(57)【要約】  本発明は、特にヒト対象における治療的又は予防的処置のためのＥＰＯポリペプチド及びそれらの使用に関する。本発明はまた、前記ポリペプチドをコードする核酸、このような核酸を含むベクター及びそれらを含有する組換え細胞に関する。本発明はさらに、このようなポリペプチドを産生する方法、並びに任意のサンプル中のこれらポリペプチドを検出し、又は投薬する方法及びツールを開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において実質的にヘマトクリットレベルを増加させることなく、前記哺乳動物、特にヒトにおける組織保護活性を有する単離エリスロポエチン変異ポリペプチド。
【請求項２】
ａ）アミノ酸５６から１９３までの少なくとも１つの欠失により、配列番号３に示された配列とは異なるポリペプチドを含むポリペプチド又は；
ｂ）アミノ酸１から２７までの欠失及びアミノ酸５６から１９３までの少なくとも１つの欠失により、配列番号３に示された配列とは異なるポリペプチドを含むポリペプチド又は；
ｃ）配列番号１３に示された配列を含むポリペプチド又は；
ｄ）配列番号１３のアミノ酸２８から５５に示された配列を含むポリペプチド又は；
ｅ）
【化１】
2009517009.tif 000039
からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により、ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）とはまったく異なるポリペプチドを含むポリペプチドであって、前記変異の位置が、配列番号３のアミノ酸の位置に関して規定されるポリペプチド又は；
ｆ）
【化２】
2009517009.tif 000040
からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により、ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）とはまったく異なるポリペプチドを含むポリペプチドであって、前記変異の位置が、配列番号３のアミノ酸の位置に関して規定されるポリペプチド又は；
ｇ）８４位、９６位、１１３位、１１５位、１１６位又は１４１位に少なくとも１つの追加Ｎ−結合グリコシル化部位を含むことにより、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）又はｆ）とはまったく異なるポリペプチドを含むポリペプチドであって、前記位置が、配列番号３のアミノ酸の位置に関して規定されるポリペプチド
からなる群から選択される請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
ａ）アミノ酸５６から１９３までの少なくとも１つの欠失により、配列番号３に示された配列とは異なるポリペプチドからなるポリペプチド又は；
ｂ）アミノ酸１から２７までの欠失及びアミノ酸５６から１９３までの少なくとも１つの欠失により、配列番号３に示された配列とは異なるポリペプチドからなるポリペプチド又は；
ｃ）配列番号１３に示された配列からなるポリペプチド又は；
ｄ）配列番号１３のアミノ酸２８から５５に示された配列からなるポリペプチド又は；
ｅ）
【化３】
2009517009.tif 000041
からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により、ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）とはまったく異なるポリペプチドからなるポリペプチドであって、前記変異の位置が、配列番号３のアミノ酸の位置に関して規定されるポリペプチド又は；
ｆ）
【化４】
2009517009.tif 000042
からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により、ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）とはまったく異なるポリペプチドからなるポリペプチドであって、前記変異の位置が、配列番号３のアミノ酸の位置に関して規定されるポリペプチド又は；
ｇ）８４位、９６位、１１３位、１１５位、１１６位又は１４１位に少なくとも１つの追加のＮ−結合グリコシル化部位を含むことにより、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）又はｆ）とはまったく異なるポリペプチドからなるポリペプチドであって、前記位置が、配列番号３のアミノ酸の位置に関して規定されるポリペプチド又は；
ｈ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）又はｇ）のポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含むポリペプチド又は；
ｉ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）又はｇ）のポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドからなるポリペプチド
からなる群から選択される請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
ａ）配列番号３のアミノ酸５４（トレオニン）から８２（グルタミン酸）までの少なくとも１つの欠失により、配列番号３に示された配列とは異なるポリペプチドを含むポリペプチド又は；
ｂ）配列番号３のアミノ酸５４（トレオニン）から８２（グルタミン酸）までの少なくとも１つの欠失及びアミノ酸１から２７までの欠失により、配列番号３に示された配列とは異なるポリペプチドを含むポリペプチド又は；
ｃ）配列番号４に示された配列を含むポリペプチド又は；
ｄ）配列番号４のアミノ酸２８から１６４に示された配列を含むポリペプチド又は；
ｅ）
【化５】
2009517009.tif 000043
からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により、ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）とはまったく異なるポリペプチドを含むポリペプチドであって、前記変異の位置が、配列番号３のアミノ酸の位置に関して規定されるポリペプチド又は；
ｆ）
【化６】
2009517009.tif 000044
からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により、ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）とはまったく異なるポリペプチドを含むポリペプチドであって、前記変異の位置が、配列番号３のアミノ酸の位置に関して規定されるポリペプチド又は；
ｇ）８４位、９６位、１１３位、１１５位、１１６位又は１４１位に少なくとも１つの追加のＮ−結合グリコシル化部位を含むことにより、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）又はｆ）とはまったく異なるポリペプチドを含むポリペプチドであって、前記位置が、配列番号３のアミノ酸の位置に関して規定されるポリペプチド
からなる群から選択される請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
ａ）配列番号３のアミノ酸５４（トレオニン）から８２（グルタミン酸）までの少なくとも１つの欠失により、配列番号３に示された配列とは異なるポリペプチドを含むポリペプチド又は；
ｂ）配列番号３のアミノ酸５４（トレオニン）から８２（グルタミン酸）までの少なくとも１つの欠失及びアミノ酸１から２７までの欠失により、配列番号３に示された配列とは異なるポリペプチドを含むポリペプチド又は；
ｃ）配列番号４に示された配列からなるポリペプチド又は；
ｄ）配列番号４のアミノ酸２８から１６４に示された配列からなるポリペプチド又は；
ｅ）
【化７】
2009517009.tif 000045
からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により、ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）とは異なるポリペプチドからなるポリペプチドであって、前記変異の位置が、配列番号３のアミノ酸の位置に関して規定されるポリペプチド又は；
ｆ）
【化８】
2009517009.tif 000046
からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により、ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）とはまったく異なるポリペプチドからなるポリペプチドであって、前記変異の位置が、配列番号３のアミノ酸の位置に関して規定されるポリペプチド又は；
ｇ）８４位、９６位、１１３位、１１５位、１１６位又は１４１位に少なくとも１つの追加のＮ−結合グリコシル化部位を含むことにより、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、又はｅ）とは異なるポリペプチドからなるポリペプチドであって、前記位置が、配列番号３のアミノ酸の位置に関して規定されるポリペプチド又は；
ｈ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）又はｇ）のポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含むポリペプチド又は；
ｉ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）又はｇ）のポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドからなるポリペプチド
からなる群から選択される請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ａ）配列番号３のアミノ酸５４（トレオニン）から１４２（グルタミン）までの少なくとも１つの欠失により、配列番号３に示された配列とは異なるポリペプチドを含むポリペプチド又は；
ｂ）配列番号３のアミノ酸５４（トレオニン）から１４２（グルタミン）までの少なくとも１つの欠失及びアミノ酸１から２７までの欠失により、配列番号３に示された配列とは異なるポリペプチドを含むポリペプチド又は；
ｃ）配列番号６に示された配列を含むポリペプチド又は；
ｄ）配列番号６のアミノ酸２８から１０４に示された配列を含むポリペプチド又は；
ｅ）
【化９】
2009517009.tif 000047
からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により、ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）とはまったく異なるポリペプチドを含むポリペプチドであって、前記変異の位置が、配列番号３のアミノ酸の位置に関して規定されるポリペプチド又は；
ｆ）
【化１０】
2009517009.tif 000048
からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により、ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）とはまったく異なるポリペプチドを含むポリペプチドであって、前記変異の位置が、配列番号３のアミノ酸の位置に関して規定されるポリペプチド又は；
ｇ）８４位、９６位、１１３位、１１５位、１１６位又は１４１位に少なくとも１つの追加のＮ−結合グリコシル化部位を含むことにより、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）又はｆ）とはまったく異なるポリペプチドを含むポリペプチドであって、前記位置が、配列番号３のアミノ酸の位置に関して規定されるポリペプチド
からなる群から選択される請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７】
ａ）配列番号３のアミノ酸５４（トレオニン）から１４２（グルタミン）までの少なくとも１つの欠失により、配列番号３に示された配列とは異なるポリペプチドからなるポリペプチド又は；
ｂ）配列番号３のアミノ酸５４（トレオニン）から１４２（グルタミン）までの少なくとも１つの欠失及びアミノ酸１から２７までの欠失により、配列番号３に示された配列とは異なるポリペプチドからなるポリペプチド又は；
ｃ）配列番号６に示された配列からなるポリペプチド又は；
ｄ）配列番号６のアミノ酸２８から１０４に示された配列からなるポリペプチド又は；
ｅ）
【化１１】
2009517009.tif 000049
からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により、ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）とは異なるポリペプチドを含むポリペプチドであって、前記変異の位置が、配列番号３のアミノ酸の位置に関して規定されるポリペプチド又は；
ｆ）
【化１２】
2009517009.tif 000050
からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により、ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）とはまったく異なるポリペプチドからなるポリペプチドであって、前記変異の位置が、配列番号３のアミノ酸の位置に関して規定されるポリペプチド又は；
ｇ）８４位、９６位、１１３位、１１５位、１１６位又は１４１位に少なくとも１つの追加のＮ−結合グリコシル化部位を含むことにより、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）又はｆ）とは異なるポリペプチドを含むポリペプチドであって、前記位置が、配列番号３のアミノ酸の位置に関して規定されるポリペプチド；
ｈ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）又はｇ）のポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含むポリペプチド又は；
ｉ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）又はｇ）のポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドからなるポリペプチド
からなる群から選択される請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ａ）配列番号８に示された配列を含むポリペプチド又は；
ｂ）配列番号８と少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される単離ポリペプチド。
【請求項９】
ａ）配列番号９に示された配列を含むポリペプチド又は；
ｂ）配列番号９のアミノ酸２８から１５４に示された配列を含むポリペプチド又は；
ｃ）
【化１３】
2009517009.tif 000051
からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により、ａ）又はｂ）とはまったく異なるポリペプチドを含むポリペプチド又は；
ｄ）
【化１４】
2009517009.tif 000052
からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により、ａ）又はｂ）とはまったく異なるポリペプチドを含むポリペプチド又は；
ｅ）５７位、７８位、７９位、８０位、８２位、８４位、９６位、１１３位、１１５位、１１６位又は１４１位に少なくとも１つの追加のＮ結合グリコシル化部位を含むことにより、ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）とはまったく異なるポリペプチドを含むポリペプチド；
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）又はｅ）のポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含むポリペプチド
からなる群から選択される請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ａ）配列番号８からなるポリペプチド又は；
ｂ）配列番号８と少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドからなるポリペプチド
からなる群から選択される請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ａ）配列番号９からなるポリペプチド又は；
ｂ）配列番号９のアミノ酸２８から１５４に示された配列からなるポリペプチド又は；
ｃ）
【化１５】
2009517009.tif 000053
からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により、ａ）又はｂ）とは異なるポリペプチドからなるポリペプチド又は；
ｄ）
【化１６】
2009517009.tif 000054
からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により、ａ）又はｂ）とはまったく異なるポリペプチドからなるポリペプチド又は；
ｅ）５７位、７８位、７９位、８０位、８２位、８４位、９６位、１１３位、１１５位、１１６位又は１４１位に少なくとも１つの追加のＮ−結合グリコシル化部位を含むことにより、ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）とは異なるポリペプチドからなるポリペプチド；
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）又はｅ）のポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含むポリペプチド又は；
ｇ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）又はｅ）のポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドからなるポリペプチド
からなる群から選択される請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
追加のアミノ酸ドメインに作動可能に結合した請求項１から１１までのいずれか一項に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、ＧＳＴ配列、Ｈｉｓタグ配列、多量体化ドメイン、免疫グロブリン分子の定常領域又はヒト柔毛膜性生殖腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）などのヘテロ二量体タンパク質ホルモンに作動可能に結合した請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項１から１３までのいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離核酸分子。
【請求項１５】
ｃＤＮＡ分子である請求項１４に記載の単離核酸分子。
【請求項１６】
【化１７】
2009517009.tif 000055
又はそれらの相補鎖若しくは縮重配列、或いは
【化１８】
2009517009.tif 000056
のポリペプチドをコードする核酸又は相補鎖からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる請求項１４又は１５に記載の単離核酸分子。
【請求項１７】
請求項１４から１６までのいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１８】
請求項１４から１６までのいずれか一項に記載の核酸分子又は請求項１７に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項１９】
原核細胞又は真核細胞である請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１から１３までのいずれか一項に記載のポリペプチドを産生する方法であって、請求項１８又は１９に記載の組換え宿主細胞を核酸分子の発現を可能にする条件下で培養すること、及び産生されたポリペプチドを回収することを含む方法。
【請求項２１】
活性な結合体又は複合体の形態である請求項１から１３までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
ペグ化された請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１から１３までのいずれか一項に記載のポリペプチドに選択的に結合する抗体、又はその断片若しくは誘導体。
【請求項２４】
モノクローナル抗体、又はその断片若しくは誘導体である請求項２３に記載の抗体。
【請求項２５】
ヒト若しくはヒト化抗体、又はその断片若しくは誘導体である請求項２３又は２４に記載の抗体。
【請求項２６】
非相同部分に結合した請求項２３から２５までのいずれか一項に記載の抗体を含む免疫結合体。
【請求項２７】
薬剤として使用するための、請求項１から１３まで又は請求項２１若しくは２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
請求項１から１３まで又は請求項２１若しくは２２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１４から１６までのいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１７に記載のベクター、又は請求項１８又は１９に記載の細胞、及び薬学的に許容できる担体、賦形剤、又は安定化剤を含む医薬組成物。
【請求項２９】
患者の障害症状、ＥＰＯ発現又は活性の調節不全を含む障害を治療、予防又は改善する方法であって、請求項２８に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む方法。
【請求項３０】
前記障害が、貧血、慢性腎不全患者の高血圧、小児透析患者、ヘマトクリット濃度不足に関連する疾患又は病態、化学療法治療に関係した障害、癌、循環器病、一次的神経系症状又は精神医学的症状を有する中枢神経系（ＣＮＳ）疾患又は末梢神経系疾患からなる群から選択される患者の障害症状を治療、予防又は改善する方法であって、請求項１から１３まで又は請求項２１若しくは２２のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項２８に記載の医薬組成物の治療有効量を患者に投与することを含む方法。
【請求項３１】
患者の障害、即ち貧血、慢性腎不全患者の高血圧、小児透析患者、ヘマトクリット濃度不足に関連する疾患又は病態、化学療法治療に関係した障害、癌、循環器病、一次的神経系症状又は精神医学的症状を有する中枢神経系（ＣＮＳ）疾患又は末梢神経系疾患からなる群から選択される障害を治療するための薬剤の製造における、請求項１から１３まで又は請求項２１若しくは２２のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項２８に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３２】
前記障害が、貧血、癌、アルツハイマー病、パーキンソン病、リー病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、虚血性再灌流傷害、心筋梗塞からなる群から選択される請求項３０又は３１に記載の方法又は使用。
【請求項３３】
前記障害が、慢性腎不全（ＣＲＦ）に関連する貧血、ジドブジン治療ＨＩＶ感染患者の貧血、化学療法又は放射線療法に対する癌患者の貧血、非骨髄性癌の進行に関連する貧血、ウィルス性感染（ＨＩＶなど）に関連する貧血及び慢性疾患の貧血からなる群から選択される貧血であるか、又は腎臓、前立腺、卵巣又は乳房の腺癌、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、中枢神経系に影響を及ぼす腫瘍からなる群から選択される癌である請求項３２に記載の方法又は使用。
【請求項３４】
薬剤として使用するための、請求項２３から２５までのいずれか一項に記載の抗体、又はその断片若しくは誘導体。
【請求項３５】
請求項２３から２５までのいずれか一項に記載の抗体、又はその断片若しくは誘導体、及び薬学的に許容できる担体、賦形剤、又は安定化剤を含む医薬組成物。
【請求項３６】
対象における癌の症状を治療、予防又は改善する方法であって、請求項２３から２５までのいずれか一項に記載の抗体、又はその断片若しくは誘導体の治療有効量を患者に投与することを含む方法。
【請求項３７】
癌を治療するための薬剤の製造における、請求項２３から２５までのいずれか一項に記載の抗体、又はその断片若しくは誘導体の使用。
【請求項３８】
請求項１４から１６までのいずれか一項に記載の核酸又はその相補鎖に選択的にハイブリダイズする核酸プローブ。
【請求項３９】
請求項１から１３までのいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも１つの特有の断片を増幅させるために使用できる核酸プライマー。
【請求項４０】
神経圧潰後、少なくとも約０．０２ｍｓの複合性筋活動電位（ＣＭＡＰ）潜伏時間の減少を誘導する請求項１から１３まで又は請求項２１若しくは２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の産生を、好ましくは、少なくとも約５％刺激する請求項１から１３まで、又は請求項２１若しくは２２、又は請求項４０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
野生型ＥＰＯの血液栄養活性の５０％未満を保持する請求項１から１３まで又は請求項２１若しくは２２、又は請求項４０若しくは４１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
ベースラインのヘマトクリット濃度と比較して、ヘマトクリット濃度を約１０％未満増加させる請求項１から１３まで、又は請求項２１若しくは２２、又は請求項４０から４２までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にヒト対象における治療的又は予防的処置のための新規なＥＰＯ（エリスロポエチン）ポリペプチド及びそれらの使用に関する。本発明はまた、前記ポリペプチドをコードする核酸、このような核酸を含むベクター及びそれらを含有する組換え細胞、並びに対応する医薬組成物に関する。本発明はさらに、このようなポリペプチドを産生する方法、並びに任意のサンプル中のこれらポリペプチドを検出し、又は投薬する方法及びツールに関する。
【背景技術】
【０００２】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、腎臓で産生される造血成長ホルモンであり、赤血球細胞（赤血球）の産生を刺激するのに関与している（Ｃａｒｎｏｔ，Ｐ及びＤｅｆｌａｎｄｒｅ，Ｃ（１９０６）Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１４３：４３２頁；Ｅｒｓｌｅｖ，ＡＪ（１９５３）Ｂｌｏｏｄ  ８：３４９頁；Ｒｅｉｓｓｍａｎｎ，ＫＲ（１９５０）Ｂｌｏｏｄ  ５：３７２頁；Ｊａｃｏｂｓｏｎ，ＬＯ、Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ，Ｅ、Ｆｒｅｉｄ，Ｗ及びＰｌｚａｋ，ＬＦ（１９５７）Ｎａｔｕｒｅ  １７９：６３３１〜４頁）。ＥＰＯは、骨髄中の拘束された赤血球前駆体の分裂及び分化を刺激し、赤血球前駆体上の受容体に結合することによりその生物活性を発揮する（Ｋｒａｎｔｚ，ＢＳ（１９９１）Ｂｌｏｏｄ  ７７：４１９頁）。ＥＰＯは、細胞内リン酸化カスケードを作動させる２つの細胞表面エリスロポエチン受容体（ＥＰＯＲ）を結合させ、配向させることによって細胞を活性化する（Ｄａｍｅｎ  ＪＥ、Ｋｒｙｓｔａｌ  Ｇ．（１９９６）Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２４（１３）：１４５５〜９頁）。
【０００３】
ヒトエリスロポエチンは、およそ３４，０００ダルトン（３４ｋＤａ）分子量の酸性糖タンパク質である。天然のヒトＥＰＯは、３つの形態：アルファ、ベータ及びアシアロで生じ得る。アルファ及びベータ形態は、炭水化物成分がわずかに異なるが、同じ効力、生物活性及び分子量を有する。アシアロ形態は、末端炭水化物（シアル酸）が除去されたアルファ又はベータ形態である。
【０００４】
身体が健康状態である場合、ＥＰＯは、血漿中極めて低濃度で通常存在する。この正常な低濃度は、通常、細胞老化により失われる赤血球細胞の一定の低濃度補充を刺激するためには十分である。循環系中のＥＰＯ量は、循環系中の血液細胞による酸素輸送が減少する場合の低酸素状態下で増加する。低酸素状態は、出血により血液の大量喪失、過剰の放射線曝露による赤血球細胞の破壊、高高度又は長期意識喪失による酸素摂取の減少、又は種々の形態の貧血により引き起こし得る。低酸素ストレスを受ける組織に応答して、エリスロポエチンは、骨髄中の始原前駆細胞の前赤芽球への変換を刺激することにより赤血球細胞の産生を増加させるが、前赤芽球は、その後成熟し、ヘモグロビンを合成し、赤血球細胞として循環系に放出される。循環系中の赤血球細胞数が、正常な組織酸素必要量よりも大きな場合、循環系中のＥＰＯは減少する。
【０００５】
ＥＰＯはまた、神経保護性があり（Ｓｉｒｅｎ  ＡＬら、（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００１年、９８（７）：４０４４〜９頁））、心保護性（Ｐａｒｓａ  ＣＪら、（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００３年、１１２：（７）：９９９〜１００７頁））があることが報告されている。
【０００６】
組換えヒトＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）は、慢性腎不全に関連する貧血患者、ジドブジンを用いる治療によるＡＩＤＳ貧血患者、化学療法剤により治療を受けた患者の非骨髄性悪性疾患、外科手術中患者、及び自己献血を治療するために現在使用されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＥＰＯの生物活性を考慮すると、生物活性ＥＰＯ変異体を得ることは、極めて価値のあることになるであろう。理想的に言えば、このような変異体としては、ＥＰＯ受容体に結合し、このタンパク質の生物活性を開始し、阻害し、活性化し、或いは調節するアゴニスト、リバースアゴニスト、部分アゴニスト、混合アゴニスト／アンタゴニスト及び完全アンタゴニストなどのリガンドが挙げられると考えられる。ヒトＥＰＯの新規なアゴニストを得ることが、特に興味深いと考えられる。
【０００８】
また、哺乳動物において実質的にヘマトクリットレベルを増加させることなく、前記哺乳動物、特にヒトにおける組織保護活性（特に神経栄養活性）を有する新規な生物活性ＥＰＯ変異体を得ることが特に興味深いと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、特にヒト対象における治療的又は予防的処置のための新規なＥＰＯポリペプチド及びそれらの使用に関する。本発明はさらに、このようなポリペプチドを産生する方法、並びにサンプル中のこれらポリペプチドを検出し、又は投薬する方法及びツールに関する。本発明はまた、前記ポリペプチドをコードする核酸、このような核酸を含むベクター、特に発現ベクター、及びそれらを含有する組換え細胞、並びに対応する医薬組成物に関する。さらに、本発明の新規なＥＰＯポリペプチドに特異的な抗体が含まれる。
【００１０】
本発明は、部分的には、特定の構造的及び生物学的特性を有するＥＰＯの新規な転写変異体の同定、単離及び特徴付けから生じる。これらの転写変異体及びそれらの誘導体により、価値ある医薬品を提示する。
【００１１】
本発明はまた、部分的には実質的にヘマトクリットレベルを増加させることなく、組織保護活性を有するＥＰＯの新規な転写変異体及びより短い変種の特徴付けから生じる。ＥＰＯのこれらのより短い変種及び転写変異体並びにそれらの誘導体により、価値ある医薬品を提示する。本発明はまた、部分的には組織保護活性（特に神経栄養活性）を有するが、血液栄養活性を欠くＥＰＯのドメインの同定から生じる。
【００１２】
したがって本発明の目的は、哺乳動物において実質的にヘマトクリットレベルを増加させることなく、前記哺乳動物、特にヒトにおける組織保護活性を有する単離エリスロポエチン変異ポリペプチドにある。
【００１３】
本発明の別の目的は、単離エリスロポエチン変異ポリペプチドにあり、前記変異ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸５６（システイン）から１９３（アルギニン）までの少なくとも１つの欠失により、配列番号３に示された配列とは異なるポリペプチド、又は前記ポリペプチドの変異体又は類似体からなる。特定の実施形態において、本発明は、単離エリスロポエチン変異ポリペプチドにあり、前記変異ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸５６（システイン）から１９３（アルギニン）までの欠失により、配列番号３に示された配列とは異なるポリペプチド、又は前記ポリペプチドの変異体又は類似体からなる。配列番号３のアミノ酸５６から１９３までを欠くポリペプチドは、配列番号１３（以後ＥＰＯｖと命名される）に示される。好ましい実施形態において、これらのペプチドは、Ｎ末端シグナルペプチドを欠く成熟ペプチドである。
【００１４】
本発明の別の目的は、配列番号３のアミノ酸５４（トレオニン）から８２（グルタミン酸）までの少なくとも１つの欠失により、配列番号３に示された配列とは異なるＥＰＯポリペプチド、又は前記ポリペプチドの変異体又は類似体を含むか、又はそれからなるポリペプチドにある。特定の実施形態において、本発明は、配列番号３のアミノ酸５４（トレオニン）から８２（グルタミン酸）までの欠失により、配列番号３に示された配列とは異なるＥＰＯポリペプチドを含むか、又はそれからなる単離ポリペプチドにある。配列番号３のアミノ酸５４から８２までを欠くポリペプチドは、配列番号４（以後ＥＰＯｖ１と命名される）に示され、ヒト遺伝子ＥＰＯのエキソン１、２、４及び５によりコードされるＥＰＯの新規な転写変異体である（したがって、この転写変異体の転写物は、内部エキソン３を欠く）。好ましい実施形態において、これらのペプチドは、Ｎ末端シグナルペプチドを欠く成熟ペプチドである。
【００１５】
本発明の別の目的は、配列番号３のアミノ酸５４（トレオニン）から１４２（グルタミン）までの少なくとも１つの欠失により、配列番号３に示された配列とは異なるＥＰＯポリペプチド、又は前記ポリペプチドの変異体又は類似体を含むか、又はそれからなる単離ポリペプチドにある。特定の実施形態において、本発明は、配列番号３のアミノ酸５４（トレオニン）から１４２（グルタミン）までの欠失により、配列番号３に示された配列とは異なるＥＰＯポリペプチドを含むか、又はそれからなる単離ポリペプチドにある。配列番号３のアミノ酸５４から１４２までを欠くポリペプチドは、配列番号６（以後ＥＰＯｖ２と命名される）に示され、ヒト遺伝子ＥＰＯのエキソン１、２及び５によりコードされるＥＰＯの新規な転写変異体である（したがって、この転写変異体の転写物は、内部エキソン３及び４を欠く）。好ましい実施形態において、これらのペプチドは、Ｎ末端シグナルペプチドを欠く成熟ペプチドである。
【００１６】
本発明の別の目的は、配列番号８に示された配列を含むか、又はそれからなる単離ポリペプチド、又は配列番号８に示されたポリペプチドの変異体にある。配列番号８に示された配列を有するポリペプチドは、初めて本明細書に開示されるＥＰＯの新規な転写変異体のＣ末端部分に相当し、エキソン４Ａの３’末端によりコードされる。前記エキソン４Ａは、野生型ＥＰＯをコードするエキソン４と比較して３’末端がより長い（図３及び６を参照）。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、配列番号９に示された配列を含むか、又はそれからなる単離ポリペプチド、又は前記ポリペプチドの変異体にある。前記配列番号９のポリペプチド（以後ＥＰＯｖ３と命名される）は、ＥＰＯの新規な転写変異体であり、ヒト遺伝子ＥＰＯのエキソン１、２、３及び４Ａによりコードされる。好ましい実施形態において、これらのペプチドは、Ｎ末端シグナルペプチドを欠く成熟ペプチドである。
【００１８】
本発明の別の目的は、さらなるアミノ酸ドメインに作動可能に結合した上記に定義されたＥＰＯポリペプチド又は変異体若しくは類似体を含む融合タンパク質にある。
【００１９】
本発明の別の目的は、上記のＥＰＯポリペプチド又は変異体或いは類似体若しくは融合タンパク質をコードする核酸、並びに任意のクローニング又はこのような核酸を含む発現ベクターにある。
【００２０】
本発明はまた、上記に定義されたベクター又は核酸を含む組換え宿主細胞、並びにこのような組換え細胞を用いる上記のＥＰＯポリペプチド又は変異体若しくは類似体を産生する方法に関する。
【００２１】
本発明の別の目的は、活性な結合体又は複合体の形態である上記に定義されたポリペプチドにある。
【００２２】
本発明のさらなる目的はまた、上記に定義されたポリペプチドに選択的に結合する抗体、このような抗体の断片又は誘導体に関する。
【００２３】
本発明はまた、非相同部分に結合した上記に定義された抗体を含む免疫結合体に関する。
【００２４】
本発明のさらなる目的はまた、上記に定義されたポリペプチド、核酸、ベクター又は組換え細胞、及び薬学的に許容できる担体、賦形剤、又は安定化剤を含む医薬組成物にある。
【００２５】
本発明はさらに、患者の障害症状を治療、予防又は改善する方法に関するものであり、その障害は、ＥＰＯ発現又は活性の調節不全を含み、該方法は、上記に定義された医薬組成物を患者に投与することを含む。
【００２６】
本発明はまた、患者の障害症状を治療、予防又は改善する方法に関するものであり、その障害は、赤血球細胞の産生の不十分又は欠損を特徴とする血液障害、貧血、慢性腎不全患者の高血圧、外科手術患者、小児透析患者、ヘマトクリット濃度不足に関連する疾患又は病態、ＡＩＤＳ、化学療法治療に関係した障害、癌及び腫瘍、感染症、性病、免疫関連疾患及び／又は自己免疫疾患並びに障害、発作などの心血管疾患、低血圧、心拍停止、虚血特に虚血−再灌流傷害、急性心筋梗塞などの心筋梗塞、慢性心不全、アンギナ、心肥大、心肺疾患、心肺バイパス、呼吸器疾患、腎臓、泌尿器及び生殖器疾患、内分泌及び代謝異常、胃腸疾患、一次的神経系症状又は精神医学的症状を有する中枢神経系（ＣＮＳ）疾患又は末梢神経系疾患、認知機能の加齢関連喪失、脳性小児麻痺、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、リー病、認知症、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、アルコール依存症、気分障害、不安障害、注意欠損障害、活動亢進、自閉症、統合失調症、うつ病、脳又は脊髄外傷若しくは虚血、クロイツフェルト−ヤコブ病、眼病、発作障害、多発性硬化症、炎症、放射線損傷、黄斑変性症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、緑内障、網膜虚血、及び網膜外傷からなる群から選択され、該方法は、上記に定義されたポリペプチド又は医薬組成物の治療有効量を患者に投与することを含む。
【００２７】
本発明はさらに、患者の障害の治療のための薬剤の製造における、上記に定義されたポリペプチドの使用又は上記に定義された医薬組成物の使用にあり、その障害は、赤血球細胞の産生の不十分又は欠損を特徴とする血液障害、貧血、慢性腎不全患者の高血圧、外科手術患者、小児透析患者、ヘマトクリット濃度不足に関連する疾患又は病態、ＡＩＤＳ、化学療法治療に関係した障害、癌及び腫瘍、感染症、性病、免疫関連疾患及び／又は自己免疫疾患並びに障害、発作などの心血管疾患、低血圧、心拍停止、虚血特に虚血−再灌流傷害、急性心筋梗塞などの心筋梗塞、慢性心不全、アンギナ、心肥大、心肺疾患、心肺バイパス、呼吸器疾患、腎臓、泌尿器及び生殖器疾患、内分泌及び代謝異常、胃腸疾患、一次的神経系症状又は精神医学的症状を有する中枢神経系（ＣＮＳ）疾患又は末梢神経系疾患、認知機能の加齢関連喪失、脳性小児麻痺、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、リー病、認知症、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、アルコール依存症、気分障害、不安障害、注意欠損障害、活動亢進、自閉症、統合失調症、うつ病、脳又は脊髄外傷若しくは虚血、クロイツフェルト−ヤコブ病、眼病、発作障害、多発性硬化症、炎症、放射線損傷、黄斑変性症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、緑内障、網膜虚血、及び網膜外傷からなる群から選択される。
【００２８】
本発明のさらなる目的はまた、本明細書の上記のとおり、抗体、又はその断片若しくは誘導体、及び薬学的に許容できる担体、賦形剤、又は安定化剤を含む医薬組成物にある。
【００２９】
本発明はまた、対象の癌の症状を治療、予防又は改善する方法に関するものであり、該方法は、本明細書の上記のとおり、抗体、又はその断片若しくは誘導体の有効量を患者に投与することを含む。本発明はまた、癌を治療するための薬剤の製造における本明細書の上記のとおり、抗体、又はその断片若しくは誘導体の使用にある。
【００３０】
本発明の他の態様は、上記に定義された核酸に特異的なプライマー及びプローブ、並びにサンプル中のこのような核酸の存在を検出又は診断するためのそれらの使用を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、部分的には、特定の構造的及び生物学的特性を有するＥＰＯの新規な転写変異体の同定、単離及び特徴付けから生じる。これらの転写変異体及びそれらの誘導体により、価値ある医薬品を提示する。本発明はまた、部分的には組織保護活性（特に神経栄養活性）を有するＥＰＯのドメインの同定、及び組織保護活性（特に神経栄養活性）を有するが、血液栄養活性を欠くＥＰＯ変異体の同定から生じる。
【００３２】
ヒト参照野生型ＥＰＯ遺伝子領域を提示する４０９９のヌクレオチドのゲノム配列は、図１に示される（配列番号１）。該ＥＰＯ遺伝子は、ヌクレオチド配列の配列番号１上の位置が以下のとおりである５つのエキソンを含有するものとして記載されている：
エキソン１：ヌクレオチド６０１からヌクレオチド７９４まで（７８２位での開始コドンを含む）。
エキソン２：ヌクレオチド１３５９からヌクレオチド１５０４まで。
エキソン３：ヌクレオチド１７６３からヌクレオチド１８４９まで。
エキソン４：ヌクレオチド２４６５からヌクレオチド２６４４まで。
エキソン５：ヌクレオチド２７７９からヌクレオチド３４９９まで（２７６３位での終止コドンを含む）。
【００３３】
対応する転写物を図２に示す（ポリＡ尾部を除く）。開始及び終止コドンは、それぞれ１８２位及び７６１位に下線が引かれている。この転写物は、図３に示されるように（配列番号３）、１９３のアミノ酸の未成熟タンパク質をコードする（以後、ＥＰＯｗｔと命名される）。この未成熟タンパク質を処理し、最初の２７のアミノ酸を含むＮ末端シグナルペプチドを開裂する。生じたタンパク質は１６６のアミノ酸長であり、以後ＥＰＯｗｔｍ（配列番号３のアミノ酸２８から１９３まで）と命名される。さらに、カルボキシル末端残基は、細胞により発現されるタンパク質が１６５のアミノ酸長のタンパク質（配列番号３のアミノ酸２８から１９２まで）であるように除去されることが記載されている。
【００３４】
エリスロポエチンは、長鎖クラスのもの、例えば、ｈＧＨ及び顆粒球コロニー刺激因子に類似したヘリックス間角を有するアップ−アップ−ダウン−ダウンの４ヘリックスバンドルトポロジーを有する（Ｓｙｅｄ  ＲＳら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９５（６７０１）：５１１〜６頁（１９９８）を参照）。しかしながら、それはまた、短鎖クラス、例えば、マクロファージのコロニー刺激因子、幹細胞因子、インターロイキン−４及びインターロイキン−５に典型的な２つの小型逆平行β鎖を含有する。一対の逆平行長ヘリックス、αＡ（ＥＰＯｗｔｍの残基８〜２６）及びαＤ（ＥＰＯｗｔｍの残基１３８〜１６１）は、ジスルフィド架橋、Ｃｙｓ７からＣｙｓ１６１により共に保持される。他の対、αＢ（ＥＰＯｗｔｍの残基５５〜８３）及びαＣ（ＥＰＯｗｔｍの残基９０〜１１２）は、短いループにより結合しる。αＤヘリックスは、Ｇｌｙ１５１における小さな屈曲のためわずかに不規則である。長いＡＢ及びＣＤ交差ループからのアミノ酸の短いセグメントは、逆平行βシート：β１（ＥＰＯｗｔｍの残基３９〜４１）及びβ２（ＥＰＯｗｔｍの残基１３３〜１３５）を形成するために、互いに相互作用する。Ｄ−ヘリックスの内面上のＰｈｅ１３８、Ｐｈｅ１４２、Ｔｙｒ１４５、Ｐｈｅ１４８、Ｌｅｕ１５３及びＴｙｒ１５６などのいくつかの芳香族及び疎水性残基は、エリスロポエチンの疎水性コアを形成するために、Ａ、Ｂ及びＣヘリックスから非極性側鎖に対して詰め込まれる。第２のジスルフィド結合、Ｃｙｓ２９からＣｙｓ３３は、αＡヘリックスの末端とＡＢループの部分とが結合する。エリスロポエチンは、２つのさらなる短いヘリックス、αＢに直交したαＢ’ヘリックス（ＥＰＯｗｔｍの残基４７〜５２）及びＧｌｙ１１３に始まって９０°傾斜を有するαＣに次いでミニヘリックスαＣ’（ＥＰＯｗｔｍの残基１１４〜１２１）を有する。
【００３５】
哺乳動物細胞に発現されるヒト尿由来のＥＰＯ（Ｍｉｙａｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２、５５５８頁（１９７７））及び組換えヒトＥＰＯの双方は、糖タンパク質の全重量のうちの約４０％を一緒に含む３本のＮ結合及び１本のＯ−結合オリゴ糖鎖を含有する。Ｎ−結合グリコシル化は、ＥＰＯｗｔｍの２４位、３８位及び８３位に配置されるアスパラギン残基に生じるが、一方、Ｏ−結合グリコシル化は、１２６位に配置されるセリン残基に生じる（Ｌａｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１、３１１６頁（１９８６）；Ｂｒｏｕｄｙら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６５、３２９頁（１９８８））。オリゴ糖鎖は、一本鎖当たり４つまでのシアル酸を典型的に有するＮ−結合鎖及び２つまでのシアル酸を有するＯ−結合鎖を持つ末端シアル酸残基により修飾されることが示されている。したがって、ＥＰＯポリペプチドは、全部で１４までのシアル酸を収容できる。ＥＰＯ炭水化物鎖の変化により、生物活性に影響を及ぼし得ることが、種々の研究において示されている。例えば、エリスロポエチンのシアリル化は、肝結合タンパク質により、その結合、及び引き続くクリアランスを防止することから、グリコシル化エリスロポエチンからすべてのシアル酸残基の酵素的除去により、インビトロ活性ではなくてインビボ活性の喪失を生じることが示されている。
【００３６】
ところで本出願者は、ヒトＥＰＯの新規な転写変異体を同定している。これら転写変異体及びそれらの誘導体は、価値ある医薬品を提示する。
【００３７】
１．本発明のＥＰＯポリペプチド及び変異体：
本発明の発明者は、組織保護活性（特に神経栄養活性）を有するＥＰＯのドメイン、及び組織保護活性（特に神経栄養活性）を有するが、血液栄養活性を欠くＥＰＯ変異体を同定している。ＥＰＯのこれら短い変種及び同定されたＥＰＯ変異体は、価値ある医薬品を提示する。
【００３８】
１．１  ＥＰＯ短ポリペプチド及びそれらの変異体：
