(57)【要約】  成熟ＣＮＳニューロンにおける傷害を有すると決定された患者における神経再生を促進するための組成物および方法が開示される。該方法は、該ニューロンと該ニューロンの再生を促進するのに十分なＥＧＦＲ阻害剤とを接触させる段階を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
成熟ＣＮＳニューロンにおける傷害を有すると決定された患者における、神経再生を促進する方法であり、前記ニューロンと前記ニューロンの再生を促進するのに十分なＥＧＦＲ阻害剤とを接触させる段階を含む、前記方法。
【請求項２】
傷害が、軸索傷害である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
傷害が、外傷に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
傷害が、ＣＮＳ変性に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
傷害が、外傷に起因し、および接触段階が、傷害の形成の９６時間以内に、もたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
傷害が、外傷に起因し、および接触段階が、傷害の形成の４８時間以内に、もたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
傷害が、外傷に起因し、および接触段階が、傷害の形成の２４時間以内に、もたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
傷害が、急性脊髄損傷に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
傷害が、急性脊髄損傷に起因し、および方法が、ニューロンと前記脊髄の炎症を減少させるのに十分なメチルプレドニゾロンとを接触させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
傷害が、視神経損傷に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
傷害が、緑内障に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＥＧＦＲ阻害剤が、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ＧＷ２０１６、ＧＷ５７２０１６、ＰＫＩ１６６、ＣＬ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、およびＧＷ２０１６から成る群から選択される小分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＥＧＦＲ阻害剤が、単クローン抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＥＧＦＲ阻害剤が、セツキシマブ、パニツムマブ、ＴｈｅｒａＣＩＭ、ＥＭＤ  ７２０００、およびＭＤＸ４４７から成る群から選択される単クローン抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＥＧＦＲ阻害剤が、注射により患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＥＧＦＲ阻害剤が、経口的に患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ＥＧＦＲ阻害剤が、埋め込み型デバイス内に含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
得られた神経再生を検出する段階を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
得られた神経再生を検出する段階を更に含み、前記神経再生が、神経学的検査により推論上検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
生分解性マトリックス、繊維、ポンプ、ステント、および吸収性ゼラチンから選択される、ＥＧＦＲ阻害剤溶離またはＥＧＦＲ阻害剤含浸ＣＮＳ−埋め込み型固体もしくは半固体デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本研究は、連邦政府助成第Ｒ２１ＮＳ０４１９９９号および第ＤＡ０１５３３５号により支援された。米国政府は、本出願についていずれかの特許発行において権利を有し得る。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の分野は、傷害した成熟ＣＮＳニューロンの神経再生を促進するための上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤の使用である。
【背景技術】
【０００３】
該ＣＮＳにおける成功的な軸索再生の障害は、成熟ニューロンの内因性再生不全に起因するだけでなく、損傷をうけた軸索が直面する環境にも起因する。阻害活性は、傷害部位でのグリア性瘢痕における、ＣＮＳミエリンおよびコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）の成分と主に関連する（１から４）。最近の研究は、３種のミエリンタンパク質である、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、Ｎｏｇｏ−Ａおよび希突起膠細胞ミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）がＣＮＳミエリンにおける阻害活性の大多数を全体として説明することを示唆した（４から６）。ＭＡＧの阻害活性、ＯＭｇｐの阻害活性およびＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインの阻害活性は、リガンド結合Ｎｏｇｏ−６６受容体（ＮｇＲ）およびそのシグナル伝達共受容体ｐ７５／ＴＲＯＹおよびＬｉｎｇｏ−１（７から１３）から成る共通の受容体複合体により介在され得る。しかし、軸索膜で起こるシグナル伝達事象が、軸索の再成長の阻害の根底にある特異的細胞骨格再配列にどのようにして翻訳されるかについては、少ししか知られていない。例えば、ＭＡＧおよびおそらく他のミエリン阻害剤が、細胞内Ｃａ２＋レベルの上昇を誘導することができることは知られている（１４から１６）。しかし、どのようにして細胞内Ｃａ２＋シグナル伝達が軸索再生の阻害に関わり得るかは、不明瞭である。
【０００４】
