(57)【要約】  動物におけるタンパク質に対する経口免疫寛容を促進する方法であって、糖化形態のタンパク質を動物に投与することを含む方法；動物における経口免疫寛容の促進に使用される糖化タンパク質；動物における経口免疫寛容の促進に使用される糖化タンパク質を含有する食品；及び前記食品を製造する方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物におけるタンパク質に対する経口免疫寛容を促進する方法であって、糖化形態の前記タンパク質を哺乳動物に経腸的に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記糖化タンパク質が経口的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記糖化タンパク質が食品の成分である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記食品が乳幼児用調製乳である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記食品がペットフードである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質がホエータンパク質である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記糖化ホエータンパク質が、ラクトシル化されたホエータンパク質である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ホエータンパク質がβ−ラクトグロブリンを含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物における非糖化タンパク質に対する経口免疫寛容の促進に使用される糖化タンパク質。
【請求項１０】
ホエータンパク質である、請求項９に記載の糖化タンパク質。
【請求項１１】
ラクトシル化されたホエータンパク質である、請求項１０に記載の糖化ホエータンパク質。
【請求項１２】
前記ホエータンパク質がβ−ラクトグロブリンを含む、請求項１０又は１１に記載の糖化ホエータンパク質。
【請求項１３】
哺乳動物における非糖化タンパク質に対する経口免疫寛容の促進に使用される糖化タンパク質を含有する食品。
【請求項１４】
前記糖化タンパク質がホエータンパク質である、請求項１３に記載の食品。
【請求項１５】
前記糖化ホエータンパク質がラクトシル化されている、請求項１４に記載の食品。
【請求項１６】
前記ホエータンパク質がβ−ラクトグロブリンを含む、請求項１４又は１５に記載の食品。
【請求項１７】
乳幼児用調製乳である、請求項１３〜１６のいずれかに記載の食品。
【請求項１８】
ペットフードである、請求項１３に記載の食品。
【請求項１９】
請求項１３〜１８のいずれかに記載の食品を製造する方法であって、製品中に含有されるタンパク質を固体状態での糖化のプロセスに供することを含む方法。
【請求項２０】
糖化タンパク質を含有する乳児用調製乳。
【請求項２１】
糖化ホエータンパク質を含有する乳児用調製乳。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、動物におけるタンパク質に対する経口免疫寛容を促進する方法であって、糖化形態のタンパク質を動物に投与することを含む方法；動物における経口免疫寛容の促進に使用される糖化タンパク質；動物における経口免疫寛容の促進に使用される糖化タンパク質を含有する食品；及び前記食品を製造する方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
母乳は全ての乳児に推奨されるものである。ところが、医学的理由で母乳供給が不十分であるか、うまくいかないか、又は勧められない場合、或いは母親が母乳供給を選択しない場合もある。乳児用調製乳は、このような場合のために開発されてきた。乳児用調製乳の大半は牛乳をベースとしている。しかし、乳児において、牛乳アレルギー又は牛乳過敏症はよくあることである。通常、このアレルギーは２歳又は３歳までに消失するが、時には生涯続くこともある。乳児では最も一般的な疾患で、発生率は正期産児で０．５〜３％、早産児で３〜５％である。このアレルギーは、発疹、じんま疹、口周辺の発赤、鼻水、くしゃみ、疝痛、下痢、嘔吐、アナフィラキシー、又はより一般的には消化不良を引き起こし得る。乳幼児突然死の数症例に関連している可能性もある。
【０００３】
牛乳過敏症は、ラクターゼ酵素が先天的に欠乏しているために牛乳への耐性を持たない乳糖不耐症とは区別されるべきである。
