(57)【要約】  本発明は、再発性または不応性、低悪性度または濾胞性、ＣＤ２０陽性、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）患者を治療するための、ＣＤ２０に結合する可溶性形態の抗体生成に使用される組み換え方法に関する。前記治療は、免疫学的活性抗ＣＤ２０抗体、または放射標識抗ＣＤ２０抗体、および／または標識および非標識双方の抗体がＮＨＬ治療のために使用される協調的戦略の使用を含む。本手順は、抗ＣＤ２０をコードする核酸配列の新規合成、構築した核酸配列のコンピテント細菌中への形質転換、および所望のタンパク質を発現するための前記核酸配列の哺乳類発現ベクター中へのサブクローニングについて述べる。目的の遺伝子に関連した制御要素を含むＤＮＡ構築物が開示される。前記目的の核酸配列はコドン最適化されて、適切な哺乳類宿主細胞中での発現を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖を新規合成する工程と、
前記抗ＣＤ２０抗体の全長κ軽鎖を構築する工程と、
前記抗ＣＤ２０抗体の全長ＩｇＧ１重鎖を構築する工程と、
前記抗ＣＤ２０分子の前記軽鎖および重鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターを構築する工程と、
生物学的に活性な抗体分子の生成のために、前記抗ＣＤ２０抗体鎖を哺乳類発現ベクター中にサブクローニングする工程と、
を含む、生体内で生物学的に活性な前記抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を調製する方法。
【請求項２】
前記抗ＣＤ２０抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号１で記載される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗ＣＤ２０抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号２で記載される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗ＣＤ２０重鎖をコードする前記核酸断片を含む前記ベクターが部位特異的変異誘発を受ける、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記全長抗ＣＤ２０重鎖および軽鎖が哺乳類ベクター中にサブクローニングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
宿主細胞を図のベクター構築物で形質転換して、前記宿主細胞またはその生育培地から前記生成物を単離する工程を含む、生体内で生物学的に活性な抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を調製する方法。
【請求項７】
前記抗体が培養中で生育させた哺乳類細胞から精製された治療的に有効量の抗ＣＤ２０抗体、および薬学的に許容可能な希釈剤、免疫賦活剤または担体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再発性または不応性、低悪性度または濾胞性、ＣＤ２０陽性、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）患者を治療するための、ＣＤ２０に結合する可溶性形態の抗体生成に使用される組み換え方法に関する。前記治療は、免疫学的に活性な抗ＣＤ２０抗体、または放射標識抗ＣＤ２０抗体、および／または標識および非標識双方の抗体がＮＨＬ治療のために使用される協調的戦略の使用を含む。本手順は、抗ＣＤ２０をコードする核酸配列の新規合成、構築した核酸配列のコンピテント細菌中への形質転換、および所望のタンパク質を発現するための前記核酸配列の哺乳類発現ベクター中へのサブクローニングについて述べる。目的の遺伝子に関連した制御要素を含むＤＮＡ構築物が開示される。前記目的の核酸配列はコドン最適化されて、適切な哺乳類宿主細胞中での発現が可能になる。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、その高いの特異性および親和性で、ほぼあらゆる分子を認識して標的とする強力なツールと見なされている。モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は生体外診断法として使用されているので、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ免疫細胞病理学、およびフローサイトメトリー用試薬の世界的標準化が可能になる。モノクローナル抗体はまた、腫瘍抗原の生体内での局在特定のために、および癌の免疫療法において広く使用される。
【０００３】
