(57)【要約】ウイルス感染を診断するための組成物および方法、ならびにそのような感染を抑制する方法を記載する。この方法は、HIV-IまたはHCVに特異的である細胞傷害性T細胞クローン由来のT細胞受容体遺伝子配列の同定に基づく。HLAクラスIに拘束性のHIVおよびHCV病原体に結合する可溶性T細胞受容体組成物が、同定され、構築された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
HLAクラスI拘束性の可溶性T細胞受容体（TCR）ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む組成物であって、当該ポリペプチドがHIVエピトープまたはHCVエピトープに特異的に結合する、組成物。
【請求項２】
核酸がSEQ ID NO:4を含む単離されたTCRポリペプチドをコードする、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
核酸がSEQ ID NO:6を含む単離されたTCRポリペプチドをコードする、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
核酸がSEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:6を含む単離されたTCRポリペプチドをコードする、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
核酸がSEQ ID NO:27を含む単離されたTCRポリペプチドをコードする、請求項1記載の組成物。
【請求項６】
核酸がSEQ ID NO:29を含む単離されたTCRポリペプチドをコードする、請求項1記載の組成物。
【請求項７】
核酸がSEQ ID NO:27およびSEQ ID NO:29を含む単離されたTCRポリペプチドをコードする、請求項1記載の組成物。
【請求項８】
HIVエピトープまたはHCVエピトープに特異的に結合する、単離されたTCRポリペプチドを含む組成物。
【請求項９】
単離されたTCRポリペプチドがSEQ ID NO:4を含む、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
単離されたTCRポリペプチドがSEQ ID NO:6を含む、請求項8記載の組成物。
【請求項１１】
単離されたTCRポリペプチドがSEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:6を含む、請求項8記載の組成物。
【請求項１２】
単離されたTCRポリペプチドがSEQ ID NO:27を含む、請求項8記載の組成物。
【請求項１３】
単離されたTCRポリペプチドがSEQ ID NO:29を含む、請求項8記載の組成物。
【請求項１４】
単離されたTCRポリペプチドがSEQ ID NO:27およびSEQ ID NO:29を含む、請求項8記載の組成物。
【請求項１５】
TCRポリペプチドがHIV-1エピトープに結合する、請求項1または8記載の組成物。
【請求項１６】
TCRポリペプチドがHCVエピトープに結合する、請求項1または8記載の組成物。
【請求項１７】
アルファ鎖T細胞受容体配列およびベータ鎖受容体配列を含む、請求項1記載の核酸。
【請求項１８】
TCRポリペプチドが検出可能なマーカーをさらに含む、請求項8記載の組成物。
【請求項１９】
検出可能なマーカーが蛍光色素である、請求項18記載のTCRポリペプチド。
【請求項２０】
細胞傷害性組成物をさらに含む、請求項8記載のTCRポリペプチド。
【請求項２１】
サイトカインをさらに含む、請求項8記載のTCRポリペプチド。
【請求項２２】
固体担体上に固定化された、請求項8記載のHLAクラスI拘束性の可溶性一本鎖T細胞受容体ポリペプチドを複数含む組成物であって、該複数のポリペプチドそれぞれが異なるウイルスエピトープに結合する、組成物。
【請求項２３】
TCRポリペプチドがアルファ鎖配列およびベータ鎖配列を含み、アルファ鎖配列およびベータ鎖配列のそれぞれが少なくとも8残基の長さである、請求項8記載の組成物。
【請求項２４】
アルファ鎖配列およびベータ鎖配列のそれぞれが8残基から20残基までの間の長さである、請求項8記載の組成物。
【請求項２５】
ポリペプチドが表1記載のα鎖配列およびβ鎖配列の組み合わせを含む、請求項8記載の組成物。
【請求項２６】
ポリペプチドが表1に挙げられたアルファ鎖配列から選択されるアルファ鎖配列を含む、請求項8記載の組成物。
【請求項２７】
ポリペプチドが表1に挙げられたベータ鎖配列から選択されるベータ鎖配列を含む、請求項8記載の組成物。
【請求項２８】
核酸が表2に挙げられたアルファ鎖コード配列から選択されるアルファ鎖コード配列を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項２９】
