(57)【要約】  本発明は、アポトーシス特異的ｅＩＦ−５ＡまたはｅＩＦ５−Ａ１と称されるアポトーシス特異的真核生物開始因子５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ）、核酸およびポリペプチド、ならびに敗血症および／または出血性ショックを治療・予防するための、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡを哺乳類へ投与することによって哺乳類における炎症性サイトカインを下方制御する方法に関する。
2009530417.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における体内の炎症性サイトカインの発現を低下させる方法であって、ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡを前記対象に投与するステップを含み、それにより前記ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡが前記対象における炎症性サイトカインの発現を低下させる、方法。
【請求項２】
前記対象はヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記炎症性サイトカインは、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１２（ｐ７０）、Ｇ−ＣＳＦ、ＫＣ、ＭＩＰ−１ａ、およびＲＡＮＴＥＳから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記炎症性サイトカインはＴＮＦ−αである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記炎症性サイトカインはＩ１−６である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記炎症性サイトカインはＫＣである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記炎症性サイトカインはＭＩＰ−１αである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記炎症性サイトカインの発現の低下は、敗血症の治療をさらに提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡは、ＣＧＧ  ＡＡＵ  ＧＡＣ  ＵＵＣ  ＣＡＧ  ＣＵＧ  Ａの配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ｅＩＦ５Ａ  ｓｉＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む、炎症性サイトカインの発現を低下させるための医薬組成物。
【請求項１１】
前記ｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＣＧＧ  ＡＡＵ  ＧＡＣ  ＵＵＣ  ＣＡＧ  ＣＵＧ  Ａを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１２】
対象における出血性ショックを予防する方法であって、前記対象においてＩＬ−１βおよび／またはＴＮＦ−αの発現を低下させるために、ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡまたはｅＩＦＡ１アンチセンスポリヌクレオチドを投与するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００６年５月８日出願の米国仮出願第６０／７９８３３号および２００６年３月２０日出願の米国仮出願第６０／７８３，４１３号に対する優先を主張し、両出願とも参照することにより本願に組み込まれる。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、「アポトーシス特異的ｅＩＦ−５Ａ」または「ｅＩＦ−５Ａ１」と称されるアポトーシス特異的真核生物開始因子（「ｅＩＦ−５Ａ」）および炎症性サイトカインの発現を下方制御するためのｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
アポトーシスは、細胞収縮、クロマチン凝縮、核フラグメンテーション、および膜ブレブ形成などの明確な形態学的状態を特徴とする、遺伝子にプログラムされている細胞的事象である。Ｋｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７２）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２６，２３９−２５７；Ｗｙｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，６８，２５１−３０６．それは、正常な組織発達および恒常性において重要な役割を果たし、アポトーシスのプログラムにおける欠陥は、神経変性および自己免疫疾患から腫瘍まで幅広いヒトの疾患の一因となると考えられる。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６７，１４５６−１４６２；Ｍｕｌｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ，４８８，２１１−２３１．アポトーシスを起こした細胞の形態学的特徴はかなり特徴的であるが、この過程を制御する分子経路は明らかになってきたばかりである。
【０００４】
