(57)【要約】本発明は、標的部分（抗体または抗体断片など）、リンカーおよび治療的部分としてのカンプトテシンを含有する種々の異常細胞を標的にするための向上した能力を有する治療的複合体に関し、さらに、該複合体を生成および使用するための工程に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンプトテシン薬物、および式ＴＭ−［Ｌ］−ＣＰＴの標的部分（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ：ＴＭ）の複合体であって、ＴＭは、疾患標的部分であり、ＣＰＴは、カンプトテシンまたはその類似体であり、Ｌは、Ｘ−Ｙ−Ｚ型のリンカー系であって、Ｘは疾患標的部分結合部分であり、Ｙはリソソーム性に開裂可能なポリペプチドであり、ＺはＣＰＴ薬物に連結される４−アミノベンジルオキシ部分である、複合体。
【請求項２】
前記疾患標的部分は、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記抗体は、キメラ抗体である、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
前記抗体は、ヒト化抗体である、請求項２に記載の複合体。
【請求項５】
前記抗体は、ヒト抗体である、請求項２に記載の複合体。
【請求項６】
前記標的部分は、２重特異性または多特異性抗体である、請求項１に記載の複合体。
【請求項７】
前記標的部分は、３価の２重特異性抗体複合体である、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
前記ＣＰＴは、ＣＰＴ、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ＳＮ−３８、トポテカン、ルルトテカン、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、およびその誘導体から成る群から選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項９】
前記ＣＰＴはＳＮ−３８である、請求項１に記載の複合体。
【請求項１０】
前記開裂可能なポリペプチドは、フェニルアラニン−リジン、バリン−シトルリン、アラニン−ロイシン、ロイシン−アラニン−ロイシン、およびアラニン−ロイシン−アラニン−ロイシンから成る群から選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項１１】
Ｚは、ＣＰＴの２０−ヒドロキシ基とアミノ酸またはポリペプチドとのエステル結合のアミン末端に連結される、請求項１に記載の複合体。
【請求項１２】
前記エステル結合は、グリシン、アラニン、およびサルコシンを含む群から選択されるアミノ酸に由来する、請求項１１に記載の複合体。
【請求項１３】
前記リンカー系Ｌは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により置換され、抗体複合基において終結する、請求項１１に記載の複合体。
【請求項１４】
Ｚは、前記ＣＰＴの２０−ヒドロキシ基へ炭酸塩結合を介して連結する、請求項１に記載の複合体。
【請求項１５】
前記抗体連結基Ｘは、チオール反応性であり、マレイミド、ビニルスルホン、ブロモアセトアミド、およびヨードアセトアミドから成る群から選択される、請求項２に記載の複合体。
【請求項１６】
前記抗体連結基Ｘは、前記抗体上のチオール反応性残基と反応するチオール基であり、前記チオール反応性残基は、マレイミド、ビニルスルホン、ブロモアセトアミド、およびヨードアセトアミドから成る群から選択される、請求項２に記載の複合体。 
【請求項１７】
前記リンカーは、Ｘの構成要素として水溶性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに備え、ＸおよびＹ間の結合を構成する、請求項１に記載の複合体。
【請求項１８】
前記ＰＥＧは、大きさが最大５ＫＤであり、好ましくは１〜３０モノマー単位を有する定義されたＰＥＧを含有し、より好ましくは１〜１２モノマー単位を有する定義されたＰＥＧを含有する、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１９】
前記ＰＥＧは、大きさが最大５ＫＤであり、好ましくは１〜３０モノマー単位を有する定義されたＰＥＧを含有し、より好ましくは１〜１２モノマー単位を有する定義されたＰＥＧを含有する、請求項１７に記載の複合体。
【請求項２０】
請求項１に記載の複合体を生成する工程であって、前記リンカーは、前記ＣＰＴ薬物に最初に結合され、それによってＣＴＰ薬物−リンカー複合体を生成し、その後、前記ＣＴＰ薬物−リンカー複合体は疾患標的部分に結合される、工程。
【請求項２１】
ＣＴＰ薬物−リンカー調製は、１０−ヒドロキシル基を含有するＣＰＴ類似体の１０−ヒドロキシル保護基の選択的脱保護を含み、 ＣＰＴの２０−ヒドロキシル基を介する前記リンカーへのＣＰＴの結合を本質的に影響されない状態に維持する、請求項２０に記載の工程。
【請求項２２】
前記１０−ヒドロキシル保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルである、請求項２１に記載の工程。
【請求項２３】
前記ＣＰＴはＳＮ−３８である、請求項２１に記載の工程。
【請求項２４】
前記ＣＴＰ薬物−リンカーは、モノクローナル抗体またはフラグメントへの結合前に精製されない、請求項２１に記載の工程。
【請求項２５】
前記疾患標的部分は、モノクローナル抗体である、請求項２０に記載の工程。
【請求項２６】
前記抗体は、１から１２ＣＰＴ部分の間に付着される、請求項２に記載の複合体。
【請求項２７】
前記ＭＡｂは、マウス、キメラ、霊長類化、ヒト化、またはヒトモノクローナル抗体であり、前記抗体は、無傷、フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２）、またはサブ−フラグメント（単鎖コンストラクト）の形態である、請求項２に記載の複合体。
【請求項２８】
前記ＭＡｂは、キメラ抗体である、請求項２７に記載の複合体。
【請求項２９】
前記ＭＡｂは、ヒト化抗体である、請求項２７に記載の複合体。
【請求項３０】
前記ＭＡｂは、ヒト抗体である、請求項２７に記載の複合体。
【請求項３１】
前記ＭＡｂは、多特異性であり、標的細胞または病原体上に含有される少なくとも２つの異なる抗原またはエピトープを標的とする多数の結合アームを有し、１つ以上の特異的標的アームは、ＣＰＴに結合される、請求項２に記載の複合体。
【請求項３２】
前記多特異性ＭＡｂは、ＬＬｌ、ＬＬ２、ｈＡ２０、１Ｆ５、Ｌ２４３、ＲＳ７、ＰＡＭ−４、ＭＮ−１４、ＭＮ−１５、Ｍｕ−９、Ｌ１９、Ｇ２５０、Ｊ５９１、ＣＣ４９およびＩｍｍｕ３１から成る群から選択される１つ以上の抗体を含む２重特異性および／または２価抗体構成である、請求項３１に記載の複合体。
【請求項３３】
前記ＣＰＴはＳＮ−３８である、請求項３１に記載の複合体。
【請求項３４】
前記ＭＡｂは、癌または悪性細胞、感染性の生物、自己免疫疾患、循環器疾患、または神経系疾患と関連する抗原または抗原のエピトープと反応する、請求項２に記載の複合体。
【請求項３５】
前記癌細胞は、造血器腫瘍、癌腫、肉腫、黒色腫または神経膠腫からの細胞である、請求項３４に記載の複合体。
【請求項３６】
前記ＭＡｂは、Ｂ細胞系列抗原、Ｔ細胞抗原、骨髄細胞系列抗原またはＨＬＡ−ＤＲ抗原に結合する、請求項３４に記載の複合体。
【請求項３７】
癌抗原またはエピトープに対して標的化された前記ＭＡｂは、ＣＤ２０抗原に対するＡ２０である、請求項３４に記載の複合体。
【請求項３８】
前記ＭＡｂは、内在化抗体である、請求項３４に記載の複合体。
【請求項３９】
前記ＭＡｂは、ＣＤ２２抗原に対するＬＬ２である、請求項３８に記載の複合体。
【請求項４０】
前記ＭＡｂは、ＥＧＰ−１抗原に対するＲＳ７である、請求項３８に記載の複合体。
【請求項４１】
前記ＭＡｂは、ＣＤ７４抗原に対するＬＬｌである、請求項３８に記載の複合体。
【請求項４２】
前記感染性の生物は、細菌、ウイルス、真菌、微生物または寄生虫である、請求項３４に記載の複合体。
【請求項４３】
前記感染性の生物は、ＡＩＤＳの原因となるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、結核菌、ストレプトコッカスアガラクチア、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、在郷軍人病菌、化膿性連鎖球菌、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、肺炎球菌菌種、インフルエンザ菌Ｂ、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、ウエストナイルウイルス、緑膿菌、らい菌、ウシ流産菌、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、単純ヘルペスウイルスＩＩ、ヒト血清パルボ様ウイルス、ＲＳウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタインバーウイルス、マウス白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、疣ウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアンウイルス４０、マウス乳癌ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ原虫、ランゲルトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマ、ブルセイトリパノソーマ、マンソン住血吸虫、日本住血吸虫、ウシバベシア、アイメリアテネラ、回旋糸状虫、熱帯リーシュマニア、旋毛虫、タイレリアパルバ、胞状条虫、羊条虫、無鉤条虫、単包条虫、有線条虫属、マイコプラズマ アルスリチジス、マイコプラズマ ハイオリニス、マイコプラズマ オラーレ、マイコプラズマ アルギニニ、アコレプラズマ レイドロウイ、マイコプラズマ サリバリウム、および肺炎マイコプラズマから成る群から選択される、請求項３４に記載の複合体。
【請求項４４】
前記自己免疫疾患は、免疫性の血小板減、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、関節リウマチ、多腺性症候群、類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホシェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎線維化肺胞炎、および若年性糖尿病から成る群から選択される、請求項３４に記載の複合体。
【請求項４５】
前記循環器疾患は、心筋梗塞、虚血性心疾患、動脈硬化巣、フィブリン塊、塞栓、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３４に記載の複合体。
【請求項４６】
前記抗体は、神経系疾患と関連する抗原を特異的に結合し、前記抗原は、アミロイドまたはβアミロイドを含む、請求項３４に記載の複合体。
【請求項４７】
前記ＭＡｂは、ＣＤ７４、ＣＤ２２、上皮糖タンパク質−１、癌胎児抗原（ＣＥＡまたはＣＤ６６ｅ）、結腸特異的原−ｐ、αフェトプロテイン、ＣＣ４９、前立腺特異的膜抗原、カルボニックアンヒドラーゼＩＸ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥｒｂＢｌ）、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＩＬＧＦ、ＢｒＥ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＶＥＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＰｌＧＦ、他の腫瘍血管新生抗原、ＭＵＣｌ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ガングリオシド、ＨＣＧ、ＥＧＰ−２、ＣＤ３７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３０、Ｉａ、Ａ３、Ａ３３、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＫＳ−Ｉ、Ｌｅ（ｙ）、ＳｌＯＯ、ＰＳＡ、テネイシン、葉酸受容体、トーマス−フリードライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、Ｇａ７３３、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴｌＯｌ、ＭＡＧＥ、遊走阻止因子（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ：ＭＩＦ）、Ｌ２４３により結合される抗原、ＰＡＭ４により結合される抗原、ＣＤ６６ａ（ＢＧＰ）、ＣＤ６６ｂ（ＣＧＭ６）、６６ＣＤｃ（ＮＣＡ）、６６ＣＤｄ（ＣＧＭｌ）、ＴＡＣおよびそれらの組み合わせから成る群から選択される抗原に結合する、請求項２に記載の複合体。
【請求項４８】
前記ＭＡｂは、ＬＬｌ、ＬＬ２、ＲＦＢ４、ｈＡ２０、１Ｆ５、Ｌ２４３、ＲＳ７、ＰＡＭ−４、ＭＮ−１４、ＭＮ−１５、Ｍｕ−９、ＡＦＰ−３１、Ｌ１９、Ｇ２５０、Ｊ５９１、ＣＣ４９、Ｌ２４３、ＰＡＭ４およびＩｍｍｕ３１から成る群から選択される、請求項２に記載の複合体。
【請求項４９】
前記複合体は、非経口投与に適した形態である、請求項２に記載の複合体。
【請求項５０】
前記モノクローナル抗体は、複合多特異性抗体の一部である、請求項２に記載の複合体。
【請求項５１】
前記複合抗体は、ＣＤ７４、ＣＤ２２、上皮糖タンパク質−１、癌胎児抗原（ＣＥＡまたはＣＤ６６ｅ）、結腸特異的抗原−ｐ、αフェトプロテイン、ＣＣ４９、前立腺特異的膜抗原、カルボニックアンヒドラーゼＩＸ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ受容体（ＥｒｂＢｌ）、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＰｌＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＭＵＣｌ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＩＬＧＦ、ガングリオシド、ＨＣＧ、ＥＧＰ−２、ＣＤ３７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３０、Ｉａ、Ａ３、Ａ３３、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＫＳ−Ｉ、Ｌｅ（ｙ）、ＳｌＯＯ、ＰＳＡ、テネイシン、葉酸受容体、トーマス−フリードライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、腫瘍血管新生抗原、ＭＩＦ、Ｇａ７３３、ＩＬ−２、ＩＬ−６、Ｔ１０１、ＭＡＧＥ、Ｌ２４３により結合される抗原、ＰＡＭ４により結合される抗原、ＣＤ６６ａ（ＢＧＰ）、ＣＤ６６ｂ（ＣＧＭ６）、６６ＣＤｃ（ＮＣＡ）、６６ＣＤｄ（ＣＧＭｌ）およびＴＡＣから成る群から選択される２つ以上の抗原に結合する、請求項５０に記載の複合体。
【請求項５２】
前記複合抗体は、ＣＤ２０およびＣＤ２２に結合する、請求項５０に記載の複合体。
【請求項５３】
前記複合抗体は、ＥＧＰ−１のための少なくとも１つの結合部位を含有する、請求項５０に記載の複合体。
【請求項５４】
前記複合抗体は、ＣＤ７４のための少なくとも１つの結合部位を含有する、請求項５０に記載の複合体。
【請求項５５】
前記標的部分は、融合タンパク質である、請求項１に記載の複合体。
【請求項５６】
前記融合タンパク質は、抗体または抗体フラグメントを含む、請求項５５に記載の複合体。
【請求項５７】
第２の融合タンパク質、抗体または抗体フラグメントをさらに含む、請求項５６に記載の複合体。
【請求項５８】
第３の融合タンパク質、抗体または抗体フラグメントをさらに含む、請求項５７に記載の複合体。
【請求項５９】
前記第２の融合タンパク質、抗体または抗体フラグメントはまた、１つ以上のＣＰＴ部分に連結される、請求項５７に記載の複合体。
【請求項６０】
前記第３の融合タンパク質、抗体または抗体フラグメントはまた、１つ以上のＣＰＴ部分に連結される、請求項５８に記載の複合体。
【請求項６１】
前記融合タンパク質は、マウス、キメラ、霊長類化、ヒト化、またはヒトモノクローナル抗体を含み、前記抗体は、無傷、フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２）、またはサブ−フラグメント（単鎖コンストラクト）の形態である、請求項５６に記載の複合体。
【請求項６２】
前記２つの融合タンパク質は、同一のエピトープ、同一の抗原上の異なるエピトープ、または異なる抗原に結合する、請求項５７に記載の複合体。
【請求項６３】
請求項１に記載の複合体を被験者に投与するステップを含む、疾患を治療する方法。
【請求項６４】
前記複合体は、非結合抗体、放射性標識抗体、薬物結合抗体、毒素結合抗体、遺伝子治療、化学療法、治療用ペプチド、オリゴヌクレオチド、限局性放射線治療、手術および干渉ＲＮＡ療法から成る群から選択される１つ以上の他の治療法と組み合わせて投与される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記疾患は、癌、病原生物感染、自己免疫疾患、循環器疾患、または神経系疾患である、請求項６３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々のがん細胞、感染性病原体を標的にするため、および／または自己免疫疾患を治療するための向上した能力を有する治療的複合体に関し、複合体は、薬物のカンプトテシン基に属する標的（結合）部分および治療的部分を含有する。標的および治療的部分は、治療効果を増強させる細胞内で開裂可能な連結を介して連結される。
【０００２】
本出願は、２００６年３月２３日に出願された米国特許出願第１１／３８８，０３２号の優先権を主張するものであり、参照することによりその全体が本願明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
科学者は、特異的に標的化された薬物療法の分野において、ヒト癌への毒性薬の特異的送達に対してモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｉｔｉｂｏｄｙ：ＭＡｂ）を使用することを長年目的としている。腫瘍関連ＭＡｂおよび適切な毒性薬の複合体が開発されているが、癌療法において成功、不成功があり、他の疾患へは事実上適用されない。毒性薬は、粒子を放射する放射性核種、または細菌もしくは植物毒素もＭＡｂに結合されているが、化学療法薬が最も一般的である。
