(57)【要約】  細胞溶解を必要とすることのないＡＡＶの製造方法が記述される。該方法は上清からＡＡＶを収集することを必要とする。ヘパリン結合部位をもつキャプシドを有するＡＡＶについて、該方法は、ＡＡＶのヘパリン結合部位と細胞の間の結合を除去するためにＡＡＶキャプシドおよび／若しくは培養条件を改変してそれによりＡＡＶが上清すなわち培地にわたることを可能にすることを必要とする。従って、本発明の方法は、細胞溶解段階を使用する方法を使用して製造されるＡＡＶに比較して、細胞膜および細胞内物質からのより高程度の純度を有するＡＡＶの高収量を含有する上清を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ヘパリン結合部位を欠くＡＡＶを細胞培養物中で培養する段階；
（ｂ）該培養物から上清を収集する段階；および
（ｃ）該上清からＡＡＶを単離する段階
を含んでなるＡＡＶの製造方法。
【請求項２】
生存可能細胞の培養物を維持することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上清の収集の間若しくは後に培地を添加して連続製造工程を提供する段階をさらに含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該方法の段階が最低２回反復される、請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該方法の段階が最低２ないし１００回反復される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＡＡＶがＡＡＶ８である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＡＡＶが、天然のヘパリン結合部位を除去するように改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ヘパリン結合部位がアミノ酸配列ＲｘｘＲ（配列番号１２）（式中Ｘはいずれかのアミノ酸である）を特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＡＡＶが、ＡＡＶ２、ｈｕ．５１、ｈｕ．３４、ｈｕ．３５、ｈｕ．４５およびｈｕ．４７よりなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ヘパリン結合部位が、ＲｘｘＲ（配列番号１２）配列の第一のアミノ酸で改変される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
改変されたヘパリン結合部位の第一のアミノ酸がＡｒｇからＳｅｒ若しくはＧｌｕに変更される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ヘパリン結合部位が、ＲｘｘＲ（配列番号１２）配列の最後のアミノ酸で改変される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
改変されたヘパリン結合部位の最後のアミノ酸がＡｒｇからＴｈｒに変更される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
培養段階が無血清培地中で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＡＡＶがＨＥＫ  ２９３細胞中で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
単離段階が、クロマトグラフィー、濾過および沈殿よりなる群から選択される方法によりＡＡＶを濃縮することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
クロマトグラフィーがカラムをベースとする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
クロマトグラフィーが膜をベースとする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）改変された哺乳動物細胞であって、ヘパリンの細胞内発現若しくは結合を妨げるように改変された哺乳動物細胞においてＡＡＶを培養する段階；
（ｂ）該培養物から上清を収集する段階；および
（ｃ）該上清からＡＡＶを単離する段階
を含んでなるＡＡＶの製造方法。
【請求項２０】
請求項１ないし１９のいずれかに記載の方法により細胞培養物から収集された細胞培養物上清。
【請求項２１】
上清が最低６０％の収率でＡＡＶを含んでなる、請求項２０に記載の細胞培養物上清。
【請求項２２】
（ａ）パッケージングに必要なアデノウイルスヘルパー機能、パッケージングに十分なＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質、パッケージングに十分なＡＡＶ  ｃａｐタンパク質、およびパッケージングされるべきＡＡＶゲノムを含んでなる細胞を培養すること；
（ｂ）（ａ）の細胞培養物から上清を収集すること；
（ｃ）ＡＡＶ粒子を単離すること
を含んでなる、ＤＮアーゼ抵抗性ＡＡＶ粒子の製造方法。
【請求項２３】
細胞が、アデノウイルスヘルパー機能をコードする配列で安定に形質転換されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
アデノウイルスヘルパー機能が、活性化可能若しくは誘導可能なプロモーター下で発現される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
細胞が、ＡＡＶ  ｒｅｐおよび／若しくはＡＡＶ  ｃａｐタンパク質をコードする配列で安定に形質転換されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
ＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質および／若しくはＡＡＶ  ｃａｐタンパク質が、活性化可能若しくは誘導可能なプロモーターの支配下で発現される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞が、パッケージングされるべきＡＡＶゲノムで安定に形質転換されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
１種若しくはそれ以上の：
（ａ）ＡＡＶウイルス粒子のパッケージングを司ることが可能な生産細胞；
（ｂ）トランスフェクション試薬；
（ｃ）ベクターの構築のためのプラスミド成分；
（ｄ）集成されたＡＡＶ粒子の収集（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、精製、濃縮若しくは採取（ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ）に必要な成分；
（ｅ）精製するためのウイルス粒子の陰性若しくは陽性選択のための試薬；
（ｆ）ウイルス調製物の濃縮のための試薬；および
（ｇ）ウイルス調製物中の汚染物質の酵素消化のための試薬
を含んでなる、ヘパリン結合部位を欠くＡＡＶの上清からの製造のためのキット。
【請求項２９】
生産細胞が、ヘパリン結合部位に結合することが可能なヘパリンを発現する能力を欠く哺乳動物細胞である、請求項２８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦に支援される研究若しくは開発に関する声明
本出願は、米国国立保健研究所からの助成金ＮＨＬＢＩ助成金番号第Ｐ０１−ＨＬ−０５９４０７号により少なくとも部分的に支援された研究を記述する。米国政府は本発明にある一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は新規のＡＡＶ収集かつ製造方法を記述する。
【０００３】