アポトーシスにおいて主要な役割を果たすと考えられるタンパク質群の１つは、カスパーゼと呼ばれるシステインプロテアーゼ族であり、それはアポトーシスのほとんどの経路に必要とされると考えられる。Ｃｒｅａｇｈ  ＆  Ｍａｒｔｉｎ（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ，２９，６９６−７０１；Ｄａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ，４１，２４７−２５３。カスパーゼは、多種の細胞タンパク質を開裂することによるアポトーシス刺激に反応してアポトーシスを引き起こし、それによって細胞収縮、膜ブレブ形成およびＤＮＡ断片化などのアポトーシスの典型的な兆候が生じる。Ｃｈａｎｇ  ＆  Ｙａｎｇ（２０００）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６４，８２１−８４６。
【０００５】
ＢａｘまたはＢａｋなどのプロアポトーシスタンパク質も、ミトコンドリアシトクロムＣなどのカスパーゼ活性化分子を放出することによってアポトーシス経路において中心的役割を果たし、それによりアポトーシスによる細胞死を促進する。Ｍａｒｔｉｎｏｕ  ＆  Ｇｒｅｅｎ（２００１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，６３−６７；Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ，９０，４０５−４１３。ＢｃＬ−２などの抗アポトーシスタンパク質は、ＢａｘおよびＢａｋなどのプロアポトーシスタンパク質の活性を拮抗することによって細胞生存を促進する。Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ（１９９８）Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，３，６９７−７０７；Ｋｒｏｅｍｅｒ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，３，６１４−６２０。Ｂａｘ：Ｂｃｌ−２の比率は、細胞の運命が決定される１つの方法であると考えられる。過剰のＢＡＸはアポトーシスを促進し、過剰のＢｃｌ−２は細胞生存を促進する。Ｓａｌｏｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７１，９５９−９６５；Ｗａｌｌａｃｅ−Ｂｒｏｄｅｕｒ  ＆  Ｌｏｗｅ（１９９９）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，５５，６４−７５。
【０００６】
アポトーシスに関与する別の主要なタンパク質は、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３によってコードされたタンパク質である。このタンパク質は、推定上Ｂａｘの上方制御によって細胞増殖を制御し、損傷した遺伝的に不安定な細胞においてアポトーシスを誘発する転写因子である。Ｂｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，６，１３３−１４２；Ｒｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｓｃｈｕｌｅｒ  ＆  Ｇｒｅｅｎ（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，２９，６８４−６８８；Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１３，３３２−３３７；Ｚｏｅｒｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１５５１，Ｆ１−Ｆ３７．
【０００７】
アポトーシス経路における変更は、癌を含む数多くの疾患過程において主要な役割を果たすと考えられる。Ｗｙｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，６８，２５１−３０６；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６７，１４５６−１４６２；Ｓｅｎ  ＆  Ｄ’Ｉｎｃａｌｃｉ（１９９２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３０７，１２２−１２７；ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，６，５３−６０。腫瘍の発生および進行に関する調査は、従来から細胞増殖に集中している。しかしながら、アポトーシスが腫瘍形成において果たす重要な役割は、最近になって明らかになってきた。実際は、現在アポトーシスに関して知られていることのほとんどは、アポトーシスの制御が腫瘍細胞において常にいくつかの方法によって変化するため、腫瘍モデルを使用して得られている。Ｂｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，６，１３３−１４２。
【０００８】
サイトカインもアポトーシス経路に関係があるとされる。生体系は、その制御のために細胞間相互作用を必要とし、細胞間のクロストークは通常、多種多様なサイトカインを伴う。サイトカインは、多くの異なる細胞型による様々な刺激に反応して産生されるメディエーターである。サイトカインは、多くの異なる細胞型に対して多くの異なる効果を発揮する多面性分子であるが、免疫反応の制御および造血細胞増殖および分化において特に重要である。標的細胞に対するサイトカインの作用は、特定のサイトカイン、相対濃度、他のメディエーターの有無によって、細胞生存、増殖、活性化、分化、またはアポトーシスを促進する。
【０００９】
乾癬、関節リウマチ、およびクローン病などの自己免疫疾患を治療するための抗サイトカインの使用は注目されてきている。炎症性サイトカインＩＬ−１およびＴＮＦは、これらの慢性疾患の病理学において大きな役割を果たす。これら２つのサイトカインの生物活性を低減させる抗サイトカイン療法によって治療的有用性がもたらされる（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ａｎｄ  Ａｂｒａｈａｍ，２００２）。
