(57)【要約】速効型又は即効型／長時間作用型組合せインスリン製剤であって、即効型インスリンのｐＨを調整して長時間作用型グラルギンが、これらが混合された場合に可溶性のままであるようにしたインスリン製剤を開発した。好ましい実施態様として、この注射用基礎ボーラスインスリン製剤を朝食前に投与すると、その食事をカバーするのに適切なインスリンのボーラス濃度が達成され、食後に低血糖が起こらず、２４時間適切な基礎インスリン濃度が得られる。昼食及び夕食は、速効型もしくは即効型又は超即効型インスリンの２回のボーラス注射によってカバーすることができる。以上の結果、集中的なインスリン療法を用いる患者は、１日当たり４回ではなく、３回注射するだけということになる。六量体インスリンに特定の酸を加えて吸収の速度及び量を高め、キレート化剤を添加することで単量体型への解離後に生物活性を維持させることの重要性を証明する実験を行った。【特許請求の範囲】
【請求項１】
中時間作用型又は長時間作用型インスリンとの組合せで速効型、即効型又は超即効型インスリンを含む組成物であって、該組成物のｐＨが該長時間作用型インスリンを可溶化するように調整される組成物。
【請求項２】
インスリングラルギンを含む請求項１の組成物。
【請求項３】
さらに即効型インスリンを含む請求項１の組成物。
【請求項４】
さらに中時間作用型インスリンを含む請求項１の組成物。
【請求項５】
３．０〜４．２のｐＨを有する請求項１の組成物。
【請求項６】
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジメルカプロール（ＢＡＬ）、ペニシラミン、アルギン酸、クロレラ、シラントロ、アルファリポ酸、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ジメルカプトプロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）及びシュウ酸からなる群から選ばれるキレート化剤を含む請求項１の組成物。
【請求項７】
前記キレート化剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である請求項６の組成物。
【請求項８】
アスパラギン酸、グルタミン酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸及びクエン酸からなる群から選ばれる酸を含む請求項１の組成物。
【請求項９】
即効型インスリン、長時間作用型インスリン及びこれらの組合せからなる群から選ばれるインスリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸又はクエン酸からなる群から選ばれる酸、インスリン、並びにキレート化剤を含むインスリン製剤。
【請求項１０】
ＥＤＴＡを含む請求項９の製剤。
【請求項１１】
クエン酸を含む請求項９の製剤。
【請求項１２】
即効型インスリンを１：２：２の比率で含む請求項９の製剤。
【請求項１３】
前記インスリンが天然型ヒトインスリン、組換え型ヒトインスリン、ブタインスリン、ウシインスリン、ヒトインスリン誘導体、又はヒトへの投与に適したヒトインスリン類似体である請求項９の製剤。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかの組成物を個体に投与することを含む、患者をインスリンで治療する方法。
【請求項１５】
前記インスリンが注射によって投与される請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記インスリンが舌下、経口、基礎、口腔、直腸又は膣内投与用の製剤の形である請求項１４の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に即効型および長時間作用型インスリン製剤を組み合わせた製剤に関するものである。
【０００２】
本願は、Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｓ．ＳｔｅｉｎｅｒおよびＲｏｄｅｒｉｋｅ  Ｐｏｈｌにより２００６年４月１２日に出願された米国特許第６０／７４４，６８７号（題名、“Ｒａｐｉｄ  Ａｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ａｃｔｉｎｇ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”）、Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｓ．ＳｔｅｉｎｅｒおよびＲｏｄｅｒｉｋｅ  Ｐｏｈｌにより２００６年９月２９日に出願された米国特許第１１／５３７，３３５号（題名、“Ｒａｐｉｄ  Ａｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  Ａｃｔｉｎｇ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ”）、およびＳｏｌｏｍｏｎ  Ｓ．ＳｔｅｉｎｅｒおよびＲｏｄｅｒｉｋｅ  Ｐｏｈｌにより２００７年４月２日に出願された米国特許第１１／６９５，５６２号（題名、“Ｒａｐｉｄ  Ａｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ａｃｔｉｎｇ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”）に対する優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病の集中的なインスリン療法は、理想的には２４時間にわたり血中に均一な濃度で存在する基礎インスリン、及び毎食に伴って消化により増加する炭水化物負荷をカバーするボーラス又は食事時間（食事時）インスリンを提供するものである。
