(57)【要約】  本発明は、式Ｉのスフィンゴイド塩基、またはその塩もしくはエステルをＣＤＷ１ｇあたり少なくとも０．５ｍｇ生産する遺伝的に操作された微生物株、詳細には遺伝的に操作された酵母株を提供する。本発明は、式Ｉのスフィンゴイド塩基またはその塩もしくはエステルをＣＤＷ１ｇあたり少なくとも０．５ｍｇ生産する遺伝的に操作された微生物株を得る方法を提供する。この方法は、ａ）セラミドシンターゼ活性を有する酵素および／またはセラミダーゼ活性を有する酵素であって、後者の酵素が式Ｉのスフィンゴイド塩基を含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できる酵素をコードするポリヌクレオチドの発現を増大させるステップ、および／またはｂ）スフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼ活性を有する酵素および／またはセラミダーゼ活性を有する酵素であって、後者の酵素がスフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンもしくはジヒドロスフィンゴシンを含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できる酵素をコードするポリヌクレオチドの発現を低減させるステップ、および所望の生産性を有する株を単離するステップを含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
2009536521.tif 000008
のスフィンゴイド塩基またはその塩もしくはエステル
［式中、ＲはＸ−（ＣＨ２）ｍ−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３であり、
ａ．ＸはＨ２またはＣＨＯＨであり、
ｂ．ｍは０〜４の間であり、好ましくはｍは１であり、
ｃ．ＹはＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＨ＝ＣＣＨ３であり、
ｄ．ｎは４〜１４の間であり、好ましくはｎは８または１０である］
をＣＤＷ１ｇあたり少なくとも０．５ｍｇ生産する微生物株。
【請求項２】
ａ．セラミドシンターゼ活性を有する酵素および／またはセラミダーゼ活性を有する酵素であって、後者の酵素が式Ｉのスフィンゴイド塩基を含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できる酵素をコードするポリヌクレオチドの発現を増大させるステップ、および／または
ｂ．スフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼ活性を有する酵素および／またはセラミダーゼ活性を有する酵素であって、後者の酵素がスフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンまたはジヒドロスフィンゴシンを含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できる酵素をコードするポリヌクレオチドの発現を低減させるステップ、および
ｃ．請求項１に定義される生産性を有する株を単離するステップ
によって請求項１に記載の微生物株を得る方法。
【請求項３】
ジヒドロセラミドデサチュラーゼ活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチドの発現を増大させるステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項２または３に定義される酵素をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを用いたＤＮＡ媒介の形質転換を含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記セラミドシンターゼ活性を有する酵素が、
ａ．配列番号２および／または配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｂ．配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも４５％、および／または配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｃ．配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｄ．配列番号９のアミノ酸に少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｅ．配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｆ．配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記セラミダーゼ活性を有する酵素であって、該セラミダーゼが、式Ｉのスフィンゴイド塩基を含有するセラミドを選択的にまたはさらには特異的に加水分解できる酵素が、
ｄ．配列番号１５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
ｅ．配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記スフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼ活性を有する酵素が、
ｆ．配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｇ．配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドと
からなる群から選択される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記セラミダーゼ活性を有する酵素であって、該セラミダーゼが、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンもしくはジヒドロスフィンゴシンを含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できる酵素が、
ｈ．配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
ｉ．配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも２５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ジヒドロセラミドデサチュラーゼ活性を有する酵素が、
ｊ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｋ．配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択される、請求項３または４に記載の方法。
【請求項１０】
前記スフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼ活性を有する酵素をコードするか、またはセラミダーゼ活性を有する酵素であって、該セラミダーゼが、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンもしくはジヒドロスフィンゴシンを含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できる酵素をコードするポリヌクレオチドが、真菌または酵母から、好ましくは酵母サッカロミセス・セレヴィジエ、クリュイベロミセス・ラクティス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、ピキア・パストリス、ピキア・シフェリイ、イエロビア・リポリティカ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ユチリスまたはアシュビア・ゴシッピーから、より好ましくは酵母ピキア・シフェリイ、アシュビア・ゴシッピーまたはイエロビア・リポリティカから入手可能である、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記セラミドシンターゼ活性を有する酵素をコードするか、またはジヒドロセラミドデサチュラーゼ活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチドが、ウイルス、真菌、植物または動物から、より好ましくは藻類ウイルス、酵母、または哺乳動物から、最も好ましくはコッコリスウイルス属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、デバリオマイセス属、クリュイベロミセス属、ピキア属、イエロビア属、カンジダ属、アシュビア属、マウス、ラットまたはヒトから入手可能である、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記セラミダーゼ活性を有する酵素であって、該セラミダーゼが、式Ｉのスフィンゴイド塩基を含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できる酵素をコードするポリヌクレオチドが、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒトから入手可能である、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
式Ｉのスフィンゴイド塩基またはその塩もしくはエステルを生産する方法であって、該スフィンゴイド塩基の生産に資する条件下での請求項１に記載の微生物株の発酵と、該発酵ブロスからの該スフィンゴイド塩基の回収とを含む方法。
【請求項１４】
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、からなる群から選択される、セラミドシンターゼ活性を示すポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、からなる群から選択される、スフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼ活性を示すポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、からなる群から選択される、セラミダーゼ活性を示すポリペプチドであって、該セラミダーゼが、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンまたはジヒドロスフィンゴシンを有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
スフィンゴ脂質は、そのメンバーがすべて、フィトスフィンゴシンまたはスフィンゴシンなど、スフィンゴイド塩基に由来するという共通の特徴を有する脂質の一群である。スフィンゴ脂質は、動物、植物、および真菌の細胞膜内に、そして一部の細菌にさえ、しばしば存在する。
【０００２】
セラミドは、脂肪酸とアミド結合しているスフィンゴイド塩基を含有するスフィンゴ脂質の特定の一群である。ヒト皮膚において、セラミドは、コレステロール、コレステロール硫酸、および遊離脂肪酸と共に、水分の保持と、物理的および化学的病毒からの皮膚の防御とに必須な透過障壁を形成する。透過障壁の成分として、これらのセラミドは、ほとんどが皮膚の上層である角質層で見出され、それらは、スフィンゴイド塩基として、スフィンゴシン、フィトスフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン（スフィンガニン）、または６−ヒドロキシスフィンゴシンを含有している。セラミドなどのスフィンゴ脂質を含む組成物の局所適用は、皮膚の障壁機能および水分保持特性を改善する（Ｃｕｒｒａｔｏｌｏ、１９８７年、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．４：２７１−２７７；Ｋｅｒｓｃｈｅｒら、１９９１年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１：３９−４３）。さらに、そのようなスフィンゴイド塩基は、プロテインキナーゼＣの活性を抑制するなど、いくつかの生理作用を媒介することが知られており、したがって、それらが抗炎症活性および抗菌活性を有するため、化粧用または皮膚科用組成物に含まれている。
【０００３】
スフィンゴシンは、ヒトにおけるスフィンゴ脂質の主要スフィンゴイド塩基成分であるので、食品、製薬、および化粧用適用のためのスフィンゴシンおよびスフィンゴシン含有スフィンゴ脂質を生産することは、商業的にかなり興味深い。
【０００４】
現在、スフィンゴシンの化学合成のためのいくつかの経路が開発されている。しかし、２つの立体中心が存在しているため、化学合成の結果、２５％のみが天然存在のＤ−エリスロ−（２Ｒ，３Ｓ）−配置を表すラセミ混合物が生じる。さらに、分子内に３つの官能基が存在するため、広範な保護化学を適用しなければならない。その結果、化学合成を介して生産されたスフィンゴシンは、非常に高価であり、食品および化粧用製剤に組み入れることができない。これは、脳または鶏卵などの天然源から単離された純粋なスフィンゴシンについても当てはまる。動物起源から抽出された異種スフィンゴ脂質調製物も利用可能である。それらは、純化合物より安いが、組成不均一性の問題を有し、病原体を含有しているかもしれないので、潜在的に安全でない。
【０００５】
酵母ピキア・シフェリイなどの微生物（ＷｉｃｋｅｒｈａｍおよびＳｔｏｄｏｌａ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９６０年、８０：４８４−４９１）は、高レベルのスフィンゴイド塩基およびその誘導体を生産するが、それらは主としてＣ１８−フィトスフィンゴシンおよびそのアセチル化誘導体であることが示された。これらは、抽出し、対応するセラミドに化学的に変換することができ、それによって純粋な化粧用成分（例えば国際公開第９３／２００３８号参照）が得られる。しかし、これらの株は、フィトスフィンゴシンまたはその誘導体以外のスフィンゴイド塩基を極わずかな量しか生産しない。
【０００６】
他の酵母でも、式Ｉのスフィンゴイド塩基の生産量は極めて低く、それらは、脂質のグルコシルセラミド画分、すなわち、遊離形態ではなく、長鎖Ｎ−アシル基および糖に結合した形態でのみ見出すことができる。グルコシルセラミドは、酵母で細胞乾燥重量（ＣＤＷ）１ｇあたり０〜１．２ｍｇを構成する（Ｓａｉｔｏら、２００５年）。たとえ、これらのグルコシルセラミド中に存在するすべてのスフィンゴイド塩基が、式Ｉのスフィンゴイド塩基であった場合でも、総質量に対するスフィンゴイド塩基質量の寄与（４０％；Ｋａｕｆｍａｎら、１９７１年）を考慮にいれて、ＣＤＷ１ｇあたり０．５ｍｇしか見出されないであろう。しかし、イエロビア・リポリティカ（Ｒｕｐｃｉｃら、１９９８年、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５０：５８３−５８８）のグルコシルセラミド中に存在しているスフィンゴイド塩基の２５％のみが式Ｉのスフィンゴイド塩基であり、これは、その酵母種では、ＣＤＷ１ｇあたり０．１３ｍｇに相当する。
【０００７】
カンジダ・アルビカンス由来のジヒドロセラミドデサチュラーゼを過剰発現する組換え体サッカロミセス・セレヴィジエΔｓｙｒ２細胞（Ｔｅｒｎｅｓら、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２５５１２−２５５１８）、およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｇａｒｔｏｎら、２００３年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５３８１９２−５３８１９６）では、ジヒドロスフィンゴシンプールの２０％未満がスフィンゴシンに変換された。サッカロミセス・セレヴィジエΔｓｙｒ２細胞は、タンパク質１ｍｇあたり３４６ｐｍｏｌのジヒドロスフィンゴシンを含有する（Ｂａｅら、２００４年）。これは、ＣＤＷの６０％がタンパク質であると仮定して、細胞乾燥重量（ＣＤＷ）１ｇあたり０．２ｍｇのジヒドロスフィンゴシンに相当する。したがって、記載されている組換え体サッカロミセス・セレヴィジエΔｓｙｒ２細胞では、細胞乾燥重量１ｇあたり０．０４ｍｇ未満のスフィンゴシンが見出されている。これは分析されてはいないが、ジヒドロスフィンゴシンからスフィンゴシンを合成する酵素であるジヒドロセラミドデサチュラーゼは、遊離スフィンゴイド塩基ではなく、そのＮ−アシル化形態に作用するので、この微量のスフィンゴシンも、遊離スフィンゴイド塩基としてではなく、長鎖Ｎ−アシル基に結合したもの、すなわちセラミドとして見出される可能性が最も高い。
【０００８】
ジヒドロスフィンゴシンからの遊離スフィンゴシンの生合成は、３つの酵素、すなわちセラミドシンターゼ、ジヒドロセラミドデサチュラーゼ、およびセラミダーゼの連続した作用を必要とする。
【０００９】
セラミドシンターゼは、遊離スフィンゴイド塩基および脂肪アシル−ＣｏＡチオエステルを基質として用い、スフィンゴイド塩基Ｎ−アシルエステルを形成する。セラミドシンターゼは、１サブユニットからなることも（マウスにおいて；ＬａｈｉｒｉおよびＦｕｔｅｒｍａｎ、２００５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：３３７３５−３３７３８）、２サブユニットからなることもある（酵母において；Ｓｃｈｏｒｌｉｎｇら、２００１年、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２：３４１７−３４２７）。Ｓｃｈｏｒｌｉｎｇら、２００１年（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２：３４１７−３４２７）は、セラミドシンターゼ活性を増強し、それによって細胞のセラミド含有量を増大させることを目的とした、サッカロミセス・セレヴィジエにおけるセラミドシンターゼの過剰生産について記載する。両方のサブユニットが過剰生産されたが、セラミドシンターゼ活性の増強も、細胞のセラミド含量の増大も観察できなかった。また、サッカロミセス・セレヴィジエにおける哺乳類セラミドシンターゼの異種過剰発現によっても、スフィンゴ脂質組成物の改変は観察できたが、増大した量のセラミドは生じなかった（Ｇｕｉｌｌａｓら、２００３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３７０８３−３７０９１）。
【００１０】
サッカロミセス・セレヴィジエにおける、数種の生物に由来する酵素ジヒドロセラミドデサチュラーゼの異種過剰生産（Ｔｅｒｎｅｓら、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２５５１２−２５５１８；Ｇａｒｔｏｎら、２００３年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５３８１９２−５３８１９６）は、微量のスフィンゴシンの形成をもたらした。しかし、前駆体分子、すなわちスフィンゴイド塩基ジヒドロスフィンゴシンの大部分（＞８０％）は変換されなかった。
【００１１】
サッカロミセス・セレヴィジエの２つのセラミダーゼ、すなわちＹｐｃ１およびＹｄｃ１の過剰発現（Ｍａｏら、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：６８７６−６８８４、およびＭａｏら、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３１３６９−３１３７８）も、スフィンゴシンの増産をもたらさなかった。式Ｉのスフィンゴイド塩基を有するセラミドを特異的または選択的に加水分解するマウスセラミダーゼの、ヒト細胞系における発現および／または酵素活性レベルの増大は、１．５倍のみのスフィンゴシンレベルの増大をもたらした（Ｍａｏら、２００３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３１１８４−３１１９１）。このマウスセラミダーゼを発現する酵母変異体のミクロソームを、外因的に添加された様々な基質と接触させることによって、このセラミダーゼの基質特異性をさらに調査した。したがって、上記セラミダーゼの過剰生産における、スフィンゴシンレベルの増大に関するデータは、専ら、ヒト細胞系実験からのものである。サッカロミセス・セレヴィジエとは対照的に、クリュイベロミセス・ラクティス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、ピキア・パストリス、ピキア・シフェリイ、イエロビア・リポリティカ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ユチリス、デバリオマイセス・ハンセニイ、およびアシュビア・ゴシッピーなど、他のほとんどの酵母種は、単一のセラミダーゼのみしか含有しない。この酵素の特徴および生理学役割は知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ここで、驚くべきことに、セラミドシンターゼおよび／またはセラミダーゼおよび／またはスフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼの発現および／または酵素活性レベルを改変することによって、式Ｉのスフィンゴイド塩基の生産性が改善されている株を作出できることを示す。これらの改変には、ジヒドロセラミドデサチュラーゼの発現および／または酵素活性レベルの改変が伴うことが好ましい。本発明は、フィトスフィンゴシンおよびジヒドロスフィンゴシン以外のスフィンゴイド塩基、とりわけスフィンゴシンを生産できる遺伝的に操作された微生物株の調製を可能にする。
【００１３】
本発明は、それらのスフィンゴイド塩基を含有する複合スフィンゴ脂質、とりわけセラミド、セレブロシド、ガングリオシド、およびイノシトールホスホリルセラミドを、当技術分野で知られているそれらの微生物株より効率的に生産できる遺伝的に操作された微生物株の調製も容易にする。例えば、増強されたセラミドシンターゼを示すように改変されており、さらに増強されたジヒドロセラミドデサチュラーゼを示すように改変されていてもよい遺伝的に操作された微生物株を、そのような複合スフィンゴ脂質の生産に用いてもよい。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、第１の態様では、本発明は、式Ｉ
【００１５】
【化１】
2009536521.tif 000002
のスフィンゴイド塩基またはその塩もしくはエステル
［式中、ＲはＸ−（ＣＨ２）ｍ−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３であり、
ａ）ＸはＣＨ２またはＣＨＯＨであり、
ｂ）ｍは０と４との間であり、最も好ましくはｍは１であり、
ｃ）ＹはＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＨ＝ＣＣＨ３であり、
ｄ）ｎは４と１４との間であり、好ましくはｎは８または１０である］
をＣＤＷ１ｇあたり少なくとも０．５ｍｇ生産する、微生物株、とりわけ酵母株を提供する。
【００１６】
本発明の微生物株は、好ましくは、式Ｉのスフィンゴイド塩基をＣＤＷ１ｇあたり少なくとも５ｍｇ生産し、より好ましくは、ＣＤＷ１ｇあたり少なくとも５０ｍｇ生産し、さらにより好ましくは、ＣＤＷ１ｇあたり少なくとも５００ｍｇ生産する。
【００１７】
本発明の微生物株のスフィンゴイド塩基の生産性および組成は、上記スフィンゴイド塩基を生産する微生物株が以下の条件下で培養され、その結果、定常期培養がもたらされているときに測定することが好ましい。微生物細胞を、寒天プレートから５００ｍｌのバッフル付き振とうフラスコ内にある１００ｍｌのＹＥＰＤ培地中に接種し、３０℃および２８０ｒｐｍで７２時間インキュベートする。次に、この培養物の１％を、ＬＣＢＮＢ生産培地１００ｍｌで満たされた新たな５００ｍｌバッフル付き振とうフラスコに移し、３０℃および２８０ｒｐｍで２４〜９６時間インキュベートする。別法では、主培養を、ＭＭ培地１００ｍｌで満たされた５００ｍｌバッフル付き振とうフラスコ内で行い、３０℃および１２０ｒｐｍで２４〜９６時間インキュベートする。
【００１８】
ＨＰＬＣを用いたアセチル化スフィンゴイド塩基（例えば、フィトスフィンゴシン、スフィンゴシン、およびスフィンガニンなどの長鎖塩基）の測定には、総培養ブロス１ｍｌをファルコンチューブ内のアセトン４ｍｌと混合した。脂質を抽出するために、このチューブを１分間あたり２５０回転で１０分間混合した。この溶液を５３００ｇで１０分間、遠心処理した。１０μｌをＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムに注入した。これらの試料はカラム温度３０℃で分析した。移動相は０．０５％ＴＦＡを含有する水／アセトニトリル（１０：９０）からなっていた。流速は１ｍｌ／分であり、ＵＶ検出は２００ｎｍであった。
【００１９】
別の実施形態では、式Ｉのスフィンゴイド塩基がアシルエステルの形態にある。上記アシル基は、スフィンゴイド塩基に、ヒドロキシル基を介して、すなわち「本当」のエステル結合を介して結合していてもよい。好ましくは、エステル結合を介してスフィンゴイド塩基に結合しているアシル基は、１〜４個の炭素原子の直鎖状短鎖アシル基、より好ましくはアセチル基である。別法では、アシル基は、スフィンゴイド塩基に、アミノ基を介して、すなわちアミド結合を介して結合していてもよい。好ましくは、アミド結合を介してスフィンゴイド塩基に結合しているアシル基は、１〜４個の炭素原子の直鎖状短鎖アシル基、より好ましくはアセチル基である。
【００２０】
好ましい実施形態では、式Ｉのスフィンゴイド塩基は、式ＩＩ
【００２１】
【化２】
2009536521.tif 000003
のＤ−エリスロ−（２Ｒ，３Ｓ）−配置を有し、式中、Ｒは式Ｉに関して定義されている通りである。
【００２２】
式ＩＩの化合物であって、式中、Ｒが（ＣＨ２）１２−ＣＨ３、ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）１１−ＣＨ３、（ＣＨ２）１４−ＣＨ３、またはＣＨＯＨ−（ＣＨ２）１３−ＣＨ３である化合物が特に好ましい。
【００２３】
上記微生物株は、好ましくは酵母であり、より好ましくはピキア属またはアシュビア属の酵母、最も好ましくはピキア・シフェリイ（Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ）種またはアシュビア・ゴシッピー（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｐｉｉ）種の酵母である。
【００２４】
第２の態様では、本発明は、遺伝的操作による、第１の態様の微生物株を構築する方法を提供する。
【００２５】
親生物の遺伝的操作によるスフィンゴ脂質代謝経路の操作は、以下の通り、様々な方法で行うことができる。例えば、代謝経路の１つまたは複数の酵素の細胞レベルを改変すること、すなわち増強または低減すること。細胞レベルの低減は、例えば、対象とする酵素をコードする遺伝子の標的不活性化によって実現されうる。追加または別法として、宿主生物に天然に存在するスフィンゴ脂質生合成酵素の濃度を増強すること。最後に、アミノ酸配列および／または基質特異性が親生物で天然に見出されるものと異なっているスフィンゴ脂質生合成酵素を導入すること。
【００２６】
より正確には、本発明は、細胞内ジヒドロスフィンゴシンから遊離スフィンゴシン、場合によりアセチル化スフィンゴシンに向かう流動の増大が得られるようなセラミドシンターゼ活性の改変を企図しており、これをジヒドロセラミドデサチュラーゼの改変と組み合わせてもよく、セラミダーゼの改変と組み合わせてもよく、スフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼの改変と組み合わせてもよい。
【００２７】
さらに、本発明は、細胞内ジヒドロスフィンゴシンから遊離スフィンゴシン、場合によりアセチル化スフィンゴシンに向かう流動の増大が得られるようなセラミダーゼ活性の改変を企図しており、これをジヒドロセラミドデサチュラーゼの改変と組み合わせてもよく、セラミドシンターゼの改変と組み合わせてもよく、スフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼの改変と組み合わせてもよい。
【００２８】
また、本発明は、細胞内ジヒドロスフィンゴシンから遊離スフィンゴシン、場合によりアセチル化スフィンゴシンに向かう流動の増大が得られるようなスフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼ活性の改変を企図しており、これをジヒドロセラミドデサチュラーゼの改変と組み合わせてもよく、セラミドシンターゼの改変と組み合わせてもよく、セラミダーゼの改変と組み合わせてもよい。
【００２９】
一実施形態では、セラミドシンターゼおよび／またはセラミダーゼならびに場合によりジヒドロセラミドデサチュラーゼの、発現および／または酵素活性レベルの増大によって引き起こされた、親株と比較して式Ｉのスフィンゴイド塩基の生産性が改善されている、すなわちＣＤＷ１ｇあたり少なくとも０．５ｍｇの生産性を示す微生物株を作出するのに遺伝的操作を用いる。詳細には、これらの株は、セラミドシンターゼおよび／またはセラミダーゼをコードするポリヌクレオチドの発現の増大を示す。上記微生物株は、ジヒドロセラミドデサチュラーゼをコードするポリヌクレオチドの発現の増大を示すようにさらに改変されてもよい。
【００３０】
そのような遺伝的操作で使用されるべきセラミドシンターゼは、セラミドをその成分、例えばスフィンゴイド塩基成分、とりわけジヒドロスフィンゴシンと、長鎖アシル基成分、とりわけ脂肪酸または脂肪アシル補酵素Ａチオエステルとから合成できるものであるべきである。
【００３１】
上記セラミドシンターゼは、
ａ．配列番号２および／または配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｂ．配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも４５％、および／または配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｃ．配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｄ．配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｅ．配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
ｆ．配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択されることが好ましい。
【００３２】
好ましくは、配列番号２、配列番号４、配列番号９、および／または配列番号１０のアミノ酸配列に対する配列同一性が５０％であり、より好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％である。
【００３３】
配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも４５％の配列同一性、または配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも４５％の配列同一性を有するセラミドシンターゼの例は、配列番号１２または配列番号１４のアミノ酸配列を有するセラミドシンターゼである。
【００３４】
セラミドシンターゼは、極めて多岐にわたるアミノ酸配列を有するポリペプチドによって代表され、１５％もの低い同一性の程度を示す。したがって、本発明での使用に適したセラミドシンターゼは、ウイルス、真菌、植物、または動物などの多岐にわたる供給源から、より好ましくは藻類ウイルス、酵母、または哺乳動物から、最も好ましくはコッコリスウイルス、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、デバリオマイセス、クリュイベロミセス、ピキア、イエロビア、カンジダ、アシュビア、マウス、ラットまたはヒトから入手可能でありうる。
【００３５】
驚くべきことに、微細藻類エミリアナ・ハクスレイに感染するコッコリスウイルスによってコードされたセラミドシンターゼが、式Ｉのスフィンゴイド塩基の発酵生産に特に適していることが判明した。
【００３６】
セラミダーゼの発現および／または酵素活性レベルの増大が提供される実施形態では、問題のセラミダーゼは、式Ｉのスフィンゴイド塩基を含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できるものであるべきである。
【００３７】
式Ｉのスフィンゴイド塩基を含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できる好ましいセラミダーゼは、
１．配列番号１５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
２．配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択される。
【００３８】
そのようなセラミダーゼは、好ましくは動物起源から、より好ましくはマウス、ラット、またはヒトなどの哺乳動物から入手可能である。
【００３９】
そのような遺伝的操作で使用されるべきジヒドロセラミドデサチュラーゼは、セラミド中、とりわけジヒドロセラミド中に存在するスフィンゴイド塩基、とりわけジヒドロスフィンゴシンの、Ｃ−４とＣ−５との間の結合を不飽和化できるものであるべきである。そのようなジヒドロセラミドデサチュラーゼは、スフィンゴ脂質Δ４デサチュラーゼとしても知られている。
【００４０】
上記スフィンゴイド塩基のＣ−４とＣ−５との間の結合を不飽和化できる好ましいジヒドロセラミドデサチュラーゼは、
ａ．配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
ｂ．配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択される。
【００４１】
配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有するジヒドロセラミドデサチュラーゼの例は、配列番号１６、配列番号１８、または配列番号１９のアミノ酸配列を有するジヒドロセラミドデサチュラーゼである。
【００４２】
そのようなジヒドロセラミドデサチュラーゼは、ウイルス、真菌、植物または動物から、好ましくは藻類ウイルス、酵母、または哺乳動物から、より好ましくはコッコリスウイルス、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、デバリオマイセス、クリュイベロミセス、ピキア、イエロビア、カンジダ、アシュビア、マウス、ラットまたはヒトから入手可能でありうる。
