(57)【要約】  本発明は、少なくとも１種のマグノリアシャンパカの花から抽出した油、その調製方法、それを含む化粧用、医薬用または皮膚科学的組成物ならびに皮膚の有害な変化の防止および／または処置のための多機能性活性成分としてのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  ２０から７０％の安息香酸エステル、
−  １５から３５％の飽和および／または不飽和脂肪酸
（前記比率はガスクロマトグラフィーにより分離された成分の合計に対する相対パーセンテージとして表されている）
を含むことを特徴とする少なくとも１種のマグノリアシャンパカの花から抽出した油。
【請求項２】
マグノリアシャンパカ、バラエティゴールド由来であることを特徴とする、請求項１に記載の油。
【請求項３】
−  １０から４０％の安息香酸シンナミル、
−  ５から３０％の安息香酸フェニルエチル、
−  ５から３０％の安息香酸ベンジル、
−  ５から３０％のリノール酸、
−  ２から２０％のリノレン酸
（前記比率はガスクロマトグラフィーにより分離された成分の合計に対する相対パーセンテージとして表されている）
を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の油。
【請求項４】
溶媒を含まないことを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の油。
【請求項５】
抽出過程において関与した化学反応物質を含まないことを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の油。
【請求項６】
少なくとも１つの分子蒸留段階を含むことを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載のマグノリアシャンパカ油を調製するための方法。
【請求項７】
−  少なくとも１種のマグノリアシャンパカの新鮮な花から生成した粉砕生成物から、少なくとも１つの非極性溶媒を用いて抽出すること、
−  前記抽出物を少なくとも１つの分子蒸留段階に供すること、および
−  蒸留物を回収すること
からなる段階を含むこと特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載のマグノリアシャンパカ油を調製するための方法。
【請求項８】
前記非極性溶媒が、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、イソオクタン、超臨界ＣＯ2またはジクロロメタンから選択されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記分子蒸留段階が、約１００℃と２００℃との間の温度、かつ約１０ミリバールと０．００１ミリバールとの間の圧力において実施されることを特徴とする、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
蒸留完了時に、分画が、Ｃ1〜Ｃ4アルコール、ポリオール、酢酸エチル、ヘキサン、シクロヘキサンおよび超臨界ＣＯ2から選択される少なくとも１つの溶媒を用いて実施されることを特徴とする、請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
分子蒸留に先立ち、鉱物油または植物油およびポリオールから選択される溶媒を加えることを特徴とする、請求項６から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
蒸留カラムに導入する際の温度が、２０℃と１２０℃との間、好ましくは５０℃と１００℃との間であることを特徴とする、請求項６から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
濃縮温度が、４０℃と１２０℃との間、好ましくは６０℃と１００℃との間であることを特徴とする、請求項６から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項６から１３のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、マグノリアシャンパカ油。
【請求項１５】
老化または老化に関連する生理学的メカニズムまたはこれらメカニズムに関連する疾患による皮膚の有害な変化を防止および／または処置するための医薬用、化粧用または皮膚科学的組成物における、多機能性活性成分としての請求項１から５または請求項１４のいずれか一項に記載のマグノリアシャンパカ油の使用。
【請求項１６】
治癒または細胞修復を向上する薬剤および／または表皮細胞の代謝を活性化するための薬剤および／またはフリーラジカルを捕捉するための薬剤および／または表皮を再生するための薬剤および／または表皮を解毒するための薬剤としての、化粧用組成物における請求項１から５または請求項１４のいずれか一項に記載のマグノリアシャンパカ油の請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
治癒または細胞修復を向上する薬剤および／または表皮細胞の代謝を活性化するための薬剤および／またはフリーラジカルを捕捉するための薬剤および／または核ＤＮＡを保護するための薬剤および／またはミトコンドリアＤＮＡを保護するための薬剤および／または表皮を再生するための薬剤および／または表皮を解毒するための薬剤としての、医薬用組成物の調製のための、請求項１から５または請求項１４のいずれか一項に記載のマグノリアシャンパカ油の請求項１５に記載の使用。
【請求項１８】
治癒または細胞修復を向上する薬剤および／または表皮細胞の代謝を活性化するための薬剤および／またはフリーラジカルを捕捉するための薬剤および／または核ＤＮＡを保護するための薬剤および／またはミトコンドリアＤＮＡを保護するための薬剤および／または表皮を再生するための薬剤および／または表皮を解毒するための薬剤としての、皮膚科学的組成物の調製のための、請求項１から５または請求項１４のいずれか一項に記載のマグノリアシャンパカ油の請求項１５に記載の使用。
【請求項１９】
メラニンの合成を阻害する薬剤としてのマグノリアシャンパカ油の請求項１５から１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
エンドセリンの合成を阻害する薬剤または転写因子ＭＩＴＦを阻害する薬剤としてのマグノリアシャンパカ油の請求項１５から１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
ケラチノサイトによる少なくとも１種の細胞増殖因子の合成を活性化する薬剤としてのマグノリアシャンパカ油の請求項１５から１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
前記増殖因子が、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦおよびＨＢ−ＥＧＦから選択されることを特徴とする、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
マトリックスメタロプロテイナーゼＭＭＰ３（すなわちストロメライシン１）およびＭＭＰ９（すなわちゼラチナーゼ−エラスターゼＢ）の活性を阻害する薬剤としてのマグノリアシャンパカ油の請求項１５から１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
細胞の代謝を刺激する薬剤としてのマグノリアシャンパカ油の請求項１５から１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
