(57)【要約】IL-31RaおよびOSMRbに対するアンタゴニストの使用は、神経組織における刺激を阻害、妨害、軽減、最小化、制限、または最小化することによって、炎症および疼痛を治療するのに使用される。このようなアンタゴニストには、可溶性の受容体、抗体、およびその断片、誘導体、または変種が含まれる。神経障害に関連した疼痛、チクチクする痛み、過敏化、くすぐり感などの症状が改善される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経組織をIL-31RAアンタゴニストまたはOSMRbアンタゴニストと混合する段階を含む、哺乳動物の神経組織の炎症を治療する方法であって、炎症が、軽減、制限、予防、最小化、または中和される方法。
【請求項２】
哺乳動物由来の神経組織をIL-31RaアンタゴニストまたはOSMRbアンタゴニストと混合する段階を含む、哺乳動物の疼痛を治療する方法であって、炎症が、軽減、制限、予防、最小化、または中和される方法。
【請求項３】
IL-31RaアンタゴニストまたはOSMRbアンタゴニストを後根神経節細胞と混合し、それによって、シグナル伝達が阻害される段階を含む、後根神経節細胞におけるIL-31によって誘導されるシグナル伝達に拮抗する方法。
【請求項４】
熱傷組織をIL-31RaアンタゴニストまたはOSMRbアンタゴニストと混合する段階を含む、熱傷に関連した症状を治療するための方法。
【請求項５】
IL-31RaアンタゴニストまたはOSMRbアンタゴニストを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物におけるウイルス感染症に関連した症状を治療するための方法。
【請求項６】
神経組織をIL-31RAアンタゴニストまたはOSMRbアンタゴニストと混合する段階を含む、炎症性腸疾患に関連した疼痛を治療する方法であって、疼痛炎症が、軽減、制限、予防、最小化、または中和される方法。
【請求項７】
IL-31RaアンタゴニストまたはOSMRBアンタゴニストが、SEQ ID NO：2に示すアミノ酸配列の残基27〜残基164を含むポリペプチドに結合する、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
アンタゴニストが、1つまたは複数の可溶性IL-31Raサブユニットを含む可溶性受容体である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
アンタゴニストが抗体である、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
神経組織が、後根神経節または脊髄組織を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
症状が疼痛またはそう痒である、請求項4〜5記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
炎症プロセスは、神経系を活性化して、炎症性の疼痛および運動機能の混乱を引き起こす。感覚神経が刺激されると、血管拡張および血漿漏出が生じて、知覚刺激、過敏症、および疼痛を引き起こす神経性の炎症および刺激がもたらされる。
【０００２】
神経性炎症は、組織中の侵害受容性かつ熱感受性の終末の活性化によって引き起こされ、かつ、アレルギーを含む自己免疫疾患のような生得的状態によって、ウイルス感染によって、ならびに損傷によって引き起こされ得る。これらの状態に起因する神経性炎症は、圧迫、接触、温度、疼痛、そう痒、くすぐり感、チクチクする痛み、およびしびれ感などの感覚を司る様々な感覚受容器からなる体性感覚系に影響を及ぼし得る。活性化された神経は、サイトカイン分泌を誘導して単球および走化性を活性化することによって、慢性的炎症を永続化させ得る。
【０００３】
神経性炎症において活性なタンパク質は、疾患の診断および治療に対する治療的アプローチの標的として役立ち得る。
【０００４】
疼痛を治療するのに使用される薬物の例は、帯状疱疹後神経痛としての糖尿病性末梢神経障害を治療するのに使用されるNeurontin(ガバペンチン)である。したがって、神経障害性疼痛を治療するためのさらなる薬物療法の必要がある。
【発明の開示】
【０００５】
発明の説明
以下の定義は、本明細書において説明する本発明の理解を容易にするために提供される。
【０００６】
「抗体」または「抗体ペプチド」という用語は、完全な抗体、または特異的結合の際に完全な抗体と競合するその結合断片を意味し、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全なヒト抗体、および二重特異性抗体が含まれる。特定の態様において、結合断片は、組換えDNA技術によって作製される。さらなる態様において、結合断片は、完全な抗体の酵素的切断または化学的切断によって作製される。結合断片には、Fab、Fab'、F(ab').sub.2、Fv、および単鎖抗体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０００７】
「単離された抗体」という用語は、その天然環境の構成要素から、同定および分離され、かつ/または回収された抗体を意味する。その天然環境の混入物構成要素は、抗体の診断的使用および治療的使用を妨げると思われる材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク性溶質または非タンパク性溶質が含まれ得る。態様において、抗体は、(1)ローリー法によって決定した場合に、99重量％超を含めて、抗体の95重量％を上回るまで、(2)スピニングカップ配列決定装置の使用によってN末端もしくは内部のアミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度まで、または、(3)クーマシーブルー染色、もしくは好ましくは銀染色を用いる、還元条件もしくは非還元条件下でのSDS-PAGEによって均質になるまで、精製される。単離された抗体には、組換え細胞内部のインサイチューの抗体が含まれ、これは、抗体の天然環境の少なくとも1種の構成要素が存在しないと考えられるためである。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも1つの精製段階によって調製される。
【０００８】
「変種」抗IL-31抗体とは、本明細書において、親抗体配列中の1つまたは複数のアミノ酸残基の付加、欠失、および/または置換によって、「親」抗IL-31抗体アミノ酸配列とアミノ酸配列が異なる分子を意味する。ある態様において、変種は、親抗体の1つまたは複数の超可変領域中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。例えば、変種は、親抗体の1つまたは複数の超可変領域中に、少なくとも1個、例えば、約1個〜約10個、および約2個〜約5個の置換を含んでよい。通常、変種は、親抗体の重鎖可変ドメイン配列または軽鎖可変ドメイン配列とのアミノ酸配列同一性が少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、および最も好ましくは少なくとも95％であるアミノ酸配列を有する。この配列に関する同一性または相同性は、本明細書において、配列をアラインし、必要な場合にはギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを実現した後の、親抗体残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。抗体配列に対するN末端、C末端、または内部の伸長、欠失、または挿入のいずれも、配列の同一性または相同性に影響を及ぼすものとして解釈されない。変種は、ヒトIL-31に結合する能力を保持し、かつ、好ましくは、親抗体の特性より優れた特性を有する。例えば、変種は、より強力な結合親和力を有し、IL-31によって誘導される免疫細胞の刺激を阻害する能力が増強されている場合がある。抗IL-31抗体の形態が、本明細書において開示する生物活性アッセイ法におけるその活性に影響を与えることが見出されているため、このような特性を解析するには、例えば、Fab型の変種をFab型の親抗体と比較するか、または、完全長型の変種を完全長型の親抗体と比較するべきである。本明細書において特に対象となる変種抗体は、親抗体と比べた場合に、生物活性の少なくとも約10倍、好ましくは少なくとも約20倍、および最も好ましくは少なくとも約50倍の増大を示すものである。
【０００９】
本明細書において使用される「親抗体」という用語は、変種の調製のために使用されるアミノ酸配列にコードされている抗体を意味する。好ましくは、親抗体は、ヒトフレームワーク領域を有し、かつ、存在する場合には、ヒト抗体定常領域を有する。例えば、親抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体でよい。
【００１０】
「アゴニスト」という用語は、別の分子の活性、活性化、または機能を増大させる、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、大分子、または小分子(10kD未満)を含む、任意の化合物を意味する。IL-31アゴニストは、例えば、NK細胞、T細胞サブセット、およびB細胞サブセット、ならびに樹状細胞の刺激を引き起こす。
【００１１】
「アンタゴニスト」という用語は、別の分子の活性、活性化、または機能を低減させる、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、大分子、または小分子(10kD未満)を含む、任意の化合物を意味する。IL-31RaアンタゴニストおよびOSMRbアンタゴニストは、NK細胞、T細胞サブセット、およびB細胞サブセット、ならびに樹状細胞の免疫機能の低下を引き起こし、かつ、IL-31に結合し、その結果、IL-31タンパク質の相互作用が妨害、阻害、減少、拮抗、または中和される。
【００１２】
「多重特異性」抗体または「多機能性」抗体以外の「二価抗体」は、特定の態様において、同一の抗原特異性を有する結合部位を含むと理解される。
【００１３】
「二重特異性」抗体または「二機能性」抗体は、2種の異なる重鎖/軽鎖ペアおよび2種の異なる結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、限定されるわけではないが、ハイブリドーマの融合またはFab'断片の連結を含む様々な方法によって、作製され得る。例えば、SongsivilaiおよびLachmann, Clin. Exp. Immunol. 79：315-321：(1990)、Kostelny et al., J. Immunol. 148：1547-1553 (1992)を参照されたい。
【００１４】
「キメラ抗体(chimeric antibody)」または「キメラ抗体(chimeric antibodies)」という用語は、その軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子が、典型的には遺伝子工学によって、異なる種に属する免疫グロブリン可変領域遺伝子および定常領域遺伝子から構築されている抗体を意味する。例えば、マウスモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変セグメントが、γ1およびγ3などのヒト定常セグメントに連結され得る。したがって、典型的な治療用キメラ抗体は、マウス抗体由来の可変ドメインまたは抗原結合ドメインおよびヒト抗体由来の定常ドメインから構成されるハイブリッドタンパク質であるが、他の哺乳動物種を使用してもよい。
【００１５】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープの決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、かつ、通常、特定の三次元構造特徴、ならびに特定の電荷特性を有する。より具体的には、本明細書において使用される「IL-31Raエピトープ」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、および最も好ましくはマウスまたはヒトにおいて抗原活性または免疫原活性を有するIL-31Raポリペプチドの一部分を意味する。免疫原活性を有するエピトープは、動物における抗体応答を誘発する、IL-31Raポリペプチドの一部分である。抗原活性を有するエピトープは、当技術分野において周知である任意の方法によって、例えばイムノアッセイ法によって決定されるように、抗体が免疫特異的に結合する、IL-31Raポリペプチドの一部分である。抗原エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。
【００１６】
「エピトープタグ付き」という用語は、本明細書において使用される場合、「エピトープタグ」に融合された抗IL-31Ra抗体を意味する。エピトープタグポリペプチドは、それに対して抗体が産生され得るエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、IL-31Ra抗体の活性を妨げない程度に短い。エピトープタグは、好ましくは、十分に独特であり、したがって、抗体は他のエピトープと実質的に交差反応しない。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも6個のアミノ酸残基を有し、かつ、通常、約8個〜50個の間のアミノ酸残基(好ましくは約9個〜30個の間の残基)を有する。例には、flu HAタグポリペプチドおよびその抗体12CA5(Field et al. Mol. Cell. Biol. 8：2159-2165(1988));c-mycタグならびにそれに対する8F9抗体、3C7抗体、6E10抗体、G4抗体、B7抗体、および9E10抗体(Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5(12)：3610-3616(1985));ならびに単純ヘルペス(Herpes Simplex)ウイルス糖タンパク質D(gD)タグおよびその抗体(Paborsky et al., Protein Engineering 3(6)：547-553(1990))が含まれる。特定の態様において、エピトープタグは、「サルベージ(salvage)受容体結合エピトープ」である。本明細書において使用される場合、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、IgG分子のインビボでの血清半減期の延長に関与している、IgG分子(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4)のFc領域のエピトープを意味する。
【００１７】
本明細書において使用される「断片」という用語は、IL-31RaポリペプチドまたはIL-31Raポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体のアミノ酸配列の少なくとも5個の連続したアミノ酸残基、少なくとも10個の連続したアミノ酸残基、少なくとも15個の連続したアミノ酸残基、少なくとも20個の連続したアミノ酸残基、少なくとも25個の連続したアミノ酸残基、少なくとも40個の連続したアミノ酸残基、少なくとも50個の連続したアミノ酸残基、少なくとも60個の連続したアミノ酸残基、少なくとも70個の連続したアミノ酸残基、少なくとも80個の連続したアミノ酸残基、少なくとも90個の連続したアミノ酸残基、少なくとも100個の連続したアミノ酸残基、少なくとも125の連続したアミノ酸残基、少なくとも150個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを意味する。