【０００４】
牛乳アレルギーはほとんどの場合、ホエー画分中のα−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンタンパク質に対する反応により引き起こされる。また、同じく牛乳中に存在する、潜在的にアレルゲン性の乳タンパク質である、カゼイン及び／又はアルブミンによって引き起こされる可能性もある。生後早期の数か月において免疫系はまだ発達中であり、このような食物タンパク質を認識及び寛容できないことがある。その結果、新生児はその食物タンパク質を異物とみなし、これに対するアレルギーを発現する。免疫系が他の食物タンパク質を認識及び寛容しない場合は、小児はそのようなタンパク質に対してもアレルギーを発現する可能性がある。
【０００５】
免疫応答には、細菌やウイルスの攻撃に対して重要な細胞性（又はＴｈ１）免疫、及びアレルギー反応に関与している体液性（又はＴｈ２）免疫の２種類がある。乳児が生まれる前は、乳児の身体は無菌状態にあり、Ｔｈ１経路は不活性である。しかし、赤ん坊が母親に対して免疫応答を確立しないようにする必要があるので、Ｔｈ２経路は誕生前に活性である。乳児は、生まれるとすぐに、良性細菌及び有害細菌を含む多数の細菌に曝露されるが、Ｔｈ１経路が活性化されてその猛攻撃に対処する。新たな潜在的な異物が腸内に出現すると、Ｍ細胞を通じて腸管関連リンパ組織に取り込まれ、ナイーブＴ細胞に遭遇する。Ｔｈ１経路が正しく機能していれば、身体は、特異的な抗体又は特異的に感作されたＴリンパ球から成る免疫応答を発生させることになる。無害な食物抗原に特化したこのようなＴ細胞は将来、Ｔｈ２経路を通じて発現する過敏症を防止する抑制機序として作用することになる。この機序は、経口免疫寛容として知られている。
【０００６】
しかし、免疫応答により産生された抗体がＩｇＥ抗体である場合、抗体は、炎症反応を引き起こすことによって、抗原へのさらなる曝露に応答する。これがアレルギーである。このタイプのアレルギーの機序は、以下のように説明することができる。まず、ＩｇＥ抗体が、血中の好塩基球を始めとする細胞表面上に出現する。アレルゲン／ＩｇＥ相互作用が生じると、ＩｇＥ／アレルゲン結合体を提示している細胞は、ヒスタミン等の化学伝達物質を産生、放出する。この現象により、局所性又は全身性血管拡張等の病的状態が生じる。
【０００７】
Ｔｈ１経路は、細菌の存在により刺激される。衛生水準の高い先進国で起こり得ることだが、誕生直後又は生まれて非常に日の浅い新生児が十分な細菌に遭遇しないと、Ｔｈ１経路はよく機能しない可能性がある。このような場合、免疫系からの唯一の応答はＴｈ２応答となり、抗原に対するアレルギーが発現することになろう。これは、経口免疫寛容が発現しない一因であるにすぎず、他の原因が存在する可能性もある。当然、遺伝的素因が存在するとも考えられる。
【０００８】
このように、経口免疫寛容の現象は、経口経路で抗原を投与することによって、免疫原の形態で与えられる同一抗原に対する以後の全身性免疫応答が起こらなくなることを可能とするものである。同様の機序は、生命にとって必須であり、無害な抗原の供給源でもある腸内正常細菌叢に対する過敏症反応を防止すると考えられている。経口免疫寛容の機序が乳児において十分に発現しない場合、又は特定の抗原に対する寛容の生理的状態に破綻が生じている場合には、過敏症反応の発現という結果を招く可能性がある。
【０００９】
通常、牛乳過敏症は、感受性のある乳児が初めて牛乳に接したときに生じる。食事の観点からは、確立されたアレルギーへの対処法は２つある。すなわち、アレルゲンを含有する食品を完全に避けるか、或いは、食品を加水分解等により処理してアレルゲン性を減少させなければならない。十分に加水分解されたタンパク質（５個以下のアミノ酸から成るペプチド）を含有する乳児用調製乳及びシリアルはいずれも、この後者の目的のために製造されている。
【００１０】
しかし、アレルギー発現のリスクを低減させ、未処理のタンパク質に対する寛容の発現を促進する製品が、特にそのリスクがあると考えられる小児（例えば、アレルギーに罹患している家族が少なくとも１人いる場合）において必要とされている。例えば、部分的に加水分解されたタンパク質を与えて、乳児における経口免疫寛容を誘導することが提案されている。経口免疫寛容の誘導及び維持のための代替的アプローチ、すなわちプロバイオティクス細菌を含有する食品の使用が、国際公開第０３／０９９０３７号パンフレットに記載されている。プロバイオティクス細菌の例としては、多様な種の乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）及びビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）が挙げられる。プロバイオティクスの投与が乳児における経口免疫寛容の誘導に有用であることが判明している。
