(57)【要約】本発明は、ＲＳウイルスおよびトリインフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１株を含む）を含む、呼吸性ウイルス感染におけるウイルス複製に干渉するｓｉＲＮＡ組成物を、提供する。本発明は、呼吸性ウイルス感染細胞におけるウイルス遺伝子の発現を阻害するためのｓｉＲＮＡ組成物の使用、および被験体における呼吸性ウイルス感染の処置における使用のためのｓｉＲＮＡ組成物の使用を、さらに提供する。一般に本発明は、ＲＳウイルスもしくはインフルエンザＡウイルスのゲノムを標的化する１５〜３０塩基の第１のヌクレオチド配列、その相補体、二本鎖ポリヌクレオチドもしくはヘアピンポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。さらに、本発明は、ｓｉＲＮＡ配列を含むベクター、細胞および薬学的組成物を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
長さが２００ヌクレオチドもしくはそれより少ないヌクレオチドである、単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、第１のヌクレオチド配列を含み、該第１のヌクレオチド配列は、ＲＳウイルスもしくはインフルエンザＡウイルスのゲノムを標的化し、ここで任意のＴ（チミジン）もしくは任意のＵ（ウリジン）は、必要に応じて他と置換され得、そしてここで、該第１のヌクレオチド配列は、
（ａ）長さが１５〜３０個の任意の数のヌクレオチドである配列、または
（ｂ）（ａ）に記載の配列の相補体
からなる、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記第１のヌクレオチド配列からループ配列によって分離される第２のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、該第２のヌクレオチド配列は、
（ａ）該第１のヌクレオチド配列と実質的に同一な長さを有し、かつ
（ｂ）該第１のヌクレオチド配列に対して実質的に相補的である、
ポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のポリヌクレオチドであって、前記第１のヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１〜２６３から選択される配列、
（ｂ）項目（ａ）に記載の配列より長い標的性配列であって、ここで該標的性配列は、呼吸性ウイルスのゲノムを標的化し、そして配列番号１〜２６３から選択される配列を含む、標的性配列、
（ｃ）配列番号１〜２６３から選択される配列のフラグメントであって、該フラグメントは、少なくとも１５ヌクレオチド長でありかつ該選択される配列より長くとも１塩基短い長さである、連続する塩基の配列からなる、フラグメント
（ｄ）５ヌクレオチドまでが、配列番号１〜２６３から選択される配列とは異なる配列、または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）に記載の配列の相補体
からなる、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１もしくは請求項２に記載のポリヌクレオチドであって、前記第１のヌクレオチド配列の長さが、２１〜２５個の任意の数のヌクレオチドである、ポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１〜２６３から選択される配列からなる、請求項１もしくは請求項２に記載のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、該選択される配列の３’に結合するジヌクレオチドオーバーハングを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１もしくは請求項２に記載のポリヌクレオチドであって、ここで前記第１のヌクレオチド配列の３’末端におけるジヌクレオチド配列は、ＴＴ、ＴＵ、ＵＴ、もしくはＵＵであり、そしてここで、該ジヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはその両方を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１もしくは請求項２に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである、ポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１もしくは請求項２に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、ＲＮＡである、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１もしくは請求項２に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１に記載の第１のポリヌクレオチド鎖、および少なくとも該第１のポリヌクレオチド鎖の該第１のヌクレオチド配列に対して相補的でありかつ該配列にハイブリダイズされる第２のポリヌクレオチド鎖を含む、二本鎖ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１、請求項２またはその両方に記載の複数の標的性ポリヌクレオチドを含む組み合わせであって、ここで、各ポリヌクレオチドは、前記標的ウイルスのゲノムにおける異なった配列を標的化する、組み合わせ。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１４】
請求項１２もしくは請求項１３に記載のベクターであって、該ベクターは、プラスミド、組換えウイルス、トランスポゾン、もしくは微小染色体である、ベクター。
【請求項１５】
１種もしくはそれより多くの請求項１に記載のポリヌクレオチドによってトランスフェクトされた細胞。
【請求項１６】
１種もしくはそれより多くの請求項２に記載のポリヌクレオチドによってトランスフェクトされた細胞。
【請求項１７】
１種もしくはそれより多くの請求項１もしくは請求項２に記載のポリヌクレオチド、またはこれらの混合物、ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物であって、各ポリヌクレオチドは、前記標的ウイルスのゲノムにおける異なった配列を標的化する、薬学的組成物。
【請求項１８】
１種もしくはそれより多くの請求項１２もしくは請求項１３に記載のベクターまたはその混合物、ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物であって、各ベクターは、前記標的ウイルスのゲノムにおける異なった配列を標的化するポリヌクレオチドを保有する、薬学的組成物。
【請求項１９】
請求項１７もしくは請求項１８に記載の薬学的組成物であって、前記キャリアは、合成ポリマー、リポソーム、デキストロース、界面活性剤、またはこれらの任意の２種またはそれより多くの組み合わせを含む、薬学的組成物。
【請求項２０】
ＲＳウイルスもしくはインフルエンザＡウイルスのゲノムを標的化する配列を有する請求項１もしくは請求項２に記載のポリヌクレオチドを合成する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）反応性末端を含み、かつ該配列の第１の末端におけるヌクレオチドに対応する、ヌクレオチド試薬を提供する工程、
（ｂ）反応性末端を含みかつ該配列の後に続く位置に対応する、さらなるヌクレオチド試薬を添加して、該工程（ａ）の該反応性末端と反応させ、そして伸長中の該ポリヌクレオチド配列の長さを１ヌクレオチド増加させる工程、ならびに所望されない産物および過剰な試薬を除去する工程、ならびに
（ｃ）該配列の第２の末端におけるヌクレオチドに対応する該ヌクレオチド試薬が添加され、それによって完全なポリヌクレオチドが提供されるまで、工程（ｂ）を繰り返す工程
を、包含する、方法。
【請求項２１】
細胞を、ＲＮＡインヒビターによってトランスフェクトする方法であって、該方法は、該細胞を、１種もしくはそれより多くの請求項１に記載のポリヌクレオチドを含有する組成物と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２２】
前記細胞は、前記１種もしくはそれより多くのポリヌクレオチドによって標的化される呼吸性ウイルスを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞を、ＲＮＡインヒビターによってトランスフェクトする方法であって、該方法は、該細胞を、１種もしくはそれより多くの請求項２に記載のポリヌクレオチドを含有する組成物と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２４】
前記細胞は、前記１種もしくはそれより多くのポリヌクレオチドによって標的化される呼吸性ウイルスを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
呼吸性ウイルスに感染した細胞における該ウイルスの複製を阻害する方法であって、該方法は、該細胞を、１種もしくはそれより多くの請求項１に記載のポリヌクレオチドを含有する組成物と接触させる工程を包含し、ここで、該１種もしくはそれより多くのポリヌクレオチドは、該ウイルスを標的化する、方法。
【請求項２６】
呼吸性ウイルスに感染した細胞における該ウイルスの複製を阻害する方法であって、該細胞を、１種もしくはそれより多くの請求項２に記載のポリヌクレオチドを含有する組成物と接触させる工程を包含し、ここで、該１種もしくはそれより多くのポリヌクレオチドは、該ウイルスを標的化する、方法。
【請求項２７】
被験体における呼吸性ウイルスに起因する感染を処置するために有効な薬学的組成物の製造における、該呼吸性ウイルスを標的化する、請求項１に記載のポリヌクレオチドの使用、または２種もしくはそれより多くの該ポリヌクレオチドの混合物の使用。
【請求項２８】
前記被験体は、ヒトである、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
被験体における呼吸性ウイルスに起因する感染を処置するために有効な薬学的組成物の製造における、該呼吸性ウイルスを標的化する、請求項２に記載のポリヌクレオチドの使用、または２種もしくはそれより多くの該ポリヌクレオチドの混合物の使用。
【請求項３０】
前記被験体は、ヒトである、請求項２９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、呼吸性ウイルス感染（特にＲＳウイルスおよびトリインフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１株を含む））におけるウイルス複製に干渉するｓｉＲＮＡ組成物に関連する。本発明は、呼吸性ウイルス感染細胞におけるウイルス遺伝子の発現を阻害するためのｓｉＲＮＡ組成物の使用、および被験体における呼吸性ウイルス感染の処置における使用のためのｓｉＲＮＡ組成物の使用に、さらに関連する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
呼吸性ウイルス感染は、何世紀にもわたって、ヒトの健康および生命に対する重大な脅威であった。悪名高いエピソードとしては、インフルエンザ株、ＲＳウイルス、および重症急性呼吸性症候群（ＳＡＲＳ）によって引き起こされる感染が挙げられる。これらは、世界中で約２〜４千万人の人々を殺傷した１９１８年の世界的なインフルエンザ汎流行を含む。より近年の年代に、他のインフルエンザ汎流行もまた、存在した。ＳＡＲＳは、２００２年に発生し、およそ８００人を犠牲にした（２）。
【０００３】
（ＲＳウイルス）
ＲＳウイルス（ＲＳＶ）感染は、深刻な汎流行性の気道疾患の主要な原因である。約３分の２の乳児が、人生の最初の１年間にＲＳＶに感染し、そして約１００％が２歳までに感染している。現在、ＲＳＶ感染を処置するために利用可能である、特定かつ有効な治療薬は存在しない。
【０００４】
ＲＳウイルス（ＲＳＶ）は、エンベロープを有する（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）、非セグメント化一本鎖ネガティブＲＮＡウイルス（ＮＮＲ）であり、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒａｄａｅ）モノネガウイルス（ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓｅｓ）属に属する（１４、２９）。パラミクソウイルスは、以下の特徴を共有する。１）これらは、ウイルスヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）によってしっかりと被包されている一本鎖ＲＮＡゲノムを有する（２９、３０）。２）サブゲノムｍＲＮＡは、ＲｄＲＰによって正常なゲノムから転写される。３）ウイルス複製は、宿主細胞の細胞質において起こる。感染から子孫ビリオンの放出までのＲＳＶ生活環の詳細は、よく研究されている（１５）。
【０００５】
ＲＳＶゲノムは、３’−ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、Ｆ、Ｍ２、Ｌ−５’の遺伝子を含む１５．５ｋｂ長の、ネガティブ鎖である（図１を参照）．これらの７つの遺伝子の産物（すなわち、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、Ｆ、およびＬ）は、他のパラミクソウイルス３と共通している。いくつかのウイルス因子もしくは宿主因子は、ＲＮＡ転写および複製の調節に関与する（２０）。さらに、ｍＲＮＡの転写およびＲＮＡ複製において調節的な役割を果たすウイルスのシス作動性シグナルが存在する（３）。
【０００６】
ＲＳＶ感染の潜伏期は、約４〜５日間である。ＲＳＶは、まず鼻咽頭に影響を及ぼし、次いで、数日のうちに、気管支および細気管支に達し、感染は呼吸器上皮の表面層に限られる。
【０００７】
（インフルエンザＡ）
１９９７年の初めに、トリインフルエンザＡの新型株であるＨ５Ｎ１が出現した。ほぼトリ（野生集団および家禽の両方）に限定されていたが、このウイルスは、感染したトリに直接的に接触したヒトにのみ感染するようであった。ヒトにおいて、感染は深刻な疾患を引き起こし、ヒトにおいて重症の呼吸性疾病および死をもたらす（３〜１２）。多くの症例および発生が、東南アジアの種々の国において起こった。このトリウイルスのヒトに感染する能力を考慮すると、接触感染性ヒト改変体への突然変異の増大した危険性が存在し、この突然変異は、効率的かつ継続的なヒトからヒトへの伝播による新型インフルエンザ汎流行の出現ならびに大勢の死の危険をもたらす。
【０００８】
トリインフルエンザＨ５Ｎ１は、肺炎に関連する新しく出現した感染性因子であるので、その病理学およびメカニズムがあまり明らかになっておらず、ヒト疾患症例におけるＨ５Ｎ１トリインフルエンザのための特定かつ有効な処置は存在しない。現在、インフルエンザ感染は、２種の（ノイラミニダーゼインヒビターのクラスの）薬物のような抗ウイルス薬：オセルタミビル（市場ではタミフルとして知られる）およびザナミビル（市場ではリレンザとして知られる）、またはより旧式なＭ２インヒビターであるアマンタジンおよびリマンタジンによって処置される。
【０００９】
Ｈ５Ｎ１は、インフルエンザウイルスＡ型のサブタイプである。このウイルスは、エンベロープを有し、フラグメント化された、ネガティブ一本鎖ＲＮＡウイルスであるので、オルトミクソウイルス科に属する。インフルエンザＡウイルス（Ｈ５Ｎ１を含む）の生活環の間、ウイルスゲノムＲＮＡ（ｖＲＮＡ）は、相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）産生のためのテンプレートとして働き、このｃＲＮＡはまた、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）産生のためのテンプレートとして働く。ウイルス複製の間に生じるＲＮＡ分子のこれらの３つの形態の各々は、全て、センスｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスｓｉＲＮＡのいずれかを用いて、ｓｉＲＮＡ媒介型分解のために標的化され得る。インフルエンザＡゲノム（８個の分離したＲＮＡセグメントからなり、少なくとも１０個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む）は、ウイルスゲノム複製およびサブゲノムのｍＲＮＡ合成もしくは遺伝子指向型ｍＲＮＡ合成の両方のためのテンプレートとして働く。図２は、インフルエンザＡビリオンの構造を表す概略図を示す。ポリメラーゼＰＢ２、ＰＢ１（ポリメラーゼ塩基性タンパク質１およびポリメラーゼ塩基性タンパク質２）ならびにＰＡ（ポリメラーゼ酸性タンパク質）は、それぞれＲＮＡ１、ＲＮＡ２およびＲＮＡ３によってコードされていた。４種のウイルス構造タンパク質である、Ｈ（血球凝集素）、Ｎ（ノイラミニダーゼ）、Ｍ１およびＭ２（マトリックスタンパク質１およびマトリックスタンパク質２）は、それぞれ、ＲＮＡセグメント４、ＲＮＡセグメント６およびＲＮＡセグメント７によってコードされ、一方、ＲＮＡ５は、ＮＰ（ヌクレオカプシドタンパク質）をコードし、そしてＲＮＡ８は、ＮＳ１およびＮＳ２（非構造タンパク質１および非構造タンパク質２）をコードする。
