(57)【要約】  活性型凝固第Ｘ因子（ＦＸａ）刺激因子は、被験体における出血の治療に用いることができる。健康な被験体または出血性素因を有する患者における出血の局所治療に特に有用な化合物および組み合わせが開示される。
2009503008.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における出血の局所治療のための薬剤の製造における、脂質化組織因子（ＴＦ）またはその機能的断片の使用。
【請求項２】
被験体が健康な被験体または出血性素因がある被験体であり、前記出血性素因が血液凝固障害および／または血小板障害を含むものである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
血液凝固障害が先天性血液凝固障害または後天性血液凝固障害である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
先天性血液凝固障害が、凝固第Ｖ因子、凝固第ＶＩＩ因子、凝固第ＶＩＩＩ因子、凝固第ＩＸ因子、凝固第Ｘ因子、凝固第ＸＩ因子、凝固第ＸＩＩ因子、凝固第ＸＩＩＩ因子およびそれらの組み合わせから選択される凝固因子の欠乏に基づく血液凝固障害である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
先天性血液凝固障害が、凝固第Ｖ因子から選択される凝固因子の欠乏に基づく血液凝固障害である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
先天性血液凝固障害が、凝固第ＶＩＩ因子から選択される凝固因子の欠乏に基づく血液凝固障害である、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
先天性血液凝固障害が、凝固第Ｘ因子から選択される凝固因子の欠乏に基づく血液凝固障害である、請求項４に記載の使用。
【請求項８】
被験体が、抗凝固剤による抗凝固剤治療によって引き起こされる後天性血液凝固障害を有する、請求項２に記載の使用。
【請求項９】
抗凝固剤が、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ワルファリン、クマリン誘導体またはジクマリンである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
被験体が、先天性または後天性の血小板障害を有する、請求項２に記載の使用。
【請求項１１】
先天性血小板障害が、Ｇｌａｎｚｍａｎｎ病、ベルナール-スーリエ症候群、Ｂｏｌｉｎ−Ｊａｍｉｅｓｏｎ症候群、ウィスコット−アルドリッチ症候群、Ｐａｒｉｓ−Ｔｒｏｕｓｓｅａｕ−Ｊａｃｏｂｓｅｎ症候群、Ｘ染色体の血小板減少症、灰色血小板症候群、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ症候群およびファンコーニ貧血から選択されるものである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
後天性血小板障害が、血小板血症、多血症または慢性骨髄性白血病などの骨髄増殖性疾患；骨髄様化生；壊血病、先天性心臓病、および肝硬変におけるタンパク異常血症から選択されるものである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
脂質化ＴＦが脂質化されたヒトＴＦである、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
（ｉ）脂質化ＴＦおよび（ｉｉ）活性型凝固第Ｘ因子（ＦＸａ）を含んでなる、製品。
【請求項１５】
（ｉ）脂質化ＴＦおよび（ｉｉ）活性型ＦＸａを別々に含んでなる、製品。
【請求項１６】
（ｉ）脂質化ＴＦおよび（ｉｉ）ＦＸａを、被験体への同時または連続投与のための組み合わせとして別々に含んでなる、製品。
【請求項１７】
（ｉ）脂質化ＴＦおよび（ｉｉ）負に荷電した無機表面（ＮＣＩＳ）を含んでなる、製品。
【請求項１８】
（ｉ）脂質化ＴＦおよび（ｉｉ）ＮＣＩＳを別々に含んでなる、製品。
【請求項１９】
（ｉ）脂質化ＴＦおよび（ｉｉ）ＮＣＩＳを、被験体への同時または連続投与のための組み合わせとして別々に含んでなる、製品。
【請求項２０】
（ｉ）脂質化ＴＦ、（ｉｉ）ＦＸａおよび（ｉｉｉ）ＮＣＩＳを含んでなる、製品。
【請求項２１】
（ｉ）脂質化ＴＦ、（ｉｉ）ＦＸａおよび（ｉｉｉ）ＮＣＩＳを別々に含んでなる、製品。
【請求項２２】
（ｉ）脂質化ＴＦ、（ｉｉ）ＦＸａおよび（ｉｉｉ）ＮＣＩＳを、被験体への同時または連続投与のための組み合わせとして別々に含んでなる、製品。
【請求項２３】
脂質化ＴＦが脂質化されたヒトＴＦである、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の製品。
【請求項２４】
薬剤としての、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の製品。
【請求項２５】
被験体における出血の治療のための薬剤の製造における、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の製品の使用。
【請求項２６】
被験体における出血の局所治療のための薬剤の製造における、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の製品の使用。
【請求項２７】
脂質化ＴＦおよびＦＸａを含んでなる、複合体（ＴＦ：：ＦＸａ）。
【請求項２８】
薬剤としての、請求項２７に記載の複合体。
【請求項２９】
被験体における出血の治療のための薬剤の製造における、請求項２７に記載の複合体の使用。
【請求項３０】
被験体における出血の局所治療のための薬剤の製造における、請求項２７に記載の複合体の使用。
【請求項３１】
脂質化ＴＦおよびＮＣＩＳを含んでなる、複合体ＴＦ：：ＮＣＩＳ。
【請求項３２】
薬剤としての、請求項３０に記載の複合体。
【請求項３３】
被験体における出血の治療のための薬剤の製造における、請求項３１に記載の複合体の使用。
【請求項３４】
被験体における出血の局所治療のための薬剤の製造における、請求項３１に記載の複合体の使用。
【請求項３５】
脂質化ＴＦ、ＦＸａおよびＮＣＩＳを含んでなる、複合体ＴＦ：：ＦＸａ：：ＮＣＩＳ。
【請求項３６】
薬剤としての、請求項３５に記載の複合体。
【請求項３７】
被験体における出血の治療のための薬剤の製造における、請求項３５に記載の複合体の使用。
【請求項３８】
被験体における出血の局所治療のための薬剤の製造における、請求項３５に記載の複合体の使用。
【請求項３９】
脂質化ＴＦを医薬的に許容可能なベヒクルと共に含んでなる、医薬組成物。
【請求項４０】
脂質化ＴＦの局所投与のための医薬組成物であって、脂質化ＴＦおよび該脂質化ＴＦの局所投与に適した医薬的に許容可能なベヒクルを含んでなる、医薬組成物。
【請求項４１】
ａ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項１４に記載の製品；または
ｂ）別々に、（ｉ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に脂質化ＴＦ、および（ｉｉ）医薬的に許容可能なベヒクルと共にＦＸａ；または
ｃ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項１７に記載の製品；または
ｄ）別々に、（ｉ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に脂質化ＴＦ、および（ｉｉ）医薬的に許容可能なベヒクルと共にＮＣＩＳ；または
ｅ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項２０に記載の製品；または
ｆ）別々に、（ｉ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に脂質化ＴＦ、（ｉｉ）医薬的に許容可能なベヒクルと共にＦＸａ、および（ｉｉｉ）医薬的に許容可能なベヒクルと共にＮＣＩＳ；または
ｇ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項２７に記載のＴＦ：：ＦＸａ複合体；または
ｈ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項３１に記載のＴＦ：：ＮＣＩＳ複合体；または
ｉ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項３５に記載のＴＦ：：ＦＸａ：：ＮＣＩＳ複合体
を含んでなる、医薬組成物。
【請求項４２】
局所投与のための医薬的投与形態である、請求項４１に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の医薬組成物、および支持体を含んでなる、製品。
【請求項４４】
医薬組成物を含む製品であって、
（ｉ）支持体、（ｉｉ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項１４に記載の製品、（ｉｉｉ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項１７に記載の製品、および（ｉｖ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項２０に記載の製品；または
医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項２７に記載のＴＦ：：ＦＸａ複合体；または
医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項３０に記載のＴＦ：：ＮＣＩＳ複合体；または
医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項３４に記載のＴＦ：：ＦＸａ：：ＮＣＩＳ複合体
を含んでなる、製品。
【請求項４５】
凝固第ＶＩＩ因子欠乏症の被験体における出血の治療のための薬剤の製造のための、非脂質化ＴＦまたはその機能的断片の使用。
【請求項４６】
非脂質化ＴＦまたはその断片の非経口投与のための薬剤の製造における、請求項４５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、被験体における出血のＦＸａ刺激因子の使用による局所治療に関する。本発明は、脂質化組織因子（ＴＦ）が可溶性およびプロトロンビナーゼ複合体結合性の両方の形のＦＸａの全てのタンパク質分解活性（アミド分解活性およびプロトロンビン加水分解活性）を刺激する新しい調節の役割を果たすという発見に基づく。
【０００２】
背景技術
１．凝固の生理学
止血は出血に対する生物の機能であり、傷害後に直ちに作動して長期間活性であり続ける二つの過程が関与する。一つ目は一次止血として知られ、血管病変部位での血管収縮および血小板凝集形成の発生によって特徴づけられる。二つ目は二次止血として知られ、様々な凝固カスケードのタンパク質分解酵素の作用によりフィブリン塊が形成されるフェーズである。
【０００３】
血小板凝集は、毛細血管の止血において重要な役割を果たし、特に皮膚粘膜出血に関連している。これに対し、フィブリン塊形成は大血管の止血においてはるかに重要であり、内出血（胃腸、脳など）にさらに関連している。次のフェーズはフィブリン塊形成中に認められる：（ｉ）傷害によって露出された内皮表面への血小板の接着、（ｉｉ）血小板の活性化に対する反応としての血小板の粒状の内容物の放出、（ｉｉｉ）続いて生じる、隔離および更なる血小板の集合を伴う傷害部位での血小板凝集、ならびに（ｉｖ）プレートが融合して固まり、ひいては止血塊安定化を可能にする、トロンビン生成およびフィブリン塊形成のためのフィブリノゲンならびにその他の凝固タンパク質の血小板表面への結合。さらに、フィブリン塊形成には血小板数が重要であり、１μＬあたり２０，０００未満の血小板数は重度の出血症状を伴うことがよく知られている。
【０００４】
いずれも凝固因子と呼ばれるいくつかの補因子およびタンパク質分解酵素が血液凝固プロセスの第二のフェーズに関与しており、また、このプロセスはトロンビンの作用によるフィブリノゲンの加水分解からフィブリン形成で終わるいくつかのフェーズからなる。さらに、トロンビン生成は、更なる血小板の活性化および凝集の増進により血小板凝集を強化する。トロンビンは、アポ酵素であるプロトロンビンのタンパク質加水分解によって予め形成される。このタンパク質分解は、活性型血小板表面に結合するセリンプロテアーゼＦＸａによってＦＸａの補因子である活性型凝固第Ｖ因子（ＦＶａ）およびカルシウムイオンの存在下でのみ行われ、このセリンプロテアーゼは、プロトロンビンを加水分解することができる。ＦＸａは、内因性経路および外因性経路の２つの別々の経路で生じ得る。
【０００５】
内因性経路は、主に凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、凝固第ＸＩ因子（ＦＸＩ）が関与し、各プロ酵素が加水分解されて活性型プロテアーゼ（ＦＶＩＩＩａ、ＦＩＸａおよびＦＸＩａ）が生じる一連の反応からなる。各段階において、直前に形成されたタンパク質分解酵素がその後のプロ酵素の活性化を触媒し、連続的に活性型を生じる。従って、内因性経路に関わる様々な凝固因子の活性化はカスケードに従って行われ、内因性経路のいかなるタンパク質の欠乏もその後の段階の活性化を阻害し、凝血塊形成を妨げて出血傾向を強める。例えばＦＶＩＩＩ、ＦＩＸまたはＦＸＩといった様々な凝固因子の欠乏は、それぞれ血友病Ａ、Ｂ、およびＣのような重度の出血症候群を引き起こす。
【０００６】
血液凝固の外因性経路において、損傷部位の外膜細胞に触れたＴＦは、ＦＸが活性化されるように、基質として作用するようカルシウムの存在下で血中の凝固第ＶＩＩ因子／活性型凝固第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ）に結合して、ＴＦ：：ＦＶＩＩａ複合体を形成する際に活性化される。外因性経路は、現在、血液凝固に最も関連する経路であると考えられており、血管傷害による出血によって生じた事象において、凝固はＴＦとそのリガンドであるＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａとの相互作用を伴う外因性経路の活性化により誘発されると一般に認められている。
【０００７】
凝固においてＴＦ：：ＦＶＩＩａ複合体に与えられた別の役割は、ＦＶＩＩａによりＦＸ活性化が行われるように、基質として作用することである。その結果、最初はフィブリン塊形成を生じるには不十分であるＦＸａの基礎濃度（＜１５０ｐＭ）が上昇する。補因子ＦＶａの存在下でのＦＸａ基礎濃度の細胞の凝固促進表面での上昇は、フィブリン塊形成に必要なトロンビン生成を可能にする。一旦活性化されると、血小板は血液凝固に重要な役割を果たすことが一般的に認められている。血小板は、アニオン性リン脂質に富むプロ凝血促進表面を与える一方で、内部に貯蔵されたＦＶａ因子およびＦＸａ因子を露出させる。これら全ては、よく知られたプロトロンビナーゼ複合体（ＦＸａ、ＦＶａ、プロトロンビン、およびアニオン性凝血促進血小板リン脂質表面を含む）を形成する血小板の細胞膜表面上で凝固に関わる様々な因子の正確な会合を可能にする。
【０００８】
外因性経路活性化の理論によれば、ＴＦ：：ＦＶｌｌａ複合体に起因する役割を通じて、どのように凝固が開始されるかを説明することができる。血液凝固プロセスにおけるＴＦ：：ＦＶｌｌａ複合体の生物学的関連を説明する一つの例は、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）症候群である。この臨床症状は、ＴＦの血管内放出に関連し、重篤な臨床症状（ショック、敗血症、心停止、大外傷、肝疾患、大手術、熱傷など）の過程で生じ得る。
【０００９】
明らかに、ＦＶＩＩａの先天的欠乏において生じるようなＦＶＩＩａが存在しない背景では、ＦＸが十分な濃度で活性化されないため、理論的に凝固は絶対に起こらず、その結果、出血症状が致命的になるはずである。ネズミのモデルでは、この理論、およびＦＶＩＩ欠乏が致命的であり、命に関わるいくつかの重度の出血が付随して生じることが確認されている。しかしこれまで、ヒトで述べられてきた先天性ＦＶＩＩ欠乏症は、必ずしも出血を伴わない。無症状で健康な個人に出血の合併症なしに生じる、ＦＶＩＩの完全な欠乏症の症例が報告されている。これら全ては、ヒトにおけるＦＶＩＩとは独立の他の凝固誘因メカニズムを示唆している。
【００１０】
ＴＦは、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａと特異的に結合するクラスＩＩサイトカイン受容体のスーパーファミリーに属する内在性膜糖タンパクであり、血液凝固の外因性経路において関連する役割を果たす。ＴＦに割り当てられた生理的な役割はよく知られており、一つはＦＶＩＩａに特異的な受容体であり、ＴＦ：：ＦＶＩＩａ複合体が形成された際にＦＸが活性化されるように基質として作用する。実際、通常は血管を外部から取り囲む外膜細胞表面に隔離されているＴＦは、血管損傷の後、血中に存在するＴＦのリガンドであるＦＶＩＩと接触して相互作用し、ＴＦ：：ＦＶＩＩ複合体を形成する。一旦この複合体が形成されると、ＦＶＩＩは自己活性化され、活性型のＦＶＩＩａが生じる。現在、ＴＦ：：ＦＶＩＩ複合体構造に関する詳細な情報がある。ＴＦとの相互作用に関与する主なＦＶＩＩ結合部位は、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）の第一ドメインに類似する第一ドメイン、およびプロテアーゼドメインに位置する。他方では、比較的関連が低い他の結合部位（４−カルボキシグルタミン酸リッチドメイン（Ｇｌａドメイン）および、第二のＥＧＦドメイン）が関与することも報告されている。ＴＦに存在する結合部位は、二つのタイプＩＩＩフィブロネクチンドメインおよび両ドメインの間の介在領域に位置する。
