(57)【要約】特定の集団に特異的な特徴を有するヒト胚性幹細胞の精製された調製物を開示する。本調製物は、以下の分化多能性細胞表面マーカーの陽性発現によって特徴付けられる：ＳＳＥＡ−１（−）；ＳＳＥＡ−４（＋）；ＴＲＡ−１−６０（＋）；ＴＲＡ−１−８１（＋）；及びアルカリホスファターゼ（＋）、並びにＯｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ２、Ｔｈｙ１、ＦＧＦ４、ＡＢＣＧ２、Ｄｐｐａ５、ＵＴＦ１、Ｃｒｉｐｔｏ１、ｈＴＥＲＴ、コネキシン−４３及びコネキシン−４５を含む、一連のＥＳ細胞マーカー。調製物の細胞は、ケラチン８、Ｓｏｘ−１及びＮＦＨ（外胚葉）、ＭｙｏＤ、ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及び心臓アクチン（中胚葉）、並びにＨＮＦ−３ベータ、アルブミン及びＰＤＸ１（内胚葉）等の系譜特異的マーカーに対して陰性である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分化多能性のヒト胚性幹細胞の精製された調製物であって、該細胞が、
（ｉ）内胚葉、中胚葉及び外胚葉の組織の派生物へ分化する能力と、
（ｉｉ）正常な核型と、
（ｉｉｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養において、少なくとも約２５回継代する間、増殖する能力と、
（ｉｖ）表４のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）対立遺伝子のうちの１種又は複数と
を含む調製物。
【請求項２】
前記細胞が、表４のＨＬＡ対立遺伝子のうちの２種以上を含む、請求項１に記載の調製物。
【請求項３】
前記細胞が、表４のＨＬＡ対立遺伝子のうちの３種以上を含む、請求項１に記載の調製物。
【請求項４】
前記細胞が、表４のＨＬＡ対立遺伝子のうちの４種以上を含む、請求項１に記載の調製物。
【請求項５】
前記細胞が、表４のＨＬＡ対立遺伝子の全てを含む、請求項１に記載の調製物。
【請求項６】
前記調製物が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養において、１年超増殖する、請求項１に記載の調製物。
【請求項７】
線維芽細胞フィーダー層上で培養すると、前記細胞の分化が抑制される、請求項１に記載の調製物。
【請求項８】
前記線維芽細胞フィーダー層が、ヒト線維芽細胞フィーダー層である、請求項７に記載の調製物。
【請求項９】
前記線維芽細胞フィーダー層が、マウス線維芽細胞フィーダー層である、請求項７に記載の調製物。
【請求項１０】
フィーダーなしのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養において培養される場合に、前記細胞の分化が抑制される、請求項１に記載の調製物。
【請求項１１】
前記調製物が、４０回継代培養後、実質的に未分化のままである、請求項１に記載の調製物。
【請求項１２】
前記調製物が、１００回継代培養後、実質的に未分化のままである、請求項１に記載の調製物。
【請求項１３】
前記細胞が、表５の短いタンデム反復遺伝子座のうちの１種又は複数をさらに含む、請求項１に記載の調製物。
【請求項１４】
前記細胞が、表５の短いタンデム反復遺伝子座のうちの２種以上をさらに含む、請求項１に記載の調製物。
【請求項１５】
前記細胞が、表５の短いタンデム反復遺伝子座のうちの３種以上をさらに含む、請求項１に記載の調製物。
【請求項１６】
前記細胞が、表５の短いタンデム反復遺伝子座の全てをさらに含む、請求項１に記載の調製物。
【請求項１７】
前記細胞が、ＳＳＥＡ−３マーカー及びＳＳＥＡ−４マーカーに対して陽性である、請求項１に記載の調製物。
【請求項１８】
前記細胞が、ＴＲＡ−１−６０マーカー及びＴＲＡ−１−８１マーカーに対して陽性である、請求項１に記載の調製物。
【請求項１９】
前記細胞が、アルカリホスファターゼを発現する、請求項１に記載の調製物。
【請求項２０】
前記細胞が、高いレベルのテロメラーゼを発現する、請求項１に記載の調製物。
【請求項２１】
懸濁培地中に置いた場合、前記細胞が、胚様体を形成することができる、請求項１に記載の調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００５年５月１７日に出願された、インド国仮特許出願５９５／ＭＵＭ／２００５に対する優先権を主張する。
【０００２】
（連邦が後援する研究又は開発に関する申告）
該当しない。
（「マイクロフィッシュの補遺」への参照）
該当しない。
【０００３】
（１．発明の分野）
本開示は、余剰胚の内部細胞塊からのヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の単離、維持及び増殖に関する。また、本開示は、単離したヒトＥＳ細胞系の特徴付けにも関し、それによって、ヒトＥＳ細胞系のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分化の可能性、並びに細胞療法及び薬物スクリーニングにおいて予期される使用を説明する。
【背景技術】
【０００４】
（２．関連分野の説明）
胚盤胞の内部細胞塊から誘導される分化多能性幹細胞は、胚性幹細胞と呼ばれ、発生しつつある生殖隆線の始原生殖細胞から誘導される幹細胞は、胚性生殖細胞と呼ばれる（非特許文献１）。胚性幹（ＥＳ）細胞は、哺乳類胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）から誘導されている（Ｅｖａｎｓ及びＫａｕｆｍａｎ、１９８１年、Ｎａｔｕｒｅ、２９２巻５８１９号：１５１〜９頁；Ｍａｒｔｉｎ、１９８１年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、７８巻：７６３４〜８頁）。これらの細胞は、分化多能性であり、いずれの臓器又は組織型にも発生することが可能である。ＥＳ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて未分化状態で増殖すること、長期の培養を通して正常な核型を維持すること、及び３種の胚性胚葉（すなわち、中胚葉、外胚葉及び内胚葉）の全ての派生物へ分化する可能性を維持することができる（非特許文献２）。
【０００５】
ＥＳ細胞は、分化多能性細胞の生物学と初期胚内における分化との基礎をなす機構の研究のための強力なモデル系の代表であり、且つ遺伝子操作の機会を提供する。ＥＳ細胞の適切な増殖及び分化を使用して、細胞の損傷又は機能障害が原因である疾患の細胞に基づく治療法に適する、無限の細胞源を産生することができる。
【０００６】
ＥＳ細胞は、マウス（（Ｓｏｌｔｅｒ及びＫｎｏｗｌｅｓ、１９７５年、７２巻１２号：５０９９〜５１０２頁）及びいくつかのその他の種において、胚盤胞期の胚のＩＣＭから単離されている。また、例えば、分化多能性細胞系も、いくつかの家畜及び実験動物の種の着床前の胚から誘導されており、例として、ウシ（Ｅｖａｎｓら、１９９０年、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ、３３巻：１２５〜８頁）、ブタ（Ｅｖａｎｓら、１９９０年、上記；Ｎｏｔａｒｉａｎｎｉら、１９９０年、Ｊ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  Ｆｅｒｔｉｌ．  Ｓｕｐｐｌ．、４１巻：５１〜６頁）、ヒツジ及びヤギ（Ｍｅｉｎｅｃｋｅ−Ｔｉｌｌｍａｎｎ及びＭｅｉｎｅｃｋｅ、１９９６年、Ｊ．  Ａｎｉｍａｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１１３巻：４１３〜２６頁；Ｎｏｔａｒｉａｎｎｉら、１９９１年、Ｊ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  Ｆｅｒｔｉｌ．  Ｓｕｐｐｌ．、４３巻：２５５〜６０頁）、ウサギ（Ｇｉｌｅｓら、１９９３年、Ｍｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  Ｄｅｖ．、３６巻２号：１３０〜８頁；Ｇｒａｖｅｓら、１９９３年、Ｍｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ａｎｄ  Ｄｅｖ．、３６巻：４２４〜３３頁）、ミンク（Ｓｕｋｏｙａｎら、１９９２年、Ｍｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ａｎｄ  Ｄｅｖ．、３３巻：４１８〜３１頁）、ラット（Ｉａｎｎａｃｃｏｎａら、１９９４年、Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１６３巻：２８８〜９２頁）、ハムスター（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８５年、Ｊ．  Ｅｍｂｒｙｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｍｏｒｐｈｏｌ．、８７巻：２７〜４５頁）、並びにアカゲザル及びマーモセット（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９５年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、９２巻１７号：７８４４〜８頁；及びＴｈｏｍｓｏｎら、１９９６年、Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．、５５巻：２５４〜５９頁）があげられる。Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２巻５３９１号：１１４５〜７頁；及びＲｅｕｂｉｎｏｆｆら、２０００年、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１８巻５号：５５９頁）は、ヒトＥＳ細胞系を誘導したと報告している。
【０００７】
ＥＳ細胞の初期の研究は、マウスで行われた（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８５年、Ｊ．  Ｅｍｂｒ．  Ｅｘｐ．  Ｍｏｒｐｈｏｌ．、８７巻：２７〜４５頁）。マウスＥＳ細胞は、着床前の胚からｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて誘導された未分化の分化多能性細胞であり、線維芽細胞のフィーダー層及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在下で、連続継代培養を通して未分化状態を維持する。マウスＥＳ細胞を用いる研究は、発生の過程及び遺伝子疾患の理解を促進するが、ヒトとマウスとの発生の顕著な違いは、ヒトの発生のモデルとしてのマウスＥＳ細胞の使用を制限する。その他の種から誘導したＥＳ細胞の形態、細胞表面マーカー及び増殖の要求性は、マウスＥＳ細胞とは、顕著に異なる。さらに、マウスの胚とヒトの胚とは、胚性遺伝子の時間的発現、例として、胚盤に対する卵円筒の形成（Ｋａｕｆｍａｎ、Ｔｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；Ｌｏｎｄｏｎ；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９２年）、いくつかの初期の系譜の提案されている誘導（Ｏ’Ｒａｈｉｌｌｙ及びＭｕｌｌｅｒ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｓｔａｇｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ；Ｃａｒｎｅｇｉｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、１９８７年）、胚体外膜及び胎盤の構造及び機能（Ｍｏｓｓｍａｎ、Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｆｅｔａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ；Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ；Ｒｕｔｇｅｒｓ、１９８７年）、発生のための増殖因子の要求性（例えば、造血系−Ｌａｐｉｄｏｔ  Ｌａｂ．、Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９９４年）、並びに成体の構造及び機能（例えば、中枢神経系）が顕著に異なる。これらの違いを克服し、ヒトの胚の発生について優れた洞察を得るために、ＥＳ細胞が、霊長類から良好に樹立された（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９５年及び１９９８年）。
【０００８】
ヒトＥＳ細胞に最も密接に類似している、現在入手可能な細胞系は、ヒト胚性癌腫（ＥＣ）細胞であり、これは、奇形癌腫から誘導される分化多能性の、不死の細胞である（Ａｎｄｒｅｗｓら、Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、５０巻２号：１４７〜１６２頁、１９８４年；Ａｎｄｒｅｗｓら、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  Ｅ．編、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｏｘｆｏｒｄ；ＩＲＬ  ｐｒｅｓｓ、２０７〜２４６頁、１９８７年）。ＥＣ細胞を、誘発して、培養中に分化させた後、分化を特異的な細胞表面マーカー（ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１）の損失及び新しいマーカーの出現によって特徴付けることができる（Ａｎｄｒｅｗｓら、１９８７年、上記）。ヒトＥＣ細胞は、ヌードマウスにおいて、奇形癌腫を形成し、腫瘍中に複数の胚性の系譜の派生物を伴うであろう。同様のマウスＥＣ細胞系が、奇形癌腫から誘導されており、一般に、その発生の可能性は、マウスＥＳ細胞よりも、より大幅に制限されている（Ｒｏｓｓａｎｔら、１９８４年、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．、１５巻：１５５〜１６１頁）。奇形癌腫は、生殖細胞から誘導される腫瘍であり、（ＥＳ細胞と同様に）生殖細胞も、理論的には分化全能性（すなわち、体内のあらゆる細胞型を形成することが可能）であるが、ＥＣ細胞のより制限された発生の可能性及び異常な核型は、奇形癌腫の腫瘍環境における選択圧の結果である考えられている（Ｒｏｓｓａｎｔ及びＰａｐａｉｏａｎｎｏｕ、１９８４年）。他方、ＥＳ細胞は、正常な胚細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて誘導され、奇形癌腫環境の選択圧がないことから、より大きな発生の可能性を保持すると考えられている。
【０００９】