【００１０】
（ＲＮＡ干渉）
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、配列特異的ＲＮＡ分解プロセスであり、理論的に任意の遺伝子を、ノックダウンするかまたはサイレンシングするための、比較的容易かつ直接的な方法を提供する（１７、１８、１９）。天然に存在するＲＮＡ干渉において、二本鎖ＲＮＡは、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ／ヘリカーゼタンパク質であるＤｉｃｅｒによって、低分子干渉（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子へと切断される。このｓｉＲＮＡ分子は、２ヌクレオチド（ｎｔ）オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を３’末端において有する、１９〜２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡである。これらのｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ：ＲＩＳＣ）と呼ばれる多成分リボヌクレアーゼ内に組み込まれる。ｓｉＲＮＡの一本の鎖は、ＲＩＳＣに結合したままであり、この複合体を同族の（ｃｏｇｎａｔｅ）ＲＮＡへと導き、この同族のＲＮＡは、ＲＩＳＣ中のこのガイド因子（ｇｕｉｄｅｒ）ｓｓ−ｓｉＲＮＡに対して相補的である配列を有する。このｓｉＲＮＡ指向型エンドヌクレアーゼは、このＲＮＡを消化し、それによってこのＲＮＡを不活性化する。近年の研究は、化学的に合成された２１〜２５−ｎｔ  ｓｉＲＮＡの使用は、哺乳動物細胞においてＲＮＡｉの作用を示すことを明らかにし（２０）、そしてｓｉＲＮＡハイブリダイゼーションの（末端におけるかもしくは中央部における）熱力学的安定性は、分子の機能を決定する際に中枢的な役割を果たすことを明らかにしている（２１、２２）。これらならびにＲＩＳＣ、ｓｉＲＮＡ分子およびＲＮＡｉの他の特徴は、記載されている（２３〜２８）。
【００１１】
哺乳動物細胞におけるＲＮＡｉの、研究室における用途、または潜在的に、治療用途は、化学的に合成されたｓｉＲＮＡもしくは内因的に発現された分子のいずれかを使用する（非特許文献１（２）、非特許文献２（２１））。内因性ｓｉＲＮＡは、最初に低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）として、発現ベクター（プラスミドもしくはウイルスベクター）によって発現され、次いで、ＤｉｃｅｒによってｓｉＲＮＡへとプロセシングされる。ｓｉＲＮＡは、特にウイルス感染によって引き起こされるヒト疾患のための治療薬であるという非常な有望性を有すると考えられる（非特許文献３（１９）、非特許文献４（２０）、２７〜３０）。
【００１２】
重要なことには、現在、ウイルスゲノム配列（例えば、約１６〜３０塩基対のオリゴヌクレオチド）を標的化する可能性のある多くの潜在的候補ｓｉＲＮＡ配列のうちのどれが、実際に有効なｓｉＲＮＡ活性を示すかは、いかなる程度の確信をもって予測することも不可能である。その代わり、個々の特異的候補ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列もしくは特異的候補ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド配列は、標的化された遺伝子の発現の意図される干渉が起こるか否かを決定するために、作製されそして試験されなければならない。したがって、所定のｍＲＮＡの発現の特異的な改変を可能にするｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを、確信を持って設計するための慣用的方法は、当該分野に存在しない。
【非特許文献１】Ａｂｂｏｔ，Ａ．Ｎａｔｕｒｅ（２００３）４２４：１２１〜１２３
【非特許文献２】Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ａ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００４）２２：３２６〜３３０
【非特許文献３】Ｓｃｈｉｗａｒｚ，Ｄ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ（２００３）１１５：１９９〜２０８
【非特許文献４】Ｋｈｖｏｒｏｖａ，Ａ．ら、Ｃｅｌｌ（２００３）１１５：２０９〜２１６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ウイルス病原体遺伝子およびその同族タンパク質産物の発現を阻害する組成物および方法についての、非常な需要が存在し続けている。特に、ウイルス感染した細胞における病原性呼吸性ウイルス遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法、ならびに被験体における呼吸性ウイルス感染を処置するための組成物および方法についての、差し迫った需要が存在する。さらに、ＲＳＶおよびトリインフルエンザＡ（特にＨ５Ｎ１株）による感染に取り組む組成物および方法についての需要が、さらに存在する。非常に有効で、かつ公知の抗ウイルス剤の使用もしくは公知の抗ウイルス剤の改変に依存しない処置のための組成物および方法についての需要が、さらに存在する。本発明は、これらおよびこれらと関連する需要に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、ウイルス病原体（例えば、インフルエンザＡ  Ｈ５Ｎ１およびＲＳＶを含む、呼吸性ウイルス感染を引き起こすウイルス病原体）のウイルスＲＮＡ分子の破壊を通して、ウイルス感染および複製を阻害するための、ＲＮＡ干渉の使用に関連する組成物および方法を提供する。これらのウイルスは、ヒトおよび他の哺乳動物において重症の呼吸性疾患を引き起こす病原体である。ウイルス複製の阻害は、このウイルスに感染した培養細胞ならびにこのウイルスに感染した被験体において、ウイルス感染と戦う。このウイルス複製の阻害は、その症状の軽減を含む。
【００１５】
第１の局面において、本発明は、長さが２００以下かつ１５以上の任意の数のヌクレオチドであり得る単離されたポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは、吸性合胞体ウイルスもしくはインフルエンザＡウイルスのゲノムを標的化する第１のヌクレオチド配列を含む。このポリヌクレオチドにおいて、任意のＴ（チミジン）もしくは任意のＵ（ウリジン）は、必要に応じて他と置換され得る。さらに、このポリヌクレオチドにおいて、第１のヌクレオチド配列は、（ａ）長さが１５〜３０の任意の数のヌクレオチドである配列、または（ｂ）（ａ）において与えられた配列の相補体からなる。このようなポリヌクレオチドは、本明細書中で、直鎖状ポリヌクレオチドと呼ばれ得る。
【００１６】
本発明の関連の局面において、上記のポリヌクレオチドは、ループ配列によって第１のヌクレオチド配列から分離される第２のヌクレオチド配列をさらに含み、この第２のヌクレオチド配列は、
（ａ）第１のヌクレオチド配列と実質的に同一の長さを有し、かつ
（ｂ）第１のヌクレオチド配列に対し実質的に相補的である。この後者の構造（ヘアピンポリヌクレオチドと呼ばれる）において、上記第１のヌクレオチド配列は、上記第２のヌクレオチド配列とハイブリダイズして、その相補的配列が、上記ループ配列によって連結されている、ヘアピンを形成する。
【００１７】
上記直鎖状ポリヌクレオチドの多くの実施形態およびこのヘアピンポリヌクレオチドの多くの実施形態において、上記第１のヌクレオチド配列は、以下のいずれかである：
（ａ）配列番号１〜２６３から選択される配列、
（ｂ）項目（ａ）において与えられた配列より長い標的性（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）配列であって、この標的性配列は、呼吸性ウイルスのゲノムを標的化し、かつ配列番号１〜２６３から選択される配列を含む、
（ｃ）配列番号１〜２６３から選択される配列のフラグメントであって、このフラグメントは、少なくとも１５ヌクレオチドの長さでありかつこの選択される配列より長くとも１塩基短い、連続する塩基の配列からなる、フラグメント、
（ｄ）配列番号１〜２６３から選択される配列と５ヌクレオチドまで異なる配列、または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）において与えられた任意の配列の相補体。
【００１８】
直鎖状ポリヌクレオチドもしくはヘアピンポリヌクレオチドの種々の実施形態において、上記第１のヌクレオチド配列の長さは、２１〜２５の任意の数のヌクレオチドである。多くの実施形態において、直鎖状ポリヌクレオチドもしくはヘアピンポリヌクレオチドは、配列番号１〜２６３から選択される配列からなり、そして必要に応じて、この選択される配列の３’に結合するジヌクレオチドオーバーハングを含む。直鎖状ポリヌクレオチドもしくはヘアピンポリヌクレオチドのなおさらなる実施形態において、この第１のヌクレオチド配列の３’末端におけるジヌクレオチド配列は、ＴＴ、ＴＵ、ＵＴ、もしくはＵＵであり、そしてリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、または両方を含む。種々のさらなる実施形態において、直鎖状ポリヌクレオチドもしくはヘアピンポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもよく、またはこれはＲＮＡであってもよく、あるいはこれはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方から構成されてもよい。
【００１９】
さらなる局面において、本発明は、二本鎖ポリヌクレオチドを提供する。この二本鎖ポリヌクレオチドは、請求項１に記載の第１のポリヌクレオチド鎖および少なくともこの第１の鎖のこの第１のヌクレオチド配列に対して相補的でありかつこれにハイブリダイズして二本鎖組成物を形成する第２のポリヌクレオチド鎖を含む。これらのポリヌクレオチド構造もまた、直鎖状ポリヌクレオチドと呼ばれ得る。
【００２０】
なおさらなる局面において、本発明は、請求項１、請求項２もしくは両方に記載の２つもしくはそれより多くの標的性ポリヌクレオチドを含む組み合わせであって、この組み合わせの各ポリヌクレオチドは、標的ウイルスのゲノムにおける異なる配列を標的化する組み合わせを提供する。
【００２１】
呼吸性ウイルス病原体標的に対する高い程度の類似性および同一性に起因して、そして理論に縛られることを望まないが、ウイルスに感染した細胞内への導入の際に、このポリヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉を誘導し、病原体ゲノムＲＮＡ、相補的ＲＮＡおよび伝令ＲＮＡの消化をもたらす。特に、本発明のこれらの局面の重要な実施形態において、これらのポリヌクレオチドにおける第１のヌクレオチド配列もしくはその相補体は、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成し、このＲＩＳＣは、上記ポリヌクレオチドｓｉＲＮＡ配列を病原体ゲノムＲＮＡ配列に誘導し、それによって病原体ゲノムＲＮＡの切断を促進すると考えられる。
【００２２】
さらなる局面において、本発明は、本発明の直鎖状ポリヌクレオチドもしくはヘアピンポリヌクレオチドによって与えられる配列を有するベクターを提供する。種々の実施形態において、これらのベクターのいずれかは、プラスミド、組換えウイルス、トランスポゾン、もしくは微小染色体であり得る。なおさらなる局面は、本発明の１種もしくはそれより多くの直鎖状ポリヌクレオチド、または本発明の１種もしくはそれより多くのヘアピンポリヌクレオチドによってトランスフェクトされた細胞を提供する。
【００２３】
なおさらなる局面において、本発明は、１種もしくはそれより多くの直鎖状ポリヌクレオチドもしくはヘアピンポリヌクレオチドまたはそれらの混合物、ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物を提供し、ここで、各ポリヌクレオチドは、標的ウイルスのゲノムにおける異なる配列を標的化する。
【００２４】
なおさらなる局面において、本発明は、直鎖状ポリヌクレオチドを有する１種もしくはそれより多くのベクター、またはヘアピンポリヌクレオチドを有するベクター、あるいはそれらの混合物、ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物を提供し、ここで、各ベクターは、標的ウイルスのゲノムにおける異なる配列を標的化するポリヌクレオチドを有する。
【００２５】
薬学的組成物の種々の実施形態において、このキャリアとしては、合成カチオン性ポリマー、リポソーム、デキストロース、界面活性剤、またはこれらの任意の２種もしくはそれより多くの組み合わせが挙げられる。
【００２６】
なおさらなる局面において、本発明は、ＲＳウイルスもしくはインフルエンザＡウイルスのゲノムを標的化する配列を有する直鎖状ポリヌクレオチドもしくはヘアピンポリヌクレオチドを合成する方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）反応性末端（ｌｉｖｅ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｅｎｄ）を含みかつこの配列の第１の末端におけるヌクレオチドに対応するヌクレオチド試薬を提供する工程；
（ｂ）反応性末端を含みかつ該配列の後に続く位置に対応する、さらなるヌクレオチド試薬を添加して、上記工程（ａ）の反応性末端と反応させ、そして伸長中のポリヌクレオチド配列の長さを１ヌクレオチド増加させる工程、ならびに所望されない産物および過剰な試薬を除去する工程、ならびに
（ｃ）上記配列の第２の末端におけるヌクレオチドに対応する上記ヌクレオチド試薬が添加され、それによって完全なポリヌクレオチドが提供されるまで、工程（ｂ）を繰り返す工程。
【００２７】
なおさらなる局面において、本発明は、ＲＮＡインヒビターによって細胞をトランスフェクトするための方法を提供し、ここで、この方法は、この細胞を、１種もしくはそれより多くの直鎖状ポリヌクレオチド、または１種もしくはそれより多くのヘアピンポリヌクレオチドを含有する組成物と接触させる工程を包含する。多くの実施形態において、このようにトランスフェクトされる細胞としては、１種もしくはそれより多くのポリヌクレオチドによって標的化される呼吸性ウイルスが挙げられる。
【００２８】
なおさらなる局面において、本発明は、呼吸性ウイルスに感染した細胞におけるこのウイルスの複製を阻害する方法を提供し、この方法は、この細胞を、１種もしくはそれより多くの直鎖状ポリヌクレオチド、または１種もしくはそれより多くのヘアピンポリヌクレオチドを含有する組成物と接触させる工程を包含し、ここで、この１種もしくはそれより多くのポリヌクレオチドは、このウイルスを標的化する。
【００２９】
なおさらなる局面において、本発明は、被験体における呼吸性ウイルスに起因する感染を処置するために有効な薬学的組成物の製造における、この呼吸性ウイルスを標的化する直鎖状ポリヌクレオチドもしくはこれらの２種もしくはそれより多くの混合物の使用、またはこの呼吸性ウイルスを標的化するヘアピンポリヌクレオチドもしくはこれらの２種もしくはそれより多くの混合物の使用を提供する。この使用の種々の実施形態において、この被験体は、ヒトである。
【００３０】
なおさらなる局面において、本発明は、被験体における呼吸性ウイルスに起因する感染を処置する方法を提供する。この方法は、呼吸性ウイルスを標的化する直鎖状ポリヌクレオチドもしくはこれらの２種もしくはそれより多くの混合物の有効用量、または呼吸性ウイルスを標的化するヘアピンポリヌクレオチドもしくはこれらの２種もしくはそれより多くの混合物の有効用量を、この被験体に投与する工程を包含する。この方法の種々の実施形態において、この被験体は、ヒトである。さらなる実施形態において、直鎖状ポリヌクレオチドおよびヘアピンポリヌクレオチドの両方が、この被験体に投与される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で記載された全ての特許、特許出願公開、および特許公報は、その全体が、本明細書中で逐語的に示されたのと同様に参考として援用される。本明細書中で記載された全ての技術的刊行物もまた、参考として援用される。
