(57)【要約】    本発明の一番目の態様は、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩と、酪酸ナトリウム若しくはそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）から選択されるヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤とを含む組合せに関する。本発明の二番目の態様は、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩と、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、ＳＡＨＡ、バルプロ酸ナトリウム、及びＴＳＡから選択されるＨＤＡＣ阻害剤とを含む、治療において同時に、連続して、又は個別に用いるための組合せ調製物としての医薬品に関する。三番目の態様は、増殖症の治療方法であって、かかる治療方法が、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩と、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、ＳＡＨＡ、バルプロ酸ナトリウム、及びＴＳＡから選択されるＨＤＡＣ阻害剤とを対象に同時に、連続して、又は個別に投与することを含むことを特徴とする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩と、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤とを含む組合せ。
【請求項２】
ＨＤＡＣ阻害剤が、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグであることを特徴とする請求項１の組合せ。
【請求項３】
プロドラッグが、ピバロイルオキシメチル酪酸であることを特徴とする請求項２の組合せ。
【請求項４】
ＨＤＡＣ阻害剤が、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）であることを特徴とする請求項１の組合せ。
【請求項５】
ＨＤＡＣ阻害剤が、トリコスタチンＡ(ＴＳＡ)であることを特徴とする請求項１の組合せ。
【請求項６】
ＨＤＡＣ阻害剤が、バルプロ酸ナトリウムであることを特徴とする請求項１の組合せ。
【請求項７】
ロスコビチンが、Ｒ−ロスコビチンであることを特徴とする請求項１〜６いずれか記載の組合せ。
【請求項８】
請求項１〜７いずれか記載の組合せと、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む医薬的組成物。
【請求項９】
増殖症を治療するための薬物の調製における請求項１〜７いずれか記載の組合せの使用。
【請求項１０】
ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩、並びに、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤を含み、治療上同時に、連続して、又は個別に用いるための組合せ調製物としての医薬品。
治療における
【請求項１１】
ＨＤＡＣ阻害剤が、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグであることを特徴とする請求項１０記載の医薬品。
【請求項１２】
プロドラッグが、ピバロイルオキシメチル酪酸であることを特徴とする請求項１１記載の医薬品。
【請求項１３】
ＨＤＡＣ阻害剤が、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）であることを特徴とする請求項１０記載の医薬品。
【請求項１４】
ＨＤＡＣ阻害剤が、トリコスタチンＡ(ＴＳＡ)であることを特徴とする請求項１０記載の医薬品。
【請求項１５】
ＨＤＡＣ阻害剤が、バルプロ酸ナトリウムであることを特徴とする請求項１０記載の医薬品。
【請求項１６】
ロスコビチンが、Ｒ−ロスコビチンであることを特徴とする請求項１０〜１５いずれか記載の医薬品。
【請求項１７】
薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物の形態としての、請求項１０〜１６いずれか記載の医薬品。
【請求項１８】
増殖症の治療において用いられることを特徴とする請求項１０〜１７いずれか記載の医薬品。
【請求項１９】
増殖症が、がんであることを特徴とする請求項１８記載の医薬品。
【請求項２０】
がんが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）であることを特徴とする請求項１９記載の医薬品。
【請求項２１】
ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩と、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤とを、同時に、連続して、又は個別に投与することを含む増殖症の治療方法。
【請求項２２】
ロスコビチンが、Ｒ−ロスコビチンであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
酪酸ナトリウムのプロドラッグが、ピバロイルオキシメチル酪酸であることを特徴とする請求項２１又は２２記載の方法。
【請求項２４】
ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩、及びＨＤＡＣ阻害剤を、個々の成分の治療効果量でそれぞれ投与することを特徴とする請求項２１〜２３いずれか記載の方法。
【請求項２５】
ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩、及びＨＤＡＣ阻害剤を、個々の成分の治療量以下でそれぞれ投与することを特徴とする請求項２１〜２３いずれか記載の方法。
【請求項２６】
ＨＤＡＣ阻害剤、及びロスコビチン又はその薬学的に許容される塩が、同時に投与されることを特徴とする請求項２１〜２５いずれか記載の方法。
【請求項２７】
ＨＤＡＣ阻害剤、及びロスコビチン又はその薬学的に許容される塩が、連続して又は個別に投与されることを特徴とする請求項２１〜２５いずれか記載の方法。
【請求項２８】
ＨＤＡＣ阻害剤が、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩より前に、連続して又は個別に投与されることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩が、ＨＤＡＣ阻害剤より前に、連続して又は個別に投与されることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
増殖症が、がんであることを特徴とする請求項２１〜２９いずれか記載の方法。
【請求項３１】
がんが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）であることを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
増殖症の治療のための薬物の調製におけるロスコビチン又はその薬学的に許容される塩の使用であって、前記治療が、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤を同時に、連続して、又は個別に対象に投与することを含むことを特徴とする使用。
【請求項３３】
薬物の調製における酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤の使用であって、前記治療が、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩を同時に、連続して、又は個別に対象に投与することを含むことを特徴とする使用。
【請求項３４】
増殖症の治療のための薬物の調製におけるロスコビチン又はその薬学的に許容される塩と、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤との使用。
【請求項３５】
ロスコビチンとその薬学的に許容される塩との併用療法において使用される、増殖症の治療のための薬物の調製における、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤の使用。
【請求項３６】
酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤との併用療法において使用される、増殖症の治療のための薬物の調製における、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項３７】
酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤との前治療において使用される、増殖症の治療のための薬物の調製における、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項３８】
ロスコビチンが、Ｒ−ロスコビチンであることを特徴とする請求項３２〜３７いずれか記載の使用。
【請求項３９】
酪酸ナトリウムのプロドラッグが、ピバロイルオキシメチル酪酸であることを特徴とする請求項３２〜３８いずれか記載の使用。
【請求項４０】
増殖症が、がんであることを特徴とする請求項３２〜３９いずれか記載の使用。
【請求項４１】
がんが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）であることを特徴とする請求項４０記載の使用。
【請求項４２】
ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩とＨＤＡＣ阻害剤の、非小細胞肺がんを治療するための薬物の調製における使用。
【請求項４３】
ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩と、酪酸ナトリウム若しくはそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤との、非小細胞肺がんを治療するための薬物の調製における使用。
【請求項４４】
以下の（i）〜（ii）を含むキット。
（i）任意で薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を混合した、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩；及び
（ii）任意で薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を混合した、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤
【請求項４５】
