(57)【要約】  転写調節に関与する領域におけるDNAのメチル化は、ICBP90の結合と、それに続いて、遺伝子転写を変える多タンパク質複合体の形成を誘導することができる。癌抑制遺伝子における、又は腫瘍形成の緩和に関与する他の遺伝子におけるDNAメチル化は、ICBP90の該遺伝子への結合を誘導することができる。結合したICBP90は、pRb2/p130調節複合体と相互作用して、クロマチンをリモデリングし、かつその遺伝子の転写を抑制することができる。したがって、DNAメチルトランスフェラーゼ、ICBP90及びpRb2/p130複合体を構成するタンパク質は、癌治療用の治療標的である。これらのタンパク質の異常は、癌又は前癌状態のマーカーにもなり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞を検出する方法であって、
（１）被験体から被検細胞を含む生物学的サンプルを採取するステップ、
（２）被検細胞から核酸を回収するステップ、及び
（３）(i)RB2/p130遺伝子のエクソン１における変異について核酸を解析するステップ、ここでRB2/p130遺伝子の１７８番若しくは２５９番ヌクレオチドにおけるホモ接合変異の存在が、被検細胞が腫瘍細胞であることを示し、又は
(ii)被検細胞から回収された核酸がDNAを含む場合、RB2/p130遺伝子のメチル化状態を解析するステップ、ここでRB2/p130遺伝子の少なくとも約＋２８７番から約＋４１１番ヌクレオチドの領域のメチル化が、被検細胞が腫瘍細胞であることを示す、
を含む、前記方法。
【請求項２】
被検細胞から回収された核酸がDNAを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被検細胞から回収された核酸がRNAを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
被検細胞から回収された核酸がDNAであり、かつRB2/p130遺伝子のメチル化状態について解析され、ここで約−９５番から約＋１７７番のヌクレオチド領域及び約＋１６７番から約＋３０２番ヌクレオチドの領域もメチル化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
腫瘍細胞が肉腫、癌腫、腺癌、神経起源の癌又は血液新生物から生じた腫瘍由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
腫瘍細胞が胸部、オス及びメスの泌尿生殖器系の組織、肺、胃腸系の組織、外分泌腺、口及び食道の組織、脳及び脊髄、腎臓、すい臓、肝胆道系、リンパ系、平滑筋及び横紋筋、骨及び骨髄、皮膚、並びに目の組織に起源を持つ癌由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
腫瘍細胞は網膜芽細胞腫、肺癌、Tリンパ芽球様白血病、Bリンパ芽球様白血病、慢性骨髄性白血病、乳癌、大腸癌、卵巣癌又は子宮内膜癌由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
癌を診断する方法であって、
（１）被験体から被検細胞を含む生物学的サンプルを採取するステップ、
（２）被検細胞から核酸を回収するステップ、及び
（３）(i)RB2/p130遺伝子のエクソン１における変異について核酸を解析するステップ、ここでRB2/p130遺伝子の１７８番若しくは２５９番ヌクレオチドにおけるホモ接合変異の存在は被験体が癌に罹患していることを示し、又は
(ii)被検細胞から回収された核酸がDNAを含む場合、RB2/p130遺伝子のメチル化状態を解析するステップ、ここでRB2/p130遺伝子の少なくとも約＋２８７番から約＋４１１番ヌクレオチドの領域のメチル化は、被験体が癌に罹患していることを示す、
を含む、前記方法。
【請求項９】
被検細胞から回収された核酸がDNAを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
被検細胞から回収された核酸がRNAを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
被検細胞から回収された核酸がDNAであり、かつRB2/p130遺伝子のメチル化状態について解析され、ここで約−９５番から約＋１７７番のヌクレオチド領域、及び約＋１６７番から約＋３０２番ヌクレオチドの領域もメチル化されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍細胞が肉腫、癌腫、腺癌、神経起源の癌又は血液新生物から生じた腫瘍由来である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍細胞が胸部；オス及びメスの泌尿生殖器系の組織、肺、胃腸系の組織、外分泌腺、口及び食道の組織、脳及び脊髄、腎臓、すい臓、肝胆道系、リンパ系、平滑筋及び横紋筋、骨及び骨髄、皮膚、並びに目の組織に起源を持つ癌由来である、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
癌は網膜芽細胞腫、肺癌、Tリンパ芽球様白血病、Bリンパ芽球様白血病、慢性骨髄性白血病、乳癌、大腸癌、卵巣癌、又は子宮内膜癌からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
腫瘍形成する傾向のある細胞を検出する方法であって、
（１）被験体から被検細胞を含む生物学的サンプルを採取するステップ、ここで、被検細胞は組織学的若しくは形態学的には正常なように見えることを特徴とし、
（２）被検細胞から核酸を回収するステップ、及び
（３）(i)RB2/p130遺伝子のエクソン１における変異について核酸を解析するステップ、ここでRB2/p130遺伝子の１７８番若しくは２５９番ヌクレオチドにおけるホモ接合変異の存在は、被検細胞が腫瘍形成する傾向があることを示し、又は
(ii)被検細胞から回収された核酸がDNAを含む場合、RB2/p130遺伝子のメチル化状態を解析するステップ、ここでRB2/p130遺伝子の少なくとも約＋２８７番から約＋４１１番ヌクレオチドの領域のメチル化は、被検細胞が腫瘍形成する傾向があることを示す、
を含む、前記方法。
【請求項１６】
被検細胞から回収された核酸がDNAを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
被検細胞から回収された核酸がRNAを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
被検細胞から回収された核酸がDNAであり、かつRB2/p130遺伝子のメチル化状態について解析され、ここで約−９５番から約＋１７７番のヌクレオチド領域、及び約＋１６７番から約＋３０２番ヌクレオチドの領域もメチル化されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
生物学的サンプルは外胚葉、中胚葉又は内胚葉起源の組織から採取される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
生物学的サンプルは網膜、肺、卵巣、子宮内膜、胸部又は大腸組織から採取される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
癌を治療する又は腫瘍形成を抑制する方法であって、
（１）癌に罹患している、若しくは癌を発症するリスクのある被験体を提供するステップ、ここで被験体の細胞がRB2/p130遺伝子の１７８番若しくは２５９番ヌクレオチドにおけるホモ接合変異を有し、又はRB2/p130遺伝子の少なくとも約＋２８７番から約＋４１１番ヌクレオチドの領域のメチル化を有しており、及び
（２）脱メチル化剤の有効量を被験体に投与するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項２２】
RB2/p130遺伝子の１７８番若しくは２５９番ヌクレオチドにおけるホモ接合変異を有する、又はRB2/p130遺伝子の少なくとも約＋２８７番から約＋４１１番ヌクレオチドの領域のメチル化を有する細胞の無制御増殖を抑制する方法であって、細胞中のRB2/p130遺伝子のメチル化状態が変化するように、前記細胞を有効量の脱メチル化剤と接触させるステップを含む、前記方法。
【請求項２３】
配列番号３、５及び７からなる群より選択される核酸配列を含む、変異体pRb2/p130タンパク質をコードする単離された核酸配列。
【請求項２４】
配列番号４、６及び８からなる群より選択される変異体pRb2/p130タンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項２５】
配列番号４、６及び８からなる群より選択される単離された変異体pRb2/p130タンパク質。
【請求項２６】
請求項２５に記載の単離された変異体pRb2/p130タンパク質に結合するが、配列番号２の野生型pRb2/p130タンパク質には結合しない抗体。
【請求項２７】
腫瘍細胞を検出する方法であって、
（１）被験体から被検細胞を含む生物学的サンプルを採取するステップ、
（２）被検細胞からタンパク質を回収するステップ、並びに
（３）pRb2/p130における変異についてタンパク質を解析するステップ、ここでpRb2/p130の３７番コドンにおけるセリンからプロリンへの置換、及び／又は６４番コドンにおけるプロリンからアラニンへの置換の存在は、被検細胞が腫瘍細胞であることを示す、
を含む、前記方法。
【請求項２８】
腫瘍形成する傾向のある細胞を検出する方法であって、
（１）被験体から被検細胞を含む生物学的サンプルを採取するステップ、ここで、被検細胞は組織学的若しくは形態学的には正常なように見えることを特徴とし、
（２）被検細胞からタンパク質を回収するステップ、並びに
（３）pRb2/p130における変異についてタンパク質を解析するステップ、ここでpRb2/p130の３７番コドンにおけるセリンからプロリンへの置換、及び／又は６４番コドンにおけるプロリンからアラニンへの置換の存在は、被検細胞が腫瘍形成する傾向があることを示す、
を含む、前記方法。
【請求項２９】
被験体における散発性網膜芽細胞腫腫瘍細胞を検出する、又は散発性網膜芽細胞腫を診断する方法であって、
（１）被験体から被検細胞を含む生物学的サンプルを採取するステップ、
（２）被検細胞から核酸を回収するステップ、及び
（３）RB2/p130遺伝子のエクソン１２における変異について被検細胞から回収された核酸を解析するステップ、ここでRB2/p130遺伝子の１６５０番ヌクレオチドにおけるホモ接合変異の存在は、被検細胞が腫瘍細胞であること、又は被験体が散発性網膜芽細胞腫を有することを示す、
を含む、前記方法。
【請求項３０】
配列番号９を含む単離された核酸。
【請求項３１】
癌を治療する又は腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、pRb2/p130複合体の形成が減少するように、ICBP90の、癌抑制遺伝子又は腫瘍形成を緩和することに関連する他の遺伝子の転写制御に関与するDNA領域への結合を抑制することを含む、前記方法。
【請求項３２】
癌抑制遺伝子又は腫瘍形成を緩和することに関連する他の遺伝子における多タンパク質転写抑制複合体の形成を抑制することを含む、癌を治療する又は腫瘍細胞の増殖を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の診断及び治療の方法、並びに癌細胞の増殖を抑制する方法に関する。特に、本発明の方法は、ICBP90タンパク質、又はpRb2/p130複合体中の若しくはpRb2/p130複合体に関連するタンパク質を阻害すること、RB2/p130遺伝子中の変異を検出すること、あるいはRB2/p130及び他の遺伝子のメチル化状態を決定することに関する。
【背景技術】
【０００２】
網膜芽細胞腫は、小児で最も一般的な眼内悪性腫瘍である。ヒト網膜芽細胞腫は、２つの型で発生する。すなわち、通常は片眼性である非遺伝型と、常染色体優性発現で、しばしば両眼性の遺伝型である。両型ともRb1/p105遺伝子の両アレル変異と、その結果として生じる癌抑制機能の欠失が原因とされている。pRb1/p105の基本的な機能は、細胞を細胞周期のG1又はG0期に留め、また転写因子のE2Fファミリーと相互作用し、それを負に調製することによってS期への進行を抑制することである。さらに、pRb1/p105は、p53前アポトーシス経路との相互作用によるアポトーシス反応にも関与する。pRb1/p105遺伝子の変異が全ての網膜芽細胞腫に共通しているという事実にもかかわらず、多くの証拠が、発生中の網膜細胞からのpRb1/p105の欠失だけでは悪性腫瘍の発生には不十分であることを示している(DiCiommo et al., 2000, Semin. Cancer Biol., 10, 255-269)。
【０００３】
pRb1/p105の機能は、2つの相同タンパク質、pRb2/p130及びp107によって共有されている。それ故、これら3つは、網膜芽細胞腫ファミリータンパク質（pRBs）と呼ばれている。特に、RB2/p130遺伝子は、変異したものや機能的に不活性となったものが多くの腫瘍で見つかっている。また、p53と独立したアポトーシス反応の制御におけるRB2/p130遺伝子の役割が最近明らかにされた(La SaIa et al., 2003, Oncogene, 22, 3518-3529.)。pRb2/p130の発現は、いくつかの散発的に発生する網膜芽細胞腫内で低下し、また発現の欠如は、低いアポトーシス指数と相関する。しかしながら、RB2/p130遺伝子の遺伝的な変化が報告されているものの、pRb2/p130発現の欠如とこの遺伝子の変異状態とを結びつけるデータは十分ではない。例えば、研究で非小細胞肺癌及び小細胞肺癌においてRb2/p130の変異がそれぞれ報告されたが、これらの変異はタンパク質の欠失を部分的に証明しているに過ぎない(Helin et al., 1997, P.N.A.S USA 94: 6933-6938; Claudio et al., 2000, Cancer Res 60: 372-382)。
【０００４】
癌における遺伝的変化の重要性は、長年にわたって認知されてきたが、腫瘍の形成や進行に影響する後成的変化の役割は、ごく最近になって示唆されてきた。後成的イベントはDNAのメチル化、並びにヒストンアセチル化、メチル化及びリン酸化を介した染色体のリモデリングに介在される。後者は、遺伝子サイレンシングをもたらす転写抑制性クロマチン状態の形成につながる。蓄積された証拠から、調節遺伝子のプロモーター領域におけるCpGアイランドの高メチル化が、癌発生の初期イベントであり、腫瘍過程に先行するかもしれないことが示された。
【０００５】
別の研究で、異常なメチル化は肺癌の癌関連遺伝子を不活性化し得るが、肺癌発生におけるRB2/p130癌抑制遺伝子の役割はまだ十分には明らかにされていないことが示された。いくつかの報告から、約30％の肺腫瘍がpRb2/p130タンパク質発現の欠如若しくは減少を示すことが実証された。しかし、癌においてこの遺伝子の異常な発現の原因となる遺伝的及び後成的イベントに関しては矛盾するデータがある(Claudio et al, supra; Modi et al., 2000, Oncogene 19: 4632-4639; Xue et al., 2003, MoI. Carcinog. 38: 124-129)。
【０００６】
pRb2/p130タンパク質は、他のタンパク質と相互作用して、いくつかの遺伝子の転写に影響を及ぼすことのできる多タンパク質複合体を形成できる。このような多タンパク質複合体へのpRb2/p130及び他のタンパク質の動員は、特定の転写環境と（例えば、DNAのメチル化状態で明らかにされたように）直接的に相関しているかもしれない。
【０００７】
「90kDaの逆方向CCAATボックス結合タンパク質（Inverted CCAAT box Binding Protein of 90kDa）」又は「ICBP90」は、最近同定された核タンパク質であり、トポイソメラーゼIIα（TopoIIα）遺伝子プロモーターの逆方向CCAATボックスの１つに結合する。ICBP90は細胞核内に局在し、ユビキチン様（UbL）ドメイン、ロイシンジッパー、PHDフィンガー型のジンクフィンガー、SRAドメイン、２つの核移行シグナル（NLSs）及びリングフィンガー型のジンクフィンガーを含んでいる。ICBP90 mRNAは、活発に増殖している組織中で大量に発現されている。同様に、ICBP90タンパク質は、培養線維芽細胞で活性増殖期に高発現しているが、細胞がコンフルエンスに達した後には発現していない。ICBP90は、Np95並びにヒト及びマウスNIRFを含むいくつかの他の核タンパク質と構造的な相同性を共有している。これは、転写調節に関与する核タンパク質の新ファミリーの出現を示唆している。
【０００８】
癌細胞株は、非癌性細胞株よりも高レベルのICBP90及びTopoIIαを発現する。例えば、初代培養ヒト肺線維芽細胞では、ICBP90の発現はG1後期にピークに達し、G2/M期の間維持される。一方、HeLa、Jurkat及びA549癌細胞株は、全細胞周期を通して一定のICBP90発現を示した。
【０００９】
２型プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（PAI-2）は、セルピンのオボアルブミン(ov-serpins)サブファミリーの一員で、元々はヒト胎盤及びマクロファージにおいて特徴付けられた。PAI-2は、腫瘍細胞を含む様々な細胞で、適当な刺激の後に合成される。細胞外PAI-2は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター(u-PA)の強力なインヒビターである。別の研究で、PAI-2が繊維素溶解の調節、角化細胞の発生調節、細胞増殖、癌細胞の浸潤及び転移、並びにアポトーシスに対する抵抗性の付与に関与することから、当該タンパク質は、多機能性タンパク質として作用することが示された。従来、細胞内標的及びPAI-2発現の調節機構は、ほとんど明らかにされていなかった。しかしながら、最近になって、HeLaやJurkat細胞で、PAI-2発現が網膜芽細胞腫タンパク質Rbの転写後回復をもたらし得ること、そしてPAI-2がRb分解を阻害し得ることが報告された。これらは、PAI-2の細胞内での興味深い役割を示唆している (Darnell et al., 2003, Mol. Cell. Biol. 23(18): 6520-6532)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
癌治療戦略は、過去数十年を通して徐々に発達してきたが、網膜芽細胞腫の主な治療法は未だに摘出や放射線療法であり、まともな視力は、限られたケースでしか取り戻せない。網膜芽細胞腫及び他の癌のための化学療法もまた、治療選択肢である。しかし、手術、放射線療法、及び従来の化学療法の高いコスト、並びに衰弱性副作用の発生により、前記治療は好ましくはない。
【００１１】
したがって、網膜芽細胞腫、肺癌、及び他の癌における腫瘍形成をとりまく遺伝的及び後成的イベントのより一層の理解が必要である。その後、より効果的及び経済的な診断並びに治療戦略を前記病気を治療するために立てることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
転写調節に関与する領域におけるDNAのメチル化は、ICBP90の結合、及びその後の遺伝子転写を変える多タンパク質複合体の形成を誘導できる。例えば、癌抑制遺伝子、又は腫瘍形成の緩和に関与する他の遺伝子におけるDNAのメチル化は、それらの遺伝子へのICBP90の結合を誘導できる。結合したICBP90は、pRb2/p130複合体と相互作用し、クロマチンをリモデリングし、その遺伝子の転写を抑制する。したがって、DNAメチルトランスフェラーゼであるICBP90と、pRb2/p130複合体を構成するタンパク質は、癌治療の治療標的となる。これらのタンパク質における異常は、癌状態又は前癌状態のマーカーにもなり得る。
