(57)【要約】  本発明は、顆粒球コロニー刺激因子とＰＥＧ部分との間のコンジュケートを提供する。コンジュゲートは、ペプチドと修飾基との間に挿入され、かつこれらと共有結合している無傷グリコシル連結基によって連結されている。コンジュゲートは、グリコシルトランスフェラーゼの作用によってグリコシル化と未グリコシル化ペプチドの両方から形成される。グリコシルトランスフェラーゼは、ペプチド上のアミノ酸またはグリコシル残基のいずれかに修飾糖部分をライゲートする。コンジュゲートを含む医薬製剤も提供される。コンジュゲートを調製するための方法も本発明の範囲内である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
顆粒球コロニー刺激因子ペプチドであって、前記ペプチドのアミノ酸残基に結合したグリコシル連結基を含んで成り、前記グリコシル連結基が、式
【化１】
2009501127.tif 000074
［式中、
Ｒ２はＨ、ＣＨ２ＯＲ７、ＣＯＯＲ７、またはＯＲ７であり、
ここで
Ｒ７は、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、または置換もしくは非置換へテロアルキルであり、
Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、ＯＲ８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ９から独立して選択されるメンバーであり、
ここで
Ｒ８およびＲ９は、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換へテロアルキル、またはシアル酸から独立して選択され、
Ｌａは、結合、置換もしくは非置換アルキル、および置換もしくは非置換へテロアルキルから選択されるリンカーであり、
Ｒ１６およびＲ１７は、ポリマー腕から独立して選択され、
Ｘ２およびＸ４は、ポリマー部分Ｒ１６およびＲ１７をＣに結合する独立して選択されるリンケージ断片であり、
Ｘ５は非反応基である］
を有する修飾シアリル残基を含んで成る、顆粒球コロニー刺激因子ペプチド。
【請求項２】
部分
【化２】
2009501127.tif 000075
が、
【化３】
2009501127.tif 000076
［式中、
Ｑは、Ｈ、および置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ６アルキルから選択され、
ｅおよびｆは、１〜２５００から独立して選択される整数であり、かつ
ｑは、０〜２０の整数である］
から選択されるメンバーである式を有する請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記部分が、
【化４】
2009501127.tif 000077
［式中、
Ｑは、Ｈ、および置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ６アルキルから選択され、
ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００から独立して選択される整数であり、かつ
ｑおよびｑ’は、１〜２０から独立して選択される整数である］
から選択されるメンバーである式を有する、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記グリコシル連結基が、
【化５】
2009501127.tif 000078
［式中、ｔは０または１である］
から選択される式を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記グリコシル連結基が、式
【化６】
2009501127.tif 000079
［式中、ｔは０または１である］
を有する、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
前記アミノ酸に結合した前記グリコシル連結基が式
【化７】
2009501127.tif 000080
［式中、ＡＡは前記ペプチドの前記アミノ酸残基である］
を有する、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
前記アミノ酸残基がセリンまたはトレオニンから選択されるメンバーである、請求項６に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【請求項９】
前記アミノ酸残基が、配列番号１の位置１３３でトレオニンである、請求項８に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドが、式
【化８】
2009501127.tif 000081
［式中、
Ｒ１５は前記修飾シアリル残基であり、かつ
ｐは１〜１０の整数である］
を有する基礎構造を含んで成る少なくとも１つのグリコシル連結基を含んで成る、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドのアミノ酸に結合した前記少なくとも１つのグリコシル連結基が、
【化９】
2009501127.tif 000082
およびそれの組合せから選択される式
［式中、
ＡＡは前記ペプチドの前記アミノ酸残基であり、
ｔは０または１に等しい整数であり、
ｐは１〜１０の整数であり、
Ｒ１５’は、Ｈ、ＯＨ、シアル酸、前記修飾シアリル残基、およびＳｉａ−Ｓｉａｐから選択されるメンバーであり、
ここで、
Ｓｉａｐは前記修飾シアリル残基であり、
ここで少なくとも１つのＲ１５’が前記修飾シアリル残基およびＳｉａ−Ｓｉａｐから選択される］
を有する、請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
前記アミノ酸残基がアスパラギン残基である、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
前記ペプチドが生物活性顆粒球コロニー刺激因子ペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１４】
（ａ）
【化１０】
2009501127.tif 000083
から選択されるグリコシル部分を含んで成る基質顆粒球コロニー刺激因子ペプチドを、式
【化１１】
2009501127.tif 000084
［式中、ａは０または１である］
を有するＰＥＧ−シアル酸ドナーと接触させるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの生成物を、前記ドナーから前記グリコシル部分のＧａｌへＰＥＧ−シアル酸を移動させる酵素と、前記移動に適切な条件下に接触させるステップと
を含んで成る、請求項１に記載のペプチドを調製する方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）の前に、
（ｂ）適切な宿主において前記基質顆粒球コロニー刺激因子ペプチドを発現させるステップ
をさらに含んで成る、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主が昆虫細胞および哺乳類細胞から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記昆虫細胞がスポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞系である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１に記載のペプチドを前記哺乳類に投与するステップを含んで成る、哺乳類における炎症性白血球産生を刺激する方法。
【請求項１９】
それを必要とする対象における感染を治療する方法であって、前記方法が、前記対象における前記状態を緩和するために有効な量の請求項１に記載のペプチドを前記対象に投与するステップを含んで成る方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の顆粒球コロニー刺激因子ペプチド、および医薬的に許容される担体を含んで成る医薬製剤。
【請求項２１】
顆粒球コロニー刺激因子ペプチドであって、前記ペプチドのアミノ酸残基に結合したグリコシル連結基を含んで成り、前記グリコシル連結基が、式
【化１２】
2009501127.tif 000085
［式中、
Ｒ２はＨ、ＣＨ２ＯＲ７、ＣＯＯＲ７、ＣＯＯ−またはＯＲ７であり、
ここで
Ｒ７は、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、または置換もしくは非置換へテロアルキルであり、
Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、ＯＲ８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ９から独立して選択されるメンバーであり、
ここで
Ｒ８およびＲ９は、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、または置換もしくは非置換へテロアルキル、またはシアル酸から独立して選択され、
ｓは１〜２０の整数であり、
ｆは１〜２５００の整数であり、かつ
ＱはＨおよび置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ６アルキルから選択されるメンバーである］
を有する修飾シアリル残基を含んで成る、顆粒球コロニー刺激因子ペプチド。
【請求項２２】
前記修飾シアリル残基が式
【化１３】
2009501127.tif 000086
を有する、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２３】
ＱがＨおよびＣＨ３から選択される、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２４】
前記ペプチドが、式
【化１４】
2009501127.tif 000087
［式中、
Ｒ１５は前記修飾シアリル残基であり、かつ
ｐは１〜１０の整数である］
を有する基礎構造を含んで成る少なくとも１つのグリコシル連結基を含んで成る、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２５】
前記ペプチドのアミノ酸に結合した前記少なくとも１つのグリコシル連結基が、
【化１５】
2009501127.tif 000088
およびそれの組合せから選択される式
［式中、
ＡＡは前記ペプチドの前記アミノ酸残基であり、
ｔは０または１に等しい整数であり、
ｐは１〜１０の整数であり、
Ｒ１５’は、Ｈ、ＯＨ、シアル酸、前記修飾シアリル残基、およびＳｉａ−Ｓｉａｐから選択されるメンバーであり、
ここで、
Ｓｉａｐは前記修飾シアリル残基であり、
ここで少なくとも１つのＲ１５’が前記修飾シアリル残基およびＳｉａ−Ｓｉａｐから選択される］
を有する、請求項２４に記載のペプチド。
【請求項２６】
前記アミノ酸残基がアスパラギンである、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２７】
前記グリコシル連結基が式
【化１６】
2009501127.tif 000089
［式中、ｂは０または１である］
を含んで成る、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２８】
ｓが１であり、ｆが約２００〜約３００の整数である、請求項２７に記載のペプチド。
【請求項２９】
前記アミノ酸残基がセリンまたはトレオニンから選択されるメンバーである、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項３０】
前記ペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項３１】
前記アミノ酸残基が配列番号１の位置１３３におけるトレオニンである、請求項３０に記載のペプチド。
【請求項３２】
前記ペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項３３】
前記アミノ酸残基が配列番号２の位置１３４におけるトレオニンである、請求項３２に記載のペプチド。
【請求項３４】
（ａ）
【化１７】
2009501127.tif 000090
から選択されるグリコシル部分を含んで成る基質顆粒球コロニー刺激因子ペプチドを、式
【化１８】
2009501127.tif 000091
［式中、ａは０または１である］
を有するＰＥＧ−シアル酸ドナーと接触させるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの生成物を、前記ドナーから前記グリコシル部分のＧａｌＮａｃ、Ｇａｌ、またはＳｉａへＰＥＧ−シアル酸を移動させる酵素と、前記移動に適切な条件下に接触させるステップと
を含んで成る、請求項２１に記載の顆粒球コロニー刺激因子ペプチドを調製する方法。
【請求項３５】
ステップ（ａ）の前に、
（ｂ）適切な宿主において前記基質顆粒球コロニー刺激因子ペプチドを発現させるステップ
をさらに含んで成る、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記宿主が昆虫細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記昆虫細胞が、スポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞系である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ペプチドをメチオニンと接触させるステップをさらに含んで成る、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
ステップ（ｂ）の後に、前記ペプチドを精製するステップをさらに含んで成り、遊離メチオニンが前記精製するステップ中に存在する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
哺乳類における炎症性白血球産生を刺激する方法であって、前記方法が前記哺乳類に請求項２１に記載のペプチドを投与するステップを含んで成る方法。
【請求項４１】
それを必要とする対象における感染を治療方法であって、前記方法が、前記対象における前記状態を緩和する有効な量の請求項２１に記載のペプチドを前記対象に投与するステップを含んで成る方法。
【請求項４２】
請求項２１に記載の顆粒球コロニー刺激因子ペプチド、および医薬的に許容される担体を含んで成る医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００５年１月１０日出願の米国仮特許出願第６０／６４３，４３７号明細書、２００５年３月２４日出願の米国仮特許出願第６０／６６５，５８８号明細書、２００５年４月２２日出願の米国仮特許出願第６０／６７４，１９９号明細書、２００５年５月２５日出願の米国仮特許出願第６０／６８４，８５１号明細書、および２００５年６月２３日出願の米国特許出願第１１／１６６，４０４号明細書の利点を請求するが、その各々はすべての目的のためにその全体が参照により本明細書で援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、好中球顆粒球前駆細胞および成熟好中球の生存、増殖、分化、および機能を刺激する糖タンパク質である。臨床的使用における組換えヒトＧ−ＣＳＦの２つの形態は好中球顆粒球形成の強力な刺激因子であり、一部の好中球減少状態の感染性合併症の予防における有効性が明らかにされた。それらは骨髄抑制療法からの好中球回復を加速するために使用されうる。
【０００３】
Ｇ−ＣＳＦは、熱性好中球減少症の発生率を削減することによって癌化学療法の死亡率、骨髄移植によって支持される高用量化学療法の死亡率、および重篤な慢性好中球減少症患者における感染の発生率と持続期間を減少させる。さらに、Ｇ−ＣＳＦは最近、心筋梗塞の発症後に投与されると治療的であることが証明されている。
【０００４】
Ｇ−ＣＳＦのヒト形態は、１９８６年に日本および米国のグループによってクローン化された（例えば、ナガタ（Ｎａｇａｔａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：４１５−４１８頁、１９８６年を参照）。天然ヒト糖タンパク質は、１つは１７５アミノ酸およびもう１つは１７８アミノ酸である、２つの形態で存在する。より豊富かつより活性の１７５アミノ酸の形態は、組換えＤＮＡ技術によって医薬品の開発において使用されている。
【０００５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系において合成される組換えヒトＧ−ＣＳＦはフィルグラスチムと呼ばれる。フィルグラスチムの構造は、天然糖タンパク質とわずかに異なる。組換えヒトＧ−ＣＳＦの他の形態はレノグラスチムと呼ばれ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で合成される。
【０００６】
ｈＧ−ＣＳＦは、２つのＧ−ＣＳＦ分子および２つの受容体の２：２の複合体の形成によってＧ−ＣＳＦ受容体を二量体化するモノマータンパク質である（ホラン（Ｈｏｒａｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５（１５）、４８８６−９６頁（１９９６年））。次のｈＧ−ＣＳＦ残基は、受容体結合インターフェイスの一環であるＸ線結晶方位試験によって同定されている。すなわち、Ｇ４、Ｐ５、Ａ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｌ９、Ｐ１０、Ｑ１１、Ｓ１２、Ｌ１５、Ｋ１６、Ｅ１９、Ｑ２０、Ｌ１０８、Ｄｌ０９、Ｄ１１２、Ｔ１１５、Ｔ１１６、Ｑ１１９、Ｅ１２２、Ｅ１２３、およびＬ１２４（例えば、アリトミ（Ａｒｉｔｏｍｉ）ら、（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：７１３頁を参照）。
【０００７】
ｒｈＧ−ＣＳＦの市販形態は短期薬理効果を有し、白血球減少状態の持続期間のためにしばしば１日１回より多く投与される必要がある。長い循環半減期を有する分子が、白血球減少症を緩和し、結果として起こる感染を予防するために必要な投与回数を減少させる。現在入手可能なｒＧ−ＣＳＦ生成物の別の問題が、用量依存骨痛の発生である。骨痛はｒＧ−ＣＳＦによる治療の重大な副作用として患者によって経験されるため、この作用を本質的に有さず、または骨痛がもたらされない十分に少用量で有効である生成物によって骨痛をもたらすことがないｒＧ−ＣＳＦ生成物を提供することが望ましい。したがって、改善された組換えＧ−ＣＳＦ分子が明らかに必要である。
【０００８】
ｈＧ−ＣＳＦのタンパク質工学による変異形が報告されている（米国特許第５，５８１，４７６号明細書、米国特許第５，２１４，１３２号明細書、米国特許第５，３６２，８５３号明細書、米国特許第４，９０４，５８４号明細書、およびリードハール・オルソン（Ｒｉｅｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：９０３４−９０４１頁、１９９６年）。天然ポリペプチドと比べ少なくとも１つの追加の炭水化物鎖を導入するためのｈＧ−ＣＳＦおよび他のポリペプチドの修飾も報告されている（米国特許第５，２１８，０９２号明細書）。また、ＰＥＧ基の結合を含む天然ｈＧ−ＣＳＦのポリマー修飾が報告され、試験されている（例えば、サタケ−イシカワ（Ｓａｔａｋｅ−Ｉｓｈｉｋａｗａ）ら（１９９２年）、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  １７：１５７頁、ボーエン（Ｂｏｗｅｎ）ら（１９９９年）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２７：４２５頁、米国特許第５，８２４，７７８号明細書、米国第５，８２４，７８４号明細書、国際公開第９６／１１９５３号パンフレット、国際公開第９５／２１６２９号パンフレット、および国際公開第９４／２００６９号パンフレットを参照）。
【０００９】
糖タンパク質治療薬の薬物動態特性を改善する試みにおけるペプチド骨格への合成ポリマーの結合は当業界で周知である。ペプチドにコンジュゲートされている代表的なポリマーがポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）である。ペプチド治療薬を誘導体化するＰＥＧの使用は、ペプチドの免疫原性を削減することが明らかにされている。例えば、米国特許第４，１７９，３３７号明細書（デービス（Ｄａｖｉｓ）ら）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールと結合される酵素およびペプチドホルモンなどの非免疫原性ポリペプチドを開示している。免疫原性の削減に加えて、循環におけるクリアランス時間は、問題のポリペプチドのＰＥＧコンジュゲートのサイズの増大により延長する。
【００１０】
ＰＥＧ、およびその誘導体のペプチドへの結合の主要な様態は、ペプチドアミノ酸残基による非特異的結合である（例えば、米国特許第４，０８８，５３８号明細書、米国特許第４，４９６，６８９号明細書、米国特許第４，４１４，１４７号明細書、米国特許第４，０５５，６３５号明細書、およびＰＣＴ国際公開第８７／０００５６号パンフレットを参照）。ＰＥＧをペプチドへ結合させる別の様態が、糖ペプチド上のグリコシル残基の非特異的酸化によるものである（例えば、国際公開第９４／０５３３２号パンフレットを参照）。
【００１１】
これらの非特異的方法において、ポリ（エチレングリコール）が無作為、非特異的な方法でペプチド骨格上の反応残基に添加される。もちろん、ＰＥＧ分子の無作為添加は、最終生成物の均質性の欠如、およびペプチドの生物または酵素活性における削減の可能性を含む、その不利点を有する。したがって、治療的ペプチドの生成のために、結果として、特異的に標識され、容易に特徴づけ可能であり、基本的に同種生成物をもたらす誘導体化法が優れている。かかる方法は開発されている。
【００１２】
特異的に標識される同種ペプチド治療薬が、酵素の作用によりインビトロで生成されうる。合成ポリマーまたは他の標識をペプチドへ結合させるための代表的な非特異的方法とは異なり、酵素ベースの合成が位置選択性および立体選択性の利点を有する。標識ペプチドの合成において使用されるための２つの主要なクラスの酵素が、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼ、オリゴ糖転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）、およびグリコシダーゼである。これらの酵素は糖の特異的結合のために使用されうるが、これはその後に治療的部分を含んで成るように修飾されうる。あるいは、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾グリコシダーゼを使用し、修飾糖をペプチド骨格へ直接移動させることができる（例えば、その各々が本明細書で参照により援用される、米国特許第６，３９９，３３６号明細書、および米国特許出願公開第２００３００４００３７号明細書、同第２００４０１３２６４０号明細書、同第２００４０１３７５５７号明細書、同第２００４０１２６８３８号明細書、および２００４０１４２８５６号明細書を参照）。化学および酵素双方の合成要素を組み合わせる方法も周知である（例えば、参照により本明細書で援用される、ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３０５：４１５−４２２頁（１９９８年）、および米国特許出願公開第２００４０１３７５５７号明細書を参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
改善された治療的Ｇ−ＣＳＦの必要に応じて、本発明は、治療的に活性であり、同一の、または糖ＰＥＧ化（ｇｌｙｃｏｐｅｇｙｌａｔｅｄ）されていない密接に類似したＧ−ＣＳＦペプチドに対して改善されている薬物動態パラメータおよび特性を有する糖ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを提供する。さらに、本発明は、費用効果的にかつ工業規模で本発明の改善されたＧ−ＣＳＦを製造するための方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の概要
現在、１つもしくはそれ以上のポリ（エチレングリコール）部分による顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の制御修飾は、対応する天然（非ＰＥＧ化）Ｇ−ＣＳＦに対して改善されている薬物動態特性を有する新規Ｇ−ＣＳＦ誘導体を提供することが見出されている（図３）。さらに、糖ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの薬理活性は、市販のモノＰＥＧ化フィルグラスチムとほぼ同じである（図４）。
【００１５】
代表的な実施形態において、本発明の「糖ＰＥＧ化」Ｇ−ＣＳＦ分子が、グリコシル化または未グリコシル化Ｇ−ＣＳＦペプチドと、その構造内にポリ（エチレングリコール）部分を含む酵素的に移動可能なサッカリール（ｓａｃｃｈａｒｙｌ）部分との間のコンジュゲートの酵素媒介形成によって生成される。ＰＥＧ部分はサッカリール部分に直接（すなわち、２つの反応基の反応によって形成される単一基により）またはリンカー部分、例えば、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換へテロアルキル等により結合される。代表的な移動可能なＰＥＧサッカリール構造が図５に記載されている。
【００１６】
したがって、１つの態様において、本発明は、ＰＥＧ部分、例えば、ＰＥＧと、当該技術分野において承認されているＧ−ＣＳＦと同様または類似のインビボ活性を有するペプチドとのコンジュゲートを提供する。本発明のコンジュゲートにおいて、ＰＥＧ部分は無傷グリコシル連結基によってペプチドに共有的に結合している。代表的な無傷グリコシル連結基は、ＰＥＧで誘導体化されるシアル酸部分を含む。
【００１７】
ポリマー修飾部分はＧ−ＣＳＦのグリコシル部分の任意の位置で結合されうる。さらに、ポリマー修飾部分は、野生型または変異Ｇ−ＣＳＦペプチドのアミノ酸配列における任意の位置でグリコシル残基に結合される。
【００１８】
代表的な実施形態において、ポリマー修飾部分は、一般にグリコシルコア上のへテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ）により、以下
【化１】
2009501127.tif 000002
［式中、Ｒ１はポリマー修飾基であり、Ｌは結合および連結基から選択される。指数ｗは１−６、好ましくは１−３、より好ましくは１−２から選択される整数である］に示されるように、リンカー、Ｌによりグリコシル連結基と結合される。代表的な連結基としては、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル部分、およびシアル酸が挙げられる。リンカーの代表的な成分がアシル部分である。別の代表的な連結基がアミノ酸残基である（例えば、システイン、セリン、リシン、および短いオリゴペプチド、例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｃｙｓ−Ｌｙｓ、Ｓｅｒ−Ｌｙｓ、等）。
【００１９】
Ｌが結合である場合、これはＲ１の前駆体に対する反応官能基およびグリコシル連結基の前駆体に対する相補的反応性の反応官能基の反応によって形成される。Ｌが非ゼロ順位の連結基である場合、ＬはＲ１前駆体との反応前にグリコシル部分上の適所にありうる。あるいは、Ｒ１の前駆体およびＬが、その後にグリコシル部分に結合される前もって作られたカセットに組込まれうる。本明細書に記載されているように、適切な反応官能基を有する前駆体の選択および調製は当業者の能力の範囲内である。さらに、前駆体の結合は当該技術分野で十分に理解されている化学反応によって継続する。
【００２０】
代表的な実施形態において、本発明は、ポリマー修飾部分とのグリコシル連結基によりコンジュゲートされるＧ−ＣＳＦペプチドを提供する。代表的なＧ−ＣＳＦペプチドコンジュゲートとしては、
【化２】
2009501127.tif 000003
から選択される式を有するグリコシル連結基が挙げられる。
【００２１】
式ＩおよびＩＩにおいて、Ｒ２はＨ、ＣＨ２ＯＲ７、ＣＯＯＲ７、ＣＯＯ−Ｍ＋、またはＯＲ７であり、ここでＲ７はＨ、置換もしくは非置換アルキル、または置換もしくは非置換ヘテロアルキルを表す。記号Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ６’は独立してＨ、置換もしくは非置換アルキル、ＯＲ８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ９を表す。Ｍ＋は金属である。指数ｄは０または１である。Ｒ８およびＲ９は独立してＨ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、またはシアル酸から選択される。Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、またはＲ６’の少なくとも１つは、ポリマー修飾部分、例えば、ＰＥＧを含む。代表的な実施形態において、Ｒ６およびＲ６’は、それらが結合されている炭素とともに、シアリル部分の側鎖の成分である。さらに代表的な実施形態において、この側鎖はポリマー修飾部分で官能化される。
【００２２】
本明細書で論じるように、本発明のコンジュゲートにおいて使用されるＰＥＧは線状または分岐でありうる。本発明の本実施形態に記載のペプチドコンジュゲートを含有する分岐ＰＥＧを形成する使用の代表的な前駆体は、式
【化３】
2009501127.tif 000004
を有する。本式に記載の分岐ポリマー種は基本的に純粋な水溶性ポリマーである。Ｘ３’は、イオン性（例えば、ＯＨ、ＣＯＯＨ、Ｈ２ＰＯ４、ＨＳＯ３、ＮＨ２、およびそれの塩など）または他の官能基、例えば、下記を含む部分である。Ｃは炭素である。Ｘ５、Ｒ１６、およびＲ１７は独立して非反応基（例えば、Ｈ、非置換アルキル、非置換へテロアルキル）およびポリマー腕（例えば、ＰＥＧ）から選択される。Ｘ２およびＸ４は、好ましくは、同じまたは異なりうる、生理的条件下に基本的に非反応であるリンケージ断片である。代表的なリンカーは芳香族部分もエステル部分も含まない。あるいは、これらのリンケージは、生理的に関連性のある条件下に、分解するようにデザインされる１つもしくはそれ以上の部分、例えば、エステル、ジスルフィド等を含みうる。Ｘ２およびＸ４は、ポリマー腕Ｒ１６およびＲ１７をＣに結合する。Ｘ３’がリンカー、糖、またはリンカー−糖カセットに対する相補的反応性の反応官能基と反応すると、Ｘ３’はリンケージ断片Ｘ３の成分に変換される。
【００２３】
本発明の他の目的および利点は、次の詳細な説明から当業者に明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
発明の詳細な説明および好ましい実施形態
略語
ＰＥＧ、ポリ（エチレングリコール）、ＰＰＧ、ポリ（プロピレングリコール）、Ａｒａ、アラビノシル、Ｆｒｕ、フルクトシル、Ｆｕｃ、フコシル、Ｇａｌ、ガラクトシル、ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミニル、Ｇｌｃ、グルコシル、ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグリコサミニル、Ｍａｎ、マンノシル、ＭａｎＡｃ、マンノサミニルアセテート、Ｘｙｌ、キシロシル、ＮｅｕＡｃ、シアリルまたはＮ−アセチルノイラミニル、Ｓｉａ、シアリルまたはＮ−アセチルノイラミニル、Ｍ６Ｐ、マンノース−６−リン酸、およびそれの誘導体と類似体。
