(57)【要約】植物または植物部分において窒素使用効率を改良し、植物または植物部分において炭素固定を増加させ、植物の穀物収量、またはバイオマス生産を増加させ、および／または植物のストレス耐性を増加させるための方法および組成物が提供される。本発明の組成物および方法は、Ｄｏｆドメイン、またはＤｏｆドメインの生物学的に活性な改変体または断片を有する少なくとも１つのＤｏｆ（ＤＯＦは“ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｏｎｅ  ｆｉｎｇｅｒ”［「１つのフィンガーでのＤＮＡ結合のため」］の略）ポリペプチドのレベルを変調することによって、これらの種々の表現型を変調する。
2009515522.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド：
（ａ）配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８０、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３５、１３８、１４１、１４４、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９または１６０を含むアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８０、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３５、１３８、１４１、１４４、１５４、１５５、１５６、１６７、１５８、１５９または１６０に対して少なくとも９０％配列同一性を含むアミノ酸配列であって、該ポリペプチドは転写を変調する能力を有する、アミノ酸配列；および
（ｃ）配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８０、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３５、１３８、１４１、１４４、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９または１６０の少なくとも４０連続アミノ酸を含むアミノ酸配列であって、該ポリペプチドは転写を変調する能力を保持する、アミノ酸配列。
【請求項２】
以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２２、２３、２５、２６、２８、２９、３１、３２、３４、３５、３７、３８、４０、４１、４３、４４、４６、４７、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、６２、６４、６５、６７、６８、７０、７１、７３、７４、７６、７７、７９、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２、１２３、１２５、１２６、１２８、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３，１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２または１５３を含むヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８０、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３５、１３８、１４１、１４４、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９または１６０を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２２、２３、２５、２６、２８、２９、３１、３２、３４、３５、３７、３８、４０、４１、４３、４４、４６、４７、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、６２、６４、６５、６７、６８、７０、７１、７３、７４、７６、７７、７９、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２、１２３、１２５、１２６、１２８、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２または１５３に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチドは、転写を変調する
能力を有するポリペプチドをコードするか、または植物における該ポリヌクレオチドの発現が少なくとも１つのＤｏｆポリペプチドの発現を減少させる、ヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２２、２３、２５、２６、２８、２９、３１、３２、３４、３５、３７、３８、４０、４１、４３、４４、４６、４７、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、６２、６４、６５、６７、６８、７０、７１、７３、７４、７６、７７、７９、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２、１２３、１２５、１２６、１２８、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２または１５３の少なくとも４０連続するヌクレオチドあるいはその相補体を含むヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチドは転写を変調する能力を有するポリペプチドをコードするか、または植物における該ポリヌクレオチドの発現は少なくとも１つのＤｏｆポリペプチドの発現を減少させる、ヌクレオチド配列；
（ｅ）ａ）またはｂ）のヌクレオチド配列の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、該ストリンジェントな条件は３７℃における５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および６０℃ないし６５℃での０．１×ＳＳＣ中での洗浄を含み、該ポリヌクレオチドは転写を変調する能力を有するポリペプチドをコードするか、あるいは植物における該ポリヌクレオチドの発現は少なくとも１つのＤｏｆポリペプチドの発現を減少させる、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｆ）配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８０、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３５、１３８、１４１、１４４、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９または１６０に対して少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチドが転写を変調する能力を有するポリペプチドをコードするか、あるいは植物における該ポリヌクレオチドの発現は少なくとも１つのＤｏｆポリペプチドの発現を減少させる、ヌクレオチド配列。
【請求項３】
請求項２記載のポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、植物における発現を駆動するプロモーターに操作可能に連結されている請求項３記載の発現カセット。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが組織で好ましいプロモーター、構成的プロモーター、または誘導性プロモーターに操作可能に連結されている請求項４記載の発現カセット。
【請求項６】
前記組織で好ましいプロモーターが葉で好ましいプロモーター、葉肉で好ましいプロモーター、維菅束鞘で好ましいプロモーター、種子で好ましいプロモーター、内乳で好ましいプロモーター、または胚で好ましいプロモーターである請求項５記載の発現カセット。
【請求項７】
植物において発現を駆動するプロモーターに操作可能に連結されているポリヌクレオチドを含む植物または植物部分であって、該ポリヌクレオチドが請求項２記載のヌクレオチド配列を含む、植物または植物部分。
【請求項８】
前記植物が単子葉植物である請求項７記載の植物または植物部分。
【請求項９】
前記単子葉植物がトウモロコシ、小麦、コメ、大麦、ソルガム、またはライ麦である請求項８記載の植物または植物部分。
【請求項１０】
前記単子葉がトウモロコシである請求項８記載の植物または植物部分。
【請求項１１】
前記植物が双子葉植物である請求項７記載の植物または植物部分。
【請求項１２】
前記双子葉植物が大豆、Ｂｒａｓｓｉｃａ、ヒマワリ、綿、またはアル
ファルファである請求項１１記載の植物または植物部分。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドが前記植物のゲノムに安定に組込まれている請求項７ないし１２いずれか１記載の植物または植物部分。
【請求項１４】
前記植物部分が細胞である請求項７ないし１３いずれか１記載の植物部分。
【請求項１５】
請求項２記載のポリヌクレオチドがそのゲノムに安定に組込まれている種子。
【請求項１６】
植物または植物部分においてＤｏｆポリペプチドのレベルを変調するための方法であって、該方法は、請求項２記載のヌクレオチド配列を含む異種ポリヌクレオチドを該植物または植物部分に導入する工程、および該異種ポリヌクレオチドを発現させる工程を含む、方法。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドが前記植物または植物部分のゲノムに安定に組込まれている請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記植物が双子葉植物である請求項１６または１７記載の方法。
【請求項１９】
前記双子葉植物が大豆、Ｂｒａｓｓｉｃａ、ヒマワリ、綿、またはアルファルファである請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記植物が単子葉植物である請求項１６または１７記載の方法。
【請求項２１】
前記単子葉植物がトウモロコシ、小麦、コメ、大麦、ソルガムまたはライ麦である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチドが組織で好ましいプロモーター、構成的プロモーター、または誘導性プロモーターに操作可能に連結されている請求項１６ないし２１いずれか１記載の方法。
【請求項２３】
前記組織で好ましいプロモーターが葉で好ましいプロモーター、葉肉で好ましいプロモーター、維菅束鞘で好ましいプロモーター、種子で好ましいプロモーター、内乳で好ましいプロモーター、または胚で好ましいプロモーターである請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
Ｄｏｆポリペプチドのレベルが増加する請求項１６ないし２３いずれか１記載の方法。
【請求項２５】
Ｄｏｆポリペプチドのレベルが減少する請求項１６ないし２３いずれか１記載の方法。
【請求項２６】
前記植物の収量が増加する請求項１６ないし２５いずれか１記載の方法。
【請求項２７】
前記植物または植物部分における窒素使用効率が増加する請求項１６ないし２５いずれか１記載の方法。
【請求項２８】
前記植物のストレス応答が改良される請求項１６ないし２５いずれか１記載の方法。
【請求項２９】
植物において窒素使用効率を増加させるための方法であって、該方法は、
ａ）該植物に異種ポリヌクレオチドを導入する工程；ならびに
ｂ）操作可能に連結されている葉で好ましいプロモーターまたは葉脈で好ましいプロモーターから該植物において該ポリヌクレオチドを発現させる工程を含み；
該異種ポリヌクレオチドの発現は配列番号１４８に記載されたアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＤｏｆポリペプチド、またはその生物学的に活性な改変体または断片のレベルを変調し、該生物学的に活性な改変体は配列番号１４５に対して少なくとも８０％の配列同一性を含み、および該Ｄｏｆポリペプチドは転写を変調することができる、
方法。
【請求項３０】
植物において収量を増加させる方法であって、該方法は、
ａ）該植物に異種ポリヌクレオチドを導入する工程；ならびに
ｂ）操作可能に連結されている葉で好ましいポロモーターまたは葉脈で好ましいプロモ
ーターから該植物において該ポリヌクレオチドを発現させる工程を含み、
ここに、該異種ポリヌクレオチドの発現は配列番号１４５に記載されたアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＤｏｆポリペプチド、またはその生物学的に活性な改変体または断片のレベルを変調し、該生物学的に活性な改変体は配列番号１４５に対して少なくとも８０％配列同一性を含み、該Ｄｏｆポリペプチドは転写を変調できる、
方法。
【請求項３１】
植物のストレス応答を改良するための方法であって、該方法は、
ａ）該植物に異種ポリヌクレオチドを導入する工程、ならびに
ｂ）操作可能に連結されている葉に好ましいプロモーターまたは葉脈に好ましいプロモーターから該植物において該ポリヌクレオチドを発現させる工程を含み、
該異種ポリヌクレオチドの発現は配列番号１４５に記載されたアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＤｏｆポリペプチド、またはその生物学的に活性な改変体または断片のレベルを変調し、該生物学的に活性な改変体は配列番号１４５に対して少なくとも８０％配列同一性を含み、および該Ｄｏｆポリペプチドは転写を変調することができる、
方法。
【請求項３２】
前記異種ポリヌクレオチドがＤｏｆポリペプチドをコードする請求項２９、３０、または３１記載の方法。
【請求項３３】
前記異種ポリヌクレオチドの発現が少なくとも１つのＤｏｆポリヌクレオチドのレベルを減少させる請求項２９、３０、または３１記載の方法。
【請求項３４】
前記葉で好ましいプロモーターが維菅束鞘で好ましいプロモーター、または葉肉で好ましいプロモーターを含む請求項２９、３０、３１、３２または３３記載の方法。
【請求項３５】
異種の葉で好ましいプロモーターまたは葉脈で好ましいプロモーターに操作可能に連結されているポリヌクレオチドを含む、単離された発現カセットであって、該ポリヌクレオチドは；
ａ）配列番号１４５に記載されたアミノ酸配列を含むＤｏｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１４５に対して少なくとも８０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＤｏｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該Ｄｏｆポリペプチドは転写を変調することができる、ポリヌクレオチド；
ｃ）植物で発現された場合に、配列番号１４５に記載されたアミノ酸配列を含むＤｏｆポリペプチドの発現レベルを減少させるポリヌクレオチド；
ｄ）植物で発現された場合、配列番号１４５に対して少なくとも８０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＤｏｆポリペプチドの発現レベルを減少させるポリヌクレオチドであって、該Ｄｏｆポリペプチドは転写を変調できる、ポリヌクレオチド；
からなる群より選択される、単離された発現カセット。
【請求項３６】
請求項３５記載の異種発現カセットを含む植物または植物部分。
【請求項３７】
前記植物が単子葉植物である請求項３６記載の植物または植物部分。
【請求項３８】
前記単子葉植物がトウモロコシ、小麦、コメ、大麦、ソルガム、またはライ麦である請求項３７記載の植物または植物部分。
【請求項３９】
前記植物が双子葉植物である請求項３６記載の植物または植物部分。
【請求項４０】
前記双子葉植物が大豆、Ｂｒａｓｓｉｃａ、ヒマワリ、綿、またはアルファルファである請求項３９記載の植物または植物部分。
【請求項４１】
前記ポリヌクレオチドが前記植物のゲノムに安定に組込まれている請求項３５ないし４０いずれか１記載の植物または植物部分。
【請求項４２】
前記植物部分が細胞である請求項３５ないし４１いずれか１記載の植物部分。
【請求項４３】
請求項３５記載の発現カセットがそのゲノムに安定に組込まれている種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、遺伝学および分子生物学の分野に向けられる。さらに詳しくは、組成物および方法は、植物における、炭素固定の変調、窒素使用の改良、収量の改良、およびストレス耐性の改良に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
慣用的な育種による穀物収量の改良はトウモロコシにおいてはほとんどプラトーに達した。従って、さらなる収量の増加を得るのに使用することができるいくつかの別の非慣用的アプローチを開発するのが自然である。トウモロコシにおける収穫の指標はここ１００年またはそのような年数にわたって穀物の収量についての選択の間に実質的に変化しないままであるので、収量の改良は、単位土地面積当たりの増大した合計バイオマス生産から実現されてきた（Ｓｉｎｃｌａｉｒら（１９９８）Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３８：６３８−６４３；Ｄｕｖｉｃｋら（１９９９）Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３９：１６２２−１６３０およびＴｏｌｌｅｎａａｒら（１９９９）Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３９：１５９７−１６０４）。この増大した合計バイオマスは植え付け密度を増大させることによって達成されており、これは葉の角度および房のサイズの低下のような適応表現型改変に導き、前者はより低い葉が日陰になるのを減少させるためのものであり、後者は恐らくは収穫指標を増加させるためのものである（Ｄｕｖｉｃｋら（１９９９）Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３９：１６２２−１６３０）。
【０００３】
炭素の固定および窒素の同化は、バイオマス生産を制限する鍵となるプロセスのうちの２つである（Ｓｉｎｃｌａｉｒら（１９７５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １８９：５６５−５６７；Ｂｈａｔｉａら（１９７６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９４：１４１８−１４２１；Ｄｈｕｇｇａら１９８９）Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．２９：１２３２−１２３９およびＳｉｎｃｌａｉｒら（１９９８）Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３８：６３８−６４３）。光合成産物の単位からの、トウモロコシにおける土壌から獲得された窒素の主な形態である、硝酸塩窒素を用いて蛋白質を作成するエネルギーコストは、炭水化物を作るのに必要なもののほぼ２倍である（Ｐｅｎｎｉｎｇら（１９７４）Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．４５：３３９−３７７  およびＳｉｎｃｌａｉｒら（１９７５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １８９：５６５−５６７）。これに合致して、トウモロコシ穀物中の蛋白質濃度はより高い植え付け密度において穀類収穫についての選択の結果として低下してきた（Ｄｕｖｉｃｋら（１９９９）Ｃｒｏｐ
Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３９：１６２２−１６３０）。理想的には、穀物の収量は最小量の適用窒素と共に最大化される。肥料価格の増大とは別に、雨水および濾された硝酸塩は望ましくない環境効果を引き起こす（Ｆｒｉｎｋら（１９９９）ＰＮＡＳ  ９６：１１７５−１１８０）。開かれた途の１つは、低下した穀物蛋白質含有量について選択することであり、これはより多量の炭水化物の蓄積による増大した穀物収量に反映されるが、その他には光合成の速度を増加させることがある（Ｌｅａｋｅｙら（２００４）Ｇｌｏｂａｌ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：９５１−９６２）。
【０００４】
代謝経路の複雑性を仮定すると、単一遺伝子の改変はバイオマス生産において実りのあるものとは判明しないであろう（非特許文献１）。しかしながら、全経路の異なる成分の同調改良は、少なくともある程度は、代謝経路の複雑性を克服するのを可能とするであろう。遺伝子発現の上流レギュレーターはこの目標を達成するのを助けることができよう（非特許文献１）。単一の上流「マスター調節」遺伝子は、例えば、経路における複数代謝
遺伝子の発現を改変するのに利用することができる（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献１）。これらのタイプの遺伝子を転写因子（ＴＦ）という。ＴＦは分子ヒエラルキーのより高いレベルで働き、種々の生物学的プロセスにおいて鍵となる役割を果たす。これは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓゲノムのほぼ５％がＴＦ（約１５００）をコードし、それらは各群に特異的なＤＮＡ結合ドメインに基づいてほぼ５０の異なる群に分類されるという事実から明白である（非特許文献４）。
【非特許文献１】Ｍｏｒａｎｄｉｎｉら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）８：７０−７５
【非特許文献２】Ｒａｂｉｎｏｗｉｃｚら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９）１５３：４２７−４４４
【非特許文献３】ＤｅｌｌａＰｅｎｎａ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（２００１）１２５：１６０−１５３
【非特許文献４】Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２９０：２１０５−２１１０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そのようなマスター調節配列を使用して、炭素固定および窒素同化を植物において変調することができる方法および組成物が当該分野で要求されている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（要旨）
本発明の組成物は、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８０、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３５、１３８、１４１、１４４、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９または１６０を含むアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、またはその改変体または断片を含む。
【０００７】
また、組成物は、配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２２、２３、２５、２６、２８、２９、３１、３２、３４、３５、３７、３８、４０、４１、４３、４４、４６、４７、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、６２、６４、６５、６７、６８、７０、７１、７３、７４、７６、７７、７９、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２、１２３、１２５、１２６、１２８、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２または１５３を含むヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドまたはその改変体または断片を含む。
【０００８】
これらの配列を含む発現カセット、植物、植物細胞、植物部分および種子がさらに提供される。特別な実施形態において、ポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、葉で好ましいプロモーター、葉肉で好ましいプロモーター、維管束鞘で好ましいプロモーター、葉脈で好ましいプロモーター、種子で好ましいプロモーター、内乳で好ましいプロモーター、または胚で好ましいプロモーターを含めた組織で好ましいプロモーターに操作可能に連結されている。
【０００９】
