(57)【要約】  本発明は、少なくとも1種の第1抗原と複合体化された、Gb3受容体に結合するものを除く、細菌毒素またはその免疫学的に機能的な誘導体から誘導されたMHCクラスI経路を標的化する非生ベクターを含み、少なくとも1種の第2抗原(第1抗原と同一であっても、もしくは異なっていてもよい)とアジュバントとをさらに含むワクチン組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1種の第1抗原と複合体化された、Gb3受容体に結合するものを除く、細菌毒素またはその免疫学的に機能的な誘導体から誘導されたMHCクラスI経路を標的化する非生ベクターを含み、少なくとも1種の第2抗原とアジュバントとをさらに含むワクチン組成物。
【請求項２】
非生ベクターが、炭疽菌致死因子(LF)、緑膿菌外毒素A、大腸菌不安定毒素(LT1)に由来するBサブユニット、LT2、コレラ毒素(CT)、百日咳菌毒素(PT)、サブチラーゼ細胞毒素および百日咳菌由来アデニル酸シクラーゼAからなる群より選択される、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
非生ベクターが大腸菌不安定毒素(LT)に由来するBサブユニットまたはその免疫学的に機能的な等価物である、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
アジュバントが、金属塩、水中油乳濁液、Toll様受容体リガンド、サポニンまたはその組合せからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
アジュバントがToll様受容体リガンドである、請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
Toll様受容体リガンドがアゴニストである、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記抗原と、細菌毒素またはその免疫学的に機能的な誘導体から誘導された非生ベクターとを一緒に複合体化させる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記抗原と、細菌毒素またはその免疫学的に機能的な誘導体から誘導された非生ベクターとを共有結合させる、請求項１〜７のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記抗原と、細菌毒素またはその免疫学的に機能的な誘導体から誘導された非生ベクターとを融合タンパク質として連結する、請求項８に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
アジュバントが、金属塩、サポニン、リピドAもしくはその誘導体、アルキルグルコサミニドホスフェート、免疫刺激性オリゴヌクレオチドまたはその組合せからなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
サポニンを、リポソーム、Iscom、または水中油乳濁液の形態で提供する、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
サポニンがQS21である、請求項１０または１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
リピドA誘導体が、モノホスホリルリピドA、3-脱アシル化モノホスホリルリピドA、OM174、OM197、OM294から選択される、請求項１０、１１または１２に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
アジュバントが、以下の群：
i)サポニン、
ii)Toll様受容体4リガンド、および
iii)Toll様受容体9リガンド、
のうちの2つに由来する少なくとも1つの組合せである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
サポニンがQS21であり、Toll様受容体4リガンドが3-脱アシル化モノホスホリルリピドAであり、Toll様受容体9がCpG含有免疫刺激性オリゴヌクレオチドである、請求項１４に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
第1抗原と第2抗原が同一である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
前記抗原を、細胞内病原体または増殖性疾患から選択される疾患群に対する免疫を提供する抗原群より選択する、請求項１６に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
第1抗原と第2抗原が異なるものである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
第1抗原がHCVに由来するNS3である、請求項１８に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
第2抗原がHCVに由来するE1である、請求項１９に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
医療における使用のための、第1抗原と複合体化させた、細菌毒素またはその免疫学的に機能的な誘導体から誘導された非生ベクターを含み、第2抗原とアジュバントとをさらに含むワクチン組成物。
【請求項２２】
疾患の予防または治療のためのワクチンの製造における、第1抗原と複合体化させた、細菌毒素またはその免疫学的に機能的な誘導体から誘導された非生ベクターの使用であって、第2抗原とアジュバントとをさらに含む、前記使用。
【請求項２３】
抗原特異的CD8応答の誘起のための請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のワクチン組成物を、疾患に罹患しているか、または疾患に罹りやすい患者に投与することを含む、疾患を治療または予防する方法。
【請求項２５】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のワクチンを患者に投与することを含む、抗原特異的CD8免疫応答を誘起させるための方法。
【請求項２６】
MHCクラスI経路を標的化する非生ベクターまたはその免疫学的に機能的な誘導体と組み合わせた第1抗原を、アジュバントおよび第2抗原と混合する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のワクチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良されたワクチン組成物、その作製方法および医療におけるその使用を提供する。具体的には、本発明は、第1抗原と複合体化させた抗原のMHCクラスI提示を改善することができる薬剤と、第1抗原と同一か、もしくは異なっていてもよい第2抗原とを含むアジュバント化ワクチン組成物であって、アジュバントと共に製剤化される前記組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
細胞性応答の支配的な誘導を必要とするワクチンの開発は、依然として挑戦である。細胞性免疫応答の主要なエフェクター細胞であるCD8+ T細胞は病原体に感染した細胞において合成される抗原を認識するため、ワクチン接種の成功にはワクチン被接種者の細胞中での免疫原性抗原の合成が必要である。これを、生弱毒化ワクチンを用いて達成することができるが、これらには有意な限界も存在する。第1に、ワクチン被接種者が免疫抑制されている場合、または病原体自身が免疫抑制を誘導し得る(例えば、ヒト免疫不全ウイルス)場合、感染の危険性が存在する。第2に、いくつかの病原体は、細胞培養物中で増殖させるのが困難であるか、または不可能である(例えば、C型肝炎ウイルス)。不活化全細胞ワクチンまたはミョウバンアジュバント化組換えタンパク質サブユニットワクチンなどの他の現存するワクチンは、CD8応答の誘導因子としては非常に弱い。
【０００３】
これらの理由から、代替的な手法が開発されている：生ベクターワクチン、プラスミドDNAワクチン、合成ペプチドまたは特異的アジュバント。生ベクターワクチンは、強力な細胞性応答の誘導においては良好であるが、該ベクターに対する予め存在する(例えば、アデノウイルス)免疫またはワクチンにより誘導された免疫は、追加のワクチン用量の効力を危うくする場合がある(Casimiroら、JOURNAL OF VIROLOGY, 2003年6月, p. 6305-6313)。プラスミドDNAワクチンも、細胞性応答を誘導することができるが(Casimiroら、JOURNAL OF VIROLOGY, 2003年6月, p. 6305-6313)、ヒトにおいては依然として弱く(Mc Conkeyら、Nature Medicine 9, 729-735, 2003)、抗体応答が非常に弱い。さらに、合成ペプチドは現在臨床試験において評価されているが(Khongら、J Immunother 2004;27:472-477)、限られた数のT細胞エピトープをコードするそのようなワクチンの効力は、ワクチン回避突然変異体の出現またはHLA適合患者のための第一選択の必要性により阻害され得る。
【０００４】
非生ベクターを用いる抗原送達に基づくMHCクラスI提示を改善することを目的とする代替的な手法も記載されてきた。いくつかの非生ベクターは、例えば、炭疽菌LFn毒素(Ballardら(1996) PNAS USA 93 pp12531-12534)、百日咳菌アデニル酸シクラーゼ毒素 (Fayolleら(1996) J. Immunology 156 p 4697-4706)またはシュードモナス外毒素A (Donnellyら、PNAS USA (1993) 90 pp 3530-3534)などの細菌毒素から誘導されたものである。
【発明の開示】
【０００５】
ワクチン抗原および送達系の限界は、新規ワクチン組成物に関する探索を正当化する。本発明者らは、MHCクラスI提示を改善することを目的とする非生ベクターを含む組成物中へのアジュバントの包含が、得られる免疫応答、特に、CD8特異的応答に対する有益な効果を有し得ることを見出した。この有益な効果は、アジュバントにより与えられる免疫応答の活性化と、MHC1経路を標的化する薬剤により提供される抗原の正確な送達との組合せのために生じると考えられる。
【０００６】
さらに、上記で考察したように、CD4応答を同時に活性化するか、または特異的抗体応答を生成させながら、CD8応答を活性化することができるワクチン組成物が有利であろう。
【０００７】
従って、本発明は、第1抗原と複合体化された、Gb3受容体に結合するものを除く、MHCクラスI提示を改善することを目的とする非生ベクターまたはその免疫学的に機能的な誘導体を含み、第1抗原と同一であるか、または異なっていてもよい1種以上の第2抗原と、アジュバントとをさらに含むワクチン組成物を提供する。
【０００８】
