(57)【要約】  刺激に応じた特定のｍＲＮＡレベルを測定することによって、クローン病のヒトがＴＮＦＳＦ又はサイトカインを標的とする治療法に応答する可能性があるか否かを判定する方法を開示する。ヒトにおいてクローン病の治療法の有効性を評価する方法も開示する。さらに、クローン病の治療に用いる化合物のスクリーニング方法を開示する。クローン病患者の疾患状態を経時的にモニタリングする方法も開示する。
2009535016.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クローン病のヒトが治療に応答するか否かを判定する方法であって、
ヒト由来の白血球を含む第１サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
刺激後、第１サンプルにおける腫瘍壊死因子サブファミリー（ＴＮＦＳＦ）−２、ＴＮＦＳＦ−５、ＴＮＦＳＦ−６、ＴＮＦＳＦ−１４、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＣＬ）−２、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４及びケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＸＣＬ）−１０から成る群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること、
ヒト由来の白血球を含む第２サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで対照刺激物質により白血球を刺激すること、
刺激後、第２サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量を測定すること、並びに、
第１サンプル中の前記ｍＲＮＡの量と、第２サンプル中の前記ｍＲＮＡの量との比を求めることを含み、
ヒトにおいては当該比が約１．７：１以上の場合に治療に応答する可能性があると判断する方法。
【請求項２】
第１サンプルにおいて白血球を刺激することが、抗Ｔ細胞受容体抗体を該第１サンプルと混合することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１サンプルにおいて白血球を刺激することが、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質を該第１サンプルと混合することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１サンプル及び第２サンプルの少なくとも１つが全血を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
対照刺激物質が精製された対照免疫グロブリンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
治療法がＴＮＦ−α活性を標的とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
治療法がインフリキシマブの投与を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
治療法がシクロスポリンＡ及びタクロリムスから成る群から選択される作用物質の投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ヒトにおいてクローン病の治療法の有効性を評価する方法であって、
ヒト由来の白血球を含む第１サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
ヒト由来の白血球を含む第２サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで対照刺激物質により白血球を刺激すること、
刺激後、第１サンプル及び第２サンプルにおいて、腫瘍壊死因子サブファミリー（ＴＮＦＳＦ）−２、ＴＮＦＳＦ−５、ＴＮＦＳＦ−６、ＴＮＦＳＦ−１４、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＣＬ）−２、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４及びケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＸＣＬ）−１０から成る群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること、
第１サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第２サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との第１の比を算出すること、
前記治療法をヒトで行うこと、
治療後に得られるヒト由来の白血球を含む第３サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
治療後に得られるヒト由来の白血球を含む第４サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記対照刺激物質により白血球を刺激すること、
刺激後、第３サンプル及び第４サンプルにおいて前記ｍＲＮＡのレベルを測定すること、
第３サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第４サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との第２の比を算出すること、並びに
第１の比と第２の比とを比較することを含み、
前記比の有意差を効果的な療法の指標とする方法。
【請求項１０】
第１サンプル及び第３サンプルにおいて白血球を刺激することが、抗Ｔ細胞受容体抗体を該サンプルと混合することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第１サンプル及び第３サンプルにおいて白血球を刺激することが、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質を該サンプルと混合することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
対照刺激物質が、精製された対照免疫グロブリンを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
第１サンプル、第２サンプル、第３サンプル及び第４サンプルの少なくとも１つが全血を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記比の有意差とは、第２の比が第１の比よりも大きいことであり、治療法が腫瘍壊死因子αの不活性化を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
治療法がインフリキシマブの投与を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記比の有意差とは、第１の比が第２の比よりも大きいことである、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
治療法がシクロスポリンＡ及びタクロリムスから成る群から選択される作用物質の投与を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
クローン病を治療できる可能性があると推定される作用物質を同定する方法であって、抗Ｔ細胞受容体抗体に曝される場合、白血球が、腫瘍壊死因子サブファミリー（ＴＮＦＳＦ）−２、ＴＮＦＳＦ−５、ＴＮＦＳＦ−６、ＴＮＦＳＦ−１４、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＣＬ）−２、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４及びケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＸＣＬ）−１０から成る群から選択されるｍＲＮＡの転写において少なくとも１．７倍の増大を示すヒト由来の白血球を含む第１サンプル、第２サンプル、第３サンプル及び第４サンプルを得ること、
第１サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
第２サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで対照刺激物質により白血球を刺激すること、
刺激後、第１サンプル及び第２サンプルにおいて前記ｍＲＮＡの量を測定すること、
第１サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第２サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との第１の比を算出すること、
第３サンプル及び第４サンプルを作用物質に曝すこと、
曝露後、第３サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
曝露後、第４サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記対照刺激物質により白血球を刺激すること、
刺激後、第３サンプル及び第４サンプルにおいて前記ｍＲＮＡのレベルを測定すること、
第３サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第４サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との第２の比を算出すること、並びに
第１の比と第２の比とを比較することを含み、前記比の有意差を推定上の作用物質の指標とする方法。
【請求項１９】
第１サンプル及び第３サンプルにおいて白血球を刺激することが、抗Ｔ細胞受容体抗体をサンプルと混合することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第１サンプル及び第３サンプルにおいて白血球を刺激することが、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質を該サンプルと混合することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
対照刺激物質が、精製された対照免疫グロブリンを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
第１サンプル、第２サンプル、第３サンプル及び第４サンプルの少なくとも１つが全血を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記比の有意差とは、第１の比が第２の比よりも大きいことである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