【００１１】
最近の研究により、ＴＦのリジン１６５残基およびリジン１６６残基がＦＸのＧｌａドメインと活性型と非活性型の両方で相互作用することが確認された。しかし、ＴＦ：：ＦＶＩＩａ複合体に関する情報とは対照的に、ＴＦのＦＸおよびＦＸａとの相互作用については殆ど知られていない。第一に、Ｌｙｓ（１６５および１６６）残基はＦＸ活性化の基質として作用することをデータが示唆している。一方、ＴＦはＦＶＩＩの活性化のためのＦＸａの補因子として作用できることが最近報告されている。つまり、ＦＶＩＩのＴＦへの結合は、ＦＶＩＩａ自己活性化およびＦＸ活性化を刺激する。ＴＦに結合したＦＸａはＦＶＩＩ活性化を刺激した後、ＦＶＩＩ活性化は同様にＦＸ活性化を高め、その結果として、プロトロンビン加水分解およびフィブリン塊形成を刺激する。
【００１２】
発明者らは、ＦＸａの補因子としてのＴＦの仮定された役割は、さらに一層関連しており、止血に重要であることを見出した。一般に認められるＦＶＩＩの膜受容体としてのＴＦの役割にも関わらず、発明者らは、ＴＦが強力なＦＸａ刺激因子でもあることを示した。ＴＦはＦＸａのタンパク質分解活性を顕著に強化するＦＸａの刺激因子として作用する。本明細書で用いられる「ＦＸａの刺激因子」は、可溶型ＦＸａおよびプロトロンビナーゼ複合体結合型ＦＸａなど、ＦＸａの全ての種類をいう。
【００１３】
ピコモル濃度のＦＸａは、よく知られた補因子ＦＶａ（表９参照）の存在下であっても、凝固に関する作用を引き起こせないことがよく知られている。従って、これらの条件下では、プロトロンビナーゼ複合体は活性ではない。驚くべきことに、ＴＦの存在下（すなわち、外傷または外因的投与）では、ピコモル濃度のＦＸａ（すなわち、生理的基礎濃度、または外因的に投与された）は、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａの非存在下でさえも、フィブリン塊形成を引き起こすプロトロンビンの加水分解を引き起こす（表７）。
【００１４】
本明細書において、発明者らは、ＴＦ：：ＦＸａ相互作用はＴＦ：：ＦＶＩＩａ複合体および外因性凝固経路から独立した凝固メカニズムの新規の誘因であることを説明する。
【００１５】
最後に、血小板凝集に障害があり、より強い出血症状の傾向を生じるある種の血小板疾患があることがよく知られており、そのうち、それぞれフィブリノゲン受容体またはＧｐ１ｂ受容体に影響する先天性欠損症であるＧｌａｎｚａｍｎｎ病およびベルナール-スーリエ症候群が顕著であることが開示されている。一方、血小板数が１μＬあたり２０，０００未満に減少すると、先天性および後天性血小板減少性疾患に重度の出血症状が存在する。
【００１６】
本明細書において、発明者らは、脂質化したＴＦが、先天的および後天的血小板疾患および重度の血小板減少性疾患（１μＬあたり９，０００未満）に存在する出血の治療にも効果的であることを実証した。
【００１７】
２．凝固の病理学
各凝固因子の先天的欠乏症は出血の出現と関連し、一般的に単一のタンパク質に関係している可能性があり、従って、例えば、血友病Ａは、ＦＶＩＩＩに影響を及ぼす遺伝的出血性疾患である。後天性血液凝固疾患は、出血の前歴がない個人に生じ、複数の原因がある可能性があり、説明として、凝固因子に対する特異的阻害因子の存在が多数の輸血を受けた個人に生じる可能性がある。後天性凝固因子欠損症は、重度の止血問題も引き起こす未知の病因存在であるが、これらは血液凝固障害がある患者が対象となる複数輸血における最も重要な問題の一つでもある。後天性血液凝固障害の別の重要な原因は、ヘパリンやワルファリン薬などの抗凝固治療である。抗凝固剤で治療された患者は顕著な割合（５−１０％）で出血症状を示し、これらの患者の多くは管理することが困難である。
【００１８】
前述のように、先天性および後天性血小板疾患も出血と関連し得る。血小板数の減少（１μＬあたり２０，０００未満）は、しばしば重度の出血症状を伴うフィブリン塊障害を引き起こす可能性がある。
【００１９】
軽度／中程度出血または（手術または外傷による）重症／致死的出血における現在利用可能な治療手段は非常に限られる。血液凝固を加速させ、出血を防止することができる様々な止血剤があり、例えば（１）血液凝固因子濃縮物、ならびに線維状コラーゲン、フィブリン接着剤、およびプロトロンビン複合体濃縮物といった局所止血剤などのヒト由来血液製剤；（２）ヒト組換えタンパク質；（３）アミノカプロン酸、トラネキサム酸などの抗線維素溶解薬；ならびに（４）シリカおよびカオリン表面などの無機局所止血剤がある。以下のような重大な制限が報告されている：
（１）静脈内投与であること
（２）投与のために特別な装置が必要
（３）治療の焦点の狭さ
（４）特定の出血症状に投与される不適切または煩雑な治療
（５）急性効果の欠如
（６）フィブリン塊の不安定さ
（７）非常に危険な副作用
（８）高価な治療。
【００２０】
ヒト由来血液製剤（凝固因子および血小板濃縮物）
常に静脈内投与されなければならない、高価で利用しにくい治療である。治療焦点が非常に狭く、特定の欠損症の治療のみに有用である。いずれの出血症状にも局所治療には不適当である。効果的であるためには長い投与プロトコルが必要なため、出血の急性治療には有用でなく、何よりも非常に危険な治療である。血友病患者の２０％が肝炎、５％がＨＩＶを患い、また１５％までがＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに対して血漿抗体を示し（後天性血友病）、特別で非常に高価な代替治療（免疫抑制剤、高用量の凝固因子、血漿交換）を必要とする。これらの理由から、公衆衛生機関（ＷＨＯ、ＦＤＡ、ＥＭＥＡなど）は、凝固因子濃縮物よりも良い新しい止血剤の開発に高い関心を寄せている。
【００２１】
局所止血剤
高価な治療であり、一部の出血症状（例えば、鼻血）における投与は不適当であり、歯科治療には煩雑であり、不安定なフィブリン塊を形成し、凝固因子濃縮物と同じ危険な副作用の可能性がある。ヒトウイルスの感染リスクの可能性があるため、ヒト由来血液製剤を投与されたことがない患者または組換えＦＶＩＩＩまたはＦＩＸによる治療を受けている患者には使用すべきでない。
【００２２】
ヒト組換えタンパク質
先進国のみで利用可能な最も高価な治療（平均コスト６，０００ユーロ）である。凝固因子濃縮物と同様に、常に静脈内投与されなければならず、特定の欠損症の治療のみに有用であるため、治療焦点が非常に狭く、局所治療には不適当であり、効果的であるためには長い投与プロトコルが必要なために出血の急性治療には有用でなく、また、ヒトウイルス感染は報告されていないものの、同じパーセンテージの後天性血友病が報告されている（１５％までが抗ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ抗体を示す）。凝固因子濃縮物と同様に、公的機関はその使用を大いに制限している。
【００２３】
抗線維素溶解薬
これらの薬剤は治療焦点が非常に狭く、これが最も重要な制限事項である。これらの薬剤は、過去のフィブリン塊形成が有効である必要がある。従って、健康な被験体のみに有用であるが、フィブリン塊の形成が不適当である場合（すなわち、ＦＶＩＩ欠損血友病などの先天性血液凝固障害）、治療効果は劇的に低下する。さらに、効果的であるためには長い投与プロトコルが必要なため、出血の急性治療には有用ではない。
【００２４】
無機局所止血剤
これらの止血剤の最も重要な使用制限は、鼻血、歯科、手術など、多くの種類の出血には投与が不適切であることである。さらに、痛みを伴う発熱反応が報告されており、危機的な状況（戦争）での皮膚粘膜出血に対してのみに使用され、著しくその使用が減っている。
【００２５】
結論として、驚くべきことに、単純な鼻血の症状または歯磨き後の歯肉や歯の出血、または単純な日常的な髭剃りが原因の傷による出血、採血における穿刺された血管による出血、または路上で誤って転んだ際の傷による出血などの局所治療に有用な利用可能な薬剤は現時点で皆無である。問題は、例えば、血友病タイプもしくはフォンヴィレブラント病の先天性血液凝固障害などの出血性素因を有する患者、またはＧｌａｎｚａｍｎｎ病タイプもしくはベルナール-スーリエ症候群の先天性血小板障害、または後天性血液凝固障害を有する患者の場合、さらに悪化する点である。これらの患者は日々の生活、単純な抜歯または出血の原因になる軽度の外傷において深刻な問題があり、彼らの生活の質を向上させるために利用可能な治療は無い。これらの患者が外傷または重度の出血事故を経験する場合には、彼らの生命は深刻な危機に瀕するので、問題は明らかにさらに大きくなる。これら全ての状況において、唯一利用可能な医薬ツールは、欠損する因子を含むヒト血漿または各凝固因子に特異的なヒト組換え因子の投与である。これら全ての治療は非経口経路を利用することを意味し、従って、例えば日常の軽いまたは中程度の出血といった場合に頻繁に使用するようには設計されていない。最後に、前述の制限がない新しい局所止血剤は、現在の治療を著しく改善し、コストと高罹患率の副作用の両方を減らすだろうと一般に広く考えられている。
【００２６】
３．発明の背景
これまでに、ＴＦは血液凝固の誘引に役割を果たす主要な因子であることが受け入れられている。凝固が開始されるには、プロトロンビン加水分解を開始するためにＦＸのＦＸａへの活性化が絶対に必要である。このＦＸａの供給源は、主にＦＶＩＩａとその受容体であるＴＦの相互作用によって生じる。ＦＸａは血小板顆粒内に存在し、血小板が活性化した際に表面に露出される可能性があると述べられてきたが、血中に存在するＦＸａの生理的濃度（＜１５０ｐＭ）は、補因子ＦＶａの存在下および血小板凝血促進表面の存在下でさえ、トロンビン形成を開始するには不十分である（図１）。従って、凝固はＦＸａの基礎濃度が著しく上昇した場合にのみ開始することができると現在一般に考えられている。ＦＸａ基礎濃度の上昇の原因は、常にＴＦ：：ＦＶｌｌａ複合体およびＦＩＸａのタンパク質分解活性の両方が原因であるとされている（図２）。
【００２７】
脂質化されたＴＦ組換えタンパク質は、インビトロ条件のみで健康な血液試料および血友病血液試料において凝固の加速を可能にしてきたが、この作用はＦＶＩＩａの受容体としてＴＦに割り当てられた古典的な役割によって生じるとされている。しかし、同じ実験条件で、非脂質化ＴＦが完全な作用の欠如を示し、このことは、脂質化がＴＦの機能の活性化を達成するために必要であることを示す（結果の６．１節）。
【００２８】
局所的な止血剤としての脂質化ＴＦの使用は、中程度、重度および致死的な出血（外傷性または手術での動脈出血および静脈出血）に対する単回治療としては、これまでに報告されたことはない。
【００２９】
欧州特許第２６６９９３号明細書には、出血症候群の非経口治療のための止血剤としての非脂質化ＴＦの使用が開示されている。しかし、同特許明細書には、欧州特許第２６６９９３号の対象とされた非脂質化ＴＦと本発明の対象である脂質化ＴＦの活性の間にある重要な違いが開示されている。
【００３０】
実際、脂質化ＴＦはインビトロ条件で活性であり、その非経口投与は致死的な結果をもたらす播種性血管内凝固症候群を直ちに開始することがよく知られている。対照的に、非脂質化ＴＦはインビトロ条件では活性ではないが、非経口投与による血液凝固障害の治療を目的として特許（欧州特許第２６６９９３号）の対象とされている。
【００３１】
今まで、出血症状の単回局所治療のための脂質化および非脂質化ＴＦ両方の作用に関するデータはない。本明細書では、発明者らは、尾切断ラットモデルを用いて、非脂質化ＴＦは出血を止めることができないことを示した。対照的に、発明者らは、脂質化ＴＦが、病的状態（ヘパリンおよびワルファリンで処理した動物）および健康な状態（凝固を変化させていない対照動物）を含む全ての種類の出血を局所的に治療する止血剤として有用であることを初めて示した。全体を通じて、脂質化および非脂質化ＴＦは明らかに異なる化合物であることを示す。従って、出血の単回局所治療のための薬剤としての脂質化ＴＦの利用は、当業者には明らかでない。
【００３２】
一方、欧州特許第２６６９９３号は、セリンプロテアーゼであるＦＶＩＩは、その受容体ＴＦと結合した場合にのみ活性化されると仮定する技術常識のもとでなされた。従って、欧州特許第２６６９９３号および技術常識に従うと、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａが存在しない場合、ＴＦは活性化されないはずである。ＴＦ（脂質化および非脂質化）がＦＶＩＩ欠損患者の治療に有効であり得ると考えることは、当業者には明らかでなかった。発明者らは、ＦＶＩＩａが存在しなくてもＴＦがＦＸａの補因子として作用することを見出した。この知見は、非脂質化ＴＦもまた、ＦＶＩＩ欠損患者の出血に対して非経口止血剤として作用できることを理解する上での基本である。
【００３３】
国際公開第９４／０２１７２号パンフレットには、一つの天然の抗凝固剤（抗体）の阻害剤の全身投与によって、一つ以上の天然の抗凝固剤による一時的な阻害が微小血管の出血を阻害できることが教示されている。場合により、該阻害剤は局所投与のトロンビンまたは脂質化ＴＦとの組み合わせで投与され得る。両方の化合物が単回処理としてではなく常に任意の補助療法としての使用である点に留意するのは重要である。さらに、国際公開第９４／０２１７２号では、これらの相乗的な治療の使用は毛細血管出血（微小血管出血、すなわち熱傷、炎症を起こした内臓表面、出血している肝臓表面など）についてのみ特許の対象とされており、手術または外傷により引き起こされた動脈および静脈の損傷を伴う重度または致死的な出血については特許の対象とされていない。しかし、国際公開第９４／０２１７２号の発明者らは、全身治療と組み合わせたトロンビンの局所的投与の際に相乗効果を観察したが、ＴＦの局所的投与の場合にはそのような相乗効果は観察されなかったと認めている（国際公開第９４／０２１７２号パンフレット、図３および第２２頁第１４〜１５行）。さらに、国際公開第９４／０２１７２号において特許の対象とされた用量は、０．１〜１０ｍｇと非常に高い範囲である。
【００３４】
国際公開第９４／０２１７２号パンフレットとは対照的に、本明細書では、治療が活性型タンパク質１．２μｇ／ｍｌの用量で外傷性出血に有効であるという例を示す、脂質化ＴＦ単独での軽度／中程度から重度／致死的な動脈または静脈出血の単回治療を特許の対象としている（表２４および２５の重症モデルを参照）。脂質化ＴＦがＦＸａタンパク質分解活性の刺激因子として作用することはどの当業者にとっても自明のことでなかったため、このような驚くべき、並はずれて効果的な治療はこれまで報告されていない。発明者らは、ＦＶＩＩａの不存在下で、ＴＦが、よく知られた補因子ＦＶａの不存在下でさえも、ＦＸａの補因子として作用することを見出した。この知見は、健康な状況および病的状況において脂質化ＴＦが単独で重度出血に対する止血剤として作用することができるということを理解するための基礎である。
【００３５】
米国特許第４，７２１，６１８号明細書には、静脈内投与したリン脂質（ＰＣＰＳ）および高濃度のＦＸａ（０．２〜０．５Ｕ／ｋｇ）の相乗的混合物は、血液凝固のカスケードプロセスが継続できるように血友病動物における第ＶＩＩＩ：Ｃ因子欠損をバイパスする可能性があると記載されている。示唆された高濃度のＦＸａは、ＰＣＰＳ脂質小胞（この活性を増強することができる）の必要なしに活性である。また、国際公開第０２／０８６１１８号パンフレットには、少なくとも一つの特定のリン脂質および少なくとも一つのセリンプロテアーゼで活性化された血液凝固因子の混合物を含む組成物が、血液凝固疾患の治療において投与される血液凝固因子の必要性を減らすために有用であることが示されている。
【００３６】
さらに、エラグ酸、およびゼオライト、シリカ、および無機酸化物材料などのその他の促進剤が血液凝固の強化に使用され、国際公開第０２／３０４７９号において特許の対象とされている。
【００３７】
国際公開第０２／０８６１１８号パンフレットによると、凝固因子は、セリンプロテアーゼで活性化される血液凝固因子として定義される（第５頁第１３〜１５行）。従って、ＴＦはセリンプロテアーゼではなく、第ＶＩＩａ因子に特異的な細胞表面受容体であるため、ＴＦは血液凝固因子として見なされない可能性もある。
【００３８】
本明細書では、発明者らは、リン脂質（様々なパーセンテージとモル濃度のホスファチジルセリンおよびホスファチジルコリン）が脂質化ＴＦによって介在される凝血促進作用を強化しないことを実証し（表２１）、これは、米国特許第４，７２１，６１８号および国際公開第０２／０８６１１８号において特許の対象とされた相乗効果は、ＴＦのような膜受容体ではなく、セリンプロテアーゼで活性化された血液凝固因子に限定されることを示す。驚くべきことに、脂質化ＴＦが負に帯電した無機表面（ＮＣＩＳ）と同時に組み合わされた場合、顕著な相乗効果がインビトロおよびインビボの実験条件で観察された。この記載で用いられたＮＣＩＳは、脂質と血液凝固促進剤であるエラグ酸の混合物で構成されている。脂質は正味負の電荷を持ち、脂質混合物は中性または両性イオン性脂質を含む可能性があるが、混合物に一定量の陰イオン特性を付与する負に帯電した脂質を含まねばならないことを意味する。限定を目的とする例ではなく説明として、負の電荷を持つ脂質は、スフィンゴ脂質（セラミド−１−リン酸、グリコシル化ホスファチジルエタノールアミン、水酸化スルファチドまたは非水酸化スルファチド、ガングリオシドなど）、ならびにグリセロールベースの脂質（ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルイノシトールリン酸、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピンなど）であってもよい。Ｄａｄｅ（登録商標）Ａｃｔｉｎ（登録商標）（Dade Behring）商標、例えばＤａｄｅ（登録商標）Ａｃｔｉｎ（登録商標）ＦＳといったＮＣＩＳが市販されている。
【００３９】
結論として、本明細書では、市販の薬剤に対する以下の利点で特徴づけられる新規局所止血剤について記載する：