本発明者らはまた、遊離形態および複合体化された形態の両方での同一抗原の包含が、該抗原に対する細胞性および体液性免疫の両方の活性化を可能にすることも見出した。本発明者らはさらに、複合体化された形態の1種の抗原および遊離形態の1種の抗原の包含が、両抗原に対する細胞性および体液性免疫の活性化を可能にし、それによって完全な免疫応答を提供することを見出した。本発明者らはまた、MHCクラスI提示を標的化する非生ベクターと複合体化させた抗原を含み、遊離抗原をさらに含む組成物中へのアジュバントの包含が、特に、複合体化された抗原に対する免疫応答に対する有益な効果を有することも見出した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本明細書で用いられる用語「非生ベクター」を、MHCクラスI提示を標的化する抗原送達物質と定義する。この用語は、弱毒化ウイルス、細菌、またはプラスミドDNAなどの複製するベクターを包含することは意図されない。この非生ベクターは、細菌毒素から誘導されたものであり、すなわち、非生ベクターは、解毒された細菌毒素、サブユニットまたはその免疫学的に機能的な等価物である。
【００１０】
本発明に関連して、用語「毒素」とは、それらがヒトに対してもはや毒性的ではないように解毒された毒素、またはヒトにおいて毒性活性を実質的に持たない毒素サブユニットもしくはその断片を意味すると意図される。
【００１１】
解毒された毒素に基づく好ましい非生ベクターは、炭疽菌(anthrax)の致死因子(LF)のアミノ末端ドメイン、緑膿菌(P. aeruginosa)の外毒素A、大腸菌の不安定毒素(LT)のBサブユニット、および百日咳菌(B. pertussis)に由来するアデニル酸シクラーゼAである。一実施形態においては、非生ベクターは、大腸菌のI型不安定毒素(LTI)に由来するBサブユニットである。一実施形態においては、非生ベクターは、AB5ファミリーのファミリーである毒素、例えば、LT2、コレラ毒素(CT)、百日咳毒素(PT)ならびに最近同定されたサブチラーゼ細胞毒素(Patonら、J Exp Med 2004, Vol 200 pp 35-46)から誘導されたものである。
【００１２】
炭疽菌(B. anthracis; anthrax)LFに由来するアミノ末端ドメインは、LFnとして知られる。それは、LFのN末端の255アミノ酸である。LFは、防御抗原(PA)への結合および転座の媒介にとって必要な情報を含むことがわかっている。このドメイン単独では、推定酵素カルボキシル末端部分に依存する致死性を欠く(AroraおよびLeppla (1993) J. Biol Chem 268 pp 3334-3341)。さらに、LFnドメインと、外来抗原との融合タンパク質が、PAの非存在下でもCD8 T細胞免疫応答を誘導することができることが最近見出され(Kushnerら(2003), PNAS 100 pp 6652-6657)、これは、担体としてPAを含まないLFnを用いて、抗原を細胞質ゾル中に送達することができることを示唆している。
【００１３】
大腸菌の不安定毒素(LT1)は、ペンタマーBサブユニットとモノマーAサブユニットの2個のサブユニットからなる。Aサブユニットは毒性を担うが、Bサブユニットは細胞への輸送を担う。LTは、GM1ガングリオシド受容体に結合する。
【００１４】
Donnellyら(上掲)は、緑膿菌から毒性ドメインを除去することができ、残りの毒素は細胞への抗原の輸送を依然として媒介することができることを証明している。さらに、完全長毒素からのアミノ酸の欠失は、それが細胞質ゾルに接近する能力を損なわないが、この突然変異がADP-リボシル化活性を排除するため、それを非毒性にする。この突然変異に基づいて、様々なサイズの抗原配列をコードするキメラを構築することができる(Fitzgerald, J Biol Chem, Vol. 273, Issue 16, 9951-9958, April 17, 1998)。
【００１５】
アデニル酸シクラーゼ毒素は、樹状細胞の表面でCD11b受容体に結合する。CD8+ T細胞エピトープを担持する組換えトキソイドは、マウスにおいて特異的CTL応答を誘導することができ、実験的腫瘍に対する防御が証明された(Fayolleら、J Immunol 1999, 162 pp 4157-4162)。送達されたエピトープの表面提示は、古典的MHCクラスI経路を介して起こる。
【００１６】
細菌毒素から誘導される特定の非生ベクターの免疫学的に機能的な等価物を、本明細書ではその非生タンパク質ベクターと少なくとも50％のアミノ酸配列同一性、例えば、60、70、80、90、95または96、97、98または99％の同一性を保持し、さらにMHCクラスI経路に抗原を標的化することができるタンパク質と定義する。例えば、前記非生ベクターの機能に影響しないアミノ酸欠失、挿入、または置換を行うことができる。特定の毒素のための受容体が公知である場合、免疫学的に機能的な等価物を、該細菌毒素と少なくとも50％のアミノ酸配列同一性を保持し、さらにその受容体に結合することができるタンパク質と定義する。例えば、LtのBサブユニットの場合、免疫学的に機能的な等価物を、LtのBサブユニットと少なくとも50％の配列同一性を保持し、さらにGM1ガングリオシド受容体に結合することができるタンパク質と定義する。そのような免疫学的に機能的な等価物は、それ自身、細菌毒素であってよく、例えば、コレラ毒素(CT)のBサブユニットは、LTの免疫学的に機能的な等価物である。ベクターまたは等価物がGM1受容体に結合するかどうかを、例えば、以下の実施例1.1に記載のプロトコルに従うことにより決定することができる。
【００１７】
本発明において用いることができる他のベクターを、ファージディスプレイライブラリー(時には、バイオパンニングとしても知られる技術)をスクリーニングするために、細菌毒素が結合することが知られる受容体または受容体模倣物質を用いることにより誘導することができる。そのような技術は、細菌毒素と同じ受容体に結合することができるが、該毒素に対する配列類似性をほとんど有さないか、または全く有さないペプチド(例えば、最大で20アミノ酸長など)を提供するであろう。この技術は、GB3受容体(Miuraら、Biochimica et Biphysica Acta 1673 (2004) pp 131-138)およびGM1受容体(Matsubaraら、FEBS letters 456 (1999) 253-256)に結合するペプチドを作製する有効な方法であることが示されている。そのようなペプチドは、同じ受容体に結合する細菌毒素と同じ方法でベクターとして働くことができるようである。そのようなペプチドは、それらが細菌毒素が結合するのと同じ受容体をスクリーニングすることにより誘導されるため、「細菌毒素から誘導されるベクター」の定義内にあると考えられる。しかしながら、一実施形態においては、「細菌毒素から誘導される」本発明のベクターは、実際には細菌毒素またはその免疫学的に機能的な等価物である。
【００１８】
本発明の範囲内に含まれないのは、Gb3受容体に結合することができる非生ベクターまたはその免疫学的に機能的な等価物である。ベクターまたは等価物がGb3受容体に結合するかどうかを、例えば、以下の実施例1.4に記載のプロトコルに従うことにより決定することができる。
【００１９】
本発明の組成物は、本発明のタンパク質と複合体化させた抗原に対するCD8特異的免疫応答を改善することができる。本発明のタンパク質と複合体化させた第1抗原とアジュバントを含まない第2抗原とを含む組成物に対する応答、または第1および第2抗原とアジュバントを含む製剤に対する応答と比較した場合の、本発明のタンパク質と複合体化させた第1抗原と、第2抗原とを含み、さらにアジュバントを含む本発明の組成物に対する応答を見ることにより、改善を測定する。改善を、免疫応答のレベルの増加、より低用量の抗原を用いた場合の等価な免疫応答の生成、免疫応答の質の上昇、免疫応答の持続性の増加、または上記の任意の組合せと定義することができる。そのような改善を、1回目の免疫後に認めることができ、および／またはその後の免疫後に認めることができる。
【００２０】
特定のアジュバントは、金属塩、水中油乳濁液、Toll様受容体リガンド(具体的には、Toll様受容体2リガンド、Toll様受容体3リガンド、Toll様受容体4リガンド、Toll様受容体7リガンド、Toll様受容体8リガンドおよびToll様受容体9リガンド)、サポニンまたはその組合せからなる群より選択されるものである。一実施形態においては、前記アジュバントは、唯一のアジュバントとして金属塩を含まない。別の実施形態においては、前記アジュバントは、金属塩を含まない。一実施形態においては、Toll様受容体リガンドは、受容体アゴニストである。別の実施形態においては、Toll様受容体リガンドは、受容体アンタゴニストである。本明細書および特許請求の範囲を通して用いられる用語「リガンド」とは、受容体に結合することができ、該受容体の活性を上方調節するか、または下方調節する効果を有する実体を意味すると意図される。
【００２１】
好ましくは、アジュバントを、サポニン、リピドAもしくはその誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、アルキルグルコサミニドホスフェート、またはその組合せからなる群より選択する。さらに好ましいアジュバントは、別のアジュバントと組み合わせた金属塩である。アジュバントは、Toll様受容体リガンド、特に、Toll様受容体2、3、4、7、8もしくは9のリガンド、またはサポニン、特に、QS21であるのが好ましい。アジュバント系は、上記一覧に由来する2種以上のアジュバントを含むのがさらに好ましい。具体的には、前記組合せは、サポニン(特に、QS21)アジュバントおよび／またはCpGもしくはCpR(式中、Rは非天然グアノシンヌクレオチドである)などの他の免疫刺激モチーフを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドなどのToll様受容体9リガンドを含む。他の好ましい組合せは、サポニン(特に、QS21)およびモノホスホリルリピドAもしくはその3脱アシル化誘導体、3D-MPLなどのToll様受容体4リガンド、またはサポニン(特に、QS21)およびアルキルグルコサミニドホスフェートなどのToll様受容体4リガンドを含む。他の好ましい組合せは、TLR3または4リガンドと、TLR8または9リガンドとを含む。
【００２２】
特に好ましいアジュバントは、3D-MPLとQS21の組合せ(EP 0 671 948 B1)、3D-MPLとQS21を含む水中油乳濁液(WO 95/17210、WO 98/56414)、または他の担体と共に製剤化された3D-MPL(EP 0 689 454 B1)である。他の好ましいアジュバント系は、米国特許第6,558,670号、同第6,544,518号に記載の3D-MPL、QS21およびCpGオリゴヌクレオチドの組合せを含む。
【００２３】
一実施形態においては、前記アジュバントは、Toll様受容体(TLR)4リガンドであり、好ましくは、リピドA誘導体、具体的には、モノホスホリルリピドAまたはより具体的には、3-脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)などのリガンドである。
【００２４】
3D-MPLは、GSK biologicalsにより商標MPL(登録商標)の下で販売されており、主にCD4+ T細胞応答を促進し、IFN-g(Th1)表現型を有する。それを、GB 2 220 211 Aに開示された方法に従って製造することができる。化学的には、それは、3-脱アシル化モノホスホリルリピドAと、3、4、5または6アシル化鎖との混合物である。好ましくは、本発明の組成物においては、小粒子3D-MPLを用いる。小粒子3D-MPLは、0.22μmフィルターを通して滅菌濾過することができるような粒子径を有する。そのような調製物は、国際特許出願WO 94/21292に記載されている。リピドAの合成誘導体は公知であり、TLR4リガンドであると考えられ、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる。
