(57)【要約】本発明はバイオリアクターに関する。本発明に係るバイオリアクターは、第一流体分配チャンバと、第一流体収集チャンバと、を備え、前記第一流体分配チャンバと前記第一流体収集チャンバの間を流体連通させる少なくとも１つの導管を受け入れるように構成され、さらに、前記第一流体分配チャンバと前記第一流体収集チャンバの間で第二流体を分配するように配置された複数の分配器を含む第二流体分配手段を備える。本発明は、バイオリアクター用の取り外し可能なインサートにも適用される。本発明に係るバイオリアクター用の取り外し可能なインサートは、第一流体分配プレートと、第一流体収集プレートと、  前記第一流体分配プレートおよび前記第一流体収集プレートの間で第二流体を分配するように配置された複数の分配器を含む第二流体分配手段と、を備える。【選択図】図５B
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一流体分配チャンバと、
第一流体収集チャンバと、を備え、
前記第一流体分配チャンバと前記第一流体収集チャンバの間を流体連通させる少なくとも１つの導管を受け入れるように構成されたバイオリアクターにおいて、
前記バイオリアクターは、前記第一流体分配チャンバと前記第一流体収集チャンバの間で第二流体を分配するように配置された複数の分配器を含む第二流体分配手段を備える。
【請求項２】
請求項１に記載のバイオリアクターであって、前記バイオリアクターは第一流体分配チャンバと前記第一流体収集チャンバの間を流体連通させる複数の導管を備える。
【請求項３】
請求項２に記載のバイオリアクターにおいて、前記複数の導管は膜導管である。
【請求項４】
請求項２に記載のバイオリアクターにおいて、前記複数の導管各々の第一端部は前記第一流体分配チャンバに連結するように構成され、前記導管の各々の第二端部は前期第一流体収集チャンバと連結するように構成されている。
【請求項５】
請求項1に記載のバイオリアクターにおいて、前記第一流体は液体である。
【請求項６】
請求項1に記載のバイオリアクターにおいて、前記第二流体は気体である。
【請求項７】
請求項1に記載のバイオリアクターにおいて、前記複数の分配器は前記複数の導管の間で前記第二流体を分配する。
【請求項８】
請求項７に記載のバイオリアクターにおいて、前記複数の分配器は、前記複数の導管の長手方向軸を横切る方向に前記第二流体を分配する。
【請求項９】
請求項1に記載のバイオリアクターにおいて、前記複数の分配器は、前期第一流体分配チャンバと前記第一流体収集チャンバの間に伸びている。
【請求項１０】
請求項１に記載のバイオリアクターであって、前記バイオリアクターは少なくとも３つの分配器を備える。
【請求項１１】
前記の請求項のいずれかに記載のバイオリアクターにおいて、前記複数の分配器は、前記複数の分配器の長手方向に沿って位置する一連の複数の出口を備える。
【請求項１２】
請求項１１に記載のバイオリアクターにおいて、前期第二流体が前記複数の分配器から出て行く速度が前記複数の出口で実質的に等しくなるように、前記複数の出口は寸法付けされる。
【請求項１３】
前記の請求項のいずれかに記載のバイオリアクターにおいて、前記第一流体分配チャンバおよび前記第一流体収集チャンバは有孔プレートを備える。
【請求項１４】
前記の請求項のいずれかに記載のバイオリアクターであって、前記バイオリアクターは前記第一流体分配チャンバと前記第一流体収集チャンバの間に内腔を画定する表皮膜を備える。
【請求項１５】
請求項１４に記載のバイオリアクターであって、前記バイオリアクターは、第二外皮膜を備える。
【請求項１６】
請求項１５に記載のバイオリアクターにおいて、前記第二外皮膜は、前記表皮膜と前記第二外皮膜間の空間において温度を変化させる流体を変性させる温度を受け入れるように構成されている。
【請求項１７】
前記の請求項のいずれかに記載のバイオリアクターであって、前記バイオリアクターは、前記第一流体収集チャンバから前記第一流体分配チャンバを分離する複数のスペーサー棒を備える。
【請求項１８】
請求項１３に記載のバイオリアクターにおいて、前記有孔プレート、前記複数の導管、前記第二流体分配手段は、取り外し可能なインサートを構成する。
【請求項１９】
請求項１８に記載のバイオリアクターにおいて、前記インサートは、前記バイオリアクターの枠組みと係合する。
【請求項２０】
第一流体分配プレートと、
第一流体収集プレートと、
前記第一流体分配プレートおよび前記第一流体収集プレートの間で第二流体を分配するように配置された複数の分配器を含む第二流体分配手段と、
を備えるバイオリアクター用の取り外し可能なインサート。
【請求項２１】
取り外し可能なインサートを受け入れるように構成されたフレームを備えるバイオリアクターであって、第一流体入口および分配手段と、第二流体入口および分配手段と、第一流体収集手段および出口と、第二流体出口と、を備えるバイオリアクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載のバイオリアクターであって、前記バイオリアクターは、前記第一流体分配プレートと前記第一流体収集プレートの間で前記第二流体を分配するように配置された複数の分配器を備える。
【請求項２３】
