(57)【要約】【課題】新規なリード分子の同定のための生化学的アッセイの信頼性をより高める方法。また、ＮＭＲに基づく生化学的スクリーニングの応用性を広げる方法。【解決手段】酵素の阻害剤を同定する方法であって、該酵素の基質をＣＦ3で標識し、該酵素の存在下でその19Ｆシグナルシフトを測定し、次に酵素及び阻害剤の存在下で19Ｆシグナルシフトを測定し、次に酵素及び阻害剤の混合物のデコンボリューションにより阻害剤を同定する方法。また、該方法に従って同定できる酵素阻害剤。同様に、酵素のアゴニストを同定する方法又は酵素の未知機能を特性決定する方法。【選択図】なし
2009501312.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素の阻害剤を同定する方法であって：
ａ）前記酵素の基質をＣＦ3部分で標識すること；
ｂ）前記ＣＦ3標識基質についての19Ｆシグナルシフトを前記酵素の存在下で時間をかけて測定することによって、前記時間が、未修飾のＣＦ3標識基質の前記酵素による修飾されたＣＦ3標識基質への転化に必要な長さの時間となること；
ｃ）前記ＣＦ3標識基質についての19Ｆシグナルシフトを前記酵素と阻害剤又は阻害剤を含有する混合物との存在下で前記時間をかけて測定すること；及び、
ｄ）阻害剤を、該阻害剤を含有する前記混合物のデコンボリューションにより同定すること
を含んでなる方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記酵素がキナーゼである方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法に従って同定できる酵素阻害剤。
【請求項４】
請求項２に記載の方法に従って同定できるキナーゼ阻害剤。
【請求項５】
酵素のアゴニストを同定する方法であって：
ａ）前記酵素の基質をＣＦ3部分で標識すること；
ｂ）前記ＣＦ3標識基質についての19Ｆシグナルシフトを前記酵素の存在下で時間をかけて測定することによって、前記時間が、未修飾のＣＦ3標識基質の前記酵素による修飾されたＣＦ3標識基質への転化に必要な長さの時間となること；
ｃ）前記ＣＦ3標識基質についての19Ｆシグナルシフトを、前記酵素とアゴニスト又はアゴニストを含有する混合物との存在下で前記時間をかけて測定すること；及び、
ｄ）アゴニストを、該アゴニストを含有する前記混合物のデコンボリューションにより同定すること
を含んでなる方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記酵素がキナーゼである方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法に従って同定できる酵素アゴニスト。
【請求項８】
請求項６に記載の方法に従って同定できるキナーゼアゴニスト。
【請求項９】
酵素の未知機能を特性決定する方法であって：
ａ）既知機能酵素の基質をＣＦ3部分で標識すること；
ｂ）前記ＣＦ3標識基質についての19Ｆシグナルシフトを活性化された既知機能酵素の存在下で時間をかけて測定することによって、前記時間が、未修飾のＣＦ3標識基質の前記既知機能酵素による修飾されたＣＦ3標識基質への転化に必要な長さの時間であること；及び、
ｃ）前記ＣＦ3標識基質についての19Ｆシグナルシフトを未知機能の活性化された酵素の存在下で時間をかけて測定することによって、前記時間が、未修飾のＣＦ3標識基質の未知機能の前記酵素による修飾されたＣＦ3標識基質への転化に必要な時間であること
を含んでなる方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、該既知機能酵素が、キナーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、又はリガーゼである方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
