(57)【要約】本発明は、タンパク質を精製するための方法を提供する。特に、本方法は、インプロセス接線流ろ過工程を使用することなく、2工程非アフィニティーイオン交換クロマトグラフィープロセスを用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、標的タンパク質および1つまたは複数の混入物質を含む混合物を精製するための方法：
(a) 混合物を、陽イオン交換クロマトグラフィー工程およびその後の陰イオン交換クロマトグラフィー工程に供する段階、ならびに
(b) 標的タンパク質を単離する段階。
【請求項２】
以下の段階を含む、標的タンパク質および1つまたは複数の混入物質を含む混合物を精製するための方法であって、
該混合物が陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて部分的に精製されている、方法：
(a) 混合物を陰イオンクロマトグラフィー工程に供する段階、および
(b) 標的タンパク質を単離する段階。
【請求項３】
以下の段階を含む、抗体および1つまたは複数の混入物質を含む混合物を精製するための方法：
(a) 混合物を、陽イオン交換カラムクロマトグラフィーおよびその後の陰イオン交換クロマトグラフィーに供する段階、ならびに
(b) 標的タンパク質を単離する段階。
【請求項４】
混入物質が、宿主細胞タンパク質、宿主細胞代謝産物、宿主細胞構成タンパク質、核酸、内毒素、産物関連混入物質、脂質、培地添加剤、および培地派生物から選択される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
標的タンパク質が精製されて、約100百万分率（ppm）またはそれ以下の宿主細胞タンパク質および約10 pg/mgまたはそれ以下の核酸となる、請求項4記載の方法。
【請求項６】
ウイルス不活性化およびウイルス除去から選択される1つまたは複数の追加の工程をさらに含む、請求項1または3記載の方法。
【請求項７】
陰イオン交換クロマトグラフィーが、約4〜約10のpHおよび約0.1〜約10 mS/cmの伝導度で実施される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
陰イオン交換クロマトグラフィーが、約6.0〜約9.0のpHおよび約0.5〜約5 mS/cmの伝導度で実施される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
陰イオン交換クロマトグラフィーが膜を用いる、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
陽イオン交換クロマトグラフィーが、約3〜約10のpHおよび約0.1〜約40 mS/cmの伝導度範囲で実施される、請求項1または3記載の方法。
【請求項１１】
陽イオン交換クロマトグラフィーが、約4.0〜約9.0のpHおよび約0.5〜約15 mS/cmの伝導度で実施される、請求項1または3記載の方法。
【請求項１２】
陽イオン交換クロマトグラフィー工程が、スルホネート、カルボン酸、カルボキシメチルスルホン酸、スルホイソブチル、スルホエチル、カルボキシル、スルホプロピル、スルホニル、スルホキシエチル、およびオルトホスフェートより選択されるリガンドを使用する、請求項1または3記載の方法。
【請求項１３】
陽イオン交換クロマトグラフィー工程が、Poros HS、Poros S、カルボキシメチルセルロース、Sartobind S、BAKERBOND ABX(商標)、アガロース上に固定されたスルホプロピルおよびアガロース上に固定されたスルホニル、MonoS、MiniS、Source 15S、30S、Capto S、SP Sepharose、CM Sepharose、BAKERBOND Carboxy-Sulfon、WP CBX、WP Sulfonic、Hydrocell CM、Hydrocel SP、UNOsphere S、Macro-Prep High S、Macro-Prep CM、Ceramic HyperD S、Ceramic HyperD CM、Ceramic HyperD Z、Trisacryl M CM、Trisacryl LS CM、Trisacryl M SP、Trisacryl LS SP、Spherodex LS SP、DOWEX Fine Mesh Strong Acid Cation Resin、DOWEX MAC-3、Matrex Cellufine C500、Matrex Cellufine C200、Fractogel EMD SO3-、Fractogel EMD SE、Fractogel EMD COO-、Amberlite Weak and Strong Cation Exchanger、Diaion Weak and Strong Cation Exchanger、TSK Gel SP-5PW-HR、TSK Gel SP-5PW、Toyopearl CM（650S、650M、650C）、Toyopearl SP（650S、650M、650C）、CM（23、32、52）、SE（52、53）、P11、Express-Ion C、ならびにExpress-Ion Sより選択される樹脂または膜上で実施される、請求項1または3記載の方法。
【請求項１４】
陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、四級アンモニウムまたはアミン、ジエチルアミン、ジエチルアミノプロピル、アミノ、トリメチルアンモニウムエチル、トリメチルベンジルアンモニウム、ジメチルエタノールベンジルアンモニウム、ポリアミンより選択されるリガンドを使用する、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、DEAEセルロース、Sartobind Q、MonoQ、MiniQ、Source 15Q、Source 30Q、ANX Sepharose Fast Flow、Q Sepharose High Performance、Capto Q、QAE SEPHADEX(商標)、FAST Q SEPHAROSE(商標)、WP PEI、WP DEAM、WP QUAT、Hydrocell DEAE、Hydrocell QA、UNOsphere Q、Macro-Prep DEAE、Macro-Prep High Q、Ceramic HyperD Q、Ceramic HyperD DEAE、Spherodex LS DEAE、QMA Spherosil LS、QMA Spherosil M、Mustang Q、DOWEX Fine Mesh Strong Base Type I Anion Resin、DOWEX Fine Mesh Strong Base Type II Anion Resin、DOWEX MONOSPHER E 77、Dow Liquid Separations製の弱塩基性陰イオン、Intercept Q膜、Matrex Cellufine Q500、Matrex Cellufine A500およびMatrex Cellufine Q800、Fractogel EMD TMAE、Fractogel EMD DEAEおよびFractogel EMD DMAE、ならびにAmberliteより選択される樹脂または膜を用いて実施される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
標的タンパク質が抗体または抗体断片である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
抗体が完全ヒト抗体である、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
抗体またはその断片が、一本鎖抗体、ダイアボディ、直鎖抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、脱フコシル化（defucosylated）抗体、ペプチボディ、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFvより選択される、請求項16記載の方法。
【請求項２０】
標的タンパク質がイムノアドヘシンである、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
以下の段階を含む、関心対象のタンパク質を製造するための方法：
標的タンパク質を発現するよう操作された宿主細胞を培養する段階；
混合物中の標的タンパク質を回収する段階；および
請求項1〜3のいずれか一項により混合物を精製する段階。
【請求項２２】
関心対象のタンパク質が抗体または抗体断片である、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
精製タンパク質を薬学的組成物中に配合する工程をさらに含む、請求項21記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2006年3月20日に出願された米国仮特許出願第60/784,311号に対する優先権を主張するが、その全文は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ヒト療法における使用のために配合できる高レベルの精製を達成するための、インプロセス接線流ろ過工程を使用しない、2回のイオン交換工程を含む2工程非アフィニティープロセスを用いるタンパク質精製に関する。特に、本発明は、ポリペプチド（組換えタンパク質、抗体、抗体断片、FabおよびFv関連産物、一本鎖抗体、ダイアボディ、直鎖抗体、二重特異性抗体、抗体断片由来のものを含む多重特異性抗体、Fc様領域と抗体様分子との融合タンパク質、例えばイムノアドヘシンまたはペプチボディなど）および1つまたは複数の混入物質を含む組成物から、該ポリペプチドを精製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
タンパク質の大規模で経済的な精製は、生物薬剤産業にとって、益々重要な問題となってきている。治療タンパク質は、典型的には、関心対象のタンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えプラスミドから、このタンパク質を発現するように操作された原核または真核の細胞株を用いて産生される。細胞に供給された構成要素と細胞性副産物の混合物から所望のタンパク質を、適切な純度まで、例えばヒト治療用物質として使用するのに十分な純度まで分離することは、いくつかの理由から、生物製剤製造者にとって手強い課題となっている。
【０００４】
タンパク質ベースの薬学的製品の製造者は、極めて厳格な純度要件を含む、厳密な規制基準に従わなければならない。安全性を確実にするため、米国食品医薬品局（FDA）などの監督官庁は、タンパク質に基づく薬学的製品が、組換えタンパク質の凝集物、断片、および変異体などの製品関連混入物質、ならびに宿主細胞タンパク質、培地構成要素、ウイルス、DNA、および内毒素などのプロセス関連混入物質の両方を含む不純物を実質的に含まないことを要求している。生物薬剤産業では、多様なタンパク質精製スキームが利用可能でありかつ広く用いられているが、これらは典型的には、薬学的に許容される純度に到達するために、（抗体の場合にはプロテインA精製などの）アフィニティー精製工程を含む。
【０００５】
進歩したクロマトグラフィーおよびろ過法の出現にもかかわらず、治療グレードの純度を達成するための生物薬剤学的抗体精製に関する純度、収量、およびスループット要件を満たす捕捉工程として、アフィニティークロマトグラフィーが未だ使用されることが多い。プロテインAクロマトグラフィーは抗体に対する結合アフィニティーが高く（ヒトIgGに対して約10-8M）、かつ99.5%程度の多さの不純物を除去可能であるが、アフィニティークロマトグラフィーは、商業規模で治療タンパク質を精製する際に用いるには高コストな精製工程である。プロテインAは、非アフィニティー媒体よりもずっと高価であるだけでなく、樹脂の不安定性、清浄の困難さ、リガンド漏出、および、精製産物に混入したプロテインAまたはプロテインA関連化合物が免疫原性である可能性などの、問題も有する。しかし、アフィニティー媒体の高コストおよび不安定性は、タンパク質ベースの治療物質、特に高用量および/または長期投与を必要とする治療物質の、最終的なコストを増加させる。クロマトグラフィー単独で、下流処理費用の3分の2を占める可能性があり、かつモノクローナル抗体に関しては、アフィニティー捕捉カラム用の樹脂の費用が原材料費用を圧倒し得る（Rathore et al, Costing Issues in the Production of Biopharmaceuticals, BioPharm International, Feb 1, 2004（非特許文献1）を参照されたい）。