植物または植物の部分においてＤｏｆポリペプチドのレベルを変調する方法が提供され
る。該方法は植物または植物の部分、本発明のＤｏｆ配列を含む異種ポリヌクレオチドを導入することを含む。Ｄｏｆポリペプチドのレベルは増加または減少させることができる。そのような方法を用いて、植物において収量を増大させ、植物の窒素使用効率を増大させ、および／または植物のストレス応答を改良することができる。
【００１０】
本発明のさらなる組成物は葉で好ましいプロモーターまたは葉脈で好ましいプロモーターに操作可能に連結されているポリヌクレオチドを含む単離された発現カセットを含み、ここに、該ポリヌクレオチドは（ａ）配列番号１４５に記載されたアミノ酸配列を含むＤｏｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号１４５に対して少なくとも８０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＤｏｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ここに、Ｄｏｆポリペプチドは転写を変調することができ；（ｃ）植物で発現されると、配列番号１４５に記載されたアミノ酸配列を含むＤｏｆポリペプチドの発現レベルを減少させるポリヌクレオチド；および（ｄ）植物で発現されると、配列番号１４５に対して少なくとも８０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＤｏｆポリペプチドの発現レベルを減少させるポリヌクレオチド、ここに、該Ｄｏｆポリペプチドは転写を変調することができる；からなる群より選択される。この発現カセットを有する植物、植物部分、細胞および種子もまた提供される。
【００１１】
さらに、植物において窒素効率を増加させ、植物において収量を増加させ、および植物のストレス応答を改良するための方法が提供される。そのような方法は、植物に異種ポリヌクレオチドを導入し；次いで、操作可能に連結されている葉で好ましいプロモーターまたは葉脈で好ましいプロモーターから植物におけるポリヌクレオチドを発現させることを含む。そのような方法において、異種ポリヌクレオチドの発現は、配列番号１４５に記載されたアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＤｏｆポリペプチド、またはその生物学的に生物学的な改変体または断片のレベルを変調する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明の全てではないがいくつかの実施形態が示される添付の図面を参照して、以下、本発明をより十分に記載する。事実、本発明は多くの異なる形態に具体化することができ、本明細書中に記載された実施形態を限定するものと解釈されるべきではなく；むしろ、これらの実施形態は、本開示が適用可能な法的要件で満足するように供される。同様な数字は全体を通じて同様なエレメントをいう。
【００１３】
本明細書中に記載された本発明の多くの修飾および他の実施形態は、これまでの記載で示された教示の利点を有する、本発明が関する技術分野における当業者が思い浮かぶであろう。従って、本発明は開示された特別な実施形態に限定されるのではなく、修飾および他の実施形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されることが理解されるべきである。特別な用語を本明細書中に使用するが、それらは総括的および記載的意味でのみ用いられ、限定する目的のものではない。
【００１４】
Ｉ．概観
植物または植物の部分において窒素使用効率を改良し、植物または植物の部分において炭素固定を増加させ、植物の収量またはバイオマス生産を増大させ、および／または植物のストレス耐性を増加させるための方法および組成物が提供される。本発明の組成物および方法は、植物において、Ｄｏｆドメインを有する少なくとも１つのＤｏｆポリペプチド、またはＤｏｆドメインの生物学的に活性な改変体または断片を有するポリペプチドのレベルを変調することによってこれらの種々の表現型を変調する。
【００１５】
ＩＩ．組成物
Ａ．Ｄｏｆポリヌクレオチドおよびポリペプチド
本発明の組成物は、転写を調節するのに関与するＤｏｆポリヌクレオチド、およびそのポリペプチドおよび改変体および断片を含む。Ｄｏｆ（ＤＯＦは“ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｏｎｅ  ｆｉｎｇｅｒ”［「１つのフィンガーでのＤＮＡ結合のため」］の略）は、多様な植物種で見出されたＤＮＡ結合蛋白質のファミリーである。Ｄｏｆファミリーのメンバーは、ＤＮＡ結合に関与する高度に保存されたアミノ酸配列である、Ｄｏｆドメインまたはその活性改変体もしくは断片を含む。該Ｄｏｆドメインは、基本的領域と会合した、Ｃ２−Ｃ２フィンガー構造を持つ約５０アミノ酸の保存された領域によって特徴付けられる。Ｄｏｆファミリーの特別なメンバーの基本的領域は５’−Ｔ／ＡＡＡＡＧ−３’コアを持つＤＮＡ配列に結合することができる。例えば、Ｌｉｊａｖｅｔｚｋｙら（２００３）ＢＭＣ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：１７およびＹａｎａｇｉｓａｗａら（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１７：２０９参照。図１は、いくつかの特徴付けられたＤｏｆポリペプチドからのＤｏｆドメインの配列整列を供する。Ｄｏｆドメインについてのコンセンサス配列は配列番号１４５に記載されている。
【００１６】
本明細書中で用いるように、「Ｄｏｆ」配列は、保存されたＤｏｆドメイン、またはＤｏｆドメインの生物学的に活性な改変体または断片をコードするポリヌクレオチド、またはそれらを有するポリペプチドを含む。コンセンサスＤｏｆドメインは以下の通りである：
【００１７】
【化１】
2009515522.tif 000003
（陰影を付した残基はＤｏｆメンバーの中で高度に保存されており、Ｘはいずれかのアミノ酸を表し、および［］はその位置で見出すことができる引用されたアミノ酸を囲う）。配列番号１４５は、この保存されたドメインを記載する。しかしながら、Ｄｏｆドメインのコンセンサス配列に記載された保存された配列は、改変することができ、依然としてＤｏｆ活性（すなわち、転写を変調する能力）を保有することができることが認識される。例えば、Ｙａｎａｇｉｓａｗａら（２００１）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４２：８１３−２２およびＬｉｊａｖｅｔｚｋｙら（２００３）ＢＭＣ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：１７および図１参照。また、表２は、種々のトウモロコシＤｏｆポリペプチドからの代表的なＤｏｆドメインを供する。Ｄｏｆドメインの生物学的活性な断片および改変体は、ドメインが適当なポリペプチドの関係内に置かれると、転写を変調する能力を継続的に保有するであろう。
【００１８】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８０、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３５、１３８、１４１、１４４、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９または１６０に示されたアミノ酸配列を含む単離されたＤｏｆポリペプチドを提供する。さらに、配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２２、２３、２５、２６、２８、２９、３１、３２、３４、３５、３７、３８、４０、４１、４３、４４、４６、４７、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、６２、６４、６５、６７、６８、７０、７１、７３、７４、７６、７７、７９、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２、１２３、１２５、１２６、１２８
、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２または１５３に記載されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８０、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３５、１３８、１４１、  １４４、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９または１６０における保存されたＤｏｆドメインを表１に概説する。
【００１９】
本発明は、単離されたまたは実質的に精製されたポリヌクレオチドまたは蛋白質組成物を含む。「単離された」または「精製された」ポリヌクレオチドまたは蛋白質、またはその生物学的に活性な部分は、通常はその天然に生じる環境で見出されるポリヌクレオチドまたは蛋白質を伴い、またはそれと相互作用する成分を実質的または本質的に含まない。かくして、単離されたまたは精製されたポリヌクレオチドまたは蛋白質は、組換え技術によって生産された場合は他の細胞物質、または培養基を実質的に含まず、あるいは化学的に合成された場合は化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。最適には、「単離された」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムＤＮＡにおいてポリヌクレオチドに天然で近接する（すなわち、該ポリヌクレオチドの５’および３’末端に位置した配列）配列（最適には、蛋白質をコードする配列）を含まない。例えば、種々の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいてポリヌクレオチドに天然で近接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｇ未満のヌクレオチド配列を含有することができる。細胞物質を実質的に含まない蛋白質は、約３０％、２０％、１０％、５％または１％（乾燥重量）未満の汚染蛋白質を有する蛋白質の調製物を含む。本発明の蛋白質またはその生物学的活性な部分が組換えにより生産される場合、最適には、培養基は約３０％、２０％、１０％、５％または１％（乾燥重量）未満の化学的前駆体または注目する化学物質の非蛋白質を表す。
【００２０】
ＤｏｆドメインまたはＤｏｆポリヌクレオチドおよびそれによりコードされる蛋白質の断片および改変体もまた本発明の方法および組成物に含まれる。「断片」はポリヌクレオチドの部分またはアミノ酸配列の部分を意図する。ポリヌクレオチドの断片は、天然蛋白質の生物学的活性を保有し、よって、転写を調節する蛋白質断片をコードする。あるいは、Ｄｏｆ配列の抑制またはサイレンシング（すなわち、発現レベルの減少）で用いられる断片は蛋白質断片をコードする必要はないが、標的Ｄｏｆ配列の発現を抑制する能力を保持するであろう。加えて、ハイブリダイゼーションプローブとして有用な断片は、一般には、生物学的活性を保有する断片蛋白質をコードしない。かくして、ヌクレオチド配列の断片は、少なくとも約１８ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから、本発明の蛋白質をコードする全長ポリヌクレオチドまでの範囲であってよい。
【００２１】
ＤｏｆドメインまたはＤｏｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの断片は、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、２７５、３００、３５２、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、４８０連続アミノ酸、あるいは全長ＤｏｆドメインまたはＤｏｆ蛋白質に存在するアミノ酸の合計数までをコードするであろう（すなわち、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８０、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３５、１３８、１４１、１４４、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９また
は１６０）。ハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマーとして、または抑制構築体として有用なＤｏｆドメインまたはＤｏｆポリヌクレオチドの断片は、一般には、Ｄｏｆ蛋白質またはＤｏｆドメインの生物学的に活性な部分をコードする必要はない。
【００２２】
ＤｏｆドメインまたはＤｏｆ蛋白質の生物学的に活性な部分が、Ｄｏｆポリヌクレオチドの部分を単離し、（例えば、イン・ビトロでの組換え発現によって）Ｄｏｆ蛋白質のコードされた部分を発現させ、次いで、Ｄｏｆ蛋白質のコードされた部分の活性を評価することによって調製することができる。ＤｏｆドメインまたはＤｏｆヌクレオチド配列の断片であるポリヌクレオチドは、少なくとも１６、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２０５０、２０８０連続するヌクレオチド、あるいは全長Ｄｏｆドメインに、またはＤｏｆポリヌクレオチドに存在するヌクレオチドの数まで含む（すなわち、配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２２、２３、２５、２６、２８、２９、３１、３２、３４、３５、３７、３８、４０、４１、４３、４４、４６、４７、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、６２、６４、６５、６７、６８、７０、７１、７３、７４、７６、７７、７９、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２、１２３、１２５、１２６、１２８、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２または１５３）。
【００２３】
「改変体」は、実質的に同様な配列を意味することを意図する。ポリヌクレオチドについては、改変体は、天然ポリヌクレオチド内の１以上の内部部位における１以上のヌクレオチドの欠失および／または付加、および／または天然ポリヌクレオチド中の１以上の部位における１以上のヌクレオチドの置換を含む。本明細書中で用いるように「天然」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、各々、天然に生じるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む。ポリヌクレオチドについては、保存的改変体は、遺伝子暗号の縮重のため、ＤｏｆポリペプチドまたはＤｏｆドメインの１つのアミノ酸配列をコードする配列を含む。これらのような天然に生じる対立遺伝子改変体は、例えば、後に概説するポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術のような、よく知られた分子生物学技術を用いて同定することができる。改変体ポリヌクレオチドは、例えば、部位特異的突然変異誘発を用いることによって生じたが、転写を調節することができるか、あるいはＤｏｆポリヌクレオチドの発現のレベルを低下させることができる（すなわち、抑制またはサイレンシング）ＤｏｆドメインまたはＤｏｆポリペプチドを依然としてコードするもののような合成により誘導されたポリヌクレオチドを含む。一般には、本発明の特別なポリヌクレオチドの改変体は、本明細書中の他の箇所に記載された配列整列プログラムおよびパラメータによって決定されたその特別なポリヌクレオチドに対して少なくとも約４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上を有するであろう。
【００２４】
本発明の特別なポリヌクレオチド（すなわち、参照ヌクレオチド）の改変体は、改変体ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、および参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの間のパーセント配列同一性の比較によって評価することもできる。かくして、例えば、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８０、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０
３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３５、１３８、１４１、１４４、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９または１６０のポリペプチドに対して与えられたパーセント配列同一性を持つポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが開示される。２つのポリペプチドの間のパーセント配列同一性は、本明細書中の他の箇所に記載された配列整列プログラムおよびパラメータを用いて計算することができる。本発明のポリヌクレオチドのいずれかの与えられた対を、それらがコードする２つのポリペプチドが有するパーセント配列同一性の比較によって評価する場合、２つのコードされたポリペプチドの間のパーセント配列同一性は少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性である。
【００２５】
「改変体」蛋白質は、天然蛋白質中の１以上の内部部位における１以上のアミノ酸の欠失または付加、および／または天然蛋白質中の１以上の部位における１以上のアミノ酸の置換によって天然蛋白質に由来する蛋白質を意味することを意図する。本発明によって含まれる改変体蛋白質は、生物学的に活性であり、すなわち、それらは天然蛋白質の所望の生物学的活性を継続して保有し、すなわち、本明細書中に記載されたような転写を調節する。そのような改変体は、例えば、遺伝的多形から、またはヒト操作から由来することができる。本発明のＤｏｆ蛋白質、またはＤｏｆドメインの生物学的に活性な改変体は、本明細書中の他の箇所に記載された配列整列プログラムおよびパラメータによって決定して、Ｄｏｆ蛋白質、またはコンセンサスＤｏｆドメインについてのアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するであろう。本発明のＤｏｆ蛋白質の、またはＤｏｆドメインの生物学的に活性な改変体は、１ないし１５アミノ酸残基のように少ない、６ないし１０（たとえば、５のように少ない）のように１ないし１０と少ない、４、３、２または１さえの少ないアミノ酸残基だけその蛋白質とは異なり得る。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドは、アミノ酸置換、欠失、切形、および挿入を含めた種々の方法で改変することができる。そのような操作のための方法は一般には当該分野で知られている。例えば、Ｄｏｆ蛋白質またはＤｏｆドメインのアミノ酸配列改変体および断片は、ＤＮＡ中の突然変異によって調製することができる。突然変異誘発およびポリヌクレオチド改変のための方法は当該分野で良く知られている。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；米国特許第４，８７３，１９２号；Ｗａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇａａｓｔｒａ編（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびその中で引用された文献参照。注目する蛋白質の生物学的活性に影響しない適当なアミノ酸置換に関するガイダンスは、ここに引用して援用する、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルで見出すことができる。１つのアミノ酸を同様な特性を有するもう１つのアミノ酸で交換するような保存的な置換は最適であろう。
【００２７】
かくして、本発明の遺伝子およびポリヌクレオチドは天然に生じる配列ならびに突然変異体形態の双方を含む。同様に、本発明の蛋白質は天然に生じる蛋白質ならびにその改変体および修飾された形態を共に含む。そのような改変体は所望の活性（すなわち、標的Ｄｏｆ配列の転写を調節し、またはその発現のレベルを減少させる能力）を継続して保有するであろう。特別な実施形態において、改変体をコードするＤＮＡにおいてなされる突然
変異は配列をリーディングフレームの外に置かず、二次的ｍＲＮＡを生じさせることができる相補的領域を作り出さない。ＥＰ特許出願公開番号７５，４４４参照。
【００２８】
本明細書中に含まれる蛋白質配列の欠失、挿入および置換は、蛋白質の特徴の劇的な変化を生じるとは予測されない。しかしながら、それを行う予めの置換、欠失または挿入の正確な効果を予測するのが困難である場合、当業者は、該効果はルーチン的スクリーニングアッセイによって評価されると認識するであろう。例えば、Ｄｏｆポリペプチドの活性は、転写を調節するポリペプチドの能力についてアッセイすることによって評価することができる。ヌクレオチドまたはポリペプチドレベルにおける標的遺伝子の発現のレベルを直接的にモニタリングすることを含めた種々の方法を用いて、この活性についてアッセイすることができる。そのような分析のための方法は、例えば、ノーザンブロットＳ１保護アッセイ、ウエスタンブロット、酵素または比色アッセイを含む。特別な実施形態において、配列がＤｏｆ活性を有するか否かの決定は、炭素固定および窒素同化経路における種々の酵素を含めた、標的遺伝子のレベルまたは活性の増加または減少についてのモニタリングによってアッセイすることができる。例えば、特別な実施形態において、Ｄｏｆ配列は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシダーゼ遺伝子、細胞質ピルベートオルト−ホスフェートジキナーゼ遺伝子、ニトレートレダクターゼ、グルタミンシンターゼ、グルタメートシンターゼ、グルタメートデヒドロゲナーゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、アスパラギン合成のような標的遺伝子の転写を変調することができる。例えば、その双方をここに引用して援用するＹａｎａｇｉｓａｗａら（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７：５５５−５６０およびＹａｎａｇｉｓａｗａら（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２１：２８１−２８８参照。あるいは、転写活性の変調についてアッセイする方法は、植物の表現型の改変についてのモニタリングを含む。例えば、本明細書中の他の箇所にさらに詳細に議論するようにＤｏｆポリペプチドのレベルの変調の結果、増大した炭素固定、改良された窒素使用効率および穀物の収量、および乾燥、熱、および窒素ストレスのような非生命ストレスを含めた環境ストレスに対する植物の改良された耐性がもたらされ得る。これらの変化についてアッセイするための方法は本明細書中において他の箇所でさらに詳細に議論する。
【００２９】
改変体ポリヌクレオチドおよび蛋白質はＤＮＡシャッフリングのような突然変異誘発および組換え原性手法に由来する配列および蛋白質も含む。そのような手法にて、１以上の異なるＤｏｆコーディング配列を操作して、所望の特性を保有する新しいＤｏｆ配列またはＤｏｆドメインを作り出すことができる。このようにして、組換えポリヌクレオドのライブラリーは、実質的な配列同一性を有する配列領域を含む関連配列ポリヌクレオチドの集団から生じさせ、イン・ビトロまたはイン・ビボにて相同的に組換えることができる。例えば、このアプローチを用い、注目するドメインをコードする配列モチーフを本発明のＤｏｆ遺伝子および他の公知のＤｏｆ遺伝子の間でシャッフルして、酵素の場合における増大したＫｍのような注目する改良された特性を持つ蛋白質をコードする新しい遺伝子を得ることができる。そのようなＤＮＡシャッフリングのための戦略は当該分野で知られている。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：４３６−４３８；Ｍｏｏｒｅら（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６−３４７；Ｚｈａｎｇら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４５０４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１；および米国特許第５，６０５，７９３号および第５，８３７，４５８号参照。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドを用いて、他の生物、特に他の植物、より特別には他の単子葉植物からの対応する配列を単離することができる。このように、ＰＣＲハイブリダイゼ