（１）容易な局所投与
（２）局所投与のための特別な装置は不要
（３）幅広い治療焦点（ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、およびＦＸＩＩＩの欠損）
（４）全てのタイプの出血症状（鼻血、歯科出血；皮膚粘膜、外傷および手術の出血）に投与される適切な治療
（５）強力な急性効果を発揮する
（６）生理的なフィブリン塊形成（極めて安定な凝血塊）
（７）副作用なし
（８）低コスト治療。
【００４０】
ＷＨＯ、ＦＤＡ、ＥＭＥＡおよびその他の公衆衛生機関の主な目標は、ヒト由来血液製剤血液の使用に伴う危険な副作用を減らすことである。本発明は、これらの満たされていない必要性に対応するよう設計されている。
【発明の概要】
【００４１】
凝固においてＴＦ：：ＦＶＩＩａ複合体に割り当てられた役割が広く知られている。ＴＦ：：ＦＶＩＩａ複合体はＦＸ活性化を行うための基質として作用する。近年の研究により、ＴＦリジン１６５残基およびリジン１６６残基が活性型および非活性型の両方でＦＸのＧｌａドメインと相互作用することが確認された。ＴＦ：：ＦＶＩＩａ複合体とは反対に、ＴＦとＦＸおよびＦＸａの相互作用についてはほとんど知られていない。ＴＦはＦＶＩＩ活性化のためのＦＸａの刺激因子として作用できることが報告されているだけである。言い換えると、ＦＸａのＴＦへの結合は、ＦＶＩＩの活性化を刺激し、ＦＶＩＩの活性化はＦＸ活性化を増大する。
【００４２】
発明者らは、ＦＸａの刺激因子としてのＴＦの役割が止血に関してなお一層重要であり、決定的なものであることを見出した（図３）。ピコモル濃度のＦＸａは、凝固および血小板凝集に何ら作用できないことがよく知られている。ＦＶＩＩに対する膜受容体としてのＴＦの一般に受け入れられた役割にもかかわらず、発明者らは、ＴＦが、ＦＸａの主なタンパク質分解活性である、フィブリン塊形成を引き起こすプロトロンビン加水分解を強化するためにＦＸａの刺激因子としても作用することを示した。
【００４３】
驚くべきことに、ＴＦ（すなわち、外傷または外因的投与）の存在下で、ピコモル濃度のＦＸａは、そのリガンドであるＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａの不存在下でさえプロトロンビン加水分解を引き起こし、フィブリン塊形成をもたらす。実験結果の全体を通じて、ＴＦがＦＸａの刺激因子として作用し、ＦＸａのＴＦへの特異的結合が血液凝固を誘発する最初の段階であることが示される。
【００４４】
発明者らのデータによれば、凝固が行われる速さはＴＦおよび前述の全ての形のＦＸａの間の相互作用に依存することが示唆される。
【００４５】
それ自体で凝固を開始することができない生理的濃度のＦＸａ（＜１５０ｐＭ）の存在下で、脂質化ＴＦは、補因子としての作用の結果としてトロンビン形成を迅速に開始することができる。
【００４６】
これらの止血効果は、驚くべきことにＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａの存在に依存せず、従って、内因性ＴＦ：：ＦＸａ複合体（ＦＸａ＜１５０ｐＭ）によって媒介される凝血促進作用は、凝固第ＶＩＩ因子欠損試料において特に有用であり、適切である。強力な止血作用が、ＦＶＩＩＩ（血友病Ａ）、ＦＩＸ（血友病Ｂ）、ＦＸＩ（血友病Ｃ）、ＦＶ、ＦＸ、ＦＸＩＩ、およびＦＸＩＩＩなどの他の凝固因子の先天性欠損を有する患者の試料、ならびにベルナール-スーリエ症候群およびＧｌａｎｚａｍｎｎ病などの先天性血小板疾患、ならびに血小板減少性疾患を有する個人においても観察された。
【００４７】
従って、本発明は、健康な個人および出血性素因を有する患者に存在する出血の局所治療に有用なＦＸａの新規刺激因子として、脂質化ＴＦの単独での使用またはＦＸａおよび／またはＮＣＩＳとの組み合わせでの使用に基づく。
【００４８】
発明者らにより得られた結果により、ＦＶＩＩ欠損被験体における出血治療に対する非脂質化ＴＦまたはその機能的断片の使用が提供される。該治療は非脂質下ＴＦの非経口的投与に適した薬剤の投与形態の使用により実施され得る。
【００４９】
従って、一つの態様において、本発明は、被験体における出血の局所治療のための薬剤の製造における、脂質化ＴＦまたはその機能的断片の使用に関する。
【００５０】
別の態様において、本発明は、脂質化ＴＦ単独またはＦＸａおよび／またはＮＣＩＳとの組み合わせを含む製品に関する。被験体における出血治療のための薬剤としての、または薬剤の製造における該製品の使用は、本発明の更なる態様をなす。
【００５１】
別の態様において、本発明は、脂質化ＴＦによって形成された複合体、ならびにＦＸａ、ＮＣＩＳおよび両方の組み合わせから選択される化合物に関する。被験体における出血治療のための薬剤としての、または薬剤合成における該複合体の使用は、本発明の更なる態様をなす。
【００５２】
別の態様において、本発明は、医薬的に許容可能な担体と共に脂質化ＴＦを含んでなる医薬組成物に関する。特定の実施態様において、該医薬組成物は、さらにＦＸａおよび／またはＮＣＩＳを含む。
【００５３】
別の態様において、本発明は、前記医薬組成物および支持体を含んでなる製品に関する。特定の実施態様において、該医薬組成物は、さらにＦＸａおよび／またはＮＣＩＳを含む。
【００５４】
別の態様において、本発明は、ＦＶＩＩ欠損被験体における出血治療のための薬剤の製造のための、非脂質化ＴＦまたはその機能的断片の使用に関する。特定の実施態様において、該薬剤は、非脂質化ＴＦの非経口的投与に適した薬剤の投与形態で製剤化される。
【発明の具体的説明】
【００５５】
本明細書における知見は、脂質化ＴＦが、そのリガンドであるＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａの不存在下で、酵素（ＦＸａ）にプロトロンビン加水分解開始を引き起こさせ、その結果、凝固が生じるＦＸａの刺激因子として作用することを初めて示す。この新しい機構は、特に非常に低いＦＸａ濃度レベル（生理的に１５０ｐＭ未満と考えられる）において重要である。血小板凝集の障害によって生じ、出血症状の高い傾向がある特定の血小板疾患があることがよく知られている。従って、外因的に投与された脂質化ＴＦは、先天性血液凝固障害において有用なだけでなく、さらに、Ｇｌａｎｚａｍｎｎ病、ベルナール-スーリエ症候群、血小板減少性疾患といった先天性および後天性血小板障害における止血も可能にする。
【００５６】
凝固が生じる早さは、従って、今まで考えられてきたようにＴＦ：：ＦＶＩＩａ複合体形成およびその後のＦＸ活性化に依存せず、生理的基礎濃度（＜１５０ｐＭ）でのＴＦおよびＦＸａの相互作用に依存する。この相互作用形成の最も重要な生物学的結果は、凝固開始の迅速な発生、ならびに血液中に存在する生理的濃度のＦＸａの存在およびその刺激因子であるＴＦとの相互作用のみを必要するということである。ＴＦ：：ＦＶＩＩａ複合体に起因しようと、トロンビンそれ自体に起因しようと、複合体によって最初に生成されたトロンビンの結果、およびＦＸａのより大量の生産の結果として、プロセスは直ちに増幅される。
【００５７】
従って、発明者らの知見は、ＦＶＩＩａの不存在下、およびそれ自体では凝固を開始できない生理的濃度（＜１５０ｐＭ）のＦＸａの存在下において、脂質化ＴＦがプロトロンビン加水分解の開始を促進するＦＸａの刺激因子としての新しい作用の結果としてトロンビン形成を迅速に開始することを明確に示す。一方、発明者らの知見は、脂質化ＴＦおよび低濃度（それ自体で抗出血作用を発揮するには有効ではない濃度）のＦＸａが共に投与された場合に、フィブリン塊形成の開始を迅速に引き起こすことができることを示す。ＴＦ：：ＦＸａとの組み合わせ、特に＜１５０ｐＭの濃度のＦＸａとの組み合わせで観察された作用は、脂質化ＴＦ単独で投与される場合に検出されるよりも遙かに良好である。ＦＸａおよび脂質化ＴＦとＮＣＩＳとの組み合わせは、止血作用をさらに一層高めることができる。得られた結果は、血漿中に存在する基礎濃度（＜１５０ｐＭ）のＦＸａの存在下ではＦＸａ自体に凝固反応を開始する能力はなく、この反応はＴＦがＦＸａの刺激因子として作用する場合に生じるという考えを支持する。
【００５８】
従って、単独、またはＦＸａおよび／またはＮＣＩＳと組み合わせた脂質化されたＴＦは、健康な個人および出血性素因に苦しむ患者に存在する出血の治療に有用な新しい局所止血剤として用いることができる。
【００５９】
非脂質化ＴＦまたはその機能的断片も、同様に、ＦＶＩＩ欠損患者に存在する出血の治療に有用な新規の止血剤として、好ましくは非経口的投与によって、用いることができる。
【００６０】
Ｉ．出血の局所治療における脂質化ＴＦの使用
発明者らは、驚くべきことに、脂質化ＴＦがＦＸａのタンパク質分解活性を高め、その結果、トロンビン生産を高めることを見いだした［本明細書の実施例の結果の節１を参照］。発明者らは、脂質化ＴＦが、インビトロ［本明細書に含まれる実施例の結果の節１から５を参照］およびインビボ［本明細書に含まれる実施例の結果の節６および７を参照］の両方で、健康な被験体、ならびにＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩおよびＦＸＩＩＩの欠損患者、ならびに（限定を目的としない例として、ヘパリン、低分子量ヘパリン、またはクマリン誘導体といった薬剤による抗凝固治療を用いて）抗凝固処置された患者など、凝固因子欠損患者の血漿および血液を凝固させることも観察した。発明者らは、脂質化ＴＦが血小板障害に苦しむ患者の血液を凝固させることをさらに見いだした［本明細書に含まれる実施例の結果の節５を参照］。これらの結果は、脂質化ＴＦが被験体における出血の局所治療に有用な抗出血剤であることを明確に示す。
【００６１】
技術常識に照らし、ＴＦを健康な被験体または血友病患者（ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸおよびＦＸＩ欠損）における凝固促進局所単回治療として考えることは自明ではない。
【００６２】
ＦＶＩＩ欠損患者においてはＴＦ−ＦＶＩＩ複合体が形成されないため、ＦＶまたはＦＸ欠損患者においてはプロトロンビナーゼ複合体が構築されないため、ならびにヘパリン治療を受けた患者においてはトロンビンおよびＦＸａが共に抗トロンビンＩＩＩによって阻害されるため、ならびにワルファリン治療を受けた患者においては全てのビタミンＫ依存性凝固因子（ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、およびＦＸ）の合成が無効にされているため、全く思いも寄らないことであった。
【００６３】
従って、一つの態様において、本発明は、被験体における出血の局所治療のための薬剤の製造における、脂質化ＴＦまたは機能的な脂質化されたその断片の使用を目的とする。
【００６４】
ＴＦは、動物界に広く分布する膜内在性糖タンパクである。ＴＦタンパク質はドメイン構造を有し、すなわち独立した機能領域を含むタンパク質である。ヒトＴＦアポタンパク質の各ドメインは、固有の構造および機能的特性を有する：（１）シグナルペプチド、またはタンパク質が未成熟型から成熟型へプロセシングされる場合は、翻訳後にプロセシングされる３２個のアミノ酸のリーダー配列を含む領域；（２）約２１９個の末端アミノ酸を含むＮ−グリコシル化親水性細胞外ドメイン；（３）主に疎水性で、膜貫通ドメインアミノ酸であると考えられる約２３個のアミノ酸の断片；および（４）タンパク質細胞質断片の一部を形成するアミノ酸であると考えられるカルボキシ末端の２１個のアミノ酸。ヒトＴＦタンパク質のこのドメイン構造は、例えばタンパク質の細胞外ドメインまたはその機能的断片の生産を可能にする。ヒトＴＦタンパク質のアミノ酸配列は既知であり、例えば、ＮＣＢＩ（ｈＴＦ、登録番号：Ｐ１３７２６）といったタンパク質データベースで閲覧することができる。
【００６５】
本明細書において用いられる「脂質化ＴＦ」の用語は、脂質小胞または細胞膜中に完全にまたは部分的にこのＴＦが挿入された任意のＴＦ供給源を意味する。説明のための、制限を目的としない「脂質化ＴＦ」供給源の例は：抽出物（抽出物の分離は、脳、胎盤、および肺組織などのいくつかの組織、ヒツジ、ウシ、ウサギ、イヌ、ヒトなどの様々な動物由来の組織から行うこともできる）を含む脂質化ＴＦ；精製され（再）脂質化されたＴＦタンパク質性成分（抽出物から、または組み換えＴＦから精製される）、すなわち精製後に脂質成分が添加されるもので、説明のための、制限を目的としない例としてＭｏｒｒｉｓｅｙにより過去に述べられたプロトコルに従って調製され得るものである［本明細書に含まれる実施例を参照］。該プロトコルにおいて、非脂質化ＴＦは、例えばＮ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドのような非イオン性界面活性剤を用いてリン脂質小胞中に組み込まれる。本発明による脂質化ＴＦに用いることができる脂質は、任意の起源（動物、植物、または合成）に由来してもよい。実質的に、任意の脂質を本発明の脂質化ＴＦの調製に用いることができる。説明のための、制限を目的としない脂質化ＴＦの調製に用いることができる脂質の例としては、リン脂質（ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンなど）、スフィンゴ脂質（セラミド、スフィンゴシン−１−リン酸、イノシトールリン酸セラミド、マンノシル−イノシトールリン酸セラミド、マンノシル−ジイノシトールリン酸セラミドなど）、ホスファチジルイノシトール（Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール、Ｌ−α−リゾホスファチジルイノシトールなど）およびホスファチジルイノシトールリン酸（Ｌ−α−［ホスファチジルイノシトール−４−リン酸］、１，２−ジオクタノール−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸］など）が挙げられる。ＴＦタンパク質性成分：脂質の比（モル、重量または体積）は広い範囲で異なり、例えばおよそ１：５０，０００からおよそ１：３，０００である。
【００６６】
本明細書において用いられるＴＦの用語は、いくつかの野生型ＴＦ変異体および野生型ＴＦの少なくとも一つの機能を維持する、有利には野生型ＴＦの少なくとも一つの凝固に関連する機能を維持する変異体を含む。
【００６７】
特定の実施態様において、本発明の実施に用いる脂質化ＴＦは脂質化ヒトＴＦであり、組織抽出物から得られたＴＦからなるか；または組織抽出物から精製され、脂質成分に挿入されたタンパク質性成分（タンパク質：脂質のモル比はおよそ１：８７００）を含むＴＦか、またはあくまで説明として限定を目的としない例としては、米国特許第６，２６１，８０３号明細書に記載されるようなプロセスで得られた組換えＴＦ（ｒＴＦ）からなるＴＦである。抽出物の獲得およびＴＦの精製は、脳、胎盤、肺組織、ならびにヒツジ、ウシ、ウサギ、イヌ、およびヒトといった様々な動物などのいくつかの組織から行われ得る。
【００６８】
本明細書において用いられる「脂質化ＴＦの機能的断片」の用語は、ＴＦのペプチド誘導体、特に一つ以上のＴＦ機能、好ましくは例えばＦＸａおよび／またはＮＣＩＳへの結合能ならびに創傷治癒中に抗出血性および血管形成を展開する機能といった凝固に関連する機能を維持する野生型ＴＦのタンパク質成分の突然変異体および変異体を含むＴＦのタンパク質成分を含むが、これらに限定されない。ＴＦの機能的断片のアミノ酸配列は、野生型ＴＦのタンパク質成分の断片の配列と同一であるか、野生型ＴＦの一つ以上の機能、有利には凝固に関連した一つ以上の機能が保存されることを条件に、一つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、または修飾を有してもよい。単純化を目的に、本明細書において用いられる「脂質化ＴＦ」の用語は、脂質化ＴＦの任意の機能的断片を含む。
【００６９】
本発明の実施に用いられるＴＦのタンパク質成分は、さらに融合タンパク質の一部であってもよい。この意味で、該融合タンパク質は、別のＴＦ断片からなる領域Ｂに結合したＴＦタンパク質または該ＴＦタンパク質の機能的断片からなる領域Ａを含んでもよい。該領域Ｂは、該ＴＦタンパク質またはＴＦタンパク質の該断片のアミノ末端領域に結合されるか、あるいは該領域Ｂは該ＴＦタンパク質またはＴＦタンパク質の該断片のカルボキシル末端領域に結合され得る。領域ＡおよびＢの両方は直接結合するか、または該領域ＡおよびＢの間のリンカーポリペプチドを介して結合され得る。融合タンパク質は、化学合成、または適した宿主細胞中で該融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の遺伝子発現を用いることのいずれかで得ることができる。
【００７０】
本明細書において用いられる「局所治療」の用語は、例えば不連続な皮膚の切断（切り傷など）および血管組織（破裂血管など）といった、治療が必要な部位での直接的な治療の適用を意味する。
【００７１】
本発明に従い、本明細書に含まれる実施例に示されるように、脂質化ＴＦはＦＸａのタンパク質分解活性を上昇させ、その結果としてプロトロンビン生産を上昇させるＦＸａの刺激因子として作用し、そのため、出血性障害、特に、出血性素因と組み合わされる出血性障害の治療または抑制に用いることもできる。
【００７２】
「出血性素因」の用語は、結果として出血症候群の発生を引き起こし、ときには広範な過度の出血を伴う出血症候群を引き起こす過程を表す。出血性素因は、先天性または後天性血液凝固障害および／または先天性または後天性血小板障害によって引き起こされ得る。
【００７３】
「血液凝固障害」の用語は、血液凝固因子障害を表す。この障害は、結果として出血症候群を発症する、特定の凝固因子欠損症または欠乏に起因する場合、または凝固因子障害による場合がある。血液凝固障害は、一般的に先天性血液凝固障害または後天性血液凝固障害である可能性がある。
【００７４】