第１の態様において、本発明は、単離エリスロポエチンの変異ポリペプチドにあり、前記変異ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸５６（システイン）から１９３（アルギニン）までのうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、さらにより好ましくは少なくとも４つ、さらにより好ましくは少なくとも５つ、さらにより好ましくは少なくとも６つ、さらにより好ましくは少なくとも７つ、さらにより好ましくは少なくとも８つ、さらにより好ましくは少なくとも９つ、さらにより好ましくは少なくとも１０、さらにより好ましくは少なくとも１１、さらにより好ましくは少なくとも１２、さらにより好ましくは少なくとも１３、さらにより好ましくは少なくとも１４、さらにより好ましくは少なくとも１５、さらにより好ましくは少なくとも１６、さらにより好ましくは少なくとも１７、さらにより好ましくは少なくとも１８、さらにより好ましくは少なくとも１９、さらにより好ましくは少なくとも２０、さらにより好ましくは少なくとも２１、さらにより好ましくは少なくとも２２、さらにより好ましくは少なくとも２３、さらにより好ましくは少なくとも２４、さらにより好ましくは少なくとも２５、さらにより好ましくは少なくとも２６、さらにより好ましくは少なくとも２７、さらにより好ましくは少なくとも２８、さらにより好ましくは少なくとも２９、さらにより好ましくは少なくとも３０、さらにより好ましくは少なくとも３１、さらにより好ましくは少なくとも３２、さらにより好ましくは少なくとも３３、さらにより好ましくは少なくとも３４、さらにより好ましくは少なくとも３５、さらにより好ましくは少なくとも３６、さらにより好ましくは少なくとも３７、さらにより好ましくは少なくとも３８、さらにより好ましくは少なくとも３９、さらにより好ましくは少なくとも４０、さらにより好ましくは少なくとも４１、さらにより好ましくは少なくとも４２、さらにより好ましくは少なくとも４３、さらにより好ましくは少なくとも４４、さらにより好ましくは少なくとも４５、さらにより好ましくは少なくとも４６、さらにより好ましくは少なくとも４７、さらにより好ましくは少なくとも４８、さらにより好ましくは少なくとも４９、さらにより好ましくは少なくとも５０、さらにより好ましくは少なくとも５１、さらにより好ましくは少なくとも５２、さらにより好ましくは少なくとも５３、さらにより好ましくは少なくとも５４、さらにより好ましくは少なくとも５５、さらにより好ましくは少なくとも５６、さらにより好ましくは少なくとも５７、さらにより好ましくは少なくとも５８、さらにより好ましくは少なくとも５９、さらにより好ましくは少なくとも６０、さらにより好ましくは少なくとも６１、さらにより好ましくは少なくとも６２、さらにより好ましくは少なくとも６３、さらにより好ましくは少なくとも６４、さらにより好ましくは少なくとも６５、さらにより好ましくは少なくとも６６、さらにより好ましくは少なくとも６７、さらにより好ましくは少なくとも６８、さらにより好ましくは少なくとも６９、さらにより好ましくは少なくとも７０、さらにより好ましくは少なくとも７１、さらにより好ましくは少なくとも７２、さらにより好ましくは少なくとも７３、さらにより好ましくは少なくとも７４、さらにより好ましくは少なくとも７５、さらにより好ましくは少なくとも７６、さらにより好ましくは少なくとも７７、さらにより好ましくは少なくとも７８、さらにより好ましくは少なくとも７９、さらにより好ましくは少なくとも８０、さらにより好ましくは少なくとも８１、さらにより好ましくは少なくとも８２、さらにより好ましくは少なくとも８３、さらにより好ましくは少なくとも８４、さらにより好ましくは少なくとも８５、さらにより好ましくは少なくとも８６、さらにより好ましくは少なくとも８７、さらにより好ましくは少なくとも８８、さらにより好ましくは少なくとも８９、さらにより好ましくは少なくとも９０、さらにより好ましくは少なくとも９１、さらにより好ましくは少なくとも９２、さらにより好ましくは少なくとも９３、さらにより好ましくは少なくとも９４、さらにより好ましくは少なくとも９５、さらにより好ましくは少なくとも９６、さらにより好ましくは少なくとも９７、さらにより好ましくは少なくとも９８、さらにより好ましくは少なくとも９９、さらにより好ましくは少なくとも１００、さらにより好ましくは少なくとも１０１、さらにより好ましくは少なくとも１０２、さらにより好ましくは少なくとも１０３、さらにより好ましくは少なくとも１０４、さらにより好ましくは少なくとも１０５、さらにより好ましくは少なくとも１０６、さらにより好ましくは少なくとも１０７、さらにより好ましくは少なくとも１０８、さらにより好ましくは少なくとも１０９、さらにより好ましくは少なくとも１１０、さらにより好ましくは少なくとも１１１、さらにより好ましくは少なくとも１１２、さらにより好ましくは少なくとも１１３、さらにより好ましくは少なくとも１１４、さらにより好ましくは少なくとも１１５、さらにより好ましくは少なくとも１１６、さらにより好ましくは少なくとも１１７、さらにより好ましくは少なくとも１１８、さらにより好ましくは少なくとも１１９、さらにより好ましくは少なくとも１２０、さらにより好ましくは少なくとも１２１、さらにより好ましくは少なくとも１２２、さらにより好ましくは少なくとも１２３、さらにより好ましくは少なくとも１２４、さらにより好ましくは少なくとも１２５、さらにより好ましくは少なくとも１２６、さらにより好ましくは少なくとも１２７、さらにより好ましくは少なくとも１２８、さらにより好ましくは少なくとも１２９、さらにより好ましくは少なくとも１３０、さらにより好ましくは少なくとも１３１、さらにより好ましくは少なくとも１３２、さらにより好ましくは少なくとも１３３、さらにより好ましくは少なくとも１３４、さらにより好ましくは少なくとも１３５、さらにより好ましくは少なくとも１３６、さらにより好ましくは少なくとも１３７、及びさらにより好ましくは少なくとも１３８のアミノ酸の欠失により配列番号３に示された配列とはまったく異なるポリペプチドからなる。
【００３９】
特定の実施形態において、本発明は、単離エリスロポエチンの変異ポリペプチドにあり、前記変異ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸５６（システイン）から１９３（アルギニン）までのうちの少なくとも１００の欠失により配列番号３に示された配列とはまったく異なるポリペプチドからなる。別の特定の実施形態において、本発明は、単離エリスロポエチンの変異ポリペプチドにあり、前記変異ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸５６（システイン）から１９３（アルギニン）までのうちの少なくとも１２０又は少なくとも１３０或いは少なくとも１３５の欠失により配列番号３に示された配列とはまったく異なるポリペプチドからなる。別の特定の実施形態において、本発明は、単離エリスロポエチンの変異ポリペプチドにあり、前記変異ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸５６（システイン）から１９３（アルギニン）までのうちの少なくとも１３６又は少なくとも１３７の欠失により配列番号３に示された配列とはまったく異なるポリペプチドからなる。別の特定の実施形態において、エリスロポエチンの変異ポリペプチドは、配列番号１３に示された配列を有する（以後ＥＰＯｖと命名される）。本明細書に開示された種々のポリペプチドを記載するために使用される用語の「単離」とは、その天然環境の成分から識別、分離及び／又は回収されるポリペプチドを意味する。したがって、本発明の単離産物は、培養上澄み液に含有させ、部分的に濃縮若しくは精製し、異種供給源から産生し、ベクター中にクローニングし、又は媒体と共に製剤化することができる。
【００４０】
さらに別の特定の実施形態において、本発明は、単離エリスロポエチンの変異ポリペプチドにあり、前記ポリペプチドは、アミノ酸１９３（アルギニン）の欠失、好ましくはアミノ酸１９２〜１９３の欠失、より好ましくはアミノ酸１９１〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１９０〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１８９〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１８８〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１８７〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１８６〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１８５〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１８４〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１８３〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１８２〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１８１〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１８０〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１７９〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１７８〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１７７〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１７６〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１７５〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１７４〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１７３〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１７２〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１７１〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１７０〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１６９〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１６８〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１６７〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１６６〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１６５〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１６４〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１６３〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１６２〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１６１〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１６０〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１５９〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１５８〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１５７〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１５６〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１５５〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１５４〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１５３〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１５２〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１５１〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１５０〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１４９〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１４８〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１４７〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１４６〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１４５〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１４４〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１４３〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１４２〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１４１〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１４０〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１３９〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１３８〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１３７〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１３６〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１３５〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１３４〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１３３〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１３２〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１３１〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１３０〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１２９〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１２８〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１２７〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１２６〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１２５〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１２４〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１２３〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１２２〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１２１〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１２０〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１１９〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１１８〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１１７〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１１６〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１１５〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１１４〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１１３〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１１２〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１１１〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１１０〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１０９〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１０８〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１０７〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１０６〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１０５〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１０４〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１０３〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１０２〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１０１〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸１００〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸９９〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸９８〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸９７〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸９６〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸９５〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸９４〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸９３〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸９２〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸９１〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸９０〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸８９〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸８８〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸８７〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸８６〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸８５〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸８４〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸８３〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸８２〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸８１〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸８０〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸７９〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸７８〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸７７〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸７６〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸７５〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸７４〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸７３〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸７２〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸７１〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸７０〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸６９〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸６８〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸６７〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸６６〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸６５〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸６４〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸６３〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸６２〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸６１〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸６０〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸５９〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸５８〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸５７〜１９３の欠失、さらにより好ましくはアミノ酸５６〜１９３の欠失により配列番号３に示された配列とはまったく異なるポリペプチドからなる。さらに別の特定の実施形態において、本発明は、単離エリスロポエチンの変異ポリペプチドにあり、前記ポリペプチドは、アミノ酸１００〜１９３の欠失により配列番号３に示された配列とはまったく異なるポリペプチドからなる。さらに別の特定の実施形態において、本発明は、単離エリスロポエチンの変異ポリペプチドにあり、前記ポリペプチドは、アミノ酸６１〜１９３の欠失により配列番号３に示された配列とはまったく異なるポリペプチドからなる。さらに別の特定の実施形態において、本発明は、単離エリスロポエチンの変異ポリペプチドにあり、前記ポリペプチドは、アミノ酸６０〜１９３の欠失により配列番号３に示された配列とはまったく異なるポリペプチドからなる。さらに別の特定の実施形態において、本発明は、単離エリスロポエチンの変異ポリペプチドにあり、前記ポリペプチドは、アミノ酸５９〜１９３の欠失により配列番号３に示された配列とはまったく異なるポリペプチドからなる。さらに別の特定の実施形態において、本発明は、単離エリスロポエチンの変異ポリペプチドにあり、前記ポリペプチドは、アミノ酸５８〜１９３の欠失により配列番号３に示された配列とはまったく異なるポリペプチドからなる。さらに別の特定の実施形態において、本発明は、単離エリスロポエチンの変異ポリペプチドにあり、前記ポリペプチドは、アミノ酸５７〜１９３の欠失により配列番号３に示された配列とはまったく異なるポリペプチドからなる。特定の実施形態において、単離エリスロポエチンの変異ポリペプチドは、配列番号１３に示された配列を有する（以後ＥＰＯｖと命名される）。
【００４１】
さらに好ましい実施形態において、本明細書において上記のペプチドは、Ｎ末端シグナルペプチドを欠く成熟ペプチドである。さらに特に、本明細書において上記のペプチドは、配列番号３のアミノ酸１から２７までからなるシグナルペプチドを欠く。したがって特定の態様において、本発明は、配列番号１３のアミノ酸２８から５５までのアミノ酸配列からなるポリペプチドにある（以後ＥＰＯｖｍと命名される）。
【００４２】
本明細書において上記の１．１節におけるポリペプチドは、以後、「ＥＰＯ短ポリペプチド」と命名される。別の態様において、本発明は、ＥＰＯ短ポリペプチドを含む単離ポリペプチドにある。
【００４３】
さらなる態様において、本発明は、本明細書において上記のＥＰＯ短ポリペプチドの変異体を含むか、又はそれからなる単離ポリペプチドにある。ポリペプチドとして定義されるＥＰＯ短ポリペプチドの変異体は、本明細書において上記のＥＰＯ短ポリペプチドと比較して１つ又はいくつかのアミノ酸置換、典型的には０から１０のアミノ酸置換、さらにより典型的には０から５つ、４つ、３つ、２つ又は１つのアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、変異ポリペプチドは、
【化１】
2009517009.tif 000002
からなる群において選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により本明細書において上記のＥＰＯ短ポリペプチドとは異なる。好ましい実施形態において、変異ポリペプチドは、Ｇ１０４Ｓ及びＳ１４７Ｃからなる群において選択される１つ又は２つの変異により本明細書における上記のＥＰＯ短ポリペプチドの配列とは異なる。アミノ酸配列の修飾のために本明細書に使用される表記は、示された位置の野生型アミノ酸がそれぞれの番号の直後のアミノ酸に変わることを意味する。所与のナンバリングは、配列番号３におけるアミノ酸のナンバリングに関連する。したがって例えば、Ｅ４０Ｑ変異は、配列番号３の４０位のアミノ酸Ｅ（グルタミン酸）のアミノ酸Ｑ（グルタミン）への変異に相当する。しかしながら、１つ以上のこれら変異部位は、ＥＰＯｗｔと比較して、ＥＰＯ短ポリペプチドに欠いているアミノ酸数に依って存在しないと考えられる。別の実施形態において、ＥＰＯ短ポリペプチドの変異体は、
【化２】
2009517009.tif 000003
からなる群において選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により本明細書において上記のＥＰＯ短ポリペプチドとは異なる。さらに別の実施形態において、ＥＰＯ短ポリペプチドの変異体は、
【化３】
2009517009.tif 000004
からなる群において選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により本明細書において上記のＥＰＯ短ポリペプチドとは異なる。さらに別の実施形態において、ＥＰＯ短ポリペプチドの変異体は、
【化４】
2009517009.tif 000005
からなる群において選択される１つの組換え変異により本明細書において上記のＥＰＯ短ポリペプチドの配列とは異なる。好ましい実施形態において、Ｃ３４Ｓからなる変異により本明細書において上記のＥＰＯ短ポリペプチドの配列とは異なる。しかしながら、１つ以上のこれら変異部位は、ＥＰＯｗｔと比較して、ＥＰＯ短ポリペプチドに欠いているアミノ酸数に依って存在しないと考えられる。好ましい実施形態において、本明細書において上記のＥＰＯ短ポリペプチドの変異体は、Ｎ末端シグナルペプチドを欠く成熟ペプチドである。さらに特に、本明細書において上記のペプチドは、配列番号３のアミノ酸１から２７までからなるシグナルペプチドを欠く。したがって、特定の態様において、本発明は、変異Ｃ３４Ｓ（配列番号１５のアミノ酸２８から５５まで）によりＥＰＯｖｍとは異なるアミノ酸配列からなるポリペプチドにある。
【００４４】
別の実施形態において、本発明は、グリコシル化に関して１つから６つまでの追加部位を有するようなポリペプチドとはさらに異なる本明細書において上記のＥＰＯ短ポリペプチド又はＥＰＯ短ポリペプチドの変異体を含むか、又はそれらからなる単離ポリペプチドに相当するＥＰＯポリペプチドの類似体にある。１つ以上のオリゴ糖基によるタンパク質のグリコシル化は、ポリペプチド骨格に沿って特定の位置に生じ、タンパク質安定性、分泌、細胞下局在化、及び生物活性などのタンパク質の物理的性質に影響を及ぼす。グリコシル化は、通常、２つのタイプがある：Ｏ−結合オリゴ糖類は、セリン又はトレオニン残基に結合し、Ｎ−結合オリゴ糖類は、アスパラギン残基に結合する。Ｎ−結合及びＯ−結合オリゴ糖類の双方に見られる１タイプのオリゴ糖は、９つ以上の炭素原子を含有するアミノ糖類のファミリーであるＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）である。シアル酸は負電荷を有し、糖タンパク質に酸性を付与することから、シアル酸は、通常、Ｎ−結合及びＯ−結合オリゴ糖類上の双方の末端残基である。本発明のポリペプチドは、シアル酸結合に対する部位数の増加をもたらすアミノ酸配列の１つ以上の変化により本明細書において上記のＥＰＯ短ポリペプチド又はＥＰＯ短ポリペプチド変異体の類似体を含む。これらの糖タンパク質類似体は、グリコシル化に利用できる部位を増加させるか、又は変化させるアミノ酸残基の付加、欠失、又は置換を有する部位特異的変異誘発により作出できる。ヒトエリスロポエチンに見られるものよりも大きなシアル酸レベルを有する本発明のＥＰＯ類似体は、生物活性に必要な第二級又は第三級立体配座を摂動しないグリコシル化部位を付加することにより作出される。本発明のポリペプチドはまた、通常、Ｎ−結合又はＯ−結合部位に密接した１つ以上のアミノ酸の置換を含むグリコシル化部位に炭水化物結合の増加レベルを有するＥＰＯ類似体を含む。本発明のポリペプチドはまた、エリスロポエチンのカルボキシ末端から伸長する１つ以上のアミノ酸を有し、少なくとも１つの追加炭水化物部位を提供するＥＰＯ類似体を含む。本発明のポリペプチドはまた、グリコシル化用に少なくとも１つの部位の転移を含むアミノ酸配列を有するＥＰＯ類似体を含む。このようなグリコシル化部位の転移は、本明細書において上記のＥＰＯ短ポリペプチド又はＥＰＯ短ポリペプチド変異体における１つ以上のグリコシル化部位の欠失及び１つ以上の非天然グリコシル化部位の付加を含む。エリスロポエチン上の炭水化物鎖数の増加、したがって、１エリスロポエチン分子当たりのシアル酸数を増加させることにより、安定性の増加、より大きな耐タンパク分解性、免疫原性の減少、血清中半減期の増加、生物活性の増加など、有利な性質を付与できる。追加のグリコシル化部位を有するエリスロポエチン類似体は、欧州特許出願第６４０，６１９号、ＰＣＴ出願ＷＯ００２４８９３及びＷＯ０１８１４０５に、さらに詳細に開示されている。
【００４５】
好ましい実施形態において、本発明のこのような類似体は、８４位、９６位、１１３位、１１５位、１１６位又は１４１位に少なくとも１つの追加Ｎ−結合グリコシル化部位を含み、本明細書において上記のＥＰＯ短ポリペプチド又はＥＰＯ短ポリペプチドの変異体を含むか、又はそれらからなる。既に本明細書の上記に説明されたように、所与の位置は、配列番号３におけるアミノ酸のナンバリングに関連する。１つ以上のこれらの部位は、ＥＰＯｗｔと比較して、ＥＰＯ短ポリペプチド、又はＥＰＯ短ポリペプチドの変異体に欠いているアミノ酸数に依って存在しないと考えられる。別の実施形態において、このようなＥＰＯ類似体は、少なくとも２つの追加グリコシル化部位、又は少なくとも３つの追加グリコシル化部位、或いは少なくとも４つの追加グリコシル化部位を含む。
【００４６】
好ましい実施形態において、本発明のこれらＥＰＯ類似体は、以下の：
【化５】
2009517009.tif 000006
から選択される修飾により修飾された、本明細書において上記のＥＰＯ短ポリペプチド、又はＥＰＯ短ポリペプチドの変異体を含むか、又はそれらからなる。
【００４７】
既に本明細書の上記に述べられたように、所与の位置は、配列番号３におけるアミノ酸のナンバリングに関連する。１つ以上のこれらの部位は、ＥＰＯｗｔと比較して、ＥＰＯ短ポリペプチド、又はＥＰＯ短ポリペプチドの変異体に欠いているアミノ酸数に依って存在しないと考えられる。
【００４８】
さらなる態様において、本発明は、本明細書において上記の１．１節に記載されたＥＰＯ短ポリペプチドの相同体、前記ＥＰＯ短ポリペプチドの変異体又はＥＰＯポリペプチドの類似体を含むか、又はそれらからなる単離ポリペプチドにある。特定の実施形態において、前記相同体は、ＥＰＯ短ポリペプチド、又は前記ＥＰＯ短ポリペプチドの変異体或いはＥＰＯポリペプチドの類似体と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性なポリペプチドとして定義される。好ましくは、前記同一性は、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９．５％のアミノ酸配列同一性である。通常、相同体ポリペプチドは、長さが１８０から２８までのアミノ酸、長さが１４０から２８までのアミノ酸、しばしば長さが１００から２８までのアミノ酸、しばしば長さが７５から２８までのアミノ酸、さらにしばしば長さが５５から２８までのアミノ酸、さらに長さが４０から２８までのアミノ酸、さらにしばしば長さが３０のアミノ酸、さらにしばしば長さが２９のアミノ酸、さらにしばしば長さが２８のアミノ酸である。特定の実施形態において、前記相同体は、配列番号１３に示されたポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性なポリペプチド（ＥＰＯｖ）又は配列番号１３のアミノ酸２８から５５までの配列を有するポリペプチド（ＥＰＯｖｍ）からなるか、又はそれらを含む。好ましくは、前記同一性は、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９．５％のアミノ酸配列同一性である。通常、ＥＰＯｖの相同体ポリペプチドは、長さが６０のアミノ酸、さらにしばしば長さが５９のアミノ酸、さらにしばしば長さが５８のアミノ酸、さらにしばしば長さが５７のアミノ酸、さらにしばしば長さが５６のアミノ酸、さらにしばしば長さが５５のアミノ酸である。通常、ＥＰＯｖｍの相同体ポリペプチドは、長さが３５のアミノ酸、さらにしばしば長さが３４のアミノ酸、さらにしばしば長さが３３のアミノ酸、さらにしばしば長さが３２のアミノ酸、さらにしばしば長さが３１のアミノ酸、さらにしばしば長さが３０のアミノ酸、さらにしばしば長さが２９のアミノ酸、さらにしばしば長さが２８のアミノ酸である。
【００４９】
本明細書で同定されたＥＰＯポリペプチド配列に関して「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、必要ならば最大パーセントの配列同一性を達成するために、配列同一性の一部としていずれの保存的置換を考慮せずに、配列の位置合わせをし、ギャップを導入した後、特定のＥＰＯポリペプチド配列においてアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを測定する目的のための位置合わせは、例えば、ＢＬＡＳＴなどの公的に利用できるコンピュータソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ、Ｇｉｓｈ  Ｗ、Ｍｉｌｌｅｒ  Ｗ、Ｍｙｅｒｓ  ＥＷ、Ｌｉｐｍａｎ  ＤＪ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９０）．２１５（３）：４０３〜４１０頁）を用いて当業界の範囲内にある種々の方法で達成できる。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大位置合わせを達成するために必要な任意のアルゴリズムなど、位置合わせを測定するために適切なパラメーターを決定できる。
【００５０】
１．２  ＥＰＯ短１ポリペプチド及びそれらの変異体
さらなる態様において、本発明は、配列番号３のアミノ酸５４（トレオニン）から８２（グルタミン酸）までのうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、さらにより好ましくは少なくとも４つ、さらにより好ましくは少なくとも５つ、さらにより好ましくは少なくとも６つ、さらにより好ましくは少なくとも７つ、さらにより好ましくは少なくとも８つ、さらにより好ましくは少なくとも９つ、さらにより好ましくは少なくとも１０、さらにより好ましくは少なくとも１１、さらにより好ましくは少なくとも１２、さらにより好ましくは少なくとも１３、さらにより好ましくは少なくとも１４、さらにより好ましくは少なくとも１５、さらにより好ましくは少なくとも１６、さらにより好ましくは少なくとも１７、さらにより好ましくは少なくとも１８、さらにより好ましくは少なくとも１９、さらにより好ましくは少なくとも２０、さらにより好ましくは少なくとも２１、さらにより好ましくは少なくとも２２、さらにより好ましくは少なくとも２３、さらにより好ましくは少なくとも２４、さらにより好ましくは少なくとも２５、さらにより好ましくは少なくとも２６、さらにより好ましくは少なくとも２７、さらにより好ましくは少なくとも２８、さらにより好ましくは少なくとも２９のアミノ酸の欠失により配列番号３に示された配列とは異なるＥＰＯポリペプチドからなる単離ポリペプチドにある。これらのＥＰＯポリペプチドは、以後「ＥＰＯ短１」と命名される。別の態様において、本発明は、ＥＰＯ短１ポリペプチドを含む単離ポリペプチドにある。
【００５１】
本明細書に開示された種々のポリペプチドを記載するために用いられる用語「単離」とは、その天然環境の成分から識別、分離及び／又は回収されるポリペプチドを意味する。したがって、本発明の単離産物は、培養上澄み液に含有させ、部分的に濃縮若しくは精製し、異種供給源から産生し、ベクター中にクローニングし、又は媒体と共に製剤化することができる。
【００５２】
好ましい実施形態において、本発明によるポリペプチドは、配列番号４に示された配列を有し（以後ＥＰＯｖ１と命名される）、ＥＰＯの新規な転写変異体に相当する。ＥＰＯｖ１は、ヒト遺伝子ＥＰＯのエキソン１、２、４及び５によりコード化され、エキソン３によりコード化された２９のアミノ酸を欠いている（図４を参照）。したがって、この転写変異体は、その未成熟形態で１６４のアミノ酸長である。Ｎ末端シグナルペプチドは、最初の２７のアミノ酸を含む。シグナルペプチドが開裂されると、生じたタンパク質は１３７のアミノ酸長であり、以後ＥＰＯｖ１ｍ（配列番号４のアミノ酸２８から１６４まで）と命名される。既に本明細書の上記に述べられたとおり、カルボキシ末端残基の除去により、細胞により発現されたタンパク質が１６５のアミノ酸長タンパク質（配列番号３のアミノ酸２８から１９２まで）であるようにＥＰＯｗｔｍに対して記載されている。したがって、成熟ＥＰＯｖ１ｍタンパク質は、細胞により同じ様式で処理でき、生じたタンパク質は、１３６のアミノ酸長（配列番号４のアミノ酸２８から１６３まで）であり得る。さらに一般的には、本発明の実施形態において、本明細書の上記のＥＰＯ短１ポリペプチドは、このカルボキシ末端アルギニン残基を欠いている。
【００５３】
本明細書の上記のとおり、ＥＰＯｖ１（図４及び配列番号４に示される）は、エキソン３によりコード化されるＥＰＯｗｔのアミノ酸５４から８２までを欠いている。ＥＰＯｖ１は、逆平行長ヘリックスαＡ（ＥＰＯｗｔｍの残基８〜２６）、αＣ（ＥＰＯｗｔｍの残基９０〜１１２）、αＤヘリックス（ＥＰＯｗｔｍの残基１３８〜１６１）及びαＢの大部分（ＥＰＯｗｔｍの残基５５〜８３）を保持すると結論付けることができる。逆平行βシート：β２（ＥＰＯｗｔｍの残基１３３〜１３５）もまた示されるが、逆平行βシート：β１（ＥＰＯｗｔｍの残基３９〜４１）は、ＥＰＯｖ１ｍが存在しない。ジスルフィド結合、Ｃｙｓ２９からＣｙｓ３３は存在しない。ミニヘリックスαＣ’（ＥＰＯｗｔｍの残基１１４〜１２１）は、ＥＰＯｖ１ｍに保持されるが、短ヘリックスαＢ’ヘリックス（ＥＰＯｗｔｍの残基４７〜５２）は存在しない。αＡヘリックス及びαＤを一緒に結合するジスルフィド結合、Ｃｙｓ７からＣｙｓ１６１もまた保持されるはずである。
【００５４】
さらなる態様において、本発明は、上記のＥＰＯ短１ポリペプチドの変異体を含むか、又はそれからなる単離ポリペプチドにある。ポリペプチドとして定義される変異体は、本明細書において上記のＥＰＯ短１ポリペプチドと比較して１つ又はいくつかのアミノ酸置換、典型的には０から１０のアミノ酸置換、さらにより典型的には０から５つ、４つ、３つ、２つ又は１つのアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、変異ポリペプチドは、
【化６】
2009517009.tif 000007
からなる群において選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により本明細書において上記のＥＰＯ短１ポリペプチドとは異なる。好ましい実施形態において、変異ポリペプチドは、Ｇ１０４Ｓ及びＳ１４７Ｃからなる群において選択される１つ又は２つの変異により本明細書における上記のＥＰＯ短１ポリペプチドの配列とは異なる。別の実施形態において、ＥＰＯ短１ポリペプチドの変異体は、
【化７】
2009517009.tif 000008
からなる群において選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により本明細書において上記のＥＰＯ短１ポリペプチドとは異なる。さらに別の実施形態において、ＥＰＯ短１ポリペプチドの変異体は、
【化８】
2009517009.tif 000009
からなる群において選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により本明細書において上記のＥＰＯ短１ポリペプチドとは異なる。さらに別の実施形態において、ＥＰＯ短１ポリペプチドの変異体は、
【化９】
2009517009.tif 000010
からなる群において選択される１つの組換え変異により本明細書において上記のＥＰＯ短１ポリペプチドとは異なる。好ましい実施形態において、Ｃ３４Ｓからなる変異により本明細書において上記のＥＰＯ短１ポリペプチドの配列とは異なる。アミノ酸配列の修飾のために本明細書に用いられる表記は、指定された位置での野生型アミノ酸は、それぞれの番号直後のアミノ酸に変えられることを意味する。所与のナンバリングは、配列番号３におけるアミノ酸のナンバリングに関連する。したがって例えば、Ｅ４０Ｑ変異は、配列番号３の４０位におけるアミノ酸Ｅ（グルタミン酸）のアミノ酸Ｑ（グルタミン）への変異に相当する。しかしながら、このナンバリングは、ＥＰＯ短１ポリペプチドの各々に関して５３位後のアミノ酸（トレオニン）に関して異なり、ＥＰＯｗｔと比較して、ＥＰＯ短１に欠いているアミノ酸数に依ることは明白である。変異を受ける対応のアミノ酸（複数可）は、ＥＰＯｗｔと比較して特定のＥＰＯ短１ペプチドに欠いているアミノ酸数を配列番号３におけるアミノ酸位置数から差し引くことにより（例えば、ポリペプチドＥＰＯ短１がアミノ酸５４から８２（２９のアミノ酸）を欠く場合、Ｇ１０４Ｓ変異は、この特定のポリペプチドに関してＧ７５Ｓに相当する）容易に同定される。
【００５５】
別の実施形態において、本発明は、グリコシル化に関して１つから６つまでの追加部位を有するようなポリペプチドとはさらに異なる本明細書において上記のＥＰＯ短１ポリペプチド又はＥＰＯ短１ポリペプチドの変異体を含むか、又はそれらからなる単離ポリペプチドに相当するＥＰＯポリペプチドの類似体にある。１つ以上のオリゴ糖基によるタンパク質のグリコシル化は、ポリペプチド骨格に沿って特定の位置に生じ、タンパク質安定性、分泌、細胞下局在化、及び生物活性などのタンパク質の物理的性質に影響を及ぼす。グリコシル化は、通常、２つのタイプがある：Ｏ−結合オリゴ糖類は、セリン又はトレオニン残基に結合し、Ｎ−結合オリゴ糖類は、アスパラギン残基に結合する。Ｎ−結合及びＯ−結合オリゴ糖類の双方に見られる１タイプのオリゴ糖は、９つ以上の炭素原子を含有するアミノ糖類のファミリーであるＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）である。シアル酸は負電荷を有し、糖タンパク質に酸性を付与することから、シアル酸は、通常、Ｎ−結合及びＯ−結合オリゴ糖類上の双方の末端残基である。２つのＮ−結合グリコシル化部位：ＥＰＯｗｔｍの２４位と８３位におけるアスパラギン残基及びＯ結合グリコシル化部位：ＥＰＯｗｔｍの１２６位に配置されるセリン残基は、ＥＰＯｖ１ｍに保持される（一方、ＥＰＯｗｔｍの３８位（アスパラギン残基）のＮ結合グリコシル化部位は、ＥＰＯｖ１ｍに存在しない）。本発明のポリペプチドは、シアル酸結合に対する部位数の増加をもたらすアミノ酸配列の１つ以上の変化により本明細書において上記のＥＰＯｖ１又はＥＰＯ短１ポリペプチドの類似体、或いはＥＰＯ短１ポリペプチド変異体の類似体を含む。これらの糖タンパク質類似体は、グリコシル化に利用できる部位を増加させるか、又は変化させるアミノ酸残基の付加、欠失、又は置換を有する部位特異的変異誘発により作出できる。ヒトエリスロポエチンに見られるものよりも大きなシアル酸レベルを有する本発明のＥＰＯ類似体は、生物活性に必要な第二級又は第三級立体配座を摂動しないグリコシル化部位を付加することにより作出される。本発明のポリペプチドはまた、通常、Ｎ−結合又はＯ−結合部位に密接した１つ以上のアミノ酸の置換を含むグリコシル化部位に炭水化物結合の増加レベルを有するＥＰＯ類似体を含む。本発明のポリペプチドはまた、エリスロポエチンのカルボキシ末端から伸長する１つ以上のアミノ酸を有し、少なくとも１つの追加炭水化物部位を提供するＥＰＯ類似体を含む。本発明のポリペプチドはまた、グリコシル化用に少なくとも１つの部位の転移を含むアミノ酸配列を有するＥＰＯ類似体を含む。このようなグリコシル化部位の転移は、本明細書において上記のＥＰＯｖ１又はＥＰＯ短１ポリペプチド、或いはＥＰＯ短１ポリペプチドの変異体における１つ以上のグリコシル化部位の欠失及び１つ以上の非天然グリコシル化部位の付加を含む。エリスロポエチン上の炭水化物鎖数の増加、したがって、１エリスロポエチン分子当たりのシアル酸数を増加させることにより、安定性の増加、より大きな耐タンパク分解性、免疫原性の減少、血清中半減期の増加、生物活性の増加など、有利な性質を付与できる。追加のグリコシル化部位を有するエリスロポエチン類似体は、欧州特許出願第６４０，６１９号、ＰＣＴ出願ＷＯ００２４８９３及びＷＯ０１８１４０５に、さらに詳細に開示されている。
