(57)【要約】ダニ類害虫を制御する方法が提供される。この方法は、ダニ類害虫の居場所に単離ポリペプチド毒素を適用することを含み、このポリペプチド毒素が殺ダニ活性を有する。一実施形態において、このポリペプチド毒素は、３つの鎖間ジスルフィド結合を含むか、そして/またはＡｔｒａｘ属又はＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ属のオーストラリアジョウゴグモの毒の成分である。このポリペプチド毒素は、例えば、ダニ類害虫そのものにも、ダニ類害虫の環境にも、ダニ類害虫の宿主にも、又はダニ類害虫の媒介動物にも適用される場合がある。
2009508862.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダニ類害虫を制御する方法であって、ダニ類害虫の居場所に単離ポリペプチド毒素を適用することを含み、該ポリペプチド毒素が殺ダニ活性を有する、方法。
【請求項２】
前記ポリペプチド毒素が３つの鎖間ジスルフィド結合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチド毒素が、Ａｔｒａｘ又はＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ属のオーストラリアジョウゴグモの毒の成分である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、配列番号１と７０％以上の配列同一性を有するオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、配列番号２と７０％以上の配列同一性を有するオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ２ａペプチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチド毒素がプレプロポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記プレプロポリペプチドが、配列番号７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９又は５２の何れか１つを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチド毒素が成熟ポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記成熟ポリペプチドが、配列番号９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１又は５４の何れか１つを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチド毒素が、発現制御配列に操作的に結合する該ポリペプチド毒素をコードするポリヌクレオチドの形態で施用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
環境への適用が、ダニ類害虫の媒介動物への適用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記媒介動物がシカ又はげっ歯類を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリペプチド毒素が、餌組成物の形態である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ダニ類害虫が植食性コナダニを含み、該コナダニが摂食または生息する植物の部分に該ポリペプチド毒素を適用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ダニ類害虫が植食性コナダニを含み、適用が、前記ポリペプチド毒素を発現するトランスジェニック植物に該植食性コナダニを曝露することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ダニ類害虫が、ヒト、家畜又はコンパニオン動物に感染する病原体を保有することができるマダニである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ダニ類害虫が、ヒト又は動物に寄生するコナダニである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ダニ類害虫がチリダニであり、適用が屋内環境への適用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
家畜、コンパニオン動物又は媒介動物におけるダニ類害虫のインフェステーションを阻害する方法であって、該ダニ類害虫の居場所に単離ポリペプチド毒素を適用することを含み、該ポリペプチドが殺ダニ活性を有する、方法。
【請求項２０】
配列番号９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１又は５４の何れか１つを含む、単離ポリペプチド毒素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
この出願は、２００５年９月１６日に出願された米国特許出願第６０／７１７，９５８号（この全体が、本明細書に参考として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（連邦政府が後援する研究開発に関する声明）
米国政府は、全米科学基金補助金番号ＭＣＢ０２３４６３８に準じて本発明における特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
マダニ（ｔｉｃｋ）及びコナダニ（ｍｉｔｅ）は、何れもクモ形綱のダニ目に分類されるメンバーであり、これらは総称的にダニ類と呼ばれる。昆虫とは関連がない。多くのダニ種は、野生動物、家畜及びコンパニオン動物、ヒト、並びに穀物の主要な有害生物である。
【０００４】
マダニは、哺乳類、鳥類、爬虫類及び両生類に寄生する偏性の外寄生生物である。マダニは世界中の家畜の約８割に寄生しているとされ、７５億米ドルの経済損失をもたらしていると推定されている。多くのマダニ種は、主に獣医学及びヒトの公衆衛生において極めて重要な意味を持つ数多くの病原体を伝播する能力を有することから、問題視されている。病原体の伝播において重要となる多くのマダニ種の限定例には、イヌダニのＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ、アメリカアムブリオマのＡｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ、ヘブライキララマダニのＡｍｂｌｙｏｍｍａ  ｈｅｂｒａｅｕｍ、熱帯ヘブライキララマダニのＡｍｂｌｙｏｍｍａ  ｖａｒｉｅｇａｔｕｍ、冬ダニのＤｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ａｌｂｉｐｉｃｔｕｓ、熱帯ウマカクマダニのＤｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｎｉｔｅｎｓ、アメリカイヌカクマダニのＤｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、ロッキー山脈森林ダニのＤｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ａｎｄｅｒｓｏｎｉ、牛ダニのＢｏｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｌｕｓ及びＢｏｏｐｈｉｌｕｓ  ａｎｎｕｌａｔｕｓ、Ｉｘｏｄｅｓ  ｒｉｃｉｎｕｓ、並びにシカダニのＩｘｏｄｅｓ  ｓｃａｐｕｌａｒｉｓが含まれるが、これらに限定されない。マダニにより伝播される細菌（リケッチアを含む）、原生動物及びアルボウイルス病原体は、例えば、ライム病、ツラレミア、心水病、デルマトフィルス症、アナプラズマ病、タイレリア症、脳炎、バベシア症、及び種々の紅斑熱群リケッチア症（ロッキー山紅斑熱を含む）を含めた広範なヒト及び動物疾患の原因となる。しかし、幾つかのマダニの場合、主要な懸念は病原体の伝播ではなく、時に動物及びヒトを死に至らしめることがある麻痺性神経毒の分泌である。この分類に属するマダニには、オーストラリア麻痺ダニのＩｘｏｄｅｓ  ｈｏｌｏｃｙｃｌｕｓ及びアフリカ麻痺ダニのＩｘｏｄｅｓ  ｒｕｂｉｃｕｎｄｉｓが含まれるが、これらに限定されない。マダニは又、咬傷及び二次感染の発生によっても家畜産業に多大な損失をもたらす。
【０００５】
植物寄生（植物性）コナダニには約７０００種類があり、その多くが材木、果物、野菜、森林作物、観賞植物及び保管穀物の有害生物である。これらのコナダニの大半は、Ｅｒｉｏｐｈｙｏｉｄｅａスーパーファミリー（没食子ダニ、エリノーズダニ、芽ダニ（ｂｕｄ）及びサビダニ）及び作物学的に重要なＴｅｔｒａｎｙｃｈｏｉｄｅａ（ハダニ及びｆｌａｔ  ｍｉｔｅ）に属する。更に、コナダニの中には、家畜及びコンパニオン動物に内部寄生又は外部寄生する有害生物であって、疥癬及び鱗屑等の疾患を引き起こすもの存在するのに対し、チリダニは、ヒトに喘息及びその他のアレルギー性疾患を引き起こすアレルゲンを生成する。コナダニは、ライフサイクル（例えば、１〜４週間）が極めて早く、多数の卵を産み付ける能力を有するため、殺ダニ剤に対する耐性をすぐに獲得してしまうことが多い。コナダニによっては、殆ど全ての既存の殺ダニ剤に対して耐性を有するものも存在する。
【０００６】
コナダニ及びマダニはダニ類であり、昆虫とは密接な関連はない。従って、殆どの殺虫剤はダニ類には有効でない。ダニ類に有効な化学物質が、殺ダニ剤と呼ばれる。コナダニ及びマダニに有効な数少ない利用できる殺ダニ剤には、大きな問題が少なくとも２つある。第一に、マダニ及びコナダニの多くの種は、これらの種々の化学物質に対する耐性を発現している点である。既にクマホス及びピレスロイドに対する耐性は広範に広がっており、アミトラズに対する耐性の報告も増えてきている。大環状ラクトン内外部寄生虫駆除薬は、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓには有効であるが、多宿主性マダニには有効でない。第二に、多くの殺ダニ剤は米国環境保護局による厳しい規制監視下にあり、幾つか（例えば、クロルピリフォス及びダイアジノン）は既に登録が抹消されている。耐性の発現又は登録の抹消により多くの種類の殺ダニ剤がなくなり、更には新しい殺ダニ剤の登録に更に厳しい要件が設けられれば、近い将来に有効な化学物質の殺ダニ剤の数が減少する可能性が高い。このため、新しい安全な殺ダニ化合物を単離することが至急求められている。
【０００７】
一部の研究者は、クモ毒を可能性ある昆虫毒の供給源と捉えている。特許文献１に開示されているオメガ−アトラコトキシンと呼ばれる一種のペプチド毒素は、この毒素の「抗オオタバコガ」活性をスクリーニングすることによって、オーストラリアジョウゴグモ（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ｆｕｎｎｅｌ  ｗｅｂ  ｓｐｉｄｅｒ）から単離された。オメガＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａと呼ばれるこれらの化合物の一つは、哺乳動物ではなく昆虫の電位依存性カルシウムチャネル電流を選択的に阻害することが明らかになっている。第二に、昆虫特異的なペプチドのカルシウムチャネル遮断剤の関連がないファミリーが、同じファミリーのクモから単離されたことが、特許文献２に開示されている。但し、これらの何れの参考文献でも、このようなペプチドが昆虫以外の有害生物を殺すのに有用であるとは示唆されていない。
【特許文献１】米国特許第５，７６３，５６８号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５８３，２６４号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（要旨）
本発明者等は以前に、オメガＡＣＴＸ−１及びオメガＡＣＴＸ−２ファミリー等のポリペプチド毒素が殺ダニ活性を有することを発見している。各毒素ファミリーの代表的な成熟毒素の生物学的活性は、既に特徴付けられている。これらの２種類の原型毒素は、アメリカアムブリオマ（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）に注入すると、不可逆的な毒性を引き起こす。オメガＡＣＴＸ−１毒素も、マダニに経口送達すると致死率が高い。
【０００９】
一実施形態においては、ダニ類害虫を制御する方法であって、該ダニ類害虫の居場所に単離ポリペプチド毒素を適用することを含み、該ポリペプチド毒素が殺ダニ活性を有する、方法が提供される。
【００１０】
別の実施形態においては、家畜、コンパニオン動物又は媒介動物におけるダニ類害虫のインフェステーションを阻害する方法であって、該ダニ類害虫の居場所に単離ポリペプチド毒素を適用することを含み、該ポリペプチド毒素が殺ダニ活性を有する、方法が提供される。
【００１１】
本発明の別の態様は、配列番号９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１又は５４の何れか１つを含む単離ポリペプチド毒素を対象とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（詳細な説明）
本明細書に開示するのは、ダニ類害虫を制御する方法であって、該ダニ類害虫の居場所に単離ポリペプチド毒素を適用することを含み、該ポリペプチド毒素が殺ダニ活性を有する、方法である。一実施形態において、ポリペプチド毒素は、Ａｔｒａｘ属及びＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ属のオーストラリアジョウゴグモの毒等のクモ毒の成分である。特異的なポリペプチド毒素には、オメガ−ＡＣＴＸ−１及びオメガ−ＡＣＴＸ−２のポリペプチドファミリー等のオメガ−ＡＣＴＸポリペプチド、並びにこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。これらのポリペプチド及びそれらをコードするポリヌクレオチドは、単独又はその他の殺ダニポリペプチド又はその遺伝子又はその他の殺ダニ剤と組み合わせて、殺ダニ剤として使用することができる。殺ダニ剤又は殺ダニ剤組成物は、１種類以上のダニ（コナダニ及びマダニ）に毒性を有するものである。殺ダニ活性とは、ダニ類を殺すか麻痺させる、又はその成長又は繁殖を阻害するポリペプチドの能力を指す。ＬＤ５０は、被験ダニ類の５０％を死亡させたオメガ−ＡＣＴＸポリペプチドの用量である。