【００１０】
インターロイキン１（ＩＬ−１）は、局所性および全身性炎症反応を調節する重要なサイトカインであり、血管炎、骨粗しょう症、神経変性疾患、糖尿病、ループス腎炎を含む多くの疾患および関節リウマチなどの自己免疫疾患の発病においてＴＮＦと共に相乗作用を与えることができる。腫瘍の血管新生および侵襲性におけるＩＬ−１βの重要性も、メラノーマ細胞を注入した際の転移および血管形成に対するＩＬ−１βノックアウトマウスの抵抗によって最近証明された（Ｖｏｒｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【００１１】
インターロイキン１８（ＩＬ−１８）は、ＩＬ−１族の中の最近発見された一員であり、構造、受容体、および機能においてＩＬ−１と関連している。ＩＬ−１８は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１を誘発する能力の結果として炎症性および自己免疫疾患と関与する主要なサイトカインである。ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８は両者とも、心筋虚血に起こる心機能異常の一因となることが知られているサイトカインであるＴＮＦ−αの産出を誘発する能力を有する（Ｍａｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ＩＬ−１８結合タンパク質を使用した中和によるＩＬ−１８の阻害は、超融合したヒト心房心筋の虚血／再還流モデルにおける虚血によって引き起こされた心筋機能障害を低下させると考えられた（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，２００１）。また、マウスＩＬ−１８結合タンパク質を使用したＩＬ−１８の中和によっても、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１βの転写量を低下させることができ、コラーゲン誘導関節炎マウスモデルにおける関節損傷を低減させることができた（Ｂａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。マウスメラノーマモデルにおけるＩＬ−１８結合タンパク質の注入によって転移を阻害することが成功したため、ＩＬ−１８産生または可用性の低下も転移性腫瘍を制御することの有益を証明する可能性がある。（Ｃａｒｒａｓｃａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。炎症性サイトカインとしての重要性のさらなる表示として、ＩＬ−１８の血漿中濃度は慢性肝疾患の患者において上昇し、濃度増加は疾患の重症度と相関した（Ｌｕｄｗｉｃｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。同様に、ＩＬ−１８およびＴＮＦ−αは、腎症を有する糖尿病患者の血清において上昇した（Ｍｏｒｉｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。外傷性脳損傷後の神経炎症も炎症性サイトカインによって調節され、ＩＬ−１８結合タンパク質によるＩＬ−１８の阻害によって、脳損傷を受けたマウスにおいて神経学的回復を改善した（Ｙａｔｓｉｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【００１２】
サイトカインのＴＮＦ族の一員であるＴＮＦ−αは、造血細胞に対する共分裂促進作用、炎症反応の誘発、多くの細胞型における細胞死の誘発など多様な効果を有する炎症性サイトカインである。ＴＮＦ−αは、一般的に細菌性リポ多糖、寄生生物、ウイルス、悪性細胞およびサイトカインによって誘発され、通常、Ｔ細胞を感染および癌から保護するよう有用に作用する。しかしながら、ＴＮＦ−αの不適当な誘発は、自己免疫疾患などの急性および慢性炎症から生じる疾患の腫瘍原因となり、癌、ＡＩＤＳ、心臓疾患、および敗血症の一員ともなり得る（ＡｇｇａｒｗａｌおよびＮａｔａｒａｊａｎによる改訂、１９９６；ＳｈａｒｍａおよびＡｎｋｅｒ，２００２）。疾患（すなわち、敗血症性ショックおよび関節リウマチ）の実験動物モデルによって、ヒトの疾患（すなわち、炎症性腸疾患および移植片対宿主病）と同様に、ＴＮＦ−αを阻止する有益な効果を証明した（Ｗａｌｌａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ＴＮＦ−αの阻害は、クローン病（ｖａｎ  Ｄｅｖｅｎｔｅｒ，１９９９）および関節リウマチ（Ｒｉｃｈａｒｄ−Ｍｉｃｅｌｉ  ａｎｄ  Ｄｏｕｇａｄｏｓ，２００１）などの自己免疫疾患に苦しむ患者を緩和させることにおいても効果的である。Ｂリンパ球の生存及び成長を促進するＴＮＦ−αの能力もＢ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）の発病において役割を果たすと考えられ、Ｂ−ＣＬＬにおけるＴ細胞によって発現しているＴＮＦ−αの量は、確実に腫瘤および疾患の段階と相関した（Ｂｏｊａｒｓｋａ−Ｊｕｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）は、ＴＮＦ−α産生を誘発することで知られているサイトカインである。
【００１３】
