(57)【要約】  本発明は、腫瘍性疾患の予防および治療用の薬学的組成物を製造するための三機能二重特異性抗体の使用に関連する。前記三機能二重特異性抗体は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＣＤ２０、ＥｐＣＡＭ、Ｇ２５０、プロテオグリカン、ＧＤ３、ＧＤ２、ＭＨＣ  ＩＩ、ＥＧＦ−ＲおよびＣＥＡから選択される腫瘍関連抗原に結合し、前記腫瘍関連抗原は、前記腫瘍細胞上に低度から中程度のレベルで発現されていることが見出された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記特性を有する三機能二重特異性抗体の使用であって、
（ａ）Ｔ細胞に結合する特性；
（ｂ）腫瘍細胞上の少なくとも一つの腫瘍関連抗原に結合し、前記抗原が、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＣＤ２０、ＥｐＣＡＭ、Ｇ２５０、プロテオグリカン、ＧＤ２、ＧＤ３、ＭＨＣ  ＩＩ、ＥＧＦ−ＲおよびＣＥＡからなる群から選択される特性；
（ｃ）Ｆｃγ受容体Ｉ型および／またはＩＩＩ型陽性細胞に、Ｆｃ領域を通じて結合する特性；
腫瘍性疾患（ｔｕｍｏｒ  ｄｅｓｅａｓｅｓ）の予防および治療用の薬学的組成物を製造するための使用であり、前記腫瘍関連抗原が、下記のとおり前記腫瘍細胞上に発現されている使用。
・Ｈｅｒ２／ｎｅｕに関する腫瘍関連抗原が、腫瘍細胞あたり約５，０００〜約１５０，０００の量で、または
・ＦＩＳＨ法陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）の腫瘍細胞におけるＨｅｒ２／ｎｅｕに関する腫瘍関連抗原が、腫瘍細胞あたり約５００，０００以下の量で、または、
・ＣＤ２０に関する腫瘍関連抗原が、腫瘍細胞あたり約１，０００〜約３５０，０００の量で、好ましくは、約３１０，００以下、もしくは約３００，００以下の量で、または、
・ＥｐＣＡＭ、Ｇ２５０、プロテオグリカン、ＧＤ２、ＧＤ３、ＭＨＣ  ＩＩ、ＥＧＦ−ＲおよびＣＥＡに関する腫瘍関連抗原が、腫瘍細胞あたり約１，０００〜約３５０，０００の量で、好ましくは、約３００，０００以下の量で。
【請求項２】
前記腫瘍関連抗原が、Ｈｅｒ２／ｎｅｕまたはＣＤ２０である請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記腫瘍抗原が、前記腫瘍細胞上に、腫瘍細胞あたり、少なくとも約５，０００、２０，０００、５０，０００または８０，０００の量で発現され、腫瘍細胞あたり、最大で約１５０，０００、１１０，０００または１００，０００の量で発現されている請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
前記三機能抗体が、抗ＣＤ３×抗腫瘍関連抗原抗体、および／または抗ＣＤ４×抗腫瘍関連抗原抗体、および／または抗ＣＤ５×抗腫瘍関連抗原抗体、および／または抗ＣＤ６×抗腫瘍関連抗原抗体、および／または抗ＣＤ８抗腫瘍関連抗原抗体、および／または抗ＣＤ２×抗腫瘍関連抗原抗体、および／または抗ＣＤ２８×抗腫瘍関連抗原抗体、および／または抗ＣＤ４４×抗腫瘍関連抗原抗体から選択される請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記三機能抗体が、異種性の二重特異性抗体から選択され、好ましくは、異種性のラット／マウス二重特異性抗体である請求項１から４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記三機能抗体が、そのＦｃ領域におけるアイソタイプの組み合わせにおいて、下記グループの少なくとも一つのメンバーから選択される請求項１から５のいずれか一項に記載の使用。
ラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−ＩｇＧ２ａ
ラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−ＩｇＧ２ｂ
ラット−ＩｇＧ２ｂ／ヒト−ＩｇＧ１
ラット−ＩｇＧ２ｂ／ヒト−ＩｇＧ２
【請求項７】
前記三機能抗体が、０．０５〜１５μｇ／ｋｇ体重の量で投与される請求項１から６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記三機能二重特異性抗体が、Ｆｃγ受容体Ｉ型／ＩＩＩ型に結合する抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ×抗ＣＤ３抗体であり、好ましくは、前記ラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−ＩｇＧ２ａのアイソタイプの組み合わせを有する請求項１から７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原が、約５，０００〜１５０，０００の量で、好ましくは、約２０，０００〜１００，０００の量で、乳腺腫瘍細胞上に発現されている請求項１から８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記腫瘍性疾患が、Ｄａｋｏ社のＨｅｒｃｅｐ  Ｔｅｓｔ（登録商標）に従ってＨｅｒ２／ｎｅｕ値１＋に分類され、または前記Ｄａｋｏ社のＨｅｒｃｅｐ  Ｔｅｓｔ（登録商標）に従ってＨｅｒ２／ｎｅｕ値２＋の場合においてＦＩＳＨ法陰性に分類されるガンであり、前記ガンが、特に乳ガンである請求項１から９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記三機能二重特異性抗体が、Ｆｃγ受容体Ｉ型／ＩＩＩ型に結合する抗ＣＤ２０×抗ＣＤ３抗体であり、好ましくは、前記ラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−ＩｇＧ２ａのアイソタイプの組み合わせを有する請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍性疾患（ｔｕｍｏｒ  ｄｅｓｅａｓｅｓ）の予防および治療用の薬学的組成物を製造するための三機能二重特異性抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫療法を行う中で単特異性モノクローナル抗体による腫瘍の治療における現在未解決の問題は、低度から中程度の発現レベルの腫瘍標的抗原を有する腫瘍細胞の破壊の効率が不十分なことである。一つの具体例は、標的抗原Ｈｅｒ２／ｎｅｕを低度から中程度のレベルで発現している乳ガンの治療であり、他の具体例は、ＣＤ２０腫瘍抗原を低度のレベルで発現している非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ性白血病の治療である。
【０００３】
転移性乳ガンは、ほとんど常に致死性の疾患である。転移が最初に明らかになってからの生存時間のメジアンは、１７から２０ヶ月の範囲である。内分泌性、細胞傷害性および生物学上の多数の薬剤が一時的な効果を証明しているが、総意としての療法の基準はなく、治療には重大な副作用を生じることが多い。
【０００４】
上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリーメンバーであるＨｅｒ２／ｎｅｕは、約２５〜３０％の乳ガン患者の腫瘍試料において過剰発現し、より急速な腫瘍の成長およびより悪い予後の原因とされる。
【０００５】
ＥＧＦ受容体のファミリーは、４つのメンバーＥＧＦＲ（ＥＲＢＢ１）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥＲＢＢ２）、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４を含む。ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２／ｎｅｕは、治療標的として鋭意研究されている。細胞内受容体シグナルを阻害する小分子化合物だけでなく、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２／ｎｅｕの細胞外ドメインを標的とする抗体も、既に臨床で使用され、臨床上の効果が証明されている。しかし、それらの抗腫瘍効果は、前臨床試験から予測されるほど強力でないことが多く、化学的療法と組み合わせることが好ましい。
【０００６】
Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は、乳ガンの治療に広く使用される、よく受け入れられたモノクローナル抗体である。しかし、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は、標的抗原であるＨｅｒ２／ｎｅｕの腫瘍細胞上での発現レベルが少なくとも２＋／ＦＩＳＨ＋（いわゆるＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）およびＦＩＳＨ法解析陽性で証明される）、または３＋である患者に対してしか使用は成功しない。いくつかの研究により、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの追加遺伝子増幅（ＦＩＳＨ法で示される）とともに相対的に高い標的抗原Ｈｅｒ２／ｎｅｕの発現密度が、統計的に有意な生存を得るために必要だということが示されている。前臨床試験での生体実験によっても、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）による腫瘍細胞の効果的な破壊が見られるのは、腫瘍細胞が標的抗原であるＨｅｒ２／ｎｅｕを高レベルに発現している場合だけであることが示されている。
【０００７】
これらの制限は、腫瘍上にＨｅｒ２／ｎｅｕを高レベルに発現する（前記Ｄａｋｏ社のＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔでスコア２＋／ＦＩＳＨ＋、または３＋とされる）、約２５〜３０％の転移性乳ガン患者しか、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を用いて効果的に治療することができないことの原因である。
【０００８】
Ｐｅｒｅｚらの研究では、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）での評価によると、３５％の乳ガン患者がＨｅｒ２のスコア１＋、１４％が２＋、１３％が３＋とされた（非特許文献１）。
【０００９】
Ｋｉｅｗｅ，  Ｐ．らは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕおよびＣＤ３を標的とする完全な二重特異性モノクローナル抗体の使用について記載している（非特許文献２）。この抗体は、転移性乳ガンの治療にフェーズＩ試験で使用された。この抗Ｈｅｒ２×抗ＣＤ３抗体によって生じる副作用の研究を行い、必要な人数である１７人の患者の募集（ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ）を早めるために、前記ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）でのスコアが１＋（２５％）、２＋（１２．５％）および３＋（６２．５％）の患者が試験された。この予備的な結果解析では、抗腫瘍応答は、評価可能な１５人の患者のうち４人で見られた。しかし、前記ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）のスコアが１＋の範疇の患者で抗腫瘍応答を示した者はいなかった。これらの応答した者のＨｅｒ２／ｎｅｕの発現状態（ｓｔａｔｕｓ）に関しては、全く情報が開示されていない。さらに、このフェーズＩ試験を計画する時点では、ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂが、高レベル（スコア＋３）のＨｅｒ２／ｎｅｕを発現する細胞系統（例えば、Ｓｋ−Ｂｒ−３）を除去するという実験データのみが入手可能であった。
【００１０】
全ての典型的なフェーズＩ試験と同様に、Ｋｉｅｗｅらが行ったフェーズＩ試験は、三機能抗体であるｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂの安全性および許容性を調査するために計画された。この試験での第二の変数（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｖａｒｉａｂｌｅｓ）は、抗腫瘍活性および種々の免疫学的変数の測定であった。この研究への患者の募集を早めるために、患者の腫瘍細胞上のＨｅｒ２／ｎｅｕの発現に関する制限を設けなかった。これが可能であったのは、この研究の第一の目的は、安全性と許容性であり、腫瘍細胞上のＨｅｒ２／ｎｅｕの発現レベルは、全く重要では無かったからである。
【００１１】
三機能抗体である抗Ｈｅｒ２×抗ＣＤ３のｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂが、スコア２＋および３＋に従いＨｅｒ２／ｎｅｕを過剰発現する患者においてのみ有効であるという知見は、全く驚きは無かった。なぜなら、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）等の抗体を用いて実施された他の調査でも、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを中（２＋／ＦＩＳＨ＋）から高レベル（３＋）に発現する患者に対してのみに効果が示されたからである。
【００１２】
例えば、Ｇａｔｚｅｍｅｉｅｒらは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ等の抗体が、実際に臨床上の利益を提供できるのは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの発現が３＋または２＋／ＦＩＳＨ＋の患者に対してだけであるという証拠を提供した（非特許文献３）。
【００１３】
同様に、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ社は、２００６年１０月２日に、乳ガンおよび前立腺ガンにおける上皮細胞接着分子ＥｐＣＡＭに対する抗体であるａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂの二つのフェーズＩＩ試験についてのデータを公表した。その腫瘍組織において高レベルにＥｐＣＡＭを発現する患者においてのみ、腫瘍増殖停止時間の有意な延長を示し、ＥｐＣＡＭの発現が低い患者においては有意な利益を示さなかった。ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂには、ＥｐＣＡＭを高度に過剰発現する乳ガンの患者に治療の選択肢を与える可能性があるということが強調された。ＥｐＣＡＭの過剰発現が低い患者には全く有用でないことが見出された。
【００１４】
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は、最も広く認められる悪性腫瘍である。ＮＨＬは、アメリカ合衆国において５番目に多い悪性疾患（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）であり、年間発症率は１０万人あたり１８〜２０である。ＮＨＬの発症件数は、１９９０年代中期まで年率５〜１０％で増加した（非特許文献４）が、それ以来一定している（非特許文献５）。ＣＬＬは、西洋で最も多い白血病であり、年間発症率は１０万人あたり３〜４である。
【００１５】
抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であるＲｉｔｕｘｉｍａｂを用いるＢ細胞リンパ腫の治療における（特に、化学療法と組み合わせにおける）結果が有望であるにも関わらず、患者は結局再発した（非特許文献６、７）。したがって、さらなる治療の選択肢が必要である。
【００１６】
Ｒｉｔｕｘｉｍａｂおよびａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ等のモノクローナル抗体の認可以後、治療における大きな改善が達成されたという事実があるにも関わらず、現在、緩徐進行性ＮＨＬおよびＣＬＬは、両方とも治癒不能な疾患である（非特許文献８〜１１）。抗体だけによる療法は高度には成功していないが、特にＣＬＬにおけるモノクローナル抗体と標準的な化学療法処方との組み合わせは、患者の結果を有意に改善した（非特許文献１２、１３）。しかし、患者は結局再発し（非特許文献６）、新しい治療法の戦略が必死に求められている。完全ヒト化抗ＣＤ２０抗体または他の抗原（例えばＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ８０もしくはＨＬＡ−ＤＲ）を標的とする抗体等の多くの新薬候補が、現在鋭意検討されている（非特許文献１４、１５）。
【００１７】
新しい標的の探索に加え、抗体療法を改善する別のアプローチとしては、二重特異性抗体の開発があげられる。多くの二重特異性の方式（ｆｏｒｍａｔ）が開発され、試験されている。例えば、クアドローマ細胞で産生させた完全長抗体、化学的にクロスリンクさせたＦ（ａｂ）２断片、一本鎖抗体（非特許文献１６）、二重特異性抗体（非特許文献１７）である。これらの抗体の中には、ヒトリンパ腫の治療に試験されたものもある。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける効能が有望であるにも関わらず、これらの分子は、限定的な臨床上の利益しか示さなかった（非特許文献１８〜２０）。
【００１８】
ＣＤ１９またはＣＤ２０等のＢ細胞特異的抗原を標的とする二重特異性抗体は、この１０〜１５年の間における鋭意研究の対象であるが、穏やかな応答しか示していない限定的な臨床データが、今のところ入手可能な程度である（非特許文献１８、２１、２２）。さらに、製造工程が複雑で効率的でないため、臨床用途のための充分な量の抗体を産生することが難しい。
【００１９】
二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）は、例えば、悪性細胞等の腫瘍細胞に対してエフェクター細胞を誘導することによって、免疫学的に治療するための道具（ｔｏｏｌ）である。しかしながら、ｂｓＡｂは通常エフェクター細胞のうち一つのクラス、すなわちＴ細胞、ＮＫ細胞、ＦｃγＲＩ＋またはＦｃαＲＩ＋細胞のいずれかだけしか誘導、活性化しないので、その効能は限定的である。これらの先行技術抗体の全てが、腫瘍関連抗原が中から高レベルで腫瘍細胞表面に発現している場合にのみ、効果的に腫瘍を治療することが記載されている。
【００２０】
抗体の免疫学的エフェクター機能を促進することは、抗体に基づくガン治療の効能を改善する一つのアプローチを示す。改善されたエフェクター機能を有する三機能二重特異性抗体は、例えば、Ｚｅｉｄｌｅｒら（非特許文献２３）、Ｒｉｅｓｅｎｂｅｒｇら（非特許文献２４）、Ｒｕｆ＆Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ（非特許文献２５）またはＨｅｉｓｓら（非特許文献２６）の出版物において、本発明者らによって、腫瘍細胞およびＴリンパ球を二つの結合アームで認識するだけではなく、Ｆｃ領域を通じてＦｃγ受容体陽性修飾細胞にも結合するものとして記載されている。しかしながら、これらの抗体が、Ｈｅｒ２／ｎｅｕまたはＣＤ２０のような腫瘍関連抗原を低レベルで発現している腫瘍細胞を治療するのに有用であるということは現在まで知られていなかった。
【００２１】
上記で説明したＨｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ２０に関する制限は、例えば、Ｇ２５０、ＧＤ３，ＧＤ２、プロテオグリカン、ＭＨＣ  ＩＩ、ＥＧＦ−ＲおよびＣＥＡ等の他の腫瘍関連抗原に関しても当てはまる。
【００２２】
要約すると、本発明の優先日までに入手できる全ての実験データは、腫瘍抗原を中程度から高度に過剰発現する患者に対する有意な利益の証拠しか提供していなかった。
【００２３】
【非特許文献１】Ｐｅｒｅｚ  ＥＡ  ｅｔ  ａｌ．：  Ｈｅｒ２  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：  ｐｏｏｒ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｗｅａｋ  ｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．  Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒｏｃ  ２００２；  ７７：  １４８−１５４
【非特許文献２】Ｋｉｅｗｅ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．：  “Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２  ｘ  ａｎｔｉ−ＣＤ３  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ”；  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ  ２３，  ｎｏ．  １６Ｓ，  １  Ｊｕｎｅ  ２００５  （ＡＳＣＯ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ２２０５−０６−０１）
【非特許文献３】Ｇａｔｚｅｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １５：１９−２７，  ２００４
【非特許文献４】Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＴＣ，  Ｍｅｄｅｉｒｏｓ  ＬＪ，  Ｊａｆｆｅ  ＥＳ．  Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ．  １９９５；７５：３７０−３８０．
【非特許文献５】Ｒｉｅｓ  ＬＡＧ，  Ｈａｒｋｉｎｓ  Ｄ，  Ｋｒａｐｃｈｏ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  ＳＥＥＲ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｒｅｖｉｅｗ，  １９７５−２００３．  ｈｔｔｐ：／／ｓｅｅｒｃａｎｃｅｒｇｏｖ．  ２００６．
【非特許文献６】Ｓｍｉｔｈ  ＭＲ．  Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  （ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ａｎｔｉｂｏｄｙ）：  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  ２００３；２２：７３５９−７３６８．