説明として、制限を目的としない先天性血液凝固障害の例として、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩＩおよびこれらの組み合わせから選択される凝固因子の欠損症が挙げられる。
【００７５】
後天性血液凝固障害は、様々な原因がある可能性がある。説明のための例は、いくつかの重度の肝不全、抗凝固療法（ヘパリン、低分子量ヘパリン、ワルファリン、クマリン誘導体、ジクマリンなど）における凝固因子合成欠損を含む。別の機構は、出血している外傷における凝血塊の形成に凝固因子が利用できなくなるような凝固因子の過剰消費に基づく。この機構は、播種性血管内凝固症候群または微小循環内皮細胞活性化血小板を破壊する重度の敗血症および複合的微小血栓の形成を伴う凝固因子といった複合的な疾患；後産などＴＦによる血液進入；死胎の残留；組織の粉砕を伴う複合的外傷；蛇咬症などで生じる凝固因子の消費に起因する血液凝固障害において生じる。脈管炎では、血管壁および内皮の障害は凝固活性因子を放出する。凝固因子の消費は、抗血小板物質および抗凝固物質であるＰＤＦ放出を伴うプラスミンの作用による多量の複合的微小血栓のフィブリン溶解によって悪化する。
【００７６】
「血小板障害」の用語は、血小板の数および機能の両方における障害を表し、これらの結果、出血症候群が生じる。この血小板障害は先天性または後天性であり得る。
【００７７】
特定の実施態様において、前記血小板障害は、先天性血小板障害である。説明のための、制限を目的としない先天性血小板障害の例は、Ｇｌａｎｚｍａｎｎ病、ベルナール-スーリエ症候群、Ｂｏｌｉｎ−Ｊａｍｉｅｓｏｎ症候群、ウィスコット−アルドリッチ症候群、Ｐａｒｉｓ−Ｔｒｏｕｓｓｅａｕ−Ｊａｃｏｂｓｅｎ症候群、Ｘ染色体の血小板減少症、灰色血小板症候群、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ症候群およびファンコーニ貧血などを含む。
【００７８】
別の特定の実施態様において、前記血小板障害は、後天性血小板障害である。説明のための、制限を目的としない後天性血小板障害の例は、血小板血症、多血症、慢性骨髄性白血病などの骨髄増殖症候群などを含み、出血時間の延長、血小板粘着能（ガラスビーズ保持力）の欠損、血小板凝集能の欠損、異常放出、および血小板因子ＩＩＩ欠損を伴う骨髄様化生における機能的血小板障害がある。機能的な血小板の欠損は、壊血病、先天性心臓病、および肝硬変におけるタンパク異常血症において見いだされている。
【００７９】
「後天性血液凝固障害」および「後天性血小板障害」の用語は、医原性またはその他の疾患の二次的障害であり得る、障害の原因を表す。
【００８０】
本明細書で用いられる「被験体」の用語は、ヒトを含む任意の動物種のメンバーを含み、説明として、限定を目的としない例は、該被験体は霊長類、家畜、齧歯類などの哺乳動物であってよく、該被験体は好ましくは任意の年齢および人種の男性または女性のヒトである。特定の実施態様において、該被験体は、凝固障害または血小板障害を持たない個人など、止血障害の前歴を持たないヒトである。別の特定の実施態様では、該被験体は、例えば、先天性もしくは後天性血液凝固障害などの凝固障害、または先天性もしくは後天性血小板障害などの血小板障害といった出血性素因を有する個人など、止血障害の前歴を持つヒトである。
【００８１】
従って、特定の実施態様において、本発明は、止血障害の前歴がないヒトにおける出血の局所治療のための薬剤の製造における、脂質化ＴＦの使用に関する。別の特定の実施態様において、本発明は、出血性素因を有するヒトにおける出血の局所治療のための薬剤の製造における、脂質化ＴＦの使用に関する。
【００８２】
被験体への投与に関して、脂質化ＴＦは、出血の局所治療のための局所投与に適した医薬的形態に製剤化される。説明のための、限定を目的としない該医薬的形態の例は、エアロゾル、溶液、懸濁液、乳液、ゲル、膏薬、クリーム、包帯剤、パッチ、軟膏、口内洗浄剤などを含む。そのために、脂質化ＴＦを含む医薬的剤形は、選択された医薬的投与形態の製造に必要な医薬的に許容可能な担体、および賦形剤を含む（さらなる詳細は、本明細書における「医薬組成物」に関する項を参照）。
【００８３】
被験体に投与される脂質化ＴＦの用量は広い範囲で異なり、例えば、０．０１μｇ活性タンパク質／ｍｌ〜１００μｇ活性タンパク質／ｍｌである。投与される脂質化ＴＦの用量は、例えばその活性および生物学的半減期といった、使用されるＴＦタンパク質の性質、製剤中のＴＦタンパク質の濃度、被験体または患者の臨床症状、治療される出血障害などを含むいくつかの要因に依存する（さらなる詳細は、本明細書における「医薬組成物」に関する項を参照）。
【００８４】
ＩＩ．複合製品および適用
ＩＩ．１  脂質化ＴＦ＋ＦＸａ
知られているように、血液凝固の外因性経路において、ＴＦは血中ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａに結合してＴＦ：：ＦＶＩＩ複合体を形成し、カルシウム存在下でＦＸが活性化されるように基質として作用する。外因性経路の活性化は、ＴＦとそのリガンドであるＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａの相互作用を伴う。この複合体、ＴＦ：：ＦＶＩＩａは、ＦＶＩＩａによるＦＸ活性化が起こるように基質として作用する。今般、発明者らは、驚くべきことに、脂質化ＴＦがＦＸａと共にＦＶＩＩ欠損被験体においてでさえ凝固を誘導し、脂質化ＴＦがＦＸａ刺激因子として作用し、このセリンプロテアーゼのプロトロンビン加水分解の開始を可能にし、プロトロンビンを生成し、凝固の開始が行われることを見いだした。本明細書で用いられる、「ＦＸａ」は、タンパク質、特に活性型において、プロトロンビン加水分解に役割を果たし、その結果、凝固開始を引き起こすセリンプロテアーゼを示す。このタンパク質分解は、活性型血小板表面に結合し、ＦＶａおよびカルシウムイオンの存在下でプロトロンビンを加水分解するＦＸａによって行われる。
【００８５】
より具体的には、発明者らは、驚くべきことに、例えそれ自体では凝固を誘導できないようなＦＸａの濃度が非常に低い場合でさえ、脂質化ＴＦおよびＦＸａの組み合わせが血漿を凝固させることを見いだした［例えば、本明細書に含まれる実施例の結果の節１（１．５）および節２を参照］。
【００８６】
従って、別の態様において、本発明は、（ｉ）脂質化ＴＦおよび（ｉｉ）ＦＸａを含んでなる製品に関する。前述の結果に基づき、該製品は薬剤として用いることができ、特に出血の治療に、例えば被験体における出血の局所治療において用いることができる。これらの成分（ｉ）および（ｉｉ）は一緒であっても別々であってもよい。特定の実施態様において、この製品の製造に用いられる脂質化ＴＦは脂質化ヒトＴＦである。
【００８７】
特定の実施態様において、本発明は、（ｉ）脂質化ＴＦおよび（ｉｉ）ＦＸａを含んでなる製品を提供する。両成分は、被験体への投与前に同じ組成物中に共に組み合わされ、一緒にされてよい。
【００８８】
別の特定の実施態様において、本発明は、（ｉ）脂質化ＴＦおよび（ｉｉ）ＦＸａを別々に含んでなる製品を提供する。別の特定の実施態様において、本発明は、被験体への同時または連続的投与のための組み合わせとして、（ｉ）脂質化ＴＦおよび（ｉｉ）ＦＸａを別々に含んでなる製品を提供する。被験体への該成分（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせ投与は、同時にまたは連続的に、一定の間隔をあけて、任意の順序で行われてもよく、すなわち、最初に脂質化ＴＦで次にＦＸａが投与されたり、またはその逆で投与されてもよい。あるいは、脂質化ＴＦおよびＦＸａは、同時に投与されてもよい。
【００８９】
被験体へのその投与に関して、上記に定義された製品は医薬的投与形態に、好ましくは、局所投与に適した医薬的投与形態に製剤化され、その目的のために、望ましい医薬的投与形態の製造に適した医薬的に許容可能な担体および賦形剤が組み込まれる。該担体および賦形剤、ならびに本発明の製品の投与に適した投与形態についての情報は、製剤学専門書に見いだすことができる。さらに詳細な情報は、本明細書の「医薬組成物」に関する項を参照されたい。
【００９０】
被験体に投与される脂質化ＴＦおよびＦＸａの用量は、広い範囲内で異なる。例として、投与される脂質化ＴＦの用量は、約０．０１μｇ活性タンパク質／ｍｌ〜約１００μｇ活性タンパク質／ｍｌの間に含まれてよい。また、例として、投与されるＦＸａの用量は、約１７ｐＭと１７ｎＭ（約０．００１μｇ活性タンパク質／ｍｌ〜約１０μｇ活性タンパク質／ｍｌ）の間に含まれてよい。一般的に、投与される脂質化ＴＦおよびＦＸａの用量は、例えば活性および生物学的半減期といった、使用されるＴＦタンパク質およびＦＸａの性質、製剤中のＦＸａおよびＴＦタンパク質の濃度、被験体または患者の臨床症状、治療される出血障害などを含むいくつかの要因に依存する。（さらに詳細な情報は、本明細書の「医薬組成物」に関する項を参照）
【００９１】
前記製品中に存在する脂質化ＴＦおよびＦＸａの重量比は広い範囲で異なり、例として、このＴＦ：ＦＸａ重量比は、１０６：１と１０：１の間に含まれるが、その他の重量比であってもよく、特定の実施態様においては、本発明の製品は、脂質化ＴＦおよびＦＸａを１から０．００１、すなわち、ＴＦタンパク質１ミリグラムあたりにＦＸａタンパク質が１マイクログラム混合物中に存在する重量比で含む。
【００９２】
上記で定義された製品の薬剤としての使用、特に該製品の被験体の出血治療のための、特に被験体における出血の局所治療のための薬剤の製造における該製品の使用は、本発明のさらなる態様をなす。
【００９３】
ＩＩ．２  脂質化ＴＦ＋ＮＣＩＳ
発明者らは、驚くべきことに、脂質化ＴＦおよび負に荷電した無機表面（ＮＣＩＳ）の組み合わせが、健康な被験体および凝固因子欠損患者の血漿および血液をインビトロ［本明細書に含まれる実施例の結果の節１（１．４）、２（２．２）、３（３．４）、４（４．２）、および５（５．２５および５．４）を参照］ならびにインビボ［本明細書に含まれる実施例の結果の節６．１を参照］の両方で凝固させることを見いだした。
【００９４】
本明細書に用いられる「負に荷電した無機表面」または「ＮＣＩＳ」の用語は、脂質およびエラグ酸、ゼオライト、シリカ、無機酸化物材料などの血液凝固促進剤の混合物によって構成される。該脂質は正味負の電荷を持ち、脂質混合物は中性または両性イオン性脂質を含み得るが、一定量の陰イオン特性を付与する負に帯電した脂質を含まねばならないことを意味する。限定を目的とする例ではなく、説明として、負の電荷を持つ脂質は、スフィンゴ脂質（セラミド−１−リン酸、グリコシル化ホスファチジルエタノールアミン、水酸化スルファチド、無水酸化スルファチド、ガングリオシドなど）、およびにグリセロールベースの脂質（ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルイノシトールリン酸、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピンなど）であり得る。本明細書では、市販されているＤａｄｅ（登録商標）Ａｃｔｉｎ（登録商標）製品（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ、商標）をＮＣＩＳの供給源として利用している。
【００９５】
従って、別の態様において、本発明は、（ｉ）脂質化ＴＦおよび（ｉｉ）ＮＣＩＳを含んでなる製品に関する。前述の結果に基づき、該製品は薬剤として用いられてもよく、特に出血の治療に、例えば被験体における出血の局所治療において用いることができる。これらの成分（ｉ）および（ｉｉ）は、一緒であっても別々であってもよい。
【００９６】
特定の実施態様において、本発明は、（ｉ）脂質化ＴＦおよび（ｉｉ）ＮＣＩＳを含んでなる製品を提供する。両成分は、被験体への投与前に同じ組成物中に組み合わされても、一緒にされてもよい。
【００９７】
別の特定の実施態様において、本発明は、（ｉ）脂質化ＴＦおよび（ｉｉ）ＮＣＩＳを別々に含んでなる製品を提供する。別の特定の実施態様において、本発明は、被験体への同時または連続的投与のための組み合わせとして、（ｉ）脂質化ＴＦおよび（ｉｉ）ＮＣＩＳを別々に含んでなる製品を提供する。被験体への該成分（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせ投与は、同時にまたは連続的に、一定の間隔をあけて、任意の順序で行われてもよく、すなわち、最初に脂質化ＴＦで次にＮＣＩＳが投与されたり、またはその逆で投与されてもよい。あるいは、脂質化ＴＦおよびＮＣＩＳは、同時に投与されてもよい。
【００９８】
被験体への投与に関して、上記に定義された製品は医薬的投与形態に、好ましくは、局所投与に適した医薬的投与形態に製剤化され、その目的のために、望ましい医薬的投与形態の製造に適した医薬的に許容可能な担体および賦形剤が組み込まれる。該担体および賦形剤、ならびに本発明の製品の投与に適した投与形態についての情報は、製剤学専門書に見いだすことができる。さらに詳細な情報は、本明細書の「医薬組成物」に関する項を参照されたい。
【００９９】
被験体に投与される脂質化ＴＦおよびＮＣＩＳの用量は、広い範囲で異なる。例として、投与される脂質化ＴＦの用量は、約０．０１μｇ活性タンパク質／ｍｌ〜約１００μｇ活性タンパク質／ｍｌの間に含まれてよい。また、例として、投与されるＮＣＩＳの用量（体積で）は、脂質化ＴＦ活性タンパク質１μｇに対して約０．１〜１００μｌの間に含まれてよい。一般的に、投与される脂質化ＴＦおよびＮＣＩＳの用量は、例えば活性および生物学的半減期といった、使用されるＴＦタンパク質およびＮＣＩＳの性質、製剤中のＮＣＩＳおよびＴＦタンパク質の濃度、被験体または患者の臨床症状、治療される出血障害などを含むいくつかの要因に依存する。（さらに詳細な情報は、本明細書の「医薬組成物」に関する項を参照）。
【０１００】
製品中に存在する脂質化ＴＦおよびＮＣＩＳの重量／体積（ｗ／ｖ）比は広い範囲で異なり、例として、このＴＦ：ＮＣＩＳｗ／ｖ比は、１：１〜１：１０６の間に含まれるが、その他のｗ／ｖ比も可能であり、特定の実施態様においては、本発明の製品は、脂質化ＴＦ活性タンパク質１μｇに対してＮＣＩＳを０．１〜１００μｌの間で含む。
【０１０１】
上記で定義された製品の薬剤としての使用、特に該製品の被験体の出血治療のための、特に被験体における出血の局所治療のための薬剤の製造における該製品の使用は、本発明のさらなる態様をなす。
【０１０２】
ＩＩ．３  脂質化ＴＦ＋ＦＸａ＋ＮＣＩＳ
発明者らは、驚くべきことに、脂質化ＴＦ、ＦＸａ、およびＮＣＩＳの組み合わせが、健康な被験体および凝固因子欠損患者の血漿および血液をインビトロ［本明細書に含まれる実施例の結果の節１（１．６）および２（２．２）を参照］で凝固させることを見いだした。
【０１０３】
従って、別の態様において、本発明は、（ｉ）脂質化ＴＦ、（ｉｉ）ＦＸａおよび（ｉｉｉ）ＮＣＩＳを含んでなる製品に関する。前述の結果に基づき、該製品は薬剤として用いることができ、特に出血の治療に、例えば被験体における出血の局所治療において用いることができる。これらの成分（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は一緒であっても別々であってもよい。あるいは、二つの成分が、例えば（ｉ）＋（ｉｉ）、（ｉ）＋（ｉｉｉ）または（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）のように一緒であり、第三の成分が別であってもよい。
【０１０４】
特定の実施態様において、本発明は、（ｉ）脂質化ＴＦ、（ｉｉ）ＦＸａおよび（ｉｉｉ）ＮＣＩＳを含んでなる製品を提供する。該成分は、被験体への投与前に同じ組成中に共に組み合わされてよく、一緒にされてもよい。
【０１０５】
別の特定の実施態様において、本発明は、（ｉ）脂質化ＴＦ、（ｉｉ）ＦＸａおよび（ｉｉｉ）ＮＣＩＳを別々に含んでなる製品を提供する。別の特定の実施態様において、本発明は、被験体への同時または連続的投与のための組み合わせとして、（ｉ）脂質化ＴＦ、（ｉｉ）ＦＸａおよび（ｉｉｉ）ＮＣＩＳを別々に含んでなる製品を提供する。被験体への該成分（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の組み合わせ投与は、同時にまたは連続的に、一定の間隔をあけて、任意の順序で行われてもよく、すなわち、最初に脂質化ＴＦ、次にＦＸａ、次にＮＣＩＳが投与されたり、または最初に脂質化ＴＦ、次にＮＣＩＳ、次にＦＸａが投与されたり、または最初にＦＸａ、次に脂質化ＴＦ、次にＮＣＩＳが投与されたり、または最初にＦＸａ、次にＮＣＩＳ、次に脂質化ＴＦが投与されたり、または最初にＮＣＩＳ、次にＦＸａ、次に脂質化ＴＦが投与されたり、または最初にＮＣＩＳ、次に脂質化ＴＦ、次にＦＸａが投与されてもよい。あるいは該成分の任意の二つが同じ組成物に混合されて一緒に投与され、一方で、第三の成分が前記二成分組成物の前または後に追加されてもよい。別の他の実施態様では、脂質化ＴＦ、ＦＸａおよびＮＣＩＳは、同時に投与されてもよい。
【０１０６】
被験体への投与に関して、上記に定義された製品は医薬的投与形態に、好ましくは、局所投与に適した医薬的投与形態に製剤化され、その目的のために、望ましい医薬的投与形態の製造に適した医薬的に許容可能な担体および賦形剤が組み込まれる。該担体および賦形剤、ならびに本発明の製品の投与に適した投与形態についての情報は、製剤学専門書に見いだすことができる。さらに詳細な情報は、本明細書の「医薬組成物」に関する項を参照されたい。
【０１０７】