パルボウイルス科の１メンバー、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、４．７キロベース（ｋｂ）ないし６ｋｂの一本鎖直鎖状ＤＮＡゲノムをもつ、小型のエンベロープを持たない（ｎｏｎｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）正二十面体ウイルスである。ＡＡＶは精製されたアデノウイルスストック中の汚染物質として発見されたため、該ウイルスはデペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）に帰属されている。ＡＡＶの生活環は、ＡＡＶゲノムが感染後に宿主ゲノムに組込まれている潜伏期、およびアデノウイルス若しくは単純疱疹ウイルスいずれかの感染後に該組込まれたＡＡＶゲノムがその後レスキューされ、複製されそして感染性ウイルスにパッケージングされる感染期を包含する。非病原性の特性、非分裂細胞を包含する広範な宿主感染性の範囲、および組込みは、ＡＡＶを魅力的な送達ベヒクルにする。
【０００４】
多様な異なるＡＡＶ配列およびそれの組織からの単離方法は記述されている。サル若しくはヒト組織供給源から得られる他のＡＡＶ配列のなかでもＡＡＶ１−６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９およびＡＡＶ９が記述されている。例えば特許文献１、特許文献２（ＡＡＶ８）および特許文献３を参照されたい。これを用いて、厳密に血清学的交差反応性（血清型）によりＡＡＶを定義することから離れる動きが起こった。最近の文献は、「クレード」と命名される群を提案する、系統的関係性に関するこれらＡＡＶ間の関係を定義する。例えば非特許文献１；特許文献３を参照されたい。
【０００５】
ＡＡＶの製造のための最近の方法論は、ＡＡＶ２が細胞に会合しかつ従って生産細胞中に主として存すると考えられるという観察結果を主に鑑みて設立された。従って、最新の従来技術のＡＡＶ製造戦略は、生産細胞株の細胞ペレットからベクター粒子を得る。これらの戦略のそれぞれは、超音波処理、酵素的、化学的若しくは物理的溶解により細胞ペレットからベクターを放出するといういくつかの方法論を使用する。これは、不幸なことに、全部の細胞内タンパク質および破片をウイルス収集物中に放出する。従って、その後の精製処置はより過大の労力を要する。製造および精製双方の比較的低い効率のため、大量の生産細胞で開始することが必要である。
【０００６】
必要とされるものは、ＡＡＶの効率的な製造および精製方法である。
【０００７】
【特許文献１】国際特許公開第ＷＯ  ０２／３３２６９号
【特許文献２】国際特許公開第ＷＯ  ０２／３８６１２２号
【特許文献３】国際特許公開第ＷＯ  ２００５／０３３３２１号
【非特許文献１】Ｇａｏら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７８（１２）：６３８１−６３８８（２００４年６月）
【発明の開示】
【０００８】
［発明の要約］
本発明は、ウイルスを生産する細胞の培養の終了を必要とすることのないＡＡＶの製造方法を提供する。該方法は、細胞ペレットの収集若しくは細胞破壊を必要とすることなく、上清中に放出されたＡＡＶを収集することを必要とする。一態様において、該方法は、ＡＡＶヘパリン結合部位と生産体細胞の間の結合を実質的に低下若しくは排除するようにＡＡＶキャプシド、細胞および／若しくは培養条件を改変して、それによりＡＡＶが上清すなわち培地にわたることを可能にすることを必要とする。従って、本発明の方法は、細胞収集および／若しくは細胞溶解段階を使用する方法を使用して製造されるＡＡＶに比較して、細胞膜および細胞内物質からより高程度の純度を有するＡＡＶの高収量を含有する上清を提供する。
【０００９】
本技術は、財政的および時間的費用の有意の改良を伴う効率的かつ規模適応性（ｓｃａｌａｂｌｅ）のＡＡＶ製造に応用し得る。本技術は、研究目的上の小スケールＡＡＶ製造および包括的キットへのその商業的応用を可能にする。ＡＡＶは上清から複数回収集し得るため、連続的系すなわちバイオリアクターは、細胞支持体が製造の制限となることなく臨床使用若しくは広範な製薬学的応用に必要な粒子の量の製造を可能にする。場合によっては、血清若しくはタンパク質が非存在であるか若しくは少ない増殖培地の使用と組合せで、精製が有意に単純化される。本技術は、従来技術の製造方法でかつ／若しくは有意の量の細胞内物質の存在下で使用し得るより効率的な精製および濃縮方法とともに適用し得る。
【００１０】
本発明のなお他の利点は、本発明の詳細な記述から明らかであろう。
【００１１】
［発明の詳細な記述］
本発明は、細胞破壊を必要とすることのないＡＡＶの製造方法を提供する。該方法は、ウイルス生産培養物の上清からＡＡＶを収集することを必要とする。
【００１２】
大多数のＡＡＶ種を含んでなる、へパラン硫酸プロテオグリカン若しくはヘパリンとの親和性を示さないＡＡＶについて、ＤＮアーゼ抵抗性の感染性粒子の大きな画分が培養物上清中に位置するか、若しくはゆるくのみ細胞と会合している。これは誘導されるウイルス、浸透圧溶解若しくはいずれかの他の型の溶解なしで観察される。
【００１３】
本発明は、多様な遺伝子移入および／若しくはワクチンの応用での使用のためのＡＡＶの製造のための規模適応性技術を可能にする。それはまた、収集のためのタンパク質汚染の低い若しくはない培地とともに使用される場合に、精製の緊縮性を劇的に低下もする。本製造方法は、精製および濃縮のための例えばクロマトグラフィー、濾過若しくは沈殿を包含する適する精製および濃縮方法とともに適用し得る。
【００１４】
大部分の現在のＡＡＶ製造戦略は粒子を単離するための支持体として細胞ペレットを使用するため、こうした方法は、定義上、連続収集戦略を排除する繰り返しの多い工程である。
【００１５】
現在の方法論と対照的に、一態様において、本発明は、上清が多くのＡＡＶの主供給源となる方法を提供する。これは、臨床若しくは前臨床の研究若しくは治療のためのより多量のＡＡＶの製造のための同一の生産体細胞の反復若しくは連続収集を可能にする。現在の細胞ペレット収集およびその後の精製方法では、使用可能なウイルス力価を効率的に提供するために大量の粒子が必要とされる。従って、それより下で使用可能な量の粒子の回収が技術上実現可能でない閾値が存在する。一態様において、ＡＡＶベクターは、それが生産される細胞から最低約１０％のＤＮアーゼ抵抗性ベクター粒子若しくはゲノム（ｄｒｐ  ｖｇ）を分泌する。こうしたｄｒｐ  ｖｇはＡＡＶキャプシドにパッケージングされるゲノム配列（例えばミニ遺伝子、カセットおよび／若しくはＡＡＶ核酸配列）を表す。
他の態様において、ＡＡＶベクターは最低約２０％のｄｒｐ  ｖｇを分泌する。なお他の態様において、ＡＡＶベクターは最低約４０％のｄｒｐ  ｖｇを分泌する。本明細書に提供されるより効率的な製造戦略により、規模適応性は小規模および大規模双方の粒子の要求に対し可能である。従って、ウイルス製造は、細胞溶解若しくは細胞培養を中断することの要件を伴わずに、必要とされる期待される量に依存してニーズに合わせて変更し得る。
【００１６】
例えば、ＡＡＶ８ベクターは、２９３細胞に基づく三重トランスフェクション製造法で、それらのウイルス粒子の平均４０％以上を上清中に分泌することが見出された。ＡＡＶ７およびｒｈ８Ｒに基づく他のベクターはこの同一範囲で分泌することが見出された。なお他のベクターは、この系、例えばＡＡＶ１［配列番号２に提供されるキャプシドタンパク質］、ＡＡＶ６［配列番号３に提供されるＡＡＶ６キャプシドタンパク質］、ＡＡＶ６．１［配列番号３、キャプシドタンパク質中にＫ５３１Ｅ変化を伴う］、ＡＡＶ６．１．２［配列番号３、Ｋ５３１Ｅ、Ｆ１２９Ｌを伴う］、ｒｈ．３２．３３［配列番号４に提供されるキャプシドタンパク質］、ｒｈ．１０［配列番号５に提供されるキャプシドタンパク質］、およびｒｈ６４Ｒ１［配列番号６に提供されるｒｈ６４キャプシドタンパク質、Ｒ６９７Ｗを伴う］ならびにｒｈ８Ｒ［配列番号７に提供されるｒｈ８キャプシドタンパク質、Ｄ５３１Ｅを伴う］で、ウイルス粒子の平均３０％以上を上清中に分泌することが見出された。なお別の例で、他のＡＡＶベクターが、この系での三重トランスフェクション後の製造の間にそれらのウイルス粒子の平均２０％以上を上清中に分泌することが見出された。なお他のＡＡＶベクター、例えばＡＡＶ９に基づくもの［配列番号８に提供されるキャプシドタンパク質］は、この系でそれらのウイルス粒子の１０％以上を上清中に放出することが見出された。なお他の例は、それらのウイルス粒子の１０％より多くを上清中に分泌するＡＡＶを包含し、本発明の方法で使用される。一態様において、本状況で製造されるこれらのベクターは、それらが製造される細胞から天然に分泌するＡＡＶからである。
