(57)【要約】  医薬組成物  ある種の甲状腺ホルモン受容体結合性化合物が、腸溶性コーティング、酸化防止剤のいずれか、または腸溶性コーティングおよび酸化防止剤の両方と共に製剤化される、組成物が記載されている。このような製剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの望ましくない反応生成物の形成を防止するよう作用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）次式Ｉの化合物、
2009531359.tif 000014
（式中、Ｚは、Ｈであるか、または亜硝酸塩によるニトロ化反応を介してＮＯ２により置換できる代替基であり、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、または１〜６個の炭素原子を有するアルキルもしくは３〜７個の炭素原子を有するシクロアルキルから選択され、
Ｘは、酸素（−Ｏ−）、硫黄（−Ｓ−）、カルボニル（−ＣＯ−）、メチレン（−ＣＨ２−）または−ＮＨ−であり、
Ｒ２およびＲ３は、同一または異なるものであって、水素、ハロゲン、１〜４個の炭素原子を有するアルキルまたは３〜６個の炭素原子を有するシクロアルキルであり、Ｒ２およびＲ３の内の少なくとも一方は水素以外であり、
Ｒ４は、水素または低級アルキルであり、
Ａは、酸素（−Ｏ−）、メチレン（−ＣＨ２−）、−ＣＯＮＲ５−、−ＮＲ５−、または−ＮＲ５ＣＯ−であり、
Ｒ５は、Ｈまたは低級アルキルであり、
Ｒ６は、カルボン酸（−ＣＯ２Ｈ）、またはそのエステルもしくはそのプロドラッグであり、
Ｙは、（−ＣＨ２）ｎであり、式中ｎは０、１、２、３、４もしくは５であり、１個もしくは複数の前記ＣＨ２基は場合によりハロゲンで置換してもよく、またはＹは−Ｃ＝Ｃ−であり、これはｃｉｓもしくはｔｒａｎｓであってよく、ならびに
Ｒ７は、水素、またはアルカノイル基もしくはアロイル基、あるいは遊離フェノール構造（式中Ｒ７＝Ｈである）を生成するために生物変換できる他の基である）
またはその医薬として許容できる塩もしくはエステル、
（ｉｉ）少なくとも１種の医薬として許容できる賦形剤、および
（ｉｉｉ）腸溶性コーティング
を含む、経口投与に適した医薬組成物。
【請求項２】
Ｘが酸素または−ＣＨ２−である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ａが−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−または−ＣＯＮＲ５−である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
Ｒ１がＨ、ヨードまたはイソプロピルである、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
Ｒ２およびＲ３がそれぞれ独立にハロゲンまたはアルキルである、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
Ｒ２およびＲ３がそれぞれ独立にＣｌ、Ｂｒ、Ｉまたはメチルである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
Ｒ４がＨまたはメチルである、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
Ｙが−（ＣＨ２）ｎ−であり、ｎが１または２である、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
Ａが−ＮＲ５ＣＯ−であり、Ｒ５がＨである、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
ＺがＨである、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
化合物（ｉ）が、以下のもの
2009531359.tif 000015
またはその医薬として許容できる塩もしくはエステルから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
化合物（ｉ）が、以下のもの、
2009531359.tif 000016
またはその医薬として許容できる塩もしくはエステルである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
化合物（ｉ）が、以下のもの、
2009531359.tif 000017
またはその医薬として許容できる塩もしくはエステルである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
不活性コーティングが、前記化合物（ｉ）を含有する組成物のその部分と、前記腸溶性コーティング（ｉｉｉ）との間に施される、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
前記腸溶性コーティングが、アクリレートポリマー、メタクリレートポリマーまたはアクリレート−メタクリレートコポリマーを含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
腸溶性錠剤の形態をしており、以下の成分、すなわちマンニトール、微晶質セルロース、ヒプロメロース、ステアリン酸マグネシウム、水、メタクリル酸−アクリル酸エチル（１：１）コポリマー、タルクおよびクエン酸トリエチルを含有する、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
ＵＳＰ装置ＩＩを用いて、人工胃液または０．１Ｎ  ＨＣｌ５００ｍｌ中、３７℃で、毎分５０回転の撹拌速度にて放出を測定したとき、式Ｉの前記化合物の５％以下が少なくとも１時間かかって放出される、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
酸化防止剤も含有する、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
前記酸化防止剤が、アスコルビン酸、フマル酸、リンゴ酸、プロピオン酸、または前記酸のいずれかの塩、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、α−トコフェロール、バルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、オレイン酸エチルおよび没食子酸プロピルから選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記化合物（ｉ）および前記酸化防止剤が実質的に均一に混合されている、請求項１８または１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
（ｉ）次式Ｉの化合物、
2009531359.tif 000018
（式中、Ｚは、Ｈであるか、または亜硝酸塩によるニトロ化反応を介してＮＯ２により置換できる代替基であり、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、または１〜６個の炭素原子を有するアルキルもしくは３〜７個の炭素原子を有するシクロアルキルから選択され、
Ｘは、酸素（−Ｏ−）、硫黄（−Ｓ−）、カルボニル（−ＣＯ−）、メチレン（−ＣＨ２−）または−ＮＨ−であり、
Ｒ２およびＲ３は、同一または異なるものであって、水素、ハロゲン、１〜４個の炭素原子を有するアルキルまたは３〜６個の炭素原子を有するシクロアルキルであり、Ｒ２およびＲ３の内の少なくとも一方は水素以外であり、
Ｒ４は、水素または低級アルキルであり、
Ａは、酸素（−Ｏ−）、メチレン（−ＣＨ２−）、−ＣＯＮＲ５−、−ＮＲ５−、または−ＮＲ５ＣＯ−であり、
Ｒ５は、Ｈまたは低級アルキルであり、
Ｒ６は、カルボン酸、またはそのエステルもしくはそのプロドラッグであり、
Ｙは、（−ＣＨ２）ｎであり、式中ｎは０、１、２、３、４もしくは５であり、１個もしくは複数の前記ＣＨ２基は場合によりハロゲンで置換してもよく、またはＹは−Ｃ＝Ｃ−であり、これはｃｉｓもしくはｔｒａｎｓであってよく、ならびに
Ｒ７は、水素、またはアルカノイル基もしくはアロイル基、あるいは遊離フェノール構造（式中Ｒ７＝Ｈである）を生成するために生物変換できる他の基である）