本明細書中に実質的に記載された、パーツの組合せ、医薬組成物、医薬品、方法、使用又はキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増殖症（proliferative disorders）の治療に適切な医薬の組合せ（combination）に関する。本発明は、特に、がん、好ましくは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の治療のための組合せに関する。
【背景技術】
【０００２】
サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、セリン／スレオニンキナーゼであって、細胞周期において重要な調節的な役割を果たす。ＣＤＫは、転写因子と腫瘍抑制タンパク質を含む、ＤＮＡ複製及び細胞分裂に関与するさまざまなタンパク質のリン酸化により、細胞周期の進行を調節する(Senderowicz, AM. Small-molecule cyclin-dependent kinase modulators, Oncogene, 2003; 22: 6609-6620)。ある種のＣＤＫは、ＲＮＡポリメラーゼII（polII）の一番大きなサブユニットのカルボキシ末端ドメイン（ＣＴＤ）のリン酸化に関与することにより、ＲＮＡ合成の調節における役割を果たしてもいる。それゆえ、ＣＤＫが魅力的な治療標的となっていることは、驚くことではない。結果として、ＣＤＫの活性を、そのＡＴＰ結合部位と競合することにより妨害することができる多くの新しい薬剤（pharmacological agent）が、臨床試験で現在試験されている(Fischer PM and Gianella-Borradori A, CDK inhibitors in clinical development for the treatment of cancer,  Expert Opin Investig Drugs. 2003; 12: 955-970)。
【０００３】
従来技術としては、サイクリン依存性キナーゼを阻害することにより細胞周期を調節することができるいくつかの化合物の記述がある。これらの化合物としては、ブチロラクトン（butyrolactone）、フラボピリドール（flavopiridol）及び２−（２−ヒドロキシエチルアミノ）−６−ベンジルアミノ−９−メチルプリン（オロモウシン（olomoucine））を挙げることができる。オロモウシンと関連化合物は、ｃｄｃ２の阻害剤であることが示されてきた。Ｃｄｃ２（ｃｄｋ１としても知られている）は、細胞周期調節に関与するサイクリン依存性キナーゼファミリーの触媒サブユニットである。
【０００４】
これらのキナーゼは、少なくとも２つのサブユニット、すなわち触媒サブユニット（なかでもｃｄｃ２がそのプロトタイプである）と、調節サブユニット（サイクリン）を含んでいる。ｃｄｋは、サイクリンファミリーである、サイクリンＡ(ｃｄｃ２、ＣＤＫ２)、サイクリンＢ１−Ｂ３(ｃｄｃ２)、サイクリンＣ(ＣＤＫ８)、サイクリンＤ１−Ｄ３(ＣＤＫ２−ＣＤＫ４−ＣＤＫ５−ＣＤＫ６)、サイクリンＥ(ＣＤＫ２)、サイクリンＨ(ＣＤＫ７)と一時的に関連して調節される。
【０００５】
これらの複合体はそれぞれ、細胞周期の各フェーズに関与する。ＣＤＫ活性は、翻訳後の改変と、他のタンパク質との一時的な関連と、細胞内部の局在化の改変とにより調節されている。ＣＤＫレギュレーターは、アクチベーター(サイクリン、ＣＤＫ７／サイクリンＨ、ｃｄｃ２５ホスファターゼ)、ｐ９.ｓｕｐ.ＣＫＳ及びｐ１５.ｓｕｐ.ＣＤＫ−ＢＰサブユニット、並びに阻害タンパク質（inhibiting proteins） (ｐ１６.ｓｕｐ.ＩＮＫ４Ａ、ｐ１５.ｓｕｐ.ＩＮＫ４Ｂ、ｐ２１.ｓｕｐ.Ｃｉｐｌ、ｐ１８、ｐ２７.ｓｕｐ.Ｋｉｐｌ)を含む。
【０００６】
ＣＤＫとそれらの調節タンパク質が、ヒト腫瘍の進行において重要な役割を果たしているという仮説については、現在では多くの文献で裏付けられている。それゆえ、多くの腫瘍において、サイクリン依存性キナーゼの一過性異常発現、及び、タンパク質阻害剤の広範囲にわたる脱制御（de-regulation）が観察されてきた。
【０００７】
ロスコビチン（Roscovitine）は、サイクリン依存性キナーゼ酵素、特にＣＤＫ２の強力な阻害剤であると実証されてきた。ＣＤＫ阻害剤は、細胞が、細胞周期のＧ１／ＳとＧ２／Ｍフェーズを通過することをブロックすると理解されている。ロスコビチンの純粋なＲ−エナンチオマーであるセリシクリブ（seliciclib）(Ｒ−ロスコビチン；ＣＹＣ２０２)は、様々な腫瘍細胞におけるアポトーシスの強力なインデューサーであることが、近年明らかとなり(McClue SJ, Blake D, Clarke R, et al,  In vitro and in vivo antitumor properties of the cyclin dependent kinase inhibitor CYC202 (R-Roscovitin), Int J Cancer. 2002; 102: 463-468)、乳がん及び非小細胞肺がんを治療するための臨床試験にすでに入っている(Fischer PM and Gianella-Borradori A, CDK inhibitors in clinical development for the treatment of cancer,  Expert Opin Investig Drugs, 2003; 12: 955-970)。ロスコビチンは、網膜芽細胞腫（retinoblastoma）のリン酸化の阻害剤であり、Ｒｂ陽性腫瘍により強力に作用するものとして関与が示されてきた。
【０００８】
活性医薬品を、治療計画を最適化するためにしばしば組み合わせて投与することができることは技術常識である。例えば、第二化学療法剤と組み合わせての、ＣＤＫ阻害剤の使用は、国際公開第０３／０７７９９９号パンフレット、国際公開第０３／０８２３３７号パンフレット、国際公開第２００４／０４１２６２号パンフレット、国際公開第２００４／０４１２６７号パンフレット、国際公開第２００４／０４１２６８号パンフレット、国際公開第２００４／０４１３０８号パンフレット、国際公開第２００４／１１０４５５号パンフレット、国際公開第２００５／０５３６９９号パンフレットに記載されている（すべてCyclacel Limited社のものである）。
【０００９】
本発明は、増殖症、とりわけがんの治療に特に適切である、公知の医薬品の新規の組合せを提供しようとするものである。より詳細には、本発明の好ましい態様は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の治療に有用な組合せを中心とするものである。
【特許文献１】国際公開第０３／０７７９９９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０８２３３７号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００４／０４１２６２号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００４／０４１２６７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００４／０４１２６８号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００４／０４１３０８号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２００４／１１０４５５号パンフレット
【特許文献８】国際公開第２００５／０５３６９９号パンフレット
【非特許文献１】Senderowicz, AM. Small-molecule cyclin-dependent kinase modulators, Oncogene, 2003; 22: 6609-6620
【非特許文献２】Fischer PM and Gianella-Borradori A, CDK inhibitors in clinical development for the treatment of cancer,  Expert Opin Investig Drugs. 2003; 12: 955-970
【非特許文献３】McClue SJ, Blake D, Clarke R, et al,  In vitro and in vivo antitumor properties of the cyclin dependent kinase inhibitor CYC202 (R-Roscovitin), Int J Cancer. 2002; 102: 463-468
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本発明の一番目の態様は、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩と、酪酸ナトリウム若しくはそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（suberoylanilide hydroxamic acid）（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム（sodium valproate）、及びトリコスタチンＡ（trichostatin A）（ＴＳＡ）から選択されるヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤とを含む組合せに関する。
【００１１】
ロスコビチン及び上述のＨＤＡＣ阻害剤は、当該技術分野においてすでに確立した個別の治療剤であるけれども、本発明でクレームされる特定の組合せが、がんの治療において効果的であるということについては、何ら示唆されていなかった。さらに、特定のクレームされている組合せが、特に治療が困難であることが知られているＮＳＣＬＣの治療に有用となろうということについては、何ら示唆がされていなかった。
【００１２】
二番目の態様は、本発明の組合せと、薬学的に許容される担体（carrier）、希釈剤（diluent）、又は賦形剤（excipient）とを含む医薬組成物に関する。
【００１３】
三番目の態様は、増殖症を治療するための薬物（medicamen）の調製における本発明の組合せの使用に関する。
【００１４】
四番目の態様は、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩と、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤とを含む、治療において同時に（simultaneously）、連続して、又は個別に用いるための組合せ調製物としての医薬品に関する。
【００１５】
五番目の態様は、増殖症の治療方法であって、かかる治療方法が、ロスコビチン、又はその薬学的に許容される塩と、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤とを同時に、連続して、又は個別に投与することを含むことを特徴とする方法に関する。