前記の請求項のいずれかに記載のバイオリアクターにおいて、前記複数の膜導管は、ポリマー材料またはセラミック材料から成る。
【請求項２４】
明細書に記載されているか、あるいは例示されているバイオリアクターと実質的に同等なバイオリアクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオリアクターに関する。特に、本発明は、膜導管を含み、かつ、第一流体および第二流体を受け入れるように構成されたバイオリアクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物工学および生物薬剤産業において、もっとも重要な生物起源化合物は、細胞培養バイオリアクターまたはモジュール内で操作かつ制御される特定の細胞培養系を含むバイオプロセスを用いて生成される。
【０００３】
一般に、これらの細胞培養系は、幾つかのプロセスの制限ならびにこれら既存の基盤技術の最大生産能力の範囲を定める基本的な物理的制約を特徴付とする。これらの制限は、基本的には、これら技術の物質移動能力における限界として表される。このような既知技術の例としては、空気圧式リアクター、固相リアクターおよび膜導管バイオリアクターなどが挙げられる。
【０００４】
上述の制限がこれらリアクターの費用対効果およびそれらが発揮する効力に負の影響を及ぼすことは明白である。
【０００５】
更に、通常、特定のプロセスには特定タイプのリアクターが必要となるので、必要に応じてプロセスに特有のリアクターを新たに購入しなければならないということは非常に費用がかかる可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
改良型バイオリアクターへの希求がある。
所要の目的に適しているか、または商業的に実現可能な方法でこのような目的に適し得る改良型リアクターに対する更なる希求がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第一態様によれば、
・第一流体分配チャンバと、
・第一流体収集チャンバと、を備え、
前記第一流体分配チャンバと前記第一流体収集チャンバの間を流体連通させる少なくとも１つの導管を受け入れるように構成されたバイオリアクターであって、
前記リアクターが、前記第一流体分配チャンバと前記第一流体収集チャンバの間で第二流体を分配するように配置された複数の分配器を含む第二流体分配手段を備える。
【０００８】
バイオリアクターは、第一流体分配チャンバと前記第一流体収集チャンバの間を流体連通させる複数の導管を含んでいてもよい。これらの導管は、好ましくは膜導管である。本発明の好ましい実施形態において、導管は、軸方向に伸び、第一端部および第二端部を有する（飲料用ストローに似ている）。このような導管は、米国特許第５，９４５，００２号（Leukes他）および米国特許出願公開２００４／０１９１８５５Ａ１（Leukes他）に記載されており、これら特許文献の内容を参照することにより本明細書の一部とする。
【０００９】
導管の第一端部は、好ましくは、第一流体分配チャンバに連結するように構成され、導管の第二端部は、第一流体収集チャンバと連結するように構成されている。
【００１０】
第一流体は液体、例えば栄養液であってもよい。第二流体は気体、例えば酸素、窒素またはこれらの混合物であってもよい。
【００１１】
好ましくは、分配器は導管の間で第二流体を分配する。これらの分配器は、好ましくは、導管の長手方向軸を横切る方向に第二流体を分配する。分配器は、好ましくは、第一流体分配チャンバと第一流体収集チャンバの間に伸びており、導管と実質的に平行であってもよい。好ましくは少なくとも２つの分配器、より好ましくは少なくとも３つの分配器、より好ましくは少なくとも４つの分配器、より好ましくは少なくとも５つの分配器、より好ましくは少なくとも６つの分配器、より好ましくは少なくとも７つの分配器およびより好ましくは少なくとも８つの分配器がある。
【００１２】
チャンバは、好ましくは、有孔プレートを含む。導管は、孔と連結しているか、その内部に連結していてもよい。導管は、エポキシシーラントおよび／または固定板によって連結していてもよい。
【００１３】
チャンバは好ましくは互いに離れており、その間に導管が伸びている。
【００１４】
バイオリアクターは、これらチャンバの間に内腔を画定する表皮膜を含んでいてもよい。バイオリアクターは、第二外皮膜を含んでいてもよい。外皮膜は、２つの表皮膜間の空間において温度を変化させる流体を受け入れるように構成されてもよい。
【００１５】
第二流体分配手段は、好ましくはチャンバを包含する。第二流体分配手段は、マニホールドを含んでいてもよい。
【００１６】
バイオリアクターは、スペーサー手段、例えば、第一流体収集チャンバから第一流体分配チャンバを分離する棒を含んでいてもよい。
【００１７】
本発明のこの態様の一実施形態において、有孔プレート、導管および第二流体分配手段は、取り外し可能なインサートを備える。このインサートは、バイオリアクターの枠組みと係合していてもよい。
【００１８】
本発明の第二態様によれば、
−第一流体分配プレートと、
−第一流体収集プレートと、
−前記第一流体分配プレートおよび前記第一流体収集プレートの間で第二流体を分配するように配置された複数の分配器を含む第二流体分配手段と、を備える、バイオリアクター用の取り外し可能なインサートを提供する。