細胞の代謝を刺激するための前記因子が、シトクロムＣまたはＡＭＰキナーゼから選択されることを特徴とする、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
抗酸化剤としてのマグノリアシャンパカ油の請求項１５から１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
ＤＴジアホラーゼの合成を刺激することによる表皮の解毒のための薬剤としてのマグノリアシャンパカ油の請求項１５から１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
請求項１から５または請求項１４のいずれか一項に記載のマグノリアシャンパカ油および化粧品または医薬品に許容できる媒体を含むことを特徴とする化粧用、医薬用または皮膚科学的組成物。
【請求項２９】
前記油が、組成物の全重量の０．００１から１０％の比率で、医薬用、化粧用または皮膚科学的組成物中に存在することを特徴とする、請求項２８に記載の化粧用、医薬用または皮膚科学的組成物。
【請求項３０】
前記油が、組成物の全重量の０．０１から５％、好ましくは０．１から１％の比率で、医薬用、化粧用または皮膚科学的組成物中に存在することを特徴とする、請求項２９に記載の化粧用、医薬用または皮膚科学的組成物。
【請求項３１】
局所経路による適用に適していることを特徴とする、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の化粧用、医薬用または皮膚科学的組成物。
【請求項３２】
エモリエント剤または湿潤剤、ゲル化剤および／または増粘剤、界面活性剤、油、活性成分、染料、防腐剤、抗酸化剤、キレート剤、有機または無機パウダー、顔料、セルフタンニング剤、サンスクリーン、精油および香料から選択される少なくとも１つの化合物も含むことを特徴とする、請求項２８から３１のいずれか一項に記載の化粧用、医薬用または皮膚科学的組成物。
【請求項３３】
生物活性を有し、かつ生物学的部位を介して皮膚への有効性を有する、天然、バイオテクノロジーまたは合成由来の活性成分を含むことを特徴とする、請求項３２に記載の化粧用、医薬用または皮膚科学的組成物。
【請求項３４】
前記活性成分が、ビタミン、微量元素、アラントイン、植物タンパク、植物抽出物およびこれらの混合物から選択されることを特徴とする、請求項３２および３３のいずれかに記載の化粧用、医薬用または皮膚科学的組成物。
【請求項３５】
前記活性成分が、藻類抽出物であることを特徴とする、請求項３２から３４の一項に記載の化粧用、医薬用または皮膚科学的組成物。
【請求項３６】
パウダー、エマルション、マイクロエマルション、ナノエマルション、サスペンジョン、溶液、ローション、クリーム、水性または水性／アルコール性ゲル、フォーム、セラム、エアロゾル溶液またはディスパージョン、または脂質小胞のディスパージョンの形態で提供されることを特徴とする、請求項２８から３５のいずれか一項に記載の化粧用、医薬用または皮膚科学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１種のマグノリアシャンパカの花から抽出した油、その調製方法、それを含む化粧用、医薬用または皮膚科学的組成物ならびに特に老化または老化に関連する生理学的メカニズムまたはこれらメカニズムに関連する疾患による皮膚の有害な変化を防止および／または処置するための医薬用、化粧用または皮膚科学的組成物における、多機能性活性成分としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は主として３つの層、すなわち最外部から出発して、表皮、真皮および皮下組織、から構成されている。
【０００３】
皮膚の外層である表皮は、重層化しており、皮膚に外界からの攻撃に対する防御を与えるのに大きく貢献している。真皮は、結合機能および皮膚への栄養付与機能の両方を提供する結合組織である。
【０００４】
皮膚の老化は、内因子または外因子を含む２つの別個かつ独立したプロセスの結果として起こる。
【０００５】
内因性老化または時間生物学的老化は、年齢に関連する「正常な」または生理学的老化に相当する。
【０００６】
外因性老化は、一般に環境によってもたらされる老化、より特に太陽への暴露による光老化に相当する。
【０００７】
本発明は内因性のまたは生理的な皮膚の老化および外因性の皮膚の老化に関連する。
【０００８】
皮膚の老化は、結合組織の変質および細胞再生能の低下に起因する。この作用は、時間経過とともに、小じわおよびしみの出現により明らかとなる。微小循環は真皮表層において低減する。ヒアルロン酸を構成成分の１つとするコラーゲン、エラスチンおよびグリコサミノグリカンなどの巨大分子は、化学的に修飾される。真皮の実際の厚さは低下し、線維は劣化し、皮膚はその生体力学的特性および弾力性を失う。化学的および酵素的酸化の現象は、加齢に伴ってより顕著になり、かつコラーゲン線維などの線維間の架橋反応の増加をもたらす。
【０００９】
老化に関連する有害な変化は種々の形で現れる可能性があり、中でも下記を挙げることができる：
−  堅さ、柔軟性および弾力性の喪失または毛細血管拡張症の発現をもたらす、エラスチン線維の非組織化；
−  微小循環の減少ならびに表皮における細胞交替の減速および小じわまたは線状小じわの出現による輝きの喪失；
−  メラニン合成（すなわちメラニン形成）における機能不全に関連する色素性のしみの出現を伴う羊皮紙様の外観を発現する皮膚の黄色化；
−  角層のバリア機能の低下および表皮交替の減速に起因する皮膚の乾燥。
【００１０】
これらの理由から、加齢によりおよび／または加齢もしくは同種のものに関連する生理学的メカニズムにおける変化により皮膚に有害な変化をもたらす原因の組合せに対して効果を有することができる多機能性の活性成分を提供する必要性が存在する。
【００１１】
文献ではミケリアシャンパカとしても知られているマグノリアシャンパカという植物は、中国の湿潤な森林地域原産の、モクレン（Ｍａｇｎｏｌｉａｃｅａｅ）科に属する低木である。その花の精油は、一般に香料に使用される。
【００１２】
特許出願ＪＰ  ０７／０６１９１８は極性溶媒を用いた抽出により得られたミケリアシャンパカ抽出物を含む化粧用組成物と抗酸化剤としての使用を開示している。
【００１３】
皮膚に対する美白効果または活性酸素捕捉活性または抗菌活性を有するミケリアシャンパカＬ．の抽出物を含む組成物は、特許出願ＪＰ−Ａ−２０００／０９５６６３において開示されている。
【００１４】
特許出願ＪＰ−Ａ−２００５／０６８０７５は、ＵＶＡおよびＵＶＢ光線を吸収し、かつ、ミケリアシャンパカ植物体の水抽出物を含むＵＶ−防止組成物に関する。
【００１５】
ミケリアシャンパカＬ．（ホワイトバラエティ）のメタノール抽出物の抗炎症および解熱活性は、Ｒ．Ｖｉｍａｌａ他により、Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．、１９９７年、３５、１３１０〜１３１４頁に記載されている。
【発明の開示】
【００１６】
本発明の著者は今般、全く驚くべきことに、少なくとも１種のマグノリアシャンパカの花から抽出した油は、生理学的メカニズムの誘導または阻害を介して、表皮および／または真皮において老化または老化に関連する生理学的メカニズムまたはこれらメカニズムに関連する疾患による症状に対する効果を有することができる活性を発揮したことを実証している。
【００１７】
この観察は、新規の化粧用、医薬用または皮膚科学的組成物、より特に、表皮および／または真皮において老化または老化に関連する生理学的メカニズムまたはこれらメカニズムに関連する疾患による症状に対する効果を有することを所望される全ての適用のために使用するものの開発に至っている。
【００１８】
用語「油」は、非極性溶媒を用いた抽出により得られ、かつ、水不溶性化合物を非常に多く含む物質を意味するものと理解される。
【００１９】
したがって、本発明は、第一の態様によれば、