【０００４】
１９３６年、Ｈａｎｓ  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ＨａｇｅｄｏｒｎとＢ．Ｎｏｒｍａｎ  Ｊｅｎｓｅｎは、カワマスの「魚精」すなわち精液から得られるプロタミンの添加によってインスリン注射の効果を延長することができることを発見した。この場合、インスリンは上記プロタミンに加えられ、得られた溶液はｐＨ７に調整して注射された。１９４６年、ノルディスク社（Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ）は、プロタミン及びインスリンの結晶を形成させるのに成功し、１９５０年、ＮＰＨ（中性プロタミン・ハゲドルン（Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ  Ｈａｇｅｄｏｒｎ)、「ＮＰＨ」）インスリンとして上市した。ＮＰＨインスリンには、これを作用発現のより速いインスリンと混合して持続性のより長い作用を与えることができるという利点がある。最終的には動物のインスリンは全て組換え型ヒトインスリンに切り替えられた。
【０００５】
ごく最近まで、また今日の多くの地域では、基礎インスリンは、通常、ＮＰＨインスリンを１２時間間隔の１日２回の用量で投与することにより供給されている。１日３回食事を摂り、ＮＰＨインスリンを基礎インスリンとして使用している患者では、１日当たり５回の注射、即ち、３度の食事のそれぞれで１回の注射及び朝１回と就寝時１回の２回のＮＰＨインスリン注射が必要となる。患者が打たねばならない注射の回数を減らすために、朝の用量のＮＰＨインスリンは、短時間作用型インスリン、（組換え型ヒトインスリン）又はリスプロなどの即効型インスリン類似体と組み合わせて用いられている。代表的な組合せは、７０％のＮＰＨ対３０％の即効型インスリン類似体の合剤である。その結果、患者は注射回数を日に５回から日に４回に減らすことができる。例えば、非特許文献１を参照されたい。
【０００６】
最近になって、「超長時間作用型」インスリン類似体であるインスリングラルギン（商品名ランタス（登録商標））が使用可能になった。これは注射後約１時間で血糖を低下させ始め、２４時間均等に作用し続ける。Ｊ．Ｒｏｓｅｎｓｔｏｃｋとその共同研究者らは、インスリングラルギンを打った患者はＮＰＨインスリンを打った患者よりも低血糖（低血糖症）になるリスクがはるかに低いことを見出した。
【０００７】
グラルギンは他の短時間作用型又は即効型インスリンと混合して用いることはできない。何故なら、その混合により注射の前にグラルギンが沈殿し、沈殿したインスリンを投与すると、既知の確実な用量を投与することが事実上不可能になるからである。グラルギンの製造業者はユーザーに対し、グラルギンを如何なる他のインスリンとも混合しないよう警告している。
【０００８】
従って、本発明の目的は、毎日の注射回数を3回に減らすために用いることができるインスリン製剤を提供することにある。
【０００９】
本発明の別の目的は、基礎/ボーラスインスリン製剤を提供することにある。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、即時及び長時間放出性を有する安定なインスリン製剤を提供することにある。
【非特許文献１】Ｇａｒｂｅｒ，  Ｄｒｕｇｓ  ６６（１）：ｐ．３１−４９  （２００６）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の要旨
速効型又は即効型／長時間作用型組合せインスリン製剤であって、速効型又は即効型インスリンのｐＨを調整して、即効型及び長時間作用型インスリンがいずれも、混合された場合に可溶性のままであるようにしたインスリン製剤を開発した。好ましい実施態様に含まれるのは、低ｐＨで任意の中時間、長時間又は超長時間作用型インスリンと混合した任意の超即効型、即効型又は速効型インスリン製剤である。別の実施態様として、任意の超即効型、即効型又は速効型インスリンをキレート化剤の存在下に低ｐＨで任意の中時間、長時間又は超長時間作用型インスリンと混合することができる。最も好ましい実施態様として、血中インスリン濃度の急激な初期スパイクを生じさせて食事の消化により吸収されている炭水化物をカバーし、血中基礎インスリン濃度の持続を継続させるために、ＶＩＡｊｅｃｔ（商標）（超即効型インスリン）をｐＨ４でインスリングラルギンと混合する。
【００１２】
注射用基礎ボーラスインスリン製剤を朝食前に即効型又は超即効型インスリンと同時投与すると、その食事をカバーするのに適切なインスリンのボーラス濃度が達成され、食後に低血糖が起こらず、２４時間適切な基礎インスリン濃度が得られる。昼食及び夕食は、速効型もしくは即効型又は超即効型インスリンの２回のボーラス注射によってカバーすることができる。以上の結果、集中的なインスリン療法を用いる患者は、１日当たり４回ではなく、３回注射するだけということになる。