【００１３】
例えば、両アレル変異が様々な癌細胞株及び異なる胚性起源から生じた原発癌で発見されている。これらのミスセンス変異は、RB2/p130遺伝子のエクソン１の領域に生じており、当該領域はCpGアイランドに富んでいる。RB2/p130遺伝子のエクソン１内部又はその周辺における領域のメチル化状態は、エクソン１変異を一方に又は両方に有する細胞で変わり、また、このような変化は、RB2/p130遺伝子発現の減少と関連している。RB2/p130遺伝子を脱メチル化する薬物は、細胞中のpRb2/p130レベルを回復させる。このように、RB2/p130遺伝子における遺伝的な及び後成的なイベントは、癌においてRB2/p130遺伝子発現を下方制御する。また、これらのイベントを抑制する、又は逆にする薬物を使用して癌治療を治療することができる。
【００１４】
したがって、本発明は、被験体から被検細胞を含む生物学的サンプルを採取するステップ及び被検細胞から核酸を回収するステップを含む、被験体における腫瘍細胞を検出する方法又は癌を診断する方法を提供する。被検細胞から回収された核酸は、RB2/p130遺伝子のエクソン１の変異について解析することができる。ここで、RB2/p130遺伝子の１７８番若しくは２５９番ヌクレオチドにおけるホモ接合変異の存在は、被検細胞が腫瘍細胞であること、又は被験者が癌に罹患していることを示す。あるいは、被検細胞から回収されたDNAは、RB2/p130遺伝子のメチル化状態を解析され得る。ここで、RB2/p130遺伝子の少なくとも約＋２８７番から約＋４１１番ヌクレオチドの領域のメチル化は、被検細胞が腫瘍細胞であること、又は被験者が癌に罹患していることを示す。
【００１５】
本発明はまた、被験体から被検細胞を含む生物学的サンプルを採取するステップを含む、腫瘍形成する傾向のある細胞を検出する方法を提供する。ここで被検細胞は、組織学的若しくは形態学的には正常なように見えることを特徴とする。核酸は、被検細胞から回収され、RB2/p130遺伝子のエクソン１における変異について解析することができる。RB2/p130遺伝子の１７８番及び／又は２５９番ヌクレオチドにおけるホモ接合変異の存在は、被検細胞が腫瘍形成する傾向があることを示す。あるいは、被検細胞から回収されたDNAは、RB2/p130遺伝子のメチル化状態について解析され得る。ここで、RB2/p130遺伝子の少なくとも約＋２８７番から約＋４１１番ヌクレオチドの領域のメチル化は、被検細胞が腫瘍を形成する傾向があることを示す。
【００１６】
本発明は、さらに、癌に罹患している若しくは癌を発症するリスクのある被験体を提供するステップを含む、癌を治療する方法を提供する。ここで、前記被験体の細胞は、RB2/p130遺伝子の１７８番若しくは２５９番ヌクレオチドにおけるホモ接合変異を有し、又はRB2/p130遺伝子の少なくとも約＋２８７番から約＋４１１番ヌクレオチドの領域のメチル化を有する。癌は、脱メチル化剤の有効量を被験体に投与することによって治療される。
【００１７】
本発明は、さらに、RB2/p130遺伝子の１７８番若しくは２５９番ヌクレオチドにおけるホモ接合変異を有する、又はRB2/p130遺伝子の少なくとも約＋２８７番から約＋４１１番ヌクレオチドの領域のメチル化を有する細胞の無制御増殖を抑制する方法を提供する。本方法は、細胞中のRB2/p130遺伝子のメチル化状態が変化するように、前記細胞を有効量の脱メチル化剤と接触させるステップを含む。
【００１８】
本発明は、さらに、RB2/p130遺伝子の１７８番ヌクレオチドにおけるTからCへのトランジション及び／又は２５９番ヌクレオチドにおけるCからGへのトランスバージョンを含む核酸配列を提供する。
【００１９】
本発明は、さらにRB2/p130遺伝子のエクソン１からエクソン２２間を増幅するために、並びにRB2/p130遺伝子のエクソン１、イントロン１及び転写開始部位のすぐ上流のプロモーター領域における非メチル化領域由来のメチル化された領域を増幅し、及び識別するために設計された配列を含む核酸プライマーを提供する。
【００２０】
本発明は、さらに、pRb2/p130の３７番コドンにおけるセリンからプロリンへの置換、及び／又は６４番コドンにおけるプロリンからアラニンへの置換を含む変異pRb2/p130タンパク質を提供する。本発明は、本変異pRb2/p130タンパク質に特異的な抗体も提供する。
【００２１】
本発明は、さらに、被験体から被検細胞を採取するステップ及び被検細胞からタンパク質を回収するステップを含む、腫瘍細胞を検出する又は被験体における癌を診断する方法を提供する。被検細胞から回収されたタンパク質は、pRb2/p130タンパク質における変異を解析することができる。ここで、pRb2/p130の３７番コドンにおけるセリンからプロリンへの置換、及び／又は６４番コドンにおけるプロリンからアラニンへの置換の存在は、被検細胞が腫瘍細胞であること又は被験体が癌に罹患していることを示す。
【００２２】
本発明はまた、被験体から被検細胞を含む生物学的サンプルを採取するステップを含む、腫瘍形成する傾向のある細胞を検出する方法を提供する。ここで、被検細胞は、組織学的若しくは形態学的には正常なように見えることを特徴とする。タンパク質は、被検細胞から回収され、pRb2/p130タンパク質の３７番コドンにおけるセリンからプロリンへの置換、及び／又は６４番コドンにおけるプロリンからアラニンへの置換の存在を解析され得る。pRb2/p130の３７番コドン及び／又は６４番コドンにおける前記置換の存在は、被検細胞が腫瘍形成する傾向があることを示す。
【００２３】
本発明は、さらに、被験体から被検細胞を含む生物学的サンプルを採取するステップ及び被検細胞から核酸を回収するステップを含む、被験体における散発性網膜芽細胞腫腫瘍細胞を検出する方法、又は散発性網膜芽細胞腫を診断する方法を提供する。被検細胞から回収された核酸は、RB2/p130遺伝子のエクソン１２における変異について解析され得る。ここで、RB2/p130遺伝子の１６５０番ヌクレオチドにおけるホモ接合変異の存在は、被検細胞が腫瘍細胞であること又は被験体が散発性網膜芽細胞腫を有することを示す。
【００２４】
本発明は、さらに癌抑制遺伝子又は腫瘍形成の緩和に関連する他の遺伝子の転写調節に関与するDNA領域へのICBP90の結合を抑制することを含む癌を治療する方法、又は腫瘍細胞の増殖を抑制する方法を提供する。ICB90への結合を抑制することは、遺伝子転写を抑制する多タンパク質複合体の形成を減少させることによって癌抑制遺伝子又は他の遺伝子の転写を可能にする。
【００２５】
本発明は、さらに、癌抑制遺伝子又は腫瘍形成の緩和に関連する他の遺伝子上で多タンパク質転写抑制複合体の形成を抑制し、それ故、癌抑制遺伝子又は他の遺伝子の転写が可能となることを含む癌を治療する方法又は腫瘍細胞の増殖を抑制する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本明細書で通常使用する場合、遺伝子又はmRNAは、イタリックで表示され、その遺伝子又はmRNAによって生成されるタンパク質は、標準文字で表示される。例えば、網膜芽細胞腫癌抑制遺伝子(pRb)は、「RB2/p130」又は「RB2/p130遺伝子」で表され、またそのRNAは、「RB2/p130 RNA」で表され、さらにRB2/p130遺伝子又はRNAから生成されるタンパク質は、「pRb2/p130」又は「pRb2/p130タンパク質」で表される。
【００２７】
DNAメチル化のような後成的イベントは、遺伝子転写に寄与すると考えられている。所定の遺伝子のメチル化状態は、網膜芽細胞腫遺伝子ファミリー由来のタンパク質がE2Fsのような転写因子及びクロマチン修飾酵素と相互作用し、その遺伝子の転写を抑制するか、あるいは増強するかを決定付けることができる。これらの多タンパク質転写調節複合体の正確な組成は、遺伝子ごとに異なり得る。しかし、いかなる理論にも縛られることなく、pRb2/p130及びICB P90のようないくつかのタンパク質は、多タンパク質転写調節複合体の開始及び／又は維持において中心的な役割を有していると思われる。
【００２８】
ICBP90は、そのSRAドメインを介してDNAにおけるメチル化されたCpGs（すなわち、3'方向に向かって続くシトシンとグアノシン、又は5'-CG-3'）と高い親和性で結合する。そして、同じSRAドメインを介してDNAと結合するHDAC1を誘導する。したがって、その発現がE2F-1によって直接調節されるICBP90は、様々な癌抑制遺伝子のメチル化されたプロモーター領域を標的とする。HDAC1は、pRb2/p130コリプレッサー複合体の一部である。本複合体は、遺伝子への結合によってその遺伝子の発現を抑制する。再びいかなる理論にも縛られることなく、以下のモデルは、癌抑制遺伝子又は腫瘍形成を緩和することに関連する他の遺伝子の転写抑制に関して想定することができる。
【００２９】
遺伝子プロモーター又は他の調節領域中のDNAは、内在性のDNAメチル化酵素（例えば、DNMT1、DNMT3a及びDNMT3b）によってメチル化される。ICBP90は、メチル化されたCpGsに結合し、HDAC1、pRb2/p130タンパク質及びpRb2/p130コリプレッサー複合体中の他のタンパク質（例えば、E2F転写因子）が、DNA上で会合する。pRb2/p130調節複合体を含む該タンパク質について論じる順番が、必ずしもその複合体に動員される順番ではないことは理解される。例えば、pRb2/p130、 HDAC1又は他のタンパク質が、最初にICBP90と結合できる。また、少なくともpRb2/p130、HDAC1、E2F転写因子（E2F 4/5等）の存在は重要と考えられているが、pRb2/p130複合体の成分は変わり得ることも理解される。HADC1に加えて、他のクロマチンリモデリング酵素（例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼSUV39H1、及びヒストンアセチル基転移酵素p300）は、前記複合体中に存在することができる。pRb2/p130複合体の会合は、局所的なクロマチン構造のリモデリング、及び遺伝子転写の阻害をもたらす。pRb2/p130調節複合体の形成が、所定の遺伝子の発現を増強（「共刺激」）又は抑制（「共調節複合体」）できることが理解される。
【００３０】
pRb2/p130コリプレッサー複合体によるエストロゲン受容体（「ER」）α遺伝子発現の抑制は、メチル化されたプロモーター領域に結合するICBP90によって開始される通常の転写抑制工程の説明に役立つ。ICBP90は、肺癌細胞（図８参照）内で発現され、通常核内に見られる（図９参照）。免疫沈降実験により、ICBP90はER-α遺伝子プロモーターの領域１とは関連するが、領域２とは関連しないことが知られている（図１０ａ及び１０ｂ）。pRb2/p130複合体とICBP90との相互作用は、DNMT1の動員と同時に複合体からヒストンアセチル基転移酵素p300の放出を引き起こす。pRb2/p130複合体は、近接したクロマチン構造を維持することによりER-αの転写を抑制する。pRb2/p130複合体は、RNAポリメラーゼII（RNA Pol II）複合体が会合及び／又は解離できない近接したクロマチン構造を維持することによりER-αの転写を抑制する。ICBP90とpRb2/p130複合体の相互作用は、図１１で図式的に示されている。DNAメチル化、ヒストン脱アセチル化、並びにこれに関連したH3のメチル化（ことによるとユビキチン化も）は、遺伝的「印」を設け、ヘテロクロマチン内で長期サイレンシング状態を達成することができる。
【００３１】
PAI-2遺伝子のICBP90によって誘導される調節の他の説明に役立つ例は、PAI-2タンパク質を含むpRb2/p130複合体によるPAI-2の転写調節である。以下の実施例で示すように、pRb2/p130及びpRb1/p105はPAI-2と正常初代ヒト角膜及び結膜上皮細胞の細胞質内と核内の両方で相互作用するが、p107とは相互作用しない。さらに、PAI-2プロモーターの特定の断片は、正常初代ヒト角膜上皮細胞中ではpRb2/ p130、PAI-2、E2F5、HDAC1、DNMT1、及びSUV39H1と同時結合し、正常初代ヒト結膜上皮細胞中ではRb2/p130、PAI-2、E2F5、HDAC1、及びDNMT１と同時に結合する。いかなる理論に縛られることなしに、角膜及び結膜上皮において、PAI-2の細胞質／核の分配は、多数の経路を介してpRb2/p130及びRb1/p1O5との相互作用によって制御することができる。例えば、特定の刺激の下で及び／又は細胞周期の特定の時期に、pRb2/p130及びRb1/p1O5は、PAI-2を細胞質と核の間でシャトルすることができ、それ故、前記細胞内のコンパートメントにおけるPAI-2の濃度を制御することができる。さらに、PAI-2は、pRb2/p130及びRb1/p105を早期分解から保護することができる。pRb2/p130複合体の成分の相互作用を図１５ａ及び１５ｂに示す。複合体の正確な構成成分は、角膜細胞及び結膜細胞間で変化し、PAI-2プロモーターの特定の領域における複合体の結合は、PAI-2基底の転写をクロマチン構造の局所的な変化を誘導することによって調整することができる。当該変化は、その近隣に結合する転写調節因子の活性を変える。
【００３２】
ICBP90 pRb2複合体転写調節モデルは、癌の治療に関するいくつかの治療標的を提供する。例えば、pRb2p130複合体（例えば、pRb2/p130、ICBP90、PAI-2、p300、SUV39H1、HDAC1、E2F、及び他の転写因子、いつかのDNAメチルトランスフェラーゼ）の一部、又は当該複合体を開始する若しくは当該複合体に関連するタンパク質を、抑制又は不活性化することができる。このような抑制又は不活性化は、直接的に又は間接的に起こり得る。例えば、タンパク質の直接的な抑制は、抗体若しくは他のタンパク質、アプタマー、又は特定部位をブロックするか、さもなくば、pRb2p130複合体タンパク質とDNA及び／又は他のpRb2p130複合体若しくは他のタンパク質との相互作用を妨げる他の分子の結合によって生じ得る。例えば、DNAメチルトランスフェラーゼ（例えば、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b）は、以下でより詳細に説明するが、DNAのシトシンへのメチル基の転移を妨げる物質で抑制することができる。pRb2p130複合体の間接的阻害は、タンパク質をコードするmRNAの転写又は翻訳を妨げることによって生じさせることができる。
【００３３】
例えば、RB2/p130遺伝子の転写抑制は、網膜芽細胞腫、肺癌、及び他の癌の発生と進行とリンクすると考えられている。いかなる理論に縛られることなしに、RB2/p130遺伝子の転写抑制は、RB2/p130遺伝子のエクソン１内及びその周辺領域のメチル化状態によって仲介されていると考えられている。特に、RB2/p130遺伝子の少なくとも約＋287から約411ヌクレオチドの領域のメチル化は、この遺伝子の転写を抑制する（図２ａ参照）。
【００３４】
以下の実施例で示すように、RB2/p130のメチル化状態は、本遺伝子のエクソン１における変異によって影響される。２つの新規RB2/p130エクソン１変異が同定された。それらは、別個に又は共に発生し得る。第１の変異は、RB2/p130エクソン１の１７８番ヌクレオチドにおけるチミン（T）からシトシン（C）へのトランジションである。また、第２の変異は、RB2/p130エクソン１の２５９番ヌクレオチドにおけるCからグアニン（G）へのトランスバージョンである。ヒト野生型RB2/p130のcDNA配列を配列番号１に示す。１７８番ヌクレオチドにおいてTからCへのトランジションを有するRB2/p130の単離されたcDNA配列は、配列番号３に示されており、２５９番ヌクレオチドにおいてCからGへのトランスバージョンを有するRB2/p130の単離されたcDNA配列は、配列番号５に示されている。１７８番ヌクレオチドにおけるTからCへのトランジションと２５９番ヌクレオチドにおけるCからGへのトランスバージョンを有するRB2/p130の単離されたcDNA配列は、配列番号７に示されている。別段の指示がない限り、本明細書で開示されたRB2/p130配列におけるヌクレオチドのナンバリングは、配列番号１に対してである。すなわち、配列番号１の最初のヌクレオチドが「１番ヌクレオチド」である。したがって、「１７８番ヌクレオチド」又は「２５９番ヌクレオチド」とは、それぞれ配列番号１の１７８番又は２５９番ヌクレオチドをいう。
【００３５】
したがって、本発明は、本明細書に記載のRB2/p130のエクソン１変異を含む単離された核酸配列を提供する。一の実施形態で、本発明の単離された核酸は、本発明のpRb2/p130変異タンパク質をコードする核酸配列を含む。例えば、配列番号３、５、若しくは７を含むプラスミド又はそれらを含むウイルス発現ベクターが該当する。
【００３６】
核酸コード配列を受け入れることのできる、あらゆるプラスミドベクターを本発明で使用することができる。例えば、pBR322、pUCベクター、pMBl、及びこれらから直接的に又は間接的に誘導されたベクター等が該当する。適切なプラスミドベクターはAmerican Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA)から入手可能である。本発明の単離された核酸配列を発現するのに適したプラスミドの選択、そのプラスミド中に前記核酸配列を導入するための方法は、周知慣用の技術である。例えば、Tuschl, T. (2002), Nat. Biotechnol, 20: 446-448；  Brummelkamp TR et al. (2002), Science 296: 550-553；  Miyagishi M et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 497-500; Paddison PJ et al. (2002), Genes Dev.16: 948-958；  Lee NS et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 500-505；及びPaul CP et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 505-508を参照されたい。これらの文献は、参照によってその全ての開示を本明細書に援用する。
【００３７】
コード配列を受け入れることのできるあらゆるウイルスベクターを本発明に使用することができる。例えば、アデノウイルス（AV）、アデノ関連性ウイルス(AAV)、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（LV）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス（AAV）、ヘルペスウイルス等に由来するベクターが挙げられる。本発明で使用するのに適したウイルスベクターの選択、そのようなベクター中に核酸配列を導入するための方法は、周知慣用の技術である。例えば、Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310；  Eglitis MA (1988), Biotechniques 6: 608-614；  Miller AD (1990), Hum Gene Therap. 1. 5-14; Anderson WF (1998), Nature 392: 25-30；及びRubinson DA et al., Nat. Genet. 33: 401-406を参照されたい。これらの文献は、参照によってその全ての開示を本明細書に援用する。
【００３８】