【００４３】
本発明の別の実施形態では、スフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼおよび／またはセラミダーゼの、発現の低減および／または酵素活性レベルの低減、および／または細胞内局在の変化によって、とりわけスフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼおよび／またはセラミダーゼをコードしているポリヌクレオチドの発現の低減によって、引き起こされた、親株と比較して式Ｉのスフィンゴイド塩基の改善されている生産性を示す微生物株を作出するのに遺伝的操作を用いる。
【００４４】
そのような遺伝的操作で使用されるべきスフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼは、上記スフィンゴイド塩基のＣ−８とＣ−９との間の結合を不飽和化できるものであるべきである。
【００４５】
好ましいスフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼは、
ａ．配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
ｂ．配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択される。
【００４６】
配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の配列同一性を有するスフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼの例は、配列番号２１のアミノ酸配列を有するスフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼである。
【００４７】
そのようなスフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼは、真菌から、好ましくは酵母から、より好ましくは酵母サッカロミセス・セレヴィジエ、クリュイベロミセス・ラクティス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、ピキア・パストリス、ピキア・シフェリイ、イエロビア・リポリティカ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ユチリスまたはアシュビア・ゴシッピーから、最も好ましくは酵母ピキア・シフェリイ、アシュビア・ゴシッピーまたはイエロビア・リポリティカから入手可能でありうる。
【００４８】
セラミダーゼの発現および／または酵素活性レベルの低減が提供される実施形態では、問題のセラミダーゼは、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンまたはジヒドロスフィンゴシンを含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できるものであるべきである。
【００４９】
スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンまたはジヒドロスフィンゴシンを含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できる好ましいセラミダーゼは、
ａ．配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
ｂ．配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択される。
【００５０】
そのようなセラミダーゼは、真菌から、好ましくは酵母から、より好ましくは酵母サッカロミセス・セレヴィジエ、クリュイベロミセス・ラクティス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、ピキア・パストリス、ピキア・シフェリイ、イエロビア・リポリティカ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ユチリスまたはアシュビア・ゴシッピーから、最も好ましくは酵母ピキア・シフェリイ、アシュビア・ゴシッピーまたはイエロビア・リポリティカから入手可能でありうる。
【００５１】
好ましい実施形態では、上記に特定した関連酵素の発現レベルの増大を、上記に特定した他の関連酵素の発現レベルの低減と組み合わせた微生物株を構築する。
【００５２】
上記実施形態では、参照配列に関して下記に言及する分析を行うことによって、参照アミノ酸配列に対する特定のアミノ酸配列の同一性パーセントを決定する。
【００５３】
本発明の状況において、遺伝的に操作された株におけるスフィンゴイド塩基の改善された生産性には、それによって、遺伝的に操作された株が由来した親株の生産性と比較した、スフィンゴイド塩基の生産性の増大、および／または親株によって実質的に生産されないか、または全く生産されないスフィンゴイド塩基の生産が含まれる。
【００５４】
本発明の状況において、必要な同一性パーセントを実現するアミノ酸配列を有するポリペプチド、いわゆる相同ポリペプチドは、問題の参照アミノ酸配列を用いて、適当な配列データベースをスクリーニングすることによって好都合に同定できる。相同ポリペプチドは、参照ポリペプチドから、このポリペプチドに変異誘発を行うことによって得ることもできる。問題のポリペプチドをコードする遺伝子に適用するのに適した変異誘発技法には、ランダム変異誘発（例えば、エラープローンＰＣＲ）、部位特異的変異誘発、および／または遺伝子シャフリングが含まれる。例えば、変異誘発を用いて、セラミドシンターゼポリペプチド、式Ｉのスフィンゴイド塩基を含有するセラミドを加水分解するセラミダーゼポリペプチドまたはジヒドロセラミドデサチュラーゼポリペプチドであって、野生型ポリペプチドよりもそれらの基質に関して高い親和性を有するポリペプチドおよび／または高い特異的酵素活性を有するポリペプチドおよび／または改変された基質特異性を有するポリペプチド（例えばスフィンゴイド塩基のアルキル鎖の長さに関して、もしくはスフィンゴイド塩基それ自体に関して）を得ることができる。また、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンもしくはジヒドロスフィンゴシンを含有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解できるセラミダーゼポリペプチド、またはそれらの基質に関して野生型ポリペプチドより低い親和性および／または低い特異的酵素活性を有するスフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼポリペプチドを得るためにも、変異誘発を用いることができる。
【００５５】
対象とする酵素の発現の増大を得るための、本発明の微生物株の遺伝的操作は、前記酵素をコードする内在性遺伝子、すなわち親株に元々コードされているものを過剰発現すること（相同過剰発現）によって、または親株に天然には存在しない遺伝子を発現すること（異種（過剰）発現）によって行ってもよい。１コピーまたは数コピーの上記遺伝子を親株の染色体内に組み入れることによって、親株の染色体の複製から独立した自律的複製ができるＤＮＡエレメント上に１コピーまたは数コピーの上記遺伝子を提供することによって、対象とする酵素をコードする遺伝子の相同および異種（過剰）発現の両方を得ることができる。そのような自律的複製を行うＤＮＡエレメントは、プラスミド、人工染色体、またはウイルスでありうるであろう。
【００５６】
本発明の状況において、対象とする酵素の活性の低減には、親株に天然に存在し、かつ対象とする酵素をコードする遺伝子の発現の低減が含まれる。そのような遺伝子の発現の低減は、対象とする酵素をコードする遺伝子の、ヌクレオチド配列の部分の欠失、および／または全ヌクレオチド配列の欠失、および／またはヌクレオチド配列の破壊を含む、遺伝的手段による上記遺伝子の標的不活性化によって引き起こすことができるであろう。別法または追加として、酵素をコードする遺伝子の発現調節の原因となるヌクレオチド配列、プロセシング、特異的細胞区画への輸送、およびメッセンジャーＲＮＡの翻訳の原因となるヌクレオチド配列を、対象とする酵素の活性を低減させるために、破壊、欠失、または改変することができる。さらに別の実施形態では、対象とする酵素をコードするヌクレオチド配列に由来するｍＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとのハイブリットの分解を誘導するために、またはこれらの酵素をコードするヌクレオチド配列に由来するｍＲＮＡの翻訳を阻害するために、これらの酵素をコードする遺伝子の部分または遺伝子全体に相当するヌクレオチド配列からアンチセンスＲＮＡを発現させることができる。
【００５７】
本発明の状況において、親株は、式Ｉのスフィンゴイド塩基を生産しない株であってもよい。親株は、式Ｉのスフィンゴイド塩基を生産するが、ＣＤＷ１ｇあたり０．５ｍｇ未満である微生物株であってもよい。
【００５８】
親株は、式Ｉのスフィンゴイド塩基から除外されるスフィンゴイド塩基をかなりの量で生産する株であってもよく、それらは、好ましくはピキア・シフェリイＮＲＲＬ  Ｙ−１０３１  Ｆ−６０−１０、および／または国際公開第９５／１２６８３号に開示されている任意のピキア・シフェリイ株などであり、これらはすべて、主としてＣ１８−フィトスフィンゴシンを生産する。
【００５９】
本発明で親株として使用するのに特に適した株は、ジヒドロスフィンゴシンをフィトスフィンゴシンに変換する酵素であるジヒドロスフィンゴシンＣ−４ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子に欠損を有する株であり、とりわけスフィンゴイド塩基であるフィトスフィンゴシンを多量に生産する株に由来するジヒドロスフィンゴシンＣ−４ヒドロキシラーゼ欠損株である。ジヒドロスフィンゴシンＣ−４ヒドロキシラーゼ欠損株は、対象とする株を、毒素であるシリンゴマイシンＥに暴露し、シリンゴマイシンＥ耐性株を選択することによって得てもよい（Ｇｒｉｌｌｅｙら（１９９８年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３、１１０６２−１１０６８）。これらの株には、スフィンガニンヒドロキシラーゼに欠損を有する株（Δｓｙｒ２株）も含まれる。別法では、ジヒドロスフィンゴシンＣ−４ヒドロキシラーゼを欠失した株を、遺伝的方法を用いた欠失または破壊によるＳＹＲ２遺伝子の標的不活性化によって得ることができる。
【００６０】
例えば、親株として使用するのに適しているのは、ピキア・シフェリイをシリンゴマイシンＥ選択にかけることによって入手可能な、ピキア・シフェリイのｓｙｒ２変異体である（予定より早い公開がされなかった国際公開第２００６／０４８４５８号を参照）。
【００６１】
本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、それらが発現されることになっている微生物株のコドン使用頻度に適合させてもよい。コドン使用頻度表は、データベース、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／などのデータベースで好都合に見出すことができる。
【００６２】
本明細書に記載のポリヌクレオチドを挿入するベクターは、組換えＤＮＡ手順を好都合に行うことのできるいかなるベクターでもよく、ベクターのこの選択は、それが導入されることになっている宿主細胞にしばしば依存するであろう。したがって、上記ベクターは、通常、複製開始点を備えた、自律的複製を行うベクター、すなわち、染色体外の実体として存在し、その複製が染色体複製から独立しているベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、またはファージベクターでありうる。別法では、上記ベクターは、宿主細胞に導入された際に、宿主細胞ゲノム内に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものでもよい。上記ベクターは、環状、例えばプラスミドでも、直鎖状、例えば発現カセットでもよい。
【００６３】
組込みベクター（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｖｅｃｔｏｒ）は、ランダムに組み込まれても、宿主細胞の染色体の所定の標的遺伝子座に組み込まれてもよい。標的組込みには、組込みベクターは、宿主細胞のゲノム内の所定の標的遺伝子座のＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ断片を含む。標的組込みを促進するために、宿主細胞の形質転換の前に、ベクターを直線化することが好ましい。直線化は、クローニングベクターの少なくとも一端に、好ましくはいずれの末端にも、標的遺伝子座に相同な配列が隣接するように行うことが好ましい。標的遺伝子座に隣接する相同配列の長さは、好ましくは少なくとも０．１ｋｂ、より好ましくは少なくとも０．２ｋｂ、さらに好ましくは少なくとも０．５ｋｂ、さらに好ましくは少なくとも１ｋｂ、最も好ましくは少なくとも２ｋｂである。相同配列は、標的遺伝子座に厳密に同一である必要はない。必要な同一性の程度は、したがって、相同配列の長さに依存しうる。典型的には、同一性パーセントは、少なくとも約８０％である。
【００６４】
本発明の遺伝的操作で使用するべきポリヌクレオチドの意図されている使用に応じて、遺伝子の発現が目標とされている場合には発現カセット内に、遺伝子の不活性化が目標とされている場合には不活性化カセット内に、上記ポリヌクレオチドを挿入することができる。
【００６５】
発現カセット内では、宿主細胞によるコード配列からのポリペプチドの発現を提供できる調節配列に、コード配列が作動可能に連結している。「作動可能に連結している」という用語は、記述されているコンポーネントがそれらの意図された様式で機能するのを可能にする関係にある近接した並置を指す。コード配列に「作動可能に連結している」プロモーター、エンハンサー、または別の発現調節シグナルなどの調節配列は、上記調節配列と適合した条件下で、そのコード配列からのポリペプチドの発現が実現されるような様式で配置されている。
【００６６】
不活性化カセットは、不活性化しようとする遺伝子内にそれが標的組み込みできるような様式で構築される。不活性化カセットは、典型的には、不活性化される遺伝子の非機能性の対応物を含む。そのような非機能性対応物は、標的組込みによって、天然コード配列が、欠損を有するコード配列で置換される結果となるように、問題の遺伝子のコード配列の部分またはすべてが欠失しているポリヌクレオチドでありうる。遺伝子不活性化に使用されるポリヌクレオチド配列は、不活性化される遺伝子を含む標的配列に対して少なくとも約８０％同一であるべきである。
【００６７】
第３の態様では、セラミドシンターゼ活性、スフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼ活性、またはセラミダーゼ活性を示す新規なポリペプチドを提供する。
【００６８】
一実施形態では、セラミドシンターゼ活性を示すポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群から選択されたポリペプチド；ならびに／または、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群から選択されたポリペプチドを提供する。上記ポリペプチドは、好ましくはピキア属から、より好ましくはピキア・シフェリイから入手可能である。
【００６９】
さらに別の実施形態では、スフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼ活性を示すポリペプチドであって、配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとからなる群から選択されたポリペプチドを提供する。上記ポリペプチドは、好ましくはピキア属から、より好ましくはピキア・シフェリイから入手可能である。
【００７０】
さらに別の実施形態では、配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとからなる群から選択された、セラミダーゼ活性を示すポリペプチドであって、前記セラミダーゼが、スフィンゴイド塩基としてフィトスフィンゴシンまたはジヒドロスフィンゴシンを有するセラミドを選択的またはさらには特異的に加水分解するポリペプチドを提供する。上記ポリペプチドは、好ましくはピキア属から、より好ましくはピキア・シフェリイから入手可能である。
【００７１】
「相同性」または「同一性パーセント」という用語は、本明細書では同義的に使用される。本発明の目的では、２つのアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するために、比較目的に最適となるように上記配列のアラインメントを行う（例えば、最適のアラインメントのために各配列にギャップを導入することができる）ものと、本明細書では定義する。その後、対応するアミノ酸位置のアミノ酸残基を比較する。第１の配列中のある位置が、第２の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基によって占められている場合、その分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列によって共有されている同一である位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一である位置の数／位置の総数（すなわち、ギャップを含めた重なり合っている位置）×１００）。２つの配列は、同じ長さであることが好ましい。
【００７２】
当業者ならば、２つの配列間の相同性を決定するのに、いくつかの異なったコンピュータ・プログラムが利用可能であるという事実に気付くであろう。例えば、配列の比較、および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて実現できる。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを、Ａｃｃｅｌｒｙｓ社ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｃｇで利用可能）に入っているＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０年））のアルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかと、１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ・ウェイトおよび０．５、１、２、３、４、５、または６の長さウェイトとを用いて決定する。当業者ならば、これらのすべての異なったパラメータがわずかに異なった結果を生むであろうこと、しかし、異なったアルゴリズムを用いた場合でも、２つの配列の総合的な同一性パーセントは有意に改変されないことを理解するであろう。上記マトリックスは、１０．０のギャップ・ウェイトおよび０．５の長さウェイトを用いたＢｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスであることが好ましい。
【００７３】
本発明のタンパク質配列は、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために、公共データベースに対して検索を行うための「クエリー配列」としてさらに使用できる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のｂｌａｓｔｐ、ｐｓｉ−ｂｌａｓｔ、ｐｈｉ−ｂｌａｓｔ、およびｔｂｌａｓｔｎプログラム（バージョン２．０）を用いて実行できる。ｂｌａｓｔｐ、ｐｓｉ−ｂｌａｓｔ、ｐｈｉ−ｂｌａｓｔ、およびｔｂｌａｓｔｎプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ｂｌａｓｔｐ、ｐｓｉ−ｂｌａｓｔ、ｐｈｉ−ｂｌａｓｔ、およびｔｂｌａｓｔｎプログラム）のデフォルト・パラメータを用いることができる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおける全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のホームページを参照のこと。
【００７４】
参照アミノ酸配列に対して同一性パーセントを示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを相同ポリペプチドと呼ぶ。相同ポリペプチドは、他の生物、とりわけ酵母または動物から入手可能な天然存在の変種であってもよく、操作された変種であってもよい。
【００７５】
第４の態様では、第３の態様のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。上記ポリヌクレオチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、および／または配列番号８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むものでありうる。例えば、それぞれ、配列番号２、配列番号４、配列番号６、および配列番号８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７である。宿主生物のコドン使用頻度に関して、上記ヌクレオチド配列を最適化することが有利となりうる。そのような最適化されたヌクレオチド配列の例は、配列番号１５のアミノ酸配列を有するアルカリ性セラミダーゼをコードする配列番号３２、配列番号９のアミノ酸配列を有するセラミドシンターゼをコードする配列番号３３、および配列番号１０のアミノ酸配列を有するセラミドシンターゼをコードする配列番号３４に提供されている。
【００７６】
別の態様では、本発明は、本発明の第２の態様の方法で入手可能である、本発明の第１の態様による微生物細胞、および／または本発明の第４の態様によるポリヌクレオチド（例えば、上述した発現カセットおよび／または不活性化カセット内にクローニングされている）で形質転換された宿主細胞を、スフィンゴイド塩基、および必要な場合、本発明に従って使用されるポリペプチドの発現を提供する条件下で培養し、場合によりスフィンゴイド塩基を回収することによって、式Ｉのスフィンゴイド塩基を製造する方法を提供する。
【００７７】
本発明の細胞は、当技術分野で知られている手順を用いて培養できる。プロモーターと宿主細胞との組合せそれぞれについて、本発明のポリペプチドの発現に資する培養条件が利用可能である。所望の細胞密度に達した後、培養を停止し、本発明のポリペプチドまたはスフィンゴイド塩基を、既知な手順を用いて回収する。
【００７８】
発酵培地は、炭素源（例えば、グルコース、マルトース、糖蜜）、窒素源（例えば、アンモニア、硫安、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、有機窒素源、例えば、酵母抽出物、麦芽エキス、ペプトン）および他の無機栄養源（例えば、リン酸、マグネシウム、カリウム、亜鉛、鉄など）を含有する既知な培養培地を含んでよい。場合により誘導因子を含んでもよい。
【００７９】
適切な培地の選択は、発現宿主の選択に基づいたもの、および／または発現コンストラクトに関する規制の要件に基づいたもの、および／または本発明によるスフィンゴイド塩基の最適な生産に関連した要件に基づいたものでありうる。そのような培地は、当業者には既知である。
【００８０】
発酵は、０．５〜３０日の期間にわたって行うことができる。それはバッチ培養法でも、連続培養法でも、流加培養法でもよく、０〜４５℃の範囲の温度、および例えばｐＨ２〜１０の間が適している。好ましい発酵条件は、２０〜３７℃の範囲の温度および／またはｐＨ３〜９の間である。通常、適切な状態は、発現宿主および発現されるタンパク質の選択に基づいて選択される。
【００８１】
発酵の後、必要な場合には、遠心法または濾過によって発酵ブロスから細胞を除去することができる。本発明のスフィンゴイド塩基は、その後、細胞および／または発酵ブロスから回収でき、望ましい場合には、従来の手段によって精製および単離できる。
【００８２】
本発明は、発酵過程中における、活性セラミドシンターゼポリペプチドの細胞内濃度を増大させることによって、式Ｉのスフィンゴイド塩基、またはその塩もしくはエステルの完全発酵生産を有意に改善できることを有利に示す。詳細には、活性セラミドシンターゼポリペプチドの細胞内濃度を増大させることによって、または宿主にとって（アミノ酸配列に関して）新規なセラミドシンターゼ活性を有する酵素を発酵過程中に生産することによって、スフィンゴシンまたはその塩もしくはエステルの発酵生産が有意に改善されることを示す。
【００８３】
好都合には、スフィンゴイド塩基組成物を生産するために、本発明のスフィンゴイド塩基を、適した賦形剤と混合することができる。
【００８４】
本発明のスフィンゴイド塩基は、他のスフィンゴイド塩基、またはセラミド、ガングリオシド、またはセレブロシドなどのスフィンゴ脂質を調製するための出発物質として使用できる。
【実施例】
【００８５】
実施例１
（アシュビア・ゴシッピー酵素Ｌａｆ１ｐおよびＤｅｓ１ｐ、またはＬａｑ１ｐおよびＤｅｓ１ｐをそれぞれ同時に過剰生産するアシュビア・ゴシッピーｓｙｒ２変異体の構築）
アシュビア・ゴシッピーＳＹＲ２遺伝子をｋａｎＭＸ耐性遺伝子で置換して、それによって不活性化するように、プラスミドｐＵＧ６−ＡｇＳＵＲ２：：ｋａｎＭＸを設計した。アシュビア・ゴシッピーＤＥＳ１、およびＬＡＧ１またはＬＡＦ１をそれぞれ同時に過剰発現させるために、プラスミドｐＡＧ−ＬＡＧ１−１またはｐＡＧ−ＬＡＦ１−１を設計した。機能的に特徴付けされている、ＳＵＲ２／ＳＹＲ２（Ｇｒｉｌｌｅｙら、１９９８年；ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＣ＿００１１３６．７）という名の、サッカロミセス・セレヴィジエのスフィンガニンＣ４−ヒドロキシラーゼを鋳型として用いて、アシュビア・ゲノム・データベース（Ａｓｈｂｙａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）（ｈｔｔｐ：／／ａｓｈｂｙａ．ｇｅｎｏｍｅ．ｄｕｋｅ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ．ｈｔｍｌ／）に対してＢＬＡＳＴＰ検索を行うことによって、アシュビア・ゴシッピーＳＹＲ２配列を得た。この結果、アシュビア・ゴシッピー遺伝子ＡＡＬ０６６Ｗ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＡＡＳ５０３００；染色体Ｉの２３２３１０〜２３３３２６位に位置）に、４０９ビットのスコアで有意な一致が得られた（それぞれ６２％および７８％の位置同一性および類似性）。アシュビア・ゴシッピーＡＴＣＣ１９８９５細胞を鋳型として用いたコロニーＰＣＲによって、アシュビア・ゴシッピーＳＹＲ２コード配列の下流領域を増幅し、その後ｐＵＧ６（ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ社、独国オーバーウルゼル（Ｏｂｅｒｕｒｓｅｌ）所在）にクローニングするために、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（独国エーバースベルク（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ）所在）が以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
ＡｇＳＵＲ２Ｔ−ｆｗ：
TAT ATA GTT AAC AGG CAA AGC TGA CGC TGC TCT CC（配列番号２３中のｎｔ１７１９−１７４１；ＨｐａＩ認識部位を含む）
ＡｇＳＵＲ２Ｔ−ｒｖ：
TAT ATA ACT AGT ATG GAC GCT GCA GTG CAG AAC C（配列番号２３中のｎｔ２５００−２５２１；ＳｐｅＩ認識部位を含む）
【００８６】
上記オリゴヌクレオチドは、製造元の説明書に従ってＰｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックス（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ社、カタログ＃Ｆ−５３１Ｌ）とともに、Ｉｎｎｉｓら（「ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９０年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社）によるＰＣＲ反応をセットアップするのに用いた。この方法を適用することによって、８１５ｂｐの断片を入手できた。製造元の説明書に従ってＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キット（Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（ＱｌＡＧＥＮ社、カタログ＃２８６０６）を用いて、この断片を精製した。その後、これをＨｐａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｒ０１３８Ｌ）およびＳｐｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｒ０１５１Ｓ）で２時間消化し、製造元の説明書に従ってＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｍ０２０２Ｌ）を用いて、ＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｒ０１９５Ｌ）およびＳｐｅＩで切断されたｐＵＧ６とライゲートした。２．５μｌのライゲーション産物を用いて、製造元のプロトコルに従って化学的コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０、カタログ＃Ｃ４０４０−０３）を形質転換した。これによって、プラスミドｐＵＧ６−ＡｇＳＵＲ２−Ｔ（４８０６ｂｐ）を取得した。ｐＵＧ６に同様にクローニングするための上流領域を増幅するために、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。ＡｇＳＵＲ２Ｐ−ｆｗ２：
TAT ATA CAG CTG CGT CTG TAC CAG AAC CTG TGC（配列番号２３中のｎｔ１−２１；ＰｖｕＩＩ認識部位を含む）
ＡｇＳＵＲ２Ｐ−ｒｖ２：
TAT ATA GTC GAC CTA CGT CAT CCA TGA ACG ACA CT（配列番号２３中のｎｔ８００−８２１；ＳａｌＩ認識部位を含む）
【００８７】
Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックス、およびアシュビア・ゴシッピーＡＴＣＣ１９８９５細胞を鋳型として用いたコロニーＰＣＲ反応をセットアップするのに、上記オリゴヌクレオチドを用いた。この方法を適用することによって、８４０ｂｐの断片を入手できた。ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いて、この断片を精製した。その後、これをＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｒ０１３８Ｌ）およびＰｖｕＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｒ０１５１Ｓ）で２時間消化し、上述の通り、ＳａｌＩおよびＰｖｕＩＩで切断されたｐＵＧ６−ＡｇＳＵＲ２−Ｔとライゲートし、図１に示すプラスミドｐＵＧ６−ＡｇＳＵＲ２：：ｋａｎＭＸ（５５３７ｂｐ）を構築した。このプラスミドは、アシュビア・ゴシッピー内に形質転換された後、ｋａｎＭＸによってアシュビア・ゴシッピーＳＹＲ２を置換し、それによってＳＹＲ２を不活性化するのに適している。
【００８８】
機能的に特徴付けされている、カンジダ・アルビカンスのジヒドロセラミドΔ４−デサチュラーゼ（Ｔｅｒｎｅｓら、２００２年；ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＷ＿１３９４３２．１）を鋳型として用いて、アシュビア・ゲノム・データベース（ｈｔｔｐ：／／ａｓｈｂｙａ．ｇｅｎｏｍｅ．ｄｕｋｅ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ．ｈｔｍｌ／）に対してＢＬＡＳＴＰ検索を行うことによって、アシュビア・ゴシッピーＤＥＳ１配列を得た。この結果、アシュビア・ゴシッピー遺伝子ＡＧＲ０２５Ｗ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＡＡＳ５４５１４；染色体ＶＩＩの７６１５１５〜７６２６５４ｂｐに位置）に、３７８ビットのスコアで有意な一致が得られた（それぞれ５２％および６５％の位置アミノ酸同一性および類似性）。アシュビア・ゴシッピーＤＥＳ１コード配列のＤＮＡ領域上流を増幅するために、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
ＡｇＤＥＳ１−ＵＳ−ｆｗ：
TAT ATA GTT AAC TCC ATC AGC GCG ACA ACA GG（配列番号２２中のｎｔ１−２０；ＨｐａＩ認識部位を含む）
ＡｇＤＥＳ１−ＵＳ−ｒｖ：
TAT ATA GAG CTC TCC GAA TCG AGG CGT GTG TAG（配列番号２２中のｎｔ８３０−８５０；ＳａｃＩ認識部位を含む）
【００８９】
Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックス、およびアシュビア・ゴシッピーＡＴＣＣ１９８９５細胞を鋳型として用いたコロニーＰＣＲ反応をセットアップするのに、上記オリゴヌクレオチドを用いた。この方法を適用することによって、８７４ｂｐの断片を入手できた。ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いて、この断片を精製した。その後、これをＨｐａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｒ０１０５Ｓ）およびＳａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｒ０１５６Ｓ）で２時間消化し、それぞれの酵素で切断されたベクターｐＡＧ３２（ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ社、独国オーバーウルゼル所在）とライゲートし、その結果、以降のクローニング手順のための中間体プラスミドである、プラスミドｐＡＧ３２−ＡｇＤＥＳ１−ＵＳ（４９１６ｂｐ）を得た。続いて、アシュビア・ゴシッピーＤＥＳ１コード配列の５’末端を増幅するために、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