核酸が表2に挙げられたベータ鎖コード配列から選択されるベータ鎖コード配列を含む、請求項2記載の組成物。
【請求項３０】
ウイルスに特異的な単離された可溶性T細胞受容体構築物を試験対象由来の体液または組織の試料と接触させる段階、およびT細胞受容体構築物への結合を検出する段階を含み、該結合がウイルス感染を示す、ウイルス感染診断方法。
【請求項３１】
単離されたウイルスに特異的な一本鎖可溶性T細胞受容体を対象に投与する段階を含み、該受容体が細胞傷害性作用物質を含む、ウイルス感染抑制方法。
【請求項３２】
受容体がHIVエピトープまたはHCVエピトープに特異的に結合する、請求項31記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
HIV-1などのヒト免役不全ウイルス（HIV）による感染およびC型肝炎ウイルス（HCV）による感染などのウイルス感染は、重大な公衆衛生問題である。いくつかの薬、例えば、逆転写酵素（RT）阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤（PI）を含む抗レトロウイルス薬が、そのようなウイルス感染に感染した個々人を処置するために、現在使用されている。これらの薬剤はHIV感染を処置するのに有効ではあるが、ウイルスの薬物耐性株および累積的な薬物毒性の発生が懸念される。
【発明の開示】
【０００２】
発明の概要
本発明は、ウイルス感染の診断および処置のための方法および組成物を特徴とする。本方法は、HIV-1またはHCVに特異的である細胞傷害性T細胞クローン由来のT細胞受容体遺伝子配列の同定に基づく。したがって、本発明は、HIV-1またはHCVにおける細胞傷害性T細胞エピトープに特異的に結合する可溶性T細胞受容体のポリペプチドまたはタンパク質をコードする、単離されたT細胞受容体遺伝子およびその遺伝子によりコードされるポリペプチドを含む。
【０００３】
エピトープは、細胞の表面上のHLA分子などのクラスI主要組織適合性複合体（MHC）抗原と結合する短い8〜11-merペプチドを含む、またはそのようなペプチドからなる。エピトープは、天然に存在するHIVタンパク質またはHCVタンパク質に対応するまたは由来するポリペプチド配列を含有する。
【０００４】
T細胞受容体遺伝子は、T細胞受容体のアルファ鎖とT細胞受容体のベータ鎖の両方をコードする。TCRアルファ鎖およびTCRベータ鎖は両方とも、定常領域（C領域）、可変領域（V領域）および相補性決定領域3（CDR3）を含む、またはそのような領域からなる。CDR3領域は、抗原ペプチド/MHCクラスI複合体との相互作用を媒介し、体細胞組換えにより生じる1〜90ヌクレオチドの無作為な配列からなる。これらの遺伝子配列は、インビトロでの診断用途およびインビボでの治療用途のために用いられる、HIV-1 またはHCV特異的組換え可溶性TCR受容体分子を構築するために用いられる。例えば、これら可溶性TCRは、インビトロアッセイにおいて患者由来の組織または液体試料中のHIV-1またはHCV細胞傷害性T細胞エピトープ提示を検出するための染色試薬として用いられ得る。任意で、可溶性T細胞受容体ポリペプチドは、蛍光分子などの検出可能なマーカーと結合し得る。検出可能なマーカーは、受容体ポリペプチドに連結または結合され、診断方法を容易にする。さらに、複数のHLAクラスI拘束性の可溶性一本鎖T細胞受容体ポリペプチドは、チップまたはプレートなどの固体担体上に固定化される。例えば、TCRは、処理されたウイルスエピトープの同定および検出のために、マイクロアレイ形式で構成される。治療目的に応じて、細胞傷害性分子またはサイトカインがTCRに連結または結合される。
【０００５】
好ましい可溶性TCR構築物は、TCRα、β鎖の組み合わせに対応する以下の配列を含む：Vb配列 CASSQGVTLLN (SEQ ID NO:4)およびVa5配列CAETY (SEQ ID NO:6)。この可溶性TCRは、HLAクラスI分子A2と関連して、SEQ ID NO:5 (HIV-1 vpr)のエピトープ特異性を有する。TCRの配列の誘導体もまた、本発明の範囲内である。TCR誘導体は、以下表1に示すHLAクラスI拘束性のエピトープへの高い結合親和性により特徴付けられる。例えば、参照配列SEQ ID NO:4および6に関連する可溶性TCR構築物誘導体は、1、2、3、4またはそれ以上の保存的なまたは非保存的なアミノ酸置換を含んでもよく、本来の参照配列を含有する構築物と比較してエピトープに対する結合親和性の増加により特徴付けられる。HCVに対するエピトープ結合特異性を伴う好ましい可溶性TCR構築物は、以下のTCRα、β鎖の組み合わせに対応する配列を含む：Va配列 CAVNEYGQNFV (SEQ ID NO:27)およびVb配列 CAWSGGLNTEAF (SEQ ID NO:29)。この可溶性TCR構築物は、HLAクラスI分子A2との関連においても提示されるHCVペプチドであるSEQ ID NO:28のエピトープ結合特異性を有する。これらのTCR配列および他のTCR配列、ならびにその結合特異性およびHLA拘束を表1に示す。