この問題は、２つの基本型の抗体の開発によって対処されている。キメラ抗体と称される第１の型では、マウスの定常領域のみがヒト起源の相当領域によって置換される（モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．、１９８４年、８１、６８５１〜６８５５頁；ブリアン（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８５年、３１４、２６８〜２７０頁；およびノイベルガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８５年、３１４、２６８〜２７０頁）。第２の型では、マウスの定常領域およびマウスのフレームワーク（ｆｌａｍｅｗｏｒｋ）部分が全てヒト起源の相当する領域および部分によって置換される。この第２の型の抗体は、ヒト化またはＣＤＲ−グラフト化抗体と称される（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８６年、３２１、５２２〜５２５頁；およびリーシュマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８８、３３２、３２３−３２７）。例えば治療を目的とする場合、ヒトＩｇＧ１およびラットＩｇＧ２ｂが現在好まれるアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）である。さらにヒトＩｇＧアイソタイプでは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３が、相補体および細胞性溶解のため、ひいては癌細胞を死滅させるために最も効果的であるように思われる。ヒト抗体はもちろん「ヒト化」の必要性を回避するが、ヒト抗体を分泌する細胞系は非常に不安定であり、一般に工業的な規模の生産に適さないことが立証されている。
【０００４】
本格的な臨床使用を目的とした十分な量の抗体を発生させるために、効率的な組み換え発現系を用いることが望ましい。骨髄腫細胞は、抗体の生成および分泌に特化した天然宿主に相当するので、これらに由来する細胞系が組み換え抗体発現のために使用されている。免疫グロブリン遺伝子制御因子に基づく複合体ベクター設計が必要とされることが多く、最終発現レベルに大きな開きあることが報告されている（ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８８年、３３２、３２３〜３２７頁；ウェイドレ（Ｗｅｉｄｌｅ）ら、Ｇｅｎｅ、１９８７年、６０、２０５〜２１６頁；ナカタニ（Ｎａｋａｔａｎｉ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ、１９８９年、７、８０５〜８１０頁；およびギリス（Ｇｉｌｌｉｅｓ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ、１９８９年、７、７９９〜８０４頁）。代案の哺乳類発現系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の使用により提供される。これらの細胞の使用は、研究および臨床用途のために、いくつかの治療用タンパク質の大量生成を可能にした（カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ、１９８５年、５、１７５０〜１７５９頁、およびツェトルマイスル（Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ、１９８７年、５、７２０〜７２５頁）。しかし抗体発現のためのこれらの細胞の使用例はごくわずかであり、これまでに報告されているマウス抗体の発現レベルはほぼ０．０１〜０．１μｇ／ｍｌ程度と低い（ウェイドレ（Ｗｅｉｄｌｅ）ら、Ｇｅｎｅ、１９８７年、５１、２１〜２９頁；およびフェイス（Ｆｅｙｓ）ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９８８年、２、２６〜２７頁）。
【０００５】
抗ＣＤ２０抗体は、プレＢおよび成熟Ｂリンパ球上に位置する分子量およそ３５ｋＤの疎水性膜貫通タンパク質である抗原ＣＤ２０（ヒトＢリンパ球限定分化抗原、Ｂｐ３５）に特異的に結合する。抗原はまた、９０％超のＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）上で発現するが、造血幹細胞、プロＢ細胞、正常な血漿細胞またはその他の正常な組織には見られない。ＣＤ２０は、細胞周期開始および分化のための活性化過程の初期段階を制御し、おそらくはカルシウムイオンチャネルとして機能する。ＣＤ２０は細胞表面から脱落せず、抗体結合に際して内部移行しない。遊離ＣＤ２０抗原は血液循環中には見られない。抗ＣＤ２０抗体は身体の自然免疫能を漸増（ｒｅｃｒｕｉｔ）して機能し、それがＣＤ２０抗原を通じて結合するＢ細胞を攻撃して死滅させる。宿主細胞死滅は、１）補体依存的細胞毒性（ＣＤＣ）経路、および２）抗体依存的細胞介在性細胞毒性（ＡＤＣＣ）経路の２つの機序で起きる。
【０００６】
抗ＣＤ２０抗体は、遺伝子改変されたキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体である。抗体はマウスの軽鎖および重鎖可変部配列およびヒト定常部配列を含有するＩｇＧ１κ免疫グロブリンである。抗ＣＤ２０抗体は、アミノ酸４５１個の２本の重鎖およびアミノ酸２１３個の２本の軽鎖（ｃＤＮＡ分析に基づく）から構成され、およその分子量１４５ｋＤを有する。抗ＣＤ２０抗体は、ＣＤ２０抗原に対しておよそ８．０ｎＭの結合親和性を有する。キメラ抗ＣＤ２０抗体は、抗生物質ゲンタマイシンを含有する栄養培地中の哺乳類細胞（チャイニーズハムスター卵巣）懸濁培養によって生成される。抗ＣＤ２０抗体は親和性およびイオン交換クロマトグラフィーによって精製される。
【０００７】