ＡｇＤＥＳ１−ＤＳ−ｆｗ：
ATG AAC CAA CGG GGT ATA GCG AC（配列番号２２中のｎｔ９０５−９２７）
ＡｇＤＥＳ１−ＤＳ−ｒｖ：
TAT ATA AAG CTT CTC TTC AAT GCT GAA GAG GTA GTG（配列番号２２中のｎｔ１６５２−１６７５；ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を含む）
【００９０】
Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックス、およびアシュビア・ゴシッピーＡＴＣＣ１９８９５細胞を鋳型として用いたコロニーＰＣＲ反応をセットアップするのに、上記オリゴヌクレオチドを用いた。この方法を適用することによって、７８３ｂｐの断片を入手できた。ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いて、この断片を精製した。Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックスを用いたクロスオーバーＰＣＲを行うことによって、事前に増幅されたアシュビア・ゴシッピーＤＥＳ１コード配列の５’末端にある開始コドンに、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（配列番号２４）のアシュビア・ゴシッピープロモーターを融合させた。機能的に特徴付けされている、サッカロミセス・セレヴィジエのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｈｏｌｌａｎｄら、１９７９年；ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＣ＿００１１４２．６）を鋳型として用いて、アシュビア・ゲノム・データベース（ｈｔｔｐ：／／ａｓｈｂｙａ．ｇｅｎｏｍｅ．ｄｕｋｅ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ．ｈｔｍｌ／）に対してＢＬＡＳＴＰ検索を行うことによって、上記プロモーター配列を得た。この結果、アシュビア・ゴシッピー遺伝子ＡＥＲ０３１Ｃ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＡＡＳ５２７１５；染色体Ｖの６９５２３３〜６９６２２８ｂｐに位置）に、５３０ビットのスコアで有意な一致が得られた（それぞれ７８％および８９％の位置アミノ酸同一性および類似性）。アシュビア・ゴシッピーのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼコード配列の開始コドンの上流にあるプロモーター領域を増幅するために、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＧＡＰ−ｆｗ：
TAT ATA GTC GAC GGC TCT CCT CGC TCT GCT CAA G（配列番号２４中のｎｔ１−２３；ＳａｌＩ認識部位を含む）
ＰＧＡＰ−ｒｖ：
GTC GCT ATA CCC CGT TGG TTC ATT GTG CGG TGT GTA TGT GTG GAC（配列番号２４中のｎｔ４９７−５１８および配列番号２２中のｎｔ１−２３）
【００９１】
Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックス、およびアシュビア・ゴシッピーＡＴＣＣ１９８９５細胞を鋳型として用いたコロニーＰＣＲ反応をセットアップするのに、上記オリゴヌクレオチドを用いた。この方法を適用することによって、５５０ｂｐの断片を入手できた。ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いて、この断片を精製した。オリゴヌクレオチドＰＧＡＰ−ｆｗおよびＡｇＤＥＳ１−ＤＳ−ｒｖと、事前に増幅および精製されたアシュビア・ゴシッピーのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼコード遺伝子のプロモーターおよびアシュビア・ゴシッピーＤＥＳ１コード配列の５’末端１μｌとを用いて、クロスオーバーＰＣＲを行った。この方法を適用することによって入手された１３１０ｂｐの断片を、ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いて精製した。その後、これをＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｒ０１３８Ｓ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｒ０１０４Ｓ）で消化し、上述の通り、それぞれの酵素で切断されたｐＡＧ３２−ＡｇＤＥＳ１−ＵＳベクターにライゲートし、図２に示すプラスミドｐＡＧ３２−ｈｙｇ−ＰＡｇＧＡＰ−ＡｇＤＥＳ１（６１９２ｂｐ）を構築した。このプラスミドは、増強されたＤｅｓ１ｐ活性を得るために、アシュビア・ゴシッピーのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼコード遺伝子のプロモーターによって、天然のアシュビア・ゴシッピーＤＥＳ１プロモーターを置換するのに適している。アシュビア・ゴシッピーＤＥＳ１遺伝子上流のクローニングされたＤＮＡ領域、アシュビア・ゴシッピーＤＥＳ１遺伝子のクローニングされた５’末端、およびアシュビア・ゴシッピーのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼコード遺伝子のクローニングされたプロモーターの真正性は、Ｓａｎｇｅｒらが開発したジデオキシ法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．、７４：５４６３−５４６７）を用いて、Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ社（独国ファーターシュテッテン（Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ）所在）が行ったＤＮＡ配列決定によって確認した。公表されているＤＥＳ１コード配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＡＡＳ５０３００；アシュビア・ゲノム・データベース：ｈｔｔｐ：／／ａｓｈｂｙａ．ｇｅｎｏｍｅ．ｄｕｋｅ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ．ｈｔｍｌ／中のＡＧＲ０２５Ｗ）のヌクレオチド３８２、４８９、および４０５は、プラスミドｐＡＧ３２−ｈｙｇ−ＰＡｇＧＡＰ−ＡｇＤＥＳ１の対応するクローニングされたＤＮＡ配列中には不在であり、その結果、公表されているタンパク質配列のアミノ酸位置２９〜３４がＡＮＬＰＩに変化しているが、これは、他のすべての酵母Ｄｅｓ１ｐの対応領域と同一である。したがって、公表されているアシュビア・ゴシッピーＤＥＳ１  ＤＮＡ配列は、おそらく配列決定エラーを含有している。
【００９２】
機能的に特徴付けされている、ＬＡＣ１（Ｓｃｈｏｒｌｉｎｇら、２００１年；ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＣ＿００１１４３．７）という名の、サッカロミセス・セレヴィジエのセラミドシンターゼ成分を鋳型として用いて、アシュビア・ゲノム・データベース（ｈｔｔｐ：／／ａｓｈｂｙａ．ｇｅｎｏｍｅ．ｄｕｋｅ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ．ｈｔｍｌ／）に対してＢＬＡＳＴＰ検索を行うことによって、アシュビア・ゴシッピーＬＡＧ１配列を得た。この結果、アシュビア・ゴシッピー遺伝子ＡＢＲ００９Ｗ（ＮＰ  ９８２９５５；染色体ＩＩの４０８４６３〜４０９７０４ｂｐに位置）に、５３１ビットのスコアで有意な一致が得られた（それぞれ６４％および７９％の位置アミノ酸同一性および類似性）。機能的に特徴付けされている、ＬＡＦ１（Ｓｃｈｏｒｌｉｎｇら、２００１年；ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＣ＿００１１４０．５）という名の、サッカロミセス・セレヴィジエのセラミドシンターゼ成分を鋳型として用いて、アシュビア・ゲノム・データベース（ｈｔｔｐ：／／ａｓｈｂｙａ．ｇｅｎｏｍｅ．ｄｕｋｅ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ．ｈｔｍｌ／）に対してＢＬＡＳＴＰ検索を行うことによって、アシュビア・ゴシッピーＬＡＧ１配列を得た。この結果、アシュビア・ゴシッピー遺伝子ＡＤＬ２０６Ｗ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＡＡＳ５１７１４；染色体ＩＶの３４０５５６〜３４１６７４ｂｐに位置）に、１１７ビットのスコアで有意な一致が得られた（それぞれ３２％および４８％の位置アミノ酸同一性および類似性）。ＬＡＧ１コード配列を増幅するために、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
ＡｇＬＡＣ１−ｆｗ：
ATG GCT GAA AAT TCG TTA TTG AAG C（配列番号１１中のｎｔ１−２５）
ＡｇＬＡＣ１−ＰａｃＩ−ｒｖ：
TAT ATA TTA ATT AAG ACC TGT ATA TAT TCT AGT AGT G（配列番号１１中のｎｔ１３８８−１４１０；ＰａｃＩ認識部位を含む）
【００９３】
Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックス、およびアシュビア・ゴシッピーＡＴＣＣ１９８９５細胞を鋳型として用いたコロニーＰＣＲ反応をセットアップするのに、上記オリゴヌクレオチドを用いた。この方法を適用することによって、１２４１ｂｐの断片を入手できた。ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いて、この断片を精製した。アシュビア・ゴシッピーのエノラーゼコード遺伝子の前にあるプロモーターをＬＡＧ１コード配列に融合させるために、上述の通り、クロスオーバーＰＣＲを適用した。機能的に特徴付けされている、ＥＮＯ１およびＥＮＯ２（ＭｃＡｌｉｓｔｅｒら、１９８２年；ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＣ＿００１１３９．７およびＮＣ＿００１１４０．５）という名の、サッカロミセス・セレヴィジエのエノラーゼイソ酵素を鋳型として用いて、アシュビア・ゲノム・データベース（ｈｔｔｐ：／／ａｓｈｂｙａ．ｇｅｎｏｍｅ．ｄｕｋｅ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ．ｈｔｍｌ／）に対してＢＬＡＳＴＰ検索を行うことによって、アシュビア・ゴシッピーのエノラーゼコード遺伝子のプロモーター配列を得た。この結果、アシュビア・ゴシッピー遺伝子ＡＥＲ２９４Ｃ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＡＡＳ５２９７５；染色体Ｖの１１７６７２４〜１１７８０３７ｂｐに位置）に、サッカロミセス・セレヴィジエＥＮＯ１に対して７３４ビットのスコア（それぞれ８３％および９１％の位置アミノ酸同一性および類似性）、そしてサッカロミセス・セレヴィジエＥＮＯ２に対して７０９ビットのスコア（それぞれ８０％および８７％の位置アミノ酸同一性および類似性）で有意な一致が得られた。ＥＮＯ１の開始コドンの上流約４５５ｂｐの領域を選択し、以下オリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
Ｐ−ＥＮＯ−ＰａｃＩ−ｆｗ：
TAT ATA TTA ATT AAC TGT TCA CAG CCT TCT GAG AC（配列番号２５中のｎｔ１−２１；ＰａｃＩ）
Ｐ−ＥＮＯ−ＣＯ−ＬＡＧ１−ｒｖ：
CCT GAC TTG GCC CGA CAT TTT GAA TTA TTT GAG TTT CGG AGG TGT TAA TC（配列番号２５中のｎｔ４３６−４６７および配列番号１３中のｎｔ１−１８）
【００９４】
Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックス、およびアシュビア・ゴシッピーＡＴＣＣ１９８９５細胞を鋳型として用いたコロニーＰＣＲ反応をセットアップするのに、上記オリゴヌクレオチドを用いた。この方法を適用することによって、４７５ｂｐの断片を入手した。ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いて、この断片を精製した。オリゴヌクレオチドＰ−ＥＮＯ−ＰａｃＩ−ｆｗおよびＡｇＬＡＣＩ−ＰａｃＩ−ｒｖと、アシュビア・ゴシッピーのエノラーゼコード遺伝子のプロモーターおよびアシュビア・ゴシッピーＬＡＧ１・コード配列に相当する、事前に増幅および精製されたＰＣＲ産物１μｌとを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックスを用いたクロスオーバーＰＣＲをセットアップした。この方法を適用することによって、１７１６ｂｐの断片を入手できた。ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いて、この断片を精製した。その後、これをＰａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｒ０５４７Ｓ）で２時間消化し、製造元のプロトコルに従ってＰａｃＩ切断および脱リン酸化された（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、アルカリホスファターゼ、コウシ腸、カタログ＃Ｍ０２９０Ｓ）ｐＡＧ３２−ｈｙｇ−ＰＡｇＧＡＰ−ＡｇＤＥＳ１ベクターにライゲートし、その結果、図３に示すプラスミドｐＡＧ−ＬＡＧ１−１（８０７７ｂｐ）を得た。このプラスミドは、アシュビア・ゴシッピー内に形質転換された後に、アシュビア・ゴシッピーＤＥＳ１およびＬＡＧ１を同時に過剰発現するのに適している。クローニングされたアシュビア・ゴシッピーのエノラーゼコード遺伝子のプロモーターおよびアシュビア・ゴシッピーＬＡＧ１コード配列の真正性は、Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ社（独国ファーターシュテッテン所在）が行ったＤＮＡ配列決定によって確認した。続いて、ＬＡＦ１コード配列を増幅するために、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
ＡｇＬＡＧ１−ｆｗ：
ATG TCG GGC CAA GTC AGG C（配列番号１３中のｎｔ１−２０）
ＡｇＬＡＧ１−ＰａｃＩ−ｒｖ：
TAT ATA TTA ATT AAC TGC ATG CGC TGT CTG GCG（配列番号１３中のｎｔ１２９１−１３０９；ＰａｃＩ認識部位を含む）
【００９５】
Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックス、およびアシュビア・ゴシッピーＡＴＣＣ１９８９５細胞を鋳型として用いたコロニーＰＣＲ反応をセットアップするのに、上記オリゴヌクレオチドを用いた。この方法を適用することによって、１１１８ｂｐの断片を入手できた。ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いて、この断片を精製した。アシュビア・ゴシッピーのエノラーゼコード遺伝子のプロモーターをＬＡＦ１コード配列に融合させるために、上述の通り、クロスオーバーＰＣＲを適用した。オリゴヌクレオチドＰ−ＥＮＯ−ＰａｃＩ−ｆｗおよびＡｇＬＡＧ１−ＰａｃＩ−ｒｖと、アシュビア・ゴシッピーのエノラーゼコード遺伝子のプロモーターおよびアシュビア・ゴシッピーＬＡＦ１コード配列に相当する、事前に増幅および精製されたＰＣＲ産物１μｌとを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックスを用いたクロスオーバーＰＣＲをセットアップした。この方法を適用することによって、１５９３ｂｐの断片を入手できた。ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いて、この断片を精製した。その後これをＰａｃＩで２時間消化し、上述の通り、ＰａｃＩ切断および脱リン酸化されたベクターｐＡＧ３２−ｈｙｇ−ＰＡｇＧＡＰ−ＡｇＤＥＳ１にライゲートし、その結果、図４に示すプラスミドｐＡＧ−ＬＡＦ１−１（７９７６ｂｐ）を得た。このプラスミドは、アシュビア・ゴシッピー内に形質転換した後、アシュビア・ゴシッピーＤＥＳ１およびＬＡＦ１を同時に過剰発現するのに適している。クローニングされた、アシュビア・ゴシッピーのエノラーゼコード遺伝子のプロモーターおよびアシュビア・ゴシッピーＬＡＦ１コード配列の真正性は、Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ社（独国ファーターシュテッテン所在）が行ったＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００９６】
アシュビア・ゴシッピーＡＴＣＣ１９８９５の形質転換は、エレクトロポレーション法により行った。液体培地中での培養中に真菌菌糸が凝固するのを防止するために、以下の通りにホモジナイズした。寒天プレート（酵母抽出物１ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、グルコース１０ｇ／ｌ、ミオイノシトール０．３ｇ／ｌ、および寒天２０ｇ／ｌ）上、３０℃で、２４ｈ培養された菌糸を完全な１ループ分採取し、１５ｍｌ反応管内の２ｍｌの滅菌水中に再懸濁した。直径３ｍｍの無菌ガラスビーズをメニスカス面まで添加した。この溶液を、ミニシェーカー（ＩＫＡ社、独国シュタウフェン所在）上で２分間、最高速で処理した。ホモジナイズされた菌糸懸濁液をシリンジを用いて除去し、７０ｍｌの液体複合培地（酵母抽出物１ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、グルコース１０ｇ／ｌ、およびミオイノシトール０．３ｇ／ｌ）を含有する２５０ｍｌのバッフル付き振とうフラスコ内に移した。これを、３０℃、１分あたり２５０ラウンドで、終夜培養し、減圧濾過（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ社、Ｖａｃｕｆｌｏ  ＰＶ  ０５０／２減圧濾過ユニット）によって採取し、２５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄し、同一溶液中、２８℃で、３０分間インキュベートし、減圧濾過によって再度、収集した。続いて、２７０ｍＭスクロースおよび１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で細胞を洗浄し、１ｍｌの同一溶液中に再懸濁し、２００μｌアリコートに分注した。形質転換用のプラスミドＤＮＡであるｐＵＧ６−ＡｇＳＵＲ２：：ｋａｎＭＸ、ｐＡＧ−ＬＡＧ１−１、またはｐＡＧ−ＬＡＦ１−１を、製造元の説明書に従って、ＨｐａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｒ０１０５Ｓ）で直線化した。このＤＮＡを、標準的なフェノール：クロロホルム抽出およびエタノール沈殿プロトコルを用いて精製した。２００μｌアリコートの菌糸懸濁液に、容積の１０％を超えない、最大２０μｇまでの精製されたＤＮＡを添加し、冷却された２ｍｍエレクトロポレーションキュベット内に分注し、１．５ｋＶ／ｃｍ、１００Ω、および２５ｐＦに設定されたＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、独国ミュンヘン（Ｍｕｎｉｃｈ）所在）でパルス印加した。エレクトロポレーションの後に、ピペットでエレクトロポレーションキュベットから菌糸を除去し、上述の通りの液体複合培地１０ｍｌ中に移し、細胞の再生を可能にするために、１００ｍｌの無バッフル振とうフラスコ内、３０℃、１分あたり２００ラウンドで、４〜６ｈインキュベートした。淘汰圧を加えるために、続いて、再生された細胞に１０ｍｌのトップアガー（１％アガロース（ｗ／ｖ）を含有する、酵母抽出物１ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、グルコース１０ｇ／ｌ、およびミオイノシトール０．３ｇ／ｌに７５０μｇ／ｍｌジェネティシンＧ４１８および／または７５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを加える）を添加し、混合し、非選択的な複合培地寒天プレート（酵母抽出物１ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、グルコース１０ｇ／ｌ、ミオイノシトール０．３ｇ／ｌ、および寒天２０ｇ／ｌ）上に注いだ。３０℃、２〜３日間のインキュベーションの後、形質転換体を得た。ジェネティシン耐性および／またはハイグロマイシン耐性の胞子の選択によって、アシュビア・ゴシッピー形質転換体のクローン精製を行った。このために、胞子形成プレート（酵母抽出物１０ｇ／ｌ、グルコース１０ｇ／ｌ、および寒天２０ｇ／ｌ）上に形質転換体を線条接種し、３０℃で５日間インキュベートした。続いて、完全な１ループ分の真菌菌糸をのトリコデルマ・ハルチアナム由来の溶解酵素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、独国タウフキルヒェン（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ）所在）１０ｍｇ／ｍｌを含有する０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ  １ｍｌ中に再懸濁し、室温で１ｈインキュベートした。放出された胞子と細胞破片とを遠心法（３０秒間、１３２００ｒｐｍ）によって沈降させ、０．９％ＮａＣｌ溶液１ｍｌで２回洗浄し、最後に、胞子を濃縮するために、等容積のパラフィンで抽出し、二相を撹拌ミル（Ｒｅｔｓｃｈ社、独国ハーン（Ｈａｈｎ）所在）内で、３０Ｈｚ、３０秒間の振とうによって完全に混合した。遠心法（３０秒間、８００ｒｐｍ）によって相分離させた。０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ中におけるパラフィン相の希釈系列を選択培地８００  ３０（７５０μｇ／ｍｌジェネティシンおよび／または７５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有する、酵母抽出物１ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、グルコース１０ｇ／ｌ、ミオイノシトール０．３ｇ／ｌ、および寒天２０ｇ／ｌ）上にプレーティングし、３０℃で、２〜３日間、インキュベートした。生じたコロニーを選択し、実施例３に記載する逆相ＨＰＬＣによるスフィンゴイド塩基の定量および特性分析用に培養した。
【００９７】
実施例２
（アシュビア・ゴシッピー酵素Ｌａｆ１ｐおよびＤｅｓ１ｐを同時に過剰生産するアシュビア・ゴシッピーＳＹＲ２  ８ＤＥＳ二重変異体の構築）
アシュビア・ゴシッピーＳＹＲ２遺伝子をｋａｎＭＸ耐性遺伝子で置換して、それによってアシュビア・ゴシッピーＳＹＲ２遺伝子不活性化し、アシュビア・ゴシッピーＤＥＳ１およびＬＡＦ１遺伝子を過剰発現するように、プラスミドｐＳＳＴＨ−ＬＡＦ１−２を設計した。アシュビア・ゴシッピーＳＹＲ２、ＤＥＳ１およびＬＡＦ１をコードする配列ならびにアシュビア・ゴシッピーのエノラーゼコード遺伝子のプロモーターの配列を、実施例１に記載の通りに得た。アシュビア・ゴシッピーＡＴＣＣ１９８９５からのＤＥＳ１コード配列を増幅するために、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（独国エーバースベルク所在）が以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
ＡｇＤＥＳ１−ＤＳ−ｆｗ：
ATG AAC CAA CGG GGT ATA GCG AC（配列番号２２中のｎｔ９０５−９２７）
ＡｇＤＥＳ１−ｒｖ−ＳａｌＩ：
TAT ATA GTC GAC GAG TTT TGA CTC CTT CTG TCT C（配列番号２２中のｎｔ２２４６−２２６７；ＳａｌＩ認識部位を含む）
【００９８】
上記オリゴヌクレオチドは、製造元の説明書に従ってＰｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックス（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ社、カタログ＃Ｆ−５３１Ｌ）とともに、Ｉｎｎｉｓら（「ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９０年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社）に従い、アシュビア・ゴシッピーＡＴＣＣ１９８９５細胞を鋳型として用いて、コロニーＰＣＲ反応をセットアップするのに用いた。この方法を適用することによって、１３７２ｂｐの断片を入手できた。製造元の説明書に従ってＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キット（ＱｌＡＧＥＮ社、カタログ＃２８６０６）を用いて、この断片を精製した。アシュビア・ゴシッピーのエノラーゼコード遺伝子のプロモーターを増幅するために、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
ＡｇＰＥＮＯ−ｆｗ−ＸｂａＩ：
TAT ATA TCT AGA CTG TTC ACA GCC TTC TGA GAC（配列番号２５中のｎｔ１−２１；ＸｂａＩ認識部位を含む）
ＡｇＰＥＮＯ−ＯＥＰＣＲ−ｒｖ：
GTC GCT ATA CCC CGT TGG TTC ATT TTG AAT TAT TTG AGT TTC GGA GGT GTT AAT C（配列番号２５中のｎｔ４３６−４６７および配列番号２２中のｎｔ９０５−９２７）
【００９９】
上記オリゴヌクレオチドは、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックスおよびアシュビア・ゴシッピーＡＴＣＣ１９８９５細胞を鋳型として用いて、コロニーＰＣＲ反応をセットアップするのに用いた。この方法を適用することによって、４９６ｂｐの断片を入手できた。ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いて、この断片を精製した。オリゴヌクレオチドＡｇＰＥＮＯ−ｆｗ−ＸｂａＩおよびＡｇＤＥＳ１−ｒｖ−ＳａｌＩと、アシュビア・ゴシッピーのエノラーゼコード遺伝子のプロモーターおよびアシュビア・ゴシッピーＤＥＳ１コード配列を表す、事前に増幅および精製されたＰＣＲ産物１μｌとを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックスとともにクロスオーバーＰＣＲをセットアップした。この方法を適用することによって、１８４６ｂｐの断片を入手できた。ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いて、この断片を精製した。その後、これをＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｒ０１３８Ｓ）およびＸｂａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｒ０１４５Ｓ）で２時間消化し、製造元のプロトコルに従ってＳａｌＩおよびＸｂａＩ切断ベクターｐＵＧ６−ＡｇＳＵＲ２：：ｋａｎＭＸ（実施例１を参照）にライゲートした。２．５μｌのライゲーション産物を用いて、製造元の説明書に従って化学的コンピテント大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０、カタログ＃Ｃ４０４０−０３）を形質転換した。これによって、プラスミドｐＳＳＴＨ（７３２３ｂｐ）を得た。アシュビア・ゴシッピーのエノラーゼコード遺伝子およびアシュビア・ゴシッピーＤＥＳ１コード配列配列を表すクローニングされた断片のＤＮＡ配列の真正性は、Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ社（独国ファーターシュテッテン所在）が行ったＤＮＡ配列決定によって確認した。アシュビア・ゴシッピーＬＡＦ１コード配列を増幅するために、次いで以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
ＡｇＬＡＧ１−ｆｗ：
ATG TCG GGC CAA GTC AGG C（配列番号１３中のｎｔ１−１９）
ＡｇＬＡＧ１−ＰａｃＩ−ｒｖ：
TAT ATA TTA ATT AAC TGC ATG CGC TGT CTG GCG（配列番号１３中のｎｔ１２９１−１３０９；ＰａｃＩ認識部位を含む）
【０１００】
上記オリゴヌクレオチドは、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックスとともにアシュビア・ゴシッピーＡＴＣＣ１９８９５細胞を鋳型として用いて、コロニーＰＣＲ反応をセットアップするのに用いた。この方法を適用することによって、１１１８ｂｐの断片を入手できた。ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いて、この断片を精製した。アシュビア・ゴシッピーのエノラーゼコード遺伝子のプロモーターを増幅するために、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
Ｐ−ＥＮＯ−ＰａｃＩ−ｆｗ：
TAT ATA TTA ATT AAC TGT TCA CAG CCT TCT GAG AC（配列番号２５中のｎｔ１−２１；ＰａｃＩ認識部位を含む）
Ｐ−ＥＮＯ−ＣＯ−ＬＡＧ１−ｒｖ：
CCT GAC TTG GCC CGA CAT TTT GAA TTA TTT GAG TTT CGG AGG TGT TAA TC （配列番号２５中のｎｔ４３６−４６７および配列番号１３中のｎｔ１−１８）
【０１０１】
上記オリゴヌクレオチドは、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックスとともにアシュビア・ゴシッピーＡＴＣＣ１９８９５細胞を鋳型として用いて、コロニーＰＣＲ反応をセットアップするのに用いた。この方法を適用することによって、４７５ｂｐの断片を入手できた。ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いて、この断片を精製した。オリゴヌクレオチドＰ−ＥＮＯ−ＰａｃＩ−ｆｗおよびＡｇＬＡＧ１−ＰａｃＩ−ｒｖならびにアシュビア・ゴシッピーのエノラーゼコード遺伝子のプロモーターおよびアシュビア・ゴシッピーのＬＡＦ１コード配列を表す、事前に増幅および精製されたＰＣＲ産物１μｌとを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックスとともにクロスオーバーＰＣＲをセットアップした。この方法を適用することによって、１５９３ｂｐの断片を入手できた。ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いて、この断片を精製した。その後、これをＰａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｒ０５４７Ｓ）で２時間消化し、上記の通りに、ＰａｃＩ切断および脱リン酸化された（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、アルカリホスファターゼ、コウシ腸、カタログ＃Ｍ０２９０Ｓ）ｐＳＳＴＨベクターにライゲートし、その結果、図５に示すプラスミドｐＳＳＴＨ−ＬＡＦ１−２（９１１７ｂｐ）を得た。このプラスミドは、アシュビア・ゴシッピーのＳＹＲ２をｋａｎＭＸで置換するのに適しており、これにより、アシュビア・ゴシッピー内に形質転換された後に、アシュビア・ゴシッピーのＳＹＲ２を不活性化し、アシュビア・ゴシッピーのＤＥＳ１およびＬＡＦ１を同時に過剰発現するのに適している。アシュビア・ゴシッピーのエノラーゼコード遺伝子およびアシュビア・ゴシッピーのＬＡＦ１コード配列を表すクローニングされた断片ＤＮＡ配列の真正性は、Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ社（独国ファーターシュテッテン所在）が行ったＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１０２】
アシュビア・ゴシッピーの８ＤＥＳ遺伝子を破壊するよう、プラスミドｐＡＧ３２−Ｄ８Ｄを設計した。機能的に特徴付けされている、クリュイベロミセス・ラクティスのデルタ（８）スフィンゴ脂質デサチュラーゼ（Ｔａｋａｋｕｗａら、２００２年；ＥＭＢＬアクセッション番号ＡＢ０８５６９０）を鋳型として用いて、アシュビア・ゲノム・データベース（ｈｔｔｐ：／／ａｓｈｂｙａ．ｇｅｎｏｍｅ．ｄｕｋｅ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ．ｈｔｍｌ／）に対してＢＬＡＳＴＰ検索を行うことによって、８ＤＥＳコード配列を得た。この結果、アシュビア・ゴシッピー遺伝子ＡＦＬ０７９Ｗ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＡＡＳ５３２９３；染色体ＶＩの２９０１３４〜２９１７５０ｂｐに位置）に、６１６ビットのスコアで有意な一致が得られた（それぞれ５６％および６９％の位置アミノ酸同一性および類似性）。８ＤＥＳコード配列の内部領域を増幅するために、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
ＡｇＤ８Ｄ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ｆｗ：
TAT ATA AAG CTT GCG CTG GAA GAT TGG GCA TGT G （配列番号２０中のｎｔ２０４−２２５；ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を含む）
ＡｇＤ８Ｄ−ＢａｍＨＩ−ｒｖ：
TAT ATA GGA TCC GAG TCC AGC TTA ACA CGT AGA G （配列番号２０中のｎｔ１０００−１０２１；ＢａｍＨＩ認識部位を含む）
