(57)【要約】  本発明は、関節リウマチに対する及び／又は多数の薬剤による副作用を有することに対する患者の性向を同定するための診断への使用のための、システインジオキシゲナーゼ（ＣＤＯ）における多型の検出及び同定；多型をコードする核酸及び単離タンパク質；ＣＤＯ活性並びにＣＤＯ活性に影響を及ぼす化合物の同定のためのアッセイ；また、付加的に、関節リウマチを治療するための、異なる化合物と任意に組合せたインターフェロン−γの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤＯ媒介性症状を診断する方法であって、以下の工程：
（ｉ）個体から試料を得ること、
（ｉｉ）変異型ＣＤＯ、又はＣＤＯ変異型をコードする核酸及び／又はＣＤＯ調節領域の変異型の存在若しくは非存在を検出すること、及び、
（ｉｉｉ）ＣＤＯ遺伝子及び／又はその調節領域における多型に対する照合により個体の状態を決定すること、
を包含する、方法。
【請求項２】
ヒトにおけるＣＤＯ遺伝子又はその調節配列における１つ又は複数の多型を診断する方法であって、ＣＤＯ遺伝子の少なくとも一部をコードする核酸分子及び／又はＣＤＯ調節領域の配列を決定すること、及び、ＣＤＯ遺伝子及び／又はその調節領域における多型に対する照合によりヒトの状態を決定することを包含する、方法。
【請求項３】
多型が以下の多型から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【表１】
2009501541.tif 000015
【請求項４】
ヒトが低減したＣＤＯ濃度及び／又は酵素活性が低減したＣＤＯを有するという指標を提供する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
関節リウマチ（ＲＡ）を発症する及び／又はＤ−ペニシラミン及び金チオマレートから選択される１つ又は複数の薬剤による副作用を発症することに対する個体又はヒトの性向の同定のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
多型を含有する核酸の領域が多型を同定する前にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＰＣＲがリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
核酸配列がＡＲＭＳ−アレル特異的増幅、アレル特異的ハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ及び制限断片長多型（ＲＦＬＰ）から選択される方法により決定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＣＤＯ遺伝子又はＣＤＯ調節配列多型を検出することが可能なアレル特異的プローブ又
はプライマー。
【請求項１０】
以下のうちの１つ又は複数の多型を検出することが可能な、請求項９に記載のアレル特異的プローブ又はプライマー。
【表２】
2009501541.tif 000016
【請求項１１】
請求項８、９又は１０に記載の１つ又は複数のプローブ又はプライマーを含む診断キット。
【請求項１２】
以下の多型から選択されるＣＤＯ多型又はＣＤＯ調節性多型をコードする少なくとも５塩基長の単離された核酸。
（ｉ）
【表３】
2009501541.tif 000017
（ｉｉ）このような配列と相補的な配列。
【請求項１３】
ＣＤＯ又はその断片をコードする、請求項１１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】
請求項１１又は１２に記載の核酸分子から得られる単離されたＣＤＯタンパク質。
【請求項１５】
請求項１３に記載のタンパク質と特異的に結合することが可能であるがＣＤＯ多型を含
有しないＣＤＯタンパク質とは結合することが不可能な抗体。
【請求項１６】
ＣＤＯ媒介性症状に対する個体の性向を決定する方法であって、以下の工程：
（ｉ）個体から試料を得ること、及び、
（ｉｉ）請求項１４に記載の抗体を用いて多型を含有するＣＤＯの存在を検出すること、
を包含する、方法。
【請求項１７】
ＣＤＯ活性に及ぼす化合物の効果を決定する方法であって、以下の工程：
（ｉ）白血球の試料を用意すること、
（ｉｉ）白血球をＣＤＯ基質及び化合物と接触させること、及び、
（ｉｉｉ）白血球中のＣＤＯによる、検出可能な産物への基質の転化に及ぼす、化合物の効果を決定すること、
を包含する、方法。
【請求項１８】
関節リウマチの治療のための薬剤候補を同定する方法であって、請求項１７に記載の方法を使用することを包含する、方法。
【請求項１９】
関節リウマチを治療する方法であって、薬学的有効量のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を投与することを包含する、方法。
【請求項２０】
関節リウマチが非ＨＴＬＶ−１関連関節リウマチである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＩＦＮ−γがシステイン、メチオニン、Ｄ−ペニシラミン、Ｎ−アセチルシステイン、δ−グルタミルシステイン、インターロイキン−４及びインターロイキン−１０からなる群から選択される少なくとも１つの化合物と組合せて投与される、請求項１９又は１９に記載の方法。
【請求項２２】
関節リウマチを治療するための薬剤の製造において用いるためのＩＦＮ−γ。
【請求項２３】
関節リウマチを治療するための薬剤の製造において用いるためのシステイン、メチオニン、Ｄ−ペニシラミン、Ｎ−アセチルシステイン、γ−グルタミルシステイン、インターロイキン−４及びインターロイキン−１０からなる群から選択される少なくとも１つの化合物とＩＦＮ−γとの組合せ。
【請求項２４】
システイン、メチオニン、Ｄ−ペニシラミン、Ｎ−アセチルシステイン、γ−グルタミルシステイン、Ｓ−カルボキシメチルシステイン、Ｓ−メチルシステイン、インターロイキン−４及びインターロイキン−１０からなる群から選択される化合物とＩＦＮ−γを組合せて含む、薬学的に許容可能な組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチに対する及び／又は多数の薬剤による副作用を有することに対する患者の性向を同定するための診断への使用のための、システインジオキシゲナーゼ（ＣＤＯ）における多型の検出及び同定；多型をコードする核酸及び単離タンパク質；ＣＤＯ活性並びにＣＤＯ活性に影響を及ぼす化合物の同定のためのアッセイ；また、付加的に、関節リウマチを治療するための、異なる化合物と任意に組合せたインターフェロン−γの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（ＲＡ）は、罹患者の関節における慢性炎症及び組織破壊を特徴とする自己免疫疾患である。この疾患がどのように発症されるかに関する正確な理由は不明である。遺伝的感受性及び微生物伝染の証拠が存在するが、いずれも申し分なく特性化されているわけではない。疾患発症時に、四肢関節の慢性炎症を引き起こし、徐々に罹患者の能力障害を増大させる前炎症性サイトカインの放出増大が認められる。関節周囲の滑膜は、正常サイズよりはるかに大きく成長する。この組織の増殖は、それが蔓延すると靭帯及び骨破壊を引き起こす線維芽細胞の塊りであるパンヌスの形成をもたらす。関節はしばしば、それらの周囲で滑液が集まると、炎症を起こす。滑液それ自体は、血清、リンパ球及び多数の分泌化学シグナルの混合物である。化学シグナルの１つは、罹患個体の慢性炎症及び進行性無能力を永続させる前炎症性サイトカインである。
【０００３】
関節リウマチの状況では、前炎症性サイトカインの２つの例は、ＴＮＦα（腫瘍壊死因子アルファ）及びＩＬ−１（インターロイキン−１）である。関節リウマチ発症の初期段階におけるシグナル伝達因子の過剰発現は、疾患症候の発症に大いに関与し、そしてサイトカインの永続性合成は罹患状態の保持に関与する。サイトカインを遮断することは、関節リウマチの治療に対する多くの研究の基礎となっている。例えば多数の抗ＴＮＦ薬が市場に出ている（例えばイフリキシマブ（Centocor製）及びエタネルセプト（Amgen製））。さらに抗ＩＬ−１薬も既知である（例えばアナキラ（Amgen製））。
【０００４】
システインジオキシゲナーゼ（ＣＤＯ）は、イオウ含有化合物の代謝に関与する酵素である。それは、システインからのシステインスルホン酸の生成を触媒する。これは次に、多数の異なる経路で用いられ、例えばタウリン、システイン酸、アラニン及びβ−スルフィニルピルベートを産生する。最後の化合物は、それが亜硫酸塩に、次に硫酸塩に代謝されるために、特に関心を引くものである。硫酸塩生成のための他の経路が存在するが、それらはほとんど重要性を有しない。自己免疫成分又は炎症性成分を伴う種々の症状、例えば関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、原発性胆汁性肝硬変、クローン病及び強直性脊椎炎は、これらの疾患を有する患者における高血漿レベルのシステイン及び低血漿濃度の無機硫酸塩と連関することが示されている。
【０００５】
硫酸塩は、関節それ自体に見出される滑液、タンパク質及びグリコサミノグリカンのスルホン化に関与する。スルホン化のレベルの低減は、これらの保護特性及び潤滑特性の低減、したがって疾患症状の悪化を引き起こす。
