(57)【要約】  本発明は、カルシニューリンおよび／またはカルシニューリン／ＮＦＡＴ経路を阻害する薬剤を単独で、またはこのような方法において有用なその他の癌治療、医薬組成物と組み合わせて投与することで、造血性腫瘍を治療する方法、および造血性腫瘍を治療するのに有用な化合物を同定するためのスクリーニング方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
持続性カルシニューリン活性を有する造血性腫瘍を治療するための薬物の調製のためのカルシニューリン阻害剤の使用。
【請求項２】
前記カルシニューリン阻害剤が癌治療法と組み合わせて使用される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記癌治療法が、癌化学療法、免疫療法、放射線治療、ホルモンまたはサイトカイン治療法、造血性腫瘍治療のために使用されるあらゆるその他の治療法、およびそれらの併用からなる群から選択され、好ましくは癌化学療法である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記カルシニューリン阻害剤が、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、Ｌ６８５，８１８、Ｌ７３２，７３１、ＩＳＡＴＸ２４７、ＦＫ５２３、および１５−０−ＤｅＭｅ−ＦＫ−５２０からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記カルシニューリン阻害剤がＦＫ５０６である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記造血性腫瘍がリンパ腫および／または白血病である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
処置する対象が前記対象から単離された造血性腫瘍細胞内に好ましくはＮＦＡＴであるカルシニューリンの脱リン酸化された基質を呈する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記カルシニューリン阻害剤が２〜７週間、好ましくは４〜６週間対象に投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
薬物が寛解療法のために使用される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
対象から単離された造血性腫瘍細胞内のカルシニューリン活性を判定する工程と、腫瘍細胞を有する対象を持続性カルシニューリン活性によって選択する工程とを含んでなる、カルシニューリン阻害剤によって処置する造血性腫瘍を有する対象を選択する方法。
【請求項１１】
対象から単離された造血性腫瘍細胞内のカルシニューリン活性を判定する工程を含んでなり、前記細胞の持続性カルシニューリン活性が処置に対するポジティブ応答性の指標である、造血性腫瘍を有する前記対象のカルシニューリン阻害剤による処置に対する応答性を評価する方法。
【請求項１２】
前記カルシニューリン阻害剤が、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、Ｌ６８５，８１８、Ｌ７３２，７３１、ＩＳＡＴＸ２４７、ＦＫ５２３、および１５−０−ＤｅＭｅ−ＦＫ−５２０からなる群から選択される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記カルシニューリン阻害剤がＦＫ５０６である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記造血性腫瘍がリンパ腫および／または白血病である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
カルシニューリン活性が、好ましくはＮＦＡＴであるカルシニューリンの基質のリン酸化を評価することで判定され、脱リン酸化された基質が持続性カルシニューリン活性の指標である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
対象から単離された造血性腫瘍細胞内のカルシニューリン活性を判定する工程を含んでなる、前記対象中の造血性腫瘍を病期分類または特性決定する方法。
【請求項１７】
持続性カルシニューリン活性が、侵襲能力、転移能、および／または再発確率の指標である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
カルシニューリン活性が、好ましくはＮＦＡＴであるカルシニューリンの基質のリン酸化を評価して判定され、脱リン酸化された基質が持続性カルシニューリン活性の指標である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＦＫ５０６および抗癌剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項２０】
持続性カルシニューリン活性を有する造血性腫瘍の処置における同時、別々または逐次の使用のための組み合わせられた調製品としてのＦＫ５０６および抗癌剤を含有する製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血性腫瘍を治療するための方法、このような方法で有用な医薬組成物、および造血性腫瘍を治療するために有用な化合物を同定するためのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）は、１０歳未満の小児における最も一般的な悪性病変である一方で、成人におけるその発生率は加齢に伴い着実に増加する。非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は最も一般的な造血性悪性病変であり、西欧諸国において目下５番目の最も一般的な癌である。これはＲＥＡＬまたはＷＨＯ分類で定義されるいくつかの病型を含み、前駆型のＴ−およびＢ細胞リンパ芽球性リンパ腫とＡＬＬとの間には、顕著な臨床的重複がある。これらの病型における寛解は、集中的な併用化学療法（例えば播種性ＮＨＬにおけるＣＨＯＰ）によって誘発される。再発は小児期ＡＬＬでは稀であるが、成人ＡＬＬでは頻繁である。ＮＨＬでは、ＣＨＯＰまたはＣＨＯＰベースの一次化学療法を使用して、病型次第で４０〜７０％の患者のみが長期寛解を達成する。したがって既存の治療計画の改善が必要とされる。この線に沿ったアプローチとしては、新しい臨床、組織学的および分子予後因子の模索、再発例における高用量化学療法の使用とそれに続く造血性幹細胞組織移植、新しい治療法の模索と既存の治療法への組み込みが挙げられる。さらにＡＬＬおよびＮＨＬの反復多剤治療は、激しい即時毒性および生活の質の不良およびその他の癌を含む長期続発症と関連付けられている。したがってリンパ腫／白血病患者は、特に、腫瘍細胞生存と増殖の原因であり、または腫瘍細胞とそれらの微小環境間の必須の相互作用に関与する分子機序を直接標的とする新しい治療アプローチから、大きな利点を享受するであろう。
【０００３】
カルシニューリン（ＰＰ２Ｂ）は、多くの生物学的過程に関与して、生命に必須である遍在性に発現されるセリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼである。カルシニューリンは、触媒サブユニット（ＣｎＡ、３つのイソ型）と調節サブユニット（ＣｎＢ、２つのイソ型）から構成されるヘテロ二量体である。その触媒領域に加えて、ＣｎＡは、ＣｎＢ−結合らせん領域、カルモジュリン結合領域、および自己抑制領域（ＡＩＤ）を含む（１）。ホスホリパーゼＣ活性化に連結している細胞表面受容体の会合は、イノシトール（１，４，５）三リン酸（ＩｎｓＰ３）およびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生をもたらす。ＤＡＧがＰＫＣ活性化に関与する一方で、ＩｎｓＰ３は内部貯蔵からのカルシウム放出を仲介する。次に貯蔵の枯渇は特異的貯蔵量誘発型チャネルの開放を誘発し、それは細胞外カルシウムの流入をもたらす。このカルシウムイオン濃度増大は、カルモジュリンとカルシニューリンとの結合、ＡＩＤ阻害からのカルシニューリン遊離、およびそのホスファターゼ活性の活性化を誘発する。遍在的に発現されるＣｎＢ１遺伝子の相同的組換えによる突然変異は、全体細胞組織中のカルシニューリン活性の抑止、およびマウス発育の１１．５日目の胎生致死をもたらす（２）。興味深いことに、ＮＦＡＴ３＋４のダブルノックアウト表現型を模写するＣｎＢ１突然変異表現型は、ＮＦＡＴタンパク質が、マウス発育においてカルシニューリンの主要な下流基質であることを示唆する（２）。
【０００４】
転写調節因子のＮＦＡＴファミリーは、ＮＦＡＴ１、ＮＦＡＴ２、ＮＦＡＴ３、ＮＦＡＴ４、およびＮＦＡＴ５を含む。ＮＦＡＴ５を除き、その他のＮＦＡＴタンパク質は、典型的にＴリンパ球中のプレ−ＴＣＲおよびＴ細胞抗原受容体である、ホスホリパーゼＣ活性化および貯蔵量誘発型Ｃａ２＋進入に連結している細胞表面受容体によって、活性化される（レビューについては（３）を参照されたい）。ＮＦＡＴ１〜４は、Ｎ末端およびＣ末端活性化領域、ＤＮＡ結合を仲介する中央Ｒｅｌ−相同性領域、複数セリンリン酸化部位を含む調節領域（４）、およびカルシニューリンドッキング領域をはじめとする同様のモジュラー構造を共有する。カルシニューリンの主要なドッキング部位は、調節領域のＮ末端領域に局在し、重要なＰｘＩｘＩＴモチーフ上に集中する。休止細胞内では、ＮＦＡＴ１〜４がそれらの調節領域において完全にリン酸化され、細胞質ゾル状態で、それらのＤＮＡ結合活性を阻害する立体配座にある。Ｃａ２＋／カルモジュリンが誘発するカルシニューリンの活性化は、ＮＦＡＴの協奏的脱リン酸化、それらの核蓄積、およびそれらのＤＮＡ結合活性の活性化を誘発する。いくつかの構成的およびシグナル誘発性の移出タンパク質キナーゼは、休止細胞内のＮＦＡＴ過リン酸化の維持と、カゼインキナーゼ１、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ２、Ｊｕｎキナーゼ１（ＪＮＫ１）、および関連ｐ３８をはじめとする、シグナル誘発性脱リン酸化後のそれらの核再リン酸化とに、関係があるとされる。ＮＦＡＴ１〜４は、単量体としてそれらの同族Ａ／ＴＧＧＡＡ結合部位でＤＮＡに結合し、二量体としてＮＦκＢ様応答要素に結合し、特異的細胞系統の、および／または特異的受容体の活性化に答えて、強調複合体（例えばＮＦＡＴ／ＡＰ１、ＮＦＡＴ／ＳＴＡＴ４、ＮＦＡＴ／ＭＡＦ／ＧＡＴＡ３）として複合ＤＮＡ応答要素に結合する。
【０００５】
ＮＦＡＴ１〜４は、多くの発育過程および免疫応答において重要な役割を果たす。カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の最も良く特徴づけられた機能は、抗原提示細胞によるＴＣＲとＣＤ２８のような同時活性化因子受容体との同時会合に続く、Ｔ細胞活性化におけるその必須の役割である。この応答において、ＮＦＡＴ１およびＮＦＡＴ２は重複する役割を果たし、ｃ−ＪＵＮ／Ｃ−ＦＯＳと共に、これらの遺伝子のプロモーター領域内の複合ＮＦＡＴ／ＡＰ１応答要素へのそれらの結合を通じて、いくつかの活性化特異的遺伝子の発現を活性化する（（５）およびその中の参考文献）。注目すべきことにＮＦＡＴ１は、付随するＰＫＣ／ＭＡＰキナーゼの活性化なしに、例えばＣａ２＋シグナル伝達などの抗体無反応化（ａｎｅｒｇｉｚｉｎｇ）刺激を被ったＴ細胞内のＴＣＲシグナル伝達の阻害において、顕著な役割を果たす。この状況において、ＮＦＡＴ１は、ホモ二量体として特異的応答要素に結合するその能力、またはＡＰ１と異なる転写パートナーとの相乗作用のいずれかを通じて、異なる組の遺伝子の転写を調節する。カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路は、Ｔ細胞発育において、特に未熟ＣＤ４ＣＤ８ダブルポジティブ（ＤＰ）胸腺細胞から成熟ＣＤ４およびＣＤ８ＳＰＴ細胞への移行中のポジティブ選択において（６）、および最も顕著には特異的ＳＴＡＴおよび系統特異的転写因子との協働作用を通じた、未感作Ｔヘルパー細胞からＴｈ１およびＴｈ２の双方への分化におけるＴ細胞の機能性分化において、主要な役割を果たす（レビューについては（７）を参照されたい）。
【０００６】
カルシニューリンおよびその下流ＮＦＡＴ基質は、Ｔ細胞活性化において中心的役割を有するので、この経路は病的免疫応答の治療的制御の重要な標的である（レビューについては（８）を参照されたい）。２つのカルシニューリン阻害剤であるシクロスポリンＡとＦＫ５０６（プログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ））は、特異的な細胞内受容体であるサイクロフィリンとＦＫＢＰ１２にそれぞれ結合して作用する。それぞれの薬剤／受容体複合体は、カルシニューリンに結合してその活性を阻害し、ＮＦＡＴの完全な再リン酸化とそれらの細胞質中の蓄積をもたらす。ＣｓＡおよびＦＫ５０６の双方は人間医学において免疫抑制剤として広く使用され、同種移植片生存および自己免疫疾患を容易にする。より特異的なＮＦＡＴ活性化阻害剤、特にＶＩＶＩＴペプチドとして知られているＰＸＩＸＩＴ領域の高親和力バージョンが作り出されており、細胞内でＧＦＰ融合物として発現すると、このペプチドはＮＦＡＴ脱リン酸化およびＮＦＡＴ依存転写を選択的にブロックする（９）。最近、ＮＦＡＴ−カルシニューリン相互作用をブロックするいくつかの薬理学的化合物が同定されているが、現在のところ細胞毒性のために、生体内では限定的関心しか持たれていない（１０）。
【０００７】
カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路は、Ｔ細胞の生存、活性化、および増殖の多くの局面で非常に重要であるが、これまでのところＴ細胞リンパ腫／白血病発生に関与していない。
【０００８】
より一般的には、腫瘍形成においてこの経路の役割が疑われるが明白ではなく証明されていない。確かに生体外研究は、以下を示した。（ｉ）ＮＦＡＴ２の構成的核突然変異体の発現は、免疫抑制マウスにおいて、３Ｔ３−Ｌ１線維芽球系の脂肪細胞への分化を妨げ、これらの細胞の形態変換およびそれらの腫瘍としての生育を誘発する（１１）。（ｉｉ）ＮＦＡＴ１発現およびＮＦＡＴ５発現の双方は、乳癌由来細胞系のインテグリンシグナル伝達に答えて誘発され、細胞遊走の活性化およびマトリゲル浸潤に関与するがこの応答はカルシニューリン活性に依存しない（１２）。（ｉｉｉ）ＮＦＡＴ２は、びまん性大細胞リンパ腫（ＬＢＣＬ）をはじめとするヒト白血病サブセット中の核であり、生体外においてＬＢＣＬ細胞系の細胞生育に関与する（１３）。
【０００９】
特許文献１は、生体外観察に基づいて、ＮＦＡＴが癌腫浸潤促進に関与しているかもしれないことを記載している。ＮＦＡＴ１およびＮＦＡＴ５は高レベルで発現し、ヒト乳癌および結腸癌に由来する細胞系内で構成的に活性である。彼らは生体外でマトリゲル浸潤の増大が、優性阻害ＮＦＡＴ突然変異体によってブロックできるが、シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６によってはブロックできないことを示した。
【００１０】
特許文献２は、煙霧剤送達用シクロスポリンＡ−リポソーム複合体およびパクリタキセル−リポソーム複合体を含んでなる組成物によって、肺転移を処置する方法を開示する。シクロスポリンＡは、原形質膜糖タンパク質（Ｐ−糖タンパク質）に拮抗することで、パクリタキセルの生体利用能を増大させる。転移性細胞に対するシクロスポリンＡの直接効果は開示されていない。非特許文献１は、シクロスポリンＡが、白血病および呼吸上皮性癌に対抗するパクリタキセルに対する新生物細胞の抵抗性を逆転させるのに成功裏に使用されたことを開示する。ＣｓＡ単独では、抗増殖活性がわずかまたは皆無であることが示唆される。ＣｓＡ単独では生存率増大は観察されていない。
【００１１】
特許文献３は、カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の阻害剤を投与することで、血管新生を阻害する方法を開示する。この方法は、血管化腫瘍を治療するために使用できる。
【００１２】
特許文献４は、チロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせたｍＴＯＲ阻害剤の投与を含んでなる、造血性腫瘍をはじめとする癌を治療する方法を開示する。ラパマイシン（シロリムス）はｍＴＯＲ阻害剤の例である。しかしラパマイシンは、いくつかの論文で実証されるようにカルシニューリン阻害剤ではない（例えば１９、２０）。
【００１３】
特許文献５は、場合によりＩＬ−７阻害剤または抗腫瘍剤と組み合わせたラパマイシンの投与を含んでなる、急性リンパ芽球性白血病を治療する方法を開示する。上で示唆されるように、ラパマイシンはカルシニューリン阻害剤ではない。
【００１４】
非特許文献２は、ラットの自然発症急性Ｔ細胞白血病におけるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の使用を考察する。しかし結論は、確立した腫瘍を保有する動物の血中効果があまり大きくなく、リンパ系組織および非リンパ系器官浸潤にＣｓＡが顕著に影響できず、腫瘍との相乗的腎毒性があり、宿主生存率が増大しなかったため否定的であった。さらに効果を示すためには、ＣｓＡを組織移植腫瘍と同時注射して、長期治療で使用しなくてはならなかった。
【００１５】