【００１７】
別の態様において、ＡＡＶはそれらの分泌を可能にするよう改変される。一態様において、発明者は、ヘパリン結合ドメインを有しかつヘパリンにより遮断される形質導入（感染）能力を有することを特徴とするＡＡＶが、検出可能な量で分泌しないことを見出した。こうしたＡＡＶの例は、製造の間に大部分が細胞と会合しているＡＡＶ２［配列番号９に提供されるキャプシドタンパク質］、およびＡＡＶ３［配列番号１０に提供されるキャプシドタンパク質］である。従って、一態様において、該方法は、ＡＡＶヘパリン結合部位と生産体細胞の間の結合を実質的に低下若しくは排除するようにＡＡＶキャプシド、細胞および／若しくは培養条件を改変して、それによりＡＡＶが上清すなわち培地にわたることを可能にすることを必要とする。
【００１８】
本発明の方法は、細胞溶解後に回収されるＡＡＶに比較して、細胞膜、タンパク質および細胞内物質からのより高程度の純度を有するＡＡＢの高収量を含有する上清を提供する。一態様において、本発明は、対照的に溶解を伴わない上清から開始し、そしてそれによりいかなるその後の精製も単純化する。正常な培養物の上清中では制限された量の細胞破片が、そしてタンパク質汚染の劇的な低下の量が見出される。一態様において、無血清培地を利用して、増殖培地により導入される血清若しくは他のタンパク質の汚染の影響を回避する。
【００１９】
一局面において、本発明はウイルス生産培養物中でのＡＡＶの製造方法を提供する。多様なＡＡＶの配列が以前に記述されている。例えば、ＡＡＶ  １（米国特許第６，７５９，２３７号）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ３２．３３、ｒｈ．１０、ｈｕ．１１、ヒトおよびヒト以外の供給源からの他のＡＡＶ（例えば、国際特許公開第ＷＯ  ０２／３３２６９号、同第ＷＯ  ０２
／３８１６２２号（ＡＡＶ８）およびＧｅｎＢａｎｋを参照されたい）、ならびにシングルトンエラーを是正するように変えられたような配列、例えばＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．１．２、ｒｈ６４Ｒ１およびｒｈ８Ｒ［例えば２００６年１０月１９日公開の第ＷＯ  ２００６／１１０６８９号を参照されたい］を参照されたい。あるいは、既知技術［例えば国際特許公開第ＷＯ  ２００５／０３３３２１号およびＧｅｎＢａｎｋを参照されたい］を使用して若しくは他の手段により当業者により同定されるものを包含する他のＡＡＶ配列を、本明細書に記述されるとおり改変しうる。
【００２０】
ある種のＡＡＶ配列はこうしたヘパリン結合部位を天然に欠く。ヘパリン結合部位を欠くＡＡＶ、例えばＡＡＶ８［配列番号１１に提供されるキャプシドタンパク質］について、ＡＡＶ配列、細胞若しくは培地の改変は必要とされない。ヘパリンを結合するＡＡＶキャプシドの能力は、多様なアッセイ形式、およびＡＡＶを結合するためのヘパリン若しくはその部分を使用して容易に同定し得る。さらに、ＡＡＶの感染／形質導入能力を遮断するヘパリンの能力は当業者により容易に決定し得る。ＡＡＶのいかなる感染／形質導入も遮断するヘパリンの能力を測定するための適するアッセイが、例えばＣ．Ｈａｌｂｅｒｔら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７５（１４）：６６１５−６６２４（２００１年７月）およびＣ．Ｅ．ＷａｌｓｈとＨ．Ｃｈａｏ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ、８（Ｓｕｐｐｌ．２）、ｐ．６０−６７（２００２）に記述されている。
【００２１】
他のＡＡＶ配列、例えばＡＡＶ６はヘパリン結合部位を有するが、しかし感染させるＡＡＶ６の能力はヘパリンの存在により部分的に阻害される（遮断されない）。ＡＡＶ６のｖｐ１キャプシドの配列は、ヘパリン結合を媒介する単一のアミノ酸残基すなわち位置５３１［配列番号３］の天然のリシン残基を有するとして記述されている。［ＡＡＶ６の配列は国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／１３３７５号に提供され、そして残基番号はその国際出願に提供される番号付けスキーム（例えば表を参照されたい）に基づく］。こうした場合には、それがゆるくのみ細胞に会合していることが見出されているため、本ＡＡＶ配列の改変は必要とされない。
【００２２】
一態様において、ヘパリン結合部位を有しかつヘパリンにより遮断される細胞を感染／トランスフェクトするその能力を有するＡＡＶについて、本発明は、上清中に分泌されるウイルス粒子の量を増大させるために、ヘパリン結合を低下若しくは排除するようなＡＡＶの改変を提供する。一態様において、ヘパリン結合ドメインは、ＡＡＶ２で記述されたところのＡｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ（ＲｘｘＲ）［配列番号１２］モチーフである（すなわちＡＡＶ２  ｖｐ１キャプシドタンパク質、配列番号９のほぼアミノ酸５８５ないし５８８、Ｋｅｒｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：１１０７２−８１；Ｏｐｉｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：６９９５−７００６（第ＷＯ  ０２／３３２６９号に具体的に説明される番号付けに基づく））。Ｘａａはいずれかのアミノ酸を表す。発明者はＲｘｘＲモチーフを有する他のＡＡＶキャプシドを同定し、それらのいくつかはクレードＢのＡＡＶである。ＲｘｘＲモチーフを有するこうしたＡＡＶキャプシドの例は、ｈｕ．５１［配列番号１３］、ｈｕ．３４［配列番号１４］、ｈｕ．３５［配列番号１５］、ｈｕ．４５［配列番号１６］およびｈｕ．４７［配列番号１７］を包含する。ＲｘｘＲドメインを有する他のＡＡＶは、記述されたＡＡＶ配列のなかから当業者により容易に同定され得る。加えて、他のヘパリン結合部位は、当業者に既知の技術を使用してＡＡＶ中で容易に同定し得る。別の例において、ＡＡＶ３はヘパリンを結合するが；しかしながらそれはＲｘｘＲドメインを含有しない。
【００２３】
発明者は、非保存的アミノ酸変化を含有するようにヘパリン結合配列のアミノ酸残基（１個若しくは複数）を変えることにより、ヘパリン結合が除去されるのみならずしかしまたＴ細胞活性化が有意に低下されることを見出した。これは、２００６年４月２８日出願の米国仮出願第６０／７９５，９６５号の優先権を主張する共通に所有される（ｃｏ−ｏ
ｗｎｅｄ）出願、”Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＡＡＶ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｃａｐｓｉｄ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ（低下されたキャプシド免疫原性を有する改変ＡＡＶベクターおよびそれらの使用）”（引用することによりここに組込まれる）の主題である。
【００２４】
一態様において、本発明はウイルス培養物中でのＡＡＶの製造方法を提供し、該ＡＡＶはヘパリン結合ドメインを除去するよう改変されている。
【００２５】
一態様において、ＡＡＶキャプシドのヘパリン結合部位をコードする核酸配列は部位特異的突然変異誘発技術を使用して改変され、ヘパリン結合を媒介する原因であるアミノ酸残基（１個若しくは複数）のコドンは、コードされるアミノ酸の非保存的変化をなすように変えられている。非保存的アミノ酸変化の例は、タンパク質の機能に影響を及ぼすもの、例えば異なる化学構造（特性）の別のアミノ酸での一アミノ酸の置換を包含する。以下の表は最も一般的なアミノ酸およびそれらの特性を具体的に説明する。
