(57)【要約】本発明は、軟骨または軟骨周囲領域への治療有効量の骨形態形成タンパク質を含む組成物の投与による軟骨組織を修復および再生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、軟骨または軟骨周囲領域に、治療有効量の形態形成タンパク質を含む組成物を投与する工程を含む、患者の軟骨欠損の修復方法を提供する。本発明はまた、軟骨または軟骨周囲領域に、治療有効量の形態形成タンパク質を含む組成物を投与する工程を含む、患者の軟骨を再生または生成する方法を提供する。
2009517387.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨または軟骨周囲領域に、治療有効量の形態形成タンパク質を含む組成物を投与する工程を含む、患者の軟骨欠損の修復方法。
【請求項２】
前記軟骨が、関節軟骨および非関節軟骨からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非関節軟骨が、半月板および椎間板からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記軟骨周囲領域が、滑液である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、およびこれらのアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記形態形成タンパク質が、ヒトＯＰ−１の保存された７システインドメインを含むＣ末端１０２〜１０６アミノ酸と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、該形態形成タンパク質が、前記軟骨欠損の修復を誘導することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、およびＣＤＭＰ−３からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、ゲル、水溶液、ペースト、およびパテからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が、徐放性処方物またはクリアランス遅延処方物として処方される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が、注射可能な処方物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が、ゲルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が、水溶液である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物が、ポリエチレングリコールを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記形態形成タンパク質が、グリコシル化されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
軟骨または軟骨周囲領域に、治療有効量の形態形成タンパク質を含む組成物を投与する工程を含む、患者の軟骨を再生または生成する方法。
【請求項１７】
前記軟骨が、関節軟骨および非関節軟骨からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記非関節軟骨が、半月板および椎間板からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記軟骨周囲領域が、滑液である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、およびこれらのアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記形態形成タンパク質が、ヒトＯＰ−１の保存された７システインドメインを含むＣ末端１０２〜１０６アミノ酸と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、該形態形成タンパク質が、前記軟骨欠損の修復を誘導することができる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、およびＣＤＭＰ−３からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物が、ゲル、水溶液、ペースト、およびパテからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物が、徐放性処方物またはクリアランス遅延処方物として処方される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物が、注射可能な処方物である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物が、ゲルである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物が、水溶液である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記組成物が、ポリエチレングリコールを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記形態形成タンパク質が、グリコシル化されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
軟骨または軟骨周囲領域に、治療有効量の形態形成タンパク質を含む組成物を投与する工程を含む、患者の軟骨成長を促進するかまたは軟骨形成を加速させる方法。
【請求項３２】
前記軟骨が、関節軟骨および非関節軟骨からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記非関節軟骨が、半月板および椎間板からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記軟骨周囲領域が、滑液である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、およびこれらのアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記形態形成タンパク質が、ヒトＯＰ−１の保存された７システインドメインを含むＣ末端１０２〜１０６アミノ酸と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、該形態形成タンパク質が、前記軟骨欠損の修復を誘導することができる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、およびＣＤＭＰ−３からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物が、ゲル、水溶液、ペースト、およびパテからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記組成物が、徐放性処方物またはクリアランス遅延処方物として処方される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記組成物が、注射可能な処方物である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記組成物が、ゲルである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記組成物が、水溶液である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記組成物が、ポリエチレングリコールを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記形態形成タンパク質が、グリコシル化されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
軟骨または軟骨周囲領域に、治療有効量の形態形成タンパク質を含む組成物を投与する工程を含む、患者の軟骨破壊を防止するか、あるいは軟骨損傷または変性性疾患もしくは変性性障害を処置する方法。
【請求項４７】
前記軟骨が、関節軟骨および非関節軟骨からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記非関節軟骨が、半月板および椎間板からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記軟骨周囲領域が、滑液である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、およびこれらのアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記形態形成タンパク質が、ヒトＯＰ−１の保存された７システインドメインを含むＣ末端１０２〜１０６アミノ酸と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、該形態形成タンパク質が、前記軟骨欠損の修復を誘導することができる、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、およびＣＤＭＰ−３からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記組成物が、ゲル、水溶液、ペースト、およびパテからなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
前記組成物が、徐放性処方物またはクリアランス遅延処方物として処方される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記組成物が、注射可能な処方物である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記組成物が、ゲルである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記組成物が、水溶液である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
前記組成物が、ポリエチレングリコールを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記形態形成タンパク質が、グリコシル化されている、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
前記組織損傷または変性性疾患が、変形性関節症、半月板裂傷、ＡＣＬ損傷、および椎間板変性からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、整形外科的組織修復に関する。より詳細には、本発明は、軟骨を修復または再生する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
軟骨の修復および再生は、現代整形外科における主な問題の１つである。変形性関節症、椎間板変性、および半月板裂傷などの軟骨の損傷および変性性障害は米国の成人における身体障害の主な原因であるので、非常に重要である。
【０００３】
軟骨は、コラーゲン線維の細胞外基質、プロテオグリカン、および他の非コラーゲンタンパク質に埋め込まれた軟骨細胞から構成される結合組織である。２つの軟骨形態（関節軟骨および非関節軟骨）が存在する。関節軟骨は結合組織の薄層であり、関節内の骨の末端を覆っている。非関節軟骨には、線維軟骨および弾性軟骨が含まれ、椎間板、半月板、気管、喉頭、鼻、および耳などが含まれる。
【０００４】
軟骨の機能は、荷重負荷を和らげ、磨耗に耐え、関節をほぼ無摩擦で運動させることである。しばしば外傷（異常な磨耗または疾患）に起因する軟骨組織の欠損により、痛みや硬直を引き起こすことがあり、処置しないままでいると、これらが進行する可能性があり、最終的に関節全体を置換する必要があり得る。例えば、関節軟骨の欠損により、しばしば、最初に関節表面が破壊され、最終的に、骨軟骨欠損、変形性関節症、またはその両方を引き起こし得る。
【０００５】
変形性関節症は、基質成分の合成と分解との間の均衡が阻害されて異化にシフトするにつれて、修復を試みているが段階的に衰える損傷した軟骨細胞外基質の修復と考えられている。
【０００６】
軟骨組織自体が再生する能力は、血管が無いために厳しく制限される。軟骨組織および基礎をなす骨の両方が含まれる骨軟骨の欠損の修復は、血液および／または骨髄の欠損による幹細胞と成長因子および分化因子の両方の欠損によってその範囲がさらに制限される。動物研究では、これらの欠損は、新規の骨膜および軟骨の形成によっていくらか修復されるが、軟骨基質の高分子組織化および生化学的特徴は不完全である。ＩＩ型コラーゲンよりもむしろＩ型コラーゲンおよび軟骨特異的ではないプロテオグリカン（プロテオグリカンを含むデルマタン硫酸など）によって修復組織が得られ、それにより、長期にわたりフィブリル化（ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ）がおき、そして変性する。軟骨下骨に浸透しない軟骨欠損の修復は起こらず、起こったとしてもその範囲は制限される。
【０００７】
さらに、軟骨欠損の外科的治療は複雑であり、一部の成功に制限されていることが示されている。例えば、関節軟骨の欠損を、関節内遊離体を切除して遷移領域を滑らかにする整形外科的アプローチを使用して処置する。しかし、この方法のみでは、しばしば、症状の緩和が長期間持続しない。膝の代替手術には、しばしば、大量の骨を切除する必要があり、しばしば、複数回手術する必要がある。
【０００８】
半月板は、骨の末端と膝関節の内側との間に存在する小さな馬蹄状組織であり、衝撃吸収材として作用する。各膝の両側に２つの半月板が存在する。半月板は、通常、若年層で強く、加齢と共に脆弱になり、容易に損傷する。裂傷は、前十字靭帯（ＡＣＬ）損傷と極めて共通している。関節硝子軟骨のような半月板線維軟骨は、特に、中間および内部の無血管領域での治癒能力が制限されている。小さな裂傷の現在の治療は、裂傷が大きな問題を引き起こさない場合、放置することである。半月板裂傷治療の選択は、損傷の性質および範囲、最も重要には、その位置が含まれる多数の要因に依存する。高度に血管新生した滑膜と組み合わされた血管新生領域は、縫合によって首尾よく修復されている。部分的または全ての関節半月板切除は、半月板の無血管領域の２／３以内の症状性裂傷の通常の外科的治療である。半月板領域の裂傷は、臨床的に認められる最も一般的な型である。関節半月板切除は、直視下、鏡視下、全部、または一部分の関節半月板切除と無関係に、変形性関節症は、術後数年以内にこれらの患者で頻繁に起こる後遺症である。したがって、共通の修復形態は、裂傷部分の一部のみを除去し、ステープリングによって軟骨を修復することである。不運なことに、この手順後の治癒過程は遅い。さらに、修復が成功しない場合、その後に全裂傷半月願を除去しなければならない。
【０００９】
背痛を持続し、且つしばしば衰弱させる主な原因は、椎間板（ＩＶＤ）変性である。椎間板が変性するにつれて、椎間板によって隣接する脊椎が圧迫され、それにより、しばしば激痛を生じる。
【００１０】
靭帯結合としてのＩＶＤにより、隣接する椎体の間に関節が生じ、軸方向に加えられた脊髄負荷を散らす荷重クッションとして作用する。これらの生体力学的機能により、中心の水和プロテオグリカンが豊富なゼラチン状髄核周囲の外側のコラーゲンが豊富な線維輪から構成されるＩＶＤの固有の構造が可能になる。上軟骨終板および下軟骨終板（ヒアリン様軟骨）は、半月板内の椎体の接触面を覆っている。
【００１１】
腰椎椎間板変性（ｄｉｓｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は、主に腰痛（ＬＢＰ）として現れる社会に実質的な社会的および経済的負担を強いる。全人口の８０％もの人々が障害で少なくとも１度は有意なＬＢＰ期間を経験し、ＬＢＰの結果として労働人口の約２．５％が１年間にいくらかの病期休暇を取っていると見積もられている。現代成長諸国におけるＬＢＰにおける実質的な費用は、９０億ドルと見積もられており、そのほとんどが一般開業医、理学療法士、および他の保守的な開業医の助言に費やされている（非特許文献１）。間接的な総支出（外科的処置が含まれる）は１０倍を超え得る（非特許文献２；Ｗａｌｋｅｒら（２００３）Ｔｈｅ  ｅｃｏｎｏｍｉｃ  ｂｕｒｄｅｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｐｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  Ａｎｎｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｃａｎｂｅｒｒａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。
【００１２】
椎間板変性は、ほとんどの場合、骨格の成熟時から起こる自然現象である（非特許文献３）。これは加齢と一致するが、多くの場合、特に腰椎の痛みにも関連し、運動性が制限される。患者が制限された運動性に対応するように生活様式を修正するので、ＬＢＰの症状は、しばしば、時間と共に自発的に解決される。しかし、多くの場合、外科的介入が必要という重要な要素が残されている。慢性ＬＢＰの伝統的な「標準的な」外科的治療は、１つまたは複数の有痛レベルを固定するための脊椎融合であった。融合は、長期入院および専門家の外科的専門知識が必要であるので高額であるにも関わらず、ほとんどのこれらの患者は、短期間しか痛みが緩和せず、融合は最良の結果をもたらさないことが明らかである。長期的研究により、脊椎融合が実際は融合部位に隣接するレベルで変性を促進することが示唆されている（非特許文献４）。関節炎の臀部および骨折した臀部および膝の機能を修復するために５０年前に人工挿入物を開発した時と同一の方法で、現在、慢性変性のために痛みおよび関節炎を引き起こした半月板の完全な機械的機能を修復する目的で人口挿入物が開発されている（非特許文献５）。しかし、試験を受けた無数のモデルのいずれかが長期的利益をもたらすと理解するのは時期尚早である。
【００１３】
現在、タンパク質自体が前駆細胞を機能的な骨、軟骨、腱、および／または靭帯組織の増殖および分化を誘導することができる真の骨および軟骨組織のモルフォゲンとして作用する能力を有するタンパク質クラスが同定されている。本明細書中で「骨形成タンパク質」または「形態形成タンパク質」と呼ばれるこれらのタンパク質には、異所性軟骨内性骨の形態形成を誘導する能力が最初に同定された骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリーのメンバーが含まれる。骨形成タンパク質は、一般に、当該分野で成長因子のＴＧＦ−βスーパーファミリーのサブグループとして分類されている（非特許文献６）。タンパク質のモルフォゲンファミリーのメンバーには、哺乳動物骨形成タンパク質−１（ＯＰ−１、ＢＭＰ−７およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａホモログ６０Ａとしても公知）、骨形成タンパク質−２（ＯＰ−２、ＢＭＰ−８としても公知）、骨形成タンパク質−３（ＯＰ−３）、ＢＭＰ−２（ＢＭＰ−２ＡまたはＣＢＭＰ−２ＡおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａホモログＤＰＰとしても公知）、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４（ＢＭＰ−２ＢまたはＣＢＭＰ−２Ｂとしても公知）、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびそのマウスホモログＶｇｒ−１、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＧＤＦ３（Ｖｇｒ２としても公知）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＧＤＦ−５（ＣＤＭＰ−１またはＭＰ５２としても公知）、ＧＤＦ−６（ＣＤＭＰ−２としても公知）、ＧＤＦ−７（ＣＤＭＰ−３としても公知）、ＸｅｎｏｐｕｓホモログＶｇｌおよびＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ならびにＮＥＵＲＡＬが含まれる。このファミリーのメンバーは、共通の構造的特徴（二量体化する能力を有する約９７〜１０６個のアミノ酸のカルボキシル末端活性ドメインを含む成熟ポリペプチド鎖を得るための前駆体の「前形態（ｐｒｏ−ｆｏｒｍ）」のプロセシングが含まれる）を有する分泌性ポリペプチド鎖をコードする。全メンバーは、このドメイン中に保存されたシステインパターンを共有し、これらのタンパク質の活性形態は、単一のファミリーメンバーのジスルフィド結合ホモ二量体または２つの異なるメンバーのヘテロ二量体のいずれかであり得る（例えば、非特許文献７；非特許文献８を参照のこと）。特許文献１；特許文献２、非特許文献９，非特許文献１０，非特許文献１１、および特許文献２；非特許文献１２；非特許文献１３も参照のこと。これらの開示は、これらの骨形成タンパク質のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列ならびに化学的特徴および物理的特徴を記載している。非特許文献１４；ＢＭＰ  ９（特許文献３，１９９３年１月７日公開）；ＤＰＰ（非特許文献１５）；およびＶｇ−１（非特許文献１６）も参照のこと。