ヒトにおいてクローン病の状態を評価する方法であって、
白血球を含み、ヒトから１回目に得られる第１サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
刺激後、第１サンプルにおいて、腫瘍壊死因子サブファミリー（ＴＮＦＳＦ）−２、ＴＮＦＳＦ−５、ＴＮＦＳＦ−６、ＴＮＦＳＦ−１４、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＣＬ）−２、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４及びケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＸＣＬ）−１０から成る群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること、
１回目にヒトから得られる白血球を含む第２サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで対照刺激物質により白血球を刺激すること、
刺激後、第２サンプルにおいて前記ｍＲＮＡの量を測定すること、
第１サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第２サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との第１の比を求めること、
白血球を含み、１回目に続く２回目にヒトから得られる第３サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
刺激後、第３サンプルにおいて前記ｍＲＮＡの量を測定すること、
２回目にヒトから得られる白血球を含む第４サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記対照刺激物質により白血球を刺激すること、
刺激後、第４サンプルにおいて前記ｍＲＮＡの量を測定すること、
第３サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第４サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との第２の比を求めること、並びに
第１の比と第２の比とを比較することを含み、第１の比と第２の比との有意な差を、疾患状態の変化の指標とする方法。
【請求項２５】
第１サンプル及び第３サンプルにおいて白血球を刺激することが、抗Ｔ細胞受容体抗体を前記サンプルと混合することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
第１サンプル及び第３サンプルにおいて白血球を刺激することが、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質を該サンプルと混合することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
対照刺激物質が精製された対照免疫グロブリンを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
第１サンプル、第２サンプル、第３サンプル及び第４サンプルの少なくとも１つが全血を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記比の有意差とは、第２の比が第１の比よりも大きいことであり、疾患状態の変化が該疾患の進行を示す、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記比の有意差とは、第１の比が第２の比よりも大きいことであり、疾患状態の変化が該疾患の退行を示す、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、他の腫瘍壊死因子スーパーファミリー又はサイトカインの作用を抑制することを含む、クローン病治療に対する患者の応答性を予測する方法、及びこのような治療の有効性をモニタリングする方法に関する。また、本開示は、クローン病の治療に用いる化合物をスクリーニングする方法に関する。さらに本開示は、クローン病の患者の病状をモニタリングする方法に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、その全体が参照により本明細書中に援用されて本明細書の一部となる、「クローン病患者の末梢血白血球におけるＴ細胞受容体介在性ＴＮＦ−Ａ及びケモカインのｍＲＮＡ発現の増強」と題され、２００６年４月７日に提出された米国特許仮出願第６０／７９０，３５４号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
自己免疫疾患は、宿主細胞と反応する抗体又は自己反応性である免疫エフェクターＴ細胞のいずれかを産生することを特徴とする。自己抗体は、重症筋無力症における抗アセチルコリン受容体抗体及び全身性エリテマトーデスにおける抗ＤＮＡ抗体のような特定の種類の自己免疫疾患で頻繁に同定される。しかしながら、このような自己抗体は、多くの種類の自己免疫疾患で見られるわけではない。さらに、自己抗体は健常な個体で検出されることが多いものの、このような抗体は自己免疫疾患を誘導しない。したがって、自己抗体の他に、まだ同定されていないさらなる機構が自己免疫疾患の病因に関与していることは明らかである。
【０００４】
自己抗体が、標的となる宿主細胞と結合すると補体カスケードが活性化し、標的となる細胞膜上にＣ５〜９膜侵襲複合体が形成され、宿主細胞の破壊をもたらすと考えられる（Esser, Toxicology, 87, 229, 1994参照）。副生成物であるＣ３ａ、Ｃ４ａ又はＣ５ａといった化学走化性因子は、さらに白血球を損傷部へと供給する（Hugli, Crit. Rev. Immunol., 1, 321, 1981参照）。供給された白血球又は損傷部に元来存在する白血球は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を介して抗体結合細胞（免疫複合体）を認識する。ＦｃＲが免疫複合体により架橋されると、白血球は、宿主細胞の表面上に存在する特異的な受容体と結合するＴＮＦ−αを放出し（Debets他, J Immunol., 141, 1197, 1988参照）、アポトーシス又は細胞損傷を誘導する（Micheau他, Cell, 114, 181, 2003参照）。活性化ＦｃＲによって、走化性サイトカインの放出も始まり、様々なサブセットの白血球が損傷部に供給される（Chantry他, Eur. J. Immunol., 19, 189, 1989参照）。ＦｃＲに加えて、細胞傷害性Ｔ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）も宿主細胞を認識することができ、活性化ＴＣＲは架橋ＦｃＲと同様に機能する（Brehm他, J. Immunol., 175, 5043, 2005参照）。ＴＣＲの機能は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と相互作用しながら抗原提示するという明確な特徴を有する（Isaacs他, Inflamm. Bowel Dis., 11, Suppl 1, S3, 2005及びGarcia他, Cell, 122, 333, 2005参照）。ＴＣＲが介在する細胞傷害機能はあまり特徴付けられていないが、免疫グロブリン及びＴＣＲが、標的となる特異的構造を認識することができる特有の分子であるので、自己抗体が同定されない場合において関与している可能性がある。これが、自己免疫疾患の分子機構の全般的な仮説である。
【０００５】
クローン病（ＣＤ）は、消化管の炎症を伴う免疫疾患である。臨床的には明確に特徴付けられているが、その病因はあまり理解されていない。しかし、腫瘍壊死因子スーパーファミリー２（ＴＮＦＳＦ−２）としても知られるＴＮＦ−αの発現が、ＣＤ等の炎症性腸
疾患で増大することが知られている。軽度から中度のＣＤであれば、スルファサラジン又は糖質コルチコイドといった５−ＡＳＡ剤、あるいはアザチオプリン又は６−メルカプトプリンといったプリンアナログで治療することができるが、シクロスポリン、タクロリムス又は抗炎症性サイトカインの投与といった標準的な療法では効果がない重度のＣＤ症例に対する治療の選択肢は限定されており、効果が様々である。ほとんどのＣＤ患者は少なくとも１つの外科的診療を必要とする。治療法の選択はＣＤ患者の疾患状態の評価によるので、疾患状態を評価し、疾患の進行をモニタリングする新規の方法を開発することが望まれる。
【０００６】
ＴＮＦ−αに対するマウス−ヒトキメラ型モノクローナル抗体であるインフリキシマブ（レミケード（登録商標））の開発は、重度のＣＤ療法に関する近年における進歩である。しかしながら、患者の約６５％だけがこの作用物質に反応し、その患者のうち約半数だけが抗体を継続的（典型的には８週ごとに１回を４４週間）に投与した後に完全に回復する。治療コストが年間数万ドルに達することもあるため、ＣＤ患者がインフリキシマブによる治療の対象として適しているか否かを迅速且つ容易に判定し、治療開始後のインフリキシマブ治療の有効性を評価する方法が強く望まれる。
【０００７】
さらに、ＣＤ治療に用いることができる新規の作用物質を迅速にスクリーニングする方法は、現行の治療法を補うかそれに代わる新規の治療法を開発するのに非常に有益である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一つの実施の形態において、クローン病のヒトが治療に応答するか否かを判定する方法であって：ヒト由来の白血球を含む第１サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること；刺激後、第１サンプル中の、腫瘍壊死因子サブファミリー（ＴＮＦＳＦ）−２、ＴＮＦＳＦ−５、ＴＮＦＳＦ−６、ＴＮＦＳＦ−１４、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＣＬ）−２、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４及びケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＸＣＬ）−１０から成る群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること；ヒト由来の白血球を含む第２サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで対照刺激物質により白血球を刺激すること；刺激後、第２サンプル中の前記ｍＲＮＡの量を測定すること；並びに第１サンプル中の前記ｍＲＮＡの量と、第２サンプル中の前記ｍＲＮＡの量との比を求めることを含み、
