(57)【要約】  本発明は、非肝臓組織由来の幹細胞から肝幹細胞を誘導する方法を提供する。本発明の一実施形態では、肝幹細胞は脂肪幹細胞から誘導される。本発明はまた、ＡＳＣから肝サイトカイン生成（例えば、ＨＧＦ）を促進する方法を提供する。この方法は、インビボ移植時において肝臓組織の再生において有用である。また、培地条件を含む組織培養条件についても提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
非肝幹細胞から肝幹細胞を誘導する方法であって、
（ａ）非肝臓組織から誘導した幹細胞を得ること、及び
（ｂ）前記幹細胞を、少なくとも１つの線維状基質タンパク質を含んで構成される細胞外基質及び肝細胞成長因子（ＨＧＦ）含んで構成される無血清培地で培養すること、
を含んで構成され、
前記非肝臓組織から誘導した前記幹細胞は、肝幹細胞に分化する、
肝幹細胞誘導方法。
【請求項２】
前記非肝臓組織は、脂肪組織である、請求項１に記載の肝幹細胞誘導方法。
【請求項３】
前記非肝臓組織は、成体哺乳類から得た組織である、請求項１に記載の肝幹細胞誘導方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの線維状基質タンパク質は、Ｉ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンからなる群より選択される、請求項１に記載の肝幹細胞誘導方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの線維状基質タンパク質は、Ｉ型コラーゲンである、請求項４に記載の肝幹細胞誘導方法。
【請求項６】
前記培地は、更に、オンコスタチンＭ若しくはＤＭＳＯ又はその両方を含んで構成される、請求項１に記載の肝幹細胞誘導方法。
【請求項７】
前記細胞外基質は、更に、フィブロネクチン、マトリゲル若しくはビトロゲン又はこれらの組み合わせを含んで構成される、請求項１に記載の肝幹細胞誘導方法。
【請求項８】
前記非肝臓組織から誘導した前記幹細胞の約７０％超は、肝幹細胞に分化する、請求項１に記載の肝幹細胞誘導方法。
【請求項９】
非肝臓組織から誘導した前記幹細胞は、継代培養により誘導したものである、請求項１に記載の肝幹細胞誘導方法。
【請求項１０】
非肝幹細胞からＨＧＦ発現を誘導する方法であって、
（ａ）非肝臓組織から誘導した幹細胞を得ること、及び
（ｂ）前記幹細胞を、少なくとも１つの線維状基質タンパク質を含んで構成される細胞外基質、及びＥＧＦ又はｂＦＧＦ若しくはこの両方を含んで構成される無血清培地で培養すること、
を含んで構成され、
前記非肝臓組織から誘導した前記幹細胞は、ＨＧＦを生成する、
ＨＧＦ発現誘導方法。
【請求項１１】
前記培地は、ＥＧＦ及びｂＦＧＦを含んで構成される、請求項１０に記載のＨＧＦ発現誘導方法。
【請求項１２】
前記培地は、更に、アスコルビン酸二リン酸ナトリウムを含んで構成される、請求項１０に記載のＨＧＦ発現誘導方法。
【請求項１３】
前記培地は、更に、アスコルビン酸二リン酸ナトリウムを含んで構成される、請求項１１に記載のＨＧＦ発現誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００６年４月２５日に出願した米国仮出願第６０／７９４，５０８号及び２００７年３月９日に出願した米国仮出願第６０／８９４，１２８号の便益を主張し、そのすべての内容は、参照により本開示に含まれるものである。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、概略的には、細胞療法分野に関する。より詳細には、本発明は、非肝臓組織由来の幹細胞からの肝幹細胞の誘導に関する。
【背景技術】
【０００３】
米国だけでも数千の肝臓が、肝炎、肝臓毒素暴露及び肝硬変による肝不全に脅かされている。米国において肝臓疾患に直接掛かる医療費用は年間で６００億ドルから１０００億ドル超と推定される。更に、障害に対して、毎年２００億〜４００億ドルが米国社会保障庁から患者とその家族に支払われている。また、残念なことに現時点では、待期処置を除き肝臓移植が患者にとっての唯一の治療法である。