【００２６】
【表１】
2009535030.tif 000002
【００２７】
例えば、ヘパリン結合部位をコードする核酸配列を、部位特異的突然変異誘発技術を使用して改変する。例えば、ＲｘｘＲモチーフ［配列番号３］中で、該モチーフの最初のアルギニンおよび／若しくは最後のアルギニンのコドンを、該アミノ酸の一方（若しくは双
方）を非保存的アミノ酸に変更するように変える。このモチーフ中のアルギニンのいずれか１個を変えることがヘパリン結合を予防することが見出された。本明細書に具体的に説明されるとおり、ヘパリン結合モチーフがＲｘｘＲである場合、該改変されたヘパリン硫酸糖タンパク質結合部位の第一のアミノ酸をＡｒｇからＳｅｒ若しくはＧｌｕに変更し得る。別の態様において、該改変されたヘパリン硫酸糖タンパク質結合部位の最後のアミノ酸をＡｒｇからＴｈｒに変更する。別の態様において、ＡＡＶ６  ｖｐ１キャプシドタンパク質［配列番号３］の位置５３１のリシンを非保存的アミノ酸に変更する。本明細書に具体的に説明されるもの以外の非保存的アミノ酸変化が、当業者により選択されうる。
【００２８】
同様に、他のヘパリン結合ドメインを当業者に既知の技術を使用して同定し、そして部位特異的突然変異誘発若しくはアルギニンのコーディング配列を変えるための別の適する技術を使用して改変しうる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）を参照されたい。
【００２９】
加えて、ヘパリン結合ドメインの配列の他の変更方法を利用してヘパリン結合を予防しうる。別の態様において、ヘパリン結合部位を含有するＡＡＶへのヘパリンの結合が、ヘパリン結合部位の配列を変えること以外の方法により除去される。例えば、生産体細胞中でヘパリン結合部位を効果的に遮蔽する分子をもつＡＡＶキャプシドを提供しうる。
【００３０】
なお別の態様において、例えばヘパリン生合成に重要な遺伝子を標的とするＲＮＡを使用するか若しくはそれを変異させて、ヘパリン生産を一過性に若しくは永続的にのいずれかで排除若しくは実質的に低下させるように生産体細胞を改変しうる。別の態様において、ヘパリン生合成に天然に欠ける生産体細胞株を使用しうる。
【００３１】
ウイルス細胞培養は、ＡＡＶ粒子を生成するのに必要とされる少なくとも最小限の成分を安定に若しくは一過性にのいずれかで含有する細胞を利用し、ここで、ＡＡＶ  ＤＮアーゼ抵抗性ゲノムを含有する粒子の生産は、発現カセットをＡＡＶキャプシドにパッケージングすることを必要とする。最小限の必要とされる成分は、ＡＡＶキャプシドにパッケージングされるべき発現カセット、ＡＡＶ  ｃａｐ、ＡＡＶ  ｒｅｐ若しくはそれらの機能的フラグメント、およびヘルパー機能を包含する。
【００３２】
多様な適する細胞および細胞株がＡＡＶの生産での使用について記述されている。該細胞それ自身は、原核生物（例えば細菌）細胞、ならびに昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞を包含する真核生物細胞を包含するいかなる生物学的生物体から選択してもよい。とりわけ望ましい宿主細胞は、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ  １、ＣＯＳ  ７、ＢＳＣ  １、ＢＳＣ  ４０、ＢＭＴ  １０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、ＨＥＫ  ２９３細胞（機能的アデノウイルスＥ１を発現する）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、ならびにヒト、サル、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを包含する哺乳動物由来の初代線維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞のような細胞を制限なしに包含するいずれかの哺乳動物種のなかから選択される。該細胞を提供する哺乳動物種の選択は本発明の制限でなく；哺乳動物細胞の型、すなわち線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞などもそうでない。
【００３３】
ＡＡＶ配列は多様な供給源から得ることができる。例えば、適するＡＡＶ配列は、第ＷＯ  ２００５／０３３３２１号に記述されるとおりに、または既知の供給源、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、若しくは多様な学術的ベクター中核施設から得ることができる。あるいは、適する配列は、公開された配列を参照して既知の技術を使用して合成で生成する。適するＡＡＶ配列の例が本明細書に提供される。
【００３４】
一般に、発現カセットは、少なくとも、５’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）、その発現を司る制御配列に作動可能に連結された所望の治療薬、免疫原若しくは抗原をコードする核酸配列、および３’ＡＡＶ  ＩＴＲより構成される。一態様においてＡＡＶ血清型２の５’および／若しくは３’ＩＴＲを使用する。しかしながら他の適する供給源からの５’および３’ＩＴＲを選択してもよい。ＡＡＶビリオン（粒子）を形成するようにキャプシドタンパク質にパッケージングされるのは、この発現カセットである。
【００３５】
発現カセットに加え、該細胞は、細胞中でのＡＡＶキャプシドの発現を駆動する配列（ｃａｐ配列）および該発現カセット中に見出されるＡＡＶ  ＩＴＲの供給源と同一供給源、若しくは交差相補供給源のｒｅｐ配列を含有する。ＡＡＶのｃａｐおよびｒｅｐ配列は異なるＡＡＶ親配列から独立に選択してよく、そして当業者に既知の適する様式で宿主細胞に導入しうる。完全長のｒｅｐ遺伝子を利用しうる一方、そのより小さいフラグメント、すなわちｒｅｐ７８／６８およびｒｅｐ５２／４０がＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にするのに十分であることが見出されている。
【００３６】
該細胞は、本発明のＡＡＶをパッケージングするためのヘルパー機能もまた必要とする。場合によっては、こうしたヘルパー機能はヘルペスウイルスにより供給しうる。別の態様において、必要なヘルパー機能は、それぞれ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナサス（米国）を包含する多様な供給源から入手可能であるようなヒト若しくはヒト以外の霊長類のアデノウイルス供給源から提供される。多様な適するアデノウイルスの配列が記述されている。例えば、チンパンジーのアデノウイルスＣ１およびＣ６８［米国特許第６，０８３，７１６号］；Ｐａｎ  ５、Ｐａｎ６およびＰａｎ７、［第ＷＯ  ０２／３３６４５号］、記述されるもののようなハイブリッドアデノウイルス［例えば第ＷＯ  ０５／００１１０３号］ならびにＧｅｎＢａｎｋを参照されたい。
【００３７】
一態様において、宿主細胞は、少なくとも、Ｅ１ａ遺伝子産物、Ｅ１ｂ遺伝子産物、Ｅ２ａ遺伝子産物および／若しくはＥ４  ＯＲＦ６遺伝子産物を発現するのに必要な最小限のアデノウイルスＤＮＡ配列を含有する。宿主細胞はＶＡＩ  ＲＮＡのような他のアデノウイルス遺伝子を含有しうるが、しかしこれらの遺伝子は必要とされない。一態様において、使用される細胞はＥ１、Ｅ２ａおよび／若しくはＥ４  ＯＲＦ６以外のいかなるアデノウイルス遺伝子も保有せず；ｒＡＡＶの製造の間の汚染するウイルスの相同的組換えをもたらし得るいかなる他のウイルス遺伝子も含有せず；そしてそれはＤＮＡによる感染若しくはトランスフェクションが可能でありかつ該トランスフェクトされた遺伝子（１種若しくは複数）を発現する。
【００３８】