非特許文献３は、免疫療法によって癌を治療することを目指して、正常なＬＡＫ細胞と細胞毒性白血病Ｔ細胞クローンとの比較を開示し、特にそれらが照射およびＣｓＡ（免疫抑制療法）による治療後に、細胞毒性活性を保持する能力に関与する。
【００１６】
非特許文献４の要約書は、生体外でのＢ−慢性白血病細胞内のＣｓＡのアポトーシス効果、およびＣＬＬ患者における未同定細胞集団に対するそれほど大きくない効果を開示する。しかし用量および投与計画に関するデータは提供されていない。さらにこれらのデータは、いかなる後続の科学論文によっても確認されていない。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５１００８９７号明細書
【特許文献２】国際公開第０３／０９９３６２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０２／２４９５７号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００４／００４６４４号パンフレット
【特許文献５】米国特許出願公開第２００４／００３９０１０号明細書
【非特許文献１】ロス（Ｒｏｓｓ）ら、（１９９７年、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３、５７〜６２頁）
【非特許文献２】スマート（Ｓｍａｒｔ）ら、（１９８８年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、第３号、補遺３、９００〜９１２頁）
【非特許文献３】チェザーノ（Ｃｅｓａｎｏ）ら、（１９９５年，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、４０、１３９〜１５１頁）
【非特許文献４】カブレレ（Ｃａｂｒｅｌｌｅ）ら、（２００２年、Ｂｌｏｏｄ、１００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
この分野におけるかなりの研究努力にもかかわらず、なおも造血性腫瘍に対する新しく、標的を定めた、より効率的な治療に対する多大な必要性がある。さらに医療は、各症例のための最も適切な治療法を探し求めている。確かに抗腫瘍治療には多くの副作用があり、好ましくは、治療は、その効率を予期することができれば使用される。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発明者らは、カルシニューリンがリンパ系悪性腫瘍中で活性化されることを見いだした。これらの癌細胞内でのカルシニューリンの活性化は観察が困難であった。確かにカルシニューリンの活性化は脱リン酸化によるＮＦＡＴ活性化を通じて評価でき、細胞が培養中で維持されるとすぐにＮＦＡＴの活性化は消失する。
【００１９】
発明者らは、カルシニューリンがリンパ系悪性腫瘍における治療的な関心対象であることを示した。意外にもカルシニューリンの阻害剤は、腫瘍細胞それ自体および／またはその間質微小環境のいずれかに影響することで、リンパ系悪性腫瘍の発達を制御する治療的な関心対象であることが示された。
【００２０】
したがって本発明は、造血性腫瘍を治療するための薬物を調製するためのカルシニューリン阻害性薬剤の使用に関する。好ましい実施態様では、前記造血性腫瘍は持続性カルシニューリン活性を有する。好ましい実施態様では、カルシニューリン阻害性薬剤は、シクロスポリンＡおよびＦＫ５０６であることができる。最も好ましい実施態様では、カルシニューリン阻害性薬剤はＦＫ５０６である。好ましい実施態様では、造血性腫瘍はリンパ腫および／または白血病である。好ましい実施態様では、カルシニューリン阻害性薬剤が癌治療法と組み合わされて使用される。
【００２１】
本発明は、癌治療法における同時、別々または逐次の使用のために組み合わせられた調製品としての、好ましくはＦＫ５０６であるカルシニューリン阻害性薬剤と抗癌剤とを含有する製品にさらに関する。本発明はまた、好ましくはＦＫ５０６であるカルシニューリン阻害性薬剤と抗癌剤とを含んでなる医薬組成物にも関する。
【００２２】
本発明は、対象から単離された造血性腫瘍細胞内のカルシニューリン活性を判定する工程を含んでなる、対象において造血性腫瘍の病期分類または特性決定をする方法にさらに関する。特定の実施態様では、持続性のまたは増大するカルシニューリン活性を有する腫瘍細胞は、侵襲能力、転移能、および／または再発確率に関係している。
【００２３】
本発明はまた、対象から単離された造血性腫瘍細胞内のカルシニューリン活性を判定する工程と、持続性カルシニューリン活性がある腫瘍細胞を有する対象を選択する工程とを含んでなる、カルシニューリン阻害剤によって処置する造血性腫瘍を有する対象を選択する方法にも関する。
【００２４】
さらに本発明は、対象から単離された造血性腫瘍細胞内のカルシニューリン活性を判定する工程を含んでなり、前記細胞の持続性カルシニューリン活性が処置に対するポジティブ応答性の指標である、造血性腫瘍を有する対象のカルシニューリン阻害剤による処置に対する応答性を評価する方法に関する。さらに本発明は、カルシニューリンがカルシニューリン基質を脱リン酸化できる条件下において、生体外または生体内で試験化合物と前記基質とを接触させる工程と、前記試験化合物が基質のリン酸化状態に影響するかどうかを判定する工程とを含んでなる、造血性腫瘍を治療するための薬剤をスクリーニング、同定または選択する方法に関する。好ましい実施態様では、カルシニューリン基質はＮＦＡＴである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本データは、カルシニューリンがリンパ系悪性腫瘍における治療的な関心の標的であることを示す。それらはさらに人間医学においてその他の適応症で広く使用されるカルシニューリンの２つの阻害剤、すなわちＣｓＡおよびＦＫ５０６が、腫瘍細胞それ自体および／またはその間質微小環境のいずれかに影響することによって、白血病およびリンパ腫の発生を制御するための治療的な関心対象になりうることを示す
【００２６】
発明者らは本発明において、試験されたヒトＴ細胞悪性腫瘍のマウスモデル中で持続性カルシニューリン活性化が観察されることを実証した。特に発明者らは、癌細胞がＮＦＡＴの持続性脱リン酸化を呈することを示した。ヒト悪性腫瘍に関連する２つのマウスモデルである、細胞内ＮＯＴＣＨ１（ＩＣＮ１）またはＴＥＬ−ＪＡＫ２誘発性Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）では、ＣｓＡまたはＦＫ５０６によるカルシニューリン活性の生体内阻害は、白血病細胞のアポトーシス、迅速な腫瘍排除を引き起こし、顕著にマウス生存を延長した。反対にカルシニューリンの構成的活性化突然変異体の異所性発現は、白血病進行に有利に働く。したがってカルシニューリン活性化は、生体内での白血病表現型の維持のために重要であり、この経路はＴ細胞悪性腫瘍における新しい治療的な標的として認められる。確かにＣｓＡおよびＦＫ５０６処置は、リンパ系器官中の腫瘍負荷の激しい阻害、正常な血球新生の回復を伴う骨髄からの白血病細胞のほぼ完全な消失、および浸潤を受けた肝臓からの白血病細胞の本質的に完全な消失をもたらす。さらに発明者らは、肝臓細胞がＣｓＡまたはＦＫ５０６処置によって影響されないことから、ＣｓＡおよびＦＫ５０６の細胞毒性の特異性を観察した。
【００２７】
さらに発明者らは、このような処置が患者にとって有益であることができる条件を確立する。確かにカルシニューリン阻害剤によって効率的な処置をするために、造血性腫瘍はカルシニューリンの持続性活性化を示さなくてはならない。
【００２８】
定義
「を含んでなる」が使用される場合、これは好ましくは「本質的に〜からなる」、より好ましくは「からなる」によって置換することができる。
【００２９】
この明細書全体において、カルシニューリン阻害性薬剤への言及で「造血性腫瘍の処置」などに言及される場合は常に、
ａ）カルシニューリン阻害性薬剤を（好ましくは薬学的に許容可能なキャリア材料中で）造血性腫瘍の処置を可能にする用量（＝治療的有効量）で、特にこのような処置を必要とするヒトである対象に（少なくとも１回の処置のために）投与する工程を含んでなる、（治療するための）造血性腫瘍の処置法、
ｂ）造血性腫瘍の処置のためのカルシニューリン阻害性薬剤の使用、また前記処置において（特にヒトで）使用するためのカルシニューリン阻害性薬剤の使用、
ｃ）造血性腫瘍の処置のための医薬品の製造のためのカルシニューリン阻害性薬剤の使用、
ｄ）造血性腫瘍の処置に適した用量のカルシニューリン阻害性薬剤を含んでなる医薬品、および／または
ｅ）造血性腫瘍の処置において、同時、別々または逐次に使用するために組み合わされた調製品としてのカルシニューリン阻害性薬剤および抗癌剤を含有する製品
を意味する。
【００３０】
本発明は造血性腫瘍を治療するための薬物の調製のためのカルシニューリン阻害性薬剤の使用に関する。好ましい実施態様では、前記造血性腫瘍は持続性のまたは増大するカルシニューリン活性を有する。特定の実施態様では、処置される対象は、前記対象から単離された造血性腫瘍細胞内に脱リン酸化ＮＦＡＴを呈する。
【００３１】
本発明では、「持続性のまたは増大するカルシニューリン活性」とは、健康なまたは正常なリンパ球で観察される活性よりも少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％高いカルシニューリン活性を指すことが意図される。「正常な」カルシニューリン活性では、リン酸化および非リン酸化カルシニューリン基質の組み合わせが観察される。持続性のまたは増大するカルシニューリン活性では、基質は本質的に非リン酸化状態にある。「本質的に」とは、基質の少なくとも７０、８０、９０、９５、９９％が非リン酸化状態にあることが意図される。好ましい実施態様では、アッセイされる基質はＮＦＡＴである。カルシニューリン活性は、当該技術分野で知られているあらゆる手段によって判定できる。本発明は、治療的な量のカルシニューリン阻害性薬剤を投与する工程を含んでなる、対象中で造血性腫瘍を治療する方法にさらに関する。場合により、対象中で造血性腫瘍を治療する方法は、前記対象から単離された造血性腫瘍細胞内のカルシニューリン活性を判定する先行工程を含んでなる。確かに、カルシニューリンの持続性のまたは増大する活性の存在は、前記造血性腫瘍を治療するためのカルシニューリン阻害性薬剤の効率の指標である。特定の実施態様では、対象中で造血性腫瘍を治療する方法は、前記対象から単離された造血性腫瘍細胞内のＮＦＡＴのリン酸化状態を判定する先行工程を含んでなることができる。脱リン酸化ＮＦＡＴの存在は、前記造血性腫瘍を治療するためのカルシニューリン阻害性薬剤の効率の指標である。このような治療的な量は、標的造血性腫瘍細胞内でカルシニューリン活性を阻害するのに十分な量である。
【００３２】
発明者らは、カルシニューリン阻害性薬剤が癌細胞のアポトーシスを誘発し、癌細胞増殖を阻害することを示した。したがってこの薬剤は、癌の進行、特に癌の拡散と生育をブロックするための多大な関心対象である。この薬剤はまた、癌退縮、血球新生回復、および生存率増大も提供できる。
【００３３】
本発明はまた、造血性腫瘍の治療効率を増大させるための薬物の調製のためのカルシニューリン阻害性薬剤の使用にも関する。好ましい実施態様では、前記造血性腫瘍は持続性のまたは増大するカルシニューリン活性を有する。好ましくは造血性腫瘍の処置は、癌化学療法、免疫療法、放射線治療、ホルモンまたはサイトカイン治療法、造血性腫瘍の処置のために使用されるあらゆるその他の治療法、またはそれらの併用であることができる。より好ましくは造血性腫瘍の処置は、癌化学療法である。特に本発明は、カルシニューリン阻害性薬剤の効率的な量を対象に投与し、それによって前記対象の生存時間を延長する工程を含んでなる、造血性腫瘍を有する対象の生存時間を延長する方法に関する。好ましくは、本方法は、前記対象から単離された造血性腫瘍細胞内のカルシニューリン活性を判定する先行工程と、持続性カルシニューリン活性がある腫瘍細胞を有する対象に薬剤を投与する工程とをさらに含んでなる。
【００３４】
好ましくは、前記対象は哺乳類である。より好ましくは、前記対象はヒトである。
【００３５】
ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）は、ＮＦＡＴ１（ＮＦＡＴＰおよびＮＦＡＴＣ２とも称される、Ｕｎｉｇｅｎｅ  Ｈｓ．３５６３２１）、ＮＦＡＴ２（ＮＦＡＴＣ１およびＮＦＡＴＣとも称される、Ｕｎｉｇｅｎｅ  Ｈｓ．５３４０７４）、ＮＦＡＴ３（ＮＦＡＴＣ４とも称される、Ｕｎｉｇｅｎｅ  Ｈｓ．７７８１０）、ＮＦＡＴ４（ＮＦＡＴＣ３およびＮＦＡＴＸとも称される、Ｕｎｉｇｅｎｅ  Ｈｓ．３４１７１６）、およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択できる。好ましい実施態様では前記ＮＦＡＴは、ＮＦＡＴ１、ＮＦＡＴ２、およびＮＦＡＴ４からなる群から選択される。前述の登録番号に対応するＵｎｉｇｅｎｅファイルの開示は、参照によって本明細書に援用する。
【００３６】
より具体的には、本発明は、造血性腫瘍の処置のために利用できる。好ましくは前記造血性腫瘍は、Ｂリンパ腫、Ｔリンパ腫、Ｂリンパ芽球性白血病およびＴリンパ芽球性白血病からなる群から選択される。より好ましい実施態様では、前記造血性腫瘍はＴ細胞白病および／またはＴ細胞リンパ腫である。例えば造血性腫瘍は、白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、毛様細胞リンパ腫およびバーキットリンパ腫をはじめとするリンパ系造血性腫瘍、および急性および慢性骨髄性白血病および前骨髄球性白血病をはじめとする骨髄系造血性腫瘍からなる群から選択できる。特定の実施態様では、造血性腫瘍は進行性白血病またはリンパ腫である。癌は原発腫瘍または転移であることができる。処置される癌はまた、再発であることもできる。
【００３７】
本発明に従って、カルシニューリン阻害性薬剤は、例えばＮＦＡＴのリン酸化などのＮＦＡＴの不活性化をもたらす。確かに発明者らは、ヒト対象から単離された原発癌細胞内でのＮＦＡＴの活性化を観察した。ＮＦＡＴ活性化としては、カルシニューリンとＮＦＡＴとの間のタンパク質−タンパク質相互作用、カルシニューリンによるＮＦＡＴの脱リン酸化、およびＮＦＡＴの核への転位が挙げられる。
【００３８】
カルシニューリン阻害剤は、臓器移植に続く拒絶反応を予防するために、治療法で免疫抑制薬として既に使用されている。免疫抑制治療法では、カルシニューリン阻害剤は長期治療のために高用量で使用される。このような薬剤としては、限定されるものではないが、スイス国（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のノバルティス・インターナショナルＡＧ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＧ）からのシクロスポリンＡ、米国イリノイ州ディアフィールド（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）のフジサワ・ヘルスケア・インコーポレーテッド（Ｆｕｊｉｓａｗａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｉｎｃ．）からのＦＫ５０６、米国ニュージャージー州ローウェイ（Ｒａｔｈｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）のメルク社（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．）からのＦＫ５２０、メルク社（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．）からのＬ６８５，８１８およびＬ７３２，７３１、ホフマン・ラ・ロシュ社（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｌｔｄ）からのＩＳＡＴＸ２４７、ＦＫ５２３、および１５−０−ＤｅＭｅ−ＦＫ−５２０（リュー（Ｌｉｕ）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１：３８９６〜３９０２頁（１９９２年））が挙げられる。国際公開第２００５０８７７９８号パンフレットは、カルシニューリンを阻害するシクロスポリン誘導体について記載している。国際公開第２００６０７８７２４号パンフレットは、カルシニューリンを阻害するＦＫ５０６およびＦＫ５２０類似体について記載している。この一覧は限定的であることを意図しない。
【００３９】