【００３２】
本明細書中で、冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、単数形もしくは複数形として、同等の意味を表す。これらの冠詞についての特定の意味は、これらが使用される文脈から明らかである。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「標的」配列ならびに類似の用語および語句は、本発明のポリヌクレオチドが指向される病原体のゲノムにおいて存在するヌクレオチド配列をいう。ポリヌクレオチドは、病原体配列を、（ａ）この病原体のゲノム内に含まれる特定の下位配列（標的配列と呼ばれる）に対し相同であるかもしくは同一である配列を含むこと、または（ｂ）相補体が標的配列と相同であるかもしくは同一である配列を含むことのいずれかによって、標的化する。病原体配列を標的化する任意のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉現象にしたがって標的配列とハイブリダイズする能力を有し、それによってＲＮＡ干渉を開始する。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「相補体」、「相補性」、ならびに類似の用語および語句は、塩基が、塩基対塩基で、相補的塩基対を形成する２つの配列に関連し、生物化学、分子生物学、遺伝学および本発明の分野に関する類似の分野のような分野における当業者によって従来理解される通りである。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、第１の配列もしくは下位配列が、第２の配列もしくは下位配列と、この配列もしくは下位配列の全ての位置において同じ塩基を有する場合、第１の配列もしくは下位配列は、第２の配列もしくは下位配列と「同一である」か、「１００％の同一性」を有するか、または１００％同一性の概念を伝達する用語もしくは語句によって記載される。同一性の決定において、Ｔ（チミジン）もしくはその任意の誘導体またはＵ（ウリジン）もしくはその任意の誘導体を含む任意の特定の塩基位置は、互いに同等であり、したがって同一であるとみなされる。
【００３６】
本明細書中で記載される場合、標的性ポリヌクレオチドの配列、またはその相補体は、標的配列に対して完全に同一であってもよく、またはこれは、標的配列における特定の位置において不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ）な塩基を含んでもよい。ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）の組み込みは、本明細書中で完全に記載される。理論に縛られることを望まないが、ミスマッチの組み込みは、目的の特定の標的配列のためのＲＮＡ干渉現象を最適化する生理学的条件下での、意図される程度のハイブリダイゼーションの安定性を提供する。同一性の程度は、２つの配列における塩基が互いに同一である位置の百分率を決定する。「配列同一性の百分率」は、最適に並べられた２つの配列を、比較の領域にわたって比較し、両配列において同一な核酸塩基（例えば、核酸の場合、Ａ、ＴもしくはＵ、Ｃ、Ｇ、またはＩ）が存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得、この一致した位置の数を比較の領域内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で割り、そしてその結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を得ることによって、計算される。互いに１００％未満同一である配列は、互いに「類似する」かもしくは「相同である」；相同性の程度もしくは同一性百分率は、以下の節において決定されるような２つの配列もしくは下位配列の間の同一性の百分率を意味する、類義語である。例えば、互いに、少なくとも６０％の同一性、もしくは好ましくは少なくとも６５％の同一性、もしくは好ましくは少なくとも７０％の同一性、もしくは好ましくは少なくとも７５％の同一性、もしくは好ましくは少なくとも８０％の同一性、もしくはより好ましくは少なくとも８５％の同一性、もしくはより好ましくは少なくとも９０％の同一性、もしくはなおより好ましくは少なくとも９５％の同一性を示す、２つの配列は、互いに「類似である」かもしくは「相同である」。あるいは、ｓｉＲＮＡ分子のオリゴヌクレオチド配列に関して、５もしくはそれ未満の塩基、または４もしくはそれ未満の塩基、または３もしくはそれ未満の塩基、または２もしくはそれ未満の塩基、または１塩基が異なる２つの配列は、互いに「類似である」かもしくは「相同である」。
【００３７】
「同一性」は、当該分野で公知であるように、２つもしくはそれより多くのポリペプチド配列もしくは２つもしくはそれより多くのポリヌクレオチド配列の間の関連であり、配列を比較することによって決定される。当該分野では、「同一性」はまた、場合によって、ポリペプチド配列もしくはポリヌクレオチド配列の間の配列の、このような配列の鎖（ｓｔｒｉｎｇ）の間のマッチ（ｍａｔｃｈ）によって決定される関連性の程度をも意味する。「同一性」および「類似性」は、公知の方法によって容易に計算され得る。これらの方法としては、以下に記載される方法が挙げられるが、これらに限定されない：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ．Ａ．Ｍ．，編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，編Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，編，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；ならびにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．（１９８８）４８：１０７３。同一性を決定する好ましい方法は、試験される配列の間の最大のマッチを与えるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、公に利用可能なコンピュータープログラムにおいてまとめられている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｃｕｘ，Ｊ．，ら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の供給源から、公に利用可能である（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ら，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用され得る。
【００３８】
配列比較のためのパラメータとしては、以下が挙げられる：アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）。
【００３９】
比較マトリックス：ＨｅｎｔｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｔｉｋｏｆｆ，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０９１５−１０９１９からのＢＬＯＳＳＵＭ６２。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「単離された」、および類似の語は、核酸、ポリヌクレオチド、もしくはオリゴヌクレオチドを記載するために使用される場合、その天然の状態もしくは元の状態から取り出されることをいう。したがって、これらが天然において存在する場合、これらは、その元の環境から取り出されている。これらが合成的に調製された場合、これらは、合成から得られた元の産物混合物から取り出されている。例えば、この用語が本明細書中で使用される場合、天然の状態において生きている生物中に天然に存在している、天然に存在するポリヌクレオチドは、「単離され」ていないが、その天然の状態において共に存在する物質から分離されている同じポリヌクレオチドは、「単離されて」いる。一般に、少なくとも１種の有意な共に存在する物質の除去は、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドの「単離」を構成する。多くの場合、いくつかの、多くの、もしくはほとんどの、共に存在する物質が、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、もしくはオリゴペプチドを単離するために除去され得る。非限定の例として、ポリヌクレオチドに関して、用語「単離された」は、天然に存在する染色体および細胞からこのポリヌクレオチドが分離されることを意味し得る。さらに、例として、タンパク質もしくはポリペプチドの「単離」は、細胞溶解物もしくは細胞ホモジネートにおける別の成分からの分離を意味し得る。
【００４１】
インビトロ合成プロセスもしくは化学合成プロセスの産物である核酸、ポリヌクレオチド、もしくはオリゴヌクレオチドは、合成プロセスの結果として、本質的に単離されている。重要な実施形態において、このような合成産物は、使用される試薬および前駆体、ならびにそのプロセスによる副産物を除去するために処理される。
【００４２】
同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、例えば、処方物、ポリヌクレオチドの細胞への導入のための組成物、化学反応もしくは酵素的反応のための組成物もしくは溶液のような組成物中に存在し得る。これらの組成物は、天然に存在する組成物ではなく、その中に、本明細書中で使用される用語の意味の範囲内である単離されたポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを維持する。
【００４３】
本明細書中および特許請求の範囲において使用される場合、「核酸」もしくは「ポリヌクレオチド」、およびこれらに基づく類似の用語は、天然に存在するヌクレオチドからなるポリマーおよび合成ヌクレオチドもしくは改変ヌクレオチドからなるポリマーをいう。したがって、本明細書中で使用される場合、ＲＮＡであるポリヌクレオチド、もしくはＤＮＡであるポリヌクレオチドは、天然に存在する部分（例えば、天然に存在する塩基およびリボース環もしくはデオキシリボース環）を含み得るか、またはこれらは、以下で記載されるような合成部分もしくは改変部分から構成され得る。ヌクレオチド間の結合は、一般に、３’−５’リン酸結合であり、これは、天然のホスホジエステル結合であっても、ホスホチオエステル結合であっても、なお他の合成的結合であってもよい。改変骨格の例としては、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホルアミデート（３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含む）、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートおよびボラノホスフェートが挙げられる。さらなる結合としては、ホスホトリエステル、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋されたホスホルアミデート、架橋されたメチレンホスホネート、架橋されたホスホロチオエートおよびスルホンのヌクレオチド内結合が挙げられる。他のポリマー性結合としては、これらの２’−５’結合アナログが挙げられる。米国特許第６，５０３，７５４号および同第６，５０６，７３５号ならびにこれらの中に引用されている参考文献（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００４４】
核酸およびポリヌクレオチドは、２０もしくはそれより多くのヌクレオチドの長さ、または３０もしくはそれより多くのヌクレオチドの長さ、または５０もしくはそれより多くのヌクレオチドの長さ、または１００もしくはそれより多いか、または１０００もしくはそれより多いか、または１０，０００もしくはそれより多いか、または１００，０００もしくはそれより多い長さである。ｓｉＲＮＡは、本明細書中で規定されるポリヌクレオチドであり得る。本明細書中で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」およびこれに基づく類似の用語は、直前の段落で記載されるように、天然に存在するヌクレオチドからなる短いポリマー、ならびに合成ヌクレオチドもしくは改変ヌクレオチドからなるポリマーをいう。オリゴヌクレオチドは、１０もしくはそれより多くのヌクレオチドの長さ、または１５、もしくは１６、もしくは１７、もしくは１８、もしくは１９、もしくは２０またはそれより多くのヌクレオチドの長さ、または２１、もしくは２２、もしくは２３、もしくは２４またはそれより多くのヌクレオチドの長さ、または２５、もしくは２６、もしくは２７、もしくは２８もしくは２９、もしくは３０またはそれより多くのヌクレオチドの長さ、３５もしくはそれより多く、４０もしくはそれより多く、４５もしくはそれより多く、約５０までのヌクレオチドの長さであり得る。ｓｉＲＮＡであるオリゴヌクレオチドは、１５と３０との間の任意の数のヌクレオチドを有し得る。多くの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、２１と２５との間の任意の数のヌクレオチドを有し得る。
【００４５】
大きさの範囲の重複ゆえに、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、本発明のｓｉＲＮＡをいうために本明細書中で同じように使用され得ることが、上で示された定義から理解される。
【００４６】
本明細書中および特許請求の範囲において使用される場合、「ヌクレオチド配列」、「オリゴヌクレオチド配列」もしくは「ポリヌクレオチド配列」、および類似の用語は、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが有する塩基の配列と、この配列を有するオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの構造との両方に、相互交換可能に関連する。ヌクレオチド配列もしくはポリヌクレオチド配列は、さらに、任意の天然のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、または任意の合成のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドに関連し、これらのポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドにおいて、塩基の配列は、当該分野で従来使用されるように、塩基を示す文字の特定の配列の記載もしくは言及によって規定される。
【００４７】
オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドにおける塩基は、プリン塩基（アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））ならびにピリミジン塩基（チミジン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ））を含む、「未改変」塩基もしくは「天然」塩基であり得る。さらに、これらは、改変もしくは置換を有する塩基であり得る。本明細書中で使用される場合、改変塩基の非限定の例は、他の合成塩基および天然塩基を含む。これらの塩基は、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミジンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンおよびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミジン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ（特に５−ブロモ）、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−フルオロ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンである。さらなる改変塩基としては、三環式ピリミジン（例えば、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン））、Ｇ−クランプ（ｃｌａｍｐ）（例えば、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’、２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン））が挙げられる。改変塩基はまた、プリン塩基もしくはピリミジン塩基が他の複素環と置換されている改変塩基（例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドン）を含む。さらなる塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示される塩基、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８５８−８５９頁，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０によって開示される塩基、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９１）３０，６１３によって開示される塩基、ならびにＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，第１５章，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２８９−３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．，編，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示される塩基が挙げられる。特定のこれらの塩基は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるために、特に有用である。これらとしては、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリンおよびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む）が挙げられる。５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を０．６〜１．２℃増大することが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．，編，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、ここで好ましい塩基置換であり、なおより好ましくは、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と結合される場合である。米国特許第６，５０３，７５４号および同第６，５０６，７３５号ならびにこれらにおいて引用された参考文献（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。任意の改変塩基の使用は、当業者に理解されるとおり、同じ塩基対特性を有する天然に存在する塩基の使用と同等である。
【００４８】
本明細書中および特許請求の範囲において使用される場合、用語「相補的」およびこれに基づく類似の語は、核酸、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドの１つの鎖における第１の核酸塩基の、核酸、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドの１つの鎖における特定の第２の核酸塩基とのみ特異的に相互作用する能力をいう。非限定の例として、天然に存在する塩基が考慮される場合、ＡとＴもしくはＵとは、互いに相互作用し、そしてＧとＣとは互いに相互作用する。本発明および特許請求の範囲において使用される場合、「相補的」は、「完全に相補的」であることを意味し、すなわち、２つのポリヌクレオチド鎖が互いに並列される場合、１本の鎖における連続する塩基の配列における各塩基が、対向する鎖における同じ長さの連続する塩基の配列における相互作用する塩基に対して相補的である、少なくとも一部分の鎖が存在する。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「ハイブリダイズ」、「ハイブリダイゼーション」および類似の語は、鎖と相補的な配列とを互いに相互作用させることによって、核酸、ポリヌクレオチド、もしくはオリゴヌクレオチドの２本鎖を形成するプロセスをいう。この相互作用は、各々の鎖における相補的な塩基が、特異的に相互作用して対を形成することによって起こる。鎖が互いにハイブリダイズする能力は、以下で示すような種々の条件に依存する。核酸鎖は、各鎖における十分な数の対応する位置が、互いに相互作用し得るヌクレオチドによって占められている場合、互いにハイブリダイズする。二本鎖を形成する鎖の配列は、特異的にハイブリダイズすることができるために互いに１００％の相補性を必要とはしないことが、本発明の分野の当業者（非限定の例として、分子生物学者および細胞生物学者が挙げられる）によって理解される。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「フラグメント」およびこれに基づく類似の語は、参照の全体配列よりも短い、核酸、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドの一部分に関連する。フラグメントにおける塩基の配列は、このフラグメントが生じた分子の対応する部分の配列から改変されない；フラグメントにおいて、このフラグメントが生じた分子の対応する部分の配列と比較して、挿入も欠失も存在しない。本明細書中で企図されるように、核酸もしくはポリヌクレオチドのフラグメント（例えば、オリゴヌクレオチド）は、１５もしくはそれより多くの塩基の長さ、または１６もしくはそれより多く、１７もしくはそれより多く、１８もしくはそれより多く、または１９もしくはそれより多く、または２０もしくはそれより多く、または２１もしくはそれより多く、または２２もしくはそれより多く、または２３もしくはそれより多く、または２４もしくはそれより多く、または２５もしくはそれより多く、または２６もしくはそれより多く、または２７もしくはそれより多く、または２８もしくはそれより多く、または２９もしくはそれより多く、３０もしくはそれより多く、５０もしくはそれより多く、７５もしくはそれより多く、１００もしくはそれより多くの塩基の長さであり、全長配列より１塩基短い長さまでの長さである。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成され得、そしてｓｉＲＮＡ、ＰＣＲプライマー、またはプローブとして使用され得る。
【００５１】
検出および標識。標的性ポリヌクレオチド、例えばｓｉＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチド、ならびにウイルスポリヌクレオチド標的は、多くの手段によって検出され得る。検出としては、標的性ポリヌクレオチドの存在もしくは量を観察する能力をもたらす、１種もしくはそれより多くの任意のプロセスが挙げられ得る。１つの実施形態において、標的性ポリヌクレオチドもしくはウイルス標的を含むサンプル核酸は、拡張（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）の前に検出され得る。代替の実施形態において、サンプル中の標的性ポリヌクレオチドは、拡張されて、拡張された標的性ポリヌクレオチドもしくは拡張されたウイルス標的を提供し得、そしてこの拡張されたポリヌクレオチドが、検出されるかもしくは定量され得る。物理的方法、化学的方法もしくは生物学的方法が、標的性ポリヌクレオチドを検出しそして定量するために使用され得る。物理的方法としては、非限定の例として、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）検出（例えば、プローブの表面への結合）および標的性ポリヌクレオチドの固定化プローブへの結合を検出するためのＳＰＲの使用、またはクロマトグラフィー媒体中にプローブを有し、そして標的性ポリヌクレオチドの結合をクロマトグラフィー媒体中で検出することをが挙げられる。物理的方法は、標的性ポリヌクレオチドが他のポリヌクレオチドから分離され、そしてこの分離されたポリヌクレオチドが検出される、ゲル電気泳動形式もしくはキャピラリー電気泳動形式をさらに含む。化学的方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法、および一般に標的性ポリヌクレオチドがプローブにハイブリダイズする、ハイブリダイゼーション方法が挙げられる。生物学的方法としては、標的性ポリヌクレオチドもしくは標的ポリヌクレオチドに、細胞において生物学的効果を発揮させ、そしてこの効果を検出することが挙げられる。本発明は、生物学的アッセイにおいて使用され得る生物学的効果の例を開示する。これらとしては、粒子を数えることによるビリオンの計数、プラークアッセイ、感染細胞における細胞変性効果の評価などが挙げられる。多くの実施形態において、ポリヌクレオチドは、以下で記載されるように標識されて、検出および定量を補助する。例えば、拡張を包含しない実施形態において、サンプル核酸は、標識化ヌクレオチドもしくは標識化オリゴヌクレオチドリンカーのような標識化部分の化学的付加もしくは酵素的付加によって標識され得る。
【００５２】
拡張されたポリヌクレオチドが、直接的に検出され得、そして／または定量され得る。例えば、拡張されたポリヌクレオチドは、ゲル中の電気泳動（大きさによって分離する）に供され、そして色素によって染色されて、その存在および量を明らかにし得る。あるいは、拡張された標的性ポリヌクレオチドは、プローブ核酸のハイブリダイゼーション条件（以下を参照）下での曝露の際に検出され得、そしてハイブリダイゼーションによる結合が、検出されそして／または定量される。検出は、標的性ポリヌクレオチドがプローブに結合していることの決定を可能にすることを何らかの手段で達成する。このことは、フラグメントをハイブリダイズすることによってもたらされるプローブの物理的特性における変化を検出することによって達成され得る。このような物理的検出方法の非限定の例は、ＳＰＲである。
【００５３】
検出を達成する代替の方法は、この拡張されたポリヌクレオチドの標識化形態を使用すること、および結合した標識を検出することである。標識は、例えば、１２５Ｉ、３５Ｓ、３２Ｐ、１４Ｃ、もしくは３Ｈのような放射性同位体標識であり得、これはその放射活性によって検出され得る。あるいは、標識は、分光学的方法を用いて（例えば、蛍光、リン光もしくは化学発光によって）検出され得るように選択され得る。したがって、蛍光標識もしくはリン光標識または化学発光反応を誘導する標識が、使用され得る。標識は、なおさらに、特定のリガンド−レセプター対におけるリガンドであり得る；このリガンドの存在は、次いで、通常はそれ自体が検出のために標識されている特異的レセプターの二次結合によって検出される。
【００５４】
（干渉性ＲＮＡ）
本発明に従って、呼吸性ウイルス標的の遺伝子発現は、ＲＮＡ干渉によって低減される。ウイルス遺伝子の発現産物は、このウイルス標的の少なくとも１つのセグメントに対して相補的である特異的二本鎖ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列によって標的化され、このセグメントは、１５と３０との間の任意の数のヌクレオチドを含むか、または多くの場合、２１と２５との間の任意の数のヌクレオチドを含む。この標的は、５’非翻訳（ＵＴ）領域中、コード配列中、または３’ＵＴ領域中に存在し得る。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ００／４４８９５、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ０１／７５１６４、ＷＯ０１／９２５１３、ＷＯ０１／２９０５８、ＷＯ０１／８９３０４、ＷＯ０２／１６６２０、およびＷＯ０２／２９８５８（各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと。
【００５５】
本発明の方法に従い、呼吸性ウイルス遺伝子発現およびそれによる呼吸性ウイルス複製は、ｓｉＲＮＡを用いて抑制される。本発明に従う標的性ポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。このようなｓｉＲＮＡはまた、ウイルス配列と同一もしくは類似であるヌクレオチド配列の化学的合成によって調製され得る。例えば、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｚａｍｏｒｅ，Ｌｅｈｍａｎｎ，ＢａｒｔｅｌおよびＳｈａｒｐ（１９９９），Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１３：３１９１−３１９７（本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと。あるいは、標的性ｓｉＲＮＡは、標的性ポリヌクレオチド配列を用いて、例えば、無細胞系（例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ抽出物であるがこれに限定されない）において呼吸性ウイルスリボポリヌクレオチド配列を消化することによって、または組換え二本鎖ウイルスｃＲＮＡの転写によって、得られ得る。
【００５６】
効率的なサイレンシングは、一般に、同じ長さの１６〜３０ｎｔのセンス鎖と１６〜３０ｎｔのアンチセンス鎖とから構成されるｓｉＲＮＡ二本鎖によって観察される。多くの実施形態において、ｓｉＲＮＡ対形成二本鎖の各鎖は、３’末端において２−ｎｔのオーバーハングの付加を有する。２−ｎｔの３’オーバーハングの配列は、ｓｉＲＮＡ標的認識の特異性に対し、さらに僅かに寄与する。１つの実施形態において、３’オーバーハング中のヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。代替の実施形態において、３’オーバーハング中のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。３’デオキシヌクレオチドの使用は、細胞内安定性の増強を提供する。
【００５７】
本発明の組換え発現ベクターは、細胞内に導入された場合、呼吸性ウイルスを標的化するｓｉＲＮＡ配列を含むＲＮＡを提供するようにプロセシングされる。このようなベクターは、発現を可能にする様式でウイルス標的化配列に隣接（ｆｌａｎｋｉｎｇ）する作動可能に連結された制御配列を含む発現ベクター内にクローニングされたＤＮＡ分子である。このベクターからは、ウイルスＲＮＡに対するアンチセンスであるＲＮＡ分子は、第１のプロモーター（例えば、クローニングされたＤＮＡの３’のプロモーター配列）によって転写され、そしてウイルスＲＮＡ標的についてのセンス鎖であるＲＮＡ分子は、第２のプロモーター（例えば、クローニングされたＤＮＡの５’のプロモーター配列）によって転写される。このセンス鎖およびアンチセンス鎖は、次いで、インビボでハイブリダイズして、呼吸性ウイルス遺伝子のサイレンシングのためにこのウイルスを標的化するｓｉＲＮＡ構築物を産生する。あるいは、２つの構築物が、ｓｉＲＮＡ構築物のセンス鎖およびアンチセンス鎖を作製するために使用され得る。さらに、クローニングされたＤＮＡは、二次構造を有する転写物をコードし得、ここで、１つの転写物は、標的遺伝子からのセンス配列および相補的アンチセンス配列の両方を有する。この実施形態の例において、ヘアピンＲＮＡｉ産物は、標的遺伝子の全てもしくは一部分に類似する。別の例において、ヘアピンＲＮＡｉ産物は、ｓｉＲＮＡである。ウイルス配列に隣接（ｆｌａｎｋｉｎｇ）する調節配列は、同一であっても異なっていてもよく、それによって、その発現は、独立して調節されてもよく、または時間的様式もしくは空間的様式で調節されてもよい。
【００５８】