被験体に投与される脂質化ＴＦ、ＦＸａおよびＮＣＩＳの用量は、広い範囲で異なる。例として、投与される脂質化ＴＦの用量は、約０．０１μｇ活性タンパク質／ｍｌ〜約１００μｇ活性タンパク質／ｍｌの間に含まれてよい。また、例として、投与されるＦＸａの用量は、約１７ｐＭ〜１７０ｎＭ（約０．００１μｇ活性タンパク質／ｍｌ〜約１０μｇ活性タンパク質／ｍｌ）の間に含まれてよい。さらに例として、投与されるＮＣＩＳの用量（体積で）は、脂質化ＴＦ活性タンパク質１μｇに対して約０．１〜１００μｌの間に含まれてよい。一般的に、投与されるＴＦタンパク質、ＦＸａおよびＮＣＩＳの用量は、例えば活性および生物学的半減期といった、使用されるＴＦタンパク質、ＦＸａおよびＮＣＩＳの性質、製剤中のＴＦタンパク質、ＦＸａおよびＮＣＩＳの濃度、被験体または患者の臨床症状、治療される出血障害などを含むいくつかの要因に依存する。（さらに詳細な情報は、本明細書の「医薬組成物」に関する項を参照）。
【０１０８】
製品中に存在する脂質化ＴＦタンパク質、ＦＸａおよびＮＣＩＳの重量比は、ＩＩ．１およびＩＩ．２に述べたように広い範囲で異なるが、特定の実施態様において、本発明の製品は、脂質化ＴＦタンパク質：ＦＸａ：ＮＣＩＳを１：０．００１：１００（ｗ：ｗ：ｖ）の比で含む。
【０１０９】
上記で定義された製品の薬剤としての使用、特に該製品の被験体の出血治療のための、特に被験体における出血の局所治療のための薬剤の製造における該製品の使用は、本発明のさらなる態様をなす。
【０１１０】
ＩＩＩ．複合体と適用
ＩＩＩ．１  ＴＦ：：ＦＸａ複合体
前述のように（本明細書の項１１．１参照）、発明者らは、脂質化ＴＦおよびＦＸａの組み合わせが、それ自体では凝固を誘導できない低濃度のＦＸａにおいてさえ、血漿を凝固させることを見いだした。何らかの理論と関連づける意図はないが、組み合わせまたは別々（任意の順序で）のいずれであっても、該脂質化ＴＦおよびＦＸａは、医薬的効果（抗出血効果、特に局所抗出血効果）が発揮されなければならない部位で観察される該医薬的効果を発揮することができる複合体の形成を引き起こすと考えられる。
【０１１１】
従って、別の態様において、本発明は、本明細書においてＴＦ：：ＦＸａとして特定される脂質化ＴＦおよびＦＸａを含んでなる複合体に関する。単純化のために該複合体はＴＦ：：ＦＸａとして示されるが、該複合体は実際には各組成物のいくつかのユニットにより形成される可能性もあり、これら全ての可能性は本発明の範囲内である。前述の結果を考慮して、該複合体は薬剤として使用することができ、また、特に出血の治療、例えば被験体における出血の局所治療に使用することができる。特定の実施態様において、この複合体の製造に用いられる脂質化ＴＦは、脂質化ヒトＴＦである。
【０１１２】
被験体への投与に関して、上記に定義された製品は医薬的投与形態に、好ましくは、局所投与に適した医薬的投与形態に製剤化され、その目的のために、望ましい医薬的投与形態の製造に適した医薬的に許容可能な担体および賦形剤が組み込まれる。該担体および賦形剤、ならびに本発明の製品の投与に適した投与形態についての情報は、製剤学専門書に見いだすことができる。さらに詳細な情報は、本明細書の「医薬組成物」に関する項を参照されたい。
【０１１３】
被験体に投与される前記複合体中に存在する脂質化ＴＦおよびＦＸａの用量は、広い範囲で異なる。一般的にこの用量は、脂質化ＴＦおよびＦＸａの組み合わせを含む製品に関する前述の項ＩＩ．１に挙げた用量に対応する。
【０１１４】
前記ＴＦ：：ＦＸａ複合体中に存在する脂質化ＴＦタンパク質およびＦＸａの重量比は広い範囲で異なるが、一般的に脂質化ＴＦおよびＦＸａを含む製品に関する前述の項ＩＩ．１に挙げた用量に対応する。
【０１１５】
上記で定義された製品の薬剤としての使用、特に前記複合体の被験体の出血治療のための、特に被験体における出血の局所治療のための薬剤の製造における前記複合体の使用は、本発明のさらなる態様をなす。
【０１１６】
ＩＩＩ．２  ＴＦ：：ＮＣＩＳ複合体
前述のように（本明細書の項１１．２参照）、発明者らは、脂質化ＴＦおよびＮＣＩＳの組み合わせが、健康な被験体および凝固因子欠損患者両方の血漿および血液をインビトロおよびインビボで凝固させることを見いだした。何らかの理論と関連づける意図はないが、組み合わせまたは別々（任意の順序で）のいずれであっても、脂質化ＴＦおよびＮＣＩＳの投与は、治療効果（抗出血効果、特に局所抗出血効果）が発揮されなければならない部位で観察される該治療効果を発揮することができる複合体の形成を引き起こすと考えられる。
【０１１７】
従って、別の態様において、本発明は、本明細書においてＴＦ：：ＮＣＩＳとして特定される脂質化ＴＦおよびＮＣＩＳを含んでなる複合体に関する。単純化のために該複合体はＴＦ：：ＮＣＩＳとして示されるが、該複合体は実際には各成分のいくつかのユニットにより形成される可能性もあり、これら全ての可能性は本発明の範囲内である。前述の結果を考慮して、該複合体は薬剤として使用することができ、特に出血の治療、例えば被験体における出血の局所治療に使用することができる。特定の実施態様において、この複合体の製造に用いられる脂質化ＴＦは、脂質化ヒトＴＦである。
【０１１８】
被験体への投与に関して、上記に定義された製品は医薬的投与形態に、好ましくは、局所投与に適した医薬的投与形態に製剤化され、その目的のために、望ましい医薬的投与形態の製造に適した医薬的に許容可能な担体および賦形剤が組み込まれる。該担体および賦形剤、ならびに本発明の製品の投与に適した投与形態についての情報は、製剤学専門書に見いだすことができる。さらに詳細な情報は、本明細書の「医薬組成物」に関する項を参照されたい。
【０１１９】
被験体に投与される複合体中に存在する脂質化ＴＦおよびＮＣＩＳの用量は、広い範囲で異なる。一般的にこの用量は、脂質化ＴＦおよびＮＣＩＳを含む製品に関する前述の項ＩＩ．２に挙げた用量に対応する。
【０１２０】
前記ＴＦ：：ＮＣＩＳ複合体中に存在する脂質化ＴＦタンパク質およびＮＣＩＳのｗ／ｖ比は広い範囲で異なるが、一般的に脂質化ＴＦおよびＮＣＩＳを含む製品に関する前述の項ＩＩ．２に述べた比に対応する。
【０１２１】
上記で定義された複合体の薬剤としての使用、特に該複合体の被験体の出血治療のための、特に被験体における出血の局所治療のための薬剤の製造における該製品の使用は、本発明のさらなる態様をなす。
【０１２２】
ＩＩＩ．３  脂質化ＴＦ：：ＦＸａ：：ＮＣＩＳ複合体
前述のように（本明細書の項１１．３参照）、発明者らは、脂質化ＴＦ、ＦＸａおよびＮＣＩＳの組み合わせが血漿を凝固させることを見いだした。何らかの理論と関連づける意図はないが、組み合わせまたは別々（任意の順序で）のいずれであっても、脂質化ＴＦ、ＦＸａおよびＮＣＩＳの投与は、医薬的効果（抗出血効果、特に局所抗出血効果）が発揮されなければならない部位で観察される該治療効果を発揮することができる複合体の形成を引き起こすと考えられる。従って、別の態様において、本発明は、本明細書においてＴＦ：：ＦＸａ：：ＮＣＩＳとして特定される脂質化ＴＦ、ＦＸａおよびＮＣＩＳを含んでなる複合体に関する。単純化のために該複合体はＴＦ：：ＦＸａ：：ＮＣＩＳとして示されるが、該複合体は実際には各複合体のいくつかのユニットにより形成される可能性もあり、ならびに例えばＴＦ：：ＮＣＩＳ：：ＦＸａ、ＦＸａ：：ＮＣＩＳ：：ＴＦ、ＦＸａ：：ＴＦ：：ＮＣＩＳ、ＮＣｌＳ：：ＴＦ：：ＦＸａまたはＮＣＩＳ：：ＦＸａ：：ＴＦといった該成分の間の相互作用の任意の可能性により形成される場合もあり、これら全ての可能性は本発明の範囲内である。前述の結果を考慮して、該複合体は薬剤として使用することができ、特に出血の治療、例えば被験体における出血の局所治療に使用することができる。特定の実施態様において、この複合体の製造に用いられる脂質化ＴＦは、脂質化ヒトＴＦである。
【０１２３】
被験体へのその投与に関して、上記に定義された製品は医薬的投与形態に、好ましくは、局所投与に適した医薬的投与形態に製剤化され、その目的のために、望ましい医薬的投与形態の製造に適した医薬的に許容可能な担体および賦形剤が組み込まれる。該担体および賦形剤、ならびに本発明の製品の投与に適した投与形態についての情報は、製剤学専門書に見いだすことができる。さらに詳細な情報は、本明細書の「医薬組成物」に関する項を参照されたい。
【０１２４】
被験体に投与される複合体中に存在する脂質化ＴＦ、ＦＸａおよびＮＣＩＳは、広い範囲で異なる。一般的にその用量は、脂質化ＴＦ、ＦＸａおよびＮＣＩＳの組み合わせを含む製品に関し、前述の項ＩＩ．３に述べた用量に対応する。
【０１２５】
前記ＴＦ：：ＦＸａ：：ＮＣＩＳ複合体中に存在する脂質化ＴＦタンパク質、ＦＸａおよびＮＣＩＳの比は広い範囲で異なるが、一般的に脂質化ＴＦ、ＦＸａおよびＮＣＩＳを含む製品に関し、前述の項ＩＩ．３に述べた比に対応する。
【０１２６】
上記で定義された複合体の薬剤としての使用、特に該複合体の被験体の出血治療のための、特に被験体における出血の局所治療のための薬剤の製造における該複合体の使用は、本発明のさらなる態様をなす。
【０１２７】
ＩＶ．医薬組成物
前述のように、脂質化ＴＦは抗出血剤として、特に局所的使用のための抗出血剤として使用することができる。従って、別の態様において、本発明は、脂質化ＴＦと共に医薬的に許容可能な担体を含んでなる医薬組成物（以下「本発明の医薬組成物」という）に関する。特定の実施態様において、脂質化ＴＦは脂質化ヒトＴＦである。
【０１２８】
被験体への投与に関して、上記に定義された製品は医薬的投与形態に、好ましくは、局所投与に適した医薬的投与形態に製剤化され、その目的のために、望ましい医薬的投与形態の製造に適した医薬的に許容可能な担体および賦形剤が組み込まれる。該担体および賦形剤、ならびに本発明の製品の投与に適した投与形態についての情報は、製剤学専門書に見いだすことができる。一般的な薬剤の様々な医薬的投与形態の概説、その調製プロセスは、C. Fauli i Trilloによる書籍「Tratado de Farmacia Galenica」（Galenic Pharmacy Treatise），1st Edition, 1993, Luzan 5, S.A.編に見いだすことができる。
【０１２９】
脂質化ＴＦの様々な医薬的投与形態を用いることができるが、該化合物の局所的な投与は実践において最も有利であり、従って、該脂質化ＴＦは局所投与に適した医薬的形態に製剤化される。説明のための、限定を目的としない該医薬的形態の例は、エアロゾル、溶液、懸濁液、乳液、ゲル、膏薬、クリーム、包帯剤、パッチ、軟膏、口内洗浄剤などを含む。そのために、脂質化ＴＦを含む医薬的剤形は、局所投与のための脂質化ＴＦの医薬的投与形態の製造に必要な医薬的に許容可能な担体および賦形剤を含む。
【０１３０】
従って、特定の実施態様において、本発明の医薬組成物は、脂質化ＴＦおよび該脂質化ＴＦの局所投与に適した医薬的に許容可能な担体を含んでなる、脂質化ＴＦの局所投与のための医薬組成物である。
【０１３１】
脂質化ＴＦは、治療的有効量で本発明の医薬組成物中に存在する。その量は、広い範囲で異なり、例えば、約０．０１μｇ活性タンパク質／ｍｌ〜１００μｇ活性タンパク質／ｍｌである。
【０１３２】
別の特定の実施態様において、本発明の医薬組成物は、
ａ）医薬的に許容可能な担体と共に（ｉ）脂質化ＴＦおよび（ｉｉ）ＦＸａを含む製品；または
ｂ）別々に、（ｉ）医薬的に許容可能な担体と共に脂質化ＴＦ、および（ｉｉ）医薬的に許容可能な担体と共にＦＸａ；または
ｃ）医薬的に許容可能な担体と共に（ｉ）脂質化ＴＦおよび（ｉｉ）ＮＣＩＳを含む製品；または
ｄ）別々に、（ｉ）医薬的に許容可能な担体と共に脂質化ＴＦ、および（ｉｉ）医薬的に許容可能な担体と共にＮＣＩＳ；または
ｅ）医薬的に許容可能な担体と共に（ｉ）脂質化ＴＦ、（ｉｉ）ＦＸａ、および（ｉｉｉ）ＮＣＩＳを含む製品；または
ｆ）別々に、（ｉ）医薬的に許容可能な担体と共に脂質化ＴＦ、（ｉｉ）医薬的に許容可能な担体と共にＦＸａ、および（ｉｉｉ）医薬的に許容可能な担体と共にＮＣＩＳ；または
ｇ）医薬的に許容可能な担体と共にＴＦ：：ＦＸａ複合体；または
ｈ）医薬的に許容可能な担体と共にＴＦ：：ＮＣＩＳ複合体；または
ｉ）医薬的に許容可能な担体と共にＴＦ：：ＦＸａ：：ＮＣＩＳ複合体
を含んでなる。
【０１３３】
前記で定義された本発明の医薬組成物は、以上のように、脂質化ＴＦ単独またはＦＸａおよび／またはＮＣＩＳとの組み合わせ、またはＦＸａおよび／またはＮＣＩＳとの複合体を形成した形で活性成分として含まれる。特定の実施態様において、前記で定義された本発明の医薬組成物中に存在する脂質化ＴＦは、脂質化ヒトＴＦである。
【０１３４】
また、特定の実施態様において、前記で定義された本発明の医薬組成物は、活性成分（脂質化ＴＦ単独またはＦＸａおよび／またはＮＣＩＳとの組み合わせ、またはＦＸａおよび／またはＮＣＩＳとの複合体を形成して）の局所投与のための医薬的形態で製剤化される。説明のための、限定を目的としない該医薬的形態の例は、エアロゾル、溶液、懸濁液、乳液、ゲル、膏薬、クリーム、包帯剤、パッチ、軟膏、口内洗浄剤などを含む。そのために、前記で定義された活性成分を含む医薬製剤は、局所投与による該活性成分の医薬的投与形態の製造に必要な医薬的に許容可能な担体および賦形剤を含む
【０１３５】
活性成分は、治療的有効量で本発明の医薬組成物中に存在する。被験体に投与される活性成分の用量は、とりわけ、該被験体が患う病理の重症度、選択された医薬的投与形態などに依存する。この理由から、本発明で述べられた用量は、当業者のための単なる指針として見なす必要があり、当業者は前述の要因に従って用量を調節しなければならない。しかしながら、本発明の医薬組成物は、予防または治療目的で一日に一回以上投与することができる。
【０１３６】
本発明の医薬組成物は、併用療法を提供するために、出血性素因の予防および／または治療に有用な他の追加の薬剤（例えば、凝固因子、ヒト血漿など）と共に使用することができる。この追加薬剤は、同じ医薬組成物の一部であってもよく、あるいは、別の組成物の形で本発明の医薬組成物の投与に対して同時または連続（時間的に逐次的に）投与のために提供することができる。
【０１３７】
Ｖ．支持体付き医薬組成物
本発明の医薬組成物は、支持体上に配置することができる。従って、別の態様において、本発明は、本発明の医薬組成物と支持体とを含んでなる製品に関する。本明細書において用いられる「支持体」の用語は、本発明の医薬組成物をその上に配置することが可能な適した材料の担体を意味し、本発明の医薬組成物は、所望の部位、例えば、本発明の医薬組成物が治療効果を発揮する部位に運ばれ、放出される。該支持体は、固形支持体、または例えば液状支持体またはガス状支持体といった非固形支持体とすることができる。説明のための、限定を目的としない固形支持体の例は、包帯剤、バンドエイド、圧迫包帯、硬膏等を含む。説明のための、限定を目的としない液状支持体の例は、ゲル、スプレー、口内洗浄剤等を含む。説明のための、限定を目的としないガス状支持体の例は、空気、高圧ガス等を含む。特定の実施態様において、前記支持体上に配置される本発明の医薬組成物は：
（ａ）（ｉ）支持体、（ｉｉ）医薬的に許容可能な担体と共に脂質化ＴＦおよびＦＸａを含む製品、（ｉｉｉ）医薬的に許容可能な担体と共に脂質化ＴＦおよびＮＣＩＳを含む製品、および（ｉｖ）医薬的に許容可能な担体と共に脂質化ＴＦ、ＦＸａおよびＮＣＩＳを含む製品；または
（ｂ）医薬的に許容可能な担体と共にＴＦ：：ＦＸａ複合体；または
（ｃ）医薬的に許容可能な担体と共にＴＦ：：ＮＣＩＳ複合体；または
（ｄ）医薬的に許容可能な担体と共にＴＦ：：ＦＸａ：：ＮＣＩＳ複合体
を含んでなる。
【０１３８】
特定の実施態様において、本発明の医薬組成物中に存在する脂質化ＴＦは、脂質化ヒトＴＦである。
【０１３９】
支持体上に配置された本発明の医薬組成物を含むこの製品は、従来の方法、例えば本発明の医薬組成物および支持体を混合することによって得ることができる。本発明の医薬組成物および支持体の間の相互作用は、使用される本発明の医薬組成物および使用される支持体の成分の性質によって、物理的または化学的相互作用であり得る。
【０１４０】
ＶＩ．非脂質化ＴＦの出血治療のための使用
発明者らによって行われたアッセイにおいて得られた結果は、ＴＦが：
−ＦＸａのタンパク質分解活性を上昇させ、また、それに応じてトロンビンの生産を上昇させること、
−健康な被験体の血漿および血液、ならびにＦＶＩＩ欠損の血液などの、凝固因子欠損患者の血漿および血液を凝固させること、
−血小板障害を患う患者の血液を凝固させること、ならびに
−様々な動物モデルにおいて、重度および致命的な出血をインビボで停止させること、
を明確に示している。
【０１４１】
従って、これらの結果の全体を通じて、脂質化ＴＦが、健康な被験体、ならびにＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩＩ、ＦＶＩＩ、Ｆ、およびＦＸ欠損患者などの凝固因子欠損患者における出血の治療に有用な抗出血剤であることが明確に示される。
【０１４２】
欧州特許第２６６９９３号明細書には、出血の治療における、特に凝固因子、具体的にはＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸＩまたはＦＸＩＩＩから選択される凝固因子の欠損による出血の治療における、非脂質化ＴＦの使用が開示されている。しかし、この特許明細書には、ＦＶＩＩ欠損による出血の治療における非脂質化ＴＦの使用の可能性については開示も示唆もされていない。
【０１４３】
ＦＸａのタンパク質分解活性刺激剤としてのＴＦの役割に関して発明者により今般なされた発見によれば、被験体がＦＶＩＩ欠損であるか否かに関わらず、ＦＶＩＩ欠損の被験体の出血治療における非脂質化ＴＦまたはその機能的非脂質化断片の使用の可能性が確立される。
【０１４４】
従って、別の態様において、本発明は、ＦＶＩＩ欠損の被験体における出血の治療を目的とする薬剤の製造のための、非脂質化ＴＦまたはその機能的非脂質化断片の使用に関する。
【０１４５】
本明細書で用いられる「非脂質化ＴＦ」の用語は、精製されたＴＦ（血漿脂質膜を含まない）を意味する。本明細書で用いられるＴＦの用語は、野生型ＴＦ変異体および少なくとも一つの野生型ＴＦの機能を維持している突然変異体、有利には、少なくとも一つの野生型ＴＦの凝固に関連する機能を維持している突然変異体を含む。ＴＦの分離および精製は、脳、胎盤、および肺組織などのいくつかの組織、ヒツジ、ウシ、ウサギ、イヌ、ヒトなどの様々な動物由来の組織から行うこともできる。ＴＦはまた、あくまで説明として限定を目的としない例として、米国特許第６，２６１，８０３号明細書に記載されているようなプロセスで得られる組換えＴＦ（ｒＴＦ）であってもよい。特定の実施態様において、本発明の実施に用いる非脂質化ＴＦは非脂質化ヒトＴＦであり、血漿脂質膜を完全に含まないヒト組織から分離精製されたＴＦのタンパク質成分からなる。