【０００４】
しかしながら、実際にはドナーから提供される臓器が不足しているため、肝臓移植待ち患者全体の３分の１未満しか移植を受けることができない。全米臓器配分機関（ＵＮＯＳ）によれば、米国では現在１５７００人の患者が肝臓移植を待っているが、これに対して移植可能な提供肝臓は年間で４０００〜５０００個に過ぎない。僅かな例外はあるものの１つの提供臓器では一人のレシピエントしか救えないため、過去十年の間、移植可能なドナーの数と待機中の移植候補者数との間の差は広がるばかりである。したがって、新たな治療法が望まれている。
【０００５】
肝機能の全体的又は部分的な再構築を必要とする患者に対して、移植に代わる治療法には幹細胞治療がある。肝細胞治療では、１つの肝臓を複数の患者の治療に用いることができ、また、細胞治療に伴う外科的処置は患者にとって移植よりもより安全で簡単で低コストであるため、全肝移植に代わるものとして様々な意味で望ましい。したがって、幹細胞移植は、機能不全肝臓の生化学的機能を安全で効果的に改善する治療法を提供することができる。
【０００６】
そして、非肝臓組織から肝幹細胞を誘導する方法が必要とされている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様では、非肝幹細胞から肝幹細胞を誘導する方法を提供し、この方法は、（ａ）非肝臓組織から誘導した幹細胞を得ること、及び（ｂ）前記幹細胞を、少なくとも１つの線維状基質タンパク質を含む細胞外基質及び肝細胞成長因子（ＨＧＦ）を含んで構成される無血清培地で培養すること、を含んで構成され、前記非肝臓組織から誘導された前記幹細胞が肝幹細胞に分化することを特徴とする。非肝臓組織の例には、限定を意図するものではないが、脾臓、腸及び脂肪組織が含まれる。好ましい態様では、脂肪幹細胞は、非肝幹細胞源として脂肪組織から誘導される。しかしながら、非肝臓組織はどのような成体哺乳類由来であってもよい。前記少なくとも１つの線維状基質タンパク質は、好ましくは、Ｉ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンからなる群から選択される。本発明の幾つかの態様では、前記培地は更に、オンコスタチンＭ若しくはＤＭＳＯ又はその両方を含んでもよく、また、前記細胞外基質は、更にフィブロネクチン、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）若しくはビトロゲン（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はこれらの組み合わせを含んでもよい。
【０００８】
幾つかの態様では、非肝臓組織から誘導された幹細胞の７０％超が、肝幹細胞に分化する。
【０００９】
本発明の他の態様では、非肝幹細胞からＨＧＦ発現を誘導する方法を提供し、この方法は、（ａ）非肝臓組織から誘導した幹細胞を得ること、及び（ｂ）前記幹細胞を、少なくとも１つの線維状基質タンパク質を含む細胞外基質及びＥＧＦ若しくはｂＦＧＦ又はその両方を含む無血清培地で培養すること、を含んで構成され、非肝臓組織から誘導した幹細胞はＨＧＦを生成することを特徴とする。前記培地は、更にアスコルビン酸二リン酸ナトリウム（sodium ascorbic diphosphate）を含んで構成されてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、非肝臓組織から肝幹細胞を誘導する方法に関するものである。また、本発明は、特定のライフステージの組織に限定されるものではない。したがって、本発明の方法において用いられる組織には、成体、胎児又は胚組織を含んでもよい。更に、組織源には、どの非肝臓組織を用いてもよい。「非肝臓」組織について、限定を意図しない例としては、脂肪組織、腸、脳、臍帯血及び骨髄が含まれる。したがって、本明細書においては、発明の多くを成体脂肪組織に関して記載するが、これは例示に過ぎず、限定として解釈されるべきものではない。
【００１１】
非肝臓組織からの非肝幹細胞の誘導