【００２５】
OM174 (2-デオキシ-6-o-[2-デオキシ-2-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラ-デカノイルアミノ]-4-o-ホスホノ-β-D-グルコピラノシル]-2-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-α-D-グルコピラノシルジヒドロゲンホスフェート) (WO 95/14026)。
【００２６】
OM294 DP(3S,9R)-3-[(R)-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9(R)-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]デカン-1,10-ジオール,1,10-ビス(ジヒドロゲンホスフェート) （WO 99/64301およびWO 00/0462）。
【００２７】
OM197 MP-AcDP(3S-,9R)-3-[(R)-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]デカン-1,10-ジオール,1-ジヒドロゲンホスフェート10-(6-アミノヘキサノエート) (WO 01/46127)。
【００２８】
用いることができる他のTLR4リガンドは、WO 98/50399もしくは米国特許第6,303,347号(AGPの調製方法も開示されている)に開示されたものなどのアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)、または米国特許第6,764,840号に開示されたようなAGPの製薬上許容し得る塩である。いくつかのAGPはTLR4アゴニストであり、いくつかはTLR4アンタゴニストである。両方ともアジュバントとして有用であると考えられる。
【００２９】
本発明における使用のための別の好ましい免疫刺激剤は、Quil Aおよびその誘導体である。Quil Aは、南米の樹木キラヤ・サポナリア・モリナ(Quilaja Saponaria Molina)から単離されたサポニン調製物であり、1974年にDalsgaardら(「サポニンアジュバント(Saponin adjuvants)」、Archiv. fur die gesamte virusforschung, Vol.44, Springer Verlag, Berlin, p243-254)によりアジュバント活性を有すると初めて記載された。例えば、QS7およびQS21(QA7およびQA21としても知られる)などのQuil Aと関連する毒性を持たずにアジュバント活性を保持するQuil Aの精製された断片が、HPLCにより単離された(EP 0 362 278)。QS-21は、キラヤ・サポナリア・モリナの樹皮から誘導された天然サポニンであり、CD8+細胞傷害性T細胞(CTL)、Th1細胞および顕著なIgG2a抗体応答を誘導し、本発明に関連して好ましいサポニンである。
【００３０】
QS21の特定の製剤が記載されており、特に好ましくは、これらの製剤はステロールをさらに含む(WO 96/33739)。本発明のサポニン形成部分は、ミセル、混合ミセル(胆汁塩のみではないが、主に胆汁塩を含む)の形態で分離していてもよく、またはコレステロールおよび脂質と共に製剤化した場合、ISCOMマトリックス(EP 0 109 942 B1)、ワーム状もしくは環状マルチマー複合体もしくは脂質／層化構造およびラメラなどのリポソームもしくは関連するコロイド状構造の形態にあってもよく、または水中油乳濁液(例えば、WO 95/17210に記載のような)の形態にあってもよい。サポニンは、好ましくは水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムなどの金属塩と結合していてもよい(WO 98/15287)。好ましくは、サポニンを、リポソーム、ISCOMまたは水中油乳濁液の形態で提供する。
【００３１】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドまたは任意の他のToll様受容体(TLR)9リガンドを用いることもできる。本発明のアジュバントまたはワクチンにおける使用にとって好ましいオリゴヌクレオチドは、CpG含有オリゴヌクレオチド、好ましくは、少なくとも3個、より好ましくは少なくとも6個以上のヌクレオチドにより分離された2個以上のジヌクレオチドCpGモチーフを含有するオリゴヌクレオチドである。CpGモチーフは、シトシンヌクレオチド、次いで、グアニンヌクレオチドである。本発明のCpGオリゴヌクレオチドは、典型的には、デオキシヌクレオチドである。好ましい実施形態においては、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間結合はジチオリン酸であるか、またはより好ましくは、チオリン酸結合であるが、ホスホジエステルおよび他のヌクレオチド間結合も本発明の範囲内にある。また、混合ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。チオリン酸オリゴヌクレオチドまたはジチオリン酸を製造する方法は、米国特許第5,666,153号、同第5,278,302号およびWO 95/26204に記載されている。
【００３２】
好ましいオリゴヌクレオチドの例は、以下の配列を有する。この配列は、チオリン酸修飾されたヌクレオチド間結合を含むのが好ましい。
【００３３】
OLIGO 1 (配列番号1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)
OLIGO 2 (配列番号2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)
OLIGO 3 (配列番号3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
OLIGO 4 (配列番号4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)
OLIGO 5 (配列番号5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)
OLIGO 6 (配列番号6): TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456)。
【００３４】
代替的なCpGオリゴヌクレオチドは、それらがそこでの重要でない欠失または付加を有するような上記の好ましい配列を含んでもよい。
【００３５】
代替的な免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドに対する改変を含んでもよい。例えば、WO 0226757およびWO 03507822は、CpG含有免疫刺激性オリゴヌクレオチドのCおよびG部分に対する改変を開示している。
【００３６】
本発明において用いられる免疫刺激性オリゴヌクレオチドを、当業界で公知の任意の方法(例えば、EP 468520を参照されたい)により合成することができる。都合の良いことには、そのようなオリゴヌクレオチドを、自動化合成装置を用いて合成することができる。
【００３７】
TLR2リガンドの例としては、ペプチドグリカンまたはリポタンパク質が挙げられる。イミキモッドおよびレシキモッドなどのイミダゾキノリンが、公知のTLR7リガンドである。一本鎖RNAも公知のTLRリガンドであるが(ヒトにおいてはTLR8、マウスにおいてはTLR7)、二本鎖RNAおよびポリIC(ポリイノシン-ポリシチジル酸-ウイルスRNAの市販の合成模倣物質)はTLR3リガンドの例である。3D-MPLはTLR4リガンドの例であるが、CPGはTLR9リガンドの例である。
【００３８】
細菌毒素またはその免疫学的に機能的な等価物から誘導された非生ベクターと、抗原とを一緒に複合体化する。複合体化とは、細菌毒素またはその免疫学的に機能的な等価物から誘導された非生ベクターと、第1抗原とを、例えば、静電気的もしくは疎水的相互作用または共有結合を介して、物理的に結合させることを意味する。好ましい実施形態においては、細菌毒素またはその免疫学的に機能的な等価物から誘導された非生ベクターを、融合タンパク質として共有結合させるか、または例えば、システイン残基を介して化学的にカップリングする。本発明の実施形態においては、ベクターあたり2、3、4、5、6種の抗原分子などの2種以上の抗原を、各非生ベクターまたはその免疫学的に機能的な等価物に連結する。2種以上の抗原が存在する場合、これらの抗原は全て同一であってもよく、1種以上は他のものと異なっていてもよく、または全ての抗原は互いに異なっていてもよい。
【００３９】
抗原自身は、1種以上の目的のエピトープを包含するペプチド、またはタンパク質であってよい。本発明により意図される様式で製剤化した場合、第1抗原がHIV、結核、クラミジア、HBV、HCV、およびインフルエンザなどの細胞内病原体に対する免疫を提供するように、該第1抗原を選択することが好ましい実施形態である。本発明はまた、良性障害および癌などの増殖性障害に対する明らかな免疫応答を生じ得る抗原についても有用である。
【００４０】
好ましくは、本発明のワクチン製剤は、ヒト病原体に対する免疫応答を引き出すことができる抗原または抗原組成物を含み、その抗原または抗原組成物は、HIV-1(p24、tat、nefなどのgagもしくはその断片、gp120もしくはgp160などのエンベロープ、またはこれらの任意の断片)、gDもしくはその誘導体またはHSV1もしくはHSV2に由来するICP27などの極初期タンパク質などのヒトヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス((特に、ヒト)(gBもしくはその誘導体など))、ロタウイルス抗原、エプスタイン・バーウイルス(gp350もしくはその誘導体など)、水痘-帯状疱疹ウイルス(gpI、IIおよびIE63など)、またはB型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルス(例えば、B型肝炎表面抗原もしくはその誘導体)に由来するか、またはA型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルスおよびE型肝炎ウイルスに由来する抗原であるか、またはパラミクソウイルス、呼吸器合胞体ウイルス(F、GおよびNタンパク質もしくはその誘導体など)、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス(例えば、HPV6、11、16、18)、フラビウイルス(例えば、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス)もしくはインフルエンザウイルス(精製されたタンパク質、もしくはその組換えタンパク質、例えば、HA、NP、NA、もしくはMタンパク質、またはその組合せ)などの他のウイルス病原体に由来するか、またはナイセリア・ゴノレア(N. gonorrhea)およびナイセリア・メニンギティディス(N. meningitidis)などのナイセリア種(例えば、トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、PilC、アドヘシン)；ストレプトコッカス・ピオジェネス(S.pyogenes)(例えば、Mタンパク質もしくはその断片、C5Aプロテアーゼ)、ストレプトコッカス・アガラクチア(S. agalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(S. mutans); ヘモフィルス・デュクレイ(H. ducreyi)；モラクセラ・カタラリス(M. catarrhalis)(ブランハメラ・カタラリス(Branhamella