【００１３】
一実施形態において、ダニ類に投与されたオメガ−ＡＣＴＸポリペプチド等のポリペプチド毒素のＬＤ５０は、約５０００ｐｍｏｌ／ｇ未満、約２５００ｐｍｏｌ／ｇ、約１０００ｐｍｏｌ／ｇ、約７５０ｐｍｏｌ／ｇ、約５００ｐｍｏｌ／ｇ未満又は約２５０ｐｍｏｌ／ｇ未満である。
【００１４】
開示した方法で使用するのに好適な毒素は、オメガ−ＡＣＴＸポリペプチドと総称し、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ（配列番号１）及びオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ２ａ（配列番号２）ポリペプチド並びにそれらのホモログを含む。
【００１５】
【化１】
2009508862.tif 000003
本明細書で使用されるオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａポリペプチドは、分子量が約４０００Ｄａであり、約３６〜約３７個のアミノ酸の長さを有し、３つの鎖間ジスルフィド架橋を形成することができるポリペプチドである。オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ２ａポリペプチドは、分子量が約４５００Ｄａであり、約４１〜約４５個のアミノ酸の長さを有し、３つの鎖間ジスルフィド架橋を形成することができるポリペプチドである。一実施形態において、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチドは、配列番号１との７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％以上の配列同一性を有し、殺虫及び／又は殺ダニ活性を有する。別の実施形態において、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ２ａポリペプチドは、配列番号２との７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％以上の配列同一性を有し、殺虫及び／又は殺ダニ活性を有する。
【００１６】
オメガ−ＡＣＴＸポリペプチドは、成熟ポリペプチド、プレプロポリペプチド（ｐｒｅｐｒｏｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）又はプロポリペプチドの形態をとることができる。理論に拘束されるわけではないが、オメガ−ＡＣＴＸポリペプチドの生物学的活性型は、成熟ポリペプチドを産生するためのプレプロポリペプチド前駆体の翻訳後のタンパク質分解プロセス（例えば、開裂）によって生成されると考えられている。開裂は、プレプロポリペプチドの特定のアミノ酸配列モチーフを認識するプロテアーゼによって、プレプロポリペプチドをエンド型タンパク質分解することで行われる場合がある。プレプロポリペプチドの「プレ」の部分は、プレプロポリペプチドのシグナルペプチド部分を指す。理論に拘束されるわけではないが、シグナル配列はプレプロポリペプチドのターゲティング、並びにオメガ−ＡＣＴＸを産生する細胞の小胞体内腔を超えたその転座において役割を担っている。一実施形態において、シグナルペプチド配列は、配列番号３  ＭＮＴＡＴＧＸ１ＩＡＬＬＶＬＡＴＶＩＧＣＩＸ２Ａ（式中、Ｘ１はＶ又はＦであり、Ｘ２はＳ又はＥである）を含む。同様の様式で機能するその他のシグナル配列も使用される場合がある。別の実施形態において、プレプロポリペプチドの「プロ」の部分は、配列番号４  ＥＤＴＲＡＤＬＱＧＧＥＡＡＥＫＶＦＲＲ；配列番号５  ＤＦＸ３ＧＸ４ＦＥＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＥＤＡＥＲＩＦＲＲ（式中、Ｘ３はＱ又はＥであり、Ｘ４はＧ又はＳであり、Ｘ５はＰ又はＳであり、Ｘ６はＹ又はＳであり、Ｘ７はＥ又は不在であり、Ｘ８はＧ、Ｅ又はＶである）；配列番号６  ＧＥＳＨＶＲＥＤＡＭＧＲＡＲＲ又は成熟オメガ−ＡＣＴＸポリペプチドの上流に共有結合するその他の配列を指す。理論に拘束されるわけではないが、プロ配列が担う可能性のある役割には、小胞体内腔からの毒素の運び出しの促進、酵素が触媒する成熟毒素配列の酸化的フォールディングの補助、並びにタンパク質分解プロセス及び翻訳後修飾に関与する酵素のシグナル伝達が含まれる。プロ配列内のＲＲモチーフは、エンド型プロテアーゼの開裂部位であると考えられている。従って、オメガ−ＡＣＴＸポリペプチドを含む精製ポリペプチドは、更にシグナルペプチド配列（「プレ」配列、プロ配列又はそれらの組み合わせ）を含む場合もある。
【００１７】
約２２個の残基からなるシグナル配列（「プレ」配列）、及び約１５個の残基からなるプロペプチド配列（「プロ」配列）は、オメガ−ＡＣＴＸのオーソログで共通して良好に保存されている。一般的には、シグナル配列及び開裂モチーフ内よりも成熟毒素配列内により多くの変異が存在する。
【００１８】
一実施形態においては、雄のオーストラリアジョウゴグモＡｔｒａｘ  ｒｏｂｕｓｔｕｓの毒腺由来のｃＤＮＡライブラリーの分析により単離された、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの５個のオーソログ（配列番号７、１０、１３、１６及び１９）の完全なプレタンパク質配列が含まれる。一実施形態において、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａオーソログは、配列番号７のプレプロペプチドを含む。
【００１９】
【化２】
2009508862.tif 000004
配列番号７をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８である。
【００２０】
【化３】
2009508862.tif 000005
配列番号７に相当する成熟ポリペプチド毒素は、配列番号９である。
【００２１】
【化４】
2009508862.tif 000006
別の実施形態において、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａオーソログは、配列番号１０のプレプロペプチド配列を含む。
【００２２】
【化５】
2009508862.tif 000007
配列番号１０をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１である。
【００２３】
【化６】
2009508862.tif 000008
配列番号１０に相当する成熟ポリペプチド毒素は、配列番号１２である。
【００２４】
【化７】
2009508862.tif 000009
別の実施形態において、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａオーソログは、配列番号１３のプレプロペプチド配列を含む。
【００２５】
【化８】
2009508862.tif 000010
配列番号１３をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４である。
【００２６】
【化９】
2009508862.tif 000011
配列番号１３に相当する成熟ポリペプチド毒素は、配列番号１５である。
【００２７】
【化１０】
2009508862.tif 000012
別の実施形態において、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａオーソログは、配列番号１６のプレプロペプチド配列を含む。
【００２８】
【化１１】
2009508862.tif 000013
配列番号１６をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１７である。
【００２９】
【化１２】
2009508862.tif 000014
配列番号１６をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１８である。
【００３０】
【化１３】
2009508862.tif 000015
別の実施形態において、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａオーソログは、配列番号１９のプレプロペプチド配列を含む。
【００３１】
【化１４】
2009508862.tif 000016
配列番号１９をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２０である。
【００３２】
【化１５】
2009508862.tif 000017
配列番号１９に相当する成熟ポリペプチド毒素は、配列番号２１である。
【００３３】
【化１６】
2009508862.tif 000018
又、雌のオーストラリアジョウゴグモＡｔｒａｘ  ｒｏｂｕｓｔｕｓの毒腺由来のｃＤＮＡライブラリーの分析により単離されたオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの１個のオーソログ（配列番号２２）の完全なプレタンパク質配列も含まれる。
【００３４】
【化１７】
2009508862.tif 000019
配列番号２２をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２３である。
【００３５】
【化１８】
2009508862.tif 000020
配列番号２２に相当する成熟ポリペプチド毒素は、配列番号２４である。
【００３６】
【化１９】
2009508862.tif 000021
又、雌のオーストラリアジョウゴグモＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｉｎｆｅｎｓａの毒腺由来のｃＤＮＡライブラリーの分析により単離されたオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの１０個のオーソログ（配列番号２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４５、４９及び５２）の完全なプレタンパク質配列も含まれる。
【００３７】
【化２０】
2009508862.tif 000022
配列番号２５をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２６である。
【００３８】
【化２１】
2009508862.tif 000023
配列番号２５に相当する成熟ポリペプチド毒素は、配列番号２７である。
【００３９】
【化２２】
2009508862.tif 000024
一実施形態において、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａオーソログは、配列番号２８のプレプロペプチド配列を含む。
【００４０】
【化２３】
2009508862.tif 000025
配列番号２８をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２９である。
【００４１】
【化２４】
2009508862.tif 000026
配列番号２８に相当する成熟ポリペプチド毒素は、配列番号３０である。
【００４２】
【化２５】
2009508862.tif 000027
別の実施形態において、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａオーソログは、配列番号３１のプレプロペプチド配列を含む。
【００４３】
【化２６】
2009508862.tif 000028
配列番号３１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３２である。
【００４４】
【化２７】
2009508862.tif 000029
配列番号３１に相当する成熟ポリペプチド毒素は、配列番号３３である。
【００４５】
【化２８】
2009508862.tif 000030
別の実施形態において、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａオーソログは、配列番号３４のプレプロペプチド配列を含む。
【００４６】
【化２９】
2009508862.tif 000031
配列番号３４をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３５である。
【００４７】
【化３０】
2009508862.tif 000032
配列番号３４に相当する成熟ポリペプチド毒素は、配列番号３６である。
【００４８】
【化３１】
2009508862.tif 000033
別の実施形態において、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａオーソログは、配列番号３７のプレプロペプチド配列を含む。
【００４９】
【化３２】
2009508862.tif 000034
配列番号３７をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３８である。
【００５０】
【化３３】
2009508862.tif 000035
配列番号３７に相当する成熟ポリペプチド毒素は、配列番号３９である。
【００５１】
【化３４】
2009508862.tif 000036
別の実施形態において、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａオーソログは、配列番号４０のプレプロペプチド配列を含む。
【００５２】
【化３５】