【００１９】
本発明の第三態様によれば、取り外し可能なインサートを受け入れるように構成されたフレームを備えるバイオリアクターであって、第一流体入口および分配手段と、第二流体入口および分配手段と、第一流体収集手段および出口と、第二流体出口と、を備えるバイオリアクターを提供する。
【００２０】
好ましくは、第二流体分配手段は、第一流体分配プレートと第一流体収集プレートの間で第二流体を分配するように配置された複数の分配器を含む。
【００２１】
好ましくは、取り外し可能なインサートは、内腔と、第一流体分配手段および第一流体収集手段の間で流体連通を行うための手段と、を備える。流体連通を行うための手段は、好ましくは導管であり、最も好ましくは膜導管である。本発明の好ましい実施形態において、導管は、軸方向に伸び、第一端部および第二端部を有する（飲料用ストローに似ている）。導管の第一端部は第一流体分配手段内に連結するように構成されており、導管の第二端部は第一流体収集手段と連結するように構成されている。
【００２２】
第一流体分配手段は、好ましくは、フレームによって画定された分配タンク（チャンバ）と、分配プレートと、ベースとを備える。分配プレートは、膜導管の第一端部が連結するように構成されている少なくとも１つの孔を画定する。フレームによって画定された収集タンク（チャンバ）と、収集プレートと、キャップとを備えるのが好ましい第一流体収集手段にも同じことが当てはまる。収集プレートは、導管の第二端部が連結する孔を画定する。膜導管の端部が、まず、同軸的にまたは別の方法でポットなどに連結し、次いで、分配プレートまたは収集プレートの孔と連結し得ることが理解されるであろう。また、エポキシシーラントを使用してもよい。更にまた、シーリングプレートを使用してもよい。
【００２３】
キャップおよびベースは、好ましくは、フレームおよび／またはインサートに取り外し可能に装着でき、第一および／または第二流体入口および／または出口を収容するように構成されてもよい。
【００２４】
分配プレートおよび／または収集プレートは、好ましくはインサート上に備えられている。
【００２５】
好ましい実施形態において、第一流体入口は、分配タンクと流体連通している。同様に、第一流体出口は、収集タンクと流体連通している。使用時には、第一流体が第一流体入口を通って分配タンクに進入し、分配プレートの孔を通過し、膜導管を通って、収集プレートの孔を通過して収集タンク内に入り、ここで、第一流体は第一流体出口を通ってバイオリアクターから出る。
【００２６】
好ましくは、第一流体は液体、例えば、微生物の成長を維持するのに好適な液体（栄養）培地であり、第二流体は気体、例えば空気である。培地によって維持され得る微生物の例としては、ストレプトミセス・セリカラー（Streptomyces  coelicolor）（好気的プロセスモード）および乳酸連鎖球菌（Lactococcus lactis）（嫌気的プロセスモード）を含むがこれらに限定されない細菌類および菌類が挙げられる。
【００２７】
膜導管は、ポリマー材料またはセラミック材料から成ってもよい。好ましくは、導管は、セラミック材料、より好ましくはＡｌ２Ｏ３から成る。これにより、膜導管やハウジングを損傷することなくオートクレーブ滅菌および化学的（例えばＨ２Ｏ２）洗浄を行うことができる。膜導管は、典型的には剛性であるので（ポリマー膜導管の場合に可撓性であるのとは対照的である）、インサートおよびバイオリアクターの組み立てが容易になり、それによって膜導管の接触が最小限に抑えられる。セラミック膜導管壁は（上述したような）微生物を良好に付着させ、その環境は、土壌適応有機体における分化を刺激し得る。
【００２８】
好ましくは、複数の膜導管は、第一流体分配手段および収集手段を接合する。膜導管を、バイオリアクターの特定用途に応じて事前に選択しておいてもよい。膜導管の一貫した間隔は正確に達成されてもよく、この間隔は用途毎に最適化されてもよい。膜導管の間隔空けは、分配プレートおよび収集プレートの孔を好適に位置決めすることによって行われる。
【００２９】
好ましくは、第二流体分配手段は、取り外し可能なインサート内に包含される。第二流体分配手段は、好ましくは、第二流体入口と、インサートの内腔内に位置する流体分配器の間を流体連通させるマニホールドを備える。流体分注手段は、１つまたは複数の膜導管に隣接し、かつ、好ましくは実質的にそれらと平行に位置決めされた少なくとも１つの軸方向に伸びる導管であってもよい。流体分配器は、１つまたは複数の膜導管の長手方向軸を横切る方向に第二流体を移動させるように構成されてもよい。これは、流体分配器の長さに沿って位置する一連の出口によって達成され得る。これらの出口は、第二流体がインサートの内腔内へ進入する速度が、流体分注手段の全ての出口で実質的に等しくなるように寸法付けされるのが好ましい。あるいは、出口はまた、第二流体が分配器から出る速度が、全ての出口で実質的に等しくなるように寸法付けされてもよい。
【００３０】
これは、出口によって付与される抵抗が各出口間の抵抗よりも実質的に大きくなるように出口を作製することによって達成され得る。
【００３１】