ヒトにおいてはこの比が約１．７：１以上である場合に治療に応答する可能性あると判断する方法が提供される。
【０００９】
さらなる態様において、第１サンプル中の白血球を刺激することは、抗Ｔ細胞受容体抗体を第１サンプルと混合することを含む。
【００１０】
さらなる態様において、第１サンプル中の白血球を刺激することは、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質を第１サンプルと混合することを含む。
【００１１】
さらなる態様において、第１サンプル及び第２サンプルの少なくとも１つは全血を含む。
【００１２】
さらなる態様において、前記対照刺激物質は精製された対照免疫グロブリンを含む。
【００１３】
さらなる態様において、治療法はＴＮＦ−α活性を標的とする。
【００１４】
さらなる態様において、治療法はインフリキシマブの投与を含む。
【００１５】
さらなる態様において、治療法はシクロスポリンＡ及びタクロリムスから成る群から選択される作用物質の投与を含む。
【００１６】
一つの実施形態において、ヒトにおけるクローン病療法の有効性を評価する方法であって、ヒト由来の白血球を含む第１サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること；ヒト由来の白血球を含む第２サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで対照刺激物質により白血球を刺激すること；刺激後、第１サンプル及び第２サンプル中の腫瘍壊死因子サブファミリー（ＴＮＦＳＦ）−２、ＴＮＦＳＦ−５、ＴＮＦＳＦ−６、ＴＮＦＳＦ−１４、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＣＬ）−２、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４及びケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＸＣＬ）−１０から成る群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること；第１サンプル中の前記ｍＲＮＡ量と、第２サンプル中の前記ｍＲＮＡ量との第１の比を算出すること；治療をヒトで行うこと；治療後に得られるヒト由来の白血球を含む第３サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること；治療後に得られるヒト由来の白血球を含む第４サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記対照刺激物質により白血球を刺激すること；刺激後、第３サンプル及び第４サンプル中の前記ｍＲＮＡのレベルを測定すること；第３サンプル中の前記ｍＲＮＡ量と、第４サンプル中の前記ｍＲＮＡ量との第２の比を算出すること；並びに第１の比と第２の比とを比較することを含み、
これらの比の有意差を効果的な治療法の指標とする方法が提供される。
【００１７】
さらなる態様において、第１サンプル及び第３サンプルにおいて白血球を刺激することは、抗Ｔ細胞受容体抗体をサンプルと混合することを含む。
【００１８】
さらなる態様において、第１サンプル及び第３サンプルにおいて白血球を刺激することは、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質をサンプルと混合することを含む。
【００１９】
さらなる態様において、前記対照刺激物質は、精製された対照免疫グロブリンを含む。
【００２０】
さらなる態様において、第１、第２、第３及び第４サンプルの少なくとも１つが全血を含む。
【００２１】
さらなる態様において、これらの比において有意差を有するとは、第２の比が第１の比よりも大きいことであり、治療法が腫瘍壊死因子αの不活性化を含む。
【００２２】
さらなる態様において、治療法はインフリキシマブの投与を含む。
【００２３】
さらなる態様において、これらの比において有意差を有するとは、第１の比が第２の比よりも大きいことである。
【００２４】
さらなる態様において、治療法がシクロスポリンＡ及びタクロリムスから成る群から選択される作用物質の投与を含む。
【００２５】
一つの実施形態において、クローン病を治療すると推定される作用物質を同定する方法
であって、抗Ｔ細胞受容体抗体に曝された場合に、腫瘍壊死因子サブファミリー（ＴＮＦＳＦ）−２、ＴＮＦＳＦ−５、ＴＮＦＳＦ−６、ＴＮＦＳＦ−１４、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＣＬ）−２、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４及びケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＸＣＬ）−１０から成る群から選択されるｍＲＮＡの転写が白血球において少なくとも１．７倍に増大するヒトに由来する白血球を含む第１、第２、第３及び第４サンプルを得ること；第１サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること；第２サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで対照刺激物質により白血球を刺激すること；刺激後、第１及び第２サンプル中の前記ｍＲＮＡ量を測定すること；第１サンプル中の前記ｍＲＮＡの量と、第２サンプル中の前記ｍＲＮＡの量の第１の比を算出すること；第３及び第４サンプルを作用物質に曝すこと；曝露後、第３サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること；曝露後、第４サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記対照刺激物質により白血球を刺激すること；刺激後、第３及び第４サンプルにおいて前記ｍＲＮＡのレベルを測定すること；第３サンプル中の前記ｍＲＮＡ量と、第４サンプル中の前記ｍＲＮＡ量の第２の比を算出すること；並びに第１の比と第２の比とを比較することを含み、
これらの比の有意差を推定上の作用物質の指標する方法が提供される。
【００２６】
さらなる態様において、第１及び第３サンプル中の白血球を刺激することは、抗Ｔ細胞受容体抗体をサンプルと混合することを含む。
【００２７】
さらなる態様において、第１及び第３サンプル中の白血球を刺激することは、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質をサンプルと混合することを含む。
【００２８】
さらなる態様において、前記対照刺激物質は、精製された対照免疫グロブリンを含む。
【００２９】
さらなる態様において、第１、第２、第３及び第４サンプルの少なくとも１つが全血を含む。
【００３０】
さらなる態様において、これらの比において有意差を有するとは、第１の比が第２の比よりも大きいことである。
【００３１】
一つの実施形態において、ヒトにおけるクローン病の状態を評価する方法であって：白血球を含み、ヒトから最初に得られた第１サンプル中の白血球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激すること；刺激後、第１サンプル中の、腫瘍壊死因子サブファミリー（ＴＮＦＳＦ）−２、ＴＮＦＳＦ−５、ＴＮＦＳＦ−６、ＴＮＦＳＦ−１４、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＣＬ）−２、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４及びケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＸＣＬ）−１０から成る群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること；最初にヒトから得られた白血球を含む第２サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで対照刺激物質により白血球を刺激すること；刺激後、第２サンプル中の前記ｍＲＮＡ量を測定すること；第１サンプル中の前記ｍＲＮＡ量と、第２サンプル中の前記ｍＲＮＡ量の第１の比を求めること；白血球を含み、最初に引き続き２回目にヒトから得られた第３サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること；刺激後、第３サンプル中の前記ｍＲＮＡ量を測定すること；２回目にヒトから得られた白血球を含む第４サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記対照刺激物質により白血球を刺激すること；刺激後、第４サンプル中の前記ｍＲＮＡ量を測定すること；第３サンプル中の前記ｍＲＮＡ量と、第４サンプル中の前記ｍＲＮＡ量の第２の比を求めること；並びに第１の比と第２の比とを比較することを含み、
第１の比と第２の比との有意差を疾患状態の変化の指標とする方法が提供される。
【００３２】
さらなる態様において、第１及び第３サンプル中の白血球を刺激することは、抗Ｔ細胞受容体抗体をサンプルと混合することを含む。
【００３３】
さらなる態様において、第１及び第３サンプル中の白血球を刺激することは、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質をサンプルと混合することを含む。
【００３４】
さらなる態様において、前記対照刺激物質が精製された対照免疫グロブリンを含む。
【００３５】
さらなる態様において、第１、第２、第３及び第４サンプルの少なくとも１つが全血を含む。
【００３６】
さらなる態様において、これらの比において有意差を有するとは、第２の比が第１の比よりも大きいことであり、疾患状態の変化が疾患の進行を示す。
【００３７】
さらなる態様において、これらの比において有意差を有するとは、第１の比が第２の比よりも大きいことであり、疾患状態の変化が疾患の退行を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本開示は、ＣＤ患者がレミケード（登録商標）による治療のような特異的治療法の対象として適しているか否かを判定する場合における、特異的な細胞刺激物質に応じた白血球中の異なるｍＲＮＡ転写パターンの使用に関する。また本開示は、レミケード（登録商標）による治療のような、ＣＤ患者に実施する治療法が有効であるか否かを判定する場合における、このような異なる転写パターンの使用に関する。さらに本開示は、ＣＤ治療に用いる候補物質をスクリーニングする場合における、このような異なる転写パターンの使用に関する。本開示は、患者におけるＣＤの状態を経時的に評価し、疾患の進行をモニタリングする際のこのような異なる転写パターンの使用に関する。
【００３９】