2009508862.tif 000037
配列番号４０をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４１である。
【００５３】
【化３６】
2009508862.tif 000038
配列番号４０に相当する成熟ポリペプチド毒素は、配列番号４２である。
【００５４】
【化３７】
2009508862.tif 000039
別の実施形態において、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａオーソログは、配列番号４３のプレプロペプチド配列を含む。
【００５５】
【化３８】
2009508862.tif 000040
配列番号４３をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４４である。
【００５６】
【化３９】
2009508862.tif 000041
配列番号４３に相当する成熟ポリペプチド毒素は、配列番号４５である。
【００５７】
【化４０】
2009508862.tif 000042
別の実施形態において、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａオーソログは、配列番号４６のプレプロペプチド配列を含む。
【００５８】
【化４１】
2009508862.tif 000043
配列番号４６をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４７である。
【００５９】
【化４２】
2009508862.tif 000044
配列番号４６に相当する成熟ポリペプチド毒素は、配列番号４８である。
【００６０】
【化４３】
2009508862.tif 000045
別の実施形態において、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａオーソログは、配列番号４９のプレプロペプチド配列を含む。
【００６１】
【化４４】
2009508862.tif 000046
配列番号４９をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５０である。
【００６２】
【化４５】
2009508862.tif 000047
配列番号４９に相当する成熟ポリペプチド毒素は、配列番号５１である。
【００６３】
【化４６】
2009508862.tif 000048
別の実施形態において、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａオーソログは、配列番号５２のプレプロペプチド配列を含む。
【００６４】
【化４７】
2009508862.tif 000049
配列番号５２をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５３である。
【００６５】
【化４８】
2009508862.tif 000050
配列番号５２に相当する成熟ポリペプチド毒素は、配列番号５４である。
【００６６】
【化４９】
2009508862.tif 000051
本発明は単離又は精製したオメガ−ＡＣＴＸポリペプチドを含む。「単離」又は「精製」ポリペプチド又はその断片は、細胞材料又はそこからポリペプチドが由来する細胞又は組織からの他の汚染ポリペプチドを実質的に持たないか、化学的前駆体又は化学的に合成された場合は他の化学物質を実質的に持たない。「細胞材料を実質的に持たない」という用語は、ポリペプチドが、そこから単離又は遺伝子組換えで生成した細胞の細胞構成要素からポリペプチドが分離される、ポリペプチドの調製物を含む。そのため、細胞材料を実質的に持たないポリペプチドは、異種のポリペプチド（本明細書では「汚染ポリペプチド」とも呼ぶ）を約３０％、約２０％、約１０％又は約５％未満（乾燥重量で）を有するポリペプチドの調製物を含む。一実施形態において、調製物は少なくとも約７５重量％、より具体的には少なくとも約９０重量％、最も具体的には少なくとも約９５重量％純粋である。実質的に純粋なオメガ−ＡＣＴＸポリペプチドは、例えば天然の供給源（昆虫細胞等）からの抽出、オメガ−ＡＣＴＸポリペプチドをコードする遺伝子組換え核酸の発現又はポリペプチドの化学的合成によって得ることができる。純度は適切な方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）解析によって測定することができる。
【００６７】
又、本発明はオメガ−ＡＣＴＸポリペプチドのホモログを含む。「ホモログ」は、当該技術分野で当該配列と高度に関連する配列を保有するポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を示すために使用される包括的用語である。このような関連性は、比較対象の配列間の同一性及び／又は類似性の程度を測定することによって定量化することができる。この包括的用語に含まれるのは、他の動物種のポリヌクレオチド又はポリペプチドの機能的等価物であるポリヌクレオチド又はポリペプチドを意味する「オーソログ」及び、同じ動物種で検討した場合に機能的に類似する配列を意味する「パラログ」である。同じ動物種に存在するパラログ又はその他の動物種のオメガ−ＡＣＴＸ遺伝子のオーソログは、不適切な実験をしない限り、当該技術分野で既知の分子生物学的技術により容易に同定することができる。
【００６８】
本明細書で使用される、２個のアミノ酸配列又は２個の核酸の「相同率」は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  （１９９０）のアルゴリズムを使用して決定される  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ．  ８７：  ２２６４−２２６８。このようなアルゴリズムをＡｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：  ４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込む。ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、語長＝３）を実施してＢＬＡＳＴタンパク質を検索し、参照ポリペプチド（例えば配列番号１）に相同のアミノ酸配列を得る。ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、語長＝１２）を実施してＢＬＡＳＴヌクレオチドを検索し、核酸分子に相同のヌクレオチド配列を得る。比較を目的としてアライメントのずれを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：  ３３８９−３４０２の記載の通り、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを使用する。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合は、一般的にはデフォルトのパラメータを使用する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）。
【００６９】
関連ポリペプチドを、種々の欠失、置換及びその他の修飾に相同性の程度を割り当てることで、オメガ−ＡＣＴＸとアライメントさせる。相同性は、全ポリペプチド又はポリヌクレオチドに従って、又は隣接残基のサブセットに従って、決定することができる。同一率は、２つの配列を比較して同一であるアミノ酸又はヌクレオチドの割合である。類似率は、２つの配列を比較して化学的に類似するアミノ酸又はヌクレオチドの割合である。成熟オメガ−ＡＣＴＸ及び相同ポリペプチドは、好ましくは約７０％以上、具体的には約７５％以上、更に具体的には約８０％以上、更に具体的には約８５％以上、更に具体的には約９０％以上、最も具体的には９５％以上同一であるのがよい。配列番号１又は配列番号２を参照ポリペプチドとして使用する。
【００７０】
特定のポリペプチドが、あらかじめ規定された長さの参照ポリペプチドと特定の同一率であるとする場合、同一率は参照ペプチドに対するものである。このため、１００個のアミノ酸の長さである参照ポリペプチドに５０％同一のポリペプチドは、参照ポリペプチドの５０個のアミノ酸部分に完全に同一な５０個アミノ酸ポリペプチドであることができる。又、参照ポリペプチドの全長に対して５０％同一な１００個アミノ酸ポリペプチドであることもできる。無論、他の多くのポリペプチドが同じ基準に合致する。
【００７１】
一次アミノ酸配列の「修飾」には、「欠失」（即ち、１個以上のアミノ酸残基が不在であるポリペプチド）、「追加」（即ち、特定のポリペプチドと比較して１個以上の追加的なアミノ酸残基を有するポリペプチド）、「置換」（即ち、１個以上のアミノ酸残基の置換により生じたポリペプチド）及び「断片」（即ち、特定のポリペプチドの一次配列の部分と同一の一次アミノ酸配列からなるポリペプチド）が含まれる。又、「修飾」には、ポリペプチドの一次、二次又は三次構造の糖化、アミド化（例えばＣ末端アミド化）、脂質化パターンを変化させる翻訳後イベントの結果変化したポリペプチドが含まれる。Ｎ末端及び／又はＣ末端の修飾が可能である。
【００７２】
オメガ−ＡＣＴＸのヌクレオチド又はアミノ酸配列の何れかの本明細書における参照は、これらの配列の自然発生の亜型の参照を含む。本明細書では、プレプロポリペプチドでは配列番号７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９又は５２、成熟ポリペプチドでは配列番号９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１又は５４とは異なり、生物学的機能を保持する非自然発生の亜型も含まれる。亜型は、保存的アミノ酸変更、即ち同じく荷電又は非荷電したアミノ酸の変更を有するポリペプチドを含むことができる。遺伝学的にコードされたアミノ酸は、一般的には（１）酸性（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）；（２）塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）；（３）非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；及び（４）非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシン）の４つのファミリーに分類される。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、共に芳香族アミノ酸として分類されることがある。ファミリーの各メンバーは同じファミリーの他のメンバーと類似した物理的及び化学的特性を有するため、ロイシンをイソロイシン又はバリンと、アスパラギン酸塩をグルタミン酸塩と、スレオニンをセリンとの単独の置換又は、構造的に関連したアミノ酸とのアミノ酸の類似した置換は、結果得られる分子の結合特性に大きな影響を与えないと予測することは妥当である。アミノ酸の変更がポリペプチドの機能に影響するかどうかは、オメガ−ＡＣＴＸポリペプチド誘導体の殺ダニ活性を測定することにより容易に決定することができる。
【００７３】
オメガ−ＡＣＴＸとする引用は、オメガ−ＡＣＴＸのポリペプチド誘導体も指す。本明細書で使用する場合、「ポリペプチド誘導体」は、自然発生したオメガ−ＡＴＣＸと長さが異なり、オメガ−ＡＣＴＸで認められる同じ一次配列の約１５個以上のアミノ酸を含むポリペプチドを含む。ポリペプチド誘導体は、そのポリペプチド誘導体が殺ダニ活性を有する限り、オメガ−ＡＣＴＸよりも長くてもよく、オメガ−ＡＣＴＸ（例えば活性断片）よりも短くてもよい。オメガ−ＡＣＴＸと同じアミノ酸配列を実質的に有するが、オメガ−ＡＣＴＸポリペプチド誘導体の殺ダニ活性に実質的に影響しない程度の少ないアミノ酸置換を有するポリペプチドは、オメガ−ＡＣＴＸポリペプチド誘導体の定義に含まれる。
【００７４】
オメガ−ＡＣＴＸのホモログは幾つかの方法で同定することができる。ある方法では、オメガ−ＡＣＴＸのオーソログの前駆体をコードする天然のｍＲＮＡを、標準的な分子生物学的技術を使用して同定し、このようなオーソログのためのクモ毒腺ｃＤＮＡライブラリーを選別する。成熟オメガ−ＡＣＴＸオーソログのアミノ酸配列は、成熟毒素を得ることのできるプロペプチドのエンド型タンパク質分解はその成熟毒素のすぐ前に位置するＡｒｇ−ＡｒｇプロセシングのＣ末端側で起こる可能性が高いということに留意して、同定したｃＤＮＡ配列の翻訳によって得ることができる（図２の二番目の矢印を参照）。天然の成熟オメガ−ＡＣＴＸオーソログはその後、そのクモ毒のクロマトグラフィーによる分画により単離し、その後オメガ−ＡＣＴＸオーソログｃＤＮＡ配列から予測される質量のマッチングを有するペプチド毒素を同定して精製する。別の方法では、合成Ｊ−アトラコトキシン−Ｈｖ１ｃの産生について以前に報告されているように（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７，  ５０５−５１３）、合成成熟毒素をオメガ−ＡＣＴＸ配列の固相ペプチド合成により生成し、その後システインを酸化して天然のジスルフィド異性体を形成する。一実施形態においては、オメガ−ＡＣＴＸポリペプチドを酸化して、還元され凍結乾燥されたペプチドをグルタチオン酸化還元緩衝剤中でインキュベートすることにより、その天然の三次構造に折り畳む。好適なグルタチオン酸化還元緩衝剤は、２００ｍＭ  ３−［Ｎ−モルフォリノ］プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）ｐＨ７．３、４００ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、４ｍＭ  還元グルタチオン（ＧＳＨ）及び２ｍＭ  酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）を含むが、多数の亜型が当業者には既知である。この反応混合物を、例えば４℃又は室温例えば３７℃で一晩インキュベートした後、逆相ＨＰＬＣを使用して分画し、個々のジスルフィド異性体を分離する。分画を回収し、殺ダニ活性を測定する。別の方法においては、オメガ−ＡＣＴＸオーソログを化学的に又は遺伝子組換えＤＮＡ技術を使用して、オメガ−ＡＣＴＸオーソログをコードするｃＤＮＡから合成する。別の方法において、オメガ−ＡＣＴＸオーソログは、遺伝子組換えＤＮＡ技術を使用して、当該技術分野で既知の手法でオメガ−ＡＣＴＸをコードする合成遺伝子を構築することによって調製する。