【００１８】
本明細書において使用される場合、「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされている1つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。1つの型の免疫グロブリンは、抗体の基本構造単位を構成する。この型はテトラマーであり、免疫グロブリン鎖の2つの同一なペアからなり、各ペアは1つの軽鎖および1つの重鎖を有する。各ペアにおいて、軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原への結合を一緒に担っており、かつ、定常領域は、抗体エフェクター機能を担っている。
【００１９】
完全長免疫グロブリンの「軽鎖」は、NH2末端を可変領域遺伝子にコードされ、かつ、COOH末端をκまたはλ定常領域遺伝子にコードされている。完全長免疫グロブリンの「重鎖」は、同様に、可変領域遺伝子および前述の他の定常領域遺伝子のうち1つ(約330アミノ酸)にコードされている。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεに分類され、それぞれ、抗体のアイソタイプをIgG(IgG1、IgG4を含む)、IgM、IgA、IgD、およびIgEと定義する。軽鎖および重鎖内部で、可変領域および定常領域は、約12個またはそれ以上のアミノ酸からなる「J」領域によって連結されており、重鎖は、約10個多いアミノ酸からなる「D」領域も含む。(一般には、Fundamental Immunology(Paul, W.編、第2版、Raven Press, N.Y., 1989)、第7章(その全体が参照により組み入れられる)を参照されたい。
【００２０】
免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変領域は、3つの超可変領域が割り込んだ「フレームワーク」領域からなる。したがって、「超可変領域」という用語は、抗原結合を担っている、抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」に由来するアミノ酸残基を含む(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)ならびにChothiaおよびLesk, 1987, J.Mol.Biol. 196：901-917を参照されたい(いずれの文献も、参照により本明細書に組み入れられる)。「フレームワーク領域」または「FR」残基は、本明細書において定義する超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内では比較的保存されている。したがって、「ヒトフレームワーク領域」は、天然のヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域に実質的に(約85％またはそれ以上、通常90％〜95％またはそれ以上)同一であるフレームワーク領域である。構成要素である軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である、抗体のフレームワーク領域は、CDRを配置し、かつ整列させるのに役立つ。CDRは、主として、抗原のエピトープへの結合を担っている。
【００２１】
したがって、「ヒト化」免疫グロブリンという用語は、ヒトフレームワーク領域および非ヒト(通常、マウスまたはラット)免疫グロブリン由来の1つまたは複数のCDRを含む免疫グロブリンを意味する。CDRを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。定常領域は存在する必要がないが、存在する場合には、それらは、ヒト免疫グロブリン定常領域に実質的に同一、すなわち、少なくとも約85％〜90％、好ましくは約95％またはそれ以上同一でなければならない。したがって、ヒト化免疫グロブリンの部分はすべて、おそらくはCDRを除いて、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分に実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖免疫グロブリンおよびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。例えば、ヒト化抗体は、例えば、キメラ抗体の可変領域全体が非ヒトであるため、上記に定義した典型的なキメラ抗体を包含しないと思われる。
【００２２】
本明細書において使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、かつ、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または、例えば、米国特許第5,939,598号においてKucherlapatiらによって説明されているように、1種または複数種のヒト免疫グロブリンに関してトランスジェニックであり、かつ、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。
【００２３】
「遺伝的に改変された抗体」という用語は、アミノ酸配列がネイティブな抗体の配列から変更されている抗体を意味する。抗体を作製する際に組換えDNA技術が関連するため、天然抗体中に存在するアミノ酸の配列に限定される必要はない。所望の特徴を得るように抗体を再設計することができる。可能な変異は多数あり、かつ、ただ1つのアミノ酸または少数のアミノ酸の変更から、例えば、可変領域または定常領域の完全な再設計まで及ぶ。定常領域中の変更は、一般に、補体結合、膜との相互作用、および他のエフェクター機能などの特徴を改善または改変するために行われる。可変領域中の変更は、抗原結合特性を改善するために行われる。
【００２４】
抗体の他に、免疫グロブリンは、例えば、単鎖またはFv、Fab、および(Fab')2、ならびにダイアボディ、直鎖状抗体、多価性または多重特異性のハイブリッド抗体(前記およびLanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17. 105(1987)に詳細に説明されている)を含む、様々な他の形態で、かつ、単鎖で(例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85 5879-5883(1988)およびBird et al., Science, 242：423-426(1988))、存在し得る。(一般に、参照により本明細書に組み入れられる、Hood et al., 「Immunology」、Benjamin, N.Y.,第2版(1984)ならびにHunkapillerおよびHood, Nature, 323：15-16(1986)を参照されたい)。
【００２５】
本明細書において使用される場合、「単鎖Fv」、「単鎖抗体」、「Fv」、または「scFv」という用語は、単一のポリペプチド鎖内に、重鎖および軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠いている抗体断片を意味する。一般に、単鎖抗体は、抗原結合を可能にすると思われる所望の構造を形成するのを可能にする、VHドメインとVLドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。単鎖抗体は、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、113巻、RosenburgおよびMoore編、Springer-Verlag, New York、269〜315頁(1994)においてPluckthunによって詳細に考察されている。同様に、開示内容が任意の目的のために参照により組み入れられる、国際特許出願公開WO 88/01649ならびに米国特許第4,946,778号および同第5,260,203号を参照されたい。特定の態様において、単鎖抗体はまた、二重特異性でよく、かつ/またはヒト化されていてよい。
【００２６】
「Fab断片」は、1本の軽鎖、ならびに1本の重鎖のCH1領域および可変領域から構成される。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とのジスルフィド結合を形成できない。
【００２７】
「Fab'断片」は、1本の軽鎖、ならびに、鎖間のジスルフィド結合が2つの重鎖間で形成されて、F(ab')2分子を形成できるように、CH1ドメインおよびCH2ドメイン間の定常領域のより多くの部分を含む1本の重鎖を含む。
【００２８】
「F(ab')2断片」は、2本の軽鎖、ならびに、鎖間のジスルフィド結合が2つの重鎖間で形成されるようにCH1ドメインおよびCH2ドメイン間の定常領域の一部分を含む2本の重鎖を含む。
【００２９】
「ダイアボディ」という用語は、2つの抗原結合部位を有する小型の抗体断片を意味し、この断片は、同じポリペプチド鎖(VH-VL)中に軽鎖可変ドメイン(VL)に連結された重鎖可変ドメイン(VH)を含む。同じ鎖上の2つのドメイン間でのペア形成を起こさせないくらい短いリンカーを用いることによって、これらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインとペアになり、かつ、2つの抗原結合部位を作り出すことを余儀なくされる。ダイアボディは、例えば、EP404,097、WO93/11161、およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6444-6448(1993)において、より十分に説明されている。
【００３０】
「直鎖状抗体」という用語は、Zapata et al. Protein Eng. 8(10)：1057-1062(1995)において説明されている抗体を意味する。手短に言えば、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成する、一対の直列型Fdセグメント(VH-CH1-VH-CH1)を含む。直鎖状抗体は、二重特異性または単特異性でよい。
【００３１】
本明細書において使用される「免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片」という用語は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変ドメインを少なくとも含むポリペプチド断片を意味する。本発明の免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片は、リガンドに結合すること、受容体へのリガンドの結合を妨げること、受容体へのリガンド結合に起因する生物学的応答を妨害すること、またはそれらの任意の組合せを行うことができる。
【００３２】
「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核生物クローン、原核生物クローン、またはファージクローンを含む、単一のクローンに由来する抗体を意味し、それを作製する方法を意味しない。
【００３３】
本発明は、IL-31に結合するヘテロ二量体受容体のサブユニット、例えばIL-31RaおよびOSMRbが、後根神経節細胞のような神経細胞上で発現されるという発見に部分的に基づいている。したがって、本発明は、アンタゴニストとしてのIL-31RaおよびOSMRbの使用を包含し、これらは、IL-31に結合し、その結果、シグナル伝達を阻害することによって、疼痛および炎症、ならびに炎症性腸疾患、クローン病、そう痒症、および神経性の疼痛および過敏化の症状を抑制する。本発明はまた、後根神経節細胞の刺激を介した過敏化を改善する際のIL-31アゴニストの使用を包含する。
【００３４】
IL-31は、公開されている米国特許出願においてZcyto17rligとして以前に説明されているサイトカインに対するHUGO名称である(参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第20030224487号、2003年1月21日に出願された米国特許出願第10/352,554号、現在では米国特許第7,064,186号として交付されている；Sprecher, Cindy et al., 2003を参照されたい)。IL-31に対するヘテロ二量体受容体は、IL-31RaおよびオンコスタチンM受容体β(OSMRb)の間で形成されるヘテロ二量体を含む。IL-31Raは、参照により本明細書に組み入れられる、2003年1月21日に出願された本願の権利者が所有する米国特許出願公開第20030215838号、米国特許出願第10/351,157号においてzcytor17と呼ばれるタンパク質に対するHUGO名称である。ヒトIL-31のポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、それぞれ、SEQ ID NO：1およびSEQ ID NO：2に示される。マウスIL-31のポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、それぞれ、SEQ ID NO：3およびSEQ ID NO：4に示される。本明細書において使用される場合、IL-31という用語は、上記に示したように、米国特許出願公開第20030224487号において使用されるzcytor17ligを意味するものとする。IL-31Raは、参照により本明細書に組み入れられる、2001年6月26日に出願された、本願の権利者が所有する米国特許出願第09/892,949号において以前に説明されている。
【００３５】
OSMR受容体およびIL-31RA受容体のアミノ酸配列により、コードされた受容体が、限定されるわけではないが、IL-2、IL-4、IL-7、Lif、IL-12、IL-15、EPO、TPO、GM-CSF、およびG-CSFに対する受容体を含むクラスIサイトカイン受容体サブファミリーに属することが示された(総説については、Cosman、「The Hematopoietin Receptor Superfamily」、Cytokine 5(2)： 95-106, 1993を参照されたい)。zcytor17受容体は、本願の権利者が所有するPCT特許出願US01/20484(WIPO公開番号WO 02/00721、参照により本明細書に組み入れられる)において十分に説明されている。
【００３６】
本発明は、抗IL-31活性を有するアンタゴニスト、抗体、結合タンパク質、変種、および断片を含む、抗IL-31Ra分子および抗OSMRb分子の使用を含む。本発明は、抗IL-31Ra分子および/または抗OSMRb分子を対象に投与することを含み、かつ、ヒトへの治療的使用および動物への治療的使用の両方を企図する。例示的な動物対象には、家畜動物および飼育動物などの哺乳動物対象が含まれる。
【００３７】