catarrhalis)としても知られる)などのモラクセラ種(例えば、高分子量および低分子量アドヘシンおよびインベイシン)；ボルデテラ・ペルツシス(B. pertussis)(例えば、ペルタクチン、百日咳毒素もしくはその誘導体、繊維性ヘマグルチニン、アデニル酸シクラーゼ、フィンブリア)、ボルデテラ・パラペルツシス(B. parapertussis)およびボルデテラ・ブロンキセプティカ(B. bronchiseptica)などのボルデテラ種；マイコバクテリウム・ツベルクロシス(M. tuberculosis)(例えば、ESAT6、85A、-Bもしくは-C抗原)、マイコバクテリウム・ボビス(M. bovis)、マイコバクテリウム・レプラ(M. leprae)、マイコバクテリウム・アビウム(M. avium)、マイコバクテリウム・パラツベルクロシス(M. paratuberculosis)、マイコバクテリウム・スメングマティス(M. smengmatis)などのマイコバクテリウム種；レジオネラ・ニューモフィラなどのレジオネラ種；腸毒性大腸菌(例えば、コロニー形成因子、熱不安定毒素もしくはその誘導体、熱安定毒素もしくはその誘導体)、腸管出血性大腸菌、病原性大腸菌などのエシェリシア種；ビブリオ・コレラ(V. cholera)(例えば、コレラ毒素もしくはその誘導体)などのビブリオ種；シゲラ・ソネイ(S. sonnei)、シゲラ・ディセンテリエ(S. dysenteriae)、シゲラ・フレクスネリ(S. flexnerii)などのシゲラ種；エルシニア・エンテロコリティカ(Y. enterocolitica)(例えば、Yopタンパク質)、エルシニア・ペスティス(Y. pestis)、エルシニア・シュードツベルクロシス(Y. pseudotuberculosis)などのエルシニア種；カンピロバクター・ジェジュニ(C. jejuni)(例えば、毒素、アドヘシンおよびインベイシン)およびカンピロバクター・コリ(C. coli)などのカンピロバクター種；サルモネラ・ティフィ(S. typhi)、サルモネラ・パラティフィ(S. paratyphi)、サルモネラ・コレラスイス(S. choleraesuis)、サルモネラ・エンテリティディス(S. enteritidis)などのサルモネラ種；リステリア・モノサイトジェンス(L. monocytogenes)などのリステリア種；ヘリコバクター・ピロリ(例えば、ウレアーゼ、カタラーゼ、細胞空胞化毒素)などのヘリコバクター種；シュードモナス・エルギノーサ(P. aeruginosa)などのシュードモナス種；スタフィロコッカス・オーレウス(S. aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(S. epidermidis)などのスタフィロコッカス種；エンテロコッカス・ファカリス(E. faecalis)、エンテロコッカス・ファシウム(E. faecium)などのエンテロコッカス種；クロストリジウム・テタニ(C. tetani)(例えば、破傷風毒素およびその誘導体)、クロストリジウム・ボツリナム(C. botulinum)(例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体)、クロストリジウム・ディフィシル(C. difficile)(例えば、クロストリジウム毒素AもしくはBおよびその誘導体)などのクロストリジウム種；バチルス・アントラシス(B. anthracis)(例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体)などのバチルス種；コリネバクテリウム・ジフテリア(C. diphtheriae)(例えば、ジフテリア毒素およびその誘導体)などのコリネバクテリウム種；ボレリア・ブルグドフェリ(B. burgdorferi)(例えば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、ボレリア・ガリニ(B. garinii)(例えば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、ボレリア・アフゼリ(B. afzelli)(例えば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、ボレリア・アンダーソニー(B. andersonii)(例えば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、ボレリア・ヘルムシ(B. hermsii)などのボレリア種；エールリヒア・エクイ(E. equi)などのエールリヒア種およびヒト顆粒球性エールリヒア症の作用因子；リケッチア・リケッチ(R. rickettsii)などのリケッチア種；クラミジア・トラコマティス(C. trachomatis)(例えば、MOMP、ヘパリン結合タンパク質)、クラミジア・ニューモニア(C. pneumoniae)(例えば、MOMP、ヘパリン結合タンパク質)、クラミジア・シッタシ(C. psittaci)などのクラミジア種；レプトスピラ・インテロガンス(L. interrogans)などのレプトスピラ種；トレポネマ・パリダム(T. pallidum)(例えば、稀な外膜タンパク質)、トレポネマ・デンティコラ(T. denticola)、トレポネマ・ハイオディセンテリー(T. hyodysenteriae)などのトレポネマ種などの細菌病原体から誘導された抗原；またはプラスモジウム・ファルシパルム(P. falciparum)などのプラスモジウム種；トキソプラズマ・ゴンジ(T. gondii)(例えば、SAG2、SAG3、Tg34)などのトキソプラズマ種；エントアメーバ・ヒストリティカ(E. histolytica)などのエントアメーバ種；バベシア・ミクロチ(B. microti)などのバベシア種；トリパノソーマ・クルージ(T. cruzi)などのトリパノソーマ種；ジアルジア・ランブリア(G. lamblia)などのジアルジア種；レーシュマニア・メジャー(L. major)などのレーシュマニア種；ニューモシスティス・カリニ(P. carinii)などのニューモシスティス種；トリコモナス・バギナリス(T. vaginalis)などのトリコモナス種；スキゾストーマ・マン��ニ(S. mansoni)などのスキゾストーマ種などの寄生虫から誘導された抗原、またはカンジダ・アルビカンス(C. albicans)などのカンジダ種；クリプトコッカス・ネオフォーマンス(C. neoformans)などのクリプトコッカス種などの酵母から誘導された抗原である。
【００４１】
結核菌(M. tuberculosis)のための他の好ましい特異的抗原は、例えば、Tb Ra12、Tb H9、Tb Ra35、Tb38-1、Erd 14、DPV、MTI、MSL、mTTC2およびhTCC1 (WO 99/51748)である。結核菌のためのタンパク質としては、少なくとも2種、好ましくは、3種の結核菌のポリペプチドを、より大きいタンパク質に融合させた融合タンパク質およびその変異体も挙げられる。好ましい融合物としては、Ra12-TbH9-Ra35、Erd14-DPV-MTI、DPV-MTI-MSL、Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erd14-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、TbH9-DPV-MTI (WO 99/51748)が挙げられる。
【００４２】
クラミジアのための最も好ましい抗原としては、例えば、高分子量タンパク質(HMW)(WO 99/17741)、ORF3(EP 366 412)、および推定膜タンパク質(Pmps)が挙げられる。ワクチン製剤の他のクラミジア抗原を、WO 99/28475に記載の群より選択することができる。
【００４３】
好ましい細菌ワクチンは、肺炎連鎖球菌(S.pneumoniae)などのストレプトコッカス種から誘導された抗原(例えば、PsaA、PspA、ストレプトリシン、コリン結合タンパク質)およびタンパク質抗原ニューモリシン(Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubinsら、Microbial Pathogenesis, 25, 337-342)、ならびにその突然変異解毒誘導体(WO 90/06951; WO 99/03884)を含む。他の好ましい細菌ワクチンは、B型インフルエンザ菌、非分類型インフルエンザ菌などのヘモフィルス種から誘導された抗原、例えば、OMP26、高分子量アドヘシン、P5、P6、Dタンパク質およびリポタンパク質D、ならびにフィンブリンおよびフィンブリン由来ペプチド(米国特許第5,843,464号)またはその複数コピー変異体もしくは融合タンパク質を含む。
【００４４】
B型肝炎表面抗原の誘導体は当業界でよく知られており、特に、欧州特許出願EP-A-414 374、EP-A-0304 578、およびEP 198-474に記載のPreS1、PreS2 S抗原が挙げられる。1つの好ましい態様においては、本発明のワクチン製剤は、特にCHO細胞中で発現させた場合、HIV-1抗原、gp120を含む。さらなる実施形態においては、本発明のワクチン製剤は、上記で定義されたgD2tを含む。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態においては、前記ワクチン組成物は、生殖器疣の原因となると考えられるヒトパピローマウイルス(HPV)(HPV6またはHPV11など)、および頸部癌の原因となるHPVウイルス(HPV16、HPV18など)から誘導された抗原を含む。
【００４６】
生殖器疣の予防用、または治療用ワクチンの特に好ましい形態は、L1タンパク質、ならびにHPVタンパク質E1、E2、E5、E6、E7、L1およびL2から選択される1種以上の抗原を含む融合タンパク質を含む。
【００４７】
融合タンパク質の最も好ましい形態は、WO 96/26277に開示されたL2E7、およびWO 99/10375に開示されたタンパク質D(1/3)-E7である。
【００４８】
好ましいHPV頸部感染もしくは癌の予防用または治療用ワクチン組成物は、HPV 16または18抗原を含んでもよい。
【００４９】
特定の好ましいHPV 16抗原は、Dタンパク質担体との融合物中に初期タンパク質E6もしくはE7を含み、HPV 16に由来するDタンパク質-E6もしくはE7融合物、またはその組合せ；またはL2とE6もしくはE7の組合せを形成する(WO 96/26277)。
【００５０】
あるいは、HPV 16または18の初期タンパク質E6およびE7を、単一の分子、好ましくはDタンパク質-E6/E7融合物中で提供してもよい。そのようなワクチンは、必要に応じて、好ましくはDタンパク質-E6もしくはDタンパク質-E7融合タンパク質またはDタンパク質-E6/E7融合タンパク質の形態の、HPV 18に由来するE6およびE7タンパク質のいずれか、または両方を含んでもよい。