適切な生化学アッセイ又は細胞アッセイにおける数多くの分子の試験は、通常、薬剤発見プロジェクトにおける最初の工程の１つである（Smith A. Nature 418, 453-459 (2002)）。蛍光偏光（ＦＰ）（Checovich, W. J.等 Nature 375, 254-256. (1995); Pope, A. J.等 Drug Discov. Today 4, 350-362 (1999)）、蛍光共鳴エネルギートランスファー（ＦＲＥＴ）、ホモジーニアス時間分割蛍光（ＨＴＲＦ）、及び伝統的なシンチレーションプロキシミティアッセイ（ＳＰＡ）に基づくスクリーニングが、今日では生化学的アッセイについてえり抜きの技術である（Parker, G. J.等 J. Biomol. Screening 5, 77-88 (2000)）。これら方法の感度及び小型化されたフォーマットは、巨大な独占化合物コレクションのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を可能とする。しかしながら、ＨＴＳに利用されるアッセイの複雑さは、しばしば、その後の第二アッセイで確認されない数多くのヒット群をもたらす。スクリーニングのためには量よりも質の方が重要であることは、いまや広く受け入れられている（Smith A. Nature 418, 453-459 (2002)）。故に、新たなリード分子の同定のための生化学的アッセイの信頼性をより高める方法が継続して開発されている。
【０００２】
ここ数年にわたり、核磁気共鳴（ＮＭＲ）に基づくスクリーニングが、リード分子同定のための強力な手段として現れてきている（Hajduk, P. J.等 Quaterly Reviews of Biophysics 32, 211-240 (1999); Stockman, B. J.等 Prog. NMR Spectr. 41, 187-231 (2002); Meyer B.等 Chem. Int. Ed. 42, 864 (2003)）。ＮＭＲは、酵素反応の生成物の特性決定や、反応速度論への知見を得るために広く適用されているが（Percival, M. D.及び Withers, S. G. Biochemistry 31, 505-512 (1992)）、新たなリード分子の同定のために酵素の阻害又は活性を測定する、ＮＭＲに基づく生化学的スクリーニングは、応用性が限られていることが見出されている（Chiyoda T.等 Chem. Pharm. Bull. 46, 718-720 (1998)）。その低い感度は、ＮＭＲを、非常に高い基質濃度での酵素反応へと制限する。それでもなお、ＮＭＲは、ＨＴＳに利用される他の技術と比べると、より信頼性の高いデータのアレイを提供する。ＮＭＲ技術は、小分子シグナル又はタンパク質シグナルを介してレセプターに結合するリガンドをモニターする。
【０００３】
1Ｈ及び、特に19Ｆ ＮＭＲ競合結合実験を用いる最近の開発は、スクリーニングのための基質及びタンパク質消費の低減を可能とする。加えて、これら実験は、同定されるリガンドの結合定数の値を、一点測定で提供する。Percival及びWithersは、酵素の、フッ素処理された基質類似体への結合を研究するためにＮＭＲ方法を用いた（Percival, M. D.及び Withers, S. G. Biochemistry 31, 505-512 (1992)）。そのような方法は、19Ｆ ＮＭＲ検出を利用し、非ペプチド基質上のフッ素原子の存在を必要とする。出発基質及び酵素的に変換された基質の19Ｆシグナルが、次いでモニターされる。実験は、観察される酵素活性が速度論的にモニターされるのを可能にするリアルタイムで行われても、終点アッセイフォーマットで行われてもよい。
【発明の要旨】
【０００４】