【非特許文献７】Ｇｈｉｅｌｍｉｎｉ  Ｍ．  Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌｉｔｙ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｓｃｈｅｄｕｌｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｓ  ａｎ  ｅｘａｍｐｌｅ．  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  （Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ）．  ２００５：３２１−３２８．
【非特許文献８】Ｌｉｎ  ＴＳ，  Ｌｕｃａｓ  ＭＳ，  Ｂｙｒｄ  ＪＣ．  Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ｉｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００３；３０：４８３−４９２．
【非特許文献９】Ｄｉｌｌｍａｎ  ＲＯ．  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｏｗ−ｇｒａｄｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｉｔｕｘｉｍａｂ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００３；３０：４３４−４４７．
【非特許文献１０】Ｂｌｕｍ  ＫＡ，  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ＮＬ．  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００３；３０：４４８−４５６．
【非特許文献１１】Ｍｏｒｅｔｏｎ  Ｐ，  Ｈｉｌｌｍｅｎ  Ｐ．  Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００３；３０：４９３−５０１．
【非特許文献１２】Ｈｉｄｄｅｍａｎｎ  Ｗ，  Ｄｒｅｙｌｉｎｇ  Ｍ，  Ｕｎｔｅｒｈａｌｔ  Ｍ．  Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ｐｌｕｓ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍａｎｔｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００３；３０：１６−２０．
【非特許文献１３】Ｍｏｎｔｓｅｒｒａｔ  Ｅ．  Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００３；３０：３４−３９．
【非特許文献１４】Ｍａｖｒｏｍａｔｉｓ  ＢＨ，  Ｃｈｅｓｏｎ  ＢＤ．  Ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ．  ２００４；１８：１３７−１４８．
【非特許文献１５】Ｎａｇｙ  ＺＡ，  Ｈｕｂｎｅｒ  Ｂ，  Ｌｏｈｎｉｎｇ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ，  ＨＬＡ−ＤＲ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  ２００２；８：８０１−８０７．
【非特許文献１６】Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ＰＡ，  Ｋｕｆｅｒ  Ｐ，  Ｌｕｔｔｅｒｂｕｓｅ  Ｒ．  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００３；５：４１３−４１９．
【非特許文献１７】Ｐｅｉｐｐ  Ｍ，  Ｖａｌｅｒｉｕｓ  Ｔ．  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．  ２００２；３０：５０７−５１１．
【非特許文献１８】Ｍａｎｚｋｅ  Ｏ，  Ｔｅｓｃｈ  Ｈ，  Ｂｏｒｃｈｍａｎｎ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｏｃｏｒｅｇｉｏｎａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｏｗ−ｇｒａｄｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｗｉｔｈ  ＣＤ３ｘＣＤ１９  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ＣＤ２８  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．  Ｉ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００１；９１：５０８−５１５．
【非特許文献１９】Ｍａｎｚｋｅ  Ｏ，  Ｔｅｓｃｈ  Ｈ，  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｊ，  Ｄｉｅｈｌ  Ｖ，  Ｂｏｈｌｅｎ  Ｈ．  Ｌｏｃｏｒｅｇｉｏｎａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｏｗ−ｇｒａｄｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｗｉｔｈ  ＣＤ３ｘＣＤ１９  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ＣＤ２８  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．  ＩＩ．  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００１；９１：５１６−５２２．
【非特許文献２０】Ｈａａｇｅｎ  ＩＡ．  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ＣＤ３ｘＣＤ１９  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ．  Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ．  １９９５；１９：３８１−３９３．
【非特許文献２１】Ｗｅｉｎｅｒ  ＧＪ，  Ｄｅ  Ｇａｓｔ  ＧＣ．  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ．  Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ．  １９９５；１６：１９９−２０７．
【非特許文献２２】Ｄｅ  Ｇａｓｔ  ＧＣ，  Ｖａｎ  Ｈｏｕｔｅｎ  ＡＡ，  Ｈａａｇｅｎ  ＩＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ＣＤ３  ｘ  ＣＤ１９  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．  １９９５；４：４３３−４３７．
【非特許文献２３】Ｚｅｉｄｌｅｒ  Ｒ，  Ｒｅｉｓｂａｃｈ  Ｇ，  Ｗｏｌｌｅｎｂｅｒｇ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｉｎｔａｃｔ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９９；１６３：１２４６−１２５２．
【非特許文献２４】Ｒｉｅｓｅｎｂｅｒｇ  Ｒ，  Ｂｕｃｈｎｅｒ  Ａ，  Ｐｏｈｌａ  Ｈ，  Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ  Ｈ．  Ｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  （ａｌｐｈａ  ＥｐＣＡＭ  ｘ  ａｌｐｈａ  ＣＤ３）．  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  ２００１；４９：９１１−９１７．
【非特許文献２５】Ｒｕｆ  Ｐ，  Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ  Ｈ．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｙ  ａ  ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．  Ｂｌｏｏｄ．  ２００１；９８：２５２６−２５３４．
【非特許文献２６】Ｈｅｉｓｓ  ＭＭ，  Ｓｔｒｏｈｌｅｉｎ  ＭＡ，  Ｊａｇｅｒ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ａｓｃｉｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００５；１１７：４３５−４４３．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
したがって、例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを低度に発現している腫瘍細胞（前記Ｄａｋｏ社のＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）において、例えば、１＋のスコアである）、腫瘍細胞あたり５００，０００以下の腫瘍関連抗原という中程度のレベルでＨｅｒ２／ｎｅｕを発現し、前記Ｄａｋｏ社のＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）において、２＋のスコアであるが、ＦＩＳＨ法陰性のもの、もしくはＣＤ２０を低度に発現している腫瘍細胞、または少なくとも１つの上記した特異的な腫瘍関連抗原、特にＣＤ２０およびＥｐＣＡＭを、腫瘍細胞あたり約１，０００〜３５０，０００、特に、５，０００〜１５０，０００のレベルおよび範囲で発現している腫瘍細胞をも死滅させることが可能な抗体の抗腫瘍活性の改善が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
上記した問題は、以下に述べる特性を有する三機能二重特異性抗体から選択され、種々のクラスの免疫細胞の協調を促進する抗体の、腫瘍性疾患の予防および治療用の薬学的組成物を製造するための使用によって解決されることを見出した。
（ａ）Ｔ細胞に結合する特性；
（ｂ）腫瘍細胞上の少なくとも一つの腫瘍関連抗原に結合し、前記抗原が、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＣＤ２０、ＥｐＣＡＭ、Ｇ２５０、ＧＤ２、ＧＤ３、プロテオグリカン、ＭＨＣ  ＩＩ、ＥＧＦ−ＲおよびＣＥＡからなる群から選択される特性；
（ｃ）Ｆｃγ受容体Ｉ型および／またはＩＩＩ型陽性細胞に、Ｆｃ領域を通じて結合する特性；
前記腫瘍関連抗原は、下記のとおり前記腫瘍細胞上に発現されている。
・Ｈｅｒ２／ｎｅｕに関する腫瘍関連抗原が、腫瘍細胞あたり約５，０００〜約１５０，０００の量で、または
・ＦＩＳＨ法陰性の腫瘍細胞におけるＨｅｒ２／ｎｅｕに関する腫瘍関連抗原が、腫瘍細胞あたり約５００，０００以下の量で、または、
・ＣＤ２０に関する腫瘍関連抗原が、腫瘍細胞あたり約１，０００〜約３５０，０００の量で、または、
・ＥｐＣＡＭ、Ｇ２５０、ＧＤ２、ＧＤ３、プロテオグリカン、ＭＨＣ  ＩＩ、ＥＧＦ−ＲおよびＣＥＡに関する腫瘍関連抗原が、腫瘍細胞あたり約１，０００〜約３５０，０００の量で、好ましくは、約３００，０００以下の量で。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の一実施形態において、全ての引用した腫瘍抗原が、腫瘍細胞あたり約５，０００〜約１５０，０００の量で腫瘍細胞上に発現している。
【００２７】
本発明は、ヒトまたは動物の腫瘍細胞を含む身体、もしくは前記腫瘍細胞を含むこれらの身体の部分を、下記の特性を有する三機能二重特異性抗体の薬学的に有効な量に接触させることにより、腫瘍性疾患を予防および治療するためのヒトまたは動物の治療方法も提供する。
（ａ）Ｔ細胞に結合する特性；
（ｂ）腫瘍細胞上の少なくとも一つの腫瘍関連抗原に結合し、前記抗原が、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＣＤ２０、ＥｐＣＡＭ、Ｇ２５０、ＧＤ２、ＧＤ３、プロテオグリカン、ＭＨＣ  ＩＩ、ＥＧＦ−ＲおよびＣＥＡからなる群から選択される特性；
（ｃ）Ｆｃγ受容体Ｉ型および／またはＩＩＩ型陽性細胞に、Ｆｃ領域を通じて結合する特性；
前記腫瘍関連抗原は、下記のとおり前記腫瘍細胞上に発現されている。
・Ｈｅｒ２／ｎｅｕに関する腫瘍関連抗原が、腫瘍細胞あたり約５，０００〜約１５０，０００の量で、または
・ＦＩＳＨ法陰性の腫瘍細胞におけるＨｅｒ２／ｎｅｕに関する腫瘍関連抗原が、腫瘍細胞あたり約５００，０００以下の量で、または、
・ＣＤ２０に関する腫瘍関連抗原が、腫瘍細胞あたり約１，０００〜約３５０，０００の量で、または、
・ＥｐＣＡＭ、Ｇ２５０、プロテオグリカン、ＧＤ２、ＧＤ３、ＭＨＣ  ＩＩ、ＥＧＦ−ＲおよびＣＥＡに関する腫瘍関連抗原が、腫瘍細胞あたり約１，０００〜約３５０，０００の量で、好ましくは、約３００，０００以下の量で。
【００２８】
患者の腫瘍細胞を、前記三機能二重特異性抗体に接触させることは、前記三機能二重特異性抗体を受容可能な服用形式、経口または非経口いずれかで、以下に記述するようにヒトまたは動物の体内に投与することによっても実施される。
【００２９】
白血病またはリンパ腫等の免疫システムの細胞が関与する腫瘍性疾患を治療するのであれば、前記接触は、ｅｘ  ｖｉｖｏで行われてもよい。例えば、米国特許第７，０１８，６３２号公報または米国特許第５，９８５，２７６号公報が引用され、それらは本明細書に完全に取り込まれている。
【００３０】
自己の腫瘍細胞を含む材料は、本明細書に記載の三機能二重特異性抗体とともに、１０分間〜１０時間、好ましくは５時間以下の短時間インキュベートされ、または、一定時間の長時間インキュベートされることにより、自己の腫瘍細胞は、抗体に襲撃される（ｃｈａｒｇｅｄ）。続いて、患者の血液細胞、好ましくは末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を加え、この混合物を１〜１４日間の長時間インキュベートする。またはそれに代えて、自己の腫瘍細胞を、前記三機能二重特異性抗体および患者の血液細胞、好ましくは末梢血単核球に直接接触させる。このようにして、腫瘍に対する無数の免疫細胞の“プライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）”が、ｅｘ  ｖｉｖｏで達成される。その後、これらの細胞は、患者に再注入される。長時間インキュベートすることによっても、抗体の内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）および分解が起こる。前述のとおり、上記で引用した米国特許には、これらの方法が完全に記載されている。しかしながら、上記で示した腫瘍関連抗原について、腫瘍細胞あたり約５，０００〜約１５０，０００の腫瘍関連抗原が発現している腫瘍細胞が関与する腫瘍性疾患を治療することも可能なのかという、専門家に向けた成功のための合理的な予測は全く提供されていない。前記方法では、健康なドナーのＰＢＭＣを加えずに、同種間または自己設定（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｅｔｔｉｎｇ）で実施してもよい。珍しいことに、腫瘍細胞、特にＢ細胞の減少は、エフェクター細胞のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＧＭ−ＳＣＦ）による前活性化（ｐｒｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）または共活性化（ｃｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）には全く依存しない。このことは、従来技術に記載されている他の二重特異性抗体または単特異性抗体に対する典型的な不利な点である。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態は、従属クレーム並びに以下の記載およびそれに伴う実験データ、図、表に示されている。
【００３２】
本発明者らは、驚いたことに、従来技術に記載されている三機能二重特異性抗体が、低度から中程度のレベルで腫瘍細胞上に発現されている、前記腫瘍細胞上の選択された特定の腫瘍関連標的抗原を標的とするのに効果的に使用可能であることを示すことができた。標的抗原として特に好ましいものは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ２０腫瘍関連抗原である。
【００３３】
前記腫瘍関連抗原は、前記腫瘍細胞上に発現される前記腫瘍関連抗原のタイプ、およびＨｅｒ２／ｎｅｕの場合は、前記腫瘍抗原が増幅されているかどうかに依存して種々のレベルで前記腫瘍細胞上に発現されている。
【００３４】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕの場合、患者の腫瘍がＨｅｒ２／ｎｅｕを腫瘍細胞上に腫瘍細胞あたり約５，０００〜約１５０，０００の量で腫瘍関連抗原が発現していれば、本明細書中の記載のように前記患者は三機能二重特異性抗体で治療が成功可能であることが見出されている。これらの患者は、前記ＤＡＫＯ社のＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）に従えば、１＋のスコアとされることになる。１＋の上限を、約１００，０００または１１０，０００に分類することも正しいと考えられる。最も重要なことは、前記スコアが、“中程度の発現”ではなく、“低度の発現”と分類されなければならないことである。
【００３５】
腫瘍細胞あたり５００，０００分子以下のＨｅｒ２／ｎｅｕ腫瘍関連抗原を発現し、前記ＤＡＫＯ社のＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）に従って２＋に分類される患者は、ＦＩＳＨ法陰性と分類された場合であっても、治療が成功可能なことも見出されている。従来は、前記ＤＡＫＯ社のＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）に従ってＨｅｒ２／ｎｅｕ値が２＋のスコアとされ、腫瘍細胞あたり５００，０００以下のＨｅｒ２／ｎｅｕ腫瘍抗原を発現し、ＦＩＳＨ法陽性の患者しか治療が成功可能でなかった。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ値が２＋であっても、ＦＩＳＨ法陰性の患者は、治療が成功可能でなかった。
【００３６】
ＣＤ２０を発現する腫瘍を有する患者では、驚いたことに、腫瘍細胞あたり約１０００〜約３５０，０００の量で腫瘍関連抗原としてＣＤ２０を発現している場合でさえも、患者の治療が成功可能であることが見出された。さらに、ＥｐＣＡＭ、Ｇ２５０、プロテオグリカン、ＧＤ２、ＧＤ３、ＭＨＣ  ＩＩ、ＥＧＦ−ＲおよびＣＥＡを腫瘍細胞あたり約１０００〜約３５０，０００の量で腫瘍関連抗原として発現している患者は、本明細書に記載の前記三機能二重特異性抗体により治療が成功可能である。
【００３７】
前記腫瘍関連抗原は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの場合、前記腫瘍細胞上に、好ましくは腫瘍細胞あたり少なくとも約１０，０００、約２０，０００、約５０，０００または約８０，０００の量で発現しており、好ましくは腫瘍細胞あたり最大で約１１０，０００、約１２０，０００または約１３０，０００の量で発現している。
【００３８】
前記ＤＡＫＯ社のＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）でＨｅｒ２／ｎｅｕ値がスコア２＋（中程度の発現）とされた患者においては、腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原の好ましい発現の量は、５００，０００以下または４５０，０００、４００，０００、３５０，０００もしくは３００，０００以下であり、下限は約１００，０００か、約１１０，０００より多いか、約１５０，０００、約２００，０００または約２５０，０００より多い。
【００３９】
ＣＤ２０腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞では、腫瘍細胞あたりのＣＤ２０分子の数は、約１０００〜約３５０，０００の範囲で、Ｂ細胞悪性腫瘍の型および体内部位に依存し、好ましくは、約３１０，００または３００，０００以下で変化する。腫瘍細胞あたりのＣＤ２０分子の数は、特に、約５０００、約１０，０００または約５０，０００から約１００，０００、１５０，０００、２００，０００、２５０，０００または３００，０００以下で変化することが可能である。前記状況は、ＥｐＣＡＭ、Ｇ２５０、プロテオグリカン、ＧＤ２、ＧＤ３、ＭＨＣ  ＩＩ、ＥＧＦ−ＲおよびＣＥＡ等の請求項１で示した他の全ての腫瘍抗原においても同様である。
【００４０】
腫瘍関連抗原の発現レベルは、単一の限定された腫瘍の実体から生じた種々の腫瘍細胞上に、より低度の発現値から高度の発現値の間に分布し得ることを申し添えておく。これらの数値は全て、悪性腫瘍のタイプ、患者のタイプ、腫瘍の進行等に依存した平均値であることを理解されなければならない。
【００４１】
本発明者らによって選択された腫瘍関連標的抗原が低度から中程度の発現レベルでのみ腫瘍細胞上に永続的かつ安定に発現していることが、極めて重要であることを申し添えておく。ヒートショックタンパク質、ＭＩＣ分子であるＭＩＣ  ＡおよびＭＩＣ  Ｂ等の他のタイプの誘導可能な抗原は、両方ともヒートショックプロモーター要素の制御下にあり、誘導後一生の間増加するレベルで発現されるが、Ｈｅｒ２／ｎｅｕおよびＣＤ２０等の腫瘍関連抗原の発現割合は、一般的に一定かつ安定である。
【００４２】
本発明者らによって選択された腫瘍関連標的抗原は、特定の腫瘍に関連するか、または特異的である。ＥｐＣＡＭは、典型的には腺ガンに関連し、Ｈｅｒ２／ｎｅｕは、乳ガンだけでなく大腸ガン、肺ガン、胃ガン、膵臓ガンおよび卵巣ガンに関連し、ＣＤ２０は、非ホジキンリンパ腫または慢性リンパ性白血病等のＢ細胞リンパ腫に関連し、Ｇ２５０は、腎臓ガンに関連し、プロテオグリカン、ＧＤ３およびＧＤ２は、メラノーマに関連し、ＭＨＣ  ＩＩはＢ細胞リンパ腫に関連し、並びにＥＧＦ−ＲおよびＣＥＡは、上皮性腫瘍に関連する。
【００４３】