【００１４】
現在の好ましい軟骨修復方法には、デブリドマン、自家細胞移植、モザイク形成術、および関節置換術が含まれる。しかし、これらの方法では軟骨組織が実際に修復および置換されない。これらの方法では、瘢痕様の特徴を有する不完全な修復組織が得られる。
【特許文献１】米国特許第５，０１１，６９１号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２６６，６８３号明細書
【特許文献３】国際公開第９３／００４３２号パンフレット
【非特許文献１】Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＤＡら，Ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｉｎｄｅｍｎｉｔｙ  ｃｏｓｔｓ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ  ｌｏｗ  ｂａｃｋ  ｐａｉｎ，１９９８年，Ｓｐｉｎｅ  第２３巻：ｐｐ．２３２９−３６
【非特許文献２】ＭａｅｔｚｅｌおよびＬｉ，Ｔｈｅ  ｅｃｏｎｏｍｉｃ  ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  ｌｏｗ  ｂａｃｋ  ｐａｉｎ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｅｔｗｅｅｎ  １９９６  ａｎｄ  ２００１，２００２年，Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  第１６巻：ｐｐ．２３−３０
【非特許文献３】Ｖｅｍｏｎ−Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｎｄ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃｓ  ａｎｄ  ａｐｏｐｈｙｓｅａｌ  ｊｏｉｎｔｓ，Ｔｈｅ  ｌｕｍｂａｒ  ｓｐｉｎｅ  ａｎｄ  ｂａｃｋ  ｐａｉｎ．Ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊａｙｓｏｎ  ＭＩＶ，編．１９９２年，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，第２章，ｐｐ．１７−４１
【非特許文献４】Ｌｅｅ，Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｔｏ  ａ  ｌｕｍｂａｒ  ｆｕｓｉｏｎ，１９８８年，Ｓｐｉｎｅ  第１３巻：ｐｐ．３７５−７
【非特許文献５】Ｓｚｐａａｌｓｋｉら，Ｖ  Ｓｐｉｎｅ  ａｒｔｈｒｏｐｌａｓｔｙ：ａ  ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ，Ｅｕｒ  Ｓｐｉｎｅ  ２００２年，第Ｊ１１巻：ｐｐ．Ｓ６５−Ｓ８４
【非特許文献６】Ｈｏｇａｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９９６年，第１０巻：ｐｐ．１５８０−１５９４
【非特許文献７】Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９０年，第６巻：ｐｐ．５９７
【非特許文献８】Ｓａｍｐａｔｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０年，第２６５巻：ｐｐ．１３１９８
【非特許文献９】Ｏｚｋａｙｎａｋら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９０年，第９巻：ｐｐ．２０８５−２０９３
【非特許文献１０】Ｗｈａｒｔｏｎら，ＰＮＡＳ  １９９１年，第８８巻：ｐｐ．９２１４−９２１８
【非特許文献１１】Ｏｚｋａｙｎａｋ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２年，第２６７巻：ｐｐ．２５２２０−２５２２７
【非特許文献１２】Ｃｅｌｅｓｔｅら，ＰＮＡＳ  １９９１年，第８７巻：ｐｐ．９８４３−９８４７
【非特許文献１３】Ｌｙｏｎｓら，ＰＮＡＳ  １９８９年，第８６巻：ｐｐ．４５５４−４５５８
【非特許文献１４】Ｗｏｚｎｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８８年，第２４２巻：ｐｐ．１５２８−１５３４
【非特許文献１５】Ｐａｄｇｅｔｔら，Ｎａｔｕｒｅ  １９８７年，第３２５巻：ｐｐ．８１−８４
【非特許文献１６】Ｗｅｅｋｓ，Ｃｅｌｌ  １９８７年，第５１巻：ｐｐ．８６１−８６７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、現在利用可能な方法および組成物に関連する問題を克服する軟骨欠損を修復および再生するための組成物および方法が依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の要旨
本発明は、軟骨または軟骨周囲領域への骨形態形成タンパク質を含む組成物の投与による軟骨組織を修復および再生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、軟骨または軟骨周囲領域に、治療有効量の形態形成タンパク質を含む組成物を投与する工程を含む、患者の軟骨欠損の修復方法を提供する。
【００１７】
本発明はまた、軟骨または軟骨周囲領域に、治療有効量の形態形成タンパク質を含む組成物を投与する工程を含む、患者の軟骨を再生または生成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、軟骨または軟骨周囲領域に、治療有効量の形態形成タンパク質を含む組成物を投与する工程を含む、患者の軟骨を再生する方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、軟骨または軟骨周囲領域に、治療有効量の形態形成タンパク質を含む組成物を投与する工程を含む、患者の軟骨を生成する方法を提供する。
【００１８】
本発明はまた、軟骨または軟骨周囲領域に、治療有効量の形態形成タンパク質を含む組成物を投与する工程を含む、患者の軟骨成長を促進するか軟骨形成を加速させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、軟骨または軟骨周囲領域に、治療有効量の形態形成タンパク質を含む組成物を投与する工程を含む、患者の軟骨成長を促進する方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、軟骨または軟骨周囲領域に、治療有効量の形態形成タンパク質を含む組成物を投与する工程を含む、患者の軟骨形成を加速させる方法を提供する。
【００１９】
本発明はまた、軟骨または軟骨周囲領域に、治療有効量の形態形成タンパク質を含む組成物を投与する工程を含む、患者の軟骨破壊を防止するか、あるいは軟骨損傷または変性性疾患を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、軟骨または軟骨周囲領域に、治療有効量の形態形成タンパク質を含む組成物を投与する工程を含む、患者の軟骨破壊を防止する方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、軟骨組織損傷または変性性疾患もしくは変性性障害を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態では、組織損傷または変性性疾患には、変形性関節症、半月板裂傷、ＡＣＬ損傷、および椎間板変性が含まれるが、これらに限定されない。
【００２０】
いくつかの実施形態では、軟骨は関節軟骨である。他の実施形態では、軟骨は非関節軟骨である。いくつかの実施形態では、非関節軟骨は、半月板または椎間板である。
【００２１】
いくつかの実施形態では、組成物を軟骨に投与する。いくつかの実施形態では、組成物を半月板または椎間板に投与する。いくつかの実施形態では、組成物を軟骨周囲領域に投与する。いくつかの実施形態では、軟骨周囲領域は滑液である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用される組成物中の形態形成タンパク質には、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、これらのフラグメント、およびアミノ酸配列改変体が含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、形態形成タンパク質は、ヒトＯＰ−１の保存された７システインドメインを含むＣ末端１０２〜１０６アミノ酸と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、形態形成タンパク質は、軟骨欠損の修復を誘導することができる。好ましい実施形態では、形態形成タンパク質は、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、およびＣＤＭＰ−３からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、形態形成タンパク質はＯＰ−１である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用される形態形成タンパク質組成物には、ゲル、パテ、ペースト、または水溶液が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、形態形成タンパク質組成物を、徐放性処方物またはクリアランス遅延処方物（すなわち、形態形成タンパク質のクリアランスがその通常のクリアランスと比較して遅延する処方物）として処方する。いくつかの実施形態では、形態形成タンパク質組成物を、注射可能な処方物として処方する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
本明細書中に記載の発明を完全に理解するために、以下に詳細な説明を記載する。
【００２５】
他で定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明に属する当業者によって一般的に理解されている意味を有する。本明細書中に記載の方法および材料に類似の方法および材料を本発明の実施または試験で使用することができるにも関わらず、適切な方法および材料を以下に記載する。材料、方法、および実施例は例示のみを目的とし、本発明を制限することを意図しない。本明細書中で言及した全ての刊行物、特許、および他の書類は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【００２６】
本明細書を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記述した整数または整数群を含むことを暗示するが、いかなる他の整数または整数群も排除しない。
【００２７】
本発明をさらに定義するために、以下の用語および定義を本明細書中に示す。
【００２８】
用語「軟骨」は、軟骨細胞または軟骨細胞様細胞（全てではないが多くの軟骨細胞の特徴を有する）、細胞間質（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＸ型、およびＸＩ型コラーゲン）、プロテオグリカン（例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、およびデルマタン硫酸プロテオグリカン）、および他のタンパク質を含む結合組織タイプをいう。軟骨には、関節軟骨および非関節軟骨が含まれる。
【００２９】
硝子軟骨とも呼ばれる「関節軟骨」はまた、関節内の骨の連接表面（ａｒｔｉｃｕｌａｔｉｎｇ  ｓｕｒｆａｃｅ）を覆い、２つの対向する骨表面の間の摩擦低減接合部分としての機能を果たす無血管の非無機化結合組織をいう。関節軟骨により、骨同士が直接接触することなく運動することが可能である。関節軟骨は、骨化する傾向はない。軟骨表面は巨視的には滑らかで真珠のような光沢があるように見え、高倍率では細かい顆粒状である。関節軟骨は、隣接する滑膜の血管および被覆される骨の血管から部分的に栄養素を得ている。関節軟骨は、ＩＩ型およびＩＸ型のコラーゲンならびに種々の十分に特徴づけられているプロテオグリカンの存在ならびに軟骨内性骨形成に関連するＸ型コラーゲンの非存在に関連する。関節軟骨の微細構造の詳細な説明については、例えば、Ａｙｄｅｌｏｔｔｅ  ａｎｄ  Ｋｕｅｔｔｎｅｒ，Ｃｏｎｎ．Ｔｉｓｓ．Ｒｅｓ．，１８，ｐ．２０５（１９８８）；Ｚａｎｅｔｔｉら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０１，ｐ．５３（１９８５）；およびＰｏｏｌｅら，Ｊ．Ａｎａｔ．，１３８，ｐ．１３（１９８４）を参照のこと。
【００３０】
「非関節軟骨」は、関節表面を被覆しない軟骨をいい、線維軟骨（関節円板、線維軟骨円板、結合線維軟骨、および関節周縁線維軟骨）および弾性軟骨が含まれる。線維軟骨では、ミクロポリサッカリド網が突出したコラーゲン束と組み合わされ、軟骨細胞が硝子軟骨または関節軟骨よりも広範に散在している。関節円板は衝撃に曝され、且つ頻繁に運動する関節（例えば、膝の半月板）で見出される。このような関節の例には、側頭下顎骨、胸鎖関節、手関節、および膝関節が含まれるが、これらに限定されない。二次軟骨結合は、線維軟骨の半月板によって形成される。対向する両表面に密接して接着するこのような線維軟骨円板は、軟骨の薄層が介在した線維組織の同心円状の輪から構成される。このような線維軟骨円板の例は、脊髄の椎間板である。結合線維軟骨は、これらの関節の骨表面の間に介在し、椎体の間および恥骨の間をわずかに移動することが可能である。関節周縁線維軟骨は、いくつかの関節腔（臀部の寛骨臼および肩の関節窩など）の縁部を取り囲む。
【００３１】
弾性軟骨は、エラスチン線維と組織学的に類似のコラーゲン線維を含む。このような軟骨は、外耳の心耳、耳管、小角軟骨、および喉頭蓋で見出される。全ての軟骨と同様に、弾性軟骨はまた、軟骨細胞および基質を含み、後者は、黄色弾性線維網によって各方向に行き渡り、各細胞のすぐ周囲に存在もの以外は全方向に分岐および吻合し、非フィブリル化したガラス質の細胞間物質の量は変化する。
【００３２】
用語「滑液」は、関節内の摩擦を低減する滑液腔内の薄い潤滑物質をいう。
【００３３】
用語「欠損」または「欠損部位」は、軟骨組織または骨軟骨組織の破壊をいう。欠損は、例えば、軟骨組織または骨軟骨組織の空隙、空洞、孔、または完全な構造の他の実質的な破壊などの三次元的欠損を意味すると理解される「空間」の形状と見なすことができる。欠損はまた、その付着点から骨または靭帯への軟骨の剥離であり得る。一定の実施形態では、欠損は、内因性または自発的な修復が不可能である。欠損は、事故、疾患、および／または外科的操作の結果であり得る。例えば、軟骨欠損は、半月板裂傷組織の関節への置換などの関節外傷の結果であり得る。軟骨欠損はまた、変形性関節症などの変性関節疾患の結果であり得る。
【００３４】
用語「修復」は、欠損部位で空間または構造の切れ目を少なくとも部分的に充填するのに十分な新規の軟骨の形成をいう。しかし、修復は、その欠損前の生理学的／構造的／機械的状態への欠損の修復に１００％有効な完全な治癒または治療の過程を意味しないか必要としない。
【００３５】
用語「治療有効量」は、軟骨組織の修復、再生、促進、加速、破壊の防止、または形成に有効な量をいう。
【００３６】
用語「患者」は、動物（哺乳動物（例えば、ヒト）が含まれる）をいう。
【００３７】
用語「アジュバントの薬学的に許容可能なキャリア」は、本発明の形態形成タンパク質と共に患者に投与することができ、その薬理学的活性を破壊しない非毒性キャリアをいう。
【００３８】
用語「形態形成タンパク質」は、形態形成活性を有するタンパク質をいう。好ましくは、本発明の形態形成タンパク質は、ＢＭＰタンパク質ファミリーに属する少なくとも１つのポリペプチドを含む。形態形成タンパク質には、骨形成タンパク質が含まれる。形態形成タンパク質は、前駆細胞の増殖および／または分化経路の開始を誘導し、局所環境に依存して軟骨、骨、腱、靭帯、または他の組織形成型を得ることができ、それにより、形態形成タンパク質は環境によって挙動が異なり得る。例えば、形態形成タンパク質は、少なくとも１つの処置部位で骨組織を誘導し、異なる処置部位で軟骨組織を誘導することができる。
【００３９】
用語「骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）」は、ＤＮＡおよびアミノ酸の配列相同性に基づいてタンパク質のＴＧＦ−βスーパーファミリーのＢＭＰファミリー（ＢＭＰファミリー）に属するタンパク質をいう。タンパク質は、ＢＭＰタンパク質ファミリーに特徴的な保存されたＣ末端システインリッチドメイン内の少なくとも１つの公知のＢＭＰファミリーメンバーとアミノ酸配列が少なくとも５０％同一である場合、本発明のＢＭＰファミリーに属する。好ましくは、タンパク質は、保存されたＣ末端システインリッチドメイン内の少なくとも１つの公知のＢＭＰファミリーメンバーとアミノ酸配列が少なくとも７０％同一である。ＢＭＰファミリーのメンバーは、全体として５０％未満のＤＮＡ配列またはアミノ酸配列が同一であり得る。本明細書中で定義した骨形成タンパク質はまた、適切なインビボ無血液位置で間接軟骨の形成を誘導する能力がある。
【００４０】
用語「アミノ酸配列相同性」は、アミノ酸配列の同一性および類似性の両方を含むと理解される。相同配列は、同一および／または類似の配列を供有し、類似の残基が、アラインメントした基準配列中の対応するアミノ酸残基と保存的に置換されるか、「点変異」される。したがって、基準配列と７０％のアミノ酸相同性を有する候補ポリペプチド配列は、アラインメントした残基の７０％が基準配列中の対応する配列と同一であるか保存的に置換されているものである。一定の特に好ましい形態形成ポリペプチドは、ヒトＯＰ−１および関連タンパク質の保存された７システインドメインを定義するＣ末端の１０２〜１０６アミノ酸と少なくとも６０％、好ましくは７０％のアミノ酸配列が同一である。
【００４１】
アミノ酸配列相同性を、当該分野で周知の方法によって決定することができる。例えば、７システインドメインの配列に対する候補アミノ酸配列の相同率を決定するために、２つの配列を最初にアラインメントする。アラインメントを、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８，ｐｐ．４４３（１９７０）に記載の動的プログラミングアルゴリズムおよびＡｌｉｇｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）によって作製された市販のソフトウェアパッケージを使用して作製することができる。両供給源による教示は、本明細書中で参考として援用される。最初のアラインメントを、関連タンパク質ファミリーの多配列アラインメントとの比較によって精緻化することができる。一旦アラインメントが作製されて緻密化されると、相同率スコアを計算する。２つの配列のアラインメントしたアミノ酸残基の配列をその相互の類似性について比較する。類似性の要因には、サイズ、形状、および電荷が含まれる。アミノ酸類似性の１つの特に好ましい決定方法は、Ｄａｙｈｏｆｆら，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５，ｐｐ．３４５−３５２（１９７８  ＆  Ｓｕｐｐ．）（本明細書中で参考として援用される）に記載のＰＡＭ２５０行列である。類似性スコアを、ペアワイズにアラインメントしたアミノ酸類似性スコアの和として最初に計算する。相同率および同一率の目的のために、挿入および欠失を無視する。したがって、この計算ではギャップペナルティを使用しない。次いで、生スコアを候補配列および７システインドメインのスコアの相乗平均で割ることによって生スコアを正規化する。相乗平均は、これらのスコアの生成物の平方根である。正規化された生スコアは、相同率である。
【００４２】
用語「保存的置換」は、対応する基準残基と物理的または機能的に類似の残基をいう。すなわち、保存的置換およびその基準残基は、類似のサイズ、形状、電荷、または化学的特性（共有結合、水素結合が含まれる）などを有する。好ましい保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆら，前出に記載の許容される点変異について定義された基準を満たすものである。保存的置換の例は、以下の群内の置換である：（ａ）バリン、グリシン、（ｂ）グリシン、アラニン、（ｃ）バリン、イソロイシン、ロイシン、（ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸、（ｅ）アスパラギン、グルタミン、（ｆ）セリン、トレオニン、（ｇ）リジン、アルギニン、メチオニン、および（ｈ）フェニルアラニン、チロシン。用語「保存的改変体」または「保存的改変物（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）」には、所与の親アミノ酸配列の代わりに置換アミノ酸残基の使用も含まれ、親配列に特異的な抗体は、得られた置換ポリペプチド配列にも特異的である（すなわち、「交差反応」または「免疫反応」する）。