上記のように、ＣＤの病因は、ＣＤ患者の免疫細胞におけるＦｃＲ又はＴＣＲの機能性に関連する。疾患におけるＦｃＲ又はＴＣＲの潜在的な役割をさらに評価するために、自己免疫疾患の患者の病的部位へ白血球が遊走するまで、末梢血の循環白血球におけるＦｃＲ又はＴＣＲの機能が通常通りであるか、又はこの遊走前に既に増強されているかを判定することが有用である。ＣＤ患者の末梢血の白血球においてＦｃＲ又はＴＣＲの機能が通常通りであるか、増強されているかを分析するために、熱凝集ヒトＩｇＧ（ＨＡＧ）又はα／βＴ細胞受容体（抗ＴＣＲ）に対するモノクローナル抗体をヘパリン化全血に直接添加し、それぞれＦｃＲ及びＴＣＲを刺激した。ＦｃγＲＩ、ＩＩａ、ＩＩｂ及びＩＩＩ（GeneBank UniGeneデータベース）といった、ＩｇＧに対する複数のＦｃＲ（ＦｃγＲ）が存在するが、ＨＡＧは全てのＦｃＲサブタイプと反応することができる一般的な刺激物質として作用する。ＴＮＦスーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）のｍＲＮＡ（例えば GeneBank UniGeneデータベース参照）、選択されたＣＣＬ及びＣＸＣＬケモカインのｍＲＮＡ、及びＨＡＧ及び抗ＴＣＲを有する刺激物質によって生じる化学走化性インターロイキンのｍＲＮＡ（ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＩＬ−８）のレベルの変化を定量した。全血と混合する際に、γ／δ抗ＴＣＲがＴＮＦＳＦのｍＲＮＡを全く誘導しなかったので、α／β抗ＴＣＲを刺激物質に用いた。
【００４０】
利用した方法は以下のようなものであった。様々なＴＮＦＳＦ及びケモカイン遺伝子の
ヌクレオチド配列は、GeneBankのUniGeneデータベースから検索した。それぞれの遺伝子のＰＣＲプライマーは、Primer Express（Applied Biosystem, フォスターシティ, カリフォルニア州）及びHYBsimulator（RNAture, アーバイン, カリフォルニア州）によって設計された（Mitsuhashi他, Nature, 367:759, 1994 及びHyndman他, BioTechniques, 20:1090, 1996を参照）。この配列は以下の表１で要約される。オリゴヌクレオチドはIDT（コーラルビル, アイオワ州）で合成された。
【００４１】
【表１−１】
2009535016.tif 000003
【表１−２】
2009535016.tif 000004
【表１−３】
2009535016.tif 000005
【００４２】
熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）は、２０ｍｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ（Sigma, セントルイス）をＰＢＳ中で６３℃で１５分間加熱することによって調製した（Ostreiko他, Immunol Lett., 15, 311, 1987参照）。８ウェルストリップマイクロチューブに、１．２μｌのＨＡＧ又は抗ＴＣＲ抗体（ＩｇＧ１κ）又は対照（ＨＡＧをリン酸緩衝生理食塩水に、又は抗ＴＣＲをマウス対照ＩｇＧ１κに代えたもの）（BioLegend, サンディエゴ）を添加し、使用まで−２０℃で保存した。本明細書中では、抗ＴＣＲ抗体刺激に対する対照として、マウスＩｇＧ１κを利用したが、他の精製した対照免疫グロブリンも利用することができる。新鮮なヘパリン化全血６０μｌをそれぞれのウェルに添加して３セット作成し、蓋をして３７℃で２〜８時間インキュベートした。それぞれの処理後、以下に記載されるように
全血５０μｌをフィルタプレートに移した。それぞれの血液サンプルを使用まで−８０℃で凍結保存した。
【００４３】
ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡは、Mitsuhashi他, Clin. Chem., 52:4, （doi:10.1373/clinchem.2005.048983で公開）に記載された方法に従って全血から調製した。参照より本明細書中に援用される米国特許出願第１０／７９６，２９８号で開示された方法を利用してもよい。すなわち、９６ウェルフィルタプレートを回収プレート上に置き、ｐＨ７．４の５ｍＭトリス１５０μｌを加えた。４℃で１分間、１２０×ｇで遠心分離した後、血液サンプル５０μｌをそれぞれのウェルに加え、すぐに４℃で２分間、１２０×ｇで遠心分離した後、４℃で５分間、２０００×ｇで遠心分離しながらＰＢＳ３００μｌで１回、それぞれのウェルを洗浄した。それから、１％の２−メルカプトエタノール（Bio Rad, ハーキュリーズ, カリフォルニア州, 米国）、０．５ｍｇ／ｍｌのプロテナーゼＫ（Pierce, ロックフォード, イリノイ州, 米国）、０．１ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ（5 Prime Eppendorf/Brinkmann, ウェストベリー, ニューヨーク州, 米国）、０．１ｍｇ／ｍｌの大腸菌ｔＲＮＡ（Sigma）、それぞれが特異的な１０ｍＭのリバースプライマーのカクテル、及び標準的なＲＮＡ３４オリゴヌクレオチドを添加したストック溶解緩衝液６０μｌをフィルタプレートに加えた後、３７℃で１０分間インキュベートした。それから、フィルタプレートをオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレート（GenePlate, RNAture）（参照により本明細書中に援用される、Mitsuhashi他, Nature, 357:519, 1992、及びHamaguchi他, Clin. Chem., 44, 2256, 1998参照）上に置き、４℃で５分間、２０００×ｇで遠心分離した。４℃で一晩保存した後、４℃でマイクロプレートをプレーン溶解緩衝液１００μｌで３回、その後洗浄緩衝液（０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４の１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ）１５０μｌで３回洗浄した。１×ＲＴ緩衝液、１．２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、４ユニットのｒＲＮａｓｉｎ、及び８０ユニットのＭＭＬＶ逆転写酵素（Promega）（プライマーなし）を含有する緩衝液３０μｌを添加し、３７℃で２時間、インキュベートすることによって、それぞれのウェルでｃＤＮＡを直接合成した。特異的なプライマーでプライミングしたｃＤＮＡが溶液中に存在し、残ったオリゴ（ｄＴ）プライミングｃＤＮＡをマイクロプレートに固定した（Hugli, Crit. Rev. Immunol., 1, 321, 1981参照）。ＳＹＢＲグリーンＰＣＲ（参照により本明細書中に援用されるMorrison他, Biotechniques, 24, 954, 1998）のために、ｃＤＮＡを水で４倍に希釈し、ｃＤＮＡ溶液４μｌを３８４ウェルＰＣＲプレートに直接移し、これにｉＴａｑ  ＳＹＢＲマスターミックス（BioRad, ハーキュリーズ, カリフォルニア州）を５μｌ及びオリゴヌクレオチドカクテル（フォワード及びリバースプライマーを１５μＭずつ）を１μｌ加え、９５℃で１０分間を１サイクル、その後９５℃で３０秒間及び６０℃で１分間を４５サイクルでＰＣＲをＰＲＩＳＭ
７９００ＨＴ（ABI）において行った。ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲも利用することができ、その場合、ｃＤＮＡ溶液を３８４ウェルＰＣＲプレートに直接移し、これにＴａｑＭａｎ汎用マスターミックス（ABI）を５μｌ及びオリゴヌクレオチドカクテル（フォワード及びリバースプライマーを１５μＭずつ、並びに３〜６μＭのＴａｑＭａｎプローブ）を１μｌ加え、９５℃で１０分間を１サイクル、その後９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間及び６０℃で１分間を４５サイクルでＰＣＲをＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ（ABI）において行った。
【００４４】
１×ＲＴ緩衝液を陰性対照として用い、プライマーダイマーがＳＹＢＲグリーンＰＣＲ条件下で生成しなかったことを確認した。さらに、溶解曲線をそれぞれの場合で解析し、ＰＣＲシグナルが単一のＰＣＲ産物に由来するものであることを確認した。Ｃｔは、解析用ソフトウェア（SDS, ABI）によって求められた。ΔＣｔは、適切な対照サンプルのＣｔ値を差し引くことによって算出され、倍数増加は、それぞれのＰＣＲサイクルの有効性を１００％と仮定することによって、２(-ΔCt)として算出された。
【００４５】
図１は、末梢全血のヒト白血球におけるＴＮＦＳＦ、ＣＣＬ、ＣＸＣＬ及びインターロ
イキンのｍＲＮＡの、ＦｃＲ及びＴＣＲ介在性の遺伝子発現の分析の結果を示す。この結果は、対照値に対する倍数増加として図１に表される。応答個体は、刺激物質に応じた前記ｍＲＮＡレベルにおいて１．７倍を超える増大を示す個体と定義された。他の実施形態では、対照刺激物質の場合と比較して、前記ｍＲＮＡレベルにおいて１．７倍を超える減少を示す個体と定義された。各データ（健常な成人では○、及びＣＤ患者では△）は、３セットの一定分量の全血の平均であった。点線で囲まれた領域は、平均±外部対照ＲＮＡ３４（Ｒ３４）の３つの値の標準偏差である。図１Ｂで示される統計的有意性（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１）は、上記のように応答個体及び非応答個体の集団を用いたχ2検定によって算出された。＋＋は、応答個体集団のみの倍数増加の対数値を用いたｔ検定でｐ＜０．０１であることを示す。
【００４６】
図１Ａで示されるように、ＨＡＧが主にＴＮＦＳＦ−２、８、１５、１８、ＩＬ−１Ｂ、８、ＣＣＬ−２、３、４、１１、２０、及びＣＸＣＬ−１、２、３を誘導したのに対し、抗ＴＣＲは異なるＴＮＦＳＦ（ＴＮＦＳＦ−１、２、５、６、９、１０、１４）及びケモカイン（ＩＬ−６、ＣＣＬ−２、３、４、８、２０、及びＣＸＣＬ−１０）のｍＲＮＡを誘導した。ＨＡＧで刺激された健常な個体の全血を用いて得られ、サイクル閾値（Ｃｔ）について表されたさらなるデータ（下記参照）が図１３に示される。ＣＤ患者はＨＡＧ誘導性の活性の増大を全く示さなかったが、抗ＴＣＲ誘導性のＴＮＦＳＦ−２、５、６、１４、及びＣＣＬ−２、３、４に対する応答個体集団（１．７倍を超える増大を示す）は、健常な対照よりもＣＤ患者において有意に大きかった。興味深いことに、ＣＤ患者はＴＮＦＳＦ−１４よりもＴＮＦＳＦ−２（＝ＴＮＦα）を有意に（ｐ＜０．００１）多く誘導した。これらのデータによって、末梢血白血球におけるＴＣＲの機能障害が示唆される。このシステムは、ＣＤ及び他の自己免疫疾患における免疫細胞の細胞傷害機能の分析に有用である。
【００４７】