【０００６】
プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いたとしても、いくつかの精製工程を組み合わせなければ適切な純度は達成されないことが多く、したがって、費用がさらに増加し、産物収量が減少する。抗体は、市販の治療用生物製剤に占める割合が益々高くなりつつあり、癌、自己免疫疾患、感染性疾患、心臓血管疾患、および移植拒絶反応の治療のための開発においては、より少ない工程を用いかつしたがってより低いコストを実現しながらタンパク質を精製可能なプロセスが必要である。
【０００７】
その全文が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2003/0229212号（特許文献1）は、非アフィニティークロマトグラフィー精製工程の後に高性能接線流ろ過（HPTFF）工程を用いて宿主細胞タンパク質を含有する混合物から抗体を精製するための方法を記載している。CHOP（チャイニーズハムスター卵巣細胞タンパク質）の減少によって判定すると、この精製プロセスでは、陽イオン交換精製後に約144,780 ppm CHOP、陰イオン交換精製後に約410 ppm CHOP、およびHPTFF精製（最終工程）後に約17〜21 ppm CHOPの混入物質レベルが得られ、それによって、3工程非アフィニティープロセスが提供された。抗体を含有する混合物からタンパク質、DNA、および内毒素などの不純物（相対サイズを限定しない）を分離するためならびにタンパク質オリゴマーおよび分解産物を排除するために荷電膜を用いるHPTFFの精製工程は、最終純度を達成するのに必須であった。
【０００８】
さらに、HPTFFおよびその他の伝統的なTFF工程は以下の欠点を有する：(1) タンパク質治療用物質の開発、最適化、およびスケールアップにおいては余分な工程であり、膜清浄化、検証、大規模GMPカセット（HPTFFについてはまだ入手可能でない）の購入可能性、ならびに、さらなる緩衝液、装置、およびより長い処理時間を必要とする；および (2) （分解、凝集、または、分子活性に影響を及ぼす他の分子変化により）抗体完全性を損なうことによって、産物の損失可能性のリスクがある一方、コストを増加させる。
【０００９】
したがって、アフィニティーに基づく精製および他の多工程精製プロセスと比較してコストが低くインプロセスTFF工程を使用しない2工程非アフィニティープロセスから、高純度のタンパク質治療用物質を得ることが望ましいと考えられる。非アフィニティー精製プロセスが、宿主細胞タンパク質、核酸、内毒素、産物関連混入物質、例えば凝集型、酸化型、脱アミド化型、または分解型のタンパク質、および、培地添加剤、例えば脂質、ビタミン、インスリン、メトトレキセート、アミノ酸、グルコースなどの炭素供給源等を除去可能であれば、好都合であると考えられる。
【００１０】
多様な種類のタンパク質に適用可能で、拡大可能かつ制御可能であり、より安く再使用可能な樹脂を使用する精製スキームの開発は、薬剤開発全体における非常に早い段階でこのスキームを製品開発に組み込むことを可能にすると考えられる。精製スキームの設計に対するこのアプローチは、その他の方法では薬物開発後期に、またはより悪いことには認可後に必要となり得る製造プロセスへの費用のかかる変化を最小限にできる。プロセスが拡大されてGMP製造条件に近づくにつれて、樹脂充填および緩衝液調製に関連するものを含むさらなる固有の複雑さが生じる。処理工程を排除することにより精製スキームを単純化し、かつ処理量および生産性を最大限にする一方、精製される分子の完全性および純度を維持することによって、製造プロセスおよびその容量を改善することができる。したがって、従来の精製プロセスと比べて低コストで高品質かつ安全な薬剤物質を生じ得る、単純で効率的なプロセスで開始することは、望ましくかつ有利であると考えられる。
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第2003/0229212号
【非特許文献１】Rathore et al, Costing Issues in the Production of Biopharmaceuticals, BioPharm International, Feb 1, 2004
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明は、アフィニティークロマトグラフィー工程もインプロセス緩衝液交換工程（例えばTFFまたはHPTFF）も含まない2工程精製プロセスを用いることによって、ポリペプチドおよびタンパク質、特にモノクローナル抗体などの組換えタンパク質が、宿主細胞タンパク質および培地構成要素などの混入物質を含有する汚染混合物から精製可能であるという、予期せぬ知見に基づく。それどころか、第一の工程から第二の工程に移るには、pH操作および/または希釈しか必要でない。したがって、本発明の2工程プロセスは、類似の高レベルのタンパク質純度を達成するためのアフィニティークロマトグラフィーまたは多工程方法論に典型的に依るタンパク質精製の費用を、実質的に減少させる。
【００１３】
本発明において、無視し得る量の不純物（例えば、100百万分率（ppm）未満の量のCHOPなどの宿主細胞タンパク質および10 pg/mgまたはそれ以下の核酸）を含有する95%を上回るモノマーの高純度タンパク質組成物を得るために、アフィニティークロマトグラフィーやインプロセスTFF工程を使用することなく、陽イオン交換クロマトグラフィー（CEC）および陰イオン交換クロマトグラフィー（AEC）を用いて、治療グレードになるまでタンパク質を高度に精製する。また、本発明の精製プロセスは、エンドトキシン、産物関連混入物質、例えば凝集型、酸化型、脱アミド化型、または分解型のタンパク質、および、培地添加剤、例えば脂質、ビタミン、インスリン、メトトレキセート、アミノ酸、グルコースなどの炭素供給源等も除去する。
【００１４】
CECの後にAECを用いる本発明の精製法の特定の態様においては、有利なことにインプロセスTFF工程が存在せず、その結果として、大規模精製のためのずっと大きな容量、より多くの混入物質と結合する能力、および工程所要時間の著しい低減がもたらされる。
【００１５】
本発明は、治療グレードの組成物を調製する際に使用するのに適した高純度のタンパク質組成物を得るための、これらに限定されるわけではないが、抗体、Fc様領域との融合タンパク質、および抗体様分子、例えばイムノアドヘシンを含む組換えタンパク質の精製のための方法を提供する。結果として、本発明の方法の利点とは、高純度のタンパク質組成物が、治療グレードの薬物を調製する際に使用するのに適していることである。
【００１６】
したがって、一局面において、本発明は、以下の段階によって、標的タンパク質および1つまたは複数の混入物質を含有する混合物を精製するための方法である：(a) CEC精製工程およびその後のAEC精製工程に混合物を供する段階であって、インプロセスTEF工程の存在しない段階、ならびに (b) 標的タンパク質を単離する段階。特定の態様において、AEC工程は、陰イオン交換膜を使用する。
【００１７】
発明の詳細な説明
定義
本明細書で用いる「タンパク質」とは、一般に、ペプチド結合によって一緒に連結された少なくとも5アミノ酸またはそれ以上を有するペプチドおよびタンパク質を指す。タンパク質とは典型的に複合ポリペプチドであり、抗体、受容体、リガンド融合タンパク質（その天然状態では融合していない2つまたはそれ以上のポリペプチドの少なくとも一部を含む）、これらの断片および変種などであってもよく、例えば、その全文が参照により本明細書に組み入れられ、かつ本発明の方法にしたがって精製できる多様なタンパク質を列挙している、US2003022921およびUS20030166869を参照されたい。本発明の方法により精製されたタンパク質は、任意の生物（原核または真核）由来であってもよく、特に哺乳動物由来であってもよい。
【００１８】
「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、イムノアドヘシン、および抗体断片を含めるために、最も広い意味で用いられる。抗体または断片は、脱フコシル化（defucosylated）抗体のように改変されてもよい。抗体は、関心対象の「抗原」を、例えば生物学的に適切な治療用標的でありうるポリペプチドを、または非ポリペプチド抗原（例えば、腫瘍関連糖脂質抗原など；米国特許第5,091,178号を参照されたい）を対象としてもよい。好ましくは、抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または障害を患う哺乳動物への抗体の投与は、該哺乳動物において治療的恩典をもたらすことができる。ポリペプチド抗原には、膜貫通分子（例えば受容体）および増殖因子などのリガンドが含まれる。例示的な抗原には、上述のポリペプチドが含まれる。抗体を作製するための抗原の調製および抗体産生は、当技術分野において周知である。可溶性抗原、または任意で他の分子に接合されたその断片を、抗体を作製するための免疫原として用いることができる。受容体などの膜貫通分子に関しては、これらの断片（例えば受容体の細胞外ドメイン）を免疫原として用いることができる。あるいは、膜貫通分子を発現している細胞を免疫原として用いることができる。このような細胞は、天然供給源（例えば癌細胞株）に由来することができ、または、膜貫通分子を発現するように組換え技術によって形質転換された細胞であってもよい。
【００１９】
「抗体断片」には、全長抗体の少なくとも一部、および典型的にはその抗原結合領域または可変領域が含まれる。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片；一本鎖抗体分子；ダイアボディ；直鎖抗体；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００２０】
「モノクローナル抗体」という用語は慣用的な意味で用いられ、少量で存在し得る、潜在的な天然変異体を除いて、集団を構成する個々の抗体が同一であるような、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位を対象とする。これは、抗原の様々な決定基（エピトープ）を対象とした多様な抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的であり、これに対して、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。抗体の説明における「モノクローナル」という用語は、実質的に均質な抗体集団から得られるものとしての抗体の特性を示し、かつ何らかの特定の方法による抗体の産生を必要とすると見なされるべきではない。例えば、本発明で用いるモノクローナル抗体を、Kohler et al., Nature 256:495 (1975)に最初に記載された従来のハイブリドーマ技術を用いて産生することができ、または、組換えDNA法（例えば米国特許第4,816,567号を参照されたい）を用いて作製することもできる。例えば、Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)；ならびに米国特許第5,223,409号、同第5,403,484号、同第5,571,698号、同第5,427,908号、同第5,580,717号、同第5,969,108号、同第6,172,197号、同第5,885,793号、同第6,521,404号、同第6,544,731号、同第6,555,313号、同第6,582,915号、および同第6,593,081号に記載の技術を用いて、モノクローナル抗体をファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
【００２１】