カルシニューリンは、触媒サブユニット（カルシニューリンＡ）および調節サブユニット（カルシニューリンＢ）から構成されるヘテロ二量体である、セリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼである。次にカルシニューリン活性は、その発現、特にそのサブユニットの１つの発現をブロックしても阻害できる。好ましい実施態様では、カルシニューリンの活性は、調節サブユニットＢの発現をブロックしても阻害できる。発現は、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）などの化学合成オリゴヌクレオチドによって、当業者に知られているあらゆる手段でブロックできる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに相補的な短い一本鎖分子であり、典型的に１０〜５０ｍｅｒの長さ、好ましくは１５〜３０ｍｅｒの長さ、より好ましくは１８〜２０ｍｅｒの長さを有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは開始コドン、標的遺伝子の転写開始部位、またはイントロン−エクソン接合部を標的とするようにデザインされる（レビューについては１６を参照されたい）。リボザイムは触媒活性を保持する一本鎖のＲＮＡ分子である。リボザイム作用の機序は、相補的標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的相互作用と、それに続くヌクレオチド鎖開裂を伴う。リボザイムは改変されて、選択的にはＧＵＣである開裂ＮＵＨトリプレットを含んでなる関心のある標的ＲＮＡと反応する（レビューについては１７を参照されたい）。ｓｉＲＮＡは、通常２１または２３ヌクレオチドの長さであり、１９または２１ヌクレオチドの二本鎖配列および２ヌクレオチド長さの３’オーバーハングがある。ｓｈＲＮＡは、いくつかの追加的ヌクレオチドが２本のｓｉＲＮＡ鎖間にループを形成すること以外は、ｓｉＲＮＡをコードする配列と同一規則でデザインされる（レビューについては１８を参照されたい）。
【００４０】
代案としては、カルシニューリン活性は、カルシニューリンサブユニット間の相互作用、特にサブユニットＡとＢとの間の相互作用を阻害する化合物によって阻害できる。カルシニューリン活性は、カルシニューリンとカルモジュリンとの間の相互作用を阻害する化合物によって阻害できる。カルシニューリン阻害はまた、ｃａｂｉｎ１、ｃａｌｃｉｐｒｅｓｓｉｎｓ、およびＡＫＡＰ７９をはじめとするカルシニューリンの内在性阻害剤の活性化によっても得ることができる。
【００４１】
カルシニューリン阻害性薬剤は、例えばＮＦＡＴなどのカルシニューリンとその基質との間の相互作用を阻害する化合物であることができる。このような化合物については、カルシニューリンとＮＦＡＴとの間の相互作用を阻害し、それによってカルシニューリンによるＮＦＡＴの脱リン酸化を阻害するＣａｂｉｎ１と称されるポリペプチド、およびその断片について記載している米国特許第６，６８６，４５０号明細書で記載される。国際公開第２００４／０６９２００号パンフレットは、カルシニューリンとＮＦＡＴおよびＰｘＩｘＩＴ結合境界面を含有するその他の基質との間の相互作用を特異的に阻害して、それによってカルシニューリンによるこれらの基質の脱リン酸化を阻害できるＮＦＡＴに由来するペプチドを開示する。このようなペプチドの一例は、アミノ酸配列ＭＡＧＰＨＰＶＩＶＩＴＧＰＨＥＥを含んでなる、またはそれからなるペプチドである。この特許出願はまた、カルシニューリンによる基質の脱リン酸化を阻害できる、例えばＩＮＣＡ−１、ＩＮＣＡ−２、およびＩＮＣＡ−６などの小型化合物についても記載している。
【００４２】
カルシニューリンを阻害するその他の薬剤は、当該技術分野で既に開示されるスクリーニング法によって同定できる。例示として、米国特許第６，８７５，５８１号明細書および米国特許第６，３３８，９４６号明細書は、カルシニューリン活性の調節因子を同定するのに有用なスクリーニング法について記載している。
【００４３】
好ましい実施態様では、カルシニューリン阻害性薬剤は、ＮＦＡＴ脱リン酸化を阻害する薬剤である。
【００４４】
カルシニューリン阻害性薬剤は、様々な起源、性質、および組成物であってもよい。それは、単離された、またはその他の物質との混合物中の脂質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、小型分子などのあらゆる有機または無機物質であってもよい。好ましい実施態様では、薬剤は小型分子である。その他の好ましい実施態様では、薬剤はペプチドまたはポリペプチドである。追加的実施態様では、薬剤は、例えばアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、リボザイムなどの核酸である。
【００４５】
カルシニューリン阻害性薬剤は、ターゲティング部分と関連して使用でき、ターゲティング部分は正常な細胞よりもむしろ癌細胞に優先的に到達できるようにする。好ましくは、ターゲティング部分は癌細胞の選択的治療を可能とする。例えば、志賀毒素のＢサブユニットを癌細胞ベクトル化手段として使用できる（より詳しくは国際公開第２００４０１６１４８号パンフレットを参照されたい）。
【００４６】
本発明に従って、カルシニューリン阻害性薬剤は、単独で、または通常の癌治療法と組み合わせて使用できる。癌治療法は、癌化学療法、免疫療法、放射線治療、ホルモンまたはサイトカイン治療法、造血性腫瘍の治療のために使用されるあらゆるその他の治療法、およびそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。好ましくは癌治療法は癌化学療法である。好ましい実施態様では、カルシニューリン阻害性薬剤が、癌化学療法と組み合わせて使用される。カルシニューリン阻害性薬剤は、癌治療法の前、同時または後に投与できる。第１の実施態様では、カルシニューリン阻害性薬剤および抗癌剤は、同一経路で投与できる。代案の実施態様では、それらは異なる投与経路によって投与される。
【００４７】
本発明は、治療的な量のカルシニューリン阻害性薬剤および治療的な量の抗癌剤を投与する工程を含んでなる、対象中で造血性腫瘍を治療する方法に関する。好ましくは、本方法は、前記対象から単離された造血性腫瘍細胞内のカルシニューリン活性を判定する工程をさらに含んでなる。より詳しくは、対象中で造血性腫瘍を治療する方法は、前記対象から単離された造血性腫瘍細胞内のＮＦＡＴのリン酸化状態を判定する先行工程を含んでなる。確かに脱リン酸化ＮＦＡＴの存在は、前記造血性腫瘍を治療するためのカルシニューリン阻害性薬剤の効率の指標である。
【００４８】
本発明は、造血性腫瘍の処置において同時、別々または逐次に使用するための組み合わせられた調製品としてのカルシニューリン阻害性薬剤および抗癌剤を含有する製品に関する。特に造血性腫瘍は、持続性のまたは増大するカルシニューリン活性を有する。好ましい実施態様では、前記カルシニューリン阻害性薬剤はＦＫ５０６である。
【００４９】
本発明は、カルシニューリン阻害性薬剤および抗癌剤を含んでなる医薬組成物に関する。好ましくはカルシニューリン阻害性薬剤はＦＫ５０６である。このような医薬組成物は、一般に、薬学的に許容可能なキャリアを含んでなる。薬学的に許容可能なキャリアとは、それと共に投与される薬剤の治療的特性を保持しながら、処置哺乳類にとって生理学的に許容可能なキャリアであることが意図される。例えば薬学的に許容可能なキャリアは、生理食塩水であることができる。その他の薬学的に許容可能なキャリアについては当業者に知られており、例えば（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）レミントン、「薬学の科学と実際（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）」（第２０版、Ａ．Ｒ．ジェンナーロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）編、２０００年、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）で記載される。
【００５０】
抗癌剤は、癌細胞が生育する（増殖する）または生存する能力を妨げる。いくつかのタイプの薬剤があり、各タイプは異なる様式で細胞が生育するまたは生存する能力を妨げる。癌患者を治療するのに使用される薬剤タイプの数例の簡単な説明が以下に続く。これらの科学療法は、当業者によく知られている。
【００５１】
第１のクラスの薬剤は、ＤＮＡと反応してそれに化学的に改変し、それが細胞生育を許すのを防止するＤＮＡ損傷薬剤である。例えばこの種類の薬剤は、限定されるものではないが、次の群から選択できる。ブスルファン（マイレラン）、カルボプラチン（パラプラチン）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、クロランブシル（ロイケラン）、シスプラチン（プラチノール）、シクロホスフアミド（シトキサン、ネオサー）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ）、イホスファミド（Ｉｆｅｘ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード、マスターゲン）、メルファラン（アルケラン）、およびプロカルバジン（マチュレーン）。
【００５２】
第２のクラスの薬剤は、細胞核中のＤＮＡと直接相互作用して細胞生存を妨害する抗腫瘍抗生物質である。例えばこの種類の薬剤は、限定されるものではないが、次の群から選択できる。ブレオマイシン（ブレノキサン）、ダウノルビシン（セルビジン）、ドキソルビシン（アドリアマイシン、ルベックス）、イダルビシン（イダマイシン）、およびミトキサントロン（ノバントロン）。
【００５３】
第３のクラスの薬剤は、ＤＮＡまたはＲＮＡ構成単位と非常に良く似た化学物質である抗代謝産物である。それらが置き換わり、ＲＮＡまたはＤＮＡを形成する細胞の能力をブロックすると細胞生育を防止するように、それらは天然化学物質から十分に変更される。例えばこの種類の薬剤は、限定されるものではないが、次の群から選択できる。５−アザシチジン（ＡＺＡ−ＣＲ）、クラドリビン（ロイスタチン）、シタラビン（シトシンアラビノシド、Ａｒａ−Ｃ、サイトサール−Ｕ）、フルダラビン（フルダラ）、ヒドロキシ尿素（ヒドレア）、６−メルカプトプリン（プリネトール）、エトポシド、メトトレキサート（ロイマトレックス）、および６−チオグアニン（チオグアニン）。
【００５４】
第４のクラスの薬剤は、常態ではＤＮＡへの損傷を修復する細胞核中の酵素に作用するＤＮＡ修復酵素阻害剤である。これらの薬剤は、酵素が働くのを防止して、ＤＮＡが損傷をより被りやすくする。例えばこのような薬剤は、エトポシド（ＶＰ−１６、ベペシド）、テニポシド（ＶＭ−２６、ブモン）、およびトポテカン（ヒカンプチン）であることができる。
【００５５】
第５のクラスの薬剤は、有糸分裂をブロックすることで細胞が分割するのを防止する薬剤である。例えばこのような薬剤は、ビンブラスチン（ベルバン）、ビンクリスチン（オンコビン）、およびパクリタキセル（タキソール）であることができる。
【００５６】
第６のクラスの薬剤は、リンパ球を殺傷できるホルモンである。高用量では、天然ホルモンコルチゾールの類縁体であるこれらの合成ホルモンは、悪性リンパ球を殺傷できる。例えばこのような薬剤は、デキサメタゾン（デカドロン）、メチルプレドニゾロン（メドロール）、プレドニゾロン、およびプレドニゾン（デルタソン）であることができる。
【００５７】
第７のクラスの薬剤は、ある種の白血病に作用して、白血病細胞の成熟を誘発する細胞成熟剤である。例示として、全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）および三酸化ヒ素（トリセノックス）が挙げられる。
【００５８】
第８のクラスの薬剤は、インターフェロン−α（ロフェロンＡ、イントロンＡ）などの正確な作用機序が不明である天然物に基づく生物変更因子である。
【００５９】
第９のクラスの薬剤は、従来の化学療法よりも少ない副作用で、癌細胞を標的とし、破壊するモノクローナル抗体である。例示として、リツキシマブ（リツキサン）およびゲムツズマブオゾガミシン（ミルオタルグ）が挙げられる。
【００６０】
第１０のクラスの薬剤は、特異的分子標的を有する薬剤である。イマチニブメシレート（グリーベック、グリベック）などのこれらの薬剤は、悪性細胞形質転換を開始する特異的な突然変異タンパク質をブロックするようにデザインされる。
【００６１】
当然ながら、この一覧は、臨床治験で使用されまたは研究されるあらゆる薬剤を含むものではない。これらの薬剤および薬剤群の組み合わせが、治療の基礎を形成することが多い。これらの薬剤のあるものは、特定のサブタイプの癌、特に白血病、リンパ腫または骨髄腫に対して、事実上活性であることが分かっている。
【００６２】
特定の実施態様では、カルシニューリン阻害剤が、第２、第３、第５、および第６のクラスからなる群から選択される少なくとも１つの抗癌薬剤と組み合わせて使用される。例えばそれは、プレドニゾロン、ビンクリスチン、ダウノルビシン、エトポシド、およびシタラビンからなる群から選択される、少なくとも１つの薬剤と組み合わせることができる。
【００６３】
本発明の組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、直腸的に、鼻から、頬側から、膣からまたは埋め込みレザバー経由で投与されてもよい。「非経口」という用語は、ここでの用法では、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、くも膜下腔内、肝臓内、病巣内、および頭蓋内注射または灌流技術を含む。好ましくは、本組成物は、経口的、腹腔内または静脈内投与される。例えばカルシニューリン阻害剤が経口的に投与され、抗癌剤は静脈内投与される。代案としてはカルシニューリン阻害剤および抗癌剤は、どちらも静脈内投与される。
【００６４】
治療的な量とは、生体内で癌生育、進行または転移を阻害するのに十分な、単独のまたは抗癌剤と組み合わさった薬剤量であることが意図される。癌治療のための薬剤の有効量は、投与様式、対象の年齢、体重、性別、および総体的健康に左右されて変動する。これは、細胞増殖、腫瘍サイズ、癌進行または転移を効果的に低下させるのに十分な量である。特定用途に対して治療的な量を判定するために、当該技術分野で既知の多くの方法があることが理解される。例えばＦＫ５０６の用量は、経口投与では０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の間、より好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｋｇ／日の間であることができ、静脈内注射では０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ／日の間、好ましくは０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇ／日の間であることができる。特定の実施態様では、血液ＦＫ５０６レベルは、５〜４０ｎｇ／ｍＬの間、好ましくは１５〜２０ｎｇ／ｍＬの間を含んでなる。したがって投与されるＦＫ５０６の用量は、上述の血液ＦＫ５０６レベルを得るために適応できる。経口製剤（ネオラール、サンディミュン）としてのシクロスポリンＡの用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日であることができる。
【００６５】
特定の実施態様では、カルシニューリン阻害性薬剤を含んでなる組成物が短期間投与される。好ましい実施態様では、カルシニューリン阻害剤は、２〜１０週間、好ましくは３〜８、より好ましくは４〜６週間対象に投与される。特定の実施態様では、期間は化学療法の期間であることができる。場合により期間は１日〜１ヶ月であることができる。場合により治療期間は、場合によりさらに低い用量のカルシニューリン阻害剤で反復できる。カルシニューリン阻害性薬剤では、１日１回、１日２回またはそれ以上投与することができる。好ましい実施態様では、カルシニューリン阻害性薬剤は免疫抑制効果を避けるように投与される。例えばこの免疫抑制効果は、用量（例えばより低い用量）または治療期間（例えばより短期間）を適応させて、得ることができる。
【００６６】
好ましい実施態様では、寛解（誘導）治療中に、カルシニューリン阻害剤を使用して対象を処置する。したがってこれは好ましくは単独で、または寛解療法で使用される少なくとも１つの抗癌剤と組み合わせて使用される。寛解療法は一般に短く（例えば６週間）、この期間の長さは、免疫不全効果なしにカルシニューリン阻害剤の抗腫瘍有益効果を得るのにうまく適合している。ＦＫ５０６は血液−脳関門を越える利点を有する。したがってＦＫ５０６およびこの能力を示すその他のカルシニューリンは、特に腫瘍細胞によるＣＮＳ浸潤にうまく適合している。代案のまたは追加的実施態様では、強化および／または継続治療中にカルシニューリン阻害剤を使用して対象を処置する。
【００６７】
癌化学療法の投与プロトコルについては、当業者によく知られている。
【００６８】
本発明は、対象から単離された造血性腫瘍細胞内のカルシニューリン活性を判定する工程を含んでなる、対象中で造血性腫瘍を病期分類または特性決定する方法にさらに関する。特定の実施態様では、カルシニューリン活性を判定する工程は、好ましくはＮＦＡＴであるカルシニューリンの基質のリン酸化を評価することで判定され、脱リン酸化された基質は持続性カルシニューリン活性の指標である。好ましい実施態様では、本発明は、対象から単離された癌サンプル中のＮＦＡＴのリン酸化状態を判定する工程を含んでなる、対象中で造血性腫瘍を病期分類または特性決定する方法にさらに関する。脱リン酸化ＮＦＡＴが癌発育に関与する活性化ＮＦＡＴであるのに対し、リン酸化ＮＦＡＴは不活性化ＮＦＡＴである。特定の実施態様では、持続性のまたは増大するカルシニューリン活性、および例えば脱リン酸化ＮＦＡＴは侵襲能力、転移能、再発確率に関係する。患者からの癌サンプルは、体液、好ましくは血液サンプルである。好ましい実施態様では、カルシニューリン基質（例えばＮＦＡＴ）のリン酸化状態は、いかなる培養工程もなしに、好ましくは切除サンプルであるサンプルで直接にアッセイする。代案としてはカルシニューリン基質（例えばＮＦＡＴ）のリン酸化状態は、好ましくは１時間未満の短時間培養サンプルである。
【００６９】