本発明で有用な１種の細胞は、ｒｅｐおよびｃａｐをコードする配列で安定に形質転換され、かつ、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａおよびＥ４ＯＲＦ６  ＤＮＡならびに上述されたところの発現カセットを保有する構築物でトランスフェクトされている宿主細胞である。Ｂ−５０（国際特許出願公開第ＷＯ  ９９／１５６８５号）、または米国特許第５，６５８，７８５号に記述されるもののような安定なｒｅｐおよび／若しくはｃａｐ発現細胞株もまた同様に使用しうる。別の望ましい宿主細胞は、Ｅ４  ＯＲＦ６を発現するのに十分である最小限のアデノウイルスＤＮＡを含有する。なお他の細胞株を、本発明の新規の改変ｃａｐ配列を使用して構築し得る。
【００３９】
本発明の宿主細胞の製造は、選択したＤＮＡ配列の集成のような技術を必要とする。この集成は慣習的技術を利用して達成しうる。こうした技術は、ポリメラーゼ連鎖反応、合成法、および所望のヌクレオチド配列を提供するいかなる他の適する方法も包含する、公知でありかつＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーに記述されるｃＤＮＡおよびゲノムクローニングを包含する。
【００４０】
ＡＡＶ製造のための必要とされる成分（例えばアデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａおよび／若しくはＥ４ＯＲＦ６遺伝子産物、ｒｅｐまたはそのフラグメント（１種若しくは複数）、ｃａｐ、発現カセット、ならびにいずれかの他の所望のヘルパー機能）は、それに保有される配列を移入するいずれかの遺伝因子の形態で、別個に若しくは組合せでパッケージング宿主細胞に送達しうる。
【００４１】
本明細書で使用されるところの遺伝因子（ベクター）は、それに保有される配列を移入する、例えば、裸のＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、ウイルス以外の送達ベヒクル（例えば脂質に基づく担体）中のタンパク質、ウイルスなどを包含する。選択されるベクターは、トランスフェクション、電気穿孔法、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を包含するいかなる適する方法によっても送達しうる。本発明のいずれかの態様を構築するのに使用される方法は核酸操作の当業者に既知であり、そして遺伝子工学、組換え工学および合成技術を包含する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照されたい。例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：５２０−５３２（１９９３）および米国特許第５，４７８，７４５号を参照されたい。
【００４２】
一態様において、アデノウイルス遺伝子の１種若しくはそれ以上は、宿主細胞のゲノムに安定に組込まれるか、若しくはエピソームとして安定に発現される。アデノウイルス遺伝子のそれぞれのプロモーターは、構成的プロモーター、誘導可能なプロモーター若しくは天然のアデノウイルスプロモーターから独立に選択しうる。プロモーターは、例えば、生物体若しくは細胞の特定の生理学的状態により（すなわち分化状態によりまたは複製している若しくは静止状態の細胞で）あるいは外因性に付加された因子により調節されうる。
【００４３】
一態様において、安定な宿主細胞は、調節可能なプロモーターの制御下に、必要とされる成分（１種若しくは複数）を含有することができる。しかしながら、該必要とされる成分（１種若しくは複数）は構成的プロモーターの制御下にあることができる。
【００４４】
調節可能なプロモーターは、外因性に供給される化合物、温度のような環境因子、または特定の生理学的状態の存在（例えば急性期、細胞の特定の分化状態、若しくは複製する細胞でのみ）による遺伝子発現の制御を可能にする。調節可能なプロモーターおよび系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄを制限なしに包含する多様な商業的供給源から入手可能である。多くの他の系が記述されており、そして当業者により容易に選択され得る。外因性に供給されるプロモーターにより調節されるプロモーターの例は、亜鉛で誘導可能なヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメサゾン（Ｄｅｘ）で誘導可能なマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系［第ＷＯ  ９８／１００８８号］；エクダイソン昆虫プロモーター［Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６−３３５１（１９９６）］、テトラサイクリンで抑制可能な系［Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７−５５５１（１９９２）］、テトラサイクリンで誘導可能な系［Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６−１７６９（１９９５）、Ｈａｒｖｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２：５１２−５１８（１９９８）もまた参照されたい］、ＲＵ４８６で誘導可能な系［Ｗａｎｇら、Ｎ
ａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５：２３９−２４３（１９９７）およびＷａｎｇら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、４：４３２−４４１（１９９７）］ならびにラパマイシンで誘導可能な系［Ｍａｇａｒｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００：２８６５−２８７２（１９９７）］を包含する。本情況で有用でありうるなお他の型の誘導可能なプロモーターは、特定の生理学的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態により、若しくは複製する細胞のみで調節されるものである。
【００４５】
別の態様において天然のプロモーターを使用する。天然のプロモーターは、遺伝子産物の発現が天然の発現を模倣すべきであることが望ましい場合に使用しうる。天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現を一時的に若しくは発達的に、または組織特異的様式で、あるいは特定の転写刺激に応答して調節しなければならない場合に使用しうる。さらなる一態様において、エンハンサー要素、ポリアデニル化部位若しくはコザックコンセンサス配列のような他の天然の発現調節領域もまた、天然の発現を模倣するのに使用しうる。
【００４６】
導入遺伝子の別の態様は、組織特異的プロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を包含する。例えば、骨格筋中での発現が望ましい場合は、筋中で活性のプロモーターを使用すべきである。これらは、骨格βアクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼをコードする遺伝子からのプロモーター、ならびに天然に存在するプロモーターより高い活性をもつ合成の筋プロモーターを包含する（Ｌｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：２４１−２４５（１９９９）を参照されたい）。組織特異的であるプロモーターの例は、とりわけ、肝（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：５１２４−３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、３：１００２−９（１９９６）；α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、７：１５０３−１４（１９９６））、骨オステオカルシン（Ｓｔｅｉｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、２４：１８５−９６（１９９７））；骨シアロタンパク質（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１１：６５４−６４（１９９６））、リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１：１０６３−８（１９９８）；免疫グロブリンＨ鎖；Ｔ細胞受容体α鎖）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１３：５０３−１５（１９９３））、神経細線維軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：５６１１−５（１９９１））およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｎｅｕｒｏｎ、１５：３７３−８４（１９９５））のような神経型について既知である。