IL-31RAの「長い」型のネイティブなポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、それぞれ、SEQ ID NO：5およびSEQ ID NO：6に示される。IL-31RAの「短い」型のネイティブなポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、それぞれ、SEQ ID NO：7およびSEQ ID NO：8に示される。IL-31RAポリペプチドのその他の切断型が、天然に発現されるようである。どちらの型も可溶性IL-31RA受容体をコードする。「長い」可溶性IL-31RAのポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、それぞれ、SEQ ID NO：9およびSEQ ID NO：10に示される。「短い」可溶性IL-31RAのポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、それぞれ、SEQ ID NO：11およびSEQ ID NO：12に示される。マウスIL-31RAのネイティブなポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、それぞれ、SEQ ID NO：13およびSEQ ID NO：14に示される。ヒトOSMRβのネイティブなポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、それぞれ、SEQ ID NO：15およびSEQ ID NO：16に示される。いずれも参照により組み入れられるPCT出願WO 02/00721およびWO 04/003140を参照されたい。したがって、神経性の炎症および刺激のアンタゴニストの例には、IL-31に結合する可溶性IL-31Raサブユニット、ホモ二量体のようなIL-31Raサブユニットの可溶性多量体、ならびにIL-31に結合するIL-31RaおよびOSMRbの可溶性ヘテロ二量体が含まれる。IL-31RaおよびOSMRbの可溶性ヘテロ二量体の構築に関しては、実施例9を参照されたい。他の可溶性ヘテロ二量体構築物およびタンパク質を作製することができ、本明細書において説明する。
【００３８】
IL-31RaアンタゴニストおよびOSMRbアンタゴニストには、可溶性受容体、その変種、断片、もしくは誘導体を含む、IL-31に結合する分子、または、IL-31がその同族受容体に結合する際に有する効果を阻害、制限、減少、最小化、妨害、または中和する、IL-31Raおよび/もしくはOSMRbに対する抗体が含まれる。
【００３９】
インサイチューの発現解析により、IL-31RAおよびOSMRβがヒトの脊髄細胞および後根神経節細胞において発現されることが明らかになった。実施例1を参照されたい。したがって、IL-31分子、それらのアゴニスト、またはアンタゴニストは、神経細胞の維持ならびに神経性の炎症および刺激においてある役割を果たす。このことから、IL-31RaおよびOSMRbのアゴニスト、アンタゴニストが、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、末梢神経障害、および多発性硬化症を含む脱髄性疾患など様々な神経変性疾患を治療するのに使用され得ることが示唆される。IL-31RAおよびOSMRbの組織特異性から、IL-31が、脊髄および脳中の成長因子および/または維持因子であり得、これを用いて、脊髄、脳、または末梢神経系の損傷を治療できることが示唆される。
【００４０】
IL-31が疼痛を刺激する能力を測定する方法は、当業者に公知である。例えば、後根神経節細胞を単離および培養することができる。Voilley, N. et al., J. Neurosci., 27(20)：8026-8033, 2001を参照されたい。例えば、後根神経節細胞は、0.1％コラゲナーゼで分離し、かつ、コラーゲンでコーティングしたP35ディッシュ中の5％ウシ胎児血清を加えたDMEM中に播種することによって、ウィスター系の成体雄ラット(5週〜7週)および新生ラットから調製される。後根神経節細胞を単離する同様の方法が、Steinhoff, M. et al. (Steinhoff, M. et al., Nature Medicine, 6(2)：151-157, 2000を参照されたい)によって説明されている。手短に言えば、後根神経節細胞が冷ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で細かく切り刻まれ、かつ、0.05mg/mlトリプシン、1mg/mlコラゲナーゼ、および0.01mg/ml DNアーゼIを含むDMEM中、37℃で45分〜60分間、インキュベートされる。トリプシンを中和するためにSBTIが添加され、かつ、懸濁液が約1,000gで1分間、遠心分離される。沈殿物中の神経細胞が、10％ウシ胎児血清、5ng/ml神経成長因子、2mMグルタミン、1mg/mlペニシリン/ストレプトマイシンおよびDNアーゼIを含むDMEM中に懸濁され、かつ、Matrigelでコーティングしたカバーガラス上に播種される。神経細胞は、使用前に、3日〜5日間培養される。形質膜でのIL-31Ra発現が、抗体を用いた免疫蛍光法によって確認される。
【００４１】
後根神経節のIL-31刺激に対するIL-31Raおよび/またはOSMRbのアンタゴニストの効果を測定するために、Steinhoffら(前記)によって説明されているように、培養した神経細胞中の細胞内カルシウムイオン濃度が測定される。神経細胞は、ハンクス平衡塩類溶液(5uM Fura-2/AM (Molecular Probes, Eugene, Oregon)を含む20mM HEPES、pH7.4)中、37℃で1時間、インキュベートされる。カバーガラスは洗浄され、Zeiss 100 TV倒立顕微鏡上のチャンバー(容積1ml)中に載せられ、Zeiss×40Fluar対物レンズを用いて観察される。340nmおよび380nmの蛍光が測定されて、カルシウムの測定が可能になる。他の増感剤と共に、またはそれら無しで、細胞がIL-31に曝露され、かつ、IL-31RAアンタゴニストおよび/またはOSMRbアンタゴニストの存在下での阻害が測定される。
【００４２】
疼痛に対する、後根神経節、または一般の神経細胞上のヘテロ二量体同族受容体へのIL-31結合に対する、IL-31RAアンタゴニストおよび/またはOSMRbアンタゴニストの能力を測定するために、例えば、限定されるわけではないが、プロスタグランジン、サブスタンスP、CGRP、ガラニン、神経ペプチドY、ヒスタミン、ブラジキニン、カンナビノイド、およびアラキノイド(arachinoid)酸経路のメディエーターなど、疼痛のいくつかのメディエーターが測定され得る。
【００４３】
神経細胞でのIL-31の疼痛誘導作用に対するIL-31RaおよびOSMRbに対するアンタゴニストの能力を測定する上記のインビトロの方法に加えて、いくつかのインビボモデルもまた有用である。例えば、Honore, P. et al., Neuroscience. 98(3)：585-598. 2000を参照されたい。この論文は、炎症性疼痛、神経障害性疼痛、および癌疼痛のいくつかのモデルを記述している。例えば、アンタゴニスト分子存在下およびアンタゴニスト分子不在下で、マウスの後肢の足底表面にIL-31を皮下注射するような1つのモデルでは、IL-31Raに対するアンタゴニストの効果を測定する。注射後3日目にマウスは安楽死させられ、末梢性浮腫が測定される。IL-31Raアンタゴニスト分子またはOSMRbアンタゴニスト分子が浮腫を抑制、制限、最小化、減少、予防、または無くす効果が測定される。その他のインビボモデルは、脊髄神経結紮、座骨神経処置、肉腫誘発骨癌、行動解析、およびモルフィネ作用である。
【００４４】
別の疼痛モデルマウスは、機械的異痛症である。例えば、Sweitzer, S. M. et al., J. Neuroimm., 125：82-93, 2002を参照されたい。手短に言えば、ラットまたはマウスが、2gおよび/または12gのフォンフレイ(von Frey)式フィラメントを用いて、機械的異痛症に関して試験される。最初に、動物は処置に順化させられ、かつ、ベースラインの測定値が計測される。様々な量のIL-31が投与される。異痛症は、IL-31投与に応答して、通常は無害な刺激に対して足を激しく引っ込めることと特徴付けられる。IL-31Raアンタゴニスト分子および/またはOSMRbアンタゴニスト分子を投与した場合と投与しない場合が比較される。
【００４５】
炎症誘発性神経ペプチドであるサブスタンスP(SP)は後根神経節で作られ、次いで、侵害受容性神経AおよびCによって末梢に輸送される(15)。SPは、肥満細胞顆粒からヒスタミンを放出することによって、そう痒を誘発し得る。皮膚において、SPはまた、ヒスタミン、IL-1、プロスタグランジン、およびリソソーム酵素を放出して、紅斑、浮腫、および神経性炎症を引き起こし得るが、真皮中で急速に分解される(16)。抗ヒスタミン薬を事前に経口投与することにより、SPによって引き起こされるそう痒症が抑制される。トウガラシから得られたカプサイシンを局部に塗布すると、皮膚神経からSPが激減し、したがって、そう痒が減少する。IL-31に対する受容体サブユニットは、後根神経節細胞において発現されるため、IL-31Raアンタゴニスト分子および/またはOSMRbアンタゴニスト分子の投与により、これらの細胞の刺激を減少させることができ、かつ、IL-31投与によって誘導され得るサブスタンスPを減少させることができる。
【００４６】
後根神経節細胞上のIL-31受容体、すなわちIL-31RAおよびOSMRβへのIL-31の結合は、圧迫、接触、温度、疼痛、そう痒、くすぐり感、チクチクする痛み、およびしびれ感などの感覚を司る様々な感覚受容器からなる体性感覚系を刺激し得る。IL-31の同族受容体への結合は、神経性の炎症および刺激をもたらし得、これは、神経性刺激を誘導する付加的な因子の放出を招き得る。疼痛を媒介する因子の1つのグループは、局所的炎症の一因にもなるプロスタグランジンである。したがって、IL-31アンタゴニストは、筋肉痛、頭痛、急性損傷に起因する関節痛など、NSAIDで一般に治療される急性の炎症性疼痛、または変形性関節が原因で生じるもののような慢性疼痛において利点を有する場合がある。このような神経性刺激は、例えば、アレルギーのような自己免疫反応、水痘のようなウイルス感染症、および熱傷または外傷などの損傷が原因で生じる炎症の結果であり得る。したがって、同族受容体へのIL-31リガンドの結合によって誘導されるシグナル伝達の邪魔をするアンタゴニストは、神経性炎症および体性感覚系の刺激を軽減、制限、妨害、または最小化する際に有用であり得る。したがって、後根神経節細胞中におけるIL-31に誘導されるシグナル伝達のアンタゴニストは、自己免疫疾患、ウイルス感染症、および外傷に関連した疼痛、そう痒、チクチク感を治療するのに使用され得る。さらに、神経性炎症は、最初の傷害後に神経の過敏症をもたらし得るため、IL-31Raおよび/またはOSMRbのアンタゴニストは、症状の有効な治療法であり得る。例えば、一部の帯状疱疹患者は、ウイルス感染が消失されるか、または最小限に抑えられたかなり後に、疼痛および/またはそう痒の感覚性症状を経験する。急性帯状ヘルペスに関連した神経痛、およびヘルペス後神経痛は、ウイルス抗原がT細胞および他の炎症細胞を誘引する、後根神経節および三叉神経節の炎症が原因である可能性が高い。長期にわたる疼痛は、強い抗ウイルス応答後の皮膚分節の持続的な炎症の結果として生じ得る。その結果として、ウイルス感染症のレベルまたは病期は、対象の感覚性知覚を表さないことがある。したがって、IL-31に誘導されるシグナル伝達に拮抗することの有益な効果は、ウイルス感染症または外傷の目下の状態より後まで及び得る。
【００４７】
神経障害および感覚欠損は疼痛および感受性の低下を伴い、かつ、例えば、アトピー、糖尿病、多発性硬化症、および高血圧などの疾患に関連し得る。IL-31RAおよびOSBRβは、脊髄および後根神経節細胞において発現されるタンパク質であるため、IL-31Raおよび/またはOSMRbのアンタゴニストは、疼痛および感覚欠損を治療するのに有用な場合がある。例えば、IL-31Raアンタゴニストおよび/またはOSMRbアンタゴニストを、局所的に、皮下に、中枢に、または全身に送達して、糖尿病性末梢神経障害、ヘルペス後末梢神経障害、ならびに、熱傷患者の症状としての疼痛を含む一般の疼痛を治療することができる。
【００４８】
熱傷損傷は、創傷包帯が交換される際に強まる、激しく、かつ長期の疼痛を引き起こす。感染症を予防し、かつ治癒を促進するためには、頻繁な包帯交換が必要である。創傷治療の間に患者が経験する疼痛の量は、依然として、熱傷犠牲者ならびにいくつかの他の患者集団に関する世界的な問題である。患者の安静時に、熱傷に関連した疼痛をオピオイドで治療することができるが、これは、いくつかの望まれない作用を有する。しかしながら、毎日の帯具交換、創傷洗浄、ステープル除去などの創傷治療の間、オピオイドは十分ではなく、熱傷患者の大多数は、創傷治癒の間に重度〜耐え難い疼痛を報告する。
【００４９】
IL-31に対するヘテロ二量体の両方のメンバー、すなわちIL-31RAおよびOSMRβは、後根神経節細胞において発現されるため、中和抗体のようなIL-31Raおよび/またはOSMRbに対するアンタゴニストは、熱傷または神経障害に関連した疼痛を含む疼痛を予防、最小化、制限、および/または治療するのに有用である。熱傷を模倣したインビボモデルは、当業者に周知である。
【００５０】
持続性の疼痛は過形成を引き起こし得、その結果、元の刺激より少ない刺激が、異痛症とも呼ばれる増大した疼痛を引き起こし得る。IL-31RAサブユニットおよびOSMRβサブユニットの両方が後根神経節細胞において発現されるため、これらのサブユニットを有する神経細胞においてIL-31Raおよび/またはOSMRbに対するアンタゴニストによって誘導されるシグナル伝達は、異痛症の症状を軽減するのに寄与し得る。
【００５１】
IL-31Raおよび/またはOSMRb、ならびにそのアゴニスト、断片、変種、および/またはキメラなど本発明のポリペプチドもまた、哺乳動物の過敏化を高めるのに使用され得る。例えば、アゴニストを含む本発明のIL-31ポリペプチドは、局部的もしくは局所的に、全身に、または中枢に送達され、かつ、当業者に公知であるか、かつ/または本明細書において説明する任意のモデルまたは実験において測定された場合、過敏化(疼痛、熱、または機械的)を高めるのに使用され得る。また、本発明のポリペプチドは、脊髄細胞および神経細胞の感受性を高めて、神経伝達物質に対する生き残っている神経細胞の機能を改善するために投与することができ、したがって、パーキンソン病またはアルツハイマー病、ならびに麻痺において有効な場合がある。
【００５２】
同様に、患者の疼痛に対する過敏化が高まっている場合、IL-31Raおよび/またはOSMRbに対するアンタゴニストを用いて、神経障害を有する患者の疼痛感覚を減少させることができる。例えば、糖尿病性神経障害およびヘルペス後神経障害を有する患者は、慢性の増大した疼痛を有し、IL-31Raおよび/またはOSMRbに対するアンタゴニストは、この疼痛を制限、予防、または減少させるのに有用な場合がある。
【００５３】
炎症誘発性のタンパク質に対する受容体として、脊髄および後根神経節中のIL-31RAおよびOSMRβの存在により、IL-31Raおよび/またはOSMRbのアンタゴニストが、これらの組織の炎症を軽減するのに使用され得ることが示唆される。したがって、髄膜炎のような状態は、抗体を含むアンタゴニストの投与から利益を受け得る。
【００５４】