本発明はまた、対象から単離された造血性腫瘍細胞内のカルシニューリン活性を判定する工程を含んでなる、造血性腫瘍を有する対象のカルシニューリン阻害剤による処置に対する応答性を評価する方法にも関し、前記細胞の持続性カルシニューリン活性は前記処置に対する、ポジティブ応答性の指標である。ポジティブ応答性とは、リンパ系器官中の腫瘍負荷の阻害、骨髄からの白血病細胞の消失、正常な血球新生の回復、肝臓、脾臓および腎臓などの浸潤を受けた器官からの白血病細胞の本質的に完全な消失、および延長された生存からなる群から選択される、少なくとも１つの効果であることが意図される。好ましい実施態様では、本発明はまた、対象から単離された癌サンプル中のＮＦＡＴのリン酸化状態を判定する工程を含んでなる、カルシニューリン阻害性薬剤による造血性腫瘍の処置に対する対象の応答性を評価する方法にも関し、脱リン酸化ＮＦＡＴの存在は、前記造血性腫瘍を治療するためのカルシニューリン阻害性薬剤の効率の指標である。
【００７０】
本発明はまた、対象から単離された造血性腫瘍細胞内のカルシニューリン活性を判定する工程、および持続性カルシニューリン活性がある腫瘍細胞を有する対象を選択する工程を含んでなる、カルシニューリン阻害剤によって処置する造血性腫瘍を有する対象を選択する方法にも関する。
【００７１】
本発明で記載される方法および用途はまた、固形腫瘍、特に固形腫瘍からの転移にも適する。したがって本発明はまた、このような方法および用途についても考察する。
【００７２】
本発明は、カルシニューリンが、好ましくはＮＦＡＴポリペプチドである前記カルシニューリン基質を脱リン酸化できる条件下で、試験化合物と、好ましくはＮＦＡＴポリペプチドであるカルシニューリン基質とを生体外または生体内で接触させる工程と、前記試験化合物が、好ましくはＮＦＡＴであるカルシニューリン基質のリン酸化状態に影響するかどうかを判定する工程を含んでなる、造血性腫瘍を治療するための薬剤をスクリーニング、同定または選択する方法に関与する。特定の実施態様では、好ましくはＮＦＡＴポリペプチドであるカルシニューリン基質は、カルシニューリンが前記基質を脱リン酸化できる条件下で、単離細胞に、または試験非ヒト動物細胞に含まれる。
【００７３】
例えばカルシニューリン活性は、カルシニューリン基質のリン酸化状態によって判定できる。リン酸化状態は、当業者に知られている、異なる方法によってアッセイできる。第１の実施態様では、カルシニューリン活性は、生化学アッセイ（すなわち特異的ペプチド基質に対する細胞抽出物中の活性）によって判定できる。このようなカルシニューリンによるリン酸化のためのペプチド基質は市販される。例えば米国サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）のカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）からのカルシニューリン比色分析アッセイキット（参考文献３１）、カルシニューリン基質としてはバイオモル・インターナショナル、アメリカン・ペプチド・カンパニー（ＢＩＯＭＯＬ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）からＲＩＩリンペプチド、オクソーラ・プラットフォーム（Ａｘｘｏｒａ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）からのＬＫＴ−Ｃ０２４８−Ｍ００１。第２のおよび好ましい実施態様では、カルシニューリン活性は、カルシニューリン基質の生体内リン酸化の分析によって判定される。このような基質は、例えばＮＦＡＴ、ＮＦ−κＢ、調節ＣＲＥＢのトランスデューサー（ＴＯＲＣ）、ＥＬＫ１またはＭＥＦ２であることができる。例えばＮＦＡＴでは、２つの形態のＮＦＡＴ（リン酸化および非リン酸化）が異なる移行を示す。したがってＮＦＡＴは、実施例で詳述するようにウエスタンブロットによって分析できる。例えばサンプルの細胞について総細胞抽出物を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法によって分解し、リン酸化レベルと直接関連付けられている移動度シフトの変化について、ＮＦＡＴ抗体でイムノブロット分析を行うことができる。代案としては、カルシニューリン基質を免疫沈降してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分解し、前記基質に特異的な抗体によるイムノブロット分析を行うことができる。第３の実施態様では、カルシニューリン活性は、そのカルシニューリン依存性リン酸化状態次第で、異なる細胞内の局在性を有する基質との免疫細胞化学によって判定できる。例えば脱リン酸化ＮＦＡＴが核内で観察されるのに対し、リン酸化ＮＦＡＴは細胞質中で観察される。好ましい実施態様では、特にＮＦＡＴであるカルシニューリン基質のリン酸化状態は、いかなる培養も工程なしに、除去したサンプル上で直接アッセイされる。代案としては、特にＮＦＡＴであるカルシニューリン基質のリン酸化状態は、好ましくは１時間未満の短時間培養サンプル上である。
【００７４】
カルシニューリンが脱リン酸化基質（例えばＮＦＡＴ）を有するかどうかを判定するために、例えば３２Ｐ−オルトホスフェートの形態などの放射性標識ホスフェート基もまた使用してよい。これは基質（例えばＮＦＡＴ）上に直接的シグナルを提供し、それは組み込まれた放射標識を計数することで、または基質（例えばＮＦＡＴ）を免疫沈降し、基質（例えばＮＦＡＴ）をゲル上で分離してゲルにオートラジオグラフィーを施して基質（例えばＮＦＡＴ）からのシグナルを判定するなどのその他の手段によって判定されてもよい。
【００７５】
その他の態様では、方法はリン酸化基質（例えばＮＦＡＴ）と非リン酸化基質（例えばＮＦＡＴ）とを区別する立体配座抗体を使用できる。ポリクローナル、モノクローナルまたは完全な抗体分子の結合断片（例えば一本鎖Ｆｖ断片）であってもよいこのような抗体はまた、残基がリン酸化された程度を判定するのに使用してもよい。このような抗体を含んでなるキットは、本発明の別の態様を形成する。入手できる場合、リン酸化カルシニューリン基質に特異的な抗体が、ウエスタンブロットにおいて好ましい。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例は、本発明を例示する。
【００７７】
実施例１
発明者らは、ｔ染色体転座を保有する小児期Ｔ細胞ＡＬＬの症例（９、１２）において、ＴＥＬと、ＪＡＫ２タンパク質キナーゼをコードする遺伝子の３’部分との融合を特性決定した。得られたキメラ遺伝子はＴＥＬ−ＪＡＫ２融合タンパク質をコードし、その中でＴＥＬの３３６個のアミノ末端残基はＪＡＫ２の触媒領域と縮合して、ＴＥＬ−ＪＡＫ２チロシンキナーゼ活性の構成的活性化をもたらす。遺伝子導入マウスのリンパ系におけるその標的を定めた発現が、高度に侵襲的リンパ腫／白血病もたらすことから、ＴＥＬ−ＪＡＫ２は強力な生体内癌遺伝子である（１４）。
【００７８】
発明者らは、今やＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞内で、カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路が活性化されることを見いだした。さらなる分析は、（ｉ）カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路が、活性化Ｎｏｔｃｈ、過剰発現Ｍｙｃをはじめとする、その他のヒト発癌性タンパク質によって誘発されるリンパ腫／白血病のいくつかのマウスモデルにおいて、およびＥＢＶ−関連ホジキン様Ｂ細胞リンパ腫の異種移植モデルにおいて活性化されること、（ｉｉ）腫瘍細胞を生体内で維持するとカルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の活性化が観察されるが、一般に生体外では失われ、それがこれらの造血性悪性腫瘍で活性化される原発癌遺伝子のみの制御下にないことが示唆されること、（ｉｉｉ）良好に特徴づけられたＴＥＬ−ＪＡＫ２誘発性Ｔ細胞白血病／リンパ腫のモデルを使用して、ＣｓＡまたはＦＫ５０６でのマウスの処置によるカルシニューリンの生体内阻害は、ＮＦＡＴの完全な不活性化、および腫瘍細胞の拡大および侵襲の阻害をもたらすことを示した。
【００７９】
材料と方法
マウスモデル：
本研究では、次のヒトリンパ腫／白血病のマウスモデルを使用した。リンパ系特異的ＥμＳＲαプロモーターの制御下にあるＴＥＬ−ＪＡＫ２を構成的に発現する遺伝子導入マウスの世代については、発明者らのグループによって以前記載された（１８）。ＴＥＬ−ＪＡＫ２遺伝子導入マウスは、２〜２２週齢で、ＳＰ  ＣＤ８およびＤＰ  ＣＤ４／ＣＤ８リンパ系Ｔ細胞の特異的増幅がある、致死性Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）およびＴ細胞リンパ腫を発生する。活性化Ｎｏｔｃｈ１の白血病誘発可能性については、レトロウイルス性に形質導入された活性化形態のＮｏｔｃｈ１、ＩＣＮ１を含有する細胞で、骨髄再構成アッセイを使用して、ピア（Ｐｅａｒ）らが出版した研究で以前証明された（１５）。ＩＣＮ１アレルを発現する細胞で再構成された１００％の動物は、組織移植の３〜８週間後にＤＰ  ＣＤ４／ＣＤ８  Ｔ−ＡＬＬ／リンパ腫を発生した。マウス骨髄ＨＳＣ中のＩＣＮ１のレトロウイルス性媒介伝達と、それに続く照射したレシピエントマウスにおける養子免疫伝達は以下に記載するとおりである。Ｔ細胞白血病／リンパ腫は、最初に記載されるように１か月以内にレシピエントマウスの脾臓およびリンパ節中に発生した。ＣＤ２プロモーターの制御下にあるＴ細胞系中で、タモキシフェン誘導性Ｍｙｃ融合タンパク質（ｃ−Ｍｙｃ−ＥＲ）が発現する遺伝子導入系統については、以前記載された。本研究で発明者らは、ｐ５３＋／−マウス、ＥＲＰ１５−１４中のｃ−Ｍｙｃ−ＥＲ誘発性胸腺リンパ腫に由来する細胞系を使用した（Ｊ．ニール（Ｎｅｉｌ）博士より快く提供された）。これらの細胞は組織培養中で、またはｎｕ／ｎｕマウスに組織移植して維持され、それらは注射部位に腫瘍を形成した。ヒトＥＢＶ−関連非ホジキンＢ細胞リンパ腫から得られた腫瘍細胞はＳＣＩＤマウス中で増殖され、パリ（Ｐａｒｉｓ）のキュリー研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｃｕｒｉｅ）のＤ．デュコダン（Ｄｅｃａｕｄｉｎ）博士より快く提供された。
【００８０】
細胞培養
白血病由来一次細胞および白血病細胞系（ＴＥＬ−ＪＡＫ２、ＩＣＮ１、およびＥＲＰ１５−１４）は、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン（全てライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から）、およびシグマ（Ｓｉｇｍａ）からの５．１０−５２−βメルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ  １６４０中で維持した。ＥＲＰ１５−１４細胞系は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）からの４−ヒドロキシ−タモキシフェン（４ＯＨＴ）の不在下で維持され、Ｍｙｃ−ＥＲ導入遺伝子は、４−ＯＨＴによる外来性刺激不在下で基本的発現活性を示すことが示唆された。生体外実験のために使用されるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）およびイオノマイシン（Ｉｏｎｏ）は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）から購入し、表示した期間にわたり１μｇ／ｍＬで使用した（ＣｓＡ  ｃａｔ．Ｃ１８３２、Ｉｏｎｏ  ｃａｔ．Ｉ０６３４）。
【００８１】
生体内薬剤投与
ノバルティス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）からのシクロスポリンＡ（ネオラール（Ｎｅｏｒａｌ）、１００ｍｇ／ｍＬ）、またはフジサワ・ラボラトリーズ（Ｆｕｊｉｓａｗａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からのＦＫ５０６（静脈内注射用プログラフ（ＰＲＯＧＲＡＦ）、５ｍｇ／ｍＬ）をＢＡＳＦからの１０％クレモフォールで希釈した。８週齢のＣ５７ＢＬ６マウスに尾静脈を通じて５．１０６ＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞を注射した。注射の１週間後に１匹のマウスを屠殺して、白血病細胞がレシピエントマウスの脾臓に浸潤したことを確認した。その時点で３群のマウスを無作為に選択し、ＣｓＡ（０．６ｍｇ／匹／日）、プログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）（０．０６ｍｇ／匹／日）のいずれかを含有するアルゼット（ＡＬＺＥＴ）浸透圧ポンプを移植し、または無処置のままにした。浸透圧ポンプシステムは、薬剤の持続的送達を保証し、毎日の腹腔内注射による急性送達で観察される毒性効果を避けるために使用されている。最後に、処置の５または１０日後にマウスを屠殺して分析した。
【００８２】
ＥＭＳＡによる白血病細胞内のＮＦＡＴ活性化の分析
浸潤胸線から得られたＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病Ｔ細胞から調製された核抽出物からの２μｇのタンパク質、および対照として非遺伝子導入同腹子からの胸腺細胞を使用して、前述のように電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）によって、マウスＩＬ２−４５プロモーター領域（＋鎖：５’−ｃｇａｇａａｔｇｃｔＧＧＡＡＡａａｔａａｔａｔｇｇｇｇｇｔｇ−３’（配列番号１））に対応する［３２Ｐ］ｄＣＴＰ末端標識プローブを使用して、ＮＦＡＴ  ＤＮＡ−結合活性を評価した。
【００８３】
ウエスタンブロットによるカルシニューリン／ＮＦＡＴ活性化の分析
罹患動物または対照同腹子から直接得られた細胞から調製された、または培養に続き表示した時点で収集された総細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、表示した抗体（Ａｂ）でイムノブロット分析を行った。ＮＦＡＴ１（ｓｃ−７２９６）、ＮＦＡＴ２（ｓｃ−７２９４）、ＮＦＡＴ４（ｓｃ−８３２１）、ＳＴＡＴ５（Ｃ−１７、ｓｃ−８３５）抗体は、サンタクルーズ・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から購入した。ホスホチロシン−ＳＴＡＴ５抗体（０５−４９５）は、アップステート・バイオテクノロジー（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から購入した。ｐａｎ−ＮＦＡＴ  Ａｂ（７９６）は、ナンシー・ライス（Ｎａｎｃｙ  Ｒｉｃｅ）博士より快く提供された。
【００８４】
結果と考察