【００４３】
用語「骨形成タンパク質（ＯＰ）」は、前駆細胞の軟骨および／または骨への形成を誘導することができる形態形成タンパク質をいう。骨は、膜内骨または軟骨内性骨であり得る。ほとんどの骨形成タンパク質は、ＢＭＰファミリーのメンバーであり、したがって、ＢＭＰでもある。本明細書中に記載のように、タンパク質のクラスは、ヒト骨形成タンパク質（ｈＯＰ−１）に代表される。本発明の実施で有用な他の骨形成タンパク質には、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＵＮＩＶＩＮ、ＮＯＤＡＬ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、またはＮＥＵＲＡＬ、およびこれらのアミノ酸配列変異形の骨形成的に活性な形態が含まれる。出願人の発明と共に使用するのに適切な骨形成タンパク質を、Ｒｅｄｄｉ  ａｎｄ  Ｓａｍｐａｔｈ（Ｓａｍｐａｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４，ｐｐ．７１０９−１３（本明細書中で参考として援用される））に記載の当該分野で認識されたバイオアッセイを使用した日常的実験を用いて同定することができる。
【００４４】
軟骨成長および修復のための方法および組成物
本発明の形態形成組成物を、軟骨修復（例えば、関節、半月板、椎間板）のために使用することができる。本明細書中に開示の形態形成タンパク質を含む形態形成組成物により、医師が局在化した刺激組織の再生または修復によって改善または矯正することができる種々の組織の損傷、組織の変性、または病態および障害を処置することが可能である。
【００４５】
本発明は、軟骨組織の損傷および軟骨変性性疾患もしくは軟骨変性性障害（変形性関節症、半月板裂傷、ＡＣＬ損傷、および椎間板変性が含まれるが、これらに限定されない）を処置するための方法および組成物を提供する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本発明は、患者の軟骨を修復または再生する方法および組成物を提供する。本発明はまた、患者の軟骨の生成、軟骨成長の促進、軟骨形成の加速、および軟骨変性の防止のための方法および組成物を提供する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、治療有効量の形態形成タンパク質を含む組成物を軟骨に投与する工程を含む。この方法は、軟骨組織への形態形成組成物の直接投与（例えば、軟骨組織への注射）を含む。例えば、形態形成タンパク質組成物を、半月板または椎間板に注射することができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、治療有効量の形態形成タンパク質を含む組成物を軟骨周囲の滑液に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、軟骨は間接軟骨である。他の実施形態では、軟骨は非間接軟骨である。いくつかの実施形態では、非間接軟骨には、椎間板、半月板、気管、耳、鼻、肋骨、および喉頭が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、非間接軟骨は椎間板である。別の好ましい実施形態では、非間接軟骨は、半月板である。いくつかの実施形態では、軟骨周囲領域は滑液である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用される組成物中の形態形成タンパク質には、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、およびこれらのアミノ酸配列改変体が含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、形態形成タンパク質は、ヒトＯＰ−１の保存された７システインドメインを含むＣ末端１０２〜１０６アミノ酸と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、形態形成タンパク質が軟骨欠損の修復を誘導することができる。好ましい実施形態では、形態形成タンパク質は、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、またはＣＤＭＰ−３である。より好ましい実施形態では、形態形成タンパク質はＯＰ−１である。
【００４９】
骨形態形成タンパク質ファミリー
その代表的な骨形態形成／骨形成タンパク質ファミリーメンバーにちなんで名付けられたＢＭＰファミリーは、ＴＧＦ−βタンパク質スーパーファミリーに属する。主に配列相同性に基づいて単離され報告された「ＢＭＰ」（ＢＭＰ−１からＢＭＰ−１８）のうちのＢＭＰ−１以外のすべてが、依然として形態形成タンパク質のＢＭＰファミリーのメンバーとして分類されている（Ｏｚｋａｙｎａｋら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，９，ｐｐ．２０８５−９３（１９９０））。
【００５０】
ＢＭＰファミリーには、形態形成タンパク質である他の構造的に関連したメンバー（ショウジョウバエデカペンタプレジック遺伝子複合体（ＤＰＰ）産物、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓのＶｇ１産物およびそのマウスホモログ（Ｖｇｒ−１）が含まれる）が含まれる（例えば、Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６，ｐｐ．５９７−６４１（１９９０）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【００５１】
ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびＯＰ−１（ＢＭＰ−７）のＣ末端ドメインは、ＢＭＰ−２のＣ末端ドメインと約６０％同一であり、ＢＭＰ−６およびＯＰ−１のＣ末端ドメインは８７％同一である。ＢＭＰ−６は、マウスＶｇｒ−１のヒトホモログの可能性が高い（Ｌｙｏｎｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６，ｐｐ．４５５４−５９（１９８９））；２つのタンパク質は、アミノ酸配列レベルで全体の９２％同一である（米国特許第５，４５９，０４７号（本明細書中で参考として援用される））。ＢＭＰ−６は、ＸｅｎｏｐｕｓのＶｇ−１産物と５８％同一である。
【００５２】
骨形態形成タンパク質の生化学的構造および機能特性
天然に存在する骨形態形成タンパク質は、そのＣ末端領域（ドメイン）中に実質的なアミノ酸配列相同性を共有する。典型的には、上記の天然に存在する骨形成タンパク質は、典型的には約３０残基未満のＮ末端シグナルペプチド配列およびその後に切断されて約９７〜１０６アミノ酸の成熟Ｃ末端ドメインを生成する「プロ」ドメインを有する前駆体として翻訳される。シグナルペプチドは、翻訳の際に、Ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４，ｐｐ．４６８３−４６９１（１９８６）の方法を使用して所与の配列で予想することができる切断部位で迅速に切断される。プロドメインは、典型的には、完全にプロセシングされた成熟Ｃ末端ドメインの約３倍の長さである。
【００５３】
ＢＭＰタンパク質ファミリーメンバーの別の特徴は、その見かけ上の二量体化能力である。７つの骨由来骨形成タンパク質（ＯＰ）およびＢＭＰは、その活性形態でホモ二量体およびヘテロ二量体として見出される。ＯＰおよびＢＭＰの二量体形成能力は、形態形成タンパク質にさらなるまたは変化した形態形成誘導能力を付与することができる。ヘテロ二量体は、ホモ二量体と異なるＯＰおよびＢＭＰ受容体分子に対する定性的または定量的結合親和性を示し得る。結合親和性の変化により、異なるシグナル伝達経路を媒介する受容体の活性化が異なり、最終的に異なる生物活性または結果を得ることができる。結合親和性の変化はまた、組織または細胞型特異的様式で現れ、それにより、特に前駆細胞型の増殖および／または分化のみを誘導することができる。
【００５４】
好ましい実施形態では、骨形成ポリペプチド対は、それぞれ基準モルフォゲンのアミノ酸配列との定義された関係を共有する配列を含むアミノ酸配列を有する。ここに、好ましい骨形成ポリペプチドは、骨形成的に活性なヒトＯＰ−１中に存在する配列（配列番号１）との定義された関係を共有する（図１を参照のこと）。しかし、本明細書中に開示の任意の１つまたは複数の天然に存在する配列または生合成配列を、基準配列として同様に使用することができる。好ましい骨形成ポリペプチドは、ヒトＯＰ−１の少なくともＣ末端の６システインドメイン（配列番号１の残基３３５〜４３１）との定義された関係を共有する。好ましくは、骨形成ポリペプチドは、ヒトＯＰ−１の少なくともＣ末端の７システインドメイン（配列番号１の残基３３０〜４３１）との定義された関係を共有する。すなわち、骨形態形成活性を有する二量体タンパク質中の好ましいポリペプチドは、それぞれ、基準配列に対応するか基準配列に機能的に等価な配列を含む。
【００５５】
機能的に等価な配列には、基準配列内に並べられたシステイン残基の機能的に等価な配置が含まれ、機能的に等価な配列は、これらのシステインの線状の配置を変化させるアミノ酸の挿入または欠失を含むが、二量体形態形成タンパク質の折り畳み構造におけるその関係を実質的に損ねず、形態形成活性に必要であり得るような鎖内または鎖間のジスルフィド結合を形成する能力を含む。機能的に等価な配列には、さらに、この相違が骨形態形成活性を破壊しない場合、１つまたは複数のアミノ酸残基が基準配列の対応する残基（例えば、ヒトＯＰ−１のＣ末端の７システインドメイン（本明細書中で、保存された７システイン骨格とも呼ばれる））と異なるものが含まれる。したがって、基準配列中の対応するアミノ酸の保存的置換は好ましい。基準配列中の対応する残基の保存的置換物であるアミノ酸残基は、対応する基準残基と物理的または機能的に類似している（例えば、類似のサイズ、形状、電荷、化学的性質（共有結合または水素結合などを形成する能力が含まれる）を有する）アミノ酸残基である。特に好ましい保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆら，前出（その教示が本明細書中で参考として援用される）に記載の許容された点変異について定義された基準を満たす保存的置換である。
【００５６】
骨形成タンパク質ＯＰ−１は記載されている（例えば、Ｏｐｐｅｒｍａｎｎらの米国特許第５，３５４，５５７号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。その成熟した天然の形態の天然起源の骨形成タンパク質は、典型的には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定したところ見かけ上の分子量が約３０〜３６ｋＤａであるグリコシル化二量体である。還元された場合、３０ｋＤａのタンパク質から見かけの分子量が約１６ｋＤａおよび１８ｋＤａの２つのグリコシル化ペプチドサブユニットが生じる。還元状態では、タンパク質は、検出可能な骨形成活性を持たない。骨形成活性も有する非グリコシル化タンパク質の見かけ上の分子量は約２７ｋＤａである。還元された場合、２７ｋＤａのタンパク質から、哺乳動物において軟骨内性骨形成を誘導することができる分子量が約１４ｋＤａから１６ｋＤａの２つの非グリコシル化ポリペプチドが生じる。骨形成タンパク質は、種々のグリコシル化パターン、種々のＮ末端を有する形態、および未変性タンパク質の活性な短縮形態または変異形態を含み得る。上記のように特に有用な配列には、ＤＰＰ（ショウジョウバエ由来）、Ｖｇ１（ツメガエル由来）、Ｖｇｒ−１（マウス由来）、ＯＰ−１およびＯＰ−２タンパク質（米国特許第５，０１１，６９１号およびＯｐｐｅｒｍａｎｎら（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）ならびにＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４（ＷＯ８８／００２０５、米国特許第５，０１３，６４９号、およびＷＯ９１／１８０９８（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）、ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６（ＷＯ９０／１１３６６、ＰＣＴ／ＵＳ９０／０１６３０（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）、ＢＭＰ−８およびＢＭＰ−９と呼ばれるタンパク質のＣ末端の９６個または１０２個のアミノ酸配列を含む配列が含まれる。
【００５７】
本発明の好ましい形態形成タンパク質および骨形成タンパク質は、少なくとも１つのポリペプチド（ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７、ＣＯＰ−１６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＭＰ１２１、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ｄｏｒｓａｌｉｎ−１、ＤＰＰ、Ｖｇ−１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、ＴＧＦ−β、ならびにこれらのアミノ酸配列の変異形およびホモログ（これらの種ホモログが含まれる）が含まれるが、これらに限定されない）を含む。好ましくは、形態形成タンパク質は、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、またはＣＤＭＰ−３から選択される少なくとも１つのポリペプチド、より好ましくは、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、またはＣＤＭＰ−３、最も好ましくは、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）を含む。
【００５８】
これらの配列を開示した刊行物ならびにその化学的および物理的性質には、ＯＰ−１およびＯＰ−２（米国特許第５，０１１，６９１号；米国特許第５，２６６，６８３号；Ｏｚｋａｙｎａｋら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，９，ｐｐ．２０８５−２０９３（１９９０）；ＯＰ−３（ＷＯ９４／１０２０３（ＰＣＴ  ＵＳ９３／１０５２０））；ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、（ＷＯ８８／００２０５；Ｗｏｚｎｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，ｐｐ．１５２８−１５３４（１９８８））；ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６（Ｃｅｌｅｓｔｅら，ＰＮＡＳ，８７，９８４３−９８４７（１９９１））；Ｖｇｒ−１（Ｌｙｏｎｓら，ＰＮＡＳ，８６，ｐｐ．４５５４−４５５８（１９８９））；ＤＰＰ（Ｐａｄｇｅｔｔら，Ｎａｔｕｒｅ，３２５，ｐｐ．８１−８４（１９８７））；Ｖｇ−１（Ｗｅｅｋｓ，Ｃｅｌｌ，５１，ｐｐ．８６１−８６７（１９８７））；ＢＭＰ−９（ＷＯ９５／３３８３０（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７０８４）；ＢＭＰ−１０（ＷＯ９４／２６８９３（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５２９０）；ＢＭＰ−１１（ＷＯ９４／２６８９２（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５２８８）；ＢＭＰ−１２（ＷＯ９５／１６０３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０）；ＢＭＰ−１３（ＷＯ９５／１６０３５（ＰＣＴ／ＬＴＳ９４／１４０３０）；ＧＤＦ−１（ＷＯ９２／００３８２（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４０９６）およびＬｅｅら，ＰＮＡＳ，８８，ｐｐ．４２５０−４２５４（１９９１）；ＧＤＦ−８（ＷＯ９４／２１６８１（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０３０１９）；ＧＤＦ−９（ＷＯ９４／１５９６６（ＰＣＴ／ＵＳ９４／００６８５）；ＧＤＦ−１０（ＷＯ９５／１０５３９（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１１４４０）；ＧＤＦ−１１（ＷＯ９６／０１８４５（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０８５４３）；ＢＭＰ−１５（ＷＯ９６／３６７１０（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０６５４０）；ＭＰ−１２１（ＷＯ９６／０１３１６（ＰＣＴ／ＥＰ９５／０２５５２）；ＧＤＦ−５（ＣＤＭＰ−１、ＭＰ５２）（ＷＯ９４／１５９４９（ＰＣＴ／ＵＳ９４／００６５７）、ＷＯ９６／１４３３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１２８１４）、およびＷＯ９３／１６０９９（ＰＣＴ／ＥＰ９３／００３５０））；ＧＤＦ−６（ＣＤＭＰ−２、ＢＭＰ１３）（ＷＯ９５／０１８０１（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０７７６２）、ＷＯ９６／１４３３５、およびＷＯ９５／１０６３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０））；ＧＤＦ−７（ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ１２）（ＷＯ９５／１０８０２（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０７７９９）およびＷＯ９５／１０６３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０））；ＢＭＰ−１７およびＢＭＰ−１８（米国特許第６，０２７，９１７号）が含まれる。上記の刊行物は、本明細書中で参考として援用される。
【００５９】
別の実施形態では、有用なタンパク質には、生物活性生合成構築物（２つまたはそれを超える公知のモルフォゲン由来の配列を使用してデザインした新規の生合成形態形成タンパク質およびキメラタンパク質が含まれる）が含まれる。
【００６０】
本発明の別の実施形態では、形態形成タンパク質を、組織形成を合成的に誘導するために調製することができる。合成的に調製した形態形成タンパク質は、天然タンパク質または非天然タンパク質（すなわち、天然で見出されないタンパク質）であり得る。
【００６１】
非天然形態形成タンパク質は、一連のコンセンサスＤＮＡ配列を使用して合成されている（米国特許第５，３２４，８１９号（本明細書中で参考として援用される））。天然の骨形成生成物から得た部分的アミノ酸配列データおよび推定または証明された発生機能を有する文献で報告された他の遺伝子との認められた相同性に基づいてコンセンサス配列をデザインした。
【００６２】
合成コンセンサス配列（コンセンサス骨形成タンパク質または「ＣＯＰ」と呼ばれる）のいくつかは、原核生物中で融合タンパク質として発現している（例えば、米国特許第５，０１１，６９１号（本明細書中で参考として援用される））。これらには、ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７、およびＣＯＰ−１６、ならびに当該分野で公知の他のタンパク質が含まれる。精製融合タンパク質を、確立された動物モデル中で切断し、再度折り畳み、移植し、骨および／または軟骨誘導活性を有することを示すことができる。現在の好ましい合成骨形成タンパク質は、ＣＯＰ−５（配列番号２）およびＣＯＰ−７（配列番号３）と命名された２つの合成アミノ酸配列を含む。
【００６３】
Ｏｐｐｅｒｍａｎｎらの米国特許第５，０１１，６９１号および同第５，３２４，８１９号（本明細書中で参考として援用される）は、以下に示すＣＯＰ−５およびＣＯＰ−７のアミノ酸配列を記載している：
ＣＯＰ５  ＬＹＶＤＦＳ−ＤＶＧＷＤＤＷＩＶＡＰＰＧＹＱＡＦＹＣＨＧＥＣＰＦＰＬＡＤ
ＣＯＰ７  ＬＹＶＤＦＳ−ＤＶＧＷＮＤＷＩＶＡＰＰＧＹＨＡＦＹＣＨＧＥＣＰＦＰＬＡＤ
ＣＯＰ５  ＨＦＮＳＴＮ−−Ｈ−ＡＶＶＱＴＬＶＮＳＶＮＳＫＩ−−ＰＫＡＣＣＶＰＴＥＬＳＡ
ＣＯＰ７  ＨＬＮＳＴＮ−−Ｈ−ＡＶＶＱＴＬＶＮＳＶＮＳＫＩ−−ＰＫＡＣＣＶＰＴＥＬＳＡ