【００７５】
本発明は、例えば、配列番号８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０又は５３等の単離オメガ−ＡＣＴＸポリヌクレオチドを含む。「単離ポリヌクレオチド」という用語は、天然資源の核酸に存在する他の核酸分子から分離したポリヌクレオチドを含む。例えば、ゲノムＤＮＡに関して言えば、「単離」という用語はゲノムＤＮＡが自然に伴う染色体から分離したポリヌクレオチドを含む。「単離」ポリヌクレオチドは、その核酸が由来する生体のゲノムＤＮＡの核酸（即ち核酸の５’及び／又は３’末端に位置する配列）の自然に態様に位置する配列を持たない。例えば、種々の実施形態において、単離ポリヌクレオチドは、その核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸分子の自然に態様に位置する約５ｋｂ未満、約４ｋｂ未満、約３ｋｂ未満、約２ｋｂ未満、約１ｋｂ未満、約０．５ｋｂ未満又は約０．１ｋｂ未満の５’及び／又は３’末端のヌクレオチド配列を含有することができる。更に、ｃＤＮＡ分子等の「単離」ポリヌクレオチドは、他の細胞材料又は、遺伝子組換え技術で産生する場合は細胞培地を実質的に含まず、化学的に合成する場合は化学的前駆体又はその他の化学物質を実質的に含まない。他の細胞材料を含まないというのは、その単離ポリヌクレオチドが約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％、約９５％以上又は約９９％以上純粋であることを意味する。
【００７６】
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、少なくとも５塩基の長さのヌクレオチドの重合形を指す。ヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はその何れかのヌクレオチドの修飾型であることができる。修飾は、自然発生の塩基の既知の置換、糖又はヌクレオシド間（骨格）と５−メチルシトシン等の修飾塩基、２’−メトキシ及び２’−フルオロ糖等の修飾糖及びホスホロチオエート及びメチルホスホネート等の修飾骨格との結合を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖を生成するのに関与するＤＮＡのセグメントを意味する。即ち、コード領域の前後の領域（リーダー及びトレイラー）及び個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
【００７７】
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子であることができる。ＤＮＡ又はＲＮＡ等のポリヌクレオチドは、ＴがＵでもあることができる配列を含む。ポリヌクレオチドは、オメガ−ＡＣＴＸポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０又は５３）に相補的であることができ、ここで相補的とは２個のヌクレオチド間で正確な対合を行う能力を指す。例えば、あるポリヌクレオチドの特定の位置にあるヌクレオチドがＤＮＡ又はＲＮＡ分子の同じ位置にあるヌクレオチドと水素結合することができる場合、そのポリヌクレオチドとそのＤＮＡ又はＲＮＡ分子とはその位置において互いに相補的である。そのポリヌクレオチドとそのＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、各分子の十分な数の対応する位置が互いにハイブリダイズすることのできるヌクレオチドで占められ所望のプロセスに作用することができる場合、実質的に互いに相補的である。本明細書で使用する場合、ハイブリダイゼーションは、相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基間の水素結合を意味し、これはＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型又は逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型水素結合であることができる。
【００７８】
又、オメガ−ＡＣＴＸポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０又は５３）と実質的に同一なポリヌクレオチド又は配列番号１及び２に実質的に同一なタンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。「実質的に同一」とは、参照アミノ酸の配列又は核酸配列に少なくとも約８５％、具体的には約９０％、より具体的には約９５％以上同一な配列を有するポリペプチド又はポリヌクレオチドを意味する。ポリペプチドでは、参照ポリペプチド配列の長さは一般的に少なくとも約１６個のアミノ酸、具体的には少なくとも約２０個のアミノ酸、より具体的には少なくとも約２５個のアミノ酸、最も具体的には少なくとも約３５個のアミノ酸である。核酸では、参照核酸配列の長さは一般的に少なくとも約５０個のヌクレオチド、具体的には少なくとも約６０個のヌクレオチド、より具体的には少なくとも約７５個のヌクレオチド及び最も具体的には約１１０個のヌクレオチドである。
【００７９】
一般的には、あるポリヌクレオチドに相同な配列はハイブリダイゼーションによって確認され、そのハイブリダイゼーションは例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）に記載のようなストリンジェントな条件下で行われるのが望ましい。Ｓａｍｂｒｏｏｋ等によって概説されているこのストリンジェントなハイブリダイゼーションを使用して（即ち、核酸断片を２回洗浄し、各洗浄は、室温にて３０分間２×塩化ナトリウム及びクエン酸ナトリウム（ＳＣＣ）及び０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で洗浄した後、５０℃で３０分間２×ＳＣＣ及び０．１％ＳＤＳで１回洗浄し、その後、室温にて１０分間２×ＳＣＣで洗浄するのを２回繰り返すことからなる）、多くても約２５〜約３０％の塩基対のミスマッチ又は約１５〜約２５％の塩基対のミスマッチ又は約５〜約１５％の塩基対のミスマッチを含む相同な配列を同定することができる。
【００８０】
相同なポリペプチドは、例えば従来のポリヌクレオチドの部位特異的突然変異（機能的に重要又は重要でないその分子の残基をルーチンに同定していく一種の方法）、無作為的変異、化学的合成又はそのポリペプチドの化学的又は酵素的開裂により、生成することができる。
【００８１】
オメガ−ＡＣＴＸ配列をコードするポリヌクレオチドは、このような遺伝子配列に特異的にハイブリダイズすることのできる比較的短いＤＮＡ（又はＲＮＡ）配列の調製を可能にする。短い核酸配列は、所定の試料における相補的配列の有無を検出するためのプローブとして使用することができるか、オメガ−ＡＣＴＸポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のあらかじめ規定されたセグメントを検出、増幅又は変異させるプライマーとして使用することができる。ハイブリダイゼーション試験に使用する核酸配列は、長さが約１４個のヌクレオチド以上であって、その断片が十分な長さをもち安定で選択的な二本鎖分子を形成することができるようにすることができる。このような断片は、例えば化学的手段によりその断片を直接合成するか、ＰＣＲ技術等の核酸複製技術を応用するか、適切な挿入配列及び好適な制限部位を含有する遺伝子組換えプラスミド由来の選択された核酸断片を開裂することによって調製することができる。
【００８２】
オメガ−ＡＣＴＸ及びホモログポリヌクレオチドは、遺伝子組換え発現ベクター又は複数のベクターに挿入することができる。「遺伝子組換え発現ベクター」という用語は、オメガ−ＡＸＴＸ遺伝配列の挿入又は組み入れにより操作されたプラスミド、ウイルス又は当該技術分野で既知のその他の手段を指す。「プラスミド」という用語は一般的に本明細書では、当業者には既知の標準的な呼称の慣例に従って、小文字のｐで始まり、大文字及び／又は数字を続けて記す。本明細書で開示するプラスミドは市販されているか、無制限に一般的に公開されているか、既知の公開された手順をルーチンに応用することで入手可能なプラスミドから構築することができる。多くのプラスミド及びその他のクローニング及び発現ベクターは既知であり、容易に入手できるか、当業者は使用に好適なプラスミドを幾つでも容易に構築することができる。これらのベクターは好適な宿主細胞に形質導入して、ポリペプチドの産生のための宿主細胞ベクター系を形成することができる。
【００８３】
オメガ−ＡＣＴＸポリヌクレオチドには、オメガ−ＡＣＴＸをコードする核酸分子に操作的に結合した細菌、植物、酵母、昆虫、両生類、又は哺乳動物細胞中の核酸分子の発現に必要な調節要素を更に含む、細菌、植物、酵母、昆虫、両生類又は哺乳動物細胞における発現に適したベクターを挿入することができる。「操作的に結合」は、記載された成分がその意図する方法で機能することを可能にするような関係で並置されることを意味する。コード配列に操作的に結合した発現制御配列は、コード配列の発現が発現制御配列と両立可能な条件下において達成されるように結合する。本明細書で使用される「発現制御配列」という用語は、それが操作的に結合された核酸配列の発現を制御する核酸配列を指す。発現制御配列は、その発現制御配列が核酸配列の転写及び必要に応じて翻訳を調節及び制御する場合には、核酸配列に操作的に結合している。このため、発現制御配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前に開始コドン（即ちａｔｇ）、イントロンのためのスプライシングシグナル（イントロンが存在する場合）、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にする当該遺伝子の正しいリーディングフレームの維持及び終止コドンを含むことができる。「制御配列」という用語は、少なくとも、その存在が発現に影響を与える成分を含むことを意図し、その存在が有益な、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列等の追加的な成分も含むことができる。発現制御配列はプロモーターを含むことができる。「プロモーター」とは、転写を命令するのに十分な最小の配列を意味する。又、プロモーター依存の遺伝子発現を細胞特異的、組織特異的に制御可能にするか、外部のシグナル又は物質によって誘導可能にするのに十分なプロモーター要素も含まれる。このような要素は遺伝子の５’又は３’領域に位置することができる。構成プロモーター及び誘導プロモーターの何れもが含まれる。
【００８４】
発現ベクターを、植物を形質転換するのに使用する場合、植物中で発現を駆動する能力を有するプロモーターを選択することができる。植物中で機能するプロモーターは業界内で既知である。組織特異的な植物プロモーターの例は、トウモロコシスクロース合成酵素−１プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ  ３５Ｓ）プロモーター、Ｓ−Ｅ９小サブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼプロモーター及びトウモロコシ熱ショックタンパク質プロモーターである。
【００８５】
発現ベクター、究極にはポリペプチドコード領域を操作的に結合するプロモーターの選択は、例えばタンパク質の発現の位置及び時期や形質転換する宿主細胞等の所望の機能特性によって直接左右される。一実施形態において、ポリペプチドを発現するのに使用するベクターは、植物細胞で有効な選択マーカーを含む。植物を形質転換するのに使用する形質転換ベクター及びそれらのベクターの作製方法は、例えば米国特許第４，９７１，９０８号、４，９４０，８３５号、４，７６９，０６１号及び４，７５７，０１１号に記載されており、これらを本願に引用して援用する。
【００８６】
又、発現系は、毒素遺伝子の発現及び／又は毒素の折り畳みを容易にするシグナルペプチド及びプロポリペプチド配列も含有する。これらは、本明細書に開示する天然のオメガ−ＡＣＴＸシグナル及びポリペプチド配列又は同じ目的に役立つ他のシグナル及び／又はプロペプチド配列であることができる。
【００８７】
ウイルスに感染しやすい昆虫は、昆虫ウイルスの標的であることができる。昆虫ウイルスの宿主の範囲は、少なくとも部分的には未修飾の野生型ウイルスの天然の宿主範囲によって決定される。昆虫ウイルスは自然発生の昆虫病原体である。これらはＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスであってよい。多くの昆虫ウイルス及びその宿主の範囲は、宿主特異的であり環境的に安全なウイルスをはじめとして業界内で既知である。好適な昆虫ウイルスは、有害昆虫に対する生物学的制御物質として従来使用されてきたＤＮＡウイルス、例えばバキュロウイルス（ヌクレオポリヘドロウイルス及びグラニュロウイルス）及びエントモポックスウイルスである。例えば、本願に引用して援用する米国特許第４，８７９，２３６号に開示されているようなバキュロウイルス発現ベクターを産生することができる。好適なＲＮＡウイルスには、シポウイルスが含まれるがこれに限定されない。
【００８８】
高等植物の遺伝子の発現に有用なベクターは業界内で既知であり、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド及びｐＣａＭＶＣＮ形質導入制御ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅより入手可能）に由来するベクターを含む。
