(57)【要約】  本発明は、一般的にはTRAILレセプター結合因子の製造及び前記物質の使用に関する。とりわけ、本発明は、TRAIL-R1及びTRAIL-R2によって共有される共通の抗原決定基（すなわちエピトープ）を認識する抗TRAILレセプター抗体の製造、並びにTRAILレセプターの検出及びTRAILレセプター仲介機能の調節のために前記を使用することに関する。TRAILレセプター結合因子はヒト癌細胞でのアポトーシスの誘導に有用である。これらの標的は、TRAIL-R1又はTRAIL-R2の一方又は両方を発現しえる。本発明は、癌の治療で本発明のTRAILレセプター結合因子の使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
TRAILレセプター1（TRAIL-R1）及びTRAILレセプター2（TRAIL-R2）と結合する抗体であって、低濃度の可溶形にて、TRAIL-R1ポリペプチド又はTRAIL-R2ポリペプチドを発現する癌細胞においてin vivo及びin vitro細胞死誘導活性を有する、前記抗体。
【請求項２】
少なくとも1つの細胞の表面で発現されるTRAILレセプター1（TRAIL-R1）ポリペプチド及びTRAILレセプター2（TRAIL-R2）ポリペプチドと結合する、請求項1に記載の抗体。
【請求項３】
TRAILレセプター1（TRAIL-R1）ポリペプチド及びTRAILレセプター2（TRAIL-R2）ポリペプチドの間で少なくとも約90パーセントのアミノ酸相同性をもつポリペプチド領域と結合する、請求項1に記載の抗体。
【請求項４】
領域が、アミノ酸配列VXDCTPWSDIECVHKE（配列番号:44）（式中XはK又はGである）を含み、TRAIL-R1及びTRAIL-R2レセプターを有する細胞の細胞死を誘導することができる、請求項3に記載の抗体。
【請求項５】
CGMCCアクセッション番号1665を有するマウス-マウスハイブリドーマCTB003によって産生される抗体と同じエピトープ特異性を有する抗体。
【請求項６】
少なくとも重鎖CDR3アミノ酸配列HITMVVGPFA（配列番号:11）又は1つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列を含む、抗体又はその抗原結合フラグメントであって、TRAILレセプター1（TRAIL-R1）及びTRAILレセプター2（TRAIL-R2）と結合し、さらに、TRAIL-R1及びTRAIL-R2を発現する癌細胞においてin vivo及びin vitro細胞死誘導活性を有する、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
癌治療剤と複合体化され、前記治療剤が、好ましくは腫瘍活性化プロドラッグ、放射性核種、化学療法剤及び毒素から成る群から選択される、請求項１から6に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
請求項1から6のいずれか1項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項９】
請求項8に記載の単離核酸を含む宿主細胞又はベクター。
【請求項１０】
請求項１から7のいずれか1項に記載の抗体及び医薬的に許容できる担体を含む組成物。
【請求項１１】
請求項1から7のいずれか1項に記載の抗体を容器中に含む、癌治療用市販用キットであって、癌治療のための化学療法剤及び癌治療用抗体を含み、前記化学療法剤及び癌治療用抗体が場合によって別々の容器に収められる、前記市販用キット。
【請求項１２】
アミノ酸配列VXDCTPWSDIECVHKE（配列番号:44）（式中、XはK又はGである）を含むTRAIL-R1及びTRAIL-R2のエピトープであって、TRAIL-R1及びTRAIL-R2と結合することができ、かつTRAIL-R1及びTRAIL-R2レセプターを有する細胞の細胞死を誘導することができる抗体によって認識される、前記エピトープ。
【請求項１３】
請求項12に記載のエピトープを含む免疫原の調製によって作製される抗体。
【請求項１４】
TRAIL-R1及びTRAIL-R2を発現する癌細胞で選択的に細胞死を誘導することを目的とする医薬の製造における、請求項1から7及び請求項10のいずれか1項に記載の抗体の使用。
【請求項１５】
TRAIL-R1及びTRAIL-R2を発現する癌細胞に対して他の化学療法剤の抗癌活性を強化するための医薬の製造における、請求項1から7及び請求項10のいずれか1項に記載の抗体の使用であって、前記治療薬が化学療法剤であり、前記治療薬が、ブレオマイシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、アクチノマイシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エトポシド、5-フルオロウラシル、フロキシウリジン、メルファラン、メトトレキセート、マイトマイシン、6-メルカプトプリン、パキシリタキセル、テニポシド、6-チオグアニン、ビンクリスチン及びビンブラスチンから成る群から選択される、前記抗体の使用。
【請求項１６】
癌治療用医薬の製造における、請求項1から7及び請求項10のいずれか1項に記載の抗体の医薬的に有効な量の使用であって、前記医薬的に有効な量の抗体が、TRAIL-R1及びTRAIL-R2ポリペプチドを発現する癌細胞の細胞死を選択的に誘導する、前記使用。
【請求項１７】
請求項1から7のいずれか1項に記載の抗体の医薬的に有効な量の医薬としての使用。
【請求項１８】
TRAIL-R1及びTRAIL-R2ポリペプチドを発現する細胞の細胞死をその必要がある対象者で選択的に誘導する方法であって、対象者に請求項1から7のいずれか1項に記載の抗体の有効量を投与し、それによってTRAIL-R1及びTRAIL-R2ポリペプチドを発現する細胞の細胞死を選択的に誘導する工程を含む、前記細胞死を選択的に誘導する方法。
【請求項１９】
TRAIL-R1及びTRAIL-R2ポリペプチドを発現する細胞が癌細胞である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌細胞が、乳癌細胞、肝癌細胞、膵臓癌細胞及び結直腸癌細胞から成る群から選択される、請求項19に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的にはTRAILレセプター結合因子の製造及び前記物質の使用に関する。とりわけ、本発明は、TRAIL-R1及びTRAIL-R2によって共有される共通の抗原決定基（すなわちエピトープ）を認識する抗TRAILレセプター抗体の製造、並びにTRAILレセプターの検出及びTRAILレセプター仲介機能の調節のために前記を使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
TRAILは前世紀の90年代に同定された。TRAILが発見されてまもなく、関心は癌療法のための抗癌剤としての潜在能力に向けられた。これは、選択的に腫瘍細胞を殺し正常細胞は殺さないTRAILの能力によるものであった。重要なことに、TRAILの抗腫瘍効果は従来の多くの癌療法（例えば化学療法及び放射線療法）によって顕著に強化されえる。他方、TRAILは腫瘍細胞を感作して化学療法及び放射線療法に対する腫瘍細胞の感受性を高めることができる。したがって、TRAILと化学療法及び放射線療法との併用は、将来において非常に有効な抗腫瘍療法であると考えられた。
TRAILはTNFタンパク質ファミリーのメンバーである。このファミリーのいくつかのタンパク質（例えばTNF-α及びFasリガンド）の特徴は、アポトーシスを誘導するそれらの能力である。しかしながら、それらの有害な副作用のために、TNF-α及びFasリガンドは臨床的応用については価値がない。対照的に、TRAILは腫瘍細胞の選択的殺傷性を示し、その臨床的価値は明白である。今日までに、TRAILの5つのレセプターが同定され、そのうちの2つ、DR4（TRAIL-R1）及びDR5（TRAIL-R2）はアポトーシスシグナルを伝達することができるが、他の3つ、DcR1（TRAIL-R3）、DcR2（TRAIL-R4）及びオステオプロテゲリン（OPG）はアポトーシスシグナルを伝達しない。TRAILの5つのレセプターはいずれもそれらの細胞外リガンド結合ドメインに顕著な相同性を共有する。DR4及びDR5の両方の細胞内セグメントは保存された機能的ドメイン（いわゆる“デスドメイン（death domain）”を含み、これはアポトーシスシグナル伝達に必要である。
【０００３】
数年の研究の後、TRAILの主要な生物学的機能はよく理解された。TRAILは腫瘍細胞に対する免疫監視において重要な役割を果たす。活性化されたTリンパ球及びNK細胞は高レベルのTRAILを発現し、TRAILはこれらの免疫コンピテント細胞を武装させて腫瘍細胞を殺す。動物実験では、TRAILのノックアウトは加齢とともに腫瘍発生率の増加をもたらすことが示された。したがって、TRAILの不完全又は不十分な発現は腫瘍発生の決定的因子であるかもしれない。
TRAILのアポトーシス誘導機能はそのレセプターによって仲介されるので、TRAILレセプター系に関する研究の数はきわめて多かった。初期の研究は、多くの正常細胞は、TRAILに対するデスレセプター（TRAIL-R1及びTRAIL-2）を転写レベルで発現することができると提唱した。抗デスレセプター抗体の利用可能性により、正常細胞及び組織は非常に低レベルの細胞表面TRAIL-R1及びTRAIL-R2を発現すると考えられてきた。対照的に、正常細胞及び組織は高レベルのTRAIL-R3及びTRAIL-R4を発現することができる。正常細胞における種々のTRAILレセプターのこの弁別的発現は、正常細胞がTRAILによる殺傷から逃れるための決定的な防御メカニズムであるかもしれない。正常細胞と異なり、ほとんどの形質転換腫瘍細胞は高レベルのTRAIL-R1及びTRAIL-R2を発現し、一方、TRAIL-R3及びTRAIL-R4の発現レベルは非常に低い。したがって、ほとんどの腫瘍細胞はTRAIL仲介殺傷に感受性を有する。正常細胞と腫瘍細胞間で弁別的に発現されるTRAILレセプターはTRAILの選択性をよく説明している。
【０００４】
多くの前臨床研究によって、TRAILは、癌治療のための安全で有効な治療薬であることが確認された。三量体化した可溶性TRAILの全身投与は、実験動物では毒性を生じず、なお移植腫瘍の退縮を誘導することができることが示された。TRAILを化学療法又は放射線療法と併用したとき、その抗腫瘍効果は顕著に強化されるということにはまた大いに元気づけられさえする。この相乗効果は、多くのin vitro及びin vivo実験で示された。さらにまた、TRAILは、化学療法及び放射線療法に対する腫瘍細胞の感受性を高めることができる。化学療法及び放射線療法に対する腫瘍細胞の耐性は癌治療における主要な障害であったので、薬剤又は放射線耐性を防止又は逆行させるTRAILの能力は、将来の癌治療における目覚しい進歩でありえよう。
しかしながら、治療薬としてTRAILはいくつかの欠点を有する。第一に、TRAILは、デスレセプター及びおとりレセプターの両方を含む少なくとも5つのレセプターを有し、したがってレセプターに対する選択性を欠く。特に、癌細胞が弁別的デスレセプター及びおとりレセプターを発現するとき、TRAILのアポトーシス誘導能力を予想することは困難である。第二に、組換えTRAILは非常に短いin vivo半減期を有し、このことはin vivoでのTRAILの効果的投与及び抗癌有効性を制限する。患者が通常的にTRAILの反復投与及び大量投与を受けることは不便である。第三に、組換えTRAILのある種の形態は潜在的な肝細胞毒性を有することが懸念される。
治療薬としてのTRAILのこのような限界はTRAILの代替物の開発につながった。モノクローナル抗体はTRAILのデスレセプターを選択的に標的とすることができ、前記は癌治療のより有効で安全な戦法であるかもしれない。
【０００５】
最初のモノクローナル抗体が作製されてから25年の間、モノクローナル抗体は癌治療に大きな衝撃を与えてきた。臨床的に有効なモノクローナル抗体のほとんどは、癌細胞表面で高度に発現される抗原又はレセプターを標的とし、腫瘍増殖に必要な増殖シグナルを阻止する。これらの抗体は、補体の活性化及び抗体依存細胞傷害性（ADCC）により腫瘍細胞を殺す。さらにまた、モノクローナル抗体は追跡分子として用いることができ、放射性同位元素、毒素及び薬剤と複合体化されたときは、これらの治療薬を癌組織に運び抗癌効果を強化することができる。
癌治療のためのTRAILに代わるTRAIL-R1又はTRAIL-R2特異的モノクローナル抗体の作製は成功した。いくつかのそのような抗体が臨床試験下にあった。予備的な結果によれば、これらの抗体は強力な抗癌作用をもつだけでなく、TRAILと比較して安全である。
日本の製薬会社の三共は、抗TRAIL-R2抗体、TRA-8を最初に開発した。Ichikawaらは、Balb/cマウスの免疫に免疫原としてTRAIL-R2-Fc融合タンパク質を用いた。TRA-8は正常細胞ではアポトーシスを誘導しなかったが、多くの主要細胞はTRA-8誘導アポトーシスに高度に感受性であった。TRAIL-R2のmRNAは正常組織に広く分布しているが、TRAIL-R2タンパク質は正常組織（肝臓、肺臓、乳房、腎臓、脾臓、卵巣、心臓及び膵臓を含む）では検出できなかった。しかしながら、これらの組織の癌細胞は高レベルのTRAIL-R2タンパク質を発現した。さらにまた、正常な神経膠細胞及び抹消血液細胞は非常に低レベルのTRAIL-R2を発現し、TRA-8誘導アポトーシスに対して感受性を示さないが、神経膠腫細胞及び白血病細胞は高レベルを発現してTRA-8誘導アポトーシスに非常に感受性である。TRA-8はまた、腫瘍細胞のアポトーシスの誘導においてTRAILよりも数倍強いアポトーシス誘導能力を示す。重要なことには、TRA-8は正常な肝細胞でアポトーシスを誘導しなかった。化学療法又は放射線療法と併用したとき、TRA-8の抗癌効果は顕著に高められる。TRA-8は現在フェーズI臨床試験下にある。
ヒューマンゲノムサイエンス社が抗TRAIL-R1抗体のフェーズI試験を実施した。予備的データによれば、患者は良好な寛容を示し、幾人かの患者で陽性の応答が観察され、抗TRAIL-R1は安全で有効な治療薬であることを示唆された。
腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することができる多くの抗体がTRAIL-R1又はTRAIL-R2のどちらかに特異的である。TRAIL-R1及びTRAIL-R2に対する二重特異性抗体もまた報告されている（Lynch, US2002/0155109）。腫瘍細胞は一タイプデスレセプターのみを選択的に発現することがありえるので、これらの抗体は限定的スペクトルを有し、全ての腫瘍細胞を標的とすることができるわけではない。ところで、癌細胞は2つのタイプのレセプターを弁別的に発現し、好みのシグナル伝達を示すことがあるので、これらの抗体の殺傷活性は大きく変動する。したがって、TRAILレセプター検出及びTRAILレセプター仲介機能の調節のために使用することができるさらに別の抗TRAILレセプター抗体が当分野で希求されている。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、TRAIL-R1及びTRAIL-R2によって共有される共通の抗原決定基（すなわちエピトープ）を認識するTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）の調製、並びにTRAILレセプターの検出及びTRAILレセプター仲介機能の調節のために前記を使用することに関する。ある特徴では、本発明は、TRAILレセプター1（TRAIL-R1）及び／又はTRAILレセプター2（TRAIL-R2）と結合するTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）を提供し、前記TRAILレセプター結合因子（例えば抗体）は、低濃度の可溶形において、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2を発現する癌細胞でin vivo及びin vitro細胞死誘導活性を有する。ある実施態様では、TRAILレセプター結合因子（例えば抗体）は、少なくとも1つの細胞の表面で発現されるポリペプチドTRAILレセプター1（TRAIL-R1）及び／又はTRAILレセプター2（TRAIL-R2）と結合する。ある実施態様では、TRAILレセプター結合因子（例えば抗体）は、TRAILレセプター1（TRAIL-R1）及び／又はTRAILレセプター2（TRAIL-R2）の間の少なくとも約90パーセントのアミノ酸相同性をもつポリペプチド領域と結合する。ある実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）が結合するアミノ酸相同性領域は、アミノ酸配列VXDCTPWSDIECVHKE（配列番号:44）（式中XはK又はGである）を含み、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2レセプターを有する細胞の細胞死を誘導することができる。
別の特徴では、本発明はTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）を提供し、前記は、マウス-マウスハイブリドーマCTB003（CGMCCアクセッション番号1665を有する）によって産生されるものと同じエピトープ特異性を有する。
別の特徴では、本発明は、TRAILレセプター結合因子（例えば抗体）又はその抗原結合フラグメントを提供し、前記は、HITMVVGPFA（配列番号:11）を有する少なくとも重鎖CDR3アミノ酸配列又は1つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列を含み、ここでTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）又はそのフラグメントは、TRAILレセプター1（TRAIL-R1）及び／又はTRAILレセプター2（TRAIL-R2）と結合し、さらに、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2を発現する癌細胞でin vivo及びin vitro細胞死誘導活性を有する。
【０００７】
いくつかの実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）（又はその抗原結合フラグメント）は、癌治療剤と複合体化され、前記治療剤は、好ましくは腫瘍活性化プロドラッグ、放射性核種、化学療法剤及び毒素から成る群から選択される。
別の特徴では、本発明は、本発明のTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）をコードする単離核酸を提供する。
別の特徴では、本発明は、本発明のTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）をコードする単離核酸を含む宿主細胞又はベクターを提供する。
別の特徴では、本発明は、本発明のTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）及び医薬的に許容できる担体を含む組成物を提供する。
別の特徴では、本発明は、本発明のTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）を容器中に含む癌治療用市販キットを提供し、前記市販キットは、さらに癌治療のための化学療法剤及び／又は癌治療用TRAILレセプター結合因子（例えば抗体）を含み、ここで前記化学療法剤及び／又は癌治療用TRAILレセプター結合因子（例えば抗体）は場合によって別々の容器に収められる。
別の特徴では、本発明は、TRAIL-R1及びTRAIL-R2のエピトープを提供し、前記エピトープは、アミノ酸配列VXDCTPWSDIECVHKE（配列番号:44）（式中、XはK又はGである）を含み、さらに前記エピトープは、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2と結合することができ、かつTRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2レセプターを有する細胞の細胞死を誘導することができるTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）によって認識される。ある実施態様では、本発明は、TRAIL-R1及びTRAIL-R2のエピトープを含む免疫原の製造によって作製されるTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）を提供し、前記エピトープは、アミノ酸配列VXDCTPWSDIECVHKE（配列番号:44）（式中、XはK又はGである）を含み、さらに前記エピトープは、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2と結合することができ、かつTRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2レセプターを有する細胞の細胞死を誘導することができるTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）によって認識される。
【０００８】
別の特徴では、本発明は、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2を発現する癌細胞で選択的に細胞死を誘導することを目的とする医薬の製造において、本発明のTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）の使用を提供する。
別の特徴では、本発明は、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2を発現する癌細胞において他の化学療法剤の抗癌活性を強化することを目的とする医薬の製造における、本発明のTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）の使用を提供する。この場合、治療薬は化学療法剤であり、ブレオマイシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、アクチノマイシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エトポシド、5-フルオロウラシル、フロキシウリジン、メルファラン、メトトレキセート、マイトマイシン、6-メルカプトプリン、パキシリタキセル、テニポシド、6-チオグアニン、ビンクリスチン及びビンブラスチンから成る群から選択される。
別の特徴では、本発明は、癌治療を目的とする医薬の製造における、医薬的に有効な量の本発明のTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）の使用を提供する。この場合、医薬的に有効な量のTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）は、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2ポリペプチドを発現する癌細胞の細胞死を選択的に誘導する。
別の特徴では、本発明は、医薬的に有効な量の本発明のTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）の医薬としての使用を提供する。
別の特徴では、本発明は、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2ポリペプチドを発現する細胞の細胞死をその必要がある対象者中で選択的に誘導する方法を提供する。前記方法は、前記対象者に有効量の本発明のTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）を投与し、それによってTRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2ポリペプチドを発現する細胞の細胞死を選択的に誘導する工程を含む。前記方法のある実施態様では、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2ポリペプチドを発現する細胞は癌細胞である。前記方法のある実施態様では、前記癌細胞は、乳癌細胞、肝癌細胞、膵臓癌細胞及び結直腸癌細胞から成る群から選択される。
【０００９】
発明の詳細な説明
概論
本発明の実質的な理解を提供するために、本発明のある種の特徴、方式、実施態様、変型及び特徴物が様々な程度に詳細に下記で記述されることは評価されよう。
本発明は、一般的には、2つのタイプのデスレセプターに同時に結合し、抗腫瘍スペクトル及び活性を強化することができるTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）を提供する。本発明は、TRAIL-R1及びTRAIL-R2に等しく結合し、単一タイプのレセプター及び両タイプのレセプターを発現することができる任意の腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することができる因子を開示する。特に、本発明は、TRAIL-R1及び／又は-R2レセプターの細胞外ドメインに存在するTRAIL-R1及びTRAIL-R2の共通の“エピトープ”（本発明のTRAILレセプター結合因子が結合する）の同定を提供する。このエピトープは、ヒトTRAILのaa218からaa233のアミノ酸残基に広がるドメイン（aa218−aa233；VKDCTPWSDIECVHKE、配列番号:45）又はヒトTRAIL-R2のaa167からaa182のアミノ酸残基に広がるドメイン（aa167−aa182；VGDCTPWSDIECVHKE、配列番号:46）内辺りに存在する。したがって、本発明の種々の特徴は、TRAILレセプター結合因子の製造、発現、及び性状決定に関する。
本発明のTRAILレセプター結合因子は、試験サンプル中でTRAILレセプターポリペプチド（別称、標的ポリペプチド）を検出するためだけでなく、TRAILレセプター仲介機能を調節するためにも、単独であれ併用であれ有用である。TRAILレセプター結合因子は、その必要がある対象者で、TRAILレセプター関連症状の診断、予防及び／又は治療に有用である。本発明のTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）は、抗デスレセプターによる固有の生物学的機能及び幅広い抗癌活性を提供する。可溶性TRAILは腫瘍細胞のアポトーシスのin vivo誘導に有効であることが示されたが、その殺傷活性は非常に短いその半減期のために非常に低いように思われ、大量（及び反復）投与がしばしば要求される。本発明の結合因子は、TRAIL及び他の単一特異性抗TRAIL-R1又はTRAIL-R2抗体と比較して、ヒト癌細胞株を保有する動物で医薬としてより有効である。
本発明の種々の特徴はさらに、本発明のTRAILレセプター結合因子を使用して症状に陥りやすい個体を識別するか、又は薬剤応答性、副作用又は最適な薬剤投与に関して個体を分類する診断方法及びキットに関する。他の特徴では、本発明は、TRAILレセプター結合因子を使用して、TRAILレセプター仲介疾患を予防又は治療するだけでなく、リガンド（例えばTRAILレセプターポリペプチドと結合する小分子）のスクリーニング及び／又は有効性の証明を実施する方法を提供する。したがって、これらの特徴を例示する種々の具体的な実施態様が以下に記載される。
【００１０】
本発明の1つ以上の実施態様の詳細が下記に付随する記述の中で説明される。本明細書に記載するものと類似又は等価の方法及び材料はいずれも、本発明の実施又は試験で用いることができるけれども、好ましい方法及び材料をこれから述べる。本発明の他の特徴物、目的及び利点は本記述及び特許請求の範囲から明白であろう。一般的には、酵素反応及び精製工程は製造業者の指定にしたがって実施される。技術及び方法は一般的には当分野および種々の一般的な参考文献（前記は本明細書を通して提供され、例えば一般的には以下を参照されたい：Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989）で通常的な方法にしたがって実施される。
特段に規定されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本発明が属する分野の業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる、単数形の“a”、“an”及び“the”は、内容が明瞭に別のものを指していない限り複数形を含む。例えば、“a cell”といえば、2つ以上の細胞の組合せが含まれる、云々。一般的には、本明細書で用いられる命名法、並びに下記に記載される細胞培養、分子生物学、有機化学、分析化学及び核酸化学、及びハイブリダイゼーションの実験室的方法はよく知られており、一般的に当分野で用いられている。核酸及びペプチド合成には標準的な技術が用いられる。化学合成及び化学分析には標準的技術及びその改変が用いられる。本明細書に引用した全ての参考文献は、個々の刊行物、特許又は特許出願が具体的に及び個々にその全体が全ての目的のために取り込まれたかのごとくに、引用によりその全体が全ての目的のために本明細書に含まれる。
【００１１】
略語の抜粋：
抜粋された生化学及び血液学用語の略語は下記の表1及び表2にそれぞれまとめられている。
表1：生化学用語抜粋
2009535044.tif 000002
【００１２】
表2：血液学用語抜粋
2009535044.tif 000003
【００１３】
定義：
本明細書で用いられる一定の用語の定義は以下で提供される。その他の用語の定義は以下の文献で見出すことができる：Illustrated Dictionary of Immunology, 2nd Edition, J.M. Cruse and R.E. Lewis Eds., Boca Raton, FL: CRC Press, 1995）。本発明に含まれる、“DR4”及び“TRAIL-R1”、“DR5”及び“TRAIL-R2”という用語は相互に用いることができる。特段の規定がなければ、本明細書で用いられるときは、前記用語はヒトのタンパク質及び遺伝子を指す。
本明細書で用いられる、本発明のTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）、又はTRAILレセプター関連ポリペプチド、又はその抗体フラグメントの“生物学的活性”という用語は、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2と結合することができ、さらに癌細胞においてin vivo及びin vitroの細胞死誘導活性を有する。
本明細書で用いられる、“TRAILレセプター”という用語はTNFレセプターファミリーのメンバーを指す。ヒトTRAILレセプターは、TRAILに対する細胞表面レセプター（AP02リガンド）である。今日までに、TRAILに対する5つのレセプターが同定され、そのうちの2つ、DR4（TRAIL-R1；CD261又はデスレセプター4）及びDR5（TRAIL-R2；CD262又はデスレセプター5）は、アポトーシスシグナルを伝達することができるが、一方、他の3つ、DcR1（TRAIL-R3；CD263又はおとりレセプター1）、DcR2（TRAIL-R4；CD264又はおとりレセプター2）、及びオステオプロテゲリン（OPG）はアポトーシスシグナルを伝達しない。三量体TRAILとTRAIL-R1又はTRAIL-R2との結合は、これらレセプターのオリゴマー化によってアポトーシスを誘導する。TRAIL-R1及びTRAIL-R2は、細胞外システイン富裕ドメイン、トランスメンブレンドメイン及び細胞質デスドメインを含む。TRAIL-R3及びTRAIL-R4もまた、細胞外システイン富裕ドメインを含むが、TRAIL-R3は細胞質デスドメインを欠き、TRAIL-R4は切端ドメインを有する。TRAILに対する5つのレセプターはいずれもそれらの細胞外リガンド結合ドメインに顕著な相同性を共有する。DR4及びDR5の両者の細胞内セグメントは、保存された機能的ドメイン、いわゆる“デスドメイン”を含み、前記はアポトーシスシグナルの伝達に必要である。デスドメインはアポトーシスのシグナル伝達に必要である。
【００１４】
本明細書で用いられるように、対象者への物質又は薬剤の投与は自家投与又は他家投与を含む。記載の症状に対する多様な態様の治療又は予防は、“実質的”な治療又は予防を意味しようとするものであることもまた理解されよう。前記実質的な治療には、完全又は不完全な治療又は予防が含まれ、この場合、何らかの生物学的又は医学的に対応する結果が達成される。
本明細書で用いられる、“アミノ酸”という用語には、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸だけでなく、天然に存在するアミノ酸と類似の態様で機能するアミノ酸類似体及び模倣体が含まれる。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるものだけでなく、後で修飾されるアミノ酸（例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート及びO-ホスホセリン）も含まれる。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基、及びR基と結合するα-炭素を有する化合物（例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。そのような類似体は、改変R基（例えばノルロイシン）又は改変ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸類似体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似の態様で機能する化合物を指す。アミノ酸は、本明細書では、一般的に知られている三文字記号又はIUPAC-IUB生化学命名委員会によって推奨される一文字記号によって記載しえる。同様にヌクレオチドも一般的に許容されている一文字コードによって記載しえる。
本明細書で用いられる、“抗体”という用語は、免疫グロブリン遺伝子由来のフレームワーク領域を含むポリペプチド、又は特異的に抗原（例えばTRAILレセプターポリペプチド）と結合し前記を認識するそのフラグメントを意味する。抗体という用語の使用は、全抗体（単鎖の全抗体を含む）及びその抗原結合フラグメントを含むことを意味する。“抗体”という用語は、二重特異性抗体及び多重特異性抗体をそれらが所望の生物学的活性又は機能を示す限り含む。
【００１５】
本明細書で用いられる、“抗体関連ポリペプチド”という用語は、単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントを意味し、前記は、可変領域のみを含むか、又は以下のポリペプチド成分（抗体のヒンジ領域、CH1、CH2及びCH3ドメイン）の全て若しくは部分と併せて含むことができる。本発明に含まれるものはまた、可変領域並びにヒンジ領域、CH1、CH2及びCH3ドメインの任意の組合せである。本発明の結合因子として有用な抗体関連分子には、Fab、Fab'及びF(ab')2、Fd、単鎖Fvs（scFv）、単鎖抗体、ジスルフィド連結Fvs（sdFv）及びVL又はVHドメインのどちらかを含むフラグメントが含まれるが、ただしこれらに限定されない。例には以下が含まれる：（i）Fabフラグメントであって、VL、VH、CL及びCH1ドメインから成る一価のフラグメント；（ii）F(ab')2フラグメントであって、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFabフラグメントを含む二価フラグメント；（iii）VH及びCH1ドメインから成るFdフラグメント；（iv）抗体の単腕のVL又はVHドメインから成るFvフラグメント；（v）dAbフラグメント（Ward et al. Nature (1989) 341:544-546）、前記はVHドメインから成る；及び（vi）単離された相補性決定領域（CDR）。したがって、そのような“抗体フラグメント”は完全長の抗体の部分、一般的にはその抗原結合又は可変領域を含むことができる。抗体フラグメントの例には、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvフラグメント；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体フラグメントから構成されるマルチ特異的抗体が含まれる。単鎖抗体分子は、多数の個々の分子をもつポリマー（例えばダイマー、トリマー又は他のポリマー）を含むことができる。
本明細書で用いられる、“生物学的サンプル”という用語は、生細胞に由来するか、又は生細胞と接触するサンプル物質を意味する。“生物学的サンプル”という用語は、対象者から単離された組織、細胞、及び生物学的液体だけでなく、対象者の内部に存在する組織、細胞及び液体を含むことが意図される。本発明の生物学的サンプルには、全血、血漿、精液、唾液、涙液、尿、糞便物質、汗、頬部、皮膚、脳脊髄の液、及び毛髪が含まれるが、ただしこれらに限定されない。生物学的サンプルはまた、内部器官の生検又は癌から入手することができる。生物学的サンプルは診断又は研究のために対象者から入手することができ、又はコントロール若しくは基礎的研究として病気でない個体から入手することもできる。
本明細書で用いられる、“CDR移植抗体”という用語は、“アクセプター”抗体の少なくとも1つのCDRが、所望の抗原特異性を保有する“ドナー”抗体由来のCDR“移植物”によって置き換えられている抗体を意味する。
【００１６】
本明細書で用いられる、“キメラ抗体”という用語は、1つの種に由来するモノクローナル抗体のFc定常領域（例えばマウスのFc定常領域）が、組換えDNA技術を用いて、別の種の抗体由来のFc定常領域（例えばヒトFc定常領域）で置き換えられる抗体を意味する。一般的には以下を参照されたい：Robinson et al., PCT/US86/02269；Akira et al. 欧州特許出願184,187号；Taniguchi, 欧州特許出願171,496号；Morrison et al. 欧州特許出願173,494号；Neuberger et al. WO86/01533；Cabilly et al. 米国特許4,816,567号；Cabilly et al. 欧州特許出願125,023号；Better et al. Science 1988, 240:1041-1043；Liu et al. Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84:3439-3443；Liu et al. J Immunol 1987, 139:3521-3526；Sun et al. Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84:214-218；Nishimura et al. Cancer Res 1987, 47:999-1005；Wood et al. Nature 1885, 314:446-449；及びShaw et al. J Natl Cancer Inst 1988, 80:1553-1559。
本明細書で用いられる、“比較ウィンドウ”という用語は、20から600、通常は約50から約200、より通常は約100から約150のアミノ酸又はヌクレオチドから成る群から選択される連続する任意の数の位置を含む領域であって、2つの配列で最適アラインメントを実施した後である配列を同じ数の連続する位置の参照配列と比較することができる、任意の数の位置を含む領域を意味する。
本明細書で用いられる、“コンセンサスFR”という用語は、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク抗体を意味する。抗体のFR領域は抗原と接触しない。
本明細書で用いられる、“コンセンサス配列”という用語は、関連配列ファミリーにおいてもっとも頻繁に出現するアミノ酸（又はヌクレオチド）から構成される配列を指す（例えば以下を参照されたい：Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)）。すなわち、タンパク質ファミリーでは、コンセンサス配列の各位置は前記ファミリーの当該位置にもっとも頻繁に出現するアミノ酸によって占められる。2つのアミノ酸が等しく頻繁に出現する場合は、いずれもコンセンサス配列に含むことができる。
【００１７】
本明細書で用いられる、“接触される”という用語は、細胞に適用されるときは、本発明のTRAILレセプター結合因子、抗体、抗体組成物、細胞傷害性物質又は部分、遺伝子、タンパク質及び／又はアンチセンス配列が標的細胞にデリバーされるか、又は標的細胞と直接接した状態に置かれるプロセスを指す。このデリバリーはin vitroでもin vivoでもよく、組換えベクター系の使用を含むことができる。
本明細書で用いられる、“細胞傷害性部分”は、細胞に接近するか又は細胞に吸収されたときに細胞の増殖を阻害するか、又は細胞死を促進する部分を意味する。これに関して適切な細胞傷害性部分には、放射性物質若しくは同位元素（放射性核種）、毒性化学物質（例えば分化誘導剤、阻害剤及び小型の毒性化学薬品）、毒素タンパク質及びその誘導体とともにヌクレオチド配列（又はそれらのアンチセンス配列）が含まれる。したがって、細胞傷害性部分は、非限定的な例として化学療法剤、光活性化毒素又は放射性物質である。
本明細書で用いられる、“ダイアボディ”は、2つの抗原結合部位を有する小型の抗体フラグメントを指す。前記フラグメントは、同じポリペプチド鎖（VHVL）内で軽鎖可変ドメイン（VL）に連結された重鎖可変ドメイン（VH）を含む。あまりに短いために同じ鎖上の2つのドメイン間で対を形成させないリンカーを使用することによって、これらのドメインは別の鎖の相補的ドメインと対を形成することを余儀なくされ、2つの抗原結合部位を生じる。ダイアボディは例えば以下でより詳細に記載されている：EP404,097；WO93/11161；及び30 Hollinger et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90:6444-64448。
本明細書で用いられる、“エフェクター細胞”という用語は、免疫応答の認識及び活性化期とは反対に、免疫応答のエフェクター期に必要とされる免疫細胞を意味する。例示的免疫細胞には、骨髄球又は類リンパ球起源の細胞、例えばリンパ球（例えばB細胞及び細胞溶解性T細胞（CTL）を含むT細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、マスト細胞及び好塩基球が含まれる。エフェクター細胞は、特異的Fcレセプターを発現し、特異的免疫機能を発揮する。エフェクター細胞は抗体依存細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を誘導することができる。例えば好中球はADCCを誘導することができる。例えば、FcαRを発現する単球、マクロファージ、好中球、好酸球及びリンパ球は、標的細胞の特異的殺傷に中心的に関与し、さらに免疫系の他の成分に対して抗原を提示し又は抗原提示細胞と結合する。エフェクター細胞はまた標的抗原、標的細胞、転移癌細胞又は微生物に対し食作用を示すことができる。
【００１８】
本明細書で用いられる、“エピトープ”という用語は、抗体と特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常は、分子、例えばアミノ酸又は糖側鎖の化学的に活性な表面型から成り、通常は特異的な三次元の構造的特徴とともに特異的な荷電的特徴を有する。立体エピトープ及び非立体エピトープは、前者との結合は変性溶媒の存在下で失われるが、後者との結合では失われないという点で区別される。ある実施態様では、TRAIL-R1及びTRAIL-R2の“エピトープ”は、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2レセプターの細胞外ドメイン中の共通領域であり、前記と本発明のTRAILレセプター結合因子が結合する。本発明のある実施態様では、このエピトープは、配列番号:45のTRAIL-R1のaa218からaa233のアミノ酸残基に広がるドメイン、又は配列番号:46のTRAIL-R2のaa167からaa182のアミノ酸残基に広がるドメイン辺りに存在する。
エピトープと結合するTRAILレセプター結合因子をスクリーニングするために、日常的な架橋阻止アッセイ（例えば以下に記載されているアッセイ：Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)）を実施することができる。このアッセイを用いて、試験TRAILレセプター結合因子が本発明のTRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2抗体と同じ部位又はエピトープに結合するか否かを決定することができる。前記とまた別に、或いは前記に加えて、当分野で公知の方法によってエピトープマッピングを実施することができる。例えば、抗体配列に、例えばアラニンスキャンニングによって変異を導入し、接触残基を同定することができる。別個の方法では、TRAIL-R1及びTRAIL-R2の種々の領域に対応するペプチドを、複数の若しくは1つの試験抗体との競合アッセイで又は性状が判明した若しくは既知のエピトープをもつ抗体との競合アッセイで用いることができる。
本明細書で用いられる、ある組成物の“有効量”又は“医薬的に有効な量”又は“治療的に有効な量”は、所望の治療効果及び／又は予防効果を達成するために十分な量、例えば治療される疾患、例えば標的ポリペプチド関連疾患に付随する症状の予防又は緩和をもたらす量である。対象者に投与される本発明の組成物の量は、疾患のタイプ及び重篤度、並びに個体の特徴、例えば一般的健康状態、年齢、性別、体重及び薬剤耐性に左右される。前記はまた、疾患の程度、重篤度及びタイプにも左右される。当業者は、これらの因子及び他の因子にしたがって適切な用量を決定することができるであろう。本発明の組成物はまた、互いに組み合わせて、又は1つ以上の別の治療用化合物と組み合わせて投与することができる（例えば、本発明のマルチ特異的TRAILレセプター結合因子を1つ以上の単一特異性TRAILレセプター結合因子と組み合わせて用いることができる）。
【００１９】
本明細書で用いられる、“発現”には以下の1つ以上が含まれる（但しこれらに限定されない）：遺伝子の前駆体mRNAへの転写；成熟mRNAを生成するための前駆体mRNAのスプライシング及び他のプロセシング；mRNA安定化；成熟mRNAのタンパク質への翻訳（コドン使用頻度及びtRNA利用可能性を含む）；及びグリコシル化及び／又は適切な発現及び機能のために要求される場合には翻訳生成物の他の改変。
本明細書で用いられる、“融合ポリペプチド”は、TRAILレセプターポリペプチドと実質的に相同でないポリペプチド（例えばTRAILレセプターポリペプチドと異なる、同じ生物又は異なる生物に由来するポリペプチド）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドと機能的に連結されたTRAILレセプターポリペプチドを含む。
本明細書で用いられる、“遺伝子”という用語は、調節されたRNA生成物の生合成に必要な全情報（プロモーター、エクソン、イントロン及び発現を制御する他の非翻訳領域を含む）を含むDNA断片を意味する。
本明細書で用いられる、“遺伝子型”という用語は、個体の1対の相同染色体上の遺伝子座の1つ以上の多型性部位又は変異部位で見出されるヌクレオチド対の5'から3'方向の未調整（unphased）配列を意味する。本明細書で用いられる、遺伝子型には完全遺伝子型及び部分遺伝子型が含まれる。
本明細書で用いられる、“ヒト配列抗体”という用語には、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び（存在する場合には）定常領域を有する抗体が含まれる。本発明のヒト配列抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含むことができる（例えばin vitroでのランダム変異導入若しくは位置特異的変異導入、又はin vivoでの体細胞変異によって導入された変異）。そのような抗体は、非ヒトトランスジェニック動物で、例えばPCT公開公報WO01/14424及びWO00/37504に記載されたように、作製することができる。しかしながら、本明細書で用いられる、“ヒト配列抗体”という用語は、別の哺乳動物種（例えばマウス）の生殖細胞由来のCDR配列がヒトのフレームワーク配列に移植された抗体（例えばヒト化抗体）を含むことは意図されない。