インサートは、スリーブを包含するか、またはスリーブ内に収容されていてもよい。スリーブは、膜導管の目視検査を可能にするものが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
ここで、ほんの一例として以下の図面を参照し、本発明をより詳細に説明する。
【００３３】
本発明によれば、図１に例証されるように、バイオリアクター１０は、取り外し可能なインサート３０を受け入れるように構成されたフレーム２０を備える。バイオリアクター１０は、第一流体入口３１および分配手段３２と、第二流体入口３３および分配手段３４と、第一流体収集手段４４および出口３５と、第二流体出口３６とを備える。
【００３４】
第一流体分配手段３２は、フレーム２０によって画定された分配タンク４７と、分配プレート３８と、ベース４８とを備える。
【００３５】
第一流体収集手段４４は、フレーム２０によって画定された収集タンク４９と、収集プレート３９と、キャップ５０とを備える。
【００３６】
キャップ５０およびベース４８は、フレーム２０に対して取り外し可能に装着でき、第一および／または第二流体入口３１、３３および／または出口３５、３６を収容するように構成されている。
【００３７】
取り外し可能なインサート３０は、第一流体分配手段３２と第一流体収集手段４４の間の流体連通を行うための手段を備え、この手段は、複数の膜導管３７の形態を取っている。導管３７は、軸方向に伸び、第一端部および第二端部を有する。導管３７の第一端部は分配プレート３８の孔に連結するように構成され、導管３７の第二端部は収集プレート３９の孔に連結するように構成されている。
【００３８】
インサート３０は、スリーブ４０を包含するか、または図２に示すようにスリーブ４０内部に収容されていてもよい。スリーブ４０は、ガラス、ステンレス鋼などのあらゆる好適な材料から作製されてもよい。ガラスは、良好な化学的適合性および良好な温度安定性を有し、ならびに、膜導管の目視検査を可能にするので、特に好適である。ステンレス鋼などの材料は、高圧用途に使用してもよい。バイオリアクター１０のフレーム２０は、第一流体分配手段３２および第一流体収集手段４４を適所に固定するための取り外し可能な支持手段４１を包含する。支持手段４１は、少なくとも１つの棒などであってもよい。支持手段４１により、取り外し可能なインサート３０を素早くかつ簡単にフレーム２０内に挿入することができる。
【００３９】
使用時には、図３に示されるような取り外し可能なインサート３０は、インサート３０をフレーム２０に対して機械的に封止することができる遊動ねじ込みロックリングなどの係止手段を用いてフレーム２０内に油圧および空気圧の両方によって封止されて特定的に位置決めされている。機械的封止は、シリコーンゴムベースのＯ−リングなどの機械的シールによって達成され得る。係止手段および機械的シールにより、膜導管３７を第一流体分配手段３２および第一流体収集手段４４から機械的に分離することができる。第一流体分配手段３２および第一流体収集手段４４はまた、それらが流体密であるように、フレーム２０に対して同様に封止されてもよい。第一流体は、第一流体分配タンク４７へ流入し、分配プレート３８の孔を通る。第一流体は、膜導管３７を通り、収集プレート３９の孔を通って第一流体収集タンク４９へと流入する。次いで、第一流体は出口３５を通って第一流体収集タンクから出てもよい。
【００４０】
第一流体分配プレート３８および収集プレート３９は、図２に例証される通りであってもよい。分配プレート３８により、分配タンク４７から膜導管３７への進入速度を、インサート３０内の膜導管３７の空間的配置全体にわたって等しくすることができる。分配手段３２は、図３に例証されるように、特定のバイオリアクターに応じて２つ以上のプレートなどからなり得ることが理解されるであろう。Ｏ−リングなどを用いて膜導管を分配プレート３８および／または収集プレート３９内に機械的に封止する際、第二プレートを圧力プレートとして使用してもよい。第二プレートが存在しない場合、樹脂または他の手段を用いて膜を分配プレート３８および／または収集プレート３９内に封止してもよく、それによって第二圧力プレートはもはや不要となる。
【００４１】
第一流体分配プレート３８および第一流体収集プレート３９ならびにバイオリアクター１０のフレーム２０は、典型的にはステンレス鋼などから作製される。典型的には、この材料によって高い化学的適合性が得られ、この鋼の表面粗度は、約０．２２μｍ未満であるのが好ましい。
【００４２】
典型的には、第一流体は液体であり、第二流体は気体、好ましくは空気である。故に、バイオリアクターは、典型的には、メンブレンバイオフィルムリアクター(Membrane Biofilm Reactor)の動作に必要な網状化を可能にする気体−液体接触器である。しかしながら、バイオリアクターはまた、膜導管の外面上に成長するバイオフィルムへ大量の液体を物質移動させる液体−固体接触器であってもよい。これは通常、嫌気性の二次代謝産物および組み換えタンパク質生成プロセスに使用される構成である。
【００４３】