ＣＯＰ５  ＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬＫＹＮＱＥＭＶＶＥＧＣＧＣＲ
ＣＯＰ７  ＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬＫＹＮＱＥＭＶＶＥＧＣＧＣＲ。
【００６４】
これらのアミノ酸配列では、ダッシュ（−）を、関連タンパク質中の匹敵する配列を一列に並べることのみを目的とした充填物（ｆｉｌｌｅｒ）として使用する。アラインメントしたアミノ酸配列間の相違を強調する。
【００６５】
これらおよび他のＢＭＰファミリーメンバーのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は公開されており、当業者は、これらを使用して新規に同定したタンパク質がＢＭＰファミリーに属するかどうかを決定することができる。新規のＢＭＰ関連遺伝子産物を、少なくとも１つの形態形成活性を保有するための類似性によって予想し、それにより、ＢＭＰとして分類する。
【００６６】
本発明の１つの好ましい実施形態では、形態形成タンパク質は、少なくとも１つのサブユニットがＢＭＰタンパク質ファミリーに属する組換えペプチドを含む、二量体種を生成するためにジスルフィド結合したサブユニット対を含む。本発明の別の好ましい実施形態では、形態形成タンパク質は、少なくとも１つのサブユニットがＢＭＰタンパク質ファミリーに属する組換えペプチドを含む、二量体種を生成するサブユニット対を含む。非共有結合的相互作用には、ファンデルワールス、水素結合、疎水性、および静電相互作用が含まれる。二量体種は、ホモ二量体またはヘテロ二量体であってよく、細胞増殖および／または組織形成を誘導することができる。
【００６７】
一定の好ましい実施形態では、本明細書中で有用な骨形態形成タンパク質には、アミノ酸配列が上記の天然に存在するタンパク質から選択される基準形態形成タンパク質と少なくとも７０％のアミノ酸配列が相同または「類似」しているか、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％が相同または類似している配列を含むものが含まれる。好ましくは、基準タンパク質はヒトＯＰ−１であり、その基準配列はヒトＯＰ−１の骨形成的に活性な形態中に存在するＣ末端の７システインドメイン（配列番号１の残基３３０〜４３１）である。一定の実施形態では、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）などのコンピュータプログラムによって都合よく実行されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ，ら，前出の方法を使用して、基準モルフォゲンポリペプチドと機能的に等価であることが疑われるポリペプチドとアラインメントする。上記のように、アミノ酸配列の相同性または同一性のレベルとして伝統的に示される候補配列と基準配列との間の定義された関係を計算する目的で候補配列中の内部ギャップおよびアミノ酸挿入を無視する。「アミノ酸配列の相同性」は、本明細書中では、アミノ酸配列の同一性および類似性の両方を含むと理解される。相同配列は、同一および／または類似のアミノ酸残基を共有し、類似の残基は、アラインメントした基準配列中の対応するアミノ酸残基が保存的に置換されるか「点変異される」。したがって、基準配列と７０％のアミノ酸が相同な候補ポリペプチド配列は、任意の７０％のアラインメントした残基が基準配列中の対応するアミノ酸残基と保存的に置換されるか点変異されたものである。これまでのところ好ましい実施形態では、基準配列はＯＰ−１である。したがって、本明細書中で有用な骨形態形成タンパク質には、天然に存在するか化学合成によって生成された好ましい基準配列の対立遺伝子、系統発生対応物、および他の改変体（例えば、「ムテイン」または「変異タンパク質」が含まれる）が含まれる（上記または定義されたものが含まれる）。一定の特に好ましい形態形成ポリペプチドは、ヒトＯＰ−１の好ましい基準配列と少なくとも６０％のアミノ酸が同一であるか、さらにより好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％のアミノ酸が同一である。
【００６８】
別の実施形態では、有用な骨形成タンパク質には、本明細書中に定義するように、保存された７システインドメインおよびＣ末端活性ドメイン内に少なくとも７０％のアミノ酸配列相同性（類似性）を有するものが含まれる。さらに別の実施形態では、本発明の骨形成タンパク質を、本明細書中に定義した一般的（ｇｅｎｅｒｉｃ）配列のいずれか１つ（ＯＰＸ（配列番号４）、一般的配列７（配列番号５）、および８（配列番号６）、または一般的配列９（配列番号７）および１０（配列番号８）が含まれる）を有する骨形成的に活性なタンパク質と定義することができる。
【００６９】
本発明で有用な骨形態形成ポリペプチドのファミリーおよびそのメンバーを、一般的アミノ酸配列によって定義することができる。例えば、一般的配列７（配列番号５）および一般的配列８（配列番号６）は、それぞれ９６および１０２アミノ酸配列であり、今日までに定義された好ましいタンパク質ファミリーメンバー（少なくともＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＣＢＭＰ−２Ａ、ＣＢＭＰ−２Ｂ、ＢＭＰ−３、６０Ａ、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、Ｖｇｒ−１、およびＧＤＦ−１が含まれる）の間で共有される相同性に適合する。これらのタンパク質のアミノ酸配列は、上記でまとめるように、本明細書中そして／または当該分野で記載されている。一般的配列には、６個および７個のシステイン骨格（それぞれ一般的配列７および８）によって定義されたＣ末端ドメイン中のこれらの配列が共有する同一のアミノ酸ならびに配列内の可変部分の代わりの残基が含まれる。一般的配列により、分子内または分子間ジスルフィド結合を形成することができ、且つ折り畳まれたタンパク質の三次構造に影響を与える可能性が高い一定の重要なアミノ酸を含む適切なシステイン骨格が得られる。さらに、一般的配列の３６位（一般的配列７）または４１位（一般的配列８）にシステインを付加することが可能であり、それにより、ＯＰ−２およびＯＰ−３の形態形成的に活性な配列を含むことが可能である。
【００７０】
【化１】
2009517387.tif 000003
（ここで、各Ｘａａは、独立して、以下に定義した１つまたは複数の特定のアミノ酸群から選択される：「ｒｅｓ．」は、「残基」を意味し、ｒｅｓ．２のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．３のＸａａ＝ＶａｌまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．４のＸａａ＝（Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、またはＡｌａ）；ｒｅｓ．７のＸａａ＝（ＡｓｐまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．８のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＩｌｅ）；ｒｅｓ．１１のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、またはＳｅｒ）；ｒｅｓ．１２のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、またはＧｌｕ）；ｒｅｓ．１３のＸａａ＝（ＴｒｐまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．１４のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．１５のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．１６（ＡｌａまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．１８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、ＰｒｏまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．１９のＸａａ＝（ＧｌｙまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．２０のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．２１のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、またはＧｌｙ）；ｒｅｓ．２３のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ａｓｎ、またはＰｈｅ）；ｒｅｓ．２６のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、またはＳｅｒ）；ｒｅｓ．２８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、またはＡｌａ）；ｒｅｓ．３０のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、またはＡｓｎ）；ｒｅｓ．３１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、またはＴｙｒ）；ｒｅｓ．３３のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＭｅｔ）；ｒｅｓ．３４のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、またはＰｒｏ）；ｒｅｓ．３５のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、またはＬｙｓ）；ｒｅｓ．３６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、またはＩｌｅ）；ｒｅｓ．３７のＸａａ＝（Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、またはＬｅｕ）；ｒｅｓ．３８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｓｅｒ、またはＬｙｓ）；ｒｅｓ．３９のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、またはＰｒｏ）；ｒｅｓ．４０のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、またはＳｅｒ）；ｒｅｓ．４４のＸａａ＝（Ｈｅ、Ｖａｌ、またはＴｈｒ）；ｒｅｓ．４５のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、またはＩｌｅ）；ｒｅｓ．４６のＸａａ＝（ＧｌｎまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．４７のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＳｅｒ）；ｒｅｓ．４８のＸａａ＝（ＬｅｕまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．４９のＸａａ＝（ＶａｌまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．５０のＸａａ＝（Ｈｉｓ、Ａｓｎ、またはＡｒｇ）；ｒｅｓ．５１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＶａｌ）；ｒｅｓ．５２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、またはＬｅｕ）；ｒｅｓ．５３のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、またはＰｈｅ）；ｒｅｓ．５４のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＶａｌ）；ｒｅｓ．５５のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、またはＬｙｓ）；ｒｅｓ．５６のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＨｉｓ）；ｒｅｓ．５７のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ａｌａ、またはＩｌｅ）；ｒｅｓ．５８のＸａａ＝（ＰｒｏまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．５９のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、またはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６０のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ｖａｌ、またはＡｌａ）；ｒｅｓ．６３のＸａａ＝（ＡｌａまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．６５のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６６のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６７のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、またはＶａｌ）；ｒｅｓ．６８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、またはＧｌｙ）；ｒｅｓ．６９のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｐｒｏ、またはＳｅｒ）；ｒｅｓ．７０のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、またはＬｅｕ）；ｒｅｓ．７１のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＰｒｏ）；ｒｅｓ．７２のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、またはＩｌｅ）；ｒｅｓ．７４のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．７５のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、またはＨｉｓ）；ｒｅｓ．７６のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ａｓｎ、またはＬｅｕ）；ｒｅｓ．７７のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、またはＳｅｒ）；ｒｅｓ．７８のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、またはＡｓｐ）；ｒｅｓ．７９のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、またはＬｙｓ）；ｒｅｓ．８０のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｔｈｒ、またはＬｙｓ）；ｒｅｓ．８２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＡｓｎ）；ｒｅｓ．８４のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．８５のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、またはＶａｌ）；ｒｅｓ．８６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、またはＨｉｓ）；ｒｅｓ．８７のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、またはＰｒｏ）；ｒｅｓ．８８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、またはＡｓｐ）；ｒｅｓ．９０のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＩｌｅ）；ｒｅｓ．９２のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕ）；ｒｅｓ．９３のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、またはＳｅｒ）；ｒｅｓ．９５のＸａａ＝（ＧｌｙまたはＡｌａ）、およびｒｅｓ．９７のＸａａ＝（ＨｉｓまたはＡｒｇ））。
【００７１】
一般的配列８（配列番号６）は、一般的配列７の全てを含み、さらに、そのＮ末端に以下の配列（配列番号９）を含む。
【００７２】
【化２】
2009517387.tif 000004
したがって、残基７から始まって、一般的配列８中の各「Ｘａａ」は、一般的配列７で定義した特定のアミノ酸であり、一般的配列７で記載した各残基数が一般的配列８で５個シフトしていることが異なる。したがって、一般的配列７中の「ｒｅｓ．２のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＬｙｓ）」は、一般的配列８中のｒｅｓ．７のＸａａをいう。一般的配列８では、ｒｅｓ．２のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、またはＧｌｎ）；ｒｅｓ．３のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＭｅｔ）；ｒｅｓ．４のＸａａ＝（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、またはＧｌｎ）；およびｒｅｓ．５のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、またはＴｙｒ）。
【００７３】
別の実施形態では、有用な骨形成タンパク質には、以下に定義のように、一般的配列９および１０によって定義されたものが含まれる。
【００７４】
詳細には、一般的配列９および１０は、以下のタンパク質の複合アミノ酸配列である：ヒトＯＰ−１、ヒトＯＰ−２、ヒトＯＰ−３、ヒトＢＭＰ−２、ヒトＢＭＰ−３、ヒトＢＭＰ−４、ヒトＢＭＰ−５、ヒトＢＭＰ−６、ヒトＢＭＰ−８、ヒトＢＭＰ−９、ヒトＢＭＰ  １０、ヒトＢＵＴ−１１、ショウジョウバエ６０Ａ、ツメガエルＶｇ−１、ウニＵＮＩＶＩＮ、ヒトＣＤＭＰ−１（マウスＧＤＦ−５）、ヒトＣＤＭＰ−２（マウスＧＤＦ−６、ヒトＢＭＰ−１３）、ヒトＣＤＭＰ−３（マウスＧＤＦ−７、ヒトＢＭＰ−１２）、マウスＧＤＦ−３、ヒトＧＤＦ−１、マウスＧＤＦ−１、ニワトリＤＯＲＳＡＬＩＮ、ｄｐｐ、ショウジョウバエＳＣＲＥＷ、マウスＮＯＤＡＬ、マウスＧＤＦ−８、ヒトＧＤＦ−８、マウスＧＤＦ−９、マウスＧＤＦ−１０、ヒトＧＤＦ−１１、マウスＧＤＦ−１１、ヒトＢＭＰ−１５、およびラットＢＭＰ３ｂ。一般的配列７のように、一般的配列９は、Ｃ末端の６システイン骨格と適合する９６アミノ酸配列であり、一般的配列８のように、一般的配列１０は、７システイン骨格と適合する１０２アミノ酸配列である。
【００７５】
【化３】
2009517387.tif 000005