ＣＮＳニューロンの発生および分化における、ＥＧＦＲ活性化の関与は、広範囲にわたって研究されてきた。Ｇｏｌｄｓｈｍｉｔら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２００４）２７９：１６３４９から１６３５５）は、ＣＮＳニューロンにおけるＳＯＣＳ２の過剰発現が神経突起伸長を促進し、この伸長がＥＧＦＲ阻害剤ＰＰ３およびＡＧ４９０の添加により遮断されることを報告している。Ｗｕら（Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ（２００４）１５：２０９３から２１０４）は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンｖｅｒｓｉｃａｎＶ１が、ＮＧＦに依存しないニューロン分化を誘導し、ＥＧＦＲおよびインテグリン活性を増強することにより培養されたＰＣ１２細胞における神経突起伸長を促進すること、およびＥＧＦＲ阻害剤ＡＧ１４７８の添加が、分化を有意に遮断することを報告している。Ｗｉｌｄｅｒｉｎｇら（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２００１）２１：９３４５から９３５４）は、ＥＧＦが、淡水の巻貝であるリムナエアスタグナリス（Ｌｙｍｎａｅａ  ｓｔａｇｎａｌｉｓ）における粉砕された右内側頭頂（ＲＩＰ）神経のニューロンの軸索再生を促進すること、および特異的ＥＧＦＲ阻害剤ＰＤ１５３０３５によるＥＧＦ作用の阻害が、軸索再生へのＥＧＦの効果を打ち消すことを報告している。Ｌｉら（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２００３）２３：６９５６から６９６４）は、減少されたＥＧＦＲシグナル伝達を有するＰＣ１２細胞株が、ＮＧＦに応答して、減少された神経突起伸長を有すること、およびＡＧ１４７８（特異的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）が、これらの細胞に対して細胞毒性であることを報告している。
【０００５】
これらの報告に照らして、抑制するＥＧＦＲの機能の抑制が、ミエリン阻害分子の存在下における傷害した成体ＣＮＳニューロンの顕著な再生を促進するという発明者の発見は、非常に意外であった。
【発明の開示】
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、傷害したＣＮＳニューロンの神経再生を促進するための組成物および方法を提供する。１つの実施形態において、本発明は、成熟ＣＮＳニューロンにおける傷害を有すると決定された患者における神経再生を促進する方法を提供し、この方法は、該ニューロンと、該ニューロンの再生を促進するのに十分なＥＧＦＲ阻害剤とを接触させる段階を含む。
【０００７】
特定の実施形態において、傷害は、軸索傷害である。
【０００８】
特定の実施形態において、傷害は、外傷、ＣＮＳ変性、視神経損傷、または緑内障に起因する。
【０００９】
特定の実施形態において、傷害は、外傷、および傷害の形成の９６時間、４８時間、または２４時間以内に、もたらされる接触段階に起因する。
【００１０】
特定の実施形態において、傷害は、急性脊髄損傷に起因し、およびこの方法は、ニューロンと脊髄の炎症を減少させるのに十分なメチルプレドニゾロンとを接触させることを場合により含む。
【００１１】
特定の実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ＧＷ２０１６、ＧＷ５７２０１６、ＰＫＩ１６６、ＣＬ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、およびＧＷ２０１６から成る群から選択される小分子である。
【００１２】
もう１つの実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、セツキシマブ、パニツムマブ、ＴｈｅｒａＣＩＭ、ＥＭＤ  ７２０００、およびＭＤＸ４４７から成る群から選択される単クローン抗体である。
【００１３】
特定の実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、経口的にまたは注射により、患者に投与される。
【００１４】
もう１つの実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、埋め込み型デバイス内に含まれる。
【００１５】
特定の実施形態において、該方法は、得られた神経再生を検出する段階を含み、該神経再生は、場合により神経学的検査により推論上検出される。
【００１６】
本発明の更なる態様は、成熟ＣＮＳニューロンにおける傷害を有すると決定された患者における神経再生を促進する医薬を製造するためのＥＧＦＲ阻害剤の使用である。
【００１７】
（本発明の具体的態様の詳細な説明）
本発明は、傷害したＣＮＳニューロンの神経再生を促進するための方法および組成物を提供する。本明細書で使用されるとおりに、単数形「１つの」および「該」は、文脈が明らかに別の様に示していない限り、単数並びに複数の両方を指す。例えば、用語「ＣＮＳニューロン」は、単数および複数のニューロンの両方を含み、語句「少なくとも１つのＣＮＳニューロン」と同等であると考えられ得る。好ましい実施形態において、該ニューロンは、哺乳動物ニューロンであり、特定の実施形態において、該ニューロンは、ヒトニューロンである。
【００１８】
傷害したニューロンは、内因性ミエリン成長反発因子による成長阻害に供せられ、および原位置（すなわち、脳内、脳幹内、脊髄内、または患者もしくは動物モデルの視神経内に位置する）にあり得、または希突起膠細胞ミエリンもしくは分離されたミエリン成長反発因子（ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、Ｎｏｇｏ−Ａ、および希突起膠細胞ミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）など）とインビトロで共培養され得る。傷害は、ニューロンの任意の部分に存在し得る。特定の実施形態において、神経突起（すなわち軸索および／または樹状突起）が傷害され、およびＥＧＦＲ阻害剤処置は、神経突起伸長を促進する。１つの態様において、本発明は、成熟（すなわち、最終的に分化されており、発達初期ではない）ＣＮＳニューロン、好ましくは懐胎後、若年性、小児のまたは成体ＣＮＳニューロンにおける傷害を有すると決定された患者における神経再生を促進する方法を提供し、この方法は、ニューロンと、ニューロンの再生を促進するのに十分なＥＧＦＲ阻害剤とを接触させる段階を含む。該患者は、伴侶動物（イヌ、ネコなど）、家畜、神経変生またはＣＮＳ損傷用の動物モデル（例えば、ラット、マウス、霊長類など）などの哺乳動物である。特定の態様において、患者は、ヒトである。