本明細書記載のモノクローナル抗体には「キメラ」および「ヒト化」抗体が含まれ、ここで、重鎖および/または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の、対応する配列と同一であるかまたは相同である一方、残りの鎖が、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の、ならびに所望の生物学的活性を示すそのような抗体の断片中の、対応する配列と同一であるかまたは相同である（米国特許第4,816,567号；およびMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)）。非ヒト（例えばネズミ）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有するキメラ抗体である。大部分は、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここで、レシピエントの超可変領域残基は、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）由来の超可変領域残基で置換されている。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域（FR）残基は、対応する非ヒト残基で置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にもドナー抗体中にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに改良するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含むと考えられ、ここで、すべてまたは実質的にすべての超可変ループは、非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、かつすべてまたは実質的にすべてのFR領域は、ヒト免疫グロブリン配列のそれである。ヒト化抗体はまた、任意で、少なくとも一部の免疫グロブリン定常領域（Fc）も含み、これは典型的にはヒト免疫グロブリン由来である。さらなる詳細に関しては、Jones et al., Nature 321:522-525(1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照されたい。
【００２２】
上述のように調製されたマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて、キメラ抗体またはヒト化抗体を調製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするDNAを、関心対象のマウスハイブリドーマから得ることができ、かつ標準的分子生物学技術を用いて非マウス（例えばヒト）免疫グロブリン配列を含有するように操作することができる。例えば、キメラ抗体を作製するために、当技術分野で公知の方法を用いて、ヒト定常領域にマウス可変領域を連結することができる（例えば、Cabillyらに対する米国特許第4,816,567号を参照されたい）。ヒト化抗体を作製するために、当技術分野で公知の方法を用いて、ヒトフレームワーク内にマウスCDR領域を挿入することができる（例えば、Winterに対する米国特許第5,225,539号、ならびに、Queenらに対する米国特許第5,530,101号、同第5,585,089号、同第5,693,762号、および同第6,180,370号を参照されたい）。
【００２３】
また、本明細書記載のモノクローナル抗体には、例えばヒト患者の血液を含む多様な供給源から単離できる、または、トランスジェニック動物を用いて組換え的に調製できる、「ヒト」抗体も含まれる。そのようなトランスジェニック動物の例には以下が含まれる：ヒト重鎖トランスジーンおよびヒト軽鎖トランスクロモソームを有するKM-Mouse(登録商標) (Medarex, Inc., Princeton, NJ) (国際公開公報第02/43478号を参照されたい)、Xenomouse (登録商標) (Abgenix, Inc., Fremont CA；例えば、Kucherlapatiらに対する米国特許第5,939,598号、同第6,075,181号、同第6,114,598号、同第6,150,584号、および同第6,162,963号に記載)、およびHuMAb-Mouse (登録商標) (Medarex, Inc.；例えば、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al.(1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; およびFishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851、米国特許第5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、同第5,789,650号、同第5,877,397号、同第5,661,016号、同第5,814,318号、同第5,874,299号、同第5,770,429号、および同第5,545,807号、ならびにKormanらに対する国際公開公報第92/03918号、同第93/12227号、同第94/25585号、同第97/13852号、同第98/24884号、同第99/45962号、および同第01/14424に記載）。本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、免疫化の際にヒト抗体応答が生じ得るようにヒト免疫細胞が再構成されているSCIDマウスを用いても、調製可能である。そのようなマウスは、例えば、Wilsonらに対する米国特許第5,476,996号および同第5,698,767号に記載されている。
【００２４】
「超可変領域」という用語は、抗原結合の原因となる抗体のアミノ酸残基を記載するために用いる。超可変領域は、「相補性決定領域」すなわち「CDR」由来のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン内の残基24〜34（L1）、50〜56（L2）、および89〜97（L3）、ならびに重鎖可変ドメイン内の残基31〜35（H1）、50〜65（H2）、および95〜102（H3）；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)を参照されたい）、および/または、「超可変ループ」由来のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン内の残基26〜32（L1）、50〜52（L2）、および91〜96（L3）、ならびに重鎖可変ドメイン内の残基26〜32（H1）、53〜55（H2）、および96〜101（H3）；Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）を含む。「フレームワーク」すなわち「FR」残基とは、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００２５】
本明細書で用いる「イムノアドヘシン」という用語は、異種由来「アドヘシン」タンパク質（例えば受容体、リガンド、または酵素）の「結合ドメイン」と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを組み合わせた、抗体様分子を表す。構造的に、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識・結合部位（抗原と結合する部位）以外の（すなわち「異種由来」である）所望の結合特異性を持つアドヘシンアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合を含む。イムノアドヘシン中の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、好ましくは、γ1、γ2、またはγ4重鎖由来であるが、これは、これらの領域を含むイムノアドヘシンがプロテインAクロマトグラフィーによって精製可能であるためである（Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)）。本発明の方法にしたがって、イムノアドヘシンを精製することができる。
【００２６】
「ペプチボディ」とは、Fcドメインおよび少なくとも1つのペプチドを含む分子を指す。そのようなペプチボディは多量体であっても、二量体であっても、またはそれらの断片であってもよく、かつこれらは誘導体化されていてもよい。ペプチボディは、米国特許出願公開第20040214190号、国際公開公報第00/24782号、および国際公開公報第01/83525号により詳細に記載されており、これらはその全文が参照により本明細書に組み入れられる。
【００２７】
「リガンド結合ドメイン」という用語は、任意の天然の細胞表面受容体、または、対応する天然受容体の少なくとも定性的リガンド結合を保持するその任意の領域もしくは誘導体を指す。特定の態様において、受容体は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーに相同な細胞外ドメインを有する細胞表面ポリペプチドに由来する。免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーではないにもかかわらず明確にこの定義に含まれるその他の受容体とは、サイトカインに対する受容体であり、特に、チロシンキナーゼ活性を持つ受容体（受容体チロシンキナーゼ）、ヘマトポエチンおよび神経成長因子受容体スーパーファミリーのメンバー、ならびに細胞接着分子、例えば（E-、L-およびP-）セレクチンである。
【００２８】
「受容体結合ドメイン」という用語は、細胞接着分子を含む、受容体に対する任意の天然リガンドを、または対応する天然リガンドの少なくとも定性的な受容体結合能を保持するそのような天然リガンドの任意の領域もしくは誘導体を示すために用いる。この定義は、中でも、上述の受容体に対するリガンド由来の結合配列を特に含む。
【００２９】
「抗体-イムノアドヘシンキメラ」には、（本明細書で定義した）抗体の少なくとも1つの結合ドメインと少なくとも1つの（本出願において定義した）イムノアドヘシンとを組み合わせた分子が含まれる。例示的な抗体-イムノアドヘシンキメラは、Berg et al., PNAS (USA) 88:4723-4727(1991)およびChamow et al., J. Immunol. 153:4268(1994)に記載された、二重特異性CD4-IgGキメラである。
【００３０】
本明細書で用いる「混合物」は、関心対象のポリペプチド（精製が望まれる）と、1つまたは複数の混入物質、すなわち不純物とを含む。該ポリペプチドを産生する宿主細胞または生物から直接、混合物を得ることができる。限定を意図する訳ではないが、本発明の方法によって精製可能な混合物の例には、採取された細胞培養液、細胞培養上清、および調整（conditioned）細胞培養上清が含まれる。「部分的に精製」されている混合物は、既に、クロマトグラフィー工程、例えば非アフィニティークロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等に供されている。「調整混合物」とは、所望のクロマトグラフィー性能を達成するようにpHおよび/もしくは伝導度範囲ならびに/または緩衝マトリックスを設定するため、緩衝液交換、希釈、塩添加、pH滴定、またはろ過のうちの1つまたは複数に混合物を供することによって、本発明の方法において用いるクロマトグラフィー工程用に調製された、混合物、例えば細胞培養上清である。「調整混合物」を用いて、第一のクロマトグラフィーカラムへの装填条件を標準化することができる。一般的に、当技術分野で周知の多様な分離手段によって、例えば、ろ過または遠心分離を用いてバイオリアクター運転の終了時にブロス中の他の構成要素から死細胞と生存細胞を物理的に分離することによって、あるいは、細胞培養上清を濃縮および/またはダイアフィルトレーションして特定の範囲のpH、伝導度、および緩衝液種（buffer species）濃度とすることによって、混合物を入手できる。
【００３１】
「不純物」および「混入物質」という用語、ならびにその文法上の変形は、交換可能に用いられ、関心対象のタンパク質を含有する組成物から除去されることが望ましい、関心対象のタンパク質以外の任意の物質を意味する。混入物質には、これらに限定されるわけではないが、任意の生物学的巨大分子、例えば、宿主細胞タンパク質（例えばCHOP）、関心対象のタンパク質以外のポリペプチド、核酸（例えばDNAおよびRNA）、脂質、糖類、内毒素、細菌または酵母などその他の微生物、培地構成要素、および、クロマトグラフィー中に試料内に浸出し得るクロマトグラフィーで用いられる吸着剤の一部である任意の分子等が含まれる。
【００３２】
「関心対象のタンパク質」および「標的タンパク質」という用語は交換可能に用いられ、本発明の方法にしたがって混合物から精製することが望ましい、上述のようなタンパク質、例えば抗体を指す。
【００３３】