【０００６】
非特許文献１は、ＣＤＯが無機硫酸塩の酸化的分解に関与する律速酵素である、ということを実証した。炎症症状、例えば関節リウマチ（ＲＡ）が患者における高いシステイン：硫酸塩比に関連づけられる、ということに彼等は注目した。腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）及び形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）はいくつかの細胞株におけるＣＤＯ産生の発現を抑制することができる、ということを彼等は示した。このようなサイトカインは
、ＣＤＯ発現を低下させることによりＲＡの悪化に関与し得る、と彼等は結論づけた。この論文では、抗体及びウエスタンブロッティングを用いてのＣＤＯの検出により、ＣＤＯに関してニューロン及び肝臓（Chang）ヒト細胞株がアッセイされた。
【０００７】
関節リウマチに関する一般的試験としては、リウマチ因子（ＲＦ）試験が挙げられる。リウマチ因子は、ほとんどのＲＡ患者の血中に最終的に存在する抗体である。しかしながら、特に、限定値の陰性結果を生じる疾患の早期では、すべてのＲＡ患者がＲＦに対して陽性の試験結果を得るわけではない。逆に、ＲＦに対して陽性の試験結果を得る他の患者は疾患を全く発症しない。この試験は関節リウマチを有する患者の６０〜７０％に関して陽性であり、このことが通常、関節炎を有し他の明白な診断を有しない患者における関節リウマチを診断するための理由である。しかしながらリウマチ因子は、他の疾患においても生じる。
【０００８】
多数の一般的生化学的指標も存在し、これは炎症の活性及び程度の何らかの印象を与えるが、これはまた関節リウマチに対して特異的でない。Ｘ線又はＭＲＩを用いる放射線学的試験も関節リウマチを検出し得るが、これもまた疾患の進行の後期においてである。さらに、ＨＬＡ型分類を用いて、ＤＲ１及びＤＲ４と関連するマーカーを見つけ出し得る。病院を基礎にした調査における関節リウマチ患者の７０〜９０％はこれらのマーカーを有するが、一般集団の約３０％もこれらのマーカーを共有する。
【非特許文献１】Wilkinson L.J.及びWaring R.H.  Toxicol in vitro (2002), pages 481-483
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
それゆえ、関節リウマチに関するさらなる診断試験が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ＲＡ患者並びにＲＡの家族歴を有する人々におけるＣＤＯ又はＣＤＯの発現を制御する調節領域をコードするＤＮＡ中に見出される多数の多型が存在し、したがってこのことはＲＡ及び低濃度のＣＤＯ間の連関を示唆する、ということを本発明者らは予期せず見出した。さらに、ＣＤＯ発現に関する新規のアッセイを本発明者らは見出し、そして多数の薬剤、例えばインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）がＣＤＯ発現を増大することを同定し、したがってＩＦＮ−γがＲＡを治療するために用いられ得るということを示した。
【００１１】
ＥＰ  ０９７４３５８Ａは、ＨＴＬＶ−１関連疾患を治療するためのＩＦＮ−γの使用を示唆している。ＨＴＬＶ−１は、成人性Ｔ細胞白血病と関連する。それは多数の他の疾患、例えばシェーグレン症候群、全身性紅斑性狼瘡、ブドウ膜炎及び慢性関節リウマチに関与し得る、ということも推測されている。ただしＨＴＬＶは慢性ＲＡと滅多に関連しない、ということが目下既知である。
【００１２】
本出願の発明人らは、ＣＤＯが関節の構成成分のスルホン化に用いられるための硫酸塩の産生における重要な限定ステップであり得る、と考えた。したがって本発明者らは、２つの異なる集団：即ち関節リウマチを有する集団と対照集団の核酸試料を試験した。ＣＤＯ遺伝子がシークエンシングされ、対照集団と比較して、関節リウマチ集団では高レベルの突然変異が認められる、ということを本発明者らは予期せず見出した。さらに、同定された突然変異のうちの１つを有する対照のうちの１名が２５歳に過ぎないが、関節リウマチの家族歴を有し、したがってこのことは、突然変異が関節リウマチの存在を示唆するマーカーであるだけでなく、その者の人生で後に関節リウマチを発症する可能性を示唆するマーカーでもある、ということを示唆しているということにも本発明者らは注目した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
したがって、本発明は、
ＣＤＯ媒介性症状を診断する方法であって、以下の工程：
（ｉ）個体から試料を得ること、
（ｉｉ）変異型ＣＤＯ、又はＣＤＯ変異型をコードする核酸及び／又はＣＤＯ調節領域の変異型の存在若しくは非存在を検出すること、及び、
（ｉｉｉ）ＣＤＯ遺伝子及び／又はその調節領域における多型に対する照合により個体の状態を決定すること、
を包含する、方法を提供する。
【００１４】
生じるスルホン化の量の低減は、ＣＤＯタンパク質のいずれかの発現低減に起因し得る。好ましくは調節領域は、ＣＤＯをコードする領域に対して５’方向にある。それは、プロモーター又はエンハンサー領域であり得る。或いは、ＣＤＯタンパク質は産生され得るが、当該タンパク質をコードするＤＮＡ中の突然変異がＣＤＯ中の１つ又は複数のアミノ酸における変化を生じ、したがってより低い酵素活性を有するＣＤＯを生じる。ＣＤＯタンパク質産生のレベル低減及びＣＤＯの酵素活性低減は、産生される硫酸塩の量の低減を生じる。それゆえ、変異型ＣＤＯは、正常レベルのＣＤＯを有する正常個体と比較して、ＣＤＯ変異型、その調節領域をコードする核酸内の多型を探すことにより、又は代替的にはこのような変異型から産生されるタンパク質のタンパク質構造の変化を探すことにより、検出され得る。
【００１５】
ＣＤＯの正常レベルは、１０〜３０、あるいは５〜１００ピコモル／タンパク質１ｍｇの範囲であると考えられる。正常ＣＤＯの酵素活性は、１０〜３０、あるいは５〜１００ピコモル／タンパク質１ｍｇ／時間と考えられる。
【００１６】
本発明はまた、ヒトにおけるＣＤＯ遺伝子又はその調節配列における１つ又は複数の多型を診断する方法であって、ＣＤＯ遺伝子の少なくとも一部をコードする核酸分子及び／又はＣＤＯ調節領域の配列を決定すること、及び、ＣＤＯ遺伝子及び／又はその調節領域における多型に対する照合によりヒトの状態を決定することを包含する、方法を提供する。
【００１７】
多型は、一集団内の２つ以上の遺伝的に決定された選択的アレル又は配列の出現を指す。多型マーカーは、多様化が起こる部位である。例えば塩基、例えばアデニンは、異なる塩基、例えばチミンに取って代わられ得る。代替的には、１つ又は複数の付加的塩基がその部位に挿入され得る。一塩基が別の塩基に置換される多型は、核酸配列に由来するメッセンジャーＲＮＡが最終酵素に翻訳される場合、異なるアミノ酸がタンパク質中に挿入されるように、例えばコドンの変化を生じ得る。例えばＧＣＣは、アラニンをコードするコドンである。このコドンが、アデニン残基を含有するように変えられる場合（例えばＧＡＣ）、コドンは読み違えられ、そしてアラニンの代わりにアスパラギン酸の挿入を生じる。１つ又は複数の塩基の置換は、例えば終止コドンの産生を生じて、タンパク質の生成の終結を引き起こす。このような置換は、それらが調節配列、例えばＣＤＯ遺伝子の上流のプロモーター配列で起こる場合、ＣＤＯの発現レベルの低減を生じ得る。代替的には、プロセシングシグナルをコードする配列における変化も、最終ＣＤＯ産物の発現に影響を及ぼし得る。
【００１８】
その他の突然変異としては、１つ又は複数の塩基が調節配列又はＣＤＯ配列それ自体をコードするＤＮＡ中に挿入される付加突然変異、及び、１つ又は複数の塩基がＤＮＡから欠失される欠失突然変異が挙げられる。このような欠失は、切頭化タンパク質の産生を生じ得るし、代替的にはＣＤＯ遺伝子の発現のレベル低減を生じ得る。
【００１９】
好ましくは２つ以上の多型が探される。好ましくはマーカーは少なくとも２つのアレルを有し、その各々は、選択集団、例えばＲＡを有する集団のうちの１％より大きい、さらに好ましくは少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％又はそれより大きい頻度で起こる。
【００２０】
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は一般的に、その名称が意味するように、或る種のいくつかのメンバーの核酸配列中に存在する単一ヌクレオチド又は点変異である。種内のこのような多型変異は、一般的に、進化を通しての偶発突然変異の結果であるとみなされる。
【００２１】
多型は、ｍＲＮＡ合成、成熟、輸送及び安定性にも影響を及ぼし得る。アミノ酸変化を生じない多型（サイレント多型）又はいかなる既知のコンセンサス配列も変更しない多型であっても、例えばｍＲＮＡフォールディング、安定性、スプライシング、転写率、翻訳率又は正確性を変更することにより、生物学的作用を有し得る。実際、アミノ酸変化を生じない多型でも、潜在的に異なる生物学的機能を有するｍＲＮＡの異なる構造フォールドを引き起こし得る、ということが報告されている（Shen, et al. (1999) PNAS USA, Vol.