【００１９】
該傷害は、外傷、脳卒中、圧力上昇、慢性の神経変性などに起因し得る。特定の実施形態において、該傷害は、挫傷、裂傷、急性脊髄損傷などにより引き起こされるものなどの急性損傷または外傷に起因する。この実施形態において、接触段階は、好ましくは、傷害の形成の９６時間以内、およびより好ましくは７２時間、４８時間、２４時間または１２時間以内に開始される。該ＥＧＦＲ阻害剤は、抗炎症剤の使用などの他の処置計画との組み合わせにおいて、またはその前もしくはその後に、損傷を受けたニューロンに投与され得る。具体的な実施形態において、該傷害は、急性脊髄損傷に起因し、該方法は、ニューロンと、脊髄の炎症を減少させるのに十分なメチルプレドニゾロンとを接触させることを更に含む。もう１つの実施形態において、該傷害は神経変性に起因し、例えば、神経毒性、またはハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、緑内障などの神経性疾患もしくは障害により、引き起こされ得る。
【００２０】
ＥＧＦＲ阻害剤は、アンチセンスおよびＲＮＡｉオリゴヌクレオチド阻害剤、ペプチド核酸、ペプチドアンタゴニスト、単クローン抗体（ＭＡＢ）、小分子阻害剤（ＳＭＩ）などを含むＥＧＦＲ機能を特異的に抑制するどんな阻害剤でもあり得る。また、ＥＧＦＲ切断、Ｇｅｎｅ３３ポリペプチド（ＲＡＬＴおよびＭＩＧ６とも呼ばれる）、およびケッコン（ｋｅｋｋｏｎ）などの、ＥＧＦＲシグナル伝達を妨げることで知られている様々な分子は、標的細胞において標的され、導入されまたは発現され得る。例えば、幅広い科学技術が、タンパク質形質移入のために利用可能であり、これらの科学技術は、カチオン性リポソーム、リン酸カルシウム共沈、電気穿孔法、微量注入、ウイルスベクター、および多数の市販の、商品である脂質、ポリアミド、および両性タンパク質試薬（「ＰｒｏＪｅｃｔ」、「ＴｒａｎｓＩＴ」、「Ｐｒｏｆｅｃｔ−１」、「Ｃｈａｒｉｏｔ」および「ＰｒｏｔｅｏＪｕｉｃｅ」を含む）の使用を含む。特定の実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲのキナーゼ機能を特異的に抑制する、小分子または単クローン抗体である。表Ｉに、ＦＤＡ承認のまたは臨床試験中である、いくつかの小分子および抗体ＥＧＦＲ阻害剤が列挙される。
【００２１】
【表１】
2009501221.tif 000002
【００２２】
ＥＧＦＲ阻害剤は、いずれかの適した薬物送達方法を使用して、ニューロンと接触させられ得る。インビトロ方法について、該阻害剤は、通常ナノモルまたはミクロモル濃度で、培地に加えられる（実施例１および実施例３参照）。原位置適用について、該ＥＧＦＲ阻害剤は、経口的に、静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラスにより、静脈内注入により、頭蓋内、腹腔内、脳室内、硬膜などに投与され得る。患者へのＥＧＦＲ阻害剤の投与のために適したプロトコルは、癌の処置用のＥＧＦＲ阻害剤について実施された広範囲の動物試験および臨床試験に、容易に由来し得る。ある実施形態において、該ＥＧＦＲ阻害剤は、経口的にまたは静脈内に投与される。いくつかの、経口的におよび静脈内に投与されたＥＧＦＲ阻害剤は、神経膠腫および他の脳腫瘍において良好な忍容性および有効性があると示され、このことは、これらの経路により送達されたＥＧＦＲ阻害剤が、ＣＮＳの細胞に対して治療的効果を有することを実証する。小分子ＥＧＦＲ阻害剤は、通常約５０から５００ｍｇ／日で経口により投与され、および単クローン性抗体は、通常約１から５ｍｇ／ｋｇで注入により週に１回、投与される。他の実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＣＮＳニューロンへの送達のために特異的に適合された埋め込み型デバイス内に含まれる。該デバイスは、徐放性の生分解性マトリックス、繊維、ポンプ、ステント、吸収性ゼラチン（例えば、ゲルフォーム）、またはニューロン再生を促進するのに十分なＥＧＦＲ阻害剤の、前処理された、分離している、および含まれた量を充填した他のデバイスを含む（実施例５を参照）。特定の実施形態において、該デバイスは、ナノモルまたはミクロモル濃度での、ニューロンとＥＧＦＲ阻害剤との連続的な接触を提供する。
【００２３】
該表題の方法は更に、得られた神経再生を検出する段階を含み得る。インビトロ適用について、神経再生は、神経突起伸長アッセイなどの、いずれかの日常使用される方法により検出され得る（実施例１を参照）。原位置適用について、神経再生は、ＭＲＩなどの画像化方法論を用いて、検出され得る。より一般に、神経再生は、患者の神経機能における改善を示す神経学的検査により推論的に検出される。検出段階は、ＥＧＦＲ阻害剤処置の開始後のいずれかの時点（例えば、処置の開始後、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月など）で起こり得る。ある実施形態において、検出段階は、初めの神経学的検査および初めの検査開始後、少なくとも１日、１週間または１ヶ月で実施される神経学的検査を含む。初めの検査と比較して、この次の検査での改善された神経機能は、得られた神経再生を示す。該使用される特異的検出および／または検査方法は、評価される神経傷害の特定の型（すなわち、外傷、神経変性など）に対する医療の、広く行われている標準に通常基づく。
【００２４】
本発明はまた、ＥＧＦＲ阻害剤溶離またはＥＧＦＲ阻害剤含浸ＣＮＳ−埋め込み型固体または半固体デバイスを提供する。ＣＮＳ埋め込み型デバイスの例として、重合体微粒子（例えば、Ｂｅｎｎｙら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００５）１１：７６８から７６を参照）またはオブラート（例えば、Ｔａｎら，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．（２００３）４：７７３から８９を参照）、脊髄損傷後の組織再生において使用される生合成埋め込み（Ｎｏｖｉｋｏｖａらにより再検討される，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌ（２００３）６：７１１から５）、生分解性マトリックス（例えば、Ｄｕｍａｎら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００４）１２５：５９１から６０４）、生分解性繊維（例えば、米国特許第６，５９６，２９６号を参照）、浸透圧ポンプ、ステント、吸収性ゼラチン（Ｄｏｕｄｅｔら，Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．（２００４）１８９：３６１から８）などが挙げられる。好ましいデバイスは、ＣＮＳ埋め込みのために、特別に仕立てられ、適合され、設計されまたは指定される。該埋め込み型デバイスは、神経再生を促進または容易にするために使用される１つ以上の追加的薬剤を含み得る。例えば、１つの実施形態において、急性脊髄損傷の処置のために使用される埋め込み型デバイスは、ＥＧＦＲ阻害剤およびメチルプレドニゾロンまたは他の抗炎症剤を含む。もう１つの実施形態において、埋め込み型デバイスは、ＥＧＦＲ阻害剤、および神経細胞の生存、成長および／または分化を促進する、神経成長因子またはホルモン（脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）など）を含む。