非肝幹細胞は、ヒト又は他の哺乳類由来の脂肪組織（即ち、脂肪幹細胞「ＡＳＣ」）から誘導することができる。ヒトＡＳＣは、好ましくは健康な男性患者又は女性患者（例えば、脂肪吸引手術を行った患者）から得られた皮下脂肪組織から分離することができる。ネズミＡＳＣも、好ましくはオスＣ５７ＢＬ／６マウス又はオスＲＯＳＡ−２６マウスから得られた皮下脂肪組織から分離できる。典型的には、これらのソースからは、５日の培養で、脂肪吸引による吸引物の１ミリリットルから約２５０，０００個のＡＳＣが回収される。ヒト脂肪吸引試料の平均は、約５００ｍＬより大きい。また、等量のネズミ脂肪組織からはより多くの細胞が回収されるが、これはおそらくドナー動物の若さによるものと考えられる。
【００１２】
脂肪組織から脂肪幹細胞を誘導する方法は、米国特許第６１５３４３２号、第６３９１２９７号、第６４２９０１３号、第６５５５３７４号、第６８４１１５０号、第７００１７４６号及び第７０３３５８７号に記載されている。尚、これらの開示内容は、その全体が参照により本開示に含まれるものである。概略としては、１例では、組織を調達後分画遠心分離を行い、培養液中で増殖させる。１グラムの組織から、典型的には、２４時間の培養で５０，０００〜１００，０００個の幹細胞が得られる。培養培地は、好ましくは、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した６０％ＤＭＥＭ（低グルコース）及び４０％ＭＣＤＢ−２０１と、インスリン５μｇ／ｍＬ、トランスフェリン５μｇ／ｍＬ及びセレン５ｎｇ／ｍＬと、デキサメタゾン１０−９Ｍと、上皮成長因子（ＥＧＦ）１０ｎｇ／ｍＬ及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）１０ｎｇ／ｍＬの少なくとも一方と、アスコルビン酸２−リン酸１０−４Ｍと、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬと、並びにストレプトマイシン１００Ｕ／ｍＬと、を含んで構成される。理論にとらわれることや縛られることを意図するものではないが、培地にＥＧＦ若しくはｂＦＧＦ又はその両方を添加することにより、ＡＳＣの肝幹細胞への分化能を高めることができると考えられている。アスコルビン酸２−リン酸もまたＡＳＣに対して、特にＨＧＦ発現能に関して、同様の効果を有している（後述）。
【００１３】
ＨＧＦは、幹細胞から肝系統（hepatic lineage）への分化を促進する。後述のように、本発明の培養条件にＨＧＦを加えることで、分化プロセスを補うことができると考えられている。したがって、本発明の一実施形態では、本明細書で記載する細胞集団から生成するＨＧＦは、インビトロ及びインビボ（例えば、移植）で、別の「発生期」幹細胞から機能性肝実質細胞への分化を助けるために用いられる。
【００１４】
分化培地
ＡＳＣは、デキサメタゾン、インスリン、イソブチルメチルキサンチン及びチアゾリジンジオンの存在下で、脂肪生成を行う。この細胞は、中性脂肪が染色される脂質液胞を蓄積し、また、分泌されたサイトカインであるレプチン及び脂肪酸結合蛋白ａＰ２を含む脂肪細胞特異性マーカーを発現する。しかしながら、ＡＳＣの分化ポテンシャルは、脂肪細胞系統に限定されるものではない。肝幹細胞及び肝実質細胞への分化用として、無血清増殖培地には更に、ＥＧＦ１０ｎｇ／ｍＬ及びｂＦＧＦ１０ｎｇ／ｍＬの少なくとも一方、ＨＧＦ１０ｎｇ／ｍＬ、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）１０ｎｇ／ｍＬ、若しくは、１％ＤＭＳＯ、又はこれらの組み合わせ、を添加する。
【００１５】
分化条件