【００４７】
適する活性化可能および構成的プロモーターの例は当業者に既知である。なお別の代替において、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下の選択された成分（１種若しくは複数）、および１種若しくはそれ以上の誘導可能なプロモーターの制御下の他の選択された成分（１種若しくは複数）を含有しうる。例えば、２９３細胞由来である（構成的プロモーターの制御下にＥ１ヘルパー機能を含有する）がしかし誘導可能なプロモーターの制御下にｒｅｐおよび／若しくはｃａｐタンパク質を含有する安定な宿主細胞を生成しうる。なお他の安定な宿主細胞が当業者により生成されうる。
【００４８】
あるいは、発現カセットをＡＡＶキャプシドにパッケージングするために宿主細胞中で培養されることが必要とされる成分の１種若しくはそれ以上を、適する遺伝因子を使用してトランスで宿主細胞に提供しうる。
【００４９】
適する細胞培養系を一旦選択したら、該細胞を、ＡＡＶのパッケージングを可能にする条件下で適する培地中で培養し、上清を培養物から収集し、そしてＡＡＶをそれから単離する。一態様において、本発明は、連続製造工程を通じて細胞培養物が維持されることを
可能にする、すなわち収集のために細胞破壊および／若しくは細胞溶解を必要としない、規模適応性である系を提供する。一態様において、こうした系は生存可能細胞の培養物を維持する。別の態様において、該細胞培養物は生存可能および生存可能でない細胞の混合集団を含有する。培養工程の間、培地は、培養工程の間にかつ／若しくは連続製造工程を提供するための上清の収集とともに添加し得る。培地、新鮮細胞、および／または必要とされる栄養素若しくは調節剤のような他の要素のこの添加は、細胞培養物の寿命に依存して最低２回、２から１００回まで、若しくは１００回以上反復しうる。
【００５０】
本発明の方法はウイルスの連続製造を可能にする一方、製造稼働の完了に際して、生産細胞から残存するいかなるＡＡＶもそれの破壊の前に抽出することが望ましいかもしれない。この抽出はそれに一般に使用される方法を使用して実施し得る。こうした方法は、典型的には、上清を除去すること、凍結／融解若しくは超音波処理技術により細胞を溶解すること、次いで洗剤処理（例えばベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ））を包含する。精製は、３回のＣｓＣｌ勾配遠心分離、透析および濃縮により伝統的に実施する。
【００５１】
一態様において、本発明は適する培地中で増殖させた細胞を含有する細胞培養物を提供する。場合によっては、所望の遺伝子産物の発現を活性化若しくは誘導するのに必要な、またはビリオン製造に必要とされるいかなる成分も、製造前若しくはその間の適切な時点で供給される。こうした成分は、培地とともに添加しうるか、若しくは別個に供給しうる。例えば、必要とされる成分（１種若しくは複数）を保有する１種若しくはそれ以上の適する遺伝因子（例えばプラスミド）を所望の細胞株にトランスフェクトしうる。
【００５２】
一態様において、培地は、ＣａＣｌ２（無水）、Ｆｅ（ＮＯ３）９Ｈ２Ｏ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４（無水）、ＮａＣｌおよびＮａＨ２ＰＯ４  Ｈ２Ｏのような無機塩、Ｌ−アルギニンＨＣｌ、Ｌ−シスチン２ＨＣｌ、グルタミン、グリシン、ヒスチジンＨＣｌ  Ｈ２Ｏ、イソロイシン、リシンＨＣｌ、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン２Ｎａ  ２Ｈ２Ｏおよびバリンのようなアミノ酸、Ｄ−Ｃａパントテン酸、塩化コリン、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、リボフラビンおよびチアミンＨＣｌのようなビタミン、ならびにＤ−グルコース、フェノールレッドおよびピルビン酸ナトリウムのような他成分を含有する、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）のような無血清培地である。他の適する無血清培地を選択してもよい。
【００５３】
本発明の血清の非存在下で（すなわち無血清培地中で）製造される細胞は、好ましくは、それを血清若しくは血清成分の非存在下で培養し得るという付加的な利点を有する。従って、単離は容易かつ費用効率がよく、安全性が高められ、そして該系は良好な信頼性を有する（合成培地は再現性に最良である）。本発明の細胞、およびとりわけ初代細胞に基づくものは、正常な（ヒトにとって）翻訳後およびペリ翻訳（ｐｅｒｉ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）修飾および集成が可能である。これは、それらが治療およびワクチン組成物での使用のためのウイルスタンパク質およびウイルスを製造するのに非常に適することを意味している。
【００５４】
別の態様において、血清を含有する培地を選択しうる。加えて、若しくはあるいは、培地は、培養工程の前若しくは間に所望の栄養素、活性化（誘導）剤若しくは血清と混合しうる（例えばＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清）。なお別の態様において、無タンパク質培地を利用しうる。
【００５５】
新鮮培地およびいかなる必要な誘導若しくは活性化剤も（例えば蠕動ポンプ若しくは他の適する手段により）供給し、そして使用済み培地（ｓｐｅｎｔ  ｍｅｄｉｕｍ）を同一流速で培養容器から除去する。培養物容量を維持し、またた、希釈速度はポンプ運転速度を変更することにより変えることができる。開始後、培養物は選択した細胞培養物に適す
る温度範囲（例えばほぼ室温ないし３７℃）で攪拌しながら維持する。培養物は選択した細胞型に依存して好気性若しくは嫌気性でありうる。
【００５６】
培地は、トランスフェクション、若しくは安定に発現する細胞株を培養することの開始のおよそ２４時間後に添加されることを必要とすることができることが予期される。しかしながら、培養物は、上清の収集および培地の添加のタイミングをより正確に評価するために、定期的にサンプリングして上清中の宿主細胞およびＡＡＶの濃度を測定し得る。
【００５７】
従って、一態様において、本発明はＡＡＶウイルス製造のための連続的系を提供する。一態様においてバッチ培養物を使用する。例えば、バッチ培養物は、懸濁液および／若しくは接着細胞、流加培養法、充填および抜き出し（ｆｉｌｌ  ａｎｄ  ｄｒａｗ）を利用しうる。多様なバッチ培養系が当業者に既知であり、そして例えばバイオリアクター、醗酵槽、微小担体系、静置フラスコ、セルファクトリー（ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｙ）、ローラーボトル、使い捨て袋（例えばＷａｖｅＴＭ系）、ステンレス鋼およびガラス容器を利用する。他の系、例えば中空繊維バイオリアクター、微小担体系、セルキューブ系（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、スピンフィルター、充填層（ｐａｃｋｅｄ  ｂｅｄ）バイオリアクター（例えばＦｉｂｒｅセル）、細胞被包化のような灌流系をＡＡＶウイルス製造に使用し得る。
【００５８】