【実施例１】
【００２５】
ＥＧＦＲ阻害剤は、ミエリン基質上で神経突起伸長を促進する
【００２６】
発明者は、固定化されたミエリン基質上の小脳粒状細胞（ＣＧＮ）の神経突起アッセイにおいて、およそ４００の良く特徴付けられる小分子のスクリーニングを行った。ミエリンを、公開されている方法を用いて９６−ウェルプレート上で固定化した（８）。シグナル伝達分子標的薬物ライブラリー（ＴＯＣＲＩＳ）からの個別の化合物を、低ナノモルからミクロモルに一般にわたる濃度において、それらのＩＣ５０値に中心を置いた１０倍希釈液により希釈し、ウェルあたり５×１０４ＣＧＮを有する培養ウェルに移した。細胞を一晩成長させ、パラホルムアルデヒド中に固定し、チューブリン抗体で染色した。伸長を、２人の、予備知識がない観察者により個別に評価した。陽性と記録された化合物を、更なる検定のために選んだ。それぞれの化合物を、ＩＣ５０値に中心を置いた１０４希釈範囲で評価し、評価したそれぞれの薬物に対する有効濃度を確認した。ｃＡＭＰ類似体、ホスホジエステラーゼ阻害剤、およびＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤を含む、いくつかの内部標準を選別において特定し、前の所見を確認し、発明者のアプローチを確証した。試験した化合物の大部分は、神経突起伸長に顕著な効果を有さず、およびこれらのうちの少数は、毒性であった。驚くべきことに、Ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ  Ｂ４４（−）、Ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ  Ａ４７、およびＴｙｒｐｈｏｓｔｉｎ  Ａ４６を含むいくつかのＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、ミエリン阻害の効果を無効にする最も優れた能力を示し、ＥＧＦＲキナーゼ活性が、ニューロン中にミエリン依存性ＣＮＳ伸長シグナルの形質導入において重要な役割を果たす可能性を示唆した。
【００２７】
ミエリン阻害におけるＥＧＦＲキナーゼの関与を確認するために、発明者は、伸長アッセイにおいて、特有の作用機構を有する２つの良く特徴付けられたＥＧＦＲ阻害剤、ＡＧ１４７８およびＰＤ１６８３９３、および非受容体チロシンキナーゼ阻害剤、ＡＧ１２８８を試験した。Ｐ７−９ＣＧＮを対照上に平板接種し、ミエリン基質を固定し、ＡＧ１２８８（１μＭ）、ＡＧ１４７８（１０ｎＭ）およびＰＤ１６８３９３（１０ｎＭ）の存在下で２０時間成長させた（８、１０）。細胞を、パラホルムアルデヒド中に固定し、抗−チューブリン抗体（Ｔｕｊｌ，Ｃｏｎｖａｎｃｅ）で染色して視覚化し、神経突起の長さを定量化した。該ＥＧＦＲ阻害剤ＡＧ１４７８およびＰＤ１６８３９３は、全部のミエリン並びに個別のミエリン阻害剤（Ｎｏｇｏ−６６およびＭＡＧを含む）の基質上で成長させた場合、ＣＧＮおよび後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン両方からの神経突起伸長を効果的に促進したが、ＡＧ１２８８は促進しなかった。およそ５００ニューロンを、少なくとも３つの独立した実験からのそれぞれの条件に対して計数した。阻害剤上のＡＧ１４７８およびＰＤ１６８３９３処置の全ては、顕著であった。対照的に、処置のいずれもが、対照ポリ−Ｄ−リシン（ＰＤＬ）基質上の神経突起伸長またはニューロンの生存のいずれにも影響を及ぼさなかった。同様に、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、ミエリンを積載するコラーゲンマトリックス内の成長させた網膜外植片培養物におけるミエリン神経突起伸長を遮断することが出来た。Ｐ５−６マウス網膜を切り取り、組織チョッパー上で小さな外植片に切断した。該得られた外植片を、ＰＤ１６８３９３（１０ｎＭ）の存在下または非存在下において、ミエリン（１０μｇ／ｍｌ）を含むまたは含まないコラーゲンマトリックス内で培養した。外植片を固定し、抗−チューブリン抗体で染色した。ミエリン培養物に加えられたＰＤ１６８３９３は、ミエリン単独と比較した場合、外植片の伸長を有意に促進した（＊スチューデントｔ検定Ｐ＜０．０００１）。これらの結果は、ＥＧＦＲ阻害剤が一般の神経突起伸長プログラムを活性化しないが、むしろミエリン阻害剤の活性のために要求されるシグナル伝達経路を妨げることを示した。
【実施例２】
【００２８】
変異体ＥＧＦＲを過剰発現し、ミエリン上で成長したＣＧＮは広範囲にわたる神経突起伸長を示す
【００２９】
薬理学的操作から得られた発明者の結果を補完するために、発明者は、ニューロンにおけるヒトＥＧＦＲの変異型の発現を形質導入する組み換えヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）を作成した（１８、１９）。キナーゼ欠乏ＥＧＦＲ−Ｋ７２１Ａ（ｋｄＥＧＦＲ）は、キナーゼＡＴＰ−結合部位における点変異体を運び（１８、１９）、過剰発現する場合、ドミナントネガティブな方法において内因性ＥＧＦＲの活性を示すことが出来る。野生型（ｗｔＥＧＦＲ）およびキナーゼ−欠乏ＥＧＦＲ（ｋｄＥＧＦＲ）ＨＳＶ感染２−２細胞を、１ｎｇ／ｍｌＥＧＦで５分間刺激し、該溶解産物を、ｐＴｙｒ１１７３ＥＧＦＲ（ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）に対する抗体で免疫ブロットした。ブロットを取り剥がし、抗−ＥＧＦＲ抗体で再プローブした。ＣＧＮを、ＨＳＶウイルスに感染させ、対照およびミエリン基質上に平板接種した。平均の神経突起の長さが、得られた。変異体で感染させられたＣＧＮは、ミエリン上で広範囲にわたる神経突起伸長を示したが、野生型ＥＧＦＲは示さなかった。これらの結果は、ＥＧＦＲキナーゼ活性がミエリン依存神経突起伸長阻害に要求されることを示した。