１つの側面では、本発明は、ＮＭＲ技術を用いてキナーゼ阻害剤を同定する方法を提供する。別の側面では、本発明は、ＮＭＲ技術により同定されたキナーゼ阻害剤を提供する。
【０００５】
本発明は、他の既知機能タンパク質のＣＦ3標識された基質との相互作用により、タンパク質の未知機能を特性決定するＮＭＲ方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【０００６】
先行するＨＴＳ技術と比較して、本発明は、タンパク質及び基質濃度に関してＮＭＲ生化学的スクリーニングの限界を克服する。本発明は、３フッ素原子を有する部分（ＣＦ3）が基質を標識するために用いられる、新規で感度のよいＮＭＲ方法を提供する。ＣＦ3標識された基質、例えば、ＣＦ3標識ペプチドの使用は、標準的なＨＴＳ技術に用いられる濃度に匹敵するタンパク質及び基質濃度での、迅速で信頼性の高い生化学的スクリーニングを可能にする。本発明のＮＭＲ方法は、独特の利点を有している。ｉ）フッ素ＮＭＲ分光法は非常に感度がよく、プロトンの感度の０．８３倍である。ｉｉ）フッ素シグナルは３フッ素原子から生じるシャープなシングレット共鳴として現れ、故に、シグナルは非常に強度が強い（ＣＦ3がプロトンにスカラーカップリングしないならば、この実験はプロトンデカップリングを必要としない）。この特性は、Ｋmの範囲における基質濃度の使用を可能とし、かくして中程度及び弱い阻害剤の検出を可能とするので、スクリーニングのためには非常に重要である。iii）酵素反応で典型的に用いられるプロトン化された溶媒、バッファー、又は洗浄剤からのスペクトル干渉がない。ＣＦ3含有分子の存在下における基質の諸シグナルの重なりは、シャープなシングレット19Ｆシグナルの限定された数（分子は典型的に１つのＣＦ3基を有することとなる）及び19Ｆ化学シフトの大きな分散のため、非常にまれにしか発生しない。ｉｖ）19Ｆ等方性（isotropic）化学シフトは、化学的環境に非常に敏感であり（Gerig, J. T. Prog. NMR Spectrosc. 26, 293-370 (1994)）、出発基質共鳴及び酵素的に変換された基質共鳴について異なる化学シフトをもたらし、かくしてそれら強度の直接的な比較を可能とする。
【０００７】
本発明の一態様では、ＮＭＲは、タンパク質Ｓｅｒ／ＴｈｒキナーゼＡＫＴ１によるＣＦ3標識された基質のリン酸化を測定するために利用される。タンパク質キナーゼＡＫＴ１は、多くのヒト悪性腫瘍において高められた活性を有する抗アポトーシスタンパク質キナーゼである（Staal, S. P.等 J. Exp. Med. 167, 1295-1264 (1988); Bellacosa, A.等 Science 254, 274-277 (1991)）。基質ＡＫＴｉｄｅは、トリフルオロ酢酸無水物でのＮ末端キャッピングによりＣＦ3部分で標識された１４アミノ酸のペプチドであり（Obata, T.等 J. Biol. Chem. 46, 36108-36115 (2000)）、ペプチド（ＣＦ3−ＣＯ−ＡＲＫＲＥＲＡＹＳＦＧＨＨＡ）（配列番号：１）をもたらす。別の方法は、トリフルオロメチルアミンでのアミド形成を介してＣ末端にＣＦ3基を導入すること、又はペプチド合成中の１アミノ酸をフッ素処理された（ＣＦ3）アミノ酸で（例えば、Ｔｙｒをパラ−ＣＦ3Ｐｈｅで）置換することを包含する。Ｎ末端、Ｃ末端、又は置換されたアミノ酸におけるＣＦ3は、セリンリン酸化部位から離れたところに位置する故にその結合を妨げない（パラ−ＣＦ3Ｐｈｅは溶媒の方へ向いている一方で、リン酸化されるべきＳｅｒは酵素の方へ向いている）。ペプチドでない基質の場合は、基質の適切な位置にＣＦ3部分を導入するために、化学合成が必要となる。
【０００８】