またはその医薬として許容できる塩もしくはエステル、
（ｉｉ）少なくとも１種の酸化防止剤、および
（ｉｉｉ）少なくとも１種の医薬として許容できる賦形剤
を含む、経口投与に適した医薬組成物。
【請求項２２】
前記化合物（ｉ）が請求項２から１３のいずれか一項に記載されている通りである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
固体組成物である、請求項２１または２２のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
前記酸化防止剤が前記化合物（ｉ）と実質的に均一に混合されている、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記酸化防止剤が、アスコルビン酸、フマル酸、リンゴ酸、プロピオン酸、または前記酸のいずれかの塩、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、α−トコフェロール、バルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、オレイン酸エチルおよび没食子酸プロピルから選択される、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記酸化防止剤が、１用量当たり０．０００１〜１５ｍｍｏｌの量で存在する、請求項１８から２５のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
脂質低下薬、抗糖尿病薬、抗うつ剤、骨吸収抑制剤、食欲抑制剤および／または抗肥満薬から選択される薬理活性成分も含む、請求項１から２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項２８】
経口投与に適した医薬組成物を安定化する方法であって、
（ｉ）請求項１から１３のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物、またはその医薬として許容できる塩もしくはエステル、および
（ｉｉ）少なくとも１種の医薬として許容できる賦形剤
を含む前記医薬組成物に、腸溶性コーティングを施すことを含む方法。
【請求項２９】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物、またはその医薬として許容できる塩もしくはエステルを含有する経口投与に適した医薬組成物において、前記化合物のニトロ化を減少または防止するための腸溶性コーティングの使用。
【請求項３０】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物、またはその医薬として許容できる塩もしくはエステルを含有する経口投与に適した医薬組成物において、前記化合物のニトロ化を減少または防止するための酸化防止剤の使用。
【請求項３１】
治療法で使用するための、請求項１から２７のいずれかに記載の組成物。
【請求項３２】
代謝機能不全と関連する疾患、もしくはトリヨードチロニン（Ｔ３）調節遺伝子の発現に依存する疾患を予防、抑制または治療するための薬剤の調製における、請求項１から２７のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項３３】
代謝機能不全と関連する疾患、もしくはトリヨードチロニン（Ｔ３）調節遺伝子の発現に依存する疾患を予防、抑制または治療する方法であって、このような予防、抑制または治療が必要な対象に請求項１から２６のいずれかに記載の組成物を投与することを伴う方法。
【請求項３４】
（１）請求項１から１３のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物、またはその医薬として許容できる塩もしくはエステルを含む第１の医薬組成物、および
（２）少なくとも１種の酸化防止剤を含む第２の医薬組成物
を含み、前記第１および第２の医薬組成物は各々、少なくとも１種の医薬として許容できる賦形剤を含有しており、かつ前記第１および第２の医薬組成物は、同時、順次、または別々に投与し得る、
経口投与に適した複合薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬組成物に関する。特に、それだけに限らないが、医薬組成物の薬理活性成分を安定化するための製剤戦略に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの薬理活性剤については、経口経路の投与が好ましい。しかし、このような薬剤が患者の血流に到達するには、普通は、少なくとも上部消化管（すなわち、胃および小腸）の内容物に曝されてしまう。ある種の薬剤は、胃の酸性環境に敏感である。このような感受性により、普通は薬剤の酸介在加水分解が起こる。加水分解に敏感な薬剤を含有する組成物に腸溶性コーティングを施すことが知られている。このようなコーティングは、一般に酸性ポリマーを含み、このポリマーは、低ｐＨ（すなわち胃内）では実質的に非帯電性で不溶性であるが、より高いｐＨ値では（すなわち小腸内を通過するとき）イオン化され、可溶性も増す。
【０００３】
以下の構造式を有する化合物１Ａは、
【化１】
2009531359.tif 000002
ＷＯ第０１／６０７８４号に記載されている（ＩＵＰＡＣ名３−［［３，５−ジブロモ−４−［４−ヒドロキシ−３−（１−メチルエチル）−フェノキシ］−フェニル］−アミノ］−３−オキソプロピオン酸）。化合物１Ａおよび一連の関連化合物は、甲状腺ホルモン受容体、具体的にはＴＲβ受容体のアゴニストとして記載されている。このような化合物は、代謝機能不全と関連する疾患もしくはトリヨードチロニン（Ｔ３）調節遺伝子の発現に依存する疾患の治療または予防に有用なはずである。このような疾患としては、例えば、肥満、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症、心不整脈、うつ病、骨粗しょう症、甲状腺機能低下症、甲状腺腫、甲状腺癌、ならびに緑内障およびうっ血性心不全が挙げられる。
【０００４】
化合物１Ａを用いた製剤開発研究を行っている際に、本発明者等は、望ましくない変換が化合物中で起こっていることを意外にも見出した。フェノール環（すなわち、上記に示した場合の左側の環）上のヒドロキシル基に対するオルト位でニトロ（−ＮＯ２）基を含有する反応生成物が生成されていた。調査の結果、この反応生成物は、変換が起こらなかった化合物１Ａと比較して、驚くべきことに遺伝毒性の潜在性を含めて、特性が変化したことが判明した。さらに調査したところ、反応生成物は、経口投与後に、ｉｎ  ｖｉｖｏで生成できることが判明した。そのため、本発明者等は、経口投与後のニトロ化反応生成物の形成を阻害することを目的として、ニトロ化反応生成物の生成に至るプロセスを調査しようとした。
【０００５】
ある種のフラボノイド化合物は、亜硝酸塩の存在下において酸性条件下で生じる、チロシンのニトロ化またはＤＮＡ塩基からの塩基脱アミノ化生成物の形成を阻害できることが（例えば、Oldrieve et al., Chem. Res. Toxicol. 1998, 11, 1574から）知られている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト唾液中での亜硝酸塩および過酸化水素の存在下におけるヒドロキシフェニル酢酸およびタンパク質のニトロ化は、還元種によって阻害できることが示されている（Takahama et al. Arch. Oral Biol. 2003, 48, 679）。しかし、これらの開示内容から、当業者が、このようなニトロ化反応が、化合物１Ａによって例証される構造的に異なる甲状腺ホルモン受容体アゴニスト等の他の化合物において起こり得るかどうかを予見することはできない。さらに、これらの開示内容は、このような反応がｉｎ  ｖｉｖｏで有意になり得ることについては指摘しておらず、かつこのようなニトロ化反応生成物の潜在的な特性（例えば、遺伝毒性）の予見に関しても示唆していない。
【０００６】