本発明で用いる三機能二重特異性抗体（略してｔｒＡｂ）は、それ自体は公知である。例えば、米国特許第６，５５１，５９２号公報が引用され、その内容は本明細書に完全に取り込まれている。同様のことがドイツ公開特許第１９６４９２２３Ａ号公報およびドイツ公開特許第１９７１０４９５Ａ号公報についても言え、それらに対応する米国特許公報とともに引用され、それらもまた本明細書中に包含されている。
【００４４】
本発明で用いる抗体は、カプセル、タブレット、水性の懸濁液、溶液等の許容できるいかなる服用形式で経口投与されてもよい。抗体およびその誘導物は、非経口的に投与されてもよい。それは以下の投与経路を介する。すなわち、皮下、静脈内、腹腔内、筋内、関節内、滑液内、胸骨内、鼻腔内、局部、莢膜内、肝内、腫瘍内、病巣内および頭蓋内への注射または注入技術である。一般的には、抗体は、静脈内への注射または注入により供給される。
【００４５】
本発明の抗体は、単独で投与されてもよいし、または、許容できるアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）、賦形剤および添加剤を含む薬学的に許容できるキャリアーとともに投与されてよい。これらは、全て当業者にとって周知である。
【００４６】
有効な服用量は、多数の因子に依存する。体重、治療の目的、最大許容服用量、使用された具体的な製剤、投与経路、患者の応答等の多数のパラメーターに従って任意の患者に対して服用量を調整することは、熟練した内科医が優に為し得る範囲である。
【００４７】
本発明に従って使用されるｔｒＡｂは、一回の注入あたり、好ましくは約５〜約１０００μｇ、さらに好ましくは約１０〜約３００μｇ、約１０〜約１００μｇ、または約１０〜約５０μｇの量である。最適な量は、実験により、熟練者によって決定され得る。前記三機能抗体は、さらに好ましくは約０．０５〜約１５μｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは約０．５〜５μｇ／ｋｇ体重、および約０．５〜２μｇ／ｋｇ体重の量で使用される。投与の回数は、患者の必要性、特に疾患の重さ、患者の応答、適用した服用量およびその技術分野で知られる他の多数の因子に従って、医師が選択できる。
【００４８】
好ましくは、前記三機能抗体は、抗ＣＤ３×抗腫瘍関連抗原抗体および／または抗ＣＤ４×抗腫瘍関連抗原抗体および／または抗ＣＤ５×抗腫瘍関連抗原抗体および／または抗ＣＤ６×抗腫瘍関連抗原抗体および／または抗ＣＤ８抗腫瘍関連抗原抗体および／または抗ＣＤ２×抗腫瘍関連抗原抗体および／または抗ＣＤ２８×抗腫瘍関連抗原抗体および／または抗ＣＤ４４×抗腫瘍関連抗原抗体が選択されるが、特に好ましくは、抗ＣＤ３×抗腫瘍関連抗原抗体が使用される。腫瘍関連抗原として特に好ましくは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｐＣＡＭまたはＣＤ２０抗原であり、さらに好ましくは、三機能抗体の抗ＣＤ３結合アームと組み合わせる。
【００４９】
本発明の前記三機能抗体を使用することで、前記ｔｒＡｂの前記Ｆｃ領域が前記Ｆｃ受容体陽性細胞に結合することによって前記Ｆｃ受容体陽性細胞が活性化される。それにより、サイトカインおよび／または共刺激抗原の発現が開始または増加される。そこで、少なくとも、Ｔ細胞の生理的活性化に必要な第二の活性化シグナルが、前記共刺激抗原および／またはサイトカインにより前記Ｔ細胞に伝達される。この活性化は、活性化マーカーの上方制御（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、腫瘍細胞の殺傷およびＴ細胞の増殖によって示される。
【００５０】
ｔｒＡｂによる前記Ｆｃ受容体陽性細胞の活性化は、前記サブクラス、または抗体の重鎖断片の前記サブクラスの組み合わせにそれぞれ依存する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験で証明されたように、例えば、前記マウスＩｇＧ２ａ／ラットＩｇＧ２ｂのサブクラスの組み合わせのｔｒＡｂは、Ｆｃ受容体陽性細胞に結合し、同時に活性化することが可能で、これらの細胞の表面におけるＣＤ４０、ＣＤ８０もしくはＣＤ８６等の共刺激抗原の上方制御または新しい形成（発現）をそれぞれ導く。一方、前記マウスＩｇＧ１／ラットＩｇＧ２ｂのサブクラスの組み合わせの二重特異性抗体は、Ｆｃ受容体陽性細胞に結合可能だが（（１）Ｈａａｇｅｎら、  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １９９５，  １５４：  １８５２−１８６０）、明らかにこれらの細胞を同程度には活性化できない（（２）Ｇａｓｔら、  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，  １９９５，  ４０：  ３９０）。したがって、ｔｒＡｂのＦｃ領域におけるマウスＩｇＧ２ａ／ラットＩｇＧ２ｂのアイソタイプの組み合わせが特に好ましい。しかしながら、本明細書に記載のとおり、これは他の全てのアイソタイプの組み合わせについても言えることであり、それらは本発明の他の好ましい実施形態において使用することができる。
【００５１】
前記ｔｒＡｂが、一つの結合アーム（例えば、抗ＣＤ３）でＴ細胞に同時に結合し、活性化する間、前記ｔｒＡｂの前記Ｆｃ領域に結合した前記Ｆｃ受容体陽性細胞からの共刺激シグナルが前記Ｔ細胞に伝達される可能性がある。すなわち、前記ｔｒＡｂの一つの結合アームを介したＴ細胞活性化、および前記Ｆｃ受容体陽性細胞から前記Ｔ細胞への共刺激シグナルの同時期の伝達の組み合わせだけが、効果的なＴ細胞の活性化につながる。
【００５２】
抗腫瘍免疫の誘導における他の重要な側面は、前記ｔｒＡｂによって標的とされる修飾細胞（単球、マクロファージ、ＮＫ細胞または樹状細胞）による腫瘍構成物の潜在的な食作用、分解および提示である。この古典的な抗原提示機構により、腫瘍特異的なＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞が生じてもよい。さらに、腫瘍特異的ＣＤ４細胞は、Ｔ／Ｂ細胞の協調という状況で体液性免疫応答の誘導に重要な役割を果たす。
【００５３】
三機能二重特異性抗体は、第１の結合アームでＴ細胞のＴ細胞受容体複合体、第二の結合アームで前記腫瘍細胞上の前記腫瘍関連抗原に結合可能である。それによって、それらは、サイトカインの放出、またはアポトーシスを起こす機構により、腫瘍細胞を破壊するＴ細胞を活性化する。さらに、三機能抗体による活性化ということでは、これらの受容体を通じて腫瘍特異的抗原を認識するＴ細胞は再び活性化する可能性があり、そうして長く持続する抗腫瘍免疫へとつながる可能性があるように思われる。この点で特に重要なのは、単球／マクロファージおよび樹状細胞等の修飾細胞への結合を媒介し、それら自身の細胞傷害性を発達させ、および／または、付随して前記Ｔ細胞に重要な共刺激シグナルを伝達させる、前記三機能二重特異性抗体の完全なＦｃ領域である。明らかに、この方法により、現在まで未知の腫瘍特異的ペプチドに対して、Ｔ細胞の応答が誘導され得る。
【００５４】
潜在的にアネルギー化した腫瘍特異的Ｔ細胞をｔｒＡｂにより腫瘍細胞に誘導し、前記ｔｒＡｂのＦｃ領域に結合した修飾細胞によってそのようなＴ細胞を同時に共刺激することにより、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）のアネルギー状態は撤廃可能であった。すなわち、患者中に存在する腫瘍に対して既に存在するＴ細胞寛容性が、ｔｒＡｂにより撤廃される可能性がある。そして、このことにより、腫瘍細胞の直接の破壊に加えて、長く持続する抗腫瘍免疫が誘導される可能性がある。
【００５５】
好ましくは、本発明に従って使用される抗体は、アネルギー状態にある腫瘍特異的Ｔ細胞を再活性化し得る。さらに、それらは腫瘍に反応する補体結合抗体を誘導可能であり、したがって体液性免疫応答を誘導する。
【００５６】
前記Ｔ細胞への結合は、好ましくはＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ２８および／またはＣＤ４４を通じて起こる。前記Ｆｃ受容体陽性細胞は少なくとも一つのＦｃγ受容体ＩまたはＩＩＩを有する。
本発明に従って使用され得る抗体は、Ｆｃγ受容体Ｉおよび／またはＩＩＩ陽性細胞である、単球、マクロファージ、樹状細胞、“ナチュラルキラー”細胞（ＮＫ細胞）および／または活性化好中球に結合し得る。
【００５７】
本発明に従って使用され得る抗体は、共刺激抗原であるＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−１および／もしくはＬＦＡ−３の発現の開始もしくは増加、または／並びに、前記Ｆｃ受容体陽性細胞によるサイトカイン分泌を導く。好ましくは、前記サイトカインはＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−αである。
好ましくは、前記Ｔ細胞への結合は、前記Ｔ細胞のＴ細胞受容体複合体を通じて起こる。
【００５８】
好ましくは、前記三機能二重特異性抗体は、異種性の完全なラット／マウス二重特異性抗体である。
【００５９】
本発明に従って使用され得るｔｒＡｂによって、Ｔ細胞は活性化され、腫瘍細胞に対して誘導される。好ましい有用な異種性の三機能二重特異性抗体は、以下のアイソタイプの組み合わせの少なくとも一つから選択される。
ラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−ＩｇＧ２ａ、
ラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−ＩｇＧ２ｂ、
ラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−ＩｇＧ３；
ラット−ＩｇＧ２ｂ／ヒト−ＩｇＧ１、
ラット−ＩｇＧ２ｂ／ヒト−ＩｇＧ２、
ラット−ＩｇＧ２ｂ／ヒト−ＩｇＧ３［東洋人のアロタイプＧ３ｍ（ｓｔ）＝プロテインＡに結合］、
ラット−ＩｇＧ２ｂ／ヒト−ＩｇＧ４、
ラット−ＩｇＧ２ｂ／ラット−ＩｇＧ２ｃ；
マウス−ＩｇＧ２ａ／ヒト−ＩｇＧ３[白色人種のアロタイプＧ３ｍ（ｂ＋ｇ）＝プロテインＡに結合しない、以後＊で示す]
マウス−ＩｇＧ２ａ／マウス−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］
マウス−ＩｇＧ２ａ／ラット−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］
マウス−ＩｇＧ２ａ／ヒト−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］
マウス−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１／ラット−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］
マウス−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒトＩｇＧ４／ラット−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ４−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ４［ＣＨ２のＮ−末端領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊［ＣＨ２のＣ−末端領域：＞アミノ酸番号２５１］−ヒト−ＩｇＧ３＊［ＣＨ３］
ラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域−ＣＨ２−ＣＨ３］
ラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ２−［ヒンジ領域−ＣＨ２−ＣＨ３］
ラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ３−［ヒンジ領域−ＣＨ２−ＣＨ３、東洋人のアロタイプ］
ラット−ＩｇＧ２ｂ／マウス−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ４−［ヒンジ領域−ＣＨ２−ＣＨ３］
ヒト−ＩｇＧ１／ヒト−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］
ヒト−ＩｇＧ１／ラット−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ４［ＣＨ２のＮ−末端領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊［ＣＨ２のＣ−末端領域：＞アミノ酸番号２５１］−ヒト−ＩｇＧ３＊［ＣＨ３］
ヒト−ＩｇＧ１／マウス−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ４［ＣＨ２のＮ−末端領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊［ＣＨ２のＣ−末端領域：＞アミノ酸番号２５１］−ヒト−ＩｇＧ３＊［ＣＨ３］
ヒト−ＩｇＧ１／ラット−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ２［ＣＨ２のＮ−末端領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊［ＣＨ２のＣ−末端領域：＞アミノ酸番号２５１］−ヒト−ＩｇＧ３＊［ＣＨ３］
ヒト−ＩｇＧ１／マウス−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ２［ＣＨ２のＮ−末端領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊［ＣＨ２のＣ−末端領域：＞アミノ酸番号２５１］−ヒト−ＩｇＧ３＊［ＣＨ３］
ヒト−ＩｇＧ１／ラット−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］
ヒト−ＩｇＧ１／マウス−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］
ヒト−ＩｇＧ２／ヒト−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ２−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］
ヒト−ＩｇＧ４／ヒト−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ４−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］
ヒト−ＩｇＧ４／ヒト−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ４−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ４［ＣＨ２のＮ−末端領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊［ＣＨ２のＣ−末端領域：＞アミノ酸番号２５１］−ヒト−ＩｇＧ３＊［ＣＨ３］
マウス−ＩｇＧ２ｂ／ラット−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］
マウス−ＩｇＧ２ｂ／ヒト−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］
マウス−ＩｇＧ２ｂ／マウス−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ２−ＣＨ３］
マウス−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ４／ラット−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ４−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ４−［ＣＨ２］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ３］
ヒト−ＩｇＧ１／ラット−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ４−［ＣＨ２］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ３］
ヒト−ＩｇＧ１／マウス−［ＶＨ−ＣＨ１，ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ１−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ４−［ＣＨ２］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ３］
ヒト−ＩｇＧ４／ヒト−［ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ］−ヒト−ＩｇＧ４−［ヒンジ領域］−ヒト−ＩｇＧ４−［ＣＨ２］−ヒト−ＩｇＧ３＊−［ＣＨ３］
【００６０】
好ましくは、本発明に基づく有用な抗体は、モノクローナル、キメラ、組み換え、合成、半合成であるか、または、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖもしくはＦ（ａｂ）２断片を有する化学的に修飾された完全な抗体である。
【００６１】
好ましくは、ヒト起源の抗体、またはその誘導体もしくは断片が使用されるか、または、ヒトでの使用に適するように修飾された抗体（いわゆる、“ヒト化抗体”）が使用される（例えば、Ｓｈａｌａｂｙら、  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７５  （１９９２），  ２１７；  Ｍｏｃｉｋａｔら、  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５７  （１９９４），  ４０５を参照）。
【００６２】
上述した種々のタイプの抗体および抗体断片の調製は、熟練者にとって周知である。モノクローナル抗体、好ましくは、例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギまたはヤギのような哺乳類起源のモノクローナル抗体の調製は、例えば、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６  （１９７５），  ４９５）、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８８），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、またはＧａｌｆｒｅ（Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ７３  （１９８１），  ３）、またはドイツ公開特許第１９５３１３４６号公報に記載されている従来法を用いて行うことが可能である。
【００６３】
さらに、組み換えＤＮＡ技術を用いて、熟練者に知られた技術に従って（Ｋｕｒｕｃｚら、  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５４  （１９９５），  ４５７６；  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０  （１９９３），  ６４４４を参照）、記載された抗体を調製することが可能である。
【００６４】
二つの異なる特異性を有する抗体、いわゆる二重特異性抗体の調製は、一方では、組み換えＤＮＡ技術を用いて実施することが可能であるが、他方では、いわゆるハイブリッドハイブリドーマ融合技術（例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、  Ｎａｔｕｒｅ  ３０５  （１９８３），  ５３７を参照）によっても実施することが可能である。この技術は、所望の特異性の一つを有する抗体をそれぞれ産生するハイブリドーマ細胞系統の融合、および、両方の特異性を有する抗体を産生する組み換え細胞系統の同定、単離を含む。
【００６５】
本発明の基礎をなす課題は、請求項１で定義した三機能二重特異性抗体を用いて解決される。続いて、二つの特異性を示す抗体の調製をより詳細に記載する。本発明に含まれる三機能二重特異性抗体は先行技術に属し、そのような調製方法を記載した文献は、本明細書中にそれら全体が取り込まれている。
【００６６】
三機能二重特異性抗体は、それぞれ特異性を示し、かつ、通常の抗体と同様に、周知のエフェクター機能を発揮するＦｃ領域を有する、二つの抗体セミ分子（それぞれが一つのＨおよび一つのＬ免疫グロブリン鎖を有する）から構成される。それらは、クアドローマ技術を用いて調製することが好ましい。この調製方法は、ドイツ公開特許第４４１９３９９Ａ号公報において例証されている。完全な開示のために、この公報は、二重特異性抗体の定義にも関連する引用によりその全体が取り込まれている。他の調製方法も、本発明において要求される上述の定義に基づく三機能二重特異性抗体に導かれる限り、有用であることは理解されるべきである。
【００６７】
前記ｔｒＡｂのＦｃγ−ＲＩへの結合は、最適な抗腫瘍効果という観点から二つの不可欠な利点を示す。
（１）Ｆｃγ−ＲＩ陽性細胞は、ＡＤＣＣによって腫瘍細胞を除去する能力を有する。そのため、前記ｔｒＡｂによって腫瘍細胞に誘導された細胞傷害性Ｔ細胞の抗腫瘍効果に相乗的に貢献することができる。
（２）ＦｃγＲＩ陽性細胞（単球／マクロファージ／樹状細胞等）は、Ｔ細胞に対して、抗原提示に似た重要な共刺激シグナルを提供し得る。それにより、Ｔ細胞アネルギーを阻害する。さらに、腫瘍特異的ペプチド（腫瘍細胞上でＭＨＣ抗原を通じて提示される）を認識するＴ細胞受容体を有するＴ細胞でさえ、Ｔ細胞の修飾細胞と腫瘍細胞とのｔｒＡｂを通じた相互作用による望ましい副産物として、刺激可能である。この配置において、Ｔ細胞の適切な活性化に必要な共刺激は、修飾細胞（単球等）から提供される。このため、Ｔ細胞受容体と独立で、ｔｒＡｂが媒介する直接的な腫瘍の破壊とは別に、本発明の抗体は、前記ｔｒＡｂの分解後も患者内でパトロールを続ける腫瘍特異的Ｔ細胞を活性化し、産生することも可能なはずである。これは、遺伝子治療的なアプローチ（例えば、腫瘍細胞中にＢ−７等の共刺激抗原を取り込むことによる）と似て、三機能二重特異性抗体によって患者の腫瘍寛容性が撤廃され得ることを意味する。
【００６８】
後述する実験データは、本明細書中に記載したｔｒＡｂが、前記標的抗原、特に好ましくはＨｅｒ２／ｎｅｕおよびＣＤ２０標的抗原を低度から中程度の発現レベルでしか有さない腫瘍細胞の破壊に、驚くほど高度に効果的に使用可能であることを示す。高度な効果の理由は、前述した前記三機能抗体の作用様式に見出すことができる。前記作用様式は、単特異性抗体とは大きく異なる。本発明において使用される三機能抗体は、抗Ｔ細胞結合アームおよびＦｃ領域により、種々のタイプの免疫細胞を誘導し、同時に活性化できる。これらの免疫細胞の典型例は、Ｔリンパ球並びにＦｃγ受容体Ｉ型（ＣＤ６４）およびＩＩＩ型（ＣＤ１６）を有する修飾細胞である。第一の結合アームは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕまたはＣＤ２０等の腫瘍細胞上の標的抗原に結合し、第二の結合アームは、例えば、Ｔリンパ球上のＣＤ３に結合する（図４）。