【０１４６】
本明細書において用いられる「非脂質化ＴＦの機能的断片」の用語は、一つ以上のＴＦの機能を維持する、好ましくは例えばＦＸａおよび／またはＮＣＩＳへの結合能ならびに創傷治癒の際の抗出血機能および血管形成機能の発現といった凝固に関連する１つ以上の機能を維持する、野生型ＴＦのタンパク質成分の突然変異体および変異体を含むＴＦのペプチド誘導体、特にＴＦのタンパク質成分のペプチド誘導体を含むが、これらに限定されない。ＴＦの機能的断片のアミノ酸配列は、野生型ＴＦのタンパク質成分の断片と同一であってもよく、または少なくとも一つの野生型ＴＦの機能が保存され、有利には少なくとも一つの凝固に関連する機能を維持することを条件に、一つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、または修飾を有してもよい。単純化のために、本明細書において用いられる「非脂質化ＴＦ」の用語は、非脂質化ＴＦの任意の機能的断片を含む。
【０１４７】
非脂質化ＴＦは、従来の方法によって得ることができる。例として、ＴＦのタンパク質成分は、有機溶媒による抽出を用いて脂質成分から分離される。説明のための該有機溶媒の例は、ピリジン、エタノール、ヘプタン−ブタノール混合物などを含む。ＴＦのタンパク質成分は、従来の化学プロセスを用いて精製することができる。このような化学プロセスの例としては、例えばデオキシコール酸塩、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの界面活性剤による処理、ゲル濾過およびドデシル硫酸ナトリウム存在下での分取用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、コンカバリンＡを結合したセファロースカラムの使用、ＴＦのタンパク質成分（タンパク質）に対する抗体を用いるアフィニティーカラムの使用などが挙げられる。
【０１４８】
ＦＶＩＩ欠損の被験体に対する投与に関して、非脂質化ＴＦは適した任意の経路による投与に適した医薬的形態に製剤化される。実質的にいかなる医薬的形態を用いてもよいが、非脂質化ＴＦの非経口のための医薬的形態の使用が有利である。
【０１４９】
従って、特定に実施態様において、本発明は、非脂質化ＴＦまたはその非脂質化断片の非経口投与のための薬剤の製造における、非脂質化ＴＦまたはその非脂質化断片の使用に関する。
【０１５０】
この場合において、非脂質化ＴＦおよび医薬的に許容可能な賦形剤または担体を含む医薬組成物は、非経口投与のための形、例えば適した投薬形態に適した滅菌溶液、懸濁液、または凍結乾燥製剤に適用され；この場合、該医薬組成物は緩衝液、界面活性剤などの適した賦形剤を含む。いずれの場合でも、この賦形剤は、選択された医薬的投与に従って選択される。担体および賦形剤、ならびに本発明の製品の投与に適した投与形態についての情報は、製剤学専門書に見いだすことができる。一般的な薬剤の様々な医薬的投与形態、その製造プロセスの概説は、C. Fauli i Trilloによる書籍「Tratado de Farmacia Galenica」（Galenic Pharmacy Treatise），1st Edition, 1993, Luzan 5, S.A.編に見いだすことができる。
【０１５１】
ＦＶＩＩ欠損の被験体に投与される非脂質化ＴＦの用量は広い範囲で異なり、例えば、約０．０１μｇ活性タンパク質／ｍｌ〜１００μｇ活性タンパク質／ｍｌであってよい。投与される非脂質化ＴＦの用量は、例えば活性および生物学的半減期といった使用されるＴＦタンパク質の性質、製剤中のＴＦタンパク質の濃度、患者の臨床症状、治療される出血障害などを含むいくつかの要因に依存する。
【実施例】
【０１５２】
ＦＸａの刺激因子としての脂質化ＴＦの能力を評価する目的で、一連のインビトロおよびインビボアッセイを実施した。具体的には以下のとおりである。
【０１５３】
１．脂質化ＴＦ（単独および組み合わせで）が、ＦＶＩＩの不存在下（欠損、欠乏または免疫遮断により引き起こされる）でフィブリン血餅形成および血液凝固の原因となるＦＸａの直接刺激因子として作用することを実証するインビトロアッセイ
１．１  脂質化ＴＦは、ＦＸａタンパク質分解活性を増加し、従ってＦＶＩＩの不存在下でのトロンビン産生を増加する（溶液におけるおよび洗浄された血小板の懸濁液における色素産生アッセイ）。
１．２  脂質化ＴＦは、ＦＶＩＩ欠乏患者からの血漿および血液を凝固することが出来る（血漿および非抗凝固処理全血における凝固アッセイ）。
１．３  脂質化ＴＦは、ＦＶＩＩに対する単クローン性抗体の存在下において健康被験体の血漿を凝固することが出来る。
１．４  脂質化ＴＦとＮＣＩＳとの組み合わせは、ＦＶＩＩ欠乏血漿における血液凝固を相乗的に増加する（凝固アッセイ）。
１．５  脂質化ＴＦとＦＸａとの組み合わせは、ＦＶＩＩに対する単クローン性抗体の存在下における血液凝固を相乗的に増加する（ＦＸ欠乏血漿における凝固アッセイ）。
１．６  脂質化ＴＦ、ＦＸａおよびＮＣＩＳの組み合わせは、抗ＦＶＩＩ抗体の存在下における凝固を相乗的に増加する（ＦＸ欠乏血漿における凝固アッセイ）。
【０１５４】
２．低濃度（いかなる凝血促進作用も誘導することが出来ない）でのＦＸａとの脂質化ＴＦの組み合わせが、ＦＸ欠乏血漿の凝固を引き起こすことを実証するインビトロアッセイ
２．１  このセリンプロテアーゼが低濃度で存在する場合、脂質化ＴＦは、ＦＸａの刺激因子として作用する。
２．２  脂質化ＴＦと、ＦＸａおよびＮＣＩＳとの組み合わせは、ＦＸａの刺激において相乗的に作用する。
【０１５５】
３．脂質化ＴＦ（単独および組み合わせで）が、ＦＶＩＩよりもむしろ他の凝固因子が欠乏している患者における凝固を引き起こすことを実証するインビトロアッセイ
３．１  脂質化ＴＦは、凝固因子ＦＶ、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、およびＦＸＩＩＩ（凝固因子欠乏血漿における、ならびにＦＸＩＩＩおよびＦＩＸからの非凝固全血における凝固アッセイ）が欠乏している患者からの血漿および血液を凝固する。
３．２  脂質化ＴＦは、前もってヘパリン処理された全血および血漿を凝固する。
３．３  脂質化ＴＦは、ワルファリンで処置された動物からの血漿を凝固する。
３．４  脂質化ＴＦとＮＣＩＳとの組み合わせは、凝固因子ＦＶ、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、およびＦＸＩＩＩ（凝固因子欠乏血漿における凝固アッセイ）が欠乏している患者からの血漿における、および血友病患者からの全血における血液凝固を相乗的に増大する。
【０１５６】
４．脂質化ＴＦ（単独および組み合わせで）が健康な被験体における血液凝固を引き起こすことを実証するインビトロアッセイ
４．１  脂質化ＴＦは、健康な被験体からの血漿および血液を凝固する。
４．２  脂質化ＴＦとＮＣＩＳとの組み合わせは、健康な被験体からの血漿および血液における血液凝固を相乗的に増大する。脂質化ＴＦがリン脂質と組み合わされる場合、相乗作用はない。
【０１５７】
５．先天性および後天性の（血小板減少性の）血小板障害を患う患者からの血漿における脂質化ＴＦ（単独および組み合わせで）の凝固効果を実証するインビトロアッセイ
５．１  脂質化ＴＦは、先天性の血小板障害を患う患者からの血漿を凝固する。
５．２  脂質化ＴＦとＮＣＩＳとの組み合わせは、先天性の血小板障害を患う患者からの全血における凝固を増加する。
５．３  脂質化ＴＦは、血小板減少症の試料を凝固する。
【０１５８】
６．ＴＦが対照ラットにおける局所抗出血処置のために有用な薬剤であることを実証するインビボアッセイ（前もって切断された血管上で、単独でまたはＮＣＩＳとの組み合わせにおける直接適用により）
６．１  脂質化ＴＦ（単独またはＮＣＩＳとの組み合わせで）は、ラットの尾の近位の切断による重度の出血動物モデルにおいて局所止血剤として有用である。
６．２  脂質化ＴＦは、前もってヘパリンまたはワルファリンで処置された重度の出血動物モデルにおける局所止血剤として有用である。
６．３  脂質化ＴＦは、ラットの尾の近位の切断による致死的な出血動物モデルにおける局所止血剤として有用である。
【０１５９】
Ｉ．材料および方法
材料
脂質化ＴＦの利用源として、ヒト組み換え組織因子（ｒＴＦ）、Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ（登録商標）Ｓ、およびＮｅｏｐｌａｓｔｉｎ（登録商標）Ｐｌｕｓを使用した。具体的に、以下の市販の製剤を使用した：Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙにより記載された方法に従って再脂質化された（ｒｅｌｉｐｉｄａｔｅｄ）、ヒト組み換え組織因子（非脂質化）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，ＵＳＡ）；カルシウムを含む、凍結乾燥された（ｌｙｏｆｉｌｉｚｅｄ）ヒト胎盤トロンボプラスチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ（登録商標）Ｓ，Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｃ）；カルシウムを含む、凍結乾燥されたウサギの脳（Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ−Ｒｏｃｈｅ）。
【０１６０】
ＴＦタンパク質の凝血促進活性を、基準物質としてヒト組み換え脂質化ＴＦ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，ＵＳＡ）を用いる検量線により決定し、本文中で活性タンパク質／ｍｌのμｇとしておよび表中でμｇ／ｍｌとして表した。簡素化のために、本実施例において、別に記載されない限り、用語ｒＴＦまたはＴＦは、脂質化ＴＦを指す。Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ市販化合物を、ＦＸａ、ＦＩＩ、およびＦＶａの利用源として使用した。市販のＤａｄｅ（登録商標）Ａｃｔｉｎ（登録商標）ＦＳ試薬（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）を、ＮＣＩＳとして使用した。市販の凝固因子欠乏血漿（ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、およびＦＸＩＩＩ）を、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｍａｒｂｕｒｇ  ＧｍｂＨから購入した。
【０１６１】
方法
オクチルグルコシドによる透析を用いる脂質ベシクルにおけるＴＦを再脂質化するための方法（Ｍｏｒｒｉｓｅｙ  Ｍｅｔｈｏｄ）
非脂質化ＴＦを、非イオン性界面活性剤Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（オクチルグルコシド）を用いて、脂質ベシクル中に取り込む。ＴＦおよび脂質の両方を、ミセルを形成するオクチルグルコシド中に溶解する。オクチルグルコシドを、その高い臨界ミセル濃度（ＣＭＣ＝２０から５０ｍＭ）に起因して透析により溶液から容易に取り除くことが出来る。オクチルグルコシドが取り除かれる場合、該脂質は、単層のベシクルにおいて組織化される。ＴＦを、その膜貫通領域によってこれらのベシクル中に浸漬する。通常、ＴＦ分子の５０〜８０％が、ベシクルから外側に向けて配置される。
【０１６２】
緩衝液および原液
Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍからのオクチルグルコシド（ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド）
【０１６３】
【表１】
2009503008.tif 000003
【０１６４】
【表２】
2009503008.tif 000004
【０１６５】
オクチルグルコシド（ＯＧ）における脂質溶液の調製
１．所望の脂質モル半径を用いて、２．６マイクロモルの総脂質を、それぞれの試料について調製する。
２．アルゴンまたは窒素を流して、脂質混合物を乾燥する。
３．管が乾燥したことが明らかな場合に、もう６０分間真空乾燥する。
４．４００μｌのＯＧ／ＨＢＳの新鮮な溶液（室温で）を乾燥脂質を含む管に加える。
【０１６６】
【表３】
2009503008.tif 000005
【０１６７】
【表４】
2009503008.tif 000006
【０１６８】
再脂質化
１ｍｌの最終容量を完成させるまで、４００μｌのＯＧ／脂質および十分なＨＢＳＡを含む管に、ＴＦの所望の量を加える。この段階を室温で実施する。
【０１６９】
洗浄された血小板懸濁液の取得
洗浄された血小板懸濁液を、Ｒａｄｏｍｓｋｉ  Ｍらにより記載された方法（Ｒａｄｏｍｓｋｉ  Ｍ，Ｍｏｎｃａｄａ  Ｓ．；１９８３  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ．）これは、プロスタサイクリンによりヒト血小板を洗浄するための改善された方法である．１５；３０（４）：３８３−９）に従って、健康な志願者からの血液採取（３．１５％クエン酸ナトリウム）から調製した。標本の処理を、血液採取後すぐに室温で、常時実施した。血小板活性化および機能性の状態を、アッセイの実施の前および実施中の凝集アッセイにより分析した。自己活性化および機能性を、既知のアゴニスト（コラーゲン）を用いた活性化により評価した。
【０１７０】
インビトロアッセイ
色素産生アッセイ
異なる色素産生アッセイは、溶液および活性化血小板懸濁液中で設計し、因子Ｘａタンパク質分解活性に対するｒＴＦの影響を実証した。
【０１７１】
ＦＸａアミド分解活性は、Ｓ−２７６５（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を、ＦＸａに対する色素産生基質として用いる色素産生アッセイにより測定し、他方トロンビン形成活性は、Ｓ−２２３８（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）をトロンビンのための色素産生基質として用いて分析した。
【０１７２】
色素産生アッセイは、懸濁液において（緩衝液において）、および洗浄した血小板懸濁液を用いて実施した。洗浄した血小板懸濁液（媒質において２５０，０００血小板数／μｌの濃度を有するような適した容量）を用いる場合において、調査されるそれぞれの因子のそれぞれの適した容量を、ＥＬＩＳＡプレート上で分配した。最終的に、特異的な色素産生基質の添加により、４０５ｎｍで読み取る分光測定器により当該タンパク質分解活性を定量した。アミド分解活性を測定するためのアッセイにおいて、ＦＸａおよび異なるｒＴＦ濃度のみを分配し、他方トロンビン形成活性を測定するためのアッセイにおいて因子ＩＩ（プロトロンビン）およびＦＶａ（洗浄された血小板アッセイにおいてこれらが既に内因性ＦＶａを含んでいるならば、後者は懸濁液におけるアッセイの場合のみ）を更に添加する必要があった。
【０１７３】
血漿における凝固アッセイ
血漿における自然凝血促進活性（非刺激）を、コアギュロメータ（Ｆｉｂｒｉｎｔｉｍｅｒ  ＢＦＴ−ＩＩ  血液凝固測定器  Ｄａｄｅ−Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において、一定の段階での凝固アッセイにより測定した。要約すれば、５０μｌの血小板欠乏血漿を、すでに調節されたキュベットに加え、５０μｌの蒸留水を加えた。この混合物を放置して６０秒間３７℃でインキュベートし、５０μｌの２５ｍＭ塩化カルシウムを直ちに加え、凝固時間を、コアギュロメータ（（血餅の形成により検証される）において秒で測定し、血餅の形成を確認した。試料の１づつを、繰り返して分析した。血小板欠乏血漿を、遠心分離手順により得て、血小板の数を、Ｃｏｕｌｔｅｒにより測定した。
【０１７４】
全血における凝固アッセイ
非抗凝固化全血における凝血促進活性を、凝固方法により測定した。調査される、異なる薬剤を、１ｍｌの非抗凝固処理全血に加え、採取の開始から固まった血餅が現れるまで、クロノメータで、凝固時間を測定した。異なる薬剤の効果を、血液凝固時間の短縮または長期化により評価した。
【０１７５】
インビボアッセイ
ラットの尾の近位の切断による重度の出血モデル
重量が３５０〜４５０グラムである２３匹のＳｐｒａｇｅ−Ｄａｗｌｅｙ系の雄のラットを、３つの処置群に無作為に分配した：対照群は、生理食塩水で局所処置を受ける１４匹の動物からなり、一方、他の２つの群はまた、１．２μｇ／ｍｌのｒＴＦでの局所処置、および１．２μｇ／ｍｌのｒＴＦ＋ＮＣＩＳ（容量：容量  １；２）でのｎ＝４局所処置をそれぞれ受ける５匹の動物からなる。全ての化合物は、動物の尾の近位の切断部と局所的に接触し、プラスチックのエッペンドルフ型のピペットにより分配されて、止血的に（ｈｅｍｏｓｔａｓｔｉｃａｌｌｙ）作用する。固定し、固まった血餅の形成は、更なる出血が無いことの確認により明らかであった。
【０１７６】
抗凝固剤で処置された動物におけるラットの尾の近位の切断による重度の出血モデル
重量が３５０〜４５０グラムである２７匹のＳｐｒａｇｅ−Ｄａｗｌｅｙ系の雄のラットを、５つの処置群に無作為に分配した：対照群は、生理食塩水で局所処置を受ける１４匹の動物からなった。２つの群は、尾の切断手順が開始する前に静脈内で１５分間２００Ｕ／Ｋｇのヘパリンを受け（ＴＦ  ｎ＝３で処置され、食塩水ｎ＝５で処置される）、他の２つの群は、尾の切断手順が開始する前に３日間、経口的に０．１ｍｇ／ｋｇ／日のワルファリンを受けた（ＴＦ  ｎ＝３で処置され、食塩水ｎ＝２で処置される）。１．２μｇ／ｍｌ  ｒＴＦでの局所処置を、それぞれの処置群の一つのみに実施した。従って、それは、それぞれの抗凝固処置に対する対照の処置群であった。脂質化ＴＦは、動物の尾の近位の切断部と局所的に接触し、プラスチックのエッペンドルフ型のピペットにより分配されて、止血的に作用する。固定し固まった血餅の形成は、更なる出血が無いことの確認により明らかであった。
