(57)【要約】ＣＡＰ３７ペプチド、およびその中の２つのシステイン残基の少なくとも１つのセリン置換またはスレオニン置換を有するペプチドアナログを含むその誘導体での処置による真菌感染を処置する方法が提供される。上記ペプチドのアミノ酸残基のその他の置換もまた企図される。本発明者らの知見は、ネイティブ配列（ＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔ）および単一のシステイン残基が置換された２つのアナログ（ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６およびＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ４２）に基づくペプチドによるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに対する顕著な活性を示した。両方のシステインの置換は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよび試験された多くのＣａｎｄｉｄａ種に対する活性を有意に無くした。
2009503092.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における真菌感染を処置または阻害する方法であって：
２０〜２５のアミノ酸であって、そして配列番号１５または配列番号５を含むペプチド、または配列番号５のペプチド誘導体であって、少なくとも１つのシステイン残基がセリンまたはスレオニン残基で置換されるペプチド誘導体の治療的に有効な量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記ペプチド誘導体が、Ｎ−末端に最も近いシステイン残基をセリンまたはスレオニンで置換した配列番号５を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチド誘導体が、Ｃ−末端に最も近いシステイン残基をセリンまたはスレオニンで置換した配列番号５を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記配列番号５のペプチド誘導体が：
チロシンで置換されたフェニルアラニン；
アラニンで置換されたグリシン；
アラニン、ロイシン、またはイソロイシンで置換されたバリン；
ロイシン、イソロイシンまたはバリンで置換されたアラニン；
アラニン、イソロイシンまたはバリンで置換されたロイシン；
バリン、ロイシンまたはアラニンで置換されたイソロイシン；
ヒスチジン、アルギニン、またはリジンで置換されたセリン；および
セリンで置換されたスレオニン、を含む少なくとも１つの置換をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記処置または阻害される真菌感染が、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、およびＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓによって引き起こされる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記被験体が、哺乳動物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドが、該ペプチドのＮ−末端上に１〜３の付加的アミノ酸、および該ペプチドのＣ−末端上に１〜２の付加的アミノ酸を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドが、以下の配列（配列番号１５）：
【化１】
2009503092.tif 000010
を含み、ここで、
Ｘ３は、ｐｈｅ、ｔｙｒ、ａｒｇ、ｌｙｓまたはｈｉｓであり；
Ｘ４は、ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｒｇ、ｌｙｓまたはｈｉｓであり；
Ｘ５は、ｇｌｙ、ａｌａ、ａｒｇ、ｌｙｓまたはｈｉｓであり；
Ｘ６は、ｇｌｙ、ａｌａ、ａｒｇ、ｌｙｓまたはｈｉｓであり；
Ｘ８〜Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、ａｌａ、ｌｅｕ、ｉｌｅまたはｖａｌであり；
Ｘ７、Ｘ１１およびＸ１４は、ａｌａ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｖａｌ、ａｒｇ、ｌｙｓ、またはｈｉｓであり；
Ｘ１３は、ｐｈｅまたはｔｙｒであり；
Ｘ１６は、ｓｅｒまたはｔｈｒであり；
Ｘ１９は、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ｈｉｓ、ａｒｇまたはｌｙｓであり；
Ｘ２０は、ｓｅｒ、ｃｙｓまたはｔｈｒであり；
Ｒは、ａｒｇであり；
Ｈは、ｈｉｓであり；そして
Ｍは、ｍｅｔである、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｘ４がｃｙｓであり、そして前記Ｘ２０がｓｅｒまたはｔｈｒである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｘ２０がｃｙｓであり、そして前記Ｘ４がｓｅｒまたはｔｈｒである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドが、ペグ化される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドが、１〜１５のアミノ酸を含むリンカー分子によりポリエチレングリコール分子に共有結合でペグ化される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
被験体における真菌感染を処置または阻害するための医薬の調製のためのペプチドの使用であって、該ペプチドが、２０〜２５のアミノ酸を有し、そして配列番号１５または配列番号５を含むペプチド、または配列番号５のペプチド誘導体であって、少なくとも１つのシステイン残基がセリンまたはスレオニン残基で置換されるペプチド誘導体を含む、使用。
【請求項１４】
前記配列番号５のペプチド誘導体のＮ−末端に最も近いシステイン残基がセリンまたはスレオニンで置換される、請求項１３に記載の医薬のペプチド。
【請求項１５】
前記配列番号５のペプチド誘導体のＣ−末端に最も近いシステイン残基がセリンまたはスレオニンで置換される、請求項１３に記載の医薬のペプチド。
【請求項１６】
前記配列番号５のペプチド誘導体が：
チロシンで置換されたフェニルアラニン；
アラニンで置換されたグリシン；
アラニン、ロイシン、またはイソロイシンで置換されたバリン；
ロイシン、イソロイシンまたはバリンで置換されたアラニン；
アラニン、イソロイシンまたはバリンで置換されたロイシン；
バリン、ロイシンまたはアラニンで置換されたイソロイシン；
ヒスチジン、アルギニン、またはリジンで置換されたセリン；および
セリンで置換されたスレオニン、を含む少なくとも１つの置換をさらに含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の医薬のペプチド。
【請求項１７】
前記処置または阻害される真菌感染が、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、およびＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓによって引き起こされる、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の医薬のペプチド。
【請求項１８】
前記被験体が、哺乳動物である、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の医薬のペプチド。
【請求項１９】
前記ペプチドが、該ペプチドのＮ−末端上に１〜３の付加的アミノ酸、および該ペプチドのＣ−末端上に１〜２の付加的アミノ酸を有する、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の医薬のペプチド。
【請求項２０】
前記ペプチドが、以下の配列（配列番号１５）：
【化２】
2009503092.tif 000011
を含み、ここで、
Ｘ３は、ｐｈｅ、ｔｙｒ、ａｒｇ、ｌｙｓまたはｈｉｓであり；
Ｘ４は、ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｒｇ、ｌｙｓまたはｈｉｓであり；
Ｘ５は、ｇｌｙ、ａｌａ、ａｒｇ、ｌｙｓまたはｈｉｓであり；
Ｘ６は、ｇｌｙ、ａｌａ、ａｒｇ、ｌｙｓまたはｈｉｓであり；
Ｘ８〜Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、ａｌａ、ｌｅｕ、ｉｌｅまたはｖａｌであり；
Ｘ７、Ｘ１１およびＸ１４は、ａｌａ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｖａｌ、ａｒｇ、ｌｙｓ、またはｈｉｓであり；
Ｘ１３は、ｐｈｅまたはｔｙｒであり；
Ｘ１６は、ｓｅｒまたはｔｈｒであり；
Ｘ１９は、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ｈｉｓ、ａｒｇまたはｌｙｓであり；
Ｘ２０は、ｓｅｒ、ｃｙｓまたはｔｈｒであり；
Ｒは、ａｒｇであり；
Ｈは、ｈｉｓであり；そして
Ｍは、ｍｅｔである、
請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の医薬のペプチド。
【請求項２１】
前記Ｘ４がｃｙｓであり、そして前記Ｘ２０がｓｅｒまたはｔｈｒである、請求項２０に記載の医薬のペプチド。
【請求項２２】
前記Ｘ２０がｃｙｓであり、そして前記Ｘ４がｓｅｒまたはｔｈｒである、請求項２０に記載の医薬のペプチド。
【請求項２３】
前記ペプチドが、ペグ化される、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の医薬のペプチド。
【請求項２４】
前記ペプチドが、１〜１５のアミノ酸を含むリンカー分子によりポリエチレングリコール分子に共有結合でペグ化される、請求項２３に記載の医薬のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（背景）
ＣＡＰ３７（Ｍｒ３７ｋＤａのカチオン性抗微生物タンパク質）は、当初、ヒト好中球（ＰＭＮ）の酸素とは独立の殺傷機構の成分として同定され、そしてＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含むグラム陰性生物に対する強い殺菌活性を有することが示された（Ｓｈａｆｅｒら、１９８４；Ｓｈａｆｅｒら、１９８６；Ｓｐｉｔｚｎａｇｅｌ  １９９０）。細菌に対するその影響とは別個に、ネイティブＣＡＰ３７タンパク質は、宿主細胞に対する強い調節効果を有する。それは、単球（Ｐｅｒｅｉｒａら、１９９０）、小神経膠細胞（Ｐｅｒｅｉｒａら、２００２）およびマクロファージ（Ｌａｒｒｉｃｋら、１９９１）のような単核食細胞システムの細胞の有効なレギュレーターである。それはまた、角膜上皮機能（Ｒｕａｎら、２００２）、内皮機能（Ｌｅｅら、２００２；Ｌｅｅら、２００３）および平滑筋細胞機能（Ｇｏｎｚａｌｅｚら、２００４）を調節する。
【０００２】