最初のヒト分化多能性ＥＳ細胞系は、１９９８年に発表された（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８年、上記）。数年後、ヒト胚性幹細胞系（「ヒトＥＳ細胞系」）が、ヒトの胚盤胞から樹立された（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、２０００年、上記）。今日まで、大部分の記載されているヒトＥＳ細胞系は、体外受精（ＩＶＦ）又は卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）後に、臨床目的で産生した５から８日目の胚盤胞から誘導されている。その上、桑実胚（４日目の胚）期からのＩＣＭの単離も報告されている（Ｇｉｌｅｓら、１９９３年）。
【００１０】
ヒトＥＳ細胞を、ヒト胚盤胞から単離することができる。ヒト胚盤胞を、ヒト生体内着床前胚から、或いはＩＶＦ胚、卵細胞質内精子注入法、卵細胞質移植又は当業者には周知のその他の方法から得ることができる。ヒトＥＳ細胞を、（それぞれが参照によって本明細書に組み入れられている）米国特許第５８４３７８０号及び第６２００８０６号；Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８年、上記；並びにＲｅｕｂｉｎｏｆｆら、２０００年、上記、に開示されている標準的な免疫手術の手法又は全胚培養を使用して、或いは独特のレーザー切除法（参照によって本明細書に組み入れられている、米国特許出願第１０／２２６７１１号）によって、胚盤胞から誘導することができる。別法として、単一細胞のヒト胚を、胚盤胞期まで発展させることができる。多数のヒトＥＳ細胞系が、今日までに誘導されているが、それらのわずか数株が、独特の独自性、自己再生能及び分化の可能性に関して、十分に特徴付けられているにすぎない（Ｂｒｉｍｂｌｅら、２００４年、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．、１３巻：５８５〜７頁）。
【００１１】
当業者に周知の、ヒトＥＳ細胞を産生するための一方法は、免疫手術による。この方法は、胚盤胞から透明帯を取り除き、ＩＣＭを免疫手術によって単離することになり、免疫手術では、栄養外胚葉細胞を、溶解した後、無傷のＩＣＭから穏やかなピペット操作によって取り除く。次いで、ＩＣＭの増殖を可能にする適切な培地を含有する組織培養フラスコ中にＩＣＭを播種する。９から１５日後、ＩＣＭから誘導した増殖物を機械的解離又は酵素分解のいずれかによって解離させて凝集塊を得、細胞を新鮮な組織培地中に再度播種する。未分化の形態を示すコロニーを、マイクロピペットによって個別に選択し、機械的に解離させて凝集塊を得た後、再度播種する。次いで、得られたＥＳ細胞を、１〜２週間毎に定期的に分割して、細胞をあまねく未分化の状態に維持する。免疫手術のより詳細な記載については、それぞれが参照によって本明細書に組み入れられている、米国特許第５８４３７８０号；Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８年、上記；Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８年、Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．、３８巻：１３３頁；Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９５年、上記；Ｂｏｎｇｓｏら、１９８９年、Ｈｕｍ．  Ｒｅｐｒｏｄ．、４巻６号：７０６〜１３頁；Ｇａｒｄｎｅｒら、１９９８年、Ｆｅｒｔ．  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ、６９巻１号：８４〜８頁）を参照されたい。
【００１２】
ヒトＥＳ細胞を未分化の状態に維持する方法として、これらに限定されないが、フィーダー層の存在下、フィーダーがない条件下、ならし培地の存在下、及び／又は血清若しくはならし培地で補充した細胞外基質上での細胞の培養があげられる。フィーダー層は、例えば、γ線を照射した又はマイトマイシンＣで処理したマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）又はヒト線維芽細胞であることができる。フィーダー層が存在しない標準的な培養環境で培養すると、ヒトＥＳ細胞は、急速に分化したり、死滅したりする場合がある。マウスのＥＳ細胞とは異なり、外因的に添加したＬＩＦが存在すると、ヒトＥＳ細胞の分化が阻止されない。幹細胞が自然過程に沿って分化するのを阻止する微小環境（又は適所）を提供するために、フィーダー細胞層を使用する。これらのフィーダー層は、幹細胞に、因子の分泌等の外部信号及び内在性膜タンパク質が仲介する細胞対細胞相互作用を提供するようである。非特許文献３。分泌因子及び直接的な細胞間相互作用が、幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける生存、増殖及び分化を制御するという事実に照らしてみると、理想的な環境は、正常な微細構造及び機能を有する健全なフィーダー組織からなる、又はそのような環境を刺激する必要がある。フィーダー細胞の例として、これらに限定されないが、（１）照射により不活性化したマウス胚性線維芽細胞；（２）有糸分裂的（マイトマイシンＣ）に不活性化したマウス胚性線維芽細胞；及び（３）照射により不活性化したＳＴＯ線維芽細胞のフィーダー層があげられる。Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８年、上記；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、２０００年、上記；及びＳｈａｍｂｌｏｔｔら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、９５巻２３号：１３７２６〜３１頁を参照のこと。
【００１３】
ＥＳ細胞の効果的な培養における進歩にもかかわらず、これらの方法に伴ういくつかの顕著な不都合が、依然として存在する。例えば、ＭＥＦでならした培地又はマトリゲル基質を介する動物の病原体への暴露の恐れが、依然として存在する。ヒトＥＳ細胞のヒトの治療における使用の主たる障壁は、ヒトＥＳ細胞を増殖させる元々記載された方法には、非ヒト由来のフィーダー細胞層上及び非ヒト由来の栄養血清の存在下でのヒトＥＳ細胞の培養が関与することである。より最近では、ヒトＥＳ細胞のための培養系を改良する広範な研究は、ＥＳ細胞を血清なし／フィーダーなしの条件下で生育させる能力に集中している。例えば、ヒトＥＳ細胞の生育のためのフィーダーなしの環境を確実にするために、血清代替物（ＳＲ）、形質転換増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ及びフィブロネクチン基質で補充した培地に基づく代わりの系も試みられている（非特許文献４）。ヒトのフィーダー上又はフィーダーなしの基質上での未分化ヒトＥＳ細胞の誘導及び増殖のための方法の評価が続いている。
【００１４】
ヒトＥＳ細胞の詳細な特徴付けには、細胞レベル及び分子レベルでの解析に加えて、細胞周期の調節、高いテロメラーゼ活性の発現、遺伝子の安定性、特に、ＨＬＡ及びＳＴＲの型、並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおける条件下の分化の可能性の解析が含まれる。未分化のヒトＥＳ細胞において提示される表面抗原のプロフィールは、ヒトＥＳ細胞及びヒトＥＣ細胞の表面抗原のプロフィールに対応する。未分化のヒトＥＳは、グロボ系細胞表面マーカー、例えば段階特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）、具体的にはＳＳＥＡ−３及びＳＳＥＡ−４、並びに腫瘍認識抗原、具体的にはＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１を発現する。その上、ヒトＥＳ細胞は、ＰＯＵ５Ｆ１、プロモーターコード化転写因子ＯＣＴ−４、Ｅ−カドヘリン及びギャップ結合タンパク質コネキシン−４３も発現する（Ａｎｄｒｅｗｓら、２００２年）。マウスＥＳ細胞とは異なり、未分化ヒトＥＳ細胞は、ＳＳＥＡ−１を発現しない。未分化ヒトＥＳ細胞は、アルカリホスファターゼに対する染色に陽性であり、高いテロメラーゼ活性を示し、これは、自己再生能が高まっていることを指し示している。
【００１５】
ヒトＥＳ細胞の遺伝子の安定性を、標準的なＧ分染法を使用することによって評価することができ、この手法は、当業者には周知である。通常、ヒトＥＳ細胞は、長期に連続して培養しても、安定な核型、４６ＸＸ又は４６ＸＹのいずれか、を維持する。しかし、継代が進むと、細胞は、１２〜１７番染色体及びＸ染色体の三染色性をはじめとする、異常な核型を示す傾向にある。ＥＳ細胞の無制限の増殖可能性は、テロメラーゼ活性と直接的に相関する。テロメラーゼ反復配列増幅法（ＴＲＡＰ）によるアッセイを行って、特定のＥＳ細胞系中のテロメラーゼ活性を評価することができる。このアッセイは、放射性同位体による方法（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８年、上記）又は放射性同位体によらない方法（Ｏｈら、２００４年、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２３巻２号：２１１〜１９頁）のいずれかを使用して行うことができる。
【００１６】
ヒトＥＳ細胞は、人体のあらゆる細胞型に分化する可能性を有する。長期に培養した後のこれらの細胞の発生の可能性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいては、胚様体の形成を通して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいては、ＳＣＩＤマウス中の奇形腫の形成を通して試験することができる（Ｅｖａｎｓ  Ｍ  Ｊ及びＫａｕｆｍａｎ  Ｍ、１９８３年、上記）。ヒトＥＳ細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分化能を保持することを確認するために、胚様体を、懸濁培地中で形成させた後、ＲＴ−ＰＣＲ及び免疫細胞化学によって、３種の胚葉のいずれかを意味するマーカーに関して解析することができる（非特許文献１；及び非特許文献２）。
【非特許文献１】Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、９５巻２３号：１３７２６〜３１頁
【非特許文献２】Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒら、２０００年、Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．、６巻２号：８８〜９５頁
【非特許文献３】Ｗａｔｔ及びＨｏｇａｎ、２０００年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８７巻５４５７号：１４２７〜３０頁
【非特許文献４】Ａｍｉｔら、２００４年、Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．、７０巻３号：８３７〜４５頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
ヒトＥＳ細胞は、発生の現象に関する洞察を提供し、このような現象は、外植体では研究することができない。ヒトＥＳ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分化に基づいて特異的な系譜に選別することによって、遺伝子標的を同定することができ、同定された遺伝子標的を使用して、組織の発生又は再生を設計又は再プログラムすること、及び催奇形性化合物又は毒性化合物を同定することができる。非機能性の細胞、組織又は臓器を、ＥＳ細胞技術を使用して置き換えることによって、パーキンソン病、脳卒中、心虚血、肝不全、若年発症糖尿病等の変性疾患の場合、或いは１種又はいくつかの細胞型の死滅又は機能障害が原因である、その他の疾患又は状態の場合における治療的処置を提供することができる（Ｗｏｂｕｓ及びＢｏｈｅｌｅｒら、２００５年、Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｒｅｖ．、８５巻２号：６３５〜８頁）。しかし、ヒトＥＳ細胞技術の有望な治療への応用が現実となるためには、手法が、ヒトＥＳ細胞から誘導された、特殊化された細胞型を、規定された増殖条件、病原体のない環境下、で、濃縮して産生すること、及び長期のｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で生存することを可能にする必要がある。
【００１８】
現在のところ、入手可能なヒトＥＳ細胞の数は限られており、これらは、ヒト集団の遺伝子多様性のごく一部の実例でしかない。したがって、細胞系のそれぞれが、特定の集団における異なる応用に関して、一連の特徴及び利点を独自に有する可能性があることから、追加の細胞系の産生及び特徴付けの差し迫った必要性がある。さらに、より多くのＥＳ細胞系が比較のために入手できれば、ヒトＥＳ細胞の判断基準を規定する世界的な努力、並びにヒトＥＳ細胞の維持及び発展のための適切で且つ頑強な方法の確立が促進されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（発明の簡単な要約）
本発明の開示は、特定の集団、例えば、インド人の集団、に好都合に、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞がより効果的に利用されることを可能にするであろう特定の遺伝子的特徴を有する分化多能性のヒトＥＳ細胞の単離及び同定に向けられている。好ましくは、ヒトＥＳ細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を発現するＨＬＡ対立遺伝子を有するものとする。ＨＬＡは、一般に、標的集団のうちの相当の割合に適合する。同定されたＨＬＡのうちの特定のＨＬＡを、標的集団の半数未満が発現する場合でも、この頻度は、顕著であると依然としてみなされる。これは、適合するＨＬＡを発現するＥＳ細胞系から生み出される治療的処置であれば、標的集団のサブセットにおいて、有効である見込みが高まるからである。
【００２０】
本開示の一実施形態は、分化多能性のヒトＥＳ細胞の精製した調製物であって、当該の細胞が、
（ｉ）内胚葉、中胚葉及び外胚葉の組織の派生物へ分化する能力と；
（ｉｉ）正常な核型と；
（ｉｉｉ）少なくとも約２５回継代の間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培地中で増殖する能力と；
（ｉｖ）表４に記載するＨＬＡ対立遺伝子の１種又は複数と
を含む調製物に向けられている。
【００２１】