先行技術は、前記化合物１Ａ等の甲状腺ホルモン受容体結合性化合物が、経口投与時に潜在的に毒性のある反応生成物に変換する恐れがあること、またはこのような変換がどのように起こり得るのか、あるいはこのような問題をどのように対処し得るのかについては、開示または示唆していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そのため、本発明の一目的は、経口投与後にある種の甲状腺ホルモン受容体結合性化合物がニトロ化する上記問題が軽減された医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明の第１の態様は、
（ｉ）その立体異性体すべて、またはその医薬として許容できる塩もしくはエステルを含む次式Ｉの化合物、
【化２】
2009531359.tif 000003
（式中、ＺはＨであるか、または亜硝酸塩によるニトロ化反応を介してＮＯ２により置換できる代替基であり、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、または１〜６個の炭素原子を有するアルキルもしくは３〜７個の炭素原子を有するシクロアルキルから選択され、
Ｘは、酸素（−Ｏ−）、硫黄（−Ｓ−）、カルボニル（−ＣＯ−）、メチレン（−ＣＨ２−）または−ＮＨ−であり、
Ｒ２およびＲ３は、同一または異なるものであって、水素、ハロゲン、１〜４個の炭素原子を有するアルキルまたは３〜６個の炭素原子を有するシクロアルキルであり、Ｒ２およびＲ３の内の少なくとも一方は水素以外であり、
Ｒ４は、水素または低級アルキルであり、
Ａは、酸素（−Ｏ−）、メチレン（−ＣＨ２−）、−ＣＯＮＲ５−、−ＮＲ５−、または−ＮＲ５ＣＯ−であり、
Ｒ５は、Ｈまたは低級アルキルであり、
Ｒ６は、カルボン酸（−ＣＯ２Ｈ−）、またはそのエステルもしくはそのプロドラッグであり、
Ｙは、（−ＣＨ２）ｎであり、式中ｎは０、１、２、３、４もしくは５であり、１個もしくは複数の前記ＣＨ２基は場合によりハロゲンで置換してもよく、またはＹは−Ｃ＝Ｃ−であり、これはｃｉｓもしくはｔｒａｎｓであってよく、および
Ｒ７は、水素、またはアルカノイル基もしくはアロイル基、あるいは遊離フェノール構造（式中Ｒ７＝Ｈである）を生成するために生物変換できる他の基である）
（ｉｉ）少なくとも１種の医薬として許容できる賦形剤、および
（ｉｉｉ）腸溶性コーティング
を含む、経口投与に適した医薬組成物を提供する。
【０００９】
式Ｉの化合物は、甲状腺ホルモン受容体アゴニストとして特に有用である。具体的に、このような化合物の多くは、（ＴＲαよりも）ＴＲβ受容体で向上した活性を示す。
【００１０】
本発明のこの第１の態様の組成物は、化合物１Ａのニトロ化反応生成物が、亜硝酸塩によるニトロ化反応を介して、経口投与時に形成されるという、上記の調査の結果としての本発明者等の驚くべき知見に基づいている。亜硝酸塩によるニトロ化反応では、反応を進めるには、適度に低いｐＨ（約２）が必要となる。組成物に腸溶性コーティング（すなわち、酸性の胃内では原形を保ち、ｐＨが中性により近い小腸内を組成物が通過するときのみに溶解するもの）を施すことにより、ニトロ化反応は有意に阻害される。腸溶性コーティングの存在は、式Ｉの薬理活性化合物が胃の酸性媒体に曝されるのを防ぎ、それにより亜硝酸塩試薬が前記活性化合物の周辺で形成されるのを防ぐ。そのため、腸溶性コーティングの重要性は、経口投与時の式Ｉの化合物のニトロ化反応を減弱させることである。ニトロ化反応減弱化について理解し、その減弱化を試みようとする本発明者等の動機は、製剤開発研究中に、化合物１Ａのニトロ化反応生成物が意外にも生成されることであったことを強調すべきである。また、このようなニトロ化反応は、例えば以下に示す化合物ＧＣ−１を含め、式（Ｉ）の他の化合物でも起こる。このニトロ化反応生成物が検出されていなければ、その潜在的な遺伝毒性を決定する根拠がなかったと思われる。このような反応生成物における潜在的な毒性（または他の望ましくない特性）に対する知識がなければ、当然ながら、その形成を防止しようとする気にもならなかったと思われる。
【００１１】
本発明の適用性は、化合物１Ａの安定化に限らない。より正しくは、本発明のこの第１の態様による組成物はすべて、経口投与時に起こりがちなニトロ化反応を減弱させることにより、ある程度安定化するはずである。式Ｉの任意の化合物のニトロ化は、化合物の薬理学的および／または毒物学的プロファイルに変化を起こし得るか、あるいは同様にその薬物動態に影響を与え得る。このような化合物のニトロ化反応生成物は、潜在的に遺伝毒性になり得る。ある種の場合には、酸性媒体のさらなる反応（例えば、それ自体が潜在的に遺伝毒性であるアニリンの遊離）も防ぐことができる。さらに、副次的な（すなわち、上記に示した場合の右側の）環におけるニトロ化反応も、求電子性芳香族置換反応により、低ｐＨで起こる恐れがある。腸溶性コーティングは、これらのニトロ化反応生成物の形成も抑制または防止するであろう。いずれにせよ、式Ｉの化合物のこのような化学修飾を制御および／または防止できれば、一般に、製剤担当者にとって有用な手段となろう。
【００１２】
本発明の第１の態様の組成物により、式Ｉの化合物の放出を胃から腸内へ通過した時点に限ることができ、この通過時に腸溶性コーティングは溶解し始めるか、および／または透過性を示し始める。しかし、腸内のｐＨは、亜硝酸によるニトロ化を有意な程度まで起こすほど低くないため、経口投与時の式Ｉの化合物のニトロ化は、有意に減弱する。
【００１３】
本明細書において、単独でまたは他の基の一部として使用する「アルカノイル」という用語は、カルボニル基に連結するアルキルのことである。本明細書において、単独でまたは他の基の一部として使用する「アロイル」という用語は、カルボニル基に連結するアリールのことである。別段の指示がない限り、単独でまたは他の基の一部として本明細書で使用する「アルキル」または「アルク（ａｌｋ）」という用語は、直鎖においては１〜１２個の炭素原子、好ましくは１〜４個の炭素原子（この場合、「低級アルキル」という用語を使用し得る）を含有する、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチルまたはイソブチル、ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、４，４−ジメチルペンチル、オクチル、２，２，４−トリメチルペンチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル等の、直鎖炭化水素および分枝鎖炭化水素の両方を含む。本明細書において、単独でまたは他の基の一部として使用する「アリール」という用語は、（フェニル、または１−ナフチルおよび２−ナフチルを含むナフチル等の）環部において６〜１０個の炭素原子を含有する単環式および二環式芳香族基を指し、場合により、利用できる炭素原子を介して、水素、ハロ、アルキル、ハロアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、アルケニル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、アルキニル、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノおよび／またはカルボキシ、もしくはそのアルキルエステルから選択される１個、２個または３個の基で置換してもよい。別段の指示がない限り、本明細書において、単独でまたは他の基の一部として使用する「シクロアルキル」という用語は、１つの環と、前記環を形成する合計３〜７個の炭素原子、好ましくは３〜６個の炭素原子を含有する、飽和環状炭化水素基または部分不飽和（１または２個の二重結合を含有）環状炭化水素基を含み、例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルが挙げられる。本明細書において、単独でまたは他の基の一部として使用する「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、塩素、臭素、フッ素およびヨウ素、ならびにＣＦ３を指し、塩素または臭素が好ましい。
【００１４】
亜硝酸塩によるニトロ化反応を介してＮＯ２により置換できる代替基は、例えば、ハロ（例えば、ヨード、クロロ、ブロモまたはフルオロが挙げられ、前者が好ましい）および擬ハロゲン（例えばＳＣＮ、ＯＣＮ、ＮＣＳ、ＮＣＯおよびＮ３）から選択することができる。
【００１５】