連続系において、多様な段階でサンプルを得かつ感染性、ゲノム滴定若しくは他の適する方法によりウイルスの濃度を測定することが当業者に公知である。適切な濃度が一旦得られれば、上清を所望の精製系に抜き出し得る。同時に、適切な量の補充培地およびいずれかの他の必要な成分を細胞培養物に供給する。
【００５９】
上清中のＡＡＶは当業者に既知である適する技術を使用して収集し得る。例えば、モノリスカラム（例えばイオン交換、アフィニティー若しくはＩＭＡＣ様式の）、クロマトグラフィー（例えば捕捉クロマトグラフィー、固定法クロマトグラフィーおよび膨張層クロマトグラフィー）、濾過ならびに沈殿を、精製および濃縮に使用し得る。これらの方法は単独で若しくは組合せで使用しうる。一態様において、カラムに基づく若しくは膜に基づく系を包含する捕捉クロマトグラフィー法を、濾過および沈殿と組合せで利用する。例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００およびＮＨ３ＳＯ４を利用する適する沈殿法が当業者により容易に選択され得る。その後、沈殿物をベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｚｅ）で処理しかつ適する技術を使用して精製し得る。
【００６０】
一態様において、有利には、本発明の方法を使用して製造される場合、細胞培養物上清は、細胞内に留まるＡＡＶに比較して有意により高レベルのＡＡＶを含有する。ある態様において、上清は最低６０％の収率でＡＡＶを含んでなる。
【００６１】
現在、発明者は、３０以上の組換えＡＡＶ種について、細胞ペレットに対し上清の収集によりＡＡＶ製造効率が増大されたことを見出した。
【００６２】
従って、本発明は、本発明の方法若しくは使用により得ることができる治療若しくはワクチン組成物での使用のためのウイルスもまた提供し、該ウイルス若しくはウイルスタンパク質はいかなるヒト以外の哺乳動物のタンパク質性物質も含まず、また、製薬学的製剤はこうしたウイルスおよび／若しくはウイルスタンパク質を含んでなる。こうしたウイルスの例は、それと同一日に申請されかつ２００６年４月２８日出願の米国仮出願第６０／７９５，９６５号の利益を主張する、”Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＡＡＶ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｃａｐｓｉｄ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ（低下されたキャプシド免疫原性を有する改変ＡＡＶベクターおよびそれらの使用）”と題された共通に所有される特許出願に記述されるものを包含する
。
【００６３】
従って、一態様において、本発明は本明細書に記述されるところのＡＡＶを製造するためのキットを提供する。こうしたキットは以下の成分の１種若しくはそれ以上を含有しうる。ＡＡＶウイルス粒子のパッケージングを司ることが可能な適する生産細胞を供給しうる。こうした生産細胞は、ＡＡＶの製造に必要とされる要素の全部を含有するよう工作されていることができる。あるいは、こうした生産細胞は、それがヘパリン結合部位に結合することが可能なヘパリンを発現する能力を欠くように変えられていてもよい。他の適する成分は、トランスフェクション試薬、ベクターの構築のためのプラスミド成分、集成されたＡＡＶ粒子の収集（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、精製、濃縮若しくは収集（ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ）に必要な成分、精製するためのウイルス粒子の陰性若しくは陽性選択のための試薬、ウイルス調製物の濃縮のための試薬、および／またはウイルス調製物中の汚染物質の酵素消化のための試薬を包含しうる。
【００６４】
以下の実施例は、本発明の細胞培養物の上清中でのＡＡＶ粒子の製造方法を具体的に説明する。
【実施例１】
【００６５】
実験：
２９３細胞を、ＡＡＶの製造に必要とされるプラスミド、すなわちＡＡＶ２  ｒｅｐ、アデノウイルスヘルパー構築物およびＩＴＲに隣接される導入遺伝子カセットで、ＣａＰＯ４を用いてトランスフェクトした。ＡＡＶ２  ｒｅｐプラスミドは、研究されている特定のウイルスのｃａｐ配列もまた含有する。該ｃａｐ配列は全実験で唯一変動可能である。これらの実験を数種の導入遺伝子カセットについて反復した。血清含有ＤＭＥＭ中で起こったトランスフェクション２４時間後に、血清を含む若しくは含まない新鮮培地で培地を置き換えた。トランスフェクション３日後に、サンプル（Ｉ）を２９３接着細胞の培地から採取した。その後、細胞を掻き取りかつ受器に移した。細胞ペレットを除去するための遠心分離後に、掻き取った後の上清からサンプル（ＩＩ）を採取した。次に、細胞溶解を３回の連続する凍結−融解周期（−８０℃ないし３７℃）により達成した。細胞破片を除去し、そしてサンプル（ＩＩＩ）を培地から採取した。サンプルは、ＴａｑｍａｎＴＭ
ＰＣＲによるＤＮアーゼ抵抗性ゲノム滴定によりＡＡＶについて定量した。こうしたトランスフェクションからの全生産収量はサンプルＩＩＩからの粒子濃度に等しい。３画分すなわち培養上清画分、細胞ペレット画分、ならびに細胞の掻き取りおよびその後の遠心により放出される画分がこれに含有される。これらの画分の絶対数を以下の方法で得る。上清の粒子数＝サンプルＩの粒子数
掻き取ることおよび回転することにより除去される画分の粒子数（ゆるく細胞に会合される）＝サンプルＩＩ−サンプルＩの粒子数
細胞ペレット中の画分の粒子数＝サンプルＩＩＩ−サンプルＩＩの粒子数。
【００６６】
結果：
ＲｘｘＲ［配列番号１２］モチーフ（ドメイン）の存在は、ＡＡＶ粒子の局在化を細胞ペレットに主に限定するのみならず、しかしまたおそらく飽和により細胞支持体からのその生産も制限する。この制限は、ヘパリンに結合しないＡＡＶ２ホモログすなわちＡＡＶ８について観察されない（図１および２）。血清の存在（Ｓ）若しくは非存在（ＳＦ）（図２）は、ヘパリンに結合しないＡＡＶについてＡＡＶ粒子の生産に対し劇的に影響しないようである。ヘパリンに結合するＡＡＶ２の飽和効果は、他方、血清の存在下でいくらか軽減されるようである。
【００６７】
別の例において、実験室スケールで従来技術の方法を使用して、約４０枚の１５ｃｍ皿が、ＡＡＶ２／７について全体で平均約４×１０１３粒子を生じることが予期されるとみ
られる。本発明は、上清の含有物についてプレートあたり４．７×１０１２粒子まで採集されることを可能にする。
【００６８】
また、無血清培地の使用と組合せで、本技術はその後の精製の努力を劇的に減少させる。より具体的には、本発明の上清収集方法を使用して製造されるＡＡＶ２／１およびＡＡＶ２／８を、以前に記述された方法を使用して製造しかつＣｓＣｌ勾配を介して精製したＡＡＶ２／１およびＡＡＶ２／８と比較した。双方のウイルスについて、ある濃度範囲にわたり、本発明の上清収集方法により得られたＡＡＶ２／１およびＡＡＶ２／８粒子について、有意により高い感染性が観察された。
【００６９】
再現可能に、多数のＡＡＶ単離物について、単一の１５ｃｍ皿トランスフェクションからのＤＮアーゼ抵抗性粒子を、アデノ−ヘルパープラスミドデルタＦ６、パッケージングのためのＡＡＶ  ｒｅｐ−ｃａｐ発現トランスプラスミド、およびベクターゲノムのためのＡＡＶ２．ＣＭＶ．ｅＧＦＰシスプラスミドを用いて製造した。ヘパリンに結合しない単離物についてのこれらの小スケール精製の力価は、プレートあたり合計１０１２ないし１０１３ゲノムコピーを含有する粒子となった（図３）。これらの量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏ実験のための大部分の実験室の応用に十分である。
【実施例２】
【００７０】