図２には、膜導管３７の配置が詳細に示されている。好ましくは、複数の膜導管３７は、第一流体分配手段３２および収集手段４４を接合する。インサート３０内の膜導管３７の構成は、典型的には、分配プレート３８の構成に依存するか、またはそれにより決定される。この可変構成により、インサート３０は、膜導管のタイプ／形態３７に対して柔軟性を有するようになる。更に、それにより、膜導管３７の間隔を正確に決定することができ、膜導管３７同士の一貫した間隔を維持するのがより容易になる。これは通常、市販のリアクターモジュールを大量生産する際に達成するのが困難であり、結果として、膜導管は、様々な微生物の成長に最適ではない無作為な束として配置されることが多い。本発明では、各特定用途に合わせて膜導管３７の間隔を最適化することがより容易である。例えば、厚いバイオフィルムが生成される場合、通常、膜導管３７同士の間隔をより広くするのがより有利である。使用するインサート３０および特定用途に応じて膜導管３７を事前に選択しておいてもよい。
【００４４】
膜導管３７は、管状の膜導管、毛細管状の膜導管、中空繊維などの形態を取ってもよい。
【００４５】
膜導管３７は、セラミック材料、好ましくはＡｌ２Ｏ３、またはその他好適な材料から作製されてもよい。これにより、膜導管やハウジングを損傷することなく、（蒸気）オートクレーブ滅菌および化学的洗浄が可能となる。膜導管３７は、典型的には剛性であり（ポリマー膜導管の場合に可撓性であるのとは対照的である）、これにより、膜導管３７の接触を最小限に抑えつつ、組み立てを容易に行うことができる。セラミック膜導管壁は微生物を良好に付着させ、その環境は、土壌適応有機体における分化を刺激し得る。
【００４６】
取り外し可能なインサートを有する利点は数多くある。第一に、従来のリアクターでは、膜導管が破損したり、割れたりした場合、リアクター全体を交換しなければならないことが多い。しかしながら、本発明によれば、プロセスを著しく遅滞させることなく、膜導管を容易に交換することができる。更に、図３に例証するように圧力プレートでインサートを機械的に封止することにより、膜の個別交換が可能になり、樹脂ベースのシーラントを使用した場合よりもインサートの再利用をより容易に行うことができる。この結果、明らかに、修理および保守の所要時間が短縮されるであろう。第二に、単一の用途に向けて特定的に製造される当該技術分野で既知の多くのリアクターとは異なりこれらのインサートは、用途に応じて容易に取り替え可能である。使用するインサートに応じて複数用途に使用できるリアクターを有することは、非常に費用効率的かつ効果的である。第三に、インサートは取り外し可能であるので、リアクターの洗浄がはるかに容易である。故に、取り外し可能なインサートは、異なる膜導管の間隔を必要とし得る異なる有機体に対する用途、またはバイオリアクターの他の用途（例えば、かん流システムのための膜濾過を含むがこれに限定されない）に対して柔軟に対応する。更に、バイオリアクターアセンブリは、インサートが取り替え可能であり、使用後に容易に取り外して洗浄することができるか、または最適な配置のために変更されてもよいようなものである。
【００４７】
図２および図３に例証されるように、インサート３０内にある、典型的には空気などの気体である第二流体３４を分配するための手段は、好ましくは、インサート３０の内腔５２内に位置する分配器４６と流体連通しているマニホールド４５を備える。マニホールド４５および／または分配器４６はインサート３０と一体成形されている。これにより、分配器がインサート構造の一部であり、かつ、後段でインサートに装着されないので、インサート３０を幾つかの様々なタイプの材料から作製することができる。
【００４８】
分配器４６は、少なくとも１つの膜導管３７（図３には示さず）に隣接し、かつそれに対して実質的に平行に位置決めされた導管である。分配器４６は、膜導管３７の軸方向長さを横切る方向に空気を移動させるように構成されている。これは、分配器４６の長さに沿って位置する一連の出口（図示せず）によって達成され得る。
【００４９】
出口は、好ましくは、空気がインサート３０へ進入する速度が全ての出口で実質的に等しくなるように寸法決めされる。故に、各出口からの空気の流動は、典型的には実質的に同じである。これは、出口によって付与される抵抗が各出口間の抵抗よりも実質的に大きくなるように出口を作製することによって達成され得る。更に、インサート３０内の分配器４６の配置は、空気流が膜導管３７の周辺で均一に拡散／分配されるようなものである（図７Ａおよび図７Ｂを参照）。
【００５０】
分配器４６を、バイオリアクターが使用される特定用途に従って、分配器４６の長さに沿った出口の数を増やすまたは減らすように製造することができる。膜導管３７を通って出口から出る空気の流動は、典型的には、低い第二流体流速で乱流を増大させ、低いエネルギー伝達速度で高い第二流体物質移動を促進する。
【００５１】
第二流体が空気である場合、物質移動は、好ましくは酸素の物質移動である。膜導管内の典型的には液相（液体培地など）と、インサート内の典型的には気相（空気など）の間の流体連通は、膜導管３７全体にわたる圧力差勾配を用いて達成される。この圧力勾配は、典型的には、バイオリアクター１０の様々な区画を空気圧および油圧により封止することを必要とする。
【００５２】
次いで、インサートの上部での空気の再循環は、空気が加熱されるときのエネルギー移動を促進して、細胞成長に貢献するインキュベーション温度を付与する。膜導管３７の配向を横切る方向に空気が流動することにより、典型的には、酸素の物質移動が良好になる。この結果、より大型のバイオリアクターも、酸素の制限なく、より小型のバイオリアクターと同じく酸素の物質移動を良好に行うことができる。分配器４６は、十分な流体（空気）が提供されるように特定の用途またはリアクターサイズの要件を満たすべく作製されてもよい。