【０１０３】
上記オリゴヌクレオチドは、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックスとともにアシュビア・ゴシッピーＡＴＣＣ１９８９５細胞を鋳型として用いて、コロニーＰＣＲ反応をセットアップするのに用いた。この方法を適用することによって、８２４ｂｐの断片が得られた。ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いて、この断片を精製した。
これをＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｒ０１３６Ｓ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｒ０１０４Ｓ）で２時間消化し、上記の通りに、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断ｐＡＧ３２ベクター、その結果、図６に示すプラスミドｐＡＧ３２−Ｄ８Ｄ（４９６０ｂｐ）を得た。このプラスミドは、アシュビア・ゴシッピー内に形質転換された後に、アシュビア・ゴシッピーの８ＤＥＳ遺伝子を破壊するのに適している。クローニングされた内部アシュビア・ゴシッピー８ＤＥＳ配列のＤＮＡ配列の真正性は、Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ社（独国ファーターシュテッテン所在）が行ったＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１０４】
アシュビア・ゴシッピーの形質転換は、実施例１に記載の通り行った。プラスミドｐＳＳＴＨ−ＬＡＦ１−２はＨｐａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｒ０１０５Ｓ）で直線化し、プラスミドｐＡＧ３２−Ｄ８ＤはＭｆｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｒ０５８９Ｓ）で直線化し、実施例１と同じように精製した。
【０１０５】
実施例３
（アシュビア・ゴシッピー株における、逆相ＨＰＬＣによるスフィンゴイド塩基の定量および特性解析）
ＨＰＬＣ分析のために、適切な抗生物質を含むＹＥＰＤプレート上で増殖させたアシュビア・ゴシッピー変異体株の菌糸を、実施例１に記載の通り懸濁し、バッフル付き１００ｍｌ三角フラスコ中、２０ｍｌのＹＥＰＤ培地（ペプトン２％（ｗ／ｖ）、酵母抽出物１％（ｗ／ｖ）およびグルコース２％（ｗ／ｖ））に接種し、３０℃および２５０ｒｐｍで３日間培養した。その時点で細胞は定常期にあった。菌糸の懸濁物１ｍｌを、１．５ｍｌ反応管中に移し、１３２００ｒｐｍで１分間遠心分離し、ピペットで液体培地を除去した。試料を１Ｍ  ＨＣｌで１．５ｍｌまで満たし、８０℃で１６時間インキュベートした。試料を簡単に混合し、懸濁物の５００μｌを新しい１．５ｍｌ反応管に移した。１ｍｌのクロロホルム：メタノール（２：１）（ｖ／ｖ）を添加し、ミキサーミル（Ｒｅｔｓｃｈ社、独国ハーン所在）により３０Ｈｚで３０分間振とうして脂質を抽出した。試料を１３２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、下層のクロロホルム相の５００μｌを、新しい１．５ｍｌ反応管に移した。真空遠心分離機（Ｃｈｒｉｓｔ  Ｖａｋｕｕｍｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、Ｃｈｒｉｓｔ  ＡＧ社、オステローデ所在）で２０分間、６０℃で溶媒を蒸発させ、適切な体積の２−プロパノール：Ｈ２Ｏ（１：１）（ｖ／ｖ）中にペレットを再懸濁し、４０℃の超音波水浴中で１０分間溶解した。
【０１０６】
菌糸乾燥重量の決定のため、実施例１で記載したように、試料を液体培地から採取し、紙フィルターで濾過した。回収した菌糸を１１０℃で一晩乾燥し、計量した。
【０１０７】
逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いてスフィンゴイド塩基濃度を決定した。Ｃ１８フィトスフィンゴシン、Ｃ１８スフィンガニンおよびＣ１８スフィンゴシンについて、市販の入手可能な基準物質を用いたキャリブレーションにより定量した。Ｃ１８スフィンガジエンについては基準物質が市販に入手可能ではなかった。従って、Ｃ１８スフィンガジエンの濃度は、Ｃ１８スフィンゴシンをキャリブラントとして用いて決定した。
【０１０８】
ＲＰ−ＨＰＬＣの詳細：
装置                Ｊａｓｃｏ；ポンプ  ＰＵ−２０８０、オートサンプラー  ＡＳ−２０５５、蛍光検出器  ＦＰ−２０２０
カラム              Ｋｒｏｍａｓｉｌ  Ｃ１８、２５０ｍｍ ｘ ４．６ｍｍ
【０１０９】
ＲＰ−ＨＰＬＣの条件：
流速                ２．００ｍｌ／分
試料体積            １０μｌ
プレカラム誘導体化  同体積のｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）で２分間
注入体積            １０μｌ
カラム温度          ４０℃
トレイ温度          周囲温度
移動相              メタノール：水（９２：８）（ｗ／ｖ）
ランタイム          ８分間
検出方法            蛍光
励起波長            ３４０ｎｍ
発光波長            ４５５ｎｍ
【０１１０】
リテンションタイム：
Ｃ１８フィトスフィンゴシン  ４．００分
Ｃ１８スフィンガジエン      ４．４０分
Ｃ１８スフィンゴシン        ５．５０分
Ｃ１８スフィンガニン        ７．００分
【０１１１】
これらの分析の結果を図１９に示す。アシュビア・ゴシッピー野生型株はごく少量のスフィンゴシンしか生産しないが、一方、ＤＥＳ１を過剰発現し、機能的ＳＹＲ２遺伝子を欠損した全ての株は、細胞乾燥重量１ｇ当たり０．５ｍｇのスフィンゴシンを生産した。ＬＡＦ１の追加的な過剰発現は、それ単独でまたは８ＤＥＳの挿入不活性化と組み合わせて、望まれない副産物、スフィンガニンおよびスフィンガジエニンの形成を劇的に低減した。
【０１１２】
実施例４
（ピキア・シフェリイＦ−６０−１０Ａ  ＮＲＲＬ  １０３１からのゲノムＤＮＡの単離）
ピキア・シフェリイ  Ｆ−６０−１０Ａ  ＮＲＲＬ  １０３１を、２５０ｍｌ三角フラスコ中の５０ｍｌＹＥＰＤ培地（ペプトン２％（ｗ／ｖ）、酵母抽出物１％（ｗ／ｖ）およびグルコース２％（ｗ／ｖ））で、２００ｒｐｍおよび３０℃で培養し、１８時間後、１．５のＯＤ６００で採取した。製造元の説明書に従って、ＰＵＲＥＧＥＮＥ（登録商標）酵母およびグラム陽性細菌用ＤＮＡ精製キット（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ＃Ｄ−６０００Ａ）を用いて染色体ＤＮＡを単離した。アガロースゲル電気泳動による単離ＤＮＡの品質確認により、分子量が大きい（＞１６ｋｂｐ）ことが証明された。
【０１１３】
実施例５
（ピキア・シフェリイのＬＡＧ１遺伝子ヌクレオチド配列のクローニングおよび決定）
（ピキア・シフェリイのＬＡＧ１遺伝子の内部部分の増幅）
まず、サッカロミセス亜門種からの推測セラミドシンターゼのアミノ酸配列を、完全および未完成の真核生物ゲノムのＮＣＢＩのデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｕｔｉｌｓ／ｇｅｎｏｍ＿ｔａｂｌｅ．ｃｇｉ）から、アシュビア・ゴシッピーＬａｇ１ｐ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＮＰ＿９８２９５５）を鋳型としてＴＢＬＡＳＴＮ検索を実行することによって、抽出した。このタンパク質は、特徴づけされたＳ．セレヴィジエのＬａｃ１ｐおよびＬａｇ１ｐタンパク質と非常に類似していた（それぞれ６５％および６９％の位置アミノ酸同一性）（Ｓｃｈｏｒｌｉｎｇら、２００１年；Ｇｕｉｌｌａｓら、２００３年）。したがって、それらはセラミドシンターゼ活性を有する可能性が非常に高い。ＣｌｕｓｔａｌＷプログラム（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）を用いて抽出配列（全て＜２ｘ１０−１２３のＥ値を有する）を配置した。ピキア・シフェリイのＬＡＧ１遺伝子の内部部分の増幅のために適切なヌクレオチドは、ピキア・シフェリイのコドン使用頻度が高度にバイアスを受けていることを考慮し、Ｌａｇ１ｐ配列において高度に保存された一続きのアミノ酸を逆翻訳することにより得られた。その後、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（独国エーバースベルク所在）が以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
ＬＡＣ１−ｄｅｇ−ｆｗ：
TTY GTY GGT TTY TAY GCW ATH TTY TTY ACW TTY TTR MGW GAA TT （配列番号１中のｎｔ１６３６−１６７９）
ＬＡＣ１−ｄｅｇ−ｒｖ：
GGT TGW SWD ATC CAA CAT TTR TAT TGT TGW GT （配列番号１中のｎｔ２２９７−２２６６）
【０１１４】
上記オリゴヌクレオチドは、製造元の説明書に従ってＰｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックス（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ社、カタログ＃Ｆ−５３１Ｌ）とともに、Ｉｎｎｉｓら（「ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９０年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社）によるＰＣＲ反応をセットアップするのに用いた。この方法を適用することによって、６６２ｂｐの断片を入手できた。製造元の説明書に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社、カタログ＃２８７０６）を用いて、この断片を精製した。
【０１１５】
（ピキア・シフェリイのＬＡＧ１遺伝子の内部部分のＤＮＡ配列の決定）
Ｓａｎｇｅｒらが開発したジデオキシ法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．、７４：５４６３−５４６７）を用いて、精製ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を決定した。配列決定プライマーとして、ＰＣＲ増幅に用いたものを使用した。ＤＮＡ配列決定は、Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ社（独国ファーターシュテッテン所在）により行われた。得られた配列情報（６６２ｂｐ、配列番号１中のｎｔ１６３６−２２９７に対応；図７Ａ）を、クローンマネージャー７ソフトウェア（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＆Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてタンパク質に翻訳し、得られたアミノ酸配列を、ＮＣＢＩの重複のない（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）タンパク質データベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）によるＢＬＡＳＴＰ探索の鋳型として用いた。探索の結果、サッカロミセス・セレヴィジエのＬａｃ１ｐ（セラミドデサチュラーゼのサブユニット）と非常に類似するクリュイベロミセス・ラクティスタンパク質（ＮＣＢＩアクセッション＃ＸＰ＿４５２１３２）が、データベース中で新規な配列と最も類似するタンパク質として同定され、ピキア・シフェリイのＬＡＧ１オルソログの部分が実際に増幅されたことが確認された。
【０１１６】
（ピキア・シフェリイの全ＬＡＧ１遺伝子の増幅およびそのＤＮＡ配列の決定）
ピキア・シフェリイの全ＬＡＧ１遺伝子（コード配列、プロモーター領域および３’−非翻訳領域）のＤＮＡ配列を決定するために、逆ＰＣＲ法に従った。ピキア・シフェリイＦ−６０−１０Ａ  ＮＲＲＬ  １０３１からの染色体ＤＮＡ（３００ｎｇ）（実施例４に記載の通りに単離）を、製造元の説明書に従って、全体積５０μｌ中で、ＶｓｐＩ（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、カタログ＃ＥＲ０９１１）により一晩消化した。製造元の説明書に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社、カタログ＃２８１０６）を用いて、この消化ＤＮＡを精製した。溶出ＤＮＡ（５０μｌ）を、製造元の説明書に従って、全体積２００μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ８００Ｕで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｍ０２０２Ｌ）を用いて一晩ライゲーションした。製造元の説明書に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、このライゲートＤＮＡを精製した。溶出物の２．５μｌを、Ｉｎｎｉｓら（「ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９０年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社）による逆ＰＣＲ反応の鋳型として用いた。これには、ピキア・シフェリイのＬＡＧ１遺伝子の既知の部分に標的化した２つのオリゴヌクレオチドを適用した：  
ＰｃＬＡＣ１−ｕｓ−ｆｗ：
CCT TCT AAA ATC AAG AGA TTT ATG GAA CAA TC （配列番号１中のｎｔ１７３２−１７６３）
ＰｃＬＡＣ１−ｕｓ−ｒｖ：
CCA ACA ATT GGT GCA AGG GGA C （配列番号１中のｎｔ１７２１−１７００）
【０１１７】
製造元の説明書に従って、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックスを用いて増幅を行った。この手順を用いて２．２ｋｂｐのＰＣＲ産物が得られた。製造元の説明書に従って、ＭｉｎＥｌｕｔｅＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社、カタログ＃２８００６）を用いて、この断片を精製した。この断片のＤＮＡ配列を、前記のとおり、オリゴヌクレオチドＰｃＬＡＣ１−ｕｓ−ｆｗ、ＰｃＬＡＣ１−ｕｓ−ｒｖ、
ＤＢｏＰｃＬＡＣ１−ｕｓ−ｒｖ２：
TTA GAC AGA AGC TCA ACA GG （配列番号１中のｎｔ１０３２−１０１３）、
ＤＢｏ−ＰｃＬＡＣ１ｉｎｔｆｗ：
TTC AGC TGG TTA TTT GTC TC （配列番号１中のｎｔ１２４０−１２５９）および
ＤＢｏ−ＰｃＬＡＣ１ｉｎｔｒｖ：
TAA CCC AGA ATC AAG GTC （配列番号１中のｎｔ９４−７７）
を配列決定プライマーとして用いて決定した。新たに得られた配列情報は、配列番号１中のｎｔ１−１６３５をカバーした。３’ＶｓｐＩ部位が、この部分のすぐ下流に位置しているため（図７Ａ）、このＤＮＡ配列の下流の新たな配列情報は得ることができなかった。ピキア・シフェリイＬＡＧ１遺伝子のコード領域の３’末端、およびその３’−非翻訳領域のＤＮＡ配列を得るために、別ラウンドの逆ＰＣＲを行う必要があった。従って、ピキア・シフェリイ染色体ＤＮＡの消化にＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｒ０１０４Ｓ）を用い、逆ＰＣＲ中に、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（独国エーバースベルク所在）により合成された以下のオリゴヌクレオチドを適用した以外は、上記の実験プロトコルを繰り返した。
ＰｃＬＡＣ１−ｄｓ−ｆｗ：
GGG AGA TTT TAA ATT AAA TTT TGC AAC TCA AC （配列番号１中のｎｔ２２４１−２２７２）
ＰｃＬＡＣ１−ｄｓ−ｒｖ：
CTG TTC TAA ATT CTG TTA AAA CTG ACC （配列番号１中のｎｔ２２３９−２２１３）
【０１１８】
この手順を用いて４．５ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。製造元の説明書に従って、ＭｉｎＥｌｕｔｅＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。この断片のＤＮＡ配列を、前記のとおり、オリゴヌクレオチドＰｃＬＡＣ１−ｄｓ−ｆｗ；ＰｃＬＡＣ１−ｄｓ−ｒｖ；
ＤＢｏ−ＰｃＬＡＣ１ｄｓｆｗ２：
AAA TCA GGT TTA ACA ATG GC （配列番号１中のｎｔ３１５２−３１７１）
ＤＢｏ−ＰｃＬＡＣ１ｄｓｆｗ３：
AGT TGA TAA ATG ACG AAT GG （配列番号１中のｎｔ４０６０−４０７９）および
ＤＢｏ−ＰｃＬＡＣ１ｄｓｒｖ２：
GAA CGT ACT CTT GTA TCA CCC （配列番号１中のｎｔ１３４３−１３２３）
を配列決定プライマーとして用いて決定した。３’ＶｓｐＩ部位の下流から次のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位まで延びる、２６５５ｂｐの新たな配列情報（配列番号１中のｎｔ２２９８−４９５２）を得ることができた（図７Ｂ）。記載した３ステップの手順を用いて、全４９５２ｂｐのピキア・シフェリイＬＡＧ１遺伝子座を単離し、そのＤＮＡ配列を決定することができた（配列番号１および図７参照）。
【０１１９】
図７Ｃに描かれたピキア・シフェリイＬＡＧ１遺伝子座は、４２９アミノ酸のピキア・シフェリイＬａｇ１ｐタンパク質をコードする（配列番号２）。ピキア・シフェリイＬａｇ１ｐは、クリュイベロミセス・ラクティスからの予測セラミドシンターゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃  ＸＰ＿４５２１３２）およびサッカロミセス・セレヴィジエからの予測セラミドシンターゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＮＣ＿００１１４３）と、それぞれ６４％（８０％）および６２％（７５％）の位置アミノ酸同一性（類似性）を有する。サッカロミセス・セレヴィジエからのＬａｃ１ｐタンパク質は、生化学的に特徴づけされ、ｉｎ  ｖｉｖｏでセラミドシンターゼ活性を示すことが示されている（Ｓｃｈｏｒｌｉｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，１２：３４１７−３４２７）。
【０１２０】
実施例６
（ピキア・シフェリイのＬＡＦ１遺伝子ヌクレオチド配列のクローニングおよび決定）
（ピキア・シフェリイのＳＳＮ８遺伝子の内部部分の増幅）
ピキア・シフェリイのＬＡＦ１遺伝子（遺伝子名は、サッカロミセス・セレヴィジエにおいて２つのセラミダーゼシンターゼサブユニットをコードする遺伝子名ＬＡＣ１およびＬＡＧ１と類似するよう選択された。これらは、ピキア・シフェリイを含む全ての他の酵母においても存在するＬＡＧ１遺伝子の重複の結果である。ピキア・シフェリイを含む他の酵母における第２のセラミダーゼシンターゼは、ＬＡＣ１およびＬＡＧ１のオルソログよりもむしろパラログであり、サッカロミセス・セレヴィジエには明らかに存在しない。したがって、ＬＡＦ１の表記が選択された。）の内部部分の増幅において、様々なサッカロミセス亜門からのＬａｆ１ｐタンパク質の多重配列アラインメント由来の縮重オリゴヌクレオチドは機能しなかったため、我々は、ほとんどのサッカロミセス亜門の種において、サイクリンＣをコードするＳＳＮ８遺伝子がＬＡＦ１遺伝子の上流に位置するという事実を利用した。まず、サッカロミセス亜門種からのサイクリンＣのアミノ酸配列を、完全および未完成の真核生物ゲノムのＮＣＢＩのデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｕｔｉｌｓ／ｇｅｎｏｍ＿ｔａｂｌｅ．ｃｇｉ）から、アシュビア・ゴシッピーＳｓｎ８ｐ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＡＡＳ５１７１３）を鋳型としてＴＢＬＡＳＴＮ検索を実行することによって、抽出した。ＣｌｕｓｔａｌＷプログラム（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）を用いて抽出配列（全て＜２ｘ１０−５２のＥ値を有する）を配置した。ピキア・シフェリイのＳＳＮ８遺伝子の内部部分の増幅のために適切なヌクレオチドは、ピキア・シフェリイのコドン使用頻度が高度にバイアスを受けていることを考慮し、Ｓｓｎ８ｐ配列において高度に保存された一続きのアミノ酸を逆翻訳することにより得られた。その後、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（独国エーバースベルク所在）が以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
ＰｃＳＳＮ８−ｄｅｇ−ｆｗ３：
GAA GAA TGT CCW CAA CAT ATH MGW（配列番号３中のｎｔ１−２４）
ＰｃＳＳＮ８−ｄｅｇ−ｒｖ２：
YAA YAA CTG YAA ATC WGT DAT （配列番号３中のｎｔ６２８−６０８）
【０１２１】
上記オリゴヌクレオチドは、製造元の説明書に従ってＰｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックス（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ社、カタログ＃Ｆ−５３１Ｌ）とともに、Ｉｎｎｉｓら（「ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９０年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社）によるＰＣＲ反応をセットアップするのに用いた。この方法を適用することによって、３９３ｂｐの断片を入手できた。製造元の説明書に従ってＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社、カタログ＃２８６０６）を用いて、この断片を精製した。
【０１２２】
（ピキア・シフェリイのＳＳＮ８遺伝子の内部部分のＤＮＡ配列の決定）
Ｓａｎｇｅｒらが開発したジデオキシ法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．、７４：５４６３−５４６７）を用いて、精製ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を決定した。配列決定プライマーとして、ＰＣＲ増幅に用いたものを使用した。ＤＮＡ配列決定は、Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ社（独国ファーターシュテッテン所在）により行われた。得られた配列情報（３３９ｂｐ、配列番号３中のｎｔ１−３３９に対応；図８Ａ）を、クローンマネージャー７ソフトウェア（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＆Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてタンパク質に翻訳し、得られたアミノ酸配列を、ＮＣＢＩの重複のないタンパク質データベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）によるＢＬＡＳＴＰ探索の鋳型として用いた。探索の結果、カンジダ・アルビカンスのＳｓｎ８ｐ（ＮＣＢＩアクセッション＃ＥＡＫ９７６０１）が、データベースにおいて新規な配列と最も類似するタンパク質であると同定され、ピキア・シフェリイのＳＳＮ８オルソログの部分が実際に増幅されたことが確認された。
【０１２３】
（ピキア・シフェリイのＬＡＦ１遺伝子の増幅およびそのＤＮＡ配列の決定）
保存的構成の場合にはＳＳＮ８遺伝子の下流に位置するであろう、ピキア・シフェリイのＬＡＦ１遺伝子のＤＮＡ配列（コード配列、プロモーター領域および３’−非翻訳領域）を決定するために、逆ＰＣＲ法に従った。ピキア・シフェリイＦ−６０−１０Ａ  ＮＲＲＬ  １０３１からの染色体ＤＮＡ（３００ｎｇ）（実施例４に記載の通りに単離）を、製造元の説明書に従って、全体積５０μｌ中で、ＨａｅＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｒ０１０８Ｓ）により一晩消化した。製造元の説明書に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社、カタログ＃２８１０６）を用いて、この消化ＤＮＡを精製した。溶出ＤＮＡ（５０μｌ）を、製造元の説明書に従って、全体積２００μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ８００Ｕで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｍ０２０２Ｌ）を用いて一晩ライゲーションした。製造元の説明書に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、このライゲートＤＮＡを精製した。溶出物の２．５μｌを、Ｉｎｎｉｓら（「ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９０年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社）による逆ＰＣＲ反応の鋳型として用いた。これには、ピキア・シフェリイのＳＳＮ８遺伝子の既知の部分に標的化した２つのオリゴヌクレオチドを適用した：
ＰｃＳＳＮ８−ｄｓ−ｆｗ：
GCT GGT CAA TTA TAA ATG ATA GTT ATG （配列番号３中のｎｔ２９３−３１９）
ＰｃＳＳＮ８−ｄｓ−ｒｖ：
GTT ATT GCT ATT ATT ATT ATG ATT ATG ACC （配列番号３中のｎｔ２４０−２１１）
【０１２４】
製造元の説明書に従って、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックスを用いて増幅を行った。この手順を用いて１．８ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。製造元の説明書に従って、ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル溶出キット（Ｑｉａｇｅｎ社、カタログ＃２８６０６）を用いて、この断片を精製した。この断片のＤＮＡ配列を、前記のとおり、オリゴヌクレオチドＰｃＳＳＮ８−ｄｓ−ｆｗおよびＰｃＳＳＮ８−ｄｓ−ｒｖを配列決定プライマーとして用いて決定した。新たに得られた配列情報は、配列番号３中のｎｔ３４０−１８００をカバーした。３’ＨａｅＩＩＩ部位がＬＡＦ１遺伝子と共に位置しているため（図８Ａ）、ＬＡＦ１遺伝子を完全に増幅することができなかった。ピキア・シフェリイＬＡＦ１遺伝子のコード領域の３’末端、およびその３’−非翻訳領域のＤＮＡ配列を得るために、別ラウンドの逆ＰＣＲを行う必要があった。従って、ピキア・シフェリイ染色体ＤＮＡの消化にＭｐｈ１１０３Ｉ（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、カタログ＃ＥＲ０７３１）を用い、逆ＰＣＲ中に、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（独国エーバースベルク所在）により合成された以下のオリゴヌクレオチドを適用した以外は、上記の実験プロトコルを繰り返した。
ＰｃＬＡＧ１−ｄｓ−ｆｗ：
GTT GGA TCT TGG TTA TAT TAT CAT TCA TC （配列番号３中のｎｔ１７３８−１７６６）
ＰｃＬＡＧ１−ｄｓ−ｒｖ：
TGT TCC ATA AAT CTT TGT TTA TCC TTT TGT G （配列番号３中のｎｔ１７００−１６７０）
【０１２５】
この手順を用いて２．５ｋｂｐのＰＣＲ産物を入手した。製造元の説明書に従って、ＭｉｎＥｌｕｔｅＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。この断片のＤＮＡ配列を、実施例５に記載のとおり、オリゴヌクレオチドＰｃＬＡｇ１−ｄｓ−ｆｗ、ＰｃＬＡｇ１−ｄｓ−ｒｖおよび
ＤＢｏ−ＰｃＬＡＧ１ｄｓｆｗ２：
TTA AAC CCA AAT AAA CCT GG （配列番号３中のｎｔ２６２０−２６３９）
を配列決定プライマーとして用いて決定した。３’ ＨａｅＩＩＩ部位の下流から次のＭｐｈ１１０３Ｉ制限部位まで延びる、２３９６ｂｐの新たな配列情報（配列番号３中のｎｔ１８０１−４１９５）を得ることができた（図８Ｂ）。記載した３ステップの手順を用いて、全４１９５ｂｐのピキア・シフェリイＬＡＦ１遺伝子座を単離し、そのＤＮＡ配列を決定することができた（配列番号３および図８参照）。
【０１２６】
図８Ｃに描かれたピキア・シフェリイＬＡＦ１遺伝子座は、３８５アミノ酸のピキア・シフェリイＬａｆ１ｐタンパク質をコードする（配列番号４）。ピキア・シフェリイＬａｆ１ｐは、クリュイベロミセス・ラクティスからの予測セラミドシンターゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＸＰ＿４５２１３２）およびアシュビア・ゴシッピーからの予測セラミドシンターゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＡＡＳ５１７１４）と、それぞれ６４％（８０％）および６５％（７９％）の位置アミノ酸同一性（類似性）を有する。
【０１２７】
実施例７
（ピキア・シフェリイのＹＸＣ１遺伝子ヌクレオチド配列のクローニングおよび決定）
（ピキア・シフェリイのＹＸＣ１遺伝子の内部部分の増幅）
まず、サッカロミセス亜門種からの推測セラミダーゼのアミノ酸配列を、完全および未完成の真核生物ゲノムのＮＣＢＩのデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｕｔｉｌｓ／ｇｅｎｏｍ＿ｔａｂｌｅ．ｃｇｉ）から、アシュビア・ゴシッピーＹＸＣ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＮＰ＿９８６８６５）を鋳型としてＴＢＬＡＳＴＮ検索を実行することによって、抽出した。このタンパク質は、特徴づけされたサッカロミセス・セレヴィジエからのセラミダーゼＹｐｃ１ｐおよびＹｄｃ１ｐと非常に類似していた（それぞれ４３％および４４％の位置アミノ酸同一性）（Ｍａｏら、２０００年、ａ，ｂ）。したがって、それらはセラミダーゼ活性を有する可能性が非常に高い。ＣｌｕｓｔａｌＷプログラム（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）を用いて抽出配列（全て＜１ｘ１０−４３のＥ値を有する）を配置した。ピキア・シフェリイのＹＸＣ１遺伝子（遺伝子名は、サッカロミセス・セレヴィジエにおいて２つのセラミダーゼをコードする遺伝子名ＹＰＣ１およびＹＤＣ１と類似するよう選択され、ここで、２番目の文字は、対応する酵素において好ましい基質、フィトセラミドおよびジヒドロセラミドを示す。ピキア・シフェリイを含む他の酵母において存在する単一のセラミダーゼの基質選択性は知られていないため、ＹＸＣ１とする。）の内部部分の増幅のために適切なヌクレオチドは、ピキア・シフェリイのコドン使用頻度が高度にバイアスを受けていることを考慮し、Ｙｘｃ１ｐ配列において高度に保存された一続きのアミノ酸を逆翻訳することにより得られた。その後、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（独国エーバースベルク所在）が以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
ＡＣＥＲ−ｄｅｇ−ｆｗ：
ATY GAT TGG TGT GAA GAA AAY TAY GT （配列番号７中のｎｔ９９５−１０２０）
ＡＣＥＲ−ｄｅｇ−ｒｖ−Ｌ２：
ACC DGT YAA NAH ATG CCA CCA ACC ATG （配列番号７中のｎｔ１６３３−１６０７）
【０１２８】
上記オリゴヌクレオチドは、製造元の説明書に従ってＰｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックス（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ社、カタログ＃Ｆ−５３１Ｌ）とともに、Ｉｎｎｉｓら（「ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９０年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社）によるＰＣＲ反応をセットアップするのに用いた。この方法を適用することによって、６３９ｂｐの断片を入手できた。製造元の説明書に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社、カタログ＃２８７０６）を用いて、この断片を精製した。
【０１２９】
（ピキア・シフェリイのＹＸＣ１遺伝子の内部部分のＤＮＡ配列の決定）
Ｓａｎｇｅｒらが開発したジデオキシ法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．、７４：５４６３−５４６７）を用いて、精製ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を決定した。配列決定プライマーとして、ＰＣＲ増幅に用いたものを使用した。ＤＮＡ配列決定は、Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ社（独国ファーターシュテッテン所在）により行われた。得られた配列情報（６３９ｂｐ、配列番号７中のｎｔ９９５−１６３３に対応；図９Ａ）を、クローンマネージャー７ソフトウェア（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＆Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてタンパク質に翻訳し、得られたアミノ酸配列を、ＮＣＢＩの重複のないタンパク質データベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）によるＢＬＡＳＴＰ探索の鋳型として用いた。探索の結果、デバリオマイセス・ハンセニイのＹｘｃ１ｐ（ＮＣＢＩアクセッション＃ＸＰ＿４５７６３７）が、データベースにおいて新規な配列と最も類似するタンパク質として同定され、ピキア・シフェリイのＹＸＣ１オルソログの部分が実際に増幅されたことが確認された。
