(57)【要約】本発明は、ターゲティング部分および送達可能化合物を有する細胞ターゲティング複合体であって、前記ターゲティング部分および前記送達可能化合物が、前記ターゲティング部分の反応サイトとの配位結合を形成する少なくとも第１の反応部分を有し、かつ前記送達可能化合物の反応サイトとの配位結合を形成する少なくとも第２の反応部分を有する（遷移）金属イオン錯体によって結合され、前記送達可能化合物が治療化合物であることを特徴とする細胞ターゲティング複合体に関する。
2009501791.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲティング部分および送達可能化合物を有する細胞ターゲティング複合体であって、前記ターゲティング部分および前記送達可能化合物が、前記ターゲティング部分の反応サイトとの配位結合を形成する少なくとも第１の反応部分を有し、かつ前記送達可能化合物の反応サイトとの配位結合を形成する少なくとも第２の反応部分を有する（遷移）金属イオン錯体によって結合され、前記送達可能化合物が治療化合物または診断化合物であることを特徴とする細胞ターゲティング複合体。
【請求項２】
前記金属イオン錯体が白金錯体であることを特徴とする請求項１記載の細胞ターゲティング複合体。
【請求項３】
前記白金錯体がｃｉｓ白金錯体、好ましくは安定化ブリッジとして不活性の２配位性部分を有するｃｉｓ白金錯体であることを特徴とする請求項２記載の細胞ターゲティング複合体。
【請求項４】
前記ターゲティング部分が、１つ以上の結合対のメンバ、好ましくは抗体もしくはその誘導体（の一部）、ハプテンまたはレセプタリガンドを有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞ターゲティング複合体。
【請求項５】
前記ターゲティング部分が、少なくとも１つの結合対のメンバを搭載した高分子キャリアを有し、該高分子キャリアが好ましくはアビジンまたはＨＳＡであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞ターゲティング複合体。
【請求項６】
前記少なくとも１つの結合対のメンバがレセプタリガンド、好ましくは環状ＲＧＤペプチドまたはマンノース-６-リン酸であることを特徴とする請求項５記載の細胞ターゲティング複合体。
【請求項７】
前記高分子キャリアが、リガンドとキャリアとの間の連結部分として、または遮蔽機能を与える連結部分として、少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を有することを特徴とする請求項５または６記載の細胞ターゲティング複合体。
【請求項８】
前記ターゲティング部分が、ヒトを含む哺乳類の腎臓、肝臓または腫瘍に蓄積する低分子量たんぱくを有し、該低分子量たんぱくは好ましくはリゾチーム、アルカリホスファターゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、免疫グロブリンまたはその一部（たとえば一本鎖Ｆａｂフラグメントまたは全ＩｇＧ）から選ばれることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞ターゲティング複合体。
【請求項９】
前記送達可能化合物が、細胞システム内のシグナル伝達系を阻害するか、抗炎症活性、抗昇圧活性、抗線維化活性、抗血管新生活性、抗腫瘍活性またはアポトーシス誘導活性を有することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞ターゲティング複合体。
【請求項１０】
前記送達可能化合物が、抗炎症化合物、好ましくはペントキシフィリンまたはピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞ターゲティング複合体。
【請求項１１】
前記送達可能化合物が抗昇圧薬、好ましくはロサルタンであることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞ターゲティング複合体。
【請求項１２】
前記送達可能化合物がキナーゼ阻害薬、好ましくはＰＴＫＩ、ＳＢ２０２１９０、ＰＴＫ７８７、ＴＫＩ、Ｙ２７６３２またはＡＧ１２９５であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞ターゲティング複合体。
【請求項１３】
前記送達可能化合物がたんぱくであることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞ターゲティング複合体。
【請求項１４】
前記たんぱくが、ヒスチジン、システインおよびメチオニンから、好ましくはヒスチジンおよびメチオニンから選ばれる少なくとも１つの残基を有することを特徴とする請求項１３記載の細胞ターゲティング複合体。
【請求項１５】
前記たんぱくが、
ａ）サイトカインおよび増殖因子、
ｂ）ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）などの治療用たんぱく、または
ｃ）ＩＬ-１０、アルカリホスファターゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、免疫グロブリンもしくはその一部（たとえば一本鎖Ｆａｂフラグメントもしくは全ＩｇＧ）、ラクトフェリン、キサンチンオキシダーゼまたはＴＮＦα
から成る群の１つから選ばれることを特徴とする請求項１３または１４記載の細胞ターゲティング複合体。
【請求項１６】
前記送達可能化合物が薬剤用治療化合物であることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１項に記載の細胞ターゲティング複合体。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか１項で定義する細胞ターゲティング複合体、および薬学的に許容できるキャリアを有する医薬組成物。
【請求項１８】
ターゲティング部分を送達可能化合物に連結するための配位結合を形成することが可能な（遷移）金属イオン錯体の使用。
【請求項１９】
前記金属イオン錯体が白金錯体であることを特徴とする請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
前記白金錯体が、好ましくは安定化ブリッジとして不活性の２配位性部分を有するｃｉｓ白金錯体であることを特徴とする請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
前記送達可能化合物が治療化合物であることを特徴とする請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
前記治療化合物が、細胞システム内のシグナル伝達系を阻害するか、抗炎症活性、抗昇圧活性、抗線維化活性、抗血管新生活性、抗腫瘍活性またはアポトーシス誘導活性を有することを特徴とする請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
前記治療化合物が、ペントキシフィリン、ＰＤＴＣ、ロサルタン、ＰＴＫＩ、ＳＢ２０２１９０、ＰＴＫ７８７、ＴＫＩ、Ｙ２７６３２、ＡＧ１２９５またはＴＲＡＩＬであることを特徴とする請求項２１または２２記載の使用。
【請求項２４】
ターゲティング部分を送達可能化合物に結合する方法であって、前記ターゲティング部分の反応サイトとの配位結合を形成する少なくとも第１の反応部分を有し、かつ前記送達可能化合物の反応サイトとの配位結合を形成する少なくとも第２の反応部分を有する（遷移）金属イオン錯体を提供する工程、および前記（遷移）金属イオン錯体に前記ターゲティング部分および前記送達可能化合物との配位結合を形成させる工程を有する方法。
【請求項２５】
前記金属イオン錯体が白金錯体であることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記白金錯体が、好ましくは安定化ブリッジとして不活性の２配位性部分を有するｃｉｓ白金錯体であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記ターゲティング部分が、結合対のメンバ、好ましくは抗体、ハプテンまたはレセプタリガンドであることを特徴とする請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記送達可能化合物が治療化合物であることを特徴とする請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記治療化合物が、細胞システム内のシグナル伝達系を阻害するか、抗炎症活性、抗昇圧活性、抗線維化活性、抗血管新生活性、抗腫瘍活性またはアポトーシス誘導活性を有することを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記治療化合物が、ペントキシフィリン、ＰＤＴＣ、ロサルタン、ＰＴＫＩ、ＳＢ２０２１９０、ＰＴＫ７８７、ＴＫＩ、Ｙ２７６３２、ＡＧ１２９５またはＴＲＡＩＬであることを特徴とする請求項２８または２９記載の方法。
【請求項３１】
請求項１７で定義する医薬組成物の治療上有効な量の医薬組成物を、それを必要としている患者に投与する工程を有する、選択した細胞集団への治療化合物のターゲティング方法。
【請求項３２】
前記細胞集団が、患者の腎臓、肝臓または腫瘍由来の細胞であることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記治療化合物が、
ａ）抗炎症化合物、好ましくはペントキシフィリンおよびＰＤＴＣ、
ｂ）抗昇圧薬、好ましくはロサルタン、
ｃ）キナーゼ阻害薬、好ましくはＰＴＫＩ、ＳＢ２０２１９０、ＰＴＫ７８７、ＴＫＩ、Ｙ２７６３２およびＡＧ１２９５
から選ばれることを特徴とする請求項３１または３２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は薬物ターゲティングの分野にあり、特に、選択した細胞集団への薬物のターゲティングおよび細胞ターゲティング部分を有する医薬組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
薬物のサイト特異的または標的送達は、治療効果の改良および薬物毒性の低減に価値ある手段であると考えられる。非標的薬物化合物は通常、全身拡散および受動拡散または細胞膜を超えるレセプタ介在摂取によって対象とする標的細胞に達するが、標的薬物は主に標的組織に到着（home-in）して集中する。結果として、標的薬物はより少ない用量でありながら、薬物が標的細胞内で治療的に有効なレベルに達し得ることが要求される。細胞膜を容易に通過するのを促進し、その特徴が薬物の他の要求に常に従うわけではない親油性は、非標的薬物に好ましいが、標的薬物にはあまり関連しない。したがって、薬物の特異的細胞へのターゲティングは、特異性を高め、全身毒性を減少させ、全身薬としては原則としてあまり適さないか適していない化合物の治療的使用を可能にするための、概念的に魅力的な方法である。
【０００３】
一般に、薬物送達技術は、薬物の生体内環境との相互作用を改めることを目的としており、薬物と他の分子との結合、マトリックス内もしくは粒子内への薬物の取込み、または単に他の薬剤との同時投与によってその目的を達成する。最終結果は、その生物学的利用能が向上し、患者内での臨床副作用の発生が低減するような薬物ターゲティングまたは生物学的障壁を超えた促進薬物移送のいずれかである。薬物ターゲティングは、薬物の生体内分布における変化が所望のサイトでの薬物蓄積をもたらす場合に達成され、そのサイトは投与サイトから概して離れている。
【０００４】
原則的に、薬物の細胞選択的送達は、薬物分子をターゲティング部分（罹患組織の標的細胞によって特異的に認識される化学作用部分を有する高分子キャリア）とカップリングさせることによって得ることができる。しかし、現在のところ、そのような細胞特異的薬物ターゲティング調製物は、主要な技術的諸問題があるためほとんど利用されていない。適した薬剤およびターゲティング分子の利用可能性は別として、治療薬剤とターゲティング装置との結合がしばしば重要な問題をもたらす。たとえば、従来の結合化学には化学的によく反応する基が存在しないのかも知れないし、化学的によく反応する基が（豊富に）存在しても、共有結合がカップリングした治療薬剤の生物活性を（不可逆的に）阻害するのかも知れない。
【０００５】
発明の要約
本発明は、治療化合物の、ターゲティンググループとの改良したカップリングを提供する。
【０００６】
第１の側面において、本発明はターゲティング部分および送達可能化合物を有する細胞ターゲティング複合体を提供し、前記ターゲティング部分および前記送達可能化合物は、前記ターゲティング部分の反応サイトとの配位結合を形成する少なくとも（第１の）反応部分を有し、かつ前記送達可能化合物の反応サイトとの配位結合を形成する少なくとも（第２の）反応部分を有する（遷移）金属イオン錯体によって結合され、前記送達可能化合物は治療化合物である。好ましい実施形態において、金属イオン錯体は白金錯体である。白金錯体はｔｒａｎｓ白金錯体であってもよいし、またはｃｉｓ白金錯体であってもよい。ｃｉｓ白金錯体はさらに、好ましくは安定化ブリッジ（bridge）として不活性の２配位性（bidentate）部分を有する。別の好ましい実施形態において、（白金）金属イオン錯体は安定化ブリッジとして３配位性（tridentate）部分を有する。前記金属イオン錯体の別の実施形態において、前記錯体は、同じであろうとなかろうと、少なくとも２つの（遷移）金属イオンを有する。ターゲティング部分および送達可能化合物の反応サイトは、（遷移）金属イオン錯体との（配位）結合を形成することができる。したがって、好ましい実施形態において、ターゲティング部分および／または送達可能化合物は１つ以上の硫黄含有反応サイトおよび／または１つ以上の窒素含有反応サイトを有する。
【０００７】
ターゲティング部分は好ましくは結合対のメンバを有する。好ましい実施形態において、ターゲティング部分は、抗体またはその部分（たとえば一本鎖Ｆａｂフラグメント）、レセプタリガンドを有する。結合対は金属イオン錯体と直接的に、またはスペーサもしくは連結分子を介して結合することができる。非常に適した連結分子は、好ましくはＨＳＡまたはアビジンといった高分子キャリアである。このような例において、高分子キャリアは金属イオン錯体に直接的または間接的に結合することができ、高分子キャリアはさらに結合対のメンバを搭載して複合体のターゲティングを促進することができる。金属イオン錯体−送達可能化合物複合体および特定の結合対のメンバの双方が結合する高分子キャリアを有するターゲティング複合体の例を、以下の記載に例示する。高分子キャリアがたとえばＰＥＧなどの追加の機能性付与化合物を有する他の実施形態が、記載および例から明らかになるだろう。別の好ましい実施形態において、ターゲティング部分はたとえばリゾチームまたは他のあらゆるたんぱくなどの低分子量たんぱくを有する。
【０００８】
送達可能化合物は本発明の細胞ターゲティング複合体の好ましい実施形態において、たんぱく、より好ましくは組換えたんぱくを有し得る。金属イオン錯体との結合を促進するために、（組換え）たんぱくは好ましくは、ヒスチジン、メチオニンおよびシステインから選ばれる少なくとも１つの残基を有し、メチオニン残基およびシステイン残基は硫黄含有反応サイトとして機能し、ヒスチジン残基は窒素含有反応サイトとして機能する。非常に好ましいのはヒスチジン残基またはメチオニン残基を有するたんぱくである。
【０００９】
代わりに、送達可能化合物は小分子、ペプチド、（ｓｉ）ＲＮＡ、アンチセンス（オリゴ）ヌクレオチド、またはその修飾および組合せを有するか、それ（ら）であってもよい。
【００１０】
低分子量たんぱくの好ましい実施形態において、前記たんぱくはヒトを含む哺乳類の腎臓に蓄積する。特に好ましい実施形態はリゾチームである。
【００１１】
さらに他の好ましい実施形態において、送達可能化合物は細胞システム内のシグナル伝達系を阻害するか、抗炎症活性、抗昇圧活性、抗線維化活性、抗血管新生活性、抗腫瘍活性またはアポトーシス誘導活性を有する。
【００１２】
さらに他の好ましい実施形態において、送達可能化合物は抗炎症化合物、好ましくはペントキシフィリンまたはＰＤＴＣである。
【００１３】
さらに他の好ましい実施形態において、送達可能化合物は抗昇圧薬、好ましくはロサルタンである。
【００１４】
さらに他の好ましい実施形態において、送達可能化合物はキナーゼ阻害薬、好ましくはＰＴＫＩ、ＳＢ２０２１９０、ＰＴＫ７８７、ＴＫＩ、Ｙ２７６３２またはＡＧ１２９５である。
【００１５】
さらに他の好ましい実施形態において、送達可能たんぱくは治療用たんぱく、より好ましくはサイトカインまたは増殖因子である。代わりに、治療用たんぱくがＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）であってもよい。さらに別の代案において、たんぱくがＩＬ-１０、アルカリホスファターゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、免疫グロブリンもしくはその一部（たとえば一本鎖Ｆａｂフラグメントまたは全ＩｇＧ（whole IgG））、ラクトフェリン、キサンチンオキシダーゼまたはＴＮＦαであってもよい。
【００１６】
さらなる側面において、本発明はここに記載される細胞ターゲティング複合体を有する医薬組成物、および対象とする用途に対する薬学的に許容できる製剤を提供する。
【００１７】
さらに別の側面において、本発明は薬剤として用いるための、前述の細胞ターゲティング複合体を提供する。
【００１８】
さらなる側面において、本発明は、ターゲティング部分と送達可能化合物とを連結するための、配位結合を形成することができる（遷移）金属イオン錯体の使用を提供する。この側面の好ましい実施形態において、金属イオン錯体は白金錯体である。ここでも、白金錯体はｔｒａｎｓ白金錯体であってもよく、またはｃｉｓ白金錯体であってもよい。安定化ブリッジを有する白金錯体の場合、これらの白金錯体は、好ましくは安定化ブリッジとして不活性の２配位性部分または３配位性部分を有する。適切には、ターゲティング部分および治療化合物は、配位結合に加わる１つ以上の硫黄含有反応サイトおよび／または１つ以上の窒素含有反応サイトを有するのがよい。本発明の金属イオン錯体は少なくとも１つの（遷移）金属イオンを有する。別の好ましい実施形態において、金属イオン錯体は、ターゲティング部分を治療化合物に結合するための２つ以上の遷移金属を有する。この実施形態は、当然ながら、前述のターゲティング複合体の側面の一部でもある。
【００１９】
本発明は、前記送達可能化合物が診断化合物または治療化合物、好ましくは（遷移）金属イオン錯体が放出機能性を付与するような治療化合物である、関連した使用を提供する。特に有用なのは、細胞システム内のシグナル伝達系を阻害する治療化合物、または、抗炎症活性、抗昇圧活性、抗線維化活性、抗血管新生活性、抗腫瘍活性もしくはアポトーシス誘導活性を有する治療化合物である。
【００２０】
好ましい化合物は、前述したように、キナーゼ阻害薬またはアポトーシス誘導化合物である。
【００２１】
本発明に従う使用の他の好ましい実施形態は、治療化合物がペントキシフィリン、ＰＤＴＣ、ロサルタン、ＰＴＫＩ、ＳＢ２０２１９０、ＰＴＫ７８７、ＴＫＩ、Ｙ２７６３２、ＡＧ１２９５またはＴＲＡＩＬである実施形態に関する。本発明の使用での適用に非常に好ましいターゲティング部分は、マンノース-６-リン酸修飾ヒト血清アルブミンもしくはＲＧＤ搭載アルブミン、ＰＥＧ化アルブミン、低分子量たんぱく、ＡｂもしくはＡｂフラグメントまたはポリマもしくは修飾ポリマである。
【００２２】
さらなる側面において、本発明は、ターゲティング部分と治療化合物とをカップリングさせる方法を提供し、前記ターゲティング部分の反応サイトとの配位結合を形成するための少なくとも第１の反応部分を有し、かつ前記治療化合物の反応サイトとの配位結合を形成するための少なくとも第２の反応部分を有する（遷移）金属イオン錯体を含み、前記（遷移）金属イオン錯体に前記ターゲティング部分と前記治療化合物との配位結合を形成させる。本発明のこの側面の好ましい実施形態は、細胞ターゲティング複合体について記載した実施形態および前述の本発明の使用を含む。
【００２３】
さらなる側面において、本発明は選択した細胞集団への治療化合物のターゲティング方法を提供し、本発明に従う治療上有効な量の医薬組成物を、それを必要としている患者に投与することを含む。
定義
ここで用いる用語「ターゲティング部分」は、薬物または他のタイプの送達可能化合物の薬物動態特性を変更、修飾、または改良することができる、あらゆる分子または複合体を表す。好ましい実施形態において、ターゲティング部分は、用語「ホーミング部分」とも示される細胞表面上の結合サイトと機能的に相互作用する化合物、または分子の一部を有する。ゆえに、ホーミング部分の存在を介してターゲティング部分は、１つ以上の細胞型に特異性または結合親和性を与える。代わりに、ターゲティング部分はホーミング部分から成ってもよい。そのような実施形態において、たとえば抗体、ハプテンまたはレセプタリガンドを、金属イオン錯体に直接的に結合する。ターゲティング部分によって標的される細胞上の分子は、たとえば細胞表面レセプタなどのあらゆる適当な標的であり得る。ターゲティング部分は、抗体、抗体フラグメント、細胞表面レセプタに対する内生または非内生リガンド、抗原結合たんぱく、ウイルス表面成分、たとえばウイルス表面成分、増殖因子、レクチン、炭水化物、脂肪酸または他の疎水性置換基を結合するたんぱく、ペプチドおよびペプチド模倣分子などのホーミング部分を含んでもよいが、これらに限定されない。ターゲティング部分は、複合体（たとえば、ホーミング部分が高分子と錯体を形成して多価構造をもたらす、図３３のＲＧＤ-ＨＳＡ、ＲＧＤ-ＨＳＡ-ＰＥＧおよびＲＧＤＰＥＧ-ＨＳＡを参照）を包含するか、抗体フラグメントまたは低分子たんぱくもしくはペプチドの形の、たとえばリゾチームなどの小分子を含むかそれから成る。
【００２４】
非常に適切には、ターゲティング部分は、キャリアとして中央高分子コアを有する複合体であって、１つ以上のホーミング分子が付着し、任意でキャリアの機能性を修飾する１つ以上の官能基が付着した複合体であるのがよい。非常に適した例は図３４に示した例であり、高分子アビジンを使用し、特異的ホーミング分子ＲＧＤを搭載して複合体の能力を増大させている。任意で、ホーミング分子をＰＥＧリンカなどの万能リンカを介して結合することができる。ゆえに、適した高分子キャリア化合物は、たとえばアビジン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、デンドリマ、たとえば、これに限られるわけではないがＰＡＭＡＭ、またはそれらの誘導体であるのがよい。本発明において使用するターゲティング部分の好ましい高分子キャリア化合物は、ヒトの体と無関係のものではないという理由で、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはその誘導体である。本文の用語「そ（れら）の誘導体」は、ホーミング分子（たとえばＲＧＤまたはＭ６Ｐ）の付着によって修飾した高分子キャリア化合物を表す。マンノース-６-リン酸誘導体化高分子キャリアは、たとえば肝臓、特に壊死した肝臓組織の星細胞レセプタへの、送達可能化合物のターゲティングを可能にする。
【００２５】
ＨＳＡはコアたんぱくとして適切に使用することができ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基で置換してもよく、これは最終構成体においてステルス特性を示す。このように、これらのＰＥＧリガンドはマクロファージなどの非標的細胞による取り込みを妨げることができる。
【００２６】
別の好ましい実施形態において、ターゲティング部分は標的レセプタに結合しないが、他の原則によって、送達可能化合物のクリアランスルートまたは速度を変更することによって、体内分布に影響を及ぼす。このクラスのターゲティング部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマを含むが、これに限定されない。このようなタイプのターゲティング部分の別の非限定的な例は、カップリングした送達可能化合物を解離する貯蔵所（depot）として機能する高分子バイオマテリアルである。このような装置は血流中で循環させるか、たとえば皮下的に体の別の部分へインプラントすることができる。前述の構造物すべてを、集合的および個別にターゲティング部分という。
【００２７】
ここで用いる用語「送達可能化合物」は、ターゲティング部分によって細胞の表面および／または内部へ運ばれるか移送される化合物を表す。本発明の態様において、送達可能化合物は治療または診断化合物である。用語「送達可能化合物」、「治療化合物」および「薬物」をここでは交互に用いており、これらは治療用途または診断用途に適用することができるあらゆる薬剤を表す。また、治療化合物は、その活性型に達するのに（生物）化学修飾を必要とする、プロドラッグであってもよい。
【００２８】
好ましい実施形態において、治療化合物は、リンカと配位結合を形成することができる芳香族窒素または硫黄原子を有する有機分子である。治療化合物は、リンカと配位結合を形成することができる芳香族窒素または硫黄原子を含有するプロドラッグ部分を有してもよい。別の好ましい実施形態において、治療化合物は治療効果のあるペプチドまたはたんぱくである。さらに、治療化合物は小分子、ペプチド、（ｓｉ）ＲＮＡ、アンチセンス（オリゴ）ヌクレオチド、またはその修飾および組合せであってもよい。
【００２９】
用語「反応部分」は、化学基、自由軌道の反応サイトもしくは金属イオン錯体のリガンドを表すか、ターゲティング部分もしくは送達可能化合物のいずれかの反応サイトとの結合を形成することができる化合物を表す。
【００３０】
ここで用いる用語「リガンド」は、別の分子と結合する分子を表し、特に、たとえば抗体に結合する抗原、レセプタに結合するリガンド、または酵素に結合する基質もしくはアロステリックエフェクタといった、大きな分子に特異的に結合する小分子を表すのに使用する。用語「リガンド」は、電子対を提供しまたは受け入れて、配位錯体の中央金属原子との配位結合を形成する分子を示すのにも使う。ゆえに、用語リガンドの意味は文脈に関連する。
【００３１】
ここで用いる用語「（遷移）金属イオン錯体」は、ターゲティング部分を送達可能化合物とカップリングするのに使用するリンカシステムを表す。このような錯体の特性は、その中の配位結合の存在である。本発明において使用する（遷移）金属イオン錯体における使用に適した金属イオンは、リガンドとの配位結合を形成することができる金属イオンである。ゆえに、Ｐｔ、Ｒｕ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｐｄ、ＯｓおよびＣｄなどの遷移金属が本発明における使用に適している。本発明の（遷移）金属イオン錯体は、リガンドとよばれるいくつかの他の分子に結合する中央金属イオンから成る。リガンドと金属との間で形成される化学結合の性質は、リガンド分子上に存在する電子対の提供を含む。すなわち、分子軌道の観点においては、リガンドの満たされた軌道を金属の空いた軌道と組合せることによって形成される分子軌道であると考えることができる。したがって、金属イオンへの化学結合の形成に直接関わるリガンド分子中のそれらの原子は、最も普通に使用される窒素、酸素、硫黄、リンおよびヒ素が存在する周期表のＶ族およびＶＩ族の元素を通常有するドナー原子とよばれる。
【００３２】
１つの金属イオンに結合することができる２つ以上のドナー原子を含有する分子は、キレート剤またはキレータとよばれ、対応する金属錯体はキレートとよばれる。あるキレータに存在するドナー原子の数は、そのキレータのデンティシティ（denticity）とよばれ、たとえば、２つのドナーサイトを有するリガンドは２配位性、３つのドナーサイトを有するリガンドは３配位性とよばれる。一般に、キレータのデンティシティが注目する特定金属イオンによって達成され得る最大配位数に一致する点まで、キレータのデンティシティが高くなるにつれて、形成されるキレートはより安定する。ある酸化状態のある金属イオンの最大配位数はその金属の固有特性であり、空軌道の数、すなわち、リガンドドナー原子と形成すことができる化学結合の数を反映する。利用できる空軌道のすべてを用いてリガンドのドナー原子との結合を形成すれば、金属が配位的に飽和されているといわれる。
【００３３】
本発明の範囲内で、キレータはターゲティング部分、送達可能化合物、または安定化ブリッジであり得る。たとえば、ピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）がキレーティング送達可能化合物である。
【００３４】
あらゆる金属イオンに対して、当該技術の当業者は以下の基準を採用して、本発明に従う有用なリガンドを選択することができる。リガンドは、標的金属イオンへの結合に有利に働くドナー原子（または、キレーティングリガンドの場合、ドナー原子のセット）を有さなければならない。特定のドナー原子（通常、カルボキシル基、フェノール基、またはエーテル酸素原子、アミン、イミン、または芳香族窒素原子、および荷電または中性硫黄原子から成る群から選ばれる）に対する、あらゆる金属イオンの一般的な優先傾向は、当該技術においてよく知られている。
【００３５】
