(57)【要約】ＨＩＶのＥｎｖおよびＴａｔタンパク質の複合体は、ＴａｔまたはＥｎｖ単独に比較して免疫原として有利であるが、それらは、ワクチンアジュバントと組み合わせた場合、解離する。解離を回避するために、ＥｎｖおよびＴａｔの複合体を共有結合的な架橋の使用によって安定化させる。架橋の程度は、複合体の結合特性に対して重要であり、そしてＣＤに対してＥｎｖが特異的に結合する能力、および抗Ｔａｔモノクローナル抗体に対してＴａｔが特異的に結合する能力の消失を回避するように制御する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶのＥｎｖポリペプチドおよびＨＩＶのＴａｔポリペプチドを含む複合体であって、（ｉ）該ＥｎｖおよびＴａｔポリペプチドが共有結合され、かつ（ｉｉ）該複合体がＣＤ４に特異的に結合し得る、複合体。
【請求項２】
ＨＩＶのＥｎｖポリペプチドおよびＨＩＶのＴａｔポリペプチドを含む複合体を調製するためのプロセスであって、ＣＤ４に対してＥｎｖタンパク質が特異的に結合する能力を除去することなくＥｎｖおよびＴａｔポリペプチドが互いに共有結合するようになる反応条件下で、ＥｎｖおよびＴａｔポリペプチドを相互作用させる工程を包含する、プロセス。
【請求項３】
前記ＥｎｖおよびＴａｔがＨＩＶ−１由来である、請求項１〜２のいずれか一項に記載の複合体またはプロセス。
【請求項４】
前記ＥｎｖおよびＴａｔがＨＩＶ−１のＭ群由来である、請求項３に記載の複合体またはプロセス。
【請求項５】
前記ＥｎｖおよびＴａｔがサブタイプＢ株由来である、請求項４に記載の複合体またはプロセス。
【請求項６】
前記ＥｎｖおよびＴａｔがサブタイプＣ株由来である、請求項４に記載の複合体またはプロセス。
【請求項７】
前記ＥｎｖおよびＴａｔがホモ二官能性架橋剤を介して連結される、請求項１〜６のいずれか一項に記載される複合体またはプロセス。
【請求項８】
前記ＥｎｖおよびＴａｔがホルムアルデヒドまたはジアルデヒドとの反応を介して連結される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合体またはプロセス。
【請求項９】
前記ＥｎｖおよびＴａｔが本質的に１：１のモル比で存在する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合体またはプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に引用された全ての書類は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
（関連出願）
本出願は、2006年3月28日に出願された米国仮出願第60/786,947号（この出願は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００３】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、そして詳細には免疫原性タンパク質複合体の分野にある。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
ＨＩＶゲノム内でコードされる種々のタンパク質としては、エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）およびトランス活性化転写因子（Ｔａｔ）が挙げられる。
【０００５】
ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の両方で、Ｅｎｖタンパク質は、長い前駆体タンパク質として最初に発現され、これがその後に切断されて、外部膜糖タンパク質および膜貫通糖タンパク質が得られる。簡便のために、これらのタンパク質はその後に、標準的なＨＩＶ−１の命名法によって呼ばれ、すなわち、この前駆体は、「ｇｐ１６０」であり、この膜糖タンパク質は、「ｇｐ１２０」であり、そしてこの膜貫通糖タンパク質は「ｇｐ４１」である。これらの名称は、ＨＩＶ−１糖タンパク質の適切な分子量に基づく。
【０００６】
このｇｐ１２０タンパク質は、ＨＩＶビリオンの表面にあり、そして宿主細胞ＣＤ４レセプターと相互作用し得る。この相互作用は、ｇｐ１２０タンパク質において構造の遷移を誘発し、これがその「Ｖ３」ループの露出をもたらす。次いで、この構造変化されたｇｐ１２０タンパク質は、ウイルス進入機構の一部としてさらなる宿主レセプター、例えば、ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４と相互作用し得る。その表面露出のせいで、ｇｐ１２０は、ここ２０年にわたってＨＩＶワクチン研究の主な焦点であった。自然な感染の間に生じる抗Ｅｎｖ抗体が、一次ＨＩＶ単離体を中和することが見出されているが、同じことはＥｎｖに基づくサブユニットワクチンによって惹起される抗体については成り立たなかった。従って、Ｅｎｖに基づくワクチンの改良が必要である。
【０００７】
Ｔａｔタンパク質は、ＨＩＶ遺伝子発現を調節するのに重要である。これは転写因子であるが、これはまた、感染細胞によって放出されることが見出されており、ワクチン抗原として提唱されている。
【０００８】
引用文献１（特許文献１）は、複合体を形成するように相互作用し得るＥｎｖおよびＴａｔタンパク質を開示している。この相互作用は、Ｅｎｖタンパク質におけるＶ３ループの存在を必要とするとされる。Ｔａｔタンパク質はＣＣＲ５の構造的ループを模倣すると提唱される。複合体におけるＥｎｖおよびＴａｔタンパク質は、それらの自然な親和性に起因して会合され得るが、ジスルフィド結合を形成することによって、またはＢＳ３架橋剤（ビス（スルホスクシンイミジル）スベリン酸ホモ二官能性架橋剤）のようなタンパク質架橋技術を用いることによって強化され得る。ＥｎｖおよびＴａｔポリペプチドの組み合わせに基づくワクチンも引用文献２（非特許文献１）に開示される。
【特許文献１】国際公開第０５／０９０３９１号パンフレット
【非特許文献１】Ｅｎｓｏｌｉら、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ（２００５）７：１３９２−９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＨＩＶのＥｎｖおよびＴａｔタンパク質のさらなる複合体および改良された複合体を得ることがこの目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ＥｎｖおよびＴａｔタンパク質の複合体は、ＴａｔまたはＥｎｖの単独と比較して免疫原として有利であるが、それらは、ワクチンアジュバントと組み合わせた場合に解離され得る。従って、ＥｎｖおよびＴａｔの複合体は、共有結合的な架橋の使用によって安定化され得るが、架橋の程度がその複合体の結合特性に対して重要であることが見出されている。詳細には、Ｅｎｖタンパク質によるＣＤ４結合の消失、およびＴａｔタンパク質によるエピトープの喪失を生じるのには多すぎる架橋が見出されている。
【００１１】
従って、本発明は、ＨＩＶのＥｎｖポリペプチドおよびＨＩＶのＴａｔポリペプチドを含む複合体であって、（ｉ）この（ｉ）ＥｎｖおよびＴａｔポリペプチドが共有結合され、かつ（ｉｉ）この複合体はＣＤ４に特異的に結合し得る、複合体を提供する。
【００１２】
本発明はまた、ＨＩＶのＥｎｖポリペプチドおよびＨＩＶのＴａｔポリペプチドを含む複合体を調製するためのプロセスであって、ＥｎｖおよびＴａｔポリペプチドが、お互いに対して共有結合するようになり、ＣＤ４に対してＥｎｖタンパク質が特異的に結合する能力を失うことのない反応条件下で相互作用することを可能にする工程を包含するプロセスを提供する。
【００１３】
本発明はまた、ＨＩＶのＥｎｖポリペプチドおよびＨＩＶのＴａｔポリペプチドを含む複合体であって、（ｉ）このＥｎｖおよびＴａｔポリペプチドが共有結合され、かつ（ｉｉ）この複合体がＨＩＶのＴａｔタンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体に特異的に結合し得る、複合体を提供する。
【００１４】
本発明はまた、ＨＩＶのＥｎｖポリペプチドおよびＨＩＶのＴａｔポリペプチドを含む複合体を調製するためのプロセスであって、ＥｎｖおよびＴａｔポリペプチドが、お互いに対して共有結合するようになる反応条件下で相互作用することを可能にし、抗Ｔａｔモノクローナル抗体に対してＴａｔタンパク質が特異的に結合する能力を失うことのない工程を包含するプロセスを提供する。
【００１５】
本発明はまた、ＨＩＶのＥｎｖポリペプチドおよびＨＩＶのＴａｔポリペプチドを含む複合体であって、（ｉ）このＥｎｖおよびＴａｔポリペプチドが共有結合され、かつ（ｉｉ）この複合体がＣＤ４に特異的に結合し得、そして（ｉｉｉ）その複合体が、ＨＩＶのＴａｔポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体に特異的に結合し得る、複合体を提供する。
【００１６】
本発明はまた、ＨＩＶのＥｎｖポリペプチドおよびＨＩＶのＴａｔポリペプチドを含む複合体を調製するためのプロセスであって、ＥｎｖおよびＴａｔポリペプチドが、お互いに対して共有結合するようになり、ＣＤに対してＥｎｖポリペプチドが特異的に結合する能力を失うことなく、かつ抗Ｔａｔモノクローナル抗体に対してＴａｔポリペプチドが特異的に結合する能力を失うことのない反応条件下で相互作用することを可能にする工程を包含するプロセスを提供する。
【００１７】
（Ｅｎｖ／Ｔａｔ架橋）
ＥｎｖおよびＴａｔタンパク質は、本発明の複合体中で一緒に共有結合する。タンパク質を共有結合するための種々の方法は、当該分野で公知であり、例えば、引用文献３および４を参照のこと。例えば、共有結合は、ホモ二官能性（ｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）の架橋剤、ヘテロ二官能性の架橋剤または長さゼロの架橋剤の使用を包含し得る。これは、タンパク質中のスルフヒドリル基に対する試薬、タンパク質中のアミノ基に対する試薬、タンパク質中のカルボキシル基に対する試薬、チロシン選択性試薬、アルギニン特異的試薬、ヒスチジン特異的試薬、メチオニンアルキル化試薬、トリプトファン特異的試薬、セリン修飾試薬などを包含し得る。
【００１８】
本発明での使用のための架橋試薬の好ましい基としては、アルデヒドが挙げられ、そして詳細には、ホルムアルデヒドおよびジアルデヒドが挙げられる。適切なジアルデヒドとしては、グリオキサール、マロンジアルデヒド、スクシンアルデヒド（ｓｕｃｃｉｎｉａｌｄｅｈｙｄｅ）、アジポアルデヒド（ａｄｉｐａｌｄｅｈｙｄｅ）、α−ヒドロキシアジポアルデヒド（α−ａｄｉｐａｌｄｅｈｙｄｅ）、グルタルアルデヒドおよびフタルアルデヒドが挙げられる。グルタルアルデヒドおよびその誘導体が特に好ましく、これには２−メトキシ−２，４−ジメチルグルタルアルデヒド、３−メトキシ−２，４−ジメチルグルタルアルデヒドおよび３−メチルグルタルアルデヒドが挙げられ、ピリドキサールリン酸も用いられ得る。他のアミノ基指向性架橋剤としては、ビスイミドエステル、ビス−スクシンイミジル誘導体（例えば、ビス（スルホスクシンイミジル）スベリン酸、すなわち「ＢＳ３」）、二官能性アリールハライド、二官能性アシル化剤（ジ−イソシアネート、ジ−イソチオシアネート、二官能性スルホニルハライド、ビス−ニトロフェニルエステルおよび二官能性のアシルアジド）、ジケトン、ｐ−ベンゾキノン、２−イミノチオラン、エリトリトールビスカルボネート、ムコ臭素酸、ムコクロル酸、エチルクロロギ酸エステルおよびマルチジアゾニウム（ｍｕｌｔｉｄｉａｚｏｎｉｕｍ）化合物が挙げられる。
【００１９】
これらの試薬を用いてタンパク質を架橋するための方法は、当該分野で公知である。一般には、本発明は、Ｅｎｖポリペプチド、Ｔａｔポリペプチドおよび架橋試薬を、架橋反応が進行することを可能にする条件下で混合する工程を包含する。しかし、ヘテロ二官能性試薬を用いる工程のようないくつかの２工程手順では、２つのポリペプチドのうちの１つを、最初に架橋試薬と反応させて、活性化ポリペプチドを形成し、次いで、この活性化ポリペプチドを第二のポリペプチドと反応させる。
【００２０】
光反応性の基を有するヘテロ二官能性リンカーも有用である。リンカーが１つの熱反応性（ｔｈｅｒｍｏｒｅａｃｔｉｖｅ）基および１つの光反応性（ｐｈｏｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ）基を有するならば、第一の工程が、熱反応性基を介して結合し得、次いでこの複合体を形成するための結合が、例えば、ＵＶ光の使用によって開始され得る。別の方法では、光反応性基が最初に用いられてもよい。
【００２１】
上記で言及されるとおり、この架橋反応は、ＥｎｖおよびＴａｔタンパク質の臨界結合活性を排除するほど大きくない程度まで行われる。従って、このＥｎｖおよびＴａｔタンパク質の濃度、架橋試薬の濃度、ｐＨ、反応温度および反応時間は、所望の架橋の程度を得るように制御されてもよい。Ｅｎｖ、Ｔａｔおよび架橋試薬の特定の組み合わせを試験するならば、最初の一連の反応を行って、適切な反応条件を評価してもよい。
【００２２】
（複合体）
本発明の複合体としては、共有結合するＥｎｖおよびＴａｔタンパク質が挙げられる。好ましい複合体は、本質的に１：１のモル比のＥｎｖおよびＴａｔを有する。従って、Ｅｎｖが三量体の形態である場合、好ましい複合体は３つのＴａｔ単量体を含む。
【００２３】
複合体中のＥｎｖおよびＴａｔポリペプチドは好ましくは、ＨＩＶが、例えば両方ともＨＩＶ−１由来または両方ともＨＩＶ−２由来である場合、同じタイプである。同じＨＩＶタイプが用いられる場合、両方ともＭ群、Ｎ群またはＯ群由来である、例えば、ＨＩＶ−１内の同じ群由来のＥｎｖおよびＴａｔポリペプチドに連結することも有用である。Ｍ群内では、同じサブタイプ（またはクレード）由来、例えば、サブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＪまたはＫ由来のＥｎｖおよびＴａｔポリペプチドを連結することが有用である。ＣＲＦ（循環組み換え型（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｏｒｍ））サブタイプ、例えば、Ａ／ＢまたはＡ／ＥのＣＲＦ由来のＥｎｖまたはＴａｔを用いることも可能である。サブタイプがサブ−サブタイプを含むならば、ＥｎｖおよびＴａｔポリペプチドは、同じサブタイプ由来であってもよい。種々の群由来のＥｎｖおよびＴａｔを用いるなら、しかし、サブタイプおよび／またはサブ−サブタイプは除外されない、ＨＩＶ−１命名法は、引用文献５にさらに詳細に考察される。
【００２４】