【０１３０】
（ピキア・シフェリイの全ＹＸＣ１遺伝子の増幅およびそのＤＮＡ配列の決定）
ピキア・シフェリイの全ＹＸＣ１遺伝子（コード配列、プロモーター領域および３’−非翻訳領域）のＤＮＡ配列を決定するために、逆ＰＣＲ法に従った。ピキア・シフェリイＦ−６０−１０Ａ  ＮＲＲＬ  １０３１からの染色体ＤＮＡ（３００ｎｇ）（実施例４に記載の通りに単離）を、製造元の説明書に従って、全体積５０μｌ中で、ＤｒａＩ（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、カタログ＃ＥＲ０２２１）により一晩消化した。製造元の説明書に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社、カタログ＃２８１０６）を用いて、この消化ＤＮＡを精製した。溶出ＤＮＡ（５０μｌ）を、製造元の説明書に従って、全体積２００μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ８００Ｕで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｍ０２０２Ｌ）を用いて一晩ライゲーションした。製造元の説明書に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、このライゲートＤＮＡを精製した。溶出物の２．５μｌを、Ｉｎｎｉｓら（「ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９０年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社）による逆ＰＣＲ反応の鋳型として用いた。これには、ピキア・シフェリイのＹＸＣ１遺伝子の既知の部分に標的化した２つのオリゴヌクレオチドを適用した：
ＹＰＣ１−ＩＰＣＲ−１−ｆｗ：
GCT GGA TTT GCC ATG TTT TCT GC （配列番号７中のｎｔ１０８２−１１０４）
ＹＰＣ１−ＩＰＣＲ−１−ｒｖ：
GCT TCT GCA ATA TAT GGA GTC ACA AC （配列番号７中のｎｔ１０４４−１０２０）
【０１３１】
製造元の説明書に従って、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックスを用いて増幅を行った。この手順を用いて０．３ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。製造元の説明書に従って、ＭｉｎＥｌｕｔｅＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社、カタログ＃２８００６）を用いて、この断片を精製した。この断片のＤＮＡ配列を、前記のとおり、オリゴヌクレオチドＹＰＣ１−ＩＰＣＲ−１−ｆｗおよびＹＰＣ１−ＩＰＣＲ−１−ｒｖを配列決定プライマーとして用いて決定した。新たに得られた配列情報は、配列番号７中のｎｔ７９５−９９４をカバーした。３’ＤｒａＩ部位がこの部分のすぐ下流に位置しているため（図９Ａ）、このＤＮＡ配列の下流の新規な配列情報は得られなかった。ピキア・シフェリイＹＸＣ１遺伝子のコード領域の３’末端、およびその３’−非翻訳領域のＤＮＡ配列を得るために、別ラウンドの逆ＰＣＲを行う必要があった。従って、ピキア・シフェリイ染色体ＤＮＡの消化にＳａｕ３ＡＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｒ０１６９Ｓ）を用い、逆ＰＣＲ中に、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（独国エーバースベルク所在）により合成された以下のオリゴヌクレオチドを適用した以外は、上記の実験プロトコルを繰り返した。
ＰｃＹＰＣ１−ＩＰ−３−ｆｗ：
CAT GGT TGG TGG CAT DTN TTY ACH GG （配列番号７中のｎｔ１６０７−１６３２）
ＰｃＹＰＣ１−ＩＰ−３−ｒｖ：
CCA GAA AGG AAA ATA CCA ATT CCT TTA ATC ATT G （配列番号７中のｎｔ１５１２−１４７９）
【０１３２】
この手順を用いて０．４ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。製造元の説明書に従って、ＭｉｎＥｌｕｔｅＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。この断片のＤＮＡ配列を、前記のとおり、オリゴヌクレオチドＰｃＹＰＣ１−ＩＰ−３−ｆｗおよびＰｃＹＰＣ１−ＩＰ−３−ｒｖを配列決定プライマーとして用いて決定した。３’ＤｒａＩ部位の下流から次のＳａｕ３ＡＩ制限部位まで延びる、１５３ｂｐの新たな配列情報（配列番号７中のｎｔ１６３４−１７８７）を得ることができた（図９Ｂ）。ピキア・シフェリイＹＸＣ１の上流領域について、さらなる情報を得るために、別ラウンドの逆ＰＣＲを行う必要があった。従って、ピキア・シフェリイ染色体ＤＮＡの消化にＢｓｅＭＩ（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、カタログ＃ＥＲ１２６１）を用い、逆ＰＣＲ中に、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（独国エーバースベルク所在）により合成された以下のオリゴヌクレオチドを適用した以外は、上記の実験プロトコルを繰り返した。
ＰｃＹＸＣ１−ｄｓ−ｆｗ：
GGG GAA ACA AGA TGA TTA TGA ATT G （配列番号７中のｎｔ１６８７−１７１１）
ＰｃＹＸＣ１−ｄｓ−ｒｖ：
CTA AAC CAG TTA AAA CAT GCC AC （配列番号７中のｎｔ１６３７−１６１５）
【０１３３】
この手順を用いて１．６ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。製造元の説明書に従って、ＭｉｎＥｌｕｔｅＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。この断片のＤＮＡ配列を、前記のとおり、オリゴヌクレオチドＰｃＹＸＣ１−ｄｓ−ｆｗおよびＰｃＹＸＣ１−ｄｓ−ｒｖを配列決定プライマーとして用いて決定した。３’Ｓａｕ３ＡＩ部位の下流から次のＢｓｅＭＩ制限部位まで延びる、６８４ｂｐの新たな配列情報（配列番号７中のｎｔ１７８８−２４６６）を得ることができた（図９Ｃ）。ピキア・シフェリイＹＸＣ１の上流領域について、さらなる情報を得るために、別ラウンドの逆ＰＣＲを行う必要があった。従って、ピキア・シフェリイ染色体ＤＮＡの消化にＡｖｒＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｒ０１７４Ｓ）を用い、逆ＰＣＲ中に、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（独国エーバースベルク所在）により合成された以下のオリゴヌクレオチドを適用した以外は、上記の実験プロトコルを繰り返した。
ＰｃＹＸＣ１−ｄｓ−ｆｗ２：
GGA GAG TTC ACG TAG TTT AGG AG （配列番号７中のｎｔ２４１７−２４３９）
ＰｃＹＸＣ１−ｄｓ−ｒｖ２：
GGA GTA TGA ATA CAT TGA TCC GAT AAT G （配列番号７中のｎｔ２３５８−２３３１）
【０１３４】
この手順を用いて５．５ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。製造元の説明書に従って、ＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。この断片のＤＮＡ配列の一部を、前記のとおり、オリゴヌクレオチドＰｃＹＸＣ１−ｄｓ−ｆｗ２を配列決定プライマーとして用いて決定した。９３７ｂｐの新たな配列情報（配列番号７中のｎｔ２４６７−３４０２）を得ることができた（図９Ｄ）。ピキア・シフェリイＹＸＣ１の下流領域について、さらなる情報を得るために、別ラウンドの逆ＰＣＲを行う必要があった。従って、ピキア・シフェリイ染色体ＤＮＡの消化にＰａｇＩ（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、カタログ＃＃ＥＲ１２８１）を用い、逆ＰＣＲ中に、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（独国エーバースベルク所在）により合成された以下のオリゴヌクレオチドを適用した以外は、上記の実験プロトコルを繰り返した。
ＰｃＹＸＣ１−ｕｓ−ｆｗ：
GGA TAA TCA GTT TAC CAT CAA AAG （配列番号７中のｎｔ８３１−８５４）
ＰｃＹＸＣ１−ｕｓ−ｒｖ：
TAT TGA TAA ACA ATT GAT ATT AGA TTA G （配列番号７中のｎｔ８３０−８０３）
【０１３５】
この手順を用いておよそ４．０ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。製造元の説明書に従って、ＭｉｎＥｌｕｔｅＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。この断片のＤＮＡ配列の一部を、前記のとおり、オリゴヌクレオチドＰｃＹＸＣ１−ｕｓ−ｒｖを配列決定プライマーとして用いて決定した。７９４ｂｐの新たな配列情報（配列番号７中のｎｔ１−７９４）を得ることができた（図９Ｅ）。
【０１３６】
記載した６ステップの手順を用いて、全３４０２ｂｐのピキア・シフェリイＹＸＣ１遺伝子座を単離し、そのＤＮＡ配列を決定することができた（配列番号７および図９参照）。
【０１３７】
図９Ｆに描かれたピキア・シフェリイＹＸＣ１遺伝子座は、２８４アミノ酸のピキア・シフェリイＹｘｃ１ｐタンパク質をコードする（配列番号８）。ピキア・シフェリイＹｘｃ１ｐは、デバリオマイセス・ハンセニイからの予測セラミダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＸＰ＿４５７６３７）およびサッカロミセス・セレヴィジエからの予測セラミダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＮＰ＿０１５２３８）と、それぞれ６１％（７５％）および４６％（６６％）の位置アミノ酸同一性（類似性）を有する。サッカロミセス・セレヴィジエからのＹｄｃ１ｐタンパク質は、生化学的に特徴づけされ、ｉｎ  ｖｉｖｏでセラミダーゼ活性を示すことが示されている（Ｍａｏら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７５：３１３６９−３１３７８）。
【０１３８】
実施例８
（ピキア・シフェリイのスフィンゴ脂質Δ８デサチュラーゼ遺伝子ヌクレオチド配列のクローニングおよび決定）
（ピキア・シフェリイのスフィンゴ脂質Δ８デサチュラーゼ遺伝子の内部部分の増幅）
まず、サッカロミセス亜門種からの推測スフィンゴ脂質Δ８デサチュラーゼのアミノ酸配列を、完全および未完成の真核生物ゲノムのＮＣＢＩのデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｕｔｉｌｓ／ｇｅｎｏｍ＿ｔａｂｌｅ．ｃｇｉ）から、アシュビア・ゴシッピーのスフィンゴ脂質Δ８デサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＡＡＳ５３２９３）を鋳型としてＴＢＬＡＳＴＮ検索を実行することによって、抽出した。このタンパク質は、特徴づけされたクリュイベロミセス・ラクティスからのスフィンゴ脂質Δ８デサチュラーゼと非常に類似していた（それぞれ６５％および５９％の位置アミノ酸同一性）（Ｔａｋａｋｕｗａら、２００２年）。したがって、スフィンゴ脂質Δ８デサチュラーゼ活性を有する可能性が非常に高い。ＣｌｕｓｔａｌＷプログラム（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）を用いて抽出配列（全て＜７ｘ１０−１２１のＥ値を有する）を配置した。ピキア・シフェリイのスフィンゴ脂質Δ８デサチュラーゼ遺伝子の内部部分の増幅のために適切なヌクレオチドは、ピキア・シフェリイのコドン使用頻度が高度にバイアスを受けていることを考慮し、スフィンゴ脂質Δ８デサチュラーゼ配列において高度に保存された一続きのアミノ酸を逆翻訳することにより得られた。その後、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（独国エーバースベルク所在）が以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
Ｄ８ＤＥＳ−ｆｗ：
5’-GAT GCW ACH GAT GAA ATG MAY GCW TAY C-3’ （配列番号５中のｎｔ２４３９−２４６６）
Ｄ８ＤＥＳ−ｒｖ：
5’-TTG RAA TTG YAA ACC ACC RTG NAA RAA ATC YAA CC-3’ （配列番号５中のｎｔ３８３９−３８０５）
【０１３９】
上記オリゴヌクレオチドは、製造元の説明書に従ってＰｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックス（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ社、カタログ＃Ｆ−５３１Ｌ）とともに、Ｉｎｎｉｓら（「ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９０年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社）によるＰＣＲ反応をセットアップするのに用いた。この方法を適用することによって、１４０１ｂｐの断片を入手できた。製造元の説明書に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社、カタログ＃２８７０６）を用いて、この断片を精製した。
【０１４０】
（ピキア・シフェリイの８ＤＥＳ遺伝子の内部部分のＤＮＡ配列の決定）
Ｓａｎｇｅｒらが開発したジデオキシ法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．、７４：５４６３−５４６７）を用いて、精製ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を決定した。配列決定プライマーとして、ＰＣＲ増幅に用いたものを使用した。ＤＮＡ配列決定は、Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ社（独国ファーターシュテッテン所在）により行われた。得られた配列情報（１４０１ｂｐ、配列番号５中のｎｔ２４３９−３８３９に対応；図１０Ａ）を、クローンマネージャー７ソフトウェア（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＆Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてタンパク質に翻訳し、得られたアミノ酸配列を、ＮＣＢＩの重複のないタンパク質データベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）によるＢＬＡＳＴＰ探索の鋳型として用いた。探索の結果、クリュイベロミセス・ラクティスのスフィンゴ脂質Δ８デサチュラーゼ（ＮＣＢＩアクセッション＃ＸＰ＿４５４８３２）が、データベースにおいて新規な配列と最も類似するタンパク質として「同定され、ピキア・シフェリイのスフィンゴ脂質Δ８デサチュラーゼをコードするオルソログの部分が実際に増幅されたことが確認された。
【０１４１】
（ピキア・シフェリイの全スフィンゴ脂質Δ８デサチュラーゼ遺伝子の増幅およびそのＤＮＡ配列の決定）
ピキア・シフェリイの全スフィンゴ脂質Δ８デサチュラーゼ遺伝子（コード配列、プロモーター領域および３’−非翻訳領域）のＤＮＡ配列を決定するために、逆ＰＣＲ法に従った。ピキア・シフェリイＦ−６０−１０Ａ  ＮＲＲＬ  １０３１からの染色体ＤＮＡ（３００ｎｇ）（実施例４に記載の通りに単離）を、製造元の説明書に従って、全体積５０μｌ中で、ＨｐｙＣＨ４Ｖ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｒ０６２０Ｓ）により一晩消化した。製造元の説明書に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社、カタログ＃２８１０６）を用いて、この消化ＤＮＡを精製した。溶出ＤＮＡ（５０μｌ）を、製造元の説明書に従って、全体積２００μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ８００Ｕで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ＃Ｍ０２０２Ｌ）を用いて一晩ライゲーションした。製造元の説明書に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、このライゲートＤＮＡを精製した。溶出物の２．５μｌを、Ｉｎｎｉｓら（「ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９０年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社）による逆ＰＣＲ反応の鋳型として用いた。これには、ピキア・シフェリイのスフィンゴ脂質Δ８デサチュラーゼ遺伝子の既知の部分に標的化した２つのオリゴヌクレオチドを適用した：
Ｄ８ＤＥＳ−ＩＰＣＲ−１−ｆｗ：
GGT GGG AAG TTC AGA ACT TTA GAA G （配列番号５中のｎｔ２５５３−２５７７）
Ｄ８ＤＥＳ−ＩＰＣＲ−１−ｒｖ：
TTG AAT AGG CGG CAC AAA ATT GAT CC （配列番号５中のｎｔ２５５２−２５２７）
【０１４２】
製造元の説明書に従って、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲマスターミックスを用いて増幅を行った。この手順を用いて０．６ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。製造元の説明書に従って、ＭｉｎＥｌｕｔｅＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社、カタログ＃２８００６）を用いて、この断片を精製した。この断片のＤＮＡ配列を、前記のとおり、オリゴヌクレオチドＤ８ＤＥＳ−ＩＰＣＲ−１−ｆｗ、Ｄ８ＤＥＳ−ＩＰＣＲ−１−ｒｖを配列決定プライマーとして用いて決定した。新たに得られた配列情報は、配列番号５中のｎｔ２１４２−２４３８をカバーした。ピキア・シフェリイのスフィンゴ脂質Δ８デサチュラーゼをコードする遺伝子の上流領域のさらなる情報を得るために、別ラウンドの逆ＰＣＲを行う必要があった。従って、ピキア・シフェリイ染色体ＤＮＡの消化にＶｓｐＩ（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、カタログ＃ＥＲ０９１１）を用い、逆ＰＣＲ中に、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（独国エーバースベルク所在）により合成された以下のオリゴヌクレオチドを適用した以外は、上記の実験プロトコルを繰り返した。
ＰｃＤ８ＤＩＰＣＲ−ＵＳ−ｆｗ：
GGG TCC TGT TGA AAA AAG CTA GG （配列番号５中のｎｔ２２２９−２２５１）
ＰｃＤ８ＤＩＰＣＲ−ＵＳ−ｒｖ：
CCA ACT GCT GGT TCA CCA AAA TAG （配列番号５中のｎｔ２２１１−２１８８）
【０１４３】
この手順方法を用いて３．４ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。製造元の説明書に従って、ＭｉｎＥｌｕｔｅＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。この断片のＤＮＡ配列を、前記のとおり、オリゴヌクレオチドＰｃＤ８ＤＩＰＣＲ−ＵＳ−ｆｗ；ＰｃＤ８ＤＩＰＣＲ−ＵＳ−ｒｖ；
ＤＢｏ−ＰｃＤ８Ｄ−ｕｓ−ｆｗ２：
TTA AAT GGT ATT TCC TTA GTG C （配列番号５中のｎｔ３１０９−３１３０）および
ＤＢｏ−ＰｃＤ８Ｄ−ｕｓ−ｒｖ２：
GAT TCA TCT TCC ATT ATC ATC TC （配列番号５中のｎｔ１３４３−１３２１）
を配列決定プライマーとして用いて決定した。３’ＶｓｐＩ部位の上流から次のＶｓｐＩ制限部位まで延びる、２１４１ｂｐの新たな配列情報（配列番号５中のｎｔ１−２１４１）を得ることができた（図１０Ｂ）。３’ＶｓｐＩ部位がこの部分のすぐ下流に位置しているため（図１０Ｂ）、このＤＮＡ配列の下流の新規な配列情報は得られなかった。ピキア・シフェリイのスフィンゴ脂質Δ８デサチュラーゼをコードする遺伝子のコード領域の３’末端、およびその３’−非翻訳領域のＤＮＡ配列を得るために、別ラウンドの逆ＰＣＲを行う必要があった。従って、ピキア・シフェリイ染色体ＤＮＡの消化にＰａｇＩ（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、カタログ＃ＥＲ１２８１）を用い、逆ＰＣＲ中に、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（独国エーバースベルク所在）により合成された以下のオリゴヌクレオチドを適用した以外は、上記の実験プロトコルを繰り返した。
ＰｃＤ８Ｄ−ｄｓ−ｆｗ：
AAA TAA GAA CAA CAA TGG AAT GTT G （配列番号５中のｎｔ３７６９−３７９３）
ＰｃＤ８Ｄ−ｄｓ−ｒｖ：
CTT TCT GAA GTT CCT AAA TCT G （配列番号５中のｎｔ３７５４−３７３３）
【０１４４】
この手順を用いて１．８ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。製造元の説明書に従って、ＭｉｎＥｌｕｔｅＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。この断片のＤＮＡ配列を、前記のとおり、オリゴヌクレオチドＰｃＤ８Ｄ−ｄｓ−ｆｗおよびＰｃＤ８Ｄ−ｄｓ−ｒｖを配列決定プライマーとして用いて決定した。３’ＶｓｐＩ部位の下流から次のＰａｇＩ制限部位まで延びる、１３１２ｂｐの新たな配列情報（配列番号５中のｎｔ３８４０−５１０６）を得ることができた（図１０Ｃ）。記載した４ステップの手順を用いて、全５１０６ｂｐのピキア・シフェリイのスフィンゴ脂質Δ８デサチュラーゼをコードする遺伝子座を単離し、そのＤＮＡ配列を決定することができた（配列番号５および図１０参照）。
【０１４５】
図１０Ｄに描かれたピキア・シフェリイ遺伝子座は、５９７アミノ酸のピキア・シフェリイのスフィンゴ脂質Δ８デサチュラーゼＰｃ８Ｄｅｓｐタンパク質をコードする（配列番号６）。ピキア・シフェリイのスフィンゴ脂質Δ８デサチュラーゼＰｃ８Ｄｅｓｐは、クリュイベロミセス・ラクティスからのスフィンゴ脂質Δ８デサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＸＰ＿４５４８３２）およびデバリオマイセス・ハンセニイからのスフィンゴ脂質Δ８デサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＸＰ＿４６１６１１）と、それぞれ６２％（７４％）および５７％（７０％）の位置アミノ酸同一性（類似性）を有する。クリュイベロミセス・ラクティスからのスフィンゴ脂質Δ８デサチュラーゼ８Ｄｅｓｐタンパク質は、生化学的に特徴づけされ、ｉｎ  ｖｉｖｏでスフィンゴ脂質Δ８−デルタ（８）−スフィンゴ脂質デサチュラーゼ活性を示すことが示されている（Ｔａｋａｋｕｗａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４５：４５９−４６１）。
【０１４６】
実施例９
（ピキア・シフェリイ酵素Ｌａｇ１ｐ、Ｌａｆ１ｐおよびＤｅｓ１ｐを同時に過剰生産するピキア・シフェリイ変異体の構築）
ピキア・シフェリイ酵素Ｌａｇ１ｐ、Ｌａｆ１ｐおよびＤｅｓ１ｐを過剰発現するシリンゴマイシンＥ耐性変異体を構築するために、我々はまず組込みＤＥＳ１発現ベクターを構築した。
【０１４７】
このために、ピキア・シフェリイＦ−６０−１０Ａ  ＮＲＲＬ  １０３１からの染色体ＤＮＡ（２００ｎｇ）（実施例４に記載の通りに単離）を、Ｉｎｎｉｓら（「ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９０年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社）によるＰＣＲの鋳型として用い、Ｐ．シフェリイのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ１）プロモーター領域を増幅した。これには以下のオリゴヌクレオチドを適用した。
ｐＧＡＰ−ＢｇｌＩＩ−ｆｏｒ：
5'-TAT ATA AGA TCT GTG GTA CCT ACA TAC AAT TGA CCC-3' （５’末端に、ＢｇｌＩＩ認識配列を含む）
ｐＧＡＰ−ＮｃｏＩ−ｒｅｖ：
5'-TAT ATA CCA TGG TTA ATT AAT TAT TTG TTT GTT TG-3' （５’末端に、ＮｃｏＩ認識配列を含む）
【０１４８】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＮｃｏＩで消化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って、）、５７５ｂｐ断片を得た。これを、それぞれ切断ｐＡＧ２５（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｔｈｒｅｅ  ｎｅｗ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，１９９９年，Ｙｅａｓｔ）にライゲートし、ｎａｔ１に縮合したＰ．シフェリイのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＴＤＨ３）のプロモーター領域を有するベクターｐＴＨ−ＧＡＰ−ｎａｔ１（３８９２ｂｐ）を生成した。挿入の方向性及び真正性は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ライゲーション、調製および化学的にコンピテントな大腸菌細胞の形質転換は、当業者に知られた手法により行った。
【０１４９】
ベクターへの組み込み部位としての遺伝子間スペーサーの挿入のために、ピキア・シフェリイのリボゾームＲＮＡオペロンの５Ｓ−２６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子間スペーサー（ＩＳ）をＰＣＲによって増幅した。ピキア・シフェリイＦ−６０−１０Ａ  ＮＲＲＬ  １０３１の染色体ＤＮＡ（２００ｎｇ）鋳型として、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ｐＩＳ−ＮｄｅＩ−ｆｏｒ：
5'-TAT ATA CAT ATG CTA ATC ACA ACA GAA CAT TCT CTA ACG-3' （５’末端に、ＮｄｅＩ認識配列を含む）
ｐＩＳ−ＮｄｅＩ−ｒｅｖ：
5'-TAT ATA CAT ATG GCT AGA TTG ACA GAA GTC GAT CAG-3' （５’末端に、ＮｄｅＩ認識配列を含む）
【０１５０】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。ベクターｐＴＨ−ＧＡＰ−ｎａｔ１およびＰＣＲ産物を、Ｎｄｅｌで消化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、続いてライゲーションによって、ベクターｐＴＨ−ＧＡＰ−ｎａｔ１−ＩＳ２（４８６４ｂｐ）を生成した。挿入の方向性及び真正性は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ライゲーション、調製および化学的にコンピテントな大腸菌細胞の形質転換は、当業者に知られた手法により行った。
【０１５１】
ベクターｐＴＨ−ＧＡＰ−ｎａｔ１−ＩＳ２の直線化のために単一のＰｍｅＩ認識配列を挿入する目的で、ベクターｐＴＨ−ＧＡＰ−ｎａｔ１−ＩＳ２を鋳型として用いて、ｐＴＨ−ＧＡＰ−ｎａｔ１−ＩＳ２に組み込まれたピキア・シフェリイのリボゾームＲＮＡオペロンの５Ｓ−２６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子間スペーサー（ＩＳ）の２つの断片を、ＰＣＲによって増幅した。断片１は、オリゴヌクレオチド：
ｐＩＳ−ＮｄｅＩ−ｒｅｖ：
5'-TAT ATA CAT ATG GCT AGA TTG ACA GAA GTC GAT CAG-3' （５’末端に、ＮｄｅＩ認識配列を含む）
ＰｍｅＩ−ｒｖ：
5'-CCC ATC CAC TAA GTT TAA ACA CCC ATA CAA AAT CGA GCT TCA AAT C-3' （５’末端に、ＰｍｅＩ−ｆｗ−オリゴヌクレオチドに対する２１ｂｐの相補配列およびＰｍｅＩ認識配列を含む）
を用いて増幅した。
【０１５２】
断片２は、オリゴヌクレオチド：
ｐ−ＩＳ−ＮｄｅＩ−ｆｏｒ：
5'-TAT ATA CAT ATG CTA ATC ACA ACA GAA CAT TCT CTA ACG-3' （５’末端に、ＮｄｅＩ認識配列を含む）
ＰｍｅＩ−ｆｗ：
5'-TGT TTA AAC TTA GTG GAT GGG AAA CCC TGT AGA ACT GGG ACA AAC-3'
を用いて増幅した。
【０１５３】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。最終的に、２つの一次ＰＣＲ産物各１０ｎｇを鋳型として、オリゴヌクレオチド：
ｐ−ＩＳ−ＮｄｅＩ−ｆｏｒ：
5'-TAT ATA CAT ATG CTA ATC ACA ACA GAA CAT TCT CTA ACG-3' （５’末端に、ＮｄｅＩ認識配列を含む）
ｐＩＳ−ＮｄｅＩ−ｒｅｖ：
5'-TAT ATA CAT ATG GCT AGA TTG ACA GAA GTC GAT CAG-3' （５’末端に、ＮｄｅＩ認識配列を含む）
とともにＰＣＲをセットアップすることによって、断片の、両端にＮｄｅｌ認識配列を有し、中間にＰｍｅＩ認識配列を有する、９７８ｂｐ断片が生成し、断片１および２の縮合物が得られた。
【０１５４】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。ＰＣＲ産物およびベクターｐＴＨ−ＧＡＰ−ｎａｔ１−ＩＳ２を、ＮｄｅＩで切断した（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）。ライゲーションを行い、ベクターｐＴＨ−ＧＡＰ−ｎａｔ１−ＩＳ２−ＰｍｅＩ（４８７９ｂｐ）が生成した。挿入の方向性及び真正性は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ライゲーション、調製および化学的にコンピテントな大腸菌細胞の形質転換は、当業者に知られた手法により行った。ピキア・シフェリイのピルベートデヒドロゲナーゼサブユニットＡ遺伝子（ＰＤＡ１）のプロモーター領域の制御下、ピキア・シフェリイのＤＥＳ１遺伝子を導入するために、ピキア・シフェリイＦ−６０−１０Ａ  ＮＲＲＬ  １０３１からの染色体ＤＮＡ（２００ｎｇ）をＰＣＲの鋳型として用い、以下のオリゴヌクレオチド：
ＤＥＳ１−ｆｗ：
5'-TAG AAG TTC CAG AAA CTA CTT TCC AAA CTT CAA AAT CAA CTT TAT TAT CAA TGG CTA CAA TTA CAC ATA GAA AAA ACC CTT CAC AAC-3' （５’末端に、ＰＤＡ１−ｒｖ−オリゴヌクレオチドに対する５０塩基の相補配列を含む）
ＤＥＳ１−ｒｖ：
5'-TAT ACT GCA GGC ATA TTG TCA ATT CTA TTG TAC TTG AGT ATT AAT GAT TA-3' （５’末端に、ＰｓｔＩ認識配列を含む）
とともに、ＤＥＳ１遺伝子を増幅した。
【０１５５】
これにより、ピキア・シフェリイのピルベートデヒドロゲナーゼサブユニットＡ遺伝子の（ＰＤＡ１）プロモーター領域が、以下のオリゴヌクレオチドとともに増幅された。
ＰＤＡ１−ｆｗ：
5'-TAT ACT GCA GTG TGC TCT AAA TTT GCC CGG TTC GCG ACG-3' （５’末端に、ＰｓｔＩ認識配列を含む）
ＰＤＡ１−ｒｖ：
5'-TGA TAA TAA AGT TGA TTT TGA AGT TTG GAA AGT AGT TTC TGG AAC TTC TA-3'
【０１５６】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。最終的に、ピキア・シフェリイのＤＥＳ１遺伝子およびＰＤＡ１プロモーター領域を含む２つのＰＣＲ産物各１０ｎｇと、オリゴヌクレオチド：
ＰＤＡ１−ｆｗ：
5'-TAT ACT GCA GTG TGC TCT AAA TTT GCC CGG TTC GCG ACG-3' （５’末端に、ＰｓｔＩ認識配列を含む）
ＤＥＳ１−ｒｖ：
5'-TAT ACT GCA GGC ATA TTG TCA ATT CTA TTG TAC TTG AGT ATT AAT GAT TA-3' （５’末端に、ＰｓｔＩ認識配列を含む）
とともにＰＣＲをセットアップすることによって、ＤＥＳ１遺伝子およびＰＤＡ１プロモーター領域の縮合物が得られた。
【０１５７】
この手順を用いて、２．２ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。ＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで消化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、ＰｓｔＩ切断ベクターｐＴＨ−ＧＡＰ−ｎａｔ１−ＩＳ２−ＰｍｅＩにライゲーションを行い、ベクターｐＴＨ／ＤＢ−００２ａ．１．が生成した。挿入の方向性及び真正性は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ライゲーション、調製および化学的にコンピテントな大腸菌細胞の形質転換は、当業者に知られた手法により行った。
【０１５８】
ヌーセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）耐性カセットをシクロヘキシミド耐性付与カセットによって置換するために、ベクターｐＴＨ／ＤＢ−００２ａ．１を、ＳａｃＩおよびＳａｌＩによる消化に供した（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）。ヌーセオスリシン耐性カセットを有さない５６６７ｂｐベクターバックボーンを、製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いてゲル精製した。
【０１５９】
シクロヘキシミド耐性付与カセットを生成するために、ピキア・シフェリイＦ−６０−１０Ａ  ＮＲＲＬ  １０３１のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、ＰＣＲによって２つの断片を増幅した。断片１は、オリゴヌクレオチド：
ＰｃＬ４１−ＳａｌＩ−ｆｗ：
5'-TAT AGT CGA CGA ATT CTC TTA AAT GAT GTT GG-3'（５’末端に、ＳａｌＩ認識配列を含む）
ＰｃＬ４１−ｉｎｔｅｒｎａｌ−ｒｖ：
5'-GTT TTA GCT TTT TTA TGG AAA ACT tGT TTG GTT TGA CCA CCG TAA CCG G-3'（５’末端に、ＰｃＬ４１−内部−ｆｗ−オリゴヌクレオチドに対する４９塩基の相補配列を含み、点変異の変異（ＣからＡ）を挿入してＬ４１ｐのａａ５６をプロリンからグルタミンへ置換してシクロヘキシミド耐性を付与する）
を用いて増幅した。
【０１６０】
断片２は、オリゴヌクレオチド：
ＰｃＬ４１−ｉｎｔｅｒｎａｌ−ｆｗ：
5'-CCG GTT ACG GTG GTC AAA CCA AAC aAG TTT TCC ATA AAA AAG CTA AAA CTA CCA AAA AAG TTG TTT TAC G-3'
ＰｃＬ４１−ＳａｃＩ−ｒｖ：
5'-TAT AGA GCT CAA TTC CAA TGT TTT GAT CTG TC-3'（５’末端に、ＳａｃＩ認識配列を含む）
を用いて増幅した。
【０１６１】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。最終的に、２つのＰＣＲ産物各１０ｎｇと、オリゴヌクレオチド：
ＰｃＬ４１−ＳａｌＩ−ｆｗ：
5'-TAT AGT CGA CGA ATT CTC TTA AAT GAT GTT GG-3'（５’末端に、ＳａｌＩ認識配列を含む）
ＰｃＬ４１−ＳａｃＩ−ｒｖ：
5'-TAT AGA GCT CAA TTC CAA TGT TTT GAT CTG TC-3'（５’末端に、ＳａｃＩ認識配列を含む）
によりＰＣＲをセットアップすることによって、２つの断片の縮合物が得られた。
【０１６２】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、得られた１．９ｋｂｐ断片を精製した。ＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩおよびＳａｃＩで消化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、ベクターｐＴＨ／ＤＢ−００２ａ．１の５６６７ｂｐベクターバックボーンにライゲーションを行い（上記を参照）、ベクターｐＤＢ００７が生成した。挿入の方向性及び真正性は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ライゲーション、調製および化学的にコンピテントな大腸菌細胞の形質転換は、当業者に知られた手法により行った。
【０１６３】
ピキア・シフェリイのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼアイソザイム１（ＴＤＨ１）のプロモーター領域の制御下でピキア・シフェリイのＬＡＦ１遺伝子を導入するために、ピキア・シフェリイＦ−６０−１０Ａ  ＮＲＲＬ  １０３１の染色体ＤＮＡ（２００ｎｇ）を鋳型として用い、以下のオリゴヌクレオチド：
ＰｃＬＡＧ１−ｆｗ：
5'-CAA ACA AAC AAA CAA ATA ATT AAT TAA CAA TGA TTT CAA CTT CAA CAA ATT CAT CAT C-3'（５’末端に、ＰＧＡＰ−ｒｖ−オリゴヌクレオチドに対する２９塩基の相補配列を含む）
ＰｃＬＡＧ１−ｒｖ：
5'-CAG ACA AGT TTA ATA TAG ATA CTT AAA C-3'
とともにＰＣＲによりＬＡＦ１遺伝子を増幅した。
【０１６４】
これにより、ピキア・シフェリイのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼアイソザイム１（ＴＤＨ１）のプロモーター領域が、以下のオリゴヌクレオチドとともに増幅された。
ＰＧＡＰ−ＳｂｆＩ：
5'-TAT ATA CCT GCA GGT TAC CCA GTG GTA CCT ACA TAC-3'（５’末端に、ＳｂｆＩ認識配列を含む）
ＰＧＡＰ−ｒｖ：
5'-CAT TGT TAA TTA ATT ATT TGT TTG TTT GTT TG-3'
【０１６５】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。最終的に、ピキア・シフェリイのＬＡＦ１遺伝子およびＴＤＨ１プロモーター領域を含む２つのＰＣＲ産物各１０ｎｇと、オリゴヌクレオチド：
ＰＧＡＰ−ＳｂｆＩ：
5'-TAT ATA CCT GCA GGT TAC CCA GTG GTA CCT ACA TAC-3' （５’末端に、ＳｂｆＩ認識配列を含む）
ＰｃＬＡＧ１−ｒｖ：
5'-CAG ACA AGT TTA ATA TAG ATA CTT AAA C-3'
によりＰＣＲをセットアップすることによって、ＬＡＦ１遺伝子およびＴＤＨ１プロモーター領域の縮合物が得られた。
【０１６６】
この手順を用いて１．９ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。ＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼＳｂｆＩで消化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、ＳａｌＩにより消化したベクターｐＤＢ００７（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）にライゲーションを行い、次いで、ＤＮＡポリメラーゼＩによりクレノーフィルインを行い（製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、ＳｂｆＩにより消化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、ベクターｐＰＣ−ＤＥＳ１−ＰｃＬＡＦ１が生成した。挿入の方向性及び真正性は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ライゲーション、調製および化学的にコンピテントな大腸菌細胞の形質転換は、当業者に知られた手法により行った。
【０１６７】
ピキア・シフェリイのピルベートデヒドロゲナーゼサブユニットＡ遺伝子（ＰＤＡ１）のプロモーター領域の制御下、ピキア・シフェリイのＬＡＧ１遺伝子を導入するために、ピキア・シフェリイＦ−６０−１０Ａ  ＮＲＲＬ  １０３１の染色体ＤＮＡ（２００ｎｇ）をＰＣＲの鋳型として用い、以下のオリゴヌクレオチド：
ＰｃＬＡＣ１−ｆｗ：
5'-GAA ACT ACT TTC CAA ACT TCA AAA TCA ACT TTA TTA TCA ATG TCC ACT TCC AGA CCA CAG-3'（５’末端に、ＰＰＤＡ−ｒｖ−オリゴヌクレオチドに対する３９塩基の相補配列を含む）
ＰｃＬＡＣ１−ＢｓｉＷＩ−ｒｖ：
5'-TAT ACG TAC GTG GTA CAT ACG ATA TAA TCC ATG TAG-3'（５’末端に、ＢｓｉＷＩ認識配列を含む）
とともに、ＬＡＧ１遺伝子を増幅した。
【０１６８】
これにより、ピキア・シフェリイのピルベートデヒドロゲナーゼサブユニットＡ遺伝子（ＰＤＡ１）のプロモーター領域が、以下のオリゴヌクレオチドとともに増幅された。
ＰＰＤＡ−ＢｓｉＷＩ−ｆｗ−ｎｅｗ：
5'-TAT ACG TAC GGA CGC ACC GGC CAT TTT CAA AC-3'（５’末端に、ＢｓｉＷＩ認識配列を含む）
ＰＰＤＡ−ｒｖ：
5'- CAT TGA TAA TAA AGT TGA TTT TGA AGT TTG GAA AGT AGT TTC-3'
【０１６９】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。最終的に、ピキア・シフェリイのＬＡＧ１遺伝子およびＰＤＡ１プロモーター領域を含む２つのＰＣＲ産物各１０ｎｇと、オリゴヌクレオチド：
ＰＰＤＡ−ＢｓｉＷＩ−ｆｗ−ｎｅｗ：
5'-TAT ACG TAC GGA CGC ACC GGC CAT TTT CAA AC-3'（５’末端に、ＢｓｉＷＩ認識配列を含む）
ＰｃＬＡＣ１−ＢｓｉＷＩ−ｒｖ：
5'-TAT ACG TAC GTG GTA CAT ACG ATA TAA TCC ATG TAG-3'（５’末端に、ＢｓｉＷＩ認識配列を含む）
によりＰＣＲをセットアップすることによって、ＬＡＧ１遺伝子およびＰＤＡ１プロモーター領域の縮合物が得られた。
【０１７０】
この手順を用いて２．２ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。ＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼＢｓｉＷＩで消化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、ＢｓｉＷＩ切断ベクターｐＰＣ−ＤＥＳ１−ＰｃＬＡＦ１にライゲーションを行い、図１２に示すベクターｐＰＣ−ＤＥＳ１−ＰｃＬＡＦ１−ＰｃＬＡＧ１が生成した。挿入の方向性及び真正性は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ライゲーション、調製および化学的にコンピテントな大腸菌細胞の形質転換は、当業者に知られた手法により行った。
【０１７１】
ベクターｐＰＣ−ＤＥＳ１−ＰｃＬＡＦ１−ＰｃＬＡＧ１をＰｍｅＩで直線化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。
【０１７２】
実施例１０
（ピキア・シフェリイ酵素Ｄｅｓ１ｐおよびＬａｆ１ｐ、アシュビア・ゴシッピー酵素Ｌａｆ１ｐおよびＬａｇ１ｐ、ならびにマウスのアルカリ性セラミダーゼを、シリンゴマイシンＥ耐性ピキア・シフェリイ変異体中で同時に過剰生産するためのプラスミドの構築）
ピキア・シフェリイ酵素Ｄｅｓ１ｐおよびＬａｆ１ｐ、アシュビア・ゴシッピー酵素Ｌａｆ１ｐおよびＬａｇ１ｐ、ならびにマウスのアルカリ性セラミダーゼのコドン最適化形態を過剰生産するシリンゴマイシンＥ耐性変異体を構築するために、まず組込みＤＥＳ１発現ベクターを設計した。
【０１７３】
このために、ピキア・シフェリイＦ−６０−１０Ａ  ＮＲＲＬ  １０３１からの染色体ＤＮＡ（２００ｎｇ）を、Ｉｎｎｉｓら（「ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９０年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社）によるＰＣＲの鋳型として用い、Ｐ．シフェリイのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ１）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＡＦ０５３３００）のプロモーター領域を増幅した。これには以下のオリゴヌクレオチドを適用した。
ｐＧＡＰ−ＢｇｌＩＩ−ｆｏｒ：
5'-TAT ATA AGA TCT GTG GTA CCT ACA TAC AAT TGA CCC-3'（５’末端に、ＢｇｌＩＩ認識配列を含む）
ｐＧＡＰ−ＮｃｏＩ−ｒｅｖ：
5'-TAT ATA CCA TGG TTA ATT AAT TAT TTG TTT GTT TG-3'（５’末端に、ＮｃｏＩ認識配列を含む）
【０１７４】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＮｃｏＩで消化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って、）、５７５ｂｐ断片を得た。これを、それぞれ切断ｐＡＧ２５（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｔｈｒｅｅ  ｎｅｗ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，１９９９年，Ｙｅａｓｔ）にライゲートし、ｎａｔ１に縮合したＰ．シフェリイのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーター領域（ＴＤＨ３）を有するベクターｐＴＨ−ＧＡＰ−ｎａｔ１（３８９２ｂｐ）を生成した。挿入の方向性及び真正性は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ライゲーション、調製および化学的にコンピテントな大腸菌細胞の形質転換は、当業者に知られた手法により行った。
【０１７５】
ベクターへの組み込み部位としてのリボゾームｒＤＮＡ遺伝子間スペーサーの挿入のために、ピキア・シフェリイのリボゾームＲＮＡオペロン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＡＦ０５３３０１）の５Ｓ−２６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子間スペーサー（ＩＳ）をＰＣＲによって増幅した。ピキア・シフェリイＦ−６０−１０Ａ  ＮＲＲＬ  １０３１の染色体ＤＮＡ（２００ｎｇ）鋳型として、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ｐＩＳ−ＮｄｅＩ−ｆｏｒ：
5'-TAT ATA CAT ATG CTA ATC ACA ACA GAA CAT TCT CTA ACG-3' （５’末端に、ＮｄｅＩ認識配列を含む）
ｐＩＳ−ＮｄｅＩ−ｒｅｖ：
5'-TAT ATA CAT ATG GCT AGA TTG ACA GAA GTC GAT CAG-3' （５’末端に、ＮｄｅＩ認識配列を含む）
【０１７６】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。ベクターｐＴＨ−ＧＡＰ−ｎａｔ１およびＰＣＲ産物を、Ｎｄｅｌで消化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、続いてライゲーションを行い、ベクターｐＴＨ'ＧＡＰ−ｎａｔ１−ＩＳ２（４８６４ｂｐ）が生成した。挿入の方向性及び真正性は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ライゲーション、調製および化学的にコンピテントな大腸菌細胞の形質転換は、当業者に知られた手法により行った。
【０１７７】
ベクターｐＴＨ−ＧＡＰ−ｎａｔ１−ＩＳ２の直線化のために単一のＰｍｅＩ認識配列を挿入する目的で、ベクターｐＴＨ−ＧＡＰ−ｎａｔ１−ＩＳ２を鋳型として用いて、ｐＴＨ−ＧＡＰ−ｎａｔ１−ＩＳ２に組み込まれたピキア・シフェリイのリボゾームＲＮＡオペロン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＡＦ０５３３０１）の５Ｓ−２６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子間スペーサー（ＩＳ）の２つの断片を、ＰＣＲによって増幅した。断片１は、オリゴヌクレオチド：
ｐＩＳ−ＮｄｅＩ−ｒｅｖ：
5'-TAT ATA CAT ATG GCT AGA TTG ACA GAA GTC GAT CAG-3'（５’末端に、ＮｄｅＩ認識配列を含む）
ＰｍｅＩ−ｒｖ：
5'-CCC ATC CAC TAA GTT TAA ACA CCC ATA CAA AAT CGA GCT TCA AAT C-3'（５’末端に、ＰｍｅＩ−ｆｗ−オリゴヌクレオチドに対する２１ｂｐの相補配列およびＰｍｅＩ認識配列を含む）
を用いて増幅した。
【０１７８】
断片２は、オリゴヌクレオチド：
ｐ−ＩＳ−ＮｄｅＩ−ｆｏｒ：
5'-TAT ATA CAT ATG CTA ATC ACA ACA GAA CAT TCT CTA ACG-3'（５’末端に、ＮｄｅＩ認識配列を含む）
ＰｍｅＩ−ｆｗ：
5'-TGT TTA AAC TTA GTG GAT GGG AAA CCC TGT AGA ACT GGG ACA AAC-3'
【０１７９】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。最終的に、２つの一次ＰＣＲ産物各１０ｎｇを鋳型として、オリゴヌクレオチド：
ｐ−ＩＳ−ＮｄｅＩ−ｆｏｒ：
5'-TAT ATA CAT ATG CTA ATC ACA ACA GAA CAT TCT CTA ACG-3'（５’末端に、ＮｄｅＩ認識配列を含む）
ｐＩＳ−ＮｄｅＩ−ｒｅｖ：
5'-TAT ATA CAT ATG GCT AGA TTG ACA GAA GTC GAT CAG-3'（５’末端に、ＮｄｅＩ認識配列を含む）
とともにＰＣＲをセットアップすることによって、断片の両端にＮｄｅｌ認識配列を有し、中間にＰｍｅＩ認識配列を有する、９７８ｂｐ断片が生成し、断片１および２の縮合物が得られた。
【０１８０】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。ＰＣＲ産物およびベクターｐＴＨ−ＧＡＰ−ｎａｔ１−ＩＳ２を、ＮｄｅＩで切断した（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）。ライゲーションを行い、ベクターｐＴＨ−ＧＡＰ−ｎａｔ１−ＩＳ２−ＰｍｅＩ（４８７９ｂｐ）が生成した。挿入の方向性及び真正性は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ライゲーション、調製および化学的にコンピテントな大腸菌細胞の形質転換は、当業者に知られた手法により行った。
【０１８１】
ピキア・シフェリイのピルベートデヒドロゲナーゼサブユニットＡ遺伝子（ＰＤＡ１）のプロモーター領域（配列番号２７）の制御下、ピキア・シフェリイのＤＥＳ１遺伝子（配列番号２６）を導入するために、ピキア・シフェリイＦ−６０−１０Ａ  ＮＲＲＬ  １０３１の染色体ＤＮＡ（２００ｎｇ）をＰＣＲの鋳型として用い、以下のオリゴヌクレオチド：
ＤＥＳ１−ｆｗ：
5'-TAG AAG TTC CAG AAA CTA CTT TCC AAA CTT CAA AAT CAA CTT TAT TAT CAA TGG CTA CAA TTA CAC ATA GAA AAA ACC CTT CAC AAC-3'（５’末端に、ＰＤＡ１−ｒｖ−オリゴヌクレオチドに対する５０塩基の相補配列を含む）
ＤＥＳ１−ｒｖ：
5'-TAT ACT GCA GGC ATA TTG TCA ATT CTA TTG TAC TTG AGT ATT AAT GAT TA-3'（５’末端に、ＰｓｔＩ認識配列を含む）
とともに、ＤＥＳ１遺伝子（配列番号２６）を増幅した。
【０１８２】
これにより、ピキア・シフェリイのピルベートデヒドロゲナーゼサブユニットＡ遺伝子の（ＰＤＡ１）プロモーター領域（配列番号２７）が、以下のオリゴヌクレオチドとともに増幅された。
ＰＤＡ１−ｆｗ：
5'-TAT ACT GCA GTG TGC TCT AAA TTT GCC CGG TTC GCG ACG-3'（５’末端に、ＰｓｔＩ認識配列を含む）
ＰＤＡ１−ｒｖ：
5'-TGA TAA TAA AGT TGA TTT TGA AGT TTG GAA AGT AGT TTC TGG AAC TTC TA-3'
【０１８３】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。最終的に、ピキア・シフェリイのＤＥＳ１遺伝子およびＰＤＡ１プロモーター領域を含む２つのＰＣＲ産物各１０ｎｇと、オリゴヌクレオチド：
ＰＤＡ１−ｆｗ：
5'-TAT ACT GCA GTG TGC TCT AAA TTT GCC CGG TTC GCG ACG-3'（５’末端に、ＰｓｔＩ認識配列を含む）
ＤＥＳ１−ｒｖ：
5'-TAT ACT GCA GGC ATA TTG TCA ATT CTA TTG TAC TTG AGT ATT AAT GAT TA-3'（５’末端に、ＰｓｔＩ認識配列を含む）
によりＰＣＲをセットアップすることによって、ＤＥＳ１遺伝子およびＰＤＡ１プロモーター領域の縮合物が得られた。
【０１８４】
この手順を用いて２．２ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。次いでＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで消化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、ＰｓｔＩ切断ベクターｐＴＨ−ＧＡＰ−ｎａｔ１−ＩＳ２−ＰｍｅＩにライゲーションを行い、ベクターｐＴＨ／ＤＢ−００２ａ．１が生成した。挿入の方向性及び真正性は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ライゲーション、調製および化学的にコンピテントな大腸菌細胞の形質転換は、当業者に知られた手法により行った。
【０１８５】
ヌーセオスリシン耐性カセットをシクロヘキシミド耐性付与カセットによって置換するために、ベクターｐＴＨ／ＤＢ−００２ａ．１を、ＳａｃＩおよびＳａｌＩで消化した（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）。ヌーセオスリシン耐性カセットを有さない５６６７ｂｐベクターバックボーンを、製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いてゲル精製した。
【０１８６】
シクロヘキシミド耐性付与カセットを生成するために、ピキア・シフェリイＦ−６０−１０Ａ  ＮＲＲＬ  １０３１のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、ピキア・シフェリイＬ４１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＡＦ０５３４５７）の２つの断片をＰＣＲによって増幅した。断片１は、オリゴヌクレオチド：
ＰｃＬ４１−ＳａｌＩ−ｆｗ：
5'-TAT AGT CGA CGA ATT CTC TTA AAT GAT GTT GG-3'（５’末端に、ＳａｌＩ認識配列を含む）
ＰｃＬ４１−ｉｎｔｅｒｎａｌ−ｒｖ：
5'-GTT TTA GCT TTT TTA TGG AAA ACT tGT TTG GTT TGA CCA CCG TAA CCG G-3'（５’末端に、ＰｃＬ４１−内部−ｆｗ−オリゴヌクレオチドに対する４９塩基の相補配列を含み、点変異の変異（ＣからＡ）を挿入してＬ４１ｐのａａ５６をプロリンからグルタミンへ置換してシクロヘキシミド耐性を付与する）
【０１８７】
断片２は、オリゴヌクレオチド：
ＰｃＬ４１−ｉｎｔｅｒｎａｌ−ｆｗ：
5'-CCG GTT ACG GTG GTC AAA CCA AAC AAG TTT TCC ATA AAA AAG CTA AAA CTA CCA AAA AAG TTG TTT TAC G-3'
ＰｃＬ４１−ＳａｃＩ−ｒｖ：
5'-TAT AGA GCT CAA TTC CAA TGT TTT GAT CTG TC-3'（５’末端に、ＳａｃＩ認識配列を含む）
を用いて増幅した。
【０１８８】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。最終的に、２つのＰＣＲ産物各１０ｎｇと、オリゴヌクレオチド：
ＰｃＬ４１−ＳａｌＩ−ｆｗ：
5'-TAT AGT CGA CGA ATT CTC TTA AAT GAT GTT GG-3' （５’末端に、ＳａｌＩ認識配列を含む）
ＰｃＬ４１−ＳａｃＩ−ｒｖ：
5'-TAT AGA GCT CAA TTC CAA TGT TTT GAT CTG TC-3'（５’末端に、ＳａｃＩ認識配列を含む）
によりＰＣＲをセットアップすることによって、２つの断片の縮合物が得られた。
【０１８９】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、得られた１．９ｋｂｐ断片を精製した。ＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩおよびＳａｃＩで消化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、ベクターｐＴＨ／ＤＢ−００２ａ．１の５６６７ｂｐベクターバックボーンにライゲーションを行い（上記を参照）、ベクターｐＤＢ００７が生成した。挿入の方向性及び真正性は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ライゲーション、調製および化学的にコンピテントな大腸菌細胞の形質転換は、当業者に知られた手法により行った。
【０１９０】
ピキア・シフェリイのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼアイソザイム１（ＴＤＨ１）のプロモーター領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＡＦ０５３３００）の制御下でアシュビア・ゴシッピーのＬＡＦ１遺伝子（配列番号１３）を導入するために、アシュビア・ゴシッピーＡＴＣＣ１９８９５の染色体ＤＮＡ（２００ｎｇ）を鋳型として用い、以下のオリゴヌクレオチド：
ＡｇＬＡＧ１−ｆｗ：
5'-CAA ACA AAC AAA CAA ATA ATT AAT TAA CAA TGT CGG GCC AAG TCA GGC AG-3'（５’末端に、オリゴヌクレオチドＰＧＡＰ−ｒｖに相補的な３２塩基配列を含む）
ＡｇＬＡＧ１−ｒｖ：
5'-CAT TAC CGA TCA CCA GGT AGG-3'
とともにＰＣＲによりＬＡＦ１遺伝子（配列番号１３）を増幅した。
【０１９１】
これにより、ピキア・シフェリイのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼアイソザイム１（ＴＤＨ１）のプロモーター領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＡＦ０５３３００）が、以下のオリゴヌクレオチドとともに増幅された。
ＰＧＡＰ−ＳｂｆＩ：
5'-TAT ATA CCT GCA GGT TAC CCA GTG GTA CCT ACA TAC-3'（５’末端に、ＳｂｆＩ認識配列を含む）
ＰＧＡＰ−ｒｖ：
5'-CAT TGT TAA TTA ATT ATT TGT TTG TTT GTT TG-3'
【０１９２】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。最終的に、アシュビア・ゴシッピーのＬＡＦ１遺伝子およびピキア・シフェリイのＴＤＨ１プロモーター領域を含む２つのＰＣＲ産物各１０ｎｇと、オリゴヌクレオチド：
ＰＧＡＰ−ＳｂｆＩ：
5'-TAT ATA CCT GCA GGT TAC CCA GTG GTA CCT ACA TAC-3'（５’末端に、ＳｂｆＩ認識配列を含む）
ＡｇＬＡＧ１−ｒｖ：
5'-CAT TAC CGA TCA CCA GGT AGG-3'
によりＰＣＲをセットアップすることによって、ＬＡＦ１遺伝子およびＴＤＨ１プロモーター領域の縮合物が得られた。
【０１９３】
この手順を用いて１．８ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。ＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼＳｂｆＩで消化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、ＳａｌＩにより消化したベクターｐＤＢ００７（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）にライゲーションを行い、次いで、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片によりクレノーフィルインを行い（製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、ＳｂｆＩにより消化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ、独国の説明書に従って）、ベクターｐＰＣ−ＤＥＳ１−ＡｇＬＡＦ１が生成した。挿入の方向性及び真正性は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ライゲーション、調製および化学的にコンピテントな大腸菌細胞の形質転換は、当業者に知られた手法により行った。
【０１９４】
ピキア・シフェリイのピルベートデヒドロゲナーゼサブユニットＡ遺伝子（ＰＤＡ１）のプロモーター領域（配列番号２７）の制御下、アシュビア・ゴシッピーのＬＡＧ１遺伝子（配列番号１１）を導入するために、アシュビア・ゴシッピーＡＴＣＣ１９８９５の染色体ＤＮＡ（２００ｎｇ）をＰＣＲの鋳型として用い、以下のオリゴヌクレオチド：
ＡｇＬＡＣ１−ｆｗ：
５'-GAA ACT ACT TTC CAA ACT TCA AAA TCA ACT TTA TTA TCA ATG GCT GAA AAT TCG TTA TTG AAG CCA C-3'（５’末端に、オリゴヌクレオチドＰＰＤＡ−ｒｖに相補的な４２塩基配列を含む）
ＡｇＬＡＣ１−ＢｓｉＷＩ−ｒｖ：
5'-TAT ACG TAC GGT GTA ATG GCG GTG GAA CAC-3'（５’末端に、ＢｓｉＷＩ認識配列を含む）
とともに、ＬＡＧ１遺伝子（配列番号１１）を増幅した。
【０１９５】
これにより、ピキア・シフェリイのピルベートデヒドロゲナーゼサブユニットＡ遺伝子（ＰＤＡ１）のプロモーター領域（配列番号２７）が、以下のオリゴヌクレオチドとともに増幅された。
ＰＰＤＡ−ＢｓｉＷＩ−ｆｗ−ｎｅｗ：
5'-TAT ACG TAC GGA CGC ACC GGC CAT TTT CAA AC-3' （５’末端に、ＢｓｉＷＩ認識配列を含む）
ＰＰＤＡ−ｒｖ：
5'-CAT TGA TAA TAA AGT TGA TTT TGA AGT TTG GAA AGT AGT TTC-3'
【０１９６】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。最終的に、アシュビア・ゴシッピーのＬＡＧ１遺伝子およびピキア・シフェリイのＰＤＡ１プロモーター領域を含む２つのＰＣＲ産物各１０ｎｇと、オリゴヌクレオチド：
ＰＰＤＡ−ＢｓｉＷＩ−ｆｗ−ｎｅｗ：
5'-TAT ACG TAC GGA CGC ACC GGC CAT TTT CAA AC-3' （５’末端に、ＢｓｉＷＩ認識配列を含む）
ＡｇＬＡＣ１−ＢｓｉＷＩ−ｒｖ：
5'-TAT ACG TAC GGT GTA ATG GCG GTG GAA CAC-3' （５’末端に、ＢｓｉＷＩ認識配列を含む）
によりＰＣＲをセットアップすることによって、ＬＡＧ１遺伝子およびＰＤＡ１プロモーター領域の縮合物が得られた。
【０１９７】
この手順を用いて２．１ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。次いでＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼＢｓｉＷＩで消化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、ＢｓｉＷＩ切断ベクターｐＰＣ−ＤＥＳ１−ＡｇＬＡＦ１にライゲーションを行い、図１１に示すベクターｐＰＣ−ＤＥＳ１−ＡｇＬＡＦ１−ＡｇＬＡＧ１が生成した。挿入の方向性及び真正性は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ライゲーション、調製および化学的にコンピテントな大腸菌細胞の形質転換は、当業者に知られた手法により行った。
【０１９８】
ベクターｐＰＣ−ＤＥＳ１−ＡｇＬＡＦ１−ＡｇＬＡＧ１をＰｍｅＩで直線化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、次いで、形質転換に先立って、製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて精製した。
【０１９９】
さらに、ピキア・シフェリイのＬＡＦ１遺伝子およびマウスのアルカリ性セラミダーゼのコドン最適化形態を有する、ピキア・シフェリイにおける発現に最適化した、第２のベクターを構築した。
【０２００】
このために、１００ｎｇのＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ  ＰＣＲ−Ｒｅａｄｙ  ｍｏｕｓｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃＤＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ社、米国テキサス州オースティン所在）を、ＰＣＲ反応の鋳型として用い、アルカリ性マウスセラミダーゼ（ｍＣＥＲ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＡＦ３４７０２３）のオープンリーディングフレームを増幅した。従って、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ｍＣＥＲ−ｆｗ：
5'-CAA ACA AAC AAA CAA ATA ATT AAT TAA CAA TGC ATG TAC CGG GCA CCA G-3'（５’末端に、オリゴヌクレオチドＰＧＡＰ−ｒｖに相補的な３２塩基配列を含む）
ｍＣＥＲ−ｒｖ：
5'-CGT TAT ATA GGA AAG CAC CGA AGC TAA ATT CAG CAG TTC TTG TCA TTC TC-3'（５’末端に、オリゴヌクレオチドＴＥＮＯ−ｆｗに対する２９塩基の相補配列を含む）
【０２０１】
これにより、Ｐ．シフェリイのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼアイソザイム１遺伝子（ＴＤＨ１）のプロモーター領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＡＦ０５３３００）が以下のオリゴヌクレオチド：
ＰＧＡＰ−ＳｂｆＩ：
5'-TAT ATA CCT GCA GGT TAC CCA GTG GTA CCT ACA TAC-3'（５’末端に、ＳｂｆＩ認識配列を含む）
ＰＧＡＰ−ｒｖ：
5'-CAT TGT TAA TTA ATT ATT TGT TTG TTT GTT TG-3'
とともに、増幅された。