酵素反応は、ＡＴＰ及び活性化されたタンパク質キナーゼＡＫＴ１の存在下で、配列番号：１の未リン酸化ＣＦ３標識ペプチドをインキュベートすることにより行われた。未リン酸化（unphosphorylated）ペプチドのリン酸化（phosphorylated）ペプチドへの転化は、図１（上）に示すように１９Ｆシグナルのシフトを生じる。図１（上）は、酵素反応の開始後、時間の関数として、基質のＣＦ3部分のシグナルを含有する19Ｆスペクトルを示す。時間０では、ペプチドの未リン酸化種に相当する１つのシグナルしか観察されない。時間が経つにつれて、未リン酸化ペプチドのシグナルは減少し、リン酸化ペプチドに相当する新しいシグナルがスペクトルに現れる。反応開始後のいずれかの時間でのその２つの積分シグナルの合計は、時間０での未リン酸化ペプチドのシグナル積分に相当する。酵素反応は１４９分後に完了し、リン酸化ペプチドのシグナルのみがスペクトル中に見られる。
【０００９】
強い阻害剤スタウロスポリン（staurosporine）の存在下で行われる同じ反応は、図１（下）で明らかなように、リン酸化ペプチドのいずれの形成ももたらさなかった。ＣＦ3基のリン酸化部位からの長い距離にもかかわらず、リン酸化及び未リン酸化ペプチドにおけるこの部分の化学シフトは異なっている。
【００１０】
スクリーニング方法として、この反応は、阻害剤を含む化合物の混合物の存在下で行うこともできる。次いで、活性混合物のデコンボリューションが、混合物中のどの化合物が阻害剤であるかを同定するために行われる。本発明に従えば、デコンボリューションは、反応が混合物の存在下及びその諸化合物のうちの各々の１つの不存在下で繰り返して行われることを意味する。すなわち、反応が阻害性化合物を除く混合物の存在下で行われるときは、阻害がない。諸化合物のうちの１つの阻害性効果を確かめるために、その混合物から同定された単一の阻害性化合物の存在下でも反応が行われるときに、阻害が観察される。例として、配列番号：１の未リン酸化ＣＦ3標識ペプチド、ＡＴＰ、及び活性化されたタンパク質キナーゼＡＫＴ１の反応が、ＡＫＴ１阻害剤である化合物Ｈ８９（Reuveni, H.等 Biochemistry 41, 10304-10314 (2002)）を含む５分子混合物の存在下でも行われた。結果は、ペプチドリン酸化の阻害であった。この反応をＨ８９を含まない混合物の存在下で行った場合は、ペプチドリン酸化の阻害がなかった。反応をＨ８９のみの存在下で行ったとき、Ｈ８９のペプチドリン酸化に対する阻害性効果が確認された。
【００１１】
スクリーニング目的及びＩＣ50測定のためには、反応は、酵素とＡＴＰ濃度とＫcatに依存することとなる遅延が確認された後に、典型的には停止される。反応は、ＥＤＴＡの濃縮溶液を添加することによっても、タンパク質を変性させることによっても停止させることができる。しかしながら、本発明に従えば、より経済的な方法、すなわち、約５〜約１０μＭの強い阻害剤スタウロスポリン（低いｎＭ範囲におけるＩＣ50）の添加が、反応を停止させるために用いられる。スタウロスポリンの添加から数時間経っても、19Ｆスペクトルの変化は見られなかった。停止後、２つの19Ｆシグナルのシグナル強度比がモニターされる。阻害剤の不存在下においてシグナル強度比Ｉ(P)／Ｉ(unP）は０％阻害に相当し、一方その比が０のとき１００％阻害に相当する。この方法はペプチド濃度が常に同じである場合のみ有効であり、そうでなければリン酸化ペプチドのシグナル積分がモニターされるべきである。
【００１２】
ＡＴＰの解離結合定数は、スクリーニング実験のために用いられ、そしてヒット群の結合定数をそれらのＩＣ50から誘導するために用いられるところのＡＴＰ濃度を最適化するため、最初に計算されるべきである。この目的のために、異なるＡＴＰ濃度での反応が記録される（Fersht, A. Enzyme Structure and Mechanism, W. H. Freeman and Company, New York 1985）。ＡＴＰ濃度の関数としてのリン酸化ペプチドのシグナル強度を、図２に示す。実験データに見合うのは、ＡＴＰについて８９＋／−１７μＭの結合定数である（３０μＭ基質の存在下）。