ＣＡＰ３７の構造機能分析は、本発明者らに、そのネイティブな分子の残基２０〜４４に対応する領域にその抗細菌ドメインの輪郭を描くことを可能にした（非特許文献１）。この２５のアミノ酸配列（ＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔ）を含むペプチドは、ネイティブ分子の抗微生物活性を模倣し（非特許文献１）、そしてその活性の範囲を、２つのグラム陽性生物であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓを含むように拡大した。このペプチドの抗細菌活性はｐＨ依存性で、最大活性は、ｐＨ５．０〜５．５の間で得られる。位置２６および４２のシステイン残基のセリン残基での置換（ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６／４２）は、不活性化合物を生じた（非特許文献１）。インビボ実験は、エンドトキシンショックの無麻酔ラットモデルにおけるＥ．ｃｏｌｉリポ多糖（ＬＰＳ）の致死的効果を弱めることにおけるＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔの効き目を示した（Ｂｒａｃｋｅｔら、１９９７）。
【０００３】
種々のＣａｎｄｉｄａ種に起因する感染は、自己限定的な表在性感染から、生命を脅かす全身感染までの範囲の疾患症状発現を生じ得る（Ｎｏｌａら、２００３）。最近、侵襲的な真菌感染における劇的な増加が存在し、そしてＣａｎｄｉｄａ種は、重篤な院内感染に実質的に寄与し始めている（ＣｌａｒｋおよびＨａｊｊｅｈ、２００２；Ｈｏｂｓｏｎ  ２００３、Ｎｏｌａら、２００３；Ｒａｐｐ  ２００４）。この理由は複雑であるが、大部分は、免疫無防備状態の人々の増加した生存に至る医学の最近の進歩、ならびに入院患者の処置のための体内留置き医療デバイスおよびカテーテルの使用が原因であり得る（ＣｌａｒｋおよびＨａｊｊｅｈ  ２００２；Ｎｏｌａら、２００３）。利用可能な抗真菌薬物への耐性の発生率の増加が、真菌症感染に付随する臨床問題および公衆の健康問題をさらにひどくしている。
【非特許文献１】Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｈ．Ａ．，Ｉ．Ｅｒｄｅｍ，Ｊ．Ｐｏｈｌ、およびＪ．Ｋ．Ｓｐｉｔｚｎａｇｅｌ．１９９３．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ＣＡＰ３７：ａ  ３７ＫＤａ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｇｒａｎｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｆｏｒ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）．９０：４７３３−４７３７
【非特許文献２】Ｂｒａｃｋｅｔｔ，Ｄ．Ｊ．，Ｍ．Ｒ．Ｌｅｒｎｅｒ，Ｍ．Ａ．Ｌａｃｑｕｅｍｅｎｔ，Ｒ．Ｈｅ，およびＨ．Ａ．Ｐｅｒｅｉｒａ．１９９７．Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＣＡＰ３７  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｃｏｎｓｃｉｏｕｓ  ｒａｔｓ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：２８０３−２８１１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
抗真菌活性を有する新たな薬物が必要である。本発明が取り扱うのはこの目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の詳細な説明）
本明細書に示されるのは、抗生物質タンパク質ＣＡＰ３７のネイティブ配列に基づくペフチドの抗真菌活性である。このペプチドは、特に、Ｃａｎｄｉｄａ種に対する抗真菌薬剤として用いられ得る。
【０００６】
ＣＡＰ３７は、伝統的にＰＭＮ−由来のタンパク質と考えられている。なぜなら、それはこれら細胞中の顆粒で構成的に発現されるからである。しかし、もっと最近になって、本発明者らは、ＣＡＰ３７の誘導性形態の存在を示した（Ｌｅｅら、２００２；Ｐｅｒｅｉｒａら、１９９７；Ｒｕａｎら、２００３；Ｇｏｎｚａｌｅｚら、２００４；およびＰｅｒｅｉｒａら、２００４）。ＣＡＰ３７は、アルツハイマー病（Ｐｅｒｅｉｒａら、１９９７）およびアテローム性動脈硬化症（Ｌｅｅら、２００２）のような炎症媒介性疾患において血管系内部を覆う内皮細胞で発現され得る。インビトロ研究は、誘導が、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）のような炎症性メディエーター、およびＬＰＳのような免疫調節物質に起因することを示す。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ角膜炎のウサギモデルを採用するインビボ研究は、感染に応答する角膜上皮中および辺縁系循環中の血管内部を覆う内皮中のＣＡＰ３７の非常に早期の誘導を示した（Ｒｕａｎら、２００２）。さらに、本発明者らは、創傷修復のインビトロラットモデルを用いて、創傷形成に応答する、皮膚の鱗状上皮細胞、毛包内部を覆う細胞、皮脂腺の腺房細胞および血管内部を覆う内皮細胞中のＣＡＰ３７の発現を示した（Ｐｅｒｉｒａら、２００４）。上皮の抗生物質が、皮膚（Ｎｉｚｅｔら、２００１；Ｓｏｕｒｅｎｓｅｎら、２００３；Ｓｈｉｒａｆｕｊｉら、１９９９；Ｏｒｅｎら、２００３）、胃腸管内部を覆う粘膜表面（Ｆｒｏｈｍ−Ｎｉｌｓｓｏｎら、１９９９；ＦｅｌｌｅｒｍａｎｎおよびＳｔａｎｇｅ、２００１）、口腔表面（Ｄａｌｅ  ２０００；Ｄａｌｅ  ２００１）；気道（Ｈｉｅｍｓｔｒａ  ２００１；Ｄｉａｍｏｎｄら、２０００；ＨｕｔｔｎｅｒおよびＢｅｖｉｎｓ、１９９９）および尿生殖器管（Ｆｒｏｈｍ−Ｎｉｌｓｓｏｎら、１９９９；Ｍａｌｍら、２０００）で示されている。これらの抗生物質タンパク質は、理想的には、侵略する病原体に対する第１のラインの防御として供するために位置される。ＣＡＰ３７の発現がＣａｎｄｉｄａ感染に応答して宿主の内側粘膜で生じるか否か、またはＣＡＰ３７の誘導が、真菌感染に対する宿主の保護におけるＣＡＰ３７の生理学的役割を示唆する再発性カンジダ症をもつ患者における粘膜表面および上皮表面で損なわれるか否かは現在未知である。本明細書で報告される研究は、ＣＡＰ３７ペプチドならびにＣＡＰ３７のネイティブ配列に基づくアナログおよび誘導体が強い抗真菌活性を所有し、そして当初に提案されるよりこのペプチドが広いスペクトルの抗感染活性を示唆することを初めて記載する。
【０００７】
１つの一連の実験で、本発明者らは、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔおよび、位置２６および／または４２におけるシステイン残基が表１に示されるようにセリン残基によって置換された３つのペプチドアナログ（ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ４２、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６／４２）を含むネイティブＣＡＰ３７配列に基づくペプチドを用いた。本発明者らは、所定範囲のＣａｎｄｉｄａ種に対するインビトロ殺傷効果に対するこれら２つの位置での置換の影響を調査した。本発明者らの知見は、ネイティブ配列（ＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔ）および単一のシステイン残基が置換された２つのアナログ（ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６およびＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ４２）に基づくペプチドによるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに対する顕著な活性を示した。両方のシステインの置換は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよび試験された多くのＣａｎｄｉｄａ種に対する活性を有意に無くした。理論に束縛されることは希望しないが、これらのデータは、分子内ジスルフィド結合が重要であるが、環状化合物の形成は抗真菌活性には必須ではないことを示唆した。なぜなら、２つの１システイン置換で可能である、２つのシステイン残基間の分子間相互作用は、殺傷活性を保持したペプチドを生じたからである。
【０００８】
【表１】
2009503092.tif 000003
フルコナゾール耐性粘膜単離株（Ａ−５、Ａ−２０、Ａ−４６）に対するＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔ、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６およびＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ４２ペプチドの活性は著しく、２つの単離株（Ａ−５およびＡ−２０）に対して強い殺傷（＜５％生存）を得、そして単離株Ａ−４６に対して＞７５％殺傷を得た（図２）。これらの知見は、新規または代替の作用機構を有する新たな治療薬による処置が必要であるＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓおよび非ａｌｂｉｃａｎｓ種のフルコナゾール耐性単離株の最近の出現に対して特に当を得ている（Ｊａｂｒａ−Ｒｉｚｋら、２００４；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、２００４）。ＣＡＰ３７ペプチドがＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのフルコナゾール耐性粘膜単離株に対して活性を有したという重要な知見に加え、図３は、これらペプチドが、Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、およびＣ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓに対して、３７．５μＭ濃度で強い活性を示したことを示す。Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓは、代表的には、処置を受けながら留置カテーテルおよびデバイスを有する集中治療室の危機的な病気の患者から最もよく単離される（Ｋｕｈｎら、２００４）。Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓの出発接種物のほぼ１００％が１５０μＭのペプチド濃度で殺傷された。Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓは、白血病、その他の腫瘍形成をもつ患者、および集中治療室の患者の血液培養物からますます単離されている（Ｗａｒｎら、２００２）。上記ペプチドのうち、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ４２が、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔよりＣ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓに対してより有効であった。Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓは、健常人にまれに見出され、しかし、主にＨＩＶ−感染個体において口咽頭感染の原因因子として見出される傾向にある新たに同定された種である（Ｓｕｌｌｉｖａｎら、２００４）。上記ペプチドは、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対しては活性ではなく、そしてＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの菌糸形態に対しては穏やかな活性を有していた。