サブタイプＢまたはＣ由来のＥｎｖおよびＴａｔの使用が好ましい。単一のサブタイプ（または適用可能、サブ−サブタイプ）内では、同じ株由来または異なる株由来のＥｎｖおよびＴａｔを用いることが可能である。例えば、ＥｎｖおよびＴａｔポリペプチドは、両方ともＳＦ１５２由来であってもよいし、または本発明は、１つの株（例えば、ＳＦ１６２）由来のＥｎｖおよび別の株（例えば、ＢＨ１０）由来のＴａｔを用いてもよい。
【００２５】
本発明のＥｎｖ／Ｔａｔ複合体は、（ａ）ＣＤ４および／または（ｂ）モノクローナル抗体（ＨＩＶのＴａｔポリペプチドに特異的に結合する）に特異的に結合し得る。従って、この複合体は、複合体でないＥｎｖポリペプチドのＣＤ４結合活性、および／または複合体でないＴａｔポリペプチドのｍＡｂ結合活性を保持する。結合活性（ａ）および（ｂ）の両方との複合体が特に好ましい。上で注記されるとおり、これらの２つの活性を保持するには、ＥｎｖとＴａｔの間に適切な程度の共有結合的な架橋を要する。この程度の架橋は、かなり広範な範囲内で変化し得、従って絶対的な正確さで制御される必要はないが、架橋が少なすぎれば、不安定な複合体がもたらされ、架橋が多すぎれば、結合活性は失われる。
【００２６】
複合体が特異的にＣＤ４に結合する場合、この結合活性は、例えば、引用文献６に記載されるように、公知のアッセイを用いて評価され得る。そのアッセイは、天然のＣＤ４を用いる必要はないが、ＣＤ４の外部ドメインに基づいて精製された可溶型のＣＤ４を用いることがさらに代表的である（例えば、引用文献６の実施例５を参照のこと）。ＣＤ４はまた、このアッセイを促進するために標識され得る。ＣＤ４は好ましくはヒトＣＤ４である。今まで少なくとも２５０個のＳＮＰがＣＤ４について記載されており、そして任意のこれらのポリペプチド、例えば、ＲＥＦＳＥＱ  ＣＤ４（ＧＩ：１０８３５１６７）が用いられてもよい。複合体でないＥｎｖは、特にＣＤ４に結合し、そしてこの特異的な結合活性は、Ｅｎｖ／Ｔａｔ複合体に保持され得る。結合活性は、除去されないが、実際の結合親和性は変化してもよい。
【００２７】
この複合体が抗Ｔａｔモノクローナル抗体に特異的に結合する場合、好ましいモノクローナル抗体は８Ｄ１．８であり、これは、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ＡＩＤＳ，ＮＩＡＩＤ，ＮＩＨ［７］から入手可能である。Ｔａｔ結合アッセイにおけるこの抗体の使用は、例えば、引用文献８〜１０において以前に開示されている。
【００２８】
架橋の間、Ｅｎｖ／Ｔａｔ複合体のより高次のオリゴマーが観察されている。本発明は、これらのオリゴマーを用いてもよく、これらのオリゴマーを形成していないＥｎｖ／Ｔａｔ複合体を用いてもよく、または両方の混合物を用いてもよい。オリゴマーが望ましくないならば、それらの形成は、適切な架橋条件を用いて回避されてもよく、またはそれらは、適切な分離技術、例えば、サイズに基づく技術などを用いて除かれてもよい。
【００２９】
（Ｅｎｖポリペプチド）
本発明の複合体は、ＨＩＶのＥｎｖポリペプチドを含み、そして種々の形態のＥｎｖポリペプチドがＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２から用いられ得る。例えば、この複合体は、全長ｇｐ１６０Ｅｎｖポリペプチド、ｇｐ１２０Ｅｎｖポリペプチド、ｇｐ１６０またはｇｐ１２０ポリペプチド（１つ以上の欠失を有する）、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０ポリペプチドを含む融合タンパク質などを含んでもよい。しかし、全長のＥｎｖ前駆体であるよりも、本発明は代表的には短くなったタンパク質を用いる。
【００３０】
ＲＥＦＳＥＱデータベース由来の全長ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ前駆体のアミノ酸配列（ＧＩ：９６２９３６３）は、下に示される８５６マー（本明細書においては配列番号１）である：
【００３１】
【化１】
2009531444.tif 000002
この野性型ＨＩＶ−１前駆体タンパク質を切断して、表面糖タンパク質ｇｐ１２０（例えば、配列番号１のアミノ酸２９〜５１１；本明細書においては配列番号２）および膜貫通ドメインｇｐ４１（例えば、配列番号１のアミノ酸５１２〜８５６；本明細書では配列番号３）を得る：
【００３２】
【化２】
2009531444.tif 000003
ｇｐ１２０領域内の超可変領域は、以下のように配置され、配列番号１：Ｖ１＝１３１〜１５７；Ｖ２＝１５７〜１９６；Ｖ３＝２９６〜３３１；Ｖ４＝３８５〜４１８；およびＶ５＝４６１〜４７１に従って番号付けされる。従って、ｇｐ１２０の全体的なＣ１−Ｖ１−Ｖ２−Ｃ２−Ｖ３−Ｃ３−Ｖ４−Ｃ４−Ｖ５−Ｃ５の配列内で、このサブドメインは以下のとおりである（配列番号２に従って番号付けされる）：１〜１０２；１０３〜１２９；１２９〜１６８；１６９〜２６７；２６８〜３０３；３０４〜３５６；３５７〜３９０；３９１〜４３２；４３３〜４４３；および４４４〜４８３。ＣＤ４結合に重要と特定されている残基としては（配列番号１に従って番号付けされる）Ａｓｐ−３６８、Ｇｌｕ−３７０、Ｔｒｐ−４２７、Ｖａｌ−４３０およびＰｒｏ−４３８が挙げられ、そして免疫優性（イムノドミナント）領域は、残基５８８〜６０７である。これらの特徴は、適切な配列アラインメントを行うことによって他のＨＩＶ−１  Ｅｎｖ配列において特定され得る。これらの特徴でアノテートされた、多数の株由来の事前に配列された配列はまた、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  ＨＩＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉａで見出され得る［１１］。
【００３３】
全長ＨＩＶ−２  Ｅｎｖ前駆体のアミノ酸配列（ＧＩ：２１４４９９６）は、下に示される８５２マーである（本明細書では配列番号４）：
【００３４】
【化３】
2009531444.tif 000004
このＨＩＶ−２  Ｅｎｖ前駆体タンパク質を切断して、表面糖タンパク質（例えば、配列番号４のアミノ酸２０〜５０２；本明細書においては配列番号５）および膜貫通ドメイン（例えば、配列番号４のアミノ酸５０３〜８５２；本明細書においては配列番号６）を得る：
【００３５】
【化４】
2009531444.tif 000005
超可変領域などは、ここでも、参照アラインメントによって、そしてＬｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  ＨＩＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉａにおけるアラインメントを参照して特定され得る。例えば、Ｖ３ループは、Ｃｙｓ−２９６〜Ｃｙｓ−３２９である。
【００３６】
用いられ得る他の特異的なＥｎｖ配列としては、引用文献１２〜１６に開示される配列が挙げられる。
【００３７】
上記で言及されるとおり、本発明は代表的には、短縮されたＥｎｖポリペプチドを用いる。この短縮は、全長配列からの１つ以上のアミノ酸の除去、例えば、Ｃ末端および／またはＮ末端での短縮、内部残基の欠失、サブドメインの除去［１７］、およびこれらのアプローチの組み合わせを包含する。
【００３８】
例えば、Ｅｎｖ前駆体の膜貫通ドメインおよび細胞質テールを除去することによってＥｎｖ前駆体の可溶型を作成することが公知である。このポリペプチドは、ｇｐ１２０配列およびｇｐ４１のエクトドメインを含み、「ｇｐ１４０」［１８］として公知であり、ｇｐ１２０よりも免疫原として優れていることが報告されている［１９］。このような前駆体は、そのＣ末端、例えば、配列番号１のＬｙｓ−６６５の後で短縮されて、配列番号１のアミノ酸Ｓｅｒ−２９〜Ｌｙｓ−６６５を有する６３７マーの成熟ｇｐ１４０配列（本明細書においては配列番号７）が得られる。従って、本発明のＥｎｖポリペプチドは、ｇｐ４１の一部を包含するが、その膜貫通ドメインは含まない。
【００３９】
Ｅｎｖ前駆体のＶ２ループ内の欠失を作成して、「ΔＶ２」変異体を得ることも公知である。例えば、４０マーのＶ２ループ内の１つ以上のアミノ酸が欠失されてもよい（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８またはそれ以上のアミノ酸）。Ｖ２ループ内の欠失は、Ｅｎｖポリペプチドの免疫原性を改善することが報告されている［２０、２１］。Ｖ２ループにおいて欠失および／または置換を有するＥｎｖポリペプチドは、本発明で好ましい。なぜなら、これらは、Ｅｎｖ／Ｔａｔ複合体を形成するのに特に有用であることが見出されているからである。詳細には、Ｅｎｖ／Ｔａｔ複合体は、そのＶ２ループが変異されない限り、単量体ｇｐ１２０では見られない。Ｖ２ループから欠失したアミノ酸は、他のアミノ酸で置換されてもよく、例えば、Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＧｌｙトリペプチドでＶ２ループの中央部分を置換することが公知である。例えば、ΔＶ２変異体は、以下の配列を有してもよい（配列番号８）：
【００４０】
【化５】
2009531444.tif 000006
ここで、１３０位置の「Ｘ」は、例えば４〜１５アミノ酸の間の変異体Ｖ２ループに相当する。本発明での使用のための特に好ましいＥｎｖポリペプチドはｇｐ１４０タンパク質であって、ＨＩＶ−１株ＳＦ１６２からΔＶ２変異を有する。その成熟型では、単一の配列の切断および分泌後（引用文献１２の図２４を参照のこと）、このポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する（配列番号９）：
【００４１】
【化６】
2009531444.tif 000007
ＨＩＶゲノムは、コンスタント・フラックス（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｆｌｕｘ）の状態であり、単離体の間の比較的高い程度の変動を示すいくつかのドメインを含むので、本発明は、公知のＨＩＶポリペプチドの正確な配列を有するＥｎｖポリペプチドの使用に限られない。従って、本発明に従って用いられるＥｎｖポリペプチドは以下から選択され得る：
（ｉ）配列番号１、２、４、５、７、８および９から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号１、２、４、５、７、８および９から選択されるアミノ酸配列に対して配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号１、２、４、５、７、８および９から選択されるアミノ酸配列に対して比較して、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の置換および／または欠失および／または挿入を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｉｖ）配列番号１、２、４、５、７、８および９から選択されるアミノ酸配列由来の少なくともｎ個の連続的なアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列を含み、ここでｎが７以上であるポリペプチド；あるいは
（ｖ）ペアワイズアラインメントを用いて配列番号１、２、４、５、７、８および９から選択されるアミノ酸配列と配列された場合、Ｎ末端からＣ末端に動くｘアミノ酸の各々のウインドウにおいて少なくともｘ・ｙ同一の配列された単量体を有するｐアミノ酸の配列を含むポリペプチドであって、ここで：ｐ＞ｘ；ｐ−ｘ＋１ウインドウがあり；ｘが２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００または８５０から選択され；ｙが０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８または０．９９から選択され；そしてｘ・ｙが整数でない場合最も近い整数に切り上げられる、ポリペプチド。
【００４２】
これらのポリペプチドは、配列番号１、２、４、５、７、８および９のホモログ、オルソログ、対立遺伝子改変体および変異体を含む。例えば、プロテアーゼに対する耐性を改善するために天然のＥｎｖ配列を変異することが公知である。このポリペプチドはまた、融合ポリペプチドを含み、ここではＥｎｖ配列が非Ｅｎｖ配列に融合されている。例えば、天然のリーダーペプチドなしのＥｎｖ配列を非Ｅｎｖタンパク質由来のリーダーペプチド（例えば、組織プラスミノゲン活性化因子由来）に融合することが公知である。
【００４３】
（ｉｉ）の範疇内では、配列同一性の程度は、５０％より大きくてもよい（例えば、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）。ポリペプチドの間の同一性は好ましくは、パラメーターのギャップ・オープン・ペナルティー＝１２およびギャップ・エクステンション・ペナルティー＝１を用いるアフィン・ギャップ検索を用いて、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）で実現されるようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジー検索プログラムによって決定される。
【００４４】
（ｉｉｉ）の範疇では、各々の置換は、単一のアミノ酸を包含し、各々の欠失は好ましくは、単一のアミノ酸を包含し、そして各々の挿入は好ましくは、単一のアミノ酸を包含する。これらの変化は、意図的に（例えば、部位特異的突然変異誘発によって）生じても、または自然に（例えば、ウイルス進化を通じて、または自然な変異を通じて）生じてもよい。（ｉｉｉ）の範疇のポリペプチドは、配列番号１、２、４、５、７、８または９に対して１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の単一のアミノ酸置換を有してもよい。これらのポリペプチドは配列番号１、２、４、５、７、８または９に対して１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の単一のアミノ酸欠失を有してもよい。これらのポリペプチドは、配列番号１、２、４、５、７、８または９に対して１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の単一のアミノ酸挿入を有してもよい。この置換、挿入および／または欠失は、別々の位置であってもよいし、または連続していてもよい。置換は、保存的、すなわち、関連の側鎖を有する別のアミノ酸でのあるアミノ酸の置換であってもよい。遺伝子コードされるアミノ酸は一般には、４つのファミリーに分けられる：（１）酸性、すなわち、アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性、すなわち、リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性、すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性、すなわち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは時に、芳香族アミノ酸として一緒に分類される。一般には、これらのファミリー内の単一のアミノ酸の置換は、生物学的な活性に大きな影響を有さない。種々の置換が、Ｅｎｖポリペプチドとの使用について記載されており、例えば、全長型で保持するポリペプチドを提供するために、ｇｐ１２０とｇｐ４１との間の切断部位を不活性にすること（例えば、Ｌｙｓ→Ｓｅｒ置換）、またはＶ３ループにおいて「クリッピング」部位を除去すること［２２］、またはグリコシル化部位、特にＮグリコシル化部位（すなわち、アスパラギン残基）を欠失もしくは置換することが公知である。