分化多能性のヒトＥＳ細胞の調製物は、いずれかの数の表４に記載するＨＬＡ対立遺伝子をさらに含むことができる。好ましくは、本細胞は、表４に記載する全ＨＬＡプロフィールを含む。本開示のヒトＥＳ細胞は、好ましくは、ヒトＥＳ細胞と関連付けられている１種又は複数の追加の特徴を有する。例えば、本開示のヒトＥＳ細胞は、（１）１年超の間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培地中で増殖することができる；（２）線維芽細胞のフィーダー層（例えば、マウス又はヒトの線維芽細胞のフィーダー層）上又はフィーダーなしの条件下で培養した場合、分化が抑制される；（３）ＳＳＥＡ−３のマーカー及びＳＳＥＡ−４のマーカーに対して陽性である；（４）ＴＲＡ−１−６０のマーカー及びＴＲＡ−１−８１のマーカーに対して陽性である；（５）アルカリホスファターゼを発現する；（６）高いレベルのテロメラーゼを発現する：或いは（７）懸濁培地に置いた場合、胚様体の形成が可能である。好ましい実施形態では、調製物は、約４０回の継代培養の後、より好ましくは、約６０回の継代培養の後、最も好ましくは、約１００回の継代培養の後、実質的に未分化のままである。調製物内の未分化ＥＳ細胞のコロニーは、分化している付近の細胞に隣接して存在する場合があるが、それにもかかわらず、調製物を適切な条件下で培養又は継代すると、調製物は実質的に未分化のままであるものとし、個々の未分化ＥＳ細胞は、細胞集団のうちのかなりの比率を構成する。実質的に未分化である調製物は、少なくとも約２０％の未分化ＥＳ細胞を含有し、且つ少なくとも約４０％、６０％、８０％又は９０％のＥＳ細胞を含有することができる。別の好ましい実施形態では、本開示のヒトＥＳ細胞は、１種又は複数の表５に記載する短いタンデム反復（ＳＴＲ）遺伝子座をさらに含み、全部を含む、いずれかの数の表５に記載するＳＴＲ遺伝子座を含むことが可能である。
【００２２】
本開示の別の実施形態は、対象の特定の集団、例えば、インド人の集団、内の個人に対するＨＬＡの適合の改善を提供することになる分化多能性のヒトＥＳ細胞系を、ヒトＥＳ細胞を対象の集団内に共通して存在する特定のＨＬＡ対立遺伝子の発現に関してスクリーニングすることによって、選択する方法に向けられている。ＨＬＡ対立遺伝子は、それが存在するならば、対象の集団内の、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の個人において、対象の集団内に共通して存在する。対象の集団は、個人の特定のグループの国籍、民族性又は遺伝子の特徴に基づくことができる。当業者であれば、種々の対象の集団内に共通して存在するＨＬＡ対立遺伝子を知っている。ヒトＥＳ細胞から誘導した細胞、組織又は臓器を用いる有望な移植療法は、典型的なＨＬＡ適合判断基準によって左右されるであろう。例えば、有望なレシピエントは、ドナーのヒトＥＳ細胞系と、適切なＨＬＡ遺伝子座に関して適合する必要があるであろう。したがって、そのようなヒトＥＳ細胞系の同定は、治療的処置に対して、多大な価値を有する可能性がある。
【００２３】
以下の図は、本明細書の一部を形成し、本開示の特定の態様をさらに実証するために含まれており、本開示の発明を、本明細書に提示する特異的な実施形態の詳細な記載と組み合せて、１つ又は複数のこれらの図を参照することによって、より良好に理解することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本開示は、独特の独自性、自己再生能及び分化の可能性に関して、十分に特徴付けられたヒトＥＳ細胞系の樹立に向けられている。具体的には、特異的集団のレシピエントに対する治療的処置を生み出すために、特に十分に適している特性を有するヒトＥＳ細胞系を生み出す。この集団は、個人の特定のグループの国籍、民族性又は遺伝子の特徴に基づくことができる。そのようなヒトＥＳ細胞系は、その特定の集団に、細胞補充療法、薬物スクリーニング及びゲノム機能解析等、様々な応用の場において、特徴及び利点を提供することができる。特定の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）対立遺伝子、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）又は短いタンデム反復（ＳＴＲ）識別子の存在等、対象の集団内において高頻度で出現する特定の遺伝子的特性によって、同定された特定の集団を治療するための特定の利点を有するとして、ヒトＥＳ細胞系を同定することができる。一般集団に共通の遺伝子的特性の１種又は複数を有するヒトＥＳ細胞を単離することによって、これらのＥＳ細胞を使用して、治療への応用又はその集団全般に利するその他の情報を開発することができる見込みが高まる。例えば、ヒトＥＳ細胞が、対象の一般集団とより組織適合性であれば、そのＥＳ細胞を使用して、治療的処置を生み出すことができる見込みが高まる。特に好ましい実施形態では、対象の集団はインド人の集団である。
【００２５】
ＭＨＣは、ＨＬＡ遺伝子又はＭＨＣ遺伝子を含有する染色体の領域であり、この領域は、クラスＩ、クラスＩＩ及びクラスＩＩＩの３つのカテゴリーに分けられる。ヒトの場合、ＭＨＣクラスＩ遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃを含み、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子は、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＲを含む（Ｇｏｌｕｂ及びＧｒｅｅｎ、１９９１年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｈａｐｔｅｒ  １５）。ＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子は、自己抗原又は外来抗原のペプチド断片に結合し、細胞表面上でＴリンパ球によって点検される。したがって、これらの分子は、細胞性又は液性の免疫の攻撃を刺激することができる（Ｇｅｒｍａｉｎ、１９９４年、Ｃｅｌｌ、７６巻：２８７〜２９９頁）。完全な製品ラインが、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＲＡ、ＤＲＢ１、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４、ＤＲＢ５、ＤＱＡ１、ＤＱＢ１、ＤＰＡ１及びＤＰＢ１を含む、全ての古典的なＨＬＡ遺伝子座の型を決めるために市販されており入手できる。例えば、ＨＬＡ対立遺伝子等、一般集団内でより高頻度で出現する遺伝子的な要因を用いてＥＳ細胞系を同定することによって、当該の細胞系を使用して、標的集団においてより有効であろう治療的処置を誘導することができる。例えば、本開示の好ましい実施形態は、インド人の集団に共通する、無作為に単離したヒトＥＳ細胞系より高い割合のマーカー、例として免疫遺伝マーカー、を有するヒトＥＳ細胞系を産生することに向けられている。これによって、本集団においては、ＥＳ細胞から誘導した治療的処置の免疫拒絶の危険が低下するであろう。
【００２６】
例えば、北部インド人の集団内のＨＬＡアイソタイプの遺伝子的な多様性の研究は、その集団内での特定のＨＬＡ対立遺伝子の高い出現率を示している。例えば、Ｍｅｈｒａら、２００１年、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ、５７巻６号：５０２〜７頁、は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１がＨＬＡ−Ａ２のレパートリーの９５％を構成する西部のコーカサス人種内のＨＬＡ−Ａ＊０２０１の分布とは対照的に、アジア系インド人内では、予想外に低い頻度のＨＬＡ−Ａ＊０２０１（同３．８％）を観察した。この例は、対象の患者集団とあまねく組織適合性であるヒトＥＳ細胞系を同定することの重要性を伝えている。
【００２７】
本開示のヒトＥＳ細胞は、これらの細胞のいくつかの独特の特性によって、特に有利であり、独特の特性とは、
（１）３種の胚葉（内胚葉、外胚葉及び中胚葉）の全てに属する、多様な組織型へ分化することができる；
（２）自己再生性であり、且つ分化多能性、高いテロメラーゼ活性及び正常な核型を維持しながら、少なくとも約４０回から約１００回又はそれ以上の継代の間、培地中で増殖することができる；
（３）胚様体（ＥＢ）を形成することができる；
（４）独特のＨＬＡ対立遺伝子を所有し、これによって、患者の選択された集団、例えば、インド人の集団に対して、移植の際にレシピエントに対するより良好な適合が得られる；
（５）独特の短いタンデム反復（ＳＴＲ）型を所有し、これによって、患者の選択された集団、例えば、インド人の集団に対して、移植の際にレシピエントに対するより良好な適合が得られる；
（６）化合物、例えば、小型分子及び薬物の、細胞集団、細胞毒性、或いは遺伝子又はタンパク質の発現の調節に対する効果に関するスクリーニングに使用することができる；且つ
（７）薬物の代謝及び毒性の研究のために、例えば、本開示のヒトＥＳ細胞から誘導した肝細胞、心筋細胞、神経細胞、膵島細胞又はその他の細胞型を使用して、従来のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける毒性モデルの代替物として使用することができる
ことである。
【００２８】
特に好ましいヒトＥＳ細胞系、これは本明細書に記載されているが、は、Ｒｅｌｉｃｅｌｌ（商標）ｈＥＳ１細胞系である（参照によって本明細書に組み入れられている、Ｍａｎｄａｌら、２００６年、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、７４巻８１〜９０頁）。この細胞系は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＮＣＣＳ）、Ｐｕｎｅ、インド、に寄託されており、国際的な寄託機関に寄託する予定である。この細胞系は、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１等の細胞表面マーカー、転写因子Ｏｃｔ−４、アルカリホスファターゼ、並びにテロメラーゼを高いレベルで発現する。この細胞系は、長期に培養しても正常な核型を保持し、ＳＴＲの解析によるＤＮＡフィンガープリント法によって示されるように、明瞭な独自性を有する。この細胞系のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分化の可能性を試験したところ、この細胞系は、外胚葉、中胚葉及び内胚葉の系譜のそれぞれに属する、ドーパミン作動性の神経細胞、心筋細胞、膵島及び肝細胞様細胞を生じることができることが実証された。
【００２９】
本開示のヒトＥＳ細胞は、哺乳類の胚の胚盤胞期の内部細胞塊（ＩＣＭ）から産生される。好ましい実施形態では、分化多能性のヒトＥＳ細胞は、自己再生が可能であり、３種の系譜（外胚葉、中胚葉及び内胚葉）の全ての細胞を生じることができる。本明細書で使用する場合、「分化多能性のヒトＥＳ細胞」という句は、哺乳類の胚の胚盤胞期のＩＣＭから誘導した細胞を指す。分化多能性の細胞は、自己再生及び３種の系譜の全ての細胞への分化が可能である。本明細書で使用する場合、「分化」という用語は、それによって、細胞がより特殊化し、特別な組織の特徴を有する状態を、未分化のＥＳ細胞が獲得する過程を指す。これらの特殊な組織は、細胞レベル及び分子レベルで、組織特異的マーカーの発現を示す。ＥＳ細胞系の分化の可能性とは、その細胞系が３種の胚葉の全て（奇形癌腫を含む、外胚葉、中胚葉及び内胚葉）に属する細胞型を生じる能力である。ＥＳ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分化の可能性を、細胞を分化に適した条件下で培養することによって実証することができる。その上、ＥＳ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける分化の可能性を、この細胞をＳＣＩＤマウスに注射することによって示すこともできる。
【００３０】
本開示の分化多能性のヒトＥＳ細胞は、非拘束の系譜である（すなわち、本開示の分化多能性のヒトＥＳ細胞は、外胚葉、中胚葉及び内胚葉等の特定の生殖系譜に拘束されない）。また、分化多能性のヒトＥＳ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、高い自己再生能を有し且つ分化の可能性を所有してもよいし、或いは細胞、組織又は臓器内で、休眠して又は無活動で残存してもよい。そこからヒトＥＳ細胞が単離される胚盤胞を、体外受精、卵細胞質内精子注入法及び卵細胞質移植等、当業者に周知のいくつかの方法によって産生することができる。特定の実施形態では、単離されたヒトＥＳ細胞を、これらに限定されないが、マウス胚性線維芽細胞又はヒト胚性線維芽細胞をはじめとする、胚性線維芽細胞上、或いは成人ヒト組織から誘導した線維芽細胞様細胞上で生育させる。別の実施形態では、ヒトＥＳ細胞を、フィーダーなしの条件下で生育させる。
【００３１】
胚盤胞から誘導したヒトＥＳ細胞の集団は、好ましい実施形態に記載するように、ＥＳ細胞の特異的なマーカーを発現し、それらには、これらに限定されないが、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ−２、ＦＧＦ４、Ｕｔｆｌ、Ｔｈｙ１、Ｃｒｉｐｔｏ１、ＡＢＣＧ２、Ｄｐｐａ５、ｈＴＥＲＴ、コネキシン−４３、コネキシン−４５が含まれる。ヒトＥＳ細胞は、分化した細胞に特徴的なマーカーを発現せず、それらのマーカーの例として、ケラチン５、ケラチン１５、ケラチン１８、Ｓｏｘ−１及びＮＦＨ（外胚葉）；ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｓｘｌ、ＭｙｏＤ、ＨＡＮＤ１及び心臓アクチン（中胚葉）；並びにＧＡＴＡ４、ＡＦＰ、ＨＮＦ−４アルファ、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミン及びＰＤＸ１（内胚葉）があげられる。また、ヒトＥＳ細胞は、細胞表面マーカーも発現し、それらの例として、段階特異的胚性抗原３（ＳＳＥＡ−３）、ＳＳＥＡ−４、腫瘍認識抗原１−６０（「ＴＲＡ−１−６０）、ＴＲＡ−１−８１、Ｏｃｔ−４、Ｅ−カドヘリン、コネキシン−４３及びアルカリホスファターゼがあげられる。発現レベルを、免疫細胞化学によって検出することができる。本開示のヒトＥＳ細胞系の広範な分子的特徴付けから、初期胚の発生について、貴重な洞察を得ることができる。
【００３２】
本開示の特定の実施形態では、単離されたヒトＥＳ細胞を、栄養培地、好ましくは、増殖因子を含む栄養培地中で培養し、手作業で継代する。本明細書で使用する場合、「増殖因子」という用語は、細胞表面の受容体に結合し、その主要な結果が、シグナル経路の活性化を介しての細胞の増殖及び分化の活性化であるタンパク質を指す。大部分の増殖因子／サプリメントは、非常に多目的であり、多数の異なる細胞型内において細胞分裂を刺激することができるが、いくつかの増殖因子の特異性は、特定の細胞型に限定される。分化多能性のＥＳ細胞及びその誘導に特異的である増殖因子を使用して、神経細胞、肝細胞、心筋細胞、ベータ島、軟骨細胞、骨芽細胞、筋細胞及びその他等、種々の系譜に分化させることができる。ＥＳ細胞培地の例は、８０％ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、１５％ＥＳ試験済みＦＢＳ、５％血清代替物、１％非必須アミノ酸溶液、１ｍＭグルタミン（ＧＩＢＣＯ）、０．１％ベータメルカプトエタノール、４ｎｇ／ｍｌヒトｂＦＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌヒト白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含有する。細胞を手作業で継代する方法は、細胞系の遺伝子の安定性を維持するのを助けることから、酵素処理によって継代する、通常使用される方法より好都合である。
【００３３】
好ましくは、本開示のＥＳ細胞は、放射活性のないＰＣＲに基づくＳｙｂｅｒ−Ｇｒｅｅｎ検出法によって評価する場合、高いレベルのテロメラーゼ活性を示す。このことは、本開示の細胞の、少なくとも約４０回の継代培養、より好ましくは、少なくとも約６０回、最も好ましくは、少なくとも約１００回の継代培養の間の高い自己再生能を指し示している。また、ヒトＥＳ細胞は、好ましくは、正常な正倍数体の核型を所有し、培地中で１年後であっても染色体に肉眼的変化を示さない。