【０００４】
ＭＡｂ−化学療法薬複合体を使用する利点は、（ａ）化学療法薬自体は、構造上明確であること、（ｂ）化学療法薬は、大抵ＭＡｂ抗原に結合する領域から遠く離れた特定部位において、非常に明確な結合化学を使用してＭＡｂタンパク質に連結されること、（ｃ）ＭＡｂ−化学療法薬複合体は、ＭＡｂおよび細菌または植物毒素を含む化学的複合体よりもより再現性よく生成されることができ、それゆえ、商業的開発および規制許可に対して、より適切であること、および、（ｄ）ＭＡｂ−化学療法薬複合体は、放射性核種ＭＡｂ複合体よりも全身的に、桁違いに低毒性であること、である。
【０００５】
本発明は、細胞毒性化合物のカンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ：ＣＰＴ）基の複合体の調製に関連する特定のの問題を解決する。ＣＰＴおよびその誘導体は、強力な抗癌剤の種類である。イリノテカン（ＣＰＴ−１１とも称される）およびトポテカンは、承認された癌治療薬である（Ｉｙｅｒ  ａｎｄ  Ｒａｔａｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．４２：Ｓ３１−Ｓ４３（１９９８））。ＣＰＴは、トポイソメラーゼＩ−ＤＮＡ複合体を安定化させることにより、トポイソメラーゼＩ酵素を抑制する作用を有する（Ｌｉｕら、ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｓ：Ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，Ｌｉｅｈｒ  Ｊ．Ｇ．，Ｇｉｏｖａｎｅｌｌａ，Ｂ．Ｃ．ａｎｄ  Ｖｅｒｓｃｈｒａｅｇｅｎ（ｅｄｓ），ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，ＮＹ  ９２２：１−１０（２０００））。
【０００６】
ＣＰＴは、複合体の調製において一連の問題を呈する。１つの問題は、ＣＰＴ誘導体の多くが水性緩衝液中で不溶性であるということである。次に、ＣＰＴは、巨大分子に結合させる構造的変化に対して特有の課題を呈する。例えば、ＣＰＴ自体は、Ｅ環において第３級ヒドロキシル基のみを含有する。ＣＰＴの場合のヒドロキシル官能基は、その後のタンパク質結合に適したリンカーと結合されなければならず、、ＣＰＴ−１１の活性代謝物であるＳＮ−３８、ならびにトポテカンおよび１０−ヒドロキシ−ＣＰＴなどの他のＣ−１０−ヒドロキシル含有誘導体などの強力なＣＰＴ誘導体において、Ｃ−１０位置でのフェノール性ヒドロキシルの存在は、必要なＣ−２０−ヒドロキシル誘導体化を困難にさせる。第３に、生理的条件下におけるそれらの構造のＥ環のδ−ラクトン部分の不安定性は、これらの生成物の抗腫瘍作用を大いに低減させる。したがって、結合手順は、ラクトン開環を避けるために７以下のｐＨで実行できるように行われる。一般的に、活性エステルなどのアミン反応基を持つ２官能性のＣＰＴの結合は、８以上のｐＨを必要とする。第４に、細胞内で開裂可能な部分は、ＣＰＴおよび抗体に連結するリンカー／スペーサーまたは他の結合部分内に組み込まれる。
【０００７】
生理的条件下におけるδ−ラクトン開口の問題は、これまで解決の努力がなされている。一つのアプローチは、アミノ酸を有するＣ−２０ヒドロキシル基をアシル化させ、アミノ酸のα−アミノ基をポリ−Ｌ−グルタミン酸に結合させることである（Ｓｉｎｇｅｒら、ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｓ：Ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，Ｌｉｅｈｒ  Ｊ．Ｇ．，Ｇｉｏｖａｎｅｌｌａ，Ｂ．Ｃ．ａｎｄ  Ｖｅｒｓｃｈｒａｅｇｅｎ（編者），ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，ＮＹ  ９２２：１３６−１５０（２０００））。このアプローチは、腫瘍部位内への高分子の受動拡散に依存する。また、このグリシン結合は、ＣＰＴの水溶性誘導体を生成する方法として（Ｖｉｓｈｎｕｖａｊｊａｌａら、米国特許第４，９４３，５７９号）、およびＣＰＴのＰＥＧ−誘導体化の調製において（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：１９３８−１９４０（１９９６））も報告されている。後者の場合において、アプローチは、水溶性および長時間作用型ＣＰＴの開発に関連して考案されており、それにより、ＣＰＴの体内半減期は向上し、薬物は体内で循環しながらその複合体から徐々に遊離される。
【０００８】
本発明は、上記４つの問題および合成の課題を考慮して、ＣＰＴの、特にＳＮ−３８などの１０−ヒドロキシ誘導体の複合体を調製する方法を開示する。ＳＮ−３８は、プロドラックの承認抗癌剤ＣＰＴ−１１の活性薬物型である。ＣＰＴ−１１の薬理作用およびＳＮ−３８へのその体内変換に関して、膨大な臨床データが利用可能である（ＩｙｅｒおよびＲａｔａｉｎ，ｓｕｐｒａ；Ｍａｔｈｉｊｓｓｅｎら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７：２１８２−２１９４（２００２）；Ｒｉｖｏｒｙ，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９２２：２０５−２１５，２０００））。活性型ＳＮ−３８は、ＣＰＴ−１１よりも２から３桁強力である。
【０００９】
タンパク質−薬物複合体に関する初期研究は、タンパク質−化学療法薬複合体が有益な治療薬となるためには、標的細胞内へ取り入れられた後に、薬物がその最初の形態で理想的には放出される必要があることを示した。Ｔｒｏｕｅｔら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６２６−６２９（１９８２））は、リソソーム性に開裂されて、そのままの薬物を遊離する、薬物と標的部分間の特異的ペプチドリンカーを使用する利点を示した。１９８０年代および１９９０年代初期の研究は、化学療法薬およびＭＡｂ間の化学的リンカーの性質にさらに重点を置いた。とりわけ、弱酸開裂可能なリンカーを使用して調製されたＭＡｂ−化学療法薬複合体が、腫瘍内部のｐＨは通常の生理学的ｐＨよりも大抵低いという見解に基づいて開発された。この点において、開裂可能なユニットとしてヒドラゾンを取り込むことにより、およびチオエーテル基を介してＤＯＸをＭＡｂに付着させることにより、優れた結果が発見された（Ｗｉｌｌｎｅｒら、米国特許第５，７０８，１４６号、Ｔｒａｉｌら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：２１２−２１５（１９９３））。このアプローチは、適切なリンカーで調製されたＭＡｂ−ドキソルビシン（ＤＯＸ）複合体が、前臨床研究においてヒト腫瘍異種移植片を有するマウスの治療に使用され得ることを示した。最初に承認されたＭＡｂ−薬物複合体であるゲムツズマブオゾガマイシン（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  Ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）は、抗ＣＤ３３抗体、ヒト化Ｐ６７．６、および強力なカリケアマイシン誘導体間で同様の酸に不安定なヒドラゾン結合を組み入れる。Ｓｉｅｖｅｒｓ  ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９：３２４４−３２５４（２００１）、Ｈａｍａｎｎ  ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：４７−５８（２００２）。一部の例では、ＭＡｂ−化学療法薬複合体は、化学療法薬およびＭＡｂ間の還元的に不安定なヒンダードジスルフィド結合を用いて生成された（Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３（１９９６））。さらに別の開裂可能なリンカーは、薬物およびジペプチド間に折り畳めるスペーサーをさらに組み込んだ、１つから４つのアミノ酸を含有する、Ｔｒｏｕｅｔらのリソソーム性に不安定なペプチドスペーサーと同様の、フェニルアラニン−リジンまたはバリン−シトルリンなどのカテプシンＢに不安定なジペプチドスペーサーを含む（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：８５５−８６９（２００２）、Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅら、米国特許第６，２１４，３４５Ｂ１号、Ｄｏｒｏｎｉｎａら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７７８−７８４（２００３））。また、後者のアプローチは、カンプトテシンの免疫複合体の調製においても利用された（Ｗａｌｋｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．１２：２１７−２１９（２００２））。研究されている別の開裂可能な部分は、抗体および化学療法薬間のリンカー内に組み込まれたエステル連結である。ＧｉｌｌｉｍａｒｄおよびＳａｒａｇｏｖｉは、パクリタキセルのエステルが抗ラットｐ７５  ＭＡｂ、ＭＣ１９２、または抗ヒトＴｒｋＡ  ＭＡｂ、５Ｃ３に結合された場合、複合��が標的特異的毒性を提示することを発見した。Ｇｉｌｌｉｍａｒｄ  ａｎｄ  Ｓａｒａｇｏｖｉ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：６９４−６９９（２００１）。
【００１０】
部分−薬物複合体の結合設計における開裂可能なリンカーの組み込みは誇張できないが、一方で、リンカーの設計がどのように特異的ＣＰＴ結合部分複合体の調製全体に影響を及ぼすかに関して重点を置くことも重要である。本発明は、２官能性の薬物−リンカー分子の調製に関連する問題を解決し、また、該薬物は、例えば、複合体の設計において、強力なＳＮ−３８類似体など、誘導体化に対する１つを超える反応基を含有することができる。抗癌剤ＣＰＴ−１１の臨床的に重要な活性薬物型であるが、ＣＰＴ−１１よりも１００〜１０００倍強力であるＳＮ−３８は、不溶性のために全身的に使用することできない。本発明は、ＣＰＴを使用における他の課題にも対応するような方法で標的部分にそれを抱合させ、一方で、疾患特異的抗体を使用してこの臨床的に重要な強力な薬物の治療的指標を同時に向上させることによって、この問題を解決する。
【００１１】
本発明の複合体は、多くの場合において、非結合または「裸」抗体または抗体フラグメント（かかる非結合の標的分子は、特定の状況で使用されているが）よりも優れた有効性を有する。例えば、癌において、裸抗体は、リンパ腫（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）およびＲｉｔｕｘａｎ（登録商標））、結腸直腸癌および他の癌（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）およびＡｖａｓｔｉｎ（登録商標））、乳癌（Ｈｅｒｅｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、ならびに現在臨床開発中の数多くのもの（例えば、エプラツズマブ）の治療に関与してきている。これらの多くの場合において、臨床用途は、化学療法または放射線療法などの他の療法と、これらの裸または非結合抗体を組み合わせることを含んでいる。また、種々の抗体は、関節炎における腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＮＦ）およびＢ細胞（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））抗体などが自己免疫および他の免疫調節異常疾患の治療において使用され、また、全身性エリテマトーデスおよびシェーグレン症候群、ならびに若年性糖尿病および多発性硬化症におけるＢ細胞抗体Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）およびエプラツズマブなどが他のそのような疾患においても検討されている。また、裸抗体は、敗血症性ショック、アルツハイマー病、および感染症においても研究されている。抗感染性モノクローナル抗体の開発は、ＲｅｉｃｈｅｒｔおよびＤｅｗｉｔｚ（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２００６；５：１９１−１９５）により最近検討されており、その全体は参照することにより本願明細書に組み込まる。これは、探求されている裸抗体療法に対する優先病原体を要約し、結果として、２つの病原体のみ（ＲＳウイルスおよびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌）の抗体が第ＩＩＩ相臨床試験中であるか市販されており、他の２５種が臨床研究に付され、２０種が臨床研究中に中止された。したがって、より強力な抗病原性抗体および他の結合部分を開発する必要性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、カンプトテシン結合部分複合体を調製するための向上された方法および組成物を提供することによって、当技術分野において実現されていない必要性を解消する。開示される方法および組成物は、他の形態の治療法に対して不応性または低反応性である種々の疾患および状態の治療に使用され、選択的な標的のための適切な標的部分が発達可能である、または利用可能もしくは既知である疾患を含むことができる。好ましくは、この標的部分は、抗体、抗体フラグメント、２重特異性もしくは他の多価抗体、または他の抗体に基づいた分子もしくは化合物である。しかし、アプタマー、アビマーまたは標的ペプチドなどの当業者には既知である他の結合部分が使用されてもよい。かかる標的部分が存在する好適な疾患または状態は、例えば、癌、自己免疫疾患、および炎症性疾患を含む免疫調節異常状態、感染性の生物が原因となる疾患、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）、および循環器疾患（フィブリン塊、粥状動脈硬化、心筋虚血および梗塞）である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
故に、開示される方法および組成物は、標的部分がカンプトテシン関連の細胞毒性薬を送達するために使用される、疾患および状態の治療に適用されてもよい。かかる疾患および状態は、癌または病原生物感染の免疫療法などにおいて、非結合または裸標的部分が使用される場合に十分に影響されない標的分子または標的細胞の存在によって特徴付けられてもよい。（疾患治療法において使用されるアイソトープ、薬物、および毒素との抗体の免疫複合体を生成する方法に関しては、例えば、それぞれ参照することによって全体が組み込まれる、米国特許第４，６９９，７８４号、第４，８２４，６５９号、第５，５２５，３３８号、第５，６７７，４２７号、第５，６９７，９０２号、第５，７１６，５９５号、第６，０７１，４９０号、第６，１８７，２８４号、第６，３０６，３９３号、第６，６５３，１０４号、第６，９６２，７０２号、および米国特許出願広報第２００５０１９１２３９号、第２００５０１７５５８２号、第２００５０１３６００１号、第２００４０１６６１１５号、第２００４００４３０３０号、第２００４００２２７２５号、第２００３００６８３２２号、第２００３００３１６６９号、第２００３００２６７６４号および第２００２０１３６６９０号を参照されたい。）
【００１４】
特定の例示的な実施形態において、抗体または抗体フラグメントのカンプトテシン複合体は、細菌、ウイルス、真菌、および寄生虫などの病原体へこの治療薬を標的にするために使用されてもよい。好適な実施形態において、かかる薬物結合標的部分は、抗真菌、抗菌および抗ウイルス薬および／または免疫調節物質である裸抗体（例えば、インターフェロンおよび／またはサイトカイン）などの他の治療法と組み合わせて使用されることができる。感染性の生物の治療のための放射免疫療法の使用は、例えば、米国特許第４，９２５，６４８号、第５，３３２，５６７号、第５，４３９，６６５号、第５，６０１，８２５号、第５，６０９，８４６号、第５，６１２，０１６号、第６，１２０，７６８号、第６，３１９，５００号、第６，４５８，９３３号、第６，５４８，２７５号、および米国特許出願広報第２００２０１３６６９０号ならびに第２００３０１０３９８２号に開示され、参照することによってそれら全体が本願明細書に組み込まれる。
【００１５】
癌の治療を含む特定の実施形態において、カンプトテシン複合体は、手術、放射線、化学療法、裸抗体を用いる免疫療法、放射免疫療法、免疫調節物質等と組み合わせて使用されてもよい。同様の組み合わせは、心血管、自己免疫および神経変性疾患など、標的部分に影響を受けやすい他の疾患の治療において好ましい。例えば、カンプトテシン複合体は、ＴＮＦ阻害剤と、Ｂ細胞抗体、および、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、多発性硬化症、血管炎および１型糖尿病（若年性糖尿病）などの自己免疫疾患の治療に有効な他の薬剤と、を組み合わせることができる。それらの組み合わせ療法は、かかる組み合わせで、各治療薬を低量投与することを可能にし、従って、特定の重度の副作用を減少させ、必要な治療回数を潜在的に減少させる。
【００１６】
一実施形態において、本発明は、
（ａ）標的部分と、
（ｂ）カンプトテシン（ＣＰＴ）またはその誘導体もしくは類似体である治療薬部分と、
（ｃ）標的部分に結合する官能基を介して該標的部分に結合し、細胞内で開裂可能な部分を介して該ＣＰＴ部分に結合するリンカーと、を含む複合体に関する。
【００１７】
別の一実施形態において、本発明は、
（ａ）標的部分と、
（ｂ）カンプトテシン（ＣＰＴ）またはその誘導体もしくは類似体である治療薬部分と、
（ｃ）標的部分に結合する官能基を介して該標的部分に結合し、細胞内で開裂可能な部分に付着するアミノ酸のＣ末端を介して該ＣＰＴまたはその誘導体に結合するリンカーと、を含む複合体に関する。
【００１８】
さらなる一実施形態において、本発明は、複合体を調製する工程に関し、該リンカーは、ＣＰＴ薬物に最初に結合され、それによってＣＰＴ薬物−リンカー複合体を生成し、該ＣＰＴ薬物−リンカー複合体の調製は、Ｃ−ＩＯヒドロキシル基の選択的な保護および脱保護を含み、Ｃ−１０ヒドロキシル基を含有するＣＰＴの誘導体において、本質的に未変化のＣ−２０炭酸塩結合を維持し、該薬物−リンカー複合体は、任意に精製されず、該薬物−リンカー複合体は、その後、モノクローナル抗体またはフラグメントに結合される。
【００１９】