【００１１】
本発明の目的は、経口免疫寛容の促進へのさらなるアプローチを提供することである。
【００１２】
乳児用調製乳は、全ての必須アミノ酸を含有し、迅速及び容易に消化される点で栄養学的に特に興味深いホエータンパク質を含有することが多い。
【００１３】
ホエータンパク質を還元糖の存在下で加熱すると、タンパク質の遊離アミノ基が糖と反応し、その結果、タンパク質の糖化が生じる。このような反応を無制限に進行させると、栄養的な価値の大幅な低下が生じる可能性があり、また、褐変が見られることもある。生じ得る複雑な一連の反応は、まとめてメイラード反応として知られている。実際に、必要な化学基を含有する食品中で、非常にゆっくりとではあるが、室温でメイラード型の反応が生じる可能性があるとさえ考えられている。メイラード反応は一般に望ましくないものと考えられ、そのため、該当する食品の加工中にはこれを制御するための措置が取られるが、最近では、慎重に制御すれば、ホエータンパク質の糖化によって、タンパク質の特性を様々な形で操作する機会が得られることが分かってきた。
【００１４】
グリコシル基とタンパク質のα−又はε−アミノ基との非酵素的相互作用の結果生じる第一の不可逆的生成物は、アマドリ化合物として知られている。全てのアマドリ化合物は酸加水分解に供されるとフロシンを生成することから、フロシン生成量の測定に基づいて乳タンパク質の糖化の進行をモニターする方法が考案されている。この手段及びその後発達した質量分析法により、メイラード反応の進行をモニターすることが理論的に可能となった。糖化は、溶液中又は固体状態で行うことができる。
【００１５】
国際公開第００／１８２４９号パンフレットには、粉末化ホエータンパク質を含有する原料を固体状態で糖化するための方法であって、粉末の水分活性を０．３〜０．８に調節するステップと、３０〜７５℃の温度で１時間〜８０日間、糖化を進行させるステップと、を含む方法が記載されている。得られる粉末では機能特性が向上し、例えば、熱安定性、乳化活性、抗酸化活性及びエンテロトキシン結合能が向上すると説明されている。この粉末は、食品の機能性及び栄養成分含有量を高めるための添加物として使用してもよい。
【発明の概要】
【００１６】
一態様において、本発明は、哺乳動物におけるタンパク質に対する経口免疫寛容を促進する方法であって、糖化形態の前記タンパク質を哺乳動物に投与することを含む方法に関する。この糖化タンパク質は、経腸的に、例えば食品中に組み込むことにより投与される。このような製品は、製造及び投与が簡単であり、かつ栄養的な価値を有する。
【００１７】
別の一態様において、本発明は、哺乳動物における非糖化タンパク質に対する経口免疫寛容の促進に使用される糖化タンパク質に関する。
【００１８】
第三の態様において、本発明は、哺乳動物における非糖化タンパク質に対する経口免疫寛容の促進に使用される糖化タンパク質を含有する食品に関する。
【００１９】
好ましくは、糖化タンパク質は糖化ホエータンパク質である。糖化ホエータンパク質を含有する食品の一例は乳幼児用調製乳である。
【００２０】
或いは、食品は、糖化タンパク質を含有する乾燥、湿潤又は液体ペットフードであってもよい。
【００２１】
好ましくは、糖化ホエータンパク質は糖化β−ラクトグロブリンを含み、また、好ましくは、糖化はラクトシル化である（すなわち、還元糖はラクトースである）。このような成分は、多くの食品成分（例えば、ホエータンパク質分離物、ホエータンパク質濃縮物又は脱脂粉乳）中に存在するので、このような製品の製造プロセスを、ラクトシル化ステップを含むように改変することは簡単である。このようなホエータンパク質含有製品はいずれも、そのタンパク質の機能特性及び良好な栄養特性の点で価値のある食品成分として広く使用されている。
【００２２】
さらに別の一態様において、本発明は、上記食品を製造する方法であって、製品中に含有されるタンパク質を糖化プロセスに供することを含む方法に関する。糖化は、溶液中で行っても固体状態で行ってもよい。
【００２３】
さらなる一態様において、本発明は、糖化タンパク質、好ましくは糖化ホエータンパク質、を含有する乳児用調製乳に関する。
【発明の詳細な説明】
【００２４】