【００２５】
定義
特に別の規定がない限り、本明細書で使用されるすべての技術および学術用語は一般に、本発明が属する当業者によって一般的に理解されている同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される用語、および細胞培養、分子遺伝学、有機化学反応および核酸化学反応、およびハイブリダイゼーションにおける実験室手順は、当技術分野で公知であり、かつ一般的に使用されているものである。標準方法は核酸およびペプチド合成に使用されている。方法および手順は、一般に当技術分野における従来の方法およびさまざまな一般の文献（一般に、参照により本明細書で援用される、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版（１９８９年）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州（Ｎ．Ｙ．）を参照）に従い実行されるが、これらは本文書の全体を通じて提供される。本明細書で使用される用語および分析的化学反応における実験手順、および書きの有機合成は、当技術分野で公知のものであり、一般的に使用されている。標準方法、またはそれの修正が化学合成および化学分析に使用される。
【００２６】
すべての（本明細書に記載の）オリゴ糖は、非還元サッカリド（すなわち、Ｇａｌ）の名称および略語の後、グリコシド結合（αまたはβ）、環結合（１または２）、結合に関与する還元サッカリドの環位置（２、３、４、６、または８）、および次いで還元サッカリドの名称または略語（すなわち、ＧｌｃＮＡｃ）で記載されている。各々のサッカリドは、好ましくは、ピラノースである。標準の糖鎖生物学用語の検討には、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  バルキ（Ｖａｒｋｉ）ら編、ＣＳＨＬプレス（Ｐｒｅｓｓ）（１９９９年）を参照。
【００２７】
オリゴ糖は、還元末端でのサッカリドが実際に還元糖であるかどうかに関係なく、還元末端および非還元末端を有するとみなされる。一般に認められた用語に従って、オリゴ糖は本明細書では左に非還元末端、右に還元末端を有するように描かれる。
【００２８】
「シアル酸」という語は、９個の炭素のカルボキシル化糖のファミリーのいずれかのメンバーを指す。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−Ｓ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノース−ｌ−オン酸（しばしばＮｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡと略される）。ファミリーの第２のメンバーが、Ｎ−グリコールイル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）であり、ここでＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基はヒドロキシル化されている。第３のシアル酸ファミリーのメンバーが、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）である（ナダノ（Ｎａｄａｎｏ）ら（１９８６年）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０−１１５５７頁、カナモリ（Ｋａｎａｍｏｒｉ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１−２１８１９頁（１９９０年））。９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃなどの９−置換シアル酸も含まれる。シアル酸ファミリーの検討のためには、例えば、バルキ（Ｖａｒｋｉ）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２５−４０頁（１９９２年）、Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ編（シュプリンガー−フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２年）を参照。シアリル化法におけるシアル酸化合物の合成および使用は、１９９２年１０月１日刊行の国際公開第９２／１６６４０号パンフレットで開示されている。
【００２９】
「ペプチド」は、モノマーがアミノ酸であり、アミド結合により結合され、あるいはポリペプチドと呼ばれるポリマーを指す。また、非天然アミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシン、およびホモアルギニンも含まれる。遺伝子符号化されていないアミノ酸も本発明において使用されうる。さらに、反応基、グリコシル化部位、ポリマー、治療的部分、生体分子などを含むように修飾されているアミノ酸も本発明において使用されうる。本発明で使用されるアミノ酸のすべては、Ｄ−またはＬ−異性体のいずれかでありうる。Ｌ−異性体が一般に好ましい。また、他のペプチド模倣剤も本発明において有用である。本明細書で使用される「ペプチド」は、グリコシル化および未グリコシル化の両方のペプチドを指す。ペプチドを発現する系によって不完全にグリコシル化されるペプチドも含まれる。一般の検討のためには、スパトラ（Ｓｐａｔｏｌａ），Ａ．Ｆ．、ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ，ＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｂ．ワインシュタイン（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）編、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ）、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６７頁（１９８３年）を参照。
【００３０】
「ペプチドコンジュゲート」という語は、本明細書に記載されているように、ペプチドが修飾糖でコンジュゲートされている本発明の種を指す。
【００３１】
「アミノ酸」という語は、天然起源および合成アミノ酸のほか、天然起源アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣剤を指す。天然起源アミノ酸は、遺伝子コードによって符号化されたもの、および後で修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸塩、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造、すなわち、水素に結合されているα炭素、カルボキシル基、アミノ酸、およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。かかる類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然起源アミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持する。アミノ酸模倣剤は、アミノ酸の一般化学構造と異なるが、天然起源アミノ酸と同様の方法で機能する化学化合物を指す。
【００３２】
本明細書で使用される「修飾糖」という語は、本発明の工程においてペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基へ酵素的に添加される天然または非天然起源炭水化物を指す。修飾糖は、糖ヌクレオチド（一、二、および三リン酸）、活性化糖（例えば、グリコシルハロゲン化物、メシル酸グリコシル）、および活性化されてもヌクレオチドでもない糖を含むが、これらに限定されない酵素基質から選択される。「修飾糖」は「修飾基」と共有官能化されている。有用な修飾基としては、ＰＥＧ部分、治療的部分、診断的部分、生体分子などが挙げられるが、これらに限定されない。修飾基は、好ましくは、天然起源、または非修飾炭水化物ではない。修飾基による官能化の位置は、「修飾糖」がペプチドへ酵素的に添加されることがないように選択される。
【００３３】
「水溶性」という語は、いくらかの検出可能な程度の水中溶解度を有する部分を指す。水溶性を検出および／または定量化する方法は当業界で公知である。代表的な水溶性ポリマーとしては、ペプチド、サッカリド、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）などが挙げられる。ペプチドは、単一アミノ酸、例えば、ポリ（リシン）から成る混合配列を有しうる。代表的なポリサッカリドがポリ（シアル酸）である。代表的なポリ（エーテル）がポリ（エチレングリコール）である。ポリ（エチレンイミン）は代表的なポリアミンであり、かつポリ（アクリル）酸は代表的なポリ（カルボン酸）である。
【００３４】
水溶性ポリマーのポリマー骨格はポリ（エチレングリコール）（すなわち、ＰＥＧ）でありうる。しかし、他の関連ポリマーも本発明の実施における使用に適切であり、ＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）という語の使用はこの点で包括的であり、排他的ではないことが意図されていると理解すべきである。ＰＥＧという語は、アルコキシＰＥＧ、二官能性ＰＥＧ、多腕ＰＥＧ、フォーク状ＰＥＧ、分岐ＰＥＧ、懸垂（ペンダント、ｐｅｎｄｅｎｔ）ＰＥＧ（すなわち、ポリマー骨格に懸垂する１つもしくはそれ以上の官能基を有するＰＥＧまたは関連ポリマー）、またはそれの中に分解性リンケージを有するＰＥＧを含むその形態のいずれかにポリ（エチレングリコール）を含む。
【００３５】
ポリマー骨格は線状または分岐でありうる。分岐ポリマー骨格は一般に当業界で周知である。一般的に、分岐ポリマーは中心分岐コア部分および中心分岐コアに連結した複数の線状ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは、グリセロール、ペンタエリトリトール、およびソルビトールなどさまざまなポリオールへのエチレンオキシドの添加によって調製されうる分岐形態で一般的に使用される。中心分岐部分は、リシンなど一部のアミノ酸由来でもありうる。分岐ポリ（エチレングリコール）は、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍとして一般形態で表されうるが、ここでＲはグリセロールまたはペンタエリトリトールなどのコア部分を表し、ｍは腕の数を表す。参照により全体として本明細書で援用される、米国特許第５，９３２，４６２号明細書に記載されているものなど多腕ＰＥＧ分子もポリマー骨格として使用されうる。
【００３６】
多くの他のポリマーも本発明に適切である。非ペプチド性および水溶性であり、２〜３００個の末端を有するポリマー骨格が、本発明において特に有用である。適切なポリマーの実施例としては、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）など他のポリ（アルキレングリコール）、エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのコポリマー、参照により全体として本明細書で援用される米国特許第５，６２９，３８４号明細書に記載されているものなどのポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアルニド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリルオイルモルフォリン）、およびコポリマー、テルポリマー、およびそれの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリマー骨格の各々の鎖の分子量は変動しうるが、一般的には約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ、しばしば約６，０００Ｄａ〜約８０，０００Ｄａの範囲である。
【００３７】
ペプチド薬剤を患者に投与するステップとの関連で「濃度曲線下面積」または「ＡＵＣ」は、ゼロ〜無限の時間の関数として患者における全身循環の濃度を述べる全濃度曲線下面積と定義される。
【００３８】
ペプチド薬剤を患者に投与するステップとの関連で本明細書で使用される「半減期」または「ｔ１／２」という語は、患者における薬剤の血漿濃度が半分に削減されるために必要とされる時間と定義される。多数のクリアランス機序、再分布、および当業界で公知の他の機序によってペプチド薬剤に関連する２つ以上の半減期がありうる。通常、アルファおよびベータ半減期が定義され、アルファ相は再分布と関係があり、ベータ相がクリアランスと関係があるようになっている。しかし、大部分、血流に限定されるタンパク質薬剤には、少なくとも２つのクリアランス半減期がありうる。一部のグリコシル化ペプチドについては、急速なベータ相クリアランスは、末端のガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、またはフコースを認識するマクロファージ、または内皮細胞上の受容体によって媒介されうる。緩徐なベータ相クリアランスは、有効半径２ｎｍ未満（ほぼ６８ｋＤ）の分子の腎糸球体ろ過、および／または組織における特異的もしくは非特異的取込みおよび代謝によって起こりうる。糖ＰＥＧ化は、末端の糖（例えば、ガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を制限し、それによって、これらの糖を認識する受容体によって急速なアルファ相クリアランスを阻止しうる。これはより大きな有効半径を与え、それによって分布および組織取込みの容積を減少させ、それによって遅発ベータ相を延長しうる。したがって、アルファ相およびベータ相半減期に対する糖ＰＥＧ化の正確な影響は、当業界で公知であるように、サイズ、グリコシル化の状態、および他のパラメータによって変動しうる。「半減期」のさらなる説明が、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９７年、ＤＦＡクロメリン（Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ）および  ＲＤシンデラー（Ｓｉｎｄｅｌａｒ）編、ハーウッド・パブリッシャーズ（Ｈａｒｗｏｏｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１０１−１２０頁）に存在する。
【００３９】
本明細書で使用される「糖コンジュゲーション」という語は、ポリペプチド、例えば、本発明のＧ−ＣＳＦペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基への修飾糖種の酵素的に媒介されるコンジュゲーションを指す。「糖コンジュゲーション」の亜属が「糖ＰＥＧ化」であり、ここでは修飾糖の修飾基はポリ（エチレングリコール）、アルキル誘導体（例えば、ｍ−ＰＥＧ）、またはそれの反応誘導体（例えば、Ｈ２Ｎ−ＰＥＧ、ＨＯＯＣ−ＰＥＧ）である。
【００４０】
「大規模」および「工業規模」という語は置換可能に使用され、少なくとも約２５０ｍｇ、好ましくは、少なくとも約５００ｍｇ、かつより好ましくは、少なくとも約１グラムの糖コンジュゲートを単一反応サイクルの終了時にもたらす反応サイクルを指す。
【００４１】
本明細書で使用される「グリコシル連結基」という語は、修飾基（例えば、ＰＥＧ部分、治療的部分、生体分子）が共有結合されるグリコシル残基を指し、グリコシル連結基は修飾基をコンジュゲートの残りの部分に結合させる。本発明の方法において、「グリコシル連結基」は、グリコシル化または未グリコシル化ペプチドに共有結合され、それによって、薬剤をペプチド上のアミノ酸および／またはグリコシル残基に連結させる。「グリコシル連結基」は一般に「修飾糖」のペプチドのアミノ酸および／またはグリコシル残基との酵素結合による「修飾糖」由来である。グリコシル連結基は、修飾基−修飾糖カセット形成（例えば、酸化→シッフ塩基形成→還元）中に分解されるサッカリド由来構造でありうるし、またはグリコシル連結基が無傷でありうる。「無傷グリコシル連結基」は、修飾基およびコンジュゲートの残りの部分に連結するサッカリドモノマーが分解されず、例えば、メタ過ヨウ素酸ナトリウムによって酸化されないグリコシル部分由来の連結基を指す。本発明の「無傷グリコシル連結基」は、グリコシル単位の添加または親サッカリド構造からの１つもしくはそれ以上のグリコシルの除去による天然起源オリゴ糖由来でありうる。
【００４２】
本明細書で使用される「標的部分」という語は、体内の特定の組織または部位に選択的に局在する種を指す。局在は、分子決定因子の特異的認識、標的剤またはコンジュゲートの分子サイズ、イオン相互作用、疎水性相互作用などによって媒介される。特定の組織または部位に薬剤を標的する他の機序は当業者に周知である。代表的な標的部分としては、抗体、抗体断片、トランスフェリン、ＨＳ−糖タンパク質、凝固因子、血清タンパク質、β−糖タンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯなどが挙げられる。
【００４３】
本明細書で使用される「治療的部分」は、抗生物質、抗炎症剤、抗腫瘍剤、細胞毒素、および放射性医薬品を含むが、これらに限定されない治療に有用な薬剤を意味する。「治療的部分」としては、生物活性剤のプロドラック、２つ以上の治療的部分が担体、例えば、多価薬剤に結合されている構成物が挙げられる。治療的部分としては、タンパク質、およびタンパク質を含む構成物も挙げられる。代表的なタンパク質としては、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−β、−γ）、インターロイキン（例えば、インターロイキンＩＩ）、血清タンパク質（例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第Ｘ因子）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）、および抗体融合タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子受容体（（ＴＮＦＲ）／Ｆｃドメイン融合タンパク質））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
本明細書で使用される「医薬的に許容される担体」としては、コンジュゲートと組合されると、コンジュゲートの活性を保持し、対象の免疫系と非反応性である材料が挙げられる。例としては、リン酸緩衝食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、およびさまざまな種類の湿潤剤などの標準的な医薬担体のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。他の担体としては、滅菌溶液、被覆錠剤およびカプセルを含む錠剤も挙げられる。一般的にかかる担体は、でんぷん、牛乳、糖、特定の種類の粘土、ゼラチン、ステアリン酸、またはそれの塩、ステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム、タルク、植物性脂肪または油、ゴム、グリコールなどの賦形剤、または他の既知の賦形剤を含有する。かかる担体は、風味および着色添加剤、または他の成分をも含みうる。かかる担体を含んで成る組成物は、公知の従来の方法によって形成される。
【００４５】
本明細書で使用される「投与するステップ」は、対象に対する経口投与、坐剤、局所接触、静脈内、腹腔内、筋内、病巣内、鼻腔内として投与、もしくは皮下投与、または持続放出デバイス、例えば、ミニ浸透ポンプの移植を意味する。投与は、非経口、および経粘膜（例えば、経口、鼻、膣、直腸、または経皮）を含むすべての経路による。非経口投与としては、例えば、静脈内、筋内、動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、および頭蓋内が挙げられる。さらに、注射が腫瘍を治療し、例えば、アポトーシスを誘発する場合、投与は腫瘍へ直接、かつ／または腫瘍周囲の組織へ行うことができる。送達の他の様態としては、リポソーム製剤の使用、静脈内注入、経皮パッチ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
「緩和すること」または「緩和する」という語は、患者の身体的または精神的健康における症状の軽減、寛解、または減少、または改善など客観的または主観的パラメータを含む病状または状態の治療における奏功の徴候を指す。症状の緩和は、身体検査および／または精神鑑定の結果を含む、客観的または主観的パラメータに基づきうる。
【００４７】
「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」という語は、疾患にかかりやすいが、未だ疾患の症状を経験または示していない動物における発生からの疾患または状態の予防（予防的治療）、疾患の抑制（その発症の遅滞または停止）、疾患の症状または副作用からの軽減を提供するステップ（緩和治療を含む）、および疾患の軽減（疾患の逆行をもたらす）を含む疾患または状態の「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」を指す。
【００４８】
「有効量」もしくは「に有効な量」または「治療に有効な量」あるいは文法的に同等の用語は、疾患を治療するために動物に投与されると、その疾患の治療もたらすのに十分である量を意味する。
【００４９】
「単離」という語は、材料を生成するために使用される成分が実質的または基本的にない材料を指す。本発明のペプチドコンジュゲートについて、「単離」という語は、通常はペプチドコンジュゲートを調製するために使用される混合物中に材料を伴う成分が実質的または基本的にない材料を指す。「単離」および「純粋」は同じ意味で使用される。一般的に、本発明の単離ペプチドコンジュゲートは、好ましくは範囲で表される純度のレベルを有する。ペプチドコンジュゲートの純度の範囲の下端は約６０％、約７０％、または約８０％であり、純度の範囲の上端は約７０％、約８０％、約９０％、もしくは約９０％超である。
【００５０】
ペプチドコンジュゲートが約９０％超の純度である場合、それらの純度は好ましくは範囲で表される。純度の範囲の下端は約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、または約９８％である。純度の範囲の上端は約９２％、約９４％、約９６％、約９８％、または約１００％の純度である。
【００５１】
純度は当技術分野で承認されている分析方法（例えば、銀染色ゲル上でのバンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、または同様の手段）によって測定される。
【００５２】
本明細書で使用される「集団の基本的に各々のメンバー」により、ペプチドに添加される選択された割合の修飾糖がペプチド上の多数の同一の受容体部位に添加される本発明のペプチドコンジュゲートの集団の特徴が記載される。「集団の基本的に各々のメンバー」は、修飾糖にコンジュゲートされたペプチド上の部位の「均質性」を示し、少なくとも約８０％、好ましくは、少なくとも約９０％、かつより好ましくは、少なくとも約９５％同種である本発明のコンジュゲートを指す。
【００５３】
「均質性」は、修飾糖がコンジュゲートされている受容体部分の集団にわたる構造上の一致を指す。したがって、各々の修飾部分が、すべての他の修飾糖がコンジュゲートされている受容体部位と同じ構造を有する受容体部位にコンジュゲートされている本発明のペプチドコンジュゲートにおいて、ペプチドコンジュゲートは約１００％同種であると考えられている。均質性は一般的に範囲で表される。ペプチドコンジュゲートの均質性の範囲の下端は約６０％、約７０％、または約８０％であり、純度の範囲の上端は約７０％、約８０％、約９０％、もしくは約９０％超である。
【００５４】
ペプチドコンジュゲートは約９０％以上同種であり、その均質性も好ましくは範囲で表される。均質性の範囲の下端は約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、または約９８％である。純度の範囲の上端は約９２％、約９４％、約９６％、約９８％、または約１００％の均質性である。ペプチドコンジュゲートの純度は、一般的に、当業者に周知の１つもしくはそれ以上の方法、例えば、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）、キャピラリー電気泳動などによって測定される。
【００５５】
「実質的に均一の糖型」または「実質的に均一のグリコシル化パターン」は、糖ペプチド種を参照すると、目的のグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、フコシルトランスフェラーゼ）によってグリコシル化される受容体部分の割合を指す。例えば、α１，２フコシルトランスフェラーゼの場合、実質的にＧａｌベータ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒおよびそれのシアリル化類似体の（下記の通り）すべてが本発明のペプチドコンジュゲートにおいてフコシル化されている場合は、実質的に均一のフコシル化パターンが存在する。本明細書に記載のフコシル化構造において、Ｆｕｃ−ＧｌｃＮＡｃリンケージは一般にα１，６またはα１，３であり、α１，６が一般に好ましい。出発原料がグリコシル化受容体部分（例えば、フコシル化Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ部分）を含有しうることを当業者によって理解されるであろう。したがって、計算されたグリコシル化率は、本発明の方法によってグリコシル化される受容体部分、および出発原料においてすでにグリコシル化された受容体部分を含む。
【００５６】
「実質的に均一の」の上記定義における「実質的に」という語は一般に、少なくとも約４０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、またはより好ましくは少なくとも約９０％、かつさらにより好ましくは少なくとも約９５％の特定のグリコシルトランスフェラーゼの受容体部分がグリコシル化されていることを意味する。
【００５７】
置換基が従来の化学式によって指定され、左から右へ書かれている場合、それらは同等に化学的に同一の置換を包含するが、これは構造を右から左へ書くことに由来し、例えば、−ＣＨ２Ｏ−は、−ＯＣＨ２−も開示することが意図されている。
【００５８】
「アルキル」という語は、単独で、または別の置換の一部として、特に明記しない限り、直鎖もしくは分岐鎖、または環状炭化水素ラジカル、またはそれの組合せを意味するが、これは完全に飽和され、モノまたはポリ不飽和されうるとともに、示された炭素原子の数（すなわち、Ｃ１−Ｃ１０は１〜１０個の炭素を意味する）を有する、二または多価ラジカルを含みうる。飽和炭化水素ラジカルの例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロへキシル、（シクロへキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−へキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどのホモログおよび異性体が挙げられるが、これらに限定されない。非飽和アルキル基は、１つもしくはそれ以上の二重結合または三重結合を有するものである。非飽和アルキル基の例としては、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、および高いホモログと異性体が挙げられるが、これらに限定されない。「アルキル」という語は、特に言及されていない限り、「ヘテロアルキル」など、以下で詳細に定義されるアルキルの誘導体を含むことも意味される。炭化水素基に限定されるアルキル基は「ホモアルキル」と呼ばれる。
【００５９】
「アルキレン」という語は、単独で、または別の置換の一部として、限定されることなく、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−によって例示された通り、アルカン由来の二価ラジカルを意味し、さらに「ヘテロアルキレン」としての下記の基を含む。一般的に、アルキル（またはアルキレン）基は１〜２４個の炭素原子を有し、１０個以下の炭素原子を有する基が本発明において好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は短鎖アルキルまたはアルキレン基であり、一般に８個以下の炭素原子を有する。
【００６０】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）という語はその従来の意味で使用され、それぞれ、酸素原子、アミノ基、またはイオウ原子によって分子の残りの部分に結合したアルキル基を指す。
【００６１】
「ヘテロアルキル」という語は、単独で、または別の語と組合せて、特に明記しない限り、安定した直鎖もしくは分岐鎖、または環状炭化水素ラジカル、または、明記された数の炭素原子、およびＯ、Ｎ、Ｓｉ、およびＳから成る基から選択される少なくとも１つのヘテロ原子から成るそれの組合せを意味し、ここで窒素およびイオウ原子は、場合により、酸化され、かつ窒素へテロ原子は、場合により、四級化されうる。ヘテロ原子Ｏ、ＮおよびＳおよびＳｉは、ヘテロアルキル基の内部位置、またはアルキル基が分子の残りの部分に結合した位置に配置されうる。例としては、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられるが、これらに限定されない。２個までのヘテロ原子、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３などが連続的でありうる。同様に、「ヘテロアルキレン」という語は、単独で、または別の置換一環として、限定されることなく、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−によって例示されている通り、ヘテロアルキル由来の二価ラジカルを意味する。ヘテロアルキレン基について、ヘテロ原子は鎖末端（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）のいずれかまたは両方をも占めうる。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基については、連結基の配向は、連結基の式が書かれている方向によって示されない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−および−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−を表す。
【００６２】
「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」という語は、単独で、または他の語と組合せて、特に明記しない限り、それぞれ、「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状変形を表す。また、ヘテロシクロアルキルについて、ヘテロ原子は、ヘテロサイクルが分子の残りの部分に結合している位置を占めうる。シクロアルキルの例としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例としては、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