ＮＦＡＴ１、ＮＦＡＴ２、およびＮＦＡＴ４に特異的な抗体を使用して、ウエスタンブロットによって、ＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞内のＮＦＡＴタンパク質発現およびカルシニューリン活性化の状況を分析し、対照胸腺細胞と比較した。これらの条件下では、それぞれのＮＦＡＴの完全脱リン酸化形態（活性化形態）はリン酸化ＮＦＡＴイソ型よりも速く移動し、完全リン酸化形態は最も遅い移行を示すので、ＮＦＡＴの活性化状態はＳＤＳ／ＰＡＧＥによって容易に評価できる。図１の結果は、疾患ＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２マウスの浸潤を受けた胸線から得られたＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞が、非遺伝子導入同腹子対照から得られた正常な胸腺細胞と比較して、より高レベルのＮＦＡＴ１を発現することを示す（図１Ａ）。さらにＮＦＡＴ１は、その迅速な電気泳動移行によって示されるように、白血病細胞内に本質的に化学量論的にその完全脱リン酸化（活性化）状態で存在する。比較のために、図２Ｂは、カルシニューリンを基底レベル活性に阻害するＣｓＡの存在下、またはカルシニューリンを最適に活性化するイオノマイシンの存在下、培養中で１時間維持されたＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞から得られた完全脱リン酸化および完全リン酸化ＮＦＡＴ１イソ型の相対移行を示す。この分析から観察できるように、ＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞内に観察されるＮＦＡＴ１イソ型は、イオノマイシン処置細胞内で誘発された完全活性化ＮＦＡＴと同一位置に移動する（図１Ｂ、レーン２および４を比較されたい）。ＮＦＡＴ２およびＮＦＡＴ４に特異的な抗体の使用は、正常な胸腺細胞対照との比較で、これらのＮＦＡＴタンパク質のＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞内での活性化を同様に実証した（データ示さず）。しかしＮＦＡＴ１とは異なり、対照胸腺細胞との比較で、ＮＦＡＴ２およびＮＦＡＴ４の発現レベルは、ＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞内で同様であることが分かった（データ示さず）。ＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞内でのカルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の活性化を独立して実証するために、発明者らは、ＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞および対照として正常な胸腺細胞から得られた核抽出物中で、ＮＦＡＴ  ＤＮＡ結合活性を電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）によって比較した。これらの実験で使用されるプローブは、マウスＩＬ２プロモーターの−４５ＮＦＡＴ結合部位に対応する高親和性［３２Ｐ］標識ＤＮＡオリゴヌクレオチドであった。図２Ａに示すように、胸腺細胞核抽出物中で遅延した複合体はほとんど検出できず、発達中の胸腺細胞内におけるＮＦＡＴ活性化の低い定常状態レベルが反映された。対照的に、ＴＥＬ−ＪＡＫ２核抽出物は、ＮＦＡＴプローブに対して高レベルのＤＮＡ結合活性を示した（図２Ａ、レーン２および３を比較されたい）。双方の抽出物タイプでＳｐ１−特異的プローブに対する同一レベルのＤＮＡ結合活性が観察されたことから、この違いは白血病および対照細胞核間のタンパク質濃度の違いに起因するものではない（図２Ａ、下パネル）。競合物として使用される未標識ＮＦＡＴオリゴヌクレオチドの１００倍モル過剰量を反応混合物に添加することで、その形成が阻害されることから、ＮＦＡＴ／プローブ複合体は特異的であるが、ＮＦＡＴ結合部位コア配���に突然変異を保有する突然変異ＮＦＡＴオリゴヌクレオチドの同一のモル過剰量の存在下では、影響を受けなかった（データ示さず）。ＮＦＡＴ／プローブ複合体は、ＮＦＡＴ１〜４に一般的なエピトープに特異的な抗体（ｐａｎ−ＮＦＡＴ抗体）の反応混合物への添加によって定量的にスーパーシフトするが、対照抗体によってはスーパーシフトしない（図２Ｂ、レーン２、５、および６を比較されたい）。ＮＦＡＴ１がＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞内で過剰発現するという事実と一致して、ＮＦＡＴ／プローブ複合体の全部ではないが大部分は、過剰なＮＦＡＴ１−特異的抗体の添加によってスーパーシフトする（図２Ｂ、レーン２および３を比較されたい）。対照的にＮＦＡＴ４に対して誘導された抗体は複合体にわずかに影響するのみであり、ＮＦＡＴ１と比較してよりより少ない程度ではあるが、ＮＦＡＴ４がＴＪ２白血病細胞内で観察されるＮＦＡＴ  ＤＮＡ結合活性に寄与していることが示唆される。対照胸腺細胞と、異なるＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２マウス個体中で発生した独立ＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病とのいくつかのペアワイズ比較で、同様の観察が行われた（データ示さず）。発明者らは、これらの実験からＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞は、ＮＦＡＴ１の発現を上方制御し、またＮＦＡＴ１、ＮＦＡＴ２、およびＮＦＡＴ４の構成的脱リン酸化、核蓄積、およびＤＮＡ結合活性化も示すと結論した。
【００８５】
構成的ＮＦＡＴ活性化が、ＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病に対して特異的であるかどうか、またはそれが白血病細胞のより一般な特質であるかどうかを調べるために、発明者らはヒト白血病のその他のマウスモデルにおいてＮＦＡＴタンパク質発現および活性化を分析した。点突然変異による、またはｔ（７、９）（ｑ３４、ｑ３４．３）染色体転座の結果としてのＮｏｔｃｈ１の突然変異は、ヒトＴ細胞白血病の大部分において観察される。以前の研究は、活性化Ｎｏｔｃｈ突然変異体によるマウス骨髄細胞のレトロウイルス媒介形質導入（細胞内Ｎｏｔｃｈ１＝ＩＣＮ１）と、それに続く照射された同系宿主中へ形質導入細胞の養子免疫伝達が、ヒト疾患を忠実に再現するＴ細胞リンパ腫／白血病をもたらすことを示している（１５）。上述のように、このプロトコルを使用してＩＣＮ１誘発性白血病を発生させ、ＮＦＡＴ活性化について分析する。図３Ａに示すように、ＩＣＮ１誘発性白血病細胞は、ＮＦＡＴ１（図３Ａ、上パネル、レーン１〜７を比較されたい）、ＮＦＡＴ２（図３Ａ、下パネル、レーン１〜７を比較されたい）、およびＮＦＡＴ４（データ示さず）の脱リン酸化（活性化）イソ型を発現する。ＩＣＮ１白血病細胞のシクロスポリンＡ処置は、無処置ＩＣＮ１白血病細胞では観察されない非リン酸化イソ型を犠牲にして、ｌＮＦＡＴ２の過リン酸化（不活性）イソ型の出現をもたらした（図３Ａ、下パネル、レーン１〜７とレーン８を比較されたい、スキームについては図３Ｂを参照されたい）。対照的にイオノマイシン処置ＩＣＮ１白血病細胞は、ＩＣＮ１非処置白血病細胞内で観察されたものと識別不能なＮＦＡＴ２移行プロフィールを示す（図３Ａ、下パネル、レーン１〜７とレーン９を比較されたい、スキームについては図３Ｂを参照されたい）。これらの結果は、ＮＦＡＴタンパク質がＩＣＮ１白血病細胞内でそれらの完全活性化状態にあることを示す。ｎｕ／ｎｕレシピエントマウスへのＣＤ２−Ｍｙｃ誘発性Ｔ細胞白血病の接種に続いて得られた移植Ｔ細胞白血病において、ならびにヒトホジキン様Ｂ細胞リンパ腫のマウス異種移植モデルにおいて、同様の観察が行われた（図５Ｂ）。
【００８６】
特徴的なシグナル伝達ネットワークで作用する一次発癌遺伝子によって誘発されるリンパ系悪性腫瘍の大きなパネルにおいて、ＮＦＡＴ活性化が観察されるという事実は、それが開始癌遺伝子の活性のみに起因することはありそうもないことを我々に示唆する。これをさらに詳しく調べるために、発明者らは、罹患動物から直接得られた、または成長因子および血清不在下で培養中に維持された同一細胞からの白血病細胞抽出物中のＮＦＡＴ１活性化を比較した（図４ＡおよびＢ、レーン２と３を比較されたい）。これらの条件下では、ＳＴＡＴ５のチロシン−リン酸化状態の維持によって示されるように、ＴＥＬ−ＪＡＫ２チロシンキナーゼ活性は影響を受けない（図４Ｂ）。上述の結果と一致して、ＮＦＡＴ１は、罹患動物から直接得られたＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞内でその脱リン酸化（活性化）状態にあった。対照的に培養中でのこれらの細胞の維持は、内在性ＮＦＡＴタンパク質キナーゼによって、それらの化学量論的に再リン酸化（不活性化）をもたらした（図４Ａ、レーン２と３を比較されたい）。予期されたように、白ＥＭＳＡによる分析で、ＮＦＡＴ１の再リン酸化は、血病細胞内のＤＮＡ結合活性を正常な胸腺細胞内で常態で観察されるレベルにまで低下させる（データ示さず）。上でＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞について記載された結果（図４Ａ）と同様に、罹患動物から直接白血病細胞を得ると、ＩＣＮ１誘発性白血病（図５Ａ）およびヒトＥＢＶ−関連非ホジキンＢ細胞リンパ腫（図５Ｂ）はＮＦＡＴ１の活性化イソ型を示し、１時間程度の短時間でも細胞を培養中に維持するとＮＦＡＴ活性化は失われた。これらの結果は、ＮＦＡＴ活性化が、これらの白血病の開始癌遺伝子の制御下のみになく、適切な生体内腫瘍微小環境の存在を必要とするようであることを示唆する。
【００８７】
カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の活性化が、生体内で腫瘍維持に重要かどうかを調べるため、および目下人間医学で使用される良好に特徴づけられたカルシニューリン阻害剤が治療的に価値があるかどうかを試験するために、発明者らは、ＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病の進行に対するＣｓＡおよびＦＫ５０６の双方の生体内効果を分析した。一次ＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞を同系のレシピエントマウスへの静脈内接種によってグラフト化した。これらの条件下では白血病は、二次宿主に効率的に組織移植されたオリジナルの白血病クローンの拡大に相当し、それらの脾臓およびリンパ節を侵襲して、２０〜３０日以内にそれらの死亡を誘発する。レシピエントマウスにＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞を組織移植し、１週間維持して白血病細胞を中程度に拡大させた。それの経過後、３つのコホートを発生させた。第１群は無処置のままにし、第２群には連続の量のＣｓＡを送達する浸透圧ポンプを移植し、および第３群にはＦＫ５０６を送達する浸透圧ポンプを移植した（材料と方法を参照されたい）。
【００８８】
非処置対照マウスと比べると、１０日間のＣｓＡおよびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置マウスは、統計学的に低下した脾臓重量（図６Ａおよび６Ｂ、ｐ値＜０．０５）を示し、ＣｓＡ処置が白血病細胞アポトーシスを誘発した、および／またはそれらの増殖を阻害したことが示唆された。これをさらに詳細に分析するために、無処置またはＣｓＡ−またはプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置白血病からの骨髄スタンプ標本を形態学的に分析した。これらのマウスの肝臓実質の組織病理学的分析もまた実施した。図８は、正常な骨髄が顆粒球細胞から主に構成されるのに対し、白血病ＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２マウスからの骨髄はＴリンパ芽球性細胞の均質集団だけから構成されることを示す（図８Ｂ）。興味深いことに、ＣｓＡまたはプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）のいずれかによるマウスの処置は、白血病芽球数の激しい減少、および正常な骨髄に近い細胞組成の回復をもたらした（図８Ｃおよび８Ｄ）。腫瘍転移の過程もまた、ＣｓＡまたはプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置によって強力に阻害される。確かに白血病芽球が非処置マウスの肝臓類洞および実質を効率的に浸潤するのに対し（図９、パネルＡおよびＢ）、ＣｓＡ−またはプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置マウス（図９Ｃおよび９Ｄ）からの肝臓では、白血病芽球の数が激しく減少する。
【００８９】
非処置マウス、およびＣｓＡまたはプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）のいずれかで処置したマウスの脾臓から単離された白血病細胞の生化学的分析は、緩慢に移動する重度にリン酸化された（不活性）イソ型ＮＦＡＴ１およびＮＦＡＴ４（図７Ａおよび７Ｂ）の出現によって示されるＮＦＡＴ活性化の損失を示し、ＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病におけるＮＦＡＴ活性化がカルシニューリンの制御下にあり、ＣｓＡまたはプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）（ＦＫ５０６）によるこの過程の阻害が腫瘍生育進行の阻害と関連付けられていることを実証した。注目すべきは、これらの白血病細胞内で活性化される別のＲＥＬスーパーファミリーメンバーであるＮＦκＢの構成的活性化（Ｎ．ドスサントス（ｄｏｓ  Ｓａｎｔｏｓ）およびＪＧ、未公開観察）は、ＣｓＡまたはプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）での処置によって影響されなかったことであり、カルシニューリンに対するこれらの化合物の特異性が実証される（データ示さず）。
【００９０】
結論として、これらの結果は、（ｉ）カルシニューリンがＴおよびＢ細胞リンパ腫／白血病の多様なマウスモデルにおいて活性化され、この特質はヒトリンパ系悪性腫瘍でもまた認識され始めたこと（発明者らの未公開観察、（１３）（２９）、（ｉｉ）この経路の活性化は、広範な開始発癌遺伝子によって惹起されるリンパ系悪性腫瘍において観察され、特定の生体内環境の存在に依存すること、（ｉｉｉ）カルシニューリンの活性化が生体内で白血病進行に重要であること、（ｉｖ）カルシニューリン活性の薬理学的阻害剤、すなわちシクロスポリンＡおよびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）（ＦＫ５０６）は、ヒト白血病のマウスモデルにおいて治療的利点を有すること、を示す。発明者らは、カルシニューリンを組織移植医学で一般に使用される２つのカルシニューリン阻害剤であるＣｓＡまたは／およびＦＫ５０６（プログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ））処置による阻害の標的とすることは、白血病細胞それ自体および／またはその微小環境（間質、血管新生）に影響することで、ヒトリンパ系悪性腫瘍の治療処置において治療的利点を有することができると提案する。この経路の活性化は、必ずしも一次（開始）発癌性の制御下にないので、カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路の活性化は、予後および／または診断に有意義な腫瘍発達（段階）および／またはリンパ腫／白血病分類の価値あるマーカーかもしれない。最後にここで使用された動物モデルおよびアプローチは、造血性悪性腫瘍中のカルシニューリンおよび／またはＮＦＡＴの新しい阻害化合物を同定および研究する道を開く。
【００９１】
実施例２
材料と方法
マウス
ＴＥＬ−ＪＡＫ２誘発性Ｔ細胞白血病／リンパ腫の遺伝子導入マウスモデルについては上述した１４。ＥμＳＲα−ＴＥＬ−ＪＡＫ２／ＣＤ３ε−／−およびＥμＳＲα−ＴＥＲＬ−ＪＡＫ２／Ｒａｇ−／−を発生させるために、標準手順に従ってＴＥＬ−ＪＡＫ２マウスをＣＤ３ε２１およびＲａｇ２２２ノックアウトマウスと交配した。使用した全てのマウスはＣ５７ＢＬ６遺伝的背景を有した（フランス国ラルブレール（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）のチャールス・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。構成的活性化ＮＯＴＣＨ１によって誘発されるＴ細胞急性リンパ芽球性白血病は、上述したようにして発生させた１５。１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ６、１０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌ、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３、および１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ（ブリティッシュ・コロンビア州バンクーバー（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）のステム・セル・テクノロジーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下、無血清培地中で、５−フルオロウラシル処置Ｃ５７Ｂ６マウス（１５０ｍｇ／ｋｇ）から得られた野生型骨髄細胞を２日間生育させ、次にウォリン・ピア（Ｗａｒｒｅｎ  Ｐｅａｒ）博士により快く提供されたｐＭｉｇ−ＩＣＮ１コンストラクト１５を使用して、全Ｎｏｔｃｈ１細胞内領域（ＩＣＮ１、アミノ酸１７６０〜２５５５）をコードするレトロウイルスでスピン感染した。再構成致死量放射線照射（８，１２５Ｇｙ）Ｃ５７ＢＬ６レシピエントマウスに、形質導入細胞を静脈内注射した。動物はフランス国オルセー（Ｏｒｓａｙ，Ｆｒａｎｃｅ）のキュリー研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｃｕｒｉｅ）の動物施設内で、特定病原体除去条件に維持した。生きた動物の実験は、フランス獣医学局のガイドラインに従って実施した。
【００９２】
免疫沈降法およびウエスタンブロット分析
ＮＦＡＴｃ１（ＳＣ−７１９４、サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ））、ＮＦＡＴｃ２（ＳＣ−７２９６、サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ））、ＮＦＡＴｃ３（ＳＣ−８３２１、サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ））、ＥＲＫ２（Ｃ−１４、サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ））、ＳＴＡＴ５Ａ＋Ｂ（ＳＣ−８３５、サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ））、カルシニューリンＡ（ＡＢ１６９５、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、ＨＡエピトープタグモノクローナル抗体（ＡＢ１６９１８、アブカム（Ａｂｃａｍ））、チロシンリン酸化−ＳＴＡＴ５（０５−４９５、アップステート（Ｕｐｓｔａｔｅ））に対する抗体を使用して、総細胞抽出物をウエスタンブロットのために上述したように処理した１４。抗ＨＡタグ抗体を使用し、上述したようにして免疫沈降法アッセイを実施した１４。