【００２０】
本明細書で用いられる、非ヒト（例えばマウス）抗体の“ヒト化”形態という用語は、最少の非ヒト免疫グロブリン由来配列を含むキメラ抗体である。大半の部分について、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリンであり、前記ではレシピエントの超可変領域残基は、ヒトでない種（例えばマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類）由来の超可変領域残基であって所望の特異性、親和性及び性能を有するもの（ドナー抗体）によって置き換えられている。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域（FR）残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられる。さらにまた、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含むことができる。これらの改変は抗体性能（例えば結合親和性）をさらに改善するために実施される。一般的には、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、前記ヒト化抗体では、超可変ループの全部又は実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンに一致し、さらにFR領域の全部又は実質的に全部がヒト免疫グロブリン配列のものであるが、ただし前記FR領域は結合親和性を改善する1つ以上のアミノ酸置換を含むことができる。FRにおけるこれらのアミノ酸置換の数は、典型的にはH鎖では6個を超えず、L鎖では3個を超えない。ヒト化抗体はまた場合によって、免疫グロブリン定常領域（Fc）、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも部分を含むであろう。さらに詳しいことについては以下を参照されたい：Jones et al. Nature 1986, 321:522-525；Reichmann et al. Nature 1988, 332:323-329；及びPresta, Curr Op Struct Biol 1992, 2:593-596。本明細書に記載のTRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2結合抗体の“アミノ酸配列改変”も意図されている。例えば、前記抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性の改善を所望することができる。TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2結合抗体アミノ酸配列変種は、適切なヌクレオチド変化を抗体核酸に導入することにより、又はペプチド合成によって調製される。そのような改変には、例えばTRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2結合抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は前記配列内への残基の挿入、及び／又は前記配列内の残基の置換が含まれる。得られた抗体が所望の特性を保有する限り、任意の欠失、挿入及び置換を組み合わせて問題の抗体を入手することができる。改変にはまたタンパク質のグリコシル化パターの変更が含まれる。変異導入のための好ましい位置を決定する有用な方法は“アラニンスキャンニング変異導入”と称され。前記はCunningham and Wellsが記載した（Science, 1989, 244:1081-1085）。続いて変異抗体を所望の活性についてスクリーニングする。本発明は、CGMCCのアクセッション番号1665を有するハイブリドーマCTB003によって規定されるアミノ酸配列で1つ以上のアミノ酸付加、欠失及び／又は置換を有する変種を含むが、ただし前記抗体は所望の特性を有することを条件とする。
【００２１】
本明細書で用いられる、“超可変領域”という用語は、抗原結合に必要な抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般的には以下を含む：“相補性決定領域”又は“CDR” に由来する残基、例えば、VL中の残基約24−24辺り（L1）、約50−56辺り（L2）及び約89−97辺り（L3）、並びにVH中の残基約31−35B辺り（H1）、約50−65辺り（H2）及び約95−102辺り（H3）（Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Healtg Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1991）及び／又は“超可変ループ”に由来する残基、例えばVL中の残基26−32（L1）、50−52（L2）及び91−96（L3）、並びにVH中の残基約26−32（H1）、約52A−55（H2）及び約96−101（H3）（Chotjia and Lesk, J Mol Biol 196:901-917, 1987）。
本明細書で用いられる、“同一性”又はパーセント“同一性”という用語は、2つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関して用いられるときは、BLAST又はBLAST2.0配列比較アルゴリズムを下記に記載のデフォルトパラメーターにより測定するか、又は手動アラインメント及び目視精査によって測定したとき、同じであるか又は明記されたパーセンテージのアミノ酸残基若しくはヌクレオチドが同じである（すなわち、明記された領域（例えば本明細書に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列又は本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列）にわたって、比較ウィンドウ又は指定の領域について最大一致を求めて比較及びアラインメントを実施したとき、約60％同一、好ましくは65％、70％、75％、80％、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれより高い同一性を有する）2つ以上の配列又は部分配列を指す（例えばNCBIウェブサイトを参照されたい）。そのような配列は“実質的に同一”であると称される。この用語はまた、試験配列のコンプリメント（compliment）を指し、又は試験配列のコンプリメントに適用することができる。この用語はまた、欠失及び／又は付加を有する配列だけでなく置換を有する配列も含む。下記に記載するように、好ましいアルゴリズムはギャップなどの理由を説明することができる。好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約25アミノ酸若しくはヌクレオチドにわたって、又は好ましくは長さが50−100アミノ酸若しくはヌクレオチドの領域にわたって存在する。
【００２２】
“単離された”若しくは“精製された”ポリペプチド又はその生物学的に活性な部分は、実質的に細胞性物質又はTRAILレセプター結合因子が誘導されたその他の細胞若しくは組織由来夾雑ポリペプチドを実質的に含まないか、又は化学的に合成されたときには化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。例えば、単離されたTRAILレセプター結合因子（前記は抗TRAILレセプター抗体である）は、前記物質の診断又は治療的使用に干渉する物質を含まないであろう。そのような干渉物質には酵素、ホルモン、並びに他のタンパク質性及び非タンパク質性溶解質が含まれえる。
本明細書で用いられる、“細胞死を誘導する”又は“細胞死を誘導することができる”という語句は、本発明のTRAILレセプター結合因子が生細胞を非生細胞にすることができる能力を指す。細胞死及び細胞生存率は、当分野の種々の方法、例えばトリパンブルー排除アッセイ及び他の細胞生存率アッセイによって決定することができる。本発明では、細胞死は、特に“アポトーシス”（又は“プログラムされた細胞死”と称される）によって誘導され、前記は、アネキシンVの結合、DNA断片化、細胞収縮、小胞体の膨張、細胞の断片化及び／又は膜小胞（アポトーシス小体と称される）によって決定される。種々の方法を利用してアポトーシスに付随する細胞性事象が判定される。例えば、ホスファチジルトランスフェリン（PS）の転移はアネキシン結合によって測定され、DNA断片化はDNAラダー形成により判定され、DNA断片化を伴う核／クロマチン凝縮は二倍体未満の細胞での任意の増加によって判定することができる。標的細胞は、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2を発現する細胞であり、好ましくは前記細胞は腫瘍細胞、例えば乳房、結腸、卵巣、胃、内膜、内皮、肝臓、脳、唾液腺、肺臓、腎臓、甲状腺、膵臓又は膀胱の細胞である。
【００２３】
本明細書で用いられる、“完全な抗体”という用語は、ジスルフィド結合によって連結された少なくとも2つの重（H）鎖ポリペプチド及び2つの軽（L）鎖ポリペプチドを有する抗体を意味する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではHCVR又はVHと略される）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は3つのドメインCH1、CH2及びCH3を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではLCVR又はVLと略される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は1つのドメインCLを含む。VH及びVL領域はさらに超可変性の領域（相補性決定領域（CDR）と称され、より保存されたフレームワーク領域（FR）と呼ばれる領域に点在する）に細別されえる。各VH及びVL領域は3つのCDR及び4つのFRを含み、それらはアミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序で配置されている：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、宿主組織又は因子（免疫系の種々の細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第一の成分（C1q）を含む）と免疫グロブリンの結合を仲介する。
本明細書で用いられる、“免疫応答”という用語は、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、及び上記細胞又は肝臓によって生成される可溶性マクロ分子（抗体、サイトカイン及び補体を含む）の協調的作用を指し、前記は、癌細胞、転移性腫瘍細胞、悪性メラノーマ、侵入病原体、病原体感染細胞若しくは組織、又は自己免疫若しくは病的炎症の場合には健常人の細胞又は組織の選択的損傷、破壊、又は身体からの排除をもたらす。
本明細書で用いられる、“免疫学的交差反応性”及び“免疫学的反応性”という用語は同じ抗原を用いて作製されるか（“免疫学的に反応性”）又は異なる抗原を用いて作製された（“免疫学的に交差反応性”）抗体と特異的に反応する抗原を指すために相互に用いられる。一般的には、抗原はTRAILレセプターポリペプチド、その変種又は部分配列である。
本明細書で用いられる、“免疫学的に反応する状態”という用語は、特定の抗原エピトープに対して作製された抗体に当該エピトープと、前記エピトープが実質的に他の全てのエピトープと結合するよりも容易に検出できるほど強く（一般的にはバックグラウンド結合よりも少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドよりも少なくとも5倍）結合し得る状態を意味する。免疫学的に反応する状態は抗体結合反応様式に左右され、典型的には免疫アッセイプロトコルで用いられるものである。免疫アッセイ様式及び状態の記述については以下の文献を参照されたい：Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988)。
【００２４】
本明細書で用いられる、“リンパ球”という用語は、血液、リンパ液及び類リンパ組織で見出される単核の非食細胞性白血球のいずれか、例えばB及びTリンパ球を意味する。
本明細書で用いられる、“症状”には、治療又は予防が所望される1つ以上の身体的及び／又は精神的状態として発現される任意の状態又は疾患が含まれ（ただしこれらに限定されない）、以前に又は新規に認定された疾患及び他の異常が含まれる。
本明細書で用いられる、“調節物質”には阻害剤及び活性化物質が含まれる。阻害剤は、例えばTRAILレセプターポリペプチドと結合し、前記の活性を部分的若しくは全体的に刺激し、低下させ、妨げ、遅らせ、不活化し、脱感作させるか又はダウンレギュレートする物質であり、例えばアンタゴニストである。活性化物質は、例えばTRAILレセプターポリペプチドと結合し、刺激し、増加させ、開放し、活性化し、促進し、活性を強化させ、感作させるか又はアップレギュレートする物質であり、例えばアゴニストである。調節物質には、例えばTRAILレセプターポリペプチドと、活性化物質若しくは阻害物質と結合するタンパク質、レセプターとの相互作用を変化させる物質が含まれる。前記は、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、多糖類又は上記の組合せ（例えばリポタンパク質、糖タンパク質など）を含む。調節物質には遺伝的に改変された（例えば改変された活性を有する）天然に存在するTRAILレセプターポリペプチドとともに、天然に存在するリガンド及び合成リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、小型の化学分子などが含まれる。
【００２５】
本明細書で用いられる、“モノクローナル抗体”という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す（すなわち集団を構成する個々の抗体が、微量で存在しえる天然に存在する可能性がある変異を除いて同一である）。例えば、モノクローナル抗体は単一クローン（任意の真核細胞、原核細胞又はファージクローン）に由来しえるが、それを作製する方法に依存する抗体ではない。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一結合特異性及び親和性を示す。モノクローナル抗体は高度に特異的で、単一の抗原性部位に対して誘導される。さらにまた、典型的には種々の決定基（エピトープ）に対して誘導された種々の抗体を含む通常の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体の各々は抗原のただ1つの決定基に向けられている。限定語の“モノクローナル”は、抗体の特徴を実質的に均質な抗体集団から得られたものと表示し、いずれか特定の方法によって抗体を作製することが要求されると解してはならない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え体及びファージディスプレー技術を含む（ただしこれらに限定されない）、当分野で公知の多様な技術を用いて調製することができる。例えば、本発明で用いられるモノクローナル抗体は、Koehlerら（Nature, 1975, 256:495）が最初に記載したハイブリドーマ法によって、又は組換えDNA法によって（たとえば米国特許4,816,567号）作製することができる。“モノクローナル抗体”はまた、例えば文献に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することができる（Clackson et al. Nature, 1991, 352:624-628；及びMarks et al. J Mol Biol 1991, 222:581-597）。
本明細書で用いられる、“中和抗体”という用語は、TRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドの少なくとも1つの生物学的機能を除去又は有意に低下させることができる抗体を意味する。
本明細書で用いられる、“医薬的に許容できる担体”という用語は、医薬としての投与に適合しえる、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌及び抗カビ化合物、等張化合物及び吸収遅延化合物など含むことが意図される。
本明細書で用いられる、“ポリクローナル抗体”という用語は、少なくとも2つの異なる抗体産生株に由来する抗体調製物を意味する。この用語の使用は、抗原の種々のエピトープ又は領域と特異的に結合する抗体を含む少なくとも2つの抗体の調製物を含む。
【００２６】
本明細書で用いられる、“ポリヌクレオチド”という用語は任意のRNA又はDNAを意味し、前記は未改変のものでも又は改変されたRNA若しくはDNAでもよい。ポリヌクレオチドには、一本鎖及び二本鎖DNA、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖及び二本鎖RNA、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるRNA、並びにDNA及びRNAを含むハイブリッド分子（前記DNA及びRNAは一本鎖、より典型的には二本鎖又は一本鎖及び二本鎖領域の混合物でありえる）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。さらにまた、ポリヌクレオチドは、RNA又はDNA又はRNAとDNAの両方を含む3本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語にはまた、1つ以上の改変塩基を含むDNA又はRNA及び安定性又は他の理由のために改変骨格を有するDNA又はRNAが含まれる。具体的な実施態様では、ポリヌクレオチドはTRAILレセプター遺伝子に由来するポリヌクレオチド配列を含む。
本明細書で用いられる、“ポリペプチド”、“ペプチド”及び“タンパク質”という用語は、ペプチド結合又は改変ペプチド結合（すなわちペプチドイソステア（ペプチド同配体））によって互いに結合された2つ以上のアミノ酸を含むポリマーを意味するために本明細書では相互に用いられる。ポリペプチドは、一般的にはペプチド、糖ペプチド又はオリゴマーと称される短い鎖及び一般的にはタンパク質と称される長い鎖の両方を指す。ポリペプチドは、20の遺伝子によってコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を含むことができる。ポリペプチドは、天然のプロセス（例えば翻訳後プロセシング）によって、又は当分野でよく知られた化学的改変技術によって改変されたアミノ酸配列が含まれる。そのような改変については基礎的な教本及びより詳細な専門論文だけでなく多数の研究論文にも記載されている。特定の実施態様では、ポリペプチドは、TRAILレセプタータンパク質由来のポリペプチド配列を含む。
【００２７】
本明細書で用いられる、“組換え体”という用語は、細胞又は核酸、タンパク質若しくはベクターに関連して用いられるときは、前記細胞、核酸、タンパク質又はベクターが、異種核酸若しくはタンパク質の導入、又は天然の核酸若しくはタンパク質の変異によって改変されたことを示すか、又は前記物質がそのように改変された細胞に由来していることを示す。したがって、例えば組換え細胞は、天然の（非組換え）型細胞内で見出されない遺伝子を発現するか、又は天然の遺伝子を発現するがまた別な異常な態様で発現するか、発現が低いか又は全く発現しない。
本明細書で用いられる、“サルベージレセプター結合エピトープ”という語句は、IgG分子（例えばIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4）のFc領域のエピトープ（前記はIgG分子のin vivo血中半減期の増加に必要である）を指す。抗体の血中半減期の増加のためには、例えば米国特許5,739,277号に記載されたように、サルベージレセプター結合エピトープを抗体（特に抗体フラグメント）に取り込むことができる。
本明細書で用いられる、“単鎖抗体”又は“単鎖Fv（scFv）”という用語は、Fvフラグメントの2つのドメイン、VL及びVHの抗体融合分子を指す。Fvフラグメントの2つのドメイン、VL及びVHは別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え技術を用いて結合させるか、VL及びVH領域対が一価分子を形成する単一タンパク質鎖にすることができる合成リンカーによってそれらを結合させることができる。例えば以下の文献を参照されたい：Bird et al. Science 1988, 242:423-426；及びHuston et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85:5879-5883。そのような単鎖抗体は、“抗体”フラグメントに関連して含まれ、組換え技術又は完全な抗体の酵素的若しくは化学的切断によって調製することができる。
本明細書で用いられる、“小分子”という用語は、約5kDa未満、より好ましくは約2kDa未満の分子量を有する組成物を意味する。小分子は、例えば核酸、ペプチド、ポリペプチド、糖ペプチド、ペプチド模倣体、炭水化物、脂質、リポ多糖類、前記の組合せ、又は他の有機若しくは無機分子でありえる。
【００２８】
本明細書で用いられる、“特異的結合”という用語は、少なくとも10-6Mの結合親和性によるTRAILレセプター結合因子と抗原との接触を意味する。好ましい結合因子は、少なくとも約10-7M、好ましくは10-8Mから10-9M、10-10M、10-11M又は10-12Mの親和性で結合する。
本明細書で用いられる、“ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”という語句は、その条件下では、典型的には核酸の複合混合物中でプローブがその標的配列とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる条件下では異なるであろう。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの重点的なガイダンスは以下で見出されるであろう：Tijessen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993)。一般的には、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度、pHで個々の配列についての融解温度（Tm）よりも約5−10℃低くあるように選択される。Tmは、規定のイオン強度、pH及び核酸濃度下で、標的と相補的なプローブの50％が標的配列と平衡状態でハイブリダイズする温度である（標的配列は過剰に存在するので、Tmでは、プローブの50％が平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件はまた、脱安定化剤（例えばホルムアミド）の添加により達成することもできる。選択的又は特異的ハイブリダイゼーションのために、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドの10倍のハイブリダイゼーションである。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下のとおりでありえる：50％ホルムアミド、5ｘSSC、及び1％SDS、42℃でインキュベート、又は5ｘSSC、1％SDS、65℃でインキュベートして0.2ｘSSC及び0.1％SDSにて65℃で洗浄。
本明細書で用いられる、“対象者”という用語は、好ましくは前記対象者が哺乳動物（例えばヒト）であることを意味するが、また動物（例えばイヌ、ネコなど）、農場動物（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）及び実験動物（例えばサル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）でもよい。
本明細書で用いられる、“置換”という用語は、当分野で一般的に用いられる変異の1つである。置換変種では、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2結合抗体分子中の少なくとも1つのアミノ酸残基が別個の分子によって置換されている。置換変異導入の最も重要な部位は超可変領域を含むが、FR変異もまた意図される。“保存的置換”は、下記の表に“好ましい置換”の表題の下で示されている。そのような置換が生物学的活性に変化を生じさせる場合は、より実質的な変化が導入され、生成物をスクリーニングすることができる（前記は、表3で“例示的置換”と称され、又はアミノ酸クラスに関して下記でさらに記述する）。
【００２９】
表3：アミノ酸置換
2009535044.tif 000004
【００３０】
置換変種の特に好ましいタイプは、親抗体の1つ以上の超可変領域残基を置換することを必要とする。そのような置換変種の便利な作成方法は、ファージディスプレーを用いるアフィニティマチュレーションを含む。特に、いくつかの超可変領域部位（例えば6−7部位）を成熟させて、各部位で可能な全てのアミノ酸置換を作製する。このようにして作製された抗体変種は、各粒子内にパッケージされたM13の遺伝子III生成物との融合物として繊維状ファージ粒子から一価の態様でディスプレーされる。続いて、このファージディスプレー変種を、それらの生物学的活性（例えば結合親和性）について本明細書に開示するようにスクリーニングする。改変のための候補超可変領域部位を決定するために、アラニンスキャンニング変異導入を実施して、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2レセプターとの抗原結合に顕著に寄与する超可変領域残基を決定することができる。前記とまた別に、或いは前記に加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を解析して、抗体とTRAIL-R1及び／又は-R2レセプターとの間の接触点を決定するのも有益であろう。そのような接触残基及び近隣残基は、本明細書の巧緻な技術による置換の候補である。いったんそのような変種を作製したら、この変種パネルを本明細書に記載するようにスクリーニングに付し、さらに、1つ以上の関連アッセイで類似の又は優れた特性を有する抗体を更なる改良のために選別することができる。本発明は、CGMCCアクセッション番号1665を有するハイブリドーマCTB003によって規定される免疫グロブリン重鎖又は軽鎖の超可変ドメインに対して1つ以上のアミノ酸置換、特に保存的置換を有する抗体を含むが、ただし前記抗体変種は所望の特性を保有することを条件とする。
本明細書で用いられる、“標的細胞”という用語は、本発明のTRAILレセプター結合因子が標的とすることができる対象者（例えば人間又は動物）の任意の細胞を意味する。
本明細書で用いられる、“治療剤”という用語は、有効量で存在するとき、その必要がある対象者で所望の治療効果を生じる化合物を意味することが意図される。
【００３１】
本明細書で用いられる、“治療する”若しくは “治療” 又は“緩和”は、治療的処置及び予防的若しくは防止的処置の両方を指し、この場合、目的は標的の病的状態又は異常の防止又は減速（緩和）である。対象者は、本発明の方法に従って本発明のTRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2結合抗体の治療量を投与された後、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2を発現する癌について成功裡に“治療”され、対象者は、個々の疾患の1つ以上の徴候及び症状で認識可能な及び／又は測定可能な低下又は消失を示す。例えば、癌については、癌細胞の数の減少又は癌細胞の消失；腫瘍サイズの減少；腫瘍転移の抑制（すなわちある程度の減速及び好ましくは停止）；腫瘍増殖のある程度の抑制；緩解期間の延長、及び／又は特定の癌に付随する症状の1つ以上のある程度の免荷；罹患率及び死亡率の減少、並びに生活の質の改善を示す。
本明細書で用いられる、“可変”という用語は、抗体間で可変ドメインの一定セグメントの配列が広範囲に異なるという事実を指す。Vドメインは抗原結合を仲介し、個々の抗体のその個々の抗原に対する特異性を規定する。しかしながら、可変性は、可変ドメインのアミノ酸全体に均等には分布しない。そうではなく、V領域は、“超可変領域”と称される各々9−12アミノ酸の長さを有する甚だしく可変性の短い領域によって分断される15−30アミノ酸のフレームワーク（FR）と称される比較的不変の連続部分から成る。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、主としてβ-シート構造をとり、3つの超可変領域よって連結される4つのFRを含む。FRはβ-シート構造を連結し、いくつかの事例ではβ-シート構造の一部分を構成する。各鎖の超可変領域はFRによって極めて接近した状態で一緒に保持され、他の鎖の超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（例えば以下を参照されたい：（Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Healtg Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1991）。定常ドメインは、抗体と抗原との結合には直接的には関与しないが、例えば抗体依存細胞性細胞傷害（ADCC）における抗体の参画のような種々のエフェクター機能を示す。
【００３２】
本発明の組成物
本発明のTRAILレセプター結合因子：
ある特徴では、本発明は、TRAILレセプター結合因子組成物（別称、結合因子）を提供する。ある実施態様では、本発明の結合因子は、TRAILレセプターポリペプチド、その同族体又は誘導体に対して生成された完全抗体である。問題の結合因子は、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2と特異的に結合するが、他のTRAILレセプター、例えばTRAIL-R3又はTRAIL-R4とは“実質的に”（“substantively”又は“substantially”）結合しない因子である。すなわち、問題の抗体は他のTRAILレセプター、例えばTRAIL-R3又はTRAIL-R4とは有意には交差反応しない。そのような実施態様では、本発明の結合因子とこれらのタンパク質との結合の程度は、蛍光活性化細胞分類（FACS）分析、ELISA又は放射能免疫沈降（RIA）で決定したとき、約10％未満、好ましくは5％未満、1％未満であろう。
本発明の結合因子は、前記結合因子が認識又は特異的に結合する、本発明のポリペプチドのエプトープ又は部分（例えば、前記ポリペプチドの表面に配置されるTRAILレセプターポリペプチドの領域（例えば親水性領域））に関して記述するか又は規定することができる。ある実施態様では、本発明は、TRAILレセプター結合因子、例えばTRAILレセプターポリペプチド（別称、標的ポリペプチド）（アミノ酸配列VXDCTPWSDIECVHKE（配列番号:44）（式中アミノ酸Xは好ましくはK又はGから選択される）を含む）に対して生成された抗体又は抗体関連ポリペプチドを提供する。そのような結合因子は、固有の機能的特徴を保有する。TRAIL-R1及びTRAIL-R2が共有する共通のエピトープを認識することによって、前記結合因子はTRAIL-R1若しくは TRAIL-R2の単一タイプ又はTRAIL-R1及びTRAIL-R2の両タイプと結合することができる。本発明のある実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子が結合するTRAIL-R1又はTRAIL-R2レセプターポリペプチドは、1つ以上の細胞の表面で発現される。前記結合因子は選択的に腫瘍細胞のアポトーシスをin vivo及びin vitroで誘導する。癌細胞はTRAIL-R1又はTRAIL-R2を単独又は同時に発現することができる。その広い抗癌活性に基づいて、本発明は、TRAILレセプター発現細胞（例示すれば広範囲の種類の癌細胞を含む）に対して有効な治療薬としてだけでなく、アポトーシスシグナリング研究のための試薬としても有用である。
選抜した実施態様では、本発明は表4に要約されるTRAILレセプター結合因子を提供する。
【００３３】
表4：選抜TRAILレセプター結合因子
2009535044.tif 000005
【００３４】
表4（上記）に要約したTRAILレセプター結合因子関連生物学的物質が全中国菌培養収集センター（China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC), China Committee for Culture Collection of Microorganisms, P.O. Box 2714, Beijing 100080, The People's Republic of China）に下記表5に記載したとおり寄託された。
【００３５】
表5：生物寄託物
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【００３６】
別の実施態様では、本発明は、TRAIL-R1及びTRAIL-R2が共有する他のアゴニスト作用性エピトープを解明する方法を提供する（前記エピトープはTRAIL-1及び／又はTRAIL-2と結合することによりアポトーシスを誘導する抗体の生成に用いることができる）。前記エピトープに対して生成される結合因子は、種々の可変領域又はCDR領域を有しえるが、ただし本発明の抗体の結合の特徴及び機能的特徴を有するべきである。抗体作製のための手段として、親水性及び疎水性領域を示すハイドロパシープロットを当分野でよく知られた任意の方法（例えばカイトドゥーリトル（Kyte Doolittle）法又はホップウッズ（Hopp Woods）法）をフーリエ変換とともに又はフーリエ変換なしに用いることによって作製することができる（例えば以下を参照されたい：Hopp and Woods, Proc Natl Acad Sci USA 1981, 78:3824-3828；Kyte and Doolittle, J Mol Biol 1982, 157:105-142）。エピトープ又はポリペプチドの部分は、本明細書に記載するように例えばN-末端及びC-末端の位置によって、連続するアミノ酸残基のサイズによって明示することができる。本発明は、本発明のポリペプチドと特異的に結合し、さらに前記の排除を可能にする結合因子を含む。本発明は、立体エピトープ又は非立体エピトープであるエピトープと特異的に結合する結合因子を含む。上記に特記したように、立体エピトープ又は非立体エピトープは、前者との結合は変性溶媒の存在下では失われるが後者との結合では失われないという点で区別される。
【００３７】
本発明の結合因子はまた、それらの交差反応性に関して記述又は明示することができる。本発明の標的ポリペプチドの他のいずれの類似体、オルトログ又は同族体とも結合しない結合因子が含まれる。本発明のポリペプチドと95％未満、90％未満、85％未満、80％未満、75％未満、70％未満、65％未満、60％未満、55％未満、50％未満の同一性（当分野で公知又は本明細書に記載の方法を用いて計算した場合）をもつポリペプチドとは結合しない結合因子もまた本発明に含まれる。さらに本発明に含まれるものは、（本明細書に記載の）ストリンジェントな条件下で本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとのみ結合する結合因子である。ある特徴では、本発明は、TRAILレセプター1（TRAIL-R1）ポリペプチド及び／又はTRAILレセプター2（TRAIL-R2）ポリペプチドと結合するTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）を提供し、前記結合因子（抗体）は、低濃度にてその可溶型において、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2ポリペプチドを発現する癌細胞においてin vivo及びin vitroで細胞死誘導活性を有する。ある実施態様では、TRAILレセプター結合因子は、少なくとも1つの細胞の表面で発現されるTRAILレセプター1（TRAIL-R1）ポリペプチド及び／又はTRAILレセプター2（TRAIL-R2）ポリペプチドと結合する。すなわち、本発明のTRAILレセプター結合因子は、単一細胞上で発現されるTRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2レセプターポリペプチドと、又は2つ以上の細胞（例えば2つの細胞）で発現されるTRAIL-R1／R2ポリペプチドと結合することができる。ある実施態様では、TRAILレセプター結合因子は、TRAILレセプター1（TRAIL-R1）及び／又はTRAILレセプター2（TRAIL-R2）との間で少なくとも約90％のアミノ酸相同性（例えば同一性）のポリペプチド領域と結合する。ある実施態様では、TRAILレセプター結合因子は、TRAILレセプター1（TRAIL-R1）及び／又はTRAILレセプター2（TRAIL-R2）との間で少なくとも約95％のアミノ酸相同性（例えば同一性）のポリペプチド領域と結合する。ある実施態様では、TRAILレセプター結合因子は、TRAILレセプター1（TRAIL-R1）及び／又はTRAILレセプター2（TRAIL-R2）との間で少なくとも約98％のアミノ酸相同性（例えば同一性）のポリペプチド領域と結合する。ある実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子は、TRAIL-R1及びTRAIL-R2ポリペプチドの間で相同性をもつ領域と結合し、この場合、前記領域は、アミノ酸配列VXDCTPWSDIECVHKE（配列番号:44）（式中XはK又はGである）を含む。アミノ酸相同性（例えば同一性）は、当分野で公知の又は本明細書に記載の方法を用いて計算することができる。
【００３８】
本発明の結合因子はまた、それらの結合親和性に関して記述又は明示することができる。好ましい結合親和性は、5ｘ10-6M、10-6M、5ｘ10-7M、10-7M、5ｘ10-8M、10-8M、5ｘ10-9M、10-9M、5ｘ10-10M、10-10M、5ｘ10-11M、10-11M、5ｘ10-12M、10-12M、5ｘ10-13M、10-13M、5ｘ10-14M、10-14M、5ｘ10-15M、及び10-15M未満の解離定数すなわちKdをもつものが含まれる。ある実施態様では、本発明は、1ｘ10-8より高くないKd値、好ましくは、約1ｘ10-9より高くないKd値でヒトTRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2と少なくとも結合するTRAILレセプター結合因子を提供する。
本発明の範囲内のTRAILレセプター結合因子には、例えば、標的ポリペプチド、その同族体、誘導体又はフラグメントと特異的に結合するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ダイアボディ並びにヒトモノクローナル抗体及びヒトポリクローナル抗体が含まれるが、ただしこれらに限定されない。本明細書で用いられる、“TRAILレセプター様ポリペプチド”は、TRAILレセプターポリペプチドとは異なるが、本発明のTRAILレセプター結合因子と免疫学的に反応性を有するポリペプチドを意味する。TRAILレセプター様ポリペプチドは、TRAILレセプターポリペプチドと同じ生物又は異なる生物に由来することができる。TRAILレセプター様ポリペプチドは、TRAILレセプターポリペプチドと同じ遺伝子又は異なる遺伝子によってコードされえる。本発明の結合因子として有用な抗体には、例えばIgG（IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4を含む）、IgA（IgA1及びIgA2）、IgD、IgE又はIgM及びIgYが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
別の実施態様では、本発明の結合因子は、TRAILレセプターポリペプチド、その同族体又は誘導体に対して生成された抗体関連ポリペプチドである。典型的には、結合因子の抗原結合領域、例えば抗TRAILレセプター結合領域は、本発明の結合因子の結合の特異性及び親和性においてもっとも重要であろう。いくつかの実施態様では、TRAILレセプター結合因子は、抗TRAILレセプターポリペプチド抗体、例えば抗TRAILレセプターポリペプチドモノクローナル抗体、抗TRAILレセプターポリペプチドキメラ抗体、及び抗TRAILレセプターポリペプチドヒト化抗体（前記は例えば抗体の部分の欠失、付加又は置換により改変されている）である。例えば、抗TRAILレセプターポリペプチド抗体は、抗体の半減期（例えば血中半減期）、安定性、親和性を高めることが意図された。ある実施態様では、TRAILレセプターポリペプチドの特定のドメインに特異的である抗体の選別は、そのようなドメインを保有するTRAILレセプターポリペプチドのフラグメントと結合するハイブリドーマの作製によって促進される。したがって、TRAILレセプターポリペプチド又はその誘導体、フラグメント、類似体又は同族体内の所望のドメインに特異的な抗体であるTRAILレセプター結合因子もまた本明細書で提供される。
【００３９】
本発明はさらに本発明の結合因子に対して抗イディオタイプである抗体を含む。本発明の結合因子は、単一特異性、二重特異性、三重特異性又はさらに多重特異性でありえる。多重特異性結合因子は本発明のTRAILレセプターポリペプチドの種々のエピトープに特異的であることができ、前記はまた本発明のTRAILレセプターポリペプチド及び異種組成物（例えば異種ポリペプチド又は固相物質）の両方に対して特異的でありえる。例えば以下を参照されたい：WO93/17715；WO92/08802；WO91/00360；WO92/05793；Tutt et al. J Immunol. 1991, 147:60-69；米国特許5,573,920号；同4,474,893号；同5,601,819号；同4,714,681号；同4,925,648号；同6,106,835号；Kostelny et al. J Immunol, 1992, 148:1547-1553。本発明の結合因子は、鳥類及び哺乳動物を含むいずれの動物起源でもよい。好ましくは、結合因子は、ヒト、げっ歯類、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ又はニワトリ由来である。本発明の結合因子は、例えばTRAILレセプターポリペプチド機能を調節するためにそれが所望される対象動物への投与に適している。したがって、TRAILレセプター調節物質、例えばTRAILレセプターポリペプチドの機能的アンタゴニスト又は機能的アゴニストであるTRAILレセプター結合因子を提供することは、本発明のさらに別の目的である。さらに、TRAILレセプターポリペプチドの部分的アンタゴニスト及び部分的アゴニストであるTRAILレセプター結合因子組成物を提供することもまた、本発明の目的である。同様に含まれるものは、TRAILレセプターポリペプチドと結合する抗TRAILレセプター中和抗体である。好ましい実施態様では、本発明の結合因子は以下の程度まで精製されるであろう：（1）Lowryの方法（Lowry et al. J Biol Chem, 1951, 193:265）によって決定したとき抗体の95質量％、もっとも好ましくは99質量％を超える；（2）スピンニングカップシークェネーターの使用によってN-末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るために十分な程度；又は（3）還元又は非還元条件下のSDS-PAGEゲルでクーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いたとき均質である。単離結合因子には組換え細胞内にin situで存在するポリペプチドが含まれる。なぜならば、抗体の天然の環境の少なくとも1つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、TRAILレセプター結合因子（例えば単離抗TRAILレセプター抗体）は好ましくは少なくとも1つの精製工程によって調製されるであろう。本発明はさらに、TRAILレセプターポリペプチドの調製物質として作用する化合物の同定、設計及び製造に役立つ、構造を基準にした方法に関する。
【００４０】
本発明の結合因子は、単独で又は他の組成物と併用して用いることができる。例えば、本発明のTRAILレセプター結合因子を、当分野で公知の1つ以上の抗TRAILレセプターモノクローナル抗体、例えば文献（US 2003/0198637, Zhou et al；US 2003/0190687,Zhou et al.）に記載されたもの及び抗TRAIL-R2抗体、TRA-8（三共）（ただしこれらに限定されない）と一緒に用いることができる。
本発明のTRAILレセプター結合因子はさらに、組換えにより異種ポリペプチドとN-又はC-末端で融合させるか、又はポリペプチド若しくは他の組成物と化学的に結合させることができる（共有結合及び非共有結合複合体化を含む）。例えば、本発明のTRAILレセプター結合因子は、検出アッセイの標識として、及びエフェクター分子（例えば異種ポリペプチド、薬剤又は毒素）として有用な分子と組換えにより融合させるか、又は複合体化することができる。例えば以下を参照されたい：WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；米国特許5,314,995号；欧州特許0396387号。
ある種の実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子は抗TRAILレセプター抗体又は抗TRAILレセプター抗体関連ポリペプチドであり、前記は1つ以上の治療用又は細胞傷害性部分と結合若しくは複合体化されて本発明のTRAILレセプター結合因子コンジュゲートタンパク質が得られる。本発明のTRAILレセプター結合因子コンジュゲートタンパク質を用いて、ある生物学的応答を改変し、又は生物学的応答を作り出す（例えばエフェクター細胞を補充する）ことができる。治療用部分は古典的な化学的治療剤と解釈されるべきではない。例えば、前記治療用部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質又はポリペプチドでもよい。そのようなタンパク質には、例えば酵素的に活性な毒素又は活性なそのフラグメント、例えばアブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、又はジフテリア毒素；タンパク質、例えば腫瘍壊死因子又はインターフェロンアルファ；又は生物学的応答変更物質、例えばリンホカイン、インターロイキン-1（“IL-1”）、インターロイキン-2（“IL-2”）、インターロイキン-6（“IL-6”）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（“GM-CSF”）、顆粒球コロニー刺激因子（“G-CSF”）、又は他の増殖因子が含まれえる。
【００４１】
本発明のTRAILレセプター結合因子の調製方法
全般的概観：
