺伝子の発現を抑制し、且つアレルギー関連症状の緩和にも有効であることが確認された（結果は記載せず）。
［実施例６］
【００５８】
気道炎症の抑制におけるマウスｓｉＲＮＡの用量効果
マウスｓｉＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡ５（配列番号５によりコードされるＲＮＡ配列に相補的な配列を有する）を、実施例３．１の手順に従って、レンチウイルスにクローニングし、高用量（３×１０６ＩＦＵ／匹）、中用量（１．５×１０６ＩＦＵ／匹）および低用量（３×１０５ＩＦＵ／匹）の３種類の用量の、ｓｉＲＮＡ５を含むウイルスベクターを、それぞれ実施例３．２のマウス喘息モデルに適用し、ＡＨＲ、ＢＡＬＦにおける細胞集団、サイトカインレベル、および血清抗体レベルを、実施例３．２に記載した手順に従って測定した。結果は図１４〜１７に示す。
【００５９】
図１４は、気道過敏性におけるマウスｓｉＲＮＡ５の用量効果を示す。図１５は、それぞれ高用量、中用量、および低用量のｓｉＲＮＡ５で前処置した動物から収集したＢＡＬＦにおける、単球、リンパ球、好塩基球および好酸球を含む細胞集団を示す。図１６は、それぞれ高用量、中用量、および低用量のｓｉＲＮＡ５で前処置した動物から収集したＢＡＬＦにおける、エオタキシンの濃度を示す。図１７は、それぞれ高用量、中用量、および低用量のｓｉＲＮＡ５で前処置した動物の、ＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａを含むＯＶＡ特異的抗体の血清レベルを示す。結果は、マウスｓｉＲＮＡ５の全ての選ばれた用量は、アレルギー関連症状の緩和に有効であり、中用量のｓｉＲＮＡ５が最も顕著な効果を表す好ましい用量であることを示す。
［実施例７］
【００６０】
《ヒトｓｉＲＮＡの構築および気道炎症の抑制におけるそれらの利用》
ヒトｓｉＲＮＡの単離
＜７．１  ヒトｓｉＲＮＡ発現ベクターの構築＞
ヒトｓｉＲＮＡがｐＲＮＡＴ−Ｈ１．１／Ｒｅｔｒｏ（SD1255、GenScript社、NJ、USA）プラスミド（図１８）にクローニングされ、また、これらのヒトｓｉＲＮＡ発現プラスミドがリポフェクタミン（Invitrogen社、Gaithersburg、MD）によりＡ５４９細胞（ヒト肺胞基底上皮細胞系（alveolar basal epithelial cell line））またはＢＥＡＳ−２Ｂ細胞（ヒト気管支上皮細胞系）にトランスフェクトされ、且つトランスフェクトされた４８時間後に、選択のためにＧ４１８（５００μｇ／ｍｌ）を１４日に亘って添加した以外は、実施例１に記載したのと同様の手順に従って、ｓｉＲＮＡを産生するために、ヒトＲＮＡｉの標的配列を選び、用いた。例えば、ヒトｓｉＲＮＡの産生のために、三つのＩＬ−５配列を使用した。それらは、位置１９６〜２１６における標的配列、ＧＧＡＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＴＡ（配列番号３４）を用いたｓｉＲＮＡ１９、位置３２８〜３４８における標的配列、ＡＧＡＡＡＴＡＣＡＴＴＧＡＣＧＧＣＣＡＡＡ（配列番号３５）を用いたｓｉＲＮＡ２０、および位置４５７〜４７７における標的配列、ＣＴＧＧＴＴＴＧＴＴＧＣＡＧＣＣＡＡＡＧＡ（配列番号３６）を用いたｓｉＲＮＡ２１を含む。それぞれｇａｔａ−３、エオタキシン、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３についてこのように産生されたｓｉＲＮＡ１６〜３０を含むヒトｓｉＲＮＡを表２に示す。
【００６１】
＜７．２  リアルタイム定量ＰＣＲ＞
ＧｅｎｅＳｔｒｉｐｓＴＭハイブリダイゼーションチューブ（RNAture社、CA、USA）を使用し、選ばれたｓｉＲＮＡの発現ベクターをトランスフェクトしたＡ５４９細胞から、ｍＲＮＡを抽出した。ランダムヘキサマープライマーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−逆転写酵素（Invitrogen、Gaithersburg、MD、USA）により、製造者の説明書に従って、ｃＤＮＡ合成を行った。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００サイクラー（Applied Biosystems社、Foster City、CA、USA）において、ヒトＩＬ−５またはエオタキシンのＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（Applied Biosystems社、Foster City、CA、USA）を用いて、定量リアルタイムＰＣＲを行った。全ての報告されたｍＲＮＡのレベルは、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのレベルで標準化した。例として、ｓｉＲＮＡ２２、２３および２４を含むエオタキシン−１に対するヒトｓｉＲＮＡのＢＥＡＳ−２Ｂ細胞へのトランスフェクション効率を図１９に示す。
【００６２】
＜７．３  ヒトエオタキシン−１を標的とするｓｉＲＮＡの抑制効果＞
ウイルスで形質転換したヒト気管支上皮細胞系ＢＥＡＳ−２Ｂは、ヒトＴＮＦ−αおよびヒトＩＬ−４の刺激により、エオタキシン−１を分泌することができる。ヒトエオタキシン−１を標的とするｓｉＲＮＡの抑制効果を研究するために、ｓｉＲＮＡトをトランスフェクトしたＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、ヒトＴＮＦ−α（５０ｎｇ／ｍｌ）およびヒトＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ）により、各々２４時間および４８時間刺激した。上清におけるエオタキシン−１の濃度を、ＥＬＩＳＡにより検出した。ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞におけるヒトエオタキシン−１を標的とするｓｉＲＮＡの抑制効果は、図２０に示す。刺激の２４時間後、ｓｉＲＮＡ２３をトランスフェクトしたＢＥＡＳ−２Ｂ細胞におけるエオタキシン−１の産生は、対照細胞（即ち、空のベクターをトランスフェクトしたＢＤＡＳ−２Ｂ細胞）と比べると、９±１４％という低レベルに減少した。刺激の４８時間後、ｓｉＲＮＡ２３またはｓｉＲＮＡ２４をトランスフェクトしたＢＥＡＳ−２Ｂ細胞におけるエオタキシン−１の産生は、対照群と比べると、それぞれ２９±４％または５５±３％に減少した。
【００６３】
＜７．４  ヒトｇａｔａ−３、ＩＬ−４またはＩＬ−１３を標的とするｓｉＲＮＡの抑制効果＞