ーションなどのような方法を用いて、本明細書中に記載された配列に対するそれらの配列相同性に基づいてそのような配列を同定することができる。本明細書中に記載された完全なＤＯＦ配列に対する、またはその改変体および断片に対するそれらの配列同一性に基づいて単離された配列は本発明に含まれる。そのような配列は、開示された配列のオルソログである配列を含む。「オルソログ」は、共通の先祖遺伝子に由来し、かつ種形成の結果として異なる種で見出される遺伝子を意味することを意図する。異なる種で見出された遺伝子は、それらのヌクレオチド配列および／またはそれらのコードされた蛋白質配列が少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有する場合にオルソログと考えられる。オルソログの機能は、しばしば、種の間で高度に保存されている。かくして、Ｄｏｆ蛋白質をコードし、ストリンジェントな条件下で本明細書中で開示されたＤｏｆ配列に、またはその改変体または断片にハイブリダイズするＤｏｆ配列またはポリヌクレオチドの発現をサイレントとし、また抑制することができる単離されたポリヌクレオチドは本発明に含まれる。
【００３１】
ＰＣＲアプローチにおいては、オリゴヌクレオチドプライマーはＰＣＲ反応で用いるために、注目するいずれかの植物から抽出されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡからの対応するＤＮＡ配列を増幅するように設計することができる。ＰＣＲプライマーを設計するための方法、およびＰＣＲクローニングは一般には、当該分野で知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に開示されている。また、Ｉｎｎｉｓら編（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ
Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｉｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ編（１９９５）ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＩｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ編（１９９９）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）も参照。ＰＣＲの公知の方法は、限定されるものではないが、対合プライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的にミスマッチしたプライマーなどを用いる方法を含む。
【００３２】
ハイブリダイゼーション技術において、公知のポリヌクレオチドの全てまたは部分は、選択された生物からのクローン化ゲノムＤＮＡ断片またはｃＤＮＡ断片（すなわち、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー）の集団に存在する他の対応するポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするプローブとして用いられる。ハイブリダイゼーションプローブはゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、または他のオリゴヌクレオチドであってよく、３２Ｐのような検出可能な基で標識されていてもよく、あるいはいずれかの他の検出可能なマーカーで標識されていてよい。かくして、例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブは、本発明のＤＯＦポリヌクレオチドに基づいて合成オリゴヌクレオチドを標識することによって作成することができる。ハイブリダイゼーション用のプローブの調製のための、およびｃＤＮＡおよびゲノムライブラリの構築のための方法は一般には当該分野で知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に開示されている。
【００３３】
例えば、完全なＤｏｆポリヌクレオチドまたは本明細書中に開示されたＤｏｆドメインをコードするポリヌクレオチド、または１以上のその断片を、対応するＤｏｆポリヌクレオチドおよびメッセンジャーＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることができるプローブ
として用いることができる。種々の条件下で特異的ハイブリダイゼーションを達成するためには、そのようなプローブには、Ｄｏｆポリヌクレオチド配列の中でユニークであり、最適には、長さは少なくとも約１０ヌクレオチド、最適には長さは少なくとも約２０ヌクレオチドである配列が含まれる。そのようなプローブを用いて、ＰＣＲによって、選択された植物からの対応するＤｏｆポリヌクレオチドを増幅することができる。この技術を用いて、所望の植物からのさらなるコーディング配列を単離することができ、または植物におけるコーディング配列の存在を決定するための診断アッセイを用いることができる。ハイブリダイゼーション技術は平板培養されたＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションのスクリーニングを含む（プラークまたはコロニー）；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。
【００３４】
そのような配列のハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で行うことができる。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが他の配列に対するよりも検出可能なより大きな程度でその標的配列にハイブリダイズする意図された条件である（例えば、少なくともバックグラウンドよりも２倍以上）。ストリンジェントな条件は配列依存性であって、異なる状況においては異なるであろう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗浄条件を制御することによって、プローブに対して１００％相補性である標的配列を同定することができる（同種プロービング）。別法として、ストリンジェンシー条件は低い程度の類似性が検出されるように配列においていくらかミスマッチング許容するように調整することができる（異種プロービング）。一般的には、プローブは長さが約１０００ヌクレオチド未満、最適には、長さが５００ヌクレオチド未満である。
【００３５】
典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ  ７．０ないし８．３において約１．５Ｍ  Ｎａイオン未満、典型的には、約０．０１ないし１．０Ｍ  Ｎａイオン濃度未満（または他の塩）であって、温度は短いプローブ（例えば、１０ないし５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、および長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドを超える）については少なくとも約６０℃であるものであろう。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような脱安定化剤の添加で達成することもできる。例示的な低ストリンジェンシー条件は３７℃における３０ないし３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液でのハイブリダイゼーションおよび１×ないし２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）での洗浄を含む。例示的な中程度のストリンジェンシー条件は、３７℃における４０ないし４５％ホルムアミド、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーション、および５５ないし６０℃における０．５×ないし１×ＳＳＣでの洗浄を含む。例示的な高ストリンジェンシー条件は、３７℃における５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーション、および６０ないし６５℃における０．１×ＳＳＣでの洗浄を含む。所望により、洗浄緩衝液は約０．１％ないし約１％ＳＤＳを含むことができる。ハイブリダイゼーションの持続は、一般には、約２４時間未満、通常、約４ないし約１２時間である。洗浄時間の持続は、少なくとも、平衡に到達するのに十分な長さの時間であろう。
【００３６】
特異性は、典型的には、ポスト−ハイブリダイゼーション洗浄の関数であり、臨界的な因子は最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドでは、ＴｍはＭｅｉｎｋｏｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４の方程式：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ  Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから近似することができ、ここに、Ｍは一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレ
オチドのパーセンテージであり、％ＦＯＲＭはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Ｌは塩基対におけるハイブリッドの長さである。Ｔｍは、相補的標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする（規定されたイオン強度およびｐＨ下での）温度である。Ｔｍはミスマッチングの各１％について約１℃だけ低下し；かくして、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件は、望まれる同一性の配列にハイブリダイズするように調整することができる。例えば、もし≧９０％同一性を持つ配列が求められるならば、Ｔｍは１０℃低下させることができる。一般には、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列およびその相補体について、熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。しかしながら、厳密にストリンジェントな条件は熱融解点（Ｔｍ）よりも１、２、３または４℃低い温度におけるハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ；中程度にストリンジェントな条件は熱融解点（Ｔｍ）よりも６、７、８、９または１０℃低い温度におけるハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ；低ストリンジェンシー条件は熱融解点（Ｔｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５または２０℃低い温度におけるハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。該方程式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、および望まれるＴｍを用い、当業者であれば、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーの変化は固有に記載されることを理解するであろう。もし所望の程度のミスマッチングの結果、４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴｍがもたらされるならば、より高い温度を用いることができるようにＳＳＣ濃度を増加させるのが最適である。核酸のハイブリダイゼーションに対する多数のガイドが、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ-Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）で見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）参照。
【００３７】
以下の用語を２以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列の関係を記載するのに用いる：（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較ウィンドウ」、（ｃ）「配列同一性」、および（ｄ）「配列同一性のパーセンテージ」。
【００３８】
（ａ）本明細書中で用いるように、「参照配列」は、配列比較のための基礎として用いられる規定された配列である。参照配列は特定の配列のサブセット、または全部であってよく；例えば、全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列のセグメント、または完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列として。
【００３９】
（ｂ）本明細書中で用いるように、「比較ウィンドウ」はポリヌクレオチド配列の連続的かつ特定のセグメントを引用し、ここに、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列は、２つのポリヌクレオチドの最適な整列については、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。一般には、比較ウィンドウは長さが少なくとも２０連続するヌクレオチドであって、所望により、３０、４０、５０、１００以上の長さであり得る。当業者であれば、ポリヌクレオチド配列にギャップが含まれていることによる参照配列に対する高い類似性を回避するには、ペナルティを典型的には導入し、マッチの数から差し引くことを理解している。
【００４０】
比較のための配列の整列方法は当該分野でよく知られている。かくして、いずれかの２つの配列の間のパーセント配列の決定は、数学的なアルゴリズムを用いて達成することができる。そのような数学的なアルゴリズムの非限定的例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７のアルゴリズム；Ｓｍｉｔｈら（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的整列アルゴリズム；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３の全体的整列アルゴリズム；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４−２４４８の局所的整列方法についてのサーチ；Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７におけるように修飾された、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７２２６４のアルゴリズムである。
【００４１】
これらの数学アルゴリズムのコンピュータ実施は、配列同一性を決定するための配列の比較のために利用することができる。そのような実施は、限定されるものではないが：（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｆｏｒｎｉａから入手可能な）ＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム中のＣＬＵＳＴＡＬ；（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
ＵＳＡから入手可能な）ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０中のＡＬＩＧＮプログラム（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）およびＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡを含む。これらのプログラムを用いる整列はデフォルトパラメータを用いて行うことができる。該ＣＬＵＳＴＡＬプログラムはＨｉｇｇｉｎｓら（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｃｏｒｐｅｔら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０；Ｈｕａｎｇら（１９９２）ＣＡＢＩＯＳ  ８：１５５−６５；およびＰｅａｒｓｏｎら（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１によってよく記載されている。該ＡＬＩＧＮプログラムはＭｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８、上述）のアルゴリズムに基づく。ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長さペナルティおよび４のギャップペナルティは、アミノ酸配列を比較する場合に、ＡＬＩＧＮプログラムで用いることができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＢＬＡＳＴプログラムはＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０、上述）のアルゴリズムに基づく。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチはＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、語長＝１２で行って、本発明の蛋白質をコードするヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴ蛋白質サーチはＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、語長＝３で行って、本発明の蛋白質またはポリペプチドに相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップド整列を得るためには、（ＢＬＡＳＴ  ２．０）中のギャップドＢＬＳＡＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載されているように利用することができる。別法として、（ＢＬＡＳＴ  ２．０における）ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて、分子の間の距離関係を検出する繰り返しサーチを行うことができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７、上述）参照。ＢＬＡＳＴ、ギャップドＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合、各プログラム（例えば、ヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮ、蛋白質についてはＢＬＡＳＴＸ）のデフォルトパラメータを用いることができる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照。整列は精査によって手動で行うこともできる。
【００４２】
特に断りのない限り、本明細書中で掲げた配列同一性／類似性の値は、以下のパラメータを用いるＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ１０を用いて得られた値をいう：５０のＧＡＰ重み、および３の長さ重み、およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを用
いるヌクレオチド配列についての％同一性および％類似性；８のＧＡＰ重みおよび２の長さ重み、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いるアミノ酸配列についての％同一性および％類似性；またはそのいずれかの同等なプログラム。「同等なプログラム」とは、問題とするいずれかの２つの配列について、ＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０によって生じた対応する整列と比較した場合、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基マッチ、および同一パーセントの配列同一性を有する整列を生じるいずれの配列比較プログラムも意図する。
【００４３】
ＧＡＰは、マッチの数を最大化し、ギャップの数を最小化する２つの完全な配列の整列を見出すために、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３のアルゴリズムを用いる。ＧＡＰは全ての可能な整列およびギャップの位置を考慮し、最大数のマッチした塩基および最小のギャップでの整列を作り出す。それは、マッチした塩基の単位においてギャップ創製ペナルティおよびギャップ延長ペナルティの提供を可能とする。ＧＡＰは、それが挿入する各ギャップについてのマッチのギャップ創製ペナルティ数の利点を作り出さなければならない。もし０よりも大きなギャップ延長ペナルティが選択されたならば、ＧＡＰは、加えて、ギャップの長さにギャップ延長ペナルティを掛け合わせたものの挿入された各ギャップについての利点を作り出さなければならない。蛋白質配列については、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＶｅｒｓｉｏｎ  １０における、デフォルトギャップ創製ペナルティ値、およびギャップ延長ペナルティ値は、各々、８および２である。ヌクレオチド配列については、デフォルトギャップ創製ペナルティは５０であり、他方、デフォルトギャップ延長ペナルティは３である。ギャップ創製およびギャップ延長ペナルティは、０ないし２００よりなる整数の群から選択された整数として表すことができる。かくして、例えば、ギャップ創製およびギャップ延長ペナルティは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５以上であり得る。
【００４４】
ＧＡＰは最良の整列のファミリーの１つのメンバーを表す。このファミリーの多くのメンバーがあり得るが、他のメンバーは最良の質を有しない。ＧＡＰは整列についての利点の４つの数字：質、比率、同一性、および類似性を示す。質は配列を整列させるために最大化された測定基準である。比率は、質を、より短いセグメント中の塩基の数で割ったものである。パーセント同一性は現実にマッチする記号のパーセントである。パーセント類似性は、同様である記号のパーセントである。ギャップを横切る記号は無視する。記号の対についてのスコアリングマトリックス値が０．５０（類似性閾値）以上である場合に、類似性をスコア取りする。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＶｅｒｓｉｏｎ  １０で用いるスコアリングマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）。
【００４５】
（ｃ）本明細書中で用いるように２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドとの関係で「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウにわたって最大応答性につき整列させた場合に同一である２つの配列中の残基への参照を行う。配列同一性のパーセンテージを蛋白質への参照で用いる場合、同一でない残基位置は、しばしば、保存的アミノ酸置換だけ異なり、ここに、アミノ酸残基は同様な化学的特性（例えば、電荷疎水性）を持つ他のアミノ酸残基に代えて置換され、従って、分子の機能的特性を変化させないことが認識される。配列が保存的置換において異なる場合、パーセント配列同一性は上方に調整して、置換の保存的性質について修正することができる。そのような保存的置換だけ異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するといわれる。この調整を行うための手段は当業者によく知られている。典型的には、これは、十分なミスマッチよりはむしろ部分的なミスマッチとして保存的置換をスコアリングし、それにより、パーセンテー
ジ配列同一性を増大させることを含む。かくして、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアが与えられ、かつ非保存的置換に０のスコアが与えられた場合、保存的置換には、０および１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実行されるように計算される。