【０００９】
殺真菌活性を達成するために必要なペプチドの濃度は、グラム陰性単離株Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを殺傷することが示された濃度の約２倍である（Ｐｅｒｅｉｒａら、１９９３）。活性におけるこの範囲は、特定の細菌種、真菌、寄生体およびまたはウイルスに対して特異性および効き目を有する傾向にあるカチオン性抗微生物ペプチドの中では一般的ではない。ＣＡＰ３７の他に、ＰＭＮは、ディフェンシン類、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ３７、殺菌透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）、およびラクトフェリンを含むいくつかのカチオン性抗微生物ペプチドを含む（Ｓｐｉｔｚｎａｇｅｌ、１９９０：ＧａｎｚおよびＷｅｉｓｓ、１９９７）。ディフェンシン類は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対して特に活性である（Ｓｅｌｓｔｅｄら、１９８５；Ｈｏｏｖｅｒら、２００３）。ヒトラクテフェリンのアミノ末端の第１のカチオン性ドメインに基づく合成ペプチドは、マイクロモル濃度レベルで抗カンジダ活性を有することが示された（Ｌｕｐｅｔｔｉら、２０００）。ヒト血小板からの抗微生物ペプチドもまた、抗微生物活性を有することが示された（Ｔａｎｇら、２００２）。血小板から単離された７つのペプチドの中で、「活性化の際に調節される正常Ｔ細胞発現および分泌」タンパク質（ＲＡＮＴＥＳ）および血小板因子−４（ＰＦ−４）のみが抗カンジダ活性を示した。それらの活性は、ＣＡＰ３７ペプチドのようにｐＨ依存性であり、ｐＨ５．５で最大活性であった（Ｔａｎｇら、２００２）。用いた活性ペプチド濃度は、各ペプチドの分子量（Ｔａｎｇら、２００２）に依存して１５０μｇと１．０ｍｇ／ｍｌとのあいだの範囲であった。別の周知の抗カンジダ分子は、唾液ヒスタチン−５である（ＴｓａｉおよびＢｏｂｅｋ  １９９７；Ｅｄｇｅｒｔｏｎら、２０００）。１５μＭの唾液ヒスタチン−５濃度は、８０〜１００％のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ分芽胞子を殺傷することが示された（ＴｓａｉおよびＢｏｂｅｋ、１９９６）。ヒスタチン−５のＣ−末端抗真菌ドメインに基づく合成ヒスタチンアナログは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｈｅｌｍｅｒｈｏｒｓｔら、１９９７）、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓのフルコナゾール耐性株に対して有効であることが示された（Ｈｅｌｍｅｒｈｏｒｓｔら、１９８９）。
【００１０】
感染の処置における新規治療薬としての天然のカチオン性ペプチドの使用は、科学的コミュニティーおよび生物工学コミュニティーで熱意を得ている。従来の抗生物質の主要な欠点は、微生物が複数耐性パターンを得ることができる迅速性である。本明細書中に記載されるようなこれらのカチオン性抗菌ペプチドがどのように微生物を殺傷するかについての正確な機構は完全には知られていない。しかし、理論に拘束されることを希望することなく、主要な殺菌機構は、ポーリンチャネルおよび自己促進される取り込み経路を通る微生物膜の透過であると考えられる（Ｈａｎｃｏｃｋ、１９９７）。カチオン性抗微生物ペプチドは、生物の代謝経路に関与しないようであり、従って、共通の耐性機構に関与しないかも知れない。Ｈａｎｃｏｃｋ（１９９７）は、カチオン性ペプチドが、最小阻止濃度に近い抗生物濃度での２０もの継代の後にさえ、耐性変異株を誘導しないことを示した。明らかに、ＣＡＰ３７ペプチドの作用の様式はなお決定されるべきであるけれども、理論に拘束されることは希望せずに、アゾールを基礎にした薬物の作用の機構とは異なるようである。なぜなら、それは、フルコナゾール耐性および感受性株を同様に等しく殺傷するからである。
【００１１】
（材料および方法）
（ペプチド合成）
ペプチドは、先に記載されるように（Ｐｅｒｅｉｒａら、ＰＮＡＳ  １９９３）、ペプチド合成器上の固相合成によって合成された。ペプチドの純度は確認された。ペプチドの質量は、質量分析法で確認された。ペプチドは、残基２０〜４４からなるＣＡＰ３７のネイティブなアミノ酸配列に基づく合成ペプチド（ＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔ）が多くのグラム陰性生物に対する強い殺菌活性を有したという先の知見（Ｐｅｒｅｉｒａら、ＰＮＡＳ  １９９３）から推定して合成された。位置２６および４２におけるシステイン残基がセリン残基によって置換されたこのペプチドの不活性アナログ（ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６／４２）（Ｐｅｒｅｉｒａら、ＰＮＡＳ  １９９３）を、不活性コントロールペプチドとして用いた。さらに、２つのその他のペプチドアナログが合成された。１つのペプチドは、位置２６のシステイン残基がセリンによって置換され（ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６）、そして他方は位置４２のシステイン残基がセリンによって置換された（ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ４２）。
【００１２】
（真菌単離株および培養条件）
この研究で用いられた単離株には、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ２８３６７）、Ａ−２２、Ａ−１１１およびＡ−１５５と称されるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの３つのフルコナゾール感受性粘膜単離株、Ａ−４６、Ａ−５、およびＡ−２０と称されるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのフルコナゾール耐性粘膜単離株、およびＷＤＯと称されるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの血液単離株を含めた。単離株は、−７０℃で凍結されて貯蔵され、そしてＳａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）プレートに画線培養し、そしてプレート上で４℃で維持され、これらの研究の持続期間のほぼ１０日毎に新たなプレート上に継代した。フルコナゾール耐性が評価された。Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａの３つの臨床単離株、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓの２つの臨床単離株、およびＣ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ各々の１つの単離株、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２つの単離株がまたこの研究で用いられ、そしてＳａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒプレート上４℃で維持された。単一の酵母コロニーを、０．１％のＤ−グルコース（Ｓｉｇｍａ）を添加した１％ファイトンペフトンブロース（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｐａｒｋｓ  ＭＤ）中、３３℃で一晩培養した。
【００１３】
（菌糸の誘導）
菌糸形成を誘導するために、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ＡｇａｒプレートからのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ単離株Ａ−５、Ａ−２０、Ａ−２２、Ａ−４６、Ａ−１１およびＡ−１５５の単一コロニーを、０．１グルコース添加の１％ファイトンペプトンブロースに移し、そして３３℃で一晩増殖させた。一晩培養物のアリコート（５００μｌ）を、１０％のウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を添加した５ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ  Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）中、３７℃で９０分継代培養した。菌糸形成は、位相差顕微鏡下で決定された。
【００１４】
（インビトロ殺カンジダアッセイ）
すべてのペプチドのストック溶液を、灌注のために滅菌されたエンドトキシンフリー水（Ｂａｘｔｅｒ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）中、１ｍｇ／ｍｌの濃度に調整した。次の希釈はすべて、トリプトン生理食塩水ｐＨ５．５（Ｓｈａｆｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ、１９８４）中でなされた。０．１％グルコースを添加した１％ファィトンペプトンブロース中、３３℃で増殖された単一コロニーの一晩培養物のアリコート（１００μｌ）を、０．１％グルコースを添加した５ｍｌの１％ファィトンペプトンブロース中で継代培養し、そして３３℃で９０分間、振とうして水浴中でインキュベートし（８０振動／分、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ、Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＶＡ）、対数増殖培養物を得た。これら条件下の細胞培養物は、位相差顕微鏡によって決定されるとき、分芽胞子を優勢に構成することが見出された。光学密度を読み取り、そしてこの培養物を、５００分芽胞子／１００μｌのトリプトン生理食塩水ｐＨ５．５（Ｓｈａｆｅｒら、Ｉｎｆｅｔ  Ｉｍｍｕｎ、１９８４）に調節した。９６ウェルの滅菌ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中の１００μｌのこの生物懸濁物に、１００μｌの上記ペプチド（４００μｇ／ｍｌおよび２００μｇ／ｍｌの最終濃度）または１００μｌのトリプトン生理食塩水を添加した。後者を、コントロールとして供した。このマイクロタイタープレートは、３７℃で４時間インキュベートされ、そして各ウェルからの１００μｌの内容物を、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒプレート上に撒き、そして３７℃で一晩インキュベートした。コロニー形成単位（ｃｆｕ）を計数し、そして抗真菌活性は、殺傷％として表され、そして以下の等式に従って算出された：［（コントロールｃｆｕ−試験ｃｆｕ）／コントロールｃｆｕ］×１００＝殺傷％。コントロールｃｆｕは、ペプチドの不在下のトリプトン生理食塩水のみの中での６０分のインキュベーションの後に存在するコロニーの数によって示される。試験ｃｆｕは、ペプチドを含むトリプトン生理食塩水中のインキュベーションの後に存在するコロニーの数を計数することにより決定される。各実験点は３回実施された。