【０２０２】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。最終的に、ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＣＥＲ遺伝子およびピキア・シフェリイのＴＤＨ１プロモーター領域を含む２つのＰＣＲ産物各１０ｎｇと、オリゴヌクレオチド：
ＰＧＡＰ−ＳｂｆＩ：
5'-TAT ATA CCT GCA GGT TAC CCA GTG GTA CCT ACA TAC-3' （５’末端に、ＳｂｆＩ認識配列を含む）
ｍＣＥＲ−ｒｖ：
5'-CGT TAT ATA GGA AAG CAC CGA AGC TAA ATT CAG CAG TTC TTG TCA TTC TC-3' （５’末端に、オリゴヌクレオチドＴＥＮＯ−ｆｗに相補的な２９塩基配列を含む）
とともにＰＣＲをセットアップすることによって、ｍＣＥＲ遺伝子およびＴＤＨ１プロモーター領域の縮合物が得られた。
【０２０３】
この手順を用いて１．４ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。
【０２０４】
ピキア・シフェリイのエノラーゼ遺伝子（ＥＮＯ１）ターミネーター領域（配列番号２８）を、事前に増幅したコンストラクトと縮合させるため、ＥＮＯ１のターミネーター領域を、まず以下のオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ＴＥＮＯ−ｆｗ：
5'-ATT TAG CTT CGG TGC TTT CCT ATA TAA CG-3'
ＴＥＮＯ−ｆｗ−ＳｂｆＩ：
5'-TAT ATA CCT GCA GGT TAT AAC GGT TGG GCA ATG TTG AG-3' （５’末端に、ＳｂｆＩ認識配列を含む）
【０２０５】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。最終的に、２つのＰＣＲ産物各１０ｎｇと、オリゴヌクレオチド：
ＰＧＡＰ−ＳｂｆＩ：
5'-TAT ATA CCT GCA GGT TAC CCA GTG GTA CCT ACA TAC-3' （５’末端に、ＳｂｆＩ認識配列を含む）
ＴＥＮＯ−ｆｗ−ＳｂｆＩ：
5'-TAT ATA CCT GCA GGT TAT AAC GGT TGG GCA ATG TTG AG-3' （５’末端に、ＳｂｆＩ認識配列を含む）
とともにＰＣＲ反応をセットアップすることによって、ＴＤＨ１プロモーター制御下のｍＣＥＲ遺伝子およびＥＮＯ１ターミネーター領域の縮合物が得られた。
【０２０６】
この手順を用いて１．８ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。次いでＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼ制限エンドヌクレアーゼＳｂｆＩで消化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、ＳｂｆＩ切断ベクターｐＤＢ００７にライゲートし、ベクターｐＰＣ−ＤＥＳ１−ｍＣＥＲが生成した。挿入の方向性及び真正性は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ライゲーション、調製および化学的にコンピテントな大腸菌細胞の形質転換は、当業者に知られた手法により行った。
【０２０７】
シクロヘキシミド耐性付与カセットをヌーセオスリシン耐性カセットによって置換するために、ベクターｐＰＣ−ＤＥＳ１−ｍＣＥＲを、ＳａｃＩおよびＳａｌＩで消化した（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）。シクロヘキシミド耐性カセットを有さない７４０３ｂｐベクターバックボーンを、製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いてゲル精製した。
【０２０８】
ヌーセオスリシン耐性付与カセットを生成するために、ＰＣＲによって３つの断片を増幅した。まず、ヌーセオスリシンに対する耐性を付与し、ピキア・シフェリイにおける発現に最適化したｎａｔ１遺伝子のコドン最適化形態（配列番号２９）を、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＧｍｂＨ（独国レーゲンスブルグ所在）から供給されたベクターｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ−ｎａｔ１を鋳型とし、以下のオリゴヌクレオチド
ｏｐｔ−ｎａｔ１−ｆｗ：
5'-CAA AAT CAA CTT TAT TAT CAA TGG GTA CTA CTT TAG ATG ATA C-3' （５’末端に、オリゴヌクレオチドＰＰＤＡ−ｒｖに相補的な２３塩基配列を含む）
ｏｐｔ−ｎａｔ１−ｒｖ：
5'-TCT TTT TAT TGT CAG TAC TGA TTA TTA TGG ACA TGG CAT TGA C-3'（５’末端に、２１塩基配列のオリゴヌクレオチドＴ−ＴＥＦ−ｆｗに相補的な２１塩基配列を含む）
を用いて増幅した。
【０２０９】
これにより、ピキア・シフェリイのピルベートデヒドロゲナーゼサブユニットＡ遺伝子の（ＰＤＡ１）プロモーター領域（配列番号２７）が、以下のオリゴヌクレオチドとともに増幅された。
ＰＰＤＡ−ＳａｌＩ−ｆｗ：
5'-TAT GTC GAC TGT GCT CTA AAT TTG CCC GGT TC-3' （５’末端に、ＳａｌＩ認識配列を含む）
ＰＰＤＡ−ｒｖ：
5'-CAT TGA TAA TAA AGT TGA TTT TGA AGT TTG GAA AGT AGT TTC-3'
【０２１０】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。最終的に、ｎａｔ１遺伝子およびピキア・シフェリイのＰＤＡ１プロモーター領域を含む２つのＰＣＲ産物各１０ｎｇと、オリゴヌクレオチド：
ＰＰＤＡ−ＳａｌＩ−ｆｗ：
5'-TAT GTC GAC TGT GCT CTA AAT TTG CCC GGT TC-3' （５’末端に、ＳａｌＩ認識配列を含む）
ｏｐｔ−ｎａｔ１−ｒｖ：
5'-TCT TTT TAT TGT CAG TAC TGA TTA TTA TGG ACA TGG CAT TGA C-3' （５’末端に、オリゴヌクレオチドＴ−ＴＥＦ−ｆｗに相補的な２１塩基配列を含む）
によりＰＣＲをセットアップすることによって、コドン最適化ｎａｔ１遺伝子およびＰＤＡ１プロモーター領域の縮合物が得られた。
【０２１１】
この手順を用いて１．３ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。
【０２１２】
アシュビア・ゴシッピーのＴＥＦターミネーター領域を、事前に増幅したコンストラクトと縮合させるため、アシュビア・ゴシッピーＡＴＣＣ１９８９５の染色体ＤＮＡ２００ｎｇを鋳型とし、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、アシュビア・ゴシッピーのＴＥＦターミネーター領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃Ａ２９８２０）を増幅した。
Ｔ−ＴＥＦ−ｆｗ：
5'-TCA GTA CTG ACA ATA AAA AGA TTC TTG-3'
Ｔ−ＴＥＦ−ＳａｃＩ−ｒｖ：
5'-TGA GCT CTC GAC ACT GGA TGG CGG CGT TAG-3' （５’末端に、ＳａｃＩ認識配列を含む）
【０２１３】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。最終的に、２つのＰＣＲ産物各１０ｎｇと、オリゴヌクレオチド：
ＰＰＤＡ−ＳａｌＩ−ｆｗ：
5'-TAT GTC GAC TGT GCT CTA AAT TTG CCC GGT TC-3' （５’末端に、ＳａｌＩ認識配列を含む）
Ｔ−ＴＥＦ−ＳａｃＩ−ｒｖ：
5'-TGA GCT CTC GAC ACT GGA TGG CGG CGT TAG-3' （５’末端に、ＳａｃＩ認識配列を含む）
とともにＰＣＲ反応をセットアップすることによって、ピキア・シフェリイのＰＤＡ１プロモーター制御下のｎａｔ１遺伝子およびアシュビア・ゴシッピーのＴＥＦターミネーター領域の縮合物が得られた。
【０２１４】
得られた１．５ｋｂｐの断片を、製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて精製した。次いで、ＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩおよびＳａｃＩで消化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、ベクターｐＰＣ−ＤＥＳ１−ｍＣＥＲの７４０３ｂｐベクターバックボーンにライゲートし（上記を参照）、ベクターｐ−ＰＣ−ＤＥＳ１−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１が生成した。挿入の方向性及び真正性は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ライゲーション、調製および化学的にコンピテントな大腸菌細胞の形質転換は、当業者に知られた手法により行った。
【０２１５】
ｍＣＥＲ遺伝子を、ピキア・シフェリイにおける発現に最適化された、遺伝子のコドン最適化形態（ｏｍＣＥＲ）によって置換するために、ベクターｐＰＣ−ＤＥＳ１−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１を、ＰａｃＩおよびＢｓｉＷＩで消化した（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）。ｍＣＥＲおよびＤＥＳ１遺伝子を有さない５５１４ｂｐベクターバックボーンを、製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いてゲル精製した。
【０２１６】
ピキア・シフェリイＥＮＯ１遺伝子のターミネーター領域を有するハツカネズミｏｍＣＥＲ遺伝子を導入するために、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＧｍｂＨ（独国レーゲンスブルグ所在）から供給されたベクターｐＵＣ−ｋａｎａ−ｍＣＥＲを鋳型とし、以下のオリゴヌクレオチド
ｏｐｔ−ｍＣＥＲ−ＰａｃＩ−ｆｗ：
5'-GGT ACC TTA ATT AAC AAT GCA TG-3' （５’末端に、ＰａｃＩ認識配列を含む）
ｏｐｔ−ｍＣＥＲ−ｒｖ：
5'-AGG AAA GCA CCG AAG CTA AAT TTA ACA ATT TTT ATC ATT TTC-3'（５’末端に、オリゴヌクレオチドＴＥＮＯ−ｆｗ−に相補的な２１塩基配列を含む）
を用いてｏｍＣＥＲ遺伝子（配列番号３０）を増幅した。
【０２１７】
これにより、ピキア・シフェリイＥＮＯ１のターミネーター領域（配列番号２８）遺伝子が、以下のオリゴヌクレオチドとともに増幅された。
ＴＥＮＯ−ｆｗ：
5'-ATT TAG CTT CGG TGC TTT CCT ATA TAA CG-3'
Ｔ−ＥＮＯ−ＢｓｉＷＩ−ｒｖ：
5'-TAC GTA CGT TAT AAC GGT TGG GCA ATG TTG-3' （５’末端に、ＢｓｉＷＩ認識配列を含む）
【０２１８】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。最終的に、ハツカネズミのＣＥＲ遺伝子とピキア・シフェリイのＥＮＯ１ターミネーター領域を含む２つのＰＣＲ産物各１０ｎｇと、オリゴヌクレオチド：
ｏｐｔ−ｍＣＥＲ−ＰａｃＩ−ｆｗ：
5'-GGT ACC TTA ATT AAC AAT GCA TG-3' （５’末端に、ＰａｃＩ認識配列を含む）
Ｔ−ＥＮＯ−ＢｓｉＷＩ−ｒｖ：
5'-TAC GTA CGT TAT AAC GGT TGG GCA ATG TTG-3' （５’末端に、ＢｓｉＷＩ認識配列を含む）
によりＰＣＲをセットアップすることによって、ｏｍＣＥＲ遺伝子およびＥＮＯ１ターミネーター領域の縮合物が得られた。
【０２１９】
この手順を用いて１．２ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。次いで、ＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼＰａｃＩおよびＢｓｉＷＩで消化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、ベクターｐＰＣ−ＤＥＳ１−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１の５５１４ｂｐベクターバックボーンにライゲートし（上記を参照）、ベクターｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１が生成した。挿入の方向性及び真正性は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ライゲーション、調製および化学的にコンピテントな大腸菌細胞の形質転換は、当業者に知られた手法により行った。
【０２２０】
ｏｍＣＥＲならびにＴＤＨ１プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＡＦ０５３３００）およびピキア・シフェリイのＥＮＯ１（配列番号２８）ターミネーター領域をの制御下の第２の遺伝子を過剰発現するベクターを構築するために、ＴＤＨ１プロモーターを、まずピキア・シフェリイＦ−６０−１０Ａ  ＮＲＲＬ  １０３１の染色体ＤＮＡを鋳型とし、以下のオリゴヌクレオチド
ＧＡＰＤＨ−ＳｐｅＩ−ｆｗ：
5'-TAT ATA ACT AGT TTA CCC AGT GGT ACC TAC ATA C-3' （５’末端に、ＳｐｅＩ認識配列を含む）
ＧＡＰＤＨ−ＣＯ−ｒｖ：
5'-CCC GGG ATT TAA ATG GCG CGC CGT TAA TTA ATT ATT TGT TTG TTT GTT TG-3'（５’末端に、オリゴヌクレオチドＥＮＯ−ＣＯ−ｆｗ−に相補的な２２塩基配列を含む）
を用いて増幅した。
【０２２１】
これにより、ピキア・シフェリイのＥＮＯ１遺伝子のターミネーター領域が、以下のオリゴヌクレオチドとともに増幅された。
ＥＮＯ−ＣＯ−ｆｗ：
5'-GGC GCG CCA TTT AAA TCC CGG GAT TTA GCT TCG GTG CTT TCC TA-3'
ＥＮＯ−ＳｐｅＩ−ｒｖ：
5'-TAT ATA CCG CGG TTA TAA CGG TTG GGC AAT GTT G-3' （５’末端に、ＳｐｅＩ認識部位を含む）
【０２２２】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。最終的に、２つのＰＣＲ産物各１０ｎｇと、オリゴヌクレオチド：
ＧＡＰＤＨ−ＳｐｅＩ−ｆｗ：
5'-TAT ATA ACT AGT TTA CCC AGT GGT ACC TAC ATA C-3' （５’末端に、ＳｐｅＩ認識配列を含む）
ＥＮＯ−ＳｐｅＩ−ｒｖ：
5'-TAT ATA CCG CGG TTA TAA CGG TTG GGC AAT GTT G-3' （５’末端に、ＳｐｅＩ認識配列を含む）
とともにＰＣＲ反応をセットアップすることによって、２つの断片の縮合物が得られた。
【０２２３】
このようにして、０．９ｋｂｐのＰＣＲ産物が得られた。この断片を、製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて精製した。次いで、ＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼＳｐｅＩで消化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、ＳｐｅＩ切断ベクターｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１にライゲートし、ピキア・シフェリイＴＤＨ１プロモーターがｎａｔ１発現カセットに発散的に(divergently)指向するベクターｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−Ｘ−Ｂが生成した。挿入の方向性及び真正性は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ライゲーション、調製および化学的にコンピテントな大腸菌細胞の形質転換は、当業者に知られた手法により行った。
【０２２４】
最終的にピキア・シフェリイのＬＡＦ１遺伝子（配列番号３）をｏｍＣＥＲ保持ベクターｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−Ｘ−Ｂに挿入するために、ピキア・シフェリイＦ−６０−１０Ａ  ＮＲＲＬ  １０３１の染色体ＤＮＡを鋳型とし、以下のオリゴヌクレオチド
ＰｃＬＡＦ１−ＨｐａＩ−ｆｗ：
5'-TAT ATA GTT AAC ATG ATT TCA ACT TCA ACA AAT TC-3' （５’末端に、ＨｐａＩ認識配列を含む）
ＰｃＬＡＦ１−ＸｍａＩ−ｒｖ：
5'-TAT ATA CCC GGG CTA ATC ATC ATC TTC ATC ATC-3' （５’末端に、ＸｍａＩ認識配列を含む）
を用いてＬＡＦ１遺伝子（配列番号３）を増幅した。
【０２２５】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。次いで、ＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼＨｐａＩおよびＸｍａＩで消化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、ＡｓｃＩで切断したベクターｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−Ｘ−Ｂにライゲートし（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、次いで、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーウ断片によりクレノーフィルインを行い（製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、ＸｍａＩにより消化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、図１２に示すベクターｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−ＰｃＬＡＦ１を製造した。挿入の方向性及び真正性は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ライゲーション、調製および化学的にコンピテントな大腸菌細胞の形質転換は、当業者に知られた手法により行った。
【０２２６】
ベクターｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−ＰｃＬＡＦ１をＰｍｅＩで直線化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、シリンゴマイシンＥ耐性ピキア・シフェリイ変異体における形質転換に先立って、製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて精製した。
【０２２７】
実施例１１
（ピキア・シフェリイ酵素Ｄｅｓ１ｐおよびＬａｇ１ｐ、アシュビア・ゴシッピー酵素Ｌａｆ１ｐおよびＬａｇ１ｐ、ならびにマウスのアルカリ性セラミダーゼを、シリンゴマイシンＥ耐性ピキア・シフェリイ変異体中で同時に過剰生産するためのプラスミドの構築）
ピキア・シフェリイＤｅｓ１ｐならびにアシュビア・ゴシッピーＬａｆ１ｐおよびＬａｇ１ｐの過剰発現のために、ベクターｐＰＣ−ＤＥＳ１−ＡｇＬＡＦ１−ＡｇＬＡＧ１を用いた（実施例１１参照）。さらに、ｏｍＣＥＲおよびピキア・シフェリイＬａｇ１ｐの過剰発現のためのベクターを構築した。
【０２２８】
このために、ピキア・シフェリイＬＡＧ１遺伝子（配列番号１）をｏｍＣＥＲ保持ベクターｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−Ｘ−Ｂに挿入した（実施例１１参照）。まず、ピキア・シフェリイＦ−６０−１０Ａ  ＮＲＲＬ  １０３１からの染色体ＤＮＡを鋳型とし、以下のオリゴヌクレオチドを用いてＬＡＧ１遺伝子（配列番号１）を増幅した。
ＰｃＬＡＧ１−ＥｃｏＲＶ−ｆｗ：
5'-TAT ATA GAT ATC ATG TCC ACT TCC AGA CCA CAG-3' （５’末端に、ＥｃｏＲＶ認識配列を含む）
ＰｃＬＡＧ１−ＸｍａＩ−ｒｖ：
5'-TAT ATA CCC GGG TTA TTC ACT CTT TTT TTC TTG-3' （５’末端に、ＸｍａＩ認識配列を含む）
【０２２９】
製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて、この断片を精製した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶおよびＸｍａＩで消化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って、）、ＡｓｃＩで切断したベクターｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−Ｘ−Ｂにライゲートし（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、次いで、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片によりクレノーフィルインを行い（製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、ＸｍａＩにより消化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、図１３に示すベクターｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−ＰｃＬＡＧ１が生成した。挿入の方向性及び真正性は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ライゲーション、調製および化学的にコンピテントな大腸菌細胞の形質転換は、当業者に知られた手法により行った。
【０２３０】
ベクターｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−ＰｃＬＡＧ１をＰｍｅＩで直線化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、シリンゴマイシンＥ耐性ピキア・シフェリイ変異体における形質転換に先立って、製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて精製した。
【０２３１】
実施例１２
（ピキア・シフェリイ酵素Ｄｅｓ１ｐ、アシュビア・ゴシッピー酵素Ｌａｆ１ｐおよびＬａｇ１ｐ、マウスのアルカリ性セラミダーゼのコドン最適化形態、ならびにコッコリスウイルスのセラミドシンターゼのコドン最適化形態を、シリンゴマイシンＥ耐性ピキア・シフェリイ変異体中で同時に過剰生産するためのプラスミドの構築）
ピキア・シフェリイＤｅｓ１ｐならびにアシュビア・ゴシッピーＬａｆ１ｐおよびＬａｇ１ｐの過剰発現のために、ベクターｐＰＣ−ＤＥＳ１−ＡｇＬＡＦ１−ＡｇＬＡＧ１を用いた（実施例１０参照）。さらに、ｏｍＣＥＲおよびコッコリスウイルスのセラミドシンターゼをコードするコドン最適化遺伝子（ｏＣｖＬＡＧ１）の過剰発現のための、ピキア・シフェリイにおける発現に最適化したベクターを構築した。
【０２３２】
このために、コッコリスウイルスのｏＣｖＬＡＧ１遺伝子（配列番号３１）をｏｍＣＥＲ保持ベクターｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−Ｘ−Ｂに挿入した（実施例１１参照）。まず、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＧｍｂＨ（独国レーゲンスブルグ所在）から供給されたベクターｐＧＡ４−ＣＶＬＡＧ１から、制限エンドヌクレアーゼＨｐａＩおよびＸｍａＩを用いて（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、ｏＣｖＬＡＧ１遺伝子（配列番号３１）を切りだし、ＳｗａＩおよびＸｍａＩにより切断したベクターｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−Ｘ−Ｂ（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）にライゲートし、図１４に示すベクターｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−ｏＣｖＬＡＧ１を製造した。挿入の方向性及び真正性は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ライゲーション、調製および化学的にコンピテントな大腸菌細胞の形質転換は、当業者に知られた手法により行った。
【０２３３】
ベクターｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−ｏＣｖＬＡＧ１をＰｍｅＩで直線化し（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）、シリンゴマイシンＥ耐性ピキア・シフェリイ変異体における形質転換に先立って、製造元の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを用いて精製した。
【０２３４】
実施例１３
（シリンゴマイシンＥ耐性ピキア・シフェリイ変異体における、ピキア・シフェリイの酵素Ｄｅｓ１ｐ、アシュビア・ゴシッピーの酵素Ｌａｆ１ｐおよびＬａｇ１ｐ、マウスアルカリ性セラミダーゼのコドン最適化形態、ならびにマウスセラミドシンターゼのコドン最適化形態の同時過剰生産用のプラスミドの構築）
ピキア・シフェリイのＤｅｓ１ｐ、アシュビア・ゴシッピーのＬａｆ１ｐおよびＬａｇ１ｐの過剰発現には、ベクターｐＰＣ−ＤＥＳ１−ＡｇＬＡＦ１−ＡｇＬＡＧ１を用いた（実施例１０を参照）。加えて、ｏｍＣＥＲ遺伝子およびコドン最適化されたマウスセラミドシンターゼ（ｏｍＬＡＳＳ５）の過剰発現用のベクターを構築した。
【０２３５】
このために、ｏｍＣＥＲ保持ベクターであるｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−Ｘ−Ｂに、マウスのｏｍＬＡＳＳ５遺伝子（配列番号３２）を挿入した（実施例１１を参照）。最初に、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＧｍｂＨ（独国レーゲンスブルク所在）販売のｐＵＫ−ｋａｎａ−ｏｍＬＡＳＳ５ベクターからｏｍＬＡＳＳ５遺伝子（配列番号３２）を制限エンドヌクレアーゼＨｐａＩおよびＸｍａＩ（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）で切り出し、ＡｓｃＩ（制限エンドヌクレアーゼの製造元の説明書に従って：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在）で切断されたｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−Ｘ−Ｂベクターにライゲートし、その後、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）を用いたクレノーフィルインと、ＸｍａＩ（制限エンドヌクレアーゼの製造元の説明書に従って：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在）での消化とを行い、図１５に示す、ｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−ｏｍＬＡＳＳ５ベクターを構築した。挿入断片の方向性および真正性はＤＮＡ配列決定によって判定した。ライゲーション、調製、および化学的コンピテント大腸菌細胞の形質転換は当業者に既知の方法で行った。
【０２３６】
ｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−ｏｍＬＡＳＳ５ベクターをＰｍｅＩ（制限エンドヌクレアーゼの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）で直線化し、その後、シリンゴマイシンＥ耐性ピキア・シフェリイ変異体の形質転換に先立って、製造元の説明書に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ社製ＰＣＲ精製キット（ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて精製した。
【０２３７】
実施例１４
（シリンゴマイシンＥ耐性ピキア・シフェリイ変異体の形質転換）
シリンゴマイシンＥ耐性ピキア・シフェリイ変異体の形質転換は、最近の記述（Ｂａｅら、「Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｐｈｉｎｇｏｉｄ  ｂａｓｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｙｅａｓｔ  Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ．」、２００３年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．；米国特許第６６３８７３５号）に従って行った。
【０２３８】
シリンゴマイシンＥ耐性ピキア・シフェリイ株（国際公開第２００６／０４８４５８号、図４のＳＹＲ２  １−２Ｃ）を、６００ｎｍの光学濃度が１〜１．５になるまで、ＹＰＤ培地上で培養した。この細胞を遠心法によって採取し、０．１培養容積の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中に再懸濁した。使用する前に、これに２５ｍＭジチオスレイトールを添加した。３７℃、１５分間のインキュベーションの後、１培養容積の氷冷安定化溶液［２７０ｍＭスクロース、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２］で２回、細胞を洗浄し、０．０１培養容積の安定化溶液中に再懸濁した。直線化されたｐＰＣ−ＤＥＳ１−ＡｇＬＡＦ１−ＡｇＬＡＧ１、ｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−ＰｃＬＡＦ１、ｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−ＰｃＬＡＧ１、ｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−ｏＣｖＬＡＧ１、またはｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−ｏｍＬＡＳＳ５ベクター５μｌ（１．６μｇのＤＮＡを含有する）を、細胞５０μｌと混合し、氷上で１０分間インキュベートした。その後、この形質転換混合物を２ｍｍエレクトロポレーションキュベット内に移した。エレクトロポレーションは、製造元の説明書に従って、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、独国ミュンヘン所在）を用いて、５００Ｖ、５０μＦ、および７００Ωで行った。エレクトロポレーションの後に、５００μｌの安定化溶液中に細胞を再懸濁し、２ｍｌのＹＰＤ培地を含有する培養試験管内に移した。３０℃、１分間あたり２５０回転で終夜、細胞を再生させた後、再生された培養物のアリコートを、１ｍｌあたり０．５μｇのシクロヘキシミド（ｐＰＣ−ＤＥＳ１−ＡｇＬＡＦ１−ＡｇＬＡＧ１）または１ｍｌあたり０．５μｇのシクロヘキシミドおよび５０μｇ／ｍｌヌーセオスリシン（既にｐＰＣ−ＤＥＳ１−ＡｇＬＡＦ１−ＡｇＬＡＧ１を含有し、ｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−ＰｃＬＡＦ１、ｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−ＰｃＬＡＧ１、ｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−ｏＣｖＬＡＧ１、またはｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−ｏｍＬＡＳＳ５で形質転換された株）を含有するＹＰＤプレート上にプレーティングした。３０℃での７日間のインキュベーションの後に、数ダースのコロニーが現れた。
【０２３９】
実施例１５
（スフィンゴイド塩基生合成遺伝子を過剰発現するシリンゴマイシンＥ耐性ピキア・シフェリイ変異体によるアセチル化スフィンゴシンの振とうフラスコ生産）
上述した遺伝子（ＰｃＤＥＳ１、ＡｇＬＡＦ１、ＡｇＬＡＧ１のみ、またはｏｍＣＥＲと組み合わせて、さらに、ＰｃＬＡＦ１、ＰｃＬＡＧ１、ｏＣｖＬＡＧ１、またはｏｍＬＡＳＳ５と組み合わせて）を過剰発現するシリンゴマイシンＥ耐性変異体によるアセチル化スフィンゴシンの生産が増大しているかどうか試験するために、対応する株を、アセチル化スフィンゴシンの振とうフラスコ生産用に培養した（対応するプラスミドについては表３を参照）。
【０２４０】
このために、これらの株を５ｍｌのＹＰＤ培地（試験管内）中に播種し、前培養として、３０℃、１分間あたり２５０回転で３日間培養した。続いて、この前培養物の１％を、２０ｍｌのＴＡＰＳ培地（１００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ内）に播種するのに用い、３０℃、１分間あたり２５０回転で、４日間培養した。
【０２４１】
【表１】
2009536521.tif 000004
【０２４２】
【表２】
2009536521.tif 000005
【０２４３】
実施例１６
（培養ブロス中のアセチル化スフィンゴイド塩基の定量）
脂質を抽出するために、１５ｍｌファルコンチューブ内の未分画ブロス１ｍｌにアセトン４ｍｌを添加し、室温、１分間あたり２５０回転で、１０分間、水平に振とうさせた。その後、混合物を５３００ｇで１０分間、遠心分離し、Ｊａｓｃｏ社製ＨＰＬＣシステム（ＬＣ−２０００シリーズ）で上清を分析した。以下の条件が適用された。
移動相：        ０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有するアセトニトリル／水９０：１０（ｖ／ｖ）