ｅＩＦ−５Ａのアミノ酸配列は種の間でよく保存され、ｅＩＦ−５Ａにおいてハイプシン残留物を取り囲んでいるアミノ酸配列の徹底的な保存があり、それはこの組み換えは生存にとって重要である可能性があることを示唆する。Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ，４，９５−１０４。この仮説は、活性化における第１段階を触媒する、イーストから始まると考えられるｅＩＦ−５Ａの両イソ型の不活性化またはＤＨＳ遺伝子の不活性化が細胞分裂を阻止するという観察によってさらに裏付けられる。Ｓｃｈｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１，３１０５−３１１４；Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３８４，１５１−１５４；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１６７７−１６８３。しかしながら、イーストにおけるｅＩＦ−５Ａタンパク質の枯渇は、ほんの少ししか総タンパク質合成を低下させず、これはｅＩＦ−５Ａがタンパク質グローバル合成よりもむしろｍＲＮＡの特定のサブセットの翻訳に必要とされる場合があることを示唆している。Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｅＩＦ−５Ａ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｎ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”  ｉｎ  Ｔｕｉｔｅ，Ｍ．（ｅｄ．），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，ＮＡＴＯ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｈ。ｅＩＦ−５Ａを結合させるリガンドは高度に保存された基調を共有するという最近の所見もｅＩＦ−５Ａの重要性を裏付ける。Ｘｕ  ＆  Ｃｈｅｎ（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，２５５５−２５６１。さらに、修正されたｅＩＦ−５Ａのハイプシン残留物は、ＲＮＡへの配列特異的結合に対して必須であることが分かり、結合によってリボヌクレアーゼから保護されなかった。
【００１４】
さらに、ｅＩＦ−５Ａの細胞内枯渇は、細胞核における特定のｍＲＮＡの有意な蓄積を引き起こし、これはｅＩＦ−５Ａが特定のクラスのｍＲＮＡを細胞核から細胞質へ輸送することに関与する可能性があることを示している。Ｌｉｕ  ＆  Ｔａｒｔａｋｏｆｆ（１９９７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，８，４２６ａ。Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．２４７６，３７ｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ。核孔関連核内糸状体でのｅＩＦ−５Ａの蓄積および一般的な核外輸送受容体とのその相互作用によって、ｅＩＦ−５Ａがポリソームの成分ではなく、むしろ核細胞質間輸送タンパク質であることがさらに示唆される。Ｒｏｓｏｒｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１２，２３６９−２３８０。
【００１５】
ｅＩＦ−５Ａの最初のｃＤＮＡは、Ｓｍｉｔ−ＭｃＢｒｉｄｅらによってヒトからクローン化され、それ以来ｅＩＦ−５ＡのｃＤＮＡまたは遺伝子は、イースト、ラット、鶏胚、アルファルファ、およびトマトなどの多種の真核生物からクローン化されている。Ｓｍｉｔ−ＭｃＢｒｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１５７８−１５８３；Ｓｃｈｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）（ｙｅａｓｔ）；Ｓａｎｏ，Ａ．（１９９５）ｉｎ  Ｉｍａｈｏｒｉ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ，  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ，ＶＮＵ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，８１−８８（ｒａｔ）；Ｒｉｎａｕｄｏ  ＆  Ｐａｒｋ（１９９２）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，６，Ａ４５３（ｃｈｉｃｋ  ｅｍｂｒｙｏ）；Ｐａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，１７，９２７−９２９（ａｌｆａｌｆａ）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，１７５４１−１７５４９（ｔｏｍａｔｏ）。
【発明の開示】
【００１６】
本発明は、「アポトーシス特異的ｅＩＦ−５Ａ」または「ｅＩＦ−５Ａ１」と称されるアポトーシス特異的真核生物開始因子５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ）に関する。また本発明は、ｅＩＦ−５Ａ１  ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスポリヌクレオチドを使用して、アポトーシス特異的ｅＩＦ−５Ａの発現を阻害することによって、ヒトの体内（および細胞外）を含む対象における炎症性サイトカインの発現を抑制または阻害することにも関する。ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡおよびｅＩＦ５Ａ１のアンチセンス構築体は、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１２（ｐ７０）、Ｇ−ＣＳＦ、ＫＣ、ＭＩＰ−１ａ、およびＲＡＮＴＥＳなどの炎症性サイトカインの発現を低下させるために投与され、それは敗血症および／または出血によって引き起こされたショックの治療または予防に有用である。