【００１５】
（殺真菌アッセイの方法）
酵母の生存率はまた、ＦＵＮ−１  Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｙｅａｓｔ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を用いて評価した。採用された方法は、蛍光顕微鏡との使用のためにメーカーによって提供されるプロトコールに本質的に従った。要約すれば、酵母培養物は、上記に記載のように正確に調製された。Ｃ．ｇｌａｂｒａｔｅ、Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（フルコナゾール感受性単離株）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（１００μｌのトリプトン生理食塩水中、５×１０５ｃｆｕ）を、ペプチド（ＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔおよびＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６／４２）の存在下または不在下、４００μｇ／ｍｌの最終濃度でインキュベートした（３７℃、２時間）。インキュベーション期間の終わりに、サンプルを、微小遠心分離チューブに移し、そして遠心分離した（室温で１０，０００×ｇ、３分間）。上清液を除去し、そしてペレットを、メーカーによって提供される技術データシートに記載のように、２５μｌのＧＨ溶液（２％Ｄ−グルコース含有１０ｍＭ  Ｎａ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）中に再懸濁した。ＦＵＮ−１試薬の作用溶液（１０μＭの１００μｌ）を、１０ｍＭのストック溶液から調製し、そして２５μｌ（最終濃度５μＭ）を酵母に添加し、そして室温で３０分間インキュベートした。サンプル（１０μｌ）を顕微鏡スライド上に置き、そしてＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＮＴ共焦点顕微鏡下、Ａｒ−４８８およびＫｒ−５６８レーザー、および６３×  Ｐｌａｎ  ＡＰＯ  １．２ＮＡ  水浸漬対物レンズを用い、染色を観察した。画像を走査し、そしてＬｅｉｃａ  ＴＣＳソフトウェアを用いて分析した。
【００１６】
（統計学的分析）
データは、３回実施された３または４つの独立の実験からの平均±標準誤差として表した。
【実施例】
【００１７】
（結果）
（ペプチドの合成）
これらの研究のために合成されたペプチドは、表１に提示される。ＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔは、ネイティブＣＡＰ３７分子中にジスルフィド架橋を形成するネイティブＣＡＰ３７タンパク質の位置２６および４２に対応する２つのシステイン残基（Ｐｏｈｌら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １９９０）を含む。従って、これら２つのシステイン残基の重要性は、システイン残基およびセリン残基の両方で（ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６／４２）、または１つのシステインを位置２６（ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６）または４２（ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ４２）で置換することによるペプチドの活性について評価された。いずれか１つまたは両方のシステイン残基の置換は、このペプチドにジスルフィド結合を形成する能力を無くし、そしてそれ故、環状構造の可能な形成を妨害する。理論に拘束されることを希望することなく、いずれかの位置における１つのシステインの置換は、環状構造の形成を妨害するが、２量体化はなお可能である。
【００１８】
（インビトロ殺カンジダアッセイの標準化）
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ２８３６７）を、インビトロ殺傷アッセイを標準化するために用いた。本発明者らは、最適増殖条件（温度および時間、２５℃５時間および３３℃９０分）、ウェルあたりの分芽胞子の数（２００、４００、５００、６００、８００、および１０００ｃｆｕ）、ペプチド濃度の範囲（７５０、５００、４００、２００および１００μｇ／ｍｌ）および殺傷が生じるペプチドとＣａｎｄｉａとの間の接触時間（１、２および４時間）を調査した。データは、２５℃で５時間または３３℃で９０分増殖したＣａｎｄｉｄａの使用の間に有意な差はなかったことを示した。この９０分のインキュベーションが技術的により簡便であり、そしてそれ故、慣用的に採用された。ウェルあたりのｃｆｕの最適数は５００であること、そしてＣａｎｄｉｄａとペプチドとの間の３７℃における４時間のインキュベーション時間が最適殺傷を得るために必要であった。用量依存的殺傷が、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔの変動する濃度とともに得られた。しかし、活性と不活性ペプチドとの間の最良の区別は、４００μｇ／ｍｌまたは１５０μＭで観察された。
【００１９】
（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのフルコナゾール感受性株および耐性株に対するＣＡＰ３７ペプチドの抗真菌活性）
ペプチドＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔ、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６、およびＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ４２は、４００μｇ／ｍｌでフルコナゾール感受性臨床単離株Ａ−１５５、Ａ−２２およびＡ−１１１に対して強力に活性であり、単離株に依存して６０％と９４％との間で殺傷される活性の範囲であった（図１）。単離株Ａ−１５５は、８０〜９４％の生物が殺傷され、最も感受性であるようであった。任意の所定の単離株に対して３つのペプチドの活性の間には統計学的な差異はなかった。これら３つのペプチドの活性とは著しく対照的なのは、両方のシステイン残基がセリン残基によって置換されたＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６／４２の活性の欠如であった。
【００２０】
ペプチドＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔ、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６、およびＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ４２は、フルコナゾール耐性株Ａ−５およびＡ−２０に対して高度に活性であり、ペプチドのより低い濃度（２００μｇ／ｍｌまたは７５μＭ）でさえ顕著な活性が得られた。より高い濃度（４００μｇ／ｍｌ）のペプチドが、フルコナゾール耐性単離株Ａ−４６に対する活性のために必要であった。その一方、不活性であると考えられたＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６／４６ペプチドは、単離株Ａ−５およびＡ−２０に対して中程度に活性であった。
【００２１】
ペプチドＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔ、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６、およびＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ４２のフルコナゾール耐性種Ａ−５、Ａ−２０、およびＡ−４６、ならびにフルコナゾール感受性株Ａ−１５５に対する影響は、静真菌的であるよりもむしろ抗真菌的であった。なぜなら、これらペプチドの存在下の生存コロニーカウントは、出発接種物より少なかったからである。
【００２２】
（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの菌糸形態に対するＣＡＰ３７の抗真菌活性）
上記ＣＡＰ３７ペプチドは、分芽胞子に対するそれらの活性と比較したとき、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの上記臨床単離株の菌糸形態に対して活性がより少なかった（図２）。ペプチドＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔ、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６、およびＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ４２間の活性を比較するとき、その他のＣＡＰ３７ペプチドより、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ４２でより大きな活性が、菌糸形態に対して得られるようだ。
【００２３】
（種々のＣａｎｄｉｄａ種に対するＣＡＰ３７ペプチドの抗真菌活性）