本発明は、ＣＤ２０に結合できる抗体の構築、クローニング、発現、精製、および生成に関する。本抗体は、再発性または不応性、低悪性度または濾胞性、ＣＤ２０陽性のＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）患者の治療に適応される治療法を目的とする。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、抗ＣＤ２０ポリペプチドをコードする核酸配列の形質転換に向けたものである。
【０００９】
本発明の態様に従って、抗ＣＤ２０分子の重鎖および軽鎖をコードする核酸配列が提供される。本発明のさらに別の態様に従って、核酸配列にコードされる対応するアミノ酸配列が提供される。
【００１０】
本発明の特定の態様は、抗ＣＤ２０分子の重鎖および軽鎖の可変部の新規合成に関する。目的の核酸配列によるベクター構築物の構築、ベクター構築物のコンピテント細菌中への形質転換、および抗ＣＤ２０鎖の哺乳類発現ベクター中へのサブクローニングもさらに開示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
抗ＣＤ２０抗体は、マウス−ヒトキメラ抗体である。これは、１）マウスモノクローナル抗体２Ｂ８軽鎖の可変領域およびヒトκ定常領域からできた軽鎖、および２）マウスモノクローナル抗体２Ｂ８重鎖の可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域からできた重鎖の２本の鎖を含む。抗体配列は国際公開第９４／１１０２６号で詳述されている。
【００１２】
抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ２Ｂ８は公知の範囲で利用できないため、ｃＤＮＡ−構築物コード領域の合成に関しては新規アプローチに従った。新規の遺伝子合成はまた、タンパク質発現に使用される特定の哺乳類細胞系についてコドン最適化を可能にした。
【００１３】
抗ＣＤ２０抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１で記載される。
【００１４】
抗ＣＤ２０抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列のコドン最適化バージョンは、配列番号２で記載される。
【００１５】
抗ＣＤ２０抗体軽鎖をコードするＤＮＡ配列中のコドンは、ＣＨＯ  Ｋ１およびＨＥＫ  ２９３などの哺乳類細胞系における最適な組み換えタンパク質発現を確実にするために、コドン最適化過程の一部として改変された。抗ＣＤ２０抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３で記載される。
【００１６】
抗ＣＤ２０抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列のコドン最適化バージョンは、配列番号４で記載される。
【００１７】
抗ＣＤ２０抗体重鎖をコードするＤＮＡ配列中のコドンは、ＣＨＯ  Ｋ１およびＨＥＫ  ２９３などの哺乳類細胞系における最適な組み換えタンパク質発現を確実にするために、コドン最適化過程の一部として改変された。
【実施例】
【００１８】
発現ベクターの選択：
抗ＣＤ２０抗体発現の哺乳類発現ベクターの設計は、市販されるベクターの１つに基づくことができ（例えばインビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のｐｃＤＮＡまたはＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のｐＩＲＥＳ）、次の特徴を含むように改変される。
（ａ）同一ベクターの別々の発現カセット中で抗ＣＤ２０抗体の軽重双方の抗体鎖をコードするｃＤＮＡの挿入のための複数クローニング部位。
（ｂ）発現ベクターの設計はまた、蛍光支援細胞選別を使用した、高度に発現する形質移入体の迅速なスクリーニングを可能にする、非依存性（バイシストロニック）ＩＲＥＳを介在して共発現した緑色蛍光タンパク質にも対応できる。
（ｃ）異なる選択マーカーを有する２つの別々の哺乳類発現系におけるキメラ軽重抗体鎖のクローニング。
【００１９】
ＲＴＸ抗体鎖の哺乳類発現ベクター中のサブクローニング
新規合成された抗ＣＤ２０抗体重鎖（ＲＴＸ−ＨＣ）および抗ＣＤ２０抗体軽鎖（ＲＴＸ−ＬＣ）は、ｐＢＳＫＩＩベクター中にクローニングされたｃＤＮＡ断片、およびそれぞれｐＢＳＫＩＩ−ＲＴＸ−ＬＣおよびｐＢＳＫＩＩ−ＲＴＸ−ＨＣと呼ぶ構築物として得られた。ＤＮＡはＤＨ１０ｂ大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞に形質転換され、アンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上に播種された。プレートからのコロニーを液体培地に接種して、ＤＮＡミニプレップを実施した。２本の抗体鎖の配列を配列決定により確認した。
【００２０】
全長抗ＣＤ２０抗体軽鎖および重鎖を哺乳類発現ベクターｐＣＡＩＮおよびｐＣＡＩＤ中にそれぞれサブクローニングした。ｐＢＳＫＩＩ／ＲＴＸ−ＬＣクローンおよびｐＣＡＩＮベクターをＢｇＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。得られた構築物をｐＣＡＩＮ／ＲＴＸ−ＬＣと呼ぶ。前者からの挿入断片（７００ｂｐ）および後者からのベクター骨格をゲル精製して、ライゲーションした（図５）。ライゲーション混合物を熱ショックコンピテントＤＨ１０ｂ細胞に形質転換して、選択抗生物質としてアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上に播種した。数個の形質転換体を選択してＤＮＡミニプレップを実施した。クローンは制限酵素消化によってチェックした（図６）。