RB2/p130のエクソン１変異は、pRb2/p130タンパク質におけるアミノ酸置換をもたらす。具体的には、１７８番ヌクレオチドのTからCへのトランジションは、pRb2/p130の３７番コドンにおけるセリンからプロリンへの置換をもたらし、また２５９番ヌクレオチドのCからGへのトランスバージョンは、pRb2/p130の６４番コドンにおけるプロリンからアラニンへの置換をもたらす。したがって、本発明は、３７番コドンのSer→Pro置換（配列番号４）又は６４番のPro→Ala置換（配列番号６）のいずれか、あるいは３７番コドンのSer→Pro置換と６４番のPro→Ala置換の両方（配列番号８）を含む単離された変異pRb2/p130タンパク質を提供する。本発明はまた、本発明の変異pRb2/p130タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。例えば、ウイルス発現ベクター又はプラスミド発現ベクター中に配列番号３、５、若しくは７を含む核酸が該当する。
【００３９】
本発明はまた、配列番号４、６及び８の変異pRb2/p130タンパク質に特異的な単離抗体を提供する。本明細書で使用する場合、「抗体」とはポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方、並びにFv、Fab及びF(ab)2断片のような抗原又はハプテンに結合できるそれらの断片を包含する。当該分野で知られる様々な方法を、本発明の変異pRb2/p130タンパク質又はその断片に結合するが、野生型pRb2/p130タンパク質には結合しないポリクローナル抗体を単離する方法を使用することができる。例えば、様々な宿主動物を、変異pRb2/p130タンパク質又はその断片の注射によって免疫することができる。宿主動物は、限定はされないが、ウサギ、マウス、ラット等を含む。宿主種によって様々なアジュバントを使用して、免疫応答を増大させることができる。アジュバントには、フロイント（完全及び不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムのような金属ゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール（pluronic polyols）、ポリアニオン（polyanions）、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びにBCG（bacille Calmette-Guerin）及びCorynebacterium parvumのような潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられる。
【００４０】
本発明の変異pRb2/p130タンパク質またはその断片に結合するが野生型pRb2/p130タンパク質には結合しない単離モノクローナル抗体の調製については、連続細胞株により培養で抗体分子の産生を提供するいかなる技術も使用することができる。このような技術の例は、ハイブリドーマ及びトリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、及びヒトモノクローナル抗体を作製するためのEBVハイブリドーマ技術を含む。
【００４１】
本発明による単離モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の作製において、所望の抗体をスクリーニングすることは、当該分野で公知の技術（例えば、酵素結合免疫固定法(ELISA)）によって達成することができる。以下のpRb2/p130複合体及び他のタンパク質に特異的な抗体の作製についての追加説明を参照されたい。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「単離された」分子とは、合成分子、又は人の介入を通して天然の状態から変えられた若しくは取り外された分子である。例えば、生きた動物中に天然に存在する核酸又はタンパク質は、「単離され」ていないが、合成核酸又は合成タンパク質であって、部分的に又は完全に天然状態の共存物質から分離されたものは、「単離され」たに該当する。単離された分子は、実質的に生成された形で存在することができ、又は非自然環境（例えば、分子が導入された細胞のように）で存在することができる。宿主細胞内に導入された核酸、及び宿主細胞のゲノム中に組み込まれた核酸は、本発明の目的上、両宿主細胞中に及び当該宿主細胞から産生された嬢細胞中に「単離され」たとみなすことが理解される。天然の工程によって細胞内部で産生されるのではなく、「単離され」た分子から又は該分子の指揮下で産生される分子もまた、「単離され」た分子であるとみなされる。例えば、単離された核酸は、標的細胞中に導入することができる。標的細胞では、前記単離された核酸が発現してRNA又はタンパク質が産生される。細胞内部で核酸から産生されるRNA又はタンパク質分子は、本発明の目的上、単離された分子である。
【００４３】
RB2/p130遺伝子発現は、上記RB2/p130のエクソン1変異を有する細胞内において減少するか、又は失われる。本明細書で用いる場合、RB2/p130遺伝子に関して「発現」とは、遺伝子にコードされた遺伝情報を具現化して、pRb2/p130タンパク質を生成することを意味する。したがって、「発現」は、それと反対の指示がない限り、転写又は翻訳のいずれか、並びに遺伝子の成熟タンパク質産物の活性を含む、その最も広い意味で用いられる。それ故、被検細胞におけるコントロール細胞に対してのRB2/p130 RNA又はpRb2/p130タンパク質の減少若しくは欠如、あるいはRB2/p130 RNA又はpRb2/p130タンパク質活性の減少若しくは欠如は、「pRb2/p130発現の抑制」と見なされるであろう。本明細書で用いる場合、「コントロール」細胞は、癌に罹患していない、又は癌に罹患している疑いがない被験体から採取される細胞である。RB2/p130遺伝子発現を測定するための適切な技術は、以下でより詳細に説明される。
【００４４】
以下の実施例で実証されたように、検出可能なRB2/p130遺伝子発現が、１７８番及び２５９番ヌクレオチドにホモ接合性変異を有する癌細胞では見られない（例えば、表１のサンプル３〜５、及び９）。RB2/p130遺伝子発現の減少は、RB2/p130エクソン１の１７８番又は２５９番ヌクレオチドのどちらかホモ接合変異で有する癌細胞で見られるが、両方を有する癌細胞では見られなかった（例えば、表１のサンプル６〜８、１０）。本明細書で開示されたRB2/p130エクソン１変異がヘテロ接合性である場合（例え、１７８番及び２５９番変異の両方が一緒に起こるとしても）、その後の、RB2/p130の発現は正常である（例えば、表１のサンプル２を参照されたい）。よって、上記で説明したホモ接合性RB2/p130エクソン１変異の存在は、RB2/p130遺伝子発現を抑制する。
【表１】
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【００４５】
表１に見られるように、RB2/p130遺伝子のホモ接合性エクソン１変異の存在は、RB2/p130遺伝子のエクソン１領域又はその近傍の３つのCpGリッチ領域のメチル化状態と関連している。RB2/p130遺伝子のこれら３つのCpGリッチ領域は、ゲノム配列中に位置している。第１の前記領域は、約−９５番ヌクレオチドから約＋１７７番ヌクレオチドに存在し、転写開始部位から5’側直前のプロモーター領域とエクソン１の一部を包含する（「領域１」）。第２の前記領域は、約＋１６７番ヌクレオチドから約＋３０２番ヌクレオチドに存在し、エクソン１のほとんどを包含する（「領域２」）。第３の前記領域は、約＋２８７番ヌクレオチドから約＋４１１番ヌクレオチドに存在し、エクソン１の3’末端とイントロン１の5’末端を包含する（「領域３」）。領域１、２、及び３に関するRB2/p130遺伝子のヌクレオチドのナンバリングは、ATG転写開始部位を基準にしており、開始コドンのアデニン又は「A」を０とし、開始コドンAの直前の5’側ヌクレオチドを−１、開始コドンAの直後の3’側ヌクレオチドを＋１としている。領域１、２、及び３は、図２aにおいて図示されている。
【００４６】
RB2/p130遺伝子発現は、領域１、２、及び３がメチル化されていない場合は、標準的である。領域３のみのメチル化、又は領域１及び３若しくは領域２及び３のメチル化は、RB2/p130遺伝子発現の下方制御をもたらし、そして領域１、２及び３のメチル化は、RB2/p130遺伝子発現を検出できない状態にする。例えば、表１並びに図２ｂ及び図６を参照されたい。したがって、少なくとも領域３のメチル化は、RB2/p130遺伝子発現の抑制をもたらす。いかなる理論にも縛られることなく、上記RB2/p130遺伝子のホモ接合変異は、RB2/p130ゲノム配列のメチル化に影響を及ぼし、次いでRB2/p130遺伝子発現を抑制すると考えられている。再度いかなる理論にも縛られることなく、前記RB2/p130発現の抑制は、細胞内部におけるpRb2/p130癌抑制因子の機能の欠損又は低下をもたらし、腫瘍形成の樹立と維持につながる。
【００４７】
RB2/p130遺伝子の領域１、領域２又は領域３におけるメチル化は、原則的には関連するRB2/p130遺伝子配列中の各シトシンであって、それに続いて3’側にグアノシンが存在する、すなわち5'-CG- 3'配列（時々「CpG」と呼ばれる）のシトシンで起こることが、当業者にはわかるであろう。したがって、「領域１、２、及び／又は３のメチル化」は、実質的には、所与の領域における利用可能な全ての5'-CG-3'メチル化部位がメチル化される。
【００４８】
ホモ接合性RB2/p130遺伝子のエクソン１変異及び／又は少なくとも領域３のメチル化は、異なる組織のヒストタイプ及び胚性起源の原発癌細胞及び癌細胞株で検出されている。したがって、本発明は、被験体において癌細胞を検出する、又は癌を診断する方法を提供する。本方法は、被験体から被検細胞を含む生物学的サンプルを採取するステップ、被検細胞から核酸を回収するステップを含む。被検細胞から回収された核酸を、RB2/p130遺伝子のエクソン１における変異について解析することができる。ここでRB2/p130遺伝子の１７８番若しくは２５９番ヌクレオチドにおけるホモ接合変異の存在は、被検細胞が腫瘍細胞であること、又は被験体が癌に罹患していることを示す。あるいは、被検細胞から回収されたDNAを、RB2/p130遺伝子のメチル化状態について解析することができる。ここで少なくとも領域３のメチル化は、被検細胞が腫瘍細胞であること、被験体が癌に罹患していることを示す。
【００４９】
また、ホモ接合性RB2/p130遺伝子のエクソン１の変異及び／又は少なくとも領域３のメチル化は、腫瘍に隣接した部位より採取された正常外見の組織由来の細胞において検出された。一方、RB2/p130遺伝子のエクソン１の変異は、癌に罹患していない被験体から、又は非腫瘍性疾患に罹患した被験体から採取された細胞中には存在しなかった。したがって、本発明はまた、腫瘍形成する傾向のある細胞を検出する方法を提供する。この方法は、被験体から被検細胞を含む生物学的サンプルを採取するステップを含む。ここで、被検細胞は、組織学的若しくは形態学的には正常なように見える。被検細胞から回収された核酸は、RB2/p130遺伝子のエクソン１変異又はRB2/p130遺伝子のメチル化状態について上記のように解析することができる。RB2/p130遺伝子の１７８番及び／又は２５９番ヌクレオチドにおけるホモ接合変異あるいは少なくとも領域３のメチル化の存在は、被検細胞が腫瘍形成する傾向にあることを示す。
【００５０】
本方法で使用するための被検細胞を含む組織サンプルは、血液サンプルを含み、標準的技術（例えば、静脈若しくは動脈からの採血、拭き消毒した皮膚若しくは粘膜表面、パンチ若しくは針生検、外科的生検等）によって採取することができる。その後、核酸を、RB2/p130エクソン１変異又はメチル化のレベルの決定のために標準的技術をもちいて被検細胞から回収することができる。被検細胞から回収された核酸はDNA、RNA、又はその両方とすることができる。
【００５１】
RB2/p130エクソン１変異の存在は、あらゆる適切な技術（たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応によるRB2/p130 RNA若しくはDNAにおける関連するエクソン１領域の増幅、又はエクソン１変異に特異的なプローブを用いたRB2/p130DNAのサザンブロットハイブリダイゼーションの分析）によって被検細胞から回収された核酸で検出することができる。
【００５２】
サザンブロットハイブリダイゼーション技術は、当該分野では公知である。例えば、被検細胞から回収されるDNAを、制限酵素で切断することができる。本切断は、ゲノムDNAの切断断片を生成する。これらの断片は、電気泳動によって（例えば、アガロースゲルで）分離することができる。制限断片は、その後ハイブリダイゼーションメンブレン（例えば、ニトロセルロース又はナイロン）上にブロットされ、RB2/p130変異に特異的な標識されたプローブを用いてハイブリダイズされる。エクソン１変異の検出に最適なプローブ標識及びハイブリダイゼーション条件については、当業者が容易に決定することができる。サザンブロットハイブリダイゼーションに適切な核酸プローブは、本明細書で開示した野生型及び変異RB2/p130 cDNAに基づいて設計することができる。
【００５３】
標識されたDNA及びRNAプローブの調製方法、並びに標的核酸配列へのそれらプローブのハイブリダイゼーションの条件は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Chapters 10 and 11に記載されている。本文献は、参照によって本明細書に援用される。例えば、核酸プローブをRigby et al. (1977), J. Mol. Biol. 113:237-251のニックトランスレーション方法によって、又はFienberg et al. (1983), Anal. Biochem. 132:6-13のランダムプライミング方法によって、高い比活性で標識することができる(これら文献の開示全体は、参照によって本明細書に援用される)。その後、ハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィー検出は、ハイブリダイズしたフィルターを写真用フィルムに露光することによって行うことができる。DNA又はRNAプローブの放射性核種標識が実用的でない場合、ランダムプライマー法を用いて、非放射線標識（例えば、dTTPアナログ5-(N-(N-ビオチニル-ε-アミノカプロイル)-3-アミノアリル)デオキシウリジン三リン酸）をプローブ分子中に取り込ませることができる。ビオチン化オリゴヌクレオチドプローブは、蛍光色素又は呈色反応を生じる酵素と一体化したビオチン結合タンパク質（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、又は抗ビオチン抗体）を用いた反応によって検出することができる。
【００５４】
RB2/p130エクソン１変異が存在するか否かを決定する他の適切な技術には、一本鎖高次構造多型（single strand conformational polymorphism）又は「SSCP」がある。これは、例えば、Orita et al. (1989), Genomics 5: 874-879及びHayashi (1991), PCR Methods and Applic. 1: 34-38に記載されている。これらの文献は、参照により本明細書に援用される。SSCP技術は、目的の遺伝子断片をPCRによって増幅すること、その断片を変性させること、及び２本の変性された一本鎖を非変性条件下で電気泳動することを含む。一本鎖は、鎖の電気泳動の移動度に影響を及ぼす複雑な配列依存性鎖内二次構造をとる。一本鎖対コントロール細胞から回収された核酸より増幅された類似する一本鎖の電気泳動移動度の違いは、RB2/p130エクソン１変異の存在を示す。
【００５５】
RB2/p130エクソン１変異は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によってそれらの遺伝子の断片を増幅し、そして配列決定又は電気泳動によって増幅された断片を解析して１７８番又は２５９番ヌクレオチドに変異が存在するかどうかを決定することにより検出されることが好ましい。DNA断片のPCR増幅に関する適切な反応及びサイクル条件については、当業者が容易に決定することができる。典型的なPCR反応及びサイクル条件は、以下の実施例中に示している。
【００５６】
RB2/p130遺伝子のメチル化パターンを決定する方法は、当該分野では公知である。関連技術は、以下の実施例中に記載したようなメチル化特異的PCR（methylation-specific PCR）又は「MSP」がある。
【００５７】
上記ホモ接合性RB2/p130遺伝子のエクソン１変異は、RB2/p130遺伝子発現の抑制をもたらすが、いくらかの変異pRB2/p130タンパク質は産生され得る。したがって、RB2/p130遺伝子のエクソン１変異の存在は、被検細胞から回収されたタンパク質によっても検出することができ、変異pRB2/p130タンパク質についてタンパク質が解析される。
【００５８】
上記のように、エクソン１変異は、３７番コドンにおけるSer→Pro置換（配列番号４）若しくは６４番コドンにおけるPro→Ala置換（配列番号６）のいずれか、又は３７番コドンにおけるSer→Pro置換及び６４番コドンにおけるPro→Ala置換の両方（配列番号８）を含む変異pRB2/p130タンパク質を産生する。被検細胞において特定の変異pRB2/p130タンパク質の存在のみが、RB2/p130遺伝子のエクソン１変異がホモ接合性であり、被検細胞が癌細胞であるか又は被験体が癌に罹患していることを示す。被検細胞が組織学的若しくは形態学的には正常な組織から採取された場合、特定の変異pRb2/p130タンパク質のみが検出され、その後、被検細胞は腫瘍形成を起こしやすくなる。しかし、正常pRb2/p130タンパク質が検出された場合、又は異なるタイプの変異pRb2/p130が見出された場合（すなわち、３７番コドンSer→Pro置換だけ、６４番コドンのPro→Ala置換だけ）、被検細胞は、ホモ接合性エクソン１RB2/p130遺伝子変異をもっていそうにない。
【００５９】
変異pRb2/p130タンパク質を検出する適切な技術は、当該分野で公知であり、それには電気泳動による分離と同定、ペプチド分解、及び配列解析、並びに免疫法（例えば、ラジオイムノアッセイ、ELISA、「サンドウィッチ」免疫法、ゲル内拡散沈降反応、in situ免疫法、補対結合法、及び免疫電気泳動法）が含まれる。
【００６０】
RB2/p130エクソン１２におけるサイレントなホモ接合変異が、散発性網膜芽細胞腫の腫瘍において同定された。本変異は、配列番号１の１６５０番ヌクレオチドで見つかったAからGへのトランジションである。エクソン１２の１６５０番ヌクレオチドにAからGへのトランジションを有するRB2/p130のcDNA配列は、配列番号９に示されている。したがって、本発明は、本明細書に記載されたRB2/p130エクソンの１２変異を含む単離された核酸配列を提供する。このエクソン１２の変異は、散発性網膜芽細胞腫に特異的である。それ故、その存在は、前記腫瘍の表現型を予測する。したがって、一の実施形態で、本発明は、被験体における散発性網膜芽細胞腫腫瘍細胞を検出する、又は散発性網膜芽細胞腫を診断する方法を提供する。以下に記載のように、被検細胞は被験体から採取され、それらの被検細胞から核酸が回収される。本核酸は、本明細書に記載されたエクソン１２の変異の存在について、例えば、上記で詳細に論じた技術を用いて解析される。エクソン１２の変異を検出するための典型的な技術は、以下の実施例に記載されている。
【００６１】