リガンドはまた、生体内で適当な安定性を示す傾向にあるリガンド−金属結合を形成する見込みをも提供しなければならない。すなわち、リガンド−金属結合は、治療化合物を標的細胞に移送するのに必要とされる時間内には解離しない。さらに、あらゆる送達可能化合物の対象とする用途によるが、リガンド−金属結合は、標的細胞内または標的サイトに薬物を放出する見込みを提供しなければならない。注目する多くの金属について、生体内での特定のリガンド−金属結合の安定性に関するかなり多くの技術が存在しており、リガンド−金属の選択を案内するのに使用することができる。
【００３６】
本発明の範囲内で、金属イオンに配位結合することが示されてきた多くの有用なリガンドがある。これらは、リガンドが金属イオンに結合するサイトの数に応じて、１、２または３配位性のいずれでもよい。
【００３７】
前記リガンドは二価性であってもよい。二価性リガンドは、少なくとも１つの金属結合サイト（ドナー原子）に加えて、リガンドの金属結合特性に大いに影響を及ぼすことなく、リガンドがたとえばたんぱくに連結することができる第２の反応部分を有する分子である。
【００３８】
本発明は、ターゲティング部分との１つ以上の配位結合によって送達可能化合物を結合する、新規タイプのリンカシステムまたはリンカを提供する。標的薬物の設計分野における種々の重要な問題は我々に、そのようなリンカと、送達可能化合物およびターゲティング部分との結合に起因する、そのような新規の遷移金属ベースのリンカ技術および「細胞ターゲティング複合体」を創出する動機を与えた。
【００３９】
この点において、多くの有機小薬物は、ターゲティング部分との薬物のカップリングに一般に適用される化学結合技術（たとえばエステル結合）に使用することができる官能基を有さない。ゆえに、既存の（共有）結合方法は、前述のように、生体内での薬物−キャリア結合の適度な安定性を有する細胞ターゲティング複合体を調製するのに不充分である。この点において、結合システムは非常に重要であり、循環中にキャリアから薬物を早まって放出するのを妨げる一方、標的サイトで、または標的サイト内に蓄積したときでさえ薬物が不活性なままであるほど安定し過ぎていない結合を提供すべきである。本発明において記載されるような新規のリンカ技術の適用は、（遷移）金属錯体との１つ以上の配位結合によって薬物分子をカップリングする機会を作り出す。記載されるリンカシステムの１つの主な利点は、カップリング技術の不足によって以前は生成することができなかった、薬物を有する細胞ターゲティング複合体の開発を可能にすることである。
【００４０】
リンカと、たとえば薬物といった送達可能化合物との配位結合の場合でも、特に、たとえば生体内のグルタチオン、試験管内のチオシアン酸カリウムといった、小さくて電子が豊富な材料が存在するときには、結合は反転され得る。送達可能化合物の構造は、結合および放出されても影響を受けずまたは変化しない。
【００４１】
送達可能化合物中のたとえば窒素および硫黄といった自然発生的なリンカ結合サイトは、送達可能化合物を化学的に修飾する必要をなくす。
【００４２】
さらに、ターゲティング部分との（抗炎症性サイトカインなどの）治療たんぱくのカップリングはしばしば、可変の大きさおよび組成である不明確な複合体形成を生じさせる。部分的に、この問題は、ターゲティング部分の治療たんぱくへの結合に適用される化学から生じる。多くの共有結合性リンカは、たんぱく内に豊富に存在するリシル残基の末端アミノ基のような反応サイトに向けられる。たんぱく内のシステイン、メチオニンおよび／またはヒスチジン残基の分布によって定義されるような、たんぱく内のより特異的な場所にて反応するリンカシステムが、より明確な細胞ターゲティング複合体を生成するだろう。好ましい実施形態において、いずれも遷移金属リンカと反応することができる、「メチオニン開始コドン」もしくは「ヒスチジンタグ」配列またはこれらの配列の組合せを示す組換えたんぱくを反応させることによって、細胞ターゲティング複合体を調製した。
【００４３】
本発明の細胞ターゲティング複合体は種々の形態または構成を有することができ、ターゲティング部分および治療化合物を、リンカシステムを包含する（遷移）金属イオンによって結合される。（遷移）金属イオン錯体において、白金が好ましい金属イオンである。
【００４４】
本発明の細胞ターゲティング複合体は、
式  ＤＣ−Ｍ−ＴＭ
によって表すことができ、
ＤＣは送達可能化合物であり、
ＴＭはターゲティング部分であり、
Ｍは（遷移）金属イオンリンカシステムである。
【００４５】
送達可能化合物およびターゲティング部分は、配位結合によって（遷移）金属イオンリンカシステムと直接カップリングすることができる。送達可能化合物またはターゲティング部分は、金属イオン錯体中の不活性な複数配位性部分または安定化ブリッジとカップリングすることもできる。たとえば、送達可能化合物またはターゲティング部分は、ｃｉｓ白金錯体のエチレンジアミン安定化ブリッジとカップリングすることができる。（遷移）金属原子は、その際、送達可能化合物またはターゲティング部分それぞれと（直接）カップリングするのではなく、ターゲティング部分または挿入可能化合物のみとカップリングする反応部分として機能する。
【００４６】
本発明の細胞ターゲティング複合体は、リンカと、送達可能化合物および／またはターゲティング部分との間にスペーサを有してもよい。そのような細胞ターゲティング複合体は、
式  ＤＣ−Ｘ１−Ｍ−Ｘ２−ＴＭ
によって表すことができ、
ＤＣ、ＴＭおよびＭを前述のように定義し、
Ｘ１は配位結合によって（遷移）金属原子とカップリングする任意のスペーサ基またはプロドラッグであり、Ｘ１は他の化学結合（たとえば共有結合による）によって送達可能化合物とカップリングする。非常に適切には、Ｘ１は、金属イオン錯体からの治療化合物の放出を可能にする（遷移）金属または（酵素反応）切断サイトを有するスペーサであるのがよい。Ｘ２は金属原子とターゲティング部分との間の任意のスペーサ基である。非常に適切には、Ｘ２は、ターゲティング部分からの治療化合物および金属イオン錯体の放出を可能にする（遷移）金属または（酵素反応）切断サイトを有するスペーサであるのがよい。
【００４７】
好ましい実施形態において、Ｘ１またはＸ２のうち少なくとも１つが存在する。
別の好ましい実施形態において、Ｘ１およびＸ２の双方が存在する。
【００４８】
適当なタイプのスペーサ基は、金属イオン錯体と別の官能基との間の適切な距離を可能にし、リンカ錯体のさらなる修飾をも可能にする分子である。好ましいリンカは、［ＮＨ２-(ＣＨ２)ｎ-ＮＨ２］であり、ｎは１〜１０、好ましくは１〜６の間で変化する。たとえば、スペーサであるジアミノヘキサン［ＮＨ２-(ＣＨ２)６-ＮＨ２］が、本発明の好ましい実施形態において非常に有用であると判明した。他の好ましいリンカは［ＮＨ２-(ＣＨ２)ｎ-Ａ-(ＣＨ２)ｎ-ＮＨ２］であり、Ａはヘテロ原子、より好ましいＮまたはＯであり、ｎは１〜５の間で変化する。さらに別の好ましいタイプのスペーサはＮＨ２-(ＣＨ２)ｎ-ＮＨＲであり、ｎは１〜６の間のあらゆる数が可能で、ＲはＣ(Ｏ)ＣＨ２Ｂｒ、ＣＯ-(ＣＨ２)ｍ-(Ｃ４Ｈ２ＮＯ２)（ｍは１〜１０、選好的に５である）、ＣＯ-(Ｃ６Ｈ１０)-ＣＨ２-(Ｃ４Ｈ２ＮＯ２)またはＣＯ-(ＣＨ２)２-ＮＨ２-ＣＯ-ＣＨ２-Ｂｒであるように独立して選ぶことができる。別の好ましいタイプのスペーサはＮＨ２-(ＣＨ２)ｎ-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ２)ｎ-ｍＰＥＧであり、ｎは１〜６の間で変化し、ｍＰＥＧはこれに結合する-(Ｃ４Ｈ２ＮＯ２)を有するか有さないポリエチレングリコールを表す。
【００４９】
リンカはまた、（遷移）金属イオン錯体の安定化ブリッジに付着するか、その一部であってもよい。好ましい構造は-(ＣＨ２)ｎ-ＮＨＲであり、ｎは１〜１０まで変化するあらゆる数が可能で、選好的に６であり、ＲはＣ(Ｏ)ＣＨ２Ｂｒ、ＣＯ-(ＣＨ２)ｍ-(Ｃ４Ｈ２ＮＯ２)（ｍは１〜１０、選好的に５である）、ＣＯ-(Ｃ６Ｈ１０)-ＣＨ２-(Ｃ４Ｈ２ＮＯ２)、ＣＯ-(ＣＨ２)２-ＮＨ２-ＣＯ-ＣＨ２-Ｂｒまたは-ＣＯ-(ＣＨ２)ｎ-ｍＰＥＧ（ｎは１〜６の間で変化する）であるように独立して選ぶことができ、ｍＰＥＧはこれに結合する-(Ｃ４Ｈ２ＮＯ２)を有するか有さないポリエチレングリコールを表す。
【００５０】
本発明の細胞ターゲティング複合体は、２つ以上の（遷移）金属イオンリンカシステムを有してもよい。２つの（遷移）金属イオンを有する（遷移）金属イオン錯体は二核種とよぶ。二核種は、
式  Ｍ１−Ａ−Ｍ２
によって表わすことができ、
Ｍ１およびＭ２は前述のように定義する（遷移）金属イオンリンカであり、
Ａはヘテロ原子を有するか有さない脂肪族鎖である。
【００５１】
白金錯体に連結される治療化合物またはターゲティング部分は、（硫黄含有反応サイトに付着すれば）Ｐｔ-Ｓ付加体として、（窒素含有反応サイトに付着すれば）Ｐｔ-Ｎ付加体として、または一般にＰｔ付加体としてよぶことができる。
【００５２】
以後、硫黄含有反応サイトをＳ反応サイトとよび、窒素含有反応サイトをＮ反応サイトとよぶ。
【００５３】
白金錯体を用いて生物有機分子を標識する方法が、長い間検討されてきた。白金錯体は生物分子の種々の反応部分と反応することができ、種々のタイプの検出可能マーカ部分がイオン性白金に付着したことが知られている。
【００５４】
この目的のためのｃｉｓ白金錯体の使用は、たとえば国際公開第９６／３５６９６号パンフレットに記載されており、このパンフレットはｃｉｓ白金錯体を介して生物有機分子およびマーカを連結する方法を開示している。これらの錯体において、２つの配位サイトが、エチレンジアミン基などの安定化ブリッジの両端によって占有される。ｃｉｓ白金錯体は、ペプチド、ポリペプチド、たんぱくおよび核酸などの、種々の生物有機分子に標識を連結するのに適している。ｔｒａｎｓ白金錯体を用いる方法も、種々の生物有機分子およびこれらとの標識の結鎖を標識するのに適しているとして報告されている（欧州特許第０ ８７０ ７７０号明細書）。
【００５５】
本発明者らは、標的薬物において、送達可能化合物とターゲティング部分との間のリンカとして（遷移）金属イオン錯体を使用する特別の利点は、（遷移）金属イオン錯体が、ターゲティング部分とカップリングさせたままで送達可能化合物を生体内の種々の組織に移送可能にするほど、充分に強い結合を提供することであるということを見出した。薬物分子の種々の反応サイトに向けられる白金錯体の反応性は、それが所望の生成物の定量的収率をもたらす直接的な結合反応を可能にするので、薬剤連結システムとしての用途において有益である。
【００５６】
（遷移）金属イオン錯体を使用するさらなる利点は、用いる反応部分に応じて、そのような錯体が、幅広い種々の生物学的活性化合物のターゲティング分子とのカップリングを支持することができるので、ターゲティング部分および治療化合物の化学的性質を大いに変化させることができる、ということである。
【００５７】
別の利点は、ターゲティング部分または送達可能化合物が、たんぱく鎖またはペプチド鎖内のヒスチジン（Ｈｉｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）および／またはシステイン（Ｃｙｓ）残基において、適した（遷移）金属イオン錯体を介して連結することができるということである。これは、たんぱく鎖またはペプチド鎖の異なる複数の側鎖基に連結する可能性を提供し、たとえば数個の送達可能化合物の、１つのターゲティング部分との結合、またはその逆を可能にするであろう。さらに、金属イオン錯体を介した薬物またはターゲティング部分基の、それらのアミノ酸残基との結合は、２つの反応を妨害せずに、従来の誘導体化戦略によるリジン側鎖の同時誘導体化を可能にするだろう。ゆえに、コアたんぱくまたはペプチドとのいずれの置換基のカップリングも、リジン残基にて両タイプの反応で目指す従来の戦略において観察されるような反応効率を低下させないだろう。
【００５８】
（遷移）金属イオン錯体によるカップリング反応の特異性を、ターゲティング部分または送達可能化合物における硫黄含有反応サイトと窒素含有反応サイトとのカップリングを区別するように制御することができる。したがって、本発明による（遷移）金属イオンリンカを用いることによって、ターゲティング部分または送達可能化合物内の特定の反応サイトへ向けて、ターゲティング部分または送達可能化合物のカップリングを導くことができる。
【００５９】
白金は、（遷移）金属イオン錯体における好ましい金属イオンである。
本発明の方法における使用に適した好ましい白金錯体の例は、式［Ｐｔ（ＩＩ）（Ｘ３）（Ｘ４）（Ｔ）（Ｄ）］のｃｉｓもしくはｔｒａｎｓ白金錯体、または式［Ｐｔ（ＩＩ）（Ｘ５）（Ｔ）（Ｄ）］のｃｉｓ白金錯体である。
【００６０】
ここで、Ｐｔは白金（Ｐｔ）を表し、ＴおよびＤは、ターゲティング部分（Ｔ）または送達可能化合物（Ｄ）との反応にそれぞれ加わる同じか異なる反応部分を表す。別の可能性は、位置ＴおよびＤの置換基が別のリガンドと置換されてターゲティング部分または送達可能化合物との複合体を形成するだろうということである。Ｘ３およびＸ４は同じか異なる不活性部分を表し、Ｘ５は、たとえば２配位性リガンドといった複数の配位性リガンドなどの安定化ブリッジとしての役割を果たし得る不活性部分を表す。好ましい群の２配位性リガンドは脂肪族ジアミンブリッジおよびジアミンシクロ（diamine cyclo）ブリッジであり、すべて当該技術の当業者に充分に知られている。好ましい３配位体の概要は、参照によってここに組込まれている特許出願欧州特許第０４０７８３２８．４号明細書に記載されている。
【００６１】
そのような白金錯体のいくつかの例の構造的表現を以下に示す。
【００６２】
【化１】
2009501791.tif 000003
【００６３】
本発明の方法において使用する白金（ＩＩ）錯体は、当該技術において周知のあらゆる方法によって調製することができる。参照はたとえばReedijkら（Structure and Bonding、第６７巻、ｐｐ．５３〜８９、１９８７年）に見られる。いくつかのｔｒａｎｓ白金錯体の調製物は欧州特許第０ ８７０ ７７０号明細書に開示されている。さらに、調製方法は国際公開第９６／３５６９６号パンフレットおよび国際公開第９８／１５５６４号パンフレットに見られる。これらのあらゆる公報に記載される方法は、参照によってここに組込んでいる。本発明の好ましい実施形態において、白金錯体をスペーサ−第三ブトキシカルボニル／ＮＨＳ−経路に従って調製する。このアプローチにおいて、金属イオンのリガンドの１つは、送達可能化合物またはターゲティング部分のいずれかを結合させる目的でさらに誘導体化することが可能な、金属イオンから離れたアミノ基を有するスペーサ分子から成る。
【００６４】
ターゲティング部分および送達可能化合物と置換することができる白金錯体の反応部分（Ｔ  Ｄ）は、好ましくは良好な脱離リガンドである。Ｔおよび／またはＤがＣｌ−、ＮＯ３−、ＨＣＯ３−、ＣＯ３２−、ＳＯ３２−、ＺＳＯ３−、Ｉ−、Ｂｒ−、Ｆ−、酢酸アニオン、カルボン酸アニオン、リン酸アニオン、硝酸エチルアニオン、シュウ酸アニオン、クエン酸アニオン、ホスホン酸アニオン、ＺＯ−および水の群から独立して選ばれる白金錯体は、本発明に従う方法における使用に特に適していることがわかった。Ｚを水素部分または１から１０までの炭素原子を有するアルキル基もしくはアリル基としてここで定義する。これらのリガンドのうち、Ｃｌ−およびＮＯ３−が最も好ましい。
【００６５】
あらゆるタイプの不活性部分Ｘ５を選ぶことができる。ここで使用する不活性の、とは、その部分が連結プロセス中において白金錯体に付着したままであることを示す。ＮＨ３、ＮＨ２Ｒ、ＮＨＲＲ’、ＮＲＲ’Ｒ”基の群から選ばれる１または２の不活性部分を有する白金錯体であって、Ｒ、Ｒ’およびＲ”が好ましくは１〜６の炭素原子を有するアルキル基を表している白金錯体は、本発明の方法における使用に特に適していることがわかった。Ｈ２ＮＣＨ３は特に好ましい不活性部分である。アルキル基が２〜６の炭素原子を有するアルキルジアミンは、ｃｉｓ白金錯体（たとえば式１ｃのＸ５）における好ましい２配位性不活性部分である。特に好ましい実施形態において、Ｘ５はエチレンジアミンを表す。
【００６６】
本発明の方法において使用するのに特に好ましい白金錯体は、ｃｉｓ［Ｐｔ(ｅｎ)Ｃｌ２］、ｃｉｓ［Ｐｔ(ｅｎ)Ｃｌ(ＮＯ３)］、ｃｉｓ［Ｐｔ(ｅｎ)(ＮＯ３)２］、ｔｒａｎｓ［Ｐｔ(ＮＨ３)２Ｃｌ２］、ｔｒａｎｓ［Ｐｔ(ＮＨ３)２Ｃｌ(ＮＯ３)］およびｔｒａｎｓ［Ｐｔ(ＮＨ３)２(ＮＯ３)２］を含む。これらの式において、ｅｎはエチレンジアミン部分を示す。
【００６７】
原則として、ターゲティング部分または送達可能化合物のあらゆるタイプの反応サイトを、本発明の方法においてカップリングサイトとして使用することができる。好ましい窒素含有反応サイトは、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、芳香族アミン、アミド、イミド、イミン、イミノエーテルまたはアジドを含む反応サイトを有する。好ましい硫黄含有反応サイトは、チオール、チオエーテル、スルフィド、ジスルフィド、チオアミド、チオン、ジチオカルバメートを含む反応サイトを有する。白金錯体リンカとカップリングすることができるターゲティング部分または送達可能化合物の例は、有機薬物分子、たんぱく、アミノ酸ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、免疫グロブリン、酵素、シンザイム、リン脂質、糖たんぱく、核酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸、ペプチド核酸オリゴマ、ペプチド核酸ポリマ、アミン、アミノグリコシド、ヌクレオペプチド、糖ペプチドおよび糖類、上記分子の組合せ、ならびにこれらの構造を模倣するのに使用することができるあらゆる有機、無機または生体分子との組合せ、を含む。
【００６８】
たんぱく性の送達可能化合物およびターゲティング部分は、組換えたんぱく技術を用いて、（酵素反応）切断サイトによって促進することができる。しかし、好ましい実施形態において、薬物放出促進機能は結合システムに含まれる。別の好ましい実施形態において、切断サイトは、標的エリア内に特異的に存在する酵素（メタロプロテイナーゼ、プラスミンまたはリソソームプロテアーゼ）によって分解可能である。このようにして、標的サイト内または標的サイトにてのみ薬理的活性化合物の放出を誘引するための、付加的なサイト特異性を与える。
【００６９】
送達可能化合物は、治療効果を与えるか、診断目的を有するあらゆる化合物であってよい。本発明における使用に適している送達可能化合物の非限定的な例は、たんぱく性の高分子、またはより小さな化学薬物分子もしくは天然由来薬物分子であってもよい。治療化合物はたとえば生物活性たんぱくであるのがよい。分子生物学は、薬物として使用することができる組換えたんぱくを設計および生成する可能性を実現してきた。たとえばサイトカインおよび増殖因子のようなたんぱくは、有力な生物活性を有するメディエータである。しかし、サイトカインの治療用途は、以下を考慮してしばしば制限される。第１に、これらの有力なメディエータは通常、患者に有害な可能性もある多数の生物活性を示す。送達可能化合物のターゲティング部分とのカップリングは、器官、組織または細胞型に対する化合物の選択性を改良し、これによってその治療プロフィールを大いに改良する。第２に、サイトカインおよび他の多くの組換えたんぱくの血漿中の半減期は通常、迅速な除去のため短い。ここでも、ターゲティング部分の、治療化合物とのカップリングは、化合物の薬物動態特性を改良するだろう。さらに、組換えたんぱくの標的送達は、低い生産量で生成される治療たんぱくの適用がうまくいくように促進することができる、低量の使用を可能にするだろう。したがって、薬物ターゲティング戦略を成功させるには、治療たんぱくの適用のスペクトルを広げるのがよい。
【００７０】
原則として、生物活性たんぱくおよび小さい薬物は、分解耐性のある安定した結合を介して、またはキャリアからの薬理活性化合物の放出をもたらす標的細胞内側または外部で切断される結合によって、ターゲティング部分とカップリングするのがよい。本発明は、たとえば配位（白金）化合物の修飾によって、両タイプの結合を可能にする。本発明は錯体に関し、ターゲティング部分を、ターゲティング部分の反応サイトとの配位結合を形成するための少なくとも第１の反応部分を有し、送達可能化合物の反応サイトとの配位結合を形成するための少なくとも第２の反応部分を有する（遷移）金属イオン錯体を介して送達可能化合物と結合する。
【００７１】
本発明の重要な利点は、（遷移）金属イオン錯体（たとえばここで示したＵＬＳリンカ）が、ターゲティング部分からの送達可能化合物の持続放出をもたらすことである。ゆえに、所望の器官、組織または細胞に到着すると、治療化合物はたとえば数時間、数日または数週間といった長期にわたってゆっくり放出する。結果として、特定の場所でどの時点においても自由化合物の濃度を制御することができる。さらに、治療効果を長期間示すこともできる。
【００７２】
持続放出様式を配位結合の化学的性質によって制御することができるのはさらなる利点である。配位結合の環境における潜在的な電子ドナーの存在（たとえば、本発明の複合体を標的する細胞内環境のグルタチオン）が結合の放出をもたらすだろうということは、当業者に理解されるだろう。ゆえに、放出を、窒素−白金結合がたとえば安定的だが可逆的である、配位結合の化学的性質に基づいて環境誘起することができ、好ましい実施形態を形成する。
【００７３】
さらに、治療化合物はしばしば低分子（薬物）化合物であってもよい。本発明の態様における好ましい実施形態は、低分子薬物が、配位結合を介して（遷移）金属イオン錯体に直接的に付着することである。これは、ターゲティング複合体と治療化合物との可逆的結合をもたらし、ゆえに固有の放出機能を提供する。
【００７４】
１つの実施形態において、本発明は、ターゲティング部分がその特定の細胞標的を認識するかそれに達するまで、ターゲティング複合体を可動（患者の体中を移動することができる）にする部分形状でターゲティング部分を提供する。この場合、ターゲティング部分は、明確な器官、組織、細胞、レセプタまたは他の生物分子に対する特異性を有する選択的ホーミング部分の形を有する。その目的のために、ターゲティング部分は結合対を有するか、レセプタなどの特定の細胞表面分子に対する親和性のある部分を有するのがよい。これに関連して、適しているのはここで開示するレセプタリガンドである。
【００７５】
同様の説明が、原位置（in situ）診断化合物、すなわち器官、組織または細胞型（腫瘍）の特定の細胞表面分子のイメージングまたは検出用に使用する化合物に当てはまる。
【００７６】
別の実施形態において、本発明は体内の特定の場所にターゲティング複合体を固定することができる部分形状でターゲティング部分を提供するので、複合体の持続放出様式は特定の場所、特に本発明の複合体を適用する場所に制限するのがよい。その目的のために複合体は、たとえばＰＥＧ分子といった、体内の循環を阻害する分子を含有するターゲティング部分を有する。当該技術において周知のそのような他の分子もまた使用することができることが、当業者に充分理解されるだろう。ゆえに、用語「ターゲティング」は、患者の体の特定のサイトに蓄積または残留する複合体の傾向を示す。
【００７７】
たんぱくとターゲティング部分との安定した結合は、ＨＩＳタグ、すなわち精製に役立つとして普通に使用され、たんぱく分子に付着するアミノ酸（ヒスチジン）残基の伸長部を備えたたんぱくの組換え型を用いることによって達成することができる。メチオニン残基およびＨＩＳタグにおけるヒスチジン残基の双方の存在によって、金属イオンリンカとＨＩＳタグとの反応が生じやすくなり、これは、もたらされる複合体の治療活性に関して有益であると判る。さらに、金属イオンリンカはまた、ＨＩＳタグを有さない組換えたんぱくのメチオニン開始コドンに選好性をもって反応することができる。この普遍的な技術によって、すべての組換えたんぱく薬物は本発明の方法によってターゲティング部分に効率的に連結することができるので、本アプローチは広い商用適用性を有している。
【００７８】
組換えたんぱくの形状の治療化合物は、標準の組換え技術によって生成することができる。たとえば、ＨＩＳタグおよび任意で切断サイトを有する所望のたんぱくをコードする組換えベクタは、周知の方法によって構築することができる。
【００７９】
本発明のカップリング方法は、（遷移）金属イオン錯体の、ターゲティング部分および送達可能化合物との配位結合の形成を可能にする工程を有する。
【００８０】
結合を形成する順序はどのようなものも適している。たとえば、第１に、（遷移）金属イオン錯体がターゲティング部分との配位結合を形成し、その後、もたらされたコンジュゲートが送達可能化合物と接触して、ターゲティング部分（金属コンジュゲート）の金属イオンと送達可能化合物との間の配位結合を形成するようにしてもよい。すべての化合物がまとまって種々の結合形成が同時に開始してもよい。
【００８１】
金属と送達可能化合物との結合および金属とターゲティング部分との結合は、同じであっても異なってもよい。たとえば、送達可能化合物−金属結合がＰｔ-Ｓ付加体を有し、ターゲティング部分−金属結合がＰｔ-Ｎ付加体を有しても、またはその逆であってもよい。金属イオンとの配位結合を形成する他のタイプの結合は、当業者によって選択することができる。
【００８２】
結合反応に対する反応パラメータが、特定のｐＨ値の選択を含んでもよい。ここで用いるｐＨは、２０°Ｃの水中でのｐＨ値として解釈すべきである。一般に、Ｐｔ-Ｓ付加体の形成はｐＨ非依存的であるが、Ｐｔ-Ｎ付加体の形成はｐＨ依存的である。好ましい実施形態において、ｐＨを利用して、１つ以上の窒素含有サイトに優先して、１つ以上のＳ反応サイトを選択的に標識する。
【００８３】
指針として、当業者は、送達可能化合物またはターゲティング部分の結合されるべきでないあらゆるＮ反応サイトの最低ｐＫａ未満のｐＨである結合反応のｐＨを選択して、Ｓ反応サイトとの選択的結合を可能にすることができる。当業者は、結合反応において、ｐＫａに加えて他の要因が役割を果たし得ることを理解できるだろう。通常、Ｓ反応サイトは酸性ｐＨでＮ反応サイトに優先して選択的に標識される。したがって、Ｎベースリガンドに優先したＳベースリガンドの選択的結合にｐＨを使用するのがよい。
【００８４】
理論的には、Ｐｔ-Ｓ付加体の形成は１工程プロセスである。反応基はＳが電子対を金属イオンに提供すると金属イオン錯体から脱離する。この金属イオン−Ｘの金属イオン−Ｓへの直接変換のプロセスは、ｐＨ非依存的であると考えられている。他方、Ｎドナーは、Ｎ置換より前に、酸素による金属イオン錯体の反応基の置換を必要とする。まず、金属イオン−Ｘは金属イオン−Ｏになり、最終的に金属イオン−Ｎになる。これは、ｐＨを変化させることによって第１工程を制御することができる、２工程のスキームである。したがって、溶液のｐＨに影響を及ぼす要因は、Ｐｔ-Ｎ付加体の形成を妨害する。前述の金属イオン結合は、特にＰｔイオン配位結合に関する。
【００８５】
イオンの存在はまた、Ｎ反応サイトとの配位結合を形成するための金属イオン（好ましくは白金）錯体の選択性を制御するために使用することもできる。実施形態において、１つ以上の脱離リガンド、好ましくはアニオン性部分を、金属イオン錯体のＮ反応サイトとのカップリングの阻害に用いて、Ｓ反応サイトとの選択的カップリングを強化する。このような脱離リガンドの例は、Ｃｌ−、ＮＯ３−、ＨＣＯ３−、ＣＯ３２−、ＺＳＯ３−、ＳＯ３２−、Ｉ−、Ｂｒ−、Ｆ−、酢酸アニオン、カルボン酸アニオン、リン酸アニオン、硝酸エチルアニオン、シュウ酸アニオン、クエン酸アニオン、ホスホン酸アニオン、ＺＯ−および水を含む。Ｚを水素部分または１から１０までの炭素原子を有するアルキル基もしくはアリル基としてここで定義する。特に良好な結果は、塩素および窒素が特に好ましいアニオン性部分を有する塩を用いて達成された。対イオンは好ましくは、アルカリカチオン、アルカリ土類カチオンまたは結合形成を導くのにも使用されるカチオンである。好ましい実施形態において、Ｎ反応サイトとの結合阻害に使用される前記アニオン性部分の総イオン強度は、少なくとも０．１ｍｏｌ／ｌである。より好ましくは、総イオン強度は０．１から０．５ｍｏｌ／１の範囲内である。
【００８６】
反応混合物内の他の（遷移）金属イオンの存在は、標識する反応サイトの選択にも用いることができる。特に、種々の（遷移）金属イオンは、Ｓ反応サイトとの結合を妨げるか低下させるのに、または結合Ｐｔ-Ｓ付加体を不安定にさせるのに適しており、効果的にＮ反応サイトがＳ反応サイトに優先して選択的に結合し得ることが判明した。本発明に従う方法において、たとえばｃｉｓ白金錯体およびｔｒａｎｓ白金錯体といった金属イオン錯体の幾何異性体を使用して、金属イオン錯体が、硫黄含有反応サイトまたは窒素含有反応サイトのいずれかに特異的に結合するように結合反応を向けることも可能である。
【００８７】
このターゲティング部分または送達可能化合物の選択的結合型は、本発明の複合体の種々の要素間の特定の結合が必要とされる場合に特定の利点を有し得るので、ターゲティング部分および送達可能化合物の双方を有する反応混合物内でカップリング反応を実行する場合に、ターゲティング部分または送達可能化合物のいずれかとのイオン金属錯体の結合を制御するのに使用することができる。
【００８８】