【００５６】
好ましい実施形態において、本発明のこのようなＥＰＯ類似体は、８４位、９６位、１１３位、１１５位、１１６位又は１４１位において少なくとも１つの追加Ｎ−結合グリコシル化部位を含み、本明細書において上記のＥＰＯ短１ポリペプチド又はＥＰＯ短１ポリペプチドの変異体を含むか、又はそれらからなる。既に本明細書の上記に説明されたように、所与の位置は、配列番号３におけるアミノ酸のナンバリングに関連する。このナンバリングは、ＥＰＯ短１又は変異ポリペプチドの各々に関して５３位後のアミノ酸（トレオニン）について異なり、ＥＰＯｗｔと比較してＥＰＯ短１に、又はＥＰＯ短１ポリペプチドの変異体に欠いているアミノ酸数に依存する。別の実施形態において、このようなＥＰＯ類似体は、少なくとも２つの追加グリコシル化部位、又は少なくとも３つの追加グリコシル化部位、或いは少なくとも４つの追加グリコシル化部位を含む。
【００５７】
好ましい実施形態において、本発明のこれらのＥＰＯ類似体は、以下の：
【化１０】
2009517009.tif 000011
から選択される修飾により修飾された、本明細書において上記のＥＰＯ短１ポリペプチド、又はＥＰＯ短１ポリペプチドの変異体を含むか、又はそれらからなる。
【００５８】
既に本明細書の上記に述べられたように、所与の位置は、配列番号３におけるアミノ酸のナンバリングに関連する。このナンバリングは、ＥＰＯ短１ポリペプチドの各々に関して５３位後のアミノ酸（トレオニン）について異なり、ＥＰＯｗｔと比較してＥＰＯ短１に、又はＥＰＯ短１ポリペプチドの変異体に欠いているアミノ酸数に依存する。
【００５９】
さらに好ましい実施形態において、本明細書の上記のペプチドは、Ｎ末端シグナルペプチドを欠く成熟ペプチドである。さらに特に、本発明のポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸１から２７までからなるシグナルペプチドを欠いている。したがって、特定の態様において、本発明は、アミノ酸１から２７を欠く本明細書の上記に開示されたＥＰＯ短１ポリペプチド、又は前記ポリペプチドの変異体或いは類似体を含むか、又はそれらからなるポリペプチドにある。さらに別の特定の態様において、本発明は、上記に定義された配列番号４のアミノ酸２８から１６４の配列又は前記配列の変異体或いは類似体を含むか、又はそれらからなるポリペプチドにある。
【００６０】
さらなる態様において、本発明は、本明細書において上記の１．２節に記載されたＥＰＯ短１ポリペプチドの相同体、又は前記ＥＰＯ短１ポリペプチドの変異体或いはＥＰＯポリペプチドの類似体を含むか、又はそれらからなる単離ポリペプチドにある。特定の実施形態において、前記相同体は、ＥＰＯ短１ポリペプチド、又は前記ＥＰＯ短１ポリペプチドの変異体或いはＥＰＯポリペプチドの類似体と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性なポリペプチドとして定義される。好ましくは、前記同一性は、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９．５％のアミノ酸配列同一性である。通常、相同体ポリペプチドは、長さが１８０から１３６までのアミノ酸、長さが１７０から１３６までのアミノ酸、しばしば長さが１６０から１３６までのアミノ酸、さらにしばしば長さが１６４のアミノ酸、さらにしばしば長さが１４０のアミノ酸、さらにしばしば長さが１３９のアミノ酸、さらにしばしば長さが１３８のアミノ酸、さらにしばしば長さが１３７のアミノ酸、さらにしばしば長さが１３６のアミノ酸である。特定の実施形態において、前記相同体は、配列番号４に示されたポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性なポリペプチド（ＥＰＯｖ１）又は配列番号４のアミノ酸２８から１６４までの配列を有するポリペプチド（ＥＰＯｖ１ｍ）からなるか、又はそれらを含む。好ましくは、前記同一性は、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９．５％のアミノ酸配列同一性である。通常、ＥＰＯｖ１の相同体ポリペプチドは、長さが１８０のアミノ酸、さらにしばしば長さが１７０のアミノ酸、さらにしばしば長さが１６６のアミノ酸、さらにしばしば長さのアミノ酸、さらにしばしば長さが１６５のアミノ酸、さらにしばしば長さが１６４のアミノ酸である。通常、ＥＰＯｖ１ｍの相同体ポリペプチドは、長さが１５０のアミノ酸、さらにしばしば長さが１４０のアミノ酸、さらにしばしば長さが１３９のアミノ酸、さらにしばしば長さが１３８のアミノ酸、さらにしばしば長さが１３７のアミノ酸、さらにしばしば長さが１３６のアミノ酸である。
【００６１】
本明細書で同定されたＥＰＯポリペプチド配列に関して「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、必要ならば最大パーセントの配列同一性を達成するために、配列同一性の一部としていずれの保存的置換を考慮せずに、配列の位置合わせをし、ギャップを導入した後、特定のＥＰＯポリペプチド配列においてアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを測定する目的のための位置合わせは、例えば、ＢＬＡＳＴなどの公的に利用できるコンピュータソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ、Ｇｉｓｈ  Ｗ、Ｍｉｌｌｅｒ  Ｗ、Ｍｙｅｒｓ  ＥＷ、Ｌｉｐｍａｎ  ＤＪ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９０）．２１５（３）：４０３〜４１０頁）を用いて当業界の範囲内にある種々の方法で達成できる。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大位置合わせを達成するために必要な任意のアルゴリズムなど、位置合わせを測定するために適切なパラメーターを決定できる。
【００６２】
１．３  ＥＰＯ短２ポリペプチド及びそれらの変異体
さらなる態様において、本発明は、配列番号３のアミノ酸５４（トレオニン）から１４２（グルタミン）までのうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、さらにより好ましくは少なくとも４つ、さらにより好ましくは少なくとも５つ、さらにより好ましくは少なくとも６つ、さらにより好ましくは少なくとも７つ、さらにより好ましくは少なくとも８つ、さらにより好ましくは少なくとも９つ、さらにより好ましくは少なくとも１０、さらにより好ましくは少なくとも１１、さらにより好ましくは少なくとも１２、さらにより好ましくは少なくとも１３、さらにより好ましくは少なくとも１４、さらにより好ましくは少なくとも１５、さらにより好ましくは少なくとも１６、さらにより好ましくは少なくとも１７、さらにより好ましくは少なくとも１８、さらにより好ましくは少なくとも１９、さらにより好ましくは少なくとも２０、さらにより好ましくは少なくとも２１、さらにより好ましくは少なくとも２２、さらにより好ましくは少なくとも２３、さらにより好ましくは少なくとも２４、さらにより好ましくは少なくとも２５、さらにより好ましくは少なくとも２６、さらにより好ましくは少なくとも２７、さらにより好ましくは少なくとも２８、さらにより好ましくは少なくとも２９、さらにより好ましくは少なくとも３０、さらにより好ましくは少なくとも３１、さらにより好ましくは少なくとも３２、さらにより好ましくは少なくとも３３、さらにより好ましくは少なくとも３４、さらにより好ましくは少なくとも３５、さらにより好ましくは少なくとも３６、さらにより好ましくは少なくとも３７、さらにより好ましくは少なくとも３８、さらにより好ましくは少なくとも３９、さらにより好ましくは少なくとも４０、さらにより好ましくは少なくとも４１、さらにより好ましくは少なくとも４２、さらにより好ましくは少なくとも４３、さらにより好ましくは少なくとも４４、さらにより好ましくは少なくとも４５、さらにより好ましくは少なくとも４６、さらにより好ましくは少なくとも４７、さらにより好ましくは少なくとも４８、さらにより好ましくは少なくとも４９、さらにより好ましくは少なくとも５０、さらにより好ましくは少なくとも５１、さらにより好ましくは少なくとも５２、さらにより好ましくは少なくとも５３、さらにより好ましくは少なくとも５４、さらにより好ましくは少なくとも５５、さらにより好ましくは少なくとも５６、さらにより好ましくは少なくとも５７、さらにより好ましくは少なくとも５８、さらにより好ましくは少なくとも５９、さらにより好ましくは少なくとも６０、さらにより好ましくは少なくとも６１、さらにより好ましくは少なくとも６２、さらにより好ましくは少なくとも６３、さらにより好ましくは少なくとも６４、さらにより好ましくは少なくとも６５、さらにより好ましくは少なくとも６６、さらにより好ましくは少なくとも６７、さらにより好ましくは少なくとも６８、さらにより好ましくは少なくとも６９、さらにより好ましくは少なくとも７０、さらにより好ましくは少なくとも７１、さらにより好ましくは少なくとも７２、さらにより好ましくは少なくとも７３、さらにより好ましくは少なくとも７４、さらにより好ましくは少なくとも７５、さらにより好ましくは少なくとも７６、さらにより好ましくは少なくとも７７、さらにより好ましくは少なくとも７８、さらにより好ましくは少なくとも７９、さらにより好ましくは少なくとも８０、さらにより好ましくは少なくとも８１、さらにより好ましくは少なくとも８２、さらにより好ましくは少なくとも８３、さらにより好ましくは少なくとも８４、さらにより好ましくは少なくとも８５、さらにより好ましくは少なくとも８６、さらにより好ましくは少なくとも８７、さらにより好ましくは少なくとも８８、さらにより好ましくは少なくとも８９のアミノ酸の欠失により配列番号３に示された配列とは異なるＥＰＯポリペプチドからなる単離ポリペプチドにある。
【００６３】
本明細書に開示された種々のポリペプチドを記載するために用いられる用語の「単離」とは、その天然環境の成分から識別、分離及び／又は回収されるポリペプチドを意味する。したがって、本発明の単離産物は、培養上澄み液に含有させ、部分的に濃縮若しくは精製し、異種供給源から産生し、ベクター中にクローニングし、又は媒体と共に製剤化することができる。
【００６４】
好ましい実施形態において、本発明によるポリペプチドは、配列番号６に示された配列を有し（以後ＥＰＯｖ２と命名される）、ＥＰＯの新規な転写変異体に相当する。ＥＰＯｖ２は、ヒト遺伝子ＥＰＯのエキソン１、２及び５によりコード化され、エキソン３によりコード化された２９のアミノ酸及びエキソン４によりコード化された６０のアミノ酸を欠いている（図５を参照）。したがって、この転写変異体は、その未成熟形態で１０４のアミノ酸長である。Ｎ末端シグナルペプチドは、最初の２７のアミノ酸を含む。シグナルペプチドが開裂されると、生じたタンパク質は７７のアミノ酸長であり、以後ＥＰＯｖ２ｍ（配列番号６のアミノ酸２８から１０４まで）と命名される。既に本明細書の上記に述べられたとおり、カルボキシ末端残基の除去により、細胞により発現されたタンパク質が１６５のアミノ酸長タンパク質（配列番号３のアミノ酸２８から１９２まで）であるようにＥＰＯｗｔｍに対して記載されている。したがって、成熟ＥＰＯｖ２ｍタンパク質は、細胞により同じ様式で処理でき、生じたタンパク質は、７６のアミノ酸長（配列番号６のアミノ酸２８から１０３まで）であり得る。さらに一般的には、本発明の実施形態において、本明細書の上記のＥＰＯ短２ポリペプチドは、このカルボキシ末端アルギニン残基を欠いている。
【００６５】
本明細書の上記のとおり、ＥＰＯｖ２（図５及び配列番号６に示される）は、エキソン３及び４によりコード化されるＥＰＯｗｔのアミノ酸５４から１４２までを欠いている。ＥＰＯｖ２は、逆平行長ヘリックスαＡ（ＥＰＯｗｔｍの残基８〜２６）及びαＤヘリックス（ＥＰＯｗｔｍの残基１３８〜１６１）を保持するが、逆平行長ヘリックスαＢ（ＥＰＯｗｔｍの残基５５〜８３）及びαＣ（ＥＰＯｗｔｍの残基９０〜１１２）は、ＥＰＯｖ２ｍが存在しない。逆平行βシート：β２（ＥＰＯｗｔｍの残基１３３〜１３５）もまた存在するが、逆平行βシート：β１（ＥＰＯｗｔｍの残基３９〜４１）は、ＥＰＯｖ２ｍが存在しない。ジスルフィド結合、Ｃｙｓ２９からＣｙｓ３３は存在しない。ミニヘリックスαＣ’の大部分（ＥＰＯｗｔｍの残基１１４〜１２１）は、ＥＰＯｖ２ｍに保持されるが、短ヘリックスαＢ’ヘリックス（ＥＰＯｗｔｍの残基４７〜５２）は存在しない。αＡヘリックス及びαＤを一緒に結合するジスルフィド結合、Ｃｙｓ７からＣｙｓ１６１もまた保持されるはずである。
【００６６】
さらなる態様において、本発明は、上記のＥＰＯ短２ポリペプチドの変異体を含むか、又はそれからなる単離ポリペプチドにある。ポリペプチドとして定義される変異体は、本明細書において上記のＥＰＯ短２ポリペプチドと比較して１つ又はいくつかのアミノ酸置換、典型的には０から１０のアミノ酸置換、さらにより典型的には０から５つ、４つ、３つ、２つ又は１つのアミノ酸置換を含む。さらに特に、変異ポリペプチドは、
【化１１】
2009517009.tif 000012
からなる群において選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により本明細書において上記のＥＰＯ短２ポリペプチドとは異なる。好ましい実施形態において、変異ポリペプチドは、Ｇ１０４Ｓ及びＳ１４７Ｃからなる群において選択される１つ又は２つの変異により本明細書における上記のＥＰＯ短２ポリペプチドの配列とは異なる。別の実施形態において、ＥＰＯ短２ポリペプチドの変異体は、
【化１２】
2009517009.tif 000013
からなる群において選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により本明細書において上記のＥＰＯ短２ポリペプチドとは異なる。さらに別の実施形態において、ＥＰＯ短２ポリペプチドの変異体は、
【化１３】
2009517009.tif 000014
からなる群において選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により本明細書において上記のＥＰＯ短２ポリペプチドとは異なる。さらに別の実施形態において、ＥＰＯ短２ポリペプチドの変異体は、
【化１４】
2009517009.tif 000015
からなる群において選択される１つの組換え変異により本明細書において上記のＥＰＯ短２ポリペプチドとは異なる。好ましい実施形態において、ＥＰＯ短２ポリペプチドの変異体は、Ｃ３４Ｓからなる変異により本明細書において上記のＥＰＯ短２ポリペプチドの配列とは異なる。アミノ酸配列の修飾のために本明細書に用いられる表記は、指定された位置での野生型アミノ酸は、それぞれの番号直後のアミノ酸に変えられることを意味する。所与のナンバリングは、配列番号３におけるアミノ酸のナンバリングに関連する。したがって例えば、Ｅ４０Ｑ変異は、配列番号３の４０位におけるアミノ酸Ｅ（グルタミン酸）のアミノ酸Ｑ（グルタミン）への変異に相当する。しかしながら、このナンバリングは、ＥＰＯ短２ポリペプチドの各々に関して５３位後のアミノ酸（トレオニン）に関して異なり、ＥＰＯｗｔと比較して、ＥＰＯ短２に欠いているアミノ酸数に依ることは明白である。変異を受ける対応のアミノ酸（複数可）は、ＥＰＯｗｔと比較して特定のＥＰＯ短２ペプチドに欠いているアミノ酸数を配列番号３におけるミノ酸位置数から差し引くことにより（例えば、ポリペプチドＥＰＯ短２がアミノ酸５４から１４２（８９のアミノ酸）を欠く場合、Ｓ１４７Ｃ変異は、この特定のポリペプチドに関してＳ５８Ｃに相当する）容易に同定される。
【００６７】
別の実施形態において、本発明は、グリコシル化に関して１つから６つまでの追加部位を有するようなポリペプチドとはさらに異なる本明細書において上記のＥＰＯ短２ポリペプチド又はＥＰＯ短２ポリペプチドの変異体を含むか、又はそれらからなる単離ポリペプチドに相当するＥＰＯポリペプチドの類似体にある。１つ以上のオリゴ糖基によるタンパク質のグリコシル化は、ポリペプチド骨格に沿って特定の位置に生じ、タンパク質安定性、分泌、細胞下局在化、及び生物活性などのタンパク質の物理的性質に影響を及ぼす。グリコシル化は、通常、２つのタイプがある：Ｏ−結合オリゴ糖類は、セリン又はトレオニン残基に結合し、Ｎ−結合オリゴ糖類は、アスパラギン残基に結合する。Ｎ−結合及びＯ−結合オリゴ糖類の双方に見られる１タイプのオリゴ糖は、９つ以上の炭素原子を含有するアミノ糖類のファミリーであるＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）である。シアル酸は負電荷を有し、糖タンパク質に酸性を付与することから、シアル酸は、通常、Ｎ−結合及びＯ−結合オリゴ糖類上の双方の末端残基である。１つのＮ−結合グリコシル化部位：ＥＰＯｗｔｍの２４位におけるアスパラギン残基及びＯ結合グリコシル化部位：ＥＰＯｗｔｍの１２６位に配置されるセリン残基は、ＥＰＯｖ２ｍに保持される（一方、ＥＰＯｗｔｍの３８位と８３位（アスパラギン残基）のＮ結合グリコシル化部位は、ＥＰＯｖ２ｍに存在しない）。本発明のポリペプチドは、シアル酸結合に対する部位数の増加をもたらすアミノ酸配列の１つ以上の変化により本明細書において上記のＥＰＯｖ２又はＥＰＯ短２ポリペプチド或いはＥＰＯ短２ポリペプチド変異体の類似体を含む。これらの糖タンパク質類似体は、グリコシル化に利用できる部位を増加させるか、又は変化させるアミノ酸残基の付加、欠失、又は置換を有する部位特異的変異誘発により作出できる。ヒトエリスロポエチンに見られるものよりも大きなシアル酸レベルを有する本発明のＥＰＯ類似体は、生物活性に必要な第二級又は第三級立体配座を摂動しないグリコシル化部位を付加することにより作出される。本発明のポリペプチドはまた、通常、Ｎ−結合又はＯ−結合部位に密接した１つ以上のアミノ酸の置換を含むグリコシル化部位に炭水化物結合の増加レベルを有するＥＰＯ類似体を含む。本発明のポリペプチドはまた、エリスロポエチンのカルボキシ末端から伸長する１つ以上のアミノ酸を有し、少なくとも１つの追加炭水化物部位を提供するＥＰＯ類似体を含む。本発明のポリペプチドはまた、グリコシル化用に少なくとも１つの部位の転移を含むアミノ酸配列を有するＥＰＯ類似体を含む。このようなグリコシル化部位の転移は、本明細書において上記のＥＰＯｖ２又はＥＰＯ短２、或いはＥＰＯ短２ポリペプチドの変異体における１つ以上のグリコシル化部位の欠失及び１つ以上の非天然グリコシル化部位の付加を含む。エリスロポエチン上の炭水化物鎖数の増加、したがって、１エリスロポエチン分子当たりのシアル酸数を増加させることにより、安定性の増加、より大きな耐タンパク分解性、免疫原性の減少、血清中半減期の増加、生物活性の増加など、有利な性質を付与できる。追加のグリコシル化部位を有するエリスロポエチン類似体は、欧州特許出願第６４０，６１９号、ＰＣＴ出願ＷＯ００２４８９３及びＷＯ０１８１４０５に、さらに詳細に開示されている。
【００６８】
好ましい実施形態において、本発明のこのようなＥＰＯ類似体は、８４位、９６位、１１３位、１１５位、１１６位又は１４１位において少なくとも１つの追加Ｎ−結合グリコシル化部位を含み、本明細書において上記のＥＰＯ短２ポリペプチド又はＥＰＯ短２ポリペプチドの変異体を含むか、又はそれらからなる。既に本明細書の上記に説明されたように、所与の位置は、配列番号３におけるアミノ酸のナンバリングに関連する。このナンバリングは、ＥＰＯ短２又は変異ポリペプチドの各々に関して５３位後のアミノ酸（トレオニン）について異なり、ＥＰＯｗｔと比較してＥＰＯ短２に、又はＥＰＯ短２ポリペプチドの変異体に欠いているアミノ酸数に依存する。別の実施形態において、このようなＥＰＯ類似体は、少なくとも２つの追加グリコシル化部位、又は少なくとも３つの追加グリコシル化部位、或いは少なくとも４つの追加グリコシル化部位を含む。
【００６９】
好ましい実施形態において、本発明のこれらＥＰＯ類似体は、以下の：
【化１５】
2009517009.tif 000016
から選択される修飾により修飾された、本明細書において上記のＥＰＯ短２ポリペプチド、又はＥＰＯ短２ポリペプチドの変異体を含むか、又はそれらからなる。
【００７０】
既に本明細書の上記に述べられたように、所与の位置は、配列番号３におけるアミノ酸のナンバリングに関連する。このナンバリングは、ＥＰＯ短２ポリペプチドの各々に関して５３位後のアミノ酸（トレオニン）について異なり、ＥＰＯｗｔと比較してＥＰＯ短２に、又はＥＰＯ短２ポリペプチドの変異体に欠いているアミノ酸数に依存する。
【００７１】
さらに好ましい実施形態において、本明細書の上記のペプチドは、Ｎ末端シグナルペプチドを欠く成熟ペプチドである。さらに特に、本発明のポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸１から２７までからなるシグナルペプチドを欠いている。したがって、特定の態様において、本発明は、アミノ酸１から２７を欠く本明細書の上記に開示されたＥＰＯ短２ポリペプチド、又は前記ポリペプチドの変異体或いは類似体を含むか、又はそれらからなるポリペプチドにある。さらに別の特定の態様において、本発明は、上記に定義された配列番号６のアミノ酸２８から１０４の配列又は前記配列の変異体或いは類似体を含むか、又はそれらからなるポリペプチドにある。
【００７２】
さらなる態様において、本発明は、本明細書において上記の１．３節に記載されたＥＰＯ短２ポリペプチドの相同体、又は前記ＥＰＯ短２ポリペプチドの変異体或いはＥＰＯポリペプチドの類似体を含むか、又はそれらからなる単離ポリペプチドにある。特定の実施形態において、前記相同体は、ＥＰＯ短２ポリペプチド、又は前記ＥＰＯ短２ポリペプチドの変異体或いはＥＰＯポリペプチドの類似体と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性なポリペプチドとして定義される。好ましくは、前記同一性は、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９．５％のアミノ酸配列同一性である。通常、相同体ポリペプチドは、長さが１２０から７７までのアミノ酸、長さが１１０から７７までのアミノ酸、しばしば長さが１０５から７７までのアミノ酸、さらにしばしば長さが１０４のアミノ酸、さらにしばしば長さが８０のアミノ酸、さらにしばしば長さが７９のアミノ酸、さらにしばしば長さが７８のアミノ酸、さらにしばしば長さが７７のアミノ酸である。特定の実施形態において、前記相同体は、配列番号６に示されたポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性なポリペプチド（ＥＰＯｖ２）又は配列番号６のアミノ酸２８から１０４までの配列を有するポリペプチド（ＥＰＯｖ２ｍ）からなるか、又はそれらを含む。好ましくは、前記同一性は、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９．５％のアミノ酸配列同一性である。通常、ＥＰＯｖ２の相同体ポリペプチドは、長さが１２５のアミノ酸、さらにしばしば長さが１１５のアミノ酸、さらにしばしば長さが１１０のアミノ酸、さらにしばしば長さのアミノ酸、さらにしばしば長さが１０９のアミノ酸、さらにしばしば長さが１０８のアミノ酸、さらにしばしば長さが１０７のアミノ酸、さらにしばしば長さが１０６のアミノ酸、さらにしばしば長さが１０５のアミノ酸、さらにしばしば長さが１０４のアミノ酸である。通常、ＥＰＯｖ２ｍの相同体ポリペプチドは、長さが９０のアミノ酸、さらにしばしば長さが８５のアミノ酸、さらにしばしば長さが８０のアミノ酸、さらにしばしば長さが７９のアミノ酸、さらにしばしば長さが７８のアミノ酸、さらにしばしば長さが７７のアミノ酸である。
【００７３】
本明細書で同定されたＥＰＯポリペプチド配列に関して「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、必要ならば最大パーセントの配列同一性を達成するために、配列同一性の一部としていずれの保存的置換を考慮せずに、配列の位置合わせをし、ギャップを導入した後、特定のＥＰＯポリペプチド配列においてアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを測定する目的のための位置合わせは、例えば、ＢＬＡＳＴなどの公的に利用できるコンピュータソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ、Ｇｉｓｈ  Ｗ、Ｍｉｌｌｅｒ  Ｗ、Ｍｙｅｒｓ  ＥＷ、Ｌｉｐｍａｎ  ＤＪ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９０）．２１５（３）：４０３〜４１０頁）を用いて当業界の範囲内にある種々の方法で達成できる。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大位置合わせを達成するために必要な任意のアルゴリズムなど、位置合わせを測定するために適切なパラメーターを決定できる。
【００７４】
１．４  ＥＰＯｖ３ポリペプチド及びそれらの変異体
さらなる態様において、本発明は、配列番号８に示された配列を含むか、又はそれからなる単離ポリペプチドにある。配列番号８に示された配列を有するポリペプチドは、初めて本明細書に開示されたＥＰＯの新規な転写変異体のＣ末端部分に相当し、エキソン４Ａの３’末端によりコード化される。前記エキソン４Ａは、野生型ＥＰＯをコードするエキソン４と比較して３’末端がより長い（図３及び６を参照）。
【００７５】
本明細書に開示された種々のポリペプチドを記載するために用いられる用語の「単離」とは、その天然環境の成分から識別、分離及び／又は回収されるポリペプチドを意味する。したがって、本発明の単離産物は、培養上澄み液に含有させ、部分的に濃縮若しくは精製し、異種供給源から産生し、ベクター中にクローニングし、又は媒体と共に製剤化することができる。
【００７６】
さらなる態様において、本発明は、配列番号８に示されたポリペプチドの変異体を含むか、又はそれからなる単離ポリペプチドにある。変異体は、配列番号８と少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドとして定義される。通常、変異ポリペプチドは、長さが少なくとも８つのアミノ酸、しばしば長さが少なくとも１０のアミノ酸、さらにしばしば長さが少なくとも１２のアミノ酸である。より好ましくは、該変異体は、２つ、さらにより好ましくは１つのアミノ酸により配列番号８とは異なる。
【００７７】
本明細書で同定されたＥＰＯポリペプチド配列に関して「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、必要ならば最大パーセントの配列同一性を達成するために、配列同一性の一部としていずれの保存的置換を考慮せずに、配列の位置合わせをし、ギャップを導入した後、特定のＥＰＯポリペプチド配列においてアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを測定する目的のための位置合わせは、例えば、ＢＬＡＳＴなどの公的に利用できるコンピュータソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ、Ｇｉｓｈ  Ｗ、Ｍｉｌｌｅｒ  Ｗ、Ｍｙｅｒｓ  ＥＷ、Ｌｉｐｍａｎ  ＤＪ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９０）．２１５（３）：４０３〜４１０頁）を用いて当業界の範囲内にある種々の方法で達成できる。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大位置合わせを達成するために必要な任意のアルゴリズムなど、位置合わせを測定するために適切なパラメーターを決定できる。
【００７８】
さらなる態様において、本発明は、配列番号９に示された配列を含むか、又はそれからなる単離ポリペプチドにある。配列番号９のポリペプチド（以後ＥＰＯｖ３と命名される）は、ヒト遺伝子ＥＰＯのエキソン１、２、３及びより長いエキソン４（本明細書においてエキソン４Ａと命名される）によりコード化されるＥＰＯの新規な転写変異体である（図６を参照）。このより長いエキソン４（エキソン４Ａ）は、ＥＰＯの新規な転写変異体のＣ末端部分をコードし、最初に本明細書に開示される。前記エキソン４Ａは、野生型ＥＰＯをコードするエキソン４と比較して３’末端がより長い（図３及び６を参照）。
【００７９】
図６において、示されるヒト転写変異体のヌクレオチド１から６０７までは、エキソン１、２、３の接合点及びエキソン４Ａの５’末端を表し、ヌクレオチド６０８から６４７までは、エキソン４Ａの３’末端を表す。ＥＰＯｖ３は、その未成熟形態での１５４のアミノ酸のポリペプチドである。Ｎ末端シグナルペプチドは、最初の２７のアミノ酸を含む。シグナルペプチドが開裂されると、生じたタンパク質は１２７のアミノ酸長であり、以後ＥＰＯｖ３ｍ（配列番号９のアミノ酸２８から１５４まで）と命名される。ＥＰＯｖ３の配列は、アミノ酸１から１４２までのＥＰＯｗｔ（図３及び配列番号３に示される）に共通しており、そのＣ末端（アミノ酸１４３から１５４まで）において異なる。ＥＰＯｖ３（図４及び配列番号９に示される）は、逆平行長ヘリックス、αＡ（ＥＰＯｗｔｍの残基８〜２６）、αＢ（ＥＰＯｗｔｍの残基５５〜８３）及びαＣ（ＥＰＯｗｔｍの残基９０〜１１２）を保持すると結論付けることができる。αＤヘリックス（ＥＰＯｗｔｍの残基１３８〜１６１）は、ＥＰＯｖ３ｍに存在しない。逆平行βシート：β１（ＥＰＯｗｔｍの残基３９〜４１）及びβ２（ＥＰＯｗｔｍの残基１３３〜１３５）もまた存在する。ジスルフィド結合、ＡＢループの一部とαＡヘリックスの末端とを結合するＣｙｓ２９からＣｙｓ３３もまた保持されるはずである。２つの追加の短いヘリックス、αＢ’ヘリックス（ＥＰＯｗｔｍの残基４７〜５２）及びミニヘリックスαＣ’（ＥＰＯｗｔｍの残基１１４〜１２１）もまたＥＰＯｖ３ｍに保持される。システインＣｙｓ７は保持されるが、Ｃｙｓ７とジスルフィド架橋を形成するシステインＣｙｓ１６１は存在しない。しかしながら、エキソン４Ａの新規な３’末端は、Ｃｙｓ７とジスルフィド架橋を形成し得る配列番号９（ＥＰＯｖ３）の１５０位、又はＥＰＯｖ３ｍの１２３位におけるシステインをコードする。
【００８０】
さらなる態様において、本発明は、ＥＰＯｖ３の変異体を含むか、又はそれからなる単離ポリペプチドにある。特定の実施形態において、配列番号９に示されたポリペプチドの変異体（ＥＰＯｖ３）は、配列番号９の配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９．５％のアミノ酸配列同一性を有する活性なポリペプチドとして定義される。通常、ＥＰＯｖ３変異ポリペプチドは、少なくとも長さが１２５のアミノ酸、しばしば少なくとも長さが１４０のアミノ酸、しばしば少なくとも長さが１４５のアミノ酸、しばしば少なくとも長さが１５０のアミノ酸、さらにしばしば少なくとも長さが１５４のアミノ酸である。さらに好ましくは、本発明のＥＰＯｖ３変異体は、配列番号９と比較して１つ又はいくつかのアミノ酸置換、典型的には０から１０のアミノ酸置換、さらにより典型的には０から５つ、４つ、３つ、２つ又は１つのアミノ酸置換を含むポリペプチドにある。さらに特に、ＥＰＯｖ３変異ポリペプチドは、
【化１６】
2009517009.tif 000017
からなる群において選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により配列番号９に示された配列とは異なる。別の実施形態において、ＥＰＯｖ３変異ポリペプチドは、Ｄ７０Ｎ及びＧ１０４Ｓからなる群において選択される１つ又は２つの変異により配列番号９に示された配列とは異なる。さらに別の実施形態において、ＥＰＯｖ３変異ポリペプチドは、
【化１７】
2009517009.tif 000018
からなる群において選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により配列番号９に示された配列とは異なる。さらに別の実施形態において、ＥＰＯｖ３変異ポリペプチドは、Ｋ７２Ｄ／Ｓ１２７Ｅ、Ａ５７Ｎ／Ｈ５９Ｔ、Ｒ１３０Ｅ／Ｌ１３５Ｓ、Ｎ５１Ｋ／Ｎ６５Ｋ／Ｎ１１０Ｋ、及びＹ４２Ａ／Ｎ５１Ｋからなる群において選択される変異の組合せの１つにより配列番号９に示された配列とは異なる。好ましい実施形態において、ＥＰＯｖ３変異ポリペプチドは、Ｃ３４Ｓからなる変異により配列番号９に示された配列とは異なる。
【００８１】
特定の実施形態において、ＥＰＯｖ３変異ポリペプチドは、グリコシル化に関して１つから６つの追加の部位を有するものなど、記載された上記のポリペプチド（配列番号９に示されたポリペプチド；又は
【化１８】
2009517009.tif 000019
からなる群において選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により配列番号９に示された配列とは異なるポリペプチド；又はＤ７０Ｎ及びＧ１０４Ｓからなる群において選択される少なくとも１つ及び２つの変異により配列番号９に示された配列とは異なるポリペプチド；又は
【化１９】
2009517009.tif 000020
からなる群において選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により配列番号９に示された配列とは異なるポリペプチド；又は
【化２０】
2009517009.tif 000021
からなる群において選択される変異の組合せの１つにより配列番号９に示された配列とは異なるポリペプチド；又はＣ３４Ｓからなる変異により配列番号９に示された配列とは異なるポリペプチド）とは異なる。１つ以上のオリゴ糖基によるタンパク質のグリコシル化は、ポリペプチド骨格に沿って特定の位置に生じ、タンパク質安定性、分泌、細胞下局在化、及び生物活性などのタンパク質の物理的性質に影響を及ぼす。グリコシル化は、通常、２つのタイプがある。Ｏ−結合オリゴ糖類は、セリン又はトレオニン残基に結合し、Ｎ−結合オリゴ糖類は、アスパラギン残基に結合する。Ｎ−結合及びＯ−結合オリゴ糖類の双方に見られる１タイプのオリゴ糖は、９つ以上の炭素原子を含有するアミノ糖類のファミリーであるＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）である。シアル酸は負電荷を有し、糖タンパク質に酸性を付与することから、シアル酸は、通常、Ｎ−結合及びＯ−結合オリゴ糖類上の双方の末端残基である。Ｎ−結合グリコシル化部位：ＥＰＯｗｔｍの２４位、３８位及び８３位におけるアスパラギン残基は、ＥＰＯｖ３ｍに保持される（一方、Ｏ−結合グリコシル化部位：ＥＰＯｗｔｍの１２６位に配置されるセリン残基は、ＥＰＯｖ３ｍに存在しない）。特定の実施形態において、本発明のＥＰＯｖ３変異体は、シアル酸結合に対する部位数の増加をもたらすアミノ酸配列の１つ以上の変化を有する類似体を含む。これらの糖タンパク質類似体は、グリコシル化に利用できる部位を増加させるか、又は変化させるアミノ酸残基の付加、欠失、又は置換を有する部位特異的変異誘発により作出できる。特定の実施形態において、ヒトエリスロポエチンに見られるものよりも大きなシアル酸レベルを有するＥＰＯｖ３変異体は、生物活性に必要な第二級又は第三級立体配座を摂動しないグリコシル化部位を付加することにより作出される。特定の実施形態において、本発明のＥＰＯｖ３変異体はまた、通常、Ｎ−結合又はＯ−結合部位に密接した１つ以上のアミノ酸の置換を含むグリコシル化部位に炭水化物結合の増加レベルを有する類似体を含む。特定の実施形態において、本発明のＥＰＯｖ３変異体はまた、エリスロポエチンのカルボキシ末端から伸長する１つ以上のアミノ酸を有し、少なくとも１つの追加の炭水化物部位を提供する類似体を含む。特定の実施形態において、本発明のＥＰＯｖ３変異体はまた、グリコシル化用に少なくとも１つの部位の転移を含むアミノ酸配列を有する類似体を含む。このようなグリコシル化部位の転移は、ＥＰＯｖ３において（又は
【化２１】
2009517009.tif 000022
からなる群において選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により；又はＤ７０Ｎ及びＧ１０４Ｓからなる群において選択される少なくとも１つ及び２つの変異により；又は
【化２２】
2009517009.tif 000023
からなる群において選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により；又は
【化２３】
2009517009.tif 000024
からなる群において選択される変異の組合せの１つにより；又はＣ３４Ｓからなる変異により、配列番号９に示された配列とは異なるポリペプチドにおいて）１つ以上のグリコシル化部位の欠失及び１つ以上の非天然グリコシル化部位の付加を含む。エリスロポエチン上の炭水化物鎖数の増加、したがって、１エリスロポエチン分子当たりのシアル酸数を増加させることにより、安定性の増加、より大きな耐タンパク分解性、免疫原性の減少、血清中半減期の増加、生物活性の増加など、有利な性質を付与できる。追加のグリコシル化部位を有するエリスロポエチン類似体は、欧州特許出願第６４０，６１９号、ＰＣＴ出願ＷＯ００２４８９３及びＷＯ０１８１４０５に、さらに詳細に開示されている。
【００８２】
特定の実施形態において、本発明のＥＰＯｖ３変異体は、５７位、７８位、７９位、８０位、８２位、８４位、９６位、１１３位、１１５位、１１６位又は１４１位に少なくとも１つの追加Ｎ−結合グリコシル化部位を含み、配列番号９のアミノ酸配列（又は
【化２４】
2009517009.tif 000025
からなる群において選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により；又はＤ７０Ｎ及びＧ１０４Ｓからなる群において選択される少なくとも１つ及び２つの変異により；又は
【化２５】
2009517009.tif 000026
からなる群において選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により；又は
【化２６】
2009517009.tif 000027
からなる群において選択される変異の組合せの１つにより；又はＣ３４Ｓからなる変異により、このような配列とは異なるアミノ酸配列）を含むか、又はこれらからなる。別の実施形態において、このようなＥＰＯｖ３変異体は、少なくとも２つの追加グリコシル化部位、又は少なくとも３つの追加グリコシル化部位、或いは少なくとも４つの追加グリコシル化部位を含む。
【００８３】
好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯｖ３変異体は、配列番号９の配列（又は
【化２７】
2009517009.tif 000028
からなる群において選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により；又はＤ７０Ｎ及びＧ１０４Ｓからなる群において選択される１つ又は２つの変異により；又は
【化２８】
2009517009.tif 000029
からなる群において選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により；又は
【化２９】
2009517009.tif 000030
からなる群において選択される変異の組合せの１つにより；又はＣ３４Ｓからなる変異により、配列番号９とは異なるアミノ酸配列）を含むか、又はこれらからなり、以下の：
【化３０】
2009517009.tif 000031
から選択される修飾により修飾される。
【００８４】
アミノ酸配列の修飾のために本明細書に用いられる表記は、指定された位置での野生型アミノ酸は、それぞれの番号直後のアミノ酸に変えられることを意味する。このナンバリングは、配列番号９におけるアミノ酸のナンバリングに関連する。したがって例えば、Ａ５７Ｎ変異は、配列番号９の５７位におけるアミノ酸Ａ（アラニン）のアミノ酸Ｎ（アスパラギン）への変異に相当する。
【００８５】
ＥＰＯｖ３変異体はまた、グリコシル化のために少なくとも１つの部位の転移を含むアミノ酸配列を有する類似体であり得る。この転移は、ヒトエリスロポエチンにおける任意のＮ−結合炭水化物部位の欠失及び配列番号９の１１５位におけるＮ−結合炭水化物部位の付加を含むことができる。好ましくは、これらのＥＰＯｖ３変異体は、配列番号９の配列（又は
【化３１】
2009517009.tif 000032
からなる群において選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により；又はＤ７０Ｎ及びＧ１０４Ｓからなる群において選択される１つ又は２つの変異により；又は
【化３２】
2009517009.tif 000033
からなる群において選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の変異により；又は
【化３３】
2009517009.tif 000034
からなる群において選択される変異の組合せの１つにより；又はＣ３４Ｓからなる変異により、配列番号９のアミノ酸配列）を含むか、又はこれらからなり、以下の：
【化３４】
2009517009.tif 000035
から選択される修飾により修飾される。
【００８６】
好ましい実施形態において、上記のペプチドは、Ｎ末端シグナルペプチドを欠く成熟ペプチドである。さらに特に、本発明のポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸１から２７までからなるシグナルペプチドを欠いている。したがって、特定の態様において、本発明は、１から２７までのアミノ酸を欠くＥＰＯｖ３ポリペプチド又は上記に開示された前記ポリペプチドの変異体又は類似体を含むか、又はそれらからなるポリペプチドにある。さらに別の特定の態様において、本発明は、上記に定義された配列番号９のアミノ酸２８から１５４までの配列又は前記配列の変異体を含むか、又はそれらからなるポリペプチドにある。
【００８７】
さらなる態様において、本発明は、本明細書において上記の１．４節に記載されたポリペプチドの相同体を含むか、又はそれからなる単離ポリペプチドにある。特定の実施形態において、前記相同体は、参照のポリペプチド、又は前記ポリペプチドの変異体或いは前記ポリペプチドの類似体と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性なポリペプチドとして定義される。好ましくは、前記同一性は、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９．５％のアミノ酸配列同一性である。通常、相同体ポリペプチドは、長さが１７０から１２７までのアミノ酸、しばしば長さが１６０から１２７までのアミノ酸、さらにしばしば長さが１５４から１２７までのアミノ酸、さらにしばしば長さが１３０のアミノ酸、さらにしばしば長さが１２９のアミノ酸、さらにしばしば長さが１２８のアミノ酸、さらにしばしば長さが１２７のアミノ酸である。特定の実施形態において、前記相同体は、配列番号９に示されたポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性なポリペプチド（ＥＰＯｖ３）又は配列番号９のアミノ酸２８から１５４までの配列を有するポリペプチド（ＥＰＯｖ３ｍ）からなるか、又はそれらを含む。好ましくは、前記同一性は、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９．５％のアミノ酸配列同一性である。通常、ＥＰＯｖ３の相同体ポリペプチドは、長さが１７０のアミノ酸、さらにしばしば長さが１６０のアミノ酸、さらにしばしば長さが１５９のアミノ酸、さらにしばしば長さが１５８のアミノ酸、さらにしばしば長さが１５７のアミノ酸、さらにしばしば長さが１５６のアミノ酸、さらにしばしば長さが１１５５のアミノ酸、さらにしばしば長さが１５４のアミノ酸である。通常、ＥＰＯｖ３ｍの相同体ポリペプチドは、長さが１５０のアミノ酸、さらにしばしば長さが１４０のアミノ酸、さらにしばしば長さが１３０のアミノ酸、さらにしばしば長さが１２９のアミノ酸、さらにしばしば長さが１２８のアミノ酸、さらにしばしば長さが１２７のアミノ酸である。
【００８８】
本明細書で同定されたＥＰＯポリペプチド配列に関して「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、必要ならば最大パーセントの配列同一性を達成するために、配列同一性の一部としていずれの保存的置換を考慮せずに、配列の位置合わせをし、ギャップを導入した後、特定のＥＰＯポリペプチド配列においてアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを測定する目的のための位置合わせは、例えば、ＢＬＡＳＴなどの公的に利用できるコンピュータソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ、Ｇｉｓｈ  Ｗ、Ｍｉｌｌｅｒ  Ｗ、Ｍｙｅｒｓ  ＥＷ、Ｌｉｐｍａｎ  ＤＪ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９０）．２１５（３）：４０３〜４１０頁）を用いて当業界の範囲内にある種々の方法で達成できる。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大位置合わせを達成するために必要な任意のアルゴリズムなど、位置合わせを測定するために適切なパラメーターを決定できる。
【００８９】
１．５  ＥＰＯポリヌクレオチドの生物活性及び本発明の変異体
上記又は下記のＥＰＯポリヌクレオチド、変異体及び類似体のいずれも、少なくともいくつかの生物活性を保持することが好ましい。より好ましくは、前記生物活性は、以下の項目の少なくとも１つである：ＥＰＯＲに対する結合、ＥＰＯＲ発現細胞におけるＪＡＫ２のチロシンリン酸化の誘導、ＥＰＯＲ発現細胞の増殖刺激、哺乳動物、特にヒトにおける赤血球細胞の産生刺激、哺乳動物起源、特にヒト起源のインビトロ及び／又はインビボでの赤血球細胞の増殖及び／又は終末成熟の誘導、哺乳動物（特にヒトにおける）における血管作動性作用（血管収縮又は血管拡張）特に高血圧の誘導、哺乳動物、特にヒトにおけるヘマトクリットの増加、活性化過剰血小板、凝血原活性、血小板の産生増加、哺乳動物、特にヒトにおけるインビトロ及び／又はインビボでの神経保護活性、哺乳動物、特にヒトにおけるインビトロ及び／又はインビボでの神経栄養活性、哺乳動物、特にヒトにおけるインビトロ及び／又はインビボでの神経細胞の生存の増強、哺乳動物、特にヒトにおけるインビトロ及び／又はインビボでの心保護活性、哺乳動物、特にヒトにおけるインビトロ及び／又はインビボでの心筋細胞の生存の増強、哺乳動物起源、特にヒト起源のインビトロ及び／又はインビボでの癌細胞（好ましくは、腎、前立腺、卵巣又は乳房に由来する細胞、又はリンパ腫細胞（特に濾胞性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫）、又は白血病細胞（特に慢性リンパ球性リンパ腫又は慢性骨髄性リンパ腫）、又は多発性骨髄腫細胞、又は中枢神経系に影響を及ぼす腫瘍細胞（特に神経膠芽腫又は神経芽腫））の増殖刺激、インビトロ及び／又はインビボ抗ウィルス活性（特にＢ型又はＣ型肝炎或いはＨＩＶに対して）。
【００９０】
さらにより好ましくは、前記生物活性は、以下の項目の少なくとも１つである：哺乳動物、特にヒトにおけるインビトロ及び／又はインビボでの神経保護活性、哺乳動物、特にヒトにおけるインビトロ及び／又はインビボでの神経栄養活性、哺乳動物、特にヒトにおけるインビトロ及び／又はインビボでの神経細胞の生存の増強、哺乳動物、特にヒトにおけるインビトロ及び／又はインビボでの心保護活性、哺乳動物、特にヒトにおけるインビトロ及び／又はインビボでの心筋細胞の生存の増強。
【００９１】
これらの生物活性は、それ自体当業界に知られているいくつかの生物学的アッセイを用いて立証できる（このようなアッセイの非限定例は、本明細書における下記の実施例に記載されている）。より好ましくは、上記又は下記のＥＰＯポリペプチド、変異体及び類似体のいずれも、天然／非修飾／野生型ＥＰＯタンパク質（このタンパク質の未成熟形態は、配列番号３に示される）の生物活性と比較して、少なくとも（又は少なくともおよそ）５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％保持する。この態様の本発明のいくつかの実施形態において、このタンパク質は、天然／非修飾／野生型タンパク質よりも高い生物活性を有することができる。
【００９２】