【００５３】
典型的には、バイオリアクター１０の第一端部および第二端部は置き換え可能ではない。これは、分配器４６がインサート３０の第一端部を通り、バイオリアクター１０の上端部のみに位置する、図１、図２および図３に示すようなインサート３０の構成に起因している。この例では、分配器４６は、インサート３０全体およびインサート／フレーム／バイオリアクターの第二端部を通らない。この選択的なアセンブリ構成により、バイオリアクター１０の様々な構成要素を封止するのに必要なシールの数が最小限に抑えられるので、あり得る汚染物質の接触点も最小限に抑えられる。しかしながら、更なる実施形態には置き換え可能な端部が包含されてもよく、故に本発明は上述の実施形態に限定されるものではないことが理解されるであろう。
【００５４】
バイオリアクター１０は、典型的には、蒸気滅菌ならびに溶媒、腐食剤および酸化剤などのきつい化学薬品による洗浄を可能にする材料から構成されている。採用する多孔率および作動流体の流速に基づいて、第一流体流に付与された流れ抵抗が、膜導管３７の全長に沿った透過を促進するように、バイオリアクターの高さが決定される。更に、膜導管はそれ程長くないので、好気的培養モードでの垂直操作における第一流体の流路は、成長（すなわち、バイオフィルムはあまりにも重くなり、崩壊する）および生成物の形成（すなわち、流路がトロイダル形状で伸びているので、代謝廃棄物がバイオリアクターの底端部でバイオマスを妨害する）にとっては次善である。
【００５５】
使用時には、バイオリアクター１０は、実質的に垂直に配置され、典型的にはリアクターの基部に第一流体入口３１を備え、かつ、典型的にはバイオリアクター１０の上部に第二流体入口３３を備える。バイオフィルムは、膜導管３７の外面に設けられており、これら膜導管３７は毛細管状の膜導管であってもよい。これは、所望の微生物の胞子または栄養移植物を膜を通して逆濾過し、あらゆる透過物をインサート３０の内腔５２から膜導管３７の内腔内に排出し、第一流体出口３５から出すことにより達成される。故に、この移植物は膜の表面に固定される。
【００５６】
次いで、微生物に適した栄養培地が、膜導管３７内に供給され、表面上に設けられたバイオフィルムにおいて成長が起こるのに十分な速度で導管を通ってインサート３０の内腔５２へと連続的にかん流する。膜導管３７を通過した栄養培地は、収集タンク４９内へ入り、出口３５から出るが、ポンプで戻され、インサート３０の分配手段３２を通って再利用されてもよい。栄養培地の一部は膜を通過して、バイオフィルム上で透過物の液滴を形成し、バイオフィルムから流れ落ちる。加湿空気が分配器４６によりインサート３０内へ供給され、出口３６および５１を通って放出される。出口５１は、バイオリアクターの用途に応じて、閉鎖されていても、開放されたままでもよい。好ましくは、出口には、バイオリアクター内の圧力をモニタリングすることができる圧力ゲージ（図示せず）が含まれる。バイオフィルムのあらゆる生成物が栄養培地の透過物内に集められ、出口３６を通って第二流体と共にリアクターの内腔５２から除去される。
【００５７】
バイオリアクター１０を通って吹き出される空気は、バイオフィルムの生存能力に必要な酸素を供給し、かつ、バイオフィルムの外面から放出される胞子や死細胞を持ち去る働きをする。
【００５８】
バイオリアクターを液体−固体接触器として作用させる場合、栄養培地は、第二流体分配器４６を通してバイオフィルムに供給される。リアクターの内腔５２に成長培地を充填し、先に記載したように、好気的操作のための移植プロセス中に流体がバイオフィルムを通り抜けて導管３７の内腔内へ入ると、膜導管３７の表面上にバイオフィルムが固定される。透過物は、第一流体分配手段３２または収集手段４４を通って、第一流体入口３１または出口３５手段から収集される。これによりバイオフィルムの微好気的または嫌気的成長が可能になり、バイオフィルムへの栄養物の物質移動が増大し、かつ、代謝廃棄物および／または産物が連続的に除去される。
【００５９】
図５Ａ、図５Ｂおよび図６は、本発明によるバイオリアクターの代替実施形態を示している（導管は図示せず）。これらの図では、バイオリアクターは密閉型装置であり、特定の目的に合うように予め組み立てられた状態で販売されていてもよい。このような実施形態では、バイオリアクターは、第一流体収集チャンバ（タンク）４９から第一流体分配チャンバ（タンク）４７を離して配置するスペーサー棒を含む。
【００６０】
バイオリアクターの構成要素は六角ねじ６１で共に固定され、これら構成要素間の界面は、Ｏ−リングシール６２により液（気）密にされている。
【００６１】
図６において、第一流体遮断器プレート６３は、第一流体入口３１に隣接して位置し、第一流体の進入ベクトルを曖昧にするので、結果として、第一流体分配チャンバ４７内での第一流体の分配が向上する。
【００６２】
図７Ａおよび７Ｂにおいて、ＬＭＡ（局所平均齢）のシミュレーションは、シミュレートした滞留時間分布解析に相似している。
【００６３】