【００６９】
腫瘍抗原の発現レベルを定量化する方法は、その技術分野において公知である。例えば、免疫細胞化学法であり、例えば、ＥＬＩＳＡ試験、定量的フローサイトメトリー、組織染色法およびサイトスピン解析等の方法である。腫瘍細胞上の腫瘍関連標的抗原の発現を定量的に決定する方法の典型例は、腫瘍組織上のＨｅｒ２／ｎｅｕの発現レベルの定量的決定を可能にした、ＤＡＫＯ社（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）によって開発されたＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）等の免疫組織化学法である。ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）に関する参考文献が、ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒコード番号Ｋ５２０７第１版として、ＤＡＫＯ社により記載されており、出版番号１１１  ７８１−００１およびＫ５２０７／ＥＦＧ／ＡＯＳ／１３．１０．０４によって同定できる。この文献は引用により本明細書中に完全に取り込まれている。腫瘍細胞の表面に発現する標的抗原のおよその数を表す４つの段階０、１＋、２＋、３＋を含む、Ｈｅｒ２／ｎｅｕによる評価システムが提供されている。このシステムに従って、標的細胞の表面に２０，０００未満のＨｅｒ２／ｎｅｕ分子が発現している細胞は、陰性と分類され、約２０，０００より多く、約１００，０００〜１１０，０００以下（最大で１５０，０００）の分子を発現する細胞は、１＋（低度の発現）と分類され、約５００，０００以下の分子を発現する細胞は、２＋（中程度の発現）、約２，０００，０００から約１０，０００，０００分子を発現する細胞は、３＋（高度の発現）に分類される。本発明によれば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕに対する三機能二重特異性抗体は、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）に従ってＨｅｒ２／ｎｅｕ  １＋および２＋（後者においては、さらにＦＩＳＨ法陰性の場合）と分類された腫瘍細胞を有する患者の治療に使用可能であることが見出されている。
【００７０】
いわゆるＦＩＳＨ法は、当該技術分野において周知である。“ＦＩＳＨ”とは「蛍光Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」を意味し、細胞遺伝学的技術であり、染色体上の特異的ＤＮＡ配列の有無を検出し、場所を特定するために使用可能である。前記技術自体は確立されており当該技術分野において公知である。引用するとすれば、例えば、Ｌａｕｄａｄｉｏ  Ｊ、Ｑｕｉｇｌｅｙ  ＤＩ、Ｔｕｂｂｓ  Ｒ、Ｗｏｌｆｆ  ＤＪ、ＨＥＲ２試験があげられる。検出方法およびそれらの臨床上の実績の総覧は、引用により本明細書中に完全に取り込まれている。
【００７１】
ＦＩＳＨ法の試験結果において陰性とは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子は増幅されていないこと、すなわちＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子の数が通常の生理学的範囲内にあるということを意味する。しかし、全ての乳ガンのうち１５から２０％では、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子は増幅されている。この増幅の検出は確立されており、乳ガンの前記療法にとって重要である。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子が増幅されている場合、ＦＩＳＨ解析は陽性であり、その場合、例えばＨｅｒｃｅｐｔｉｎによる療法が有効である可能性がある。一方、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを過剰発現するが、ＦＩＳＨ法において陰性の患者は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ等の抗体では効果的に治療できない。それゆえ、５００，０００以下のＨｅｒ２／ｎｅｕの発現を有するがＦＩＳＨ法において陰性の患者もまた、本明細書に記載されているように前記三機能二重特異性抗体で治療が成功可能であることは、乳ガンの療法における重要な進歩であると考えられなければならない。多数のグループが、Ｂ細胞悪性腫瘍でのＣＤ２０の発現も調査している。Ｇｉｎａｌｄｉら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，  ５１：３６４，  １９９８）は、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓキット（Ｓｉｇｍａ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）を用いて、種々のＢ細胞悪性腫瘍のＣＤ２０の発現を評価した。彼等は、例えばＢ−ＣＬＬでは白血球細胞あたり平均６５，０００のＣＤ２０分子、マントル細胞リンパ腫では細胞あたり１２３，０００のＣＤ２０分子を見出した。この調査により、有毛細胞白血病の場合、平均値は細胞あたり３１２，０００のＣＤ２０分子と決定された。
【００７２】
Ｈｕｈら（Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  １１６：４３７，  ２００１）は、さらに、例えば、末梢血および骨髄のような種々の部位でのＣＤ２０の種々の発現を、Ｂ細胞悪性腫瘍で比較可能な方法で調査した。ここにおいて、骨髄試料では、Ｂ−ＣＬＬにおいて細胞あたりのＣＤ２０分子の数は最低であり（平均４，０６７；範囲２２２〜４６，３９５）、濾胞性リンパ腫（平均２２，２４０；範囲３，６８９〜３９，６４３）、マントル細胞リンパ腫（平均２９，７７０；範囲２，７８５〜９７，７２７）ではより高く、有毛細胞白血病（平均３１，５６３；範囲１，６０７〜７２，５４０）では最高であった。対照的に、末梢血では、細胞あたりのＣＤ２０分子の数は一般的により高く、例えばＢ−ＣＬＬでは平均数は９，０５１で、５６３から３１，５０７の範囲であった。
【００７３】
まとめると、Ｂ細胞悪性腫瘍の場合、細胞あたりのＣＤ２０分子数は、約１０００から３００，０００まで、Ｂ細胞悪性腫瘍のタイプおよび身体での部位に依存して変化し、最大約３５０，０００であった。
【００７４】
次の実施例において、添付の図および表を参照することによって、本発明を、さらに詳細に記載する。第一の実施例は、本発明を、商標Ｒｅｘｏｍｕｎ（登録商標）（国際一般名  ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）で入手可能な三機能抗体、および、Ｒｅｘｏｍｕｎ（登録商標）の標的となる前記腫瘍関連抗原Ｈｅｒ２／ｎｅｕの観点から例証する。第二の実施例は、ＣＤ３を通じてＴ細胞に結合し、腫瘍抗原としてＣＤ２０を認識するＢｉ２０（ＦＢＴＡ０５としても知られる）という三機能二重特異性抗体に向けられている。これらの実施例は、請求項１および明細書全体で特定した他の全ての腫瘍関連抗原に関しても、本発明が使用可能であるという説得力のある証拠を提供する。これらの腫瘍関連抗原全ては、従来使用されていた抗体に基づく免疫療法ではほとんど治療不可能なほど少数しか腫瘍細胞の表面上に存在していなくてもよい。
【００７５】
本発明を説明するための図および表は、実施例１および２に関連し、次のとおりに説明される。
【００７６】
図１：Ａ−Ｆ  異なる抗Ｈｅｒ２抗体を用いてフローサイトメトリーにより測定された細胞系統Ｌｏｘ、ＨＣＴ−８およびＳＫＢＲ３のＨｅｒ２／ｎｅｕ発現特性
【００７７】
図２ａ：Ｈｅｒ２＋３  ＳＫＢＲ−３細胞の死滅：Ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いたドットプロット解析；  ＊印の番号は、表３に対応する。
【００７８】
図２ｂ：Ｈｅｒ２＋１  ＨＣＴ−８細胞の死滅：Ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いたドットプロット解析；  ＊印の番号は、表３に対応する。
【００７９】
図２ｃ：Ｈｅｒ２ネガティブ  Ｌｏｘ細胞の死滅：Ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いたドットプロット解析；  ＊印の番号は、表３に対応する。
【００８０】
図２ｄ：Ｈｅｒ２＋１  ＨＣＴ−８細胞の死滅：ＭＤＳワークフロー（ｗｏｒｋｆｌｏｗ）によるドナー２のドットプロット結果の一例；  ＊印の番号は、表３に対応する。
【００８１】
図３：サイトカインビーズアレイシステム（ＣＢＡ）を用いて測定された２４時間後のクローン原性アッセイ上清中のサイトカイン分泌
【００８２】
図４：推定される三細胞複合体（ｔｒｉ−ｃｅｌｌ−ｃｏｍｐｌｅｘ）。三機能抗体は、異なる免疫学的メカニズムにより腫瘍細胞の認識と破壊を促進することができる。ＩＦＮ−γを除く図中のサイトカインに関するリストをまとめなければならない（Ｂｅｉ  ｄｅｒ  Ａｕｆｌｉｓｔｕｎｇ  ｄｅｒ  Ｚｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｍ  Ｂｉｌｄ  ｓｏｌｌｔｅ  ｍａｎ  ｎｏｃｈ  ＩＦＮ−γ  ａｕｆｎｅｈｍｅｎ）。
注：ＡＤＣＣ、抗体依存性細胞傷害；ＤＣ、樹状細胞；ＮＫ、ナチュラルキラー細胞；ＤＣ−ＣＫ１、樹状細胞サイトカイン１；ＩＬ、インターロイキン；ＬＦＡ、リンパ球機能関連抗原；ＴＮＦ−α、腫瘍壊死因子α；ＣＤ、表面抗原分類（出典  Ｒｕｆ＆Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ，２００１）
【００８３】
図５．Ｂｉ２０の精製。（Ａ）陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＩＥＸ）。親マウス抗体（ピーク１）を、ＨＲ１０／１０  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｃｏｌｕｍｎ上で、三機能抗体（ピーク２）から分離した。（Ｂ）Ｂｉ２０三機能抗体精製の等電点電気泳動（ＩＥＦ）。親ラット抗体（２６ＩＩ６）を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＡＣ  Ｂｉ２０）後に除去し、親マウス抗体（ＴＰＡ１０）を、ＣＩＥＸ（ＣＩＥＸ  Ｐ１  Ｂｉ２０）により三機能抗体から分離した。精製されたＢｉ２０は、前記陽イオン交換クロマトグラフィーのピーク２（ＣＩＥＸ  Ｐ２  Ｂｉ２０）に見出された。
【００８４】
図６．Ｂｉ２０が特異的に結合するエフェクター細胞。１９０ｎｇのＢｉ２０を、５×１０５個の標的細胞とともにインキュベートし、その結合をＦＡＣＳ解析により測定した。Ｒａｍｏｓ細胞（Ａ）を、ＣＤ２０アームの標的細胞として用いた。ＴＨＰ−１細胞（Ｂ）を、Ｆｃ領域用に用いた。拮抗実験のために、細胞を予めＲｉｔｕｘｉｍａｂ（Ｒｉｔ）とともに所定の過剰量の抗体で３０分間インキュベートした。
【００８５】
図７．エフェクター細胞の存在下におけるＢｉ２０が媒介する効果的なＢ細胞の減少。（Ａ）１×１０６個／ｍｌのＰＢＭＣおよび２×１０５個／ｍｌの腫瘍細胞（Ｒａｊｉ、Ｍｅｃ１）を、５０ｎｇ／ｍｌのＢｉ２０、ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ（Ｃａｔｕｍ）、ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、または親抗体であるＴＰＡ１０および２６ＩＩ６とともにインキュベートした。Ｂ細胞の除去を、単球、Ｂ細胞およびＴ細胞のトリパンブルー色素排除集計並びにＦＡＣＳ解析により、３日目に測定した。抗体を用いない（ネガティブ）（ｎｅｇ）前記アッセイにおけるＢ細胞の絶対数を、１００％に設定した。（Ｂ）１×１０６個／ｍｌのＰＢＭＣおよび２×１０５個／ｍｌのＲａｊｉ細胞を、Ｂｉ２０とともに、Ｂｉ２０の量を増加させて（０．５〜２５０ｎｇ／ｍｌ）インキュベートした。前記Ｂ細胞の絶対数を、トリパンブルー色素排除集計およびＦＡＣＳ解析により、１日目、２日目、３日目において測定し、Ｂ細胞の減少割合を算出した。
【００８６】
図８．Ｂｉ２０が媒介するＴ細胞の活性化。（Ａ）１×１０６個／ｍｌのＰＢＭＣおよび２×１０５個／ｍｌのＲａｊｉ腫瘍細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのＢｉ２０、ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ（Ｃａｔｕｍ）、ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、または親抗体であるＴＰＡ１０および２６ＩＩ６とともに３日間インキュベートした。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上におけるＣＤ２５の発現のＭＦＩを、ＦＡＣＳ解析により測定した。（Ｂ）ＰＢＭＣおよびＲａｊｉ細胞を、Ｂｉ２０とともに、Ｂｉ２０の量を増加させて（０．５〜２５０ｎｇ／ｍｌ）インキュベートした。ＣＤ４＋Ｔ細胞上におけるＣＤ２５の発現のＭＦＩを、１日目、２日目および３日目に測定した。
【００８７】
図９．Ｂｉ２０が誘導するＴ細胞の増殖。１×１０６個／ｍｌのＰＢＭＣおよび２×１０５個／ｍｌのＲａｊｉ細胞を、５０ｎｇ／ｍｌの濃度のＢｉ２０、ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ（Ｃａｔｕｍ）、ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、または親抗体であるＴＰＡ１０および２６ＩＩ６とともに３日間インキュベートした。Ｔ細胞数を、トリパンブルー色素排除集計並びに抗ＣＤ５／４抗体および抗ＣＤ５／８抗体を用いたＦＡＣＳ解析により測定した。
【００８８】
図１０．Ｂｉ２０により媒介される単球の活性化。（Ａ）１×１０６個／ｍｌのＰＢＭＣおよび２×１０５個／ｍｌのＲａｊｉ腫瘍細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのＢｉ２０、ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ（Ｃａｔｕｍ）またはｒｉｔｕｘｉｍａｂとともに１日間インキュベートした。ＣＤ１４＋単球によるＣＤ２５の発現のＭＦＩを、ＦＡＣＳ解析により測定した。（Ｂ）１×１０６個／ｍｌのＰＢＭＣおよび１×１０５個／ｍｌのＴＨＰ−１細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのＢｉ２０、ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ（Ｃａｔｕｍ）、ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（Ｒｉｔ）、ＴＰＡ１０、または２６ＩＩ６とともに１日間インキュベートした。ＣＤ３３＋ＴＨＰ−１細胞の活性化を、ＣＤ２５またはＣＤ４０の発現によって測定した。
【００８９】
図１１．健康なドナーのエフェクター細胞存在下におけるＢｉ２０が誘導するＣＬＬ  Ｂ細胞の減少。（Ａ）１×１０６個／ｍｌのＰＢＭＣおよび２×１０５個／ｍｌのＣＬＬ腫瘍細胞を、５、５０、もしくは２５０ｎｇ／ｍｌのＢｉ２０、２５０ｎｇ／ｍｌのｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ（Ｃａｔｕｍ）、または２５０ｎｇ／ｍｌのＲｉｔｕｘｉｍａｂ（Ｒｉｔ）とともに３日間インキュベートした。Ｂ細胞の除去を、単球、Ｂ細胞およびＴ細胞のトリパンブルー色素排除集計並びにＦＡＣＳ解析により、３日目に測定した。抗体を用いない（ネガティブ）前記アッセイにおけるＢ細胞の絶対数を、１００％に設定した。ＭＶ：ＣＬＬ−１からＣＬＬ−９の平均値。（Ｂ）ＣＬＬ患者検体（１〜１４）におけるＣＤ２０の発現の概要、細胞系統（Ｒａｊｉ、Ｍｅｃ−１）および１体の健康なドナー（ＰＢＭＣ）。ＭＦＩ＝蛍光強度の平均値。
【００９０】
表１：用いた抗体およびそれらに対応する検出抗体の特性
＊  ＴＲＩＯＮ  Ｐｈａｒｍａ社、ミュンヘン、＄  Ｒｏｃｈｅ社、＃  Ｍｉｃｒｏｍｅｔ社、ミュンヘン
【００９１】
表２：用いた細胞系統およびそれらのＨｅｒ２／ｎｅｕスコア
＊：Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ３：３７９−３９８，  ２００４に準拠
【００９２】
表３：クローン原性アッセイサンプル
Ａｂ＝抗体、μｇ＝マイクログラム、ｎｇ＝ナノグラム
【００９３】
表４．Ｂｉ２０が媒介するサイトカイン分泌。１×１０６個／ｍｌのＰＢＭＣおよび２×１０５個／ｍｌの腫瘍細胞（Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｍｅｃ１、Ｇｒａｎｔａ、ＤＯＨＨ−２）を、５０ｎｇ／ｍｌのＢｉ２０、ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ（Ｃａｔｕｍ）、ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、または親抗体であるＴＰＡ１０および２６ＩＩ６とともに、３日間インキュベートした。上清を収集し、サイトカイン分泌を、ＣＢＡ解析およびＦＡＣＳ解析を用いて測定した。
【００９４】
表５．Ｂｉ２０が媒介する自己設定におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＬＬ  Ｂ細胞の除去。Ｂ細胞およびＴ細胞の割合（％）、Ｂ細胞上におけるＣＤ２０の発現（ＭＦＩ）、およびＥ：Ｔ比を、ＣＬＬ  ＰＢＭＣの調製後直ちにインキュベート前に測定した。ＣＬＬ細胞を所定量のＢｉ２０またはｒｉｔｕｘｉｍａｂとともに、０、３、６、および９日目にインキュベートした。Ｂ細胞の除去を、患者検体に応じて３日目から１０日目の間に測定した。Ｂ細胞の除去を、減少したＢ細胞の割合（％）で示す。Ｔ細胞活性化：ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上におけるＣＤ２５の発現は、少なくとも５倍（＋＋）上方制御された。エフェクター／ターゲット比（Ｅ：Ｔ）を、単球数、ＮＫ細胞数およびＴ細胞数に対するＢ細胞数として定義した。１０％以下のＢ細胞の除去は、ネガティブとみなした。
【実施例】
【００９５】
実施例１
実施例１は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕに結合する三機能二重特異性抗体をＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）におけるスコア１＋の患者の治療に用いた場合の性能に関するキャラクタリゼーションについて記載する。
【００９６】
方法
［細胞系統および抗体］
Ｒｅｘｏｍｕｎ（登録商標）（Ｔｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ社製、ミュンヘン）は、一方の結合アームにより腫瘍関連抗原Ｈｅｒ２／ｎｅｕを標的にし、他方のアームによりＴ細胞上のＣＤ３分子に結合する三機能抗体である。さらに、Ｒｅｘｏｍｕｎ（登録商標）は、マウスＩｇＧ２ａおよびラットＩｇＧ２ｂアイソタイプからなる強力なＦｃ領域を通じてＦｃγＲＩ陽性およびＦｃγＲＩＩＩ陽性細胞（例えば、マクロファージ、ＮＫ細胞、樹状細胞）に結合する。モノクローナル抗体２５０２Ａ（Ｔｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ社、ミュンヘン）は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕに特異的であり、Ｒｅｘｏｍｕｎ（登録商標）に含まれる親抗体の一つである。２６ＩＩ６（Ｔｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ社、ミュンヘン）は、ＣＤ３に特異的であり、Ｒｅｘｏｍｕｎ（登録商標）に含まれる親抗体の他の一つである。５２０Ｃ９（ＡＴＣＣ  ＨＢ−８６９６）は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ受容体を認識する他のモノクローナル抗体である。Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂは、マウスの抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体であるＭａｂ４Ｄ５（５８）から開発されたヒト化抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体である。表１に、用いた抗体およびそれらに対応する検出抗体の特性を示す。
【００９７】
ＳＫＢＲ３（ＡＴＣＣ  Ｈ  ＴＢ−３０）は、ＩＨＣにより検出されたＨｅｒ／ｎｅｕを強力に過剰発現する（ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）スコア＋３）乳ガン細胞系統であり（５８）、ＨＣＴ−８（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４４）は、大腸ガン細胞系統であり、Ｌｏｘは、メラノーマ細胞系統である（表２）。
【００９８】
［Ｈｅｒ２／ｎｅｕスコアリング］
ＨＣＴ−８細胞におけるＨｅｒ２／ｎｅｕの状態（ｓｔａｔｕｓ）を、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）キット（ＤＡＫＯ社、グロストラップ、デンマーク）を用いてＩＨＣにより評価し、製造者のマニュアルに従って、ミュンヘン大学（ＬＭＵ  ミュンヘン）の病理学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）の力を借りて実施した。
【００９９】
［ＦＡＣＳ解析］