【０００６】
「実質的に純粋」とは、天然に付随する成分から分離されている核酸、ポリペプチド、または他の分子を意味する。典型的には、天然に付随する、タンパク質および天然の有機分子が存在せず、重量で少なくとも60%、70%、80%、90%、95%または99%と同等の場合、ポリペプチドは実質的に純粋である。例えば、実質的に純粋なポリペプチドは、天然源からの抽出により、そのタンパク質を通常発現しない細胞における組換え核酸の発現により、または化学合成により得られ得る。タンパク質の単離された断片は、全配列より短い参照タンパク質の配列の一部分を有するペプチドを意味し、天然に存在する隣接領域を含有しない。単離されたペプチドは、天然に存在する分子中で参照断片に直接隣接する、1つまたは複数のアミノ酸を欠く。
【０００７】
特定のポリペプチドまたは核酸分子が、定義された長さの参照ポリペプチドまたは参照核酸分子に対してある決まったパーセントの同一性を有すると言う場合、その同一性のパーセントは参照ポリペプチドまたは参照核酸分子を基準とする。したがって、100アミノ酸長である参照ポリペプチドに対し50%同一性であるペプチドは、参照ポリペプチドの50アミノ酸長の部分に対して完全に同一である50アミノ酸ポリペプチドとなり得る。参照ポリペプチドの全長に対して50%同一性である100アミノ酸長ポリペプチドであってもよい。同じ規則が核酸分子に適用される。
【０００８】
ポリペプチドの場合、参照ポリペプチド配列の長さは概して、少なくとも5アミノ酸の長さであるとする。例えば、ペプチドは、長さが5、6、7、8、9、10、11、12アミノ酸である。いくつかの場合、ペプチドはより長く、例えば、15、20、25アミノ酸またはそれ以上の長さである。例えば、ある決まった配列のペプチド、例えば、エピトープ配列に、天然に存在するタンパク質中でその配列に隣接するアミノ酸とは異なる他のアミノ酸が隣接する。核酸の場合、参照核酸配列の長さは概して、少なくとも15、20または25ヌクレオチドの長さであるとする。しかしながら、より大きな構築物、例えば、少なくとも50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも60ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも75ヌクレオチド、および最も好ましくは100ヌクレオチドまたは300ヌクレオチドである構築物である。
【０００９】
本発明はまた、TCR配列またはエピトープ配列に対応するペプチド誘導体を包含する。参照配列に対して100%より低い同一性であるポリペプチド配列の場合、同一でない位置は、好ましくは、しかし必ずしもそうではないが、参照配列に対する保存的置換である。保存的置換は典型的には、以下のグループ内での置換を含む：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびトレオニン；リジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。参照配列に対するアミノ酸置換がなされたペプチドにおいて、そのHLA拘束性のエピトープに対するT細胞受容体の結合親和性は、増加する。あるいは、誘導体配列を含有する構築物は、際立った安定性、例えば、培養培地などの生理学的に許容できる溶液、または血液、血漿もしくは血清などの体液中での半減期の延長を有する。例えば、そのようなペプチド誘導体の結合親和性および/または安定性は、参照ペプチド配列と比べて、少なくとも5%、10%、25%、50%、75%、90%、100%、2倍、5倍、10倍、20倍、またはそれ以上である。任意で、ペプチド誘導体配列は、配列のアミノ末端および/またはカルボキシ末端に、参照配列に隣接する付加的アミノ酸を含む。上記のように、非天然の隣接配列を含有するそのような構築物は、エピトープ結合親和性の増加および/または安定性の増加を有するとして特徴付けられる。そのようなペプチド誘導体配列をコードする核酸配列は、本発明に包含される。
【００１０】
単離された核酸または精製された核酸分子は、生物の天然のゲノム中で直接連続する5'コード配列および3'コード配列または非コード配列から分離される分子である。単離された核酸分子は、天然に存在しない核酸分子、例えば組換えDNA技術により作製された核酸分子を含む。本明細書において同定される核酸は、参照配列に対して、少なくとも85%、90%、95%、98%、99%同一であり、かつ参照核酸配列の変異体を生ずる配列を含む。