癌又は前癌細胞においてメチル化されたRB2/p130遺伝子部分の脱メチル化は、RB2/p130遺伝子発現の抑制を解除し、細胞内のpRB2/p130癌抑制機能を回復させる。本明細書で使用する場合、「前癌細胞」とは、１７８番及び／又は２５９番ヌクレオチドにおけるホモ接合変異を有するか、あるいはRB2/p130遺伝子の少なくとも領域３のメチル化を有するが、組織学的若しくは形態学的には正常な細胞である。したがって、本発明は、癌を治療する、又は癌形成を抑制する方法を提供する。この方法では、被験体の細胞が１７８番及び／又は２５９番ヌクレオチドにおけるホモ接合変異を有するか、あるいはRB2/p130遺伝子において少なくとも領域３のメチル化を有する。本治療方法は、脱メチル化剤の有効量を、癌に罹患している、若しくは癌を発症するリスクのある被験体に投与するステップを含む。適切なDNA脱メチル化剤は、5-アザシチジン（5-アザ）及び5-アザ-2'-デオキシシチジン（5-アザ-2dc）のようなDNAメチルトランスフェラーゼインヒビターを含む。DNAを脱メチル化する方法、及びRB2/p130遺伝子のメチル化パターンを決定する方法は、当該分野で公知であり、代表的な技術は、以下の実施例に記載されている。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「腫瘍形成を抑制すること」とは、前癌細胞が組織学的若しくは形態学的に正常な状態から組織学的若しくは形態学的に新生物又は癌として分類される状態に転換することを意味する。本明細書で使用する場合、「脱メチル化剤の有効量」とは、RB2/p130遺伝子の少なくとも領域１及び／又は領域２、好ましくは領域１、領域２及び領域３へのメチル基の付加を抑制するのに、又はそれら領域からメチル基を除去するのに、あるいは細胞におけるRB2/p130遺伝子の転写抑制を解除するのに十分な量である。本明細書で使用する場合、脱メチル化剤の「有効量」は、腫瘍細胞の増殖を抑制するのに十分な量とすることもできる。
【００６３】
RNA若しくはタンパク質レベルにおけるRB2/p130発現のレベルを測定するのに使用される被検細胞及びコントロール細胞は、上記のような標準的技術（例えば、静脈若しくは動脈からの採血、パンチ若しくは針生検、外科的生検等）によって得ることができる。その後、RB2/p130 RNA又はpRb2/p130タンパク質は、被検細胞及びコントロール細胞から標準技術を用いて、RB2/p130発現レベルを測定するために回収することができる。あるいは、テストサンプルにおけるRB2/p130発現レベルを、予め正常なコントロール被験体の集団から得られたRB2/p130遺伝子発現の平均レベルと比較することができる。本明細書で使用する場合、「正常なコントロール被験体」とは、癌に罹患していない、又は癌罹患の疑いのない被験体である。
【００６４】
細胞内の特定の遺伝子のRNA転写産物レベルを測定するための適当な方法は、当該分野では公知である。前記一の方法によれば、全細胞RNAは、細胞から核酸抽出バッファーの存在下でのホモジナイゼーションとそれに続く遠心によって精製することができる。その後、核酸は沈殿され、DNAがDNaseによる処理で除かれる。RNA分子は、ゲル電気泳動によりアガロースゲルにおいて標準技術によって分離される。そして、ニトロセルロース又は他の適当なフィルターに、例えば、いわゆる「ノーザン」ブロッティング技術によって転写される。RNAは、加熱によってフィルター上に固定される。特定のRNAの検出と定量は、適当に標識された、問題となっているRNAに相補的なDNA又はRNAプローブを用いて達成される。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Chapter 7を参照されたい。本文献は、参照によりその全ての開示を援用される。
【００６５】
RB2/p130 RNAへのプローブハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィー検出は、ハイブリダイズフィルターを写真用フィルムに露光することによって行われる。ハイブリダイズフィルターによって露光された写真用フィルムの密度スキャニングは、RNA転写産物レベルの正確な測定を提供する。あるいは、RNA転写産物レベルは、ハイブリダイゼーションフィルターのコンピューターイメージングによって（例えば、Amersham Biosciences, Piscataway, NJ.から市販されているMolecular Dynamics 400-B 2D Phosphorimagerを用いて）定量することができる。
【００６６】
ブロッティングハイブリダイゼーション技術に加えて、所与の遺伝子からのRNA転写物の検出は、in situハイブリダイゼーションによって実行することができる。この技術は、ノーザンブロッティング技術よりも少量の細胞を必要とし、顕微鏡スライド又はカバースリップ上に全細胞を沈着させることに関連する。そして、細胞の核酸含有量を放射性若しくは非放射性標識されたcDNA又はcRNAプローブを含む溶液でプロービングする。in situハイブリダイゼーションの実施は、米国特許第5,427,916号により詳細に記載されている。本文献は、参照によってその全開示が援用される。
【００６７】
被検細胞又はコントロール細胞におけるRB2/p130 RNA転写物の数は、RB2/p130 RNA転写物の逆転写と、それに続くポリメラーゼ連鎖反応による増幅（RT-PCR）によって測定することもできる。RB2/p130 RNA転写物のレベルは、内部標準との比較で、（例えば、同一サンプル中に存在する「ハウスキーピング」遺伝子から生じたRNAのレベルとの比較によって）定量することができる。内部標準としての使用するのに適した「ハウスキーピング」遺伝子は、ミオシン、β−アクチン、又はグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）を含む。定量RT−PCRを実行する方法及びその変異型は、当該分野で公知である。
【００６８】
RB2/p130遺伝子発現は、被検細胞とコントロール細胞におけるpRB2/p130タンパク質レベルを測定することによって決定することもできる。pRB2/p130タンパク質レベルを測定するのに適当な技術は当該分野で公知であり、電気泳動による分離と同定、ペプチド分解、及び配列解析、並びに免疫法（例えば、ラジオイムノアッセイ、ELISA（酵素固定免疫検出法）、「サンドウィッチ」免疫法、ゲル内拡散沈降反応、in situ免疫法、補対結合法、及び免疫電気泳動法）が含まれる。
【００６９】
当業者は、脱メチル化剤の有効量を容易に決定して、所与の被験体に、該被験体の身長や体重；腫瘍の成長又は疾患浸透の範囲；被験体の年齢、健康度及び性別；投与経路；並びに投与が局所（例えば、局部的）か全身かといったような要素を考慮して投与することができる。
【００７０】
例えば、脱メチル化剤の有効量は、約5〜3000μg（化合物）／kg（体重）、好ましくは、約700〜1000μg（化合物）／kg（体重）、より好ましくは約1000μg（化合物）／kg（体重）よりも多い量を含み得る。脱メチル化剤は、程度の差こそあれ被験体に投与することができると考えられている。本発明の化合物の有効量はまた、治療すべき腫瘍塊のおおよその重量に基づくことができる。腫瘍塊のおおよその重量は、その塊のおおよその容量を算出することによって決定することができる。ここで、1立方センチメートル容量は、大体1グラムに等しい。腫瘍塊の重量に基づいた脱メチル化剤の有効量は、少なくとも、約10μg／腫瘍塊グラム数である。好ましくは約10〜500μg／腫瘍塊グラム数である。より好ましい有効量は、少なくとも約60μg／腫瘍塊グラム数である。特に好ましい有効量は、少なくとも約100μg／腫瘍塊グラム数である。腫瘍塊の重量に基づく脱メチル化剤の有効量は、腫瘍内に直接導入することが好ましい。
【００７１】
脱メチル化剤は、癌細胞又は前癌細胞を該薬物に暴露するためのあらゆる手段によって被験体に投与することができる。例えば、薬物を非経口経路又は経腸経路で投与することができる。適当な経腸投与経路には、経口、直腸、又は鼻腔内送達が含まれる。適当な非経口投与経路には、血管内投与（例えば、静脈内ボーラス注射、静脈内注射、動脈内ボーラス注射、動脈注射、及び血管内カテーテル点滴）、腫瘍周辺及び腫瘍内導入、筋肉内注射、皮下注入（浸透圧ポンプのような）を含む皮下注射又は皮下沈着、目的の組織への直接適用（例えば、カテーテルや他の配置装置（例えば、多孔性の、非多孔性の、若しくはゼリー状の物質を含む座薬又はインプラント）による）、及び吸入が含まれる。脱メチル化剤は、注射又は注入によって投与されることが好ましく、腫瘍内への直接的注射によって投与されることがより好ましい。
【００７２】
当業者は、脱メチル化剤を被験体に投与するための適当な投与計画を用意して決定することもできる。例えば、薬物を被験体に一回、例えば一回の注射又は沈着として、投与することができる。あるいは、薬物を一日に一回若しくは二回、約３日から約２８日の期間で、より好ましくは約７日から約１０日の期間で被験体に投与することができる。好ましい用量及び用法では、薬物は一日一回７日間導入される。用量及び用法が、複数回投与を含む場合、被験体に投与される脱メチル化剤の有効量は、全用量及び用法にわたって投与された薬物の総量を含むことがわかる。
【００７３】
脱メチル化剤は、被験体に投与する前に当該分野で既知の技術によって医薬組成物又は医薬として製剤化され得る。したがって、癌治療用医薬組成物又は医薬の製造のための脱メチル化剤の使用は、特に本発明に組み込まれる。
【００７４】
本明細書で使用する場合、「医薬組成物」又は「医薬」は、ヒト及び家畜への製剤を含む。本発明の非経口投与用の医薬組成物又は医薬は、少なくとも無菌で発熱物質なしの物として特徴付けられている。本発明の医薬組成物又は医薬を調製する方法は、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)に記載されているように、当該分野で公知である。本文献は、参照によって本明細書にその全開示が援用される。
【００７５】
本発明の医薬組成物又は医薬は、生理的に許容可能な担体と混合された少なくとも一の脱メチル化剤（例えば、0.1〜90％重量で）、あるいは生理的に許容可能なそれらの塩を含む。生理的に許容可能な担体は、水、バッファー用水、生理食塩水、0.4％食塩水、0.3％グリシン、ヒアルロン酸等が好ましい。
【００７６】
本発明の医薬組成物又は医薬は、従来の調剤の医薬品賦形剤、及び／又は添加剤を含むこともできる。適当な医薬品賦形剤は、安定化剤、酸化防止剤、浸透圧調整剤、バッファ、及びpH調整剤を含む。適当な添加剤は、生理学的生体適合バッファー（例えば、塩酸トロメタミン）、キレート（例えば、DTPA又はDTPA-ビスアミドのような）若しくはカルシウムキレート錯体（例えば、カルシウムDTPA又はCaNaDTPA-ビスアミドのような）の添加、又は任意で、カルシウム若しくはナトリウム塩（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、又は乳酸カルシウム）の添加を含む。本発明の医薬組成物を、液体形状での使用のために包装する事ができ、又は凍結乾燥することができる。
【００７７】
固形組成物については、従来の無毒な固形担体を使用することができる。例えば、マンニトール、乳糖、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、ブドウ糖、ショ糖、炭酸マグネシウム等の医薬品等級物が該当する。例えば、経口投与用固形医薬組成物は、上に列挙したいずれかの担体及び賦形剤と10〜95％、好ましくは25〜75％の一以上の脱メチル化剤を含むことができる。エアロゾル（吸入）投与用の医薬組成物又は医薬は、リポソーム内に封入された0.01〜20%重量の、好ましくはl%〜10%重量の脱メチル化剤と高圧ガスを含むことができる。担体は、所望により、例えば鼻腔内伝達用のレシチンを含むこともできる。
【００７８】
ICBP90タンパク質、及びpRb2/p130複合体（pRb2/p130、PAI-2、HDAC1、DNMT1、p300、SUV39H1及びE2F、並びに他の転写因子を含む）又はDNAメチラーゼ（例えば、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b）を含む他のタンパク質はまた、癌治療用の治療標的でもあり得る。説明を容易にするため、以下の議論はICBP90に焦点を当てる。しかし、以下の議論は、ICBP90-pRb2/p130複合体において、遺伝子発現の調節に関与する、本段落の最初の文に列挙したようないずれのタンパク質にも適用されることがわかる。
【００７９】
したがって、ICBP90タンパク質活性の直接的な、又は間接的な抑制は、pRb2/p130タンパク質複合体の形成に影響を及ぼし得る。それは、いくつかの癌又は前癌状態において下方制御されない限り、結果的に癌抑制遺伝子の発現をもたらす。ICBP90タンパク質の抑制は、当該分野で公知のあらゆる適当な技術によって（例えば、抗体、アプタマー又はICBP90に結合する他の分子並びにICBP90がDNA上のメチル化部位に結合すること及びpRb2/p130複合体の形成を開始することを阻止する他の分子の導入によって）達成することができる。ICBP90タンパク質は、ICBP90 RNAの転写又は翻訳を特異的に妨げることででも抑制することができる。
【００８０】
ICBP90発現は、当業者に公知のあらゆる適当な技術によって抑制することができる。例えば、ICBP90の発現は、ICBP90 mRNAを標的に設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、GenBank Accession No. AB126777を参照されたい。参照により当該開示を本明細書に援用する）を投与することによって抑制することができる。ICBP90標的は、一本鎖又は二本鎖のDNA又はRNAとすることができる。しかし、一本鎖DNA又はRNA標的が好ましく、一本鎖mRNA標的が特に好ましい。本発明のICBP90アンチセンスオリゴヌクレオチドの向けられた標的にはICBP90のアレルが含まれることがわかる。
【００８１】
標的ポリヌクレオチドの配列知識を与えるアンチセンスオリゴヌクレオチド用として特定の配列を選択するための多くのガイダンスが文献中に存在する。例えば、Peyman and Ulmann, 1990, Chemical Reviews, 90, 543；  Crooke, 1992, Ann. Rev.；Pharmacal. Toxicol., 32, 329；及びZamecnik and Stephenson, Proc. Natl. Acad. Sci., 75, 280が挙げられる。これらの全ての開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ICBP90アンチセンス化合物の配列は、GC含量が少なくとも60％となるように選択されることが好ましい。好ましいICBP90 mRNA標的は、5’キャップ部位、tRNAプライマー結合部位、開始コドン部位、mRNAスプライシングドナー部位、及びmRNAスプライシングアクセプター部位を含む。例えば、Goodchildらの米国特許第4,806,463号を参照されたい。本文献は、その全開示を参照により本明細書に組み込まれる。
【００８２】
標的ポリヌクレオチドがICBP90 mRNA転写産物を含む場合、その転写産物のあらゆる部分に相補的なオリゴヌクレオチドは、原則として、翻訳を抑制するのに有効であり、本明細書に記載した効果を含み得る。
【００８３】
転写は、開始コドンで又はその付近でmRNAをブロックすることにより最も効果的に抑制される。したがって、ICBP90 mRNA転写産物の5’領域に相補的なオリゴヌクレオチドが好ましい。ICBP90 mRNAに相補的なオリゴヌクレオチドは、開始コドン（pRb2/p130転写産物の翻訳部分の5’末端における最初のコドン）又は開始コドンに隣接するコドンを含んでいることが好ましい。
【００８４】
ICBP90転写産物の5’領域、特に開始コドンを含む領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましいが、当然のことながら、有用なアンチセンスオリゴマーは、mRNA転写産物の翻訳部分に見られる配列に相補的なものに限られず、mRNA転写産物の5’及び3’非翻訳領域中に含まれる、又はそれらの領域に渡るヌクレオチド配列に相補的なオリゴマーも含む。
【００８５】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、あらゆる高分子化合物を含むことができる。この高分子化合物は、Watson-Crick型塩基対、Hoogsteen型若しくは逆Hoogsteen型塩基対等のようなモノマーとヌクレオチドとの相互作用による一定のパターンを介して標的ポリヌクレオチドに特異的に結合できる。本発明のアンチセンス化合物は、側基又は張り出し部分を、いずれも高分子の基本的な繰り返し単位の一部として又はそれから分かれて含み、特異性、ヌクレアーゼ抵抗性、送達性又はその他の効率に関する性質（例えば、コレステリル基、アクリジンのような二本鎖インターカレーション、ポリLリジン、一以上のヌクレアーゼ抵抗性連結基（例えば、ホスホロチオエート等）での「末端キャッピング」）を増強することもできる。
【００８６】
例えば、増強された脂溶性及び／又はヌクレアーゼ分解に対する抵抗性が、インターヌクレオチドホスホジエステル連結のリン酸基の酸素をアルキル基又はアルコキシル基に置換することによって生じて、アルキルホスホネートオリゴヌクレオチド又はアルキルホスホトリエステルオリゴヌクレオチドが形成される。ヌクレアーゼ加水分解に対する増加した抵抗性、及び／又は増加した細胞の取り込みによって特徴付けられる一方、相補的な核酸配列と安定な複合体を形成する能力を保持しているような非イオン性オリゴヌクレオチドがある。アルキルホスホネートは、特に、ヌクレアーゼ分解に対して安定であり、脂質に可溶である。アルカリホスホネート オリゴヌクレオチドの調製は、Ts'oらの米国特許第4,469,863号に開示されている。本文献は、その全開示を参照により、本明細書中に援用される。
【００８７】
ヌクレアーゼ抵抗性は、ヌクレアーゼ抵抗性インターヌクレオシディック結合を提供することによって本発明のアンチセンス化合物により付与されることが好ましい。そのような結合が多数、当該分野で知られている。例えば、ホスホロチオエート：Zon and Geyser, 1991, Anti Cancer Drug Design, 6:539；Stecらの米国特許第5,151,510号；Hirschbeinの米国特許第5,166,387号; Bergotの米国特許第5,183,885号；  ホスホロジチオエート：Marshall et al., 1993, Science, 259, 1564；CaruthersとNielsenの国際出願PCT/US 89/02293号；  ホスホロアミデート：例えば、Rl及びR2が水素又はC-C3アルキルを有する-OP(=O)(NR1R2)-O-； Jager et al., 1988, Biochemistry, 27, 7237；Froehlerらの国際出願PCT/US90/03138号；ペプチド核酸：Nielsen et al., 1993, Anti-Cancer Drug Design, 8, 53；国際出願第PCT/EP92/01220号；メチルホスホネート：Millerらの米国特許第.4,507,433号；Ts'oらの米国特許第4,469,863号; Millerらの米国特許第4,757,055号；並びに様々なタイプのPキラル結合、特にホスホロチオエート、Stecらの欧州特許出願第506,242号(1992)及びLesnikowski, Bioorganic Chemistry, 21, 127.が挙げられる。付加的なヌクレアーゼ結合は、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニーロチオエート、ホスホロアニリデート、メチル及びエチルホスホトリエステルのようなアルキルホスホトリエステル、カルボキシメチルエステルのような炭酸、カルバミン酸、カルバミン酸モルフォリノ、3'-チオホルムアセタール、ジアルキル(C-Ce)-、又はジフェニルシリルのようなシリル、スルファミンエステル等を含む。それらをヌクレオチド内に導入するための前記結合及び方法は、多くの文献中に記載されている。例えば、一般には、Peyman and Ulmann, 1990, Chemical Reviews 90:543; Milligan et al., 1993, J; Med. Chem., 36, 1923；Matteucciらの国際出願第PCT/US91/06855号に概説されている。当該段落で引用した全ての文献の開示内容の全てを参照により本明細書に援用する。