【実施例３】
【００３０】
ミエリン阻害剤Ｎｏｇｏ−６６およびＯＭｇｐは、ＥＧＦＲを活性化する
【００３１】
前の遺伝学的研究は、発生中のニューロン移動および軸索投射におけるＥＧＦＲを意味付けた。（２０、２１）しかし、成体神経系におけるＥＧＦＲの発現および機能は、不明瞭のままである。原位置ハイブリダイゼーションを用いて、発明者は、ＥＧＦＲが、大脳皮質、小脳、ほとんどのＤＲＧニューロン、および網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を含む、成熟神経系のほとんどの部分において発現したことを見出した。更に、抗−ＥＧＦＲ抗体は、培養されたＤＲＧニューロンの細胞体および神経突起ならびに網膜外植片の両方を免疫染色した。
【００３２】
ミエリン阻害剤が、ミエリン−応答ニューロンにおけるＥＧＦＲの活性に直接影響を及ぼすかどうかを検討するために、発明者は、血清欠乏ＣＧＮを組み換え型可溶性ミエリン阻害剤で処置し、ＥＧＦＲ受容体活性を評価した。ニューロン溶解産物をリン酸化ＥＧＦＲに対して向けられる抗体を用いてブロットすることにより、発明者は、Ｎｏｇｏ−６６およびＯＭｇｐの両方が、早くも刺激後１分で、ＥＧＦＲリン酸化を５ｎＭで誘発したことを見出した。対照アルカリホスファターゼ（ＡＰ）タンパク質またはケモレペラント（ｃｈｅｍｏｒｅｐｅｌｌａｎｔ）Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）のいずれもが、ＥＧＦＲリン酸化の検出可能なレベルを誘導しないので、このＥＧＦＲ活性化は、ミエリン阻害剤に対して特異的であると思われた。ＥＧＦＲ活性化の更なる証拠は、Ｎｏｇｏ−６６−依存性ＥＲＫ１／２ＭＡＰキナーゼ活性化が、ＥＧＦＲキナーゼ依存方法において起きることを観察することにより、得られた。
【００３３】
以前に、発明者は、そのシグナル伝達共受容体ではなくリガンドに結合する能力を有するＮｇＲの切断型を開発した（８から１０、１２）。過剰発現する場合、該切断された受容体は、共受容体結合に対する内因性ＮｇＲと競合することが出来、従って阻害剤誘導シグナル伝達経路を遮断する（８から１０、１２）。ＥＧＦＲ活性化がＮｇＲ複合体依存性であることを示唆し、発明者は、この切断された（しかし、完全な長さではない）ＮｇＲの発現がまた、Ｎｏｇｏ−６６により誘発されるＥＧＦＲリン酸化を効果的に遮断することを見出した。次いで、発明者は、細胞表面結合および共−免疫沈降実験を行ったが、阻害剤リガンドへのＥＧＦＲの直接結合、またはＮｇＲもしくはｐ７５との物理的会合を検出することに失敗した。これらの結果は、ＥＧＦＲがミエリン由来阻害剤に対する受容体でなく、正準のＮｇＲ複合体の一部でもない可能性があることを示した。同族のリガンドによる活性化に加えて、ＥＧＦＲリン酸化がまた、他のシグナル伝達経路による「トランス−活性化」に起因し得ることは、知られている（２２、２３）。例えば、アンギオテンシンＩＩは、アンギオテンシンＡＴ１受容体を通って作用し、ＥＧＦＲのトランス−活性化およびＭＡＰキナーゼの活性化を介する心筋細胞の成長を促進する（２３）。ＮｇＲ受容体複合体におけるＥＧＦＲを検出しない場合は、活性ＮｇＲ受容体複合体のシグナル伝達下流によるＥＧＦＲの可能なトランス−活性化を示唆する。これの支持において、発明者は、ミエリン阻害剤の最適濃度により誘発されるＥＧＦＲリン酸化の範囲が、上皮増殖因子（ＥＧＦ）の低濃度（１から２ｎｇ／ｍｌ）から得られたものと比較可能であったことを見出し、これを連想させることは、ＥＧＦＲトランス−活性化に対して以前に報告されている（２４）。いくつかの分子は、ＥＧＦＲトランス−活性化に関わり、これは、Ｃａ２＋、ＰＫＣ、非受容体チロシンキナーゼ（ＳｒｃおよびＰｙｋ２）、Ｇ−タンパク質−結合受容体およびＥＧＦ様リガンドを生成するメタロプロテアーゼを含む（２２から２５）。発明者は、これらの機構のいずれかが特異的シグナル伝達経路を薬理学的に阻害することにより、ＮｇＲ−依存ＥＧＦＲトランス−活性化に関わるかどうかを検査した。カルシウムキレート剤ＥＧＴＡおよびＢＡＰＴＡ−ＡＭのみが、Ｎｏｇｏ−６６処置に続くＥＧＦＲリン酸化を有意に減少させた。ＰＫＣ阻害剤Ｇｏ６９７６、メタロプロテアーゼ阻害剤ＴＡＰＩおよびＧＭ６００１、Ｓｒｃ阻害剤ＰＰ２、および百日咳毒素は、Ｎｏｇｏ−６６誘発ＥＧＦＲリン酸化に対して効果を有さない。ＥＧＦＲトランス−活性化の発想の更なる支持において、ＥＧＴＡもＢＡＰＴＡ−ＡＭもいずれも、ＥＧＦによる直接ＥＧＦＲ活性化に対してまったく影響をおよぼさない。従って、結果は、ＥＧＦＲトランス活性化が、ミエリン阻害剤に応答するＣａ２＋シグナル伝達の重要な下流成分であることを示す。
【実施例４】
【００３４】
ＥＧＦＲ阻害剤は、ＣＳＰＧの神経突起伸長阻害活性を中和する
【００３５】
ミエリン阻害剤に加えて、グリア性瘢痕におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）は、軸索の再生に対する主な障害物を表す。ＣＳＰＧが、応答するニューロンにおける細胞内Ｃａ２＋レベルを上昇させるという以前の観察と一致して（２６）、発明者は、ＥＧＦＲ阻害剤がまた、ＣＳＰＧの神経突起伸長阻害活性を中和出来ることを見出した。網膜外植片を、ＣＰＳＧ（２００ｎｇ／ｍｌ、ｃｈｅｍｉｃｏｎ）およびＰＤ１６８３９３（１００ｎＭ）を有するおよび有さないコラーゲンゲル中で３日間成長させ、固定し、抗−チューブリン抗体で染色した。ＣＳＰＧ単独と比較した場合、ＰＤ１６８３９３は、外植片の神経突起の長さを有意に増加させた。更に、血清欠乏ＣＧＮに加えられた可溶性ＣＳＰＧは、カルシウム依存性に、ＥＧＦＲリン酸化を誘発することが出来た。対照的に、成長円錐崩壊もＳｅｍａ３Ａにより誘導される反発的な応答も、ＥＧＦＲ阻害剤により影響を受けなかった。Ｓｅｍａ３Ａが細胞内Ｃａ２＋から独立して作用することが以前に示唆されたので（２７）、これらの結果は更に、ＥＧＦＲが軸索ガイダンス経路における重要なカルシウム特異的シグナル伝達分子であることを示す。
【実施例５】
【００３６】
ＥＧＦＲ阻害は、成体マウスにおける傷害した視神経線維の再生を促進する
【００３７】