ＣＡＰ３７ペプチドの影響は、試験されたＣａｎｄｉｄａの異なる種に依存して変動した（図３）。ＣＡＰ３７ペプチドは、Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉおよびＣ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓに対して最も有効であった。１００μｇ／ｍｌ（３７．５μＭ）程度の低いペプチド濃度は、これに２つの種に対して抗真菌的であった。Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓはまた、すべてのＣＡＰ３７ペプチドに対し極度に感受性であった。Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉおよびＣ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓとでは、いくらかの活性がまた、ペプチドＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６／４２とで得られたが、その他の３つのＣＡＰ３７ペプチドとより有意に少なかった。Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、およびＣａｎｄｉｄａの血液単離株もまた、ペプチドＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔ、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６、およびＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ４２によって殺傷された。上記の種のすべてに対する活性は、静真菌的であるよりはむしろ抗真菌的であった。これらのＣＡＰ３７ペプチド（ＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔ、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６、およびＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ４２）は、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓの両方の単離株およびＣ．ｇｌａｂｒａｔａの１つの単離株に対して有効であったが、その程度はより小さかった。これらＣＡＰ３７ペプチドは、２つのＣ．ｇｌａｂｒａｔａ単離株、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉおよび２つのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ単離株に対しては有効でなかった。
【００２４】
（ＣＡＰ３７ペプチドの抗真菌活性は抗真菌的である）
本発明者らは、細胞生存率を評価するために共焦点顕微鏡法と蛍光色素ＦＵＮ−１を用いた。本発明者らは、ＣＡＰ３７２０−４４に感受性であったフルコナゾール感受性Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ単離株およびＣ．ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、ならびにＣＦＵアッセイによって決定されるとき、上記ペプチドによって影響されなかった真菌の例としてＣ．ｇｌａｂｒａｔａおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ単離株の１つを選択した。この技法を用い、本発明者らは、コロニーカウントを用いる先のデータとこの顕微鏡評価との間の良好な相関を観察した。共焦点データの代表的な図（図４）は、すべてのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ射出分生胞子のほぼ７０〜８０％が緑または緑−黄色に染色され、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔペプチドとインキュベートされるとき、酵母細胞大多数が死んでいたことを示す。他方で、比較的不活性であるペプチド（ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６／４２）は、わずか３０％の射出分生胞子が生存していることを示した。Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓのペプチドＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔでの処理は、細胞の＞９５％の殺傷を示した。類似の結果が、不活性ペプチド（ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６／４２）で得られ、本発明者らが、コロニー形成ユニットアッセイで得た結果を確認した。Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで実施した研究は、コロニー形成ユニットアッセイで得た結果を反映し；約１０〜１５％の細胞が、上記活性ペプチドによって殺傷され、そして実質的にすべての細胞が、不活性ペプチドの存在下で生存していた。酵母細胞がペプチドの不在下でインキュベートされたコントロールは、生存率に対する影響はなかった。
【００２５】
（有用性）
本発明に従って、抗真菌治療薬として用いられ得るペプチドは、本明細書中に記載されるペプチド、および、米国特許番号第６，１０７，４６０号；同第６，５１４，７０１号；および同第６，７３０，６５９号に記載されるペプチドを含み、それら各々の明細書は、本明細書によりその全体を参考として本明細書中に明示して援用される。
【００２６】
本明細書中のいずれにも記載されるように、本発明は、好ましい実施形態では、抗真菌処置として、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔ（線状、またはシステイン間で環状化）、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ４２、およびＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６／４２の使用を企図する。本発明はさらに、Ｎ−末端の３つのアミノ酸およびＣ−末端の２つのアミノ酸を短縮したペプチド（ＣＡＰ３７（２３−４２）ｎａｔ（線状、またはシステイン間で環状化）、ＣＡＰ３７（２３−４２）ｓｅｒ２６、およびＣＡＰ３７（２３−４２）ｓｅｒ４２、およびＣＡＰ３７（２３−４２）ｓｅｒ２６／４２）を除く、ペプチドＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔ、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ４２、およびＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６／４２に類似のペプチドの使用を含む。あるいは、これらセリン置換ペプチドの各々は、代わりにスレオニンで置換され得る（例えば、配列番号９〜１４）。さらに、本明細書で用いられるＣＡＰ３７ペプチドまたはペプチド誘導体は、以下の置換の少なくとも１つを含み得る：チロシンで置換されるフェニルアラニン；アラニンで置換されるグリシン；アラニン、ロイシン、またはイソロイシンで置換されるバリン；ロイシン、イソロイシンまたはバリンで置換されるアラニン；アラニン、イソロイシンまたはバリンで置換されるロイシン；バリン、ロイシンまたはアラニンで置換されるイソロイシン；ヒスチジン、アルギニン、またはリジンで置換されるセリン；およびセリンで置換されるスレオニンである。
【００２７】
本明細書のいずれかに記載されるように、上記ペプチド誘導体は、上記で記載のように改変されたＣＡＰ３７（２０−４４）ペプチドの誘導体またはＣＡＰ３７（２３−４２）の改変体であり得る。１つの代替の実施形態では、用いられるペプチドは、ＣＡＰ３７（１２０−１４６）、すなわち、配列番号１６を含み得る。あるいは、全長ＣＡＰ３７タンパク質が、本発明の抗真菌処置で用いられ得る。
【００２８】
本発明は、患者、被験体または哺乳動物における真菌感染を処置するか、または患者、被験体または哺乳動物における真菌感染を予防的に防ぐ方法を企図し、この患者、被験体または哺乳動物に治療的に有効な量の本明細書に記載のペプチドを投与する工程を包含する。
【００２９】
さらに、抗真菌処置としての使用のために本明細書中で企図されるペプチドは、２０、２１、２２、２３、２４、または２５残基を有するペプチドを含み得、そして配列（配列番号１５）を含む：
【００３０】
【化３】
2009503092.tif 000004
ここで、Ｘ３およびＸ１３は、フェニルアラニン、チロシン、アルギニン、リジンまたはヒスチジンであり；Ｘ４は、システイン、セリン、スレオニン、アルギニン、リジンまたはヒスチジンから選択され；Ｘ５およびＸ６は、グリシン、アラニン、アルギニン、リジンまたはヒスチジンが選択され；Ｘ７、Ｘ１１、およびＸ１４は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、リジンまたはヒスチジンから選択される。Ｘ９、Ｘ１７、およびＸ１８は、アラニン、ロイシン、イソロイシンおよびバリンから選択され；Ｘ１６は、セリンまたはスレオニンであり；Ｘ１９は、セリン、スレオニン、ヒスチジン、アルギニンおよびリジンから選択され；Ｘ２０は、システイン、セリンおよびスレオニンから選択され；Ｒは、アルギニンであり；Ｈは、ヒスチジンであり；そしてＭはメチオニンであり、そしてここで、上記ペプチドは、ペプチドのＮ−末端上に１つ、２つ、または３つのさらなる残基、およびＣ−末端上に１つまたは２つのさらなる残基を含み得、そしてここで、１つの実施形態では、例えば、Ｘ３−Ｘ７は、アルギニンであり得、そしてＸ１１−Ｘ１４は、リジンであり得る。
【００３１】
本明細書中に記載の任意のペプチドは、抗真菌処置として、単独または組み合わせて用いられ得る。例では、配列番号１〜１６のいずれかが、単独またはペプチドの「カクテル」として組み合わせて用いられ得、さらに、上記ペプチドがＰＥＧのようなポリマーに複合体化される場合、配列番号１〜１６の種々のペプチドが、同じＰＥＧ分子に付着され得る。さらに、本発明の任意のペプチドは、２量体化され得、例えば、例えば、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔダイマー、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６ダイマー、およびＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ４２ダイマー、またはＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６−ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ４２ダイマーのようなホモダイマーまたはヘテロダイマーを形成する。分子内環状化には、２つのシステイン間のジスルフィド架橋が形成される。チオール基間のペプチドの２量体化および分子内環状化は当該技術分野で周知であり、そしてその詳細な説明は、本明細書中には必要とは思われない。しかし、これらプロセスの例は、その全体が本明細書中に参考として含まれるＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ＴＩ−ＰＥＰ０５−０４０５  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．２００５に示されている。ダイマーは、「分子間酸化」、例えば、位置２６におけるｃｙｓに結合したチオール基を経由して、ｃｙｓ２６を有する別のペプチドからのＳＨ基に連結され得、ホモダイマーを与える。同様に、ｃｙｓ４２にあるＳＨ基を別のペプチドからのｃｙｓ４２上のＳＨ基と環状化し得、ｃｙｓ４２ホモダイマーを与える。第３の代替では、ｃｙｓ４２とｃｙｓ２６との間のチオール基が連結され得、ヘテロダイマーを与える。環状化および２量体化の技術の状態を示すその他の参考文献は、Ｊ．Ｄａｖｉｅｓ、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉ．９：４７１〜５０１（２００３）；Ｐ．ＬｉおよびＰ．Ｒｏｌｌｅｒ．Ｃａｎ．Ｔｏｐ．Ｉｎ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２：３２５〜３４１（２００２）；およびＭ．Ｈｏｒｎｅｆら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（８）：８３６〜８４３（２００４）を含み、これらすべては、本明細書によりそれらの全体が本明細書中に参考として明示して援用される。