【００８８】
ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性は、Dagle et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18, 4751の方法によるホスホロアミダイトを有する5’と3’の両末端においてインターヌクレオチド結合を修飾することによって達成することもできる。当該文献の全開示を参照により本明細書に援用する。
【００８９】
ホスホジエステル結合のリン類似体が本発明の化合物中に使用されるのが好ましい。例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデート、又はメチルホスホネートが該当する。ホスホロチオエートは、ヌクレアーゼ抵抗性結合として使用する上で、より好ましい。
【００９０】
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、インターヌクレオチドホスホジエステル結合内の酸素から硫黄への置換を含んでいる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、二本鎖形成のための有効なハイブリダイゼーションと実質的なヌクレアーゼ抵抗性とを組み合わせながら、電荷したリン酸類似体の水溶性を保持している。電荷は、受容体を介して細胞内取込み能力を付与すると考えられている（Loke et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., 86, 3474参照。本文献の全開示を、参照によって本明細書に援用する）。
【００９１】
好ましい連結基に加えて、本発明のアンチセンス化合物は、付加的修飾を含むことができる。例えば、ホウ素化された塩基（例えば、Spielvogelらの米国特許第5,130,302号を参照されたい）；コレステロール部分（例えば、Shea et al., 1990, Nucl. Acids Res., 18, 3777、又はLetsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6553を参照されたい）及びピリミジンの5-プロピニル修飾（例えば、Froehler et al., 1992, Tetrahedron Lett., 33, 5307を参照されたい）。本段落で述べた全文献の全ての開示内容は、参照により本明細書に援用される。
【００９２】
本発明のアンチセンス化合物は、従来の手段により、市販の自動DNA合成機（例えば、Applied Biosystems (Foster City, CA) model 380B, 392 or 394 DNA/RNA synthesizer）で合成することができる。ホスホロアミダイト化学が、例えば、以下の文献で開示されたように使用されることが好ましい。すなわち、Beaucage and Iyer, 1992, Tetrahedron, 48, 2223；Molkoらの米国特許第4,980,460号；Kosterらの米国特許第4,725,677号；Caruthersらの米国特許第4,415,732号；第4,458,066号； 及び第4,973,679号である。これらの文献の全開示内容を参照によって本明細書に援用する。
【００９３】
実施形態において、三重鎖の核酸形成が望まれる場合、標的配列の選択に制限がある。一般に、Hoogsteen型結合を介した第３鎖の結合は、二本鎖標的におけるホモピリミジン−ホモプリン主溝に沿い、最も安定である。一般に塩基トリプレットは、T‐A＊T又はC‐G＊Cモチーフを形成する（ここで、「‐」はWatson-Crickペアリングを示し、「＊」はHoogsteen型の結合を示す）。しかしながら、他のモチーフも可能である。例えば、Hoogsteen塩基対は、鎖の状態及び構成により、第３鎖（Hoogsteen鎖）と第３鎖が結合する二本鎖のプリン富化領域との間で平行配向及び逆平行配向を可能にする。特定の実施形態で記載されたように、三重鎖の安定性を最大にするため、さもなくば調節するために、適当な配列、配向、状態、ヌクレオシド型（例えば、リボースヌクレオシドを使用するか、デオキシリボースを使用するか）、塩基修飾（例えば、メチル化シトシン等）を選択するための非常に多くの指標が、文献中に記載されている。例えば、Roberts et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 9397；Roberts et al., 1992, Science, 258, 1463；Distefano et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1179；Merguy et al., Biochemistry, 30, 9791-9798 (1992); Cheng et al., J. Am. Chem. Soc, 114:4465-4474 (1992)；Beat and Dervan, Nucleic Acids Research, 20:2773- 2776 (1992)；Beat and Dervan, J. Am. Chem. Soc, 114:4976-4982; Giovannangeli et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89:8631-8635 (1992)；Moser and Dervan, Science, 238:645-650 (1987)；McShan et al., J. Biol. Chem., 267: 5712-5721 (1992); Yoon et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89:3840-3844 (1992)；及びBlume et al., Nucleic Acids Research, 20:1777-1784 (1992)を参照されたい。これらの全開示を参照により本明細書に援用する。
【００９４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、十分な長さにして、特異的結合が所望の標的ポリヌクレオチドでのみ生じ、他の偶発的部位で生じないことを確実にしなければならない。これについては、多くの文献で説明されている。例えば、Rosenberg et al., International application PCT/US92/05305；又はSzostak et al., 1979, Meth. Enzymol., 68, 419が挙げられる。これらの文献の全開示内容を参照により本明細書に援用する。長さの上方範囲は、いくつかの要素によって決定される。これらの要素には、不便さ、及び約30〜40ヌクレオチド長よりも大きい合成及び精製の費用、短いオリゴヌクレオチドよりも長いオリゴヌクレオチドのミスマッチに関する最大許容、結合又は特異性を増強する改変が存在するかどうか、二重鎖結合又は三重鎖結合のいずれが所望であるか等が含まれる。
【００９５】
一般に、本発明のアンチセンス化合物は、約１２〜のヌクレオチドの範囲にその長さを有している。約１５〜４０ヌクレオチドの範囲にその長さを有していることがより好ましい。約１８〜３０ヌクレオチドの範囲にその長さを有していることが最も好ましい。
【００９６】
通常、本発明の実施で用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの選択部分に対して完全に相補的な配列を有している。しかしながら、絶対的相補性は、特に長いオリゴマーでは必要ではない。したがって、本明細書で、標的ポリヌクレオチド「に相補的なヌクレオチド配列」とは、必ずしも標的セグメントと100％の相補性を有した配列を意味していない。通常、標的（例えばICBP90 mRNA）と安定した二本鎖を形成するのに十分な相補性を有するあらゆるオリゴヌクレオチドが適している。安定した二本鎖形成は、ハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドの配列及び長さ、並びに標的ポリヌクレオチドとの相補性の程度による。通常、ハイブリダイズしたオリゴマーが長ければ長いほど、ミスマッチが増加する可能性が高くなる。一以上のミスマッチは、約２１ヌクレオチド未満のアンチセンスオリゴマーでは恐らく生じないであろう。当業者は、あらゆる所与のアンチセンスオリゴマー及び標的配列間で許容することのできるミスマッチの程度を融点に基づいて、それにより生じる二本鎖の熱安定性を容易に決定することができる。
【００９７】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドによって形成されるハイブリッドの熱安定性は、融解曲線又は鎖解離曲線によって決定されることが好ましい。50％の鎖解離温度が融解温度Tmと解されており、安定性の簡便な測定を提供している。Tmの測定は、通常、標的及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを約1.0〜2.0μMの濃度で有する中性pHの食塩水中で行われる。典型的条件は、10mMのリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.0)又は10mM Tris-HClバッファー(pH 7.0)に溶解させた150mM NaCl及び10mM MgC12である。融解曲線に関するデータは、アンチセンスオリゴヌクレオチド／標的ポリヌクレオチド複合体のサンプルを室温から約85〜90℃に加熱することによって蓄積される。サンプルの温度が上昇するとき、260nmの吸光度が1℃間隔で（例えば、Cary (Australia) model IE、又はHewlett- Packard (Palo Alto, CA) model HP 8459 UVfVIS spectrophotometer並びにmodel HP 8910OA temperature controller、あるいは類似の機器を用いて）モニターされる。このような技術は、異なる長さ及び異なる組成のアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合力を測定し、比較する上で簡便な手段を提供する。
【００９８】
ICBP90の発現は、「RNA干渉」又は「RNAi」によって抑制することもできる。RNAiは、転写後の遺伝子調節方法であり、多くの真核生物間で保存されている。RNAiは、短い（すなわち、>３０ヌクレオチド）二本鎖RNA（「dsRNA」）分子によって誘導される（Fire A et al. (1998), Nature 391: 806-811）。
【００９９】
これらの短いdsRNA分子（「低分子干渉RNA」又は「siRNA」と呼ばれる）は、siRNAと配列相同性を共有するRNAを１ヌクレオチドにまで分解してその破壊を引き起こす(Elbashir SM et al. (2001), Genes Dev, 15: 188-200)。siRNAと標的RNAは、標的RNAを分解する「RNA誘導サイレンシング複合体（RNA-induced silencing complex）」又は「RISC」に結合すると考えられている。siRNAは、複数回転酵素（multiple-turnover enzyme）によく似て、どうやらリサイクルされるらしい。１siRNA分子は約1000RNA分子の分解を誘導できる。したがって、RNAのsiRNA介在RNAi分解は、標的遺伝子の発現を抑制するために現在利用可能な技術よりも効果的である。siRNAで誘導されるRNAiの特異性は、被験体の乳癌「個別化治療」が行えるように、被験体特異的な標的（例えば、ICBP90）アレルのターゲティングを可能にする。本発明のRNAiは、約１７ヌクレオチドから約２９ヌクレオチドの長さの、好ましくは約１９ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドの長さの、約１７ヌクレオチドから約２９ヌクレオチドの長さで、特定のRNA（例えば、ICBP90 RNA）を標的とする短い二本鎖RNAを含むことができる。siRNAは、センスRNA鎖と相補的なアンチセンスRNA鎖が共に標準的なWatson-Crick型塩基対相互作用（以下、「塩基対（合）」とする）によってアニールしたものを含む。以下でより詳細に説明されるように、センス鎖は、標的RNA内に含まれる標的配列と同一の核酸配列を含む。
【０１００】
このsiRNAのセンス及びアンチセンス鎖は、２本の相補的な一本鎖RNA分子を含み得る。あるいは、相補的な２つの部分が塩基対合し、一本鎖「ヘアピン」エリアによって共有結合で連結された単一分子を含み得る。いかなる理論にも縛られることなく、前記後者のタイプのsiRNA分子におけるヘアピンエリアは、「Dicer」タンパク質（又はその相同体）によって細胞内にて開裂され、２本の個別の塩基対合したRNA分子からなるsiRNAが形成される（上記Tuschl, T. (2002)参照）。
【０１０１】
本発明のsiRNAは、部分精製されRNA、十分に精製されたRNA、合成RNA、又は組換え技術により作製されたRNA、並びに、天然のRNAとは一以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は変化によって異なる変異RNAを含むことができる。前記変異は、非核酸物質の付加（例えば、siRNAの末端に、又は一以上のsiRNAの内部ヌクレオチドに）、siRNAをヌクレアーゼ分解抵抗性にする修飾、又はデオキシリボヌクレオチドを有するsiRNA中の一以上のヌクレオチドの置換を含み得る。本発明のsiRNAの一方又は双方の鎖は、3’オーバーハングも含むことができる。本明細書で使用する場合、「3’オーバーハング」とは、RNA鎖の3’末端から伸びる少なくとも一の非対合ヌクレオチドをいう。
【０１０２】
したがって、本発明のsiRNAは、１から約６ヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む）の長さ、好ましくは１から約５ヌクレオチドの長さ、より好ましくは１から約４ヌクレオチドの長さ、及び特に好ましくは約２から約４ヌクレオチドの長さの少なくとも１の3’オーバーハングを含むことができる。
【０１０３】
siRNA分子の両鎖が3’オーバーハングを含む実施形態において、オーバーハングの長さは、各鎖で同一又は異なるようにすることができる。最も好ましい実施形態では、3’オーバーハングは、siRNAの両鎖に存在し、２ヌクレオチドの長さである。例えば、本発明のsiRNAの各鎖はジチミジル酸（「TT」）、又はジウリジル酸（uu）を含むことができる。
【０１０４】
本siRNAの安定性を強化するために、3’オーバーハングを分解に対して安定にすることができる。一の実施形態で、オーバーハングは、アデノシン又はグアノシンヌクレオチドのようなプリンヌクレオチドを含むことで安定化される。
【０１０５】
あるいは、改変された類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換（例えば、3’オーバーハングのウリジンヌクレオチドの2'デオキシチミジンでの置換）は、許容され、またRNAi分解の効率には影響を及ぼさない。特に、2'デオキシチミジンの2’水酸基の欠如は、組織培養液中で3’オーバーハングのヌクレアーゼ抵抗性を顕著に増強する。
【０１０６】
本発明のsiRNAは、標的RNA中の約１９〜２５の連続したヌクレオチド（「標的配列」）のどんなストレッチをも標的とすることができる。一般に、標的RNA上の標的配列は、標的RNAに相当する所定のcDNA配列、好ましくは開始コドンから５０〜１００ヌクレオチド下流（すなわち、3’方向に）から始まるcDNA配列を選択することができる。一方、標的配列は、5’又は3’非翻訳領域に位置することや開始コドン近傍の領域に位置することができる。
【０１０７】
siRNA用の標的配列を選択するための技術は、当該分野では公知であり、例えば、Tuschl Tらの「The siRNA User Guide」（2002年10月11日改訂）に記載されている。本文献の開示内容の全てを、参照により本明細書に援用する。「The siRNA User Guide」は、Thomas Tuschl教授（Department of Cellular Biochemistry, AG 105, Max-Planck-Institute for Biophysical Chemistry, 37077 Gottingen, Germany）により管理されているウェブサイトにおいてワールドワイドウェブ上で入手することができ、あるいは、Max Planck Instituteのウェブサイトにアクセスすることで、又はキーワード「siRNA」で検索することで見つけることができる。したがって、本siRNAのセンス鎖は、標的RNA中の約１９〜２５ヌクレオチドのいずれの連続したストレッチとも同一のヌクレオチド配列を含む。
【０１０８】
本発明のsiRNAは、当該分野で公知の多くの技術を用いて得ることができる。例えば、siRNAは、当該分野で公知の技術を用いて化学的に合成すること又は組換え技術を用いて作製することができる（例えば、Tuschlらの米国公開番号第2002/0086356号に記載のDrosophilaインビトロシステムのように：本文献の全開示内容を参照により援用する）。
【０１０９】
本発明のsiRNAは、適当な保護されたリボヌクレオシドホスホロアミダイトと従来のDNA／RNA合成機を使用して化学的に合成されることが好ましい。合成RNA分子又は合成試薬のメーカーには、Proligo (Hamburg, Germany)、Dharmacon Research (Lafayette, CO, USA)、Pierce Chemical (part of Perbio Science, Rockford, IL, USA), Glen Research (Sterling, VA, USA)、ChemGenes (Ashland, MA, USA)及びCruachem (Glasgow, UK)が含まれる。
【０１１０】
あるいは、siRNAは、組換え環状又は直鎖上DNAプラスミドから適当なプロモーターを用いて発現させることもできる。本発明のsiRNAをプラスミドから発現させるための適当なプロモーターには、例えば、U6、又はH1 RNA pol IIIプロモータ配列及びサイトメガロウィルス プロモーターが含まれる。他の適切なプロモーターの選択は、当該分野の技術範囲内である。本発明の組換えプラスミドは、特定の組織又は特定の細胞内環境においてsiRNAを発現させるための誘導又は調節プロモーターを含むこともできる。
【０１１１】
組換えプラスミドから発現されたsiRNAは、培養細胞発現システムから標準的技術によって分離されるか、又は細胞内で発現させることができる。本発明のsiRNAを細胞にインビボで送達するための組換えプラスミドの使用については、以下に詳述する。
【０１１２】
本発明のsiRNAは、組換えプラスミドから、２本の分離した相補的RNA分子として、又は２つの相補的領域をもつ一本鎖RNA分子として発現させることもできる。
【０１１３】