まずＩ型コラーゲンでプレコートした組織ディッシュ又はウェルの増殖培地上に、ＡＳＣを５〜１５×１０３細胞／ｃｍ２の密度で平板培養する。Ｉ型コラーゲンコート組織ディッシュは市販されており（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社のＭＡＴＲＩＧＥＬ、ＰｕｒｅＧｅｌ社のＶＩＴＲＯＧＥＮ）、本発明にはどの組織ディッシュを用いてもよい。加えて、理論にとらわれることや縛られることを意図するものではないが、本発明の発明者は、本発明による方法において、線維状肝臓基質タンパク質（例えば、コラーゲン、特にＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン）の使用が好ましいと考える。これは、この線維状肝臓基質タンパク質を使用することにより、成体肝組織に見られる幹細胞のインビボ環境をより良好に再現されると考えられたためである。換言すると、線維状基質タンパク質は、利用不可能な又は基質タンパク質ほど強くはない他の分化シグナルであると考えられる。
【００１６】
例えば、フィブロネクチンは非線維性分子であり、糖タンパクであって（コラーゲンは糖タンパクではない。）、主に細胞を他のマトリックス分子又は組織培養ディッシュに付着させる働きをしている。つまり、フィブロネクチンは、細胞表面上のインテグリンを、器官内のコラーゲンマトリックス下層（インビボ）又は組織培養ディッシュの底（インビトロ）に繋ぐ橋であると考えられる。したがって、フィブロネクチン結合により活性化されるシグナルは、コラーゲン結合により活性化されるものと大きく異なると考えられる。したがって、フィブロネクチン等の非線維状タンパク質を使用する必要がないとしても、本発明による線維状タンパク質と併せて用いることもできる。幾つかの実施形態では、細胞外基質はフィブロネクチンを含まずに構成される。
【００１７】
このように、本発明方法は、非肝幹細胞を肝幹細胞に「変換」する技術に関するものであって、場合によってはその後成熟肝実質細胞に分化させてもよく、したがって肝幹細胞ステージを飛ばして非肝幹細胞を実質細胞に直接分化させるものではない。これを、図１に模式的に示した。本発明に適した他の基質タンパク質の例には、胚性肝臓基質タンパク質が含まれる。
【００１８】
この初期段階において、細胞を、最大３日かけて約８０％超のコンフルエントにし、上記増殖培地でインキュベートする。約８０％超のコンフルエントに達した後、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のみで２〜３回洗浄し、続いて無血清分化培地に平板培養する。ＡＳＣを、分化が起こるように、更に４〜２０日間これらの培養条件下に維持する。ここで代表培養物を、分析において標準的なインターバルで収集してもよい。
【００１９】
（実施例１）
ヒトＡＳＣを、（無血清）増殖培地に平板培養した。２〜３継代後、細胞集団をトリプシンで分散させ、細胞密度５，０００〜１０，０００細胞／ｃｍ２でＩ型コラーゲンコートディッシュ上に播種した。細胞を約８０％コンフルエントに達するまで増殖させ、このとき培地を肝細胞分化培地（ＨＧＦ１０ｎｇ／ｍＬ、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）１０ｎｇ／ｍＬ及び０．１％ＤＭＳＯを添加した無血清増殖培地を含む。）に変更した。培地は、３日毎に交換した。
【００２０】
細胞溶解産物を、分化後複数回にわたってＲＴ−ＰＣＲ分析用に回収、又は肝細胞バイオマーカー（hepatic biomarker）の組織学的分析用に固定した。バイオマーカーのいくつかはインビトロ肝形成の評価に用いられ、これには（ａ）ＲＴ−ＰＣＲによるアルブミン（ＡＬＢ）及びα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の発現、並びに（ｂ）グリコーゲン貯蔵（ＰＡＳ染色陽性により評価される後段肝細胞マーカー）が含まれる。
【００２１】
図２は、分化培地で１０日間インキュベートしたＡＳＣのＡＦＰ発現及びＡＬＢ発現を示している。市販キットを用いて細胞からｔｏｔａｌＲＮＡを精製した。ｔｏｔａｌＲＮＡ２μｇをＭＭＬＶ−ＲＴを用いてＯｌｉｇｏ−ｄＴで４２℃１時間２０μＬ反応で逆転写した。希釈（１：１０）ｃＤＮＡ２μＬを用いてＰＣＲを４０サイクル行った。５μＬの増幅産物を２％アガロースゲル上で分離し、ＥｔＢｒで可視化した。（ｃＤＮＡインプットのコントロールには、サイクロフィリンＢ（Ｃｙｃｌｏ）を用いた。）データからは、ここに示す細胞集団ではアルブミンが発現しているが、同集団には、肝幹細胞を実質的に含んだ細胞集団の指標となるＡＦＰは殆ど乃至全く存在しないことが示されている。実際、ＡＦＰ発現は、肝幹細胞から分化した可能性のあるより成熟した幹細胞の存在指標であると考えられる。他の分析により、これらの細胞が肝幹細胞の他のマーカーを示すことが確認された。ここでいう他のマーカーには、Ｅｐ−ＣＡＭ及びＩＣＡＭ−１の陽性発現並びにＭＨＣクラスＩａの陰性発現が含まれる。