神経性の炎症および刺激を伴い、かつ、後根神経節細胞を含む神経組織においてIL-31に誘導される疼痛に拮抗することから利益を受け得る疾患には、以下のものが含まれる：慢性疼痛、片頭痛、関節炎、変形性関節症、関節リウマチ、多発ニューロパシー、糖尿病性末梢神経障害、神経切断後の疼痛(例えば、手術後の疼痛)、神経性の疼痛をもたらす構成要素を含む炎症性状態、例えば、炎症性腸疾患、腎炎、ある種の転移性癌、および血管炎症。これらの疾患はまた、IL-31によって誘導されるシグナル伝達のアンタゴニストによって治療され得る。さらに、放射線刺激および熱傷、化学熱傷、多重化学物質過敏症、汗疹、鼻炎、熱による熱傷、日焼け、皮膚の発赤、および化学的に誘発された病変を含む皮膚状態、ならびに、化学物質曝露が原因で生じる急性の喘息発作および肺炎症などの急性アレルギー反応、ならびにじんま疹、ならびに、結膜炎および歯肉疾患が、IL-31Raアンタゴニストおよび/またはOSMRbアンタゴニストで治療され得る。さらに、肩甲腓骨症候群は、肩帯および腓骨筋の分布における衰弱を特徴とする、不均一な神経筋障害である。神経性の肩甲腓骨症候群(肩甲腓骨型脊髄性筋萎縮症、SPSMA)および筋障害性の肩甲腓骨症候群(肩甲腓骨型筋ジストロフィー、SPMD)の両方が説明されている。SPMDの染色体上の遺伝子座が、染色体12qに最近割り当てられ、これは、IL-31と同じ遺伝子座である。したがって、IL-31Raアンタゴニストおよび/またはOSMRbアンタゴニストを用いて、これらの疾患を治療することができる。
【００５５】
米国では、約500,000名の人々が、小腸および大腸のいずれかまたは両方を含み得る炎症性腸疾患に罹患している。潰瘍性大腸炎およびクローン病は、炎症性腸疾患の最もよく知られた形態であり、両方とも、病因が不明であるため、「特発性」 炎症性腸疾患に分類されている。
【００５６】
クローン病は、胃腸管の任意の部分を含み得るが、最も頻繁には、遠位の小腸および結腸を含む。炎症は、リンパ濾胞を覆う小規模の潰瘍から、貫壁性の瘢痕化および慢性炎症につながる亀裂の入った深い潰瘍までの何らかをもたらし得る。病因は不明であるが、感染メカニズムおよび免疫学的メカニズムは提唱されている。症状は多様であり、下痢、発熱、および疼痛、ならびに、関節炎、ブドウ膜炎、結節性紅斑、および強直性脊椎炎の腸外の症状発現が含まれ得る。
【００５７】
炎症性腸疾患を治療するための伝統的なアプローチは、アザチオプリンを用いた免疫抑制である(例えば、Rutgeerts, J. Gastroenterol. Hepatol. 17(補遺)：S 176-85 (2002)を参照されたい)。さらに最近では、キメラの抗腫瘍壊死因子モノクローナル抗体であるインフリキシマブは、病因に関係した特定の疾患メカニズムを標的とするのに使用されており、かつ、疾患プロセスの徹底的な抑制および長期に渡る腸の治癒を可能にする。しかしながら、この治療法は、免疫原性の問題を伴う。インフリキシマブに対する抗体の形成は、有効性を妨げ、かつ、注入反応に関連している。
【００５８】
過敏性腸症候群(IBS)は、慢性の機能性胃腸障害である。これは、通常は腸習慣の変化に関連する腹痛および鼓脹を含む様々な腸症状を特徴とする、不均一な状態である(Collins et al, 2001)。米国人口の12％〜20％の間の人々がこの状態に罹患していると概算されている。Manning基準(Manning et al, 1978)、Rome基準(Thompson et al, 1992)、および最も最近のRome II(Thompson et al., 1999)を含む様々な基準が、IBSを定義するために提唱されている。IBSに関する研究報告では、しばしば、IBS患者を、便秘型(CON)および下痢型(DIA)の2つのサブタイプに分類し、時には、第3のサブタイプの交代型(ALT)を含む。
【００５９】
抗IL-31Ra分子および/または抗OSMRb分子、アンタゴニスト、抗体、結合タンパク質、変種、ならびに断片は、炎症性腸疾患(IBD)および過敏性腸症候群(IBS)に関連した疼痛を治療および検出する際に有用である。
【００６０】
炎症性腸疾患(IBD)は、結腸および/もしくは直腸(潰瘍性大腸炎)、または小腸および大腸(クローン病)に影響を及ぼし得る。これらの疾患の病因は不明瞭であるが、これらは、罹患組織の慢性的な炎症を伴う。潜在的な治療物質には、抗IL-31Ra抗体および/または抗OSMRb抗体、他の結合タンパク質、変種、断片、キメラ、ならびに他のIL-31Raアンタゴニストおよび/またはOSMRbアンタゴニストを含む、抗IL-31Ra分子および/または抗OSMRb分子が含まれる。これらの分子は、IBDおよび関連疾患における炎症および病理学的作用を減少させるための有益な治療物質として役立ち得る。
【００６１】
潰瘍性大腸炎(UC)は、結腸の粘膜または最内側の内層の炎症および潰瘍を特徴とする、一般に結腸と呼ばれる大腸の炎症性疾患である。この炎症は、結腸を空にし、しばしば、下痢をもたらす。症状には、大便のゆるみ、ならびに付随する腹部の有痛性痙攣、発熱、および体重減少が含まれる。UCの正確な原因は不明であるが、最近の調査により、身体の天然防御が、身体が異物と考える身体中のタンパク質に対抗して作動していることが示唆されている(「自己免疫反応」)。おそらくは、それらが腸中の細菌タンパク質に似ているため、これらのタンパク質は、結腸の内層を破壊し始める炎症プロセスを扇動または刺激し得る。結腸内層が破壊されるにつれ、潰瘍が形成して、粘液、膿汁、および血液を放出する。この疾患は、通常、直腸領域で始まり、かつ、最終的に、大腸全体に拡大し得る。炎症エピソードの反復は、瘢痕組織を伴う腸および直腸の壁の肥厚を招く。結腸組織の死滅または敗血症が、重度の疾患と共に発生することがある。潰瘍性大腸炎の症状の重症度は様々であり、それらの発症は、漸進的または急激な場合がある。呼吸器感染症またはストレスを含む多くの因子によって、発病が引き起こされ得る。したがって、本発明の抗IL-31分子は、UCを治療および/または検出するために有用であり得る。
【００６２】
現在、UCの治癒法は利用可能ではないが、治療は、結腸内層における異常な炎症プロセスを抑制することに焦点を合わせている。コルチコステロイド、免疫抑制薬(例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン、およびメトトレキサート)ならびにアミノサリチル酸を含む治療薬が、この疾患を治療するために利用可能である。しかしながら、コルチコステロイドおよびアザチオプリンなどの免疫抑制薬の長期の使用は、骨の希薄化、白内障、感染症、ならびに肝臓および骨髄への影響を含む重大な副作用をもたらし得る。現在の治療法が成功していない患者においては、外科手術が選択肢である。外科手術は、結腸全体および直腸の切除を含む。
【００６３】
慢性の潰瘍性大腸炎をある程度再現し得るいくつかの動物モデルがある。最も広く使用されているモデルは、結腸における慢性的な炎症および潰瘍形成を誘発する、2,4,6-トリニトロベンスルホン酸(trinitrobenesulfonic acid)/エタノール(TNBS)誘発性大腸炎モデルである。TNBSが、感受性の高いマウスの結腸に直腸内点滴注入によって導入された場合、これは、結腸粘膜においてT細胞性免疫応答を誘導して、この場合、大腸壁全体に広がるT細胞およびマクロファージの密な浸潤を特徴とする広範囲の粘膜炎症をもたらす。さらに、この組織病理学的病像は、進行性の体重減少(痩せ)、血性下痢、直腸脱、および大腸壁肥厚という臨床像を伴う(Neurath et al. Intern. Rev. Immunol. 19：51-62, 2000)。
【００６４】
別の大腸炎モデルは、硫酸デキストランナトリウム(DSS)を使用し、これは、血性下痢、体重減少、結腸の短縮化、および好中球浸潤を伴う粘膜潰瘍形成が認められる急性大腸炎を誘発する。DSS誘発性大腸炎は、組織学的に、リンパ様過形成、限局性の陰窩損傷、および上皮潰瘍形成を伴う、固有層中への炎症細胞の浸潤を特徴とする。これらの変化は、上皮に対するDSSの毒性効果に起因し、かつ、固有層細胞の食作用ならびにTNF-αおよびIFN-γの産生によって発生すると考えられている。DSSは、SCIDマウスのようなT細胞欠損動物において観察されるため、T細胞非依存性モデルとみなされている。
【００６５】
これらのTNBSモデルまたはDSSモデルへのIL-31Raおよび/またはOSMRbのアンタゴニストまたは結合相手の投与は、症状の改善を測定し、かつ、胃腸疾患の経過を変更するために使用することができる。IL-31は、大腸炎に関連した炎症応答および疼痛においてある役割を果たしている可能性があり、アンタゴニストの投与によるIL-31活性の中和は、IBDに対する潜在的な治療アプローチである。
【００６６】
過敏性腸症候群は、胃腸科において最も一般的な病態の1つである。それにもかかわらず、IBSの診断および治療は、依然として限られている。IL-31およびIL-31RA1の発現は、クローン病の上方調節と相関関係があるため(実施例5を参照されたい)、抗IL-31Ra抗体および/または抗OSMRb抗体、他の結合タンパク質、変種、断片、キメラ、ならびに他のIL-31Raアンタゴニストおよび/またはOSMRbアンタゴニストを含む、IL-31Raアンタゴニストおよび/またはOSMRbアンタゴニストは、この疾患の症状軽減および治療において有用である。
【００６７】
IBD患者またはIBS患者へのIL-31Raおよび/またはOSMRbのアンタゴニストまたは結合相手の投与は、症状を改善し、かつ、胃腸疾患の経過を変更するために使用することができる。IL-31は、大腸炎における炎症応答においてある役割を果たしている可能性があり、アンタゴニストの投与によるIL-31活性の中和は、IBDおよび/またはIBSに対する潜在的な治療アプローチである。
【００６８】
IBSおよびIBDに関係する障害に関して、機能改善の臨床的徴候には、限定されるわけではないが、疼痛、有痛性痙攣、および感受性の減少、下痢の減少および大便の軟度の改善、腹部膨満の軽減、ならびに腸通過の増大が含まれる。改善は、クローン病活動性指標(CDAI)平均値の減少によって測定することもできる。Best. W. et al., Gasttoenterology 70： 439-44, 1976を参照されたい。さらに、機能改善は、Irvineら(Irvine, E. et al., Gasttoenterology 106： 287-96, 1994)によって記述されているクオリティ・オブ・ライフ評価によって測定することもできる。
【００６９】
過敏性腸症候群の動物モデルは、MayerおよびCollins. Gastroenterol. 122：2032-2048 (2002)によって記述されている。これらのモデルは、CNSを対象とするメカニズムによって主として媒介されるもの(「ストレス記憶」モデル)および腸を対象とする一次的病因によるもの(「疼痛記憶」モデルおよび「免疫記憶」モデル)に分けることができる。1つのモデルにおいて、動物は、外科的に前処理されて、近位結腸および横紋筋上に電極を埋め込まれ、かつ、脳の側脳室にカテーテルを埋め込まれる。直腸から挿入したバルーンを膨張させることによって直腸膨満が実施され、特徴的な内臓運動応答を誘発する圧力が測定される。IL-31Raアンタゴニストおよび/もしくはOSMRbアンタゴニストならびに/または変種もしくはアンタゴニストなどの試験化合物が、膨満に先立って、適切な経路(経口的に、腹腔内に、皮下に、静脈内に、または筋肉内に)を介して、かつ、適切な時間(すなわち、腹腔内または脳室内の場合には、約20分)、投与される。試験化合物は、結腸の運動性、腹部収縮、および内臓疼痛に影響を及ぼす能力に関して評価される。
【００７０】
さらに、腸の炎症に関連した障害は、本明細書において説明するその断片、アゴニスト、およびアンタゴニストなどIL-31Raアンタゴニストおよび/またはOSMRbアンタゴニストを用いて治療され得る。例えば、過敏性腸症候群(IBS)は、非常に広範な症状(疼痛、下痢および/または便秘の発病、異常な胃腸運動性)を特徴とする。病因を正確に指摘することは困難であり、かつ、ストレス、遺伝的性質、および/または炎症に関係する構成要素を有する可能性がある。同様に、抗体および結合相手を含む、本発明の抗IL-31Ra分子および/または抗OSMRb分子を用いて、炎症性腸疾患(大腸炎およびクローン病を含む)を治療することもできる。IBDはIBSよりも重篤であり、下痢、疼痛、および栄養失調を特徴とする。IBD患者は、しばしば、消化器癌の高いリスクを有する。
【００７１】
胃腸管運動活性は、以下のようにしてイヌモデルにおいて測定され得る：イヌは麻酔をかけられ、腹腔が切開される。管腔外の力変換器(収縮を測定するためのセンサー)が、5つの(5)部位、すなわち、胃前庭部(gastric antrum)(幽門輪より3cm近位側)、十二指腸(幽門輪より5cm遠位側)、空腸(幽門輪より70cm遠位側)、回腸(回腸結腸接合部より5cm近位側)、および結腸(回腸結腸接合部より5cm遠位側)に縫合される。これらの力変換器のリード線は、腹腔から取り出され、次いで、コネクタが連結されている、肩甲骨間に作られた皮膚切開部を通して外に出される。手術後、コネクタを保護するために、ジャケットプロテクターがイヌの上に置かれる。胃腸管運動活性の測定は、手術後2週間目に開始される。適宜測定するために、テレメーター(電波データ送信器)がコネクタと連結されて、胃腸管の各部位における収縮性の運動性が決定される。データは、解析のために、テレメーターを介してコンピューター中に保存される。IL-31アンタゴニストのような試験化合物が、適切な経路(経口的、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内)を介して、適切な時点に投与されて、胃腸管の運動活性に影響を与える能力が評価される。これは、通常のイヌ、または胃不全麻痺/イレウスが導入されたイヌにおいて実施され得る。上記の方法は、YoshidaおよびIto. J. Pharmacol. Experiment. Therap. 257, 781-787 (1991)ならびに Furuta et al. Biol. Pharm. Bull. 25： 103-1071 (2002)における方法の改良法である。
【００７２】
IL-31は、水痘感染のような潜在性のウイルス感染症を再活性化する引き金となり得る。水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)一次感染において、水痘帯状疱疹ウイルスに感染する可能性が最も高いT細胞は、CLAおよびCCR4を発現するCD4陽性記憶T細胞である。これらは、細胞に関連したウイルス血症ならびに皮膚およびDRGへの感染性ウイルスの輸送を促進し得る、皮膚ホーミングT細胞である。これらの細胞はまた、IL-31の主要産生者でもある。したがって、VZV一次感染におけるIL-31は、皮膚病変に関与するそう痒/疼痛の一因となり得る。DRGにおける潜伏ウイルスの再活性化により、VZVに特異的なT細胞応答が誘導され、神経性炎症の一因となる。皮膚ホーミングT細胞は、VZVに最も容易に感染し、かつ、T細胞からDRGへのウイルスのインビボの移動が観察されている。ヘルペス後神経痛は、水痘帯状疱疹ウイルスの再活性化によって引き起こされる、帯状ヘルペスの主要な合併症の1つであり、重度の疼痛を特徴とする。参照により本明細書に組み入れられる、Sato-Takeda、M. et al., Anesthesiology. 2006 104(5)： 1063-9を参照されたい。この参考文献はまた、ヘルペス後神経痛に対応する、ヘルペス後疼痛のマウスモデルも教示している。手短に言えば、BALB/c マウス(MHCハプロタイプ：H-2)、C57BL/6マウス(MHCハプロタイプ：H-2)、およびBALB/bマウス、H-2を有する類遺伝子性のBALB/c系統の後足に、単純ヘルペスウイルスI型が経皮的に接種される。一側性に、帯状疱疹状の皮膚病変および疼痛に関係した応答(急性のヘルペス性疼痛)が引き起こされ、かつ、一部のマウスは、皮膚病変の治癒後に、疼痛に関係した応答(ヘルペス後疼痛)を示す。単純ヘルペスウイルスI型抗原およびCD3陽性細胞は、急性期に後根神経節において免疫染色される。参照により本明細書に組み入れられるArgoff, C.E., et al., J Pain Symptom Manage. 2004 Oct;28(4)：396-411も参照されたい。IL-31Raおよび/またはOSMRbに対するアンタゴニストは、水痘によるウイルス感染症の再活性化を制限または予防するのに使用され得る。