図２は、様々なＨＡＧにより誘導される前記ｍＲＮＡ応答間の相関関係を示す。図２では、図１Ａのデータをｘ−ｙプロットに変換した。図２ＡはＩＬ−１Ｂ対ＩＬ−８を示し、図２ＢはＩＬ−１Ｂ対ＣＣＬ−２を示し、図２ＣはＩＬ−１Ｂ対ＣＸＣＬ−１を示し、図２ＤはＣＸＣＬ−１対ＣＸＣＬ−２を示し、図２ＥはＩＬ−１Ｂ対ＴＮＦＳＦ−１５を示し、図２ＦはＴＮＦＳＦ−１５対ＴＮＦＳＦ−８をそれぞれ示す。この図では、○：健常な成人、▲：ＣＤを示す。
【００４８】
図３は、様々な抗ＴＣＲにより誘導される前記ｍＲＮＡ応答間の相関関係を示す。図３では、図１Ａのデータをｘ−ｙプロットに変換した。図３ＡはＴＮＦＳＦ−２対ＴＮＦＳＦ−１４を示し、図３ＢはＴＮＦＳＦ−５対ＴＮＦＳＦ−６を示し、図３ＣはＣＣＬ−２対ＣＣＬ−３を示し、図３ＤはＣＣＬ−２対ＣＣＬ−４を示し、図３ＥはＣＣＬ−２対ＣＣＬ−２０を示し、図３ＦはＣＣＬ−８対ＣＸＣＬ−１０をそれぞれ示す。この図では、○：健常な成人、▲：ＣＤを示す。図３Ａでは、対照及びＣＤ患者の両方に対する回帰直線が示されている。
【００４９】
個体間の変動が広く、また応答個体と非応答個体が存在することから、通常のスチューデントｔ検定はこれらの結果の分析に適切ではない。ＣＤ患者におけるＴＮＦＳＦ−２、５、６、１４、及びＣＣＬ−２、３、４に対する応答個体の集団（上述のように１．７倍を超える増大を示す）はχ2検定によると、それぞれ９２．９％、６６．７％、７５．０％、８２．１％、７５．０％、７５．０％及び８３．３％であり、これは健常な対照のもの（それぞれ、３８．９％、２８．６％、４２．９％、４４．４％、３３．３％、２０．０％及び２０．０％）より有意に高かった（図１Ｂ：＊参照）。応答個体集団の倍数増加を対数スケールで比較した場合、ＣＤ患者は対照被験者よりも有意に（Ｐ＜０．０１）高い値を示した（図１Ｂ：＋＋参照）。さらに、ＨＡＧにより誘導される遺伝子発現の結果と同様に（図２）、特定のＴＮＦＳＦ及びケモカインに対する応答個体は、他のＴＮＦＳ
Ｆ及びケモカインに対する応答個体でもあり（図３）、このことは抗ＴＣＲにおけるデータの変動がアッセイ手法ではなく、個々の応答性に由来することを示唆していた。驚くべきことに、抗ＴＣＲにより誘導されるＴＮＦＳＦ−２（＝ＴＮＦα）と、ＴＮＦＳＦ−１４との間の相関関係は、健常な対照とＣＤ患者との間で大きく異なっており（ｐ＜０．００１）、ＴＮＦＳＦ−２及びＴＮＦＳＦ−１４の応答性は健常な対照とＣＤ患者の両方で互いに相関しているものの、ＣＤ患者はＴＮＦＳＦ−１４よりもＴＮＦＳＦ−２を多く誘導する（図３Ａ）。
【００５０】
外部対照ＲＮＡ３４は全ての場合で不変であり、アッセイが適切に行われていたことを示唆していた。この結果によって個体間の変動が広いことが示されたが、特定のＴＮＦＳＦ及びケモカインに対する応答個体は、他のＴＮＦＳＦ及びケモカインに対する応答個体でもあり（図２参照）、データの変動がアッセイ手法ではなく、個々の応答性に由来することを示唆していた。興味深いことに、ＣＤ患者はＨＡＧにより誘導される活性の増大を全く示さず、何人かのＣＤ患者では実際に、ＨＡＧにより誘導されるＩＬ−１Ｂ、ＩＬ−８、ＣＣＬ−２０及びＣＸＣＬ−３のｍＲＮＡ発現の活性の低減が示された（図１Ａ）。これに対して、抗ＴＣＲは、様々なＴＮＦＳＦ（ＴＮＦＳＦ−１、２、５、６、９、１０、１４）及びケモカイン（ＩＬ−６、ＣＣＬ−２、３、４、８、２０、及びＣＸＣＬ−１０）のｍＲＮＡを誘導した。ＩＬ−１Ｂ及びＩＬ−８のｍＲＮＡは抗ＴＣＲでは誘導されなかった。
【００５１】
ＨＡＧ刺激に対する用量応答及び速度論研究が図４で示される。図４は、末梢血白血球におけるＴＮＦＳＦ及びケモカインのｍＲＮＡ発現に対する熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）の効果を示す。図４Ａは反応速度を示す。３セットの６０μｌのアリコートのヘパリン化全血をそれぞれＰＢＳ（○、△）、又は２００μｇ／ｍｌのＨＡＧ（●、▲）と混合し、３７℃で０〜１２時間インキュベートした。それから、ＴＮＦＳＦ−１５（○、●）及びＩＬ−８（△、▲）のｍＲＮＡを上記のように定量した。対照として時間０での値を用いて倍数増加を算出した。図４Ｂは用量応答を示す。３セットの６０μｌのアリコートのヘパリン化全血をそれぞれ様々な濃度のＨＡＧと混合し、３７℃で２時間インキュベートした。それから、ＴＮＦＳＦ−２（●）、ＴＮＦＳＦ−１５（▲）、ＩＬ−８（○）、ＩＬ−１Ｂ（◇）及びＣＸＣＬ−２（△）のｍＲＮＡを上記のように定量した。対照として溶媒（ＰＢＳ）に対する値を用いて倍数増加を算出した。それぞれのデータ点は、３セットのアリコートの全血の平均±標準偏差（Ａ）又は平均（Ｂ）であった。
【００５２】
抗ＴＣＲ刺激に対する用量応答及び速度論研究が図５で示される。図５は、末梢血白血球におけるＴＮＦＳＦ及びケモカインのｍＲＮＡに対する抗ＴＣＲ抗体の効果を示す。図５Ａは、刺激物質の用量応答及び刺激物質の反応速度を示す。３セットの６０μｌのアリコートのヘパリン化全血をそれぞれ１０（●）、１（◆）又は０．１（▲）μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトα／β  ＴＣＲ  ＩｇＧ１κ、ＰＢＳ（○）、又は１０（□）μｇ／ｍｌの精製マウスＩｇＧ１κと混合し、３７℃で０〜７時間インキュベートした。それから、ＴＮＦＳＦ−２のｍＲＮＡを上記のように定量した。図５Ｂは、刺激物質の反応速度を示す。３セットの６０μｌのアリコートのヘパリン化全血をそれぞれ１０μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトα／β  ＴＣＲ  ＩｇＧ１κ、又は１０μｇ／ｍｌの精製マウスＩｇＧ１κと混合し、３７℃で２時間インキュベートした。それから、ＴＮＦＳＦ−２（●）、ＴＮＦＳＦ−５（□）、ＴＮＦＳＦ−６（▲）、ＴＮＦＳＦ−９（◆）、ＴＮＦＳＦ−１４（○）、及びＣＸＣＬ−１０（△）のｍＲＮＡを上記のように定量した。対照としてマウスＩｇＧ１κの値を用いて倍数増加を算出した。それぞれのデータは、３セットのアリコートの全血の平均±標準偏差（Ａ）又は平均（Ｂ）であった。
【００５３】
上記の抗ＴＣＲ及びＨＡＧに加えて、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ
（Ｃｏｎ−Ａ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＡ、熱凝集ＩｇＥ、及び熱凝集ＩｇＭといった他の刺激物質も、図６〜図１２及び図１４〜図１６で示されるように、健常な個体から採取された全血において様々なサブタイプのＴＮＦＳＦ及びケモカインを誘導する。これらのアッセイにおけるプロトコルは、それぞれの場合で利用された刺激物質が異なることを除いて上記で示されたものと同じであった。図６〜図１６では、データは、特定量のＰＣＲ産物を生成するのに必要とされるＰＣＲのサイクル数であるサイクル閾値（Ｃｔ）について表される。刺激したサンプルのＣｔ値から刺激していないサンプルのＣｔ値を差し引くことによって、ΔＣｔ値を得た。Ｃｔは対数スケールであるので、１ΔＣｔ単位は、量が２倍変化することを示す。発現レベルが高くなると、標準量の産物を生成するのに必要とされるＰＣＲのサイクル数が減少するので、負のΔＣｔ値は発現の増大を示す。
【００５４】
これらの刺激物質の多くが抗ＴＣＲのものと同様の刺激パターン示す。特に、図６及び図７で示されるように、ＰＭＡ及びＰＨＡは、ＣＤ患者において抗ＴＣＲが刺激するのと同じＴＮＦＳＦサブタイプ（ＴＮＦＳＦ−２、−５、−６及び−１４）を刺激する。さらに、図８〜図１２で示されるように、ＷＧＡ、ＣｏｎＡ、ＬＰＳ、ジャカリン及びフコイダンは全て、ＣＤと関連することが知られるＴＮＦＳＦ−２サブタイプを刺激する。図１６で示されるように、熱凝集ＩｇＥはＴＮＦＳＦ−２、並びにＣＣＬ−３、−４、及びＣＸＣＬ−１０を刺激する。最後に、図１４で示されるように、熱凝集ＩｇＡは、ＣＣＬ−２、−３及び−４を刺激する。刺激パターンと、上記の抗ＴＣＲパターンとが類似しているために、これらの刺激物質は、ＣＤ患者に対する治療法を評価し、ＣＤを治療する新規の薬剤をスクリーニングするのにも有用である。
【００５５】
ＣＤで起こると考えられているような免疫系の活性によって生じる細胞死を研究するのに、細胞傷害アッセイが一般的に用いられている。一般的に、様々な比で51Ｃｒ充填した標的細胞をエフェクター細胞とインキュベートし、死細胞又は損傷細胞から放出された51Ｃｒ放射活性の量を定量することによって細胞傷害アッセイが行われる（Dunkley他, J Immunol Methods, 6, 39, 1974参照）。いくつかの場合、放射性物質を蛍光物質のような非放射性物質に置き換えているが（Kruger-Krasagakes他, J Immunol Method, 156, 1, 1992参照）、基本原理は変わらない。このように、細胞傷害アッセイの結果は現実の細胞死を反映する。
【００５６】
しかし、非生理的な実験条件下で細胞傷害アッセイを行い、複雑な細胞間相互作用及び細胞−血漿間相互作用をこのような研究の中で評価するのは難しい。さらに、細胞傷害アッセイは、どのＴＮＦＳＦが細胞死に関与するのかを示していない。エフェクター細胞が標的細胞を認識すると、単一のエフェクター細胞では多くの標的細胞を破壊するのに十分ではないので、エフェクター細胞の機能は標的細胞を破壊するだけでなく、他のエフェクター細胞を供給することでもある。この供給機能は、化学走化性因子の放出によって示されると考えられる。エフェクター細胞によって放出されるこのような化学走化性因子の識別は、従来の細胞傷害アッセイでは示されない。しかし、本開示に記載のアッセイシステムによって、エフェクター細胞において多くの種類の遺伝子発現を同時に同定することができる。
【００５７】
応答性ＴＮＦＳＦ及びケモカインサブタイプの同定は、これらの分子が標的細胞又は白血球上の特異的な受容体と反応するので非常に重要である。例えば、UniGeneの発現配列タグ（ＥＳＴ）プロファイルデータベースによれば、ＴＮＦＳＦ−２に対する受容体（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）−１Ａ）は小腸に存在するが、ＴＮＦＳＦ−５、６及び１４に対する受容体（ＴＮＦＲＳＦ−５、6及び１４）は存在しない。したがって、ＣＤ患者におけるＴＮＦＳＦ−２活性の増大（図１Ｂ、図３Ａ）は主なＣＤ疾患部位である小腸に対する損傷に関連する。さらに、ＣＣＬ−２の受容体（ＣＣＲ
−２）は、単球化学誘引タンパク質−１の受容体として知られており、ＣＸＣＬ−１０に対する受容体（ＣＸＣＲ−３）はＮＫ細胞及びＴ細胞の遊走に関与する（Unigeneデータベース）。上記のように、開示されたデータは、刺激するとＣＤ患者のエフェクター白血球はＣＣＬ−２及びＣＸＣＬ−１０のｍＲＮＡの転写を増大させることを示しており、ＣＤ疾患部位で見られる様々な白血球浸潤が説明される。
【００５８】