【００４５】
（ｉｖ）の範疇内では、ｎの値は、７より大きくても、例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０以上であってもよい。このフラグメントは、この配列の少なくとも１つのＴ細胞および／またはＢ細胞エピトープを含んでもよい。Ｔ細胞およびＢ細胞のエピトープは、経験的に特定されてもよいし（例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ［２３、２４］または類似の方法）、またはそれらは、予測されてもよい（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数［２５］、マトリックスベースのアプローチ［２６］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［２７］、天然のネットワーク［２８］、ＯｐｔｉＭｅｒ＆ＥｐｉＭｅｒ［２９，３０］、ＡＤＥＰＴ［３１］、Ｔｓｉｔｅｓ［３２］、親水性［３３］、抗原性指数［３４］または引用文献３５に開示される方法などを用いる）。
【００４６】
（ｖ）の範疇では、好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、デフォールトパラメーター（例えば、ギャップ・オープニング・ペナルティー＝１０．０、およびギャップ・エクステンション・ペナルティー＝０．５を用い、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いる）を用いる、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム［３６］である。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージにおけるニードル（ｎｅｅｄｌｅ）ツールで都合よく実現される［３７］。
【００４７】
Ｅｎｖポリペプチドは、ＨＩＶビリオン上でオリゴマー型で見出され、そして本発明で用いられる好ましいＥｎｖポリペプチドはまた、オリゴマーを、そして詳細には三量体を形成し得る。例えば、ｇｐ１４０のΔＶ２変異体は、三量体を形成することが示されている［２０］。下に考察されるとおり、Ｅｎｖ／Ｔａｔ複合体は、そのＶ２ループが変異されない限り、単量体ｇｐ１２０を用いて形成されないが、三量体ｇｐ１４０からＶ２変異を要することなく形成される。
【００４８】
本発明で用いられ得るＥｎｖポリペプチドのこの群内では、好ましい特徴は、このポリペプチドが、ＣＤ４に対して天然のＥｎｖが結合する能力を保持しなければならないということである。本発明のＥｎｖ／Ｔａｔ複合体がＣＤ４に特異的に結合し得るならば、この複合体のＥｎｖ成分はそれ自体が、ＣＤ４に対して、Ｔａｔの非存在下でさえ結合し得る。この複合体を作製する場合、例えば、ＣＤ４結合Ｅｎｖポリペプチドは、Ｔａｔポリペプチドと混合され、そしてＣＤ４結合活性は、複合体形成によって除かれないが、実際の結合親和性は変化し得る。
【００４９】
（Ｔａｔポリペプチド）
本発明の複合体は、ＨＩＶのＴａｔポリペプチドを包含し、そしてＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２由来の種々の形態のＴａｔポリペプチドが用いられ得る。Ｔａｔポリペプチドの長さは、ウイルス株に依存して変化する。ＲＥＦＳＥＱデータベース由来の全長ＨＩＶ−１  Ｔａｔポリペプチドのアミノ酸配列（ＧＩ：９６２９３５８）は、下に示される８６マーである（本明細書においては、配列番号１０）：
【００５０】
【化７】
2009531444.tif 000008
種々のＨＩＶ−１  Ｔａｔポリペプチド配列内で、Ｃｙｓ−２２およびＣｙｓ−３７が保存され、そして分子内ジスルフィド結合を形成する。ＲＫＫＲＲＱＲＲＲの９マーは、核局在化シグナルである。これらの特徴は、適切な配列アラインメントを行うことによって他のＨＩＶ−１  Ｅｎｖ配列中で特定され得る。これらの特徴でアノテートした、多数の株からの事前に整列させた配列はまた、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  ＨＩＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉａで見出され得る［１１］。
【００５１】
全長ＨＩＶ−２  Ｔａｔポリペプチドのアミノ酸配列（ＧＩ：４１０５６７８１）は、下に示される１３０マーである（本明細書においては、配列番号１１）：
【００５２】
【化８】
2009531444.tif 000009
これ、および他のＨＩＶ−２のＴａｔ配列のアラインメントは、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  ＨＩＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉａに見出され得る。
【００５３】
用いられ得る他の特異的なｔａｔ配列としては、引用文献１２〜１５および３８に開示される配列が挙げられる。
【００５４】
本発明での使用のための特に好ましいＴａｔポリペプチドは、ＨＩＶ−１株ＢＨ１０由来である。このポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する（配列番号１２：ＧＩ：６２２９１０２２）：
【００５５】
【化９】
2009531444.tif 000010
ＨＩＶゲノムは、コンスタント・フラックス（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｆｌｕｘ）の状態であり、そして単離体の間で比較的高い程度の変動を示すいくつかのドメインを含むので、本発明は、公知のＨＩＶポリペプチドの正確な配列を有するＴａｔポリペプチドの使用に限定されない。従って本発明に従って用いられるＴａｔポリペプチドは、以下から選択され得る：
（ｉ）配列番号１０、１１および１２から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号１０、１１および１２から選択されるアミノ酸配列に対して配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号１０、１１および１２から選択されるアミノ酸配列に対して比較して、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の置換および／または欠失および／または挿入を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｉｖ）配列番号１０、１１および１２から選択されるアミノ酸配列由来の少なくともｎ個の連続的なアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列を含み、ここでｎが７以上であるポリペプチド；あるいは
（ｖ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて配列番号１０、１１および１２から選択されるアミノ酸配列と配列された場合、Ｎ末端からＣ末端に動くｘアミノ酸の各々のウインドウにおいて少なくともｘ・ｙ同一の配列された単量体を有するｐアミノ酸の配列を含むポリペプチドであって、ここで：ｐ＞ｘである場合；ｐ−ｘ＋１ウインドウがあり；ｘが２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、または８５から選択され；ｙが０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８または０．９９から選択され；そしてｘ・ｙが整数でない場合、最も近い整数に切り上げられる、ポリペプチド。
【００５６】
これらのポリペプチドは、配列番号１０、１１および１２のホモログ、オルソログ、対立遺伝子改変体および変異体を含む。それらはまた、融合ポリペプチドを含み、ここではこのＴａｔ配列が、非Ｔａｔ配列に融合される。
【００５７】
（ｉｉ）の範疇では、配列同一性の程度は、５０％より大きくてもよい（例えば、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）。ポリペプチドの間の同一性は好ましくは、パラメーターのギャップ・オープン・ペナルティー＝１２およびギャップ・エクステンション・ペナルティー＝１を用いるアフィン・ギャップ検索を用いて、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）で実現されるようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジー検索プログラムによって決定される。
【００５８】
（ｉｉｉ）の範疇では、各々の置換は、単一のアミノ酸を包含し、各々の欠失は好ましくは、単一のアミノ酸を包含し、そして各々の挿入は好ましくは、単一のアミノ酸を包含する。これらの変化は、意図的に（例えば、部位特異的突然変異誘発によって）生じても、または自然に（例えば、ウイルス進化を通じて、または自然な変異を通じて）生じてもよい。（ｉｉｉ）の範疇のポリペプチドは、配列番号１０、１１または１２に対して１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の単一のアミノ酸置換を有してもよい。これらのポリペプチドは配列番号１０、１１または１２に対して１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の単一のアミノ酸欠失を有してもよい。これらのポリペプチドは、配列番号１０、１１または１２に対して１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の単一のアミノ酸挿入を有してもよい。この置換、挿入および／または欠失は、別々の位置であってもよいし、または連続していてもよい。上で言及されるとおり、置換は、保存的であってもよい。
【００５９】
（ｉｖ）の範疇内では、ｎの値は、７より大きくても、例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０以上であってもよい。このフラグメントは、この配列の少なくとも１つのＴ細胞および／またはＢ細胞エピトープを含んでもよい。上記のように、このようなエピトープは、経験的に特定されてもよいし、またはそれらは、予測されてもよい。
【００６０】
（ｖ）の範疇内では、好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、上記のような、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムである。
【００６１】
（薬学的組成物）
本発明の複合体は、免疫原性成分において活性成分として用いられ得る。これらの組成物は、免疫応答を惹起するために動物に投与され得る。この免疫応答としては好ましくは、体液性の応答（例えば、抗体応答、例えば、中和性の抗体応答）、ならびに／または、Ｅｎｖおよび／もしくはＴａｔに対する細胞性応答が挙げられる。ＨＩＶに既に感染している患者では、免疫応答は、感染の重篤度を軽減（例えば、ウイルス負荷を軽減）し得、そしてＨＩＶ感染のクリアランスさえ生じ得る。ＨＩＶに感染していない患者では、免疫応答は、将来のＨＩＶ感染のリスクを軽減し得、そして将来のＨＩＶ感染に対して防御さえし得る。免疫原性組成物の投与から生じるこれらの効果は、他の抗ＨＩＶストラテジーの使用、例えば、限定はしないが、ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、プロテアーゼインヒビター、進入インヒビター、融合インヒビターなどを含む抗ウイルス剤の投与によって増強され得るか、またはそれらを要するかもしれない。
【００６２】
免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の複合体を含む。「免疫学的に有効な量（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」とは、個体に対するその量の投与が、単一の用量でもまたは一連の一部としてでも、所望の処置または予防に有効であるということを意味する。この量は、処置されるべき個体の健康度および肉体的な条件、処置されるべき個体（例えば、非ヒト霊長類、霊長類、など）の分類群、固体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方、医学的状態の処置医師の評価、および他の関連の要因に依存して変化し得る。この量は、慣用的なトライアルを通じて決定され得る比較的広範な範囲内におさまり、そして１用量あたりの複合体の代表的な量は、抗原あたり１μｇ〜１０ｍｇの間であることが期待される。
【００６３】
本発明の免疫原性組成物は薬学的に受容可能である。それらは通常、その複合体に加えて成分を含む、例えば、それらは代表的には、１つ以上の薬学的なキャリアおよび／または賦形剤を含む。このような成分の詳細な考察は、引用文献３９で得られる。
【００６４】
組成物は一般には、水溶型である。
【００６５】
張度を制御するために、生理学的な塩、例えば、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは、１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在し得る。存在してもよい他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、無水リン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【００６６】