【００７３】
実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)のマウスモデルは、免疫介在性疾患のメカニズムおよび潜在的な治療的介入の方法の両方を調査するための道具として使用されている。このモデルは、ヒト多発性硬化症に似ており、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)またはプロテオリピドタンパク質(PLP)などの神経タンパク質(neuroprotein)に対するT細胞活性化の結果として、脱随を生じる。抗原を接種すると、CD4+MHCクラスII拘束性T細胞(Th1)が誘導される。EAEに対するプロトコールを変更することにより、このモデルの急性変種、慢性再発性変種、または受身移入変種を作製することができる(Weinberg et al., J. Immunol. 162：1818-26, 1999、Mijaba et al., Cell. Immunol. 186：94-102, 1999、およびGlabinski, Meth. Enzym. 288： 182-90, 1997)。IL-31アンタゴニストまたは他の可溶性タンパク質および融合タンパク質の投与は、症状を改善し、かつ疾患の経過を変更するのに有用な場合がある。
【００７４】
抗IL-31Raおよび/または抗OSMRbなど、後根神経節細胞中におけるIL-31に誘導されるシグナル伝達に対するアンタゴニストは、以下のように、尿毒症性そう痒症(pruritus uraemicus)、肝炎、肝不全、または胆汁うっ滞に起因するそう痒、疥せんまたは汗疱状白せんに起因するそう痒、妊娠性そう痒症によるそう痒、透析患者のそう痒症によるそう痒、ならびに麻酔および心理的障害に起因するそう痒症によるそう痒を治療するのに有用であり得る。
【００７５】
尿毒症性そう痒症または腎性そう痒(renal itch)は、慢性の腎機能不全の往々にして耐えられない症状であり(Blachley JD, Blankenship DM, Menter A et al. Uremic pruritus： skin divalent ion content and response to ultraviolet phototherapy.Am J Kidney Dis 1985; 5： 237-41.)、症例の約13％において存在し、引っ掻きが原因の二次的皮膚病変を認めることができる。これは、腹膜透析または血液透析を受けている患者において、さらに好発する(Murphy M, Carmichael AJ. Renal itch.Clin Exp Dermatol 2000; 25： 103-6)。これは、局所的または全身的であり得る。そう痒は、急性腎不全では存在しない。腎性そう痒症の治療は、血液から痒み誘発物質を除去するための徹底的かつ効率的な透析、および非補体活性化膜の使用に基づいている。また、紫外線療法、皮膚軟化軟膏剤、活性炭、コレスチラミン(1日2回、4グラム)、リン酸結合剤も使用することができる。上皮小体切除が必要なことがある。
【００７６】
疼痛は、そう痒に拮抗する。例えば、Ward, L. et al., Pain 64：129-138. 1996を参照されたい。したがって、IL-31Raアンタゴニストおよび/またはOSMRbアンタゴニストなど疼痛のメディエーターを用いて、そう痒に関連する疼痛を治療し、それによって、そう痒または引っ掻き行動だけでなく、関連する疼痛も改善することができる。
【００７７】
そう痒症は、肝臓疾患および肝臓内または肝後方の胆汁うっ滞に罹患している患者の間では良く認識されている症状である。そう痒症をもたらす肝臓疾患には、原発性胆汁性肝硬変、B型ウイルス肝炎およびC型ウイルス肝炎、原発性硬化性胆管炎、胆管癌、アルコール性肝硬変、および自己免疫性肝炎などが含まれる。そう痒症は全身性であり、かつ、手、足、および窮屈な衣服の周辺でより激しいが、顔、首、および性器領域は希にしか含まれない。
【００７８】
全身性そう痒症は、妊娠女性の1％〜8％に存在する。妊娠性そう痒症は、妊娠性類天疱瘡(妊娠性ヘルペス)および妊娠の丘疹状かつそう痒性の皮膚疾患などの妊娠中のそう痒性皮膚疾患とは区別され得る。妊娠性そう痒症は、主として妊娠の3番目の3半期に、発疹は全く伴わずに発症するが、より早い段階で、腹部に最初に出現する場合もあり、次いで、全身性になる。この症状は、通常、夜に悪化する傾向があり、出産後、消失する(1週間〜4週間以内)。これらの患者において、γGTおよびアルカリホスファターゼの増加、および時には直接的なビリルビンレベルの増加も認められるため、これは、肝内胆汁うっ滞に関連している可能性が高い。そう痒症は、多胎妊娠においてより頻繁であり、かつ、その後の妊娠または経口避妊薬使用中に再発し得る。さらに、妊娠に関連した最も一般的な皮膚疾患である妊娠期のそう痒性じんま疹性の丘疹および斑(PUPP)は、抗ヒスタミン薬に応答せず、かつ、しばしば、分娩以降も持続する。
【００７９】
いくつかの血液学的障害が、そう痒症に関連していることが公知である。3種の造血細胞株すべての過剰産生を伴う真性一次性赤血球増加症において、患者は、典型的には、温かい水との接触後数分目に、胴部に位置するが、顔、手、および足は含まない、重度のそう痒を経験する。水によって誘発されるそう痒(水原性そう痒症または入浴かゆみ症)は、患者の70％において存在し得る。そう痒は、約15分〜1時間持続し得、かつ、患者が入浴を拒否するほどに重度であり得る。この10年間で、そう痒症は、骨髄移植後の移植片対宿主反応を有する患者において説明されている。
【００８０】
IL-31を長期的に送達すると、マウスにおいて、そう痒症および脱毛症とそれに続く皮膚炎に似た皮膚病変の発症が誘導され、これにより、IL-31がそう痒を誘導し得ることが示唆される。Dillon S.R., et al., Nat Immunol： 5, 752 (2004)を参照されたい。そう痒応答の誘導へのIL-31の関与を、実施例2に示す2つの方法によって試験した：(i)IL-31で処置したマウスのカプサイシン処置、および(ii)神経ペプチド発現の欠如が原因で、侵害受容性の疼痛応答が有意に減少しているTac1ノックアウトマウスのIL-31処置。さらに、IL-31処置マウスにおいてIL-31を中和することにより、そう痒症および脱毛症が予防され得るかを実施例2において試験した。
【００８１】
NC/Ngaマウスは、6週齢〜8週齢前後で非特定病原体不在(非SPF)条件で飼育された場合に、臨床経過および徴候、病理組織学および免疫病理学を含む多くの特徴がヒトADと類似しているAD様病変を自発的に発症する。一方、SPF条件下で飼育されたNC/Ngaマウスは、皮膚病変を発症しない。しかしながら、自然発症皮膚病変および引っ掻き行動の発生は、未精製のチリダニ抗原を毎週皮内注射することによって、SPF施設で飼育されたNC/Ngaマウスにおいて同時発生させることができる。Matsuoka H., et al., Allergy： 58, 139 (2003)を参照されたい。したがって、NC/NgaにおけるAD発症は、AD治療用の新規な治療物質を評価するための有用なモデルである。
【００８２】
自然発症ADのNC/Ngaモデルの他に、OVAを用いたマウスの皮膚(epicutaneous)感作もまた、感作されたマウスの皮膚における単核浸潤物を伴う抗原依存性の表皮肥厚および真皮肥厚を誘導するモデルとして使用され得る。これは、通常、全IgEおよび特異的IgEの血清レベルの上昇と同時に発生するが、皮膚バリアの機能障害も、そう痒症も、このモデルにおいては通常起こらない。Spergel J.M., et al., J Clin Invest, 101： 1614, (1998)を参照されたい。このプロトコールは、DO 11.10 OVA TCRトランスジェニックマウスをOVAで感作することによって皮膚バリアの調節障害およびそう痒症を導入するために、改変することができる。感作抗原を認識し得る抗原特異的T細胞の数を増加させることにより、皮膚における炎症レベルが上昇して、目に見える引っ掻き行動および皮膚の苔癬化/落屑が誘導され得る。
【００８３】
NC/Nga自然発症型ADモデルとOVA皮膚(epicutaneous)DO 11.10モデルの両方とも、ADにおけるIL-31およびIL-31RAの発現、ならびに、本明細書において説明するアンタゴニストがIL-31の作用を阻害、減少、または中和する能力を測定するために使用され得る。本明細書において説明するアンタゴニストは、アトピー性皮膚炎、結節性痒疹および湿疹を含む皮膚炎およびそう痒性疾患に関連した引っ掻きを抑制するのに有用である。ADにおいて、極めてかゆい皮膚によって引き起こされる引っ掻き行動は、皮膚バリア機能を壊し、かつ、ケラチノサイトを活性化して、ケモカイン産生および炎症増大を招くことによって、疾患を悪化させると考えられている。頻繁に引っ掻くことによって形成される病変は、感染、およびさらに抗原刺激の影響を受けるため、多くの臨床家は、ADを自己増殖サイクルとみなしている。体表面積のほぼ全体が関与している患者は、引っ掻くのが困難である領域に無影響の皮膚を有し得るという事実は、この仮説に信憑性を与える。そう痒症を予防することによって、IL-31Raおよび/またはOSMRbのアンタゴニストの投与は、IL-31によって誘導されるケラチノサイト活性化および神経学的刺激を減少させ、それによって炎症とそう痒の連鎖を断つことによって、そう痒性疾患を治療する際に有効となり得る。また、そう痒の軽減により、神経刺激因子の分泌が減少し、かつ、恒常的な引っ掻きに関連する炎症および表皮剥脱が軽減して、疾患スコアが改善し得、かつ/または疾患再発するまでの持続期間がより長くなり得る。引っ掻きを中止することにより、発症が引っ掻きに依存している皮膚炎の進行が止められると考えられるため、引っ掻きを抑制、軽減、または予防することは、限定されるわけではないが、アトピー性皮膚炎、結節性痒疹、および湿疹を含むそう痒性疾患を治療する際に単独で有効になり得る。
【００８４】
本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製したポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ならびにF(ab')2タンパク質分解断片およびFabタンパク質分解断片などの抗原結合断片が含まれる。キメラ抗体、Fv断片、および単鎖抗体など遺伝的に操作された完全な抗体または断片、ならびに合成の抗原結合ペプチドおよびポリペプチドもまた、含まれる。非ヒト抗体は、非ヒトCDRをヒトのフレームワーク領域および定常領域に接合することによって、または、非ヒト可変ドメイン全体を組み入れることによって(任意で、露出した残基を置換することによってヒト様表面でそれらを「覆う(cloaking)」ことにより、結果物は、「ベニアリングされた(veneered)抗体」である)、ヒト化することができる。場合によっては、ヒト化抗体は、適切な結合特徴を向上させるために、ヒト可変領域フレームワークドメイン内に非ヒト残基を保持してよい。抗体をヒト化することによって、生物学的半減期を延長することができ、かつ、ヒト投与時の有害な免疫反応の可能性は減少する。さらに、ヒト抗体は、WIPO公開番号WO 98/24893において開示されているように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むように操作された非ヒトトランスジェニック動物において作製することもできる。これらの動物中の内因性免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えなどによって不活性化または除去されていることが好ましい。
【００８５】
抗体は、以下の場合に、特異的に結合するとみなされる：1)それらが、閾値レベルの結合活性を示す場合、および2)それらが、関連するポリペプチド分子と有意に交差反応しない場合。閾値レベルの結合は、本明細書における抗IL-31抗体が、対照(非IL-31)ポリペプチドに対する結合親和力より少なくとも10倍大きな親和力でIL-31ポリペプチド、ペプチド、またはエピトープに結合する場合に決定される。これらの抗体が、106M-1またはそれ以上、好ましくは、107M-1またはそれ以上、より好ましくは108M-1またはそれ以上、および最も好ましくは109M-1またはそれ以上の結合親和性(Ka)を示すことが好ましい。抗体の結合親和力は、例えば、スキャッチャード解析により(Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51：660-672, 1949)、当業者が容易に決定することができる。
【００８６】
抗IL-31抗体が、関連するポリペプチド分子と有意に交差反応しないかどうかは、例えば、IL-31ポリペプチドを検出するが、公知の関連ポリペプチドを検出しない抗体を用いて、標準的なウェスタンブロット解析によって示される(Ausubel et al.、同書)。公知の関連ポリペプチドの例は、公知のオルソログおよびパラログ、ならびにタンパク質ファミリーの類似した公知のメンバーなど、先行技術において開示されているものである。スクリーニングはまた、非ヒトIL-31ポリペプチドおよびIL-31変異ポリペプチドを用いて実施することもできる。さらに、抗体は、公知の関連ポリペプチド「に対してスクリーニング」して、IL-31ポリペプチドに特異的に結合する集団を単離することができる。例えば、IL-31に対して産生させた抗体は、不溶性マトリックスに接着された関連ポリペプチドに吸着される。IL-31に特異的な抗体は、適切な緩衝液条件下でマトリックスを通過すると考えられる。スクリーニングにより、公知の密接に関連したポリペプチドと交差反応しないポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の単離が可能になる(Antibodies：A Laboratory Manual, HarlowおよびLane(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al.(編)、National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995)。特異的抗体のスクリーニングおよび単離は、当技術分野において周知である。Fundamental Immunology, Paul(編)、Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol. 43：1-98, 1988; Monoclonal Antibodies：Principles and Practice, Goding, J.W.(編)、Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al., Ann. Rev. Immunol. 2：67-101, 1984を参照されたい。特異的に結合する抗IL-31抗体は、当技術分野のものであり、かつ下記に開示するいくつかの方法によって検出することができる。