【００３４】
さらに、本開示は、ＨＬＡ及びＳＴＲの型決めによって証明されるように、ヒトＥＳ細胞の独特の特徴を記載する。ＨＬＡの型決めの解析は、幹細胞に基づく移植療法において中枢的な役割をはたす。また、ＳＴＲ遺伝子型解析によるゲノム中のタンデム反復要素の活用も、遺伝子地図作成、連鎖解析及びヒト鑑定試験を含む、いくつかの分野で重要になっている。本開示のヒトＥＳ細胞系は、独特のＨＬＡ及びＳＴＲの型を有し、これらの型から、インド人の集団に対する移植の際により良好な適合が得られるであろう。
【００３５】
本開示のヒトＥＳ細胞は、本来、分化多能性であり、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、３種の胚葉の全ての代表的なものへ分化する能力を有する。ＳＣＩＤマウスに注射すると、ヒトＥＳ細胞は、３種の胚性胚葉の全てから誘導された細胞に分化し、それらとして、これらに限定されないが、骨、軟骨、平滑筋、黄門筋、造血細胞（内胚葉）、肝臓、原腸及び呼吸上皮（内胚葉）、並びに神経細胞、グリア細胞、毛包及び歯芽（外胚葉）があげられる。この特徴は、本明細書に記載するヒトＥＳ細胞を注射した部位において、マウス内に形成された腫瘍の組織切片を試験することによって確認することができる。
【００３６】
また、誘導されたヒトＥＳ細胞は、懸濁培地中で胚様体（ＥＢ）を形成することもできる。本明細書で使用する場合、「胚様体」という用語は、懸濁培地中で産生した原始内胚葉によって囲まれた、分化した又は分化していない分化全能性のＥＳ細胞の凝集体を指す。胚様体は、外胚葉、中胚葉及び内胚葉を含む、３種の系譜の全ての細胞を含有する。成熟したヒト胚様体においては、神経細胞、造血細胞、肝細胞、心筋細胞及び膵島細胞等、種々の細胞型のマーカーを有する細胞を識別することが可能である。胚様体及びその詳細な特徴付けから、ＥＳ細胞の運命の決定について、価値ある洞察を得ることができる。さらに、適切な増殖因子及びそれらのサプリメントの利用を通して、ＥＳ細胞の望ましい表現型への分化も研究することができる。
【００３７】
ＥＢを産生する一方法では、懸濁凝集体を、ＬＩＦを有しないＥＳ培地内で、１０〜１４日間分化させる。産生されたＥＢは、一連の系譜の特異的なマーカーを発現することができる。それらの例として、ケラチン５、ケラチン１５、ケラチン１８、Ｓｏｘ−１及びＮＦＨ（外胚葉）；Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｓｘｌ、ＭｙｏＤ、ＨＡＮＤ１及び心臓アクチン（中胚葉）；並びにＧＡＴＡ４、ＡＦＰ、ＨＮＦ−４アルファ、ＨＮＦ−３β、アルブミン及びＰＤＸ１（内胚葉）があげられる。一連の分化したマーカーが明確に発現することは、ヒトＥＳ細胞系の分化の可能性を明らかに実証し、例えば、培養条件によって、分化した細胞の少なくとも８０％が神経細胞であることができ、３０〜５０％が心筋細胞であることができ、８０〜９０％が肝細胞であることができ、４０〜６０％が膵臓細胞であることができる。
【００３８】
特定の実施形態では、本明細書に記載するヒトＥＳ細胞を使用して、例えば、小型分子及び薬物を、細胞集団に対する効果に関してスクリーニングすることができる。また、化合物を、細胞毒性又は発現の調節に関してスクリーニングすることもできる。別の実施形態では、本明細書に記載するヒトＥＳ細胞を使用して、発生に関する細胞及び分子の生物学を、ゲノム機能解析を、且つ治療又は予防のための移植、治療、薬物スクリーニング又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける創薬において使用するための分化した細胞の産生を研究することができる。例えば、ゲノム解析に、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーを産生するために、これらに限定されないが、ヒト化モノクローナル抗体（参照によって本明細書に特に組み入れられている、国際公開第０１／５１６１６号）を含む、特異的なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を産生するために、或いはヒトＥＳ細胞及びヒトＥＳ細胞から誘導した細胞又は組織の上で、異なる試験化合物又は生物学的活性分子、例として、薬物研究における薬学的化合物、の効果をスクリーニングするために、ヒトＥＳ細胞を使用することができる。スクリーニングする試験化合物又は生物学的活性分子は、例えば、植物、植物に基づく抽出物又は合成の源に由来することができる。また、ヒトＥＳ細胞を使用して、培地中のヒトＥＳ細胞の特徴、並びにヒトＥＳ細胞の種々の特異的な細胞型又は組織型への分化に影響する、因子（小型分子の薬物、ペプチド、ポリペプチド及びその他等）又は条件（細胞の培養の条件又は操作）について、スクリーニングすることができる。
【００３９】
最近、毒物学の研究における幹細胞の使用が報告されている（Ｄａｖｉｌａら、２００４年、Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ｓｃｉ．、７９巻２号：２１４〜２３頁）。幹細胞を毒物学に応用すると、ヒトの一次細胞と比較して、独特の特性（すなわち、無限に増殖する能力、その他の細胞型を産生する柔軟性、及びヒト細胞のより容易に入手できる源）から、幹細胞の圧倒的な利点が展開する。マウスＥＳ細胞の肝細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分化が報告されている（Ｈａｍａｚａｋｉら、２００１年；Ｊｏｎｅｓら、２００２年）が、これらの分化した肝細胞の、有望な薬物候補のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるスクリーニングのモデルとしての有用性は、広範には研究されていない。マウスＥＳ細胞を用いた実験に基づいて、マウスＥＳ細胞から産生した肝細胞が、薬物の代謝及び毒性の研究のための従来のｉｎ  ｖｉｔｒｏの毒性モデルの適切な代替物になることを証明する可能性がある。
【００４０】
本開示は、これらに限定されないが、血清グルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素（ＳＧＰＴ）、血清グルタミン酸オキザロ酢酸アミノ基転移酵素（ＳＧＯＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）及び乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）をはじめとする、酵素の放出を測定することによって、生体異物誘発肝毒性を研究するためのＥＳ細胞から誘導した肝細胞の使用を記載する。応用は、毒性の研究に用いるＥＳ細胞から誘導した肝細胞の使用に限定されないが、この細胞型は、毒性試験に特によく適している。これは、細胞、分子及び機能のレベルでの特徴付け試験が十分規定されており、形態学的に、高い割合の肝細胞をＥＳ細胞から効率的に誘導することが可能であり、且つ肝細胞は明らかに識別可能であり、このことは、混合した集団に伴う混乱を減らすからである（参照によって本明細書に組み入れられている、Ｋｕｌｋａｒｎｉ及びＫｈａｎｎａ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、２００６年、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ（印刷中）を参照）。この概念を、本開示のヒトＥＳ細胞から誘導した肝細胞を使用して、薬物の代謝及び毒性の研究のための従来のｉｎ  ｖｉｔｒｏの毒性モデルの代替物として利用することができる。
【００４１】
ヒトＥＳ細胞は、分化多能性ヒト胚性癌腫（ＥＣ）細胞と、特色を共有する。したがって、推定上のヒトＥＳ細胞を、形態及びヒトＥＣ細胞に特徴的な細胞表面マーカーの発現によって特徴付けることができる。その上、推定上のヒトＥＳ細胞を、発生の可能性、核型及び不死によって特徴付けることもできる。ヒトＥＳ細胞を同定する特徴の例を、以下に列挙する。
ａ）形態：ヒトＥＳ細胞のコロニーの形態は、マウスＥＳ細胞に類似するものの、それとは異なる。マウスＥＳ細胞もヒトＥＳ細胞も共に、未分化の幹細胞の特徴的な特色を有し、核／細胞質の高い比、顕著な核小体及び緻密なコロニー形成を伴う。しかし、ヒトＥＳ細胞のコロニーは、マウスＥＳ細胞のコロニーより扁平であり、個々のＥＳ細胞を容易に識別することができる。
ｂ）細胞表面マーカー：本開示のヒトＥＳ細胞系は、以下に記載する特定の細胞表面マーカーの有無に基づいて、マウスＥＳ細胞系とは異なる。一連の糖脂質の細胞表面マーカーが、段階特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）の１から４として知られている。これらの抗原は、ヒトＥＳ細胞とマウスＥＳ細胞とでは、発現に差異があり、抗原に対する抗体を使用して同定することができる。ＮＴＥＲＡ−２  ＣＬ．Ｄ１細胞系は、広範に研究され、文献に報告されていることから、ＮＴＥＲＡ−２  ＣＬ．Ｄ１細胞系を、陽性のコントロールとして選んだが、その他のヒトＥＳ細胞系も同様に使用することができる。
【００４２】
マウスＥＳ細胞（ＥＳ  Ｊ１）を、ＳＳＥＡ−１に関する陽性のコントロールとして、且つＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１に関する陰性のコントロールとして使用する。その他の日常的な陰性のコントロールには、一次抗体又は二次抗体の除外、及び一次抗体の無関係な特異性による置換が含まれる。アルカリホスファターゼを、４％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定化した後に検出することができる。グロボ系糖脂質であるＳＳＥＡ−３及びＳＳＥＡ−４は、ヒトＥＣ細胞上に、一貫して存在する。ＮＴＥＲＡ−２  ＣＬ．Ｄ１細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分化の結果、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１の発現が損失し、ラクト系糖脂質であるＳＳＥＡ−１の発現が増加する。このことは、未分化のマウスＥＳ細胞とは対照的であり、未分化のマウスＥＳ細胞は、ＳＳＥＡ−１を発現するが、ＳＳＥＡ−３もＳＳＥＡ−４も発現しない。これらの抗原の機能は、不明であるが、Ｒｅｌｉｃｅｌｌ（商標）ｈＥＳ１細胞とヒトＥＣ細胞とが共通してそれらの抗原を発現することから、密接な胚性の類似性が示唆される。また、アルカリホスファターゼも、全てのヒトＥＳ細胞上に存在するであろう。本開示の良好なヒトＥＳ細胞培養は、その他の樹立されたヒトＥＳ細胞系中に存在する、これらの細胞表面マーカーと相関するであろう。
ｃ）奇形腫形成による発生の可能性：本開示のヒトＥＳ細胞は、分化多能性である。ＳＣＩＤマウス内に注射すると、良好なヒトＥＳ細胞系は、骨、軟骨、平滑筋、横門筋及び造血細胞（中胚葉）；肝臓、原腸及び呼吸上皮（内胚葉）；並びに神経、グリア細胞、毛包及び歯芽（外胚葉）を含む、３種の胚性胚葉の全てに由来する細胞に分化するであろう。
ｄ）核型：良好なヒトＥＳ細胞系は、正常な核型を有する。ＸＸ細胞系及びＸＹ細胞系の両方を、誘導することができる。ヒトＥＳ細胞系中の正常な核型は、自発的に発生するヒトの生殖細胞の腫瘍（奇形癌腫）から誘導される、ヒトＥＣ細胞中に存在する異常な核型とは対照をなす。腫瘍から誘導されるヒトＥＣ細胞系は、ＥＳ細胞系と共通する
特性をいくつか有するが、今日までに誘導されたヒトＥＣ細胞系の全てが、異数体である。したがって、ヒトＥＳ細胞系とヒトＥＣ細胞系とを、ヒトＥＳ細胞系中に存在する正常な核型とヒトＥＣ細胞系中に存在する異常な核とによって識別することができる。「正常な核型」とは、種が正常な場合に特徴的な染色体が全て存在し、且つそれらが顕著に変化していないことを意味する。ヒトＥＳ細胞系の正常な核型は、この細胞系が正常な分化を招くであろうことを示唆する。
ｅ）不死：不死の細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、連続して無期限に複製することができる。この特性を有しない一次細胞を培養しても、１年超の期間にわたり連続して分裂できないことから、１年超の間培養しても連続して増殖することは、不死の十分な証拠となる。好ましくは、ヒトＥＳ細胞は、１年超の間、適切な培養条件下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて増殖し続け、発生の可能性を維持して、３種の胚性胚葉の全てに寄与するものとする。この発生の可能性を、長期に（１年超）培養されているＥＳ細胞をＳＣＩＤマウス内に注射し、次いで、得られる腫瘍を組織学的に試験することによって実証することができる。核型の変化は、長期の培養に伴って無作為に生じる場合があるが、大部分のヒトＥＳ細胞は、１年超連続して培養しても、正常な核型を維持しなければならない。このことは、増殖の後期において、ヒトＥＳ細胞のテロメラーゼ酵素の活性を検出することによって実証することができる。高いレベルのテロメラーゼ活性が、胚の発生の際の細胞の増殖、並びに細胞の形質転換及び癌に伴う。
ｆ）培養条件：分化を阻止するための増殖因子の要求性は、本開示のヒトＥＳ細胞系の場合と、マウスＥＳ細胞系の場合とでは異なる。マウスＥＳ細胞に関して、ＬＩＦが、フィーダーの非存在下で、未分化の細胞としての自己再生及び増殖を補助することができることを決定したことは、顕著な発見であった。残念なことに、ＬＩＦは、ヒトＥＳ細胞培養に関しては、この能力を有さないようである（Ｊｏｎｅｓら、１９９８年；Ｂｏｎｇｓｏら、２０００年、上記。
【００４３】
別法として、（ヒトＥＳ細胞培養のための異物なしの環境を開発する目的で）ヒトＥＳ細胞を生育させるために、これらに限定されないが、ヒト胚性線維芽細胞、ヒト包皮、骨髄の間葉細胞、種々の成人由来の間質細胞及びそれらの組合せを含む、ヒトのフィーダーの源を、本開示において、マウス胚性フィーダー（ＭＥＦ）の代用品として使用することができる。しかし、フィーダーを有しないヒトＥＳ細胞の培地が、理想的である。これによって、病原体を有する恐れのある外因性の汚染が心配される源を排除するのみならず、ＥＳ細胞培養の、特に大規模な場合の、ロジスティクスもまた単純化するであろう。フィーダー非存在下で、マウス胚性線維芽細胞からのならし培地は、細胞外基質製剤Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＩＮＶＩＴＯＲＧＥＮ）上で培養されるヒトＥＳ細胞の増殖を補助する（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、２００１年）。このことは、いくつかの実用的な利点を提供するが、ならし培地からの活性な因子は、まだ同定されておらず、このアプローチは、マウスの外因性のレトロウイルスからの汚染の可能性を、排除することができない。
ｇ）胚体外組織への分化：胚性線維芽細胞上で生育させ、集密（すなわち、培地表面を連続して覆う）状態に達した後２週間生育させた場合、本開示のヒトＥＳ細胞は、神経細胞、心筋細胞、肝細胞及び膵島細胞へ自発的に分化する。上記の細胞型に対応するマーカーを、対象の遺伝子のそれぞれに対する遺伝子特異的プライマー及び抗体を使用して、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ及び免疫細胞化学によって検出することができる。