本発明のさらに別の一実施形態は、本明細書に記載される複合体を用いて癌、悪性腫瘍、自己免疫疾患、感染症、または感染性病変を治療する方法である。
【００２０】
特別の定めのない限り、「単数（「ａ」または「ａｎ」）」は「１つまたはそれ以上」を意味する。
【００２１】
下記の記述において、多くの用語が使用され、以下の定義は本発明の理解を容易にするために提供される。本明細書において明確に定義されない用語は、平易なおよび／または一般的な意味に従って使用される。
【００２２】
本明細書で使用される標的部分という用語は、標的分子、細胞、粒子、組織または集合体に特異的または選択的に結合する分子、複合体または集合体を言う。好適な実施形態において、標的部分は、抗体、抗体フラグメント、２重特異性抗体または他の抗体に基づいた分子もしくは化合物である。しかし、アプタマー、アビマー、受容体結合リガンド、核酸、ビオチン−アビジン結合対、結合ペプチドまたはタンパク質など、標的部分の他の例は、当技術分野においては既知であり、使用されてもよい。用語「標的部分」および「結合部分」は本明細書において同義に用いられる。
【００２３】
本明細書に説明される抗体は、全長の（つまり、自然発生的なまたは通常の免疫グロブリン遺伝子フラグメント組み換え工程により形成された）免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）または抗体フラグメントのような免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な（つまり特異的に結合する）一部分を言う。抗体または抗体フラグメントは、主張される要旨の範囲内において抱合、あるいは誘導体化されてもよい。
【００２４】
抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）などの抗体の一部分である。構造にかかわらず、有益な抗体フラグメントは、無処置の抗体により認識される同一の抗原と結合する。また、用語「抗体フラグメント」は、特異的抗原に結合し、複合体を形成することによって、抗体のように作用する合成または遺伝子操作されたタンパク質も含む。例えば、抗体フラグメントは、重および軽鎖の可変ドメインから成る「Ｆｖ」フラグメントなどの可変ドメインから成る単離されたフラグメントと、軽および重可変ドメインがペプチドリンカー（「ｓｃＦｖタンパク質」）により連結される組み換え単鎖ポリペプチド分子と、ＣＤＲなどの高可変ドメインを模倣するアミノ酸残基から成る最小認識単位とを含む。Ｆｖフラグメントは、多価および／または多特異性結合形態を得るように異なる用法で構成されてもよい。前者の多価の場合は、それらは、特異的エピトープに対して１つを超える結合部位と反応し、一方、多特異性形態では、（抗原の、あるいは、さらにその特異的抗原および異なる抗原に対する）１つを超えるエピトープが結合される。本明細書で使用される抗体構成要素という用語は、抗体全体、融合タンパク質の両方、およびそれらのフラグメントを含む。
【００２５】
裸抗体は、概して、治療薬に結合されない抗体全体である。これは、機構が細胞融解をもたらすことができるようにする補体結合およびＡＤＣＣ（抗体依存性細胞の細胞傷害性）などのエフェクターまたは免疫学的機能を、抗体分子のＦｃ部分が提供するためである。しかし、Ｆｃ部分は、抗体の治療的機能には必要とされない場合があるが、むしろ、アポトーシス、血管新生抑制、抗転移作用、ヘテロタイプおよびホモタイプ接着の阻害などの抗接着活性、およびシグナル経路における干渉などの他の機構は、疾患進行に関与および阻害し得る。裸抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体およびそれらのフラグメントなど、マウス抗体および特定の組み換え抗体を含むポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方、ならびにそれらのフラグメントを含む。したがって、一部の場合において、また、「裸抗体」は、「裸」抗体フラグメントも言う。本発明において定義されるような「裸」は、「非結合」と同義であり、投与される治療薬に連結または結合されることを意味しない。
【００２６】
自己免疫疾患は、その自身の組織に対する免疫応答を生成する体に起因する疾患である。例として、参照することによりその全体が本願明細書に組み込まれる、２００２年３月１日に出願された米国仮出願第６０／３６０，２５９号に開示されるような、急性特発性血小板減少性紫斑病および慢性特発性血小板減少性紫斑病などの免疫性の血小板減などのクラスＩＩＩ自己免疫疾患、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホシェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、関節リウマチ、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎および線維化肺胞炎が挙げられる。
【００２７】
キメラ抗体は、抗体分子の定常ドメインがヒト抗体のものに由来する一方で、好ましくはげっ歯類抗体である、１つの種に由来する抗体の領域（ＣＤＲ）を決定する相補性を含む重および軽抗体鎖の両方の可変ドメインを含有する組み換えタンパク質である。獣医学的用途では、キメラ抗体の定常ドメインは、ネコまたはイヌなどの他の種のものに由来してもよい。
【００２８】
ヒト化抗体は、例えば、げっ歯類抗体などの１つの種からの抗体からのＣＤＲが、げっ歯類抗体の重および軽可変鎖からヒト重および軽可変ドメイン内へ移動される、組み換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体のものに由来する。一部の例では、ヒト化抗体のフレームワーク領域の特異的残基、特にＣＤＲ配列に接触または近接しているのは、修飾されてもよく、例えば、本来のげっ歯類または他の抗体からの対応する残基で置換されてもよい。
【００２９】
ヒト抗体は、例えば、抗原投与に応じて特異的ヒト抗体を生成するように「操作された」遺伝子導入マウスから取得される。この技術において、ヒト重および軽鎖遺伝子座の要素は、内在性重鎖および軽鎖遺伝子座の標的破壊を含有する胚性幹細胞株に由来するマウスの菌株内へ導入される。遺伝子導入マウスは、ヒト抗原に対して特異的なヒト抗体を合成することができ、マウスは、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを生成するために使用することできる。遺伝子導入マウスからヒト抗体を取得する方法は、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４），Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４），およびＴａｙｌｏｒら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）に記載されている。また、完全なヒト抗体は、遺伝子または染色体トランスフェクション方法およびファージディスプレイ技術によっても構成されることができ、それら全ては、当業者には既知である。例えば、未免疫ドナーからの免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーから、ヒト抗体および体内のそのフラグメントを生成には、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０）を参照。この技術において、抗体可変ドメイン遺伝子は、線維状バクテリオファージのメジャーまたはマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれか一方内にインフレームでクローン化され、ファージ粒子の表面上に機能的抗体フラグメントとしてディスプレイされる。線維状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するため、抗体の機能的特性に基づいた選択は、それらの特性を提示する抗体をコードする遺伝子の選択にも繋がる。このように、ファージは、Ｂ細胞の一部の特性を模倣する。ファージディスプレイは、種々の形式で行うことができ、それらの検討には、例えば、ＪｏｈｎｓｏｎおよびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５５６４−５７１（１９９３）を参照。また、ヒト抗体もまた、体外で活性されＢ細胞によって産生することができる。参照することにより全体が本願明細書に組み込まれる、米国特許題５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号を参照されたい。
【００３０】
本明細書で使用される感染症は、細菌、リケッチア、マイコプラズマ、原虫、真菌、ウイルス、寄生虫、または他の微生物因子などの病原体による感染症を含む疾患である。例として、ＡＩＤＳの原因となるヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）、結核のマイコバクテリア、ストレプトコッカスアガラクチア、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、在郷軍人病菌、化膿性連鎖球菌、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、肺炎球菌、インフルエンザ菌Ｂ、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、ウエストナイルウイルス、緑膿菌、らい菌、ウシ流産菌、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、単純ヘルペスウイルスＩＩ、ヒト血清パルボ様ウイルス、ＲＳウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタインバーウイルス、マウス白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、疣ウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアンウイルス４０、マウス乳癌ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ原虫、ランゲルトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマ、ブルセイトリパノソーマ、マンソン住血吸虫、日本住血吸虫、ウシバベシア、アイメリアテネラ、回旋糸状虫、熱帯リーシュマニア、旋毛虫、タイレリアパルバ、胞状条虫、羊条虫、無鉤条虫、単包条虫、有線条虫属、マイコプラズマアルスリチジス、マイコプラズマハイオリニス、マイコプラズマオラーレ、マイコプラズマアルギニニ、アコレプラズマレイドロウイ、マイコプラズマサリバリウムおよび肺炎マイコプラズマが挙げられる。
【００３１】
治療薬は、例えば抗体または抗体フラグメント、またはそのサブ−フラグメントなどの、結合部分と共に、別々に、同時にまたは連続して投与され、疾患の治療に有益な分子または原子である。治療薬の例は、抗体、抗体フラグメント、複合体、薬物、細胞毒性薬、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節物質、キレート剤、ホウ素化合物、光活動性薬剤または色素、放射性同位元素または放射性核種、オリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ、ペプチド、血管新生阻害剤、化学療法薬剤、チオカイン、ケミカイン、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素、結合タンパク質またはペプチド、複合体またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００３２】
複合体は、治療薬に結合された抗体構成要素または他の標的部分である。適切な治療薬は上記に記載される。
【００３３】
本明細書で使用される、抗体融合タンパク質という用語は、同一または異なる特異性を有する単鎖抗体または抗体フラグメントセグメントである、２つ以上の同一、または異なる自然抗体が連結される、組み換えで生成された抗原結合分子である。融合タンパク質は、少なくとも１つの特異的結合部位を含む。融合タンパク質の結合価は、抗原またはエピトープへの融合タンパク質の有する結合アームまたは部位の総数、つまり、１価、２価、３価または多価を示す。抗体融合タンパク質の多価性は、抗原への結合における多数の相互作用を利用することによって、抗原への、または異なる抗原への結合親和力を増強できることを意味する。特異性は、抗体融合タンパク質がいくつの異なる種類の抗原またはエピトープに結合できるか、つまり、単一特異性、２重特異性、３重特異性、多特異性を示す。これらの定義を使用すると、一つの自然抗体、例えば、ＩｇＧは、２つの結合アームを有するので２価であるが、１種類の抗原またはエピトープに結合するため単一特異性である。単一特異性の多価融合タンパク質は、同一の抗原またはエピトープに対して１つを超える結合部位を有する。たとえば、単一特異性の二重特異性抗体は、同一の抗原と反応する２つの結合部位を有する融合タンパク質である。融合タンパク質は、異なる抗体構成要素の多価もしくは多特異性の組み合わせ、または同一の抗体構成要素の複数のコピーを含んでもよい。融合タンパク質は、治療薬をさらに含んでもよい。
【００３４】
免疫調節物質は、存在する場合、体の免疫系を変化、抑制または刺激させる治療薬である。一般的に、有益な免疫調節物質は、マクロファージ、Ｂ細胞、および／またはＴ細胞などの免疫応答カスケードを増殖または活性化させるために免疫細胞を刺激する。しかし、一部の例において、有益な免疫調節物質は、自己免疫疾患の治療療法などの場合、免疫細胞の増殖または活性化を抑制する場合がある。本明細書に記述される免疫調節物質の例は、特異的抗原に接触することで１つの細胞集団（例えば、薬物刺激されたＴ−リンパ球）によって放出され、細胞間の細胞内メディエーターとして機能する約５〜２０ｋＤの可溶性低分子タンパク質である、サイトカインである。当業者により理解されるように、サイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、インターロイキン、ならびに腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＮＦ）およびインターフェロンなどの幾つかの関連シグナル分子を含む。ケモカインは、サイトカインのサブセットである。特定のインターロイキンおよびインターフェロンは、Ｔ細胞および他の免疫細胞増殖を刺激するサイトカインの例である。
【００３５】
ＣＰＴは、カンプトテシンの略称であり、本出願においてＣＰＴは、カンプトテシン自体またはカンプトテシンの類似体もしくは誘導体を表す。表示した番号付けおよび文字Ａ〜Ｅで標識付けされた環を有するカンプトテシンおよびその類似体の一部の構造を、下記の式１に示す。
【００３６】
【化１】
2009531325.tif 000002
【００３７】
方法は、抗体（ＭＡｂ）などの標的部分を有するＣＰＴまたはＣＰＴ類似体もしくは誘導体（総称してＣＰＴ）の複合体を調製するため、以下の方法で考案された。開示される方法は、本発明の好適な実施形態を表す。（１）ＣＰＴの溶解度は、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）をＣＰＴと抗体の間に配置することで向上させる。（２）ペプチドスペーサーなどのリソソーム性に開裂可能なリンカーが、未変化ＣＰＴの細胞内放出のためにＣＰＴと抗体の間に配置される。（３）リソソーム性に開裂可能なペプチドスペーサーは、折り畳めるリンカーを介して炭酸塩の形で、またはＣＰＴのＣ−２０位置でエステルを介してカルバミン酸塩の形でＣＰＴに付着される。（４）抗体結合基は、チオールまたはチオール反応基のいずれか一方であるように設計される。（５）方法は、ＳＮ−３８などのＣＰＴ類似体を含む薬物−リンカー前駆物質の調製においてＣ−２０炭酸塩の存在下で、１０−ヒドロキシル基を選択的に再生するために考案される。複合体が抗体または抗体フラグメントを含む下記の検討において、アプタマー、アビマーまたは標的ペプチドなどの別の種類の結合部分が代替されてもよい。
【００３８】
方法  １
例示的な好適な実施形態は、カンプトテシン薬物誘導体および一般式２の抗体の複合体に関する。
ＭＡｂ−［Ｌ］−ＡＡ−ＣＰＴ
（２）
ここで、ＭＡｂは、疾患標的抗体であり、ＣＰＴは、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ：ＣＰＴ）またはその類似体であり、Ｌは、Ｘ−Ｙ−Ｚ型のリンカー系であって、Ｘは抗体結合部分であり、Ｙはリソソーム性に開裂可能なポリペプチドであり、ＺはＣＰＴ薬物に連結される４−アミノベンジルオキシ部分である。ＸおよびＹは、直鎖または環状炭化水素である、またはポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）などの水溶性化部分である介在スペーサーでアミド結合を介して連結されてもよい。ＡＡは、ＣＰＴの２０−ヒドロキシル間でエステルを形成し、その（ＡＡの）Ｎ末端を介してリンカーＬのＺ構成要素にさらに付着されるアミノ酸またはポリペプチド部分である。
【００３９】
方法１の好適な実施形態において、細胞内で開裂可能な部分は任意に、細胞内エステラーゼによって開裂可能である。好適な実施形態において、細胞内で開裂可能な部分は、グリシン、アラニンもしくはサルコシンなどのアミノ酸、またはグリシルグリシンなどのペプチドのカルボン酸と、ＣＰＴの２０−ヒドロキシルとの間に形成されたエステル部分である。これらの場合において、該アミノ酸またはポリペプチドのＮ末端は、ブチルオキシカルボニルもしくは９−フルオレニルメチルオキシカルボニルまたはモノメトキシトリチル（ｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ：ＭＭＴ）誘導体として保護され、ＣＰＴの２０−ヒドロキシルを有するエステル結合の形成後に脱保護される。図式１に示される一部の類似体などの場合、さらなる１０−ヒドロキシル基を含有するＣＰＴ類似体のＣ−１０−ヒドロキシル位置でのＢＯＣ保護基の存在下において、アミン保護基の選択的な除去は、ＭＭＴが、ＢＯＣ基を開裂させないジクロロ酢酸などの弱酸処理によって除去可能であるため、エステル形成に関与するアミノ酸またはポリペプチドのアミノ基に対する保護基としてＭＭＴを使用して実現される。
【００４０】