【００８７】
モノクローナル抗体の調製は、当業者に周知である。発現系から産生させた、精製した成熟組換えヒトIL-31ポリペプチド(SEQ ID NO：2のアミノ酸残基27(Leu)〜167(Thr))またはマウスのオルソログを用いて、モノクローナル抗体を作製することができる。
【００８８】
IL-31を介したシグナル伝達のアンタゴニストを投与する効果は、例えば、炎症、皮膚肥厚または真皮肥厚、リンパ球動員、および表皮肥厚、ならびに、当業者には明らかである湿疹面積および重症度指数(EASI)のような他の症状また複合症状の減少、阻害、予防、最小化、中和に基づいて、インビボで測定することができる。その他の効果には、皮内微量透析または他の方法によって測定されるように、損傷した皮膚によるサイトカインまたはケモカインの産生の変化または減少、アトピーバッチテストのスコアの低下、およびサイトカイン、ケモカイン、または神経ペプチドなどの可溶性因子の放出の減少が含まれ得る。そう痒または疼痛の程度の評価は、視覚的アナログスケールのような臨床的に認可された機器または道具を用いて測定することができる。引っ掻きの頻度は、肢動作計量器、指の爪に取り付けられた圧電トランスデューサー装置、または患者の夜間の引っ掻きの微速度赤外線写真もしくはビデオカメラ撮影によってモニターすることができる。疼痛またはそう痒の減少を評価するための他の方法は、当業者には明らかである。
【００８９】
組織培養培地から精製されたモノクローナル抗体は、組換えヒトIL-31および天然ヒトIL-31を定量的に測定するためのELISAにおける有用性に関して特徴付けがなされる。これらの抗体が選択され、かつ定量的アッセイ法が開発される。
【００９０】
組織培養培地から精製されたモノクローナル抗体は、IL-31RaおよびOSMRbを発現する神経細胞上での精製組換えhuIL-31の受容体結合活性を妨害するか、または減少させる能力に関して特徴付けられる(「中和アッセイ法」)。いくつかの「中和性」モノクローナル抗体は、このようにして同定される。次いで、説明されるヒトIL-31に対する中和性モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマは、ブダペスト条約のもと、オリジナルの寄託物としてAmerican Type Tissue Culture Collection (ATCC; Manassas VA)特許寄託機関に寄託され得る。
【００９１】
組織培養培地中のモノクローナル抗体は、精製組換えタンパク質ヒトIL-31の存在下で増殖させた場合に、受容体結合を妨害するか、または減少させる能力に関して特徴付けられる。
【００９２】
モノクローナル抗体の結合親和力は、作り出すことができる。ヤギ抗ラットIgG-Fcγ特異的抗体(Jackson)が、CM5 Biacoreチップ上に固定化される。このアッセイ法は、抗ラット捕捉表面上に各mAbが結合するように最適化され、次いで、IL-31の濃度系列がmAb全体にわたって注射されて、結合(Ka)および解離(Kd)が観察される。各試験後に、表面は、20mM HClの注射2回によって、抗ラット抗体に再生される。データは各試験に対して取得され、かつ、評価ソフトウェア(BIA評価ソフトウェア  バージョン3.2、Pharmacia BIAcore, Uppsala, Sweden)が、IL-31タンパク質に結合する抗IL-31抗体の動態を評価するのに使用される。
【００９３】
推定上の抗IL-31mAbによって認識される標的分子IL-31が、実際、IL-31であるという生化学的確認は、標準的な免疫沈降法とそれに続くSDS-PAGE解析またはウェスタンブロット法手順(両方とも、非トランスフェクトBaf3細胞に対してIL-31トランスフェクトBaf3細胞に由来する可溶性膜調製物を使用する)によって実施される。mAbは、可溶性IL-31-muFcタンパク質を特異的に免疫沈降させるか、またはウェスタンブロットする能力に関して試験される。
【００９４】
本明細書において説明する方法によって作製されたIL-31Raアンタゴニストおよび/またはOSMRbアンタゴニストは、様々な方法により、中和、阻害、減少、拮抗に関して試験することができる。さらに、中和は、リガンドおよびモノクローナル抗体の存在下でのケラチノサイト培養物に由来するTARCおよびMDCなどの炎症誘発性ケモカインの産生の減少を測定することによっても、試験することができる。MCP-1、MIP1a、TARC、MCP-1、MDC、IL-6、IL-8、I-309、SCYA19、MPIF-1、TECK、MIP-1b、SCYB13、GROa/MGSA、CTACK、SCCA1/Serpin B3、TSLP、およびNT-4など他のバイオマーカーもまた、使用され得る。中和はまた、本明細書において説明するインビボモデルによって測定することもできる。
【００９５】
本明細書において説明する生理活性を有するアンタゴニストまたは抗体コンジュゲートは、静脈内に、動脈内もしくは管内に、皮下に、局所的に送達されてよく、または、所期の作用部位に局所的に導入されてよい。
【００９６】
本発明のアンタゴニストは、限定されるわけではないが、NcNgaモデル、Ova皮膚(epicutaneous)モデル、慢性過敏症モデル、慢性ハプテンモデル、カルシウム流入モデル、異痛症モデルを含む、本明細書において説明するインビボモデルのいずれかによって決定されるように、IL-31リガンドに結合する能力に関して測定され得る。
【００９７】
抗IL-31Raアンタゴニストおよび/またはOSMRbアンタゴニストの阻害効果を測定するためのその他のモデルは、当業者には公知であり、かつ本明細書において説明され、Umeuchi, H. et al., European Journal of Pharmacology, 518： 133-139, 2005およびYoo, J. et al., J. Experimental Medicine, 202：541-549, 2005によって記述されている。
【００９８】
神経性炎症を測定するためのマウスモデルは、当技術分野において公知である。例えば、Sweitzer, S. M., et al., J. Neuroimmunology 125： 82-93; 2002およびHonore, P., et al., Neuroscience, (98)： 585-598, 2000を参照されたい。また、Yonehara, N.およびYoshimura M., Pain, 2001 (92/1-2)： 259〜265頁)も参照されたい。
【００９９】
本発明の局面内で、本発明は、哺乳動物の神経組織の炎症を治療する方法、哺乳動物の疼痛を治療する方法、後根神経節細胞におけるIL-31によって誘導されるシグナル伝達に拮抗する方法、熱傷に関連した症状を治療するための方法、ウイルス感染に関連した症状を治療し、かつウイルス感染の再活性化を予防するための方法、および炎症性腸疾患に関連した疼痛を治療する方法を提供する。ある態様内で、炎症性腸疾患はクローン病である。
【０１００】
これらの局面の態様内で、本発明は、IL-31Raアンタゴニストおよび/またはOSMRbアンタゴニストと神経組織を混合する段階を含む方法であって、炎症、疼痛、後根神経節シグナル伝達、ウイルス感染もしくは再活性化、または熱傷組織、または炎症性腸疾患に関連した疼痛が減少、制限、予防、最小化、または中和される方法を提供する。
【０１０１】
他の態様内で、IL-31Raアンタゴニストおよび/またはOSMRbアンタゴニストは、SEQ ID NO：2に示すアミノ酸配列の残基27〜残基164を含むポリペプチドに結合する。他の態様内で、アンタゴニストは、抗イディオタイプ抗体、抗体断片、キメラ抗体、およびヒト化抗体から選択される。別の態様内で、アンタゴニストは可溶性受容体である。他の態様内で、可溶性受容体は、IL-31Raの少なくとも1つのサブユニットを含む。
【０１０２】
他の態様内で、神経組織は、後根神経節または脊髄組織を含む。
【０１０３】
実施例
実施例1  神経組織中のIL-31RA、IL-31、およびpOSMRbに対するインサイチューハイブリダイゼーション
すべて同じ個体に由来する5つのヒト脳組織試料および1つの脊髄試料、ならびに別の患者に由来する後根神経節(DRG)をこの研究において解析した。
【０１０４】
使用したプローブは、IL-31RA、IL-31、およびOSMRβに対するプローブであった。
【０１０５】
結果を表1に示す。
【０１０６】
（表１）ISH解析の結果
2009526756.tif 000002
【０１０７】
脳切片：
脳の全領域において、3種全てのプローブに関して検出可能な量のシグナルは無かった。視床下部中の神経細胞のサブセットにむらのあるpOSMRb染色が認められた。このむらは、検出レベル付近である極めて低レベルのpOSMRb発現によって起こる可能性がある。
【０１０８】
脊髄：
脊髄の1つの領域に陽性染色が認められた。脊髄切片のあり得る位置または向きに関する情報は、入手できなかった。シグナルは、脊髄の前方(腹側)部分に存在するようである。反対側/領域(同様に前方)は陰性であった。陽性シグナルは、より大型の神経細胞のサブセットに限局すると思われる。IL-31RAおよびpOSMRbの両方とも、この領域において同様の発現パターンを示した。IL-31は陰性であった。
【０１０９】
後根神経節(DRG)：
DRG中の単極神経細胞のサブセットがIL-31RAおよびpOSMRbの両方に関して陽性であった。小型の衛星細胞は陰性であった。IL-31は、神経細胞を含む全細胞において陰性であった。
【０１１０】
したがって、IL-31アンタゴニストは、神経性刺激に関連した症状および神経性刺激を緩和するのに有用であり得る。したがって、IL-31アンタゴニストは、後根神経節刺激のような神経細胞刺激に関連した炎症および疼痛を治療するのに使用することができ、かつ、疼痛および炎症の軽減、制限、最小化、予防、または中和として測定することができる。
【０１１１】
実施例2：そう痒応答の誘導へのIL-31関与
A.方法I(IL-31処置マウスのカプサイシン処置)
10週齢のBALB/c動物(CRL)を麻酔し、かつ、持続性の鎮痛剤である塩酸ブプラノルフィン(bupranorphine)を0.1mg/kgで皮下注射した後、生理食塩水中10％エタノール＋10％Tween-80に溶かした4mg/mlのカプサイシン溶液0.25mlを頸部の首筋に皮下注射した。神経毒処理後少なくとも30分間、動物を麻酔下で維持した。48時間後、20ug/日のIL-31を14日間連続的に送達するために、14日用浸透圧ポンプを皮下に埋め込んだ。以下の基準を用いて、マウスの脱毛症およびそう痒症を6日間、毎日モニターした。0＝引っ掻き無し。動物は正常と思われる。1=小規模の領域で毛皮が薄くなり、引っ掻きが注目される。2=軽微な脱毛(小さな部分)、引っ掻き有り。3=中程度の脱毛、引っ掻き有り。4=重度の脱毛、過剰な引っ掻き。
【０１１２】
結果から、カプサイシン未処置マウスは、3日間のIL-31送達後に平均ひっかき/脱毛スコア2.625を示すのに対し、カプサイシン処置マウスは、有意に低いスコア1を示すことが実証された。したがって、IL-31送達前にカプサイシンで処置したマウスは、6日間の実験を通して、引っ掻きおよび脱毛の発生の遅延ならびに引っ掻きおよび脱毛の強さを示すスコアの低下の両方を示した。これらのデータにより、IL-31が、IL-31によって誘導される脱毛症およびそう痒症に寄与する何らかの神経性成分を誘導することが示唆される。したがって、IL-31を中和することにより、そう痒を伴う皮膚障害に罹患している患者において、そう痒の発生および強さ、したがって、皮膚炎が減少し得る。
【０１１３】
B.方法II
Tac1遺伝子に関してホモ接合性ヌルであるマウスは、検出可能なサブスタンスPもニューロキニンAも発現しない。これらのマウスの中程度〜強い刺激に対する侵害受容性の疼痛応答は有意に低下しており、したがって、これらのマウスは、疼痛/そう痒プロセッシングおよび炎症性疾患状態に対するタキキニンペプチドの寄与を研究するための有用な道具である。12週齢のTac1ノックアウトマウスに、1ug/日のIL-31タンパク質を送達する14日用浸透圧ポンプを埋め込み、かつ、以下の基準を用いて、脱毛症およびそう痒症に関して毎日観察した。0＝引っ掻き無し。動物は正常と思われる。1=小規模の領域で毛皮が薄くなり、引っ掻きが注目される。2=軽微な脱毛(小さな部分)、引っ掻き有り。3=中程度の脱毛、引っ掻き有り。4=重度の脱毛、過剰な引っ掻き。
【０１１４】
この研究の結果から、Tac1欠損マウスが、対照の野生型マウスと比べて、IL-31に誘導される引っ掻き/脱毛に対する感受性が低かったことが示される。100％(10/10)の野生型マウスが、IL-31処置の6日目までに引っ掻きおよび脱毛の証拠を示したのに対し、Tac1欠損マウスの33.3％(2/6)しか、同じ時点に引っ掻きおよび脱毛の徴候を示していなかった。これらのデータにより、IL-31が、IL-31処置マウスにおいて引っ掻き/脱毛表現型に寄与する神経性成分を誘導し、かつ、IL-31を中和することで、皮膚炎における引っ掻きの発生率および強さが減少し得ることが示される。
【０１１５】
C.方法III(IL-31中和抗体の投与)
約8週齢〜12週齢の正常雌BALB/cマウス(CRL)の皮下に、1ug/日のmIL-31を送達する14日用浸透圧ポンプ(Alzet、2002番)を埋め込んだ。マウス群に、IL-31送達の1週間前に開始して毎週2回、ラット抗マウスIL-31モノクローナル抗体10mg/kg(200ug/マウス)を腹腔内(i.p.)注射した。対照群のマウスには、同一の投薬スケジュールを用いて、ビヒクル(PBS/0.1％BSA)を腹腔内注射した。以下の基準を用いて、マウスの脱毛症およびそう痒症を、毎日記録した。0＝引っ掻き無し。動物は正常と思われる。1=小規模の領域で毛皮が薄くなり、引っ掻きが注目される。2=軽微な脱毛(小さな部分)、引っ掻き有り。3=中程度の脱毛、引っ掻き有り。4=重度の脱毛、過剰な引っ掻き。
【０１１６】
すべての実験において、ラット抗mIL-31 mAbで処置したマウスは、症状発現が約5日〜7日遅れ、かつ、脱毛症およびそう痒症の総合スコアは低かった。mAb処置マウスの全群(投薬頻度にも濃度にも関わらない)は、研究の13日目までに、対照マウスと同様の脱毛症およびそう痒症を発症した。これらのデータから、IL-31を中和することにより、IL-31によって誘導される引っ掻き/脱毛応答の発現を遅延できることが示唆される。
【０１１７】
実施例3
IL-31RA/OSMRβ受容体ルシフェラーゼアッセイ法
【０１１８】