本発明のsiRNAを発現するのに適したプラスミドの選択、プラスミド内へのsiRNA発現用の核酸配列の挿入方法、及び組換えプラスミドを目的の細胞に送達する方法は、当該分野の技術範囲内である。例えば、Tuschl, T. (2002), Nat. Biotechnol, 20: 446-448；Brummelkamp TR et al. (2002), Science 296: 550-553；Miyagishi M et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 497-500；Paddison PJ et al. (2002), Genes Dev. 16: 948- 958；Lee NS et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 500-505; and Paul CP et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 505-508を参照されたい。これらの文献の全ての開示内容を参照によって本明細書に援用する。
【０１１４】
本発明のsiRNAは、組換えウイルスベクターから細胞内でインビボにて発現させることもできる。本発明の組み換えウイルスベクターは、本発明のsiRNAをコードする配列、及びsiRNA配列発現用の任意の適当なプロモーターを含む。適当なプロモーターは、例えばU6又はHi RNA pot IIIプロモーター配列及びサイトメガロウイルスプロモーターを含む。他の適切なプロモーターの選択は、当該分野の技術範囲内である。本発明の組換えウイルスベクターは、特定の組織又は特定の細胞内環境においてsiRNAを発現させるための誘導又は調節プロモーターを含むこともできる。本発明のsiRNAを細胞にインビボで送達するための組換えウイルスベクターの使用については、以下に詳述する。
【０１１５】
本発明のsiRNAは、組換えウイルスベクターから、２本の分離した相補的RNA分子として、又は一本鎖RNA分子として発現させることができる。siRNA分子のコード配列を受容し、発現させることが可能なあらゆるウイルスベクターを使用することができる。例えば、アデノウイルス（AV）；アデノ関連ウイルス（AAV）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（LV）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス（AAV））；ヘルペスウイルス等に由来するベクターが挙げられる。ウイルスベクターのトロピズム（指向性）は、ベクターを他のウイルス由来のエンベロープタンパク質又は他の表面抗原でシュードタイピングすることによって改変することもできる。例えば、本発明のAAVベクターは、水泡性口内炎ウイルス（VSV）、狂犬病、エボラ、Mokola等由来の表面タンパク質でシュードタイピングすることができる。
【０１１６】
本発明での使用に適した組換えウイルスベクターの選択、ベクター内へのsiRNA発現用核酸配列の挿入方法、及びウイルスベクターを目的の細胞に送達する方法は、当該分野の技術範囲内である。例えば、Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis MA (1988), Biotechniques 6: 608-614；Miller AD (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14；Anderson WE (1998), Nature 392: 25-30；及びRubinson DA et al., Nat. Genet. 33: 401-406を参照されたい。これらの文献の全ての開示内容を、参照により本明細書に援用する。
【０１１７】
好ましいウイルスベクターは、AV及びAAVに由来するベクターである。特に好ましい実施形態において、本発明のsiRNAは、２本の分離した相補的な一本鎖RNA分子として、組換えAAVベクター（例えば、U6若しくはHi RNAプロモーター、又はサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターのいずれかを含む組換えAAVベクター）から発現される。本発明のsiRNAを発現するのに適したAVベクター、組換えAVベクターを構築する方法、及びベクターを標的細胞へ送達する方法は、Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006 1010に記載されている。本発明のsiRNAを発現するのに適したAAVベクター、組換えAVベクターを構築する方法、及びベクターを標的細胞へ送達する方法は、Samulski R et al. (1987), J: Virol. 61: 3096-3101；Fisher KJ et al. (1996), J: Virol., 70: 520-532, Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826；米国特許第5,252,479号; 米国特許第5,139,941号；国際特許出願WO94/13788号；及び国際特許出願WO 93/24641号に記載されている。これらの文献の全ての開示内容を、参照により本明細書に援用する。
【０１１８】
ICBP90発現は、抗ICBP抗体及び抗ICBPアプタマーのような化合物によってタンパク質レベルで抑制することもできる。抗ICBP90抗体は、ICBP90アミノ酸配列（例えば、上記GenBank Accession No. AB 126777で提供されるような配列）、その免疫原性断片を用いて標準的な技術によって作製することができる。抗体は、所定の被験体から単離された、又は所定の被験体から単離されたICBP90 cDNAから発現されたICBP90タンパク質から作製することもできる。
【０１１９】
抗ICBP90抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又はICBP90タンパク質のエピトープを結合することのできる抗体断片を含み得る。このような抗体は、キメラ、一本鎖、及びヒト化抗体、並びにFab断片及びFab発現ライブラリーの産物を含む。
【０１２０】
ポリクローナル抗ICBP90抗体は、動物を十分に精製したICBP90タンパク質又はその免疫原性断片で、当該分野で公知の技術を用いて免疫接種することによって作製することができる。Fab抗体断片のような抗体断片は、その断片の元となった抗体の抗原に選択的に結合するためのいくつかの能力を保持しており、これは、当該分野で周知の方法を用いて作製することができる。いくつかの方法は、米国特許第5,876,997号に大まかに記載されている。本文献の全ての開示内容を参照によって本明細書に援用する。
【０１２１】
モノクローナル抗ICBP90抗体は、Mishell, BB et al., Selected Methods In Cellular Immunology, (Freeman WH, ea.) San Francisco, 1980の方法を用いて調製することができる。本文献の全ての開示内容を参照によって本明細書に援用する。簡単に言えば、ペプチドがBalb/Cマウスの脾臓細胞を免疫するのに用いられる。免疫された脾臓細胞は、ミエローマ細胞と融合される。脾臓細胞とミエローマ細胞の特徴を含む融合細胞は、HAT培地における成長によって単離される。本培地は、両親細胞を殺すが、融合した産物は生存と成長が可能である。
【０１２２】
ICBP90、pRb2/p130複合体又はDNAメチルラーゼタンパク質を抑制する化合物を、上記DNA脱メチル化剤の項で説明したように、医薬組成物中に製剤化することができる。前記化合物、又はその医薬組成物の有効量を使用して、癌を治療するのに又は腫瘍細胞の増殖を抑制するのに使用することができる。本明細書で使用する場合、「ICBP90、pRb2/p130複合体又はDNAメチルラーゼタンパク質を抑制する化合物の有効量」とは、腫瘍細胞の増殖を抑制するのに十分な量のことである。
【０１２３】
ICBP90、pRb2/p130複合体又はDNAメチルラーゼタンパク質のインヒビターの有効量、投与量域、及び投与計画は、当業者であれば（例えば、被験体の体長、健康状態、年齢、性別、及び疾患浸透度を考慮して、また前記インヒビターを被験体に投与する間にわたり、徴候の改善を観察しながら）容易に決定することができる。前記化合物及びその医薬組成物を被験体に上記DNA脱メチル化剤の項で説明したように投与することができる。
【０１２４】
本方法を使用して、癌由来の腫瘍細胞を検出すること若しくは癌を診断すること、又は少なくとも一の以下に挙げる組織学的サブタイプの腫瘍細胞、すなわち、肉腫（結合組織及び中胚葉起源の他の組織の癌）、黒色腫（色素性メラノサイト由来の癌）、癌腫（上皮起源の癌）、腺癌（腺上皮起源の癌）、神経細胞を起源とする癌（神経膠腫/グリア芽腫、及び星状細胞腫）、及び白血病及びリンパ腫のような血液学的新生物（例えば、急性リンパ性白血病及び慢性骨髄性白血病）の増殖を抑制することができる。
【０１２５】
本発明を使用して、癌由来の腫瘍細胞を検出すること若しくは癌を診断すること、組織学的サブタイプに関係なく少なくとも以下の器官又は組織を起源とする腫瘍細胞、すなわち胸部；雄（男性）及び雌（女性）の泌尿生殖器系（例えば、尿管、膀胱、前立腺、睾丸、卵巣、子宮頚部、子宮体部、膣）の組織；肺；胃腸系（例えば、胃、大腸及び小腸、結腸、直腸）の組織；すい臓及び副腎のような外分泌腺；口及び食道の組織；脳及び脊髄；腎臓（腎臓の）；すい臓；肝胆道系（例えば、肝臓、胆嚢）；リンパ系；平滑筋及び横紋筋；骨及び骨髄；皮膚；並びに目（例えば、網膜芽細胞腫）の組織の増殖を抑制することができる。
【０１２６】
本方法を使用して、発症のあらゆる予後の段階（例えば、「全段階分類」（「ローマ数字」で呼ばれる）又は「腫瘍リンパ節転移：Tumor, Nodes, and Metastases」(TNM)段階システムによって判断される）における腫瘍から癌若しくは腫瘍由来の細胞を検出すること又は癌若しくは腫瘍を診断すること、あるいは腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。所定の癌に関する適切な予後段階システム及び段階及び段階の説明は当該分野で公知である。例えば、国立癌研究所（National Cancer Institute）の「CancerNet」インターネットウェブサイトで説明に記載されている。
【０１２７】
本発明で使用する場合、「腫瘍細胞の増殖を抑制する」こととは、腫瘍細胞を殺すこと、又は永久的に若しくは一時的に腫瘍細胞の成長を停止することを意味する。腫瘍細胞増殖の抑制は、被験体に腫瘍細胞数が本発明の化合物若しくは医薬組成物の投与後に不変で残っているか、減少しているという条件で推測することができる。腫瘍細胞増殖の抑制は、腫瘍細胞の絶対数は増加しているが腫瘍増殖率は減少している場合にも察することができる。被験体の体内における腫瘍細胞の数は、直接的な測定によって、又は原腫瘤若しくは転腫瘤の大きさからの見積もりによって決定することができる。腫瘤の大きさは、例えば、直接的な目視観察によって、又はX線、磁気共鳴画像、超音波及びシンチグラフィーのような画像診断方法によって確認することができる。このような画像診断方法は、造影剤とともに、又は造影剤なしに使用することができる。腫瘍瘤のサイズは、物理的手段（例えば、腫瘤の触診、又はカリパスのような測定器を用いた腫瘤の測定）によって解明することができる。
【０１２８】
ここで、本発明を以下の非限定的な実施例によって説明する。
【実施例】
【０１２９】
実施例１及び２において使用された材料及び方法
組織学的評価のための症例選択及び組織の処理
計１０個の眼球網膜芽細胞腫及び有痛性絶対緑内障により摘出を受けた患者から得られた３つの正常な網膜サンプルに由来する前処理済み外科標本パラフィンワックス塊が、イタリアのシエナ大学のDepartment of Human Pathology and Oncologyで収集されていた。組織を切断し、緩衝化した4%アガロースホルムアルデヒド溶液（pH7.4）中で固定した。従来の組織学に従い、4μm厚切片を前処理したパラフィンワックス塊から得た。そして、ヘマトキシリン（hemalum）及びエオシン、ギムザ、過ヨウ素酸シッフ（PAS）、Gomori鍍銀法、並びにFeulgen法で染色した。
【０１３０】
免疫組織化学
３μm厚で切断した網膜芽細胞腫組織の連続切片を免疫染色した。関連性のない３人の患者に由来する正常網膜の組織サンプルをコントロールとして用いた。En VisionTM +HRP法（Dako, Milan, Italy）を用いて、免疫組織化学的反応産物を視覚化した。抗原回復（Antigen retrieval）は、脱パラフィンした切片を1mM EDTA（pH 8.0）中で5分間電子レンジを用いて処理することにより行った。続いて、室温で冷却し、抗体と共にインキュベーションした。モノクローナル抗体として抗pRb2/pl30をTransduction Laboratories (Lexington, KY, USA)から入手し、TBSで1：100に希釈して用いた。１次抗体を、正常マウス血清と置き換えたものをネガティブコントロールとした。正常ヒト扁桃腺をポジティブコントロールとして用いた。
【０１３１】
レーザーキャプチャーマイクロダイゼクション及びDNA抽出
３つの正常ヒト網膜及び７つの網膜芽細胞腫が保存されたパラフィン固定組織をヘマトキシリン及びエオシン(H&E)染色切片で同定し、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(Arcturus PixCell IITM MWG-BIOTECH, Florence, Italy)で分離した。選択されたサンプルを、CapsureTM転写フィルムに付着させた。CapsureTM転写フィルムキャリアを直接、分解バッファ（0.04% Proteinase K、10mM Tris-HCL (pH 8.0)、1mM EDTA及び1% Tween-20を含む50μlのバッファ）の入った標準微量遠心チューブの中に入れた。チューブを直立状態で37℃オーブン内にて5分間予熱した。その後、分解バッファがキャップ上の組織にも触れるように上下反転して置いた。サンプルを37℃で一晩インキュベーションして、5分遠心した後、キャップを除いた。サンプルを95℃で８分間加熱し、Proteinase Kを失活させ、これを直接PCR用鋳型として用いた。ゲノムDNAを、３つの凍結網膜芽細胞腫サンプル、Weri-Rb1細胞、及び１５人の健常ドナーから得た血液サンプルから、標準使用説明書に従って抽出した。
【０１３２】
RB2/p130変異解析及びメチル化特異的PCR(methylation-specific PCR:MSP)解析
マイクロダイセクションした原発腫瘍及びWeri-Rb1細胞（培養については下記）から抽出されたゲノムDNAのPCRを、RB2/p130の変異解析に関して行った。全２２エクソンをアニーリング温度55℃で増幅し（プライマーのリストについては、表２を参照）、配列決定を行った。１０個の網膜芽細胞腫及びWeri-Rb1細胞のメチル化状態を、転写開始部位(ATG)のすぐ5’側、エクソン１及びイントロン１内部のCpG領域について確認した。３つの領域がCpG WareTM プライマー設計ソフト(Intergen, Purchase, NY, USA)を用いて同定された。解析は、DNA modification CpGenome Kit(Intergen, Purchase, NY, USA)による亜硫酸水素修飾後のメチル化DNAと非メチル化DNA間のDNA配列の相違に基づく。亜硫酸水素反応は、使用説明書に従って行われた。その後PCRを、メチル化（Tm=66℃）、非メチル化（Tm=61℃）及び野生型（Tm=68℃）間を識別するために設計された特異的プライマーを用いて実行した（プライマーのリストについては表３を参照）。PCR産物は、2.5％アガロースゲルで解析した。
【表２】
2009501024.tif 000003
【０１３３】
【表３】
2009501024.tif 000004
【０１３４】
Weri-Rb1細胞株及び5-Aza-2-dc DNAメチルトランスフェラーゼインヒビター処理
American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)から入手したヒト網膜芽細胞腫細胞株（Weri-Rb1）を、10％FCSを添加したRPMI1640で１週間に一度1：2の回転率で培養した。2.5μmの5-Aza-2-dc（DNAメチルトランスフェラーゼインヒビター）(Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA)を処理細胞の培地に添加した。
【０１３５】
細胞生存率(MTT)及びFACS解析
定量的細胞生存率を細胞増殖キット（MTT）(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)を用いて比色分析により測定した。計5000細胞／ウェルのWeri-Rb1細胞及び5-Aza-2-dc処理済Weri-Rb1を、マイクロタイタープレート（96ウェル）において最終容量100μlの培地で育てた。細胞培養のインキュベーション期間は、2.5μMのDNAメチルトランスフェラーゼインヒビターの存在下、又は非存在下で２４、４８、及び９６時間とした。インキュベーション期間後、10μlのMTT標識した試薬を各ウェルに添加し、最終濃度を0.5μg/mlとした。MTTは、成長中の細胞によって開裂され、ホルマザン結晶体（formazan crystal）を形成する。この結晶体は、550nmにおける分光高度分析（ELISA）によって細胞生存率の定量化を可能にする。細胞生存率を、薬剤処理した及び未処理の細胞の吸光度の０時間の未処理細胞に対するパーセンテージとして表した。FACS解析を、5-Aza-2-dcで処理した細胞を未処理（コントロール）細胞と比較して培養２４、３６、４８、７２及び９６時間後に行った。
【０１３６】
ウェスタンブロッティング
pRb/p105及びpRb2/p130のウェスタンブロット解析を、３つの新しい原発腫瘍サンプル（サンプル８〜１０）で行った。Weri-Rb1細胞及び有痛性絶対緑内障により摘出を受けた患者から得た正常網膜サンプルの一つを実験コントロールとして用いた。新鮮な組織を液体窒素中で直ちに凍結させた。さらに、5-AZA-2-dcを用いて様々な時間で処理した及び未処理のWeri-Rb1細胞を、ウェスタンブロット解析用に処理した。全組織溶解物を、ホモジナイズした組織及び細胞小粒を溶解バッファー（50mM Tris/HCl、5mM EDTA、250mM NaCl、50mM NaF、0.1% Triton X-100、0.1mM Na3VO4に新たに調製したインヒビターを加えたもの）中に再懸濁することにより調製した。100μgの総抽出物を等量、ロード(積載)し、7又は10％SDS-PAGEで分離した。その後、ゲルをニトロセルロースフィルター上に転写し、0.1％のポンソーレッドを用いて確認した。ポリクローナル抗pRb/p105(C15) (Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA)及びモノクローナル抗pRb2/p130 (Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA)を、それぞれ1：300及び1：500の希釈で用いた。モノクローナル抗p53(Ab6)(Calbiochem, Cambridge, MA, USA)を、1：1000の希釈で用いた。一方、モノクローナル抗E2Fl (KH95)、ポリクローナル抗E2F4(C20)及びポリクローナル抗p73(H79) (Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA)を、1：200の希釈で用いた。抗アクチン抗体(Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA)を使用説明書に従ってローディングコントロールとして用いた。
【０１３７】
実施例１−変異状態に関するpRb2/p130発現レベルの有意性