【０１７７】
ラットの頚動脈における穿刺による致死の出血モデル
重量が３５０〜４５０グラムである４匹のＳｐｒａｇｅ−Ｄａｗｌｅｙ系のラットを、２匹の動物を含む、２つの処置群に無作為に分配した。対照群動物は、処置として、生理食塩水を受けた一方、他の群は、局所投与された脂質化ＴＦを受けた（２μｇの活性タンパク質の最終用量で）。ラットの頚動脈における穿刺による致死の出血モデルを、以下の標準手順に従って実施した。脂質化ＴＦおよび生理食塩水を、それぞれの３ｍｌを含む包帯剤において、穿刺の点上に直接投与した。これは、２分間の対応する処置の圧迫と接触とに組み合わされた。
【０１７８】
ＩＩ．結果
１．脂質化ＴＦ（単独および組み合わせで）が、ＦＶＩＩの不存在下（欠損、欠乏または免疫遮断により引き起こされる）でフィブリン血餅形成および血液凝固の原因となるＦＸａの直接刺激因子として作用することを実証するインビトロアッセイ
１．１．脂質化ＴＦは、ＦＸａタンパク質分解活性を増加し、従ってＦＶＩＩの不存在下でのトロンビン産生を増加する。
ＦＶＩＩの不存在下における因子Ｘａ刺激剤として脂質化ＴＦの能力を評価するために、いくつかのインビトロアッセイを実施した：（ｉ）溶液中のＦＸａアミド分解活性に対する色素産生アッセイ；および（ｉｉ）洗浄された血小板懸濁液におけるトロンビン形成活性に対する色素産生アッセイ。
【０１７９】
ＦＸａアミド分解活性に対する色素産生アッセイ
ＦＸａ特異的基質Ｓ−２７６５を用いる溶液における、ＦＸａアミド分解活性に対する直接アッセイは、脂質化ＴＦが、ＦＸａタンパク質分解活性を非常に著しく増加することが出来ることを実証した。高ｒＴＦ濃度（１μｇ／ｍｌ）の存在において、低および高ＦＸａ濃度により生成される活性の増加（ｐ＜０．００１）が、観察された。同様の著しい刺激効果（ｐ＜０．００１）が、より低い脂質化ＴＦ濃度（０．１μｇ／ｍｌ）の存在下において観察された。表１は、５つの独立した実験において得られた結果を示す。
【０１８０】
【表５】
2009503008.tif 000007
【０１８１】
洗浄された血小板懸濁液におけるトロンビン形成活性のための色素産生アッセイ
血小板懸濁液を、凝血促進表面の利用源として使用し、トロンビン形成を、特異的基質Ｓ−２２３８により測定した場合、検出された凝血促進作用は、非常により大きかった（表２）。外因性ＦＸａの不存在下において、脂質化ＴＦは、トロンビン形成において著しい刺激効果を生じた（ｐ＜０．００１）。同様の刺激効果が、外因性ＦＸａの存在下において、低および高濃度の両方で観察された（ｐ＜０．００１）。
【０１８２】
【表６】
2009503008.tif 000008
【０１８３】
１．２．脂質化ＴＦは、ＦＶＩＩ欠乏患者からの血漿および血液を凝固することが出来る（血漿および非抗凝固処理全血における凝固アッセイ）。
一連のインビトロ凝固アッセイを実施し、ＦＶＩＩ欠乏患者からの血漿および非抗凝固処理全血における脂質化ＴＦの凝固効果を示し、従って、脂質化ＴＦは、抗出血性の処置のために有用な薬剤である。
【０１８４】
市販のＦＶＩＩ枯渇血漿およびＦＶＩＩ欠乏患者からの非抗凝固処理全血における凝固アッセイ
市販のＦＶＩＩ枯渇血漿およびＦＶＩＩが欠乏している２人の患者からの非抗凝固処理全血を用いる凝固アッセイにより、脂質化ＴＦの凝固に対する効果を調査した（表３）。脂質化ＴＦは、濃度依存性に欠損ＦＶＩＩ血漿における凝固を著しく促進することが出来た。同じ方法において、脂質化ＴＦは、ＦＶＩＩ欠乏患者からの非抗凝固処理全血をまた、低、中および高脂質化ＴＦ濃度の存在下において凝固し、ＦＶＩＩの不存在下においてでさえ、脂質化ＴＦにより正常の凝固を生じることが出来ることを示した。表３は、枯渇ＦＶＩＩ血漿に対する５つの独立した実験から得られた結果を示す。
【０１８５】
【表７】
2009503008.tif 000009
【０１８６】
健康な志願者からの血液に対する脂質化ＴＦの効果は、０．０１μｇ／ｍｌの濃度後に著しかった一方、より大きい濃度が、ＦＶＩＩ欠乏患者において必要であった（表４）。著しい凝血促進作用（ｐ＜０．００１）が、０．１μｇ／ｍｌの後に検出されたが、脂質化ＴＦは、０．０１μｇ／ｍｌの濃度で凝固時間を正常化することが出来、基礎条件での標準の被験体において検出された凝固時間と該脂質化ＴＦ濃度を有するＦＶＩＩ欠乏被験体において検出された凝固時間の間に差異は存在しなかった。最終的に、１μｇ／ｍｌでの脂質化ＴＦが、ＦＶＩＩ欠損血漿における同じ強い凝血促進作用を誘導することが出来なかったが、非常に著しい効果が観察され、このことは、脂質化ＴＦが、これらの患者における止血を正常化することができることを示す。
【０１８７】
【表８】
2009503008.tif 000010
【０１８８】
１．３．脂質化ＴＦは、ＦＶＩＩに対する単クローン性抗体の存在下において健康な被験体の血漿を凝固することが出来る（凝固アッセイ）。
インビトロ凝固アッセイを実施し、ＦＶＩＩに対する単クローン性抗体（この抗体は、正常の血漿において凝固を遮断することが出来る）の存在下において健康な被験体中の血漿における脂質化ＴＦの凝固効果を示した。
【０１８９】
抗ＦＶＩＩを用いた遮断によりＦＶＩＩが欠乏した正常血漿における凝固アッセイ
脂質化ＴＦの血漿凝固に対する効果を、ＦＶＩＩに対する単クローン性抗体の存在下において、健康な志願者からの血漿を用いる凝固アッセイにより調査した（表５）。脂質化ＴＦは、ＦＶＩＩに対する単クローン性抗体（これは、血液凝固を完全に阻害することが出来る）の存在下においてでさえ凝固を引き起こすことが出来た。これらの実験条件（ＦＶＩＩ欠乏試料などの）下で、脂質化ＴＦは、血漿凝固を生じることが出来る。
【０１９０】
【表９】
2009503008.tif 000011
【０１９１】
１．４．脂質化ＴＦとＮＣＩＳとの組み合わせは、ＦＶＩＩ欠乏血漿における血液凝固を相乗的に増加する（凝固アッセイ）。
一連のインビトロ凝固アッセイを実施し、ＦＶＩＩ欠乏血漿における負に帯電した無機表面［ＮＣＩＳ］と組み合わされる脂質化ＴＦの凝固効果を示した。該凝血促進作用は、脂質化ＴＦが凝固促進剤として単独で使用された場合に得られたものを超えた。これらの結果は、脂質化ＴＦにより介在される効果が、ＦＶＩＩに依存せず、その特異的リガンドが存在しない場合でさえ血漿凝固を誘導することが出来ることを示す。表６は、５つの独立した実験において得られた結果を示す。
【０１９２】
【表１０】
2009503008.tif 000012
【０１９３】
１．５．脂質化ＴＦとＦＸａとの組み合わせは、ＦＶＩＩに対する単クローン性抗体の存在下にいて血液凝固を相乗的に増加する（ＦＸ欠乏血漿における凝固アッセイ）。
ＦＶＩＩの不存在下における低濃度（１７０ｐＭおよび１７００ｐＭ）での脂質化ＴＦおよびＦＸａの組み合わせの凝固効果を、抗ＦＶＩＩで免疫遮断されるＦＸａ欠損血漿において調査した（表７）。
【０１９４】
【表１１】
2009503008.tif 000013
【０１９５】
１．６．脂質化ＴＦ、ＦＸａおよびＮＣＩＳの組み合わせは、ＦＶＩＩに対する単クローン性抗体の存在における凝固を相乗的に増加する（ＦＸ欠乏血漿における凝固アッセイ）。
低濃度（１７０ｐＭおよび１７００ｐＭ）での脂質化ＴＦ、ＦＸａとＮＣＩＳとの組み合わせの凝固効果をまた、ＦＸａ欠乏血漿において調査した（表８）。
【０１９６】
【表１２】
2009503008.tif 000014
【０１９７】
２．低濃度（いかなる凝血促進作用も誘導することが出来ない）でのＦＸａとの脂質化ＴＦの組み合わせが、ＦＸ欠乏血漿の凝固を引き起こすことを実証するインビトロアッセイ
２．１．このセリンプロテアーゼが低濃度で存在する場合、脂質化ＴＦは、ＦＸａの刺激因子として作用する。
インビトロ凝固アッセイを、凝固ＦＸ欠乏血漿において実施し、脂質化ＴＦのＦＸａに対する相乗効果を示した（１７０ｐＭおよび１７００ｐＭの低濃度でＦＸ欠乏血漿に加え、従って、これらの血漿は、いかなる凝固経路からもＦＸａを生じることが出来ない）。低濃度での脂質化ＴＦとＦＸａとの組み合わせの凝血促進作用を、表９に示す。
【０１９８】
【表１３】
2009503008.tif 000015
【０１９９】
２．２．脂質化ＴＦと、ＦＸａおよびＮＣＩＳとの組み合わせは、ＦＸａの刺激において相乗的に作用する。
低濃度（１７０ｐＭおよび１７００ｐＭ）での脂質化ＴＦ、ＦＸａとＮＣＩＳとの組み合わせの凝血促進作用をまた、ＦＸ欠乏血漿において調査した（表１０）。
【０２００】
【表１４】
2009503008.tif 000016
【０２０１】
３．脂質化ＴＦ（単独および組み合わせで）が、ＦＶＩＩよりもむしろ他の凝固因子が欠乏している患者における血液凝固を引き起こすことを実証するインビトロアッセイ
３．１．脂質化ＴＦは、凝固因子ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、およびＦＸＩＩＩが欠乏している患者からの血漿および血液を凝固する。
脂質化ＴＦ（単独）の凝固因子欠乏血漿に対する凝血促進作用を、免疫親和性技法により、欠乏した市販の血漿、並びに血友病Ａ（ＦＶＩＩＩ欠乏）と診断された３人の患者および血友病Ｂ（ＦＩＸ欠乏）と診断された２人の患者からの血漿を用いて調査した。表１１は、該結果を示す。１μｇ／ｍｌの濃度で、脂質化ＴＦは、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、およびＦＸＩＩＩが欠乏している全ての血漿を効果的に凝固することが出来た。一方、既知のＦＸａ補因子、ＦＶａの不存在下において、脂質化ＴＦはまた、高および中濃度でのみであるが、血漿凝固を生じることが出来た。残りの凝固因子欠乏において、脂質化ＴＦは、使用される全ての濃度で効果的であり、非常に低濃度で、優れた結果が得られた。ＦＸ（１％）の不存在下においてでさえ、脂質化ＴＦは、凝固することが出来たが、しかし高濃度のみであった。すべてのこれらの結果を、血友病Ａおよび血友病Ｂを患う患者からの試料で確認した。
【０２０２】
【表１５】
2009503008.tif 000017
【０２０３】
血友病Ａおよび血友病Ｂを患う人々からのヒト非抗凝固処理全血における脂質化ＴＦ（単独）の凝血促進作用を、凝固アッセイにより評価した。血餅が固まるのに要する時間（分）を推定することにより、血餅形成を測定した。健康な志願者からの血液における脂質化ＴＦの効果は、０．００１μｇ／ｍｌの濃度から有意であったが、血友病患者においてはより大きい用量が必要であり、有意の凝血促進作用（ｐ＜０．００１）が、０．０１μｇ／ｍｌから検出された。０．１μｇ／ｍｌの濃度で、脂質化ＴＦは、凝固時間を完全に正常化することが出来、正常な被験体において検出された凝固時間と血友病にかかった被験体において検出された凝固時間との間に差異は存在しなかった。表１２は、健康な個体（試料番号１〜４）からの４つの試料、血友病Ａを患う患者からの３つの試料および血友病Ｂを患う患者からの２つの試料から得られた結果を示す。
【０２０４】
【表１６】
2009503008.tif 000018
【０２０５】
３．２．脂質化ＴＦは、前もってヘパリン処理された、全血および血漿を凝固する。
脂質化ＴＦは、高ヘパリン濃度で前もってインキュベートされた、血漿（表１３）および非抗凝固処理全血（表１４）を凝固することが出来、ＦＸａに対するこの作用は、ヘパリン型阻害剤の存在下でさえ、この抗凝固促進剤により介在された阻害作用から影響を受けないことを実証した。
【０２０６】
【表１７】
2009503008.tif 000019
【０２０７】
【表１８】
2009503008.tif 000020
【０２０８】
３．３．脂質化ＴＦは、ワルファリンで処置された動物からの血漿を凝固する。
脂質化ＴＦは、方法の中で詳細に示された手順に従ってワルファリン処置されたラットからの血漿を凝固することが出来た。該結果は、表１５において、全てのビタミンＫ依存凝固因子の合成が止められる場合でさえ、脂質化ＴＦが凝固することが出来ることを示し、ＦＸａに対するこの作用が、この抗凝固剤により介在された阻害作用から影響を受けないことを実証する。
【０２０９】
【表１９】
2009503008.tif 000021
【０２１０】
３．４．脂質化ＴＦとＮＣＩＳとの組み合わせは、凝固因子ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、およびＦＸＩＩＩ（凝固因子欠乏血漿における凝固アッセイ）が欠乏している患者からの血漿における、および血友病患者からの全血における血液凝固を相乗的に増大する。
一連のインビトロ凝固アッセイを実施し、凝固因子欠乏患者（ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、およびＦＸＩＩＩ）からの血漿におけるＮＣＩＳと組み合わせた脂質化ＴＦの凝固効果を示した。該凝血促進作用は、脂質化ＴＦが凝血促進剤として単独で使用された場合に得られたものを超えた。脂質化ＴＦがＦＶ欠乏血漿（ＦＶ−Ｄ血漿）を凝固することが出来なかった低濃度（１μｇ／ｍｌ）でさえ、両方の薬剤の組み合わせは、著しい凝血促進作用をもたらした。同じく、同様の相乗作用が、ＦＶＩＩ欠損血漿（ＦＶＩＩ−Ｄ血漿）が使用された場合に得られた。これらの結果は、脂質化ＴＦにより介在された効果が、ＦＶＩＩに依存せず、ＦＶの不存在下においてでさえ血漿凝固を誘導することができることを示す。同様に、組み合わせ（脂質化ＴＦ＋ＮＣＩＳ）はまた、血友病患者（ＡおよびＢ）からの血漿試料における効力のある凝血促進作用を及ぼす。表１６は、５つの独立した実験において得られた結果を示す。
【０２１１】
【表２０】
2009503008.tif 000022
【０２１２】
脂質化ＴＦおよびＮＣＩＳの組み合わせの非抗凝固処理全血における凝血促進作用をまた、血友病Ａ（３人の患者）およびＢ（２人の患者）を患う患者からの血液を使用する凝固アッセイにより調査した。脂質化ＴＦが単独であるアッセイとの比較により（表１２）、組み合わせ（ｒＴＦ＋ＮＣＩＳ）の凝血促進作用は、有意に（ｐ＜０．００１）より大きかった（表１７）。
【０２１３】
【表２１】
2009503008.tif 000023
【０２１４】
４．脂質化ＴＦ（単独および組み合わせで）が健康な被験体における血液凝固を引き起こすことを実証するインビトロアッセイ
４．１．脂質化ＴＦは、健康な被験体からの血漿および血液を凝固する。
一連のインビトロアッセイを実施し、止血障害の病歴がない健康な志願者からの血漿および非抗凝固処理全血における脂質化ＴＦの凝固効果を示す。表１８は、健康な血漿における５つの独立した実験から得られた結果を示し、表１９は、非抗凝固処理全血における結果を示す。
【０２１５】
【表２２】
2009503008.tif 000024
【０２１６】
【表２３】
2009503008.tif 000025
【０２１７】
４．２．脂質化ＴＦとＮＣＩＳとの組み合わせは、健康な被験体からの血漿および血液における血液凝固を相乗的に増強する。脂質化ＴＦがリン脂質と組み合わされる場合、相乗作用は存在しない。
一連のインビボ凝固アッセイを実施し、健康な志願者からの血漿におけるＮＣＩＳと組み合わされたｒＴＦの凝固効果を示した。表２０は、５つの独立した実験から得られた結果を示す。ｒＴＦが単独であったアッセイとの比較により、組み合わせ（ｒＴＦ＋ＮＣＩＳ）の凝血促進作用は、使用された濃度のそれぞれおよび全てにおいて有意に（ｐ＜０．００１）より大きかった。
【０２１８】
【表２４】
2009503008.tif 000026
【０２１９】
表２１は、脂質化ＴＦがリン脂質と組み合わされる場合に相乗作用が存在しないことを示す（ＰＣ／ＰＳの０．６６ｍＭ；異なる比率でのホスファチジコリン／ホスファチジセリン）。
【０２２０】
【表２５】
2009503008.tif 000027
【０２２１】
５．先天性および後天性の（血小板減少性の）血小板障害を患う患者からの血液における脂質化ＴＦ（単独および組み合わせで）の凝固効果を実証するインビトロアッセイ
５．１．脂質化ＴＦは、先天性の血小板障害を患う患者からの全血を凝固する。
血小板障害を患う患者における血液凝固に対する脂質化ＴＦの凝血促進作用を、Ｇｌａｎｚｍａｎｎ病およびベルナール・スリエ症候群を患う２人の患者からの血液を用いて凝固アッセイにより調査した。ｒＴＦは、Ｇｌａｎｚｍａｎｎ病およびベルナール・スリエ症候群を患う個体における血液の凝固を、非常に著しく，かつ濃度依存性に促進することが出来た（表２２）；ｒＴＦは、従って、該個体の抗出血処置に対して有用な薬剤である。
【０２２２】
【表２６】
2009503008.tif 000028
【０２２３】
５．２．脂質化ＴＦとＮＣＩＳとの組み合わせは、先天性の血小板障害を患う患者からの全血における凝固を増加する。
一連のインビトロアッセイを実施し、先天的な血小板障害を患う患者からの全血においてＮＣＩＳと組み合わせたｒＴＦの凝固効果を示す。表２３は、Ｇｌａｎｚｍａｎｎ病、ベルナール・スリエ症候群を患う２人の患者から得られた結果を示す。ｒＴＦが単独であったアッセイとの比較により、組み合わせ（ｒＴＦ＋ＮＣＩＳ）の凝血促進作用は、それぞれの患者において有意に（ｐ＜０．００１）より大きかった。
【０２２４】
【表２７】
2009503008.tif 000029
【０２２５】
５．３．脂質化ＴＦは、血小板減少症の試料を凝固する。
一連のインビトロ凝固アッセイを実施し、血小板数が異なる血漿における脂質化ＴＦの凝固効果を示した。表２４は、血小板減少性状態に対する正常の血小板数から得られた結果を示す。
【０２２６】
【表２８】
2009503008.tif 000030
【０２２７】
６．ＴＦが対照ラットにおける局所抗出血処置のために有用な薬剤であることを実証するインビボアッセイ（前もって切断された血管上での直接適用により）。