改変c-fos Sis誘導性エレメント(m67SIEまたはhSIE)(Sadowski, H. et al., Science 261： 1739-1744, 1993)、p21 WAF1遺伝子由来のp21 SIE1(Chin, Y. et al., Science 272：719-722, 1996)、βカゼイン遺伝子の乳腺応答エレメント(Schmitt-Ney, M. et al., Mol. Cell. Biol. 11：3745-3755, 1991)、およびFcg RI遺伝子のSTAT誘導性エレメント(Seidel, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92：3041- 3045, 1995)を含む4遺伝子に由来するSTAT転写因子結合エレメントを含む相補的オリゴヌクレオチドを用いて、KZ134プラスミドを構築した。これらのオリゴヌクレオチドは、Asp718-XhoIと適合する末端を含む。これらを、標準的な方法を用いて、同じ酵素で消化され、かつネオマイシン選択マーカーを含む、c-fosプロモーターを有するレシピエントのホタルルシフェラーゼレポーターベクター(Poulsen, L.K. et al., J. Biol. Chem. 273：6229-6232, 1998)中に連結した。KZ134プラスミドを用いて、標準的なトランスフェクション法および選択法によって、BaF3細胞を安定にトランスフェクトして、BaF3/KZ134細胞株を作製した。
【０１１９】
完全長IL-31RAまたはIL-31RA/OSMRβ受容体を発現する安定なBaF3/KZ134指標細胞株を構築した。標準技術を用いてクローンを希釈し、播種し、かつ選択した。ヒトIL-31順化培地または精製IL-31タンパク質を誘導物質として使用するルシフェラーゼアッセイ法(下記のBを参照されたい)によって、クローンをスクリーニングした。(STATルシフェラーゼを介した)ルシフェラーゼ応答が最も多く、かつバックグラウンドが最も少ないクローンを選択した。安定なトランスフェクタント細胞株を選択した。この細胞株を、細胞株にトランスフェクトされた受容体に応じてBaF3/KZ134/IL-31RAまたはBaF3/KZ134/IL-31RA/OSMRβと呼んだ。
【０１２０】
同様に、BHK細胞株もまた、本明細書において説明する方法を用いて構築し、かつ、本明細書において説明するルシフェラーゼアッセイ法において使用した。これらの細胞株を、細胞株にトランスフェクトされた受容体に応じてBHK/KZ134/IL-31RAまたはBHK/KZ134/IL-31RA/OSMRβと呼んだ。
【０１２１】
BaF3/KZ134/IL-31RA細胞およびBaF3/KZ134/IL-31RA/OSMRβ細胞を遠心沈殿し、かつ、mIL-3を含まない培地中で洗浄した。細胞を遠心脱水し、かつ、3回洗浄して確実にmIL-3を除去した。次いで、細胞を血球計数器で計数した。mIL-3を含まない培地を用いて、100μl/ウェルの体積で、約30,000細胞/ウェルで96ウェルフォーマットに細胞を播種した。後続のアッセイ法において対照として使用するために、非トランスフェクトBaF3/KZ134細胞に対して同じ手順を使用した。BHK/KZ134/IL-31RA細胞またはBHK/KZ134/IL-31RA/OSMRβ細胞を、培地100μl中に15,000細胞/ウェルで96ウェルフォーマットに播種した。BHK/KZ134親細胞を対照として使用した。
【０１２２】
BaF3/KZ134/IL-31RA細胞、BaF3/KZ134/IL-31RA/OSMRβ細胞、BHK/KZ134/IL-31RA細胞、またはBHK/KZ134/IL-31RA/OSMRβ細胞のSTAT活性化は、順化培地または精製タンパク質を用いて評価する。100マイクロリットルの希釈した順化培地またはタンパク質を、BaF3/KZ134/IL-31RA細胞、BaF3/KZ134/IL-31RA/OSMRβ細胞、BHK/KZ134/IL-31RA細胞、またはBHK/KZ134/IL-31RA/OSMRβ細胞に添加する。順化培地を使用するアッセイ法は、対照としての非トランスフェクトBaF3/KZ134細胞またはBHK/KZ134細胞と並行して実施する。アッセイ総体積は200μlである。アッセイプレートを37℃、5％CO2で24時間インキュベートし、その時点で、BaF3細胞を2000rpm、10分間の遠心分離によって沈殿させ、かつ、培地を吸引し、溶解緩衝液(Promega)25μlを添加する。BHK細胞株の場合、細胞が接着性であるため、遠心分離段階は必要ない。室温で10分間放置した後、測定時間5秒(five second integration)で、ルシフェラーゼアッセイ法基質(Promega)40μlを添加したプレートをルミノメーター(Labsystems Luminoskan、RSモデル)で読み取ることによって、STATレポーター構築物の活性化に関してプレートを測定する。
【０１２３】
実施例4
アデノウイルスSTAT/SREレポーター遺伝子による一過性感染によって形質転換されたヒト上皮細胞株におけるルシフェラーゼアッセイ法
IL-31活性の阻害、減少、および/または中和をルシフェラーゼアッセイ法によって測定することができる。例えば、ヒト形質転換細胞株を、96ウェルの平底プレート中の各細胞型に対して指定された通常の増殖培地中に10,000細胞/ウェルで播種することができる。翌日、これらの細胞を、感染多重度5000でアデノウイルスレポーター構築物KZ136に感染させる。KZ136レポーターは、血清応答エレメントの他に、STATエレメントを含む。総体積は100ul/ウェルであり、2mM L-グルタミン(GibcoBRL)、1mMピルビン酸ナトリウム(GibcoBRL)および1×インスリン-トランスフェリン-セレン補給物(GibcoBRL)を添加したDMEM（以下、無血清培地と呼ぶ）を使用する。細胞を一晩培養する。
【０１２４】
翌日、培地を除去し、かつ、誘導培地100μlに交換する。誘導培地は、無血清培地中で希釈した100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/mlおよび1.56ng/mlのヒトIL-31である。陽性対照の20％FBSを用いて、アッセイ法を確認し、かつ、アデノウイルスによる感染が成功していることを確認する。これらの細胞を5時間誘導し、終了時に培地を吸引する。次いで、細胞を50μl/ウェルのPBS中で洗浄し、続いて、30μl/ウェルの1×細胞溶解緩衝液(Promega)中で溶解する。室温で10分間インキュベーションした後、25μl/ウェルの溶解物を乳白色の96ウェルプレートに移す。次いで、これらのプレートに、40μl/ウェルのルシフェラーゼ基質(Promega)を注入し、測定時間5秒でLuminometer上で読み取る。
【０１２５】
実施例5
炎症性腸疾患に由来する結腸組織におけるIL-31解析
A)IL-31免疫組織化学：
ポリクローナル抗体(ウサギ抗-ヒトIL-31 CEE、1.0mg/mlまでアフィニティー精製)を、ABC-eliteベースの検出系を介して炎症性腸疾患患者由来の胃腸管組織中のヒトIL-31を検出するのに使用した。正常ウサギ血清、1.66mg/mlまで精製したプロテインAを、同じプロトコールおよび抗体濃度を用いる陰性対照として使用した。
【０１２６】
プロトコールは以下のとおりであった：ABC-HRP Elite (Vector Laboratories, PK-6100)、Target Retrieval(ph9)中で20分間蒸し、室温まで20分間放冷、30分間タンパク質をブロッキング、一次抗体(1：1,000〜2,500)を60分間、二次抗体(Bi：抗ウサギ)を45分間、ABC-HRP複合体を45分間、および推奨されるDAB基質。
【０１２７】
この研究において、合計19種の個別のGI組織を、ウサギ抗ヒトIL-31ポリクローナル抗体を用いて解析した。この群において、IBD組織または癌組織に隣接した正常組織に由来する5つの結腸試料がある。9つの試料は、クローン病と診断されたものであり、5つは潰瘍性大腸炎と診断されたものであった。全体的に見て、IBD組織もしくは癌組織または潰瘍性大腸炎組織に隣接した正常組織よりも、クローン病試料において、陽性の細胞が多いと思われる。クローン病試料中のシグナルを伴う顕著な細胞は、固有層および粘膜下組織中に位置しており、浸潤細胞が、平滑筋束間のシグナルを示している。肉芽腫では、小結節中心の多くの大型細胞が陽性であるが、これらの小結節の表層およびパイエル板は陰性と思われる。腸腺の上皮は、時折、陽性である。潰瘍性大腸炎試料では、粘膜下組織中に少数の散在する細胞があり、かつ、平滑筋束間の浸潤細胞は陽性である。潰瘍性大腸炎試料中の陽性細胞のパーセンテージは、クローン病での値より低いが、「正常」試料の値と同様であるか、またはそれより若干高い。潰瘍性大腸炎の固有層中の細胞は、大部分は陰性である。要約すれば、この研究により、IL31がクローン病のGI試料において上方調節されていることが実証される。この研究において、IL31は、潰瘍性大腸炎試料および「正常」対照において同様の発現プロファイルを示すと思われる。
【０１２８】
B)IL-31インサイチューハイブリダイゼーション：
組織のサブセットも、インサイチューハイブリダイゼーション(ISH)を用いて解析した。ISHでは、IL-31 mRNAが、粘膜下組織および脂肪組織中の少数の浸潤細胞中で観察された。IHCによって、本発明者らは、IL31タンパク質が、前述の細胞集団、ならびに固有層および肉芽腫中心中の細胞において陽性に染色されることを観察した。これら2種のアッセイ法の違いは、アッセイ法の感受性によって説明することができる。
【０１２９】
実施例6  炎症性腸疾患に由来する結腸組織におけるIL-31Ra解析
A)IL-31Ra免疫組織化学：
ポリクローナル抗体(ウサギ抗ヒトIL-31RA(4型)CEE、1.33mg/mlまでアフィニティー精製)を、ABC-eliteベースの検出系を介して炎症性腸疾患患者由来の胃腸管組織中のヒトIL-31RAを検出するのに使用した。正常ウサギ血清、1.66mg/mlまで精製したプロテインAを、同じプロトコールおよび抗体濃度を用いる陰性対照として使用した。ウサギ抗ヒトIL-31RA(4型)抗体を1：2000(665ng/ml)で使用した。
【０１３０】
プロトコールは以下のとおりであった：ABC-HRP Elite (Vector Laboratories, PK-6100)、Target Retrieval (ph 9) 中で20分間蒸し、室温まで20分間放冷、30分間タンパク質をブロッキング、一次抗体(1：2,000)を60分間、二次抗体を45分間、ABC-HRP複合体を45分間、およびDAB+Dako Cytomationを10分間。
【０１３１】
この研究において、合計19種の個別のGI組織を、ウサギ抗ヒトIL-31RA(4型)CEE抗体を用いて解析した。この群において、IBD組織または癌組織に隣接した正常組織に由来する約5つの結腸試料がある。9つの試料は、クローン病と診断されたものであり、5つは潰瘍性大腸炎と診断されたものであった。全体的に見て、IBD組織もしくは癌組織または潰瘍性大腸炎組織に隣接した正常組織よりも、クローン病試料において、陽性の細胞が多いと思われる。クローン病試料中の陽性細胞は、粘膜下組織の結合組織中に主に位置している。肉芽腫小結節は陰性である。時折、クローン病試料中に弱い上皮シグナルが認められる。潰瘍性大腸炎(UC)試料中には検出可能なシグナルは認められなかった。粘膜下組織中の少数の細胞は、IL31 RAタンパク質に対するIHCによって陽性に染色された。
【０１３２】
B)IL-31Raインサイチューハイブリダイゼーション：
以前の研究において、5種の組織(うち3種はクローン病結腸であった)をISHによって研究した。これらのクローン病組織において、IL31RA mRNAは、正常な対応物と比べて有意に上方調節されており、かつ、シグナルは、肉芽腫小結節の表層ならびに粘膜下組織領域および脂肪組織領域の結合組織中の多数の浸潤細胞に局在していた。IHCとインサイチュー解析との矛盾に関して考え得る理由には、一過性のmRNA発現、タンパク質処理時間、IL31RAタンパク質の安定性、および/またはこれら2種のアッセイ法の感度の差が含まれる。
【０１３３】
実施例7  EμLck IL-31トランスジェニックマウスにおけるDSS誘導性大腸炎の研究
EμLck IL-31トランスジェニックマウスおよび対照の非トランスジェニック同腹子マウスを、疾患の罹病性および重症度の潜在的な差異を探索するために硫酸デキストランナトリウム(DSS)によって誘導した粘膜炎症モデルにおいて試験した。飲料水中2％〜3％DSSを与えられた正常マウスは、ヒト炎症性腸疾患を再現する症状および病理を示す(Strober, FussおよびBlumberg, Annu. Rev. Immunol. 2002を参照されたい)。機構的に、DSSは、大腸の粘膜上皮バリアを破壊し、それにより、その後の炎症を引き起こす。この炎症の結果として、DSSで処置したマウスは、体重が減少し、かつ下痢を発症する。体重、大便の軟度、および便中に存在する血液に基づく累積的スコアである疾患活動性指標(DAI)を用いて、マウスの大腸炎の重症度をモニターする。DSSを用いて、急性型または慢性型の大腸炎を誘導することができる。急性大腸炎は、0日目〜7日目まで、飲料水に溶かしたDSS(本発明者らの研究では2％または3％)を送達することによって誘導されるのに対し、慢性大腸炎は、飲料水に溶かしたDSSを5日間送達し、続いて、7日〜12日の回復期の後に、DSS処置を繰り返すことによって、誘導される。
【０１３４】
EμLck IL-31トランスジェニックマウスにおいて4回の研究を実施した。急性DSSモデルを使用するか慢性DSSモデルを使用するかに関わらず、EμLck IL-31トランスジェニックマウスは、対照の同腹子マウスと比べて、より早期により多くの体重を失った。実際には、4回の研究中3回において、IL-31トランスジェニックマウスは、対照と比べて有意に多い体重減少を示した(p<0.001、p=0.011)。さらに、トランスジェニックマウスは、野生型対照と比べて、結腸が有意に短かった(p<0.05)。DAIスコアは、慢性大腸炎研究において、非トランスジェニック対照と比べて、IL-31トランスジェニックマウスにおいて有意に高かった(p<0.001)。
【０１３５】
IL-31の全身送達が、正常な非トランスジェニックマウスにおけるDSS誘導性大腸炎の発症に影響し得るかを判定するために、本発明者らは、DSS処置前に、IL-31またはビヒクル(PBS、0.1％BSA)の1日量を送達する浸透圧ポンプを動物に埋め込んだ。1つの研究において、N3世代の非トランスジェニックマウス(B6C3F2×C57BL/6)の皮下に、DSS投与の経過中に20μg/日のIL-31またはビヒクルのいずれかを送達するポンプを埋め込んだ。IL-31処置マウスとビヒクル処置マウスの間で、体重減少にも、DAIスコアにも、結腸の長さにも差異はなかった。同様のポンプ送達研究を、正常C57BL/6マウスにおいても実施した。マウスに、10μg/日のIL-31またはビヒクルを送達するポンプを埋め込み、かつ、急性の投与計画で2％DSSを与えた。やはり、IL-31送達ポンプを埋め込んだか、ビヒクル送達ポンプを埋め込んだかを問わず、DSS大腸炎パラメーターのいずれにおいても、マウス間で差異は認められなかった。最後に、2％DSS急性大腸炎研究を、IL-31RA欠損(IL-31RA-/-)マウスにおいて実施した。やはり、IL-31RA欠損マウスと対照の野生型の間で、体重減少にも、DAIスコアにも、結腸の長さにも差異はなかった。
【０１３６】