96, pages 7871-7876）。したがってイントロン配列及びプロモーター領域におけるようなコード配列の外側に起こる変化は、その配列の転写及び／又はメッセンジャー安定性に影響を及ぼし、したがって細胞中のＣＤＯタンパク質のレベルに影響を及ぼし得る。
【００２２】
好ましくは、上記多型が以下の多型から選択される。
【００２３】
【表１】
2009501541.tif 000002
【００２４】
ＣＤＯが５つのエキソンを含むことが知られている。ＣＤＯのヌクレオチド配列は、http://www.ncbi.nlm.nih.govでアクセスすることができるＧｅｎｂａｎｋから入手可能である。ヌクレオチド配列は３つのセグメントで入手可能である。ＣＤＯセグメント１は４１８６ヌクレオチド長であり、エキソン１（ヌクレオチド６０９〜１０２６）及びエキソン２（ヌクレオチド４０００〜４０７７）を含み、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ６０２３２．１、ＧＩ：２１３８１０８によってアクセスすることができる。ＣＤＯセグメント２は２７３９ヌクレオチド長であり、エキソン３（ヌクレオチド１７３５〜１８８９）を含み、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ７８９７９．１、ＧＩ：１６９９０３５によってアクセスすることができる。ＣＤＯセグメント３は２９９５ヌクレオチド長であり、エキソン４（ヌクレオチド１１１５〜１２８４）及びエキソン５（ヌクレオチド２１７３〜２９０７）を含み、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ８００５５．１、ＧＩ
：２１３８１０９によってアクセスすることができる。
【００２５】
配列リストにおいて、セグメント１＝配列番号１、セグメント２＝配列番号２、セグメント３＝配列番号３、エキソン１＝配列番号４、エキソン２＝配列番号５、エキソン３＝配列番号６、エキソン４＝配列番号７及びエキソン５＝配列番号８である。
【００２６】
上記のＳＮＰ配位は、ＮＣＢＩデータバンクより入手可能な野生型のＣＤＯヌクレオチド配列を表す。エキソン１に関して、その配位はセグメント１（すなわち、配列番号１）の番号付けに対応する。したがって、同定された多型は、エキソン１のコード配列内に位置しておらず、エキソン１の隣接領域内に位置している。エキソン３及びエキソン４に関して、それらのＳＮＰ配位はエキソン３（すなわち、配列番号６）及びエキソン４（すなわち、配列番号７）それぞれの番号付けに対応する。
【００２７】
多型はゲノムＤＮＡにおいて検出することができる。代替的に、多型はｍＲＮＡ等のＲＮＡ又はこのようなｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡにおいて検出することができる。
【００２８】
本発明の方法は、上記ヒトが低減したＣＤＯ濃度及び／又は酵素活性が低減したＣＤＯを有するという指標を提供する。
【００２９】
試料は、例えば血液又はその他の身体組織、或いは口腔検査スワブから得ることができる。診断は、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行される。
【００３０】
ＣＤＯ媒介性症状は、関節リウマチ、及び／又はＤ−ペニシラミン及び金チオマレートから選択される１つ又は複数の薬剤による副作用の発症であり得る。
【００３１】
診断を手助けするために、１つ又は複数の多型の存在又は非存在を用いる。
【００３２】
例えば関節リウマチを発症することに対する個体又はヒトの性向を同定する能力は、関節リウマチの疼痛性症候の発生の前に、例えばメトトレキセートを用いて個体を治療することを可能にする。これは、糜爛性関節リウマチを発症する患者を防止するのに役立つ。それは、このような個体が早期に同定され、そして関節リウマチの完全な発症を防止する手助けをすることにより彼等の生活の質がかなり改善され得る、ということを意味する。
【００３３】
Ｄ−ペニシラミン及び金チオマレートのような薬剤は、このような化合物で治療されている関節リウマチ患者において副作用を引き起こすことが既知である。当該薬剤は、それらの患者における低レベルのＣＤＯ又は低レベルの活性ＣＤＯのため（おそらくは）に、適正に酸化されることができない。それゆえ、このような副作用を蒙ると思われる患者を同定することができることが助けとなるが、それは、患者を代替的投薬に委ねさせ得るからである。
【００３４】
核酸の一量域内の多型の存在又は非存在を同定する方法は、それ自体、一般的に既知である。
【００３５】
好ましくは多型は、多型を同定する前に、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。これは、多型の上流の配列に対するプライマーを用い、多型をコードする一本の核酸を増幅し、次に増幅配列をシークエンシングすることにより簡単に達成され得る。代替的には、プライマーが多型部位とハイブリダイズして、次にＰＣＲ産物を産生するために用いられるように、プライマーは多型の部位に関し得、当該多型配列と実質的に相補的なプライマーの配列を有する。当該多型がそこにない場合には、プライマーはその部位に結合せず、そしてＰＣＲ産物を産生しない。その結果、検出に利用可能なＰＣＲ産物は存在しない。
リアルタイムＰＣＲを用いて、ＳＮＰを同定し得る。リアルタイムＰＣＲは、例えば蛍光発生分子によりプライマー、プローブ及びアンプリコンを標識する種々の化学作用の出現のため、発展してきた。反応は通常は、キュベットとして作用する毛管中で設定されて、各周期の終了時に蛍光シグナルをモニタリングさせる。これは、同一管内で標的増幅及び検出を起こさせて、後増幅プロセシング及び検出の必要性を排除する閉管系を作り出す。例えば国際公開第９７／４６７１２号は、サーマルサイクリング法及び装置を開示している。
【００３６】
国際公開第００／１８９６５号は、突然変異又は多型の存在の検出に関する方法を開示している。この方法は、ポリメラーゼ連鎖反応及び蛍光標識オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを用いて、ハイブリダイゼーションプローブの融解曲線分析に基づいて突然変異及び多型を同定する。用いられるフルオロフォアは、当該技術分野で既知の多数の異なる化合物、例えばエチジウムブロマイド、ＹＯ−ＰＲＯ−１及びＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉのうちの１つであり得る。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、２つのハイブリダイゼーションプローブの隣接アニーリングによっている（Lay N.J. and Wittwer C.T. Clin. Chem. (1997), Vol. 43, pages 2262-2267）。第１のプローブはその３’末端に供与ダイを含有し、そして他のものはその５’末端に受容ダイを含有する。外部供給源により光が加えられると、蛍光共鳴エネルギー移動プロセスにおいてドナー染料は励起され、そして受容染料にエネルギーを移動する。両プライマーが密に近接してアニールする場合のみ、エネルギー移動が可能である。それゆえ、このような技法は、特定多型への相補的プライマーの結合の検出を可能にする。
【００３７】
代替的には、潜在的多型部位周囲の核酸の増幅といったあまり複雑でない技法が成され得る。増幅ＤＮＡは、例えば電気泳動を用いることによって分離され、そしてＤＮＡは、当該多型と相補的な標識プローブを用いてプローブされ得る。標識プローブは、放射性標識、又は例えば当該技術分野で既知の蛍光標識を用いて標識され得る。
【００３８】
用いられる方法としては、好ましくは、ＡＲＭＳ−アレル特異的増幅、アレル特異的ハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ及び制限断片長多型（ＲＦＬＰ）から選択される方法により核酸配列が決定される本発明による方法が挙げられる。ＡＲＭＳ−アレル特異的増幅は、例えば欧州特許第０３３２４３５号及び米国特許第５，５９５，８９０号に記載されている。これは、プライマーの３’末端ヌクレオチド及びその鋳型の相補性によっている。プライマーの３’末端ヌクレオチドは、検出されるべき特定の突然変異、アレル又は多型と相補性であるか又は非相補性である。ＲＦＬＰは、制限エンドヌクレアーゼ部位に影響を及ぼす配列の変更、及び制限酵素によるその部位の消化の防止によっている。
【００３９】
個体における１つ又は複数の、好ましくは２つ以上の異なる多型の存在又は非存在は、例えば関節リウマチを発症する及び／又は薬剤に対する副作用を発症することに対するヒトの性向を決定させ得る。このＣＤＯ欠陥と関連し得る他の疾患としては、自己免疫疾患、例えば全身性紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群、ブドウ膜炎、クローン病、強直性脊椎炎、神経変成疾患、例えばパーキンソン病及びアルツハイマー病及び運動神経疾患が挙げられる。このＣＤＯ欠陥と関連し得るさらなる疾患としては、炎症性サイトカインに対する抗体を包含するものが挙げられる。
【００４０】