【００４６】
（ｄ）本明細書中で用いるように、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定された値を意味し、ここに、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適整列についての（付加または欠失を含まない）参照配列と比較した付加または欠失（ギャップ）を含むことができる。パーセンテージは、同一核酸塩基またはアミノ酸残基が双方の配列で起こる位置の数を決定して、マッチした位置の数が得られ、マッチした位置の数を比較のウィンドウにおける位置の合計数で割り、次いで、結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【００４７】
Ｂ．植物
特別な実施形態において、本発明は、Ｄｏｆ配列の改変されたレベル（すなわち、増加または減少）を有する植物、植物細胞、および植物部分を提供する。いくつかの実施形態において、植物および植物部分は、そのゲノムに、配列番号１４５に記載されたＤｏｆドメインを含むＤｏｆポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド、またはその生物学的に活性な改変体または断片が安定に組み込まれている。１つの実施形態において、Ｄｏｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２２、２３、２５、２６、２８、２９、３１、３２、３４、３５、３７、３８、４０、４１、４３、４４、４６、４７、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、６２、６４、６５、６７、６８、７０、７１、７３、７４、７６、７７、７９、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２、１２３、１２５、１２６、１２８、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な改変体または断片に記載されている。
【００４８】
なお他の実施形態において、植物および植物部分が提供され、ここに、該植物または植物部分のゲノムに安定に組み込まれた異種ポリヌクレオチドは、植物において発現された場合に、配列番号１４５に記載されたＤｏｆドメインを含むＤｏｆポリペプチドのレベルを減少させるポリヌクレオチド、またはその活性な改変体または断片を含む。Ｄｏｆポリペプチドの発現を抑制するのに用いることができる配列は、限定されるものではないが、配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２２、２３、２５、２６、２８、２９、３１、３２、３４、３５、３７、３８、４０、４１、４３、４４、４６、４７、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、６２、６４、６５、６７、６８、７０、７１、７３、７４、７６、７７、７９、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２、１２３、１２５、１２６、１２８、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１４４、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２または１５３に記載された配列のいずれか、またはその改変体または断片を含む。
【００４９】
特別な実施形態において、植物または植物部分における異種ポリペプチドは、種子で好
ましいプロモーター（すなわち、内乳で好ましいプロモーターまたは胚で好ましいプロモーター）、葉脈で好ましいプロモーター、または葉で好ましいプロモーター（すなわち、維菅束鞘で好ましいプロモーター、または葉肉で好ましいプロモーター）のような組織で好ましいプロモーターに操作可能に連結されている。
【００５０】
本明細書中において他の箇所でさらに詳細に議論するように、そのような植物、植物細胞、および植物部分は、例えば、炭素固定の変調、改良された窒素使用効率、改良された収量、または改良されたストレス耐性を含めた改変された表現型を有することができる。
【００５１】
本明細書中で用いるように、用語植物は、植物細胞、植物プロトプラスト、それから植物を再生することができる植物細胞組織培養、植物カルス、植物塊、および胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、核種、穂、穂軸、殻、茎、根、根端、葯等のような植物または植物の部分において無傷である植物細胞を含む。穀物は、種の成長または再生以外を目的とした商業的栽培者によって生産された成熟種子を意味することを意図する。再生した植物の先祖、改変体、および突然変異体もまた本発明の範囲内に含まれるが、但し、これらの部分は本明細書中に開示された導入されたまたは異種ポリヌクレオチドを含むものとする。
【００５２】
本発明は、限定されるものではないが、単子葉植物および双子葉植物を含めたいずれの植物種の形質転換に用いることもできる。注目する植物種の例はトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ），Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．（ｅ．ｇ．，Ｂ．ｎａｐｕｓ，Ｂ．ｒａｐａ，Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、特に、種子油の源として有用なＢｒａｓｓｉｃａ種、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ライ麦（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ，Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、雑穀（例えば、唐人稗（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、粟（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ）、竜爪稗（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ））、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、紅花（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、落花生（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ  ｓｐｐ．）、ヤシ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）、柑橘樹木（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｐ．）、ココヤシ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ  ｓｐｐ．）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカデミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、サトウダイコン（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐ．）、オート麦、大麦、野菜、観葉植物、および針葉樹を含む。
【００５３】
野菜はトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、レタス（例えば、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、エンドウ豆（Ｌａｔｈｙｒｕｓ  ｓｐｐ．）、ならびにキュウリ（Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ）、カンタロープ（Ｃ．ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ）、およびマスクメロン（Ｃ．ｍｅｌｏ）のような属Ｃｕｃｕ
ｍｉｓのメンバーを含む。観葉植物はツツジ（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ  ｓｐｐ．）、アジサイ（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ  ｈｙｄｒａｎｇｅａ）、ハイビスカス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ）、薔薇（Ｒｏｓａ  ｓｐｐ．）、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ  ｓｐｐ．）、水仙（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｓｐｐ．）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ポインセチア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、および菊を含む。
【００５４】
本発明を実施するのに使用することができる針葉樹は、例えば、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）、スラッシュ・パイン（Ｐｉｎｕｓ  ｅｌｌｉｏｔｉｉ）、ポンデローサ松（Ｐｉｎｕｓ  ｐｏｎｄｅｒｏｓａ）、ロッジボールパイン（Ｐｉｎｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔａ）、およびモンテレイパイン（Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ）のような松；ダグラスファー（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）；アメリカツガ（Ｔｓｕｇａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）；ベイトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ｇｌａｕｃａ）；アメリカスギ（Ｓｅｑｕｏｉａ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）；ヨーロッパモミ（Ａｂｉｅｓ  ａｍａｂｉｌｉｓ）およびバルサミモミ（Ａｂｉｅｓ  ｂａｌｓａｍｅａ）のようなモミ樹木；およびウエスタンレッドセダー（Ｔｈｕｊａ  ｐｌｉｃａｔａ）、およびアラスカ黄杉（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ）のようなヒマラヤスギを含む。特別な実施形態において、本発明の植物は作物植物（例えば、トウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ属、大豆、綿、紅花、落花生、ソルガム、小麦、雑穀、タバコ等）である。他の実施形態において、トウモロコシおよび大豆植物が最適であり、なお他の実施形態において、トウモロコシ植物が最適である。
【００５５】
注目する他の植物は、注目する種子を供する穀物植物、油−種子植物、およびマメ科植物を含む。注目する種子はトウモロコシ、小麦、大麦、コメ、ソルガム、ライ麦等のような穀物種子を含む。油−種子植物は、綿、大豆、紅花、ヒマワリ、アブラナ科、トウモロコシ、アルファルファ、ヤシ、ココヤシ等を含む。マメ科植物は豆類およびエンドウ豆を含む。豆類はグアー、ローカストビーン、コロハ、大豆、インゲン豆、ササゲ、ヤエナリ、ライマメ、ソラマメ、レンティル豆、サヤエンドウ等を含む。
【００５６】
「対象植物または植物細胞」は、形質転換またはポリペプチドの導入のような改変が起こってしまったもの、またはそのように改変された植物または細胞からの子孫である、および改変を含む植物または植物細胞である。「対象」または「対照植物」または「対照植物細胞」は、対象植物または植物細胞の表現型の変化を測定するための参照点を供する。
【００５７】
対照植物または植物細胞は、例えば：（ａ）対象植物または細胞をもたらした改変についての出発物質と同一の遺伝子型の野生型植物または細胞；（ｂ）ヌル構築体で（すなわち、マーカー遺伝子を含む構築体のような、注目する特性に対して知られた効果を有しない構築体で）形質転換されていることを除いては出発物質と同一の遺伝子型の植物または植物細胞；（ｃ）対象植物または植物細胞の子孫の中で非形質転換分離体である植物または植物細胞；（ｄ）注目する遺伝子の発現を誘導するであろう条件または刺激に暴露されない以外は、対象植物または植物細胞と遺伝子的に同一である植物または植物細胞；または（ｅ）注目する遺伝子が発現されない条件下における、対象植物またはその植物細胞を含むことができる。
【００５８】
Ｃ．ポリヌクレオチド構築体
用語「ポリヌクレオチド」の使用は、本発明をＤＮＡを含むポリヌクレオチドに限定する意図ではない。当業者であれば、ポリヌクレオチドはリボヌクレオチド、およびリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの組合せを含むことができることを認識するであろう。そのようなデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは、天然に生じ
る分子および合成アナログ双方を含む。本発明のポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、一本鎖形態、二本鎖形態、ヘアピン、ステム−ループ構造等を含めた配列の全ての形態も含む。
【００５９】
本発明の方法および組成物で使用される種々のポリヌクレオチドは、注目する植物での発現用の発現カセット中で供することができる。該カセットは本発明のポリヌクレオチドに操作可能に連結されている５’および３’調節配列を含むであろう。「操作可能に連結した」は、２以上のエレメントの間の機能的連結を意味することを意図する。例えば、注目するポリヌクレオチドおよび調節配列（すなわち、プロモーター）の間の操作可能な連結は、注目するポリヌクレオチドの発現を可能とする機能的リンクである。操作可能に連結されているエレメントは連続的または非連続的であってよい。２つの蛋白質をコードする領域の接合をいう場合、操作可能に連結したとは、コーディング配列が同一のリーディングフレームにあることを意図する。カセットは、加えて、生物に共形質転換すべき少なくとも１つのさらなる遺伝子を含有することができる。別法として、さらなる遺伝子を多重発現カセットにて供することができる。そのような発現カセットには、複数の制限部位、および／または調節領域の転写調節下にあるべきＤＯＦポリヌクレオチドの挿入用の組換え部位が設けられている。発現カセットが、加えて、選択マーカー遺伝子を含有することができる。
【００６０】
発現カセットは、植物において機能的な、転写の５’ないし３’方向、転写および翻訳開始領域（すなわち、プロモーター）、Ｄｏｆポリヌクレオチド、および転写および翻訳終止領域（すなわち、終止領域）を含むことができる。調節領域（すなわち、プロモーター、転写調節領域、および転写終止領域）、および／またはＤｏｆポリヌクレオチドが宿主細胞に対して、または相互に対して天然／類似であってよい。別法として、調節領域および／またはＤｏｆポリヌクレオチドは宿主細胞に対して、または相互に対して異種である。本明細書中で用いるように、配列への参照における「異種」は、外来種に由来する配列であり、あるいはもし同一種に由来するならば、慎重なヒト介入によって組成物および／またはゲノム遺伝子座におけるその天然形態から実質的に修飾されている。例えば、異種ポリヌクレオチドに操作可能に連結されているプロモーターは、ポリヌクレオチドが由来する種とは異なる種からのものであるか、あるいはもし同一／類似種からのものであれば、一方または双方はそれらの元来の形態および／またはゲノム遺伝子座から実質的に修飾されており、あるいはプロモーターは操作可能に連結されているポリヌクレオチド用の天然プロモーターではない。本明細書中で用いるように、キメラ遺伝子は、コーディング配列に対して異種である転写開始領域に操作可能に連結されているコーディング配列を含む。
【００６１】
異種プロモーターを用いて配列を発現させるのが最適であろうが、天然プロモーター配列を用いてもよい。そのような構築体は、植物または植物細胞中でのＤｏｆの発現レベルを変化させることができる。かくして、植物または植物細胞の表現型を改変することができる。
【００６２】
終止領域は転写開始領域に対して天然であってよく、注目する操作可能に連結したＤｏｆポリヌクレオチドに対して天然であってよく、植物宿主に対して天然であってよく、またはプロモーター、注目するＤｏｆポリヌクレオチド、植物宿主、またはそのいずれかの組合せに対してもう１つの源に由来してもよい（すなわち、外来性または異種）。便利な終止領域はオクトピンシンターゼおよびオパリンシンターゼ終止領域のような、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉ−プラスミドから入手可能である。また、Ｇｕｅｒｉｎｅａｕら，（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６４：６７１−６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎら（１９９１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１４１−１４９；Ｍｏｇｅｎら（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅ
ｌｌ  ２：１２６１−１２７２；Ｍｕｎｒｏｅら（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：１５１−１５８；Ｂａｌｌａｓら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３；およびＪｏｓｈｉら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９．参照。
【００６３】
適切な場合、ポリヌクレオチドは形質転換された植物での増大した発現に対して最適化されてもよい。すなわち、ポリヌクレオチドは、改良された発現のための植物に好ましいコドンを用いて合成することができる。例えば、宿主に好ましいコドン用法の議論については例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｏｗｒｉ（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１参照。植物に好ましい遺伝子を合成する方法は当該分野で利用できる。例えば、ここに引用して援用する、米国特許第５，３８０，８３１号、およびＭｕｒｒａｙら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８参照。
【００６４】
さらなる配列修飾は、細胞宿主において遺伝子発現を増強させることが知られている。これらは、疑似ポリアデニル化シグナル、エクソン−イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン反復、および遺伝子発現に対して有害であろう他のそのようなよく特徴付けられた配列をコードする配列の排除を含む。配列のＧ−Ｃ含有量は、宿主細胞で発現された公知の遺伝子を参照することによって計算して、与えられた細胞宿主についてのレベル平均に調整してもよい。可能な場合、配列を修飾して、予測されたヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を回避する。
【００６５】
発現カセットは、加えて、５’リーダー配列を含有してもよい。そのようなリーダー配列は翻訳を増強するように作用することができる。翻訳リーダーは当該分野で知られており、ピコナウイルスリーダー、例えば、ＥＭＣＶリーダー（脳神経炎５’非コーディング領域）（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６１２６−６１３０）；ポチウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコエッチウイルス）（Ｇａｌｌｉｅら（１９９５）Ｇｅｎｅ  １６５（２）：２３３−２３８）、ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシモザイク病ウイルス）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５４：９−２０）、およびヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：９０−９４）；アルファルファモザイク病ウイルスの外皮蛋白質ｍＲＮＡからの非翻訳リーダー（ＡＭＶ  ＲＮＡ  ４）（Ｊｏｂｌｉｎｇら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：６２２−６２５）；タバコモザイク病ウイルスリーダー（ＴＭＶ）（Ｇａｌｌｉｅら（１９８９）ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＲＮＡ，ｅｄ．Ｃｅｃｈ（Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２３７−２５６）；およびトウモロコシクロロチックモットルウイルスリーダー（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｍｍｅｌら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８１：３８２−３８５）を含む。また、Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８参照。
【００６６】
発現カセットを調製する際において、種々のＤＮＡ断片を操作して、適当な向きの、かつ適切には、適当なリーディングフレームでのＤＮＡ配列を供することができる。この目的に向けて、アダプターまたはリンカーを使用して、ＤＮＡ断片を接合させることができるか、あるいは他の操作を含めて、便利な制限部位、余分なＤＮＡの除去、制限部位の除去等を供することができる。この目的では、イン・ビトロ突然変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えば、トランジションおよびトランスバージョンを含めてもよい。
【００６７】
注目するポリヌクレオチド配列の天然プロモーターを含めた、多数のプロモーターを本発明の実施で用いることができる。プロモーターは、所望の結果に基づいて選択すること
ができる。核酸を、植物における発現のために、構成的、組織で好ましい、または他のプロモーターと組合せることがきる。
【００６８】
そのような構成的プロモーターは、例えば、Ｒｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーター、およびＷＯ  ９９／４３８３８および米国特許第６，０７２，０５０号に開示された他の構成的プロモ−ター；コアＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）；コメアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙら（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１６３−１７１）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔら（１９９１）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎら（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７２３−２７３０）；ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号）等を含む。他の構成的プロモーターは、例えば、米国特許第５，６０８，１４９号；第５，６０８，１４４号；第５，６０４，１２１号；第５，５６９，５９７号；第５，４６６，７８５号；第５，３９９，６８０号；第５，２６８，４６３号；第５，６０８，１４２号；および第６，１７７，６１１号を含む。
【００６９】