組成物は一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量モル浸透圧濃度を有し、そしてさらに好ましくは、２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内におさまる。
【００６７】
組成物は、１つ以上の緩衝液を含んでもよい。代表的な緩衝液としては以下が挙げられる：リン酸緩衝液；Ｔｒｉｓ緩衝液；ホウ酸塩緩衝液；コハク酸エステル緩衝液；ヒスチジン緩衝液；またはクエン酸塩緩衝液。緩衝液は代表的には、５〜２０ｍＭの範囲で含まれる。
【００６８】
組成物のｐＨは一般には５〜８、さらに代表的には６〜７の範囲である。
【００６９】
この組成物は好ましくは無菌である。この組成物は好ましくは、非発熱性であり、例えば、１用量あたり１ＥＵ（内毒素単位、標準的な指標）未満を、そして好ましくは１用量あたり０．１ＥＵ未満を含む。この組成物は好ましくはグルテンを含まない。
【００７０】
本発明の組成物は、界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステルサーファクタント（「Ｔｅｗｗｎｓ」として公知）、オクトキシノール（ｏｃｔｏｘｙｎｏｌ）（例えば、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）などを含んでもよい。
【００７１】
ワクチンは、約０．５ｍｌの投薬容積で投与され得る。
【００７２】
（ワクチンアジュバント）
本発明の組成物は有利には、組成物を投与される患者で惹起された免疫応答（体液性および／または細胞性）を増強するように機能し得るアジュバントを含んでもよい。本発明で用いられ得るアジュバントとしては、限定はしないが以下が挙げられる：
・ミネラル含有組成物であって、カルシウム塩およびアルミニウム塩（またはその混合物）を含む組成物。カルシウム塩は、リン酸カルシウム（例えば、引用文献４０に開示される「ＣＡＰ」粒子）を含む。アルミニウム塩としては、任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、非結晶）をとる塩との、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などが挙げられる。これらの塩に対する吸着が好ましい。ミネラル含有組成物はまた、金属塩の粒子として処方されてもよい［４１］。アルミニウム塩アジュバントは下にさらに詳細に記載される。
【００７３】
・水中油型エマルジョン（下にさらに詳細に記載されるような）。
【００７４】
・免疫刺激性オリゴヌクレオチド、例えば、Ｃｐｇモチーフ（グアノシンに対するリン酸結合によって結合される非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）を含むもの、ＴｐＧモチーフ［４２］、二本鎖ＲＮＡ、パリンドローム配列を含むオリゴヌクレオチド、またはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチド。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート改変のようなヌクレオチド改変／アナログを含んでもよく、そして二本鎖であっても、または（ＲＮＡを除く）一本鎖であってもよい。引用文献４３〜４５は、可能性のあるアナログ置換、例えば、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンでのグアノシンの置換を開示する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果はさらに、引用文献４６〜５１に考察される。ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９、例えば、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴに対して関連し得る［５２］。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）のように、Ｔｈ１免疫応答を誘導するのに特異的であり得、またはそれは、ＣｐＧ−ＢＯＤＮのようなＢ細胞応答を誘導するのにさらに特異的であり得る。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−ＢのＯＤＮは、引用文献５３〜５５に考察される。好ましくは、ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。好ましくはＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端がレセプター認識に到達可能であるように構築される。必要に応じて、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒｓ）」を形成するために２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が、それらの３’末端に付着されてもよい。例えば、引用文献５２および５６〜５８を参照のこと。有用なＣｐＧアジュバントはＣｐＧ７９０９であり、これはＰｒｏＭｕｎｅ（商標）（Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）としても公知である。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは代表的には、少なくとも２０ヌクレオチドを含む。それらが含むのは、１００ヌクレオチドより少なくてもよい。
【００７５】
・３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（「３ｄＭＰＬ」であって、「ＭＰＬ（商標）」としても公知）［５９〜６２］。３−ｄＭＰＬは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトセレス（ｈｅｐｔｏｓｅｌｅｓｓ）変異体から調製されており、そして脂質Ａと化学的に類似であるが、酸性の不安定なホスホリル基および塩基性の不安定なアシル基を欠く。３ｄＭＰＬの調製はもともと、引用文献６３に記載された。３ｄＭＰＬは、そのアシル化によって変化する（例えば、異なる長さであり得る、３、４、５または６つのアシル鎖を有する）、関連分子の混合物の形態をとってもよい。２つのグルコサミン（２−デオキシ−２−アミノ−グルコースとしても公知）単糖は、それらの２位置の炭素で（すなわち、２位置および２’位置で）Ｎアシル化され、そしてまた３’位置にＯ−アシル化が存在する。
【００７６】
・イミダゾキノリン化合物、例えば、イミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（「Ｒ−８３７」）［６４、６５］、レシキモド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）（「Ｒ−８４８」）［６６］、およびそれらのアナログ；ならびにそれらの塩（例えば、塩酸塩）。免疫刺激性のイミダゾキノリンについてのさらなる詳細は、引用文献６７〜７１に見出され得る。
【００７７】
・チオセミカルバゾン化合物、例えば、引用文献７２に開示されるもの。活性な化合物について処方する、製造する、そしてスクリーニングする方法はまた、引用文献７２に記載される。このチオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αのようなサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核球の刺激において特に有効である。
【００７８】
・トリプタンスリン（ｔｒｙｐｔａｎｔｈｒｉｎ）化合物、例えば、引用文献７３に開示されるもの。活性な化合物について処方する、製造する、そしてスクリーニングする方法はまた、引用文献７３に記載される。このチオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αのようなサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核球の刺激において特に有効である。
【００７９】
・ヌクレオチドアナログ、例えば：（ａ）イサトラビン（Ｉｓａｔｏｒａｂｉｎｅ）（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：
【００８０】
【化１０】
2009531444.tif 000011
およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）引用文献７４〜７６に開示される化合物；（ｆ）以下の式：
【００８１】
【化１１】
2009531444.tif 000012
を有する化合物であって、
ここで：
Ｒ１およびＲ２が各々独立して、Ｈ、ハロ、−ＮＲａＲｂ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、Ｃ１−６アルキル、または置換Ｃ１−６アルキルであり；
Ｒ３が、存在しないか、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり；
Ｒ４およびＲ５が各々独立して、Ｈ、ハロ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキルであるか、または一緒に結合して５員の環をＲ４−５：
【００８２】
【化１２】
2009531444.tif 000013
の中において形成し：
この結合は、
【００８３】
【化１３】
2009531444.tif 000014
によって示される結合で得られ、
Ｘ１およびＸ２は各々独立して、Ｎ、Ｃ、ＯまたはＳである；
Ｒ８は、Ｈ、ハロ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、−ＯＨ、−ＮＲａＲｂ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｒｃ、−Ｏ−（Ｃ１−６アルキル）、−Ｓ（Ｏ）ｐＲｅ、または−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄであり；
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリルまたはＲ９ａであり、
ここでＲ９ａが：
【００８４】
【化１４】
2009531444.tif 000015
であり、
この結合は、
【００８５】
【化１５】
2009531444.tif 000016
によって示される結合で得られ、
Ｒ１０およびＲ１１は各々独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＲａＲｂ、または−ＯＨであり；
各々のＲａおよびＲｂが独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、Ｃ６−１０アリールであり；
各々のＲｃは独立して、Ｈ、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、Ｃ１−６アルキル、または置換Ｃ１−６アルキルであり；
各々のＲｄは各々独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、−ＮＨ（置換Ｃ１−６アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−Ｎ（置換Ｃ１−６アルキル）２、Ｃ６−１０アリールまたはヘテロシクリルであり；
各々のＲｅは独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アリール、置換Ｃ６−１０アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり；
各々のＲｆは独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩であり；
各々のｎは独立して、０、１、２または３であり；
各々のｐは独立して、０、１、２または３であるか；あるいは
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの薬学的に受容可能な塩、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの互変異性体、またはその互変異性体の薬学的に受容可能な塩。
【００８６】
・ロキソリビン（７−アリル−８−オキソグアノシン）［７７］。
【００８７】
・引用文献７８に開示される化合物であって、以下を含む化合物：アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドライソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン（ＢＩＱ）化合物［７９、８０］、ヒドラプタラミド（Ｈｙｄｒａｐｔｈａｌａｍｉｄｅ）化合物、ベンゾフェノン化合物、イソオキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物［８１］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラザロピリミジン化合物およびベンザゾール化合物［８２］。
【００８８】
・引用文献８３に開示される化合物であって、３，４−ジ（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、スタウロスポリンアナログ、誘導体化ピリダジン、クロメン−４−オン、インドリノン、キナゾリン、およびヌクレオシドアナログを含む化合物。
【００８９】
・アミノアルキルグルコサミニドリン酸塩誘導体、例えば、ＲＣ−５２９［８４、８５］。
【００９０】
・ホスファゼン、例えば、引用文献８６および８７に記載されるような、ポリ［ジ（カルボキシルアトフェノキシ）ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」）。
【００９１】
・低分子免疫賦活薬（ｉｍｍｕｎｏｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒｓ）（ＳＭＩＰ）、例えば：
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−エチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−ペンチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロプ−２−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−（２−メチルプロピル）−２−［（フェニルメチル）チオ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