本発明によれば、アレルギー発現の対象となり得る抗原である、ホエータンパク質β−ラクトグロブリンのようなタンパク質は、当該抗原に対する経口免疫寛容を促進するために、糖化して哺乳動物に投与することができる。使用可能なその他のタンパク質としては、ホエータンパク質α−ラクトアルブミン、カゼイン及びアルブミンが挙げられる。
【００２５】
経口免疫寛容の促進という語は、経口免疫寛容の誘導及び維持の両方をまとめて指す場合もあれば、各々を指す場合もある。
【００２６】
最も一般的な食物アレルギー又は食物過敏症は、牛乳アレルギー又は牛乳過敏症であるが、これは、大抵の場合、牛乳が、乳児が接する最初の食品であることによる。従って、本明細書の議論は、このアレルギーを中心として行われている。しかし、本願の範囲はこのアレルギーに限定されず、同様に小児アレルギーに関連してよく問題となる他の食物タンパク質（例えば、ナッツ（例えば、ピーナッツ）、小麦及び卵のタンパク質）に対する経口免疫寛容の促進にも関するものであるとする。例えば、本発明によれば、小麦タンパク質に対する経口免疫寛容を促進するために、哺乳動物に、糖化された小麦タンパク質を投与してもよく、卵タンパク質に対する経口免疫寛容を促進するために、哺乳動物に、糖化された卵タンパク質を投与してもよく、また、ナッツタンパク質に対する経口免疫寛容を促進するために、哺乳動物に、糖化されたナッツタンパク質を投与してもよい。
【００２７】
糖化タンパク質は、好ましくは当該タンパク質を糖化プロセス、好ましくは固体状態での糖化のプロセスに供することにより調製される。Ｍｏｒｇａｎ（Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ（１９９９）４７（１１）：４５４３〜８）によれば、固体状態でのプロセスの方がタンパク質分子の構造変化が少ない。さらに、固体状態でのプロセスの方がモニター及び制御しやすいことから、タンパク質の凝集、メイラード反応の進行等、望ましくない結果を避けることができる。
【００２８】
糖化プロセスは、Ａｗが（０．２〜０．７に）調節されたタンパク質／糖粉末を最大約７２時間、穏やかに（５０〜８０℃で）熱処理することを含んでもよい。プロセスは、全体として、非常に単純で、既存の工業装置によく適応し、また、エネルギーコストも低い。プロセスは、粉末の水分活性（Ａｗ）の調節及び平衡化、加湿粉末の熱処理を含んでもよく、また、場合により粉末の冷却及び／又は乾燥を含んでもよい。
【００２９】
本発明の好ましい一態様において、糖化タンパク質は食品中に組み込まれる。本発明において、「食品」という語は、摂取可能なあらゆる物を包含するものとする。従って、食品としては、ヒトによる摂取が意図された製品、特に乳児用調製乳、新生児用調製乳、乳児及び新生児用フォローアップ調製乳等が挙げられる。
【００３０】
乳児用調製乳及びフォローオン調製乳に関する、１９９１年５月１４日付のＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ９１／３２１／ＥＥＣのＡｒｔｉｃｌｅ１．２によれば、１２月齢未満の小児が「乳児」とみなされる。「乳児用調製乳」は、生後最初の６か月間の乳児の完全栄養を目的とする食品である。
【００３１】
しかし、糖化タンパク質は、乳児又は新生児用の栄養を特に目的としていなくても、この群に摂取される食品、中でも、例えば乳、ヨーグルト、カード、チーズ、発酵乳、乳ベースの発酵製品、アイスクリーム、発酵シリアルベースの製品、又は乳ベースの製品、の中に含有させることもできる。
【００３２】
「食品」という語は、他の哺乳動物、例えば、ペット（イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、マウス、ラット等）又はその他の飼育哺乳動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、ラクダ等の家畜）によって摂取される製品も包含する。ここで、ペットは、好ましくはコンパニオンアニマルである。従って、上記糖化タンパク質は、経口免疫寛容を促進する目的でペットフード製品中に組み込むこともできる。好適なペットフード製品としては、チャンク製品、クロケット（ｃｒｏｑｕｅｔｔｅ）、チュー（ｃｈｅｗ）製品、湿潤製品（缶詰製品等）及び液体調製乳（子ネコ又は子イヌ用ミルク等）が挙げられる。
【００３３】
ペットフードは、ペットによる摂取に適した食物、好ましくはペットの完全栄養に適切な食品である。
【００３４】