【００１３】
本発明に従えば、スクリーニングは、ライブラリー中の諸化合物について、単一の濃度でまず行われる。諸化合物は、小又は大混合物においてスクリーニングされることができる。例えば、ＩＣ50＜５μＭの強い阻害剤のみを考慮することとするならば、その時は約５μＭ濃度の諸分子を使用すれば十分となる。実際、本発明方法の信頼性は、スクリーニングされる分子の濃度が約５μＭしかない時であっても、例えば、１０〜２０μＭの範囲のＩＣ50を有する弱い阻害剤の同定を可能とする。図５が示すように、基質濃度は、約１０〜２０ｎＭのように低くすることができる。この低い濃度は、凝集又は溶解性の深刻な問題を起こさずに、多数の成分を有する混合物の調製を可能とする。活性混合物のデコンボリューションが、次いで阻害剤の同定のために行われる。次いで、ヒット群のＩＣ50の特性決定のために、異なる阻害剤濃度での実験が、化合物Ｈ８９について図３に示されるように行われる（Reuveni, H.等 Biochemistry 41, 10304-10314 (2002)）。アロステリック効果の不存在下において、有意なＩＣ50値が一点測定で得られる。ＣＦ3標識されたＡＴＰ類似体を、本発明の方法で用いることもできる。この場合には、ＡＴＰ及びＡＤＰの19Ｆシグナルがモニターされる。ＡＴＰ結合ポケットに結合する阻害剤又は基質結合部位に対してペプチドと競合する阻害剤を同定することができる。
【００１４】
従って、本発明の方法は、均質であり、かつ、リン酸化基質と未リン酸化基質の両方を直接的に検出するので、簡便でかつ信頼性の高いアッセイに相当する。19Ｆ ＮＭＲアッセイは、ｉ）酵素又は特定の抗体とともに行われる第二反応の存在も、ｉｉ）他の方法での読み出しに必須な分離及び／又は洗浄工程も必要としない。その方法の簡便さは、信頼性の高いリード分子同定と分子の阻害活性の定量化をもたらす。弱い阻害活性しか示さない化合物も安全に選ばれることができる。弱い阻害剤の小さな化学的変化又は同じ骨格を有する類似分子の選択は、強力な阻害剤の同定をもたらすかもしれない。
【００１５】
他の認識されているＨＴＳ技術では、しばしば、真の濃度が名目上の濃度とは異なる。化合物濃度における大きな差は、得られるＩＣ50の有意な誤りをもたらす。他の先行ＨＴＳ技術における濃度差についての原因は、検量誤差、サンプル不純物、化合物の低い溶解性、及び水性環境における化学的な不安定性に帰する。対照的に、本発明のＮＭＲ方法では、これら化学的特性を、フッ素スペクトルに加えてプロトンスペクトルも得ることにより容易に測定することができる。故に、1Ｈ ＮＭＲで決定される阻害剤の真の濃度は、有意により正確なＩＣ50値の測定を可能とする。
【００１６】
本発明の方法は、阻害剤の同定のみに限定されず、アゴニストの検出のために用いることもできる。タンパク質キナーゼの場合には、参照試料（すなわち、反応がスクリーニングされる化合物の不存在下で行われる場合の試料）の同じシグナルと比較すると、アゴニストの存在下におけるリン酸化ペプチドの19Ｆシグナルの方が大きい。
【００１７】
この方法で用いられるタンパク質の濃度は、数ナノモーラーもの低さであることができ、他のＨＴＳ技術で用いられる濃度に比べて勝るとも劣らない。しかしながら、５ｍｍプローブを用いる各々のＮＭＲサンプルに必要な容量は、約５００〜５５０μＬである。本発明に従ってフローインジェクションプローブ又は３ｍｍプローブを用いれば、１／２〜１／３容量の低減が達成される。ＣＦ3シグナルの高い感度は、スペクトルの迅速な獲得を可能とする。さらに、同じスペクトルを、19Ｆ検出に適用される低温学的技術（cryogenic technology）を使用することで、よりいっそう迅速に記録することができる。故に、従来方法の状況下では３分の獲得時間を必要とするスペクトルを、たった１２秒で記録することができる。さらに、クリオプローブで記録されるプロトン検出実験において遭遇する放射減衰の問題が、ＣＦ3標識された基質の濃度が低いため、本発明のフッ素検出方法では存在しない。