「ハロ」または「ハロゲン」という語は、単独で、または別の置換の一部として、特に明記しない限り、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。また、「ハロアルキル」などの語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むことが意味される。例えば、「ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル」という語は、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含むが、これらに限定されないことが意味される。
【００６４】
「アリール」という語は、特に明記しない限り、融合され、または共有結合されている単一環または多重環（好ましくは、１〜３個の環）でありうるポリ非飽和、芳香族、置換を意味する。「ヘテロアリール」という語は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を含有するアリール基（または環）を指し、ここで窒素およびイオウ原子は場合により酸化され、窒素原子は場合により四級化される。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子により分子の残りの部分に結合されうる。アリールおよびヘテロアリール基の非限定的例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、テトラゾリル、ベンゾ［ｂ］フラニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル、ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル、および６−キノリルが挙げられる。上記アリールおよびヘテロアリール環系の各々の置換基は、下記の許容される置換の基から選択される。
【００６５】
簡潔さのために、「アリール」という語は、他の語（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）と組合せて使用されると、上記のアリールとヘテロアリール環の両方を含む。したがって、「アリールアルキル」という語は、炭素原子（例えば、メチレン基）が、例えば、酸素原子（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）によって置換されているアルキル基を含むアルキル基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）にアリール基が結合されているラジカルを含むことが意味される。
【００６６】
上記の語の各々（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」、および「ヘテロアリール」）は、指示ラジカルの置換および非置換形態を含むことが意味される。各々の型のラジカルの好ましい置換基は以下に示されている。
【００６７】
アルキルおよびヘテロアルキルラジカル（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルとしばしば呼ばれる基を含む）の置換基は、一般的に「アルキル基置換基」と呼ばれ、それらは、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’＝Ｎ−ＯＲ’−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ、および−ＮＯ２であるが、これらに限定されないものから選択されるさまざまな基の１つもしくはそれ以上でありうるが、数字の範囲はゼロ〜（２ｍ’＋１）であり、ここでｍ’はかかるラジカルにおける炭素原子の総数である。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’は各々好ましくは独立して水素、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、例えば、１−３個のハロゲンで置換されたアリール、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基の各々が独立して、これらの基の２つ以上が存在する場合に各々Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’であるように選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に結合されている場合、それらは窒素原子と組合され、５−、６−、または７−員環を形成しうる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むが、これらに限定されないことが意味される。置換基の上記の議論から、当業者は、「アルキル」という語が、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）などの水素基以外の基に結合された炭素原子を含む基を含むことが意味されることを理解するであろう。
【００６８】
アルキルラジカルについて記載された置換基と同様、アリールおよびヘテロアリール基の置換基は一般的に「アリール基置換」と呼ばれる。置換基は、例えば、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルから選択されるが、数字の範囲はゼロ〜芳香族系での開放価の総数であり、かつここでＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’は好ましくは独立して水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換へテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、および置換もしくは非置換へテロアリールから選択される。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基の各々が独立して、これらの基の２つ以上が存在する場合に各々Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’であるように選択される。次のスキームにおいて、記号Ｘは上記の「Ｒ］を表す。
【００６９】
アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２つが、場合により、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｕ−Ｕ−［式中、ＴおよびＵは独立して−ＮＲ−、−Ｏ−、ＣＲＲ’−または単一結合であり、ｕは０〜３の整数である］の置換基で置換されうる。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２つが、場合により、式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−［式中、ＡおよびＢは独立して−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−、または単一結合であり、ｒは１〜４の整数で４ある］の置換基で置換されうる。こうして形成された新しい環の単一結合の１つが、場合により、二重結合で置換されうる。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２つが、場合により、式−（ＣＲＲ’）ｚ−Ｘ−（ＣＲ’’Ｒ’’’）ｄ−［式中、ｚおよびｄは独立して０〜３の整数であり、かつＸは−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である］の置換基で置換されうる。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、およびＲ’’’は、好ましくは、独立して水素または置換もしくは非置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される。
【００７０】
本明細書で使用される「ヘテロ原子」という語は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、イオウ（Ｓ）、およびケイ素（Ｓｉ）を含むことが意味される。
【００７１】
はじめに
本発明は、Ｇ−ＣＳＦでのグリカン構造の修飾のための方法を包含する。Ｇ−ＣＳＦは、活性化Ｔ細胞、マクロファージ、内皮細胞、および間質線維芽細胞によって生成されるサイトカインとして当業界で公知である。Ｇ−ＣＳＦは主に骨髄で作用し、炎症性白血球の産生を増大させ、さらに内分泌性ホルモンとして作用し、炎症性機能中に消費される好中球の補充を開始させる。Ｇ−ＣＳＦには化学療法後の骨髄置換における臨床用途もある。
【００７２】
本発明は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のコンジュゲートを提供する。本発明は、顆粒球コロニー刺激活性を有するグリコシル化および未グリコシル化ペプチドのコンジュゲートを提供する。コンジュゲートは、治療的部分、診断的部分、標的部分などなどのさまざまな種によるコンジュゲーションによって追加的に修飾されうる。
【００７３】
本発明はさらに、Ｇ−ＣＳＦの再構築および／または修飾の方法を含む。Ｇ−ＣＳＦは、多数の疾患の治療における有益な手段であるが、上記の通り、その臨床的有効性はその比較的不良な薬物動態によって阻まれている。
【００７４】
代表的な実施形態において、本発明のＧ−ＣＳＦペプチドが、特定の種類の放射線療法、化学療法、および骨髄移植を受ける癌患者における感染を予防する目的のために患者に投与され、原因にかかわらず、重篤な慢性または相対的白血球減少症の治療にために末梢血前駆細胞移植における収集のための前駆細胞を動員し、かつ急性骨髄性白血病患者の治療を支持しうる。また、本発明のポリペプチドコンジュゲートまたは組成物は、ＡＩＤＳまたは他の免疫不全疾患および細菌感染の治療に使用されうる。
【００７５】
Ｇ−ＣＳＦはクローン化され、配列決定されている。代表的な実施形態において、Ｇ−ＣＳＦは、配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。当業者は、本発明が本明細書に示された配列に限定されないだけではなく、本明細書での上記の通り、Ｇ−ＣＳＦの変異形を含むことも容易に十分に理解するであろう。
【００７６】
したがって、本発明はさらに、当業界で公知のＧ−ＣＳＦ変異形を包含する。一例として、ただし決して本発明を限定するためではなく、Ｇ−ＣＳＦ変異形は米国特許第６，１６６，１８３号明細書に記載されており、ここでリシン残基の非天然相補体を含んで成り、さらに１つもしくは２つのポリエチレングリコール分子に連結されたＧ−ＣＳＦが記載されている。また、米国特許第６，００４，５４８号明細書、同第５，５８０，７５５号明細書、同第５，５８２，８２３号明細書、および同第５，６７６，９４１号明細書ではＧ−ＣＳＦ変異形が記載されており、ここでは位置１７、３６、４２、６４、および７４における１つもしくはそれ以上のシステイン残基がアラニン、または代わりとしてセリンによって置換されている。米国特許第５，４１６，１９５号明細書は、位置１７でシステイン、位置２７でアスパラギン酸、および位置６５および６６でセリンが、それぞれ、セリン、セリン、プロリン、およびプロリンで置換されているＧ−ＣＳＦ分子を記載している。他の変異形は当業界で公知であり、例えば、米国特許第５，３９９，３４５号明細書に記載されている。さらなる変異形は配列番号３−１１から選択されるアミノ酸を有する。
【００７７】
本発明の修飾Ｇ−ＣＳＦの発現および活性は、当業界で公知の方法を使用し、かつ、例えば、米国特許第４，８１０，６４３号明細書に記載されている通り評価されうる。一例として、活性は、放射性標識チミジン取込みアッセイを使用して測定されうる。手短に言えば、健康なドナーからのヒト骨髄をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（１．０７７ｇ／ｍＬ、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャジー州（ＮＪ））による密度カットにかけ、低密度細胞を、１０％ウシ胎仔血清、グルタミン、および抗生物質を含有するイスコーブ（Ｉｓｃｏｖｅ）培地（ジブコ（ＧＩＢＣＯ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州（ＣＡ））中に懸濁する。約２×１０４ヒト骨髄細胞を対照培地または本発明のＧ−ＣＳＦのいずれかで９６ウェル平底プレートにおいて約３７℃下、大気中５％ＣＯ２で約２日間インキュベートする。次いで、培養物を約４時間、０．５μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジン（ニュー・イングランド・ヌークレア（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）、Ｂｏｓｔｏｎ、マサチューセッツ州（Ｍａｓｓ．））でパルスし、例えば、ベンチュア（Ｖｅｎｔｕａ）ら（１９８３年、Ｂｌｏｏｄ  ６１：７８１頁）に記載されている通り取込みを測定する。対照化合物で処理した骨髄細胞と比較したヒト骨髄細胞への３Ｈ−チミジン取込みの増大が、活性および有望なＧ−ＣＳＦを示す。
【００７８】
上記の通り、本発明のコンジュゲートは、修飾糖のグリコシル化または未グリコシル化Ｇ−ＣＳＦペプチドとの酵素結合によって形成される。修飾糖は、Ｇ−ＣＳＦペプチドと糖上の修飾基との間に挿入されると、本明細書では例えば、「無傷グリコシル連結基」と呼ばれうるものになる。グリコシルトランスフェラーゼなど酵素の優れた選択性を使用することにより、本方法は、１つもしくはそれ以上の特定の位置で所望の基を有するペプチドを提供する。したがって、本発明によれば、修飾糖が直接、Ｇ−ＣＳＦペプチド鎖上の選択位置に結合され、あるいは、修飾糖は糖ペプチドの炭水化物部分へ付加される。修飾糖が糖ペプチド炭水化物、およびＧ−ＣＳＦペプチド骨格のアミノ酸残基に直接結合されているペプチドも本発明の範囲内である。
【００７９】
既知の化学的および酵素的ペプチド精緻化法とは対照的に、本発明の方法は、実質的に同種の誘導体化パターンを有するペプチドおよび糖ペプチドをアセンブルすることを可能にし、本発明において使用される酵素は一般に特定のアミノ酸残基またはＧ−ＣＳＦペプチドのアミノ酸残基の組合せに対して選択的である。この方法は、修飾ペプチドおよび糖ペプチドの大規模製造にも実用的である。したがって、本発明の方法は、予め選択された均一の誘導体化パターンを有する糖ペプチドの大規模調製のための実用的な手段を提供する。この方法は、詳しくは、細胞培養細胞（例えば、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、または原核細胞）またはトランスジェニックの植物もしくは動物における製造中に不完全にグリコシル化される糖ペプチドを含むがこれに限定されない治療的ペプチドの修飾に適切である。
【００８０】
本発明は、例えば、免疫もしくは細網内皮系（ＲＥＳ）によるクリアランス率の削減、または取込み率の削減による治療的半減期が増大されたグリコシル化および未グリコシル化Ｇ−ＣＳＦペプチドのコンジュゲートも提供する。さらに、本発明の方法は、ペプチド上の抗原決定基をマスキングするための手段を提供し、したがって、ペプチドに対する宿主免疫反応を削減または除去する。標的剤の選択的結合を使用し、特定の標的剤に特異的である特定の組織または細胞表面受容体にペプチドを標的することもできる。
【００８１】
コンジュゲート
第１の態様において、本発明は、選択修飾基とＧ−ＣＳＦペプチドとの間にコンジュゲートを提供する。
【００８２】
ペプチドと修飾部分との連結は、ペプチドと選択部分との間に挿入されたグリコシル連結基を含む。本明細書で論じるように、選択修飾部分は基本的にサッカリド単位に結合されうる種であり、結果として、修飾糖をペプチドへ付加する適切なトランスフェラーゼ酵素、またはそれに結合されたグリコシル基によって認識される「修飾糖」がもたらされる。修飾糖のサッカリド成分は、ペプチドと選択部分との間に挿入されると、「グリコシル連結基」、例えば、「無傷グリコシル連結基」になる。グリコシル連結基は、修飾基による修飾後、修飾糖をペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に添加する酵素の基質である単糖またはオリゴ糖から形成される。
【００８３】
グリコシル連結基は、修飾基の添加前またはその最中に分解的に修飾されるサッカリド部分であり、またはこれを含みうる。例えば、グリコシル連結基は、例えば、メタ過ヨウ素酸の作用によって、対応するアルデヒドへの無傷サッカリドの酸化的分解反応によって生成され、その後に適切なアミンでシッフ塩基に変換され、これが次いで、対応するアミンに還元されるサッカリド残基由来でありうる。
【００８４】
本発明のコンジュゲートは一般に一般構造
【化４】
2009501127.tif 000005
［式中、記号ａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｓは正の、ゼロ以外の整数を表し、ｔは０または正の整数のいずれかである。「薬剤」は治療薬、生物活性薬、検出可能な標識、水溶性部分（例えば、ＰＥＧ、ｍ−ＰＥＧ、ＰＰＧ、およびｍ−ＰＰＧ）または同様のものである。「薬剤」はペプチド、例えば、酵素、抗体、抗原等でありうる。リンカーは下記の多様な連結基でありうる。あるいは、リンカーは単一結合または「ゼロ順位リンカー」でありうる］に対応する。
【００８５】
代表的な実施形態において、選択修飾基は水溶性ポリマー、例えば、ｍ−ＰＥＧである。水溶性ポリマーはグリコシル連結基によってペプチドに共有結合されている。グリコシル連結基はペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残基に共有結合されている。本発明は、アミノ酸残基およびグリコシル残基がグリコシル連結基で修飾されているコンジュゲートをも提供する。
【００８６】
代表的な水溶性ポリマーはポリ（エチレングリコール）、例えば、メトキシポリ（エチレングリコール）である。本発明で使用されるポリ（エチレングリコール）は、特定の形態または分子量範囲に制限されていない。非分岐ポリ（エチレングリコール）分子については、分子量は、好ましくは、５００〜１００，０００である。２０００−６０，０００の分子量が好ましくは使用され、好ましくは、約５，０００〜約３０，０００である。
【００８７】
別の実施形態において、ポリ（エチレングリコール）は、付加された２つ以上のＰＥＧ部分を有する分岐ＰＥＧである。分岐ＰＥＧの例は、米国特許第５，９３２，４６２号明細書、米国特許第５，３４２，９４０号明細書、米国特許第５，６４３，５７５号明細書、米国特許第５，９１９，４５５号明細書、米国特許第６，１１３，９０６号明細書、米国特許第５，１８３，６６０号明細書、国際公開第０２／０９７６６号パンフレット、コデラ（Ｋｏｄｅｒａ）Ｙ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：２８３−２８８頁（１９９４年）、およびヤマサキ（Ｙａｍａｓａｋｉ）ら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、５２：２１２５−２１２７頁、１９９８年に記載されている。好ましい実施形態において、分岐ＰＥＧの各々のポリ（エチレングリコール）の分子量は、４０，０００ダルトン以下である。
【００８８】
酵素的に添加されるグリコシル連結基により形成されるコンジュゲートを提供するステップに加えて、本発明は、その置換パターンがきわめて同種であるコンジュゲートを提供する。本発明の方法の使用により、本発明のコンジュゲートの集団にわたって修飾糖部分の基本的にすべてが構造的に同一のアミノ酸またはグリコシル残基に結合されるペプチドコンジュゲートを形成することが可能である。したがって、第２の態様において、本発明は、グリコシル連結基、例えば、無傷グリコシル連結基によりペプチドに共有結合される水溶性ポリマー部分の集団を有するペプチドコンジュゲートを提供する。本発明の好ましいコンジュゲートにおいて、基本的に集団の各々のメンバーはグリコシル連結基によってペプチドのグリコシル残基に結合され、グリコシル連結基が結合されるペプチドの各々のグリコシル残基は同じ構造を有する。
【００８９】
グリコシル連結基によりそれに共有結合された水溶性ポリマー部分の集団を有するペプチドコンジュゲートも提供される。好ましい実施形態において、水溶性ポリマー部分の集団の基本的にすべてのメンバーは、グリコシル連結基によってペプチドのアミノ酸残基に結合され、それに結合されたグリコシル連結基を有するアミノ酸残基は同じ構造を有する。
【００９０】
本発明は、ペプチドが治療的部分、診断的部分、標的部分、毒素部分、または同様のものに無傷グリコシル連結基によってコンジュゲートされている上記のものと類似のコンジュゲートをも提供する。上記部分の各々は小分子、非天然ポリマー（例えば、ポリペプチド）または合成ポリマーでありうる。修飾部分がシアル酸に結合されている場合、修飾部分は実質的に非蛍光であることが好ましい。
【００９１】
任意の配列を有する基本的にいずれかの顆粒球コロニー刺激因子ペプチドまたは薬剤は、本発明のコンジュゲートのペプチド成分として使用される。顆粒球コロニー刺激因子はクローン化され、配列決定されている。代表的な例において、Ｇ−ＣＳＦペプチドは配列番号１に示されている配列を有する。すなわち、
【化５】
2009501127.tif 000006
【００９２】
別の代表的な例において、Ｇ−ＣＳＦペプチドは配列番号２に示されている配列を有する。すなわち、
【化６】
2009501127.tif 000007
【００９３】
別の代表的な例において、Ｇ−ＣＳＦペプチドは以下の配列番号３−１１に示されている配列を有する。すなわち、
【化７】
2009501127.tif 000008
【化８】
2009501127.tif 000009
【００９４】
本発明は、決して本明細書に記載の配列に限定されない。ペプチドの特性を増加または減少させ、または構造的特徴を変更するために突然変異される他の配列のＧ−ＣＳＦペプチドの使用が本発明の範囲内である。例えば、本発明において使用される変異Ｇ−ＣＳＦペプチドは、追加のＯ−グリコシル化部位または他の位置でのかかる部位が供給されるものを含む。さらに、１つもしくはそれ以上のＮ−グリコシル化部位を含む変異ペプチドが本発明において使用される。
【００９５】
好ましくは、Ｇ−ＣＳＦペプチドのアミノ末端もカルボキシ末端もポリマー修飾部分で誘導体化されない。
【００９６】
本発明のペプチドは、少なくとも１つのＯ連結またはＮ連結グリコシル化部位を含み、これはポリマー修飾部分、例えば、ＰＥＧ部分を含むグリコシル残基でグリコシル化される。代表的な実施形態において、ＰＥＧは無傷グリコシル連結基によってペプチドに共有結合されている。グリコシル連結基は、ペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残基のいずれかに共有結合されている。あるいは、グリコシル連結基は、糖ペプチドの１つもしくはそれ以上のグリコシル単位に結合されている。本発明は、グリコシル連結基がアミノ酸残基およびグリコシル残基に結合されているコンジュゲートをも提供する。
【００９７】
ＰＥＧ部分は無傷グリコシルリンカーに直接、または非グリコシルリンカー、例えば、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキルによって結合されている。
【００９８】
代表的な実施形態において、本発明は式
【化９】
2009501127.tif 000010
［式中、Ｊはグリコシル部分（例えば、ヌクレオチド糖）であり、Ｌは結合またはリンカーであり、Ｒ１は修飾基、例えば、ポリマー修飾部分である］を有する修飾糖アミンを使用する。代表的な結合は、グリコシル部分でのＮＨ２部分と修飾基での相補的反応性の基との間に形成されるものである。例えば、Ｒ１がカルボン酸部分を含む場合、この部分は活性化され、グリコシル残基でのＮＨ２部分と結合され、構造ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１を有する結合を与える。Ｊは、好ましくは、ピラノースまたはフラノース構造を開裂する条件、例えば、酸化的条件、例えば、過ヨウ素酸ナトリウムにさらされることによって分解されていない、「無傷」であるグリコシル部分である。
【００９９】
代表的なリンカーとしてはアルキルおよびヘテロアルキル部分が挙げられる。リンカーとしては、連結基、例えば、アシルベースの連結基、例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−などが挙げられる。連結基は、本発明の種の成分間、例えば、グリコシル部分とリンカー（Ｌ）との間、またはリンカーと修飾基（Ｒ１）との間に形成された結合である。他の代表的な連結基はエーテル、チオエーテル、およびアミンである。例えば、１つの実施形態において、リンカーは、グリシン残基などのアミノ酸残基である。グリシンのカルボン酸部分は、グリコシル残基でのアミンとの反応によって対応するアミドへ変換され、グリシンのアミンは修飾基の活性化カルボン酸または炭酸塩との反応によって対応するアミドまたはウレタンへ変換される。
【０１００】
別の代表的なリンカーはＰＥＧ部分、例えば、アミノ酸残基で官能化されるＰＥＧ部分である。ＰＥＧリンカーは、１つのＰＥＧ末端でアミノ酸残基によりグリコシル基にコンジュゲートされ、かつ他のＰＥＧ末端によりＲ１に結合されている。あるいは、アミノ酸残基はＲ１に結合され、アミノ酸に結合されていないＰＥＧ末端はグリコシル基に結合されている。
【０１０１】
ＮＨ−Ｌ−Ｒ１の代表的な種は式：
−ＮＨ｛Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ａＮＨ｝ｓ｛Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨ｝ｔＲ１［式中、指数ｓおよびｔは独立して０または１である。指数ａ、ｂ、およびｄは独立して０〜２０の整数であり、ｃは１〜２５００の整数である］を有する。他の同様のリンカーは、−ＮＨ部分が別の基、例えば、−Ｓ、−Ｏ、または−ＣＨ２によって置換される種に基づく。当業者であれば十分に理解するように、指数ｓおよびｔに対応する１つもしくはそれ以上の括弧付き部分は、置換もしくは非置換アルキル、もしくはヘテロアルキル部分で置換されうる。
【０１０２】
より詳しくは、本発明では、ＮＨ−Ｌ−Ｒ１が、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ａＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨ（ＣＨ２）ａＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ａＮＨＲ１、ＮＨＣ（ＣＨ２）ａＮＨＲ１、およびＮＨＲ１である化合物が使用される。これらの式において、指数ａ、ｂ、およびｄは、０〜２０、好ましくは、１〜５の整数から独立して選択される。指数ｃは１〜約２５００の整数である。
【０１０３】
代表的な実施形態において、ｃは、ＰＥＧ部分がおよそ１ｋＤａ、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａ、または８０ｋＤａであるように選択される。
【０１０４】
次の議論において、本発明は、フラノースおよびピラノースの選択誘導体の使用を参照することにより説明される。当業者は、議論の焦点が説明の明確さであり、かつ記載されている構造および組成物がサッカリド基、修飾サッカリド基、活性化修飾サッカリド基、および修飾サッカリド基のコンジュゲートの属にわたって一般に適用可能であることを認識するであろう。
【０１０５】
代表的な実施形態において、本発明は、
【化１０】
2009501127.tif 000011
から選択される式を有する無傷グリコシル連結基によりポリマー修飾部分にコンジュゲートされている糖ペプチドを提供する。式Ｉにおいて、Ｒ２はＨ、ＣＨ２ＯＲ７、ＣＯＯＲ７、またはＯＲ７であり、ここでＲ７はＨ、置換もしくは非置換アルキル、または置換もしくは非置換ヘテロアルキルを表す。ＣＯＯＲ７がカルボン酸またはカルボン酸塩である場合、両形態は単一構造のＣＯＯ−またはＣＯＯＨの指定によって表される。式ＩおよびＩＩにおいて、記号Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ６’は独立してＨ、置換もしくは非置換アルキル、ＯＲ８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ９を表す。指数ｄは０または１である。Ｒ８およびＲ９は独立してＨ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、シアル酸、またはポリシアル酸から選択される。Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ６’の少なくとも１つは、ポリマー修飾部分、例えば、結合または連結基により連結されたＰＥＧを含む。代表的な実施形態において、Ｒ６およびＲ６’は、それらが結合される炭素といっしょにシアル酸のピルビル側鎖の成分である。さらに代表的な実施形態において、この側鎖はポリマー修飾部分で官能化されている。別の代表的な実施形態において、Ｒ６およびＲ６’は、それらが結合される炭素といっしょにシアル酸の側鎖の成分であり、ポリマー修飾部分はＲ５の成分である。
【０１０６】
さらに代表的な実施形態において、ポリマー修飾部分は、一般にヘテロ原子、例えば、窒素により、以下の式
【化１１】
2009501127.tif 000012
［式中、Ｒ１はポリマー部分であり、Ｌは結合および連結基から選択される。指数ｗは、１−６、好ましくは、１−３、かつより好ましくは、１−２から選択される整数を表す］に示される通り、リンカー、Ｌによりコア上で糖コアに結合される。代表的な連結基は、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル部分およびシアル酸を含む。リンカーの代表的の成分がアシル部分である。
【０１０７】
本発明による代表的な化合物は、式ＩまたはＩＩによる構造を有し、ここでＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、またはＲ６’の少なくとも１つは式
【化１２】
2009501127.tif 000013
を有する。
【０１０８】
本実施形態に記載の別の実施例において、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、またはＲ６’の少なくとも１つは式
【化１３】
2009501127.tif 000014
［式中、ｓは０〜２０の整数であり、Ｒ１は線状ポリマー修飾部分である］を有する。
【０１０９】
代表的な実施形態において、ポリマー修飾部分−リンカー構成物は、中心部分に結合した２つもしくはそれ以上のポリマー鎖を含む分岐構造である。本実施形態において、構成物は式
【化１４】
2009501127.tif 000015
［式中、Ｒ１およびＬは上記の通りであり、ｗ’が２〜６、好ましくは、２〜４、かつより好ましくは、２〜３の整数である］を有する。
【０１１０】