１−（２−メチルプロピル）−２−（プロピルチオ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エタノール
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エチルアセテート
４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−｛４−アミノ−２−［メチル（プロピル）アミノ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル｝−２−メチルプロパン−２−オール
１−｛４−アミノ−２−（プロピルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル｝−２−メチルプロパン−２−オール
Ｎ４，Ｎ４−ジベンジル−１−（２−メトキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン。
【００９２】
・サポニン［引用文献１１８の第２２章］は、ステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種の群であり、これは、広範な種類の植物種の樹皮、葉、幹、根および花からさえ見出される。Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａのＭｏｌｉｎａの木の樹皮からのサポニンは、アジュバントとして広範に研究されている。サポニンはまた、Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ）、およびＳａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ｓｏａｐ  ｒｏｏｔ）から商業的に入手され得る。サポニンアジュバント処方物としては、精製処方物、例えば、ＱＳ２１、ならびに液体処方物、例えば、ＩＳＣＯＭｓが挙げられる。ＱＳ２１は、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）として市販される。サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されている。これらの技術を用いる特定の精製された画分が特定されており、これにはＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の産生方法は、引用文献８８に開示される。サポニン処方物はまた、ステロール、例えば、コレステロールを含んでもよい［８９］。サポニンおよびコレステロールの組み合わせを用いて、免疫刺激性複合体（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘｓ）（ＩＳＣＯＭｓ）と呼ばれる固有の粒子を形成してもよい［引用文献１１８の第２３章］。ＩＳＣＯＭはまた代表的には、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンのようなリン脂質を包含する。任意の公知のサポニンがＩＳＣＯＭで用いられてもよい。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡ＆ＱＨＣのうちの１つ以上を包含する。ＩＳＣＯＭはさらに引用文献８９〜９１に記載される。必要に応じて、ＩＳＣＯＭＳはさらなる界面活性剤を欠いてもよい［９２］。サポニンベースのアジュバントの開発の概説は、引用文献９３および９４に見出され得る。
【００９３】
・細菌のＡＤＰリボシル化毒素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」、コレラ毒素「ＣＴ」、または百日咳毒素「ＰＴ」）およびその無毒化誘導体、例えば、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２として公知の変異毒素［９５］。粘膜アジュバントとしての無毒化ＡＤＰリボシル化毒素の使用は、引用文献９６に記載されており、そして引用文献９７においては非経口アジュバントとして記載されている。
【００９４】
・生体接着材料および粘膜付着材、例えば、エステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア［９８］またはキトサンおよびその誘導体［９９］。
【００９５】
・微小粒子（すなわち、直径で約１００ｎｍ〜１５０μｍ、より好ましくは直径で約２００ｎｍ〜３０μｍ、または直径で約５００ｎｍ〜１０μｍの粒子）であって、生分解性でかつ非毒性である物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオリトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成され、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）が好ましく、必要に応じて、負に荷電された表面（例えば、ＳＤＳで）または正に荷電された表面（例えば、陽イオン性界面活性剤、例えば、ＣＴＡＢで）を有するように処理された、微小粒子。
【００９６】
・リポソーム（引用文献１１８の第１３章および１４章）。アジュバントとしての使用に適切なリポソーム処方物の例は、引用文献１００〜１０２に記載される。
【００９７】
・ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル［１０３］。このような処方物はさらに、オクトキシノール［１０４］と組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステルサーファクタント、ならびにポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステルサーファクタントを、少なくとも１つのさらなる非イオン性サーファクタント、例えば、オクトキシノールと組み合わせて含む［１０５］。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス（ｌａｕｒｅｔｈ）９）、ポリオキシエチレン−９−ステロイルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステロイルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【００９８】
・ムラミルペプチド、例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（「ｔｈｒ−ＭＤＰ」）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（「ＤＴＰ−ＤＰＰ」、または「Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標）」、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチレンアミン（「ＭＴＰ−ＰＥ」）。
【００９９】
・第二のグラム陰性細菌由来のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）調製物と組み合わされた第一のグラム陰性細菌から調製された外部膜タンパク質プロテアソーム調製物であって、ここで外部膜タンパク質プロテアソームおよびＬＰＳ調製物が安定な非共有結合性のアジュバント複合体を形成する調製物。このような複合体は、「ＩＶＸ−９０８」、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外部膜およびＬＰＳからなる複合体を包含する。
【０１００】
・メチルイノシン５’−一リン酸塩（「ＭＩＭＰ」）［１０６］。
【０１０１】
・ポリヒドロキシル化ピロリジン化合物［１０７］、例えば、以下の式：
【０１０２】
【化１６】
2009531444.tif 000017
を有する化合物であって、
Ｒが、水素、直鎖または分枝した、非置換または置換の、飽和したまたは不飽和のアシル、アルキル（例えば、シクロアルキル）、アルケニル、アルキニルおよびアリール基、またはその薬学的に受容可能な塩もしくは誘導体を含む群より選択される。例としては限定はしないが以下が挙げられる：カスアリン（ｃａｓｕａｒｉｎｅ）、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリンなど。
【０１０３】
・γインスリン［１０８］またはその誘導体、例えば、アルガムリン（ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ）。
【０１０４】
・引用文献１０９に記載されるような、構造式Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩの化合物、またはその塩：
【０１０５】
【化１７】
2009531444.tif 000018
、例えば、「ＥＲ８０３０５８」、「ＥＲ８０３７３２」、「ＥＲ８０４０５３」、「ＥＲ８０４０５８」、「ＥＲ８０４０５９」、「ＥＲ８０４４４２」、「ＥＲ８０４６８０」、「ＥＲ８０４７６４」、「ＥＲ８０３０２２」、または「ＥＲ８０４０５７」、例えば：
【０１０６】
【化１８】
2009531444.tif 000019
【０１０７】
【化１９】
2009531444.tif 000020
・ＯＭ−１７４のようなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来の脂質Ａの誘導体（引用文献１１０および１１１に記載される）。
【０１０８】
・陽イオン性脂質および（通常は天然の）コ−脂質の処方物、例えば、アミノプロピル−ジメチル−ミリストールイルオキシ−プロパンアミニウム（ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｉｕｍ）ブロミド−ジフィタノイルホスファチジル−エタノールアミン（「Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（商標）」）またはアミノプロピル−ジメチル−ビス−ドデシルオキシプロパンアミニウムブロミド−ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン（「ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ」）。（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（シン−９−テトラデセニルオキシ）−１−プロパンアミニウム塩を含む処方物が好ましい［１１２］。
【０１０９】
・リン酸塩含有非環式骨格に連結された脂質含有化合物、例えば、ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４［１１３、１１４］：
【０１１０】
【化２０】
2009531444.tif 000021
これらおよび他のアジュバント活性物質は、引用文献１１８および１１９にさらに詳細に考察される。
【０１１１】
組成物は、このアジュバントの２つ以上を含んでもよい。
【０１１２】
組成物中の抗原およびアジュバントは、代表的には混合される。
【０１１３】
水中油型エマルジョンアジュバント
水中油型エマルジョンはアジュバントとして特に有用である。種々のこのようなエマルジョンが公知であり、そしてそれらは代表的には少なくとも１つのオイルおよび少なくとも１つのサーファクタントを含み、そしてこのオイルおよびサーファクタントは、生分解性（代謝可能）で、かつ生体適合性である。エマルジョン中の油滴は一般には直径５μｍ未満であり、サブミクロンの直径を有してさえよく、これらの小さいサイズは、安定なエマルジョンを得るためにマイクロフルイダイザーで達成される。濾過滅菌に供することができるので、サイズが２２０ｎｍ未満の小滴が好ましい。
【０１１４】
本発明は、動物（例えば、魚）または植物供給源由来のオイルのようなオイルと用いられてもよい。植物油のための供給源としては、ナッツ、種子、および穀類が挙げられる。ピーナツ油、大豆油、ココナツ油およびオリーブ油が最も一般的に入手可能であり、堅果油が例証される。例えば、ホホバマメ（ｊｏｊｏｂａ  ｂｅａｎ）から得られるホホバ油が用いられ得る。種油としては、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ（種子）油、ゴマ油などが挙げられる。穀物群では、コーン油は、最も容易に入手可能であるが、他の穀物、例えば、コムギ、カラスムギ、ライムギ、イネ（米）、テフ（ｔｅｆｆ）、ライコムギなどのオイルも用いられてもよい。６〜１０炭素の脂肪酸エステルのグリセロールおよび１，２−プロパンジオールは、種油には天然には存在しないが、ナッツおよび種油から出発する適切な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製され得る。哺乳動物の乳汁由来の脂肪およびオイルは代謝可能であり、従って、本発明の実施において用いられ得る。動物の供給源から純粋なオイルを得るために必要な分離、精製、けん化および他の手段のための手順は、当該分野で周知である。ほとんどの魚は、容易に回収可能である代謝性オイルを含む。例えば、タラの肝油、サメの肝油および鯨油、例えば、鯨ろうが、例示される魚油のいくつかであり、これが本明細書で用いられてもよい。多数の分枝鎖オイルが、５炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、そして一般にはテルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレンとして公知の、分枝した、不飽和のテルペノイド、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサンを含み、これが本明細書において特に好ましい。スクアレンに対する飽和アナログであるスクアランはまた、好ましいオイルである。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、市販の供給源から容易に入手可能であるか、または当該分野で公知の方法によって得られてもよい。他の好ましいオイルはトコフェロールである（下を参照のこと）。オイルの混合物が用いられてもよい。
【０１１５】