【００３２】
本発明はさらに、本明細書中に列挙または記載される任意のアミノ酸配列で規定されるアミノ酸配列を有するペプチド、特に、位置２６または４２で置換されるシステイン残基を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子を含む。
【００３３】
本発明は、継続する真菌感染を処置するため、およびこのような感染のリスクを有し得る個体を予防的に処置するための両方に、本明細書中に記載されるペプチドおよび／またはその有効サブユニットを用いることを企図する。
【００３４】
本発明で用いられるペプチドは、合成によって、または組換え法によって生成され、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせられるとき、薬学的組成物として用いられ得る。このような組成物は、上記のペプチドおよびキャリアに加え、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、および当該技術分野で周知のその他の材料を含み得る。処方物の適切なキャリア、ビヒクルおよびその他の成分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、１９８０または最新版）中に記載されている。用語「薬学的に受容可能」は、活性成分（単数または複数）の生物学的活性の有効性を妨害しない非毒性材料を意味する。キャリアの特徴は、投与の経路に依存する。
【００３５】
本発明の薬学的組成物は、水性溶液中でミセル、不溶性単層、液晶、または層状（ラメラ）層として凝集形態で存在する、脂質のような両親媒性剤とともに、その他の薬学的に受容可能なキャリアに加え、単離されたペプチドが合わせられ得るリポソームの形態であり得る。リポソーム処方物に適切な脂質は、制限なくして、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リソレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などを含む。このようなリポソーム処方物の調製は、例えば、米国特許番号第４，２３５、８７１号；米国特許番号第４，５０１，７２８号；米国特許番号第４，８３７，０２８号；および米国特許番号第４，７３７，３２３号に開示されるように当該技術分野における技術のレベル内にあり、これらのすべては、本明細書によりそれらの全体が本明細書中に参考として明示して援用される。
【００３６】
本発明の化合物の治療的に有効な量は、真菌感染を制御し、減少し、または阻害することで有効である量をいう。用語「制御する」は、この感染の進行の遅延、中断、抑止、または停止が存在し得るすべてのプロセスをいうことが意図され、そして感染徴候をすべてなくすことを必ずしも示さない。
【００３７】
用語「治療的に有効な量」はさらに、真菌感染の任意のパラメーターまたは臨床徴候特徴の改善を生じる量を規定することをさらに意味する。実際の用量は、患者の全体の状態、徴候の重篤度、および阻止する適応症とともに変動する。
【００３８】
本明細書で用いられるとき、用語「被験体」または「患者」は、真菌感染を罹患している温血動物、特に哺乳類をいう。モルモット、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウマ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、動物、家畜、霊長類、およびヒトが、この用語の意味の範囲内の動物の例であることが理解される。
【００３９】
本明細書中に記載される処置で用いられる化合物の治療的に有効な量は、当業者としての担当診断医により、従来技法の使用により、そして類似の状況の下で得られた結果を観察することにより容易に決定され得る。治療的に有効な用量を決定することで、多くの因子が担当診断医によって考慮され、制限されないで：哺乳動物の種；そのサイズ、年齢、および全身健康；関与する特定の真菌疾患または症状；この真菌疾患または症状の程度、またはそれ関与の程度またはその重篤度；個々の被験体の応答；投与される特定の化合物；投与の様式；投与される調製物のバイオアベイラビリティー特徴；選択される投与計画；付随薬物の使用；およびその他の関係する状況を含む。
【００４０】
本発明の化合物の治療的に有効な量はまた、真菌感染を制御または低減するのに有効である化合物の量をいう。
【００４１】
本発明の組成物の治療的に有効な量は、一般に、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ（活性成分の重量／患者の重量）を送達するために十分な活性成分（すなわち、ペプチド）を含む。好ましくは、この組成物は、少なくとも０．５μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、そしてより好ましくは少なくとも１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇを送達する。
【００４２】
本発明の方法の実施は、被験体に、治療的に有効な量のペプチドを任意の適切な全身または局所処方物で、上記に列挙された用量を送達するために有効な量で投与する工程を包含する。真菌感染を実質的に阻害するためのペプチドの有効な特に好ましい用量は、このペプチドの１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇである。この用量は、所望の治療効果に依存して、１回のベースで投与され得るか、または１日あたり（例えば）１〜５回、もしくは１週間あたり１回もしくは２回、または静脈点滴を経由して連続的に投与され得る。
【００４３】
本明細書で用いられるとき、用語「治療的に有効な量」は、重要な患者利益、すなわち、真菌感染の減少を示すに十分である薬学的組成物または方法の各活性成分の合計量を意味する。単独で投与される個々の活性成分に適用されるとき、この用語は、その成分単独についていう。組み合わせに適用されるとき、この用語は、逐次的に、または同時に組み合わせて投与されようと、治療効果を生じる活性成分の合わせた量をいう。
【００４４】
本発明の処置または使用の方法を実施することで、治療的に有効な量のペプチド組成物は、真菌疾患状態を有する哺乳動物に投与される。ペプチドは、単独またはその他の治療薬と組み合わせてのいずれかで本発明の方法に従って投与され得る。
【００４５】
上記薬学的組成物で、または本発明の方法を実施するために用いられるペプチドの投与は、種々の従来方法で実施され得、経口により、吸入法により（例えば、洞の真菌感染に対し）、直腸に、または皮膚により、皮下により、腹腔内、経膣、または静脈内注入含む。経口処方物は、上記ペプチドが放出される前に消化系の部分を通過するように処方され得、例えば、それは、小腸、または結腸に到達するまでに放出されなくても良い。
【００４６】
ペプチドの治療的に有効な量が経口的に投与されるとき、このペプチドは、錠剤、カプセル、粉末、溶液またはエリキシルの形態である。錠剤形態で投与されるとき、本発明の薬学的組成物は、ゼラチンまたはアジュバントのような固形キャリアをさらに含み得る。錠剤、カプセル、および粉末は、好ましくは、約５〜９５％のペプチドを含む。液体形態で投与されるとき、水、石油、動物または植物起源の油（ピーナッツ油、鉱物油、大豆油、またはゴマ油、または合成油など）のような液体形態で添加され得る。上記薬学的組成物の液体形態は、生理食塩溶液、デキストロースもしくはその他の糖溶液、またはエチレングリコール、３５プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールのようなグリコールをさらに含み得る。液体形態で投与されるとき、上記薬学的組成物は、好ましくは、約０．００５〜９５重量％のペプチドを含む。例えば、１日に１〜２度の１００〜１０００ｍｇの活性成分が経口的に投与され得る。
【００４７】
経口投与には、上記化合物は、カプセル、ピル、錠剤、ロゼンジ、メルト、粉末、懸濁物、またはエマルジョンのような固形または液体調製物に処方され得る。固形単位用量形態は、例えば、界面活性剤、潤滑剤、および充填剤（例えば、ラクトース、シュークロース、およびコーンスターチ）を含む通常のゼラチンタイプのカプセルであり得るか、またはそれらは持続放出調製物であり得る。
【００４８】
別の実施形態では、本発明の化合物は、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンのような結合剤、ポテトスターチまたはアルギン酸のような崩壊剤、およびステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤と組み合わせた、ラクトース、シュークロース、およびコーンスターチのような従来の錠剤ベースで錠剤化され得る。液体調製物は、当該技術分野で公知のように、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、および保存剤をまた含み得る水性または非水性の薬学的に受容可能な溶媒中に上記活性成分を溶解することにより調製される。
【００４９】
非経口投与には、上記化合物は、生理学的に受容可能な薬学的キャリア中に溶解され得、そして溶液または懸濁液のいずれかとして投与される。例示の適切な薬学的キャリアは、水、生理食塩水、デキストロース溶液、フルクトース溶液、エタノール、または動物、植物もしくは合成起源の油である。この薬学的キャリアはまた、当該技術分野で公知のように、保存剤、および緩衝液を含み得る。
【００５０】
ペプチドの治療的に有効な量が、静脈内、皮膚または皮下注入によって投与されるとき、ペプチドは、好ましくは発熱物質を含まない非経口的に受容可能な水溶液または懸濁液である。このような非経口的に受容可能なペプチド溶液の調製物は、ｐＨ、等張性、安定性などに関し当然の値を有し、当業者の範囲内である。静脈内、皮膚または皮下注入のための好ましい薬学的組成物は、ペプチドに加え、塩化ナトリウム注入物、リンゲル注入物、デキストロース注入物、デキストロースおよび塩化ナトリウム注入物、乳酸リンゲル注入物クエン酸緩衝液ｐＨ５．５のような等張ビビクル、または当該技術分野で公知のようなその他のビヒクルを含む。本発明の薬学的組成物はまた、安定化剤、保存剤、緩衝剤、抗酸化剤、または当業者に公知のその他の添加物を含み得る。
【００５１】
上記に記載のように、上記組成物はまた、適切なキャリアを含み得る。局所的使用には、任意の従来の賦形剤が添加され得、活性成分を、ローション、軟膏、粉末、クリーム、スプレー、またはエアロゾルに処方する。外科的移殖には、これら活性成分は、ポリ乳酸およびコラーゲン処方物のような、任意の周知の生分解性および生腐食性キャリアと組み合わせられ得る。このような材料は、固形インプラント、縫合糸、スポンジ、創傷包帯などの形態であり得る。いずれの場合にも、材料の局所使用には、上記活性成分は、通常、キャリアまたは賦形剤中に、約１：１０００〜１：２０，０００の重量比で存在するが、この範囲の比に制限されるわけではない。局所使用のための組成物の調製は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版、（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）中に詳述されている。