−  ２０から７０％の安息香酸エステル、
−  １５から３５％の飽和および／または不飽和脂肪酸
（前記比率はガスクロマトグラフィーにより分離された成分の合計に対する相対パーセンテージとして表されている）
を含むことを特徴とする少なくとも１種のマグノリアシャンパカの花から抽出した油に関する。
【００２０】
好ましくは、本発明の油は、「金の花」としても知られているマグノリアシャンパカ、バラエティゴールド（variety gold）由来である。
【００２１】
用語「ガスクロマトグラフィーにより分離された成分の合計に対する相対パーセンテージとして表される含有量」は、ガスクロマトグラフィーシステムにより分離された成分の合計に対して決定された個々の成分の含有量を意味するものと理解される。試料調製の間に溶媒によって抽出され、かつ、インジェクター中で蒸発することができる化合物のみが存在する。
【００２２】
試料は、１９７７年５月のフランス規格ＮＦ  Ｔ  ６０−２３３、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｄｅｓ  ｅｓｔｅｒｓ  ｍｅｔｈｙｌｉｑｕｅｓ  ｄ’ａｃｉｄｅｓ  ｇｒａｓ」、（§５．２  −  Ｍｅｔｈｏｄｅ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ａｕｘ  ｃｏｒｐｓ  ｇｒａｓ  ａｃｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｃｉｄｅｓ  ｇｒａｓ）［「脂肪酸のメチルエステルの調製」（§５．２  −酸性脂肪性物質および脂肪酸に適用される方法）］に従って調製しなければならない。クロマトグラフィーの条件は、１９９５年６月のフランス規格ＮＦ  ＥＮ  ＩＳＯ  ５５０８に記載されている。
【００２３】
簡潔に言えば、前記方法は、酸性メタノール性媒体中で脂肪酸をエステル化し、次いでヘプタンを用いて抽出し、かつ、次いでヘプタン溶液をガスクロマトグラフィーに注入することを本質とする。
【００２４】
好ましくは、本発明の油は：
−  １０から４０％の安息香酸シンナミル、
−  ５から３０％の安息香酸フェニルエチル、
−  ５から３０％の安息香酸ベンジル、
−  ５から３０％のリノール酸、
−  ２から２０％のリノレン酸
（前記比率はガスクロマトグラフィーにより分離された成分の合計に対する相対パーセンテージとして表されている）
を含む。
【００２５】
本発明はまた、続いての態様によれば、少なくとも１つの分子蒸留段階を含む、前記に定義のマグノリアシャンパカ油を調製するための方法にも関する。
【００２６】
使用される出発物質は、例えば、少なくとも１種のマグノリアシャンパカ、好ましくはマグノリアシャンパカバラエティゴールドの摘み採ったばかりの花（新鮮な花）からなる。この花は、通常、粉砕されるかまたは小片にされていてもよい。
【００２７】
花は、少なくとも１種の非極性溶媒、例えば、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、イソオクタン、超臨界ＣＯ2またはジクロロメタンによる抽出を受ける。
【００２８】
抽出は一般に、例えば周囲温度から１００℃の温度範囲で、約３０分から１２時間の間、１種または複数の上記の溶媒中で、花を浸漬または緩やかに攪拌することにより行われる。
【００２９】
ろ過後に、抽出を数回繰り返してよい。溶液は、花の不溶性部分を除去するために、一緒にしてろ過する。適切な場合、溶媒が揮発性溶媒、例えばヘキサンまたはヘプタンまたはシクロヘキサンなどである場合には、溶媒も、除去する。
【００３０】
この抽出段階は、植物抽出物の分野では通常のものであり、かつ、当業者は、自己の一般知識に基づき、その反応パラメータを調節できる立場にある。
【００３１】
本発明の有利な態様によれば、分画段階は、抽出の結果として得られた生成物を精製するために行われてよい。
【００３２】
Ｃ1〜Ｃ4アルコール、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノールおよび同種のものなど、ポリオール、例えばプロピレングリコール、ジプロピレングリコールなど、または酢酸エチル、ヘキサン、シクロヘキサンなどの有機溶媒、あるいはこの分野で一般的である他のあらゆる溶媒から選択される溶媒または溶媒の混合物を使用することは好ましいであろう。
【００３３】
超臨界液体、好ましくは超臨界ＣＯ2による分画もまた用いられてよい。
【００３４】
上記のように、１種または複数の揮発性溶媒が使用される場合、次の段階に進む前に揮発性溶媒を除去することには根拠があることになる。
【００３５】
抽出の、および任意選択で、上記に記載の分画段階の結果として、マグノリアシャンパカ凝固物が得られる。このタイプの抽出物は通常、香料工業を対象とするアブソリュートの製造において中間体として使用される。
【００３６】
有利には、前記凝固物は、ワイプドフィルムおよび短工程蒸留装置中で行われる分子蒸留段階に供される。
【００３７】
好ましい態様によれば、本発明はしたがって：
−  少なくとも１種のマグノリアシャンパカの花（好ましくは新鮮な花）から、少なくとも１つの非極性溶媒を用いて抽出すること、
−  前記抽出物を少なくとも１つの分子蒸留段階に供すること、および
−  蒸留物を回収すること
からなる段階を含む上記に定義のマグノリアシャンパカ油の調製のための方法に関する。
【００３８】
ワイプドフィルムおよび短工程分子蒸留器を、分子蒸留段階の実施において使用することが好ましい。これら装置は、蒸留表面（高温表面）に、蒸留しようとする物質を、継続的に広げることを可能にする回転ワイパー装置を提供する蒸留チャンバーを含む。物質の蒸気は蒸留チャンバーの中央部に設置された冷却フィンガーを用いて濃縮される。残渣および蒸留物の回収は、重力流により行う。この手法の目的は、複雑な混合物の成分をその沸点の違いを利用することにより分離するということである。ワイプドフィルムおよび短工程分子蒸留は、蒸留が高真空下で行われることによる蒸留温度の低減、およびまた蒸留器中で分離される混合物の滞留時間の低減という利点を有する。物質の分解速度は、温度および暴露時間の関数として極度に増加し、「アレンビック」タイプの蒸留器においては、例えば、混合物が何時間も高温で保持されることがあり、それが変性を引き起こす。
【００３９】
これまで、植物油の場合、このような方法は、不けん化画分の分離のためまたは不けん化画分を除去することによる同植物油の精製のためにのみ、あるいはまた、水溶性または脂溶性画分の場合、抽出物の脱色または脱臭のためにのみ用いられてきた。
【００４０】
実際には、驚くべきことに今般、分子蒸留段階の使用は、油性画分が少量存在する脂溶性抽出物から、その油性画分を分離することを可能にすることが見出された。
【００４１】
この方法の実施のための好ましい条件を下記に示す。
【００４２】
有利には、蒸留前に、蒸留またはカラムに沿った流れを促進するために、鉱物油または植物油および、例えばポリエチレングリコールなどのポリオールから選択される重溶媒を、抽出および任意選択で分画の後に得られたマグノリアシャンパカ凝固物に加える。
【００４３】
抽出および任意選択で分画の後に得られた凝固物と重溶媒との混合物を、２０℃と１２０℃との間、好ましくは５０℃と１００℃との間の温度で、一定の流速で、シリンダ型エバポレータのホットウォールに導入する。
【００４４】
回転する環状ワイパーを用いて塗り広げることにより、約１００℃と２００℃との間、好ましくは１１０℃と１７０℃との間の温度に維持されたホットウォールの全表面を覆うように、混合物を、薄いフィルム状に広げる。
【００４５】
次いで、ホットウォールとの接触に際して、かつ、エバポレータ全体に行き渡った１０ミリバールから０．００１ミリバール程度の非常に低い圧力下で、揮発性のより低い物質がウォールに沿って流れる間に、揮発性物質は部分的にかつ次第に蒸発する。