最初に、本発明の結合因子（例えば抗TRAILレセプター抗体）を生じさせることのできる標的ポリペプチドが選択される。標的ポリペプチドに対して生成される結合因子の作製技術は当分野でよく知られている。そのような技術の例には、例えばディスプレーライブラリー、ゼノ若しくはヒューマブ（humab）マウス、ハイブリドーマなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。本発明の範囲内の標的ポリペプチドには、抗原性を提示することができる任意のポリペプチド又はポリペプチド誘導体が含まれる。前記の例には、タンパク質（例えばレセプター、酵素、ホルモン、増殖因子）、ペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、TRAILレセプターポリペプチドなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。例示的な標的ポリペプチドにはまた、ヒトの疾患を引き起こす細菌、カビ、ウイルス病原体（例えばHIV、肝炎（A型、B型及びC型）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌、シュードモナス・エルギノーザ）が含まれる。他の標的ポリペプチドは、その発現レベル又は組成がヒトの疾患又は他の表現型と相関しているヒトのタンパク質である。他の対象となる標的ポリペプチドには腫瘍細胞抗原及びウイルス粒子抗原が含まれる。
本開示にしたがって使用される結合因子として適切なものは天然に存在する抗体だけでなく、組換えにより操作された抗体及び抗体フラグメント、例えば抗体関連ポリペプチド（これらはTRAILレセプターポリペプチドに対して生成される）もまた適切であることは理解されよう。
本明細書に示す技術に付すことができる結合因子、例えば抗TRAILレセプター抗体には、モノクローナル及びポリクローナル抗体、並びに抗体フラグメント（例えばFab、Fab'、F(ab')2、Fd、scFv、ダイアボディ、抗体軽鎖、抗体重鎖及び／又は抗体フラグメント）が含まれる。抗体のFv含有ポリペプチド（例えばFab'及びF(ab')2抗体フラグメント）の高収量製造に有用な方法は既に記載されている（米国特許5,648,237号を参照されたい）。
【００４２】
一般的には、結合因子は出発種から入手する。より具体的には、標的ポリペプチド抗原に対して特異性を有する出発種の抗体の軽鎖、重鎖又は両方の鎖の可変部分の核酸又はアミノ酸配列を入手する。出発種は、本発明の結合因子又は結合因子のライブラリーの作製に有用である任意の種、例えばラット、マウス、ウサギ、ニワトリ、サル、ヒトなどである。
好ましい実施態様では、TRAILレセプター結合因子は抗TRAILレセプター抗体である。ファージ又はファージミドディスプレー技術は、本発明の結合因子の誘導に有用な技術である。本発明で有用な抗TRAILレセプター抗体は“ヒト抗体”（例えばヒトから単離された抗体）又は“ヒト配列抗体”である。ヒト抗体は、ファージディスプレー法を含む、当分野で公知の多様な方法によって作製することができる。米国特許4,444,887号、同4,716,111号、同5,545,806号及び同5,814,318号；並びに、WO 96/34096、WO 96/33735及びWO 91/10741もまた参照されたい。ポリファージ粒子をスクリーニングすることによってマルチマーポリペプチド複合体のメンバーをコードする核酸配列を同定するために有用な方法は、既に記載されている（米国特許6,667,150号（Rudert et al.））。組換え免疫グロブリンもまた製造することができる（米国特許4,816,567号（Gabilly）；米国特許6,331,415号（Gabilly et al.）；及びQueen et al. Proc Narl Acad Sci USA 1989, 86:10029-10033）。モノクローナル抗体を作製及びクローニングする技術は当業者にはよく知られている。本発明のTRAILレセプター結合因子は、好ましくは高い免疫反応性を有する。すなわち、抗体分子の標的抗原と特異的に結合することができるように正確に折り畳まれた高い割合の抗体分子を有する。結合因子（例えば本発明の抗体）をコードする配列の発現は、下記に記載するように大腸菌で実施することができる。そのような発現は少なくとも80％、90％、95％又は99％の免疫反応性をもたらす。
【００４３】
これらタンパク質又は遺伝子のある種の短縮は、完全な配列のタンパク質又は遺伝子の調節的又は酵素的機能を発揮する。したがって、例えば核酸配列コードは、機能的に等価のタンパク質又は遺伝子を提供する置換、付加、欠失又はマルチマー発現によって変化させることができる。核酸コード配列の縮退のために、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列をコードする他の配列を本発明の実施に用いることができる。前記には上記のポリペプチドをコードする核酸配列の全部又は部分を含む核酸配列が含まれ（ただしこれらに限定されない）、それらは、配列内で機能的に等価のアミノ酸残基をコードする種々のコドンの置換によって変化させられ、したがってサイレント変異を生じる。本発明の免疫グロブリンのヌクレオチド配列は、標準的方法（“Current Methods in Sequence Copparison and Analysisi”, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp.127-149, 1998, Alan R. Liss, Inc.）によって計算したとき25％までの相同性変動に耐えることは理解されよう（ただし、そのような変種が、TRAIL-R1及びTRAIL-R2を認識する機能的抗体を形成する場合に限る）。例えば、ポリペプチド配列内の1つ以上のアミノ酸残基は、機能的等価物として作用する類似の極性をもつ別のアミノ酸によって置換され、サイレント変異を生じる。配列内のアミノ酸の置換は、当該アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが含まれる。極性の中性アミノ酸にはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが含まれる。陽性荷電（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれる。陰性荷電（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。さらにまた、本発明の範囲内に含まれるものは、翻訳中に又は翻訳後に（例えばグリコシル化、タンパク分解切断、抗体分子又は他の細胞性リガンドとの結合などによって）弁別的に修飾された、タンパク質又はそのフラグメント若しくは誘導体である。さらにまた、インヒビターコード核酸配列をin vitro又はin vivoで変異させて、翻訳配列、開始配列及び／又は終止配列を作出及び／又は破壊するか、又はコード領域に変型を作出するか、及び／又は新規な制限エンドヌクレアーゼ部位を作出するか、又は既に存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を破壊して、in vitro改変を促進することができる。当分野で公知の任意の変異導入技術を用いることができる。前記技術にはin vitro位置特異的変異導入（J Biol Chem 253:6551）、Tabリンカー（Pharmacia）の使用などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００４４】
ポリクローナル抗血清及び免疫原の調製：
本発明の抗体又は抗体フラグメントの作製方法は、典型的には対象（一般的には非ヒト対象、例えばマウス又はウサギ）の精製TRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプターポリペプチド発現細胞による免疫を含む。免疫原としてTRAILレセプターポリペプチドのいずれの免疫原性部分を用いてもよい。適切な免疫原性調製物は、例えば組換え発現TRAILレセプターポリペプチド又は化学的合成TRAILレセプターポリペプチドを含むことができる。単離されたTRAILレセプターポリペプチド、又はその部分若しくはフラグメントを免疫原として利用し、ポリクローナル及びモノクローナル抗体調製物のための標準的な技術を用いてTRAILレセプターポリペプチド又はその部分若しくはフラグメントと結合するTRAILレセプター結合因子を作製することができる。完全長のTRAILレセプターポリペプチドを用いることができるが、また別に本発明は、免疫原としてTRAILレセプターポリペプチドフラグメントの使用を提供する。TRAILレセプターポリペプチドは配列番号:1に示すアミノ酸配列の少なくとも4アミノ酸残基を含み、さらに、このペプチドに対して生じた抗体は、TRAILレセプターポリペプチドと特異的な免疫複合体を形成することができるTRAILレセプターポリペプチドの1つのエピトープを包含する。好ましくは。抗原性ペプチドは、少なくとも5、8、10、15、20、又は30アミノ酸残基を含む。当業者によく知られた方法に応じて、より長い抗原性ポリペプチドがときに短い抗原性ペプチドより好ましい。典型的には、免疫原は、長さが少なくとも約8アミノアシル残基、好ましくは長さが少なくとも約10アシル残基であろう。あるエピトープのマルチマーがときにモノマーよりも有効である。
必要な場合には、TRAILレセプターポリペプチド（又はそのフラグメント）の免疫原性は、ハプテン（例えばキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）又はオバルブミン（OVA））との融合又はコンジュゲーションで高めることができる。多くのそのようなハプテンが当分野で知られている。さらにまた、TRAILレセプターポリペプチドを通常のアジュバント、例えばフロイントの完全又は不完全アジュバントと一緒にして、前記ポリペプチドに対する対象動物の免疫反応を高めることができる。免疫学的応答を高めるために用いられる種々のアジュバントには、フロイントの（完全又は不完全）アジュバント、鉱物ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、多価陰イオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノールなど）、ヒト用アジュバント（例えばカルメット-ゲラン杆菌及びコリネバクテリウム・パルブム）又は同様な免疫刺激化合物が含まれるが、ただしこれらに限定されない。これらの技術は当分野では標準的である。
【００４５】
簡便にするために、免疫応答は、本発明ではしばしば“一次”又は“二次”免疫応答として記載される。一次免疫応答（“防御”免疫応答とも記載される）は、特定の抗原（例えばTRAILレセプターポリペプチド）への最初の何らかの暴露（例えば初回“免疫”）の結果として個体で生じる免疫応答を指す。そのような免疫は、例えば、抗原（例えば抗原を表示又は提示している何らかの病原体による最初の感染に由来）に対する自然な状態での何らかの暴露の結果として、又は個体の何らかの腫瘍（例えば悪性メラノーマ）の癌細胞によって提示される抗原から生じえる。また別には、免疫は、前記抗原を含むワクチンによる個体のワクチン接種の結果として生じえる。例えば、ワクチンは、TRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチド由来の1つ以上の抗原を含むTRAILレセプターワクチンであってもよい。
一次免疫応答は時間が経つと低下又は減弱し、消失するか又は減弱して検出不能になる。したがって、本発明はまた“二次”免疫応答に関し、前記応答はまた本明細書では“記憶免疫応答”と記載される。二次免疫応答という用語は、一次免疫応答が既に生じた後に個体で誘引される免疫応答を指す。
したがって、二次又は記憶免疫応答は、例えば、低下又は減弱した既存の免疫応答を強化するために、又は消失したか若しくはもはや検出できない以前の免疫応答を再出現させるために誘引することができる。制限的ではなく例示として、二次免疫応答は、個体に一次免疫応答を誘引した抗原（例えばTRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチド）を（例えばワクチンの再投与によって）再導入することにより誘引することができる。しかしながら、抗原に対する二次免疫応答はまた、実際の抗原を含まない他の物質を投与することによって誘引することができる。例えば、本発明は、TRAILレセプター結合因子を個体に投与することによって二次免疫応答を強化する方法を提供する。そのような方法では、実際の抗原は必ずしもTRAILレセプター結合因子により投与される必要はなく、さらにTRAILレセプター結合因子を含む組成物は必ずしも抗原を含む必要はない。二次又は記憶免疫応答は液性（抗体）応答又は細胞性応答のどちらかでありえる。二次又は記憶液性応答は、抗原の最初の提示で生成されたメモリーB細胞刺激で生じる。遅延型過敏性（DTH）反応は、CD4+細胞によって仲介される細胞性二次又は記憶免疫応答の型である。抗原への最初の暴露は免疫系をプライミングし、追加の暴露はDTHをもたらす。
適切な免疫に続いて、TRAILレセプター結合因子、例えば抗TRAILレセプターポリクローナル抗体は、対象動物の血清から調製することができる。所望の場合は、TRAILレセプターポリペプチドに対して生成された抗体分子を前記哺乳動物から（例えば血液から）単離することができ、さらによく知られた技術（例えばポリペプチドAクロマトグラフィー）によってさらに精製してIgG画分を得ることができる。
【００４６】
モノクローナル抗体：
本発明のある実施態様では、結合因子は抗TRAILレセプターモノクローナル抗体である。本発明のある実施態様では、抗TRAILレセプターモノクローナル抗体は、ヒト抗TRAILレセプターモノクローナル抗体である。個々のTRAILレセプターポリペプチド又はその誘導体、フラグメント、類似体、又は同族体に対して誘導されたモノクローナル抗体の調製のためには、持続的細胞株培養による抗体分子の産生を提供する任意の技術を利用することができる。そのような技術には、ハイブリドーマ技術（例えばKohler & Milstein, 1975, Nature 256:495-497）；トリオーマ技術；ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（例えば以下を参照されたい：Kozbor et al. 1983, Immunol Today 4:72）及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術（例えば以下を参照されたい：Cole et al. 1985, In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。ヒトモノクローナル抗体を本発明の実施に利用することができ、さらにヒトハイブリドーマを用いることによって（例えば以下を参照されたい：Cote et al. 1983, Proc Natl Acad Sci USA 80:2026-2030）、又はヒトB細胞のエプスタイン-バーウイルスによるin vitro形質転換によって（例えば以下を参照されたい：Cole et al. 1985, In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96）ヒトモノクローナル抗体を産生することができる。例えば、抗体領域をコードする核酸集団を単離することができる。抗体の保存された領域をコードする配列に由来するプライマーを利用するPCRを用いて、前記核酸集団から抗体の部分をコードする配列を増幅し、続いて、前記増幅配列から抗体又はそのフラグメント（例えば可変ドメイン）をコードするDNAを再構築する。そのような増幅配列をまた、他のタンパク質（例えば細菌ファージコートタンパク質又は細菌細胞表面タンパク質）をコードするDNAと融合させ、ファージ又は細菌上で融合ポリペプチドを発現及び提示することができる。続いて、増幅配列を発現させ、さらに発現抗体又はそのフラグメントのTRAILレセプターポリペプチド上に存在する抗原又はエピトープに対する親和性を基準にして選別又は単離することができる。また別には、対象動物を免疫し続いて日常的な方法を用いて前記対象動物の脾臓からハイブリドーマを単離することによって、抗TRAILレセプターモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを調製することができる（例えば以下を参照されたい：Galfre and Milstein, Methods Enzymol 1989, 73:3-46）。標準的な方法を用いて、ハイブリドーマをスクリーニングすることによって、多様な特異性（すなわち種々のエピトープに対する特異性）及び親和性を有するモノクローナル抗体が製造される。ハイブリドーマによって発現される、所望の特性（例えばTRAILレセプター結合）を有する選別モノクローナル抗体を利用することができる。前記は、例えばポリエチレングリコール（PEG）と結合させてその特性を変化させるか、又は前記をコードするcDNAを単離し、配列決定し、さらに多様な方法で操作することができる。合成のデンドロメリックツリーを反応性アミノ酸側鎖（例えばリジン）に付加して、TRAILレセプターポリペプチドの免疫原性特性を強化することができる。さらにまた、CPG-ジヌクレオチド技術を用いて、TRAILレセプターポリペプチドの免疫原性特性を強化することができる。その他の操作には、保存中又は対象への投与後の抗体の不安定性に影響する個々のアミノシル残基の置換又は欠失、及びTRAILレセプターポリペプチドの抗体の親和性改善のためのアフィニティ成熟技術が含まれる。
【００４７】
ハイブリドーマ技術：
ある実施態様では、本発明の結合因子は、ヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物（例えばトランスジェニックマウス）から得られたB細胞（不朽化細胞と融合）を含むハイブリドーマによって産生される抗TRAILレセプターモノクローナル抗体である。ハイブリドーマ技術には当分野で公知の技術及び以下の文献に開示された技術が含まれる：Harlow et al. Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 349 (1988)；Hammerling et al. Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas, 1981, 563-681。ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体を製造するその他の方法は当業者にはよく知られている。
【００４８】
ファージディスプレー技術：
上記に特記したように、本発明の結合因子は、組換えDNA及びファージディスプレー技術を適用することにより製造することができる。例えば、本発明の結合因子、例えば抗TRAILレセプター抗体は、当分野で公知の多様なファージディスプレー方法を用いて製造することができる。ファージディスプレー方法では、機能的抗体ドメインは、ファージ粒子の表面でディスプレーされる（前記ファージ粒子は機能的抗体ドメインをコードする配列を保持している）。レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えばヒト又はげっ歯類）から、抗原（典型的には固体表面又はビーズに結合又は捕捉された抗原）を用いて直接選別することによって、所望の結合特性を有するファージを選別する。これらの方法で用いられるファージは、典型的にはfd及びM13が含まれる繊維状ファージで、Fab、Fv又はジスルフィド安定化Fv抗体ドメインが、ファージ遺伝子IIIタンパク質又は遺伝子VIIIタンパク質と組換えにより融合されている。さらにまた、Fab発現ライブラリーの構築のための方法を適用して（例えば以下の文献を参照されたい：Huse et al. Science 2989, 246:1275-1281）、TRAILレセプターポリペプチド（例えば前記ポリペプチド又はその誘導体、フラグメント、類似体若しくは同族体）に対して所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速で効果的な同定を可能にすることができる。本発明の結合因子を製造するために用いることができるファージディスプレー法のその他の例には、以下に開示されている方法が含まれる：Huston et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 85:5879-5883；Chaudhary et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87:1066-1070；Brinkman et al. J Immunol Methods 1995, 182:41-50；Ames et al. J Immunol. Methods, 1995, 184:177-186；Kettleborough et al. Eur J Immunol 1994, 24:952-958；Perisic et al. Gene 1997, 187:9-18；Burton et al. Advances in Immunology 1994, 57:191-280；PCT/GB91/01134；WO90/02809；WO91/10737；WO91/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；WO96/06213；WO92/01047；（Medical Research Council et al.）；WO97/08320（Morphosys）；WO92/01047（CAT/MRC）；WO91/17271（Affymax）；及び米国特許5,698,426号、同5,223,409号、同5,403,484号、同5,580,717号、同5,427,908号、同5,705,753号、同5,821,047号、同5,571,698号、同5,427,908号、同5,516,637号、同5,780,225号、同5,658,727号、及び同5,773,743号。バクテリオファージ粒子の表面でジスルフィド結合を介してポリペプチドを付着させることによってポリペプチドをディスプレーするために有用な方法が、米国特許6,753,136号（Lohning）に記載されている。上記の参考文献に記載されているように、ファージを選別した後、ファージから抗体コード領域を単離し、これを用いて全抗体（ヒト抗体又は所望される他の任意の抗原結合フラグメントを含む）を作製し、所望の任意の宿主（哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及び細菌を含む）で発現させることができる。例えば、Fab、Fab'及びF(ab')2フラグメントを組換えにより製造するための技術もまた、当分野で公知の方法（例えば以下で開示されている方法：WO92/22324；Mullinax et al. BioTechniques 1992, 12:864-869； Sawai et al. AJRI 1995, 34:26-34；及びBetter et al. Science 1988, 240:1041-1043）により利用することができる。
抗体又は抗体フラグメントは、ファージ又はファージミド粒子の表面に存在するので、良好な結合活性を維持している変種を同定するために、一般的には、ディスプレーベクターでクローニングされるハイブリッド抗体又はハイブリッド抗体フラグメントを適切な抗原に対して選別することができる（例えば以下を参照されたい：Barbas III et al. Phage Display, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001)。しかしながら、他のベクター様式（例えば選別及びスクリーニングのために抗体フラグメントのライブラリーを溶解性ファージベクター（改変T7又はラムダZap系）にてクローニングする）もこのプロセスに用いることができよう。
【００４９】
組換えTRAILレセプター結合因子の発現：
上記に特記したように、本発明の結合因子は組換えDNA技術の適用により製造することができる。本発明のTRAILレセプター結合因子をコードする組換えポリヌクレオチド構築物は、典型的には、抗TRAILレセプター抗体鎖のコード配列に作動可能に連結された発現制御配列（天然の状態において結合しているプロモーター又は異種プロモーター領域を含む）を含む。したがって、本発明の別の特徴は、本発明のTRAILレセプター結合因子をコードする1つ以上の核酸配列を収納したベクターを含む。本発明の1つ以上のポリペプチドの組換え発現のために、TRAILレセプター結合因子をコードするヌクレオチド配列の全部又は部分を含む核酸を、当分野でよく知られており下記で詳述する組換えDNA技術によって適切なクローニングベクター又は発現ベクター（すなわち、挿入されたポリペプチドコード配列の転写及び翻訳のための必要なエレメントを含むベクター）に挿入する。多様なベクター集団を作製する方法は、米国特許6,291,160号、同6,680,192号（Lerner et al.）に記載されている。
一般的には、組換えDNA技術で有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態である。プラスミドはもっとも通常的に用いられるベクターの形態であるので、本明細書では、“プラスミド”及び“ベクター”は相互に用いられる。しかしながら、本発明は、技術的にはプラスミドではない他の形態の発現ベクター、例えばウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス、前記は等価の機能を供する）も含むことを意図している。そのようなウイルスベクターは対象動物の感染及び対象動物での化合物の発現を可能にする。好ましくは、発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換しえるか、又は前記にトランスフェクトしえる真核細胞プロモーター系である。いったん、ベクターが適切な宿主に取り込まれたら、TRAILレセプター結合因子をコードするヌクレオチド配列の高レベル発現、並びにTRAILレセプター結合因子（例えば交差反応性抗TRAILレセプター抗体）の収集及び精製に適した条件下で前記宿主を維持する。全般的には、米国特許出願20020199213号を参照されたい。これらの発現ベクターは、エピソームとして又は宿主染色体DNAの不可欠の部分として、宿主生物内で典型的には複製することができる。一般的には、発現ベクターは、選別マーカー（例えばアンピシリン耐性又はヒグロマイシン耐性）を含み、所望のDNA配列で形質転換された細胞の検出を可能にする。ベクターはまた、細胞外抗体フラグメントの分泌の指令に有用なシグナルペプチド（例えばペクテートリアーゼ）を含むことができる（米国特許5,576,195号を参照されたい）。
【００５０】
本発明の組換え発現ベクターは、TRAILレセプター結合特性を有する化合物をコードする核酸を、宿主細胞内での前記核酸の発現に適した形態で含む。これは、前記組換え発現ベクターが、発現に用いられる宿主細胞を基準にして選択されてある、発現されるべき核酸配列に作動できるように連結された1つ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内では、“作動できるように連結された”とは、（例えばin vitro転写／翻訳系で、又はベクターが宿主細胞に導入されるときは宿主細胞内で）ヌクレオチド配列の発現を可能にする態様で問題のヌクレオチド配列が調節配列と連結されることを意味しようとするものである。“調節配列”という用語は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。そのような調節配列は例えば以下に記載されている：Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞での構成的ヌクレオチド発現を指令するもの、及びある種の宿主細胞でのみヌクレオチド配列の発現を指令するもの（例えば組織特異的調節配列）が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望されるポリペプチドの発現レベルなどに左右されることは、当業者には理解されよう。組換えポリペプチド発現（例えばTRAILレセプター結合因子）のプロモーターとして有用な典型的な調節配列には、例えば3-ホスホグリセレートキナーゼ及び他の解糖酵素が含まれるが、ただしこれらに限定されない。誘導性酵母プロモーターにはとりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソチトクロームC、並びにマルトース及びガラクトース利用に必要な酵素に由来するプロモーターが含まれる。ある実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子をコードするポリヌクレオチドは、araΒプロモーターに作動できるように連結され、宿主細胞で発現可能である（例えば米国特許5,028,530号を参照されたい）。本発明の発現ベクターは宿主細胞に導入され、それによってポリペプチド又はペプチド（本明細書に記載の核酸によってコードされる融合ポリペプチド（例えばTRAILレセプター結合因子など）を含む）を産生することができる。
本発明の別の特徴は、TRAILレセプター結合因子発現宿主細胞に関する。前記細胞は1つ以上のTRAILレセプター結合因子をコードする核酸を含む。本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞又は親核細胞でのTRAILレセプター結合因子の発現のために設計することができる。例えば、TRAILレセプター結合因子は、細菌細胞（例えば大腸菌）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、菌類細胞（例えば酵母）、酵母細胞又は哺乳動物細胞で発現させることができる。適切な宿主細胞はさらに以下の著書で考察されている：Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)。また別には、組換え発現ベクターは、例えばT7プロモーター調節配列及びT7ポリメラーゼを用いてin vitroで転写及び翻訳することができる。確率論的に作製したポリヌクレオチド配列の発現を介する、予め定めた特性を有するポリペプチド（例えばTRAILレセプター結合因子）の調製物のスクリーニングに有用な方法は既に記載されている（例えば米国特許5,763,192号、5,723,323号、5,814,476号、5,817,483号、5,824,514号、5,976,862号、6,492,107号、6,569,641号を参照されたい）。
【００５１】
原核細胞におけるポリペプチドの発現は、もっとも頻繁には融合又は非融合ポリペプチドの発現を指令する構成的又は誘導性プロモーターを含むベクターを用いて大腸菌で実施される。融合ベクターは、その中でコードされるポリペプチドに、通常は組換えポリペプチドのアミノ末端に多数のアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは典型的には3つの目的にかなう：(i)組換えポリペプチドの発現増加；（ii）組換えポリペプチドの溶解性の増加；（iii）アフィニティ精製におけるリガンドとして機能することによって組換えポリペプチドの精製の促進。しばしば融合発現ベクターでは、タンパク分解切断部位が融合部分と組換えポリペプチドとの接合部に導入され、融合ポリペプチドの精製に続いて融合部分から組換えポリペプチドの分離を可能にする。そのような酵素及びそれらの同系認識配列にはXa因子、トロンビン及びエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターには、pGEX（Pharmacia Biotech Inc.；Smith and Johnson, 1988, Gene 67:31-40）、pMAL（New England Biolabs, Beverly, Mass）及びpRIT5（Pharmacia, Piscataway, N.J.）が含まれ、前記では、標的の組換えポリペプチドにそれぞれグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、マルトースE結合ポリペプチド、又はポリペプチドAが融合している。
【００５２】
適切な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例には、pTrc（Amrann et al. Gene, 1988, 69:301-315）及びpET11d（Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89）が含まれる。ポリペプチド融合を介して多機能性ポリペプチドを生成することを目的とする、別個の活性なペプチド又はタンパク質ドメインの照準アッセンブリーのための方法が、米国特許6,294,353号、6,692,935号（Pack et al.）に記載されている。組換えポリペプチド（例えばTRAILレセプター結合因子）の発現を大腸菌で最大限にするためのある戦略は、組換えポリペプチドのタンパク分解切断能力が障害された宿主細菌でこのポリペプチドを発現させることである（例えば以下を参照されたい：Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128）。別の戦略は、発現ベクターに挿入されるべき核酸のヌクレオチド配列を、各アミノ酸に対する個々のコドンが発現宿主（例えば大腸菌）で優先的に利用されるコドンとなるように変更することである（例えば以下を参照されたい：Wada et al. Nucl Acids Res 1992, 20:2111-2118）。本発明の核酸配列のそのような変更は、標準的なDNA合成技術によって実施することができる。
【００５３】
別の実施態様では、TRAILレセプター結合因子発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母サッカロミセス・セレビシアエでの発現用ベクターの例にはpYepSec1（Baldari et al. EMBO J 1987, 6:229-234）、pMFa（Kurjan and Herskowitz, Cell, 1982, 30:933-943）pJRY88（Shultz et al. Gene 1987, 54:113-123）、pYES2（Invitrogen Corporation, San Diego, Calif）、及びpicZ（Invitrogen Corp. San Diego, Calif）が含まれる。また別には、TRAILレセプター結合因子は、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞で発現することができる。ポリペプチド（例えばTRAILレセプター結合因子）の培養細胞（例えばSF9細胞）での発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、pAcシリーズ（Smith et al. Mol Cell Biol, 1983, 3:2156-2165）及びpVLシリーズ（Lucklow and Summers Virology, 1989, 170:31-39）が含まれる。
さらに別の実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子をコードする核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、例えばpCDM8（Seed, Nature 1987, 329:840）及びpMT2PC（Kaufman et al. EMBO J 1987, 6:187-195）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。哺乳動物細胞で用いられるとき、発現ベクターの制御機能はしばしばウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス及びサルウイルス40に由来する。本発明のTRAILレセプター結合因子の発現に有用な原核細胞及び真核細胞の両方に適切な他の発現系については、例えば以下を参照されたい：Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989（16章及び17章）。
【００５４】
別の実施態様では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞タイプで優先的に核酸の発現を指令することができる（例えば組織特異的調節エレメントが核酸の発現に用いられる）。組織特異的調節エレメントは当分野では公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝特異的；Pinkert et al. Gene Dev 1987, 1:268-277）、類リンパ特異的プロモーター（Calame and Eaton, Adv Immunol 1988 43:235-275）、特にT細胞レセプターのプロモーター（Winoto and Baltimore, EMBO J 1989, 8:729-733）及び免疫グロブリンプロモーター（Banerji et al. Cell 1983, 33:729-740；Queen and Baltimore, Cell 1983, 33:741-748）、ニューロン特異的プロモーター（例えばニューロフィラメントプロモーター；Byrne and Ruddle, Proc Natl Acad Sci USA 1989, 86:5473-5477）、膵特異的プロモーター（Edlund et al. Science 1985, 230:912-916）、及び乳腺特異的プロモーター（例えば乳清プロモーター；米国特許4,873,316号及び欧州特許出願公開264,166号）が含まれる。発生調節プロモーターもまた包含され、例えばげっ歯類hoxプロモーター（Kessel and Gruss, Science 1990, 249:374-379）及びα-フェトプロテインプロモーター（Campes and Tilghman, Genes Dev 1989, 3:537-546）である。
本発明はさらに、発現ベクター中でアンチセンス方向でクローニングされた本発明のTRAILレセプター結合因子をコードするDNA分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、DNA分子は、RNA分子（TRAILレセプター結合分子のmRNAに対してアンチセンスである）の発現が（前記DNA分子の転写によって）可能となる態様で調節配列に作動できるように連結される。多様な細胞タイプでアンチセンスRNA分子の連続的発現を指令する、アンチセンスの向きでクローニングされる核酸に作動できるように連結される調節配列が選択されるか（例えばウイルスプロモーター及び／又はエンハンサー）、或いは、アンチセンスRNAの構成的、組織特異的又は細胞タイプ特異的発現を指令する調節配列が選択される。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド又は弱毒ウイルスの形態でもよく、この場合、アンチセンス核酸は高効率調節領域の制御下で生成され、その活性はベクターが導入される細胞タイプによって決定されえる。アンチセンス遺伝子を用いる遺伝子発現の調節に関する考察については例えば以下を参照されたい：Weintraub et al. "Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis", Reviews-Trends in Genetics, vol. 1(1) 1986。
本発明の別の特徴は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。“宿主細胞”及び“組換え宿主細胞”という用語は本明細書では相互に用いられる。そのような用語は個々の対象細胞を指すだけでなく、そのような細胞の子孫又は潜在的子孫も指すことは理解されよう。ある種の改変がその後に続く世代で変異又は環境的影響により生じえるので、そのような子孫は、実際のところ親細胞とは同一でない可能性があるが、それでもなおそれらは本明細書で用いられる用語の範疇に含まれる。
宿主細胞は任意の原核細胞又は親核細胞でありえる。例えばTRAILレセプター結合因子は、細菌細胞（例えば大腸菌）、昆虫細胞、酵母又は哺乳動物細胞で発現させることができる。免疫グロブリン又はそのフラグメントをコードするヌクレオチドセグメントの発現には哺乳動物細胞が好ましい（以下を参照されたい：Winnacker, From Genes to Clones（VCH Publishers, N.Y., 1987））。完全な異種タンパク質を分泌することができる適切な多数の宿主細胞株が当分野で開発されている。前記にはチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株、種々のCOS細胞株、HeLa細胞、L細胞及びミエローマ細胞株が含まれる。好ましくは、細胞は非ヒトである。これらの細胞のための発現ベクターは、発現制御配列（例えば複製起点、プロモーター、エンハンサー）及び必要なプロセシング情報部位（例えばリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位及び翻訳ターミネーター配列）を含むことができる（Queen et al. Immunol Rev 1986, 89:49）。好ましい発現制御配列は、内因性遺伝子、サイトメガロウイルス、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターである（Co et al. J Immunol 1992, 148:1149）。他の適切な宿主細胞は当業者には公知である。
【００５５】
ベクターDNAは、通常の形質転換又はトランスフェクション技術による原核細胞又は真核細胞に導入することができる。本明細書で用いられる、“形質転換”及び“トランスフェクション”という用語は、外来核酸（例えばDNA）を宿主細胞に導入するための多様な特殊技術として認知された技術を指し、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈、DEAE-デキストラン仲介トランスフェクション、リポフェクチン又はエレクトロポレーションが含まれるが、バイオリスティクス又はウイルス依存トランスフェクションは他の細胞宿主に用いることができる。哺乳動物細胞を形質転換するために用いられる他の方法には、ポリブレンの使用、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション及びマイクロインジェクションが含まれる（一般的にはSambrookらの“Molecular Cloning”を参照されたい）。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするために適した方法は、以下の著書（Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989）又は他の実験室マニュアルで見出すことができる。問題のDNAセグメントを含むベクターは、細胞宿主のタイプに応じてよく知られた方法によって宿主細胞に移すことができる。
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのためには、用いられる発現ベクター及びトランスフェクション技術に応じて、わずかな部分の細胞のみが外来DNAをそれらのゲノムに組み込むことができることが知られている。これらの組み込み体を同定し選別するために、選別可能なマーカー（例えば抗生物質耐性）をコードする遺伝子が一般的に問題の遺伝子と一緒に宿主細胞に導入される。多様な選別可能マーカーには、薬剤（例えばG418、ヒグロマイシン及びメトトレキセート）に対する耐性を付与するものが含まれる。選別可能マーカーをコードする核酸は、TRAILレセプター結合因子をコードするベクターと同じベクターで宿主細胞に導入することができるが、或いは別々のベクターで導入してもよい。導入核酸で安定的にトランスフェクトされた細胞は薬剤選別によって同定することができる（例えば選別可能マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【００５６】
本発明のTRAILレセプター結合因子を含む宿主細胞（例えば原核細胞又は真核細胞培養）を用いて、組換えTRAILレセプター結合因子を生成する（すなわち発現させる）ことができる。ある実施態様では、前記方法は、TRAILレセプター結合因子が産生されるように適切な培養液中で本発明の宿主細胞（TRAILレセプター結合因子をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養する工程を含む。別の実施態様では、前記方法はさらに、TRAILレセプター結合因子を培養液又は宿主細胞から単離する工程を含む。いったん発現されたら、TRAILレセプター結合因子（例えば抗TRAILレセプター抗体又は抗TRAILレセプター関連ポリペプチド）の収集物を培養液又は宿主細胞から精製する。TRAILレセプター結合因子は標準的な方法にしたがって精製することができ、前記方法には、HPLC精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などが含まれる。ある実施態様では、TRAILレセプター結合因子は、米国特許4,816,397号（Boss et al.）の方法にしたがって宿主生物で産生される。通常は、抗TRAILレセプター抗体鎖はシグナル配列とともに発現され、したがって培養液中に放出される。しかしながら、抗TRAILレセプター抗体鎖が自然に宿主細胞によって分泌されない場合は、穏やかな界面活性剤による処理によって抗TRAILレセプター抗体鎖を遊離させることができる。組換えポリペプチドの精製は当分野ではよく知られており、硫安沈殿、アフィニティクロマトグラフィー精製技術、カラムクロマトグラフィー、イオン交換精製技術、ゲル電気泳動などが含まれる（一般的には以下を参照されたい：“Protein Purification”（Scopes, Springer-Verlag, N.Y., 1982））。
TRAILレセプター結合因子をコードする配列（例えば抗TRAILレセプター抗体コード配列）は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入のために導入遺伝子に取り込ませ、続いてトランスジェニック動物のミルク中での発現させることができる（例えば米国特許5,741,957号、同5,304,489号及び同5,849,992号を参照されたい）。適切な導入遺伝子は、乳腺特異的遺伝子（例えばカゼイン又はβ-ラクトグロブリン）由来のプロモーター及びエンハンサーに作動できるように連結された軽鎖及び／又は重鎖のコード配列を含む。トランスジェニック動物の作製のために、導入遺伝子を受精卵母細胞にマイクロインジェクトするか、或いは胚性幹細胞のゲノムに取り込ませ、そのような細胞の核を脱核した卵母細胞に移入することができる。
【００５７】
単鎖抗体：
ある実施態様では、本発明の結合因子は単鎖抗TRAILレセプター抗体である。本発明にしたがえば、複数の技術をTRAILレセプターポリペプチドに特異的な単鎖抗体の製造に応用することができる（例えば米国特許4.946,778号を参照されたい）。本発明の単鎖Fv及び抗体の製造に用いることができる技術の例には、以下の文献に記載された技術が含まれる：米国特許4,946,778号及び5,258,498号；Huston et al. Methods in Enzymology 1991, 203:46-88；L. Shu et al. Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90:7995-7999；及びSkerra et al. Science 1998, 240:1038-1040。
【００５８】
キメラ抗体及びヒト化抗体：
ある実施態様では、本発明の結合因子はキメラ抗TRAILレセプター抗体である。ある実施態様では、本発明の結合因子はヒト化抗TRAILレセプター抗体である。本発明のある実施態様では、ドナー及びアクセプター抗体は異なる種に由来するモノクローナル抗体である。例えば、アクセプター抗体はヒト抗体であり（ヒトにおけるその抗原性を最少にするため）、この場合には得られるCDR移植抗体は“ヒト化”抗体と称される。