全血の使用が培養培地において単離白血球を使用することよりも好ましく、これは前者が後者よりも生理学的であり、全白血球をスクリーニングすることができるためである。より長期的に全血をインキュベートすることによって、さらなる人工産物を生成することができる。したがって、理想的な方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏからｅｘ  ｖｉｖｏに切り替えることによって、短期間のインキュベート中の全血における初期の致死シグナル及び供給シグナルを同定することである。ｍＲＮＡの転写は、タンパク質合成又は最終的な生物学的生産のいずれよりも早くに起きる事象である。したがって、前記ｍＲＮＡはこの研究の論理的標的である。図１で示されるように、本開示のデータによって、多くのＴＮＦＳＦ、ＣＣＬ、ＣＸＣＬ及びインターロイキンのｍＲＮＡの中で、ＦｃＲ及びＴＣＲが遺伝子の様々なサブクラスを誘導することが示される。
【００５９】
近年の研究によって、ＴＮＦＳＦ−２がＣＤにおける主な要因の１つであることが示唆されている（Isaacs他, Inflamm. Bowel Dis., 11, Suppl 1, S3, 2005参照）。実際、上記のように、ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体であるレミケード（登録商標）が、重度のＣＤで、他の従来の治療でうまくいかなかった患者に臨床的に用いられる。ＴＮＦ−αは疾患部位でＣＤの病因に重要な役割を果たすが、本開示で記載されるデータによって、これまでに観察されていない、末梢血の循環白血球におけるＴＮＦ−α（ＴＮＦＳＦ−２）を含む幾つかのＴＮＦＳＦのＴＣＲ誘導性の機能亢進の基礎が示される。本方法が腸組織ではなく全血を利用するので、ＣＤに対する診断試験として用いて、ＴＮＦ−α療法に対する応答性の見込みを評価し、治療応答をモニタリングすることができる。
【００６０】
特に、ＣＤのヒトが、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体を利用する治療法のような、ＴＮＦ−α活性を標的とする治療法対して応答する可能性があるか否かを判定する方法の好ましい実施形態において、上記のように、ＣＤ患者から全血を得て、血液サンプルに抗ＴＣＲ抗体刺激、及び任意で対照刺激（１０ｍｇ／ｍｌの精製マウスＩｇＧ１κ）を与える。上記のようにサンプル中のＴＮＦＳＦ−２のｍＲＮＡレベルを測定することができる。抗ＴＣＲ抗体で刺激した後にＴＮＦＳＦ−２のｍＲＮＡレベルが有意に上昇したＣＤ患者（例えば、１．７倍を超える倍数変化によって示されるような）は、ＴＮＦ−αを標的とする治療法に適した候補者である。
【００６１】
あるいは、ＴＮＦＳＦ−５、ＴＮＦＳＦ−６、ＴＮＦＳＦ−１４、ＣＣＬ−２、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４又はＣＸＣＬ−１０のようなＴ細胞刺激物質に応じて特異的に転写される１つ又は複数の他のｍＲＮＡのレベルを測定することができる。１つ又は複数のこれらのｍＲＮＡの刺激後のレベルが有意に（１．７倍を超える変化のように）上昇したＣＤ患者は、これらのｍＲＮＡに関与するタンパク質を標的とする治療法に適した候補者である。
【００６２】
さらに、患者においてＴＮＦＳＦ−２、ＴＮＦＳＦ−５、ＴＮＦＳＦ−６、ＴＮＦＳＦ−１４、ＣＣＬ−２、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４及びＣＸＣＬ−１０、ＴＮＦ−αの１つ又は複数を標的とするＣＤ治療の有効性を評価する方法の好ましい実施形態において、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで抗ＴＣＲ抗体又は別の刺激物質を用いたＴ細胞刺激後の全血における前記ｍＲＮＡの量と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの対照刺激後の量との第１の比を治療の開始前に得る。それから一連の治療を開始する。治療の間又は治療後の幾つかの時点で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗ＴＣＲ抗体刺激後の全血における前記ｍＲＮＡの量と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで
の対照刺激後の量との第２の比を得る。これらの比の有意差が治療法の有効性を示す。例えば、治療がインフリキシマブの投与である場合、測定されるｍＲＮＡはＴＮＦＳＦ−２であり、第２の比が第１の比より大きく、治療法の有効性を示す。ＴＮＦ−αに関与するｍＲＮＡに対する誘導性の増大が不活性化の成功を示す理由は、レミケード（登録商標）等の治療物質による分泌ＴＮＦ−αの不活性化が成功した場合に、より多くのＴＮＦＳＦ−２のｍＲＮＡを転写するＴ細胞でフィードバック機構が働くためである。
【００６３】
他の場合において、ＣＤ関連ｍＲＮＡに関する第２の比の減少が療法の成功を示す。このような結果によって、治療後に測定された前記ｍＲＮＡに関してＴ細胞の誘導性が小さくなっていることが示される。例えば、ＴＮＦＳＦ−２に関する白血球の誘導性、つまり放出されたＴＮＦ−αの量を低減させる治療法は、ＣＤの症状を緩和するのに有益であると推測される。同様に、転写されたＣＣＬ−２及びＣＸＣＬ−１０の量の減少によって、白血球浸潤が低減し、重度の症状が軽減すると考えられる。
【００６４】
重要なことに、このｅｘ  ｖｉｖｏにおける方法は、抗ＴＣＲが介在するＴＮＦαのｍＲＮＡ発現を阻害する化合物のスクリーニングにも用いることができる。ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体が疾患部位において既に放出されたＴＮＦ−αと反応する一方で、これらの新規の薬剤候補が白血球のＴＮＦ−α生成を転写レベルで阻害するので、このような化合物は興味深い薬剤標的である。これは自己免疫疾患に対する薬剤開発の新たな戦略である。
【００６５】
開示されたシステムを用いて薬剤化合物をスクリーニングし、それによってＣＤを治療し得ると推定される作用物質を同定する方法の実施形態において、抗ＴＣＲといったＴ細胞刺激に曝された場合に、これらの白血球においてＣＤに関与する前記ｍＲＮＡレベルが少なくとも１．７倍の増大を示す応答個体であると判断されるＣＤ患者から全血を得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗ＴＣＲ抗体又は別の刺激物質を用いたＴ細胞刺激後の全血における前記ｍＲＮＡの量と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの対照刺激後の量との第１の比を算出する。さらに、被験者からの全血サンプルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで薬剤化合物に曝した後、上記のように特異的に刺激する。それから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞刺激後の全血における前記ｍＲＮＡの量と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの対照刺激後の量との第２の比を算出する。これらの比の有意差によって、薬剤化合物がＣＤに対する潜在的な治療法として、さらなる研究候補であることが示される。
【００６６】
さらに、患者から得られた白血球を含むサンプルにおいて、ＴＮＦＳＦ−２、ＴＮＦＳＦ−５、ＴＮＦＳＦ−６、ＴＮＦＳＦ−１４、ＣＣＬ−２、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４及びＣＸＣＬ−１０の１つ又は複数のｍＲＮＡレベルを測定することによってＣＤ患者の疾患状態をモニタリングする方法の好ましい実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗ＴＣＲ抗体又は他の刺激物質を用いたＴ細胞刺激後の全血における前記ｍＲＮＡの量と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの対照刺激後の量との第１の比を１回目に得る。１回目に続く２回目で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞刺激後の全血における前記ｍＲＮＡの量と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの対照刺激後の量との第２の比を得る。これらの比の有意差は疾患状態の変化を示す。例えば、第２の比が第１の比より大きい場合、疾患の進行を示す一方で、第１の比の増大が疾患の退行を示す。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ＣＤ患者及び対照由来の末梢全血中のヒト白血球におけるＴＮＦＳＦ、ＣＣＬ、ＣＸＣＬ及びインターロイキンのｍＲＮＡのＦｃＲ及びＴＣＲ介在性遺伝子発現の定量結果を示す図である。
【図２】ＨＡＧにより誘導される様々なｍＲＮＡ応答間の相関関係を示す図である。
【図３】抗ＴＣＲにより誘導される様々なｍＲＮＡ応答間の相関関係を示す図である。
【図４】末梢血の白血球におけるＴＮＦＳＦ及びケモカインのｍＲＮＡ発現に対する熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）の効果を示す図である。
【図５】末梢血の白血球におけるＴＮＦＳＦ及びケモカインのｍＲＮＡ発現に対する抗ＴＣＲ抗体の効果を示す図である。