【００８９】
発現ベクター又はその他のＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に既知の技術により実施することができる。「形質転換」とは、新しいＤＮＡ（即ち細胞の外在ＤＮＡ）の組み入れの後、細胞に恒久性又は一過性の遺伝的変化が誘導されることを意味する。その細胞が哺乳動物細胞である場合、恒久性の遺伝的変化は一般的に、細胞のゲノムへのＤＮＡの導入によって達成される。「形質転換細胞」又は「宿主細胞」は、遺伝子組換えＤＮＡ技術によって本発明のポリペプチド（即ちオメガ−ＡＣＴＸポリペプチド）をコードするＤＮＡ分子又はその断片が導入された（又はその祖先に導入された）細胞（例えば原核細胞又は真核細胞）を意味する。
【００９０】
宿主が真核細胞である場合、リン酸カルシウム共沈殿等のＤＮＡ形質導入方法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームに包埋したプラスミドの挿入等の機械的手法並びに当該技術分野で既知のその他の方法を使用することができる。宿主が植物細胞である場合、例えばポリエチレングリコールを介するプロトプラストの形質転換、乾燥／阻害を介する（ｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎ／ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）ＤＮＡの取り込み、炭化ケイ素線維との振盪、ＤＮＡコーティング粒子の加速、生殖器への注入及び未成熟胚への注入等の、細胞への他の遺伝子導入方法も使用することができる。
【００９１】
又、真核細胞には、本開示内容のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子等の選択可能な表現型をコードする第二の外来ＤＮＡ分子とを同時に形質導入することもできる。好適なマーカーには、例えばネオマイシン及びヒグロマイシン等が含まれ、哺乳動物細胞に取り込ませることができる。マーカーへの耐性は、例えばその遺伝子が好適な真核細胞プロモーターを有する場合は、ネオマイシン遺伝子又はヒグロマイシン遺伝子によって付与することができる。別の方法は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス又はウシパピローマウイルス等の真核細胞ウイルスベクターを使用して、真核細胞に一過性に感染又は形質導入させて当該タンパク質を発現させるものである（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｇｌｕｚｍａｎ  ｅｄ．，  １９８２）。一実施形態においては、真核細胞宿主を本明細書に記載のような宿主細胞として使用する。真核細胞は酵母細胞（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等）又はヒト細胞を含む哺乳動物細胞であることができる。
【００９２】
発現を命令するのに遺伝子組換えウイルス又はウイルス要素を使用する哺乳動物細胞系は、工学的に操作することができる。例えば、アデノウイルス発現ベクターを使用する場合、外来タンパク質をコードする核酸配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーター及び三分節（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列に結合することができる。このキメラ遺伝子は、その後ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組換えによって、アデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムを非重要領域に挿入すると、感染した宿主で生存し、オメガ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現することのできる遺伝子組換えウイルスができる。
【００９３】
長期的には、安定した発現を行う遺伝子組換えポリペプチドの高収率での生成が望ましい。ウイルス由来の複製物を含有する発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御要素（プロモーター配列、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）によって制御されるオメガ−ＡＣＴＸ融合ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ及び選択マーカーで宿主細胞を形質転換することができる。遺伝子組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に耐性を付与し、細胞が安定的にその染色体にプラスミドを組み入れ、増殖して細胞巣を形成し、それをクローニングして細胞系まで拡大することを可能にする。例えば、外来ＤＮＡの導入後、工学的操作をした細胞は栄養の豊富な培地で１〜２日間増殖させ、その後選択的培地に切り替える。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼを含むがこれらに限定されない多数の選択系を使用することができる。
【００９４】
又、オメガ−ＡＣＴＸポリペプチドをデザインして、例えばカラムによる捕捉又は抗体の使用によって精製が容易な追加のＣ末端又はＮ末端アミノ酸をコードする配列を追加する等、追加的な配列を得ることができる。このようなタグは、例えばニッケルカラム上でのポリペプチドの精製を可能にするヒスチジンに富むタグを含む。このような遺伝子修飾技術及び好適な追加的配列は分子生物学の当該技術分野で既知である。
【００９５】
オメガ−ＡＣＴＸタンパク質、ポリペプチド又はポリペプチド誘導体は、当該技術分野で既知の方法によって精製することができる。これらの方法は、サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画法、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、結晶化、等電点分画電気泳動、分取ゲル電気泳動及び前記の１つ以上の方法を含む組み合わせを含むが、これらに限定されない。当業者に既知の方法に基づいて精製を実施し、他のポリペプチド及び炭水化物、脂質又は細胞小器官を実質的に有さないオメガ−ＡＣＴＸを調製することができる。純度は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動等の当該技術分野で既知の手段で評価することができる。
【００９６】
又、性質上それが結合しないポリペプチドに共有結合するオメガ−ＡＣＴＸポリペプチドを含むオメガ−ＡＣＴＸ融合ポリペプチドが提供される。融合ポリペプチドは種々の検定系で使用するのに有用である。このため、融合ポリペプチドは例えば、オメガ−ＡＣＴＸの発現を検出し、必要に応じてオメガ−ＡＣＴＸの発現に対する防御機序を提供するために使用することができる。例えば、オメガ−ＡＣＴＸ融合ポリペプチドは、オメガ−ＡＣＴＸポリペプチドと相互作用し、その機能に影響を与えるタンパク質を同定するのに使用することができる。この相互作用は、オメガ−ＡＣＴＸが他のタンパク質を調節する能力に特異性を付与するか、オメガ−ＡＣＴＸの機能の作用を促進又は抑制することができる。タンパク質親和性クロマトグラフィー等の物理的方法、又は酵母ツーハイブリッド又はファージディスプレイシステム等のタンパク質間相互作用のためのライブラリーに基づく検定をこの目的に使用することができる。このような方法は業界内で既知である。
【００９７】
融合ポリペプチドは、ペプチド結合によって融合した少なくとも２個の異種ポリペプチドセグメントを含む。第一のポリペプチドセグメントは、オメガ−ＡＣＴＸポリペプチドの隣接アミノ酸の全体又は一部を含むことができる。一部を含む場合、オメガ−ＡＣＴＸポリペプチドの少なくとも約８個の隣接アミノ酸、具体的には少なくとも約１０個、より具体的には約１５個、最も具体的には少なくとも約２０個の隣接アミノ酸を使用することができる。第一のポリペプチドセグメントは又、全長オメガ−ＡＣＴＸタンパク質であることもできる。第二のポリペプチドセグメントは、βガラクトシダーゼ等の検出可能な産物を生成する酵素又は当該技術分野で既知のその他の酵素を含むことができる。或いは、第二のポリペプチドセグメントは、緑色蛍光タンパク質、ＨｃＲｅｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）等の蛍光タンパク質又は当該技術分野で既知のその他の蛍光タンパク質を含むことができる。更に、融合タンパク質は、放射活性マーカー、蛍光マーカー、化学発光マーカー、ビオチン化マーカー等の検出可能なマーカーで標識することができる。
【００９８】
遺伝子組換え又は共有結合によって２個のポリペプチドセグメントを結合する融合ポリペプチドの作製技術は既知である。遺伝子組換えＤＮＡ方法を使用して、例えば、第二のポリペプチドセグメントをコードし、宿主細胞中でＤＮＡ構築物を発現するヌクレオチドで適切なリーディングフレーム内のオメガ−ＡＣＴＸコード配列を含むＤＮＡ構築物を作製することによって、オメガ−ＡＣＴＸ融合ポリペプチドを構築することができる。ＤＮＡ構築物は、タンパク質の産生を容易にする配列（即ち、プロモーター等）に操作的に結合することができる。
【００９９】
融合ポリペプチドに加え、オメガ−ＡＣＴＸは当該技術分野で既知の方法でｉｎ  ｖｉｔｒｏで標識することができる。オメガ−ＡＣＴＸは、テキサスレッド、ローダミン染料、フルオレセイン等の染料及び当該技術分野で既知のその他の染料と抱合させることができる。抱合用化学物質には、スクシニミジルエステル、イソチオシアネート及びマレイミドが含まれる。抱合可能な染料及び抱合用化学物質に関する詳細な情報は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓに記載されている。このような融合ポリペプチドは、短いアミノ酸配列に対して生成されたものよりも、特異性及び感受性の高い抗体を産生するのに使用することができる。更に、融合ポリペプチドを使用して、組織培養検定における細胞の生存、増殖及び分化に影響を与える能力を試験することができる。
【０１００】
オメガ−ＡＣＴＸポリペプチド又は毒素のプレポリペプチド又はプレプロポリペプチド形態を発現するトランスジェニック植物を構築することができる。「トランスジェニック植物」とは、「形質転換植物」細胞、又は植物ＤＮＡ（核又は葉緑体）が、同種の天然の非トランスジェニック植物に本来存在しない、導入された外在ＤＮＡ分子を含有するプロトプラストに由来する植物又はその子孫を意味する。
【０１０１】
単一の植物のプロトプラスト又は種々の外植体の何れかの植物の発育又は再生は、当該技術分野で既知である。この再生及び成長のプロセスは一般的には、形質転換細胞の選択、及び固着性の小植物段階を介した胚発達の通常の段階を通じたこれら個々の細胞の培養を含む。トランスジェニック胚及び種は同様に再生することができる。結果得られたトランスジェニックの固着性苗条をその後、土壌等の適切な植物成長培地に植えることができる。
【０１０２】
再生した植物を自家受粉させて、同型接合トランスジェニック植物を得ることができる。このほか、再生した植物から得られた花粉を、農業学的に重要な近交系の種子植物と交配させることができる。逆に、重要な系の植物の花粉を使用して、再生した植物に受粉することができる。所望のポリペプチドを含有するトランスジェニック植物は、当業者に既知の方法で栽培することができる。
【０１０３】
好適なトランスジェニック植物は、オメガ−ＡＣＴＸ遺伝子及びその子孫までの活性を伝播することのできる独立したセグレガントを含む。一実施形態において、トランスジェニック植物はオメガ−ＡＣＴＸ遺伝子の同型接合体であり、その遺伝子を性的交配でその子孫全てに伝播する。トランスジェニック植物の種を畑又は温室で成長させ、結果得られた性的に成熟したトランスジェニック植物を自家受粉して、真の交配植物を生成する。これらの植物からの子孫は真の交配系となり、例えば、好ましくは畑においてある範囲の環境条件下で１つ以上のダニ類に対する殺ダニ能力の増加等によって評価される。トランスジェニック植物は、トウモロコシ、ダイズ、綿、小麦、オート麦、大麦、その他の穀物、野菜、果物、果樹、ベリー類、芝草、観賞植物、潅木及び樹木等であることができる。
【０１０４】
スクリーニング目的の突然変異殺ダニポリペプチドのライブラリーは、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ２ａの遺伝子又は亜型のｉｎ  ｖｉｔｒｏの進化によって得られる。ライブラリーは、全オメガ−ＡＣＴＸ又は亜型遺伝子のｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ又は適切な酵素でオメガ−ＡＣＴＸ又は亜型遺伝子を分解した後、全遺伝子配列のｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲによる再構築を行うことにより作製することができる。これらのｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ手順は、オメガ−ＡＣＴＸ又は亜型の完全なプレプロポリペプチド遺伝子配列にも応用することができる。
【０１０５】
次に、変異型オメガ−ＡＣＴＸ又は亜型遺伝子配列のライブラリーを使用して、一連のオメガ−ＡＣＴＸ亜型アンタゴニストを生成することができる。次に、オメガ−ＡＣＴＸ又は選択したその亜型の分子的標的への結合の阻害能力に関してこれらのアンタゴニストをスクリーニングする。例えば、変異遺伝子ライブラリーのファージディスプレイによってスクリーニングを実施し、オメガＡＣＴＸの分子的標的に強く結合するファージ粒子又はオメガＡＣＴＸ又は選択されたその亜型のオメガＡＣＴＸの分子的標的への結合を阻害するファージ粒子を選択する。当業者は理解することであるが、変異遺伝子ライブラリーは、オリゴヌクレオチドカセット突然変異又は配位を無作為化した特定のヌクレオチドを使用した合成遺伝子の構築等の他の標準的な分子生物学的方法によって構築することもできる。