組換え抗TRAILレセプター抗体（例えばキメラ及びヒト化モノクローナル抗体、前記はヒト部分及び非ヒト部分の両方を含む）は、標準的な組換えDNA技術を用いて作製することができ、本発明の範囲内である。いくつかの使用（本発明の結合因子のヒトでのin vivo使用とともにin vitro検出アッセイもおけるこれらの物質の使用を含む）のためには、キメラ、ヒト化、又はヒト抗TRAILレセプター抗体を使用することが好ましい。そのようなキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は当分野で公知の組換えDNA技術によって製造することができる。そのような有用な方法には、例えば以下に記載されている方法が含まれる（ただしこれらに限定されない）：国際出願PCT/US86/02269；米国特許5,225,539号；欧州特許184187号、同171496号；欧州特許173494号；PCT国際公開WO86/01533；米国特許4,816,567号；同5,225,539号；欧州特許125023号；Better et al. Science 1988, 240:1041-1043；Liu et al. Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84:3439-3443；Liu et al. J Immunol 1987, 139:3521-3526；Sun et al. Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84:214-218；Nishimura et al. Cancer Res 1987, 47:999-1005；Wood et al. Nature 1985, 314:446-449；Shaw et al. J Natl Cancer Inst 1988, 80:1553-1559；Morrison Science 1985, 229:1202-1207；Oi et al. BioTechniques 1986, 4:214；Jones et al. Nature 1986, 321:552-525；Verhoeyan et al. Science 1988, 239:1534；Morrison, Science 1985, 229:1202；Oi et al. BioTechniques 1986, 4:214；Gillies et al. J Immunol Methods 1989, 125:191-202；米国特許5,807,715号；及びBeidler et al. J Immunol 1988,141:4053-4060。例えば、抗体は以下を含む多様な技術を用いてヒト化することができる：CDR移植（EP0239400；WO91/09967；米国特許5,530,101号；同5,585,089号；同5,859,205号；同6,248,516号；EP460167）、表面加工又は表面再生（EP059106；EP0519596；E.A. Padlan Molecular Immunology 1991, 28:489-498；Studnicka et al. Protein Engineering 1994, 7:805-814；Roguska et al. PNAS 1994, 91:969-973）、及びチェーンシャッフリング（米国特許5,565,332号）。ある実施態様では、特にFc定常領域をコードする配列を除去するために選択した制限酵素で、マウス抗TRAILレセプターモノクローナル抗体をコードするcDNAを消化し、ヒトFc定常領域をコードするcDNAの等価部分で代用する（以下を参照されたい：PCT/US86/02269（Robinson et al.）；欧州特許出願184,187号（Akira et al.）；欧州特許出願171,496号（Taniguchi）；欧州特許出願173,494号（Morrison et al.）；WO86/01533（Neuberger et al.）；米国特許4,816,567号（Cabilly et al.）；欧州特許出願125,023号（Cabilly et al.）；Better et al. Science, 1988, 240:1041-1043；Liu et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84:3439-3443；Liu et al. J Immunol 1987, 139:3521-3526；Sun et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84:214-218；Nishimura et al. Cancer Res 1987, 47:999-1005；Wood et al. Nature 1985, 314:446-449；及びShaw et al. J Natl Cancer Inst, 1988, 80:1553-1559；米国特許6,300,064号；同6,696,248号；同6,706,484号；同6,828,422号。
ある実施態様では、本発明は、抗マウスヒト抗体（以下では“HAMA”と称する）応答を誘導しないが、有効な抗体エフェクター機能をなお保持するヒト化抗TRAILレセプター抗体の構築を可能にする。本明細書で用いられる、抗体に関して“ヒト”及び“ヒト化”という用語は、ヒト対象において治療的に容認できる程度の弱い免疫原性応答を誘引すると思われる任意の抗体に関する。ある実施態様では、本発明は、ヒト化TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2二重特異的抗体、CTB003又はhCTB003重鎖及び軽鎖免疫グロブリンを提供する。
【００５９】
CDR抗体：
ある実施態様では、本発明の結合因子は抗TRAILレセプターCDR抗体である。一般的には、抗TRAILレセプターCDR抗体を作製するために用いられるドナー及びアクセプター抗体は、異なる種に由来するモノクローナル抗体である。典型的にはアクセプター抗体はヒト抗体であり（ヒトにおける抗原性を最少にするために）、この場合、得られるCDR移植抗体は“ヒト化”抗体と称される。移植物は、アクセプター抗体のただ1つのVH又はVL内のただ1つのCDR（又はその部分でもよい）であってもよいが、一方又は両方のVH又はVL内の多様なCDRであってもよい。しばしば、アクセプター抗体の全ての可変ドメイン内の3つのCDR全てが対応するドナーCDRで置き換えられるが、ただし得られるCDR移植抗体とMetAp3との適切な結合に必要な数だけ置換することができる。CDR移植及びヒト化抗体を作製する方法は以下で教示される：米国特許5,585,089号、同5,693,761号（Queen et al.）；米国特許5,693,762号；米国特許5,225,539号；及びEP0682040。VH又はVLポリペプチドを調製するために有用な方法は以下で教示される：米国特許4,816,397号（Winter et al.）；同6,291,158号；同6,291,159号；同6,291,161号；同6,545,142号；EP0368684；EP0451216；EP0120694。
同じファミリー及び／又は同じファミリーメンバー由来の適切なフレームワーク領域を選択した後、本来の種に由来するCDRをハイブリッドフレームワーク領域に移植することによって重鎖及び軽鎖の可変領域の一方又は両方を作製する。上記の態様のいずれかに対応するハイブリッド可変鎖領域を有するハイブリッド抗体又はハイブリッド抗体フラグメントのアッセンブリーは、当業者に公知の通常的な方法を用いて達成することができる。例えば、本明細書に記載のハイブリッド可変ドメイン（すなわち標的種のフレームワークおよび本来の種由来のCDR）をコードするDNA配列は、オリゴヌクレオチド合成及び／又はPCRによって作製することができる。CDR領域をコードする核酸はまた適切な制限酵素を用いて本来の種の抗体から単離し、適切な連結酵素を用いて連結することによって標的種のフレームワークに連結することができる。また別には、本来の種の抗体の可変鎖のフレームワーク領域を位置特異的変異導入により変異させることができる。
ハイブリッドは各フレームワーク領域に対応する多様な候補物から選択されたものから構築されるので、本明細書に記載の原則に従って構築することができる多くの配列の組合せが存在する。したがって、個々のフレームワークの種々の組合せによるメンバーを含むハイブリッドライブラリーを組み立てることができる。そのようなライブラリーは配列収集物の電子データベースであってもハイブリッドの物理的収集物であってもよい。
このプロセスは典型的には、移植されたCDRにフランキングするアクセプター抗体のFRを変化させない。しかしながら、当業者は、与えられたFRのある種の残基を置き換えてドナー抗体の対応するFRにいっそう類似させることによって、得られた抗TRAILレセプターCDR移植抗体の抗原結合親和性をときに改善することができる。置換の好ましい場所には、CDRに隣接するアミノ酸残基、又はCDRと相互作用することができる残基が含まれる（例えば米国特許5,585,089号の特に12−16段を参照されたい）。当業者はドナーFRから始めて、それをアクセプターFR又はヒトコンセンサスFRにより類似させるべく改変することができる。そのような改変を実施する技術は当分野で公知である。特に、得られたFRが当該位置についてヒトコンセンサスFRと一致するか、又はそのようなコンセンサスFRと少なくとも90％以上同一であるならば、得られた改変抗TRAILレセプターCDR抗体の抗原性は、完全にヒトのFRをもつ同じ抗体と比較して有意には増加しないであろう。
【００６０】
融合タンパク質：
ある実施態様では、本発明の結合因子は融合タンパク質である。本発明のTRAILレセプター結合因子は、第二のタンパク質と融合したとき、抗原性タグとして用いることができる。ポリペプチドと融合させることができるドメインの例には、異種シグナル配列だけでなく他の機能性異種領域が含まれる。融合は必ずしも直結的である必要はなく、リンカー配列を介してもよい。さらにまた、本発明の融合タンパク質は、TRAILレセプター結合因子の性状を改善するために操作してもよい。例えば、追加のアミノ酸、特に荷電をもつアミノ酸の領域をTRAILレセプター結合因子のN-末端に付加して、宿主細胞から精製している間又はその後の操作及び保存時の安定性及び持続性を改善することができる。さらにまた、ペプチド部分をTRAILレセプター結合因子に付加して精製を促進することができる。そのような領域はTRAILレセプター結合因子の最終調製の前に取り除くことができる。ポリペプチドの操作を容易にするポリペプチド部分の付加は当分野では知られており、日常的な技術である。本発明のTRAILレセプター結合因子は、マーカー配列、例えば融合ポリペプチドの精製を促進するペプチドと融合させることができる。好ましい実施態様では、マーカーアミノ酸配列はヘキサヒスチジンペプチドである（とりわけ、例えばpQEベクター（QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311）で提供されるタグであり、それらの多くは市場で入手することができる）。例えば、Gentzら（Proc Natl Acad Sci USA 1989, 86:821-824）が記載しているように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な別のペプチドタグ、“HA”タグはインフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する（Wilson et al. Cell 1984, 37:767）。
したがって、これら上記の融合のいずれも本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドを用いて操作することができる。さらにまた、融合タンパク質はin vivoでの半減期の延長を示すことができる。
ジスルフィド結合したダイマー構造を有する（IgGのため）融合タンパク質は、モノマーの分泌タンパク質又はタンパク質フラグメント単独よりも他の分子との結合および中和がより効率的である（Fountoulakis et al. J Biochem 270:3958-3964, 1995）。
同様に、EP-A-O464533（カナダの対応出願2045869）は、免疫グロブリン分子定常領域の種々の部分を別のヒトタンパク質又はその部分とともに含む融合タンパク質を開示している。多くの事例で、融合タンパク質のFc部分は治療及び診断に有益であり、したがって、例えば薬理学特性の改善をもたらしえる（EP-A-0232262参照）。また別には、融合タンパク質を発現し、検出しさらにこれを精製した後で、Fc部分の欠失が所望されよう。例えば、融合タンパク質が免疫様抗原として用いられる場合、Fc部分は治療及び診断を妨げる可能性がある。薬剤探索で、例えばヒトタンパク質（例えばhIL-5）が、hIL-5のアンタゴニストの同定のために高処理スクリーニングアッセイを目的としてFc部分と融合された（Bennett et al. J Molecular Recognition 1995, 8:52-58；Johanson et al. J Biol Chem 1995, 270:9459-9471）。
【００６１】
T細胞エピトープの改変による治療用タンパク質の脱免疫：
臨床で使用される多くの治療用タンパク質は、望まない抗体応答を誘引することが示され、いくつかの事例では、そのような応答は副作用と連携していた。本発明のある実施態様では、組換え抗TRAILレセプター抗体、TRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター結合因子は、与えられた種のT細胞に対する1つ以上の潜在的エピトープをそれらのアミノ酸配列において同定し、さらにアミノ酸配列を改変することにより前記T細胞エピトープの少なくとも1つを除去することによって、与えられた種に対する免疫原性を失わせるか又は低下させられる。これによって、与えられた種の免疫系へ暴露したとき、前記ポリペプチド又はタンパク質の免疫原性は除去されるか又は低下する。モノクローナル抗体及び他の免疫グロブリン様分子はこのようにして特に脱免疫から利益を享受することができ、例えば、マウス由来免疫グロブリンを人間の治療に使用するために脱免疫することができる。当分野でのポリペプチド又はタンパク質の脱免疫のための方法については、例えば以下を参照されたい：米国特許出願20030153043号（Carr et al.）；De Groot et al. AIDS Res and Human Retroviruses 1997, 13:539-541；Schafer et al. Vaccine 1998, 16:1880-1884；De Groot et al. Dev Biol 2003, 112:71-80；De Groot et al. Vaccine 2001, 19:4385-4395；Reijonen and Kwok, Methods, 29:282-288；Novak et al. J Immunology 2001, 166:6665-6670。
ある実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子は、融合タンパク質の部分として候補結合因子をコードするゲノムDNA又はESTを用いて調製される（前記融合タンパク質は宿主細胞内での発現に際して封入体を形成する）。宿主細胞内での発現に際して封入体を形成する融合タンパク質の部分として結合タンパク質をコードするゲノムDNA又はESTを調製するために有用な方法は既に記載されている（米国特許6,653,068号；U.S.S.N 20040157291を参照されたい）。例えば、封入体は、標的（ポリ）ペプチドと特異的に結合する結合パートナー（例えばTRAILレセプター結合因子）の作製に有用である。
【００６２】
TRAILレセプター結合因子コンジュゲートタンパク質：
上記に特記したように、ある種の好ましい実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子は、1つ以上の治療用又は細胞傷害性部分と結合又は複合体化されて、本発明のTRAILレセプター結合因子コンジュゲートタンパク質を生じる。場合によって、本発明のTRAILレセプター結合因子は、新形成性疾患の治療のために投与することによって実証されるように、TRAILレセプター結合因子細胞傷害性コンジュゲートタンパク質として有用である。
一般的には、治療用部分は、本発明のTRAILレセプター結合因子と、薬剤動力学的安定性及び対象者に対する全体的毒性の軽減に対する要請を考慮しながら、例えば任意の適切な技術によって複合体化することができる。治療用薬剤、細胞傷害性薬剤、又は標識／画像化薬剤（すなわち“部分”）は、適切なTRAILレセプター結合因子と直接的又は間接的に（例えばリンカー基を介する）結合させることができる。部分とTRAIL結合因子との間の直接的反応は、各々が互いに反応することができる官能基を有するときに可能である。例えば、救核基（例えばアミノ基又はスルホヒドリル基）は、カルボニル含有基（例えば無水物又は酸ハロゲン化物）と、又は良好な脱離基（例えばハロゲン化物）を含むアルキル基と反応することができる。また別には、適切な化学的リンカー基を用いてもよい。リンカー基はスペーサーとして機能し、TRAILレセプター結合因子を部分から離し、結合能力の干渉を避けることができる。リンカー基はまた、部分又はTRAILレセプター結合因子上の置換基の化学反応性を高め、したがって結合効率を高めることができる。化学的反応性の増加はまた、部分又は部分の官能基の利用を促進することができる（化学反応性の増加がなければそれらは利用されないであろう）。
適切な結合化学には、マレイミジルリンカー及びハロゲン化アルキルリンカー（前記は抗体部分のスルホヒドリルと反応する）、及びスクシンイミジルリンカー（前記は抗体部分の第一アミンと反応する）が含まれる。いくつかの第一アミンとスルホヒドリル基は免疫グロブリン上に存在し、さらに追加される基は組換え免疫グロブリン分子内部に設計することができる。多様な二官能性、又は多官能性試薬、ホモ及びヘテロ官能性の両方（例えばピアースケミカル社（Pierce Chemical Co., Rockford, Ill）のカタログに掲載されているもの）をリンカー基として利用することができることは当業者には明らかであろう。結合は、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルホヒドリル基又は酸化された炭水化物残基を介して影響されえる（例えば米国特許4,671,958号を参照されたい）。
また別の結合方法として、本発明のTRAILレセプター結合因子に部分を、米国特許5,057,313号及び5,156,840号に記載されているように、例えばグリコシル化部位に酸化炭水化物基を介して結合させることができる。TRAILレセプター結合因子と部分とのさらにまた別の結合方法は、非共有結合対（例えばストレプトアビジン／ビオチン又はアビジン／ビオチン）の使用による。これらの実施態様では、結合対の一方のメンバーは、TRAILレセプター結合因子と共有結合し、結合対の他方のメンバーは部分と共有結合する。
【００６３】
切断可能リンカー：
本発明の免疫複合体のTRAILレセプター結合因子部分から遊離したときに、細胞傷害性部分又は治療用部分がより強力である場合は、細胞内で又は細胞内に局在化されたときに切断されえるか、或いは細胞外環境で時間をかけて徐々に切断されえるリンカー基を使用することが望ましい。多数の種々の切断可能なリンカー基が記載されている。これらリンカー基から細胞傷害性部分を細胞内に遊離させる例には、例えば、ジスルフィド結合の還元による切断（例えば米国特許4,489,710号を参照されたい）、光分解性結合の照射（例えば米国特許4,625,014号）、誘導アミノ酸側鎖の加水分解（例えば米国特許4,638,045号）、血清補体仲介加水分解（例えば米国特許4,671,958号）、及び酸触媒加水分解（例えば4,569,789号）による切断が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
ある実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子は1つ以上の治療用部分、細胞傷害性部分及び／又は画像化部分と結合される。本発明のTRAILレセプター結合因子の多重誘導体化によって、いくつかの細胞傷害方法を同時に実施することが可能であり、TRAILレセプター結合因子を可視化技術のためのコントラスト剤として有用にし、或いは可視化技術による追跡のために治療用抗体に標識を付加することができる。ある実施態様では、細胞傷害性部分をもつ多数の分子が1つのTRAILレセプター結合因子に結合される。ある実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子は、細胞傷害性部分、治療用部分、及び標識／画像化部分から成る群から選択される少なくとも2つの部分の混合物と結合される。すなわち、1つ以上のタイプの部分を1つのTRAILレセプター結合因子に結合させることができる。例えば、治療用部分（例えばポリヌクレオチド又はアンチセンス配列）を、ケモトキシン部分又は放射性毒素部分と一緒にTRAILレセプター結合因子に結合させることができ、化学療法又は放射線療法の有効性を高めるだけでなく、所望の治療効果を得るために必要な投与量を減少させることができる。具体的な実施態様に関係なく、1つ以上の部分との免疫複合体は多様な方法で製造することができる。例えば、1つ以上の分子をTRAILレセプター結合因子と直接結合させることができるが、或いは結合のために多重部位を提供するリンカー（例えばデンドリマー）を用いてもよい。また別には、1つ以上の細胞傷害性部分を保持する能力を有する担体を用いてもよい。
上記で説明したように、TRAILレセプター結合因子は、共有結合（直接的又はリンカー基を介して）及び非共有結合を含む多様な方法で前記部分を保持することができる。ある実施態様では、TRAILレセプター結合因子結合タンパク質は被包化担体と結合させることができる。これは、特に、ケモトキシン治療薬による実施態様で有用である。なぜならば、それらは、治療組成物が時間をかけて徐々にTRAILレセプター結合因子のケモトキシン部分を遊離させ、一方、標的細胞近傍では濃縮されることを可能にするからである。
【００６４】
放射性核種と複合体化したTRAILレセプター結合因子：
ある実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子は、放射性核種である細胞傷害性部分と結合される。本発明の細胞傷害性部分として使用される好ましい放射性核種は薬理学的投与に適した核種である。そのような放射性核種には、123I、125I、131I、90Y、211At、67Cu、186Re、188Re、212Pb、及び212Biが含まれる。ヨウ素及びアスタチン同位元素は、本発明の治療用組成物での使用に好ましい放射性核種である。なぜならば、それらの使用について大量の文献が蓄積されているからである。131I（数ミリメートルの有効範囲を有する）は、他のβ線放射核種の中では特に好ましい。123I、125I、131I、又は211Atは、いくつかの公知のコンジュゲーション試薬（ロドゲン、N-スクシンイミジル3-[211At]アスタトベンゾエート、N-スクシンイミジル3-[131I]ヨードベンゾエート（SIB）、及びN-スクシンイミジル5-[131I]ヨード-3-ピリジンカルボキシレート（SIPC）を含む）のいずれかを利用する組成物及び方法で使用するTRAILレセプター結合因子と複合体化することができる。いずれのヨウ素同位元素も列挙したヨード試薬で用いることができる。他の放射性核種は、核医学分野の業者に公知の適切なキレート化剤によって本発明のTRAILレセプター結合因子と複合体化することができる。
【００６５】
ケモトキシン部分：
ある実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子は、ケモトキシン部分と結合される。本発明で有用な好ましい毒性化学物質には、小分子薬剤（例えばメトトレキセート）並びにピリミジン及びプリン類似体が含まれるが、ただしこれらに限定されない。好ましいケモトキシン分化誘導物質にはフォルボールエステル及び酪酸が含まれる。ケモトキシン部分は本発明のTRAILレセプター結合因子に直接結合させることができる。ある実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子は化学的リンカーを介して細胞傷害性部分と結合される。別の実施態様では、部分は担体内に被包化され、続いて本発明のTRAILレセプター結合因子と結合される。
【００６６】
タンパク質毒素：
ある実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子はタンパク質毒素部分と結合される。本発明の細胞傷害性部分として使用するために好ましい毒素タンパク質には、例えばアクチノミセス属又はストレプトミセス属の抗生物質、デュオカルミシン、タキソール、サイトケラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトプシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（dihydoroxy anthracin didne）、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、並びにピューロマイシン及びその類似体又は同族体が含まれるが、ただしこれらに限定されない。細胞傷害性部分としての使用に好ましい毒素タンパク質には、さらにリシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、シュードモナス外毒素、赤痢菌毒素、アメリカヤマゴボウの抗ウイルスタンパク質、及び薬剤生化学分野で公知の他の毒素タンパク質が含まれる。これらの毒性薬剤は、特に静脈内注射された場合に、対象動物で望ましくない免疫応答を引き起こしえるので、本発明のTRAILレセプター結合因子（例えば本発明の抗TRAILレセプター抗体及び抗体関連ポリペプチド）と結合させるためにはそれらを担体中に被包化することが好ましい。
【００６７】
酵素的に活性な毒素：
ある実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子は酵素的に活性な毒素と結合される。前記酵素的に活性な毒素は、細菌由来又は植物由来であるか、又はそのような毒素の酵素的に活性なフラグメント（“A鎖”）であってもよい。本発明で有用な酵素的に活性な毒素及びそのフラグメントはジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、エキソトキシンA鎖（シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンA鎖、アルビンA鎖、モデクシン（modeccin）A鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォルディイ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンシン（dianthin）タンパク質、フィトラッカ・アメリカーナ（Phytolacca americana）タンパク質（PAPI、PAPII及びPAP-S）、モモルディカ・シャランチア（Momordica charantia）インヒビター、クルシン（curcin）、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（Sapaonaria officinalis）インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノミシン、及びエノミシンである。本発明のTRAILレセプター結合因子と細胞傷害性部分との複合体は、多様な二官能基性タンパク質結合因子を用いて作製される。そのような試薬の例は、SPDP、IT、イミドエステルの二官能基誘導体（例えば塩酸ジメチルアジピミデート）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えばビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン、ビス-ジアゾニウム誘導体（例えばビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン、ジイソシアネート（例えばトリレン2,6-ジイソシアネート、及びビス-活性フッ素化合物（例えば1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン）である。毒素の溶解部分は、抗体（例えばTRAILレセプター結合因子）のFabフラグメントと結合させることができる。
【００６８】
治療薬部分：
ある実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子は治療薬部分と結合される。本発明の治療薬部分には、例えば抗代謝薬（例えばメトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン）、アルキレート化剤（例えばメクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（BSNU）及びロムスチン（CCNU）、シクロソスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、及びcis-ジクロロジアミンプラチナム（II）（DDP、シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前にはダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前にはアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミスラマイシン及びアントラマイシン（AMC））、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン、ブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミドヒドロキシウレア又はリシンA、及び抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
そのような治療薬部分を本発明のTRAILレセプター結合因子に複合体化する技術は知られており、例えば以下を参照されたい：Arnon et al. “Monoclonal Antibodies Fro Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al.(eds.), pp.243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstrom et al. “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al.(eds.), pp.623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe, “Antibody Cariers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp.475-506 (1985)；“Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, In Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp.303-16 (Academic Press 1985)；及びThorpe et al. “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol Rev 1982, 62:119-58。
【００６９】
標識TRAILレセプター結合因子：
ある実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子は標識部分（すなわち検出可能基）と結合される。本発明のTRAILレセプター結合因子と複合体化される個々の標識又は検出可能基は、前記が本発明のTRAILレセプター結合因子とTRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドとの特異的な結合を顕著に妨げない限り、本発明の重要な特徴ではない。検出可能基は、検出可能な物理的又は化学的特性を有する任意の物質でありえる。そのような検出可能な標識は免疫アッセイ及び画像化の分野ではよく開発されてあり、一般的には、そのような方法で有用ないずれの標識もほぼ本発明に応用することができる。したがって、標識は、分光分析的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、又は化学的手段によって検出可能な任意の組成物である。本発明で有用な標識には、磁性ビーズ（例えばDynabeadsTM）、蛍光色素（例えばフルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば3H、14C、35S、125I、121I、112In、99mTc）、他の画像化剤（例えばマイクロバブル（超音波画像化用））、18F、11C、15O（陽電子放出断層撮影法用）、99mTc、111In（単光子放出断層撮影法用）、酵素（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ及び他のELISAで一般的に用いられるもの）、比色標識（例えば金コロイド又は着色ガラス若しくはプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズ）が含まれる。そのような標識の使用を記載している特許には以下が含まれる（その各々は参照によりその全体が全ての目的のために本明細書に含まれる）：米国特許3,817,837号、同3,850,752号、3,939,350号、3,996,345号、4,277,437号、4,275,149号、及び4,366,241号。さらに下記著書も参照されたい：Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals（6th Ed., Molecular Probes, Inc., Eugene OR）。
標識は、当分野でよく知られた方法にしたがって、アッセイの所望の成分に直接的又は間接的に結合させることができる。上記に示したように、多様な標識を用いることができ、標識は、要求される感度、化合物との結合の容易さ、安定性要件、利用可能な装置、及び任意の条件に応じて選択される。
【００７０】
非放射性標識は、しばしば間接的手段によって結合される。一般的には、リガンド分子（例えばビオチン）は分子に共有結合される。続いてリガンドは抗リガンド（例えばアビジン）分子と結合する。前記抗リガンド分子は、固有の特性により検出されるか、或いはシグナル系（例えば検出可能な酵素、蛍光化合物又は化学発光化合物）と共有結合される。多数のリガンド及び抗リガンドを用いることができる。リガンドが天然の抗リガンド（例えばビオチン、チロキシン及びコーチゾル）を有する場合、前記リガンドを標識した天然に存在する抗リガンドと一緒に用いることができる。また別には、任意のハプテン化合物又は抗原性化合物を、抗体（例えば抗TRAILレセプター抗体）と組み合わせて用いることができる。
分子はまた、酵素又は蛍光発光団との結合によりシグナル発生化合物に直接的に結合させてもよい。標識として有益な酵素は、主としてヒドロラーゼ（特にホスファターゼ、エステラーゼ及びグリコシダーゼ）又はオキシドレダクターゼ（特にペルオキシダーゼ）であろう。標識部分として有用な蛍光化合物には、例えばフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。標識部分として有用な化学発光化合物には、例えばルシフェリン及び2,3-ジヒドロフタラジンジオン（例えばルミノール）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。用いることができる多様な標識又はシグナル発生系の概説については、米国特許4,391,904号を参照されたい。
【００７１】
標識を検出する手段は当業者にはよく知られている。したがって、例えば、標識が放射能性標識である場合は、検出手段は、オートジオグラフィーの場合のようにシンチレーションカウンター又は写真用フィルムを含む。標識が蛍光標識の場合、適切な波長の光で蛍光色素団を励起し生じた蛍光を検出することにより検出される。蛍光は、写真フィルムの手段によって、電子的検出装置（例えば電荷カップル装置（CCD）又は光増幅装置など）の手段によって視覚的に検出することができる。同様に、酵素標識は、酵素に適した基質を提供し、生じた反応生成物を検出することによって検出することができる。最後に、単純な比色標識は、標識に付随する色を簡単に検出することができる。したがって、多様なディップスティックアッセイでは、金複合体はピンクの外観を示し、一方、ビーズコンジュゲートはビーズの色を示す。
いくつかのアッセイ様式は標識成分の使用を要求しない。例えば、凝集アッセイは、標的抗体（例えば抗TRAILレセプター抗体）の存在を検出するために用いることができる。この事例では、抗原被覆粒子は標的抗体を含むサンプルによって凝集される。この様式では、成分のいずれも標識する必要はなく標的抗体の存在は単純な肉眼精査によって検出される。
【００７２】
医薬組成物の処方：
本発明のTRAILレセプター結合因子は、投与に適した医薬組成物に取り込むことができる。医薬組成物は、一般的には少なくとも1つのTRAILレセプター結合因子及び対象者への投与に適した形状の医薬的に許容できる担体を含む。医薬的に許容できる担体は、部分的には、組成物の投与に用いられる具体的な方法と同様に、投与される具体的な組成物によって決定される。したがって、抗体組成物を投与することを目的とする医薬組成物の極めて多様な適切な処方が存在する（例えば以下を参照されたい：Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA 18th ed., 1990）。医薬組成物は一般的には、無菌的で実質的に等張であるように、かつ米国食品医薬局のグッドマニュファクチャリングプラクティス（GMP）を順守して処方される。
“医薬的に許容できる”、“生理学的に許容できる”という用語及び前記の文法的な変型は、それらが組成物、担体、希釈剤及び試薬を指すときは、相互に用いられ、投与を禁止する程度に望ましくない生理学的影響の発生をもたらすことなく対象者にそれら物質を投与できることを示す。例えば、“医薬的に許容できる賦形剤”は、一般的に安全で毒性がない望ましい医薬組成物の製造に有用な賦形剤を意味し、人間用医薬用途と同様に獣医用用途のためにも許容可能な賦形剤が含まれる。そのような賦形剤は個体、液体、半固体であり、エーロゾル組成物の場合はガス状である。“医薬的に許容できる塩及びエステル”は、医薬的に許容でき、所望の薬理学的特性を有する塩及びエステルを意味する。そのような塩には、TRAILレセプター結合因子に存在する酸性陽子が無機又は有機塩基と反応することができる場合に形成されえる塩が含まれる。適切な無機塩には、アルカリ金属、例えばナトリウム及びカリウム、マグネシウム、カルシウム及びアルミニウムにより形成されるものが含まれる。適切な有機塩には、有機塩基、例えばアミン塩基（例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、N-メチルグルカミンなど）により形成されるものが含まれる。そのような塩にはまた、無機酸（例えば塩酸及び臭化水素酸）及び有機酸（例えば酢酸、クエン酸、マレイン酸、並びにアルカン-及びアレーン-スルホン酸、例えばメタンスルホン酸及びベンゼンスルホン酸）により形成される酸付加塩が含まれる。医薬的に許容できるエステルには、TRAILレセプター結合因子に存在するカルボキシ、スルホニルオキシ、及びホスホノキシ基から形成されるエステル、例えばC1-6アルキルエステルが含まれる。2つの酸性基が存在するとき、医薬的に許容できる塩又はエステルは一酸一塩若しくはエステル又は二塩若しくはエステルでありえる。同様に3つ以上の酸性基が存在する場合は、そのような基のいくつか又は全てが塩化又はエステル化されえる。本発明に記載のTRAILレセプター結合因子は、非塩化若しくは非エステル化形、又は塩化及び／又はエステル化形で存在することができ、そのようなTRAILレセプター結合因子の名称は、本来の（非塩化及び非エステル化）化合物及びその医薬的に許容できる塩及びエステルの両方を含むことが意図される。さらにまた、本発明に記載のある種のTRAILレセプター結合因子は、2つ以上の立体異性型として存在することができ、そのようなTRAILレセプター結合因子の名称は、全ての単一立体異性体及び前記立体異性体の全混合物（ラセミ体又はその他の形態に関係なく）を含むことが意図される。当業者は、本発明の個々の薬剤及び組成物の投与に関して適切なタイミング、反復及び投与量の決定に困難を感じないであろう。
そのような担体又は希釈剤の好ましい例には、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液及び5％ヒト血清アルブミンが含まれるが、ただしこれらに限定されない。リポソーム及び非水性ベヒクル、例えば固定油もまた用いることができる。医薬的に活性な物質のためにそのような媒体及び化合物を使用することは当分野でよく知られている。任意の一般的な媒体又は化合物がTRAILレセプター結合因子と不適合でない限り、組成物におけるそれらの使用は予想される。
【００７３】
本発明の医薬組成物は、その意図する投与ルートに適合するように処方される。本発明のTRAILレセプター結合因子の組成物は、非経口的、局所的、静脈内、経口的、皮下、動脈内、皮内、経皮的直腸、頭蓋内、腹腔内、鼻内、筋肉内ルートによって、又は吸入物として投与することができる。免疫原性物質、例えばTRAILレセプターポリペプチドのもっとも典型的な投与ルートは皮下であるが、他のルートも等しく有効である。次に一般的なルートは筋肉内注射である。このタイプの注射はもっとも一般的には腕又は脚の筋肉内に実施される。本発明のいくつかの方法では、物質は、沈着物が蓄積した特定の組織内に直接注射される（例えば頭蓋内注射）。筋肉内注射又は静脈内輸液は、TRAILレセプター結合因子（例えば抗TRAILレセプター抗体）の投与のために好ましい。いくつかの方法では、本発明の個々のTRAILレセプター結合因子は頭蓋内に直接注射される。いくつかの方法では、本発明のTRAILレセプター結合因子は、徐放性組成物又は装置（例えばMedipadTM装置）として投与される。
本発明のTRAILレセプター結合因子は、場合によって他の物質と組み合わせて投与することができる。前記他の物質は、多様なTRAILレセプター関連疾患を含む種々の疾患の治療に少なくとも部分的に有効な物質である。対象者の中枢神経系に投与する場合には、本発明のTRAILレセプター結合因子はまた、本発明の物質の血液-脳関門の通過を高める他の物質と組み合わせて投与することができる。
非経口、皮内又は皮下適用に用いられる溶液又は分散液は以下の成分を含むことができる：無菌的希釈剤、例えば注射用の水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、ポリプロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗菌化合物、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウム；キレート化合物、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）；緩衝液、例えば酢酸、クエン酸又はリン酸緩衝液、及び張度調節のために化合物、例えば塩化ナトリウム又はデキストロース。pHは酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムで調節することができる。非経口調製物は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射筒又はマルチ用量バイアルに封入することができる。
注射可能な使用に適した医薬組成物には、無菌的水溶液（水溶性の場合）若しくは分散液、及び無菌的注射可能溶液若しくは分散液の即席調製物のための無菌的散剤が含まれる。静脈内投与の場合、適切な担体には、生理学的食塩水、制菌水（Cremophor ELTM（BASF, Parsippany, NJ）又はリン酸緩衝食塩水（PBS）が含まれる。全ての事例で、組成物は無菌的でなければならず、容易な注射筒操作性が得られる程度に流動的であるべきである。組成物は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、微生物（例えば細菌及びカビ）の夾雑作用に対して保護されねばならない。担体は溶媒又は分散媒体でありえる。前記は例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及び適切な前記の混合物を含む。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えばレシチン）の使用によって、分散液の場合には要求される粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持される。微生物の作用の防御は、種々の抗菌及び抗カビ化合物、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの事例では、等張性化合物、例えば、砂糖、ポリアルコール（例えばマンニトール、ソルビトール）塩化ナトリウムを組成物中に含有するのが好ましい。注射可能組成物の吸収延長は、吸収を引き伸ばす化合物、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含有することによってもたらされえる。
無菌的な注射可能溶液は、必要な量のTRAILレセプター結合因子を、必要に応じて上記に列挙した成分の1つ又は組合せとともに適切な溶媒に取り入れ、続いてろ過滅菌することによって調製することができる。一般的には、分散液は、基礎的分散媒体及び上記に列挙したものに由来する他の必要な成分を含む無菌的なベヒクルに結合因子を取り入れることによって調製される。無菌的な注射可能溶液の調製のための無菌的散剤の事例では、調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、前記は、活性成分の散剤プラス以前にろ過滅菌されたその溶液に由来する任意の所望される付加的な成分を生じる。本発明の物質は、デポット注射又はインプラント調製物の形態で投与することができる（前記調製物は、活性成分の徐放性又は拍動性放出を許容する態様で処方することができる）。
経口組成物は、一般的には不活性な希釈剤又は食用担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封入されるか、又は錠剤に圧縮される。治療用経口投与のためには、結合因子は賦形剤とともに取り込まれ、錠剤、トローチ又はカプセルの形態で用いることができる。経口組成物はまた、口腔洗浄物としての使用のために流動担体を用いて調製することができ、この場合、前記流動担体中の化合物は経口的に適用され、ゆすいで（swish）吐き出すか又はのみ込む。医薬として適合しえる結合化合物及び／又はアジュバント物質を組成物の部分として含むことができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の任意の成分又は類似の性質を有する化合物を含むことができる：結合剤、例えば微晶質セルロース、アラビアゴム又はゼラチン；賦形剤、例えばデンプン又はラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲル、又はコーンスターチ；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム又はステロート；研磨剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味化合物、例えばシュクロース又はサッカリン；又は香料化合物、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ香料。
【００７４】
吸入による投与の場合、TRAILレセプター結合因子は、加圧容器若しくはディスペンサー（前記は適切な発射薬（例えば二酸化炭素のようなガス）を含む）又はネブライザからエーロゾルスプレーの形態でデリバーされる。