Ｌが結合である場合、これはＲ１の前駆体上の反応官能基とサッカリールコア上の相補的反応性の反応官能基との間に形成される。Ｌがゼロ順位リンカーである場合、Ｌの前駆体はＲ１前駆体との反応前にグリコシル部分上の適所にありうる。あるいは、Ｒ１およびＬの前駆体は、その後にグリコシル部分に結合される前もって作られたカセットへ組込まれうる。本明細書に記載されているように、適切な反応官能基を有する前駆体の選択および調製は当業者の能力の範囲内である。さらに、前駆体の結合は、当技術分野で十分に理解されている化学によって進行する。
【０１１１】
代表的な実施形態において、Ｌは、アミノ酸、または、ポリマー修飾部分が置換アルキルリンカーにより結合されている修飾糖を提供する小さなペプチド（例えば、１−４アミノ酸残基）から形成される連結基である。代表的なリンカーとしては、グリシン、リシン、セリン、およびシステインが挙げられる。ＰＥＧ部分は、アミドまたはウレタン結合によりリンカーのアミン部分に結合されうる。ＰＥＧは、それぞれ、チオエーテルまたはエーテル結合によりシステインおよびセリンのイオウまたは酸素原子に連結される。
【０１１２】
代表的な実施形態において、Ｒ５はポリマー修飾部分を含む。別の代表的な実施形態において、Ｒ５は、ポリマー修飾部分、および修飾部分を分子の残りの部分に結合するリンカー、Ｌを含む。上記の通り、Ｌは線状または分岐構造でありうる。同様に、ポリマー修飾部分は分岐または線状でありうる。
【０１１３】
代表的な実施形態において、
【化１５】
2009501127.tif 000016
は次式
【化１６】
2009501127.tif 000017
［式中、部分
【化１７】
2009501127.tif 000018
はリンカー腕、Ｌ、であり、Ｒ１６およびＲ１７はＲ１である。Ｒ１６およびＲ１７は独立してポリマー修飾部分から選択される。Ｃは炭素である。Ｘ５は、好ましくは、非反応基（例えば、Ｈ、非置換アルキル、非置換へテロアルキル）であり、ポリマー腕でありうる。Ｘ２およびＸ４は、好ましくは、同じまたは異なりうる、生理的条件下に非反応であるリンケージ断片である。代表的なリンカーは、芳香族もエステル部分も含まない。あるいは、これらのリンケージは、生理的に関連性の条件下に分解するようにデザインされている１つもしくはそれ以上の部分、例えば、エステル、ジスフィルド等を含みうる。Ｘ２およびＸ４はポリマー腕Ｒ１６およびＲ１７をＣに結合させる。Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の代表的なリンケージ断片は独立して選択され、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、（Ｏ）ＣＮＨ、およびＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、およびＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＣＨ２Ｓ、ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２Ｓ、（ＣＨ２）ｏＯ、（ＣＨ２）ｏＳまたは（ＣＨ２）ｏＹ’−ＰＥＧを含み、ここでＹ’はＳ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、またはＯであり、ｏは１〜５０の整数である。代表的な実施形態において、リンケージ断片Ｘ２およびＸ４は異なるリンケージ断片である］による構造を有する。
【０１１４】
代表的な実施形態において、
【化１８】
2009501127.tif 000019
は次式
【化１９】
2009501127.tif 000020
［指数ｍおよびｎは、独立して０〜５０００から選択される整数である。Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、およびＡ１１は、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換へテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、−ＮＡ１２Ａ１３、−ＯＡ１２、および−ＳｉＡ１２Ａ１３から独立して選択されるメンバーである。指数ｊおよびｋは、０〜２０から独立して選択される整数である。Ａ１２およびＡ１３は、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、および置換もしくは非置換ヘテロアリールから独立して選択されるメンバーである］による構造を有する。
【０１１５】
式ＩＩＩａは式ＩＩＩのサブセットである。式ＩＩＩａによって記載された構造は式ＩＩＩによっても包含される。
【０１１６】
代表的な実施形態において、
【化２０】
2009501127.tif 000021
は次式
【化２１】
2009501127.tif 000022
［代表的な実施形態において、Ａ１およびＡ２は各々−ＯＣＨ３またはＨである］による構造を有する。
【０１１７】
１つの実施形態において、本発明は、部分
【化２２】
2009501127.tif 000023
［式中、Ｄは−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、ＧはＨおよびＲ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、Ｒ１は直鎖−鎖または分岐ポリ（エチレングリコール）残基を含んで成る部分であり、Ｌはリンカー、例えば、結合（「ゼロ順位」）、置換もしくは非置換アルキル、および置換もしくは非置換ヘテロアルキルである。代表的な実施形態において、ＤがＯＨである場合、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである場合、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である］を含んで成るＧ−ＣＳＦペプチドを提供する。
【０１１８】
別の代表的な実施形態において、本発明は、本発明の修飾糖と基質Ｇ−ＣＳＦペプチドとの間に形成されるコンジュゲートを提供する。本実施形態において、修飾糖の糖部分は、ペプチド基質と修飾基との間に挿入されたグリコシル連結基になる。代表的なグリコシル連結基が無傷グリコシル連結基であるが、ここで連結基を形成するグリコシル部分は、化学的（例えば、メタ過ヨウ素酸ナトリウム）または酵素的（例えば、オキシダーゼ）方法によって分解されない。本発明の選択コンジュゲートは、アミノ−サッカリド、例えば、マンノサミン、グルコサミン、ガラクトサミン、シアル酸等のアミン部分に結合されている修飾基を含む。本モチーフに記載の代表的な修飾基−無傷グリコシル連結基カセットは、式
【化２３】
2009501127.tif 000024
を有するものなどのシアル酸構造に基づく。
【０１１９】
上式において、Ｒ１およびＬは上記の通りである。代表的なＲ１基の構造に関する詳細が以下に示されている。
【０１２０】
さらに代表的な実施形態において、コンジュゲートは、基質Ｇ−ＣＳＦとサッカリール部分との間に形成されるが、ここで修飾基はリンカーによりサッカリール部分の６炭素位置で結合されている。したがって、本実施形態に記載の例示的なコンジュゲートは式
【化２４】
2009501127.tif 000025
［式中、ラジカルは上記の通りである］を有する。かかるサッカリール部分は、グルコース、グルコサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、マンノース、マンノサミン、Ｎ−アセチル−マンノサミンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
Ｇ−ＣＳＦなど治療的ペプチド上の修飾グリコシル残基に利用可能な方法の多用途性により、本発明のペプチドコンジュゲート上のグリコシル構造は実質的に任意の構造を有しうる。さらに、グリカンはＯ連結またはＮ連結でありうる。下記で例示される通り、上記のピラノースおよびフラノース誘導体の各々がペプチドのグリコシル部分の成分でありうる。
【０１２２】
別の代表的な実施形態において、本発明はＧ−ＣＳＦペプチドコンジュゲートを提供するが、ここで修飾グリコシル残基（グリコシル連結基を含む）はＴｈｒ１３３にある（配列がＭｅｔで始まる場合はＴｈｒ１３４）。本実施形態に記載の代表的な式は部分
【化２５】
2009501127.tif 000026
［式中、Ｌは、０順位リンカー、置換もしくは非置換アルキル、および置換もしくは非置換ヘテロアルキル部分であるリンカーである。代表的なリンカーが天然または非天然アミノ酸のアミドまたはカルバメートである（例えば、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ＳＮＨＣ（Ｏ）−）が、ここで指数ｓは１〜２０の整数を表す。ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分は、約１００ｋＤまでの分子量を有しうる。代表的なＰＥＧ部分はほぼ１ＫＤａ、２ＫＤａ、５ＫＤａ、１０ＫＤａ、１５ＫＤａ、２０ＫＤａ、２５ＫＤａ、３０ＫＤａ、３５ＫＤａ、４０ＫＤａ、４５ＫＤａ、５０ＫＤａ、５５ＫＤａ、６０ＫＤａ、６５ＫＤａ、７０ＫＤａ、７５ＫＤａ、または８０ＫＤａである。ＰＥＧ部分は、本明細書に記載のものなど線状または分岐ＰＥＧ種である。リンカーに結合されていないＰＥＧ部分の末端は、ＯＨまたは別の部分のいずれか、例えば、Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４）置換もしくは非置換アルキル基でありうる。ＯＭｅが現在、好ましい。］を含む。
【０１２３】
さらに代表的な実施形態において、本発明の糖ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦは基礎構造
【化２６】
2009501127.tif 000027
［式中、Ｒおよびｎは上記の通りである］を含む。リンカー腕−ＰＥＧカセットは任意の位置でシアル酸に結合されている。炭素５での窒素は現在、好ましいが、炭素９でのヒドロキシルはアミンで置換され、上記の通り官能化されうる。
【０１２４】
上記の図式の各々において、グリコシル化部位は位置１３４でのトレオニンとして表される。図式は、末端のメチオニンを含むＧ−ＣＳＦペプチドに関する。図式は、末端のメチオニンを含むことがないＧ−ＣＳＦペプチドにも関するが、この場合、上記図式の各々Ｔｈｒは適切にＴｈｒ１３３と標識される。
【０１２５】
本発明は、式
【化２７】
2009501127.tif 000028
を有するグリコシル基を含む修飾Ｇ−ＣＳＦペプチドを提供する。
【０１２６】
他の実施形態において、基は式
【化２８】
2009501127.tif 000029
［式中、指数ｔは０または１である］を有する。
【０１２７】
さらに代表的な実施形態において、基は次式
【化２９】
2009501127.tif 000030
［式中、指数ｔは０または１である］から選択されるメンバーである構造を有する。
【０１２８】
さらに別の実施形態において、基は式
【化３０】
2009501127.tif 000031
［式中、指数ｐは１〜１０の整数を表し、ａは０または１のいずれかである］を有する。
【０１２９】
上記の式の各々に記載の代表的な実施形態において、ＰＥＧグリコシル連結基はＧ−ＣＳＦのＴｈｒ１３３（Ｔｈｒ１３４）で結合されている。
【０１３０】
代表的な実施形態において、本発明の糖ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦペプチドは、下記
【化３１】
2009501127.tif 000032
のグリコシル残基から選択される少なくとも１つのＮ−連結グリコシル残基を含む。
【０１３１】
上式において、指数ｔ１は０または１であり、指数ｐは１〜１０の整数である。記号Ｒ１５’は、Ｈ、ＯＨ（例えば、Ｇａｌ−ＯＨ）、シアリル部分、ポリマー修飾シアリル部分（すなわち、グリコシル連結基−ポリマー修飾部分（Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ１））またはポリマー修飾シアリル部分に結合しているシアリル部分（例えば、Ｓｉａ−Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ１）（「Ｓｉａ−ＳｉａＰ」）。代表的なポリマー修飾サッカリール部分は式ＩおよびＩＩに記載の構造を有する。本発明の代表的なＧ−ＣＳＦペプチドは、式ＩまたはＩＩに記載の構造を含むＲ１５’を有する少なくとも１つのグリカンを含む。式ＩおよびＩＩの開放価を有する酸素は、好ましくは、グリコシルリンケージによりＧａｌまたはＧａｌＮａｃ部分の炭素に結合されている。さらに代表的な実施形態において、酸素はガラクトース残基の位置３で炭素に結合されている。代表的な実施形態において、修飾シアル酸はα２，３でガラクトース残基に連結されている。別の代表的な実施形態において、シアル酸はα２，６でガラクトース残基に連結されている。
【０１３２】
別の代表的な実施形態において、本発明は、ペプチドのアミノ酸残基に共有結合されている上記のものなどグリコシル連結基を含むＧ−ＣＳＦペプチドコンジュゲートを提供する。本モチーフによる１つの実施形態において、グリコシル連結部分は、Ｓｉａ残基によりガラクトース残基に連結されている。
【化３２】
2009501127.tif 000033
本モチーフによる代表的な種が、Ｓｉａ−Ｓｉａ結合形成する酵素、例えば、ＣＳＴ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩＩ、およびＳＴ８Ｓｉａ−ＩＶを使用することにより、Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ１をグリカンの末端のシアル酸にコンジュゲートすることによって調製される。
【０１３３】
別の代表的な実施形態において、グリカンは基
【化３３】
2009501127.tif 000034
およびそれの組合せから選択される式を有する。
【０１３４】
本基のグリカンは一般に昆虫（例えば、Ｓｆ−９）細胞によって、本明細書に記載された方法による再構築後に生成されるＧ−ＣＳＦペプチドで確認されるものに対応する。例えば、トリマンノシルコアで発現される昆虫由来Ｇ−ＣＳＦは、その後にＧｌｃＮＡｃドナーとＧｌａＮａｃトランスフェラーゼおよびＧａｌドナーとＧａｌトランスフェラーゼと接触される。ＧｌａＮＡｃおよびＧａｌのトリマンノシルコアへの付加は、２つのステップまたは単一のステップのいずれかで達成される。修飾シアル酸が、本明細書で論じるように、グリコシル部分の少なくとも１つの分岐に添加される。修飾シアル酸で官能化されていないＧａｌ部分は、場合により、シアリルトランスフェラーゼの存在下にシアル酸ドナーとの反応によって「キャップ」される。
【０１３５】
代表的な実施形態において、ペプチドの集団における末端Ｇａｌ部分の少なくとも６０％はシアル酸でキャップされ、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、さらにより好ましくは、少なくとも９０％、かつさらにより好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％はシアル酸でキャップされる。
【０１３６】
上式の各々において、Ｒ１５’は上記の通りである。本発明のさらに代表的な修飾Ｇ−ＣＳＦペプチドは、式ＩまたはＩＩによる構造を有するＲ１５部分を有する少なくとも１つのグリカンを含む。
【０１３７】
代表的な実施形態において、グリコシル連結部分は式
【化３４】
2009501127.tif 000035
［式中、ｂは０または１である。指数ｓは１〜１０の整数を表し、ｆは１〜２５００の整数を表す］を有する。一般に、約２０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧ部分の使用が好ましい。また、配列番号１の１３３でのトレオニンまたは配列番号２のトレオニン１３４へのグリコシル連結基の結合も好ましい。
【０１３８】
さらに別の代表的な実施形態において、本発明は、基礎構造
【化３５】
2009501127.tif 000036
［式中、Ｒおよびｎは上記の通りである。Ｒ１はＨまたは脱プロトン化酸の負電荷（すなわち、ＣＯＯ−）を表す］を含む糖ＰＥＧ化ＧＣＳＦを提供する。
【０１３９】
別の代表的な実施形態において、Ｇ−ＣＳＦは昆虫細胞由来であり、ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌをマンノースコアに添加することによって再構築され、線状ＰＥＧ部分を有するシアル酸を使用することにより糖ＰＥＧ化され、式
【化３６】
2009501127.tif 000037
［式中、ｓは１〜１０の整数を表し、ｆは１〜２５００の整数を表す］を有する少なくとも１つの部分を含んで成るＧ−ＣＳＦペプチドを与える。
【０１４０】
本明細書で論じるように、本発明のコンジュゲートにおいて使用されるＰＥＧは線状または分岐でありうる。本発明の本実施形態による分岐コンジュゲートを形成するために使用する代表的な前駆体は式
【化３７】
2009501127.tif 000038
を有する。
【０１４１】
本式による分岐ポリマー種は基本的に純粋な水溶性ポリマーである。Ｘ３は、イオン性の、例えば、ＯＨ、ＣＯＯＨ、Ｈ２ＰＯ４、ＨＳＯ３、ＨＰＯ３、およびそれの塩等、または他の反応官能基、例えば、下記を含む部分である。Ｃは炭素である。Ｘ５は、好ましくは、非反応基（例えば、Ｈ、非置換アルキル、非置換へテロアルキル）であり、ポリマー腕でありうる。Ｒ１６およびＲ１７は独立して選択されるポリマー腕、例えば、非ペプチド、非反応性ポリマー腕（例えば、ＰＥＧ）である。Ｘ２およびＸ４は、好ましくは、同じまたは異なりうる生理的条件下に基本的に非反応性であるリンケージ断片である。代表的なリンカーは芳香族部分もエステル部分も含まない。あるいは、これらのリンケージは、生理的に関連性のある条件下に分解するように考えられている１つもしくはそれ以上の部分、例えば、エステル、ジスルフィド等を含みうる。Ｘ２およびＸ４は、ポリマー腕Ｒ１６およびＲ１７をＣに結合する。Ｘ３’がリンカー、糖、またはリンカー−糖カセットに対する相補的反応性の反応官能基と反応すると、Ｘ３’はリンケージ断片Ｘ３の成分に変換される。
【０１４２】
Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の代表的なリンケージ断片は独立して選択され、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、（Ｏ）ＣＮＨ、およびＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、およびＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＣＨ２Ｓ、ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２Ｓ、（ＣＨ２）ｏＯ、（ＣＨ２）ｏＳまたは（ＣＨ２）ｏＹ’−ＰＥＧを含み、ここでＹ’はＳ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、またはＯであり、ｏは１〜５０の整数である。代表的な実施形態において、リンケージ断片Ｘ２およびＸ４は異なるリンケージ断片である。
【０１４３】
代表的な実施形態において、前駆体（ＩＩＩ）、またはそれの活性化誘導体は、Ｘ３’と糖部分上の相補的反応性の基、例えば、アミンとの間の反応により糖、活性化糖、または糖ヌクレオチドと反応、かつそれによって、これらに結合される。あるいは、Ｘ３’は、リンカー、Ｌに対する前駆体上の反応官能基と反応する。式ＩおよびＩＩのＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５Ｒ６、またはＲ６’の１つもしくはそれ以上が、分岐ポリマー修飾部分を含み、またはこの部分がＬにより結合されうる。
【０１４４】
代表的な実施形態において、部分
【化３８】
2009501127.tif 000039
はリンカー腕、Ｌである。本実施形態において、代表的なリンカーは、天然または非天然アミノ酸、アミノ酸類似体もしくはアミノ酸模倣剤、または１つもしくはそれ以上のかかる種から形成された小ペプチド由来である。例えば、本発明の化合物に存在するある分岐ポリマーは式
【化３９】
2009501127.tif 000040
を有する。
【０１４５】
Ｘａは、分岐ポリマー修飾部分の前駆体、および糖部分での反応官能基、またはリンカーへの前駆体に対する、反応官能基、例えば、Ｘ３’の反応によって形成されるリンケージ断片である。例えば、Ｘ３’がカルボン酸である場合、これは活性化され、アミノ−サッカリドから懸垂するアミン基（例えば、Ｓｉａ、ＧａｌＮＨ２、ＧｌｃＮＨ２、ＭａｎＮＨ２等）に直接結合され、アミドであるＸａを形成する。追加の代表的な反応官能基および活性化前駆体は以下に記載されている。指数ｃは１〜１０の整数を表す。他の記号は上記のものと同一性を有する。
【０１４６】
別の代表的な実施形態において、Ｘａは別のリンカー
【化４０】
2009501127.tif 000041
［式中、Ｘｂは第２のリンケージ断片であり、Ｘａについて記載されている基から独立して選択され、かつ、Ｌと同様に、Ｌ１は、結合、置換もしくは非置換アルキル、または置換もしくは非置換ヘテロアルキルである］で形成された連結部分である。
【０１４７】
ＸａおよびＸｂの代表的な種としては、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨおよびＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、およびＯＣ（Ｏ）ＮＨが挙げられる。
【０１４８】
別の代表的な実施形態において、Ｘ４は、アミノ酸、ジペプチド（例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）、またはトリペプチド（例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）であるＲ１７に結合されたペプチドであり、ここでアルファ−アミン部分および／または側鎖へテロ原子はポリマー修飾部分で修飾される。
【０１４９】
さらに代表的な実施形態において、本発明のコンジュゲートは、部分、例えば、
【化４１】
2009501127.tif 000042
から選択される式［式中、さまざまな記号によって表されるラジカルの同一性は、上記のものと同じである。ＬａはＬおよびＬ１の上記の通り結合またはリンカーであり、例えば、置換もしくは非置換アルキル、または置換もしくは非置換ヘテロアルキル部分である。代表的な実施形態において、Ｌａは、示される通りポリマー修飾部分で官能化されているシアル酸の側鎖の部分である。代表的なＬａ部分は、１つもしくはそれ以上のＯＨまたはＮＨ２を含む置換もしくは非置換アルキル鎖を含む］を有するＲ１５部分である。
【０１５０】
さらに別の代表的な実施形態において、本発明は、部分、例えば、式
【化４２】
2009501127.tif 000043
によるＲ１５部分を有するコンジュゲートを提供する。さまざまな記号によって表されるラジカルの同一性は、上記のものと同じである。当業者であれば、式ＶＩＩおよびＶＩＩＩにおけるリンカー腕が同等に本明細書に記載の他の修飾糖に適用可能であることを十分に理解するであろう。代表的な実施形態において、式ＶＩおよびＶＩＩの種は、本明細書に記載のグリカン構造に結合したＲ１５部分である。
【０１５１】
さらに別の代表的な実施形態において、Ｇ−ＣＳＦペプチドは式
【化４３】
2009501127.tif 000044
［式中、ラジカルの同一性は上記の通りである。Ｌａの代表的な種は、−（ＣＨ２）ｊＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｈＣ（Ｏ）ＮＨ−であり、ここで指数ｈおよびｊは０〜１０の独立して選択される整数である。さらに代表的な種が−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。指数ｊおよびｋは０〜２０の独立して選択される整数である。指数ｍおよびｎは０〜５０００の独立して選択される整数である。Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、およびＡ１１は、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換へテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換へテロアリール、−ＮＡ１２Ａ１３、−ＯＡ１２、および−ＳｉＡ１２Ａ１３から独立して選択されるメンバーである。Ａ１２およびＡ１３は、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、および置換もしくは非置換ヘテロアリールから独立して選択されるメンバーである］によるＲ１５部分を含む。
【０１５２】
上記の本発明の実施形態は、さらに、ポリマーが水溶性ポリマー、詳しくは、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）、例えば、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）である種を参照することにより例示される。当業者は、以下の焦点が説明の明確さのためであり、代表的なポリマーとしてＰＥＧを使用する記載されたさまざまなモチーフが、ＰＥＧ以外のポリマーが使用される種に同等に適用可能であることを十分に理解するであろう。
【０１５３】
任意の分子量、例えば、１ＫＤａ、２ＫＤａ、５ＫＤａ、１０ＫＤａ、１５ＫＤａ、２０ＫＤａ、２５ＫＤａ、３０ＫＤａ、３５ＫＤａ、４０ＫＤａ、４５ＫＤａ、５０ＫＤａ、５５ＫＤａ、６０ＫＤａ、６５ＫＤａ、７０ＫＤａ、７５ＫＤａ、または８０ＫＤａのＰＥＧが本発明において使用される。
【０１５４】
代表的な実施形態において、Ｒ１５部分は基
【化４４】
2009501127.tif 000045
から選択されるメンバーである式を有する。上記構造の各々において、リンカー断片−ＮＨ（ＣＨ２）ａ−は存在または非存在でありうる。
【０１５５】
他の代表的な実施形態において、コンジュゲートは基
【化４５】
2009501127.tif 000046
から選択されるＲ１５部分を含む。
【０１５６】
上式の各々において、指数ｅおよびｆは独立して１〜２５００の整数から選択される。さらに代表的な実施形態において、ｅおよびｆは、約１ＫＤａ、２ＫＤａ、５ＫＤａ、１０ＫＤａ、１５ＫＤａ、２０ＫＤａ、２５ＫＤａ、３０ＫＤａ、３５ＫＤａ、４０ＫＤａ、４５ＫＤａ、５０ＫＤａ、５５ＫＤａ、６０ＫＤａ、６５ＫＤａ、７０ＫＤａ、７５ＫＤａ、または８０ＫＤａであるＰＥＧ部分を提供するように選択される。記号Ｑは、置換もしくは非置換アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６アルキル、例えば、メチル）、置換もしくは非置換ヘテロアルキルまたはＨを表す。
【０１５７】
他の分岐ポリマーは、ジ−リシン（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）ペプチド、例えば、
【化４６】
2009501127.tif 000047
およびトリ−リシン（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）、例えば、
【化４７】
2009501127.tif 000048
に基づく構造を有する。上記の図の各々において、ｅ、ｆ、ｆ’、およびｆ’’は独立して１〜２５００から選択される整数を表す。指数ｑ、ｑ’およびｑ’’は独立して１〜２０から選択される整数を表す。
【０１５８】
別の代表的な実施形態において、Ｇ−ＣＳＦペプチドは式
【化４８】
2009501127.tif 000049
［式中、Ｌａは、本明細書に記載された結合またはリンカーであり、指数ｔは０または１を表し、指数ａは０または１を表す。これらの基の各々は、上記の一、二、三、および四触角のサッカリド構造の成分として包含されうる］から選択されるグリコシル部分を含んで成る。
【０１５９】
さらに別の実施形態において、本発明のコンジュゲートは、
【化４９】
2009501127.tif 000050
［式中、指数ａおよびリンカーＬａは上記の通りである。指数ｐは１〜１０の整数である。指数ｔおよびａは独立して０または１から選択される。これらの基の各々は、上記の一、二、三、および四触角のサッカリド構造の成分として包含されうる］から選択される基礎構造を含む修飾グリコシル残基を含む。
【０１６０】
さらに代表的な実施形態において、本発明は、上記のものなどのリンカー修飾基カセットを生み出す、対応するアミン部分に６−ヒドロキシル位置が変換される修飾糖を使用する。これらの修飾糖のコアとして使用されうる代表的なサッカリール基としては、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃ、Ｘｙｌ、Ｍａｎなどが挙げられる。本実施形態による代表的な修飾糖は式
【化５０】
2009501127.tif 000051
［式中、Ｒ１１−Ｒ１４は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ＮＨ、およびＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３から独立して選択されるメンバーである。Ｒ１０は、別のグリコシル残基（−Ｏ−グリコシル）またはＧ−ＣＳＦペプチドのアミノ酸（−ＮＨ−（Ｇ−ＣＳＦ））とのリンクである。Ｒ１４は、ＯＲ１、ＮＨＲ１、またはＮＨ−Ｌ−Ｒ１である。Ｒ１およびＮＨ−Ｌ−Ｒ１は上記の通りである］を有する。
【０１６１】
本モチーフによる選択コンジュゲートは、マンノース、ガラクトース、もしくはグルコース、またはマンノース、ガラクトース、もしくはグルコースの立体化学反応を有する種に基づく。これらのコンジュゲートの一般式は、
【化５１】
2009501127.tif 000052
である。
【０１６２】
上記の通り、本発明は、修飾基、これらの種の活性化類似体、およびペプチドや脂質および本発明の修飾サッカリドなどの種間に形成されたコンジュゲートを有するサッカリドを提供する。
【０１６３】
修飾糖
本発明では修飾糖および修飾糖ヌクレオチドを使用し、修飾糖のコンジュゲートを形成する。本発明において使用される修飾糖化合物において、糖部分は、好ましくは、サッカリド、デオキシ−サッカリド、アミノ−サッカリド、またはＮ−アシルサッカリドである。「サッカリド」およびその等価物、「サッカリール」、「糖」、および「グリコシル」という語は、モノマー、二量体、オリゴマー、およびポリマーを指す。糖部分は修飾基で官能化もされる。修飾基は、一般的に、糖上のアミン、スルフヒドリル、またはヒドロキシル、例えば、一級ヒドロキシル、部分とのコンジュゲーションにより、糖部分にコンジュゲートされる。代表的な実施形態において、修飾基は、糖上のアミン部分により、例えば、修飾基の反応誘導体とのアミンの反応により形成されるアミド、ウレタン、または尿素により結合される。
【０１６４】
任意の糖を本発明のコンジュゲートのグリコシル連結基の糖コアとして使用されうる。本発明の組成物の形成において有用である代表的な糖コアとしては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、およびシアル酸が挙げられるが、これらに限定されない。他の有用な種としては、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、シアル酸の５−アミン類似体などのアミノ糖が挙げられる。糖コアは自然に存在する構造でありうるとともに、修飾基をコンジュゲートするための部位を提供するように修飾されうる。例えば、１つの実施形態において、本発明は、９−ヒドロキシ部分がアミンで置換されるシアル酸誘導体を提供する。該アミンは、選択修飾基の活性化類似体で容易に誘導体化される。