「宿主細胞タンパク質」、または「HCP」という用語は、標的タンパク質を発現する宿主細胞の代謝（細胞内および細胞外）に由来する任意のタンパク質を指し、宿主細胞のゲノムから発現する任意のタンパク質、または、組換え的に発現されかつ標的タンパク質とは見なされないタンパク質を含む。宿主細胞は、標的タンパク質を発現可能な任意の細胞、特に哺乳動物（例えばCHO、およびNS0などのマウス骨髄腫細胞株）、昆虫、細菌、植物、および酵母の細胞株であってもよい。本発明の特定の態様において、HCPは、「チャイニーズハムスター卵巣細胞タンパク質」または「CHOP」であり、これは、チャイニーズハムスター卵巣（「CHO」）細胞培養物由来の任意の宿主細胞タンパク質（「HCP」）を指す。一般にHCPは、関心対象のタンパク質を含有する細胞培養培地または溶解物[（例えば、採取された細胞培養液（「HCCF」））]中の不純物として存在する。関心対象のタンパク質を含む混合物中に存在するHCPの量は、関心対象のタンパク質の純度の程度の尺度を提供する。典型的には、タンパク質混合物中のHCPの量は、混合物中の関心対象のタンパク質の量に対する百万分率として表される。
【００３４】
「百万分率」または「ppm」という用語は、本明細書において交換可能に用いられ、本発明の方法によって精製される関心対象のタンパク質の純度の尺度を指す。単位ppmとは、タンパク質が溶液中にある場合、関心対象のタンパク質（ミリグラム/ミリリットル）あたりのHCPの量（ナノグラム/ミリリットル）を指す（すなわち、以下の実施例に記載するように、HCP ppm=(CHOP ng/ml)/(関心対象のタンパク質mg/ml)）。凍結乾燥などによってタンパク質を乾燥させた場合、ppmとは、(HCP ng)/(関心対象のタンパク質mg) を指す。
【００３５】
「純度」という用語およびその文法上の変形は、タンパク質および1つまたは複数の不純物を含有する混合物からの少なくとも1つの不純物の完全なまたは部分的な除去を意味するために用いられ、それによって（すなわち組成物中の不純物の量（ppm）を減少させることによって）、組成物中のタンパク質の純度レベルが向上する。本発明によると、2回の非アフィニティークロマトグラフィー工程により、かつインプロセスTFF工程を行うことなく、精製が実施される。本発明の方法により、関心対象のタンパク質を精製して、100 ppm未満のHCP、好ましくは90 ppm未満、80 ppm未満、70 ppm未満、60 ppm未満、50 ppm未満、40 ppm未満、30 ppm未満、または20 ppm未満のHCP（ELISAにより測定される）を含有する組成物を得ることができる。
【００３６】
本明細書で用いる「単離する」という用語およびその文法上の変形は、混入物質、不純物、および他の物質を実質的に含むことなく関心対象のタンパク質を含有する均質な組成物を得るために、別の物質から、例えば関心対象のタンパク質を精製するために用いたカラムまたは樹脂から、関心対象の精製タンパク質を分離することを指す。
【００３７】
「クロマトグラフィー」という用語は、プロセスの特定の緩衝条件下で、pI、疎水性、サイズ、および構造などの溶質の特性のために多少強く溶質を吸着させるかまたは保持する吸着剤を通じた混合物のパーコレーションによって、該混合物中の関心対象の溶質、例えば関心対象のタンパク質を、該混合物中の他の溶質から分離するプロセスを指す。「クロマトグラフィー」という用語の使用には、カラムタイプおよび膜タイプが含まれる。
【００３８】
「吸着剤」とは、関心対象の分子との直接相互作用または吸着剤に付着した化合物との相互作用のいずれかによる接着によってその表面に別の物質を吸着させることが可能な、任意の固形かつ不揮発性の物質である。多様な種類のクロマトグラフィーにおいて有用な吸着剤が当技術分野で周知であり、これらは商業的供給源を通じて容易に入手可能である。
【００３９】
「アフィニティークロマトグラフィー」および「タンパク質アフィニティークロマトグラフィー」という用語は交換可能に用いられ、通常は、結合部位における空間的相補性と1つまたは複数種類の化学的相互作用、例えば静電気力、水素結合、疎水性力、および/またはファンデルワールス力との組み合わせとしての、関心対象のタンパク質が可逆的かつ特異的に生体特異的リガンドに結合するタンパク質分離技術を指す。これらの相互作用は、等電点、疎水性、またはサイズなどの分子の全般的な特性に依るものではなく、例えばプロテインAと抗体の相互作用に関する疎水性で正確なタンパク質ドメインの適合などの、関心対象の分子とリガンドの特異的相互作用の結果である。プロテインAは吸着剤の例であり、これを、Fc領域を含有する分子を結合させるために固体支持体、例えばSepharoseに固定することができる。その全文が参照によって本明細書に組み入れられる、Ostrove (1990) in Guide to Protein Purification, Methods of Enzymology 182:357-379を参照されたい。
【００４０】
それぞれの特異的結合タンパク質を精製するために、任意のリガンドを用いることができる。好ましくは、二重特異性リガンドはクロマトグラフィー固相物質に共有結合し、溶液がクロマトグラフィー固相物質と接触するにつれて、溶液中の関心対象のタンパク質（例えば抗体、酵素、または受容体タンパク質）に接触可能となる。関心対象のタンパク質は、クロマトグラフィー工程の際に生体特異的リガンド（例えば抗原、基質、補因子、またはホルモン）に対する特異的結合アフィニティーを保持するが、一方、混合物中の他の溶質および/またはタンパク質は、認識可能にまたは特異的にリガンドに結合しない。固定化リガンドに関心対象のタンパク質が結合することによって、混入タンパク質およびその他の不純物はクロマトグラフィー媒体を通過可能になるが、一方、該関心対象のタンパク質は、固相物質上の該固定化リガンドに特異的に結合し続ける。次いで、低pH、高pH、低塩、高塩、競合リガンド等を用いて、特異的に結合したタンパク質を固定化リガンドから除去し、溶出緩衝液によってクロマトグラフィーカラムを通過させる。これより前にカラムを通過させた、関心対象のタンパク質と比べて相対的濃度が低い混入タンパク質、ならびに核酸および内毒素などの他の種類の混入物質もまた、存在し得る。
【００４１】
「特異的結合」および「結合特異性」という用語ならびにその文法上の変形は、関心対象のタンパク質とリガンドの間の一般に特異的かつ可逆的な相互作用を説明するものであり、これは、結合部位での静電気力、水素結合、疎水性力、および/またはファンデルワールス力の1つまたは複数種類と対になった、結合部位でのタンパク質およびリガンド構造の空間的相補性の効果の組み合わせを必要とする。リガンドは化学的に修飾可能な基を有するべきであり、これによって、その結合活性を破壊することなくマトリックスに付着することが可能になる。理想的には、リガンドは、結合物質に対して自由溶液中で10-4〜10-8 Mの範囲のアフィニティーを有するべきである。結合部位での空間的相補性が高く、かつ他の力が強くなればなる程、タンパク質の各リガンドに対する結合特異性が大きくなると考えられる。特異的結合の非限定的な例には、抗体-抗原結合、酵素-基質結合、酵素-補因子結合、金属イオンキレート化、DNA結合タンパク質-DNA結合、調節タンパク質-タンパク質相互作用等が含まれる。
【００４２】
「非アフィニティークロマトグラフィー」および「非アフィニティー精製」という用語は、アフィニティークロマトグラフィーを用いることなくむしろ溶質（例えば関心対象のタンパク質）と吸着剤マトリックスとの間の非特異的結合相互作用を必要とする、精製工程を指す。
【００４３】
本明細書で用いる「非特異的結合」という用語は、相互作用部位での非特異的相互作用による、例えば静電気力、水素結合、疎水性力、および/またはファンデルワールス力によるが、アフィニティー（特異的）結合などにおける非構造的な力の影響を増大させる構造的相補性を欠く、関心対象のタンパク質と固相マトリックスに結合したリガンドまたは他の化合物との間の相互作用を指す。アフィニティーではなく非特異的結合に依るクロマトグラフィープロセスの例には、イオン交換（例えば陰イオンおよび陽イオン交換）クロマトグラフィーおよび疎水性電荷誘導クロマトグラフィーが含まれる。
【００４４】
「疎水性電荷誘導クロマトグラフィー」（または「HCIC」）という用語は混合様式のクロマトグラフィープロセスの一種であり、ここで、混合物中の関心対象のタンパク質が、塩（例えば離液性の塩）を添加することなく弱疎水性相互作用を通じて、デュアルモードで（すなわち結合のための1つの様式および溶出のための別の様式が存在する）、イオン化可能リガンド [Boschetti et al., 2000, Genetic Engineering News 20(13)を参照されたい] に結合する。「疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂」とは、チオ親和性（thiophilic）効果（すなわちチオ親和性クロマトグラフィーの特性を利用する）、疎水性、およびイオン化可能基（その分離能力に関して）の特性の組み合わせを有するリガンドを含有する固相である。したがって、本発明の方法で用いられるHCIC樹脂は、中性（生理学的）または弱酸性のpHにおいて、例えば約pH5〜10、好ましくは約pH6〜9.5においてイオン化可能でありかつ弱疎水性であるリガンドを含有する。このpH範囲では、リガンドは主に非荷電であり、かつ弱非特異的疎水性相互作用を介して関心対象のタンパク質に結合する。pHが低下するにつれて、リガンドは電荷を獲得し、かつ、pHシフトのため、溶質に対する静電電荷反発によって疎水性結合が破壊される。
【００４５】
HCICにおける使用に適したリガンドの例には、任意のイオン化可能芳香族または複素環構造および色素（これらの誘導体を含む）が含まれる；Burton and Harding, Journal of Chromatography A 814: 81-81 (1998) およびBoschetti, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 49: 361-389 (2001)を参照されたく、これは、リンカーアームおよび/またはリガンド構造上に、脂肪族鎖および少なくとも1つの硫黄原子を含む。HCIC樹脂の例には、MEP HYPERCEL（Pall Corporation; East Hills, NY）が含まれる。
【００４６】
「イオン交換」および「イオン交換クロマトグラフィー」という用語は、関心対象の溶質が荷電化合物と非特異的に、混合物中の溶質不純物または混入物質よりも強くまたは弱く相互作用するように、関心対象のイオン化可能溶質（例えば、混合物中の関心対象のタンパク質）が、固相イオン交換物質に（例えば共有結合によって）連結された逆荷電リガンドと、適切なpHおよび伝導度の条件下で相互作用する、クロマトグラフィープロセスを指す。混合物中の混入溶質をイオン交換物質のカラムから洗い流すことができ、または、該混入溶質は、関心対象の溶質よりも速くもしくは遅く、樹脂に結合するかもしくは樹脂から排除される。「イオン交換クロマトグラフィー」には、特に、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、および混合様式クロマトグラフィーが含まれる。
【００４７】
「イオン交換物質」という用語は、負に荷電した固相（すなわち陽イオン交換樹脂）または正に荷電した固相（すなわち陰イオン交換樹脂）を指す。一態様において、1つまたは複数の荷電リガンド（または吸着剤）を、例えば共有結合によって固相に付着させることによって、電荷を供給することができる。あるいは、またはさらに、電荷は固相固有の特性を有することができる（例えば、全体的に負電荷を有するシリカの場合など）。
【００４８】