当然のことであるが、糖化の度合いが進むにつれ、糖化タンパク質の栄養的な価値は次第に低下する。ホエータンパク質の場合、ブロック化リジンの比率（％）を測定することによってそれを評価することができる。このようなタンパク質の限定的な糖化によりその栄養的な価値に顕著な悪影響がもたらされることはないが、製品を調製する際には、当該製品中で使われる糖化タンパク質の糖化度及び糖化タンパク質の割合のいずれにも留意しなければならない。例えば、乳児用調製乳は、好ましくは、約１５％を超えるブロック化リジンを含有すべきではない。糖化タンパク質を調製乳に使用する場合、この目標値は、全てのタンパク質を所望の糖化度の最大限度まで糖化すること、又は、より高度に糖化されたタンパク質と未処理タンパク質との混合物を使用して、ブロック化リジンに関する目標値を全体として遵守すること、のいずれかによって実現することができる。
【００３５】
本発明のさらなる一態様では、上記食品を製造する方法であって、タンパク質を糖化プロセス、好ましくは固体状態での糖化のプロセスに供することを含む方法が提供される。
【００３６】
本発明はまた、糖化ホエータンパク質等の糖化タンパク質を含有する乳児用調製乳を提供する。乳児用調製乳は、含有されるタンパク質が糖化されているか、最適な糖化タンパク質と置き換えられている標準的な組成物とすることができる。上述のように、糖化ホエータンパク質を含有する乳児用調製乳は、好ましくは、約１５％を超えるブロック化リジンを含有すべきではなく、この目標値は、全てのタンパク質を所望の糖化度の最大限度まで糖化すること、又は、より高度に糖化されたタンパク質と未処理タンパク質との混合物を使用して、ブロック化リジンに関する目標値を全体として遵守すること、のいずれかによって実現することができる。
【００３７】
糖化タンパク質は、好ましくは、当該タンパク質に対する寛容が確立されるまで非糖化タンパク質の代わりとして摂取されるべきである。例えば、卵タンパク質に対する寛容が確立されて、アレルギー反応を恐れることなく普通の卵を摂取することができるようになるまでは、糖化された卵タンパク質のみが摂取されるべきである。同様に、糖化タンパク質を含有する乳児用調製乳を新生児に与えたら、離乳が終わって、その子が通常の食品を食べる年齢（例えば３〜５歳）に達するまで与え続けるべきである。
【実施例】
【００３８】
以下の実施例は、本発明の範囲内にある製品及びその製造方法を例示するものである。本実施例は、決して本発明を制限するものとみなされるべきではない。本発明に関しては変更及び修正が可能である。すなわち、当業者であれば、広範囲の組成物、成分、加工方法及び混合物を含む、これらの実施例の多くの可能な変形例を認識するであろうし、天然物レベルの本発明の化合物を様々な用途に適合させることができる。
【００３９】
〔実施例１：液体状態でのホエータンパク質の糖化〕
β−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）をＤａｖｉｓｃｏ（ＵＳＡ）から入手した。ＲＰ−ＨＰＬＣにより純度（９０％）を評価した。ラクトースはＦｌｕｋａから入手した。
【００４０】
４％ＢＬＧ（約２．２ｍＭ）及び７％ラクトース一水和物（約２００ｍＭ）を、ｐＨ６．８の２０ｍＭリン酸緩衝液中に溶解させた。０．２２ｍｍ酢酸セルロースフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）での濾過後、タンパク質及びラクトースの混合物をしっかり栓の閉まるフラスコ中に入れ、ラクトシル化レベルが、タンパク質の栄養的な価値に顕著な悪影響を誘発しない程度に低くなるように、６０℃の水浴中で０時間、２４時間又は７２時間加熱した。理論上は、このような条件では、合計１４個存在し得るリジン残基に、β−ラクトグロブリン単量体当たりラクトース２〜３分子が結合することが可能である（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｊ．Ａｇｒｉ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４７，８３〜９１）。全ての実験は、３００ｍｌフラスコ中の上部空間を１〜２ｍｌに減らすことにより、嫌気的、無菌的条件下で実施した。加熱後、種々の画分は、ゲル化を防ぐために、透析せずに速やかに凍結乾燥した。
【００４１】
対照の未処理β−ラクトグロブリン（対照ＢＬＧ）を室温で６時間水和させ、氷水浴中で冷却した後、糖化ＢＬＧと同じ７％の濃度になるようにラクトースを加えた。
【００４２】
さらに別の対照として、同純度のＢＬＧの溶液を、ラクトースは加えずにインキュベートし、冷却後、７％の濃度になるようにラクトース粉末を加え溶解させた。その後速やかに溶液を凍結乾燥させた。
【００４３】
さらに、下記の２種のホエータンパク質分離物（ＷＰＩ）を試験した。