ＦＡＣＳ解析を、５×１０５個の標的細胞（ＳＫＢＲ３、ＨＣＴ−８またはＬｏｘ）を用いて実施した。細胞を、１００ｎｇのモノクローナル抗体または１００ｎｇの三機能抗体Ｒｅｘｏｍｕｎ（登録商標）とともに、４５分間４℃でインキュベートした。それから、検体をＭｇ２＋およびＣａ２＋を含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｓ社、アイデンバッハ）を用いて洗浄し、対応する検出抗体（Ｄｉａｎｏｖａ社、ハンブルク）とともに４５分間４℃でインキュベートした（表１）。ＰＢＳを用いてもう一度洗浄工程を行った後、細胞を０．０１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含むＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ社、ミュンヘン）中に再懸濁した。結合した抗体の量を、オーバーレイヒストグラム（ｏｖｅｒｌａｙ  ｈｉｓｔｏｇｒａｍ）における蛍光強度の平均値により解析した。抗ヒト検出抗体のみを用いた検体、または２６ＩＩ６（抗ＣＤ３）およびそれに対応する検出抗体（アイソタイプコントロール）とともにインキュベートした検体を、ネガティブコントロールとした。すべてのＦＡＣＳ解析は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、ハイデルベルク）により実行し、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  ＰｒｏまたはＷｉｎＭＤＩ２．８を用いて解析した。
【０１００】
［クローン原性アッセイ］
抗体が媒介する腫瘍の除去を、刺激されていないエフェクター細胞を用いた長期クローン原性アッセイを用いて検討した。そのために、１０６個のＰＢＭＣを、５％の標的細胞（ＳＫＢＲ３、ＨＣＴ−８またはＬｏｘ）とともにスパイクし（ｓｐｉｋｅ）、２４穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社）に播種した。抗体を、表３に示す異なる濃度および組み合わせで添加した。標的細胞のみの検体およびいずれの抗体も添加していない標的細胞とエフェクター細胞との混合物からなる検体を、コントロールとした。検体を、３７℃／５％の二酸化炭素でインキュベートし、ＲＰＭＩ１６４０、Ｌ−グルタミンおよび１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を３日に一度ずつ供給した。８日間のインキュベート後、細胞を前記２４穴プレートから収集し、Ｍｇ２＋／Ｃａ２＋を含まないＰＢＳを用いて洗浄し、Ｎｅｕｂａｕｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｃｈａｍｂｅｒにおいて、トリパンブルーによる死細胞の排除により計数した。それから、生細胞をスライドあたり２．５×１０５個の細胞濃度で、サイトスピンスライド（Ｍｅｎｚｅｌ社）上で遠心沈殿した。遠心沈降後の検体を一晩乾燥させ、続いて免疫細胞化学法にかけた。異なる３体のドナー由来のＰＢＭＣを用いて、実験を３回繰り返した。
【０１０１】
［免疫細胞化学法］
サイトスピンスライド上での非特異的結合特性を、１０％のヒト血清を用いて飽和させた。ＳＫＢＲ３およびＨＣＴ−８細胞を、スライドあたり１．５μｇの抗サイトケラチン８、１８、１９抗体（Ａ４５Ｂ−Ｂ３、マウスＩｇＧ１、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ社、ミュンヘン）を用いて染色し、Ｌｏｘ細胞を、スライドあたり１．５μｇの抗ＥＧＦＲ抗体（ミュンヘンのＤｒ．Ｈｔｕｎに快く提供していただいたマウスＩｇＧ２ａ）を用いて染色した。サイトケラチン染色用の抗マウスＩｇＧ１  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４７７（ＦＩＴＣ）抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社、ユージーン）、またはＥＧＦＲ染色用の抗マウスＩｇＧ２ａ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４７７（ＦＩＴＣ）抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社、ユージーン）を、検出抗体として、スライドあたり１．５μｇで用いた。サイトスピンスライドを、ＦＩＴＣ標識された細胞を計数するコンピュータ化された画像解析を用いたＭｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＭＤＳ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ社）により解析した。
【０１０２】
［＋１のＨｅｒ２／ｎｅｕ発現を示す大腸ガン細胞系統であるＨＣＴ−８］
Ｈｅｒ２／ｎｅｕの＋１発現を有する細胞系統を見出すために、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発現のレベルを、異なる細胞系統において検討した。
【０１０３】
そのために、前記モノクローナルＨｅｒ２／ｎｅｕ抗体である２５０２Ａ、５２０Ｃ９、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂおよび前記三機能抗体Ｒｅｘｏｍｕｎ（登録商標）を用いたＦＡＣＳ解析を実施した。前記モノクローナル抗ＣＤ３抗体である２６ＩＩ６を、ニセのコントロールとした。図１Ａ−Ｆに、ＳＫＢＲ−３、ＨＣＴ−８またはＬｏｘ細胞に用いた抗体の結合特性を示す。異なる検出抗体のみを用いたフローサイトメトリー検体を、コントロールとし（図１Ａ）、それに対応する検出抗体を用いた２６ＩＩ６（抗ＣＤ３）を、アイソタイプコントロールとした（図１Ｂ）。
【０１０４】
メラノーマ細胞系統であるＬｏｘは、予想どおりＨｅｒ２／ｎｅｕ受容体の発現を示さなかった（図１Ｃ−Ｆ）。一方、ＳＫＥＲ３細胞は、モノクローナル抗体５２０Ｃ９（図１Ｃ）、２５０２Ａ（図１Ｄ）およびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（図１Ｅ）を用いたＨｅｒ２／ｎｅｕに対して重度に染色された。Ｒｅｘｏｍｕｎ（登録商標）は、ＳＫＢＲ３細胞を低度に染色した。おそらく、その一方のアームの結合特性のためであろう（図１Ｆ）。ＳＫＢＲ３細胞と比較して、ＨＣＴ−８細胞は、すべての用いたＨｅｒ２抗体に対するＨｅｒ２／ｎｅｕ受容体の発現が明らかに弱い（図１Ｃ−Ｆ）。このことは、これらの細胞のさらなる評価を正当化する。加えて、ＨＣＴ−８細胞のＨｅｒ２／ｎｅｕ発現を、ＤＡＫＯ社のＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）を用いて解析した。前記テストを、ミュンヘン工科大学（ＴＵ、ミュンヘン）の病理学研究所の力を借りて実施した。前記大腸ガン細胞系統であるＨＣＴ−８は、実施したＤＡＫＯテストにおいて、ＦＡＣＳ解析の結果を確認することで、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの＋１発現を示した。表２に、用いた細胞系統、それらのＨｅｒ２／ｎｅｕスコアおよびＨｅｒ２／ｎｅｕ発現の測定に適用された方法の概要を示す。
【０１０５】
［Ｒｅｘｏｍｕｎ（登録商標）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ＋３細胞系統およびＨｅｒ２／ｎｅｕ＋１細胞系統を死滅させることが可能である］
腫瘍部位に対して異なるタイプの免疫細胞を補充すると同時に活性化するＲｅｘｏｍｕｎ（登録商標）の能力は、Ｒｅｘｏｍｕｎ（登録商標）が、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを低度（＋１）に発現している腫瘍細胞を除去することも可能であるかもしれないという仮説を導いた。
【０１０６】
そのために、長期細胞障害性解析（クローン原性アッセイ）を確立した。３体の健康なドナーのＰＢＭＣを、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ＋３発現する細胞系統であるＳＫＢＲ−３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕネガティブのＬｏｘ細胞系統またはＨｅｒ２／ｎｅｕ＋１発現するＨＣＴ−８細胞系統とともに、８日間インキュベートした。異なる抗体濃度のＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（１００μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ）、またはＲｅｘｏｍｕｎ（登録商標）（１００ｎｇ／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍｌ）を、表３に示すように添加した。腫瘍細胞の死滅を、８日後に前記細胞を収集し、それらをサイトスピンスライドに移し、前記細胞を抗ＣＫ８、１８、１９抗体（ＳＫＢＲ−３およびＨＣＴ−８）、または抗ＥＧＦＲ抗体（Ｌｏｘ）と、これらに対応するＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ＦＩＴＣ抗体とを用いて染色することで評価した。それから、前記染色したサイトスピンスライドを、Ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＤＳ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ社、英国）上のＳＬＩＤＥ  ＳＣＡＮプログラムを用いるコンピュータ化された画像解析により評価した。
【０１０７】
この研究において、前記三機能抗体であるＲｅｘｏｍｕｎ（登録商標）（抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ×抗ＣＤ３）を、低度にＨｅｒ２／ｎｅｕを発現する腫瘍細胞系統であるＨＣＴ−８（ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔスコア：＋１）の腫瘍細胞増殖を阻害する能力において、ヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕモノクローナル抗体であるＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（登録商標）と比較した。
【０１０８】
前記細胞系統ＳＫＢＲ３（＋３  Ｈｅｒｃｅｐスコア）、ＨＣＴ−８（＋１  Ｈｅｒｃｅｐスコア）およびＬｏｘ（Ｈｅｒ２／ｎｅｕネガティブ）におけるＨｅｒ２／ｎｅｕ発現を、ＦＡＣＳ解析により測定した。一方、ＨＣＴ−８細胞を、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）によってもテストした。Ｈｅｒ２／ｎｅｕに対する種々の抗体を用いたＦＡＣＳ解析は、ＳＫＢＲ３細胞においては強力なＨｅｒ２発現を示し、ＨＣＴ−８細胞においてはより弱い発現を示し、Ｌｏｘ細胞においてはＨｅｒ２／ｎｅｕの発現を示さなかった。これらの結果は、ＨＣＴ−８細胞の＋１ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）スコアと一致する。三機能抗体であるＲｅｘｏｍｕｎ（登録商標）の蛍光の平均値は、モノクローナル抗体の前記値より、わずかに低い。モノクローナル抗体が二価の結合であるのと比較して、Ｒｅｘｏｍｕｎ（登録商標）が一価の結合であるためである（図１：Ａ−Ｆ）。
【０１０９】
前記低度にＨｅｒ２／ｎｅｕを発現する細胞系統であるＨＣＴ−８の増殖を阻害するＲｅｘｏｍｕｎ（登録商標）およびＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（登録商標）の能力をテストするために、クローン原性アッセイを実施した。８日後の培養細胞を、培養皿から収集し、サイトスピンスライド上で遠心沈降し、腫瘍細胞を染色した。抗体を添加していないすべてのコントロール検体（２４穴プレートあたり１２，５００個の腫瘍細胞）（図２ａ〜ｃ、検体Ａ１、Ｂ１、Ｃ１）は、サイトスピン染色後のＭＤＳにおいて、細胞系統ＳＫＢＲ３、ＨＣＴ−８およびＬｏｘに関して腫瘍細胞の増殖を示した。スパイクした腫瘍細胞、または抗体を添加していない２５００００個のＰＢＭＣを含むスライドでは、予想どおり全てにおいて腫瘍細胞が見られなかった（図２ａ〜ｃ、検体Ａ２、Ｂ２、Ｃ２）。ＰＢＭＣを５％のＳＫＢＲ３、ＨＣＴ−８またはＬｏｘ細胞とともに、抗体を添加せずに混合することで、腫瘍の増殖を、同種間のコントロールにおいて明確に可視化した（図２ａ〜ｃ、検体Ａ３、Ｂ３、Ｃ３）。
【０１１０】
Ｈｅｒ２＋３細胞系統であるＳＫＢＲ−３の腫瘍細胞の増殖は、予想どおり１００μｇ、５０μｇ、１０μｇおよび１μｇのＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（登録商標）の添加により阻害された（図２ａ、検体Ａ４〜Ａ８）。さらに、Ｒｅｘｏｍｕｎ（登録商標）も、わずか１００ｎｇ、５０ｎｇ、１０ｎｇまたは１ｎｇ添加しただけで、腫瘍の増殖を阻害することが可能であった。検体Ａ９〜Ａ１２に示すように（図２ａ）、腫瘍細胞の増殖は、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（登録商標）よりも効果的に阻害された。
【０１１１】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕネガティブ細胞系統であるＬｏｘは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ受容体が存在することにより駆り立てられる（ｄｒｉｖｅｎ）腫瘍細胞除去の特異性を示すＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（登録商標）、またはＲｅｘｏｍｕｎ（登録商標）を種々の量で添加しても、腫瘍細胞の増殖は阻害されなかった（図２ｃ、検体Ｃ４〜Ｃ１２）。
【０１１２】
大腸ガン細胞系統であるＨＣＴ−８（Ｈｅｒ２／ｎｅｕスコア＋１）の増殖は、種々の量（１００μｇ〜１μｇ）のＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（登録商標）によって、際立っては阻害されなかった（図２ｂ、検体Ｂ４〜Ｂ８）。このことは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ＋１の乳ガン細胞系統であるＭＣＦ−７（５）に関する従来の知見と一致する。ＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２）は、ＴＮＦ−αによる増殖阻害を示すため、三機能抗体であるｒｅｍｏｖａｂ（登録商標）（抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３）に類似するｒｅｘｏｍｕｎ（登録商標）は、その活性化特性によりＴＮＦ−α分泌の引き金を引いてしまうとして、これらの細胞をクローン原性アッセイに用いることができなかった（５９）。しかしながら、Ｒｅｘｏｍｕｎ（登録商標）は、１穴あたり１００ｎｇ、５０ｎｇ、１０ｎｇという低濃度で、＋１のＨｅｒ２／ｎｅｕの細胞系統であるＨＣＴ−８を破壊することが可能であった（図２ｂ、検体Ｂ９〜Ｂ１１）。１ｎｇのＲｅｘｏｍｕｎ（登録商標）では、ＨＣＴ−８細胞の腫瘍細胞増殖の阻害に成功しなかった（図２ｂ、検体Ｂ１２）。図２ｄに、標的としてＨＣＴ−８細胞を用いるドナー２のクローン原性アッセイ関する元のＭＤＳデータプロットを示す。
【０１１３】
結論として、Ｒｅｘｏｍｕｎ（登録商標）は、＋３または＋２の過剰発現／遺伝子増幅を示す乳ガン患者のためだけでなく、低度のＨｅｒ２／ｎｅｕ発現レベルの患者のための治療の選択肢となる。
【０１１４】
実施例２
ここでは、ヒトＣＤ３およびヒトＣＤ２０に対する新規な三機能二重特異性抗体であるＢｉ２０の産生と性能に関するキャラクタリゼーションについて記載する。特に、腫瘍抗原であるＣＤ２０を低レベルでしか発現していない患者の治療に用いられるその能力について記載する。
【０１１５】
ＣＤ２０は、３５ｋＤａの糖化されていないリン酸化タンパク質であり、Ｂ細胞分化において役割を果たすカルシウムチャネルとして働くと言われている２４。しかしながら、ＣＤ２０欠損マウスが正常なＢ細胞発生を示し、表現型的にも正常であることから２５、その正確な機能は未だに不明である。ＣＤ２０は、いくつかの理由により免疫療法のための標的として選択される：（ｉ）ＣＤ２０は、正常なＢ細胞および悪性のＢ細胞においては独占的に発現されるが、血液学的な前駆体細胞または他のヒトの組織の細胞においては発現されず２６、（ｉｉ）ＣＤ２０は、ほとんどのＢ細胞リンパ腫細胞において発現され２７、（ｉｉｉ）ＣＤ２０は、抗体との結合のために噴出され、または分泌されない２８、２９。さらに、腫瘍治療用の標的としてのＣＤ２０の適合性は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂの使用、特に従来の化学療法との組み合わせによる使用の成功により臨床的に確認されている。
【０１１６】
本発明の研究においては、このｔｒＡｂが、効果的にヒトＢ細胞腫瘍細胞および、低レベルでしかＣＤ２０を発現していない慢性リンパ性白病（ＣＬＬ）患者由来の細胞を死滅させることを実証するために、前記Ｂｉ２０のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける特性について詳細に解析を行った。腫瘍細胞の除去のために、エフェクター細胞を予め活性化させる必要がなく、前記腫瘍細胞の除去は、典型的なＴｈ１サイトカインパターン、並びにＴ細胞および単球の強力な活性化に伴って起こった。臨床応用のための重要な必要条件としては、Ｂｉ２０が、容易に精製され、充分な量を産生し得ることである。従って、このｔｒＡｂは、治癒不能な非ホジキン悪性リンパ腫（ＮＨＬ）患者、およびＣＬＬ患者のための他の新規な治療の選択肢を提案し得る。
【０１１７】
材料および方法
［抗体および試薬］
ＣＤ２０特異的モノクローナルＩｇＧ２ａ抗体を産生するマウスの細胞系統であるＴＰＡ１０を、２６ＩＩ６を用いてＣＤ３特異的ＩｇＧ２ｂ抗体を分泌するラットの細胞系統と融合し、結果として、Ｂｉ２０（ＦＢＴＡ０５）を産生するクアドローマ細胞系統であるＴＰＢｓ０５を得た。Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ（Ｒｅｍｏｖａｂ（登録商標））を、２６ＩＩ６由来のＣＤ３特異的アームおよび抗ＥｐＣＡＭ特異性からなる三機能性のコントロール抗体として用いた。キメラの抗ＣＤ２０抗体であるＲｉｔｕｘｉｍａｂ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標））は、Ｒｏｃｈｅ社（バーゼル、スイス）から入手した。前記抗ＣＤ２０抗体および対応するアイソタイプは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社（クレフェルト、ドイツ）から入手した。ＦＡＣＳ解析に用いた他のすべての抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（ハイデルベルク、ドイツ）から購入した。ヨウ化プロピジウムは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（ダイゼンホッフェン、ドイツ）から入手した。
【０１１８】
［細胞系統およびＰＢＭＣの調製］
ＣＬＬ細胞系統であるＭｅｃ１を、Ｄｒ．  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｈａｌｌｅｋ（ＧＳＦ、ミュンヘン、ドイツ）に快く提供していただいた。バーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ（ＢＬ））細胞系統であるＲａｍｏｓは、ＡＴＣＣ（米国）から入手した。前記ＢＬ細胞系統であるＲａｊｉ、前記ＮＨＬ細胞系統であるＤＯＨＨ−２およびＧｒａｎｔａ、並びにＡＭＬ細胞系統であるＴＨＰ−１は、ＤＳＭＺ（ブラウンシュヴァイク、ドイツ）から購入した。細胞を、１０％の熱失活したＦＣＳ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびＬ−グルタミン酸塩（ＰＡＮ−Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＰＡＮ−Ｂｉｏｔｅｃｈ社、アイデンバッハ、ドイツ）中で生育した。ヒト抹消血単核球細胞（ＰＢＭＣ）は、ＰＡＮＣＯＬＬ（ＰＡＮ−Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて密度勾配遠心により、健康なドナーのヘパリン処理した血液から単離した。ＣＬＬ患者由来の抹消血検体は、インフォームドコンセント（ｉｎｆｏｒｍｅｄ  ｃｏｎｓｅｎｔ）の後に入手した。ＣＬＬの診断は、標準的な臨床的診断基準および研究室的診断基準（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｃｒｉｔｅｒｉａ）に従った。ＣＬＬ細胞は、精製後直ちに用い、または後の使用のために凍結保存した（ｃｒｙｏ−ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）。ＣＬＬ細胞は、１０％のＦＣＳを添加したＩＭＤＭ（ＰＡＮ−Ｂｉｏｔｅｃｈ社）中で培養した。自己設定におけるアッセイには、新鮮に調製したＣＬＬ細胞のみを用いた。
【０１１９】
［Ｂｉ２０の産生および精製］
Ｂｉ２０を、クアドローマ技術を用いて産生した３０。クアドローマ細胞の上清を、標的細胞に結合するｔｒＡｂ用に、ＦＡＣＳ解析によりテストした。ｔｒＡｂ産生細胞を、抗体産生の安定性を向上させるために数回にわたってサブクローニングし、マスター細胞バンクを確立した。ｔｒＡｂを、クアドローマ細胞の培養上清から、説明されているように３１、ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ  １００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ウプサラ、スウェーデン）を用いて、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
【０１２０】
［等電点電気泳動］
抗体検体を、ｐＨ７〜１１のＩｓｏＧｅｌ−Ａｇａｒｏｓｅ−ＩＥＦ（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、ロックランド、米国）に、スポットし（ｓｐｏｔｔｅｄ）、７５分間、１５００Ｖ、５０ｍＡ、および２５Ｗで分離した。抗体のアイソフォームを、クーマシーブリリアントブルー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミズーリ州、米国）を用いて染色することにより可視化した。ゲルを、解析のためにスキャンした。
【０１２１】
［ＦＡＣＳ解析］
標的細胞への抗体の結合、エフェクター細胞の活性化、関連するＣＤ２０の発現、および細胞のサブタイプ組成を、４８８ｎｍのアルゴンレーザーを備えたＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ハイデルベルク、ドイツ）を用いて、フローサイトメトリーにより解析した。データを、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて解析した。