方法１の好適な実施形態において、細胞内で開裂可能な部分は、カテプシンＢなどの細胞内酵素により開裂可能なリンカーＬのＹ構成要素の実施形態としてポリペプチドをさらに含む。後者の生成物は、ｐ−アミノベンジルアルコール、つまり、ＰＮＰがｐ−ニトロフェニルであるＰＡＢＯＣＯＰＮＰの活性型を介して、ＣＰＴ由来のエステルを、上記に示されるリンカーＬのＺに結合させることによって産生される。好適な実施形態において、リンカーは、該標的部分のチオール基に連結するチオール反応基を含む。チオール反応基は任意に、該標的部分のチオール基に連結する、マレイミドもしくはビニルスルホン、またはブロモアセトアミド、もしくはヨードアセトアミドである。好適な実施形態において、チオール反応基を有する該試薬は、例えば、サクシニミジル−４−（Ｎマレイミドメチル）シクロヘキサン−ｌ−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）から、またはサクシニミジル−（ε−マレイミド）カプロン酸から産生され、チオール反応基はマレイミド基である。
【００４１】
方法１の好適な実施形態において、複合体は、一般式のＸおよびＹ間にポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）スペーサーを含有し、ＰＥＧは、大きさが最大ＭＷ５０００であることができ、好適な実施形態において、ＰＥＧは、（１〜１２または１〜３０）反復モノマー単位を有する定義されたＰＥＧであり、より好適な実施形態において、ＰＥＧは、１〜１２の反復モノマー単位を有する定義されたＰＥＧである。ＰＥＧの導入は、市販のヘテロ２官能性を持たせたＰＥＧ誘導体を使用することを含んでもよい。本発明との関連で、ヘテロ２官能性のＰＥＧは、例えば、マレイミド部分または保護チオール部分などの抗体または結合部分に結合する基ならびにサクシニミジルカルボキシレートなどの活性化エステルを含有する。ＮＨＳがサクシニミジルである、１２反復モノマー単位を含有するヘテロ２官能性の定義されたＰＥＧの一例を、式３において下記に示す。
【化２】
2009531325.tif 000003
【００４２】
サクシニミドとして表されたＭＡｂへの結合を有する、マレイミド含有のＳＮ−３８−リンカー誘導体で調製された抗体の代表的なＳＮ−３８（ＣＰＴ類似体含有の追加のヒドロキシル基）複合体を、下記に示す。ここで、ＳＮ−３８に結合する２０−Ｏ−ＡＡエステルはサルコシネートである。
【化３】
2009531325.tif 000004
【００４３】
サクシニミドとして表されたＭＡｂへの結合を有する、マレイミド−ＰＥＧ含有のＳＮ−３８−リンカー誘導体で調製された方法１の抗体の代表的なＣＰＴ複合体を、下記に示す。ここで、ＳＮ−３８に結合する２０−Ｏ−ＡＡエステルはグリシン酸塩である。
【化４】
2009531325.tif 000005
【００４４】
方法１において、Ｘ基がチオール反応性部分である場合、抗体上のチオールは、チオール基を導入する試薬を使用して、抗体のリシン基上で産生される。ＭＡｂのリシン基の修飾により抗体上にチオール基を導入する方法は、本技術分野において既知である（ＷｏｎｇによるＣｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９９１），ｐｐ２０−２２）。あるいは、ジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ：ＤＴＴ）などの還元剤を使用する抗体上の鎖間ジスルフィド結合の軽度還元（Ｗｉｌｌｎｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．４：５２１−５２７（１９９３））は、抗体上に７から１０チオールを産生することができ、抗原結合領域から離れたＭＡｂの鎖間領域において、上記に示した一般式の［Ｌ］−エステル−ＣＰＴとの反応次第、多数のＣＰＴ部分を組み込むことの利点を有する。このようにして、チオール反応基を有するＣＰＴは、ジスルフィド還元によって産生されたシステイン上で部位特異的に、またはチオール基を含むように誘導体化されたＭＡｂのリジン側鎖上で間接的に、ＭＡｂに結合されることができる。
【００４５】
さらに、方法１の好適な実施形態において、リンカーは、該標的部分の１つ以上のリジン側鎖アミノ基に導入されたチオール反応性残基と反応するチオール基を含む。方法１において、例えば、ＸおよびＹ間の結合がチオプロピオニル部分である場合のように、Ｘ基がチオールの場合、抗体は、当技術分野において十分に説明される手順によってマレイミド、ビニルスルホン、ブロモアセトアミド、またはヨードアセトアミドなどのチオール反応基で事前誘導体化される。
【００４６】
方法１の開裂可能なペプチドＹは、フェニルアラニン−リジン、バリン−シトルリン（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ、上記参照）、アラニン−ロイシン、ロイシン−アラニン−ロイシン、およびアラニン−ロイシン−アラニン−ロイシン（Ｔｒｏｕｅｔら、上記参照）から成る群から選択されてもよい。
【００４７】
本発明の好適な実施形態において、好適な化学療法部分は、ＣＰＴ、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ＳＮ−３８、トポテカン、ルルトテカン、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、およびそれらの誘導体から成る群から選択される。より好適な実施形態において、化学療法部分はＳＮ−３８である。好ましくは、本発明の好適な実施形態の複合体において、標的部分は、少なくとも１つの化学治療部分、好ましくは１から約１２の化学治療部分、最も好ましくは約７から約１２の化学治療部分に連結する。
【００４８】
方法  ２
別の例示的な実施形態は、カンプトテシン薬物誘導体および一般式６の抗体の複合体に関する。
ＭＡｂ−［Ｌ］−ＣＰＴ
（６）
ここで、ＭＡｂは、疾患標的抗体であり、ＣＰＴは、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ：ＣＰＴ）またはその類似体であり、Ｌは、Ｘ−Ｙ−Ｚ型のリンカー系であって、Ｘは抗体結合部分であり、Ｙはリソソーム性に開裂可能なポリペプチドであり、ＺはＣＰＴ薬物に直接または間接的に連結される４−アミノベンジルオキシ部分であり、最後に、ＸおよびＹは、ＸおよびＹは、直鎖または環状炭化水素である、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性化部分である介在スペーサーでアミド結合を介して連結される。方法２の実施形態において、Ｘ−Ｙ−Ｚから成るリンカーＬは、ＣＰＴの２０−Ｏ−カルボニル部分に直接または間接的に付着される。
【００４９】
段落００３８、００４０、００４１および００４４〜００４７の方法１に対して規定されたリンカーＬ（Ｘ−Ｙ−Ｚ）のすべての実施形態は、Ｚの付着モードが、ＣＰＴのＣ−２０位置でヒドロキシルのクロロギ酸と直接的に反応して炭酸を形成する場合にＰＡＢＯＨ部分を介すること、またはＣ−２０位置でカルバミン酸のアミン末端と反応する場合にＰＡＢＯＨの活性型を介することを除けば、全体として方法２の実施形態に適用する。
【００５０】
サクシニミドとして表されたＭＡｂへの結合を有する、マレイミド含有のＳＮ−３８−リンカー誘導体で調製された方法２の抗体の代表的なＣＰＴ複合体を、下記に示す。
【化５】
2009531325.tif 000006
【００５１】
サクシニミドとして表されたＭＡｂへの結合を有する、マレイミド−ＰＥＧ含有のＳＮ−３８−リンカー誘導体で調製された方法２の抗体の代表的なＣＰＴ複合体を、下記に示す。
【化６】
2009531325.tif 000007
【００５２】
方法２の別の実施形態を構造式９で示す。段落００３８、００４０、００４１および００４４〜００４７の方法１に対して規定されたリンカーＬ（Ｘ−Ｙ−Ｚ）のすべての実施形態は、全体としてこの方法２の実施形態に適用する。ここで、Ｚの活性型、すなわち、ＰＮＰがｐ−ニトロフェニルであるＰＡＢＯＣＯＰＮＰは、ＣＰＴの２０−カルバミン酸誘導体に結合し、後者は、ＣＰＴの２０−クロロギ酸およびＮ一置換、もしくはＮ，Ｎ’二置換、または非置換エチレンジアミンに由来する。サクシニミドとして表されたＭＡｂへの結合を有する、マレイミド含有のＳＮ−３８−リンカー誘導体で調製された方法２の抗体の代表的なＣＰＴ複合体を下記に示す。ここで、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンは、ＬをＳＮ−３８の２０−クロロギ酸に連結させるために使用される。理論で束縛されることを望まないが、細胞内処理後に産生された薬剤−２０−カルバミン酸の末端アミノ基は、５員環へ環化し、遊離ＣＰＴ（この場合ＳＮ−３８）を放出させることができる。あるいは、下記の構造内のＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンスペーサーは、ＣＰＴ（またはＳＮ−３８などの類似体）−２０−クロロギ酸と反応させたサルコシンヒドラジドで、およびＬリンカー系に結合されたヒドラジド部分で、置換されることができる。また、この場合、抗体およびリンカーの細胞内異化反応後に放出されたヒドラジドは、遊離ＣＰＴ（またはＳＮ−３８などの類似体）分子の随伴性の放出を伴い、６員環を得るように環化することもできる。本明細書に列挙されるエチレンジアミン型ならびにヒドラジド型は、本発明の範囲内にある。
【化７】
2009531325.tif 000008
【００５３】
さらに、方法２の好適な実施形態において、リンカーは、該標的部分のリジン側鎖でチオール反応性残基と反応するチオール基を含み、該チオール反応性部分は、マレイミド、ビニルスルホン、ブロモアセトアミド、およびヨードアセトアミドから成る群から選択される。
【００５４】
サクシニミドとして表されたＭＡｂへの結合を有する、チオール含有のＳＮ−３８−リンカー誘導体で調製された方法２の抗体の代表的なＣＰＴ複合体を、下記に示す。
【化８】
2009531325.tif 000009
【００５５】
方法  ３
さらに別の例示的な実施形態は、カンプトテシン薬物誘導体および一般式１１の抗体の複合体に関する。
ＭＡｂ−［架橋剤］−ＡＡ−ＣＰＴ
（１１）
ここで、アミノ酸またはポリペプチド部分ＡＡのＣ末端で形成されたＣＰＴの２０−Ｏ−ＡＡエステルは、抗体結合基Ｘに直接的に結合され、それによって、スキーム１＆２のリンカーＬのＹ−Ｚ構成要素を取り除く。方法１＆２の、ＸおよびＹ間の結合に関連するスペーサーの様態とともに、Ｘのすべての実施形態、およびＣＰＴ定義は、方法３においてＸおよびＹ間のスペーサーがＸとエステルのアミン末端との間のスペーサーで置換されることを除いては、全体として本明細書において適用する。
【００５６】
サクシニミドとして表されたＭＡｂへの結合を有する、マレイミド−ＰＥＧ含有のＳＮ−３８−リンカー誘導体で調製された方法３の抗体の代表的なＣＰＴ複合体を、下記に示す。
【化９】
2009531325.tif 000010
【００５７】
他の実施形態はさらに、該ＭＡｂ−ＣＰＴ複合体を生成する工程に関し、それにより方法１〜３のリンカーＬは、ＣＰＴ薬物の誘導体化された形態に最初に結合され、この工程に続いて、リンカー上およびＣＰＴ上に存在する場合もある一部の官能基上の保護基を除去し、それによりＣＰＴ薬物−リンカー複合体が得られる。その後、ＣＰＴ薬物−リンカー複合体は、ＭＡｂまたはフラグメントに結合される。
【００５８】
００４８〜００５４の実施形態との関連において、ＣＰＴが１０−ヒドロキシル基をさらに有する、ＣＰＴ薬物−リンカーを調製できる工程が意外にも発見された。この工程は、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ：ＢＯＣ）誘導体としての該１０−ヒドロキシル基の保護、続いて、薬物−リンカー複合体の最後から２番目の中間体の調製を含むが、これに限定されない。通常、ブチルオキシカルボニル基の除去は、トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ：ＴＦＡ）などの強力な酸での処置を必要とする。これらの条件下において、除去すべき保護基を含有するＣＰＴ２０−Ｏ−リンカー炭酸は開裂の影響を受けやすいため、非修飾ＣＰＴを生じさせる。事実、当技術分野において明確に述べられている、リンカー分子のリジン側鎖のために軽度に除去可能なメトキシトリチル（ＭＭＴ）保護基を使用することの論理的根拠は、この可能性を的確に回避することであった（Ｗａｌｋｅｒら、上記参照）。フェノール性ブチルオキシカルボニル保護基の選択的な除去は、最適には３から５分の短時間で反応を実行することによって可能であることが発見された。これらの条件下において、主な生成物は、１０−ヒドロキシル位置のブチルオキシカルボニルが除去され、その一方、２０位置の炭酸が未変化であったものであった。
【００５９】
一実施形態において、標的部分は、モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＭＡｂ）である。さらなる実施形態において、標的部分は、多価および／または多特異性ＭＡｂであってもよい。標的部分は、マウス、キメラ、ヒト化、またはヒトモノクローナル抗体であってもよく、該抗体は、無傷、フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２）、またはサブ−フラグメント（単鎖コンストラクト）形態である。
【００６０】
好適な実施形態において、標的部分は、癌または悪性細胞上に発現する抗原または抗原のエピトープに反応するモノクローナル抗体である。好ましくは、癌細胞は、造血器腫瘍、癌腫、肉腫、黒色腫または神経膠腫からの細胞である。
【００６１】
本発明による処置される好適な悪性腫瘍は、悪性固形腫瘍または造血器腫瘍である。
【００６２】
好適な実施形態において、細胞内で開裂可能な部分は、ＭＡｂ−薬物複合体によるその受容体への結合の際に細胞内部に取り入れられた後、特にエステラーゼおよびペプチダーゼによって開裂することができる。
【００６３】
好ましくは、標的部分は抗体（完全なヒト、非ヒト、ヒト化またはキメラ抗体を含む）または抗体フラグメント（酵素的または組み換えで生成されたフラグメントを含む）および抗体または抗体フラグメントからの配列を組み込む結合タンパク質である。抗体、フラグメントおよび結合タンパク質は、上記に定義される、多価および多特異性または多価および単一特異性であってもよい。
【００６４】
本発明の好適な実施形態において、高レベルで標的細胞上に発現し、大部分または唯一１つが異常細胞対正常組織上に発現するマーカーまたは腫瘍関連抗原に結合および認識するＭＡｂなどの抗体、および早急に内部に取り入れる抗体が使用される。本発明の範囲内における有益な抗体は、上記の特性を有するＭＡｂ（および細胞および微生物内への異なるレベルの内部移行の特徴的特性を示す）を含み、限定されないが、癌において、限定されないが、以下のＭＡｂの使用を意図している。ＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ＬＬ２およびＲＦＢ４（抗ＣＤ２２）、ＲＳ７（抗上皮糖タンパク質−１（ＥＧＰ−１））、ＰＡＭ−４およびＫＣ４（どちらも抗ＭＵＣ１）、ＭＮ−１４（抗癌胎児抗原（ＣＤ６６ｅとしても知られるＣＥＡ）、Ｍｕ−９（抗結腸特異的抗原−ｐ）、Ｉｍｍｕ３１（抗αフェトプロテイン）、ＴＡＧ−７２（例えば、ＣＣ４９）、Ｔｎ、Ｊ５９１（抗ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原））、Ｇ２５０（抗カルボニックアンヒドラーゼＩＸ  ＭＡｂ）およびＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）。これらの複合を使用して標的にされ得る他の有益な抗原は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０（例えば、Ｃ２Ｂ８、ｈＡ２０、１Ｆ５  ＭＡｂ）ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ８０、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦ（例えば、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、フィブロネクチンスプライス変異）、ＥＤ−Ｂ（例えば、Ｌ１９）、ＥＧＦ受容体またはＥｒｂＢ１（例えば、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、胎盤成長因子（ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰｌＧＦ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＰＳＭＡ、ガングリオシド、ＨＣＧ、ＥＧＰ−２（例えば、１７−１Ａ）、ＣＤ３７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３０、Ｉａ、Ａ３、Ａ３３、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、Ｓ１００、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、テネイシン、葉酸受容体、トーマス−フリードライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、腫瘍血管新生抗原、Ｇａ７３３、ＩＬ−２、ＩＬ−６、Ｔ１０１、ＭＡＧＥ、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＩＬＧＦ）、遊走阻止因子（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ：ＭＩＦ）、Ｌ２４３が結合するＨＬＡ−ＤＲ抗原、ＣＤ６６抗原つまりＣＤ６６ａ−ｄ、またはそれらの組み合わせを含む。ＣＤ６６抗原は、ＣＤ６６ａ−ｅである同様の構造を有する５つの異なる糖タンパク質から成り、癌胎児抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＣＥＡ）遺伝子ファミリーメンバーである、ＢＣＧ、ＣＧＭ６、ＮＣＡ、ＣＧＭ１およびＣＥＡによってそれぞれコードされる。これらのＣＤ６６抗原は、顆粒球、消化管の正常上皮細胞および種々の組織の腫瘍細胞内に発現する。多くの上記抗原は、２００２年１１月１５日に出願された表題「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ、Ｎｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｆｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」の米国仮出願第６０／４２６，３７９号に記載され、参照することにより本願明細書に組み込まれる。
【００６５】