本発明の実施形態において、上記又は下記のＥＰＯポリペプチド、変異体及び類似体は、実質的に哺乳動物においてヘマトクリット濃度を増加させることなく、前記哺乳動物、特にヒトにおける組織保護活性を有する。用語「組織保護」とは、虚血／低酸素症、精神的外傷、毒性及び／又は炎症の組織又は臓器による経験に対し典型的に関連する細胞損傷作用に対する組織防御のことである。細胞損傷は、アポトーシス及び／又は壊死（即ち、毒性細胞死）に導き得る。このように、「組織保護」効果は、通常、所与の精神的外傷、炎症、毒性又は虚血傷害と関連するアポトーシス及び／又は毒性細胞死の程度を経験することから組織を保護する。例えば、ＥＰＯは、神経保護性（Ｓｉｒｅｎ  ＡＬら、（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００１年、９８（７）：４０４４〜９頁）及びＢｒｉｎｅｓ  ＭＬら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０００年、９７（１９）：１０５２６〜３１））、及び心保護性（Ｐａｒｓａ  ＣＪら（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００３年、１１２（７）：９９９〜１００７頁、Ｍｏｏｎ  Ｃら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３年；１００（２０）：１１６１２〜７頁）及びＣａｌｖｉｌｌｏ  Ｌら、（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３年、１００（８）：４８０２〜６頁））であることが判明している。したがって、このような条件下のＥＰＯは、通常、虚血傷害（例えば、虚血発作）に関連する壊死及び／又はアポトーシスを有効に減少させることにより「組織保護」効果を呈する。「組織保護」とはまた、細胞損傷作用及び、引き続く網膜症、又は神経変性疾患などの変性疾患に関連する細胞死に対する組織の防御のことである。
【００９３】
本発明の好ましい態様において、上記又は下記のＥＰＯポリペプチド、変異体及び類似体は、実質的に前記哺乳動物においてヘマトクリット濃度を増加させることなく組織保護活性を有し、前記組織保護活性は、以下の項目の少なくとも１つである：神経保護活性、神経栄養活性、心保護活性、肝保護活性、網膜の保護、筋肉の保護、肺の保護、腎臓の保護、小腸の保護、副腎皮質の保護、副腎髄質の保護、毛細血管内皮の保護、精巣の保護、卵巣の保護、及び子宮内膜組織の保護。本発明のさらなる好ましい態様において、上記又は下記のＥＰＯポリペプチド、変異体及び類似体は、実質的に前記哺乳動物においてヘマトクリット濃度を増加させることなく組織保護活性を有し、前記組織保護活性は、以下の項目の少なくとも１つである：神経保護活性、神経栄養活性、心保護活性。本発明のさらなる好ましい態様において、上記又は下記のＥＰＯポリペプチド、変異体及び類似体は、実質的に前記哺乳動物においてヘマトクリット濃度を増加させることなく組織保護活性を有し、前記組織保護活性は、神経保護活性及び／又は神経栄養活性である。これらの活性は、それ自体当業界に知られているいくつかの生物学的アッセイを用いて試験することができる（このようなアッセイの非限定例は、本明細書における下記の実施例に記載されている）。
【００９４】
本発明の実施形態において、上記又は下記のＥＰＯポリペプチド、変異体及び類似体は、哺乳動物、特にヒトにおける神経保護活性を有する。前記神経保護活性は、生物学的試験、特に実施例１１に記載された生物学的試験（坐骨神経圧潰）を用いて測定できる。したがって本発明の実施形態において、上記又は下記のＥＰＯポリペプチド、変異体及び類似体は、神経圧潰後、少なくとも約０．０２ｍｓ、好ましくは少なくとも約０．０５ｍｓ、好ましくは少なくとも約０．１ｍｓ、さらに好ましくは少なくとも約０．１５ｍｓの複合筋肉活動電位（ＣＭＡＰ）潜伏時間の減少を誘導する。本発明の実施形態において、上記又は下記のＥＰＯポリペプチド、変異体及び類似体は、実施例１１に記載された生物学的試験（坐骨神経圧潰実験）を用いて測定された非処理動物と比較して、７日目に少なくとも約０．０２ｍｓ、好ましくは少なくとも約０．０５ｍｓ、好ましくは少なくとも約０．１ｍｓ、さらに好ましくは少なくとも約０．１５ｍｓの複合筋肉活動電位（ＣＭＡＰ）潜伏時間の減少を誘導する。本発明の実施形態において、上記又は下記のＥＰＯポリペプチド、変異体及び類似体は、実施例１１に記載された生物学的試験（坐骨神経圧潰実験）を用いて測定された非処理動物と比較して、１４日目に少なくとも約０．０２ｍｓ、好ましくは少なくとも約０．０５ｍｓ、好ましくは少なくとも約０．１ｍｓ、さらに好ましくは少なくとも約０．１５ｍｓの複合筋肉活動電位（ＣＭＡＰ）潜伏時間の減少を誘導する。
【００９５】
本発明の実施形態において、上記又は下記のＥＰＯポリペプチド、変異体及び類似体は、以下の生物活性の少なくとも１つを有する：哺乳動物のシュワン細胞（特にヒトのシュワン細胞）の増殖刺激、哺乳動物（特にヒト）における軸索再生刺激、哺乳動物のシュワン細胞によるＴＮＦアルファ発現の減少（特に神経損傷後のヒトシュワン細胞により産生されたＴＮＦアルファの減少）、特に哺乳動物の乏突起神経膠細胞及び／又は哺乳動物のシュワン細胞（特にヒトの乏突起神経膠細胞及び／又はヒトのシュワン細胞）におけるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の発現刺激。
【００９６】
本発明の実施形態において、上記又は下記のＥＰＯポリペプチド、変異体及び類似体は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の産生を刺激する。前記ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の産生刺激は、生物学的試験、特に実施例１５に記載された生物学的試験を用いて測定できる。したがって本発明の実施形態において、上記又は下記のＥＰＯポリペプチド、変異体及び類似体は、実施例１５に記載された生物学的試験を用いて測定されたように、１６日目に少なくとも約５％、好ましくは少なくとも７％、さらに好ましくは少なくとも１０％まで産生を誘導する。
【００９７】
本発明の好ましい実施形態において、上記又は下記のＥＰＯポリペプチド、変異体及び類似体は、上記又は下記のいずれの生物活性、特に上記に定義された組織保護活性を有するが、哺乳動物、特にヒトにおけるヘマトクリット濃度を実質的に増加させない。特定の実施形態において、上記又は下記のＥＰＯポリペプチド、変異体及び類似体は、前記ポリペプチドが野生型ＥＰＯ（特に市販の製品Ｅｐｒｅｘ）の９０％未満、好ましくは８０％未満、好ましくは７０％未満、好ましくは６０％未満、好ましくは５０％未満、好ましくは４０％未満、好ましくは３０％未満、好ましくは２０％未満、好ましくは１０％未満、好ましくは５％未満、好ましくは２％未満、好ましくは１％未満、さらに好ましくは０．５％未満の血液栄養活性を保持する場合にヘマトクリット濃度を実質的に増加させない。血液栄養活性の判定は、十分に当業者のレベル内にある。本発明のＥＰＯポリペプチドの血液栄養活性は、例えば、実施例１２に記載された技法を用いて野生型ＥＰＯの血液栄養活性と比較して測定できる。
【００９８】
特定の実施形態において、上記又は下記のＥＰＯポリペプチド、変異体及び類似体は、前記ポリペプチドがベースラインのヘマトクリット濃度（即ち、処置前のヘマトクリット濃度）と比較して、約２０％未満、好ましくは約１５％未満、好ましくは約１０％未満、好ましくは約５％未満、さらに好ましくは約１％未満、ヘマトクリット濃度を増加させる場合には実質的にヘマトクリット濃度を増加させない。ヘマトクリット濃度の増加は、ベースラインのヘマトクリット濃度（即ち、処置前）と処置後のヘマトクリットとを比較することにより測定される。一実施形態において、前記処置は、ヒトにおいて１回の注射当たり０．８４μｇ／ｋｇの用量で８週間、１週３回の静脈内処置である。別の実施形態において、ヘマトクリット濃度の増加は、実施例１２に記載されたとおりに測定される。図１０に示されるように、野生型ＥＰＯは、マウスにおける１２日目に約２７％のヘマトクリットの増加を示す（約５０％のヘマトクリット濃度を示すｐＤＥＳＴ１２．２単独で処置された群と、約７７％のヘマトクリット濃度を示すＥＰＯｗｔ−ｐＤＥＳＴ１２．２で処置された群との比較）。
【００９９】
２．融合タンパク質：
本発明はまた、追加のアミノ酸ドメインに作動可能に結合した、上記に開示されたポリペプチド（特にＥＰＯ短ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯ短１ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯ短２ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯｖ３ポリペプチド又はその変異体）を含む融合タンパク質に関する。追加のアミノ酸ドメインは、本明細書の上記のポリペプチドの配列から上流（Ｎ末端）又は下流（Ｃ末端）に配置され得る。この追加のドメインは、例えば、融合タンパク質の安定性、ターゲティング又は生物学的利用能の増加を提供する機能性領域を含むことができ；精製又は産生を容易にし、又は分子に追加の生物活性を付与する。このような追加のアミノ酸配列の特定の例としては、米国特許第６，１９３，９７２号に記載されたＧＳＴ配列、Ｈｉｓタグ配列、多量体化ドメイン、免疫グロブリン分子の定常領域又はヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）などのヘテロ二量体タンパク質ホルモンを含む。用語の「作動可能に結合した」とは、ポリペプチド及び追加のアミノ酸ドメインは、直接的又はスペーサー残基を介してペプチド結合により結合することを示す。この様式で、融合タンパク質は、下記のとおり、同じものをコードする核酸分子の宿主細胞における直接発現により組換え的に産生できる。また、必要ならば、融合タンパク質に含まれた追加のアミノ酸配列は、産生／精製過程の終末、又はインビボで例えば、適切なエンド−／エキソ−ペプチダーゼの手段により除去できる。例えば、融合タンパク質に含まれたスペーサー配列は、インビボ又はインビトロのいずれかで追加のアミノ酸ドメインから所望のポリペプチド変異体の酵素的開裂により分離するために使用できるエンドペプチダーゼ（カスパーゼなど）に対する認識部位を含むことができる。
【０１００】
特定の実施形態において、本発明による融合タンパク質は、免疫グロブリンを含み、即ち上記に開示された本発明のＥＰＯポリペプチド、変異体又は類似体（特に、ＥＰＯ短ポリペプチド若しくはその変異体、ＥＰＯ短１ポリペプチド若しくはその変異体、ＥＰＯ短２ポリペプチド若しくはその変異体、又はＥＰＯｖ３ポリペプチド若しくはその変異体）は、免疫グロブリンのすべて又は一部、特にヒト免疫グロブリンのＦｃ部分に融合される。免疫グロブリン融合タンパク質を作製する方法は、例えば、ＷＯ０１／０３７３７に記載されたものなど当業界によく知られている。本発明の生じた融合タンパク質が、本発明のＥＰＯポリペプチド、変異体又は類似体の生物活性を実質的に保持することを当業者は認識するであろう。前記生物活性は、上記の生物活性の少なくとも１つである。特定の実施形態において、前記生物活性は、哺乳動物、特にヒトにおけるインビトロ及び／又はインビボでの神経保護活性である。
【０１０１】
この融合は、直接的か、又は長さが１つから３つと短いか、又はそれ以上長いアミノ酸残基、例えば、長さが１３のアミノ酸残基であり得る短いリンカーペプチドを経由できる。前記リンカーは、ＥＰＯポリペプチド（特にＥＰＯ短ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯ短１ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯ短２ポリペプチド又はその変異体、又はＥＰＯｖ３ポリペプチド又はその変異体）配列と免疫グロブリン配列との間で導入されたＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔを含む１３−アミノ酸リンカー配列であり得る。免疫グロブリンに由来するアミノ酸配列は、本発明のＥＰＯポリペプチド、変異体又は類似体のＣ末端又はＮ末端、好ましくはＣ末端に結合できる。生じた融合タンパク質は、体液中の滞留時間（半減期）の延長、特定の活性増加、発現レベルの増加などの性質を改善するか、又は融合タンパク質の精製を容易にする。
【０１０２】
好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯポリペプチド、変異体又は類似体（特にＥＰＯ短ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯ短１ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯ短２ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯｖ３ポリペプチド又はその変異体）は、Ｉｇ分子の定常領域、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分に融合する。場合によっては、例えば、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域を有するＣＨ２及びＣＨ３ドメインのような重鎖領域に融合することが好ましい。Ｆｃ部分は、例えば、Ｆｃ受容体などに結合する補体結合など、求められていない活性を防止するために変異できる。Ｉｇ分子の他のイソ体は、例えば、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４、或いはＩｇＭ又はＩｇＡのような他のＩｇクラスなど、本発明による融合タンパク質の作出にも好適である。融合タンパク質は、モノマー又は多量体、ヘテロ多量体又はホモ多量体であり得る。
【０１０３】
本発明のＥＰＯポリペプチド、変異体又は類似体のさらなる融合タンパク質は、その形成又はダイマー、トリマーなどを可能にする他のタンパク質から単離されたドメインを融合することにより調製できる。本発明のポリペプチドの多量化を可能にするタンパク質配列に関する例としては、ｈＣＧ（ＷＯ９７／３０１６１）、コラーゲンＸ（ＷＯ０４／３３４８６）、Ｃ４ＢＰ（ＷＯ０４／２０６３９）、Ｅｒｂタンパク質（ＷＯ９８／０２５４０）、又は多重ペプチド（ＷＯ０１／００８１４）などのタンパク質から単離されたドメインである。
【０１０４】
本発明はまた、このようなタンパク質をコードする対応のＤＮＡ配列と共にシグナルペプチドを含有する本明細書に開示された融合タンパク質に関する。このシグナルペプチドは、本明細書に開示された天然シグナルペプチド、又は異種或いは合成シグナルペプチドであり得る。
【０１０５】
本発明はまた、さらなるＮ末端アミノ酸残基、好ましくはメチオニンを含む上記に開示されたＥＰＯポリペプチド、変異体又は類似体（特にＥＰＯ短ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯ短１ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯ短２ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯｖ３ポリペプチド又はその変異体）のいずれかに関する。実際、発現系及び条件に依って、本発明のポリペプチドは、組換え宿主細胞内で出発のメチオニンにより発現できる。次いでこの追加のアミノ酸は、生じた組換えタンパク質に維持できるか、又は文献（Ｖａｎ  Ｖａｌｋｅｎｂｕｒｇｈ  ＨＡ及びＫａｈｎ  ＲＡ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２００２）３４４：１８６〜９３頁；Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ  Ａ、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）１２：１４７〜５９頁）に開示された方法に従ってメチオニンアミノペプチダーゼなどのエキソペプチダーゼの手段により除去できる。
【０１０６】
３．本発明のポリペプチド及び融合タンパク質の調製
Ａ．本発明のポリペプチド、タンパク質及び融合タンパク質をコードする核酸及びベクター類：
本発明のさらなる目的は、上記に定義されたポリペプチド、タンパク質及び融合タンパク質をコードする単離核酸分子である。これに関して、用語「核酸分子」は、限定はしないが、デオキシリボ核酸（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、合成ＤＮＡなど）、リボ核酸（例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなど）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）など、すべて異なるタイプの核酸を包含する。好ましい実施形態において、核酸分子は、二本鎖ＤＮＡ分子又はｃＤＮＡ分子などのＤＮＡ分子である。用語の「単離」とは、通常、天然源に結合する少なくとも１種の不純物の核酸分子から同定及び分離された核酸分子を意味する。単離核酸分子は、天然に見られる形態又は設定以外のものである。したがって、単離核酸分子は、天然細胞に存在する特異的核酸分子と区別される。
【０１０７】
本発明の特定の目的は、より具体的に
【化３５】
2009517009.tif 000036
からなる群又は相補鎖又はその縮重鎖、又は
【化３６】
2009517009.tif 000037
のポリペプチドをコードする核酸、又はその相補鎖を含むか、又はそれらからなる単離核酸分子にある。縮重配列とは、参照ヌクレオチド配列として同じアミノ酸配列をコードするが、遺伝子コード縮重の結果、異なるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を称す。好ましい実施形態において、核酸分子は、二本鎖ＤＮＡ分子又はｃＤＮＡ分子などのＤＮＡ分子である。
【０１０８】
本発明のさらなる目的は、任意の上記又は下記ポリヌクレオチドをコードするＤＮＡを含むベクターである。該ベクターは、クローニング又は発現ベクターであり、任意の原核細胞又は真核細胞において組込み又は自己複製の機能的であり得る。特に、該ベクターは、プラスミド、コスミド、ウィルス、ファージ、エピソーム、人工染色体などであり得る。該ベクターは、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、複製起点などの調節要素を含むことができる。このようなベクターの具体的な例としては、下記に考察されるように、ｐＢＲ、ｐＵＣ又はｐｃＤＮＡプラスミドなどの原核細胞プラスミド；レトロウィルス、アデノウィルス又はＡＡＶベクターなどのウィルスベクター類；バクテリオファージ；バキュロウィルス；ＢＡＣ又はＹＡＣなどが挙げられ得る。
【０１０９】
適切な核酸配列は、種々の手法によりベクターに挿入できる。一般に、ＤＮＡは、当業界に知られた技法を用いて適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（複数可）に挿入される。ベクター成分としては、限定はしないが一般に、１つ以上のシグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列が挙げられる。１つ以上のこれらの成分を含有する好適なベクターの構築は、当業者に知られている標準的な連結技法を使用する。
【０１１０】
Ｂ．宿主細胞
本発明のさらなる態様は組換え宿主細胞であり、前記細胞は、上記に定義された核酸分子又はベクターを含む。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。原核細胞の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌を含む。真核細胞の例としては、任意の一次的細胞培養又は確立された細胞系（例えば、３Ｔ３、ベロ、ＨＥＫ２９３、ＴＮ５など）を含む酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞及び昆虫細胞である。グリコシル化タンパク質の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２及びスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９などの昆虫細胞、並びに植物細胞が挙げられる。有用な哺乳動物宿主細胞系の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びＣＯＳ細胞が挙げられる。さらに具体的な例としては、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）により変換されたサル腎臓ＣＶ１系；ヒト胎仔腎臓系（懸濁培地中の増殖用にサブクローン化された２９３又は２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９頁（１９７７））；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６頁（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３〜２５１頁（１９８０））；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；及びマウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）が挙げられる。本発明の特に好ましい哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。
【０１１１】
Ｃ．本発明のポリペプチド及び融合タンパク質の産生
本発明のポリペプチド及び融合タンパク質は、組換えテクノロジー、化学合成、クローニング、連結又はそれらの組合せによるなど、それ自体当業界に知られている任意の技法により産生できる。特定の実施形態において、ポリペプチド又は融合タンパク質は、組換えテクノロジー、例えば、好適な宿主細胞における対応する核酸の発現により産生される。したがって、本発明の別の目的は、本発明のＥＰＯポリペプチド、変異体又は類似体（特にＥＰＯ短ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯ短１ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯ短２ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯｖ３ポリペプチド又はその変異体）を産生する方法であり、該方法は、核酸分子の発現を可能にする条件下、本発明の組換え宿主細胞を培養すること、及び産生されたポリペプチドを回収することを含む。産生されたポリペプチドは、グリコシル化されていてもされてなくてもよく、又は使用される宿主細胞タイプに依って他の翻訳後の修飾を含有してもよい。多数の書籍及びレビュー、例えば、オックスフォード大学プレスにより出版された「実用的アプローチ（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」シリーズにおけるいくつかのタイトル（「ＤＮＡクローニング２：発現系（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、１９９５年；「ＤＮＡクローニング４：哺乳動物系（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ４：Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、１９９６年；「タンパク質発現（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、１９９９年；「タンパク質精製技法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、２００１年）などで、ベクター及び原核細胞又は真核細胞を用いた組換えタンパク質をクローン化する方法及び産生する方法を教示している。
【０１１２】
本発明によるポリペプチドを産生する方法に使用されるベクター類は、任意の好適な手段（形質転換、形質移入、接合、原形質融合、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、直接的ミクロ注入など）により適切な宿主細胞に導入できるエピソーム又は非−相同的／相同的組込みベクターであり得る。特定のプラスミド、ウィルス又はレトロウィルスベクターを選択するのに重要な因子としては：ベクターを含有するレシピエント細胞が、ベクターを含有しないこれらのレシピエント細胞から認識し、選択できる容易性；特定の宿主に望まれるベクターのコピー数；異なる種の宿主細胞間でベクターを「輸送」できることが望ましいかどうか、が挙げられる。該ベクター類は、前記細胞において構成的に活性又は誘導性であるように選択される適切な転写開始／終結調節配列の制御下、原核又は真核宿主細胞において本発明のポリペプチド又は融合タンパク質の発現を可能にするはずである。次いでこのような細胞中に実質的に豊富な細胞系を単離して安定な細胞系を提供できる。
【０１１３】
宿主細胞は、タンパク質産生のために本明細書に記載された発現又はクローニングベクターにより形質移入されるか、又は形質転換され、プロモーターを誘導、形質転換体を選択、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅させるために適切に修飾された従来の栄養培地中で培養される。培地、温度、ｐＨなどの培養条件は、過度の実験をすることなく当業者により選択できる。一般に、細胞培養の生産性を最大にする原理、プロトコル、及び実用的技法は、哺乳動物細胞のバイオテクノロジー：実用的アプローチ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編集（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９１年）及びＳａｍｂｒｏｏｋら、上記文献に見ることができる。
【０１１４】
真核宿主細胞（例えば、酵母、昆虫又は哺乳動物細胞）に関して、異なる転写及び翻訳調節配列を、宿主の性質に依って使用できる。それらは、アデノウィルス、パピローマウィルス、シミアンウィルスなどのウィルス源に由来することができ、この調節シグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子に関連する。例としては、ヘルペスウィルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーターなどである。遺伝子発現が調節できるように、抑制及び活性化を可能にする転写開始調節シグナルを選択できる。導入されたＤＮＡにより安定に形質転換された細胞は、発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによっても選択できる。このマーカーはまた、栄養要求性宿主、耐殺生剤性、例えば、抗生物質、又は銅などの重金属に対する光合成を提供できる。選択性マーカー遺伝子は、発現される（例えば、同じベクター上の）ＤＮＡ配列に直接結合できるか、又は共形質移入により同じ細胞に導入できる。追加の要素もまた、本発明のタンパク質の最適合成に必要と考えられる。
【０１１５】
特に好適な原核細胞としては、組換えバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）など）が挙げられる。このような細胞は、典型的にＮ末端メチオニン残基を含むタンパク質を産生し、このようなタンパク質は、本発明の特定の目的物を表す。適正な折りたたみ又は適正な部位でのグリコシル化など、タンパク質分子に翻訳後の修飾を供することから、本発明の用いられる好ましい細胞は、真核宿主細胞、例えば、ヒト、サル（例えば、ＣＯＳ細胞）、マウス及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞である。代替の真核宿主細胞は、酵母発現ベクターにより形質転換された酵母細胞（例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）など）である。また、酵母細胞は、グリコシル化などの翻訳後のペプチド修飾を実施できる。酵母において所望のタンパク質の産生を利用できる、強力なプロモーター配列及びプラスミドの高いコピー数を利用する多くの組換えＤＮＡ方式が存在する。酵母細胞は、クローン化哺乳動物遺伝子産物においてリーダー配列を認識し、リーダー配列を有するポリペプチド（即ち、プレペプチド）を分泌する。
【０１１６】
組換えポリペプチドの長期の高収率産生に関して、安定な発現が好ましい。例えば、対象のポリペプチドを安定に発現する細胞系は、ウィルス複製起点及び／又は内因性発現要素及び同じか又は別個のベクター上の選択性マーカー遺伝子を含有できる発現ベクターを用いて形質転換できる。ベクターの導入後、細胞を、濃縮培地中で１〜２日間増殖させてから、それらを選択性培地に切り替える。選択性マーカーの目的は、耐選択性を付与することであり、その存在は、導入配列を首尾よく発現する細胞の増殖及び回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞タイプに適切な組織培養技法を用いて増殖できる。次に実質的にこのような細胞に富んだ細胞系を単離して安定な細胞系を提供できる。
【０１１７】
本発明の組換えポリペプチドの高収率産生の特に好ましい方法は、米国特許第４，８８９，８０３号に記載されているメトトレキサートの連続濃度増加の使用により、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ細胞においてＤＨＦＲ増幅の使用による。得られたポリペプチドは、グリコシル化形態であり得る。
【０１１８】
発現のための宿主として利用できる哺乳動物の細胞系は、当業界に知られており、限定はしないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、サル腎臓（ＣＯＳ）、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、バウエス（Ｂｏｗｅｓ）黒色腫及びヒト肝細胞癌（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）細胞並びに多数の他の細胞系などＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手できる多数の継代細胞系が挙げられる。バキュロウィルス系において、バキュロウィルス／昆虫細胞発現系に関する材料は、とりわけＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからキット形態で市販されている。
【０１１９】
組換えＤＮＡテクノロジーに加えて、本発明のポリペプチド又は融合タンパク質は、化学合成テクノロジーにより調製できる。化学合成テクノロジーの例としては、固相合成及び液相合成である。固相合成として、例えば、合成されるポリペプチドのカルボキシ末端に相当するアミノ酸は、有機溶媒に不溶性の支持体に結合し、反応の交互の繰返し（例えば、それらのアミノ基と適切な保護基により保護された側鎖官能基との連続縮合）により、ポリペプチド鎖を伸長する。固相合成法は、使用される保護基のタイプに依ってｔＢＯＣ法及びＦｍｏｃ法により主として分類される。ＥＰＯと同等のサイズの全合成タンパク質は、文献に開示される（Ｂｒｏｗｎ  Ａら、１９９６年）。
【０１２０】
本発明のポリペプチドは、製造、製剤化、投与、或いは使用及び／又は製造の所望の方法に従って好ましくなり得る他の代替形態で一般に使用できる。本発明のタンパク質は、例えば、グリコシル化により翻訳後に修飾できる。本発明のポリペプチド又はタンパク質は、単離（又は精製）された生物活性形態、又は前駆体、それらの誘導体及び／又は塩類として提供できる。前記生物活性は、本明細書の上記の生物活性の少なくとも１つである。
【０１２１】
「前駆体」は、細胞又は生物にそれらの投与前又は投与後に代謝及び／又は酵素処理により本発明のポリペプチドに変換できる化合物である。本明細書の用語「塩類」とは、本発明のポリペプチドのカルボキシル基の塩類及びアミノ基の酸付加塩類の双方のことである。カルボキシル基の塩類は、当業界に知られた手段により形成でき、無機塩類、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄又は亜鉛の塩類など、例えば、トリエタノールアミン、アルギニン又はリシン、ピペリジン、プロカインなどのアミン類により形成されたものとしての有機塩基による塩類が挙げられる。例えば、酸付加塩類としては、例えば、塩酸又は硫酸などの鉱酸による塩類、例えば、酢酸又はシュウ酸などの有機酸による塩類が挙げられる。任意のこのような塩類は、本発明のポリペプチドと実質的に同様の活性を有する必要がある。本明細書に用いられる用語「誘導体」とは、それ自体が当業界に知られている方法に従ってアミノ酸部分の側鎖又はアミノ−／又はカルボキシ末端基に存在する官能基から調製できる誘導体のことである。このような誘導体としては、例えば、カルボキシル基のエステル類又は脂肪族アミド類及び遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体又は遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体が挙げられ、例えば、アルカノイル−又はアロイル基としてアシル基により形成される。本発明のポリペプチドの精製は、限定はしないが、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動など、それら自体当業界に知られた種々の方法により実施できる。特定の精製法としては、ポリペプチドに選択的に結合し、カラム内に含まれるゲルマトリックスに典型的に固定化される（モノクローナル）抗体又は親和性基を用いるアフィニティークロマトグラフィーである。本明細書に用いられる本発明のタンパク質の精製調製とは、１５％未満の不純物を含有し、より好ましくは、少なくとも９０、９５又は９７％のポリペプチドを含む調製のことである。
【０１２２】
４．活性結合体又は複合体
本発明のポリペプチド又は融合タンパク質（特にＥＰＯ短ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯ短１ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯ短２ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯｖ３ポリペプチド又はその変異体）は、共有結合又はそうでなく、直接的又はカップリング剤若しくはリンカーの使用により、細胞毒性剤、標識（例えば、ビオチン、蛍光標識）、薬物又は他の治療剤から選択できる異種部分による活性な結合体又は複合体の形態であり得る。有用な結合体又は複合体は、例えば、ＥＰＯ受容体との相互作用の検出（放射性又は蛍光標識、ビオチン）、サンプル中のＥＰＯ受容体発現細胞の検出（放射性又は蛍光標識、ビオチン）、治療効力（細胞毒性剤、薬物又は他の治療剤）を可能にするために、それら自体当業界に知られている分子及び方法を用いて作出できる。細胞毒性剤としては、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位元素（即ち、放射性結合体）が挙げられる。使用できる酵素活性毒素及びそれらの断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテスフォルジ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラカアメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルジカカランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリアオフィシナリス（ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセン類が挙げられる。種々の放射性核種は、放射性結合タンパク質の製造に利用できる。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅが挙げられる。
【０１２３】
有用な結合体又は複合体はまた、薬物送達効力の観点から薬剤を改善するために作出できる。この目的のために、本発明のポリペプチド又は融合タンパク質（特にＥＰＯ短ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯ短１ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯ短２ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯｖ３ポリペプチド又はその変異体）は、ポリエチレングリコール及び他の天然又は合成ポリマー類との活性な結合体又は複合体の形態であり得る（Ｈａｒｒｉｓ  ＪＭ及びＣｈｅｓｓ  ＲＢ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．（２００３）、２（３）：２１４〜２１頁；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ  ＲＢら、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．（２００３）、５５（２）：２１７〜５０頁；Ｐｉｌｌａｉ  Ｏ及びＰａｎｃｈａｇｎｕｌａ  Ｒ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．（２００１）、５（４）：４４７〜５１頁）。これに関して、本発明は、本明細書に開示された化学的に修飾されたポリペプチド及びタンパク質を考慮し、ポリペプチド及びタンパク質はポリマーと結合する。生理的環境などで、該結合体が水性環境で沈殿しないように、ポリマーは典型的には水溶性である。好適なポリマーの例は、アシル化に関しては活性エステル、又はアルキル化に関してはアルデヒドなどの単一の反応性基を有するように修飾されたものである。この様式で、重合度を調節できる。反応性アルデヒドの例は、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、又はモノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ、又はそのアリールオキシ誘導体である（例えば、Ｈａｒｒｉｓら、米国特許第５，２５２，７１４号を参照）。このポリマーは分枝状であっても又は非分枝状であってもよい。さらに、ポリマーの混合物は、結合体を製造するために使用できる。治療に用いられる結合体は、薬学的に許容できる水溶性ポリマー部分を含むことができる。好適な水溶性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ＰＥＧ、モノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−ＰＥＧ、アリールオキシ−ＰＥＧ、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ＰＥＧ、トレシルモノメトキシＰＥＧ、ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ビス−スクシンイミジルカーボネートＰＥＧ、プロピレングリコールホモポリマー類、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール類（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロース、又は他の炭水化物ベースポリマー類が挙げられる。好適なＰＥＧは、例えば、５，０００、１２，０００、２０，０００及び２５，０００など、約６００から約６０，０００までの分子量を有することができる。結合体はまた、このような水溶性ポリマーの混合物を含むことができる。
【０１２４】
結合体の例は、配列番号１３のポリペプチド（ＥＰＯｖ）又は配列番号１３のアミノ酸２８から５５（ＥＰＯｖｍ）、配列番号１５のポリペプチド又は配列番号１５のアミノ酸２８から５５、配列番号４のＥＰＯｖ１ポリペプチド又は配列番号４のアミノ酸２８から１６４（ＥＰＯｖ１ｍ）、配列番号６のＥＰＯｖ２ポリペプチド又は配列番号６のアミノ酸２８から１０４（ＥＰＯｖ２ｍ）、又は配列番号９のＥＰＯｖ３ポリペプチド又は配列番号９のアミノ酸２８から１５４（ＥＰＯｖ３ｍ）、及び前記ＥＰＯポリペプチド部分のＮ末端に結合したポリアルシルオキシド部分を含む。ＰＥＧは１つの好適なポリアルキルオキシドである。引例として、本発明のＥＰＯポリペプチド、変異体又は類似体（特にＥＰＯ短ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯ短１ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯ短２ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯｖ３ポリペプチド又はその変異体）は、「ペグ化」として知られている工程である、ＰＥＧにより修飾できる。ペグ化は、当業界に知られている任意のペグ化反応により実施できる（例えば、ＥＰ０  １５４  ３１６、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ９：２４９頁（１９９２）、Ｄｕｎｃａｎ及びＳｐｒｅａｆｉｃｏ、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２７：２９０頁（１９９４）、及びＦｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ６８：１頁（１９９８）を参照）。例えば、ペグ化は、アシル化反応により、又は反応性ポリエチレングリコール分子とのアルキル化反応により実施できる。代わりのアプローチにおいて、結合体は、ＰＥＧの末端ヒドロキシ又はアミノ基が、活性化リンカーにより置換されている活性化ＰＥＧを縮合することにより形成される（例えば、Ｋａｒａｓｉｅｗｉｃｚら、米国特許第５，３８２，６５７号を参照）。
【０１２５】
５．抗ＥＰＯ変異体ポリペプチド抗体：
本発明の組成物及び方法に使用するためのいくつかの薬物候補は、任意の上記又は下記のポリペプチドに選択的に結合する抗体、抗体断片又はそれらの誘導体である。
【０１２６】
特定の実施形態において、抗体、その断片又は誘導体は、本明細書の上記のＥＰＯｖ及び／又はＥＰＯ短ポリペプチド及び／又は前記ポリペプチドの変異体及び／又は類似体に選択的に結合する。
【０１２７】
特定の実施形態において、抗体、その断片又は誘導体は、本明細書の上記のＥＰＯｖ１及び／又はＥＰＯ短１ポリペプチド及び／又は前記ポリペプチドの変異体及び／又は類似体に選択的に結合する。
【０１２８】
別の特定の実施形態において、抗体、その断片又は誘導体は、本明細書の上記のＥＰＯｖ２及び／又はＥＰＯ短２ポリペプチド及び／又は前記ポリペプチドの変異体及び／又は類似体に選択的に結合する。
【０１２９】
別の実施形態において、抗体、その断片又は誘導体は、本明細書の上記の配列番号８及び／又は配列番号９のポリペプチド及び／又は前記ポリペプチドの変異体に選択的に結合する。さらに具体的な実施形態において、抗体、その断片又は誘導体は、本明細書の上記のＥＰＯｖ３及び／又は前記ポリペプチドの変異体に選択的に結合し、前記ポリペプチドはＥＰＯｗｔ及び／又はＥＰＯｗｔｍとは区別される。なおさらに具体的には、抗体、その断片又は誘導体は、本明細書の上記のＥＰＯｖ３及び／又は前記ポリペプチドの変異体に存在するエピトープに結合するが、ＥＰＯｗｔ及び／又はＥＰＯｗｔｍを欠いている。なおさらに具体的には、抗体、その断片又は誘導体は、ＥＰＯｖ３のＣ末端部分に配置されるエピトープに結合し、さらに特にこのエピトープは、配列番号９のアミノ酸１４３から１５４までに配置される。
【０１３０】
本発明の文脈内で、用語の「選択的」結合とは、抗体が標的ポリペプチド又はエピトープを優先的に、即ち、任意の他の抗原又はエピトープに対する結合よりも高親和力で結合することを示している。言い換えれば、標的ポリペプチドに対する結合は、他の抗原に対する非特異的結合と区別することができる。本発明による抗体は、標的ポリペプチド又はエピトープに対して１０６Ｍ−１超、好ましくは１０７Ｍ−１超、さらに好ましくは１０８Ｍ−１超、最も好ましくは１０９Ｍ−１超の結合親和力（Ｋａ）を示すことが好ましい。抗体の結合親和力は、通常の当業者によって、例えば、スキャチャード解析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  Ｇ．、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０〜６７２頁、１９４９年）により容易に測定できる。
【０１３１】
特定の実施形態において、抗体、その断片又は誘導体は、本明細書の上記のＥＰＯｖ及び／又はＥＰＯ短ポリペプチド及び／又は前記ポリペプチドの変異体及び／又は類似体に選択的に結合し、前記ポリペプチドはＥＰＯｗｔ及び／又はＥＰＯｗｔｍとは区別される。なおさらに具体的には、抗体、その断片又は誘導体は、本明細書の上記のＥＰＯｖ及び／又はＥＰＯ短及び／又は前記ポリペプチドの変異体及び／又は類似体に存在するエピトープに結合するが、ＥＰＯｗｔ及び／又はＥＰＯｗｔｍを欠いている。
【０１３２】
別の特定の実施形態において、抗体、その断片又は誘導体は、本明細書の上記のＥＰＯｖ１及び／又はＥＰＯ短１ポリペプチド及び／又は前記ポリペプチドの変異体及び／又は類似体に選択的に結合し、前記ポリペプチドはＥＰＯｗｔ及び／又はＥＰＯｗｔｍとは区別される。なおさらに具体的には、抗体、その断片又は誘導体は、本明細書の上記のＥＰＯｖ１及び／又はＥＰＯ短１及び／又は前記ポリペプチドの変異体及び／又は類似体に存在するエピトープに結合するが、ＥＰＯｗｔ及び／又はＥＰＯｗｔｍを欠いている。
【０１３３】
別の特定の実施形態において、抗体、その断片又は誘導体は、本明細書の上記のＥＰＯｖ２及び／又はＥＰＯ短２ポリペプチド及び／又は前記ポリペプチドの変異体及び／又は類似体に選択的に結合し、前記ポリペプチドはＥＰＯｗｔ及び／又はＥＰＯｗｔｍとは区別される。なおさらに具体的には、抗体、その断片又は誘導体は、本明細書の上記のＥＰＯｖ２及び／又はＥＰＯ短２及び／又は前記ポリペプチドの変異体及び／又は類似体に存在するエピトープに結合するが、ＥＰＯｗｔ及び／又はＥＰＯｗｔｍを欠いている。
【０１３４】
本発明の抗体は、同じ抗原特異性を実質的に有するモノクローナル又はポリクローナル抗体、或いはその断片若しくは誘導体であり得る。
【０１３５】
Ａ．ポリクローナル抗体：
げっ歯類、霊長類及びウマなど、種々の種からポリクローナル抗体を調製する方法は、例えば、Ｖａｉｔｕｋａｉｔｉｓら（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．３３（１９７１）９８８頁）に記載されている。ポリクローナル抗体は、例えば、１回以上の免疫剤、及び所望ならば、アジュバントの注射により哺乳動物において増加させることができる。典型的には、免疫剤及び／又はアジュバントは、複数回の皮下又は腹腔内注射により哺乳動物に注入される。
【０１３６】
特定の実施形態において、免疫剤としては、上記の配列番号１３のポリペプチド（ＥＰＯｖ）又は配列番号１３のアミノ酸２８から５５（ＥＰＯｖｍ）、配列番号１５のポリペプチド又は配列番号１５のアミノ酸２８から５５、又はＥＰＯ短ポリペプチド、或いはその変異体若しくは類似体又はその融合タンパク質を挙げることができる。
【０１３７】
別の特定の実施形態において、免疫剤としては、上記の配列番号４のポリペプチド又は配列番号４のアミノ酸２８から１６４（ＥＰＯｖ１ｍ）、又はＥＰＯ短１ポリペプチド、或いはその変異体若しくは類似体又はその融合タンパク質を挙げることができる。
【０１３８】
別の特定の実施形態において、免疫剤としては、上記の配列番号６のポリペプチド又は配列番号６のアミノ酸２８から１０４（ＥＰＯｖ２ｍ）、又はＥＰＯ短２ポリペプチド、或いはその変異体若しくは類似体又はその融合タンパク質を挙げることができる。
【０１３９】
別の特定の実施形態において、免疫剤としては、上記の配列番号９のポリペプチド（ＥＰＯｖ３）又は配列番号９のアミノ酸２８から１５４（ＥＰＯｖ３ｍ）、又は変異体若しくはその融合タンパク質を挙げることができる。特定の実施形態において、免疫剤としては、上記の配列番号８のポリペプチド又はその変異体又はその融合タンパク質を挙げることができる。
【０１４０】