抗体の結合を解析するために、５×１０５個の細胞（Ｒａｍｏｓ、ＪｕｒｋａｔまたはＴＨＰ−１）を、所定の濃度のＢｉ２０とともに、３０分間４℃でインキュベートし、２％の熱失活したＦＣＳを添加したＰＢＳを用いて洗浄し、およびＦＩＴＣ−標識されたマウスの抗ラットＩｇＧ検出抗体（Ｒａｍｏｓ）、またはＦＩＴＣ標識されたラットの抗マウス抗体（Ｊｕｒｋａｔ、ＴＨＰ−１）とともに、３０分間４℃でインキュベートした。
Ｂｉ２０の活性化特性を決定するために、１×１０６個／ｍｌのＰＢＭＣおよび２×１０５個／ｍｌのヒトの腫瘍細胞を、前記インキュベートした濃度の抗体とともに、１、２、および３日間３７℃で、ＲＰＭＩ培地においてインキュベートした。細胞を収集、洗浄し、ＦＩＴＣまたはＰＥ標識されたＣＤ２５およびＣＤ６９に対する検出抗体とともに、３０分間４℃でインキュベートした。
細胞のサブタイプ組成を、下記の抗ＣＤ抗体混合物（ＦＩＴＣ／ＰＥ／ＡＰＣ）を用いて、３×１０６個のＰＢＭＣを染色することにより決定した：１４／１９／５、４／８／５、４／８／２５、４５／３／５および１６／５６／５。
【０１２２】
［Ｂ細胞減少解析］
Ｂｉ２０が媒介するＢ細胞減少を、バイオアッセイを用いて測定した。健康なドナーから入手したＰＢＭＣ（１×１０６個／ｍｌ）に、２×１０５個／ｍｌの所定の腫瘍細胞（Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｍｅｃ１、ＤＯＨＨ−２もしくはＧｒａｎｔａ）、またはＣＬＬ患者の細胞（エフェクター対標的比  ５：１）を添加し、所定の濃度における異なる抗体の存在下において総容積１ｍｌでインキュベートした。１日目、２日目および３日目における細胞を、収集、洗浄して、生きている（ｖｉａｂｌｅ）Ｂ細胞を、ＰＥ結合抗ＣＤ１９検出抗体を用いてＦＡＣＳ解析により解析した。生きている細胞の総数を、トリパンブルー色素排除集計により測定した。
自己ＣＬＬ患者検体中の抗体が媒介するＢ細胞減少を検討するために、ＣＬＬ患者から単離したＰＢＭＣを、２×１０６個／ｍｌの密度で蒔いた。抗体を、所定の濃度で０日目、３日目および６日目に添加した。ＦＡＣＳ測定およびトリパンブルー色素排除集計を、所定の時点で実施した。
【０１２３】
［サイトカインの測定］ 
Ｂｉ２０に誘導されたサイトカインの放出を、Ｂ細胞減少実験に用いた条件と同じ条件下において測定した。腫瘍Ｂ細胞系統および健康なドナーからのＰＢＭＣを、５０ｎｇ／ｍｌの所定の抗体とともにインキュベートした。３日後、上清を収集した。サイトカインを、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２細胞数測定ビーズアレイ（ＣＢＡ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓｓ社、ハイデルベルク、ドイツ）を用いて測定した。前記ＣＢＡは、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６およびＩＬ−１０の解析を同時に行うことが可能である。データの取得および解析を、製造者のプロトコールに従って実施した。
【０１２４】
結果
［Ｂｉ２０の産生および精製］ 
前記ｔｒＡｂであるＢｉ２０を、クアドローマ細胞において産生し、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーにより獲得した。強力なラットの抗体は、プロテインＡに結合しないため、溶出液が不要である。それから、親マウス抗体等の不純物を、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＩＥＸ）により除去した（図５Ａ）。マウス抗体を、１４８ｍＭのＮａＣｌで溶出した（図５Ａ、ピーク１）。一方、ｔｒＡｂを、３２０ｍＭのＮａＣｌで溶出した。精製されたｔｒＡｂの等電点電気泳動は、ｐＩが８．６５〜８．１５の範囲において明確なバンドパターンを示した。ｔｒＡｂは、ＣＩＥＸ分離のピーク２においてのみ検出された。親抗体の混入は検出されなかった。
【０１２５】
［Ｂｉ２０の結合特性］ 
Ｂｉ２０の三機能の性質を実証するために、その特異的な標的細胞への結合を検討した。ＣＤ２０結合アームの機能性を確認するために、ＣＤ２０＋バーキットリンパ腫細胞系統であるＲａｍｏｓを、ＣＤ３結合アームのためにＣＤ３＋Ｔ細胞系統であるＪｕｒｋａｔを、ＦｃγＲＩに結合することを確認するために単球細胞系統であるＴＨＰ−１を用いた（図６）。ＣＤ２０へのＢｉ２０の結合を確認するために、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂを用いた競合的結合アッセイを実施した。Ｒａｍｏｓ細胞上でのＢｉ２０の結合を、予め前記細胞を２１倍の過剰なＲｉｔｕｘｉｍａｂとともにインキュベートすることにより、完全に阻止することができた（図６Ａ）。同様に、ＴＨＰ−１細胞へのＢｉ２０の結合を、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂにより、競合することができた（図６Ｂ）。Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３へのＢｉ２０の結合は、Ｒａｍｏｓ細胞上でのＣＤ２０へのＢｉ２０の結合に匹敵した（データを示さず）。前記Ｂｉ２０のＣＤ３結合アームは、特性がはっきりしているｔｒＡｂであるｃａｔｕｍａｘｏｍａｂおよびｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂにおいて対応するアームと同一であるため、前記ＣＤ３結合アームの特異性のさらなる解析を、実施しなかった。要約すれば、これらのデータにより、Ｂｉ２０の三価の結合機序および結合特性が確認された。
【０１２６】
［Ｂｉ２０が媒介するＢ細胞の除去］
Ｂ細胞の死滅についてのＢｉ２０の効果を研究するために、ＦＡＣＳに基づくバイオアッセイを開発した。事前の、または同時の刺激のいずれもしていない新鮮に調製したＰＢＭＣを、腫瘍Ｂ細胞と５：１の比率で混合した。さらに、５０ｎｇ／ｍｌの所定の抗体を混合し、３日間インキュベートした。細胞を収集し、分集団の組成をＦＡＣＳ解析により決定した。トリパンブルー色素排除集計を、細胞の絶対数を得るために実施した。
標的細胞として、前記ＣＤ２０＋バーキットリンパ腫細胞系統であるＲａｊｉを用い、５０ｎｇ／ｍｌのＢｉ２０を用いたことで、効果的なＢ細胞の死滅が観察された（図７）。コントロールとして、前記ｔｒＡｂである、Ｂ細胞と結合しない（データを示さず）ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ（抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３）、並びに前記親抗体２６ＩＩ６（抗ＣＤ３）およびＴＰＡ１０（抗ＣＤ２０）を用いた。Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ（Ｃａｔｕｍ）および親抗体の組み合わせは、いくらかのＢ細胞減少を誘導した。おそらく、ＩＮＦ−γおよびＴＮＦ−α等のサイトカインの放出によるものであろう（表４）。このことは、Ｂｉ２０の抗腫瘍活性が、実際にはその三機能デザイン（ｄｅｓｉｇｎ）により引き起こされることを示している。これらの実験的な条件（低濃度の抗体およびＥ：Ｔ比）下では、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂは、軽微なＢ細胞数の減少しか媒介しなかった。ＣＬＬ細胞系統であるＭｅｃ１を用いた比較可能なデータを入手した。そのデータでは、ＣＤ２０の発現がＲａｊｉ細胞より２．５倍低かった（ＭＦＩ  １７９対４２８、データを示さず）。
【０１２７】
これらの結果は、Ｂｉ２０が媒介したＢ細胞の減少をより詳細に解析するのに勢いをつけた。時間−動態解析（Ｔｉｍｅ−ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ）は、わずか２４時間後にＲａｊｉ細胞の減少を示した（図７Ｂ）。少なくとも３５％のＢ細胞が、０．５ｎｇ／ｍｌという低濃度の抗体において除去された。２５０ｎｇ／ｍｌおよび５０ｎｇ／ｍｌの濃度のＢｉ２０においては、２日目および３日目それぞれにおいて、完全なＢ細胞の減少が観察された。Ｍｅｃ１細胞においても匹敵する結果が見出された（データを示さず）。
さらに、Ｂ細胞系統における代表的な他のリンパ腫の実体を、効果的に死滅させることができるかどうか検討した。ＤＯＨＨ−２（濾胞性リンパ腫）、Ｇｒａｎｔａ（マントル細胞リンパ腫）、またはＲａｍｏｓ（バーキットリンパ腫）を標的細胞として用いた場合、効果的なＢ細胞減少を検出した（データを示さず）。
【０１２８】
［同時発生的なＢ細胞結合に依存しないＢｉ２０が媒介するＴ細胞の活性化］ 
前述した、例えば、抗ＣＤ２８抗体を用いて予め刺激した後のみにＢ細胞の細胞傷害性を示す二重特異性抗リンパ腫抗体３２とは対照的に、Ｂｉ２０により誘導された効果的なＢ細胞の溶解には、Ｔ細胞または単球の前活性化が必要ではなかった。そのために、エフェクター細胞が、Ｂｉ２０が結合することにより活性化され得るかどうかを問うた。ＰＢＭＣおよびＲａｊｉ細胞を、前記所定の抗体とともにインキュベートした。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上の活性化マーカーであるＣＤ２５の上方制御を、フローサイトメトリーにより測定した（図８Ａ）。Ｂｉ２０およびｃａｔｕｍａｘｏｍａｂの両方が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５の明確な上方制御を誘導した。このことは、ｔｒＡｂがＣＤ３およびＣＤ２０に同時に結合することが、Ｔ細胞の活性化には必要ないことを示している。ＣＤ２５の上方制御は、前記親抗体２６ＩＩ６（抗ＣＤ３）とＴＰＡ１０（抗ＣＤ２０）との組み合わせによっても観察された。予想どおり、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂは、いずれのＴ細胞の活性化も誘導しなかった（図８Ａ）。
【０１２９】
図８Ｂに示すように、Ｔ細胞の活性化は、インキュベートする期間と抗体の濃度とに依存する。最大のＣＤ２５発現は、２日目の最も高い濃度（２５０ｎｇ／ｍｌ）のＢｉ２０において観察された。ＣＤ６９等の他の活性化マーカーも上方制御されたが、より低度でより短期間なものであった（データを示さず）。
【０１３０】
［Ｂｉ２０が誘導するＴ細胞の増殖］
Ｔ細胞の活性化に加えて、前記異なる抗体により誘導されるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞数の増加を測定した（図９）。Ｂｉ２０を用いたインキュベーションの結果として、ＣＤ４＋サブセットと比較して、ＣＤ８＋サブセットのＴ細胞が優先的な増殖を示した（１４５％対８５％のＴ細胞発現）。ＣＤ４＋：ＣＤ８＋比は、１．８：１から１．３：１に変化した。Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂおよび親抗体はともに、Ｔ細胞増殖を誘導したが、Ｂｉ２０より低度であった。予想どおり、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂは、Ｔ細胞増殖を刺激しなかった。特に、前記抗体以外の刺激因子は、増殖を誘導するのに必要ではなかった。
【０１３１】
［単球の活性化は、同時発生的なＴ細胞結合には依存するが、同時のＢ細胞結合には依存しない］
つぎに、単球／マクロファージ等のＦｃγＲＩ／ＩＩＩ＋細胞も、Ｂｉ２０により活性化され得るかどうかという問いに取り組んだ。ＰＢＭＣおよびＲａｊｉ細胞を、異なる抗体の存在下においてインキュベートし、ＣＤ１４＋細胞の活性化を測定した。図６Ａに示すように、Ｂｉ２０およびｃａｔｕｍａｘｏｍａｂの両ｔｒＡｂは、ＣＤ１４＋単球／マクロファージ上でのＣＤ２５の上方制御を誘導した。このことは、同時のＢ細胞結合は、単球の活性化に必要ではないことを示している。対照的に、Ｂ細胞および単球／マクロファージに結合し、そのＦｃ領域を通じてＴ細胞とは結合しないＲｉｔｕｘｉｍａｂは、ＣＤ１４＋修飾細胞の活性化を誘導しなかった。これらの結果から、Ｔ細胞の関与が、修飾細胞の活性化には不可欠であると結論付けられる。
【０１３２】
この結果を、悪性のＢ細胞が存在しない場合におけるわずかに異なるシステムを用いて確認した。ＰＢＭＣおよびＴＨＰ−１細胞を、異なる抗体の存在下においてインキュベートした。ＣＤ３３＋であるＴＨＰ−１細胞の活性化を、ＣＤ２５およびＣＤ４０の発現によりモニターした（図１０Ｂ）。ＴＨＰ−１およびＴ細胞に同時に結合するすべての抗体（Ｂｉ２０、ＴＰＢｓ０１、２６ＩＩ６）は、ＴＨＰ−１細胞を活性化した。対照的に、ＴＨＰ−１およびＢ細胞には結合するが、Ｔ細胞には結合しない抗体（ＴＰＡ１０、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）を用いた場合は、活性化は観察されなかった。ＰＢＭＣが存在しない場合におけるＴＨＰ−１細胞は、いずれの抗体によっても活性化されなかった（データを示さず）。このことは、同時発生的にＴ細胞および単球と結合することは、本実験条件において単球を活性化するための絶対的な必須条件であることを示している。
【０１３３】
［Ｂｉ２０が誘導するＴｈ１類似のサイトカイン特性］
サイトカインの放出は、モノクローナル抗体を治療的に使用した後に発生する免疫反応のひとつであるので３３、Ｂｉ２０により誘導されるサイトカインの特性を研究した。ＰＢＭＣを、異なる腫瘍細胞（Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、ＤＯＨＨ−２、ＧｒａｎｔａまたはＭｅｃ１）および５０ｎｇ／ｍｌの抗体とともにインキュベートした。３日後、上清を収集し、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６およびＩＬ−１０の量を解析した（表４）。
【０１３４】
Ｂｉ２０は、ＩＬ−６を高レベルに誘導した。前記ＩＬ−６は、前記他の抗体とともにインキュベートした後の場合には、明らかに低いレベルで検出された。ＴＮＦ−αは、Ｂｉ２０またはｃａｔｕｍａｘｏｍａｂによる処理を行った後に検出されたが、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂまたは前記親抗体とともにインキュベートした後には検出されなかった。ＩＬ−２の発現における強力な増加が、Ｂｉ２０とともにインキュベートした後にだけ検出された。これにより、３つの結合パートナー（腫瘍細胞、Ｔ細胞および修飾細胞）が、すべて存在した場合にのみＩＬ−２が放出されることを示すｔｒＡｂを用いた従来の研究が確認された１８。Ｔｈ２系統のマーカーであるＩＬ−４は、わずかにだけ分泌された。一方、Ｔｈ１に特異的なサイトカインであるＩＦＮ−γは、強力に産生された。興味深いことに、抑制性サイトカイン（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ）として振る舞い得るＩＬ−１０も放出されている。このことは、免疫学的なカウンター反応（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｒｅａｃｔｉｏｎ）を示唆している。同様の結果は、すべての細胞系統（Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｍｅｃ１、ＤＯＨＨ−２、Ｇｒａｎｔａ；表４）においても得られた。
【０１３５】
［Ｂｉ２０が媒介するＣＬＬ患者由来のＢ細胞の除去］
つぎに、Ｂｉ２０が媒介するＢ細胞の減少が、ＣＬＬ患者由来の細胞を用いることにより確認できるかを検討した。図１１に示すように、９体の異なるドナー由来の細胞を、健康なドナー由来のＰＢＭＣおよびＢｉ２０（５、５０または２５０ｎｇ／ｍｌ）、またはコントロール抗体とともに培養した。Ｂｉ２０の濃度を向上させることにより、ＣＬＬ  Ｂ細胞の除去が向上した（最大９９％）。Ｒｉｔｕｘｉｍａｂも、明らかなＢ細胞減少を誘導したが、２５０ｎｇ／ｍｌの濃度でもＢ細胞の半分近くが生き残った。このことは、少なくとも本実験条件の範囲内においては、前記ｔｒＡｂであるＢｉ２０は、ＣＬＬ患者由来の原発性腫瘍細胞の除去に関して、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂよりもいっそう強力であることを示している。この場合において、ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂにより媒介された非特異的なＢ細胞減少は、Ｂ細胞系統を用いた従来の実験と比較して、実質的に低下していた（図７および１１）。
【０１３６】
意外なことに、非常に低いレベルでＣＤ２０を発現しているＣＬＬ  Ｂ細胞をテストしたときでさえ（ＣＬＬ２、３および４；図１１ＡおよびＢ）、ほとんどすべてのＢ細胞が、Ｂｉ２０により除去された（それぞれ、９９％、９３％および９８％）。対照的に、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂは、同じ患者グループ由来の細胞を用いた場合、その効果が劣っていたか、またはその効果を示さなかった（それぞれ、７６％、７９％および１％）。
【０１３７】
つぎに、Ｂｉ２０が、健康なドナー由来のエフェクター細胞の添加なしに、自己設定においてＣＬＬ  Ｂ細胞の死滅を誘導できるのかどうかという重大な疑問に取り組んだ。そのために、ＣＬＬ患者由来のＰＢＭＣを、Ｂｉ２０およびコントロール抗体とともにインキュベートした。好ましくないＥ：Ｔ比および公知のＣＬＬにおけるＴ細胞アネルギーのために、細胞を、少なくとも６日間（ＣＬＬ１０患者を除く）インキュベートし、抗体を３日おきに添加した。Ｂ細胞の減少およびＴ細胞の活性化の解析を、ＣＬＬ１０患者の場合（３日目）を除いて、６日目から１０日目の間に実施した。
【０１３８】
表２を要約すると、効果的なＢ細胞の減少（＞８５％）を、７つの患者検体のうち３つにおいて検出した。１つの検体（ＣＬＬ１３の患者）において、６５％の腫瘍Ｂ細胞の減少が観察された。興味深いことに、Ｂ細胞の減少が、非常に低いレベルでＣＤ２０を発現している検体（ＣＬＬ１１、１２および１３の患者、図１１Ｂ）でさえ観察された。このことは、同種間の設定（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｓｅｔｔｉｎｇ）において前記結果が得られることにより確認された（図１１ＡおよびＢ）。同じ濃度でＲｉｔｕｘｉｍａｂを用いたコントロール実験では、ＣＬＬ  Ｂ細胞が減少しない、または減少が非常に低度であることが示された。
【０１３９】
効果的なＢ細胞の減少は、エフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）に依存すると思われる。最も良い反応を示した患者検体（ＣＬＬ１０、１１および１２）は、エフェクター細胞の割合も最も高かった。特に、最も好ましいＥ：Ｔ比を有する検体（３．５：１；ＣＬＬ１０の患者由来）は、３日後にだけ効果的なＢ細胞の除去を示した。
【０１４０】
ＣＬＬのＴ細胞は、アネルギー性であることが知られており、特にＣＤ４サブセットであることが知られている３４。驚いたことに、インキュベーションの終盤におけるＣＤ２５の上方制御によるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を解析した場合、６つの患者検体のうち５つの検体で前記ＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットの両方の活性化が効果的に発生していることが見出された（表２）。検体をＲｉｔｕｘｉｍａｂとともに処理した場合には、活性化が見られなかった（データを示さず）。これらの結果より、少なくともｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＢｉ２０は、腫瘍細胞の存在下でさえＣＬＬ検体におけるＴ細胞アネルギーを克服し得る。
【０１４１】
前記抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であるＲｉｔｕｘｉｍａｂを用いるＢ細胞リンパ腫の治療における（特に、化学療法との組み合わせにおける）有望な結果にもかかわらず、最終的には、患者は再発してしまう９、３５。従って、さらなる治療の選択肢が必要である。二重特異性抗体を使用することが、改善方法の一つであろう。それは、腫瘍細胞に対するＴ細胞等のエフェクター細胞に向けられる。
【０１４２】
ＣＤ１９またはＣＤ２０等のＢ細胞に特異的な抗原に対する二重特異性抗体は、この１０〜１５年間で集中的に研究がなされてきた。しかし、これまでは中程度の反応を示すわずかな臨床データしか入手できなかった１４、３６、３７。さらに、製造工程が複雑で効果的でなかったため、臨床用途のための充分な量の抗体を産生することが難しかった。ここで、ＣＤ２０およびＣＤ３に対する新規な三機能二重特異性抗体であるＢｉ２０の産生と生産について記載する。特に、マウスＩｇＧ２ａとラットＩｇＧ２ｂアイソタイプとの組み合わせの使用のみならず、本明細書に記載した他の三機能二重特異性抗体の使用は、種制限的な（ｓｐｅｃｉｅｓ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）重鎖／軽鎖の組み合わせによって、正確に組み合わせられた二重特異性抗体の高収率生産を可能にする３０。これらのｔｒＡｂは、腫瘍細胞、Ｔ細胞およびＦｃγＲＩ／ＩＩＩ＋修飾細胞と同時に結合し、腫瘍細胞の根絶を増強することを特徴とする１７、１８。
【０１４３】
Ｂｉ２０は、何らの同時刺激を必要とせずにｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＢ細胞の除去において非常に効果的であることが示された。Ｂ細胞の減少アッセイは、抗体濃度が０．５ｎｇ／ｍｌと低度であっても、２４時間後に７０％近くのＲａｊｉ腫瘍Ｂ細胞を除去することが可能であり、３日後には、腫瘍細胞の完全な根絶が可能であったことが実証された。Ｂ細胞系統における代表的な他のＮＨＬの実体（Ｍｅｃ１、ＧｒａｎｔａまたはＤＯＨＨ−２）を用いても、同様の結果が得られた。このことは、腫瘍細胞の除去が、この種の悪性疾患（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）の特定のサブグループに限定されないことを示している。
【０１４４】
さらに、前記ＣＬＬ患者由来のＢ細胞もまた、アポトーシス耐性が亢進され、ＣＤ２０の発現レベルが低いという特性を有するＣＬＬ  Ｂ細胞であるにもかかわらず２７、３８、３９、効果的に死滅した（図１１ＡおよびＢ、表５）。この場合も先と同様に、効果的なＣＬＬ  Ｂ細胞の除去に、Ｔ細胞の前活性化または共活性化を必要とせず、前述の他の二重特異性抗体とは対照的であった。例えば、前記二重特異性マウス抗体であるＢｉｓ２０（マウスＩｇＧ１  ＣＤ２０×マウスＩｇＧ２ｂ  ＣＤ３）は、実験に用いたＥ：Ｔ比は同じであるが、１０倍の抗体濃度、予め活性化されたＴ細胞および短いインキュベーション時間において、６０％近くのＢ細胞の減少を誘導した４０。抗ＣＤ２０×抗ＣＤ３二重特異性抗体を用いる研究において、腫瘍細胞（Ｒａｊｉ）の溶解は、末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）を、予めＩＬ−２を用いて刺激した場合においてのみ達成された。１０００ｎｇ／ｍｌの濃度の二重特異性抗体、および２０：１のＥ：Ｔ比であっても、約３５％の細胞しか溶解されなかった４１。さらに、Ｃｏｃｈｌｏｖｉｕｓらは、１〜２．５μｇ／ｍｌの抗体濃度における効果的なＢ細胞の溶解に、ＣＤ２８による予め活性化されたＰＢＬおよびＴ細胞の同時刺激が必要である抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９二重特異性抗体を示した３２、４２。