【００１３】
六量体インスリンにアスパラギン酸、グルタミン酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸などの特定の酸を加えて吸収の速度及び量を高め、二量体／単量体への解離後に生物活性を維持させることの重要性を証明する実験を行った。これらはキレート化剤、好ましくはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）とともに添加する。多価酸はその分子の大きさ及び構造に基づき選択してインスリン表面の水素結合部位との会合を最適化し、原料（天然型インスリン、組換え型インスリン、長時間作用型インスリン、ブタインスリン、ウシインスリン、インスリン誘導体及びこれらの類似体など）とは無関係に荷電アミノ酸残基を効果的に遮蔽した（図１）。これらの酸は最適な荷電遮蔽効果が得られる濃度で用いた（実施例に示したように、好ましい酸はアスパラギン酸、グルタミン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸及びクエン酸である）。上記インスリン製剤にこうした好ましい酸とキレート化剤を共に混合することがインスリンの速やかな吸収に関与するものと思われる。ＥＤＴＡは全ての酸で有効というわけではなかった。アジピン酸、シュウ酸又はＨＣｌと共に用いると、インスリンの吸収速度に明らかな増加は認められなかった。以上の研究は、インビトロ（ヒト口腔上皮細胞）並びにインビボ（ラット、ブタ及びヒト）での検討の両者において酸とキレート化剤の重要性を立証するものである。これらの知見は、（クエン酸及びＥＤＴＡと組み合わせた）超即効型インスリン並びに基礎インスリングラルギンで治療した糖尿病患者で認められた結果を裏付けるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
Ｉ．  組成物
Ａ．  インスリン
本組成物は、速効型、即効型又は超即効型インスリン及び中時間又は長時間作用型インスリンを含む。その即効型インスリンは、長時間作用型インスリンが、これらを混合した場合に長時間作用型インスリンに対する即効型インスリンの比率の広い範囲にわたっても沈殿しないような低いｐＨで供給される。
【００１５】
糖尿病患者にはいく種類かの異なる市販インシュリンが入手可能である。こうした種類のインスリンは、（１）これらが血流に到達して血中グルコース濃度を低下させ始めるのにどのくらいの時間がかかるか、（２）このインスリンがどのくらいの時間最大の強さで作用するか、及び（３）このインスリンが血糖に対する効果をどのくらいの時間示し続けるか、によって異なる。
【００１６】
速効型インスリン
速効型インスリンは、食事時の炭水化物の摂取に由来するグルコースに対して反応させるためのものである。速効型インスリンは１〜２０分以内に作用し始め、約１時間後にピークに達し、３〜５時間持続する。速効型インスリンは、全身循環に完全に吸収されるのに約２時間かかる。速効型インスリンとしては、組換え型ヒトレギュラーインシュリン（リリー（Ｌｉｌｌｙ）より上市のヒュームリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ）（登録商標）、ノボノルディスク（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ）より上市のノバリン（Ｎｏｖａｌｉｎ）（登録商標）など）が挙げられ、これらはｐＨ７の等張溶液として投与される。ヒトインスリンに対して数個のアミノ酸が異なるが、ヒトにおいて活性のあるウシ及びブタインスリンも速効型インスリンである。
【００１７】
即効型インスリン
糖尿病患者の中には食事時には即効型インスリン、「バックグラウンド」の持続性インスリン用には長時間作用型インスリンを使用する者がいる。このグループには、吸収速度を高めるために修飾され、又はアミノ酸の位置が変更されたインスリンが含まれる。
【００１８】
現在、３種類の市販即効型インスリン類似体、即ち、リスプロインスリン（ヒューマログ（ＨＵＭＡＬＯＧ）（登録商標）としてイーライリリー（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）から市販のリジン／プロリンインスリン）、グルリジンインスリン（アピドラ（ＡＰＩＤＲＡ）（登録商標）としてサノフィ−アベンティス（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）から市販）及びアスパルトインスリン（ノボログ（ＮＯＶＯＬＯＧ）としてノボノルディスクより発売）が入手可能である。
【００１９】
超即効型インスリン
ビオデル（Ｂｉｏｄｅｌ）社は、上記即効型インスリン類似体よりもさらにより即効性であるヒトレギュラーインスリンの独自開発インスリン製剤ＶＩＡＪＥＣＴ（商標）を持っている。これは、ＥＤＴＡ及びクエン酸とヒトレギュラーインスリンを組み合わせたｐＨ４の製剤である。
【００２０】
中時間作用型インスリン