免疫化される哺乳動物において、免疫原性であることが知られているタンパク質に免疫剤を結合することは有用であり得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、限定はしないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、及びダイズトリプシン阻害剤が挙げられる。使用できるアジュバントの例としては、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。反復注射を実施できる。血液サンプルを採取し、免疫グロブリン又は血清を分離する。
【０１４１】
Ｂ．モノクローナル抗体：
抗体は、代わりにモノクローナル抗体であってもよい。本明細書に用いられる用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体集団から得られた抗体のことであり、即ち、該集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る天然変異の可能性を除いて同一である。モノクローナル抗体は高特異的であり、単一の抗原部位に対して向けられる。モディファイヤー「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法により抗体の産生を必要とするものと解すべきではない。
【０１４２】
モノクローナル抗体を産生する方法は、例えば、参照として本明細書に組み込まれているＨａｒｌｏｗら（抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８年）又はＫｏｈｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５）４９５頁）に見ることができる。
【０１４３】
ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿主動物は、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するか、又は産生できるリンパ球を誘発する免疫剤により典型的に免疫化される。
【０１４４】
特定の実施形態において、免疫剤としては、上記の配列番号１３のポリペプチド（ＥＰＯｖ）又は配列番号１３のアミノ酸２８から５５（ＥＰＯｖｍ）、配列番号１５のポリペプチド又は配列番号１５のアミノ酸２８から５５、又はＥＰＯ短ポリペプチド、或いはその変異体若しくは類似体又はその融合タンパク質を挙げることができる。
【０１４５】
別の特定の実施形態において、免疫剤としては、上記の配列番号４のポリペプチド又は配列番号４のアミノ酸２８から１６４（ＥＰＯｖ１ｍ）、又はＥＰＯ短１ポリペプチド、或いはその変異体若しくは類似体又はその融合タンパク質を挙げることができる。
【０１４６】
別の特定の実施形態において、免疫剤としては、上記の配列番号６のポリペプチド又は配列番号６のアミノ酸２８から１０４（ＥＰＯｖ２ｍ）、又はＥＰＯ短２ポリペプチド、或いはその変異体若しくは類似体又はその融合タンパク質を挙げることができる。
【０１４７】
別の特定の実施形態において、免疫剤としては、上記の配列番号９のポリペプチド（ＥＰＯｖ３）又は配列番号９のアミノ酸２８から１５４（ＥＰＯｖ３ｍ）、又は変異体若しくはその融合タンパク質を挙げることができる。特定の実施形態において、免疫剤としては、上記の配列番号８のポリペプチド又はその変異体又はその融合タンパク質を挙げることができる。
【０１４８】
或いは、リンパ球はインビトロで免疫化できる。一般に、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）は、ヒト起源の細胞が望まれる場合に用いられるか、又は脾細胞或いはリンパ節細胞は、非ヒト哺乳動物源が望まれる場合に用いられる。次いでリンパ球は、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を用いて継代細胞系と融合してハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、モノクローナル抗体：原理と実施（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）５９〜１０３頁）。継代細胞系は、通常、形質転換哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシ及びヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫細胞系が用いられる。好ましくは、非融合の継代細胞の増殖又は生存を阻害する１種以上の物質を含有する好適な培養培地中で、ハイブリドーマ細胞を培養できる。例えば、親細胞が、酵素であるヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマに対する培養培地には、物質がＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止するヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（「ＨＡＴ培地」）を典型的に含む。好ましい継代細胞系は、選択された抗体産生細胞により、安定な高レベル発現の抗体を効率的に融合し、支えるものであり、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性がある。さらに好ましい継代細胞系は、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、サンディエゴ、カリフォルニア州及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナサス、バージニア州から入手できるマウス骨髄腫系である。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１頁（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、モノクローナル抗体産生技法と応用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ社、ニューヨーク、（１９８７）５１〜６３頁）。
【０１４９】
ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、次に免疫ペプチドに対して向けられるモノクローナル抗体の存在に関してアッセイできる。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など、免疫沈殿又はインビトロ結合アッセイにより判定されることが好ましい。このような技法及びアッセイは当業界に知られている。モノクローナル抗体の結合親和力は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ及びＰｏｌｌａｒｄのスキャチャード解析、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０頁（１９８０）により測定できる。
【０１５０】
所望のハイブリドーマ細胞が確認されたら、このクローンは、希釈手法を制限することによりサブクローン化でき、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ、上記文献）により増殖できる。この目的のために好適な培養培地としては、例えば、ダルベッコ修飾イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。或いは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物の腹水中インビボで増殖できる。
【０１５１】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手法により、培養培地又は腹水から単離又は精製できる。
【０１５２】
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されたものなど組換えＤＮＡ法により作製できる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）、容易に単離及び配列決定できる。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。単離されたら、次にＤＮＡを、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は他に免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞など、宿主細胞形質移入される発現ベクターに入れて、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成することができる。
【０１５３】
「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８頁［１９９１］及びＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１〜５９７頁（１９９１）に記載された技法を用いてファージ抗体ライブラリーからも単離できる。
【０１５４】
該抗体は一価の抗体である。一価の抗体を調製する方法は、当業界によく知られている。例えば、一方法としては、免疫グロブリンの軽鎖及び修飾重鎖の組換え発現が挙げられる。重鎖架橋を防ぐために、一般に重鎖は、Ｆｃ領域の任意の点で切断される。或いは、架橋を防ぐために、関連するシステイン残基を別のアミノ酸残基で置換するか、又は欠失する。
【０１５５】
インビトロ方法はまた、一価の抗体を調製するのに好適である。その断片、特にＦａｂ断片を産生するための抗体の消化は、当業界に知られたルーチン的技法を用いて達成できる。
【０１５６】
抗体はまた、例えば、Ｗａｒｄら（Ｎａｔｕｒｅ  ３４１（１９８９）５４４頁）に開示されている免疫グロブリン類の組合せライブラリーの選択により製造できる。
【０１５７】
Ｃ．ヒト及びヒト化抗体：
本発明の抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含むことができる。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又は非ヒト免疫グロブリンに由来する最少配列を含有するその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合部分配列など）である。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含み、レシピエントの相補決定領域（ＣＤＲ）からの残基は、所望の特異性、親和力及び能力を有するマウス、ラット又はウサギなど、非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基により置換される。いくつかの場合、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基により置換される。
【０１５８】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当業界によく知られている。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５頁（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６頁（１９８８））の方法に従って、げっ歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列を、対応するヒト抗体の配列に置き換えることによって本質的に実施できる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、実質的に無処置のヒト可変性ドメイン未満が、非ヒト種からの対応する配列により置換されている。
【０１５９】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーなど、当業界に知られた種々の技法（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２２７：３８１頁（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２２２：５８１頁（１９９１））を用いて産生できる。Ｃｏｌｅら及びＢｏｅｒｎｅｒらの技法は、ヒトモノクローナル抗体の調製にも利用できる（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）及びＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５頁（１９９１））。同様に、ヒト抗体は、遺伝子導入動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全不活化されているマウスに、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することにより作製できる。誘発の際に、遺伝子転移、組立て、及び抗体レパートリーなど、すべての点でヒトに見られるものに非常に似ているヒト抗体産生が観察される。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；米国特許第５，５４５，８０６号；米国特許第５，５６９，８２５号；米国特許第５，６２５，１２６号；米国特許第５，６３３，４２５号；米国特許第５，６６１，０１６号、及び以下の科学出版物：Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３頁（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６〜８５９頁（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８１２〜１３頁（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８４５〜５１頁（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８２６頁（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３：６５〜９３頁（１９９５）に記載されている。
【０１６０】
Ｄ．免疫結合体：
本発明はまた、直接的又はカップリング剤或いはリンカーの使用を介して、共有結合又は非共有結合の細胞毒性剤、標識、薬物又は他の治療剤などの異種部分に結合した抗体を含む免疫結合体に関する。細胞毒性剤としては、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素、又はその断片）、又は放射線同位元素（即ち放射性結合）が挙げられる。
【０１６１】
使用できる酵素活性毒素及びそれらの断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテスフォルジ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラカアメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルジカカランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリアオフィシナリス（ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセン類が挙げられる。種々の放射性核種は、放射性結合抗体の製造に利用できる。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅが挙げられる。
【０１６２】
別の実施形態において、抗体は、腫瘍プレターゲッティングへの利用のために「受容体」（ストレプトアビジンなど）に結合でき、抗体−受容体結合体を患者に投与し、次いで清浄剤を用いて循環系から非結合の結合体を除去し、次に細胞毒製剤（例えば、放射性核種）に結合しる「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。
【０１６３】
さらに、本発明の抗体又は抗体断片は、当業界の方法及び本明細書に記載された方法を用いてペグ化できる。本明細書に開示された抗体は、免疫リポソーム類としても形成できる。抗体を含有するリポソーム類は、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：３６８８頁（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４０３０頁（１９８０）；及び米国特許第４，４８５，０４５号及び米国特許第４，５４４，５４５号に記載されたものなど当業界に知られた方法により調製される。循環時間の増強があるリポソーム類は、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０１６４】
Ｅ．抗体断片
本発明はまた、無処置抗体、好ましくは抗原結合又は無処置抗体の可変性領域の一部を含む「抗体断片」に関する。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ジア体；線状抗体（Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、８（１０）：１０５７〜１０６２頁［１９９５］）；単鎖抗体分子；モノボディ；及び抗体断片から形成された多特異的抗体が挙げられる。
【０１６５】
「Ｆｖ」は、完全抗原認識及び抗原結合部位を含有する最小抗体断片である。この領域は、硬非共有結合において１本の重鎖及び１本の軽鎖可変性ドメインの二量体からなる。各々の可変性ドメインの３つのＣＤＲは、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を規定するために相互作用することがこの形状にある。６つのＣＤＲは、集合的に抗体に対する抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変性ドメイン（又は抗原に特異的な３つだけのＣＤＲを含むＦｖの半分）でさえ、全結合部位よりも親和力が低いが、抗原を認識し、結合する能力を有する。
【０１６６】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の一定ドメイン及び重鎖の第１の一定ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域から１つ以上のシステインなど、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ終端で２、３の残基の付加によりＦａｂ’断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書においてＦａｂ’と呼称され、一定ドメインのシステイン残基（複数可）は、遊離チオール基を有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来それらの間でヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として製造された。抗体断片の他の化学的カップリングもまた知られている。任意の脊椎動物種に由来の抗体（免疫グロブリン類）の「軽鎖」は、それらの一定ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ及びラムダと呼ばれる２種の明確に異なるタイプの１つに帰することができる。
【０１６７】
「単鎖抗体分子」は、前記抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体の断片であり、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖に存在する。単鎖抗体分子が、抗体結合に対して所望の構造を形成できるＶＨドメインとＶＬドメインとの間で、Ｆｖポリペプチドはポリペプチドリンカーをさらに含むことが好ましい。単鎖抗体分子のレビューに関して、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎのモノクローナル抗体の薬理学（Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編集、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、２６９〜３１５頁（１９９４）を参照されたい。
【０１６８】
用語「ジア体」とは、断片が、同じポリペプチド鎖内で軽鎖可変性ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変性ドメインを含む（ＶＨ−ＶＬ）、２つの抗原結合部位を有する小型の抗体断片のことである。同じ鎖上の２つのドメイン間で対合させるのに短かすぎるリンカーを用いることにより、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合することになり、２つの抗原結合部位を創製させる。ジア体は、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８頁（１９９３）に、より完全に記載されている。
【０１６９】
本明細書に用いられる用語「モノボディ」とは、重鎖可変性ドメインを有し、軽鎖可変性ドメインのない抗原結合分子のことである。モノボディは、軽鎖の不在の抗原に結合でき、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３と称される３つのＣＤＲ領域を典型的に有する。モノボディとしては、２本の足指及び皮のような足裏の脚を有する動物など、ラクダ科の動物源から得られる「ラクダモノボディ」が挙げられる。ラクダ科の動物としては、ラクダ、ラマ、及びアルパカが挙げられる。ラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍｅｄａｒｉｅｓ及びＣａｍｅｌｕｓ  ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）は、血清からの物質を分析する際に、しばしば可変性軽鎖ドメインを欠くことが報告されており、十分な抗体特異性及び親和力は、ＶＨドメイン（３つのＣＤＲループ）単独に由来し得ることを示唆している。モノボディはまた、ＶＬの不在下、抗原に特異的に結合できる種々の動物源、特に哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ロバ、ウシ又はヒト）からの修飾ＶＨを含む。ＶＨは、ＶＬの不在下、抗原にＶＨの結合を提供するためにＶＬ界面での位置で修飾されることが好ましい。Ｄａｖｉｅｓ及びＲｉｅｃｈｍａｎｎは、例えば、高親和力（標的ポリペプチドに対して１０７Ｍ−１超の結合親和力（Ｋａ））及び高特異性を有する「ラクダ化モノボディ」を作出できることを立証している（Ｄａｖｉｅｓ及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ、１９９５年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ニューヨーク州）、１３（５）：４７５〜９頁）。軽鎖可変性ドメイン（ＶＬ）に関してその界面を介してＶＨの非特異的結合は、この界面内の３つの変異（Ｇ４４Ｅ、Ｌ４５Ｒ及びＷ４７Ｇ）により防止された。これらの変異は、軽鎖パートナーがなくて自然のラクダ抗体の重鎖を模倣するために導入された。
【０１７０】
Ｆ．本発明の抗体及び抗体断片の使用：
本発明の抗体及び抗体断片は、種々の有用性を有する。例えば、抗体は、本明細書に上記された本発明の任意のＥＰＯポリペプチド又は変異体を検出、投薬、精製又は中和に使用できる。特定の態様において、本発明はこのように、サンプル中の上記に定義された本発明のＥＰＯポリペプチド又は変異体を検出又は投薬する方法にあり、この方法は、このようなサンプルを、上記に開示された抗体、その断片又は誘導体と接触させること、及び免疫複合体の形成を判定するか、又はその（関連する）量を投薬することを含む。サンプルは、例えば、場合によっては、任意選択で希釈及び／又は処理された血液、血漿、血清などの任意の生体液であり得る。抗体、その断片又は誘導体を懸濁液中にあるか、又は支持体上に固定できる。免疫複合体の存在又は量は、例えば、レポーター抗体、標識抗体などを用いて、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどにより、それ自体当業界に知られている任意の技法により測定できる。特定の実施形態において、抗体、その断片又は誘導体は、本明細書の上記のＥＰＯｖ及び／又はＥＰＯ短ポリペプチド及び／又は前記ポリペプチドの変異体及び／又は類似体に選択的に結合する。別の特定の実施形態において、抗体、その断片又は誘導体は、本明細書の上記のＥＰＯｖ１及び／又はＥＰＯ短１ポリペプチド及び／又は前記ポリペプチドの変異体及び／又は類似体に選択的に結合する。別の特定の実施形態において、抗体、その断片又は誘導体は、本明細書の上記のＥＰＯｖ２及び／又はＥＰＯ短２ポリペプチド及び／又は前記ポリペプチドの変異体及び／又は類似体に選択的に結合する。別の実施形態において、抗体、その断片又は誘導体は、本明細書の上記の配列番号８及び／又は配列番号９のポリペプチド及び／又は前記ポリペプチドの変異体に選択的に結合する。
【０１７１】
本発明の抗体及び抗体断片はまた、組換え細胞培養又は天然源から本明細書の上記の本発明のＥＰＯポリペプチド、変異体又は類似体の親和性精製に有用である。この工程において、本発明のＥＰＯポリペプチド、変異体又は類似体に対する抗体は、当業界によく知られた方法を用いて、セファデックス樹脂又はろ紙などの好適な支持体上に固定される。次に固定化抗体を、精製されるべきＥＰＯポリペプチド、変異体又は類似体を含有するサンプルと接触させ、その後、この支持体を、固定化抗体に結合しているＥＰＯポリペプチド、変異体又は類似体を除いてサンプル中のすべての物質を実質的に除く好適な溶媒で洗浄する。最後に、この支持体を、抗体からＥＰＯポリペプチド、変異体又は類似体を放出する別の好適な溶媒で洗浄する。特定の実施形態において、抗体、その断片又は誘導体は、本明細書の上記のＥＰＯｖ及び／又はＥＰＯ短ポリペプチド及び／又は前記ポリペプチドの変異体及び／又は類似体に選択的に結合する。別の特定の実施形態において、抗体、その断片又は誘導体は、本明細書の上記のＥＰＯｖ１及び／又はＥＰＯ短１ポリペプチド及び／又は前記ポリペプチドの変異体及び／又は類似体に選択的に結合する。別の特定の実施形態において、抗体、その断片又は誘導体は、本明細書の上記のＥＰＯｖ２及び／又はＥＰＯ２短ポリペプチド及び／又は前記ポリペプチドの変異体及び／又は類似体に選択的に結合する。別の実施形態において、抗体、その断片又は誘導体は、本明細書の上記の配列番号８及び／又は配列番号９のポリペプチド及び／又は前記ポリペプチドの変異体に選択的に結合する。
【０１７２】
本発明の抗体及び抗体断片は、特に特定のヒト疾患の治療において本発明のＥＰＯポリペプチド、変異体又は類似体の活性を遮断し、阻止し、軽減し、アンタゴナイズし、又は中和するために使用できる。したがって本発明の抗体は、特に治療剤として有用である。ＥＰＯは、赤血球細胞（赤血球）の産生を刺激するなど、種々の生理的作用に関与する。ＥＰＯ受容体（ＥＰＯＲ）は、骨髄由来の赤血球前駆体及び筋細胞、皮質ニューロン及び前立腺、乳房並びに卵巣上皮などのいくつかの非造血組織に発現される。ＥＰＯはまた、中枢神経系の特定の受容体を活性化することが報告されており、インビトロ及びインビボ双方のモデルにおいて神経栄養性及び神経保護性であることが判明した。
【０１７３】
したがって、本発明のさらなる目的は、上記に定義された抗体又は抗体断片、及び薬学的に許容できる担体、賦形剤、又は安定化剤を含む医薬組成物である。本発明はまた、好ましくは、ヒト対象を治療するための薬剤の製造のために上記に定義された抗体又は抗体断片の使用に関する。本発明はまた、患者の障害症状を治療し、予防し、又は改善する方法に関するものであり、該障害はＥＰＯ発現又は活性のアップレギュレーションを含み、該方法は、上記に定義された抗体又は抗体断片を含む医薬組成物を患者に投与することを含む。別の態様内で本発明は、対象、好ましくはヒト対象の癌の症状を治療し、予防し又は改善する方法を提供し、本明細書に開示された抗体の治療有効量を投与することを含み、それによって前記病的状態を治療する。本発明はまた、癌及び腫瘍の治療用薬剤の製造において本明細書に開示された抗体の使用に関する。治療のための癌の例としては、限定はしないが、腺癌、リンパ腫、芽腫、肉腫、黒色腫及び白血病などの癌が挙げられる。本明細書における治療のためのさらに好ましい癌としては、腎細胞癌、特に転移腎癌及びウィルムス腫瘍などの腎臓癌、濾胞性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、ＡＩＤＳの場合にカポジ肉腫を含む免疫不全後に現れる腫瘍、扁平上皮癌、中枢神経系に影響を及ぼす腫瘍、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵癌、子宮頚癌、卵巣癌、肝癌及び肝細胞癌などの肝臓癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、及び種々のタイプの頭頚部癌である。中枢神経系に影響を及ぼす腫瘍としては、特にアストロサイト腫瘍（未分化星細胞腫又はグリア芽細胞腫など）、未分化乏突起膠腫、未分化オリゴ星細胞腫、髄芽腫又は神経芽腫が挙げられる。本明細書における治療に好ましい癌は、腺癌、より好ましくは、腎臓の腺癌（腎細胞癌、特に転移腎癌及びウィルムス腫瘍など）、前立腺癌、卵巣癌又は乳癌、又はリンパ腫（特に濾胞性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキン又は非ホジキンリンパ腫）、又は白血病（特に慢性リンパ球性白血病又は慢性骨髄性白血病）、又は多発性骨髄腫、又は中枢神経系に影響を及ぼす腫瘍（特にグリア芽細胞腫又は神経芽腫）である。
【０１７４】
６．上記に定義されたポリペプチド又はタンパク質、核酸分子、ベクター又は細胞の薬学的使用：
ＥＰＯは種々の生理学的作用に関与してきた。特に、ＥＰＯは、赤血球細胞（赤血球）の産生刺激に関与してきた。組換えヒトＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）は現在、慢性腎不全に関連した貧血を有する患者、ジドブジンを用いた治療による貧血を有するＡＩＤＳ患者、化学療法剤を用いて治療されている患者における非骨髄性悪性疾患、外科手術中の患者、及び自己血液供与の処置に用いられている。
【０１７５】
また、ＥＰＯは、中枢神経系における特定の受容体を活性化することが報告されており、インビトロモデル及びインビボモデルの双方で、神経栄養性であり、神経保護的であることが判明している（Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｊ．編、Ｅｒｉｔｈｒｏｐｏｅｔｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｕｓｅ．におけるＭａｒｔｉ  ＨＨ、Ｂｅｒｎａｕｄｉｎ  Ｍ．、脳におけるエリスロポエチンの機能（Ｆｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ）、ジョンソンシティー、テネシー州、Ｆ．Ｐ．Ｇｒａｈａｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、１９５〜２１５頁、２００２年；Ｊｕｕｌ  Ｓ．Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ４３８（増補）：３６〜４２頁、２００２年）。ＥＰＯ及びＥＰＯ受容体は共に、大脳皮質、小脳、海馬、脳下垂体及び脊髄内に報告されている。ＥＰＯが神経保護効果を生じる機序として提案されているのは：グルタメート毒性の減少、神経抗アポトーシス因子の産生増加、一酸化窒素媒介損傷の減少、抗炎症効果、及び抗酸化性である。
【０１７６】
また、ＥＰＯは、インビトロモデルとインビボモデルの双方で心臓保護を有することが報告されている（Ｃａｌｖｉｌｌｏ  Ｌ．ら、（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３年；１００（８）：４８０２〜６頁））、Ｐａｒｓａ  ＣＪら（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００３年、１１２（７）：９９９〜１００７頁）及びＭｏｏｎ  Ｃら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３年；１００（２０）：１１６１２〜７頁）。
【０１７７】
本発明のポリペプチドの生物活性を考慮すると（例えば、本明細書上記の１．５節を参照）、本発明のＥＰＯポリペプチド、変異体及び類似体は、ヒト対象における治療的又は予防的処置において、特に有用である。
【０１７８】
したがって、本発明のさらなる目的は、上記で定義されたポリペプチド又はタンパク質、核酸、ベクター又は組換え細胞を含む医薬組成物、及び薬学的に許容できる担体、賦形剤、又は安定化剤である。本発明の医薬組成物は、上記で定義された本発明のＥＰＯポリペプチド又は変異体又は類似体を含むことが好ましい。
【０１７９】
特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、ＥＰＯ短ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯ短１ポリペプチド又はその変異体、ＥＰＯ短２ポリペプチド又はその変異体、又はＥＰＯｖ３ポリペプチド又はその変異体を含む。他の特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、本明細書上記で定義したＥＰＯｖｍ（配列番号１３のアミノ酸２８から５５）又は変異体又は類似体、又はそのようなポリペプチドを含む、本明細書上記で定義した融合タンパク質を含む。他の特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、本明細書上記で定義したＥＰＯｖ１ｍ（配列番号４のアミノ酸２８から１６４）又は変異体又は類似体、又はそのようなポリペプチドを含む、本明細書上記で定義した融合タンパク質を含む。他の特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、本明細書上記で定義したＥＰＯｖ２ｍ（配列番号６のアミノ酸２８から１０４）又は変異体又は類似体、又はそのようなポリペプチドを含む、本明細書上記で定義した融合タンパク質を含む。他の特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、本明細書上記で定義したＥＰＯｖ３ｍ（配列番号９のアミノ酸２８から１５４）又は変異体又は類似体、又はそのようなポリペプチドを含む、本明細書上記で定義した融合タンパク質を含む。
【０１８０】
本発明の他の態様は、薬剤、好ましくは、ヒト対象の治療用薬剤を製造するために、上記で開示したポリペプチド又はタンパク質、核酸分子、ベクター又は細胞の使用に関する。
【０１８１】
本発明はまた、患者、好ましくはヒト対象における障害の症状を治療、予防又は改善する方法に関するものであり、該障害は、ＥＰＯの発現又は活性の調節障害を含み、該方法は、該患者に上記で定義した医薬組成物を投与することを含む。該方法は、本明細書上記に開示した本発明のＥＰＯポリペプチド、変異体又は類似体の治療有効量を、該患者に投与することを含むことが好ましい。特定の実施形態において、該ポリペプチドは、ＥＰＯ短ポリペプチド又はその変異体であるか、該ポリペプチドは、ＥＰＯ短１ポリペプチド、又はその変異体であるか、ＥＰＯ短２ポリペプチド、又はその変異体であるか、ＥＰＯｖ３ポリペプチド又はその変異体である。他の特定の実施形態において、該ポリペプチドは、本明細書上記に定義したＥＰＯｖｍ（配列番号１３のアミノ酸２８から５５）又は変異体又は類似体、又はそのようなポリペプチドを含む上記に定義した融合タンパク質を含むか、それらよりなる。他の特定の実施形態において、該ポリペプチドは、本明細書上記に定義したＥＰＯｖ１ｍ（配列番号４のアミノ酸２８から１６４）又は変異体又は類似体、又はそのようなポリペプチドを含む上記に定義した融合タンパク質を含むか、それらよりなる。他の特定の実施形態において、該ポリペプチドは、本明細書上記に定義したＥＰＯｖ２ｍ（配列番号６のアミノ酸２８から１０４）又は変異体又は類似体、又はそのようなポリペプチドを含む上記に定義した融合タンパク質を含むか、それらよりなる。他の特定の実施形態において、該ポリペプチドは、本明細書上記に定義したＥＰＯｖ３ｍ（配列番号９のアミノ酸２８から１５４）又は変異体又は類似体、又はそのようなポリペプチドを含む上記に定義した融合タンパク質を含むか、それらよりなる。
【０１８２】
別の態様において、本発明は、患者、好ましくはヒト対象における障害症状を治療し、予防し又は改善する方法を提供し、該障害としては、赤血球細胞の産生の不十分又は欠損を特徴とする血液障害、貧血、慢性腎不全患者の高血圧、外科手術患者、小児透析患者、ヘマトクリット濃度不足に関連する疾患又は病態、ＡＩＤＳ、化学療法治療に関係した障害、癌及び腫瘍、感染症、性病、免疫関連疾患及び／又は自己免疫疾患並びに障害、発作などの心血管疾患、低血圧、心拍停止、虚血特に虚血−再灌流傷害、急性心筋梗塞などの心筋梗塞、慢性心不全、アンギナ、心肥大、心肺疾患、心肺バイパス、呼吸器疾患、腎臓、泌尿器及び生殖器疾患、内分泌及び代謝異常、胃腸疾患、一次的神経系症状又は精神医学的症状を有する中枢神経系（ＣＮＳ）疾患又は末梢神経系疾患、認知機能の加齢関連喪失、脳性小児麻痺、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、リー病、認知症、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、アルコール依存症、気分障害、不安障害、注意欠損障害、活動亢進、自閉症、統合失調症、うつ病、脳又は脊髄外傷若しくは虚血、クロイツフェルト−ヤコブ病、眼病、発作障害、多発性硬化症、炎症、放射線損傷、黄斑変性症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、緑内障、網膜虚血、及び網膜外傷からなる群から選択され、該方法は、本発明のポリペプチド又は医薬組成物の治療有効量を患者に投与することを含む。さらなる態様において、本発明は、患者、好ましくはヒト対象における障害の治療用薬剤の製造において本発明のポリペプチド又は医薬組成物の使用を考慮しており、該障害としては、赤血球細胞の産生の不十分又は欠損を特徴とする血液障害、貧血、慢性腎不全患者の高血圧、外科手術患者、小児透析患者、ヘマトクリット濃度不足に関連する疾患又は病態、ＡＩＤＳ、化学療法治療に関係した障害、癌及び腫瘍、感染症、性病、免疫関連疾患及び／又は自己免疫疾患並びに障害、発作などの心血管疾患、低血圧、心拍停止、虚血特に虚血−再灌流傷害、急性心筋梗塞などの心筋梗塞、慢性心不全、アンギナ、心肥大、心肺疾患、心肺バイパス、呼吸器疾患、腎臓、泌尿器及び生殖器疾患、内分泌及び代謝異常、胃腸疾患、一次的神経系症状又は精神医学的症状を有する中枢神経系（ＣＮＳ）疾患又は末梢神経系疾患、認知機能の加齢関連喪失、脳性小児麻痺、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、リー病、認知症、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、アルコール依存症、気分障害、不安障害、注意欠損障害、活動亢進、自閉症、統合失調症、うつ病、脳又は脊髄外傷若しくは虚血、クロイツフェルト−ヤコブ病、眼病、発作障害、多発性硬化症、炎症、放射線損傷、黄斑変性症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、緑内障、網膜虚血、及び網膜外傷からなる群から選択される。
【０１８３】
一実施形態において、治療される障害は、貧血、慢性腎不全患者の高血圧、透析を受けている小児科患者、不十分なヘマトクリットレベルに関連した疾患又は病態、化学療法に関係した障害、癌、心臓血管疾患、主に神経学的又は精神医学的症状を有する、中枢神経系（ＣＮＳ）又は末梢神経系の疾患である。
【０１８４】
好ましい一実施形態において、治療される障害は、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患である。好ましい一実施形態において、前記治療される障害は、急性虚血性発作、又は脳若しくは脊髄の外傷又は虚血である。さらに他の好ましい実施形態において、前記治療される障害は、アルツハイマー病、又はパーキンソン病などの神経変性疾患である。さらに他の好ましい実施形態において、前記治療される障害は、統合失調症、癲癇、冠状動脈バイパス損傷及びくも膜下出血からなる群から選択される。さらに他の好ましい実施形態において、前記治療される障害は、多発性硬化症又はアルツハイマー病、又はパーキンソン病である。さらに他の好ましい実施形態において、前記治療される障害は、多発性硬化症である。
【０１８５】
他の好ましい実施形態において、治療される障害は、末梢神経系の疾患である。好ましい一実施形態において、前記治療される障害は、ニューロパシー、糖尿病性ニューロパシー、椎骨盤圧迫症又は手根管症候群である。
【０１８６】
他の好ましい実施形態において、治療される障害は、ニューロパシー痛である。好ましい一実施形態において、治療される障害は、アルコール中毒症、及び／又は切断術、及び／又は坐骨神経症、及び／又は癌の化学療法、及び／又は糖尿病及び／又は顔面神経問題（三叉神経痛）、及び／又はＨＩＶ感染即ちＡＩＤＳ、及び／又は多発性硬化症及び／又は帯状疱疹（帯状疱疹ウィルス感染）及び／又は脊椎外科手術、に関連したニューロパシー痛である。
【０１８７】
治療される心臓血管疾患は、好ましくは特定の虚血−再潅流損傷における虚血又は急性心筋梗塞などの心筋梗塞である。他の特定の実施形態において、治療される心臓血管疾患は、慢性心不全である。
【０１８８】
他の好ましい一実施形態において、治療される障害は、網膜の疾患である。好ましい一実施形態において、前記治療される障害は、糖尿病性網膜症、網膜外傷、黄斑変性症、網膜虚血又は糖尿病性黄斑浮腫である。
【０１８９】
他の好ましい一実施形態において、治療される障害は、腎臓の疾患である。好ましい一実施形態において、前記治療される障害は、糖尿病性ニューロパシー、腎毒性傷害、移植又は腎不全である。
【０１９０】
本明細書における治療のための癌の例としては、限定はしないが、腺癌、リンパ腫、芽腫、肉腫、黒色腫及び白血病などの癌が挙げられる。本明細書における治療のためのさらに好ましい癌としては、腎細胞癌、特に転移腎癌及びウィルムス腫瘍などの腎臓癌、濾胞性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、ＡＩＤＳの場合にカポジ肉腫を含む免疫不全後に現れる腫瘍、扁平上皮癌、中枢神経系に影響を及ぼす腫瘍、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵癌、子宮頚癌、卵巣癌、肝癌及び肝細胞癌などの肝臓癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、及び種々のタイプの頭頚部癌である。中枢神経系に影響を及ぼす腫瘍としては、特にアストロサイト腫瘍（未分化星細胞腫又はグリア芽細胞腫など）、未分化乏突起膠腫、未分化オリゴ星細胞腫、髄芽腫又は神経芽腫が挙げられる。本明細書における治療に好ましい癌は、腺癌、より好ましくは、腎臓の腺癌（腎細胞癌、特に転移腎癌及びウィルムス腫瘍など）、前立腺癌、卵巣癌又は乳癌、又はリンパ腫（特に濾胞性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキン又は非ホジキンリンパ腫）、又は白血病（特に慢性リンパ球性白血病又は慢性骨髄性白血病）、又は多発性骨髄腫、又は中枢神経系に影響を及ぼす腫瘍（特にグリア芽細胞腫又は神経芽腫）である。
【０１９１】
本明細書において、治療される感染性疾患の例としては、慢性Ｂ型及びＣ型肝炎並びにＨＩＶ／ＡＩＤＳを含んでなるウィルス感染、感染性肺炎、及び性器いぼなどの性病が挙げられる。
【０１９２】
本明細書において、治療される免疫学的及び自己免疫学的関連疾患の例としては、組織又は臓器移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が挙げられる。
【０１９３】
一実施形態において、本明細書において、治療される疾患は貧血であり、より好ましくは、慢性腎不全（ＣＲＦ）に関連した貧血、ジドブジン処置ＨＩＶ感染患者における貧血、化学療法又は放射線療法を受けている癌患者における貧血、非骨髄系癌の進行に関連した貧血、ウィルス感染（ＨＩＶなど）に関連した貧血又は慢性疾患に関連した貧血である。
【０１９４】
また、本発明のポリペプチド又は医薬組成物は、異なる自己血液採取プログラムに関与している患者において、他の人からの血液の使用を避けるために、自己血液の産生を増加させる目的の治療用化合物の調製にも使用できる（これは、例えば、外科手術の際に出血が想定される場合である）。
【０１９５】
本発明の医薬組成物は、活性成分としての本発明のポリペプチド又はタンパク質と組み合わせて、好適な薬学的に許容できる希釈剤、担体、生物適合性媒体及び動物への投与に好適な添加物（例えば、生理学的生理食塩溶液）を含有でき、並びに任意に、薬剤的に使用できる製剤へ活性化合物を処理することを助ける助剤（賦形剤、安定化剤、又はアジュバントなど）を含む。該医薬組成物は、投与様式の必要性に合致するように、任意の許容できる方法で製剤化できる。例えば、薬剤送達のための生体材料及び他のポリマーの使用、並びに特定の投与様式を検証するための種々の技法及びモデルが、文献に開示されている（Ｌｕｏ  Ｂ及びＰｒｅｓｔｗｉｃｈ  ＧＤ、２００１年；Ｃｌｅｌａｎｄ  ＪＬら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００１）、１２（２）：２１２〜９頁）。「薬学的に許容できる」は、該活性成分の生物活性の有効性を妨害せず、投与される宿主に毒性でない任意の担体を包含することを意味している。例えば、非経口投与用に、上記活性成分は、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンガー液などの媒体中、注射用の単位用量形態において製剤化できる。担体はまた、殿粉、セルロース、タルク、ブドウ糖、乳糖、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール、及び石油、動物源、植物源又は合成源のものを含む種々の油類（落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油）からも選択できる。
【０１９６】
該医薬組成物は、液体形態又は凍結乾燥形態であり得、種々のｐＨ値及びイオン強度を有する希釈剤（トリス、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液又はリン酸緩衝液）、ツウィーン又はポリソルベートなどの可溶化剤、ヒト血清アルブミン又はゼラチンなどの担体、チメロサール、パラベン類、塩化ベンジルアルコニウム又はベンジルアルコールなどの保存剤、アスコルビン酸又はメタ重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、及びリシン又はグリシンなどの他の成分を含む。具体的な組成物の選択は、治療されている病態、投与経路及び所望の薬物動態パラメーターなどの多数の要因に依存する。医薬組成物に好適な成分のより広範な概論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、マック、イーストン、ペンシルベニア州（１９８０）に見られる。好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯポリペプチド及び変異体は、ヒトアルブミンを含有する、且つ任意に、保存剤としてベンジルアルコールを含有する等張塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム緩衝液中、液体形態で製剤化される。
【０１９７】
活性成分の所望の血中濃度を確立するために、任意の許容された投与様式を使用でき、当業者により決定できる。例えば、投与は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経皮、経直腸、経口、又は頬側経路などの種々の非経口経路によるものであり得る。本発明の医薬組成物は、皮下又は静脈内の注射によって投与されることが好ましい。最終的に選択された投与経路は、多数の要因に依存し、当業者によって確認できる。