シミュレーション結果により、決定すべき流出空気分子齢の変動を解析することができる。有意な差異は、層流および乱流の不均一な流動および／または状態が発生するかまたは存在する、設計容量内の領域を示している（ここで、レイノルズ数（Ｒｅ）は、解析されている同容量内で２０００よりも著しく大きいか、または小さい）。
【００６４】
２０００よりも大きいおよび２０００よりも小さいＲｅが存在する状況では、有機体が低いせん断環境下にある（本発明に固有の利点）という前提が無効である。計算流体力学（ＣＦＤ）シミュレーションによると、設計は、これを考慮に入れており、全てのＬＭＡ値が多かれ少なかれ互いの７〜１０秒以内である為、速度プロファイルが相似していることを示し、かつ、有機体周辺の環境が不均質ではなく、実際にはより均質であることを示しており、ハードウェアに関する限り、これらの状態が解析され（全ての状態を「バイオフィルムなし」と示す）、それに加えて、導管上に存在するバイオフィルム（１２ｍｍのバイオフィルムをシミュレートした全モデル）で明らかであろう空気流増加の可能性（および、おそらくはチャネリング）も考慮に入れていた。１２ｍｍのバイオフィルムは、所定の量成長した後の、２７ｍｍから３ｍｍまでの導管同士の空間制約をシミュレートした。
【００６５】
全てのシミュレーションを、１分当たりの進入空気および排出空気１容量に相当する直線気流速度で行った。
【００６６】
図７Ａおよび図７Ｂに示される断面図は、空気流入ジェットパターン（４つのベクトルパターン）をシミュレートしており、シミュレートされたバイオフィルムが、リアクター容量内の領域のいずれかへの空気道を不利に制限するかどうかをシミュレートしている。
ここで、以下の非限定例を参照して本発明を説明する。
【００６７】
＜例１＞
＜ストレプトミセス・セミカラー（Streptomyces  coelicolor）によるアクチノロージン（Actinorhodin）の生成＞
＜滅菌処理＞
ＭＦＲ(Multi-Fibre Reactor：多繊維型リアクター）モジュール、網状構造、圧力ゲージおよび補助器具／ボトルを、殺菌技法を用いて別々にオートクレーブで処理し、互いに接続した。標準的な操作手順に従って、ＭＦＲを好気的操作用に構成した。
【００６８】
＜移植＞
ＭＦＲモジュールのＥＣＳ（Extra Capillary Space：毛細管の外側空間）に、ストレプトミセス・セミカラーの３日間フラスコ培養物１００ｍｌを含有するおよそ２Ｌの成長培地を充填した。菌糸移植物を圧力下で毛細管膜の外面上に固定した。胞子移植物を、毛細管膜の内腔側から、培地の出口または主要なラインを通って収集容器内で収集した。全容量のＥＣＳ内移植物が排出されたら、標準の操作手順に従って、リアクターを好気的操作用に構成した。
【００６９】
＜操作＞
ＭＦＲを２８℃でインキュベートし、１時間当たり２Ｌの流速で毛細管膜（およびバイオフィルム）の外面全体にわたって空気流を用いて好気的に操作した。ＥＣＳ内の空気圧を、最初の２６日間は２０ｋＰａで維持し、２７日目および３６日目にそれぞれ４０ｋＰａおよび５０ｋＰａまで増大させた。毛細管の内腔およびＥＣＳ間の圧力差を利用して、膜表面にわたる流束およびバイオフィルムへの栄養物の供給を調節した。成長しているバイオフィルムが栄養物の流動に対する抵抗を増大させると流束レベルに影響を及ぼすので、安定な流束を維持するべく培地の圧力を手動で調節した。
【００７０】
バイオフィルムは急速に成長し、各膜表面に沿って広がり、黄色から赤へと変色した後、分化および胞子形成が観察された。８日目までには、バイオフィルムは青灰色になり、胞子および赤−黒色の透過物の液滴がバイオフィルムの表面上に目視できた。アクチノロージン生成物を含有する着色透過物を空気および透過物出口を介して収集した。Ａｔｅｓらによって１９９７年に記載された方法に基づく標準の操作手順を用いて、透過物内のアクチノロージンレベルを分光光度的に定量した（Ｅ１％、１ＣＭ＝３５５）。
【００７１】
＜生産性の概要＞
５０日間にわたって、ＭＦＲにより合計１０６７ｍｇが生成された。効率よくするために、生成は移植の３日後から開始した。ピーク生成は、２７日目〜５０日目の間であり（バイオフィルムの密集成長および分化と一致）、毎日の生成平均は３２．３ｍｇであり、リアクター容量１Ｌ当たりの平均容量生産性（空間／時間収量）は０．９８ｍｇ／ｈであった。
【００７２】
【表１】
2009533042.tif 000003
【００７３】
＜例２＞
＜Ｐ１７０発現系を用いた乳酸連鎖球菌（L.lactis）株ＰＲＡ２９０による組み換えベータ・ラクタマーゼの生成＞
＜滅菌処理＞
ＭＦＲモジュール、網状構造、圧力ゲージおよび補助器具／ボトルを、殺菌技法を用いて別々にオートクレーブで処理し、互いに接続した。標準的な操作手順に従って、ＭＦＲを微好気的または嫌気的操作用に構成した。
【００７４】
＜移植＞
乳酸連鎖球菌ＰＲＡ２９０の１５時間培養物５０ｍｌ（Ｐ１７０プロモータ−の制御下で組み換えベータ・ラクタマーゼ酵素を生成）を、ＭＦＲモジュールのＥＣＳ内に直接移植した。ＥＣＳにＬＭ１成長培地を充填し、ＥＣＳを再循環モード下で操作し、培養培地をシェル側から毛細管膜を通ってポンプで押出し、透過物を内腔側から収集した。このプロセスによって、毛細管膜の外面上にバイオマスを固定化することができた。
【００７５】
＜操作＞