上清中へのベクター放出を、血清型１、２、３、５、６、７、８および９、ならびに新規ベクターｒｈ３２．３３、ｒｈ．１０、ｈｕ．１１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．１．２、ｒｈ６４Ｒ１およびｒｈ８Ｒについて検討した。ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／３およびＡＡＶ２／５が最小限（全ＤＮアーゼ抵抗性ベクターゲノム若しくは粒子（ｄｒｐ  ｖｇ）の１０％未満）分泌することが見出された。ＡＡＡＶ２／９は、ウイルスベクター生産の間、上清中に適度に放出される（全ｄｒｐ  ｖｇの１０％以上、２０％未満）。試験した全部の他のベクターは、三重トランスフェクション後の２９３細胞での生産の間、それらのウイルス粒子の２０％以上を上清中に分泌する。
【００７１】
該上清から収集したベクターの感染性を、精製した（ヘパリン精製したＡＡＶ２を除きＣｓＣｌ純粋）調製物、ならびに細胞ペレットライセートから収集したベクターのものと比較した。上清から収集したＡＡＶは、単離物１、２、６、８若しくは９に基づくＡＡＶベクターならびにＡＡＶ２ＨＳＰＧ−についての２９３形質導入アッセイで、２種の後者の画分に比較した場合に等しい若しくはより高い感染性のものであることが見出された。
【００７２】
上清中へのベクター放出はそのヘパリン親和性と相関するようである。天然のＡＡＶ２（配列番号９）のＲＧＮＲ［配列番号１８］ヘパリン結合モチーフを遺伝子的に変異すること（ＳＧＮＴ、配列番号１９へ）によるこの親和性の除去は、上清中に放出されるベクターの画分を４０％以上増大する。ＡＡＶ８キャプシド（ヘパリンに結合しない、配列番号１１）の相同な位置でのヘパリンに結合するアルギニンの導入は、ウイルスベクター生産の収集の間に細胞ペレットとほぼ完全に会合しているＡＡＶ８ＲＱＮＲベクターを生じる。これは、その回収可能なベクターゲノム粒子の平均４０％以上を上清中に放出するその親ベクターＡＡＶ８と対照的である。
【実施例３】
【００７３】
異なるキャプシドを有する多様なＡＡＶベクターのＴ細胞活性化に対する影響を評価するために免疫化試験を実施した。該試験は、位置５３１のリシン残基にヘパリン結合ドメインを有することが知られている天然のＡＡＶ６を、キャプシドに部位特異的改変を導入させた３種の改変ＡＡＶと比較した。ＡＡＶ２／６．２（Ｋ５３１以外の１位置で改変した）、ＡＡＶ２／６．１（グルタミン酸を含有する（すなわち非保存的アミノ酸変化）ように位置５３１でＡＡＶ６キャプシド［配列番号３］を改変させた）、ならびにＡＡＶ６
．２およびＡＡＶ６．１キャプシドの改変の双方を伴うＡＡＶ６キャプシドを有するＡＡＶ２／６．１．２と呼称されるこれらのＡＡＶを利用した。これらのベクターの配列および生成は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／１３３７５号に記述されている。ＡＡＶ１は陰性対照としてはたらき、また、ＡＡＶ２が陽性対照としてはたらいた。
【００７４】
Ｂａｌｂ／ｃマウス（雄性）を、１×１０１１ＧＣのＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／６．１、ＡＡＶ２／６．２、ＡＡＶ２／６．１．２、ＡＡＶ２／１若しくはＡＡＶ２ベクターで筋肉内に免疫した。１３日後に群あたり３マウスから脾細胞を収集しかつ合わせた。等量の脾細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでＢａｌｂ／ｃ  ＡＡＶエピトープＩＰＱＹＧＹＬＴＬ［配列番号１］でｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激した。図４を参照されたい。
【００７５】
これらの結果は、未改変のＡＡＶ６キャプシドを含有するウイルスベクターが、ＡＡＶ２キャプシドにより誘導されるものに匹敵するＴ細胞のレベルを誘導したことを示す。対照的に、除去されたヘパリン結合ドメインを有する改変ＡＡＶ６ベクター（ＡＡＶ２／６．１およびＡＡＶ２／６．１．２）は、陰性対照（ＡＡＶ１）と事実上識別不可能であるＴ細胞応答を有した。
【００７６】
これは、ＡＡＶキャプシドへのヘパリン結合を媒介する原因であるアミノ酸残基を非保存的アミノ酸に変更することが、ヘパリン結合を除去するのみならず、しかしまたＴ細胞活性化も有意に低下させることを示す。
【実施例４】
【００７７】
数種の血清型のＡＡＶを、６．０から９．０までの範囲にわたるｐＨをもつ緩衝液中での陰イオン交換膜（Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ、Ｐａｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に結合するそれらの能力について評価し、そして０ないし５００ｍＭ塩勾配を使用して溶離をモニターした。高ｐＨ緩衝液は、試験した血清型のそれぞれの結合および溶離に最適であった（表１）。３血清型（ＡＡＶ８、ＡＡＶ７およびＲｈ８Ｒｃ）の溶離は１００ないし１５０ｍＭ範囲の勾配で起こった一方、２種（ＡＡＶ９およびＲｈ６４Ｒ１）は勾配の適用直後に溶離した。負荷した物質の回収は５０％（ＡＡＶ７）から１００％（ｒｈ６４Ｒ１）までの範囲にわたった。
【００７８】
【表２】
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【００７９】
該データは、陰イオン交換膜技術が多数のＡＡＶ血清型の精製に応用可能であることを示す。膜のマクロ孔質（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）構造により供給される高流速および結合能力により、本技術は細胞培養上清からのＡＡＶの精製にとりわけ適する。該データは、上清希釈若しくは緩衝剤交換が、陰イオン交換膜へのＡＡＶ結合のための適切な塩濃度を得るのに必要であろうことを示す。
【００８０】
本明細で引用される全部の刊行物は引用することにより本明細書に組込まれる。本発明
はとりわけ好ましい態様に関して記述された一方、本発明の技術思想から離れることなく改変をなし得ることが認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】陽性対照としてのＡＡＶ２／８製造を伴う、血清の存在（Ｓ）若しくは非存在（ＳＦ）下でのＡＡＶ２およびＡＡＶ２ＨＳＰＧ−の製造に対するヘパラン硫酸糖タンパク質（ＨＰＳＧ）の影響を具体的に説明する。
【図２Ａ】ＡＡＶ２／８陽性対照の上清（Ｉ）、ゆるく細胞に会合した（ＩＩ）および強固に細胞に会合した（ＩＩＩ）画分中のＤＮアーゼ抵抗性ＡＡＶ粒子（ｄｒｐ）の定量を示す。
【図２Ｂ−２Ｅ】血清の存在（血清若しくはＳ）または非存在（無血清若しくはＳＦ）下でのＡＡＶ２およびＡＡＶ２ＨＳＰＧ−の類似の画分を示す。
【図３】単一の１５ｃｍ皿トランスフェクションからのＡＡＶ単離物の収量を具体的に説明する。全部のヘパリンに結合しない単離物は合計１×１０１３ＧＣまでの範囲にわたる２×１０１２ＧＣ以上を生じる。ＡＡＶ２および単離物ｈｕ．５１はヘパリンを結合することが示されており、そして製造が制限される。
【図４】Ｔ細胞活性化での多様なＡＡＶでの免疫化の結果を示す棒グラフである。Ｂａｌｂ／ｃマウスを１×１０１１ＧＣのＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／６．１、ＡＡＶ２／６．２、ＡＡＶ２／６．１．２、ＡＡＶ２／１およびＡＡＶ２ベクターで免疫した。１３日後に脾細胞を群あたり３マウスから収集しかつ合わせた。等量の脾細胞をＥＬＩＳＰＯＴアッセイでＢａｌｂ／ｃ  ＡＡＶエピトープＩＰＱＹＧＹＬＴＬ［配列番号１］でｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激した。
【図５】２９３細胞培養系での三重の一過性トランスフェクションによる指定されるＡＡＶウイルスベクターの製造後に上清中に放出されるベクターの画分を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2009535030.tif 000006
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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