【００２１】
ｐＢＳＫＩＩ／ＲＴＸ−ＨＣクローンおよびｐＣＡＩＤベクターをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、得られた構築物をｐＣＡＩＤ／ＲＴＸ−ＨＣと呼ぶ。前者からの挿入断片（１４２９ｂｐ）および後者からのベクター骨格をゲル精製してライゲーションした（図７）。ライゲーション混合物を熱ショックコンピテントＤＨ１０ｂ細胞に形質転換して、選択抗生物質としてアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上に播種した。数個の形質転換体を選択し、ＤＮＡミニプレップを実施した。クローンは制限酵素消化によってチェックした（図８）。
【００２２】
ＤＮＡ配列決定および分析：
ｐＣＡＩＤおよびｐＣＡＩＮ哺乳類発現ベクター中にそれぞれクローニングしたＲＴＸ−ＨＣおよびＲＴＸ−ＬＣの最終クローンを配列決定して、それらの配列精度を確認した。
【００２３】
抗ＣＤ２０抗体鎖をコードする遺伝子の維持および増殖：
キメラの抗ＣＤ２０抗体軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡ構築物をＴｏｐ１０（インビトロジェン）などの標準細菌細胞系中で維持して増殖させる。
【００２４】
ＣＨＯ−Ｋ１中の一過性／安定組み換えタンパク質発現：
（ａ）構築物の一過性／安定発現は、ＦＤＡが産業上の利用のために認可する哺乳類細胞系であるチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を使用して行われる。一過性発現は、構築物発現をチェックして、少量の組み換えタンパク質を迅速に得るのに有用である。
（ｂ）引き続いて、所望のモノクローナル抗体の安定かつ高い発現を示すＣＨＯ細胞を標準の手順を使用して開発する。
【００２５】
抗ＣＤ２０抗体の精製：
成熟キメラ抗体である抗ＣＤ２０抗体は、２本の抗体重鎖（アミノ酸４５１個ｘ２）および２本の抗体軽鎖（アミノ酸２１３個ｘ２）を含み、およそ１４５ｋＤａの分子量を有する。どちらの鎖もホルモン分泌に先だって切断される２０個のアミノ酸のリーダー配列をＮ末端に有する。
【００２６】
上述の推奨される機能性／結合分析に従った、再現可能な生物活性の確立に引き続いて、精製手順を最適化する努力がなされる。精製戦略は、主要目的として、プロセス経済、製品を市場に出すまでの時間の短縮、拡張性、再現性、および機能安定性と構造完全性がある生成物の最大純度を目指す。この趣旨で、濾過（通常および接線流濾過）およびクロマトグラフィーの双方によるコンビナトリアルアプローチが探索される。工程検証要件および合格基準の研究は３つのバッチで行われる。
【００２７】
したがって本発明は、精製工程において以下の工程を想定する。
ａ．ＣＯＨＣ／Ａ１ＨＣ／０．４５μデプス型フィルターを使用した初期浄化。
ｂ．接線流濾過に基づくペリコン  ＸＬ  バイオマックス（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  Ｂｉｏｍａｘ）  ５０ｋＤａカットオフフィルターを使用した濃縮。
ｃ．クロモステップ（ｃｈｒｏｍｏｓｔｅｐ）−Ｉ：血清ベース（２％ウシ胎仔血清［ＦＣＳ］）の培養上清のためのプロセップ  ＶＡ  ウルトラ（Ｐｒｏｓｅｐ  ＶＡ  Ｕｌｔｒａ）／および血清フリー培養上清のためのＰｒｏｓｅｐ  ＶＡを使用した親和クロマトグラフィー。
ｄ．クロモステップ−ＩＩ：ＳＰセファロースなどの強カチオン交換体。
ｅ．クロモステップ−ＩＩＩ：宿主細胞タンパク質および核酸除去のためのセルファインＱ（Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｑ）（セルロースベースの培地）などの通過ベースの強陰イオン交換体。
ｆ．サイズ排除濾過を使用したウイルス除去およびセルファインサルフェート（Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  ｓｕｌｆａｔｅ）を使用したプロテインＡ溶脱。
ｇ．無菌濾過。
ｈ．レムトックス（Ｒｅｍｔｏｘ）／セルファイン（Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ）ＥＴクロマトグラフィーのどちらかを使用した内毒素除去。
ｈ．定式化（Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）。
【００２８】
生化学的、免疫学的、および物理化学的方法を使用した標的タンパク質の同定の確立
各段階における全タンパク質の％回収率は、ビシンコニン酸法（ＢＣＡ）／ブラッドフォード染料結合法を使用して定量化される。各精製段階における標的タンパク質濃度は、直接または間接的サンドイッチＥＬＩＳＡなどの高度に特異的で信頼性のある酵素ベースの免疫測定法を使用して調べられる。定性的および標的特異的ウエスタン分析が、各段階に続く。逆相クロマトグラフィー、等電点電気泳動、および二次元ゲル電気泳動法を用いて、精製された生成物を評価する。遠紫外線円偏光二色性を使用して、二次構造分析を評価する。サイズ排除およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用して、分子量およびオリゴマー状態を調査する。調査はまた、ｐＨおよび温度に関するタンパク質の安定性にも着目する。ＮＥＳＰは過グリコシル化タンパク質であるので、精製タンパク質のグリコシル化パターンはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析を使用して記録される。