【００１７】
また本発明は、ｅＩＦ−５Ａ１  ｓｉＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む、炎症性サイトカインの発現を減少させるための医薬組成物も提供する。本発明の医薬組成物は、ヒトを含む対象における敗血症の発症を治療または予防するために投与してもよい。特定の実施形態では、該医薬組成物は、ヌクレオチド配列ＣＧＧ  ＡＡＵ  ＧＡＣ  ＵＵＣ  ＣＡＧ  ＣＵＧ  Ａを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の詳細な説明
真核生物開始因子５Ａ（「ｅＩＦ−５Ａ」）のいくつかのイソ型が単離され、公開データバンクに保存されている。これらのイソ型は機能的に余剰であると考えられた。本発明者らは、１つのイソ型がアポトーシスの誘発の直前に上方制御されていることを見出し、アポトーシス特異的ｅＩＦ−５ＡまたはｅＩＦ−５Ａ１と指定した。本発明の目的は、アポトーシス特異的ｅＩＦ−５Ａおよび炎症性サイトカインの発現を下方制御するためのその発現の下方制御である。
【００１９】
敗血症は、年間約２１万件の死亡を引き起こしている悪性血管内炎症の過程である。それに応じて、補助療法が必要とされる。敗血症は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）としても知られている。敗血症は、体のあらゆるところに起こり得る細菌感染によって生じる。敗血症は、単に全身性炎症および凝固を特徴とする感染に対する患者の免疫反応によって生じる臨床症状のスペクトルとして定義されてよい。それには、全身性炎症反応（ＳＩＲＳ）から臓器機能不全、多臓器障害および最終的には死亡というあらゆる反応が含まれる。
【００２０】
敗血症は、非常に複雑な配列の事象であり、患者がどのようにＳＩＲＳから敗血症性ショックへ移行するのかを完全に理解するためには、まだ多くの研究が必要とされる。敗血症性ショックを有する患者は、二相性の免疫反応を有する。まず、感染に対する重篤な炎症反応を示す。これは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、およびＩＬ−６の炎症性サイトカインによる可能性が最も高い。そして、体は抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０）、溶解性阻害物質（ＴＮＦ受容体、ＩＬ−１受容体タイプＩＩ、およびＩＬ−ＩＲＡ（不活性形のＩＬ−１））を産生することによってこの反応を制御するが、これは免疫抑制の期間に患者に現れる。この低応答性の残留性は、院内感染および死亡の危険性の増加に関連する。
【００２１】
この全身性炎症性カスケードは、多種の細菌産物によって始まる。グラム陰性菌＝エンドトキシン、ホルミルペプチド、エクソトクシン、およびプロテアーゼ；グラム陽性菌＝エクソトクシン、超抗原（毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ）、連鎖球菌発熱毒素Ａ（ＳｐｅＡ））、エンテロトキシン、溶血素、ペプチドグリカン、およびリポタイコ酸、および真菌細胞壁物質などのこれらの細菌産物は、宿主のマクロファージ上の細胞受容体と結合し、核内因子κＢ（ＮＦｋＢ）などの調節タンパク質を活性化させる。エンドトキシンは、いくつかの受容体と相互に作用することによって調節タンパク質を活性化させる。ＣＤ受容体は、ＬＰＳ−ＬＰＳ結合タンパク質複合体を細胞の表面に貯めて、その後、ＴＬＲ受容体は信号を細胞に翻訳する。
【００２２】
上記のように、産生された炎症性サイトカインは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン１、６および１２およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）である。これらのサイトカインは、臓器機能に影響を与えるよう直接作用する場合と、第２メディエーターを経由して間接的に作用する場合がある。第２メディエーターとして、一酸化窒素、トロンボキサン、ロイコトリエン、血小板活性化因子、プロスタグランジン、および補体がある。ＴＮＦおよびＩＬ−１（エンドトキシンも同様）は、内皮細胞による組織因子の放出も引き起こし、線維素沈着および播種性血管内凝固（ＤＩＣ）に至る。
【００２３】
そして、これらの第１および第２メディエーターは、凝固カスケード、補体カスケード、およびプロスタグランジンおよびロイコトリエンの産生の活性化を引き起こす。凝血塊が血管につまり、多くの臓器を低下させ、複数の臓器系障害を引き起こす場合がある。やがてこの凝固カスケードの活性化によって、凝血塊を生成する患者の能力が消耗され、ＤＩＣおよびＡＲＤＳが引き起こされる。
【００２４】
このカスケードの蓄積効果は不平衡状態であり、炎症優性遺伝子が消炎に優り、凝固優性遺伝子が線維素溶解に優る。微小血管血栓症、還流低下、虚血、および組織傷害が引き起こされる。重度の敗血症、ショック、および多臓器機能不全が引き起こされる場合があり、死亡に至る。
【００２５】
本発明者らは、以前、ｅＩＦ−５Ａ１  ｓｉＲＮＡ（裸のｓｉＲＮＡとして鼻腔内に送達される）は細胞系において敗血症の複数の潜在的メディエーターの産生または発現を低下させ（例えば、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ｉＮＯＳ、ＴＬＲ−４発現）、鼻腔内リポ多糖体（ＬＰＳ）の後に血液中の少数の炎症性サイトカインは体内で挑戦するということを断定したため、内毒素血症マウスにおける生存およびサイトカイン発現に対する影響が研究された。すべて参照することにより本願に組み込まれる、米国同時係属出願第１１／１３４，４４５号（２００５年５月２３日出願）、第１１／１８４，９８２号（２００５年６月２０日出願）、第１１／２９３，３９１号（２００５年１１月２８日出願）、および第１１／５９５，９９０号（２００６年１１月１３日出願）を参照されたい。