腸溶性コーティングは、こうした目的のために製造された任意の市販のポリマーを使用して形成されるのが好ましい。このようなポリマーの例としては、アクリレート系ポリマー、メタクリレート系ポリマーまたはそれらのコポリマー（例えば、Ｄｅｇｕｓｓａ／ＲｏｅｈｍよりＥｕｄｇｒａｇｉｔ（登録商標）の商品名で販売されている一連の腸溶性コーティングポリマー等）、ポリビニルアセテートフタレート、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネートおよびカルボキシメチルエチルセルロースを挙げることができる。１つの具体的な実施形態では、腸溶性コーティングは、メタクリル酸−アクリル酸エチルコポリマーを含む。このようなコポリマーの構成モノマーは、１：１の比で存在できる。腸溶性コーティングは、タルク等の流動促進成分も含有していることが好ましい。可塑剤が含まれるのも有益である。適当な可塑剤は、クエン酸トリエチルである。
【００１６】
ＵＳＰ溶解装置ＩＩを用いて、９００ｍｌもしくは５００ｍｌいずれかの人工胃液または０．１Ｎ  ＨＣＬ中で、３７℃で、毎分５０回転の撹拌速度で放出を測定したとき、式Ｉの化合物の５％以下、より好ましくはほぼ０％が、少なくとも１時間、より好ましくは２時間、最も好ましくは３時間かかって放出されるように、腸溶性コート組成物が製剤されるのが好ましい。好ましい実施形態では、ｐＨ６．８の緩衝媒体（例えば、ｐＨ６．８の人工腸液）中で測定を行ったとき、式Ｉの化合物の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくはほぼすべてが、好ましくは１時間以内、より好ましくは４５分以内に放出される。
【００１７】
状況によっては、不活性コーティングが、式Ｉの化合物を含有する組成物のその部分と腸溶性コーティング（ｉｉｉ）との間に施されるのが好ましいこともあり得る。腸溶性コーティングは、通常酸性ポリマーで構成されており、したがってその本質から、ある種の有効成分に有害な変化を起こす可能性がある。間に施した不活性コーティング（ヒドロキシプロピルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース等の、例えばセルロース誘導体から作られているもの）は、こうした相互作用を阻害する傾向がある。不活性コートは、当然ながら、式Ｉの化合物を放出できるようにするために、腸媒体内で可溶性（あるいは分散性）となるべきである。
【００１８】
本明細書で使用する「腸溶性コーティング」という用語は、剤形がその他の点では基本的に完成したとき組成物／剤形（例えば、錠剤）に施されるコーティング、および剤形製造の中間段階で施されるコーティングを含むことが意図されている。このため、式Ｉの化合物を賦形剤と共に顆粒に製剤し、次いで錠剤に圧縮するか、または例えばゼラチンカプセル等のカプセルに充填する等のさらなる処理を行う前に腸溶性コーティングを施す、組成物が含まれる。同様に、ＷＯ第００／２２９０９号に記載されているような方式は、それほどには好ましくないが、式Ｉのある種の化合物に関する本発明の第１の態様により組成物を調製するのに適当となり得る。この方式では、薬理活性成分と相対的に疎水性のカルボン酸（例えばＣ９〜Ｃ３０脂肪族カルボン酸）との間の複合体が、ｐＨを調整して溶液から共沈させて調製される。
【００１９】
式Ｉのある種の化合物では、Ｘは酸素または−ＣＨ２−である。あるいは、またはさらに、Ａは−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−またはＣＯＮＲ５−であってよい。式Ｉのいくつかの好ましい化合物では、Ｒ１はイソプロピル、ヨードまたはＨである。さらに、またはあるいは、Ｒ２およびＲ３が、それぞれ独立にハロゲンまたはアルキルであることが好ましいこともあり得る。この場合、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立にＣｌ、Ｂｒ、Ｉまたはメチルであることが好ましい。ある種の好ましい実施形態では、Ｒ２＝Ｒ３である。Ｒ２＝Ｒ３＝ＢｒまたはＣｌが特に好ましい。
【００２０】
式Ｉの化合物では、Ｒ４はＨまたはメチルであることが好ましく、Ｈが特に好ましい。
【００２１】
式Ｉのある種の化合物では、Ｙは−（ＣＨ２）ｎ−であり、ｎは１または２である。あるいは、またはさらに、Ａは−ＮＲ５ＣＯ−であってよく、Ｒ５はＨである。式Ｉの特に好ましい化合物では、Ｙは−（ＣＨ２）ｎ−で、ｎ＝１であり、ＡはＮＨＣＯまたはＣＯＮＨであり、Ｒ６はＣＯＯＨ、またはＣＯＯＨの対応する塩、エステルまたはプロドラッグの形態である。
【００２２】
本発明の選択された実施形態では、化合物（ｉ）は、以下のもの、
【化３】
2009531359.tif 000004
またはそれらの医薬として許容できる塩もしくはエステルから選択される式を有している。
【００２３】
当業者であれば理解されようが、上記のニトロ化反応により、上記構造式に示されているような左側のベンゼン環の最下部で、すなわちＯＨに対してオルト位でニトロ基が導入されることになろう。したがって、大抵の場合は、置換される基はＨであると思われるが、亜硝酸塩によるニトロ化反応により置換できる代替基、例えばフェノール性ヒドロキシ基に対してオルト位のヨード基等も意図されている。本発明者等は、水素の置換よりは遅いが、これが簡易反応であることを示した。
【００２４】
式Ｉの化合物がエステルの形で存在するとき、そのアルキルエステルが好ましい。式Ｉの化合物が、医薬として許容できる塩の形で存在するとき、このような塩としては、化合物が少なくとも１つの塩基性中心を有する場合、例えば、鉱酸等（例えば硫酸、リン酸またはハロゲン化水素酸）の無機強酸と、非置換であるか、例えばハロゲンにより置換される１〜４個の炭素原子を有するアルカンカルボン酸等（例えば酢酸）、飽和もしくは不飽和ジカルボン酸等（例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸またはテレフタル酸）、ヒドロキシカルボン酸等（例えばアスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸またはクエン酸）、アミノ酸等（例えばアルパラギン酸もしくはグルタミン酸、またはリジンもしくはアルギニン）または安息香酸等の強い有機カルボン酸と、あるいは非置換であるか、例えばハロゲンによって置換される（Ｃｌ−Ｃ４）アルキルまたはアリールスルホン酸等（例えば、メタンスルホン酸またはｐ−トルエンスルホン酸等）の有機スルホン酸との酸付加塩が挙げられる。
【００２５】
対応する酸付加塩は、所望される場合、追加的に存在する塩基性中心を有するように形成することもできる。
【００２６】
式Ｉの化合物が少なくとも１個の酸性基（例えばＣＯＯＨ）を有するとき、塩基との塩を形成することもできる。適当な塩基との塩としては、例えば、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩等（例えばナトリウム塩、カリウム塩またはマグネシウム塩）の金属塩、あるいはアンモニアとの塩、あるいはモルホリン、チオモルホリン、ピペリジン、ピロリジン、モノ、ジもしくはトリ低級アルキルアミン（例えばエチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ジエチル、ジイソプロピル、トリエチル、トリブチルもしくはジメチルプロピルアミン）またはモノ、ジもしくはトリヒドロキシ低級アルキルアミン等（例えばモノ、ジもしくはトリエタノールアミン）の有機アミンとの塩である。さらに、対応する内部塩を形成してもよい。
【００２７】
塩基性基を含む式Ｉの化合物の好ましい塩としては、一塩酸塩、硫酸水素塩、メタンスルホン酸塩、リン酸塩または硝酸塩が挙げられる。酸性基を含む式Ｉの化合物の好ましい塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩およびマグネシウム塩、ならびに医薬として許容できる有機アミンが挙げられる。
【００２８】
化合物（ｉ）は、所望される場合、当然ながら溶媒和することができ、例えば、本発明では水和物が使用できる。
【００２９】