「陽イオン交換樹脂」とは、負に荷電し、かつ固相上または固相中を通過する水溶液中の陽イオンと交換するための遊離陽イオンを有する、固相を指す。陽イオン交換樹脂の形成に適した、固相に付着しかつ負に荷電した任意のリガンド、例えばカルボキシレート、スルホネート、および以下に記載するような他のものを用いることができる。市販されている陽イオン交換樹脂には、これらに限定されるわけではないが、例えば以下が含まれる：スルホネートに基づく基（例えば、GE Healthcare製のMonoS、MiniS、Source 15Sおよび30S、SP Sepharose Fast Flow(商標)、SP Sepharose High Performance、Tosoh製のToyopearl SP-650SおよびSP-650M、BioRad製のMacro-Prep High S、Pall Technologies製のCeramic HyperD S、Trisacryl MおよびLS SPおよびSpherodex LS SP）；スルホエチルに基づく基（例えばEMD製のFractogel SE、Applied Biosystems製のPoros S-10およびS-20）；スルホプロピルに基づく基（例えば、Tosoh製のTSK Gel SP 5PWおよびSP-5PW-HR、Applied Biosystems製のPoros HS-20およびHS 50）；スルホイソブチルに基づく基（例えばEMD製のFractogel EMD SO3-）；スルホキシエチルに基づく基（例えば、Whatman製のSE52、SE53、およびExpress-Ion S）；カルボキシメチルに基づく基（例えば、GE Healthcare製のCM Sepharose Fast Flow、Biochrom Labs Inc.製のHydrocell CM、BioRad製のMacro-Prep CM、Pall Technologies製のCeramic HyperD CM、Trisacryl M CM、Trisacryl LS CM、Millipore製のMatrex Cellufine C500およびC200、Whatman製のCM52、CM32、CM23、およびExpress-Ion C、Tosoh製のToyopearl CM-650S、CM-650M、およびCM-650C）；スルホン酸およびカルボン酸に基づく基（例えばJ.T. Baker製のBAKERBOND Carboxy-Sulfon）；カルボン酸に基づく基（例えばJ.T Baker製のWP CBX、Dow Liquid Separations製のDOWEX MAC-3、Sigma-Aldrich製のAmberlite Weak Cation Exchanger、DOWEX Weak Cation Exchanger、およびDiaion Weak Cation Exchanger、ならびにEMD製のFractogel EMD COO-）；スルホン酸に基づく基（例えば、Biochrom Labs Inc.製のHydrocell SP、Dow Liquid Separations のDOWEX Fine Mesh Strong Acid Cation Resin、J. T. Baker製のUNOsphere S、WP Sulfonic、Sartorius製のSartobind S膜、Sigma-Aldrich製のAmberlite Strong Cation Exchanger、DOWEX Strong Cation and Diaion Strong Cation Exchanger）；ならびに、オルトリン酸に基づく基（例えばWhatman製のP11）を有するもの。
【００４９】
望ましいならば、陽イオン交換樹脂の代わりに、陽イオン交換膜、例えばSartobind S（Sartorius; Edgewood, NY）を用いることができる。
【００５０】
「陰イオン交換樹脂」とは、正に荷電した、すなわち1つまたは複数の正荷電リガンドが付着した固相を指す。陰イオン交換樹脂を形成するのに適した、固相に付着した任意の正荷電リガンド、例えば四級アミノ基を用いることができる。例えば、AECにおいて使用するリガンドは、四級アルキルアミンおよび四級アルキルアルカノールアミンなどの四級アンモニウム、または、アミン、ジエチルアミン、ジエチルアミノプロピル、アミノ、トリメチルアンモニウムエチル、トリメチルベンジルアンモニウム、ジメチルエタノールベンジルアンモニウム、ならびにポリアミンであってよい。あるいは、AECについては、陰イオン交換樹脂の代わりに、上述のリガンドなどの正荷電リガンドを有する膜を用いることができる。
【００５１】
市販の陰イオン交換樹脂には、これらに限定されるわけではないが、以下が含まれる：Applied Biosystems製のDEAEセルロース、Poros PI 20、PI 50、HQ 10、HQ 20、HQ 50、D 50、GE Healthcare製のMonoQ、MiniQ、Source 15Qおよび30Q、Q、DEAEおよびANX Sepharose Fast Flow、Q Sepharose High Performance、QAE SEPHADEX(商標)、およびFAST Q SEPHAROSE(商標)、J.T. Baker製のWP PEI、WP DEAM、WP QUAT、Biochrom Labs Inc.製のHydrocell DEAE、およびHydrocell QA、Biorad製のUNOsphere Q、Macro-Prep DEAE、およびMacro-Prep High Q、Pall Technologies製のCeramic HyperD Q、ceramic HyperD DEAE、Q HyperZ、Trisacryl M、およびLS DEAE、Spherodex LS DEAE、QMA Spherosil LS、QMA Spherosil M、Dow Liquid Separations製のDOWEX Fine Mesh Strong Base Type IおよびType II Anion Resin、およびDOWEX MONOSPHER E 77、弱塩基性陰イオン、Millipore製のMatrex Cellufine A200、A500、Q500、およびQ800、EMD製のFractogel EMD TMAE、Fractogel EMD DEAE、およびFractogel EMD DMAE、Sigma-Aldrich製のAmberlite弱および強陰イオン交換体I型およびII型、DOWEX弱および強陰イオン交換体I型およびII型、Diaion弱および強陰イオン交換体I型およびII型、Duolite、Tosoh製のTSKゲルQおよびDEAE 5PWおよび5PW-HR、Toyopearl SuperQ-650S、650M、および650C、QAE-550Cおよび650S、DEAE-650Mおよび650C、ならびに、Whatman製のQA52、DE23、DE32、DE51、DE52、DE53、Express-Ion D、およびExpress-Ion Q。
【００５２】
望ましいならば、陰イオン交換樹脂の代わりに、陰イオン交換膜を用いることができる。市販の陰イオン交換膜には、Sartorius製のSartobind Q、Pall Technologies製のMustang Q、およびMillipore製のIntercept Q膜が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００５３】
「混合様式イオン交換樹脂」とは、陽イオン性、陰イオン性、および/または疎水性の部分で共有結合により修飾された固相を指す。混合様式イオン交換樹脂の例には、BAKERBOND ABX(商標) (J. T. Baker; Phillipsburg, NJ)、セラミックヒドロキシアパタイトI型およびII型ならびにフッ化物ヒドロキシアパタイト（BioRad; Hercules, CA）、Capto MMC（GE Healthcare; Waukesha, WI）ならびにMEPおよびMBI HyperCel（Pall Corporation; East Hills, NY）が含まれる。
【００５４】
「チオ親和性」という用語は、チオエーテル基にごく近接して存在するスルホン基に対して、タンパク質が有する選択性を指す（Porath et al, 1985）。「チオ親和性クロマトグラフィー」は、「チオ親和性吸着クロマトグラフィー」としても公知であり、チオ親和性領域および芳香族アミノ残基を含有する関心対象のタンパク質が、該タンパク質単離のための硫黄含有リガンドに結合する、非アフィニティークロマトグラフィーの一種である。（Sepharose 4Bと共役した）ジビニルスルホンをβ-メルカプトエタノールで還元することによって、チオ親和性ゲルを調製することができる。チオ親和性吸着クロマトグラフィーは、電子供与体-受容体特性に基づくものであり、疎水性に基づくクロマトグラフィーとは別個である。チオエチルスルホン構造は明白な疎水性もイオン電荷も包含しないため、疎水性会合およびイオン性相互作用はチオ親和性吸着剤によっては起こらない。市販のチオ親和性クロマトグラフィー樹脂の例には、Fractogel EMD TA（Merck KGaA; Darmstadt, Germany）、UniflowおよびSuperflow樹脂（Clontech; Mountain View, CA）、ならびにT-Gel（Pierce; Rockford, IL）が含まれる。
【００５５】
「固相」という用語は、1つまたは複数のリガンドが接着可能な任意の非水性マトリックスを意味するように用いられ、またはサイズ排除クロマトグラフィーの場合には、樹脂のゲル構造を指すことも可能である。固相は、この様式でリガンドに接着可能な任意のマトリックスであることができ、例えば精製カラム、別個の粒子の不連続相、膜、フィルター、ゲル等である。固相を形成するのに使用可能な物質の例には、多糖（アガロースおよびセルロースなど）およびシリカなどのその他の機械的に安定なマトリックス（例えば制御孔ガラス）、ポリ(スチレンジビニル)ベンゼン、ポリアクリルアミド、セラミック粒子、およびこれらのいずれかの誘導体が含まれる。本発明は、クロマトグラフィー工程で使用するための任意の特定の固相物質に限定されるものではなく、かつ当業者は、本発明における使用に関して適切な固相物質を選択可能であると考えられる。
【００５６】
ある種のクロマトグラフィーに言及するために本明細書において使用される「膜」とは概して、吸収特性を有する酢酸セルロースおよびポリフッ化ビニリデンなどのポリマーマイクロフィルターである。包装、制限、実証、または浄化および再利用試験の実施の必要がないので、クロマトグラフィーにおいて樹脂の代わりに膜を使用することは有利である。さらに膜は、その樹脂相対物よりもずっと高い、例えば200倍高いクリアランス能力値、および、わずか数分のサイクルをもたらす高い流速能力（flow rate capability）を提供し、これにより、混入物質除去に必要な時間を有意に短縮する。
【００５７】
溶出工程を用いる高速クロマトグラフィーにおいて、または、非常に大きな容積を処理できるフロースルーモードとして、膜を用いることができる。その結果、緩衝液の使用量は樹脂と比べて最大90%最小化され、これにより有意な経費削減がもたらされる。さらに、膜クロマトグラフィー技術によって、伝統的なクロマトグラフィー法よりも100倍程度速い流速におけるプロセススケールのDNA除去が提供され、これにより、製造シフトあたり大量の処理が可能になる。
【００５８】
実施の観点からは、吸収剤により気泡の発生を防止しなければならないが、これは膜構造を妨害するものではない。これらのフィルターの構造を考慮すると、その性能は基本的に、ポンプの種類など、付属装置の種類に依存しない。これらは、従来のクロマトグラフィーカラムのように拡散律速とならない。膜のマクロ多孔性構造のために、非常に大きな生体分子およびウイルスに対する結合能は、従来のゲルを用いた場合と比べて膜吸収剤を用いた場合には必然的に高くなる。
【００５９】
「界面活性剤」という用語は、イオン性、双性イオン性、および非イオン性の界面活性剤を指すが、これらは、タンパク質の凝集を防止するのにおよび関心対象のタンパク質への混入物質の非特異的相互作用または結合を予防するのに有用であり、かつ、衛生化（sanitization）、平衡化、装填、装填後洗浄、溶出、または剥離緩衝液を含む本発明で使用する多様な緩衝液中に存在できる。特定の態様において、界面活性剤を洗浄緩衝液に添加する。本発明で使用可能な界面活性剤の例には、これらに限定されるわけではないが、以下が含まれる：ポリソルベート（例えばポリソルベート20または80）；ポロキサマー（例えばポロキサマー188）；Triton；ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）；ラウリル硫酸ナトリウム；オクチルグリコシドナトリウム；ラウリル-、ミリスチル-、リノレイル-、またはステアリル-スルホベタイン；ラウリル-、ミリスチル-、リノレイル-、またはステアリル-ザルコシン；リノレイル-、ミリスチル-、またはセチル-ベタイン；ラウロアミドプロピル-、コカミドプロピル-、リノレアミドプロピル-、ミリスタミドプロピル-、パルミドプロピル-、またはイソステアラミドプロピル-ベタイン（例えばラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピル-、パルミドプロピル-、またはイソステアラミドプロピル-ジメチルアミン；ココイルメチルタウリンナトリウムまたはオレイルメチルタウリン二ナトリウム；MONAQUAT(商標)シリーズ（Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.）；Igepal CA-630、Pluronic、Triton、BRIJ、Atlas G2127、Genapol、HECAMEG、LUBROL PX、MEGA、NP、THESIT、TOPPS、CHAPS、CHAPSO、DDMAU、EMPIGEN BB、AWITTERGENT、およびC12E8が含まれる。界面活性剤を任意の作業緩衝液に添加することができ、また、関心対象の分子を含有するフィード中に含めることもできる。界面活性剤は、タンパク質精製プロセスにおける使用に適した任意の量、例えば約0.001%〜約20%、典型的には約0.01%〜約1%で存在しうる。特定の態様において、CECの洗浄緩衝液中で、ポリソルベート80を用いる。