前述のパラメータに加えて、本発明に従う方法は、好ましくは０°Ｃから１２０°Ｃの範囲、より好ましくは２０°Ｃから７０°Ｃの範囲で変化する温度、通常は１分から４８時間の範囲内、好ましくは１０分から２４時間の範囲内、より好ましくは２５分から１５時間の範囲内である反応時間、試薬濃度、試薬のモル比、金属イオン錯体の総合的な正味荷電などのパラメータによってさらに微調整することができる。これらのパラメータは、当該技術において周知のあらゆる方法での特定の適用に応じて調整することができる。金属イオン錯体の総合的な正味荷電は、たとえば中性ｐＨでのヒスチジンのＰｔ-Ｎ付加体形成の特異性といった金属イオン−Ｎ付加体形成の特異性に影響を及ぼす。中性のＰｔ錯体はＰｔ-Ｎ付加体を形成するが、正帯電の白金錯体はＰｔ-Ｎ付加体を形成しない。正帯電のＰｔ錯体は、ペプチド、たんぱくなどの等電点を超えると、Ｎ付加体に向かう異なる結合を示す。Ｓ反応サイトに優先したＮ反応サイトとの選択的結合、またはその逆の選択的結合を可能とするだけでなく、本発明に従う方法はまた、欧州特許第１ ２６２ ７７８号明細書に記載されるような正確な条件を選択することによって、はっきりとＮ反応サイト間またはＳ反応サイト間で差別化することも可能にする。
【００８９】
コンジュゲートの精製、品質および安定性は、標準的な技術を用いて実行および評価することができる。たとえば、標的細胞におけるコンジュゲートとの結合およびコンジュゲートの摂取は、放射性標識生成物または免疫組織化学的技術を用いて試験管内で研究することができる。適当な試験管内試験システムは、たとえば細胞および器官切片を含み得る。開発した複合体の器官分布および細胞分布は、たとえば健常動物および疾患実験モデル（たとえばラットまたはマウスモデル）において研究することができる。
【００９０】
細胞ターゲティング複合体を調製すると、これらを薬学的に許容できるキャリアと組合せて医薬組成物を形成することができる。当該技術の当業者によって充分理解されるように、キャリアは、以下に記載する投与経路、標的組織の場所、送達される薬物、薬物送達の経時変化などに基づいて選択するのがよい。
【００９１】
本発明の目的はまた、体内の選択した細胞集団への送達可能化合物のターゲティング方法を提供することである。これらの目的および他の目的は、本発明に従う細胞ターゲティング複合体を有する医薬組成物を提供することによって扱うことができる。好ましい実施形態において、組成物は、本発明の細胞ターゲティング複合体と混合した薬学的に許容できるキャリアを有する。ここで用いる用語「薬学的に許容できるキャリア」は、あらゆるタイプの、不活性固体、半固体もしくは液体フィラ、希釈剤、カプセル化材料、または製剤補助剤を意味する。「薬学的に許容できる」キャリアは、妥当な損益比に見合う、（毒性、炎症およびアレルギ反応などの）過度の副作用のない、ヒトおよび／または動物への使用に適したものである。そのような材料は、それらが無毒で、薬物送達を妨害せず、他のあらゆる理由について生物学的に、または非生物学的に不所望ではないという点で、薬学的に許容できる。Remington's Pharmaceutical Sciences（第２０版、Gennaro, A. R.（編）、Mack Publishing Company、イーストン、ペンシルベニア州、２０００年）は、医薬組成物を製剤設計するのに用いる種々のキャリアと、その調製について周知の技術を開示している。薬学的に許容できるキャリアとして機能し得る材料のいくつかの例は、これらに限定されないが、ラクトース、グルコースおよびシュークロースなどの糖類、コーンスターチおよびポテトスターチなどの澱粉、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体、トラガント末、モルト、ゼラチン、タルク、ココアバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびダイズ油などの油、プロピレングリコールなどのグリコール、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル、寒天、TWEEN８０などの界面活性剤、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、アルギン酸、発熱物質非含有水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、ならびにリン酸バッファ液を含み、調製者の判断に従って、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の無毒の混合可能な潤滑剤、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、香料剤、防腐剤および抗酸化剤もまた、組成物中に存在し得る。
【００９２】
選択した細胞集団への送達可能化合物のターゲティング方法は、本発明に従う、治療上有効な量の医薬組成物を、それを必要としている患者に投与することを含む。ここで使用する「有効量」は、無毒だが、あらゆる治療に伴う妥当な損益比で所望の局所的効果または全身的効果および性能を提供するのに充分である薬物または薬理的活性化合物の量を意味する。ここで使用する「投与」および類似の用語は、治療する個体に組成物を送達して、組成物が、対象とする標的サイトに達するか、体循環を達成することが可能であることを意味する。組成物を好ましくは、全身投与によって、通常は静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与または筋内投与によって、個体に投与する。そのような使用のための注入物質は、溶液か懸濁液のような従来の形状で、または、溶液もしくは注射前の液体中の懸濁液として、もしくはエマルジョンとして、調製に適した固体状で、調製することができる。適した賦形剤またはキャリアは、たとえば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどを含み、必要に応じて、湿潤剤または乳化剤、緩衝剤などの微量の補助剤を添加することができる。他のキャリアを使用することができ、それらは当該技術においてよく知られている。
【００９３】
本発明の医薬組成物は、経口経路および非経口経路を含む、当該技術において周知のあらゆる手段によって患者に投与することができる。ここで用いる用語「患者」は、ヒトならびにたとえば哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類および魚類を含むヒト以外を示す。好ましくは、ヒト以外とは哺乳類である（たとえば齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、霊長類またはブタ）。ある実施形態において、非経口経路は消化管に見られる消化酵素との接触を避けるので、好ましい。
【００９４】
医薬組成物は、（たとえば静脈注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔内注射といった）注射によって、（粉末、クリーム、軟膏、ドロップによって）経直腸的に、経膣的に、局所的に、または（噴霧による）吸入によって、投与することができる。
【００９５】
たとえば滅菌注射用の水性または油性懸濁液といった注射用調製物は、適当な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて、当該技術に従って製剤設計することができる。滅菌注射用調製物はまた、たとえば１,３-ブタンジオール中の溶液といった、非経口的に許容できる無毒の希釈剤または溶媒中の、滅菌注射用溶液、懸濁液またはエマルジョンであってもよい。使用する許容ビークルおよび溶媒は、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．および等張食塩液である。さらに、滅菌固定油を溶媒または懸濁化剤として通常使用する。本目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、当たり障りのないあらゆる固定油を使用することができる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸を注入物質の調製に用いる。特に好ましい実施形態において、細胞ターゲティング複合体を、１％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび０．１％（ｖ／ｖ）TWEEN 80を有する流体キャリア中に懸濁する。注射製剤は、たとえば、細菌保持フィルタを通したろ過によって、または使用前に滅菌水または他の滅菌注射媒体中に溶解または分散させることができる滅菌固体組成物の形状の滅菌剤を組込むことによって、滅菌することができる。
【００９６】
直腸投与または膣内投与用の組成物は、好ましくは、大気温度では固体であるが体温では液体である、ココアバター、ポリエチレングリコールまたは坐剤ワックスなどの適当な非刺激性賦形剤またはキャリアと細胞ターゲティング複合体とを混合することによって調製することができる坐薬であるので、直腸または膣腔内で融解して、細胞ターゲティング複合体を放出する。
【００９７】
発明の医薬用組成物の局所的投与または経皮的投与用の服用形態は、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、噴霧、吸入剤またはパッチを含む。細胞ターゲティング複合体を、必要に応じて、薬学的に許容できるキャリアおよび必要とされるあらゆる防腐剤または緩衝剤と滅菌状態下で混合する。眼科製剤、点耳薬および点眼薬もまた、本発明の範囲内にあると意図する。軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本発明の細胞ターゲティング複合体に加えて、動物性および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクならびに酸化亜鉛、またはそれらの混合物などの賦形剤を含んでもよい。経皮パッチは、体への化合物の制御した送達を提供するという別の利点を有する。
【００９８】
そのような服用形態は、適当な媒体に細胞ターゲティング複合体を溶解または拡散させることによってなされ得る。吸収エンハンサもまた、経皮的な化合物の流れを増加させるのに使用することができる。その速度は、速度制御膜を与えるか、ポリママトリックス中もしくはゲル中に細胞ターゲティング複合体を拡散させるかによって制御することができる。
【００９９】
粉末および噴霧は、本発明の細胞ターゲティング複合体に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの薬剤の混合物などの賦形剤を含むことができる。噴霧は、さらにクロロフルオロ炭化水素などの慣用的な推進剤を含むことができる。
【０１００】
経口的に投与する場合、細胞ターゲティング複合体を、必ずではないが好ましくはカプセル化する。適当な種々のカプセル化システムが当業技術において知られている（「    Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy」、Doubrow, M.編、CRC Press、ボーカラトーン、１９９２年；MathiowitzとLanger、J. Control. Release、第５巻第１３号、１９８７年；Mathiowitzら、Reactive Polymers、第６巻第２７５号、１９８７年；Mathiowitzら、J. Appl. Polymer Sci.、第３５巻第７５５号、１９８８年；Langer、Acc. Chem. Res.、第３３巻第９４号、２０００年；Langer、J. Control. Release、第６２巻第７号、１９９９年；Uhrichら、Chem. Rev.、第９９巻第３１８１号、１９９９年；Zhouら、J. Control. Release、第７５巻第２７号、２００１年；およびHanesら、Pharm. Biotechnol.、第６巻第３８９号、１９９５年）。
【０１０１】
細胞ターゲティング複合体を、生分解性高分子マイクロスフェアまたはリポソーム内にカプセル化するのがよい。生分解性マイクロスフェアの調製において有用な天然および合成ポリマの例は、アルギネート、セルロースなどの炭水化物、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリアミド、ポリホスファゼン、ポリプロピルフマレート、ポリエーテル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、生分解性ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアンヒドリド、ポリヒドロキシ酸、ポリ（オルトエステル）および他の生分解性ポリエステルを含む。リポソームの生成に有用な脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴリピド、セレブロシドおよびガングリオシドなどのホスファチジル化合物を含む。
【０１０２】
経口投与用の医薬組成物は液体または固体であり得る。
発明の組成物の経口投与に適した液体服用形態は、薬学的に許容できるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤を含む。カプセル化した、またはカプセル化していない細胞ターゲティング複合体に加えて、液体服用形態は、当該技術において共通して用いられる、たとえば水または他の溶媒などの不活性希釈剤、ならびにエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１,３-ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタン脂肪酸エステルおよびそれらの混合物などの溶解補助剤および乳化剤を含む。経口組成物はまた、不活性希釈剤の他に、アジュバント、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、香味剤および香料剤を含むこともできる。ここで用いる用語「アジュバント」は、免疫応答の非特異的モジュレータであるあらゆる化合物を表す。ある好ましい実施形態において、アジュバントは免疫応答を促進する。あらゆるアジュバントを本発明に従って使用することができる。多数のアジュバント化合物が当該技術において知られている（Allison、Dev. Biol. Stand.、第９２巻第３号、１９９８年；Unkelessら、Annu. Rev. Immunol.、第６巻第２５１号、１９９８年；およびPhillipsら、Vaccine、第１０巻第１５１号、１９９２年）。
【０１０３】
経口投与用固体服用形態は、カプセル、タブレット、ピル、粉末および顆粒を含む。このような固体服用形態において、カプセル化した、またはカプセル化していない細胞ターゲティング複合体を、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸カルシウムなどの薬学的に許容できる、少なくとも１つの不活性な賦形剤もしくはキャリアと、ならびに／または（ａ）澱粉、ラクトース、シュークロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸などの充填剤もしくは増量剤、（ｂ）たとえばカルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、シュークロースおよびアカシアなどの結合剤、（ｃ）グリセロールなどの保湿剤、（ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ポテトスターチもしくはタピオカスターチ、アルギン酸、ある種のシリケートおよび炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、（ｅ）パラフィンなどの溶液緩染剤、（ｆ）第４級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、（ｇ）たとえばセチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなどの湿潤剤、（ｈ）カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤、（ｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムなどの潤滑剤、およびそれらの混合物と、混合する。カプセル、タブレットおよびピルの場合、服用形態は緩衝剤を含んでもよい。
【０１０４】
よく似たタイプの固体組成物を、ラクトースすなわち乳糖などと同様に高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いる軟充填および硬充填ゼラチンカプセルにおける、充填剤としても使用することができる。タブレット、糖衣錠、カプセル、ピルおよび顆粒の固体服用形態は、製剤処方技術においてよく知られている腸溶コーティングおよび他のコーティングなどのコーティングおよびシェルによって調製することができる。
【０１０５】
細胞ターゲティング複合体の正確な服用量を、治療する患者を考慮して、医師個人によって選択するのは当然である。通常、服用量および投与は、治療する患者に有効量の細胞ターゲティング複合体を与えるように調節する。ここで使用する細胞ターゲティング複合体の「有効量」は、所望の生物学的反応を導くのに必要な量を表す。当該技術の当業者によって充分に理解されるように、細胞ターゲティング複合体の有効量は、所望の生物学的評価項目、送達される薬物、標的組織、投与経路などの要因に応じて変化し得る。たとえば、抗癌薬物を有する細胞ターゲティング複合体の有効量は、所望の期間にわたる所望の量によって腫瘍サイズの縮小をもたらす量であるのがよい。考慮し得るさらなる要因は、病状の重症度、治療する患者の体重および性別、規定食、投与の時間および頻度、薬物の組合せ、反応感度、ならびに治療への耐性／応答を含む。長時間作用型の医薬用組成物は、特定の組成物の半減期およびクリアランス率に応じて、３〜４日ごと、毎週、または２週間ごとに投与するのがよい。
【０１０６】
本発明の細胞ターゲティング複合体を、投与の容易化および用量の均一化のために、好ましくは服用単位形態で製剤設計する。ここで用いる表現「服用単位形態」は、治療する患者にふさわしい細胞ターゲティング複合体の物理的に不連続な単位を表す。しかし、本発明の組成物の１日の総使用量は、正常な医学的判断の範囲内で主治医によって決定することが理解されるだろう。あらゆる細胞ターゲティング複合体について、治療有効量を、最初、細胞培養アッセイまたは通常はマウス、ウサギ、イヌもしくはブタといった動物モデルにおいて、推定することができる。動物モデルは、所望の濃度範囲および投与経路を実現するためにも使用する。その後、このような情報を用いて、ヒトにおける投与に関して有用な服用量および経路を決定することができる。
【０１０７】
細胞ターゲティング複合体の治療効果および毒性は、たとえばＥＤ５０（服用量が集団の５０％において治療的に有効である）およびＬＤ５０（服用量が集団の５０％の死を招く）といった、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手段によって決定することができる。治療効果に対する毒性の服用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。高い治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得たデータを、ヒトへの使用のための服用範囲の製剤設計に用いる。
【０１０８】
本発明を、以下の限定されない例によって説明する。
これらの例は、異なる分類の薬物および異なる分類のターゲティング部分を有する細胞ターゲティング複合体を合成する本発明の実現性を示す。さらに、これらは、異なる器官および疾患における異なる標的細胞に向けた構成体を開発する本発明の実現性を示す。ゆえに、新規のリンカ技術が、単一の薬物および単一の分類の薬物、ならびに単一のターゲティング部分のタイプおよび単一の標的細胞タイプに限定されないことを示すことができる。
【０１０９】
むしろ、本発明の細胞ターゲティング複合体はたとえば、肝線維症（活性化肝星細胞）、腎線維症（腎臓近位尿細管細胞）、慢性炎症性疾患（活性化内皮細胞）、または腫瘍の血管新生（血管新生内皮細胞）において主要な役割を果たす細胞を標的にすることができる。複合体に組込まれる薬物はたとえば、炎症過程もしくは線維形成過程（ペントキシフィリン、キナーゼ阻害薬、アンジオテンシンIIレセプタブロッカ、ピロリジンジチオカルバメート）またはプログラム細胞死（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）に関わることができる。合成した細胞ターゲティング複合体の可能性のある有用性を、試験管内での培養標的細胞による薬物ターゲティング実験において、および動物モデルでの薬物ターゲティング研究において実証する。
【０１１０】
実施例
以下の実施例においては、次の治療化合物を使用する。
ペントキシフィリン              ３,７-ジメチル-１-(５-オキソへキシル)
（ＴＮＦ-α合成阻害薬；          プリン-２,６-ジオン
抗炎症剤）
ロサルタン                      ２-ブチル-５-クロロ-３-((４-(２-(２
（アンジオテンシンＩＩ          Ｈ-テトラゾール-５-イル)フェニル)フェ
レセプタ拮抗薬）                ニル)メチル)イミダゾール-４-イル］メ
タノール
ＰＴＫＩ                        ４-クロロ-Ｎ-［４-メチル-３-(４-ピリジ
（ＰＤＧＦ）レセプタ            ン-３-イル-ピリミジン-２-イルアミノ）-
チロシンキナーゼ阻害薬）        フェニル］-ベンズアミド
ＳＢ２０２１９０                ４-［５-(４-フルオロフェニル)-２-(４
（ｐ３８                        -メチルスルフィニルフェニル)-３Ｈ-イミ
ＭＡＰキナーゼ阻害薬）          ダゾール-４-イル］ピリジン
ＰＴＫ７８７                    Ｎ-(４-クロロフェニル)-４-(ピリジン-
（ＺＫ２２２５８４）            ４-イルメチル)フタラジン-１-アミン
（ＶＥＧＦレセプタ
チロシンキナーゼ阻害薬）
ＴＫＩ（ＡＬＫ-５阻害薬Ｉ）      ３-(ピリジン-２-イル)-４-(４-キノニ
（ＴＧＦ-β ＲＩ                  ル)-１Ｈ-ピラゾール
キナーゼ阻害薬）
Ｙ２７６３２                    ４-(１-アミノエチル)-Ｎ-ピリジン-４-
（Ｒｈｏキナーゼ阻害薬）        イル-シクロヘキサン-１-カルボキサミド 
二塩酸塩
ＡＧ１２９５                    ６，７-ジメチル-２-フェニルキノキサリン
（ＰＤＧＦ-レセプタ
チロシンキナーゼ阻害薬）
ＰＤＴＣ                        ピロリジン ジチオカルバメート
（転写因子核因子κ-Ｂ
（ＮＦｊＢ）阻害薬；抗炎症剤）
【０１１１】
実施例１
薬物送達複合体の合成
１．１．  薬物−リンカ付加体および薬物−リンカ−キャリア複合体の調製
Ｐｔ(ｅｎ(ＮＯ３)Ｃｌ)リンカ（以下、ｃｉｓＵＬＳとよぶ）を用いた、薬物−キャリアコンジュゲートの合成のための一般的なプロトコールを開発した。通常、このタイプの細胞ターゲティング複合体は、薬物を白金含有リンカに結合させ、次いで、リンカを高分子キャリアと反応させることによって調製した。いくつかの例では、この方法は、第２の反応工程の後に、薬物ターゲティング調製物を産生する。他の例においては、複合体をホーミングリガンドによってさらに修飾して、最終の細胞ターゲティング複合体を産生する。
【０１１２】
一般的条件
通常、白金（エチレンヂアミン）二塩化物（Ｐｔ(ｅｎ)Ｃ１２；８２．５ｍｇ、０．２５３ｍｍｏｌ）を、３ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、少量ずつに分割したＡｇＮＯ３（３８．５ｍｇ、０．２２７ｍｍｏｌ、１ｍｌのＤＭＦに溶解）を２時間以内に添加することによって、より反応性の高いＰｔ(ｅｎ(ＮＯ３)Ｃｌ（ｃｉｓＵＬＳ一硝酸塩）へと変換した。沈殿した塩化銀を遠心分離によって除去した。種々の薬物分子を、生じたｃｉｓＵＬＳ一硝酸塩と、示した条件およびモル比で反応させた。一般に、反応は、１：１のモル比で、ＨＰＬＣによる分析で目的生成物の形成が完全になるまで行った。生じた薬物−ＵＬＳ生成物を精製し、以下に示すように、種々のターゲティング装置すなわちキャリアに反応させた。薬物−ＵＬＳ−キャリアの複合体形成ための一般的な反応条件は、１０：１の薬物−ＵＬＳ：キャリアの比、ｐＨ８のバッファ、３７°Ｃの温度および２４時間の反応時間である。しかし、反応条件は、生成物の組成によって変わり得る。
【０１１３】
１．１．ａ．  ペントキシフィリン−ｃｉｓＵＬＳ含有複合体の合成
ペントキシフィリン−ｃｉｓＵＬＳの合成
ペントキシフィリン（ＰＴＸ、４３．２ｍｇ、０．１５５ｍｍｏｌ、１ｍｌのＤＭＦに溶解）を、ｃｉｓＵＬＳ（０．２５ｍｍｏｌ）と、６０°Ｃで２日間反応させた。ＤＭＦを回転蒸発によって留去し、その後、残渣を２ｍｌの水に溶解し、減圧下で再度乾燥した。粗生成物を水（２ｍｌ）に溶解して−２０°Ｃで一晩貯蔵し、その後、黄色結晶として沈殿した未反応のＰｔ(ｅｎ)Ｃｌ２を、遠心分離（１４０００ｒｐｍで１０分）によって除去した。最終生成物ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳの同定と純度を、ＨＰＬＣ（９５％）、ＮＭＲおよび質量分析によって調べた。ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳを、さらなる使用まで、４°Ｃで貯蔵した。
【０１１４】
収量：１０５ｍｇ（０．１６６ｍｍｏｌ、収率１０７％）。
ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳの１Ｈ ＮＭＲ(Ｄ２Ｏ)：δＨ１．６２（ｍ、４Ｈ、ＣＨ２(ＣＨ２)２ＣＨ２）、２．２５（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３ＣＯ）、２．５８（ｍ、６Ｈ、ＣＯＣＨ２、Ｈ２Ｎ(ＣＨ２)２ＮＨ２）、３．９９（ｔ、Ｊ＝６．５６Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ２Ｎ）、４．０２（ｓ、３Ｈ、ＣＯＮＣＨ３）、４．５５（ｓ、３Ｈ、ＣＮＣＨ３Ｃ）、５．５９（ｍ、４Ｈ、Ｈ２Ｎ(ＣＨ２)２ＮＨ２）、８．４８（ｓ、１Ｈ、ＣＨ）ｐｐｍ。
ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳの１９５Ｐｔ ＮＭＲ(Ｄ２Ｏ)：δＰｔ−２４７１ｐｐｍ。
ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳのイオンスプレイＭＳ：計算質量：５６８、検出：５６８［Ｍ］；５５０［Ｍ−Ｃｌ＋ＯＨ］。ＰＴＸ−ＵＬＳ両種を、第２の反応工程においてキャリアと等しく反応させる。
【０１１５】
ペントキシフィリン−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡの合成
本実施例において、抗炎症化合物ＰＴＸを、キャリアたんぱくであるマンノース-６-リン酸修飾ヒト血清アルブミン（Ｍ６ＰＨＳＡ）と結合させる。Ｍ６ＰＨＳＡは、肝線維症の間、活性化肝臓星細胞（ＨＳＣ）［１］上に多く発現される、インスリン様増殖因子ＩＩ／マンノース-６-リン酸レセプタに結合する。Ｍ６ＰＨＳＡを前述のように合成し［２］、凍結乾燥後、さらなる使用まで、−２０°Ｃで貯蔵した。ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳをＭ６ＰＨＳＡに結合させるために、１０ｍｇのＭ６ＰＨＳＡ（１４．３ｎｍｏｌ）を１ｍｌの２０ｍＭ トリシン／ＮａＮＯ３バッファ（ｐＨ８．３）に溶解した。ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳ（１４３ｎｍｏｌ）を添加し、ｐＨを調べて必要に応じて補正した。混合物を一晩３７°Ｃで反応させた後、未反応のＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳを、使い捨てのPD10カラム（Amersham Biosciences）を用いるサイズ排除クロマトグラフィによって、または４°ＣのＰＢＳに対する透析によって除去した。最終生成物を０．２μｍフィルタによってろ過滅菌し、−２０°Ｃで貯蔵した。ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡをたんぱく含量（ＢＣＡ法）およびＨＰＬＣ分析による薬物含量について特徴づけた。一般に、結合薬物はＰＢＳ中の０．５Ｍ ＫＳＣＮと８０°Ｃで一晩インキュベートすることによってＭ６ＰＨＳＡから放出される。放出されたＰＴＸを、２７４ｎｍで作動するＵＶ検出器および４０°Ｃで作動するサーモスタトカラムオーブンを備える標準ＨＰＬＣシステムを用いて測定した。溶出は、・ondapak Guard-pak C18プレカラムと５μｍ Hypersil BDS C8カラムとを組み合わせて（２５０×４．６ｍｍ、Thermoquest、ランコーン、英国）、アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸（２５／７５／０．１）から成る移動相を用いて、１ｍｌ／分で行った。ＰＴＸは注入後６分で溶出した。一般に、生成物は、反応に１０倍モル過剰を用いれば、Ｍ６ＰＨＳＡあたり５〜８の結合薬物分子を含有した。