Ｊｕｒｋａｔ細胞には、実施例７．１に記載の手順に従って構築したヒトｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、ｇａｔａ−３、ＩＬ−４またはＩＬ−１３の遺伝子発現に対する抑制効果は、実施例７．２に記載の手順によって、リアルタイムＰＣＲを用いてモニターした。結果は図２１に示す。
【００６４】
【表１】
2009536518.tif 000002
【００６５】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の利点は、ｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシン遺伝子などの気道炎症関連遺伝子の少なくとも一種の発現を妨害するように特別に設計されたｓｉＲＮＡの利用により、アレルギー疾患を治療する新規な方法を提供することである。本発明によるｓｉＲＮＡ、方法および組成物は、炎症を阻害し、アレルギーを抑制するように、宿主の免疫を高めることができ、それによって、対象の気道炎症を最小化および／もしくは軽減することにより、花粉症、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、呼吸窮迫症候群、アトピー性皮膚炎およびアナフィラキシーショックなどのアレルギー疾患を患っている対象に治療を提供する。
【００６７】
前述の本発明の様々な実施形態の記述は、例示および説明を目的として提示した。それは完全であること、または、本発明を開示した実施形態にだけに限定することを意図するものではない。数多くの修正または変更が上記教示に照らして可能である。論じた実施形態は、本発明の原理の最適な例示、およびその実用的な用途を提供して、当業者が、本発明を、意図する特定の用途に適した様々な実施形態で、および様々な修正を伴って利用できるように選択し、記述した。全てのかかる修正および変更は、適正、適法、且つ公正に与えられた範囲に従って解釈した添付の特許請求の範囲により決定される本発明の範囲内にある。
【図２Ａ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2009536518.tif 000024
【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図１】
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【図２Ｂ】
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【図１８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年1月9日(2009.1.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ干渉により、ｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシン遺伝子のＲＮＡを切断する単離された二本鎖短鎖干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）分子であって、（ａ）前記ｓｉＲＮＡ分子のそれぞれの鎖は約１９〜２１リボヌクレオチドの長さであり、（ｂ）前記ｓｉＲＮＡ分子の一本の鎖は、ＲＮＡ干渉により、ｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシンのＲＮＡを切断するための、配列番号３２、３３、３６、３８、４１、４４または４５から選ばれる、前記ｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシンのＲＮＡまたはその部分に相補的なリボヌクレオチド配列を含む、前記単離された二本鎖短鎖干渉リボ核酸分子。
【請求項２】
ヒト由来である、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項３】
ｓｉＲＮＡ１７、１８、２１、２３、２６、２９または３０のいずれかと少なくとも８０％同一である、請求項２に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項４】
配列番号４７、４８、５１、５３、５６または５９のいずれかから選ばれるリボ核酸配列を含む、請求項３に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項５】
薬学的に受容可能な担体において請求項１に記載のｓｉＲＮＡ分子を含む、アレルギー疾患を治療するための組成物。
【請求項６】
アレルギー疾患が、花粉症、気管支喘息、副鼻腔炎、呼吸窮迫症候群またはアレルギー性鼻炎である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ｓｉＲＮＡ分子がヒト由来である、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
ｓｉＲＮＡ分子が、ｓｉＲＮＡ１７、１８、２１、２３、２６、２９または３０のいずれかと少なくとも８０％同一である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
ｓｉＲＮＡ分子が、配列番号４７、４８、５１、５３、５６または５９のいずれかから選ばれるリボ核酸配列を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
ｇａｔａ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはエオタキシンの遺伝子の発現を抑制することにより、アレルギーを緩和する、アレルギー疾患を治療するための薬物を調製するための請求項１に記載のｓｉＲＮＡの使用。
【請求項１１】
ｓｉＲＮＡ分子がヒト由来である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
ｓｉＲＮＡ分子が、ｓｉＲＮＡ１７、１８、２１、２３、２６、２９または３０のいずれかと少なくとも８０％同一である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
ｓｉＲＮＡ分子が、配列番号４７、４８、５１、５３、５６または５９のいずれかから選ばれるリボ核酸配列を含む、請求項１２に記載の使用。
【国際調査報告】
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2009536518.tif 000043
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