サーファクタントは、それらの「ＨＬＢ」（ヒドロフィル／リポフィルのバランス）によって分類され得る。本発明の好ましいサーファクタントは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、そしてさらに好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、サーファクタントとともに用いられてもよく、サーファクタントとしては限定はしないが以下が挙げられる：ポリオキシエチレンソルビタンエステルサーファクタント（Ｔｗｅｅｎｓと一般に呼ばれている）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；ＤＯＷＦＡＸ（商標）という商標で販売される、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば、直鎖ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；オクトキシノールであって、反復するエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数を変化し得るもので、オクトキシノール−９（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に目的のものである；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊサーファクタントとして公知）、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）；ならびにソルビタンエステル（ＳＰＡＮとして一般に公知）、例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５）およびソルビタンモノラウレート。エマルジョンに含まれるのに好ましいサーファクタントは、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎＸ−１００である。サーファクタントの混合物、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５混合物が用いられてもよい。
【０１１６】
本発明で有用な特異的な水中油型エマルジョンアジュバントとしては、限定はしないが以下が挙げられる：
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ８０およびＳｐａｎ８５のサブミクロンのエマルジョン。容積あたりのエマルジョンの組成物は、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０および約０．５％のＳｐａｎ８５であってもよい。重量に関しては、これらの比は、４．３％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０および約０．４８％のＳｐａｎ８５になる。このアジュバントは、引用文献１１８の第１０章、および引用文献１１９の第１２章にさらに詳細に記載されるように、「ＭＦ５９」として公知である［１１５〜１１７］。このＭＦ５９エマルジョンは有利には、クエン酸イオン、例えば、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液を含む。
【０１１７】
・スクアレン、トコフェロールおよびＴｗｅｅｎ８０のエマルジョン。このエマルジョンはリン酸緩衝化生理食塩水を含んでもよい。これはまた、Ｓｐａｎ８５（例えば、１％で）および／またはレシチンを含んでもよい。これらのエマルジョンは、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のトコフェロールおよび０．３〜３％のＴｗｅｅｅｎ８０を有してもよく、そしてスクアレン：トコフェロールの重量比は好ましくは１以下であり、これによって、より安定なエマルジョンが得られる。このようなエマルジョンの１つは、ＰＢＳ中にＴｗｅｅｎ８０を溶解して２％の溶液を得ること、次いでこの溶液と、ある混合物（５ｇのＤＬ−αトコフェロールおよび５ｍｌのスクアレン）の９０ｍｌを混合すること、次いで、この混合物を微小流体化することによって作成され得る。この得られたエマルジョンは、サブミクロンの油滴、例えば、１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径を有してもよい。
【０１１８】
・スクアレン、トコフェロールおよびＴｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）のエマルジョン。
【０１１９】
・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ１２１」）のエマルジョン。このエマルジョンは、リン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４の中で処方され得る。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバント中でトレオニル−ＭＤＰと用いられ得る［１２０］（０．０５〜１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクアラン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％のポリソルベート８０）。これはまた、「ＡＦ」アジュバント中で、Ｔｈｒ−ＭＤＰなしでも用いられ得る［１２１］（５％のスクアラン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％のポリソルベート８０）。微小流体化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓａｔｉｏｎ）が好ましい。
【０１２０】
・０．５〜５０％のオイル、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性サーファクタントを有するエマルジョン。引用文献１２２に記載されるとおり、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロンの小滴サイズが有利である。
【０１２１】
・代謝性でないオイル（例えば、軽油）および少なくとも１つのサーファクタント（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ８０またはＳｐａｎ８０）のサブミクロンの水中油型エマルション。添加物、例えば、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−脂溶性結合体（例えば、グルクロン酸のカルボキシル基を介したデサシルサポニンへの脂肪族アミンの付加によって生成される、引用文献１２３に記載される、ＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドおよび／またはＮ．Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンが含まれてもよい。
【０１２２】
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）がヘリカル・ミセルとして会合されるエマルジョン［１２４］。
【０１２３】
そのエマルジョンは、送達の時点で、その場で抗原と混合されてもよい。従って、そのアジュバントおよび抗原は、使用の時点で最終処方の準備がととのった、別々にパッケージされるかまたは分配されたワクチン中に保持されてもよい。この抗原は一般には、そのワクチンが２つの液体を混合することによって最終的に調製されるように、水溶型である。混合のための２つの液体の容積比は、変化してもよい（例えば、５：１〜１：５）が、一般には１：１である。
【０１２４】
アルミニウム塩アジュバント
水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知のアジュバントが用いられてもよい。これらの名称は慣習的であるが、存在する実際の化合物の正確な説明ではなく、簡便のために用いられているに過ぎない（例えば、引用文献１１８の第９章を参照のこと）。本発明は、アジュバントとして一般的に使用される任意の「水酸化物（ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）」または「リン酸塩（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）」アジュバントを用いてもよい。
【０１２５】
「水酸化アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）」として公知のアジュバントは代表的には、オキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは通常少なくとも部分的に結晶である。化学式ＡｌＯ（ＯＨ）で提示され得るオキシ水酸化アルミニウムは、他のアルミニウム化合物、例えば、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３から、赤外線（ＩＲ）分光法によって、詳細には、１０７０ｃｍ−１の吸着バンドおよび３０９０−３１００ｃｍ−１の強力なショルダーの存在によって識別され得る［引用文献１１８の第９章］。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度の程度は、半分の高さでの回折帯の幅（ｗｉｄｔｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｂａｎｄ  ａｔ  ｈａｌｆ  ｈｅｉｇｈｔ）（ＷＨＨ）によって反映され、結晶粒子が乏しければより小さい結晶サイズに起因する、より大きい広幅化を示している。表面積は、ＷＨＨが増大するにつれて増大し、そしてより高いＷＨＨ値を有するアジュバントほど、有する抗原吸着の能力が大きいことが見られている。線維の形態（例えば、透過電子顕微鏡でみられる）は、水酸化アルミニウムアジュバントに代表的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは代表的には、約１１であり、すなわちこのアジュバント自体が、生理学的なｐＨで正の表面電荷を有する。ｐＨ７．４での１ｍｇのＡｌ＋＋＋あたり１．８〜２．６ｍｇというタンパク質の吸着能力が、水酸化アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【０１２６】
「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは代表的には、アルミニウムヒドロキシホスフェートであり、しばしば少量の硫酸塩（すなわち、ヒドロキシリン酸アルミニウム硫酸塩）を含む。それらは、沈澱によって得られてもよく、そして沈澱の間の反応の条件および濃度が、塩におけるヒドロキシルのリン酸塩の置換の程度に影響する。ヒドロキシリン酸塩は一般には、０．３〜１．２の間のＰＯ４／Ａｌのモル比を有する。ヒドロキシリン酸塩は、ヒドロキシル基の存在によって厳密なＡｌＰＯ４から識別され得る。例えば、３１６４ｃｍ−１（例えば、２００℃に加熱された場合）のＩＲスペクトルのバンドは、構造的なヒドロキシルの存在を示す［引用文献１１８の第９章］。
【０１２７】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋のモル比は一般的には０．３〜１．２の間、好ましくは０．８〜１．２の間、そしてより好ましくは０．９５±０．１である。リン酸アルミニウムは一般には、特にヒドロキシリン酸塩については非結晶である。代表的なアジュバントは、０．６ｍｇのＡｌ３＋／ｍｌで含まれる、０．８４〜０．９２のＰＯ４／Ａｌモル比を有する非結晶性ヒドロキシリン酸アルミニウムである。リン酸アルミニウムは一般には、粒子性である（例えば、透過電子顕微鏡でみられるプレート状の形態）。粒子の代表的な直径は、任意の抗原吸着後に０．５〜２０μｍ（例えば、約５〜１０μｍ）の範囲である。ｐＨ７．４で１ｍｇのＡｌ＋＋＋あたり０．７〜１．５ｍｇのタンパク質という吸着能力が、リン酸アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【０１２８】
リン酸アルミニウムのゼロ荷電のポイント（ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｚｅｒｏ  ｃｈａｒｇｅ）（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルのリン酸塩の置換の程度に反比例し、そしてこの置換の程度は、沈澱によって塩を調製するために用いられる反応条件および反応物の濃度に依存して変化し得る。ＰＺＣはまた、溶液中で遊離のリン酸塩イオンの濃度を変化することによって（リン酸塩が多ければ＝より酸性ＰＺＣである）、またはヒスチジン緩衝液のような緩衝液を添加することによって（ＰＺＣをさらに塩基性にさせる）変更される。本発明に従って用いられるリン酸アルミニウムは一般には、４．０〜７．０、より好ましくは５．０〜６．５、例えば、約５．７のＰＺＣを有する。
【０１２９】
本発明の組成物を調製するために用いられるアルミニウム塩の懸濁物は、緩衝液（例えば、リン酸塩またはヒスチジンまたはＴｒｉｓ緩衝液）を含んでもよいが、これは、常に必要というわけではない。この懸濁液は好ましくは無菌であってかつ発熱物質を含まない（パイロジェンフリー）である。懸濁液は、１．０〜２０ｍＭ、好ましくは５〜１５ｍＭ、そしてさらに好ましくは約１０ｍＭの濃度で例えば存在する遊離の水溶性リン酸イオンを含んでもよい。その懸濁液はまた塩化ナトリウムを含んでもよい。
【０１３０】
本発明は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物を用い得る。この場合、水酸化アルミニウムよりも多くのリン酸アルミニウムが存在してもよい。例えば、少なくとも２：１、例えば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１などの重量比。
【０１３１】
患者に対する投与のための組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は好ましくは、１０ｍｇ／ｍｌ未満である。例えば≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなど。好ましい範囲は、０．３〜１ｍｇ／ｍｌである。
【０１３２】
（本発明のキット）
ある組成物が、患者に対する送達のための２つの成分、例えば、Ｅｎｖ／Ｔａｔ複合体およびアジュバントを含む場合、これらは、製造の間に混合されてもよいし、またはそれらは、送達の時点で即席に混合されてもよい。従って、本発明は、混合の準備が整った種々の成分を含むキットを提供する。このキットによって、アジュバントおよび複合体は、使用時点まで別々に保持することが可能になる。この構成は水中油型エマルジョンアジュバントを用いる場合、特に有用である。