ニューロンのＥＧＦＲ活性の阻害が、ミエリン阻害剤およびＣＳＰＧの両方の阻害活性を効果的に遮断することが出来たという発見は、ＣＮＳ傷害部位で導入されたＥＧＦＲ阻害剤が、視神経粉砕のモデルにおける軸索再生を促進出来たかどうかを、発明者が検査するよう促した（２８）。全ての動物実験は、スケペンス眼研究所（Ｓｃｈｅｐｅｎｓ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）での動物管理使用委員会により承認されたプロトコルに従って行われた。成体マウスの視神経を眼球の後ろで曝露し、粉砕した。成体マウスにおける損傷の後すぐに、ＥＧＦＲ阻害剤ＰＤ１６８３９３または０．１％ＤＭＳＯ（対照）を含む溶液内で浸漬されたゲルフォームを、神経の粉砕部位と接して置き、調査の初めの６日間３日ごとに交換した。動物を、損傷後２週間で屠殺し、次いで４％パラホルムアルデヒドで経心腔的潅流を行った。視神経を、１０μｍで凍結切片にし、抗−ＧＡＰ４３抗体（ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で染色し、再生する軸索を検出した（２８）。ＤＭＳＯ処置された対照マウスにおいて再生は、ほとんど検出されなかった。しかし、ＰＤ１６８３９３の損傷部位適用によるＥＧＦＲキナーゼ活性の抑制は、対照マウスと比較して、損傷部位から０．２５ｍｍを超えると測定された、再生した軸索の数における９倍の増加を有するかなりの軸索再成長をもたらした。ＰＤ１６８３９３処置後の網膜神経節ニューロン（ＲＧＣ）の観察された軸索再成長が、改善された細胞生存の結果であった可能性を試験するために、発明者は、抗−チューブリンＴｕｊ１抗体（この抗体は、網膜内のＲＧＣを染色する。）で網膜切片を染色し、生存するＲＧＣを計数した。ＲＧＣ生存におけるＰＤ１６８３９３の検出可能な効果は、見出されなかった。従って、損傷後の局所的および短時間窓内でＥＧＦＲ活性を遮断することは、成体マウスにおける傷害した視神経線維の有意な再生を促進するのに十分である。
【実施例６】
【００３８】
ラットにおける皮質の衝撃損傷後のゲフィチニブの神経保護効果
【００３９】
Ｃｈｅｒｉａｎら（Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．（２００３）３０４：６１７から２３）から適合させた方法論を用いて、脳衝撃損傷のラットモデルにおけるゲフィチニブの異なる用量の効果および処置スケジュールの効果を、試験する。３００から４００ｇの重量である全部で６０匹の雄Ｅｖａｎｓラットを、腹腔内（ｉ．ｐ）注射した以下の用量：無し（食塩水対照群）、１、１０、および５０ｍｇ／ｋｇ／日ゲフィニチブの１つのに割り当てる。それぞれの処置群における４匹のラットおよびそれぞれの対照群における３匹のラットを、１、３、７、または１４日の処置持続期間（すなわち食塩水を１、３、７または１４日投与した）に該ラットを、更に割り当てる。
【００４０】
衝撃損傷を生み出す方法の詳細は、以前に説明された（Ｃｈｅｒｉａｎら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ（１９９６）１３：３７１から３８３）。簡潔に、ラットの頭部を耳バーおよび切歯バーにより定位フレーム内に固定する。直径１０ｍｍの開頭術を、頭頂葉皮質にわたる頭蓋の右側上で行う。８ｍｍの直径を有する衝撃器の先端を、垂直からおよそ４５度の角度で、脳の曝露した表面に垂直の開頭部位において中心に位置させる。該先端が硬膜の表面にちょうど触るまで、先端を下げる。次いで、衝撃器杆体を収縮させ、該先端を更に３ｍｍ進め、衝撃の間に３ｍｍの脳変形を生じさせる。衝撃器に適用された気体圧力を、１５０ｐｓｉに調節し、およそ５ｍ／ｓの衝撃速度およびおよそ１５０から１６０ｍｓの持続期間を与える。
【００４１】
ラットを一晩絶食させ、ベント型麻酔チャンバー内で１００％酸素中の３．５％のイソフルランで麻酔をかける。１６−ゲージのＴｅｆｌｏｎカテーテルでの気管内の挿管に次いで、該ラットを、外科的準備および衝撃損傷のために１００％の酸素中の２％イソフルランで機械的に通気する。頭蓋内圧（ＩＣＰ）を、衝撃部位からかなり離れた、左前頭葉に挿入された３Ｆマイクロセンサー変換器（Ｃｏｄｍａｎ＆Ｓｃｈｕｒｔｌｅｆｆ，Ｒａｎｄｏｌｐｈ，ＭＡ）によりモニターする。ＩＣＰを、損傷の重症度の測定として、衝撃損傷の間にモニターする。直腸温度を、加温パッドにより３６．５から３７．５℃に維持し、これは、直腸サーミスターにより制御する。頭部に向けられる加熱ランプの助けにより、脳の温度を、３７℃に一定に維持する。
【００４２】
送達される容量がそれぞれの群に対して同じであり、ゲフィチニブの投与量のみが変化するように、ゲフィチニブのそれぞれの用量を、無菌０．９％食塩水の１ｍｌ中に溶解する。第１の用量を、衝撃損傷後の１時間以内に投与する。全てのカテーテルを取り除いた後および外科創傷を縫合した後に、該ラットを麻酔から覚ます。損傷後初めの３日間に、該ラットを、酒石酸ブトルファノール（鎮痛のための筋内の０．０５ｍｇ、１２時間ごと（１日２回））、およびエンロフロキサシン２．２７％（ＩＭ  ｑｄの０．１ｍｌ）で処置し、術後感染のリスクを減少させる。ゲフィチニブを、割り当てられた処置持続期間、毎日一回投与する。
【００４３】
結果の測定を、処置群についての予備知識がない調査者により行う。衝撃の２週間後に、該動物を、ケタミン／キシラジン／アセプロマジンの組み合わせで深く麻酔し、０．９％食塩水、次いで１０％リン酸緩衝ホルムアルデヒドで経心腔的潅流を行う。全体の脳を取り除き、４％ホルマリン内に固定する。固定された脳を、挫傷、血腫、およびヘルニア形成の存在に対して肉眼的に検査する。脳を、写真に撮り、２−ｍｍ間隔で切断し、次いでパラフィン中に包埋する。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色された９−μｍの厚さの切片を、組織学的検査のために調製する。包埋された切片の切断表面上の皮質の損傷の最も大きい断面領域を含めるために、特別な配慮を行う。Ｈ＆Ｅで染色された冠状切片を、ＰａｔｈＳｃａｎ  Ｅｎａｂｌｅｒ（Ｍｅｙｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を備えているＰｏｌａｒｏｉｄ  Ｓｐｒｉｎｔ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｐｏｌａｒｏｉｄ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いてデジタル化する。それぞれのＨ＆Ｅで染色された冠状画像における損傷の断面領域を決定し、および薄片間の組織の厚さを掛けることにより、損傷容量を、測定する。このスラブ容量技術を、画像処理プログラムＯｐｔｉｍａｓ５．２（Ｏｐｔｉｍａｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）上で実行する。海馬のＣＡ−１領域およびＣＡ３領域の中央の１ｍｍ部分のにおけるニューロンを、２００Ｘの倍率で計数する。ニューロンを、核形態および細胞質形態により特定し、および個別の細胞を、正常であるか損傷を受けているかについて計数する。細胞質の収縮、好塩基球増加症、もしくは好酸球増加症を有するニューロンまたは核の詳細の損失を有するニューロンを、損傷を受けたとみなす。測定された領域は、長さ１ｍｍおよび幅１ｍｍ（分節の長軸の両側上で０．５ｍｍ）である。ニューロンの総数、および正常であると思われるニューロンの数は、平方ミリメートルあたりのニューロン数として表現する。