本発明の別の好適な実施形態において、早急に内部に取り入れ、その後、細胞表面上で再発現され、処理され、呈され、細胞による循環複合体の継続的取り込みおよび癒着を可能にする抗体が使用される。最も好適な抗体／抗原対の一例は、抗ＣＤ７４ＭＡｂであるＬＬ１である（不変鎖、クラスＩＩ特異的シャペロン、Ｉｉ）。ＣＤ７４抗原は、Ｂ細胞リンパ腫、特定のＴ細胞リンパ腫、黒色腫および特定の他の癌（Ｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９８：２９６−３０２（１９９９））、ならびに特定の自己免疫疾患に高度に発現する。
【００６６】
好ましくは抗ＣＤ７４抗体で治療される疾患は、非ホジキンリンパ腫、ホジキン、黒色腫、肺癌、骨髄性白血病、および多発性骨髄腫を含むがそれらに限定されない。標的細胞表面上での短時間のＣＤ７４抗原の継続的発現と、それに続く抗原の内部移行、および抗原の再発現は、運搬する任意の化学療法部分とともに内部に取り入れられるＬＬ１抗体を標的にすることを可能にする。これにより、高度なおよび治療的ＬＬ１−化学療法薬複合体の濃度をかかる細胞内部に蓄積させることが可能である。内部に取り入れられたＬＬ１−化学療法薬複合体は、リソソームおよびエンドソームを介して循環され、化学療法部分は、標的細胞内において活性型で放出される。
【００６７】
別の側面において、本発明は、被験者を治療する方法に関し、本発明の好適な実施形態の治療的複合体の治療的に有効な量を被験者に投与するステップを含む。本発明の好適な実施形態の治療的複合体で治療され得る疾患は、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、ＬＬ２ＭＡｂなどを使用する、非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ性白血病、米国特許第６，１８３，７４４号を参照）、内胚葉由来の消化器系上皮の腺癌、乳癌および非小細胞肺癌などの癌、ならびに他の癌腫、肉腫、神経膠腫、骨髄性白血病等を含むがそれらに限定されない。特に、例えば、胃腸、肺、乳房、前立腺、卵巣、精巣、脳またはリンパ管腫瘍などの悪性固形腫瘍もしくは造血器腫瘍、肉腫または黒色腫によって生成されるまたは関連する、例えば、腫瘍胎児抗原などの抗原に対する抗体が有利に使用される。かかる治療薬は、疾患状態および複合体の忍容性次第で、１回または繰り返し投与され、また、手術、外部放射、放射免疫療法、免疫療法、化学療法、アンチセンス療法、干渉ＲＮＡ療法、遺伝子治療等の他の治療法と組み合わせて最適に使用されることもできる。各組み合わせは、腫瘍型、病期、患者の状態および以前の治療、ならびに管理医師により考慮される他の要因に適応される。
【００６８】
本明細書で使用されるような、用語「被験者」は、ヒトを含む哺乳類を含むがそれに限定されない任意の動物（つまり、脊椎動物および無脊椎動物）を言う。また、被験者という用語は、げっ歯類（例えば、マウス、ラットおよびモルモット）も含む。用語は、特定の年齢または性に制限されることを意図するものではない。故に、用語は、性にかかわらず、成人および新生児被験者ならびに胎児を包含する。
【００６９】
別の好適な実施形態において、本発明の好適な実施形態のＭｕ−９ＭＡｂを含む治療的複合体は、２００２年４月５日に出願されたＧｏｌｄらの米国出願第１０／１１６，１１６号（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：６４０５（１９９０）、および本明細書において引用された文献）に開示されるように、結腸直腸癌ならびに膵癌および卵巣癌を治療するために使用することできる。さらに、本発明の好適な実施形態のＰＡＭ−４ＭＡｂを含む治療的複合体は、２００２年６月１４日に出願された米国仮出願第６０／３８８，３１４号に開示されるように、膵癌を治療するために使用することできる。
【００７０】
別の好適な実施形態において、好適な実施形態のＲＳ−７ＭＡｂを含む治療的複合体は、２００２年３月１日に出願されたＳｔｅｉｎらの米国仮出願第６０／３６０，２２９号（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１３３０（１９９０）およびＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．４：７０３（１９９１））に開示されるように、肺、胃、膀胱、乳房、卵巣、子宮、および前立腺の癌腫などの癌腫を治療するために使用することできる。
【００７１】
別の好適な実施形態において、好適な実施形態の抗ＡＦＰ  ＭＡｂを含む治療的複合体は、２００２年８月１日に出願された米国仮出願第６０／３９９，７０７号に開示されるように、ヒト化、キメラおよびヒト抗体形態を使用して、肝細胞癌、胚細胞性腫瘍および他のＡＦＰ産生腫瘍を治療するために使用することできる。
【００７２】
別の好適な実施形態において、抗テネイシン抗体を含む治療的複合体は、造血性および固形腫瘍を治療するために使用することでき、Ｌｅ（ｙ）への抗体を含む複合体は、固形腫瘍を治療するために使用することできる。
【００７３】
好適な実施形態において、ヒト疾患の治療において使用される抗体は、抗体のヒトまたはヒト化（ＣＤＲ移植された）型であるが、抗体のマウスおよびキメラバ型を使用することできる。送達薬剤としての同一種ＩｇＧ分子は、免疫応答を最小化するために好適であることが多い。これは、反復治療を検討する場合に特に重要である。ヒトにおいて、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体は、患者から抗ＩｇＧ免疫応答を産生しにくい。ｈＬＬ１およびｈＬＬ２などの抗体は、標的細胞上で内部移行する抗原に結合後、早急に内部移行し、これは、運搬される化学療法薬が細胞内部に早急に取り入れられることも意味する。しかし、低い内部移行速度を有する抗体も、本発明内の選択的療法を実現するために使用することできる。
【００７４】
別の好適な実施形態において、好適な実施形態の治療的複合体は、病原体に対する抗体が既知であるため、病原体に対して使用することできる。例えば、細菌、リケッチア、マイコプラズマ、原虫、真菌、およびウイルスなどの病原体に起因するウイルス、細菌、真菌および寄生虫感染を含む感染性病変によって産生されるまたは関連するマーカーを特異的に結合する抗体および抗体フラグメント、ならびにかかる微生物に関連する抗原および生成物は、とりわけ、Ｈａｎｓｅｎらの米国特許第３，９２７，１９３号、およびＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，３３１，６４７号、第４，３４８，３７６号、第４，３６１，５４４号、第４，４６８，４５７号、第４，４４４，７４４号、第４，８１８，７０９および第４，６２４，８４６号、および上記のＲｅｉｃｈｅｒｔおよびＤｅｗｉｔｚにおいて開示されている。好適な実施形態において、米国特許第６，４４０，４１６号に開示されるように、病原体は、ＡＩＤＳの原因となるＨＩＶウイルス、結核菌、ストレプトコッカスアガラクチア、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、在郷軍人病菌、化膿性連鎖球菌、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、肺炎球菌、インフルエンザ菌Ｂ、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、緑膿菌、らい菌、ウシ流産菌，、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、単純ヘルペスウイルスＩＩ、ヒト血清パルボ様ウイルス、ＲＳウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタインバーウイルス、マウス白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、疣ウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアンウイルス４０、マウス乳癌ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、ウエストナイルウイルス、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ原虫、ランゲルトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマ、ブルセイトリパノソーマ、マンソン住血吸虫、日本住血吸虫、ウシバベシア、アイメリアテネラ、回旋糸状虫、熱帯リーシュマニア、旋毛虫、タイレリアパルバ、胞状条虫、羊条虫、無鉤条虫、単包条虫、有線条虫属、マイコプラズマアルスリチジス、マイコプラズマハイオリニス、マイコプラズマオラーレ、マイコプラズマアルギニニ、アコレプラズマレイドロウイ、マイコプラズマサリバリウムおよび肺炎マイコプラズマから成る群から選択される。
【００７５】
より好適な実施形態において、抗ｇｐ１２０および他のかかる抗ＨＩＶ抗体を含む本発明の薬物複合体は、ＡＩＤＳ患者におけるＨＩＶの治療法として使用することでき、結核菌への抗体の薬物複合体は、薬物屈折の結核の治療法に適している。抗ｇｐ１２０ＭＡｂ（抗ＨＩＶ  ＭＡｂ）およびシュードモナス外毒素などの毒素の融合タンパク質が抗ウイルス特性について検討されている（Ｖａｎ  Ｏｉｇｅｎら、Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ，５：７５−９１，１９９８））。ＡＩＤＳ患者におけるＨＩＶ感染を治療する試みは、不十分な効力または容認できない宿主毒性のために恐らく失敗した。本発明の薬物複合体は、そのようなタンパク質毒素の毒性副作用を有利に欠き、したがって、ＡＩＤＳ患者におけるＨＩＶ感染の治療に使用される。これらの薬物複合体は、単独または単独で与えられる場合にそのような患者において有効な他の抗菌もしくは治療薬との組み合わせで与えられることができる。
【００７６】
別の好適な実施形態において、本発明の好適な実施形態の治療的複合体を使用して治療され得る疾患は、２００２年３月１日に出願された米国仮出願第６０／３６０，２５９号に開示されるように、急性特発性血小板減少性紫斑病および慢性特発性血小板減少性紫斑病などの免疫性の血小板減などのクラスＩＩＩ自己免疫疾患を含む、免疫調節異常疾患および関連自己免疫疾患、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホシェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、関節リウマチ、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎および線維化肺胞炎、またならびに若年性糖尿病を含むがそれらに限定されない。これらの疾患において有益な一般的な抗体は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、Ｂ細胞抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、Ｂ７、ＭＵＣ１、Ｉａ、ＨＭ１．２４、およびＨＬＡ−ＤＲ）と反応するものを含むがそれらに限定されない。これらの自己免疫疾患の多くは、異常Ｂ細胞集団によって生成される自己抗体の影響を受けるため、特にＢ細胞抗体が、特定の状況下でＨＬＡ−ＤＲ抗体および／またはＴ細胞抗体（抗ＴＡＣ抗体などの、抗原としてＩＬ−２を標的にするものを含む）と組み合わされる場合に、本発明において使用される薬物で結合されるかかる抗体を含む、治療的複合体によるこれらＢ細胞の除去は、自己免疫疾患療法の好適な方法である。好適な実施形態において、また、抗Ｂ細胞、抗Ｔ細胞、もしくは抗マクロファージまたは自己免疫疾患を有する患者の治療に有益な他のかかる抗体は、該自己免疫疾患に関与する宿主応答を制御するためにより有効な治療法をもたらすように結合されることもでき、単独で、またはＴＮＦ阻害剤もしくはＴＮＦ抗体、非結合ＢもしくはＴ細胞抗体等の他の治療薬との組み合わせで与えられることができる。
【００７７】
好適な実施形態において、本発明の治療的複合体を使用して治療され得る疾患は、フィブリン塊、粥状動脈硬化、心筋虚血および梗塞などの循環器疾患を含む。フィブリンへの抗体は既知であり、該血塊および肺塞栓を明らかにするための造影剤として臨床試験中であり、一方、ＭＮ−３、ＭＮ−１５、ＮＣＡ９５、およびＣＤ１５抗体などの抗顆粒球抗体は、心筋梗塞および心筋虚血を標的にすることができ、また一方、抗マクロファージ、抗低比重リポタンパク質（ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＬＤＬ）、および抗ＣＤ７４（例えば、ｈＬＬ１）抗体は、動脈硬化巣を標的にするために使用することができる。
【００７８】
さらに別の好適な実施形態において、本発明の治療的複合体を使用して治療され得る疾患は、アルツハイマー病と関連するアミロイドまたはβアミロイドなどの標的部分が使用されることができ、抗体を局在化するための標的として機能する、特異的病変によって特徴付けられた神経変性疾患を含む。
【００７９】
本発明の好適な実施形態において、細胞および病原体内へのより効果的な取り込みは、多価、多特異性または多価、単一特異性抗体を使用して実現することができる。多価は、細胞上に発現した同一または異なる抗原またはエピトープに対する幾つかの結合アームの使用を意味し、一方、多特異性抗体は、標的細胞または病原体上に含有される少なくとも２つの異なる抗原またはエピトープを標的にするために多数の結合アームの使用を伴う。かかる２価および２重特異性抗体の例は、米国特許出願第６０／３９９，７０７号（２００２年８月１日出願）、第６０／３６０，２２９号（２００２年３月１日出願）、第６０／３８８，３１４号（２００２年６月１４日出願）、および第１０／１１６，１１６号（２００２年４月５日出願）に記載され、これらのすべては、参照することにより本願明細書に組み込まれる。多数の抗原標的および同一の抗原標的の多数のエピトープをも発現させ、しかし、細胞または病原体上の単一抗原標的の不十分な発現または有効性のために、免疫療法のための抗体の標的および十分な結合を回避することのある癌および感染性の生物（病原体）の標的において、これらの多価または多特異性抗体は特に好ましい。多数の抗原またはエピトープを標的にすることで、該抗体は、標的に対するより高い結合および滞留時間を示し、故に、本発明において標的にされる薬剤を使用してより高い飽和を生じさせる。
【００８０】
別の好適な実施形態において、本発明のカンプトテシン複合体との組み合わせで使用される治療薬は、２１２Ｂｉ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、または１１１Ｉｎなどの１つ以上のアイソトープを含んでもよい。マンガン、鉄およびガドリニウムなどの非放射性金属は、本明細書に記述される安定に繋留された構造および担体とともに、または直接的な治療法として使用される場合、放射性映像またはＭＲＩにとって有益である（例えば、β、αまたはオージェを放射する放射性核種が使用される場合、それらすべては本明細書において有益であると考えられる。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、およびＴＥＴＡなどの大環状キレートは、種々の金属および放射性金属とともに有用であり、とりわけ、ガリウム、イットリウムおよび銅の放射性核種とともにそれぞれ有用である。かかる金属−キレート錯体は、環サイズを関心金属に合わせることで非常に安定に生成されることができる。錯化２２３Ｒａのための大環状ポリエーテルなどの他の環型のキレートを使用してもよい。また、本発明のカンプトテシン複合体との組み合わせで使用される治療薬は、例えば、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピドフィロ毒素、タキサン、代謝拮抗薬、アルキル化剤、抗菌、Ｃｏｘ−２阻害剤、抗有糸分裂薬、血管新生阻害剤およびプロアポトーシス剤、特にドキソルビシン、メトトレキサート、タクソール、他のカンプトテシン、および抗癌剤のこれらのおよび他のクラスからの他のもの等の化学療法薬を含む。他の癌化学療法薬は、ナイトロジェンマスタード、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位錯体、ホルモン等を含む。適切な化学療法薬剤は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、１９ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９９５）、およびＧＯＯＤＭＡＮ  ＡＮＤ  ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ  ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ、７ｔｈ  Ｅｄ．（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９８５）ならびにこれら出版物の改訂版に記載されている。実験的薬剤などの他の適切な化学療法薬剤は、当業者には既知である。
【００８１】
治療薬の別のクラスは、α粒子（２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃなど）、β粒子（３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、１１１Ａｇ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１６６Ｄｙ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅなど）またはオージェ電子（１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、６７Ｇａ、１９１Ｏｓ、１９３ｍＰｔ、１９５ｍＰｔ、１９５ｍＨｇなど）を放射する放射性核種から成る。あるいは、治療薬は、画像診断に有益な放射性同位元素を含んでもよい。適切な放射性同位元素は、エネルギー範囲６０から４，０００ＫｅＶのもの、またはより具体的には、１８Ｆ、５２ＦＥ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、４５Ｔｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、１７７Ｌｕ、３２Ｐ、１８８Ｒｅ等、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。例えば、造影目的のため、１８Ｆ、６８Ｇａ、９４ｍＴｃ等の陽電子放射体を開示する表題「Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇａｌｌｉｕｍ−６８」の米国特許出願（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｇ．Ｌ．ａｎｄ  Ｗ．Ｊ．ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｗ．Ｊ，米国仮出願第６０／３４２，１０４号）を参照されたい。これらは参照することによりその全体が本願明細書に組み込まれる）。検出は、例えば、単光子放出コンピュータ断層撮影（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｈｏｔｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ＰＥＣＴ）、またはポジトロンＣＴ（ＰＥＴ）によって達成され得る。また、応用範囲は、潜在性新生物腫瘍を特定するための術中診断向けであってもよい。また、造影治療薬は、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）およびエルビウム（ＩＩＩ）から成る群から選択される金属の錯体を含んでもよい、１つ以上の画像造影剤を含んでもよい。