【００４６】
発生した蒸気は、ホットウォールと同心を有し、かつホットウォールから非常に近距離に配置されたコールドウォール上に、好ましくは４０℃と１２０℃との間、特に６０℃と１００℃との間の温度で、濃縮される。
【００４７】
装置が稼動する間に分離された物質は、重力によりホットウォールおよびコールドウォールに沿って流れる。
【００４８】
蒸留物を回収し、適切な場合には、追加的分離操作（例えば、ろ過または遠心分離）に供する。
【００４９】
このようにして、本発明のマグノリアシャンパカ油が得られる。
【００５０】
有利には、前記油は淡色である。さらに、前記油は、この抽出の間に関与する溶媒または他のいかなる化学反応物をも含まない。
【００５１】
また、前記油は、エマルション形態の化粧用、医薬用または皮膚科学的組成物において活性を得るために通常必要な濃度に関連する処方上の問題を起こすことなく、かつ、標準的な方法によって得られる植物抽出物が濃縮された形態にあるときとは対照的に、濃い色を示すことなく使用されることが可能な、十分に濃縮された形態で提供される。
【００５２】
このような理由から、本発明の油は、化粧用、医薬用または皮膚科学的組成物の調製に、直接使用することができる。
【００５３】
本発明はまた、上記に記載の方法により得ることが可能なマグノリアシャンパカ油にも関する。
【００５４】
続いての態様によれば、本発明は、老化または老化に関連する生理学的メカニズムまたはこれらメカニズムに関連する疾患による皮膚の有害な変化を防止および／または処置するための、多機能性活性成分としての、化粧用、医薬用または皮膚科学的組成物における上記に記載のマグノリアシャンパカ油の使用に関する。
【００５５】
特に、本発明は、治癒または細胞修復を向上する薬剤および／または表皮細胞の代謝を活性化するための薬剤および／またはフリーラジカルを捕捉するための薬剤および／または表皮を解毒するための薬剤としての、化粧用組成物における、上記に記載のマグノリアシャンパカ油の使用に関する。
【００５６】
本発明はまた、治癒または細胞修復を向上する薬剤および／または表皮細胞の代謝を活性化するための薬剤および／またはフリーラジカルを捕捉するための薬剤および／または核ＤＮＡを保護するための薬剤および／またはミトコンドリアＤＮＡを保護するための薬剤および／または表皮を解毒するための薬剤としての、医薬用または皮膚科学的組成物の調製のための、上記に記載のマグノリアシャンパカ油の使用にも関する。
【００５７】
これは、有利には、本発明のマグノリアシャンパカ抽出物は、特に老化による皮膚の有害な変化に関連する生理学的メカニズムの防止または修復に関するいくつかの有利な活性を有することが見出されたためである。
【００５８】
したがって、本発明は、より特に、メラニンの合成を阻害する薬剤として、特にエンドセリンの合成を阻害する薬剤としての、化粧用、医薬用または皮膚科学的組成物における上記に記載のマグノリアシャンパカ油の使用に関する。エンドセリンは、メラノサイトの増殖、および老化に関連する皮膚の色素沈着（「肝斑」）の原因となるメラニン形成の増大を促進するメッセンジャータンパク質である。
【００５９】
本発明は特に、転写因子ＭＩＴＦ（小眼球症関連転写因子）、メラノサイトを調節しかつ分化させる因子を阻害する薬剤としての、化粧用または皮膚科学的組成物における上記に記載のマグノリアシャンパカ油の使用に関する。
【００６０】
有利には、本発明のマグノリアシャンパカ油は、ケラチノサイトによる、増殖因子のいくつかのファミリーの合成を刺激することも、また見出されている。
【００６１】
特に、この活性は、下記の増殖因子に関して発揮される：
−  特に間充織由来の細胞の大部分に対して分裂促進活性を発揮し（Ｌｅｐｉｓｔｏ  Ｊ．他、１９９５年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２０９（２）、３９３〜９頁）、かつこれらの細胞によるコラーゲンおよびコラゲナーゼの合成を刺激し、それにより治癒および組織修復などの生理学的方法において役割を果たしている（Ｔａｎ  Ｅ．Ｍ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９９５年、３１０（Ｐｔ  ２）、５８５〜８頁）ＰＤＧＦ、すなわち血小板由来の増殖因子；ＰＤＧＦ誘導のレベルおよび細胞の複製能は、年齢に関連していたことも示されている：老化線維芽細胞は、そのＰＤＧＦレベルが低下している（Ｋａｒｌｓｓｏｎ  Ｃ．他、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９４年、１５８（２）、２５６〜６２頁）。また、種々の増殖因子の量およびタイプにより、組織がそれ自体を修復する能力の年齢による違いを説明することができたことも示されている（Ａｓｈｃｒｏｆｔ  Ｇ．Ｓ．他、Ｊ．Ａｎａｔ．、１９０、１９９７年（Ｐｔ３）、３５１〜６５頁）。
−  皮膚において、主要な皮膚血管形成因子に相当するＶＥＧＦ、すなわち血管内皮増殖因子。表皮は、ケラチノサイトの増殖により大量に分泌されるＶＥＧＦの重要な供給源である。ＶＥＧＦのｍＲＮＡは、組織内原位置および細胞培養物の両方において、正常ケラチノサイトにより、発現される。ＶＥＧＦは、高齢の被験者においてさえも、内皮細胞のホメオスタシスおよび内皮細胞の血管系生成の刺激に対する応答能力を維持するであろうことが示されている（Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｙ．他、１９９７年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１４、２０２５〜２０３２頁）。
【００６２】
さらに、ＶＥＧＦの減少は、ＵＶ照射への暴露に引き続いて、観察されている（Ｍｉｌｄｎｅｒ  Ｍ．他、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．、１９９９年、７０（４）、６７４〜９頁）。
−  ケラチノサイトの調節および分化において重要な役割を果たし（Ｉｗａｍｏｔｏ他、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２０００年、１１、３３５〜３４４頁）、かつ若い細胞の老化において、その成長がこの因子に依存している（ＪＩＤ  Ｓｕｐｐｌ．、２４、Ｓ４６〜Ｓ５０；Ｋａｎｚａｋｉ  Ｙ．他、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．、２００２年、２７９（２）、３２１〜３２９頁）、ＨＢ−ＥＧＦすなわちヘパリン結合性表皮増殖因子。
【００６３】
用語「増殖因子のいくつかのファミリーの合成の活性化剤」は、本発明によれば、ケラチノサイトによりかつケラチノサイト中で発現されかつ／または合成されるこれらの増殖因子の少なくとも１つの活性および／または発現および／または放出を刺激することができるあらゆる分子を意味するものと理解される。
【００６４】
本発明は、したがって、ケラチノサイトによる少なくとも１つの増殖因子の合成を活性化する薬剤として、特にＰＤＧＦ、ＶＥＧＦおよびＨＢ−ＥＧＦから選択される少なくとも１つの増殖因子を活性化する薬剤としての、化粧用、医薬用または皮膚科学的組成物における、上記に記載のマグノリアシャンパカ油の使用に関する。
【００６５】
本発明はまた、マトリックスの分解に関連する酵素、特にマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、非常に特にＭＭＰ３（すなわちストロメライシン１）およびＭＭＰ９（すなわちゼラチナーゼＢ）の活性を阻害する薬剤としての、上記に記載のマグノリアシャンパカ油の使用にも関する。
【００６６】