【００６０】
本発明で用いる「緩衝液」は、その酸-塩基共役構成要素の作用によって、酸または塩基の添加によるpHの変化に耐性を有する溶液である。本発明の方法においては、緩衝液の所望のpHおよび精製プロセスの特定の工程に応じて、多様な緩衝液を使用することができる（Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975)を参照されたい）。本発明の方法のために望ましいpH範囲を制御するのに使用可能な緩衝液構成要素の非限定的な例には、以下が含まれる：酢酸、クエン酸、ヒスチジン、リン酸、アンモニウム緩衝液、例えば酢酸アンモニウム、コハク酸アンモニウム、MES、CHAPS、MOPS、MOPSO、HEPES、およびTris等、ならびにこれらの組み合わせである、TRIS-リンゴ酸-NaOH、マレイン酸、クロロ酢酸、ギ酸、安息香酸、プロピオン酸、ピリジン、ピペラジン、ADA、PIPES、ACES、BES、TES、トリシン、ビシン、TAPS、エタノールアミン、CHES、CAPS、メチルアミン、ピペリジン、0-ホウ酸、炭酸、乳酸、ブタンアンジオン酸、ジエチルマロン酸、グリシルグリシン、HEPPS、HEPPSO、イミダゾール、フェノール、POPSO、コハク酸、TAPS、アミンに基づく、ベンジルアミン、トリメチルもしくはジメチルもしくはエチルもしくはフェニルアミン、エチレンジアミン、または、モホリン（mopholine）。必要に応じて、さらなる構成要素（添加剤）を緩衝液中に存在させることができ、例えば、緩衝液イオン強度を調整するために、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、および塩化カリウムなどの塩を用いることができ；かつ、アミノ酸（グリシンおよびヒスチジンなど）、カオトロープ（尿素など）、アルコール（エタノール、マンニトール、グリセロール、およびベンジルアルコールなど）、界面活性剤（上記を参照されたい）、および糖（スクロース、マンニトール、マルトース、トレハロース、グルコース、およびフルクトースなど）などのその他の添加剤を用いることができる。使用する緩衝液構成要素および添加剤ならびに濃度は、本発明において実施されるクロマトグラフィーの種類に応じて変動可能である。
【００６１】
緩衝液のpHおよび伝導度は、精製プロセスにおけるどの工程で緩衝液を用いるかに応じて変動可能である。関心対象のタンパク質を精製するために、上述の緩衝液などの、選択された樹脂と適合するpHを有する任意の適切な緩衝液を用いることができる。CECにおいては、使用する精製工程および緩衝液に応じて、緩衝液のpHは3〜10の間、より好ましくは約4.0〜9.0の間であることができ；伝導度は約0.1〜40 mS/cm、より好ましくは約0.5〜15 mS/cmであることができる。AECにおいては、使用する精製工程および緩衝液に応じて、緩衝液のpHは約4〜10、より好ましくは約6.0〜9.0であることができ；伝導度は、約0.1〜10.0 mS/cm、より好ましくは約0.5〜5 mS/cmであることができる。精製プロセス全体で用いる緩衝液を、各クロマトグラフィー工程に関して、以下により詳細に記載する。
【００６２】
典型的に、「衛生化」溶液は、精製プロセス前に全ての結合混入物質、例えば生体起源のものを除去することによって、カラムクロマトグラフィーにおいて使用される樹脂を浄化するために用いられる。本発明の方法にしたがって選択される特定のカラムおよび樹脂と適合するという条件で、この目的のために任意の所望の緩衝液を用いることができる。好ましくは、衛生化溶液のpHは高く、例えばpH10またはそれ以上、より好ましくはpH11またはそれ以上、かつさらにより好ましくはpH12またはそれ以上であるか；あるいは、衛生化溶液のpHは低くてもよく、例えばpH4またはそれ以下、より好ましくはpH3またはそれ以下であってもよい。特定の態様において、本発明の方法において使用する樹脂は、1 N NaOH、pH ? 12を含む衛生化溶液を用いて浄化される。
【００６３】
「平衡化緩衝液」は、精製のために関心対象のタンパク質を含有する混合物と共に樹脂を装填する前に、CECまたはACEにおいて使用されるクロマトグラフィー媒体、例えば樹脂または膜のpHおよび伝導度を調整するために用いられる。例えば上述の緩衝液などの、この目的のために用いることができる適切な緩衝液が当技術分野で周知であり、これには、関心対象のタンパク質を精製するためのクロマトグラフィー工程に用いられる、選択された樹脂と適合可能なpHの任意の緩衝液が含まれる。特定の態様において、CECおよびAEC用の平衡化緩衝液種は、ホスフェートまたはTRISベースである。
【００６４】
平衡化緩衝液は、CECかAECのどちらを使用するかに基づき、関心対象のポリペプチドが樹脂に結合するような、または、関心対象のタンパク質がカラムを通過する一方で1つもしくは複数の不純物がカラムに結合するような、伝導度および/またはpHを有する。特定の態様において、クロマトグラフィー媒体のpHおよび伝導度がそれぞれ平衡化緩衝液の±0.2および±0.4 mS/cm内である場合、より好ましくは、それぞれ平衡化緩衝液の±0.1および±0.2 mS/cm内である場合に、平衡化は完了する。CECにおいて、平衡化緩衝液のpHは約3〜約9、より好ましくは約4.0〜約8.0であり、伝導度は約0.1〜約40 mS/cm、より好ましくは約0.5〜約10.0 mS/cmである。AECにおいて、平衡化緩衝液のpHは約4〜約10、より好ましくは約6〜9であり、伝導度は約0.1（WFI）〜約10 mS/cm、より好ましくは約0.5〜約5 mS/cmである。
【００６５】
「装填緩衝液（loading buffer）」は、関心対象のタンパク質を含有する混合物をカラムに装填するために用いられる。クロマトグラフィー媒体として膜を使用する場合、したがって、当技術分野で使用する従来法により装填緩衝液は膜に単に接触するだけであることが認識されよう。装填緩衝液として、任意の適切な緩衝液を用いることができる。特定の態様において、装填緩衝液はリン酸緩衝液またはTRIS緩衝液である。CECについては、装填緩衝液の伝導度およびpHは、混入物質が貫流できる一方で関心対象のタンパク質がクロマトグラフィー媒体に結合するように選択される。AECについては、装填緩衝液の伝導度およびpHは、混入物質がクロマトグラフィー媒体によって保持される一方で関心対象のタンパク質が貫流できるように選択される。例えば上述のものなど、装填緩衝液としての使用に適した緩衝液は、当技術分野において周知である。CECおよびAEC用の平衡化緩衝液に関して上述したのと同等の（同一でないとしても）pHおよび伝導度において、CECおよびAEC用の装填緩衝液を使用できることが、当業者には認識されよう。
【００６６】
本明細書で使用する「洗浄緩衝液」または「装填後洗浄」という用語は、（例えばカラムを用いる場合に）関心対象のタンパク質を溶出する前に、クロマトグラフィー樹脂から1つまたは複数の不純物を除去するために用いられる緩衝液を指す。「洗浄」という用語、およびその文法上の変形は、クロマトグラフィー樹脂の内部またはその表面の適切な洗浄緩衝液の通過を記載するために用いる。本発明において洗浄緩衝液は、カラムから産物を「押し出す」ためにCECにおいて使用されており、AECにおいても使用可能であるが、必須ではない。関心対象のタンパク質はAEC膜媒体によって保持されるわけではないので、膜AECにおいて洗浄緩衝液は必須ではない。望ましいならば、洗浄、平衡化、および装填緩衝液は、同一であってもよい。CECにおいて使用される洗浄緩衝液のpHおよび伝導度は、樹脂が関心対象のポリペプチドを保持する一方で1つまたは複数の不純物が樹脂から溶出されるようなものである。望ましいならば、洗浄緩衝液は、上述したような、ポリソルベートなどの界面活性剤を含有してもよい。関心対象のタンパク質が有意に溶出されることなくHCPおよび他の混入物質が除去されるように洗浄緩衝液のpHおよび伝導度を選択することが、重要である。平衡化緩衝液および装填緩衝液について上述したpHおよび伝導度の条件は、十分にこの目的を達成する。関心対象のタンパク質よりも高い親水性および高い酸性または塩基性を有する混入物質を除去するため、ならびに、溶出工程の前に系の伝導度を低下させるために、混合物装填後に、CECのその後の洗浄工程で用いる洗浄緩衝液において、伝導度およびpHを低下させるか、維持するか、または上昇させることができる。
【００６７】
プロセスで用いるCEC樹脂中で関心対象のタンパク質が保持されるように、洗浄緩衝液のpHおよび伝導度を選択する。洗浄緩衝液としての使用に適した緩衝液の例は上述されている。特定の態様において、洗浄緩衝液はホスフェートまたはTRISベースである。
【００６８】
CECで用いる洗浄緩衝液のpHは約3〜約10であってよく、より好ましくは約4〜約9であり；伝導度は約0.1〜約40 mS/cm、より好ましくは約0.5〜約5 mS/cmである。
【００６９】
本明細書で用いる「溶出緩衝液」という用語は、CEC樹脂から関心対象のタンパク質を溶出させるために用いる緩衝液を指す。「溶出させる」という用語およびその文法上の変形は、関心対象のタンパク質が樹脂に結合不能でありかつしたがってクロマトグラフィーカラムから溶出されるような適切な条件を用いることによって（例えばクロマトグラフィー物質周囲の緩衝液のイオン強度もしくはpHを改変することによって、リガンドに対する競合分子を添加することによって、分子の疎水性を改変することによって、またはリガンドの化学特性（例えば電荷）を変化させることによって）、分子、例えば関心対象のポリペプチドをクロマトグラフィー物質から除去することを指す。「溶出液」という用語は、溶出をカラムに適用した際の、関心対象のポリペプチドを含有するカラムからの流出液を指す。関心対象のポリペプチドの溶出後、必要に応じて、カラムを再生し、衛生化し、かつ保存することができる。
【００７０】
プロセスにおいて用いる特定のCEC樹脂から関心対象のタンパク質が溶出されるように、溶出緩衝液のpHおよび伝導度を選択する。溶出緩衝液としての使用に適した緩衝液の例は上述されている。特定の態様において、溶出緩衝液はホスフェートまたはTRISベースである。
【００７１】
CECで用いる溶出緩衝液のpHは約3〜約10、より好ましくは約4〜約9であってよく；伝導度は約0.1〜約40 mS/cm、より好ましくは約5〜約15 mS/cmであってよい。
【００７２】
望ましいならば、さらなる溶液を用いて、再利用のためにカラムを調製してもよい。例えば「再生溶液」を用いて、精製プロセスで用いたカラムから、強固に結合した混入物質を「剥離」または除去することができる。典型的には、再生溶液は、実質的に全ての残存不純物および関心対象のタンパク質を樹脂から除去するのに十分な伝導度およびpHを有する。
【００７３】
AEC膜は関心対象のタンパク質に結合せず、かつ再利用されない。したがって、使用前に平衡化緩衝液を用いた平衡化しか必要としないので、膜AECを使用することは有利であり得る。膜AECで用いる平衡化緩衝液のpHは約4〜約10であってよく、より好ましくは約6〜約9であり；伝導度は約0.1〜約10 mS/cm、より好ましくは約0.5〜約5 mS/cmである。
【００７４】
本明細書で用いる「伝導度」という用語は、水溶液が、特定の温度で2つの電極間に電流を伝導する能力を指す。電流は、溶液中のイオン輸送によって流れる。したがって、水溶液中に存在するイオンの量が増加するにつれて、溶液はより高い伝導度を有すると考えられる。本発明の方法において、精製が典型的に行われる温度は、特定のpH範囲内で約4℃〜約37℃、より好ましくは約15℃〜約25℃であってもよい。
【００７５】
伝導度の測定値の単位は、センチメートルあたりのミリジーメンス（mS/cm）であり、標準的な伝導度計を用いて測定可能である。そのイオン濃度を変化させることによって、溶液の伝導度を改変することができる。例えば、所望の伝導度を得るために、溶液中の緩衝剤の濃度および/または塩（例えばNaClまたはKCl）の濃度を改変してもよい。好ましくは、以下の実施例に記載するように、塩濃度を調節して所望の伝導度を得る。
【００７６】
ポリペプチドの「pI」または「等電点」とは、ポリペプチドの正電荷がその負電荷と平衡を保つpHを指す。多様な従来の方法論によって、例えばポリペプチド上のアミノ酸および/またはシアル酸残基の正味電荷から、または等電点分離法を用いることによって、pIを計算することができる。