（ここで、各Ｘａａは、独立して、以下に定義した１つまたは複数の特定のアミノ酸群から選択される：「ｒｅｓ．」は、「残基」を意味し、ｒｅｓ．１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、またはＧｌｕ）；ｒｅｓ．２のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、またはＧｌｕ）；ｒｅｓ．３のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＡｓｐ）；ｒｅｓ．４のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、またはＰｈｅ）；ｒｅｓ．５のＸａａ＝（ＰｈｅまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、またはＡｓｎ）；ｒｅｓ．７のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、またはＧｌｎ）；ｒｅｓ．８のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、またはＰｈｅ）；ｒｅｓ．９のＸａａ＝（Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ）；ｒｅｓ．１０のＸａａ＝（ＴｒｐまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．１１のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、またはＧｌｙ）；ｒｅｓ．１２のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、またはＨｉｓ）；ｒｅｓ．１３のＸａａ＝（ＴｒｐまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．１４のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．１５のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．１６のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐ）；ｒｅｓ．１８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ）；ｒｅｓ．１９のＸａａ＝（Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、またはＰｈｅ）；ｒｅｓ．２０のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．２１のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、またはＴｈｒ）；ｒｅｓ．２２のＸａａ＝（ＡｌａまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．２３のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ａｌａ、またはＡｒｇ）；ｒｅｓ．２４のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、またはＡｒｇ）；ｒｅｓ．２６のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、またはＧｌｙ）；ｒｅｓ．２８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＧｌｎ）；ｒｅｓ．３０のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、またはＬｅｕ）；ｒｅｓ．３１＝（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、またはＡｒｇ）；ｒｅｓ．３２のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＶａｌ）；ｒｅｓ．３３のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ）；ｒｅｓ．３４のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、またはＰｒｏ）；ｒｅｓ．３５のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、またはＨｉｓ）；ｒｅｓ．３６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、またはＧｌｙ）；ｒｅｓ．３７のＸａａ＝（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、またはＴｙｒ）；ｒｅｓ．３８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、またはＡｒｇ）；ｒｅｓ．３９のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、またはＰｈｅ）；ｒｅｓ．４０のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＭｅｔ）；ｒｅｓ．４１のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、またはＧｌｎ）；ｒｅｓ．４２のＸａａ＝（Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、またはＬｙｓ）；ｒｅｓ．４３のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、またはＴｙｒ）；ｒｅｓ．４４のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、またはＰｒｏ）；ｒｅｓ．４５のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、またはＨｉｓ）；ｒｅｓ．４６のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ａｒｇ、またはＴｈｒ）；ｒｅｓ．４７のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｎ、またはＨｉｓ）；ｒｅｓ．４８のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ａｓｎ、またはＩｌｅ）；ｒｅｓ．４９のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、またはＩｌｅ）；ｒｅｓ．５０のＸａａ＝（Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、またはＧｌｎ）；ｒｅｓ．５１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、またはＧｌｎ）；ｒｅｓ．５２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、またはＴｙｒ）；ｒｅｓ．５３のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、またはＶａｌ）；ｒｅｓ．５４のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、またはＡｓｐ）；ｒｅｓ．５５のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ）；ｒｅｓ．５６のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、またはＡｒｇ）；ｒｅｓ．５７のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、またはＳｅｒ）；ｒｅｓ．５８のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、またはＡｌａ）；ｒｅｓ．５９のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、またはＧｌｙ）；ｒｅｓ．６０のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、またはＳｅｒ）；ｒｅｓ．６１のＸａａ＝（Ｃｙｓ、Ｖａｌ、またはＳｅｒ）；ｒｅｓ．６３のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｖａｌ、またはＴｈｒ）；ｒｅｓ．６５のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、またはＴｙｒ）；ｒｅｓ．６６のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、またはＶａｌ）；ｒｅｓ．６７のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、またはＴｙｒ）；ｒｅｓ．６８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、またはＶａｌ）；ｒｅｓ．６９のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒ）；ｒｅｓ．７０のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、またはＶａｌ）；ｒｅｓ．７１のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、またはＧｌｙ）；ｒｅｓ．２のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＭｅｔ）；ｒｅｓ．７４のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、またはＭｅｔ）；ｒｅｓ．７５のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、またはＶａｌ）；ｒｅｓ．７６のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、またはＧｌｕ）；ｒｅｓ．７７のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、またはＰｒｏ）；ｒｅｓ．７８のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、またはＬｙｓ）；ｒｅｓ．７９のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、またはＡｒｇ）；ｒｅｓ．８０のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、またはＧｌｎ）；ｒｅｓ．８１のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、またはＡｌａ）；ｒｅｓ．８２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、またはＡｌａ）；ｒｅｓ．８３のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、またはＩｌｅ）；ｒｅｓ．８４のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、またはＧｌｙ）；ｒｅｓ．８５のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、またはＶａｌ）；ｒｅｓ．８６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、またはＩｌｅ）；ｒｅｓ．８７のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、またはＬｙｓ）；ｒｅｓ．８８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、またはＬｙｓ）；ｒｅｓ．８９のＸａａ＝（ＭｅｔまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．９０のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＬｙｓ）；ｒｅｓ  ９１のＸａａ＝（ＶａｌまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．９２のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒ）；ｒｅｓ．９３のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、またはＴｈｒ）；ｒｅｓ．９５のＸａａ＝（Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＴｈｒ）；ｒｅｓ．９７のＸａａ＝（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、またはＳｅｒ））。さらに、ｒＢＭＰ３ｂおよびｍＧＤＦ−１０中のｒｅｓ．５３の後にＩｌｅが存在し、ＧＤＦ−１のｒｅｓ．５４の後にＴが存在し、ＢＭＰ３中のｒｅｓ．５４の後にＶが存在し、ＢＭＰ−８およびドルサリン中のｒｅｓ．７８の後にＧが存在し、ｈＧＤＦ−１中のｒｅｓ．３７の後にＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏが存在する。
【００７６】
一般的配列１０（配列番号８）は、一般的配列９（配列番号７）の全てを含み、さらに、そのＮ末端に以下の配列（配列番号９）を含む。
【００７７】
【化４】
2009517387.tif 000006
したがって、残基６から始まって、一般的配列１０中の各「Ｘａａ」は、一般的配列９で定義した特定のアミノ酸であり、一般的配列９で記載した各残基数が一般的配列１０で５個シフトしていることが異なる。したがって、一般的配列９中の「ｒｅｓ．１のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、またはＧｌｕ）」は、一般的配列１０中のｒｅｓ．６のＸａａをいう。一般的配列１０では、ｒｅｓ．２のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、またはＣｙｓ）；ｒｅｓ．３のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、またはＡｌａ）；ｒｅｓ．４のＸａａ＝（Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、またはＴｙｒ）；およびｒｅｓ．５のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、またはＬｅｕ）。
【００７８】
上記のように、本発明で有用な一定のこれまでのところ好ましい骨形態形成ポリペプチド配列は、ｈＯＰ−１の好ましい基準配列を定義するアミノ酸配列と６０％を超えて同一であるか、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％を超えて同一である。これらの特に好ましい配列は、ＯＰ−１タンパク質およびＯＰ−２タンパク質（ショウジョウバエ６０Ａタンパク質が含まれる）の対立遺伝子および系統発生対応物変異形を含む。したがって、一定の特に好ましい実施形態では、有用な形態形成タンパク質には、７システイン骨格を定義し、ＯＰ−１とＯＰ−２のいくつかの同定された変異形の間の相同性に適合する本明細書中で「ＯＰＸ」（配列番号４）と呼ばれる一般的アミノ酸配列内のポリペプチド鎖対を含む活性タンパク質が含まれる。本明細書中に記載のように、所与の位置の各Ｘａａは、マウスまたはヒトのＯＰ−１またはＯＰ−２のＣ末端配列中の対応する位置で生じる残基から選択される。
【００７９】
【化５】
2009517387.tif 000007
（ここで、ｒｅｓ．２のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．３のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．１１のＸａａ＝（ＡｒｇまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．１６のＸａａ＝（ＧｌｎまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．１９のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．２３のＸａａ＝（ＧｌｕまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．２６のＸａａ＝（ＡｌａまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．３５のＸａａ＝（ＡｌａまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．３９のＸａａ＝（ＡｓｎまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．４１のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＣｙｓ）；ｒｅｓ．５０のＸａａ＝（ＶａｌまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．５２のＸａａ＝（ＳｅｒまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．５６のＸａａ＝（ＰｈｅまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．５７のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．５８のＸａａ＝（ＡｓｎまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．６０のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、またはＡｓｎ）；ｒｅｓ．６１のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＶａｌ）；ｒｅｓ．６５のＸａａ＝（ＰｒｏまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．７１のＸａａ＝（ＧｌｎまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．７３のＸａａ＝（ＡｓｎまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．７５のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．８０のＸａａ＝（ＰｈｅまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．８２のＸａａ＝（ＡｓｐまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．８４のＸａａ＝（ＳｅｒまたはＡｓｎ）；ｒｅｓ．８９のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．９１のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＨｉｓ）；およびｒｅｓ．９７のＸａａ＝（ＡｒｇまたはＬｙｓ）。
【００８０】
さらに別の好ましい実施形態では、有用な骨形成的に活性なタンパク質は、低い、中程度の、または高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で基準モルフォゲン配列（ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、６０Ａ、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−６、およびＧＤＦ−７などの保存された７システインドメインを定義するＣ末端配列）をコードするＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイゼーションする核酸によってコードされる配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を有する。本明細書中で使用されるように、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を、公知の技術にしたがった４０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ液、および０．１％ＳＤＳ中における３７℃でのハイブリダイゼーションならびに０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳにおける５０℃での洗浄と定義する。標準的なストリンジェントの条件は、市販の標準分子クローニングテキスト中で十分に特徴づけられている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；およびＢ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）（その開示が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００８１】
上記のように、本発明で有用なタンパク質は、一般に、上記ポリペプチドの折り畳まれた対を含む二量体タンパク質である。このような形態形成タンパク質は、還元された場合に不活性であるが、酸化ホモ二量体として活性であり、本発明の他の物質と組み合わせて酸化されてヘテロ二量体を生成する。したがって、形態形成的に活性なタンパク質中の折り畳まれた形態形成ポリペプチド対のメンバーを、独立して、上記の特定のポリペプチドのいずれかから選択することができる。いくつかの実施形態では、骨形態形成タンパク質は単量体である。
【００８２】