・ラクトシルβ−ラクトグロブリンが実質的に枯渇している（質量分析法により制御）Ｄａｖｉｓｃｏ  ＷＰＩ  ＢＩＰＲＯ
・高濃度のラクトシルβ−ラクトグロブリンを含有する（質量分析法により特徴分析）Ｌａｃｐｒｏｄａｎ８０（Ａｒｌａ  Ｆｏｏｄｓ）
【００４４】
ブロック化リジンをフロシンアッセイにより測定した。一定分量のタンパク質（約２０ｍｇタンパク質）を還流装置中、１１０℃で２４時間、６Ｍ塩酸６０ｍｌで加水分解した。水を加えて量を１００ｍｌ容積にした後、１０ｍｌの分量を蒸発させて乾燥状態とし、さらに０．０２Ｍ  ＨＣｌ３ｍｌ中で再懸濁させた。次いで、クエン酸ナトリウム緩衝液及びタンパク質加水分解物分析用カラムを備えたＨｉｔａｃｈｉ  Ｌ−８５００アミノ酸分析機中に１０μｌを注入して、分析を行った。ニンヒドリン試薬を用いたポストカラム誘導体化の後、外部標準との比較により、リジン及びフロシンを同じクロマトグラム中で定量した。加水分解中にε−デオキシフルクトシルリジン（ブロック化リジン）の約４０％がリジンに再転換され、一部がピリドシン（ｐｙｒｉｄｏｓｉｎｅ）に、また、約３２％はフロシンに転換されると仮定して、酸加水分解物中のリジン及びフロシンの含有量から、ブロック化リジンの比率（％）を計算した（Ｆｉｎｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）  Ｐｒｏｇ．Ｆｏｏｄ  Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．５，３４５〜３５５）。全ての結果は、２つの独立した測定値から得られる平均値である。
【００４５】
結果を下記表１に示す。
【表１】
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【００４６】
〔実施例２：マウスにおける経口免疫寛容の誘導〕
経口免疫寛容の誘導を試験するため、Ｐｅｃｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．に記載の標準のマウスプロトコル（１９９９，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９６：２７８〜２８５）を使用した。実施例１に記載のように、異なる種類のホエータンパク質又はＢＬＧを、ラクトシル化して、又はラクトシル化せずにマウスに与えた。５日後、Ａｌ（ＯＨ）３溶液中に希釈したＢＬＧ（１００ｍｇ  β−ラクトグロブリン／マウス）を皮下注射によりマウスに投与した。３週間後、種々の群におけるＢＬＧ特異的ＩｇＥ及びＩｇＧ１力価を測定することによって経口免疫寛容の誘導を評価するために、マウスを屠殺し血液試料を採取した。
【００４７】
下記の群に従ってマウスを処置した。
Ａ群：  水
Ｂ群：  対照ＢＬＧ、ラクトースとともに凍結乾燥（インキュベーションなし）
Ｃ群：  ＢＬＧ＋ラクトース  Ｔ０
Ｄ群：  対照ＢＬＧ、２４時間インキュベーション後、ラクトースとともに凍結乾燥
Ｅ群：  ＢＬＧ＋ラクトース、２４時間インキュベーション後、凍結乾燥
Ｆ群：  対照ＢＬＧ、７２時間インキュベーション後、ラクトースとともに凍結乾燥
Ｇ群：  ＢＬＧ＋ラクトース、７２時間インキュベーション後、凍結乾燥
Ｈ群：  低ラクトシル化ＷＰＩ（ホエータンパク質分離物）（Ｂｉｐｒｏ）
Ｉ群：  高ラクトシル化ＷＰＩ（Ｌａｃｐｒｏｄａｎ）
【００４８】
図１に示す結果は、マウスにラクトシル化ＢＬＧ（Ｅ群）及び高ラクトシル化ホエータンパク質（Ｉ群）を与えると、未処理ＢＬＧ（Ｂ群）及び低ラクトシル化ホエータンパク質（Ｈ群）を与えた群（Ｂ、Ｈ両群は陽性対照）と比較して、特異的抗ＢＬＧ  ＩｇＥ低応答性がさらに改善されることを示している。
【００４９】
与えたタンパク質のラクトシル化率が最高であったにも関わらず、Ｂ群（４２％ブロック化リジン）が最良の応答を示さなかったことは注目すべきである。これについては、ラクトシル化反応が制御されなかったことが１つの説明となりえよう。さらに、過剰なラクトシル化によりタンパク質中の重要なエピトープがマスクされる、という事実によるものである可能性もある。同様に、Ｇ、Ｉ両群に与えたタンパク質中のブロック化リジンの比率は同じであるにも関わらず、Ｇ群の結果はＩ群の結果と変わらない。これは、Ｇ群に与えたＢＬＧのラクトシル化が液体状態で行われ、そのためよく制御されなかったためであるかもしれない。制御困難な液体状態でのラクトシル化は、タンパク質の凝集、メイラード反応の進行を始めとするいくつかの望ましくない現象の発生につながる可能性がある。他方、Ｉ群に与えたホエータンパク質のラクトシル化は、より良好に制御された乾燥状態で生じたものである（初期メイラード反応のみ）。