組織で好ましいプロモーターを利用して、特定の植物組織内での増強された発現を標的化することができる。組織で好ましいプロモーターは、Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１２（２）：２５５−２６５；Ｋａｗａｍａｔａら（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８（７）：７９２−８０３；Ｈａｎｓｅｎら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．２５４（３）：３３７−３４３；Ｒｕｓｓｅｌｌら（１９９７）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．６（２）：１５７−１６８；Ｒｉｎｅｈａｒｔら（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（３）：１３３１−１３４１；Ｖａｎ  Ｃａｍｐら（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５２５−５３５；Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉら（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５１３−５２４；Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５（５）：７７３−７７８；Ｌａｍ（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１８１−１９６；Ｏｒｏｚｃｏら（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２３（６）：１１２９−１１３８；Ｍａｔｓｕｏｋａら（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（２０）：９５８６−９５９０およびＧｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａら（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４（３）：４９５−５０５を含む。そのようなプロモーターは、もし必要であれば、弱い発現のために修飾することができる。
【００７０】
葉で好ましいプロモーターは当該分野で知られている。例えば、ら（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１２（２）：２５５−２６５；Ｋｗｏｎら（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０５：３５７−６７；Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５（５）：７７３−７７８；Ｇｏｔｏｒら（１９９３）Ｐｌａｎｔ
Ｊ．３：５０９−１８；Ｏｒｏｚｃｏら（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３（６）：１１２９−１１３８およびＭａｔｓｕｏｋａら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（２０）：９５８６−９５９０参照。
【００７１】
種々のタイプの葉細胞における発現を指令するプロモーターを使用することもできる。例えば、葉肉で好ましいプロモーターは当該分野で公知であり、限定されるものではないが、Ｃ４ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子についてのプロモーター（Ｇｏｗｉｋら（２００４）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １６：１０７７−１０９０）；クロロフィルａ／ｂ結合蛋白質遺伝子（ｃａｂ）のプロモーター（Ｈｕｄｓｐｅｔｈら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ９８：４５８-４６４）；Ａｒａｂｉｄ
ｏｐｓｉｓプロモーターｐＲｂｃＳ２ｂ（Ｍｏｏｎら、Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｎｏｎ−ｃｅｌｌ  ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ  Ａｂｓ  ＃８６４）；サイトゾルフルクトース−１，６−ビスホスファターゼ遺伝子（ｃｙ−ＦＢＰａｓｅ遺伝子）のプロモーター（米国出願公開ＵＳ２００２１２０９５５）；およびコメおよびトウモロコシからのリブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット（ｒｂｃＳ）遺伝子プロモーター（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒら（１９９１）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ９：９９７−１０１２）を含み；これらの文献の各々を、ここに引用して援用する。
【００７２】
注目する他の葉で好ましいプロモーターは維管束鞘で好ましいプロモーターを含む。維管束鞘で好ましいプロモーターは当該分野で知られており、限定されるものではないが、ｐｐｃＡからのプロモーターの修飾された形態（Ｓｔｏｃｋｈａｕｓ（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ９：４７９）；および維管束鞘細胞において、および葉脈細胞において発現を指令するＺｊＰｃｋプロモーター（Ｎｏｍｕｒａ（２００５）Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ
Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ４６（５）：７５４−７６１を含み；これらの文献の各々をここに引用して援用する。
【００７３】
限定されるものではないが、米国出願公開番号２００４０１６３１４６のプロモーターを含めた、葉脈で好ましいプロモーターも当該分野で知られている。
【００７４】
光によって誘導される種々のプロモーターが、本発明の方法および組成物で用いることができる。当該分野で知られているそのようなプロモーターは、限定されるものではないが、ｃａｂまたはルビスコからのプロモーター（Ｓｉｍｐｓｏｎら（１９８５）ＥＭＢＯ
Ｊ  ４：２７２３−２７２９およびＴｉｍｋｏら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５７９−５８２）を含む。
【００７５】
種子で好ましいプロモーターは、種子特異的プロモーター（種子貯蔵蛋白質のプロモーターのような種子発生の間に活性なプロモーター）、ならびに種子発芽プロモーター（種子発芽の間に活性なプロモーター）を共に含む。ここに引用して援用する、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９８９）ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  １０：１０８参照。そのような種子で好ましいプロモーターは、限定されるものではないが、Ｃｉｍ１（サイトカイニン誘導メッセージ）；ｃＺ１９Ｂ１（トウモロコシ１９  ｋＤａゼイン）；ｍｉｌｐｓ（ミオ−イノシトール−１−リン酸シンターゼ）（ここに引用して援用する、ＷＯ  ００／１１１７７および米国特許第６，２２５，５２９号）、ＰＣＮＡ２（２００３年３月１３日に出願された米国特出願第１０，３８８，３５９号）、およびＣＫＸ１−２（米国出願公開２００２０１５２５００）を含む。双子葉植物では、種子特異的プロモーターは、限定されるものではないが、ビーンβ−ファゼオリン、ナピン、β−コングリシニン、大豆レクチン、クルシフェリン等を含む。単子葉植物では、種子特異的プロモーターは、限定されるものではないが、トウモロコシ１５ｋＤａゼイン、２２ｋＤａゼイン、２７ｋＤａゼイン、ガンマ−ゼイン、ワクシー、シュルンケン１、シュルンケン２、グロブリン１等を含む。また、ｅｎｄ１およびｅｎｄ２遺伝子からの種子で好ましいプロモーターが開示されるＷＯ  ００／１２７３３、およびＺｍ４０プロモーターが開示されるＷＯ  ０１／２１７８３および６，４０３，８６２（その双方をここに引用して援用する）を参照のこと。
【００７６】
胚特異的プロモーターはグロブリン１（Ｇｌｂ−１）、ＥＳＲ（米国出願公開２００４０２１０９６０）、およびｌｅｃｌ（２０００年１１月２２日に出願された米国特許出願第０９／７１８，７５４号）を含む。さらなる胚特異的プロモーターはＳａｔｏら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：８１１７−８１２２；Ｎａｋａｓｅら（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １２：２３５−５６およびＰｏｓｔｍａ−Ｈａａｒｓ
ｍａら（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９：２５７−７１に開示されている。内乳で好ましいプロモーターは米国出願公開２００４０２３７１４７に開示されたガンマ−ゼインプロモーター、ｅｐｐ１およびｅｅｐ２を含む。さらなる内乳特異的プロモーターはＡｌｂａｎｉら（１９８５）ＥＭＢＯ  ３：１５０５−１５；Ａｌｂａｎｉら（１９９９）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．９８：１２５３−６２；Ａｌｂａｎｉら（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．５：３５３−５５；Ｍｅｎａら（１９９８）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １１６：５３−６２およびＷｕら（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ３９：８８５−８８９に開示されている。未成熟穂組織で好ましいプロモーターも使用することができる。
【００７７】
発現カセットは形質転換細胞の選択のための選択マーカー遺伝子を含むこともできる。選択マーカー遺伝子は、形質転換された細胞または組織の選択で利用される。マーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードするもののような抗生物質耐性をコードする遺伝子、ならびにグルフォシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン、および２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）のような除草剤化合物に対する耐性を付与する遺伝子を含む。さらなる選択マーカーはβ−ガラクトシダーゼのような表現型マーカー、および緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）（Ｓｕら（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８５：６１０−９およびＦｅｔｔｅｒら（２００４）Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ  １６：２１５−２８）、シアン蛍光蛋白質（ＣＹＰ）（Ｂｏｌｔｅら（２００４）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１７：９４３−５４およびＫａｔｏら（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １２９：９１３−４２）、および黄色蛍光蛋白質（ＥｖｒｏｇｅからのＰｈｉＹＦＰ（登録商標）、Ｂｏｌｔｅら（２００４）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１７：９４３−５４参照）のような蛍光蛋白質を含む。さらなる選択マーカーについては、一般に、Ｙａｒｒａｎｔｏｎ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：５０６−５１１；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６３１４−６３１８；Ｙａｏら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１：６３−７２；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：２４１９−２４２２；Ｂａｒｋｌｅｙら（１９８０）ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｏｐｅｒｏｎ，ｐｐ．１７７−２２０；Ｈｕら（１９８７）Ｃｅｌｌ  ４８：５５５−５６６；Ｂｒｏｗｎら（１９８７）Ｃｅｌｌ  ４９：６０３−６１２；Ｆｉｇｇｅら（１９８８）Ｃｅｌｌ  ５２：７１３−７２２；Ｄｅｕｓｃｈｌｅら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ａｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４００−５４０４；Ｆｕｅｒｓｔら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２５４９−２５５３；Ｄｅｕｓｃｈｌｅら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：４８０−４８３；Ｇｏｓｓｅｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｒｅｉｎｅｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１９１７−１９２１；Ｌａｂｏｗら（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３３４３−３３５６；Ｚａｍｂｒｅｔｔｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３９５２−３９５６；Ｂａｉｍら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：５０７２−５０７６；Ｗｙｂｏｒｓｋｉら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４６４７−４６５３；Ｈｉｌｌｅｎａｎｄ−Ｗｉｓｓｍａｎ（１９８９）Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．１０：１４３−１６２；Ｄｅｇｅｎｋｏｌｂら（１９９１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３５：１５９１−１５９５；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｄｔら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７：１０９４−１１０４；Ｂｏｎｉｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｇｏｓｓｅｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１；Ｏｌｉｖａら（１９９２）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ
Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６：９１３−９１９；Ｈｌａｖｋａら（１９８５）Ｈａｎｄｂ
ｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７８（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；Ｇｉｌｌら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：７２１−７２４参照。そのような開示をここに引用して援用する。上述の選択マーカー遺伝子のリストは限定的なことを意図しない。いずれの選択マーカー遺伝子も本発明で用いることができる。
【００７８】
ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、注目するポリヌクレオチド配列のいずれかの組合せにてスタックして、所望の特性を持つ植物を作り出すことができる。本明細書中で用いるように、特性とは、特定の配列、または配列の群に由来する表現型をいう。生じた組合せは、注目するポリヌクレオチドのいずれか１つの多重コピーも含むことができる。本発明のポリヌクレオチドは、病気または除草剤耐性（例えば、フモニシン解毒遺伝子（米国特許第５，７９２，９３１号）；アビルレンスおよび病気耐性遺伝子（Ｊｏｎｅｓら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７８９；Ｍａｒｔｉｎら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４３２；Ｍｉｎｄｒｉｎｏｓら（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７８：１０８９）；Ｓ４および／またはＨｒａ突然変異のような除草剤耐性に導くアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）突然変異体；ホスフィノスリシンまたはバスター（例えば、ｂａｒ遺伝子）のようなグルタミンシンターゼの阻害剤；およびグリフォセート耐性（ＥＰＳＰＳ遺伝子））についての望ましい特性とスタックすることもでき；および高油（例えば、米国特許第６，２３２，５２９号）；修飾された油（例えば、脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子（米国特許第５，９５２，５４４号；ＷＯ  ９４／１１５１６））；修飾された澱粉（例えば、ＡＤＰＧピロホスホリラーゼ（ＡＧＰａｓｅ）、澱粉シンターゼ（ＳＳ）、澱粉分岐酵素（ＳＢＥ）、および澱粉脱分岐酵素（ＳＤＢＥ））；およびポリマーまたはバイオプラスチック（例えば、米国特許第５，６０２，３２１号；ベータ−ケトチオラーゼ、ポリヒドロキシ酪酸シンターゼ、およびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５８３７−５８４７）のような処理または製品で望ましい特性はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の発現を容易とし；その開示をここに引用して援用する。また、本発明のポリヌクレオチドを、雄性不稔（例えば、米国特許第５，５８３，２１０号参照）、茎の強さ、開花時間のような耕種学特性、あるいは細胞周期調節または遺伝子標的化（例えば、ＷＯ  ９９／６１６１９、ＷＯ  ００／１７３６４、およびＷＯ  ９９／２５８２１）のような形質転換技術の特性を供するポリヌクレオチドと組み合わせることもでき、その開示をここに引用して援用する。
【００７９】
これらのスタックされた組合せは、限定されるものではないが、いずれかの慣用的なまたはＴｏｐＣｒｏｓｓ方法、または遺伝子形質転換による交雑育種植物を含めたいずれかの方法によって作り出すことができる。もし配列が植物を遺伝子的に形質転換することによってスタックされれば、注目するポリヌクレオチド配列はいずれかの時点において、およびいずれかの順番で組み合わせることができる。例えば、１以上の所望の特性を含むトランスジェニック植物を標的として用いて、引き続いての形質転換によってさらなる特性を導入することができる。特性は、形質転換カセットのいずれかの組合せによって供される注目するポリヌクレオチドでの共形質転換プロトコルにて同時に導入することができる。例えば、もし２つの配列が導入されるのであれば、２つの配列は別々の形質転換カセットに含有させることができ（トランス）、または同一の形質転換カセットに含有させることができる（シス）。配列の発現は、同一プロモーターによって、または異なるプロモーターによって駆動することができる。ある場合には、注目するポリヌクレオチドの発現を抑制するであろう形質転換カセットを導入するのが望ましいであろう。これを、他の抑制カセットまたは過剰発現カセットのいずれかの組合せと組合せて、植物における特性の所望の組合せを作り出すことができる。さらに、ポリヌクレオチド配列は、部位特異的組換えシステムを用いて所望のゲノム位置でスタックすることができる。例えば、その全てをここに引用して援用する、ＷＯ  ９９／２５８２１、ＷＯ  ９９／２５８５４、ＷＯ  ９
９／２５８４０、ＷＯ  ９９／２５８５５、およびＷＯ  ９９／２５８５３参照。
【００８０】
Ｄ．導入の方法
本発明の方法は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの植物への導入を含む。「導入」は、配列が植物の細胞の内部への接近を獲得する方法にて、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを植物に提示することを意味することを意図する。本発明の方法は配列を植物に導入する特定の方法に依存し、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが植物の少なくとも１つの細胞の内部への接近を獲得することのみに依存する。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを植物に導入する方法は当該分野で知られており、限定されるものではないが、安定な形質転換方法、一過性形質転換方法、およびウイスル媒介方法を含む。
【００８１】
「安定な形質転換」は、植物に導入されたヌクレオチド構築体が該植物のゲノムに組み込まれ、その子孫によって遺伝され得ることを意味することを意図する。「一過性形質転換」は、ポリヌクレオチドが植物に導入され、該植物のゲノムに組み込まれず、またはポリペプチドが植物に導入されることを意味することを意図する。
【００８２】
形質転換プロトコル、ならびにポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を植物に導入するためのプロトコルは、形質転換のために標的化された、植物または植物細胞のタイプ、すなわち、単子葉植物または双子葉植物に依存して変化し得る。ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを植物細胞に導入する適当な方法は、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙら（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：３２０−３３４）、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：５６０２−５６０６）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（米国特許第５，５６３，０５５号および米国特許第５，９８１，８４０号）、直接的遺伝子導入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７１７−２７２２）、および弾丸粒子加速（例えば、米国特許第４，９４５，０５０号；米国特許第５，８７９，９１８号；米国特許第５，８８６，２４４号；および第５，９３２，７８２号；Ｔｏｍｅｓら（１９９５）ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；ＭｃＣａｂｅら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−９２６参照）；およびＬｅｃ１形質転換（ＷＯ  ００／２８０５８）を含む。また、Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７；Ｓａｎｆｏｒｄら（１９８７）Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：２７−３７（タマネギ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（大豆）；ＭｃＣａｂｅら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−９２６（大豆）；Ｆｉｎｅｒ  ａｎｄ  ＭｃＭｕｌｌｅｎ（１９９１）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７Ｐ：１７５−１８２（大豆）；Ｓｉｎｇｈら（１９９８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：３１９−３２４（大豆）；Ｄａｔｔａら（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：７３６−７４０（コメ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３０５−４３０９（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：５５９−５６３（トウモロコシ）；米国特許第５，２４０，８５５号；第５，３２２、７８３号；および第５，３２４，６４６号；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０−４４４（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍら（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３−８３９（トウモロコシ）；Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ  Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１１：７６３−７６４；米国特許第５，７３６，３６９号（穀類）；Ｂｙｔｅｂｉｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：５３４５−５３４９（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）；Ｄｅ  Ｗｅｔら（１９８５）ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｖｕｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，ｅｄ．Ｃｈａｐｍａｎら（Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．１９７−２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒら（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ９：４１５−４１８およびＫａｅｐｐｌｅｒら（１９９２）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８４：５６０−５６６（ウィスカー媒介形質転換）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：１４９５−１５０５（エレクトロポレーション）；Ｌｉら（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １２：２５０−２５５およびＣｈｒｉｓｔｏｕ  ａｎｄ  Ｆｏｒｄ（１９９５）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ７５：４０７−４１３（コメ）；Ｏｓｊｏｄａら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：７４５−７５０（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを介するトウモロコシ）参照；その全てをここに引用して援用する。