【０１４５】
Ｂｉ２０は、健康なドナーのＰＢＭＣを添加しない自己設定においてさえ、７つの患者検体のうち４つの検体において効果的な腫瘍細胞の死滅を誘導する。Ｒｉｔｕｘｉｍａｂとは際立って対照的に、Ｂｉ２０が媒介するＢ細胞の減少は、ＣＬＬ腫瘍細胞による非常に低レベルのＣＤ２０発現下においてさえも効果的である。そしてそのＢ細胞の減少は、自己設定および同種間設定（ａｌｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｅｔｔｉｎｇ）について言える（表５および図１１）。この知見は、おそらく、ＣＬＬ腫瘍細胞によるＣＤ２０の発現が低いために、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂが単独療法として限定的な効果しか示さないというＣＬＬ研究の臨床データに基づいている３、４３。
【０１４６】
いくつかの他の二重特異性抗体４４、４５とは対照的に、Ｂｉ２０は、抗ＣＤ２８抗体またはＩＬ−２等の任意の同時刺激分子が存在しない場合においても、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットのいずれも効果的に活性化した。結果的に、高いレベルのＩＮＦ−γを検出した。前記ＩＮＦ−γは、刺激されたＴ細胞により放出されることが知られており、Ｔｈ１型反応の指標（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）である４６。Ｔ細胞の活性化も、Ｔ細胞サブセットの両方の増殖により伴って起こる。
【０１４７】
Ｔ細胞の活性化は、健康なドナーのＴ細胞だけでなく、Ｂ−ＣＬＬ患者由来のＴ細胞を用いた場合にも観察された（表５）。これらのＴ細胞は、多くの場合アネルギーの特徴を有する。おそらく、ＣＤ２８およびＴ細胞受容体の発現が低いためであろう４７、４８。本実験においては、実質的なＣＬＬ  Ｂ細胞の減少が観察されない検体においてさえも、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの活性化を検出した。いくつかの検体（ＣＬＬ−２、−４、−１４）におけるＢ細胞の減少が限定的なのは、インキュベート期間が短いためかもしれない。前記インキュベーション期間は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＢ−ＣＬＬ細胞の生存率がわずかであるために制限されてしまう。活性補助因子（ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ）依存性Ｔ細胞の活性化に基づく比較可能なＢ細胞の減少が、単鎖ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性抗体に関して近年述べられており、さらに、前記二重特異性抗体の方式（ｆｏｒｍａｔ）の効力を確認している４９、５０。従って、本発明者らの成果は、Ｂｉ２０が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏだけでなくｉｎ  ｖｉｖｏにおいても、ＣＬＬのＴ細胞のアネルギーを克服する可能性を有しているかもしれないことを示す。
【０１４８】
Ｂｉ２０は、Ｔ細胞に加えて、ＦｃγＲＩ＋細胞に結合し、ＦｃγＲＩ＋細胞を活性化する。腫瘍標的細胞およびＦｃγＲＩ＋細胞の結合が、活性化にとって充分ではないため、活性化は、親抗体であるＴＰＡ１０において示されるように、Ｂｉ２０のＴ細胞に同時に結合することに依存する（図１０ＡおよびＢ）。ｔｒＡｂのＦｃ領域の重要性は、免疫担当性のマウスＢ細胞リンパ腫モデルにおける近年の本発明者等による知見により裏づけられ、長期間持続する抗腫瘍免疫の誘導は、前記ｔｒＡｂのＦｃ領域の機能性に依存した。これらの実験において、ｔｒＡｂのＦ（ａｂ）２断片の使用は、これらのマウスの生存期間を減少させた２０。この結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびマウスモデルにおいて、単一の二重特異性抗体と比較して高い抗腫瘍活性を示す抗ＣＤ１９×抗ＦｃγＲＩＩＩと抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３との二重特異性抗体の組み合わせを示す近年の出版物と一致する５１。しかしながら、両ケースにおいては、抗ＣＤ２８抗体によるＴ細胞の付加的な同時刺激が必要であった。これらの結果は、Ｂｉ２０により媒介されるものとして、同時に起こるＴ細胞およびＦｃγＲ＋エフェクター細胞の結合および活性化が、腫瘍細胞とＴ細胞単独に結合する場合より、さらに効果的に腫瘍細胞を死滅させることが可能であることを示している。
【０１４９】
総合すれば、本発明者らの成果は、腫瘍細胞によるＣＤ２０の発現が非常に低い場合であっても、ｔｒＡｂであるＢｉ２０が、強力な腫瘍Ｂ細胞減少の誘導因子（ｉｎｄｕｃｅｒ）であり、前活性化または共活性化のいずれにも依存しないことを示す。同時に発生するＴ細胞および修飾免疫細胞の活性化、並びにそれらの腫瘍細胞の減少は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてだけでなく、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても、前述のＣＬＬのＴ細胞アネルギーを克服する。従って、本明細書中に記載の前記三機能二重特異性抗体は、かねてから治癒不能とされてきた非ホジキンリンパ腫および、本明細書に記載したＣＤ２０の発現が低い患者におけるＣＬＬを治療するための新しい治療の選択肢を提案する。
【０１５０】
参照文献
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８．  Ｍｏｎｔｓｅｒｒａｔ  Ｅ．  Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００３；３０：３４−３９．
９．  Ｓｍｉｔｈ  ＭＲ．  Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  （ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ａｎｔｉｂｏｄｙ）：  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  ２００３；２２：７３５９−７３６８．
１０．  Ｍａｖｒｏｍａｔｉｓ  ＢＨ，  Ｃｈｅｓｏｎ  ＢＤ．  Ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ．  ２００４；１８：１３７−１４８．
１１．  Ｎａｇｙ  ＺＡ，  Ｈｕｂｎｅｒ  Ｂ，  Ｌｏｈｎｉｎｇ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ，  ＨＬＡ−ＤＲ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  ２００２；８：８０１−８０７．
１２．  Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ＰＡ，  Ｋｕｆｅｒ  Ｐ，  Ｌｕｔｔｅｒｂｕｓｅ  Ｒ．  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００３；５：４１３−４１９．
１３．  Ｐｅｉｐｐ  Ｍ，  Ｖａｌｅｒｉｕｓ  Ｔ．  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．  ２００２；３０：５０７−５１１．
１４．  Ｍａｎｚｋｅ  Ｏ，  Ｔｅｓｃｈ  Ｈ，  Ｂｏｒｃｈｍａｎｎ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｏｃｏｒｅｇｉｏｎａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｏｗ−ｇｒａｄｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｗｉｔｈ  ＣＤ３ｘＣＤ１９  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ＣＤ２８  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．  Ｉ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００１；９１：５０８−５１５．
１５．  Ｍａｎｚｋｅ  Ｏ，  Ｔｅｓｃｈ  Ｈ，  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｊ，  Ｄｉｅｈｌ  Ｖ，  Ｂｏｈｌｅｎ  Ｈ．  Ｌｏｃｏｒｅｇｉｏｎａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｏｗ−ｇｒａｄｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｗｉｔｈ  ＣＤ３ｘＣＤ１９  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ＣＤ２８  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．  ＩＩ．  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００１；９１：５１６−５２２．
１６．  Ｈａａｇｅｎ  ＩＡ．  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ＣＤ３ｘＣＤ１９  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ．  Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ．  １９９５；１９：３８１−３９３．
１７．  Ｚｅｉｄｌｅｒ  Ｒ，  Ｍｙｓｌｉｗｉｅｔｚ  Ｊ，  Ｃｓａｎａｄｙ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  Ｆｃ−ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｉｎｔａｃｔ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｄｉｒｅｃｔ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２０００；８３：２６１−２６６．
１８．  Ｚｅｉｄｌｅｒ  Ｒ，  Ｒｅｉｓｂａｃｈ  Ｇ，  Ｗｏｌｌｅｎｂｅｒｇ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｉｎｔａｃｔ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９９；１６３：１２４６−１２５２．
１９．  Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ  Ｈ，  Ｍｅｎｚｅｌ  Ｈ，  Ｇｕｎｔｈｅｒ  Ｗ，  Ｈｕｌｔｎｅｒ  Ｌ，  Ｔｈｉｅｒｆｅｌｄｅｒ  Ｓ．  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｔｗｏ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｒｅｌａｐｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ．  １９９６；８８：４６５１−４６５８．
２０．  Ｒｕｆ  Ｐ，  Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ  Ｈ．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｙ  ａ  ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．  Ｂｌｏｏｄ．  ２００１；９８：２５２６−２５３４．
２１．  Ｈｅｉｓｓ  ＭＭ，  Ｓｔｒｏｈｌｅｉｎ  ＭＡ，  Ｊａｇｅｒ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ａｓｃｉｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００５；１１７：４３５−４４３．
２２．  Ｒｉｅｓｅｎｂｅｒｇ  Ｒ，  Ｂｕｃｈｎｅｒ  Ａ，  Ｐｏｈｌａ  Ｈ，  Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ  Ｈ．  Ｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  （ａｌｐｈａ  ＥｐＣＡＭ  ｘ  ａｌｐｈａ  ＣＤ３）．  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  ２００１；４９：９１１−９１７．
２３．  Ｋｉｅｗｅ  Ｐ，  Ｈａｓｍｕｌｌｅｒ  Ｓ，  Ｋａｈｌｅｒｔ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＨＥＲ２  ｘ  ａｎｔｉ−ＣＤ３  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００６；１２：３０８５−３０９１．
２４．  Ｔｅｄｄｅｒ  ＴＦ，  Ｅｎｇｅｌ  Ｐ．  ＣＤ２０：  ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ．  １９９４；１５：４５０−４５４．
２５．  Ｏ’Ｋｅｅｆｅ  ＴＬ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＧＴ，  Ｄａｖｉｅｓ  ＳＬ，  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ＭＳ．  Ｍｉｃｅ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ａ  ＣＤ２０  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．  １９９８；４８：１２５−１３２．
２６．  Ｎａｄｌｅｒ  ＬＭ，  Ｒｉｔｚ  Ｊ，  Ｈａｒｄｙ  Ｒ，  Ｐｅｓａｎｄｏ  ＪＭ，  Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ  ＳＦ，  Ｓｔａｓｈｅｎｋｏ  Ｐ．  Ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ  ｏｆ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｏｒｉｇｉｎ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９８１；６７：１３４−１４０．
２７．  Ｄｅｌｇａｄｏ  Ｊ，  Ｍａｔｕｔｅｓ  Ｅ，  Ｍｏｒｉｌｌａ  ＡＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ＣＤ２０  ａｎｄ  ＦＭＣ７  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２００３；１２０：７５４−７５９．
２８．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＫＣ，  Ｂａｔｅｓ  ＭＰ，  Ｓｌａｕｇｈｅｎｈｏｕｐｔ  ＢＬ，  Ｐｉｎｋｕｓ  ＧＳ，  Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ  ＳＦ，  Ｎａｄｌｅｒ  ＬＭ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｎ  ｌｅｕｋｅｍｉａｓ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ：  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｂｌｏｏｄ．  １９８４；６３：１４２４−１４３３．
２９．  Ｐｒｅｓｓ  ＯＷ，  Ｈｏｗｅｌｌ−Ｃｌａｒｋ  Ｊ，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｓ，  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｉ．  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ．  １９９４；８３：１３９０−１３９７．
３０．  Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ  Ｈ，  Ｍｏｃｉｋａｔ  Ｒ，  Ｓｔｅｉｐｅ  Ｂ，  Ｔｈｉｅｒｆｅｌｄｅｒ  Ｓ．  Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｈｅａｖｙ／ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｐａｉｒｉｎｇ  ｉｎ  ｒａｔ／ｍｏｕｓｅ  ｑｕａｄｒｏｍａｓ．  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９５；１５５：２１９−２２５．
３１．  Ｒｕｆ  Ｐ，  Ｊａｇｅｒ  Ｍ，  Ｅｌｌｗａｒｔ  Ｊ，  Ｗｏｓｃｈ  Ｓ，  Ｋｕｓｔｅｒｅｒ  Ｅ，  Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ  Ｈ．  Ｔｗｏ  ｎｅｗ  ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００４；１０８：７２５−７３２．
３２．  Ｃｏｃｈｌｏｖｉｕｓ  Ｂ，  Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ＳＭ，  Ｓｔａｓｓａｒ  ＭＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ＣＤ３  ｘ  ＣＤ１９  ｄｉａｂｏｄｙ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０００；１６５：８８８−８９５．
３３．  Ｗｉｎｋｌｅｒ  Ｕ，  Ｊｅｎｓｅｎ  Ｍ，  Ｍａｎｚｋｅ  Ｏ，  Ｓｃｈｕｌｚ  Ｈ，  Ｄｉｅｈｌ  Ｖ，  Ｅｎｇｅｒｔ  Ａ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｒｅｌｅａｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｃｏｕｎｔｓ  ａｆｔｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （ｒｉｔｕｘｉｍａｂ，  ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８）．  Ｂｌｏｏｄ．  １９９９；９４：２２１７−２２２４．
３４．  Ｂａｒｔｉｋ  ＭＭ，  Ｗｅｌｋｅｒ  Ｄ，  Ｋａｙ  ＮＥ．  Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  １９９８；２５：２７−３３．
３５．  Ｇｈｉｅｌｍｉｎｉ  Ｍ．  Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌｉｔｙ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｓｃｈｅｄｕｌｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｓ  ａｎ  ｅｘａｍｐｌｅ．  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  （Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ）．  ２００５：３２１−３２８．
３６．  Ｗｅｉｎｅｒ  ＧＪ，  Ｄｅ  Ｇａｓｔ  ＧＣ．  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ．  Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ．  １９９５；１６：１９９−２０７．
３７．  Ｄｅ  Ｇａｓｔ  ＧＣ，  Ｖａｎ  Ｈｏｕｔｅｎ  ＡＡ，  Ｈａａｇｅｎ  ＩＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ＣＤ３  ｘ  ＣＤ１９  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．  １９９５；４：４３３−４３７．
３８．  Ｈｕｈ  ＹＯ，  Ｋｅａｔｉｎｇ  ＭＪ，  Ｓａｆｆｅｒ  ＨＬ，  Ｊｉｌａｎｉ  Ｉ，  Ｌｅｒｎｅｒ  Ｓ，  Ａｌｂｉｔａｒ  Ｍ．  Ｈｉｇｈｅｒ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ＣＤ２０  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ  ｉｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２００１；１１６：４３７−４４３．
３９．  Ｒｅｅｄ  ＪＣ，  Ｋｉｔａｄａ  Ｓ，  Ｋｉｍ  Ｙ，  Ｂｙｒｄ  Ｊ．  Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｌｏｗ−ｇｒａｄｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００２；２９：１０−２４．