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、例えば、より低分子の核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６もしくはヒトＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡ  Ｈ１由来のＲＮＡｐｏｌ  ＩＩＩ転写単位を含むベクター内に、ウイルス遺伝子テンプレートをクローニングすることによって細胞内で転写される。ベクター系の１つの例は、ＧｅｎｅＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒＴＭ  ＲＮＡ干渉キット（Ｉｍｇｅｎｅｘから市販される）である。Ｕ６プロモーターおよびＨ１プロモーターは、Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターのＩＩＩ型クラスのメンバーである。Ｕ６様プロモーターの＋１ヌクレオチドは、常にグアノシンであり、一方、Ｈ１プロモーターについての＋１は、アデノシンである。これらのプロモーターについての終止シグナルは、５つの連続するチミジンによって規定される。この転写物は、代表的に、第２のウリジンの後で切断される。この位置における切断は、発現されたｓｉＲＮＡにおいて３’ＵＵオーバーハングを産生し、これは、合成ｓｉＲＮＡの３’オーバーハングと類似する。４００ヌクレオチド未満の長さの任意の配列が、これらのプロモーターによって転写され得るので、これらは、例えば、約５０ヌクレオチドのＲＮＡステム−ループ転写物における約２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡの発現に理想的に適合する。ＲＮＡｉの特徴およびｓｉＲＮＡの効力に影響を及ぼす要因が、研究されている（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ＬｅｎｄｅｃｋｅｌおよびＴｕｓｃｈｌ（２００１）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１５：１８８−２００）。
【００５９】
選択されたｓｉＲＮＡ配列についての最初のＢＬＡＳＴ相同性検索は、入手可能なヌクレオチド配列ライブラリーに対して行われ、ウイルス遺伝子のみが標的化され、宿主遺伝子が標的化されないことを確認する。Ｅｌｂａｓｈｉｒら，２００１  ＥＭＢＯ  Ｊ．２０（２３）：６８７７−８８を参照。
【００６０】
（ポリヌクレオチドの合成）
標的性ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドおよび標的性配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、自動化ＤＮＡ合成装置を用いて、標準的合成技術によって調製され得る。オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、周知の化学的プロセスを含み、これらとしては、表面誘導体化粒子へのヌクレオチドホスホルアミダイトの連続的付加（Ｔ，ＢｒｏｗｎおよびＤｏｒｃａｓ  Ｊ．Ｓ．Ｂｒｏｗｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．１−２４（１９９１）によって記載され、本明細書中で参考として援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
合成手順の一例は、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ＲＮＡホスホルアミダイトおよびチミジンホスホルアミダイト（Ｐｒｏｌｉｇｏ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用する。合成オリゴヌクレオチドは、脱保護されそしてゲル精製されて（Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１５，１８８−２００）、その後、Ｓｅｐ−ＰａｋＣ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ）精製される（Ｔｕｓｃｈｌら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：１１６５８−１１６６８）。相補的ｓｓＲＮＡは、アニーリング緩衝液（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ酢酸マグネシウム）中で９０℃で、１分間インキュベーションされ、その後、３７℃で１時間インキュベーションされて、対応するｄｓ−ｓｉＲＮＡとハイブリダイズする。
【００６２】
オリゴヌクレオチド合成の他の方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ホスホトリエステル方法およびホスホジエステル方法（Ｎａｒａｎｇら，（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０）ならびにＨ−ホスホネート方法（とりわけＧａｒｅｇｇ，Ｐ．Ｊ．ら，（１９８５）「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ  ｂｏｎｄｓ  ｖｉａ  ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ」，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｒｉｐｔａ  ２５，２８０−２８２；およびＦｒｏｅｈｌｅｒ，Ｂ．Ｃ，ら，（１９８６ａ）「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｖｉａ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｈ−ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１４，５３９９−５４０７）に従う固相オリゴヌクレオチド合成、ならびに支持体上の合成（Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９−１８６２）、ならびにホスホルアミデート技術（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，ら，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」，第１５４巻，ｐｐ．２８７−３１４（１９８８））、米国特許第５，１５３，３１９号、同第５，１３２，４１８号、同第４，５００，７０７号、同第４，４５８，０６６号、同第４，９７３，６７９号、同第４，６６８，７７７号、および同第４，４１５，７３２号ならびに「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ」，Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ，編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７およびその中に含まれる参考文献に記載される技術、ならびに非ホスホルアミダイト技術。固相合成は、オリゴヌクレオチドを不純物および過剰な試薬から単離することを助ける。一旦固体支持体から切断されると、このオリゴヌクレオチドは、公知の技術によってさらに単離され得る。
【００６３】
（本発明の阻害性ポリヌクレオチド）
本発明は、呼吸性ウイルス病原体に感染した細胞内に侵入する際にＲＮＡ干渉現象を引き起こすように意図されるオリゴヌクレオチドを、広く提供する。本発明は、呼吸性ウイルス標的の性質に制限されないが、ＲＳＶおよびインフルエンザＡのいくつかの株を標的化するオリゴヌクレオチドを強調する。ＲＮＡ干渉は、適切な二本鎖ＲＮＡによって細胞内で起こり、この二本鎖ＲＮＡの鎖のうちの１本は、ウイルスの標的遺伝子における配列と同一であるかこれに高度に類似する。一般に、呼吸性ウイルスを標的化するオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡであり得るか、または、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの混合物を含み得る。後者の一例は、デオキシジヌクレオチド配列（例えば、ｄ（ＴＴ）、ｄ（ＵＵ）、ｄ（ＴＵ）、ｄ（ＵＴ）および他の可能性のあるジヌクレオチド）で３’末端において終止するＲＮＡ配列である。さらなる実施形態において、３’オーバーハングは、上で特定された塩基を有するリボヌクレオチドなどから構成され得る。さらに、このオリゴヌクレオチド薬剤は、一本鎖もしくは二本鎖であり得る。本発明の治療用オリゴヌクレオチドのいくつかの実施形態は、オリゴリボヌクレオチドであるか、もしくは３’ｄ（ＴＴ）末端を有するオリゴリボヌクレオチドであることが予測される。一本鎖標的性ポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞への侵入の際、細胞内に存在する内因性酵素活性によって、容易に二本鎖分子に変換される。
【００６４】
最も一般的には、本発明は、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドを提供し、これは、１５ヌクレオチドから２００ヌクレオチドの長さまでのいずれかの長さの範囲であり得る。このポリヌクレオチドは、ＲＳウイルスもしくはインフルエンザＡウイルスのゲノムを標的化する第１のヌクレオチド配列を含む。この第１のヌクレオチド配列は、（ａ）１５〜３０の任意の数のヌクレオチドの長さである配列、または（ｂ）その相補体のいずれかから構成される。このようなポリヌクレオチドは、本明細書中で、直鎖状ポリヌクレオチドと呼ばれる。
【００６５】
図３は、本発明のポリヌクレオチドの特定の実施形態の概略図を提供する。本発明は、ＲＳＶもしくはインフルエンザＡの種々の株における標的配列を開示するか、または特定の場合には、標的配列と僅かに不適合であるｓｉＲＮＡ配列を開示し、これらの全ては、配列番号１〜２６３に提供される。配列番号１〜２６３に提供される配列は、１９ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの長さの範囲である。この標的性配列は、図３において薄い影をつけたブロックによって表される。図３、パネルＡのａ）は、「ＳＥＱ」として示される開示された配列が、必要に応じてより大きなポリヌクレオチド内に含まれ得、このポリヌクレオチドの全長が２００ヌクレオチドまでの範囲に及び得る、実施形態を図示する。
【００６６】
本発明は、標的性ポリヌクレオチドにおいて、配列番号１〜２６３から選択される配列が、ＳＥＱによって表される第１のヌクレオチド配列よりも長いウイルスゲノム中の配列を標的化するようなより長い標的性配列の一部分であり得ることを、さらに提供する。これは、図３、パネルＡのｂ）に図示され、ここでは、完全な標的性配列が、ポリヌクレオチドの上の横線およびＳＥＱブロックの周囲の濃い影によって示される。ポリヌクレオチドの全ての実施形態において、このより長い配列は、必要に応じて、なおより長い（２００もしくはより少ない塩基の長さである）ポリヌクレオチドに含まれ得る（図３、パネルＡ、ｂ））。
【００６７】
本発明は、配列番号１〜２６３のいずれかのフラグメントであって、少なくとも１５ヌクレオチドの長さである（そして長くとも参照配列番号よりも１塩基短い；図３、パネルＡ、ｃ）において図示される）配列、ならびに５ヌクレオチドまでが配列番号１〜２６３において与えられる標的配列から異なり得る（図３、パネルＡ、ｄ）において図示される）配列（この例において、３つの改変塩基が、３本の濃い縦棒によって表される）をさらに提供する。
【００６８】
なおさらに、本発明は、上記の配列のいずれかの相補体である配列を提供する（図３、パネルＡのｅ）に示され、「ＣＯＭＰＬ」と名付けられる）。任意のこれらの配列が、本発明のオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドに含まれる。本発明の任意の直鎖状ポリヌクレオチドは、上記のａ）〜ｅ）に記載される配列のみによって構成されてもよく、または必要に応じて、上限２００ヌクレオチドまでのさらなる塩基を含んでもよい。ＲＮＡ干渉は、二本鎖ＲＮＡを必要とするので、標的性ポリヌクレオチド自身は、少なくとも配列番号１〜２６３において与えられる配列に対して相補的でありかつこれにハイブリダイズする第２の鎖を含む二本鎖であり得るか、または細胞内プロセシングに依存して相補鎖を産生し得る。
【００６９】
従って、上記のポリヌクレオチドは、一本鎖であってもよく、または二本鎖であってもよい。なおさらなる実施形態において、このポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドのみを含むか、またはリボヌクレオチドのみを含むか、あるいはデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの両方を含む。本明細書中で記載されるポリヌクレオチドの重要な実施形態において、標的配列は、１５ヌクレオチド（ｎｔ）、もしくは１６ｎｔ、もしくは１７ｎｔ、もしくは１８ｎｔ、もしくは１９ｎｔ、もしくは２０ｎｔ、もしくは２１ｎｔ、もしくは２２ｎｔ、もしくは２３ｎｔ、もしくは２４ｎｔ、もしくは２５ｎｔ、もしくは２６ｎｔ、もしくは２７ｎｔ、もしくは２８ｎｔ、もしくは２９、もしくは３０ｎｔのいずれかの長さであり得る配列からなる。なおさなる有利な実施形態において、この標的性配列は、ウイルス病原体ゲノムにおける標的配列と５塩基まで異なり得る。
【００７０】
本発明のいくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、標的性配列からなり、そして必要に応じて、本明細書中に記載される３’ジヌクレオチドオーバーハングを含む、ｓｉＲＮＡである。
【００７１】
あるいは、ＲＮＡ干渉における二本鎖ＲＮＡの必要を認識して、上記オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドは、分子内ヘアピンループ二本鎖分子を形成するように調製され得る。このような分子は、上の段落の実施形態のいずれかにおいて記載される第１の配列、その後ろの短いループ配列、そのさらに後ろの第２の配列であって第１の配列に対して相補的な配列から形成される。このような構造は、所望の分子内ヘアピンを形成する。その上さらに、また、挙げられた３つの所望の構造が、２００ヌクレオチドまでの任意の全体の長さを有する任意のオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドにおいて構成され得るような、最大２００ヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチドが開示される。ヘアピンループポリヌクレオチドは、図３、パネルＢにおいて図示される。
【００７２】
（標的としてのＲＳＶ株）
ＲＳＶについて、ウイルスゲノムの任意の部分が標的化され得るが、理屈からすれば、ウイルス特異的酵素的機能をコードする標的性遺伝子が潜在的ｓｉＲＮＡ候補を提供するはずである。これらの遺伝子としては、Ｌ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｇ遺伝子およびＰ遺伝子が挙げられる。ウイルスゲノムの５’末端に位置するＬ遺伝子は、少量でしか発現されず、従って、有効なＲＮＡｉサイレンシングは、少量のＲＮＡｉのみを必要とし得る。構造遺伝子もまた、標的化され得る。
【００７３】
以下のＲＳＶサブグループＡおよびＢの代表的な株の配列は、サブグループＡとサブグループＢとの間で共通である（表１）か、またはサブグループＡ（表２）もしくはサブグループＢ（表３）に特異的である標的配列を選択するために使用された。
【００７４】
サブグループＡ：株Ａ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ７４５６８）および株Ｌｏｎｇ（Ｐ−ｍＲＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ２２６４４、およびＦ−ｍＲＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ２２６４３のみ）。
【００７５】
サブグループＢ：株Ｂ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＣ＿００１７８１）および株９３２０（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＹ３５３５５０）。
【００７６】
ウイルス遺伝子配列は、共通領域もしくは独特の領域を探索するために並列された。各標的化遺伝子もしくは標的化領域について、少なくとも２つの標的を、適用不可能（ＮＡ）でない限り選択した。両サブグループに共通の標的配列を見出すことは、これらのどちらかに独特の標的を見出すよりも難しかった。何故なら、利用可能な、相同であるかもしくは同一である配列は、非常に少ないからである。この場合（表１）、時々、ＲＮＡ二本鎖の１端の５’末端にミスマッチを導入する必要があった。
【００７７】