流速：          １．０ｍｌ／分
ランタイム：    １１分
注入体積：      １００μｌ
カラム：        Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００Ｃ１８（２５０×４．６ｍｍ、粒径５μｍ）
カラム温度：    ３０℃
トレー温度：    周囲温度
ＵＶ検出波長：  ２００ｎｍ
【０２４４】
アセチル化塩基の同定は、特定の基準物質（ＤＳＭ社、オランダ国デルフト所在）との、リテンションタイムおよびＵＶスペクトルの比較によって行い、したがって、定量化は、試料と基準物質との、ピーク面積の比較によって行った。
【０２４５】
上述の遺伝子を過剰発現するシリンゴマイシンＥ耐性ピキア・シフェリイ変異体によるアセチル化スフィンゴイド塩基の振とうフラスコ生産を、表３にまとめる。濃度は、バイオマス乾燥重量１ｇあたりのｍｇで示す。
【０２４６】
【表３】
2009536521.tif 000006
【０２４７】
実施例１７
（シリンゴマイシンＥ耐性ピキア・シフェリイ株におけるスフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼ・コード遺伝子の不活性化、ならびにピキア・シフェリイ酵素Ｄｅｓ１ｐ、マウスアルカリ性セラミダーゼのコドン最適化形態、およびコッコリスウイルス・セラミドシンターゼのコドン最適化形態の同時過剰生産）
ピキア・シフェリイは、スフィンゴイド塩基のＣ−８とＣ−９との間に二重結合を導入することが知られている（Ｔａｋａｋｕｗａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、４５：４５９−６１）、クリュイベロミセス・ラクティスのスフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼに高い類似性を有する酵素をコードする遺伝子を保持している（実施例８を参照）。したがって、この酵素の活性がスフィンゴシン生産に関して、逆効果となっているかもしれない。何故なら、ジヒドロスフィンゴシンへのそのような二重結合の導入は、それが遊離スフィンゴイド塩基であろうと、ジヒドロセラミドの構成成分であろうと、スフィンゴシン形成の共通の前駆体との競合をもたらすであろうからである。上述したスフィンゴ脂質生合成遺伝子の過剰発現を、ピキア・シフェリイスフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼ・コード遺伝子８ＤＥＳの不活性化と組み合わせるために、最初に、ピキア・シフェリイが抗生物質シクロヘキシミドの存在下で増殖するのを可能にする、アミノ酸位置５６における点突然変異を含有するｐＤＢ００６ベクターから入手したピキア・シフェリイＰｃＬ４１の遺伝子で、ｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−ｏＣｖＬＡＧ１ベクター（実施例１２参照）のｎａｔ１遺伝子を置換した。そのために、ベクターｐＴＨ−ＧＡＰ−ｎａｔ１−ＩＳ２−Ｐｍｅ１（実施例１０を参照）を制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩおよびＳａｌＩで消化し、ＱＩＡＧＥＮ社製ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて、３４４８ｂｐの断片をゲル精製した。ＰｃＬ４１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＡＦ０５３４５７）を得て、所望の点突然変異を導入するために、ピキア・シフェリイＦ６０−１０Ａ  ＮＲＲＬ１０３１の染色体ＤＮＡを鋳型として用いて、２つの断片をＰＣＲで増幅させた。断片１は以下のオリゴヌクレオチドを用いて増幅させた。
ＰｃＬ４１−ＳａｌＩ−ｆｗ：
5’-TATAGTCGACGAATTCTCTTAAATGATGTTGG-3’ （５’末端に、ＳａｌＩ認識配列を含む）
ＰｃＬ４１−ｉｎｔｅｒｎａｌ−ｒｖ：
5’-GTTTTAGCTTTTTTATGGAAAACTtGTTTGGTTTGACCACCGTAACCGG-3’ 
【０２４８】
この結果、アミノ酸５６をプロリンからグルタミンに置換する、ＣからＡへの点突然変異を挿入するオリゴヌクレオチドＰｃＬ４１−ｉｎｔｅｒｎａｌ−ｆｗに相補的な４９ｂｐの配列を含有する１２２２ｂｐの断片が生成した。断片２は以下のオリゴヌクレオチドを用いて増幅させた。
PcL41-internal-fw:
5’-CCGGTTACGGTGGTCAAACCAAACaAGTTTTCCATAAAAAAGCTAAAACTACCA AAAAAGTTGTTTTACG-3’ 
PcL41-SacI-rv:
5’-TATAGAGCTCAATTCCAATGTTTTGATCTGTC-3’ （５’末端に、ＳａｃＩ認識配列を含む）
【０２４９】
この結果、アミノ酸５６をプロリンからグルタミンに置換する点突然変異（ＣからＡ）を挿入する、オリゴヌクレオチドＰｃＬ４１−ｉｎｔｅｒｎａｌ−ｒｖに相補的な４９ｂｐの配列を含有する７５３ｂｐの断片を生成した。これら２つの断片を、ＱＩＡＧＥＮ社製ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いてゲル精製した。鋳型として各断片２μｌ、そしてオリゴヌクレオチドＰｃＬ４１−ＳａｌＩ−ｆｗおよびＰｃＬ４１−ＳａｃＩ−ｒｖ（上記参照）を用いて、クロスオーバーＰＣＲを行った。これによって、末端にＳａｌＩ制限部位およびＳａｃＩ制限部位を有する１９０６ｂｐの断片が生成した。その後、この断片をＳａｌＩおよびＳａｃＩで消化し、ＱＩＡＧＥＮ社製ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、ｐＴＨ−ＧＡＰ−ｎａｔ１−ＩＳ２−ＰｍｅＩの３４４８ｂｐバックボーンにライゲートした。ライゲーション、調製、および化学的コンピテント大腸菌細胞の形質転換、ならびに所望のプラスミドが存在していることの確認は、当業者に既知の方法で行った。得られたプラスミドをｐＤＢ００６と名付けた。
【０２５０】
ｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−ｏＣｖＬＡＧ１プラスミドを制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩおよびＳａｃＩ（製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在の説明書に従って）で消化し、ＱＩＡＧＥＮ社製ＱｌＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて、６９９７ｂｐ断片をゲル精製した。ｐＤＢ００６のＰｓｔＩおよびＳａｃＩ消化で挿入断片ＰｃＬ４１を入手し、この１９１８ｂｐ断片を同様にしてゲル精製し、その後、上記ベクターにライゲートした。ライゲーション、調製、および化学的コンピテント大腸菌細胞の形質転換、ならびに所望のプラスミドが存在していることの確認は、当業者に既知の方法で行った。この確認の過程で、このクローニング手順に使用されたＳａｃＩ制限部位が、得られたプラスミドｐ−ｍＣＥＲ−ＬＰ−ＰｃｖＬ４１−ｏＣｖＬＡＧ１中にはもはや存在しないことが明白になった。したがって、真正性を確認するために、挿入断片全体と隣接している領域とを配列決定した。おそらくＳａｃＩのスター活性により、ｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−ｏＣｖＬＡＧ１ベクターは、認識配列ＧＡＧＣＴＣで切断されずに、その代わりに、遺伝子ｏＣｖＬＡＧ１に属するエノラーゼターミネーター領域内の配列ＧＡＧＣＴＴで切断されたことが確認できた。その結果、ライゲートの後にはＳａｃＩ認識部位はもはや存在しておらず、ターミネーターは３３２ｂｐの代わりに２１１ｂｐに短縮されていた。この事実は重要ではないと考えられ、このベクターを次のステップである、ピキア・シフェリイＤＥＳ１遺伝子（配列番号２６）の導入に用いた。これを以下のオリゴヌクレオチド、すなわち、
ＰｃＤＥＳ１−ＰｓｔＩ−ｆｗ：
5’-TATATACTGCAGTTACCCAGTGGTACCTACATAC-3’ （５’末端に、ＰｓｔＩ認識配列を含む）
ＰｃＤＥＳ１−ＰｓｔＩ−ｒｖ
5’-TATATACTGCAGTTATAACGGTTGGGCAATG-3’ （５’末端に、ＰｓｔＩ認識配列を含む）
と、鋳型としてピキア・シフェリイＦ−６０−１０Ａ  ＮＲＲＬ１０３１の染色体ＤＮＡとを用いて、ＰＣＲを介して増幅した。この結果得られた１９８３ｂｐの断片を、上述の通り、ゲル精製し、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで消化し、ＱＩＡＧＥＮ社製ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いて、ＰＣＲ精製した。ｐ−ｍＣＥＲ−ＬＰ−ＰｃｖＬ４１−ｏＣｖＬＡＧ１ベクターを同様に切断し、精製した。ライゲーション、調製、および化学的コンピテント大腸菌細胞の形質転換、ならびに所望のプラスミドが存在していることの確認は、当業者に既知の方法で行った。この方法を適用することによって得られたプラスミドをｐＴＨ−ＬＰ−１と名付けた。挿入断片の方向性および真正性はＤＮＡ配列決定によって判定した。
【０２５１】
鋳型としてピキア・シフェリイＦ−６０−１０Ａ  ＮＲＲＬ１０３１の染色体ＤＮＡ、そして以下のオリゴヌクレオチドを用いて、ピキア・シフェリイのスフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼ・コード遺伝子（配列番号５）の内部領域をＰＣＲで増幅した。
ＰｃＤ８Ｄ−ＰｓｈＡＩ−ｆｗ：
5’-TATATAGACAAAAGTCCAGTTCCAAAGTGCTC-3’ （５’末端に、ＰｓｈＡＩ認識配列を含む）
ＰｃＤ８Ｄ−ＢｓｉＷＩ−ｒｖ：
5’-TATATACGTACGAAAATTGCACTAAGGAAATAC-3’ （５’末端に、ＢｓｉＷＩ認識配列を含む）
【０２５２】
ＱＩＡＧＥＮ社製ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いて、８５５ｂｐの断片をゲル精製し、その後、製造元（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在）によって与えられた説明書に従って、制限エンドヌクレアーゼＰｓｈＡＩおよびＢｓｉＷＩで消化した。その後、これをＱＩＡＧＥＮ社製ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。ｐＴＨ−ＬＰ−１ベクターを同様に消化し、ＱＩＡＧＥＮ社製ＱｌＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて、９６６２ｂｐ断片をゲル精製した。ライゲーション、調製、および化学的コンピテント大腸菌細胞の形質転換、ならびに所望のプラスミドが存在していることの確認は、当業者に既知の方法で行った。図１７に示す、この方法を適用することによって得られたプラスミドをｐＴＨ−ｄｅｌｔａＤ８Ｄと名付けた。挿入の方向性および真正性はＤＮＡ配列決定によって判定した。
【０２５３】
実施例１８
（シリンゴマイシンＥ耐性ピキア・シフェリイ株におけるアルカリ性セラミダーゼ・コード遺伝子の不活性化、ならびにピキア・シフェリイ酵素Ｄｅｓ１ｐ、マウスアルカリ性セラミダーゼのコドン最適化形態、およびコッコリスウイルスのセラミドシンターゼのコドン最適化形態の同時過剰生産）
ピキア・シフェリイは、スフィンゴイド塩基として、スフィンゴシンではなく、フィトスフィンゴシンまたはジヒドロスフィンゴシンを含有するセラミドを選択的に加水分解することが知られている（Ｍａｏら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７５：３１３６９−３１３７８）、Ｓ．セレヴィジエのアルカリ性セラミダーゼに高い類似性を有する酵素をコードする遺伝子を保持する（実施例７を参照）。したがって、この酵素の活性は、スフィンゴシン生産に関して、逆効果となっているかもしれない。何故なら、スフィンゴイド塩基としてジヒドロスフィンゴシンを含有するセラミドは、スフィンゴシン形成の前駆体であるからである。上述したスフィンゴ脂質生合成遺伝子の過剰発現を、ピキア・シフェリイ内在性アルカリ性セラミダーゼ遺伝子ＹＸＣ１の不活性化と組み合わせるために、ｐＴＨ−ｄｅｌｔａＤ８Ｄプラスミド上の遺伝子間スペーサ（ＩＳ）領域（実施例１７および図１７参照）を、ピキア・シフェリイ・セラミダーゼ・コード遺伝子の内部領域（配列番号８）で置換した。
【０２５４】
最初に、鋳型としてピキア・シフェリイＦ−６０−１０Ａ  ＮＲＲＬ１０３１の染色体ＤＮＡ、そして、それぞれ、オリゴヌクレオチド対ＯＴＫＤ２８４／ＯＴＫＤ２８５およびＯＴＫＤ２８６／ＯＴＫＤ２８７を用いて、ピキア・シフェリイ・セラミダーゼ・コード遺伝子（配列番号８）の２つの部分的に重なりあった内部断片をＰＣＲによって増幅した。
ＯＴＫＤ２８４：
5’-TAT ATA GAC AGA AGT CCA TAT CAT TTA CCA TTT GCT AAA CC-3’(下線：ＰｓｈＡＩ認識配列)
ＯＴＫＤ２８５：
5’-TAA ATC TCA ATT CAC ACT GGT GCT AAA TTA TTT TTA AAT GCA GA -3’ (下線：ＡｌｅＩ認識配列)
ＯＴＫＤ２８６：
5’-TAAAAATAATTTAGCACCAGTGTGAATTGAGATTTATATTGATAAGTT-3’ (下線：ＡｌｅＩ認識配列)
ＯＴＫＤ２８７：
5’-TAT ATA CGT ACG CAA TAT TAT AGA AAT ACC AAT TGT-3’ (下線：ＢｓｉＷＩ認識配列)
【０２５５】
これら２つの部分的に重なりあった断片（それぞれ２３９および２３６ｂｐ）を、ＱＩＡＧＥＮ社製ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いてゲル精製した。鋳型として各断片２μｌ、そしてオリゴヌクレオチドＯＴＫＤ２８４およびＯＴＫＤ２８７（上記参照）を用いて、クロスオーバーＰＣＲを行った。末端に単一のＰｓｈＡＩおよびＢｓｉＷＩ部位、そして中央にＡｌｅＩ部位を有する４３９ｂｐＤＮＡ断片を得た。この断片を、製造元（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、独国シュヴァルバッハ所在）によって与えられた説明書に従って、ＰｓｈＡＩおよびＢｓｉＷＩで消化した。その後、これを、ＱＩＡＧＥＮ社製ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。ｐＴＨ−ＬＰ−１ベクターを同様に消化し、ＱＩＡＧＥＮ社製ＱｌＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて、９６６２ｂｐ断片をゲル精製した。これら２つの断片のライゲーション、調製、および化学的コンピテント大腸菌細胞の形質転換、ならびに所望のプラスミドが存在していることの確認は、当業者に既知の方法で行った。図１８に示す、この方法を適用することによって得られたプラスミドを、ｐＳｏ−５と名付けた。挿入断片の方向性および真正性はＤＮＡ配列決定によって判定した。
【０２５６】
実施例１９
（スフィンゴイド塩基生合成遺伝子を過剰発現するシリンゴマイシンＥ耐性ピキア・シフェリイ変異体によるアセチル化スフィンゴイド塩基の振とうフラスコ生産、および培養ブロス中のアセチル化スフィンゴイド塩基の定量化）
ｐＳｏ−５をＡｌｅＩで消化した後に、実施例１４に記載した通りに、実施例１７および１８のプラスミドで、シリンゴマイシンＥ耐性ピキア・シフェリイ株の形質転換を行った。実施例１５で記載した通りに、シリンゴマイシンＥ耐性ピキア・シフェリイ変異体による、アセチル化スフィンゴイド塩基の振とうフラスコ生産を行い、実施例１６に従って、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いた、アセチル化スフィンゴイド塩基の検出および定量化を行った。
【０２５７】
結果を表４に示す。驚くべきことに、ｒＤＮＡ遺伝子間スペーサ（ｐＴＨ−ＬＰ−１）の代わりに、ピキア・シフェリイのスフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼコード遺伝子の断片を標的配列（ｐＴＨ−ｄｅｌｔａＤ８Ｄ）として用いた場合に、結果として、染色体内へのプラスミドｐＴＨ−ｄｅｌｔａＤ８Ｄの相同組込みに際してピキア・シフェリイ８ＤＥＳの不活性化がもたらされ、トリアセチル化スフィンゴシン（ＴｒｉＡＳｏ）の量が著しく増大した。加えて、ｒＤＮＡ遺伝子間スペーサ（ｐＴＨ−ＬＰ−１）の代わりに、ピキア・シフェリイＹＸＣ１アルカリ性セラミダーゼ・コード遺伝子の断片を標的配列（ｐＳｏ−５）として用いた場合に、結果として、染色体内へのプラスミドｐＳｏ−５の相同組込みに際してピキア・シフェリイＹＸＣ１の不活性化がもたらされ、トリアセチル化スフィンゴシン（ＴｒｉＡＳｏ）の総量と、ＴｒｉＡＳｏ／ＴｒｉＡＳａ比との両方が著しく増大した。
【０２５８】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０２５９】
【図１】アシュビア・ゴシッピーにおいてＳＹＲ２を標的不活性化するためのプラスミドｐＵＧ６−ＡｇＳＵＲ２：：ｋａｎＭＸを示す図である。アシュビア・ゴシッピーＴＥＦプロモーター（水平線の網かけ）、アシュビア・ゴシッピーＴＥＦターミネーター（斜線）、ｌｏｘＰ部位（黒色）、カナマイシン耐性遺伝子（暗灰色）、相同組換えに用いられたアシュビア・ゴシッピーＳＹＲ２の上流領域（ＵＳ）および下流領域（ＤＳ）（格子線）、ならびにアンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ；明灰色）が示されている。クローニング手順に関係する制限部位も示されている。
【図２】アシュビア・ゴシッピーにおいて、ＤＥＳ１の前の天然プロモーターをＧＡＰプロモーターで標的置換するためのプラスミドｐＡＧ３２−ｈｙｇ−ＰＡｇＧＡＰ−ＡｇＤＥＳ１を示す図である。アシュビア・ゴシッピーＴＥＦプロモーター（水平線の網かけ）、アシュビア・ゴシッピーＴＥＦターミネーター（斜線）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（暗灰色）、相同組換えに用いられたアシュビア・ゴシッピーＤＥＳ１の上流領域（ＵＳ）（格子線）およびアシュビア・ゴシッピーＤＥＳ１の５’領域（黒色）、ならびにアンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ；明灰色）が示されている。クローニング手順および形質転換に関係する制限部位も示されている。
【図３】アシュビア・ゴシッピーにおいて、ＤＥＳ１の前にある天然プロモーターをＧＡＰプロモーターで標的置換し、アシュビア・ゴシッピーＥＮＯプロモーターの制御下でアシュビア・ゴシッピーＬＡＧ１を過剰発現するためのプラスミドｐＡＧ−ＬＡＧ１−１を示す図である。アシュビア・ゴシッピーＴＥＦプロモーター（水平線の網かけ）、アシュビア・ゴシッピーＴＥＦターミネーター（斜線）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（暗灰色）、相同組換えに用いられたアシュビア・ゴシッピーＤＥＳ１の上流領域（ＵＳ）（格子線）およびアシュビア・ゴシッピーＤＥＳ１の５’領域（黒色）、アシュビア・ゴシッピーＬＡＧ１（黒色）、ならびにアンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ；明灰色）が示されている。クローニング手順および形質転換に関係する制限部位も示されている。
【図４】アシュビア・ゴシッピーにおいて、ＤＥＳ１の前にある天然プロモーターをＧＡＰプロモーターで標的置換し、アシュビア・ゴシッピーＥＮＯプロモーターの制御下でアシュビア・ゴシッピーＬＡＦ１を過剰発現するためのプラスミドｐＡＧ−ＬＡＦ１−１を示す図である。アシュビア・ゴシッピーＴＥＦプロモーター（水平線の網かけ）、アシュビア・ゴシッピーＴＥＦターミネーター（斜線）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（暗灰色）、相同組換えに用いられたアシュビア・ゴシッピーＤＥＳ１の上流領域（ＵＳ）（格子線）およびアシュビア・ゴシッピーＤＥＳ１の５’領域（黒色）、アシュビア・ゴシッピーＬＡＦ１（黒色）、ならびにアンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ；明灰色）が示されている。クローニング手順および形質転換に関係する制限部位も示されている。
【図５】アシュビア・ゴシッピーＳＹＲ２を標的置換し、アシュビア・ゴシッピーＥＮＯプロモーターの制御下で、アシュビア・ゴシッピーＤＥＳ１およびＬＡＦ１をそれぞれ過剰発現するための、プラスミドｐＳＳＴＨ−ＬＡＦ１−２を示す図である。アシュビア・ゴシッピーＴＥＦプロモーター（水平線の網かけ）、アシュビア・ゴシッピーＴＥＦターミネーター（斜線）、ｋａｎＭＸ耐性遺伝子（暗灰色）、アシュビア・ゴシッピーＳＹＲ２のプロモーター領域（ＡｇＳＵＲ２−Ｐ）およびターミネーター領域（ＡｇＳＵＲ２−Ｔ）（格子線）、アシュビア・ゴシッピーＤＥＳ１（黒色）、アシュビア・ゴシッピーＬＡＦ１（黒色）、ならびにアンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ；明灰色）が示されている。クローニング手順および形質転換に関係する制限部位も示されている。
【図６】アシュビア・ゴシッピー８ＤＥＳを標的破壊するためのプラスミドｐＡＧ３２−Ｄ８Ｄを示す図である。アシュビア・ゴシッピーＴＥＦプロモーター（水平線の網かけ）、アシュビア・ゴシッピーＴＥＦターミネーター（斜線）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（暗灰色）およびアンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ；明灰色）が示されている。クローニング手順および形質転換に関係する制限部位も示されている。
【図７】ピキア・シフェリイＬＡＧ１遺伝子座全体の単離をもたらす３ステップ手順を示す模式図である。  ＰｃＬＡＧ１の内部部分の増幅（Ｉ．）の後に、逆ＰＣＲを２ラウンド行った（ＩＩ．およびＩＩＩ．）。個々のステップで用いられたオリゴヌクレオチドが示されている。また、様々な陰影の配列表示は、個々のステップでＤＮＡ配列が決定された、ＰｃＬＡＧ１遺伝子座の部分を示す。実験手順に関係する制限部位も示されている。
【図８】ピキア・シフェリイＬＡＦ１遺伝子座全体の単離をもたらす３ステップ手順を示す模式図である。  ＰｃＬＡＦ１の内部部分の増幅（Ｉ．）の後に、逆ＰＣＲを２ラウンド行った（ＩＩ．およびＩＩＩ．）。個々のステップで用いられたオリゴヌクレオチドが示されている。また、様々な陰影の配列表示は、個々のステップでＤＮＡ配列が決定された、ＰｃＬＡＦ１遺伝子座の部分を示す。実験手順に関係する制限部位も示されている。
【図９】ピキア・シフェリイＹＸＣ１遺伝子座全体の単離をもたらす６ステップ手順を示す模式図である。  ＰｃＹＸＣ１の内部部分の増幅（Ｉ．）の後に、逆ＰＣＲを５ラウンド行った（ＩＩ．〜Ｖ．）。個々のステップで用いられたオリゴヌクレオチドが示されている。また、様々な陰影の配列表示は、個々のステップでＤＮＡ配列が決定された、ＰｃＹＸＣ１遺伝子座の部分を示す。実験手順に関係する制限部位も示されている。
【図１０】ピキア・シフェリイ８ＤＥＳ遺伝子座全体の単離をもたらす４ステップ手順を示す模式図である。  Ｐｃ８ＤＥＳの内部部分の増幅（Ｉ．）の後に、逆ＰＣＲを３ラウンド行った（ＩＩ．〜ＩＶ．）。個々のステップで用いられたオリゴヌクレオチドが示されている。また、様々な陰影の配列表示は、個々のステップでＤＮＡ配列が決定された、Ｐｃ８ＤＥＳ遺伝子座の部分を示す。実験手順に関係する制限部位も示されている。
【図１１】ピキア・シフェリイにおいて、ＰｃＤＥＳ１、ＡｇＬＡＦ１、およびＡｇＬＡＧ１を過剰発現するためのプラスミドｐＰＣ−ＤＥＳ１−ＡｇＬＡＦ１−ＡｇＬＡＧ１を示す図である。ピキア・シフェリイＴＤＨ１（斜線）およびＰＤＡ１プロモーター（水平線の網かけまたは白色）、アシュビア・ゴシッピーＬＡＦ１およびＬＡＧ１遺伝子（両方とも暗灰色）、ピキア・シフェリイＤＥＳ１（斜線）およびＬ４１遺伝子（暗灰色）、相同組換えに用いられた５Ｓ−２６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子間領域（格子線）、ならびにアンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ；明灰色）が示されている。クローニング手順に関係する制限部位も示されている。
【図１２】ピキア・シフェリイにおいて、ＰｃＬＡＦ１およびｏｍＣＥＲを過剰発現するためのプラスミドｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−ＰｃＬＡＦ１を示す図である。ピキア・シフェリイＴＤＨ１プロモーター（白色）およびＰＤＡ１プロモーター（水平線の網かけ）、ピキア・シフェリイＬＡＦ１（斜線）、コドン最適化されたｏｍＣＥＲ（垂直線の網かけ）およびコドン最適化されたｎａｔ１遺伝子（暗灰色）、相同組換えに用いられた５Ｓ−２６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子間領域（格子線）、ならびにアンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ；明灰色）が示されている。クローニング手順に関係する制限部位も示されている。
【図１３】ピキア・シフェリイにおいて、ＰｃＬＡＧ１およびｏｍＣＥＲを過剰発現するためのプラスミドｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−ＰｃＬＡＧ１を示す図である。ピキア・シフェリイＴＤＨ１プロモーター（白色）およびＰＤＡ１プロモーター（水平線の網かけ）、ピキア・シフェリイＥＮＯ１ターミネーター（暗灰色）、ＴＥＦターミネーター（斜線）、ピキア・シフェリイＬＡＧ１（斜線）、コドン最適化されたｏｍＣＥＲ（垂直線の網かけ）およびコドン最適化されたｎａｔ１遺伝子（暗灰色）、相同組換えに用いられた５Ｓ−２６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子間領域（格子線）、ならびにアンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ；明灰色）が示されている。クローニング手順に関係する制限部位も示されている。
【図１４】ピキア・シフェリイにおいて、ｏＣｖＬＡＧ１およびｏｍＣＥＲを過剰発現するためのプラスミドｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−ｏＣｖＬＡＧ１を示す図である。ピキア・シフェリイＴＤＨ１プロモーター（白色）およびＰＤＡ１プロモーター（水平線の網かけ）、ピキア・シフェリイＥＮＯ１ターミネーター（暗灰色）、ＴＥＦターミネーター（斜線）、コドン最適化されたｏＣｖＬＡＧ１（斜線）、コドン最適化されたｏｍＣＥＲ（垂直線の網かけ）およびコドン最適化されたｎａｔ１遺伝子（暗灰色）、相同組換えに用いられた５Ｓ−２６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子間領域（格子線）、ならびにアンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ；明灰色）が示されている。クローニング手順に関係する制限部位も示されている。
【図１５】ピキア・シフェリイにおいて、ｏｍＬＡＳＳ５およびｏｍＣＥＲを過剰発現するためのプラスミドｐ−ｍＣＥＲ−ｎａｔ１−ｏｍＬＡＳＳ５を示す図である。ピキア・シフェリイＴＤＨ１プロモーター（白色）およびＰＤＡ１プロモーター（水平線の網かけ）、ピキア・シフェリイＥＮＯ１ターミネーター（暗灰色）ＴＥＦターミネーター（斜線）、コドン最適化されたｏｍＬＡＳＳ５（斜線）、コドン最適化されたｏｍＣＥＲ（垂直線の網かけ）およびコドン最適化されたｎａｔ１の遺伝子（暗灰色）、相同組換えに用いられた５Ｓ−２６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子間領域（格子線）ならびにアンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ；明灰色）が示されている。クローニング手順に関係する制限部位も示されている。
【図１６】ピキア・シフェリイの５Ｓ−２６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子間領域への標的組み込みを行い、ピキア・シフェリイＤＥＳ１の過剰発現、コドン最適化されたｏｍＣＥＲの過剰発現、およびコドン最適化されたｏＣｖＬＡＧ１の過剰発現を、それぞれの遺伝子に対してピキア・シフェリイＴＤＨ１プロモーターの制御下で行うためのプラスミドｐＴＨ−ＬＰ−１を示す図である。ピキア・シフェリイＴＤＨ１プロモーター（白色）、ピキア・シフェリイＥＮＯ１ターミネーター（黒色）、ピキア・シフェリイＤＥＳ１（垂直線の網かけ）、コドン最適化されたｏｍＣＥＲ（垂直線の網かけ）、コドン最適化されたｏＣｖＬＡＧ１（垂直線の網かけ）、ピキア・シフェリイＰｃＬ４１シクロヘキシミド耐性遺伝子（黒色）、５Ｓ−２６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子間領域組込み部位（ＩＳ；点の陰影）、およびアンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ；明灰色）が示されている。クローニング手順および形質転換に関係する制限部位も示されている。
【図１７】ピキア・シフェリイのスフィンゴ脂質Δ８−デサチュラーゼコード遺伝子８ＤＥＳの標的破壊を行い、ピキア・シフェリイＤＥＳ１の過剰発現、コドン最適化されたｏｍＣＥＲの過剰発現、およびコドン最適化されたｏＣｖＬＡＧ１の過剰発現を、それぞれの遺伝子に対してピキア・シフェリイＴＤＨ１プロモーターの制御下で行うためのプラスミドｐＴＨ−ｄｅｌｔａＤ８Ｄを示す図である。ピキア・シフェリイＴＤＨ１プロモーター（白色）、ピキア・シフェリイＥＮＯ１ターミネーター（黒色）、ピキア・シフェリイＤＥＳ１（垂直線の網かけ）、コドン最適化されたｏｍＣＥＲ（垂直線の網かけ）、コドン最適化されたｏＣｖＬＡＧ１（垂直線の網かけ）、ピキア・シフェリイＰｃＬ４１シクロヘキシミド耐性遺伝子（黒色）、染色体組込み部位８ＤＥＳ（点の陰影）、およびアンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ；明灰色）が示されている。クローニング手順および形質転換に関係する制限部位も示されている。
【図１８】ピキア・シフェリイのアルカリ性セラミダーゼ遺伝子（ＰｃＹＸＣ１）の標的不活性化、ならびにピキア・シフェリイにおけるｏＣｖＬＡＧ１、ＰｃＤＥＳ１、およびｏｍＣＥＲの同時過剰発現に使用されたｐＳｏ−５プラスミドを示す図である。ピキア・シフェリイＴＤＨ１プロモーター（ＰＴＤＨ１、白色）、ピキア・シフェリイＥＮＯ１ターミネーター（ＴＥＮＯ１、黒色）、ピキア・シフェリイＤＥＳ１（斜線）、コドン最適化されたｏｍＣＥＲ（垂直線の網かけ）およびコドン最適化されたｏＣｖＬＡＧ１の遺伝子（水平線の網かけ）、標的組み込みに用いられたピキア・シフェリイＹＸＣ１アルカリ性セラミダーゼの内部断片（格子線）、ならびにアンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ；明灰色）が示されている。クローニング手順に関係する制限部位も示されている。
【図１９】アシュビア・ゴシッピー株におけるスフィンゴイド塩基組成のＲＰ−ＨＰＬＣ分析の結果を示すグラフである。分析された株は、野生型ＡＴＣＣ１９８９５（ＷＴ）、および以下の遺伝子型を有する、その誘導体であった。Δｓｙｒ２（Δｓｙｒ２）、Δｓｙｒ２  ＰＴＤＨ３−ＤＥＳ１  （Δｓｙｒ２  ＯＰ  Ｄｅｓ１ｐ）、Δｓｙｒ２  ＰＴＤＨ３−ＤＥＳ１  ＰＥＮＯ１−ＬＡＦ１  （Δｓｙｒ２  ＯＰ  Ｄｅｓ１ｐ  ＯＰ  Ｌａｆ１ｐ）、およびΔｓｙｒ２  ＰＥＮＯ１−ＤＥＳ１  ＰＥＮＯ１−ＬＡＦ１  ８ＤＥＳ：：ｐＡＧ３２−Ｄ８Ｄ  （Δｓｙｒ２  Δ８ＤＥＳ  ＯＰ  Ｄｅｓ１ｐ  ＯＰ  Ｌａｆ１ｐ）。
【図１】
2009536521.tif 000009
【図２】
2009536521.tif 000010
【図３】
2009536521.tif 000011
【図４】
2009536521.tif 000012
【図５】
2009536521.tif 000013
【図６】
2009536521.tif 000014
【図７Ａ】
2009536521.tif 000015
【図７Ｂ】
2009536521.tif 000016
【図７Ｃ】
2009536521.tif 000017
【図８Ａ】
2009536521.tif 000018
【図８Ｂ】
2009536521.tif 000019
【図８Ｃ】
2009536521.tif 000020
【図９Ａ】
2009536521.tif 000021
【図９Ｂ】
2009536521.tif 000022
【図９Ｃ】
2009536521.tif 000023
【図９Ｄ】
2009536521.tif 000024
【図９Ｅ】
2009536521.tif 000025
【図９Ｆ】
2009536521.tif 000026
【図１０Ａ】
2009536521.tif 000027
【図１０Ｂ】
2009536521.tif 000028
【図１０Ｃ】
2009536521.tif 000029
【図１０Ｄ】
2009536521.tif 000030
【図１１】
2009536521.tif 000031
【図１２】
2009536521.tif 000032
【図１３】
2009536521.tif 000033
【図１４】
2009536521.tif 000034
【図１５】
2009536521.tif 000035
【図１６】
2009536521.tif 000036
【図１７】
2009536521.tif 000037
【図１８】
2009536521.tif 000038
【図１９】
2009536521.tif 000039
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年12月22日(2008.12.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009536521000001.app
【国際調査報告】
2009536521.tif 000096
2009536521.tif 000097
2009536521.tif 000098
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