【００７７】
本明細書で用いる「低pH保持」とは、ウイルス不活性化（すなわちウイルス力価の少なくとも2対数減少、より好ましくは少なくとも3対数減少）を達成するための関心対象のタンパク質を含有する溶出液のpHの低下（ここで、pHは、約pH5未満まで、好ましくは約pH4未満まで、より好ましくは約pH3.7未満まで、最も好ましくは約pH3.4〜約3.6まで低下する）と、その後の、第二のクロマトグラフィー工程用に溶出液を調製するため、または関心対象の産物の分子完全性に安定性を与えるマトリックスへと産物を運ぶためのpHの上昇を指す。低pH保持に関してpHを低下させるため、関心対象のタンパク質を含有する溶出液に任意の適切な酸、例えば1 N HClまたは氷酢酸ベースの溶液を適用することができる。pHをより中性の範囲に戻すため、溶出液に任意の適切な塩基、例えば1 N NaOHまたは1 N Trisを適用することができる。
【００７８】
「接線流ろ過」または「TFF」または「交差流ろ過」は、膜の上方全体に試料混合物が循環する一方で、印加された圧力によって特定の溶質および小分子が膜を通過する、ろ過プロセスを指す。TFFでは、典型的に、溶液はフィルター膜と平行に流れる。膜を介した圧力差によって、流体およびろ過可能溶質（膜の分子量より小さい分子量を有するかまたはそのように挙動するもの、例えば球状タンパク質）がフィルターを通過する。溶液が膜上を繰り返し通過する一方で、フィルターを通過した流体は別個の回路へと継続的に取り除かれるため、これを連続流プロセスとして行うことができる。HPTFF（高性能接線流ろ過）においては、膜が荷電されており、したがって混入物質を分離するために分子のサイズおよび電荷の両方を用いる（米国特許公報2003/0229212を参照されたい）。望ましいならば、TFFを用いて緩衝液を交換することができ、ここで、本発明の方法を開始する前に、クロマトグラフィー樹脂表面への結合により適した別の緩衝液に対して関心対象のタンパク質が可溶化される。しかし、本方法において、クロマトグラフィーの間に使用する緩衝液およびリガンドの性質により第一の精製工程から次の工程の直接移動が可能となるので、インプロセスTFF工程（すなわち、2回のクロマトグラフィー工程の間にTFFを行う）は必須ではない。
【００７９】
本明細書で使用する「インプロセス」とは、CECを用いた捕捉工程開始の後でありかつAECの間の関心対象のタンパク質収集の完了よりも前に実施される、任意の方法論、工程、操作等を指す。インプロセス方法論は純度の変化を直接引き起こすことができるが（例えばインプロセスTFF）、純度の変化を引き起こすのに必須ではない（例えばpHおよび/または伝導度の操作）。
【００８０】
本発明の方法を用いて治療グレードのタンパク質純度を達成することが望ましい可能性があり、この場合、任意で、当技術分野で周知のさらなる工程を使用することができる。例えば、外来および内在ウイルスの両方に対するウイルスクリアランス能を達成するために、荷電膜ろ過（例えば、CUNO製のVR CUNO、Pall Technologies製のDV20、およびAsahi製のPlanovaフィルター）を含む、低pH不活性化およびウイルスろ過法を使用することができる。
【００８１】
本明細書で用いる「深層ろ過」とは、典型的にはフィルターマトリックス内に粒子を保持するための設計を有することを特徴とする深層フィルターを用いる、ろ過法である。深層フィルターの容量は典型的に、例えば10インチまたは20インチのマトリックスの深さ、およびしたがって、固体の保持容量によって規定される。本発明の方法において、精製スキームのウイルスクリアランス能を改善するために深層フィルターを用いることができるが、これは任意の工程であり、かつ本発明の方法の純度レベルを達成するために必要ではない。ウイルス除去用の深層フィルターは精製スキームの間の任意の時点で使用可能であるが、フィルターのコストが高いため、好ましくは、処理容積が小さな第一のクロマトグラフィー工程後に用いられる。
【００８２】
プロセスの説明
本発明の方法において、関心対象のタンパク質を精製して、HCP約100 ppmまたはそれ以下およびDNA 10 pg/mgまたはそれ以下といった低純度、ならびにモノマー純度99%以上といった高純度を達成するために、CECに続いてAECを用いる。この高レベルの純度を得るために、TFFもさらなるクロマトグラフィー工程も必要ではない。
【００８３】
関心対象のタンパク質を産生するように遺伝子操作されている生存宿主細胞によって、該タンパク質を産生または発現させることができる。細胞を遺伝子操作してタンパク質を産生する方法は、当技術分野において周知である。例えば、その各々が参照により特に本明細書に組み入れられる、Ausabel et al., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York)、ならびに米国特許第5,534,615号および同第4,816,567号を参照されたい。このような方法には、タンパク質をコードしかつその発現を可能にする核酸を、生存宿主細胞に導入する段階が含まれる。これらの宿主細胞は、培養物中で増殖している細菌細胞、真菌細胞、または好ましくは動物細胞であってもよい。細菌宿主細胞には、大腸菌（E. coli）細胞が非限定的に含まれる。適切な大腸菌株の例には以下が含まれる：HB101、DH5α、GM2929、JM109、KW251、NM538、NM539、および、外来DNAを切断することができない任意の大腸菌株。使用可能な真菌宿主細胞には、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、およびアスペルギルス属（Aspergillus）細胞が非限定的に含まれる。使用可能な動物細胞株のいくつかの例は、CHO、VERO、DXB11、BHK、HeLa、Cos、MDCK、293、3T3、NS0、およびWI138である。当業者に周知の方法を用いて新規動物細胞株を樹立することができる（例えば、形質転換、ウイルス感染、および/または選択による）。特定の態様において、関心対象のタンパク質はCHO細胞中で産生される（例えば、国際公開公報第94/11026号を参照されたい）。多様な種類のCHO細胞、例えばCHO-K1、CHO-DG44、CHO-DXB11、CHO/dhfr-、およびCHO-Sが、当技術分野で公知である。関心対象のタンパク質をコードする核酸を用いて操作された宿主細胞を、該タンパク質の発現を可能にする、当技術分野において周知の条件下で培養することができる。
【００８４】
細胞破片からのタンパク質精製のための混合物の調製は、始めに、タンパク質の発現様式に左右される。細胞から周辺の増殖培地中に直接分泌されるタンパク質もあり、細胞内に保持されるタンパク質もある。細胞内で産生されるそのようなタンパク質については、機械的剪断、浸透圧ショック、および酵素処理などの任意の多様な方法を用いて、細胞を破壊することができる。破壊によって細胞の全内容物がホモジネート中に放出され、さらに、遠心分離またはろ過によって除去可能な細胞下（subcellular）断片が生じる。より程度は低いが、直接分泌されるタンパク質についても、タンパク質産生実行過程の間の細胞の自然死および細胞内宿主細胞タンパク質の放出のために同様の問題が生じる。
【００８５】
組換え技術を用いると、関心対象のタンパク質を細胞内で産生するか、細胞周辺腔内で産生するか、または培地中に直接分泌することが可能である。本発明の方法は、細胞破片を除去するためのいかなる特定の方法論にも頼らない。これを達成するために実施者は任意の方法を使用できる。第一の工程として、タンパク質が細胞内で産生される場合、精製用の混合物を調製するために、例えば遠心分離またはろ過工程によって宿主細胞または溶解した断片のいずれの粒子状破片も除去することができる。タンパク質が培地中に分泌される場合、精製用の混合物を調製するために、例えば接線流ろ過（TTF）または深層ろ過によって細胞培養培地から組換え宿主細胞を分離してもよい。
【００８６】
本発明によると、関心対象のタンパク質を含有する混合物が得られたら（すなわち、適切な宿主細胞培養条件下で発現後に該タンパク質が回収されたら）、本明細書で上述のように、適切な条件下で、CECとAECの組み合わせを用いて（図1を参照されたい）混合物中の混入物質からの分離を行う。本発明の方法によって到達可能な純度レベルを達成するために、他のインプロセス精製工程、例えばTFFやHPTFFは必要ではない。第二のクロマトグラフィーの工程における精製用の混合物を調製するために、2回のクロマトグラフィー工程の間に、必要に応じてpH操作および/または希釈のみを行う。
【００８７】
特定の態様において、AEC工程は、四級アンモニウムイオンリガンドを使用する膜を用い、CEC工程は、樹脂に付着したスルホネートベースのリガンドを用いる。これらのクロマトグラフィー技術は、多様な特性、例えば電荷に基づいて、タンパク質の混合物を分離する。
【００８８】
望ましいならば、インプロセス工程として低pH保持を本方法に組み入れてもよいことが、当業者には認識されよう。治療タンパク質の産生に関して監督官庁がウイルスクリアランスを要求するため、異なる化学的作用機序に基づいて、ウイルス不活性化およびクリアランスのために少なくとも2つの別個の工程が存在しなければならないが、これらは典型的には低pH保持およびウイルスろ過工程である。本発明は、AEC工程の前後の任意の時点に低pH保持を収容することができる。AEC工程の適用前に関心対象のタンパク質を含有する混合物が適切に緩衝されているという条件で、当技術分野で公知の任意の方法論を用いて2回のクロマトグラフィー工程間でpH保持を遂行し、典型的には低pH保持によって達成されるウイルスクリアランスを遂行できることが、当業者には認識されよう。
【００８９】
低pH保持は、典型的には、少なくとも0.5 mS/cmの伝導度の上昇をもたらす。pH保持および中和の後に得られるpHは適切なpH範囲内にあると考えられ、これは、約4〜約10、好ましくは約6〜約9である。低pH保持工程は、本発明の方法によって到達可能な純度レベルを達成するために必須ではないことが、当業者には認識されよう。
【００９０】
例えば、酸および塩基の試薬またはpH値に関して限定する意図はないが、CEC溶出液のpH範囲を約3.4〜3.6まで低下させるために例えば1N HCl、リン酸、または氷酢酸を用い、その後、溶出液のpHを約7.0まで上昇させるために例えば2M Tris pH9.0を添加することで、低pH保持を実行することができる。多様な酸および塩基を適用できることが、当業者には認識されよう。
【００９１】
当業者は、本発明の方法で用いる低pH保持工程のための適切なタイミング条件を認識するであろう。典型的には、低pH保持は、少なくとも約15分間、好ましくは約30分間、より好ましくは約45分間、さらにより好ましくは最大約60分間、最も好ましくは最大約90分間行われる。特定の精製スキームにおいて、精製されるタンパク質に応じて、低pH保持を最大5時間行うことが望ましい可能性もある。あるいは、界面活性剤の添加によっておよび従来法により溶液中の接触時間を可能にすることによって、ウイルスを不活性化することができる。
【００９２】
治療グレードのタンパク質製剤が望ましい場合、次に、第二のウイルスクリアランス工程、例えばウイルスろ過工程を用いてもよいが、これは、本発明の方法によって到達可能な純度レベルを達成するのに必須ではない。ウイルスクリアランスにおいて有用なろ過装置は、当技術分野で周知である（例えば、Ultipor(登録商標) VF Grade DV20またはDV50およびFiltron(登録商標)TFF（Pall Corporation, East Hills, NY）；Viresolve（Millipore, Billerica, MA）；VR CUNO（CUNO; Meriden, CT）；ならびにPlanova(登録商標)（Asahi Kasei Pharma, Planova Division, Buffalo Grove, IL)）。ウイルスおよびその他の生体物質を除去するために、ポリオウイルスを除去することができる20 nm未満の孔径が、典型的に使用される。ウイルスろ過は、プロセス中の任意の時点に含めることができるが、典型的には、産物が精製され処理容積が最小限となったらすぐに実施される。
【００９３】