【００５１】
本発明のワクチンはさらに、他のHPV株、好ましくは、HPV 31または33株に由来する抗原を含んでもよい。
【００５２】
本発明のワクチン組成物はさらに、マラリアを引き起こす寄生虫から誘導された抗原、例えば、スポロゾイト周囲タンパク質(CSタンパク質)、RTS、S、MSP1、MSP3、LSA1、LSA3、AMA1およびTRAPなどのプラスモジウム・ファルシパルムに由来する抗原を含む。RTSは、B型肝炎ウイルスの表面(S)抗原に、B型肝炎表面抗原のpreS2部分の4個のアミノ酸を介して連結されたP.falciparumのスポロゾイト周囲(CS)タンパク質のC末端部分の実質的に全部を含むハイブリッドタンパク質である。その完全な構造は、英国特許出願第9124390.7号から優先権を主張するWO 93/10152の下で公開された、国際特許出願PCT/EP92/02591に開示されている。酵母中で発現される場合、RTSはリポタンパク質粒子として産生され、HBVに由来するS抗原と共に同時発現される場合、RTS,Sとして知られる混合粒子を産生する。TRAP抗原は、WO 90/01496の下で公開された、国際特許出願PCT/GB89/00895に記載されている。多段階マラリアワクチンの成分の候補となる可能性のある他のプラスモジウム抗原は、P.falciparumのMSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP１、RAP2、セクエストリン、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230およびプラスモジウム種におけるその類似体である。本発明の一実施形態は、抗原調製物がRTS,SもしくはCSタンパク質またはRTS,SのCS部分などのその断片と、1種以上のさらなるマラリア抗原とを含み、そのいずれか、または両方を、本発明に従って志賀毒素Bサブユニットに結合させることができるマラリアワクチンである。1種以上のさらなるマラリア抗原を、例えば、MSP1、MSP3、AMA1、LSA1またはLSA3からなる群より選択することができる。
【００５３】
前記製剤は、抗腫瘍抗原を含んでもよく、癌の免疫治療的処理にとって有用である。例えば、アジュバント製剤は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌またはメラノーマに対するものなどの腫瘍拒絶抗原にとって有用である。例示的な抗原としては、MAGE1およびMAGE3もしくは他のMAGE抗原(メラノーマの治療のため)、PRAME、BAGE、またはGAGE(RobbinsおよびKawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636； Van den Eyndeら、International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997年提出); Correaleら(1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p293)が挙げられる。実際に、これらの抗原は、メラノーマ、肺癌、肉腫および膀胱癌などの様々な腫瘍型で発現される。他の腫瘍特異的抗原も本発明のアジュバントと共に使用するのに好適であり、限定されるものではないが、腫瘍特異的ガングリオシド、前立腺特異的抗原(PSA)もしくはHer-2/neu、KSA (GA733)、PAP、マンマグロビン、MUC-1、癌胎児性抗原(CEA)またはp501S(プロステイン)が挙げられる。従って、本発明の一態様においては、本発明に係るアジュバント組成物と、腫瘍拒絶抗原とを含むワクチンが提供される。
【００５４】
ワクチンが、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌またはメラノーマなどの腫瘍抗原を含むのが、本発明の特に好ましい態様である。従って、前記製剤は、腫瘍関連抗原、ならびに腫瘍支援機構(例えば、血管新生、腫瘍侵襲)に関連する抗原を含んでもよい。さらに、癌の治療におけるワクチンにとって特に関連する抗原はまた、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、p501S(プロステイン)、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、チロシナーゼ、スルビビン、NY-ESO1、プロスターゼ、PS108(WO 98/50567)、RAGE、LAGE、HAGEも含む。さらに、前記抗原は、短い10アミノ酸長のペプチドである全長ゴナドトロピンホルモン放出ホルモン(GnRH、WO 95/20600)などの自己ペプチドホルモンであってよく、多くの癌の治療、または免疫去勢(immunocastration)において有用である。
【００５５】
本発明のワクチンを、アレルギーの予防または治療に用いることができる。そのようなワクチンは、アレルゲン特異的抗原、例えば、Der p1を含むであろう。
【００５６】
本発明の一態様においては、本発明のワクチン組成物は、2種以上の異なる抗原を含み、少なくとも1種の抗原を、本発明のタンパク質と複合体化させる。そのような組成物は、本発明のタンパク質と複合体化させた抗原が病原体に由来する内部抗原であり、そのようなものとして、一般的には抗体応答を生成せず、従って、MHCクラスI提示経路に指向させる必要がある免疫応答を生じさせるのに有用であろう。さらに、前記組成物は、本発明のタンパク質と複合体化されていない少なくとも1種の第2抗原をさらに含む。好ましい態様においては、この第2の複合体化されていない抗原は、抗体応答を生じることができるか、またはMHCクラスII提示経路を介して指向させることができる。この二重手法により、免疫系の多くの異なる部門を可能な限り刺激し、それによって、防御免疫応答を生じる可能性が高くなることが確保される。
【００５７】
そのような手法は、本発明のタンパク質と複合体化されていない抗原は、外部病原体抗原(換言すれば、実質的に病原体の外側に露出され、一般的には、免疫系に対して「可視的」である抗原)、例えば、HPVのL1およびL2タンパク質、C型肝炎のE1タンパク質、インフルエンザウイルスのHAもしくはNAタンパク質、RSVのF、GもしくはSHタンパク質、HBVのHBsタンパク質、HIVのgp120タンパク質、デング熱ウイルスのEタンパク質、VZVのgEタンパク質、CMVのgBタンパク質およびEBVのgp350タンパク質、またはその免疫原性断片であり、一方、本発明のタンパク質と複合体化された抗原は内部病原体抗原である、少なくとも2種の抗原に対する免疫応答を生じさせるのに最も有用であると考えられる。後者の例としては、HPVのE1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9抗原、HSVのNS1、NS2、NS3、NS4a、4b、NS5a、5bタンパク質、インフルエンザウイルスマトリックス、核タンパク質、NS1、NS2、PB1、PB2もしくはPAタンパク質、RSVのM1、M2-1、M2-2、L、NS1、NS2、Pタンパク質もしくは核タンパク質、B型肝炎ウイルスのHBコアタンパク質、HIVのNef、tat、P27、F4もしくはP24タンパク質、CMVのpp65タンパク質またはエプスタイン・バーウイルスの潜伏期関連遺伝子、またはその免疫原性断片が挙げられる。本発明の一実施形態においては、前記抗原は2種の異なる病原体に由来するが、本発明の別の実施形態においては、該抗原は同一病原体に由来する。この実施形態においては、本発明により提供される1つの利点は、同一抗原に対するCD8およびCD4応答の提供である。
【００５８】
本発明の一実施形態においては、2種の抗原のみが存在し、その1つは本発明のタンパク質と複合体化されておらず、その1つは本発明のタンパク質と複合体化されている。さらなる実施形態においては、本発明のタンパク質と複合体化された1種の抗原のみが存在するが、前記組成物は本発明のタンパク質と複合体化されていない2種以上の抗原を含む。さらなる実施形態においては、本発明のタンパク質と複合体化されていない1種以上の抗原が存在し、本発明のタンパク質と複合体化された2種以上の抗原が存在する。この実施形態においては、それぞれの複合体化された抗原を、本発明の別のタンパク質と複合体化させるか、または2種以上の抗原、例えば、2、3、4もしくは5種の抗原を、本発明の1種のタンパク質と複合体化させることができる。
【００５９】
さらなる実施形態においては、前記組成物、ならびに本発明のタンパク質は、特許出願WO 05112991に記載のさらなるタンパク質を含んでもよい。この実施形態においては、Gb3受容体に結合することができる志賀毒素のBサブユニットまたはその免疫学的に機能的な等価物も用いて、抗原を複合体化する。かくして、例えば、本発明の組成物は、1種以上の遊離抗原、本発明の1種以上のタンパク質と複合体化させた1種以上の抗原、およびWO2005/112991に記載の志賀毒素のBサブユニットまたはその免疫学的に機能的な等価物と複合体化させた1種以上の抗原を含んでもよい。
【００６０】
一実施形態においては、前記抗原はウイルス抗原である。一態様においては、本発明のタンパク質と複合体化させるのに用いるか、または複合体化されていない形態で用いるための好適なウイルス抗原を、上記の一覧から選択することができる。
【００６１】
一態様においては、本発明のタンパク質と複合体化されていない抗原は、HPVのL1タンパク質またはその免疫原性断片である。好適なL1タンパク質およびL1タンパク質断片は当業界でよく知られており、例えば、WO2004/056389およびその参考文献に開示されており、それらは全て参照により本明細書に組み入れられるものとする。一態様においては、L1タンパク質は完全長L1である。一態様においては、L1タンパク質は、トランケートされたL1タンパク質である。一態様においては、L1タンパク質は、ウイルス様粒子(VLP)の形態にあり、VLPは完全長L1またはトランケートされたL1から構成される。L1がトランケートされている場合、一態様においては、トランケーションは核局在化シグナルを除去する。一態様においては、トランケーションは、C末端トランケーションである。一態様においては、C末端トランケーションは、50個未満のアミノ酸、例えば、40個未満のアミノ酸を除去する。L1がHPV 16のVLPである場合、一態様においては、C末端トランケーションはHPV 16のL1から34個のアミノ酸を除去する。VLPがHPV 18のVLPである場合、一態様においては、C末端トランケーションは、HPV 18のL1から35個のアミノ酸を除去する。L1を、任意の好適なHPV、例えば、HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68などの癌原性HPV型から選択することができる。
【００６２】
トランケートされたL1タンパク質は、好適には、機能的L1タンパク質誘導体である。機能的L1タンパク質誘導体は、免疫応答を生じさせることができ(必要に応じて、好適にアジュバント化された場合)、該免疫応答は、完全長L1タンパク質および／またはL1タンパク質が誘導されたHPV型からなるVLPを認識することができる。
【００６３】
本発明のタンパク質と複合体化されていない1種の抗原がHPVのL1タンパク質またはその免疫原性断片である場合、一態様においては、本発明のタンパク質と複合体化させた1種の抗原は、HPVのE2タンパク質、もしくはE4タンパク質、もしくはE5タンパク質、もしくはE6タンパク質、もしくはE7タンパク質、またはその免疫原性断片である。