全身的投与はまた経粘膜又は経皮手段によって実施することができる。経粘膜又は経皮投与の場合、浸透されるべき障壁に適した浸透剤が処方物に用いられる。そのような浸透剤は当分野で一般的に知られており、経粘膜のためには、例えば界面活性剤、胆汁塩及びフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は鼻内スプレー又は座薬の使用により達成することができる。経皮投与の場合、TRAILレセプター結合因子は、当分野で一般的に知られているように軟膏、膏薬、ゲル、又はクリームに処方される。
TRAILレセプター結合因子はまた、直腸デリバリーのために座薬（例えば通常の座薬基剤（例えばカカオ脂及び他のグリセリド）を用いる）又は停留浣腸の形態で医薬組成物として調製することができる。
ある実施態様では、TRAILレセプター結合因子は、身体からの迅速な排除に対してTRAILレセプター結合因子を保護する担体と一緒に調製され、例えば制御放出処方物であり、インプラント及び微細被包化デリバリー系が含まれる。生体分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ酪酸を用いてもよい。そのような処方物の製造方法は当業者には明白であろう。材料はまた、アルザ社（Alza Corporation）及びノバファーマシューティカルズ社（Nova Pharmaceuticals, Inc.）から市場で入手することができる。リポソーム分散物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体により感染細胞を標的とするリポソームを含む）もまた、医薬的に許容できる担体として用いることができる。これらは、当業者に公知の、例えば米国特許4,522,811号に記載の方法にしたがって製造することができる。
【００７５】
投与を容易にするために及び均質な投与のために、投与単位型の経口及び非経口組成物を処方することが特に有利である。本明細書で用いられる、投与単位製剤型は、治療される対象者のための分割できない投与量として適切な物理的に別個の投与単位を指し、各単位は、所望の治療効果を生じるように計算された予め決定された量の結合因子を必要な医薬担体と一緒に含む。本発明の投与単位製剤型についての詳細は、結合因子の固有の特徴及び達成されるべき具体的な治療効果、及びそのようなTRAILレセプター結合因子を対象者の治療のために化合物として生成する場合の当分野に固有の制限によって定められ、さらに前記に直接左右される。
本発明の核酸分子をベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして用いることができる。遺伝子治療ベクターは、対象者に、例えば静脈内注射、局所投与（例えば米国特許5,328,470号を参照されたい）によって、又はステレオタクティックな注射によって（例えば以下を参照されたい：Chen et al. Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91:3054-3057）デリバーすることができる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は、遺伝子治療ベクターを許容可能な希釈剤中に含むか、或いはその中に遺伝子デリバリーベヒクルが埋め込まれている徐放性マトリックスを含むことができる。また別には、完全な遺伝子デリバリーベクターが組換え細胞（例えばレトロウイルスベクター）から完全な状態で生成されえる場合は、医薬調製物は、遺伝子デリバリー系を産生する1つ以上の細胞を含むことができる。医薬組成物は、容器、パック又はディスペンサーに投与の指示と一緒に収めることができる。
【００７６】
本発明のTRAILレセプター結合因子の同定及び性状の決定
本発明の結合因子を同定及び／又はスクリーニングする方法：
TRAILレセプターポリペプチドに対して所望の特異性を有する結合因子（例えば抗TRAILレセプター抗体及び抗TRAILレセプター抗体関連ポリペプチド）を同定及びスクリーニングするために有用な方法には、当分野内で公知の任意の免疫学介在技術が含まれる。免疫応答成分は、当業者によく知られた多様な方法によってin vitroで検出することができる。例えば、（1）細胞傷害性Tリンパ球を放射能標識標的細胞とともにインキュベートし、これらの標的細胞の溶解を放射能の遊離によって検出することができる；（2）ヘルパーTリンパ球を抗原及び抗原提示細胞とともにインキュベートし、サイトカインの合成及び分泌を標準的な方法で測定することができる（A. Windhagen et al. Immunity 1995, 2:373-80）；（3）抗原提示細胞をタンパク質抗原全体とともにインキュベートし、MHC上の当該抗原の提示をTリンパ球活性化アッセイ又は生物物理学的方法によって検出することができる（Harding et al. Proc Natl Acad Sci 1989, 86:4230-4）；（4）マスト細胞を、それらのFc-εレセプターを架橋する試薬とともにインキュベートし、ヒスタミンの放出を酵素免疫アッセイによって測定することができる（Siraganian et al. TIPS 1983, 4:432-437）；及び（5）酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）。
同様に、モデル生物又はヒト対象における免疫応答の生成物はまた、当業者によく知られた多様な方法によっても検出することができる。例えば（1）ワクチンに対する応答での抗体の生成は、臨床検査室で従来用いられている標準的な方法、例えばELISAによって容易に検出することができる；（2）炎症部位への免疫細胞の遊走は、皮膚表面をスクラッチしさらにスクラッチ部位上の遊走細胞を捕捉する無菌的容器を静置することによって検出することができる（Peters et al. Blood, 1988, 72:1310-5）；（3）マイトジェン又は混合リンパ球に対する応答における抹消血の単核細胞の増殖は、3H-チミジンを用いて測定することができる；（4）顆粒球、マクロファージ及びPBMC中の他の食細胞の食細胞性能力は、PMBCを標識粒子とともにウェルに静置することによって測定することができる（Peters et al. Blood, 1988, 72:1310-5）；及び（5）免疫系細胞の分化は、CD分子（例えばCD4及びCD8）に対する抗体でPBMCを標識し、これらのマーカーを発現するPBMCの部分を決定することによって測定することができる。
【００７７】
ある実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子は、複製可能な遺伝子パッケージの表面上の候補結合因子のディスプレーを用いて選別される（例えば米国特許5,514,548号；同5,837,500号；同5,871,907号；5,885,793号；同5,969,108号；同6,225,447号；同6,291,650号；同6,492,160号；EP585287；EO605522；EP616640；EP1024191；EP589877；EP774511：EP844306を参照されたい）。所望の特異性を有する結合分子をコードするファージミドゲノムを含む繊維状バクテリオファージ粒子を製造／選別するために有用な方法は既に記載されている（例えばEP774511、米国特許5871907号、同5969108号、同6225447号、同6291650号、同6492160号を参照されたい）。
ある実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子は、酵母宿主細胞の表面上の候補結合因子のディスプレーを用いて選別される。酵母表面ディスプレーによるscFvポリペプチドの単離に有用な方法は、Kiekeら（Protein Eng. 1997, Nov, 10(11):1301-10）によって記載されている。
ある実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子は、リボソームディスプレーを用いて選別される。リボソームディスプレーを用いるペプチドライブラリーでリガンドを同定するために有用な方法は以下に記載されている：Mattheakis et al. Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91:9022-26；及びHanes et al Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94:4937-42。
【００７８】
ある実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子は、候補結合因子のtRNAディスプレーを用いて選別される。tRNAディスプレーを用いてin vitroでリガンドを選別するために有用な方法は、Merrymanら（Chem Biol 2002, 9:741-46）によって記載されている。
ある実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子はRNAディスプレーを用いて選別される。RNAディスプレーライブラリーを用いてペプチド及びタンパク質を選別するために有用な方法は、文献（Roberts et al. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94:12297-3021；及びNemoto et al FEBES Lett 1997, 414:405-8）に記載されている。非天然のRNAディスプレーライブラリーを用いてペプチド及びタンパク質を選別するために有用な方法は、Frankelら（Curr Opin Struct Biol 2003, 13:506-12）によって記載されている。
ある実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子はグラム陰性細菌のペリプラズムで発現され、標識したTRAILレセプター結合因子と混合される（WO02/34886を参照されたい）。TRAILレセプターポリペプチドに対して親和性を有する組換えポリペプチドを発現するクローンでは、結合因子と結合する標識TRAILレセプターポリペプチドの濃度は増加し、文献（Harvey et al. Proc Natl Acad Sci 2004, 22:9193-98；及び米国特許公開2004/0058403）に記載されているように、前記細胞をライブラリーの残りの細胞から単離することを可能にする。
所望のTRAILレセプター結合因子を選別した後、当業者に任意の技術（例えば原核細胞又は真核細胞発現など）によって前記物質を大量に製造できることは予測される。TRAILレセプター結合因子（例えば抗TRAILレセプターハイブリッド抗体又はフラグメントであるが、ただしこれらに限定されない）は、通常の技術を用い抗体重鎖をコードする発現ベクターを構築することによって製造することができる。前記重鎖では、CDR及び必要な場合には可変領域フレームワークの最少部分（本来の種の抗体結合特性を維持するために必要であり、本明細書に記載の技術にしたがって操作される）は、本来の種の抗体に由来し、抗体の残りは標的種の免疫グロブリンに由来する。前記は本明細書の記載にしたがって操作することができ、それによってハイブリッド抗体重鎖の発現用ベクターを製造する。
【００７９】
TRAILレセプターの結合の測定：
ある実施態様では、TRAILレセプター結合アッセイは、TRAILレセプターポリペプチドとTRAILレセプター結合因子との間の結合に適した条件下で、TRAILレセプターポリペプチド及びTRAILレセプター結合因子を混合し、TRAILレセプターポリペプチド及びTRAILレセプター結合因子間の結合量を判定するアッセイ様式を指す。結合量は適切なコントロールと比較される。コントロールは、TRAILレセプターポリペプチドの非存在下での結合量、非特異的免疫グロブリン組成物の存在下での結合量、又はその両者でありえる。結合量は任意の適切な方法によって判定することができる。結合アッセイの方法には、例えばELISA、放射性レセプター結合アッセイ、シンチレーション近似アッセイ、細胞表面レセプター結合アッセイ、蛍光エネルギー転移アッセイ、液体クロマトグラフィー、膜ろ過アッセイなどが含まれる。TRAILレセプターポリペプチドとTRAILレセプター結合因子との結合の直接測定のための生物物理学的アッセイは、例えば核磁気共鳴、蛍光、蛍光分極、表面プラズモン共鳴（BIACOR chips）などである。特異的結合は、当分野で公知の標準的アッセイ、例えば放射性リガンド結合アッセイ、ELISA、FRET、免疫沈降、SPR、NMR(2D-NMR)、質量分析などによって決定される。候補TRAILレセプター結合因子の特異的結合が、候補TRAILレセプター結合因子の非存在下で観察される結合よりも少なくとも1パーセント多ければ、候補TRAILレセプター結合因子は本発明のTRAILレセプター結合因子として有用である。
TRAILレセプターポリペプチド及びTRAILレセプター結合因子の共同結晶もまた、分子の相互作用を決定する方法として本発明で提供される。TRAILレセプター結合因子とTRAILレセプターポリペプチドとの結合に適した条件は、化合物及びそのリガンドに左右され、当業者には容易に決定されえる。
【００８０】
TRAILレセプター結合因子の生物学的活性の測定：
本発明のTRAILレセプター結合因子、例えばTRAILレセプター抗体及び抗TRAILレセプター抗体関連ポリペプチドは、本明細書に記載の特異的な活性を含む生物学的活性に対するアゴニスト又はアンタゴニストと特徴付けることができる。例えば、TRAILレセプターアゴニスト及びアンタゴニスト（前記はTRAILレセプター結合因子である）は、当分野で公知の方法を用いて製造することができる。例えば以下を参照されたい：WO96/40281；米国特許5,811,097号；Deng et al. Blood, 1998, 92:1981-1988；Chen et al. Cancer Res 1998, 58:3668-3678；Harrop et al. J Immunol 1998, 161:1786-1794；Zhu et al. Cancer Res 1998, 58:3209-3214；Yoon et al. J Immunol 1998, 160:3170-3179；Prat et al. J Cell Sci 1998, 111:237-247；Pitard et al. J Immunol Methods 1997, 205:177-190；Liautard et al. Cytokinde, 1997, 9:233-241；Carlson et al. J Biol Chem 1997, 272:11295-11301；Taryman et al. Neuron 1995, 14:755-762；Muller et al. Structure, 1998, 6:1153-1167；Bartunek et al. Cytokinem, 1996, 8:14-20。生物学的活性、すなわちTRAILレセプター結合因子のアゴニスト及びアンタゴニスト活性は、TRAILレセプターポリペプチドの生物学的活性を測定するために開発された、任意の通常的なin vivo及びin vitroアッセイを用いて性状を調べることができる。
【００８１】
本発明のTRAILレセプター結合因子の使用
概論：
本発明の結合因子は、TRAILレセプターポリペプチドの局在化及び／又は定量に関連する、当分野で公知の方法で有用である（例えば、適切な生理学的サンプル内のTRAILレセプターポリペプチドのレベルの測定で使用するため、診断方法で使用するため、前記ポリペプチドの画像化で使用するためなど）。ある実施態様では、抗体由来結合ドメインを含むTRAILレセプター結合因子は、薬理学的に活性な組成物（以下では“治療薬”）として有用である。本発明の結合因子は、TRAILレセプターポリペプチドを標準的な方法（例えばアフィニティクロマトグラフィー又は免疫沈降によって単離するために有用である。本発明のTRAILレセプター結合因子は、天然の免疫反応性TRAILレセプターポリペプチド又は免疫反応性TRAILレセプター様ポリペプチドを生物学的サンプル（例えば細胞）から精製することを促進するだけでなく、同様に、宿主系で発現させた組換え生成免疫反応性TRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドの精製を促進することができる。さらにまた、TRAILレセプター結合因子を用いて、免疫反応性TRAILレセプターポリペプチド又は免疫反応性TRAILレセプター様ポリペプチドを（例えば細胞溶解物又は細胞懸濁物で）検出し、免疫反応性ポリペプチドの豊富さ及び発現パターンを判定することができる。本発明のTRAILレセプター結合因子を診断に用い、臨床検査方法の部分として、例えばある治療スケジュールの有効性の決定のために、組織内の免疫反応性TRAILレセプター及び／又は免疫反応性TRAILレセプター様ポリペプチドレベルをモニターすることができる。上記に特記したように、前記検出は、検出可能物質に本発明のTRAILレセプター結合因子を結合させることによって（すなわち物理的に連結する）促進することができる。
【００８２】
TRAILレセプターポリペプチド発現の検出：
生物学的サンプルにTRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドが存在しているか否かを検出するための例示的方法は、被検対象者から生物学的サンプルを入手する工程及び前記生物学的サンプルを、TRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドが生物学的サンプルで検出できるように、TRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドを検出することができる本発明のTRAILレセプター結合因子と接触させる工程を含む。TRAILレセプター結合因子の例は、配列番号:1に対して作製した抗体であり、前記は、TRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドと結合することができ、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。結合因子に関連して、“標識されている”という用語は、結合因子に検出可能な物質を結合させる（すなわち物理的に連結させる）ことによって結合因子を直接標識するだけでなく、直接標識される別の化合物の反応性によって前記結合因子を間接的に標識することも同様に含むことが意図される。間接的標識の例には、蛍光標識した二次抗体を用いる一次抗体の検出、及び蛍光標識したストレプトアビジンで検出することができるビオチン末端標識DNAプローブが含まれる。
本発明の検出方法を用いて、生物学的サンプル中のTRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドを、in vitro及びin vivoで同様に検出することができる。TRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドを検出するin vitroの技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ウェスタンブロット、免疫沈澱、及び免疫蛍光が含まれる。さらにまた、TRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドを検出するin vivo技術には、対象者への標識TRAILレセプター結合因子（例えばTRAILレセプター抗体）の導入が含まれる。例えば、抗体は放射性マーカーで標識することができる（対象者における前記標識の存在及び局在は、標準的画像化技術によって検出することができる）。ある実施態様では、生物学的サンプルは被検対象者由来のポリペプチド分子を含む。
【００８３】
免疫アッセイ及び画像化：
本発明のTRAILレセプター結合因子を用い、生物学的サンプル中のTRAILレセプターポリペプチドレベル又はTRAILレセプター様ポリペプチドレベルを抗体使用技術によりアッセイすることができる。例えば、組織内のタンパク質発現は古典的免疫組織学的方法で調べることができる（M Jalkanen et al. J Cell Biol 1985, 101:976-985；M. Jalkanen et al. 1987, J. Cell Biol 1987, 105:3087-96）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な他の抗体使用方法には、免疫アッセイ、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）及び放射性免疫アッセイ（RIA）が含まれる。適切な抗体アッセイ標識は当分野で公知であり、酵素標識（例えばグルコース）、及び放射性同位元素又は他の放射性物質（例えばヨウ素（125I、121I）、炭素（14C）、硫黄（35S）、トリチウム（3H）、インジウム（112In）及びテクネチウム（99mTC））、及び蛍光標識（例えばフルオレセイン及びローダミン）、並びにビオチンが含まれる。
生物学的サンプルでの分泌TRAILレセプターポリペプチドレベル又はTRAILレセプター様ポリペプチドレベルのアッセイに加えて、分泌TRAILレセプターポリペプチドレベル又はTRAILレセプター様ポリペプチドレベルはまた画像化によりin vivoで検出することができる。TRAILレセプターポリペプチドレベル又はTRAILレセプター様ポリペプチドのin vivo画像化を目的とする、TRAILレセプター結合因子（例えば抗TRAILレセプター抗体）の標識又はマーカーには、X線-ラジオグラフィー、NMR又はESRによって検出可能なものが含まれる。X線-ラジオグラフィーの場合、適切な標識には放射性同位元素、例えばバリウム又はセシウムが含まれる（前記は検出可能な放射線を放出するが対象者に対して明白には有害ではない）。NMR及びESRに適したマーカーには、検出可能な特徴的スピンを有するもの、例えば重水素が含まれる（前記は対応するscFvクローンのための栄養素の標識によってTRAILレセプター結合因子に取り込まれえる）。
適切な検出可能な画像化部分（例えば放射性同位元素（例えば131I、112In、99mTc）、放射線不透過性物質、又は核磁気共鳴によって検出可能な物質）で標識されたTRAILレセプター結合因子が対象者に（例えば非経口的、皮下又は腹腔内に）導入される。対象者のサイズ及び用いられる画像化系が、診断画像の作成に必要な画像化部分の量を決定することは当分野では理解されよう。放射性同位元素の場合、ヒト対象では、注射される放射能は通常は約5から20ミリキュリーの範囲の99mTcであろう。続いて標識されたTRAILレセプター結合因子は、特異的な標的ポリペプチドを含む細胞の存在場所に優先的に蓄積されるであろう。例えば、in vivo腫瘍画像化は以下に記載されている：S.W. Burchiel et al. Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer 13 (1982)。
したがって本発明は医学的状態を診断する方法を提供する。前記方法は：（a）個体の細胞内又は体液中における本発明のTRAILレセプター結合因子の結合を測定することによってポリペプチドの発現をアッセイする；（b）前記の遺伝子発現レベルを標準遺伝子発現レベルと比較することを含み、それによって標準発現レベルと比較されたアッセイポリペプチド遺伝子の発現レベルの増減が医学的状態の指標となる。
【００８４】
診断的使用：
本発明のTRAILレセプター結合組成物は診断方法で有用である。したがって、本発明は、対象者におけるTRAILレセプター関連症状の診断において有用な本発明の結合因子を使用する方法を提供する。本発明の結合因子は、それらがTRAILレセプターポリペプチドに対して任意のレベルのエピトープ結合特異性及び非常に高い結合親和性を持つように選択することができる。一般的には、結合因子の結合親和性が高ければ高いほど、よりストリンジェントな洗浄条件を免疫アッセイで実施して、標的ポリペプチドを除去することなく非特異的に結合した物質を除去することができる。したがって、診断アッセイで有用な本発明のTRAILレセプター結合因子は通常、少なくとも108、109、1010、1011又は1012M-1の結合親和性を有する。さらに、診断試薬として用いられるTRAILレセプター結合因子は、標準的な条件下で少なくとも12時間、好ましくは少なくとも5時間、より好ましくは少なくとも1時間で平衡に達するために十分な動力学的オンレートを有することが望ましい。
本発明のいくつかの方法は、診断試薬として本発明の抗TRAILレセプター抗体及び抗TRAILレセプター抗体組成物のポリクローナル調製物を利用し、他の方法はモノクローナル単離体を利用する。ポリクローナル混合物の使用は、1つのモノクローナル抗TRAILレセプター抗体で製造された組成物と比較して多くの利点を有する。TRAILレセプターポリペプチド上の多様な部位と結合することによって、ポリクローナル抗TRAILレセプター抗体又は他のポリペプチドは、TRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチド上の単一部位と結合するモノクローナル抗体よりも強いシグナルを（診断のために）生じることができる。さらに、ポリクローナル調製物は、原型標的配列の多数の変種（例えば対立遺伝子座変種、種変種、株変種、薬剤誘導エスケープ変種）と結合することができるが、一方、モノクローナル抗体は原型配列又は狭い範囲のその変種とのみ結合しえる。しかしながら、モノクローナル抗TRAILレセプター抗体は、近縁抗原の存在下又は潜在的存在下においてただ1つの抗原を検出する利点を有する。
上記に記載の方法にしたがって製造したヒトポリクローナル抗TRAILレセプター抗体を利用する方法では、前記調製物は典型的には、標的ポリペプチドに対して種々のエピトープ特異性を有するTRAILレセプター結合因子（例えば抗体）の集合物を含む。モノクローナル抗体を利用するいくつかの方法では、異なるエピトープ結合特異性を有する2つの抗体を有することが望ましい。エピトープ結合特異性の相違は競合結合アッセイによって決定することができる。
ヒト抗体であるTRAILレセプター結合因子を診断試薬として任意の種類のサンプルについて用いることができるが、それらはヒトの生物学的サンプルのための診断試薬としてもっとも有用である。TRAILレセプター結合因子を用いて、与えられたTRAILレセプターポリペプチドを種々の標準的アッセイ様式で検出することができる。そのような様式には、免疫沈澱、ウェスタンブロッティング、ELISA、放射性免疫アッセイ及びイムノメトリックアッセイが含まれる。以下を参照されたい：Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988)；米国特許3,791,932号；同3,839,153号；同3,850,752号；同3,879,262号；同4,034,074号；同3,791,932号；同3,817,837号；同3,839,153号；同3,850,752号；同3,850,578号；同3,853,987号；同3,867,517号；同3,879,262号；同3,901,654号；同3,935,074号；同3,984,533号；同3,996,345号；同4,034,074号；及び同4,098,876号。生物学的サンプルは対象者の任意の組織又は体液から入手できる。
【００８５】
イムノメトリック又はサンドイッチアッセイは本発明の診断方法にとって好ましい様式である（米国特許4,376,110号、同4,486,530号、同5,914,241号、及び同5,965,375号を参照されたい）。そのようなアッセイは、1つのTRAILレセプター結合因子、例えば抗TRAILレセプター抗体又は固相に固定された抗TRAILレセプター抗体の集団、及び別の抗TRAILレセプター抗体又は抗TRAILレセプター抗体の集団を用いる。典型的には、溶液の抗TRAILレセプター抗体又は抗TRAILレセプター抗体集団が標識される。抗体集団が用いられる場合は、前記集団は典型的には、標的ポリペプチド内の種々のエピトープ特異性と結合する抗体を含む。したがって、同じ集団を固相及び溶液抗体の両方について用いることができる。抗TRAILレセプターモノクローナル抗体を用いる場合は、異なる結合特異性を有する第一及び第二のTRAILレセプターモノクローナル抗体が固相及び液相について用いられる。固相および溶液抗体はどちらかを先に又は同時に標的抗原と接触させることができる。固相抗体を最初に接触させる場合は、アッセイはフォワードアッセイと称される。逆に溶液抗体を最初に接触させる場合は、アッセイはリバースアッセイと称される。標的を両抗体と同時に接触させる場合は、アッセイは同時アッセイと称される。TRAILレセプターポリペプチドを抗TRAILレセプター抗体と接触させた後、通常は約10分から約24時間の範囲で、通常は約1時間の間サンプルをインキュベートする。続いて洗浄工程を実施し、診断試薬として用いられた抗TRAILレセプター抗体と特異的に結合しなかったサンプルの成分を除去する。固相及び溶液抗体が別々の工程で結合されるときは、洗浄はいずれかの工程後又は両工程後に実施することができる。洗浄後、典型的には、標識された溶液抗体との結合を介して固相に連結された標識を検出することによって結合が定量される。通常は、ある抗体対又は抗体集団対及びある反応条件について、検量線が既知濃度の標的抗原を含むサンプルから作成される。続いて、試験されるサンプル中のTRAILレセプターポリペプチドの濃度を前記検量線から内挿法により読み取る。分析物は、平衡状態で結合している標識溶液抗体の量から、又は平衡に達する前の一連の時点における標識溶液抗体結合の動力学的測定によって測定することができる。そのような曲線の勾配がサンプル中のTRAILレセプターポリペプチドの濃度の測定値である。
上記の方法で使用される適切な固相には、例えばニトロセルロース膜、ナイロン膜、及び誘導体化ナイロン膜、並びにまた粒子、例えばアガロース、デキストラン系ゲル、ディップスティック、微粒子、ミクロ粒子、磁性粒子、試験管、マイクロタイターウェル、SEPHADEXTM（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.）などが含まれる。固定は、吸収によって又は共有結合によって実施することができる。場合によって、抗TRAILレセプター抗体は、表面結合リンカー（例えばアビジン）との結合のために、リンカー分子（例えばビオチン）と結合させることができる。
【００８６】
予測医学：
本発明はまた予想医学の分野に属し、前記分野では、診断アッセイ、予後アッセイ、ファーマコゲノミクス及び追跡臨床試験を予後的（予測的）目的で用い、対象者を予防的に処置する。したがって、本発明のある特徴は、対象者が疾患又は異常に罹患しているか否か、又は異常なTRAILレセプターポリペプチド発現に関連する異常を進行させるリスクがあるか否かを決定するために、生物学的サンプル（例えば血液、血清、細胞、組織）中のTRAILレセプターポリペプチド発現を決定することを目的とする診断アッセイに関する。
本発明はまた、個体が、TRAILレセプターポリペプチド発現又は活性に関連する異常を進行させるリスクを有しているか否かを決定することを目的とする予後（又は予測）アッセイを提供する。そのようなアッセイを予後又は予測の目的に用い、それによってTRAILレセプターポリペプチドを特徴とする又は前記に関連する異常の開始前に個体を予防的に処置することができる。さらにまた、本発明の方法はまた、本発明のTRAILレセプター結合因子がTRAILレセプターポリペプチドの多形性型に対してより強いTRAILレセプターポリペプチド親和性を示す事例で、個体がTRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプターポリペプチドの多形性型を発現しているか否かを判定するために用いることができる（逆もまた同様である）。
【００８７】
対象者の個々の組織中（又は血中）のある種のポリペプチドのレベルは、薬剤が患者に投与されたとき、与えられた薬剤の毒性、有効性、クリアランス速度又は代謝速度の指標でありえる。本明細書に記載の方法はまた、そのようなポリペプチドの対象者におけるレベルを決定し、これらの薬剤に対する対象者の応答の予測を容易にするために用いることができる。本発明のまた別の特徴は、個体におけるTRAILレセプターポリペプチド発現を決定し、それによって適切な治療用又は予防用化合物を当該個体のために選択する（以下では“ファーマコゲノミクス”と称する）方法を提供する。ファーマコゲノミクスは、個体の遺伝子型（例えば、個々の化合物に対する個体の応答能力を決定するために試験された個体の遺伝子型）を基準にして、個体の治療的又は予防的処置のための化合物（例えば薬剤）の選択を可能にする。
例えば、TRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドと本発明のTRAILレセプター結合因子との結合を利用して、TRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドの発現若しくは活性に関連する異常を有するか、又は進行させるリスクがある対象者を同定することができる（前記は上記に記載されている）。また別には、予後アッセイを利用して、前記疾患若しくは異常を有するか又は進行させるリスクがある対象者を同定することができる。したがって、本発明は、異常なTRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチド発現若しくは活性に関連する疾患又は異常を同定する方法を提供する。前記方法では、試験サンプルは対象者から入手され、TRAILレセプター結合因子が検出され、この場合、TRAILレセプター結合因子の変質があれば、対象者が、異常なTRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチド発現若しくは活性に関連する疾患又は異常を有するか、又は進行させるリスクを有すると診断される。本明細書で用いられる、“試験サンプル”は、問題の対象者から入手される生物学的サンプルを指す。
【００８８】
さらにまた、本明細書に記載の予後アッセイを用いて、異常なTRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチド発現若しくは活性に関連する疾患又は異常を治療するために、対象者に化合物（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣体、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小分子又は他の薬剤候補物）を投与しえるか否かを決定することができる。例えば、そのような方法を用いて、対象者が、TRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチド関連異常に対する化合物で効果的に治療されえるか否かを決定することができる。したがって、本発明は、異常なTRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチド発現若しくは活性に関連する異常に対する化合物で、対象者が効果的に治療されえるか否かを決定するための方法を提供する。前記方法では、試験サンプルを入手し、TRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドは、TRAILレセプター結合因子を用いて検出される（例えば、この場合、TRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドが存在すれば、対象者は、異常なTRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチド発現若しくは活性に関連する異常を治療するために化合物を投与することができる対象者と診断される）。
【００８９】
対象者から入手した血液又は組織サンプル中のTRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドのレベルを決定し、当該疾患をもたない個体から入手した血液サンプル又は同じ組織由来のサンプル中で見出されるレベルと比較する。健常な対象者から入手したサンプルと比較したとき、TRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチド関連疾患を有すると疑われる対象者から入手したサンプルに過剰の（過少の）TRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドが存在すれば、被検対象者におけるTRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチド関連疾患の存在の指標となる。陽性診断を確立するために更なる試験が要求されえる。
ある種のTRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドの過剰発現の度合いが、罹患対象者が特定のタイプの治療又は処置に応答する可能性が高いか否かの指標となることが知られている多数の疾患が存在する。したがって、サンプル中のTRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドを検出する方法は、予後判定方法として、例えば対象者が治療又は処置に応答する蓋然性を判定するために用いることができる。対象者の適切な組織又は血液サンプル中の関連する予後判定ポリペプチドのレベルを決定し、適切なコントロール、例えば同じ疾患を有するが当該治療に良好に応答した対象者のレベルと比較する。コントロールと比較した予後判定ポリペプチドのサンプル中の過剰発現（又は過少発現）の度合いは、対象者が当該処置又は治療に良好に応答しない蓋然性を予測しえる。コントロールと比較して過剰発現（又は過少発現）が高ければ高いほど、当該対象者が当該治療に応答する蓋然性は低くなる。
ある種の標的ポリペプチド（本明細書では“前兆ポリペプチド”と称される）の過剰発現（過少発現）の度合いが、対象者が疾患を進行させるか否かの指標となることが知られている多数の疾患が存在する。したがって、サンプル中のTRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドを検出する方法は、対象者が疾患を進行させるか否かを予測しうる方法として用いることができる。当該疾患を進行させるリスクがある対象者の適切な組織又は血液サンプル中の関連する前兆ポリペプチドのレベルを決定し、コントロール、例えば当該疾患の進行のおそれがない対象者のレベルと比較する。コントロールと比較した、サンプル中の前兆ポリペプチドの過剰発現（過少発現）の度合いは、対象者が当該疾患を進行させる蓋然性の予測となりえる。コントロールと比較して過剰発現（又は過少発現）が高ければ高いほど、当該対象者が当該疾患を進行させる蓋然性は高くなる。
本明細書に記載した方法は、例えば、少なくとも1つのプローブ試薬（例えば本明細書に記載のTRAILレセプター結合因子）を含む予め包装された診断キットを利用することによって実施することができる。前記キットは、例えば、TRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドが中心的に関与する疾患又は不快の症状又は家族歴を示す対象者を診断する臨床環境で便利に用いることができる。さらにまた、TRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドが発現される任意の細胞タイプ又は組織を、本明細書に記載する予後アッセイで用いることができる。
【００９０】
TRAILレセプター結合因子の予防的及び治療的使用
概論：
本発明のTRAILレセプター結合因子は、疾患の予防又は治療に有用である。特に本発明は、異常なTRAILレセプター結合因子発現又は活性を有するか又は前記と関連する異常のおそれがある（又は前記異常に感受性を有する）対象者を処置する予防的及び治療的方法の両方を提供する。したがって、本発明は、対象者でTRAILレセプター関連症状を予防及び／又は治療する方法を提供し、前記方法は、有効量のTRAILレセプター結合因子をその必要がある対象者に投与することを含む。例えば、欠損した又はレベルが低下したTRAILレセプターポリペプチド（例えばインスリン）の代用にするため、欠損した又はレベルが低下した別個のポリペプチド（例えば抗TRAILレセプター抗体）を補充するため、あるポリペプチド（例えばオンコジーン）の活性を抑制するため、TRAILレセプターポリペプチドの活性を活性化するため（例えばレセプターと結合させることによって）、膜結合レセプターの活性を前記と遊離リガンドについて競合させることによって低下させるため（例えば可溶性TNAレセプターが炎症の緩和に用いられる）、又は所望の応答を生じさせるために（例えば血管の増殖）、本発明のTRAILレセプター結合因子組成物を対象者に投与することができる。
本発明のTRAILレセプター結合因子は、対象者における多様な疾患（骨細胞の発生、分化及び活性化を必要とする疾患；血液循環内の細胞（例えば赤血球及び血小板）の疾患又は病変；種々の免疫学的異常及び／又は病変；肺の疾患及び異常；自己免疫及び炎症性疾患；心脈管系疾患；代謝疾患；生殖器疾患、腎臓病、糖尿病、脳外傷、癌の増殖及び転移；ウイルス感染、癌療法、歯周病；組織再生；急性リンパ芽球性白血病；グリオーマ；神経学的疾患；神経変性疾患；アルツハイマー病；パーキンソン病及び造血性疾患を含むが、但しこれらに限定されない）に関連する潜在的な予防及び治療的適用で有用である。
【００９１】
本発明の好ましい実施態様では、医薬的に有効な量の抗TRAIL-R1及びTRAIL-R2抗体は、標的細胞と接触することによって細胞死を誘導する。TRAIL-R1及びTRAIL-R2を認識する抗体又はTRAIL-R1及びTRAIL-R2を認識するヒト化抗体の医薬的に有効な量は、所望の効果を引き起こすために十分な、個体に投与される量である。医薬的に有効な量のTRAIL-R1及びTRAIL-R2認識抗体投与の所望される効果は、標的細胞の死、標的細胞の増殖抑制、TRAIL-R1及びTRAIL-R2の刺激、及び標的細胞中のTRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2への結合である。標的細胞は、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2を発現する細胞であり、異常増殖細胞、例えばヒトの癌細胞及び白血病細胞である。さらにまた病的状態を有する細胞が含まれるが、そのような細胞では細胞増殖は異常であるか又は調節を逸脱し、例えば悪性又は良性癌である。したがって、本発明のいくつかの実施態様では、本発明の抗TRAILレセプター結合因子は、その必要がある対象者で、癌（例えば乳癌、肝癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、脳腫瘍、膵臓癌、及び結直腸癌を含むが、ただしこれらに限定されない）の増殖及び／又は転移を防止する方法で有用である。ある実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子はin vitroアポトーシス誘導活性を有し、この場合、前記結合因子は、10μg/mLに等しいか又はそれより低い濃度で、少なくとも30％の細胞死、好ましくは少なくとも50％、70％、90％、より好ましくは100％の細胞死を誘導することができる。ある実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子はin vivoアポトーシス誘導活性を有し、この場合、前記結合因子は、10mg/kg体重と等しいかそれより低い用量で処置したとき、ヒトの癌のゼノグラフトモデルで、腫瘍サイズを少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、70％、90％、より好ましくは100％減少させることができる。
in vivoの治療に用いられる場合、TRAILレセプター結合因子（例えば本発明の抗TRAILレセプター抗体）は対象者に有効量（すなわち所望の治療効果を有する量）で投与される。通常それらは非経口的に投与されるであろう。用量及び投与スケジュールは、TRAILレセプター関連疾患又は異常の度合い、用いられるここのTRAILレセプター結合因子の特徴（例えばその治療インデックス）、対象者及び対象者の歴史に左右されるであろう。有利には、TRAILレセプター結合因子は持続的に1−2週間にわたって血管内の細胞の治療のために静脈内に、及び域内のリンパ節の治療のために皮下及び腹腔内に投与される。
場合によって、前記の投与は例えば放射線治療、化学療法、又は腫瘍壊死因子、インターフェロン若しくは他の細胞保護若しくは免疫調節因子の投与の混合サイクルのような補助療法コースの間に実施される。したがって、本発明の結合因子及び補助療法で有用な化合物は、当該投与の必要がある対象者に同時に又は連続的に投与することができる。ある実施態様では、本発明のTRAILレセプター結合因子は、治療用抗体、特に抗TRAIL-R1又は抗TRAIL-R2単一特異性抗体の治療効果を強化するために用いることができる。
【００９２】
本発明の抗体はまた、増感剤と一緒に作用する。本明細書で用いられる増感剤は、アポトーシスを誘導する任意の刺激薬を含むと定義される。前記刺激薬には、有機分子（例えば化学療法物質）及び照射因子（前記は本発明の抗体の効果を顕著に強化することができる）が含まれる。他方、本発明の抗体は、化学療法及び放射線療法の治療効果を強化するために用いることができる。さらにまた、本発明の抗体は、化学療法及び放射線療法に対する腫瘍細胞の耐性の発達を防止又は逆戻りさせるために用いることができる。本発明の抗体はまた、増感剤として作用し、TRAIL-R1又はTRAIL-R2に対する単一特異性抗体によって誘導される癌細胞のアポトーシスを促進する。
悪性新生物に対する治療法の関係では、本発明の抗体、特にCTB003及びhCTB003はまたほとんどのTRAIL感受性腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することができる。CTB003は、in vivoで強力な殺腫瘍活性を示す。本明細書に列挙する腫瘍細胞の大半は細胞表面TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2を発現し、CTB003又はhCTB003誘導細胞死に対するそれらの感受性はTRAILに対するそれらの感受性と対応する。CTB003又はhCTB003はおとりレセプターを迂回してアポトーシスを誘導する。マウス-マウスハイブリドーマ、CTB003（本発明の抗体を生成する）は寄託され、アクセッション番号CGMCC1665が割り当てられた。アゴニスト作用を有するヒトTRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2二重特異的モノクローナル抗体CTB003及びhCTB003に関して詳述した技術及び結果は、類似の種類の二重特異的抗体全体に及び、さらにそれらに完全に適用しえることは理解されよう。この利点は一般的に本発明のヒト化二重特異的抗体に及ぶ。
非経口投与のために、TRAILレセプター結合因子は、医薬的に許容可能な非経口ベヒクルと結合させたユニット製剤注射可能型（溶液、分散液、乳濁液）として処方される。そのようなベヒクルは本質的に非毒性であり、治療薬ではない。
抗TRAILレセプターIgM抗体の使用がある種の適用には好ましい。しかしながら、IgGはより小さいことにより、IgMよりもある種のタイプの細胞への局在能力が高くありえる。in vivoでの補体活性化は多様な生物学的効果（炎症応答の誘導及びマクロファージの活性化（Unanue and Benecerraf, Textbook of Immunology, 2nd Edition, Williams & Wilkins, p.218, 1984）を含む）をもたらすという証拠が存在する。炎症に付随する血管拡張増強は、感染細胞内への種々の物質の局在化能力を高めることができる。したがって、本発明で規定したタイプのTRAILレセプター抗体組合せは、多くの方法で治療に用いることができる。さらにまた、抗原（例えば精製TRAILレセプターポリペプチド、そのフラグメント又は類似体（Hakomori, Ann Rev Immunol 1984, 2:103））又はそのような抗原に関連する抗イディオタイプ抗体（Nepom et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 81:2864；Koprowski et al. Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81:216）は、ヒト対象で活性な免疫応答を誘導するために用いることができる。そのような応答には、所望の生物学的効果、例えば標的細胞の破壊のためにヒト補体を活性化することができる抗体の生成が含まれる。