任意の機械的手段によって、本発明のクロマトグラフィー工程を行うことができる。カラム中でクロマトグラフィーを行ってもよい。圧力によりまたはそれなしで、上部から下部へまたは下部から上部へ、カラムを流すことができる。望ましいならば、当技術分野において周知の従来法によって、クロマトグラフィープロセスの間にカラム中の流体流れの方向を反転させてもよい。また、重力、遠心分離、またはろ過を含む任意の適切な手段によって試料を装填し、洗浄し、かつ溶出させるために用いる液体から固体支持体を分離するバッチプロセスを用いて、クロマトグラフィーを行ってもよい。また、クロマトグラフィー樹脂に関して記載されたのと同じ化学的原理を用いて、試料中の一部の分子を他のものより強く吸収または保持する荷電フィルターと試料を接触させることによって、クロマトグラフィーを行ってもよい。本発明で用いるカラムの調製における工程を実施者の個々の需要を満たすように調整することができるが、以下の説明は指針として提供されるものであって、当業者は、本発明の趣旨から逸脱することなく適切な改変を行ってもよいことを認識するであろう。製造者の指示にしたがって、カラムおよび膜を調製する。典型的には、精製前に、衛生化溶液を用いてカラムを衛生化し、次いで離液性の塩、例えば1 M NaClを用いて荷電し、平衡化緩衝液を用いて平衡化する。衛生化工程の際、典型的には、衛生化溶液をカラムに適用した後、例えば約15〜30分間、好ましくは約1時間保持し、生物学的起源の混入物質を含む任意の結合混入物質を有する樹脂を清浄化する。衛生化溶液を置換することによって荷電工程は樹脂を中和するが、例えばCECでは、NaClを用いてカラムからNaOHを除去し、正に荷電したイオンと樹脂リガンドとの接触を維持することができる。カラムが荷電された後、平衡化緩衝液を用いてカラムを平衡化して、関心対象のタンパク質と結合するように樹脂のpHおよび伝導度を調製する。例えば、そのpHおよび伝導度が、それぞれ、平衡化緩衝液のpHおよび伝導度の±0.1以内および±0.2 mS/cm以内である場合、カラムは平衡化されたと見なされ得る。
【００９４】
典型的には、濃縮されかつ適切な緩衝塩（すなわち装填緩衝液）中で緩衝液交換された細胞培養上清である、装填混合物を調製する。任意で平衡化緩衝液と同じであってもよい装填緩衝液を用いて、組換え宿主細胞に由来する装填混合物（すなわち、精製が望ましい関心対象のタンパク質を含有する）を、平衡化カラム（CEC）に装填する。混合物がカラムの固相を通って流れるにつれ、関心対象のタンパク質および他の不純物（例えばタンパク質がCHO細胞内で産生される場合にはHCP）が固相に差次的に結合し、それにより、タンパク質および混入物質がクロマトグラフィーカラムの中を通過しながらの分離が可能になる。
【００９５】
混合物をカラムに装填しかつ関心対象のタンパク質が樹脂に結合したら、記載のような洗浄緩衝液を用いた洗浄工程を行って、混入物質をカラムから除去する。任意で、他の洗浄工程および溶出工程より遅い流速で、例えば滞留時間数分間（例えば2〜30分間）に対応する流速を用いて、洗浄工程を行うことができる（必須ではない）。以下でより詳細に流速を論じる。HCPの除去を最大にするためには、洗浄緩衝液のpHおよび伝導度が重要である。本方法では、CECにおける洗浄工程によって核酸および残存HCPが除去される一方で、関心対象のタンパク質が保持される。
【００９６】
カラムから関心対象のタンパク質を溶出させるため、上述のように適切な溶出緩衝液を用いて、関心対象のタンパク質の結合を反転させてカラムから離す。緩衝液、塩、および/または緩衝液組成中のその他の化合物の種類および濃度は、不純物に対して関心対象のタンパク質が差次的に溶出されるというものである。本明細書に提供される実施例を指針として用いることで、当業者は、溶出の際に関心対象のタンパク質が回収されるような、装填、洗浄、および溶出緩衝液に適したpHおよび伝導度範囲を容易に決定できる。関心対象のタンパク質を含む溶出液中のHCPを最小限にするために、以下に記載のように流速を低下させる。関心対象のタンパク質がカラムから除去されるので、A280上昇からA280下降までのピークの形成に基づいて、これを回収する。ベースラインは、平衡化緩衝液がカラムの中を通過する間に平衡化緩衝液の吸光度を250〜280 nmで測定することによって、当業者により容易に決定可能である。関心対象のタンパク質を含有する精製組成物を調製するためにHCPの回収量を減少させるためには、関心対象のタンパク質を含有する溶出液を、最大ピーク高さの25%前に回収することが好ましい。
【００９７】
本質的には、本発明で用いる分離法が混入物質を長いカラムの下方へと様々な速度で移動させるが、このことによって、これらがさらにカラムの下方へと通過するにつれて増加する物理的分離が達成される一方で、関心対象のタンパク質がクロマトグラフィー媒体に付着し、その後、緩衝液に応じて差次的に溶出される。本発明の精製法において、混合物がカラムの下方に移動する低い流速とは、約2〜10分間の滞留時間、好ましくは30分間以下の滞留時間である。本発明の特定の態様において、クロマトグラフィー工程における流速は、約6分間以下の滞留時間に対応する。本発明の方法によって得られ得る純度レベルを達成するために流速は必須ではないが、指針の目的で、速度を提供する。当業者は、必要に応じて流速を修正できる。
【００９８】
本発明のプロセスによるタンパク質精製効率の好ましい尺度は、宿主細胞タンパク質除去の尺度である。精製タンパク質は、好ましくは、上で定義されたような均質な組成物である。精製の任意の段階における試料のタンパク質濃度を、任意の適切な方法によって測定することができる。そのような方法は当技術分野において周知であり、以下を含む：(1) Lowryアッセイ法、Bradfordアッセイ法、Smithアッセイ法、およびコロイド金アッセイ法などの比色法；(2) タンパク質のUV吸収特性を利用する方法；ならびに(3) 同じゲル上の公知の量のタンパク質標準との比較に依る、ゲル上の染色タンパク質バンドに基づく視覚的評価。例えば、Stoschek (1990), Quantitation of Protein, in Guide to Protein Purification, Methods in Enzymol.182: 50-68を参照されたい。当技術分野で公知の多様な手段によって、例えば酵素連結免疫吸着アッセイ法（ELISA；例えば、参照によりその全文が本明細書に組み入れられるReen (1994), Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), in Basic Protein and Peptide Protocols, Methods Mol. Biol. 32:461-466を参照されたい）によって、関心対象のタンパク質を含有する均質組成物のタンパク質混入を判定することができる。
【００９９】
関心対象のタンパク質を含有する均質組成物中に存在しうる核酸の量は、任意の適切な方法によって測定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を利用するアッセイ法を用いることができる。核酸を10 pg/mg未満のレベルまで減少させることができる。
【０１００】
このように回収されたタンパク質を、当技術分野で周知の日常的な製剤法によって生物薬剤的に許容される組成物中に配合することができ、かつ、高度に精製されたタンパク質組成物を必要とする多様な診断、治療、およびその他の目的のために用いることができる。
【０１０１】
関心対象のタンパク質を含有する溶出液を収集した後、より高いモル濃度および/または修正pHを有する溶液を用いてクロマトグラフィー媒体を剥離することによって、カラムに結合したままの可能性がある全てのタンパク質を放出することができる。次いで、クロマトグラフィー媒体から大部分またはすべてのタンパク質を放出しかつクロマトグラフィー媒体中に存在し得る微生物混入を低減するか完全に消失させる効果を有すると考えられる溶液（例えば再生溶液）を用いて、カラムを再生してもよい。続いて、カラムを濯ぎ、微生物増殖を阻止する溶液中で保存してもよい。このような溶液は水酸化ナトリウムを含んでもよいが、エタノール、アジ化ナトリウム、ベンジルアルコール、または高濃度の離液性塩などの他の試薬を用いることもできる。
【０１０２】
本発明を実証する目的で以下の実施例が提供されるが、これは限定を意図するものではない。
【０１０３】
実施例
本実施例は、本発明の精製法を用いた抗体の精製を説明するものである（図1を参照されたい）。腫瘍抗原（TA）に対して、完全ヒト抗体を調製した。CHO DG44細胞を用いて、トランスフェクトーマ（transfectoma）を調製した。中性pH（7〜8）および10〜20 mS/cmの伝導度を有する合成かつ血清非含有の規定培地を用いて、細胞培養を行った。DG44 CHO細胞を約2〜10×106細胞/mlの密度まで増殖させた。60MO2 CUNOフィルター（Meriden, CT）を用いたろ過によって、細胞培養物を清澄化した。得られた細胞培養上清を濃縮し、70 mMリン酸ナトリウム、pH6.2においてダイアフィルトレーションした。
【０１０４】
表1および2は、治療グレードのタンパク質材料を産生するための本発明の2工程精製プロセスの操作上の詳細の概要を示す。第一の非アフィニティークロマトグラフィー工程は、捕捉のためにFractogel EMD SE HiCap樹脂を用いる陽イオン交換クロマトグラフィーであり、その後、溶出液のpHを3.4〜3.6まで低下させるための1N HClまたは氷酢酸、および画分のpHを7.0まで上昇させるための2M Tris pH9.0を用いる低pH保持を行う。表1に示すような各樹脂用の平衡化、装填、洗浄、および溶出緩衝液を用いるCEC工程において、本プロセスを実行した。
【０１０５】
（表１）抗体捕捉のための陽イオン交換クロマトグラフィー：主要な操作上の詳細の概要。結合能は40 mg/ml樹脂であった。より広範な実験の柔軟性を提供するために、流速を、対応する滞留時間で表す。運転温度は15〜25℃の間で変動させた。NaP = リン酸ナトリウム。
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【０１０６】
（表２）装填調製物：抗体研磨（antibody polishing）のための陰イオン交換クロマトグラフィー膜：主要な操作上の詳細の概要。結合能は2100 mg/ml膜であった。より広範な実験の柔軟性を提供するために、流速は、対応する総容積で表す。運転温度は15〜25℃の間で変動させた。
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NaP：リン酸ナトリウム
BV：系の総容積
流速（mL/min）= [(線形流速 (cm/hr)) / (60min/hr)]×[前面積 (cm2)]
【０１０７】
本精製法ではインプロセス緩衝液交換工程を用いなかった、すなわち試料は、任意の低pH保持を実行するためのpH操作および希釈操作のみを伴い、第一のクロマトグラフィー工程から第二のクロマトグラフィー工程に進行した。本実施例において治療グレードのタンパク質組成物を作製するために、希釈、ウイルス不活性化、ウイルス除去、および製剤化の工程を使用した。これらの工程のいずれも、その他の有機化合物に対して相対的に、タンパク質産物の純度に影響を与えないことが、当業者には認識されよう。
【０１０８】
CHOPレベルを確認するための標準的ELISAアッセイ法、DNAレベルを確認するためのPCR、および、抗体のモノマー純度を確認するためのHPLC-SECを用いて、本実施例の精製プロセスにより、100 ppm未満の宿主細胞タンパク質（以下の表3を参照されたい）、10 pg未満のDNA/mg抗体、および99%を上回るモノマーを含有する均質組成物を得たが、これにより、精製物質をさらに処理および製剤化して治療グレードの産物とすることができる。第一の工程後の混入物質濃度は、CHOPに関しては200〜1,500 ng/mgの間で、かつ95〜100%モノマーで変動した。結果を図3に報告する。
【０１０９】
（表３）示唆される精製スキームを用いた混入物質除去の概要
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【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】実施例1において実施された本発明の2工程精製プロセスの流れ図を示す。この特定の態様において、本精製法は、CEC工程に続いてウイルス不活性化工程およびAEC工程を含む。CEC溶出バルクの伝導度を低下させるため、ならびにAEC工程においてウイルスおよび混入物質の望ましいクリアランスを得るために、CEC工程とAEC工程の間に希釈手順を設ける。
【図１】
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【国際調査報告】
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