【００２６】
ＢＡＬＢ／Ｃマウスに大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４  ＬＰＳを腹腔内（ＩＰ）に植菌したところ、対照の９３％が死亡した。動物は、ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡ（Ｎ＝５）（３’−ＧＣＣ  ＵＵＡ  ＣＵＧ  ＡＡＧ  ＧＵＣ  ＧＡＣ  Ｕ−５’）または対照としてスクランブルＲＮＡ（Ｎ＝１５）のいずれかを接種した。１回分５０μｇのｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡをＩＰで、ＤＯＴＡＰから成る１００μｇのトランスフェクションミセルとともに投与した。ｓｉＲＮＡ−リポソーム複合体は、ＬＰＳ投与前にｔ＝−４８および−２４時間で投与された。生存実験が行われ、同様の条件下でマウスはＬＰＳ投与の９０分または８時間後に死亡させ、血液を採取した。ビーズベースの多重サンドイッチ免疫測定法によって、循環サイトカインを定量化した。結果として、ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡでのＢＡＬＢ／Ｃマウスの治療によって、６０％の保護（ｐ＜０．０１）が得られた。治療により、ＩＬ−１βは９０分後で５９０９から６５８ｐｇ／ｍＬに、８時間後で２４７８から１０３２ｐｇ／ｍＬに減少した。治療により、ＴＮＦ−αも９０分後で３３６４９から３６９６ｐｇ／ｍＬに、８時間後で１２７２から９０１に低下した。ＭＩＰ−１αも治療によって、９０分後で１０４９９から３４７５ｐｇ／ｍＬに、８時間後で６８０から４１３ｐｇ／ｍＬに低下した。８時間後では、治療によってＩＦＮ−γが１４２から８６ｐｇ／ｍＬに低減し、ＩＬ−１２（ｐ４０）が４６５７０から１４２６１ｐｇ／ｍＬに低減した。抗炎症性サイトカインＩＬ−１０は治療により９０分後で７１９から８９８ｐｇ／ｍＬに増加した。これらの研究によって、ｓｉＲＮＡによって炎症性メディエーターを標的にすると、エンドトキシン血症マウスにおいて保護が得られることが示され、これは敗血症患者の治療において有用な方法である可能性があることを示唆する。
【００２７】
上記で検討した敗血症モデルの他に、本発明者らは出血性ショックを研究するための新規マウスモデルも開発した。このモデルの雄マウスＣ−５７ＢＬ／６Ｊ（週齢８〜１２）において、６０秒間以上の心穿刺（メトキシフルラン麻酔下）によって、計量された血液量（０．５５ｍｌ）の３０％を除去することによって出血ショックを誘発した。肺は出血後１時間に摘出し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ＰＨ７．４）、２０ｍＭグリセロリン酸エステル、２０ｍＭピロリン酸ナトリウム、０．２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭフッ化ナトリウム、１０ｍＭベンズアミジン、１ｍＭ  ＤＴＴ、２０ｎｇ／ｍｌロイペプチン、０．４ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ  ＳＣ、および０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する１ｍｌのよく冷えた抽出緩衝液において均質にした。ホモジネートは１４，０００ｇで１５分間４℃で遠心分離機にかけた。浮遊物を収集し、タンパク質濃度はビシンコニン酸アッセイで決定した。得られた浮遊物は、製造業者の指示通りにＥＣＬ（液相ＥＬＩＳＡ）によるＴＮＦ、ＩＬ−１、およびＩＬ−６の決定に使用した。最終結果は、タンパク質１ミリグラムごとに、サイトカインタンパク質をピコグラムで表した。
【００２８】
他の出血モデルでは、本発明者らはｅＩＦ５Ａ  ｓｉＲＮＡによってＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの発現を低減させることができることを示した。５匹のｉｐで誘発した雄マウスＣ−５７ＢＬ／６Ｊは、出血の２４時間前に５０μｇのｅＩＦ５Ａ  ｓｉＲＮＡで治療した。最終的に、５匹のｉｐで誘発した雄マウスＣ−５７ＢＬ／６Ｊは、出血の２４時間前に５０μｇのスクランブルｓｉＲＮＡで治療した。出血ショックは、６０秒間以上の心穿刺（メトキシフルラン麻酔下）による０．５５ｍＬの除去により引き起こされた。図２１は、出血ショック誘因前のｓｉＲＮＡの投与がＩ１−１βおよびＴＮＦ−αの発現を低下させることによって保護的利点をもたらしたことを示す。
【００２９】
したがって、本発明の一実施形態は、対象における体内の炎症性サイトカインの発現を低下させる方法を提供し、それは対象にｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡを投与するステップを含み、それによってｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡは炎症性サイトカインの発現を低下させる。対象は、ヒトを含むいかなる動物であってよい。
【００３０】
炎症性サイトカインは、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１２（ｐ７０）、Ｇ−ＣＳＦ、ＫＣ、ＭＩＰ−１ａ、およびＲＡＮＴＥＳなどの炎症カスケードに関与するいかなるサイトカインである。図１〜１８および２１〜２２は、ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡでの治療は、ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡを受けていない動物と比較して、炎症性サイトカインの量を低下させたことを示す。
【００３１】