マトリックスメタロプロテイナーゼは、皮膚の生理学的再構築という状況において、細胞外マトリックスを分解する酵素（エンドプロテアーゼ）である。加齢およびＡおよび／またはＢタイプのＵＶ照射への暴露は、これらのＭＭＰ、特にＭＭＰ３（すなわちストロメライシン１）およびＭＭＰ９（すなわちゼラチナーゼＢ）の活性を増加させ、この増加は、細胞増殖の減速によって皮膚の加齢による老化の一因となる、という結果をもたらす（ＷＯ  ９８／３６７４２）。このような理由から、細胞外マトリックスは、結果として皮膚組織のたるみおよびしわの形成を伴うような、さらに大幅な分解を受ける（Ｒｉｔｔｉｅ  Ｌ．他、Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．、２００２年、１（４）、７０５〜２０頁；Ｃｈｕｎｇ  Ｊ．Ｈ．他、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、２００１年、１１７（５）、１２１８〜２４頁）。
【００６７】
用語「メタロプロテイナーゼ阻害剤」は、本発明によれば、皮膚によりかつ皮膚において発現および／または合成される少なくとも１つのメタロプロテイナーゼの活性および／または発現および／または放出を阻害することができるあらゆる分子を意味するものと理解される。
【００６８】
本発明はまた、好ましい態様によれば、抗酸化剤としての、化粧用組成物におけるまたは医薬用または皮膚科学的組成物の調製のための、上記に記載のマグノリアシャンパカ油の使用にも関する。
【００６９】
本発明はまた、好ましい態様によれば、細胞の代謝を刺激する薬剤としての、化粧用組成物におけるまたは医薬用または皮膚科学的組成物の調製のための、上記に記載のマグノリアシャンパカ油の使用にも関する。
【００７０】
本発明はまた、好ましい態様によれば、表皮を解毒するための薬剤、特にキノンの解毒を触媒するＤＴジアホラーゼ（ＮＱＯ１）の合成を刺激することによる、ならびに脂質過酸化生成物などの化学的代謝物の解毒を触媒するグルタチオンＳ−トランスフェラーゼの合成を刺激することによる、酸化ストレスを受けた表皮の解毒のための薬剤としての、化粧用組成物におけるまたは医薬用または皮膚科学的組成物の調製のための、上記に記載のマグノリアシャンパカ油の使用にも関する。
【００７１】
本発明はまた、もう１つの好ましい態様によれば、細胞のエネルギー、特にシトクロムＣおよびＡＭＰキナーゼを刺激する薬剤としての、化粧用組成物におけるまたは医薬用または皮膚科学的組成物の調製のための、上記に記載のマグノリアシャンパカ油の使用にも関する。
【００７２】
シトクロムＣオキシダーゼは、電子伝達鎖の最終段階であり、細胞呼吸にとってはきわめて重要であり、また細胞ＡＴＰの合成にも寄与している（Ｌａｌｌａ  Ａ．他、Ｗｅｓｔ  Ｉｎｄｉａｎ  Ｍｅｄ．Ｊ．、２００１年６月、５０（２）、１１１〜６頁）。細胞のエネルギー状態は、ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）システムにより調整され、かつ細胞のＡＴＰ含有量にも寄与している（Ｄａｇｏｎ  Ｙ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００５年、２３、２８０（５１）、４２１４２〜８頁）。
【００７３】
本発明はまた、続いての態様によれば、上記に記載のマグノリアシャンパカ油および化粧品または医薬品に許容できる媒体を含む化粧用または医薬用または皮膚科学的組成物にも関する。
【００７４】
好ましくは、前記抽出物は、化粧用、医薬用または皮膚科学的組成物中に、組成物の全重量の０．００１から１０％の比率、特に０．０１から５％の比率、好ましくは組成物の全重量の０．１から１％の比率で、存在する。
【００７５】
前記化粧用、医薬用または皮膚科学的組成物は、特に局所経路による適用に適していてよい。
【００７６】
有利には、前記化粧用、医薬用または皮膚科学的組成物は、パウダー、エマルション、マイクロエマルション、ナノエマルション、サスペンジョン、溶液、ローション、クリーム、水性または水性／アルコール性ゲル、フォーム、セラム、エアロゾル溶液またはディスパージョン、または脂質小胞のディスパージョンの形態で提供されてよい。
【００７７】
エマルションの場合、エマルションは、油中水型または水中油型エマルションであってよい。
【００７８】
本発明の化粧用、医薬用または皮膚科学的組成物はまた、種々の成分および投与形態に従って選択される溶媒をも含む。
【００７９】
例として、水（好ましくは脱塩水）、エタノールなどのアルコール、またはエトキシジグリコールもしくはジエチレングリコールモノメチルエーテルなどのジエチレングリコールエーテルを挙げることができる。
【００８０】
前記化粧用、医薬用または皮膚科学的組成物はまた、当分野において一般的である少なくとも１つの添加剤、例えば、エモリエント剤または湿潤剤、ゲル化剤および／または増粘剤、界面活性剤、油、活性成分、染料、防腐剤、抗酸化剤、キレート剤、有機または無機パウダー、顔料、セルフタンニング剤、サンスクリーン、精油および香料から選択される少なくとも１種の化合物などをも含んでよい。
【００８１】
特に、限定することなしに、前記組成物は下記を含んでよい：
−  例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ポリエチレングリコールなどのポリオール、糖類またはこれらの誘導体、尿素、グリコール酸またはその塩、乳酸またはその塩、またはヒアルロン酸から選択される１種または複数の湿潤剤。
【００８２】
前記湿潤剤は、組成物中に、組成物の全重量の０．０１から２０％、好ましくは０．５から１０％程度の含有量で存在することになる。
−  例えば、揮発性または不揮発性シリコーン（ジメチコン、シクロメチコン、ジメチコノール、および同種のもの）、長鎖炭化水素、または脂肪酸もしくは脂肪アルコールのエステルから選択される１種または複数のエモリエント剤。
【００８３】
前記エモリエント剤は、組成物中に、組成物の全重量の０．５から３０％、好ましくは０．５から１５％程度の含有量で存在することになる。
−  例えば、セルロース誘導体、植物由来のガム（グアー、ローカストビーン、アルギン酸塩、カラギーナン、ペクチン）、微生物由来のガム（キサンタン）、クレイ（ラポナイト）、カルボキシビニルポリマー（カーボマー）、アクリル酸コポリマー、例えば、アクリレート／アルキルアクリレートコポリマー、ポリアクリルアミド、アンモニウムアクリロイルジメチルタウレートコポリマー、例えばアンモニウムアクリロイルジメチルタウレート／ビニルピロリドン（ＶＰ）コポリマーおよびアンモニウムアクリロイルジメチルタウレート／ベヘネス−２５メタクリレートコポリマー（例えば、Ｃｌａｒｉａｎｔ社によりＡｒｉｓｔｏｆｌｅｘ  ＡＶＣおよびＨＭＢの名称で販売されているものなど）から選択される１種または複数のゲル化剤および／または増粘剤、好ましくは１種または複数の親水性ゲル化剤。
【００８４】
非皮膜形成性ゲル化剤は、例えば、クレイ（ラポナイト）、アンモニウムアクリロイルジメチルタウレート／ＶＰコポリマーおよびアンモニウムアクリロイルジメチルタウレート／ベヘネス−２５メタクリレートコポリマー（例えば、Ｃｌａｒｉａｎｔ社によりＡｒｉｓｔｏｆｌｅｘ  ＡＶＣおよびＨＭＢの名称で販売されているものなど）から選択されてよい。
【００８５】
前記ゲル化剤および／または増粘剤は、組成物中に、組成物の全重量の０から１０％、好ましくは組成物の全重量の０．１から５％程度の含有量で存在することになる。
−  組成物中に、組成物の全重量の０．０１から１０％、好ましくは０．１から５％程度の含有量で存在する１種または複数の界面活性剤またはコサーファクタント、好ましくは非イオン性界面活性剤。