【０１１６】
１．１．ｂ．  ロサルタン含有複合体の合成
ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳの合成
ロサルタンカリウム（２-ブチル-４-クロロ-１-［ｐ-（ｏ-１Ｈ-テトラゾル-５-イル-フェニル）ベンジル］イミダゾール-５-メタノール 一カリウム）は、アンジオテンシンＩＩレセプタ（ＡＴ１タイプ）拮抗薬である。
【０１１７】
ロサルタン（３２μｍｏｌ、ＤＭＦ中１０ｍｇ／ｍｌのロサルタンカリウム塩）をｃｉｓＵＬＳ（３２μｍｏｌ）と６０°Ｃで３日間反応させた。出発物質の消費を分析ＨＰＬＣによって観察した。質量分析は、反応完了後に、１：１ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ種の存在を確認した。
ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳの１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δＨ０．７９（ｍ、３Ｈ、ＣＨ３）、１．２５（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＣＨ３）、１．４８（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２．５０（ｍ、６Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２ＣおよびＣＨ２ＮＨ２）、４．４３（ｍ、１．８Ｈ、ＮＣＨ２Ｃ）、５．１８（ｍ、２．２Ｈ、ＣＨ２ＯＨおよび残余ＮＣＨ２Ｃ）、５．４２（ｍ、４Ｈ、ＮＨ２）；環状Ｈｓ：６．８２（ｍ、０．２Ｈ）、６．８７（ｍ、１．８Ｈ）、７．０４（ｔ、Ｊ＝８．０６Ｈｚ、１Ｈ、ＣＨＣＨＣＨ）、７．１８（ｍ、０．５Ｈ）、７．２８（ｍ、１Ｈ）、７．３８（ｍ、３Ｈ）、７．８８（ｍ、０．５Ｈ）。ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳの１９５Ｐｔ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δＰｔ−２４９１および−２６５８ｐｐｍ。ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ：６９５［Ｍ−Ｋ＋−ＯＨー−Ｈ］＋、６７７［Ｍ−Ｋ＋−Ｃｌ−−Ｈ＋］＋、６５９［Ｍ−Ｋ＋−Ｃｌ−−Ｈ＋−Ｃｌ−＋ＯＨ−］＋。
【０１１８】
ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡの合成
本実施例において、アンジオテンシンＩＩレセプタ拮抗薬ロサルタンをキャリアたんぱくＭ６ＰＨＳＡに結合させる。前述のように、このキャリアは線維症肝臓内の活性化肝星細胞（ＨＳＣ）に結合する。結合薬剤ロサルタンはレニン−アンジオテンシン系に干渉する。手短に、１０ｍｇのＭ６ＰＨＳＡ（１４．３ｎｍｏｌ）を１ｍｌの２０ｍＭ トリシン／ＮａＮＯ３バッファ（ｐＨ８．３）に溶解した。ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ（１４３ｎｍｏｌ）を１０倍モル過剰で添加して、ｐＨを調べ、必要に応じて補正した。混合物を一晩３７°Ｃにて反応させ、その後、生成物を４°ＣのＰＢＳに対する透析によって精製した。最終生成物を０．２μｍフィルタによってろ過滅菌し、−２０°Ｃで貯蔵した。ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡは、そのたんぱく含量および薬物含量（ＨＰＬＣ）によって計算したところ、たんぱくモル当たりおよそ７の結合ロサルタン分子を有した。ロサルタンのＨＰＬＣ分析を、Novapak C18カラム、および２３／７７／０．１の比のアセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸から成る移動相を用いて実行した。溶出した化合物を２２５ｎｍにて観察した。
【０１１９】
ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−リゾチームの合成
本実施例において、アンジオテンシンＩＩ拮抗薬ロサルタンをキャリアたんぱくリゾチーム（ＬＺＭ）に結合させる。ＬＺＭおよび他の低分子量たんぱくは糸球体ろ過およびその後の近位尿細管細胞での摂取を受けるので、生じた生成物ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭは、生体内投与後、腎臓に蓄積する。このように、開発されたコンジュゲートは腎臓へのアンジオテンシン拮抗薬の送達において機能することができる。１つの付加的メチオニン基を、薬物−ｃｉｓＵＬＳ分子との反応前にＬＺＭに導入した。手短に、Ｂｏｃ-Ｌ-メチオニンヒドロキシサクシンイミドエステル（１７μｍｏｌ；ＤＭＳＯ中で１０ｍｇ／ｍｌ）をリゾチーム（１４μｍｏｌ；０．１Ｍ 重炭酸ナトリウムバッファ（ｐＨ８．５）中で１０ｍｇ／ｍｌ）に添加し、１時間室温で攪拌した。生成物を水に対して透析し、凍結乾燥した。メチオニン修飾リゾチームは、電子スプレイ質量分析によって確認したところ、１から２の追加のメチオニン基を有した。生成物を、さらなる使用まで−２０°Ｃで貯蔵した。ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ（０．７２μｍｏｌ；ＤＭＦ中で３ｍｇ／ｍｌ）をメチオニン修飾ＬＺＭ溶液（０．３６μｍｏｌ；２０ｍＭトリシン／硝酸ナトリウムバッファ（ｐＨ８．５）中で１０ｍｇ／ｍｌ）に添加し、混合物を３７°Ｃで２４時間インキュベートした。生じた生成物を２日間の水に対する透析によって精製し、０．２μｍ膜フィルタを通してろ過し、凍結乾燥して−２０°Ｃで貯蔵した。ロサルタンとリゾチームとの１：１のモル比のカップリングを、最終生成物の質量分析、およびキャリアからの放出後の結合薬剤のＨＰＬＣ分析によって確認した。
【０１２０】
１.１.ｃ．  ＰＴＫＩ含有複合体の合成
本実施例において、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）レセプタチロシンキナーゼ阻害薬（ＰＴＫＩ）をキャリアたんぱくＭ６ＰＨＳＡに結合させる。前述のように、このキャリアは線維症肝臓内の活性化肝星細胞（ＨＳＣ）に結合する。結合薬物ＰＴＫＩは、ＰＤＧＦキナーゼ経路に干渉する。ＰＤＧＦ ＢＢは、ＨＳＣ増殖のための最も有力なマイトジェンの１つであり、線維形成過程において重要な役割を果たす。
【０１２１】
ＰＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳの合成
ＰＴＫＩ（４-クロロ-Ｎ-［４-メチル-３-(４-ピリジン-３-イル-ピリミジン-２-イルアミノ)-フェニル］-ベンズアミド）（７．２μｍｏｌ、ＤＭＦ中で１０ｍｇ／ｍｌ）を、等モル量のｃｉｓＵＬＳ（７．２μｍｏｌ、水中で２０ｍＭ）と混合した。反応混合物を３７ーＣで２４時間加熱し、その後、出発物質の消費を分析ＨＰＬＣによって観察した。ｃｉｓＵＬＳの追加量を添加し（０．５当量、３．６μｍｏｌ）、反応を４８時間３７°Ｃで継続した。反応混合物を減圧下で濃縮し、メタノール（６００μｌ）に再溶解した。粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製し、集めたピークの主生成物を減圧下で乾燥した。生じた白色固体を水で処理して無機塩を除去し、乾燥した。収量：０．９ｍｇ（２０％）。質量分析は、１：１のＰＴＫＩ−ＵＬＳ種の存在を確認した。１Ｈ ＮＭＲ分析は、阻害薬とＰｔ（ＩＩ）との結合がピリジル窒素を介して起こるということを示した。
【０１２２】
ＰＴＫＩの１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δＨ２．３３（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、７．２６（ｄ、Ｊ＝８．２８Ｈｚ、１Ｈ、ＣＣＨ３ＣＨ）、７．３７（ｍ、２Ｈ、ＣＨＣｌ）、７．５２（ｍ、３Ｈ、Ｎ（ＣＨ）２ＣＣＣＨ）、７．９３（ｄ、Ｊ＝８．６０Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨＣＨＣｌ）、８．２２（ｓ、１Ｈ、ＮＨＣＣＨＣ）、８．４７（ｄ、Ｊ＝５．２３Ｈｚ、１Ｈ、ＣＨＮＣＮＨ）、８．６４（ｍ、２Ｈ、ＣＨ（ＣＨ）２ＣおよびＣＨＣＨＣＮＨ）、９．２９（ｓ、１Ｈ、ＮＣＨＣ）ｐｐｍ。
ＰＴＫＩ−ＵＬＳの１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δＨ２．２７（ｍ、３Ｈ、ＣＨ３）、２．６６（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２）、２．７４（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２）、７．１５（ｍ、３Ｈ、ＣＨＣＣＨ３およびＣＨＣｌ）、７．４７（ｍ、３Ｈ、Ｎ（ＣＨ）２ＣＣＣＨ）、７．８４（ｄ、Ｊ＝５．２３Ｈｚ、１Ｈ、ＣＨＣＨＣＮＨ）、７．８９（ｍ、２Ｈ、ＣＨＣＨＣｌ）、８．３９（ｄ、Ｊ＝３．９５Ｈｚ、１Ｈ、ＣＨＮＣＮＨ）ｐｐｍ。
ＰＴＫＩ−ＵＬＳの質量分析（ＥＳＩ＋）：計算質量：７０６（ｍ／ｚ）；検出質量：７０６［Ｍ＋］、６８８［Ｍ−Ｃｌ−＋ＯＨ−］＋、６７０［Ｍ−Ｃｌ−−Ｈ＋］＋、６６９［Ｍ−Ｃｌ−２Ｈ＋］＋。
【０１２３】
ＰＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡの合成
他の薬物−ＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡコンジュゲートに関して前述したのと同じプロトコールに従って、ＰＴＫＩ−ＵＬＳをＭ６ＰＨＳＡと結合させた。ＰＴＫＩ−ＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡおよびＭ６ＰＨＳＡを、サイズ排除クロマトグラフィおよびアニオン交換クロマトグラフィによって分析し、ＰＴＫＩ−ＵＬＳのカップリングがＭ６ＰＨＳＡたんぱくの特性を変えないことを確認した。過剰の白金リガンドチオシアン酸カリウム（ＫＳＣＮ、ＰＢＳ中で０．５Ｍ）との８０°Ｃでの一晩のインキュベーションによる薬物の競争的置換後、Ｍ６ＰＨＳＡに結合するＰＴＫＩ量をアイソクラチックＨＰＬＣによって分析した。溶出は、５μｍ Hypersil BDS C8カラム（２５０×４．６ｍｍ、Thermoquest、ランコーン、英国）、４０°Ｃで作動するサーモスタトカラムオーブンおよび２６９ｎｍで作動するＵＶ検出器を備える、Watersシステム（Waters、ミルフォード、マサチューセッツ州、米国）で実行した。移動相は、アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸（４０／６０／０．１、ｐＨ２）から成り、流速は１．０ｍｌ／分、感度は０．０１であった。保持時間：ＰＴＫＩ：７分；ＰＴＫＩ−ＵＬＳ：５分。
【０１２４】
１．１．ｄ．  ＳＢ２０２１９０含有複合体の合成
ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳの合成
ＳＢ２０２１９０（４-(-フルオロフェニル)-２-(４-ヒドロキシ-フェニル)-５-(４-ピリジル)-１Ｈ-イミダゾール、５．４３μｍｏｌ）をＤＭＦ中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、ｃｉｓＵＬＳ（５．４３μｍｏｌ、ＤＭＦ中で２０．５ｍＭ）と５０°Ｃで２時間反応させた。反応をＨＰＬＣによって追跡した。反応完了後、混合物を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、淡黄色固体を得て、これをＨＰＬＣ、１Ｈ ＮＭＲおよびエレクトロスプレイ質量分析によって分析した。質量分析は、標的とする１：１の薬物：ＵＬＳ種の存在を確認し、１Ｈ ＮＭＲ分析は、ＳＢ２０２１９０とｃｉｓ−ＵＬＳとの結合が、Ｐｔ（ＩＩ）金属への、薬物中に含まれるピリジン環のＮドナーの配位を介して起こるということを示した。
収量は９２％だった。
【０１２５】
自由ＳＢ２０２１９０の１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δＨ６．８８（ｄ、Ｊ＝８．７４Ｈｚ、２Ｈ、Ｆ(ＣＨＣＨ)２）、７．１７（ｍ、２Ｈ、Ｎ(ＣＨＣＨ)２）、７．５０（ｍ、４Ｈ、(ＣＨＣＨ)２ＯＨ）、７．８２（ｄ、Ｊ＝８．６８Ｈｚ、２Ｈ、Ｆ(ＣＨＣＨ)２）、８．４１（ｍ、２Ｈ、Ｎ(ＣＨＣＨ)２）ｐｐｍ。ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳの１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δＨ２．５９（ｍ、４Ｈ、Ｈ２Ｎ(ＣＨ２)２ＮＨ２）、５．５８（ｓ、２Ｈ、ＮＨ２）、５．９１（ｓ、２Ｈ、ＮＨ２）、６．８９（ｄ、Ｊ＝８．７５Ｈｚ、２Ｈ、Ｆ(ＣＨＣＨ)２）、７．２２（ｍ、２Ｈ、Ｎ(ＣＨＣＨ)２）、７．５３（ｍ、４Ｈ、(ＣＨＣＨ)２ＯＨ）、７．８２（ｄ、Ｊ＝８．７３Ｈｚ、２Ｈ、Ｆ(ＣＨＣＨ)２）、８．５２（ｍ、２Ｈ、Ｎ(ＣＨＣＨ)２）ｐｐｍ。ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ：６２２［Ｍ＋Ｈ］＋、５８５［Ｍ−Ｃｌ−−Ｈ＋］＋。
【０１２６】
ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＲＧＤＰＥＧ−ＨＳＡの合成
本実施例において、ｐ３８マイトジェン活性化経路（ＭＡＰ）キナーゼ阻害薬ＳＢ２０２１９０を、キャリアたんぱくヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合させる。生じた生成物に、新たに形成された血管の内皮細胞によって発現されるレセプタである［３］、αｖβ３インテグリンに結合するＲＧＤ−ペプチドホーミングリガンドを持たせる。さらに、ＨＳＡコアたんぱくに、最終構造においてステルス特性を暗示する、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を持たせる。このため、これらのＰＥＧリガンドは非標的細胞による摂取を妨げることができる。この分類のＲＧＤ搭載ホーミング装置の他の典型を以下に例示する。第１反応工程において、１０ｍｇのＨＳＡ（１４．３ｎｍｏｌ）を２０ｍＭ トリシン／ＮａＮＯ３バッファ（ｐＨ８．５）の１ｍｌ中に溶解した。ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ（１４３ｎｍｏｌ）を添加し、ｐＨを調べ、必要に応じて補正した。混合物を２４時間３７°Ｃで反応させ、その後、未反応のＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳを、４°ＣのＰＢＳに対する透析によって除去した。最終生成物を０．２μｍフィルタによってろ過滅菌し、−２０°Ｃで貯蔵した。ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＨＳＡをたんぱく含量（ＢＣＡ法）および薬物含量（ＨＰＬＣ分析）について特徴づけた。さらに、ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳとたんぱくとの結合を、ＵＶスペクトルを得ることによって確認した。というのも、最終生成物が、もとのＨＳＡには存在しない結合薬剤によって３３４ｎｍに特異的吸収を示すからである。ＳＢ２０２１９０のＨＰＬＣ検出のために、ＰＢＣ中の０．５Ｍ ＫＳＣＮとの一晩８０°Ｃでのインキュベーションによって、結合薬物をＨＳＡから放出させた。放出されたＳＢ２０２１９０は、C18 μBondapakカラムおよび２５４ｎｍで作動するＵＶ検出器を備える標準ＨＰＬＣシステムを用いて決定した。化合物を水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸の８０／２０／０．１混合液によって１ｍｌ／分で溶出した。通常、１０倍モル過剰のＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳを反応に用いた場合、生成物はＨＳＡあたり５〜８の結合薬物分子を有する。最終反応工程において、ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＨＳＡをＰＥＧおよびＲＧＤペプチド基で修飾した。ＰＢＳに溶解したＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＨＳＡを、５０倍モル過剰のＶＮＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（Nektar、アラバマ州、米国；水中で２０ｍｇ／ｍｌ）で滴加によって処理した。混合物をスズ箔で遮光し、ローラバンク上で室温１時間インキュベートした。一方、環状ＲＧＤペプチドｃ(ＲＧＤｆＫ−Ａｔａ)（Ansynth Service、ローセンダール、オランダ）を１：４のアセトニトリル／水混合液中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。ＲＧＤペプチドを反応混合物に５５：１のモル比で滴加し、その後、ヒドロキシルアミンを最終濃度が５０ｍＭになるように添加した。反応は、遮光しながら室温で一晩実行した。残余ＶＮＳ基をシステインの添加によって消去し（ＨＳＡ量に対して５５：１モル過剰）、その後、生成物をＰＢＳに対して透析し、最終的に、Aktaシステムのsuperdex200カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィによって精製した（Amersham Pharmacia、ウプサラ、スウェーデン）。最終生成物を−２０��Ｃで貯蔵した。ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＲＧＤＰＥＧ−ＨＳＡを、ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＨＳＡについて前述したように、そのたんぱく含量および薬物含量について特徴づけた。分析サイズ排除クロマトグラフィを実行してＰＥＧ化によるサイズの増大を明らかにし、生成物の純度を決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて、自家調製した抗ＲＧＤペプチド抗血清によるウェスタンブロッティングおよび免疫検出を実行して、ＲＧＤペプチドと複合体との結合を明らかにした。
【０１２７】
ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−リゾチームの合成
本実施例において、ＳＢ２０２１９０をキャリアたんぱくリゾチーム（ＬＺＭ）に結合させる。開発されたＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭコンジュゲートは、腎臓へのｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害薬の送達において機能することができる。メチオニン修飾リゾチーム（ｍｅｔ−ＬＺＭ、前述参照；２．６μｍｏｌ；トリシン／硝酸ナトリウムバッファ（ｐＨ８．５）中１０ｍｇ／ｍｌ）をＳＢ２０２１９０−ＵＬＳ（７．８μｍｏｌ；ＤＭＦ中１０ｍｇ／ｍｌ）で処理し、その後、混合物を３７°Ｃで２４時間インキュベートした。生成物を水に対して透析し、０．２μｍ膜フィルタを通してろ過し、凍結乾燥して−２０°Ｃで貯蔵した。ＳＢ２０２１９０のリゾチームとの１：１の比のカップリングを、最終生成物の電子スプレイ質量分析によって確認した。さらに、薬物のカップリングを、ＳＢ２０２１９０−リゾチームコンジュゲートからの薬物の放出後に、結合ＳＢ２０２１９０のＨＰＬＣ分析によって確認した。この目的のために、コンジュゲートを、０．１Ｍ リン酸バッファ生理食塩水中に溶解した０．５Ｍ チオシアン酸カリウム（ＫＳＣＮ）と８０°Ｃで２４時間インキュベートして、ＳＢ２０２１９０を完全に放出させた。他の場所で記載したＨＰＬＣ分析法（Waters、ミルフォード、マサチューセッツ州、米国）を用いてＳＢ２０２１９０を評価した。手短に、サンプルに内標準のＳＢ２０２１９０誘導体を添加し、２ｍｌジエチルエーテルで３回抽出した。抽出物を５０°Ｃで乾燥し、残渣を１００μｌの移動相（アセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸、３０：７０：０．１ｖ／ｖ／ｖ）に再溶解した。その２５マイクロリッタをＨＰＬＣカラム(Thermo-Hypersil Keystone、Bellefonte、ペンシルベニア州)に注入し、３５０ｎｍで検出した。ＳＢ２０２１９０と内標準とのピーク高比を用いて濃度を計算した。コンジュゲートのＳＢ２０２１９０の置換の程度は、リゾチームのモル当たり１モルのＳＢ２０２１９０であることがわかった。最終調製物において自由ＳＢ２０２１９０は見つけられなかった。
【０１２８】
ｃｉｓＵＬＳ−デンドリマ複合体の合成
デンドリマは、アルブミン系薬物送達システムについて前述したのと類似の方法で、薬物およびホーミング装置を備えることができる分岐ポリマである。本実施例はＰＡＭＡＭデンドリマで調製された薬物−デンドリマコンジュゲートの開発を記載する。開発された生成物は、分子サイズに応じて、種々の標的への薬物送達に、さらにホーミング装置またはＰＥＧのような他の官能基との誘導体化に、適用することができる。後者の分類の生成物は、ＲＧＤ_ＰＥＧ搭載薬物−デンドリマ複合体によって例示される。
【０１２９】
ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−デンドリマの合成
ＰＡＭＡＭ−ＮＨ２デンドリマ（世代３）に、Ｂｏｃ-Ｌ-メチオニンヒドロキシサクシンイミドエステル（１４．４μｍｏｌ；アセトニトリル中で１０ｍｇ／ｍｌ）とデンドリマ（１．４μｍｏｌ、ＰＢＳ中で１０ｍｇ／ｍｌ）との１時間室温での反応によって、メチオニン基を持たせた。生成物を水に対する透析によって精製し、凍結乾燥した。ＰＡＭＡＭ−ＮＨ２デンドリマ（世代４）に、同プロトコールに続いてメチオニン基（合成比３５：１）を持たせ、ｐ-イソチオシアネート-ベンジル-ＤＴＰＡ基（合成比３：１）を持たせて、複合体の放射性トレーサ同位体との標識化を促進した。生じたキャリアをＰＢＳに対する透析によって精製した。他の薬物−キャリア複合体に関する前述のプロトコールに従って、Ｇ３デンドリマをＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳと反応させ（合成比４：１）、Ｇ４デンドリマを４０：１の比で反応させた。最終生成物は透析によって精製し、３６０ｎｍでのＵＶ吸光度（結合ＳＢ２０１１９０-ＵＬＳの吸光度）を測定したところ、平均１：１（Ｇ３Ｄ）または２０：１（Ｇ４Ｄ）の薬物／デンドリマを含んでいた。
ＲＧＤ−ＰＥＧ搭載ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−デンドリマの合成
ＰＡＭＡＭ−ＮＨ２デンドリマ（世代４）に、ＲＧＤ−ＰＥＧ搭載アルブミンキャリアについて以下に記載する類似のプロトコールに従って、ＶＮＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（合成比４０：１）およびＲＧＤ−ペプチド（比５０：１）を持たせた。ＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＡＭＡＭデンドリマの、４０：１モル当量のＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳによる修飾を、PAMAM世代４のデンドリマについて前述したように実行し、薬物／デンドリマの錯体を生成した。結合薬剤のＵＶ吸光度を測定したところ、平均１５：１の薬物／デンドリマの錯体であった。
【０１３０】
１．１．ｅ．  ＰＴＫ７８７含有複合体の合成
本実施例において、血管形成の強力阻害薬である、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプタチロシンキナーゼインヒビタＰＴＫ７８７を、ＲＧＤ搭載ヒト血清アルブミンに結合させる。
【０１３１】
ＰＴＫ７８７−ｃｉｓＵＬＳの合成
ＰＴＫ７８７（５．８μｍｏｌ、ＤＭＦ中で１０ｍｇ／ｍｌ）をｃｉｓＵＬＳ（５．８μｍｏｌ）と混合した。生じた溶液を３７°Ｃで２４時間加熱し、その間、薬物出発物質の消費を分析ＨＰＬＣによって観察した。溶媒を減圧下で除去し、５０：５０のＤＭＦ：水で処理した。質量分析は、標的とする１：１の薬物：ＵＬＳ種の存在を確認し、１９５ｐｔ ＮＭＲおよび１Ｈ ＮＭＲ分析は、ピリジン環のＮドナーの配位を介して、ＰＴＫ７８７のｃｉｓＵＬＳとの結合が生じていることを示した。
【０１３２】
［Ｐｔ(エチレンジアミン)二塩素］の１９５ＰｔＮＭＲ：−２０７５ｐｐｍ。ＰＴＫ７８７−ＵＬＳの１９５ＰｔＮＭＲ：−２４９３ｐｐｍ。ＰＴＫ７８７の１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δＨ４．６４（ｓ、２Ｈ、ＣＨ２）、７．３３（ｍ、４Ｈ、ＣＨ２Ｃ(ＣＨ)２およびＣＨＣＨ(ＣＣ)２）、７．８２（ｄ、Ｊ＝８．６３Ｈｚ、２Ｈ、ＮＨＣ(ＣＨ)２）、７．８９（ｍ、２Ｈ、(ＣＨ)２ＣＣｌ）、８．０４（ｄ、Ｊ＝７．８０Ｈｚ、１Ｈ、ＣＨＣＨＣＣＮＨ）、８．４０（ｄ、Ｊ＝６．０６Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨＮ）、８．４４（ｄ、Ｊ＝７．７４Ｈｚ、１Ｈ、ＣＨＣＨＣＣＣＨ２）ｐｐｍ。ＰＴＫ７８７−ｃｉｓＵＬＳの１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δＨ２．５７（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨ２）、２．６５（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＨ２）、７．３６（ｄ、Ｊ＝８．８４Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨＣＨ(ＣＣ)２）、７．４８（ｄ、Ｊ＝６．５１Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ２Ｃ(ＣＨ)２）、７．８２（ｄ、Ｊ＝８．４８Ｈｚ、２Ｈ、ＮＨＣ(ＣＨ)２）、７．９５（ｔ、Ｊ＝８．６１Ｈｚ、２Ｈ、(ＣＨ)２ＣＣｌ）、８．１０（ｄ、Ｊ＝７．２５Ｈｚ、１Ｈ、ＣＨＣＨＣＣＮＨ）、８．４８（ｄ、Ｊ＝７．５８Ｈｚ、１Ｈ、ＣＨＣＨＣＣＣＨ２）、８．６１（ｄ、Ｊ＝６．６５Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨＮ）ｐｐｍ。ＰＴＫ７８７−ＵＬＳの質量分析（ＥＳＩ＋）：理論ｍ／ｚ：６３７．４５［Ｍ］。検出質量ｍ／ｚ：６５８［Ｍ＋Ｎａ＋−Ｈ＋］、６３７［Ｍ］＋、６０１［Ｍ−Ｃｌ−−Ｈ＋］＋。ＵＶ／Ｖｉｓ（ＰＢＳ中）：λｍａｘ３３９ｎｍ（ε＝１１６７９Ｍ−１ｃｍ−１）。
【０１３３】
ＰＴＫ−ＵＬＳのＲＧＤ搭載キャリアとの結合
３つの異なるタイプのキャリアを、ＰＥＧおよびＲＧＤペプチドを有するアルブミンの誘導体化によって開発した。これらのコンジュゲート（ＨＳＡ）におけるＰＥＧの取込みは、溶解度を改良し、マクロファージによる非特異的摂取を妨げる。ＰＥＧはさらに、生成物の体内分布を変更して、長期の循環様式を助ける。付加されたＲＧＤ-ペプチドは、前述のように、血管新生内皮細胞への結合を促進する。
【０１３４】
ＲＧＤ−ＨＳＡの合成
ＰＢＳに溶解したＨＳＡ（３０ｍｇ、４４４ｎｍｏｌ）を、２２倍モル過剰のヨード酢酸Ｎ-ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＳＩＡリンカ、SIGMA、ミズーリ州、米国；ＤＭＦ中の１０ｍｇ／ｍｌ、９．７μｍｏｌ）とインキュベートした。一方、ＲＧＤペプチドｃ(ＲＧＤｆ(ε-Ｓ-アセチルチオアセチル)Ｋ)（Ansynth Service、ローセンダール、オランダ）を、１：４のアセトニトリル／水混合液に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。ペプチド（１１．１μｍｏｌ）を、ペプチド対たんぱくのモル比２５：１にて反応混合物に滴加し、その後、ヒドロキシルアミンを最終濃度が５０ｍＭになるまで添加した。ヒドロキシルアミンはＲＧＤペプチドのアセチル基を放出して、自由スルフヒドリル基を獲得する。遮光して反応を一晩室温で実行し、その後、生成物を、ＰＢＳに対して徹底的に透析した。最終生成物ＲＧＤ−ＨＳＡを−２０°Ｃにて貯蔵した。コントロールコンジュゲートＲＡＤ−ＨＳＡを、コントロールペプチドｃ(ＲＡＤｆ(ε-Ｓ-アセチルチオアセチル)Ｋ)と同じプロトコールに従って調製した。
【０１３５】
ＲＧＤ−ＨＳＡ−ＰＥＧの合成