【００６４】
本発明の一実施形態においては、本発明の組成物は、遊離抗原としてHPV 16のL1およびHPV 18のL1、ならびに複合体化された抗原として1種以上のHPV初期タンパク質を含む。好ましくは、HPV 16と18の両方に由来する初期タンパク質が存在する。好ましくは、2種以上の初期タンパク質が存在する。この実施形態の一態様においては、前記組成物は、HPV16のE7およびHPV 18のE7を含む。この実施形態のさらに特定の態様においては、前記組成物は、複合体化された抗原として、HPV16のE2、HPV18のE2、HPV16のE6およびHPV18のE6を含む。この実施形態の一態様においては、HPV16およびHPV18のL1は、VLPの形態で存在する。
【００６５】
一態様においては、本発明のタンパク質と複合体化されていない1種の抗原は、HCVのE1タンパク質もしくはその免疫原性断片、例えば、そのトランケート、例えば、C末端E1トランケートであり、本発明のタンパク質と複合体化された1種の抗原は、HCVのNS3タンパク質もしくはその免疫原性断片である。
【００６６】
一態様においては、本発明のタンパク質と複合体化されていない1種の抗原は、VZVのgEタンパク質またはその免疫原性断片である。この場合、本発明のタンパク質と複合体化された1種の抗原は、例えば、IE63もしくはIE62、またはその免疫原性断片であってよい。
【００６７】
一態様においては、本発明のタンパク質と複合体化されていない1種の抗原は、HCMVのgBタンパク質もしくはその免疫原性断片、またはgHタンパク質もしくはその免疫原性断片である。一態様においては、本発明のタンパク質と複合体化されていない1種の抗原は、pp65タンパク質もしくはその免疫原性断片、または主要極初期タンパク質IE1 72、もしくはその免疫原性断片である。
【００６８】
本発明の一態様においては、本発明のタンパク質と複合体化されていない1種の抗原は、インフルエンザサブユニット抗原、例えば、NAもしくはHAまたはその免疫原性断片またはその組合せである。さらなる態様においては、インフルエンザスプリット調製物を前記組成物中で用いて、本発明のタンパク質と複合体化されていない抗原を提供することができる。これらの場合における本発明のタンパク質と複合体化された1種の抗原は、例えば、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質、NP、PB1、PB2、PA、NS2もしくはNS1タンパク質またはその免疫原性断片であってよい。
【００６９】
本発明の一態様においては、本発明のタンパク質と複合体化されていない1種の抗原は、RSVのF、GもしくはSHタンパク質またはその免疫原性断片である。この場合、本発明のタンパク質と複合体化された1種の抗原は、例えば、RSVのM1、M2-1、M2-2、L、P、NS1、NS2、Nタンパク質またはその免疫原性断片であってよい。
【００７０】
本発明の一態様においては、本発明のタンパク質と複合体化されていない1種の抗原は、HBVのHBsタンパク質またはその免疫原性断片である。この場合、本発明のタンパク質と複合体化された1種の抗原は、例えば、HBコアタンパク質またはその免疫原性断片であってよい。
【００７１】
本発明の一態様においては、本発明のタンパク質と複合体化されていない1種の抗原は、HIVのgp120タンパク質またはその免疫原性断片である。この場合、本発明のタンパク質と複合体化された1種の抗原は、例えば、HIVのNef、tat、P27、F4もしくはP24タンパク質またはその免疫原性断片であってよい。
【００７２】
本発明の一態様においては、本発明のタンパク質と複合体化されていない1種の抗原は、デング熱ウイルスのEタンパク質またはその免疫原性断片である。この場合、本発明のタンパク質と複合体化された1種の抗原は、例えば、デング熱ウイルスのNS1タンパク質またはその免疫原性断片であってよい。
【００７３】
本発明の一態様においては、本発明のタンパク質と複合体化されていない1種の抗原は、EBVのgp350タンパク質またはその免疫原性断片である。この場合、本発明のタンパク質と複合体化された1種の抗原は、例えば、EBVの潜伏期関連遺伝子産物またはその免疫原性断片であってよい。
【００７４】
抗原の免疫原性断片の例としては、例えば、Bおよび／またはT細胞エピトープを含むペプチドが挙げられ、これを用いて免疫応答を刺激することができる。
【００７５】
HPVのL1およびHPVのE5などの、同一ウイルスに由来する2種の異なる抗原を用いる場合、一態様においては、該抗原は同一ウイルス型またはサブタイプ、例えば、両方ともHPV16に由来する。この原理を、他のウイルスに由来する抗原の組合せに適用することができる。
【００７６】
本発明のさらなる態様においては、本発明のワクチン組成物は、本発明のタンパク質と複合体化させた抗原を含み、遊離抗原、すなわち、本発明のタンパク質と複合体化されていない抗原として同一抗原をさらに含む。
【００７７】
本発明の上記態様の両方において、前記ワクチン組成物は、本明細書に記載のアジュバントをさらに含む。
【００７８】
各ワクチン用量中の抗原の量を、典型的なワクチン被接種者において有意かつ有害な副作用を示さずに免疫防御応答を誘導する量として選択する。そのような量は、特定の免疫原を用い、それをどのように提供するかに依存して変化するであろう。
【００７９】
一般的には、各ヒト用量は、0.1〜1000μg、好ましくは、0.1〜500μg、好ましくは、0.1〜100μg、最も好ましくは、0.1〜50μgの抗原を含むと予想される。特定のワクチンのための最適量を、ワクチン接種された被験者における好適な免疫応答の観察を含む標準的な試験により確認することができる。初回のワクチン接種後、被験者は十分に間隔を空けた1回または数回の追加免疫を受けてもよい。そのようなワクチン製剤を、初回または追加ワクチン接種計画において哺乳動物の粘膜表面に適用することができる；またはあるいは、例えば、経皮、皮下もしくは筋肉内経路を介して、全身投与することができる。筋肉内投与が好ましい。
【００８０】
用いる3D-MPLの量は、一般的には小さいが、ワクチン製剤に応じて、用量あたり1〜1000μg、好ましくは、1〜500μg、およびより好ましくは1〜100μgの範囲にあってよい。
【００８１】
本発明のアジュバントまたはワクチンにおけるCpGまたは免疫刺激性オリゴヌクレオチドの量は、一般的には小さいが、ワクチン製剤に応じて、用量あたり1〜1000μg、好ましくは、1〜500μg、およびより好ましくは1〜100μgの範囲にあってよい。
【００８２】
本発明の組成物における使用のためのサポニンの量は、用量あたり1〜1000μg、好ましくは、1〜500μg、より好ましくは1〜250μg、および最も好ましくは1〜100μgの範囲にあってよい。
【００８３】
本発明の製剤を、予防および治療目的の両方のために用いることができる。従って、本発明は、医療における使用のための本明細書に記載のワクチン組成物を提供する。
【００８４】
さらなる実施形態においては、実質的に本明細書に記載された組成物の投与による、疾患に罹りやすいか、または罹患している個体の治療方法が提供される。
【００８５】
また、感染性細菌およびウイルス疾患、寄生虫疾患、特に、細胞内病原性疾患、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌もしくはメラノーマなどの増殖性疾患；非癌性慢性障害、アレルギーを含む群から選択される疾患に個体が罹患することを防止する方法であって、実質的に本明細書に記載された組成物を該個体に投与することを含む前記方法も提供される。
【００８６】
さらに、哺乳動物に本発明の組成物を投与することを含む、該哺乳動物におけるCD8+抗原特異的免疫応答を誘導する方法が記載される。さらに、非生ベクターまたはその免疫学的に機能的な等価物と組み合わせた抗原と、アジュバントとを混合することを含む、ワクチンの製造方法が提供される。
【００８７】
本発明の組合せにおける使用のための好適な製薬上許容し得る賦形剤の例としては、特に、水、リン酸緩衝生理食塩水、等張性緩衝溶液が挙げられる。
【００８８】
本発明を、以下の実施例および図面を参照することにより例示する。全ての図面において、アデノ-ova(adeno-ova)(OVAタンパク質を含むアデノウイルスベクター)を、1回目の注入における陽性対照として用いた。P/B(初回／追加)は、アデノ-Ovaの1回目の注入、およびAS A中のOvaの2回目の追加注入についての陽性対照である。
【実施例】
【００８９】
実施例1：試薬および培地
1.1 LTB、LTB-cysおよびLTB-siinfekl組換え体の調製
LTB、LTB-cys(配列番号7)およびLTB-siinfekl(配列番号8)をコードする配列を、PCRにより増幅し、大腸菌中での発現のためにpET発現ベクター中にクローニングした。総タンパク質抽出物を、フレンチプレスを用いてOD(620)60で細菌ペレットから取得した。15000gで30分間遠心分離した後、上清を収穫し、(NH4)2SO4(4.95 g/10 ml)を添加することにより沈降させ、4℃で少なくとも4時間インキュベートした。遠心分離後、タンパク質ペレットを収穫し、PBS中に溶解し(4倍濃縮)、同じバッファーに対して集中的に透析した。不溶性画分を遠心分離および0.22μmフィルターにより排除した。清澄化された上清を、固定化D-ガラクトース樹脂(Calbiochem)で予め平衡化させた15 mlのPBSを含むXK16/15 cm長カラム上にロードし、光学密度が基底レベルに落下するまでPBSで洗浄した。結合したタンパク質を、PBS中の1 Mガラクトースを用いて溶出させた。透析後、回収されたタンパク質を、SDS-PAGE、クマシー染色およびウェスタンブロッティングにより可視化する。D-ガラクトース樹脂を用いてタンパク質を精製するこの方法を用いて、目的のタンパク質がGM1受容体に結合するかどうかを決定することもできる。
【００９０】
配列番号7
2009517422.tif 000002
【００９１】
配列番号8
2009517422.tif 000003
【００９２】
LTBおよびLTB-cysベクター(配列番号7)を、以下の節に記載のように、市販の完全長ニワトリオボアルブミン抗原にコンジュゲートさせた。
【００９３】
LTB-siinfekl(配列番号8)組換え体を、以下に記載のアジュバント系A中で直接製剤化した。
【００９４】
LTB/OVAコンジュゲートの調製
室温で2時間のDTT処理により、市販の完全長ニワトリオボアルブミン抗原(5 mg)を還元して、SH基を露出させた。PD10(Sephadex G-25, Amersham)カラム(2 mMリン酸バッファー(pH 6.8)を用いる溶出、1 mlの画分)を用いて、DTTを除去した。上記のLTBベクター(8 mg)を、室温で1時間、10倍モル過剰量のSGMBSを用いて活性化した。PD10カラム(100 mMリン酸バッファー(pH 7.2)を用いる溶出、1 mlの画分)を用いて、過剰のSGMBSを除去した。コンジュゲーションのために、等モル量の還元されたオボアルブミン(OVA-SH)と活性化されたLTBを、室温で1時間反応させた。得られたコンジュゲートを、S-300 HR Sephacrylカラム(100 mMリン酸バッファー(pH 6.8)を用いる溶出、1 mlの画分)上での分子濾過により精製した。次いで、LTB/OVAコンジュゲートを、以下に記載のアジュバント系A中で製剤化した。