実験は、１０個の網膜芽細胞原発腫瘍（２つは家族性で、８つは散発性）、Weri-Rb1細胞、及び３つの正常網膜サンプルで行われた。pRb1/p105及びpRb2/p130タンパク質発現レベルを、ウェスタンブロット解析により、正常網膜(NR)、３つの凍結された散発性網膜芽細胞腫サンプル（サンプル８〜１０）、及びWeri-Rb1細胞(W)で評価した。データを図３ａに示す。この図では、pRb1/p105発現の欠如及びpRb2/p130の下方制御が、原発腫瘍とWeri-Rb1細胞で見られる。pRb2/p130の下方制御は、パラフィン包理組織由来の切片上で、７つの網膜芽細胞腫のケースまで広げられた免疫組織化学解析により確認された（図３ｂ及び３ｃ）。さらに、この解析は、各患者間のpRb2/p130発現レベルにおける相違を明らかにした（上記表１参照）。特に、下方制御は１０サンプル中４サンプルで検出された。一方、４つケースで、pRb2/p130は、発現しておらず、残りの２ケースは正常網膜との違いがなかった。本結果と臨床病理学的分類間の唯一の相互関係は、正常網膜との区別ができなかった２つのサンプルが両眼家族性網膜芽細胞腫(B/F)患者に起因していたということであった。
【０１３８】
pRb2/p130発現レベルにおける違いが変異パターンの違いに依存するか否かを確認するため、DNAサンプルをRB2/p130コード領域における変異について２２個のRB2/p130エクソンを増幅できる、適切に設計されたプライマー（上記表２）を用いてスクリーニングした。正常網膜由来の組織及び腫瘍標本をレーザーキャプチャーマイクロダイセクションによって分離した（図３ｄ〜ｆ）。そして、DNAを抽出し、PCRによって処理した。PCR産物の配列を、野生型RB2/p130配列とマッチさせた（Gene Bank Accession Numbers X74594とU53220、及びMayol et al, 1993；Baldi et al, 1996を参照。前記文献の全開示内容を参照により本明細書中に援用する）。家族性網膜芽細胞腫患者の１人を除いて、２つのエクソン１変異が１７８番及び２５９番ヌクレオチド（TCT→CCT：SER→PRO及びCCC→GCC：PRO→ALA）において全ての原発腫瘍で検出された（表１、図３ｇ）。エクソン１変異は、正常網膜サンプル及び１５人の健常ドナーの血液サンプルのいずれからも検出されなかった（表１）。原発腫瘍において、明らかな相関関係が、RB2/p130の発現レベルとエクソン１ホモ接合性／ヘテロ接合性変異間で見られた。特に、発現の喪失は、二重ホモ接合性変異と相関しており（表１、サンプル３〜５、９）、また弱い発現が１７８番ヌクレオチドのヘテロ接合性変異及び２５９番ヌクレオチドのヘテロ接合性変異の存在と合致した（表１、サンプル６〜８、１０）。一方、両変異がヘテロ接合の場合、発現レベルは正常である（表２、サンプル２）。Weri-Rb1網膜芽細胞腫細胞株におけるRB2/p130の変異パターンのスクリーニングは、１０個の原発腫瘍中９個で観察された同じエクソン１のホモ接合変異を証明した。
【０１３９】
さらなる変異が原発腫瘍及びWeri-Rb1網膜芽細胞腫細胞株の両方で、RB2/p130エクソン４、６、１３、１６、及び２１において検出された（詳細は表１参照）。３つの付加的なホモ接合性サイレント変異が、エクソン１５及び１７においてコントロール（正常網膜及び健常ドナー）及び網膜芽細胞腫サンプル（原発腫瘍及びWeri-Rb1細胞）の両方に存在していた。さらなるホモ接合性サイレント変異が、エクソン１２において散発性網膜芽細胞腫腫瘍でのみ検出可能であった（８サンプル中６サンプル、表１参照）。これらの結果は、エクソン１５及び１７における２つのサイレント変異は集団中で自然発生した遺伝子多型であることを示唆し、一方、エクソン１２のホモ接合性サイレント変異は、散発性網膜芽細胞腫に特異的であり、腫瘍タイプを予測することを示唆している。
【０１４０】
実施例２−RB2/p130遺伝子発現における後成的イベントの役割
潜在的メチル化部位であるCpGアイランドは、広範囲に発現する遺伝子のプロモーター近辺及び通常は第１エクソンにわたってしばしば見られる。また、CpGアイランドは、転写開始部位から下流にも現れ得、正常細胞ではメチル化されていない。しかし、前記アイランドは、ヒトの癌において新たにメチル化される潜在的標的となるようである。
【０１４１】
それ故、実施例１に由来する全サンプルを、メチル化特異的PCR（MSP：methylation specific-PCR）アッセイにより、CpGジヌクレオチドの多い３つのRB2/p130領域の解析にフォーカスを当てて処理した。当該領域とは、すなわち、約−９５番〜約＋１７７番ヌクレオチドの、転写開始部位(ATG)のすぐ5’側に隣接するプロモーター領域（「領域１」)、エクソン１のほとんどを包含する、約＋１６７番〜約＋３０２番ヌクレオチドの領域（「領域２」）、及びエクソン１の3’末端とイントロン１の5’末端を包含する約＋２８７番〜約＋４１１番ヌクレオチドの領域（「領域３」）である。図２ｂでは、pRb2/p130発現レベルパターンの代表として選択された３つのサンプルから得られた結果（表１のサンプル２、３及び８）を報告している。図２ｂで示すように、pRb2/p130発現レベルが正常(+++)であるとき、３つの検査領域は全てメチル化されていなかった。(U1、U2及びU3)。発現の欠損(-)は、領域１、２及び３のメチル化と一致した（M1、M2及びM3）。一方、下方制御(+)は、領域３のメチル化とだけ相関した（表１）。これらの結果は、エクソン１の変異パターンが、遺伝子のメチル化に対する感受性を確立することができ、それが言い換えれば、タンパク質の発現レベルを決定することを示唆している。
【０１４２】
RB2/p130メチル化の原因となる転写ブロックの除去が内在性pRb2/p130の発現レベルを変えるかどうか、及びその癌抑制機能が回復するかどうかを検証するために、Weri-Rb1細胞をDNAメチルトランスフェラーゼインヒビター5-アザ-2-デオキシシチジン (5-Aza-dC)で処理した。Weri-Rb1細胞で得られたデータは、このモデルでは、メチル化の、ひいてはRB2/p130発現レベルのパーセンテージが、原発腫瘍で見られたようなメチル化状態との相関関係がないことを示した。しかし、脱メチル化剤の効果は、この利用できる唯一の実験モデルに関して十分に調べることができた。
【０１４３】
処理継続時間の関数としてWeri-Rb1細胞増殖における脱メチル化剤の効果を図４ａに示している。本図から明らかなように、細胞数が顕著に減少したときに、増殖率の有意な差異が処理の９６時間後に検出できた。FACS解析により、全細胞数の減少は、アポトーシスを生じた細胞の量の増加（処理細胞の20％に対してコントロールの6％）に一致した。さらに、G1期停止細胞の優位性は、既に２４時間後に検出された処理細胞の40％に対してコントロールの30％）。ウェスタンブロット解析は、細胞増殖の脱メチル化処理の効果が９６時間の細胞培養後に得られたコントロールに対する内在性pRb2/p130の発現の増加と同時に起こることを示した。
【０１４４】
以下の材料及び方法は、実施例３及び４で使用された。
【０１４５】
細胞培養及び処理
細胞株は、American Type Culture Collection (Rockville, MD)から購入した。細胞をDMEM又はRPMI1640培地に10％のウシ胎児血清及び2mM L-グルタミンを添加して培養した。トリートメントに関しては、細胞を5×105細胞/100mm組織培養用ディッシュの密度で播種した。2.5μMのDNAメチルトランスフェラーゼインヒビター（5-アザ-2-デオキシシチジン）を96時間まで培地に添加した。
【０１４６】
H23細胞におけるRB2/p130 mRNA及びタンパク質発現レベルの解析
ヒト非小細胞肺癌(H23)細胞株由来の全RNAを、TRIzol (Life Technologies)を用いて、使用プロトコルに従って抽出した。RNAをホルムアルデヒド(Sigma)アガロースゲル(Kodak)で電気泳動した後、Hybond N+ナイロンメンブレン(Amersham)に一晩転写した。続いて、フィルターをＵＶでクロスリンクした。メンブレンをランダムプライマー標識したcDNAプローブ（RB2/p130断片）でハイブリダイズした後、洗浄し、Kodak X-rayフィルムに−80℃で露光した。RB2/p130 mRNAレベルを、GAPDH mRNAレベルで標準化した。
【０１４７】
pRb2/p130のウェスタンブロット解析を、未処理及び5-アザ-2-デオキシシチジン処理したH23細胞由来の全タンパク質溶解物を用いて行った。全細胞溶解物を溶解バッファー（50mM Tris/HCl、5mM EDTA、250mM NaCl、50mM NaF、0.1% Triton-X、0.1mM Na3VO4に新たに調製したインヒビターを加えたもの）中で調製した。100μgの総抽出物を等量、ロードし、7又は10％SDS-PAGEで分離した。その後、ゲルをニトロセルロースフィルター上に転写し、0.1％のポンソーレッドを用いて確認した。モノクローナル抗pRb2/p130 (Transduction Laboratories, KY, USA)を、1：800の希釈で用いた。
【０１４８】
RB2/p130変異解析及びメチル化特異的PCR(MSP)アッセイ
H23細胞に由来する高分子量のゲノムDNAをQiamp Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA)を用いて使用プロトコルに従って得た。ゲノムDNAのPCRを用いて、RB2/p130の変異解析を行った。２２個のエクソン全てをPCRで増幅し（プライマー配列については上記表２を参照）、上記実施例１に記載のように配列決定を行った。
【０１４９】
RB2/p130の領域１、２及び３のメチル化状態を、メチル化特異的PCR（MSP）アッセイ(CpGenome, Intergene, NY, USA)を用いて、上記のように評価した。プライマーは、特異的に設計されており、メチル化（Tm=66℃）、非メチル化（Tm=61℃）及び野生型（Tm=68℃）を識別する（図３ａ及びｂ）。ＰＣＲ産物を2.5％アガロースゲルで解析した（上記表３参照）。
【０１５０】
Multiplex RT-PCR
Multiplex RT-PCR解析を、処理済及び未処理のH23細胞由来の0.2μgの総RNAで実行した。PCRを、RB2/p130プライマー及びβアクチン特異的プライマー(Superscript RT-PCR System, Invitrogen)を用いて行った。
【０１５１】
実施例３−RB2/p130の変異解析
非小細胞肺癌H23細胞株におけるRB2/p130 mRNA及びタンパク質双方の低い発現レベル（図５ａ及びｂ）がRB2/p130遺伝子に生じた遺伝的変異によるものかどうかを調べるため、H23 DNAを、RB2/p130コード領域中の変異について、上記実施例１に記載したような２２個の各エクソンを増幅できる、適当に設計したプライマーを用いてスクリーニングした。１７８番及び２５９番ヌクレオチドにおけるエクソン１の２つのホモ接合変異は、H23細胞で見い出された（図５ｃ及びｄ）。これらの変異が腫瘍表現型と関連することを確認するため、RB2/p130エクソン１のヌクレオチド配列を以下の癌細胞株及び原発腫瘍、すなわち、Tリンパ芽球白血病(CCRF-CEM, Molt-1及び Jurkat)、Bリンパ芽球白血病(Daudi)、慢性骨髄性白血病(K562)、乳癌(SK-Br3とMCF-7)、網膜芽細胞腫(Weri-Rb1)及び大腸癌(HT29)細胞株、並びに網膜芽細胞腫、卵巣、大腸及び子宮内膜の各原発腫瘍でスクリーニングした。これら全てのサンプルの中で、エクソン１のホモ接合変異は、１７８番と259番のヌクレオチドで検出された（図５ｃ及びｄ）。
【０１５２】
１７８番及び２５９番ヌクレオチドにおけるエクソン１のホモ接合変異は、腫瘍部位からできる限り離れた隣接非腫瘍域で採取された同一被験体に由来する、（組織学によって確認したとき）外見が正常な子宮内膜組織においても存在していた。さらに、H23細胞では、変異はエクソン２から２２までには見られなかった。加えて、変異は、腫瘍性疾患の影響を受けない患者由来の、及び１５人の健常ドナー由来の血液サンプルにおける、正常な網膜、肺、卵巣、子宮内膜、胸部及び大腸組織では見られなかった。
【０１５３】
実施例４−H23細胞のRB2/p130のメチル化状態及びRB2/p130発現の回復
H23細胞のRB2/p130遺伝子のメチル化状態を上記実施例２に記載したように調べた。メチル化特異的PCR(MSP)アッセイを行うことによる、H23細胞におけるRB2/p130の領域１（−９５〜＋１７７番）及び領域３（＋２８７番〜＋４１１番）のメチル化（図６）。
【０１５４】
また、RB2/p130発現におけるDNAメチルトランスフェラーゼインヒビター5-アザ-2-デオキシシチジンの効果を、5-Aza-dC処理がH23細胞の内在性RB2/p130の発現を回復させるのに十分であるかどうかを含めて評価した。処理後異なる時点におけるRB2/p130 mRNA及びタンパク質発現レベルの双方における5-Aza-dCの効果を、図７ａ及び７ｂに示した。multiplex RT/PCRを用いることで、RB2/p130 mRNAレベルの増加が5-Aza-dC処理後４８時間から観察された（図７ａ）。さらに、pRb2/p130タンパク質レベルの増加は、活性の低リン酸化型において、5-Aza-dC処理後７２時間で観察され、９６時間で最大に達した（図７ｂ）。これらのデータは、後成的イベントが、非小細胞肺癌H23細胞でRB2/p130転写を下方制御することで起こり得ることを示している。
【０１５５】
実施例５〜９で使用された材料及び方法
組織の入手と細胞培養
通常の白内障手術を受けた患者由来の１２対の正常ヒト角膜及び結膜生検をDelaware Valley Lions Eye Bankから入手した。インフォームドコンセントは、ペンシルバニア大学施設内倫理委員会の規則に従い患者から得られた。初代角膜及び結膜細胞株を、以前にWilliams et al, 1999, Investigative Ophthalmology & Visual Science 40 (8): 1669-1675に記載されたようにして、生検から起こした。本文献の全開示内容を、参照により本明細書に援用する。初回〜６回目の継代間の細胞を本実験に使用した。
【０１５６】
Multiplex RT-PCR
全RNAを対を成す正常ヒト初代角膜及び結膜細胞から、RNeasy kit (Qiagen)を使用説明書に従って用いることにより抽出した。さらなる使用の前に、抽出したRNAを増幅用グレードのDNaseI(1U DNase/1mg 全RNA；Life Technologies)で処理した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（「RT-PCR」）をReverse Transcription System (Promega)を用いて実行した。Multiplex RT-PCRを1/100のcDNAと以下の各反応用プライマー群、すなわち、PAI-2：5'-tgacaaactcaacaagtgga-3'（フォワード；配列番号６８）、5'-tgcataagataaccaactgc-3'（リバース；配列番号６９）；βアクチン：5'- tgacgggctcacccacactgtgccca-3'（フォワード；配列番号７０）、5'-ctagaagcatttgcggtggacgatgg-3'（リバース；配列番号７１）を用いて実行した。βアクチンとPAI-2のそれぞれのプライマー比は、0.3:2.0である。増幅断片を、1.5％(w/w)アガロースゲル電気泳動で検出した。各バンドを定量化し、特定の遺伝子発現レベルを、PAI-2バンド由来の密度値の比率βアクチンで表される内部標準に対して算出することによって半定量的に決定した。
【０１５７】
ウェスタンブロット及びクロマチン免疫沈降アッセイ
細胞質タンパク質及び核タンパク質を１２組の対を成す正常ヒト角膜及び結膜上皮細胞から、PARIS kit (Ambion)を使用説明書に従って用いることにより抽出した。有効な細胞質分画及び核分画を、細胞質分画については抗GAPDH抗体を、また核分画については抗Oct-1抗体を使用してウェスタンブロッティング解析により確認した。免疫沈降実験を細胞質分画及び核分画を用いて免疫沈降用抗体としてPAI-2(N-18, Santa Cruz Biotechnology, CA)で行った。PAI-2核及び細胞質の両沈降物におけるpRb2/p130、Rb1/p105及びp107の存在を、抗pRb2/p130、抗Rb1/p105及び抗p107抗体（それぞれ211.6、C-15及びC-18；Santa Cruz Biotechnology, CA）を用いてウェスタンブロッティングにより評価した。
【０１５８】
クロスリンククロマチン免疫沈降（「XchIP」）
XChIPsを、以前にMacaluso et al, 2003, Oncogene 22(42): 6472-6478に記載されたようにして行った。本文献の全開示内容を参照により本明細書に援用する。角膜及び結膜細胞をホルムアルデヒド（最終濃度1％）を直接培地に添加することでクロスリンクし、37℃でインキュベーションした。免疫沈降を3〜4μgのpRb2/p130、Rb1/p105、p1O7、E2F1、E2F4、E2F5、DNMT1、p300、PAI-2 (Santa Cruz Biotechnology)、HDAC1、SUV39H1(Upstate Biotechnology)又はICBP90に対する抗体を用いて行った。ネガティブコントロールとして、抗体なしの免疫沈降と無関係の抗体を用いた免疫沈降の両方を行った。クロスリンクを、サンプルを65℃で一晩インキュベーションすることによって解除し、DNAをフェノール：クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。PAI-2プロモーターの特定の領域にわたるプライマーをPCR反応に用いた（Pl：5'-atacccgaagaaaattagga-3'（フォワード；配列番号７２）；P2：5'- aagttgcagttctaacgtaga-3'（リバース；配列番号７３）；GenBank accession no. M22469参照。これら全開示内容を参照により本明細書に援用する）。1%の全クロマチン（「Input」）をポジティブコントロールとして使用した。
【０１５９】
実施例５−MCF-7、MDA-MB-231及びMDA-MB-361におけるICBP90のタンパク質発現レベル
乳癌細胞株MCF-7、MDA-MB-231及びMDA-MB-361をATCCから入手し、標準的な増殖条件と培地を用いて培養した。全細胞溶解物を角膜及び結膜細胞について上記したようにして得た。そして、その溶解物を先で説明したように、抗ICBP90抗体を用いてウェスタンブロット解析にかけた。βアクチンを抗βアクチン抗体で検出しローディングコントロールとした。その結果を図８に示す。
【０１６０】
実施例６−MCF-7、MDA-MB-231及びMDA-MB-361細胞の核及び細胞質分画におけるpRb2/p130とICBP90間の相互作用
MCF-7、MDA-MB-231及びMDA-MB-361細胞由来の全細胞溶解物を実施例5のようにして得た後、核及び細胞質分画を分離した。各分画を抗pRb2/p130抗体で免疫沈降し、免疫沈降物を抗ICBP90抗体を用いてウェスタンブロット解析にかけた。図9で示すように、ICBP90は、培養MCF-7、MDA-MB-231及びMDA-MB-361細胞の核分画においてpRb2/p130と会合する。一方、ICBP90は、pRb2/p130と培養MCF-7細胞の細胞質分画においてのみ会合する。
【０１６１】
実施例７−MDA-MB-231細胞におけるER-αプロモーターへのICBP90のインビボ結合
MDA-MB-231 cellsをXChIP解析のためホルムアルデヒドで上記のようにクロスリンクした。図１０ａで示したように、エストロゲン受容体（「ER」）-αプロモーター領域１及び２に隣接するプライマーを用いて、抗ICBP90抗体で免疫沈降したクロマチンを増幅した。図１０ｂで示すように、ICBP90は、エストロゲン受容体αプロモーター領域１と結合するが、領域２とは結合しない。