ＰＢＳに溶解したＲＧＤ−ＨＳＡ（１３ｍｇ、１９３ｎｍｏｌ）を２０倍モル過剰のｍＰＥＧサクシンイミジルαメチル酪酸（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ、Nektar Therapeutics、米国；２０ｍｇ／ｍｌ、３．８５μｍｏｌ）と、３時間室温でインキュベートした。生成物を、AktaシステムのSuperdex200 HR 10/60カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって精製した（GE Healthcare、ウプサラ、スウェーデン）。ＳＥＣをＰＢＳ ０．５ｍｌ／分で実行し、２１４ｎｍ、２８０ｎｍおよび３３９ｎｍで観察した。最終生成物ＲＧＤ−ＨＳＡ−ＰＥＧおよびＲＡＤ−ＨＳＡ−ＰＥＧ（同じプロトコールに従って調製した）を−２０°Ｃで貯蔵した。
【０１３６】
ＲＧＤＰＥＧ−ＨＳＡの合成
ＨＳＡ（１０ｍｇ、１４８ｎｍｏｌ）をＰＢＳに溶解し、５０倍モル過剰のビニルスルホン-ポリエチレングリコール-Ｎ-ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＶＮＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ；Nektar、アラバマ州、米国；水中２０ｍｇ／ｍｌ、７．４μｍｏｌ）とインキュベートした。混合物をアルミホイルで遮光し、spiramixローラバンク上で穏やかに攪拌しながら１時間室温でインキュベートした。前述のように、ＲＧＤペプチド（８．１４μｍｏｌ）を、ＨＳＡに対して５５倍モル過剰に添加し、続いてヒドロキシルアミンを添加した。遮光しながら反応を一晩室温で実行した。残余ＶＮＳ基をシステインの添加によって消去し（８．１４μｍｏｌ；ＨＳＡ量に対して５５倍モル過剰）、その後、生成物を前述のようにＳＥＣによって精製した。最終生成物ＲＧＤＰＥＧ−ＨＳＡおよびＲＡＤＰＥＧ−ＨＳＡを−２０°Ｃにて貯蔵した。
【０１３７】
ＰＴＫ７８７−ＵＬＳのＲＧＤ搭載アルブミンとのカップリング
ＲＧＤ修飾キャリアをＰＢＳに溶解し、続いて１５倍モル過剰のＰＴＫ７８７−ＵＬＳと２４時間３７°Ｃでインキュベートし、その後、未反応のＰＴＫ−ＵＬＳおよび凝集生成物をサイズ排除クロマトグラフィによって除去した。生成物を０．２μｍフィルタによってろ過滅菌し、−２０°Ｃで貯蔵した。
【０１３８】
１．１．ｆ．  ＴＫＩ含有複合体の合成
本実施例において、ＡＬＫ−５阻害薬（ＴＧＦ−βキナーゼ阻害薬、ＴＫＩ）３-(ピリジン-２-イル)-４-(４-キノニル)-１Ｈ-ピラゾール（Ca lBiochem）を腎臓対象キャリアたんぱくＬＺＭに結合させる。ＴＫＩは、最も重要な前線維化増殖因子の１つであるＴＧＦ−βによって活性化されるシグナル伝達系を阻害する。ＴＫＩは、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの有力な阻害薬でもある。
【０１３９】
ＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳの合成
ＴＫＩ（９．９８ｍｇ、３７μｍｏｌ）を、１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＦに溶解し、その後、調製したばかりの当モル量のｃｉｓＵＬＳ溶液を添加した。混合物を３７°Ｃで一晩加熱した。生成物をＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳおよびＰｔ−ＮＭＲによって分析した。これらの分析はＴＫＩとＵＬＳとの１：１のカップリング比を確認した。収量：７７．３％（ＨＰＬＣによる）。
【０１４０】
ＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−リゾチームの合成
ＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳを、他の薬物−ＵＬＳ−キャリア複合体の結合について前述したように、ｍｅｔ−ＬＺＭと反応させた。生成物を水に対する透析によって精製し、凍結乾燥して−２０°Ｃで貯蔵した。イオンスプレイＭＳ分析はＴＫＩ−ＬＺＭコンジュゲートの形成を確認した。結合した薬物量を、リンカからの放出後に定量した。平均で、ＬＺＭあたり１〜２のＴＫＩ分子が結合していた。
【０１４１】
１．１．ｇ．  Ｙ２７６３２含有複合体の合成
本実施例において、ＲＯＣＫ阻害薬Ｙ２７６３２を腎臓対象キャリアたんぱくＬＺＭに結合させる。
【０１４２】
Ｙ２７６３２−ｃｉｓＵＬＳの合成
Ｙ２７６３２（３８μｍｏｌ、水中１０ｍｇ／ｍｌ）を１Ｍ ＮａＯＨによってｐＨ８．５に塩基性化し、ｃｉｓＵＬＳ（６６μｍｏｌ）と５０°Ｃで一晩反応させた。出発薬物の消費および生成物の形成をＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳで追跡した。その後、過剰ＵＬＳを、２０ｍＭ濃度のＮａＣｌであるＤＭＦ：水の１：１溶液の等体積の添加、および一晩室温での攪拌によって沈殿させた。その後、黄色固体をろ過除去する。収量：５０％（ＨＰＬＣ；粗生成物について）。Ｙ２７６３２−ｃｉｓＵＬＳ−リゾチームの合成
Ｙ２７６３２−ｃｉｓＵＬＳを、他の薬物−ＵＬＳ−キャリア複合体の結合について前述したように、ｍｅｔ−ＬＺＭと反応させた。生成物を水に対する透析によって精製し、凍結乾燥して−２０°Ｃで貯蔵した。イオンスプレイＭＳ分析はコンジュゲートの形成を確認した。結合した薬物量を、リンカからの放出後に定量した。平均で、ＬＺＭあたり１〜２のＹ２７６３２分子が結合していた。
【０１４３】
１．２．  薬物−trans白金錯体の合成
多数の薬物−trans白金システムの合成を、たとえば以下に記載するような５工程（図１も参照）といった、複数の工程において実行した。
【０１４４】
１．ｔｒａｎｓ-［ＰｔＣｌ(ＯＮＯ２)(ＮＨ３)２］
４ｍｌ ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のトランスプラチン（０．１ｇ、０．３３３ｍｍｏｌ）を、０．９等量のＡｇＮＯ３（０．０５１ｇ、０．３ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を暗所で一晩撹拌した。この後、ＡｇＣｌをろ過除去し、ｃｉｓ-［ＰｔＣｌ(ＯＮＯ２)(ＮＨ３)２］を含有する黄色溶液を１９５Ｐｔ ＮＭＲによって調べた。−１７７５ｐｐｍに単一のピークが観察され、これは白金核周辺のＣｌＯＮ２環境と一致する。
【０１４５】
２．ｔｒａｎｓ-［ＰｔＣｌ(ＮＨ３)２(Ｂｏｃ１，ｎ)］＋ （ｎ＝３，４，５）
ＤＭＦ中のｃｉｓ-［ＰｔＣｌ(ＯＮＯ２)(ＮＨ３)２］を０．８等量のＢｏｃ１，ｎ（ｎ＝３（０．０４６ｇ、０．２６６ｍｍｏｌ）、４（０．０５０ｇ、０.２６６ｍｍｏｌ）、５（０．０９９ｇ、０．２６６ｍｍｏｌ））および０．８当量のトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）で処理した。反応混合物を一晩室温で反応させた。ｃｉｓ-［ＰｔＣｌ(ＮＨ３)２(Ｂｏｃ１，ｎ)］＋の形成を、反応溶液から直接、１９５Ｐｔ ＮＭＲによって調べた。単一シグナルが−２３９９ｐｐｍに観察され、これは白金周辺のＣｌＮ３環境に当たる。同じシグナルが、３つの使用リンカ、Ｂｏｃ１，３；Ｂｏｃ１，４およびＢｏｃ１，５について、同じ化学シフトに観察された。
【０１４６】
３．ｔｒａｎｓ-［Ｐｔ(ＯＮＯ２)(ＮＨ３)２(Ｂｏｃ１，ｎ)］＋（ｎ＝３，４，５）
ｃｉｓ-［Ｐｔ(Ｃｌ)(ＮＨ３)２(Ｂｏｃｌ，ｎ)］＋をＤＭＦ中０．９等量のＡｇＮＯ３（０．０５１ｇ、０．３ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を一晩暗所で攪拌した。この後、ＡｇＣｌをろ過除去し、ｃｉｓ-［Ｐｔ(ＯＮＯ２)(ＮＨ３)２(Ｂｏｃｌ，ｎ)］＋を含有する黄色溶液を１９５Ｐｔ ＮＭＲで調べた。単一シグナルが−２１３３ｐｐｍに観察された。このシグナルは白金周辺のＯＮ３環境と一致する。同じ化学シフト値が３つの使用したリンカについて観察された。
【０１４７】
４．ｔｒａｎｓ-［Ｐｔ(ｐｔｘ)(ＮＨ３)２(Ｂｏｃ１，ｎ)］２＋（ｎ＝３，４，５）（ＰＴＸはペントキシフィリンである）
ｃｉｓ-［Ｐｔ(ＯＮＯ２)(ＮＨ３)２(Ｂｏｃｌ，ｎ)］＋を暗所にて一晩７５°Ｃで０．８等量のＰＴＸ（０．０７４ｇ、０．２６６ｍｍｏｌ）で処理した。一晩後、所望の種の形成を１９５Ｐｔ ＮＭＲで調べた。複合体ＲＢｏｃ１，３、ＲＢｏｃ１，４およびＲＢｏｃ１，５について、それぞれ−２４８７，−２４８４および−２４９２ｐｐｍにシグナルが観察された。これらの値は白金核周辺の４Ｎ環境と一致する。
【０１４８】
５．Ｂｏｃ基の脱保護
最終工程におけるアミン基の脱保護は、各複合体ＲＢｏｃ１，３、ＲＢｏｃ１，４およびＲＢｏｃ１，５の０．１Ｍ ＨＣｌとの、５０°Ｃ暗所での一晩の処理によって起こる。１Ｈ ＮＭＲは、三級ブチル基に割り当てられた１．３４ｐｐｍのシグナルの消失によって、脱保護が成功したことを証明した。
【０１４９】
ｔｒａｎｓ-［Ｐｔ(ｐｔｘ)(ＮＨ３)２(Ｂｏｃ１，ｎ)］２＋（ｎ＝３，４，５）のＨＰＬＣによる精製（ＰＴＸはペントキシフィリンシステムである）
３つすべてのｔｒａｎｓ-ＵＬＳシステムに対するＨＰＬＣによる精製は、異なる種の混合物が最初に生じるように実行した。すべての複合体について、ＭＳおよび１Ｈ ＮＭＲで調べたところ、精製は成功した。
【０１５０】
リンカのＮＨ２基の修飾
アミン基の修飾について、５つのシステムを水に溶解し、ｐＨを１Ｍ ＮａＯＨで８〜９に調整する。ｐＨの調整後、１．５等量のブロモ酢酸Ｎ-ヒドロキシサクシンイミドエステルを溶液に添加する。反応液を室温で７時間攪拌する。反応が完了するまで（図２）、アミン基とエステルとの反応を可能にするために、反応混合物のｐＨを８〜９に維持することが重要である。
【０１５１】
反応の進行をＬＣＭＳで追跡した。
２時間ごとに一定分量を取り出し、ＬＣＭＳで調べた。修飾複合体に対応するピークは時間とともにその強度を増していることが観察された。反応７時間後、クロマトグラムにさらなる変化は観察されなかった。所望の種の質量は、それぞれ７０１．０８，７１５．０５，７２９．０８であるとわかった。修飾複合体の精製が必要であった。非修飾複合体の精製に使用したのと同じ条件でＨＰＬＣによって精製を実行し、すべての場合において成功した。次に、これらの複合体は、限定はしないが、修飾アルブミン、抗体などのターゲティング装置に連結することができる。
【０１５２】
ＡＧ１２９５-ｔｒａｎｓＵＬＳの合成における媒介物としてのｔｒａｎｓ-［ＰｔＣｌ(ＯＮＯ２)(ＮＨ３)２］の使用
ＡＧ１２９５（１８．７μｍｏｌ）をＤＭＦ中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、５０°Ｃで１．５時間ｔｒａｎｓＵＬＳ（８．５４μｍｏｌ、ＤＭＦ中１８．７ｍＭ）と反応させた。反応後をＨＰＬＣで追跡した。質量分析は標的とする１：１の薬物：ＵＬＳ種の存在を確認した。溶媒は減圧下で除去することができる。Ｋ２−ｔｒａｎｓＵＬＳ（ＥＳＩ＋）の質量分析：計算質量：４９７（ｍ／ｚ）；検出質量：４９７［Ｍ＋］。
【０１５３】
ＰＴＫ７８７−ｔｒａｎｓＵＬＳ
ＰＴＫ７８７（５．７７μｍｏｌ）をＤＭＦ中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。等モルのｔｒａｎｓ−ＵＬＳ（ＤＭＦ中１８．７ｍＭ）を添加し、生じた混合物を３７°Ｃで２時間加熱した。その後、さらに０．２５モル当量のｔｒａｎｓＵＬＳを添加し、生じた溶液を３７°Ｃで１．５時間加熱した。過剰ＵＬＳは、Ｙ２７６３２−ｃｉｓＵＬＳの合成において記載したようなＮａＣｌ処理によって、除去することができる。溶媒は減圧下で除去することができる。反応をＨＰＬＣで追跡した。質量分析は標的とする１：１の薬物：ＵＬＳ種の存在を確認した。
ＫＴＫ７８７−ｔｒａｎｓＵＬＳ（ＥＳＩ＋）の質量分析：計算質量：６０９（ｍ／ｚ）；検出質量：６０９［Ｍ＋]。
【０１５４】
ロサルタン-ｔｒａｎｓＵＬＳ
生成物は、ロサルタン（３．４０μｍｏｌ；１０ｍｇ／ｍｌ）の、等モルのＤＭＦ中ｔｒａｎｓＵＬＳ（１８．７ｍＭ）との一晩室温での処理で生じた。反応をＨＰＬＣで追跡した。質量分析は標的とする１：１の薬物：ＵＬＳ種の存在を確認した。ロサルタン−ｔｒａｎｓＵＬＳ（ＥＳＩ＋）の質量分析：計算質量：７１０（ｍ／ｚ）；検出質量：７１０［Ｍ＋］。
【０１５５】
ＳＢ２０２１９０−ｔｒａｎｓＵＬＳ
この種は、ＤＭＦ中ＳＢ２０２１９０（５．４３μｍｏｌ、１０ ｍｇ／ｍｌ）と、等モルのＤＭＦ中ｔｒａｎｓＵＬＳ（１８．７ｍＭ）との１時間３７°Ｃでの反応によって生じた。反応をＨＰＬＣで追跡した。質量分析は標的とする１：１の薬物：ＵＬＳ種の存在を確認した。ＳＢ２０２１９０−ｔｒａｎｓＵＬＳ（ＥＳＩ＋）の質量分析：計算質量：５９４（ｍ／ｚ）；検出質量：５９４［Ｍ＋］。
【０１５６】
１．３．  二核種の合成および特性
ジクロロ（エチレンジアミン）白金（ＩＩ）（１）
ヨウ化カリウム（２ｇ、１２ｍｍｏｌ）を５０ｍｌの水中１ｇ（２ｍｍｏｌ）のＫ２Ｐｔｌ４溶液に添加した。生じたＫ２ＰｔＣｌ４の黒ずんだ溶液を０．１６ｍｌ（２．４ｍｍｏｌ）のエチレンジアミンで処理し、室温で数時間静置した。その後、ＰｔｅｎＩ２の暗黄色の沈殿物をろ過して集め、水、氷冷エタノールおよびエーテルで洗浄し、空気中で乾燥した。収量：１ｇ（９９％）。
【０１５７】
その後、５ｍｌ水中の硝酸銀（０．６６ｇ、３．９ｍｍｏｌ）を、攪拌しながら、２５ｍｌ水中のＰｔｅｎＩ２（１ｇ、２ｍｍｏｌ）懸濁液に添加した。混合物を一晩室温暗所で攪拌した。その後、ＡｇＩの白色沈殿をろ過除去し、０．３３ｇ（４．４ｍｍｏｌ）のＫＣｌをろ液に添加した。混合物を暗所で一晩貯蔵し、生じた黄色の沈殿をろ過して集め、氷水、エタノールおよびエーテルで洗浄し、空気中で乾燥した。収量：０．５２ｇ（８０％）。Ｃ２Ｈ８Ｎ２Ｃｌ２Ｐｔの元素分析、計算値：Ｃ，７．３７；Ｈ，２．４７；Ｎ，８．５９。検出値：Ｃ，７．５８；Ｈ，２．８０；Ｎ，８．５０。１９５Ｐｔ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ−２３３０。
【０１５８】
２-(２-三級-ブチルオキシカルボニルアミノ)エトキシ)エタノール（２ａ）
１０ｍｌエタノール中２．６２ｇ（１２ｍｍｏｌ）の二炭酸ジ-三級-ブチル溶液を、１０ｍｌエタノール中１．０５ｇ（１０ｍｍｏｌ）の２-(２-アミノエトキシ)エタノール攪拌溶液に穏やかに添加した。室温で４時間攪拌した後、溶媒を減圧下で除去した。残渣を２５ｍｌ 酢酸エチルで抽出し、有機相を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、蒸発させて生成物を得た。収量：１．９５ｇ（９５％）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．８８（ｓ、１Ｈ、ＮＨ）、３．７４（ｔ、２Ｈ、Ｈ１）、３．５６（ｍ、４Ｈ、Ｈ２＋ Ｈ３）、３．３４（ｍ、２Ｈ、Ｈ４）、１．４５（ｓ、９Ｈ、Ｂｏｃ）。
【０１５９】
１-(２-(三級-ブチルオキシカルボニルアミノ)エトキシ)-２-スルホニルエタン（２ｂ）
塩化メタンスルホニル（０．８８ｍｌ、１１．４ｍｍｏｌ）を、０°Ｃの５０ｍｌジクロロメタン中１．９５ｇ（９．５ｍｍｏｌ）の２ａおよび２ｍｌ（１４．３ｍｍｏｌ）のトリエチルアミン攪拌溶液に穏やかに添加した。生じた溶液を１時間０°Ｃおよび３０分室温で攪拌した。その後、溶液を、１Ｍ ＨＣｌ（５０ｍｌ）、水（５０ｍｌ）、１０％ Ｎａ２ＣＯ３水溶液（５０ｍｌ）および塩水（５０ｍｌ）で引き続いて洗浄した。有機相を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、蒸発させて生成物を得た。収量：１．６２ｇ（６０％）。１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．３５（ｔ、２Ｈ、Ｈ１）、３．７３（ｔ、２Ｈ、Ｈ２）、３．５６（ｔ、２Ｈ、Ｈ３）、３．３３（ｍ、２Ｈ、Ｈ４）。
【０１６０】
１-(２-(三級-ブチルオキシカルボニルアミノ)エトキシ)-２-アジドエタン（２Ｃ）
アジ化ナトリウム（１．４９ｇ、２２．９ｍｍｏｌ）を２０ｍｌ無水ジメチルホルムアミド中２ｂ（１．６２ｇ、５．７２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に添加した。混合物を６０〜７０°Ｃで一晩加熱した。冷却後、溶液を水に注ぎ、酢酸エチルで抽出した（５×３０ ｍｌ）。有機相を集め、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、蒸発させて生成物を得た。収量：０．６ｇ（４６％）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ３．６５（ｔ、２Ｈ、Ｈ２）、３．５５（ｔ、２Ｈ、Ｈ３）、３．３６（ｍ、４Ｈ、Ｈ１＋Ｈ４）。
【０１６１】
１-(２-(-三級-ブチルオキシカルボニルアミノ)エトキシ)-２-アミノエタン（ＮＯＮＢｏｃ、２ｄ）
１０ｍｌテトラヒドロフラン中０．８２ｇ（３．１ｍｍｏｌ）のトリフェニルホスフィン溶液を、２０ｍｌテトラヒドロフラン中０．６ｇ（２．６ｍｍｏｌ）の２ｃ溶液に添加した。生じた溶液を２時間室温で攪拌した。続いて、２００ｍｌの水を添加し、混合物を一晩室温で攪拌した。その後、混合物を蒸発させて７５ｍｌとし、ろ過した。ろ液を２５ｍｌジクロロメタンで洗浄し、蒸発させて生成物を得た。収量：０．５ｇ（７９％）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ３．５０（ｍ、４Ｈ、Ｈ２＋Ｈ３）、３．３３（ｍ、２Ｈ、Ｈ４）、２．８６（ｔ、２Ｈ、Ｈ１）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ２０５．２（Ｍ＋Ｈ）。
【０１６２】
［Ｐｔ(エチレンジアミン)Ｃｌ(ＮＯ３)］ （１ａ）
１ｍｌジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中３８．６ｍｇ（０．２３ｍｍｏｌ）のＡｇＮＯ３溶液を、暗所にて室温で、１．６ｍｌ ＤＭＦ中７８．２ ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ）の１の攪拌溶液に、１．５時間にわたって滴加した（図３）。混合物を暗所で５時間攪拌し、その後ＡｇＣｌ沈殿をろ過除去した。生じた［ＰｔｅｎＣｌ（ＮＯ３）］の淡黄色ＤＭＦ溶液を、以下に記載するように、１ｂおよび１ｃの調製用出発物質として使用した。
【０１６３】
［Ｐｔ(エチレンジアミン)Ｃｌ(ＮＯＮＢｏｃ)］(ＮＯ３) （ｌｃ）
上述のようにして得た１ａ溶液を、暗所で４０ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）のＮＯＮＢｏｃ （２ｄ）に添加した。生じた溶液を一晩暗所にて室温で攪拌した。その後ＤＭＦを真空下で除去した。過剰の水を残渣に添加し、ＰｔｅｎＣｌ２の黄色の沈殿をろ過除去した。残りの１ｃろ液を凍結乾燥した。収量：８７ｍｇ。１９５Ｐｔ ＮＭＲ（Ｈ２Ｏ）：δ−２６４５。
【０１６４】
［Ｐｔ(エチレンジアミン)(ＰＴＸ)(ＮＯＮＢｏｃ)］(ＮＯ３) （１ｆ）、ＰＴＸがペントキシフィリンである経路ＩＩ
１ｍｌ ＤＭＦ中１９．８ｍｇ（０．１１７ｍｍｏｌ）のＡｇＮＯ３溶液を、暗所にて室温で、１．６ｍｌ ＤＭＦ中６８．６ｍｇ（０．１２３ｍｍｏｌ）の１ｃの攪拌溶液に、１．５時間にわたって滴加した。混合物を５時間暗所で攪拌し、その後ＡｇＣｌ沈殿をろ過除去した。ろ液１ｅを２７．４ ｍｇ（０．０９８ｍｍｏｌ）のＰＴＸに添加した。生じた溶液を暗所にて７０°Ｃで攪拌した。その後、黒色沈殿をろ過除去し、蒸発させた。残渣を水に溶解し、ろ過し、ろ液１ｆを凍結乾燥した。収量（粗生成物）：７１ｍｇ。１９５Ｐｔ ＮＭＲ（ＤＭＦ）：δ−２７００。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ７３７．２（Ｍ−２（ＮＯ３）−Ｈ）、４５９．２８（Ｍ−２（ＮＯ３）−ＰＴＸ−Ｈ）。
【０１６５】
[{Ｐｔ(エチレンジアミン)(ＰＴＸ)}(μ-ＮＯＮ){Ｐｔ(エチレンジアミン)Ｘ}](ＣＨ３ＣＯＯ)３、Ｘ＝Ｃｌ（４）またはＣＨ３ＣＯＯ（４ａ）
複合体１ｆ（８１．４ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）を４ｍｌの０．１Ｍ塩酸に溶解し、生じた溶液を暗所にて５０°Ｃで一晩加熱した。その後、溶液のｐＨを２Ｍ ＮａＯＨで８に調整した。その後、６８ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ）の硝酸銀を添加して、溶液から塩化物イオンを除去した。ＡｇＣｌの沈殿をろ過除去し、続いて、前述のようにして得た１ａの溶液をろ液に添加した。生じた溶液を暗所にて２４時間５０°Ｃで攪拌した。その後溶媒を真空下で除去した。残渣を水に溶解し、ろ過し、高速液体クロマトグラフィによって精製した。精製物を凍結乾燥し、１Ｈおよび１９５Ｐｔ ＮＭＲならびにＬＣ ＥＳＩ−ＭＳによって特徴づけた。収量：５ｍｇ。１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ８．６１（ｓ、１Ｈ、ｐｔｘ）、４．５０（ｓ、３Ｈ、ｐｔｘ）、４．０９（ｓ、３Ｈ、ｐｔｘ）、４．０１（ｔ、２Ｈ、ＮＯＮ）、３．７２（ｔ、２Ｈ、ＮＯＮ）、３．６４（ｍ、４Ｈ、ＮＯＮ）、２．８１（ｍ、２Ｈ、ｅｎ）、２．７８（ｍ、２Ｈ、ｅｎ）、２．６５（ｍ、４Ｈ、ｐｔｘ）、１．９３（ｓ、ＣＨ３ＣＯＯ）、１．６２（ｍ、４Ｈ、ｐｔｘ）。１９５Ｐｔ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ−２４００（４ａ）、−２６３２（４）、−２７００。ＬＣ ＥＳＩ−ＭＳ：４の保持時間９．６８分（ｍ／ｚ ９８５．１４（Ｍ(４)３＋−２Ｈ＋ＣＨ３ＣＯＯ）、６４７．０４（Ｍ(４)３＋−３Ｈ−ｐｔｘ）；４ａの保持時間１２．０９分（ｍ／ｚ １００９．０８（Ｍ(４ａ)３＋−２Ｈ＋ＣＨ３ＣＯＯ）、６６９．９３（Ｍ(４ａ)３＋−３Ｈ−ｐｔｘ）。上述の生成物は媒介錯体にすぎない。次に、ターゲティング部分をこの生成物に連結する。
【０１６６】
１．４．  ヘテロ二価性リンカの合成および特性
ＳＭＣＣ−ＵＬＳの合成
２０．２ｍｇのＫＲＥ−Ｂｏｃ−ＵＬＳ（３．５４×１０−５ｍｏｌ）をＭｉｌｌｉＱ中２００ｍＭの塩酸溶液５７７μｌに溶解した。生じた溶液を５０°Ｃで一晩加熱した。その後、ＭｉｌｌｉＱ中２００ｍＭの塩酸２６４μｌを添加した。ＭｉｌｌｉＱ中１Ｍの水酸化ナトリウム溶液およびＭｉｌｌｉＱ中２００ｍＭの塩酸溶液を用いて、ｐＨを約７．５に調整した。ＭｉｌｌｉＱ中１Ｍの水酸化ナトリウム溶液を用いて、０．０５Ｍリン酸バッファのｐＨを７．２５に調整した。その後、生じたバッファ溶液５６１μｌを、脱保護したＫＲＥ−Ｂｏｃ−ＵＬＳ溶液に添加した。１１．９ｍｇ（３．５６×１０−５ｍｏｌ）のＳＭＣＣサクシンイミジルエステルを約５滴のＮ,Ｎ’-ジメチルホルムアミドに溶解し、ＵＬＳ溶液に滴加した。沈殿が生じた。したがって、溶解を達成するまでＤＭＦを滴加した。生じた溶液を遮光下室温で一晩撹拌した。その後、質量分析を行った。
【０１６７】
ＲＧＤ−ＳＭＣＣ−ＵＬＳ−ＴＲＡＩＬの合成
以下の実施例は、ＲＧＤペプチドホーミング装置の、組換え治療たんぱくＴＲＡＩＬ（腫瘍壊死因子［ＴＮＦ］関連アポトーシス誘導リガンド）への結合を記載する。ＴＲＡＩＬは癌細胞根絶の有力候補である。ＴＲＡＩＬへのＲＧＤペプチドの搭載は、その腫瘍血管系へのホーミングを促進することができる。
【０１６８】
ヒトｈｉｓＴＲＡＩＬを１０％ グリセロールを含有するＰＢＳ中０．７ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。ＳＭＣＣ−ＵＬＳを２０ｍＭ ＮａＣｌ中１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。全サンプルをｐＨ７．４に調整した。ｈｉｓＴＲＡＩＬ（５００μｇ、７．６ｎｍｏｌ）をＳＭＣＣ−ＵＬＳ（７６ｎｍｏｌ）と４時間３７°Ｃでインキュベートし、その後、未反応ＳＭＣＣ−ＵＬＳを４℃のＰＢＳ １０％グリセロールに対する透析によって除去した。ＲＧＤペプチドｃ(ＲＧＤｆ(ε-Ｓ-アセチルチオアセチル)Ｋ)を１：４アセトニトリル／水混合溶媒に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。ＲＧＤペプチド（１５２ｎｍｏｌ）を反応混合物に滴加し、その後、ヒドロキシルアミンを５０ｍＭの最終濃度にまで添加した。混合物を遮光しながら一晩室温でインキュベートした。残余ＳＭＣＣ基をシステインの添加（ＴＲＡＩＬ量を上回る２０：１モル過剰）によって消去した。精製物ＲＧＤ＿ＳＭＣＣ−ＵＬＳ−ＴＲＡＩＬを、最終的にＰＢＳ／１０％グリセロールに対する透析によって精製し、−２０°Ｃで貯蔵した。
【０１６９】
Ｂｉｏ−ＵＬＳ−ＴＲＡＩＬの合成
以下の実施例は、ビオチン−ＵＬＳ−ＴＲＡＩＬの合成を記載しており、ビオチン−ＵＬＳ−ＴＲＡＩＬは、アビジン−ビオチンの相互作用を介して、ＲＧＤ−ＰＥＧ−アビジンといったＲＧＤ搭載キャリアと複合体形成することができる。生じたｂｉｏ−ＵＬＳ−ＴＲＡＩＬ／／ＲＧＤ−ＰＥＧ−アビジン複合体は、血管新生内皮細胞と相互作用することができ、これによって、ＴＲＡＩＬを腫瘍細胞および腫瘍血管に向け直すことができる。
【０１７０】
ｂｉｏ−ＵＬＳ−ＴＲＡＩＬの合成
ｈｉｓＴＲＡＩＬ量に対して１０：１のモル比のビオチン−ＵＬＳを用いて、前述したのと同じプロトコールで、ｂｉｏ−ＵＬＳ−ＴＲＡＩＬを調製した。最終生成物をＰＢＳ／１０％グリセロールに対する透析によって精製し、−２０°Ｃで貯蔵した。ビオチンの組込みを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを用いる抗ビオチンウェスタンブロッティングによって確認した。
【０１７１】
ＲＧＤ−ＰＥＧ−アビジンの合成
ＲＧＤ−ＰＥＧ−アビジンを、ＲＧＤ−ＰＥＧ−ＨＳＡについて記載したのと類似のプロトコールで調製した。２ｍｇのアビジン（３０μｍｏｌ）、１０倍モル過剰のヘテロ二価性ビニルスルホン-ポリエチレングリコール-Ｎ-ヒドロキシサクシンイミドエステル（１ｍｇ、３００ｎｍｏｌ）および１１倍モル過剰のＲＧＤペプチドを用いた。アビジンあたり平均５．４のＲＧＤ基が組込まれた。ビオチン−ＴＲＡＩＬのＲＧＤ−ＰＥＧ−ア        
【０１７２】
ビジンとの複合体形成
複合体を、ビオチン化ＴＲＡＩＬとＲＧＤ−ＰＥＧ−アビジンとの混合によって生成するか、原位置で（in situ）、すなわち両成分を連続して細胞に添加した後に、形成した。
【０１７３】
実施例２
細胞ターゲティング複合体の試験管内評価
２．１．  薬物放出研究
薬物−キャリア結合の安定性を、たとえばバッファ、薬物放出物質または生物学的媒介物を混合したバッファといった種々の条件下で、細胞ターゲティング複合体を３７°Ｃでインキュベートすることによって調査した。概して、放出された薬物をＨＰＬＣによって分析し、結合した薬物／ターゲティング複合体の総量の割合として表した。
【０１７４】
結果
薬物放出プロフィールの一般的な例を、図４に表わしている。
【０１７５】
パネルＡ：血清／ＰＢＳ １：１中３７°Ｃのインキュベーション中のＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡの薬物放出プロフィール。ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡは血清中に緩やかに薬物を放出するだけで、薬物とキャリアとの結合が、コンジュゲートが標的細胞に到達するのを可能とするのに充分な安定性を表していることを示す。代わりに、観察された放出プロフィールは、特定の標的細胞に活発に結合しない薬物の、薬物キャリアからの緩やかな放出プロフィールを許容するだろう。このような生成物は薬物を継続的に解放することによって、体内の薬物レベルを制御する。そのような調製物の例は、たとえば血流を循環する、皮下注射された持効性調製物またはキャリアである。
【０１７６】
パネルＢ：バッファ、ＨＳＣ培地または示した化合物を含むＰＢＳ中での３７°Ｃ２４時間のインキュベーション後の、ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡからのＰＴＸの放出。
【０１７７】
＊：ＰＢＳに対してｐ＜０．０５。
この図から充分理解できるように、薬物は細胞内条件に似た環境内で放出された。ゆえに、もとの薬物ＰＴＸは、原則として、標的細胞内部のコンジュゲートから生じることができる。
【０１７８】
パネルＣ：ＰＢＳ ｐＨ７．４、ラット血清、またはＰＢＳにおける腎臓ホモジネート１／３（ｗ／ｖ）中で、３７°Ｃにてインキュベーションしたときの、ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭからのＳＢ２０２１９０の放出。ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭは、バッファまたは血清中で高い安定性を示したが、腎臓ホモジネート中でインキュベーションすると自由薬物を継続的に放出した。これらの結果は、生成物の意図した適用と充分一致している。すなわち、複合体は、標的組織内での蓄積後、その貨物（結合薬物）を放出することができる。
【０１７９】
２．２．  試験管内効果の研究