【００２２】
図３は、６ウェルディッシュ上に播種され、約８０％コンフルエントに達し、肝細胞分化培地に切り替えられた初期継代［ｐ３］ＡＳＣを示している。各ウェルを、０日目（パネルＡ）及び１７日目（パネルＢ)に固定し、グリコーゲンを染色した（濃影）。図４は更に、分化条件下で１８日間インキュベートして肝実質細胞形態を得た細胞を示している。
【００２３】
以上をまとめると、これらのデータからは、ＡＳＣが肝幹細胞に分化可能であることが示されている。これら幹細胞の幾つかは、その後成熟して肝実質細胞又は胆細胞（biliary cell）となるが（図１）、幾つかは自己再生（self regenerate）する。
【００２４】
本発明の他の実施形態では、ＡＳＣからの肝再生に関与するサイトカインの発現を誘導する方法を提供する。このサイトカインには、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６、ＬＩＦ、ＴＮＦａ及びレプチン並びにこれらの組み合わせが含まれる。本発明は、これらサイトカインの１つ又は全ての生成を促進させる培養条件を提供する。加えて、理論にとらわれることや縛られることを意図するものではないが、本発明の発明者は、本発明方法において代表的には線維状基質タンパク質（例えば、Ｉ型コラーゲン）の使用が好ましいと考える。これは、この繊維状肝臓基質タンパク質を使用することにより、肝幹細胞のインビボ環境をより良好に再現すると考えられたためである。更には、ＥＧＦ単独又はアスコルビン酸ナトリウムと共に取り込むことで、これらの条件下においてサイトカインの生成が実質的に促進されると考えられる。肝再生サイトカインの生成に寄与する他の因子及び条件には、ホルボールエステル、ＦＧＦ、ヘパリン若しくは低酸素（＜５％Ｏ２と定義）又はこれらの組み合わせが含まれる。
【００２５】
（実施例２）
ヒトＡＳＣを、３％血清添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で増殖させ、サイトカイン生成におけるＥＧＦ及びアスコルビン酸二リン酸ナトリウムの効果を測定した。３連ウェル（５〜１０×１０３細胞／ｃｍ２で播種）をＥＧＦ（濃度は、０、０．１、１又は１０ｎｇ／ｍＬ）＋／−アスコルビン酸二リン酸ナトリウムでインキュベートした。７２時間後、培地をＨＧＦのＥＬＩＳＡ検出用に回収した。図５は、ＨＧＦをｐｇ／１０６細胞（ｎ＝３）でノーマライズしたデータの代表を示している。培地単体では、ＨＧＦを含まなかった。このデータは、ＥＧＦ及びアスコルビン酸ナトリウムの非存在下では、１０６８０ｐｇ／１０６細胞超のＨＧＦが合成されたことを示している。一方、両因子が存在すると、生成量はおよそ５倍に増加する。
【００２６】
（実施例３）
未分化ヒトＡＳＣを、３％血清とＥＧＦ又はｂＦＧＦの一方１０ｎｇ／ｍＬとを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で増殖させた。図６Ａは、ＥＧＦ存在下では、未分化ＡＳＣでは、３０００ｎｇ／１０６細胞超のレベルでＨＧＦが発現することを示している。これは、ベースラインレベルに対して２倍高い値である。アスコルビン酸２−リン酸の存在下では、更に、ＥＧＦの誘導効果により誘導量が２５倍に増加した。同条件下において、脂肪細胞分化ＡＳＣは、アスコルビン酸２−リン酸の存在下又は非存在下でそれぞれ更に２．０倍及び６．３倍レベルのＨＧＦを発現した（図６Ｂ）。ｂＦＧＦの存在下では、未分化ヒトＡＳＣによるＨＧＦの発現についても統計学的な増加がみられた（図６Ｃ）。しかしながら、ｂＦＧＦは、脂肪細胞分化ＡＳＣによるＨＧＦ発現には影響を及ぼさなかった（図６Ｄ）。
【００２７】