【００９３】
レトロウイルス媒介遺伝子移入
構成的活性化ＨＡ標識カルシニューリンＡα突然変異体をコードするｃＤＮＡ２３は、ニール・クリップストーン（Ｎｅｉｌ  Ｃｌｉｐｓｔｏｎｅ）博士からｐＢＪ５ベクター中で快く提供され、クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのＭＳＶ−Ｐｕｒｏベクター中にサブクローニングされた。レトロウイルス性ウイルス株は、リン酸カルシウム共沈降法を使用したＰｌａｔＥパッケージング細胞系２４の形質移入に続いて得られた。一晩のインキュベーション後、培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清）を取り替えて、２４時間後にウイルス性株を収集し、ＮＩＨ３Ｔ３細胞上で滴定して、１０６感染単位／ｍＬに正規化した。白血病細胞に形質導入するために、ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のシグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）からの４μｇ／ｍＬのポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）を補足したレトロウイルス上清で、３０℃で２時間３０００ｒｐｍでスピン感染を実施した。ＭＳＣＶ−Ｐｕｒｏ空ベクターおよびＭＳＣＶ−Ｐｕｒｏ−ＣｎＡ＊に相当するウイルス上清を同一感染効率（ＭＯＩ）で使用して、白血病細胞を感染した。
【００９４】
ＣｓＡおよびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）による白血病マウスの処置
インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの無血清ＲＰＭＩ培地中で臓器を穏やかに破壊して、ＩＣＮ１またはＴＪ２誘発性原発白血病のいずれかの浸潤脾臓からの細胞を収集し、フランス国ラルブレール（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）のチャールス・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からの６〜１０週齢のＣ５７ＢＬ６マウスの尾静脈に静脈内注射した。脾臓重量が２００ｍｇに達したら、マウスを無作為化して、ビヒクル単独（１０％クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）ＥＬ（登録商標）添加ＰＢＳ）、用量３０ｍｇ／ｋｇ／日のＣｓＡ（フランス国レイユ・マルメゾン（Ｒｕｅｉｌ−Ｍａｌｍａｉｓｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）のノバルティス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）からのネオラール（Ｎｅｏｒａｌ）（登録商標）、または用量３ｍｇ／ｋｇ／日のプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）（アイルランド国（Ｉｒｅｌａｎｄ）のアステラス（Ａｓｔｅｌｌａｓ）からのプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）（登録商標））のいずれかで処置した。ＣｓＡをドイツ国シュタインハイム（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のシグマ−アルドリッチ・ケミーエ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ）からの１０％クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）ＥＬ（登録商標）添加ＰＢＳで希釈した。製造業者の取り扱い説明書に従って、米国カリフォルニア州クパチーノ（Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）のアルゼット社（ＡＬＺＥＴ  ｃｏｍｐａｇｎｙ）からのアルゼット（Ａｌｚｅｔ）（登録商標）浸透圧ポンプをそれらの皮下人工移植の２４時間前に装填し、次に３７℃でＰＢＳ０．９％ＮａＣｌでプライミングした。統計学的分析、生存曲線、および臓器重量は、米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）のグラフパッド（ＧｒａｐｈＰａｄ）からのプリズム（Ｐｒｉｓｍ）４を使用して計算した。
【００９５】
生体内アポトーシスおよび増殖の評価
浸潤肝臓空の単一細胞懸濁液を調製し、上述したようにして蛍光色素標識抗体で染色した１４。製造業者の取り扱い説明書に従って、英国ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）のアブカム（Ａｂｃａｍ）からのアネキシンＶ−ＰＥアポトーシス検出キットを使用して、アネキシンＶ染色を実施した。製造業者の取り扱い説明書に従って、フランス国（Ｆｒａｎｃｅ）のＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からのＦＩＴＣまたはＡＰＣ  ＢｒｄＵフローキットを使用して、ＢｒｄＵ染色を実施した。簡単に説明すると、屠殺２時間前に２ｍｇ／匹のＢｒｄＵをマウスに腹腔内注射して細胞を蛍光色素標識抗ＢｒｄＵ抗体で染色し、フランス国（Ｆｒａｎｃｅ）のＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からのファックスキャリバー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）サイトメーターを使用して分析した。循環またはアポトーシスの白血病細胞の比率を特異的に評価するために、ＩＣＮ１モデルではＧＦＰポジティブ細胞上でＴＥＬ−ＪＡＫ２モデルではＴＨＹ１．２ポジティブ細胞（抗Ｔｈｙ１．２−ＦＩＴＣ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）のからのＢＤファーミンゲン（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）上で、ＢｒｄＵおよびアネキシンＶ分析を実施した。データはＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からのセルクエスト（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）およびオレゴン州アッシュランド（Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）のトリー・スター（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）からのフロージョー（ＦｌｏｗＪｏ）ソフトウェアを使用して分析した。プロティナーゼＫ（２０μｇ／ｍＬ）で室温で１５分処置した脱パラフィン５μｍ厚さ切片上で、末端ｄＵＴＰ  Ｎｉｃｋ−Ｅｎｄ標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイ２５を使用して、細分化ＤＮＡの原位置検出によって細胞アポトーシスを確認した。
【００９６】
病理学および電子顕微鏡法
メイ−グリュンワルド−ギムザ染色したサイトスピン上で、ＩＣＮ１およびＴＪ２マウス骨髄の形態および分化を評価した。白血病細胞で浸潤された臓器のパラフィン包埋組織切片（５μｍ厚）上で、組織化学分析を実施した。フランス国フランシュビル（Ｆｒａｎｃｈｅｖｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）のミクロム（Ｍｉｃｒｏｍ）からの水流ミクロトーム（ＨＭ３５０ナイヤガラ（ＨＭ  ３５０  Ｎｉａｇａｒａ））上で連続切片を得た。引き続く同型切片をＨ＆Ｅ染色およびＴＵＮＥＬアッセイ分析のために使用した。電子顕微鏡分析では、０．１Ｍカコジル酸塩緩衝液中の２％グルタルアルデヒド中で固定したサンプルをエポキシ樹脂に包埋した。上述したようにして半薄片を２％トルイジンブルーで、極薄片をウラニル酢酸鉛で染色した２６。
【００９７】
結果と考察
カルシニューリンホスファターゼが不活性の場合、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）転写因子は過リン酸化されて細胞質内に位置する。Ｔ細胞活性化はカルシニューリンのカルシウムおよびカルモジュリン依存活性化をもたらし、それはＮＦＡＴの脱リン酸化および立体配座スイッチを誘発してそれらの核への転位を可能にし、そこでそれらはＴ細胞機能の多くの局面で重要な役割を果たす。したがってＮＦＡＴの完全リン酸化形態（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ中で緩慢な移動）、および完全脱リン酸化形態（迅速な移動）間の比率は、カルシニューリン活性を評価するのに都合よい指標を提供する。したがって生体外で維持された未刺激胸腺細胞内では、ＮＦＡＴｃ１（ＮＦＡＴ２）、ＮＦＡＴｃ２（ＮＦＡＴ１）、およびＮＦＡＴｃ３（ＮＦＡＴ４）は、カルシニューリン阻害剤シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）への曝露に非感受性に過リン酸化されるが、イオノマイシンによる刺激に際して完全に脱リン酸化される（図１０ａ、レーン２〜４および表示されないデータ）。生体内では胸腺細胞はリン酸化および非リン酸化ＮＦＡＴｃ１およびＮＦＡＴｃ２（図１０ａ、レーン１）の組み合わせを示し、おそらくはいくつかの発育合図に非同期的に反応している細胞内のカルシニューリンの活性化を反映している。著しいことに、活性化細胞内ＮＯＴＣＨ１（ＩＣＮ１）１５またはＴＥＬ−ＪＡＫ２融合タンパク質１４によって誘発される独立した原発Ｔ細胞腫瘍は、完全脱リン酸化ＮＦＡＴｃ１およびＮＦＡＴｃ２を示した（図１０ａ、レーン５および８）。生体外ＣｓＡ−またはイオノマイシン処置腫瘍細胞をＮＦＡＴリン酸化状態の対照として使用した（図１０ａ、レーン６、７、９、１０）。これらの観察はこれらのＴ細胞悪性腫瘍中でカルシニューリンが持続性に活性化されることを示唆する。完全脱リン酸化ＮＦＡＴはまた、ＴＥＬ−ＪＡＫ２／ＣＤ３ε−／−およびＴＥＬ−ＪＡＫ２／Ｒａｇ−／−化合物マウスから得られたＴ細胞リンパ腫／白血病でも観察され、この中ではカルシニューリン／ＮＦＡＴ経路のカルシウム依存活性化に連結している２つの良好に特徴づけられた受容体である、プレ−Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＴＣＲは非機能性または不在のいずれかである２１（図１０ｂ）ことから、カルシニューリン活性化は、これらの受容体由来のシグナルに対する白血病細胞の過敏性に起因しなかった。重要なことには、持続性カルシニューリン活性はまた、機能喪失型Ｉｋａｒｏｓ２２または過剰発現ｃ−Ｍｙｃ２７によって誘発されるＴ細胞リンパ腫／白血病のマウスモデルでも、およびヒトＥＢＶ関連非ホジキンＢ細胞リンパ腫２８の異種移植モデルでも観察された（図１０ｅおよび表示されないデータ）。興味深いことに白血病細胞内のカルシニューリン活性化は、細胞を培養中で維持すると迅速にかつ絶えず失われたことから、それは腫瘍微小環境からの特異的シグナルを必要とし（図１０ｃ）、この設定におけるカルシニューリン活性化の重要性に関するあらゆる生体外研究を不可能にした。注目すべきことに、ＴＥＬ−ＪＡＫ２は、これらの白血病細胞内でのＳＴＡＴ５構成的活性化の維持によって示されるように、これらの生体外条件下で活性を維持した（図１０ｄ）。これは、これらの腫瘍細���内における持続性カルシニューリン活性化のために、開始癌遺伝子の活性化だけでは十分でないことを示唆する。
【００９８】
カルシニューリン活性化がＴ細胞白血病誘発に関与するかどうかを調べるために、ＩＣＮ１またはＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病マウスをＣｓＡまたはプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）で処置した。これらの構造的に無関係の化合物の阻害活性は、それが異なるイムノフィリンに対するそれらの結合に依存することから、機構的に特徴的である。原発ＩＣＮ１およびＴＥＬ−ＪＡＫ２腫瘍細胞を同系マウスに組織移植して、これらのオリゴ／モノクローナル疾患のレシピエントマウスへの同期的な生着をもたらした。オリジナルのＩＣＮ１およびＴＥＬ−ＪＡＫ２マウス白血病モデルの病理学的特徴群に従って１４，１５、組織移植された白血病は、正常な骨髄（ＢＭ）構造に影響して、それを単一形態のリンパ芽球の均質集団で置き換え（図１１ａおよび図１１ｅ）、末梢性リンパ系器官（図１１ｂ）、ならびに肝臓などのいくつかの非造血器官を浸潤した（図１１ｃおよび表示されないデータ）。白血病進行の初期段階にあるマウスを３０ｍｇ／ｋｇ／日のＣｓＡ、または３ｍｇ／ｋｇ／日プログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）、または対照として溶剤ビヒクルのいずれかで処置し、さらになる疾患の進展について比較した。著しいことに、ＣｓＡまたはプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置は双方の白血病モデルにおいて、成熟顆粒球および巨核球の再出現と関連付けられている、骨髄中の白血病芽球の激しい減少と共に、正常な血球新生を復元した（図１１ａおよび図１１ｅ）。さらにこれらの阻害剤は、脾臓の腫瘍負荷の劇的な低下（図１１ｂ）、肝臓の血管周囲腔および類洞からの腫瘍細胞のほぼ完全な抑止（図１１ｃ）を誘発する。これらの抗白血病効果は、これらの条件下におけるほぼ完全なＮＦＡＴ再リン酸化（図１２ａおよび表示されないデータ）によって証明されるように、退縮する腫瘍中のカルシニューリン活性化の阻害と関連付けられており、生体内で白血病細胞内の構成的ＮＦＡＴ脱リン酸化が、確かにカルシニューリン活性化の帰結であることが外見的に実証されており、カルシニューリンの酵素活性がＴ細胞白血病誘発において必須の役割を果たすことが示唆される。ＣｓＡまたはプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）での治療的な処置は、退縮腫瘍中のアポトーシス細胞の構造的（図１２ｂおよび表示されないデータ）および超構造的（図１２ｃ）特徴群を持つ細胞外観によって示されるように、腫瘍細胞死を誘発した。発明者らはまた、ＴＵＮＥＬおよびアネキシンＶ染色を使用して、ＣｓＡ−およびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置腫瘍中のアポトーシス細胞数の特筆すべき増大を示した（図１２ｄおよび１２ｅ）。細胞死に対するこの効果に加えて、ＩＣＮ１およびＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞内における生体内カルシニューリン阻害は、ＢｒｄＵポジティブ増殖性腫瘍細胞の比率の顕著な減少によって証明されるように、細胞周期の進行にも影響を与える（図１２ｅおよびｆ）。重要なことに、プログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置によって誘発される、これらの細胞応答および腫瘍生育に対する強力な効果は、プログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置された腫瘍保有マウスの統計学的に有意な生存延長と関連付けられている（図１１ｄおよび表示されないデータ）。
【００９９】
ＩＣＮ１−およびＴＥＬ−ＪＡＫ２誘発性白血病におけるカルシニューリン活性化は、生体内腫瘍微小環境に特異的な外来性シグナルに依存するので（図１０ｃ）、発明者らはこの要件を回避しようと努め、白血病細胞内におけるカルシニューリンの構成的活性化突然変異体の発現が、疾患進行に有利に働くかどうかを研究した。カルシニューリンの触媒サブユニットのカルボキシ−末端自己抑制領域（ＰＰ３ＣＡ、ＣｎＡと称される）の欠失は、その構成的カルシウム非依存性活性化をもたらす２３。カルシニューリン（ＣｎＡ＊）の構成的活性化突然変異体をコードするレトロウイルス、またはＭＳＣＶ対照レトロウイルス（図１３ａ）で、ＩＣＮ１およびＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞を形質導入し、形質導入直後に同系のマウスに静脈内注射した。ＣｎＡ＊形質導入ＩＣＮ１またはＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞を注射したマウスの腎臓、肝臓および脾臓重量は、模擬形質導入細胞を移植したマウスと比べて顕著に増大した（図１３ｂ、ｃ、およびｅ）。さらに胸骨および腎臓切片の組織病理学的分析は、ＣｎＡ＊形質導入白血病が模擬形質導入細胞と比較して、顕著により侵襲的な表現型を示すことを明らかに示した（図１３ｃおよびｄ）。
【０１００】