【００５２】
好ましい治療方法では、上記ペプチド組成物は、１日に１回の１ｍｇ〜４ｍｇ活性成分／ｋｇ体重の範囲でＩＶ注入で提供される。
【００５３】
注記されるように、投与の好ましい量および様式は、当業者によって決定され得る。処方物を調製する当業者は、選択された化合物の特定の特徴、処置されるべき感染、感染のステージ、およびその他の関連する状況に依存して、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．に記載される、当該技術分野で公知の処方技法を用い、投与の適切な形態および様式を容易に選択し得る。
【００５４】
薬学的組成物は、当該技術分野で公知の技法を利用して製造され得る。代表的には、上記ペプチドの治療的に有効な量は、薬学的に受容可能なキャリアと混合される。
【００５５】
本発明はさらに、上記感染を処置するに十分なペプチドの量、例えば、０．５〜１０％を局所的に付与することによって局所的真菌感染を処置する方法を含む。この局所的医薬は、ペースト、ゲル、クリーム、および軟膏のような任意の数の標準的形態をとり得る。局所的付与は、投与されるべき化合物の溶液を、好ましくは、エタノールまたはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような経皮的吸収を促進することが知られる溶媒を用い、その他の賦形剤とともにまたは賦形剤なしで単に調製することによって達成され得る。好ましくは、局所投与は、リザーバーおよび多孔性膜タイプ、または固体マトリックス種類のいずれかのパッチを用いて達成され得る。
【００５６】
本発明の薬学的組成物中のペプチドの量は、処置される症状の性質および重篤度、ならびにこの患者が受けた先の処置の性質に依存する。最終的には、担当医が、各々の個々の患者を処置するペプチドの量を決定する。最初に、担当医は、好ましくは、ペプチドの低用量を投与し、そして患者の応答を観察する。より大きな用量のペプチドが、最適な治療効果がこの患者に対して得られるまで投与され得、そしてその時点でこの用量はさらには増加されない。特定の用量に保持されることを望むことなく、本発明の方法を実施するために用いられる種々の薬学的組成物は、約０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇのペプチド／ｋｇ体重／用量を含むことが企図される。
【００５７】
本発明の薬学的組成物を用いる静脈内治療の持続時間は、処置される疾患の重篤度、および各々の個々の患者の状態および可能な特異体質応答に依存して変動する。上記ペプチドの各適用に持続時間は、１〜２時間の範囲であり得、そして１２または２４時間毎に一度、持続的静脈内投与によって与えられることが企図される。最終的には、担当医は、本発明の薬学的組成物を用いる静脈内治療の適切な持続時間について決定する。
【００５８】
その他の抗生物質、静脈内液、心臓血管および呼吸支持物もまた、担当医によって要求されれば、当業者に公知の様式で提供され得る。
【００５９】
本明細書で記載されるペプチド組成物によって処置され得る真菌疾患は、制限されないで：ヒストプラズマ症を引き起こすＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ヒストプラスマ症を引き起こすＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍおよびその他のｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ種、アスペルギルス症を引き起こすＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓおよびその他の種（肺中で最も多く生じる）、およびクリプトコックス症として知られる疾患を引き起こすＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ（ときどき肺で見出されるが、大部分は中枢神経系で見出される）を含む。
【００６０】
さらなる薬学的方法が、ペプチドの作用の持続時間を制御するために採用され得る。増加した半減期および制御された放出調製物は、本明細書に記載されるペプチドに結合し、複合体化し、または吸収するポリマーの使用を通じて達成され得る。この制御送達および／または増加した半減期は、放出を制御するために、適切な高分子（例えば、多糖類、ポリエステル、ポリアミノ酸、ホモポリマー、ポリビニルピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、またはカルボシキメチルセルロース、およびＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドのようなアクリルアミド）、および適切な濃度の高分子ならびに取り込みの方法を選択することによって達成され得る。
【００６１】
制御された放出調製物および半減期によって作用の持続時間を制御することで有用な別の可能な方法は、ポリエステル、ポリアミド、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）、エチレンビニルアセテートコポリマー、例えば、ＰＥＧおよびポリ（ｌ−アスパルトアミド）のコポリマーミセルのようなポリマー材料粒子へのペプチド分子またはその機能的誘導体の取り込みである。
【００６２】
本明細書中に記載されるペプチドの半減期は、薬物−ポリマー結合物を形成するために当該技術分野で公知の方法を用いて、ポリマーのようなその他の分子へそれらが結合されることにより延長され得る。例えば、上記ペプチドは、「ＰＥＧ修飾化」として知られる方法で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子のような、当該分野で公知の不活性ポリマーの分子に結合（例えば、共有結合により）結合され得る。ＰＥＧ修飾化は、それ故、上記ペプチド分子のインビボ寿命、そしてそれ故その治療有効性を延長し得る。ＰＥＧ修飾化はまた、ペプチド分子の潜在的な抗原性を減少する。ＰＥＧ修飾化はまた、上記ペプチドの溶解度を増加し得、それによって、それらの治療効果を改善する。用いられるＰＥＧは、線状または分岐鎖であり得る。
【００６３】
ＰＥＧ分子は、例えば、Ｈａｒｒｉｓら、「Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ、Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」、Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ、２００１：４０（７）；５３９〜５５１に示されるように、官能基によって改変され得、そしてペプチドのアミノ末端残基のアミノ基もしくは内部システイン残基、またはその中に連結基を有するその他のアミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン、セリン、スレオニンまたはメチオニン）がそれに連結され得、ここで、ＰＥＧ分子は、１つ以上のタイプのペプチドの１つまたは複数を保持し得るか、またはこのペフチドは、１つ以上のＰＥＧ分子を保持し得る。
【００６４】
「ペグ化ペプチド」により、上記ペプチドのアミノ酸残基または連結基に共有結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を有する本発明のペプチドが意味される。このＰＥＧ分子はまた、例えば、１〜１０のアミノ酸を含むリンカーを経由して上記ペプチドに付着され得る。
【００６５】
「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」により、カップリング部分または活性化部分を有する（例えば、チオール、トリフレート、トレシレート、アジルジン（ａｚｉｒｄｉｎｅ）、オキシラン、または好ましくは、マレイミド部分を有する）カップリング試薬もしくは誘導体化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ）があるか、またはなしのポリアルキレングリコール化合物またはその誘導体が意味される。マレイミドモノメトキシＰＥＧのような化合物が、本発明の例示のまたは活性化ＰＥＧ化合物である。その他の適切なポリマー結合体は、制限されないで、以下のタイプの荷電されたか、または中性のポリマーである非ポリペプチドポリマーを含む：例えば、デキストラン、コロミン酸またはその他の炭水化物を基礎にしたポリマー、ビオチン誘導体およびデンドリマー。用語ＰＥＧはまた、ポリアルキレンオキシドのクラスのその他のポリマーを含むことが意味される。
【００６６】
このＰＥＧは、上記ペプチドの任意のＮ−末端アミノ酸に連結され得、そして／または、例えば、リジン、ヒスチジン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、メチオニン、およびシステイン、もしくは当業者に公知のその他のアミノ酸のような、Ｎ−末端下流のアミノ酸残基に連結され得る。システイン−ペグ化ペプチドは、例えば、ポリエチレングリコールを、上記ペプチドのシステイン残基上のＳＨ基に結合することにより生成される。
【００６７】
化学的に改変されたペプチドは、活性を無くすることなく、このペプチドに結合された、少なくとも１つのＰＥＧ部分、好ましくは少なくとも２つのＰＥＧ部分、最大数までのＰＥＧ部分を含み、例えば、これらＰＥＧ部分（単数または複数）は、好ましくは、このペプチドのＮ−末端またはその近傍でアミノ酸残基に結合される。
【００６８】
上記タンパク質に結合されたＰＥＧ部分は、好ましくは、分子量が約２００〜３０，０００ＭＷの範囲である。好ましくは、上記ＰＥＧ部分は、約１，０００〜８，０００ＭＷ、より好ましくは約３，２５０〜５，０００ＭＷ、最も好ましくは約５，０００ＭＷである。
【００６９】
本発明の化学的に改変されたペプチドあたり共有結合されるＰＥＧ分子の実際の数は、所望のペプチド安定性（すなわち、血清半減期）に依存して広く変動し得る。
【００７０】
本明細書における使用のために企図されるペプチド分子は、例えば（しかし制限されないで）、米国特許第４，１７９，３３７号；同第５，３８２，６５７号；同第５，９７２，８８５号；同第６，１７７，０８７号；同第６，１６５，５０９号；同第５，７６６，８９７号；および同第６，２１７，８６９号に示される技法を用いてＰＥＧ分子に連結され得；これらの各々の明細書および図面は、本明細書によりそれらの全体が参考として本明細書中に明示して援用される。
【００７１】
あるいは、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）において、またはマクロエマルジョンにおいて、例えば、コアセルベーション技法により、または界面重合により調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）中に上記ペプチドを包括することが可能である。このような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に開示されている。
【００７２】