本発明の第１の態様のある種の実施形態では、組成物は、酸化防止剤も含む。このような実施形態は、化合物１Ａのニトロ反応生成物は、フリーラジカルが介在する亜硝酸塩による反応を介して、経口投与時に形成されるという、上記調査の結果としての、本発明者等の意外な発見に基づくものである。やはり上記した、非ビアリールエーテル化合物ＧＣ−１が、生理的に適切な条件下において、容易にニトロ化されることも本発明者らにより決定された。酸化防止剤を本発明の第１の態様の組成物に組み込むことにより、フリーラジカルの形成を阻害し、かつ／または形成されるフリーラジカルを除去し、腸溶性コーティングにも関わらず起こる任意のニトロ化反応を減弱させるという結果を伴う。
【００３０】
酸化防止剤は、水溶性であることが好ましい。このような酸化防止剤としては、アスコルビン酸、フマル酸、リンゴ酸、プロピオン酸、または前記酸いずれかの塩、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムおよびメタ重亜硫酸ナトリウムが挙げられる。好ましい酸化防止剤は、アスコルビン酸またはそのナトリウム塩であり、ニトロ化反応に対して特に有意な阻害作用を有していることが判明した。
【００３１】
あるいは、酸化防止剤は、非水溶性であってもよい。このような酸化防止剤は、α−トコフェロール、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、オレイン酸エチルおよび没食子酸プロピルから選択することができる。
【００３２】
本質的ではないが、化合物（ｉ）および酸化防止剤（ｉｉ）は実質的に均一に混合するのが好ましくなり得る。このことは、化合物（ｉ）が亜硝酸塩（および／または亜硝酸、ならびに／あるいは任意の窒素含有および酸素含有フリーラジカル種）と任意に接触するとき、酸化防止剤がこのような接触部の周辺に存在しやすく、このため、起こり得る任意のニトロ化反応をより良好に減弱できることを確実にするための一助となる。
【００３３】
本発明の第２の態様によれば、
（ｉ）上記のような、式Ｉの化合物、またはその医薬として許容できる塩もしくはエステル、
（ｉｉ）少なくとも１種の酸化防止剤、および
（ｉｉｉ）少なくとも１種の医薬として許容できる賦形剤
を含む、経口投与に適した医薬組成物が提供される。
【００３４】
本発明の第２の態様の好ましい実施形態では、組成物は固体組成物である。本発明の第１の態様に関して記載されているように、式Ｉの好ましい特徴は、第２の態様（および必要に応じて、以下に記載する他の態様）に関しても適用される。
【００３５】
本発明の第２の態様の組成物は、好ましくは腸溶性コーティングも含む。腸溶性コーティングは、本発明の第１の態様に関して前記したとおりとすることができる。
【００３６】
第３の態様では、本発明は、経口投与に適した医薬組成物を安定化させる方法であって、
（ｉ）上記のような、式Ｉの化合物、またはその医薬として許容できる塩もしくはエステル、および、
（ｉｉ）少なくとも１種の医薬として許容できる賦形剤
を含む前記医薬組成物に腸溶性コーティングを施すことを含む方法をさらに提供する。
【００３７】
さらなる態様では、本発明は、上記のように、式Ｉの化合物、またはその医薬として許容できる塩もしくはエステルを含有する経口投与に適した医薬組成物において、前記化合物のニトロ化の減少または防止のため、腸溶性コーティングまたは酸化防止剤、あるいは腸溶性コーティングおよび酸化防止剤の両方の使用を提供する。
【００３８】
本発明は、治療法で使用するための、本発明の組成物も提供する。
【００３９】
本発明は、代謝機能不全と関連する疾患またはトリヨードチロニン（Ｔ３）調節遺伝子の発現に依存する疾患の予防、抑制または治療する薬の調製における本発明の組成物の使用も提供する。その疾患は、肥満、高コレステロール血症、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、心不整脈、うつ病、骨粗しょう症、甲状腺機能低下症、甲状腺腫、甲状腺癌、ならびに緑内障およびうっ血性心不全から選択され得る。
【００４０】
同様に、本発明は、代謝機能不全と関連する疾患またはトリヨードチロニン（Ｔ３）調節遺伝子の発現に依存する疾患の予防、阻害または治療する方法であって、このような予防、阻害または治療を必要とする対象に本発明の組成物を投与することを伴う方法も提供する。
【００４１】
直前に記載した使用および方法において、薬剤または組成物は、３０分〜１カ月の投与間隔で投与することができる。投与間隔は、より好ましくは１〜７日間、さらにより好ましくは１〜３日間である。化合物（ｉ）の一般成人の用量範囲は、１日当たり約１μｇ〜約２０００μｇとなろう。多くの化合物（ｉ）の１日量は、３００μｇ未満となろう。化合物（ｉ）の用量は、好ましくは１日当たり約１μｇ〜約２００μｇ、より好ましくは１日当たり約１〜約１００μｇである。例えば、化合物（ｉ）は、１日当たり１回、２回、３回または４回で投与してもよい。組成物の単位用量当たりの化合物（ｉ）の量は、好ましくは１〜２００μｇ、より好ましくは１〜１００μｇ、より好ましくは１、５、１０、２０、２５または５０μｇである。例えば、単位用量当たりの化合物（ｉ）の量は、１０〜１００μｇ、例えば２０〜８０μｇ、通常は２５〜５０μｇであってよい。
【００４２】
本発明の第１または第２の態様による組成物は、脂質低下薬、抗糖尿病薬、抗うつ剤、骨吸収抑制剤、食欲抑制剤および／または抗肥満薬から選択されるさらなる薬理活性成分も含んでよい。
【００４３】
さらなる薬理活性成分は、その代謝効果が高まるように、化合物（ｉ）との相加効果または相乗効果を有する傾向にある。
【００４４】
酸化防止剤を含有する上記の組成物では、酸化防止剤の量は、非常に広範囲にわたって変化し得る。酸化防止剤は、好ましくは少なくとも０．０００１ｍｍｏｌ、例えば０．０００５ｍｍｏｌ、より好ましくは少なくとも０．０１ｍｍｏｌ存在する。酸化防止剤の量は、例えば、組成物の用量当たり０．０００１〜１５ｍｍｏｌ、例えば０．０００５〜１０ｍｍｏｌ、通常は０．０１〜４ｍｍｏｌであってよい。
【００４５】
以下により詳細に示すように、平均的なヒトは、１時間当たり唾液中の亜硝酸塩を約０．１ｍｍｏｌ飲み込む。組成物中に酸化防止剤が上記の量存在することにより、本発明の組成物が、比較的長期間、胃内に滞留する場合でも、化合物（ｉ）に対して有用な安定化効果がもたらされるはずである。
【００４６】
さらに別の態様では、本発明は、経口投与に適した複合薬であって、
（１）前記のような、式Ｉの化合物、またはその医薬として許容できる塩もしくはエステルを含む第１の医薬組成物、および
（２）少なくとも１種の酸化防止剤を含む第２の医薬組成物
を含み、
前記第１および第２の医薬組成物は各々、少なくとも１種の医薬として許容できる賦形剤を含有し、かつ前記第１および第２の医薬組成物は、同時、順次または別個に投与することができる複合薬を提供する。
【００４７】
本発明の複合薬は、化合物（ｉ）の安定化をもたらすためには、酸化防止剤は、化合物（ｉ）が酸および亜硝酸塩源と接触するときだけ存在すべきであるという事実を利用している。複合薬の組成物２種が、胃内に滞留する各々の期間が重なるように時間的に接近して投与されるならば、化合物（ｉ）は、ニトロ化反応に対して少なくともある程度の安定化を享受するはずである。組成物、少なくとも第１の組成物は、固体組成物であることが好ましい。
【００４８】
次に、単に例証として添付の図面を参照しながら本発明をより詳細に説明する。
【００４９】
上記のように、化合物１Ａの開発中に、５’−ニトロ反応生成物の形成が非生物的（すなわち非酵素的）経路を介して起こっていることが確定された。ニトロ反応生成物の毒性は、親化合物と比較して、問題となる程度まで変化することが確定された。そのため、ニトロ化反応がどのように起こっているのかを確定し、これをｉｎ  ｖｉｖｏで制御または防止する方式を工夫することが重要であった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
【実施例１】
【００５１】
化合物１Ａの反応生成物の遺伝毒性
【００５２】
１．１  序論
化合物１Ａの２５μｇカプセル製剤の開発中、これまで検出されなかった不純物が数バッチで認められた。不純物の範囲は親化合物の０．８〜１．２％の範囲であった。この不純物は、ニトロ類似体として特定され、以降、反応生成物１Ｂと称する。
【００５３】