【００１６】
六番目の態様は、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩の、増殖症の治療のための薬物の調製における使用であって、かかる治療が、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤を同時に、連続して、又は個別に投与することを含むことを特徴とする使用に関する。
【００１７】
七番目の態様は、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤の増殖症の治療のための薬物の調製における使用であって、かかる治療が、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩を同時に、連続して、又は個別に投与することを含むことを特徴とする使用に関する。
【００１８】
八番目の態様は、(i)ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩；と、(ii)酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤；との、増殖症の治療のための薬物の調製における使用に関する。
【００１９】
九番目の態様は、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤の、増殖症の治療のための薬物の調製における使用であって、かかる薬物が、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩と併用療法において使用されることを特徴とする使用に関する。
【００２０】
十番目の態様は、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤の、増殖症の治療のための薬物の調製における使用であって、かかる薬物が、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩での前治療（pretreatment）において使用されることを特徴とする使用に関する。
【００２１】
十一番目の態様は、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩の、増殖症の治療のための薬物の調製における使用であって、かかる薬物が、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤と併用療法において使用されることを特徴とする使用に関する。
【００２２】
十二番目の態様は、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩の、増殖症の治療のための薬物の調製における使用であって、かかる薬物が、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤での前治療において使用されることを特徴とする使用に関する。
【００２３】
十三番目の態様は、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩と、ＨＤＡＣ阻害剤との、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の治療のための薬物の調製における使用に関する。
（発明の詳細な説明）
【００２４】
以下に記載されている好ましい実施態様は、上記の本発明の態様すべてに適用可能である。
【００２５】
ロスコビチン、又は２−[(１−エチル−２−ヒドロキシエチル)アミノ]−６−ベンジルアミン−９−イソプロピルプリン）は、２−(１−Ｄ,Ｌ−ヒドロキシメチルプロピルアミノ)−６−ベンジルアミン−９−イソプロピル−プリンとも記述される。本明細書で使用されている「ロスコビチン」なる用語は、分離したＲとＳのエナンチオマー、その混合物、及びそのラセミ体を含む。
【００２６】
本明細書で使用されている「セリシクリブ」なる用語は、ロスコビチンのＲエナンチオマー、すなわち、２−(１−Ｒ−ヒドロキシメチルプロピルアミノ)−６−ベンジルアミノ−９−イソプロピルプリンを意味し、構造は以下に示される。
【００２７】
【化１】
2009515862.tif 000002
【００２８】
本発明のすべての実施態様では、ロスコビチンは、Ｒエナンチオマーの形態、すなわち、２‐(１‐Ｒ‐ヒドロキシメチルプロピルアミノ)−６−ベンジルアミノ−９−イソプロピル−プリンであり、以下、「セリシクリブ」、「ＣＹＣ２０２」、又はＲ−ロスコビチンという。
【００２９】
ロスコビチンのインビトロ活性は以下の通りである。
【００３０】
【表１】
2009515862.tif 000003
【００３１】
上述の通り、現在、請求の範囲に記載されている組合せは、ロスコビチンとヒスチジンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤とを含む。
【００３２】
ヒストンは、塩基性アミノ酸に富んだ、正電荷を帯びた小タンパク質である（生理的ｐＨにおいて正電荷を帯びている）。ヒストンは、主として５つのタイプがあり、すなわち、構造的に高度な類似性を示すＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４である。ヒストンは、真正細菌（eubacteria）（例えば、大腸菌）には見い出されないが、これらのバクテリアのＤＮＡは、バクテリアの細胞内のＤＮＡをパッケージするためにヒストンのように機能すると推定される別のタンパク質と関連している。古細菌（archaebacteria）は、しかしながら、真核生物のクロマチンと類似する構造において、ＤＮＡをパッケージするヒストンを含まない(G. M. Cooper, “The Cell - A Molecular Approach”, 2ndEdition, Chapter II)。
【００３３】
ヒストンの大部分は、細胞周期のＳ期の間に合成され、新しく合成されたヒストンは、ＤＮＡと結合するために速やかに細胞核に入る。合成後数分の間に新しいＤＮＡは、ヌクレオソーム構造においてヒストンと結合する。
【００３４】
ヒストンのアミノ末端尾部ドメインは、メチル基（リジン及びアルギニン基への）、アセチル基（リジン基への）、又はリン酸基（セリン基への）の翻訳後付加により、酵素的に改変されてもよい(Spencer et al, Gene, 1999, 240(1), 1)。このことにより、ヒストンの正味の正電荷が減少し、結果的に、ヒストンのＤＮＡへの結合が弱まる場合がある。
【００３５】
ヒストンデアセチレーター（ＨＤＡＣ）の研究は、ＨＤＡＣを阻害する化合物の研究と共に、いくつかの病状が作用するメカニズムを通じて解明されてきた。例えば、新規の抗マラリア化合物の探索において、天然に存在するアピシジン（apicidin）が、Ｐ．ファルスィパラム（P. falciparum）のインビトロの成長を、ヒストンを過剰アセチル化することにより阻害することが示された(K. T. Andrews et al, Int. J. Parasitol., 2000, 30(6), 761)。
【００３６】
ＨＤＡＣは、それゆえ、白血病（Lin et al, Nature, 1998, 391, 811）、メラノーマ／扁平上皮カルシノマ(Gillenwater et al, Int. J. Cancer, 1998, 75217; Saunders et al, Cancer Res., 1999, 59, 399)、乳がん、前立腺がん、膀胱がん(Gelmetti et al, Mol. Cell Biol., 1998, 18, 7185; Wang et al, PNAS, 1998, 951, 10860)、及び大腸がん(C. A. Hassig, et al, 1997, Chem. Biol., 4, 783; S. Y. Archer et al, PNAS, 1998, 95(12), 6791)などの増殖症を含む多種多様な病気と関連していると信じられている。
【００３７】
米国特許出願公開２００５／０００４００７号明細書は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤と細胞分化を誘導する薬剤とを投与することに関与する、がん細胞におけるアポトーシスを促進する方法を開示する。細胞分化を誘導する薬剤のいくつかのカテゴリーとしては、すなわち、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、プロテインキナーゼＣ、レチノイド、及びビタミンＤ３を挙げることができる。しかしながら、ロスコビチンとＨＤＡＣ阻害剤とを含む組合せは、具体的に開示されておらず、ＮＳＣＬＣのような固型腫瘍の治療におけるかかる組合せの使用も開示されていない。それどころか、米国特許出願公開２００５／０００４００７号明細書は、白血病細胞株で試験した、選択されたＨＤＡＣ阻害剤とフラボピリドール（flavopiridol）との組合せに限定している。
【００３８】
したがって、現在までに、ＮＳＣＬＣのような肺がんの治療において治療上有用となろうことについての何らかの示唆については言うまでもなく、本願の請求の範囲に記載されている特定の組合せについては、何ら開示はされていない。
【００３９】
本発明の好ましい一実施態様では、ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウムである。
【００４０】
酪酸ナトリウムは、大腸管腔内の食物繊維の発酵により形成される(G. J. Kelloff et al, Cancer Chemoprevention: Volume 1, page 665)。脊髄性筋萎縮リンパ細胞株におけるＳＭＮ２遺伝子由来のエクソン７を含むＳＭＮタンパク質の発現を増加することが見い出されている。ヌクレオソームＤＮＡと、ＳＭＮ２遺伝子のエクソン７の選択的スプライシングを制御する別の因子とをアセチル化することにより、酪酸ナトリウムが作用することが提唱された（J.-G. Chang et al, PNAS, 2001, 98(17), 9809）。
【００４１】
酪酸ナトリウムは、赤白血病培養細胞(A. Leder et al, Cell, 1975, 5(3), 319)とＰＣ１２クロム親和性細胞腫(J. C. Byrd et al, Brain Res., 1987, 428(1), 151)の分化を誘導し、ヒト及び他の動物の胎児ヘモグロビン遺伝子の発現を増加させる(S. P. Perrine et al, Adv. Exp. Med. Biol., 1989, 271, 177 and S. P. Perrine et al, PNAS, 1988, 85(22), 8540)ことが示されてきた。
【００４２】
別の好ましい実施態様では、ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウムのプロドラッグである。
【００４３】