２００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を含有するＬＭ１成長培地内で乳酸連鎖球菌を培養した。培養物を２５℃でインキュベートした。
【００７６】
はじめに、ＭＦＲを再循環モードで嫌気的に操作した。この期間中に、試料を内腔の出口から採取し、ｐＨおよび酵素活性を記録した。１５時間後、内腔出口を栄養物供給容器から切断し、透過物を清潔な透過物収集容器に収集した。新鮮なＬＭ１成長培地をＭＦＲに装着し、リアクターに新鮮な栄養物を連続供給した。透過物の流束、ｐＨおよび酵素活性を経時的にモニタリングした。シェル側で栄養培地をＭＦＲへ供給する圧力を変更することにより流束を手動で調節した。固定されたバイオフィルムが厚くなり、流動に対する抵抗が増すにつれ、培地の圧力を段階的に増大させて、流束レベルを維持した。最適な流束は、透過物のｐＨをモニタリングすることによって決定され、流束制御方策は、ＥＣＳ内のｐＨを、Ｐ１７０プロモータの制御下における組み換えタンパク質発現に最適なｐＨ範囲（ｐＨ５．５〜６．５）に可能な限り近づけて維持することを目的としていた。
【００７７】
透過物のＰＨレベルがｐＨ４に近づいたことを観察し、透過物のベータ・ラクタマーゼ活性が低下したことを観察し、１００ｋＰａに近い圧力においてさえ流束レベルを維持できなくなったら、実験を終了した。
【００７８】
ニトロセフィン法（Ｏｘｏｉｄ社）に基づく標準的な操作手順を用いてベータ・ラクタマーゼ活性を分光光度的に定量した。
【００７９】
＜生産性の概要＞
初期のベータ・ラクタマーゼレベルは、移植物の残留活性が再循環中に培地供給容器内で弱まるにつれ、最初の１５時間で低下した。更に、栄養物濃度の増大および乳酸連鎖球菌により生成された乳酸の希釈は、成長には最適であるが、ベータ・ラクタマーゼ生成を制御するＰ１７０発現系の自己誘導に悪影響を及ぼすので、組み換え酵素の発現が制限された。この１５時間の間で、およそ１０２１個のベータ・ラクタマーゼユニットが生成された。
【００８０】
１５時間後、成長しているバイオフィルムが、毛細管膜の表面上に薄膜としてはっきりと見えた。より低い流束で新鮮な栄養培地を連続供給するようにＭＦＲ操作を変更する際に、ベータ・ラクタマーゼ発現に最適な条件が達成された（ｐＨ５．５〜６．５）。移植後１６〜３８時間で、合計で３０９個のベータ・ラクタマーゼユニットが生成され、最大力価は７８５Ｕ／Ｌであった。この期間中、より高い流速を維持した結果、リアクター容量１Ｌ当たりの最大容量生産性は１９．７Ｕ／ｈであり、平均はリアクター容量１Ｌ当たり１０．５Ｕ／ｈであった。バイオフィルムが成長し、栄養物の流動に対する抵抗が増大するにつれ、流束を持続させるには圧力を連続的に高くすることが必要であった。ＭＦＲをモニタリングしなかった一晩の間に流束レベルは低下し、透過物のｐＨはｐＨ４．５まで下がり、これは発現に最適な範囲を下回っていた。栄養供給物を供給する圧力を増大させることにより、より高い流束レベルはある程度まで回復したが、バイオフィルムの厚さおよび抵抗が増大したので、生成範囲内にｐＨを安定化するのに十分な程高い流束レベルが得られず、バイオフィルムのプランクトン成長を防止するのに十分な程高い流速も得られなかった（この結果、栄養物供給容器内への再生長が生じ得る）。３９〜６２時間で、合計で８７個のベータ・ラクタマーゼユニットが生成され、最大力価は４００Ｕ／Ｌであった。流速が低い為に容量生産性は半減し、最大値はリアクター容量１Ｌ当たり６．９Ｕ／ｈに達し、平均値はリアクター容量１Ｌ当たり５．３Ｕ／ｈであった。
【００８１】
【表２】
2009533042.tif 000004
【００８２】
以下に示す文献は、本出願の内容を含むものとして考慮されるべきものである。
プロセス・バイオケミ３２の273-278頁に掲載「バッチおよびフェッド・バッチ培養によるストレプトミセス・セリカラーの産生」（1997年）S.エーテス、M.エリボル、F.マビトゥーナ共著。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】本発明によるバイオリアクターを上側の一面から見た斜視図である。
【図２】本発明によるバイオリアクターの断面図である。
【図３】本発明による取り外し可能なインサートを上側の一面から見た斜視図である。
【図４】ＭＦＲを用いたストレプトミセス・セリカラーによるアクチノロージンの経時的生成を示している。
【図５Ａ】本発明の一態様による、組立バイオリアクターの側面図である。
【図５Ｂ】図５Ａの断面を示している。
【図６】本発明の一態様によるバイオリアクターの立体分解図である。
【図７Ａ】バイオリアクター内での第二流体分配パターンの断面平面図であり、膜導管上にバイオフィルムが存在している。
【図７Ｂ】バイオリアクター内での第二流体分配パターンの断面平面図であり、膜導管上にバイオフィルムが存在していない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2009533042.tif 000010
【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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