−  周囲温度で液体または固体であり、通常、油と称され、揮発性であっても不揮発性であってもよく、炭化水素ベースであってもシリコーンベースであってもよく、かつ、直鎖状、環状または分枝状またはバター状、例えば、イソドデカン、シクロペンタジメチルシロキサン、ジメチコン、イソノナン酸イソノニル、ペンタエリスリチルテトライソステアレート、カプリル酸およびカプリン酸のトリグリセリド、シアバターおよび同種のものであってよい、好ましくは組成物の全重量の０．０１から約１５％、好ましくは０．１から１０％の割合の、１種または複数の脂肪物質。
−  例えば、ビタミン、微量元素、アラントイン、植物タンパク、植物抽出物および同種のものから選択される、生物活性を有し、かつ生物学的部位を介しての皮膚への有効性を有する、天然、バイオテクノロジーまたは合成由来の１種または複数の活性成分。特に、前記活性成分は、藻類抽出物であってよい。
−  例えば、ポンソーの二ナトリウム塩、アリザリングリーンの二ナトリウム塩、キノリンイエロー、アマランスの三ナトリウム塩、タートラジンの二ナトリウム塩、ローダミンの一ナトリウム塩、フクシンの二ナトリウム塩、またはキサントフィルなどの、好ましくは組成物の全重量の０から約２％の割合の１種または複数の水溶性染料。
【００８６】
化粧品、医薬品または皮膚科学分野において通常使用される他の添加剤もまた、本発明の組成物中に存在してよく、それらは特に、技術分野でよく知られている防腐剤、キレート剤、抗酸化剤、精油または香料である。
【００８７】
当業者は、これら可能性のある全ての添加剤の中で、組成物および組成物に添加されるであろう添加剤の量を、組成物がその特性をすべて維持するように選択することができる立場にある。
【００８８】
本発明は、黙示的に限定されることなく、下記の実施例により例証される。
【実施例１】
【００８９】
本発明のマグノリアシャンパカ油の調製のための方法
１）ヘキサン抽出
２００ｋｇの新鮮なマグノリアシャンパカの花を１０００Ｌの反応器に充填する。
８００Ｌのヘキサンを加え、３５℃で４０分間の加熱を行う。
反応器からヘキサン溶液を取り出す。充填した溶媒は、残しておく。
６００Ｌのヘキサンを再び、反応器に充填する。３５℃で４０分間、加熱を行う。
再び、反応器からヘキサン溶液を取り出す。２つのろ液を合わせる。
ヘキサンを蒸発させる。
このようにして、０．５６ｋｇのマグノリアシャンパカ凝固物を回収する。
収率：０．２８％
【００９０】
２）分子蒸留
３０３ｇのマグノリアシャンパカ凝固物を１３０ｇのポリエチレングリコール６００（ＩＮＣＩ名：ＰＥＧ  １２）と混合する。
【００９１】
下記の蒸留パラメータに従って、ＫＤＬ４タイプ（ＵＩＣ  ＧｍＨ）の蒸留装置により２段階の蒸留を行う：
【００９２】
【表１】
2009530365.tif 000002
蒸留の収量は、下記の通りであり、出発物質の重量に対しての表示である：
蒸留物、第１段階＝２５．７％
蒸留物、第２段階＝３１．３４％
【００９３】
３）混合
２つの蒸留物を合わせて、ホモジナイズした後、プロピレングリコールを用いて混合物を生成する：９０重量％のプロピレングリコールに１０重量％の蒸留物を混合する。混合物をホモジナイズし、２５μｍフィルターを通してろ過する。
ろ液を回収する。
１６４０ｇのマグノリアシャンパカ油が得られる。
【実施例２】
【００９４】
本発明のマグノリアシャンパカ油の組成物の分析
実施例１に記載の方法の第３段階において得られた抽出物１００ｍｇを１Ｎの塩酸メタノール溶液２ｍｌに溶解する。溶液を攪拌した後、８０℃の水浴に１０分間入れる。
【００９５】
このようにしてエステル化した試料を２ｍｌのヘプタンを用いて液−液抽出により回収し、ガスクロマトグラフィーに注入する。
クロマトグラフィーは、下記の条件で行う：
ガスクロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｓｅｒｉｅｓ  ６８９０）。
インジェクター、２５０℃で、スプリットまたはスプリットレス注入
１／１００に分割して調製した試料の０．５μｌを注入。
１００％グラフト化ポリジメチルシロキサンキャピラリカラム、長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、フィルム厚：０．２５μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｓｅｒｉｅｓ  ＤＢ−１）での分離。
キャリアーガス：ヘリウム、１ｍｌ／分
カラムオーブンの初期温度：７０℃
７０℃から２５０℃まで、２℃／分の温度勾配、２５０℃で６０分間等温。
合計時間：１２０分
検出：炎イオン化検出器（補助ガス  窒素）
【００９６】
下記の表１に示すパーセンテージは、クロマトグラフのインテグレータにより得られた相対パーセンテージとして示される。この結果には、インジェクター内で蒸発可能な化合物のみが含まれている。プロピレングリコールは積分されておらず、したがって下記の表には収載されていない。
【００９７】
成分は、質量スペクトルにより同定した。
【００９８】
結果を下記の表１に示す。
【００９９】
【表２】
2009530365.tif 000003
【実施例３】
【０１００】
本発明のマグノリアシャンパカ油の増殖因子ＨＢ−ＥＧＦに対する活性の研究
実施例１で得られたマグノリアシャンパカ油の試料を、予めプロピレングリコール中１０％に希釈したものを種々の濃度で試験した。
【０１０１】
１）ケラチノサイト培養物の調製
本プロトコールは、全ての生物活性のアッセイに共通である。
新生児包皮由来のケラチノサイト（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社、米国サンディエゴ）を６−ウェルプレートに播種し、ケラチノサイト増殖用の培地（ＫＢＭ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）、すなわち組換えヒトＥＧＦ、インシュリン、ヒドロコルチゾン、ウシ下垂体抽出物、ゲンタマイシンおよびアンホテリシンＢを補充した改変培地中で培養した。
３７℃、５％  ＣＯ2および飽和湿度のインキュベーター中で２４時間培養した後、細胞をＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、試験物質を種々の濃度で含む特定の塩基性培地（ＫＢＭ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）で、試験に応じて６時間または２４時間、インキュベートした。
各濃度について、「ＥＬＩＳＡ」試験および「Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ」試験用の２つのドナーに対して３回ずつ、および分子生物学的試験用の２つのドナーに対して２回ずつ、試験を行った。
試験物質を含まない（「非処置の」）コントロールもまた、同一の培地中で細胞を処置することなく維持することにより、試験した。
陽性対照は、任意選択で活性試験済みの比較物質により行った。
【０１０２】
２）ＨＢ−ＥＧＦメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現の測定
アッセイの原理
処置試料におけるＨＢ−ＥＧＦメッセンジャーＲＮＡの発現を、非処置試料と比較して定量化するためにリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用する。結果は、これら試料中のハウスキーピング遺伝子の発現に関して規準化し、ＰＣＲ効率の違いに関して較正する。
【０１０３】
結果は、複写の絶対数としてではなく、処置試料において標的遺伝子（ＨＢ−ＥＧＦ）の発現が増加または減少する回数として示される。
【０１０４】
調査する遺伝子のｃＤＮＡ／ｍＲＮＡの配列は、ＧｅｎＢａｎｋから得られた。
標的遺伝子：ＨＢ−ＥＧＦ
ハウスキーピング遺伝子：ＰＢＤＧ
【０１０５】