上記に示すように、本発明者らは、炎症性サイトカイン発現が減少した際、ｅＩＦ５Ａ  ｓｉＲＮＡはエンドトキシン血症マウスにおいて保護をもたらすことを証明した。したがって、本発明の一実施形態は、対象にｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡを投与することによって対象における敗血症を治療する方法も提供し、それによりＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの投与はｅＩＦ５Ａ１の発現を低下させ、炎症性サイトカインの発現の低下をもたらす。発現の低下は、発現の減少を意味するとともに、ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡではなく他のｅＩＦ５Ａ１アンチセンス構築物で治療された対象における発現レベルまたはタンパク質の量と比較すると、特定のタンパク質のレベルの低下または減少を意味する。
【００３２】
本発明の他の実施形態は、ヒトを含む対象における出血性ショックを防止する方法をさらに提供し、それはＩＬ−１βおよび／またはＴＮＦ−αの発現を低下させるための、ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスポリヌクレオチドを投与するステップを含む。
【００３３】
ｅＩＦ５Ａ１の発現を阻害するいかなるｅＩＦ−５Ａ１  ｓｉＲＮＡを使用してもよい。「阻害」という用語は、低下または減少も意味する。１つの典型的なｅＩＦ−５Ａ１  ｓｉＲＮＡは、配列：ＣＧＧ  ＡＡＵ  ＧＡＣ  ＵＵＣ  ＣＡＧ  ＣＵＧ  Ａを含む。米国同時係属出願第１１／１３４，４４５号（２００５年５月２３日出願）、第１１／１８４，９８２号（２００５年６月２０日出願）、第１１／２９３，３９１号（２００５年１１月２８日出願）、および第１１／５９５，９９０号（２００６年１１月１３日出願）（参照することにより本願に組み込まれる）は、他の細胞型においてｅＩＦ−５Ａ１の発現を阻害するために使用されており、炎症性サイトカインの発現を阻害するとも思われる追加の典型的なｅＩＦ−５Ａ１  ｓｉＲＮＡおよび他のアンチセンス構築物を提供する。当業者は、ｅＩＦ５１Ａ配列を前提として、他のｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡを設計することができ、必要以上の実験をせずに発現を阻害するｓｉＲＮＡの能力について簡単に試験することができる。図２２〜２７は、ｅＩＦ５Ａ１、典型的なｅＩＦ−５Ａ１  ｓｉＲＮＡおよびアンチセンス構築物の配列が提供される。
【００３４】
また本発明は、ｅＩＦ−５Ａ１  ｓｉＲＮＡまたは上記で検討された、炎症性サイトカインの発現を低下させるために有用なアンチセンスポリヌクレオチドを含む医薬組成物も提供する。組成物は、ｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスポリヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含んでよい。媒体、アジュバント、担体または希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤は、一般で容易に入手可能である。また、ｐＨ調整剤・緩衝剤、等張化剤、安定剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助剤も一般で容易に入手可能である。
【００３５】
一般的に、上述のｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡまたはｅＩＦ５Ａ１アンチセンスヌクレオチドの有効量は、受容者の年齢、体重および疾患の状態または重症度によって決定される。投薬は、１日１回以上またはそれ以下であってよい。本発明はここに記載されるいかなる用量に限られているわけではないことに注意すべきである。
【００３６】
医薬組成物は、例えば、経口、非経口（皮下、筋肉内、および静脈内など）、直腸内、経皮、口腔、または経鼻など、対象の状態に適切ないかなる方法で投与されるよう薬剤として調製されてよく、または溶液として目に入れてもよい。
【００３７】
ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス構築物は、「裸」のｓｉＲＮＡまたはアンチセンスヌクレオチドとして運ばれてよく、または、例えば、コアセルベーション法または界面重合（例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルのそれぞれ）、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョンで調整されたマイクロカプセルに封入されてよい。そのような手法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．，Ｅｄ．，（１９８０）において公開されている。
【００３８】
アンチセンスポリヌクレオチドおよび／またはｓｉＲＮＡは、化学的に修正されてよい。これによって、ヌクレアーゼに対する抵抗が強化される可能性があり、細胞内に入る能力が強化される可能性がある。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが使用されてよい。他のデオキシヌクレオチド類似体には、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、ジチオリン酸、Ｎ３’Ｐ５’−ホスホルアミデートおよびオリゴリボヌクレオチドホスホロチオエートとその２’−Ｏ−アルキル類似体および２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドメチルホスホネートがある。
【００３９】