本発明は、本発明による方法に用いるためのアレル特異的プローブ又はプライマーも提供する。上記のように、多型を同定するために用いられるプロセスは、それ自体一般的に既知である。適切なプローブ又はプライマーの同定は、多型部位が一旦同定されれば、それ自体普通は当業者の知識内である。
【００４１】
好ましいプローブ又はプライマーは、以下の配列を含む。
【００４２】
【表２】
2009501541.tif 000003
【００４３】
エキソン１プライマーは、最初に、アクセッション番号Ｄ８５７７８．１  ＧＩ：１７４７３２５（エキソン１）の配列とハイブリダイズするように意図されたもので、これは、www.ncbi.nlm.nih.govで公的に入手可能である。
【００４４】
好ましいプローブは、対象の当該ＳＮＰを含有する核酸の領域と特異的にハイブリダイズし、そして適切な特質、例えば特異性、融解温度でプライマーを設計するための技法を当業者は熟知している。
【００４５】
好ましくは、プローブ又はプライマーは、以下の多型を検出することが可能である。
【００４６】
【表３】
2009501541.tif 000004
【００４７】
本発明のプローブ又はプライマーは、好ましくは検出されるべき多型に対応し、即ち、それらは検出されるべき多型と相補的である。本発明のプローブ又はプライマーは、好ましくは１７〜５０ヌクレオチド長、さらに好ましくは約１７〜３０ヌクレオチド長である。プライマー又はプローブは、多型の約６〜８のヌクレオチドに対応し得る。
【００４８】
プローブ又はプライマーが単にプローブとして、即ち、ＰＣＲのためのプライマーとしてというよりむしろ標識として用いられている場合、プローブのサイズは、例えば８〜２５塩基長、好ましくは８〜１５塩基長に低減され得る。
【００４９】
好ましくは本発明のプローブ又はプライマーは、多型部位と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の相同性を有する。好ましくはそれらは、多型部位と同一であり、或いは代替的には多型部位と相補的である。プローブ又はプライマーは、もちろん、多型を含有するＣＤＯをコードする核酸の鎖又はその調節領域と結合し得るし、代替的にはその相補的鎖（存在する場合）と結合し得る。
【００５０】
また、本発明による１つ又は複数のプローブ又はプライマーを含む診断キットも提供される。
【００５１】
本発明のさらなる態様は、ＣＤＯ又はＣＤＯ調節性多型をコードするか又はかかる多型と相補的な少なくとも５塩基長の単離核酸を提供する。好ましくは、当該多型は以下の配列及びこのような配列と相補的な配列から選択される。
【００５２】
【表４】
2009501541.tif 000005
好ましくは、単離核酸は少なくとも１０、１５、２０、３０又は４０の塩基を有する。
【００５３】
さらに好ましくは単離核酸分子は、ＣＤＯ又はその断片をコードし、これはさらに好ましくは多型を含有する。
【００５４】
このような核酸分子から得られる単離ＣＤＯタンパク質も提供される。単離核酸分子からの組換えタンパク質を産生する方法は、当該技術分野で既知である。単離核酸分子は、適切なベクター中にクローン化され、そして適切な原核生物又は真核生物宿主中で発現される。
【００５５】
したがって、本発明の単離核酸分子を含有するベクター及び宿主細胞も、本発明により提供される。このようなベクターは、好ましくは当該技術分野で既知の型の適切なプロモーター及び終結配列を含有する。代替的には、ＣＤＯそれ自体のプロモーター及び調節配列が用いられ、これらの配列のうちの１つ又は複数に及ぼす多型の作用を試験させ得る。後者の場合、調節配列は、その発現が容易にアッセイされ得るβ−ガラクトシダーゼ又は緑色蛍光タンパク質のような当該技術分野で既知の適切なレポーター配列に付着され得る。
【００５６】
上記のように、多型はＣＤＯのアミノ酸配列中の変化を生じ、したがって酵素の構造における変化を生じ得る。酵素の構造におけるこのような変化は、１つ又は複数の抗体、例えばＣＤＯタンパク質に特異的なモノクローナル抗体の単離により容易に同定され得る。即ち、抗体は、コード核酸配列中の多型を含有しないＣＤＯに結合しない。モノクローナル抗体の産生は、例えばケーラー及びミルステインの方法により、それ自体既知である。
【００５７】
本発明のさらなる態様は、ＣＤＯ媒介性症状に対する個体の性向を決定する方法であって、以下の工程：
（ｉ）個体から試料を得ること、及び、
（ｉｉ）本発明による抗体を用いて多型を含有するＣＤＯの存在を検出すること、
を包含する、方法を提供する。
【００５８】
好ましくは、ＣＤＯは白血球中で発現される、ということを本発明者らは予期せず見出した。従来、ＣＤＯは脳及び肺組織中に見出されている。このような組織は、容易にアクセス可能であるというわけではない。したがって、好ましくは本発明の方法に用いられる試料、例えば変異型ＣＤＯ又はＣＤＯをコードする核酸、或いはもちろんその調節配列の
試料は、白血球から得られる。
【００５９】
ＣＤＯを含有する組織試料が比較的容易に利用可能であることにより、ＣＤＯ活性のアッセイを行うことが可能である。したがって、本発明のさらなる態様は、ＣＤＯ活性に及ぼす化合物の効果を決定する方法であって、以下の工程：
（ｉ）白血球の試料を用意すること、
（ｉｉ）白血球をＣＤＯ基質及び化合物と接触させること、及び、
（ｉｉｉ）白血球中のＣＤＯによる、検出可能な産物への基質の転化に及ぼす、化合物の効果を決定すること、
を包含する、方法を提供する。
【００６０】
ＣＤＯ基質の例としては、システイン、Ｓ−カルボキシメチルシステイン、Ｓ−メチルシステイン、金チオマレート、Ｎ−アセチルシステイン、アルキル−システイン及びＤ−ペニシラミンが挙げられる。これらの基質は分解して、システインスルフィン酸を含めた生成物を生じる。このような方法は、関節リウマチの治療のための薬剤候補を同定するのに用いられ得る。即ち、白血球内のＣＤＯ発現に及ぼす、例えばサイトカイン又は代替的には異なる化合物の作用が決定され得る。
【００６１】
本発明者らによるさらなる研究は、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）がＣＤＯ発現を増大し得る、ということを示した。これは、ＣＤＯ発現を低減するＴＮＦ−αと対照をなす。
【００６２】
ＣＤＯはヒト身体中の硫酸塩の取り込みにとって極めて重要であり、また、低レベルの硫酸塩は関節リウマチに関連するので、ＩＦＮ−γは治療薬として用いられ得る、と予測される。
【００６３】
したがって、本発明は、関節リウマチを治療する方法であって、薬学的有効量のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を投与することを包含する方法を提供する。好ましくは、関節リウマチは、非ＨＴＬＶ−１関連関節リウマチである。すでに示したように、ＨＴＬＶ−１関連関節リウマチは相対的に稀であると考えられる。
【００６４】
インターフェロン−γは、硫酸塩産生のレベルを上げることが可能な１つ又は複数の化合物と組合せて投与することができる。これらの化合物としては、システイン、メチオニン、Ｄ−ペニシラミン、Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−アルキルシステイン、γ−グルタミルシステイン、インターロイキン−４及びインターロイキン−１０が挙げられる。
【００６５】
関節リウマチを治療するための薬剤の製造において用いるためのＩＦＮ−γであって、任意に上記の硫酸塩誘導性化合物とともに用いるためのＩＦＮ−γも提供される。
【００６６】
本発明のさらなる他の態様は、例えば以下の：システイン、メチオニン、Ｄ−ペニシラミン、Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−アルキルシステイン、γ−グルタミルシステイン、インターロイキン−４、Ｓ−カルボキシメチル、Ｓ−メチルシステイン及びインターロイキン−１０の１つ又は複数の硫酸塩誘導性化合物と組合せたインターフェロン−γを含む薬学的に許容可能な組成物を提供する。
【００６７】
インターフェロン−γは、重篤な感染を低減するのを手助けするための慢性肉芽腫症の治療における臨床的使用のためにすでに認可されている。その投与量は、９０マイクログラムを週３回である。関節リウマチの治療に適した投与用量は、同様の投与量限度内であると予測される。
【００６８】
ＩＦＮ−γ及び任意に上で言及されたその他の化合物は、グルコース、スクロース又はトレハロースのような１つ又は複数の安定剤と組合せて用いられ得る。ＩＦＮ−γ及び／又は硫酸塩誘導性化合物の薬学的に許容可能な塩が用いられ得る。
【００６９】
さらに、１つ又は複数の薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤、充填剤、安定剤、ｐＨ調整剤、生物学的活性物質等が組入れられ得る。
【００７０】
好ましくは物質は、経口投与可能剤、例えばカプセル、粉末又は錠剤になるように形成される。代替的には、それは別の経路、例えば筋肉内注射により用いられ得る。
【００７１】
本発明は、図面を参照しながら、もっぱら例示として説明される。
【実施例】
【００７２】
［材料及び方法］
ゲノムＤＮＡ試料を、関節リウマチ（ＲＡ）患者及び対照ボランティア（Ｃ）からの血液から得た。静脈穿刺により、血液をＥＤＴＡ処理試験管中に収集した。以下のようにＰＣＲを実行した。
【００７３】
［プライマー設計］