特に好ましい実施態様では、プロドラッグは、ピバロイルオキシメチル酪酸（pivaloyloxymethyl butyrate）である。ピバロイルオキシメチル酪酸（ピバネックス（Pivanex）（登録商標））は、酪酸のアシルオキシアルキルエステルプロドラッグであり、白血病及び神経芽腫細胞におけるアポトーシス固有の（instrinsic）経路を誘導することが示されてきた(S. Mei et al, International Journal of Oncology, 2004, 25, 1509)。
【００４４】
本発明の別の好ましい実施態様では、ＨＤＡＣ阻害剤はトリコスタチンＡ（trichostatin A）（ＴＳＡ）である。
【００４５】
抗真菌性抗生物質であるトリコスタチンは、最初にストレプトマイセス・ハイグロスコピカス株の代謝産物から単離された（N. Tsuji et al, J. Antibiot.,1976,29,1)。トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）は、ＨＤＡＣの特異的で可逆的な阻害剤である。ナノモル濃度では、ＴＳＡは、インビボでは、高度にアセチル化されたヒストンの顕著な蓄積を引き起こし、インビトロでは、部分的に精製されたヒストンデアセチラーゼの活性を強く阻害する（M. Yoshida et al, J. Biol. Chem., 1990, 265(28), 17174)。ヒトのジャーカットＴ細胞（Jerkat T cells）において、ＴＳＡは、Ｇ１における細胞周期の進行を阻止し、ＨＤ１デアセチラーゼの活性を５０％抑制濃度の７０ｎＭで阻害した(Y. Hoshikawa et al, Exp. Cell Res., 1994, 214, 189)。
【００４６】
ＴＳＡは、同時に遺伝子の発現を改変することもできる。Mishra et alは、ＴＳＡが、顕著にＣＤＩ５４とＩＬ−１０とをダウンレギュレートし、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ遺伝子発現をアップレギュレートしたことを実証した。ＳＬＥは、抗体の無調節な産生が特徴である自己免疫疾患であり、非可逆的な、免疫複合体介在性末端器官障害（complex-mediated end-organ failure）を導く(N. Mishra et al, PNAS, 2001, 98(5), 2628)。
【００４７】
本発明の別の好ましい実施態様では、ＨＤＡＣ阻害剤は、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）である。
【００４８】
スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）は、ＴＳＡの合成誘導体であり、マイクロモル濃度でＨＤＡＣ活性を阻害する。ＳＡＨＡは、再発性又は難治性の進行性ホジキンリンパ腫の治療において使用するために、米国内でフェーズIIの臨床試験に現時点で進んでいる。
【００４９】
ＳＡＨＡの抗増殖剤効果は、十分に立証されている。米国特許出願公開第２００５／０９７７４７号明細書（Aton Pharma）は、新生物（neoplasms）とチオレドキシン（ＴＲＸ）が介する病気の治療、並びにＣＮＳ病の予防及び／若しくは治療におけるＳＡＨＡなどのＨＤＡＣ阻害剤をベースとしたヒドロキサム酸のプロドラッグの使用について開示している。
【００５０】
米国特許出願公開第２００４／４１２７５２５号明細書（Bacopoulos et al）は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫などのリンパ腫の治療におけるＳＡＨＡの使用について開示している。国際公開第２００５／０３９４９８号パンフレット、国際公開第２００５／０１８５７８号パンフレット（両者ともAton Pharma社）は、新生物の治療の方法についてさらに開示しており、国際公開第２００５／０３９４９８号パンフレットは白血病に関し、国際公開第２００５／０１８５７８号パンフレットは中皮腫又はリンパ腫に関する。
【００５１】
本発明の好ましい一実施態様では、ＨＤＡＣ阻害剤は、バルプロ酸ナトリウム（若しくは、２−プロピルペンタン酸ナトリウムとしても知られている）である。バルプロ酸ナトリウムは、バルプロ酸のナトリウム塩であり、ＮＩＣＥに認可されているてんかんの治療において用いられる抗けいれん薬である。つい近年、進行性固型悪性腫瘍（advanced solid tumour malignancies）とがん関連の神経因性痛（neuropathic pain）の治療のためにバルプロ酸ナトリウムの使用についての研究が検討されてきた。バルプロ酸とＵＣＮ−０１が関与する併用の研究が着手されている。これらにより、バルプロ酸それ自身の抗がん効果は弱いが、組み合わせて用いられる場合はがん細胞に対して非常に効果的であることが研究により示されている。
【００５２】
本発明の別の態様は、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩と、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤とを含む医薬の組合せに関する。
【００５３】
別の態様は、増殖症の治療において用いられる本発明の組合せを含む医薬品に関し、疾患は、ガンが好ましく、ＮＳＣＬＣがより好ましい。
【００５４】
さらに、本発明の態様は、同時に、連続して、又は個別に用いられる組み合わせた調製物としての、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩と、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤とを含む医薬品に関する。
【００５５】
さらに、別の態様は、増殖症の治療方法に関し、かかる方法は、本発明の組合せを、同時に、連続して、又は個別に投与することを含む。
【００５６】
本明細書で用いられている「同時に」なる用語は、２つの薬剤が、時を同じくして（concurrently）投与されることを意味し、「組み合わせて（in combination）」なる用語は、同時にではないにしろ、２つの薬剤が投与されることを意味するために用いられ、「連続的に」とは、２つの薬剤が同じ時間枠の間に治療的に作用することができることを意味する。それゆえ、「連続的な」投与により、一方の薬剤が、他方の薬剤が提供された後５分、１０分、又は数時間以内に、治療量として両方が同時に存在することができるよう投与される。構成成分の投与間の時間遅延は、それぞれの相互作用や半減期といった、成分の実際の性質に依拠して変化するものである。
【００５７】
「組み合わせて」又は「連続的に」とは対照的に、本明細書で用いられる「個別に」とは、一方の薬剤と他方の薬剤を投与する間にギャップがあることを意味する。すなわち、投与された第１薬剤が、第２薬剤が投与された場合には、治療効果量としては血流中にもはや存在しないことを意味する。
【００５８】
好ましい態様では、ＨＤＡＣ阻害剤は、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩より前に、連続して、又は個別に投与される。
【００５９】
別の好ましい態様では、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩は、ＨＤＡＣ阻害剤より前に、連続して、又は個別に投与される。
【００６０】
別の好ましい態様では、ＨＤＡＣ阻害剤とロスコビチン又はその薬学的に許容される塩は、時を同じくして投与される。
【００６１】
ＨＤＡＣ阻害剤が、酪酸ナトリウム若しくはそのプロドラッグ、又はＴＳＡである場合、ＨＤＡＣ阻害剤とロスコビチンは、同時に、個別に、又は連続して、投与の順序にかかわりなく投与してもよい。
【００６２】
ＨＤＡＣ阻害剤が、ＳＡＨＡである場合、ＳＡＨＡは、ロスコビチンより前に投与され、すなわち、対象にＳＡＨＡによる前治療が行われることが好ましい。
【００６３】
ＨＤＡＣ阻害剤が、バルプロ酸ナトリウムである場合、ロスコビチンとバルプロ酸ナトリウムは、個別に、又は連続して、投与の順序にかかわりなく投与される。
【００６４】
好ましい実施態様では、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩とＨＤＡＣ阻害剤とは、個々の成分に関しての治療効果量でそれぞれ投与される。
【００６５】
別の好ましい実施態様では、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩と、ＨＤＡＣ阻害剤とは、個々の成分に関しての準治療量でそれぞれ投与される。
【００６６】
「準治療量（sub-therapeutic amount）」なる用語は、ロスコビチン単独又はＨＤＡＣ阻害剤単独による治療に対して治療効果をもたらすために一般に要求されている量よりも低い用量を意味する。
【００６７】
さらに別の一態様は、増殖症の治療のための薬物の調製における本発明の組合せの使用に関する。
【００６８】
本明細書における「薬物の調製」なる表現は、１又は複数の上述の構成成分の薬物としての直接的な使用、又はかかる薬物の製造の任意のステージにおける使用を含む。
【００６９】
別の態様は、増殖症の治療のための薬物の調製におけるロスコビチン又はその薬学的に許容される塩の使用であって、かかる治療は、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤を、対象に、同時に、連続して、又は個別に投与することを含む。
【００７０】
さらに別の態様は、増殖症の治療のための薬物の調製における酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤の使用に関し、かかる薬物は、ロスコビチン又はその薬学的に許容される塩と併用療法において使用される。あるいは、かかる療法は、前治療であってもよい。
【００７１】
別の態様は、増殖症の治療のための薬物の調製におけるロスコビチン又はその薬学的に許容される塩の使用に関し、かかる薬物は、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるＨＤＡＣ阻害剤と併用療法において使用される。あるいは、療法は、前治療でもよい。
【００７２】
本明細書における「併用療法」なる用語は、ＨＤＡＣ阻害剤とロスコビチンが、同時にではないとしても、両方が同一の時間枠内で治療上作用することができるような時間枠内で連続的に投与される療法を意味する。
【００７３】
本明細書における「前治療療法（pretreatment therapy）」、又は「前治療（pretreated）」が、一つの薬剤が、第二の薬剤の前に、個別に又は連続的のいずれかで投与される形態を意味する。第二の薬剤は、第一の薬剤の投与後少なくとも２時間後に投与されることが好ましい。第二の薬剤は、第一の薬剤の投与の少なくとも４時間、より好ましくは少なくとも６時間又は８時間後に投与されることがより好ましい。第二の薬剤は、第一の薬剤の投与の少なくとも１２時間、又はより好ましくは少なくとも１８時間又は２４時間後に投与されることがさらにより好ましい。
【００７４】