４０．  Ｗｉｔｈｏｆｆ  Ｓ，  Ｂｉｊｍａｎ  ＭＮ，  Ｓｔｅｌ  ＡＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＢＩＳ２０ｘ３，  ａ  ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ＣＤ２０−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂ−ｃｅｌｌｓ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００１；８４：１１１５−１１２１．
４１．  Ｘｉｏｎｇ  Ｄ，  Ｘｕ  Ｙ，  Ｌｉｕ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ｘ  ａｎｔｉ−ＣＤ３  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｉａｂｏｄｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．  ２００２；１７７：２９−３９．
４２．  Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ＳＭ，  Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  Ｇ，  Ｓｔｒａｕｓｓ  Ｇ，  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｍ．  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ３  ｘ  ＣＤ１９  ｄｉａｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  １９９８；７７：７６３−７７２．
４３．  Ｎｇｕｙｅｎ  ＤＴ，  Ａｍｅｓｓ  ＪＡ，  Ｄｏｕｇｈｔｙ  Ｈ，  Ｈｅｎｄｒｙ  Ｌ，  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＬＷ．  ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  （ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ−ｇｒａｄｅ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｎ  ４８  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  １９９９；６２：７６−８２．
４４．  Ｍａｎｚｋｅ  Ｏ，  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｆ，  Ｈｕｅｂｅｌ  Ｋ，  Ｔｅｓｃｈ  Ｈ，  Ｄｉｅｈｌ  Ｖ，  Ｂｏｈｌｅｎ  Ｈ．  ＣＤ３ｘＣＤ１９  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ＣＤ２８  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｂ−ＡＬＬ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  １９９９；８０：７１５−７２２．
４５．  Ｍａｎｚｋｅ  Ｏ，  Ｔｉｔｚｅｒ  Ｓ，  Ｔｅｓｃｈ  Ｈ，  Ｄｉｅｈｌ  Ｖ，  Ｂｏｈｌｅｎ  Ｈ．  ＣＤ３  ｘ  ＣＤ１９  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ＣＤ２８  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｌｏｃｏｒｅｇｉｏｎａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｏｗ−ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  １９９７；４５：１９８−２０２．
４６．  Ｂｅｒｅｎｓｏｎ  ＬＳ，  Ｏｔａ  Ｎ，  Ｍｕｒｐｈｙ  ＫＭ．  Ｉｓｓｕｅｓ  ｉｎ  Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ  １  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ−−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ａｎｄ  ｕｎｒｅｓｏｌｖｅｄ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．  ２００４；２０２：１５７−１７４．
４７．  Ｍｅｌｌｓｔｅｄｔ  Ｈ，  Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ  Ａ．  Ｔ  ａｎｄ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｂ−ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ：  Ｆａｕｓｔ，  Ｍｅｐｈｉｓｔｏｐｈｅｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｉｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２００６；５５：２１０−２２０．
４８．  Ｒｏｓｓｉ  Ｅ，  Ｍａｔｕｔｅｓ  Ｅ，  Ｍｏｒｉｌｌａ  Ｒ，  Ｏｗｕｓｕ−Ａｎｋｏｍａｈ  Ｋ，  Ｈｅｆｆｅｒｎａｎ  ＡＭ，  Ｃａｔｏｖｓｋｙ  Ｄ．  Ｚｅｔａ  ｃｈａｉｎ  ａｎｄ  ＣＤ２８  ａｒｅ  ｐｏｏｒｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｌｅｕｋｅｍｉａ．  １９９６；１０：４９４−４９７．
４９．  Ｄｒｅｉｅｒ  Ｔ，  Ｌｏｒｅｎｃｚｅｗｓｋｉ  Ｇ，  Ｂｒａｎｄｌ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ  ｐｏｔｅｎｔ，  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００２；１００：６９０−６９７．
５０．  Ｌｏｆｆｌｅｒ  Ａ，  Ｇｒｕｅｎ  Ｍ，  Ｗｕｃｈｔｅｒ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉ−ＣＤ１９／ａｎｔｉ−ＣＤ３  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ．  Ｌｅｕｋｅｍｉａ．  ２００３；１７：９００−９０９．
５１．  Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ＳＭ，  Ｃｏｃｈｌｏｖｉｕｓ  Ｂ，  Ｓｃｈａｆｅｒ  ＨＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ１９  ｘ  ＣＤ３  ａｎｄ  ＣＤ１９  ｘ  ＣＤ１６  ｄｉａｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ａ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００２；１６９：１３７−１４４．
５２．  Ｓｌａｍｏｎ  ＤＪ，  Ｃｌａｒｋ  ＧＭ，  Ｗｏｎｇ  ＳＧ，  Ｌｅｖｉｎ  ＷＪ，  Ｕｌｌｒｉｃｈ  Ａ，  ＭｃＧｕｉｒｅ  ＷＬ．  Ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｌａｐｓｅ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８７；２３５（４７８５）：１７７−８２．
５３．  Ｓｌａｍｏｎ  ＤＪ，  Ｇｏｄｏｌｐｈｉｎ  Ｗ，  Ｊｏｎｅｓ  ＬＡ，  Ｈｏｌｔ  ＪＡ，  Ｗｏｎｇ  ＳＧ，  Ｋｅｉｔｈ  ＤＥ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９；２４４（４９０５）：７０７−１２．
５４．  Ｈｙｎｅｓ  ＮＥ，  Ｓｔｅｒｎ  ＤＦ．  Ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｅｒｂＢ−２／ｎｅｕ／ＨＥＲ−２  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９９４；１１９８（２−３）：１６５−８４．
５５．  Ｌｅｗｉｓ  ＧＤ，  Ｆｉｇａｒｉ  Ｉ，  Ｆｅｎｄｌｙ  Ｂ，  Ｗｏｎｇ  ＷＬ，  Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ，  Ｇｏｒｍａｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｔｏ  ａｎｔｉ−ｐ１８５ＨＥＲ２  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  １９９３；３７（４）：２５５−６３．
５６．  Ｓａｒｕｐ  ＪＣ，  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＲＭ，  Ｋｉｎｇ  ＫＬ，  Ｆｅｎｄｌｙ  ＢＭ，  Ｌｉｐａｒｉ  ＭＴ，  Ｎａｐｉｅｒ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｐ１８５ＨＥＲ２  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈａｔ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ．  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌ．  １９９１；１（２）：７２−８２．
５７．  Ｐａｉｋ  Ｓ，  Ｂｒｙａｎｔ  Ｊ，  Ｔａｎ−Ｃｈｉｕ  Ｅ，  Ｒｏｍｏｎｄ  Ｅ，  Ｈｉｌｌｅｒ  Ｗ，  Ｐａｒｋ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅａｌ−ｗｏｒｌｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ＨＥＲ２  ｔｅｓｔｉｎｇ−−ａｔｉｏｎａｌ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  Ｂｏｗｅｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ．  Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ２００２；９４（１１）：８５２−４．
５８．  Ｈｕｄｚｉａｋ  ＲＭ，  Ｌｅｗｉｓ  ＧＤ，  Ｗｉｎｇｅｔ  Ｍ，  Ｆｅｎｄｌｙ  ＢＭ，  Ｓｈｅｐａｒｄ  ＨＭ，  Ｕｌｌｒｉｃｈ  Ａ．  ｐ１８５ＨＥＲ２  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈａｓ  ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ．  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９８９；９（３）：１１６５−７２．
５９．  Ｚｅｉｄｌｅｒ  Ｒ，  Ｍａｙｅｒ  Ａ，  Ｇｉｒｅｓ  Ｏ，  Ｓｃｈｍｉｔｔ  Ｂ，  Ｍａｃｋ  Ｂ，  Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．  ＴＮＦａｌｐｈａ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ，  ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００１；２１（５）：３４９９−５０３．
【０１５１】
【表１】
2009526823.tif 000002
【０１５２】
【表２】
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【０１５３】
【表３】
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【０１５４】
【表４】
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【０１５５】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】図１Ａ−Ｆは、異なる抗Ｈｅｒ２抗体を用いてフローサイトメトリーにより測定された細胞系統Ｌｏｘ、ＨＣＴ−８およびＳＫＢＲ３のＨｅｒ２／ｎｅｕ発現特性を示す。
【図２ａ】図２ａは、Ｈｅｒ２＋３  ＳＫＢＲ−３細胞の死滅：Ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いたドットプロット解析を示す。  ＊印の番号は、表３に対応する。
【図２ｂ】図２ｂは、Ｈｅｒ２＋１  ＨＣＴ−８細胞の死滅：Ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いたドットプロット解析を示す。  ＊印の番号は、表３に対応する。
【図２ｃ】図２ｃは、Ｈｅｒ２ネガティブ  Ｌｏｘ細胞の死滅：Ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いたドットプロット解析を示す。  ＊印の番号は、表３に対応する。
【図２ｄ】図２ｄは、Ｈｅｒ２＋１  ＨＣＴ−８細胞の死滅：ＭＤＳワークフロー（ｗｏｒｋｆｌｏｗ）によるドナー２のドットプロット結果の一例を示す。  ＊印の番号は、表３に対応する。
【図３】図３は、サイトカインビーズアレイシステム（ＣＢＡ）を用いて測定された２４時間後のクローン原性アッセイ上清中のサイトカイン分泌を示す。
【図４】図４は、推定される三細胞複合体（ｔｒｉ−ｃｅｌｌ−ｃｏｍｐｌｅｘ）を示す。三機能抗体は、異なる免疫学的メカニズムにより腫瘍細胞の認識と破壊を促進することができる。ＩＦＮ−γを除く図中のサイトカインに関するリストをまとめなければならない（Ｂｅｉ  ｄｅｒ  Ａｕｆｌｉｓｔｕｎｇ  ｄｅｒ  Ｚｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｍ  Ｂｉｌｄ  ｓｏｌｌｔｅ  ｍａｎ  ｎｏｃｈ  ＩＦＮ−γ  ａｕｆｎｅｈｍｅｎ）。注：ＡＤＣＣ、抗体依存性細胞傷害；ＤＣ、樹状細胞；ＮＫ、ナチュラルキラー細胞；ＤＣ−ＣＫ１、樹状細胞サイトカイン１；ＩＬ、インターロイキン；ＬＦＡ、リンパ球機能関連抗原；ＴＮＦ−α、腫瘍壊死因子α；ＣＤ、表面抗原分類（出典  Ｒｕｆ＆Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ，２００１）
【図５Ａ】図５は、Ｂｉ２０の精製を示す。（図５Ａ）陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＩＥＸ）を示す。親マウス抗体（ピーク１）を、ＨＲ１０／１０  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｃｏｌｕｍｎ上で、三機能抗体（ピーク２）から分離した。
【図５Ｂ】（図５Ｂ）Ｂｉ２０三機能抗体精製の等電点電気泳動（ＩＥＦ）を示す。親ラット抗体（２６ＩＩ６）を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＡＣ  Ｂｉ２０）後に除去し、親マウス抗体（ＴＰＡ１０）を、ＣＩＥＸ（ＣＩＥＸ  Ｐ１  Ｂｉ２０）により三機能抗体から分離した。精製されたＢｉ２０は、前記陽イオン交換クロマトグラフィーのピーク２（ＣＩＥＸ  Ｐ２  Ｂｉ２０）に見出された。
【図６Ａ】図６は、Ｂｉ２０が特異的に結合するエフェクター細胞を示す。１９０ｎｇのＢｉ２０を、５×１０５個の標的細胞とともにインキュベートし、その結合をＦＡＣＳ解析により測定した。Ｒａｍｏｓ細胞（図６Ａ）を、ＣＤ２０アームの標的細胞として用いた。
【図６Ｂ】ＴＨＰ−１細胞（図６Ｂ）を、Ｆｃ領域用に用いた。拮抗実験のために、細胞を予めＲｉｔｕｘｉｍａｂ（Ｒｉｔ）とともに所定の過剰量の抗体で３０分間インキュベートした。
【図７Ａ】図７は、エフェクター細胞の存在下におけるＢｉ２０が媒介する効果的なＢ細胞の減少を示す。（図７Ａ）１×１０６個／ｍｌのＰＢＭＣおよび２×１０５個／ｍｌの腫瘍細胞（Ｒａｊｉ、Ｍｅｃ１）を、５０ｎｇ／ｍｌのＢｉ２０、ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ（Ｃａｔｕｍ）、ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、または親抗体であるＴＰＡ１０および２６ＩＩ６とともにインキュベートした。Ｂ細胞の除去を、単球、Ｂ細胞およびＴ細胞のトリパンブルー色素排除集計並びにＦＡＣＳ解析により、３日目に測定した。抗体を用いない（ネガティブ）（ｎｅｇ）前記アッセイにおけるＢ細胞の絶対数を、１００％に設定した。
【図７Ｂ】（図７Ｂ）１×１０６個／ｍｌのＰＢＭＣおよび２×１０５個／ｍｌのＲａｊｉ細胞を、Ｂｉ２０とともに、Ｂｉ２０の量を増加させて（０．５〜２５０ｎｇ／ｍｌ）インキュベートした。前記Ｂ細胞の絶対数を、トリパンブルー色素排除集計およびＦＡＣＳ解析により、１日目、２日目、３日目において測定し、Ｂ細胞の減少割合を算出した。
【図８Ａ】図８は、Ｂｉ２０が媒介するＴ細胞の活性化を示す。（図８Ａ）１×１０６個／ｍｌのＰＢＭＣおよび２×１０５個／ｍｌのＲａｊｉ腫瘍細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのＢｉ２０、ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ（Ｃａｔｕｍ）、ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、または親抗体であるＴＰＡ１０および２６ＩＩ６とともに３日間インキュベートした。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上におけるＣＤ２５の発現のＭＦＩを、ＦＡＣＳ解析により測定した。
【図８Ｂ】（図８Ｂ）ＰＢＭＣおよびＲａｊｉ細胞を、Ｂｉ２０とともに、Ｂｉ２０の量を増加させて（０．５〜２５０ｎｇ／ｍｌ）インキュベートした。ＣＤ４＋Ｔ細胞上におけるＣＤ２５の発現のＭＦＩを、１日目、２日目および３日目に測定した。
【図９】図９は、Ｂｉ２０が誘導するＴ細胞の増殖を示す。１×１０６個／ｍｌのＰＢＭＣおよび２×１０５個／ｍｌのＲａｊｉ細胞を、５０ｎｇ／ｍｌの濃度のＢｉ２０、ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ（Ｃａｔｕｍ）、ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、または親抗体であるＴＰＡ１０および２６ＩＩ６とともに３日間インキュベートした。Ｔ細胞数を、トリパンブルー色素排除集計並びに抗ＣＤ５／４抗体および抗ＣＤ５／８抗体を用いたＦＡＣＳ解析により測定した。
【図１０Ａ】図１０は、Ｂｉ２０により媒介される単球の活性化を示す。（図１０Ａ）１×１０６個／ｍｌのＰＢＭＣおよび２×１０５個／ｍｌのＲａｊｉ腫瘍細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのＢｉ２０、ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ（Ｃａｔｕｍ）またはｒｉｔｕｘｉｍａｂとともに１日間インキュベートした。ＣＤ１４＋単球によるＣＤ２５の発現のＭＦＩを、ＦＡＣＳ解析により測定した。
【図１０Ｂ】（図１０Ｂ）１×１０６個／ｍｌのＰＢＭＣおよび１×１０５個／ｍｌのＴＨＰ−１細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのＢｉ２０、ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ（Ｃａｔｕｍ）、ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（Ｒｉｔ）、ＴＰＡ１０、または２６ＩＩ６とともに１日間インキュベートした。ＣＤ３３＋ＴＨＰ−１細胞の活性化を、ＣＤ２５またはＣＤ４０の発現によって測定した。
【図１１Ａ】図１１は、健康なドナーのエフェクター細胞存在下におけるＢｉ２０が誘導するＣＬＬ  Ｂ細胞の減少を示す。（図１１Ａ）１×１０６個／ｍｌのＰＢＭＣおよび２×１０５個／ｍｌのＣＬＬ腫瘍細胞を、５、５０、もしくは２５０ｎｇ／ｍｌのＢｉ２０、２５０ｎｇ／ｍｌのｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ（Ｃａｔｕｍ）、または２５０ｎｇ／ｍｌのＲｉｔｕｘｉｍａｂ（Ｒｉｔ）とともに３日間インキュベートした。Ｂ細胞の除去を、単球、Ｂ細胞およびＴ細胞のトリパンブルー色素排除集計並びにＦＡＣＳ解析により、３日目に測定した。抗体を用いない（ネガティブ）前記アッセイにおけるＢ細胞の絶対数を、１００％に設定した。ＭＶは、ＣＬＬ−１からＣＬＬ−９の平均値を示す。
【図１１Ｂ】（図１１Ｂ）ＣＬＬ患者検体（１〜１４）におけるＣＤ２０の発現の概要、細胞系統（Ｒａｊｉ、Ｍｅｃ−１）および１体の健康なドナー（ＰＢＭＣ）。ＭＦＩ＝蛍光強度の平均値を示す。
【図１】
2009526823.tif 000007
【図２ａ】
2009526823.tif 000008
【図２ｂ】
2009526823.tif 000009
【図２ｃ】
2009526823.tif 000010
【図２ｄ】
2009526823.tif 000011
【図３】
2009526823.tif 000012
【図４】
2009526823.tif 000013
【図５Ａ】
2009526823.tif 000014
【図６Ａ】
2009526823.tif 000015
【図６Ｂ】
2009526823.tif 000016
【図７Ａ】
2009526823.tif 000017
【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
2009526823.tif 000019
【図８Ｂ】
2009526823.tif 000020
【図９】
2009526823.tif 000021
【図１０Ａ】
2009526823.tif 000022
【図１０Ｂ】
2009526823.tif 000023
【図１１Ａ】
2009526823.tif 000024
【図１１Ｂ】
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【図５Ｂ】
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【国際調査報告】
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