【０１６５】
代表的な修飾糖は、水溶性または水不溶性ポリマーで修飾される。有用なポリマーの例はさらに以下で例示される。
【０１６６】
水溶性ポリマー
多くの水溶性ポリマーが当業者に周知であり、本発明の実施において有用である。水溶性ポリマーという語は、サッカリド（例えば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリ（シアル酸）、ヘパラン、ヘパリン、等）、ポリ（アミノ酸）、例えば、ポリ（アスパラギン酸）、およびポリ（グルタミン酸）、核酸、合成ポリマー（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エーテル）、例えば、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、タンパク質などの種を包含する。本発明は、ポリマーがコンジュゲートの残りの部分を結合することができる点を含む必要があるという唯一の制限とともに水溶性ポリマーで実施されうる。
【０１６７】
ポリマーの活性化の方法は、国際公開第９４／１７０３９号パンフレット、米国特許第５，３２４，８４４号明細書、国際公開第９４／１８２４７号パンフレット、国際公開第９４／０４１９３号パンフレット、米国特許第５，２１９，５６４号明細書、米国特許第５，１２２，６１４号明細書、国際公開第９０／１３５４０号パンフレット、米国特許第５，２８１，６９８号明細書、さらに国際公開第９３／１５１８９号パンフレット、および活性化ポリマーとペプチド、例えば、凝固因子ＶＩＩＩとの間のコンジュゲーション（国際公開第９４／１５６２５号パンフレット）、ヘモグロビン（国際公開第９４／０９０２７号パンフレット）、酵素を有する分子（米国特許第４，４１２，９８９号明細書）、リボヌクレアーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ（ベロネーゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ）ら、Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：１４１−４５頁（１９８５年））ついても確認されうる。
【０１６８】
好ましい水溶性ポリマーは、ポリマーの試料中のポリマー分子の実質的な割合がほぼ同じ分子量であるものであり、かかるポリマーは「同種分散（ｈｏｍｏｄｉｓｐｅｒｓｅ）」である。
【０１６９】
本発明はさらに、ポリ（エチレングリコール）コンジュゲートを参照することにより例示される。ＰＥＧの官能化およびコンジュゲーションに関するいくつかの検討およびモノグラフが入手可能である。例えば、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）、Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５：３２５−３７３頁（１９８５年）、スクーテン（Ｓｃｏｕｔｅｎ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３５：３０−６５頁（１９８７年）、ワン（Ｗｏｎｇ）ら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８６６−８７４頁（１９９２年）、デルガド（Ｄｅｌｇａｄｏ）ら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ９：２４９−３０４頁（１９９２年）、ザリプスキー（Ｚａｌｉｐｓｋｙ）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６：１５０−１６５頁（１９９５年）、およびバドラー（Ｂｈａｄｒａ）ら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、５７：５−２９頁（２００２年）を参照。反応性ＰＥＧ分子を調製し、反応分子を使用してコンジュゲートを形成するための経路は当業界で周知である。例えば、米国特許第５，６７２，６６２号明細書は、線状または分岐ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、およびポリ（アクリロモルホリン）から選択されるポリマー酸の活性エステルの水溶性および単離可能なコンジュゲートを開示している。
【０１７０】
米国特許第６，３７６，６０４号明細書は、有機溶媒中にジ（１−ベンゾトリアゾイル）炭酸塩とポリマーのヒドロキシルの末端を反応させることによって水溶性および非ペプチドポリマーの水溶性１−ベンゾトリアゾリル炭酸エステルを調製するための方法を記載している。活性エステルは、タンパク質またはペプチドなど生物活性剤とのコンジュゲートを形成するために使用される。
【０１７１】
国際公開第９９／４５９６４号パンフレットは、ポリマー骨格を含んで成り、安定したリンケージによりポリマー骨格との少なくとも１つの末端連結を有する生物活性薬剤および活性化水溶性ポリマーを含んで成るコンジュゲートを記載しているが、ここで少なくとも１つの末端は分岐部分を含んで成り、この分岐部分に近位の反応基連結を有し、ここで生物活性薬剤は近位反応基の少なくとも１つに連結されている。他の分岐ポリ（エチレングリコール）が国際公開第９６／２１４６９号パンフレットに記載されており、米国特許第５，９３２，４６２号明細書は、反応官能基を含む分岐末端を含む分岐ＰＥＧ分子で形成されたコンジュゲートを記載している。ポリ（エチレングリコール）と生物活性種との間でコンジュゲートを形成する、タンパク質またはペプチドなど生物活性種と反応させる遊離反応基が入手可能である。米国特許第５，４４６，０９０号明細書は、二官能性ＰＥＧリンカーおよびＰＥＧリンカー末端の各々でペプチドを有するコンジュゲートの形成におけるその使用を記載している。
【０１７２】
分解性ＰＥＧリンケージを含むコンジュゲートが国際公開第９９／３４８３３号パンフレット、および国際公開第９９／１４２５９号パンフレットのほか、米国特許第６，３４８，５５８号明細書に記載されている。かかる分解性リンケージが本発明において利用可能である。
【０１７３】
上記のポリマー活性化の当技術分野で承認されている方法は、本明細書に記載の分岐ポリマーの形成における本発明との関連で使用され、これらの分岐ポリマーを他の種、例えば、糖、糖ヌクレオチドなどとのコンジュゲートのためのものでもある。
【０１７４】
修飾糖は、グリコシルコア（またはコア上のリンカー）をポリマー修飾部分（またはポリマー修飾部分上のリンカー）と接触させることによって調製される。次の議論は、本発明において使用される選択ポリマー修飾部分の例を提供する。例えば、代表的なポリマー修飾部分は、アミノ酸、例えば、セリン、システイン、リシン、および小ペプチド、例えば、ｌｙｓ−ｌｙｓを含有する側鎖に基づく。代表的な構造は以下を含む。
【化５２】
2009501127.tif 000053
当業者は、ジ−リシン構造における遊離アミンがＰＥＧ部分とのａｍｄｉｅまたはウレタンによりＰＥＧ化されうることも十分に理解するであろう。
【０１７５】
さらに別の実施形態において、分岐ＰＥＧ部分は、トリ−リシンペプチドに基づく。トリ−リシンは、モノ、ジ−、トリ−、またはテトラ−ＰＥＧ化されうる。本実施形態による代表的な種は式
【化５３】
2009501127.tif 000054
［式中、ｅ、ｆ、およびｆ’は、１〜２５００から独立して選択される整数であり、かつｑ、ｑ’、およびｑ’’は、１〜２０の独立して選択される整数である］を有する。
【０１７６】
当業者には明らかなように、本発明において使用される分岐ポリマーは、上記のテーマでの変化物を含む。例えば、上記のジ−リシン−ＰＥＧコンジュゲートは、３つのポリマーサブユニットを含みうるが、第３は上記の構造において未修飾でしめされているα−アミンに結合されている。同様に、所望の方法でポリマー修飾部分で標識された３つもしくは４つのポリマーサブユニットで官能化されたトリ−リシンの使用は本発明の範囲内である。
【０１７７】
ポリマー修飾部分は、グリコシルコアとの反応のために活性化されうる。活性化種（例えば、炭酸塩および活性エステル）の代表的な構造は、
【化５４】
2009501127.tif 000055
を含む。
【０１７８】
本明細書に記載された化合物の調製において使用される線状および分岐ＰＥＧを活性化するために適切な他の活性化、または脱離基は、
【化５５】
2009501127.tif 000056
を含むがこれに限定されない。
これらおよび他の種で活性化されるＰＥＧ分子および活性化ＰＥＧを製造する方法は、国際公開第０４／０８３２５９号パンフレットに記載されている。
【０１７９】
当業者は、上記の分岐ポリマーの１つもしくはそれ以上のｍ−ＰＥＧ腕が、異なる末端、例えば、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、Ｃ２−Ｃ１０−アルキル等を有するＰＥＧ部分によって置換されうることを十分に理解するであろう。さらに、上記の構造は、アミノ酸側鎖のα−炭素原子と官能基との間にアルキルリンカーを挿入すること（または炭素原子を除去すること）によって容易に修飾される。したがって、「ホモ」誘導体および高いホモログ、および低いホモログが本発明において使用される分岐ＰＥＧのためのコアの範囲内である。
【０１８０】
本明細書に記載された分岐ＰＥＧ種は、以下のスキーム
【化５６】
2009501127.tif 000057
［式中、ＸｄはＯまたはＳであり、ｒは１〜５の整数である。指数ｅおよびｆは独立して選択される１〜２５００の整数である。代表的な実施形態において、これらの指数の一方または両方は、ポリマーが分子量において約１０ｋＤ、１５ｋＤ、または２０ｋＤであるように選択される］に記載されているものなどの方法によって容易に調製される。
【０１８１】
したがって、本スキームによれば、天然または非天然アミノ酸が、活性化ｍ−ＰＥＧ誘導体、この場合には、トシレートと接触し、側鎖へテロ原子Ｘｄをアルキル化することによって１を形成する。単機能化ｍ−ＰＥＧアミノ酸は、反応性ｍ−ＰＥＧ誘導体によるＮ−アシル化条件を受け、それによって、分岐ｍ−ＰＥＧ２をアセンブルする。当業者が十分に理解するように、トレシレート脱離基は、適切な脱離基、例えば、ハロゲン、メシレート、トリフレート等で置換されうる。同様に、アミンをアシル化するために使用される反応炭酸塩は、活性エステル、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド等によって置換され、または酸は、ジシクロへキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール等など脱水剤を使用してインサイチューで活性化されうる。
【０１８２】
他の代表的な実施形態において、尿素部分はアミドなどの基によって置換される。
【０１８３】
例示的実施形態において、修飾糖はシアル酸であり、本発明において使用される選択修飾糖化合物は次式を有する。
【化５７】
2009501127.tif 000058
指数ａ、ｂ、およびｄは０〜２０の整数である。指数ｃは１〜２５００の整数である。上記の構造物はＲ１５の成分でありうる。
【０１８４】
別の例示的実施形態において、糖の１級ヒドロキシル部分が修飾基で官能化される。例えば、シアル酸の９−ヒドロキシルは対応するアミンに変換され、官能化され、本発明による化合物を提供しうる。本実施形態による式は以下を含む。
【化５８】
2009501127.tif 000059
上記の構造物はＲ１５の成分でありうる。
【０１８５】
当業者が十分に理解するように、上記の代表的な化合物におけるシアル酸部分は、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、そのＮ−アシル誘導体などを含むが、これらに限定されない他のいずれかのアミノ−サッカリドで置換されうる。
【０１８６】
本発明は、ＰＥＧを参照することにより前項で例示されているが、当業者が十分に理解するように、一連のポリマー修飾部分が本発明による化合物および方法に使用される。
【０１８７】
選択実施形態において、Ｒ１またはＬ−Ｒ１は分岐ＰＥＧ、例えば、上記の種の１つである。本実施形態による例示的修飾糖は、
【化５９】
2009501127.tif 000060
［式中、Ｘ４は、結合またはＯである］を含む。上記の構造の各々において、アルキルアミンリンカー−（ＣＨ２）ａＮＨ−は存在または非存在でありうる。上記の構造物はＲ１５／Ｒ１５’の成分でありうる。
【０１８８】
本明細書で論じるように、本発明における脂溶のポリマー修飾シアル酸は線状構造でもありうる。したがって、本発明は、
【化６０】
2009501127.tif 000061
［式中、ｑおよびｅは上記の通りである］などの構造物由来のシアル酸部分を含むコンジュゲートを提供する。
【０１８９】
水不溶性ポリマー
上記のものと類似の別の実施形態において、修飾糖は、水溶性ポリマーではなく、水不溶性ポリマーを含む。本発明のコンジュゲートは、１つもしくはそれ以上の水不溶性ポリマーも含みうる。本発明の本実施形態は、それにより制御された方法で治療的ペプチドを送達するビヒクルとしてのコンジュゲートの使用によって説明される。ポリマー薬物送達系は当業界で周知である。例えば、ダン（Ｄｕｎｎ）ら編、ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＤＲＵＧＳ  ＡＮＤ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍシリーズ第４６９巻、米国化学会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９１年。当業者は、実質的にすべての既知の薬物送達系が本発明のコンジュゲートに利用可能であることを十分に理解するであろう。
【０１９０】
Ｒ１、Ｌ−Ｒ１、Ｒ１５、Ｒ１５’、および他のラジカルの上記のモチーフは同等に水不溶性ポリマーに適用可能であり、これは当業者に容易に利用可能な化学反応を使用して制限なしに線状および分岐構造へ組込まれうる。
【０１９１】
代表的な水不溶性ポリマーとしては、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリ炭酸塩、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハロゲン化物、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（へキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルアセテート）、ポリビニルクロライド、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニック、およびポリビニルフェノール、およびそれのコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９２】
本発明のコンジュゲートにおいて使用される合成修飾天然ポリマーとしては、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、およびニトロセルロースが挙げられるが、これらに限定されない。広範のクラスの合成修飾天然ポリマーの特に好ましいメンバーとしては、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシメチルセルロース、セルローストリアセテート、硫酸セルロースナトリウム塩、およびアクリルおよびメタクリルエステルのポリマー、およびアルギン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９３】
本明細書で論じられたこれらおよび他のポリマーは、シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州（ＭＯ））、ポリサイエンス（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｗａｒｒｅｎｔｏｎ、ペンシルベニア州（ＰＡ））、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ウィスコンシン州（ＷＩ））、フルカ（Ｆｌｕｋａ）（Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ、ニューヨーク州（ＮＹ））、およびバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、カリフォルニア州（ＣＡ））などの商業的供給源から容易に得られ、あるいは標準方法を使用してこれら供給元から得られるモノマーから合成されうる。
【０１９４】
本発明のコンジュゲートにおいて使用される代表的な生体分解性ポリマーとしては、ポリラクチド、ポリグリコリド、およびそれのコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、それの混合物およびコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。特に使用されるのは、コラーゲン、プルロニックなどを含むものなどゲルを形成する組成物である。
【０１９５】
本発明において使用されるポリマーとしては、少なくともその構造の一部分内に生体吸収性分子を有する水溶性材料を含む「ハイブリッド」ポリマーが挙げられる。かかるポリマーの例が、ポリマー鎖当り生体吸収性部位、親水性部位、および複数の架橋可能官能基を有する水不溶性コポリマーを含むものである。
【０１９６】
本発明において、「水不溶性材料」は、水または水含有環境下に実質的に不溶性である材料を含む。したがって、コポリマーの一定の部位または部分は親水性またはさらに水溶性でありうるが、ポリマー分子は、全体として、水中で実質的程度に溶解することはない。
【０１９７】
本発明において、「生体吸収性分子」という語は、体によって正常な排泄経路により代謝され、または分解され、および吸収され、かつ／または除去されうる部位を含む。かかる代謝産物または分解生成物は、好ましくは、実質的に体に対して非毒性である。
【０１９８】
生体吸収性部位は、コポリマー組成物が全体として水溶性が提供されない限り、疎水性または親水性でありうる。したがって、生体吸収性部位は、ポリマーが、全体として、水不溶性のままである選好に基づき選択される。したがって、相対的特性、すなわち、含まれる官能基の種類、および生体吸収性部位の相対的特性、および親水性部位は、有用な生体吸収性組成物が水不溶性のままであること確実にするために選択される。
【０１９９】
代表的な吸収性ポリマーとしては、例えば、ポリ（α−ヒドロキシ−カルボン酸）／ポリ（オキシアルキレン、（コーン（Ｃｏｈｎ）ら、米国特許第４，８２６，９４５号明細書）の合成製造された吸収性ブロックコポリマーが挙げられる。これらのコポリマーは架橋されず、水溶性であるため、体は分解ブロックコポリマー組成物を排泄することができる。ユーニス（Ｙｏｕｎｅｓ）ら、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２１：１３０１−１３１６頁（１９８７年）、およびコーン（Ｃｏｈｎ）ら、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２２：９９３−１００９頁（１９８８年）を参照。
【０２００】
現在、好ましい生体吸収性ポリマーとしては、ポリ（エステル）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミド）、ポリ（エステル−アミド）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（炭酸塩）、ポリ（ホスファジン）、ポリ（ホスホエステル）、ポリ（チオエステル）、ポリサッカリド、およびそれの混合物から選択される１つもしくはそれ以上の成分が挙げられる。さらにより好ましくは、生体吸収性ポリマーとしては、ポリ（ヒドロキシ）酸成分が挙げられる。ポリ（ヒドロキシ）酸のうち、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロ酸、ポリ酪酸、ポリ吉草酸、およびコポリマー、およびそれの混合物が好ましい．
【０２０１】
インビボ吸収される（「生体吸収性」）断片の形成に加えて、本発明の方法において使用されるための好ましいポリマーコーティングが排泄可能および／または代謝可能な断片も形成しうる。
【０２０２】
高次コポリマーも本発明において使用されうる。例えば、１９８４年３月２０日に発行されたケーシー（Ｃａｓｅｙ）ら、米国特許第４，４３８，２５３号明細書は、ポリ（グリコール酸）およびヒドロキシル末端ポリ（アルキレングリコール）のエステル交換から製造されたトリブロックコポリマーを開示している。かかる組成物は、吸収性モノフィラメント縫合糸として使用するために開示されている。かかる組成物の柔軟性は、テトラ−ｐ−トリルオルト炭酸塩など芳香族炭酸塩のコポリマー構造物への組込みによって制御される。
【０２０３】
乳酸および／またはグリコール酸に基づく他のポリマーも使用されうる。例えば、１９９３年４月１３日に発行された、スピヌ（Ｓｐｉｎｕ）、米国特許第５，２０２，４１３号明細書は、オリゴマージオールまたはジアミン残基のいずれかへのラクチドおよび／またはグリコリドの開環重合の後、ジイソシアネート、ジアシルクロライド、またはジクロロシランなど二官能性化合物による鎖延長によってポリラクチドおよび／またはポリグリコリドの連続的に順序化されたブロックを有する生体分解性マルチブロックコポリマーを開示している。
【０２０４】
本発明において有用なコーティングの生体吸収性部位は、加水分解的および／または酵素的に開裂可能であるようにデザインされうる。本発明において、「加水分解的に開裂可能」は、コポリマー、特に生体吸収性部位が、水および水含有環境下に加水分解の影響を受けやすいことを指す。同様に、本明細書で使用される「酵素的に開裂可能」は、コポリマー、特に生体吸収性部位が、内因性または外因性酵素による開裂の影響を受けやすいことを指す。
【０２０５】
体内に配置されると、親水性部位は排泄可能および／または代謝可能な断片へ加工されうる。したがって、親水性部位は、例えば、ポリエーテル、ポリアルキレンオキシド、ポリオール、ポリ（ビニルピロリジン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキルオキサゾリン）、ポリサッカリド、炭水化物、ペプチド、タンパク質、およびコポリマー、およびそれの混合物を含みうる。さらに、親水性部位は、例えば、ポリ（アルキレン）オキシドでありうる。かかるポリ（アルキレン）オキシドは、例えば、ポリ（エチレン）オキシド、ポリ（プロピレン）オキシド、およびそれの混合物、およびコポリマーを含みうる。
【０２０６】
ヒドロゲルの成分であるポリマーも本発明において有用である。ヒドロゲルは、比較的大量の水を吸収しうるポリマー材料である。化合物を形成するヒドロゲルの例としては、ポリアクリル酸、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジン、ゼラチン、カラギナン、および他のポリサッカリド、ヒドロキシエチレンメタクリル酸（ＨＥＭＡ）のほか、それの誘導体などが挙げられるが、これらに限定されない。安定し、生体分解性、かつ生体吸収性であるヒドロゲルが製造されうる。さらに、ヒドロゲル組成物は、これらの特性の１つもしくはそれ以上を示すサブユニットを含みうる。
【０２０７】
その完全性が架橋結合により制御されうる生体適合性ヒドロゲル組成物が周知であり、本発明の方法において使用されるために現在、好ましい。例えば、１９９５年４月２５日発行のハッベル（Ｈｕｂｂｅｌｌ）ら、米国特許第５，４１０，０１６号明細書、および１９９６年６月２５日発行の同第５，５２９，９１４号明細書は、２つの加水分解的に不安定な伸長間に挟まれた水溶性の中心ブロック部分を有する架橋結合ブロックコポリマーである水溶性系を開示している。かかるコポリマーはさらに、光重合性アクリレート官能性で末端キャップされる。架橋結合されると、これらの系はヒドロゲルになる。かかるコポリマーの水溶性中心ブロックはポリ（エチレングリコール）を含みうるが、加水分解的に不安定な伸長は、ポリグリコール酸またはポリ乳酸などのポリ（α−ヒドロキシ酸）でありうる。ソーニー（Ｓａｗｈｎｅｙ）ら、Ｍａｃｒｏｍｅｌｅｃｕｌｅｓ  ２６：５８１−５８７頁（１９９３年）を参照。
【０２０８】
別の好ましい実施形態において、ゲルは熱可逆性ゲルである。プルロニック、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、ポリサッカリド、ポリウレタンヒドロゲル、ポリウレタン−尿素ヒドロゲル、およびそれの組合せなどの成分を含む熱可逆性ゲルが現在、好ましい。
【０２０９】
さらに別の代表的な実施形態において、本発明のコンジュゲートは、リポソームの成分を含む。リポソームは、例えば、エプシュタイン（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ）ら、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載されているような当業者に周知の方法に従って調製されうる。例えば、リポソーム製剤は、適切な脂質（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン、およびコレステロールなど）を次いで蒸発される無機溶媒中に溶解し、容器の表面上の乾燥脂質の薄膜の背後に脱離することによって調製されうる。次いで、活性化合物またはその医薬的に許容される塩の水溶液を容器に導入する。次いで、容器を手で回転させ、容器の側面から脂質材料を取除き、脂質凝集体を分散させ、それによってリポソーム懸濁液を形成する。
【０２１０】
上記の微小粒子および微小粒子を調製する方法は実施例によって示され、それらは本発明において使用される微小粒子の範囲を規定することが意図されていない。異なる方法によって加工された一連の微小粒子が、本発明において使用されることは当業者には明らかであろう。
【０２１１】
水溶性ポリマーに関連した上記の構造的フォーマット、直鎖および分岐は一般に水不溶性ポリマーに対しても同じく適用可能である。したがって、例えば、システイン、セリン、ジリシン、およびトリリシン分岐コアは、２つの水不溶性ポリマー部分で官能化されうる。これらの種を製造するために使用される方法は一般に、水溶性ポリマーを製造するために使用されるものときわめて類似している。
【０２１２】
方法
上記のコンジュゲートに加えて、本発明は、これらおよび他のコンジュゲートを調製するための方法を提供する。さらに、本発明は、疾患を発症するリスクがある対象、または疾患を有する対象に本発明のコンジュゲートを投与することによって疾患状態を予防、治癒、または改善する方法を提供する。
【０２１３】
代表的な実施形態において、コンジュゲートは、ポリマー修飾部分とグリコシル化または未グリコシル化ペプチドとの間で形成される。ポリマーは、ペプチド（グリコシル残基）と修飾基（例えば、水溶性ポリマー）との間に挿入され、かつこれらに共有結合したグリコシル連結基によってペプチドにコンジュゲートされる。この方法は修飾糖および酵素、例えば、修飾糖を基質にコンジュゲートするグリコシルトランスフェラーゼを含有する混合物と接触させるステップを含む。反応は、修飾糖とペプチドとの間に共有結合を形成するのに適切な条件下に行われる。修飾糖の糖部分は、好ましくは、ヌクレオチド糖から選択される。
【０２１４】
代表的な実施形態において、上記のものなどの修飾糖は、対応するヌクレオチド糖として活性化される。その修飾形態で本発明において使用される代表的な糖ヌクレオチドは、ヌクレオチド一、二、および三リン酸、またはそれの類似体を含む。好ましい実施形態において、修飾糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−グリコシド、ＣＭＰ−グリコシド、またはＧＤＰ−グリコシドから選択される。さらにより好ましくは、修飾糖ヌクレオチドの糖ヌクレオチド部分は、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−ガラクトサミン、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルコサミン、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−フコース、ＣＭＰ−シアル酸、またはＣＭＰ−ＮｅｕＡｃから選択される。代表的な実施形態において、リン酸ヌクレオチドはＣ−１に結合されている。
【０２１５】
したがって、グリコシル部分がシアル酸である例示的実施形態において、本発明の方法は式
【化６１】
2009501127.tif 000062
［式中、Ｌ−Ｒ１は上記の通りであり、Ｌ１−Ｒ１は修飾基に結合されたリンカーを表す。Ｌのように、Ｌ１による代表的なリンカー種は、結合、アルキル、またはヘテロアルキル部分を含む］を有する化合物を使用する。
【０２１６】
さらに、上記の通り、本発明は、直鎖または分岐のいずれかである水溶性ポリマーで修飾されるヌクレオチド糖の使用を提供する。例えば、下記の式
【化６２】
2009501127.tif 000063
［式中、Ｘ４はＯまたは結合である］を有する化合物は本発明の範囲内のコンジュゲートを調製するために使用される。
【０２１７】
本発明は、６−炭素位置でＬ−Ｒ１で修飾された糖ヌクレオチドの使用をも提供する。本実施形態による代表的な種は、
【化６３】
2009501127.tif 000064
［式中、Ｒ基、およびＬは、上記の部分を表す。指数「ｙ」は０、１、または２である］を含む。代表的な実施形態において、ＬはＮＨとＲ１との間の結合である。塩基は核酸塩基である。
【０２１８】
６−位置での炭素が修飾される本発明において使用される代表的なヌクレオチド種は、ＧＤＰマンノースの立体化学反応、例えば、
【化６４】
2009501127.tif 000065
［式中、Ｘ５は結合またはＯである。指数ｉは０または１を表す。指数ａは１〜２０の整数である。指数ｅおよびｆは独立して１〜２５００の整数を表す。Ｑは、上記の通り、Ｈまたは置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ６アルキルである］を有する種を含む。当業者は十分に理解するように、ＳがＯで置換されているセリン誘導体もこの一般モチーフの範囲内にある。
【０２１９】
さらに代表的な実施形態において、本発明は、修飾糖がＵＤＰガラクトースの立体化学反応に基づくコンジュゲートを提供する。本発明において使用される代表的なヌクレオチド糖は構造
【化６５】
2009501127.tif 000066
を有する。
【０２２０】
別の代表的な実施形態において、ヌクレオチド糖はグルコースの立体化学に基づく。本実施形態による代表的な種は式
【化６６】
2009501127.tif 000067
を有する。
【０２２１】