ｈ）再生医療における分化した幹細胞：本開示のヒトＥＳ細胞を誘導して、特定の表現型へ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて分化させることができる。そのような手法を使用して、所望の細胞型の純粋な集団を生み出すことができ、これを、例えば、損傷した臓器に注射して、損傷を修復することができる。そのような損傷の原因として、様々な疾患又は状態、例として、これらに限定されないが、神経変性疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、肝不全及び糖尿病があげられる。神経変性疾患の例として、これらに限定されないが、脳卒中、脊髄損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症及びその他があげられる。したがって、分化したヒトＥＳ細胞は、細胞補充療法又は組織再生のための細胞移植において、莫大な可能性を所有している。その上、本開示によって誘導された細胞系を、治療に活性な分子のための担体ビークルとして使用することができる。例えば、特異的な遺伝子を、人体の様々な部位へ伝達することができ、好ましくは、細胞内で遺伝子的に操作し、遺伝子療法のための標的部位へ伝達する。
ｉ）薬物スクリーニング及び治療薬のための分化した幹細胞：本開示は、薬学的介入、並びに創薬及びｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける毒性試験に用いる細胞に基づくアッセイのために、ヒトＥＳ細胞を使用する可能性及びヒトＥＳ細胞の３種の系譜（外胚葉、中胚葉及び内胚葉）の全ての細胞へ分化する独特な能力を提供する。本開示の別の態様は、これらに限定されないが、神経細胞、心筋細胞、肝細胞及びベータ島を含む、これらの分化した細胞を使用して、種々の生物学的に活性な分子、例えば、植物に基づく抽出物及び合成の源に由来する分子をスクリーニングする機会を提供する。スクリーニングの方法を使用して、様々な疾患、例として、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、心障害、糖尿病及び肝疾患等、に用いる新規な薬物分子を開発することができる。
【００４４】
同様の路線に沿って、これらに限定されないが、血清グルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素（ＳＧＰＴ）、血清グルタミン酸オキザロ酢酸アミノ基転移酵素（ＳＧＯＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）及び乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）をはじめとする、酵素の放出を測定することによって、生体異物誘発肝毒性を研究するために、マウスＥＳ細胞から誘導した肝細胞が使用された。また、薬物によって誘発したチトクロームＰ４５０のアイソフォーム、これらに限定されないが、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｅ１及びＣＹＰ３Ａ４を含む、の誘発を研究するため、並びに解析の手法、これらに限定されないが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）及びガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）を含む、を使用して薬物の代謝物を同定するために、本開示の細胞を使用することもできる。
【００４５】
また、本開示によって誘導される細胞を、研究又は治療の可能性に向けて、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方の産生のために、好ましくは、種々の疾患の治療に向けて、ヒト化モノクローナル抗体の産生のために使用することができる。
【００４６】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれている。当業者には、以下の実施例に開示する手法は、本発明者によって発見された手法が、発明の実施にあたって十分機能することを示し、したがって、そのような手法は、発明の実施のための好ましい形態を構成するとみなすことができることを認識されたい。しかし、当業者にあっては、本開示に照らし、開示された特異的な実施形態において、多くの変化をもたらすことができ、それでもなお、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、同様又は類似の結果を得ることができることを認識されたい。
【００４７】
（実施例１）
本実施例は、体外受精による胚盤胞の調製を開示する。
１）胚盤胞の単離
胚盤胞期の胚（胚盤胞）を、種々の源から単離することができる。これらの胚盤胞を、回収したｉｎ  ｖｉｖｏにおいて受精した着床前の胚から、又は体外受精（ＩＶＦ）（例えば、従来の精子注入、卵細胞質内精子注入法又は卵細胞質移植によって受精させた胚）から単離することができる。ヒト胚盤胞を、余剰胚を自発的に提供する夫婦又はドナーから得る。これらの夫婦又はドナーから自発的な同意を書面にて得た後、これらの胚は、研究目的で使用される。別法として、胚盤胞は、体細胞又は細胞核をヒト又は非ヒトに由来する除核された卵母細胞へ移植することによって誘導し、次いで、これを刺激して胚盤胞期まで発生させることもできる。また、使用する胚盤胞は、凍結保存されていてもよいし、又はこれより前の段階で凍結保存された胚を得て、それを胚盤胞期の胚へと発生させ続けてもよい。好ましくは、本開示においては、良好な形態の程度の胚盤胞、例えば、内部細胞塊が十分に発生している胚盤胞を使用する。胚盤胞及び内部細胞塊の両方の発生は、種によって異なり、このことは、当業者には周知である。胚を、生存を維持し、胚盤胞期の胚への発生を増強する培地条件で培養する（それぞれが参照によって本明細書に組み入れられている、Ｆｏｎｇ及びＢｏｎｇｓｏ、１９９９年）。
【００４８】
ヒト胚盤胞を使用する本明細書に開示する研究のいずれかを開始する前には、機関の倫理委員会の承認を得た。不妊症の治療が完了した後、本研究のための余剰胚の提供に関して、個々のドナーから、書面による事前の同意を得た。不妊症患者から生存可能な胚を得るために一般的に使用したプロトコールを、以下に記載する。
【００４９】
２）体外受精
ＩＶＦの場合、まず、女性が、酢酸リュープロレリン（Ｌｕｐｒｏｎ）等のＧｎＲＨアゴニストを用いて、下方制御により、下垂体抑制処置を受ける必要がある。この処置に続いて、７〜１２日間、ゴナドトロピン（ｈＭＧ）を注射して、制御しながら卵巣を過剰刺激し、この間、卵胞の成長を、超音波検査及び血漿エストラジオールのレベルによってモニターする。少なくとも１個又は複数の卵胞が、直径１８ｍｍになったところで、排卵を、１０，０００ＩＵのｈＣＧ（Ｐｒｏｆａｓｉ）の筋肉内注射によって引き起こす。
【００５０】
３）卵母細胞の回収及び胚の回収
卵母細胞の回収を、第３４〜３６時において、超音波検査の誘導下、卵胞吸引によって行う。受精を、２個の前核（２ＰＮ）の存在によって評価し、受精した卵母細胞を、胚の培養皿に移動させる。各プレートに受精した卵母細胞（２ＰＮ）の２個とし、０．７５〜１ｍｌの卵割培地（Ｑｕｉｎｎ’ｓ  ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓａｇｅ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ、カタログ番号：ＡＲＴ−１０２６））中に移動させる。これらの皿を、恒温器中で、５％ＣＯ２の環境中、３７℃にて、第２日までインキュベートする。第２日に、卵割培地を変える。第３日に、胚盤胞培地（ＱＡ  Ｂｌａｓｔｏｃｙｔｅｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓａｇｅ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ、カタログ番号：ＡＲＴ−１０２９））で卵割培地を交換し、胚を、第５日から第７日まで培養し、この時点で、発展した胚盤胞が得られる。培地は、１日おきに交換する。一晩培養後、胚を、手術用顕微鏡下で、視覚的にモニターした。胚が、桑実胚又は十分に発展した胚盤胞に発生した（図１．１及び１．２）ら、統合は成功したとみなされた。本明細書に開示するように、ヒトＥＳ細胞を、桑実胚期から胚盤胞期に単離することが可能である。
【００５１】
（実施例２）
本実施例は、マウス胚性線維芽（フィーダー）細胞の誘導及び保存を開示する。
１）妊娠マウスの獲得及び解剖
マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を、近交系Ｃ５７Ｂｌａｃｋマウス又はその他の適切な系統から得ることができる。例示的な方法では、マウスを、妊娠／性交後第１３．５日（ｄｐｃ）に、頸椎脱臼によって堵殺する。マウスの腹部に７０％イソプロパノールを塗布後、小さく切開する。腹部の皮膚を両側に引き離すことによって、内臓を露出させる。胎仔の詰まった子宮が、後側の腹腔内に見られる。子宮を、無菌の鉗子及び剪刀を用いて解体し、２０ｍｌの無菌のダルベッコリン酸緩衝食塩水、Ｃａ及びＭｇを含有せず（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、カタログ番号：１４１９０−１４４）を含有する５０ｍｌのねじ口コニカル遠心チューブ内に入れる。堵殺した妊娠マウスの全てから、胎仔を含有する子宮を、解体して取り出す。次いで、層流カバー内で、子宮を、無菌のダルベッコリン酸緩衝食塩水、Ｃａ及びＭｇを含有せず、で５〜６回洗浄する。無菌のとがった鉗子及び剪刀を用いて、胎仔を収集し、次いで、胎盤、膜及び軟組織を取り除く。
【００５２】
２）マウス胎仔の段階付け
マウス胎仔を、手術用顕微鏡下で段階付ける。マウス胎仔の段階付けは、様々な判断基準にしたがって行うことができるが、それらのうちで最も一般的なものが、Ｔｈｅｉｌｅｒによって、「Ｔｈｅ  Ｈｏｕｓｅ  Ｍｏｕｓｅ：  Ａｔｌａｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」（１９８９年）（参照によって本明細書に組み入れられている）に記載されている。Ｔｈｅｉｌｅｒの判断基準は、初期の発生の多くの重要な相を識別するには広すぎ、したがって、その他、例えば、細胞数、体節数又は参照によって本明細書に組み入れられている、Ｄｏｗｎｓ及びＤａｖｉｓ、１９９３年、Ｄｅｖ．、１１８巻４号：１２５５〜６６頁、によって使用されるその他の特徴によって補充する必要がある。同一の在胎期間の胎仔でも、発生の段階が異なる場合がある。Ｄｏｗｎｓ及びＤａｖｉｓによって認識される段階は、Ｃ５７Ｂｌａｃｋ  Ｘ  ＣＢＡマウス、近交系Ｃ５７ｂｌａｃｋマウス及びその他の近縁の系統の一代雑種に適用できる。ヒトＥＳ細胞を生育させる目的でフィーダーを得るための最も許容できる段階は、Ｔｈｅｉｌｅｒの段階２１及び２２である。Ｔｈｅｉｌｅｒの段階２１は、１３ｄｐｃであり、１２．５〜１４ｄｐｃの範囲を有し、５２〜５５体節期である。この段階は、前側の湾入したあぶみ骨底、同定可能な肘及び手首、５本のひげ、並びに明らかに認められる臍へルニアによって同定される。その上、毛包は存在せず、指は遠位で分かれている。Ｔｈｅｉｌｅｒの段階２２は、１４ｄｐｃとして認識され、１３．５〜１５ｄｐｃの範囲を有し、５６〜６０体節期である。この段階の、他と区別する特色は、遠位で分かれている指、後側あぶみ骨底の指の間の湾入、並びに肢の長骨と胸、骨盤及び体幹の領域の毛包との存在である。その他の特色には、開いた眼瞼が存在しないこと及び頭部の領域に毛包が存在することが含まれる。
【００５３】
３）マウス胎仔の加工
まず頭部を、次いで全ての内臓の臓器を、手術用顕微鏡下で、無菌のとがった鉗子の助けをかりて廃棄することによって、胎仔をさらに処理した。次いで、堵殺体を、９６ｍｍの無菌のペトリ皿の蓋内へ移動させ、無菌の弯剪刀の助けをかりて適切に刻んだ。次いで、刻んだ塊を、およそ１５〜２０ｍｌの０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、カタログ番号：２５２００−０５６）を含有する、３７℃にてあらかじめ加温した５０ｍｌのコニカル遠心チューブ内に移動させた。次いで、刻んだ塊を、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液中で、１０ｍｌのピペットの助けをかりて３〜４回砕き、１８ゲージの針に付けた２０ｍｌの注射器を２〜３回通過させた。次いで、細胞懸濁液を、３７℃にて、１０〜１５分間インキュベートした。細胞懸濁液を、再度、１０ｍｌのピペットを通して砕いた。細胞懸濁液中のトリプシンを、２０ｍｌの完全培地（９０％ダルベッコ変法イーグル培地−高グルコース、１０％ウシ胎仔血清、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸及び０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール）を添加することによって不活性化し、最後に、細胞懸濁液を、組織培養フラスコ内に播種した。その後、培地を１日おきに変え、定期的にモニターしながら、細胞を集密状態に達するまで生育させた。
【００５４】
４）マウス胚性線維芽細胞の凍結
細胞の凍結を、集密状態において、６０％ウシ胎仔血清、２０％ＤＭＳＯ及び２０％完全培地からなる凍結培地中で行った。凍結するために、細胞を、完全培地中に再度懸濁し、次いで、１：１の比で凍結培地と混合した。次いで、この凍結懸濁液を、１ｍｌずつ凍結バイアルに分注すると、１ｍｌが５×１０６個の細胞を含有するようになった。次いで、これらのバイアルを、液体窒素中に保存し、長期の使用に供した。
【００５５】
５）ＭＥＦの適性評価
フィーダーをバッチ毎に、ＭＥＦ上で５回継代して生育させてあるヒトＥＳ細胞を試験することによって適性評価する。適性評価の過程では、ヒトＥＳ細胞のコロニーの形態学的解析（図２．１及び２．２）、免疫化学によるＥＳ細胞マーカーの発現（図２．３及び２．４）、ＲＴ−ＰＣＲ（図２．５）、並びに菌体内毒素及びマイコプラズマの試験による無菌性の確認等、重大な意味をもつパラメーターを評価することになる。適性と評価されたフィーダーのみを、Ｒｅｌｉｃｅｌｌ（商標）ｈＥＳ１細胞系の単離、継代及び維持のために使用した。
【００５６】
（実施例３）
本実施例は、ヒトＥＳ細胞の誘導及び維持を記載する。
１）マウス胚性線維芽（フィーダー）細胞の不活性化及び播種