ロスコビチンとＨＤＡＣ阻害剤とは、相乗的に作用することが好ましい。本明細書で用いられる「相乗的」なる用語は、ロスコビチンとＨＤＡＣ阻害剤とを組み合わせて用いた場合に、２つの構成成分の個々の効果を合計したものよりも大きな効果をもたらすことを意味する。相乗的相互作用は、患者に投与する各構成成分の投与量を減少させる点で有利であり、それゆえ、同じ治療効果をもたらしつつ、及び／又は維持しつつ、化学療法の毒性を減少させることができる。それゆえ、特に好ましい実施態様においては、各構成成分は、準治療量を投与することができる。
【００７５】
別の好ましい実施態様では、ロスコビチンとＨＤＡＣ阻害剤は、単剤療法における個々の構成成分の使用における副作用、又はこれら成分の公知の使用における副作用を軽減し、又は排除するように相互作用する。
【００７６】
上記の実施態様すべてについて、ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、及びトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）から選択されることが好ましい。
【００７７】
（増殖症）
本明細書で使用される「増殖症」なる用語は、細胞周期の制御を必要とする任意の疾患を含む広い意味で用いられ、例えば、動脈再狭窄（restenosis）及び心筋症（cardiomyopathy）などの循環器疾患や、糸球体腎炎（glomerulonephritis）及びリウマチ性関節炎（rheumatoid arthritis）などの自己免疫疾患や、乾癬（psoriasis）などの皮膚疾患、抗炎症性、抗真菌性、マラリアなどの抗寄生虫性の疾患、肺気腫（emphysema）並びに脱毛症（alopecia）を挙げることができる。これらの疾患においては、本発明の化合物は、アポトーシスを誘導し、必要とされる望ましい細胞内で均衡状態を維持できる。
【００７８】
上述の態様及び実施態様のすべてにおいて、増殖症はがんが好ましい。
【００７９】
（非小細胞肺がん）
特に好ましい本発明の実施態様において、増殖症は、肺がん、より好ましくは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。
【００８０】
肺がん（気管支がん）は、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）と非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の２つの広義のカテゴリーに分けてもよい。これらの２つのタイプのがんの相違は、顕微鏡下で観察した場合の腫瘍細胞の外観に基づくものである。
【００８１】
ＳＣＬＣは、肺がんと診断されたうちの２０％を占め、細胞核に大部分満たされている小細胞により特徴づけられる（よって、この名前となっている。）。時には、「燕麦細胞（oat cell）」がんと呼ばれることがもある。ＳＣＬＣは、最も侵襲性の強いがんのタイプであって、急速に体の他の部分に転移する。がんが体中に拡がった後にやっとＳＣＬＣであると診断されることが、しばしばおこる。ＳＣＬＣは、ほとんどの場合、喫煙の結果引き起こされるのが一般的である。
【００８２】
ＮＳＣＬＣは、肺がんに関するグループに分類することができ、例えば、類表皮（epidermoid）又は扁平上皮がん、腺がん、及び大細胞がんを挙げることができる。
【００８３】
肺扁平上皮がん（squamous cell lung cancer）は、すべての肺がん症例の３０％を占める。肺及び気管支の粘膜の補充細胞（reserve cells）（損傷上皮細胞を置換する役割を有する）から発症する。結果として、がんは、まず肺の中心で発症する。肺扁平上皮がんは、多くの場合成長は遅く、限局腫瘍から湿潤がんへ進行するために数年かかることもある。１０〜２０％の症例では、がんは、肺内部で空洞を作る。転移する場合は、骨、肝臓、副腎、小腸、脳にしばしば拡大する。
【００８４】
腺がん（squamous cell lung cancer）は、すべての肺がん例の３０〜４０％を占める、最も一般的な肺がんの形態である。肺の外側部分に発症し、粘液を発生する細胞から発症する。このがんの経過は、広範囲にわたって変化に富むが、進行は遅く、患者が訴える症状は少ないか、全くない。いくつかの症例では、しかしながら、極度に侵襲的であり、速やかに死に至る。転移すると５０％の症例では、脳にのみ拡大する。腺がんが転移する他の部位としては、肝臓、副腎、及び骨を挙げることができる。
【００８５】
大細胞がんの発生率は、腺がん又は肺扁平上皮がんのいずれよりもそれほど多くはないが、肺がんの例の１０〜２０％を占める。がんは、本来未分化である大球性細胞からできており、しばしば気管支で発症する。大細胞がんは、肺の周辺で進行し、複数に転移しうる。
【００８６】
現在、肺がんは、外科手術、放射線療法、又は化学療法によって治療されうる。化学療法は、単独で、又は、ほかの治療の選択肢と組み合わせて行われてもよい。一般のＮＳＣＬＣドラッグ又は形態としては、カンプトサール（camptosar）（イリノテカン；ＣＰＴ−１１）、カンプトテシン、カルボプラチン（パラプラチン）、シスプラチン（プラチノール（platinol））、エピルビシン、ゲムシタビン（gemcitabine）、ナベルビン（navelbine）（ビノレルビン（vinorelbine））、オキサリプラチン（oxaliplatin）、タキソール（パクリタキセル）、及びタキソテール（taxotere）、ドセタキソール（docetaxol）（ＮＳＣＬＣ治療−化学療法、肺がんオンライン）を含む。
【００８７】
しかしながら、化学療法は治癒的ではない。この治療法の別の不都合な点としては、毒性、正常組織へのバイスタンダーダメージと薬剤耐性である(W. Wang et al, Cancer Sci., 2005, 96(10), 706)。さらに、研究によると、ビノレルビンなどの公知の治療法のいくつかによる延命効果は、ほとんどないことが示されている(M. A. Socinski et al, Clin. Adv. Hematol. Oncol., 2003, 1(1), 33)。トロキサシタビンなどの新規の活性剤（active）を、３週間ごとに３０分以上にわたって１０ｍｇ／ｍ２の投与量を静脈内投与しても、ＮＳＣＬＣにおいてはほとんど作用しないことが示されてきた。
【００８８】
ゲムシタビン／シスプラチンの組合せは、ヨーロッパではＮＳＣＬＣの治療について広く用いられてきた。シスプラチンは、しかしながら、患者において嘔吐を伴い、顕著な非血液毒性（中毒性難聴（ototoxicity）及びネフロキシシティ（nephroxicity））を起こすというある種の副作用が知られている（P. Zatloukal et al, Lung Cancer, 2002, 38, S33）。
【００８９】
肺がんと診断された患者の予後は不良である。すなわちすべての治療例のうち１０年後の生存率は、約８％ほどであり、引き続き効果的な治療を開発する必要がある。
【００９０】
（医薬組成物）
特に好ましい実施態様では、本発明の医薬品は、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む医薬組成物の形態である。
【００９１】
本発明の化合物（その薬学的に許容される塩、エステル、及び薬学的に許容される溶媒和を含む）は、単独で投与できるが、これらは、特にヒトの治療においては担体、賦形剤、又は希釈剤を混合して、通常投与される。医薬化合物は、ヒト及び動物の医学において、ヒト又は動物のために使用してもよい。
【００９２】
本明細書における医薬化合物の多様な異なる形態のかかる適切な賦形剤の例は、“Handbook of Pharmaceutical Excipients”, 2nd "Edition, (1994), Edited by A Wade and PJ Wellerにおいて見い出すことができる。
【００９３】
治療上の使用のために容認できる使用担体又は希釈剤は、医薬業界において周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.  (A. R. Gennaro edit. 1985)に記載されている。
【００９４】
適切な担体の例としては、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトール、その他を挙げることができる。適切な希釈剤としては、エタノール、グリセロール及び水を挙げることができる。
【００９５】
医薬的な担体、賦形剤、又は希釈剤の選択肢としては、所望の投与経路及び、標準的な薬務に関連して選択してもよい。医薬組成物は、担体、賦形剤、希釈剤として、又は担体、賦形剤、希釈剤に加え、任意の適切な１又は複数のバインダー、１又は複数の潤滑剤、１又は複数の懸濁剤、１又は複数のコーティング剤、１又は複数の可溶化剤を含んでもよい。
【００９６】
適切なバインダーの例としては、デンプンや、ゼラチンや、グルコースなどの天然糖や、無水ラクトースなどの天然糖や、フリーフローラクトースや、ベータラクトースや、コーンシロップや、アカシア、トラガカント、又はアルギン酸ナトリウムなどの天然及び合成ガムや、カルボキシメチルセルロースや、ポリエチレングリコールを挙げることができる。
【００９７】
適切な潤滑剤の例としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、その他を挙げることができる。
【００９８】
防腐剤、安定剤、色素、さらには着香料が、医薬組成物に提供されてもよい。防腐剤としては、例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルを挙げることができる。酸化防止剤及び懸濁化剤が用いられてもよい。
【００９９】
（塩／エステル）
本発明の薬剤は、塩又はエステルとして、特に薬学的に許容される塩又はエステルとして存在してもよい。
【０１００】
薬剤の薬学的に許容される塩は、その適切な酸付加塩又はその塩基性塩（base salt）を挙げることができる。適切な医薬塩の概説は、Berge et al, J Pharm Sci, 66, 1-19 (1977)に見い出すことができる。塩は、例えば、硫酸、リン酸、又はハロゲン化水素酸といった鉱酸などの強い無機酸類；酢酸等の非置換の若しくは置換された（例えばハロゲンで）１〜４炭素原子のアルカンカルボン酸類などの有機強酸類；例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸、若しくはテトラフタル酸などの飽和又は不飽和のジカルボン酸類; 例えば、アスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、又はクエン酸といったヒドロキシカルボン酸類；例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸といったアミノ酸類；安息香酸；あるいはメタン酸又はｐ−トルエンスルホン酸などの非置換の若しくは置換された（例えばハロゲンで）（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル−又はアリールのスルホン酸類などの有機スルホン酸類を挙げることができる。