【００８３】
特別な実施形態において、Ｄｏｆ配列、またはその改変体および断片は、種々の一過性形質転換方法を用いて植物に供することができる。そのような一過性形質転換は限定されるものではないが、Ｄｏｆ蛋白質、またはその改変体および断片の植物への直接的導入、またはＤｏｆ転写物の植物への導入を含む。そのような方法は、例えば、マイクロインジェクションまたは粒子衝撃を含む。例えば、その全てをここに引用して援用する、Ｃｒｏｓｓｗａｙら（１９８６）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：１７９−１８５；Ｎｏｍｕｒａら（１９８６）Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．４４：５３−５８；Ｈｅｐｌｅｒら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：２１７６−２１８０およびＨｕｓｈら（１９９４）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０７：７７５−７８４参照。別法として、Ｄｏｆポリヌクレオチドは、当該分野で公知の技術を用いて一過的に植物に形質転換することができる。そのような技術は、ウイスルベクター系、およびＤＮＡの引き続いての放出を妨げるような、ポリヌクレオチドの沈殿を含む。かくして、粒子結合ＤＮＡからの転写が起こりかねないが、それが放出されてゲノムに組み込まれるようになる頻度は大いに低下する。そのような方法は、ポリエチルイミンでコートされた粒子の使用を含む（ＰＥＩ；Ｓｉｇｍａ＃Ｐ３１４３）。
【００８４】
他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、植物をウイスルまたはウイスル核酸と接触させることによって植物に導入することができる。一般に、そのような方法は、ウイスルＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に本発明のヌクレオチド構築体を組み込むことを含む。Ｄｏｆ配列、またはその改変体または断片はウイスルポリ蛋白質の一部として最初に合成でき、それは後にイン・ビボまたはイン・ビトロにて蛋白質分解によって処理して、所望の組換え蛋白質を得ることができると認められる。さらに、本発明のプロモーターは、ウイスルＲＮＡポリメラーゼによる転写で利用されるプロモーターも含むと認められる。ウイスルＤＮＡまたはＲＮＡ分子に関する、ポリヌクレオチドを植物に導入し、そこにコードされた蛋白質を発現させる方法は当該分野で公知である。例えば、ここに引用して援用する米国特許第５，８８９，１９１号、第５，８８９，１９０号、第５，８６６，７８５号、第５，５８９，３６７号、第５，３１６，９３１号、およびら（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：２０９−２２１参照。
【００８５】
植物ゲノム中の特定の位置におけるポリヌクレオチドの標的化挿入のための方法は当該分野で知られている。１つの実施形態において、所望のゲノム位置におけるポリヌクレオチドの挿入は、部位特異的組換え系を用いて達成される。例えば、その全てをここに引用して援用する、ＷＯ  ９９／２５８２１、ＷＯ  ９９／２５８５４、ＷＯ  ９９／２５８４０、ＷＯ  ９９／２５８５５、およびＷＯ  ９９／２５８５３参照。簡単に述べれば、本発明のポリヌクレオチドは、２つの非組換え原性組換え部位が近接する導入カセットに含有させることができる。導入カセットは、その導入カセットの部位に対応する２つの非組換え原性組換え部位が近接する標的部位がそのゲノムに安定に組み込まれた植物に導入される。適当なリコンビナーゼが供され、導入カセットは標的部位において組み込まれる
。注目するポリヌクレオチドは、それにより、植物ゲノム中の特異的染色体位置において組み込まれる。
【００８６】
形質転換されている細胞は、慣用的な方法に従って植物に成長させることができる。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら（１９８６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５：８１−８４参照。次いで、これらの植物を成長させ、同一の形質転換された株または異なる株で受粉させることができ、得られた子孫が同定された所望の表現型特徴の構成的発現を有する。２以上の世代を成長させて、所望の表現型特徴の発現が安定に維持され、遺伝されることを確実とし、次いで、種子が収穫されて、所望の表現型特徴の発現が達成されたことを確認することができる。このようにして、本発明が、そのゲノムに安定に組み込まれた、本発明のポリヌクレオチド、例えば、本発明の発現カセットを有する（「トランスジェニック種子」ともいう）形質転換種子を提供する。
【００８７】
ＩＩＩ．使用の方法
Ａ．植物または植物部分における、少なくとも１つのＤｏｆ配列、またはその改変体または断片の発現を変調する方法
本発明の方法との関係で、ポリペプチドの「変調されたレベル」「変調レベル」とは、発現、濃度または活性におけるいずれの相対的増分を含めた、遺伝子産物の発現、濃度、または活性のいずれの増加または減少もいう。転写または翻訳のレベルいずれかにおいて標的遺伝子産物の発現を変調し、または標的遺伝子の産物の活性を変調するいずれの方法または組成物を用いて、標的遺伝子産物の変調された発現、濃度、活性を達成することもできる。一般に、レベルは、適当な対照植物、植物部分、または細胞に対して少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上だけ増加し、減少する。本発明における変調は、植物の成長の間に、および／または植物の成長に引き続いて、発生の所望の段階まで起こり得る。特別な実施形態において、本発明のポリペプチドは単子葉植物、特にトウモロコシにおいて変調される。
【００８８】
Ｄｏｆドメイン、またはその生物学的に活性な改変体または断片を有するポリペプチドの発現レベルは、例えば、植物におけるＤｏｆポリペプチドのレベルをアッセイすることによって、直接的に、あるいは例えば、蛋白質をコードするポリヌクレオチドのレベルを測定することによって、あるいは植物におけるＤｏｆポリペプチドの活性を測定することによって間接的に測定することができる。Ｄｏｆポリペプチドの活性を測定する方法は本明細書中において他の箇所に記載されている。
【００８９】
特別な実施形態において、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは植物細胞に導入される。引き続いて、本発明の導入された配列を有する植物細胞は、限定されるものではないが、サザーンブロット分析、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ分析、または表現型分析のような当業者に知られた方法を用いて選択される。これまでの実施形態によって改変されたまたは修飾された植物または植物部分を、植物において本発明のポリペプチドの濃度および／または活性を変調するのに十分な時間の間、植物形成条件下で成長させる。植物形成条件は当該分野でよく知られており、本明細書中において他の箇所で簡単に議論する。
【００９０】
また、ポリペプチドのレベルおよび／または活性は、形質転換された植物において、蛋白質またはＲＮＡの発現を指令することができないポリヌクレオチドを使用することによって変調できることも認識される。例えば、本発明のポリヌクレオチドを用いて、生物においてゲノムヌクレオチド配列を改変し、または突然変異させるための方法で用いることができるポリヌクレオチド構築体を設計することができる。そのようなポリヌクレオチド構築体は、限定されるものではないが、ＲＮＡ：ＤＮＡベクター、ＲＮＡ：ＤＮＡ突然変異ベクター、ＲＮＡ：ＤＮＡ修復ベクター、混合デュプレックスオリゴヌクレオチド、自己相補性ＲＮＡ：ＤＮＡオリゴヌクレオチド、および組換え原性オリゴヌクレオベースを
含む。そのようなヌクレオチド構築体、および使用方法は当該分野で知られている。その全てをここに引用して援用する、米国特許第５，５６５，３５０号；第５，８７３１，１８１号；第５，７５６，３２５号；第５，７６０，０１２号；第５，７９５，９７２号；および第５，８７１，９８４号参照。また、ここに引用して援用するＷＯ  ９８／４９３５０、ＷＯ  ９９／０７８６５、ＷＯ  ９９／２５８２１、およびＢｅｅｔｈａｍら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：８７７４−８７７８参照。
【００９１】
従って、本発明の方法はゲノムへの全ポリヌクレオチドの組込みに依存せず、植物またはその細胞はポリヌクレオチドの細胞への導入の結果として改変されるに過ぎないと認められる。本発明の１つの実施形態において、ゲノムは、ポリヌクレオチドの細胞への導入に従い改変できる。例えば、ポリヌクレオチド、またはそのいずれかの部分は植物のゲノムへ組み込まれ得る。本発明のゲノムに対する改変は、限定されるものではないが、ヌクレオチドのゲノムへの付加、欠失および置換を含む。本発明の方法はいずれか特定の数のヌクレオチドの付加、欠失および置換に依存しないが、そのような付加、欠失、または置換は少なくとも１つのヌクレオチドを含むと認められる。
【００９２】
１つの実施形態において、Ｄｏｆポリペプチドの活性および／またはレベルは増加する。Ｄｏｆポリペプチドのレベルおよび／または活性の増加は、Ｄｏｆポリペプチドまたはその生物学的に活性な改変体または断片を植物に供することによって達成することができる。本明細書中において他の箇所で議論したように、限定されるものではないが、Ｄｏｆポリペプチドの植物への直接的導入、またはＤｏｆ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築体を（一過的にまたは安定に）植物に導入することを含めた、植物にポリペプチドを供するための多くの方法が当該分野で知られている。また、本発明の方法は、形質転換された植物において蛋白質またはＲＮＡの発現を指令できないポリヌクレオチドを使用することができると認められる。かくして、Ｄｏｆポリペプチドのレベルおよび／または活性はＤｏｆポリペプチドまたはそのプロモーターをコードする遺伝子を改変することによって増大させることができる。例えば、Ｋｍｉｅｃ，米国特許第５，５６５，３５０号；Ｚａｒｌｉｎｇら、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８参照。従って、Ｄｏｆ遺伝子中に突然変異を運び、ここに、該突然変異はＤｏｆの発現を増大させ、またはコードされたＤｏｆポリペプチドの活性を増加させる突然変異した植物が提供される。
【００９３】
他の実施形態において、本発明のＤｏｆポリペプチドの活性および／またはレベルは、ポリペプチドのレベルまたは活性を阻害するポリペプチドを植物に導入することによって低下され、または無くされる。ポリヌクレオチドはＤｏｆメッセンジャーＲＮＡの翻訳を妨げることによって直接的に、あるいはＤｏｆ蛋白質をコードするＤｏｆ遺伝子の転写または翻訳を阻害するポリペプチドをコードすることによって間接的にＤｏｆの発現を阻害することができる。植物において遺伝子の発現を阻害し、または無くする方法は当該分野で良く知られており、いずれのそのような方法も本発明で用いて、植物における少なくとも１つのＤｏｆ配列の発現を阻害することができる。本発明の他の実施形態において、Ｄｏｆポリペプチドの活性は、Ｄｏｆポリペプチドの活性を阻害するポリペプチドをコードする配列で植物細胞を形質転換することによって低下させ、または無くする。他の実施形態において、Ｄｏｆポリペプチドの活性は、Ｄｏｆポリペプチドをコードする遺伝子を破壊することによって低下させ、または無くすることができる。本発明はＤｏｆ遺伝子中に突然変異を運ぶ突然変異誘発植物を含み、ここに、突然変異はＤｏｆ遺伝子の発現を低下させ、またはコードされたＤｏｆポリペプチドのＤｏｆ活性を阻害する。
（遺伝子サイレンシングまたは遺伝子抑制としても知られた）特定の遺伝子の活性の低下は、植物における遺伝子工学のいくつかの態様で望ましい。遺伝子サイレンシングのための多くの技術は当業者によく知られており、限定されるものではないが、アンチセンス技術（例えば、Ｓｈｅｅｈｙら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ  ８５：８８０５−８８０９；および米国特許第５，１０７，０６５号；第５，４５３，５６６号；および第５，７５９，８２９号）；共抑制（例えば、Ｔａｙｌｏｒ（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ９：１２４５；Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．８（１２）：３４０−３４４；Ｆｌａｖｅｌｌ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３４９０−３４９６；Ｆｉｎｎｅｇａｎら（１９９４）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８８３−８８８およびＮｅｕｈｕｂｅｒら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４４：２３０−２４１）；ＲＮＡ干渉（Ｎａｐｏｌｉら（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：２７９−２８９；米国特許第５，０３４，３２３号；Ｓｈａｒｐ（１９９９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：１３９−１４１；Ｚａｍｏｒｅら（２０００）Ｃｅｌｌ  １０１：２５−３３およびＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１５５０２−１５５０７）、ウイスル誘導遺伝子サイレンシング（Ｂｕｒｔｏｎら（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １２：６９１−７０５；およびＢａｕｌｃｏｍｂｅ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏ．２：１０９−１１３）；標的−ＲＮＡ特異的リボザイム（Ｈａｓｅｌｏｆｆら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１）；ヘアピン構造（その全てをここに引用して援用する、Ｓｍｉｔｈら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：３１９−３２０；ＷＯ  ９９／５３０５０；ＷＯ  ０２／００９０４；ＷＯ  ９８／５３０８３；Ｃｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：４９８５−４９９０；Ｓｔｏｕｔｊｅｓｄｉｊｋら（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２９：１７２３−１７３１；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ａｎｄ  Ｈｅｌｌｉｗｅｌｌ（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．４：２９−３８；Ｐａｎｄｏｌｆｉｎｉら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：７，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００３０１７５９６５；Ｐａｎｓｔｒｕｇａら（２００３）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．３０：１３５−１４０；Ｗｅｓｌｅｙら（２００１）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２７：５８１−５９０；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．５：１４６−１５０；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００３０１８０９４５およびＷＯ  ０２／００９０４）；リボザイム（Ｓｔｅｉｎｅｃｋｅら（１９９２）ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：１５２５およびＰｅｒｒｉｍａｎら（１９９３）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．３：２５３）；オリゴヌクレオチド媒介標的化修飾（例えば、ＷＯ  ０３／０７６５７４およびＷＯ  ９９／２５８５３）；Ｚｎ−フィンガー標的化分子（例えば、ＷＯ  ０１／５２６２０；ＷＯ  ０３／０４８３４５；およびＷＯ  ００／４２２１９）；トランスポゾンタギング（Ｍａｅｓら（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．４：９０−９６；ＤｈａｒｍａｐｕｒｉおよびＳｏｎｔｉ（１９９９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ���Ｌｅｔｔ．１７９：５３−５９；Ｍｅｉｓｓｎｅｒら（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２２：２６５−２７４；Ｐｈｏｇａｔら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．２５：５７−６３；Ｗａｌｂｏｔ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．２：１０３−１０７；Ｇａｉら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：９４−９６；Ｆｉｔｚｍａｕｒｉｃｅら（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５３：１９１９−１９２８；Ｂｅｎｓｅｎら（１９９５）Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ  ７：７５−８４；Ｍｅｎａら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１５３７−１５４０および米国特許第５，９６２，７６４号）；その各々をここに引用して援用する；および当業者に知られた他の方法または前記方法の組合せを含む。
【００９４】
本発明のポリヌクレオチドでは、Ｄｏｆ配列についてのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の少なくとも部分に対して相補的なアンチセンス構築体を構築することができることが認められる。アンチセンスヌクレオチドは対応するｍＲＮＡとハイブリダイズするように構築される。アンチセンス配列が対応するｍＲＮＡにハイブリダイズし、その発現に干渉する限りは、アンチセンス配列の修飾をなすことができる。このように、対応するアンチセンス配列に対して７０％、最適には８０％、より最適には８５％配列同一性を有する
アンチセンス構築体を用いることができる。さらに、アンチセンスヌクレオチドの部分を用いて、標的遺伝子の発現を破壊することができる。一般には、少なくとも５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００、４００、４５０、５００、５５０以上のヌクレオチドの配列を用いることができる。
【００９５】
本発明のポリヌクレオチドは、植物における内因性遺伝子の発現を抑制するためにセンス向きで用いることもできる。センス向きのポリヌクレオチドを用いて植物における遺伝子発現を抑制する方法は当該分野で知られている。該方法は、一般には、内因性遺伝子の転写物に対応するポリヌクレオチドの少なくとも部分に操作可能に連結されている植物において発現を駆動するプロモーターを含むＤＮＡ構築体で植物を形質転換することを含む。典型的には、そのようなヌクレオチド配列は、内因性遺伝子の転写物の配列に対して実質的な配列同一性、最適には、約６５％よりも大きな配列同一性、より最適には約８５％よりも大きな配列同一性、最適には約９５％よりも大きな配列同一性を有する。ここに引用して援用する、米国特許第５，２８３，１８４号、および第５，０３４，３２３号参照。
【００９６】
かくして、多くの方法を用いて、Ｄｏｆポリペプチド、またはその生物学的に活性な改変体または断片の活性を低下させ、または無くすることができる。加えて、方法の組合せを使用して、少なくとも１つのＤｏｆポリペプチドの活性を低下させ、または無くすることができる。さらに、単一Ｄｏｆ配列のレベルを変調して、所望の表現型を生じさせることができるとさらに認識される。別法として、Ｄｏｆドメインを有する多数の配列またはその生物学的に活性な改変体または断片の発現レベルを変調する（増加させるおよび／または変調させる）のが望ましいであろう。単一Ｄｏｆ配列（または高度に関連するＤｏｆ配列）のレベルを減少させるためには、特異的Ｄｏｆ配列、またはＤｏｆ配列の特異的サブセットの抑制を標的とする抑制構築体を使用することができる。別法として、もし広い範囲のＤｏｆ配列を抑制するのが望ましいならば、抑制構築体は、ＤｏｆドメインのようなＤｏｆファミリーメンバーの中で高度に保存されている配列を使用することができよう。
【００９７】
前記で議論したように、種々のプロモーターを使用して、Ｄｏｆ配列のレベルを変調することができる。１つの実施形態において、少なくとも１つのＤｏｆポリペプチドのレベルを変調する異種ポリヌクレオチドの発現は、組織で好ましいプロモーター、特に、葉で好ましいプロモーター（すなわち、葉肉で好ましいプロモーターまたは維管束鞘で好ましいプロモーター）、および／または種子で好ましいプロモーター（すなわち、内乳で好ましいプロモーターまたは胚で好ましいプロモーター）によって調節することができる。
【００９８】
Ｂ．植物において炭素固定、窒素同化、収量および／またはストレス耐性を変調する方法