【００１８】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、タンパク質のチューブ壁への粘着を避けるために本発明の方法で用いることができる（Hlady, V.等 Curr. Opin. Biotechnol. 7, 72-77 (1996)）。しかしながら、全ての酵素は溶液中において利用可能であるという事実のためにＢＳＡ存在下での酵素反応はより速くなる一方、化合物がＢＳＡにより溶液から隔離されるために化合物のＩＣ50は弱くなり得る。故に、ＢＳＡ又はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下又は不存在下で行われる、ヒットした諸化合物が最適化段階をもたらす本方法は、標的酵素への保持された阻害活性とアルブミンへの低減された親和性を有する類似体を設計するための重要な構造情報を提供することができる。
【００１９】
本発明の方法は、多くの異なるタイプ及びサブタイプの酵素（例えば、プロテアーゼ、ホスファターゼ、リガーゼ等）にも適用することができる。本発明の別態様では、スクリーニングは、トリプシン、すなわちリジン及びアルギニンのペプチド結合をＣ末端側で開裂するプロテアーゼ（Price, N. C.等 Fundamentals of Enzymology, Oxford University Press, Oxford, U. K. (1999)）、基質として、ペプチド（ＡＲＫＲＥＲＡＦ（３−ＣＦ3）ＳＦＧＨＨＡ）（配列番号：２）で行うことができる。図４ｂに示すように、トリプシン存在下では、出発ペプチド及び開裂したペプチドのそれぞれから生じた１３．３８及び１３．３３ｐｐｍにおいて、２つの19Ｆシグナルがスペクトル中に見られる。スクリーニングは、既知のトリプシン阻害剤を用いて決められた遅延後に反応が停止させられる終点アッセイフォーマットで行われた（図４ｃ）。次いで、活性混合物のデコンボリューションが、阻害剤の同定のために行われた（図４ｄ、ｅ）。故に、天然産物抽出物を、この方法で容易にスクリーニングすることができる。次いで、活性抽出物の成分は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を介して分離され、単一化合物として、本発明の方法で、阻害活性の原因である化合物の同定について試験されることとなる。
【００２０】
本発明方法の別の用途は、タンパク質機能の決定である。ハイスループットゲノムシークエンシングを容易に利用できることからみて、何千ものタンパク質が同定されている。しかしながら、これらタンパク質の多くの機能は未知である。タンパク質の機能は、修飾することができる基質のタイプから推測できる。この目的のために、既知機能の酵素のＣＦ3標識された基質の機能的ゲノムライブラリーが生成される。これら基質は、出発基質及び修飾された基質の19Ｆ化学シフトを決定するために、それらの既知のそれぞれの酵素についてまず試験される。一部の基質は、異なるクラスの酵素に対して基質として作用できる。この基質のライブラリーは、次いで、単一化合物として、又は少ない混合物において、未知機能を有するタンパク質に対してスクリーニングされる。19Ｆシグナルのシグナル強度の低減及び決められた化学シフトでの新しい共鳴の出現は、タンパク質機能の認知を可能とする。
【００２１】