【０１０１】
エステルは、有機酸又はアルコール／水酸化物を用いて、エステル化される官能基に応じて形成される。有機酸類としては、酢酸等の非置換の又は置換された（例えばハロゲンで）１〜１２炭素原子のアルカン−カルボン酸類などのカルボン酸類；例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸、若しくはテトラフタル酸などの飽和又は不飽和のカルボン酸類;例えば、アスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、又はクエン酸などのヒドロキシカルボン酸類;アミノ酸類、例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸といったアミノ酸類；あるいはメタン酸又はｐ−トルエンスルホン酸などの非置換の若しくは置換された（例えばハロゲンで）（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル−又はアリールのスルホン酸類などの有機スルホン酸類を挙げることができる。適切な水酸化物類としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウム等の無機水酸化物類を挙げることができる。アルコールとしては、非置換の又は例えばハロゲンにより置換した１〜１２炭素原子のアルカン−アルコール類を挙げることができる。
【０１０２】
［光学異性体／互変異性体］
本発明は、薬剤のすべての適当な光学異性体と互変異性体をも含む。当業者であれば、光学的性質（１又は複数の不斉炭素原子）又は互変異性的特徴を有する化合物について認識するであろう。対応する光学異性体及び／又は互変異性体は、当該技術分野において公知の方法により単離／調製してもよい。
【０１０３】
［立体異性体／幾何異性体］
本発明のいくつかの薬剤は、立体異性体及び／又は幾何異性体として存在してもよく、例えば、１又は複数の不斉及び／又は幾何学的中心を有し、２又はそれ以上の立体異性体及び／又は幾何異性体（geometric forms）として存在してもよい。本発明は、すべての個々の阻害剤の立体異性体及び幾何異性体の阻害剤、及びそれらの混合物の使用を意図するものである。クレームに用いられる用語は、これらの形態が適当な機能活性を保持することを条件に、かかる形態を包含する（必ずしも同一の程度ではないが）。
【０１０４】
本発明は、薬剤又はその薬学的に許容される塩のすべての同位体バリエーションをも含む。本発明の薬剤の同位体バリエーション又はその薬学的に許容される塩は、少なくとも一つの原子が、同一の原子番号を有するが、原子質量が天然に見出される原子質量と相違する原子により置換されているものとして定義される。薬剤に組み込むことのできる同位体の例としては、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ及び３６Ｃｌ等の水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、及び塩素の同位体などを挙げることができる。薬剤のある種の同位体バリエーションとその薬学的に許容される塩としては、例えば、３Ｈ又は１４Ｃなどの放射性同位体が取り込まれているものを挙げることができ、ドラッグにおいて及び／又は基質組織分布研究において有用である。トリチウムすなわち３Ｈ、炭素１４すなわち１４Ｃ同位体は、調製の容易さと検出能において特に好ましい。さらに、重水素、すなわち２Ｈなどの同位体との置換は、代謝的安定性からもたらされる、ある種の治療上の利点を得ることができ、例えば、インビボでの半減期が増加し、必要な用量が減少し、それゆえ、状況次第で好ましい。本発明の薬剤の同位体バリエーション又はその薬学的に許容される塩は、同位体バリエーションの適切な試薬を用いることにより、適当な慣用の手順で通常調製することができる。
【０１０５】
［溶媒和物］
本発明は、本発明の薬剤の溶媒和物（solvates）の形態をも含む。クレームにおいて用いられる用語は、これらの形態を含む。
【０１０６】
［多形］
本発明は、様々な結晶形態、多形形態、及び（無）水和形態をさらに含む。製薬業界では、化合物は、かかる化合物を合成して調製するときに使用した溶剤や、精製及び／又は単離方法を若干変更した形式で単離できるということが立証されている。
【０１０７】
［プロドラッグ］
本発明は、プロドラッグの形態での本発明の薬剤をさらに含む。一般的に、かかるプロドラッグは、その中の１又は複数の適当な基が修飾されており、修飾は、ヒトやほ乳類対象への投与時に復帰（reversed）しうる化合物である。かかる復帰は、かかる対象において天然に存在する酵素により通常行われるが、インビボで復帰を行うためにかかるプロドラッグと共に第二の薬剤を投与することもできる。かかる修正の例としては、エステル（例えば、上述のいずれか）を挙げることができ、エステラーゼその他により復帰変異が行われる。別のシステムも当業者に周知であろう。
【０１０８】
［投与］
本発明の医薬組成物は、経口、直腸、膣内、非経口、筋肉内、腹腔内（intraperitoneal）、動脈内、くも膜下腔内（intrathecal）、気管支内、皮下（subcutaneous）、皮内、静脈内、鼻腔内、口腔（buccal）又は舌下の投与経路に適応させてもよい。
【０１０９】
経口投与においては、特定の使用は、圧縮錠、ピル、タブレット、ジェルレ（gellules）、ドロップ、及びカプセルを含む。好ましくは、かかる組成物は、１〜２０００ｍｇ、より好ましくは１用量あたり５０〜１０００ｍｇの活性成分を含むことが好ましい。
【０１１０】
別の投与形態としては、静脈内、動脈内、くも膜下腔内、皮下、皮内、腹腔内又は筋肉内に注射できる溶液又はエマルジョンを含み、消毒した又は消毒可能な溶液から調製される。本発明の医薬組成物は、坐薬、ペッサリー、懸濁液、エマルジョン、ローション、軟膏、クリーム、ジェル、スプレー、溶液、又はパウダーの形態でもよい。
【０１１１】
経皮投与の別の手段としては、スキンパッチの使用を挙げることができる。例えば、活性成分は、ポリエチレングリコール又は流動パラフィンの水性エマルジョンからなるクリームに組み入れることができる。活性成分は、必要に応じて安定化剤や保存料とともに、白ろう又は白軟パラフィンベースからなる軟膏に１〜１０質量％の濃度で組み入れることができる。
【０１１２】
注射剤型としては、１用量あたり１０〜１０００ｍg、好ましくは１０〜５００ｍｇの活性成分を含むことができる。
【０１１３】
組成物は、単一剤形（unit dosage form）、すなわち、１回服用量（unit dose）又は１回服用量の複数、若しくはサブユニットを含む、個別の量（portion）で処方されてもよい。
【０１１４】
特に好ましい実施形態では、本発明の組合せ又は医薬組成物は、静脈内に投与される。
【０１１５】
（投与量）
当業者であれば、過度な実験なしに、対象に投与する本発明の組成物の一つの適当な投与量を容易に決定することができる。通常、医師が、個々の患者のために最も適切な実際の投与量を決定するものであり、用いられている特定の化合物の活性を含む様々な因子や、代謝安定性や、化合物の作用の長さや、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、投与方法及び時間、食事、排出速度、ドラッグの組合せ、特殊状況の重篤性、個人が受けている治療法に依拠するものである。本発明における投与量は、平均的ケースにおける典型的な例である。もちろん個々の事例としては、本発明の範囲を逸脱することなく、より高い又はより低い投与量が利益となることもある。
【０１１６】
必要に応じて、薬剤は、体重１ｋｇあたり０．1〜３０ｍｇ／ｋｇという用量で投与してもよいが、体重１ｋｇあたり２〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｋｇである。
【０１１７】
ガイダンスにより、ＨＤＡＣ阻害剤は、上述の関連資料に記載されている投与量を医師の指示により投与されるのが通常である。ピバネックスは、一日あたり約２．３４ｇ／ｍ２通常投与される。ピバネックスは、静脈注射により投与することが好ましい。スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）は、一日あたり１００〜６００ｍｇ通常投与される。スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）は、経口投与することが好ましい。ＨＤＡＣ阻害剤の一日あたりの合計投与量は、単回投与又は個別の容量に分割されて、一日に２回、３回、４回投与されることが好ましい。
【０１１８】
ロスコビチンは、通常、一日あたり約０．０５〜約５ｇ投与され、好ましくは、一日あたり約０．４〜約３ｇ投与される。ロスコビチンは、タブレット又はカプセルで経口投与することが好ましい。ロスコビチンの一日あたりの合計投与量は、単回投与又は個別の容量に分割されて、一日に２回、３回、４回投与されることが好ましい。
【０１１９】
好ましい実施態様では、ロスコビチンは、一日あたり約０．４〜約３ｇ経口投与又は静脈内投与され、ＨＤＡＣ阻害剤は、上述の適当な容量でもっとも適切とみなされる方法で投与される。ＨＤＡＣ阻害剤は、ロスコビチンの投与の少なくとも２時間前に投与されることが好ましい。ＨＤＡＣ阻害剤は、ロスコビチンの投与の少なくとも４時間、より好ましくは少なくとも６時間又は８時間前に投与されることがより好ましい。ＨＤＡＣ阻害剤は、ロスコビチンの投与の少なくとも１２時間、より好ましくは少なくとも１８時間又は２４時間前に投与されることがさらにより好ましい。
【０１２０】
別の好ましい実施態様としては、ＨＤＡＣ阻害剤は、ロスコビチンの投与の少なくとも２時間後に投与されることが好ましい。ＨＤＡＣ阻害剤は、ロスコビチンの投与後、少なくとも４時間、より好ましくは少なくとも６時間又は８時間後に投与されることがより好ましい。ＨＤＡＣ阻害剤は、ロスコビチンの投与後、少なくとも１２時間、より好ましくは少なくとも１８時間又は２４時間後に投与されることがより好ましい。
【０１２１】
（キットのパーツ）
さらに、本発明の態様は、キットのパーツに関するものであり、かかるキットのパーツは、
（i）ロスコビチン、又はその薬学的に許容される塩であって、任意で薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と混合したもの、及び
（ii）酪酸ナトリウム又はそのプロドラッグ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸ナトリウム、及びトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）から選択されるＨＤＡＣ阻害剤であって、任意で薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と混合したもの.