窒素同化は植物の成長および発育にとって必須であり、従って、大量の窒素肥料を植物で用いて、作物の収量を最大化する。しかしながら、単一の最も高価な農場インプットを構成するのとは別に、そのような窒素肥料は環境に対してネガティブなインパクトを有する。従って、窒素を同化し、それにより、植物収量を改良する植物または植物部分の能力を増加させるための方法および組成物が提供される。そのような方法は、植物または植物部分においてＤｏｆドメインを有する少なくとも１つのＤｏｆポリヌクレオチドのレベルを変調し、それにより、窒素同化（増大した窒素使用効率）および／または植物収量を増大させることを含む。
【００９９】
窒素同化の増加は、植物または植物部分の窒素含有量を決定することによってアッセイすることができる。例えば、窒素同化のレベルの増加は、対照植物または植物部分と比較した場合に、約０．１％、０．５％、１％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５
％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の植物または植物部分の全窒素含有量の増加を含むことができる。あるいは、窒素含有量の増加したレベルは、対照植物または植物部分と比較した場合に、植物または植物部分における窒素レベルの全増加における約０．５倍、１倍、２倍、４倍、８倍、１６倍または３２倍増加を含むことができる。窒素のレベルについてアッセイするための方法は公知である。例えば、ここにその双方を引用してその全体を援用する、Ｙａｎａｇｉｓａｗａら（２００４）ＰＮＡＳ  １０１：７８３３−７８３８およびＳｔｉｔｔら（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７４：５１８−５５２参照。
【０１００】
窒素同化の増加もまた、植物または植物部分におけるアミノ酸のレベルを決定することによってアッセイすることもできる。「アミノ酸のレベルの増加」は、植物または植物部分におけるアミノ酸レベルのいずれの増加も含む。例えば、アミノ酸のレベルの増加は、対照植物または植物部分と比較した場合に、約０．１％、０．５％、１％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の植物または植物部分の全アミノ酸含有量の増加を含むことができる。あるいは、アミノ酸の増大したレベルは、対象植物または植物部分と比較した場合に、植物または植物部分におけるアミノ酸レベルの全増加における約０．５倍、１倍、２倍、４倍、８倍、１６倍、または３２倍増加を含むことができる。
【０１０１】
さらに、アミノ酸のレベルの増加はアミノ酸レベルの全増加である必要はなく、単一アミノ酸、またはアミノ酸の組合せのレベルの変化も含むと認識される。この実施形態においては、アミノ酸レベルの増加はアミノ酸濃度の全増加である必要はなく、種々のアミノ酸の比率の変化も含む。例えば、アミノ酸含有量の増加は、窒素資化についての良好なマーカーであるグルタミンまたはグルタメートの上昇したレベルを通じて反映させることができよう。例えば、その全てをここに引用して援用する、Ｓｔｉｔｔら（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．２２：５８３−６２１，Ｍａｔｔら（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３０：６６３−６７７およびＦｏｙｅｒら（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．５４：５８５−５９３およびＹａｎａｇｉｓａｗａら（２００４）ＰＮＡＳ  １０１：７８３３−７８３８参照。
【０１０２】
窒素同化の増加（窒素使用効率の増加）は、窒素ストレスに対する植物の耐性をモニターすることによってアッセイすることもできる。そのようなアッセイは本明細書中において他の箇所でさらに詳細に議論する。簡単に述べれば、植物または植物部分が、対照植物または植物部分と比較して、低窒素条件下で良好な成長を呈するかを決定することによって、窒素同化の変調をアッセイすることができる。そのような表現型は、低窒素成長条件下で葉の変色の欠如を含むことができる。例えば、ここに引用して援用する、Ｙａｎａｇｉｓａｗａら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  １０１：７８３３−７８３８参照。
【０１０３】
該方法および組成物をさらに用いて、植物の収量を増加させることができる。本明細書中で用いるように、用語「改良された収量」は、いずれかの測定された植物産物の収量のいずれかの改良を意味する。収量における改良は、測定された植物産物における０．１％、０．５％、１％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の増加を含むことができる。あるいは、増加した植物収量は、測定された植物産物における約０．５倍、１倍、２倍、４倍、８倍、１６倍、または３２倍増加を含むことができる。例えば、同一条件下で栽培された未処理大豆またはトウモロコシからの基礎単位／エーカー収量と比較した、本処理を有する作物に由来する大豆またはトウモロコシの基礎単位／エーカー収量の増加は改良された収量と考えられよ
う。
【０１０４】
また、植物のストレス耐性を改良するための方法が提供される。本発明の方法は、植物または植物部分においてＤｏｆドメインを有するポリペプチドのレベルを変調し、それにより、植物のストレス耐性を増加させることを含む。
【０１０５】
本明細書中で用いるように、無生物ストレス耐性は、限定されるものではないが、増大した収量、成長、バイオマス、あるいは適当な対照植物と比較した場合に、限定されるものではないが、熱ストレス、塩ストレス、冷ストレス（発芽の間の冷ストレスを含む）、熱ストレス、水ストレス（限定されるものではないが、旱魃ストレスを含む）、および窒素ストレス（高および低窒素を含む）を含むストレスに対して耐性を示す他の尺度を含む。
【０１０６】
「熱耐性」は、本明細書中においては、適当な対照植物の成長、活力、収量、および／またはサイズに熱またはより暖かい温度が悪影響するであろう条件下で成長する植物の能力の尺度と定義される。改良された熱耐性を呈する植物は、非熱耐性植物よりも熱ストレスの条件下で良好に成長する。
【０１０７】
「冷耐性」は、本明細書中においては、適当な対照植物の成長、活力、収量、および／またはサイズに冷たいまたはより冷たい温度が悪影響するであろう条件下で成長する植物の能力の尺度と定義される。改良された冷耐性を呈する植物は、非冷耐性植物よりも冷ストレスの条件下で良好に成長する。
【０１０８】
本明細書中で定義される「旱魃」とは、特に延長された場合に、作物に対して損害を引き起こし、またはそれらの首尾よい成長を妨げかねない乾燥の期間をいう（すなわち、減少した活力、成長、サイズ、根の長さ、および／または種々の他の生理学的および物理的尺度）。改良された旱魃耐性を呈する植物は、非旱魃耐性植物よりも旱魃ストレスの条件下で良好に成長する。
【０１０９】
「窒素ストレス」は、本明細書中においては、作物に対して損害を引き起こし、またはそれらの首尾よい成長を妨げかねない窒素の存在の増加または減少いずれかと定義される（すなわち、減少した活力、成長、サイズ、根の長さ、および／または種々の他の生理学的および物理的尺度）。窒素ストレスに対して改良された耐性を呈する植物は、同一種からの適当な対照植物よりも低いおよび／または高い窒素ストレスの条件下で良好に成長する。窒素ストレスに対する改良された耐性についてアッセイする方法が知られている。例えば、その各々をここに引用して援用する、Ｓｅｐｅｈｒｉら（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３：５７８−５８４；Ｈｅｎｒｙら（１９９２）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  １５３：１７８−８５；Ｂａｎｚｉｎｇｅｒら（２０００）Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｄｒｏｕｇｈｔ  ａｎｄ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｉｚｅ：  Ｆｒｏｍ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｔｏ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｍｅｘｉｃｏ，Ｄ．Ｆ．：ＣＩＭＭＹＴ；Ｄｈｕｇｇａ  ａｎｄ  Ｗａｉｎｅｓ（１９８９）Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９：１２３２；およびＳｉｃｈｅｒら（２００５）Ｐｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ  １２３：２１９参照。
【０１１０】
従って、窒素同化を増加させ、収量を増加させ、および／または植物のストレス耐性を増加させる種々の方法が提供される。１つの実施形態において、窒素同化の増加、および／または収量の増加、および／または植物または植物部分のストレス耐性の増加は、植物または植物部分へ異種ポリヌクレオチドを導入し、次いで、植物または植物部分における異種ポリヌクレオチドを発現させることを含む。この方法において、異種ポリヌクレオチドの発現は、植物または植物部分における少なくとも１つのＤｏｆポリペプチドのレベル
を変調させ、ここに、Ｄｏｆポリペプチドは配列番号１４５に記載されたアミノ酸配列を有するＤｏｆドメイン、または該ドメインの改変体または断片を含む。
【０１１１】
特別な実施形態において、Ｄｏｆポリペプチドのレベルの変調は、少なくとも１つのＤｏｆポリペプチドのレベルの増加を含む。そのような方法において、植物へ導入された異種ポリペプチドは、Ｄｏｆドメイン、またはその生物学的に活性な改変体または断片を有するポリペプチドをコードする。特別な実施形態において、異種ポリペプチドは少なくとも１つの配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２２、２３、２５、２６、２８、２９、３１、３２、３４、３５、３７、３８、４０、４１、４３、４４、４６、４７、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、６２、６４、６５、６７、６８、７０、７１、７３、７４、７６、７７、７９、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２、１２３、１２５、１２６、１２８、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２または１５３に記載された配列および／またはその生物学的に活性な改変体または断片を含む。
【０１１２】
他の実施形態において、少なくとも１つのＤｏｆポリペプチドのレベルの変調は、少なくとも１つのＤｏｆポリペプチドのレベルを減少させることを含む。そのような方法において、植物に導入された異種ポリヌクレオチドは機能的Ｄｏｆポリペプチドをコードする必要はなく、むしろ、ポリヌクレオチドの発現の結果、Ｄｏｆドメイン、または該Ｄｏｆドメインの生物学的に活性な改変体または断片を含むＤｏｆポリペプチドの減少した発現をもたらす。特別な実施形態において、減少したレベルを有するＤｏｆポリペプチドは配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８０、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３５、１３８、１４１、１４４、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９または１６０の少なくとも１つ、またはその生物学的に活性な改変体または断片に記載されている。
【０１１３】
Ｄｏｆポリペプチドのレベルを変調するのに用いることができる例示的なプロモーターを本明細書中の他の箇所に記載する。１つの実施形態において、少なくとも１つのＤｏｆポリペプチドのレベルを変調するための異種ポリヌクレオチドの発現は、組織で好ましいプロモーター、特に、葉脈で好ましいプロモーター、葉で好ましいプロモーター（すなわち、葉肉で好ましいプロモーター、または維管束鞘で好ましいプロモーター）および／または種子で好ましいプロモーター（すなわち内乳で好ましいプロモーター、または胚で好ましいプロモーター）によって調節される。
【実施例】
【０１１４】
実施例１  トウモロコシＤｏｆ配列についての配列分析および発現データ
配列番号１ないし１４４および１４６に記載されたＤｏｆ配列の配列分析を行った。図２は、配列番号１ないし１４４および１４６によってコードされるＤｏｆドメインのまとめを供する。図２に記載された整列は、公に入手可能なツールのＥＭＢＯＳＳスイート中の「Ｎｅｅｄｌｅ」プログラムを用いて生じさせた。このプログラムはＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｖｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いる。例えば、ＧＡＰデフォルトパラメータ（すなわち、８のギャップペナルティ）を用いた。また、ｅｍｂｏｓｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ａｐｐｓ／ｎｅｅｄｌｅ．ｈｔｍｌ．参照。
【０１１５】
表１は、配列番号１ないし１４４および１４６、および１４７ないし１６０によってコ
ードされるポリペプチドに対する最高の配列同一性および類似性を有する配列のまとめを供する。表２は配列番号１ないし１４４および１４６によってコードされるポリペプチドの間で共有される全パーセント配列同一性のまとめを供する。表２に供される整列データは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ  ７．１の成分であるＶＮＴ１９．０  ＡｌｉｇｎＸツール（２００２年２月４日）を用いて生じさせた。
【０１１６】
表３はトウモロコシＤｏｆ配列の発現データのまとめを供し、古典的なＮＰＳＳデータと共に示された組織についての百万当たりの平均部を供する。
【０１１７】
【表１−１】
2009515522.tif 000004
【０１１８】
【表１−２】
2009515522.tif 000005
【０１１９】
【表１−３】
2009515522.tif 000006
【０１２０】
【表１−４】
2009515522.tif 000007
【０１２１】
【表２−１】
2009515522.tif 000008
【０１２２】
【表２−２】
2009515522.tif 000009
【０１２３】
【表２−３】
2009515522.tif 000010
【０１２４】
【表２−４】
2009515522.tif 000011
【０１２５】
【表３−１】
2009515522.tif 000012
【０１２６】
【表３−２】
2009515522.tif 000013
【０１２７】
【表３−３】
2009515522.tif 000014
実施例２  トウモロコシにおいて窒素同化を変調するためのＤｏｆ配列の過剰発現
温室ドナー植物からの未成熟トウモロコシ胚は、除草剤ビアラフォスに対する耐性を付与する、ＵＢＩプロモーターおよび選択マーカー遺伝子ＰＡＴ（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７０：２５−３７）の制御下で、（Ｚｍ−ＤＯＦ１、９、１０、１１、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１または２２のような）Ｄｏｆ配列を含有するプラスミドで衝撃する。別法として、選択マーカー遺伝子は別のプラスミドで供される。形質転換は以下のように行われる。媒体レシピは以下に従う。
【０１２８】
標的組織の調製
穂の皮を剥ぎ、表面を３０％クロロックス漂白剤＋０．５％ミクロ洗剤中で２０分間滅菌し、滅菌水で２回濯ぐ。未成熟胚を切り出し、５６０Ｙ培地上に４時間、プレート当たり２５胚にて、胚軸を横に倒し（胚盤を持ち上げ）、次いで、衝撃用の調製において２．５ｃｍ標的ゾーン内に整列させる。
【０１２９】
ユビキチンプロモーターに操作可能に連結されているＤｏｆ配列を含むプラスミドベクターを作成する。このプラスミドＤＮＡ＋ＰＡＴ選択マーカーを含有するプラスミドＤＮＡを、以下のように、ＣａＣｌ２沈殿手法を用いて１．１μｍ（平均直径）タングステンペレット上に沈殿させる：水中の１００μｌの調製されたタングステン粒子；トリスＥＤＴＡ緩衝液中１０μｌ（１μｇＤＮＡ（１μｇの合計ＤＮＡ）；１００μｌの２．５ｍ  ＣａＣｌ２；および１０μｌの０．１Ｍスペルミジン。
【０１３０】
マルチチューブボルテキサー上に維持しつつ、各試薬をタングステン粒子懸濁液に順次加える。最終混合物を軽く音波処理し、一定のボルテキシング下で１０分間インキュベートする。インキュベーション期間の後、チューブを軽く遠心し、液体を除去し、５００ｍｌの１００％エタノールで洗浄し、３０秒間遠心する。再度、液体を除去し、１０５μｌの１００％エタノールを最終タングステン粒子ペレットに加える。粒子銃衝撃のために、タングステン／ＤＮＡ粒子を軽く音波処理し、１０μｌを各マクロキャリアーの中心にスポットし、衝撃の前に約２分間乾燥する。
【０１３１】
試料プレートを粒子銃においてレベル＃４で衝撃する（米国特許第５，２４０，８５５号）。全ての試料は６５０ＰＳＩの単一ショットを受け、合計して１０のアリコットを調製された粒子／ＤＮＡの各チューブから採取する。
【０１３２】
衝撃に続き、胚を５６０Ｙ培地上に２日間維持し、次いで、３ｍｇ／リットルのビアラフォスを含有する５６０Ｒ選択培地に移し、２週間毎に継代培養する。ほぼ１０週間の選択の後、選択耐性カルスクローンを２８８Ｊ培地に移して、植物再生を開始する。体細胞胚成熟の後（２ないし４週間）、よく発達した体細胞胚を発芽のために培地に移し、照明を施した培養部屋に移す。ほぼ７ないし１０日後、発生する小植物を、小植物がよく樹立されるまで、チューブ中の無２７２Ｖホルモン培地に７ないし１０日間移す。次いで、植物を、鉢植え土壌を含有するフラット（２．５インチポットに相当）中のインサートに移し成長チャンバー中で１週間成長させ、引き続いて温室中でさらに１ないし２週間成長させ、次いで、古典的な６００ポット（１．６ガロン）に移し、成熟するまで成長させる。植物をモニターし、窒素使用効率の増加、収量の増大、またはストレス耐性の増加をスコア取りする。
【０１３３】
衝撃培地（５６０Ｙ）は４．０ｇ／ｌ  Ｎ６基礎塩（ＳＩＧＭＡ  Ｃ−１４１６）、１．０ｍｌ／ｌのＥｒｉｋｓｓｏｎビタミンミックス（１０００×  ＳＩＧＭＡ−１５１１）、０．５ｍｌ／ｌのチアミンＨＣｌ、１２０．０ｇ／ｌのスクロース、１．０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、および２．８８ｇ／ｌのＬ−プロリン（ＫＯＨでのｐＨ５．８への調整に続いてＤ−１  Ｈ２Ｏで一定容量とする）；２．０ｇ／ｌのゲルライト（Ｄ−１  Ｈ２Ｏで一定容量とした後に添加）；および８．５ｍｇ／ｌの硝酸銀（培地を滅菌し、室温まで
冷却した後に添加）を含む。選択培地（５６０Ｒ）は４．０ｇ／ｌのＮ６基礎塩（ＳＩＧＭＡ  Ｃ−１４１６）、１．０ｍｌ／ｌのＥｒｉｋｓｓｏｎビタミンミックス（１０００×ＳＧＭＡ−１５５）、０．５ｍｇ／ｌのチアミンＨＣｌ、３０．０ｇ／ｌスクロース、および２．０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ（ＫＯＨでのｐＨ５．８への調整後にＤ−１  Ｈ２Ｏで一定容量とする）；３．０ｇ／ｌのゲルライト（Ｄ−１  Ｈ２Ｏで一定容量とした後に添加）；および０．８５ｍｇ／ｌ硝酸銀および３．０ｍｇ／ｌのビアラフォス（共に培地を滅菌し、室温まで冷却した後に添加）を含む。
【０１３４】
植物再生培地（２８８Ｊ）は４．３ｇ／ｌのＭＳ塩（ＧＩＢＣＯ  １１１１７−０７４）、５．０ｍｌ／ｌのＭＳビタミンストック溶液（０．１００ｇニコチン酸、０．０２ｇ／ｌのチアミンＨＣＬ、０．０１ｇ／ｌのピリドキシンＨＣＬ、および精製Ｄ−１  Ｈ２Ｏで一定容量とした０．４０ｇ／ｌグリシン）（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ（１９６２）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１５：４７３）、１００ｍｇ／ｌのミオ−イノシトール、０．５ｍｇ／ｌのゼアチン、６０ｇ／ｌのスクロース、および１．０ｍｌ／ｌの０．１ｍＭアブシジン酸（ｐＨ５．６に調整した後に精製Ｄ−１  Ｈ２Ｏで一定容量としたもの）；３．０ｇ／ｌのゲルライト（Ｄ−１  Ｈ２Ｏで一定容量とした後に添加）および１．０ｍｇ／ｌのインドール酢酸および３．０ｍｇ／ｌのビアラフォス（培地を滅菌し、６０℃まで冷却した後に添加）を含む。無ホルモン培地（２７２Ｖ）は、滅菌され、６０℃まで冷却された、４．３ｇ／ｌのＭＳ塩（ＧＩＢＣＯ  １１１１７−０７４）、５．０ｍｌ／ｌ  ＭＳビタミンストック溶液（０．１００ｇ／ｌニコチン酸、０．０２ｇ／ｌチアミンＨＣＬ、０．１０ｇ／ｌピリドキシンＨＣＬ、および精製Ｄ−１  Ｈ２Ｏで一定容量とした０．４０ｇ／ｌグリシン）、０．１ｇ／ｌのミオ−イノシトール、および（５．６へｐＨを調整した後に精製Ｄ−１  Ｈ２Ｏで一定容量とした）４０．０ｇ／ｌスクロース；および６ｇ／ｌバクト−寒天（精製Ｄ−１  Ｈ２Ｏで一定容量とした後に添加）を含む。
【０１３５】
実施例３  トウモロコシにおける多数Ｄｏｆ配列の抑制
多数のトウモロコシＤｏｆ配列を、例えば、Ｚｍ−Ｄｏｆ１からのＤｏｆドメイン配列をコードするヌクレオチド配列を標的化するように設計されたＲＮＡｉ構築体を用いて抑制のために標的化することができる。簡単に述べれば、多数のＤｏｆ配列を標的化するために、ＤｏｆドメインをコードするＤＮＡ配列（またはＤｏｆドメインに対して少なくとも７０％、８０％、９０％以上の配列同一性を有する配列）を使用し、それを用いて、ベクター中に逆方向反復を作成する。例えば、Ｚｍ−Ｄｏｆ１（Ｄｏｆドメイン）：：ＡＤＨ１イントロン１：：ＡＴＴＢ２：：ＺＭ−Ｄｏｆ１を有する構築物（Ｄｏｆドメインを使用することができる）。
【０１３６】
少なくとも１つのＤｏｆ配列を特異的に標的化する１以上の抑制構築体でのトウモロコシのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換では、Ｚｈａｏの方法を使用する（その内容をここに引用して援用する米国特許第５，９８１，８４０号、およびＰＣＴ特許公開ＷＯ  ９８／３２３２６）。簡単に述べると、未成熟胚をトウモロコシから単離し、胚をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの懸濁液と接触させ、ここに、該細菌は種子で好ましいプロモーターに操作可能に連結されているＤｏｆ抑制配列を未成熟胚の少なくとも１つの少なくとも１つの細胞に移すことができる（工程１：感染工程）。この工程においては、未成熟胚を、接種の開始のためのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液に浸漬させる。胚をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと共に一定時間共培養する（工程２：共培養工程）。未成熟胚を、感染工程に続いて固体培地で培養する。この共培養期間に続き、最適な「休止」工程が考えられる。この休止工程において、植物形質転換体のための選択剤の添加なくして、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの成長を阻害することが知られた少なくとも１つの抗生物質の存在下で胚をインキュベートする（工程３：休止工程）。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの排除のために、および感染した細胞についての休止相のために、抗生物質を含むが、選択剤
を含まない固体培地上で未成熟胚を培養する。次に、接種した胚を選択剤を含有する培地で培養し、成長する形質転換カルスを回収する（工程４：選択工程）。未成熟胚を選択剤を含む固体培地上で培養し、その結果、形質転換された細胞が選択的に成長する。次いで、細胞を植物に再生し、（工程５：再生工程）、選択培地で成長したカルスを個体培地上で培養して、植物を再生する。
【０１３７】
Ｄｏｆ配列発現の減少は、Ｄｏｆ転写物のレベルについてアッセイすることによって直接的に測定することができるか、あるいは発現の減少は窒素同化の増加、ストレス応答の増加、または収量の増加についてアッセイすることによって測定することができる。
【０１３８】
実施例４  トウモロコシにおける個々の標的Ｄｏｆ配列の抑制