ＣＤＯのエキソン１、２、３及び４の増幅のために、特定のＰＣＲプライマーを設計した。ＮＣＢＩデータベース（www.ncbi.nlm.nih.gov）から入手した配列データ及びＰｒｉｍｅｒ  ３インターネット・ベースのプライマー設計ツール（http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi、これはMassachusetts Institute of Technology, http://web.mit.edu/index.htmlが主催する）を用いて、プライマーを設計した。オリゴヌクレオチドプライマーはAlta Biosciences（Birmingham, UK）により合成され、その後、蒸留水で１００ｐｍｏｌ／μｌ濃度に希釈された。
【００７４】
［ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）］
ＰＣＲにより、ＣＤＯエキソン２、３及び４を増幅した。
【００７５】
各エキソンに関する各プライマー（１０ｐｍｏｌｅ／ｍｌのストック溶液）の試料１０μｌを混合し、蒸留水中でさらに希釈して５ｐｍｏｌe／μｌの濃度にして、各エキソンに関するフォワード及びリバースプライマーの混合溶液を生成した。反応のための鋳型ＤＮＡは、２つの型を有した：即ち、対照「Ｃ」及び「ＲＡ」。多くの対照及び患者試料が利用可能であった。対照試料は単に数字で呼ばれたが、一方、ＲＡ患者ＤＮＡ試料は接頭辞「Ａ」のついた数字で示された。そこで、鋳型試料は９０、９１、９２、９３及び９４（対照）、並びにＡ１１、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１４、Ａ１６、Ａ１７、Ａ１８及びＡ１９（ＲＡ）であった。ＰＣＲ反応をサーモサイクラー中で実行した。
【００７６】
以下の反応を、０．５ｍｌマイクロチューブ中で、氷上で設定した：
ＤＮＡ                        ３μl
１０×ＰＣＲ緩衝液            ５μl
ｄＮＴＰミックス（２００μＭ）  ２．５μl
フォワードプライマー          ２．５μl
リバースプライマー            ２．５μl
ポリメラーゼ                  ２Ｕ
滅菌水                        ５０μｌまで
【００７７】
ｄＮＴＰミックス、ポリメラーゼ及びＰＣＲ緩衝液は、Bioline（London, UK）から入手した。ＰＣＲ緩衝液は、ＮＨ4反応緩衝液であった。ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド
）も、いくつかの反応で用いた。塩化マグネシウム（５０ｎＭ）を、１〜５μｌの体積で添加した。ＰＣＲ混合物の総体積は５０μｌであった。
【００７８】
一般的なＰＣＲプログラム：
１．  ９４°Ｃで５分間。融解工程。
２．  ９４°Ｃで３０秒間。融解工程。
３．  ５３°Ｃ*で３０秒間。アニーリング工程。
４．  ７２°Ｃで１分間。伸長工程。
５．  段階２〜段階４を３０サイクル繰り返す。
６．  ７２°Ｃで１０分間。最終伸長工程。
*アニーリング温度をプライマーの融解温度を算定して、５℃差し引くことにより決定した。プライマーの融解温度は、当業者に既知の方程式を用いて算定され得る。
【００７９】
初期ＰＣＲを実施した後、直ぐに上手くいかない場合はタッチダウンＰＣＲの使用が促された。タッチダウンＰＣＲは、アニーリング温度がサイクルを通して定期的に変化する非典型的プロトコルを使用する。それは予測アニーリング温度より高い温度で開始し、何組目か（例えば５回）のサイクルの後に、１℃だけ下がり、最後に、最終組のサイクルで「タッチダウン」アニーリング温度に到達する。これを行なう理由は、ＰＣＲプロトコルのアニーリング温度を調整する必要があるか否かを調べるためである。タッチダウンＰＣＲは、擬似プライミングを減少することも示されており（Don, RH, Cox, PT, Wainwright, BJ, Baker, K and Mattick, JS (1991). "Touchdown" PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Research 19: 4008）、即ち、正しくない位置でのプライマーの非特異的アニーリングは多数の異なるＰＣＲ産物の産生を生じ、したがってゲル上に不十分な（スメア又は拡散）バンドを示す。
【００８０】
【表５】
2009501541.tif 000006
【００８１】
［ＰＣＲ最適化］
システインジオキシゲナーゼのエキソン２、３及び４を正確に且つ確実に増幅するために、ＰＣＲプロトコルを最適化した。いくつかの戦略を用いて最適化を実行したが、そのほとんどが、特定の反応構成成分の濃度を変えること、或いは添加剤の存在又は非存在で実験することを包含した。制御された変数を以下に示す：
・塩化マグネシウム濃度。
・鋳型ＤＮＡ濃度。
・プライマー濃度。
・プライマー設計。
・ＤＭＳＯ添加／非添加。
【００８２】
しかし、エキソン１に関しては、以下のＰＣＲプログラムを使用した：
段階１．  ９４°Ｃで１分間を１サイクル
段階２．  ９４°Ｃで３０秒間
６１°Ｃで３０秒間
７２°Ｃで１分間
を３０サイクル
段階３．  ７２°Ｃで１０分間を１サイクル。
そして、反応成分は以下の成分：
ＤＮＡ                        ３μl
１０×ＰＣＲ緩衝液            ５μl
ｄＮＴＰミックス                ２．５μl
エキソン１に対するプライマー  ２つのプライマーそれぞれ１２．５μｌ（それぞれ１０μｕＭの濃度）
ポリメラーゼ酵素混合物        ２Ｕ
滅菌水                        ５０μｌまで
であった。
【００８３】
アガロースゲル電気泳動及びその後のＤＮＡ「プラスミド−プロファイル」シークエンシングにより、これらの実験結果を評価する。
【００８４】
［エキソン１のＰＣＲ増幅］
標準ＰＣＲ又はタッチダウンＰＣＲを用いて、配列番号９及び配列番号１０で示されるＰＣＲプライマーを用いて、エキソン１を増幅した。エキソン１は、配列番号９及び配列番号１７のプライマーを用いてタッチダウンＰＣＲによっても増幅された。
【００８５】
［アガロースゲル電気泳動］
この研究の異なる段階で、１、２及び３％のアガロースゲルを用いた。ＴＡＥ緩衝液中でアガロースゲルを調製した。ＴＡＥ緩衝液の５０×ストックの組成は、以下の通りである：２４２ｇのトリス塩基、５７．１ｍｌの氷酢酸、１００ｍｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）；蒸留水で全体を１リットルにする。標準方法（Molecular Cloning: Sambrook,
Fritsch and Maniatis, 1989）に従ってアガロースゲルを調製した。アガロースゲルはエチジウムブロマイド（Sigma）を標準濃度で含んだ。
【００８６】
ＰＣＲの完了後、ＰＣＲ産物の１０μｌアリコートを、０．５ｍｌマイクロチューブ中の４μｌ体積のゲルローディングダイ（この場合、オレンジＧ及びグリセロール）に添加した。次にこれらの試料をゲルに負荷した。ＰＣＲ産物のほかに、２μｌのローディングダイ及び５μｌの１００ｂｐ  ＤＮＡラダー（Bioline）の混合物をすべてのゲルの最初のウエル中にピペット添加した。種々の時間（通常は少なくとも１時間）、１２５ボルトでゲルを泳動させて、ＵＶ光で観察した場合に目視でそれらが分離するのに十分にゲル全体にＤＮＡ断片を移動させた。バンドの適切な分解能及び十分な分離を達成するために、電気泳動条件を最適化した。
【００８７】
［ＰＣＲ産物精製］
ゲル電気泳動後、選択されたＰＣＲ産物を精製して、生成混合物の他の構成成分（変性ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ等）からＤＮＡを単離した。これを、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ産物精製キット（Qiagen, UK）を用いて実施した。このキットは、多数の緩衝液（結合緩衝液、洗浄緩衝液及び溶離緩衝液）及びスピンカラムを用いて、ＰＣＲ混合物からＤＮＡを単離する。メーカーの使用説明書（キットとともに提供される）に従って、キットを用いた。このキットは、緩衝液ＥＢ（溶離緩衝液）の５０μｌ溶液中にＰＣＲ産物からＤＮＡを溶離する。
【００８８】
［ゲル抽出］
ＰＣＲ後に純ＤＮＡ試料を得るために用いられる別の方法は、アガロースゲルからの対
象のバンドの抽出である。インターカレートしたエチジウムブロマイドは、ＵＶ光下でＤＮＡバンドを同定させる。鋭利な清浄メスを用いて、ゲルから対象のバンドを切り出した。切除バンドを１．５ｍｌ微量遠心管中に入れて、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キット（Qiagen, UK）を用いてＤＮＡを単離した。このキットは、多数の緩衝液（ＰＣＲ精製キットのものと同様）及びスピンカラム（ＰＣＲ精製キットからのものと同一）で構成された。体積５０μｌの溶離緩衝液（緩衝液ＥＢ）中に、最終精製ＤＮＡ試料が得られる。
【００８９】
［ＤＮＡ定量］