一般に、糖部分または糖部分−リンカーカセットおよびＰＥＧまたはＰＥＧ−リンカーカセット基は、連結方法によって一般的に新しい有機官能基または未反応種に変換されている反応基の使用により連結されている。糖反応官能基は、糖部分の任意の位置に配置されている。本発明の実施において有用な反応基および反応クラスは一般にバイオコンジュゲート化学の当業界で公知であるものである。反応糖部分で利用可能な反応の現在好ましいのは、比較的温和な条件下に行われるものである。これらには、求核置換反応（例えば、アミンおよびアルコールのアシルハロゲン化物、活性エステルとの反応）、求電子置換反応（例えば、エナミン反応）、および炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子多重結合へ付加（例えば、マイケル反応、ディールス・アルダー付加）が含まれるが、これらに限定されない。これらおよび他の有用な反応は、例えば、マーチ（Ｍａｒｃｈ）、ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第３版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８５年、ヘルマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９６年、およびフィーニー（Ｆｅｅｎｅｙ）ら、ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ、第１９８巻、米国化学会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９８２年において議論されている。
【０２２２】
糖核または修飾基から懸垂する有用な反応官能基としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
（ａ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、および芳香族エステルを含むが、これらに限定されないカルボキシル基、およびそれのさまざまな誘導体、
（ｂ）例えば、エステル、エーテル、アルデヒド等に変換されうるヒドロキシル基、
（ｃ）ハロゲン化物が後に、例えば、アミン、カルボン酸アニオン、チオールアニオン、カルバニオン、またはアルコキシドイオンなどの求核基で置換され、それによって結果としてハロゲン原子の官能基で新しい基の共有結合が生じうるハロアルキル基、
（ｄ）例えば、マレイミド基など、ディールス・アルダー反応に関与できる求ジエン基、
（ｅ）その後の誘導体化が、例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾン、またはオキシムなどカルボニル誘導体によって、またはグリニュール付加もしくはアルキルリチウム付加などの機序によって可能であるアルデヒドまたはケトン基、
（ｆ）例えば、スルホンアミドを形成するその後のアミンとの反応のためのスルホニルハロゲン化物基、
（ｇ）例えば、ジスルフィドに変換され、またはアシルハロゲン化物と反応されうるチオール基、
（ｈ）例えば、アシル化、アルキル化、または酸化されうるアミンまたはスルフヒドリル基、
（ｉ）例えば、シクル付加、アシル化、マイケル付加等を受けうるアルケン、および
（ｊ）例えば、アミンおよびヒドロキシル化合物と反応しうるエポキシド。
【０２２３】
反応官能基は、それらが反応糖核または修飾基をアセンブルするために必要な反応に関与することがなく、またはこれを阻害することがないように選択される。あるいは、反応官能基は保護基の存在によって反応に関与することから保護されうる。当業者は、それが選ばれた一連の反応条件に干渉しないように特定の官能基を保護する方法を理解している。有用な保護基については、例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）ら、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年を参照。
【０２２４】
次の議論において、本発明の実施において有用な修飾糖の多くの特定の実施例が記載されている。代表的な実施形態において、シアル酸誘導体は、修飾基が結合される糖核として使用される。シアル酸誘導体への議論の焦点が説明の明確さに限定され、本発明の範囲を制限すると考えるべきではない。当業者は、さまざまな他の糖部分が、一例としてシアル酸の使用が記載されているものと類似の方法で活性化および誘導体化されることを十分に理解するであろう。例えば、当技術分野で承認されている方法によって容易に修飾される糖物質の２〜３の例を挙げると、修飾ガラクトース、グルコース、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびフコースについて多数の方法が利用可能である。例えば、エルハラビ（Ｅｌｈａｌａｂｉ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：９３（１９９９年）、およびシェーファー（Ｓｃｈａｆｅｒ）ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５：２４（２０００年）を参照。
【０２２５】
代表的な実施形態において、修飾糖は６−アミノ−Ｎ−アセチル−グリコシル部分に基づく。Ｎ−アセチルガラクトサミンについて図５に示されているように、６−アミノ糖部分は標準方法によって容易に調製される。
【０２２６】
上記のスキームにおいて、指数ｎは１〜２５００の整数を表す。代表的な実施形態において、この指数は、ポリマーが分子量において約１０ｋＤ、１５ｋＤ、または２０ｋＤであるように選択される。記号「Ａ」は活性化基、例えば、ハロ、活性化エステルの成分（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、炭素酸の成分（例えば、ｐ−ニトロフェニル炭酸塩）などを表す。当業者は、他のＰＥＧ−アミドヌクレオチド糖がこれや類似の方法によって容易に調製されることを十分に理解する。
【０２２７】
受容体ペプチドは一般的にデノボ合成され、または原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞）または哺乳類、酵母、昆虫、真菌、または植物細胞など真核細胞において組換え発現される。ペプチドは完全長タンパク質または断片のいずれかである。さらに、ペプチドは、野生型または変異ペプチドでありうる。代表的な実施形態において、ペプチドは、１つもしくはそれ以上のＮまたはＯ連結グリコシル化部位をペプチド配列に付加する変異を含む。
【０２２８】
本発明の方法は、組換え製造される不完全にグリコシル化したペプチドの修飾も提供する。多くの組換え製造された糖タンパク質は不完全にグリコシル化され、望ましくい特性、例えば、ＲＥＳによって認識される免疫原性を有しうる炭水化物残基を露出する。本発明の方法における修飾糖を使用することにより、ペプチドは、例えば、水溶性ポリマー、治療的薬剤、または同様のもので同時にさらにグリコシル化および誘導体化されうる。修飾糖の糖部分は、完全にグリコシル化されたペプチドにおける受容体、または所望の特性を有する別の糖部分に適切にコンジュゲートされる残基でありうる。
【０２２９】
当業者は、本発明が、すべての供給源の実質的にすべてのペプチドまたは糖ペプチドを使用することにより実施されうる。本発明はそれにより実施されうる代表的ペプチドは、国際公開第０３／０３１４６４号パンフレット、および本明細書に記載されている文献に記載されている。
【０２３０】
本発明の方法によって修飾されるペプチドは合成され、もしくは野生型ペプチドであり、またはそれらは、部位特異的突然変異生成など当業界で周知の方法によって製造される変異化ペプチドでありうる。ペプチドのグリコシル化は一般的にＮ連結またはＯ連結のいずれかである。代表的なＮリンケージはアスパラギン残基の側鎖との修飾糖の結合である。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニンは、ここでＸはプロリン以外のアミノ酸であり、アスパラギン側鎖との炭水化物部分の酵素結合の標識配列である。したがって、ポリペプチドカセットにおけるこれらトリペプチド配列のいずれかにおける存在は、グリコシル化部位の可能性をもたらす。Ｏ連結グリコシル化は、１つの糖（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、ＧｌｃＮＡｃ、グルコース、フコース、キシロース）のヒドロキシアミノ酸、好ましくは、セリンまたはトレオニンのヒドロキシ側鎖との結合を指すが、異常なまたは非天然アミノ酸、例えば、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用されうる。
【０２３１】
さらに、ペプチドに加えて、本発明の方法は他の生物構造物（例えば、糖脂質、脂質、スフィンゴイド、セラミド、グリコシル化部位を含有する全細胞など）で実施されうる。
【０２３２】
グリコシル化部位のペプチドまたは他の構造物への付加は、それが１つもしくはそれ以上のグリコシル化部位を含有するようにアミノ酸配列を変更することによって便利に行われる。付加は、−ＯＨ基、好ましくは、セリンまたはトレオニン残基を示す１つもしくはそれ以上の種のペプチドの配列内の（Ｏ連結グリコシル化部位に対して）組込みによっても行われうる。付加は、ペプチドの突然変異または完全化学合成によって行われうる。ペプチドアミノ酸配列は、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変化により、詳しくは、所望のアミノ酸へ翻訳するコドンが生成されるように所定の塩基でペプチドを符号化するＤＮＡを突然変異させることによって変更される。ＤＮＡ突然変異は、好ましくは、当業界で周知の方法を使用することによって行われる。
【０２３３】
代表的な実施形態において、グリコシル化部位は、ポリヌクレオチドをシャフリングすることによって付加される。候補のペプチドを符号化するポリヌクレオチドは、ＤＮＡシャフリングプロトコールで調節されうる。ＤＮＡシャフリングは、関連遺伝子のプールのランダム断片化の後、ポリメラーゼ連鎖反応状方法による断片の再アセンブリによって行われる再帰的組換えおよび突然変異の方法である。例えば、ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｔ．ＵＳＡ９１：１０７４７−１０７５１頁（１９９４）、ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ３７０：３８９−３９１頁（１９９４）、および米国特許第５，６０５，７９３号明細書、同第５，８３７，４５８号明細書、同第５，８３０，７２１号明細書、および同第５，８１１，２３８号明細書を参照。
【０２３４】
本発明がそれにより実施されうる代表的なペプチド、グリコシル部位を付加または除去、およびグリコシル構造または基礎構造の付加および除去の方法は、国際公開第０３／０３１４６４号パンフレットおよび関連米国およびＰＣＴ出願に詳細に記載されている。
【０２３５】
本発明は、１つもしくはそれ以上の選択グリコシル残基をペプチドに付加（またはペプチドから除去）するステップも活用し、その後に修飾糖がペプチドの選択グリコシル残基の少なくとも１つにコンジュゲートされる。本実施形態は、例えば、ペプチドに存在しないか、または所望の量で存在しない選択グリコシル残基に修飾糖をコンジュゲートすることが望ましい場合に有用である。したがって、修飾糖をペプチドに結合する前に、選択されたグリコシル残基は酵素または化学結合によってペプチドにコンジュゲートされる。別の実施形態において、糖ペプチドのグリコシル化パターンは、糖ペプチドからの炭水化物残基の除去によって修飾糖のコンジュゲーション前に変更される。例えば、国際公開第９８／３１８２６号パンフレットを参照。
【０２３６】
糖ペプチドに存在する炭水化物の付加または除去は化学的または酵素的に行われる。代表的な化学的脱グリコシル化は、ポリペプチド変異形の化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または同等の化合物への曝露によってもたらされる。この処置の結果、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除きほとんど、またはすべての糖の開裂が生じるが、ペプチドを無傷のままにする。化学的脱グリコシル化は、ハキムジン（Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ）ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２頁（１９８７年）およびエッジ（Ｅｄｇｅ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１頁（１９８１年）によって記載されている。ポリペプチド変異形における炭水化物部分の酵素的開裂は、トタクラ（Ｔｈｏｔａｋｕｒａ）ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｘｙｍｏｌ．１３８：３５０頁（１９８７年）によって記載されている通りさまざまなエンド−およびエキソグリコシダーゼの使用によって行われうる。
【０２３７】
代表的な実施形態において、ペプチドは、ペプチド上で糖コンジュゲーションまたは再構築ステップを行う前にノイラミダーゼで基本的に完全に脱シリアル化される。糖コンジュゲーションまたは再構築ステップ後、ペプチドは、場合により、シアリルトランスフェラーゼを使用して再シアリル化される。代表的な実施形態において、再シアリル化は基本的にシリアル受容体の集団における各々（例えば、＞８０％、好ましくは、８５％以上、９０％以上、好ましくは、９５％以上、かつより好ましくは、９６％、９７％、９８％、または９９％以上）末端のサッカリール受容体で起こる。好ましい実施形態において、サッカリドは実質的に均一のシアリル化パターン（すなわち、実質的に均一のグリコシル化パターン）を有する。
【０２３８】
グリコシル部分の化学的付加は、当技術分野で承認されている方法によって行われる。糖部分の酵素的付加は、好ましくは、本明細書に記載の方法の修飾を使用し、本発明において使用される修飾糖の天然グリコシル単位を置換することによって行われる。糖部分を付加する他の方法は、米国特許第５，８７６，９８０号明細書、同第６，０３０，８１５号明細書、同第５，７２８，５５４号明細書、および同第５，９２２，５７７号明細書に開示されている。
【０２３９】
選択グリコシル残基の代表的な結合点としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。すなわち、（ａ）Ｎ連結グリコシル化のコンセンサス部位、およびＯ連結グリコシル化の部位、（ｂ）グリコシルトランスフェラーゼの受容体である末端のグリコシル部分、（ｃ）アルギニン、アスパラギン、およびヒスチジン、（ｄ）遊離カルボキシル基、（ｅ）システインのものなど遊離スルフヒドリル基、（ｆ）セリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリンのものなど遊離ヒドロキシル基、（ｇ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのものなど芳香族残基、または（ｈ）グルタミンのアミド基。本発明において使用される代表的な方法は、１９８７年９月１１日発行の国際公開第８７／０５３３０号パンフレット、およびアプリン（Ａｐｌｉｎ）とリストン（Ｗｒｉｓｔｏｎ）、ＣＲＣ  ＣＲＩＴ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．、２５９−３０６頁（１９８１年）に記載されている。
【０２４０】
１つの実施形態において、本発明は、２つもしくはそれ以上のペプチドを、連結基を通じて連結するための方法を提供する。連結基は有用な構造であり、直鎖および分岐鎖構造から選択されうる。好ましくは、ペプチドの結合したリンカーの各々の末端は、修飾糖（すなわち、新生無傷グリコシル連結基）を含む。
【０２４１】
本発明の代表的な方法において、２つのペプチドは、ポリマーを含むリンカー（例えば、ＰＥＧリンカー）によって連結されている。構成物は、上記の図に記載されている一般構造に一致する。本明細書に記載されている通り、本発明の構成物は２つの無傷グリコシル連結基（すなわち、ｓ＋ｔ＝１）を含む。２つのグリコシル基を含むＰＥＧリンカーへの焦点は、明確さのためであり、本発明の本実施形態において使用されるリンカー腕の同一性の制限と解釈すべきではない。
【０２４２】
したがって、ＰＥＧ部分は第１のグリコシル単位により第１の末端で、および第２のグリコシル単位により第２の末端で官能化される。第１および第２のグリコシル単位は、好ましくは、異なるトランスフェラーゼの基質であり、それぞれ、第１および第２のペプチドの第１および第２のグリコシル単位との直交の結合を可能にする。実際には、（グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２リンカーは、第１のグリコシル単位が基質である第１のペプチドおよび第１のトランスフェラーゼと接触し、それによって（ペプチド）１−（グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２を形成する。次いで、トランスフェラーゼおよび／または未反応ペプチドは、場合により、反応混合物から除去される。第２のグリコシル単位が基質である第２のペプチドおよび第２のトランスフェラーゼは、（ペプチド）１−（グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２コンジュゲートに付加され、（ペプチド）１−（グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２−（ペプチド）２を形成し、グリコシル残基の少なくとも１つは直接または間接のいずれかのＯ連結である。当業者は、上記の方法が、例えば、分岐ＰＥＧ、デンドリマー、ポリ（アミノ酸）、ポリサッカリド、または同様のものを使用することによって、３つ以上のペプチド間のコンジュゲートの形成にも提供可能であることを十分に理解するであろう。
【０２４３】
代表的な実施形態において、本発明の方法によって修飾されるペプチドは、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）またはトランスジェニック動物において生成される糖ペプチドであり、したがって、Ｎおよび／またはＯ連結オリゴ糖鎖を含有し、これらは不完全にシアリル化される。シアル酸を欠き、かつ末端のガラクトース残基を含有する糖ペプチドのオリゴ糖鎖は、ＰＥＧ化、ＰＰＧ化され、または修飾シアル酸で修飾されうる。
【０２４４】
スキーム１において、アミノグリコシド１は、保護アミノ酸（例えば、グリシン）誘導体の活性エステルで処理され、糖アミノ酸残基を対応する保護アミノ酸アミド付加化合物へ変換する。この付加化合物はアルドラーゼで処置され、α−ヒドロキシカルボン酸塩２を形成する。化合物２は、ＣＭＰ−ＳＡ合成酵素の作用の後、ＣＭＰ誘導体の触媒水素化によって対応するＣＭＰ誘導体に変換され、化合物３を生成する。グリシン付加化合物の形成によって導入されるアミンは、化合物３を活性化ＰＥＧまたはＰＰＧ誘導体（例えば、ＰＥＧ−Ｃ（Ｏ）ＮＨＳ、ＰＥＧ−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−ｐ−ニトロフェニル）と反応させることによってＰＥＧ結合の位置として使用され、それぞれ、４または５などの種を生成する。
【化６７】
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【０２４５】
修飾糖のペプチドへのコンジュゲーション
ＰＥＧ修飾糖は、コンジュゲーションを媒介する適切な酵素を使用してグリコシル化または未グリコシル化ペプチドへコンジュゲートされる。好ましくは、修飾ドナー糖、酵素、および受容体ペプチドの濃度は、受容体が消費されるまでグリコシル化が継続するように選択される。以下で議論される考慮は、シアリルトランスフェラーゼとの関連で記載されているが、一般に他のグリコシルトランスフェラーゼ反応にも適用可能である。
【０２４６】
所望のオリゴ糖構造を合成するグリコシルトランスフェラーゼを使用する多くの方法が周知であり、一般に本発明に適用可能である。代表的な方法は、例えば、国際公開第９６／３２４９１号パンフレット、イトウ（Ｉｔｏ）ら、Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６５：７５３頁（１９９３年）、米国特許第５，３５２，６７０号明細書、同第５，３７４，５４１号明細書、同第５，５４５，５５３号明細書、共同所有の米国特許第６，３９９，３３６号明細書および同第６，４４０，７０３号明細書、および共同所有の公開ＰＣＴ出願、国際公開第０３／０３１４６４号パンフレット、国際公開第０４／０３３６５１号パンフレット、国際公開第０４／０９９２３１号パンフレットに記載されているが、これらは参照により本明細書で援用される。
【０２４７】
本発明は、単一グリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼの組合せを使用して実施される。例えば、シアリルトランスフェラーゼとガラクトシルトランスフェラーゼの組合せが使用されうる。２つ以上の酵素を使用する実施形態においては、酵素および基質は、好ましくは、初期反応混合物において混合され、または第２の酵素反応の酵素および試薬は、第１の酵素反応が完了またはほぼ完了すると反応培地に添加される。単一容器中で順に２つの酵素反応を行うことによって、全体的収率は、中間種が単離される方法を超えて改善される。さらに、余分な溶媒および副産物の清掃および除去が削減される。
【０２４８】
好ましい実施形態において、第１および第２の酵素の各々はグリコシルトランスフェラーゼである。別の好ましい実施形態において、１つの酵素はエンドグリコシダーゼである。追加の好ましい実施形態において、３つ以上の酵素が使用され、本発明の修飾糖タンパク質をアセンブリする。酵素は、ペプチドへの修飾糖の付加の前後いずれかの時点でペプチド上のサッカリド構造を変更するために使用される。
【０２４９】
別の実施形態において、この方法は１つもしくはそれ以上のエキソまたはエンドグリコシダーゼを使用する。グリコシダーゼは一般的に、遺伝子操作され、それらを破壊するよりもグリコシル結合を形成する突然変異体である。突然変異グリカナーゼは一般的に活性部位酸性アミノ酸残基のアミノ酸残基の置換を含む。例えば、エンドグリカナーゼがエンドＨである場合、置換活性部位残基は一般的に位置１３０でＡｓｐ、位置１３２でＧｌｕまたはそれの組合せとなる。アミノ酸は一般にセリン、アラニン、アスパラギン、またはグルタミンで置換される。
【０２５０】
変異酵素は、通常、エンドグリカナーゼ加水分解ステップの逆反応と類似である合成ステップによって反応を触媒する。これらの実施形態において、グリコシルドナー分子（例えば、所望のオリゴ−またはモノサッカリド構造）は脱離基を含有し、反応はドナー分子のタンパク質上のＧｌｃＮＡｃ残基への添加により継続する。例えば、脱離基はフッ化物などのハロゲンでありうる。他の実施形態において、脱離基はＡｓｎ、またはＡｓｎペプチド部分である。別の実施形態において、グリコシルドナー分子上のＧｌｃＮＡｃ残基は修飾される。例えば、ＧｌｃＮＡｃ残基は１，２オキサゾリン部分を含んで成りうる。
【０２５１】
好ましい実施形態において、本発明のコンジュゲートを生成するために使用される酵素の各々は触媒量で存在する。特定の酵素の触媒量が酵素の基質の濃度のほか、温度、時間、およびｐＨ値など反応条件によって変動する。予め選択された基質濃度および反応条件下の所定の酵素の触媒量を決定する手段は当業者に公知である。
【０２５２】
上記の方法が行われる温度は氷点下のすぐ上から最も感受性の酵素が変性する温度までの範囲でありうる。好ましい温度範囲は、約０℃〜約５５℃、かつより好ましくは、約２０℃〜３７℃である。別の代表的な実施形態において、本方法の１つもしくはそれ以上の成分は、好熱性酵素を使用する高温で行われる。
【０２５３】
反応混合物は、受容体はグリコシル化されるのに十分な時間にわたって維持され、それによって所望のコンジュゲートを形成する。コンジュゲートの一部はしばしば数時間後に検出されうるが、回収可能な量が通常、２４時間以内に得られる。当業者は、反応速度が、選択される系に対して最適化される多くの変動要因（例えば、酵素濃度、ドナー濃度、受容体濃度、温度、溶媒容積）によって左右されることを理解する。
【０２５４】
本発明は、修飾ペプチドの工業規模の製造をも提供する。本明細書で使用される工業規模は一般に少なくとも１グラムの完成した精製コンジュゲートをもたらす。
【０２５５】
次の議論において、本発明は、修飾シアル酸部分のグリコシル化ペプチドとのコンジュゲーションによって例示される。代表的な修飾シアル酸はＰＥＧで標識される。次の議論のＰＥＧ修飾シアル酸およびグリコシル化ペプチドの使用への焦点は説明の明確さのためであり、本発明がこれら２つのパートナーのコンジュゲーションに限定されることを意味することは意図されていない。当業者は、議論が一般にシアル酸以外の修飾グリコシル部分の付加にも適用可能であることを理解する。さらに、議論は同等に他のＰＥＧ部分、治療的部分、および生体分子を含むＰＥＧ以外の薬剤とともにグリコシル単位の修飾に適用可能である。
【０２５６】
酵素方法をペプチドまたは糖ペプチドへのＰＥＧ化またはＰＰＧ化炭水化物の選択的導入のために使用されうる。この方法ではＰＥＧ、ＰＰＧ、またはマスクした反応官能基を含有する修飾糖が使用され、適切なグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシンターゼと混合される。所望炭水化物リンケージを作るグリコシルトランスフェラーゼを選択し、ドナー基質として修飾糖を使用することによって、ＰＥＧまたはＰＰＧは、ペプチドに付加されているペプチド骨格、糖ペプチドの既存の残基、または糖残基へ直接、導入されうる。
【０２５７】
代表的な実施形態において、シアリルトランスフェラーゼの受容体が、天然起源構造として、またはそこに組換え、酵素的、もしくは化学的に配置されて修飾すべきペプチド上に存在する。適切な受容体としては、例えば、Ｇａｌβ１、４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１、４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１、３ＧａｌＮＡｃ、ラクト−Ｎ−テトラｏｓｅ、Ｇａｌβ１、３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１、３Ａｒａ、Ｇａｌβ１、６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１、４Ｇｌｃ（ラクトース）などのガラクトシル受容体、および当業者に周知の他の受容体が挙げられる（例えば、パウルソン（Ｐａｕｌｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：５６１７−５６２４頁（１９７８年）を参照）。代表的なシアリルトランスフェラーゼは本明細書に記載されている。
【０２５８】
１つの実施形態において、シアリルトランスフェラーゼの受容体が糖ペプチドのインビボ合成と同時に修飾される糖ペプチド上に存在する。かかる糖ペプチドは、糖ペプチドのグリコシル化パターンの事前の修飾なしに請求された方法を使用してシアリル化されうる。あるいは、本発明の方法を使用し、適切な受容体を含むことのないペプチドをシアリル化することができ、最初にペプチドを修飾し、当業者に周知の方法によって受容体を含める。代表的な実施形態において、ＧａｌＮａｃ残基がＧａｌＮａｃトランスフェラーゼの作用によって付加される。
【０２５９】
代表的な実施形態において、ガラクトシル受容体はガラクトース残基をペプチドに連結した適切な受容体、例えば、ＧｌｃＮＡｃに結合させることによってアセンブリされる。この方法には修飾すべきペプチドを適切な量のガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｇａｌβ１，３、またはＧａｌβ１，４）、および適切なガラクトシルドナー（例えば、ＵＤＰ−ガラクトース）でインキュベートするステップを含む。反応は実質的に完了するまで継続され、あるいは、反応は、予め選択された量のガラクトース残基が添加されると終了する。選択されたサッカリド受容体をアセンブリする他の方法は当業者には明らかであろう。
【０２６０】
さらに別の実施形態において、糖ペプチド連結オリゴ糖が最初に全部または部分的に「トリミングされ」、シアリルトランスフェラーゼの受容体、または１つもしくはそれ以上の適切な残基が付加されて適切な受容体を得る部分を曝露する。グリコシルトランスフェラーゼおよびエンドグリコシダーゼなどの酵素（例えば、米国特許第５，７１６，８１２号明細書を参照）は、結合およびトリミング反応に有用である。本方法の別の実施形態において、ペプチドのシアル酸部分は基本的に完全に除去され（例えば、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも９９％）、修飾シアル酸の受容体を曝露する。
【０２６１】
次の議論において、本発明の方法はそれに結合されるＰＥＧ部分を有する修飾糖の使用によって例示される。議論の焦点は説明の明確さのためのである。当業者は、議論が同等に、修飾糖が治療的部分、生体分子、または同様のものを有する実施形態のものと関連することを十分に理解するであろう。
【０２６２】
炭水化物残基が修飾糖の付加前にトリミングされる本発明の代表的な実施形態において、高マンノースが第１世代の二分岐構造にトリミングバックされる。ＰＥＧ部分を有する修飾糖が、「トリミングバック」によって曝露される１つもしくはそれ以上の糖残基にコンジュゲートされる。１つの例において、ＰＥＧ部分がＰＥＧ部分にコンジュゲートされたＧｌｃＮＡｃ部分によって付加される。修飾ＧｌｃＮＡｃは、二分岐構造の末端のマンノース残基の一方または両方に結合される。あるいは、未修飾ＧｌｃＮＡｃが分岐種の末端の一方または両方に付加される。
【０２６３】
別の代表的な実施形態において、ＰＥＧ部分が、末端のマンノース残基へ付加されたＧｌｃＮＡｃ残基にコンジュゲートされているガラクトース残基を有する修飾糖によって二分岐構造の末端のマンノース残基の一方または両方に付加される。あるいは、未修飾Ｇａｌが末端のＧｌｃＮＡｃ残基の一方または両方に付加されうる。
【０２６４】
さらに別の例において、ＰＥＧ部分が上記のものなど修飾シアル酸を使用してＧａｌ残基へ付加される。
【０２６５】
別の代表的な実施形態において、高マンノース構造がマンノースに「トリミングバック」され、そこから二分岐構造が枝分かれする。１つの例において、ＰＥＧ部分がポリマーで修飾されたＧｌｃＮＡｃによって付加される。あるいは、未修飾ＧｌｃＮＡｃがマンノースに付加された後、結合ＰＥＧ部分を有するＧａｌが付加される。さらに別の実施形態において、未修飾ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌ残基が連続的にマンノースに付加された後、ＰＥＧ部分で修飾されたシアル酸部分が付加される。
【０２６６】
高マンノース構造は基本トリマンノシルコアにもトリミングバックされうる。
【０２６７】
さらに代表的な実施形態において、高マンノースが、第１のマンノース付加されているＧｌｃＮＡｃに「トリミングバック」される。ＧｌｃＮＡｃはＰＥＧ部分を有するＧａｌ残基にコンジュゲートされる。あるいは、未修飾ＧａｌがＧｌｃＮＡｃに付加された後、水溶性種で修飾されたシアル酸が付加される。さらに別の例において、末端のＧｌｃＮＡｃがＧａｌでコンジュゲートされ、ＧｌｃＮＡｃはその後にＰＥＧ部分を有する修飾フコースでフコシル化される。
【０２６８】
高マンノースはペプチドのＡｓｎに結合した第１のＧｌｃＮＡｃにもトリミングバックされうる。１つの例において、ＧｌｃＮＡｃ−（Ｆｕｃ）ａ残基のＧｌｃＮＡｃは水溶性ポリマーを有するＧｌｃＮＡｃでコンジュゲートされる。別の例において、ＧｌｃＮＡｃ−（Ｆｕｃ）ａ残基のＧｌｃＮＡｃは、水溶性ポリマーを有するＧａｌで修飾される。さらに別の実施形態において、ＧｌｃＮＡｃはＧａｌで修飾された後、ＰＥＧ部分で修飾されたシアル酸のＧａｌにコンジュゲートされる。
【０２６９】