【００１１】
本発明の他の特徴および利点は、以下のその好ましい態様の記載、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。本明細書において引用される参考文献の全体の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００１２】
発明の詳細な説明
定義されたMHCクラスI拘束性の細胞障害性T細胞エピトープを認識するHIV-1またはHCV特異的細胞を、限界希釈クローニングにより単離した。クローン細胞を、各エピトープペプチドを用いてリフォールディングされたMHCクラスI四量体で染色し、四量体結合細胞をFACS ARIA装置を用いて選別した。選別された細胞のmRNAを抽出し、逆転写し、TCR遺伝子のcDNAをネステッドPCRにより増幅した。PCR産物を、大腸菌（E. coli）を形質転換するために用いられるクローニングベクターの中に連結した。細菌の増幅の後、ベクター挿入物を精製し、標準的手法に従って配列決定した。以下のTCRの配列が、同定された。
【００１３】
（表１）TCR配列
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【００１４】
（表２）TCRをコードするヌクレオチド配列
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【００１５】
病原体に特異的な可溶性TCR構築物
HIV-1感染細胞の表面上のMHCクラスI分子に結合するHIV-1細胞障害性T細胞エピトープを特異的に認識する分子化合物は、インビボ免疫療法アプローチにとって感染細胞を直接標的化するための強力な手段である。さらに、これらの化合物は、自然感染中にリンパ球またはプロフェッショナル抗原提示細胞（professional antigen presenting cells）上に提示されるHIV-1抗原のエクスビボでの診断評価のために用いられる。同族のMHC複合体に特異的に結合する可溶性の一本鎖α/β T細胞受容体構築物は、HIV-1感染細胞をエクスビボまたはインビボで直接標的化するための最も有望な分子を意味する。ある決まった病原体を認識する可溶性TCRのアミノ酸配列は、天然に存在するTCRの配列に基づく。本開示前は、非常に限定された情報のみが、HIV-1エピトープまたはHCVエピトープに特異的な天然に存在するTCRのTCR配列について入手可能であった。本明細書において記載されるデータは、診断用および治療用の可溶性TCR構築物に用いられるHIV-1またはHCVに特異的なTCR遺伝子の配列を明らかにする。
【００１６】
現在、HIV-1に特異的な組換え抗体が、HIV-1感染細胞の直接標的化に利用可能である。抗体アプローチの欠点の一つは、HIV-1ウイルスのエンベロープしかHIV-1抗体は到達できず、機能的に最も重要なHIVタンパク質はエンベロープの中に隠され、細胞内プロセシングおよびMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子による提示の後にしか免疫系は到達できない点である。一度MHC分子により提示されると、これらのHIV遺伝子産物はTCRにより認識されるが、抗体では認識されない。したがって、HIV-1抗体は、HIV-1感染細胞の非常に限定された標的化を可能とするだけである。本明細書において記載される組成物は、本課題への解決を提供する。
【００１７】
HIV1またはHCVに特異的である可溶性TCRは、既存のアプローチに対して有意な利点を有する
天然に存在するHIV-1に特異的なCD8+T細胞クローンのTCRアルファ鎖およびベータ鎖の完全な配列は、同定されている。これらHIV-1またはHCVに特異的なCD8+T細胞のTCR配列は、今日までに同定されている。
【００１８】
TCR配列は、HIV-1感染細胞を特異的に認識することができる組換え一本鎖TCRの産生に有用である。これら組換えTCRは実際に、 (i)免疫療法におけるHIV-1感染細胞のインビボ標的化、（ii）リンパ球またはプロフェッショナル抗原提示細胞上のHIV-1抗原発現のエクスビボ評価、に用いられる。HIV-1抗原発現の定量的解析は、HIV-1免疫病原性の研究において重要であり、免疫療法の処置アプローチのエクスビボモニタリングに有用である。
【００１９】
現在、HIV-1感染患者の処置は、抗レトロウイルス薬の使用に基づいている。これらの薬は、非常に有効だが、蓄積毒性を有し、高い服用負担（pill burden）を伴い、耐性ウイルスをもたらし得る。したがって、これらの患者に対して他の処置選択肢が継続的に必要である。可溶性TCRを用いた免疫療法の処置アプローチは、HIV-1またはHCV感染患者集団に対する代替の処置選択肢の一つを示す。加えて、TCRはHIV-1抗原発現のエクスビボ評価に用いられる。