供試試料が特定量のＤＮＡ（本件の場合は、２００ｎｇ〜６００ｎｇのＤＮＡ）を含有することを、ＤＮＡシークエンシングは必要とする。したがって、２６０ｎｍの波長でＵＶ分光測光法を用いて、精製プロセスから結果的に生じる溶液中に存在するＤＮＡの量を定量した。吸光度値をＤＮＡナノグラム／マイクロリットルに変換するために、以下の既知の計算を実施した：
ＵＶ吸光度×５０×５００＝ＤＮＡ（ｎｇ／μｌ）
【００９０】
［シークエンシングのためのＤＮＡ試料の調製］
「プラスミド−プロファイル」シークエンシングのためのＤＮＡの正確な濃度は、２００〜６００ｎｇ／ｍｌであるとして引用されている（メーカーにより）。研究のこの段階で、実験の一部は、最適結果のためのシークエンシング溶液中のＤＮＡの最適濃度を決定することを目標とした。実験後、試料を希釈してＤＮＡを適切な濃度にして、最適結果を提供した。最後に、適切なプライマーのアリコート（プライマーの５ｐｍｏｌｅ／μｌ溶液０．６４μｌ）をＤＮＡ試料に添加して、シークエンシング試料中のプライマーの量を３．２ｐｍｏｌｅ（０．６４×５＝３．２）とした。次にこれを、「プラスミド−プロファイル」シークエンシングのために、バーミンガム大学の機能的ゲノム学研究所（University of Birmingham Functional Genomics Laboratory）に付託した。
【００９１】
［シークエンス分析］
Functional Genomics Laboratory ウエブサイトにおけるＣｈｒｏｍａｓ（商標）（ソフトウエア：Ｃｈｒｏｍａｓ  ｖ４．１（商標）及びＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ  ｖ１．５（商標）（著作権）Telynesium Pty. Ltd. http://www.telynesium.com.au）フォーマット（．ａｂ１  ファイル）で、完了シークエンシング結果が得られる。これらは、Ｃｈｒｏｍａｓソフトウエアを用いて開かれ、読まれ得る。このソフトウエア内で、シークエンシングから得られた配列データに関するＢＬＡＳＴ検索を実施することが可能である（インターネット接続と連携して）。この検索の結果、クエリ配列（即ちシークエンシングをプロファイリングするためのプラスミドからのデータ）との相同性を示す、多数の供給源からの遺伝子配列及びＤＮＡ配列の一覧が、相同順に整列され与えられる。これらの結果は、「ＢＬＡＳＴヒット」と呼ばれる。シークエンシングが完全にうまくいった場合、ＢＬＡＳＴヒットのトップは「ホモサピエンス・システインジオキシゲナーゼ・エキソン・・・（Homo sapiens Cysteine Dioxygenase Exon...）」である。配列アラインメント線図もＢＬＡＳＴ出力に含まれ、整合がクエリ配列と参照配列との間でどれくらい近いかを示す。これは２つの重要な用途を供し得る：第１に、それは、シークエンシング結果中に存在する任意の不一致を示し得る（したがってシークエンシング成功の測定値であり得る）、そして第２に、シークエンスされた試料中に存在する任意の多型を示し得る。これはこの試験の重要な目的、即ち、疾患症候に影響を及ぼし得る対照と疾患ＣＤＯ遺伝子との間の任意の多型を同定することである。関節リウマチ患者におけるＣＤＯ活性低減を説明し得る多型、例えば活性部位ドメインにおける有害多型が見出された場合、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏで観察された現象、即ち高血漿システインレベルを説明するのにいくらか役立ち得る。
【００９２】
［結果］
［プライマー設計］
プライマー３ウェブツール（Ｐｒｉｍｅｒ  ３インターネットプライマー設計ツール、http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi（これはMassachusetts Institute of Technology, http://web.mit.edu/index.htmlが主催する））を用いて、ＰＣＲ反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。全組のプライマーに関して、遺伝子のその特定セクションに関するイントロン及びエキソンの配列（例えばエキソン２、３又は４）をプライマー３中にアップロードした。次にプライマー３は、各エキソンのために用いられ得るプライマーのいくつかの組を組み立てた。付加的情報、例えばプライマーの融解温度、それらの特異性も予測された。用いられる最初の３組のプライマーに関する結果、及びエキソン１プライマーに関する結果を、図３に示す。
【００９３】
［ＰＣＲ最適化］
ＰＣＲは、ごく高感度の技法である。それは外因性ＤＮＡによる汚染傾向が強く、反応は多数の構成成分を有し、その相対比は反応の成否を大きく左右する。これらの変数を試験して、最適濃度を決定した。理論的には、反応のすべての構成成分を修正し得るが、この研究の目的のために、重要な変数のみを調べた。ＰＣＲ反応の定数因子及び変数因子を以下に示す。
定数因子：ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの濃度及び容量、
プライマー容量、
緩衝液の濃度及び容量、
塩化マグネシウム濃度、
鋳型ＤＮＡ容量。
変数因子：プライマー濃度、
プライマー配列、
鋳型濃度、
塩化マグネシウム溶液の容量、
ＤＭＳＯ添加剤の有無。
【００９４】
これらのパラメーターに加えて、２つの異なる型の鋳型ＤＮＡをこの試験に用い、したがってエキソン２、３及び４の増幅のためのＰＣＲ条件は、両鋳型に関して最適化されなければならなかった。理論的には、異なる鋳型は同一条件下で首尾よく増幅され得るが、この場合、対照ＤＮＡ及び関節リウマチＤＮＡはＰＣＲによる増幅のための異なる要件を有する、ということが判明した（後述の結果参照）。
【００９５】
［アガロースゲル電気泳動分離］
ＰＣＲ反応の成否を評価するために、１０μｌ体積のＰＣＲ産物をアガロースゲル上で泳動させた。２％アガロースゲルは、主として小分子（＜３００ｂｐ）用でありそしてそれより高いパーセンテージのゲルはより小さい分子をより多く分離するので、この研究からのＰＣＲ産物のために最も適切である、ということが判明した。１２０ボルトの電圧でのゲルの泳動は、バンドの分解能とゲルを泳動するのに要する時間との間の最良の平衡をもたらし、この電圧でのゲルの泳動は約７５分を要する（データは示されていない）、ということも判明した。ゲルは、ローディングダイ（オレンジＧ及びグリセロール）がウエルからゲルの長さの約４分の３移動すると、完了となるとみなされた。
【００９６】
［初回ＰＣＲテスト］
一般的なプロトコル（材料及び方法参照）及び反応構成成分を用いて実施されたＣＤＯエキソンを増幅しようと試みる初回反応は、非常に限定された成功を実証したが、このことは、増幅が非常に多大な最適化を要する、ということを示す。電気泳動による試験は、この反応で増幅されるＤＮＡは全くなく（又はごくわずかであり）、そして提供されるＤＮＡラダーは取り替えられなければならない（ラダーはゲル上には認められない）、とい
うことを示した。このゲル上のＤＮＡのこの欠如は、対照鋳型ＤＮＡ試料はいかなるＤＮＡも含有しない、ということを意味し得た。しかしながらこれは、対照鋳型試料のアリコートがゲル上で泳動されると、除外され、このことは、それが実際にＤＮＡを含有することを示した。
【００９７】
初回に首尾よくいかない可能性のある理由を調べるために、タッチダウンＰＣＲプロトコルを３つのＣＤＯエキソンのために設計された特異的プライマーの周囲に考案した。５８℃の平均融解温度（したがって５３℃のＰＣＲアニーリング温度）で、タッチダウンプロトコルは約５３℃の一連の温度から下げ、４８℃の温度に達する。そのプロトコルを以下に示す。
【００９８】
【表６】
2009501541.tif 000007
【００９９】
このプロトコルの使用は部分的に上首尾のＰＣＲを生じたが、この場合、ＣＤＯエキソン３及び４が増幅され、一方、エキソン２に関しては首尾よくいかなかった。図４は、タッチダウンＰＣＲ産物のゲル電気泳動を示す。
【０１００】
図４は、ＰＣＲがエキソン３及び４に関しては上首尾であったが、それはエキソン２に関しては不首尾に終わった、ということを示す。バンドの試験時に、バンドは分離が不十
分で、そしてバンドそれ自体より下の位置にスメアを示す、ということが分かる。これは、標的産物より大きい非特異的産物を産生するＰＣＲ反応により引き起こされる。この結果から、添加剤としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をＰＣＲ反応に付加する、ことが示唆された。図５は、ＤＭＳＯ添加剤を用いて実施された最初のＰＣＲの結果を示し、それは、エキソン２、３及び４が増幅されたことを示す。バンドの強度は、エチジウムブロマイドの相対濃度及び（推測として）ゲルのその領域におけるＤＮＡの量を示す。最も明るいバンドはエキソン３のバンドであり、したがって今までのところ、ＰＣＲはエキソン３で最良に働いた、と推測することができる。
【０１０１】
図１１は、エキソン１の増幅からのＰＣＲ産物を示す。
【０１０２】
［塩化マグネシウム濃度］