【０１０６】
又、オメガ−ＡＣＴＸ及びその亜型の三次構造を使用して、オメガ−ＡＣＴＸの重要な構造的要素、特に突然変異／トランケーション（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）／修飾の実験により活性において重要であることが明らかになった領域に類似したペプチド又は非ペプチド化合物の何れかの構造ライブラリーを検索（又は設計）することもできる。その後、これらの化合物の有する、オメガ−ＡＣＴＸ又はその亜型のその分子的標的への結合を阻害する能力を試験することができる。
【０１０７】
一実施形態において、精製オメガ−ＡＣＴＸポリペプチド及び農業学的に許容される担体を含む殺ダニ組成物が提供される。別の実施形態において、殺ダニ組成物は、オメガ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現するウイルスを含む。ウイルスへの感染は、摂取、吸入、昆虫ウイルスとの直接的な接触等の従来の方法を介して達成することができる。
【０１０８】
殺ダニ組成物は、水性溶液又は懸濁液等の流動性を有する溶液又は懸濁液の形態をとることができる。このような水性溶液又は懸濁液は、適用前に希釈する濃縮ストック溶液として、或いはすぐに適用できる希釈済み溶液として提供される。別の実施形態において、殺ダニ組成物は、水に分散できる顆粒を含む。別の実施形態において、殺ダニ組成物は、顆粒水和剤を含む。更に別の実施形態において、殺ダニ組成物は、水和の粉末、粉剤、ペレット又はコロイド状濃縮物を含む。このような殺ダニ組成物の乾燥形態は、湿潤によって直ちに溶解するか、或いは放出制御、徐放又はその他の時間依存性で溶解するべく調合される。
【０１０９】
オメガ−ＡＣＴＸポリペプチドはｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現し、実地使用のために単離することができる。このようなポリペプチドは粗細胞ライセート、懸濁液、コロイド等の形態を取ることができるか、精製、精練、緩衝及び／又は更に処理して、活性殺ダニ調合物として調合することができる。
【０１１０】
応用方法に関係なく、殺ダニ作用有効量で活性成分の量が適用されるが、これは制御される特異的なダニの種類、治療対象の特異的宿主又は環境、環境条件及び殺ダニ活性組成物の適用の方法、速度及び量等の因子によって異なる。
【０１１１】
オメガ−ＡＣＴＸポリペプチド、ポリヌクレオチド等を含む殺ダニ組成物は、農業学的に許容される担体と調合することができる。好適な農業学的担体は固体又は液体であることができ、業界内で既知である。「農業学的に許容される担体」という用語は、殺虫剤調合技術で通常使用される、例えば不活成分、分散剤、界面活性剤、粘着性付与剤、結合剤等の全ての補助剤を含む。これらは害虫駆除薬を調合する当業者には既知である。調合物は、１つ以上の固体又は液体の補助剤と混合することができ、従来の調合技術を使用して、殺ダニ組成物を好適な補助剤と均一に混合、ブレンド及び／又は粉砕する等、種々の方法によって調製することができる。
【０１１２】
殺ダニ組成物は、単独で又は、その他の害虫駆除剤を含むがこれに限定されない他の化合物と共に使用することができる。これらは、界面活性剤、洗浄剤、ポリマー又は徐放剤等のその他の処理剤と共に使用することができる。殺ダニ組成物は、ダニ誘引剤を含むことができる。殺ダニ組成物は、全身投与又は局所投与の何れかの用途のため調合することができる。このような物質はダニ類に直接適用することもできる。
【０１１３】
オメガ−ＡＣＴＸポリペプチドは、ダニ類害虫の制御に関与する方法において特に有用である。ダニを制御する方法は、ダニの居場所に殺ダニ作用のための有効量のオメガ−ＡＣＴＸポリペプチドを接触させることを含む。オメガ−ＡＣＴＸポリペプチドは、精製ポリペプチド、場合により発現ベクター内にあるオメガ−ＡＣＴＸポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、オメガ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現する植物細胞又は細菌細胞及び／又はオメガ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現するトランスジェニック植物の形態をとることができる。接触には、例えばオメガ−ＡＣＴＸポリペプチドの注入、外的接触又はオメガ−ＡＣＴＸポリペプチド又はポリヌクレオチド又はオメガ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現するウイルスの摂取が含まれる。
【０１１４】
殺ダニ組成物はダニ有害生物の居場所に適用することができる。コナダニ又はマダニの「居場所」は、ダニ有害生物それ自体又はそのなかでコナダニ又はマダニが生息するか、それらの卵が存在する、それを取り巻く大気、それが食べる食物、それが接触する物体又は宿主を含めた環境を指す。殺ダニ適用の強度及び期間は、処置する特定のダニ有害生物及び特定の環境条件に特異的な条件に応じて設定することができる。担体に対する活性成分の構成比は、当然のことながら、その殺ダニ組成物の化学的性状、可溶性及び安定性並びに検討対象となる特定の調合物によって異なる。
【０１１５】
マダニ及びコナダニ等の外部寄生虫の攻撃対象は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、バッファロー、スイギュウ、シカ、ウサギ、ニワトリ、七面鳥、鴨、ガチョウ、ダチョウ等の多数の家畜動物である。ウマ及びその他の娯楽のための動物も、毛皮のために育てられるミンクやその他の動物も、実験及び研究に使用されるラット、マウス及びその他の動物も外部寄生虫の攻撃対象である。イヌ及びネコ等のコンパニオン動物は外部寄生虫に攻撃されることが極めて多い対象で、これらの動物はヒトと密接につながっているため、このような寄生が彼らを伴うヒトにおいて問題となる。
【０１１６】
殺ダニ剤を家畜及びコンパニオン動物に送達するための通常の方法には、動物の身体に殺ダニ剤を含有する液体をかける等の全身処理、例えば経口剤及び植込み型の徐放製剤等の殺ダニ剤を宿主の血液中で循環させるようにする全身投与、首輪や耳タグ等の通常物理的にその動物に装着されており、殺虫剤を持続的に数週間又は数ヵ月にわたって放出する徐放系、及び、食物や巣作りのための材料等の誘惑を提供する道具に動物が引き付けられ、それによってその動物が殺ダニポリペプチドを噴霧されるかコーティングされる自己投与方法が含まれる。自己投与方法では、動物はその道具に接触するか、何らかの方法でその道具が殺虫剤を放出するようなきっかけを与える。
【０１１７】
ヒトも、ダニ類等の多くの外部寄生虫の宿主になる可能性があり、熱帯地域及び衛生状態の不良な地域では、寄生虫感染症は医療の現場でよくみられる問題である。マダニの場合、マダニは寄生虫及びヒト及び／又は動物に伝播するおそれのある他の病原体を運搬する。ヒトが罹患することのあるマダニが媒介する感染症には、ライム病、バベシア病及びヒト顆粒性アナプラズマ病が含まれる。これらとは異なり、疥癬は、顕微鏡によらなければ見えないコナダニのＳａｒｃｏｐｔｅｓ  ｓｃａｂｅｉによる皮膚の感染症である。殺ダニポリペプチドは、例えば内服又は注射によってヒトに投与することができる。
【０１１８】
マダニが媒介する疾患の場合、ヒト又は動物の宿主への伝播は、シカやマウス等の野生媒介動物を介して行われることがある。動物上（マウス等のげっ歯類、シカ、リス、家畜及びマダニの生息地に入るヒト等）で幼虫が約１週間生息して成長してから離れ、１週間から８ヵ月後にかけてあらゆる場所で脱皮（抜け殻）する。幼虫はその後、８脚の若虫になる。若虫は動物上で成長し、３〜１１日間血を吸い、離れて、約１ヵ月後に脱皮する（時期は種類や環境条件によって異なる）。一度幼虫が脱皮すると、成虫のマダニ（雄又は雌）になる。マダニは草及び植物を這い上がり、その脚を上げて餌動物を「感知」し「探す」。マダニは口を挿入し、その餌動物に取り付き、その血を吸う。摂食中、マダニの唾液が宿主の身体及び血瘤に入ることがある。例えばＢｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに感染しているマダニは、意図せずこの細菌を宿主に伝播することがある。
【０１１９】
マダニのライフサイクルは媒介動物によって左右されるため、ヒト及び動物（家畜及びコンパニオン動物）におけるマダニが媒介する感染症を予防するための一つの方法は、媒介動物の居場所に殺ダニポリペプチドを適用することである。ポリペプチドは、例えば媒介動物、媒介動物の環境又は媒介動物の食物に適用することができる。一実施形態において、殺ダニ組成物は餌組成物の形態で投与される。餌組成物には、摂食刺激物質及び場合により誘引物質が含まれる。誘引物質とは、例えばげっ歯類の動物又はシカを餌に近づけるのに役立つ物質である。摂食刺激物質は、例えばげっ歯類の動物又はシカが、餌を摂食し、摂食し続けるようにさせる。ある物質は、誘引物質としても摂食刺激物質としても機能することができる。誘引物質は食物又は「好奇心をそそるエンハンサー」であることができる。餌組成物は、例えばマダニの群の少ないブラシの中又は住宅に設置することができる。
【０１２０】
一実施形態において、殺ダニポリペプチドはダニ類の環境に適用される。ダニ類の生息地を処理するのに好適な適用法には、例えば、ダスティング、散水、浸漬、土壌への注入、種子のコーティング、苗木のコーティング、噴霧、曝気、ミスト化、霧化等が含まれる。これらの適用手順も当業者には既知である。
【０１２１】
寄生するコナダニは、例えばヒト及び動物の皮膚に感染する。例えば疥癬は、顕微鏡によらなければ見えないコナダニのＳａｒｃｏｐｔｅｓ  ｓｃａｂｅｉによるヒト皮膚の寄生虫症である。Ｐｓｏｒｏｐｔｅｓ属等のコナダニは、例えばヒツジのような動物に感染し、疥癬を引き起こす。
【０１２２】
殺ダニポリペプチドは、植物に寄生する植食性のコナダニ等のダニ類を制御するのに使用することができる。植食性のコナダニは、最も食欲の盛んな穀物の植食性害虫である。植食性のコナダニは、コナダニが摂食または生息する植物の部分に活性化合物を適用することによって制御することができる。殺ダニポリペプチドは、例えば噴霧、霧化、蒸気化、撒布、ダスティング、撒水、噴水、散水、注水及び燻蒸等の当該技術分野で既知の好適な方法で適用することができる。殺ダニポリペプチドの容量は、害虫の種類、使用する担体、適用の方法及び適用のための気候条件（屋内、乾燥、高湿度、風が強い、寒い、暑い、調節された気温等）及び調合剤の種類（エアロゾル、液体又は固体等）のような因子によって異なる。但し、有効用量は当業者によって容易に決定することができる。
【０１２３】
一実施形態において、植食性のコナダニは、殺ダニポリペプチドを発現するトランスジェニック植物の使用によって制御することができる。
【０１２４】
殺ダニポリペプチドは、一般的には屋内に生息するダニ類を制御することができる。殺ダニポリペプチドを使用して制御することのできるダニ類の、説明目的であって制限のない例には、アメリカハウスダストコナダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ）及びＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｎｏｎｙｓｓｉｎｕｓ等のサシダニ科、Ｌａｒｄｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｋｏｎｏｉ、カビ又はコプラ又はマグサコナダニ（Ｔｙｒｏｐｈａｇｕｓ  ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｔｉａｅ）及びムギコナダニ（Ａｌｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｏｖａｔｕｓ）等のコナダニ科、Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ  ｐｒｉｖａｔｕｓ、Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ、食料コナダニ（Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ  ｄｅｓｔｕｃｔｏｒ）等のニクダニ科及びＣｈｅｌａｃａｒｏｐｓｉｓ  ｍｏｏｒｅｉ、Ｃｈｅｌａｃａｒｏｐｓｉｓ  ｍａｌａｃｃｅｎｓｉｓ、Ｃｈｅｙｌｅｔｕｓ  ｆｏｒｔｉｓ、Ｃｈｅｙｌｅｔｕｓ  ｅｒｕｄｉｔｕｓ及びＣｈｅｌａｔｏｍｏｒｐｈａ  ｌｅｐｉｄｏｔｅｒｏｒｕｍ等のＣｈｏｒｔｏｇｌｙｐｈｕｓ属Ｃｈｅｙｌｅｔｉｄａｅ科、Ｏｒｎｉｔｈｏｎｙｓｓｕｓ  ｂａｃｏｔｉ、Ｏｒｎｉｔｈｏｎｙｓｓｕｓ  ｓｙｌｖｉａｒｕｍ、Ｄｅｒｍａｎｙｓｓｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｅ及びＤｅｒｍａｎｙｓｓｕｓ  ｈｉｒｕｎｄｉｎｉｓ等のオオサシダニ科、Ｈａｐｌｏｃｈｔｈｏｎｉｕｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ、シラミダニ及びヒゼンダニ等が含まれる。
【０１２５】
屋内のダニ類害虫の処理において、殺ダニポリペプチドは、例えばチリダニが寄生することが知られているソファー、布張り椅子、ベッド類、枕、ラグ、カーペット等の織布表面に噴霧して適用することができる。ここで焦点はチリダニとそのアレルゲンに当てられているが、これらの方法は、一般のチリ粒子に対しても、それに伴う花粉や動物のフケを含めた他のアレルゲンに対しても等しく有効であることは理解される必要がある。適用は、内蔵式のエアロゾル噴霧器具によってなされることができる。例えばしっかりと枕の全ての側に噴霧し、スプレーが角や間隙にも届くように、噴霧は注意深く行う必要がある。
【０１２６】
本発明を下記の非制限の実施例により更に説明する。
【実施例】
【０１２７】
（実施例１  オメガ−ＡＣＴＸ−１ファミリーポリペプチドの発見）