液体窒素中に保存したフィーダー細胞を、必要に応じて、解凍し、培養した。凍結バイアルを３７℃の水浴中に内容物が半解凍状態になるまで入れることによって、バイアルを解凍した。次いで、内容物をチューブ内に収集した後、暖かい培地と混合して、凍結保護物質を希釈した。細胞をペレット化し、再度懸濁した後、組織培養フラスコ中の新鮮なＭＥＦ培地（９０％ダルベッコ変法イーグル培地−高グルコース（ＧＩＢＣＯ）、１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ）、１％非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ）及び０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ））内に播種した。いったん細胞が集蜜状態に達すると、細胞は不活性化できるようになった。マイトマイシンＣの処置又はガンマ線照射によって、細胞を不活性化した。ここでは、細胞を、マイトマイシンＣで２．５時間処置することによって不活性化した。１０ｎｇ／ｍｌのマイトマイシンＣを、３７℃及び５％ＣＯ２における不活性化のために使用した。次いで、細胞を、数回洗浄して、マイトマイシンＣを完全に除去した後、トリプシン−ＥＤＴＡ等の酵素を使用してトリプシン処理した。次いで、これらの細胞を数え、０．２％ゼラチン処理プレート上に、６．２５×１０４細胞／ｃｍ２の濃度で播種した。細胞を播種した後、３７℃及び５％ＣＯ２にて、インキュベートした。次いで、これらのプレートを、単離したヒトＥＳ細胞を播種するために使用した。
【００５７】
２）ＩＣＭの単離
細胞の損失の危険を冒すことなくＩＣＭを単離するために、全胚培養法を第６日の胚の培養物上に用いた（図１及び３）。透明帯を、０．５％プロナーゼによって、約２分間消化した。次いで、ＩＣＭを有糸分裂的に不活性化したＭＥＦ細胞上に播種した。この手法において使用したヒトＥＳ細胞の培地は、８０％ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（ＧＩＢＣＯ、グルコース４５００ｍｇ／Ｌを有する）、１５％ＥＳ試験済みＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）、５％血清代替物（ＧＩＢＣＯ、＃１０８２８−０２８）、１％非必須アミノ酸溶液（ＧＩＢＣＯ）、１ｍＭグルタミン（ＧＩＢＣＯ）、０．１％ベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、４ｎｇ／ｍｌヒトｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１０ｎｇ／ｍｌヒト白血病抑制因子（Ｓｉｇｍａ）からなる。７日後、ＩＣＭ塊を、マイクロピペットを用いた機械的解離によって、その他の細胞から分離させた。次いで、ＩＣＭ塊を、新鮮なフィーダー細胞層上に再度播種し、新鮮な培地を添加した。
【００５８】
３）ヒトＥＳ細胞の培養及び手作業での継代
未分化のコロニーのその後の継代は、コロニーを、約１００個の細胞の塊に、ガラス製のマイクロピペットの鋭利な縁部を使用して、系統的に切断することによって行った（図４）。コロニーの望まれない分化した領域を選択して除去した。塊が解離するや否や、塊を、吸引セットの口に付けた（塊の大きさより若干大きな口径を有する）同一のマイクロピペットによって拾い、新鮮な線維芽細胞のフィーダー層へ移動させた。培養系を、５％ＣＯ２の恒温器中に置くことによって、３７℃の一定の温度に維持した。細胞系Ｒｅｌｉｃｅｌｌ（商標）ｈＥＳ１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて４０回継代の間生育し続け、本細胞系は、依然として、主にヒトＥＳ細胞の形態を有する細胞からなる。
【００５９】
４）ヒトＥＳ細胞の凍結保存
３日齢の「良好な」未分化のヒトＥＳのコロニーを、凍結に使用した。フィーダー層と共にＥＳのコロニーを、細胞スクレーパーを使用して、小片に切断した。次いで、細胞を、無菌の１５ｍｌの遠心チューブ（Ｎｕｎｃ）内に収集し、２００Ｇにて、３分間回転させた。上澄を吸引して除去した。細胞ペレットの容量を測定した後、ＥＳ培地中に再度懸濁させて、容量を０．５ｍｌとした。次に、６０％ＥＳ試験済みＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）、２０％ＥＳ培地及び２０％ＤＭＳＯ  ＨＹＢＲＩＭＡＸ（Ｓｉｇｍａ）を含む凍結培地の等容量を、ｈＥＳ細胞懸濁液に、時々回旋させながら、穏やかに添加した。ＥＳ細胞の塊を、凍結培地を含有する１．２ｍｌの凍結バイアル（Ｎａｌｇｅ−Ｎｕｎｃ、米国）内に移動させた。バイアルを、凍結容器（Ｓｉｇｍａ）内で、ゆっくり（約１℃／分）、−８０℃まで、冷却し、翌日、液体窒素中に保存した。復活時、凍結されたヒトＥＳ細胞の解凍後の生存率は、約５０％以上であることが見出された。
【００６０】
（実施例４）
本実施例は、単離したヒトＥＳ細胞を特徴付ける。
１）胚様体の産生
ＥＢを産生させるために、ヒトＥＳ細胞のコロニーを、手作業で小片に切断するか、或いはコラゲナーゼ又はトリプシンＥＤＴＡを用いる酵素処理によって小片に解離させるかのいずれかが必要である。ここでは、胚様体の形成のために、ヒトＥＳ細胞のコロニーを、手作業で小片に切断した。次いで、小片を、ＥＢ培地（８０％ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ、グルコース４５００ｍｇ／Ｌを有する）、１５％ＥＳ試験済みＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）、５％血清代替物（Ｇｉｂｃｏ、＃１０８２８−０２８）、１％非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭグルタミン（Ｇｉｂｃｏ）及び０．１％ベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ））中で、細菌学的プレートに移動させて、凝集させた。細胞の凝集物を、この培地中で、１０〜１４日間、３日おきに培地を変えて生育させた。この方法によって産生したＥＢを、細胞マーカー及び分子マーカーを使用して、異なる日、例えば、第０日、第６日、第１０日及び第１４日に、懸濁培地中で特徴付けして（図９．１から９．４）、ヒトＥＳ細胞系のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分化の可能性を評価した。
【００６１】
２）免疫細胞化学
２ウェルのチャンバースライド（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国）内で生育させた細胞を、新たに調製した４％パラアルデヒド中に固定し、ＰＢＳ中の０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて透明処理した。非特異的結合部位を、ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミンを用いてブロックした。次いで、細胞を、一次抗体と共に、４℃にて、一晩インキュベートした。この方法を使用して、Ｏｃｔ−３／４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、アルカリホスファターゼ、コネキシン４３、Ｅ−カドヘリン等の未分化の幹細胞のマーカーのパネル（図５．１から５．８）、さらに、ネスチン（外胚葉）、平滑筋アクチン及びｂｒａｃｈｙｕｒｙ（中胚葉）、並びにＡＦＰ及びＧＡＴＡ４（内胚葉）等の分化したマーカーのグループ（図１０．１から１０．５）を解析した。（表１は、使用した抗体の関連する詳細を記載する。次いで、細胞を、洗浄し、適切なＦＩＴＣで標識化した二次抗体と共に、暗所で、室温にて、１時間インキュベートした。次に、細胞を、ＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を用いて対比染色した。細胞を蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００）に載せた後、観察して、免疫陽性の領域を評価した。ヒトＥＳ細胞は、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１及びＯｃｔ−４を発現し、このことは、ヒトＥＳ細胞には典型的であり、且つＥ−カドヘリン及びコネキシン−４３も発現した（図５）。また、ヒトＥＳ細胞は、蛍光顕微鏡法によって証明されるように、アルカリホスファターゼ活性も示した（図５．８）。さらに、第１４日のＥＢは、ネスチン（外胚葉）、平滑筋アクチン及びｂｒａｃｈｙｕｒｙ（中胚葉）、並びにＧＡＴＡ４及びＡＦＰ（内胚葉）等の分化のマーカーに関して、陽性に染色した（図１０）。
【００６２】
【表１】
2009517001.tif 000002
３）ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現解析
本明細書に開示するヒトＥＳ細胞の全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、メーカーのプロトコールにしたがい単離した。ＲＮａｓｅ−ＯＵＴ  ＲＮＡ分解酵素阻害剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理した１μｇのＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成に使用した。また、反応の準備を整えるために、Ｓｕｐｅｒｓｃｔｉｐｔ逆転写酵素ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＯｌｉｇｏ  ｄＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する逆転写も行った。異なるエクソンに特異的な個々のプライマーを使用することによって、ｃＤＮＡとゲノムのＤＮＡとを識別するように、ＰＣＲプライマーを選択した。１μｇのｃＤＮＡを、Ａｂｇｅｎｅ  ２Ｘ  ＰＣＲマスターミックス（Ａｂｇｅｎｅ、Ｓｕｒｒｅｙ、英国）及び適切なプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって増幅した。Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ−２、ＦＧＦ４、Ｕｔｆｌ、Ｔｈｙ１、Ｃｒｉｐｔｏ１、ＡＢＣＧ２、Ｄｐｐａ５、ＴＥＲＴ、コネキシン−４３及びコネキシン−４５等の未分化幹細胞のマーカー、さらに、ケラチン５、ケラチン１５、ケラチン１８、Ｓｏｘ−１及びＮＦＨ（外胚葉）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｓｘｌ、ＭｙｏＤ、ＨＡＮＤ１及び心臓アクチン（中胚葉）、並びにＧＡＴＡ４、ＡＦＰ、ＨＮＦ−４アルファ、ＨＮＦ−３ベータ、アルブミン及びＰＤＸ１（内胚葉）等の系譜特異的マーカーを含む、一連のマーカーの発現を評価した。表２に、プライマーの詳細を記載する。全ての遺伝子について、ＰＣＲを３５サイクル行い、これは、はじめに９４℃にて１分間変性させた後、９４℃にて３０秒間とそれぞれの遺伝子のプライマーのアニーリング温度にて４５秒間と７２℃にて１分間とからなる３５サイクルからなった。最後のサイクルの後、最後の伸長を、７２℃にて５分間行った。ヒトＥＳ細胞は、継代の初期及び後期において、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｃｒｉｐｔｏ１、ＦＧＦ４、Ｔｈｙ１、Ｕｔｆｌ、ＡＢＣＧ２、Ｄｐｐａ５及びｈＴＥＲＴを含む、分化全能性に、且つコネキシン−４３及びコネキシン−４５等のギャップ結合タンパク質に関連する一連の遺伝子の明確な発現を示した（図６及び表３）。我々が陰性のコントロールとして使用したＨＥＦ細胞は、これらのマーカーのいずれの発現も欠いた。さらに、系譜特異的分化に関係のある遺伝子の徹底的なリストの発現プルフィールを、０日齢、６日齢、１０日齢及び１４日齢のＥＢを用いて評価した（図１１及び表３）。ケラチン５、ケラチン１５及びケラチン１８等の初期の外胚葉のマーカーの一貫した発現が、分化の第６日から第１４日において、ＥＢ中で観察された。興味深いことに、分化の第０日では、これらのマーカーは発現せず、後期の神経外胚葉のマーカーであるＳｏｘ−１及びＮＦＨは、分化第１０日から第１４日においてのみ存在した（図１１）。中胚葉の系譜のマーカーのうち、Ｍｓｘ１、前心蔵転写因子、は、分化の日数の経過に伴って、終始、均一に発現した。ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＨＡＮＤ１、ＭｙｏＤ及び心臓アクチンを含む、その他の中胚葉のマーカーは、ヒトＥＳ細胞中では、弱い発現を示すか、全く発現しなかった（図１１）。同様に、ＡＦＰ、ＨＮＦ−４α及び���ＮＦ−３βを含む、初期の内胚葉の細胞マーカーが、細胞凝集体形成の第６日及び第１０日において、発現を示し、ＧＡＴＡ４レベルは、懸濁培養の第１０日からはじまり第１４日までに、一過性の増加を示した（図１１）。成熟した肝細胞、膵島細胞、アルブミン及びＰＤＸ１のそれぞれに関するマーカーについては、非常に弱い発現が検出され、これによって、成熟した内胚葉の派生物が存在しないことが示される（図１１）。
【００６３】
【表２】
2009517001.tif 000003
【００６４】
【表３】
2009517001.tif 000004
【００６５】
【表４】
2009517001.tif 000005
【００６６】
【表５】
2009517001.tif 000006
４）ＨＬＡの型決め
ヒトＥＳ細胞上に発現するＨＬＡ抗原の範囲は、臨床に関連する特徴であることから、ＲｅｌｉＣｅｌｌ（商標）ｈＥＳ１細胞系のＨＬＡプロフィールを得た。手短にいうと、ＨＬＡの型決めのための主要な技術として、配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ（ＳＳＯＰ）を採用したＰＣＲ増幅ＤＮＡのハイブリダイゼーションを利用することによって、ＨＬＡのＤＮＡの型決めを行った（Ｔｅｐｎｅｌ  Ｌｉｆｅｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｙｔｈｅｎｓｈａｗｅ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、英国）。アッセイを行って、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ及びＨＬＡ−ＤＱＢの遺伝子座を解析した。
【００６７】
【表６】
2009517001.tif 000007
表４に示すように、結果は、ＲｅｌｉＣｅｌｌ（商標）ｈＥＳ１細胞系は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１及びＨＬＡ−ＤＱＢ１の対立遺伝子を有するＨＬＡのハプロタイプの範囲を表すことを実証している。
【００６８】
５）ＳＴＲの型決め
ＲｅｌｉＣｅｌｌ（商標）ｈＥＳ１細胞系のＤＮＡフィンガープリントを得た。ＳＴＲ解析のために解析した遺伝子座として、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１６Ｓ５３９、ｖＷＡ、ＴＨ０１、アメロゲニン、ＴＰ０Ｘ及びＣＳＦ１Ｐ０が含まれる（マルチプレックスＰＣＲに基づくＰｏｗｅｒＰｌｅｘ  １．２キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州、米国））。解析した遺伝子座として、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１６Ｓ５３９、ｖＷＡ、ＴＨ０１、アメロゲニン、ＴＰ０Ｘ及びＣＳＦ１Ｐ０が含まれ、結果を、表５に示す。このセットに含まれる遺伝子座の全ては、真性のテトラヌクレオチド反復である。単位複製配列を、電気泳動によって分離した後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＧｅｎｏｔｙｐｅｒ（登録商標）２．０ソフトウエアを使用して解析した。これらの９種のＳＴＲ遺伝子座の研究から、本細胞系が、インド人起源の胚から誘導されていることが明らかであり、本細胞系は、これまでに報告されている細胞系とは異なる。また、これらのフィンガープリントの結果は、本細胞系を配給した後にも、本細胞系について有用な情報を提供する。