要約すれば、急性大腸炎研究において正常マウスへのIL-31の全身送達は、疾患の転帰に影響をあたえなかったため、IL-31は、DSSによって誘導される粘膜炎症に直接的に影響しないようである。IL-31トランスジェニック動物は、トランスジェニック表現型によって引き起こされたストレスの結果として、DSS誘導性大腸炎に対する感受性がより高い場合がある。しかしながら、EμLck IL-31トランスジェニックマウスの末梢リンパ節中の活性化CD4+T細胞およびCD8+T細胞の数は増加しており(Dillon, et al, 2004)、かつ、EμLck IL-31トランスジェニックマウスにおいて観察されるDSS誘導性大腸炎に対する感受性の増大は、これらの活性化リンパ球の存在の結果である可能性がある。
【０１３７】
実施例8：
微量透析法を用いて皮膚間質液を試料採取することによる、抗IL31処置の効果
微量透析法を本発明の分子と共に使用して、皮膚中の抗体の生物学的利用能および分布の直接的解析を実施することができる。微量透析法は、細胞間液を採取および解析するための用途である。間質液中の抗体は、ルミネックスビーズに架橋された種特異的抗IgGを用いて測定することができる。さらに、遊離IL-31からIgG結合IL31の評価は、二次抗体として抗IgGではなく抗IL31を用いて実施する。2.ケラチノサイトおよび/または後根神経節のIL31活性化によって産生される炎症誘発性サイトカインおよびケモカインを分析する。British J. Dermatology 142(6); 1114-1120, (2000)、J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 73; 299-302, (2002)、 Am J. Physiol Heart Circ. Physiol 286; 108-112, (2004)、Neuroscience Letters 230; 117-120, (1997)、およびAAPS J. 7(3); E686-E692, (2005)を参照されたい。また、Steinhoff, M., et al., J. Neuroscience, 23 (15)： 6176-6180, 2003も参照されたい。
【０１３８】
微量透析プローブは、TSE Systems (Midland, Michigan)によって供給される。プローブはT形であり、かつ、15mmの軸に結合された長さ(L)4mmの3000 kDa膜(外径(OD)0.3mm)からなる。入口および出口は、内径(ID)0.12mmのピークチューブ(peek tubing)に連結されている。インビボ解析に使用されるのと同一のチューブ長を用いて、エクスビボ解析を実施する。HMWCOプローブを、プッシュプルポンプシステムを用いて動かして、外向きの(間質中への)流れを最小限に抑える。しかしながら、プッシュのみ(Harvard PHD 2000)も使用される。ΔpおよびΔΠに起因する液体損失を、様々な流速で測定する。膜の効率(Ed)を、非膜拡散(外部拡散)を消去するために混合チャンバー中で公知の量のIgGを用いて、様々な流速で決定する。マウスIgGおよびマウスヘモグロビンのEdを決定し、これらは、インビボでの対照として役立つ。定量化は、ルミネックスビーズに結合されたヤギ抗ラットIgGを用いて実施し、捕捉は、非特異的反応性を減少させるウサギまたはロバのビオチン抗ラットIgGを用いて報告する。マウスIgGおよびヘモグロビンに関するアッセイ法は、インビボの研究における対照のために開発する。ビーズ結合は、標準的なキットおよびプロトコールを用いて実施する。
【０１３９】
浸透圧ポンプ、IDによるか、または微量透析ファイバーを介した、マウスおよびラットのサイトカイン処置を使用する。抗体を静脈注射する。プローブを紫外線滅菌する。微量透析プローブを挿入し、血液分析物を試料採取する。血液循環から皮膚中へのIgG輸送の定量を、エクスビボで決定した膜パラメーターを用いて測定し、抗体透過性および灌流速度を推定する。
【０１４０】
一組の動物につき1つの時点および十分な数の時点を用いて以下の段階を実施して、経時的な循環抗体レベルおよび真皮/表皮中への拡散を推定する：i)微量透析膜を皮膚中に挿入し、かつ、エクスビボ解析によって決定した速度で予備試料を抜き取る。この対照試料により、浸透液のベースラインの反応性を決定する。2)ラット抗IL31抗体を尾部への静脈注射によって導入し、かつ、所定の時点で、眼窩内の血液試料を採取して、循環抗体レベルを決定する。3)解析用に十分な体積の微量透析試料をプロトコールのくみ上げ速度で採取する。4)分析物採取の最後に、別の眼窩内試料を採取して、抗IL31循環レベルを決定する。
【０１４１】
Luminexによって分析物および血漿の多重解析を実施し、1)抗IL31抗体、2)枯渇/拡散の対照としての抗マウスIgG、ならびに3)微量透析による挿入外傷および血管損傷の対照となる抗マウスヘモグロビンについて定量を実施する。エクスビボで決定した膜パラメーターおよび所与の循環抗体濃度で測定された分析物中への抗IL31の流入速度を用いて、皮膚拡散速度の推定値を決定する。分析物中のマウスIgG濃度を用いて、プローブ付近のタンパク質の局所的枯渇を評価する。拡散解析における局所的枯渇を相殺するための式を考案する必要があり得る。
【０１４２】
実施例9
ヒトIL-31Ra/オンコスタチンM受容体(OSMRβ)ヘテロ二量体を作製するための構築物
このような可溶性ヘテロ二量体受容体を構築、発現、および精製するための系は当技術分野において公知であり、受容体ペアであるヒトオンコスタチンM受容体(OSMRβ)およびヒトIL-31Ra向けに改案されている。この構築物に関して、可溶性受容体OSMRβのポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：17に示し、対応するポリペプチドはSEQ ID NO：18に示す。可溶性受容体ヒトIL-31Raのポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：20に示し、対応するポリペプチドはSEQ ID NO：21に示す。
【０１４３】
分泌性の可溶性hIL-31Ra/ヒトOSMRβヘテロ二量体を発現する細胞株を構築するために、結果として生じるヘテロ二量体可溶性受容体が、C末端にGlu-Gluタグを有するIgGγ1(Fc4)の重鎖に融合されたヒトOSMRβの細胞外ドメインを含み、一方、IL-31Raの細胞外ドメインがC末端にHisタグを有するFc4に融合されるように、構築物を作製した。ヘテロ二量体のhIL-31RaアームおよびヒトOSMRβアームの両方に対して、受容体の細胞外部分とFc4のN末端の間に、12アミノ酸からなるGly-Serスペーサーを人工的に設計した。
【０１４４】
A.ヒト可溶性OSMRβ/Fc4-CEEの構築
ヘテロダイマーのヒト可溶性OSMRβ/Fc4-CEE部分を構築するために、ヒトOSMRβの細胞外部分を、以下のPCR反応条件下でオリゴと共にPCRを用いて単離した：95℃で60秒間、57℃で30秒間、および72℃で100秒間を30サイクル、ならびに72℃で7分間。QIAquick PCR精製キット(Qiagen)を用いてPCR産物を精製し、EcoR1およびBglII(Boerhinger-Mannheim)で消化し、ゲル電気泳動によって分離し、かつ、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen)を用いて精製した。
【０１４５】
キメラの発現カセット、プラスミド主鎖、およびFc4-GluGluタグ部分が、予め作製されたインハウスプラスミドベクター内に含まれた。このプラスミドベクターをEcoR1およびBamH1(Boerhinger-Mannheim)で消化し、ゲル電気泳動によって分離し、かつ、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen)を用いて精製した。ヒトOSMRβおよびFc4-cEEを含むプラスミドの消化および精製した断片を、T4 DNAリガーゼ(Life Technologies, Bethesda, MD)を用いて、標準的な連結法によって一つに連結した。結果として生じる連結物のミニプレップを、可溶性OSMRβの正確なサイズ(772bp)のEcoRI/Sma1挿入物に関してスクリーニングし、陽性のミニプレップを配列決定して、PCR反応の精度を確認した。この新しいプラスミド構築物をpZP9-ONCOMR-Fc4CEEと呼ぶ。
【０１４６】
B.ヒト可溶性IL-31Ra/Fc4-CHISの構築
ヘテロ二量体のhIL-31Ra/Fc4-CHIS部分を構築するために、IL-31Ra-Fc4可溶性受容体を予め含むプラスミドを消化することによって、ヒトIL-31Raの細胞外部分を単離した。このプラスミドを、Sal1(New England Biolabs, Beverly, MA)で最初に消化し、その後、反応物を連続的にフェノールクロロホルムで抽出し、かつエタノール沈殿させた。次いで、消化されたDNAをT4 DNAポリメラーゼ(Boerhinger-Mannheim)で処理して、Sal1消化によって作り出した5'オーバーハングを充填して、DNA末端を平滑にし、その後、反応物を連続的にフェノールクロロホルムで抽出し、かつエタノール沈殿させた。次いで、平滑末端化したDNAをBglIIでさらに消化して3'末端で切断し、ゲル電気泳動によって分離し、かつ、製造業者の取扱い説明書に従ってQIAquickゲル抽出キット(Qiagen)を用いて精製した。IL-31Raの細胞外ドメインをコードする配列を含む、結果として生じるDNA断片を、以下のようにして調製した、Fc4-CHISタグを含む哺乳動物発現ベクター中に連結した。
【０１４７】
キメラの発現カセット、プラスミド主鎖、およびFc4-CHISタグ部分が、予め作製されたインハウスプラスミドベクター内に含まれた。このプラスミドベクターを、EcoR1 (Boerhinger-Mannheim) で消化し、その後、反応物を連続的にフェノールクロロホルムで抽出し、かつエタノール沈殿させた。次いで、消化されたDNAをT4 DNAポリメラーゼ(Boerhinger-Mannheim)で処理して、EcoR1消化によって作り出した5'オーバーハングを充填して、DNA末端を平滑にし、その後、反応物を連続的にフェノールクロロホルムで抽出し、かつエタノール沈殿させた。次いで、平滑末端化したDNAをBamH1(Boerhinger-Mannheim)でさらに消化して3'末端で切断し、ゲル電気泳動によって分離し、かつ、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen)を用いて精製した。ヒトIL-31RaおよびFc4-CHISを含むプラスミドの消化および精製した断片を、T4 DNAリガーゼ(Life Technologies, Bethesda, MD)を用いて、標準的な連結法によって一つに連結した。
【０１４８】
結果として生じる連結物のミニプレップを、IL-31Ra特異的センスプライマーおよびFc4特異的アンチセンスプライマーを用いたPCRによって、以下のPCR反応条件でスクリーニングした：94℃で60秒間、68℃で150秒間を30サイクル、および72℃で7分間。予測される産生物サイズ848bpにより、pZEM228 hIL-31Ra/Fc4HISと呼ばれるプラスミドの正確な組立を確認した。
【０１４９】
第2のIL-31Ra-Fc4構築物を、COS細胞からホモ二量体タンパク質を生成させる際に使用するために作製した。手短に言えば、完全融合タンパク質のコード領域を、IL-31Ra-Fc4可溶性受容体を予め含むプラスミドをSal1(Boerhinger-Mannheim)で消化することによって単離した。反応物を連続的ににフェノールクロロホルムで抽出し、かつエタノール沈殿させた。次いで、消化されたDNAをT4DNAポリメラーゼ(Boerhinger-Mannheim)で処理して、EcoR1消化によって作り出した5'オーバーハングを充填して、DNA末端を平滑にし、その後、反応物を連続的にフェノールクロロホルムで抽出し、かつエタノール沈殿させた。次いで、平滑末端化したDNAをNot1(Boerhinger-Mannheim)でさらに消化して3'末端で切断し、ゲル電気泳動によって分離し、かつ、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen)を用いて精製した。CMV駆動型発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターを消化して、適合性のある末端を生成し、かつ、2つの断片を一つに連結した。結果として生じる連結物のミニプレップを、ベクター特異的センスプライマーおよびIL-31Ra特異的アンチセンスプライマーを用いたPCRによって、以下のPCR反応条件でスクリーニングした：94℃で30秒間、64℃で30秒間、70℃で90秒間を30サイクル、および72℃で7分間。予測される産生物サイズ約1000bpにより、pZP7NX-hIL-31Ra-Fc4と呼ばれるプラスミドの正確な組立を確認した。続いて、製造業者の取扱い説明書に従ってリポフェクタミン(Gibco/BRL)を用いて、COS細胞中にこのプラスミドをトランスフェクトした。これらの細胞をDMEM+5％FBS(Gibco/BRL)中で60時間順化させた後、プロテインG-セファロース4Bクロマトグラフィーカラムによってタンパク質を精製し、例えば本明細書において説明するもののようなインビトロのバイオアッセイ法に利用できるようにした。
【０１５０】
C.ヒトIL-31Ra/オンコスタチンM受容体(OSMRβ)の作製
製造業者の取扱い説明書に従ってリポフェクタミン(Gibco/BRL)を用いて、pZP9-ONCOMR-Fc4CEEおよびpZEM228hIL-31Ra/Fc4HIS各約16μgをBHK-570細胞(ATCC番号CRL-10314)中に同時トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、10日間、0.5mg/ml G418(Gibco/BRL)および250nMメチルトレキサート(methyltrexate)(MTX)(Sigma, St. Louis, MO)を含むDMEM+5％FBS(Gibco/BRL)中で10日間選択した。
【０１５１】
結果として生じる、二重に選択した細胞のプールを用いて、ヘテロ二量体タンパク質を生成させた。このプールの3つのセルファクトリー(Nunc, Denmark)を用いて、無血清順化培地10Lを作製した。1mlのプロテインAカラムにこの順化培地を通過させ、(10)750マイクロリットル画分に溶出させた。最高濃度を有することが判明したこれらの画分のうち4つを集め、かつPBSに対して透析した(カットオフ分子量10kD)。このプールをニッケルカラムに通し、かつ、様々な濃度のイミダゾールでカラムを洗浄することによって、所望のヘテロ二量体可溶性IL-31Ra/OSMRβタンパク質複合体を他の培地成分から単離した。可溶性IL-31Ra/OSMRβタンパク質は中程度の濃度のイミダゾールで溶出されたのに対し、hIL-31Ra/Fc4HISホモ二量体は、より高濃度のイミダゾールで溶出された。
【０１５２】
前述の内容から、本発明の特定の態様が、例証のために本明細書において説明されるが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な修正を加え得ることが、理解されると考えられる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて、限定されない。
【配列表】
2009526756000001.app