全てのＰＣＲプライマーは、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ＲｅｓｅａｒｃｈのＰＲＩＭＥＲ３ソフトウェアを用いて得られた。
【０１０６】
アッセイプロトコール
ｍＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の推奨に従って、分離した。ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造者の推奨に従って、逆転写を行った。
【０１０７】
リアルタイムＰＣＲ測定を、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ検出器を備えたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ法（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行った。全てのアッセイにおいて、標準化プログラムを用いて、ｃＤＮＡを増幅させた。個々のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒキャピラリに、１．５μｌのＤＮＡマスターミックス、１．８μｌのＭｇＣｌ2（２５ｍＭ）、１０．１μｌの水および０．５μｌの各プライマー（１０μＭストック）を充填する。１反応当りのｃＤＮＡの最終量は、逆転写に使用される全ＲＮＡの２５ｎｇに相当する。
【０１０８】
ＰＣＲの特異性は、アガロースゲル電気泳動および塩基配列検査法により試験し、各試料についてＰＣＲプログラムに含まれている融点分析を用いて評価した。
【０１０９】
標的遺伝子発現の相対的定量化は、Ｐｆａｆｆｌ数学モデルを用いて行った（Ｐｆａｆｆｌ、Ｍ．Ｗ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｒｅｓ．、２９（９）、Ｅ４５頁、２００１年）。
【０１１０】
結果を下記の表２に示す。
【０１１１】
陽性対照として、ＨＢ−ＥＧＦを刺激することが知られている抗炎症サイトカインである腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）を用いた。
【０１１２】
【表３】
2009530365.tif 000004
【０１１３】
結果は、本発明のマグノリアシャンパカ油がＨＢ−ＥＧＦ  ｍＲＮＡの合成に対する刺激活性を有することを示している。
【実施例４】
【０１１４】
本発明のマグノリアシャンパカ油の増殖因子ＶＥＧＦに対する活性の研究
測定は、実施例３においてと同一の方法でＲＴ−ＰＣＲにより行った。調査する遺伝子のｃＤＮＡ／ｍＲＮＡの配列は、ＧｅｎＢａｎｋから得られた。
標的遺伝子：ＶＥＧＦ
ハウスキーピング遺伝子：β2−マイクログロブリン
ケラチノサイトの培養条件は、実施例３に記載の通りである。
【０１１５】
結果を下記の表３に報告する：
【０１１６】
【表４】
2009530365.tif 000005
【０１１７】
結果は、本発明のマグノリアシャンパカ油がＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの合成に対する刺激活性を有することを示している。
【実施例５】
【０１１８】
本発明のマグノリアシャンパカ油の増殖因子ＰＤＧＦ−ＡＡに対する活性の研究
細胞培養物におけるヒトＰＤＧＦ−ＡＡ増殖因子の濃度の定量評価を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）免疫学アッセイキット（Ｎｏ．ＤＡＡ００、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＥＬＩＳＡ法により行った。
【０１１９】
ケラチノサイトの培養条件および試験した試料は、実施例３に記載の通りである。
【０１２０】
結果を下記の表４に報告する：
【０１２１】
【表５】
2009530365.tif 000006
【０１２２】
結果は、本発明のマグノリアシャンパカ油がＰＤＧＦ−ＡＡの合成に対する刺激活性を有することを示している。
【実施例６】
【０１２３】
本発明のマグノリアシャンパカ油のエンドセリン−１に対する活性の研究
細胞培養物におけるヒトエンドセリン−１の濃度の定量評価を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）免疫学アッセイキット（Ｎｏ．ＢＢＥ５、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＥＬＩＳＡ法を用いて行った。
【０１２４】
ケラチノサイトの培養条件および試験した試料は、実施例３に記載の通りである。
【０１２５】
結果を下記の表５に報告する：
【０１２６】
【表６】
2009530365.tif 000007
【０１２７】
結果は、本発明のマグノリアシャンパカ油がエンドセリン−１の合成に対する阻害活性を有することを示している。
【実施例７】
【０１２８】
本発明のマグノリアシャンパカ油のＭＩＴＦに対する活性の研究
細胞培養物におけるＭＩＴＦ  ｍＲＮＡの濃度の定量評価を、実施例３において記載のプロトコールに従って行った。
標的遺伝子：ＭＩＴＦ
ハウスキーピング遺伝子：β2−マイクログロブリン
阻害の陽性対照として、コウジ酸を用いた。
【０１２９】
結果を下記の表６に報告する。
【０１３０】
【表７】
2009530365.tif 000008
【０１３１】
結果は、本発明のマグノリアシャンパカ油がＭＩＴＦ  ｍＲＮＡの発現に対する阻害活性を有することを示している。
【実施例８】
【０１３２】
本発明のマグノリアシャンパカ油のマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）に対する活性の研究
１／  アッセイの原理
試験する物質を、活性化したＭＭＰとともにインキュベートする。各ＭＭＰに対して特異的な蛍光酵素基質を添加することにより、酵素活性を制御する。
【０１３３】
２／  アッセイプロトコール
Ｐｒｏ−ＭＭＰ３またはＰｒｏ−ＭＭＰ９を１ｍＭのＡＰＭＡ（ｐ−アミノフェニル水銀アセテート）溶液とともに、周囲温度で、穏やかに攪拌しながら１時間、プレートの中でインキュベートする。
【０１３４】
種々の濃度の、種々の潜在的阻害剤を添加する。その後、混合物を穏やかに攪拌しながら周囲温度でインキュベートする。ＤＭＳＯに溶解した蛍光基質（ＳＩＧＭＡ）を添加することにより、酵素反応を開始させる。
【０１３５】
酵素反応を、蛍光光度計を用いて１時間モニターし、ＭＭＰ３（すなわちストロメライシン１）については励起波長３６０ｎｍおよび発光波長４６０ｎｍで、ＭＭＰ９（すなわちゼラチナーゼＢ）については励起波長３２０ｎｍおよび発光波長４０５ｎｍで蛍光を測定する。
【０１３６】
結果は、放出された蛍光の単位（ＲＦＵ）で表し、ＲＦＵは、加水分解される基質の１分間当りの量に相当する。
【０１３７】
Ｍｉｃｒｏｗｉｎ  ２０００蛍光光度計で、吸収の変動Δを算出する。これは、酵素反応の初期速度（Ｖｉ）に相当する。各アッセイにおいて、潜在的阻害剤の各濃度について得られたＶｉの３つの値の平均値を算出する。１０回の実験の結果を平均値±ＳＤ（標準偏差）として表し、次いで残存活性のパーセンテージとして示した。
【０１３８】
結果を下記の表７（ＭＭＰ３すなわちストロメライシン１）および表８（ＭＭＰ９すなわちゼラチナーゼＢ）に報告する。
【０１３９】
陽性対照として、メタロプロテイナーゼ類に対してよく知られた阻害活性を有するエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を用いた。
【０１４０】
【表８】
2009530365.tif 000009
【０１４１】
【表９】
2009530365.tif 000010
【０１４２】