【０１９８】
また、本発明の医薬組成物は、好ましくは、正確な投与量の単回投与に好適な単位用量形態で、予め決定された速度における該ポリペプチドの長期投与のために、蓄積注射、浸透圧ポンプなどの持続された又は制御された放出投与形態においても投与できる。
【０１９９】
非経口投与は、大量瞬時注射又は経時的に漸次的潅流によるものであり得る。非経口投与用の製剤としては、滅菌水性又は非水性液剤、懸濁剤、及び乳剤が挙げられ、それらは、当業者に知られた助剤又は賦形剤を含有でき、ルーチン法によって調製できる。さらに、適切な油性注射用懸濁剤として、該活性化合物の懸濁剤が投与できる。好適な親油性溶媒又は媒体としては、脂肪油、例えば、ゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えば、ゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチル又はトリグリセリドが挙げられる。該懸濁剤の粘度を増加させる物質を含有し得る水性注射用懸濁剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、及び／又はデキストランが挙げられる。該懸濁剤はまた、任意に、安定化剤も含有し得る。医薬組成物には、注射による投与のための好適な液剤が含まれ、賦形剤と共に、約０．０１パーセントから９９．９９パーセント、好ましくは、約２０パーセントから７５パーセントの活性化合物を含有する。
【０２００】
当然のことながら、投与される用量は、レシピエントの年齢、性別、健康状態、及び体重、存在する場合は、併用治療の種類、治療の頻度、及び所望の効果の性質に依存する。当業者によって理解され、決定されるように、用量は、個々の対象によって調整される。各治療に必要な総用量は、複数用量又は単回用量によって投与できる。
【０２０１】
例えば、貧血（ＣＲＦに関連した貧血、ジドブジン処置ＨＩＶ感染患者における貧血、化学療法又は放射線療法を受けている癌患者における貧血、非骨髄系癌の進行に関連した貧血、ウィルス感染（ＨＩＶなど）に関連した貧血又は慢性疾患に関連した貧血など）の治療の場合、本発明のＥＰＯポリペプチド又は変異体又は類似体の投与頻度は、治療されている病態及び標的ヘマトクリットに依って変わるが、一般に、週に３回未満となろう。投与頻度は、週に約２回、週に約１回となろう。また、投与頻度は、週に約１回未満、例えば、２週ごとに約１回（１４日当たり約１回）、１カ月に１回又は２カ月ごとに１回でもよい。当然のことながら、実際に用いられる投与回数は、該ＥＰＯポリペプチド又は変異体又は類似体に対する異なる個体による応答の変動によって、本明細書に開示された頻度からいくらか変化することがあり得；用語「約」は、このような変動を反映することが意図されている。本発明のＥＰＯポリペプチド又は変異体又は類似体による貧血の治療の場合、治療有効量とは、標的ヘマトクリットへの、又は患者に利益を提供する標的ヘマトクリット範囲へのヘマトクリット増加を提供するか、又は標的ヘマトクリットに、又は標的ヘマトクリット範囲内に患者を維持するＥＰＯポリペプチド又は変異体又は類似体（又は本明細書上記の融合タンパク質）の量を称する。この量は、個体によって変動し、患者の全体的な身体状態、貧血の重症度及び基礎となっている原因及び個々の患者にとっての最終的な標的ヘマトクリットなど、多数の要因に依存する。標的ヘマトクリットは典型的に、３０％〜６０％の範囲、又は３０％〜４５％の範囲、より好ましくは、４０％〜４５％の範囲である。当然のことながら、このような標的は、所与の患者にとっての実際の標的ヘマトクリット決定において、医師の裁量が適切であり得るように、個体によって変動する。しかしながら、標的ヘマトクリットの判定は、十分に当業者のレベル内にある。
【０２０２】
本発明の医薬組成物は、単独で、又は該病態に向けられた、又は該病態の他の症状に向けられた他の療法と関連付けて投与できる。通常、本発明によるＥＰＯポリペプチド又は変異体又は類似体の週１回投与の用量範囲は、１用量、１ｋｇ当たり、約０．０５μｇから約１０μｇのエリスロポエチンペプチドである。週３回投与の用量範囲は通常、１用量、１ｋｇ当たり、０．０２μｇから２．５μｇとなろう。該個体に投与された最初の、又は以前の用量と同一、それ未満、又はそれより超の投与量で、引き続いての投与が実施できる。
【０２０３】
好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯポリペプチド又は変異体又は類似体は、ｒＨｕＥＰＯよりも大きな効力を有する治療薬である。このような組成物の利点は、より低頻度で、及び／又はより低用量で投与し得ることである。貧血を患っている患者に対する現行の治療は、週３回のＥＰＯ投与、外科手術患者では１日１回の投与を要する。より低頻度の投与計画は、医師と患者の双方にとって、特に、医師のオフィス又は診療所に定期的に来られない患者、又はＥＰＯを自己注射する患者にとって、より便利になると思われる。より強力な分子の他の利点は、ヘマトクリットの同等な増加のために、患者に導入される薬剤がより少ないことである。したがって、好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯポリペプチド又は変異体又は類似体は、ｒＨｕＥＰＯに比較して、貧血の治療に関してより強力な分子であり、より低頻度の投与計画を可能にする。他の好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯポリペプチド又は変異体又は類似体は、より低用量で投与された際、少なくともｒＨｕＥＰＯと同等なレベルに、ヘマトクリットを増加及び維持する。さらに他の好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯポリペプチド又は変異体又は類似体は、少なくともｒＨｕＥＰＯと同様に忍容され、一部の患者では、より忍容される可能性がある。
【０２０４】
さらに、極めて好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯポリペプチド又は変異体又は類似体は、哺乳動物におけるヘマトクリットレベルを実質的に増加させることなく、前記哺乳動物、特にヒトにおいて、組織保護的活性を有する。このようなポリペプチドは、治療される患者のヘマトクリットレベルに対し、野生型ＥＰＯに比較してより少ない効果で、又はさらに無効果で投与できるため、特に有利である。このようなポリペプチドの利点は、ヘマトクリットを関連した副作用及び危険のある高すぎるレベルへと増加させることなく、野生型ＥＰＯに比較して、より高い頻度で、及び／又はより高い用量で投与し得ることである。このような本発明のポリペプチド又は変異体又は類似体は、患者において、より忍容される可能性がある。
【０２０５】
７．本発明のＥＰＯポリペプチド又は変異体をコードする核酸の検出：
本発明のさらなる態様は、サンプル中、本発明のＥＰＯポリペプチド又は変異体又は類似体をコードする核酸、好ましくは、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを検出又は投与する組成物及び方法に関する。このような組成物としては、例えば、本明細書における上記のＥＰＯポリペプチド又は変異体又は類似体をコードする核酸を特異的に認識する任意の特異的核酸プローブ又はプライマーが挙げられる。
【０２０６】
特定の実施形態は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用できる、本発明によるＥＰＯポリペプチド又は変異体又は類似体をコードする核酸配列の断片に関するものである。このような核酸断片は、２０から８０ヌクレオチドの長さ、好ましくは、２０から６０ヌクレオチドの長さ、より好ましくは、２０から５０ヌクレオチドの長さ、最も好ましくは、２０から３８ヌクレオチドの長さである。
【０２０７】
特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも部分的には、本明細書上記で定義された配列番号４のポリペプチド又は前記ポリペプチドの変異体又は類似体をコードする配列又はその相補鎖に由来する。さらなる特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号４のポリペプチドをコードする２０から３８ヌクレオチドの長さの核酸又はその相補鎖であり、さらに好ましくは、配列番号５の２０から３８ヌクレオチドの核酸又はその相補鎖である。
【０２０８】
他の特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも部分的には、本明細書上記で定義された配列番号６のポリペプチド又は前記ポリペプチドの変異体又は類似体をコードする配列又はその相補鎖に由来する。さらなる特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号６のポリペプチドをコードする２０から３８ヌクレオチドの長さの核酸又はその相補鎖であり、さらに好ましくは、配列番号７の２０から３８ヌクレオチドの核酸又はその相補鎖である。
【０２０９】
他の特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも部分的には、本明細書上記で定義された配列番号８、又は配列番号９のポリペプチド又は前記ポリペプチドの変異体をコードする配列又はその相補鎖に由来する。さらなる好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号８、又は配列番号９のポリペプチドをコードする３６から３８ヌクレオチドの長さの核酸又はその相補鎖であり、さらに好ましくは、配列番号１０、又は配列番号１１の２０から３６又は３８ヌクレオチドの核酸又はその相補鎖である。
【０２１０】
他の特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも部分的には、本明細書上記で定義された配列番号１３のポリペプチド又は前記ポリペプチドの変異体又は類似体をコードする配列又はその相補鎖に由来する。さらなる特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号１３のポリペプチドをコードする２０から３８ヌクレオチドの長さの核酸又はその相補鎖であり、さらに好ましくは、配列番号１２の２０から３８ヌクレオチドの核酸又はその相補鎖である。
【０２１１】
これに関して、用語「核酸分子」は、限定はしないが、デオキシリボ核酸（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、合成ＤＮＡなど）、リボ核酸（例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなど）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）などの種々のタイプのすべての核酸を包含する。好ましい実施形態において、該核酸分子は、二本鎖ＤＮＡ分子又はｃＤＮＡ分子などのＤＮＡ分子である。ハイブリダイゼーションプローブは、３２Ｐ、３３Ｐ又は３５Ｓなどの放射性ヌクレオチド、又はアビジン／ビオチン結合系により該プローブに結合したアルカリホスファターゼなどの酵素標識など、種々の標識によって標識できる。本発明のｃＤＮＡの配列に相補的な配列を有する標識プローブを用いて、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーンし、該プローブがハイブリダイズするのは、このようなライブラリーのどのメンバーかを判定することができる。ハイブリダイゼーション技術は当業界でよく知られている。
【０２１２】
本発明によるＥＰＯポリペプチド又は変異体又は類似体をコードする核酸配列の他の有用な断片としては、標的ｍＲＮＡ（センス）又はＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合することのできる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。特定の実施形態において、前記断片は、本明細書上記で定義した配列番号４のポリペプチド又は前記ポリペプチドの変異体又は類似体をコードする核酸若しくはその相補鎖、又は配列番号５の核酸若しくはその相補鎖の断片である。他の特定の実施形態において、前記断片は、本明細書上記で定義した配列番号６のポリペプチド又は前記ポリペプチドの変異体又は類似体をコードする核酸若しくはその相補鎖、又は配列番号７の核酸若しくはその相補鎖の断片である。他の特定の実施形態において、前記断片は、本明細書上記で定義した配列番号１３のポリペプチド又は前記ポリペプチドの変異体又は類似体をコードする核酸若しくはその相補鎖、又は配列番号１２の核酸若しくはその相補鎖の断片である。他の特定の実施形態において、前記断片は、本明細書上記で定義した配列番号８又は配列番号９のポリペプチド又は前記ポリペプチドの変異体をコードする核酸若しくはその相補鎖、又は配列番号１０又は配列番号１１の核酸若しくはその相補鎖の断片である。
【０２１３】
本発明によるアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、ＥＰＯ  ＤＮＡのコード領域の断片を含む。このような断片は一般に、少なくとも１４ヌクレオチド、好ましくは１４から３６又は３８ヌクレオチド、さらに好ましくは、１４から３０ヌクレオチドを含む。所与のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいたアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、Ｓｔｅｉｎ及びＣｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：２６５９頁、１９８８年）及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら（Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８頁、１９８８年）に記載されている。標的核酸へのアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの結合により、二重鎖分解の増加、転写又は翻訳の早期終結などのいくつかの手段の１つにより、又は他の手段により、標的配列の転写又は翻訳を遮断する二重鎖の形成がもたらされる。したがって、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＥＰＯタンパク質（特に本発明によるＥＰＯポリペプチド又は変異体又は類似体）の発現を遮断するために、より具体的には、特定の転写変異体の発現、特に、ＥＰＯｖ１、ＥＰＯｖ２又はＥＰＯｖ３の発現を遮断するために使用できる。特定の実施形態において、エキソン２からエキソン４の間の連結部領域（該連結部を覆っているような）におけるＥＰＯｖ１をコードするｍＲＮＡに結合するような、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが選択される。他の特定の実施形態において、エキソン２からエキソン５の間の連結部領域（該連結部を覆っているような）におけるＥＰＯｖ２をコードするｍＲＮＡに結合するような、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが選択される。
【０２１４】
本明細書上記に定義した核酸配列の断片のさらなる使用は、上記に定義したＥＰＯポリペプチド又は変異体又は類似体をコードする核酸分子の少なくとも特有の断片を増幅するためのプライマーとして、それらを使用することである。「プライマー」とは、標的ヌクレオチド配列に相補的であり、該標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせるために使用される特異的オリゴヌクレオチド配列を意味する。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素のいずれかによって触媒されるヌクレオチド重合のための開始ポイントとして働く。本発明の典型的なプライマーは、６から５０ヌクレオチドの長さ、より好ましくは、８から４０ヌクレオチドの長さ、さらに好ましくは、１２から３０ヌクレオチドの長さの一本鎖核酸分子である。プライマーの配列は、標的核酸分子の配列から直接引き出すことができる。高い特異性を確実にするためには、プライマー配列と標的遺伝子との間の完全相補性が好ましい。しかし、一定の誤対合は許容できる。特定の実施形態において、該プライマーは、１２から３０ヌクレオチド、より好ましくは、１５から２０ヌクレオチドの長さであり、配列番号５又はその相補鎖の断片である。これらのプライマーは、エキソン２からエキソン４の間の連結部領域（該連結部を覆っているような）におけるＥＰＯｖ１をコードするｃＤＮＡに結合し、当業界に知られた方法によって上流又は下流に選択された他のプライマーに結合するように選択された場合、転写変異体ＥＰＯｖ１を特異的に増幅するためのＲＴ−ＰＣＲプライマーとして特に好適である。他の特定の実施形態において、該プライマーは、１２から３０ヌクレオチド、より好ましくは、１５から２０ヌクレオチドの長さであり、配列番号７又はその相補鎖の断片である。これらのプライマーは、エキソン２からエキソン５の間の連結部領域（該連結部を覆っているような）におけるＥＰＯｖ１をコードするｃＤＮＡに結合し、当業界に知られた方法によって上流又は下流に選択された他のプライマーに結合するように選択された場合、転写変異体ＥＰＯｖ２を特異的に増幅するためのＲＴ−ＰＣＲプライマーとして特に好適である。さらに他の特定の実施形態において、該プライマーは、１２から３０ヌクレオチド、より好ましくは、１５から２０ヌクレオチドの長さであり、配列番号１１又はその相補鎖の断片である。これらのプライマーは、当業界に知られた方法によって上流又は下流に選択された他のプライマーに結合した場合、エキソン４Ａの３’端によって少なくとも部分的にコードされた転写変異体を特異的に増幅するためのＲＴ−ＰＣＲプライマーとして特に好適である。他の特定の実施形態において、該プライマーは、１２から３０ヌクレオチド、より好ましくは、１５から２０ヌクレオチドの長さであり、配列番号１２若しくはその相補鎖、又は配列番号１４若しくはその相補鎖の断片である。
【０２１５】
本発明はまた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術にも関する。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、対象となっている遺伝子又はｍＲＮＡに対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、生体内に導入されて、対応するｍＲＮＡの分解がもたらされる転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）の機序を称する。ＲＮＡｉ反応においては、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖の双方が、１９から２５ヌクレオチド（ｎｔ）、好ましくは、２１から２３ヌクレオチドの長さの範囲にあり、２−ヌクレオチド３’尾部を有する小型ＲＮＡ断片又はセグメントに処理される。これらのｄｓＲＮＡは、「ガイドＲＮＡ」又は「短干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）として知られている。ｓｉＲＮＡはまた、ｓｉＲＮＡの二重鎖の双方の鎖が単一のＲＮＡ分子内に含まれる短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）も含み得る。或いは、１９から２５ｎｔ、好ましくは、２１から２３ｎｔの長さであり、２−ヌクレオチド３’尾部を有する合成ｄｓＲＮＡを合成し、精製し、該反応に用いることができる。次いで、ｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ複合体内にｓｉＲＮＡに対して相同性を有する内因性ｍＲＮＡを標的とし、破壊するタンパク質を含む該複合体に結合する。この様式で、特定のｍＲＮＡを標的化し、分解することができ、それによって、標的ｍＲＮＡからのタンパク質発現の減少がもたらされる。ｄｓＲＮＡの具体的な要件及び修飾は、ＰＣＴ国際公開第０１／７５１６４号（参照として本明細書に組み込まれている）に記載されている。ｄｓＲＮＡ分子は長さが変わり得るが、１９から２５ｎｔの長さ、最も好ましくは、２１から２３ヌクレオチドの長さであり、２−から３−ヌクレオチド３’オーバーハングが、典型的に（２’−デオキシ）チミジン又はウラシルで終わる特徴を有するｓｉＲＮＡ分子を用いることが好ましい。ｓｉＲＮＡは典型的に、３’ヒドロキシル基を含む。一本鎖ｓｉＲＮＡ並びにｄｓＲＮＡの平滑末端形態もまた使用できる。ＲＮＡの安定性をさらに増強させるために、３’オーバーハングを分解に対して安定化させることができる。このような一実施形態において、アデノシン又はグアノシンなどのプリンヌクレオチドを含むことによって、ＲＮＡを安定化させる。或いは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、（２’−デオキシ）チミドによるウリジン２−ヌクレオチドオーバーハングの置換が許容され、ＲＮＡｉの有効性に影響を及ぼさない。２’ヒドロキシル基の不在により、組織培養培地中のオーバーハングのヌクレアーゼ耐性が著しく増強する。ｓｉＲＮＡは、ＰＣＴ国際公開第０１／７５１６４号に記載されている方法などの当業界に知られた任意の方法を用いて、又は、ＲＮＡのインビトロ転写に関する標準的方法及びＥｌｂａｓｈｉｒら（Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．、１５：１８８〜２００頁、２００１年）に記載されたｄｓＲＮＡアニーリング法を用いて調製できる。本発明において、ｄｓＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡは、本明細書に記載されたＥＰＯポリペプチド又は変異体又は類似体ｍＲＮＡのｍＲＮＡ配列の少なくとも一部に実質的に相補的であり、本明細書に記載されたＥＰＯ変異体の発現又は生物活性を減少又は抑制することができる。ｓｉＲＮＡは、本明細書に記載された��ＰＯ変異体（特にＥＰＯｖ１、ＥＰＯｖ２又はＥＰＯｖ３）の１８から２５の連続ヌクレオチドに１００％相補的であることが望ましい。本明細書に記載されたＥＰＯポリペプチド又は変異体又は類似体の生物活性の減少は、対照のｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡで処置された細胞に比較して、好ましくは、少なくとも５％、より好ましくは、少なくとも１０％、２０％、又は２５％、最も好ましくは、少なくとも５０％である。タンパク質発現のレベルをアッセイする方法もまた、当業界に知られており、ウェスタンブロット、免疫沈降、及びＥＬＩＳＡが挙げられる。ＥＰＯポリペプチド又は変異体又は類似体の生物活性をアッセイする方法としては、本明細書に記載されたアッセイが挙げられる。
【０２１６】
本明細書に引用された特許及び参考文献はすべて、参照として、それらの全体が本明細書に組み込まれている。
【０２１７】
本発明のさらなる態様及び利点は、以下の実施例に開示されるが、それらは、単に例示として考えるべきであって、本出願を限定するものではない。
【実施例】
【０２１８】
（実施例１）
ヒト遺伝子ＥＰＯのエキソン１、２、４及び５によってコードされたＥＰＯの転写変異体のクローニング
エキソン１、２、４及び５によってコードされたＥＰＯ転写変異体（ＥＰＯｖ１）が、ＥＰＯのヒト遺伝子において予想された（図４を参照）。我々の予想により、４つのエキソンにまたがっている４９２ｂｐに対応する、１６４のアミノ酸（配列番号４）においてコードされたＥＰＯｖ１タンパク質が導かれる。この予想には、開始メチオニン、シグナル配列及び停止コドンが含まれた（図４）。
【０２１９】
ＥＰＯｖ１タンパク質を作出するために、該エキソンを、ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅することができる。次いで、増幅されたエキソンを、当業界によく知られたクローニング技法により再組立てする。次いで、ＥＰＯｖ１コード配列に対応するＰＣＲ産物（図４）を、哺乳動物発現ベクター内にサブクローン化する。
【０２２０】
ＥＰＯｖ１タンパク質作出のための他の可能性は、本明細書下記のとおり、ＲＮＡのプールからのクローニングである。
【０２２１】
１．１：ＲＮＡのプールからのエキソン１、２、４及び５によってコードされたＥＰＯｖ１のクローニング
逆転写及びクローニングの技法を用い、ＥＰＯｖ１を、ＲＮＡのプールからクローン化した。用いられたＲＮＡのプールは、種々の組織からのＲＮＡの混合物である。用いられた混合物は、以下のとおりである：ヒト膵臓のポリＡ  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；カタログ照会番号：６３６１１９）、ヒト骨格筋のポリＡ  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；カタログ照会番号：６３６１２０）、ヒト小腸のポリＡ  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；カタログ照会番号：６３６１２５）、ヒト精巣のポリＡ  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；カタログ照会番号：６３６１１５）、ヒト肝臓のポリＡ  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；カタログ照会番号：６３６１０１）、ヒト脳（全体）のポリＡ  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；カタログ照会番号：６３６１０２）及びヒト正常脂肪の総ＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ組織コレクション、（ロットＡ５０４０００４）、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）。
【０２２２】
１．１．１．ｃＤＮＡの合成（プールの作出）
Ａ）第１鎖ｃＤＮＡの合成：
該ｃＤＮＡの合成には、ＣｌｏｎｔｅｃｈからのＳＭＡＲＴ（商標）ＲＡＣＥｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（マウンテンビュー、カリフォルニア州、カタログ照会番号：６３４９１４）を、製造元の推奨に従って使用した。用いられたプロトコルは以下のとおりであった：
１−混合物調製
−  ０．５μｌのＲＮＡプール（上記参照）
−  １μｌの３’ＳＭＡＲＴ  ＣＤＳＰｒｉｍｅｒＩＩＡ（１０μＭ）
−  １μｌのＳＭＡＲＴＩＩＡオリゴヌクレオチド（１０μｍ）
−  ２．５μｌの脱イオン化Ｈ２Ｏ
２−内容物を混合し、該管をマイクロ遠心分離機内で簡単に回転させる
３−７２℃で２分間インキュベートする
４−該管を氷上で２分間冷却する
５−各反応管に以下のものを加える
−  ２μｌの５×第１鎖緩衝液
−  １μｌのＤＴＴ（２０ｍＭ）
−  １μｌの５０×ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
−  １μｌのＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ
６−該管を４２℃で１時間インキュベートする
７−１９０μｌのＴＥ  １×（ｐＨ７．５）を加える
８−７２℃で７分間インキュベートする
９−−２０℃で保存する
【０２２３】
Ｂ）Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ＰＣＲプロトコル
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（マウンテンビュー、カリフォルニア州、カタログ照会番号：６３９１１９）からのＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ２  ＰＣＲ  Ｋｉｔ  ＆  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘを用いたＰＣＲを実施した。用いられたプロトコルは以下のとおりであった：
１−混合物調製
−  ２９μｌのＨ２Ｏ
−  １０μｌの５×ＧＣ×２ＰＣＲ緩衝液
−  ５μｌのＧＣ  Ｍｅｌｔ（５Ｍ）
−  ２μｌの入れ子ユニバーサルプライマーＡ  １０ｍＭ
−  １μｌの５０×ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ）
−  １μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  Ｐｏｌ．Ｍｉｘ
２−ステップＡ）で得られた産物２μｌを加える
３−ＰＣＲ反応：
９４℃    １分間        １サイクル
９４℃    １５秒間    ）
６５℃    ５秒間      ）２０サイクル
６８℃    １２分間    ）
６８℃    １２分間      １サイクル
４−使用された管：０．４ｎｇ／μｌ
【０２２４】
１．１．２．ＥＰＯｖ１  ｃＤＮＡのクローニング
Ｇａｔｅｗａｙクローニング法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから商品として入手できるＧａｔｅｗａｙ  ＰＣＲクローニングシステム）の第１段階は、本明細書上記でテンプレートとして作出されたｃＤＮＡを用いて、５’末端にａｔｔＢ１組換え部位及びＫｏｚａｋ配列が隣接し、３’末端にインフレーム６ヒスチジン（６Ｈｉｓ）タグをコードする配列、停止コドン及びａｔｔＢ２組換え部位（Ｇａｔｅｗａｙ適合性ｃＤＮＡ）が隣接したＥＰＯｖ１のＯＲＦを作出する２ステップのＰＣＲ反応を含む。
【０２２５】
Ａ）第１のＰＣＲ
プライマーとして、ＲｅｃＦ１（ＴＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＧＣＧＧＡＧ（配列番号１６））及びＲｅｃＲ１（ＡＴＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡＣＡＣＣＴＧＧＴＣＡ（配列番号１７））、マトリックスとして、本明細書上記のステップＢ）で得られた産物並びに以下の条件を用いて、第１のＰＣＲを実施した。
１−混合物調製
−  ５μｌの本明細書上記ステップＢ）で得られた産物
−  ４５μｌのＨ２Ｏ
−  ５μｌの緩衝液「ＴａｑＰｌｕｓ（登録商標）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ」１０×、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ラジョーラ、カリフォルニア州、カタログ照会番号：６００２１１）
−  ０．４μｌのｄＮＴＰ  ２５ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールスバッド、カリフォルニア州、カタログ照会番号：１０２９７−０１８）
−  各１０μＭで１μｌのプライマー、ＲｅｃＦ１及びＲｅｃＲ１（上記参照）
−  ０．２５μｌのＴａｑＰｌｕｓ（登録商標）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ラジョーラ、カリフォルニア州、カタログ照会番号：６００２１１）
−  ２．５μｌのＤＭＳＯ  １００％
２−ＰＣＲ反応：
９４℃    １分間        １サイクル
９４℃    ４０秒間    ）
４５℃    ４０秒間    ）３サイクル
７２℃    １分間      ）
９４℃    ４０秒間    ）
５５℃    ４０秒間    ）９サイクル
７２℃    １分間      ）
７２℃    ５分間
４℃      終了
【０２２６】
Ｂ）第２のＰＣＲ
プライマーとして、ｃｌｏＦ１（ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣ（配列番号１８））及びｃｌｏＲ１（ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧ（配列番号１９））、マトリックスとして、本明細書上記のステップＡ）で得られた産物並びに以下の条件を用いて、第２のＰＣＲを実施した：
１−混合物調製
−  １０μｌの本明細書上記ステップＡ）で得られた産物
−  ３１．５μｌのＨ２Ｏ
−  ４μｌの緩衝液「ＴａｑＰｌｕｓ（登録商標）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ」１０×、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ラジョーラ、カリフォルニア州、カタログ照会番号：６００２１１）
−  ０．３２μｌのｄＮＴＰ  ２５ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールスバッド、カリフォルニア州、カタログ照会番号：１０２９７−０１８）
−  各１０μＭで４μｌのプライマー、ｃｌｏＦ１及びｃｌｏＲ１（上記参照）
−  ０．２μｌのＴａｑＰｌｕｓ（登録商標）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ラジョーラ、カリフォルニア州、カタログ照会番号：６００２１１）
２−ＰＣＲ反応
９４℃    １分間        １サイクル
９４℃    ４０秒間    ）
４５℃    ４０秒間    ）３サイクル
７２℃    １分間      ）
９４℃    １分間
９４℃    ４０秒間    ）
５０℃    ４０秒間    ）３サイクル
７２℃    １分間      ）
９４℃    ４０秒間    ）
５５℃    ４０秒間    ）７サイクル
７２℃    １分間      ）
７２℃    ５分間
４℃      終了
【０２２７】
Ｃ）ＢＰ反応
Ｇａｔｅｗａｙクローニング法の第２段階（ＢＰ組換えによるＧａｔｅｗａｙエントリークローニング、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、ＧａｔｅｗａｙエントリーベクターｐＤＯＮＲ（商標）２０１へのＧａｔｅｗａｙ修飾ＰＣＲ産物（即ち、上記ステップＢ）で得られたＰＣＲ産物）のサブクローニングを含む。
１−混合物調製
−  １μｌの本明細書上記ステップＢ）で得られた産物
−  ４μｌのＴＥ１０．１
−  １μｌのベクターｐＤＯＮＲ２０１（３００ｎｇ／μｌ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールスバッド、カリフォルニア州、カタログ照会番号：１１７９８−０１４）
−  ２μｌの緩衝ＢＰ反応液５×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールスバッド、カリフォルニア州、カタログ照会番号：１１７８９−０１３）
−  ２μｌのＢＰクロナーゼ酵素、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールスバッド、カリフォルニア州、カタログ照会番号：１１７８９−０１３）
２−２５℃で１時間インキュベートする
３−１μｌのプロテイナーゼＫを加える（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ（ダルムスタット、ドイツ国、カタログ照会番号：１．２４５６８）
４−３７℃で１０分間インキュベートする
５−４℃で保存する
【０２２８】
Ｄ）形質転換
本明細書上記のステップＣ）で得られた反応産物を用い、電気穿孔により、大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換した。
１−混合物組成：
−  １μｌの本明細書上記ステップＣ）で得られたＢＰ−反応産物
−  ３０μｌのＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ  ＤＨ１０Ｂ細胞、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールスバッド、カリフォルニア州、カタログ照会番号：１８２９０−０１５）
該混合物を冷却した０．１ｃｍの電気穿孔キュベットに移し、製造元のプロトコルに従って、該細胞を電気穿孔した。
−  電気穿孔直後に、５００μｌのＳＯＣ培地を加えた。
２−攪拌下、３７℃で１時間インキュベートする
３−ＬＢアガープレート上に３０μｌを塗布する（＋５０μｇ／ｍｌのカナマイシン）
４−３７℃で一晩インキュベートする
【０２２９】
スプライス変異体の同定：
１５０μｌのＬＢ培養物＋カナマイシンを接種するために、９６のクローンを取り出して用い、３７℃で２０時間インキュベートした。ｐＤＯＮＲ特異的プライマー（正プライマー、５’−ＴＣＧＣＧＴＴＡＡＣＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＡＴＣＴＣ−３’（配列番号３２）；逆プライマー、５’−ＧＴＡＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡＴＴＴＴＧＡＧＡＣＡＣ−３’（配列番号３３））によるＰＣＲのために、各培養物２マイクロリットルを用いた。
ＰＣＲ条件：
ＰＣＲ混合物：
２μｌの培養物
１０×ＰＣＲ緩衝液２μｌ
２０ｍＭのｄＮＴＰ０．２μｌ
１０μＭのｐＤＯＮＲ正プライマー１μｌ
１０μＭのｐＤＯＮＲ逆プライマー１μｌ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）０．１μｌ
ｄｄＨ２Ｏを２０μｌまで加える
ＰＣＲプログラム
９５℃で２分間
９５℃で３０秒間）
５６℃で３０秒間｝３５サイクル
７２℃で６０秒間）
【０２３０】
ＴＡＥ中、５０ｃｍの２％アガロースゲル上、５Ｖ／ｃｍで３時間、５μｌのＰＣＲ産物を処理した。二者択一的スプライス変異体構造の配列決定及び確認のために、カノニカルの予想されたサイズとは異なる断片サイズを示すＰＣＲ産物を選択した（５ｍｌの培養物）。
【０２３１】
得られたコロニーのいくつかの５ｍｌの培養物から、プラスミドミニプレップＤＮＡを調製し、ＤＮＡ配列決定に供した。次いで、１０μｌの最終容量中、１．５μｌのｐＥＡＫ１２ｄベクター（０．１μｇ／μｌ）、２μｌのＬＲ緩衝液及び１．５μｌのＬＲクロナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する組換え反応液中、正しい配列（ｐＤＯＮＲ２０１＿ＥＰＯｖ１−ＨＩＳ）を含有するクローンの１つからのプラスミドＤＮＡ（１．５μｌ又は約１００ｎｇ）を用いた。該混合物を、室温で１時間インキュベートした。プロテイナーゼＫ（２μｇ）の添加により該反応を停止させ、さらに１０分間３７℃でインキュベートした。各反応液のアリコート（１μｌ）を用い、電気穿孔により、大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換した。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬ−ブロス（ＬＢ）プレート上に、形質転換混合物のアリコートを塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０２３２】
得られたコロニーのいくつかの５ｍｌの培養物から、プラスミドミニプレップＤＮＡを調製した。ｐＥＡＫ１２ｄベクター内のプラスミドＤＮＡ（２００〜５００ｎｇ）を、ＤＮＡ配列決定に供した。Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭＥＧＡ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、製造元の指示に従って、配列を検証したクローン（ｐＥＡＫ１２ｄ＿ＥＰＯｖ１−ＨＩＳ）の培養物５００ｍｌから、プラスミドマキシプレップＤＮＡを調製した。滅菌水（又は、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）中、１μｇ／μｌの濃度でプラスミドＤＮＡを再懸濁し、−２０℃で保存した。
【０２３３】
プラスミドｐＥＡＫ１２ｄ＿ＥＰＯｖ１−ＨＩＳの配列は、配列番号２０で示されている。
【０２３４】
（実施例２）
ＥＰＯｖ１（Ｈｉｓ−タグ化）の発現
ヒト細胞、例えば、エプスタインバーウィルス核抗原を発現するヒト胚腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、このような細胞にＥＰＯｖ１の発現を可能にさせる発現ベクター（ｐＥＡＫ１２ｄ＿ＥＰＯｖ１−ＨＩＳ）をトランスフェクトした。ＥＰＯｖ１を発現する細胞を増殖させ、該培養培地から該組換えタンパク質を抽出した。
【０２３５】
２．１  クローン化ＥＰＯｖ１（Ｈｉｓ−タグ化）の哺乳動物細胞における機能的ゲノム発現
エプスタインバーウィルス核抗原を発現するヒト胚腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、Ｅｘ−細胞ＶＰＲＯ無血清培地（シードストック、維持培地、ＪＲＨ）中、懸濁してルーチンに維持した。トランスフェクション前に、５０ｍｌのＦＥＭＥ１％ＦＢＳに、５００μｇのＥＰＯｖ１コードプラスミドＤＮＡ（ｐＥＡＫ１２ｄ＿ＥＰＯｖ１−ＨＩＳ）及び１０μｇのレポーター遺伝子プラスミドを加えた。次いで、１ｍｌのＰＥＩ（１ｍｇ／ｍｌ  Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を加えた。攪拌後、該混合物を室温で１０分間インキュベートした。該細胞接種物をトランスフェクション混合溶液と再懸濁し、１％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した２００ｍｌのＦＥＭＥ（１９ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｇ／Ｌのグルコース、７．５ｍＭのＬ−グルタミン、４ｍｌ／ＬのＩＴＳ−ＸにＤＭＥＭ／ハムのＦ−１２、１：１を補足）（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地に加え、好適な容器中、１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度にする。該培養物を、５％ＣＯ２大気、及び少なくとも７０％の相対湿度のインキュベーター中、３７℃で９０分間、さらにインキュベートした。最後に、該容量に、４ｍｌ／ＬのＩＴＳ−Ｘを補足した２５０ｍｌの化学的に規定された無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地をつぎ足した。トランスフェクションのため、該トランスフェクトした培養物を、同一条件でさらに６日間インキュベートした。採集日に、定性的蛍光試験（Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １０  Ｚｅｉｓｓ）によって、陽性トランスフェクションの確認を行った。上澄み液（５００ｍｌ）を、遠心分離し（１８００×ｇ、４℃、６〜１０分間）、０．２２ｕｍのフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、５００ｍｌフィルターユニット）を通して滅菌ろ過し、ＩＭＡＣ（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）クロマトグラフィーにより精製した。該上澄み液の１つのアリコート（５００μｌ）を、６Ｈｉｓ−タグ化タンパク質のＱＣ用に保持した。
【０２３６】
２．２  クローン化ＥＰＯｖ１（Ｈｉｓ−タグ化）の精製
Ｃ末端６Ｈｉｓタグを有するＥＰＯｖ１組換えタンパク質を含有する５００ｍｌの培養培地サンプルを、１容量の冷緩衝液Ａ（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；６００ｍＭのＮａＣｌ；８．７％（ｗ／ｖ）のグリセロール、ｐＨ７．５）で希釈し、１０００ｍｌの最終容量にした。該サンプルを、０．２２ｍｍの滅菌フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、５００ｍｌフィルターユニット）を通してろ過し、１リットルの滅菌角形培地瓶（Ｎａｌｇｅｎｅ）中、４℃で保持した。自動サンプル充填器（Ｌａｂｏｍａｔｉｃ）に接続したＶＩＳＩＯＮワークスステーション（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上、４℃で精製を行った。精製操作は、２つの連続的ステップ、Ｎｉイオンを充填したＰｏｒｏｓ  ２０ＭＣ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）カラム（１０×５０ｍｍ、３．９３ｍｌ）上での金属アフィニティークロマトグラフィー、引き続いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５培地（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ゲルろ過カラム（１．０×１５ｃｍ）上での緩衝液交換を含んだ。第１のクロマトグラフィーステップでは、金属アフィニティーカラムを、３０カラム容量のＥＤＴＡ液（１００ｍＭのＥＤＴＡ；１ＭのＮａＣｌ；ｐＨ８．０）で再生し、１５カラム容量の１００ｍＭ  ＮｉＳＯ４溶液を用いた洗浄によってＮｉイオンによる再荷電を行い、１０カラム容量の緩衝液Ａ、続いて７カラム容量の緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；６００ｍＭのＮａＣｌ；８．７％（ｗ／ｖ）のグリセロール、４００ｍＭ；イミダゾール、ｐＨ７．５）により洗浄し、最後に、１５ｍＭのイミダゾールを含有する１５カラム容量の緩衝液Ａによって平衡化した。該サンプルをＬａｂｏｍａｔｉｃサンプル充填器により、２００ｍｌのサンプルループ内に移し、引き続き、２０ｍｌ／分の流速で、Ｎｉ金属アフィニティーカラム上に充填した。該Ｎｉカラム上にサンプル全体（１０００ｍｌ）を移すために、該充填操作を５回繰り返した。引き続いて、１２カラム容量の緩衝液Ａ、続いて、２０ｍＭのイミダゾールを含有する２８カラム容量の緩衝液Ａによって該カラムを洗浄した。２０ｍＭのイミダゾール洗浄の間に、緩く結合した混入タンパク質をカラムから溶出させた。最後に、組換えＥＰＯｖ１  Ｈｉｓタグ化タンパク質を、２ｍｌ／分の流速で１０カラム容量の緩衝液Ｂにより溶出させ、溶出した該タンパク質を、２．７ｍｌのフラクション中に採集した。第２のクロマトグラフィーステップでは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５ゲルろ過カラムを、２ｍｌの緩衝液Ｄ（１．１３７ＭのＮａＣｌ；２．７ｍＭのＫＣｌ；１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；８ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４；ｐＨ７．２）で再生し、引き続き、４カラム容量の緩衝液Ｃ（１３７ｍＭのＮａＣｌ；２．７ｍＭのＫＣｌ；１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；８ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４；２０％（ｗ／ｖ）のグリセロール；ｐＨ７．４）で平衡化した。該Ｎｉカラムから、積分サンプル充填器を通して、ピークフラクションをＶＩＳＩＯＮ上に自動的に溶出させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム上に充填し、該タンパク質を、２ｍｌ／分の流速で緩衝液Ｃにより溶出させた。脱塩サンプルを、２．７ｍｌのフラクション中に採集した。該フラクションを、��．２２ｍｍの滅菌遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通してろ過し、分割し、凍結し、−８０℃で保存した。サンプルのアリコートを、クーマシーブルー染色及び抗Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロットによりＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％のＮｕＰＡＧＥゲル；Ｎｏｖｅｘ）上で分析した。レベルＬＰＳエンドトキシンの判定用にさらなるアリコートを採取した。
【０２３７】