【０１６２】
いかなる理論に縛られることなしに、図８、９及び１０で示された結果は、pRb2/p130が細胞質と核間のICBP90の生化学的バランスを制御することができ、そしてICBP90とpRb2/p130は、遺伝子転写を制御する共通の機構に関与し得ることを示している。例えば、MCF-7細胞では、pRb2/p130は、ICBP90を細胞質内において核内の濃度よりも低い状態で保持し、ひいてはその機能を制限することができる。MDA-MB-231細胞では、核内の高濃度のICBP90がエストロゲン受容体（「ER」）-αプロモーターにおける特定のメチル化部位へのICBP90の結合を可能にするはずである。したがって、ICBP90とpRb2/p130間の相互作用は、DNMT1のMDA-MB-231におけるpRb2/p130複合体への動員に、またER-αプロモーター領域周辺へのDNMT1の動員に関与することができる。したがって、ICBP90は、クロマチンリモデリングの第１ステップの一つであるH3をユビキチン化するE3リガーゼとなり得、その後のER-αプロモーター上でDNMT1の動員を可能にする。これに伴うヒストン脱アセチル化及びメチル化、並びにDNAメチル化は、遺伝性の印を作り出し、長期サイレンシングのヘテロクロマチン状態を確立することができる。
【０１６３】
実施例８−抗PAI-2抗体は、正常初代ヒト角膜及び結膜上皮細胞の細胞質及び核においてpRb2/p130及びRb1/p105を免疫共沈降するが、P107はしない
PAI-2が網膜芽細胞腫ファミリーのタンパク質群と会合するかどうかを評価するため、PAI-2を１２対の組を成す正常初代ヒト角膜及び結膜上皮細胞の核及び細胞質溶解物から免疫沈降した。その後、免疫沈降物を抗pRb2/p130、抗Rb1/p105、抗p107及び抗PAI-2抗体を用いてウェスタンブロットにより解析した。解析した全ての細胞株について、抗PAI-2抗体は、pRb2/p130及びRb1/p105を核と細胞質の両分画から免疫共沈降した。一方、PAI-2とp107との間の結合は検出されなかった（図１２ａ）。角膜及び結膜の両細胞質分画から抗PAI-2抗体により免疫沈降したほとんどのpRb2/pl30が、高リン酸化型を示した（図１２ａ、上方バンド）。一方、相当する核分画では、ほとんどのpRb2/p130が低リン酸化型を示した（図１２ａ、下方バンド）。さらに、予想通り、抗PAI-2抗体は、PAI-2を全ての細胞株の核と細胞質の両分画から免疫沈降した（図１２ａ）。
【０１６４】
全細胞質溶解物を用いたウェスタンブロッティング解析は、角膜と結膜の両細胞がpRb2/p130、Rb1/p105、p107及びPAI-2タンパク質で同様のレベルを示すことを立証した（図１２ｂ）。核及び細胞質分画の純度を、抗GAPDH及び抗Oct1抗体をそれぞれ、細胞質及び核のマーカーとして用いることで確認した（図１２ｃ）。これらのデータは、正常ヒト角膜及び結膜上皮細胞におけるPAI-2とpRbファミリータンパク質群の特定のメンバー（pRb2/p130及びpRb1/p105）間の細胞質及び核の相互作用を示す。
【０１６５】
実施例９−pRb2/p130、E2F5、HDAC1、DNMT1、SUV39H1及びPAI-2は、インビボでPAI-2近位プロモーター領域と結合する
−２０６２及び−１６４３残基間の特定のPAI-2プロモーター断片は、細胞型独立様式でPAI-2プロモーター活性を抑制するネガティブ調節エレメントを規定し、推定E2F結合部位を含む（図１３ａ）；Ogbourne et al, 2001, Nucleic Acids Res. 29 (19): 3919-3927を参照。本文献の全開示内容を参照により本明細書に援用する。この情報は、図１２ａで示した結果とともに、pRbファミリーのタンパク質群がPAI-2プロモーター上にF2F因子の結合を介して動員されるかもしれず、またこの相互作用がPAI-2転写の制御（おそらくは、クロマチンリモデリングによる）において、生理学的意義を持ち得るという仮説を示唆した。これを調べるために、XChIP実験を角膜及び結膜細胞で、免疫沈降抗体として抗pRb2/p130、抗pRb1/p105、抗E2F4、抗E2F5、抗E2Fl、抗HDAC1、抗SUV39H1、抗p300、抗DNMT1又は抗PAI-2を用いて行った。図１３ｂで示したように、XChIP実験は、pRb2/p130、E2F5、HDAC1、DNMT1及びPAI-2がインビボで同時にPAI-2プロモーターの特定の断片に、正常初代ヒト核膜及び結膜の両上皮細胞で結合することを示す。さらに、SUV39H1は、同じPAI-2プロモーター断片に角膜細胞でのみ結合した。一方pRb1/p105、p107、E2F4、E2F1及びp300は角膜及び結膜の両細胞で検出されなかった。
【０１６６】
図１４に挙げたマルチプレックス半定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)の結果は、PAI-2 mRNAのレベルが結膜細胞で、角膜細胞よりも高いことを示している。これらのデータは、角膜及び結膜細胞株が特異的なPAI-2遺伝子発現パターンを示すことを表している。まとめると、これらのデータは、正常ヒト角膜及び結膜上皮細胞において、pRb2/p130-PAI-2複合体の、PAI-2プロモーターの特定領域への結合が、PAI-2の基底転写をクロマチン構造の局所的な変化を誘導することによって調節できることを示唆している。特定の刺激の下で又は細胞周期の特定の時期に、PAI-2のpRb2/p130及びRb1/p105との相互作用はPAI-2の細胞質と核間のシャトルを許可することができ、それによって、それらの細胞内コンパートメントにおけるPAI-2の濃度を制御している。PAI-2遺伝子の転写は、特定のpRb2/p130-PAI-2-クロマチン修飾複合体の結合をPAI-2プロモーター上で支配する、核内の特定のPAI-2濃度に由来したフィードバックトリガーループによって制御されているのかもしれない。pRb2/p130のクロマチン上の動員は、すぐ近くに結合した転写調節因子の活性を変えるために機能できるので、E2F5との相互作用は、pRb2/p130が細胞周期段階に関係なくクロマチンに動員される主要な機構ということもあり得る。
【０１６７】
本明細書で参照した全ての文献は、参照により援用される。本発明を、好ましい実施形態及び様々な図に関して説明したが、他の類似の実施形態を使用して、本発明を逸脱しない同一の機能を実行するために記載した実施形態に改変及び付加を行うことができることが理解されたい。したがって、本発明は、いずれも一つの実施形態に限定すべきではなく、むしろ添付の特許請求の範囲の詳述に従った大きさと範囲で解釈されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】図１は、腫瘍形成がRB2/p130遺伝子における遺伝的及び後成的イベントの両方の結びついた力によって生じているかもしれないことを示す概略図である。RB2/p130エクソン１の１７８番及び２５９番ヌクレオチドにおける変異(それぞれ、TCT→CCT、及びCCC→ GCC)は、それぞれpRb2/p130のセリンからプロリンへの置換（３７番コドン）及びプロリンからアラニンへの置換（６４番コドン）を決定する（図１ａ）。RB2/p130エクソン１変異によるアミノ酸置換は、pRb2/p130の安定性や機能を損なうタンパク質の構造変化をもたらし得る。RB2/p130エクソン１変異は、RB2/p130遺伝子がRB2/p130遺伝子発現の阻害を引き起こす後成的変化を生じ易くする「ヒットイベント」となり得、その結果、腫瘍形成がもたらされる。
【図２ａ】図２ａは、RB2/p130プロモーター、エクソン１及びイントロン１における領域１、領域２及び領域３のCpGメチル化部位の概略図である。
【図２ｂ】図２ｂは、RB2/p130遺伝子の領域１、領域２及び領域３から、３つそれぞれのサンプルについてメチル化特異的PCR（「MSP」）によって増幅した核酸断片のアガロースゲル電気泳動を示している。MSP増幅は、メチル化（M1、M2及びM3）及び非メチル化（U1、U2及びU3）修飾されたDNAに特異的なプライマーを用いて行われた。網膜芽細胞腫非修飾DNA（C1、ポジティブコントロール）及び修飾DNA（C2、ネガティブコントロール）は、野生型プライマーで増幅された。正常RB2/p130発現（+＋+）を有するサンプルは、領域１、領域２、及び領域３がメチル化されいていない（U1、U2及びU3）ことを示す。弱いRB2/p130発現（+）を有するサンプルは、領域３のみがメチル化されている（M3）ことを示す。ネガティブなRB2/p130発現（−）を有するサンプルは、領域１、領域２、及び領域３の全てがメチル化されている（Ml、M2及びM3）ことを示す。
【図３−１】図３ａ〜３ｇは、ヒト細胞株及び腫瘍サンプルにおけるpRb1/p105及びpRb2/p130のタンパク質発現レベル、並びに突然変異解析を示している。図３ａは、抗体のポジティブコントロールとして用いたJurkat細胞株（C）、正常網膜（NR）、Weri-Rb1細胞株（W）及び凍結網膜芽細胞腫サンプル（８〜１０）におけるpRb1/p105及びpRb2/p130のウェスタンブロット解析である。抗アクチン抗体をローディングコントロールとして用いた。図３ｂ及び３ｃは、正常網膜（b）及び典型的網膜芽細胞腫サンプル（c）におけるpRb2/p130の免疫組織化学分析である。図３ｄ〜３ｆは、パラフィン固定された腫瘍サンプル（d）の２つの選択域（e、f）のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを示している。図３ｇは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによって採取された代表的DNAサンプルにおいて検出されたRB2/p130の１７８番及び２５９番コドンにおけるエクソン１ホモ接合性ミスセンス変異を示している。配列は、RB2/p130野生型配列とマッチさせた。
【図３−２】図３−１の続きである。
【図４】図４ａ及び４ｂは、Weri-Rb1細胞における5-アザ-dC処理の効果を示している。図４ａは、2.5μmの5-アザ-2-dcを用いて異なる時間（２４、４８及び９６時間）で処理したWeri-Rb1細胞の増殖解析である。増殖指数は、サンプルシグナルの、0時間における未処理細胞のシグナルに対するパーセンテージとして算出された。図４ｂは、2.5mMの5-アザ-2-dcを用いて異なる時間（２４、３６、４８、７２及び９６時間）で処理したWeri-Rb1細胞株由来の全細胞溶解物を用いたpRb2/p130のウェスタンブロット解析である。96時間で回収された未処理のWeri−Rb1細胞由来の全細胞溶解物をコントロール（C）として用いた。全タンパク質100mgを等濃度で各ウェルにロードした（アクチン）。
【図５−１】図５ａ〜５ｄは、ヒト肺腺癌（H23）細胞株におけるRB2/p130 mRNA及びpRb2/p130タンパク質の発現レベル、並びに突然変異解析を示している。図５ａは、H23及びコントロール（Saos-2）細胞におけるRB2/p130 mRNAのノーザンブロット解析である。RNAのローディングと完全性は、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)cDNAプローブを用いたハイブリダイゼーションで確認された。図５ｂは、H23及びコントロール（Saos-2）細胞におけるpRb2/p130のウェスタンブロット解析である。βアクチンを標準化に用いた。図５ｃ及び５ｄは、H23細胞におけるRB2/p130のエクソン１を増幅及び配列決定することにより行われた突然変異解析である。配列は、野生型配列とマッチさせた。ヌクレオチド変化は、３７番と６４番コドンで見つかった。
【図５−２】図５−１の続きである。
【図６】図６は、H23細胞のメチル化特異的PCR RB2/p130プロモーターによるRB2/p130メチル化状態の分析を示している。領域１（M1）及び領域３（M3）はメチル化されているが、領域２はメチル化されていない（U2）。野生型プライマーで増幅されたH23非修飾DNA（C1）。野生型プライマーで増幅された修飾H23DNA（C2）。
【図７】図７は、RB2/p130発現における異なる処理時間での脱メチル化剤5-アザ-2-デオキシシチジンの効果を示している。図７ａは、未処理（C）の及び2.5μMの5-アザ-2-デオキシシチジンで異なる時間（２４、３６、４８、７２及び９６時間）処理したH23細胞由来の全RNAを用いたマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲのアガロースゲル電気泳動である。RB2/p130のmRNAレベルは、基準レベル（C）に対して、処理を始めて４８時間後に増加した。βアクチンをタンパク質ローディングレベルの標準化に用いた。図７ｂは、2.5μMの5-アザ-2-デオキシシチジンで異なる時間（２４、３６、４８、７２及び９６時間）処理したH23細胞由来の全細胞溶解物を用いたウェスタンブロット解析である。pRb2/p130活性低リン酸化型のレベルは、処理から７２時間後に増加し始めて、９６時間後に最大に達した。βアクチンを、タンパク質のローディングレベルを標準化するために用いた。上方のバンドは、pRb2/p130のリン酸化型(pRb2/p130-P)、そして下方のバンドは、pRb2/p130の非リン酸化型（pRb2/p130）を示している。
【図８】図８は、MCF-7、MDA-MB-231、及びMDA-MB-361培養乳癌細胞の全細胞溶解物（「tot lys」）中のICBP90のタンパク質発現レベルを示すウェスタンブロット解析である。βアクチンは、タンパク質のローディングレベルを標準化するのに用いた。
【図９】図９は、MCF-7、MDA-MB-231及びMDA-MB-361培養乳癌細胞の核及び細胞質分画におけるICBP90タンパク質のレベルを示す免疫沈降（「IP」)解析である。細胞質及び核分画の有効性は、細胞質分画については抗グリセルアルデヒド-３-リン酸脱水素酵素(GAPDH)抗体を、及び核分画については抗Oct-1抗体を用いた免疫ブロット解析で確認された。
【図１０】図１０ａは、エストロゲン受容体αプロモーターの領域１（−７２２番から−４５８番）及び領域２（−２５５番から−１３０番）を示す概略図である。CAAT及びTATAボックスの位置、並びにE2F転写因子の結合部位を示している。転写開始部位は、湾曲した白抜き黒矢印で示している。また、エストロゲン受容体αの領域１に隣接するPCRプライマー（「WTNF」及び「WTNR」）及び領域２に隣接するPCRプライマー（「WTl」及び「WT2」）も示している。図１０ｂは、エストロゲン受容体αプロモーター領域１及び２に結合するICBP90のクロスリンククロマチン免疫沈降（「XChIP」）解析である。ICBP90は、エストロゲン受容体αプロモーター領域１(ER-α Regl)に結合するが、領域２(ER-α Reg2)には結合しないことを示している。DNA配列は、図１０ａで示したようなエストロゲン受容体αプロモーター領域に隣接するフォワード及びリバースプライマーを用いてPCRで増幅された。「IP:ICBP90」は、ICBP90の免疫沈降反応の増幅、及び免疫沈降したクロマチンを示している。全クロマチン（「inputs」）の１％をPCR反応のポジティブコントロールとして用いた。また、非抗体免疫沈降をPCR反応のネガティブコントロールとして行った（データ示さず）。
【図１１】図１１は、DNAメチル化とICBP90によって仲介される転写抑制の提唱されている機構を示した略図である。白丸は、非メチル化CpGであり、また黒丸はメチル化CpGである。「HDAC1」は、ヒストン脱アセチル化酵素１である。「SUV39H1」は、ヒストンメチルトランスフェラーゼである。「DNMT1」は、DNAメチルトランスフェラーゼ１である。「p300」はヒストンアセチルトランスフェラーゼである。「RNA Pol II」は、RNAポリメラーゼIIである。「E2 F4/5」は、E2F転写因子4/5である。「TBP」は、TATA結合タンパク質である。「TAFs」は、TATA関連因子である。「TF2」は、転写因子２である。
【図１２】図１２は、対を成す初代角膜（「Corn」）細胞及び結膜（「Conj」）細胞の３つの代表的なケースから得た核（「IP PAI-2核」）分画及び細胞質（「IP PAI-2」）分画由来の抗PAI-2抗体を用いたPAI-2の免疫沈降、それに続く電気泳動、並びに抗pRb2/p130、抗Rb1/p105、抗p107及び抗PAI-2抗体を用いた免疫沈降のウェスタンブロットを示している。コントロール（レーン1）は、抗PAI-2抗体が除かれている核及び細胞質の免疫沈降のウェスタンブロットを示している。「角膜1」及び「結膜1」はドナー１、「角膜2」及び「結膜2」はドナー２、「角膜3」及び「結膜3」はドナー３である。図１２ｂは、角膜細胞由来の全溶解物（「角膜総溶解物」）及び結膜細胞由来の全溶解物（「結膜総溶解物」）の等量を、抗pRb2/p130、抗Rb1/p105、抗p107及び抗PAI-2の各抗体を用いてウェスタンブロット解析したものである。図１２ｃは、図１２ａの核及び細胞質分画の純度を示す、細胞質マーカーとして抗GAPDH抗体を、核マーカーとして抗Oct1抗体を用いた免疫ブロット解析である。
【図１３】図１３ａは、P1/P2プライマーによって認識されるPAI-2プロモーターの領域１の略図である(GenBank accession no. M22469)。図１３ｂは、ヒト初代角膜及び結膜細胞のXChIP解析から得られた代表的結果を示している。ホルムアルデヒドクロスリンククロマチンを、各パネル上部に示した抗体を用いて免疫沈降した。免疫沈降物中のPAI-2プロモーター領域の存在は、PAI-2プロモーターの領域１にわたる特異的プライマー(P1/P2)を用いたPCRによってテストされた。１％の全クロマチン(inputs)を、PCR反応のポジティブコントロールとして用いた。抗体なしの免疫沈降を、PCR反応のネガティブコントロールとして行った（データ示さず）。
【図１４】図１４ａは、対を成す初代角膜（「Corn」）正常細胞と結膜（「Conj」）正常細胞の４つの代表的なケースにおけるPAI-2 mRNAレベルの定常状態を示すアガロースゲル電気泳動である。マルチプレックスRT-PCRを、Corn 及びConj細胞由来の全細胞RNAを用いて行った。各RT-PCR反応は、1/100のcDNAを含む。0.3:2.0は、βアクチンとPAI-2のプライマー比率であり、両産物を対数関数的に、かつ相対的に近似の量で増幅するために用いた。各ラインの上方バンドと下方バンドは、それぞれβアクチンとPAI-2遺伝子のPCR産物を示している。マルチプレックスRT-PCRの結果を示すパネルは、４つの分離した実験の代表的結果である。図１４ｂは、Corn及び Conj細胞における相対的PAI-2発現レベルを示す棒グラフである。値は、同一cDNA由来のPAI-2遺伝子産物をβアクチンの産物で割った濃度として算出された。
【図１５】図１５ａ及び１５ｂは、それぞれ角膜細胞及び結膜細胞のPAI-2遺伝子におけるpRb2/p130コリプレッサー複合体を示す略図である。「HDAC1」は、ヒストン脱アセチル化酵素１である。「SUV39H1」は、ヒストンメチルトランスフェラーゼである。「DNMT1」は、DNAメチルトランスフェラーゼ１である。「E2 F5」は、E2F転写因子5である。「TAFs」は、TATA関連因子である。「PAI-2」は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターのインヒビター（PAI-2遺伝子産物）である。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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