【００９５】
LTB-cys/OVAコンジュゲートの調製
室温で1時間、80倍モル過剰量のSGMBSを用いて、市販の完全長ニワトリオボアルブミン抗原(10 mg)を活性化した。PD10カラム(1 ml画分のDPBSバッファー(136.87 mM NaCl、2.68 mM KCl、8.03 mM Na2HPO4、1.47 mM KH2PO4 (pH 7.5)を用いて溶出)を用いて、過剰のSGMBSを除去した。コンジュゲーションのために、等モル量のLTB-cysと活性化されたオボアルブミンを、室温で1時間反応させた。得られたコンジュゲートを、S-300 HR Sephacrylカラム(DPBSバッファーを用いる溶出、4 mlの画分)上での分子濾過により精製した。次いで、LTB-cys/OVAコンジュゲートを、以下に記載のアジュバント系A中で製剤化した。
【００９６】
1.2 LFn-siinfeklとLFn-OVA161-191の組換え体の調製
6 x HisテイルおよびSiinfeklコード配列またはこのエピトープ(断片161-291)を含むより大きいオボアルブミン断片によりフランキングした炭疽菌LF毒素に由来するアミノ末端の255アミノ酸を含む2種の合成遺伝子を調製した(それぞれ、配列番号9および10)。得られた産物を、大腸菌中での発現のためにpET発現ベクター中にクローニングした。細胞を遠心分離により回収し、濃縮し(25〜40倍)、フレンチプレスを用いて溶解した。凝集物を、4℃で一晩、6 M尿素中に溶解させた。組換えタンパク質を精製するために、5 mlの予め平衡化させたNi-NTA樹脂(Qiagen)を溶解物に添加し、回転式ホイール上、4℃で2時間インキュベートし、polyprep使い捨てカラム(BioRad)上にロードした。カラムを15 mlの300 mM NaCl、6 M尿素、5 mMイミダゾール、50 mMリン酸バッファー(pH 8)を用いて3回洗浄した後、500 mMイミダゾールを含む4 x 2 mlの同じバッファーを用いて溶出させた。回収されたタンパク質を、SDS-PAGE、クマシー染色およびウェスタンブロッティングにより可視化し、透析により尿素を除去した。
【００９７】
配列番号9
2009517422.tif 000004
2009517422.tif 000005
【００９８】
配列番号10
2009517422.tif 000006
【００９９】
次いで、LFn-siinfekl(配列番号9)とLFn-OVA161-191(配列番号10)の組換え体を、以下に記載のアジュバント系A中で製剤化した。
【０１００】
1.3 ExoA-siinfekl組換え体の調製
SiinfeklエピトープがIbドメインの多くと毒素とを入れ替えるように該エピトープを導入した、外毒素Aの非毒性形態(E553の欠失)に対応する合成遺伝子を調製した(配列番号11-以下を参照)。得られた産物をpET発現ベクター中にクローニングし、大腸菌中で発現させた。次いで、組換えタンパク質を封入体から抽出し、本質的にはFitzGeraldら、J Biol Chem 273, 9951, 1998に記載のように精製した。
【０１０１】
配列番号11
2009517422.tif 000007
【０１０２】
次いで、ExoA-siinfekl組換え体(配列番号11)を、以下に記載のアジュバント系A中で製剤化した。
【０１０３】
1.4 ガラビオース結合アッセイ
志賀毒素のBサブユニットにより優先的に認識されるGb3受容体は、細胞表面のスフィンゴ糖脂質、グロボトリアオシルセラミド(Galα1-4Galβ1-4グルコシルセラミド(式中、Galはガラクトースである))である。以下に記載の方法は、Tarrago-Trani (Protein Extraction and Purification 38, pp 170-176, 2004)により記載されたものに基づいており、市販のガラビオース結合アガロースゲル(calbiochem)上でのアフィニティクロマトグラフィーを含む。ガラビオース(Galα1->4Gal)は、Gb3のオリゴ糖部分の末端炭水化物部分であり、志賀毒素のBサブユニットにより認識される最小の構造であると考えられる。この方法を上手く用いて、大腸菌溶解物から直接的に志賀毒素を精製した。従って、この部分に結合するタンパク質はGb3受容体に結合するであろうと仮定することができる。
【０１０４】
PBSバッファー(500μl)中の目的のタンパク質を、同じバッファー中で予め平衡化させた100μlの固定ガラビオース樹脂(Calbiochem)と混合し、回転式ホイール上、4℃で30分〜1時間インキュベートする。5000 rpmで1分間、1回目の遠心分離を行った後、ペレットをPBSで2回洗浄する。次いで、結合した材料を、2 x 500μlの100 mMグリシン(pH 2.5)中に最終ペレットを再懸濁することにより、2回溶出させる。次いで、フロースルーに対応するサンプル、プールした洗浄物およびプールした溶出物を、SDS-PAGE、クマシー染色およびウェスタンブロッティングにより分析する。これらの分析技術により、タンパク質がガラビオースに結合したかどうか、および従って、Gb3受容体に結合するかどうかを同定することができる。
【０１０５】
1.5 アジュバント系A：QS21および3D-MPLの調製
有機溶媒中の脂質(卵黄由来もしくは合成由来のホスファチジルコリンなど)およびコレステロールおよび3D-MPLの混合物を、減圧下(またはあるいは不活性ガス流下)で乾燥させた。次いで、水溶液(リン酸緩衝生理食塩水など)を添加し、全ての脂質が懸濁液中になるまで、容器を攪拌した。次いで、リポソームのサイズが約100 nmに低下するまで、この懸濁液を微小流体化した後、0.2μmフィルターを通して滅菌濾過した。押出または超音波処理を、この工程に代えて行うことができる。
【０１０６】
典型的には、コレステロール：ホスファチジルコリン比は1:4(w/w)であり、水溶液を添加して、5〜50 mg/mlの最終コレステロール濃度を得た。
【０１０７】
リポソームは、100 nmの規定のサイズを有し、これをSUV(小単層ベシクル)と呼ぶ。リポソームは、それ自体、長時間安定であり、融合能力を持たない。SUVの滅菌バルクをPBSに添加して、最終濃度10、20または100μg/mlの3D-MPLを達成した。PBSの組成は、9 mM Na2HPO4; 48 mM KH2PO4；100 mM NaCl (pH 6.1)であった。水溶液中のQS21をSUVに添加した。この混合物を、DQMPLinと呼ぶ。次いで、Siinfekl非生ベクターを添加した。成分のそれぞれの添加の間に、中間生成物を5分間攪拌した。pHを調べ、必要に応じて、NaOHまたはHClを用いて6.1±0.1に調整した。
【０１０８】
以下の3.1節に記載の実験においては、50μlの注入量は、0.05、0.1、0.2、1または5μgのSiinfekl組換え非生ベクターおよび0.5μgの両免疫刺激剤(3D-MPLとQS21)に相当していた。
【０１０９】
実施例2. 本発明のワクチンを用いるC57/B6マウスのワクチン接種
上記の様々な製剤を用いて、6〜8週齢のC57BL/B6メスマウス(10匹／群)をワクチン接種した。マウスは14日間隔で2回の注入を受け、1、2、3および4週の間に採血した(実際の採血日数については、特定の例を参照)。マウスを筋肉内的にワクチン接種した(最終容量50μlで左腓腹筋に注入)。オボアルブミン組換えアデノウイルスを、5 x 108VPの用量で注入した。
【０１１０】
ex vivoでのPBLの刺激を、5％FCS(Harlan, Holland)、1μg/mlの各抗マウス抗体CD49dおよびCD28(BD, Biosciences)、2 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム、10μg/ml硫酸ストレプトマイシン、10ユニット/mlペニシリンGナトリウム(Gibco)、10μg/mlストレプトマイシン、50μM B-MEメルカプトエタノールおよび100倍希釈された非必須アミノ酸(これらの添加物は全てGibco Life technologies社製である)を補給したRPMI 1640 (Biowitaker)である完全培地中で行った。ペプチド刺激は常に5％CO2下、37℃で行った。
【０１１１】
2.1 免疫学的アッセイ：
2.1.1 抗原特異的T細胞の検出
PBLの単離とテトラマーの染色。テトラマーは、オボアルブミン抗原モデル(ova)についてのみ入手可能であり、siinfekl-テトラマーは市販されている(Immunomics Coulter)。血液を後眼窩静脈(retro-orbital vein)から取得し(マウス1匹あたり50μl、10匹のマウス／群)、RPMI＋ヘパリン(LEO)培地中に直接希釈した。PBLを、lymphoprep gradient (CEDERLANE)を用いて単離した。次いで、細胞を洗浄し、計数し、最終的に3 x 105個の細胞を1/50最終濃度(f.c.)のCD16/CD32抗体(BD Biosciences)を含む50μlのFACSバッファー(PBS、FCS1％、0.002％NaN3)中に再懸濁した。10分後、50μlのテトラマーミックスを細胞懸濁液に添加した。テトラマーミックスは、1μlのsiinfekl-H2Kbテトラマー-PE (Immunomics Coulter社製)を含み、抗CD8a-PercP (1/100 f.c.)抗体を試験において添加した。次いで、細胞を37℃で10分間静置した後、1回洗浄し、試験あたり、生CD8のゲート内の3000事象が必要である、CELLQuest(商標)ソフトウェアを用いるFACS Calibur(商標)を用いて分析した。
【０１１２】
2.1.2 細胞内サイトカイン染色(ICS)
2.1.1節に記載のように取得した血液サンプルに対して、ICSを実施した。この技術を、両抗原モデル：ovaおよびHBSに適用する。106個のPBLを、必要に応じて、15マー(mer)のHBSペプチドのプール(各ペプチドの1μg/mlのf.c.で用いられる全HBS配列をカバーする54種のペプチド)またはそれぞれ1μg/mlの濃度で存在する15マーのOvaペプチドの17種のプール(11種のMHCクラスI拘束ペプチドおよび6種のMHCクラスII拘束ペプチド)を補給した完全培地中に再懸濁した。2時間後、1μg/mlのBrefeldin-A (BD, Biosciences)を16時間添加し、合計18時間後に、細胞を回収した。細胞を1回洗浄した後、全てBD, Biosciencesで購入した抗マウス抗体で染色した；全てのさらなる工程を、氷上で行った。まず、細胞を50μlのCD16/32溶液(1/50 f.c., FACSバッファー)中で10分間インキュベートした。50μlのT細胞表面マーカーミックスを添加し(1/100 CD8a perCp, 1/100 CD4 APCcy7)、細胞を20分間インキュベートした後、洗浄した。細胞を、200μlのperm/fix溶液(BD, Biosciences)中で固定＆透過処理し、perm/washバッファー(BD, Biosciences)中で1回洗浄した後、抗IFNg-APC抗IL2-FITCおよび抗TNFa-PEを用いて4℃で2時間または一晩染色した。試験あたり、生CD8のゲート内の15000事象が必要である、CELLQuest(商標)ソフトウェアを用いるFACS Calibur(商標)を用いて、データを分析した。
【０１１３】