【００８２】
さらに他の実施形態において、治療薬は、β放射体（３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、１１１Ａｇ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｉ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１６６Ｄｙ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅなど）、オージェ電子放射体（１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、６７Ｇａ、１９１Ｏｓ、１９３ｍＰｔ、１９５ｍＰｔ、１９５ｍＨｇなど）、α放射体（２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃなど）、またはそれらの組み合わせを含む、新生物のまたは他の急速に分裂する細胞を死滅させるのに有益な１つ以上の放射性アイソトープを含んでもよい。
【００８３】
また、カンプトテシン複合体とともに使用される治療薬は、標的部分に結合される毒素であってもよい。この関連で使用され得る毒素は、リシン、アブリン，リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ポークウィード抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリン毒素、シュードモナス外毒素、およびシュードモナスエンドトキシンを含む。（例えば、Ｐａｓｔａｎら、Ｃｅｌｌ（１９８６），４７：６４１，およびＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ−Ａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ（１９９４），４４：４３を参照。本明細書における使用に適したさらなる毒素は、当業者には既知であり、米国第６，０７７，４９９号に開示されており、参照することによりその全体が本願明細書に組み込まれる。
【００８４】
種々の実施形態において、本明細書に開示される複合体は、複合、多特異性抗体の一部であってもよい。かかる抗体は、異なる特異性を有する２つ以上の異なる抗原結合部位を含有してもよい。多特異性複合物は、同一の抗原の異なるエピトープに結合してもよく、あるいは、異なる抗原に結合してもよい。一部のより好適な標的組み合わせは以下を含む。これは、好適な組み合わせ例の一覧であり、包括的なものであると意図されない。
【００８５】
【表１】
2009531325.tif 000011
2009531325.tif 000012
【００８６】
癌治療に好適なものなどのさらに他の組み合わせは、ＣＤ２０＋ＣＤ２２抗体、ＣＤ７４＋ＣＤ２０抗体、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）＋ＣＥＡＣＡＭ６抗体、インスリン様成長因子（ＩＬＧＦ）＋ＣＥＡＣＡＭ５抗体、ＥＧＰ−Ｉ（例えば、ＲＳ−７）＋ＩＬＧＦ抗体、ＣＥＡＣＡＭ５＋上皮成長因子受容体抗体を含む。参照することによりその全体が本願明細書に組み込まれる米国特許第６，０８３，４７７号、第６，１８３，７４４号および第６，９６２，７０２号ならびに米国特許出願広報第２００３０１２４０５８号、第２００３０２１９４３３号、第２００４０００１８２５号、第２００４０２０２６６６号、第２００４０２１９１５６号、第２００４０２１９２０３号、第２００４０２３５０６５号、第２００５０００２９４５号、第２００５００１４２０７号、第２００５００２５７０９号、第２００５００７９１８４号、第２００５０１６９９２６号、第２００５０１７５５８２号、第２００５０２４９７３８号、第２００６００１４２４５号および第２００６００３４７５９号に記載されているように、かかる抗体は、組み合わせで使用されるだけでなく、ＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等の種々の形態の融合タンパク質として組み合わされることができる。
【００８７】
特定の実施形態において、本明細書に記述される結合部分は、１つ以上のアビマー配列を含んでもよい。アビマーは、種々の標的分子に対するそれらの親和性および特異性において抗体とある程同様である結合タンパク質のクラスである。それらは、体外エキソンシャッフリングおよびファージディスプレイによってヒト細胞外受容体ドメインから開発された\。（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１４９３−９４；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２２０）。結果と生じるマルチドメインタンパク質は、単一エピトープ結合タンパク質と比べて向上された親和性（一部の例ではｎＭ以下）および特異性を呈示し得る多数の非依存的結合ドメインを含んでもよい。（同文献）それぞれが参照することによりそれら全体が本願明細書に組み込まれる、２００５年４月６日に出願された米国仮特許出願第６０／６６８，６０３号および２００５年１２月１６日に出願された第６０／７５１１９６号に記述されているように、種々の実施形態において、例えば、アビマーは、主張される方法および組成物において使用されるＡＤおよび／またはＤＤＤ配列に付着されてもよい。アビマーの構成および使用方法に関するさらなる詳細は、例えば、米国特許出願広報第２００４０１７５７５６号、第２００５００４８５１２号、第２００５００５３９７３号、第２００５００８９９３２号および第２００５０２２１３８４号に開示され、各々の実施例部分は、参照することにより本願明細書に組み込まれる。
【００８８】
抗体フラグメントの生成
モノクローナル抗体の生成方法は、当技術分野において既知であり、任意のかかる既知の方法は、主張される方法および組成物において使用される抗体を生成するために使用されてもよい。主張される方法および／または組成物の一部の実施形態は、抗体フラグメントに関してもよい。かかる抗体フラグメントは、従来の方法で抗体全体のペプシンまたはパパイン消化によって得られてもよい。例えば、抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２という５Ｓフラグメントを得るために、ペプシンで抗体を酵素的開裂することによって生成されてもよい。このフラグメントは、３．５Ｓ  Ｆａｂ’１価のフラグメントを得るため、チオール還元剤および、随意に、ジスルフィド連結の開裂により生じるスルフヒドリル基に対する保護基を使用してさらに開裂されてもよい。あるいは、ペプシンを使用する酵素的開裂は、２つの１価のＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントを生成する。抗体フラグメントを生成するための例示的な方法は、米国特許第４，０３６，９４５号、米国特許第４，３３１，６４７号、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，１９６０，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，８９：２３０；Ｐｏｒｔｅｒ，１９５９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，７３：  １１９；Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６７，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，ｐａｇｅ  ４２２  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），およびＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），  １９９１，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）に開示されている。
【００８９】
フラグメントが、無処置の抗体により認識される抗原に結合する限り、１価の軽−重鎖フラグメントを形成するための重鎖の遊離、フラグメントのさらなる開裂または他の酵素的、化学的もしくは遺伝子技術などの抗体を開裂させる他の方法が使用されてもよい。例えば、Ｆｖフラグメントは、ＶＨおよびＶＬ鎖の対合を含む。この対合は、Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２６５９に記述されるように非非共有結合性であることができる。あるいは、可変鎖は、分子内ジスルフィド結合によって連結されてもよく、またはグルタルアルデヒドなどの化学薬品によって架橋結合されてもよい。Ｓａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：４３７を参照。
【００９０】
好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによって連結されるＶＨおよびＶＬ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドリンカー配列によって連結される、ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構成することによって調製される。構造遺伝子は、大腸菌などの宿主細胞にその後導入される発現ベクター内へ挿入される。組み換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドで単一ポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを生成する方法は当技術分野において既知である。Ｗｈｉｔｌｏｗら、１９９１，  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：９７；Ｂｉｒｄら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３；米国特許第４，９４６，７７８号；Ｐａｃｋら、１９９３，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１２７１，およびＳａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：４３７を参照。
【００９１】
抗体フラグメントの別の形態は、単一相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）をコードしているペプチドである。ＣＤＲペプチド（“最小認識単位”）は、関心抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構成することによって得ることができる。例えば、かかる遺伝子は、抗体を生成する細胞のＲＮＡから可変ドメインを合成するために、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して調製されてもよい。Ｌａｒｒｉｃｋら、１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏＭｅｔｈｏｄｓｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：１０６；Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９５，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，ｐａｇｅｓ  １６６−１７９（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｉｒｃｈら、（編者），１９９５，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ｐａｇｅｓ  １３７−１８５（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照。
【００９２】
キメラおよびヒト化抗体
キメラ抗体は、例えば、マウス抗体の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）を含むマウス抗体の可変ドメインにより、ヒト抗体の可変ドメインが置換された組み換えタンパク質である。キメラ抗体は、被験者に投与された場合、免疫原性の減少および安定性の増加を呈示する。キメラ抗体を構成する方法は当技術分野において既知である（例えば、Ｌｅｕｎｇら、１９９４，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １３：４６９）。
【００９３】
キメラモノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重および軽可変鎖からヒト抗体の対応する可変ドメイン内へマウスＣＤＲを移動させることによってヒト化できる。キメラモノクローナル抗体中のマウスフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ：ＦＲ）も、ヒトＦＲ配列で置換される。ヒト化モノクローナルの安定性および抗原特異性を維持するため、１つ以上のヒトＦＲ残基は、マウス対応物残基により置換されてもよい。ヒト化モノクローナル抗体は、被験者の治療療法に使用されてもよい。また、標的に対するヒト化抗体の親和性も、ＣＤＲ配列（ＷＯ００２９５８４Ａ１）の選択された修飾によって増加し得る。ヒト化モノクローナル抗体の生成技術は、当技術分野において既知である。（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，  １９８８，３３２：３２３；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５；Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９２，１２：４３７；Ｔｅｍｐｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６；Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎ．，１９９３，１５０：２８４４を参照。）
【００９４】
他の実施形態は、非ヒト霊長類抗体に関してもよい。ヒヒにおいて治療的に有益な抗体をもたらす一般的な技術は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、ＷＯ９１／１１４６５（１９９１），およびＬｏｓｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ４６：３１０（１９９０）に見いだされ得る。別の実施形態において、抗体はヒトモノクローナル抗体であってもよい。かかる抗体は、抗原的チャレンジに対応して特異的ヒト抗体を生成するように操作された遺伝子導入マウスから得られる。この技術において、ヒト重および軽鎖遺伝子座の要素は、内在性重鎖および軽鎖遺伝子座の標的化された破壊を含有する胚性幹細胞株に由来するマウスの菌株内に導入される。遺伝子導入マウスは、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、マウスは、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを生成するために使用することができる。遺伝子導入マウスからヒト抗体を得る方法は、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ７：１３（１９９４），Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６  （１９９４），およびＴａｙｌｏｒ  ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）により記述される。
【００９５】
ヒト抗体
組み合わせのアプローチまたはヒト免疫グロブリン遺伝子座で形質転換された方法遺伝子導入動物のいずれか一方を使用して、完全なヒト抗体を生成する方法は、当技術分野において既知である（例えば、Ｍａｎｃｉｎｉら、２００４，  Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：３１５−２８、Ｃｏｎｒａｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，２００５，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．８：１１７−２６、Ｂｒｅｋｋｅ  ａｎｄ  Ｌｏｓｅｔ，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．３：５４４−５０であり、それぞれ参照することにより本願明細書に組み込まれる）。かかる完全なヒト抗体は、キメラまたはヒト化抗体よりもさらに少ない副作用を呈示し、本質的に内在性ヒト抗体として体内で機能することが予想される。特定の実施形態において、主張される方法および手順は、かかる技術によって生成されたヒト抗体を活用してもよい。
【００９６】
一代替案において、ファージディスプレイ技術は、ヒト抗体を産生するために使用されてもよい（例えば、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａら、２００５，Ｇｅｎｅｔ．ＭｏＩ．Ｒｅｓ．４：１２６−４０、参照することにより本願明細書に組み込まれる）。ヒト抗体は、正常ヒトまたは癌などの特定の疾患状態を呈示するヒトから産生されてもよい（Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａら、２００５）。疾患のある個人からヒト抗体を構成することの利点は、循環抗体レパートリーが疾患関連抗原に対する抗体に偏っている可能性があることである。