他の代表的な実施形態が一般的に認められた米国特許出願刊行物に記載されている。すなわち、米国特許出願公開第２００４０１３２６４０号明細書、同第２００４００６３９１１号明細書、同第２００４０１３７５５７号明細書、米国特許出願第１０／３６９，９７９号明細書、同第１０／４１０，９１３号明細書、同第１０／３６０，７７０号明細書、同第１０／４１０，９４５号明細書、および国際公開公報（ＰＣＴ）第ＵＳ０２／３２２６３号明細書であり、その各々は参照により本明細書で援用される。
【０２７０】
上記の例は、本明細書に記載の方法の能力の説明を提供する。本明細書に記載の方法を使用することにより、実質的にすべての所望の構造の炭水化物残基を「トリミングバック」し、かつ増加させることが可能である。修飾糖は、上記の通り炭水化物部分の末端に付加され、これはペプチドコアと炭水化物の末端との中間に存在しうる。
【０２７１】
代表的な実施形態において、既存のシアル酸がシアリダーゼを使用して糖ペプチドから除去され、それによって基礎を成すガラクトシル残基のすべてまたはほとんどを脱マスキングする。あるいは、ペプチドまたは糖ペプチドがガラクトース残基、またはガラクトース単位で終わるオリゴ糖残基で標識される。ガルトース残基の曝露または付加の後、適切なシアリルトランスフェラーゼが修飾シアル酸を付加するために使用される。
【０２７２】
別の代表的な実施形態において、シアル酸をシアル酸へ移動させる酵素が使用される。この方法は、シアリル化グリカンをシアリダーゼで処置し、シアル酸の下にグリカン残基を曝露することなく実施されうる。代表的なポリマー修飾シアル酸がポリ（エチレングリコール）で修飾されたシアル酸である。シアル酸および修飾シアル酸部分をシアル酸残基を含み、グリカン上の既存のシアル酸残基をこれらの種と交換する他の代表的な酵素としては、ＳＴ３Ｇａｌ３、ＣＳＴ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩＩ、およびＳＴ８Ｓｉａ−ＩＶが挙げられる。
【０２７３】
さらに別の方法において、マスクした反応官能性がシアル酸上に存在する。マスクした反応基は、好ましくは、修飾シアル酸をＧ−ＣＳＦに結合するために使用される条件によって影響を受けない。ペプチドとの修飾シアル酸の共有結合後、マスクは除去され、ペプチドはＰＥＧなどの薬剤でコンジュゲートされる。薬剤は修飾糖残基上の脱マスキングされた反応基とともにその反応によって特殊な方法でペプチドにコンジュゲートされる。
【０２７４】
修飾糖をその適切なグリコシルトランスフェラーゼとともに、糖ペプチドのオリゴ糖側鎖の末端の糖に応じて使用されうる。上記の通り、ＰＥＧ化構造の導入のために必要とされる糖ペプチドの末端の糖が発現中に自然に導入され、または発現後に適切なグリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、またはグリコシダーゼとグリコシルトランスフェラーゼの混合物を使用することにより生成されうる。
【０２７５】
さらに代表的な実施形態において、ＵＤＰ−ガラクトース−ＰＥＧがβ１，４−  ガラクトシルトランスフェラーゼと反応し、それによって修飾ガラクトースを適切な末端のＮ−アセチルグルコサミン構造に移動させる。糖ペプチド上の末端のＧｌｃＮＡｃ残基は、哺乳類、昆虫、植物、または真菌などの発現系で起こりうるように発現中に生成されるだけではなく、必要に応じて、シアリダーゼおよび／またはグリコシダーゼおよび／またはグリコシルトランスフェラーゼで糖ペプチドを処置することによっても生成されうる。
【０２７６】
別の代表的な実施形態において、ＧＮＴ１−５などのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼが使用され、ＰＥＧ化−ＧｌｃＮＡｃを糖ペプチド上の末端のマンノース残基に移動させる。さらに別の代表的な実施形態において、Ｎおよび／またはＯ連結グリカン構造が酵素的に糖ペプチドから除去され、アミノ酸または末端のグリコシル残基を曝露し、これはその後に修飾糖とコンジュゲートされる。例えば、エンドグリカナーゼが使用され、糖ペプチドのＮ連結構造物を除去して末端のＧｌｃＮＡｃをＧｌｃＮＡｃ連結Ａｓｎとして糖ペプチド上に曝露する。ＵＤＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧおよび適切なガラクトースイルトランスフェラーゼが使用され、ＰＥＧ−ガラクトース官能性を曝露ＧｌｃＮＡｃ上に導入する。
【０２７７】
別の実施形態において、修飾糖は直接、糖残基をペプチド骨格に移動することが知られているグリコシルトランスフェラーゼを使用してペプチド骨格に付加される。本発明の実施において有用な代表的なグリコシルトランスフェラーゼとしては、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃＴｌ−１４）、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。この方法の使用により、炭水化物を欠くペプチド、あるいは、既存の糖ペプチドへの修飾糖の直接の付加が可能となる。両方の場合に、修飾糖の付加は、グリコシルトランスフェラーゼの基質特異性によって規定されるペプチド骨格上の特定の位置で起こり、化学的方法を使用するタンパク質のペプチド骨格の修飾中に起こるようなランダムな方法では起こらない。一連の薬剤が、適切なアミノ酸配列をポリペプチド鎖へ遺伝子操作することによってグリコシルトランスフェラーゼ基質ペプチド配列を欠くタンパク質または糖ペプチドへ導入されうる。
【０２７８】
上記の代表的な実施形態の各々において、１つもしくはそれ以上の追加の化学的または酵素的修飾ステップが修飾糖のペプチドとのコンジュゲーション後に使用されうる。代表的な実施形態において、酵素（例えば、フコシルトランスフェラーゼ）が使用され、グリコシル単位（例えば、フコース）をペプチドに結合した末端の修飾糖へ付加する。別の例では、酵素反応が使用され、修飾糖がコンジュゲートできなかった部位を「キャップ」する。あるいは、化学反応が使用され、コンジュゲート修飾糖の構造を変更する。例えば、コンジュゲート修飾糖は、修飾糖が結合されているペプチド成分とのそのリンケージを安定化または不安定化させる薬剤と反応する。別の例では、修飾糖の成分がペプチドとのそのコンジュゲーション後に脱保護される。当業者は、修飾糖がペプチドにコンジュゲートされた後の段階で本発明の方法において有用である一連の酵素的および化学的方法があることを十分に理解するであろう。さらに、修飾糖−ペプチドコンジュゲートの精緻化が本発明の範囲内である。
【０２７９】
本発明のコンジュゲートを調製するための酵素および反応条件は、本出願の親および共同所有公開ＰＣＴ特許出願国際公開第０３／０３１４６４号パンフレット、国際公開第０４／０３３６５１号パンフレット、国際公開第０４／０９９２３１号パンフレットにおいて詳しく議論されている。
【０２８０】
選択実施形態において、昆虫細胞で発現されるＧ−ＣＳＦペプチドが、再構築糖ペプチド上のグリカンがＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌグリコシル残基を含むように再構築される。ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌの付加は、単一容器で別々の反応として、または単一の反応として起こりうる。この例では、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩおよびＧａｌ−トランスフェラーゼＩが使用される。修飾シアリル部分がＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩＩを使用して付加される。
【０２８１】
別の実施形態において、ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ、および修飾Ｓｉａの付加も上記の酵素を使用して単一の反応容器で起こりうる。酵素再構築および糖ＰＥＧ化ステップの各々は個別に行われる。
【０２８２】
ペプチドが哺乳類細胞で発現すると、異なる方法が使用される。１つの実施形態において、ペプチドは、修飾シアル酸をペプチド上のシアル酸へ移動させ、Ｓｉａ−Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ１を形成し、ペプチド上のシアル酸を修飾シアル酸と交換し、Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ１を形成するシアリルトランスフェラーゼとペプチドを接触させることによってコンジュゲート前に再構築の必要なしにコンジュゲートされる。本方法において使用される代表的酵素がＣＳＴ−ＩＩである。シアル酸をシアル酸に付加する他の酵素は当業者に周知であり、かかる酵素の例が本明細書に添付の図面に記載されている。
【０２８３】
本発明のコンジュゲートを調製するさらに別の方法において、哺乳類系で発現されるペプチドはシアリダーゼを使用して脱シアリル化される。曝露Ｇａｌ残基は、Ｏ連結グリカンに特異的なシアリルトランスフェラーゼを使用する修飾シアル酸でシアリル化され、Ｏ連結修飾グリカンを有するＧ−ＣＳＦペプチドを提供する。脱シアリル化、修飾Ｇ−ＣＳＦペプチドは、場合により、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩなどのシアリルトランスフェラーゼを使用することによって部分的または完全に再シアリル化される。
【０２８４】
別の態様において、本発明は、本発明のＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを製造する方法を提供する。この方法は、（ａ）
【化６８】
2009501127.tif 000069
から選択されるグリコシル基を含んで成る基質Ｇ−ＣＳＦペプチドを、式
【化６９】
2009501127.tif 000070
を有するＰＥＧシアル酸ドナー、および前記グリコシル基のＧａｌＮａｃ、Ｇａｌ、およびＳｉａから選択されるメンバー上へ前記ドナーからＰＥＧシアル酸を移動させる酵素と、前記移動に適切な条件下に接触させるステップを含む。代表的な修飾シアル酸ドナーが、リンカー部分により、ポリマー、例えば、直鎖または分岐ポリ（エチレングリコール）部分で修飾されるＣＭＰシアル酸である。本明細書で論じるように、ペプチドは、場合により、修飾糖を結合させる前にＧａｌＮＡｃおよび／またはＧａｌおよび／またはＳｉａとグリコシル化される（「再構築」）。再構築ステップは、ステップ間のグリコシル化ペプチドの精製なしに同じ容器において順に起こりうる。あるいは、１つもしくはそれ以上の再構築ステップの後、グリコシル化ペプチドはそれを次のグリコシル化またはｇｌｙｃＰＥＧ化ステップにかける前に精製されうる。
【０２８５】
実施例に示され、以下に議論されるように、ＰＥＧ糖の受容体部分の配置が所望数のステップで行われる。例えば、１つの実施形態において、ＧａｌＮＡｃのペプチドへの付加の後には第２のステップが続きうるが、ここでＰＥＧ糖は同じ反応容器でＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされる。あるいは、これら２つのステップは単一容器でほぼ同時に行われうる。
【０２８６】
代表的な実施形態において、ＰＥＧ−シアル酸ドナーは式
【化７０】
2009501127.tif 000071
を有する。
【０２８７】
別の代表的な実施形態において、ＰＥＧ−シアル酸ドナーは式
【化７１】
2009501127.tif 000072
を有する。
【０２８８】
さらに代表的な実施形態において、Ｇ−ＣＳＦペプチドは糖ＰＥＧ化または再構築前に適切な発現系で発現される。代表的な発現系としては、Ｓｆ−９／バキュロウイルスおよびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。
【０２８９】
別の代表的な実施形態において、本発明は、コンジュゲートにおけるＧ−ＣＳＦが基本的に非酸化されている本明細書に記載されているものなどＧ−ＣＳＦのコンジュゲートを形成する方法を提供する。ＰＥＧ−ＧＣＳＦのメチオニン残基の酸化は、Ｎ末端の配列決定およびペプチドマッピングによって検出されうる。酸化またはその不在は、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して確認されうる。例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用することにより、ピークまたは主要なＰＥＧ−ＧＣＳＦピークが検出されたが、これはメチオニンが酸化されている（Ｍｅｔ−Ｏｘ）ＰＥＧ−ＧＣＳＦ種を表す。ＧＣＳＦのこのピークはＭｅｔ１２７／Ｍｅｔ１３８酸化として確認されており、主要なピークの０．２分前に溶出する。また、Ｍｅｔ１２２酸化として主要なピークのほぼ３分前に溶出する小さなピークが確認されている。Ｍｅｔ１酸化は、６０℃法を使用してＲＰ−ＨＰＬＣによって検出されたが、これは主要なピークと共溶出する。このＮ末端のメチオニン酸化はペプチドマッピングによって検出され、Ｇｌ−Ｏｘと呼ばれる。
【０２９０】
したがって、代表的な実施形態において、本発明は、本明細書に記載されている通り、Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートの集団を提供し、ここで１０％未満、好ましくは、５％未満、より好ましくは、１％未満、より好ましくは、０．５％未満、さらにより好ましくは、０．１％未満、好ましくは、０．０５％未満、より好ましくは、０．０１％未満、さらにより好ましくは、０．００５％未満、およびさらにより好ましくは、０．００１％未満の集団のメンバーが、Ｍｅｔ１２７、Ｍｅｔ１３８、Ｍｅｔ１２２、Ｎ末端Ｍｅｔ、および酸化されているその組合せから選択されるメチオニン残基を含む。
【０２９１】
本発明による代表的な方法において、修飾糖のペプチドとの酵素コンジュゲーションは、ペプチドのメチオニン残基の酸化を阻止または遅らせる条件下に行われる。代表的な実施形態において、反応混合物は追加のメチオニンを含む。本発明の代表的な方法ではコンジュゲーション反応混合物において約２０ｍＭまでのメチオニンが使用される。
【０２９２】
Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートの精製
上記の方法で製造される生成物は精製なしに使用されうる。しかし、通常、生成物および１つもしくはそれ以上の中間体、例えば、ヌクレオチド糖、分岐および線状ＰＥＧ種、修飾種、およぶ修飾ヌクレオチド糖を回収することが好ましい。薄層または厚層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または膜ろ過などグリコシル化サッカリドの回収のための公知の方法を使用することができる。好ましくは膜ろ過を使用すること、より好ましくは、逆浸透圧膜、または、以下、および本明細書に引用された文献で議論されている回収のための１つもしくはそれ以上のカラムクロマトグラフィー法を使用することが好ましい。例えば、膜が約３０００〜約１０，０００の分子量カットオフを有する膜ろ過を使用し、グリコシルトランスフェラーゼなどのタンパク質を除去することができる。次いで、ナノろ過または逆浸透を使用し、塩を除去し、かつ／または生成物サッカリドを精製することができる（例えば、国際公開第９８／１５５８１号パンフレットを参照）。ナノフィルター膜は、使用される膜に応じて、一価塩を通過させるが、約１００〜約２，０００ダルトンより大きい多価塩および非荷電溶質保持する逆浸透膜のクラスである。したがって、代表的な用途において、本発明の方法によって調製されたサッカリドは、膜に保持され、夾雑塩は通過する。
【０２９３】
ペプチドが、第１のステップとして細胞内で生成される場合は、微粒子デブリ、宿主細胞または溶解断片のいずれかが除去される。糖ＰＥＧ化の後、ＰＥＧ化ペプチドは当技術分野で承認されている方法、例えば、遠心分離または限外ろ過によって精製され、場合により、タンパク質は、市販のタンパク質濃度フィルターで濃縮された後、免疫親和性クロマトグラフィー、イオン交換カラム分別（例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）上またはカルボキシメチルもしくはスルホプロピル基を含有するマトリクス上）、ブルー−セファロースでの、ＣＭブルー−セファロース、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンチルレクチン−セファロース、ＷＧＡ−セファロース、ＣｏｎＡ−セファロース、エーテルトヨパール、ブチルトヨパール、フェニルトヨパール、またはタンパク質Ａセファロースでのクロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、クロマト焦点化、逆相ＨＰＬＣ（例えば、追加脂肪族基を有するシリカ）、例えば、セファデックス分子篩またはサイズ排除クロマトグラフィーを使用するゲルろ過、選択的にポリペプチドを結合するカラム上のクロマトグラフィー、およびエタノールまたは硫酸アンモニウム沈殿から選択される１つもしくはそれ以上のステップによってポリペプチド変異形を他の不純物から分離する。
【０２９４】
培養で生成される修飾糖ペプチドは通常、細胞、酵素等からの初期抽出の後、１つもしくはそれ以上の濃縮、塩析、水性イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフィーのステップによって単離される。また、修飾糖タンパク質は親和性クロマトグラフィーによって精製されうる。最後に、ＨＰＬＣは最終精製ステップのために使用されうる。
【０２９５】
プロテアーゼ阻害剤、例えば、メチルスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）を、前記ステップのいずれかに含め、タンパク質分解を阻害することができ、抗生物質または保存剤を含め、付随的汚染物質の成長を阻止することができる。
【０２９６】
別の実施形態により、発明の修飾糖ペプチドを生成する系からの上清を、市販のタンパク質濃度フィルター、例えば、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）またはミリポア（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）限外ろ過ユニットを使用して最初に濃縮する。濃縮ステップの後、濃縮物は適切な精製マトリックスに適用されうる。例えば、適切な親和性マトリックスが、ペプチドのリガンド、適切な担体に結合したレクチンまたは抗体を含んで成りうる。あるいは、陰イオン交換樹脂、例えば、懸垂ＤＥＡＥ基を有するマトリックスまたは基質が使用されうる。適切なマトリックスとしては、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製において一般的に使用される種類が挙げられる。あるいは、陽イオン交換ステップが使用されうる。適切な陽イオン交換としては、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含んで成るさまざまな不溶性マトリックスが挙げられる。
【０２９７】
精製において使用される他の方法としては、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびブルーセファロースでのクロマトグラフィーが挙げられる。これらおよび他の有用な方法は、同時譲渡米国仮特許第（代理人整理番号第４０８５３−０１−５１６８−Ｐ１、２００５年５月６日出願）において説明されている。
【０２９８】
疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ培地、例えば、懸垂メチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを有する１つもしくはそれ以上のＲＰ−ＨＰＬＣステップを使用し、さらにポリペプチドコンジュゲート組成物を精製することができる。さまざまな組合せで前記精製ステップの一部または全部を使用し、同種または基本的に同種の修飾糖タンパク質を提供することもできる。
【０２９９】
大規模発酵に由来する本発明の修飾糖ペプチドは、ウルダル（Ｕｒｄａｌ）ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１頁（１９８４年）によって開示されたものと類似の方法によって精製されうる。この文献では、調製ＨＰＬＣカラムでの組換えヒトＩＬ−２の精製のための２つの連続的ＲＰ−ＨＰＬＣステップが記載されている。あるいは、親和性クロマトグラフィーなどの方法を使用し、修飾糖タンパク質を精製することができる。
【０３００】
代表的な実施形態において、精製は、一般的に所有される、同時譲渡米国仮特許第６０／６６５，５８８号明細書、２００５年３月２４日出願に記載されている方法によって行われる。
【０３０１】
別の代表的な実施形態において、精製は溶離剤として適切な緩衝液を使用するＳＰＨＰクロマトグラフィーによって達成される。代表的な緩衝液としては、クエン酸および酢酸緩衝液が挙げられるが、クエン酸が現在、好ましい。
【０３０２】
さらに代表的な実施形態において、リン酸塩、例えば、リン酸ナトリウムが酵素コンジュゲーション反応混合物に添加される。反応混合物は遠心分離され、結果として生じる混合物はＳＰＨＰによって精製される。
本実施形態において、ＧＣＳＦに共有結合していない遊離メチオンが、精製ステップ中に存在または非存在である。上記の代表的の精製方法は結果として、本明細書に記載されている通り、Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートの集団の単離をもたらすが、ここで１０％未満、好ましくは、５％未満、より好ましくは、１％未満、より好ましくは、０．５％未満、さらにより好ましくは、０．１％未満、好ましくは、０．０５％未満、より好ましくは、０．０１％未満、さらにより好ましくは、０．００５％未満、およびさらにより好ましくは、０．００１％未満の集団のメンバーが、Ｍｅｔ１２７、Ｍｅｔ１３８、Ｍｅｔ１２２、Ｎ末端Ｍｅｔ、および酸化されているその組合せから選択されるメチオニン残基を含む。
【０３０３】
さらに別の代表的実施形態において、精製Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート組成物はＧ−ＣＳＦペプチドの集団を含み、１０％未満、好ましくは、５％未満、より好ましくは、１％未満、より好ましくは、０．５％未満、さらにより好ましくは、０．１％未満、好ましくは、０．０５％未満、より好ましくは、０．０１％未満、さらにより好ましくは、０．００５％未満、およびさらにより好ましくは、０．００１％未満のペプチドの集団が、サイズ排除クロマトグラフィーによって測定されるようにペプチド凝集体に結合される。
【０３０４】
医薬組成物
別の態様において、本発明は医薬組成物を提供する。医薬組成物としては、医薬的に許容される希釈剤、および非天然起源、ＰＥＧ部分、治療的部分、または生体分子、およびグリコシル化もしくは未グリコシル化ペプチド間の共有コンジュゲートが挙げられる。ポリマー、治療的部分、または生体分子は、ペプチドおよびポリマー、治療的部分または生体分子の間に挿入され、これらに共有連結した無傷グリコシル連結基によってペプチドにコンジュゲートされる。
【０３０５】
本発明の医薬組成物は、さまざまな薬物送達系において使用されるために適切である。本発明において使用される適切な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、メース・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ペンシルベニア州（ＰＡ）、第１７版、（１９８５年）において確認される。薬物送達の方法の簡単な検討については、ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３頁（１９９０年）を参照。
【０３０６】
医薬組成物は、例えば、局所、経口、鼻内、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下、または筋内投与を含む適切な投与の方法のために形成されうる。皮下注射などの非経口投与のために、担体は、好ましくは、水、食塩水、アルコール、脂肪、ろう、または緩衝液を含んで成る。経口投与のために、上記の担体、またはマニトール、ラクトース、でんぷん、マグネシウムステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、およびマグネシウム炭酸塩などの固体担体を使用することができる。生体分解性マイクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ポリグリコレート）も本発明の医薬組成物の担体として使用されうる。適切な生体分解性マイクロスフェアが、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号明細書および同第５，０７５，１０９号明細書で開示されている。
【０３０７】
一般に、医薬組成物は非経口、例えば、静脈内投与される。したがって、本発明は、許容される担体、好ましくは、水性担体、例えば、水、緩衝水、食塩水、ＰＢＳなどに溶解または懸濁された化合物を非経口投与用の組成物を提供する。組成物は、ｐＨ調節および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤、界面活性剤などの生理的条件に近づけるために必要な医薬的に許容される補助剤を含有しうる。
【０３０８】
これらの組成物は、従来の滅菌法によって滅菌され、または滅菌ろ過されうる。結果として生じる水溶液は、使用のためにパッケージされ、または凍結乾燥され、凍結乾燥調製液は投与前に滅菌水性担体と混合される。調製液のｐＨは一般的に３〜１１、より好ましくは、５〜９、最も好ましくは、７〜８である。
【０３０９】
一部の実施形態において、本発明の糖ペプチドは、標準ベシクル形成脂質から形成されるリポソームへ組込まれうる。リポソームを調製するさまざまな方法が利用可能であるが、例えば、スゾカ（Ｓｚｏｋａ）ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７頁（１９８０年）、米国特許第４，２３５，８７１号明細書、同第４，５０１，７２８号明細書、および同第４，８３７，０２８号明細書に記載されている通りである。さまざまな標的薬剤（例えば、本発明のシアリルガラクトシド）を用いてリポソームで標的化することが当業界で公知である（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号明細書、および同第４，６０３，０４号明細書を参照）。
【０３１０】
標的薬剤をリポソームに結合するための標準方法が使用されうる。これらの方法は一般に、標的薬剤、または本発明の脂質誘導体化糖ペプチドなど誘導体化親油性化合物の結合のために活性化されうるホスファチジルエタノールアミンなど脂質成分のリポソームへの組込みを含む。
【０３１１】
標的機序は一般に、標的部分が標的、例えば、細胞表面受容体との相互作用のために利用可能であるような方法で標的薬剤がリポソームの表面上に配置されることが必要である。本発明の炭水化物は、当業者に周知の方法（例えば、それぞれ、長鎖アルキルハロゲン化物または脂肪酸を有する炭水化物上に存在するヒドロキシル基のアルキル化またはアシル化）を使用してリポソームが形成される前に脂質分子に結合されうる。あるいは、リポソームは、連結部が最初に膜を形成する時点で膜へ組込まれるような方法で構築されうる。連結部は、膜にしっかりと組込まれて固定される親油性部分を有する必要がある。リポソームの水性表面上で化学的に利用可能である反応部も有する必要がある。反応部は、後に付加される標的薬剤または炭水化物との安定した化学結合を形成することが化学的に適切であるように選択される。場合によっては、標的薬剤を連結分子に直接結合させるこが可能であるが、ほとんどの場合、橋として作用する第３の分子を使用することがより適切であり、したがって、ベシクル表面から三次元的に延びる標的薬剤または炭水化物とともに膜にある連結分子を連結する。
【０３１２】
本発明の方法によって調製される化合物は、診断上の試薬としても使用されうる。例えば、例えば、標識化合物を使用し、炎症を有することが疑われる患者における炎症または腫瘍転移の部位を局在することができる。この用途のために、化合物は１２５Ｉ、１４Ｃ、またはトリチウムで標識されうる。
【０３１３】
本発明の医薬組成物において使用される活性成分は、糖ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ、および刺激顆粒球生成の生物特性を有するその誘導体である。好ましくは、本発明のＧ−ＣＳＦ組成物は、非経口（例えば、ＩＶ、ＩＭ、ＳＣ、またはＩＰ）投与される。有効な投与量は、治療される状態および投与経路によって大幅に変動することが予想されるが、活性材料の約０．１（約７Ｕ）〜１００（約７０００Ｕ）μｇ／ｋｇ体重の範囲であることが予想される。貧血状態の治療のための好ましい用量は、週３回約５０〜約３００単位／ｋｇである。本発明はインビボ滞留時間の増大したＧ−ＣＳＦを提供するため、上記投与量は場合により本発明の組成物が投与されると低下される。
【０３１４】
本発明の組成物の調製における種の調製方法は一般にさまざまな特許刊行物、例えば、米国特許出願公開第２００４０１３７５５７号明細書、国際公開第０４／０８３２５８号パンフレット、および国際公開第０４／０３３６５１号パンフレットに記載されている。次の実施例は、本発明のコンジュゲート、および方法を説明するために提供されるが、請求される発明を限定するためには提供されていない。
【０３１５】
代表的な実施形態において、本発明は、本明細書に記載されているような、医薬的に許容される担体と組合せたＧ−ＣＳＦコンジュゲートの集団を含む医薬製剤を提供する。本発明の好ましい製剤は、緩衝液、界面活性剤、およびポリオールを含む。
【０３１６】
代表的な製剤は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約５ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬ、かつより好ましくは、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの量でのペプチドコンジュゲートを含む。
【０３１７】
代表的な製剤は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、好ましくは、約５ｍＭ〜約７５ｍＭ、かつより好ましくは、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度で緩衝液を含む。
【０３１８】
代表的な製剤において、界面活性剤は、約０．００００１％〜約１０％、好ましくは、約０．００００５％〜約１％、より好ましくは、約０．０００１％〜約０．１％、より好ましくは、約０．０００５％〜約０．００５％、かつさらにより好ましくは、約０．００１％〜約０．０１％の量で存在する。
【０３１９】
代表的な製剤において、ポリオールは、約１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、約１５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの量で存在する。
【０３２０】
代表的な実施形態において、製剤のｐＨは約３〜約７．５、好ましくは、約４〜約６．５、かつより好ましくは、約５〜約６である。ペプチドコンジュケートの構造がどうであれ、ペプチドのｐＩの約０．５ｐＨ単位の範囲内であるｐＨで調製されることが一般に好ましい。