６．１．脂質化ＴＦは、ラットの尾の近位の切断による重度の出血動物モデルにおいて局所止血剤として有用である。
インビボアッセイを実施して、単独またはＮＣＩＳとの組み合わせで投与された脂質化ＴＦが、局所抗出血処置のために有用な薬剤であることを示した。単独またはＮＣＩＳとの組み合わせで投与される、局所止血剤としての脂質化ＴＦの使用を、ラットの尾の近位の切断による動物モデルにおける重度の出血の使用により評価した。得られた結果を、表２５において示す。見られ得るように、該重度の出血モデルにおいて、出血は、対照動物（生理食塩水で処置された、ＰＳＳ対照）において、１８．１±５．９８分で自然に凝固した；しかし、脂質化ｒＴＦ（単独）の局所投与は、有意な減少をもたらした（１１．１±５．５４分、ｐ＜０．００１）。ｒＴＦがＮＣＩＳと組み合わせて投与された場合、凝血促進作用は、さらにより大きかった（５．０±１．１分、ｐ＜０．００１）。
【０２２８】
【表２９】
2009503008.tif 000031
【０２２９】
同じ実験条件下で、非脂質化ＴＦ（ｎ＝３）を、評価した。効果は観察されず、出血凝固時間は、対照動物と同様であった。これらの結果は、非脂質化ＴＦが、出血症状を局所的に処置するために有用ではなかったことを示す。
【０２３０】
６．２．脂質化ＴＦは、前もってヘパリンまたはワルファリンで処置された重度の出血動物モデルにおいて局所止血剤として有用である。
インビボアッセイが実施され、単独で投与された脂質化ＴＦが抗凝固条件における局所抗出血（ａｎｔｉｈｅｍｏｒｒａｇｉｃ）処置のために有用な薬剤であることを示した（表２５）。単独で投与される局所止血剤としての脂質化ＴＦの使用を、尾の切断手順を開始する前に静脈内で１５分間２００Ｕ／Ｋｇのヘパリンで、または尾の切断手順を開始する前に３日間０．１ｍｇ／ｋｇ／日のワルファリンで前もって処置されたラットの尾の近位の切断による動物モデルにおける重度の出血の使用により評価した。得られた結果を、表２６に示す。見られ得るように、該重度の出血モデルにおいて、生理食塩水で処置された対照食塩水群は、１８．１±５．９８分で自然に凝固した。対照のヘパリン処置群の出血は、自然に凝固しなかった（＞９０分）。対照のワルファリン処置群は、４１，６±８．５分で自然に凝固した。表２６は、脂質化ＴＦ（単独）の局所投与が、全ての処置群において著しい減少をもたらしたことを示す。
【０２３１】
【表３０】
2009503008.tif 000032
【０２３２】
６．３．脂質化ＴＦは、頚動脈における穿刺による致死的な出血動物モデルにおける局所止血剤として有用である。
インビボアッセイを実施して、単独で投与されたｒＴＦが、血管上に直接適用された局所抗出血処置のために有用な薬剤であることを示した。単独で投与されたｒＴＦの使用を、頚動脈における穿刺による動物モデルにおける致死的な出血の使用により評価した。得られた結果を表２７に示し、この結果は、非常に有意であった。見られ得るように、対照動物の群において（生理食塩水で処置された、ＰＳＳ対照）、全ての動物が出血で死亡した、他方、脂質化ＴＦの群において、動物は死亡せず、切断部は、全ての場合において首尾よく塞がれ凝固され得た。該処置は、安定した凝固および穿刺創の封鎖を得るために必要な時間の観点から有効であった。
【０２３３】
【表３１】
2009503008.tif 000033
【０２３４】
結論：
実施例番号１からの結果は、以下を明確に実証する。
１）そのリガンドＦＶＩＩの不存在下において、脂質化ＴＦは、そのタンパク質分解活性を著しく増加するＦＸａと直接相互作用することが出来（両方、アミド分解およびトロンビン形成）、この結果は、ＦＸａに対する新たな補因子（周知のＦＶａに依存しない）として作用する脂質化ＴＦに対する新たな役割を初めて示す。
２）脂質化ＴＦは、ＦＶＩＩ欠損血漿を凝固することが出来る。従って、脂質化ＴＦは、これらの患者の処置のための良好な代替法である（現在、唯一の処置法は、高価なヒト組み換えＦＶＩＩａである。）。
３）脂質化ＴＦは、ＮＣＩＳおよびＦＸａと相乗的に作用する（低濃度では凝固を生じることが出来ない）。
【０２３５】
実施例番号２からの結果は、以下を明確に実証する。
１）脂質化ＴＦは、生理学的ＦＸａ濃度（いかなる著しい凝血促進作用も、もたらすことが出来ない）が、プロトロンビン加水分解を誘発し、結果としてトロンビン形成が起こる原因となる。
２）脂質化ＴＦには、ＦＸａ（可溶であり、プロトロンビナーゼ複合体に結合する。）の全ての形態の全てのタンパク質分解活性に対する補因子として作用する新たな役割がある。
３）ＦＸ欠損血漿（ＦＸの痕跡を含む）でさえ、脂質化ＴＦにより凝固され得る。従って、脂質化ＴＦは、これらの患者の処置のための良好な代替法である。
４）脂質化ＴＦは、ＦＸａ活性の刺激効果においてＮＣＩＳと相乗的に作用する。
【０２３６】
実施例番号３からの結果は、以下を明確に実証する。
１）脂質化ＴＦは、血友病患者（ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸおよびＦＸＩ）における血液凝固を引き起こすことが出来る。従って、脂質化ＴＦは、これらの患者の処置のための良好な代替法である。
２）脂質化ＴＦは、ＦＶの不存在下においてでさえ血液凝固を引き起こすことが出来る。これらの結果は、脂質化ＴＦがＦＸａに対して強力な促進作用を引き起こすことを明らかに示すが、それは、その補因子の不存在下において（欠乏ＦＶ血漿）、脂質化ＴＦが、同じ促進作用を引き起こす補因子として作用するからである。
３）脂質化ＴＦは、ＦＸ欠損血漿（ＦＸの痕跡を含む）においてでさえ、血液凝固を引き起こすことが出来る。従って、脂質化ＴＦは、これらの患者の処置のための代替法である。
４）脂質化ＴＦは、ヘパリンおよびワルファリン処置された血漿における血液凝固を引き起こすことが出来、脂質化ＴＦがアンチトロンビンＩＩＩの作用に干渉し、おそらくＦＸａの基礎濃度への促進作用を通して、ワルファリン処置条件においてでさえ、凝固する可能性があることを示す。
５）最後に、脂質化ＴＦは、全ての因子凝固欠乏において観察される凝血促進作用において、ＮＣＩＳと相乗的に作用する。
【０２３７】
実施例番号４からの結果は、以下を明確に実証する。
１）脂質化ＴＦは、健康な被験体における血液凝固を引き起こすことが出来る。従って、脂質化ＴＦは、健康な被験体における出血症状の処置のための良好な代替法である。
２）脂質化ＴＦは、健康な被験体において観察された凝血促進作用においてＮＣＩＳと相乗的に作用するが、リン脂質のみでは、相乗的に作用しない。
【０２３８】
実施例番号５からの結果は、以下を明確に実証する。
１）脂質化ＴＦは、先天性および後天性など血小板障害（すなわち、血小板減少症）を患う患者における血液凝固を引き起こすことが出来る。従って、脂質化ＴＦは、血小板数および／または機能性の変性を有する患者における出血症状の処置のための良好な代替法である。
【０２３９】
実施例番号６からの結果は、以下を明確に実証する。
１）局所的に投与された脂質化ＴＦは、重度の出血の動物モデル（近位の全ての尾の切断）における出血を停止することが出来る。
２）局所的に投与された脂質化ＴＦは、抗凝固治療（ヘパリンまたはワルファリン）を絡ませて施した、重度の出血の動物モデル（近位の全ての尾の切断）における出血を停止することが出来る。
３）局所的に投与された脂質化ＴＦは、致死的な出血の動物モデル（頚動脈における頚動脈穿刺）における出血を停止することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【０２４０】
【図１】ＦＸａの基礎濃度およびフィブリン塊形成を示す概略図である。
【図２】古典的な血液凝固の内因性および外因性経路を示す概略図である。
【図３】本発明によるＦＸａの刺激因子としての脂質化ＴＦの新しい調節作用を示す概略図である。
【図１】
2009503008.tif 000034
【図２】
2009503008.tif 000035
【図３】
2009503008.tif 000036
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月13日(2007.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における出血の局所治療のための薬剤の製造における、脂質化組織因子（ＴＦ）またはその機能的断片の使用。
【請求項２】
被験体が健康な被験体または出血性素因がある被験体であり、前記出血性素因が血液凝固障害および／または血小板障害を含むものである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
血液凝固障害が先天性血液凝固障害または後天性血液凝固障害である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
先天性血液凝固障害が、凝固第Ｖ因子、凝固第ＶＩＩ因子、凝固第ＶＩＩＩ因子、凝固第ＩＸ因子、凝固第Ｘ因子、凝固第ＸＩ因子、凝固第ＸＩＩ因子、凝固第ＸＩＩＩ因子およびそれらの組み合わせから選択される凝固因子の欠乏に基づく血液凝固障害である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
先天性血液凝固障害が、凝固第Ｖ因子から選択される凝固因子の欠乏に基づく血液凝固障害である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
先天性血液凝固障害が、凝固第ＶＩＩ因子から選択される凝固因子の欠乏に基づく血液凝固障害である、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
先天性血液凝固障害が、凝固第Ｘ因子から選択される凝固因子の欠乏に基づく血液凝固障害である、請求項４に記載の使用。
【請求項８】
被験体が、抗凝固剤による抗凝固剤治療によって引き起こされる後天性血液凝固障害を有する、請求項２に記載の使用。
【請求項９】
抗凝固剤が、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ワルファリン、クマリン誘導体またはジクマリンである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
被験体が、先天性または後天性の血小板障害を有する、請求項２に記載の使用。
【請求項１１】
先天性血小板障害が、Ｇｌａｎｚｍａｎｎ病、ベルナール-スーリエ症候群、Ｂｏｌｉｎ−Ｊａｍｉｅｓｏｎ症候群、ウィスコット−アルドリッチ症候群、Ｐａｒｉｓ−Ｔｒｏｕｓｓｅａｕ−Ｊａｃｏｂｓｅｎ症候群、Ｘ染色体の血小板減少症、灰色血小板症候群、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ症候群およびファンコーニ貧血から選択されるものである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
後天性血小板障害が、血小板血症、多血症または慢性骨髄性白血病などの骨髄増殖性疾患；骨髄様化生；壊血病、先天性心臓病、および肝硬変におけるタンパク異常血症から選択されるものである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
脂質化ＴＦが脂質化されたヒトＴＦである、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
（ｉ）脂質化ＴＦおよび（ｉｉ）活性型凝固第Ｘ因子（ＦＸａ）を含んでなる、製品。
【請求項１５】
（ｉ）脂質化ＴＦおよび（ｉｉ）活性型ＦＸａを別々に含んでなる、製品。
【請求項１６】
（ｉ）脂質化ＴＦおよび（ｉｉ）ＦＸａを、被験体への同時または連続投与のための組み合わせとして別々に含んでなる、製品。
【請求項１７】
（ｉ）脂質化ＴＦおよび（ｉｉ）負に荷電した無機表面（ＮＣＩＳ）を含んでなる、製品。
【請求項１８】
（ｉ）脂質化ＴＦおよび（ｉｉ）ＮＣＩＳを別々に含んでなる、製品。
【請求項１９】
（ｉ）脂質化ＴＦおよび（ｉｉ）ＮＣＩＳを、被験体への同時または連続投与のための組み合わせとして別々に含んでなる、製品。
【請求項２０】
（ｉ）脂質化ＴＦ、（ｉｉ）ＦＸａおよび（ｉｉｉ）ＮＣＩＳを含んでなる、製品。
【請求項２１】
（ｉ）脂質化ＴＦ、（ｉｉ）ＦＸａおよび（ｉｉｉ）ＮＣＩＳを別々に含んでなる、製品。
【請求項２２】
（ｉ）脂質化ＴＦ、（ｉｉ）ＦＸａおよび（ｉｉｉ）ＮＣＩＳを、被験体への同時または連続投与のための組み合わせとして別々に含んでなる、製品。
【請求項２３】
脂質化ＴＦが脂質化されたヒトＴＦである、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の製品。
【請求項２４】
薬剤としての、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の製品。
【請求項２５】
被験体における出血の治療のための薬剤の製造における、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の製品の使用。
【請求項２６】
被験体における出血の局所治療のための薬剤の製造における、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の製品の使用。
【請求項２７】
脂質化ＴＦおよびＦＸａを含んでなる、複合体（ＴＦ：：ＦＸａ）。
【請求項２８】
薬剤としての、請求項２７に記載の複合体。
【請求項２９】
被験体における出血の治療のための薬剤の製造における、請求項２７に記載の複合体の使用。
【請求項３０】
被験体における出血の局所治療のための薬剤の製造における、請求項２７に記載の複合体の使用。
【請求項３１】
脂質化ＴＦおよびＮＣＩＳを含んでなる、複合体ＴＦ：：ＮＣＩＳ。
【請求項３２】
薬剤としての、請求項３０に記載の複合体。
【請求項３３】
被験体における出血の治療のための薬剤の製造における、請求項３１に記載の複合体の使用。
【請求項３４】
被験体における出血の局所治療のための薬剤の製造における、請求項３１に記載の複合体の使用。
【請求項３５】
脂質化ＴＦ、ＦＸａおよびＮＣＩＳを含んでなる、複合体ＴＦ：：ＦＸａ：：ＮＣＩＳ。
【請求項３６】
薬剤としての、請求項３５に記載の複合体。
【請求項３７】
被験体における出血の治療のための薬剤の製造における、請求項３５に記載の複合体の使用。
【請求項３８】
被験体における出血の局所治療のための薬剤の製造における、請求項３５に記載の複合体の使用。
【請求項３９】
ａ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項１４に記載の製品；または
ｂ）別々に、（ｉ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に脂質化ＴＦ、および（ｉｉ）医薬的に許容可能なベヒクルと共にＦＸａ；または
ｃ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項１７に記載の製品；または
ｄ）別々に、（ｉ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に脂質化ＴＦ、および（ｉｉ）医薬的に許容可能なベヒクルと共にＮＣＩＳ；または
ｅ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項２０に記載の製品；または
ｆ）別々に、（ｉ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に脂質化ＴＦ、（ｉｉ）医薬的に許容可能なベヒクルと共にＦＸａ、および（ｉｉｉ）医薬的に許容可能なベヒクルと共にＮＣＩＳ；または
ｇ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項２７に記載のＴＦ：：ＦＸａ複合体；または
ｈ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項３１に記載のＴＦ：：ＮＣＩＳ複合体；または
ｉ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項３５に記載のＴＦ：：ＦＸａ：：ＮＣＩＳ複合体
を含んでなる、医薬組成物。
【請求項４０】
局所投与のための医薬的投与形態である、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
請求項３９または４０に記載の医薬組成物、および支持体を含んでなる、製品。
【請求項４２】
医薬組成物を含む製品であって、
（ｉ）支持体、（ｉｉ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項１４に記載の製品、（ｉｉｉ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項１７に記載の製品、および（ｉｖ）医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項２０に記載の製品；または
医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項２７に記載のＴＦ：：ＦＸａ複合体；または
医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項３０に記載のＴＦ：：ＮＣＩＳ複合体；または
医薬的に許容可能なベヒクルと共に請求項３４に記載のＴＦ：：ＦＸａ：：ＮＣＩＳ複合体
を含んでなる、製品。
【請求項４３】
凝固第ＶＩＩ因子欠乏症の被験体における出血の治療のための薬剤の製造のための、非脂質化ＴＦまたはその機能的断片の使用。
【請求項４４】
非脂質化ＴＦまたはその断片の非経口投与のための薬剤の製造における、請求項４３に記載の使用。
【国際調査報告】
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