したがって、この不純物／反応生成物のｉｎ  ｖｉｖｏ形成に対する理論的可能性が確認された。そこで、ハーモナイゼーション国際会議（ＩＣＨ）基準の一連の試験において、この推定反応生成物の遺伝毒性作用について試験した。
【００５４】
本実施例は、反応生成物１Ｂを用いて行った遺伝毒性試験を要約しており、この不純物／反応生成物への臨床的暴露についての知見が関係している。
【００５５】
１．２  遺伝毒性
１．２．１  反応生成物１Ｂ
１．２．１．１  予備エームス試験
反応生成物１Ｂは、Ｓ−９代謝活性剤の存在下および不在下において複製培養物中で試験した。水中に溶解したアジ化ナトリウムは別として、陽性対照品は、複製培養物中で試験し、ＤＭＳＯ中で調製した。陰性（溶媒）対照は、５つの複製培養物中で試験した。
【００５６】
反応生成物１Ｂは、試験したＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株およびＥ．ｃｏｌｉ株各々に対して細胞毒性を示した。細胞毒性は、最小から著しいものまで、復帰突然変異体の平均数の減少および／または細菌叢バックグラウンド濃度の低下から明らかになった。陰性対照と比較したとき、ヒスチジン＋復帰突然変異体値は、Ｓ−９代謝活性化の存在下および不在下それぞれにおいて、菌株ＴＡ１００の反応生成物１Ｂ処理培養物中で上昇した。予想どおり、陽性対照化合物で処理した培養物において、ヒスチジン＋およびトリプトファン＋復帰突然変異体数の有意な増加が認められた。
【００５７】
結論として、反応生成物１Ｂは、この試験で陽性反応を示した。
【００５８】
１．２．１．２  ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおけるエームス復帰突然変異試験
反応生成物１Ｂは、微生物変異原性試験において評価し、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ヒスチジン−）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（トリプトファン−）の各菌株でフレームシフト変異または塩基対置換変異を誘発する可能性を決定した。
【００５９】
反応生成物１Ｂは、濃度範囲決定試験、続いて突然変異本試験で各菌株を用いて試験した。反応生成物１Ｂは、濃度範囲決定試験および突然変異本試験では、各々、Ｓ−９代謝活性化あり・なし両方で、最大濃度３０００および１０００μｇ／プレート以下で評価した。試験した各細菌の菌株で、細胞毒性が認められた。ヒスチジン＋突然変異体の平均数は、Ｓ−９代謝活性化の存在下および不在下で、濃度範囲決定試験および突然変異本試験での両方において、試験株ＴＡ１００の反応生成物１Ｂ処理培養物中で有意に上昇した（約２〜３倍）。
【００６０】
株ＴＡ１００中で復帰突然変異体が反応生成物１Ｂに誘発されて対照値よりも増加したことは、陽性反応を示している。
１．２．１．３  実施したエームス試験の要約
要約すれば、化合物１Ａの芳香族ニトロ不純物／反応生成物、すなわち反応生成物１Ｂは、予備エームス試験で試験し、対照値を超える復帰突然変異体の濃度依存的増加を誘発することが判明した。増加は、対照の２．５〜３倍、すなわち陽性反応とみなされた。この結果は、エームス本試験で確認された。
【００６１】
１．２．１．４  一次ヒトリンパ球における細胞遺伝学的試験
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞遺伝学的試験は、反応生成物１Ｂが培養したヒトリンパ球において染色体異常を誘発する可能性を調査するために行われた。濃度範囲決定試験の細胞毒性結果に基づき、評価用には、代謝酵素活性化なしでの２４時間の暴露には５〜３０μｇ／ｍｌの濃度、Ａｒｏｃｌｏｒ１２５４誘発ラット肝臓（Ｓ９画分）代謝活性化を用いた５時間の暴露には２．５〜２０μｇ／ｍｌの濃度を選択した。
【００６２】
Ｓ−９代謝活性化の存在下において反応生成物１Ｂに５時間暴露した場合では、染色体異常の頻度は、統計的に有意に増加した。最高濃度２０μｇ／ｍｌでは、染色体異常の頻度は溶媒対照の２．５％と比較して１０．５％で、分裂指数の減少は約５１％であった。
【００６３】
Ｓ−９代謝活性化の不在下において反応生成物１Ｂに２４時間暴露した場合は、染色体異常の頻度は、統計的に有意に増加した。評価した最高濃度の４０μｇ／ｍｌでは、染色体異常の頻度は溶媒対照の２．５％と比較して７．５％で、分裂指数の減少は約４８％であった。
【００６４】
予想通り、各試行において陽性対照は、損傷した分裂中期の頻度の統計的に有意な増加を誘発した。このため、この試験の有効性が示された。
【００６５】
結論として、反応生成物１Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞遺伝学的試験に関する国際ガイドラインで推奨されている最大濃度まで試験したとき、分裂中のヒトリンパ球に対して染色体異常誘発性であった。
【００６６】
１．２．１．５  マウスにおける経口小核試験
反応生成物１Ｂは、マウス骨髄小核試験で評価し、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝毒性の可能性を決定した。マウスの各群には、３日間連続で、反応生成物１Ｂを１日１０００、１５００または２０００ｍｇ／ｋｇ経口投与した（すなわち、ＩＣＨおよびＯＥＣＤの国際規制ガイドラインで必要とされる最大用量レベル以下）。大腿骨髄試料は、小核多染性赤血球（ＭＮ−ＰＣＥ）の評価のため、最後に投薬してから約２４時間ですべての動物から採取した。
【００６７】
いずれの動物も試験中に死亡せず、薬物関連の臨床的兆候は認められなかった。多染性赤血球（ＰＣＥ）の有意な減少で判断したとき、骨髄毒性は認められなかった。ＭＮ−ＰＣＥの頻度は、１０００および１５００ｍｇ／ｋｇで統計的に増加した。
【００６８】
結論として、用量非依存的陽性反応がマウス中で見出された。
【００６９】
１．３  反応生成物１Ｂへの臨床暴露
ヒトボランティアに化合物１Ａの単回経口用量を投与した後、反応生成物１Ｂを血漿中で検出することができた。同様に、対象に化合物１Ａの１日量を２週間投与した試行では、反応生成物１Ｂが何人かの対象中で検出することができた。
【００７０】
結論として、ヒトに化合物１Ａを投与した後、潜在的に変異誘発性のニトロ反応生成物１Ｂが血漿中で検出することができた。これは、比較的短期間（例えば、上記のように１４日間）投与を行う場合にも当てはまる。潜在的遺伝毒性物質は、通常、変異原性作用において用量非依存性であり、そのため反応生成物１Ｂが低濃度で存在する場合でも、臨床的関連性がある。さらに、式Ｉの化合物は、通常長期間投与されると思われるので、ニトロ反応生成物の蓄積による潜在的な遺伝毒性効果を回避しようとする場合には、前記ニトロ反応生成物が形成されるのを防止することが決定的に重要となる。
【００７１】
１．４  要約および結論
化合物１Ａの不純物／反応生成物、すなわち反応生成物１Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏヒト末梢リンパ球で染色体異常を、およびｉｎ  ｖｉｖｏマウス小核試験で用量非依存的に小核を誘発することが判明した。
【００７２】
さらに、反応生成物１Ｂは、化合物１Ａを短期間投与した後で、ヒト血漿中で検出することができた。したがって、潜在的遺伝毒性物質は、非常に低濃度で遺伝毒性効果を与えることができ、かつ化合物１Ａ等の式Ｉの化合物は、通常長期間投与されると思われるため、ニトロ反応生成物の形成の防止は、明らかに相当に有益なはずである。
【実施例２】
【００７３】
硝酸塩および亜硝酸塩−供給源およびニトロ化機構
【００７４】
２．１  序論
考え得るニトロ化源は、非古典的な亜硝酸塩経路である。この経路は、まずUemura等（1978, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 9, 1076）によって報告された。亜硝酸塩経路は、適度に低いｐＨ（約２）で進むことができ、硝酸塩経路と比較して、水に対する耐性がある。亜硝酸塩経路は、ヒドロキシル化ベンゼン含有化合物と反応できるフリーラジカル種の生成をもたらす（Beake et al.（1992）J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2, 10, 1653）。