【００４４】
好ましい神経保護の効果を実証するゲフィチニブ処置計画を、脳衝撃損傷後１時間、２４時間、４８時間、７２時間、または９６時間でのゲフィチニブの第１の用量を受ける群に分けられたラットの追跡調査において繰り返し、外傷性の脳損傷に続くゲフィチニブ投与の神経保護の効果に対する時間窓を、評価する。
【実施例７】
【００４５】
急性脊髄損傷のためのセツキシマブ処置に続く、改善された神経学的結果
【００４６】
発明者は、Ｇｅｉｓｌｅｒら（Ｓｐｉｎｅ（２００１）２６：５８７から５９８）により記載されたＳｙｇｅｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  Ａｃｕｔｅ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｉｎｊｕｒｙ  Ｓｔｕｄｙから、この調査に対する発明者のプロトコルを適合した。プロトコルは、二重盲検、無作為化、層化、多施設治験であり、およそ８００の患者をプラセボ、低用量セツキシマブ、および高用量セツキシマブの３つの初期の処置群に無作為化し：それぞれにおいて少なくとも７２０が完了し、かつ評価可能であるようにした。該患者を、損傷の重症度の３つの程度（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｉｎｊｕｒｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｇｒａｄｅｓＡ、ＢおよびＣ＋Ｄ）および解剖的損傷の２つのレベル（頸部および胸部）に従って、６つの群に層別化する。７２０／４＝１８０の患者のそれぞれの群が２６週の検査に達し、評価可能になる際に、該試行を、事前に計画を立てた中間解析を行う。患者は、実質的な動作不自由な、少なくとも１つの下肢を有することを要求される。脊髄離断または穿通を有する患者を除外するが、なぜなら患者が顕著な馬尾、腕もしくは仙骨神経叢、または末梢神経損傷を有するからである。脊髄を貫通しない銃創は、許容される。神経学的測定評価または解釈を防ぐほど激しくない限り、多発外傷は、許容される。
【００４７】
全ての患者は、脊髄損傷（ＳＣＩ）後８時間以内に開始するメチルプレドニゾロン（ＭＰＳＳ）の第２の全米急性期脊髄損傷研究（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃｕｔｅ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｉｎｊｕｒｙ  Ｓｔｕｄｉｅｓ）（ＮＡＳＣＩＳ  ＩＩ）投与計画を受ける。ＭＰＳＳおよびセツキシマブの間のすべての可能性のある有害な相互作用を避けるために、ＭＰＳＳ投与の完了後まで、治験投薬を開始しない。
【００４８】
プラセボ群は、プラセボの負荷投与量、および次いで５６日のプレセボ投与を受ける。低用量セツキシマブ群は、静脈内（ｉ．ｖ．）投与された３００ｍｇの負荷投与量を投与され、次いで、５６日間、１００ｍｇ／日を静脈内に投与される。高用量セツキシマブ群は、６００ｍｇの負荷投与量を投与され、次いで５６日間、２００ｍｇ／日を投与される。
【００４９】
観察期の神経学的評価は、ＡＩＳおよび詳細な米国脊髄損傷協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｉｎｊｕｒｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＡＳＩＡ）の運動性ならびに感覚検査の両方を含む。修正されたベンゼル分類（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｂｅｎｚｅｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）および該ＡＳＩＡ運動性および感覚検査は、損傷後、４週間、８週間、１６週間、２６週間、および５２週間で行われる。修正されたベンゼル分類は、観察期測定後に使用されるが、なぜなら、この分類は、歩行能力を評価し、および事実上、ＡＩＳの広いＤ区分を細分するからである。ほとんどの患者は観察期で不安定な脊椎骨折を有するので、その時に歩行能力を評価することは不可能である；（従って、異なった観察期およびフォローアップスケールを使用。）。著しい回復は、基準ＡＩＳからの修正されたベンゼル分類における少なくとも２段階に等しい改善として定義される。１次有効性評価は、２６週で著しい回復を有する患者の割合である。２次有効性評価は、著しい回復の時間経過および脊髄機能の他の確立した測定（ＡＳＩＡ運動性および感覚スコア、機能障害の相対および絶対感覚レベル、ならびに膀胱および腸の機能の評価）を含む。
【実施例８】
【００５０】
ゲフィチニブは、多系統萎縮症のマウスモデルにおける神経変性を減少させる
【００５１】
多系統萎縮症（ＭＳＡ）は、希突起膠細胞およびＣＮＳニューロンに影響を及ぼす神経変性疾患である。この試験は、ＭＳＡの最近発展したマウスモデル（Ｙａｚａｗａら，Ｎｅｕｒｏｎ（２００５）４５：８４７から８５９）を使用して、ゲフィチニブ処置に続く神経学的転帰を評価する。このＭＳＡモデルは、ヒトα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎを過剰発現する形質転換マウスであり、このヒトα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎは、希突起神経膠およびニューロンの損失および穏徐進行性運動障害に関連する、正常なおよび変性した軸索および軸索終末において蓄積する。マウスを、腹腔内（ｉ．ｐ）注射した以下の用量：無し（食塩水対照群）、１、１０、および５０ｍｇ／ｋｇ／日ゲフィチニブの１つに割り当てる。処置を１月齢のマウスで開始する。３、６、１２、１８、および２４月齢で、運動試験を、ロータロッドトレッドミル試験および針金掛け（ｗｉｒｅ  ｈａｎｇｉｎｇ）グリップ強度試験を用いてゲフィチニブ処置マウスおよび対照マウスに対して行う。マウスを１２および２４月齢時に屠殺し、脳切片を固定し、神経細胞形態を、透過電子顕微鏡（ＥＭ）により分析し、ニューロンの総数を計数する。
【００５２】
ロータロッドトレッドミル試験：加速ロータロッドトレッドミル（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ，Ｉｔａｌｙ）を用いて、処置マウスおよび対照マウスの運動機能を分析する。マウスは、３週間、２連続日のそれぞれについて４５分の試行間間隔で３つの試験を受ける。それぞれのマウスの耐久時間（ＡＥＴ）を記録し、ＡＥＴの平均を計算する。