【表１】
2009526516.tif 000003
（表２．サブグループＡ（株Ａ２  ＆  Ｌｏｎｇ株のＦ／Ｐ）に特異的な遺伝子標的）
【００７８】
【表２】
2009526516.tif 000004
（表３．サブグループＢ（株Ｂ１および株９３２０）に特異的な遺伝子標的）
【００７９】
【表３】
2009526516.tif 000005
ウイルスゲノムの５’末端に対して指向されるｓｉＲＮＡ因子を提供するために、株Ｂ１もしくは株９３２０のいずれか個々に独特の尾部（ｔｒａｉｌ）標的が、以下に示される（表４）。（＋）鎖（アンチ−ゲノムＲＮＡ）の５’末端が標的化され、すなわち、ポジティブＲＮＡ鎖（アンチゲノムＲＮＡ）をテンプレートとして用いてウイルスゲノムが複製を開始する際、新生リーダー配列が産生される。
【００８０】
（表４．ＲＳＶサブグループＢの２つの株についての尾部標的）
【００８１】
【表４】
2009526516.tif 000006
上の表１〜表４に列挙した標的に基づき、ｓｉＲＮＡは、以下のように作製され得る：ａ）二本鎖ｓｉＲＮＡの各鎖に、３’−ｄＴｄＴオーバーハングが提供される、ｂ）「ミスマッチ」が必要な場合、Ｇ：Ｃは、Ｇ：ＴもしくはＧ：Ａに変えられ、Ａ：Ｔは、Ａ：ＣもしくはＡ：Ｇに変えられ、そしてＣ：ＧはＣ：ＴもしくはＣ：Ａに変えられる。
【００８２】
（標的としてのインフルエンザＡ株）
（＋）鎖ｍＲＮＡ配列内の２５ヌクレオチドおよび１９ヌクレオチドの長さのｓｉＲＮＡ標的配列が、全ての８つのセグメントで同定されている。この配列は、表５〜表１２に示される。ｓｉＲＮＡ配列は、この８つのセグメントの各々に由来する。各配列についての記載（ｅｎｔｒｙ）はまた、５’末端からのｍＲＮＡにおける開始ヌクレオチド位置を示す。
【００８３】
（表５．インフルエンザＡウイルスのヘマグルチニン遺伝子（Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／ＣＨ−２／２００４（Ｈ５Ｎ１）；ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＹ６４９３８２）を標的化するｓｉＲＮＡ配列。）
【００８４】
【表５】
2009526516.tif 000007
（表６．インフルエンザＡウイルスのマトリックスタンパク質２およびマトリックスタンパク質１（Ｍ）遺伝子（Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／１（ＫＡＮ−１）／２００４（Ｈ５Ｎ１）；ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＹ６２６１４４）を標的化するｓｉＲＮＡ配列。）
【００８５】
【表６】
2009526516.tif 000008
（表７．インフルエンザＡウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子（Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／ＣＨ−２／２００４（Ｈ５Ｎ１）；ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＹ６４９３８３）を標的化するｓｉＲＮＡ配列。）
【００８６】
【表７】
2009526516.tif 000009
（表８．インフルエンザＡウイルスのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子（Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／１（ＫＡＮ−１）／２００４（Ｈ５Ｎ１）；ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＹ６２６１４５）を標的化するｓｉＲＮＡ配列。）
【００８７】
【表８】
2009526516.tif 000010
（表９．インフルエンザＡウイルスの非構造タンパク質１および非構造タンパク質２（ＮＳ）の遺伝子（Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／１（ＫＡＮ−１）／２００４（Ｈ５Ｎ１）；ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＹ６２６１４６）を標的化するｓｉＲＮＡ配列。）
【００８８】
【表９】
2009526516.tif 000011
（表１０．インフルエンザＡウイルスのポリメラーゼ酸性タンパク質（ＰＡ）遺伝子（Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／１（ＫＡＮ−１）／２００４（Ｈ５Ｎ１）；ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＹ６２６１４７）を標的化するｓｉＲＮＡ配列。）
【００８９】
【表１０】
2009526516.tif 000012
（表１１．インフルエンザＡウイルスのポリメラーゼ塩基性タンパク質１（ＰＢ１）遺伝子（Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／１（ＫＡＮ−１）／２００４（Ｈ５Ｎ１）；ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＹ６２６１４８）を標的化するｓｉＲＮＡ配列。）
【００９０】
【表１１】
2009526516.tif 000013
（表１２．インフルエンザＡウイルスのポリメラーゼ塩基性タンパク質２（ＰＢ２）遺伝子（Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／１（ＫＡＮ−１）／２００４（Ｈ５Ｎ１）；ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＹ６２６１４９）を標的化するｓｉＲＮＡ配列。）
【００９１】
【表１２】
2009526516.tif 000014
インフルエンザＡを標的化する潜在的ｓｉＲＮＡ候補配列の選択のための別のアプローチは、２つの主要なウイルス表面糖タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）のサブタイプ特異性に着目することである。ヒト感染を引き起こすことが報告されているサブタイプは、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、およびＨ９Ｎ２である。以下は、サブタイプ特異的なＨＡ標的およびＮＡ標的の例である。
【００９２】
（表１３．Ｈ５Ｎ１ヘマグルチニン（ＨＡ）のｓｉＲＮＡ標的化配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＤＱ０２３１４５，ＧＩ：６６７７５６２４に基づく）：
【００９３】
【表１３】
2009526516.tif 000015
表１３における配列は、中国において２０００年と２００３年との間にＨＰＡＩウイルスによって感染したニワトリから単離された６種のＨ５Ｎ１株によって共有される。これらのＨ５Ｎ１株は、表１４に列挙される。
【００９４】
（表１４）
【００９５】
【表１４】
2009526516.tif 000016
（表１５．Ｈ５Ｎ１ノイラミニダーゼ（ＮＡ）のｓｉＲＮＡ標的化配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＤＱ０２３１４７，ＧＩ：６６７７５６２８に基づく）：
【００９６】
【表１５】
2009526516.tif 000017
上の配列は、中国において２００１年と２００３年との間に感染したニワトリもしくはブタから単離された６種のＨ５Ｎ１株によって共有される。これらのＨ５Ｎ１株は、以下の表１６に列挙される。
【００９７】
（表１６）
【００９８】
【表１６】
2009526516.tif 000018
（表１７．Ｈ７Ｎ７ヘマグルチニン（ＨＡ）のｓｉＲＮＡ標的化配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＹ９９９９８６，ＧＩ：６６３９４８３７に基づく）：
【００９９】
【表１７】
2009526516.tif 000019
上の全ての配列は、スウェーデンにおいて２００２年にマガモから単離された６種のＨ７Ｎ７株によって共有される。これらのＨ７Ｎ７株は、以下の表１８に列挙される。
【０１００】
６種のＨＡ配列を比較して、ＨＡ１関連ドメインがより高い頻度の点変異を有することが見出されており、従って、１０個の標的がＨＡ２ドメインから選択される。
【０１０１】
（表１８）
【０１０２】
【表１８】
2009526516.tif 000020
いくつかのインフルエンザＡ  Ｈ５Ｎ１  ｍＲＮＡ配列に対するさらなるｓｉＲＮＡ二本鎖が、同定された。これらを表１９に示す。これらの位置は図４に図示される。
【０１０３】
（表１９．Ｈ５Ｎ１トリインフルエンザを標的化するＲＮＡｉ配列）
【０１０４】
【表１９】
2009526516.tif 000021
（ｓｉＲＮＡの組み合わせ）
本発明のいくつかの実施形態は、２種もしくはそれより多くのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含有する薬学的組成物を提供し、これらのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの各々は、呼吸性ウイルスのゲノムにおける遺伝子を標的化する配列を含む。関連の実施形態は、この組み合わせを用いて細胞を処置する方法、および呼吸性ウイルス感染を処置する方法を提供し、そしてこのような組み合わせ組成物の、呼吸性ウイルス感染を処置することを意図される薬学的組成物の製造における使用を提供する。この組み合わせの個々のポリヌクレオチド成分は、ウイルス病原体のゲノムにおける同じ遺伝子の異なる部分、または異なる遺伝子、あるいは１つの遺伝子および１つより多くの遺伝子のいくつかの部分を、標的化し得る。オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの組み合わせを用いる利点は、所定の遺伝子の発現を阻害する利益が、この組み合わせにおいて大きくなることである。多数の標的性配列の使用により、遺伝子のノックダウンもしくはウイルスゲノムのサイレンシングにおいて、より大きな効力が、達成される。ウイルス複製の阻害における増大した効力は、ウイルスゲノムにおける１種より多くの遺伝子を標的化することによって達成される。
【０１０５】
（薬学的組成物）
本発明の標的性ポリヌクレオチドは、本明細書中で「活性化合物」もしくは「治療薬」と記載される。これらの治療薬は、被験体への投与のために適する薬学的組成物中に組み込まれ得る。
【０１０６】
本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的投与に適合性の、任意のそして全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことを意図される。適切なキャリアは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲ（編）第２０版（２０００）Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ，ＵＳＡならびにＷｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｉｓｖｏｌｄ’ｓ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＤｅｌｇａｄｏおよびＲｅｍｅｒｓ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ．による）のような教科書（本明細書中で参考として援用される）に記載される。このようなキャリアもしくは希釈剤において使用され得る成分の好ましい例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：水、生理食塩水、リン酸塩、カルボン酸塩、アミノ酸溶液、リンガー液、デキストロース（グルコースについての異名）溶液、および５％ヒト血清アルブミン。非限定の例として、デキストロースは、５％もしくは１０％の水溶液として使用され得る。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた、使用され得る。このような媒体および薬剤の薬学的に活性な物質のための使用は、当該分野で周知である。追加の活性化合物もまた、組成物中に組み込まれ得る。
【０１０７】
本発明の薬学的組成物は、意図される投与の経路に適合するように処方される。投与の経路の例としては、非経口投与（例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与）、経口投与、鼻投与、吸入投与、経皮投与（局所投与）、経粘膜投与および直腸投与が挙げられる。非経口適用、静脈内適用、皮内適用もしくは皮下適用のために使用される溶液もしくは懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールもしくは他の合成溶媒のような無菌希釈剤；ベンジルアルコールもしくはメチルパラベンのような抗細菌剤；アスコルビン酸もしくは亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩のような緩衝剤、ならびに張度を調整するための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。
【０１０８】
吸入による投与のために、上記化合物は、適切な噴霧体（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む加圧式容器もしくはディスペンサーまたは噴霧器からエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０１０９】
１つの実施形態において、活性化合物は、制御放出処方物のように、この化合物を身体からの迅速な除去から保護するキャリアと共に調製され、移植物およびマイクロカプセル化送達系を含む。持続放出調製物の適切な例としては、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形された製品の形態（例えば、フィルムもしくはマイクロカプセル）である。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）もしくはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能ミクロスフェア））、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日間にわたって分子を放出可能であり、特定のヒドロゲルは、より短い期間にわたって薬学的活性薬剤を放出する。有益なポリマーは、生分解性もしくは生物適合性である。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体によって感染細胞を標的化するリポソームを含む）もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号において記載されるような当業者に公知の方法に従って調製され得る。有益な形態を有する持続放出調製物（例えばミクロスフェア）は、上記のような材料から調製され得る。
【０１１０】
本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、多くの経路（例えば、米国特許第５，７０３，０５５号に記載される）のいずれかによって被験体に送達され得る。従ってまた、送達としては、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照）または定位注射（ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７を参照）が挙げられる。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中に治療ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞からインタクトに産生され得る（例えば、レトロウイルスベクター）場合、この薬学的調製物は、この遺伝子送達系を産生する１つもしくはそれより多くの細胞を含み得る。
【０１１１】
薬学的組成物は、例えば容器、パックもしくはディスペンサー中で、投与の指示書と共にキットに含まれ得る。
【０１１２】
被験体における呼吸性ウイルス感染を処置するための薬学的組成物もしくは医薬の製造における治療薬の使用もまた、本発明の範囲内である。
【０１１３】
（送達）