「マグネシウム勾配」を行うことにより、ＰＣＲ混合物中の塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ2）溶液の最適濃度の決定を実施した。ここでは、異なる体積のＭｇＣｌ2を用いて多数の反応が設定され、そして結果はアガロースゲル上でＰＣＲ産物を分離することにより評価される。通常、ＰＣＲ反応におけるＭｇＣｌ2容量の範囲は１〜５μｌである。図６は、対照ＤＮＡ鋳型を用いた場合の第１のマグネシウム勾配を示す。この初回の結果から、増幅ＤＮＡバンドは、マグネシウム濃度が４μｌ又は２μｌであった反応では少し明るい（より高濃度のＤＮＡを示す）ということが分かる。しかしながらその差はごくわずかである。ほとんどのバンド上にスメアが存在するが、これは、反応が非効率的に起こり、種々の長さの産物のアレイを産生した、ということを示す。
【０１０３】
［プライマー］
最良のＰＣＲ結果を生じる組を同定するために、この研究の経過全体を通してプライマーのいくつかの対が設計されなければならなかった。これらはすべて、プライマー３（Ｐｒｉｍｅｒ  ３インターネットプライマー設計ツール、http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi（これはMassachusetts Institute of Technology, http://web.mit.edu/index.htmlが主催する））インターネットツールを用いて設計した。５組のプライマーすべてにおいて試験した。ＰＣＲは一貫して十分に生じて、新規のプライマーを必要としなかったので、最適化実験の経過全体を通して、新規のプライマーを設計しなければならないということなく、エキソン３及び４の増幅を最適化し得た。しかしながら、ＰＣＲ反応のほかの成分は、大幅な変更を必要とした。
【０１０４】
エキソン２は、増幅するのが最も難しいエキソンであることを立証した。ＰＣＲ実験全体を通して、エキソン３及び４は、成功の程度は種々ではあるが、それらの増幅において（或る程度まで）一貫性を示した。しかしながらエキソン２はしばしば、良好に反応が作用したかどうかが予測不可能で、時として、良好に分離された緻密なバンドを生じるが、一方、そうでない場合は不十分なバンドを産生し、そしてしばしばバンドは全く生じなかった。一貫したＰＣＲの成功を見出す試みにおいて、２つの付加的な組のプライマーを設計した。プライマーの設計に際しては、エキソン３及び４に関するプライマーと類似の融解温度を有するプライマーを得ることを目指し、したがって３つのエキソンすべてを同一ＰＣＲプロトコルを用いて増幅し得た。エキソン１は、配列番号９及び１０で記載されるようなＰＣＲプライマーを用いて、上記のような異なるＰＣＲプロトコルを用いて増幅した。
【０１０５】
［鋳型濃度］
塩化マグネシウム及びプライマー濃度と全く同一の方法で、鋳型ＤＮＡ濃度を調べた。鋳型ＤＮＡ勾配を、種々の濃度の鋳型ＤＮＡを用いて、多数の反応とともに行った。ＰＣＲは極めて高感度の技法（前節参照）であり、したがって理論的には鋳型濃度は主要因子である必要はない、ということはすでに確立されている。鋳型ＤＮＡ試料を少量の水性「
ストック」として得て、これからアリコートを採取し、所望の量に希釈した。分光測光計を用いて、ストック溶液のＤＮＡ含量を定量した。これらの溶液から作製した希釈液は、１／２、１／１０及び１／２０であった。溶液中の鋳型ＤＮＡの最適濃度を決定するために、一実験を実施した。即ち、鋳型ＤＮＡを希釈し、これらの異なる希釈液を用いてＰＣＲ反応を実行した。以前の予測は、当該技法の感受性のため、鋳型濃度がＰＣＲの成否に大きな影響を及ぼすべきでない、ということを記述した。
【０１０６】
【表７】
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【０１０７】
［タッチダウンＰＣＲ］
上記のように、研究の早期にタッチダウンＰＣＲを用いて、増幅実験に伴う何らかの早期成功を達成した（図７参照）。この早期の成功のため、一ＰＣＲプロトコルにおけるエキソン２、３及び４の増幅の考え得る一手段として、タッチダウンＰＣＲを再び調べた。最適化ＰＣＲ構成成分を用いて（第１表参照）、２つのタッチダウンＰＣＲプロトコルを考案した。１つは５５℃で開始し、サイクル毎に１℃下げ、そして他方は、５４℃で開始し、サイクルの組毎に２℃下げる。これらの反応は混合結果を生じ、一組の反応は非常に良好に作用して、３つのエキソンすべてを効率的に増幅したが、他方は、全く作用できなかった。３つのエキソンすべてに関して１つのプロトコルを適応させようとするよりむしろ、全エキソンに関して異なる反応を最適化することに集中するのが最良であると考えられた。上首尾の一タッチダウンＰＣＲ結果を図７に示す。これは非常に有望な技法であった。
【０１０８】
［最適化されたポリメラーゼ連鎖反応条件の要約］
この研究で実施された全実験から、ホモサピエンス・システインジオキシゲナーゼ・エキソン２、３及び４の増幅に関する最適化スキームを考案した。これらの詳細を、第２表に示す。これらの知見を検証するために、多数の対照及びＲＡ患者ＤＮＡ試料からの全エキソンの増幅に関する最適化された条件を用いて、ＰＣＲ反応を設定した。大多数の場合において、ＰＣＲは上首尾であった。これらの反応からの生成物を次に精製し、そしてシークエンシングに付した。
【０１０９】
【表８】
2009501541.tif 000009
【０１１０】
エキソン１は、上記のようにエキソン１に特異的なプライマー及び異なる反応混合物並びに上記のパラメーターを用いて増幅した。
【０１１１】
［ＰＣＲ産物精製］
上記のようにＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キットを用いて、ＰＣＲ産物を単離及び精製した。３．２ｐｍｏｌｅの精製産物をプラスミド−プロファイルシークエンシングに付した。この技法による初回実験後、精製プロセスはＰＣＲ反応からのＤＮＡをすべて単離し得たが、収集されたＤＮＡはあまりに不均質で、正確なシークエンシング結果を得ることができなかった、ということが明らかになった。精製されたＤＮＡをこの方法に付すことにより得られたシークエンシング結果はすべて、不十分すぎて正確なシークエンシング結果が得られなかった。配列の不十分な分離は、ＢＬＡＳＴ検索により有意の整合を生じなかった。
【０１１２】
これらの知見は、ＰＣＲにより増幅される正確なＤＮＡオリゴヌクレオチドの単離及び精製のためにより慎重な系を用いさせた。アガロースゲルスラブからのゲル抽出を、ＰＣＲ産物精製のための代替物として選択した。これは、シークエンシングからの結果の劇的改善を生じた。
【０１１３】
［ゲル抽出］
ゲル抽出は、良好な純度のＤＮＡ（抽出及び精製されたＤＮＡのゲル電気泳動により示されるように）及びシークエンシング結果改善を生じた。小さな一欠点は、ＤＮＡ濃度低減のため、ゲル抽出試料からのバンドはしばしば不明瞭で、ＵＶ下で観察するのが困難である（不十分な画像のためにデータは含まれていない）、という点である。最も重要なことは、ゲル抽出ＤＮＡから得られるシークエンシング結果はＰＣＲ産物精製により得られるものよりはるかに高品質を有することである。これらの２つの方法から得られる配列の例を、図８に示す。
【０１１４】
［シークエンシング及び多型分析］
多数の理由、主に鋳型ＤＮＡ（患者試料から増幅）の汚染及び不純物及びプライマーのために、初回シークエンシング試験の成功はごく限定されている。ＰＣＲ産物の精製のための主な技法は、スピンカラムを用いたＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キットによるものであった。この技法を用いたシークエンシング結果は、十分な品質を有せず、ほとんど使用可能でない配列を有した。ゲル抽出法を用いると、はるかに良好な結果が生じ、そしてＰＣＲ条件をさらにわずかに最適化した後、適切な品質の良好なシークエンシング結果が得られ、配列比較が可能になった。配列データを参照配列と比較して、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＮＰ）（配列中の単一塩基対差）を同定し、これから、考え得るＳＮＰの記録を構築した。対照配列とＲＡ配列との間に、有意数の多型が存在する。データをより視覚的な形態で表すために、エキソン２、３及び４に関する多型を、図９中の配列上で強調させた。
【０１１５】
【表９】
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【０１１６】
【表１０】
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【０１１７】
【表１１】
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【０１１８】
第３表Ａ、第３表Ｂ及び第３表Ｃに示した置換に関して、その用語は従来用いられているものと反対である、ということに留意すべきである。例えば第３表Ｂでは、エキソン３の位置１５での置換は、＋１５  Ｔ−Ａと記載されている。標準用語（例えば本出願において前に用いた用語）を用いた場合、これは１５  Ａ−Ｔと読む。第３表Ａ、第３表Ｂ及び第３表Ｃは、内的に一致しており、そして互いに一貫している。明解にするために、本出願の本文全体を通して、標準用語が用いられており、即ち、好ましい多型は標準用語を用いて記載されている。
【０１１９】