本発明の材料および方法で有用な骨形態形成タンパク質には、天然に存在する供給源から単離されるか組換えＤＮＡ技術または他の合成技術によって産生される上記のポリペプチド鎖のいずれかを含むタンパク質、これらのタンパク質の対立遺伝子および系統発生対応物の改変体、そのムテイン、ならびに種々の短縮構築物および融合構築物が含まれる。欠失変異体または付加変異体も活性であると考えられ、変化によって折り畳み構造中のシステインの関係が機能的に破壊されない場合、保存されたＣ末端の６または７システインドメインが変化することができる変異体が含まれる。したがって、このような活性形態は、本明細書中に開示の具体的に記載した構造と等価であると見なされる。タンパク質には、種々のグリコシル化パターン、種々のＮ末端、アミノ酸配列相同性領域を有する関連タンパク質ファミリーを有する形態、および宿主細胞中の組換えＤＮＡの発現によって産生された天然タンパク質または生合成タンパク質の活性な短縮形態または変異形態が含まれ得る。
【００８３】
本明細書中で企図される骨形態形成タンパク質を、インタクトもしくは短縮されたｃＤＮＡまたは原核生物もしくは真核生物宿主細胞中の合成ＤＮＡから発現するか、精製、切断、再折り畳み、および二量体化して形態形成的に活性な組成物を形成することができる。今のところ好ましい宿主細胞には、原核生物（大腸菌が含まれる）、真核生物（酵母が含まれる）、または哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、またはＢＳＣ細胞など）が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、他の宿主細胞を使用して利益を得ることができることを認識している。本発明の実施で有用な骨形態形成タンパク質の詳細な説明（どのようにして作製し、使用し、骨形成活性について試験するのかが含まれる）は、多数の刊行物（米国特許第５，２６６，６８３号および同第５，０１１，６９１号（その開示が本明細書中で参考として援用される）ならびにこれらで引用された刊行物のいずれか（その開示が本明細書中で参考として援用される）が含まれる）に開示されている。
【００８４】
したがって、当該分野で利用可能なこの開示および知識を考慮して、遺伝子エンジニアは、適切なアミノ酸配列をコードする種々の異なる生物種のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーから遺伝子を単離するかオリゴヌクレオチドからＤＮＡを構築し、次いで、これらを種々の宿主細胞型（原核細胞および真核細胞の両方が含まれる）で発現させて、哺乳動物における骨および軟骨の形態形成を刺激することができる活性タンパク質の巨大ライブラリーを生成することができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、骨形成タンパク質には、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、およびこれらのアミノ酸配列変異形が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、形態形成タンパク質は、ヒトＯＰ−１の保存された７システインドメインを含むＣ末端１０２〜１０６アミノ酸と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、形態形成タンパク質が軟骨欠損の修復を誘導することができる。
【００８６】
好ましい実施形態では、形態形成タンパク質は、ＯＰ−１、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６およびＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２またはＣＤＭＰ−３である。最も好ましい実施形態では、形態形成タンパク質はＯＰ−１である。
【００８７】
薬学的組成物
形態形成タンパク質を含む薬学的組成物は、種々の形態であり得る。これらには、例えば、粉末、錠剤、丸薬、座剤、溶液、懸濁液、ゲル、パテ、ペースト、乳濁液、および輸液などの固体、半固体、および液体の投薬形態が含まれる。好ましい形態は、意図される投与様式および処置への適用に依存し、当業者が選択することができる。投与様式には、経口、非経口、筋肉内、腹腔内、関節内、皮下、静脈内、病変内、または局所への投与が含まれ得る。組成物を、各投与経路に適切な投薬形態で処方することができる。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物を、組織の再生または修復を必要とする部位に（すなわち、軟骨に直接）投与する。他の実施形態では、本発明の薬学的組成物を、組織の再生または修復を必要とする部位の周辺に投与する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物を、修復（すなわち、関節）を必要とする軟骨周囲領域（例えば、滑液）に投与する。他の実施形態では、本発明の薬学的組成物を、軟骨組織（例えば、半月板または椎間板）に直接投与することができる。
【００８８】
形態形成タンパク質を含む薬学的組成物を、例えば、取り込みまたは安定性を刺激する補因子を使用するか使用することなく滅菌等張処方物に含めることができる。処方物は、好ましくは、液体であるか、凍結乾燥粉末であり得る。例えば、形態形成タンパク質を、処方緩衝液で希釈することができる。溶液を、凍結乾燥させ、冷蔵下で保存し、投与前に滅菌注射用水（ＵＳＰ）を使用して再構成することができる。
【００８９】
組成物はまた、好ましくは、当該分野で周知の従来の薬学的に許容可能なキャリアを含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｍａｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０）を参照のこと）。このような薬学的に許容可能なキャリアには、他の薬物、キャリア、遺伝子キャリア、アジュバント、ビヒクルなど（ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物など）が含まれ得る。好ましくは、キャリアは、患者の血液または滑液と等張である。このようなキャリア賦形薬の例には、水、生理食塩水、リンゲル液、緩衝化溶液、ヒアルロナン、およびデキストロース溶液が含まれる。不揮発油およびオレイン酸エチルなどの非水性賦形薬も本明細書中で有用である。組成物は、好ましくは、単位投与形態であり、通常、特定の組織処置に依存する投与計画として投与する。
【００９０】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、徐放性処方、遅延送達処方、形態形成タンパク質のクリアランスが遅延する処方である。これらの組成物を調製するために利用可能な、多数の送達材料が存在する。それらとしては、ポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリマーのマイクロスフィア、リポソーム、コラーゲン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒアルロン酸／フィブリンマトリックス、ヒアルロン酸、フィブリン、キトサン、ゼラチン、ＳＡＢＥＲＴＭシステム（イソアセテートイソブチレート（ＳＡＩＢ））、ＤＵＲＩＮＴＭ（薬物添加（ｄｒｕｇ  ｌｏａｄｅｄ）インプラントのための生分解性ポリマー）、ＭＩＣＲＯＤＵＲＴＭ（生分解性ポリマー／マイクロカプセル封入）、およびＤＵＲＯＳＴＭ（ミニ浸透圧ポンプ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、形態形成タンパク質は、送達材料に共有結合している。
【００９１】
好ましい実施形態において、形態形成タンパク質は、送達材料としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と一緒に処方される。ＰＥＧ基は、任意の簡便な分子量であり得、そして直線状または分岐状であり得る。いくつかの実施形態において、形態形成組成物は、ＰＥＧを含む。いくつかの実施形態において、形態形成タンパク質は、ＰＥＧ基に共有結合している。一般に、ＰＥＧ基は、形態形成タンパク質上の反応基およびＰＥＧ基を介して、その形態形成タンパク質と連結している。タンパク質をＰＥＧ化するための方法は、当該分野で公知である。好ましい実施形態において、ＰＥＧ含有処方物において使用される形態形成タンパク質としては、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、およびこれらのアミノ酸配列改変体が挙げられるが、これらに限定されない。より好ましい実施形態において、上記処方は、ＰＥＧ化ＯＰ−１である。
【００９２】
本発明の組成物は、化合物のための適切な送達系として機能する生体適合キャリア材料中に分散された形態形成タンパク質を含む。徐放性キャリアの適切な例には、半透性ポリマー材料が含まれる。移植可能であるかマイクロカプセルの徐放性材料には、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，３１９号；欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチルＬ−グルタミン酸とのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２，ｐｐ．５４７−５６（１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５，ｐｐ．１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２，ｐｐ．９８−１０５（１９８２））、ポリ−Ｄ−（−）−３ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、または上記のポリマーが含まれる。
【００９３】
本発明の薬学的組成物を、例えば、ミクロスフェア、リポソーム、他の微粒子送達系、または徐放性組成物を使用して、罹患組織中、罹患組織付近、または罹患組織に通じている領域、これらの組織が浸漬している流動物（例えば、滑液）、またはこれらの組織が浸漬している血流に投与することもできる。
【００９４】
本発明の形態形成タンパク質を含むリポソームを、周知の方法によって調製することができる（例えば、ドイツ特許第３，２１８，１２１号；Ｅｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，ｐｐ．３６８８−９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７，ｐｐ．４０３０−３４（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号を参照のこと）。一般に、リポソームは、脂質含有量が約３０ｍｏｌ．％コレステロールを超える小さな（約２００〜８００Å）単層型である。形態形成タンパク質の至適な放出速度を調節するために、コレステロールの比率を選択する。
【００９５】
本発明の形態形成タンパク質を、組織誘導の速度および特徴を調整するために、免疫抑制薬、サイトカインなどの他の生物活性分子を含むリポソームに付着させることもできる。リポソームへの形態形成タンパク質の付着を、ターゲティングされた送達のための抗体への毒素または化学療法薬をカップリングするために広く使用されているヘテロ二官能性架橋剤などの任意の公知の架橋剤によって行うことができる。リポソームへの抱合を、炭水化物指向性架橋試薬である４−（４−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）を使用して行うこともできる（Ｄｕｚｇｕｎｅｓら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｂｓｔ．Ｓｕｐｐｌ．１６Ｅ  ７７（１９９２））。
【００９６】
本発明の形態形成タンパク質はまた、グリコシル化され得る。グリコシル化は、１つ以上のオリゴ糖基の付加による、タンパク質の改変である。通常、２つの型のグリコシル化が存在する：Ｏ−結合型オリゴ糖は、セリン残基またはトレオニン残基に結合し、一方で、Ｎ−結合型オリゴ糖は、アスパラギン残基が配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸であり得る）の一部である場合に、アスパラギン残基に結合する。グリコシル化は、タンパク質の物理的性質に、劇的に影響を与え得、そしてタンパク質の安定性、分泌、半減期、および細胞内の局在においても重要であり得る。いくつかの実施形態において、本発明の形態形成タンパク質は、Ｎ−結合型オリゴ糖を含む。他の実施形態において、本発明の形態形成タンパク質は、Ｏ−結合型オリゴ糖を含む。さらに他の実施形態において、本発明の形態形成タンパク質は、Ｎ−結合型オリゴ糖およびＯ−結合型オリゴ糖の両方を含む。いくつかの実施形態において、形態形成タンパク質のグリコシル化パターンは、糖タンパク質の炭水化物の組成を制御するために改変され得る。
【００９７】
当業者は、組織誘導を促進するのに最適な生体適合性および／または生分解性処方物を作製することができる。
【００９８】
形態形成タンパク質のための首尾のよいキャリアは、いくつかの重要な機能を果たすべきである。形態形成タンパク質の遅延放出送達系として作用するか、形態形成タンパク質のクリアランスを遅延させ、非特異的タンパク質分解から形態形成タンパク質を保護するべきである。
【００９９】
さらに、選択された材料は、インビボで生体適合性を示し、好ましくは生分解性を示さなければならない。ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、および種々の組み合わせは、インビボで異なる解離速度を有する。
【０１００】
キャリアはまた、ヒドロゲル形態を取ることができる。キャリア材料がヒドロゲルを含む場合、キャリア材料は、実質的に水から構成されるゲルの形態の架橋親水性ポリマーの三次元ネットワークをいい、好ましくは、９０％を超える水を含むゲルであるが、これに限定されない。ヒドロゲルは、正味の正電荷または正味の負電荷を有し得るか、中性であり得る。典型的な正味の負電荷のヒドロゲルはアルギニン酸塩である。正味の正電荷を有するヒドロゲルを、コラーゲンおよびラミニンなどの細胞外基質成分に代表され得る。市販の細胞外基質成分の例には、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭおよびＶｉｔｒｏｇｅｎＴＭが含まれる。正味の中性ヒドロゲルの例は、高度に架橋したポリエチレンオキシドまたはポリビニルアルコールである。
【０１０１】
種々の成長因子、サイトカイン、ホルモン、栄養因子、ならびに抗体および化学療法薬、酵素、酵素インヒビター、および他の生体活性薬を含む処置組成物を、形態形成タンパク質を含むキャリア材料上に吸着させるかキャリア材料内に分散させることができ、また、長期放出させてゆっくり吸収させる。
【０１０２】
約１μｇ／日と約１０００μｇ／日、好ましくは３μｇ／日と５０μｇ／日との間の投薬レベルの形態形成タンパク質は、軟骨の修復および再生に有用である。当業者が認識するように、引用した用量よりも低いか高い用量が必要な可能性がある。任意の特定の患者のための特定の投薬量および処置計画は、種々の要因（使用した特定の形態形成タンパク質の活性、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間、排出速度、薬物の組み合わせ、組織損傷の重症度、および処置する医師の判断が含まれる）に依存する。
【実施例】
【０１０３】
実施例１：骨軟骨欠損のイヌモデル修復
１２匹の繁殖用（ｂｒｅｄ  ｆｏｒ  ｐｕｒｐｏｓｅ）の雌成体イヌを手術する。両後肢を準備し、滅菌した布で包む。長さ約４ｃｍの内側傍膝蓋骨切片を作製する。膝蓋骨を側面に沿って引っ張って大腿骨顆部を露呈させる。右内側顆では、特別にデザインするか改変した５．０ｍｍのドリル用ビットを使用して、軟骨層に及び、且つ軟骨下骨に６ｍｍの深さで浸透した直径５．０ｍｍの欠損を、大腿顆の中央の荷重負荷領域に作製する。動物をそれぞれ６匹の動物を含む２つの群に分ける。第１の群では、破片を除去して骨髄細胞を流出させるための大量の生理食塩水での洗浄後、適切な徐放性ＯＰ−１を欠損周囲の滑液に適用する。６匹の動物を含む第１の群では、右側の欠損に徐放性ＯＰ−１を投与する。全動物の左側の肢は、コントロールビーズ（０％ＯＰ−１）を投与したコントロールとしての役割を果たす。
【０１０４】
６匹の動物を含む第２の群には、手術時にＯＰ−１で処置しない。術後３日目に、適切な徐放性ＯＰ−１処方物を欠損関節周囲の滑液に注射する。６匹の動物には、徐放性ＯＰ−１を、右側の欠損周囲の滑液に注射する。全動物の左側の肢は、コントロールビーズ（０％ＯＰ−１）を投与したコントロールとしての役割を果たす。
【０１０５】
術後１６週目に動物を屠殺する。屠殺時に、大腿遠位をひとまとめに回収し、欠損部位を、以前の調査で使用されたＭｏｒａｎら（Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．７４Ｂ：６５９−６６７，１９９２）のスキームに基づいて組織化学的または肉眼的に評価する。
【０１０６】
後肢のＸ線写真を、手術前、手術直後、および術後１６週間後に得る。手術前のＸ線写真を使用して、事前に異常が存在しないことを確認し、骨格の成熟を検証する。術後Ｘ線写真を使用して欠損の配置を評価する。解剖（ｓａｃｒｉｆｉｃｅ）Ｘ線写真を使用して、軟骨下骨および関節表面の治癒および修復速度を評価する。評価日の１週間以内にＸ線写真を得る。
【０１０７】
屠殺直後に死体の肉眼的病理学試験を行う。大腿遠位を即座に一まとめに採取し、生理食塩水に浸したタオル中で保存し、ラベルを貼ったプラスチックバッグに入れる。欠損部位の高倍率写真を撮影し、慎重にラベルを貼る。
【０１０８】
欠損部位から軟組織を慎重に切り取り、大腿近位端を除去する。水冷式ダイアモンドカットノコギリにて、組織学的評価のために各欠損部位を単離する。
【０１０９】
検体を、４％パラホルムアルデヒド溶液への浸漬によって固定し、組織学的脱灰過程のために調製する。３つのレベル由来の３つの切片を各ブロックから切断する。レベル１および３は、欠損周囲に最も近い。レベル２は欠損中心に存在する。各レベル由来の３つの切片を、トルイジンブルー、サフラニンＯ、およびファーストグリーンで染色する。Ｍｏｒａｎら（Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．７４Ｂ：６５９−６６７，１９９２）のスキームに基づいて、切片を採点する。
【０１１０】
ＯＰ−１処置動物は、コントロール動物と比較した場合、骨軟骨欠損が改善すると予想される。
【０１１１】
実施例２：徐放性ミクロスフェアにおけるＯＰ−１の関節内投与による軟骨欠損の代表的なヒツジモデル
１８匹の繁殖用ヒツジを手術する。特別にデザインした装置を使用して、体重負荷がかかる顆状突起表面上に石灰化層に対して深さ２ｍｍまでの直径１０ｍｍの軟骨欠損を、１８匹のヒツジの後肢膝に作製する（血液の曝露は明白な失敗（ｆａｉｌｕｒｅ）である）。全動物の右膝をコントロールとして処置しないままにする。
【０１１２】
群１（６匹の動物）：術後３日目に、各動物の左膝にＯＰ−１を含まない５７ｍｇのコントロール０．３％ミクロスフェアを含む２５０μｌの懸濁液を関節内注射する。
【０１１３】
群２（６匹の動物）：術後３日目に、各動物の左膝に１７０μｇのＯＰ−１を含む５７ｍｇの０．３％ミクロスフェアを含む２５０μｌの懸濁液を関節内注射する。
【０１１４】
群３（６匹の動物）：術後３日目および術後６週目に、各動物の左膝に１７０μｇのＯＰ−１を含む５７ｍｇの０．３％ミクロスフェアを含む２５０μｌの懸濁液を関節内注射する。
【０１１５】
術後３週目および６週目に全動物で膝の関節鏡評価を行う。術後３週目および６週目にＮＭＲ／ＭＲＩスキャンを行う。定期的に膝の機械的試験も行う。
【０１１６】
術後３ヶ月目に全動物を屠殺する。屠殺後、組織学、組織形態計測、免疫染色、および特定の関節軟骨細胞マーカーについてのインサイツハイブリダイゼーションを行う。ＯＰ−１処置膝は、コントロール膝と比較して再生が改善すると予想される。
【０１１７】
実施例３：変形性関節症の予防のためのヒツジモデル
ヒツジは１回の損傷による衝撃後に進行性変形性関節症を引き起こすことが証明されているので、変形性関節症モデルとしてヒツジを使用する。１２匹の１４日間馴化させたメス交雑ヒツジを本研究で使用した。全ヒツジを全身麻酔し、無菌技術を使用して、３ｃｍの関節切開を使用して両大腿頸骨関節にアクセスした。バネ荷重の機械装置を使用して、大腿顆の中央の荷重負荷領域に両側衝撃による損傷を作製した（３０Ｍｐａ、直径６ｍｍ×２）（図１を参照のこと）。これらの切開の日常的な縫合後、ヒツジの各膝にＯＰ−１を含むコラーゲンおよびカルボキシメチルセルロースのビヒクル（ＯＰ−１  Ｉｍｐｌａｎｔ、３４０μｇ）またはビヒクルのみを関節内注射した。２つの実験群（Ｎ＝６）を使用した。群Ａには、一方の膝に、手術の当日（０日目）および１週間後（７日目）に０．３ｍｌのＯＰ−１＋コラーゲン＋カルボキシメチルセルロースを関節内に投与した。０日目の注射は、外科的切開を縫合した直後に行った。群Ｂには、０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、および３５日目に、一方の膝にＯＰ−１を投与した。ＯＰ−１およびビヒクルの注射前に滑液を吸引し、炎症の指標として白血球数および総タンパク質を測定した。ＯＰ−１処置により、術後１週目に滑液中の白血球は有意に減少したが（ｐ＜．００３、対応のあるＴ検定）、総タンパク質濃度は減少しなかった（図２を参照のこと）。