クーマシーブルー染色。該ＮｕＰＡＧＥゲルを、０．１％のクーマシーブルーＲ２５０染色溶液（３０％メタノール、１０％酢酸）中、室温で１時間で染色し、引き続き、２０％メタノール、７．５％酢酸中、背景が明瞭になり、タンパク質のバンドがはっきり見えるようになるまで脱染色した。
【０２３８】
ウェスタンブロット。電気泳動後、該タンパク質を、４℃で１時間、２９０ｍＡで、該ゲルからニトロセルロース膜へ電子移動させた。該膜を、室温で１時間、緩衝液Ｅ（１３７ｍＭのＮａＣｌ；２．７ｍＭのＫＣｌ；１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；８ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；０．１％ツウィーン２０、ｐＨ７．４）中、５％粉乳によりブロックし、引き続き、緩衝液Ｅ中、２．５％粉乳中の２種のウサギポリクローナル抗Ｈｉｓ抗体（Ｇ−１８及びＨ−１５、各０．２ｕｇ／ｍｌ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）の混合物と共に、４℃で一晩インキュベートした。室温でさらに１時間インキュベーション後、該膜を、緩衝液Ｅで洗浄（３×１０分）してから、２．５％粉乳を含有する緩衝液Ｅ中、１／３０００に希釈した第２のＨＲＰ結合抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯ、ＨＲＰ  ０３９９）と共に室温で２時間インキュベートした。緩衝液Ｅで洗浄（３×１０分）後、該膜をＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により、１分間展開させた。引き続き、該膜を、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に曝し、該フィルムを展開させ、ウェスタンブロット画像を可視的に解析した。
【０２３９】
タンパク質アッセイ。標準どおり、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、ウシ血清アルブミンにより、該タンパク質濃度を判定した。収量は５２０ｍｇの精製ＥＰＯｖ１−６ＨＩＳであった。
【０２４０】
ＬＰＳに関するアッセイ。Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ−Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＰＴＳ１００）を用い、製造元の指示に従って、ＬＰＳ含量を推定した。サンプルは四重に試験し、ＬＰＳは、Ｕ／ｍｇタンパク質として表した。ＥＰＯｖ１のＬＰＳ濃度は、５．３２Ｕ／ｍｇと判定され、これは、動物への注射に許容できる。
【０２４１】
（実施例３）
ヒト遺伝子ＥＰＯ（ＥＰＯｖ２）のエキソン１、２、及び５によってコードされたＥＰＯの変異体のクローニング
実施例１に記載された方法を用いて、ＥＰＯのヒト遺伝子のエキソン１、２、及び５を含有し、ＥＰＯｖ２をコードする配列（図５を参照）を同定し、クローン化した。得られた発現プラスミド、ｐＥＡＫ１２ｄ＿ＥＰＯｖ２−ＨＩＳの配列は、配列番号２１で示される。
【０２４２】
（実施例４）
ＥＰＯｖ２（Ｈｉｓタグ化）の発現
ＥＰＯｖ２タンパク質は、３つのエキソンにまたがる３１２ｂｐに対応する、１０４のアミノ酸長（配列番号６）である。該配列は、開始メチオニン、シグナル配列及び停止コドンを含有する（図５）。
【０２４３】
ヒト細胞、例えば、エプスタインバーウィルス核抗原を発現するヒト胚腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、このような細胞にＥＰＯｖ２の発現を可能にする発現ベクター（ｐＥＡＫ１２ｄ＿ＥＰＯｖ２−ＨＩＳ）をトランスフェクトした。実施例２に記載されたプロトコルに従って、該タンパク質を作出した。
【０２４４】
（実施例５）
ヒト遺伝子ＥＰＯのエキソン１、２、３及びより長いエキソン４（本明細書においてエキソン４Ａと称される）によってコードされるＥＰＯの転写変異体のクローニング
坐骨神経圧潰におけるＥＰＯｖ１及びＥＰＯｖ２の効果を試験することにより、本試験における野生型タンパク質で見られた活性と同様な活性を双方とも有することが判明した（実施例１１及び図９参照）。該変異タンパク質は、２つのドメイン、即ち、エキソン２及びエキソン５によってコードされたドメインを、完全長分子と共有する。坐骨神経圧潰モデルにおいて保護を与える該タンパク質の領域をより正確に規定する目的で、変異タンパク質ＥＰＯｖ３の活性を調べた。この変異体は、エキソン５を欠いており、下記のとおりクローン化された。
【０２４５】
ＥＰＯのヒト遺伝子において、エキソン１、２、３及び４ＡによってコードされたＥＰＯ変異体（ＥＰＯｖ３）が予測された。前記エキソン４Ａは、野生型ＥＰＯをコードするエキソン４に比較して、３’端でより長い（図３及び６参照）。我々の予測により、４つのエキソン（同定された新規エキソンは、エキソン４Ａと称された）にまたがっている４６２ｂｐに対応する、１５４のアミノ酸（配列番号９）においてコードされたＥＰＯｖ３タンパク質が導かれる。この予測は、開始メチオニン、シグナル配列及び停止コドンを含有した（図６）。
【０２４６】
５．１：ＲＮＡプールからのエキソン１、２、３及びわずかにより長いエキソン４によってコードされたＥＰＯｖ３のクローニング
逆転写及びクローニング技法を用いてＲＮＡのプールからＥＰＯｖ３をクローン化した。用いられたＲＮＡのプールは、種々の組織からのＲＮＡの混合物である。用いられた混合物は、以下のとおりであった：ヒト膵臓のポリＡ  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；カタログ照会番号：６３６１１９）、ヒト骨格筋のポリＡ  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；カタログ照会番号：６３６１２０）、ヒト小腸のポリＡ  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；カタログ照会番号：６３６１２５）、ヒト精巣のポリＡ  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；カタログ照会番号：６３６１１５）、ヒト肝臓のポリＡ  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；カタログ照会番号：６３６１０１）、ヒト脳（全体）のポリＡ  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；カタログ照会番号：６３６１０２）及びヒト正常脂肪の総ＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ組織コレクション、（ロットＡ５０４０００４）、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）。
【０２４７】
５．１．１  ｃＤＮＡの合成（プールの作出）
Ａ）第１鎖ｃＤＮＡの合成：
ｃＤＮＡ合成のために、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（マウンテンビュー、カリフォルニア州、カタログ照会番号：６３４９１４）からのＳＭＡＲＴ（商標）ＲＡＣＥｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを、製造元の推奨に従って用いた。用いられたプロトコルは、以下のとおりであった：
１−混合物調製
−  ０．５μｌのＲＮＡプール（上記参照）
−  １μｌの３’ＳＭＡＲＴ  ＣＤＳプライマーＩＩＡ（１０μＭ）
−  １μｌのＳＭＡＲＴＩＩＡオリゴヌクレオチド（１０μｍ）
−  ２．５μｌの脱イオン化Ｈ２Ｏ
２−内容物を混合し、該管をマイクロ遠心管中で簡単に回転させる
３−７２℃で２分間インキュベートする
４−該管を氷上で２分間冷やす
５−各反応管に以下のものを加える：
−  ２μｌの５×第１鎖緩衝液
−  １μｌのＤＴＴ（２０ｍＭ）
−  １μｌの５０×ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
−  １μｌのＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素
６−該管を４２℃で１時間インキュベートする
７−１９０μｌのＴＥ１Ｘ（ｐＨ７．５）を加える
８−７２℃で７分間インキュベートする
９−−２０℃で保存する
【０２４８】
Ｂ）Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ＰＣＲプロトコル
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（マウンテンビュー、カリフォルニア州、カタログ照会番号：６３９１１９）からのＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ２ＰＣＲキット  ＆  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘを用いたＰＣＲを実施した。用いられたプロトコルは、以下のとおりである：
１−混合物調製
−  ２９μｌのＨ２Ｏ
−  １０μｌの５×ＧＣＸ  ２  ＰＣＲ緩衝液
−  ５μｌのＧＣ溶融液（５Ｍ）
−  ２μｌの入れ子ユニバーサルプライマー１０ｍＭ
−  １μｌの５０×ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ）
−  １μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  Ｐｏｌ．Ｍｉｘ
２−ステップＡ）で得られた産物の２μｌを加える
３−ＰＣＲ反応：
９４℃  １分間        １サイクル
９４℃  １５秒間    ）
６５℃  ５秒間      ）２０サイクル
６８℃  １２分間    ）
６８℃  １２分間      １サイクル
４−使用する管：０．４ｎｇ／μｌ
【０２４９】
５．１．２  ＥＰＯｖ３  ｃＤＮＡのクローニング：
Ｇａｔｅｗａｙクローニング法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから商品として入手できるＧａｔｅｗａｙ  ＰＣＲクローニングシステム）の第１段階は、テンプレートとして本明細書上記で作製したｃＤＮＡを用いて、５’末端にａｔｔＢ１組換え部位及びＫｏｚａｋ配列が隣接し、３’末端にインフレーム６ヒスチジン（６Ｈｉｓ）タグをコードする配列、停止コドン及びａｔｔＢ２組換え部位（Ｇａｔｅｗａｙ適合性ｃＤＮＡ）が隣接したＥＰＯｖ３のＯＲＦを作出する２ステップのＰＣＲ反応を含む。
【０２５０】
Ａ）第１のＰＣＲ
プライマーとして、ＲｅｃＦ１（ＴＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＧＣＧＧＡＧ（配列番号１６））及びＲｅｃＲ１（ＡＴＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡＣＡＣＣＴＧＧＴＣＡ（配列番号１７））、マトリックスとして、本明細書上記ステップＢ）で得られた産物及び以下の条件を用いる第１のＰＣＲを実施した：
１−混合物調製
−  ５μｌの本明細書上記ステップＢ）で得られた産物
−  ４５μｌのＨ２Ｏ
−  ５μｌの緩衝液「ＴａｑＰｌｕｓ（登録商標）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ」１０×、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ラジョーラ、カリフォルニア州、カタログ照会番号：６００２１１）
−  ０．４μｌのｄＮＴＰ  ２５ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールスバッド、カリフォルニア州、カタログ照会番号：１０２９７−０１８）
−  各１０μＭのプライマー１μｌ、ＲｅｃＦ３及びＲｅｃＲ３（上記参照）
−  ０．２５μｌのＴａｑＰｌｕｓ（登録商標）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ラジョーラ、カリフォルニア州、カタログ照会番号：６００２１１）
−  ２．５μｌのＤＭＳＯ  １００％
２−ＰＣＲ反応：
９４℃    １分間      １サイクル
９４℃    ４０秒間    ）
４５℃    ４０秒間    ）３サイクル
７２℃    １分間      ）
９４℃    ４０秒間    ）
５５℃    ４０秒間    ）９サイクル
７２℃    １分間      ）
７２℃    ５分間
４℃      終了
【０２５１】
Ｂ）第２のＰＣＲ
プライマーとして、ｃｌｏＦ１（ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣ（配列番号１８））及びｃｌｏＲ３（ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＡＡＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＴ（配列番号２２））、マトリックスとして、本明細書上記ステップＡ）で得られた産物及び以下の条件を用いて、第２のＰＣＲを実施した：
１−混合物調製
−  本明細書上記ステップＡ）で得られた産物１０μｌ
−  ３１．５μｌのＨ２Ｏ
−  ４μｌの緩衝液「ＴａｑＰｌｕｓ（登録商標）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ」１０×、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ラジョーラ、カリフォルニア州、カタログ照会番号：６００２１１）
−  ０．３２μｌのｄＮＴＰ  ２５ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールスバッド、カリフォルニア州、カタログ照会番号：１０２９７−０１８）
−  各１０μＭのプライマー４μｌ、ｃｌｏＦ３及びｃｌｏＲ３（上記参照）
−  ０．２μｌのＴａｑＰｌｕｓ（登録商標）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ラジョーラ、カリフォルニア州、カタログ照会番号：６００２１１）
２−ＰＣＲ反応：
９４℃    １分間      １サイクル
９４℃    ４０秒間    ）
４５℃    ４０秒間    ）３サイクル
７２℃    １分間      ）
９４℃    １分間      ）
９４℃    ４０秒間    ）
５０℃    ４０秒間    ）３サイクル
７２℃    １分間      ）
９４℃    ４０秒間    ）
５５℃    ４０秒間    ）７サイクル
７２℃    １分間      ）
７２℃    ５分間
４℃      終了
【０２５２】
Ｃ）ＢＰ反応
Ｇａｔｅｗａｙクローニング法（ＢＰ組換えによるＧａｔｅｗａｙエントリークローニング、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の第２段階は、ＧａｔｅｗａｙエントリーベクターｐＤＯＮＲ（商標）２０１内へのＧａｔｅｗａｙ修飾ＰＣＲ産物（即ち、本明細書上記ステップＢ）で得たＰＣＲ産物）のサブクローニングを含む。
１−混合物調製
−  本明細書上記ステップＢ）で得られた産物１μｌ
−  ４μｌのＴＥ１０．１
−  １μｌのベクターｐＤＯＮＲ２０１（３００ｎｇ／μｌ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールスバッド、カリフォルニア州、カタログ照会番号：１１７９８−０１４）
−  ２μｌの緩衝ＢＰ反応液５×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールスバッド、カリフォルニア州、カタログ照会番号：１１７８９−０１３）
−  ２μｌのＢＰクロナーゼ酵素、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールスバッド、カリフォルニア州、カタログ照会番号：１１７８９−０１３）
２−２５℃で１時間インキュベートする
３−１μｌのプロテイナーゼＫを加える
４−３７℃で１０分間インキュベートする
５−４℃で保存する
【０２５３】
Ｄ）形質転換
本明細書上記のステップＣ）で得られた反応産物を用いて、電気穿孔により、大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換した。
１−混合物組成
−  本明細書上記ステップＣ）で得られたＢＰ反応産物１μｌ
−  ３０μｌのＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ  ＤＨ１０Ｂ細胞、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールスバッド、カリフォルニア州、カタログ照会番号：１８２９０−０１５）
該混合物を０．１ｃｍの冷電気穿孔キュベットに移し、製造元のプロトコルに従って該細胞を電気穿孔した。
−  電気穿孔直後に、５００μｌのＳＯＣ培地を加えた
２−攪拌下、３７℃で１時間、インキュベートする
３−ＬＢ寒天プレート上に３０μｌを塗布する（＋５０μｇ／ｍｌのカナマイシン）
４−３７℃で一晩インキュベートする
【０２５４】
得られたコロニーのいくつかからの５ｍｌの培養物から、プラスミドミニプレップＤＮＡを調製し、ＤＮＡ配列決定に供した。次いで、正しい配列（ｐＤＯＮＲ２０１＿ＥＰＯｖ３−ＨＩＳ）を含有したクローンの１つからのプラスミドＤＮＡ（１．５μｌ又は約１００ｎｇ）を、１０μｌの最終容量中、１．５μｌのｐＥＡＫ１２ｄベクター（０．１μｇ／μｌ）、２μｌのＬＲ緩衝液及び１．５μｌのＬＲクロナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する組換え反応液中に用いた。該混合物を室温で１時間インキュベートした。該反応をプロテイナーゼＫ（２μｇ）の添加により停止させ、３７℃でさらに１０分間インキュベートした。各反応液（１μｌ）のアリコートを用いて、電気穿孔により大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換した。形質転換混合物のアリコートを、アンピシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）を含有するＬブロス（ＬＢ）プレート上に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０２５５】
得られたコロニーのいくつかからの培養物５ｍｌから、プラスミドミニプレップＤＮＡを調製した。ｐＥＡＫ１２ｄベクター内のプラスミドＤＮＡ（２００〜５００ｎｇ）を、ＤＮＡ配列決定に供した。Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭＥＧＡ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、製造元の指示に従って、配列を検証したクローン（ｐＥＡＫ１２ｄ＿ＥＰＯｖ３−ＨＩＳ）の５００ｍｌの培養物からプラスミドマキシプレップＤＮＡを調製した。滅菌水（又は１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）中、１μｇ／μｌの濃度で、プラスミドＤＮＡを再懸濁させ、−２０℃で保存した。
【０２５６】
プラスミドｐＥＡＫ１２ｄ＿ＥＰＯｖ３−ＨＩＳの配列は、配列番号２３で与えられる。
【０２５７】
（実施例６）
ＥＰＯｖ３（Ｈｉｓタグ化）の発現
ヒト細胞、例えば、エプスタインバーウィルス核抗原を発現するヒト胚腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、このような細胞にＥＰＯｖ３の発現を可能にする発現ベクター（ｐＥＡＫ１２ｄ＿ＥＰＯｖ３−ＨＩＳ）をトランスフェクトする。ＥＰＯｖ３を発現する該細胞を増殖させ、該組換えタンパク質を培養培地から抽出する。
【０２５８】
６．１  クローン化ＥＰＯｖ３（Ｈｉｓタグ化）の哺乳動物細胞における機能的ゲノム発現
エプスタインバーウィルス核抗原を発現するヒト胚腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、Ｅｘ−ｃｅｌｌ  ＶＰＲＯ無血清培地（シードストック、維持培地、ＪＲＨ）中、懸濁してルーチンに維持する。トランスフェクション前に、５０ｍｌのＦＥＭＥ１％ＦＢＳに、５００μｇのＥＰＯコードプラスミドＤＮＡ（ｐＥＡＫ１２ｄ＿ＥＰＯｖ３−ＨＩＳ）及び１０μｇのレポーター遺伝子プラスミドを加える。次いで、１ｍｌのＰＥＩ（１ｍｇ／ｍｌ  Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を加える。攪拌後、該混合物を室温で１０分間インキュベートする。該細胞接種物をトランスフェクション混合溶液と再懸濁し、１％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した２００ｍｌのＦＥＭＥ（１９ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｇ／Ｌのグルコース、７．５ｍＭのＬ−グルタミン、４ｍｌ／ＬのＩＴＳ−ＸにＤＭＥＭ／ハムのＦ−１２、１：１を補足）（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地に加え、好適な容器中、１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度にする。該培養物を、５％ＣＯ２大気、及び少なくとも７０％の相対湿度のインキュベーター中、３７℃で９０分間、さらにインキュベートする。最後に、該容量に、４ｍｌ／ＬのＩＴＳ−Ｘを補足した２５０ｍｌの化学的に規定された無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地をつぎ足す。トランスフェクションのため、該トランスフェクトした培養物を、同一条件でさらに６日間インキュベートする。採集日に、定性的蛍光試験（Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １０  Ｚｅｉｓｓ）によって、陽性トランスフェクションの確認を行う。上澄み液（５００ｍｌ）を、遠心分離し（１８００×ｇ、４℃、６〜１０分間）、０．２２ｕｍのフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、５００ｍｌフィルターユニット）を通して滅菌ろ過し、ＩＭＡＣ（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）クロマトグラフィーにより精製する。該上澄み液の１つのアリコート（５００μｌ）を、６Ｈｉｓ−タグ化タンパク質のＱＣ用に保持する。
【０２５９】
６．２  クローン化ＥＰＯｖ３（Ｈｉｓタグ化）の精製
Ｃ末端６Ｈｉｓタグを有するＥＰＯｖ３組換えタンパク質を含有する５００ｍｌの培養培地サンプルを、１容量の冷緩衝液Ａ（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；６００ｍＭのＮａＣｌ；８．７％（ｗ／ｖ）のグリセロール、ｐＨ７．５）で希釈し、１０００ｍｌの最終容量にする。該サンプルを、０．２２ｍｍの滅菌フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、５００ｍｌフィルターユニット）を通してろ過し、１リットルの滅菌角形培地瓶（Ｎａｌｇｅｎｅ）中、４℃で保持する。自動サンプル充填器（Ｌａｂｏｍａｔｉｃ）に接続したＶＩＳＩＯＮワークスステーション（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上、４℃で精製を行う。精製操作は、２つの連続的ステップ、Ｎｉイオンを充填したＰｏｒｏｓ  ２０ＭＣ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）カラム（１０×５０ｍｍ、３．９３ｍｌ）上での金属アフィニティークロマトグラフィー、引き続いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５培地（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ゲルろ過カラム（１．０×１５ｃｍ）上での緩衝液交換を含む。第１のクロマトグラフィーステップでは、金属アフィニティーカラムを、３０カラム容量のＥＤＴＡ液（１００ｍＭのＥＤＴＡ；１ＭのＮａＣｌ；ｐＨ８．０）で再生し、１５カラム容量の１００ｍＭ  ＮｉＳＯ４溶液を用いた洗浄によってＮｉイオンによる再荷電を行い、１０カラム容量の緩衝液Ａ、続いて７カラム容量の緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；６００ｍＭのＮａＣｌ；８．７％（ｗ／ｖ）のグリセロール、４００ｍＭ；イミダゾール、ｐＨ７．５）により洗浄し、最後に、１５ｍＭのイミダゾールを含有する１５カラム容量の緩衝液Ａによって平衡化する。該サンプルをＬａｂｏｍａｔｉｃサンプル充填器により、２００ｍｌのサンプルループ内に移し、引き続き、２０ｍｌ／分の流速で、Ｎｉ金属アフィニティーカラム上に充填する。該Ｎｉカラム上にサンプル全体（１０００ｍｌ）を移すために、該充填操作を５回繰り返す。引き続いて、１２カラム容量の緩衝液Ａ、続いて、２０ｍＭのイミダゾールを含有する２８カラム容量の緩衝液Ａによって該カラムを洗浄する。２０ｍＭのイミダゾール洗浄の間に、緩く結合した混入タンパク質をカラムから溶出させる。最後に、組換えＥＰＯｖ３  Ｈｉｓタグ化タンパク質を、２ｍｌ／分の流速で１０カラム容量の緩衝液Ｂにより溶出させ、溶出した該タンパク質を、２．７ｍｌのフラクション中に採集した。第２のクロマトグラフィーステップでは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５ゲルろ過カラムを、２ｍｌの緩衝液Ｄ（１．１３７ＭのＮａＣｌ；２．７ｍＭのＫＣｌ；１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；８ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４；ｐＨ７．２）で再生し、引き続き、４カラム容量の緩衝液Ｃ（１３７ｍＭのＮａＣｌ；２．７ｍＭのＫＣｌ；１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；８ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４；２０％（ｗ／ｖ）のグリセロール；ｐＨ７．４）で平衡化した。該Ｎｉカラムから、積分サンプル充填器を通して、ピークフラクションをＶＩＳＩＯＮ上に自動的に溶出させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム上に充填し、該タンパク質を、２ｍｌ／分の流速で緩衝液Ｃにより溶出させた。脱塩サンプルを、２．７ｍｌのフラクション中に採集した。該フラクションを、０．２��ｍｍの滅菌遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通してろ過し、分割し、凍結し、−８０℃で保存した。サンプルのアリコートを、クーマシーブルー染色及び抗Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロットによりＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％のＮｕＰＡＧＥゲル；Ｎｏｖｅｘ）上で分析した。
【０２６０】
クーマシーブルー染色。該ＮｕＰＡＧＥゲルを、０．１％のクーマシーブルーＲ２５０染色溶液（３０％メタノール、１０％酢酸）中、室温で１時間で染色し、引き続き、２０％メタノール、７．５％酢酸中、背景が明瞭になり、タンパク質のバンドがはっきり見えるようになるまで脱染色する。
【０２６１】
ウェスタンブロット。電気泳動後、該タンパク質を、４℃で１時間、２９０ｍＡで、該ゲルからニトロセルロース膜へ電子移動させる。該膜を、室温で１時間、緩衝液Ｅ（１３７ｍＭのＮａＣｌ；２．７ｍＭのＫＣｌ；１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４；８ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；０．１％ツウィーン２０、ｐＨ７．４）中、５％粉乳によりブロックし、引き続き、緩衝液Ｅ中、２．５％粉乳中の２種のウサギポリクローナル抗Ｈｉｓ抗体（Ｇ−１８及びＨ−１５、各０．２ｕｇ／ｍｌ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）の混合物と共に、４℃で一晩インキュベートする。室温でさらに１時間インキュベーション後、該膜を、緩衝液Ｅで洗浄（３×１０分）してから、２．５％粉乳を含有する緩衝液Ｅ中、１／３０００に希釈した第２のＨＲＰ結合抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯ、ＨＲＰ  ０３９９）と共にインキュベートする。緩衝液Ｅで洗浄（３×１０分）後、該膜をＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により、１分間展開させる。引き続き、該膜を、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に曝し、該フィルムを展開させ、ウェスタンブロット画像を可視的に解析する。
【０２６２】
タンパク質アッセイ。標準どおり、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、ウシ血清アルブミンにより、該タンパク質濃度を判定する。
【０２６３】
（実施例７）
ヒトＥＰＯ変異体の組織分布
予測されたＥＰＯｖ１、ＥＰＯｖ２及びＥＰＯｖ３  ｍＲＮＡの発現パターンを、ＲＴ−ＰＣＲ解析によって判定する。該変異体の組織発現を判定するために、種々の特異的プライマーを用いて、種々の組織のｃＤＮＡテンプレートを増幅する。
【０２６４】
（実施例８）
ヒト遺伝子ＥＰＯ（本明細書において、ＥＰＯｖ及びその成熟形態においてＥＰＯｖｍと称する）のエキソン１、２、及びエキソン３の最初の２つのアミノ酸によってコードされたＥＰＯの切断変異体のクローニング
配列番号１２で示された配列を作出するために、オリゴヌクレオチド特異的欠失変異誘発を実施した。以下のＰＣＲ反応を実施するために、４種のオリゴヌクレオチドプライマー、ＡＳ６７１からＡＳ６７４（表１を参照）を用いた。１及び２のＰＣＲ反応において、テンプレートＤＮＡは、ｐＤＥＳＴ１２．２発現ベクターにクローン化された完全長野生型エリスロポエチンｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１８０８０１１）であった。反応１では、図８に示された配列のＮ末端部分を増幅するために、プライマーＡＳ６７１及びＡＳ６７４が用いられ；反応２では、図８に示された配列のＣ末端部分を増幅するために、プライマーＡＳ６７２及びＡＳ６７３が用いられた。双方の場合とも、反応混合物は、１×ＰＣＲ緩衝液、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．５ｍＭの各ＰＣＲプライマー、５０ｎｇのテンプレートＤＮＡを含有するように設定し、反応は、５ＵのＰｆｕＴｕｒｂｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の添加により開始させた。サイクリング条件は、９５℃２分間（１サイクル）；９５℃１５秒間、５０℃３０秒間、７２℃７０秒間（２５サイクル）；７５℃７分間（１サイクル）であった。ＰＣＲの効率及び収率を推定するために、０．８％アガロースゲル中電気泳動により、各ＰＣＲ反応物のアリコートを分析した。第３のＰＣＲ反応において、反応１及び２の等モル量の重複産物を共に混合し、ＰＣＲプライマーＡＳ６７１及びＡＳ６７２の存在下、増幅して、完全長の０．９ｋｂ断片を作出した。反応１及び２に関し、ＰＣＲ反応条件は上記のとおりであった。精製ＰＣＲ反応物のアリコートを、製造元により供給された酵素緩衝液を用い、３７℃で２時間、ＮｄｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）により消化した。並行して、適切な量のｐＤＥＳＴ１２．２発現ベクターを、ＮｄｅＩにより消化した。消化されたベクター及び挿入体を各々、０．８％アガロースゲル上で分離し、対応する断片を切除し、Ｗｉｚａｒｄ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、製造元により提供されたプロトコルに従って精製した。精製したベクターＤＮＡ及びＰＣＲ産物を、１：３のモル比で混合し、２．５容量のエタノールの添加により、−２０℃で一晩沈殿させた。沈殿したＤＮＡを、遠心分離により回収し、７０％エタノール中で洗浄し、減圧乾燥し、Ｒａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用い、製造元によって供給されたプロトコルに従って、最終容量１０μｌにおいて結合させた。
【０２６５】
次いで、該結合混合物を用いて、大腸菌株ＪＭ１０１を以下のとおり形質転換した。競合ＪＭ１０１細胞の５０μｌアリコートを氷上で解凍し、該結合混合反応液の１μｌ又は５μｌを加えた。該細胞を氷上で４０分間インキュベートしてから、４２℃で２分間インキュベーションすることによって熱ショックを行った。１ｍｌの温（室温）Ｌブロス（ＬＢ）を加え、サンプルを３７℃でさらに１時間インキュベートした。次いで、形質転換混合物をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。プラスミド単離のために、単一コロニーを採取した。
【０２６６】
プラスミドＤＮＡ調製、制限消化及び配列解析
Ｂｉｏｒｏｂｏｔ  ８０００ロボットシステム（Ｑｉａｇｅｎ）又はＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：１４６０）を用い、製造元の指示に従って、５ｍｌの培養物からミニプレッププラスミドＤＮＡを調製した。プラスミドＤＮＡを、８０μｌの滅菌水中に溶出させた。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＢＯ光度計又はＳｐｅｃｔｒａｍａｘ１９０光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０２６７】
ミニプレッププラスミドＤＮＡのアリコート（１００〜２００ｎｇ）を、ＮｄｅＩにより、３７℃で２時間消化し、０．８％アガロースゲル中、電気泳動により分析した。適切なサイズの挿入体を有するプラスミドを、ＤＮＡ配列解析のために選択した。２００〜５００ｎｇのプラスミドＤＮＡを、２１Ｍ１３又はＭ１３ｒｅｖいずれかの配列決定プライマー（表１を参照）と混合することにより、挿入体を双方向で配列決定し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：４３９０２４６）を用い、製造元の指示に従って処理した。Ｄｙｅ−Ｅｘカラム（Ｑｉａｇｅｎ）又はＭｏｎｔａｇｅ  ＳＥＱ９６クリーンアッププレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号：ＬＳＫＳ０９６２４）を用いて、配列決定反応物を精製してから、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７００シークエンサーで解析した。ｐＤＥＳＴ１２．２のＮｄｅＩ部位間に正しく挿入された、配列番号１２で示される配列を含有したプラスミドの中で、大規模プラスミドＤＮＡ調製用に、ミニプレップ＃６を選択した。プラスミドＤＮＡの大規模調製は、Ｑｉａｇｅｎ  ＥＮＤＯ−ｆｒｅｅ  Ｍｅｇａｐｒｅｐキット（カタログ番号：１２３８１）を用いて実施した。上記のミニプレップ＃６によって形質転換した大腸菌株ＪＭ１０１を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する５００ｍｌのＬＢ培地中で一晩増殖させ、製造元により供給されたプロトコルに従って、プラスミドＤＮＡを飽和培養液から単離した。ファーストトラップ電気穿孔プロトコル用に、ＤＮＡ濃度を、調製物中、５ｍｇ／ｍｌに調整した（下記の実施例１１を参照）。
【０２６８】
（実施例９）
成熟タンパク質の７位における遊離システイン残基がセリンに置換されているヒト遺伝子ＥＰＯ（本明細書において、その成熟形態において、ＥＰＯｖＣ３４Ｓ及びＥＰＯｖｍＣ３４Ｓと称される）のエキソン１、２、及びエキソン３の最初の２つのアミノ酸によってコードされた、ＥＰＯの切断変異体のクローニング
完全長エリスロポエチンを切断してＥＰＯｖｍ変異体を作出した１つの結果は、完全長分子において通常は対になっている、成熟タンパク質の７位（ＥＰＯｖの３４位）におけるシステイン残基が、遊離のままであり、したがって、分子間対合に利用し得ることである。したがって、この小型ペプチド断片の凝集の問題が生じる可能性を回避するために、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発により、誘導体Ｃ３４Ｓが構築された。
【０２６９】
２種の相補的変異誘発ＰＣＲプライマーＡＳ６７５及びＡＳ６７６（表１を参照）が設計され、ＰＣＲ反応を以下のとおり実施した。ＰＣＲ反応１及び２では、テンプレートＤＮＡは、ｐＤＥＳＴ１２．２発現ベクターにクローン化したＥＰＯｖであった（本明細書上記の実施例８を参照）。反応１では、図８に示された配列のＮ末端部分を増幅するために、プライマーＡＳ６７１及びＡＳ６７６が用いられ；反応２では、図８に示された配列のＣ末端部分を増幅するために、プライマーＡＳ６７５及びＡＳ６７２が用いられた。双方の場合とも、反応混合物は、１×ＰＣＲ緩衝液、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．５ｍＭの各ＰＣＲプライマー、５０ｎｇのテンプレートＤＮＡを含有するように設定し、反応は、５ＵのＰｆｕＴｕｒｂｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の添加により開始させた。サイクリング条件は、９５℃２分間（１サイクル）；９５℃１５秒間、５０℃３０秒間、７２℃７０秒間（２５サイクル）；７５℃７分間（１サイクル）であった。ＰＣＲの効率及び収率を推定するために、０．８％アガロースゲル中電気泳動により、各ＰＣＲ反応物のアリコートを分析した。第３のＰＣＲ反応において、反応１及び２の等モル量の重複産物を共に混合し、ＰＣＲプライマーＡＳ６７１及びＡＳ６７２の存在下、増幅して、完全長の０．９ｋｂ断片を作出した。反応１及び２に関し、ＰＣＲ反応条件は上記のとおりであった。精製ＰＣＲ反応物のアリコートを、製造元により供給された酵素緩衝液を用い、３７℃で２時間、ＮｄｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）により消化した。並行して、適切な量のｐＤＥＳＴ１２．２発現ベクターを、ＮｄｅＩにより消化した。消化されたベクター及び挿入体を各々、０．８％アガロースゲル上で分離し、対応する断片を切除し、Ｗｉｚａｒｄ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、製造元により提供されたプロトコルに従って精製した。精製したベクターＤＮＡ及びＰＣＲ産物を、１：３のモル比で混合し、２．５容量のエタノールの添加により、−２０℃で一晩沈殿させた。沈殿したＤＮＡを、遠心分離により回収し、７０％エタノール中で洗浄し、減圧乾燥し、Ｒａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用い、製造元によって供給されたプロトコルに従って、最終容量１０μｌにおいて結合させた。
【０２７０】
次いで、該結合混合物を用いて、大腸菌株ＪＭ１０１を以下のとおり形質転換した。競合ＪＭ１０１細胞の５０μｌアリコートを氷上で解凍し、該結合混合反応液の１μｌ又は５μｌを加えた。該細胞を氷上で４０分間インキュベートしてから、４２℃で２分間インキュベーションすることによって熱ショックを行った。１ｍｌの温（室温）Ｌブロス（ＬＢ）を加え、サンプルを３７℃でさらに１時間インキュベートした。次いで、形質転換混合物をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。プラスミド単離のために、単一コロニーを採取した。
【０２７１】
プラスミドＤＮＡ調製、制限消化及び配列解析
Ｂｉｏｒｏｂｏｔ  ８０００ロボットシステム（Ｑｉａｇｅｎ）又はＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：１４６０）を用い、製造元の指示に従って、５ｍｌの培養物からミニプレッププラスミドＤＮＡを調製した。プラスミドＤＮＡを、８０μｌの滅菌水中に溶出させた。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＢＯ光度計又はＳｐｅｃｔｒａｍａｘ１９０光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０２７２】
ミニプレッププラスミドＤＮＡのアリコート（１００〜２００ｎｇ）を、ＮｄｅＩにより、３７℃で２時間消化し、０．８％アガロースゲル中、電気泳動により分析した。適切なサイズの挿入体を有するプラスミドを、ＤＮＡ配列解析のために選択した。２００〜５００ｎｇのプラスミドＤＮＡを、２１Ｍ１３又はＭ１３ｒｅｖ又はＡＳ６７３の配列決定プライマー（表１を参照）と混合することにより、挿入体を双方向で配列決定し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：４３９０２４６）を用い、製造元の指示に従って処理した。Ｄｙｅ−Ｅｘカラム（Ｑｉａｇｅｎ）又はＭｏｎｔａｇｅ  ＳＥＱ９６クリーンアッププレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号：ＬＳＫＳ０９６２４）を用いて、配列決定反応物を精製してから、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７００シークエンサーで解析した。ｐＤＥＳＴ１２．２のＮｄｅＩ部位間に正しく挿入された配列を含有したプラスミドの中で、大規模プラスミドＤＮＡ調製用に、ミニプレップ＃２を選択した。プラスミドＤＮＡの大規模調製は、Ｑｉａｇｅｎ  ＥＮＤＯ−ｆｒｅｅ  Ｍｅｇａｐｒｅｐキット（カタログ番号：１２３８１）を用いて実施した。上記のミニプレップ＃２によって形質転換した大腸菌株ＪＭ１０１を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する５００ｍｌのＬＢ培地中で一晩増殖させ、製造元により供給されたプロトコルに従って、プラスミドＤＮＡを飽和培養液から単離した。高速追跡電気穿孔プロトコル用に、ＤＮＡ濃度を、調製物中、５ｍｇ／ｍｌに調整した（下記の実施例１１を参照）。
【０２７３】
【表１】
2009517009.tif 000038
【０２７４】
（実施例１０）
本発明のＥＰＯポリペプチド及び変異体の生物活性
本発明のポリペプチドの生物活性は、当業界にそれ自体知られているいくつかの生物学的アッセイを用いて検証できる。
【０２７５】
１０．１  インビトロ細胞試験におけるエリスロポエチン受容体に対する本発明のポリペプチドの結合：
ＥＰＯ受容体へのＥＰＯ結合のスキャッチャード解析は、例えば、Ｎａｇａｏ  Ｍら、Ｂｌｏｏｄ．１９９３年；８１（１０）：２５０３〜１０頁におけるものなど、当業界に十分記載されている。
【０２７６】
エリスロポエチン受容体発現細胞に対する放射ヨウ素標識（１２５Ｉ）ポリペプチドの結合がアッセイされる。参照番号ＣＣＬ−１０の下でのＢＨＫ−２１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（マナサス、バージニア州、米国）でアクセス可能）を、組織培養プレートに接種し、４８時間培養する。次いで、各ウェル内の培養培地を、新鮮培養培地、及び種々の濃度の非標識ポリペプチドを有するか、又は有さない１２５Ｉ−ポリペプチドからなる結合混合物により置換する。１０℃でのインキュベーション後、各ウェルを氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。細胞を分離させるために、各ウェルにトリプシンを加える。細胞懸濁液の放射活性をカウントする。１ウェル当たりの細胞数もまたカウントする。所与の１２５Ｉ−ポリペプチド濃度における特異的結合は、非標識ＥＰＯの非存在下、又は過剰な非標識ポリペプチドの存在下でインキュベートしたサンプル間の結合放射活性の違いとして定められる。結合データのスキャッチャードプロット解析を実施する。
【０２７７】
１０．２  エリスロポエチン受容体発現細胞における本発明のポリペプチドによるＪＡＫ２のチロシンリン酸化の誘導：
ＪＡＫ２のチロシンリン酸化を試験するための種々の試験が当業界に記載されており、これらの技法は当業者に知られている。例えば、エリスロポエチン受容体発現細胞における本発明のポリペプチドによるＪＡＫ２のチロシンリン酸化の誘導は、Ｃｅｌｌ．１９９３年；７４（２）：２２７〜３６頁におけるＷｉｔｔｈｕｈｎ  ＢＡらによって開示されている試験によって試験することができる。
【０２７８】
１０．３  本発明のポリペプチドによるエリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）発現細胞の増殖刺激：
１０．３．１  ヒトエリスロポエチン細胞系ＴＦ−１を用いた細胞ベースの増殖アッセイ：
この目的のため、試験すべき少量のポリペプチドを、例えば、実施例２、４又は６に記載された方法に従って作出する。次いで、エリスロポエチン受容体を発現し、増殖のためにＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ又はＥＰＯに依存性である（Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，Ｕ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．１２：１４５５〜６９頁（１９９６））ヒトエリスロポエチン細胞系ＴＦ−１を用いて、該タンパク質を、生物学的応答を誘発するその能力に関して試験する。この因子依存性細胞系を用いた細胞ベースの増殖アッセイを、エリスロポエチンのインビトロ生物活性測定のための工業標準として用いる（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．ら、Ｊ：Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４０：３２３（１９８９））。このアッセイは極めて鋭敏であり、極めて少量の生物活性タンパク質を検出することができる。このアッセイのさらなる利点は、純粋なタンパク質を得るために大規模な精製法を使用せずに、本発明の修飾エリスロポエチン分子を発現する細胞培養物からの未精製の上澄み液を、生物活性の試験に使用できることである。類似タンパク質各々の活性を野生型タンパク質の活性と比較して、市販のＥＬＩＳＡキットを用いて必要な定量化を行うことができる。
【０２７９】
１０．３．２  Ｂａ／Ｆ３−ＥｐｏＲ細胞系を用いた細胞ベースの増殖アッセイ：
Ｂａ／Ｆ３−ＥｐｏＲ細胞の増殖を測定することにより、本発明のポリペプチドの生物活性を評価できる。この目的のために、ヒトＥＰＯ受容体（ＥｐｏＲ）の全コード配列に対応するＤＮＡ断片をＰＣＲによって得て、チミジンキナーゼ（ｔｋ）−ネオマーカーを含有する発現ベクターにクローン化する。制限酵素による消化によって線形化した後、該ベクター構築体を、Ｂａ／Ｆ３（末梢血から確立したＩＬ−３依存性マウスプロＢ細胞系；Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ、ブラウンシュバイク、ドイツ国）で参照番号ＡＣＣ３００でアクセス可能）内に導入する。２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８中、ＥｐｏＲ構築体を発現するネオマイシン耐性細胞を選択し、限界希釈により個々のクローンを得る。Ｂａ／Ｆ３−ＥｐｏＲ細胞の増殖刺激を測定する生物学的アッセイにおいて、ＥｐｏＲを発現するクローンを、組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）（Ａｍｇｅｎ）又は試験される本発明のポリペプチドに対するそれらの応答に関して解析する。ｒｈＥＰＯ及び試験される本発明のポリペプチドそれぞれに応答してのＢａ／Ｆ３−ＥｐｏＲ細胞の増殖刺激を、細胞ＤＮＡ内への［３Ｈ］−チミジンの組込みの程度によって測定する。細胞は始め、１６時間、ＩＬ−３飢餓とし、引き続き、ｒｈＥＰＯ又は試験される本発明のポリペプチドを含有する培地中、２５，０００細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレート内に接種する。２２時間のインキュベーション後、［３Ｈ］−チミジン／ウェルの１μＣｉを該ウェルに加え、該細胞をさらに６時間インキュベートしてから採集する。例えば、Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、４０μｌのシンチレーション液（例えば、ｉｃｒｏｓｃｉｎｔ  ２０）の存在下、細胞組込み放射活性を判定する。Ｂａ／Ｆ３−ＥｐｏＲ細胞内トリチウム化チミジンの組込み刺激における本発明のポリペプチドの効率を、ｒｈＥｐｏによる刺激の効率と比較できる。