いくつかの実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、リポソーム媒介型トランスフェクションによって、例えば市販の試薬もしくは技術（例えば、ＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅＴＭ試薬、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ  ２０００ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびにエレクトロポレーションおよび同様の技術）を使用して、培養物中の細胞に送達される。さらに、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、吸入もしくは気道への点滴注入を介して、動物モデル（例えばげっ歯類もしくは非ヒト霊長類）に送達される。動物モデルでの使用のためのさらなる経路としては、静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＣ）、および関連の投与の経路が挙げられる。ｓｉＲＮＡを含有する薬学的組成物は、ｓｉＲＮＡの安定性を保護するか、ｓｉＲＮＡの持続時間を延長させるか、ｓｉＲＮＡ機能を助長するか、または特異的な組織／細胞にｓｉＲＮＡを標的化させる、さらなる成分を含む。これらの成分としては、種々の生分解性ポリマー、カチオン性ポリマー（例えばポリエチレンイミン）、ヒスチジン−リジン（ＨＫ）ポリペプチドのようなカチオン性コポリペプチド（例えば、Ｍｉｘｓｏｎらに対するＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／４７４９６、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘに対するＷＯ０２／０９６９４１およびＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに対するＷＯ９９／４２０９１を参照）、ペグ化カチオン性ポリペプチド、およびリガンドを組み込んだポリマーなど、正に荷電したポリペプチド、ＰｏｌｙＴｒａｎポリマー（天然の多糖類、スクレログルカンとしても知られる）、標的性リガンドと結合体化したポリマーからなるナノ粒子（ＴａｒｇｅＴｒａｎ改変体）、界面活性剤（Ｉｎｆａｓｕｒｆ；Ｆｏｒｅｓｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．；ＯＮＹ  Ｉｎｃ．）、ならびにカチオン性ポリマー（例えばポリエチレンイミン）が挙げられる。Ｉｎｆａｓｕｒｆ（登録商標）（カルファクタント（ｃａｌｆａｃｔａｎｔ））は、気管内点滴注入における使用のための、仔ウシ肺から単離された天然の肺界面活性剤である；これは、リン脂質、中性脂質、ならびに疎水性界面活性剤関連タンパク質Ｂおよび疎水性界面活性剤関連タンパク質Ｃを含む。このポリマーは、一次元ポリマーもしくは多次元ポリマーのいずれかであり得、そしてまた、直径２０ミクロン未満、２０ミクロンと１００ミクロンとの間もしくは１００ミクロンを超える、ミクロ粒子もしくはナノ粒子であり得る。このポリマーは、特定の組織もしくは細胞のレセプターまたは分子に特異的なリガンド分子を有し得、従って、ｓｉＲＮＡの送達を標的化するために使用され得る。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドはまた、カチオン性リポソームベースのキャリア（例えば、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ／コレステロール（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．））および他の型の脂質水溶液によって送達される。さらに、低パーセント（５〜１０％）のグルコース水溶液およびＩｎｆａｓｕｒｆは、ｓｉＲＮＡの気道送達のための有効なキャリアである３０。
【０１１４】
５％グルコースおよびＩｎｆａｓｕｒｆの経口気道送達溶液に懸濁した蛍光標識化ｓｉＲＮＡを用い、蛍光顕微鏡で試験して、ｓｉＲＮＡが外鼻孔を介してもしくは経口−気道経路を介してマウスに送達されそして肺組織を洗浄した後に、このｓｉＲＮＡは肺において広汎に分布していることが示されている（共有に係るＷＯ２００５／０１９４０（本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照）。マウスの鼻道および肺（上気道および気道深部（ｄｅｅｐｅｒ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｔｒａｃｔ））へのｓｉＲＮＡの送達は、ｓｉＲＮＡと同時にプラスミド中で送達した指示遺伝子（ＧＦＰもしくはルシフェラーゼ）を、首尾よくサイレンシングすることを示した（このプラスミドは、この指示遺伝子とｓｉＲＮＡ標的との融合物を有した）（共有に係るＷＯ２００５／０１９４０を参照）。さらに、本発明者ら（他と共に研究した）によって報告された実験は、ｓｉＲＮＡ種がＳＡＲＳコロナウイルスの複製を阻害し、それによって肺の病理学を緩和することを、ＳＡＲＳ感染したアカゲザルにおいて示した。
【０１１５】
（ｓｉＲＮＡ組換えベクター）
本発明の別の局面は、本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、連結した別の核酸を輸送可能な核酸分子をいう。ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントを連結し得る、環状二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの別の型は、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクターは、作動可能に連結した遺伝子の発現を指示し得る。このようなベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において使用される発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるので、本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、相互交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、ウイルスベクター（例えば、複製欠損型のレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）のような発現ベクターの他の形態を含むことを意図し、これらは、同等の機能をもたらす。
【０１１６】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を、この核酸の宿主細胞における発現のために適する形態で含み、これは、この組換え発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択される１つもしくはそれより多くの調節配列を含むことを意味し、これらの調節配列は、発現される核酸配列に作動可能に連結される。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結される」は、目的のヌクレオチド配列が、このヌクレオチド配列の（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、もしくはこのベクターが宿主細胞に導入される場合には宿主細胞においての）発現を可能にする様式で、調節配列に連結されることを意味する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．において記載される。調節配列としては、多くの型の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指示する調節配列、ならびに特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の構成的発現を指示する調節配列（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ  ６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞において使用される場合、発現ベクターの制御機能は、多くの場合、ウイルス調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。さらなるベクターは、細菌人工染色体、酵母人工染色体もしくは哺乳動物人工染色体のような微小染色体を含む。他の適切な発現系は、原核生物細胞および真核細胞の両方についての発現系である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０１１７】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型（例えば、気道の細胞）において選択的に核酸の発現を指示し得る。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。本発明は、組換え発現ベクター内にクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む発現ベクターを、さらに提供する。このＤＮＡ分子は、（このＤＮＡ分子の転写による）ウイルスＲＮＡを標的化するｓｉＲＮＡを含むＲＮＡ分子の発現を可能にする様式で、調節配列に作動可能に連結される。種々の細胞型において上記ＲＮＡ分子の連続的な発現を指示する、核酸に作動可能に連結される調節配列（例えば、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサー）が選択され得るか、またはアンチセンスＲＮＡの、構成的発現、組織特異的発現もしくは細胞型特異的発現を指示する調節配列が選択され得る。
【０１１８】
ベクターＤＮＡは、従来的な形質転換技術もしくはトランスフェクション技術を介して、原核生物細胞もしくは真核細胞内に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞内に導入するための、種々の当該分野で認識されている技術をいうことが意図され、これらとしては、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウムの共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介型トランスフェクション、リポフェクション、もしくはエレクトロポレーションが挙げられる。宿主細胞を形質転換するかもしくはトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら（２００１），Ａｕｓｕｂｅｌら（２００２），および他の研究室マニュアルにおいて見出され得る。
【０１１９】
（ウイルスの力価もしくは量についてのアッセイの方法）
本発明の実施において、ウイルスについてのアッセイは、いくつかの手順によって実施され得る。これらの中でも、非限定の例として、免疫ブロット（ウエスタンブロット）、免疫沈降（Ｉ．Ｐ．）、および複合型逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイなどが挙げられる。このような手順は、トランスフェクトされた組織培養物中の溶解物もしくは上清に存在し得る、標的化したｍＲＮＡもしくはそのタンパク質産物の合成の減少を測定する。同様に、これらのアッセイは、診断的手順として、感染した動物被験体もしくはヒト被験体から得られた、ホモジナイズした組織サンプル、鼻咽頭洗浄液、分泌液中に存在し得る、標的化したｍＲＮＡもしくはそのタンパク質産物の合成の減少を測定するために用いられ得る。
【０１２０】
ＲＴ−ＰＣＲアッセイ方法において、ウイルスゲノムＲＮＡの合成は、ＮＳ１  ＯＲＦとＮＳ２  ＯＲＦとの間の結合部（ｊｏｉｎｔ）にまたがった配列に相補的であるプライマーを用いて検出される。ＮＳ１／ＮＳ２プライマーを用いたこのＲＴ−ＰＣＲの結果は、全ゲノムＲＮＡの合成を反映する。
【０１２１】
この方法は、組織培養物におけるｓｉＲＮＡによって誘導されたウイルス複製の干渉が、本発明の分野における当業者に公知であるように、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴＱ−ＰＣＲ）、ＴＣＩＤ５０、ウイルスプラークアッセイ、免疫蛍光アッセイおよび免疫組織化学などによって測定されるアッセイをさらに含む。さらに、この方法は、上記ＴＣＩＤ５０法を用いて組織培養物中のウイルス複製の阻害をモニタリングする、ウイルスの存在についてのアッセイをさらに含む。ここで、ウイルス力価は、任意の種類の細胞病原性終末点（非限定の例として、細胞融合、細胞変性効果（ＣＰＥ）、細胞吸着などが挙げられる）によって測定される。
【０１２２】
上記の方法は、試験動物における上記ｓｉＲＮＡ媒介型ウイルス複製の干渉が、ＲＴＱ−ＰＣＲ、病理学、免疫組織化学およびウイルスの再単離などによって測定されるアッセイを、さらに含む。
【０１２３】
プライマーが、ＲＮＡｉによるｍＲＮＡ合成の減少を測定するために使用されるＲＴ−ＰＣＲ検出のために設計される。このＲＴ反応は、ヘキサマーもしくはポリ−ｄＴプライマーによって開始される；そしてＰＣＲは、ｓｉＲＮＡによって標的化される各遺伝子に特異的な上流もしくは下流のプライマーを用いて実施される。
【０１２４】
ゲノムＲＮＡ合成の検出について、一対のプライマー（上および下）が、ＮＳ１  ＯＲＦおよびＮＳ２  ＯＲＦの中の配列に対応して設計される。ウイルスゲノムのどちらかの端に対して相補的なプライマーではなく「結合部にまたがる（ｊｏｉｎｔ−ｃｒｏｓｓｉｎｇ）」プライマーを使用する目的は、取り扱いにくい大型の全体のＲＮＡ転写物（約１５Ｋ−ｎｔの長さ）を避けるためである。このＲＴ−ＰＣＲの産物は、この設計により、ゲノムＲＮＡ全体の合成を反映する。
【０１２５】
同定されているプライマーおよびＲＴ−ＰＣＲの産物が、以下の表２０、表２１および表２２に列挙される。
【０１２６】
（表２０．ＲＳＶ株Ａ２（サブグループＡ）についてのプライマー）
【０１２７】
【表２０】
2009526516.tif 000022
（表２１．ＲＳＶ株Ｂ１（サブグループＢ）についてのプライマー）
【０１２８】
【表２１】
2009526516.tif 000023
（表２２．ＰＣＲ産物の大きさ）
【０１２９】
【表２２】
2009526516.tif 000024
【実施例】
【０１３０】
（実施例１．細胞培養物における抗Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ  ｓｉＲＮＡ分子の効果。）
本実施例は、培養物におけるＨ５Ｎ１感染細胞に対するｓｉＲＮＡの阻害性効果の評価を報告する。
【０１３１】
（ｓｉＲＮＡの設計および合成）
各々、Ｈ５Ｎ１のＮＰ遺伝子（ＮＰ−１およびＮＰ−２；表１９、配列番号）遺伝子およびＭ２遺伝子（Ｍ２−１およびＭ２−２；表１９、配列番号）を標的化する２つのｓｉＲＮＡを、開発した。これらのｓｉＲＮＡ標的配列は、Ｈ５Ｎ１ウイルスのいくつかの株において保存されている（例えば、ｇｉ｜４７８３４９４５＿１０−１５０６、ｇｉ｜８４５２８２７＿１−１４９７、ｇｉ｜１３９２５１５８＿４６−１５４２、ｇｉ｜６１９２７２３７＿４６−１５４２、ｇｉ｜５９９４０３９１＿４４−＞１５３５、ｇｉ｜９８０２２７７＿４６−１５４２）。５’センス鎖においてフルオレセイン標識されているｄｓ−ｓｉＲＮＡを、Ｐｒｏｌｉｇｏ  ＢｉｏＴｅｃｈ  Ｌｔｄ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）によって化学的に合成した。その抗Ｈ５Ｎ１効果を、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした、Ｈ５Ｎ１ウイルスに感染したＭＤＣＫ細胞において検出した（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓；ＡＴＣＣ登録番号：ＣＣＬ−３４，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）。Ｈ５Ｎ１の阻害を、以下に記載されるように、細胞変性効果（ＣＰＥ）、標準的ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染用量）プロトコールによる培養培地中に放出されたウイルスの逆滴定、およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いる細胞内ウイルスＲＮＡの定量によって、決定した。
【０１３２】
（細胞培養、ｓｉＲＮＡトランスフェクションおよびＨ５Ｎ１ウイルス感染）