本発明の別態様では、３つの異なるタンパク質であるＡＫＴ１、トリプシン、及びｐ−２１活性化タンパク質（ＰＡＫ４）が、配列番号：２のＣＦ3標識されたペプチドとともにインキュベートされた。図５に示すように、ＰＡＫ４存在下における反応は、ＡＫＴ１存在下における反応の19Ｆシグナルのように、リン酸化ペプチドのシフトに類似する化学シフトの19Ｆシグナルの出現をもたらす。この結果は、ＰＡＫ４をキナーゼファミリーへと分類することを可能とする。その基質が、未知機能を有するタンパク質にとって最適ではないかもしれないので、未知機能を有するより高い濃度のタンパク質と、より長い期間のインキュベーションが必要とされる。ＰＡＫ４の酵素反応速度は、ＡＫＴ１の速度の１／２２しかないので、ＰＡＫ４存在下での反応のための時間は、ＡＫＴ１存在下での反応のための時間よりも長かった。本発明の方法は、活性化された酵素にも適用できる。
【００２２】
本発明の方法は、ＮＭＲの可能性を、Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ類により行われる酵素反応へと広げる。この方法は、よく機能し、かつ、信頼性の高い実験データのアレイを提供する。
【実施例１】
【００２３】
材料及び方法
ＷｔＡＫＴ１組替えタンパク質を、Ｎ末端でＧＳＴに縮合するタンパク質の全長をコードするバキュロウイルスを有するｓｆ２１昆虫細胞の感染により生成した。この細胞を、採取する前に、オカダ酸で４時間処理した。この処理は、細胞のホスファターゼを阻害することにより、タンパク質の総リン酸化レベルを増加させ、ＡＫＴ活性に重要な２部位である活性化ループにおけるスレオニン３０８及びＣ末端疎水モチーフにおけるセリン４７３のリン酸化をもたらした。溶解、精製、及びＧＳＴタグの除去が、次の標準的手順により行われた。Roche Molecular Biochemical (Cat. No. 1418025)から購入したトリプシンを、１％酢酸溶液中に、８．３３μＭの最終ストック溶液濃度で溶解した。
【００２４】
セリン／スレオニンｐ−２１活性化キナーゼＰＡＫ４は、Escherichia coliにおいてＧＳＴ縮合タンパク質として発現し、ＧＳＴタグの除去後に均質に精製された。
全ての化合物が、ＤＭＳＯストック溶液（２０〜４０ｎＭ）に調製された。配列番号：１と配列番号：２のペプチド、及びロイペプチンは、それぞれ１０及び２．１ｍＭの濃度で水溶液に調製された。反応を、ＡＫＴ１については１ｍＭ ＤＴＴ及び５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む５０ｍＭトリスｐＨ７．５において進行させ、トリプシンについては５０ｍＭトリスｐＨ７．５において進行させた。Ｄ2Ｏを、ロックシグナルのために、その溶液に添加した（８％最終濃度）。酵素反応は、エッペンドルフバイアル中で室温で行われ、次いで、決められた遅延後に、ＡＫＴ１についてはスタウロスポリンの添加で、トリプシンについてはＰＭＳＦの添加で停止させた。溶液を、次いで、５ｍｍＮＭＲチューブへと移した。
【００２５】
全てのＮＭＲスペクトルは、２０℃で、５６４ＭＨＺの19Ｆラーモア回転数（Larmor  frequency）で操作する６００ＮＭＲ分光法で記録した。19Ｆ回転数にも1Ｈ回転数にも調節できる５ｍｍプローブを用いた。装置には、自動的なデータ収集のために、サンプル管理システム（ＳＭＳ）オートサンプラーが備え付けられた。データは、プロトンデカップリングをせずに、０．８秒の獲得時間と２．８秒の緩和時間で得た。化学シフトは、トリフルオロ酢酸に標準化された。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、酵素反応の開始後、時間の関数（分で示される）として、ＣＦ3−ＣＯ Ｎ−キャップ化−ＡＫＴｉｄｅについての19Ｆ５６４ＭＨｚ ＮＭＲスペクトルを提供する。活性化されたタンパク質、ペプチド、及びＡＴＰ濃度は、それぞれ５０ｎＭ、３０μＭ、及び１３１μＭであった。ＷｔＡＫＴ１組換えタンパク質を、Ｎ末端でＧＳＴ部分に縮合するタンパク質の全長をコードするバキュロウイルスを有するＳｆ２１昆虫細胞の感染により生成し、次いで、ＧＳＴタグの除去後に、精製して均質にした。そのサンプルは、５０ｍＭトリスｐＨ７．５中で、１ｍＭ ＤＴＴ及び５ｍＭ ＭｇＣｌ2と一緒にした。スペクトルを、１０μＭスタウロスポリンの不存在下（図１Ａ上）及び存在下（図１Ｂ下）で、２０℃で記録した。２．８秒反復時間を有する全部で２５６スキャンを、各々のスペクトルについて記録した（１２分測定時間）。化学シフトは、トリフルオロ酢酸に標準化している。