2.1.4 Ag特異的抗体力価(総IgGの個々の分析)：ELISA
この技術を、両抗原モデル：ovaおよびHBSに適用する。血清学的分析を15日間評価した。マウス(10匹／群)から後眼窩穿刺により採血した。抗HBSおよび抗ova総IgGを、ELISAにより測定した。96穴プレート(NUNC、免疫吸着プレート)を、抗原を用いて4℃で一晩被覆した(50μl/ウェルのHBS溶液(HBS 10μg/ml, PBS)または50μl/ウェルのova溶液(ova 10μg/ml, PBS))。次いで、プレートを洗浄バッファー(PBS/0.1％Tween 20(Merck))中で洗浄し、100μlの飽和バッファー(PBS/0.1％Tween 20/1％BSA/10％FCS)を用いて37℃で1時間飽和させた。洗浄バッファー中でさらに3回洗浄した後、100μlの希釈されたマウス血清を添加し、37℃で90分間インキュベートした。別に3回洗浄した後、プレートを、飽和バッファー中に1000倍希釈されたビオチン化抗マウス総IgGと共に、37℃でさらに1時間インキュベートした。飽和後、96穴プレートを上記のように再び洗浄した。飽和バッファー中で1000倍希釈されたストレプトアビジンペルオキシダーゼ(Amersham)の溶液を、ウェルあたり50μl添加した。最後の洗浄は、洗浄バッファー中での5段階洗浄であった。最後に、ウェルあたり50μlのTMB(酸性バッファー中の3,3',5,5'-テトラメチルベンズイジン-H2O2の濃度は0.01％である-BIORAD)を添加し、プレートを暗室中、10分間室温で保持した。
【０１１４】
反応を停止させるために、ウェルあたり50μlの0.4 N H2SO4を添加した。BIORAD社製ELISAプレート読み取り装置により、450/630 nmの波長で吸光度を読み取った。結果を、softmax-proソフトウェアを用いて算出した。
【０１１５】
3. 結果
以下に記載の結果は、LFn、LT-BまたはExo-Aを用いて、CD8応答の誘導における非生ベクター系の効率を、それをアジュバント系Aと組み合わせることにより改善することができることを示している。
【０１１６】
アジュバント系Aを用いる場合の応答の評価
図1および2(上記の2.1.1に記載のように実行された方法)に示される結果は、1回目の注入の7日後に測定した場合、非ベクター化SiinfeklアジュバントまたはSiinfekl LT-Xのみを用いる場合に認められるものよりも、ASを用いてアジュバント化されたSiinfekl LTを用いる場合に、CD8応答のより良好な増加が認められることを示している(図1A)。この改善は、0.1μgのLT-Xの低用量で認められる。同じことは、Siinfekl LFn(図2A)およびSiinfekl-ExoA(図2A)を用いる場合にも認められる。しかしながら、この改善は、1回目の投与の15日後に測定した場合には認められない(図1Bおよび2B)。
【０１１７】
2回目の注入の7日後に見た場合、非ベクター化SiinfeklアジュバントもしくはSiinfekl LFnまたはアジュバントを含まないLTもしくはExoAと比較して、アジュバント系Aと組み合わせた場合、Siinfekl LT(図1C)、Siinfekl LFnおよびSiinfekl-ExoA(図2C)を用いる場合に再び改善が認められる。
【０１１８】
図3は、抗原として完全長オボアルブミンタンパク質を用いる場合、コンジュゲートされたオボアルブミンのみ、またはアジュバント系Aと共に投与された非ベクター化オボアルブミンを用いる場合に認められるものよりも、アジュバントと組み合わせたLTBまたはLTBcysベクターにコンジュゲートされたオボアルブミンを用いる場合に、より良好な結果が認められることを示している。この改善は、感染の7および14日後の両方、ならびに2回目の注入の7日後に認められる。
【０１１９】
図4Aおよび4Bは、CD8サイトカイン産生T細胞の検出を見るものである。示された両時点：1回目の注入の14日後(図4A)および2回目の注入の6日後(図4B)において、少なくとも2種のサイトカインが産生される。再度、アジュバントとベクター化の組合せが、ベクター化された抗原のみ、または非ベクター化抗原とアジュバントと比較して相乗効果を示すことが認められる。これは再び、異なるコンジュゲーション化学の両方(抗原とベクターとの直接的コンジュゲーション、またはシステイン残基を介するコンジュゲーション)については真実である。
【０１２０】
図4Cは、CD4サイトカイン産生T細胞の検出を見るものである(少なくとも2種のサイトカインが産生される)。程度が小さいが、再度、アジュバントとベクター化の組合せが、ベクター化された抗原のみ、または非ベクター化抗原とアジュバントと比較して相乗効果を有することが示される。これは再び、異なるコンジュゲーション化学の両方については真実である。
【０１２１】
LTとコンジュゲートさせたova、遊離抗原としてのB型肝炎表面抗原(HBs)、およびアジュバント系Aを含む組成物により誘導される免疫応答の評価
図5〜12は、2種の抗原-LTとコンジュゲートさせたova、および同じ組成物中に遊離抗原として含まれる酵母により産生され、精製された組換えB型肝炎表面タンパク質に対する免疫応答を評価する。この組成物を、アジュバント系Aを用いてアジュバント化した。全適合免疫応答を試験し、抗体を両抗原に対して測定し(図12)、テトラマーの読み出し値を取った(図5)。さらに、CD4およびCD8応答を、1回目の注入の7および14日後、ならびに2回目の注入の7日後に測定した(図6〜11)。応答を、全サイトカイン(IFNg/TNFa/IL2)を産生するT細胞として示す。
【０１２２】
テトラマーの読み出し値は、HBsが遊離抗原として存在する場合、siinfekl特異的応答を認めることができることを示しており、従って、遊離抗原の存在はコンジュゲートされた抗原に対する免疫応答を妨害しないことを確認している。
【０１２３】
両抗原に対して全ての時点でサイトカイン応答が認められたが、一次応答は非常に低かった。予想されるように、Ova特異的CD4応答は、CD8応答よりも低かった。HBsおよびOva特異的T細胞応答は両方とも、2回目の注入の7日後に測定された二次応答において検出可能であった。アジュバント化されたベクターにより誘導されるova特異的T細胞応答に対するHBs抗原の正の影響を認めることができる。
【０１２４】
両抗原は2回目の注入の15日後に測定される体液性応答をもたらす。これは、遊離抗原またはコンジュゲートされた抗原の存在が、他の抗原に対して認められる免疫応答を妨害しないことを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１Ａ】AS A LTx-Siinfeklワクチンを用いる1回目の注入の7日後のPBLにおけるSiinfekl特異的CD8頻度を示す。
【図１Ｂ】AS A LTx-Siinfeklワクチンを用いる1回目の注入の15日後のPBLにおけるSiinfekl特異的CD8頻度を示す。
【図１Ｃ】AS A LTx-Siinfeklワクチンを用いる2回目の注入の7日後のPBLにおけるSiinfekl特異的CD8頻度を示す。
【図２Ａ】Exo-A-Siinfekl AS AまたはLF-Siinfekl AS Aワクチンを用いる1回目の注入の7日後のPBLにおけるSiinfekl特異的CD8頻度を示す。
【図２Ｂ】Exo-A-Siinfekl AS AまたはLF-Siinfekl AS Aワクチンを用いる1回目の注入の14日後のPBLにおけるSiinfekl特異的CD8頻度を示す。
【図２Ｃ】Exo-A-Siinfekl AS AまたはLF-Siinfekl AS Aワクチンを用いる2回目の注入の7日後のPBLにおけるSiinfekl特異的CD8頻度を示す。
【図３Ａ】AS Aを含むか、または含まないLT-OvaまたはLT-cys-Ovaを用いる1回目の注入の7日後のPBLにおけるSiinfekl特異的CD8頻度を示す。
【図３Ｂ】AS Aを含むか、または含まないLT-OvaまたはLT-cys-Ovaを用いる1回目の注入の14日後のPBLにおけるSiinfekl特異的CD8頻度を示す。
【図３Ｃ】AS Aを含むか、または含まないLT-OvaまたはLT-cys-Ovaを用いる2回目の注入の7日後のPBLにおけるSiinfekl特異的CD8頻度を示す。
【図４Ａ】AS Aを含むか、または含まないLT-OvaまたはLT-cys-Ovaを用いる1回目の注入の14日後のサイトカイン産生CD8+T細胞の頻度(％)を示す。グラフは少なくとも2種のサイトカイン(IFNg、IL2、TNFa)のCD8産生細胞を示している。
【図４Ｂ】AS Aを含むか、または含まないLT-OvaまたはLT-cys-Ovaを用いる2回目の注入の6日後のサイトカイン産生CD8+T細胞の頻度(％)を示す。グラフは少なくとも2種のサイトカイン(IFNg、IL2、TNFa)のCD8産生細胞を示している。
【図４Ｃ】AS Aを含むか、または含まないLT-OvaまたはLT-cys-Ovaを用いる2回目の注入の6日後のサイトカイン産生CD4+T細胞の頻度(％)を示す。グラフは少なくとも2種のサイトカイン(IFNg、IL2、TNFa)のCD4産生細胞を示している。
【図５】LT-Ovaおよび遊離抗原としてHBsを含むASAアジュバント化組成物を用いる注入後のPBLにおけるSiinfekl特異的CD8の頻度であり、1回目の注入の7日後、1回目の注入の14日後および2回目の注入の7日後のOvaに対するテトラマーの応答を示す。
【図６】LT-Ovaおよび遊離抗原としてHBsを含むASAアジュバント化組成物を用いる1回目の注入の7日後のPBLにおける抗原特異的サイトカイン産生CD4の頻度(％)であり、上のグラフはHBs応答を示し、下のグラフはOva応答を示す。
【図７】LT-Ovaおよび遊離抗原としてHBsを含むASAアジュバント化組成物を用いる1回目の注入の7日後のPBLにおける抗原特異的サイトカイン産生CD8の頻度(％)であり、上のグラフはHBs応答を示し、下のグラフはOva応答を示す。
【図８】LT-Ovaおよび遊離抗原としてHBsを含むASAアジュバント化組成物を用いる1回目の注入の14日後のPBLにおける抗原特異的サイトカイン産生CD4の頻度(％)であり、上のグラフはHBs応答を示し、下のグラフはOva応答を示す。
【図９】LT-Ovaおよび遊離抗原としてHBsを含むASAアジュバント化組成物を用いる1回目の注入の14日後のPBLにおける抗原特異的サイトカイン産生CD8の頻度(％)であり、上のグラフはHBs応答を示し、下のグラフはOva応答を示す。
【図１０】LT-Ovaおよび遊離抗原としてHBsを含むASAアジュバント化組成物を用いる2回目の注入の7日後のPBLにおける抗原特異的サイトカイン産生CD4の頻度(％)であり、上のグラフはHBs応答を示し、下のグラフはOva応答を示す。
【図１１】LT-Ovaおよび遊離抗原としてHBsを含むASAアジュバント化組成物を用いる2回目の注入の7日後のPBLにおける抗原特異的サイトカイン産生CD8の頻度(％)であり、上のグラフはHBs応答を示し、下のグラフはOva応答を示す。
【図１２】LT-Ovaおよび遊離抗原としてHBsを含むASAアジュバント化組成物を用いる2回目の注入の14日後のHBs(上)およびOva(下)に対する抗体応答を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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