結果は、本発明のマグノリアシャンパカ油が、マトリックスメタロプロテイナーゼＭＭＰ３およびＭＭＰ９の活性を阻害することを示している。
【実施例９】
【０１４３】
本発明のマグノリアシャンパカ油のＤＴジアホラーゼの合成に対する活性の研究
実施例３のプロトコールに従って細胞を調製した後、ウエスタンブロッティングによる分析を行うために細胞を溶解する。キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ニューヨーク）に従ってタンパク質を定量した後、タンパク質をゲルグラディエントの上で分画する。ゲルからの転写により生じるポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜を抗−ＮＱＯ１ポリクロナール抗体（Ｇｅｎｅｔｅｘ、テキサス州サンアトニア）の存在下でインキュベートする。すすぎを行った後、膜を「Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ」検出キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ニューヨーク）により展開する。
【０１４４】
結果を下記の表９に報告する。
【０１４５】
【表１０】
2009530365.tif 000011
【０１４６】
結果は、本発明のマグノリアシャンパカ油が、ＤＨジアホラーゼの活性を刺激することを示している。
【実施例１０】
【０１４７】
本発明のマグノリアシャンパカ油の、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の合成に対する活性の研究
実施例３のプロトコールに従って細胞を調製した後、細胞を溶解して上清を回収する。ＧＳＴの活性を、「ＧＳＴ活性アッセイキット」（Ｂｉｏｄｉｖｉｓｉｏｎ、カリフォルニア州マウンテンビュー）を使用することにより、キットのサプライヤーにより記載されたプロトコールに従って、評価する。
【０１４８】
結果を下記の表１０に報告する：
【０１４９】
【表１１】
2009530365.tif 000012
結果は、本発明のマグノリアシャンパカ油が、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの合成を刺激することを示している。
【実施例１１】
【０１５０】
本発明のマグノリアシャンパカ油の、細胞シトクロムＣの合成に対する活性の研究
実施例３のプロトコールに従って調製したケラチノサイトのライセート中のシトクロムＣの量を、「シトクロムＣ  ＥＬＩＳＡキット」（Ｚｙｍｅｄ（登録商標））を用いて定量する。
【０１５１】
結果を下記の表１１に報告する：
【０１５２】
【表１２】
2009530365.tif 000013
【０１５３】
結果は、本発明のマグノリアシャンパカ油が、細胞シトクロムＣの合成を刺激することを示している。
【実施例１２】
【０１５４】
本発明のマグノリアシャンパカ油の、ＡＭＰキナーゼの合成に対する活性の研究
実施例３のプロトコールに従って細胞を調製した後、ウエスタンブロッティングによる分析を行うために細胞を溶解する。キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ニューヨーク）に従ってタンパク質を定量した後、タンパク質をゲルグラディエントの上で分画する。ゲルから膜（ＰＶＤＦ）への転写により生じる膜を抗−ＡＭＰＫまたは抗−ホスホ−ＡＭＰＫαモノクロナール抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、マサチューセッツ州ベバリー）の存在下でインキュベートする。すすぎを行った後、膜を「Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ」検出キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ニューヨーク）により展開し、バンドを画像解析により定量する。
【０１５５】
結果を下記の表１２に報告する：
【０１５６】
【表１３】
2009530365.tif 000014
【０１５７】
結果は、本発明のマグノリアシャンパカ油が、ＡＭＰキナーゼの合成に対する刺激活性を有することを示している。
【実施例１３】
【０１５８】
本発明のマグノリアシャンパカ油の抗酸化活性の研究
３つのプロトコールの原理
種々のＡｂｅｌ（登録商標）１抗酸化テストキット（Ｋｎｉｇｈｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）により、試料がフリーラジカルを遮断する能力を測定することが可能である。各実験において、特定のタイプのラジカルまたは酸化剤が生成される：ヒドロキシルラジカル、ハロゲン化オキシダントまたはスーパーオキシドラジカルである。これらのケモルミネッセント試験は、フリーラジカルおよびある種の酸化剤の存在下で光を発する特別なＰｈｏｌａｓｉｎ（登録商標）光タンパク質を含む。試料の抗酸化能は、試料またはコントロールの存在下または非存在下での種々の試験のときに観察されるＰｈｏｌａｓｉｎ（登録商標）の発光ピークの減少のパーセンテージにより表される。
【０１５９】
陽性対照が、下記の試験ａ、ｂおよびｃのそれぞれに使用された。
【０１６０】
ａ／  本発明のマグノリアシャンパカ油のヒドロキシルラジカル阻害に関する活性の研究
陽性対照として、ヒドロキシルラジカルに対して既知の抗フリーラジカル効果を発揮するマンニトールを使用した。
【０１６１】
【表１４】
2009530365.tif 000015
【０１６２】
結果は、本発明のマグノリアシャンパカ油が、ヒドロキシルラジカルに対して抗酸化活性を有することを示している。
【０１６３】
ｂ／  本発明のマグノリアシャンパカ油のハロゲン化オキシダント阻害に関する活性の研究
陽性対照として、ハロゲン化オキシダントに対して既知の阻害活性を発揮するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用した。
【０１６４】
【表１５】
2009530365.tif 000016
結果は、本発明のマグノリアシャンパカ油が、ハロゲン化オキシダントに対して抗酸化活性を有することを示している。
【０１６５】
ｃ／  本発明のマグノリアシャンパカ油のスーパーオキシドラジカル阻害に関する活性の研究
陽性対照として、ビタミンＣ（アスコルビン酸）を使用した。アスコルビン酸は、スーパーオキシドラジカルの形成におけるその役割でよく知られている。
【０１６６】
【表１６】
2009530365.tif 000017
【０１６７】
結果は、本発明のマグノリアシャンパカ油が、スーパーオキシドラジカルに対して抗酸化活性を有することを示している。
【実施例１４】
【０１６８】
本発明のマグノリアシャンパカ油を含むアイコントアクリーム
下記の表１６および１７に記載の種々の成分は、その一般的な化学名でまたはＩＮＣＩ国際命名法（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｃｏｓｍｅｔｉｃ，Ｔｏｉｌｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｆｒａｇｒａｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ出版、第９版、２００２年）に従って示されている。
【０１６９】
【表１７】
2009530365.tif 000018
【実施例１５】
【０１７０】
本発明のマグノリアシャンパカ油を含むフェイスクリーム
【０１７１】
【表１８】
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【国際調査報告】
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