コンジュゲートの薬理効果を、たとえば活性化肝星細胞（ＨＳＣ）、腎臓尿細管細胞（ＨＫ−２細胞）またはヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）といった、異なる培養細胞型で試験した。概して、細胞をコンジュゲートと３７°Ｃで２４時間インキュベートした。続いて、細胞を、結合薬物の薬理活性に関する分析（遺伝子発現分析、影響マーカの免疫組織化学的評価）、または複合体の可能性のある細胞毒性に関する評価（細胞生存率評価、アポトーシス評価）に付した。
【０１８０】
結果
細胞ターゲティング複合体の薬理学的プロフィールの一般的な例を図５〜１４に示す。
【０１８１】
図５．ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡの、線維症マーカＩ型コラーゲンおよびα−平滑筋アクチンへの影響。ＨＳＣを、ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳ−ＨＳＡ、ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡ（双方とも１００μＭ ＰＴＸに相当する１ｍｇ／ｍｌにて）、または１ｍＭ 非標的ＰＴＸとインキュベートした。Ｉ型コラーゲンまたはα−平滑筋アクチンについて細胞を染色し、ヘマトキシリン（hematoxillin）で対比染色した。パネルＡ、Ｂ）コントロール；パネルＣ、Ｄ）ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳ−ＨＳＡ；パネルＥ、Ｆ）ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡ；パネルＧ、Ｈ）非標的ＰＴＸ。倍率１０×。肝線維症の顕著な特徴の１つは、活性化ＨＳＣによるａ−平滑筋アクチン（ａＳＭＡ）およびＩ型コラーゲンの誘導発現および生産である。したがって、これらのたんぱくを、標的ＰＴＸの抗線維化効果の読出しパラメータとして選択した。図５において見ることができるように、活性化ＨＳＣは、おそらくＩ型プロコラーゲンの存在に対応して、Ｉ型コラーゲンを細胞質において粒状染色パターンで表わし、一方、ａＳＭＡは線維症様パターンで染色された（パネルＡ、Ｂ）。１ｍＭ濃度のＰＴＸの処理によって、Ｉ型コラーゲン生産およびａＳＭＡ双方の強度は低下した（パネルＧ、Ｈ）。１００μＭの結合ＰＴＸに相当する、１ｍｇ／ｍｌのＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡとの細胞のインキュベーションは、染色強度の低下として観察することができるように、２４時間のインキュベーション後、Ｉ型コラーゲンの発現に大いに影響を及ぼした（パネルＥ）。ａＳＭＡ染色強度に影響はなかったが、ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳＭ６ＰＨＳＡとのインキュベーション後、星細胞の形態に顕著な変化が観察された。特に、豊富に存在するａＳＭＡを染色した後、細胞構造の変化をはっきり見ることができる（パネルＦ）。ＨＳＣは、ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡの処理に反応して、細胞質体積の損失、丸い細胞形状およびプレート表面からの細胞の剥離をもたらした。これらの効果はＰＴＸ−ＨＳＡの等濃度でのインキュベーション後には観察されなかった（パネルＣ、Ｄ）。
【０１８２】
図６．培養活性化ＨＳＣ（パネルＡ）または線維症ラット肝臓由来肝臓切片（結紮後３週間の胆管結紮ラット；パネルＢ）へのＰＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡの影響。濃度は、ＰＴＫＩ量（１０μＭ）またはＭ６ＰＨＳＡキャリアのその相当量（０．１ｍｇ／ｍｌ）を示す。遺伝子発現レベルをＧＡＰＤＨの発現に対して標準化し、続いてコントロール細胞または切片の相対発現比に対して標準化した。
【０１８３】
ＰＴＫＩ活性およびそれによって生成された細胞ターゲティング複合体を、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによって分析した、線維症マーカの遺伝子発現レベルの決定によって調べた。この例から充分に理解することができるように、ＰＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡは自由薬物ＰＴＫＩに類似する抗線維化効果を及ぼすが、キャリアＭ６ＰＨＳＡは調査した遺伝子に影響を及ぼさなかった。
【０１８４】
図７．内皮細胞における炎症へのＲＧＤ−ＰＥＧ−ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＨＳＡの影響。ＨＵＶＥＣを、薬物、薬物ターゲティングコンジュゲートおよびコントロールコンジュゲートと２４時間プレインキュベートし、その後ＴＮＦαを添加した。細胞および培地を２４時間後に採取し、炎症関連遺伝子の定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出または分泌されたＩＬ−８のＥＬＩＳＡベースの検出に用いた。
【０１８５】
パネルＡ：ＴＮＦおよび記載した化合物で処理したＨＵＶＥＣにおけるＩＬ８の遺伝子発現レベル。充分理解することができるように、ＩＬ８およびＥ−セレクチン遺伝子は、ＴＮＦによる処理に反応してＨＵＶＥＣにおいて上方調節されている。この反応を、１０μＭ濃度のＳＢ２０２１９０によって４０％のレベルにまで阻害することができる。ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＲＧＤＰＥＧ−ＨＳＡによる処理は、それほどではないにせよ、この遺伝子の阻害をもたらしている。薬物を持たないＲＧＤ−ＰＥＧ−ＨＳＡキャリアによる処理は、ＩＬ８遺伝子発現を低減させなかった。
【０１８６】
さらに、ＩＬ−８遺伝子発現の阻害は、培地におけるＩＬ８の生産および分泌の低下にも対応する（図７パネルＢ）。
【０１８７】
これらの２つの結果から、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害薬ＳＢ２０２１９０は、化合物が細胞によって処理されると、細胞ターゲティング複合体から生じ得ると結論する。薬物の有効性において観察された差異は、コンジュゲートの細胞ルーティングによって説明することができる。すなわち、薬物ターゲティング構成体は、活性薬物を放出するために、細胞のリソソームコンパートメントにおいて内在化および処理されなければならない。これらの処理は、自由化合物の単純な受動拡散よりも長い。しかし、生体内でのキャリアの異なる挙動との組み合わせによって、ＲＧＤ標的薬物は自由化合物に対してよりも優れた活性を示すかも知れない。
【０１８８】
薄灰色のバーは自由薬物を、黒色のバーは薬物ターゲティングコンジュゲートを、濃い灰色のバーは異なるコントロールコンジュゲートを表している。２１μｇ／ｍｌのＲＧＤＰＥＧ−ＳＢ−ＨＳＡは３μＭのＳＢ２０２１９０と等しく、７０μｇ／ｍｌでは１０μＭのＳＢ２０２１９０と等しい。ｐ＜０．０１は、各コントロールコンジュゲートおよびＴＮＦα処理コントロールと比較したものである。
【０１８９】
図８．ＨＫ−２尿細管細胞においてＴＧＦ−β１によって誘導されるＩａ１型プロコラーゲンの遺伝子発現に及ぼすＳＢ−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭ（パネルＡ）およびＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭ（パネルＢ）の影響。細胞を２４時間８０％の密集度に増殖し、その後血清から剥脱した。ＳＢ−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭコンジュゲート（１５５μｇ／ｍｌ）、ＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭコンジュゲート（８または８０μｇ／ｍｌ）またはメチオニン修飾ＬＺＭ（等濃度）を血清剥奪時にインキュベートし、自由ＳＢ２０２１９０（１０μｍ）またはＴＫＩを細胞に添加し、その１時間後にＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。さらに、細胞を２４時間培養し、その後、ＲＮＡを細胞から単離し、ｍＲＮＡの発現を定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。データは少なくとも３回の実験の平均±ＳＥＭを表す。対コントロールの差異を†††ｐ＜０．００１として表す。他の差異は＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【０１９０】
図９．内皮細胞における血管新生応答に及ぼすＲＧＤ搭載ＴＫ７８７−アルブミンコンジュゲートの影響。薬物ターゲティングコンジュゲートを、ＶＥＧＦ誘導遺伝子発現を阻害する能力について試験した。細胞を低血清培地（１．５％ ＦＣＳ）で培養し、示した化合物とインキュベートした。２４時間のインキュベーション後、５ｎｇのＶＥＧＦをウェルに添加し、さらに５０分後、細胞溶解物を採取した。ＶＥＧＦの添加後、ＮＲ４Ａ１核内レセプタを直ちに上方調節した。３つすべての薬物ターゲティングコンジュゲート（おおよそ４μｇ／ｍｌ、結合ＰＴＫ７８７の５００ｎＭに相当）は、この上方調節を有意に阻害することができたが、薬物を持たないキャリアはＶＥＧＦ誘導遺伝子発現には影響しなかった。自由薬物を１００ｎＭの濃度で添加した。
【０１９１】
２．３．  細胞ターゲティング複合体の毒性
ｃｉｓ白金はよく知られた抗腫瘍剤であるので、薬物をキャリアに連結するための白金配位化学の使用は、構成体内への不所望の毒性を暗示しているのかもしれない。したがって、コンジュゲートの、ターゲット細胞の細胞生存およびアポトーシスへの影響を綿密に評価した。図１０，１１および１２は、異なるタイプの標的細胞（それぞれＨＳＣ、尿細管ＮＲＫ-５２Ｅ細胞およびＨＵＶＥＣ）の、細胞ターゲティング複合体、自由薬物、自由キャリア／ホーミング装置、またはシスプラチン（ポジティブコントロール）とのインキュベート後の、細胞生存率研究およびアポトーシス評価の結果を示す。インキュベーションを２４時間３７°Ｃで実行し、Alaniar Blueアッセイ（ＨＳＣ、ＨＫ−２細胞）またはMTSアッセイ（ＨＵＶＥＣ）を用いる標準のプロトコールによって、細胞生存率を評価した。標準のプロトコールに従う、カスパーゼ３／７アッセイまたはTUNEL染色のいずれかによって、アポトーシスを評価した。
【０１９２】
図１０．パネルＡ〜Ｄ：ＨＳＣの、ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡとのインキュベーション。
Ａ：ＨＳＣの細胞生存率；Ｂ：カスパーゼ３／７活性；Ｃ：TUNEL染色；Ｄ：TUNELポジティブ核の定量化（TUNEL／DAPI比）、＊コントロールに対してｐ＜０．０５。パネルＥ、Ｆ：培養活性化ＨＳＣの、それぞれロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡおよびＰＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡとのインキュベーション後の細胞生存率。示した濃度はコンジュゲートもしくは等量のシスプラチン、薬物またはＭ６ＰＨＳＡの白金含量を反映している。活性化ＨＳＣの、シスプラチンとの２４時間の処理は、すべての評価において反映されるように、この細胞型のアポトーシスを誘導した。反対に、細胞ターゲティング複合体は、アポトーシスの活性化も生存ＨＳＣ数の減少も誘導しなかった。このことから、薬物−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡコンジュゲートは、ＨＳＣにおいてｃｉｓ白金様細胞毒性効果を示さなかったと結論する。＊コントロールに対してｐ＜０．０５。
【０１９３】
図１１．細胞ターゲティング複合体およびシスプラチンの、尿細管細胞（ＮＲＫ−５２Ｅ）への細胞毒性の比較。腎臓毒性は、シスプラチン処理に関連する主要な副作用の１つであるので、腎臓を対象とした細胞ターゲティング複合体の安全性を注意深く調査した。この目的のために、薬物−ｃｉｓＵＬＳ生成物および薬物−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭコンジュゲートを腎臓近位尿細管細胞とインキュベートし、２４時間後に細胞生存率を評価した。細胞を２４時間、示した化合物とインキュベートし、その後、細胞生存率をAlamarブルーアッセイによって決定した。試験した濃度は１０および１００μＭの白金に相当し、また、薬物（ＳＢ２０２１９０）もしくはたんぱく（ＬＺＭ）の量に等しかった。＊＊ｐ＜０．０１。薬物−ｃｉｓＵＬＳでの処理は細胞生存率に影響を及ぼし、もとの薬物での処理と類似する。同様に、ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭは非修飾リゾチーム以外の細胞生存率に影響しなかった。反対に、シスプラチンは、参考文献より予想されるように、細胞生存率に有意に影響を及ぼした。これらの結果から、ｃｉｓＵＬＳによって調製した細胞ターゲティング複合体は、尿細管細胞とインキュベートしたとき、白金関連毒性を示さないと結論する。
【０１９４】
図１２．ＲＧＤＰＥＧ−ＳＢ−ＨＳＡおよびＵＬＳ含有コンジュゲートは内皮細胞に対して毒性を示さなかった。ＲＧＤＰＥＧ−ＳＢ−ＨＳＡ（１００μｇ／ｍｌ）、ＳＢ−ＵＬＳ、ＵＬＳまたはシスプラチン（すべて１００μＭ）をＥＣ培地に添加し、３日間インキュベートした。ＭＴＳ評価を用いて、細胞生存率を、非処理コントロール（＝１００％ 生存率）と比較して評価した。
【０１９５】
図１３は、ＨＵＶＥＣ細胞生存率が、非修飾ｈｉｓＴＲＡＩＬおよびビオチン化ＴＲＡＩＬ（パネルＡ）またはＲＧＤ搭載ＴＲＡＩＬ（パネルＢ）によって影響されないことを示す。１００ｎｇ／ｍｌの組換えたんぱく濃度で４８時間インキュベーションを実行した。別の例において（以下参照）、腫瘍細胞がＴＲＡＩＬおよびその誘導体に応答していることを実証する。したがって、ＨＵＶＥＣはＴＲＡＩＬに応答せず、遷移金属系の細胞ターゲティング複合体における細胞毒性の不在はリンカシステムの安全性を示すと結論した。ＴＲＡＩＬ：ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド；修飾ＴＲＡＩＬを、市販のbio-EZ試薬（ＢＩＯ−ＮＨＳ−ＴＲＡＩＬ）、ＫＲＥ−Ｂｉｏ−ＵＬＳ（ＢＩＯ−ＵＬＳ−ＴＲＡＩＬ）；ヨード酢酸ＮＨＳ試薬（ＲＧＤ ＳＩＡ−ＴＲＡＩＬ）；ＶＮＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ ３．４ｋＤａリンカ（ＲＧＤ ＰＥＧ−ＴＲＡＩＬ）；ＳＭＣＣ−ＵＬＳ（ＲＧＤＵＬＳ−ＴＲＡＩＬ）を用いて調製した。
【０１９６】
図１４．ＴＲＡＩＬおよびその細胞ターゲティング複合体の薬理活性を、Jurkat leukemicＴ-細胞において、細胞生存率（４８時間のインキュベーション）またはカスパーゼ評価の誘導（４時間のインキュベーション）を分析することによって評価した。両タイプの実験は、ＴＲＡＩＬおよびＴＲＡＩＬで調製した誘導体が腫瘍細胞を殺すことができると実証した。さらに、ＵＬＳ系リンカで調製した誘導体は、細胞ターゲティング複合体を調製する他の化学的アプローチと比較して、より優れた細胞毒性を示した（パネルＡ、Ｂ：ＢＩＯ−ＮＨＳ−ＴＲＡＩＬよりも優れた活性のＢｉｏ−ＵＬＳ−ＴＲＡＩＬ；パネルＣ、Ｄ：ＲＧＤ−ＰＥＧ−ＴＲＡＩＬよりも優れた活性のＲＧＤ−ＵＬＳ−ＴＲＡＩＬ）。ホーミングリガンドによるたんぱくの修飾後も、ＴＲＡＩＬの薬理活性は保存されると結論した。パネルＡ、Ｂ：Jurkat細胞のビオチン化ＴＲＡＩＬとのインキュベーション。Ａ）細胞生存率評価；Ｂ）カスパーゼ活性評価。パネルＣ、Ｄ：Jurkat細胞のＲＧＤ搭載ＴＲＡＩＬとのインキュベーション。Ｃ）細胞生存率評価；Ｄ）カスパーゼ活性評価。＊：ｐ＜０．０５．
【０１９７】
２．４．  試験管内ターゲティング研究
細胞ターゲティング複合体と標的細胞との相互作用を培養標的細胞内で調査した。通常、標的細胞を複合体と４°Ｃまたは３７°Ｃでインキュベートすることによって、試験管内ターゲティング研究を実行した。標的細胞による複合体の結合および／または内在化を、複合体に対する免疫組織化学的染色（たとえば抗ＨＳＡもしくは抗ＬＺＭ染色）または複合体に導入された放射性レポータ基（たとえば１２５Ｉ）の定量化によって検出した。ターゲティング研究の典型的な例を図１５〜１７に示す。
【０１９８】
１２５Ｉ放射性標識ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡと、ＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞を発現するＭ６Ｐ／ＩＧＦＩＩレセプタとの結合（インキュベーション：４時間３７°Ｃ）を調べた。図１５Ａは、トレーサ量の細胞ターゲティング複合体が細胞に結合したこと、および結合を過剰の非標識Ｍ６ＰＨＳＡによって置換することができることを示している。さらに、抗ＨＳＡ免疫検出によって、ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡの結合を実証したが（１ｍｇ／ｍｌ、４時間３７°Ｃ）、ＰＴＸ−ＨＳＡは細胞に結合しなかった（図１５Ｂ）。ゆえに、ＰＴＸ−Ｍ６ＰＨＳＡの、標的細胞への結合は、コンジュゲート中のＭ６Ｐホーミングリガンドを介して仲介された。
【０１９９】
８９Ｚｒ放射性標識化合物を用いて、ＲＧＤ搭載複合体の、内皮細胞への結合を調べた。
図１６Ａは、ＲＧＤＰＥＧ−ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＨＳＡの、内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）との結合を、自由ＲＧＤペプチドおよびＳＢ２０２１９０を搭載しないＲＧＤＰＥＧ−ＨＳＡによって置換することができることを示している。反対に、ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＨＳＡは、複合体と標的細胞との相互作用に影響しなかった。図１６Ｂは、細胞および化合物を３７°Ｃでインキュベートしているうちに複合体の蓄積が増加したことを示しており、複合体のレセプタ仲介内在化を表す。
【０２００】
結合定数の計算を可能とする、異なる実験機構において、ＲＧＤ搭載ＰＴＫ７８７−ｃｉｓＵＬＳ−アルブミンの親和性を調査した。ＨＵＶＥＣの表面で発現するαｖβ３−インテグリンの放射性リガンドとして、１２５Ｉ標識エキスタチンを用いた。競合的結合研究を、ＨＵＶＥＣの融合性単層を用いる、放射性標識リガンドおよび非放射性標識複合体とのコインキュベーティング（coincubating）によって実行した。すべてのＲＧＤ搭載コンジュゲートは完全に１２５Ｉエキスタチンを置換したが、コントロールＲＡＤペプチドで修飾したコンジュゲートは置換を示さなかった（図１７Ａ〜Ｃ）。さらに、ＰＴＫ７８７−ｃｉｓＵＬＳの、キャリアとの結合は、ホーミングリガンドと標的細胞との相互作用を妨害しなかった。薬物を持つキャリアおよび持たないキャリアが類似の親和性を示したためである。最も高い結合親和性を、ＲＧＤ−ＰＴＫ−ＨＳＡ（ＩＣ５０：４．４ｎＭ；０．３μｇ／ｍｌ）について決定し、続いてＲＧＤ−ＰＴＫ−ＨＳＡ−ＰＥＧ（ＩＣ５０：６５ｎＭ、４．４μｇ／ｍｌ）およびＲＧＤＰＥＧ−ＰＴＫ−ＨＳＡ（ＩＣ５０：６４０ｎＭ、４３μｇ／ｍｌ）について決定した（図１７Ｄ）。
【０２０１】
ＲＧＤＰＥＧ−アビジンとＨＵＶＥＣとの相互作用を、類似の機構において試験した（ＩＣ５０：１３４ｎＭ；図１７Ｅ）。
【０２０２】
実施例３．
細胞ターゲティング複合体の生体内評価
３．１．  生体内ターゲティングの研究
生体内ターゲティングの研究は、標的器官もしくは他の組織または体液（血清、尿）における薬物レベルをＨＰＬＣによって定量化する研究を含んだ。概して、薬物レベルを、ターゲティング複合体からの薬物の放出後にＨＰＬＣによって決定し、または複合体から放出された薬物を反映する自由薬物レベルを評価した。さらに、組織または細胞型における細胞ターゲティング複合体の蓄積を、複合体に対する免疫組織化学的染色（抗ＨＳＡまたは抗ＬＺＭ染色）によって、または放射性標識複合体（１２５Ｉ放射性標識コンジュゲート）の検出によって決定した。典型的な例を図１８〜２２に示している。
【０２０３】
３．１．１．  肝臓対象細胞ターゲティング複合体の薬物動態評価
このタイプの細胞ターゲティング複合体による組織分布研究を、肝線維症のよく知られた２つの動物モデル（それぞれ担管結紮（ＢＤＬ）モデル［１］およびＣＣｌ４吸入モデル［６］）において実行した。すべての生体内実験は、実験動物の配慮および使用に関する地方委員会（Local Committee for Care and Use of Laboratory Animals）によって認可された。
【０２０４】
ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡの評価
薬物動態研究を、線維症が進行した動物（ＢＤＬ後３週間）において実行した。この時点で、ＩＩＩ型コラーゲンおよびαＳＭＡの免疫染色によって評価したように、肝臓は、重度の線維症障害および過度のマトリックス沈着を示した。生体内分布研究中、ラットをイソフルラン麻酔下に保ち、体温を３７〜３８°Ｃに維持した。
【０２０５】
陰茎背静脈を介して、１２５Ｉ−ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡまたは１２５Ｉ−放射性標識Ｍ６ＰＨＳＡのいずれかのトレーサ量（１０６ｃｐｍ／ラット）で、ラットに点滴注射した。投与後１０分で、心穿刺によって血液サンプルを採取し、器官を摘出し、生理食塩水で洗浄し、重さを量り、それらの後、放射能を計数した。尿を膀胱から回収し、測定した。器官あたりの全放射能を計算し、ＢＤＬ補正係数を用いて血液由来放射能に対して補正した。１２５Ｉ−放射性標識ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡおよび１２５Ｉ−放射性標識Ｍ６ＰＨＳＡの、線維症肝臓への迅速な分布が観察された（図１８）。他の組織では蓄積を観察されなかった。さらに、非放射性標識ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡ（２ｍｇ／ｋｇ）をＢＤＬ３ラットに投与した。組織標本を、標準的な手順に従う免疫組織化学的分析用に処理した。肝臓のクリオスタット切片（４μｍ）をアセトンで固定し、抗ＨＳＡ免疫検出によってコンジュゲートの存在について染色した。ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡとＨＳＣとの共局在を観察し（抗デスミンによる染色）、このことから、ＰＴＸ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡはＨＳＣに特異的に結合すると結論した。
【０２０６】
ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡの評価
ＢＤＬモデルおよびＣＣｌ４吸入モデルにおいて、薬物動態研究を実行した。ＣＣｌ４吸入モデルにおける線維症プロセスは、基礎を成す病態生理学および進行速度の双方において、ＢＤＬとは完全に異なる特性を有する。実験を中間病期、すなわちＢＤＬ後２週、およびＣＣｌ４吸入開始後９週で実行した。
【０２０７】
胆管結紮後１２〜１５日で、ラットは、生理食塩水の静脈注射、ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡ（３．３ｍｇ／ｋｇ／日、１２５μｇロサルタン／ｋｇに相当）、Ｍ６ＰＨＳＡのみ（３．３ｍｇ／ｋｇ／日）、または経口投与ロサルタン（５ｍｇ／ｋｇ／日。胃管栄養法による）を受けた。最終投与の１０分後、動物を犠牲にして血液および肝臓のサンプルを得た。異なる器官におけるロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡまたはＭ６ＰＨＳＡの存在を、抗ＨＳＡ抗体を用いる免疫染色によって決定した（図１９Ａ）。ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡは、ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡで処理したラットの肺（ａ）、脾臓（ｂ）、心臓（ｃ）または腎臓（ｄ）において検出されなかったが（倍率４×）、（ｅ）の肝臓の非実質細胞内において顕著に検出された（倍率４×）。ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡは、抗ＨＳＡおよび抗デスミンによる免疫二重染色で評価したところ（ｆ）（倍率４０×）、ラット肝臓の星細胞と共局在した（矢印）。肝臓組織ホモジネート内のロサルタン量（ＰＢＳ中０．３ｇ   肝臓／ｍｌ、Turraxホモジナイゼーション）を、メチルブチルエーテルを用いるロサルタンの液液抽出後、ＨＰＬＣによって分析した。ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−ＭβＰＨＳＡで処理した動物由来の肝臓ホモジネートを０．５Ｍ ＫＳＣＮと８０°Ｃで一晩インキュベートして、コンジュゲートからロサルタンを放出したが、自由ロサルタン処理動物由来のホモジネートはＫＳＣＮで処理しなかった。３ｍｌのメチルブチルエーテルを２００μｌの肝臓ホモジネートに添加し、５分ボルテックスすることによって抽出を行った。９００×ｇ ５分間の遠心分離によって層を分離し、水層を液体窒素中で冷凍した。上層の有機層を別のホウケイ酸ガラスチューブに移し、６０°Ｃで完全に蒸発させた。抽出手順を２度繰り返し、蒸発残留物を２００μｌの移動相に再溶解した。アセトニトリル−水−トリフルオロ酢酸（３０：７０：０．１、ｖ／ｖ／ｖ；ｐＨ２．０）から成るアイソクラチック移動相によって、４０°Ｃで、Ｃ１８（Ｃ１８、５μｍ、４．６×１５０ｍｍ）逆相カラム（Sunfire、Waters Inc.、ミルフォード、マサチューセッツ州、米国）を用いるクロマトグラフィを実行した。
【０２０８】
自由経口ロサルタンの経口投与は、４％の累積量に相当する、肝臓ｇあたり平均組織濃度１２．１μｇを与え、ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡを与えた動物は、２０％の累積量（８１％の最終注入量）に相当する、１．５μｇ／ｇのロサルタンレベルを示した。これらの結果から充分に理解することができるように、ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡは選択的肝臓分布を示した。さらに、ＨＳＣにおける薬物レベルは、細胞ターゲティング複合体の細胞特異的蓄積、および星細胞が全肝臓のごく僅かを構成するだけであるという事実によると、大概ずっと高いものである。経口投与されたロサルタンは、このＨＳＣへの選択的ホーミングを示さない。
【０２０９】
ＣＣｌ４吸入開始後第９週目に、ラットを、生理食塩水、ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡ（８ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ ロサルタン／ｋｇに相当）、Ｍ６ＰＨＳＡのみ（８ｍｇ／ｋｇ）または自由ロサルタン（０．３ｍｇ ロサルタン／ｋｇ）の４日連続の連日静脈注射によって処理した。最後の注射から１０分後、動物を犠牲にして血液および肝臓のサンプルを得、前述のように処理した。ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡの、線維症肝臓へのよく似た選択的分布が観察されたが、他の器官における抗ＨＳＡ染色はネガティブであった。さらに、ロサルタンの組織レベルは、自由ロサルタンとは対照的に、ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡの、肝臓への選択的分布を実証した（図１９Ｂ）。
【０２１０】
ＰＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡの評価
ＢＤＬ後１０日目に、ラットにＰＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡの単回の静脈注射を受けさせた（３．３ｍｇ／ｋｇ、１５０μｇ ＰＴＫＩ／ｋｇに相当）。コントロール動物を等量の媒介物（生理食塩水）で注射した。コンジュゲートの免疫組織化学的検出のために、他の薬物−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡコンジュゲートについて前述したように、動物を化合物の注射２時間後に犠牲にし、組織を採取して処理した。肝臓内のＰＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡ蓄積が観察されたが、心臓、腎臓、肺および脾臓のような他の組織においては構成体を検出できなかった。
３．１．２．  腎臓対象細胞ターゲティング複合体の薬物動態評価。
【０２１１】
このタイプの細胞ターゲティング複合体による器官分布研究を、健康なWistarラットにおいて実行した。すべての生体内実験は、実験動物の配慮および使用に関する地方委員会によって認可された。ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭの評価