【０１３３】
この成分は、キット内でお互いから物理的に隔てられ、そしてこの分離は、種々の方法で達成され得る。例えば、２つの成分が、バイアルのような２つの別々の容器内にあってもよい。次いで、２つのバイアルの成分は、例えば、１つのバイアルの内容物を除去すること、そしてそれらを他のバイアルに添加することによって、または両方のバイアルの内容物を別々に取り出してそれらを第三の容器中で混合することによって、混合されてもよい。
【０１３４】
好ましい構成では、キットの構成要素の１つは、シリンジ中にあり、そして他は、バイアルのような容器中にある。このシリンジは、混合のために第二の容器中にその内容物を挿入するために（例えば、ニードル（ハリ）とともに）用いられてもよく、次いで、その混合物は、シリンジ中に吸引されてもよい。次いで、そのシリンジの混合された内容物は、代表的には新しい無菌のニードルを通じて患者に投与されてもよい。シリンジ中に１成分をパッキングすることによって、患者投与のために別のシリンジを用いる必要がなくなる。
【０１３５】
別の好ましい構成では、２つのキット構成要素を、一緒に、ただし同じシリンジ、例えば、引用文献１２５〜１３２などに開示されるシリンジなどの二重−チャンバ（ｄｕａｌ−ｃｈａｍｂｅｒ）シリンジ中に別々に保持する。このシリンジが作動されれば（例えば、患者への投与の間）、２つのチャンバの内容物が混合される。この構成によって、使用時点における別々の混合工程の必要性が回避される。
【０１３６】
このキット成分は一般には水溶型である。ある構成では、ある成分（代表的には、アジュバント成分ではなく抗原成分）は、乾燥型（例えば、凍結乾燥型）であり、他の成分が水性型としてある。この２つの成分は、乾燥成分を再活性化して患者への投与のための水性成分を得るために混合され得る。凍結乾燥成分は代表的には、シリンジでなくバイアル内に配置される。乾燥された成分は、安定化剤、例えば、ラクトース、スクロースまたはマンニトール、ならびにその混合物、例えば、ラクトース／スクロース混合物、スクロース／マンニトール混合物などを包含し得る。１つの可能な構成では、プレ・フィルド（ｐｒｅ−ｆｉｌｌｅｄ）シリンジ中の水性アジュバント成分、およびバイアル中の凍結乾燥された抗原成分を用いる。
【０１３７】
（処置の方法、およびワクチンの投与）
本発明は、患者において免疫応答を惹起する方法を提供し、この方法は、この患者に対して本発明の組成物を投与する工程を包含する。本発明の組成物はヒト患者に投与するために特に適切であるが、また研究目的のため、抗血清を惹起するためなどのために他の哺乳動物に投与されてもよい。
【０１３８】
本発明はまた、医薬としての投与のための本発明のキットまたは組成物を提供する。
【０１３９】
本発明はまた、患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造における本発明のＥｎｖ／Ｔａｔ複合体の使用を提供する。
【０１４０】
本発明の組成物は種々の方法で投与され得る。最も好ましい免疫経路は、注射による（例えば、筋肉内、皮下、静脈内）であるが、他の利用可能な経路としては限定はしないが、経鼻、口腔、皮内、皮下、経皮、肺内などが挙げられる。
【０１４１】
処置は、単回用量スケジュールまたは複数用量スケジュールによってもよい。複数用量は、（プライム）初回免疫スケジュールおよび／またはブースター（追加）免疫スケジュールで用いられ得る。複数用量スケジュールでは、種々の用量が同じまたは異なる経路、例えば、非経口の初回および粘膜の追加、粘膜の初回および非経口の追加などで与えられてもよい。２回以上の用量（代表的には２用量）の投与が代表的である。複数の用量が代表的には、少なくとも１週間あけて投与される（例えば、約２週、約３週、約４週、約６週、約８週など）。
【０１４２】
（全般）
「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含む、からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含する。例えば、ある組成物が、Ｘを「含む（ｃｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、排他的にＸからなってもよいし、または何か追加のものを含んでもよい、例えばＸ＋Ｙ。
【０１４３】
「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」という言葉は、「完全に（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ）」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｆｒｅｅ）」組成物は、完全にＹを含まなくてもよい。必要に応じて、「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」という言葉は、本発明の定義から省略されてもよい。
【０１４４】
「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、ある数値ｘに関して、例えばｘ±１０％を意味する。
【０１４５】
特に言及しない限り、２つ以上の成分を混合する工程を包含するプロセスは、なんら特異的な順序の混合を必要としない。従って、成分は任意の順序で混合されてもよい。３つの成分が存在するならば、２つの成分をお互いと合わせ、次いでその組み合わせを第三の成分と組み合わせるなどしてもよい。
【０１４６】
動物（そして特にウシ）の物質を細胞の培養に用いる場合、それらは感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）のない、そして詳細には、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）のない供給源から得られるべきである。全体として、動物由来の材料の全くなしで細胞を培養することが好ましい。
【０１４７】
タンパク質または複合体が特定の標的（例えば、ＣＤ４またはモノクローナル抗体に対して）「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」場合、これは代表的には、その標的に対して、コントロールのタンパク質に対してよりも、例えば、ＣＤ３に対してよりも、または抗Ｒｅｖ抗体に対してよりも、少なくとも１０倍大きい親和性で結合する。特異的な結合および非特異的な結合は、標準的な技術によって、例えば、相互作用に対するコントロールのタンパク質の影響をチェックすることによって、用量応答性をチェックすることによってなどによって識別され得る。
【０１４８】
「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、任意の長さのアミノ酸ポリマーをいう。このポリマーは直鎖であってもまたは分枝であってもよく、これは修飾されたアミノ酸を含んでもよく、そしてこれは非アミノ酸によって解釈されてもよい。この用語はまた、天然にもしくは介入によって改変されているアミノ酸ポリマーを包含する；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、ホスホリル化または任意の他の操作もしくは修飾、例えば、標識成分との結合体化。また、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、天然でないアミノ酸などを含む）および当該分野で公知の他の改変体を含むポリペプチドもこの定義に含まれる。ポリペプチドは、単鎖または会合された鎖として存在してもよい。本発明のポリペプチドは、天然にまたは天然でなくグリコシル化されてもよい（すなわち、このポリペプチドは、対応する天然に存在するポリペプチドに見出されるグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する）。
【０１４９】
本発明での使用のためのＥｎｖおよびＴａｔポリペプチドは、多くの方法で、例えば、化学合成によって（全体または部分的に）、プロテアーゼを用いてより長いポリペプチドを消化することによって、ＲＮＡからの翻訳によって、細胞培養物から（例えば、組み換え発現から）の精製によって、生物体自体から（例えば、細菌培養後、または患者から直接）などによって調製されてもよい。４０アミノ酸長未満のペプチドの産生のための好ましい方法は、インビトロの化学合成を包含する［１３３、１３４］。ｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ［１３５］化学に基づく方法などの固相のペプチド合成が特に好ましい。酵素的な合成［１３６］も、部分的にまたは完全に用いられ得る。化学合成とは別に、生物学的な合成を用いてもよく、例えば、ポリペプチドは翻訳によって生成されてもよい。これはインビトロでおこなっても、またはインビボでおこなってもよい。生物学的な方法は一般に、Ｌアミノ酸に基づくポリペプチドの産生に限定されるが、翻訳機構（例えば、アミノアシルｔＲＮＡ分子）の操作を用いることによって、Ｄアミノ酸（または他の非天然のアミノ酸、例えば、ヨードチロシンまたはメチルフェニルアラニン、アジドホモアラニンなど）の導入を可能にしてもよい［１３７］。しかし、Ｄアミノ酸が導入される場合、化学合成を用いることが好ましい。本発明のポリペプチドは、Ｃ末端および／またはＮ末端で共有結合的な修飾を有してもよい。
【０１５０】
ＥｎｖおよびＴａｔポリペプチドは、種々の形態をとり得る（例えば、天然、融合、グリコシル化、非グリコシル化、脂質化、非脂質化、リン酸化、非リン酸化、ミリストイル化、非ミリストイル化、単量体、マルチマー、微粒子、変性など）。Ｅｎｖについては、オリゴマーのグリコシル化ポリペプチドが好ましい。単量体ポリペプチドが好ましい。
【０１５１】
ＥｎｖおよびＴａｔポリペプチドは好ましくは、精製されるか、または実質的に精製された形態、すなわち、他のポリペプチドを実質的に含まない（例えば、天然に存在するポリペプチドを含まない）、特に他のＨＩＶもしくは宿主細胞のポリペプチドを実質的に含まない形態で提供され、そして一般には、少なくとも約５０％純粋（重量で）、そして通常は少なくとも約９０％純粋、すなわち、約５０％未満、そしてさらに好ましくは約１０％未満（例えば、５％以下）の組成物が、他の発現されたポリペプチドから作成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１５２】
（本発明を行うための方式）
（ＥｎｖおよびＴａｔの非共有結合）
４つの形態のＥｎｖタンパク質を、ＨＩＶ−１のＳＦ１６２株から調製した：ｇｐ１２０；ｇｐ１２０ΔＶ２；ｇｐ１４０；およびｇｐ１４０ΔＶ２。ｇｐ１２０分子は、単量体であるが、ｇｐ１４０分子は三量体である。これらの４つのタンパク質は、前に記載されている（例えば、引用文献１２、１３８および１３９）。要するに、ＨＩＶ−１  ＳＦ１６２およびＨＩＶ−１  ＳＦ１６２ΔＶ２単離体由来のＥｎｖエクトドメインをコードする配列を、前に記載されたように［１３８］コドン改変して、２．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩＤＮＡフラグメントとして合成的に構築した。この遺伝子カセットは、効率的な分泌のためにヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ（ＴＰＡ）シグナル配列にインフレームで融合されたＥｎｖタンパク質のタンパク質コード領域を含んだ。コードされたオリゴマータンパク質のオリゴマー構造を安定化するために、Ｅｎｖポリペプチドにおける一次（ＲＥＫＲ）および二次（ＫＡＫＲＲ）プロテアーゼ切断部位を改変した［１３８］。得られたＥｎｖ発現カセット（ｇｐ１２０ＳＦ１６２、ｇｐ１２０ＳＦ１６２ΔＶ２、ｇｐ１４０ＳＦ１６２およびｇｐ１４０ＳＦ１６２ΔＶ２）を、２９３細胞の一過性トランスフェクションのため、そしてまた安定なＣＨＯ細胞株の発達のためにｐＣＭＶ３発現ベクターのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ部位にクローニングした。このベクターは、サイトメガロウイルスのエンハンサー／プロモーターエレメント、アンピシリン耐性遺伝子、ならびにジヒドロ葉酸還元酵素および減弱ネオマイシン耐性タンパク質から構成される融合タンパク質をコードする配列を含む。
【０１５３】
ｇｐ１２０ＳＦ１６２、ｇｐ１２０ΔＶ２ＳＦ１６２、ｇｐ１４０ＳＦ１６２およびｇｐ１４０ＳＦ１６２ΔＶ２を分泌する安定なＣＨＯ細胞株は、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子における二重の欠失を有するＤＧ−４４細胞を用いること、従って、前に記載された実験プロトコールに従う、増殖培地に対するヒポキサンチン、グリシンおよびチミジンの添加に依存して細胞株を作成することによって誘導された［１３８、１３９］。
【０１５４】
目的のタンパク質を産生するＣＨＯ細胞クローンを用いて、各々のタンパク質について３リットルのバイオリアクターに播種した。バイオリアクターを、細胞の密度、ｐＨ、ＣＯ２およびＯ２濃度などについて毎日モニターした。分泌されたＥｎｖの構造、構成および発現のレベルを毎週モニターした。最高のプロデューサークローン由来の物質を、１００ｋＤａの細孔サイズの膜フィルターを通じて２０倍に濃縮して、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのＥＧＴＡの存在下で−８０℃で保管した。
【０１５５】
全てのエンベロープタンパク質を、前に記載されたストラテジーに従って精製した［１３９］。要するに、濃縮されたＣＨＯ細胞上清を、２０ｍＭのＴｒｉｓ−１００ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で平衡にしたＧａｌａｎｔｈｕｓ  Ｎｉｖａｌｉｓのアガロースカラム（ＧＮＡ）上にロードした。結合したＥｎｖを５００ｍＭのメチルマンノースピラノシドで溶出した。ＧＮＡカラム後の溶出液を、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．０）を含有する緩衝液で平衡にしたＤＥＡＥカラム上にロードした。これらの条件下で、Ｅｎｖは、カラムには結合せず、しかし混入したタンパク質は、このカラム上に保持される。このＤＥＡＥのフロー・スルー（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）は、１０ｍＭのＰＯ４濃度に調節して、ｐＨを６．８に調節して、そしてそのフロー・スルーを、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．８）を含有する緩衝液で平衡にしたセラミック・ヒドロキシアパタイト（ＣＨＡＰ）カラム上にロードさせた。これらの条件下で、ｅｎｖタンパク質は、ＣＨＡＰカラムに結合せず、そしてこのフロー・スルー中で回収された。精製プロセスの間、画分を、標準的な方法に従って、そしてまたＣＤ４レセプター結合アッセイにおいて、還元および変性の下ならびに天然の条件の下でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分析した。ゲルをクマーシー・ブリリアント・ブルーで染色するか、または免疫ブロッティングのために処理した。Ｖ２ループの有無のあるＥｎｖ単量体を含む全ての画分をプールして、濃縮し、そして−８０℃で凍結保存した。ｏ−ｇｐ１４０ＳＦ１６２およびｏ−ｇｐ１４０ＳＦ１６２ΔＶ２を含有するピーク画分をプールして、濃縮し、そして１０ｍＭのＮａＣｉｔｒａｔｅに加えて３００ｍＭのＮａＣｌで平衡にされた１６×９０ｍｍのＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラムで分画して、三量体から単量体を分離した。三量体高次構造にＥｎｖタンパク質を含有する画分をプールして、濃縮し、そして用いるまで−８０℃で凍結して保持した。