また、これに続いて行ったＲＴ−ＰＣＲによるｔｏｔａｌＲＮＡ分析では、未分化及び脂肪細胞分化ヒトＡＳＣが、ｂＦＧＦレセプター及びＥＧＦレセプター並びにＨＧＦ（ｃ−ｍｅｔ）レセプターを発現したことが示された（図７）。
【００２８】
ＡＳＣサイトカイン発現
ＨＧＦに加えて、ヒトＡＳＣは、造血サイトカイン及び他の機能性サイトカインを幅広く分泌する。リポ多糖類(ＬＰＳ、１００ｎｇ／ｍＬ）で誘導すると、他の静止期ＡＳＣ培養では、インターロイキン−６、−７、−８、−１１（ＩＬ−６、−７、−８、−１１）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、図８に示すようなｆｌｔ−３  ｌｉｇａｎｄ（Ｆｌｔ３Ｌ）及びｋｉｔ  ｌｉｇａｎｄ（ＫＬ、又は幹細胞因子）、腫瘍壊死因子−ａ（ＴＮＦａ）、並びに骨形成タンパク質２及び４（ＢＭＰ−２、−４）について、ｍＲＮＡの定常状態濃度に増加が見られた。ネズミ及びヒト骨髄由来幹細胞もまた、上記と同じサイトカインを発現する。下記表１及び図８に示すように、ＬＰＳ刺激後２４時間におけるＡＳＣのＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＭ−ＣＳＦの分泌は、有意に増加した。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
このように、肝傷害が起こるのと略同時に又はその後直ぐにＡＳＣを移植することで、ＨＧＦ及びＶＥＧＦの局所放出により、肝臓再生をある程度促進することができる。哺乳類におけるＡＳＣの導入には、注射等、本発明の属する技術分野において公知の方法及び利用可能な方法のいずれを用いて行ってもよい。他の細胞デリバリー方法では、ＡＳＣは、カプセル化後の実質内又は肝内注射によりレシピエント哺乳類に移植される。例えば、アルギン酸マトリックス内に包埋させた細胞の移植には、次に挙げるような利点がある。（ａ）細胞に、移植後のバイアビリティを向上させる「３Ｄ環境」を提供できる、（ｂ）より多くの細胞が移植可能になる、（ｃ）成長及び分化を支持する微小環境を作り出すことができる、及び（ｄ）移植前に複数の因子（例えば、上記の成長因子又は複数細胞型）を一緒にカプセル化することが可能になる。
【００３１】
加えて、細胞懸濁物を移植に使用する際にしばしば身体の他部位への分散が見られるが、ここでは細胞はヒドロゲルに埋包されているため、このような分散傾向は弱くなる。
【００３２】
概略としては、細胞カプセル化は、アルギン酸ナトリウム溶液中で細胞を混合した後、静電ビーズ作成装置を用いて行われる。このビーズを、ＰＢＳ中に再懸濁する。このときの細胞濃度は約１０７細胞／ｍＬとする。小側腹切開術を、レシピエントに対して適当な麻酔及び鎮静を行った後、無菌操作で行う。細胞懸濁物を針で直接、当該組織付近に局所圧迫により血流遮断して注入する（マウスでは通常０．１ｍＬ注入）。この方法は、ヒト及びネズミモデルに対して同様に適応可能である。
【００３３】
第二の移植方法として、最大で１０６細胞を、Ｃｙｔｏｄｅｘ３ＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）マイクロキャリアビーズに付着させた後に、脾臓内に注入してもよい。移植後、細胞は肝洞様（liver sinusoid）に急速に転位置し、移植後２時間で肝臓内から検出されるようになる。
【００３４】
投与量
ヒトに対して、肝臓循環系に直接注入する場合、３×１０９細胞又は肝重の１％の「投与量」は、好ましくはマウスでの研究における投与経験に基づくものである。実際に、マウスにおける投与量は２００万細胞が好ましい。中投与量の４００万細胞及び高投与量の６００万細胞は、試験急性致死性試験の結果に基づいている。この試験では、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ雄マウス３匹のグループにそれぞれ１ミリリットルあたり０、２５０万、５００万、１０００万、２０００万及び４０００万個のヒト肝細胞を投与した。１０００万、２０００万、及び４０００万細胞の移植により、死亡率は１００％となり、５００万細胞では、マウス３匹中１匹が２０時間以内に死亡し、一方、マウスあたり２５０万細胞では、良好な耐性が示された。高投与量である６００万細胞（０．２ｍＬ投与）は、脾破裂させずに投与可能な最大量であると考えられ、またこの投与量であれば動物の大多数は耐用性を示す（すなわちＭＴＤ）と予測されたため選択された。中投与量である４００万細胞は、低投与量及び高投与量の中間点として好ましい。