米国特許第４，７８９，７３４号は、リポソーム中に生化学的物質をカプセル化する方法を記載し、本明細書によりそれらの全体が参考として本明細書中に明示して援用される。本質的に、上記物質は水溶液中に溶解され、必要であれば界面活性剤とともに適切なリン脂質および脂質が添加され、そして必要に応じてこの材料は透析されるか、または音波処理される。公知の方法の総説は、Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、第１４章、「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ」、Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２８７〜３４１頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９７９）による。ポリマーまたはタンパク質から形成されるマイクロスフェアは当業者に周知であり、そして胃腸管を通る、直接的な血流中への通過のために調整され得る。あるいは、上記薬剤は取り込まれ得、そして上記マイクロスフェア、またはマイクロスフェアのコンポジットは、数日〜数ヶ月の範囲の所定の時間にわたる遅延放出のために移植される。例えば、本明細書中に参考として援用される、米国特許第４，９０６，４７４号；同第４，９２５，６７３号；および同第３，６２５，２１４号を参照のこと。
【００７３】
上記組成物が、注入可能な材料として用いられるべきとき、それは、従来の注射可能なキャリアに処方され得る。適切なキャリアは、生体適合性でかつ薬学的に受容可能なリン酸緩衝化生理食塩水溶液を含み、これらは好ましくは等張である。
【００７４】
本発明による凍結乾燥産物の再構成には、滅菌希釈剤を採用し得、これは、生理学的条件に近づくために一般に認識され、そして／または必要に応じて政府規制によって要求されるような材料を含み得る。この点で、この滅菌希釈剤は、塩化ナトリウム、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、および／または使用のために生理学的に受容可能、および／または安全であるその他の物質のような生理学的に受容可能なｐＨを得るための緩衝化剤を含み得る。一般に、ヒトにおける静脈内注入のための材料は、当業者に利用可能である食品医薬品局によって確立された規制に一致すべきである。
【００７５】
上記薬学的組成物はまた、凍結乾燥産物の再構成のために上記の記載と同じ物質の多くを含む水溶液の形態であり得る。
【００７６】
上記化合物はまた、塩化水素酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸のような無機酸、およびギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸のような有機酸との反応により、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムのような無機塩基、およびモノ−、ジ−、トリアルキルおよびアリールアミンならびに置換エタノールアミンのような有機塩基との反応により形成される、薬学的に受容可能な酸付加塩、または塩基付加塩として投与され得る。
【００７７】
上記で述べたように、本発明の化合物は、治療目的のために用いられ得る薬学的調製物中に取り込まれ得る。しかし、この用語「薬学的調製物」は、本明細書ではより広い意味であることが意図され、治療目的のためのみならず、当該技術分野で公知のような試薬もしくは診断目的、または組織培養のために、本発明によるペプチド組成物を含む調製物を含む。治療使用のために意図される薬学的調製物は、「薬学的に受容可能」または「治療的に有効な量」のペプチド、すなわち、予防的または治療的健康基準のために必要なその量を含む。この薬学的調製物が、試薬または診断薬として採用されるべき場合、そのときは、それは、試薬または診断量のペプチドを含む。
【００７８】
本明細書中で列挙されるアッセイ方法のすべては、本明細書に提供される教示が与えられれば、当業者の能力内に十分ある。
【００７９】
本発明を、その局面がより完全に理解され、かつ認識され得るように、特定の実施形態と組み合わせて本明細書中に説明されているが、本発明がこれらの特定の実施形態に制限されることは意図されない。反対に、すべての代替物、改変物および等価物が、本明細書に規定されるような本発明の範囲内に含まれることが意図される。それ故、好ましい実施形態を含む上記に記載された例は、本発明の実施を説明するために供され、示されるその詳細は、例示であり、そして本発明の好ましい実施形態の例示の論議の目的のために過ぎず、そして最も有用であり、そして手順の容易に理解される説明であると考えられるものを提供し、ならびに本発明の原理および思想の局面のために提示されることが理解される。本明細書に記載される種々の組成物の処方における、または本明細書に記載される方法のステップもしくはステップの順序における変更が、本明細書に記載されるような本発明の思想および範囲から逸脱することなくなされ得る。
【００８０】
本明細書に引用されるすべての参考文献、論文、および特許出願は、本明細書により参考としてそれらの全体が本明細書中に明示して援用される。
【００８１】
【表２−１】
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【００８２】
【表２−２】
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【００８３】
【表２−３】
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【００８４】
【表２−４】
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【００８５】
【表２−５】
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【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、４つのＣＡＰ３７ペプチドの殺カンジダ活性を示すグラフである。４００ｍｇ／ｍｌ（黒棒）および２００ｍｇ／ｍｌ（斜線）における、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔ、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ４２、およびＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６／４２の活性が、臨床単離株Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  Ａ−１５５、Ａ−２２およびＡ−１１１（フルコナゾール感受性であることが知られる）、ならびに単離株Ａ−５、Ａ−２０およびＡ−４６（フルコナゾール耐性であることが知られる）に対して試験された。殺傷％は、材料および方法のセクションで詳述されるように決定されている。値は、３回実施された３つの独立の実験からの平均±標準誤差として表されている。
【図２】図２は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの菌糸形態に対するＣＡＰ３７ペプチドの活性を示す。４００ｍｇ／ｍｌ（黒棒）および２００ｍｇ／ｍｌ（斜線）における、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔ、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ４２、およびＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６／４２の活性が、臨床単離株Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  Ａ−１５５、Ａ−２２およびＡ−１１１、Ａ−５、Ａ−２０およびＡ−４６の菌糸形態に対して試験された。殺傷％は、材料および方法のセクションで詳述されるように決定されている。値は、３回実施された３つの独立の実験からの平均±標準誤差として表されている。
【図３】図３は、種々のＣａｎｄｉｄａ種に対するＣＡＰペプチドの活性を示すグラフである。ＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔ、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ４２、およびＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６／４２の抗真菌活性が、Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの血液単離株、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓの２つの単離株、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａの３つの単離株、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉの１つの単離株およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２つの単離株に対して試験された。Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉおよびＣ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓに対するペプチド濃度は１００μｇ／ｍｌ（３７．５μＭ）であり、その一方、すべてのその他の株は、４００μｇ／ｍｌ（１５０μＭ）のペプチド濃度でアッセイされた。値は、３回実施された３〜４の独立の実験からの平均±標準誤差として表されている。
【図４】図４は、ＦＵＮ−１  生体（ｖｉｔａｌ）色素および共焦点顕微鏡法で決定されたＣＡＰ３７の抗真菌活性を示す。本発明者らは、これらの研究を実施するために、フルコナゾール感受性Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ単離株（画像Ａ〜Ｃ）、Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ（画像Ｄ〜Ｆ）、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ単離株（画像Ｇ〜Ｉ）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ単離株（画像Ｊ〜Ｌ）を選択した。これら真菌単離株を、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｎａｔペプチド、ＣＡＰ３７（２０−４４）ｓｅｒ２６／４２とともに、そしてペプチドの不在下でインキュベートした。赤に染まる細胞は生存しており、そして均一に緑または緑−黄に染まる株は死んでいる。これら独立の実験からの代表的なデジタル画像が示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年7月3日(2008.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009503092000001.app
【国際調査報告】
2009503092.tif 000022
2009503092.tif 000023
2009503092.tif 000024