を含み、
ロスコビチンとＨＤＡＣ阻害剤とは、それぞれ単一剤形であることが好ましい。好ましくは、キットのパーツは、各構成成分、すなわち上述の(i)及び（ii）の構成成分の単一剤形を複数含むことが好ましい。
【０１２２】
あるいは、キットのパーツは、特定の投与計画によるコンプライアンスを促進する手段をさらに含んでもよく、例えば、各構成要素の単一剤形が、いつ、どの様に、どれぐらいの頻度で摂取されなければならないかについて記載した指示書である。
【０１２３】
本発明は、添付の図面と併せて読むべき以下の実施例を参照して説明される。
【実施例】
【０１２４】
［Ｒ−ロスコビチン］
Ｒ−ロスコビチンは、欧州特許０８７４８４７号明細書（ＣＮＲＳ）が開示している方法により調製された。
【０１２５】
［ＨＤＡＣ阻害剤］
酪酸ナトリウム及びバルプロ酸ナトリウムは、Sigma社から取得し、ＴＳＡは、AG Scientific, Inc.社から取得し、ＳＡＨＡは、Toronto Research Chemicals, Inc.社から取得した。
【０１２６】
[細胞培養]
実験は、９６ウェルプレートで行われ、細胞株は、Ａ５４９については２０００／ウェル、及びＨ４６０については３０００／ウェルの密度にて播種された。処理２４時間後及び処理７２時間後のＩＣ５０値が、それぞれの細胞株における酪酸ナトリウムについてと、Ｈ４６０細胞株におけるＳＡＨＡ、バルプロ酸ナトリウム及びＴＳＡについて、アラマーブルーアッセイ（Alamar blue assay.）を用いて測定された。各ＨＤＡＣ阻害剤は、同時処理、セリシクリブ前処理後にＨＤＡＣ阻害剤処理、ＨＤＡＣ阻害剤前処理後にセリシクリブ処理、というセリシクリブと組み合せた異なる併用投与計画（regime）を用いて試験された。
【０１２７】
（カルクシン（Calcusyn）薬剤組合せプロトコル）
併用療法においては、セリシクリブ、ＨＤＡＣ阻害剤、又は両方の薬剤の１．５倍の段階希釈が同時に、２４時間培養後細胞に添加され、３７℃にて７２時間置かれた。選択された薬剤濃度は、被検薬剤のＩＣ５０値に及ぶように選ばれた。前処理投与計画においては、第一の薬剤は、細胞をプレート培養した後２時間して添加された。培地は、吸引され、第二の薬剤を含む新鮮培地と置き換えられ、７２時間インキュベートされた。それぞれの連続的処理の二つのコントロールは、一つの薬剤処理を培地と置換することに関連する。薬剤処理後、各ウェルの細胞数は、その後１０％アラマーブルー(Roche社製, Lewes, East Sussex, U.K.)を含む培地に１時間細胞をインキュベートし、５４４〜５９５ｎｍの吸光度を読むことにより推測された。ドラッグの相互作用は、Chou及びTalalayの５０％有効モデル（median effect model）に基づく市販のソフトウェアパッケージであるカルクシンを用いて解析された(Chou, T.C. & Talalay, P. (1984) Adv. Enzyme Regul. 22, 27-55. Quantatative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors)。組合せ指数（Combination Index）（Ｃ．I．)が１である場合は、付加的な薬剤相互作用を示す一方、Ｃ．I．が１よりも大きい場合は拮抗的であり、スコアが１よりも小さい場合は相乗的である。
【０１２８】
（ウエスタンブロット分析）
タンパク質溶解物は、１０％ＦＣＳを含む培地に約５×１０５細胞／ウェルにて播種した１０ｃｍプレートから作製された。細胞は、指示された濃度にてＨＤＡＣ阻害剤及び／又はセリシクリブと共に、集菌するまで培養された。培養後、上清は除去され、いずれの浮遊細胞をもペレットにするため５分間２０００ｒｐｍにて遠心分離された。プレート上の細胞は、氷冷バッファーＡ（２０ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０）で一度洗浄された後、各プレートは、ＤＴＴ１ｍＭと、プロテアーゼ阻害剤（バッファーＡで１：１０００に希釈した)と、ホスファターゼ阻害剤（１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭフッ化ナトリウム、及び１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム）とを含むバッファーＡ０．１５ｍｌでスクレープ（scrape）された。細胞上清ペレットは、ＤＴＴと、プロテアーゼ阻害剤と、ホスファターゼ阻害剤とを含む５０μＬバッファーＡに懸濁し、プレートに由来する適当なサンプルと共にプールされた。細胞は、超音波処理によって溶解され（２×３ｓプローブソニケーターにより破砕）、各試験管のタンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイを用いて測定された。溶解物（２０〜３０μｇタンパク質／ウェル(loaded/well)）は、１２％アクリルアミドを含むビス−トリスゲルに再溶解し、ウエスタンブロットによる分析のためにニトロセルロースにトランスファーされた。メンブレンは、０．０２％(ｖ／ｖ)トゥイーン２０と５％(ｗ／ｖ)無脂肪粉ミルクとを含むＰＢＳで室温にて１時間ブロッキングされた。抗体培養は、０．０２％(ｖ／ｖ)Tween２０と３％(ｗ／ｖ)粉ミルクとを含むＰＢＳにおいて、２〜８℃にて一晩行われた。ニトロセルロースメンブレンは、以下の抗体をプローブとして分析された。
【０１２９】
【表２】
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【０１３０】
（フローサイトメトリー：セリシクリブ／酪酸ナトリウムの組合せ）
約３×１０５細胞／プレートのＨ４６０細胞が、１０ｃｍプレートに播種され、定着させるために一晩置かれた。次の日、指示された濃度のセリシクリブ、酪酸ナトリウム、又は両方の薬剤が添加された。２４時間又は７２時間のいずれかの処理の後に、細胞はトリプシン処理（trypsinisation）により集菌された。ヨウ化プロピジウム（propidium iodide）（ＰＩ）染色による細胞周期解析は、フローサイトメトリー解析の前に、−２０℃にて７０％（ｖ／ｖ）エタノールで一晩細胞を固定して行った。アネキシンV染色は、非固定生細胞について、製造者の使用説明書の指示どおりに行われた。
【０１３１】
（フローサイトメトリー：セリシクリブ／バルプロ酸ナトリウムの組合せ）
約０．５×１０６細胞／プレートのＨ４６０細胞が、１０ｃｍプレートに播種され、２４時間で静置された。細胞はバルプロ酸ナトリウムで２４時間処理され、さらにセリシクリブで２４時間処理された。用いられた化合物の濃度は、１×ＩＣ５０に相当した。単剤コントロール処理が行われた。かかる処理は、細胞をバルプロ酸ナトリウムでの２４時間の処理後、薬剤を含まない培地による２４時間の処理すること、或いは、薬剤を含まない培地による２４時間の処理後セリシクリブによる２４時間の処理することを含む。すべての細胞は培地を変更する前と４８時間後に集菌された。接着細胞は、トリプシン処理により集菌され、細胞懸濁液にプールされ、ＰＢＳで２回洗浄し、氷冷７０％エタノール１ｍＬに再懸濁することで固定した（fixed）。ヨウ化プロピジウムによる標準細胞周期解析を、フローサイトメーターにより行った。結果は、２つのサンプルの平均をとった。
【０１３２】
［Ｍ３０／ＴＰＳタイムギャップ実験の解析］  
Ａ５４９細胞を、９６ウェルプレートに播種し、定着させるために一晩置いた。細胞は、指示された濃度のセリシクリブ、酪酸ナトリウム、又はその組合せで処理された。処理７２時間後、培地は集菌され、維持され、−２０℃にて保存した。サンプルは、Ｍ３０ＥＬＩＳＡで、製造者の使用説明書の指示通りに解析された。
【０１３３】
（結果）
［ＮＳＣＬＣ細胞株におけるセリシクリブとＨＤＡＣ阻害剤との組合せ］
セリシクリブは、Ｈ４６０細胞株とＡ５４９細胞株において、指示どおりにＨＤＡＣ阻害剤と組み合わせた３つの異なる投与計画を用いて試験された。各ドラッグの処理の組合せの指標値は、ＥＤ５０、ＥＤ７５、及びＥＤ９０の値（曲線上で５０％、７５％、及び９０％が細胞死した地点）を示す。データは、少なくとも３つの独立した実験の平均である（表１参照）。
【０１３４】
【表１】
2009515862.tif 000005
【０１３５】
これらの結果により、セリシクリブと酪酸は、Ｈ４６０細胞株とＡ５４９細胞株とにおいて、３つの投与計画で相乗的であることが実証している。セリシクリブとＳＡＨＡは、Ｈ４６０細胞株において、ＳＡＨＡの前処理の後セリシクリブで処理した場合に中程度に相乗的であり、別の２つの治療計画では追加的であった。相乗的作用は、投与の順序に関係なく、セリシクリブとバルプロ酸ナトリウムとの連続的処理において観察された。それゆえ、細胞がＨＤＡＣ阻害剤で前処理された場合、セリシクリブは、試験された４つのＨＤＡＣ阻害剤すべてと組み合わせて用いられた場合に相乗的であり、ＨＤＡＣ阻害剤をセリシクリブと組み合わせることは、ＮＳＣＬＣ細胞株の処理のために優れた概念である。
【０１３６】
（フローサイトメトリー試験）
［セリシクリブと酪酸は、サブＧ１Ａ５４９細胞において、相乗的増加を誘導する。］