【０１１８】
関節組織の詳細な評価（パラビタール（ｐａｒａｖｉｔａｌ）染色、ＴＵＮＥＬ染色、組織病理学、軟骨、硫酸化ＧＡＧ分析、生化学的圧痕試験）のために、術後１２週間後にヒツジを屠殺した。ＯＰ−１膝の病変がしばしば光沢／反射率の減少に制限されるのに対して、コントロール関節はフィブリル化領域またはびらん領域を有するので、異常軟骨（インディアインク取り込み）は群間で有意に異なっていた（ｐ＜．０３）（表１を参照のこと）。
【０１１９】
【表１】
2009517387.tif 000008
１関節表面上のインディアインク取り込み（デジタル写真）からのＮｏｒｔｈｅｒｎ  ＥｃｌｉｐｓｅＴＭ形態計測ソフトウェアを使用した瘢痕領域の測定。
【０１２０】
組織切片はビヒクル処置関節中に軟骨細胞クラスター、無細胞基質、および軟骨の喪失を示すのに対して（図３Ａ）、ＯＰ−１処置関節中の病変（図３Ｂ）は、表面上の軟骨細胞喪失帯および／または小さな溝を示した。Ｍａｎｋｉｎ組織採点法（Ｍａｎｋｉｎ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ｓｃｏｒｉｎｇ）は有意に異なったが（ｐ＜．０６、ウィルコクソン符合順位検定）、病変サイズに敏感なＯＡＲＳＩ採点システムでは有益性が証明された（ｐ＜．０３）（表２を参照のこと）（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｌｕｉｊｓ  Ｊ．ら，Ｔｈｅ  ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａｎｋｉｎ  ｓｃｏｒｅ  ｆｏｒ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｓ．Ｏｒｔｈｏ  Ｒｅｓ  １９９２，１０：５８−６１）。
【０１２１】
【表２】
2009517387.tif 000009
１修正Ｍａｎｋｉｎスコアは０〜１３であり、０は正常軟骨である。
２Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｏｒｅの計算＝損傷重症度×１損傷について最大２４の領域。
【０１２２】
硫酸化グリコサミノグリカン濃度は、ＯＰ−１処置群でより高く、統計的に有意である傾向が強い（ｐ＜．０６）（図４を参照のこと）。
【０１２３】
コラーゲン／ＣＭＣのみの群は表面がフィブリル化およびびらんを引き起こすのに対して、ＯＰ−１群は損傷の徴候がほとんど内か全くない（図５を参照のこと）。ＯＰ−１処置骨格は、コントロールよりも健康で光沢があるようである。
【０１２４】
これらの実験は、２種のＯＰ−１注射を使用した注射により完全とまではいかないが顕著な改善を示す。処置にもかかわらず小さな病変が存在し得るが、これは、３０ＭＰａの衝撃による損傷によって部分的な厚さの欠損が生じ、完全に修復される可能性が低いためである。ＯＰ−１は、大腿顆の変性変化の遠心性拡大を抑制することができるのに対して、ビヒクル処置関節は単顆型（ｕｎｉｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ）変形性関節症を発症した。ＯＰ−１がこの効果を発揮する機構は、修復の影響によるその同化特性による可能性がある。しかし、衝撃部位で修復組織はほとんど存在しないので、損傷軟骨細胞の生存を促進する別の機構が有効であり得る。これらの所見は、ＯＰ−１が細胞を採取するか操作した場合に損傷が生じ得る組織工学および細胞ベースの処置などの他の適用に有用であり得ることを示す。
【０１２５】
実施例４：関節内注射後のＯＰ−１の処置効果についてのヒツジモデル
本研究は、研究前に１４日間馴化させ、健康状態を評価した１．５〜２．５歳の成体雌交雑ヒツジ（Ｎ＝１２）を使用する。全身麻酔下で無菌技術を使用して、３ｃｍの最小浸潤性関節切開術によって全ヒツジの両方（左および右）の内側大腿顆に標準化した３０ＭＰａの衝撃による損傷を負わせる。術後３週目に、表３にしたがって、ヒツジをジアゼパム（１０ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（３〜５ｍｇ／ｋｇ）で鎮静して滑膜穿刺（ｓｙｎｏｖｉｏｃｅｎｔｅｓｉｓ）のための膝を準備し、被験物質、偽薬、または生理食塩水を内側大腿頸骨関節に注射する。
【０１２６】
【表３】
2009517387.tif 000010
全ヒツジに、両側内側大腿顆損傷を負わせる。９匹のヒツジから構成される第１の群では、一方の膝に被験物質を投与し、反対側の膝にビヒクルのみを含む偽薬を投与する。完全なブロックデザイン（ｂｌｏｃｋ  ｄｅｓｉｇｎ）によって膝の処置を割り当てる。３匹のヒツジから構成される第２の群に、偽薬効果のコントロールとして生理食塩水ＵＳＰを投与する。
【０１２７】
研究は、以下の表４に記載の手順に従う。
【０１２８】
【表４】
2009517387.tif 000011
実施例５：変形性関節症のモルモットモデルおよびウサギモデル
健康なモルモット（自発性）およびＡＣＬ切除したウサギ（誘導性）の変形性関節症モデルを使用した。３、６、および９月齢の１４匹のモルモットの右膝に、５０μｇのｒｈＯＰ−１を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を３週間間隔で１２週間注射した。左膝を、未処置コントロールとして使用した。
【０１２９】
１０匹のニュージーランドホワイトウサギの左側のＡＣＬを切除し、１００μｇのｒｈＯＰ−１を含むＰＢＳ溶液またはコントロール溶液のいずれかを１２週間の評価期間に３週間間隔で注射した。全動物において、右膝を、非ＡＣＬ切除未処置コントロールとして使用した。
【０１３０】
両モデルの全動物を、変性重症度を採点するための修正Ｍａｎｋｉｎスケールを使用して、肉眼による外観および組織学的証拠について評価した。未処置モルモットの膝は、３〜６、６〜９、および９〜１２月齢で関節の変化が進行し、１２月齢で肉眼的および組織学的に明らかに重篤な変性を示した。ＯＰ−１処置により、初期段階でモルモットにおける変性の防止に最も顕著な効果が認められた。９月齢のｒｈＯＰ−１処置動物における膝の肉眼的および組織学的変性は、６月齢の未処置動物と類似していた。１２月齢で、変性の重症度の変化は同程度であった。ウサギＡＣＬ切除モデルでは、ＯＰ−１処置により、１２週目の評価期間において処置部位の変性の重症度のわずかな改善が認められた。これらの結果は、ＯＰ−１が初期段階の関節炎の変化を防止または遅延させる有利な効果がいくらかあることを示す。
【０１３１】
実施例６：半月板治癒のヒツジモデル
非再吸収性の糸によって縫合した孔（直径６ｍｍ）および縦裂（長さ２ｃｍ）を、ヒツジの両膝の各内側半月に作製した。以下の２つの処置群が存在した：ＯＰ−１パテ群（カルボキシメチルセルロースを含む１ｇのウシ１型コラーゲンあたり３．５ｍｇＯＰ−１）および外科的に作製した欠損以外の処置を行わないコントロール群。ＯＰ−１処置動物に、切開の縫合直前に０．３ｍｌ（３５０ｍｃｇ）を注射し、次いで、術後７日目に関節腔に注射した。
【０１３２】
処置後６、１２、および２６週目に、動物を安楽死させる。安楽死後、半月板を除去し、前側の縫合縦裂および後側の２つに切断し、孔が作製された。切片を、ＭａｓｓｏｎトリコロームおよびサフラニンＯで染色する。コラーゲンＩ、ＩＩ、ＶＩ、Ｓ１００、プロテアーゼＭＭＰ１に特異的な抗体を使用して、半月板の免疫組織化学も行った。
【０１３３】
半月板切片を分離し、ＯＣＴに包埋し、液体窒素中で凍結させた。低温保持装置を使用して得た切片を回収し、ホモジナイズし、トリゾール試薬を使用してＲＮＡを調製した。ＲＴ−ＰＣＲにより、種々のマーカー（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩ型コラーゲン、細胞外基質についてのマーカーとしてのアグレカン、成長因子としてのＴＧＦ−βおよびＩＧＦ−２、基質分解酵素としてのＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、およびＴＩＭＰ−１、最後に、細胞の増殖状態およびアポトーシス状態のためのサイクリンＡ、Ｂｃｌ−２、ＢＡＸ、およびカスパーゼ３が含まれる）の遺伝子発現を研究する。他の関節組織も調査し、ＯＰ−１に起因し得る任意の肉眼的相違についてコントロールと比較する。
【０１３４】
半月板の無血管野中の孔におけるＯＰ−１パテの効果についての予備段階の結果は、孔を有する全半月板でＯＰ−１パテでの処置後に正の結果が得られたことを示す。パテは最初の６週間保持され、その後に再吸収されて消滅した。明らかに、半月板表面から孔への細胞の相当な浸透が認められ、主に８週間後から線維組織に充填された。
【０１３５】
６週間後、ほとんどのコントロール動物は、材料の欠損への充填がほとんど認められず、存在する材料は繊維状でありわずかであった（ｗｈｉｓｐｙ）。ＯＰ−１処置欠損では、巨大な特定のコラーゲンと共により多くの組織が存在した。細胞応答は、ＯＰ−１群でより高いようであった（図６および７を参照のこと）。１２週目まで、ほとんどのコントロール欠損は空のままであった。細胞活性は、欠損周囲に認められなかった。ＯＰ−１処置欠損は依然としてコラーゲン粒子を含んでいたが、欠損周囲の細胞性は増加し、新規の組織形成にいくらか進行しているようであった（図８を参照のこと）。２５週目に、いくつかのコントロール動物で線維の架橋が認められたが、これのほとんどが事実上わずかであった。ＯＰ−１群で欠損から消滅したコラーゲン粒子は、主に線維組織に置換された。再造形は、活性なままのようであった（図９を参照のこと）。
【０１３６】
半月板縦裂修復におけるＯＰ−１パテの効果についての予備段階の結果は、決定的ではなかった。コントロール群と比較した場合に、ＯＰ−１で処置した病変からわずかな相違しか認められなかった。これは、縫合によって適切に固定されず、縫合によってタンパク質が十分に一体化しないという事実に起因し得る。いくつかのＯＰ−１処置動物では、欠損の架橋が認められた（図１０を参照のこと）。
【０１３７】
実施例７：椎間板の修復および再生のヒツジモデル
ヒツジにおける制御された外側の環状欠損の実験的誘導により、ヒトにおける椎間板再生が病理学的および生化学的に密接に再生される一連の事象が開始される。組成の変化には、病変部位の細胞によって合成されるコラーゲンの量および型の変動（Ｋａａｐａら  １９９４ａ，ｂ，１９９５  Ｋａａｐａ  Ｅ．ら（１９９５）Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｙｐｅｓ  Ｉ，ＩＩＩ，ＩＶ，ａｎｄ  ＶＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎｓ  ｉｎ  ａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｄｉｓｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，Ｓｐｉｎｅ  ２０，５９−６７；Ｋａａｐａ  Ｅら（１９９４）Ｃｏｌｌａｇｅｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｊｕｒｅｄ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．１２．９３−１０２；ａｎｄ  Ｋａａｐａ  Ｅら（１９９４）Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ  ｉｎｊｕｒｅｄ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｋ，Ｊ．Ｓｐｉｎ．Ｄｉｓ．７，２９６−３０６）、巨大な高浮遊密度アグリカン型プロテオグリカンの喪失および損傷椎間板中の小ＤＳ置換プロテオグリカンであるデコリンレベルおよびバイグリカンレベルの評価（Ｍｅｌｒｏｓｅ  Ｊ．ら（１９９２）Ａ  ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｂｙ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｄａｍａｇｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｎｎｕｌｕｓ  ｆｉｂｒｏｓｕｓ，Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ  １０：６６５−６７６；Ｍｅｌｒｏｓｅ  Ｊ．ら（１９９７）Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ａｇｇｒｅｃａｎ  ｉｎ  ａｎ  ｏｖｉｎｅ  ａｎｎｕｌａｒ  ｌｅｓｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｄｉｓｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｊ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｄｉｓｏｒｄ  １０：５５−６７；およびＭｅｌｒｏｓｅ  Ｊ．ら（１９９７）Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｉｇｌｙｃａｎ  ａｎｄ  ｄｅｃｏｒｉｎ  ｉｎ  ａｎ  ｏｖｉｎｅ  ａｎｎｕｌａｒ  ｌｅｓｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｄｉｓｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，Ｅｕｒ  Ｓｐｉｎｅ  Ｊ  ６：３７６−８４）が含まれる。椎間板変性の結果としての軟骨終板（ＣＥＰ）への血管供給の変化（Ｍｏｏｒｅ  ＲＪら（１９９２）Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｅｎｄｐｌａｔｅ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｔｙ  ａｆｔｅｒ  ａｎ  ｏｕｔｅｒ  ａｎｕｌｕｓ  ｔｅａｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｈｅｅｐ，Ｓｐｉｎｅ  １７：８７４−８７８）および実験環状欠損に隣接する椎骨の再造形の変化（Ｍｏｏｒｅ  ＲＪ，ら（１９９６）Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｂｏｎｅ  ａｆｔｅｒ．ｏｕｔｅｒ  ａｎｕｌａｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｓｈｅｅｐ，Ｓｐｉｎｅ  ２１：９３６−９４０．）、「修復された」病変罹患椎間板の生体力学的能力の変化（Ｌａｔｈａｍ  ＪＭら（１９９４）Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ａｎｎｕｌａｒ  ｔｅａｒｓ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏ��，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｍｅｃｈ  ９：２１１−９）、ならびに脊髄椎間関節の変形性関節症への変化（Ｍｏｏｒｅ  ＲＪら（１９９９）Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆａｃｅｔ  ｊｏｉｎｔｓ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ａｎｕｌａｒ  ｒｉｍ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｈｅｅｐ  ｌｕｍｂａｒ  ｄｉｓｃｓ，Ｓｐｉｎｅ，２４：５１９−５２５）も留意した。
【０１３８】
Ａ．ヒツジ輪状病変モデル
手術の２４時間前にヒツジを絶食させ、１ｇのチオペントンの静脈内注射によって麻酔する。正常な腰椎の生体構造を検証するために、側方単純Ｘ線写真を撮影する。２．５％ハロタンによる気管内挿管後に全身麻酔が維持され、パルス酸素測定および呼吸終期ＣＯ２測定によってモニタリングした。滅菌手術のために肋骨から腸骨稜までの左側腹部を準備する。ヒツジに１２００ｍｇのペニシリンを筋肉内注射する。脊椎の横突起の直前の左側の皮膚を切開し、前筋分割技術を使用した鈍的切開によって腰椎を露呈させる。血管および神経の生体構造を重視し、必要に応じて直接的な圧迫または電気焼灼器によって出血を制御する。
【０１３９】
１１番外科用メスを使用した頭側の終板（ｃｒａｎｉａｌ  ｅｎｄｐｌａｔｅ）と平行し、且つ隣接した左前外側線維輪を通した切開によって、全部で１２匹の２歳のヒツジのＬ１−Ｌ２、Ｌ３−Ｌ４、およびＬ５−Ｌ６の椎間板に制御された輪状病変を作製して長さ４ｍｍ×深さ５ｍｍの病変を作製する。介在する腰椎（Ｌ２−Ｌ３、Ｌ４−Ｌ５）は切開しない。
【０１４０】
切開した椎間板に以下の３つの処置のうちの１つを行う：（Ｉ）処置なし、（ＩＩ）ラクトース溶液、または（ＩＩＩ）ＯＰ−１含有ラクトース。全ヒツジにおいて、Ｌ３−Ｌ４椎間板に輪状病変を負わせ、処置を行わない。４匹のヒツジでは、Ｌ１−Ｌ２椎間板を、ラクトース溶液のみで処置し、Ｌ５−Ｌ６椎間板をラクトース＋ＯＰ−１で処置する。残りの４匹のヒツジでは、脊髄レベルに関連するいかなる潜在的な結果の偏りも回避するために、Ｌ１−Ｌ２およびＬ５−Ｌ６椎間板の処置を逆にする。非操作椎間板は、その後の力学的試験においてＦＳＵが適切に固定されるように処置椎間板の間に留まらなければならない（以下を参照のこと）。その後のＸ線での同定および形態学的同定のために、針金縫合を使用して、頭側操作レベルを同定する。これらのさらなる非操作動物を、生体力学研究のためのコントロールとしても使用する。
【０１４１】
ヒツジにおける輪状切開後の変性は十分に確立されており（Ｏｓｔｉ  ＯＬら（１９９０）Ｖｏｌｖｏ  Ａｗａｒｄ  ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｎｕｌｕｓ  ｔｅａｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ａｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ，Ｓｐｉｎｅ  １５：７６２−７）、１２週間後に最も早いＸ線写真および組織化学による証拠が示されると予想することができる。輪状病変の誘導から３ヶ月後に、ヒツジを６．５ｇペントバルビタールナトリムの静脈内注射によって屠殺し、腰椎のＸ線写真を撮影して椎間板の石灰化を評価し、生体力学的分析（ｎ＝８）および組織化学的分析（ｎ＝４）のために切開および処理し、生体力学試験後、この椎間板を組成分析のために帯状に切開する。
【０１４２】
Ｂ．椎間板組織の組成分析
図１１に示すように、椎間板組織を、四分円および髄核に帯状に切開する。
【０１４３】
Ｃ．椎間板組織のプロテオグリカンおよびコラーゲン含有量の決定
線維輪および髄核のサンプルを、氷上で細かく刻み、既知の湿重量の各組織帯の代表的な部分を一定重量まで凍結乾燥させる。組織の出発重量と最終重量との間の差により、その含水量が得られる。３連の部分（１〜２ｍｇ）の乾燥組織を、６Ｍ  ＨＣｌにて１１０℃で１６時間水和し、中和水和物のアリコートを、組織コラーゲン含有量の基準としてヒドロキシプロリンについてアッセイする（Ｍｅｌｒｏｓｅ  Ｊら（１９９２）Ａ  ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｂｙ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｄａｍａｇｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｎｎｕｌｕｓ  ｆｉｂｒｏｓｕｓ，Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ  １０：６６５−６７６；Ｍｅｌｒｏｓｅ  Ｊら（１９９４ａ）Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｏｒｍａｌ  ａｄｕｌｔ  ｏｖｉｎｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ，Ｍａｔｒｉｘ  １４：６１−７５；Ｍｅｌｒｏｓｅ  Ｊら（１９９４ｂ）Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｖｉｎｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｗｉｔｈ  ｓｐｉｎａｌ  ｌｅｖｅｌ  ａｎｄ  ｉｎ  ｉｔｓ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ，Ｖｅｔ  Ｃｏｍｐ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｔｒａｕｍ  ７：７０−７６；Ｍｅｌｒｏｓｅ  Ｊら（１９９１）Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｃｏｌｉｏｓｉｓ  ａｎｄ  ａｇｅｉｎｇ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ  ９：６８−７７；ａｎｄ  Ｍｅｌｒｏｓｅ  Ｊら（１９９６）Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｃｈｅｍｏｎｕｃｌｅｏｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｙｍｏｐａｐａｉｎ  ｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｄｏｓａｇｅ：ａｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｂｅａｇｌｅ  ｄｏｇｓ  Ｓｐｉｎｅ  ２１：９−１７）。乾燥組織の３連の部分（約２ｍｇ）を、パパインでも消化し、可溶化組織のアリコートを、異染色素である１，９−ジメチルメチレンブルーを使用して、組織プロテオグリカンの基準として硫酸化グリコサミノグリカンについてアッセイする（Ｍｅｌｒｏｓｅら  １９９１，１９９２，１９９４，１９９６，前出を参照のこと）。