個々のＤｏｆ配列、あるいはＤｏｆ配列のサブセットは、Ｄｏｆ配列の所望のサブセットを標的化するように設計されたＲＮＡｉ構築体を用いることによって抑制について標的化することができる。例えば、ＤＯＦ１、ＤＯＦ１０、およびＤＯＦ１４は個々に標的化することができる。簡単に述べると、個々のＤｏｆ遺伝子を抑制するためには、各Ｄｏｆに対して特異的なＤＮＡ配列（すなわち、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲまたはＣＤＳの特異的領域）を用いて、逆方向反復を作製することができる。例えば、Ｄｏｆ  １  ３’ＵＴＲ、Ｄｏｆ１４コーディング配列の領域、またはＤｏｆ１０コーディング配列の領域を標的化することができる。例えば、Ｚｍ−Ｄｏｆ１（３’ＵＴＲ）：：ＡＤＨ１イントロン１：：ＡＴＴＢ２：：Ｚｍ−Ｄｏｆ１（３’ＵＴＲ）を含む構築体、またはＺｍ  Ｄｏｆ１４：：ＡＤＨ１イントロン１：：ＡＴＴＢ２：：Ｚｍ  Ｄｏｆ１４を含む構築体、またはＺｍ  Ｄｏｆ１０：：ＡＤＨ１イントロン１：：ＡＴＴＢ２：：Ｚｍ  Ｄｏｆ  １０を含む構築体を構築する。
【０１３９】
少なくとも１つのＤｏｆ配列を特異的に標的化する１以上の抑制構築体でのトウモロコシのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換では、Ｚｈａｏの方法を使用する（その内容をここに引用して援用する米国特許第５，９８１，８４０号、およびＰＣＴ特許公開ＷＯ  ９８／３２３２６）。簡単に述べると、未成熟胚をトウモロコシから単離し、胚をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの懸濁液と接触させ、ここに、該細菌は、未成熟胚の少なくとも１つの少なくとも１つの細胞へ、種子で好ましいプロモーターに操作可能に連結されているＤｏｆ抑制配列を移すことができる（工程１：感染工程）。この工程においては、未成熟胚を接種の開始のためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液に浸漬させる。胚をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと共に一定時間共培養する（工程２：共培養工程）。未成熟胚を感染工程の後に固体培地上で培養する。この共培養期間に続いて、任意の「休止」工程が阿考えられる。この休止工程において、植物形質転換体のための選択剤を添加することなく、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの成長を阻害することが知られた少なくとも１つの抗生物質の存在下で胚をインキュベートする（工程３：休止工程）。未成熟胚を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの排除のために、および感染した細胞についての休止相のために、抗生物質を含んだ、選択剤を含まない固体培地上で培養する。次に、接種された胚を選択剤を含有する培地で培養し、増殖する形質転換カルスを回収する（工程４：選択工程）。未成熟胚を選択剤を含む固体培地で培養し、その結果、形質転換された細胞が選択的に成長する。次いで、カルスを植物に再生し（工程５：再生工程）、選択培地で成長させたカルスを個体培地で培養して、植物を再生する。
【０１４０】
Ｄｏｆ配列発現の減少は、Ｄｏｆ転写物のレベルについてアッセイすることによって直接的に測定することができ、あるいは発現の減少は、窒素同化の増加、ストレス応答の増加、または収量の増加についてアッセイすることによって測定することができる。
【０１４１】
実施例５  大豆における窒素同化の変調
大豆胚を、以下のように、葉で好ましいプロモーターに操作可能に連結されている少な
くとも１つのＤｏｆ配列についての抑制カセットを含有するプラスミドで衝撃する。体細胞胚を誘導するために、大豆栽培品種Ａ２８７２の表面―滅菌未成熟種子から切り出した長さが３ないし５ｍｍの双子葉植物を適当な寒天培地上で２６℃にて明所または暗所で６ないし１０週間培養する。次いで、二次胚を生産する体細胞胚を切り出し、適当な液体培地中に入れる。初期球状―段階胚として増殖した体細胞胚のクラスターについての反復した選択の後、懸濁液を後に記載するように維持する。
【０１４２】
大豆胚原性懸濁液培養を、１６：８時間明／暗スケジュールにて、蛍光を用いる２６℃でのロータリーシェーカー１５０ｒｐｍ上の３５ｍｌの液体培地中に維持することができる。ほぼ３５ｍｇの組織を３５ｍｌの液体培地に接種することによって、培養を２週間ごとに継代培養する。
【０１４３】
次いで、粒子銃衝撃の方法によって、大豆胚原性懸濁液培養を形質転換することができる（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０−７３、米国特許第４，９４５，０５０号）。
【０１４４】
大豆形質転換を容易とするのに用いることができる選択マーカー遺伝子は、カリフラワーモザイクウイスルからの３５Ｓプロモーターから構成される導入遺伝子（Ｏｄｅｌｌら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）、（Ｅ．ｃｏｌｉからの；Ｇｒｉｔｚら（１９８３）Ｇｅｎｅ  ２５：１７９−１８８）プラスミドｐＪＲ２２５からのヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡからのノパリンシンターゼ遺伝子の３’領域である。葉で好ましいプロモーターに操作可能に連結されているＤｏｆ配列についての抑制カセットを含む発現カセットは、制限断片として単離することができる。次いで、この断片を、マーカー遺伝子を運ぶベクターのユニークな制限部位に挿入することができる。
【０１４５】
５０μｌの６０ｍｇ／ｍｌ  １μｍ金粒子懸濁液に、（この順番で）：５μｌのＤＮＡ（１μｇ／μｌ）、２０μｌのスペルミジン（１．０Ｍ）、および５０μｌのＣａＣｌ２（２．５Ｍ）を加える。次いで、粒子調製物を３分間撹拌し、マイクロヒュージ微小遠心管中で１０秒間回転させ、上清を除去する。次いで、ＤＮＡ被覆粒子を、一旦４００μｌの７０％エタノール中で洗浄し、４０μｌの無水エタノールに再度懸濁させる。ＤＮＡ／粒子懸濁液を各々１秒につき３回音波処理することができる。次いで、５マイクロリットルのＤＮＡ被覆金粒子を各マクロキャリアーディスクに付加する。
【０１４６】
ほぼ３００ないし４００ｍｇの２週間齢懸濁液培養を空の６０×１５ｍｍペトリ皿にいれ、残存する液体をピペットで組織から除去する。各形質転換実験では、ほぼ５ないし１０プレートの組織を通常に衝撃する。膜破壊圧を１１００ｐｓｉに設定し、チャンバーを２８インチ水銀の真空に引く。組織を保持するスクリーンからほぼ３．５インチ離し、３回衝撃する。衝撃に続き、組織を半分に分割し、液体に戻し、前記したように培養することができる。
【０１４７】
衝撃から５ないし７日後に、液体培地を新鮮な培地で交換し、衝撃から１１ないし１２日に後に、５０ｍｇ／ｍｌヒグロマイシンを含有する新鮮な培地と交換する。この選択培地を毎週新たに補給することができる。衝撃から７ないし８週間後に、緑色の形質転換した組織を形質転換していない壊死胚原性クラスターから成長しているのが観察できる。単離された緑色組織を取り出し、個々のフラスコに接種して、新しいクローン的に増殖させた形質転換胚原性懸濁液培養を得る。各新しい系を独立した形質転換事象として処理することができる。次いで、これらの懸濁液を継代培養し、未成熟胚のクラスターとして維持するか、あるいは個々の体細胞胚の成熟および発芽によって全植物に再生する。
【０１４８】
実施例６  トウモロコシにおけるＺＭ−ＤＯＦの操作
いくつかのＺＭ−ＤＯＦのコーディング領域をトウモロコシにおける過剰発現のために強力な構成的プロモーターであるＺＭ−ＵＢＩ  ＰＲＯによって駆動した。ターミネーター配列（ＮＯＳまたはＰＩＮＩＩ）をＤＯＦコーディング領域の下流で用いた。全てのトランスジェニック事象において、「ＵＢＩ：ＭＯＰＡＴ：ＰＩＮＩＩ」を除草剤耐性選択マーカーとして用い、これらのいくつかにおいて、トランスジェニック「ＺＭ−ＬＴＰ２ＰＲＯ：ＲＦＰ：ＰＩＮＩＩ」を用いて、分離する非トランスジェニック種子からトランスジェニック種子を分類した。いくつかの場合において、ＺＭ−ＰＥＰＣ１およびＺＭ−ＧＯＳ２のような他のプロモーターも用いて、各々、葉肉細胞を特異的に、およびＺＭ−ＤＯＦの弱い構成的発現を駆動した。全てのこれらのベクターを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介トウモロコシ形質転換プロトコルにしたがってｉｎｔｒｏＥＦ０９Ｂ遺伝子型に形質転換した。全ての過剰発現トランスジェニック事象において、導入遺伝子コピー数、導入遺伝子発現およびアクチン対照の点についての分子分析をＴ０事象で行った。各構築体において、Ｔ０事象をその構築体内で高、中程度および低導入遺伝子発現レベルについて分類した（表４参照）。単一コピー導入遺伝子発現（および／またはＲＦＰ発現種子）事象を選択して、さらなる実験のために進行させた。ＺＭ−ＵＢＩプロモーターによって駆動した場合に同系交配させたＢ７３からのＺＭ−ＤＯＦ１対立遺伝子は、いくつかの異なる形質転換実験において致死的であるように見えた。よって、トウモロコシ同系交配Ｈ８４からの公開された（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ  ａｎｄ  Ｉｚｕｉ（１９９２）ＪＢＣ
２８８：１６０２８）ＺＭ−ＤＯＦ１対立遺伝子をＲＴ−ＰＣＲによってクローン化した。Ｂ７３およびＨ８４同系繁殖体からのＤＯＦ１対立遺伝子は蛋白質レベルにおいて９７％同一である。リン酸化部位予測分析は、１００％確率でもって推定リン酸化部位である４７位置のセリンはＢ７３に存在するが、ＺＭ−ＤＯＦ１のＨ８４対立遺伝子において脱落していることが明らかとされる。転写因子の（リン酸化のような）翻訳後修飾はそれらの活性を修飾することが知られている。Ｈ８４同系繁殖体からのＺＭ−ＤＯＦ１対立遺伝子での形質転換実験は現在進行中である。ＺＭ−ＤＯＦ１、７、１０および１４についてのＲＮＩｉベクターも生じた。ＤＯＦ１  ＲＮＡｉベクター（ＰＨＰ２６３３９および２６３４０）のうちの２つは、Ｔ０トランスジェニック事象の分子分析が内因性ＤＯＦ１
ｍＲＮＡのいずれかの有意な低下を示さなかったため、リストからはずされた。単一導入遺伝子コピー、および１１の異なるＺＭ−ＤＯＦ関連ＰＨＰからの導入遺伝子発現植物は、現在、将来の場評価のためのさらなる実験およびテスト交雑についての種子を増加させるために遺伝子ナーサリー（ＧＮ）中にある。６つのＰＨＰは現在形質転換パイプラインにあり、Ｔ０事象は本年度の終わりまでには温室に入れられていると予測される。加えて、１２の異なるＤＯＦ関連ＰＨＰを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍはトウモロコシ形質転換のために準備ができている。全てのＤＯＦ−関連ＰＨＰおよびそれらの現在の状態の詳細を表４にまとめる。
【０１４９】
【表４】
2009515522.tif 000015
これらのトウモロコシトランスジェニック事象の継続した詳細な表現型分析（目視、分子的、生化学／酵素、生理学、ストレスなど）は行われつつある。
【０１５０】
実施例７  ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるＺＭ−ＤＯＦの過剰発現
トウモロコシにおけるＺＭ−ＤＯＦの過剰発現に加えて、構成的ＺＭ−ＵＢＩプロモーターの制御下でＺＭ−ＤＯＦを過剰発現するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓトランスジェニック系を作製した。いくつかの場合において、週構成的（ＺＭ−ＧＯＳ２）または葉肉細胞特異的プロモーター（ＺＭ−ＰＥＰＣ１）も用いて、ＺＭ−ＤＯＦの発現を駆動した。ターミネーター配列（ＮＯＳまたはＰＩＮＩＩ）をＤＯＦコーディング領域の下流で用いた。全てのトランスジェニック事象において、「ＵＢＩ：ＭＯＰＡＴ：ＰＩＮＩＩ」を除草剤耐性選択マーカーとして用いた。これらの過剰発現ベクターを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介「Ｆｌｏｒａｌ−Ｄｉｐ」方法によってＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａエコタイプＣｏｌｕｍｂｉａ−０に形質転換した（Ｃｌｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １６：７３５）。Ｔ０種子を除草剤耐性について土壌中のＴ１形質転換体でスクリーニングした。トランスジェニックＴ１事象の分子
分析では、ＲＴ−ＰＣＲを行って、導入遺伝子の発現、アクチン制御、およびＲＮＡ調製物におけるゲノムＤＮＡの存在を検出した。各構築体において、Ｔ１事象を、その構築体内で、高、中程度および低導入遺伝子発現レベルについて分類した（添付の表５参照）。導入遺伝子発現事象はさらなる研究のために進行させた。全Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて、トランスジェニック系を、２２の異なるＺＭ−ＤＯＦを表す２６の異なる過剰発現ＰＨＰについて作製した。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおける種々のＺＭ−ＤＯＦ過剰発現実験の状態を以下の表にまとめる。
【０１５１】
【表５】
2009515522.tif 000016
これらのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓトランスジェニック系の継続された詳細な表現型分析（目視、分子的、生化学／酵素、生理学、ストレスなど）は行われつつある。
【０１５２】
実施例８  ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるＵＢＩ  ＰＲＯ：：ＺＭ−ＤＯＦ１−Ｈ８４（ＰＨＰ２８８６５）過剰発現は、ＡｔＰＥＰＣ１およびＡｔＰＰＤＫ１をアップレギュレートする
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて過剰発現させる初期実験において、ＺＭ−ＵＢＩプロモーターの制御下で同系交配させたＢ７３トウモロコシからのＺＭ−ＤＯＦ１対立遺伝子は、いずれの導入遺伝子発現事象を生じなかった。この観察は、トウモロコシ形質転換実験で見出されたものと合致した。若い葉ＲＮＡに関してＲＴ−ＰＣＲによって同系交配させたＨ８４トウモロコシからの公開されたＺＭ−ＤＯＰ１のクローン（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ  ａｎｄ  Ｉｚｕｉ（１９９２）ＪＢＣ  ２８８：１６０２８）対立遺伝子を調製し
た。Ｂ７３およびＨ８４同系繁殖体からのＤＯＦ１対立遺伝子は蛋白質レベルにおいて９７％同一である。ＺＭ−ＵＢＩプロモーターで同系交配させたＨ８４からのＺＭ−ＤＯＦ１対立遺伝子の過剰発現の結果、いくつかの導入遺伝子発現事象がもたらされ、該事象のいくつかはＡｔＰＥＰＣ１（Ａｔ３ｇ１４９４０）およびＡｔＰＰＤＫ１（Ａｔ５ｇ０８５７）の有意なアップレギュレーションを示し、これは公表された研究で報告された結果と合致する（Ｙａｎａｇｉｓａｗａら（２００４）ＰＮＡＳ  １０１：７８３３）。また、実験により、ＡｔＰＥＰＣ１、ＡｔＰＰＤＫ１発現レベルの検出可能な有意な差を有しない葉肉細胞特異的ＺＭ−ＰＥＰＣ１プロモーターの制御下でＢ７３およびＨ８４同系繁殖体双方からＺＭ−ＤＯＦ１対立遺伝子を過剰発現するいくつかのトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ系が生じた。
【０１５３】
実施例９  ＺＭ−ＤＯＦ７は内乳特異的遺伝子である
初期オオヤマネコＭＰＳＳ発現分析は、ＺＭ−ＯＤＦ７が内乳ライブラリーにおいてのみ発現されることを示した。この観察を確認するために、飽和したＲＴ−ＰＣＲ（３５サイクル）を、トウモロコシ同系交配Ｂ７３の種々の器官から単離された全ＲＮＡで行った。Ｖ３実生、未成熟穂、成熟葉、内乳（１４ＤＡＰ）、若い葉、節間および根から単離された全ＲＮＡを用いて、ＺＭ−ＤＯＦ７遺伝子特異的（Ｐ８９４ＢＣ＃１１８４３  ＆  Ｐ８９５ＢＣ＃１８８９４４）およびＡＴ−アクチン２（Ｐ８１５ＢＣ＃９９５４７  ＆
Ｐ８１６ＢＣ＃９９５４８）プライマーでのＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。ＲＴ−ＰＣＲデータにより、ＺＭ−ＤＯＦ７はテストした異なる器官内でのみ内乳（１４ＤＡＰ）において発現されることが明らかとされる。
【０１５４】
実施例１０  ＺＭ−ＤＯＦ１０およびＺＭ−ＤＯＦ１４の細胞下局所化
細胞下局所化を決定するために、ＺＭ−ＤＯＦ１０およびＺＭ−ＤＯＦ１４にＦＲＰにタグを付し、強力な構成的ＺＭ−ＵＢＩプロモーターによって駆動した。ＲＦＰ単独を発現するベクターは、ＺＭ−ＵＢＩプロモーターの制御下で対照としても用いた。これらの３つの構築体を、ＲＦＰ融合蛋白質局所化のためにタマネギ表皮細胞に衝撃した。結果は、ＺＭ−ＤＯＦ１０−ＲＦＰおよびＺＭ−ＤＯＦ１４−ＲＦＰは核に圧倒的に局所化されており、他方、ＲＦＰ単独は他の箇所（例えば、サイトゾル）に多少存在することを明瞭に示す。初期オオヤマネコＭＰＳＳ発現分析は、ＺＭ−ＯＤＦ１０が先端分裂組織および未成熟穂ライブラリーで発現されることを示した。ＺＭ−ＤＯＦ１０の空間的発現パターンをさらに決定するために、Ｖ３シュート先端分裂組織（ＳＡＭ）および未成熟穂先端および基部でイン−サイチュウハイブリダイゼーション実験を行った。ＺＭ−ＤＯＦ１０のセンスおよびアンチセンスストランドのハイブリダイゼーションからのデータの比較は、ＤＯＦ１０がＶ３  ＳＡＭにおいて特異的細胞層で発現され、他方、未成熟穂においては、この遺伝子は先端（活発に成長する細胞、分裂組織）においてのみ発現されることを示唆する。
【０１５５】
実施例１１  Ｄｏｆ配列の改変体
Ａ．コードされたアミノ酸配列を改変しないＤｏｆ配列の改変体ヌクレオチド配列
配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２２、２３、２５、２６、２８、２９、３１、３２、３４、３５、３７、３８、４０、４１、４３、４４、４６、４７、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、６２、６４、６５、６７、６８、７０、７１、７３、７４、７６、７７、７９、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２、１２３、１２５、１２６、１２８、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２または１５３に記載されたＤｏｆヌクレオチド配列を用いて、適当な配列番号の出発未改変ＯＲＦヌクレオチド配列と比較した場合に
、約７０％、７６％、８１％、８６％、９２％および９７％ヌクレオチド配列同一性でもって、オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列を有する改変体ヌクレオチド配列を得る。これらの機能的改変体は、標準的なコドン表を用いて作成される。改変体のヌクレオチド配列は改変されているが、オープンリーディングフレームによってコードされるアミノ酸配列は変化しない。
【０１５６】
Ｂ．Ｄｏｆ配列の改変体アミノ酸配列
Ｄｏｆ配列の改変体アミノ酸配列が作成される。本実施例においては、１つのアミノ酸が改変される。具体的には、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８０、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３５、１３８、１４１、１４４、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９または１６０に記載されたオープンリーディングフレームをレビューして、適当なアミノ酸改変を決定する。変化に対するアミノ酸の選択は、（種々の種からの他のオルソログおよび他の遺伝子ファミリーのメンバーにて）蛋白質整列を検討することによってなされる。図１および表１参照。高選択圧下にあるようには見えない（高度に保存されていない）、かつ同様な化学的特徴（すなわち、同様な機能的側鎖）を持つアミノ酸によってむしろ容易に置換されるアミノ酸が選択される。図１、表１に記載された蛋白質整列組、および配列番号１４５に記載されたコンセンサス配列を用いて、適当なアミノ酸を変化させることができる。一旦標的化されたアミノ酸が同定されれば、実施例６Ａに概説された手法をその後行う。配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８０、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３５、１３８、１４１、１４４、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９または１６０に対して約７０％、７５％、８１％、８６％、９２％および９７％核酸配列同一性を有する改変体は、この方法を用いて作成される。
【０１５７】
Ｃ．Ｄｏｆ配列のさらなる改変体アミノ酸配列
本実施例においては、参照蛋白質配列に対して８２％、８７％、９２％および９７％同一性を有する人工蛋白質配列が作成される。この後者の努力は、図１および２に記載された整列からの保存されたかつ可変領域を同定すること、次いで、アミノ酸置換表の賢明な適用を必要とする。これらの部分は以下により詳細に議論する。
【０１５８】
主として、いずれのアミノ酸配列が改変されたかの決定は、Ｄｏｆ蛋白質の間の、または他のＤｏｆ蛋白質の間の保存された領域に基づいてなされる。図１、２および表１参照。配列整列に基づいて、改変できるらしいＤｏｆ配列の種々の領域は小文字で表され、他方、保存された領域は大文字によって表される。機能を変化させることなく、保存的置換を以下の保存された領域でなすことができることが認識される。加えて、当業者であれば、本発明のＤｏｆ配列の機能的改変体は保存されたドメインにおいて些細な非保存アミノ酸改変を有することができることを理解するであろう。
【０１５９】
次いで、８０ないし８５％、８５ないし９０％、９０ないし９５％、および９５ないし１００％同一性の間隔で元のものとは異なる人工的蛋白質配列が作成される。これらの間隔の中点が標的とされ、例えば、±１％の厳格でない寛容度である。アミノ酸置換は慣用的なＰｅｒｌスクリプトによって行われるであろう。置換の表を以下に表６に掲げる。
【０１６０】
【表６】
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まず、変化させるべきでない蛋白質中のいずれの保存されたアミノ酸も同定され、置換からの隔離のために「マークが付される」。開始メチオニンは、もちろん、このリストに自動的に加えられる。次に、変化がなされる。
【０１６１】
Ｈ、ＣおよびＰはいずれの状況においても変化されない。変化は最初にイソロイシンで起こり、Ｎ−末端ないしＣ−末端を掃引する。次いで、それが所望の標的に到達するまで、ロイシン等、リストを下る。数字の間の置換を、変化の逆行を引き起こさないようになすことができる。該リストは１ないし１７の順番であり、従って、ロイシン前では必要に応じて多くのロイシン変化で出発し、メチオニンまで下る。明らかに多くのアミノ酸は、このようにして、変化される必要がない。Ｌ、ＩおよびＶは２つの交互最適置換の５０：５０置換に関連した。
【０１６２】
改変体アミノ酸配列は出力として書かれる。Ｐｅｒｌ  ｓｃｒｉｐｔを用いて、パーセント同一性を計算する。この手法を用い、対応する配列番号の未改変ＯＲＦヌクレオチド配列に対して約８２％、８７％、９２％および９７％アミノ酸同一性を有するＤｏｆ配列の改変体が生じつつある。
【０１６３】
冠詞「ある」は、本明細書中においては、冠詞の文法的目的語の１以上（すなわち、少なくとも１）をいうのに用いる。その例として、「あるエレメント」は１以上のエレメントを意味する。
【０１６４】
明細書中で言及された全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する技術分野における技量のレベルを示す。全ての刊行物および特許出願は、あたかも各個々の刊行物または
特許出願が具体的かつ個々に示されて引用により援用されるのと同程度に引用により援用される。
【０１６５】
これまでの発明は、理解の明瞭性の目的で説明および実施例により幾分詳細に記載してきたが、ある種の変形および修飾は特許請求の範囲の範囲内で実施することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】図１は、コメからの種々のＤｏｆポリペプチドからの特徴付けられたＤｏｆドメインの整列を供する。
【図２Ａ】図２は、トウモロコシＤｏｆファミリーの種々のメンバーからのＤｏｆドメインの整列を供する。保存された領域は強調する。コンセンサスＤｏｆドメイン（配列番号１４５）は整列の上方に記載する。
【図２Ｂ】図２は、トウモロコシＤｏｆファミリーの種々のメンバーからのＤｏｆドメインの整列を供する。保存された領域は強調する。コンセンサスＤｏｆドメイン（配列番号１４５）は整列の上方に記載する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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