Ａ５４９細胞は、ＩＣ５０酪酸、０．２５〜1．５×ＩＣ５０セリシクリブ、又はＩＣ５０酪酸存在下で０．２５〜1．５×ＩＣ５０セリシクリブにおいて、７２時間インキュベートされた。細胞はその後集菌され、ヨウ化プロピジウムにより染色され、そのＤＮＡ含量がフローサイトメトリーで解析された。データは、２つの独立した実験を代表するものである（図１参照）。
【０１３７】
酪酸単独では、死んだ、又はアポトーシスを遂げつつあるサブ−Ｇ１細胞(＜２ｎＤＮＡ)において、少しの増加を誘導した。セリシクリブ処理の治療は、サブ−Ｇ１細胞において、用量依存的な増加を誘導し、酪酸を含めることで、相乗的に促進された。これらのデータは、セリシクリブと酪酸とが、死んだ又は死にかけている細胞において相乗的な増加を誘導することを示している。 
【０１３８】
［セリシクリブと酪酸は、アポトーシスを遂げつつある４６０細胞において、相乗的増加を誘導する。］
Ｈ４６０細胞株は、０．２５〜1．５×ＩＣ５０酪酸、０．２５〜1．５×ＩＣ５０セリシクリブ、又は０．２５〜1．５×ＩＣ５０セリシクリブと酪酸とで、７２時間培養された。細胞はその後集菌され、アネクシンＶ（annexinV）により染色され、フローサイトメーターで解析された。データは、２つの独立した実験を代表するものである（図２参照）。
【０１３９】
アネクシンＶは、アポトーシスを遂げつつある生細胞を標識する。０．６７×と１×ＩＣ５０濃度において、酪酸とセリシクリブは、２つの単剤処理を組み合わせたよりも顕著に大きいアネクシンＶのシグナルを誘導し、アポトーシス細胞における相乗的増加を示唆した。酪酸とセリシクリブ（1．５×ＩＣ５０）の一番高い濃度では、アポトーシスを遂げつつある細胞は、０．６７×又は１×ＩＣ５０濃度で処理された細胞より少ない様に思われたが、この理由については、現時点では明らかでない。
【０１４０】
［セリシクリブと酪酸は、Ａ５４９細胞においてアポトーシスを相乗的に誘導する。］
Ａ５４９細胞株は、ＤＭＳＯ（コントロール）で処理され、又は、セリシクリブ、酪酸ナトリウム、若しくはセリシクリブと酪酸とで、７２時間指示どおりに処理された。細胞培養上清は集菌され、Ｍ３０ＡｐｏｐｔｏｓｅｎｓｅＥＬＩＳＡで試験され、集菌された細胞は、ウエスタンブロットにより、切断されたＰＡＲＰとＭｃｌ−１について解析した。データは、２つの独立した実験を代表するものである（図３参照）。
【０１４１】
結果は、セリシクリブと酪酸とが一緒に、２つの単独処理を組み合わせたよりも大きいＭ３０シグナルのシグナルを示し、アポトーシス細胞における相乗的増加を示唆した。このデータは、セリシクリブと酪酸とが、セリシクリブと酪酸単独よりも大きい切断されたＰＡＲＰシグナルを示し、アポトーシスにおける追加的／相乗的増加を示唆した。セリシクリブと酪酸は、また、Ａ５４９細胞において、抗アポトーシスタンパク質であるＭｃｌ−１を減少させた一方、単剤処理では、このタンパク質に何ら重要な効果を及ぼさなかった。この結果は、検出されたアポトーシスの増加を促進する役割を果たすものかもしれない。
【０１４２】
［セリシクリブと酪酸は、いくつかのアポトーシス性のタンパク質を容量依存的に制御する。］
Ｈ４６０細胞は、１×若しくは１．５×ＩＣ５０濃度にて、酪酸、セリシクリブ、又はセリシクリブと酪酸とで２４時間処理された。細胞は集菌され、生じた細胞溶解物は、指示された抗体で、ウエスタンブロットにより分析された。データは、２つの独立した実験の代表である（図４参照）。
【０１４３】
データによれば、２４時間の処理により、セリシクリブと酪酸は、抗アポトーシスタンパク質であるＭｃｌ−１とカスパーゼ阻害剤であるＸＩＡＰのタンパク質レベルを、相乗的に減少させる。酪酸処理は、抗アポトーシスタンパク質であるＢｃｌ−２とカスパーゼ阻害剤であるサーバイビン（survivin）のレベルを減少させる。共に、これらの変化は、強いプロアポトーシス性のシグナルとなる。実際、増加した１．５×ＩＣ５０で切断されたＰＡＲＰは、せいぜい追加的効果があるように思われただけであったが、１．５×ＩＣ５０濃度で切断されたＰＡＲＰにおいてのみ相乗的増加があり、図２において、１．５×ＩＣ５０で作成されたアネクシンＶデータと一致するものである。
【０１４４】
［セリシクリブと酪酸は、いくつかアポトーシス性のタンパク質を時間依存的に制御する。］
Ｈ４６０細胞は、１×ＩＣ５０酪酸、セリシクリブ、又はセリシクリブと酪酸で指示された時間処理された。細胞は集菌され、生じた細胞溶解物は、指示された抗体でウエスタンブロットにより解析された。データは、２つの独立した実験の代表である（図５参照）。
【０１４５】
酪酸は、サーバイビンとＢｃｌ−２のレベルを減少させ、セリシクリブと酪酸は、Ｍｃｌ−１とＸＩＡＰのレベルを相乗的に減少させることから、結果は、図４による観察を確認するものである。これらのデータによれば、薬剤の組合せは、カスパーゼ３とカスパーゼ９の活性型の相乗的増加を誘導するものであることをも示しており、切断されたＰＡＲＰにおける増加とほぼ同時に見い出される。興味深いことに、アポトーシスの増加は（切断されたＰＡＲＰの出現として測定される）、Ｍｃｌ−１と、Ｂｃｌ−２と、サーバイビンと、ＸＩＡＰとが減少する後まで起こらず、この細胞株では、これらの変化のいずれか又はすべてがアポトーシス効果を促進するために要求されてもよいことを示している。
【０１４６】
［セリシクリブ／バルプロ酸ナトリウムの組合せ］
バルプロ酸ナトリウム／セリシクリブの組合せのフローサイトメトリー解析を上述の通り行った。バルプロ酸ナトリウム前処理のスケジュールが、カルクシンにより相乗的作用を示したため選択された。Ｈ４６０細胞において、セリシクリブによる処理は、サブＧ１（アポトーシスを遂げつつある細胞）における細胞の多少の増加を誘導するが、用いられている濃度においては、Ｈ４６０細胞の全体的な細胞周期の配分に対して顕著なインパクトを与えるものではなかった（図６参照）。
【０１４７】
セリシクリブとバルプロ酸ナトリウムとの組合せは、サブＧ１（アポトーシスを起こした細胞）の割合を顕著に増加させ、単剤コントロールの合計と比較した場合に、カルクシン解析により得られたデータと一致するものである。
【０１４８】
上記に例証されているデータは、セリシクリブが、スケジュールと独立した方法で、Ｈ４６０細胞においてＨＤＡＣ阻害剤であるバルプロ酸ナトリウムと相乗的作用のあると思われる証拠を提供するものである。
【０１４９】
本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の改変及び変更は、当業者には明らかであろう。本発明を、特定の好ましい実施形態に関して説明してきたが、特許請求の範囲に記載される本発明がこうした特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解されたい。実際に、関連分野の当業者には自明である、本発明を実施するためのここに記載した形態の種々の改変は、特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】セリシクリブと酪酸ナトリウムとの同時の処理が、Ａ５４９細胞において、７２時間の処理後にアポトーシスの増加を相乗的に導き、サブＧ１細胞フラグメントにおける増加により決定されることを示す。
【図２】セリシクリブと酪酸ナトリウムとの同時の処理が、Ｈ４６０細胞において、７２時間の処理後にアポトーシスの相乗的増加を導くことが、アネクシンＶにより測定により、決定されることを示す。
【図３】セリシクリブ／酪酸ナトリウムの組合せについては、ＩＣ５０濃度でアポトーシスの増加があり、サイトケラチン１８（Ｍ３０ＥＬＩＳＡ）のカスパーゼ切断及びＰＡＲＰ切断により決定される。加えて、図３によると、細胞のアポトーシスを引き起こす抗アポトーシスタンパク質の欠如におそらく関連しているＭｃｌ１レベルの相乗的減少を示すものである。
【図４】セリシクリブ／酪酸ナトリウムの組合せに関連して詳細にアポトーシスの分子経路を示す。Ｍｃｌ１とＢｃｌ２（両方とも抗アポトーシスタンパク質）の欠如が細胞のアポトーシスを引き起こす。ＸＩＡＰとサーバイビンは、アポトーシス経路の阻害剤であり、これらのたんぱく質の欠如が、再び細胞をアポトーシスに向かわせる。ＸＩＡＰとＭｃｌ１は、相乗的であるので、この効果は、ＰＡＲＰの存在により示される。ヒストンのウエスタンブロットは、ＨＤＡＣ阻害剤がアセチル化ヒストンの量を増加させる（脱アセチル化が阻害されているから）ことを示す。
【図５】セリシクリブ／酪酸ナトリウムの組合せにおけるＩＣ５０の細胞事象の経時変化を示す。カスパーゼ３とカスパーゼ９（アポトーシスが誘導されていることが示唆されている）の相乗的活性化をみることができる。
【図６】ＤＭＳＯ（コントロール）、バルプロ酸ナトリウム、セリシクリブ、及びバルプロ酸ナトリウム／セリシクリブの組合せによる処理後の細胞周期の分配を示す。Ｈ４６０細胞は、フローサイトメーターのＰＩ解析前に示される。Ｈ４６０細胞は、フローサイトメーターのＰＩ解析前に示された時間指示された薬剤で処理された。結果は、２つのデュプリケートの平均である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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