あるいは、混合バックボーンオリゴヌクレオチド（ＭＢＯ）を使用してよい。ＭＢＯは、ホスホチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの切片および修正されたオリゴデオキシまたはオリゴリボヌクレオチドの適当に置かれた切片を含有する。ＭＢＯは、ホスホロチオエート連鎖の切片および非イオンで、ヌクレアーゼまたは２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチドに対して強い耐性を示すメチルホスホネートなどの他の修正されたオリゴヌクレオチドの他の切片を有する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、炎症性サイトカインの効果に対する、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡの効果を示す。図１は、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡがＩＬ−１βの発現を低下させることを示す。
【図２】図２は、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡがＩＬ−２の発現を低下させることを示す。
【図３】図３は、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡがＩＬ−４の発現を低下させることを示す。
【図４】図４は、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡがＩＬ−５の発現を低下させることを示す。
【図５】図５は、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡがＩＬ−１０の発現を低下させることを示す。
【図６】図６は、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡがＧＭ―ＣＳＦの発現を増加させることを示す。
【図７】図７は、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡがＩＦＮ−γの発現を低下させることを示す。
【図８】図８は、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡがＴＮＦ−αの発現を低下させることを示す。
【図９】図９は、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡがＩＬ−１αの発現を増加させることを示す。
【図１０】図１０は、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡがＩＬ−３の発現を低下させることを示す。
【図１１】図１１は、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡがＩＬ−６の発現を低下させることを示す。
【図１２】図１２は、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡがＩＬ−１２（ｐ４０）の発現を低下させることを示す。
【図１３】図１３は、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡがＩＬ−１２（ｐ７０）の発現を低下させることを示す。
【図１４】図１４は、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡがＩＬ−１７の発現を増加させることを示す。
【図１５】図１５は、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡがＧ−ＣＳＦの発現を低下させることを示す。
【図１６】図１６は、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡがＫＣの発現を低下させることを示す。
【図１７】図１７は、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡがＭＩＰ−１αの発現を低下させることを示す。
【図１８】図１８は、ｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡがＲＡＮＴＥＳの発現を低下させることを示す。
【図１９】図１９は、ｅＩＦ−５Ａ１  ｓｉＲＮＡ構築体を提供する。
【図２０】図２０は、心穿刺の効果および１時間後の出血性肺の出血を示す。ＩＬ−１β発現は有意に増加する。
【図２１】図２１は、出血ショック誘因の前に行われたｅＩＦ５Ａ１  ｓｉＲＮＡの投与によって、Ｉ１−１ΒおよびＴＮＦ−αの発現が低下したことを示す。
【図２２】図２２は、ｅＩＦ５Ａ２に対して配列されたヒトｅＩＦ５Ａ１のヌクレオチド配列を提供する。
【図２３】図２３は、ｅＩＦ５Ａ２に対して配列されたヒトｅＩＦ５Ａ１のアミノ酸配列を提供する。
【図２４】図２４は、典型的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを有するヒトｅＩＦ５Ａ１のヌクレオチド配列を提供する。
【図２５】図２５は、典型的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを有するヒトｅＩＦ５Ａ１のヌクレオチド配列を提供する。
【図２６Ａ】典型的なｓｉＲＮＡを有するヒトｅＩＦ５Ａ１のヌクレオチド配列を提供する。
【図２６Ｂ】典型的なｓｉＲＮＡを有するヒトｅＩＦ５Ａ１のヌクレオチド配列を提供する。
【図２７】図２７は、典型的なｓｉＲＮＡを有するヒトｅＩＦ５Ａ１のヌクレオチド配列を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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