雌のＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｉｎｆｅｎｓａクモをオーストラリアのクイーンズランド州の都市Ｔｏｏｗｏｏｍｂａで採集した。雌のＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｖｅｒｓｕｔａクモは、オーストラリア  ニューサウスウェールズ  ブルーマウンテン地区で入手した。雄及び雌のＡｔｒａｘ  ｒｏｂｕｓｔｕｓクモはオーストラリアのニューサウスウェルズのシドニー郊外で採集した。検体を気密性の収集容器で飼育して、毒腺を抽出した。ジョウゴグモは−２０℃まで４０〜６０分かけて冷却した。毒腺は個々に各検体から切除した。各毒腺の対を抽出緩衝剤に個別に入れた。
【０１２８】
毒腺を単離したらすぐに、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐＴＭ  Ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してポリＡ＋  ｍＲＮＡを調製した。精製ｍＲＮＡ試料を８０％エタノールで洗浄し、Ｓｐｅｅｄｖａｃで乾燥した。ｃＤＮＡ合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から入手したＲＮＡｓｅを含まない蒸留水１０μＬを使用して、ｍＲＮＡ試料を再水和した。精製ｍＲＮＡ試料は−２０℃で保管した。
【０１２９】
その後、ＭａｒａｔｈｏｎＴＭ  ｃＤＮＡ増幅キット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を使用して、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。適合するｍＲＮＡテンプレートから、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ）及びポリ（ｄＴ）アンカープライマー（ＧＧＧＣＡＧＧＴ１７）（配列番号５８）であるＥｃｈｏｃｌｏｎａｎｃｈ−２プライマーを使用して、一本鎖ｃＤＮＡを構築した。第二の鎖の合成は、キットの指示通りに実施した。ｃＤＮＡ産物をＣｏｎｃｅｒｔＴＭ  Ｒａｐｉｄ  ＰＣＲ精製キット（ＧＩＢＣＯ）を使用して精製した。二本鎖ｃＤＮＡを５０μＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝剤（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で溶出した。
【０１３０】
次に、ＭａｒａｔｈｏｎＴＭ  ｃＤＮＡ増幅アダプター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）をこの二本鎖ｃＤＮＡに結合した。ライゲーション反応は１６℃で一晩行わせた。一晩のライゲーションの後、試料を１〜２０倍希釈のグリコーゲン１０μＬ、ｐＨ５．２の３Ｍ  酢酸ナトリウム１０μＬ及び１００％冷却エタノール１００μＬを使用して沈殿させた。その後、試料を８０％エタノールで洗浄し、１０分間乾燥させて、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝剤２００μＬに再懸濁させた。
【０１３１】
リーダー配列の情報を、５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅法；Ｆｒｏｈｍａｎら、Ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡｓ  ｆｒｏｍ  ｒａｒｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ：  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｇｅｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒ，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ８５，  ８９９３−９００２，  １９８８を参照）を使用して入手した。５’ＲＡＣＥは、対応するｍＲＮＡの５’配列を増幅することにより、部分的ｃＤＮＡのクローンを伸長させるのに使用される。５’ＲＡＣＥではこの部分的ｃＤＮＡのクローン内の配列の小領域のみの知見を使用する。５’ＲＡＣＥは、末端基転移酵素により、ホモポリマーの尾を全てのテンプレートｃＤＮＡの５末端に付加された初回の伸長ｃＤＮＡを使用する。この合成の尾は、標的ｍＲＮＡの未知の５’配列の上流のプライマー結合部位を提供する。その後、この新しい５’の尾に結合する一般的なセンスプライマー及び既知のｃＤＮＡ配列に結合する特異的なアンチセンスプライマーを使用して、ＰＣＲ反応を実施する。重複ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）プライマーはこの技法のためにデザインされたものである。この重複プライマーを５’共通アダプタープライマー（ＥｃｈｏＡＰ１）と共に使用して、未知のリーダー配列に関する情報を得た。３’ＲＡＣＥ用のプライマーを、５’ＲＡＣＥで得られたｃＤＡＮリーダー配列からデザインした。３’ＲＡＣＥプライマーを共通アダプターオリゴｄ（Ｔ）プライマー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）と共に使用して、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａと相同なシグナル配列を有する遺伝子産物を生成した。キットに含まれていないプライマーは全て、ＰＲＯＬＩＧＯ  Ｌｔｄが構築した。
【０１３２】
５’ＲＡＣＥプライマーは以下の通りである。
【０１３３】
【化５０】
2009508862.tif 000052
（式中、Ｒはプリン（Ａ／Ｇの縮退）であり、Ｙはピリミジン（Ｃ／Ｔの縮退）及びＮは完全な縮退（Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴ）である）
３’ＲＡＣＥプライマーは以下の通りである。
【０１３４】
【化５１】
2009508862.tif 000053
５μＬの二本鎖ｃＤＮＡ、２７μＬのＭｉｌｌｉ  Ｑ水、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０×ＰＣＲ緩衝剤、５０×ｄＮＴＰ及び５μＬのＡＭＰＬＩＧＯＬＤ  ＴＡＱＴＭ  Ｅｎｚｙｍｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ  Ｇｏｌｄ  ｗｉｔｈ  ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｋｉｔ）を使用して、ＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応は、以下のプロトコールを使用して熱サイクラーで実行した。
【０１３５】
【化５２】
2009508862.tif 000054
増幅したｃＤＮＡ産物を１．５％アガロースゲル上で電気泳動させ、サイズの確認のため臭化エチジウムで染色した。
【０１３６】
確認したＰＣＲ産物を、ＧＩＢＣＯゲル精製キットを使用してアガロースゲルから抽出し、Ｐｅｌｌｅｔ  Ｐａｉｎｔ（登録商標）  Ｃｏ−Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ  ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して沈殿させた。沈殿させたら、ｃＤＮＡ末端をキナーゼでリン酸化し、クローニングの準備をした。試料をｐＳＭＡＲＴＴＭベクターとライゲーションし、Ｌｕｃｉｇｅｎ  ＣｌｏｎｅＳｍａｒｔ  Ｂｌｕｎｔ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔを使用して、Ｅ．  ｃｌｏｎｉ細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を形質転換した。形質転換に成功したクローンを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加したＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ中で１時間培養し、その後一晩静置して増殖させた。
【０１３７】
試料が正確な挿入サイズをしているかどうかを、ＰＣＲ及びゲル電気泳動で試験した。正確な挿入サイズを含有する試料をＤＮＡシーケンシングに使用した。オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのプレプロタンパク質をコードする完全ｃＤＮＡ配列（配列番号１）及びその１６個のパラログ（配列番号７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９又は５２）を、多数のクローンをシーケンシングして得た。これらのプレプロタンパク質配列を要約し、図１に並べる。これらのプレプロタンパク質のシグナルペプチド開裂部位を、ＳｉｇｎａｌＰ  ｐｒｏｇｒａｍのバージョン３．０（Ｄｒｙｌoｖら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  ＳｉｇｎａｌＰ  ３．０，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３４０，  ７８３−７９５，  ２００４；プログラムはウェブからも入手可能  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を使用して予測した。成熟毒素は、オーストラリアジョウゴグモが産生するω−ＡＣＴＸ−１毒素における既知のプロペプチド開裂部位と同じく、３６〜３７位の二塩基性Ａｒｇ−Ａｒｇ配列に続くプロペプチドの開裂によって得られることが予測される。これらの２つのエンド型プロテアーゼの開裂部位を図１の矢印で示す。
【０１３８】
（実施例２  遺伝子組換えオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの調製）
遺伝子組換えオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを、Ｔｅｄｆｏｒｄら、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ−ｈａｉｒｐｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ｏｍｅｇａ−ａｔｒａｃｏｔｏｘｉｎ−Ｈｖ１ａ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：  ２６５６８−２６５７６，  ２００１に記載の通りに調製した。要約すれば、大腸菌ＢＬ２１細胞をｐＨＷＴ１で形質転換し、ＧＳＴ：オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ融合タンパク質を過剰産生するようにした。細胞をＬＢ培地、３７℃で、ＯＤ６００が０．６〜０．８になるまで増殖させ、その後１５０μＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を有する融合タンパク質を誘導した。誘導から３〜４時間後に、遠心分離で細胞を回収し、フレンチプレスを使用して破砕した。この遺伝子組換え融合タンパク質を、ＧＳＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上での親和性クロマトグラフィーを使用して可溶性細胞分画から精製した後、約２４時間ウシトロンビン（Ｓｉｇｍａ）をカラム上に添加して開裂した。未結合の毒素をＴｒｉｓ−緩衝生食水（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ８．０）を入れたカラムから溶出し、すぐに逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｐＨＰＬＣ）を使用して精製した。遺伝子組換え毒素及び汚染物質を、１２．５〜２０％アセトニトリルの直線勾配を使用して２０分かけて流量１ｍＬ／分−１でＶｙｄａｃ  Ｃ１８分析ｒｐＨＰＬＣカラム（４．６×２５０ｍｍ、孔径５μｍ）から溶出した。オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａに相当する単一の大きなピークが溶出され、保持時間は約１１分であった。この遺伝子組換え毒素が、天然のタンパク質に比べて２個過剰にＮ末端残基（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を有しており、これらはＧＳＴ融合タンパク質におけるトロンビン開裂部位の痕跡であることに留意されたい。
【０１３９】
（実施例３  天然のオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ２ａの精製）
Ｗａｎｇら、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｌｏｃｋｅｒ  ｏｆ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６，  ４０８０６−４０８１２，  ２００１に記載されている通りに、オーストラリアジョウゴグモ  Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｖｅｒｓｕｔａの毒から天然のオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ２ａを精製する。要約すれば、凍結乾燥した粗毒を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８分析逆相高圧液体クロマトグラフィー（ｒｐＨＰＬＣ）カラムを使用して分画する。この初回の分画で得られた半純粋のオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ２ａを同じカラム上で、３０〜４８％アセトニトリルの直線勾配を使用して、約３５分かけて流量約１ｍＬ／分で更に精製する。約９８％を超える均質性が得られるまで精製したら、ペプチドを凍結乾燥して使用するまで２０℃で保管する。