【００９３】
疾患及び異常：
TRAILレセプターポリペプチドのレベル又は生物学的活性の増加（疾患又は異常に罹患していない対象者と比較して）を特徴とする疾患又は異常は、活性を相殺（すなわち軽減又は抑制）するTRAILレセプター結合因子をベースにした治療化合物を用いて治療することができる（前記化合物は治療的又は予防的態様で投与することができる）。利用することができる治療化合物には、（i）前述のTRAILレセプター結合因子；及び（ii）TRAILレセプター結合因子をコードする核酸、が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
TRAILレセプターポリペプチドのレベル又は生物学的活性の低下（疾患又は異常に罹患していない対象者と比較して）を特徴とする疾患又は異常は、TRAILレセプター活性を高める（すなわちアゴニストである）TRAILレセプター結合因子をベースにした治療化合物を用いて治療することができる。活性をアップレギュレートする治療薬は治療的又は予防的態様で投与することができる。利用することができる治療薬には生物利用性を高めるTRAILレセプター結合因子が含まれるが、ただし前記に限定されない。
レベルの増加又は低下は、TRAILレセプター結合因子誘導ペプチド及び／又はRNAの定量によって、対象者の組織サンプル（例えば生検組織から）を入手することによって、及びRNA又はペプチドレベル、発現されたTRAILレセプターポリペプチド（または前述のポリペプチドのmRNA）の構造及び／又は活性について前記サンプルをin vitroでアッセイすることによって容易に検出することができる。当分野でよく知られた方法には、免疫アッセイ（例えばウェスタンブロット分析、免疫沈澱とそれに続くドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫化学など）及び／又はmRNAの発現を検出するハイブリダイゼーションアッセイ（ノザンアッセイ、ドットブロット、in situハイブリダイゼーションなど）が含まれる。
【００９４】
予防的方法：
ある特徴では、本発明は、TRAILレセプターポリペプチド発現又は少なくとも1つのTRAILレセプターポリペプチド活性を調節するTRAILレセプター結合因子を対象者に投与することによって、異常なTRAILレセプター発現又は活性を伴う疾患又は異常を対象者で予防する方法を提供する。
異常なTRAILレセプターポリペプチド発現又は活性によって引き起こされるか、又は前記に起因する疾患のおそれがある対象者は、例えば本明細書に記載の診断アッセイ又は予後アッセイのいずれか又はその組合せによって同定することができる。予防的適用では、TRAILレセプター結合因子の医薬組成物又は医薬は、疾患又は症状（すなわち免疫疾患）に感受性を有するか、そうでなければそのおそれがある対象者に、前記おそれを排除又は軽減するか、重篤度を緩和するか、又は前記疾患の開始（前記疾患の生化学的、組織学的、行動的症状、その合併症、及び疾患進行時に介在する病理学的表現型提示を含む）を遅らせるために十分な量で投与される。予防的なTRAILレセプター結合因子の投与は、疾患又は異常が防止されるか、また別にはその進行を遅らせることができるように、異常に特徴的な症状の出現前に実施することができる。異常のタイプに応じて、例えばTRAILレセプターアゴニストとして又はTRAILレセプターアンタゴニストとして作用するTRAILレセプター結合因子を対象者の治療に用いることができる。適切な化合物は、本明細書に記載のスクリーニングアッセイを基にして決定することができる。
【００９５】
治療的方法：
本発明の別の特徴は、治療目的でTRAILレセプターポリペプチド発現又は活性を対象者で調節する方法を含む。本発明の調節方法は、本発明のTRAILレセプター結合因子と細胞を接触させることを必要とする（前記物質は細胞に付随するTRAILレセプターポリペプチド活性の1つ以上を調節する）。治療的適用では、組成物又は医薬は、そのような疾患が疑われるか又は既に罹患している対象者に、治癒又は疾患（その合併症及び当該疾患の進行中に介在する病理学的表現型を含む）の症状（生化学的、組織学的及び／又は行動上の症状を含む）を少なくとも部分的に停止させるために十分な量で投与される。治療的又は予防的処置を達成するために適切な量は、治療的又は予防的に有効な用量と定義される。
TRAILレセプターポリペプチド活性を調節する化合物は本明細書に記載されてあり、例えばTRAILレセプター結合因子又はTRAILレセプター結合因子関連ペプチドをコードする核酸が含まれえる。ある実施態様では、TRAILレセプター結合因子は、1つ以上のTRAILレセプターポリペプチド活性を刺激する。そのような刺激性化合物の例には、TRAILレセプター結合因子及びTRAILレセプター結合因子をコードする核酸（前記は既に細胞内に導入されてある）が含まれる。別の実施態様では、TRAILレセプター結合因子は1つ以上のTRAILレセプターポリペプチド活性を抑制する。これらの調節方法は、in vitroで（例えば細胞をTRAILレセプター結合因子とともに培養することによって）、また別にはin vivoで（例えばTRAILレセプター結合因子を対象者に投与することによって）実施することができる。したがって、本発明は、TRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプターポリペプチドをコードする核酸分子の異常な発現又は活性を特徴とする、TRAILレセプター関連疾患又は異常に罹患した個体を治療する方法を提供する。ある実施態様では、前記方法は、TRAILレセプターポリペプチドの発現又は活性を調節（例えばアップレギュレート又はダウンレギュレート）するTRAILレセプター結合因子（例えば本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって同定される化合物）又はTRAILレセプター結合因子の組合せを投与することを必要とする。別の実施態様では、前記方法は、低下した又は異常なTRAILレセプターポリペプチド発現又は活性を代償する治療法として、TRAILレセプター結合因子及びTRAILレセプター結合因子をコードする核酸を投与することを必要とする。TRAILレセプターポリペプチド活性の刺激は、TRAILレセプターポリペプチドが異常にダウンレギュレートしているその場所で実施されるのが好ましい。
【００９６】
TRAILレセプター結合因子をベースにした治療薬の生物学的効果の決定：
本発明の種々の実施態様では、適切なin vitro又はin vivoアッセイを実施して、TRAILレセプター結合因子をベースとする個々の治療薬の効果を決定し、さらにその投与が対象者の罹患組織の治療の適用であるか否かが決定される。
種々の施態様では、対象者の異常に中心的に関与する代表的な細胞タイプを用いてin vitroアッセイを実施し、与えられたTRAILレセプター結合因子をベースとする治療薬が当該細胞タイプに望ましい効果を示すか否かが決定される。治療で使用される化合物は、ヒトの対象で試験する前に、適切な動物モデル系（ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなどを含むが、ただしこれらに限定されない）で試験することができる。同様に、in vivo試験のために、ヒト対象に投与する前に、当分野で公知の任意の動物モデルを用いることができる。
【００９７】
治療スケジュール及び効果的な投与：
いくつかの組成物は、本発明の多様な（例えば2つ以上）TRAILレセプター結合因子の組合せを含む。いくつかの組成物では、当該組成物の各TRAILレセプター結合因子はモノクローナル抗体又はヒト配列抗体（1つ以上のTRAILレセプターポリペプチドの予め選択した別個のエピトープと結合する）である。
本明細書に記載したTRAILレセプター関連症状および疾患に対して、本発明のTRAILレセプター結合因子（例えば抗TRAILレセプター抗体又は抗TRAILレセプター抗体サイトトキシン複合体）の有効用量は、種々の多くの因子に応じて変動する。前記因子には、投与手段、標的部位、対象の生理学的状態、対象がヒトであるか動物であるか、投与されている他の医薬、及び処置が予防的でるか治療的であるかが含まれる。通常は、対象はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物もまた処置することができる。治療用投与量は安全性及び有効性の最適化のために定量する必要がある。  典型的には、本発明の組成物の有効量（治療的又は予防的効果を達成するために十分である）は、体重1kgにつき1日当たり約0.000001mgから約10,000（100）mg/kg体重/日の範囲である。好ましくは、前記投与量範囲は、1週間毎、2週間毎、又は3週間毎に約0.0001から100mg/kg、より通常的には0.01から5mg/kg宿主体重である。例えば、投与量は、1週間毎、2週間毎、若しくは3週間毎に1mg/kg体重又は10mg/kg体重であるか、又は1週間毎、2週間毎、若しくは3週間毎に1−10mg/kgの範囲内でありえる。ある実施態様では、抗体のシングル投薬は、0.1−10,000マイクログラム／kg体重の範囲である。ある実施態様では、担体中の抗体濃度は、デリバーされる単位ミリリットル当たり0.2から2000マイクログラムの範囲である。例示的な治療スケジュールは、2週間毎に1回、又は1ヶ月毎に1回、又は3から6ヶ月毎に1回の投与を伴う。いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する2つ以上のTRAILレセプター結合因子が同時に投与され、前記事例では、投与される各抗体の投与量は前記明示範囲内に含まれる。TRAILレセプター結合因子（例えば抗TRAILレセプター抗体）は通常多数の場合に投与される。シングル投薬の間隔は1週間、1ヶ月又は1年でもよい。間隔はまた対象者における抗体の血中レベルの測定による指標にしたがって不規則であってもよい。いくつかの方法では、投与量は血漿のTRAILレセプター結合因子（例えば抗TRAILレセプター抗体）濃度が1−1000μg/mLを達成するように、さらにいくつかの方法では25−300μg/mLを達成するように調節される。また別には、TRAILレセプター結合因子（例えば抗TRAILレセプター抗体）は、徐放性処方物として投与することができる。この事例では、より少ない投与頻度が要求される。投与量及び頻度は対象者におけるTRAILレセプター結合因子の半減期に応じて変動する。一般的には、ヒト抗TRAILレセプター抗体が最長の半減期を示し、ヒト化抗TRAILレセプター抗体、キメラ抗TRAILレセプター抗体及び非ヒト抗TRAILレセプター抗体がこれに続く。投与量及び投与頻度は、処置が予防的であるか又は治療的であるかに応じて変動しえる。予防的適用では、比較的低い投与量が比較的低頻度の間隔で長期間にわたって投与される。いくらかの対象者は生涯にわたって治療を受け続ける。治療的処置では、時には比較的短い間隔で比較的高用量が、疾患の進行が減速するか又は停止するまで、好ましくは対象者が症状若しくは疾患の部分的若しくは完全な緩和を示すまで要求される。その後、患者は予防的スケジュールを受けることができる。TRAILレセプター免疫原をコードする核酸の用量は対象者当たり約10ngから1g、100ngから100mg、1μgから10mg、又は30−300μg DNAの範囲である。感染性ウイルスベクターの用量は10−100以上のビリオン/ドースの範囲である。
【００９８】
毒性：
好ましくは、本明細書に記載のTRAILレセプター結合因子の有効量（例えば用量）は、対象者に実質的な毒性を引き起こすことなく治療的利益を提供する。本明細書に記載のTRAILレセプター結合因子の毒性は、細胞培養又は実験動物での標準的な製薬方法によって、例えばLD50（集団の50％に致死的である用量）又はLD100（集団の100％に致死的である用量）を測定することによって決定することができる。毒性作用と治療効果との間の用量比が治療インデックスである。これらの細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータを、ヒトでの使用に毒性を示さない投与範囲の処方の決定に用いることができる。本明細書に記載のTRAILレセプター結合因子の投与量は、好ましくはほとんど又は全く毒性がない有効用量を含む循環濃度範囲内に存在する。前記投与量は、用いられる投薬形態及び利用される投与経路に応じて前記範囲内で変動しえる。厳密な処方、投与経路及び投与量は、個々の医師が対象者の状態を考慮しながら選択することができる（例えば以下を参照されたい：In "Pharmaceutical Basis of Therapeutics," Ch.１,1975）。
【００９９】
キット：
本発明の範囲内にはまた、本発明のTRAILレセプター結合因子組成物（例えば抗体サイトトキシン複合体、モノクローナル抗体、ヒト配列抗体、ヒト抗体、マルチ特異的及び二特異的分子）及び使用の指示を含むキットが存在する。前記キットは、生物学的サンプル中のTRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドの検出に有用である。例えば、前記キットは以下を含むことができる：TRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドと結合することができる標識TRAILレセプター結合因子；サンプル中のTRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドの量を決定するための手段；及びサンプル中のTRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドの量を標準物と比較する手段。前記キットの成分（例えば試薬）は適切な容器に詰めることができる。キットはさらに、TRAILレセプターポリペプチド又はTRAILレセプター様ポリペプチドを検出するために当該キットを使用するための指示を含むことができる。
ある実施態様では、本発明の組成物キットは、本発明の抗体と疾患を抑制する化合物との組合せを含み、この場合、前記化合物は抗腫瘍薬剤（例えば放射性同位元素、化学療法剤、治療用抗体又はサイトカイン）である。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様をより完全に説明するために提示される。これらの実施例は、どのようなことがあっても、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものと解されるべきではない。
【０１００】
実施例
実施例1：本発明のげっ歯類TRAILレセプター結合因子の調製及び性状決定のための一般的アプローチ
特に、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2二重特異的モノクローナル抗体CTB003はハイブリドーマを培養することによって入手することができる。前記ハイブリドーマは、順次、マウスをTRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2でマウスを免疫し、続いて前記マウス由来の脾臓細胞又はリンパ節細胞をマウスミエローマ細胞と融合させることによって入手することができる。
モノクローナル抗体の調製は以下の工程を含む：
１．抗原として使用されるタンパク質の精製；
２．抗体産生細胞の調製：動物の最後の免疫の後で血清サンプルを採集し、抗体産生細胞が生じたか否かを決定するために、特異的抗体産生力価を分析した。
３．ミエローマ細胞の調製；
４．抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合；
５．所望の抗体を産生するハイブリドーマの選別；
６．単一細胞クローンを調製（クローニング）；
７．モノクローナル抗体の大規模製造のためにハイブリドーマ細胞を培養；
８．モノクローナル抗体の精製；
９．モノクローナル抗体の生物学的活性及び特異性を分析。
本発明の抗体の調製方法は、上記に記載した工程に言及しながら下記で詳述する。本発明の抗体を調製するこの方法は調製方法の単なる例示を意図しており、前記方法に限定されない。他の既知の方法にしたがってもよい。
【０１０１】
Ａ．抗原の調製
本発明は、TRAIL-R1及びTRAIL-R2両レセプターを認識する抗体を誘導するために免疫原としてTRAIL-R1及びTRAIL-R2の細胞外ドメインを含むヘテロ二量体化組換えタンパク質を利用する。
TRAIL-R1及びTRAIL-R2の細胞外ドメインをコードするcDNAをヒトIgG1のFc部分をコードするcDNAと融合させた。さらに、前記融合cDNAを発現ベクター（pcDNAIII（Invutrogen））にてクローニングした。QBI-293A細胞を発現ベクターpcDNAIII-TRAIL-R1-Fc及びpcDNAIII-TRAIL-R2-Fcで同時トランスフェクトした。トランスフェクション後48時間して、培養上清に分泌された融合タンパク質をプロテインAクロマトグラフィーによって精製した。
また別には、配列番号:15及び／又は配列番号:16のアミノ酸配列を含むペプチドを、公知の方法（例えばサンガー法）によって化学的に合成し、抗原として用いてもよい。
【０１０２】
Ｂ．モノクローナル抗体の調製
ａ．マウスの免疫：工程（a）で調製した免疫原をアジュバント（例えばフロイントの完全又は不完全アジュバント）と混合する。他の適切な実験動物には、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ニワトリ、ウマ、ブタ、ウシ及びヒツジが含まれえる。実験動物を免疫するための適切な投与ルートには、皮下、腹腔内、静脈内、皮内、及び筋肉内注射が含まれるが、皮下及び腹腔内注射が好ましい。免疫は、場合によって単一用量によって実施されるか、又は適切な間隔での数回反復投与によって実施される。免疫動物の抗体産生は抗原特異的抗体の血清レベルによって決定される。高力価の抗体が達成されたときに、当該動物を抗体産生細胞の調製源として用いることができる。抗体産生細胞は、免疫原による最後の注射後3−5日で採集することができる。
血清抗体力価を分析する方法には、多様なよく知られた技術、例えば放射性免疫アッセイ（以下では“RIA”と称する）、固相酵素免疫アッセイ（以下では“ELISA”と称する）、蛍光抗体アッセイ、及び受動的血球凝集アッセイが含まれるが、RIA及びELISAが、検出感度、迅速性、正確性および自動化潜在能力の理由から好ましい。RIA及びELISAが好ましい。
ELISAによる抗体力価の決定：第一に、精製又は部分精製したTRAIL-R1Fc／TRAIL-R2-Fcを固相（例えば96ウェルELISAプレート）表面に吸着させる。一切の残留表面をブロッキングした後、前記ウェルの表面をマウス血清の連続希釈サンプルと接触させる。二次抗体として、酵素標識抗マウス抗体を添加して、マウス抗体と結合させる。抗体力価は、基質の変化などによって生じた発色による吸収の変化を測定することによって概算される。
ｂ．ミエローマ細胞の調製：マウス樹立細胞株に由来する細胞がミエローマの供給源として供される。前記細胞株には、P3X63Ag8U.1（P3-U1）、P3/NSI/1-Ag4-1（NS-1）、Sp2/0-Ag14（SP-2）、P3X63Ag8.653及びP3X63Ag8（X63）が含まれ、それらはATCCから入手できる。選択した細胞株を連続的に適切な培養液（例えば8-アザグアニン培養液）に移す。8-アザグアニン培養液には、イスコフ（Iscove's）改変ダルベッコー培養液（以下では“IMDM”と称する）又はダルベッコー改変イーグル培養液（以下では“DMEM”と称する）、RPMI培養液が含まれ、前記にグルタミン、2-メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、ウシ胎児血清（以下では“FCS”と称する）及び8-アザグアニンが補充される。
ｃ．細胞融合：動物の適切ないずれかの部分から入手したリンパ球及び形質細胞は抗体を産生するための前駆体細胞である。リンパ球及び形質細胞供給源には、脾臓、リンパ節、抹消血又はそれらの任意の適切な組合せが含まれ、脾臓がもっとも一般的な供給源である。最後のブースター注射の後で、抗体産生細胞が存在する類リンパ組織から単一リンパ球懸濁液を調製する。融合技術は以下の工程を含む：脾臓及びミエローマ細胞を血清非含有培養液（例えばRPMI1640）又はリン酸緩衝生理食塩水（以下では“PBS”と称する）で洗浄し、脾臓細胞対ミエローマ細胞数の比をほぼ約5：1から10：1の間とし、続いて遠心する。上清を廃棄し、沈殿細胞を十分に遊離させ、50％（w/v）ポリエチレングリコール（m.w.が1000から4000）を含む1mLの血清非含有培養液を混合しながら滴下して加える。続いて、10mLの血清非含有培養液をゆっくりと添加し、続いて遠心する。上清を再び廃棄し、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンの溶液を含む適切な量のHAT培養液（以下では“HAT”と称する）に前記沈殿させた細胞を分散させる。
【０１０３】
ｄ．ハイブリドーマの選別：融合後、一切の非融合ミエローマ細胞及び一切のミエローマ-ミエローマ融合細胞はHAT培養液では生存することができない。他方、抗体産生細胞同士の融合は抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマと同様に生存することができるが、前者は限定的な一生しかもたない。したがって、HAT培養液での継続的インキュベーションは、所望のハイブリドーマのみの選別をもたらす。得られたハイブリドーマをコロニーへと増殖させ、前記を続いてアミノプテリンを欠くHAT培養液（HT培養液）に移す。その後、培養上清の一部分を取り出し、例えばELISAによって抗体力価を決定する。
ｅ．ハイブリドーマのクローニング：抗体力価を決定するために工程b）に記載した方法と類似の方法を用いて特異的抗体を産生することが示されたハイブリドーマを、続いてクローニングのために別のプレートに移す。適切なクローニングの方法には以下が含まれる：限界希釈法（この方法では、ハイブリドーマは、プレートの各ウェルにつき1個の細胞を含むように希釈され、続いて培養される）；軟寒天法（前記方法では軟寒天培地で培養後コロニーが回収される）；マイクロマニピュレーターを用いて培養のために単一細胞を分離する方法；及び“クローン分類（sort-a-clone）”（この方法では単一細胞はセルソーターによって分離される）。例えば限界希釈法によるクローニング方法は、抗体力価を示す各ウェルについて2から4回繰り返され、安定な抗体力価を有するクローンが抗体産生ハイブリドーマとして選別される。
本発明の抗体の土台であるマウス-マウスハイブリドーマCTB003はCGMCCに2006年3月28日に寄託され、アクセッション番号CGMCC1665を有する。
ｆ．モノクローナル抗体の製造及び精製：細胞培養によるモノクローナル抗体の調製：安定な抗体産生ハイブリドーマを入手した後、選別したハイブリドーマ培養を増やすことができる。続いて大規模培養の上清を採集し、適切な方法（例えばアフィニティクロマトグラフィー及びゲルろ過によって精製する。ハイブリドーマはまた、同系マウス（例えばBALB/cマウス又はnu/nuマウス）の腹腔内で増殖させ、大量の抗TRAIL-R1及び抗TRAIL-R2モノクローナル抗体を含む腹水を得ることができる。
ｇ．モノクローナル抗体の性状決定：モノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスはELISAで決定することができる。抗体濃度の定量は、Folin-Lowry法によって、又は280nmでの吸収／1.4（OD280）＝免疫グロブリン1mg/mLを基準にした計算によって実施することができる。
【０１０４】
Ｃ．モノクローナル抗体の特異性の分析
TRAIL-R1及びTRAIL-R2と結合するが他のTRAILレセプター（例えばTRAIL-R3及びTRAIL-R4）とは結合しないモノクローナル抗体を得るために、ELISAプレートを以下の組換えタンパク質で被覆する：1．TRAIL-R1及びTRAIL-R2ヘテロダイマー抗原、2．TRAIL-R1-Fc融合抗原、3．TRAIL-R2-Fc融合抗原、4．TRAIL-R3-Fc融合抗原、5．TRAIL-R4-Fc融合抗原、及び陰性コントロールとしてBSA。種々の濃度の精製抗体とのインキュベーション後にHRP結合ヤギ抗マウスIgGを添加する。TMB基質反応の後、ELISAプレートリーダーで光学密度を記録する。光学密度値を用いて、抗体と対応する抗原との結合を概算する。CTB003は、TRAIL-R1/TRAIL-R2ヘテロダイマー抗原と、TRAIL-R1-Fc又はTRAIL-R2-Fc融合抗原と同様に用量依存結合を示すが、TRAIL-R3-Fc、TRAIL-R4-Fc融合抗原及びBSAとは用量依存結合を示さず、CTB003はTRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2を認識する抗体であることが示唆される。
【０１０５】
Ｄ．モノクローナル抗体の機能の分析
ａ．ヒト悪性腫瘍細胞のin vitroアポトーシス誘導：ヒト癌細胞株パネルを種々の濃度の抗体とともに一晩インキュベートし、抗体処理後の細胞生存率を殺傷活性の決定に用いる。
ｂ．in vivo におけるCTB003の殺腫瘍活性：CTB003の殺腫瘍活性はヒト腫瘍細胞ゼノグラフトモデルで判定される。ヌードマウスの皮膚にヒト癌細胞を接種する。眼に見える腫瘍の増殖後に、担癌マウスにCTB003を腹腔内注射する。処理後の腫瘍サイズの減少の度合いをin vivo殺腫瘍活性の判定に用いる。
【０１０６】
Ｅ．抗体配列の分析
全RNAをハイブリドーマ細胞から単離し、鋳型として用いる。逆転写酵素によってcDNAを合成する。免疫グロブリン重鎖の可変領域をコードするcDNAを15のVH5'プライマー及び1つのCH3'プライマーのパネルを用いてPCRにより入手する。免疫グロブリン軽鎖の可変領域をコードするcDNAを8つのVK5'プライマー及び1つのCK3'プライマーのパネルを用いてPCRにより入手する。このPCR生成物をさらにTAクローニングベクター（Invitrogen）にてクローニングする。5つの別個のクローンを採取し、配列を決定する。CDR1、CDR2及びCDR3配列は、それらの高い可変性及び重鎖及び軽鎖内におけるそれらの位置から決定される。
【０１０７】
Ｆ．抗体認識エピトープの同定
抗原シリーズの調製：抗原のパネルは、抗体によって認識される完全な又は部分的な抗原エピトープを含む。これらの抗原は、ポリペプチドの化学的合成により、又は組換えDNA技術により入手できる。エピトープを含む領域を決定した後、正確なマッピングは、エピトープを含むポリペプチドをさらに短縮することによって達成される。さらにまた、エピトープを含むポリペプチドによる競合的阻害アッセイを利用して、前記エピトープを確認することができる。
【０１０８】
実施例2：TRAIL-R1及びTRAIL-R2抗原のヘテロダイマー型の調製
１．TRAIL-R1及びTRAIL-R2のcDNAのクローニング
ヒトTRAIL-R1及びTRAIL-R2タンパク質をコードするDNAを以下のRT-PCR法によってクローニングした：
a）鋳型
HeLa細胞の全RNAはTRIzol試薬（GIBCO BRL）を用いることによって抽出した。PCR反応のための鋳型は、ファースト-ストランドcDNA合成キット（Amersham Pharmacia Biotech）をキットとともに提供された指示マニュアルにしたがって用いることによって得た。
b）PCRプライマー
以下のオリゴヌクレオチドプライマーをPCRのために合成した：
5’-gacgatgcccgatctactttaaggg-3’（DR5p1：配列番号:49）
5’-ccactgggtgatgttggatggg-3’  （DR5p2：配列番号:50）
5’-gacgatgcccgatctactttaaggg-3’（DR4p1：配列番号:51）
5’-gacgatgcccgatctactttaaggg-3’（DR4p2：配列番号:52）
c）PCR反応
PCR反応溶液の組成：
鋳型cDNA、5μL（総反応物33μL）
プライマーDR5p1，10pmol；
プライマーDR5p2，10pmol；
10倍濃縮PCR緩衝液（キットとともに提供される）、10μL；
dNTP（各々2.5mM）、4μL；及び
Taqポリメラーゼ（Promega）、5単位。
滅菌蒸留水を前記溶液に総体積で100μLまで添加した。
PCR反応は以下のように実施した。先ず初めに溶液を94℃で2分間加熱した。その後、94℃で30秒、52℃で1分及び72℃で3分のサイクルを40回繰り返した。このプロセスの完了後、反応溶液を72℃で10分加熱した。このようにして得た増幅DNAフラグメントを0.25μg/mLの臭化エチジウムを含む1％アガロースゲルで分離させた。バンドが所望のDNAを含むことを確認し、Gene Cleanキット（BIO101）を用いて回収した。
d）PCR生成物のTAクローニング
前記DNAフラグメントはTAクローニングキット（Invitrogen, CA）を用いてクローニングした。これは以下のように実施した：PCR反応溶液から回収したDNAフラグメントを、50ngのpCR2.1ベクター（TAクローニングキットを用いて提供された）と併せて、1μLの10ｘリガーゼ反応緩衝液（6mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）、6mM塩化マグネシウム、5mMの塩化ナトリウム、7mMβ-メルカプトエタノール、0.1mMのATP、2mMのDTT、1mMスペルミジン及び0.1mg/mLのウシ血清アルブミン）で混合した（前記リガーゼ反応緩衝液には4単位のT4 DNAリガーゼ（1μL）が添加されてあった。混合物の全体積を無菌的な脱イオン水で10μLに調節し、得られたリガーゼ溶液は14℃で15時間インキュベートした。この後、前記リガーゼ反応溶液の2μLを50μLのコンピテント大腸菌株TOP10Fに添加し（前記TOP10FはTAクローニングキットで提供され、指示マニュアルにしたがってコンピテンスにした）、得られた混合物を氷上で30分、続いて42℃で30秒、再び氷上で5分維持した。次に500μLの培養液（2％v/vトリプトン、0.5％w/v酵母抽出液、0.05％w/v塩化ナトリウム、2.5mM塩化カリウム、1mM塩化マグネシウム及び20mMのグルコースを含む（以下では“SOC”培養液と称する））を前記培養に添加し、この混合物を37℃で1時間振盪しながらインキュベートした。この後、100μg/mLのアンピシリンを含む、L-ブロス寒天プレート（１％v/vトリプトン、0.5％w/v酵母抽出液、0.5％w/v塩化ナトリウム、0.1％w/vグルコース及び0.6％w/vバクトアーガー（Difco））上に前記培養を広げた。プレート上に出現したアンピシリン耐性コロニーを選別し、白金耳で掻きとり、100μg/mLのアンピシリンを含むL-ブロス培養液中にて37℃で一晩、200rpmで振盪しながら培養した。インキュベーション後、細胞を遠心によって採集し、この細胞からプラスミドDNAをアルカリ法によって調製した。TRAIL-R1又はTRAIL-R2の細胞外ドメインをコードするcDNAは、ヒトIgG1のFc部分をコードするcDNAを含むpcDNA3発現ベクター（Invitrogen, CA）にてさらにクローニングした。このようにして、TRAIL-R1-Fc又はTRAIL-R2-Fc融合タンパク質をコードする融合cDNAが得られた。
【０１０９】
２．TRAIL-R1-Fc及びTRAIL-R2-Fc融合タンパク質の発現及び精製
QBI-293A細胞にpcDNAIII-TRAIL-R1-Fc及びpcDNAIII-TRAIL-R2-Fcを同時トランスフェクトした。培養液をトランスフェクション48時間後に採集した。
上記のトランスフェクション細胞から採集した上清の合計500mLをプロテインA-セファロースCL-4Bアフィニティクロマトグラフィー（Pharmacia）に適用した。流速は2mL/分であった。培養上清を通過させた後、カラムを50mLのPBSで洗浄した。タンパク質は溶出緩衝液（0.1Mグリシン（pH2.4）、0.15MのNaCl）で溶出させた。各溶出画分（1mL）の光学密度をOD280nmで測定した。OD280が0.1を超える画分を採集した。100μLの中和緩衝液（1Mトリス塩酸、pH8.5）を添加した後、溶出液を別々に透析チューブに入れ、1リットルのPBS（pH7.5）に対して4℃で透析した。透析緩衝液は2回交換した。精製タンパク質は1mg/mLに濃縮し-80℃で保存した。タンパク質の純度は、SDS-PAGEで決定したとき95％を超えていた。非還元条件下では精製タンパク質の分子量は90kDであり、一方、還元条件下では分子量は45kDであった。
【０１１０】
３．組換えTRAIL-R1-Fc及びTRAIL-R2-Fc融合タンパク質の性状決定
ELISAプレートをPBS中のヤギ抗ヒトIgG（2μg/mL）で4℃にて一晩被覆した。PBSで3回洗浄した後、このプレートを3％のBSA PBSで室温にて1時間ブロッキングした。10μg/mLの精製融合タンパク質を添加し、37℃で1時間インキュベートした。PBSで3回洗浄した後、2μg/mLの抗TRAIL-R1及び抗TRAIL-R2モノクローナル抗体をさらに1時間37℃で添加した。PBSで3回洗浄して未結合抗体を除去し、続いてHRP-結合ヤギ抗マウスIgGを37℃で30分添加した。PBSで3回洗浄後、TMB基質緩衝液を10分間添加し、続いて2NのH2SO4を添加して反応を停止させた。450nm/650nmの二重波長を用いて光学密度の値をELISAプレートリーダーで記録した。
結果は表6に要約されている。抗TRAIL-R1及び抗TRAIL-R2モノクローナル抗体は精製融合タンパク質と反応するが、ヒトIgGとは反応しない。
【０１１１】
表6
2009535044.tif 000007
【０１１２】
ヘテロダイマーTRAIL-R1及びTRAIL-R2融合体の性状決定：ELISAプレートを1μg/mLの抗TRAIL-R1（CTB007）又は抗TRAIL-R2（CTB006）で4℃にて一晩被覆した。PBSで3回洗浄した後、このプレートを3％のBSA PBSでブロッキングした。100ng/mLの精製TRAIL-R1/TRAIL-R2融合タンパク質を37℃で1時間添加した。PBSで3回洗浄した後、100ng/mLのHRP-結合抗TRAIL-R1及び抗TRAIL-R2抗体をさらに1時間添加した。PBSで3回洗浄後、TMB基質緩衝液を10分間添加し、続いて2NのH2SO4を添加して反応を停止させた。450nm/650nmの二重波長を用いて光学密度の値をELISAプレートリーダーで記録した。表7の結果は、被覆抗体が抗TRAIL-R1であるときは、HRP-結合抗TRAIL-R2は融合タンパク質と反応することを示している。同様に、被覆抗体が抗TRAIL-R2であるときは、HRP-結合抗TRAIL-R1は融合タンパク質と同様に反応する。対照的に、抗体対、TRAIL-R1/TRAIL-R1又はTRAIL-R2/TRAIL-R2は弱い反応を示す。これらの結果は、精製タンパク質の大半はTRAIL-R1/TRAIL-R2のヘテロダイマー型であることを示している。
【０１１３】
表7：TRAIL-R1/TRAIL-R2タンパク質のヘテロダイマー融合物の性状決定
2009535044.tif 000008
【０１１４】
実施例3：ヒトTRAIL-R1及びTRAIL-R2に対するモノクローナル抗体の作製
１．免疫
6−8週齢の雌のBalb/cマウス（Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me）を、アフィニティ精製したヒトTRAIL-R1及びTRAIL-R2-Fc融合タンパク質で免疫した。フットパッドの初回免疫には、融合タンパク質（50μg）をフロイントの完全ジュバント（Difco, Detroit, Mich）に乳化させた。続いて、1日おきにアジュバント無しで50μgの融合タンパク質のブースター注射を4回投与した。最後の注射の3日後に、抹消リンパ節からリンパ球を採集した。
２．細胞融合
単一細胞懸濁液をリンパ節から調製し、NS1ミエローマ細胞と2：1の比率で混合した。得られた混合物をRPMI1640と3回洗浄した。続いて、37℃に予熱した1ｍLの50％w/vポリエチレングリコール1500（Boehringer Manheim）をゆっくりと前記チューブに添加し、その間ずっとピペットの先端を用いてペレットを攪拌した。続いて、37℃に予熱した50mLの血清非含有RPMI培養液をゆっくりと添加した。得られた混合物を続いて遠心し、上清を捨てて50mLのHAT培養液（12％v/vのFCSを含む）を添加し、その間ピペットの先端で穏やかに攪拌した。前記懸濁液を96ウェルの細胞培養マイクロプレートに100μL/ウェルで分注し、5％v/vのCO2雰囲気下で37℃にて7−10日間インキュベートした。
【０１１５】
３．モノクローナル抗体のスクリーニング
ELISAプレートを1μg/mLのヘテロダイマーTRAIL-R1及びTRAIL-R2-Fc融合タンパク質で4℃にて一晩被覆した。PBSで3回洗浄した後、前記プレートを3％BSA PBSで室温にて1時間ブロッキングした。続いて、100μLのハイブリドーマ培養上清を37℃で1時間添加した。PBSで3回洗浄後、HRP-結合抗マウスIgG抗体を30分添加した。PBSで3回洗浄後、TMB基質緩衝液を10分間添加し、続いて2NのH2SO4を添加して反応を停止させた。450nm/650nmの二重波長を用いて光学密度の値をELISAプレートリーダーで記録した。
全ての陽性クローンを二次確認スクリーニングに付し、TRAIL-R1又はTRAIL-R2単一特異性クローンおよびヒトIgG1と反応する偽陽性クローンを排除した。ELISAプレートを、1μg/mLのヘテロダイマーTRAIL-R1及びTRAIL-R2-Fc融合タンパク質、TRAIL-R1-Fc、TRAIL-R2-Fc、又はヒトIgG1で4℃にて一晩それぞれ被覆した。PBSで3回洗浄した後、プレートを3％BSA PBSで室温にて1時間ブロッキングした。続いて、100μLのハイブリドーマ培養上清を37℃で1時間添加した。PBSで3回洗浄後、HRP-結合抗マウスIgG抗体を30分添加した。PBSで3回洗浄後、TMB基質緩衝液を10分間添加し、続いて2NのH2SO4を添加して反応を停止させた。450nm/650nmの二重波長を用いて光学密度の値をELISAプレートリーダーで記録した。
250の陽性クローン全ての中で、ほぼ40％がTRAIL-R1-Fcと反応し、25％がTRAIL-Fcと反応し、残りがヒトIgG1と反応した。CTB003と称されるただ1つのクローンが、ヘテロダイマー型TRAIL-R1及びTRAIL-R2-Fc融合タンパク質、TRAIL-R1-Fc、TRAIL-R2-Fcと反応したが、ヒトIgG1とは反応しなかった。したがって、CTB003をTRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2に対する二重特異的クローンとして選別した。
【０１１６】
４．限界希釈によるクローニング
元のCTB003ハイブリドーマ細胞を12％のFCSを含むRPMI1640で0.3細胞/mLに希釈し、フィーダー細胞としてBalb/cマウスの105胸腺細胞の存在下で2枚の96ウェルプレートで培養した。7−10日後に、100μLの培養上清を採集し、上記に記載したようにELISAによって抗体産生を測定した。陽性クローンは限界希釈によって3回サブクローニングした。
クローニングしたCTB003はTRAIL-R1及びTRAIL-R2との反応性を保持しているが、ヒトIgG1との反応性はなく、したがって前記の二重特異的反応性が確認された。CTB003ハイブリドーマクローンはGCMCCに寄託され、アクセッション番号GCMCC1665を得た。
CTB003のアイソタイプは、マウス免疫グロブリンアイソタイプテストキットによってげっ歯類IgG1カッパと決定された。
５．CTB003モノクローナル抗体の精製
培養上清からCTB003の精製：培養上清をプロテインG-セファロースCL-4Bアフィニティクロマトグラフィー（Pharmacia）に適用した。流速は2mL/分であった。培養上清を通過させた後、カラムを50mLのPBSで洗浄した。タンパク質は溶出緩衝液（0.1Mグリシン（pH2.4）、0.15MのNaCl）で溶出させた。各溶出画分（1mL）の光学密度をOD280nmで測定した。OD280が0.1を超える画分を採集した。100μLの中和緩衝液（1Mトリス塩酸、pH8.5）を添加した後、溶出液を別々に透析チューブに入れ、1リットルのPBS（pH7.5）に対して4℃で透析した。透析緩衝液は2回交換した。精製タンパク質は1mg/mLに濃縮し、滅菌して-4℃で使用まで保存した。
【０１１７】
実施例4：CTB003のTRAILレセプターとの結合特異性
TRAIL及びTNFRファミリーの他のタンパク質に対するレセプターの全てが顕著な相同性を共有するので、TRAIL-R1及びTRAIL-R2に対する例示的抗体CTB003の特異性を、上記に記載の抗原としてTRAILレセプターの可溶形のパネルを用いELISAによって決定した。ELISAプレートは、以下の組換えタンパク質（PBS中で1μg/mL）を用いて4℃で一晩被覆した：1． TRAIL-R1及びTRAIL-R2ヘテロダイマー抗原、2．TRAIL-R1-Fc融合抗原、3．TRAIL-R2-Fc融合抗原、4．TRAIL-R3-Fc融合抗原、5．TRAIL-R4-Fc融合抗原、又は陰性コントロールとしてBSA。PBSで3回洗浄後、プレートを3％BSA PBSで室温にて1時間ブロッキングした。このプレートを種々の濃度の精製CTB003とともに37℃で1時間インキュベートした。PBSで3回洗浄後、HRP-結合抗マウスIgG抗体を続いて30分添加した。PBSで3回洗浄後、TMB基質緩衝液を10分間添加し、続いて2NのH2SO4を添加して反応を停止させた。450nm/650nmの二重波長を用いて光学密度の値をELISAプレートリーダーで記録した。CTB003は、TRAILR1/TRAIL-R2ヘテロダイマー抗原と、TRAIL-R1-Fc又はTRAIL-R2-Fc融合抗原と同様に用量依存結合を示した。試験した抗体濃度範囲では、CTB003はTRAIL-R3-Fc、TRAIL-R4-Fc融合抗原及びBSAとは反応しない（図2）。
【０１１８】
実施例5：CTB003のin vitroアポトーシス誘導活性
1．ヒト癌細胞株
CTB003のin vitroアポトーシス誘導活性の判定に以下を含むヒト癌細胞株のパネルを用いた：3つのヒト乳癌細胞株（図3、パネルA）；3つのヒト結腸癌細胞株（図3、パネルB）；3つのヒト膵臓癌細胞株（図3、パネルC）；3つのヒト卵巣癌細胞株（図3、パネルD）；3つのヒト前立腺癌細胞株（図3、パネルE）；3つのヒト肺癌細胞株（図3、パネルF）。全ての細胞株は、フローサイトメトリーによる試験で、TRAIL-R1及びTRAIL-R2の細胞表面発現について陽性であった（全ての細胞はATCCから購入した）。
２．細胞生存率決定のためのATPLiteアッセイ
10倍希釈CTB003の７つの濃度（最高希釈1000ng/mL及び最低希釈0.01ng/mL）の存在下で1,000標的細胞/ウェルを96ウェルプレートで培養した。37℃で一晩培養後、製造業者（Packard Instruments, Meriden, Conn.）の指示にしたがいATPLiteキットを用い、50μLの細胞溶解緩衝液、続いて50μLの基質緩衝液を添加して細胞生存率を決定した。反応は、ルミネッセンスリーダーで計測した。細胞生存率は、（処理細胞のcpm／コントロール細胞のcpm）ｘ100として計算される。
【０１１９】
３．CTB003による腫瘍細胞の用量依存殺傷
これらの結果は、CTB003はほとんどの被検ヒト腫瘍細胞に対して種々の殺傷活性を有することを示した。試験した3つのヒト乳癌細胞株では、2つの細胞株の生存率は10％未満であった（図3、パネルA）。3つの結腸癌細胞株全ての生存率は10％未満であった（図3、パネルB）。全てのヒト膵臓癌細胞株がCTB003に対して感受性であったが、3つのヒト膵臓癌細胞株のうち2つがCTB003に対してより感受性であった。1000ng/mLのCTB003で処理した後、生存細胞は5％未満であった（図3、パネルC）。全てのヒト卵巣癌細胞株がCTB003に対して感受性であったが、3つのヒト卵巣癌細胞株のうち2つがより感受性であった（図3、パネルD）。3つのヒト前立腺癌細胞株全てがCTB003に対して感受性であった（図3、パネルE）。3つのヒト肺癌細胞株のうち2つがCTB003処理に対して感受性であったが、1つの株はCTB003に対して耐性であるように思われた。これらの結果は、CTB003は被検癌細胞株のほとんどのタイプで殺傷活性を有することを示している。
４．CTB003による腫瘍細胞の時間依存殺傷
ヒト結腸癌細胞（Colo205）又はヒト乳癌細胞（MDA231）を、1000細胞/ウェルで1000ng/mLのCTB003の存在下で96ウェルプレートで表示した時間培養した。各時間の最後にATPLiteアッセイによって細胞生存率を決定した。細胞を1000ng/mLのCTB003で処理した後、処理したColo205及びMDA231の細胞生存率を4、8、12及び24時間の時点で決定した。結果は、CTB003の殺傷活性は時間依存性であることを示している。両細胞株の生存細胞は処理4時間後に50％未満、処理24時間後に5％未満に低下した（図4）。
【０１２０】
実施例6：化学療法薬によるCTB003の相乗的殺傷活性
１．癌細胞株
CTB003と化学療法薬との相乗的殺傷活性を決定するために、CTB003仲介殺傷に対して他の癌細胞株よりも感受性が低いヒト癌細胞株のパネルを選択した。実験のために選択した細胞株には以下が含まれた：ヒト乳癌細胞（BT474）、ヒト結腸癌細胞（SW620）、ヒト肺癌細胞（A437）、ヒト結腸癌細胞（SW1116）、及びヒト膵臓癌細胞（Panc 1）。全ての細胞をATCCから購入した。
２．化学療法薬
試験した化学療法薬にはアドリアマイシン、タキソール、シスプラチン及びCTP-11、並びにゲムシタビンが含まれる。
３．細胞生存率を決定するためのATPLiteアッセイ
10倍希釈CTB003の4つの濃度（最高希釈1000ng/mL及び最低希釈10ng/mL）の存在下で1,000標的細胞/ウェルを96ウェルプレートで、異なる3希釈の化学療法薬とともに培養した。37℃で一晩培養後、製造業者（Packard Instruments, Meriden, Conn.）の指示にしたがいATPLiteキットを用い、50μLの細胞溶解緩衝液、続いて50μLの基質緩衝液を添加して細胞生存率を決定した。反応は、ルミネッセンスリーダーで計測した。細胞生存率は、（処理細胞のcpm／コントロール細胞のcpm）ｘ100として計算される。
４．CTB003及びアドリアマイシンによるヒト乳癌細胞（BT474）の相乗的殺傷
アドリアマイシンの非存在下では、CTB003はBT474細胞に対して弱い殺傷活性を示す。細胞生存率は1000ng/mLのCTB003単独では20％低下するだけであった。しかしながら、アドリアマイシンは用量依存態様で相乗的にCTB003殺傷性を強化した。0.1μMのアドリアマイシンの存在下では、細胞生存率は25％未満に低下し、一方、より高濃度のアドリアマイシン（0.5及び1.0μM）では、細胞生存率は同じ濃度のCTB003で5％未満であった（図5、パネルA）。アドリアマイシンによるCTB003の相乗効果は図5のパネルBに提示されている。100％細胞生存率として培養液コントロールウェルから得られたAPTLite計測数を用い、処理細胞の細胞生存率パーセントを以下のように算出した：処理ウェルの計測数をコントロールウェルの計測数で割り、続いて100％を掛ける。結果は3ウェルの平均として提示される。
【０１２１】
５．CTB003及びタキソールによるヒト結腸癌細胞（SW620）の相乗的殺傷
タキソールの非存在下では、CTB003はSW620細胞に対して弱い殺傷活性を示す。細胞生存率は1000ng/mLのCTB003単独では20％低下するだけであった。しかしながら、タキソールは用量依存態様で相乗的にCTB003殺傷性を強化した。0.2μMのタキソールの存在下では、細胞生存率は25％未満に低下し、一方、より高濃度のタキソール（1.0μM）では、細胞生存率は同じ濃度のCTB003で5％未満であった（図6、パネルA）。タキソールによるCTB003の相乗効果は図6のパネルBに提示されている。100％細胞生存率として培養液コントロールウェルから得られたAPTLite計測数を用い、処理細胞の細胞生存率パーセントを以下のように算出した：処理ウェルの計測数をコントロールウェルの計測数で割り、続いて100％を掛ける。結果は3ウェルの平均として提示される。