ＭＤＣＫ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）含有ＭＥＭ培地中で培養し、そして維持した。約５０００個の細胞を、ウイルス感染および複製アッセイのために、９６ウェルプレートの各ウェル中に入れた。細胞を、０．５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）と混合した１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭおよび１２．５ｎＭのｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。ルシフェラーゼを標的化する無関係のｓｉＲＮＡ（ＧＬ２ｉ）、もしくはＳＡＲＳコロナウイルス（Ｃ−１）を標的化するｓｉＲＮＡ、およびトランスフェクト体（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００のみ（Ｃ−２）を、本実験においてネガティブコントロールとして含めた。トランスフェクションの６時間後、この培養培地を除去し、そしてこの細胞を、Ｈ５Ｎ１ウイルス感染の前にＰＢＳで２回洗浄した。１％  ＦＢＳ含有ＭＥＭ中に希釈した１００μｌの１００  ＴＣＩＤ５０  Ｈ５Ｎ１ウイルス（株：Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８６／９７）７を、トランスフェクトされた細胞に加えた。培養上清および細胞を、それぞれ感染の１２時間後、１６時間後および２４時間後に、放出されたウイルス力価および細胞内ウイルスＲＮＡコピー数の検出のために収集した。感染の２４時間後、位相差顕微鏡下でＣＰＥを観察し、そして記録した。この実験を、３連で行い、そして少なくとも３回繰り返した。
【０１３３】
（定量的ＲＴ−ＰＣＲ）
Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲを、以下のように実行する。全細胞内ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者の指示に従って用いて単離した。逆転写実験を、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用いるオリゴ−ｄＴプライミングによって実施した。次いで、リアルタイムＰＣＲを、表２３に示すプライマーを用いて実施した。
【０１３４】
（表２３．Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲのためのＨ５Ｎ１プライマー）
【０１３５】
【表２３】
2009526516.tif 000025
５μｌのＲＴ産物（テンプレート）、各１μｌの順（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマーおよび逆（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー（最終濃度５００ｎＭ）、２μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ならびに９μｌのＨ２Ｏを、２μｌのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ，ＵＳＡ）と混合し、そしてリアルタイム定量を、ＡＢＩ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて実施した。ＰＣＲ条件は、以下であった：５０℃を５分間、９５℃を１０分間、次いで９５℃を１０秒間、６１℃を５秒間および７２℃を５秒間を４０サイクル。β−アクチンのコピー数もまた、内部コントロールとして測定した。１０００コピーのβ−アクチンあたりの細胞内ウイルスＲＮＡのコピー数を、計算し、そして未処理コントロールと比較した相対的ウイルスＲＮＡコピー数として表した（処理したコピー数／未処理のコピー数×１００％）。
【０１３６】
（ウイルス力価の測定）
ｓｉＲＮＡ処理を行ったかまたは行わない培養物中のウイルス力価を、以下のように試験した。簡潔には、感染細胞からの馴化培地を、１％  ＦＢＳ含有ＭＥＭ中に、１０倍の連続工程で希釈した。各希釈物を、標準的ＴＣＩＤ５０プロトコールに従って細胞を感染させるために使用した。簡潔には、細胞を、９６ウェル皿に感染の１６時間前に入れた。感染の７２時間後、ＣＰＥを、位相差顕微鏡下で観察し、そしてＣＰＥ陽性（ＣＰＥ+）細胞を決定した。次いで、ＴＣＩＤ５０を、以下のように評価した：
【０１３７】
【化１】
2009526516.tif 000026
ここで、ｈ＝希釈工程の補間されたｌｏｇ１０値、これを５０％を超える値の工程のｌｏｇ１０に加えた。感染性ウイルス力価を、計算しそして未処理コントロールと比較した相対的ウイルス収率として表した（処理した力価／未処理の力価×１００％）。
【０１３８】
（結果）
ｓｉＲＮＡ  ＮＰ−１（表１９）処理は、培養培地中のＨ５Ｎ１ウイルス産生（図５、パネルＡ）および細胞におけるウイルスＲＮＡコピーの複製（図５、パネルＢ）を、１２．５〜１００ｎＭの濃度において９９％を超えて低下させた。一方、ＮＰ−２を標的化するｓｉＲＮＡ（表１９）による処理は、１００ｎＭの濃度において、細胞培養物中のウイルス増殖の約６０％しか阻害しなかった。対照的に、無関係のｓｉＲＮＡ処理コントロール（Ｃ−１）およびキャリア処理コントロール（Ｃ−２）は、未処理コントロールと比較して、ウイルス増殖を有意に阻害しなかった。
【０１３９】
Ｍ２−１（表１９）に対して指向されるｓｉＲＮＡ（表１９）による処理もまた、種々の濃度で、ウイルス増殖（図５、パネルＣ）およびウイルスＲＮＡの複製（図５、パネルＤ）に対して、約８０％〜９４％の阻害性効果を示した。ここで、Ｍ２−２は、１００ｎＭの濃度で約６０％の阻害性効果を示したが、より低い濃度は試験しなかった。
【０１４０】
第２の実験において、培養物中の細胞を、５０ｎＭの種々のｓｉＲＮＡで処理した。培養上清培地中に産生されるウイルスを、３回の時点で収集した。サンプルを、培養物中の細胞の５０％に感染するために必要な組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）を決定することによって滴定した（図６、パネルＡ；これは対数座標スケール上に示されていることに留意されたい）。ウイルスＲＮＡのコピーの数／１０００コピーのβ−アクチンを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって決定した（図６、パネルＢ）。無関係のｓｉＲＮＡ（Ｃ−１）およびトランスフェクト体（Ｃ−２）を、コントロールとして実験に適用した。ＮＰ−１  ｓｉＲＮＡおよびＮＰ−２  ｓｉＲＮＡが、ウイルス粒子の増殖およびウイルスＲＮＡの増大の阻害において非常に有効であることが示される。Ｍ１−１  ｓｉＲＮＡおよびＭ２−２  ｓｉＲＮＡの使用は、ウイルス複製の妨害において部分的に有効である。
【０１４１】
この実施例における結果は、Ｈ５Ｎ１ゲノムにおける異なる遺伝子に対して指向される種々のｓｉＲＮＡが、培養中の感染細胞増殖におけるウイルス複製の阻害において、非常に有効であることを実証する。
【０１４２】
（実施例２．Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡに対して指向されるｓｉＲＮＡの組み合わせ。）
Ｈ５Ｎ１ゲノム中の種々の遺伝子に対して指向されるｓｉＲＮＡの組み合わせを、有効な抗Ｈ５Ｎ１活性を提供するために同定した。この実施例は、このような２つの組み合わせを示す。
【０１４３】
【化２】
2009526516.tif 000027
（実施例３．インビトロの細胞中のｓｉＲＮＡによる標的遺伝子およびウイルス複製の阻害）
この実施例において、種々の呼吸性ウイルス遺伝子を標的化する、同族（ｃｏｇｎａｔｅ）の標的遺伝子をサイレンシングする能力もしくはウイルス複製を阻害する能力において最適に有効なｓｉＲＮＡおよび最適に有効なｓｉＲＮＡの組み合わせが、細胞培養物中の実験によって同定される。インビトロで有効なｓｉＲＮＡは、インビボでさらに試験されそして使用される候補である。
【０１４４】
培養した許容細胞株（例えば、非限定の例として、Ａ５４９（ＡＴＣＣ登録番号：ＣＣＬ−１８５ＴＭ、ＩＩ型肺胞上皮肺癌腫細胞株））を、ＲＳＶウイルス株もしくはインフルエンザＡ株（例えば、Ｈ５Ｎ１）で感染させ、次いで種々のｓｉＲＮＡにより、個々にもしくは組み合わせて、トランスフェクトする。組み合わせの場合、１つのシグナル遺伝子を標的化する２種のｓｉＲＮＡ、もしくは２つもしくはそれより多くの遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡが、使用される。単独のｓｉＲＮＡもしくは組み合わせのｓｉＲＮＡの総ｓｉＲＮＡ用量を一定にする。異なる実験プロトコールにおいて、ｓｉＲＮＡトランスフェクションは、ＲＳＶ感染もしくはインフルエンザＡ感染の数時間前に実施されるか、ウイルス感染と同時に実施されるか、または感染の数時間後に実施される。これらの異なる手順は、試験したｓｉＲＮＡが、細胞レベルにおいて予防的効果および／もしくは治療的効果を示すか否かについての情報を提供する。
【０１４５】
標的遺伝子の阻害の程度、もしくはウイルス複製の阻害を、種々の方法によってアッセイする。アッセイの非限定の例としては、以下の手順が挙げられる：
（１）免疫ブロット（ウエスタン）を、細胞溶解物および所定のウイルス抗原に対するＲＳＶ特異的抗体もしくはインフルエンザＡ特異的抗体を用いて実施する。
【０１４６】
（２）免疫沈降（ＩＰ）を、細胞溶解物および上記の１つの遺伝子産物に対するＲＳＶ特異的抗体もしくはインフルエンザＡ特異的抗体を用いて実施する。
【０１４７】
（３）ｒｖｔｒ−ＰＣＲを行って、ｍＲＮＡ転写もしくはウイルスＲＮＡ複製の阻害を実証する。標的化遺伝子の転写物を検出するため、もしくは試験したｓｉＲＮＡオリゴがゲノムＲＮＡをもまた標的化し得るか否かを検出するための、特別なプライマーを設計する。
【０１４８】
（４）細胞融合体ベースのＴＣＩＤ５０の測定を使用して、無関係のコントロールｓｉＲＮＡの特異的ｓｉＲＮＡで処理した細胞培養物と比較して、ウイルス複製の阻害をモニタリングし得る。
【０１４９】
（５）免疫蛍光もしくは免疫組織化学もまた、ウイルス力価を滴定するために使用され得、それによって、ウイルス複製のｓｉＲＮＡ媒介型阻害をモニタリングし得る。
【０１５０】
（実施例４．小動物モデルにおける、ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子の阻害）
この実施例において、種々のｓｉＲＮＡ（個々にもしくは組み合わせ）が、動物モデルにおけるＲＳＶもしくはトリインフルエンザＨ５Ｎ１の処置におけるその効力を決定するために試験される。ＲＳＶ株もしくはインフルエンザＨ５Ｎ１株を、吸入もしくは点滴注入により気道を通して試験動物に感染させるために使用する。ｓｉＲＮＡは、同じ経路を通って送達され、そしてＲＳＶ感染もしくはインフルエンザＨ５Ｎ１感染の前に、感染と同時に、もしくは感染後に適用される。ｓｉＲＮＡ送達時間を変えることにより、試験動物におけるＲＳＶもしくはインフルエンザＨ５Ｎ１の複製の阻害、ＲＳＶもしくはインフルエンザＨ５Ｎ１によって誘導される病理学の低減、およびＲＳＶもしくはインフルエンザＨ５Ｎ１様の症状の軽減における、ｓｉＲＮＡの効力の情報を得ることが可能であり、そしてＲＳＶもしくはインフルエンザＨ５Ｎ１に特異的なｓｉＲＮＡが、動物における実験的なＲＳＶ感染もしくはインフルエンザＨ５Ｎ１感染に対する予防効果もしくは治療効果を示すか否かの情報を得ることが可能である。
【０１５１】
ＲＳＶおよびインフルエンザＨ５Ｎ１は広範な範囲の動物種に感染し得るが、ＲＳＶもしくはインフルエンザＨ５Ｎ１の動物モデル研究において、マウスおよびコットンラット（ｃｏｔｔｏｎ  ｒａｔ）が、従来使用されている。げっ歯類の感染は、通常、低レベル〜中レベルのウイルス複製をもたらし、これは、４日目にピークを迎え、そして迅速に除去される。これらの動物は、明らかな気道疾患を示さないが、肺の病理学を示す。高用量のウイルス感染において、これらは、体重減少、肺機能の変化、および毛皮の乱れ（ｒｕｆｆｌｅｄ  ｆｕｒ）を示し、これらは疾患の指標である。
【０１５２】
上の実施例３に記載したものと同じ診断アッセイを、動物から採取したサンプル（例えば、鼻、頬および咽頭のスワブ）におけるｓｉＲＮＡ媒介型遺伝子サイレンシングおよびＲＳＶ感染もしくはインフルエンザＨ５Ｎ１感染の阻害をモニタリングするために使用する。さらに、肺の病理学、肺の免疫組織化学および症状観察を実施し、インビボでのＲＳＶ感染もしくはインフルエンザＨ５Ｎ１感染におけるｓｉＲＮＡの効力を決定する。
【０１５３】
（実施例５．非ヒト霊長類モデルにおける、ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子の阻害）
本実施例は、非ヒト霊長類における、ＲＳＶもしくはインフルエンザＨ５Ｎ１のウイルス複製のｓｉＲＮＡ媒介型阻害の研究を記載する。用量投与の効力および安全性が、本研究の主要な目的である。
【０１５４】
本発明者らのプロトコールに基づき、別の呼吸性疾患であるＳＡＲＳについてのアカゲザルモデルを用いて、３０ｍｇ／ｋｇ体重までのｓｉＲＮＡの用量は耐容可能であり、動物に毒性の徴候を示さない。（２２）非ヒト霊長類哺乳動物によって事前にスクリーニングされているｓｉＲＮＡの呼吸器送達（吸入もしくは点滴注入による）は、ウイルス複製の阻害ならびにウイルス誘導型病理学および疾患様症状の軽減に対して実質的に影響することを示した。ＲＳＶもしくはインフルエンザＨ５Ｎ１の本研究のために、同じ送達経路を使用し、そして類似の投薬量のｓｉＲＮＡを送達する。
【０１５５】
小動物研究について記載された実験（実施例４）に加え、以下のアッセイが、霊長類において容易に実施され、そして治療効力のより直接的な評価に寄与する。
【０１５６】
（１）ウイルス散布性：ウイルス散布性を、感染したサルの鼻咽頭洗浄サンプルを用いて測定する。ウイルス収量を、ＴＣＩＤ５０（細胞融合体ベース）および／または免疫蛍光アッセイのいずれかによって滴定する。
【０１５７】
（２）鼻咽頭洗浄サンプルのＲＴＱ−ＰＣＲ：ウイルスゲノムコピー数の変化をモニタリングする。
【０１５８】
（３）症状モニタリング：ヒト乳児患者において観察されるような細気管支炎症状を見出しやすい。
【０１５９】
本発明は、本発明の種々の例示的実施形態に関して記載され、そして説明されているが、均等な実施形態および種々の他の改変、付加および削除が、これらの実施形態において、そしてこれらの実施形態に対して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、なされ得る。
【０１６０】
（参考文献）
【０１６１】
【化３】
2009526516.tif 000028
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】ヒトＲＳウイルス（ｈＲＳＶ、ＲＳＶ）（−）ｓｓＲＮＡゲノムの概略図。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１７８１に基づく。
【図２】インフルエンザＡ型ウイルス構造の概略図。この図は、ウイルスゲノムの８つのセグメントが、ビリオン内に組み込まれていることを示す。
【図３】本発明のポリヌクレオチドの種々の実施形態の概略図。パネルＡは、直鎖状ポリヌクレオチドの実施形態。長さは、２００ヌクレオチド以下かつ１５ヌクレオチド以上である。（ｂ）において、記載の標的性配列は、より大きな標的性配列内に含まれる。（ｄ）において、暗色の垂直の棒は、置換されたヌクレオチドを図解する。パネルＢは、全体の長さが２００ヌクレオチド以下のヘアピンポリヌクレオチドの実施形態である。
【図４】ｓｉＲＮＡ配列のＨ５Ｎ１ゲノム内の配置を示す概略図である。
【図５−１】ＭＤＣＫ細胞培養物におけるＨ５Ｎ１ウイルス増殖の阻害。
【図５−２】ＭＤＣＫ細胞培養物におけるＨ５Ｎ１ウイルス増殖の阻害。
【図６】異なる時点で決定されたｓｉＲＮＡの阻害性効果。
【図１】
2009526516.tif 000029
【図２】
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【図３】
2009526516.tif 000031
【図４】
2009526516.tif 000032
【図５−１】
2009526516.tif 000033
【図５−２】
2009526516.tif 000034
【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009526516.tif 000038
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