【０３２１】
代表的な実施形態において、界面活性剤はツイーン（Ｔｗｅｅｎ）、例えば、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０である。さらに代表的な実施形態において、ポリオールはソルビトールである。別の実施形態において、緩衝液は酢酸ナトリウムである。
【０３２２】
本発明の代表的な製剤としては、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、０．００３％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、およびｐＨ４．０での５０ｍｇ／ｍＬソルビトールの混合物中のＧ−ＣＳＦコンジュゲート（２ｍｇ／ｍＬ）が挙げられる。
【実施例】
【０３２３】
実施例１
ＣＨＯ細胞において生成されるＧ−ＣＳＦの糖ＰＥＧ化
ａ．アシアロ顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の調製
ＣＨＯ細胞で生成されたＧ−ＣＳＦを５０ｍＭトリス５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２中２．５ｍｇで溶解し、セントリコン・プラス（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ）２０遠心ろ過機中で５００μＬに濃縮した。溶液を３００ｍＵ／ｍＬノイラミニダーゼＩＩ（Ｖｉｖｒｉｏ  Ｃｈｏｋｅｒａｅ）で１６時間３２℃下にインキュベートした。反応をモニタリングするために、小アリコートの反応物を適切な緩衝液で希釈し、ＩＥＦゲルを実行した。次いで、反応混合物を予め洗浄したＮ−（ｐ−アミノフェニル）オキサミド酸−アガロースコンジュゲートに添加し（８００μＬ／ｍＬ反応容積）、洗浄ビーズを静かに２４時間、４℃下に回転した。混合物を１０，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を採集した。ビーズをトリス−ＥＤＴＡ緩衝液で３回、０．４ｍＬのトリス−ＥＤＴＡ緩衝液で１回、０．２ｍＬのトリス−ＥＤＴＡ緩衝液で１回洗浄し、すべての上清をプールした。上清を４℃下、５０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．４、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３に対して透析し、次いでさらに２回、５０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．４、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３に対して透析した。次いで、透析溶液を、セントリコン・プラス２０遠心ろ過機を使用して濃縮し、−２０℃下に保存した。ＩＥＦゲルの条件をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって供給された方法および試薬に従い実行した。天然および脱シアリル化Ｇ−ＣＳＦの試料を水に対して透析し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析した。
【０３２４】
ｂ．Ｇ−ＣＳＦ−（アルファ２，３）−シアリル−ＰＥＧの調製
脱シアリル化Ｇ−ＣＳＦを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ７．２中２．５ｍｇ／ｍＬで溶解した。溶液を１ｍＭ  ＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧおよび０．１Ｕ／ｍＬのＳＴ３Ｇａｌｌで３２℃下、２日間インキュベートした。２日後、反応混合物をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．１）を使用し、画分を採集するトソ・ハース（Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ）Ｇ３０００ＳＷ調製カラムを使用して精製した。反応性生物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＥＦ分析を使用してインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって供給された方法および試薬に従い分析した。天然およびＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの試料を水に対して透析し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析した。
【０３２５】
ｃ．Ｇ−ＣＳＦ−（アルファ２，８）−シアリル−ＰＥＧの調製
アルファ２，３−シアリル化Ｏ連結グリカンを含有するＣＨＯ細胞で生成されたＧ−ＣＳＦを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ７．２中２．５ｍｇ／ｍＬで溶解した。溶液を１ｍＭ  ＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧおよび０．１Ｕ／ｍＬのＣＳＴ−ＩＩで３２℃下、２日間インキュベートした。２日後、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．１）を使用し、画分ベースを採集するトソ・ハース（Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ）Ｇ３０００ＳＷ調製カラムを使用して反応混合物を精製した。反応性生物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＥＦ分析を使用してインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって供給された方法および試薬に従い分析した。天然およびＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの試料を水に対して透析し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析した。
【０３２６】
ｄ．Ｇ−ＣＳＦ（アルファ２，６）−シアリル−ＰＥＧの調製
Ｏ連結ＧａｌＮＡｃのみを含有するＧ−ＣＳＦを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ７．２中２．５ｍｇ／ｍＬで溶解する。溶液を１ｍＭ  ＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧおよび０．１Ｕ／ｍＬのＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩまたはＩＩで３２℃下、２日間インキュベートした。２日後、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．１）を使用し、画分を採集するトソ・ハース（Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ）Ｇ３０００ＳＷ調製カラムを使用して、反応混合物を精製した。反応性生物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＥＦ分析を使用してインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって供給された方法および試薬に従い分析した。天然およびＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの試料を水に対して透析し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析した。
【０３２７】
ＣＨＯ細胞で生成されたＧ−ＣＳＦをアルスロバクター・シアリダーゼ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｉａｌｉｄａｓｅ）で処理し、次いでＳｕｐｅｒｄｅｘ７５でサイズ排除によって精製し、ＳＴ３Ｇａｌ１またはＳＴ３Ｇａｌ２で処理し、次いでＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ  ２０ｋＤａで処理した。結果として生じる分子をイオン交換およびゲルろ過によって精製し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによる分析により、ＰＥＧ化が完了したことが明らかにされた。これはＯ連結グリカンの糖ＰＥＧ化の最初の証明である。
【０３２８】
実施例２
２ポットでの２つの酵素法
次の実施例では２つの連続ステップにおけるＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧの調製が例示され、ここで各々の中間生成物は次にステップで使用される前に精製される。
【０３２９】
ａ．ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２を使用するＧ−ＣＳＦおよびＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃからのＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ（ｐＨ６．２）の調製
パッケージされた緩衝液３．２ｍＬ中Ｇ−ＣＳＦ（９６０ｍｃｇ）を、ＵＦフィルター（ＭＷＣＯ５Ｋ）を使用する限外ろ過によって濃縮し、次いで２５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２、０．００５％ＮａＮ３）１ｍＬで再構成した。ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（６ｍｇ、９．２４ｍＭ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（４０μＬ、０．０４Ｕ）、および１００ｍＭ  ＭｎＣｌ２（４０μＬ、４ｍＭ）を次いで添加し、結果として生じる溶液を室温下にインキュベートした。
【０３３０】
２４時間後、ＭＡＬＤＩは、反応が完了したことを示した。反応混合物を直接、ＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５およびＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）、およびＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ４．９および０．００５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）８０）を含んで成る溶出緩衝液を使用するＨＰＬＣ精製にかけた。Ｇ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃの採集ピークをセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）５ＫＤａＭＷＣＯフィルターを使用して約１５０μＬに濃縮し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ４．９および０．００５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）８０）を思量して容積を１ｍＬに調節した。最終タンパク質濃度１ｍｇ／ｍＬ（Ａ２８０）、収率１００％。試料４℃下に保存した。
【０３３１】
ｂ．精製Ｇ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ＫＤａ）およびマウスＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−１（ｐＨ６．２）を使用するＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧの調製
タンパク質１ｍｇを含有するＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ溶液を２５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２、０．００５％ＮａＮ３）へ緩衝液交換し、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ＫＤａ）（５ｍｇ、０．２５ｕｍｏｌ）を添加した。溶解後、ＭｎＣｌ２（１００μＬ、１００ｍＭ溶液）およびＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ（１００μＬ、マウス酵素）を添加し、反応混合物をゆっくり３２℃下に３日間振動させた。反応混合物を限外ろ過（ＭＷＣＯ５Ｋ）によって濃縮し、緩衝液を２５ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．９）で１回交換し、次いで全容積１ｍＬに濃縮した。次いで生成物をＳＰ−セファロース（Ａ：２５ｍＭ  ＮａＯＡｃ＋０．００５％トウィーン８０  ｐＨ４．５、Ｂ：２５ｍＭ  ＮａＯＡｃ＋０．００５％トウィーン８０  ｐＨ４．５＋２Ｍ  ＮａＣｌ）を保持時間１３−１８分、ＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５、ＰＢＳ−ｐＨ７．２、０．００５％トウィーン８０）を保持時間８．６分（ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５、フロー１ｍＬ／分）で使用して精製した。所望の画分を採集し、０．５ｍＬに濃縮し、４℃下に保存した。
【０３３２】
実施例３
酵素の同時添加によるＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧを製造する１ポット法
次の実施例では、酵素の同時添加を使用する１ポットでのＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧの調製が例示される
【０３３３】
ａ．マウスＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ（ｐＨ６．０）を使用する１ポット法。
Ｇ−ＣＳＦ（生成物精製緩衝液３．２ｍＬ中に溶解したタンパク質９６０μｇ）を  限外ろ過（ＭＷＣＯ５Ｋ）によって０．５ｍＬに濃縮し、２５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０、０．００５％ＮａＮ３）で全容積を約１ｍＬまたはタンパク質濃度を１ｍｇ／ｍＬに再構成した。ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（６ｍｇ、９．２１μｍｏｌ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（８０μＬ、８０ｍＵ）、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ＫＤａ）（６ｍｇ、０．３μｍｏｌ）およびマウス酵素ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ（１２０μＬ）および１００ｍＭ  ＭｎＣｌ２（５０μＬ）を次いで添加した。溶液を３２℃下に４８時間振動させ、ＳＰセファロースで標準クロマトグラフィー条件を使用して精製した。合計０．５ｍｇのタンパク質（Ａ２８０）が得られ、または全体的収率が約５０％であった。生成物構造をＭＡＬＤＩおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析によって確認した。
【０３３４】
ｂ．ニワトリＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ（ｐＨ６．０）を使用する１ポット法。
Ｇ−ＣＳＦ１４．４ｍｇを３ｍＬ最終容積に濃縮し、２５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０、０．００５％ＮａＮ３、０．００４％トウィーン８０）で緩衝液交換し、容積を１３ｍＬに調節した。ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（９０ｍｇ、１５０μｍｏｌｅ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（０．５９Ｕ）、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０ＫＤａ（９０ｍｇ）、ニワトリＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ（０．４４Ｕ）、および１００ｍＭ  ＭｎＣｌ２（６００ｍｃＬ）を次いで添加した。結果として生じる混合物を室温下に６０時間保存した。次いで、反応混合物をＵＦ（ＭＷＣＯ５Ｋ）および遠心分離を使用して濃縮した。残留物（約２ｍＬ）を２５ｍＭ  ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４．５）中に溶解し、再び最終容積５ｍＬに濃縮した。この試料を、ＳＰセファロースを約１０−２３分間、ＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５、１７分、流量０．５ｍＬ／分）、および追加のＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、２３分、流量０．５ｍＬ／分）を使用して精製し、３．６ｍｇ（全体的収率２５％）のＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０ＫＤａを得た（Ａ２８０およびＢＣＡ法）。
【０３３５】
実施例４
酵素の連続的添加によるＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧを製造する１ポット法
次の実施例では酵素の連続的添加による１ポットでＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧを製造する方法が例示される。
【０３３６】
ａ．ＧａｌＮＡｃ−Ｇ−ＣＳＦからの開始
１．ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２を使用するＧ−ＣＳＦおよびＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃからのＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ（ｐＨ６．２）調製
パッケージされた緩衝液３．２ｍＬ中Ｇ−ＣＳＦ（９６０ｍｃｇ）を、ＵＦフィルター（ＭＷＣＯ５Ｋ）を使用する限外ろ過によって濃縮し、次いで２５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２、０．００５％ＮａＮ３）１ｍＬで再構成した。ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（６ｍｇ、９．２４ｍＭ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（４０μＬ、０．０４Ｕ）、および１００ｍＭ  ＭｎＣｌ２（４０μＬ、４ｍＭ）を次いで添加し、結果として生じる溶液を室温下にインキュベートした。
【０３３７】
２．Ｇ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃからのＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧの調製、ＵＤＰ−ガラクトース、ＳＡ−ＰＥＧ−２０ｋＤａ、および適切な酵素
ＵＤＰ−ガラクトース（４ｍｇ、６．５μｍｏｌｅｓ）、コア−１−Ｇａｌ−Ｔ（３２０μＬ、１６０ｍＵ）、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０ｋＤａ（８ｍｇ、０．４μｍｏｌｅ）、ＳＴ３Ｇａｌ２（８０μＬ、０．０７ｍＵ）および１００ｍＭ  ＭｎＣｌ２（８０μＬ）を直接、上記ａ．のステップからの２５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）１．５ｍＬ中Ｇ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ（１．５ｍｇ）の粗反応混合物に添加した。結果として生じる混合物を３２℃下に６０時時間インキュベートした。反応混合物を遠心分離し、限外ろ過（ＭＷＣＯ５Ｋ）を使用して溶液を０．２ｍＬに濃縮し、次いで２５ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）で再溶解して最終容積を１ｍＬにした。ＳＰセファロース（保持時間１０〜１５分）を使用して生成物を精製し、スピンフィルター（ＭＷＣＯ５Ｋ）を使用してピーク画分を濃縮し、残留物をさらにＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５、保持時間１０．２分）を使用して精製した。スピンフィルター（ＭＷＣＯ５Ｋ）を使用する濃縮後、タンパク質をＰＢＳ、２．５％マニトール、０．００５％ポリソルベート、ｐＨ６．５による製剤緩衝液を使用して１ｍＬに希釈し、ｍＬ当り８５０μｇタンパク質のタンパク質濃度で形成した（Ａ２８０）。全体的収率は５５％であった。
【０３３８】
実施例５
酵素の同時添加によるＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧを製造する１ポット法
ａ．Ｇ−ＣＳＦからの開始
Ｇ−ＣＳＦ（９６０ｍｃｇ、３．２ｍＬ）を限外ろ過（ＭＷＣＯ５Ｋ）で濃色し、２５ｍＭ  Ｍｅｓ緩衝液（ｐＨ６．０、０．００５％ＮａＮ３）で再構成した。Ｇ−ＣＳＦ溶液の全容積は約１ｍｇ／ｍＬであった。ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（６ｍｇ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（８０μＬ、〜８０μＵ）、ＵＤＰ−Ｇａｌ（６ｍｇ）、コアｌＧａｌＴ（１６０μＬ、８０μＵ）、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０Ｋ）（６ｍｇ）およびシアリルトランスフェラーゼ、例えば、ＳＴ３Ｇａｌｌ（１６０μＬ、１２０μＵ）、１００ｍＭ  ＭｎＣｌ２（４０μＬ）を添加した。結果として生じる混合物を３２℃下に４８時間インキュベートした。ＩＥＸおよびＳＥＣを使用して下記の通り精製を行った。生成物を含有する結果として生じる画分を、限外ろ過（ＭＷＣＯ５Ｋ）を使用して濃縮し、容積を緩衝液で約１ｍＬに調節した。タンパク質濃度はＡ２８０によって０．３９２ｍｇ／ｍＬであることが判定され、Ｇ−ＣＳＦからの全体的な収率４０％を示した。
【０３３９】
実施例６
システイン−ＰＥＧ２（２）の調製
【化７２】
2009501127.tif 000073
ａ．化合物１の合成
水酸化カリウム（８４．２ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、粉末として）をアルゴン下の無水メタノール（２０Ｌ）中Ｌ−システイン（９３．７ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。混合物を室温下に３０分間撹拌し、次いで分子量２０キロダルトンのｍＰＥＧ−Ｏ−トシレート（Ｔｓ、１．０ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を２時間にわたっていくつかの部分で添加した。混合物を室温下に５日間撹拌し、ロータリーエバポレーションによって濃縮した。残留物を水（３０ｍＬ）で希釈し、室温下に２時間撹拌し、過剰な２０キロダルトンのｍＰＥＧ−Ｏ−トシレートを破壊した。次いで溶液を酢酸で中和し、ｐＨをｐＨ５．０に調節し、逆相クロマトグラフィー（Ｃ−１８シリカ）カラム上に装填した。カラムをメタノール／水のグラジエントで溶出し（生成物は約７０％のメタノールを溶出）、生成物溶出を蒸発光散乱によってモニタリングし、適切な画分を採集し、水（５００ｍＬ）で希釈した。この溶液をクラマトグラフし（イオン交換、ＸＫ５０Ｑ、ＢＩＧビーズ、３００ｍｌ、水酸化物形態、水の水／酢酸に対するグラジエント−０．７５Ｎ）、適切な画分のｐＨを酢酸で６．０に低下させた。次いで、この溶液を逆相カラム（Ｃ−１８シリカ）で捕捉し、上記のメタノール／水のグラジエントで溶出した。生成物画分をプールし、濃縮し、水中に再溶解し、凍結乾燥して４５３ｍｇ（４４％）の白色固体（１）を得た。化合物の構造的データは次の通りであった。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ２．８３（ｔ、２Ｈ、Ｏ−Ｃ−ＣＨ２−Ｓ）、３．０５（ｑ、１Ｈ、Ｓ−ＣＨＨ−ＣＨＮ）、３．１８（ｑ、１Ｈ、（ｑ、１Ｈ、Ｓ−ＣＨＨ−ＣＨＮ）、３．３８（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３Ｏ）、３．７（ｔ、ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、３．９５（ｑ、１Ｈ、ＣＨＮ）。生成物の純度はＳＤＳ  ＰＡＧＥによって確認された。
【０３４０】
ｂ．化合物２（システイン−ＰＥＧ２）の合成
トリエチルアミン（約０．５ｍＬ）を溶液が塩基性になるまで無水ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）中に溶解した化合物１（４４０ｍｇ、２２μｍｏｌ）の溶液に滴下した。ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中２０キロダルトンのｍＰＥＧ−Ｏ−ｐ−ニトロフェニル炭酸塩（６６０ｍｇ、３３μｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３．６ｍｇ、３０．８μｍｏｌ）の溶液を室温下に１時間にわたっていくつかの部分で添加した。反応混合物を室温下に２４時間拡販した。次いで溶媒をロータリーエバポレーションによって除去し、残留物を水（１００ｍＬ）中に溶解し、ｐＨを１．０Ｎ  ＮａＯＨで９．５に調節した。塩基性溶液を室温下に２時間撹拌し、次いで酢酸でｐＨ７．０に中和した。次いで、溶液を逆相クロマトグラフィー（Ｃ−１８シリカ）上に装填した。カラムをメタノール／水のグラジエントで溶出し（生成物は７０％メタノールで溶出する）、生成物溶出を蒸発光散乱によってモニタリングし、適切な画分を採集し、水（５００ｍＬ）で希釈した。この溶液をクラマトグラフし（イオン交換、ＸＫ５０Ｑ、ＢＩＧビーズ、３００ｍｌ、水酸化物形態、水の水／酢酸に対するグラジエント−０．７５Ｎ）、適切な画分のｐＨを酢酸で６．０に低下させた。次いで、この溶液を逆相カラム（Ｃ−１８シリカ）で捕捉し、上記のメタノール／水のグラジエントで溶出した。生成物画分をプールし、濃縮し、水中に再溶解し、凍結乾燥して５７５ｍｇ（７０％）の白色固体（２）を得た。化合物の構造的データは次の通りであった。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ２．８３（ｔ、２Ｈ、Ｏ−Ｃ−ＣＨ２−Ｓ）、２．９５（ｔ、２Ｈ、Ｏ−Ｃ−ＣＨ２−Ｓ）、３．１２（ｑ、１Ｈ、Ｓ−ＣＨＨ−ＣＨＮ）、３．３９（ｓ、３Ｈ  ＣＨ３Ｏ）、３．７１（ｔ、ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）生成物の純度はＳＤＳ  ＰＡＧＥによって確認された。
【０３４１】
本明細書に記載の実施例および実施形態は例示目的に限定され、それに照らしてさまざまな修正または変更が当業者には示唆されており、かつ本出願の精神および範囲内ならびに添付の請求項の範囲内に含まれることが理解される。本明細書に引用されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書で援用される。
【図面の簡単な説明】
【０３４２】
【図１】本発明の実施において有用な代表的な修飾シアル酸ヌクレオチドを示す図である。Ａ．代表的な分岐（例えば、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ）ＣＭＰシアル酸ＰＥＧ糖ヌクレオチドの構造。Ｂ．線状ＣＭＰシアル酸ＰＥＧ（例えば、１０ｋＤａ）の構造。
【図２】ＰＥＧで誘導体化されたサッカリール部分を添加する前にＧ−ＣＳＦペプチド上の炭水化物残基がＧａｌＮＡｃ部分をＴｈｒ１３３（メチオニンが存在する場合にはＴｈｒ１３４）におけるグリコシル残基に酵素的に添加することによって再構築される本発明の代表的な実施形態を示すスキームである。
【図３】非ＰＥＧ化−ＣＳＦ（Ａ）、化学的ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ（Ｂ）、および酵素的糖ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ）のインビボ滞留寿命の比較を示す図である。
【図４】図３に示されている種の活性の比較を示す図である。
【図５】本発明のコンジュゲートの調製において使用される代表的なＰＥＧグリコシル連結基前駆体（修飾糖）を製造するための合成スキームを示す図である。
【図６】代表的なＧ−ＣＳＦアミノ酸配列を示す図である。配列番号１は１７５アミノ酸変異形であり、ここで第１のアミノ酸はメチオニンであり、Ｔｈｒ１３４にはトレオニン残基がある。配列番号２は、主要なメチオニンが欠けていることを除き１７５アミノ酸変異形と同じ配列を有する１７４アミノ酸変異形であり、したがって、配列はＴで始まり、位置１３３にはトレオニン残基がある。
【図７】例えば、修飾シアル酸によりペプチドを糖ＰＥＧ化する、本発明の糖コンジュゲートの形成において使用される代表的なシアリルトランスフェラーゼを示す表である。
【図１Ａ】
2009501127.tif 000092
【図１Ｂ】
2009501127.tif 000093
【図２】
2009501127.tif 000094
【図３】
2009501127.tif 000095
【図４】
2009501127.tif 000096
【図５】
2009501127.tif 000097
【図６】
2009501127.tif 000098
【図７Ａ】
2009501127.tif 000099
【図７Ｂ】
2009501127.tif 000100
【図７Ｃ】
2009501127.tif 000101
【図７Ｄ】
2009501127.tif 000102
【図７Ｅ】
2009501127.tif 000103
【図７Ｆ】
2009501127.tif 000104
【図７Ｇ】
2009501127.tif 000105
【図７Ｈ】
2009501127.tif 000106
【図７Ｉ】
2009501127.tif 000107
【図７Ｊ】
2009501127.tif 000108
【図７Ｋ】
2009501127.tif 000109
【図７Ｌ】
2009501127.tif 000110
【図７Ｍ】
2009501127.tif 000111
【図７Ｎ】
2009501127.tif 000112
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月22日(2008.10.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009501127000001.app
【国際調査報告】
2009501127.tif 000113