活性化ＮＯＴＣＨ１突然変異は５０％を超えるＴ−ＡＬＬ患者中に観察され、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路の構成的活性化は、ＡＬＬで観察されることが多いので、この研究で使用されたＩＣＮ１およびＴＥＬ−ＪＡＫ２マウスモデルは、ヒト悪性腫瘍と高度に関係している。これらのマウスモデルを使用して、発明者らは、Ｔ細胞リンパ腫／白血病誘発における重要なシグナル伝達経路としてカルシニューリン活性化を同定し、これらの悪性腫瘍の治療において特異的阻害剤によるカルシニューリン標的化が、治療的に価値があることを示した。これらの白血病細胞内におけるカルシニューリンの持続性活性化の原因となる分子機序は、依然として同定されていないが、腫瘍微小環境からのシグナルを必要とし、少なくともＴＥＬ−ＪＡＫ２マウスモデルでは、ＴＣＲおよびプレ−ＴＣＲ発現から独立しているようである。ＮＦＡＴ転写因子はＴ細胞内のカルシニューリン活性化の重要なメディエータであり、重複性、特異的または拮抗的でさえあるいずれかの役割を果たす。したがってそれらは白血病細胞内のカルシニューリンの下流エフェクターとして可能な候補である。しかしその他のカルシニューリン標的もまた、このホスファターゼの増殖機能および抗アポトーシス機能に寄与するかもしれない。異なる動物および細胞モデルでは、ＮＦＡＴ因子が発癌に対して、ポジティブまたはネガティブな様式で寄与することが提案されている。より最近では、ヒト進行性Ｂ細胞リンパ腫のサブセットおよび膵臓癌中で、ＮＦＡＴｃ１のＣｓＡ感応性核蓄積について記載された１３，２９，３０。これらの観察は、カルシニューリン阻害剤がまた、非造血性悪性腫瘍においても治療的な利点を有するかもしれないという期待を抱かせる。
【０１０１】
ここで報告される前臨床データは、ヒトリンパ系悪性腫瘍におけるカルシニューリン活性化の包括的な分析を正当化する。多くのＴ細胞白血病／リンパ腫は、既存の治療法に対して部分的にのみ感応性であるので、単独で、または併用または逐次投与計画で現行の化学療法と提携した、利用できるカルシニューリン阻害剤による造血性腫瘍の処置は、少なくともカルシニューリン活性化が実証できる分子サブタイプにおいては高い関心が持たれる。
【０１０２】
参考文献
本明細書中で言及される全ての文献は、参照によって本明細書に援用する。
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１３．マラフィオッティ（Ｍａｒａｆｉｏｔｉ），Ｔ．ら、（２００５年）Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １２８（３）、３３３〜３４２頁
１４．キャロン（Ｃａｒｒｏｎ），Ｃ．ら、（２０００年）Ｂｌｏｏｄ  ９５（１２）、３８９１〜３８９９頁
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１６．カレック（Ｋｕｒｒｅｃｋ），Ｊ．（２００３年）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０（８）、１６２８〜４４頁
１７．ウスマン（Ｕｓｍａｎ），Ｎ．、Ｂｌａｔｔ，Ｌ．Ｍ．（２０００年）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１０６（１０）、１１９７〜２０２頁
１８．ミタル（Ｍｉｔｔａｌ），Ｖ．（２００４年）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ５（５）：３５５〜６５頁
１９．フルマン（Ｆｒｕｍａｎ），ＤＡ（１９９２年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８９、３６８６〜９０頁
２０．セイバーズ（Ｓａｂｅｒｓ），ＣＪ（１９９５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７０、８１５〜２２頁
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２２．デュモルティエ（Ｄｕｍｏｒｔｉｅｒ），Ａ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２６、２０９〜２０頁（２００６年）
２３．オキーフ（Ｏ’Ｋｅｅｆｅ），Ｓ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５７、６９２〜４頁（１９９２年）
２４．モリタ（Ｍｏｒｉｔａ），Ｓ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７、１０６３〜６頁（２０００年）
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２７．ブライズ（Ｂｌｙｔｈ），Ｋ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９、７７３〜８２頁（２０００年）
２８．デコダン（Ｄｅｃａｕｄｉｎ），Ｄ．ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  １７、６８５〜９５頁（２００６年）
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３０．ブーフホルツ（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ），Ｍ．ら、Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２５、３７１４〜２４頁（２００６年）
３１．フルマン（Ｆｒｕｍａｎ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９、１４６〜１５２頁（１９９６年）
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１Ａ】ＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病におけるＮＦＡＴ１発現および活性化。ＮＦＡＴ１特異的抗体（上パネル）を使用して、ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより、浸潤を受けた胸線から単離された対照胸腺細胞（ＷＴ）およびＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞（ＴＪ２）（１４）の細胞抽出物全体を分析した。抗ＳＴＡＴ５（中央）または抗ＥＲＫ２抗体（下パネル）のいずれかを使用して、サンプルを正規化した。
【図１Ｂ】ＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病におけるＮＦＡＴ１発現および活性化。レーン３および４で使用された細胞が、表示のようにシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）またはイオノマイシン（Ｉｏｎｏ）の存在下において組織培養中で維持されたこと以外は、図１Ａと同一である。
【図２Ａ】活性化ＮＦＡＴを発現するＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞：電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）による分析。マウスＩＬ２プロモーター−４５ＮＦＡＴ−応答要素（上パネル）に対応するＤＮＡプローブとして二本鎖オリゴヌクレオチドを使用して、ＥＭＳＡによりＮＦＡＴ  ＤＮＡ結合活性について、対照胸腺細胞（ＷＴ）およびＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞から得られた核抽出物を分析した。あらゆる抽出物不在下でのプローブ移行をレーン１に示す。下パネルは遍在的に発現したＳｐ１に特異的なプローブに対する、使用された核抽出物の結合活性を示す。ＷＴおよびＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２核抽出物では、Ｓｐ１プローブへの等しい結合が観察されたことに留意されたい。
【図２Ｂ】活性化ＮＦＡＴを発現するＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞：電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）による分析。ＤＮＡ結合反応混合物が１μＬの表示されたＮＦＡＴ抗体（抗ＮＦＡＴ１、抗ＮＦＡＴ４）またはｐａｎ−ＮＦＡＴ抗体、特にＮＦＡＴ１〜４を含んだこと以外は、図２Ａと同様である。使用した負の対照はｃ−Ｒｅｌ−特異的抗体である。
【図３Ａ】活性化Ｎｏｔｃｈ誘発性Ｔ細胞白血病はＮＦＡＴを活性化する。ＮＦＡＴ１またはＮＦＡＴ２に特異的な抗体をそれぞれ使用して、ＮＦＡＴ１（上パネル）およびＮＦＡＴ２（下パネル）の発現および活性化について、ウエスタンブロットによって、罹患マウスから直接得られた一連の独立したＩＣＮ１誘発性Ｔ細胞白血病からの腫瘍細胞（レーン１〜７）、またはＣｓＡ（レーン８）またはイオノマイシン（レーン９）のいずれかの存在下で培養中に６０分間維持した腫瘍細胞を分析した。リン酸化および脱リン酸化イソ型を色つき矢印によって示す。
【図３Ｂ】活性化Ｎｏｔｃｈ誘発性Ｔ細胞白血病はＮＦＡＴを活性化する。異なるＮＦＡＴ２スプライシングイソ型、およびそれらの完全なリン酸化（イオノマイシン）または脱リン酸化状態（ＣｓＡ）におけるそれらの相対移行の略図である。
【図４Ａ】ＮＦＡＴ活性化は、ＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞内のＴＥＬ−ＪＡＫ２腫瘍性蛋白の単独制御下にないが、適切な腫瘍微小環境を必要とする。胸腺細胞（レーン１）およびＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞（レーン２および３）からの全抽出物中のＮＦＡＴ１活性化のウエスタンブロット分析である。罹患動物から直接得られた白血病細胞から調製された抽出物（レーン２）の分析は、正常な胸腺細胞とは対照的に、ＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２動物ではＦＡＴ１が主に脱リン酸化活性状態で存在することを示す（レーン１および２を比較されたい）。しかし単離細胞として培養中で１５分後（レーン３）、ＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞は、ＮＦＡＴ１タンパク質のほとんど完全な細胞内プールの再リン酸化を示す（レーン２および３を比較されたい）。
【図４Ｂ】ＮＦＡＴ活性化は、ＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞内のＴＥＬ−ＪＡＫ２腫瘍性蛋白の単独制御下にないが、適切な腫瘍微小環境を必要とする。上：罹患動物から直接得られたＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞からの全抽出物中の（レーン１）または培養中で２時間後（レーン２）のＮＦＡＴ１活性化のウエスタンブロット分析。中央：ＳＴＡＴ５ホスホチロシン抗体を使用して分析された、罹患動物から直接得られた（レーン１）、または培養中で２時間後（レーン２）のＳＴＡＴ５活性化ＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞のウエスタンブロット分析。下：ＳＴＡＴ５−特異的抗体を使用したＳＴＡＴ５発現の分析。ＳＴＡＴ５のリン酸化（下パネル）によって示されるように、これらの条件下ではＴＥＬ−ＪＡＫ２チロシンキナーゼ活性が維持されることに留意されたい。
【図５Ａ】ＩＣＮ１誘発性白血病およびＥＢＶ誘発性ヒトリンパ腫において、ＮＦＡＴ活性化には適切な腫瘍微小環境が必要とされる。ＩＣＮ１誘発性白血病から得られた白血病細胞から直接調製された全抽出物中（レーン１）、または培養中で１時間維持された同一細胞（レーン２）のＮＦＡＴ１発現および活性化のウエスタンブロット分析である。ＮＦＡＴ１がＩＣＮ−１白血病細胞内でそのリン酸化（活性化）形態にあること、そして白血病細胞が通常の微小環境から除去されて単離細胞として培養中に維持されると、活性化が迅速に失われることに留意されたい。
【図５Ｂ】ＩＣＮ１誘発性白血病およびＥＢＶ誘発性ヒトリンパ腫において、ＮＦＡＴ活性化には適切な腫瘍微小環境が必要とされる。ＥＢＶ誘発性ヒトＢ細胞リンパ腫から得られた白血病細胞から直接調製された全抽出物中の（レーン１）、または単離細胞としてさらなる処置なしに（レーン２）、またはイオノマイシン（レーン３）またはＣｓＡ存在下の（レーン４）培養中で１時間維持された同一細胞のＮＦＡＴ１発現および活性化のウエスタンブロット分析である。ＮＦＡＴ１が白血病細胞内では原位置で活性化されるが、細胞が通常の腫瘍微小環境から除去されるとその活性化が失われることに留意されたい。
【図６Ａ】カルシニューリン阻害剤シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）およびＦＫ５０６（プログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ））は、ＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病の進行を阻害する。ＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病細胞を同系レシピエントマウスにグラフト化した。これらの条件下では、白血病細胞は末梢リンパ系器官器に生着して増殖し、肝臓などの非造血器官に転移する。（Ａ）対照（無処置、ＮＴ）、ＣｓＡで処置したマウス、プログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）で処置したマウスの３つのコホートのマウスを比較した。脾臓重量測定によって分析されるように、脾臓浸潤がＣｓＡおよびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置（左）によって阻害されることに留意されたい。比較のために、年齢をマッチさせた対照マウス（正常）の重量を示す。
【図６Ｂ】カルシニューリン阻害剤シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）およびＦＫ５０６（プログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ））は、ＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病の進行を阻害する。説明で示される代表的な脾臓の写真。正常な脾臓、白血病脾臓（無処置）、ＣｓＡ処置、およびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置マウスからの白血病脾臓。
【図７Ａ】ＣｓＡおよびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置は、ＮＦＡＴ因子活性化を阻害する。無処置（ＮＴ）およびＣｓＡ処置ＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病における、ＮＦＡＴ１（上）およびＮＦＡＴ４（中央）発現およびリン酸化のウエスタンブロット分析。
【図７Ｂ】ＣｓＡおよびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置は、ＮＦＡＴ因子活性化を阻害する。無処置（ＮＴ）およびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置ＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病におけるＮＦＡＴ１（上）およびＮＦＡＴ４（中央）発現およびリン酸化のウエスタンブロット分析。未処置白血病中のＮＦＡＴ１およびＮＦＡＴ４の迅速移動（活性化）形態、およびＣｓＡ−およびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置白血病中の完全リン酸化不活性種に留意されたい。ローディング対照としてＥＲＫ発現（下）のウエスタンブロット分析を示す。
【図８Ａ】ＣｓＡおよびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置は、白血病の進行を強力に妨げる。正常な骨髄のスタンプ標本をメイ−グリュンワルド−ギムザで染色したものである。
【図８Ｂ】ＣｓＡおよびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置は、白血病の進行を強力に妨げる。無処置ＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病マウスからの白血病骨髄のスタンプ標本をメイ−グリュンワルド−ギムザで染色したものである。
【図８Ｃ】ＣｓＡおよびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置は、白血病の進行を強力に妨げる。ＣｓＡ処置ＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病マウスからの骨髄のスタンプ標本をメイ−グリュンワルド−ギムザで染色したものである。