【０２８０】
１０．３．３  シュワン細胞増殖アッセイ：
Ｌｉら（Ｌｉ  Ｘ、Ｇｎｉａｓ  ＳＬ、Ｃａｍｐａｎａ  ＷＭ．Ｇｌｉａ．第５１巻（４）：２５４〜６５頁）は、シュワン細胞がＥｐｏ受容体を発現することを示している。本明細書下記のとおり、ＢｒｄＵ組込みの判定により、本発明のポリペプチドの生物活性を評価できる。
【０２８１】
シュワン細胞一次培養
シュワン細胞を、Ｈｉｒａｉｗａら（Ｈｉｒａｉｗａ  Ｍら、１９９７年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：４７７８〜４７８１頁）及びＣａｍｐａｎａら（Ｃａｍｐａｎａ  ＷＭら、１９９８年、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １２：３０７〜３１４頁）によって記載されたとおり１日齢のＳＤラットの坐骨神経から単離する。シュワン細胞をさらに、抗フィブロネクチン抗体及びウサギ補体を用いて、線維芽細胞から分離する。これにより、Ｓ−１００免疫蛍光によって評価できるとおり、およそ９９％純粋なシュワン細胞培養物が生じる。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２１ｍｇ／ｍｌのウシ下垂体抽出物及び４ｍＭのホルスコリン（完全培地）を含有するＤＭＥＭ中で一次シュワン細胞を維持し、加湿５．０％ＣＯ２下、３７℃でインキュベートする。該培養物を確立後、シュワン細胞を３〜４回継代することにより増殖させる。
【０２８２】
シュワン細胞増殖アッセイ
シュワン細胞を、完全培地中、９６ウェルプレート内に、１ウェル当たり５，０００細胞で塗布する。細胞を一晩付着させてから、洗浄し、引き続き、ｒｈＥｐｏ又は試験される本発明のポリペプチドと共に、又はそれなしで、ＤＭＥＭ中、１％ＦＢＳと共に、３７℃で２４時間培養する。増殖対照として、完全培地（ウシ下垂体抽出物、ＢＰＥを含有）を用いる。次いで、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ  キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、インジアナポリス、インジアナ州）を用い、Ｓ期の間のＤＮＡ合成の指標として、ＢｒｄＵ組込みを測定する。２４時間のｒｈＥｐｏ又は試験される本発明のポリペプチド処理時間の最後の２０時間、ＢｒｄＵを加える。
【０２８３】
１０．４  赤血球産生の刺激（正常赤血球マウスアッセイによって判定された本発明のポリペプチドのインビボ活性）：
正常赤血球マウスバイオアッセイは当業界に知られており（Ｐｈａｒｍ．Ｅｕｒｏｐａ  Ｓｐｅｃ．Ｉｓｓｕｅ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  Ｂｒｐ  Ｂｉｏ、１９９７年（２））、方法は、Ｐｈ．Ｅｕｒ．ＢＲＰのエリスロポエチンのモノグラフにおいて知られている。７〜１５週齢の正常な健康マウスに、ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液中、０．２ｍｌの被験ポリペプチド又は対照としての緩衝液を、皮下投与する。６日間にわたって、尾部静脈の穿刺により血液を採取し、０．１５μモルのアクリジンオレンジ染色液の１ｍｌ中に１μｌの血液が存在するように、希釈する。染色時間は３分から１０分である。赤色蛍光ヒストグラムの解析により、フローサイトメーターにおいて、マイクロ蛍光定量的に網状赤血球のカウントを実施する。網状赤血球カウントは、絶対数によって与えられる（分析される３０，０００個の血球当たり）。
【０２８４】
結果は、網状赤血球の量を増加させる能力に関する本発明のポリペプチドのインビボ活性の指標を与える。
【０２８５】
１０．５  本発明のポリペプチドによる赤血球細胞の増殖の誘導：
本発明のポリペプチドの生物活性は、ヒト骨髄細胞からの赤血球コロニーの産生を刺激する本発明のポリペプチドの能力を測定することによって評価できる。
【０２８６】
新鮮なヒト骨髄吸引物を、健康なドナーから得る。免疫磁気陽性選択によって、単核フラクションのＣＤ３４を高濃度にする。メチルセルロース培養は、エリスロポエチンなしの完全メチルセルロース培地中、１０００個の細胞で開始する（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、ＢＣ）。培養培地は後で、５０ｎｇ／ｍＬのｒｈＥｐｏ又は本発明の被験ポリペプチド、及び幹細胞因子として作用し、これらのアッセイにおいてＥｐｏと協力して赤血球コロニーの形成を促進する５０ｎｇ／ｍｌのキットリガンド（ＫＬ）を添加する。１２〜１４日後、コロニーを数え、倒立光学顕微鏡で表現型決定する。ヒト骨髄細胞の赤血球コロニー産生刺激における本発明のポリペプチドの有効性を測定し、ｒｈＥＰＯによるアッセイの結果と比較する。
【０２８７】
１０．６  本発明のポリペプチドによる赤血球細胞の成熟誘導：
本発明のポリペプチドの生物活性は、骨髄細胞の培養液中の未成熟及び成熟赤血球細胞の形成を刺激する本発明のポリペプチドの能力を測定することによって評価することができる。ＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌのキットリガンド（ＫＬ）及び５０ｎｇ／ｍＬのｒｈＥｐｏ（Ａｍｇｅｎ）又は本発明の被験ポリペプチドの存在下、ＩＭＤＭ／１０％ＦＣＳ中、上記のとおり単離した２０，０００個のＣＤ３４＋細胞を培養する。培養細胞の７〜１０インチのプレートを血球計数器によりカウントし、引き続き、赤血球細胞表面マーカーＣＤ３６、ＣＤ７１及びグリコホリンＡの発現に関してアッセイする。その結果により、骨髄培養液中の未成熟及び成熟赤血球細胞の形成を刺激する本発明のポリペプチドの能力を判定することが可能となる。
【０２８８】
１０．７  本発明のポリペプチドの血管作動作用：
本発明のポリペプチドの生物活性は、本発明のポリペプチドで処置した哺乳動物の血圧を、非処置対象と比較して測定することによって試験することができる。このような哺乳動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ウシ又はサル（例えば、チンパンジー）であり得る。これらの哺乳動物の血圧を測定する種々の方法は当業者によく知られている。
【０２８９】
１０．８  ヘマトクリットレベルに及ぼす本発明のポリペプチドの効果：
本発明のポリペプチドの生物活性は、本発明のポリペプチドで処置した哺乳動物のヘマトクリットレベルを、非処置対象と比較して測定することによって試験することができる。このような哺乳動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ウシ又はサル（例えば、チンパンジー）であり得る。
【０２９０】
ヘマトクリットは、赤血球の測定値の１つであり、赤血球からなる総血液容量のパーセンテージとして一般に表される。ヘマトクリットを測定するためのいくつかの試験が当業界に記載されており、当業者によく知られている。例えば、較正直径を有する特定のヘパリン毛細管を用いた後眼窩放血を実施する。毛細管を、マイクロヘマトクリット遠心分離管（ＳｔａｔＳｐｉｎ−ＩＲＩＳ社）中、室温で２分間遠心分離する。０、３、５、７、１０及び１２日目に末梢血サンプルを採集する。ヘマトクリットを測定するために、赤血球容量対総血液容量の比（％）を算出する。
【０２９１】
１０．９  本発明のポリペプチドの神経保護活性：
１０．９．１  神経保護活性のインビボ試験：
本発明のポリペプチドの神経保護活性は、例えば、大脳中央動脈閉鎖モデルにおいて試験できる。体重２５０ｇのオスＳＤラットを、Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，Ｅ．ら、１９９７年、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ７６、１０５〜１１６頁に記載されているとおり、６０分の可逆的虚血により生じた極めて広い境界域内の狭いコア損傷部からなる中央脳動脈閉鎖に供する。該動物は、閉鎖の時点で、本発明の被験ポリペプチド、陽性対照としての組換え野生型ヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）（５，０００ユニット／ｋｇ体重）又は陰性対照としての生理食塩水のいずれかを、腹腔内注射により投与される。製造元のプロトコル（Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に従って、該脳を２４時間後に取り出し、連続切片とし（厚さ５０ｎｍ）、メタノール中３％Ｈ２Ｏ２中で１０分間ブロックし、４℃で０．１％トリトンＸ−１００／クエン酸ナトリウム中で２分間透過化処理し、ＴＵＮＥＬ反応混合物によって処理する。展開後に陽性ニューロンを同定する（ジアミノベンジジン中３０分、脱水、及びカバーガラス化）。陰性対照として、末端トランスフェラーゼを除外する。
【０２９２】
Ｓｉｒｅｎ  ＡＬら、（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００１年、９８（７）：４０４４〜９頁）及びＢｒｉｎｅｓ  ＭＬら、（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０００年；９７（１９）：１０５２６〜３１頁）は、ｒｈＥＰＯが、このようなモデルにおいて、神経保護活性を有することを示している。
【０２９３】
１０．９．２  ＥＡＥモデルにおける神経保護活性のインビボ試験：
脱髄性疾患、例えば、本明細書上記で特定した多発性硬化症（ＭＳ）又はギラン−バレ症候群の治療における本発明のポリペプチドの有用性は、例えば、本発明後記の方法に従って、動物試験法において実証することができる。多発性硬化症の最も広く使用されている動物モデルは、ヒト疾患と共有された組織病理学的及び臨床的特徴に基づいた実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）である。
【０２９４】
Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおける慢性ＥＡＥモデルは、ＭＳの一次的進行（ＰＰ）形態又は二次的進行（ＳＰ）形態といくつかの共通した特質を共有している。マウスを、０日目と７日目に、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中、２００μｇ皮下のミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）により、両側に免疫化した後、５００ｎｇ腹腔内の百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）毒素を２回注射する（０日目と２日目）。
【０２９５】
群は１０匹から１３匹のＥＡＥマウスからなる。臨床スコア、全体的な健康状態、体重及び死亡数を毎日記録する。７日目から開始して、該動物を、臨床スコア：０＝疾患の徴候なし、１＝尾部麻痺、２＝尾部麻痺＋後肢脱力又は後肢部分的麻痺、３＝尾部麻痺＋後肢完全麻痺、４＝尾部麻痺＋後肢麻痺＋脱力又は前肢の部分的麻痺、５＝瀕死又は死亡、によって、麻痺の存在に関して個々に検査する。
【０２９６】
１０日目〜１２日目から始まって、たいていの動物で、麻痺が増加していく。病状は慢性であり、動物は、身体障害の最初の臨床的徴候の後、及びその後の２８日から３０日の観察の間、寛解の徴候を示さない。
【０２９７】
治療処置は、疾患の発症時に開始される。したがって、いったん疾患が確立されても、２８日から３０日間、依然として進行し継続している。２０，０００Ｕ／マウスの用量でのｍＩＦＮβ（Ｓｅｒｏｎｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｇｅｎｅｖａ）による毎日の皮下処置によって、後肢の完全麻痺から部分的麻痺へと、疾患の重症度の有意な低下による臨床的結果の有益な効果が示される。本発明のポリペプチドは、このモデルにおけるそれらの活性に関して、該被験ポリペプチドの異なる用量によるマウスの毎日の二重処置によって試験することができる。実験には、同一投与経路による対照の媒体処置ＥＡＥ群が含まれる。
【０２９８】
１０．９．３  神経保護活性のインビトロ試験：
本発明のポリペプチドの神経保護活性は、例えば、Ｓｉｒｅｎ  ＡＬら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００１年、９８（７）：４０４４〜９頁）によって記載された培養物中に一次運動神経を用いることによって、インビトロで試験できる。１５日齢のＳＤラット胚から脊髄を得る。前角をトリプシン処理し、４％ＢＳＡクッションにより、３００×ｇで１０分間遠心分離する。細胞（混合神経膠培養物を表す）を、ポリ−ＤＬ−オルニチン及びラミニンでプレコートした２４ｍｍのウェルプレートに、２，０００細胞／ｃｍ２の密度で接種する。運動神経を、免疫パニングによりさらに精製し（Ｍｅｔｔｌｉｎｇ，Ｃ．ら、１９９５年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５、３１２８〜３１３７頁によって記載されているとおり）、細胞を、ポリ−ＤＬ−オルニチン及びラミニンでプレコートし、完全培養培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌｙ／Ｂ２７（２％）／０．５ｍＭのＬ−グルタミン／２％ウマ血清／２５μＭの２−メルカプトエタノール／２５μＭのグルタメート／１％ペニシリン及びストレプトマイシン／１ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ）を含有する２４ｍｍのウェルプレートに、低密度（２０，０００細胞／ｃｍ２）で接種する。この培地（グルタメートなし）を、４日目と６日目、培養液に再添加する。４８時間の血清／ＢＤＮＦ欠乏により、又は４８時間のカイニン酸（混合ニューロン／グリア培養物では５μＭ；精製培養物では５０μＭ）とのインキュベーションにより、培養物において、６日目に細胞死を誘導する。本発明の被験ポリペプチド、又は陽性対照としてのｒｈＥＰＯ（１０ユニット／ｍｌ）又は陰性対照としての媒体を、細胞死誘導の７２時間前に、該培養物に添加し、処置を４８時間継続する。次いで、該培地を廃棄し、細胞を、ＰＢＳ中、４％（容量／容量）パラホルムアルデヒドにより４０分間固定し、０．２％トリトンＸ−１００により透過化処理し、ＰＢＳ中、１０％（容量／容量）ＦＣＳによりブロックし、非リン酸化神経フィラメントに対する抗体（ＳＭＩ−３２；１：９，０００）と共に一晩インキュベートし、ジアミノベンジジンによるアビジン−ビオチン法を用いることによって可視化する。運動神経の生存度を、カバーガラスの４つの側面にわたってＳＭＩ−３２陽性細胞をカウントすることによって、形態学的に評価する。Ｈ３３２５８を用いることによって（Ｇａｌｌｉ，Ｇ  ＆  Ｆｒａｔｅｌｌｉ，Ｍ．（１９９３）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０４、５４〜６０頁に記載されているとおり）アポトーシス体の染色を行う。
【０２９９】
Ｓｉｒｅｎ  ＡＬら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００１年、９８（７）：４０４４〜９頁）は、ｒｈＥＰＯが、このようなモデルにおいて、神経保護活性を有することを示している。
【０３００】
１０．１０  本発明のポリペプチドのインビトロ及び／又はインビボでの心臓保護活性：
インビトロ及びインビボ双方でのポリペプチドの心臓保護活性を試験するための種々の試験が当業界に記載されており、これらの技法は当業者に知られている。このような技法の例は、本明細書下記に、及び参照として組み込まれている引用文献に記載されている。
【０３０１】
１０．１０．１  本発明のポリペプチドによるインビトロでの心筋細胞の生存の増強：
本発明のポリペプチドの心臓保護活性は、例えば、以下のモデルにおいて試験することができる。記載されているとおり（Ｆｉｏｒｄａｌｉｓｏ，Ｆ．ら、（２００１）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０、２３６３〜２３７５頁及びＬｅｒｉ，Ａ．ら、（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１、１３２６〜１３４２頁）、３カ月齢のオスＳＤラットから左心室の心筋細胞を単離する。簡単に述べると、抱水クロラール麻酔下（３００ｍｇ／ｋｇ体重）、心臓を切除し、コラゲナーゼにより心筋細胞を分離する。心筋細胞（９８〜９９％純粋）を、０．５μｇ／ｃｍ２のラミニンでコーティングしたペトリ皿に、１ｃｍ２当たり２×１０４細胞の密度で塗布する。非必須アミノ酸、トランスフェリン（１０μｇ／ｍｌ）、ＢＳＡ（０．１％）、及び抗生物質を有する修飾イーグル培地（ＭＥＭ）からなる無血清培地中で、細胞をインキュベートする。非結合心筋細胞を除去するために、この培地を塗布３０分後、新たな培地に交換する。窒素を継続的にフラッシュさせた気密チャンバー内に曝すことにより、低酸素条件を作り出し、２８時間維持する。この操作により、該培地中の酸素圧は５ｍｍＨｇ（約＝通常の３％；１ｍｍＨｇ＝１３３Ｐａ）に低下する。低酸素状態は２８時間維持される。本発明の被験ポリペプチド又は陽性対照としてのｒｈＥＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｈｅｐｅｓ（２０ｍＭ）、又は双方を、低酸素誘導の３０分前に該培地に加える。長時間低酸素により生じたアシドーシスを補正するためにＨｅｐｅｓが用いられる。
【０３０２】
２つの独立した方法（エチジウムモノアジドブロマイド；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）及び平滑末端を有するヘアピンオリゴヌクレオチドプローブ（ｈａｉｒｐｉｎ２；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、サンディエゴ）を用いることによって、細胞壊死を定量化する。単一塩基３’オーバーハングを有するヘアピンオリゴヌクレオチドプローブ（ｈａｉｒｐｉｎ１；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）アッセイの使用によって、アポトーシスを評価する（Ｃｉｇｏｌａ，Ｅ．ら、（１９９７年）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２３１、３６３〜３７１頁）。各調製物中の測定筋細胞の数は、最少３００である。
【０３０３】
Ｃａｌｖｉｌｌｏ  Ｌ．ら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３年；１００（８）：４８０２〜６頁）は、ｒｈＥＰＯは、このようなモデルにおいて、心臓保護活性を有することを示している。
【０３０４】
また、Ｐａｒｓａ  ＣＪら（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００３年、１１２（７）：９９９〜１００７頁）及びＭｏｏｎ  Ｃら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３年；１００（２０）：１１６１２〜７頁）も、他のモデルを用いて、インビトロでのｒｈＥＰＯの心臓保護活性を示している。これらのモデルは、本発明のポリペプチドの心臓保護活性を試験するためにも使用することができる。
【０３０５】
１０．１０．２  本発明のポリペプチドによるインビボでの心筋細胞生存の増強：
オスＳＤラット（約２５０ｇ）を、抱水クロラール（１５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）及びジエチルエーテルで麻酔し、気管内カニューレにより人工呼吸にかける（１分当たり６１呼吸、１回呼吸量１．２ｍｌ／１００ｇの体重）。第５肋間空間における１５ｍｍの開口部を通して、心臓を外部に出した後、左前下降冠状動脈（ＬＡＤ）を、５−Ｓ絹縫合糸に結さつする。２つの縫合糸上にプレインノットを結び、３０分後にそれを除去して、再潅流を開始させる。胸部を陰圧下で閉鎖し、継続的な心電図モニタリング下で、ラットを人工呼吸器から外す。心室転位症及び心筋の白化の発現により虚血が確認される。通常の潮紅により再潅流の成功が示される。偽操作のラットは、同一の外科手術操作を受けるが、ＬＡＤの結さつは行わない。虚血の誘導（処置前）前、又は再潅流時（処置後）のいずれかに、本発明の被験ポリペプチド又は陽性対照としてのｒｈＥＰＯ（５，０００ユニット／ｋｇ体重）を腹腔内投与する。各動物が、試験完了まで、本発明の被験ポリペプチド又はｒｈＥＰＯの追加用量を毎日投与される。
【０３０６】
３０分のＬＡＤ閉塞を７日間生き延びたラットは、血液動態評価、続いて、Ｃａｌｖｉｌｌｏ  Ｌ．ら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３年；１００（８）：４８０２〜６頁）に記載されているとおり、組織形態計測のために、心臓の固定潅流を受ける。また、Ｐａｒｓａ  ＣＪら（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００３年、１１２（７）：９９９〜１００７頁）及びＭｏｏｎ  Ｃら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３年；１００（２０）：１１６１２〜７頁）も、他のモデルを用いて、インビボでのｒｈＥＰＯの心臓保護活性を示している。これらのモデルは、本発明のポリペプチドの心臓保護活性を試験するためにも使用することができる。
【０３０７】
１０．１１  本発明のポリペプチドによる癌細胞の増殖刺激：
癌細胞の増殖を刺激するポリペプチドの能力を試験するためのインビトロ及びインビボモデルは、当業界によく知られている。例えば、試験される癌に由来する１つ以上の細胞系の増殖を、当業界によく知られた種々の技法を用いて、インビトロで測定することができる。このような技法としては、例えば、［３Ｈ］−チミジンの組込み、ＭＴＴ細胞増殖アッセイ、細胞数のカウントが挙げられる。
【０３０８】
インビボモデルとしては、例えば、無胸腺マウスに異種移植されたヒト腫瘍細胞が挙げられる。これらのモデルはまた、本発明の抗体の抗腫瘍形成活性を試験するためにも使用できる。
【０３０９】
（実施例１１）
本発明のＥＰＯｖ１、ＥＰＯｖ２、ＥＰＯｖ３及びＥＰＯｖの神経保護活性
Ｅｐｏ変異体の神経保護効果を、「Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ（高速追跡）」によるタンパク質送達後、マウス坐骨神経圧潰モデルを用いて試験した。ＥＰＯｖ１、ＥＰＯｖ２、ＥＰＯｖ３及びＥＰＯｖをコードするｃＤＮＡを、発現ベクターｐＤＥＳＴ１２．１２内にクローン化又はサブクローン化した。Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ操作において、発現ベクターｐＤＥＳＴ１２．１２内にクローン化したｃＤＮＡを、レシピエントマウスの筋肉内に電気穿孔し、コードされたタンパク質を、該筋肉の細胞によって発現させ、宿主マウスの循環内に分泌させる。これらの実験において、各ｃＤＮＡを６匹のマウスに電気穿孔し、観察結果の統計的有意性を提供した。電気穿孔後、赤血球容量（ヘマトクリット）及びひ腹筋における複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）測定値に及ぼす効果をモニターした。
【０３１０】
坐骨神経圧潰に関する筋肉内へのＥｐｏ変異体ｃＤＮＡの電気穿孔
原Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋプロトコルにおいて、ｃＤＮＡの電気穿孔部位として、ひ腹筋を用いた。しかし、坐骨神経圧潰モデルにおいて、ひ腹筋を用いた電気筋運動記録読取り（ＥＭＧ）も実施されるため、電気生理学的読取りを妨害しないように、他の電気穿孔部位を試験した。これらの試験の結果、前肢上部の筋肉を選択して、本明細書に記載の実験に用いた。神経圧潰の４日前の０日目に、６匹のメスＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｅｌｅｖａｇｅ  Ｊａｎｖｉｅｒ）の群を、イソフラン（イソフランＢａｘｔｅｒ、照会番号：ＺＤＧ９６２３）により麻酔し、右前肢への最初の電気穿孔を、以下のとおり実施した：０．９％ＮａＣｌ、６ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタメート（Ｓｉｇｍａ、照会番号：Ｐ４７６１）中、ｃＤＮＡを２ｍｇ／ｍｌで調製した。電気穿孔前に、２５μｌのヒアルラニダーゼ（１００Ｕ／ｍｌ）を、２０分後に２５μｌ（５０ｍｇ）のｃＤＮＡを筋肉内に注射した。超音波検査ゲルを適用し、筋肉を、ＥｌｅｃｔｒｏＳｑｕａｒｅＰｏｒａｔｏｒ  ＢＴＸ（照会番号：ＥＣＭ８３０）の２つの円形電極（直径０．５ｍｍ）間に保持した。７５ボルトの電場を２０ミリ秒加え、これを、各パルス間１秒の間隔で１０回繰り返した。
【０３１１】
実験１２日目、第１回目のＥＭＧ読取りの１日後、左前肢に、上記のとおり、第２の電気穿孔を実施した。実験１８日目に、２回目のＥＭＧ読取りを実施した。
【０３１２】
マウスにおける坐骨神経圧潰
メスマウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス、Ｅｌｅｖａｇｅ  Ｊａｎｖｉｅｒ）を、イソフルランで麻酔し、体温をチェックした。コッヒャー鉗子を用いて右坐骨神経を圧潰した（２×３０秒）。圧潰の７日後及び１４日後、電気筋運動記録パラメーター、即ち、振幅、潜伏時間及び持続時間を、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃの装置（Ｋｅｙｐｏｉｎｔモデル）を用いて評価した。過最大強度（１２．８ｍＡ）での坐骨神経の単一０．２ミリ秒刺激後に、複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）を、ひ腹筋において測定した。振幅（ｍＶ）は、活性運動単位数に関連し、軸索変性により影響される。潜伏時間（ミリ秒）は、運動神経伝導及び神経筋伝達速度に関連し、脱髄に影響される。持続時間（１つの脱分極／再分極サイクルに必要な時間）は、電導の定性的指数であり、やはり脱髄によって影響される。
【０３１３】
Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ送達後の神経圧潰実験の結果
エリスロポエチン及びＥＰＯ変異体によって最も改善され易いＣＭＡＰパラメーターは潜伏時間である。図９に示された実験で、すべてのＥＰＯ変異体は、潜伏時間において、野生型タンパク質の活性に比較して、統計的に有意な改善を示す。他方、ベクター単独も、非関連タンパク質ＩＬ４の発現も、潜伏時間に正の効果を示さない。興味深いことに、すべての変異体に共通のエリスロポエチンのＮ末端の２８個のアミノ酸だけを発現するＥｐｏｖは、野生型タンパク質と同様に活性であり、すべての神経保護活性がこの配列（図７及び配列番号１３を参照）内に包含されていることを示唆している。
【０３１４】
また、ＥＰＯｖＣ３４ＳもＦａｓｔ  Ｔｒａｃｋ送達により試験し、神経圧潰後、７日目に試験した際、ＥＰＯｖと同等の活性を有した。
【０３１５】
（実施例１２）
ヘマトクリット濃度に及ぼす本発明のＥＰＯｖ１、ＥＰＯｖ２、ＥＰＯｖ３及びＥＰＯｖの効果
実施例１１に記載されたＦａｓｔ  Ｔｒａｃｋプロトコルに従って処置されたマウスのヘマトクリット濃度を測定した。
【０３１６】
ヘマトクリット読取り：
血液サンプルをヘパリン化ガラス毛細管に移し、ＣｒｉｔＳｐｉｎ遠心分離管中、１６０００ｒｐｍで１２０秒間遠心分離する。ヘマトクリット読取りは、サンプルの総容量のパーセンテージとして表される沈降赤血球容量として行われる。
【０３１７】
ヘマトクリット実験の結果
図１０に示された結果から、野生型エリスロポエチンのみが造血経路を活性化でき、一方、Ｅｐｏ変異体（ＥＰＯｖ１、ＥＰＯｖ２、ＥＰＯｖ３及びＥＰＯｖ）のいずれも赤血球カウントに影響を及ぼさないことが結論付けられる。
【０３１８】
（実施例１３）
ヒト赤白血病細胞系ＴＦ−１を用いた細胞ベースの増殖アッセイ：
ＴＦ−１（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２００３）は、生存及び増殖のために、ＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインの存在に依存することが知られている赤白血病細胞系である。ＴＦ−１細胞増殖に及ぼすエリスロポエチンの効果を調べるために試験を行った。図１１において、ｒＥＰＯｗｔｍ（実施例２と同様のプロトコルに従って得られた、Ｈｉｓタグ化した組換え野生型ＥＰＯ）及びｒＥＰＯｖｌｍ（実施例２に記載されたとおりに得られた、Ｈｉｓタグ化した組換えＥＰＯｖｌｍ）の効果を、市販製品、Ｅｐｒｅｘの活性と比較した。その結果は、１ｎｇ／ｍｌでのＧＭ−ＣＳＦは、およそ２０時間の培養倍増時間で細胞増殖を支持することができる一方、市販のエリスロポエチン（Ｅｐｒｅｘ１０００）は、０．２Ｕ／ｍｌ（１．７ｎｇ／ｍｌ）以上の濃度でＴＦ−１細胞の用量依存的生存を示すが、増殖は示さないこと（上枠）を示している。組換えＥＰＯｗｔｍ−６Ｈｉｓタンパク質は、Ｅｐｒｅｘ（中央の枠）の活性と同一の活性を示す。他方、ＥＰＯｖｌｍは、１７０ｎｇ／ｍｌで部分的保護を示すが、より低用量（下枠）では保護を示さない。この赤血球細胞系においてアッセイされたＥＰＯｖｌｍの活性は、完全長ＥＰＯｗｔｍの活性のおよそ１％であることが結論付けられる。この活性低下は、ヘマトクリットアッセイにおいて活性の減少を示すインビボデータ（図１０）と一致する。
【０３１９】
（実施例１４）
本発明のＥＰＯｖ１及びＥＰＯｖの神経保護活性
坐骨神経圧潰の回復に及ぼすＥＰＯｗｔ及びＥＰＯ変異タンパク質の皮下注射の効果を試験した。
【０３２０】
ＥＰＯｖｌｍ−６Ｈｉｓは、実施例２に記載されるとおりにＨＥＫ２９３細胞において作出した。ＥＰＯｗｔｍ−６Ｈｉｓは、同じ方法を用いて作出した。ＥＰＯｖｍ＿Ｃ３４Ｓ−６Ｈｉｓペプチドは、化学的に合成された（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）。ＥＰＯｖｍ＿Ｃ３４Ｓ−６Ｈｉｓは、６Ｈｉｓタグに結合したＥＰＯｖｍＣ３４Ｓ（配列番号１５のアミノ酸２８から５５）に対応する。「混合」ペプチド（ＥＰＯｖｍ  Ｃ３４Ｓの２８の同じアミノ酸だが、順序はランダム）もまた化学的に合成された（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）。
【０３２１】
５０μｇ／Ｋｇ（６０００Ｕ／Ｋｇ）Ｅｐｒｅｘと等価な等量のタンパク質を、ＰＢＳ中で希釈して、１グラムのマウス体重当たり１０μｌの最終容量とし、背上部筋肉内に注射した。実験の間、注射は毎日１回、１週当たり５日を繰り返した。ひ腹筋において測定された複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）に及ぼす処置の効果を、神経圧潰後の８日目及び１５日目にモニターした。
【０３２２】
注射によるタンパク質送達後の神経圧潰実験の結果
図１２に示されているとおり、精製ＥＰＯｖ１及びＥＰＯｖの注射は双方とも、潜伏時間パラメーターに関して、野生型タンパク質と同等の活性を示すが、媒体だけの注射後には効果が見られなかった。Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ実験で先に判明したとおり、持続時間及び振幅に及ぼす効果の明白さはより少ない。
【０３２３】
「混合」ペプチドもまた活性に関して試験した。このペプチドは、この実験において活性を示した。推測によって限定されることは望まないが、これは、機能的モチーフの保持、汚染又は実験誤差のいずれかによるものであると考えられる。この「混合」ペプチドの観察された活性を解明するために、さらなる実験が必要とされると考えられる。
【０３２４】
（実施例１５）
圧潰後の坐骨神経のＭＢＰ含量に及ぼすＥＰＯｗｔ及びＥＰＯ変異タンパク質の効果
ＣＭＡＰに及ぼすＥＰＯ及びＥＰＯ変異体の観察された主な効果は、髄鞘形成の程度に大きく影響される潜伏時間に対するものであるため、電気生理学的読取りと、髄鞘の再生において生じる生化学的変化との関連付けに努めた。これを行うために、坐骨神経におけるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の濃度を判定するための新規な方法が開発された。坐骨神経切開後、圧潰部位はより厚い瘢痕組織として容易に確認できるが、ＭＢＰ測定のために、それを回避することにした。したがって、各動物に関して、圧潰部位と遠位の圧潰神経のおよそ２ｍｍのセクションを、対側神経の対応するセクションと共に除去した。切開した神経セクションを、ドライアイス上に保持した９６ウェルの丸底細胞培養皿に移した。抽出のため、２０μｌの１０％ＳＤＳを加え、該プレートを、４×１０秒パルスを用いレベル５に出力を設定したＸ２０２０マイクロタイタープレート超音波処理器（Ｍｉｓｏｎｉｘ社）において超音波処理した。次いで、１８０μｌのＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、室温で１時間インキュベーションすることによって、各サンプルを抽出した。該マイクロタイタープレートを、出力設定７で上記のとおり再超音波処理し、各ウェルの内容物を、エッペンドルフ管に移した。該管に５０μｌのクロロホルムを添加後、激しくボルテックスし、１４Ｋｒｐｍで１０ｍ、遠心分離することによって相を分離させた。ペレット化した不溶物質を乱すことなく、下部の有機相を慎重に除去し、５容量のアセトンを加え、室温で１時間インキュベーションすることによって該タンパク質を沈殿させる。沈殿したタンパク質を、遠心分離によって採集し、７０％エタノール中で洗浄し、減圧下遠心分離により簡単に乾燥させた。ペレットは、０．２％ＳＤＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス  ｐＨ８．０中、４℃で一晩、続いて９５℃で１０ｍインキュベートすることによって可溶化した。次いで、５０μｌの２％ＮＰ４０、１％デオキシコレート、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス  ｐＨ８．０をさらに添加して、ＭＢＰ  Ｅｌｉｓａに用いるトリプルディタージャント緩衝液を再構成した。
【０３２５】
この操作を用いて、実施例１４に記載された実験の１６日目、２回目のＣＭＡＰ測定の完了後、３６匹すべての動物の両四肢の坐骨神経からタンパク質を抽出した。
【０３２６】
ＭＢＰ  Ｅｌｉｓａ
ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用い、製造元により推奨された操作に従って、各サンプル中のタンパク質濃度を判定した。すべてのサンプルを同一のタンパク質濃度に希釈し、各サンプルの連続希釈のＭＢＰ含量を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって判定した。Ｅｌｉｓａのために、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ、＃４３９５４５）を、ＰＢＳ中１：５０００に希釈した抗ＭＢＰモノクローナル抗体（Ｍａｂ３８２、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で一晩コーティングした。プレートを空にし、ＰＢＳ中、０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ａ９６４７）でブロックした。Ｔｒｉｐｌｅ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ緩衝液（１％ＮＰ４０、０．５％ジオキシコレート、０．１％ＳＤＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス  ｐＨ８．０）中、神経抽出物の連続希釈液を、コーティングしたウェルに加え、ロッカープラットホーム上、室温で２時間インキュベートした。検量標品として、精製マウスＭＢＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１３２２８−０１０）の連続希釈液をプレート中に入れた。インキュベーション後、該ウェルを、０．５％ツウィーン２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し、検出抗体、ＰＢＳ０．１％ＢＳＡ中１：３００に希釈したウサギ抗ＭＢＰポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ  １８−００３８）を加え、ロッカープラットホーム上で２時間インキュベートした。該検出抗体を除去し、ウェルを、上記のとおり、ＰＢＳ、ツウィーン２０中、再度洗浄した。ＰＢＳ  ０．１％ＢＳＡ中、１：１０，０００に希釈したビオチン化ヤギ抗ウサギポリクローナル（Ｖｅｃｔｏｒ、ＢＡ−１０００）を１時間加え、ウェルを上記のとおり洗浄し、１：８０００に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＲＰＮ１０５１Ｖ）を加えた。１時間後、ウェルを、上記のとおり、ＰＢＳ、ツウィーン２０中、３回洗浄し、Ｓｉｇｍａｆａｓｔ  ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ９１８７）と共に、室温で３０分間インキュベーションすることにより、シグナルを展開させた。この時間の最後に、等容量の２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加により反応を停止させ、該プレートを４９２ｎｍにおいて読み取った。
【０３２７】
ＭＢＰ標品の曲線を参照して、各サンプルのＭＢＰ含量を判定し、ｎｇＭＢＰ／μｇ総タンパク質として表した。圧潰神経に関して得られた値を、対応する対側神経に関して得られた値に対して正規化した。ＡＮＯＶＡ試験を用いて、統計的解析を実施した。
【０３２８】
ＥＰＯｗｔ及びＥＰＯ変異体によって処置した圧潰坐骨神経のＭＢＰ含量についての結果
上記のとおり判定された坐骨神経のＭＢＰ含量は、各群内の標準偏差の小ささにより判断して再現性が高かった。正常な媒体処置坐骨神経においては、ＭＢＰは総抽出タンパク質のおよそ５％であるが、圧潰された媒体処置坐骨神経の遠位セクションでは、圧潰１６日後、ＭＢＰは、総抽出タンパク質のおよそ１％である。ＥＰＯｗｔｍ、ＥＰＯｖｌｍ又はＥＰＯｖｍ  Ｃ３４Ｓで処置された群はすべて、媒体処置群に比較して、圧潰神経におけるＭＢＰの濃度の増加を示す。本発明に記載されたＥＰＯｗｔ及びＥＰＯ変異体は、ＭＢＰ産生を刺激することができ、これは恐らく、坐骨神経圧潰後のミエリン再生の改善を反映していると思われる。このように、ＣＭＡＰ読取りにより判定されるＥＰＯｗｔ及びＥＰＯ変異体の電気生理学的結果は、ＭＢＰの増加に関連しており、したがって、恐らくミエリン含量に関連していると思われる。
【０３２９】
「混合」ペプチドもまた、この実験において活性を示した。推測に限定されることは望まないが、これは、機能的モチーフの保持、汚染又は実験誤差のいずれかによるものと考えられる。この「混合」ペプチドの観察された活性を解明するために、さらなる実験が必要とされると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０３３０】
【図１】ヒトの参照野生型ＥＰＯ遺伝子領域（配列番号１）を表す４０９９ヌクレオチドのゲノム配列を示す図である。ＥＰＯ遺伝子は、図１のヌクレオチド配列上の位置が以下のとおりである５つのエキソンを含有するものとして記載されている：エキソン１：ヌクレオチド６０１からヌクレオチド７９４まで（７８２位での開始コドンを含む）、エキソン２：ヌクレオチド１３５９からヌクレオチド１５０４まで、エキソン３：ヌクレオチド１７６３からヌクレオチド１８４９まで、エキソン４：ヌクレオチド２４６５からヌクレオチド２６４４まで、エキソン５：ヌクレオチド２７７９からヌクレオチド３４９９まで（２７６３位での終止コドンを含む）。各エキソンは灰色に着色されている。開始及び終止コドンは、下線が引かれている。
【図２】野生型ＥＰＯの１３２８ヌクレオチドの転写物配列（ポリＡ尾部を除く）（配列番号２）を示す図である。開始及び終止コドンは、それぞれ１８２位及び７６１位に下線が引かれている。
【図３】野生型ＥＰＯ並びにコード化タンパク質の転写物配列を示す図である。開始及び終止コドンは、それぞれ１８２位及び７６１位にある。該転写物は、１９３のアミノ酸の未成熟タンパク質をコードする（以後、ＥＰＯｗｔと命名される）（配列番号３）。
【図４】ＥＰＯｖ１の転写物配列並びにコード化タンパク質ＥＰＯｖ１を示す図である。開始及び終止コドンは、それぞれ１８２位及び６７４位にある（したがって、このコード化配列は、開始及び終止コドン双方を含む１８２位及び６７６位までである）。該転写物は、１６４のアミノ酸の未成熟タンパク質をコードする（以後、ＥＰＯｖ１と命名される）（配列番号４）。ＥＰＯｖ１は、ヒト遺伝子ＥＰＯのエキソン１、２、４及び５によりコードされるＥＰＯの新規な転写変異体である。
【図５】ＥＰＯｖ２の転写物配列並びにコード化タンパク質ＥＰＯｖ２を示す図である。開始及び終止コドンは、それぞれ１８２位及び４９４位にある（したがって、このコード化配列は、開始及び終止コドン双方を含む１８２位及び４９６位までである）。該転写物は、１６４のアミノ酸の未成熟タンパク質をコードする（以後、ＥＰＯｖ２と命名される）（配列番号６）。ＥＰＯｖ２は、ヒト遺伝子ＥＰＯのエキソン１、２、及び５によりコードされるＥＰＯの新規な転写変異体である。
【図６】ＥＰＯｖ３の転写物配列並びにコード化タンパク質ＥＰＯｖ３を示す図である。開始及び終止コドンは、それぞれ１８２位及び６４４位にある（したがって、このコード化配列は、開始及び終止コドン双方を含む１８２位及び６４６位までである）。該転写物は、１５４のアミノ酸の未成熟タンパク質をコードする（以後、ＥＰＯｖ３と命名される）（配列番号９）。ＥＰＯｖ３は、ヒト遺伝子ＥＰＯのエキソン１、２、３及び４ＡによりコードされるＥＰＯの新規な転写変異体である。配列番号８に示された配列を有するポリペプチドは、初めて本明細書に開示されたＥＰＯの新規な転写変異体のＣ末端部分に相当し、エキソン４Ａの３’末端によりコードされる。エキソン４Ａは、野生型ＥＰＯをコードするエキソン４と比較して３’末端がより長い（図３を参照）。
【図７】ＥＰＯｖの転写物配列並びにコード化タンパク質ＥＰＯｖを示す図である。開始及び終止コドンは、それぞれ１８２位及び３４７位にある（したがって、このコード化配列は、開始及び終止コドン双方を含む１８２位及び３４９位までである）。該転写物は、５５のアミノ酸の未成熟タンパク質をコードする（以後、ＥＰＯｖと命名される）（配列番号１３）。ＥＰＯｖは、ヒト遺伝子ＥＰＯのエキソン１，２、及びエキソン３の最初の６つのヌクレオチドによりコードされるＥＰＯの合成切断変異体である。その成熟形態（ＥＰＯｖｍ）において、それは、第１のアルファヘリックスモチーフを形成するＥＰＯ成熟ポリペプチドのＮ末端２８のアミノ酸に相当する。
【図８】ＥＰＯｖの変異体（ＥＰＯｖ  Ｃ３４Ｓ変異体）の配列を示す図である。この変異体において、成熟タンパク質の７位（未成熟形態の３４位）のシステイン残基はセリンにより置換される。該転写物は５５のアミノ酸の未成熟タンパク質をコードする（以後、ＥＰＯｖ  Ｃ３４Ｓと命名される）（配列番号１５）。
【図９】神経圧潰後の時点でＣＭＡＰに対して電気穿孔Ｅｐｏ及びＥｐｏ変異体ｃＤＮＡ類の効果を示す図である。６匹のメスＣ５７ＢＬ／６匹マウス群は、ＥＰＯ野生型（斑点）又はＥＰＯｖ１（水平線）、ＥＰＯｖ２（斜線）、ＥＰＯｖ３（空四角）、及びＥＰＯｖ（斜影線）に対してｃＤＮＡ類を含有するｐＤＥＳＴ１２．２発現ベクターにより注入された。陰性対照として、ｐＤＥＳＴ１２．２単独（黒色バー）又はヒトＩＬ４に対してｃＤＮＡを含有するもの（縞バー）を電気穿孔した。神経圧潰後７日目と１４日目に、潜伏時間、持続時間及び振幅のＣＭＡＰパラメーターを、すべての動物の圧潰肢、またｐＤＥＳＴ１２．２ベクター単独（空シンボル）により注入された動物の対側性肢において記録した。
【図１０】赤血球数（ヘマトクリット）に対するＥｐｏ変異体の効果を示す図である。血液サンプルは、図９に記載されたすべての動物から、電気穿孔１２日目に採血された。ヘマトクリット（赤血球容量は、全血容量のパーセンテージとして算出された）を測定した。
【図１１】ＴＦ−１の増殖に対するＥｐｏ変異体の効果を示す図である。ＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−２００３）を、ＡＴＣＣにより推奨され、１ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ又は指定された用量のＥｐｒｅｘ（上部パネル）、ｒＥＰＯｗｔｍ−６Ｈｉｓ（中央パネル）又はｒＥＰＯｖｌｍ（下部パネル）のいずれかで補足された培地中、６ウェル細胞培養用皿内で培養した。細胞培養は、およそ５×１０４細胞／ｍｌに設定され、生存細胞数は、ノイバウェル改良血球計算器の二重チャンバーをカウントすることにより４日間にわたり毎日算出された。
【図１２】神経圧潰後の時点でＣＭＡＰに対して注入されたＥｐｏＷＴ及びＥｐｏ変異体タンパク質の効果を示す図である。６匹のメスＣ５７ＢＬ／６匹マウス群は、５０μｇ／ｋｇのＥｐｒｅｘ（縞バー）、５２．４μｇ／ｋｇのＥＰＯｗｔｍ（斑点）、４３．５μｇ／ｋｇのＥＰＯｖｌｍ（水平線）、又は１０．７μｇ／ｋｇのＥＰＯｖｍ（斜影線）、又は１０．７μｇ／ｋｇのＥＰＯｖＣ３４Ｓ混合（垂直線）により注入された。陰性対照として、媒体（ＰＢＳ）を単独（黒色バー）で注入した。神経圧潰後８日目と１５日目に、潜伏時間、持続時間及び振幅のＣＭＡＰパラメーターを、すべての動物の圧潰肢、また媒体単独（空シンボル）により注入された動物の対側性肢において記録した。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて統計解析を実施する。
【図１３】神経圧潰後の坐骨神経のＭＢＰ含量を示す図である。図１２に記載された実験の１６日目に、動物を殺処理し、圧潰部位に遠位の坐骨神経の切片を取り出した。各動物の対側性部位から対応する神経切片もまた取り出し、平行して処理した。各サンプルのタンパク質含量は、ＢＣＡ法により測定され；ＭＢＰ含量はＥｌｉｓａにより測定された。各サンプルのＭＢＰ含量は、ｎｇ  ＭＢＰ／μｇの総タンパク質として表され、圧潰神経のＭＢＰ含量は、対応する対側性神経のＭＢＰ含量に正規化された（対側性％）。Ｏｎｅ−Ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ検定を用いて統計解析が実施された。群は以下のとおり指定された：媒体（実バー）、Ｅｐｒｅｘ（縞バー）、組換えＥＰＯｗｔｍ（点刻バー）、ＥＰＯｖ１ｍ（水平線）、ＥＰＯｖｍ  Ｃ３４Ｓ（斑点）、ＥＰＯｖ  Ｃ３４Ｓ混合（垂直線）。
【図１】
2009517009.tif 000057
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図９】
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【図１１】
2009517009.tif 000067
【図１２】
2009517009.tif 000068
【図１３】
2009517009.tif 000069
【配列表】
2009517009000001.app
【国際調査報告】
2009517009.tif 000070
2009517009.tif 000071
2009517009.tif 000072
2009517009.tif 000073
2009517009.tif 000074