【００６９】
【表７】
2009517001.tif 000008
６）核型分析
単離したヒトＥＳ細胞の核型分析を、コルセミドによる抑制及びＧ分染法の標準的な方法を使用して行った。手短にいうと、ヒトＥＳ細胞を、６０ｍｍの培養皿内で、６０％集密状態になるまで培養した。細胞を、臭化エチジウム（１２μｇ／ｍｌ）と共に、３７℃、５％ＣＯ２にて、４０分間インキュベートした後、コルセミド（１２０ｎｇ／ｍＬ）で４０分間処理した。次に、細胞を、あらかじめ温めた０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて解離させた。次いで、細胞を、遠心分離によって収集し、低張ＫＣＬ溶液（０．０７５Ｍ）中に１５分間再度懸濁させた後、カルノア固定液（氷酢酸：メタノール；３：１）中に固定した。分裂中期のスプレッドを、湿らせた顕微鏡用スライドガラス上に調製し、風乾後、９０℃にて、１時間焼いた後、ギムザ染色を行った。２０個の分裂中期を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４０顕微鏡を使用して、完全に核型分析し、画像を、Ｃｙｔｏｖｉｓｉｏｎデジタル画像システムを使用して撮影した。
【００７０】
７）テロメラーゼアッセイ
Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、米国、製のＴＲＡＰｅｚｅテロメラーゼ検出キット（カタログ番号：Ｓ７７００）を使用する、非放射性同位体的な、ゲルに基づく、標準的ＴＲＡＰ（テロメラーゼ反復配列増幅法）のプロトコール（Ｚｈａｎｇら、２０００年、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、１０巻１号：７１〜７頁；及びＲｕｂｉａｎｏら、２００３年、Ｍｅｍ．  Ｉｎｓｔ．  Ｏｓｗａｌｄｏ  Ｃｒｕｚ．、９８巻５号：６９３〜５頁）を使用して、テロメラーゼアッセイを行った。およそ、ヒトＥＳ細胞の５０〜７０個のコロニーをペレット化し、２００μｌの１×ＣＨＡＰＳ溶解緩衝液を使用して溶解させた。１×ＣＨＡＰＳ溶解緩衝液中の細胞の懸濁液を、氷中にて、３０分間インキュベートし、次いで、１２，０００ｇで、４℃にて、２０分間遠心分離した。上澄を、素早く凍結し、−８０℃にて保存した。全タンパク質を、ブラッドフォードアッセイを使用して推定した。テロメラーゼアッセイは、１〜６μｇの全抽出物を使用して行った。熱により不活性化した検体を、各アッセイで、陰性のコントロールとして用いた。テロメラーゼＰＣＲのために、ｄＮＴＰ、ＴＲＡＰ  Ｐｒｉｍｅｒミックス、ＴＳプライマー及びＴＡＱポリメラーゼを、キットの指示にしたがって添加することによって、マスターミックスを調製した。次に、細胞抽出物を添加し、全反応容量を、５０μｌに維持した。２段階ＰＣＲ反応（９４度にて３０秒間、及び５９度にて３０秒間）を、３３から３５サイクル行った。ＰＣＲ産物を、１２．５％非変性ポリアクリルアミド垂直ゲル上で、４００ボルトにて、キシレン−シアノール色素の前面が全移動路の３分の２に達するまで、電気泳動した。次いで、ゲルを、１：５０００に希釈したＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  Ｉ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号：Ｓ−７５６７）で染色し、ＵＶトランスイルミネーター下で可視化した後、ゲル記録システムを使用して写真撮影した。産生したテロメラーゼ産物（ＴＰＧ）の相対定量化を、Ｚｈａｎｇら、２００３年、の方法にしたがって行った。ＴＰＢは、式：ＴＰＧ＝｛［（ＴＰ−Ｂ）／ＴＩ］／［（Ｒ８−Ｂ）／ＲＩ］｝によって説明される。ただし、ＴＰは、試験抽出物中に産生したテロメラーゼ産物であり；Ｂは、ブランクの溶解緩衝液中に産生したテロメラーゼ産物であり；Ｒ８は、定量化標準物質、ＴＳＲ８コントロール鋳型、中に産生したテロメラーゼ産物であり；ＴＩは、試験抽出物中の内部コントロールであり；且つＲＩは、定量化標準物質、ＴＳＲ８コントロール鋳型、の内部コントロールである。図８は、ＲｅｌｉＣｅｌｌ（商標）ｈＥＳ１の３７回継代における高いテロメラーゼの活性を示しており、ＮＴＥＲＡ−２ｈＥＣ細胞を陽性のコントロールとして、ＭＥＦを陰性のコントロールとしている。
【００７１】
８）無菌性及び病原体の試験
広範な細菌及び真菌の試験を、Ｒｅｌｉｃｅｌｌ（商標）ｈＥＳ１細胞培養物上で行った。培養物を、日常的にモニターし、インキュベート第４８時間、第１４日及び第２１日において報告した。その上、菌体内毒素及びマイコプラズマの試験を、各培養物について、Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ａｓｓａｙを使用して行った。最後に、培養物を、ＨＩＶ−ｌ、ＨＩＶ−２、ヒトＴ細胞リンパ増殖性ウイルスＩ／ＩＩ、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、  ＥＢＶ、ＣＭＶ、Ｂ型肝炎ウイルス及びＣ型肝炎ウイルスを含む、ヒトの病原体の存在についてスクリーニングした。
【００７２】
９）奇形腫の形成
成体マウスを、奇形腫の形成の研究に使用した。未分化のヒトＥＳ細胞の懸濁液を、マウスに筋肉内注射した（５〜１０×１０６細胞／マウス）。注射後、マウスを、個別のフィルター付きトップのケージで飼育した。これらのケージを、特別の動物隔離飼育器内に収容して、心配される感染のいずれをも防止した。８〜１０週間後、マウスに、ケタミンを過量投与（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）して屠殺した後、へパリン食塩水（０．９％食塩水中に０．１へパリン）、その後、リン酸緩衝液中に調製した４％パラホルムアルデヒドを用いて、経心的に灌流した。腫瘍を、マウスから解体して取り出し、２０％スクロースを含有する４％パラホルムアルデヒド中で、一晩固定した。腫瘍を、クリオミクロトームを使用して切片（２０μｍ）化し、切片を、ゼラチンでコートしたスライド上に収集した。腫瘍切片を、ヘマトキシリン／エオシンで染色し、３種の胚葉である、外胚葉、中胚葉及び内胚葉に属する細胞を顕微鏡下で観察した。図７は、本実験の結果を示す。全ての動物実験は、機関の動物倫理委員会の指針にしたがって行われた。
【００７３】
１０）マウスＥＳ細胞から分化した肝細胞を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ肝毒性モデルの確立
ＬＩＦを有しない培地中でＥＢを形成させることによって、マウスＥＳ細胞を肝細胞へ分化させた。懸濁液中での４日後、１５〜２０個のＥＢを、１％マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）であらかじめコートした３５ｍｍの培養皿上に播種し、２０〜２５日間分化させた。増殖因子であるサイトカイン（例えば、骨形成タンパク質（ＢＭＰ２及びＢＭＰ４）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）及び塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ））及び副腎皮質ステロイド（例えば、デキサメタゾン）の濃度を、肝臓への分化のために最適化した。肝臓のマーカーの陽性の発現を、ＲＴ−ＰＣＲ及び免疫細胞化学によって調べることによって、得られた分化した細胞が、肝細胞であることを確認した。集密に達する前の段階（一般に、播種後４８時間）のＨｅｐＧ２、ヒトの肝細胞癌の細胞系、を、陽性のコントロールとして使用して、分化したＥＳ細胞に基づく肝毒性のモデルを最適化した。ＨｅｐＧ２細胞をＣＣｌ４（Ｓｉｇｍａ）に、一定期間（３０、９０、１２０、１５０、１８０及び２４０分間）、用量依存性の様式（０．１％、０．３％、０．６％及び１．０％）で暴露させた。これらの観察に基づいて、０．６％用量のＣＣｌ４及び１８０分間の暴露時間を、マウスＥＳ細胞から分化した（２０日）肝細胞を用いる実験のために選択した（図１３）。ＣＣｌ４を、５％ＦＢＳを含有するＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、米国）中に調製した。インキュベートの期間の終わりに、上澄を収集し、１０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。この上澄を使用して、ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴ、ＬＤＨ及びＡＬＰのレベルを測定した。細胞を、細胞スクレーパーを使用して取り出した後、細胞の懸濁液を、エッペンドルフチューブ内に収集した。この細胞懸濁液を、２０００ｒｐｍで４分間遠心分離した後、細胞ペレットを、２００μｌのＭ−ＰＥＲ溶解緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）中に溶解させ、タンパク質の測定に供した。
【００７４】
細胞懸濁液を、メーカーのプロトコールにしたがって、ＳＧＰＴ、ＳＧＯＴ、（ＡＬＰ）及びＬＤＨのレベルの測定のために使用した。ＳＧＰＴ及びＳＧＯＴについては、ＥＲＢＡキット（ｍａｎｕｌ．）を使用し、ＬＤＨ及びＡＬＰについては、ＨＵＭＡＮキット（ｍａｎｕｌ．）を使用した。検体を、Ｋｏｎｅｌａｂ−２０ｉ自動分析器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、フィンランド）を使用して分析した。レベルを、単位／リットルとして表した。
【００７５】
０．６％ＣＣｌ４は、ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴ、ＡＬＰ及びＬＤＨのレベルを、時間依存性に上昇させ、時間の経過に伴う肝細胞の損傷の増加を示している。これらの酵素の最大の放出は、第１８０分で見られた。Ｎ−アセチルシステインを用いた前処置（２４時間、２５μＭ）は、これらの酵素の放出の上昇を効果的にブロックした。このことから、Ｎ−アセチルシステインを用いた前処置は、ＣＣｌ４によって誘発される幹細胞の損傷を阻止することが示されている（図１３）。
【００７６】
（実施例４）
本実施例は、Ｒｅｌｉｃｅｌｌ（商標）ｈＥＳ１のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分化の可能性を実証する。
【００７７】
分化を開始させるために、ヒトＥＢを誘導して、コロニーを１００〜１５０個の細胞からなる小型から中型の大きさの小片に機械的に分離させることによって、細菌学的皿上で、ＬＩＦを有しない基本培地中で、フィーダー層なしで、６〜１４日間懸濁培養して、ＥＢを形成させた。別々の胚葉に属する異なる表現型への分化誘導に関するＥＢの時間経過を、ＲＴ−ＰＣＲによって証明されるように、ＥＢ内の系譜特異的マーカーの発現プロフィールに基づいて決定した。
【００７８】
神経外胚葉分化：ヒトＥＳ細胞系の神経細胞へ分化する可能性を決定するために、複数段階のプロトコールにしたがった。６日齢のＥＢを、血清を含有しないＩＴＳＦｎ培地中で７〜１０日間インキュベートすることによって、神経前駆体を選択した。次いで、細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含有し、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で補充したＮ２培地中で発展させた。分化のステップでは、ｂＦＧＦを取り除き、細胞をＧＤＮＦ（５ｎｇ／ｍｌ）で補充したＮ２培地の存在下で２〜３週間培養することになる。ＭＡＰ−２（１：２００、ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、神経細胞マーカー、の発現を、免疫蛍光法による解析によって評価して、神経細胞への分化を確認した。
【００７９】
中胚葉分化：ＥＢの産生後、８日齢のＥＢを、０．１％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ、米国）であらかじめコートした３５ｍｍの組織培養皿（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）上の、１５％ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸、１ｍＭグルタミン、０．１％ベータ−メルカプトエタノール及び１２．５ｎｇ／ｍｌヒト塩基性線維芽細胞増殖因子で補充した８０％ＤＭＥＭ培地中に播種した。分化培養の第１７〜１８日に出現する、心筋への分化を指し示す律動性の拍動を、培養物を位相差顕微鏡下で毎日観察することによって、４５日超の間、注意深くモニターした。ＥＢ内の無傷の収縮している領域を、実体顕微鏡下で、無菌のガラス製ピペットを使用して、機械的に解体した後、ゼラチンでコートした２ウェルのチャンバースライドガラス（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）上に播種し、さらなる特徴付けに供した。
【００８０】
内胚葉分化：膵臓への分化を誘発するために、Ｓｅｇｅｖら、２００４年、の古典的なプロトコールにしたがった。１０日齢のＥＢを、３５ｍｍのプラスチック製の組織培養プレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）上に播種し、ＤＭＥＭ  Ｆ／１２、インスリン（１０ｎｇ／ｌ）、トランスフェリン（６．７ｎｇ／ｌ）、セレン（５．５ｍｇ／ｌ）及び１ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全て、Ｇｉｂｃｏ製）を含有し、サプリメントの５μｇ／ｍｌフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）を有する培地Ｉ中で生育させた。１週間後、細胞を、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて解離させ、０．１％ゼラチンであらかじめコートした３５ｍｍのプラスチック製の組織培養皿（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）上で、２×１０５細胞／ｍｌの細胞濃度で、ＤＭＥＭ  Ｆ／１２、５００μｇ／ｍｌインスリン、１０，０００μｇ／ｍｌトランスフェリン、０．６３μｇ／ｍｌプロゲステロン、１．６１１μｇ／ｍｌプトラシン、並びにＮ２及びＢ２７のサプリメント（共に、Ｇｉｂｃｏ製）を有する０．５２μｇ／ｍｌセレン、並びに１ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する培地ＩＩ中に再度播種した。この段階で、膵島様のクラスターの出現がモニターされ、ＰＤＸ−１等の組織特異的マーカーを用いて免疫化学を使用して評価した。
【００８１】