【００９７】
本方法の限定されない例において、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａら（２００５）は、骨肉腫患者からヒトＦａｂ抗体フラグメントのファージディスプレイライブラリーを構築した。該して、総ＲＮＡは循環血液リンパ球から得られた（同文献）。組み合わせＦａｂは、μ、γおよびκ鎖抗体レパートリーからクローン化され、ファージディスプレイライブラリー内に挿入された（同文献）。ＲＮＡは、ｃＤＮＡへ変換されて、重および軽鎖免疫グロブリン配列に対する特異的プライマーを使用し、Ｆａｂ  ｃＤＮＡ  ライブラリーを生成するために使用された（Ｍａｒｋｓら、１９９１，Ｊ．  ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７、参照することにより本願明細書に組み込まれる）。ライブラリー構築は、Ａｎｄｒｉｓ−  Ｗｉｄｈｏｐｆら（２０００，  Ｉｎ：Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ｐｐ．９．１から９．２２、参照することにより本願明細書に組み込まれる）に従って行われた。最終的なＦａｂフラグメントは、制限エンドヌクレアーゼで消化され、バクテリオファージゲノム内に挿入され、ファージディスプレイライブラリーを生成した。かかるライブラリーは、一般的なファージディスプレイ方法によって選別されてもよい。当業者は、本技術がただ例示的なものであり、ファージディスプレイでヒト抗体または抗体フラグメントを生成および選別する、いかなる既知の方法も活用されてもよいことを理解されたい。
【００９８】
別の代替案において、ヒト抗体を生成するために遺伝子操作された遺伝子導入動物は、上述のような一般的な免疫方法を使用して、本質的に任意の免疫原性標的に対する抗体を産生するために使用することができる。そのような系の限定されない例は、Ａｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（例えば、Ｇｒｅｅｎら、１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２３１：１１−２３、参照することにより本願明細書に組み込まれる）である。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）および同様の動物において、マウス抗体遺伝子は、不活性化および機能的ヒト抗体遺伝子により置換され、一方、マウス免疫系の残部は未変化のままである。
【００９９】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、アクセサリー遺伝子および調節配列に沿った大部分の可変ドメイン配列を含む、ヒトＩｇＨおよびＩｇκ遺伝子座の一部を含有した生殖系列構成ＹＡＣ（酵母人工染色体）で形質転換された。ヒト可変ドメインレパートリーは、既知の技術によりハイブリドーマに加工されるＢ細胞を生成する抗体を産生するために使用されてもよい。標的抗原で免疫されたＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、上述の一般的な技術により収集および／または生成され得る、正常免疫応答によってヒト抗体を生成する。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）の種々の株菌が使用可能であり、それぞれは、異なるクラスの抗体を生成することができる。かかるヒト抗体は、化学的架橋または他の既知の方法により結合されてもよい。遺伝子導入で生成されたヒト抗体は、正常ヒト抗体の薬物動態学的特性を保持しながら治療可能性を示している（Ｇｒｅｅｎら、１９９９）。当業者は、主張される組成物および方法は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系の使用に制限されないが、ヒト抗体を生成するために遺伝子操作された任意の遺伝子導入動物を活用してもよいことを理解されたい。
【０１００】
アビマー
特定の実施形態において、本明細書に記述される前駆物質、モノマーおよび／または錯体は、１つ以上のアビマー配列を含んでもよい。アビマーは、種々の標的分子に対するそれらの親和性および特異性において、抗体とある程度同様である結合タンパク質のクラスである。それらは、体外エキソンシャッフリングおよびファージディスプレイによってヒト細胞外受容体ドメインから開発された。（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ら、２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１４９３−９４；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２００６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２２０）。結果と生じるマルチドメインタンパク質は、単一エピトープ結合タンパク質と比べて向上された親和性（一部の例ではｎＭ以下）および特異性を呈示し得る多数の非依存的結合ドメインを含んでもよい。（同文献）種々の実施形態において、アビマーは、例えば、主張される方法および組成物において使用されるＤＤＤ配列に付着されてもよい。アビマーの構成および使用方法に関するさらなる詳細は、例えば、米国特許出願広報第２００４０１７５７５６号、第２００５００４８５１２号、第２００５００５３９７３号、第２００５００８９９３２号および第２００５０２２１３８４号に開示され、それぞれの実施例部分は、参照することにより本願明細書に組み込まれる。
【０１０１】
ファージディスプレイ
主張される組成物および／または方法の特定の実施形態は、結合ペプチドおよび／または種々の標的分子、細胞または組織のペプチド模倣薬に関してもよい。結合ペプチドは、ファージディスプレイ技術を含むがそれに限定されない、当技術分野において既知の任意の方法により同定することができる。ファージディスプレイの種々の方法およびペプチドの多様な集団を生成するための技術は、当技術分野において既知である。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号、第５，６２２，６９９号および第６，０６８，８２９号は、ファージライブラリーを調製する方法を開示し、それぞれは参照することにより本願明細書に組み込まれる。ファージディスプレイ技術は、小ペプチドがそれらの表面上に発現できるように、バクテリオファージを遺伝子操作することを含む（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ  １．２１：２２８−２５７）。
【０１０２】
ファージディスプレイされたペプチドライブラリーの構築において、およびペプチドリガンドを単離させるためにライブラリーが使用される選別方法の発達において多大な進歩が過去１０年間に見られている。例えば、ペプチドライブラリーの使用は、炎症反応に関与する抗体または細胞接着を媒介するインテグリンなど、多くのタンパク質内での相互作用部位および受容体−リガンド結合モチーフを特徴付けることを可能にしている。また、この方法は、ペプチド模倣薬または造影剤の発達をもたらす役目をし得る新規ペプチドリガンドを特定するためにも使用されている（Ａｒａｐ  ｅｔ  ａｌ，１９９８ａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：３７７−３８０）。ペプチドに加えて、単鎖抗体などのより大きなタンパク質ドメインも、ファージ粒子の表面上に表示され得る（Ａｒａｐら、１９９８ａ）。
【０１０３】
所定の器官、組織、細胞型または標的分子に選択的な標的アミノ酸配列は、パニングにより単離されてもよい（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：３６４−３６６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，１９９９，Ｔｈｅ  Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４３：１５９−１６２）。つまり、推定標的ペプチドを含有するファージのライブラリーは、未変化の生物へまたは単離された器官、組織、細胞型または標的分子へ投与され、結合されたファージを含有する試料が採取される。標的に結合するファージは、標的器官、組織、細胞型または標的分子から溶離されてもよく、その後宿主細菌中でそれらを増殖させることによって増幅されてもよい。
【０１０４】
特定の実施形態において、ファージは、パニングのラウンド間に宿主細菌において伝播されてもよい。細菌は、ファージによって溶解されるのではなく、むしろ代わりに特定の挿入を表示するファージの多数のコピーを分泌することができる。所望される場合、増幅されたファージは、標的器官、組織、細胞型または標的分子に再び曝露されてもよく、パニングのさらなるラウンドのために採取されてもよい。パニングの複数ラウンドは、選択的または特異的なバインダーが得られるまで行われてもよい。ペプチドのアミノ酸配列は、ファージゲノム中の標的ペプチド挿入に対応してＤＮＡの配列を決定することにより決定されてもよい。同定された標的ペプチドは、その後、一般的なタンパク質化学技術で合成ペプチドとして生成されてもよい（Ａｒａｐら、１９９８ａ、Ｓｍｉｔｈら、１９８５）。
【０１０５】
一部の実施形態において、減算手順は、背景ファージ結合をさらに減少させるために使用されてもよい。減算の目的は、関心領域以外の標的に結合するライブラリーからファージを除去することである。代替的実施形態において、ファージライブラリーは、対照細胞、組織または器官に対して事前に選別されてもよい。例えば、腫瘍に結合するペプチドは、対照正常株化細胞に対するライブラリーを事前選別後、同定されてもよい。減算後、ライブラリーは、関心の分子、細胞、組織または器官に対して選別されてもよい。例えば、参照することにより本願明細書に組み込まれる米国特許第５，８４０，８４１号、第５，７０５，６１０号、第５，６７０，３１２号および第５，４９２，８０７号に開示されるように、減算手順の他の方法は、既知であり、主張される方法の実施に際して使用されてもよい。
【０１０６】
アプタマー
特定の実施形態において、有益な標的部分はアプタマーであってもよい。アプタマーの結合特性を構成および決定する方法は、当技術分野において既知である。例えば、かかる技術は、米国特許第５，５８２，９８１号、第５，５９５，８７７号および第５，６３７，４５９号に記述され、それぞれ参照することにより本願明細書に組み込まれる。特定の関心標的に結合するアプタマーの調製および選別方法は、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号および米国特許第５，２７０，１６３号において既知であり、それぞれ参照することにより本願明細書に組み込まれる。
【０１０７】
アプタマーは、合成、組み換えおよび精製方法を含む任意の既知の方法によって調製されてもよく、単独または同一の標的に特異的な他のリガンドとの組み合わせで使用されてもよい。概して、特異的な結合をもたらすには、最低限約３ヌクレオチド、好ましくは少なくとも５ヌクレオチドが必要である。１０、２０、３０または４０ヌクレオチドのアプタマーが好適であり得るが、１０塩基より短い配列のアプタマーが可能である。
【０１０８】
アプタマーは、結合特異性を与える配列を含有する必要があるが、隣接領域で拡張されてもよく、その他誘導体化されてもよい。好適な実施形態において、アプタマーの結合配列は、プライマー結合配列により隣接されてもよく、ＰＣＲまたは他の増幅技術でアプタマーの増幅を促進させる。
【０１０９】
アプタマーは、単離、配列および／または増幅または従来のＤＮまたはＲＮＡ分子として合成されてもよい。あるいは、関心アプタマーは、修飾オリゴマーを含んでもよい。通常アプタマー内に存在するヒドロキシル基のいずれも、ホスホン酸基、リン酸基により置換されてもよく、一般的な保護基により保護されてもよく、または他のヌクレオチドへのさらなる連結を調製するために活性化されてもよく、または固体担体に結合されてもよい。１つ以上のリン酸ジエステル連結は、Ｐ（Ｏ）Ｓ、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＮＲ２により置換されたＰ（Ｏ）Ｏなどの代替連結基により置換されてもよく、ここで、Ｒは、Ｈまたはアルキル（１〜２０Ｃ）であり、Ｒ’は、アルキル（１〜２０Ｃ）であり、さらに、この基は、ＯまたはＳを介して隣接するヌクレオチドに付着されてもよい。オリゴマー内のすべての連結が同一である必要はない。
【０１１０】
結合手順
好適な結合手順は、中性または酸性ｐＨで容易なチオール−マレイミド、チオール−ビニルスルホン、チオール−ブロモアセトアミド、またはチオール−ヨードアセトアミド反応に基づく。これは、活性エステルを使用する場合に必要とされるような結合に対するより高いｐＨ条件の必要性を取り除く。
【０１１１】
本発明の好適な実施形態の複合体の投与の適切な経路は、制限されないが、経口、非経口、直腸、経粘膜、腸管投与、筋肉内、皮下、髄内、くも膜下腔内、直接的脳室内、静脈内、硝子体内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射を含む。投与の好適な経路は非経口である。あるいは、例えば、固形腫瘍内への直接的な化合物の注入を介して、全身的方法よりもむしろ局所的方法で化合物を投与してもよい。
【０１１２】
本発明の種々の実施形態は、その範囲を制限することなく、以下の実施例により例証される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１３】
ＭＣがマレイミドカプロイルであり、Ｐｈｅがフェニルアラニンであり、Ｌｙｓがリジンであり、ＭＭＴがモノメトキシトリチルであり、ＰＡＢＯＨがｐ−アミノベンジルアルコールであり、ＰＮＰがｐ−ニトロフェニル部分である、中間体Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨならびに架橋剤Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ，ＭＣ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨおよびＭＣ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＣＯＯ−ＰＮＰを公開されている方法を使用して合成した（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら、上記参照）。アミノ酸のＣＰＴ−２０−Ｏ−アシル誘導体を公開されている方法を適応して調製した（Ｖｉｓｈｎｕｖａｊｊａｌａ、上記参照）。下記の実施例において、記載された略称を本明細書に適用する。さらに、実施例３のＰＥＧ１２は、マレイミド−ＰＥＧ１２−ＮＨＳエステル（００４１、式３を参照）であり、ＰＥＧは、ポリエチレングリコールである。実施例４におけるＡＡは、アミノ酸の略称である。
【実施例１】
【０１１４】
ＭＣ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＯＣＯ−２０−Ｏ−ＣＰＴ−１０−Ｏ−ＢＯＣの調製およびＢＯＣ保護基の選択的な除去の検討
１０−ヒドロキシ−ＣＰＴ（０．２３０７ｇ）を、下記の実施例２の与えられる条件下において、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル二炭酸およびピリジンと反応させ、１０−ＢＯＣ−Ｏ−ＣＰＴ誘導体を得た。後者（２４．７ｍｇ）を無水ジクロロメタン中の４−ジメチルアミノピリジン（２０．７ｍｇ）およびトリホスゲン（５．９ｍｇ）で処置し、そのように形成されたクロロギ酸を、短時間、通常５分間、等モル量のＭＣ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨと反応させた。メタノール−ジクロロメタン勾配を使用したシリカゲル（２３０〜４００メッシュ）上のクロマトグラフィーにより、いくらかの未反応出発物質との厳密な溶離混合物としての表題生成物の単離がもたらされた。質量スペクトルは、生成物の形成を明確に示した（ｍ／ｅ１３７６でのＭ＋Ｎａ）。反応時間１−７／４分間の薄層クロマトグラフィーによる経時的解析と、最適化された条件で得られた生成物のペクトルデータ（ｍ／ｅ９８２での強ＭＨ＋）とによって示されるように、単に２から５分間のＴＦＡ媒介の開裂は必要なＢＯＣ除去生成物を与えた。３０分間の延長ＴＦＡ脱保護は、２０−炭酸塩結合の開裂ももたらし、１０−ＯＨ−ＣＰＴを形成した。故に、２０−炭存在下、短時間ＴＦＡ反応による１０−ＢＯＣの選択的な開裂を達成した。
【実施例２】
【０１１５】
ＭＣ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＯＣＯ−２０−Ｏ−ＳＮ−３８（ＣＬ−ＳＮ−３８）
の調製
ＳＮ−３８（０．５１１４ｇ、１．３０５ミリモル）を無水ピリジン（８ｍＬ）中のジ−ｔｅｒｔ−ブチル二炭酸（０．３０７ｇ）と１８時間外気温で反応させた。溶媒を蒸発させ、メタノール−ジクロロメタン勾配を使用して、シリカゲル（２３０−４００メッシュ）上のフラッシュクロマトグラフィーで粗材料を精製し、０．５５ｇの淡黄色固形生成物としてＢＯＣ−ＳＮ−３８であるＳＮ−３８の１０−ｔ−ブチルオキシルカルボニル誘導体を得た。この材料（０．０３５８ｇ）を無水ジクロロメタン（１．５ｍＬ）に溶解し、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、２６．６ｍｇ）およびトリホスゲン（０．００９５ｍｇ）で７分間処置し、ＢＯＣ−ＳＮ−３８−２０−クロロギ酸である産生されたクロロギ酸をＭＣ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨと原位置で短時間、通常５分間反応させた。次いで、メタノール−ジクロロメタン勾配を使用して、反応混合物をシリカゲル（２３０−４００メッシュ）上のフラッシュクロマトグラフィーで精製した。収率：４２．４ｍｇ。この生成物の一部（２１．９ｍｇ）を、数分間、通常５分未満、トリフルオロ酢酸（「ＴＦＡ」、１ｍＬ）、ジクロロメタン（０．２５ｍＬ）、およびアニソール（０．１４ｍＬ）の混合物で処置し、生成物をジエチルエーテルで沈殿させることにより単離させた。随意に、ＴＦＡ処置をそれぞれ５分未満の短時間でさらに２または３回繰り返した。逆相ＨＰＬＣによる解析（Ｃ１８カラム、勾配溶離で使用した溶液Ａは、３ｍＬ／分で１０分で溶液Ｂに変わり、その後５分間１００％のＢを維持した。Ａは、ｐＨ４．４３の０．３％含水酢酸アンモニウムであり、Ｂは、ｐＨ４．４３の９：１ＣＨ３ＣＮ／０．３％含水酢酸アンモニウムである）は、表題化合物のためにピーク１０．７９６分（３６０ｎｍでの吸光度）を示し、これは、通常７６％〜８３％で、残部の殆どはＳＮ−３８であった。さらなる精製は、残部がＳＮ−３８である、約９０％の純度を有する生成物をもたらした。これらのレベルの純度を有する最終的な生成物を抗体への結合に使用する。エレクトロスプレー質量スペクトルは、表題化合物に対し、陰イオンモード（Ｍ−Ｈ）においてｍ／ｅ１００９で質量ピークを示し、陽イオンモードにおいてｍ／ｅ１０１１で強いピークを示した。