【０１４０】
（実施例４  遺伝子組換えオメガＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは注入によりマダニに対する致死性を有する）
遺伝子組換えオメガＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの殺ダニ活性を、毒素を直接アメリカアムブリオマ（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）（クモ形綱：ダニ目：マダニ科）に注入することにより、定量的に測定した。マダニは、実験室で交配した病原体を持たないＡｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍのコロニーから入手し、コネチカット大学健康センター免疫学科で２７±１℃、相対湿度７５％で飼育した。Ａ．  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍは、米国においてヒトの人畜共通性感染症の病原体の重要なベクターである。ヒトのエールヒア症（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ及びＥ．  ｅｗｉｎｇｉｉ）、南部のマダニに起因するライム病に似た臨床的症状を有する発疹病（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｌｏｎｅｓｔａｒｉ）の原因物質を伝播する役割を果たす。又、ツラレミア（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）及びロッキー山紅斑熱（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）の原因物質のベクターとしても働く。
【０１４１】
マダニ１ｇ当たり毒素２００〜１２００ピコモルの用量を注入することにより、用量反応曲線を構築した。毒素の分子量は約４２００ダルトンであるため、これはマダニ１ｇ当たり約０．８〜５μｇの毒素に相当する。この毒素を昆虫生理食塩水（２００ｍＭ  ＮａＣｌ、３．１ｍＭ  ＫＣｌ、５．４ｍＭ  ＣａＣｌ２、５．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３及び０．１ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）に溶解して、注入に必要な各用量がストック溶液の２μＬを超えないような十分な濃度のストック溶液を得た。マダニは注入のため、一時的に４℃で固定した。注入後、各マダニを個々に２７℃の加湿したチャンバー内のバイアルで飼育した。毒素の各用量に対して６〜８匹のマダニのコホート集団に注入を行い、対照の６〜８匹のマダニのコホート集団には賦形剤（昆虫生理食塩水）のみを注入した。注入は、Ｈａｍｉｌｔｏｎマイクロシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏ．［米国ネバダ州レノ］）を使用して実施した。４８時間後の死亡をスコア化した。症状の重症度及び発症は、投与用量及び投与経路によってさまざまであったが、高用量では数分以内に重度の作用が認められた。最も著明な表現型作用は、８本全ての脚が閉ループを形成する丸まりを呈することであった。これにより移動は極めて困難になったが、低用量の毒素を注入されたマダニはそれでも極めて緩徐に曲がった脚で歩くことができた。又、おそらくは全般的な脚の衰弱及び上に記載の「丸まり」表現型のため、立ち直り反射が消失した。高用量の毒素（＞１０００  ｐｍｏｌ／ｇ）では、注入されたマダニの外被は黒くなり、瀕死のマダニは静止位で麻痺した。毒素のこの不動化（麻痺）作用は非可逆性であった。
【０１４２】
図２は、この方法を使用したオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａで得られた用量反応曲線を示す。各点は、別の日に実施した３回の独立した測定による値の平均値を示す。ＬＤ５０値（即ち、注入から４８時間後にマダニの５０％を殺すオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの用量）を、以下の公式をログ用量反応曲線に当てはめることによって算出した：
ｙ＝（ａ−ｂ）／［１＋（ｘ／ＬＤ５０）ｎ］
式中、ｙは注入から４８時間後の試料集団における死亡率であり、ｘはｐｍｏｌｇ−１で表す毒素の用量であり、ｎは変動する勾配因子であり、ａは最大の反応、ｂは最小の反応である。算出されたＬＤ５０値は、４４７±３ｐｍｏｌｇ−１であった。
【０１４３】
（実施例５  遺伝子組換えオメガＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは摂取によりマダニに対する致死性を有する）
遺伝子組換えオメガＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの経口殺ダニ活性を、アメリカアムブリオマ（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）にマダニ１ｇ当たり毒素４００〜１４００ピコモルの用量で、毒素を摂取させることにより、定量的に測定した。この毒素の分子量は約４２００ダルトンであるため、これはマダニ１ｇ当たり約１．７〜６μｇに相当する。摂取実験では、毒素をＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）−１６４０培地に溶解し、マダニに５μＬ毛細管（ＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，  ＰＡ）を使用してこの溶液を２〜３ｍμＬ摂取させた。ＲＰＭＩ培地は以下を含む。
【０１４４】
【化５３】
2009508862.tif 000055
【０１４５】
【化５４】
2009508862.tif 000056
【０１４６】
【化５５】
2009508862.tif 000057
毛細管を磨いて、表面を面取りし、マダニの口部を含む鋏角及び口円錐に挿入する。摂取実験中にマダニが脱水しないように注意を払う。６〜８匹のマダニのコホート集団に毒素の各用量を摂取させ、対照の６〜８匹のマダニのコホート集団には賦形剤（ＲＰＭＩ−１６４０）のみを摂取させた。４８時間後の死亡をスコア化したが、高用量では数分以内に症状が認められ、マダニは迅速に麻痺した。最も稀な中毒症状は、脚が閉ループを形成する丸まりを呈することであった。又、立ち直り反射も消失した。対照のマダニはＲＰＭＩ−１６４０の摂取によって影響を受けなかった。
【０１４７】
図３は、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのＡ．  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍへの摂取により得られた用量反応曲線を示す。各点は、別の日に実施した３回の独立した測定による値の平均値を示す。ＬＤ５０値（即ち、注入から４８時間後にマダニの５０％を殺すオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの用量）を、以下の公式をログ用量反応曲線に当てはめることによって算出した：
ｙ＝（ａ−ｂ）／［１＋（ｘ／ＬＤ５０）ｎ］
（式中、ｙは注入から４８時間後の検体集団における死亡率であり、ｘはｐｍｏｌｇ−１で表す毒素の用量であり、ｎは変動する勾配因子であり、ａは最大の反応、ｂは最小の反応である）。毒素の経口送達による算出されたＬＤ５０値は７１６±２３ｐｍｏｌｇ−１であり、毒素の直接注入で得られたＬＤ５０の２倍未満であった（図３）。
【０１４８】
毒素を添加したＲＰＭＩ培地を摂取させたマダニは、毒素を有さないＲＰＭＩ培地を摂取させた対照マダニでは認められない独特の行動を示した。毒素を添加したＲＰＭＩ培地を摂取させたマダニは、培地の入った毛細管を追い払おうとし、対照マダニ（平均４〜６μＬ）に比べて６０分間の摂取時間で少量の液体しか消費しなかった（平均２〜３μＬ）。更に、被験コホート集団は、対照マダニ（２５〜３０分）に比べて、この少量の容量のＲＰＭＩ培地を飲むのに著明に長い時間がかかった（５０〜６０分）。このため、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの経口摂取による算出されたＬＤ５０値は、ほぼ確実に過大な値であり、これによって、この経路を介して送達された毒素は、マダニに注入された場合に比べて殆ど等位であることが示唆される。更に、これらの結果は、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａがマダニに対して極めて毒性が高いのに加えて、有効な摂食阻害剤であることを示している。
【０１４９】
（実施例６  天然のオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ２ａは注入によりマダニに対して致死性を有する）
天然のオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ２ａの殺ダニ活性を、５匹の血を吸っていない雄及び５匹の血を吸っていない雌のＡ．  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍからなるコホート集団に毒素の単回用量（６ｎｍｏｌ／ｇ、約２５μｇ／ｇ）を直接注入することによって測定した。毒素は昆虫生理食塩水に溶解して、注入容量が２μＬ未満で済むような十分な濃度のストック溶液を得た。５匹のマダニのコホート集団には、賦形剤（昆虫生理食塩水）のみを注入した。マダニは注入のため、一時的に４℃で固定した。注入後、各マダニを個々に２７℃の加湿したチャンバー内のバイアルで飼育した。毒素を注入したマダニでは数分以内に症状が認められ、マダニは迅速に非可逆的に麻痺した。最も稀な中毒症状は、脚が閉ループを形成する丸まりを呈することであった。又、立ち直り反射も消失した。４８時間後には雄及び雌のマダニ集団の両方で死亡率は１００％であった。これとは逆に、対照マダニは昆虫生理食塩水の注入によって影響を受けなかった。
【０１５０】
本明細書に示すように、マダニ等のダニ類害虫は殺ダニポリペプチドを使用することによって有効に制御することができる。ポリペプチドは、殺虫活性を有することが明らかにされているオメガ−ＡＣＴＸ−１及びオメガ−ＡＣＴＸ−２ファミリーを含むことができる。昆虫とマダニは緊密に関連していないことから、ポリペプチドの殺ダニ活性は予期されなかった。
【０１５１】
本明細書で使用する「第一」、「第二」等の用語は、何らかの順序、量又は重要性を示すものではなく、ある要素と別の要素を区別するために使用され、「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は量の制限を意味するのではなく、少なくとも１つの引用項目が存在することを示すものである。本明細書に開示する全ての範囲は、包括的なものであり、組み合わせることができる。
【０１５２】
以上において本発明を好ましい実施形態を引用して説明してきたたが、本発明の適用範囲から逸脱することなく、種々の変更を加えて、等価物をその要素と置き換える場合があることを、当業者は理解するであろう。更に、本発明の本質的な適用範囲から逸脱することなく、本発明の教示内容に特定の状況又は材料を適応させるために多くの改変を加える場合がある。このため、本発明は、本発明を実施するにあたって検討した最良の様式として開示される特定の実施形態によって限定されるものではなく、本発明は添付の特許請求の範囲内の全ての実施形態を包含するものとして意図される。
【０１５３】
言及した特許、特許出願及びその他の参考文献は全て、全体が参考として本明細書で援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】図１は、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ（配列番号１）と１６個のオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａオーソログの完全なプレプロポリペプチド配列（配列番号７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９又は５２）とのアライメントを示す。高度に保存されたアミノ酸残基は、灰色の網掛けで示す。縦の矢印は、シグナルペプチド及びプロペプチド開裂部位を示す。
【図２】図２は、遺伝子組換えオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａをアメリカアムブリオマ（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）に注入することにより得られた用量反応曲線である。
【図３】図３は、遺伝子組換えオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａをアメリカアムブリオマ（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）に経口摂取させた時に得られた用量反応曲線である。
【図１】
2009508862.tif 000058
【図２】
2009508862.tif 000059
【図３】
2009508862.tif 000060
【配列表】
2009508862000001.app
【国際調査報告】
2009508862.tif 000061
2009508862.tif 000062
2009508862.tif 000063
2009508862.tif 000064
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