幹細胞の分化を誘導するために、１０日齢のＥＢを、１％のマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ，マサチューセッツ州、米国）であらかじめコートした３５ｍｍのプラスチック製の組織培養プレート（Ｎｕｎｃ）上に播種し、ＤＭＥＭ（高グルコース）、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン（１ｍＭ）、非必須アミノ酸（１％）、β−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）２０ηｇ／ｍｌ、ＦＧＦ４（１０ηｇ／ｍｌ）、ヒトオンコスタチン（１０ηｇ／ｍｌ）、インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸（ＩＴＳ）（１×）、デキサメタゾン（１０−５ｍＭ）及びＥＧＦ（２０ηｇ／ｍｌ）（全ての増殖因子は、Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製である）を含有する培地中で、２５〜３０日間分化させた。分化させる期間中、培養物を、卵円形の細胞の出現についてモニターした。さらなる特徴付けのために、第２０日の分化細胞を含有する２ウェルのチャンバースライドを解析した。
【００８２】
細胞系の複数の表現型への分化の可能性を試験した。ヒトＥＳ細胞コロニーから形成したＥＢを、培養皿上に付着させた後に、神経外胚葉性、中胚葉性及び内胚葉性の運命へ誘導した。ＩＴＳＦｎ培地に添加すると、ＥＢは、増殖を開始し、１週間以内に、複数の神経突起様伸展を発生させた。これらの神経前駆体は、ポリ−１−オルニチン及びラミニンであらかじめコートした組織培養プレート上のＮ２培地中で培養すると、円形の細胞体を発生させ、この細胞体は、進行性に神経細胞の形態を帯び、双極性及び多極性の伸展を発生させ、これらは、結果的に回路網となった。ｂＦＧＦを除去し、分化培地を添加すると、これらの細胞は、典型的な神経細胞の外観を示し、それに続き、精巧になり、一次及び二次の分枝を示す過程が伴った（図１２．１）。間接免疫染色は、これらの細胞が神経細胞特異的タンパク質マーカーＭＡＰ−２に対して免疫反応性であることを示した（図１２．２）。細胞の寸法及び配向性が、心臓細胞の回路網の重要な決定要因であることから、ヒトＥＳ細胞から誘導した心臓のコロニーの構造的な特性を研究した。自発的に収縮している領域を、分化の第１５〜１８日の間のＥＢの増殖物において同定した（図１２．３）。さらに、免疫化学は、分化したＥＢにおいて心筋の収縮の調節に関与する心臓特異的タンパク質である心筋トロポニン−Ｉ（ｃＴｎＩ）（１：２００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、カリフォルニア州、米国）の存在を示した（図１２．４）。膵臓の前駆細胞の発展後、膵島様のクラスターが観察され、これは、ＰＤＸ−１マーカーを用いた免疫染色によって確認された（図１２．５及び１２．６）。分化第１５〜１８日後には、卵円形の細胞が見られ、これは、肝細胞の分化を指し示した。ＡＦＰ、初期の内胚葉特異的マーカーを、分化の第１５日後に検出した。さらに、ＣＫ１８を使用した免疫染色は、ケラチンの存在を確認し、これは、肝芽細胞には妥当なことである（図１２．７及び１２．８）。
【００８３】
本明細書に開示する全ての組成物及び方法は、本開示に照らせば、過度に実験せずとも、作製及び実行が可能である。本発明の組成物及び方法が、好ましい実施形態に関して記載されているが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載する、組成物、並びに／或いは方法及び方法のうちのステップ又は一連のステップに変更を加えることができることは、当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的又は生理学的に関連がある特定の薬剤を、本明細書に記載する薬剤に置き換えて、同一又は同様の結果を達成することができることは明らかであろう。当業者に明らかな、そのような類似の置換及び改変は全て、本発明の精神、範囲及び概念のうちにあるものとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、ヒト胚盤胞の、低倍率（１００×）及び高倍率（２００×）での顕微鏡写真である。この胚盤胞を使用して、Ｒｅｌｉｃｅｌｌ（商標）細胞系を樹立した。写真１．２は、第６日の胚盤胞を高倍率で示しており、明らかに目に見える透明帯、単層の栄養外胚葉及び発生が不十分なＩＣＭを伴う。胚の段階は、段階Ｃであった（Ｇａｒｄｎｅｒら、２０００年、Ｆｅｒｔｉｌ．  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ、７３巻：１１５５〜５８頁を参照）。
【図２】図２は、Ｒｅｌｉｃｅｌｌ（商標）ｈＥＳ１細胞系の培養及び増殖のために用いるマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を示す写真である。写真２．１は、播種してから４８時間後の８０〜９０％の集密状態のＭＥＦ細胞を示す。写真２．２は、形態学的解析のためのＭＥＦ上のｈＥＳＣコロニーを示し、生育したｈＥＳＣのコロニーの健常な生育を実証している。写真２．３及び２．４はそれぞれ、ｈＥＳＣのＭＥＦ上における、Ｏｃｔ−３／４抗体及びＳＳＥＡ−４抗体との陽性染色を示す。写真２．５は、ＭＥＦ細胞上で生育したｈＥＳＣ中の以下のＥＳ細胞マーカーの発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより実証している：ＧＡＰＤＨ、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、ＴＤＧＦ１、Ｓｏｘ−２、Ｔｈｙ１及びＦＧＦ４の遺伝子。
【図３】図３は、一連の位相差顕微鏡写真であり、ヒトＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地内のＭＥＦ層上に播種した後、日数の経過に伴うＲｅｌｉｃｅｌｌ（商標）ｈＥＳ１細胞の形態を示している。播種第１日後に、ＩＣＭが付着し、第１２日後まで、次第にＭＥＦ細胞上に広がった。第１２日において、ヒトＥＳ細胞のコロニーを単離し、継代して、細胞系を増殖させた。パネル１：播種後第１日；パネル２：播種後第４日；パネル３：播種後第５日；パネル４：播種後第６日；パネル５：播種後第８日；パネル６：播種後第１２日。
【図４】図４は、一連の位相差顕微鏡写真であり、１０回継代からはじめて３０回継代までの異なる継代における未分化のｈＥＳＣのコロニーの形態を示している。写真３．１は、健常に見えるＭＥＦ細胞上にある、１０回継代における緻密なｈＥＳＣのコロニーを示し、ＭＥＦ細胞は、ＥＳ細胞に栄養を提供するのみならず、ＥＳ細胞の未分化状態の維持もまた促進する。写真３．２は、１５回継代におけるｈＥＳＣのコロニーを示す。写真３．３は、２０回継代におけるｈＥＳＣを示す。写真３．４は、より高い倍率（２００×）で撮られており、３０回継代における、未分化のｈＥＳＣの明瞭な細胞の境界、細胞質に対する核の高い比、及び顕著な核小体を示している。ｈＥＳＣを、１０％ＦＢＳ及びヒトＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む培地中に維持した。
【図５】図５は、一連の８枚の顕微鏡写真であり、ＭＥＦ細胞上で生育させた細胞に関して、免疫細胞化学によって検出された異なるＥＳ細胞のマーカーの表現型の発現を示す。写真５．１は、Ｏｃｔ−３／４（＋）ｈＥＳＣを示し；写真５．２は、ＳＳＥＡ−３（＋）ｈＥＳＣを示し；写真５．３は、ＳＳＥＡ−４（＋）ｈＥＳＣを示し；写真５．４は、Ｔｒａ−１−６０（＋）ｈＥＳＣを示し；写真５．５は、Ｔｒａ−１−８１（＋）ｈＥＳＣを示し；写真５．６は、コネキシン−４３（＋）ｈＥＳＣを示し；写真５．７は、Ｅ−カドヘリン（＋）ｈＥＳＣを示し；且つ写真５．８は、４％パラホルムアルデヒド中に固定したｈＥＳＣのアルカリホスファターゼの（＋）免疫染色を示す。ＰＯＵ５Ｆ１プロモーターコード化転写因子であるＯｃｔ−３／４及びギャップ結合分子であるコネキシン−４３以外は、解析したマーカーは全て、炭水化物に富む細胞表面抗原である。免疫蛍光法による解析は、Ｒｅｌｉｃｅｌｌ（商標）ｈＥＳ１の増殖中、５回継代毎に行い、使用した抗体は全て、ＦＩＴＣで標識化されていた。
【図６】図６は、２２回継代におけるＲｅｌｉｃｅｌｌ（商標）ｈＥＳ１細胞系中の未分化遺伝子の遺伝子発現プロファイリングを示す写真であり、これによって、長期培養における細胞系の分化多能性を確立する。ＲＴ−ＰＣＲ解析を、Ｒｅｌｉｃｅｌｌ（商標）ｈＥＳ１細胞系の増殖中に、５回継代毎に行った。マーカーは、左から右へ、レーン１：１００ｂｐマーカー；レーン２：ＧＡＰＤＨ（８９２ｂｐ）；レーン３：Ｏｃｔ−４（２４７ｂｐ）；レーン４：Ｎａｎｏｇ（２６２ｂｐ）；レーン５：Ｒｅｘ１（３０６ｂｐ）；レーン６：Ｓｏｘ２（４４８ｂｐ）；レーン７：Ｔｈｙ１（２７２ｂｐ）；レーン８：ＦＧＦ４（３７４ｂｐ）；レーン９：ＡＢＣＧ２（６８４ｂｐ）；レーン１０：Ｄｐｐａ５（３５３ｂｐ）；レーン１１：ＵＴＦ１（２３０ｂｐ）；レーン１２：Ｃｒｉｐｔｏ１（２１７ｂｐ）；レーン１３：ＦｏｘＤ３（１６５ｂｐ）；レーン１４：ｈＴＥＲＴ（１８７ｂｐ）；レーン１５：コネキシン−４３（２９５ｂｐ）；レーン１６：コネキシン−４５（８１９ｂｐ）；及びレーン１７：１００ｂｐマーカーを含む。ｈＴＥＲＴ遺伝子の増強された発現は、ヒトＥＳ細胞系の高い自己再生能を指し示している。ＧＡＰＤＨは、ハウスキーピング遺伝子のコントロールとして使用する。未分化の遺伝子を増幅するために使用したプライマーの詳細を、表１に提供する。
【図７】図７は、ＲｅｌｉＣｅｌｌ（商標）ｈＥＳ１細胞をＳＣＩＤマウスに注射した後に形成した奇形腫の解析を示す。分化多能性のｈＥＳＣ株は、ＳＣＩＤマウスへの注射後、３種の胚性胚葉の全てから誘導される細胞に分化するはずである。パネルＡ：奇形腫の低倍率による画像；パネルＢ：内胚葉誘導の実証（腸管上皮）；パネルＣ及びＤ：外胚葉誘導の実証（神経組織）；並びにパネルＥ及びＦ：中胚葉誘導の実証（それぞれ、血液細胞及び骨）。
【図８】図８は、ＰＣＲに基づくＳＹＢＥＲ−Ｇｒｅｅｎ染色を使用して、ＲｅｌｉＣｅｌｌ（商標）ｈＥＳ１細胞系内の３７回継代における相当なテロメラーゼ活性を示す、１．５％アガロースゲルの写真である。各アッセイに、６μｇの全タンパク質を添加した。レーン１：ＮＴＥＲＡ−２；レーン２：ＮＴＥＲＡ−２（熱により不活性化した）；レーン３：ＭＥＦ；レーン４：ＭＥＦ（熱により不活性化した）；レーン５：ＲｅｌｉＣｅｌｌ（商標）ｈＥＳ１（ｐ３７）；レーン６：ＲｅｌｉＣｅｌｌ（商標）ｈＥＳ１（ｐ３７、熱により不活性化した）；レーン７：内部コントロール；レーン８：ＴＳＲ８コントロール鋳型（１．５μｌ、キットと共に得た）。
【図９】図９は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分化を誘導するのに適した培地（ｈＬＩＦなし）中に維持した胚様体の、懸濁培養の日数の経過に伴う４枚の写真を示す。写真８．１は、懸濁培養６日後のヒトＥＳ細胞の緩い凝集体／コロニーを示し；写真８．２は、第１０日における緻密な胚様体を示し；写真８．３は、第１４日における血島形成の開始を実証し；且つ写真８．４は、第２１日における血島の高密度の形成を示し、これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける血管新生の証拠である。
【図１０】図１０は、Ｒｅｌｉｃｅｌｌ（商標）ｈＥＳ１細胞系のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分化の可能性を、２ウェルのチャンバースライド内に固定した胚様体（第１４日）の免疫化学によって実証する顕微鏡写真である。写真１０．１は、ネスチンの（＋）免疫染色（外胚葉）を示し；写真１０．２及び１０．３はそれぞれ、平滑筋及びｂｒａｃｈｙｕｒｙの（＋）免疫染色（中胚葉）を示し；且つ写真１０．４及び１０．５は、ＡＦＰ及びＧＡＴＡ−４の（＋）免疫染色（内胚葉）を示し、これによって、ＲＴ−ＰＣＲの結果を確認している。研究に使用した抗体は全て、ＦＩＴＣが結合していた。写真は、Ｎｉｋｏｎ  Ｅ６００倒立顕微鏡を使用して得た。
【図１１】図１１は、一連の系譜特異的マーカーの示差的遺伝子発現を示し、これから、３種の胚葉から誘導された細胞が、Ｒｅｌｉｃｅｌｌ（商標）ヒトＥＳ１細胞系から産生した胚様体（３２回継代）中には存在することが指し示されている。それらには、（１）ケラチン８、ケラチン１５、ケラチン１８、ＮＦＨ及びＳｏｘ−１（外胚葉）；（２）Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＭｙｏＤ、Ｍｓｘ１、ＨＡＮＤ１及び心臓アクチン（中胚葉）；並びに（３）ＧＡＴＡ−４、ＡＦＰ、ＨＮＦ−３ｂ、ＨＮＦ−４ａ、アルブミン及びＰＤＸ１（内胚葉）が含まれる。写真から、胚様体形成の第１０日から第１４日に、上記のマーカーの高いｍＲＮＡのレベルが実証され、それによって、ヒトＥＳ細胞系の３種の系譜の全てへのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分化の可能性が指し示されている。ＨＥＦ細胞を、陰性のコントロールとして使用し、ＧＡＰＤＨを、ハウスキーピング遺伝子のコントロールとして使用した。
【図１２】図１２は、Ｒｅｌｉｃｅｌｌ（商標）ｈＥＳ１のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分化の可能性の評価を示す。以下は、未分化のヒトＥＳ細胞から胚様体形成を介して適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で分化した、異なる表現型の細胞の例の位相差顕微鏡写真である：パネルＡ：複数の過程を有する神経細胞；パネルＣ：心筋細胞；パネルＥ：膵島；及びパネルＧ：卵円形の肝細胞。その上、これらの分化した細胞の免疫染色を、特定の細胞に特異的なマーカーを用いて行った：パネルＢ：ＭＡＰ−２；パネルＤ：心筋トロポニン−Ｉ；パネルＦ：ＰＤＸ−１；及びパネルＨ：ＣＫ１８。
【図１３】図１３は、ＨｅｐＧ２、肝細胞癌の細胞系、の四塩化炭素（０．６％）に対する種々の時間間隔での暴露を示すグラフである。その上、以下の酵素のレベルを、生化学的方法によって測定した。パネルＡ：血清グルタミン酸オキザロ酢酸アミノ基転移酵素（ＳＧＯＴ）；パネルＢ：血清グルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素（ＳＧＰＴ）；パネルＣ：アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）；及びパネルＤ：乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）。
【図１４】図１４は、マウスＥＳ細胞由来肝細胞の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ肝毒性モデルとしての樹立を示す。肝細胞を、マウスＥＳ細胞から分化させ、四塩化炭素（０．６％）に、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、抗酸化剤（２５μＭ）の非存在下及び存在下で、１８０分間暴露させる。以下の酵素のレベルを、生化学的方法によって測定した：パネルＡ：ＳＧＯＴ；パネルＢ：ＳＧＴＰ；パネルＣ：ＡＬＰ；及びパネルＤ：ＬＤＨ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年1月27日(2009.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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