【００７５】
本発明者等は、この経路が、胃および腸内で式Ｉの経口投与化合物がニトロ化するための主な経路である可能性が高いと考えた。
【００７６】
食品添加物以外の供給源からの硝酸塩および亜硝酸塩の１日の平均摂取量が、すでに推定されている（T. Hambridge, WHO Food Additives Series: 50, Nitrate and Nitrite）。
【００７７】
亜硝酸塩の内在源に関する限りでは、硝酸塩は、口内の硝酸還元酵素の作用により唾液中の硝酸塩から生成されることが知られている（Benjamin (2000) Ann. Zootech. 49, 207）。これにより、唾液中の亜硝酸塩の濃度が約２００μＭとなる。平均的なヒトは１時間当たり約５００ｍｌの唾液を飲み込む。このため、１日当たり亜硝酸塩約２．４ｍｍｏｌ（１１０ｍｇ）を摂取していることになる。これは、亜硝酸塩約１．６ｍｇ／ｋｇ／日となる（体重７０ｋｇの平均的な成人の場合）。
【００７８】
２．２  ｉｎ  ｖｉｖｏニトロ化試験
ラットにてｉｎ  ｖｉｖｏで行った実験では、化合物１Ａを硝酸塩・亜硝酸塩溶液（ラット１匹当たり各５４ｍｇおよび４ｍｇ）と共に投与したとき、化合物１Ａの投薬量の約６％がニトロ化されていることが判明した。
【００７９】
２．３  酸化防止剤
上記に示したように、化合物１Ａ（したがって、式Ｉの化合物等の他のヒドロキシル化ベンゼン含有化合物）のニトロ化機構は、亜硝酸塩を経由するため、フリーラジカルが介在すると仮定された。したがって、ニトロ化反応は、フリーラジカルスカベンジャー／酸化防止剤によって阻止できると考えられた。
【００８０】
一般的に、本発明によれば、任意の酸化防止剤が使用できる。「真性」酸化防止剤とは、フリーラジカルと反応することによって（ラジカル種に単一電子を与えることによって）、ラジカル介在連鎖反応を妨害する物質である。このような真性酸化防止剤の一例としては、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）がある。このような種の他の例としては、フェルラ酸、ルチン、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、アピカテキンガレートおよびエピガロカテキンガレート等のフェノール系酸化防止剤が挙げられる。このような種の多くは、天然に存在する、例えば、フラボノイド型またはｔｒａｎｓ−スチルベン型酸化防止剤である。還元剤は、保護するために使用している当該化合物よりも低い酸化還元電位を有する種であり、および／またはニトロ化デコイとして作用し得る。このようにして作用する作用剤の一例としては、アスコルビン酸がある。さらに、ある種の作用剤は、「酸化防止剤の共力剤」である。これらの作用剤は、酸化防止剤の効果を高めるものであり、これらも本発明の組成物に含め得る。一例としてはエデト酸ナトリウムがある。
【００８１】
酸化防止剤は、溶解度特性に応じて分類することもできる。水溶性酸化防止剤としては、アスコルビン酸（またはそのナトリウム塩）、フマル酸、リンゴ酸、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム（ＫＯ３Ｓ−ＳＯ２Ｋ）、プロピオン酸（ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）、重亜硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）および亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）が挙げられる。非水溶性酸化防止剤としては、α−トコフェロール、パルチミン酸アスコビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、オレイン酸エチルおよび没食子酸プロピルが挙げられる。
【００８２】
２．４  ニトロ化反応およびその阻害
Ｌ−チロシンは、ニトロ化反応生成物に変換される可能性があり、ここではＮＯ２基が、環ヒドロキシル基に対してオルト位で置換されることが知られている。Ｌ−チロシンのニトロ化の程度を決定するための実験手順を、化合物１Ａのニトロ化と選択した酸化防止剤によるその阻害とを決定するために使用した。Ｌ−チロシンの実験手順は周知である（1998, Chem. Res. Toxicol., 11, 1578）。簡単に言うと、化合物１Ａ（５０μＭ）溶液をリン酸緩衝液の存在下または不在下において、３７℃にて、様々なｐＨ値でＮａＮＯ３（２５００μＭ）および／またはＮａＮＯ２（様々な濃度）の各溶液に曝した。ニトロ化反応により、化合物１Ａの５’−ニトロ反応生成物の形成に至る。この反応生成物は、ＨＰＬＣを用いて検出および定量化することができ、前記反応生成物は、親化合物と比較して（使用した条件下で）保持時間が減少している。次いで、酸化防止性阻害剤をＮａＮＯ２および１Ａ含有試験液に添加し、ニトロ化試験を繰り返した。
【００８３】
図１は、５０ｎＭ〜５０μＭの反応生成物１Ｂの存在下における１Ａ（５０μＭ）の一連の標準ＨＰＬＣクロマトグラムを示している。分析は、以下の条件で、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳで行った。
【００８４】
ＨＰＬＣ条件
装置：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ２７９５ＬＣ
保護カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｅｎｔｒｙ  Ｇｕａｒｄ  Ｃｏｌｕｍｎ、Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８  ３．５μｍ、２．１×１０ｍｍ
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８  ３．５μｍ、２．１×５０ｍｍ
カラム温度：４５℃
注入量：５μｌ
オートサンプラー温度：１０℃
流量：０．２ｍｌ／分
移動相：Ａ＝１０ｍＭ酢酸アンモニウム（酢酸でｐＨ＝４．５に調整）
Ｂ＝アセトニトリル
2009531359.tif 000005
質量分析条件
装置：  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＱｕａｔｔｒｏミクロＡＰＩ
モード：  ＥＳＩ−
実験：  ＭＲＭ（多重反応監視）
化合物１ＡのＭＲＭ遷移：  ｍ／ｚ４８６．０＞３９９．９（ｔＲ＝３．４７分）
反応生成物１ＢのＭＲＭ遷移：  ｍ／ｚ５３１．０＞４４４．８（ｔＲ＝３．９１分）
定量限界（ＬＯＱ）
ＭＲＭでの化合物１ＡのＬＯＱは、アセトニトリル５０％：水５０％中で１０ｎＭである。
ＭＲＭでの反応生成物１ＢのＬＯＱは、アセトニトリル５０％：水５０％中で１ｎＭである。
【００８５】
使用した条件下で、反応生成物の保持時間は減少しており、親化合物１Ａは約３．５分で溶出し、反応生成物は約４分で溶出することがはっきりと分かる。
【００８６】
１Ａを様々な濃度のＮａＮＯ２および／またはＮａＮＯ３でインキュベートしたとき、表１の結果が得られた。
【００８７】
【表１】
2009531359.tif 000006
【００８８】
これらのデータに基づき、いくつかの結論を出すことができる。第一に、適当な酸性条件下では、化合物１Ａを有意にニトロ化するには亜硝酸塩だけで十分であることが明確に示されている。陰性対照に示されるように（１〜４行）、亜硝酸塩および硝酸塩が不在のとき、ニトロ化の結果は認められない。第二に、リン酸緩衝液の存在により、亜硝酸塩による反応を実際に有意に阻害することができ、ｐＨ２の緩衝液よりもｐＨ２のＨＣＬ溶液中ではるかに大きな程度まで反応が起こる。第三に、ｐＨ２（ＨＣｌまたは緩衝液）での硝酸塩は、化合物１Ａを適度にニトロ化することができない。第四に、硝酸塩は、亜硝酸塩による反応を有意な程度まで阻害すると思われる。（１桁以上；太字の数字参照）。
【００８９】