【００３５】
とりわけヒトを治療する際には、すべての処理ステップは、適切なＳＯＰ（標準操作手順）を用いてｃＧＭＰ基準にしたがって実行するものとする。ヒトＡＳＣは好ましくはトリプシン消化により単離される。細胞は、その後直ぐに使用されるか、又は使用前に凍結保存される。ヒトＡＳＣは、凍結保存されたものであれば融解し、約１０万細胞／ｍＬ以上及び１０００万細胞／ｍＬ以下の濃度での注入に適した無血清等浸透圧培地に懸濁される。細胞生存率は、ｔｙｐｈａｎ  ｂｌｕｅ排除法又は同様の分析手法を用いて評価してもよい。細胞を、室温又は湿氷（wet ice）上で保存され、クランピングについて顕微鏡検査を用いて評価してもよく、クランピングが観察された場合は、ナイロンメッシュ（４０ミクロン）フィルタで選別し、細胞の最終濃度を測定してもよい。細胞を、投与量を体重１ｋｇあたり１００万〜１０００万細胞として、肝障害（例えば、急性毒物暴露）に苦しむレシピエントに静脈内注入してもよい。レシピエントを、熱、悪寒又は精神状態の変化など、幾つかの急性反応について観察し、これらの反応が見られた場合、標準医療行為により症状を治療することとしてもよい。また、被験者を、その後週１回の血液生化学検査を行うことにより肝機能再生を評価して２ヶ月間観察することとしてもよい。
【００３６】
このように、本発明は急性及び慢性の多種の肝不全の治療において上記利点を有する。肝機能を改善するために自家性又は同種異系間のヒトＡＳＣを成体幹細胞として利用できることは、毒物暴露（四塩化炭素、アセトアミノフェン）や、病原菌（肝炎、サイトメガロウイルス）や、腫瘍転移若しくは外傷に起因する外科的切除による肝障害に苦しむ患者にとって価値のあるものである。患者の上記状態において、ヒトＡＳＣの機能性肝実質細胞への分化能、又は内因性肝実質細胞前駆体の増殖及び分化を支持する成長因子の放出能により、肝機能再生を改善し促進させるメカニズムを提供することができる。
【００３７】
尚、ここでは本発明を、その具体的な実施形態と関連させて記載したが、これを更に変更可能であることは理解され得るものであり、また、この出願は、本発明の如何なる変形、使用又は改変をも含むことを意図していると理解されるものである。一般的に、本発明の原理は、本発明の属する技術分野において知られる又は慣行されるような本開示からの逸脱、及びこれまでに開示され又は特許請求の範囲において示される本質的特徴に適用し得る逸脱をも包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明による非肝幹細胞（例えば、ＡＳＣ）からの肝幹細胞誘導を示す模式図である。
【図２】ＡＳＣ由来肝幹細胞におけるアルブミン（ＡＬＢ）及びアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）のｍＲＮＡ発現を相対的に示す図である。
【図３】ＡＳＣ由来肝幹細胞においてグリコーゲン貯蔵を示す図である。
【図４】ＡＳＣ由来肝幹細胞の形態を示す図である。
【図５】ＥＧＦ及びアスコルビン酸二リン酸ナトリウムが、ヒトＡＳＣにおけるＨＧＦ発現の誘導に関して一致した能力を有することを示すグラフである。
【図６】ＥＧＦ及びｂＦＧＦについて、アスコルビン酸二リン酸の存在下又は非存在下で、ＡＳＣにおいてＨＧＦ発現を誘導する能力を比較するグラフである。
【図７】ＲＴ−ＰＣＲ分析による、ＡＳＣに発現したレセプターを示す図である。
【図８】リポ多糖類暴露後０〜２４時間の所定時間について、一部のサイトカイン（ＡＳＣドナー、ｎ＝６〜８）の分泌を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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