【図２】図２は、ＡＴＰについて３つの異なる濃度（μＭで示される）で記録されるＣＦ3−ＣＯ Ｎ−キャップ化−ＡＫＴｉｄｅについての19Ｆ５６４ＭＨｚ ＮＭＲスペクトルを提供する（図２Ａ上）。活性化されたタンパク質及びペプチド濃度は、それぞれ、４０ｎＭ及び３０μＭであった。そのサンプルは、５０ｍＭトリスｐＨ７．５中で、１ｍＭ ＤＴＴ及び５ｍＭ ＭｇＣｌ2と一緒にした。その反応は、２２℃で進行させ、６０分後に１０μＭスタウロスポリンの添加で停止させた。（図２Ｂ下）ＡＴＰ濃度の関数としてのリン酸化ペプチドの積分値と、実験データに最もよく一致したＡＴＰについて誘導された８９＋／−１７μＭのＫM。
【図３】図３は、阻害剤Ｈ８９について３つの異なる濃度（μＭで示される）で記録されるＣＦ3−ＣＯ Ｎ−キャップ化−ＡＫＴｉｄｅについての19Ｆ５６４ＭＨｚ ＮＭＲスペクトルを提供する（図３Ａ上）。活性化されたタンパク質、ペプチド、及びＡＴＰ濃度は、それぞれ、４０ｎＭ、３０μＭ、及び１３１μＭであった。そのサンプルは、５０ｍＭトリスｐＨ７．５中で、１ｍＭ ＤＴＴ及び５ｍＭ ＭｇＣｌ2と一緒にした。その反応は、２２℃で進行させ、１２０分後に１０μＭスタウロスポリンの添加で停止させた。（図３Ｂ下）阻害剤濃度の関数としてのリン酸化ペプチドの積分値と、実験データに最もよく一致したＨ８９について誘導された０．７２＋／−０．０５μＭのＩＣ50。
【図４】図４は、プロテアーゼのスクリーニングを提供し、その基質は配列番号：２のペプチドであり、そのタンパク質はウシ膵臓からのトリプシンである。トリプシンの不存在下（ａ）及び存在下（ｂ〜ｅ）のペプチドについての19Ｆ ＮＭＲスペクトル。その反応は、２２℃で進行させ、３０分後に、０．５ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の添加で停止させた。その反応は、化合物の不存在下（ｂ）、５つの化合物混合物（２−アミノ−６メチルキナゾリン−４オール、エチル２−キノキサリンカルボキシレート、５−メチル−ベンズイミダゾール、メチルイソキノリン−３−カルボキシレート、及びロイペプチン）の存在下（ｃ）、ロイペプチンを含まない同じ混合物の存在下（ｄ）、及びロイペプチンのみの存在下（ｅ）で行われた。そのタンパク質、ペプチド、及び化合物濃度は、それぞれ、１５ｎＭ、３０μＭ、及び２０μＭであった。２．８秒反復時間を有する全部で１２８スキャンを、各々のスペクトルについて記録した（６分測定時間）。Ｐｅｐ及びＣ−ｐｅｐは、それぞれ基質及び生成物である。（ｃ）及び（ｅ）における星印は、失われた開裂ペプチドのシグナルの化学シフトを示す。
【図５】図５は、３つの異なるタンパク質である２５ｎＭ ＡＫＴ１（図５Ａ上）、１５ｎＭトリプシン（図５Ｂ中）、及び１５０ｎＭ ＰＡＫ４（図５Ｃ下）の存在下における配列番号：２のペプチドの１９Ｆスペクトルを提供する。そのペプチドは、ＡＫＴ１及びトリプシンについての良好な基質である。リン酸化ペプチドの化学シフトと比較すると、その開裂したペプチドの化学シフトは全く異なる。ｐ−２１活性化タンパク質ＰＡＫ４の存在下で行われるその反応は、リン酸化ペプチドの化学シフトでのシグナルの出現をもたらす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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