結果は、エキソン全体を通してＳＮＰのかなりの分布が存在する、ということを示している。エキソン２は、ＳＮＰ遺伝子座の広範囲の分布を示すが、一方、エキソン４では、それらはかなり少ない部位に限定される。しかしながら、シークエンシングから収集されたデータは、これらの潜在的ＳＮＰの割合が、シークエンシング設備が特定位置でヌクレオチドを決定できないことを反映しているに過ぎないと思われるので、篩い分けされなければならない。潜在的擬陽性に加えて、同定されるその他の潜在的ＳＮＰは、ＤＮＡ配列中のそれらの上流の多型のために、誤って導かれる位置に存在し得る。高品質データのために結果を篩い分けする試みにおいて、「Ｎ」を含有するすべての潜在的ＳＮＰは「潜在的擬陽性」と呼ばれ、そして残りの多型は真正結果と推測される。これらの「潜在的ＳＮＰ」（第３表参照）は、３つのエキソンの記録されたＤＮＡ配列上にマッピングされ、そしてこれらの多型エキソン由来のタンパク質に関する結果を調べるために翻訳される。図９は、潜在的ＳＮＰが劇的且つ（ほぼ確実に）有害な変化をアミノ酸配列に対して引き起こす、ということを示す。ほとんどの場合、アミノ酸配列のほぼ半数がオリジナルと異なる。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、自身のＣＤＯエキソン中にこれらの多型すべてを有する個体は
、ほぼ確実に、非効率的な又は遅延型のＣＤＯ酵素を保有する。
【０１２０】
「潜在的擬陽性」という用語は、本発明者らがこれらの結果をＲＡ検出に関して無関係であるとして無視した、ということを意味しない、ということに留意すべきである。そうではなく、それは、「潜在的ＳＮＰ」と呼ばれるそれらの結果がＲＡの存在を示している可能性がより高いということを強調するよう意図される。
【０１２１】
［篩い分け結果］
シークエンシングされた試料の各々において、ここで同定されたＳＮＰをすべて含有するものはなかった。特定のＳＮＰが生じる頻度は、これがＣＤＯエキソン内の高度多型遺伝子座を示し得るものとして、有意である。ＳＮＰの頻度を、第４表に示す。ｉｎ  ｖｉｖｏ状況でのより適切な表現を提供するために、最も高頻度に生じるＳＮＰ（即ちこの研究において２回以上出現する）のみを単独で試験した。それを図１０に示す。
【０１２２】
【表１２】
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【０１２３】
［考察］
ホモサピエンス・システインジオキシゲナーゼ・エキソン２、３及び４の増幅及びシークエンシングのためのＰＣＲプロトコルを、本発明者らは首尾よく最適化し得た。これは、一連のＰＣＲ実験により達成され、相対的に短時間でどの条件が種々のエキソンを増幅させ、シークエンシングさせ得るかを示し得た。ホモサピエンス・システインジオキシゲナーゼ・エキソン１の増幅及びシークエンシングに適したＰＣＲプロトコルも、本発明者らは作成した。種々の多型を、エキソン１、３及び４において同定した。
【０１２４】
［化合物がＣＤＯ活性に及ぼす効果］
ＣＤＯは関節リウマチに関与する重要な酵素であり得る、ということを本発明者らは了解した。ＴＮＦ−α及びＴＧＦ−βがＣＤＯ活性に影響を及ぼすことを、本発明者らはすでに同定していた（Wilkinson L.J. and Waring R.H. 2002、上記）。
【０１２５】
Wilkinson L.J. and Waring R.H. (Toxicol in vitro (2002), pages 481-483)に記載されている方法を用いて、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの効果をアッセイした。
【０１２６】
インターフェロン−γがＣＤＯ発現に及ぼす作用を、第５表に示す：
【０１２７】
【表１３】
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【０１２８】
これは、インターフェロン−γがＣＤＯ発現を増大するために用いられ得るということ、したがって利用可能な硫酸塩の量を増大し、したがって関節リウマチ症候を低減し得る、ということを示している。さらにそれは、硫酸塩の産生を増大することが既知である化合物、例えばシステイン、メチオニン、Ｄ−ペニシラミン、Ｎ−アセチルシステイン、δ−グルタミルシステイン、インターロイキン−４及びインターロイキン−１０、Ｓ−カルボキシメチルシステイン、Ｓ−メチルシステインとともに用いられて、関節リウマチの治療をさらに改善し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】ヒトＣＤＯ遺伝子のイントロン及びエキソンの配置を示す。
【図２−１】ＣＤＯのエキソン２、３及び４のイントロン配列及びエキソン配列を示す。大文字はエキソン配列を示し、太字の小文字はイントロン配列を示す。行の数字は、コードのその行の第１の塩基の位置である。National Center for Biotechnology Information（www.ncbi.nlm.nih.gov）からＣＤＯ配列を得た。ＣＤＯのアクセッション番号は、Ｕ６０２３２（Ｕ６０２３２．１、ＧＩ：２１３８１０８）である。
【図２−２】ＣＤＯのエキソン１のイントロン配列及びエキソン配列を示す。大文字はエキソン配列を示し、太字の小文字はイントロン配列を示す。行の数字は、コードのその行の第１の塩基の位置である。National Center for Biotechnology Information（www.ncbi.nlm.nih.gov）からＣＤＯ配列を得た。ＣＤＯのアクセッション番号は、Ｕ６０２３２（Ｕ６０２３２．１、ＧＩ：２１３８１０８）である。
【図３−１】ＣＤＯエキソン２（パートＡ）、エキソン３（パートＢ）及びエキソン４（パートＣ）の増幅のために設計されたプライマーの第１の組を示す線図である。プライマー領域は小文字で示され、そして太字でなく、下線が施され、プライマーからの合成の方向を示す矢印に隣接する。
【図３−２】エキソン１（パートＤ）の増幅のために設計されたプライマーの第１の組を示す線図である。プライマー領域は小文字で示され、そして太字でなく、下線が施され、プライマーからの合成の方向を示す矢印に隣接する。２つの異なるエキソン１リバースプライマーが示されている。代替的エキソン１リバースプライマー（配列番号１７）とエキソン１のプライマー結合（即ち標的）領域との間に単一ヌクレオチド差が認められる。
【図４】タッチダウンＰＣＲ産物のゲル画像を示す。レーン（画像の左から数える）：（１）対照エキソン４、（２）対照エキソン３、（３）対照エキソン２、（４）ＤＮＡラダー。
【図５】反応においてＤＭＳＯの添加とともに対照鋳型を用いたＰＣＲ産物のゲル画像を示す。エキソン２、３及び４が観察される（円内）。エキソン１のＰＣＲ増幅中は、ＤＭＳＯを用いなかった（示されていない）。
【図６】以下を示す図である：      Ａ）対照ＰＣＲ反応のマグネシウム勾配シリーズ。レーン（左から数える）（１）Ｅ４、［ＭｇＣｌ2］４；（２）Ｅ３、［ＭｇＣｌ2］４；（３）Ｅ２、［ＭｇＣｌ2］４；（４）Ｅ４、［ＭｇＣｌ2］３；（５）Ｅ３、［ＭｇＣｌ2］３；（６）Ｅ２、［ＭｇＣｌ2］２；（７）Ｅ４、［ＭｇＣｌ2］２；（８）Ｅ３、［ＭｇＣｌ2］２；（９）Ｅ２、［ＭｇＣｌ2］２；（１０）ラダー。      Ｂ）関節リウマチ鋳型ＰＣＲ反応（ＤＭＳＯを含む）のマグネシウム勾配シリーズ。レーン：（１）Ｅ４、［ＭｇＣｌ2］４；（２）Ｅ３、［ＭｇＣｌ2］４；（３）Ｅ２、［ＭｇＣｌ2］４；（４）Ｅ４、［ＭｇＣｌ2］３；（５）Ｅ３、［ＭｇＣｌ2］３；（６）Ｅ２、［ＭｇＣｌ2］３；（７）Ｅ４、［ＭｇＣｌ2］２；（８）Ｅ３、［ＭｇＣｌ2］２；（９）Ｅ２、［ＭｇＣｌ2］２；（１０）Ｅ４、［ＭｇＣｌ2］１；（１１）Ｅ３、［ＭｇＣｌ2］１；（１２）Ｅ２、［ＭｇＣｌ2］１；（１３）ラダー。  これらの図において、エキソンはＥ２（エキソン２）、Ｅ３（エキソン３）及びＥ４（エキソン４）により識別され、用いられるＭｇＣｌ2の体積はマイクロリットルで示される。例えば、レーン（１）は、４μｌのＭｇＣｌ2の存在下で増幅されたエキソン４を示す。
【図７】タッチダウンＰＣＲからのＰＣＲ産物のゲル画像を示す。対照及びＲＡ  ＤＮＡの両方からのエキソンはすべて、首尾よく増幅された。
【図８】例として、共にＲＡエキソン３からの２つのシークエンシング結果の比較を示す。（Ａ）精製結果のＰＣＲ産物、不良な配列、二重シグナル、多数の「Ｎ」（不明確なヌクレオチド）、（Ｂ）ゲル抽出結果、良好な配列、並びに明確な塩基位置。
【図９】多型がアミノ酸置換に及ぼすと予測される影響を示す。すべての考え得るＳＮＰが含まれており（第３表参照）、したがって図示された影響はそれらがｉｎ  ｖｉｖｏで起こるより顕著である。太矢印で示された遺伝子座は、置換ＳＮＰを示す。細い方の矢印は付加的ＳＮＰを示す。下線は正常（対照）配列と異なるアミノ酸配列を示す。（Ａ）エキソン２多型、（Ｂ）エキソン３多型、（Ｃ）エキソン４多型。
【図１０】篩い分けされたＳＮＰ分析を示す。エキソン３はアミノ酸配列における変化の大きな低減を示し、一方、エキソン４は、ＳＮＰの数の低減にもかかわらず、非常に高レベルのアミノ酸破壊を保持する。
【図１１】エキソン１のＰＣＲ産物のゲル画像を示す。レーン１：ＤＮＡラダー、レーン２〜７：エキソン１、レーン８：陽性対照。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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