このため、これらのデータは、経口投与時に、式Ｉの化合物（例えば、化合物１Ａ）等のヒドロキシル化ベンゼン含有化合物で認められるニトロ化反応が、硝酸塩よりも亜硝酸塩により介在されていることを確認している。また前記データは、ニトロ化反応にとっての酸性環境の重要性を明確に示している。本発明の腸溶性コート組成物は、酸性媒体が前記組成物に含有される薬理活性成分に到達するのを減少させるか、または防止する。したがって、このような製剤化の手法は、そうしなければ起こると思われるニトロ化反応を有意に減少できる。
【００９０】
亜硝酸塩の存在下で、選択した酸化防止性阻害剤を化合物１Ａに添加したとき、表２の結果が得られた。使用した酸化防止剤の量は、全般的に化合物１Ａの量の約１０〜２０倍とした。
【００９１】
【表２】
2009531359.tif 000007
【００９２】
表２のデータにより、いくつかの重要な結論を導くことができる。亜硝酸塩が酸性化されない限り、亜硝酸塩の濃度を８倍まで上昇させても、化合物１Ａはまったくニトロ化しないか、それがごくわずかであることは明らかである。さらに重要なことに、試験化合物がほぼ完全にニトロ反応生成物に変換されることが判明している、ｐＨおよび亜硝酸塩濃度条件下で、ＢＨＴ（非水溶性）またはアスコルビン酸塩（水溶性）の存在により、亜硝酸塩介在ニトロ化が本質的に完全に阻害されること（太字の数字参照）が分かる。
【００９３】
そのため、概して、本明細書に報告されたデータは、硝酸塩（ＮＯ３）ではなく亜硝酸塩（ＮＯ２）が、式Ｉの化合物（例えば化合物１Ａ）等のヒドロキシル化ベンゼン含有化合物で認められたｉｎ  ｖｉｖｏニトロ化の有力源であることを明確に示している。この亜硝酸塩介在ニトロ化は、フリーラジカル機構を介して進み、酸性媒体でのみ問題となる程度まで起こる。酸化防止剤をヒドロキシ化ベンゼン含有化合物を含む組成物に組み込むと、このニトロ化反応が有意な程度まで阻害される。さらに、またはあるいは、腸溶性コーティングにより組成物を保護することで、酸性化した亜硝酸塩とヒドロキシ化ベンゼン含有化合物との接触が防止されると思われる。したがってニトロ化に対して該化合物を安定化させるための有力な戦略がもたらされる。
【実施例３】
【００９４】
化合物１Ａの腸溶性コート製剤
【００９５】
３．１  粉砕前後の化合物１Ａの粒径測定
粉砕前の化合物１Ａは、錠剤の含量均一性に影響を与えると思われる、約１００μｍより大きい粒径を高比率で含有していたので、化合物１Ａを粉砕した。２×２ｇの化合物１Ａの粉砕には、Ｒｅｔｓｃｈ  ＭＭ２０００を使用した。直径１００μｍ、密度１．５ｇ／ｃｍ３の球形粒子の質量は約１μｇである。
【００９６】
粒径分布は、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＭａｓｔｅｒＳｉｚｅｒ２０００、すなわちレーザー回折技術で測定した。粉末試料は、Ｔｗｅｅｎ２０および水の中に分散させる。
【００９７】
粉砕前の化合物１Ａ：測定により、メジアン直径ｄ（０．５）が１０１μｍおよび１０３μｍであることが明らかとなった。９０％の四分位数ｄ（０．９）は１５８μｍおよび１５９μｍであった。
【００９８】
粉砕後の化合物１Ａ：粉砕後、ｄ（０．５）は２０μｍ、ｄ（０．９）は８５μｍであった。これは、許容できる粒径分布であった。
【００９９】
３．２  錠剤の処方
製造した医薬品は、白色、円形（直径７ｍｍ）、凸状であり、錠剤当たりの化合物１Ａ（以降、「１Ａ」）が２つの強度、５０μｇおよび３００μｇの腸溶性フィルムコーティング錠剤であった。医薬品の完全な組成を以下の表３．１示す。
【０１００】
【表３．１】
2009531359.tif 000008
【０１０１】
核錠の目標重量は１４０ｍｇで、フィルムの目標重量は１２ｍｇであった。
【０１０２】
バッチ処方
５０μｇ／錠剤および３００μｇ／錠剤のバッチ処方（表３．２参照）は、錠剤製造中では核錠６０００個（８４０ｇ）およびコーティング中では核錠５７００個（７９８ｇ）を示している。
【０１０３】
【表３．２】
2009531359.tif 000009
【０１０４】
３．３  製造
１Ａ腸溶性コート錠剤の製造プロセスのフロー図が図２に示されている。５０μｇおよび３００μｇの１Ａを含有する核錠を製造した。核錠は、「基剤粒状体」（１Ａ含有）、マンニトール、ヒプロメロースおよびステアリン酸マグネシウムの混合物である。「基剤粒状体」は、粉砕した１Ａをヒプロメロース水溶液中に懸濁し、分散液をＭＣＣにスプレーすることにより製造する。１Ａの過多量６％は、損失により使用される。水を蒸発させた後、乾燥生成物をふるいにかける。粉末混合物は、適当な破砕強度と崩壊時間を有する円形で凸状の錠剤に圧縮する。錠剤は重量１４０ｍｇ、直径７ｍｍである。
【０１０５】
核錠は、耐胃液性を得るためにコーティングする。ポリマーは、メタクリル酸−アクリル酸エチルの水性コポリマー分散液（Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０  Ｄ−５５）とする。タルクは、流動促進剤としてポリマー分散液に添加され、クエン酸トリエチルは、可塑剤として機能する。
【０１０６】
各賦形剤の機能は、以下の表に記載されている。
【０１０７】
【表３．３】
2009531359.tif 000010
【０１０８】
３．４  腸溶性コート組成物の分析
腸溶性コート錠剤の含量および不純物等を評価するのに適当な方式は、以下の通りである。化合物１Ａは、試料溶媒中で撹拌することによって錠剤から抽出する。不溶性粒子を除去するために遠心分離した後、上清中の１Ａ、個別関連物質および全関連物質の量は、表３．４に記載の装置条件を用いて決定することができる。１Ａおよびその関連物質の量は、逆相クロマトグラフィーおよびＵＶ検出によって決定する。
【０１０９】
【表３．４】
2009531359.tif 000011
【０１１０】
溶解試験は以下のように実行することができる。溶解試験は、２つのステップに分かれる。第１のステップは、腸溶性コーティングの抵抗性を試験し、第２のステップは、溶解速度を試験する。コーティングの抵抗性は、０．１Ｍ塩酸中で３時間試験する。溶解速度は、ｐＨ６．８の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中で１時間試験する。採取した試料を遠心分離して、分析前に不溶性粒子を除去する。
【０１１１】
組成物から放出した１Ａの量は、表３．５にしたがって、逆相クロマトグラフィーおよびＵＶ検出により決定できる。
【０１１２】
【表３．５】
2009531359.tif 000012
【０１１３】
０．１Ｍ  ＨＣｌでの溶解試験後、化合物１Ａの放出を検出できないことが判明した。しかし、溶解試験をｐＨ６．８の媒体中で繰り返したとき、試験した各錠剤については、実質的に完全に、錠剤が溶解され、化合物１Ａが放出された。
【０１１４】
したがって、このような腸溶性コート組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用したとき、経口投与後に、胃において活性成分が酸性亜硝酸塩含有媒体に曝されるのを阻止し、それにより潜在的に遺伝毒性をもつ、このような活性成分の反応生成物の生成を防ぐか、有意に減少させるであろう。
【実施例４】
【０１１５】
式Ｉの追加化合物のニトロ化
【０１１６】
以下の式Ｉの追加化合物について試験を行い、ニトロ化の傾向を決定した。
【化４】
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【０１１７】
あらゆる例において、上記実施例２．４のように、様々な濃度の硝酸塩および亜硝酸塩の溶液に暴露することでニトロ化することが判明した。
【実施例５】
【０１１８】
臨床試験
【０１１９】
化合物ＩＡの臨床的に関連する投与量は、単回用量で溶液の形でヒト対象に投与した。有意な数の対象においてニトロ化反応生成物が検出された。化合物を腸溶性コート錠剤の形で投与したとき、ニトロ化生成物の劇的な減少が認められた。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】様々な濃度の５’−ニトロ反応生成物の存在下において化合物１Ａの一連の標準ＨＰＬＣトレースを示す図である。
【図２】化合物１Ａを含有する腸溶性コート錠剤の製造プロセスを例示した図である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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