６．CTB003及びシスプラチンによるヒト肺癌細胞（A437）の相乗的殺傷
シスプラチンの非存在下では、CTB003はA437細胞に対して殺傷活性をもたない。対照的に、シスプラチンは用量依存態様で相乗的にCTB003殺傷性を強化した。50μMのシスプラチンの存在下では、細胞生存率は25％未満に低下した（図７、パネルA）。シスプラチンによるCTB003の相乗効果は図7のパネルBに提示されている。100％細胞生存率として培養液コントロールウェルから得られたAPTLite計測数を用い、処理細胞の細胞生存率パーセントを以下のように算出した：処理ウェルの計測数をコントロールウェルの計測数で割り、続いて100％を掛ける。結果は3ウェルの平均として提示される。
【０１２２】
７．CTB003及びCTP-11によるヒト結腸癌細胞（SW1116）の相乗的殺傷
CTP-11の非存在下では、CTB003はSW1116細胞に対して弱い殺傷活性を示す。細胞生存率は1000ng/mLのCTB003単独では10％低下するだけであった。しかしながら、CTP-11は用量依存態様で相乗的にCTB003殺傷性を強化した。5μMのCTP-11の存在下では、細胞生存率は50％に低下し、一方、より高濃度のCTP-11（20μM）では、細胞生存率は同じ濃度のCTB003で25％未満であった（図8、パネルA）。CTP-11によるCTB003の相乗効果は図8のパネルBに提示されている。100％細胞生存率として培養液コントロールウェルから得られたAPTLite計測数を用い、処理細胞の細胞生存率パーセントを以下のように算出した：処理ウェルの計測数をコントロールウェルの計測数で割り、続いて100％を掛ける。結果は3ウェルの平均として提示される。
８．CTB003及びゲムシタビンによるヒト膵臓癌細胞（Panc-1）の相乗的殺傷
ゲムシタビンの非存在下では、CTB003はPanc-1細胞を殺すことができない。しかしながら、ゲムシタビンは用量依存態様で相乗的にCTB003殺傷性を強化した。1μMのゲムシタビンの存在下では、細胞生存率は25％未満に低下し、一方、より高濃度のゲムシタビン（10μM）では、細胞生存率は同じ濃度のCTB003で25％未満であった（図9、パネルA）。ゲムシタビンによるCTB003の相乗効果は図9のパネルBに提示されている。100％細胞生存率として培養液コントロールウェルから得られたAPTLite計測数を用い、処理細胞の細胞生存率パーセントを以下のように算出した：処理ウェルの計測数をコントロールウェルの計測数で割り、続いて100％を掛ける。結果は3ウェルの平均として提示される。
【０１２３】
実施例7：抗TRAIL-R1又は抗TRAIL-R2単一特異性モノクローナル抗体によるCTB003の相乗的殺傷活性
１．癌細胞株
抗TRAIL-R1又は抗TRAIL-R2単一特異性モノクローナル抗体によるCTB003の相乗的殺傷活性を決定するために、ヒト結腸癌細胞（SW1116）を選択した。CTB003又は抗TRAIL-R1若しくは抗TRAIL-R2単一特異性モノクローナル抗体は、単独ではSW1116細胞で細胞殺傷を誘発しなかった。
２．単一特異性抗TRAIL-R1又は抗TRAIL-R2抗体
CTB007はTRAIL-R1に対するモノクローナル抗体であり、前記は腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する。CTB006はTRAIL-R2に対して生成されたモノクローナル抗体であり、前記はTRAIL-R2を発現する腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する。
３．細胞生存率を決定するためのATPLiteアッセイ
10倍希釈CTB003の4つの濃度（最高希釈1000ng/mL及び最低希釈10ng/mL）の存在下で1,000標的細胞/ウェルを96ウェルプレートで、異なる3希釈の抗TRAIL-R1又は抗TRAIL-R2抗体とともに培養した。37℃で16時間培養後、製造業者（Packard Instruments, Meriden, Conn.）の指示にしたがいATPLiteキットを用い、50μLの細胞溶解緩衝液、続いて50μLの基質緩衝液を添加して細胞生存率を決定した。反応は、ルミネッセンスリーダーで計測した。細胞生存率は、（処理細胞のcpm／コントロール細胞のcpm）ｘ100％として計算した。
【０１２４】
４．CTB003及びCTB007によるヒト結腸癌細胞（SW1116）の相乗的殺傷
CTB007の非存在下では、CTB003はSW116細胞に対して弱い殺傷活性を示す。細胞生存率は1000ng/mLのCTB003単独では10％低下しただけであった。しかしながら、CTB007は用量依存態様で相乗的にCTB003殺傷性を強化した。10ng/mLのCTB007の存在下では、細胞生存率は50％に低下し、一方、より高濃度のCTB007（100ng/mL）では、細胞生存率は同じ濃度のCTB003で25％未満であった（図10、パネルA）。CTB007によるCTB003の相乗効果は図10のパネルBに提示されている。100％細胞生存率として培養液コントロールウェルから得られたAPTLite計測数を用い、処理細胞の細胞生存率パーセントを以下のように算出した：処理ウェルの計測数をコントロールウェルの計測数で割り、続いて100％を掛ける。結果は3ウェルの平均として提示される。
５．CTB003及びCTB006によるヒト結腸癌細胞（SW1116）の相乗的殺傷
CTB007の非存在下では、CTB003はSW620細胞に対して弱い殺傷活性を示す。細胞生存率は1000ng/mLのCTB003単独では10％低下しただけであった。しかしながら、CTB006は用量依存態様で相乗的にCTB003殺傷性を強化した。10ng/mLのCTB006の存在下では、細胞生存率は50％に低下し、一方、より高濃度のCTB006（100ng/mL）では、細胞生存率は同じ濃度のCTB003で25％未満であった（図11、パネルA）。CTB006によるCTB003の相乗効果は図11のパネルBに提示されている。100％細胞生存率として培養液コントロールウェルから得られたAPTLite計測数を用い、処理細胞の細胞生存率パーセントを以下のように算出した：処理ウェルの計測数をコントロールウェルの計測数で割り、続いて100％を掛ける。結果は3ウェルの平均として提示される。
【０１２５】
実施例8：CTB003のin vivo殺腫瘍活性
１．ヒト癌細胞株
ヒト癌のげっ歯類ゼノグラフトモデルの作製に用いられたヒト癌細胞株は以下である：a）MDA231ヒト乳癌細胞株；b）7402ヒト肝癌細胞株；c）Colo205ヒト結腸癌細胞株；及びd）MIAcapaヒト膵臓癌細胞株。細胞はいずれもATCCから購入し、10％FCSを補充したDMEMで培養した。
２．異種移植モデル
6から8週齢のBalb/cヌードマウスの皮下に1ｘ107のヒト癌細胞を接種した。接種した腫瘍細胞株に応じて腫瘍接種後7−14日で、90％を越えるマウスが眼に見える腫瘍塊を形成した。前記担癌マウスをランダムに2つの群に分けた。1つは未処置コントロール群でもう一方はCTB003処置群であった。ヒト癌の腫瘍増殖は腫瘍サイズによって判定した。接種後、腫瘍サイズは毎週測定した。
３．異種移植マウスのCTB003による処置
担癌マウスに200μgのCTB003を3日間隔で1週間に2回腹腔内注射した。この処置を3週間内に6回繰り返した。
【０１２６】
４．ヒト乳癌異種移植モデルにおけるCTB003のin vivo抗腫瘍活性
未処置群では、腫瘍の倍化時間は約7日であった。CTB003による処置後、腫瘍サイズは急速に減少した。処置群では、2回処置後に7匹のマウスのうち3匹で完全な腫瘍の退縮が生じた。他の3匹のマウス及び1匹のマウスでそれぞれ70％及び50％を超える腫瘍サイズの縮退が観察された。4回処置後、完全な腫瘍の縮退が7匹のマウスの全てで生じた。対照的に、未処置コントロール群の全マウスで腫瘍サイズは増加し続けた。これらの結果は、CTB003は強力な抗腫瘍効果を有することを示している（図12）。別の実験では、MDA231ゼノグラフトモデルにおける抗腫瘍効果が、癌細胞接種後49日間判定された。未処置群の100％（8/8）のマウスが腫瘍サイズの持続的増加を示し、CTB003処置マウスの大半（7／8）が腫瘍の完全な退縮を示した（図13）。したがって、本発明のTRAILレセプター結合因子は、ヒト癌（例えばヒト乳癌）のin vivoモデルで対象に投与したとき、治療的利益（例えば腫瘍増殖抑制）を示す。したがって、本発明のTRAILレセプター結合因子は、その同族体及び機能的等価物（例えばhCTB003）も同様に、その必要がある対象に有効量で投与されたとき、ヒト癌（例えばヒト乳癌）の予防又は治療方法で有用である。
５．ヒト肝癌異種移植モデルにおけるCTB003のin vivo抗腫瘍活性
7402ヒト肝癌異種移植モデルで、CTB003は顕著な抑制活性を示した。腫瘍の倍化時間は、CTB003処置群の35日と比較して、未処置群では約10日であった（図14）。したがって、本発明のTRAILレセプター結合因子は、ヒト癌（例えばヒト肝癌）のin vivoモデルで対象に投与したとき、治療的利益（例えば腫瘍増殖抑制）を示す。したがって、本発明のTRAILレセプター結合因子は、その同族体及び機能的等価物（例えばhCTB003）も同様に、その必要がある対象に有効量で投与されたとき、ヒト癌（例えばヒト肝癌）の予防又は治療方法で有用である。
６．ヒト結腸癌異種移植モデルにおけるCTB003のin vivo抗腫瘍活性
Colo205ヒト結腸癌異種移植モデルで、CTB003は、未処置群の100％の腫瘍進行と比較して100％の完全な腫瘍退縮を示した（図15）。したがって、本発明のTRAILレセプター結合因子は、ヒト癌（例えばヒト結腸癌（例えば結直腸癌））のin vivoモデルで対象に投与したとき、治療的利益（例えば腫瘍増殖抑制）を示す。したがって、本発明のTRAILレセプター結合因子は、その同族体及び機能的等価物（例えばhCTB003）も同様に、その必要がある対象に有効量で投与されたとき、ヒト癌（例えばヒト結腸癌）の予防又は治療方法で有用である。
【０１２７】
７．ヒト膵臓癌異種移植モデルにおけるCTB003のin vivo抗腫瘍活性
MIAcapaヒト膵臓癌異種移植モデルで、CTB003は顕著な抑制活性を示した。腫瘍の倍化時間は、CTB003処置群の70日と比較して、未処置群では約14日であった（図16）。したがって、本発明のTRAILレセプター結合因子は、ヒト癌（例えばヒト膵臓癌）のin vivoモデルで対象に投与したとき、治療的利益（例えば腫瘍増殖抑制）を示す。したがって、本発明のTRAILレセプター結合因子は、その同族体及び機能的等価物（例えばhCTB003）も同様に、その必要がある対象に有効量で投与されたとき、ヒト癌（例えばヒト膵臓癌）の予防又は治療方法で有用である。
総合すれば、本発明のTRAILレセプター結合因子は、多様なヒト癌（例えばヒト乳癌、ヒト肝癌、ヒト結腸癌、ヒト膵臓癌）のin vivoモデルで対象に投与したとき、治療的利益（例えば、未処置コントロールで観察される腫瘍の増殖と比較して腫瘍増殖の低下）を示す。これらの癌は、TRAIL−R1及び／又はTRAIL-R2ポリペプチド発現の生物学的特徴を共有する。上記で考察したように、細胞上での機能的TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2ポリペプチドの活性化は細胞死（例えばアポトーシス細胞死）をもたらすことができる。したがって、本発明のTRAILレセプター結合因子は、その同族体及び機能的等価物（例えばhCTB003）も同様に、その必要がある対象に有効量で投与されたとき、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2ポリペプチドを発現するヒト癌細胞（例えば乳癌、肝癌、結腸癌、膵臓癌を含むが、ただしこれらに限定されない）の予防又は治療方法で有用である。
【０１２８】
実施例9：CTB003及びアドリアマイシンの相乗的in vivo抗腫瘍効果
１．ヒト癌細胞株
ヒト乳癌細胞株（MDA231）をヌードマウスの異種移植モデルの調製に用いる。
２．異種移植モデル
6から8週齢のBalb/cヌードマウスの皮下に1ｘ107のヒトMDA231乳癌細胞を接種した。腫瘍接種後7−10日で、90％を越えるマウスが眼に見える腫瘍塊を形成した。前記担癌マウスをランダムに4つの群に分けた：第一群は未処置コントロール群であり、第二群はアドリアマイシンだけで処置し、第三群はCTB003だけで処置し、第四群はアドリアマイシン及びCTB003を併用して処置した。ヒト乳癌の腫瘍増殖は腫瘍サイズの測定によって判定した。接種後、腫瘍サイズはマウスで毎週測定した。
３．異種移植マウスのCTB003及びアドリアマイシンによる処置
100μg/ドースのアドリアマイシンを3日間隔で1週間に2度3回腹腔内注射した。200μg/ドースのCTB003を3日間隔で1週間に2度、合計6回腹腔内注射した。アドリアマイシンはCTB003の注射の1日前に投与した。
４．CTB003及びアドリアマイシンのin vivo相乗的抗腫瘍効果
未処置群では、腫瘍の倍化時間は約7日であった。アドリアマイシン単独処置後、腫瘍抑制は観察されたが、処置前と比較して腫瘍サイズ減少は顕著ではなかった。CTB003処置群では、腫瘍サイズは急速に減少した。2用量の処置後に、処置群の7匹のマウスのうち3匹で完全な腫瘍の退縮が生じた。他の3匹のマウス及び1匹のマウスでそれぞれ70％及び50％を超える腫瘍サイズの縮退が観察された。4用量処置後、ほぼ完全な腫瘍の縮退が7匹のマウスの全てで生じた。マウスをCTB003及びアドリアマイシンで処置したとき、処置の二巡後に、7匹のマウスのうち5匹で完全な腫瘍の縮退が生じ、他のマウスの腫瘍サイズは、CTB003だけで処理したマウスで観察された腫瘍サイズよりも顕著に小さかった。与えられた用量のアドリアマイシンだけではほとんど効果を示さなかったので、CTB003及びアドリアマイシン併用処置における顕著に増加した完全な腫瘍退縮は、CTB003及びアドリアマイシンはin vivoで相乗的な抗腫瘍効果を有することを示唆している（図17）。
したがって、本発明のTRAILレセプター結合因子は、別の化学療法薬（例えばアドリアマイシン）と併用した場合は、ヒト癌（例えばヒト乳癌）のin vivoモデルで対象に投与したとき治療的利益（例えば腫瘍増殖抑制）を示す。したがって、本発明のTRAILレセプター結合因子は、その同族体及び機能的等価物（例えばhCTB003）も同様に、1つ以上の化学療法薬（例えばアドリアマイシン）と併用してその必要がある対象に有効量で投与されたとき、ヒト癌（例えばヒト乳癌）の予防又は治療方法で有用である。
【０１２９】
実施例10：CTB003及びCTB006のin vivo抗腫瘍効果
１．ヒト癌細胞株
ヒト乳癌細胞株（MDA231）をヌードマウスの異種移植モデルの調製に用いた。
２．異種移植モデル
6から8週齢のBalb/cヌードマウスの皮下に1ｘ107のヒトMDA231乳癌細胞を接種した。腫瘍接種後7−10日で、90％を越えるマウスが眼に見える腫瘍塊を形成した。前記担癌マウスをランダムに4つの群に分けた：第一は未処置コントロール群であり、第二群はCTB006だけで処置し、第三群はCTB003だけで処置し、第四群はCTB006及びCTB003を併用して処置した。ヒト乳癌の腫瘍増殖は腫瘍サイズの測定によって判定した。接種後、腫瘍サイズはマウスで毎週測定した。
３．異種移植マウスのCTB003及びCTB006による処置
CTB006処置群の担癌マウスに、100μgのCTB006を週2回、3日間隔で3回腹腔内注射した。CTB003処置群の担癌マウスに、200μgのCTB003を週2回、3日間隔で腹腔内注射した。2つの抗体は同時に投与した。
４．CTB003及びアドリアマイシンのin vivo抗腫瘍効果
未処置群では、腫瘍の倍化時間は約7日であった。CTB006単独処置後、腫瘍抑制は観察されたが、処置前と比較して腫瘍サイズ減少は顕著ではなかった。CTB003処置群では、腫瘍サイズは急速に減少した。2用量の処置後に、処置群の7匹のマウスのうち3匹で完全な腫瘍の退縮が生じた。他の3匹のマウス及び1匹のマウスでそれぞれ70％及び50％を超える腫瘍サイズの縮退が観察された。4用量処置後、完全な腫瘍の縮退が7匹のマウスの全てで生じた。マウスをCTB003及びCTB006で併用処置したとき、7匹のマウスのうち4匹で完全な腫瘍の縮退が生じ、前記処置群の残りのマウスの腫瘍サイズは、CTB003単独処置群で観察されたものよりも顕著に小さかった。これらの結果は、CTB003及びCTB006はin vivoで相乗的な抗腫瘍効果を有することを示唆している（図18）。
したがって、本発明のTRAILレセプター結合因子は、別のTRAILレセプター結合因子（例えばCTB006）と併用した場合は、ヒト癌（例えばヒト乳癌）のin vivoモデルで対象に投与したとき治療的利益（例えば腫瘍増殖抑制）を示す。したがって、本発明のTRAILレセプター結合因子は、その同族体及び機能的等価物（例えばhCTB003）も同様に、別のTRAILレセプター結合因子（例えばCTB006、hCTB006）と併用してその必要がある対象に有効量で投与された場合、ヒト癌（例えばヒト乳癌）の予防又は治療方法で有用である。
【０１３０】
実施例11：CTB003の重鎖及び軽鎖の可変領域の配列の分析
１．CTB003の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするcDNAのクローニング
全RNAはCTB003ハイブリドーマから単離する。cDNAを逆転写により合成し、これをCTB003の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするcDNAのクローニングのための鋳型として用いる。
２．PCRオリゴヌクレオチドプライマーの合成
a）15の重鎖可変領域プライマー（SfiI制限部位を含む）は以下のとおりである：
VH1 (49mer)：5'- GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CC(C又はG) AGG T (C or T) C AGC T(C又はG又はT)C AGC AGT C -3' (配列番号:53)
VH2 (49mer)：5'- GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCC AGG TTC ACC TGC AGC A(A又はG)T C -3' (配列番号:54)
VH3 (49mer)：5'- GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCC AGG T(A又はG)C AGC TGA AGG AGT C -3' (配列番号:55)
VH4 (49mer)：5'- GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCC AGG TCC AAC T(A又はC又はG)C AGC A(A又はG)C C -3' (配列番号:56)
VH5 (49mer)：5'- GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCC AGA TCC AGT TGG T(A又はC又はG)C AGT C -3' (配列番号:57)
VH6 (49mer)：5'- GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCC AGG TGC AGC TGA AG(C又はG) A(C又はG)T C -3' (配列番号:58)
VH7 (49 mer)：5'- GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCG AGG TGC AG(C又はG) (G又はT)GG TGG AGT C -3' (配列番号:59)
VH8 (49mer)：5'- GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCG AAG TGA ARS TTG AGG AGT C -3' (配列番号:60)
VH9 (49mer)：5'- GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCG A(G又はT)G T(C又はG)(A又はC又はG) AGC TTC AGG AGT C -3' (配列番号:61)
VH10 (49mer)：5'- GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCG AGG TGA A(C又はG)(C又はG) TGG TGG AAT C -3' (配列番号:62)
VH11 (49mer)：5'- GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCG AGG TGA AGC TG(A又はG) TGG A(A又はG)T C -3' (配列番号:63)
VH12 (49mer)：5'- GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCG A(A又はG)G TGA AGC TG(A又はG) TGG AGT C -3' (配列番号:64)
VH13 (49mer)：5'- GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCG AAG TGC AGC TGT TGG AGA C -3' (配列番号:65)
VH14 (49mer)：5'- GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCG A(A又はG)G TGA AGC TTC TC(C又はG) AGT C -3' (配列番号:66)
VH15 (48mer)：5'- GGA ACC CTT TGG CCC AGC CGG CCA TGG CCC A(A又はG)G TTA CTC TGA AAG AGT -3' (配列番号:67)
b）IgG定常領域プライマー：
IgG CH (20mer)：5'- TAR CCY TTG ACM AGG CAT CC -3' (配列番号:68)
【０１３１】
c）8つの軽鎖可変領域プライマー：
VK1 (32mer)：5'- TAT TCG TCG ACG GAT ATT GTG ATG AC(C又はG又はT) CAG (A又はG又はT)C -3' (配列番号:69)
VK2 (32mer)：5'- TAT TCG TCG ACG GAT (A又はG)TT (G又はT)TG ATG ACC CA(A又はG) AC -3' (配列番号:70)
VK3 (32mer)：5'- TAT TCG TCG ACG GAA AAT GTG CTC ACC CAG TC -3' (配列番号:71)
VK4 (32mer)：5'- TAT TCG TCG ACG GA(C又はT) ATT GTG ATG ACA CAG TC -3' (配列番号:72)
VK5 (32mer): 5'- TAT TCG TCG ACG GAC ATC CAG ATG ACA CAG AC -3' (配列番号:73)
VK6 (32mer)：5'- TAT TCG TCG ACG GA(C又はT) ATT GTG CTS AC(C又はT) CA(A又はG) TC -3' (配列番号:74)
VK7 (32mer)：5'- TAT TCG TCG ACG GAC ATC CAG ATG AC(C又はT) CA(A又はG) TC -3' (配列番号:75)
VK8 (32mer)：5'- TAT TCG TCG ACG CAA ATT GTT CTC ACC CAG TC -3' (配列番号:76)
d）カッパ軽鎖定常領域プライマー：
IgG CK (18mer)：5'- CGT TCA CTG CCA TCA ATC -3' (配列番号:77)
【０１３２】
３．PCR反応
CTB003の重鎖可変領域をコードするcDNAを得るために合計15のPCR反応を設定し、一方、軽鎖可変領域をコードするcDNAのために8反応を設定した。PCR反応溶液の組成は以下のとおりであった：鋳型cDNA5μL、10pmolの5'プライマー：VH1−VH5又はVK1−VK8、10pmolの3'プライマーCH又はCK。10μLの10倍濃縮PCR緩衝液、4μLのdNTP（各々2.5mM）、5ユニットのTaqポリメラーゼ（Promega）。無菌的蒸留水を前記溶液に加えて総体積100μLにした。PCR反応は以下のように実施した。溶液は最初に94℃で2分加熱し、その後、94℃で30秒、52℃で1分及び72℃で3分の加熱サイクルを40回繰り返した。この工程の完了後、反応溶液を72℃で10分加熱した。このようにして得た増幅DNAフラグメントを、0.25μg/mLの臭化エチジウムを含む1％アガロースゲルで分離した。所望のDNAフラグメントを含むと決定されたバンドをGene Cleanキット（BIO101）を用いて回収した。
４．PCR生成物のTAクローニング
前記DNAフラグメントはTAクローニングキット（Invitrogen, CA）を用いてクローニングした。これは以下のように実施した：PCR反応溶液から回収したDNAフラグメントを、50ngのpCR2.1ベクター（TAクローニングキットを用いて提供された）と併せて、1μLの10ｘリガーゼ反応緩衝液（6mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）、6mM塩化マグネシウム、5mMの塩化ナトリウム、7mMベータ-メルカプトエタノール、0.1mMのATP、2mMのDTT、1mMスペルミジン及び0.1mg/mLのウシ血清アルブミン）とともに混合した（前記リガーゼ反応緩衝液には4単位のT4 DNAリガーゼ（1μL）が添加されてあった）。混合物の総体積は無菌的な脱イオン水で10μLに調節し、得られたリガーゼ溶液は14℃で15時間インキュベートした。この後、前記リガーゼ反応溶液の2μLを50μLのコンピテント大腸菌株TOP10Fに添加し（前記TOP10FはTAクローニングキットで提供され、指示マニュアルにしたがってコンピテンスにした）、得られた混合物を氷上で30分、続いて42℃で30秒、再び氷上で5分維持した。次に500μLの培養液（2％v/vトリプトン、0.5％w/v酵母抽出液、0.05％w/v塩化ナトリウム、2.5mM塩化カリウム、1mM塩化マグネシウム及び20mMのグルコースを含む（以下では“SOC”培養液と称する））を前記培養に添加し、この混合物を37℃で1時間振盪しながらインキュベートした。この後、L-ブロス寒天プレート（１％v/vトリプトン、0.5％w/v酵母抽出液、0.5％w/v塩化ナトリウム、0.1％w/vグルコース及び0.6％w/vバクトアーガー（Difco））上に前記培養を広げた。プレート上に出現したアンピシリン耐性コロニーを選別し、白金耳で掻きとり、100μg/mLのアンピシリンを含むL-ブロス培養液中にて37℃で一晩、200rpmで振盪しながら培養した。インキュベーション後、細胞を遠心によって採集し、この細胞からプラスミドDNAをアルカリ法によって調製した。
５．配列分析
5つのそれぞれ別個のTAクローンをランダムに採取した。配列はM13プライマーを用いて双方向の配列を得た。
６．結果
PCR反応はVH1及びVK1プライマーを用いて特異的DNA生成物を産出した。軽鎖及び重鎖の可変領域の配列は図1に示されている。
【０１３３】
実施例12：CTB003によって認識されるエピトープの分析
１．TRAIL-R2の細胞外ドメインをコードするポリペプチドの合成
ペプチドA．TRAIL-R2 (aa52-aa81)    ESALITQQDLAPQQRAAPQQKRSSPSEGLC（配列番号:6）
ペププチドB．TRAIL-R2 (aa72-aa101)    KRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQ（配列番号:78）
ペプチドC． TRAIL-R2 (aa92-aa121)    RDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDS（配列番号:79）
ペプチドD．TRAIL-R2 （aa112-aa141)    FCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEE（配列番号:80）
ペプチドE．TRAIL-R2 (aa132-aa161)    TRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCP（配列番号:81）
ペプチドF．TRAIL-R2 (aa154-aa183)    RKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKES（配列番号:82）
ペプチドG．TRAIL-R2 (aa164-aa193)    MVKVGDCTPWSDIECVHKESGTKHSGEAPA（配列番号:83）
【０１３４】
２．競合的阻害ELISA
ELISAプレートは、PBS中のTRAIL-R2-Fc融合タンパク質（1μg/mL）で4℃にて一晩被覆した。PBSで3回洗浄後、このプレートを3％のBSA PBSで室温にて1時間ブロッキングした。種々の濃度のTRAIL-R2ポリペプチドA、B、C、D、E、F、Gのそれぞれとともに、1μg/mLのCTB003を37℃で1時間添加した。PBSで3回洗浄して未結合抗体を除去し、続いてHRP-結合ヤギ抗マウスIgG1を37℃で30分添加した。PBSで3回洗浄後、TMB基質緩衝液を10分間添加し、続いて2NのH2SO4を添加して反応を停止させた。450nm/650nmの二重波長を用いて光学密度の値をELISAプレートリーダーで記録した。
CTB003とTRAIL-R2との最大結合として、ペプチドの非存在下でのOD値を決定した。CTB003とTRAIL-R2との結合に対する種々の濃度のペプチドの競合的阻害は、最大結合のパーセンテージとして算出した。
３．結果
図19に示すように、試験した他のペプチド（すなわちペプチドA−E）と異なり、ペプチドF及びペプチドGは、用量依存態様でCTB003とTRAIL-R2との結合を阻害した。したがって、CTB003によって認識されるエピトープは、TRAIL-R2のaa163からaa211の間の配列に存在する。
【０１３５】
４．TRAIL-R2及びTRAIL-R1の細胞外ドメインをコードするポリペプチドの合成
CTB003のエピトープの更なる確認のために、TRAIL-R1及びTRAIL-R2の細胞外ドメインのアミノ酸配列相同性を比較した。TRAIL-R2のaa167からaa182とTRAIL-R1のaa218からaa233との間に高度に相同な領域が同定されたが、TRAIL-R3及びTRAIL-R4の対応する領域では同定できなかった（図31）。したがって、TRAIL-R1及びTRAIL-R2の両方でCTB003によって認識されるエピトープはこの領域に存在する可能性があると仮定された。この仮説を試験するために、ペプチドH及びペプチドIを以下のように合成した：
ペプチドH．TRAIL-R2 (aa167-aa182)    VGDCTPWSDIECVHKE（配列番号:46）
ペプチドI．TRAIL-R1 (aa218-aa233)    VKDCTPWSDIECVHKE（配列番号:45）
【０１３６】
５．競合的阻害ELISA
ELISAプレートは、PBS中のTRAIL-R1又はTRAIL-R2-Fc融合タンパク質（1μg/mL）で4℃にて一晩被覆した。PBSで3回洗浄後、このプレートを3％のBSA PBSで室温にて1時間ブロッキングした。種々の濃度のポリペプチドH及びポリペプチドIのそれぞれとともに、1μg/mLのCTB003を37℃で1時間添加した。PBSで3回洗浄して未結合抗体を除去し、続いてHRP-結合ヤギ抗マウスIgG1を37℃で30分添加した。PBSで3回洗浄後、TMB基質緩衝液を10分間添加し、続いて2NのH2SO4を添加して反応を停止させた。450nm/650nmの二重波長を用いて光学密度の値をELISAプレートリーダーで記録した。
CTB003とTRAIL-R1又はTRAIL-R2との最大結合として、ペプチドの非存在下でのOD値を決定した。CTB003とTRAIL-R2との結合に対する種々の濃度のペプチドの競合的阻害は、最大結合のパーセンテージとして算出した。
６．結果
図20のパネルAに示すように、ペプチドH又はI両方とも、用量依存態様でCTB003とTRAIL-R1との結合を阻害した。同様に、図20のパネルBに示すように、ペプチドH又はI両方とも、用量依存態様でCTB003とTRAIL-R2との結合を阻害した。したがって、CTB003によって認識されるエピトープは、TRAIL-R2のaa167からaa182の間及びTRAIL-R1のaa218からaa233の間の配列（すなわちTRAIL-R1及びTRAIL-R2間の配列相同性領域）に存在する。出願人の知るところでは、TRAIL-R1及びTRAIL-R2ポリペプチドの共通エピトープとしてこの領域が同定されたのはこれが最初であり、この領域は、TRAIL-R1又はTRAIL-R2又はその両方を発現する癌細胞のアポトーシスを誘導するアゴニスト抗体の生成の標的となりえる。
【０１３７】
実施例13：本発明のマウス-ヒトキメラCTB003、CTB006及びCTB007 TRAILレセプター結合因子の調製及び性状決定
Ｉ．マウス-ヒトキメラCTB003、CTB006及びCTB007 TRAILレセプター結合因子の調製
マウス可変領域遺伝子：マウス-ヒトキメラ抗体の構築に用いられる重鎖及び軽鎖可変領域は、マウス-マウスハイブリドーマCTB003（CGMCC No.1665）、CTB006（CGMCC No.1691）、又はCTB007（CGMCC No.1733）から得られた。これらの重鎖及び軽鎖クローンをPCR変異導入のための鋳型として用いて、TAクローニングベクターでのクローニングのための制限部位を導入した。
ヒトIgG1定常領域cDNAのクローニング：ヒトIgG1重鎖及び軽鎖定常領域をコードするcDNAクローンを、ヒト抹消血の単核細胞から単離した全RNAを用いてRT-PCRによってクローニングした。配列を確認した後、cDNAを発現ベクター（pcDNAIII）でクローニングした。
キメラCTB003、CTB006及びCTB007発現ベクターの構築：上記に記載のハイブリドーマに由来するクローン化重鎖及び軽鎖可変領域cDNAをプライマーとともにPCRのための鋳型として用いた。前記クローンにはpcDNAIII発現ベクターへの連結のための制限部位が取り込まれてあり、pcDNAIII発現ベクターには、ヒトIgG1重鎖又は軽鎖定常領域が正しい読み枠内に取り込まれていた。PCR生成物を先ず初めにpCRIIに連結し、大腸菌でクローニングし、再度配列を決定して、この新規な制限部位の導入時に変異が発生していないことを確認した。軽鎖及び重鎖可変領域生成物を、Ig発現ベクターのDraIII及びBsiWI（カッパ軽鎖）及びMluI及びNheI（ガンマ1重鎖）部位にてクローニングした。生成された完全な発現ベクターを、pcDNAIII-hCTB003LC、pcDNAIII-hCTB003HC、pcDNAIII-hCTB006LC、pcDNAIII-hCTB006HC、pcDNAIII-hCTB007LC、pcDNAIII-hCTB007HCと称した。これらのcDNAクローン及び発現ベクターは、上記で詳述したように全中国菌培養収集センター（China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC)）に2007年4月13日に寄託された。
【０１３８】
キメラ抗体の発現のためのCHO細胞のトランスフェクション及び抗体産生クローンの選別：対プラスミド、pcDNAIII-hCTB003LC及びpcDNAIII-hCTB003HC、pcDNAIII-hCTB006LC及びpcDNAIII-hCTB006HC、又はpcDNAIII-hCTB007LC及びpcDNAIII-hCTB007HCを、DNA-リポソーム仲介トランスフェクションによってそれぞれ別々にチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞に導入した。略記すれば、最終体積1mLの血清非含有培養液中で、2μgのプラスミドDNAを8μLのリポフェクタミン（Gibco, Gaithersberg, MD）とともに混合した。前記トランスフェクション混合物を37℃で5時間インキュベートした。細胞を洗浄し、新しい培養液を添加し、細胞をさらに48時間インキュベートした。細胞を採集し、G418（400μg/mL；Gibco）を含む培養液に再懸濁し、種々の希釈で12ウェルプレートに播種した。抗生物質選別下で増殖した細胞によるキメラ抗体産生を酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって測定した。ELISAプレートを、2μgのTRAIL-R1-Fc又はTRAIL-R2-Fc融合タンパク質のどちらかで被覆し、培養上清中のmAb（すなわちモノクローナル抗体）の結合は、HRP-結合ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖特異的抗体（SoutherBiotech, Birmingham, Alabama）により検出した。
キメラ抗体の精製：キメラIgG抗体は、プロテインAアフィニティクロマトグラフィー（Pharmacia）によって組織培養上清から精製した。トランスフェクトしたCHO細胞由来の500mL培養上清をプロテインAセファロースカラムに流速2mL/分で流した。培養上清を流した後、カラムを50mLのPBSで洗浄した。タンパク質は溶出緩衝液（0.1Mグリセリン（pH2.4）、0.15MのNaCl）で溶出させた。各溶出画分（1mL）の光学密度はOD280nmで測定した。OD280が0.1を超える画分を収集した。100μLの中和緩衝液（1Mのトリス塩酸、pH8.5）の添加後、溶出液を別々に透析チューブに入れ、前記溶出液を1LのPBS（pH7.5）に対して4℃で透析した。透析緩衝液は2回交換した。精製タンパク質を1mg/mLに濃縮し、滅菌して使用まで-4℃で保存した。ヒトキメラ抗体の純度は10％SDS-PAGEで95％を超えた。
【０１３９】
II．キメラCTB003、CTB006及びCTB007とTRAILレセプターとの結合の特徴
キメラCTB003、CTB006及びCTB007のTRAILレセプターとの結合活性をそれらの親マウス抗体とELISAによって比較した。以下の組換えタンパク質（PBS中で1μg/mL）でELISAプレートを4℃で一晩被覆した：１．TRAIL-R1及びTRAIL-R2ヘテロダイマー抗原、２．TRAIL-R1-Fc融合抗原、３．TRAIL-R2-Fc融合抗原、４．TRAIL-R3-Fc融合抗原、５．TRAIL-R4-Fc融合抗原、又は陰性コントロールとしてBSA。PBSで3回洗浄した後、このプレートを3％のBSA PBSで室温にて1時間ブロッキングした。種々の濃度の精製キメラ抗体又は親マウス抗体とともに37℃で1時間インキュベートした。PBSで3回洗浄して未結合抗体を除去し、続いて、マウス抗体に対してはHRP-結合ヤギ抗マウスIgG1を、ヒトキメラ抗体に対してはHRP-結合ヤギ抗ヒトカッパを37℃で30分添加した。PBSで3回洗浄後、TMB基質緩衝液を10分間添加し、続いて2NのH2SO4を添加して反応を停止させた。450nm/650nmの二重波長を用いて光学密度の値をELISAプレートリーダーで記録した。
キメラCTB003は、TRAIL-R1-Fc（図21、パネルB）又はTRAIL-R2-Fc（図21、パネルC）融合抗原と同様に、TRAIL-R1/TRAIL-R2ヘテロダイマー抗原（図21、パネルA）に対し用量依存結合を示し、その結合カイネティクスは、親マウスCTB003で観察された結合の特徴と実質的に識別不能であった。試験した抗体濃度の範囲では、キメラCTB003は、TRAIL-R3-Fc（図21、パネルD）、TRAIL-R4-Fc（図21、パネルE）融合抗原又はBSA（図21、パネルF）とは反応しない。
キメラCTB006及びキメラCTB007の特徴はそれぞれ図22及び23に要約されている。これらの結合因子とヒト化キメラ型との結合の特徴もまた、それらの親マウス対応物と本質的に識別不能であった。すなわち、キメラCTB006は、TRAIL-R2-Fc（図22、パネルC）融合抗原と同様に、TRAIL-R1/TRAIL-R2ヘテロダイマー抗原（図22、パネルA）に対し用量依存結合を示し、その結合カイネティクスは、親マウスCTB006の結合カイネティクスと非常に類似している。試験した抗体濃度の範囲では、キメラCTB006は、TRAIL-R1-Fc（図22、パネルB）、TRAIL-R3-Fc（図22、パネルD）、TRAIL-R4-Fc（図22、パネルE）融合抗原又はBSA（図22、パネルF）とは反応しない。
キメラCTB007は、TRAIL-R1-Fc（図23、パネルB）融合抗原と同様に、TRAIL-R1/TRAIL-R2ヘテロダイマー抗原（図23、パネルA）に対し用量依存結合を示し、その結合カイネティクスは、親マウスCTB007の結合カイネティクスと非常に類似している。試験した抗体濃度の範囲では、キメラCTB007は、TRAIL-R2-Fc（図23、パネルC）、TRAIL-R3-Fc（図23、パネルD）、TRAIL-R4-Fc（図23、パネルE）融合抗原又はBSA（図23、パネルF）とは反応しない。
【０１４０】
実施例12に記載した実験と同様に、競合的阻害ELISAをTRAIL-R1及びTRAIL-R2融合ポリペプチドによる相互実験で実施して、ヒトキメラCTB003のエピトープ特異性をさらにマッピングした。図24のパネルAに示したように、ペプチドH又はIの両ペプチドは、ヒト化キメラCTB003とTRAIL-R1との結合を用量依存態様で阻害した。同様に、図20のパネルBで示したように、ペプチドH又はIの両ペプチドは、ヒト化キメラCTB003とTRAIL-R2との結合を用量依存態様で阻害した。したがって、ヒト化キメラCTB003によって認識されるエピトープは、TRAIL-R2のaa167からaa182及びTRAILR1のaa218からaa233の間の配列（すなわちTRAIL-R1とTRAIL-R2との間の配列相同性領域）に存在する。重要なことには、両ヒト化キメラCTB003結合因子の結合特性は、マウスCTB003と本質的に識別不能である。これらの結合因子が同じ生物学的特性を共有しているか否かを決定するために、以下に記載するように、キメラCTB003のin vitroアポトーシス誘導活性をマウスCTB003と多数の癌細胞株で比較した。
【０１４１】
III．CTB003、CTB006及びCTB007のin vitroアポトーシス誘導活性
以下を含むヒト癌細胞株パネルを用いて、キメラCTB003、CTB006及びCTB007のin vitroアポトーシス誘導活性の判定に用いた：ヒト乳癌細胞株、MDA231；ヒト結腸癌細胞株、Colo205；ヒト膵臓癌細胞株、MIAcapa；ヒト卵巣癌細胞株、CaOvc3；ヒト前立腺癌細胞株、Du145；及びヒト肺癌細胞株、H2122。
ATPLiteアッセイを用いて細胞生存率及び各抗体のIC50を決定した。10倍希釈のキメラ抗体又はそれらの対応する親マウス抗体の７つの濃度（最高濃度1000ng/mL及び最低濃度0.01ng/mL）の存在下で1,000標的細胞/ウェルを96ウェルプレートで培養した。37℃で一晩培養後、製造業者（Packard Instruments, Meriden, Conn.）の指示にしたがいATPLiteキットを用い、50μLの細胞溶解緩衝液、続いて50μLの基質緩衝液を添加して細胞生存率を決定した。反応は、ルミネッセンスリーダーで計測した。細胞生存率は、（処理細胞のcpm／コントロール細胞のcpm）ｘ100％として計算した。容量依存殺傷曲線を作成した。IC50は直線回帰によって算出した。結果は、三つ組培養の平均±標準偏差として提示されている。
【０１４２】
表8：キメラ抗体と親マウス抗体の殺傷活性の比較
2009535044.tif 000009
【０１４３】
試験した6つのヒト癌細胞株のいずれも（MDA231ヒト乳癌細胞株（図25）、Colo205ヒト結腸癌細胞株（図26）、MIAcapaヒト膵臓癌細胞株（図27）、CaOvc3ヒト卵巣癌細胞株（図28）、Du145ヒト前立腺癌細胞株（図29）、及びH2122ヒト肺癌細胞株を含む）、マウスCTB003及びヒトキメラCTB003（パネルA）、又はマウスCTB006及びキメラCTB006（パネルB）又はマウスCTB007及びキメラCTB007（パネルC）の両結合因子によって誘導されるアポトーシスに対して等しく感受性であった。組換えキメラ抗体は、それらの対応する親マウス抗体に類似する用量応答関係を示した。これらの結果は、操作されたキメラ抗体はいずれもそれらの親マウス抗体のアポトーシス誘導活性を保持することを示している。
ヒトキメラ抗体及びマウス抗体のアポトーシス誘導活性は表8でIC50として提示され、組換えキメラCTB003、CTB006及びCTB007は、試験した全てのヒト癌細胞でそれらの対応する元の抗体と非常に類似するIC50を示すことを表している。ヒト化キメラCTB003及びげっ歯類CTB003で観察された共通の結合特性及びin vitroの生物学的応答を基にして、ヒト化キメラCTB003もまた、マウスCTB003のようにin vivoで腫瘍増殖の抑制をもたらすであろうと当業者は認識しえよう。したがって、本発明の結合因子（例えばhCTB003）は、その必要がある対象（ヒト対象を含む）に有効量で投与されるとき、腫瘍増殖を抑制する方法で有用である。
【０１４４】
実施例14：非ヒト霊長類におけるCTB003の前臨床毒性試験
CTB003の全身毒性は、薬剤安全性評価国立北京センター（National Beijing Center for Drug Safety Evaluation and Research, Beijing of China）で非ヒト霊長類により判定された。4−５ヶ月齢の雄のアカゲザル（体重4.5kg）の静脈内に、PBSに3mg/mLで溶解したCTB003を40mg/kgの用量で輸液し、総輸液体積は20mL/kg体重であった。輸液速度は5滴/分で、輸液は90分以内に完了した。処置される動物の一般的健康状態は、処置前7日から処置後15日まで毎日調べた。体重、体温、EKG、血液学パラメーター、血液生化学パラメーターは処置7日前及び処置後0、3、7及び14日目に調べた。
処置後、動物の一般的健康状態は正常のようであった。体重はわずかに増加し、体温は正常範囲内にとどまった（表9）。
【０１４５】
表9：体重及び体温に対するCTB003の静脈内投与の影響
2009535044.tif 000010
【０１４６】
処置後、検査した血液学的パラメーターのいずれについても有意な変化は存在せず（表10）、生化学的測定値は処置後も正常を維持していた（表11）。前記の結果は、アカゲザルは40mg/kgでのCTB003の全身投与に十分な耐性を有することを示している。
【０１４７】
表10：血液学的パラメーターに対するCTB003の静脈内投与の影響
2009535044.tif 000011
【０１４８】
表11：生化学的パラメーターに対するCTB003の静脈内投与の影響
2009535044.tif 000012
【０１４９】
前記の結果は、アカゲザルは40mg/kgでのCTB003の全身投与に十分な耐性を有することを示している。
【０１５０】
実施例15：非ヒト霊長類におけるCTB006及びCTB007の前臨床毒性試験
CTB006及びCTB007の全身毒性は、薬剤安全性評価国立北京センター（National Beijing Center for Drug Safety Evaluation and Research, Beijing of China）で非ヒト霊長類により判定された。4−５ヶ月齢の雌のアカゲザル（体重4.0−4.3kg）の静脈内に、40mg/kgの用量でCTB006及びCTB007を輸液した。CTB006及びCTB007はPBSに3mg/mLで溶解し、総輸液体積は20mL/kg体重であった。輸液速度は40滴/分で、輸液は90分以内に完了した。処置される動物の一般的健康状態は、処置前7日から処置後15日まで毎日調べた。体重、体温、EKG、血液学パラメーター、血液生化学パラメーターは処置7日前及び処置後0、3、7及び14日目に調べた。