ラットに陰茎静脈注射でＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−リゾチームコンジュゲートを単回投与した（１６ｍｇ／ｋｇ、３７６μｇ／ｋｇのＳＢ２０２１９０に相当；５％ グルコースに溶解）。投与後１〜７２時間の間の異なる時点にて、動物を犠牲にした。血液サンプルを心穿刺によって採取し、生理食塩水で器官を穏やかに洗い流した後、腎臓を単離した。血清および器官を直ちに液体窒素内でスナップ冷凍した。代謝ケージを用いて尿サンプルを採取し、動物を犠牲にした後に膀胱から採取した尿と合わせた。腎臓の重さを量り、ホモジナイズし（ＰＢＳ中１：３ ｗ／ｖ、Turraxホモジナイゼーション）、その後−８０°Ｃで貯蔵した。放出薬物量を、以前に記載したように［７］、摘出後のＨＰＬＣ分析によって評価した。全薬物（結合プラス放出）を評価するために、サンプルを前述のようにＫＳＣＮで処理してＵＬＳリンカからＳＢ２０２１９０を放出させ、その後、ＨＰＬＣ分析にかけた。抗ＬＺＭ免疫組織化学的染色をクリオスタット腎臓切片に実行して、尿細管細胞におけるコンジュゲートの摂取を検出した。
【０２１２】
他の薬物−ＬＺＭコンジュゲートの先行研究において、静脈内投与後にこれらの生成物の迅速な腎臓蓄積を観察した［４］。この識見を用いて、薬物動態パラメータの最適推定を可能とする薬物−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭコンジュゲートの薬物動態研究のための最適プロトコールを設計した。ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭの血清−消失曲線を図２０Ａに示す。血清中ではキャリア結合ＳＢ２０２１９０が検出されただけで、自由薬物は全時点において不在であった。この結果から、コンジュゲートは血清中において安定したままであったと結論した。
【０２１３】
さらに、ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭは、静脈注射後１時間以内に腎臓において効果的に蓄積し、総量で注入量の２０％となった（図２０Ｂ）。際立っていたことに、単回投与後の３日間で自由薬物および結合薬物の双方の持続的なレベルを観察した。このプロフィールは、生成物の腎臓蓄積であって、その後リンカからの緩慢な薬物放出によって自由薬物を発生する貯蔵所（depot）を形成する生成物の腎臓蓄積によって説明することができる。反対に、５ｍｇ／ｋｇの自由ＳＢ２０２１９０の投与後、僅か０．２％が投与後４時間で腎臓に分布した［４］。自由薬物とＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭとの差異は明らかに、特定組織の薬物の選択的濃縮の付与における、開発した細胞ターゲティング複合体の可能性を示している。
【０２１４】
近位尿細管細胞におけるコンジュゲートの蓄積を、腎臓切片の抗ＬＺＭ免疫組織化学的染色によって確認した（図２０Ｃ）。矢印は、尿細管細胞におけるＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭの蓄積を示している。ＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭおよびＹ２７６３２−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭの評価
前述したのと類似のプロトコールにおいて、ＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭ（２０ｍｇ／ｋｇ、５％グルコースに溶解）およびＹ２７６３２−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭ（２０ｍｇ／ｋｇ、５％グルコースに溶解）の器官分布を研究した。腎臓の薬物レベルを、各薬物について最適化したＨＰＬＣ法を用いて、ＫＳＣＮ処理腎臓ホモジネートおよび血清サンプルにおいて評価した。Ｙ２７６３２を、流速１ｍｌ／分で水−メタノール−トリフルオロ酢酸（８６：１４：０．１、ｖ／ｖ／ｖ；ｐＨ２．０）の移動相を用いるＣ１８逆相SunFire（商標）カラムＣ１８で分析した。ＴＫＩを、流速１ｍｌ／分で水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸（９１：９：０．１、ｖ／ｖ／ｖ；ｐＨ２．０）から成る移動相を用いる同じカラムで分析した。
【０２１５】
図２１はＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭで得られた結果を示す。パネルＡ：血清消失；パネルＢ：腎臓の薬物レベル；パネルＣ：尿中累積排泄。符号は各時点でのＴＫＩの％量を表し、実線は薬物動態データ近似曲線（２分画モデル）を表す。パネル（Ｄ）は、抗ＬＺＭ免疫組織化学的分析による、１時間での尿細管細胞におけるコンジュゲートの局在を表す（倍率２００×）。
【０２１６】
これらのデータから充分に理解することができるように、ＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭは腎臓に迅速に広く分布し、ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭで観察したのと類似の方法で局所的に薬物を放出することによって腎臓の薬物レベルを与えた。コンジュゲートの代謝産物は、パネルＣにおいて観察することができるように、尿中に排泄された。
【０２１７】
Ｙ２７６３２−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭの薬物動態研究は類似の結果を示し、投与後１時間を超えると注入量のおよそ２０％の腎臓レベルをもたらした（図２２）。
３．２．  生体内効果の研究
生体内効果の研究は、細胞ターゲティング複合体の薬理学的活性および可能性のある治療活性を、病気関連パラメータを研究することによって調査する研究を含んだ。線維症肝臓のＨＳＣに向けられた細胞ターゲティング複合体に関して、細胞外マトリックス成分の沈着（Sirius Red染色）、ＨＳＣマーカαＳＭＡ、免疫細胞の流入（ＣＤ４３染色）を調査した。腎線維症の治療用の腎臓対象細胞ターゲティング複合体に関して、腎臓形態、発現αＳＭＡ、マクロファージの流入（ＥＤ−１染色）およびｐ３８−ＭＡＰキナーゼの活性（phospho-p38染色）を評価した。全アプローチにおいて、設計済みAssays-on-Demand TaqManプローブを用いるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって遺伝子発現レベルを定量化した。
【０２１８】
薬物関連効果に加えて、健康なラットへの細胞ターゲティング複合体の投与が、可能性のある白金関連毒性を誘導するかを調査した。腎臓は細胞増殖抑制化合物の白金毒性の主要な場所の１つであるので、これらの研究を腎臓に蓄積するＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭで実行した。アポトーシスの形態および誘導（ＴＵＮＥＬ染色）ならびに基本腎臓パラメータを調査した。
【０２１９】
生体内影響研究の典型的な例を図２３〜３０に示している。
３．２．１．  肝臓対象細胞ターゲティング複合体の評価
ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡおよびＰＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡの抗線維化効果を肝線維症のＢＤＬモデルで研究した。さらに、ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡを肝線維症のＣＣｌ４吸入モデルで評価した。動物実験を前述のように実行した。ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡ処理動物は４日間の投与を受け、最終投与１０分後に犠牲となった。ＰＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡ処理動物は単回投与を受け、化合物投与２４時間後または４８時間後に犠牲となった。クリオスタット切片またはパラフィン切片を、標準の手順に従う免疫組織化学的染色用に処理し、ポジティブ染色領域を形態学的分析によって定量化した。肝線維症の程度をpicro Sirius Redでポジティブに染色された各切片の領域の割合として評価した。線維形成筋線維芽細胞量を、αＳＭＡについてポジティブに染色された領域の割合を測定することによって評価した。浸潤炎症細胞量を、抗ＣＤ４３免疫染色の定量化によって評価した。累積データは同時に、このタイプの細胞ターゲティング複合体が肝線維症に介入し、線維形成過程を覆すことすら可能であることを示している。さらに、非送達薬物について報告したような、かなり低い薬物投与量で効果を得ることができる。
【０２２０】
図２３．ＢＤＬラットにおける肝線維症時のロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡの効果（パラフィン切片におけるSirius Red染色、および定量化）。重度のブリッジが、生理食塩水（Ａ）、Ｍ６ＰＨＳＡ（Ｂ）および経口ロサルタン（Ｄ）を受けたラットにおいて観察された。しかし、ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡ（Ｃ）で処理したラットは、コラーゲン蓄積のあった領域がより少ないことを示した（倍率４×）。（Ｅ）：肝臓標本におけるSirius Red染色領域の定量化（ｎ＝１０、平均±ＳＥＭ、統計分析：偽薬に対して＊Ｐ＜０．０５；生理食塩水、ＭＰ６ＰＨＳＡおよび経口ロサルタンに対して＃Ｐ＜０．０５）。（Ｆ）：ラット肝臓におけるα１（ＩＩ）型プロコラーゲン遺伝子発現の発現定量化。生理食塩水と薬物処理群とのMann-Whitney検定：偽薬に対して＊Ｐ＜０．０５；生理食塩水、ＭＰ６ＰＨＳＡおよび経口ロサルタンに対して＃Ｐ＜０．０５。
【０２２１】
図２４．ＣＣｌ４ラットにおける肝線維症時のロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡの効果（パラフィン切片におけるSirius Red染色、および定量化）。ＣＣＬ４ラットを、生理食塩水（Ａ）、Ｍ６ＰＨＳＡ（Ｂ）、ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡ（Ｃ）および自由ロサルタン（Ｄ）で処理した。（Ｅ）：Sirius Redポジティブ領域の定量化。コントロール線維症ラットに対して＊Ｐ＜０．０５。
【０２２２】
図２５．αＳＭＡの発現によって評価した、筋線維芽細胞および活性化肝星細胞の蓄積に対する異なる処理の効果。生理食塩水（Ａ）、Ｍ６ＰＨＳＡ（Ｂ）または経口ロサルタン（Ｄ）を受けたＢＤＬラットは、線維成長が活発な領域と共局在するαＳＭＡポジティブ細胞の著しい蓄積を示した。しかし、ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡ（Ｃ）で処理したラットは、αＳＭＡポジティブ細胞の著しい減少を示した（倍率４×）。
【０２２３】
（Ｅ）．生理食塩水で処理した胆管結紮ラット由来肝臓の高倍率（４００×）顕微鏡写真。αＳＭＡ染色が、活性化肝星細胞に相当する類洞に位置する細胞（上の矢印）および増殖型胆管を囲む筋線維芽細胞（下の矢印）において検出された。
【０２２４】
（Ｆ）．αＳＭＡ染色領域の定量化。統計分析：偽薬に対して＊Ｐ＜０．０５；生理食塩水、ＭＰ６ＰＨＳＡおよび経口ロサルタンに対して＃Ｐ＜０．０５。
【０２２５】
ロサルタン−ＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡで処理したＣＣｌ４動物由来肝臓切片のＳＭＡ染色は、生理食塩水で処理した疾病動物（Ｇ）よりも少ないαＳＭＡ−ポジティブ細胞の蓄積を示した（Ｈ）。
【０２２６】
（Ｉ）．肝臓標本におけるαＳＭＡ染色領域の定量化。生理食塩水に対して＊Ｐ＜０．０５。
【０２２７】
図２６．ＣＤ４３染色によって評価した、肝実質における炎症細胞の浸潤に対する異なる処理の効果。生理食塩水（Ａ）またはＭ６ＰＨＳＡ（Ｂ）を受けたＢＤＬラットは、ＣＤ４３ポジティブ細胞によって強い浸潤を示した（茶色の染色）。ロサルタン−ＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡ（Ｃ）による処理、および、より少ない程度のロサルタン（Ｄ）による処理は、ＣＤ４３浸潤白血球数を減少させた（倍率４×）。
【０２２８】
（Ｅ）．２０のランダムに選ばれた高倍率視野におけるポジティブ細胞数の定量化。生理食塩水およびＭ６ＰＨＳＡに対する＊Ｐ＜０．０５。
【０２２９】
図２７．Sirius Red染色によって評価した、肝臓におけるコラーゲンの沈着に対するＰＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡの効果。
【０２３０】
（Ａ）．ラット肝臓標本におけるSirius Red染色領域の定量化。ＢＤＬ生理食塩水コントロールに対して＊Ｐ＜０．０５。
【０２３１】
（Ｂ）．Sirius Redで染色された肝臓切片の典型的な画像（倍率４０×）。生理食塩水を受けたラット（左の列）は、線維成長が活発な領域と共局在するコラーゲンの顕著な沈着を示した。ＰＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡ（右の列）で処理したラットは、ＢＤＬ後１１および１２日（すなわち、投与後それぞれ２４時間および４８時間）で弱い肝臓線維症の進行を示した。
【０２３２】
図２８．αＳＭＡの発現によって評価した、筋線維芽細胞および活性化ＨＳＣの蓄積に対するＰＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡの効果。
【０２３３】
（Ａ）．αＳＭＡ染色の定量化。ＢＤＬ生理食塩水コントロールに対して＊Ｐ＜０．０５。
【０２３４】
（Ｂ）．生理食塩水（左のパネル）またはＰＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡ（右のパネル）を受けたラットの典型的な画像（倍率４０×）。ＢＤＬ後１０日でのＰＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−Ｍ６ＰＨＳＡの単回投与による処理は、ＢＤＬ後１１および１２日（すなわち、投与後それぞれ２４時間および４８時間）で筋線維芽細胞数を減少させた。
３．２．２．  腎臓対象細胞ターゲティング複合体の評価。
【０２３５】
腎臓対象細胞ターゲティング複合体の可能性のある白金関連毒性を検出するために、健常ラットにおいてＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭを評価した。オスWistarラットを前述のようにＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭで処理し、無処理動物および低量のシス白金（３ｍｇ／ｋｇ、点滴）で２４時間処理した動物と比較した。しかし、用いたシス白金量は、ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭコンジュゲートにおける白金量よりも８倍高い。腎機能への効果を調査するために、血清および尿クレアチニンレベルを決定し、クレアチニンクリアランスを算出した。ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭ処理動物の場合、２４，３２，４８および７２時間でのクレアチニンクリアランスを、動物を犠牲にする前の２４時間にて採取した血清および尿サンプルから算出した。ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭ群のたんぱく尿を計算するために、異なる日の尿たんぱくレベルの平均をとった。ＴＵＮＥＬ染色を冷凍腎臓切片で実行して、アポトーシス細胞数を調査した。さらに、２４時間室温の濃硝酸における組織の消化および澄明な溶液を形成するまでの７０°Ｃでの加熱後、誘導結合プラズマ原子吸光分析（ＩＣＰ−ＡＡＳ）を用いて、腎臓の白金レベルを決定した。結果を表１に要約した。
【０２３６】
表１：標準ラットにおけるＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭの薬理学的評価。腎機能パラメータの比較、アポトーシスの誘導および腎臓の白金含量。
【０２３７】
【表１】
2009501791.tif 000004
【０２３８】
無処理群およびシス白金群のデータを平均±ＳＥＭ（ｎ＝４、２４時間）として表わしている。ＳＢ−ＵＬＳ−ＬＺＭの値を平均±ＳＥＭ（ｎ＝４；２４，３２，４８および７２時間）として示している（ＴＵＮＥＬポジティブ細胞はｎ＝５；２４（ｎ＝２），３２，４８および７２時間である）。シス白金とＳＢ−ＵＬＳ−ＬＺＭ群との差異は＊ｐ，０．０５、＊＊ｐ，０．０１である。無処理群に対する差異は、†ｐ，０．０５、††ｐ＜０．０１である。Ｎ．Ｄ．は検出できなかったことを示す。
【０２３９】
クレアチニンクリアランスは両群において標準のままであったが、尿たんぱくレベルの増加が、無処理ラットと比較して、ＳＢ２０２１９０−ＵＬＳ−ＬＺＭで検出された。しかし、コンジュゲート処理群の観察値は充分正常範囲内であった。２つ目として、腎臓切片のＴＵＮＥＬ染色によって尿細管細胞アポトーシスを調査したところ、無処理ラットと比較して、シス白金誘導尿細管毒性をはっきりと示した。反対に、ＳＢ−ＵＬＳ−ＬＺＭ処理ラットは、両処理群の腎臓において白金は同程度であったにもかかわらず、アポトーシス細胞数の増加を示さなかった。
【０２４０】
腎臓対象細胞ターゲティング複合体の可能性のある抗線維化および抗炎症活性を、腎臓病の２つの異なるモデル、片側虚血再かん流傷害（Ｉ／Ｒ）モデルおよび片側尿管閉塞（ＵＵＯ）モデルにおいて評価した。Ｉ／Ｒモデルにおける細胞ターゲティング複合体の        
【０２４１】
評価
腎臓対象細胞ターゲティング複合体による処理は、先に考察したように、それらの制御薬物放出プロフィールによって、長期間にわたって腎臓において充分な量の活性薬物を提供するという仮説を立てた。したがって、コンジュゲートを虚血２時間前に投与すれば、コンジュゲートは腎臓内に完全に蓄積することができる。化合物の投与後、腎虚血を誘導するまで、動物をケージに戻した。ラットを手術して、腎血流を止めるために、クランプで腎動脈および腎静脈を顕微鏡下で締めた。４５分後、クランプを取外し、創傷縫合前に腎臓の再かん流を観察した。偽手術動物には、血管のクランピング以外、類似の外科的処置を施した。４日後、動物を犠牲にして血液サンプルを腹大動脈から採取した。食塩水で器官を穏やかに洗い流した後、腎臓を単離し、パラフィン切片の調製のために４％ホルマリンで保存し、または低温切片の調製のために氷冷イソペンタン中で凍結させた。免疫染色を一般に確立された方法に従って実行し、２人の独立した観察者による盲式（blind   manner）の、形態学的分析または半定量スコアリングによって定量化した。
【０２４２】
ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭで得た結果を図２９に示す。動物を、ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭ（３２ｍｇ／ｋｇ コンジュゲート、７５２μｇ／ｋｇ ＳＢ２０２１９０に相当；ｎ＝６）、媒介物（５％ グルコース；ｎ＝６）、または自由ＳＢ２０２１９０（８００μｇ／ｋｇ；ｎ＝３）で処理した。ＳＢ２０２１９０−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭを５％ グルコースに溶解し、ＳＢ２０２１９０を、５％ ＤＭＳＯを有する２０％ ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン溶液に溶解した。抗-ｐ-ｐ３８免疫組織化学染色（細胞シグナル伝達から得た抗体）をパラフィン切片に実行した。αＳＭＡ染色をクリオスタット切片に実行した。媒介物処理Ｉ／Ｒラットは、腎皮質および髄質の双方において、ｐ−ｐ３８ポジティブ細胞を強く示す（パネルＡ、評点＋＋＋）、拡張損傷尿細管を有した。ＳＢ２０２１９０−ＵＬＳ−ＬＺＭによる処理は、髄質におけるｐ−ｐ３８ポジティブ細胞数を減少させたが（パネルＢ、評点＋）、ＳＢ２０２１９０処理動物では減少が見られなかった（パネルＣ、評点＋＋＋）。さらに、Ｉ／Ｒ障害の４日後、ＳＭＡ発現は腎皮質の尿細管間質空間において大いに増加したことがわかった（パネルＤ、評点＋＋＋）。ＳＢ２０２１９０−ＵＬＳ−ＬＺＭコンジュゲートの単回投与はＳＭＡ発現を低下させたが（パネルＥ、評点＋＋）、非標的ＳＢ２０２１９０はＳＭＡの発現に影響しなかった（パネルＦ、評点＋＋＋）。
【０２４３】
図３０は、ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭによるＩ／Ｒラットの処理後に得られた結果を示している。前述のようにＩ／Ｒ手順に付した動物を、ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭの４回投与（２０ｍｇ／ｋｇ／日、５２０μｇロサルタン／ｋｇ／日に相当）で処理した。初回はＩ／Ｒ損傷の傷害２時間前に投与し、最終投与２４時間後に動物を犠牲にした。浸潤マクロファージ数を検出するために、パラフィン包埋腎臓切片を、ラットマクロファージマーカＥＤ−１に対する抗体とインキュベートした。間質マクロファージ流入の広がりを、コンピュータ制御の形態計測によって測定した。茶色の沈殿物量を測定して、選択領域のマクロファージ数として表した。すべての形態計測を、独立した（blinded）観察者によって実行した。観察できるように、ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭによる処理は浸潤マクロファージ数を減少させた。
【０２４４】
片側Ｉ／Ｒモデルで評価した第３の細胞ターゲティング複合体はＹ２７６３２−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭコンジュゲートである。ロサルタン−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭと類似して、Ｉ／Ｒ動物を、生成物の４回の静脈投与（５％グルコースに溶解した、５５５μｇ／ｋｇのＹ２７６３２に相当する、２０ｍｇ／ｋｇのＹ２７６３２−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭ）で処理した。動物のコントロール群を自由Ｙ２７６３２（５５５μｇ／ｋｇ）で処理した。初回はＩ／Ｒ損傷の傷害２時間前に投与し、最終投与２４時間後に動物を犠牲にした。すなわち、Ｉ／Ｒ後４日目である。ｍＲＮＡ単離および定量遺伝子発現分析のために、腎臓片を液体窒素内でスナップ冷凍した。Bio-RadのAurum Total RNA Miniキット（Bio-Rad、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を用いて全ＲＮＡを腎皮質から単離した。ＲＮＡ含量をnanodrop UV-detector（NanoDrop Technologies、ウィルミントン、デラウエア州）によって測定した。Superscript III first strand合成キット（Invitrogen、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いて、ｃＤＮＡを類似量のＲＮＡから合成した。以下の遺伝子について、定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Applied Biosystems．、Foster City、カリフォルニア州）によって遺伝子発現レベルを測定した。以下のラット種用のプライマを、Sigma-Genosys（ヘーバリル、英国）から得た：単球遊走たんぱく-１（ＭＣＰ-１；５’-ＴＣＣ ＴＣＣ ＡＣＣ ＡＣＴ ＡＴＧ ＣＡＧ ＧＴ-３’および５’-ＴＴＣ ＣＴＴ ＡＴＴ ＧＧＧ ＧＴＣ ＡＧＣ ＡＣ-３’、２５５ｂｐ）、メタロプロテイナーゼ-１の組織阻害薬（ＴＩＭＰ-１；５’-ＧＡＧ ＡＧＣ ＣＴＣ ＴＧＴ ＧＧＡ ＴＡＴ ＧＴ-３’および５’-ＣＡＧ ＣＣＡ ＧＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＴＣ ＴＴ-３’、３３４ｂｐ）、Ｉα１型プロコラーゲン（５’-ＡＧＣ ＣＴＧ ＡＧＣ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＴＴ ＧＡ-３’および５’-ＣＣＡ ＧＧＴ ＴＧＣ ＡＧＣ ＣＴＴ ＧＧＴ ＴＡ-３’、１４５ｂｐ）、α平滑筋アクチン（α-ＳＭＡ；５’-ＧＡＣ ＡＣＣ ＡＧＧ ＧＡＧ ＴＧＡ ＴＧＧ ＴＴ-３’および５’-ＧＴＴ ＡＧＣ ＡＡＧ ＧＴＣ ＧＧＡ ＴＧＣ ＴＣ-３’、２０２ｂｐ）、ＴＧＦ-β１（５’-ＡＴＡ ＣＧＣ ＣＴＧ ＡＧＴ ＧＧＣ ＴＧＴ ＣＴおよび５’-ＴＧＧ ＧＡＣ ＴＧＡ ＴＣＣ ＣＡＴ ＴＧＡ ＴＴ-３’、１５３ｂｐ）、ならびにグリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ；５’-ＣＧＣ ＴＧＧ ＴＧＣ ＴＧＡ ＧＴＡ ＴＧＴ ＣＧ-３’および５’-ＣＴＧ ＴＧＧ ＴＣＡ ＴＧＡ ＧＣＣ ＣＴＴ ＣＣ-３’、１７９ｂｐ）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの蛍光プローブとして、SYBR（登録商標）Green PCR Master Mix（Applied Biosystems、ウォリントン、英国）を用いた。各サンプルについて、１μｌのｃＤＮＡを、０．４μｌの各遺伝子特異的プライマ（５０μＭ）、０．８μｌ ＤＭＳＯ、８．４μｌ 水、および１０μｌ SYBR Green PCR Master Mixと混合した。４０サイクルまでｃＤＮＡ増幅を実行し、その後解離サイクルを行った。最終生成物を調査したところ、解離曲線のシングルピークを与えた。最終的に、閾値サイクル数（Ｃｔ）を遺伝子ごとに算出し、コントロール遺伝子ＧＡＰＤＨの発現に対して標準化した後、相対遺伝子発現比を算出した。図３１は腎臓における遺伝子発現レベルを表している。標準ラットと比較して、媒介物処理Ｉ／Ｒ動物は��炎症マーカＭＣＰ-１、ならびに線維症マーカα-ＳＭＡ、ＴＧＦ-βＬ、Ｉα１型プロコラーゲンおよびＴＩＭＰ-１の遺伝子発現において有意な増加を有した。データは平均±ＳＥＭを表す。††ｐ＜０．０１および†††ｐ＜０．００１は、標準ラットに対する差異を表す。他の差異は＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１として示す。
【０２４５】
ＵＵＯモデルにおける細胞ターゲティング複合体の評価
腎線維症のＵＵＯモデルにおける化合物の単回投与後のＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭの効果を研究した。動物を４群に分割した：標準ラット、線維症コントロール動物（媒介物、５％ グルコース）、ＴＫＩ−ＬＺＭ（２５ｍｇ／ｋｇ、６３０μｇ／ｋｇ ＴＫＩに相当）および非結合自由ＴＫＩ（６３０μｇ／ｋｇ）。ＴＫＩを、５％ ＤＭＳＯを有する水中２０％ ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンに溶解し、ＴＫＩ−ＬＺＭを５％ グルコースに溶解した。腎臓において生成物の障害のない摂取を可能にするために、ラットを尿道閉塞２時間前にそれらの化合物のいずれかで静脈注射した。イソフルラン麻酔下の側腹切開によって左腎および尿管を露出し、その後、尿管を４−０シルクによって門付近の３か所で結紮した。３日後、動物を麻酔下で犠牲にし、腎臓を穏やかに洗い流して採取した。前述のように、腎臓皮質片をスナップ冷凍してＲＮＡを単離した。腎臓片をＰＢＳ中４％ ホルマリン溶液において固定し、抗α-ＳＭＡおよびＥＤ-１免疫組織化学染色ならびに形態学的分析用にパラフィン切片を作製した。本研究の結果を図３２に示している。ＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭによる処理は、ＭＣＰ-１遺伝子発現をかなり低下させた（パネルＡ）。反対に、自由ＴＫＩの単回投与はＭＣＰ-１の発現を低下させなかった。免疫組織化学分析は遺伝子発現データを確認した。マクロファージの化学誘引物質である、ＭＣＰ-１の生成が低下するに従って、ＴＫＩ-ＬＺＭ処理の浸潤マクロファージの有意な低下レベルも検出しされた（ＥＤ-１免疫染色、パネルＢ）。しかし、遺伝子発現研究とは対照的に、自由ＴＫＩによるＥＤ-１免疫染色の低下も観察された。さらに、線維症マーカα-ＳＭＡの発現もＴＫＩ-ＬＺＭまたはＴＫＩ処理によって有意に低下し、このことはＴＫＩおよびＴＫＩ-ＬＺＭの可能性のある抗線維症活性を示している（パネルＣ）。これらのデータは、腎線維症のＴＫＩ−ｃｉｓＵＬＳ−ＬＺＭの可能性のある抗線維症活性を実証している。
【０２４６】
引用文献
[1] L. Beljaars, G. Molema, B. Weert, H. Bonnema, P. Olinga, G.M.M.