【００５０】
同様のプロファイルは、Ｔｈ１細胞の制御下で産生された別のアイソタイプである抗ＢＬＧ特異的ＩｇＧ１についても観察され、経口免疫寛容の誘導によりこれらの細胞がアネルギー状態にあることが示された。図２に示されるように、Ｅ群及びＩ群は最も低い抗ＢＬＧ  ＩｇＧ１力価を示した。このことは、これら２群中のタンパク質のラクトシル化が、ラクトシル化度の低い同種のタンパク質を与えた群、すなわちＢ群及びＨ群と比較して、低応答性を改善させることを示唆している。
【００５１】
〔実施例３：乾燥状態での糖化〕
ホエータンパク質濃縮物（ＷＰＣ）Ｐｒｏｌａｃｔａ７５を、Ｌａｃｔａｌｉｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ（Ｒｅｔｉｅｒｓ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。メーカーによれば、この製品は、タンパク質７６．４％、ラクトース１５．３％、灰分３．２％、カルシウム０．４２％及び水５％を含有する。
【００５２】
このＷＰＣを、固体状態での糖化によりラクトシル化した。簡単に言うと、飽和Ｋ２ＣＯ３の入った密閉チャンバー中に粉末を入れることにより、水分活性（Ａｗ）を約０．４４に調節した。この間、吸水量及びＡｗをモニターした。所望のＡｗに達した時点で、粉末を不透明な袋に密封した。次いで、この粉末を１５℃で少なくとも４８時間維持し、マトリックス内で水を平衡化させた。自家製の細管加熱装置中の密封されたステンレス鋼管（内径１６ｍｍ、粉末〜３０ｇ）に粉末を入れ、６０℃で３時間及び８時間インキュベートすることによって、タンパク質糖化を誘導した。糖化時間の終わりに水分活性を確認したところ、変化は観察されなかった。その後、粉末を１５℃で密封保存した。
【００５３】
質量分析法（ＭＡＬＤＩ）を用いて、ラクトシル化形態のタンパク質を検出するとともに、Ｐｒｏｌａｃｔａ７５（非糖化及び糖化）中のタンパク質単量体当たりの結合ラクトース数（平均）を定量した。
【００５４】
上述の遊離アミノ基の定量により糖化度を評価した。
【００５５】
遊離アミノ基は、オルトフタルジアルデヒド法（ＯＰＡ）を用いて定量した。タンパク質溶液（ｐＨ７．８の５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝液中に１．５ｇ／ｌ）２００ｍｌ、還元溶液（ｐＨ９．３の０．１ｍｏｌ／ｌホウ酸ナトリウム緩衝液２００ｍｌ中にＮ−アセチル−Ｌ−システイン４８０ｍｇを分散させたもの）２ｍｌ及び２０％（ｗ／ｗ）ＳＤＳ溶液５０ｍｌを混合することによって、ＯＰＡ定量を行った。混合及び５０℃、１０分間のインキュベーション後、ＯＰＡ試薬（ＯＰＡ１７０ｍｇをメタノール５ｍｌ中に分散させて調製）５０ｍｌを加えた。この混合物を５０℃で３０分間さらにインキュベートした後、室温で３０分間冷却し、Ｕｖｉｋｏｎ８１０分光光度計（Ｆｌｏｗｓｐｅｋ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて３４０ｎｍの吸光度を読み取った。最終混合物中で濃度範囲１０〜２００ｍｍｏｌ／ｌのＬ−ロイシン標準液を用いて、検量線を得た。反応のシグナルを得るために２つのブランク値を差し引いた。ＯＰＡ試薬の代わりにメタノールを用いてブランク１（タンパク質シグナル）を得た。タンパク質溶液をリン酸ナトリウム緩衝液に置き換えることによってブランク２を得た。使用した製品及び試薬は次の通りである。ホウ酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、ＯＰＡ［Ｆｌｕｋａ（Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）］；リン酸二水素ナトリウム一水和物、メタノール、水酸化ナトリウム［Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）］；Ｌ−ロイシン［Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）］。
【００５６】
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、Ｐｒｏｌａｃｔａ７５（非糖化及び糖化）中の凝集タンパク質の存在を確認した。開始時点のタンパク質濃度で１ｇ／ｌ相当のタンパク質濃度を示すように、適正量の溶出緩衝液でタンパク質試料を希釈した。カラムはＴＳＫ  ２０００ＳＷ（Ｔｏｓｏｈａａｓ）であり、０．１Ｍリン酸（ｐＨ６．８）＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌにより０．５ｍｌ／分で溶出した。２１４ｎｍ又は２８０ｎｍで光学濃度を記録した。未処理のα−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンを含有する分子量標準を用いてカラムを較正した。