CTB006又はCTB007のいずれによる処置後でも、動物の一般的健康状態は正常のようであった。体重は変化せず、体温は正常範囲内にとどまった（表12）。
【０１５１】
表12：体重及び体温に対するCTB006及びCTB007の全身投与の影響
2009535044.tif 000013
CTB006（表13）又はCTB007（表14）による処置後、検査したいずれの血液学的パラメーターにも顕著な変化は存在せず、さらにいずれの生化学的測定値も（表15及び16）、血漿ALT及びASTのわずかで一過性の増加（前記は処置後7日目に正常に復帰した）を除いて、処置後も正常を維持した。
【０１５２】
表13：血液学的パラメーターに対するCTB006の全身投与の影響
2009535044.tif 000014
【０１５３】
表14：血液学的パラメーターに対するCTB007の全身投与の影響
2009535044.tif 000015
【０１５４】
表15：生化学的パラメーターに対するCTB006の静脈内投与の影響
2009535044.tif 000016
【０１５５】
表16：生化学的パラメーターに対するCTB007の静脈内投与の影響
2009535044.tif 000017
【０１５６】
これらの結果は、アカゲザルは40mg/kgでのCTB006又はCTB007の全身投与に十分な耐性を有することを示している。
【０１５７】
実施例16：CTB003、CTB006及びCTB007の重鎖並びに軽鎖のN-末端アミノ酸配列の決定
CTB003、CTB006及びCTB007の重鎖並びに軽鎖のcDNAを得るために、CTB003、CTB006及びCTB007の重鎖並びに軽鎖のN-末端アミノ酸配列を公知の技術によって決定した。5μgのアフィニティ精製CTB003、CTB006及びCTB007を還元条件下の10％SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（“SDS-PAGE”）で分離した。電気泳動後、ゲル中のタンパク質をポリビニリデンジフルオリド膜（“PVDF”）に移した。タンパク質を移した後、PVDF膜を洗浄緩衝液（25mMのNaCl、10mMホウ酸ナトリウム緩衝液（pH8.0））で洗浄した後、染色溶液（50％v/vメタノール、20％v/v酢酸及び0.05％w/vクマシーブリリアントブルー）で5分間染色してタンパク質バンドの位置を決定した。続いて、このPVDF膜を90％（v/v）メタノール水で脱色し、重鎖に対応するバンド（PVDF膜で以前に位置を決定した低い移動度を有するバンド）及び軽鎖に対応するバンド（高い移動度を有するバンド）を切り出し、脱イオン水で洗浄した。重鎖及び軽鎖のN-末端アミノ酸配列は、プロテインシークェンサー（PROCISE491， ABI， USA）を用い、エドマン自動化法によって決定した。
CTB003の重鎖に対応するバンドのN-末端アミノ酸配列は以下であると決定され：
Glu-Val-His-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Arg-Pro-Gly-Gly-Ser（配列番号:84）
さらに、CTB003の軽鎖に対応するバンドのそれは以下であると決定された：
Ala-Thr-Met-Arg-Leu-Pro-Ala-Gln-Leu-Leu-Gly-Leu-Leu-Met-Leu-Trp-Val-Ser（配列番号:85）。
CTB006の重鎖に対応するバンドのN-末端アミノ酸配列は以下であると決定され：
Gln-Val-Gln-Leu-Gln-Gln-Pro-Gly-Pro-Glu-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-Ala-Ser（配列番号:86）
さらに、CTB006の軽鎖に対応するバンドのそれは以下であると決定された：
Asp-Ile-Val-Met-Thr-Gln-Ser-His-Lys-Phe-Met-Ser-Thr-Ser-Val-Gly（配列番号:87）。
CTB007の重鎖に対応するバンドのN-末端アミノ酸配列は以下であると決定され：
Glu-Val-Gln-Leu-Gln-Gln-Ser-Gly-Ala-Glu-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-Ala-Ser（配列番号:88）
さらに、CTB007の軽鎖に対応するバンドのそれは以下であると決定された：
Asp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ser-Val-Ser-Val（配列番号:89）。
【０１５８】
実施例17：CTB003関連配列
CTB003関連配列は下記に提供される。
マウスCTB003軽鎖可変領域の核酸配列は下記表17で示される。
【０１５９】
2009535044.tif 000018
【０１６０】
マウスCTB003軽鎖可変領域のアミノ酸配列は下記表18で示される。
【０１６１】
2009535044.tif 000019
【０１６２】
マウスCTB003軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列は下記表19で示される。
【０１６３】
2009535044.tif 000020
【０１６４】
マウスCTB003軽鎖CDR1の核酸及びアミノ酸配列は下記表20で示される。
表20：マウスCTB003軽鎖CDR1アミノ酸配列
2009535044.tif 000021
マウスCTB003軽鎖CDR2の核酸及びアミノ酸配列は下記表21で示される。
表21：マウスCTB003軽鎖CDR2アミノ酸配列
2009535044.tif 000022
マウスCTB003軽鎖CDR3の核酸及びアミノ酸配列は下記表22で示される。
表22：マウスCTB003軽鎖CDR3アミノ酸配列
2009535044.tif 000023
【０１６５】
マウスCTB003重鎖可変領域の核酸配列は下記表23で示される。
表23：マウスCTB003重鎖可変領域の核酸配列
【０１６６】
2009535044.tif 000024
【０１６７】
マウスCTB003重鎖可変領域のアミノ酸配列は下記表24で示される。
【０１６８】
2009535044.tif 000025
【０１６９】
マウスCTB003重鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列は下記表25で示される。
【０１７０】
2009535044.tif 000026
【０１７１】
マウスCTB003重鎖CDR1のアミノ酸配列は下記表26で示される。
表26：マウスCTB003重鎖CDR1アミノ酸配列
2009535044.tif 000027
マウスCTB003重鎖CDR2のアミノ酸配列は下記表27で示される。
表27：マウスCTB003重鎖CDR2アミノ酸配列
2009535044.tif 000028
げっ歯類CTB003重鎖CDR3のアミノ酸配列は下記表28で示される。
表28：げっ歯類CTB003重鎖CDR3アミノ酸配列
2009535044.tif 000029
【０１７２】
ヒトキメラCTB003軽鎖核酸配列は下記表29に示される。
【０１７３】
2009535044.tif 000030
【０１７４】
ヒトキメラCTB003軽鎖アミノ酸配列は下記表30に示される。
2009535044.tif 000031
【０１７５】
ヒトキメラCTB003軽鎖の核酸及びアミノ酸配列は下記表31で示される。
【０１７６】
2009535044.tif 000032
【０１７７】
ヒトキメラCTB003重鎖の核酸配列は下記表32で示される。
【０１７８】
2009535044.tif 000033
【０１７９】
ヒトキメラCTB003重鎖のアミノ酸配列は下記表33で示される。
【０１８０】
2009535044.tif 000034
【０１８１】
ヒトキメラCTB003重鎖の核酸及びアミノ酸配列は下記表34で示される。
【０１８２】
2009535044.tif 000035
2009535044.tif 000036
【０１８３】
実施例18：CTB006関連配列
CTB006関連配列は下記で提供される。
マウスCTB006軽鎖可変領域の核酸配列は下記表35で示される。
【０１８４】
2009535044.tif 000037
【０１８５】
マウスCTB006軽鎖可変領域のアミノ酸配列は下記表36で示される。
【０１８６】
2009535044.tif 000038
【０１８７】
マウスCTB006軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列は下記表37で示される。
【０１８８】
2009535044.tif 000039
【０１８９】
マウスCTB006軽鎖CDR1のアミノ酸配列は下記表38で示される。
表38：マウスCTB006軽鎖CDR1アミノ酸配列
2009535044.tif 000040
マウスCTB006軽鎖CDR2のアミノ酸配列は下記表39で示される。
表39：マウスCTB006軽鎖CDR2アミノ酸配列
2009535044.tif 000041
マウスCTB006軽鎖CDR3のアミノ酸配列は下記表40で示される。
表40：マウスCTB006軽鎖CDR3アミノ酸配列
2009535044.tif 000042
【０１９０】
マウスCTB006重鎖可変領域の核酸配列は下記表41で示される。
【０１９１】
2009535044.tif 000043
【０１９２】
マウスCTB006重鎖可変領域のアミノ酸配列は下記表42で示される。
【０１９３】
2009535044.tif 000044
【０１９４】
マウスCTB006重鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列は下記表43で示される。
【０１９５】
2009535044.tif 000045
【０１９６】
マウスCTB006重鎖CDR1のアミノ酸配列は下記表44で示される。
表44：マウスCTB006重鎖CDR1アミノ酸配列
2009535044.tif 000046
マウス類CTB006重鎖CDR2のアミノ酸配列は下記表45で示される。
表27：マウスCTB006重鎖CDR2アミノ酸配列
2009535044.tif 000047
マウスCTB006重鎖CDR3のアミノ酸配列は下記表46で示される。
表46：マウスCTB006重鎖CDR3アミノ酸配列
2009535044.tif 000048
【０１９７】
ヒトキメラCTB006軽鎖核酸配列は下記表47に示される。
【０１９８】
2009535044.tif 000049
【０１９９】
ヒトキメラCTB006軽鎖アミノ酸配列は下記表48に示される。
【０２００】
2009535044.tif 000050
【０２０１】
ヒトキメラCTB006軽鎖の核酸及びアミノ酸配列は下記表49で示される。
【０２０２】
2009535044.tif 000051
【０２０３】
ヒトキメラCTB006重鎖の核酸配列は下記表50で示される。
【０２０４】
2009535044.tif 000052
【０２０５】
ヒトキメラCTB006重鎖のアミノ酸配列は下記表51で示される。
【０２０６】
2009535044.tif 000053
【０２０７】
ヒトキメラCTB006重鎖の核酸及びアミノ酸配列は下記表52で示される。
【０２０８】
2009535044.tif 000054
2009535044.tif 000055
【０２０９】
実施例19：CTB007関連配列
CTB007関連配列は下記で提供される。
マウスCTB007軽鎖可変領域の核酸配列は下記表53で示される。
【０２１０】
2009535044.tif 000056
【０２１１】
マウスCTB007軽鎖可変領域のアミノ酸配列は下記表54で示される。
【０２１２】
2009535044.tif 000057
【０２１３】
マウスCTB007軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列は下記表55で示される。
【０２１４】
2009535044.tif 000058
【０２１５】
マウスCTB007軽鎖CDR1のアミノ酸配列は下記表56で示される。
表56：マウスCTB007軽鎖CDR1アミノ酸配列
2009535044.tif 000059
マウスCTB007軽鎖CDR2のアミノ酸配列は下記表57で示される。
表57：マウスCTB007軽鎖CDR2アミノ酸配列
2009535044.tif 000060
マウスCTB007軽鎖CDR3のアミノ酸配列は下記表58で示される。
表58：マウスCTB007軽鎖CDR3アミノ酸配列
2009535044.tif 000061
【０２１６】
マウスCTB007重鎖可変領域の核酸配列は下記表59で示される。
【０２１７】
2009535044.tif 000062
【０２１８】
マウスCTB007重鎖可変領域のアミノ酸配列は下記表60で示される。
【０２１９】
2009535044.tif 000063
【０２２０】
マウスCTB007重鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列は下記表61で示される。
【０２２１】
2009535044.tif 000064
【０２２２】
マウスCTB007重鎖CDR1のアミノ酸配列は下記表62で示される。
表62：マウスCTB007重鎖CDR1アミノ酸配列
2009535044.tif 000065
マウスCTB007重鎖CDR2のアミノ酸配列は下記表63で示される。
表63：マウスCTB007重鎖CDR2アミノ酸配列
2009535044.tif 000066
マウスCTB007重鎖CDR3のアミノ酸配列は下記表64で示される。
表64：マウスCTB007重鎖CDR3アミノ酸配列
2009535044.tif 000067
【０２２３】
ヒトキメラCTB007軽鎖核酸配列は下記表65に示される。
【０２２４】
2009535044.tif 000068
【０２２５】
ヒトキメラCTB007軽鎖アミノ酸配列は下記表66に示される。
【０２２６】
2009535044.tif 000069
【０２２７】
ヒトキメラCTB007軽鎖の核酸及びアミノ酸配列は下記表67で示される。
【０２２８】
2009535044.tif 000070
【０２２９】
ヒトキメラCTB007重鎖の核酸配列は下記表68で示される。
【０２３０】
2009535044.tif 000071
【０２３１】
ヒトキメラCTB007重鎖アミノ酸配列は下記表69で示される。
【０２３２】
2009535044.tif 000072
【０２３３】
ヒトキメラCTB007重鎖核酸及びアミノ酸配列は下記表70で示される。
【０２３４】
2009535044.tif 000073
2009535044.tif 000074
【０２３５】
実施例20：CTB003及びhCTB003によって認識されるエピトープの分析
本発明のTRAILレセプター結合因子（例えばCTB003及びhCTB003）によって認識される共通エピトープは、本明細書で提供されるアミノ酸配列VXDCTPWSDIECVHKE（配列番号:44）（式中XはK又はG）の部分領域（フラグメント）又は同族体（これらは本発明のTRAILレセプター結合試薬が結合したとき、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2レセプターポリペプチド発現細胞でin vitro及び／又はin vivo系で当該細胞（例えば癌細胞）のアポトーシスを誘導することができる）に関してさらに分析することができることは理解されよう。
アミノ酸配列VXDCTPWSDIECVHKE（配列番号:44）のフラグメント又は同族体である選抜候補ペプチドを当分野で公知の方法によって調製する。これらの候補ペプチドは、下記に記載する競合的ELISAにおいて、TRAILレセプター結合因子とTRAILレセプター（例えばTRAIL-R1及びTRAIL-R2）との結合を阻害するそれらの能力について試験される。
競合的阻害ELISA
ELISAプレートは、PBS中のTRAIL-R1又はTRAIL-R2-Fc融合タンパク質（1μg/mL）で4℃にて一晩被覆した。PBSで3回洗浄後、このプレートを3％のBSA PBSで室温にて1時間ブロッキングした。それぞれ種々の濃度の候補ペプチドとともに、1μg/mLのCTB003又はhCTB003（TRAILレセプター結合因子）を37℃で1時間添加した。PBSで3回洗浄して未結合TRAILレセプター結合因子を除去し、続いてHRP-結合ヤギ抗マウスIgG1を37℃で30分添加した。PBSで3回洗浄後、TMB基質緩衝液を10分間添加し、続いて2NのH2SO4を添加して反応を停止させた。450nm/650nmの二重波長を用いて光学密度の値をELISAプレートリーダーで記録した。CTB003（又はhCTB003；TRAILレセプター結合因子）とTRAIL-R1又はTRAIL-R2との最大結合として、候補ペプチドの非存在下でのOD値を決定した。CTB003とTRAIL-R2との結合に対する種々の濃度の候補ペプチドの競合的阻害は、最大結合のパーセンテージとして算出した。
結果と解釈
候補化合物が、TRAILレセプター結合因子とTRAIL-R1及びTRAIL-R2の両方との濃度依存態様結合を阻害する場合、その候補ペプチドは、TRAILレセプター結合因子（例えばCTB003又はhCTB003）によって認識される共通領域を提示している。さらにまた、当該候補物の配列は、TRAIL-R1又はTRAIL-R2又はその両方を発現する癌細胞のアポトーシスの誘導を目的とするアゴニスト抗体の作製の標的となりえる。さらにまた、候補ペプチドがTRAILレセプター結合因子仲介細胞増殖阻害（例えば腫瘍増殖阻害）を阻害することができるか否かを決定するために、本発明のin vitro及びin vivoモデルで候補ペプチドを試験することができる。
【０２３６】
実施例21：弁別的にTRAIL-R1及びTRAIL-R2を発現する腫瘍細胞と結合しアポトーシスを誘導するCTB003の活性
腫瘍細胞は弁別的細胞表面レベルでTRAIL-R1及びTRAIL-R2を発現することができ、したがってTRAIL-R1又はTRAIL-R2のどちらかに対して生成された単一特異性抗体は、単独投与されたときは全ての腫瘍細胞と結合してそのアポトーシスを誘導することができるとはかぎらない可能性がある。CTB003が、単一特異性TRAIL-R1又はTRAIL-R2抗体と比較してより広い結合及びアポトーシス誘導活性を有するか否かを決定するために、2つの代表的細胞株（ヒトT白血病細胞及びヒトBリンパ腫細胞）で実験を行った。ヒトT白血病細胞（Jurkat）はTRAIL-R2のみを発現しTRAIL-R1を発現しない。ヒトBリンパ腫細胞（Ramos）は高レベルのTRAIL-R1を発現するが低レベルのTRAIL-R2しか発現しない。前記細胞はまた、TRAIL-R1又はTRAIL-R2単一特異性抗体誘導アポトーシスに対して弁別的感受性を示す。
CTB003の細胞表面結合のフローサイトメトリー分析
細胞培養液から1ｘ106個の単一細胞を採集し、FACS緩衝液（5％FCS、0.1%のNaN3を含むPBS、pH7.4）で2回洗浄した。細胞を20μL（10μg/mL）のCTB003、CTB006又はCTB007とともに氷上で30分インキュベートした。1mLのFACS緩衝液で2回洗浄した後、細胞をさらにPE-結合ヤギ抗マウスIgG1抗体とともに氷上で30分インキュベートした。1mLのFACS緩衝液で2回洗浄した後、細胞を0.5mLのFACS緩衝液に懸濁し、10,000個の生存細胞をFACScanフローサイトメーターで分析した。
細胞生存率決定のためのATPLiteアッセイ
10倍希釈CTB003、CTB006又はCTB007の4つの濃度（最高希釈1000ng/mL及び最低希釈10ng/mL）の存在下で1,000標的細胞/ウェルを96ウェルプレートで培養した。37℃で16時間培養した後、製造業者（Packard Instruments, Meriden, Conn.）の指示にしたがいATPLiteキットを用い、50μLの細胞溶解緩衝液、続いて50μLの基質緩衝液を添加して各培養の細胞生存率を決定した。反応は、ルミネッセンスリーダーで計測した。細胞生存率は、（処理細胞のcpm／コントロール細胞のcpm）ｘ100％として計算される。
結果：
Jurkat細胞はCTB006で陽性に染色されたが、CTB007では染色されず（図32、パネルA）、Jurkat細胞はTRAIL-R2のみを発現し、TRAIL-R1は発現しないことを示している。Jurkat細胞はTRAIL-R1を発現しないが、それらはCTB003で等しく染色された。対照的に、Ramos細胞はCTB007又はCTB003で強力に染色されたが、CTB006では弱く染色されただけであり（図32、パネルB）、Ramos細胞は、主としてTRAIL-R1を発現することを示している。これらの結果は、CTB003は、腫瘍細胞表面のTRAIL-R1又はTRAIL-R2の弁別的レベルとは無関係に当該腫瘍細胞表面と等しく結合する能力を有することを示している。
Jurkat細胞は、CTB006誘導及びCTB003誘導アポトーシスに対して類似する感受性を有するが、CTB007に対しては試験した抗体濃度範囲では完全に非応答性であった（図32、パネルC）。対照的に、Ramos細胞は、CTB006又はCTB007によって誘導されるアポトーシスに対して感受性ではなかったが（図32、パネルD）、CTB003誘導アポトーシスに対しては比較的感受性を示した。これらの結果は、CTB003は、１つのタイプのデスレセプターのみを弁別的に発現する腫瘍細胞のアポトーシス誘導で有用であることを示している。したがって、本発明のTRAILレセプター結合因子（TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2と結合する（例えばCTB003又はhCTB003））は、患者の原発性腫瘍細胞におけるTRAILレセプターの発現及び機能は極めて変動するので、TRAIL-R1又はTRAIL-R2のみと結合する物質よりも、癌患者の治療で極めて大きな臨床的有用性を有する可能性がある。
等価物
本発明は、本出願に記載した具体的な実施態様（前記は本発明の個々の特徴の単独例として意図されるものである）に限定されない。当業者には明白な、本発明の多くの改変型及び変型が本発明の範囲を逸脱することなく実施可能である。本明細書に列挙した方法及び装置の他に、本発明の範囲内にある機能的に等価な方法及び装置が、前述の記載から当業者には明白であろう。そのような改変物及び変型は添付の特許請求の範囲内に含まれよう。本発明は、添付の特許請求の範囲の表現並びにそのような特許請求の範囲によって資格が付与される一切の等価物によってのみ制限されよう。本発明は、具体的な方法、試薬、化合物の組成物又は生物学的な系（前記はもちろんのこと変動しえる）に限定されないことは理解されよう。さらにまた、本発明で使用した用語は、具体的な実施態様を記載することのみを目的としており、制限を意図するものではないことも理解されよう。
【０２３７】
図面は、制限のためではなく例示のために好ましい実施態様を示す。
【図面の簡単な説明】
【０２３８】
【図１】ハイブリドーマCGMCC1665に由来する免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す模式図である。パネルAは、CTB003Vkヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。パネルBは、CTB003VHヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。CDR配列には下線が付されている。
【図２】CTB003の結合特性を示すグラフである。ヒトTRAIL-R1及びTRAIL-R2の細胞外ドメインのヘテロダイマー型を含む組換えヒトIgG1-Fc融合タンパク質、又はTRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3又はTRAIL-R4のホモダイマー型を含む組換えヒトIgG1-Fc融合タンパク質をELISAプレートに固定し、種々の濃度のCTB003とインキュベートした。HRP結合ヤギ抗マウスIgG1との反応後、発色反応を示すためにTMB基質を添加した。結合能力は、各タンパク質に対するCTB003のOD値によって決定した。データはCTB003濃度（ng/mL）の関数としてOD 450/650により表されている。
【図３】ヒト癌細胞のアポトーシス誘導におけるCTB003の用量応答関係を示すグラフである。以下のヒト癌細胞株パネル（パネルA、乳癌；パネルB、結腸癌；パネルC、膵臓癌、パネルD、卵巣癌；パネルE、前立腺癌；及びパネルF、肺癌）を種々の濃度のCTB003と一晩インキュベートした。100％生存率として培養液コントロールを用い、細胞生存率をATPLiteアッセイによって決定した。
【図４】癌細胞のアポトーシス誘導におけるCTB003の時間依存応答を示すグラフである。ヒト乳癌細胞（MDA231）及び結腸癌細胞（Colo205）を1000ng/mLのCTB003とともに表示した時間インキュベートし、細胞生存率をATPLiteアッセイによって決定した。データはインキュベーション時間（時間）の関数として細胞生存率（％）により表されている。
【図５】CTB003及びアドリアマイシンによる癌細胞死の相乗的誘導を示すグラフである。ヒト乳癌細胞株（BT474）を種々の濃度のCTB003と種々の濃度のアドリアマイシンの存在下又は非存在下で一晩インキュベートした。細胞生存率はATPLite細胞生存率アッセイによって決定した。パネルAは、CTB003濃度（ng/mL）の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。パネルBは、種々の処置群について観察された細胞生存率（％）の棒グラフを示す。
【図６】CTB003及びタキソールによる癌細胞死の相乗的誘導を示すグラフである。ヒト結腸癌細胞株（SW620）を種々の濃度のCTB003と種々の濃度のタキソールの存在下又は非存在下で一晩インキュベートした。細胞生存率はATPLite細胞生存率アッセイによって決定した。パネルAは、CTB003濃度（ng/mL）の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。パネルBは、種々の処置群について観察された細胞生存率（％）の棒グラフを示す。
【図７】CTB003及びシスプラチンによる癌細胞死の相乗的誘導を示すグラフである。ヒト肺癌細胞株（A437）を種々の濃度のCTB003と種々の濃度のシスプラチンの存在下又は非存在下で一晩インキュベートした。細胞生存率はATPLite細胞生存率アッセイによって決定した。パネルAは、CTB003濃度（ng/mL）の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。パネルBは、種々の処置群について観察された細胞生存率（％）の棒グラフを示す。
【図８】CTB003及びCTP-11による癌細胞死の相乗的誘導を示すグラフである。ヒト結腸癌細胞株（SW1116）を種々の濃度のCTB003と種々の濃度のCTP-11の存在下又は非存在下で一晩インキュベートした。細胞生存率はATPLite細胞生存率アッセイによって決定した。パネルAは、CTB003濃度（ng/mL）の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。パネルBは、種々の処置群について観察された細胞生存率（％）の棒グラフを示す。
【図９】CTB003及びゲムシタビンによる癌細胞死の相乗的誘導を示すグラフである。ヒト膵臓癌細胞株（PANC1）を種々の濃度のCTB003と種々の濃度のゲムシタビンの存在下又は非存在下で一晩インキュベートした。細胞生存率はATPLite細胞生存率アッセイによって決定した。パネルAは、CTB003濃度（ng/mL）の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。パネルBは、種々の処置群について観察された細胞生存率（％）の棒グラフを示す。
【図１０】CTB003及び抗TRAIL-R1（CTB007）による癌細胞死の相乗的誘導を示すグラフである。ヒト結腸癌細胞株（SW1116）を種々の濃度のCTB003と種々の濃度の抗TRAIL-R1抗体（CTB007）の存在下又は非存在下で一晩インキュベートした。細胞生存率はATPLite細胞生存率アッセイによって決定した。パネルAは、CTB003濃度（ng/mL）の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。パネルBは、種々の処置群について観察された細胞生存率（％）の棒グラフを示す。
【図１１】CTB003及び抗TRAIL-R2（CTB006）による癌細胞死の相乗的誘導を示すグラフである。ヒト結腸癌細胞株（SW1116）を種々の濃度のCTB003と種々の濃度の抗TRAIL-R2抗体（CTB006）の存在下又は非存在下で一晩インキュベートした。細胞生存率はATPLite細胞生存率アッセイによって決定した。パネルAは、CTB003濃度（ng/mL）の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。パネルBは、種々の処置群について観察された細胞生存率（％）の棒グラフを示す。
【図１２】CTB003のin vivoにおける抗腫瘍活性を示すグラフである。Balb/cヌードマウスの皮下にヒト乳癌細胞（MDA231）を接種した。接種後10日に200μgのCTB003を3日間隔で1週間に2回マウスの腹腔に投与した。この処置を3週間繰り返した。腫瘍サイズを毎週測定した。データは、処置後の時間（日数）の関数として腫瘍サイズにより表されている。
【図１３】マウス異種移植in vivo実験モデルにおける、ヒト乳癌細胞株MDA231の増殖に対するマウスTRAILレセプター結合因子CTB003の影響の時間依存性を示すグラフである。データは、処置後の時間（日数）の関数として腫瘍サイズの％変化により表されている。
【図１４】マウス異種移植in vivo実験モデルにおける、ヒト肝癌細胞株7402の増殖に対するマウスTRAILレセプター結合因子CTB003の影響の時間依存性を示すグラフである。データは、処置後の時間（日数）の関数として腫瘍サイズの％変化により表されている。
【図１５】マウス異種移植in vivo実験モデルにおける、ヒト結腸癌細胞株Colo205の増殖に対するマウスTRAILレセプター結合因子CTB003の影響の時間依存性を示すグラフである。データは、処置後の時間（日数）の関数として腫瘍サイズの％変化により表されている。
【図１６】マウス異種移植in vivo実験モデルにおける、ヒト膵臓癌細胞株MIAcapaの増殖に対するマウスTRAILレセプター結合因子CTB003の影響の時間依存性を示すグラフである。データは、処置後の時間（日数）の関数として腫瘍サイズの％変化により表されている。
【図１７】アドリアマイシンと併用したCTB003の殺腫瘍活性を示すヒストグラムである。Balb/cヌードマウスの皮下にヒト乳癌細胞（MDA231）を接種した。接種後10日に、マウスに先ず100μgのアドリアマイシンを、1日後に200μgのCTB003を腹腔注射した。3日間隔で1週間に2回マウスを処置した。この処置を2週間繰り返した。腫瘍サイズを最後の処置の2日後に測定した。データは、処置群（前及び後）の関数として腫瘍サイズ（cm3）により表されている。表示の処置群は、未処置（コントロール）；アドリアマイシン；CTB003；及びアドリアマイシン＋CTB003である。
【図１８】ヒトMDA231乳癌異種移植モデルにおける、抗TRAIL-R2（CTB006）と併用したCTB003の殺腫瘍活性を示すヒストグラムである。Balb/cヌードマウスの皮下にヒト乳癌細胞（MDA231）を接種した。接種後10日に、マウスに200μgのCTB003及びCTB006を腹腔注射した。3日間隔で1週間に2回マウスを処置した。この処置を2週間繰り返した。腫瘍サイズを最後の処置の2日後に測定した。データは、処置群（前及び後）の関数として腫瘍サイズ（cm3）により表されている。表示の処置群は、未処置（コントロール）；CTB003；CTB006；及びCTB003＋CTB006である。
【図１９】CTB003によって認識されるTRAIL-R2の抗原性エピトープの分析を示すグラフである。ポリペプチド阻害アッセイを用い、TRAIL-R2でCTB003によって認識されるエピトープを決定した。ELISAプレートをTRAIL-R2-Fc融合タンパク質で被覆し、TRAIL-R2細胞外ドメインの種々の部分をコードする一連のポリペプチド（A−G）とともにインキュベートした。データは、ペプチド濃度（nM）の関数として、観察されたCTB003とTRAIL-R2との結合のパーセント（％）最大結合により表されている。
【図２０】CTB003によって認識されるTRAIL-R1及びTRAIL-R2の抗原性エピトープの実験による確認を示すグラフである。ポリペプチド阻害アッセイを用い、TRAIL-R1及びTRAIL-R2でCTB003によって認識されるエピトープを決定した。ELISAプレートをTRAIL-R1及びTRAIL-R2-Fc融合タンパク質で被覆し、それぞれTRAIL-R1及びTRAIL-R2の細胞外ドメインをコードするポリペプチド（I及びH）の種々の濃度の存在下又は非存在下でCTB003とともにインキュベートした。データは、ペプチド濃度（nM）の関数として、観察されたCTB003とTRAIL-R1（パネルA）又はTRAIL-R2（パネルB）との結合のパーセント（％）最大結合により表されている。
【図２１】CTB003（マウス）及びhCTB003（ヒト化キメラ）TRAILレセプター結合因子の結合特性の比較を示すグラフである。TRAIL-R1/TRAIL-R2ヘテロダイマー抗原の細胞外ドメインを含む組換えヒトIgG1-Fc融合タンパク質（パネルA）、TRAIL-R1-Fc（パネルB）、TRAIL-R2-Fc（パネルC）、TRAIL-R3-Fc（パネルD）、TRAIL-R4-Fc（パネルE）、又はBSA（コントロール；パネルF）をELISAプレートに固定し、種々の濃度（ng/mL）のCTB003（マウス）又はhCTB003（ヒト化キメラ；別称キメラCTB003）とともにインキュベートした。CTB003（マウス）についてはHRP結合ヤギ抗マウスIgG1、又はhCTB003についてはHRP結合ヤギ抗ヒトカッパとの反応後、発色反応を示すためにTMB基質を添加した。結合能力は、各タンパク質に対するCTB003又はhCTB003のOD値によって決定した。各パネル（A−F）のデータは、抗体濃度（ng/mL）（すなわちCTB003濃度（ng/mL）又はキメラCTB003濃度（ng/mL））の関数としてOD 450/650により表されている。
【図２２】CTB006（マウス）及びhCTB006（ヒト化キメラ；別称キメラCTB006）TRAILレセプター結合因子の結合特性の比較を示すグラフである。TRAIL-R1/TRAIL-R2ヘテロダイマー抗原の細胞外ドメインを含む組換えヒトIgG1-Fc融合タンパク質（パネルA）、TRAIL-R1-Fc（パネルB）、TRAIL-R2-Fc（パネルC）、TRAIL-R3-Fc（パネルD）、TRAIL-R4-Fc（パネルE）、又はBSA（コントロール；パネルF）をELISAプレートに固定し、種々の濃度（ng/mL）のCTB006（マウス）又はhCTB006（ヒト化キメラ）とともにインキュベートした。CTB006（マウス）についてはHRP結合ヤギ抗マウスIgG1、又はhCTB006についてはHRP結合ヤギ抗ヒトカッパとの反応後、発色反応を示すために基質を添加した。結合能力は、各タンパク質に対するCTB006又はhCTB006のOD値によって決定した。各パネル（A−F）のデータは、抗体濃度（ng/mL）（すなわちCTB006濃度（ng/mL）又はキメラCTB006濃度（ng/mL））の関数としてOD 450/650により表されている。
【図２３】CTB007（マウス）及びhCTB007（ヒト化キメラ；別称キメラCTB007）TRAILレセプター結合因子の結合特徴の比較を示すグラフである。TRAIL-R1/TRAIL-R2ヘテロダイマー抗原の細胞外ドメインを含む組換えヒトIgG1-Fc融合タンパク質（パネルA）、TRAIL-R1-Fc（パネルB）、TRAIL-R2-Fc（パネルC）、TRAIL-R3-Fc（パネルD）、TRAIL-R4-Fc（パネルE）、又はBSA（コントロール；パネルF）をELISAプレートに固定し、種々の濃度（ng/mL）のCTB007（マウス）又はhCTB007（ヒト化キメラ）とともにインキュベートした。CTB00７（マウス）についてはHRP結合ヤギ抗マウスIgG1、又はhCTB007についてはHRP結合ヤギ抗ヒトカッパとの反応後、発色反応を示すために基質を添加した。結合能力は、各タンパク質に対するCTB007又はhCTB007のOD値によって決定した。各パネル（A−F）のデータは、抗体濃度（ng/mL）（すなわちCTB007濃度（ng/mL）又はキメラCTB007濃度（ng/mL））の関数としてOD 450/650により表されている。
【図２４】hCTB003（すなわちヒト化キメラ；別称キメラCTB003）によって認識されるTRAIL及びTRAIL-R2の抗原性エピトープの確認を示すグラフである。ポリペプチド阻害アッセイを用いて、TRAIL-R1及びTRAIL-R2でhCTB003によって認識されるエピトープを決定した。ELISAプレートをTRAIL-R1又はTRAIL-R2-Fc融合タンパク質で被覆し、それぞれTRAIL-R1及びTRAIL-R2の細胞外ドメインをコードするポリペプチド（I及びH）の種々の濃度の存在下又は非存在下でCTB003とともにインキュベートした。データは、ペプチド濃度（nM）の関数として、観察されたCTB003とTRAIL-R1（パネルA）又はTRAIL-R2（パネルB）との結合のパーセント（％）最大結合により表されている。
【図２５】ヒト乳癌細胞株MDA231のin vitro増殖に対する本発明のげっ歯類及びヒト化キメラTRAILレセプター結合因子の影響を比較するグラフである。パネルAは、CTB003（マウス）又はhCTB003（ヒト化キメラ；別称キメラCTB003）の濃度の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。パネルBは、CTB006（マウス）又はhCTB006（ヒト化キメラ；別称キメラCTB006）の濃度の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。パネルCは、CTB007（マウス）又はhCTB007（ヒト化キメラ；別称キメラCTB007）の濃度の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。
【図２６】ヒト結直腸癌細胞株Colo205のin vitro増殖に対する本発明のげっ歯類及びヒト化キメラTRAILレセプター結合因子の影響を比較するグラフである。パネルAは、CTB003（マウス）又はhCTB003（ヒト化キメラ；別称キメラCTB003）の濃度の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。パネルBは、CTB006（マウス）又はhCTB006（ヒト化キメラ；別称キメラCTB006）の濃度の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。パネルCは、CTB007（マウス）又はhCTB007（ヒト化キメラ；別称キメラCTB007）の濃度の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。
【図２７】ヒト膵臓癌細胞株MIAcapaのin vitro増殖に対する本発明のげっ歯類及びヒト化キメラTRAILレセプター結合因子の影響を比較するグラフである。パネルAは、CTB003（マウス）又はhCTB003（ヒト化キメラ；別称キメラCTB003）の濃度の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。パネルBは、CTB006（マウス）又はhCTB006（ヒト化キメラ；別称キメラCTB006）の濃度の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。パネルCは、CTB007（マウス）又はhCTB007（ヒト化キメラ；別称キメラCTB007）の濃度の関数における細胞生存率（％）のグラフである。
【図２８】ヒト卵巣癌細胞株Caov3のin vitro増殖に対する本発明のげっ歯類及びヒト化キメラTRAILレセプター結合因子の影響を比較するグラフである。パネルAは、CTB003（マウス）又はhCTB003（ヒト化キメラ；別称キメラCTB003）の濃度の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。パネルBは、CTB006（マウス）又はhCTB006（ヒト化キメラ；別称キメラCTB006）の濃度の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。パネルCは、CTB007（マウス）又はhCTB007（ヒト化キメラ；別称キメラCTB007）の濃度の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。
【図２９】ヒト前立腺癌細胞株Du145のin vitro増殖に対する本発明のげっ歯類及びヒト化キメラTRAILレセプター結合因子の影響を比較するグラフである。パネルAは、CTB003（マウス）又はhCTB003（ヒト化キメラ；別称キメラCTB003）の濃度の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。パネルBは、CTB006（マウス）又はhCTB006（ヒト化キメラ；別称キメラCTB006）の濃度の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。パネルCは、CTB007（マウス）又はhCTB007（ヒト化キメラ；別称キメラCTB007）の濃度の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。
【図３０】ヒト肺癌細胞株H2122のin vitro増殖に対する本発明のげっ歯類及びヒト化キメラTRAILレセプター結合因子の影響を比較するグラフである。パネルAは、CTB003（マウス）又はhCTB003（ヒト化キメラ；別称キメラCTB003）の濃度の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。パネルBは、CTB006（マウス）又はhCTB006（ヒト化キメラ；別称キメラCTB006）の濃度の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。パネルCは、CTB007（マウス）又はhCTB007（ヒト化キメラ；別称キメラCTB007）の濃度の関数としての細胞生存率（％）のグラフである。
【図３１】ヒトTRAILレセプターの選抜領域のアミノ酸配列アラインメントを示す模式図である。
【図３２】弁別的にTRAIL-R1及びTRAIL-R2を発現する腫瘍細胞におけるCTB003の結合及びアポトーシス誘導活性を示すグラフである。パネルAは、Jurkat細胞とのCTB003、CTB006及びCTB007の細胞表面結合のフローサイトメトリー分析から得られたデータを表すグラフを示す。パネルBは、Ramos細胞とのCTB003、CTB006及びCTB007の細胞表面結合のフローサイトメトリー分析から得られたデータを表すグラフを示す。パネルCは、Jurkat細胞におけるCTB003、CTB006及びCTB007のアポトーシス誘導活性を示すグラフである。パネルDは、Ramos細胞におけるCTB003、CTB006及びCTB007のアポトーシス誘導活性を示すグラフである。パネルC及びパネルDのデータは抗体濃度の関数として細胞生存率（％）により表されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年1月16日(2009.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
TRAILレセプター1（TRAIL-R1）及びTRAILレセプター2（TRAIL-R2）と結合する抗体であって、可溶形にて、TRAIL-R1ポリペプチド又はTRAIL-R2ポリペプチド又は前記両ペプチドを発現する癌細胞において細胞死誘導活性を有し、TRAILレセプター３（TRAIL-R3）またはTRAILレセプター４（TRAIL-R4）ポリペプチドに特異的に結合しない、前記抗体。
【請求項２】
TRAILレセプター1（TRAIL-R1）及びTRAILレセプター2（TRAIL-R2）と結合する抗体であって、可溶形にて、TRAIL-R1ポリペプチド又はTRAIL-R2ポリペプチド又は前記両ペプチドを発現する癌細胞において細胞死誘導活性を有し、VXDCTPWSDIECVHKE（式中XはK又はGである）（配列番号:44）に少なくとも90パーセントのアミノ酸相同性を有するポリペプチド領域に結合する、前記抗体。
【請求項３】
CGMCCアクセッション番号1665を有するマウス-マウスハイブリドーマCTB003によって産生される抗体と同じエピトープ特異性を有する、請求項２記載の抗体。
【請求項４】
少なくとも重鎖CDR3アミノ酸配列HITMVVGPFA（配列番号:11）又は前記配列中1つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列を含み、TRAILレセプター1（TRAIL-R1）及びTRAILレセプター2（TRAIL-R2）と結合し、さらに、TRAIL-R1及びTRAIL-R2を発現する癌細胞において細胞死誘導活性を有する、請求項２記載の抗体。
【請求項５】
癌治療剤と複合体化され、前記治療剤が、好ましくは腫瘍活性化プロドラッグ、放射性核種、化学療法剤及び毒素から成る群から選択される、請求項１〜４に記載の抗体。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか1項に記載の抗体及び医薬的に許容できる担体を含む組成物。
【請求項７】
容器中の請求項１から４のいずれか1項に記載の抗体、および、化学療法剤、を含み、前記化学療法剤が場合によって別個の容器に収められる、癌治療用市販キット。
【請求項８】
請求項１から４のいずれか1項に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸を含む宿主細胞又はベクター。
【請求項１０】
TRAIL-R1及びTRAIL-R2の免疫原であって、VXDCTPWSDIECVHKE（式中XはK又はGである）（配列番号:44）に少なくとも90パーセントのアミノ酸相同性を有する配列から成り、TRAIL-R1およびTRAIL-R2に結合し得る抗体によって認識され、TRAIL-R1およびTRAIL-R2レセプターを有する細胞の細胞死を誘導することのできる、前記免疫原。
【請求項１１】
請求項１０に記載の免疫原によって作製される抗体。
【請求項１２】
TRAIL-R1及びTRAIL-R2を発現する癌細胞で選択的に細胞死を誘導するための医薬の製造における、請求項１から４または請求項１１のいずれか1項に記載の抗体の使用。
【請求項１３】
TRAIL-R1及びTRAIL-R2を発現する癌細胞に対して他の化学療法剤の抗癌活性を強化するための医薬の製造における、請求項１から４または請求項１１のいずれか1項に記載の抗体の使用であって、前記治療薬が化学療法剤であり、前記治療薬が、ブレオマイシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、アクチノマイシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エトポシド、5-フルオロウラシル、フロキシウリジン、メルファラン、メトトレキセート、マイトマイシン、6-メルカプトプリン、パキシリタキセル、テニポシド、6-チオグアニン、ビンクリスチン及びビンブラスチンから成る群から選択される、前記抗体の使用。
【請求項１４】
癌治療用医薬の製造における、請求項１から４または請求項１１のいずれか1項に記載の抗体の医薬的に有効な量の使用であって、前記医薬的に有効な量の抗体が、TRAIL-R1及びTRAIL-R2ポリペプチドを発現する癌細胞の細胞死を選択的に誘導する、前記使用。
【国際調査報告】
2009535044.tif 000107
2009535044.tif 000108
2009535044.tif 000109
2009535044.tif 000110