Groothuis, D.K.F. Meijer, and K. Poelstra, Albumin modified with mannose 6- phosphate: A potential carrier for selective delivery of antifibrotic drugs to rat and human hepatic stellate cells, Hepatology 295 (1999) 1486-1493.
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【図面の簡単な説明】
【０２４７】
【図１】修飾[Ｐｔ(エチレンジアミン)２塩化物]システムのｔｒａｎｓ［Ｐｔ(ＮＨ３)２(ｐｔｘ)(ＮＨ２(ＣＨ)ｎＮＨ２)］（ｎ＝リンカの脂肪族鎖中のＣ原子数）の反応スキームを示す図である。
【図２】リンカのＮＨ２基の修飾の反応スキームを示す図である。
【図３】二核コンジュゲート４の調製の合成スキームを示す図である。
【図４】細胞ターゲティング複合体の薬物放出プロフィールを示す図である。Ａ：血清／ＰＢＳ １：１におけるＰＴＸ-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡのインキュベーション。Ｂ：異なる媒質における２４時間のＰＴＸ-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡのインキュベーション。Ｃ：ＳＢ２０２１９０-ｃｉｓＵＬＳ-ＬＺＭ。詳細は実施例２．１を参照されたい。
【図５】２４時間のＰＴＸ-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡによるＨＳＣのインキュベーションに続く、線維症マーカの免疫組織化学的染色の図である。パネルＡ，Ｂ）  コントロール；パネルＣ，Ｄ）  ＰＴＸ-ｃｉｓＵＬＳ-ＨＳＡ；パネルＥ，Ｆ）  ＰＴＸ-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡ；パネルＧ，Ｈ）  非標的ＰＴＸ。活性化ＨＳＣは細胞質内の粒状染色パターンにおいて、おそらくＩ型プロコラーゲンの存在を反映するＩ型コラーゲンを表し、αＳＭＡは線維様パターンに染色された。１ｍＭ濃度のＰＴＸによる処理は、両線維症マーカの赤色強度を低下させた。ＰＴＸ-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡによる細胞のインキュベーションは、Ｉ型コラーゲンの発現にかなり影響した（Ｅ）。αＳＭＡ染色強度はＰＴＸ-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡによって影響されなかったが、ＨＳＣの形態において顕著な変化が観察された（Ｆ）。これらの効果はＰＴＸ-ＨＳＡ（Ｃ，Ｄ）の当量濃度によるインキュベーション後には観察されなかった。詳細は実施例２．２を参照されたい。
【図６】ＰＴＫＩ-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡの、ＨＳＣにおける遺伝子発現への影響（パネルＡ）または線維症ラットの肝臓由来の肝臓切片における遺伝子発現への影響（パネルＢ）を示す図である。詳細は実施例２．２を参照されたい。
【図７】ＲＧＤ-ＰＥＧ-ＳＢ２０２１９０-ｃｉｓＵＬＳ-ＨＳＡの、内皮細胞における遺伝子発現への影響を示す図である。ＴＮＦ-活性化ＨＵＶＥＣを指示化合物とインキュベートした。パネルＡ：遺伝子発現分析；パネルＢ：培地におけるＩＬ-８の決定。詳細は実施例２．２を参照されたい。
【図８】ＳＢ-ｃｉｓＵＬＳ-ＬＺＭ（パネルＡ）およびＴＫＩ-ｃｉｓＵＬＳ-ＬＺＭ（パネルＢ）の、ＨＫ-２尿細管細胞におけるＴＧＦ-β１によって誘導されたプロコラーゲン-Ｉａ１の遺伝子発現への影響を示す図である。詳細は実施例２．２を参照されたい。
【図９】ＲＧＤ-搭載ＴＫ７８７-アルブミンコンジュゲートの、内皮細胞における遺伝子発現への影響を示す図である。ＶＥＧＦ-活性化ＨＵＶＥＣを指示化合物とインキュベートした。詳細は実施例２．２を参照されたい。
【図１０】ＨＳＣの、細胞ターゲティング複合体とのインキュベーションを示す図である。Ａ〜Ｄ：ＰＴＸ-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡ；Ａ：細胞の生存；Ｂ：カスパーゼ３／７活性；Ｃ：ＴＵＮＥＬ染色；Ｄ：ＴＵＮＥＬポジティブ核の定量化（ＴＵＮＥＬ／ＤＡＰＩ比）。Ｅ：ロサルタン-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡ、細胞の生存評価；Ｆ：ＰＴＫＩ-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡ、細胞の生存評価。詳細は実施例２．３を参照されたい。
【図１１】ＮＲＫ-５２Ｅ細胞の、細胞ターゲティング複合体とのインキュベーション、および細胞毒性の、他の化合物との比較を示す図である。Ａ：シスプラチンまたはｃｉｓＵＬＳとのインキュベーション；Ｂ：ＳＢ２０２１９０またはＳＢ２０２１９０-ｃｉｓＵＬＳとのインキュベーション；Ｃ：ＬＺＭまたはＳＢ２０２１９０-ｃｉｓＵＬＳ-ＬＺＭとのインキュベーション。詳細は実施例２．３を参照されたい。
【図１２】ＨＵＶＥＣの、ＲＧＤＰＥＧ-ＳＢ２０２１９０-ｃｉｓＵＬＳ-ＨＳＡとのインキュベーション：３日間のインキュベーション後の、ＭＴＳ細胞の生存評価を示す図である。詳細は実施例２．３を参照されたい。
【図１３】ＨＵＶＥＣの、非修飾ｈｉｓＴＲＡＩＬおよびビオチン化ＴＲＡＩＬ（パネルＡ）またはＲＧＤ-搭載ＴＲＡＩＬ（パネルＢ）との４８時間のインキュベーション後の、ＭＴＳ細胞の生存評価を示す図である。詳細は実施例２．３を参照されたい。
【図１４】Jurkat Ｔ-細胞の、細胞ターゲティング複合体とのインキュベーションを示す図である。Ａ，Ｃ：４８時間のインキュベーション後の細胞の生存評価；Ｂ，Ｄ：４時間のインキュベーション後のカスパーゼ活性評価。詳細は実施例２．３を参照されたい。
【図１５】Ａ：ＰＴＸ-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡの、線維芽細胞との結合を示す図である。Ａ：コンペティタＭ６ＰＨＳＡの存在／不在下の放射性標識ＰＴＸ-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡとのインキュベーション後の細胞関連放射能；Ｂ：細胞結合の抗ＨＳＡ免疫検出。ＰＴＸ-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡとインキュベートした細胞が、細胞関連または内在コンジュゲートの強い赤色染色を示し、ＰＴＸ-ｃｉｓＵＬＳ-ＨＳＡとのインキュベーション後には観察されなかった。詳細は実施例２．４を参照されたい。
【図１６】細胞ターゲティング複合体の、内皮細胞：ＳＢ２０２１９０-ｃｉｓＵＬＳ搭載複合体との結合を示す図である。放射性標識ＲＧＤＰＥＧ-ＳＢ２０２１９０-ｃｉｓＵＬＳ-ＨＳＡとのインキュベーション後の細胞関連放射能。Ａ：４°Ｃ、４時間のインキュベーション；Ｂ：異なる温度および異なる期間でのインキュベーション。詳細は実施例２．４を参照されたい。
【図１７】細胞ターゲティング複合体の、内皮細胞との結合を示す図である。結合親和性を放射性標識エキスタチンの競争的置換によって決定した。Ａ〜Ｄ：ＲＧＤ搭載ＰＴＫ７８７-ｃｉｓＵＬＳ複合体とのインキュベーション；Ｅ：ＲＧＤＰＥＧ-アビジンとのインキュベーション。詳細は実施例２．４を参照されたい。
【図１８】ＢＤＬ３ラットにおけるＰＴＸ-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡの薬物動態を示す図である。器官分布を化合物の１０分の投与でＢＤＬラットにおいて決定した。詳細は実施例３．１．１を参照されたい。
【図１９】Ａ：ＢＤＬラットにおけるロサルタン-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡの器官分布を示す図である。肺（ａ）、脾臓（ｂ）、心臓（ｃ）、腎臓（ｄ）、肝臓（ｅ）、の抗ＨＳＡ染色、肝臓の抗ＨＳＡおよび抗デスミンの二重染色（ｆ，ｇ）。ロサルタン-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡで処理したラットの非実質細胞内で、ＨＳＡ染色の赤色は、肺、脾臓、心臓または腎臓で検出されなかったが、肝臓で検出された（４×の倍率）。抗ＨＳＡおよび抗デスミンの二重染色によって評価したように、ロサルタン-Ｍ６ＰＨＳＡはラットの肝臓の星細胞と共局在した（ｆ，ｇの矢印；４０×の倍率）。Ｂ：ＣＣＬ４ラットの肝臓におけるロサルタン組織レベル。詳細は実施例３．１．１を参照されたい。
【図２０】ＳＢ２０２１９０-ｃｉｓＵＬＳ-ＬＺＭの薬物動態評価を示す図である。Ａ，Ｂ：血清（Ａ）または腎臓（Ｂ）におけるＳＢ２０２１９０レベル。Ｃ：腎臓切片における抗ＬＺＭ染色であり、矢印は尿細管細胞におけるコンジュゲート（赤色）の蓄積を示す。詳細は実施例３．１．２を参照されたい。
【０２４８】
【図２１】ＴＫＩ-ｃｉｓＵＬＳ-ＬＺＭの薬物動態評価を示す図である。Ａ〜Ｃ：血清（Ａ）、腎臓（Ｂ）または尿（Ｃ）におけるＴＫＩレベル。Ｄ：腎臓切片における抗ＬＺＭ染色であり、矢印は尿細管細胞におけるコンジュゲート（赤色）の蓄積を示す。詳細は実施例３．１．２を参照されたい。
【図２２】Ｙ２７６３２-ｃｉｓＵＬＳ-ＬＺＭの薬物動態評価を示す図である。詳細は実施例３．１．２を参照されたい。
【図２３】ＢＤＬラットにおけるロサルタン-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡの薬物動態評価を示す図である。Ａ〜Ｄ：線維症肝臓におけるコラーゲンのSirius Red染色。コラーゲンの重度のブリッジ（赤色）が、生理食塩水（Ａ）、Ｍ６ＰＨＳＡ（Ｂ）および経口ロサルタン（Ｄ）を受けたラットにおいて観察された。しかし、ロサルタン-Ｍ６ＰＨＳＡ（Ｃ）で処理したラットは、コラーゲン蓄積のあった領域がより少なかった。Ｅ：Sirius Red染色の形態学的定量化。Ｆ：α１型プロコラーゲンの遺伝子発現分析。詳細は実施例３．１．２を参照されたい。
【図２４】ＣＣｌ４ラットにおけるロサルタン-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡの薬理評価を示す図である。Ａ〜Ｄ：線維症肝臓におけるコラーゲンのSirius Red染色。赤色は肝臓におけるコラーゲンの沈着を示し、ロサルタン-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡの処理後は顕著に減少したが、Ｍ６ＰＨＳＡまたは自由ロサルタンの処理後は顕著に減少しなかった。Ｅ：Sirius Red染色の形態学的定量化。詳細は実施例３．２．１を参照されたい。
【図２５】線維症ラットにおけるロサルタン-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡの薬理評価を示す図である。Ａ〜Ｄ：ＢＤＬラットの線維症肝臓におけるαＳＭＡの染色。Ｍ６ＰＨＳＡまたは自由ロサルタンではなく、処理ロサルタン-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡによる処理が、ポジティブに染色される領域（茶色）を減少させた。Ｅ：生理食塩水処理したＢＤＬラットの高倍率顕微鏡写真。矢印は、活性化ＨＳＣ由来（上の矢印）または増殖型胆管を囲む筋線維芽細胞（下の矢印）におけるＳＭＡを示す。Ｆ：ＢＤＬラットにおけるＳＭＡ染色の形態的定量化。Ｇ，Ｈ：ＣＣＬ４ラットの線維症肝臓におけるαＳＭＡの染色。ロサルタン-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡによる処理は染色強度を低下させた（茶色の減少）。Ｉ：ＣＣＬ４ラットにおけるＳＭＡ染色の形態的定量化。詳細は実施例３．２．１を参照されたい。
【図２６】ＢＤＬラットにおけるロサルタン-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡの薬理評価を示す図である。Ａ〜Ｄ：線維症肝臓における浸潤免疫細胞のＣＤ４３染色。生理食塩水（Ａ）またはＭ６ＰＨＳＡ（Ｂ）を受けたラットは、ＣＤ４３ポジティブ細胞による強い浸潤を示した（茶色）。より少ない程度のロサルタン-Ｍ６ＰＨＳＡ（Ｃ）、または経口ロサルタン（Ｄ）による処理は、ＣＤ４３浸潤白血球数の減少を誘導した。Ｅ：２０のランダムに選ばれた高倍率視野におけるポジティブ細胞数のＣＤ４３染色の形態的定量化。詳細は実施例３．２．１を参照されたい。
【図２７】ＢＤＬラットにおけるＰＴＫＩ-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡの薬理評価を示す図である。Ａ：線維症肝臓におけるSirius Red染色の形態的定量化。Ｂ：化合物の投与１日後（ＢＤＬ１１）または投与２日後（ＢＤＬ１２）の肝臓のSirius Red染色の顕微鏡写真。ＰＴＫＩ-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡによる処理は、両時点において赤褐色の染色コラーゲンを減少させ、コラーゲンリッチな領域間のブリッジをも減少させた。詳細は実施例３．２．１を参照されたい。
【図２８】ＢＤＬラットにおけるＰＴＫＩ-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡの薬理評価を示す図である。Ａ：線維症肝臓におけるαＳＭＡ染色の形態的定量化。Ｂ：化合物の投与１日後（ＢＤＬ１１）または投与２日後（ＢＤＬ１２）の肝臓のαＳＭＡ染色の顕微鏡写真（茶色）。ＰＴＫＩ-ｃｉｓＵＬＳ-Ｍ６ＰＨＳＡによる処理は両時点において赤褐色の染色ＳＭＡを減少させた。詳細は実施例３．２．１を参照されたい。
【図２９】Ｉ／ＲラットにおけるＳＢ２０２１９０-ｃｉｓＵＬＳ-ＬＺＭの薬理評価を示す図である。Ａ〜Ｃ：コントロールＩ／Ｒラット（Ａ）、ＳＢ２０２１９０-ｃｉｓＵＬＳ-ＬＺＭ処理Ｉ／Ｒラット（Ｂ）、またはＳＢ２０２１９０処理Ｉ／Ｒラット（Ｃ）におけるリン酸化ｐ３８の染色。Ｄ〜Ｆ：コントロールＩ／Ｒラット（Ｄ）、ＳＢ２０２１９０-ｃｉｓＵＬＳ-ＬＺＭ処理Ｉ／Ｒラット（Ｅ）、またはＳＢ２０２１９０処理Ｉ／Ｒラット（Ｆ）におけるαＳＭＡの染色。パネルＡ〜Ｃの矢印は、拡張および損傷した尿細管に相当する尿細管細胞におけるｐ-ｐ３８ポジティブ核の免疫学的局在決定を示す（暗褐色）。パネルＤ〜Ｆの矢印は、尿細管間質空間におけるαＳＭＡ（赤色）の局在化を示す。ＳＢ２０２１９０-ｃｉｓＵＬＳ-ＬＺＭによる処理は、Ｉ／Ｒコントロールと比較して、ｐ-ｐ３８ポジティブ細胞数およびαＳＭＡの発現を減少させたが、自由ＳＢ２０２１９０はどちらのパラメータにも影響を及ぼさなかった。詳細は実施例３．２．２を参照されたい。
【図３０】Ｉ／Ｒラットにおけるロサルタン-ｃｉｓＵＬＳ-ＬＺＭの薬理評価を示す図である。腎臓における浸潤免疫細胞を、ＥＤ１染色によって検出し、２人の独立した観察者がカウントした。詳細は実施例３．２．２を参照されたい。
【図３１】Ｉ／ＲラットにおけるＹ２７６３２-ｃｉｓＵＬＳ-ＬＺＭの薬理評価を示す図である。腎臓の遺伝子発現レベルは、ｑＲＴ-ＰＣＲによって決定し、コントロールＩ／Ｒ動物のレベルに関連して発現した。詳細は実施例３．２．２を参照されたい。図３１Ａは腎臓における遺伝子発現レベルを示す。標準ラットと比較して、ビークル-処理Ｉ／Ｒ動物は、炎症マーカＭＣＰ-Ｉならびに線維症マーカαＳＭＡ、ＴＧＦ-β１、Ｉα１型プロコラーゲンおよびＴＩＭＰ-１の遺伝子発現において有意に増加した。データは平均±ＳＥＭを表す。††ｐ＜０．０１および†††ｐ＜０．００１は、標準ラットに対する差異を表す。他の差異は＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１として示す。腎臓切片の免疫組織学的評価は、マクロファージの浸潤時（ＥＤ-１染色、図３１Ｂ）、および線維症マーカαＳＭＡの発現時（図３１Ｃ）の、Ｙ２７６３２-ｃｉｓＵＬＳ-ＬＺＭの有益な効果を示した。両マーカはコントロールの腎臓切片において不在であり、Ｉ／Ｒ動物において広く増加したが、Ｙ２７６３２-ｃｉｓＵＬＳ-ＬＺＭによる処理およびより少ない程度のＹ２７６３２は、染色領域の形態学的スコアを有意に低下させた。
【図３２】ＵＵＯラットにおけるＹ２７６３２-ｃｉｓＵＬＳ-ＬＺＭの薬理評価を示す図である。Ａ：ＭＣＰ-１の腎臓における相対遺伝子発現；Ｂ：腎臓で浸潤されたマクロファージの定量化；Ｃ：腎臓におけるＳＭＡ染色の定量化。詳細は実施例３．２．２を参照されたい。
【図３３】送達可能化合物ＰＴＫ７８７のターゲティングのための本発明に従う複合体の１つの可能性のある構造を示す図である。図は、ＲＧＤが、ターゲティング部分のホーミング部分の例として、種々の様式で薬物ＰＴＫ７８７とカップリングすることができることを示している。ＰＴＫ７８７は金属イオン錯体と直接カップリングし、環状ＲＧＤはキャリアたんぱく（ＨＳＡ）を介して、またはさらに付加的ＰＥＧリンカを介して、金属イオン錯体と結合し得る。ＨＳＡを用いる利点は、このたんぱくがヒト患者とは無関係ではないので、免疫応答を発揮させないということである。
【図３４】治療化合物のターゲティング用の本発明の複合体の別の可能な構造を示す図である（ＴＲＡＩＬを示す）。Ａはキャリア／ホーミングたんぱくである（たとえば、ビオチンに対する高い親和性および高いＲＧＤ搭載能力を有するアビジン）。Ｂは万能リンカであり（たとえば、ＲＧＤ結合用の二価リンカとして機能し、循環時間を延長するように機能する（非標的細胞結合を避ける）ポリエチレングリコール）、修飾キャリアを（たとえばマクロファージのクリアランスから）遮蔽する。Ｃはホーミング分子である（たとえば、αｖβ３インテグリン発現細胞（新たに形成された血管内の内皮細胞）への高い結合親和性を示す、ｃ（ＲＧＤｆ））。Ｄは送達可能化合物である（たとえば、腫瘍細胞において選択的アポトーシスを誘導する、治療たんぱくヒト組換えＴＲＡＩＬ）。Ｅは精製目的に適したヒスチジンタグであり、（遷移）金属イオン錯体（たとえば配位された白金化合物）とカップリングする。Ｆはバイオリンカである（たとえば、リジン残基との直接カップリング用スルホ-ＮＨＳビオチン部分、および薬物結合用白金系リンカである、ＵＬＳビオチン部分から成る）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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