【図６】ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）による健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図７】フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）による健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図８】コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）による健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図９】コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）による健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１０】リポ多糖（ＬＰＳ）による健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１１】ジャカリンによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１２】フコイダンによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１３Ａ】熱凝集ＩｇＧによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１３Ｂ】熱凝集ＩｇＧによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１３Ｃ】熱凝集ＩｇＧによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１３Ｄ】熱凝集ＩｇＧによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１４Ａ】熱凝集ＩｇＡによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１４Ｂ】熱凝集ＩｇＡによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１４Ｃ】熱凝集ＩｇＡによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１５Ａ】熱凝集ＩｇＭによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１５Ｂ】熱凝集ＩｇＭによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１５Ｃ】熱凝集ＩｇＭによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１６Ａ】熱凝集ＩｇＥによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１６Ｂ】熱凝集ＩｇＥによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１６Ｃ】熱凝集ＩｇＥによる健常な個体の全血の刺激の結果を示す図である。
【図１】
2009535016.tif 000006
【図２】
2009535016.tif 000007
【図３】
2009535016.tif 000008
【図４】
2009535016.tif 000009
【図５】
2009535016.tif 000010
【図６】
2009535016.tif 000011
【図７】
2009535016.tif 000012
【図８】
2009535016.tif 000013
【図９】
2009535016.tif 000014
【図１０】
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【図１１】
2009535016.tif 000016
【図１２】
2009535016.tif 000017
【図１３Ａ】
2009535016.tif 000018
【図１３Ｂ】
2009535016.tif 000019
【図１３Ｃ】
2009535016.tif 000020
【図１３Ｄ】
2009535016.tif 000021
【図１４Ａ】
2009535016.tif 000022
【図１４Ｂ】
2009535016.tif 000023
【図１４Ｃ】
2009535016.tif 000024
【図１５Ａ】
2009535016.tif 000025
【図１５Ｂ】
2009535016.tif 000026
【図１５Ｃ】
2009535016.tif 000027
【図１６Ａ】
2009535016.tif 000028
【図１６Ｂ】
2009535016.tif 000029
【図１６Ｃ】
2009535016.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成20年12月2日(2008.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クローン病のヒトが治療に応答するか否かを判定する方法であって、
ヒト由来の白血球を含む第１サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
刺激後、第１サンプルにおける腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）−２、ＴＮＦＳＦ−５、ＴＮＦＳＦ−６、ＴＮＦＳＦ−１４、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＣＬ）−２、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４及びケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＸＣＬ）−１０から成る群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること、
ヒト由来の白血球を含む第２サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで対照刺激物質により白血球を刺激すること、
刺激後、第２サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量を測定すること、並びに、
第１サンプル中の前記ｍＲＮＡの量と、第２サンプル中の前記ｍＲＮＡの量との比を求めることを含み、
ヒトにおいては当該比が約１．７：１以上の場合に治療に応答する可能性があると判断する方法。
【請求項２】
第１サンプルにおいて白血球を刺激することが、抗Ｔ細胞受容体抗体を該第１サンプルと混合することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１サンプルにおいて白血球を刺激することが、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＧ、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質を該
第１サンプルと混合することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１サンプル及び第２サンプルの少なくとも１つが全血を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
対照刺激物質が精製された対照免疫グロブリンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
治療法がＴＮＦ−α活性を標的とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
治療法がインフリキシマブの投与を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
治療法がシクロスポリンＡ及びタクロリムスから成る群から選択される作用物質の投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ヒトにおいてクローン病の治療法の有効性を評価する方法であって、
ヒト由来の白血球を含む第１サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
ヒト由来の白血球を含む第２サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで対照刺激物質により白血球を刺激すること、
刺激後、第１サンプル及び第２サンプルにおいて、腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）−２、ＴＮＦＳＦ−５、ＴＮＦＳＦ−６、ＴＮＦＳＦ−１４、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＣＬ）−２、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４及びケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＸＣＬ）−１０から成る群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること、
第１サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第２サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との第１の比を算出すること、
前記治療法をヒトで行うこと、
治療後に得られるヒト由来の白血球を含む第３サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
治療後に得られるヒト由来の白血球を含む第４サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記対照刺激物質により白血球を刺激すること、
刺激後、第３サンプル及び第４サンプルにおいて前記ｍＲＮＡのレベルを測定すること、
第３サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第４サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との第２の比を算出すること、並びに
第１の比と第２の比とを比較することを含み、
前記比の有意差を効果的な療法の指標とする方法。
【請求項１０】
第１サンプル及び第３サンプルにおいて白血球を刺激することが、抗Ｔ細胞受容体抗体を該サンプルと混合することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第１サンプル及び第３サンプルにおいて白血球を刺激することが、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＧ、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質を該サンプルと混合することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
対照刺激物質が、精製された対照免疫グロブリンを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
第１サンプル、第２サンプル、第３サンプル及び第４サンプルの少なくとも１つが全血
を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記比の有意差とは、第２の比が第１の比よりも大きいことであり、治療法が腫瘍壊死因子αの不活性化を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
治療法がインフリキシマブの投与を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記比の有意差とは、第１の比が第２の比よりも大きいことである、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
治療法がシクロスポリンＡ及びタクロリムスから成る群から選択される作用物質の投与を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