【図８Ｄ】ＣｓＡおよびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置は、白血病の進行を強力に妨げる。プログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置ＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病マウスからの骨髄のスタンプ標本をメイ−グリュンワルド−ギムザで染色したものである。正常な骨髄（図８Ａ）からの細胞の大部分が脊髄起源（顆粒球性形態）であり、対照的に無処置動物から得られた白血病骨髄（図８Ｂ）は、正常な細胞と置き換わるＴリンパ芽球性細胞の均質な集団から構成されることに留意されたい。ＣｓＡ（図８Ｃ）およびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）（図８Ｄ）での処置は、白血病細胞数の激しい減少と、正常な骨髄に近い細胞組成および形態の回復をもたらす。
【図９Ａ】ＣｓＡおよびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置は、非造血器官中の白血病細胞浸潤を阻害する。正常なマウスからの肝臓のパラフィン包埋切片のＨＥＳ（ヘマトキシリン・エオジン・サフラン）染色である。
【図９Ｂ】ＣｓＡおよびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置は、非造血器官中の白血病細胞浸潤を阻害する。白血病の無処置マウスからの肝臓のパラフィン包埋切片のＨＥＳ（ヘマトキシリン・エオジン・サフラン）染色である。
【図９Ｃ】ＣｓＡおよびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置は、非造血器官中の白血病細胞浸潤を阻害する。白血病のＣｓＡ処置マウスからの肝臓のパラフィン包埋切片のＨＥＳ（ヘマトキシリン・エオジン・サフラン）染色である。
【図９Ｄ】ＣｓＡおよびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置は、非造血器官中の白血病細胞浸潤を阻害する。白血病のプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置マウスからの肝臓のパラフィン包埋切片のＨＥＳ（ヘマトキシリン・エオジン・サフラン）染色である。図９Ａは、肝臓実質の正常な構造を示す。無処置ＴｇＴＥＬ−ＪＡＫ２白血病マウスは、門脈域および類洞を貫く肝臓実質中の白血病細胞の広範囲浸潤を示す（青色に染色される）（図９Ｂ）。ＣｓＡ−（図９Ｃ）またはプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）（図９Ｄ）での処置は、白血病細胞による肝臓浸潤の激しい減少を示す。
【図１０ａ】細胞内ＮＯＴＣＨ１−およびＴＥＬ−ＪＡＫ２誘発性Ｔ−ＡＬＬからの白血病細胞内の持続性カルシニューリン活性化。新鮮な単離細胞（生体内、レーン１、５、８）内で、または１μｇ／ｍＬのイオノマイシン（Ｉｏｎ、レーン２、６、９）、１μｇ／ｍＬのシクロスポリンＡ（ＣｓＡ、３、７、１０）存在下で、または無処置（Ｕｎｔ、レーン４）のまま、生体外で６０分間の培養後のいずれかで、ウエスタンブロットによって、野生型マウス（ＷＴ）およびＴＥＬ−ＪＡＫ２（ＴＪ２）および細胞内ＮＯＴＣＨ１（ＩＣＮ１）白血病細胞からの一次胸腺細胞をＮＦＡＴｃ２（上パネル）およびＮＦＡＴｃ１（下パネル）のリン酸化について分析した。完全リン酸化および脱リン酸化形態のＮＦＡＴｃ２およびＮＦＡＴｃ１を、それぞれ塗りつぶしおよび白抜き矢印で示す。公開されたデータに一致して、ＮＦＡＴｃ１は代案のスプライシングによって発生した３つのイソ型として移動する。
【図１０ｂ】細胞内ＮＯＴＣＨ１−およびＴＥＬ−ＪＡＫ２誘発性Ｔ−ＡＬＬからの白血病細胞内の持続性カルシニューリン活性化。ＴＪ２／Ｒａｇ２−／−およびＴＪ２／ＣＤ３ε−／−化合物マウス（レーン２、３、５、および６）、およびそれらの対照同腹子ＴＪ２／Ｒａｇ２＋／−およびＴＪ２／ＣＤ３ε＋／−（レーン１および４）から得られた白血病細胞内のＮＦＡＴｃ２リン酸化のウエスタンブロット分析である。
【図１０ｃ】細胞内ＮＯＴＣＨ１−およびＴＥＬ−ＪＡＫ２誘発性Ｔ−ＡＬＬからの白血病細胞内の持続性カルシニューリン活性化。新鮮に切除した細胞内で、またはＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ中で生体外で１時間の培養後のいずれかで、ウエスタンブロットによって、ＴＪ２またはＩＣＮ１白血病細胞をＮＦＡＴｃ２（上パネル）のリン酸化について分析した。
【図１０ｄ】細胞内ＮＯＴＣＨ１−およびＴＥＬ−ＪＡＫ２誘発性Ｔ−ＡＬＬからの白血病細胞内の持続性カルシニューリン活性化。ウエスタンブロットによって、パネル（図１０ｃ）のＴＪ２サンプルをＳＴＡＴ５チロシンリン酸化（上パネル）および発現（下パネル）について分析した。
【図１０ｅ】細胞内ＮＯＴＣＨ１−およびＴＥＬ−ＪＡＫ２誘発性Ｔ−ＡＬＬからの白血病細胞内の持続性カルシニューリン活性化。ヒトリンパ腫／白血病のマウスモデルからの腫瘍細胞内の持続性カルシニューリン活性化。直接（生体内、レーン１、４）に、または１μｇ／ｍＬイオノマイシン（Ｉｏｎ、レーン２）または１μｇ／ｍＬシクロスポリンＡ（ＣｓＡ、レーン３、５）存在下において生体外で６０分間の培養後のいずれかで、ウエスタンブロットによって、ＩｋＬ／Ｌ白血病（Ｔ６４）由来細胞系の皮下注射によりヌードマウスで誘発された腫瘍から得られた細胞、およびヒトバーキット様リンパ腫の異種移植モデルから得られた腫瘍細胞をＮＦＡＴｃ２（上パネル）およびＮＦＡＴｃ１（下パネル）のリン酸化について分析した。
【図１１ａ】ＣｓＡおよびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）はＴ−ＡＬＬ退縮を誘発し、マウス生存を延長する。野生型マウス（ＷＴ）、および溶剤キャリア単独（ＩＣＮ１  Ｕｎｔ）、プログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）（ＩＣＮ１  Ｐｒｏｇ）またはＣｓＡ（ＩＣＮ１  ＣｓＡ）のいずれかで５日間処置されたＩＣＮ１白血病マウスから骨髄サイトスピンを調製し、メイ−グリュンワルド−ギムザ染色後に分析した。オリジナル倍率：８００倍。
【図１１ｂ】ＣｓＡおよびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）はＴ−ＡＬＬ退縮を誘発し、マウス生存を延長する。ＣｓＡ（λ）、プログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）（ｚ）または溶剤キャリア（σ）処置白血病マウスの脾臓重量を散布図で示す。比較のために正常個体からの脾臓の重量を示す（◆）。ＴＥＬ−ＪＡＫ２（ＴＪ２）およびＩＣＮ１腫瘍負荷のかなりの低下が、１０日間および５日間の処置後にそれぞれ明白である。ＷＴ、ｎ＝２、ＴＪ２  Ｕｎｔ、ｎ＝５、ＴＪ２  ＣｓＡ、ｎ＝４、ＴＪ２  Ｐｒｏｇ、ｎ＝４、ＩＣＮ１  Ｕｎｔ、ｎ＝３、ＩＣＮ１  ＣｓＡ、ｎ＝３、ＩＣＮ１  Ｐｒｏｇ、ｎ＝２。これらのデータは、少なくとも３つの独立した実験を代表する。脾臓重量中央値の差のＰ値は、ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）およびｐ＜０．０００１（＊＊＊）と示される。
【図１１ｃ】ＣｓＡおよびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）はＴ−ＡＬＬ退縮を誘発し、マウス生存を延長する。野生型マウス（ＷＴ  ｕｎｔ）、および溶剤キャリア単独（ＩＣＮ１  ｕｎｔ、ＴＪ２  ｕｎｔ）またはプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）（ＩＣＮ１  Ｐｒｏｇ、ＴＪ２  Ｐｒｏｇ）またはＣｓＡ（ＩＣＮ１  ＣｓＡ、ＴＪ２  ＣｓＡ）のいずれかで処置したＩＣＮ１またはＴＪ２白血病マウスから肝臓切片を調製し、ヘマトキシリン・エオジン・サフラン（ＨＥＳ）染色後に分析した。低オリジナル倍率：４０倍、高オリジナル倍率：８００倍。
【図１１ｄ】ＣｓＡおよびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）はＴ−ＡＬＬ退縮を誘発し、マウス生存を延長する。５．１０６ＩＣＮ１白血病細胞を移植し、次にプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）（３ｍｇ／ｋｇ／日）で１４日間処置（破線）し、または無処置（実線）の同系マウスのカプラン−マイヤー生存曲線である。各群のマウスの数、および平均生存を括弧内に示す。Ｐ値は、ログランク検定を使用して計算した。
【図１１ｅ】ＣｓＡおよびプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）はＴ−ＡＬＬ退縮を誘発し、マウス生存を延長する。ＣｓＡまたはプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）によるＴＥＬ−ＪＡＫ２−罹患マウスの治療的処置は、骨髄細胞内の白血病退縮を誘発する。溶剤キャリア単独（ＴＪ２  Ｕｎｔ）またはプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）（ＴＪ２  Ｐｒｏｇ）またはＣｓＡ（ＴＪ２  ＣｓＡ）のいずれかで１０日間処置されたＴＪ２白血病マウスからの骨髄サイトスピンのメイ−グリュンワルド−ギムザ染色。オリジナル倍率：８００倍。
【図１２ａ】ヒト白血病マウスモデルにおいて、生体内カルシニューリン阻害は、白血病細胞の増殖低下をもたらしアポトーシスを誘発する。溶剤キャリア処置（レーン１〜４および７〜１０）、またはプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置（レーン５および６）、またはＣｓＡ処置（レーン１１および１２）ＴＥＬ−ＪＡＫ２（ＴＪ２）マウス（図１１で記載される）のいずれかの脾臓から得られた白血病細胞内で、ウエスタンブロットによってＦＡＴｃ２リン酸化を評価した。ＮＦＡＴｃ２の完全リン酸化および脱リン酸化形態をそれぞれ塗りつぶしおよび白抜き矢印で示す。
【図１２ｂ】ヒト白血病マウスモデルにおいて、生体内カルシニューリン阻害は、白血病細胞の増殖低下をもたらしアポトーシスを誘発する。トルイジンブルーで染色された、溶剤キャリアまたはプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置ＴＪ２白血病マウスのいずれかから得られた、肝臓半薄片である。肝細胞および白血病細胞をそれぞれ塗りつぶしおよび白抜き矢印で示す。プログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置サンプル中では、肝細胞の核でなく白血病細胞の核だけが核濃縮性であることに留意されたい。オリジナル倍率：１５００倍。
【図１２ｃ】ヒト白血病マウスモデルにおいて、生体内カルシニューリン阻害は、白血病細胞の増殖低下をもたらしアポトーシスを誘発する。代表的なプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置ＴＪ２マウスから得られた極薄肝臓切片の電子顕微鏡検査である。ＴＪ２白血病細胞内のアポトーシス細胞に特徴的な典型的クロマチン凝縮に留意されたい。
【図１２ｄ】ヒト白血病マウスモデルにおいて、生体内カルシニューリン阻害は、白血病細胞の増殖低下をもたらしアポトーシスを誘発する。溶剤キャリア−またはプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）処置されたＴＪ２白血病マウスから得られた肝臓中のアポトーシス白血病細胞の比率を評価するための組織学的分析、およびＴＵＮＥＬ染色の代表的な視野である。ＣｓＡ処置後に同様の観察を行った（データ示さず）。オリジナル倍率：８００倍。
【図１２ｅ】ヒト白血病マウスモデルにおいて、生体内カルシニューリン阻害は、白血病細胞の増殖低下をもたらしアポトーシスを誘発する。左側パネル：表示されるように、溶剤キャリアまたはＣｓＡまたはプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）のいずれかで５日間処置されたＩＣＮ１白血病マウスの肝臓中のアネキシンＶポジティブ（アポトーシス）およびＢｒｄＵポジティブ（増殖中）白血病細胞の比率の分析である。ＢｒｄＵポジティブおよびアネキシンＶポジティブ細胞の百分率を各グラフの右側に示す。右側パネル：溶剤キャリア単独またはＣｓＡまたはプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）のいずれかで２日間処置されたＴＪ２白血病マウスについて同一実験を実施した。アネキシンＶポジティブ細胞の百分率をグラフの右側に示す。
【図１２ｆ】ヒト白血病マウスモデルにおいて、生体内カルシニューリン阻害は、白血病細胞の増殖低下をもたらしアポトーシスを誘発する。ＴＪ２白血病細胞に対するプログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）およびＣｓＡの生体内抗増殖性効果である。ＴＪ２白血病細胞をｎｕ／ｎｕマウスに皮下注射した。これらの条件下で、ＴＪ２細胞は１０〜１５日後に注射部位に腫瘍を形成したが、リンパ系（脾臓、リンパ節）および非リンパ系器官（腎臓、肝臓）もまた浸潤した。２週間後にマウスを無作為化して、プログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）（３ｍｇ／ｋｇ／日）またはＰＢＳ対照を腫瘍内注射した。ＢｒｄＵ−ＦＩＴＣおよび７−ＡＡＤ二重染色を使用して、白血病細胞の細胞周期分布を評価した。結果は２つの独立した実験を代表する。Ｇ０／Ｇ１（Ｒ６）、Ｓ（Ｒ３）、およびＧ２／Ｍ（Ｒ５）細胞周期相にある細胞の百分率を対応する各四角形で示す。ＣｓＡ処置後に腫瘍を分析したところ、同様の結果が得られた（データ示さず）。
【図１３ａ】白血病の進行および侵襲に有利に働く、白血病細胞におけるＣｎＡ（ＣｎＡ＊）の構成的活性突然変異体の異所性発現。模擬形質導入（ＴＪ２）またはＣｎＡ＊形質導入（ＴＪ２＋ＣｎＡ＊）ＴＪ２細胞のいずれかを静脈内注射された４匹のマウスの脾臓からの白血病細胞を単離して、抗ＨＡｔａｇ抗体を使用した免疫沈降法とそれに続く抗ＣｎＡ抗体を使用したウエスタンブロットによって、ＣｎＡ＊発現について分析した。
【図１３ｂ】白血病の進行および侵襲に有利に働く、白血病細胞におけるＣｎＡ（ＣｎＡ＊）の構成的活性突然変異体の異所性発現。ＩＣＮ１またはＩＣＮ１＋ＣｎＡ＊白血病を有するマウスからの脾臓（上パネル）および肝重量（下パネル）を比較した（左側パネル、ＩＣＮ１、ｎ＝７、ＩＣＮ１＋ＣｎＡ＊、ｎ＝８）。ＴＪ２モデルについて同一の比較を行った（右側パネル、ＴＪ２、ｎ＝５、ＴＪ２＋ＣｎＡ＊、ｎ＝７）。Ｐ値はログランク検定を使用して計算され、ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）およびｐ＜０．０００１（＊＊＊）と示される。
【図１３ｃ】白血病の進行および侵襲に有利に働く、白血病細胞におけるＣｎＡ（ＣｎＡ＊）の構成的活性突然変異体の異所性発現。ヘマトキシリン−エオジン−サフラン（ＨＥＳ）染色された代表的なＴＪ２およびＴＪ２＋ＣｎＡ＊白血病マウスからの腎臓切片である。オリジナル倍率：１２．５倍。ＴＪ２＋ＣｎＡ＊白血病マウスにおける腎臓の間葉の広範囲の浸潤に留意されたい。
【図１３ｄ】白血病の進行および侵襲に有利に働く、白血病細胞におけるＣｎＡ（ＣｎＡ＊）の構成的活性突然変異体の異所性発現。ＴＪ２およびＴＪ２＋ＣｎＡ＊白血病マウスからの胸骨切片の組織学的分析である。ＴＪ２マウスと比較してＴＪ２＋ＣｎＡ＊マウスの骨髄中の白血病細胞のより高い細胞密度に留意されたい（上パネル）。高倍率（×８０）で観察されるように、ＴＪ２＋ＣｎＡ＊白血病細胞は骨髄区画を超えて広範囲に広がり、隣接する筋肉を浸潤する（下パネル）。
【図１３ｅ】白血病の進行および侵襲に有利に働く、白血病細胞におけるＣｎＡ（ＣｎＡ＊）の構成的活性突然変異体の異所性発現。模擬形質導入ＴＪ２細胞を移植されたマウスと比較した、ＣｎＡ＊形質導入ＴＪ２細胞を移植されたマウスの腎臓中の増大する腫瘍負荷である。模擬形質導入ＴＪ２細胞（ＴＪ２、ｎ＝５）またはＣｎＡ＊形質導入ＴＪ２細胞（ＴＪ２＋ＣｎＡ＊、ｎ＝７）のいずれかを移植されたマウスの腎臓重量を判定して散布図で報告した。Ｐ値はログランク検定を使用して計算された（ｐ＜０，０００１［＊＊＊］）。
【図１Ａ】
2009515932.tif 000002
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
2009515932.tif 000010
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１０ｅ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１１ｅ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１２ｅ】
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【図１２ｆ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１３ｅ】
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【国際調査報告】
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