【００２０】
診断の方法
可溶性TCRは、プロフェッショナル抗原提示細胞上の細胞傷害性T細胞エピトープ提示のHLAクラスI媒介性の提示を解析するために用いられる。例えば、体液、例えば血液、または体組織、例えばリンパ節の試料を対象から入手する。試料由来の白血球を本明細書に記載されている一本鎖TCRに接触させる。感受性を増すために、4つの一本鎖TCR構築物を相互に連結させ、例えば、中心のストレプトアビジンを用いて、四量体の複合体を形成する。構築物を検出可能なマーカーに連結する、例えば、蛍光フルオロフォアで標識する。検出可能なマーカーは、フィコエリトリン（PE）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）およびアロフィコシアニン（APC）などの蛍光色素を含む。検出は、フローサイトメトリーおよび/または組織染色（免疫組織化学検査）により行われる。別の例では、複数のTCR構築物をマイクロアレイ、例えばチップまたはプレート中に固定化し、患者由来のサンプルをアレイに接触させ、アレイを洗浄し、結合細胞を検出する。このようにして、患者の抗原提示細胞上に発現または提示されているペプチドが決定される。よって、可溶性TCRは、HIV-1またはHCV CTLエピトープ提示のエクスビボ評価および定量化のための研究手段としても有用である。それらは、ある決まったHIV-1またはHCV CTLエピトープを発現する患者を同定するための有用な手段であり、したがって本明細書において記載される免疫療法処置のための有望な候補となる。
【００２１】
治療の方法
HCVまたはHIVで感染された患者を処置するために、一つの可溶性一本鎖TCR構築物またはその混合物を投与する。TCRは、例えばインターロイキン2、インターフェロン-ガンマ、インターフェロン-アルファなどのサイトカイン、もしくはパーフォリン、グランザイムなどの細胞傷害性試薬といった第二の組成物、またはある決まった薬剤に結合する。HCVの処置の場合、HCVに特異的な可溶性一本鎖TCRをインターフェロン-アルファなどのインターフェロンに結合または連結してもよい。そのような構築物の一つの利点は、半減期の増加、およびこれらの試薬の、感染細胞に対する直接の抗原特異的送達である。この治療戦略は、全体的な投薬量、投与頻度、および処置に関連する副作用を低減する。
【００２２】
TCR構築物は、標的集団の遺伝的特徴（例えば、特定のHLA型の保有率）に基づいて選択される。例えば、ある決まった集団において最も高い頻度で生じるHLAクラスI分子により拘束される細胞傷害性T細胞エピトープのレパートリーを認識する可溶性TCRのプールが用いられる。あるいは、一人の特定の患者のHLA型を決定し、患者のHLA型に基づいて投与のための1つまたは複数のHLA特異的TCRを選択する。
【００２３】
静脈内、皮下、筋肉内および腹腔内送達経路などの非経口投与が、可溶性TCR構築物を送達するために用いられ得る。例えば、可溶性TCRは、1匹につき32μgの投与量でマウス内へ静脈注射されている。患者投与量の決定は、当技術分野において周知の方法を用いて行われる。
【００２４】
組成物は、ウイルス病原体を抑制するために投与される。特定の状況に対する適切な投薬量および投与計画の決定は、当業者の能力の範囲内である。治療化合物の有効量は、好ましくは約0.1 mg/kg〜約150 mg/kgである。有効投与量は、当業者により認識されているように、投与の経路、賦形剤の使用、および他の薬剤または治療剤の使用を含む他の治療処置との併用に応じて、変化する。治療計画は、標準的な方法を用いて、哺乳動物、例えば、ウイルス病原体による感染を患っている（または発症する危険性がある）ヒト患者を同定することにより行われる。薬学的化合物は、当技術分野において公知の方法を用いて、そのような個体に投与される。好ましくは、化合物は、経口的に、直腸的に、経鼻的に、局所的に、または非経口的に、例えば、皮下に、腹腔内に、くも膜下腔内に、筋肉内に、および静脈内に投与される。
【００２５】
他の態様
本発明は、その詳細な記載と共に記載されているが、その一方で前述の記載は、添付の特許請求の範囲によって定義される発明の範囲の例証を目的とし、その範囲の限定を目的とするものではない。他の局面、利点、および変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【手続補正書】
【提出日】平成20年12月9日(2008.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009536922000001.app
【国際調査報告】
2009536922.tif 000017
2009536922.tif 000018