クローン病を治療できる可能性があると推定される作用物質を同定する方法であって、抗Ｔ細胞受容体抗体に曝される場合、白血球が、腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）−２、ＴＮＦＳＦ−５、ＴＮＦＳＦ−６、ＴＮＦＳＦ−１４、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＣＬ）−２、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４及びケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＸＣＬ）−１０から成る群から選択されるｍＲＮＡの転写において少なくとも１．７倍の増大を示すヒト由来の白血球を含む第１サンプル、第２サンプル、第３サンプル及び第４サンプルを得ること、
第１サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
第２サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで対照刺激物質により白血球を刺激すること、
刺激後、第１サンプル及び第２サンプルにおいて前記ｍＲＮＡの量を測定すること、
第１サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第２サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との第１の比を算出すること、
第３サンプル及び第４サンプルを作用物質に曝すこと、
曝露後、第３サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
曝露後、第４サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記対照刺激物質により白血球を刺激すること、
刺激後、第３サンプル及び第４サンプルにおいて前記ｍＲＮＡのレベルを測定すること、
第３サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第４サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との第２の比を算出すること、並びに
第１の比と第２の比とを比較することを含み、前記比の有意差を推定上の作用物質の指標とする方法。
【請求項１９】
第１サンプル及び第３サンプルにおいて白血球を刺激することが、抗Ｔ細胞受容体抗体をサンプルと混合することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第１サンプル及び第３サンプルにおいて白血球を刺激することが、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＧ、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質を該サンプルと混合することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
対照刺激物質が、精製された対照免疫グロブリンを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
第１サンプル、第２サンプル、第３サンプル及び第４サンプルの少なくとも１つが全血を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記比の有意差とは、第１の比が第２の比よりも大きいことである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
ヒトにおいてクローン病の状態を評価する方法であって、
白血球を含み、ヒトから１回目に得られる第１サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
刺激後、第１サンプルにおいて、腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）−２、ＴＮＦＳＦ−５、ＴＮＦＳＦ−６、ＴＮＦＳＦ−１４、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＣＬ）−２、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４及びケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＸＣＬ）−１０から成る群から選択されるｍＲＮＡの量を測定すること、
１回目にヒトから得られる白血球を含む第２サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで対照刺激物質により白血球を刺激すること、
刺激後、第２サンプルにおいて前記ｍＲＮＡの量を測定すること、
第１サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第２サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との第１の比を求めること、
白血球を含み、１回目に続く２回目にヒトから得られる第３サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで白血球を刺激すること、
刺激後、第３サンプルにおいて前記ｍＲＮＡの量を測定すること、
２回目にヒトから得られる白血球を含む第４サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記対照刺激物質により白血球を刺激すること、
刺激後、第４サンプルにおいて前記ｍＲＮＡの量を測定すること、
第３サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量と、第４サンプルにおける前記ｍＲＮＡの量との第２の比を求めること、並びに
第１の比と第２の比とを比較することを含み、第１の比と第２の比との有意な差を、疾患状態の変化の指標とする方法。
【請求項２５】
第１サンプル及び第３サンプルにおいて白血球を刺激することが、抗Ｔ細胞受容体抗体を前記サンプルと混合することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
第１サンプル及び第３サンプルにおいて白血球を刺激することが、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＧ、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質を該サンプルと混合することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
対照刺激物質が精製された対照免疫グロブリンを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
第１サンプル、第２サンプル、第３サンプル及び第４サンプルの少なくとも１つが全血を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記比の有意差とは、第２の比が第１の比よりも大きいことであり、疾患状態の変化が該疾患の進行を示す、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記比の有意差とは、第１の比が第２の比よりも大きいことであり、疾患状態の変化が該疾患の退行を示す、請求項２４に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
さらなる態様において、第１サンプル中の白血球を刺激することは、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＧ、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質を第１サンプルと混合することを含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
さらなる態様において、第１サンプル及び第３サンプルにおいて白血球を刺激することは、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＧ、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質をサンプルと混合することを含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
さらなる態様において、第１及び第３サンプル中の白血球を刺激することは、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＧ、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質をサンプルと混合することを含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
さらなる態様において、第１及び第３サンプル中の白血球を刺激することは、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＧ、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ及び熱凝集ＩｇＭから成る群から選択される作用物質をサンプルと混合することを含む。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
上記の抗ＴＣＲ及びＨＡＧに加えて、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトへムアグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（Ｃｏｎ−Ａ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＧ、熱凝集ＩｇＡ、熱凝集ＩｇＥ、及び熱凝集ＩｇＭといった他の刺激物質も、図６〜図１６で示さ
れるように、健常な個体から採取された全血において様々なサブタイプのＴＮＦＳＦ及びケモカインを誘導する。これらのアッセイにおけるプロトコルは、それぞれの場合で利用された刺激物質が異なることを除いて上記で示されたものと同じであった。図６〜図１６では、データは、特定量のＰＣＲ産物を生成するのに必要とされるＰＣＲのサイクル数であるサイクル閾値（Ｃｔ）について表される。刺激したサンプルのＣｔ値から刺激していないサンプルのＣｔ値を差し引くことによって、ΔＣｔ値を得た。Ｃｔは対数スケールであるので、１ΔＣｔ単位は、量が２倍変化することを示す。発現レベルが高くなると、標準量の産物を生成するのに必要とされるＰＣＲのサイクル数が減少するので、負のΔＣｔ値は発現の増大を示す。
【国際調査報告】
2009535016.tif 000031