【００５７】
化学的特性解析の結果を下記表２に示す。
【表２】
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【００５８】
タンパク質のラクトシル化の特徴を分析するために用いた種々の方法間で良好な相関が見られた。タンパク質のラクトシル化に用いた条件（乾燥状態での糖化）では、タンパク質凝集体の形成は起こらなかった（サイズ排除クロマトグラフィーにより示された）。
【００５９】
〔実施例４：マウスにおける経口免疫寛容の誘導〕
ラクトシル化の効果を測定するために、上述のマウスモデルで経口免疫寛容の誘導を行った。種々のタンパク質調製物、すなわち実施例３で調製した非糖化及び糖化Ｐｒｏｌａｃｔａをマウスに与えた。次いで、β−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）をマウスに全身的に投与し、３週間後、ＢＬＧ特異的ＩｇＥ及びＩｇＧ１のマウス血清中濃度を測定することによって、ＢＬＧに対する経口免疫寛容の誘導を評価した。
【００６０】
下記の群に従ってマウスを処置した。
Ａ群：  Ｌａｃｐｒｏｄａｎ
Ｂ群：  非糖化Ｐｒｏｌａｃｔａ７５
Ｃ群：  糖化Ｐｒｏｌａｃｔａ７５（ブロック化Ｌｙｓ：１９％）
Ｄ群：  糖化Ｐｒｏｌａｃｔａ７５（ブロック化Ｌｙｓ：３１％）
Ｅ群：  対照（水）
【００６１】
結果を図３に示す。実施例２で示された結果と同様に、ラクトシル化Ｐｒｏｌａｃｔａで寛容化されたマウス（Ｃ群及びＤ群）は、非ラクトシル化Ｐｒｏｌａｃｔａを与えた群又はＬａｃｐｒｏｄａｎを与えた群より良好な、ＢＬＧ特異的ＩｇＥ低応答性を示していることが分かる。図４に示す抗ＢＬＧ  ＩｇＧ１力価は同様のタイプの寛容誘導性の応答を示唆し、Ｃ群及びＤ群の力価は最も低い。
【００６２】
結論として、このデータは、ホエータンパク質のラクトシル化は、非ラクトシル化タンパク質と比較して、特異的な寛容誘導性の低応答性（ＩｇＥ及びＩｇＧ１）を改善させることを示している。
【００６３】
〔実施例５：糖化ホエータンパク質を含有する乳児用調製乳〕
乳児用調製乳の組成を下に示す。
【表３】
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【００６４】
タンパク質源は、実施例３に記載のプロセスにより、ブロック化リジン含有量が１１％になるまで糖化したホエータンパク質濃縮物Ｐｒｏｌａｃｔａ７５である。タンパク質源、炭水化物源及び脂肪源をブレンドすることによって乳児用調製乳を調製する。必要に応じて、このブレンドに乳化剤を含有させてもよい。次いで、逆浸透に供した水を混合して、液体混合物を得る。
【００６５】
約５秒〜約５分間、約８０℃〜約１１０℃の温度まで急速に加熱することにより、液体混合物を熱処理して、細菌負荷を減少させる。次いで、液体混合物を６０℃〜８５℃まで瞬間冷却する。次いで、液体混合物を２段階でホモジナイズする。第１段階では約７ＭＰａ〜約４０ＭＰａ、第２段階では約２ＭＰａ〜約１４ＭＰａで行う。ホモジナイズした混合物をさらに冷却した後、熱に弱いビタミン及びミネラルを加える。ホモジナイズした混合物のｐＨ及び固形成分含有量を、この時点で標準化する。
【００６６】
次いで、ホモジナイズした混合物を噴霧乾燥機に移し、含水量約５重量％未満の粉末に転換する。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ラクトシル化度の異なる種々のホエータンパク質又はβ−ラクトグロブリンを与えた９群のマウスにおける抗β−ラクトグロブリンＩｇＥ低応答性を示すグラフである。
【図２】図１と同じ９群のマウスにおける抗β−ラクトグロブリンＩｇＧ１低応答性を示すグラフである。
【図３】ラクトシル化度の異なる種々のホエータンパク質又はβ−ラクトグロブリンを与えた５群のマウスにおける抗β−ラクトグロブリンＩｇＥ低応答性を示すグラフである。
【図４】図３と同じ５群のマウスにおける抗β−ラクトグロブリンＩｇＧ１低応答性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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