【実施例３】
【０１１６】
マレイミド−ＰＥＧ１２−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＯＣＯ−２０−Ｏ−ＳＮ−３８（ＰＥＧ−ＣＬ−ＳＮ−３８）の調製
市販のヘテロ２官能性の架橋剤、マレイミド−ＰＥＧ１２−ＮＨＳエステル（００４０、式３を参照）を使用して、ＤＭＦ中の中間体Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨおよびジイソプロピルエチルアミンを反応させることによって、マレイミド−ＰＥＧ１２部分を、実施例２のマレイミドカプロイルに置換し、架橋剤マレイミド−ＰＥＧ１２−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨを産生した。ここで、ＰＥＧ１２は、１２モノマー単位を含有する定義されたＰＥＧ基質であり、ＭＡｂ結合条件下において薬物−リンカー中間体の溶解度を増強させるために使用した。架橋剤であるマレイミド−ＰＥＧ１２−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨを、実施例２のＢＯＣ−ＳＮ−３８  ２０−クロロギ酸と反応させた。実験条件および精製は、実施例２で詳述したものと類似した。生成物をＴＦＡ媒介の脱保護にさらし、表題生成物を得た。エレクトロスプレー質量スペクトルは、表題化合物に対し、陰イオンモードにおいてｍ／ｅ１６０２（Ｍ＋Ｃｌ）および１６８１（Ｍ＋ＴＦＡ）でピークを示し、陽イオンモードにおいてｍ／ｅ１５６８（Ｍ＋Ｈ）で強いピークを示した。
【実施例４】
【０１１７】
ＭＣ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＯＣＯ−ＡＡ−２０−Ｏ−ＳＮ−３８
（ＣＬ−ＡＡ−Ｓ−３８）の調製
生成物の一般式を式１３に示す。ＢＯＣ−グリシン、ＭＭＴ−グリシン、ＢＯＣ−サルコシン、またはＢＯＣ−アラニンを使用し、実施例２のＢＯＣ−ＳＮ−３８を２０−ヒドロキシル位置でエステル化した。基本手順は、触媒量の４−ジメチルアミノピリジンが存在下で、ＢＯＣ−ＳＮ−３８を、約２０％のモル過剰のそれぞれのアミンで保護されたアミノ酸（ａｍｉｎｅ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ：ＡＡ）および無水ジクロロメタン中のジシクロヘキシルカルボジイミドと外気温で一晩反応させることを含んだ。フラッシュクロマトグラフィーで精製したエステル化生成物をジクロロ酢酸（ｄｉｃｈｌｏｒｏ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ：ＤＣＡ）で処置し、単にＭＭＴ基を除去、またはＴＦＡで処置し、エステルのアミン末端およびＳＮ−３８上のＢＯＣ基上の両方の保護基を除去した。次いで、ＴＦＡまたはＤＣＡ塩として存在するアミン末端を有する、および保護されたまたは遊離１０−ヒドロキシルを有するＣ−２０エステルを含有するＳＮ−３８誘導体を、１０％モル過剰のＭＣ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＣＯＯ−ＰＮＰ（記述は、実施例の一般項目を参照）およびＤＭＦ中のＤＩＥＡと反応させた。フラッシュクロマトグラフィーでの精製は、それぞれの場合において最後から２番目の中間体を提供し、ＴＦＡと反応させて表題材料を得た。表題化合物：Ｃ−２０でグリシン酸塩を有する（構造中Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ）：質量スペクトル、ｍ／ｅ１０６５でのＭ−Ｈ、Ｃ−２０でサルコシネートを有する（構造中Ｒ１＝メチル、Ｒ２＝Ｈ）：質量スペクトル、ｍ／ｅ１０８１でのＭ＋Ｈ（陽イオンモード）およびｍ／ｅ１０７９でのＭ−Ｈ（陰イオンモード）；Ｃ−２０でアラネートを有する（構造中Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝メチル）：質量スペクトル、陽および陰イオンモードそれぞれにおいてｍ／ｅ１６６２でのＭ＋Ｎａ、ｍ／ｅ１６３８でのＭ−Ｈ。
【化１０】
2009531325.tif 000013
【実施例５】
【０１１８】
ＨＳ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＯＣＯ−２０−Ｏ−ＳＮ−３８
（ＣＬＳ−ＳＮ−３８）の調製
ジイソプロピルエチルアミン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙａｍｉｎｅ：ＤＩＥＡ）の２．５等価物を含有する無水ジクロロメタン中のＭＭＴクロライドのモル等価物と後者を反応させることによって、ステップ２においてチオプロピオン酸からサクシニミジルＳ−メトキシトリチルチオプロピオン酸を調製したが、ＭＭＴとはモノメトキシトリチルの略称である。薄層クロマトグラフィーで監視された、反応の終了後、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。フラッシュクロマトグラフィーで精製された生成物を、等モル量のＮ−ヒドロキシサクシニミドおよびＤＭＦ中のジシクロヘキシルカルボジイミドを有するそのサクシニミジル  エステルに変換した。沈殿したＤＣＣ−ウレアをろ過し、濾液を、等モル量の反応物およびＤＩＥＡを使用してＤＭＦ中の中間体Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ（実施例の一般項目を参照）との反応に使用した。必要な生成物をフラッシュクロマトグラフィーで単離した。生成物ＭＭＴ−Ｓ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨを、８４．７％の収率で得た。そのエレクトロスプレー質量スペクトルは、その構造に対して予測されたように、陽イオンモードにおいて、ｍ／ｅ１０３２でのＭ＋Ｈおよびｍ／ｅ１０５４での強いＭ＋Ｎａ、ならびに陰イオンモードにおいて、ｍ／ｅ１０３０でのＭ−Ｈピークを示した。この材料をＢＯＣ−ＳＮ−３８−（２０）−クロロギ酸と反応させ、生成物を実施例２に記述したものと同様の方法で精製し、生成物ＭＭＴ−Ｓ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＯＣＯ−（２０）−ＳＮ−３８−（ｌ０）−ＢＯＣを得た。その質量スペクトルは構造と一致した（ｍ／ｅ１５７２でのＭ＋Ｎａ、ｍ／ｅ１５４８でのＭ−Ｈ、ｍ／ｅ１６６３でのＭ＋ＴＦＡ）。最後に、実施例２に記述したようなＴＦＡとの短時間処置は、副生成物として約５％のＳＮ−３８を有するＨＰＬＣによって＞８７％の純度の表題生成物を提供した。その質量スペクトルは、陽および陰イオンモードそれぞれにおいて、ｍ／ｅ９０６でのＭ＋Ｈおよびｍ／ｅ９０４でのＭ−Ｈを示した。
【実施例６】
【０１１９】
軽度に還元された抗体に対するマレイミド含有のＳＮ−３８中間体の結合：ＭＡｂ
の鎖間領域への付着
抗ＣＤ２２ヒト化ＭＡｂ、ｈＬＬ２、抗ＣＤ７４ヒト化ＭＡｂ、ｈＬＬ１、抗ＥＧＰ−１ヒト化ＭＡｂ、ｈＲＳ７、および抗ＩＧＦＲ１キメラＭＡｂ、ｃＲ１をこれらの研究に使用した。５．４ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するｐＨ７．４の４０ｍＭ  ＰＢＳ中のジチオスレイトール（ＤＴＴ）（５０から７０倍モル過剰で使用) で、各抗体を４５分間３７℃（浴槽）で還元した。還元された生成物を、遠心分離したサイズ排除カラムで精製し、７５ｍＭ酢酸ナトリウム−１ｍＭ  ＥＤＴＡで緩衝液交換を行った。チオール含有量をエルマンのアッセイで決定し、６．５から８．５ＳＨ／ＩｇＧの範囲であった。還元したＭＡｂを実施例２の１２．５から２２．５倍モル過剰のＣＬ−ＳＮ−３８または実施例３のＰＥＧ−ＣＬ−ＳＮ−３８、あるいは、実施例４のＣＬ−ＡＡ−ＳＮ−３８と、５〜１０％ｖ／ｖのＤＭＦを共溶媒として使用して反応させ、外気温で２０分間インキュベートした。複合体を遠心分離したＳＥＣ、疎水性カラムの通過、および最後に限外ろ過ダイアフィルトレーションで精製した。生成物を、ＳＮ−３８に対して３６６ｎｍの吸収度で分析し、基準値と相関させ、一方、タンパク質濃度は、この波長でＳＮ−３８吸光度の溢流に対して採取された２８０ｎｍの吸光度から推定した。この方法により、ＳＮ−３８／ＭＡｂ置換率を決定した。精製した複合体を、ガラス製薬瓶内に凍結乾燥製剤として保管し、真空下でふたをして、−２０℃のフリーザー内に保管した。ＳＮ−３８モル置換率（ｍｏｌａｒ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｒａｔｉｏ：ＭＳＲ）をこれらの一部の複合体に対して取得し、これは表２に示すように、結合モードを考慮して一般的に５〜８の範囲である。
【実施例７】
【０１２０】
マレイミド付加の抗体に対するＣＬＳ−ＳＮ−３８の結合：ＭＡｂ
のリジン側鎖への付着
抗ＣＤ２２ヒト化ＭＡｂ、ｈＬＬ２および抗ＥＧＰ−１ヒト化ＭＡｂ、ｈＲＳ７を、これらの研究において検討した。ｐＨ７．４のＰＢＳ中の７から１０倍モル過剰のスルホ−ＳＭＣＣによって、４０分間４℃で、各抗体を誘導体化した。遠心分離したＳＥＣおよび５ｍｇ／ｍＬに希釈したｐＨ６．５の７５ｍＭ  酢酸ナトリウム−１ｍＭ  ＥＤＴＡによる緩衝液交換で、各例における複合体を精製し、酢酸でｐＨをｐＨ５に調節した。次いで、マレイミド付加の抗体を、約１０％ｖ／ｖで共溶媒として使用したＤＭＦで、実施例５のＣＬＳ−ＳＮ−３８の僅かなモル過剰（抗体上の各マレイミド基に対して約１．１５等価）と反応させた。外気温で１５分後、複合体を精製し、ＳＮ−３８モル置換を実施例６の複合体に関して記述したように決定した。薬物がＭＡｂのリジンアミノ基に付着されるこれらの複合体の一部に対して得られたＳＮ−３８置換を表２（イタリック体のもの全体）に示す。代替調剤は一般的に実施例６の複合体のものよりも少ない。
【０１２１】
【表２】
2009531325.tif 000014
【実施例８】
【０１２２】
リンパ腫における抗体−ＳＮ−３８複合体の体外細胞傷害性
Ｒａｊｉ  Ｂ−リンパ腫細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得た。ＳＮ−３８複合体をジスルフィド還元の抗ＣＤ７４ＭＡｂ、ｈＬＬ１、または、陰性対照ＭＡｂ抗ＥＧＰ−１  ＭＡｂ、ｈＲＳ７（対照として使用）から調製し、以下の組成を有した。ｈＬＬ１（またはｈＲＳ７）−［サクシニミドカプロイル（ＳＣと略す）］−ＣＬ−ＳＮ−３８およびｈＬＬ１（またはｈＲＳ７）−［サクシニミド−ＰＥＧ１２（Ｓ−ＰＥＧ１２と略す）Ｊ−ＣＬ−ＳＮ−３８、ここで、ＣＬは、ｐ−アミノベンジル由来のＰＡＢを有するＰｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＯＣＯ部分である。凍結乾燥された複合体を生理食塩水で５ｍｇ／ｍＬに再構成した。他の対照は未修飾ｈＬＬ１およびＳＮ−３８（ＤＭＳＯ溶液）を含んだ。細胞を収集し、９６ウェルプレート（２５，０００細胞／ウェル）内に蒔いた。２０μＬの連続的に希釈した複合体溶液または対照 を、ＳＮ−３８と等価の最終濃度０−７μＭの最終濃度になるまで各ウェルに加え、３７℃でインキュベートした。培地を４時間または４８時間で廃棄し、培地を洗浄し、その後新鮮な培地を追加した。インキュベーションの合計時間は４８時間であった。ＭＴＳ色素還元アッセイを使用して用量反応曲線を決定し、ＰｒｉｓｍＰａｄ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ、ＣＡ）を使用して効果的なＥＣ５０濃度を決定した。下記の表３は、ｈＬＬ１複合体による特異的細胞傷害性を示す。
【０１２３】
【表３】
2009531325.tif 000015
【０１２４】
異なる実験において、ＳＮ−３８−２０−グリシン酸塩またはＳＮ−３８−２０−サルコシネートに由来する２官能性のＳＮ−３８のｈＬＬ１およびｈＲＳ７複合体を、上記のようなＲａｊｉ細胞を使用して体外で評価した。使用した特異的基質は、ｈＬＬ１−［ＳＣ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＯＣＯ−Ｇｌｙ−ＳＮ−３８］および［ＳＣ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＯＣＯ−Ｓａｒ−ＳＮ−３８］であり、非特異的基質は、ｈＲＳ７−［ＳＣ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＯＣＯ−Ｇｌｙ−ＳＮ−３８］およびｈＲＳ７−［ＳＣ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＯＣＯ−Ｓａｒ−ＳＮ−３８］であった。略称ＳＣ、ＰＡＢは上述のとおりであり、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、ＧＩｙ、およびＳａｒはアミノ酸である。表４は、これらのｈＬＬ１複合体による特異的細胞傷害性を示す。
【０１２５】
【表４】
2009531325.tif 000016
【実施例９】
【０１２６】
ｈＬＬ１−ＳＮ−３８誘導体による重症複合免疫不全（Ｓｅｖｅｒｅ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ：ＳＣＩＤ）マウスにおけるＲａｊｉ全身性リンパ腫の体内療法
評価した複合体は、抗ＣＤ７４ＭＡｂ、ｈＬＬ１に由来し、ｈＬＬ１−［サクシニミドカプロイル（ＳＣと略す）］−ＣＬ−ＳＮ−３８およびｈＬＬ１−［サクシニミド−ＰＥＧ１２（Ｓ−ＰＥＧ１２と略す）］−ＣＬ−ＳＮ−３８の構造を有し、ＣＬは、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＯＣＯ部分であって、 ＰＡＢはｐ−アミノベンジルに由来し、ＰｈｅおよびＬｙはそれぞれ、アミノ酸フェニルアラニンおよびリジンである。８週齢のメスＳＣＩＤマウスに２．５ｘ１０６Ｒａｊｉ細胞を静脈内注射によって接種した。翌日、５００μｇの検査薬または未修飾ｈＬＬ１抗体を５つのマウスの群に静脈内注射した。後肢麻痺および／または２０％を超える体重減少が兆候である疾患進行について、動物を毎日観察した。未修飾抗体で処理したものの５６日の生存期間中央値と比べて、どちらかの複合体で処理したマウスは１２５日の生存期間中央値を超えて生存している。さらに、ｈＬＬ１−［ＳＣ−ＣＬ］−ＳＮ−３８（「ｈＬＬ１−ＣＬ−ＳＮ−３８」）は、抗体単独の対照よりも有意に良好だった（Ｐ＜０．００６４）。これらのデータは、治療的効果がこれらの複合体で得られたことを示した。
【実施例１０】
【０１２７】
抗ＣＤ２２ｈＬＬ２−ＳＮ−３８薬物複合体による重症複合免疫不全（Ｓｅｖｅｒｅ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ：ＳＣＩＤ）マウスにおける
Ｄａｕｄｉ全身性リンパ腫の体内療法
８週齢メスＳＣＩＤマウスに１．５ｘ１０７Ｄａｕｄｉ細胞を静脈内注射により接種した。翌日、１００、２００、または５００μｇのｈＬＬ２−ＳＮ−３８を注射し、その後、３週間の間週２回および第４週目に１回注射した。対照は、未処置マウスおよび未修飾ｈＬＬ２の等用量を受け取るものから成った。１群当り８匹の動物を使用した。疾患進行の兆候である動物の後肢麻痺および／または２０％を超える体重減少について毎日観察した。５００μｇ用量、２００μｇ用量、および１００μｇ用量群の生存期間中央値、および括弧内に示される各相当する裸ｈＬＬ２用量群生存期間中央値は、それぞれ９８日（４９．５日）、９２．５日（５４．５日）、７４．５日（４２日）であった。未処置の動物は、２７日目に死んだ。最も高い用量グループでは、８匹のマウス中７匹が生存し、生存期間中央値は９８日目にまだ到達していなかった。これらのデータは、抗ＣＤ２２ｈＬＬ２−ＳＮ−３８複合体の治療効果を示した。
【実施例１１】
【０１２８】
抗ｇｐｌ２０ＭＡｂのＳＮ−３８複合体を用いた処置によるＨＩＶ感染の排除
Ｐ４／Ｄ１０などのＨＩＶ外被タンパク質ｇｐｌ２０、抗ｇｐ１２０抗体に標的化されたＭＡｂを、実施例５に記述した条件を使用して還元し、還元したＭＡｂを実施例１に対して記述したような２０倍モル過剰の薬物−リンカーＣＬ−ＳＮ−３８と反応させる。抗体当り約８薬物分子の置換を有する抗ｇｐ１２０−ＳＮ−３８複合体を得る。非感染Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞および完全にＨＩＢ感染したＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の種々の混合物を使用し（９９．８：２から９５：５の比率で）、複合体、非特異的ｈＲＳ７−ＣＬ−ＳＮ３８複合体対照、裸抗体、およびＨＩＶ陰性血清の１００から０．００００１μｇ／ｍＬまでの連続希釈法で処置し、該複合体での体外ＨＩＶ抑制検査を行う。そのように処置した細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地内で７日間３７℃でインキュベートし、次いで、関連するＥＬＩＳＡテストによってＨＩＶ抑制を検査する。この実験は、特異的薬物複合体によるＨＩＶの細胞間伝播の強い特異的な抑制を示す。特異的および非特異的ＳＮ−３８複合体とともに同種ＨＩＶ感染の細胞を用いて、マウスに投与することで体内有効性をテストする。このため、免疫抱合体投与と同時に、ＨＩＶ−１／ＭｕＬＶ偽型ウイルスに感染した一次マウスの脾細胞をマウスの群に腹腔内移動させる。腹膜細胞を１０日後に収集する。対照マウスにおいて感染性ＨＩＶの存在が示される一方、１００μｇ未満の抗ｇｐ１２０−ＳＮ−３８複合体で処置したマウスにおいて感染性ＨＩＶは検出されない。対照複合体処置したマウスに保護は見られない。
【０１２９】
上述の説明により、当業者は、本発明の本質的な特性を容易に把握することができ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、必要以上の実験なしに種々の用途および条件に適用させるため、発明の種々の変更および改良を行うことができる。本明細書に記載されるすべての特許、特許出願および公報は、参照することによりそれら全体が本願明細書に組み込まれる。 
【国際調査報告】
2009531325.tif 000017