【００５３】
針金掛けグリップ強度試験：マウスを、前足を水平の針金上にして置き、針金を把持させて吊り下げたままにする。それぞれのマウスで、２時間の試行間間隔で２つの試験を行う。該マウスが針金に吊り下がったままの総時間を、吊り下がり時間として秒で記録する。
【００５４】
透過型ＥＭ：１２および２４月齢でのマウス（それぞれｎ＝３）を透過型ＥＭにより分析する。該マウスを深く麻酔し、０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）、次いで４％パラホルムアルデヒドおよび２％グルタルアルデヒドを用いる経心腔的潅流により屠殺する。大脳、橋、小脳、およびより下部胸髄を、１８時間固定する。組織に、１時間、２％四酸化オスミウムで後固定し、脱水し、Ｅｐｏｎに包埋する。超薄切片を切断し、Ｊｏｅｌ  １０１０透過型電子顕微鏡（Ｐｅａｂｏｄｙ，ＭＡ）で観察する。
【００５５】
ニューロンおよび希突起膠細胞の定量分析：Ｌ２腰部脊髄並びに黒質中のドーパミン作動性ニューロンにおけるニューロンの総数を、１２および２４月齢ゲフィチニブ処置マウスおよび対照マウス（それぞれｎ＝３、それぞれのマウスから８切片）からの切片上で計数する。細胞を、ＮｅｕＮ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、ニューロンの核を標識する抗体、およびチロシン水酸化酵素（ＴＨ）（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｓｅ，Ｂｒｏｗｎ  Ｄｅｅｒ，ＷＩ）で免疫染色することにより視覚化する。画像分析ソフトウェアＩｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）を用いて、問題の全体の領域を含む写真上で、定量分析を行う。希突起膠細胞分析について、細胞を、抗−ＣＮＰ抗体で免疫染色することにより視覚化する。処置マウスおよび対照マウスからの腰部脊髄切片（それぞれ、ｎ＝３、８切片）における細胞の総数を、手動で計数する。
【実施例９】
【００５６】
ＥＧＦＲ−特異的ｓｈＲＮＡの神経保護効果
【００５７】
一過性完全虚血に対するラットモデルは、Ｎｉｎｇら（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００４）２４：４０５２から６０）から適合させた方法論を用いて、ＥＧＦＲ−特異的短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の神経保護効果を実証する。
【００５８】
ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡのヌクレオチド２５２９から２５５７（受け入れ番号Ｘ００５８８；Ｚｈａｎｇら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００４）１０：３６６７から７７を参照）に一致するＥＧＦＲ標的配列を、ｐＳＵＰＥＲベクター（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９６：５５０から５５３を参照）に構築する。スクランブルＥＧＦＲ標的配列を使用して、対照ベクターを構築する。プラスミド形質移入を、前に記載（Ｗａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３８８：６８６から６９０）の、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いて行う。
【００５９】
２００から３００の重量である成体マウスＷｉｓｔａｒラットを、２％ハロタンで麻酔し、Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｔｕｊｕｎｇａ，ＣＡ）定位装置に置く。ＥＧＦＲ−特異的ｓｈＲＮＡおよびビヒクルを、以下の座標：ブレグマの３．５ｍｍ後、正中線から１．６ｍｍ横、および頭蓋から３．０ｍｍの深さで、ラットのＣＡ１錐体細胞層中に注射する。濃縮されたベクター（１×１０６粒子数／μｌ）の１μの容量を、０．０５μｌ／分の速度で、海馬の一側に注射する。
【００６０】
プラスミド注射の２日後に、ラットを、１．５％ハロタンで麻酔し、および椎骨動脈を、１日目に電気焼灼する。２４時間後、該動物を再麻酔し、両方の総頚動脈を、動脈瘤クリップで１５分間固定する。動物が、全閉塞期間の間に等電ＥＥＧを示す場合、散大した瞳孔、および角膜対光反射の欠如を示す場合、および再灌流の３０分以内にＥＥＧ活性を回復する場合にのみ、動物を次の実験に含める。直腸体温計で測定される体温を、手順を通じて加熱ランプで、３６．５℃から３８℃の間に維持する。模擬の動物は、管閉塞無しで、同一の外科的曝露および取り扱いを受ける。
【００６１】
完全虚血の４８時間後に、ラットを、４％パラホルムアルデヒドで灌流する。背側海馬を通しての冠状切片（４０μｍの厚さ）を、滑走式ミクロトーム上で切断し、次いで、Ｆｌｕｏｒｏ−ＪａｄｅＢ組織化学的染色のために処理し、この染色は、ニューロンの死または変性を一貫して明らかにする。定量評価を、２０ｘ対物レンズを用いて、Ｆｌｕｏｒｏ−ＪａｄｅＢ−染色ニューロンを視覚的に計数することにより行う。それぞれの脳における３つの切片（８０μｍ離れた）上にベクターおよびビヒクルを注射した、背面海馬の中間点での１つの一貫した場にわたる数を平均することにより、平均細胞数を得た。ＥＧＦＲ−特異的ｓｈＲＮＡの神経保護効果は、対照と比較したＦｌｕｏｒｏ−ＪａｄｅＢ染色ニューロンの減少で実証される。
【００６２】
前述の実施例および詳細な説明は、説明のために提供されるもので、制限するためのものではない。あたかも、それぞれの個別の公報または特許出願が、参照により組み込まれるべく、具体的におよび個別に指示されたように、本明細書において引用される全ての公報および特許出願は、ここで参照により取り込まれる。前述の発明が、理解を明確にする目的で、例示および実施例によって、いくらか詳細に記載されたが、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、一定の変更および変形が、行われ得ることは、本発明の教示に照らして、当業者には明らかであろう。
【００６３】
【表２】
2009501221.tif 000003
2009501221.tif 000004
【国際調査報告】
2009501221.tif 000005
2009501221.tif 000006
2009501221.tif 000007