【０１５６】
ＢＨ１０株由来のＴａｔタンパク質も発現させて精製した。
【０１５７】
Ｆａｒ−Ｗｅｓｔｅｒｎ分析を用いて、これらのＥｎｖとＴａｔタンパク質との間の相互作用を研究する。要するに、ＴａｔおよびＥｎｖタンパク質の公知の量を、４℃で２時間インキュベートして、複合体を形成する。次いで、５μｌのモノクローナル抗Ｔａｔ抗体（４．３ｍｇ／ｍｌ）を添加し、そしてその混合物を一晩４℃でインキュベートした。次いで、５０μｌのプロテインＡ（プロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ、５０％溶液）を添加し、そしてその混合物を攪拌しながらさらに２時間、４℃でインキュベートした。次いで、その混合物を３回洗浄して、５０μｌの容積中で４×サンプル緩衝液中に溶出した。次いでその溶出されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そして半乾性のトランスファーを用いてニロトセルロース上に転写した。得られたブロットを、抗Ｅｎｖポリクローナルウサギ抗体とともに最初にインキュベートした。そのブロットを洗浄して、アレクサ・フルオア（ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ）７８０に結合体化された抗ウサギ二次抗体とともにインキュベートした。次いでブロットをＯｄｙｓｓｅｙ赤外線検出器で読み取った。
【０１５８】
図１は、１μｇのＴａｔおよび８μｇのＥｎｖを用いる、Ｆａｒ−Ｗｅｓｔｅｒｎ分析の結果を示す。バンドはレーン２、３、４および６において明らかに可視である。図２は、レーン１〜４における標識強度の定量的分析を示しており、これはＥｎｖ／Ｔａｔ混合物を含む。最低の強度は、レーン１（ｇｐ１２０の単量体）である。レーン２（ｇｐ１２０ΔＶ２の単量体）およびレーン３（ｇｐ１４０の三量体）は、類似の強度を示した。最強の強度は、レーン４に示された（ｇｐ１４０ΔＶ２三量体）。
【０１５９】
１μｇのＴａｔおよび種々の量のＥｎｖ（図３）を用いるさらなる実験によって、ＥｎｖとＴａｔとの間の相互作用が特異的であることが確認された。
【０１６０】
逆の実験では、Ｅｎｖの量を固定して、ただし種々の量のＴａｔを用い、異なる結果がみられた。ＥｎｖおよびＴａｔを１：２というＥｎｖ：Ｔａｔの質量比で混合した場合、最高の相互作用が観察された。増えた量のＴａｔは、Ｅｎｖ結合に対して有害な影響を有した（図４）。
【０１６１】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、速度実験においてＥｎｖ／Ｔａｔ結合の強度を決定した。その結果（図５）によって、Ｆａｒ−Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイの結果が確認された。ｇｐ１４０ΔＶ２三量体（図５Ａ）、ｇｐ１４０三量体（図５Ｂ）、およびｇｐ１２０ΔＶ２単量体（図５Ｃ）の解離定数は、それぞれ、２２ｎＭ、３７ｎＭおよび９１ｎＭであった。ｇｐ１２０単量体は、試験されたいずれの濃度でも、そして異なる実験条件下でさえＴａｔに結合しなかった。
【０１６２】
さらなるＳＰＲ実験では、Ｔａｔタンパク質を、ＣＭ４チップに固定して、サブタイプＣ株ＴＶ１由来のＥｎｖタンパク質に曝した。種々の濃度（６３、１２５、２５０、および１０００ｎＭ）のいずれかの天然のＥｎｖ三量体（ｏ−ｇｐ１４０ＴＶ１）またはΔＶ２−Ｅｎｖ三量体（ｏ−ｇｐ１４０ＤＶ２ＴＶ１）を試験した。図１５は、その結果を示す。
【０１６３】
Ｔａｔによるｇｐ１２０に対する結合の欠失が、機能的に不活性なｇｐ１２０に起因するか否かを決定するために、全てのＥｎｖタンパク質を、機能的な活性の予測因子としてそれらがＣＤ４に結合する能力について分析した。４つ全てのＥｎｖタンパク質が、予想される範囲の解離定数でＣＤ４に結合した（図６）。従って、単量体のｇｐ１２０は機能的であった。
【０１６４】
ＴａｔおよびＥｎｖの三量体の間の相互作用はまた、遊離の溶液における等温滴定熱量分析（ＩＴＣ）を用いて検討した。予備的なＩＴＣデータは、前の実験と一致しており、このことは、ｇｐ１４０三量体が、ｇｐ１４０ΔＶ２三量体よりも弱くＴａｔに結合することを示している（図７）。このデータはまた、Ｅｎｖ三量体が３つのＴａｔ分子に結合する、例えば、各々のＥｎｖ単量体が単一のＴａｔ結合部位を有することを示唆している。
【０１６５】
Ｅｎｖタンパク質に対するＴａｔ結合の部位を検討するために、ＣＤ４との結合相互作用を比較した。Ｔａｔは、ＣＤ４に対する結合について競合しないので、ＴａｔおよびＣＤ４についてのＥｎｖ上の結合部位は異なるとみなされる。
【０１６６】
（ＥｎｖおよびＴａｔの共有結合）
Ｅｎｖ／Ｔａｔ複合体を安定化するために、ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドを、図１４に図示される反応スキームに従い架橋試薬として用いた。それらは、１８の異なる条件下で試験した：
【０１６７】
【化２１】
2009531444.tif 000022
得られた複合体を、種々の基準で試験した、この基準としては以下が挙げられる：Ｅｎｖの存在；Ｔａｔの存在；架橋の性質；エピトープの保存；および結合活性の保存。コントロールの複合体をまた、架橋なしで用いた。
【０１６８】
ＥｎｖおよびＴａｔタンパク質を、上記のとおり混合した。架橋試薬を、種々の濃度で添加して、その反応を、種々の期間進行させた。反応をクエンチし、次いで透析を用いて未反応の架橋試薬を除去した。次いで、その複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、Ｆａｒ−Ｗｅｓｔｅｒｎ分析、ＳＰＲおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。
【０１６９】
図８は、標識のために抗Ｔａｔ抗体を用いるウエスタンブロットを示す。１８の反応条件のうち、遊離のＴａｔは、ナンバー４〜６および１３〜１５に存在せず、分子量の種として代わりに泳動された。従って、４〜８時間の０．０１％〜０．０４％の間のグルタルアルデヒド架橋というのが、有効な共有結合架橋のための条件の原型的なセットである。
【０１７０】
図９は、グルタルアルデヒドを０．０２％、０．０４％または０．０８％で用いた後、（９Ａ）抗Ｔａｔまたは（９Ｂ）抗Ｅｎｖ抗体を用いるウエスタンブロットを示す。これらの結果によって、ＥｎｖおよびＴａｔは両方とも、共有結合した高ＭＷ複合体として遊走することが確認された。還元および変性の条件下での、図９におけるのと同じ複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、２５０ｋＤａより大きい複合体、そしてこの種の強度は、架橋試薬の濃度とともに増大することが確認される。
【０１７１】
ＥｎｖのＣＤ４結合活性に対する架橋の効果を検討した。図１１は、図９において分析された同じ複合体のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す。比較のために、架橋のないＥｎｖ／Ｔａｔ複合体、純粋なＥｎｖ、純粋なＴａｔ、および事前に架橋した等モルのＥｎｖ／Ｔａｔ混合物（「ＳＭ」）も分析した。この共有結合されたタンパク質は、ＣＤ４に対して結合する能力を保持する（レーン１および４、そして６も比較する）。ＳＰＲを同様の分析に用いた（図１２）。架橋の程度が増大するにつれてＣＤ４結合はｇｐ１４０ΔＶ２に対して減少するが、０．０８％のサンプル中でさえ明白なままであり、そして陰性コントロールでみられるレベルをかなり上回って保持される。
【０１７２】
Ｔａｔエピトープに対する架橋の効果も検討した。図１３は、ＳＰＲ分析の結果を示す。ＥｎｖによるＣＤ４結合に関しては、架橋のレベルの増大によってエピトープ結合活性が減少するが、０．０８％のサンプルでさえ明白なままであり、コントロールをかなり上回って保持される。
【０１７３】
従って、これらの結果を組み合わせれば、ＥｎｖおよびＴａｔは、安定な複合体を形成するように共有結合的に架橋されてもよく、そしてそれらの結合活性は、機能的なレベルで維持され得ることが示される。
【０１７４】
本発明は、ほんの一例として記載されており、そして本発明の範囲および趣旨内に保持されたまま改変がなされ得るということが理解される。
【０１７５】
参考文献（これらの内容は、参考として本明細書に援用される）
【０１７６】
【化２２】
2009531444.tif 000023
【０１７７】
【化２３】
2009531444.tif 000024
【０１７８】
【化２４】
2009531444.tif 000025
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】図１は、Ｆａｒ−Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイの結果を示す。レーンは以下である：（１）ｇｐ１２０およびＴａｔ；（２）ｇｐ１２０ΔＶ２およびＴａｔ；（３）ｇｐ１４０およびＴａｔ；（４）ｇｐ１４０ΔＶ２およびＴａｔ；（５）ｇｐ１２０およびＣＤ４；ならびに（６）ｇｐ１２０、ＣＤ４およびＥｎｖ。
【図２】図２は、任意の単位で測定した、図１由来の結果の定量的分析を示す。
【図３】図３は、ＥｎｖおよびＴａｔについてＦａｒ−Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイを４つの異なるＥｎｖ濃度で示す。
【図４】図４は、ＥｎｖおよびＴａｔについてのＦａｒ−Ｗｅｒｔｅｒｎアッセイを３つの異なるＥｎｖ：Ｔａｔ比で示す。
【図５】図５は、ＥｎｖについてのＳＰＲの結果をＴａｔ（図５）で示す。Ｅｎｖタンパク質は以下であった：（Ａ）ｇｐ１４０ΔＶ２；（Ｂ）ｇｐ１４０；（Ｃ）ｇｐ１２０ΔＶ２；および（Ｄ）ｇｐ１２０。このＸ軸は、時間（秒）を示し、そしてＹ軸は相対単位を示した。各々のグラフの５つの異なる線は、異なるＥｎｖ濃度であり、これは１０００ｎＭおよび４つの連続的２倍希釈である。
【図６】図６は、ＥｎｖについてのＳＰＲの結果をＣＤ４（図６）で示す。Ｅｎｖタンパク質は以下であった：（Ａ）ｇｐ１４０ΔＶ２；（Ｂ）ｇｐ１４０；（Ｃ）ｇｐ１２０ΔＶ２；および（Ｄ）ｇｐ１２０。このＸ軸は、時間（秒）を示し、そしてＹ軸は相対単位を示した。各々のグラフの５つの異なる線は、異なるＥｎｖ濃度であり、これは１０００ｎＭおよび４つの連続的２倍希釈である。
【図７】図７は、（Ａ）ｇｐ１４０および（Ｂ）ｇｐ１４０ΔＶ２のＩＴＣ分析をＴａｔで示す。上のパネルでは、Ｘ軸は、時間（分）を示し、そしてＹ軸は、μｃａｌ／秒を示す。下のパネルでは、Ｘ軸は、モル比を示し、そしてＹ軸は、注入物のｋｃａｌ／モルを示す。
【図８】図８は、異なる条件下で異なる架橋試薬とともにインキュベートしたＥｎｖ／Ｔａｔ複合体のウエスタンブロットを示す。遊離のＴａｔは、ブロットの底にむかって示され得る。
【図９】図９は、（９Ａ）抗−Ｔａｔまたは（９Ｂ）抗Ｅｎｖ抗体を用いた４つのＥｎｖ／Ｔａｔ複合体のウエスタンブロットを示す。レーンは以下である：（１）０．０２％グルタルアルデヒド；（２）０．０４％のグルタルアルデヒド；（３）０．０８％のグルタルアルデヒド；そして（４）非架橋剤。ＭＷマーカーは、１５、２５、３０、３５、５０、７５、１０５、１６０および２５０ｋＤａである。
【図１０】図１０は、同じ複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ＭＷマーカーは、１５、２５、３０、３５、５０、７５、１０５、１６０および２５０ｋＤａである。
【図１１】図１１は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を示す。プロット１〜４は、図８および９のレーン１〜４にマッチする。プロット５は、Ｔａｔ単独であり、そしてプロット６はＥｎｖ単独である。プロット７はＳＭである。２つの矢印は、Ｅｎｖ結合したＣＤ４（左側）および遊離のＣＤ４（右側）を示す。
【図１２】図１２は、図８および９のレーン１〜３と同じ３つの架橋された複合体について、およびｇｐ１４０ΔＶ２についてもＳＰＲプロットを示す。図１２Ａおよび１３Ａの４つの線は、上から下に以下のとおりである：ｇｐ１４０ΔＶ２；０．０２％；０．０４％；および０．０８％。このＸ軸は、時間（秒）を示し、そしてＹ軸は、相対単位（ＲＵ）を示す。図１２Ｂおよび１３Ｂは、４つのサンプルについて、そしてまた陰性のコントロール（緩衝液のみ）についてピークＲＵ値を示す。
【図１３】図１３は、図８および９のレーン１〜３と同じ３つの架橋された複合体について、およびｇｐ１４０ΔＶ２についてもＳＰＲプロットを示す。図１２Ａおよび１３Ａの４つの線は、上から下に以下のとおりである：ｇｐ１４０ΔＶ２；０．０２％；０．０４％；および０．０８％。このＸ軸は、時間（秒）を示し、そしてＹ軸は、相対単位（ＲＵ）を示す。図１２Ｂおよび１３Ｂは、４つのサンプルについて、そしてまた陰性のコントロール（緩衝液のみ）についてピークＲＵ値を示す。
【図１４】図１４は、ＥｎｖおよびＴａｔの共有結合架橋についての一般的な反応スキームを図示する。
【図１５】図１５は、サブタイプＣ株由来のＥｎｖでのＳＰＲの結果を示す。このｙ軸は、相対的な単位を示し、そしてｘ軸は、時間（秒）を示す。各々の線は異なるＥｎｖ濃度である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年2月2日(2009.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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