【０１４４】
Ｄ．組織化学的分析および免疫組織化学的分析
組織化学的分析のために指定された脊髄運動セグメントを、骨用ノコギリ（ｂｏｎｅ  ｓａｗ）を使用した軟骨終板付近の頭蓋椎体および尾椎体を通した切断によって単離する。隣接する椎体セグメントを含む椎間板検体の全体を、１０％中性緩衝化ホルマリンまたはＨｉｓｔｏｃｈｏｉｃｅ（登録商標）のいずれかで５６時間ひとまとめに固定し、Ｆａｘｉｔｒｏｎ  ＨＰ４３８５５Ａ  Ｘ線キャビネット（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ，ＭｃＭｉｎｎｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）を使用して完全な脱灰が確認されるまで、１０％蟻酸を含む５％ＮＢＦを振とうしながら２週間に数回交換して脱灰する。
【０１４５】
脱灰椎間板−椎体検体の矢状スライス（厚さ５ｍｍ）を、標準的な組織学的方法によってエタノール溶液で段階的に脱水し、パラフィンワックス中に包埋する。組織化学的染色のために厚さ４μｍのパラフィン切片を調製し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ  ｇｌａｓｓ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ｓｌｉｄｅｓ（Ｍｅｎｚｅｌ−Ｇｌａｓｅｒ）上にマウントし、８５℃で３０分間乾燥させ、その後５５℃で一晩乾燥させる。切片を、キシレン中で脱パラフィンし（４回交換×２分）、段階的なエタノール洗浄（１００〜７０％ｖ／ｖ）によって再水和する。
【０１４６】
全ブロック由来の３つの切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。これらの切片を符号化し、切開のみを行った輪状切開レベルと切開してｒｈＯＰ−１を投与した輪状切開レベルとの組織学的特長を比較する独立した組織病理学者が試験する。４点半定量的等級付けシステムを使用して、微視的特長を評価する。偏光顕微鏡法を使用して、マッソン三色染色法およびピクリン酸−シリウスレッドで染色した切片中のコラーゲンの構造も試験する。
【０１４７】
以前に記載のＳｅｑｕｅｎｚａカセットおよび使い捨てのＣｏｖｅｒｐｌａｔｅ免疫染色システムを使用して、免疫組織化学的手順を行う（Ｍｅｌｒｏｓｅ  Ｊら（２００２）Ｐｅｒｌｅｃａｎ，ｔｈｅ  Ｍｕｌｔｉ−ｄｏｍａｉｎ  Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｏｆ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｉｓ  ａｌｓｏ  ａ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ  Ｐｅｒｉｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ  Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｏｆ  Ｏｖｉｎｅ  Ｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｐｌａｔｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｉｌａｇｉｎｏｕｓ  Ｅｎｄ  Ｐｌａｔｅ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１８，２６９−２８０；Ｍｅｌｒｏｓｅ  Ｊら（２００２）Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｎｅｒｖｅ  ａｎｄ  ｂｌｏｏｄ−ｖｅｓｓｅｌ  ｉｎ−ｇｒｏｗｔｈ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ｏｖｉｎｅ  ａｎｎｕｌａｒ  ｌｅｓｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｄｉｓｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，Ｓｐｉｎｅ  ２７，１２７８−８５；Ｍｅｌｒｏｓｅ  Ｊら（２００２）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｃｅｌｌｓ，ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ａｎｄ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ  ａｎｄ  ａｌｇｉｎａｔｅ  ｂｅａｄ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｅｕｒ．Ｓｐｉｎｅ  Ｊ．１２，５７−６５；Ｍｅｌｒｏｓｅ  Ｊら（２００１）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｏｖｉｎｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｃｅｌｌｓ  ｇｒｏｗｎ  ｉｎ  ａｌｇｉｎａｔｅ  ｂｅａｄｓ，Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ  １６８：１３７−１４６；Ｍｅｌｒｏｓｅ  Ｊら（２００３）Ｐｅｒｌｅｃａｎ，ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉ  ｄｏｍａｉｎ  ＨＳ−ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｏｆ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｉｓ  ａ  ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｒｔｉｌａｇｉｎｏｕｓ  ｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｂｏｄｙ  ｒｕｄｉｍｅｎｔｓ，ｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｌａｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｌｕｍｎ，Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ５１：１３３１−１３４１；Ｍｅｌｒｏｓｅ  Ｊら（２０００）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｂｙ  ｏｖｉｎｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｃｅｌｌｓ  ｇｒｏｗｎ  ｉｎ  ａｌｇｉｎａｔｅ  ｂｅａｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｊ．Ａｎａｔ．１９７：１８９−１９８；Ｍｅｌｒｏｓｅ  Ｊら（２００２）Ｓｐａｔｉａｌ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ−（３，Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−２，Ｏｓｔｅｏｎｅｃｔｉｎ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ−Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ａｃｔｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｊｕｒｅｄ  Ａｎｎｕｌｕｓ  Ｆｉｂｒｏｓｕｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｒｅｐａｉｒ，Ｓｐｉｎｅ  ２７：１７５６−１７６４；ａｎｄ  Ｋｎｏｘ  Ｓら（２００２）Ｎｏｔ  ａｌｌ  ｐｅｒｌｅｃａｎｓ  ａｒｅ  ｃｒｅａｔｅｄ  ｅｑｕａｌ：ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−２（ＦＧＦ−２）ａｎｄ  ＦＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１４６５７−１４６６５）。内因性ペルオキシダーゼ活性を、組織切片の３％Ｈ２Ｏ２とのインキュベーションによって最初に遮断する。この後に、組織切片を、コンドロイチナーゼＡＢＣ（０．２５Ｕ／ｍｌ）を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐＨ８．０）（３７℃で１時間）とウシ精巣ヒアルロニダーゼ（１０００Ｕ／ｍｌ）（３７℃で１時間）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）との組み合わせで予備消化し、その後に、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ＴＢＳ）で３回洗浄して、またはプロテイナーゼ−Ｋ（ＤＡＫＯ  Ｓ３０２０）にて６分間室温で抗原エピトープを曝露する。次いで、組織を、２０％の正常なブタ血清中で１時間ブロッキングし、巨大および小さなプロテオグリカンおよびコラーゲンに対する多数の一次抗体で探索する（表５）。一次抗体を省略するか、目的の真の一次抗体を無関係のイソ型に適合する一次抗体と置換して負のコントロールの切片も処理する。西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ結合体化二次抗体を、０．０５％３，３’−ジアミノベンジジン二塩酸および０．０３％Ｈ２Ｏ２を含むＴＢＳまたはＮｏｖａ  ＲＥＤ基質を使用した検出のために使用する。染色したスライドを、明視野顕微鏡法によって試験し、Ｌｅｉｃａ  ＭＰＳ６０顕微鏡写真デジタルカメラシステムを使用して写真を撮影する。
【０１４８】
【表５】
2009517387.tif 000012
Ｅ．脊髄運動セグメントの生体力学的評価
種々の可動面（屈曲−伸展、横曲げ、圧迫、およびねじれ）における各椎単位（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｐｉｎａｌ  ｕｎｉｔ）（ＦＳＵ）について非破壊生体力学的可動域（ＲＯＭ）分析を行う。各ＦＳＵは、２つの隣接した脊髄（介在椎間板および関連する靭帯）を含む。
【０１４９】
ＣａｌｌａｇｈａｎおよびＭｃＧｉｌｌにおって開発されたジグ（ｊｉｇ）に基づいて特別にデザインされたジグにより、軸方向荷重が一定に維持しながら純粋なねじれおよび曲げモーメントが各ＦＳＵに適用される。この組み合わせ荷重は、脊椎がインビボで経験する生理学的荷重と酷似している。
【０１５０】
以下の４つのＦＳＵを試験する：非操作コントロールレベル、切開したレベル、切開してＯＰ−１およびキャリアで処置したレベル、ならびに切開してキャリアのみで処置したレベル。各ＦＳＵを、２つのアルミニウム合金カップに入れ、低温硬化歯科用セメントで固定する。椎間板がカップと確実に揃うように注意する。試験開始前に、再現可能な水和状態が選られるまで、各ＦＳＵに０．５ＭＰａの圧力を予め荷重する。これを、各試験前のベースラインとして使用する。予め荷重した０．５ＭＰａの圧力によって弛緩状態が刺激され、これは、脊髄内圧（ｉｎｔｒａｄｉｓｔａｌ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）のインビボ測定に基づく（Ｗｉｌｋｅ  Ｈ−Ｊら（１９９９）Ｎｅｗ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｐｒｅｓｓｕｒｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｉｎ  ｄａｉｌｙ  ｌｉｆｅ，Ｓｐｉｎｅ  ２４：７５５−６２）。±５Ｎｍのねじれ荷重および±１Ｎｍの屈曲伸展、横曲げ荷重を、０．５ＭＰａの軸方向荷重を一定に保ちながら１０サイクルにわたり加える。ＩＶＤの軸圧縮応答を調査するために、周期的（ｃｙｃｌｉｃ）軸方向荷重（１０サイクルにわたり０〜１０００Ｎ）を加える。
【０１５１】
Ｆ．パイロット研究
実験技術を検証するために、ヒツジおよびカンガルーの脊髄についてパイロット研究を完了した。図１２は、１０回の屈曲伸展荷重サイクルにおけるヒツジＦＳＵの典型的な「トルク対回転」プロットを示す。２つのプロットは、関節周囲の前輪状縁（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ａｎｎｕｌａｒ  ｒｉｍ）病変前後のＦＳＵを示す。輪状の切断により伸展中の可動域（ＲＯＭ）が増加する一方で、屈曲ＲＯＭには影響がないことが認められる。このＲＯＭの増加全体は、脊髄の不安定度の増加を示す。別の所見は、荷重サイクルの高い反復性であり、これにより、試験設定の再現性が実証される。
【０１５２】
データ分析には、５回目の荷重サイクル中の細長い領域の剛性、ヒステリシス、および歪みエネルギー、および中立帯範囲が含まれる。非操作領域由来のデータを、ＯＰ−１を使用するか使用しない切開レベルと比較し、各生体力学パラメーターについて反復測定一元配置分散分析を行う。
【０１５３】
実施例８：ヤギモデルにおける軟骨および微小骨折処置軟骨欠損に対するＯＰ−１の効果
本研究は、ヤギモデルにおける微小骨折手順によって誘導された修復組織の量および組成に対するＯＰ−１の効果を評価する。体重が約２５ｋｇの全部で２４匹の成体雄ヤギ（１．５〜３歳）を使用する。手術前に、膝関節を、変性関節欠損または他の顕著な整形外科上の問題を有する動物を排除するためにレントゲン写真で試験する。全動物の右膝の滑車溝（後膝関節）中に１つの（一辺が）８ｍｍの正方形の軟骨欠損（石灰化軟骨層の最高到達点（ｔｉｄｅｍａｒｋ）に至るまで軟骨を除去する）を作製する。これらのヤギのうちの１２匹で、この軟骨欠損を質部位として使用する（ＩＡ群およびＩＢ群）（以下の表４を参照のこと）。次いで、１２匹の動物の右膝関節に微小骨折処置を行う（ＩＩＡ群およびＩＩＢ群）。直径約１ｍｍのピックを使用して１６個の微小骨折孔を作製する。
【０１５４】
操作直後に、生理食塩水で水和した約０．３ｍｌのＯＰ−１パテ（コラーゲン＋ＣＭＣ）を、関節の滑液内に注射する。７日目に、第２の注射を行う。軟骨欠損群（ＩＢ）の６匹の動物および微小骨折群（ＩＩＢ）の６匹の動物に、ビヒクルのみを送達させる。
【０１５５】
【表６】
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術後１６週目に全動物を屠殺する。全部位を、組織形態計測による評価のために準備する。各欠損の中央部分由来の１つの組織学的切片を評価する。元の軟骨欠損領域を満たす特定の組織型（関節軟骨、硝子軟骨、線維軟骨、および線維組織）の全領域および比率を、顕微鏡の接眼レンズのグリッドを使用して決定する。組織型についての十分に許容された組織学的基準を使用する（例えば、Ｗａｎｇ  Ｑ．，ら，Ｈｅａｌｉｎｇ  ｏｆ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｃａｎｉｎｅ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ：ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｖａｓｃｕｌａｒ  ａｌｐｈａ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ，Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ．８，ｐｐ．１４５−１５８（２０００）；Ｂｒｅｉｎａｎ  ＨＡ，ら，Ｈｅａｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃａｎｉｎｅ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｉｃｒｏｆｒａｃｔｕｒｅ，ａ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｍａｔｒｉｘ，ｏｒ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．１８，ｐｐ．７８１−７８９（２０００）；およびＢｒｅｉｎａｎ，ＨＡ，ら，Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｏｎ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｃｈｏｎｄｒａｌ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ａ  ｃａｎｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．７９Ａ，ｐｐ．１４３９−１４５１（１９９７）を参照のこと）。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】図１は、両側衝撃損傷部位を示す関節の略図である。
【図２】図２は、ＯＰ−１処置動物およびコントロール動物についての滑液中の白血球数を示すグラフである。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、コントロールおよびＯＰ−１処置関節の組織学的切片である。
【図４】図４は、ＯＰ−１処置動物およびコントロール動物についての大腿骨内顆軟骨中のｓＧＡＧレベルを示すグラフである。
【図５】図５は、変形性関節症モデルにおけるコントロールおよびＯＰ−１処置ヒツジの代表的な結果を示す。コントロールヒツジを、コラーゲンのみで処置した。ＯＰ−１処置ヒツジに３５０μｇのＯＰ−１パテを手術時に投与し、１週間後の関節腔への注射によって第２の投与を行った。
【図６】図６は、ＯＰ−１パテでの処置から６週間後の孔の組織学的切片である。
【図７】図７は、６週間のコントロール欠損の孔の組織学的切片である。
【図８】図８は、１２週間のコントロール欠損の孔の組織学的切片である。
【図９】図９は、ＯＰ−１パテでの処置から１２週間後の孔の組織学的切片である。
【図１０】図１０は、ＯＰ−１パテでの処置から６週間後の半月板裂傷の組織学的切片である。
【図１１】図１１は、線維輪（ＡＦ）四分円および髄核（ＮＰ）に半月板を分離するための帯状解剖（ｚｏｎａｌ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）スキームならびにヒツジ腰椎椎間板の水平断面および垂直断面における四分円１中の前外側輪状病変の位置および範囲を示す。術後３ヶ月および６ヶ月の水平断面中のＡＦ病変の位置は、この図の左側に十分に詳細に図解している。椎間板および隣接する椎体ならびに上脊椎成長板および下脊椎成長板を通過する組織学的垂直断面も、外側のＡＦのコラーゲンの変化（マッソン三色染色法）に関連するＡＦ病変（矢印）の限局的性質ならびに半月板に約４ｍｍ透過する病変部位中のコラーゲン性組織化（ピクロシリウスレッド）およびプロテオグリカンの限局的枯渇（トルイジンブルー）を示す（図の右側）。
【図１２】図１２は、インタクトおよび損傷した（前輪状病変）ヒツジ椎単位（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｐｉｎａｌ  ｕｎｉｔ）（ＦＳＵ）についての屈曲伸展ＲＯＭプロットを示す。
【図１３】図１３は、ヒトＯＰ−１のアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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