【００２９】
７．抗ＣＤ２０抗体の生体外および生体内活性の分析：
抗ＣＤ２０抗体の生体外ＣＤ２０結合、および抗体のエフェクター機能を検出するための生物検定は、以下を使用して行われる。
ａ）フルオレセイン標識Ｃ１ｑを使用したフローサイトメトリー分析中のヒトＣ１ｑ結合およびＣＤ−２０陽性ＳＢ細胞。
ｂ）ＣＤ２０陽性ＳＢ細胞の補体依存性細胞溶解。
ｃ）ＣＤ２０陽性細胞およびＣＤ２０陰性細胞を使用した抗体依存性細胞傷害エフェクター分析。
【００３０】
以下について、非ヒト霊長類（カニクイザル）において抗ＣＤ２０抗体の前臨床生体内生活性を試験する。
ａ）末梢血液リンパ節および骨髄からのＢ細胞枯渇の有効性。
ｂ）キメラ抗体に関連したあらゆる毒性の評価。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
2009508467.tif 000002
【図２】
2009508467.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
2009508467000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年1月30日(2008.1.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
宿主細胞を図７および８のベクター構築物で形質転換して、前記宿主細胞またはその生育培地から前記生成物を単離する工程を含む、生体内で生物学的に活性な抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を調製する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
全長抗ＣＤ２０抗体軽鎖および重鎖を哺乳類発現ベクターｐＣＡＩＮおよびｐＣＡＩＤ中にそれぞれサブクローニングした。ｐＢＳＫＩＩ／ＲＴＸ−ＬＣクローンおよびｐＣＡＩＮベクターをＢｇＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。得られた構築物をｐＣＡＩＮ／ＲＴＸ−ＬＣと呼ぶ。前者からの挿入断片（７００ｂｐ）および後者からのベクター骨格をゲル精製して、ライゲーションした（図１）。ライゲーション混合物を熱ショックコンピテントＤＨ１０ｂ細胞に形質転換して、選択抗生物質としてアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上に播種した。数個の形質転換体を選択してＤＮＡミニプレップを実施した。クローンは制限酵素消化によってチェックした（図２）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
ｐＢＳＫＩＩ／ＲＴＸ−ＨＣクローンおよびｐＣＡＩＤベクターをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、得られた構築物をｐＣＡＩＤ／ＲＴＸ−ＨＣと呼ぶ。前者からの挿入断片（１４２９ｂｐ）および後者からのベクター骨格をゲル精製してライゲーションした（図３）。ライゲーション混合物を熱ショックコンピテントＤＨ１０ｂ細胞に形質転換して、選択抗生物質としてアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上に播種した。数個の形質転換体を選択し、ＤＮＡミニプレップを実施した。クローンは制限酵素消化によってチェックした（図４）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
【図１】ライゲーション反応のために制限消化およびゲル精製されたＲＴＸ−ＬＣおよびｐＣＡＩＮを示す図である。
【図２】挿入断片含有形質転換体の同定のための、ｐＣＡＩＮ／ＲＴＸ−ＬＣクローンのＢｇＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによる制限消化を示す図である。
【図３】ライゲーション反応のために制限消化およびゲル精製されたＲＴＸ−ＨＣおよびｐＣＡＩＤを示す図である。
【図４】挿入断片含有形質転換体の同定のための、ｐＣＡＩＤ／ＲＴＸ−ＨＣクローンのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩによる制限消化を示す図である。
【図５】ｐＣＡＩＮ／ＲＴＸ−ＬｃのＤＮＡ配列を示す図である。
【図６】ｐＣＡＩＤ／ＲＴＸ−ＨｃのＤＮＡ配列を示す図である。
【図７】ｐＣＡＩＤ／ＲＴＸ−Ｈｃのベクター構築図である。
【図８】ｐＣＡＩＮ／ＲＴＸ−Ｌｃのベクター構築図である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2009508467.tif 000010
【国際調査報告】
2009508467.tif 000011
2009508467.tif 000012
2009508467.tif 000013
2009508467.tif 000014