中時間作用型インスリンは、短時間作用型インスリンよりも寿命が長いが、作用の開始がより遅く、最大の強度に達するのにより時間がかかる。通常、中時間作用型インスリンは注射後２〜４時間以内に作用し始め、４〜１４時間の間でピークに達し、２４時間まで有効性が存続する。中時間作用型インスリンの種類としては、ＮＰＨ（Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ  Ｈａｇｅｄｏｒｎ（中性プロタミン・ハゲドルン））及びＬＥＮＴＥインスリンが挙げられる。ＮＰＨインスリンは、吸収速度を低下させることによってインスリンが血流に達するのにより時間がかかり、ピーク及び寿命が長くなるようにするプロタミンを含有している。中時間作用型インスリンには、１日当たりの総注射回数を減らすために、中性ｐＨで即効型インスリンを混合することができる。
【００２１】
長時間作用型インスリン
ＬＡＮＴＵＳ（商標）（インスリングラルギン）は、最長２４時間の持続時間を示し得る組換え型ヒトインスリン類似体である。これは、２１番目の位置のアスパラギンの代わりにグリシンを有し、ベータ鎖のカルボキシ末端に２個のアルギニンが付加されていることで、ヒトインスリンと異なる。ＬＡＮＴＵＳ（商標）は澄明な液体に溶解されているインスリングラルギン（インスリン１００ＩＵ、３．６３７８ｍｇ、亜鉛３０マイクログラム、ｍ−クレゾール２．７ｍｇ、８５％グリセロール２０ｍｇに水を加えて１ｍｌとしたもの）からなる。そのｐＨはＨＣｌで４に調整されている。
【００２２】
注射と薬理効果の終点との間の時間の中央値は、注射後最大２４時間である。この注射と薬理効果の終点との間の時間の中央値は、インスリングラルギンでは２４時間、ＮＰＨヒトインスリンでは１４．５時間であった。
【００２３】
添付文書には、多くの即効型及び中時間作用型インスリンと異なり、ＬＡＮＴＵＳ（商標）を如何なる他の種類のインスリンとも、混合時に沈殿を生じるため、混合しないようにと記載されている。
【００２４】
インスリングラルギンの場合、Ｖｉａｊｅｃｔ（商標）と混合しても、これがインスリングラルギンと一致してｐＨ４であるので、沈殿が形成されない。詰まるところ、この組合せによって超即効型インスリンが供給されて患者はボーラスインスリンを少なくした食事により支えられる。というのは、超即効型インスリンが極めて速やかに吸収され、食事の消化後すぐに除去されることで、低血糖の起きる確率が減少し、２４時間持続性基礎インスリンが供給されるからである。これにより、最終的に、１日当たり必要な注射回数は４回から３回へ減少する。
【００２５】
Ｂ．  酸安定剤およびキレート化剤
酸安定剤
六量体結晶インスリンを効果的に可溶化する酸は、その分子の大きさ及びｐＫａに基づいて選択され、単量体又は二量体へ解離するときに暴露されるインスリン分子上の荷電（図１）を遮蔽するのに最も効果的であると予測される。特定の酸は、生物活性を保護し、効果的に遮蔽をかけ、六量体インスリンの単量体への解離後の吸収速度を増加させる。
実施例は、インビトロ（ヒト口腔上皮細胞）並びにインビボ（ラット、ブタ及びヒト）の両者においてこの酸の重要性を立証するものである。レギュラーヒトインスリン（ヒュームリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ）（登録商標）Ｒ）は、ＨＣｌで可溶化し、生理的ｐＨで製剤化される。このインスリンの薬理学的プロフィールから、このインスリンはあまり速やかに吸収されず、投与後約２時間にピークインスリン濃度を示すことが分かる。
【００２６】
好ましい酸は「多酸性」であり、即ち、複数の酸性残基を有する。好ましい多酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸及びクエン酸が挙げられる。有用な濃度範囲は、インスリンを０．５〜４ｍｇ／ｍｌ含有する溶液の場合、酸が０．１〜３ｍｇ／ｍｌである。ｐＨの範囲は３．０〜４．２であるが、好ましい範囲は３．８〜４．１である。これらの酸は、任意の即効型インスリンと併用してｐＨを下げ、ランタスとの混合後これらを可溶性にすることができる。
【００２７】
キレート化剤
好ましい実施態様として、キレート化剤を上記活性薬剤と混合する。また、このキレート化剤は、キレート化における本来の役割の他に、インスリンと水素結合することによってその荷電を遮蔽しインスリンの吸収を促進すると考えられている。キレート化剤によってインスリンから亜鉛が引き離されることにより、皮下組織（例えば、粘膜又は脂肪組織）への注射後、インスリンの四量体より単量体の方が有利になると考えられている。これにより、インスリンを単量体に維持することでその吸収が容易になる。その上、キレート化剤は、インスリン分子の暴露された表面荷電を覆い隠し、又は荷電遮蔽することで、さらに吸収を促進する。
【００２８】
キレート化剤はイオン性であっても非イオン性であってもよい。好適なキレート化剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、ジメルカプロール（ＢＡＬ）、ペニシラミン、アルギン酸、クロレラ、シラントロ、アルファリポ酸、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ジメルカプトプロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）及びシュウ酸が挙げられる。好ましい実施態様として、キレート化剤はＥＤＴＡである。イオンは、活性薬剤の一部であっても、安定剤に添加しても、キレート化剤に混合しても、及び／又はコーティングに含ませてもよい。代表的なイオンとしては、亜鉛、カルシウム、鉄、マンガン、マグネシウム、アルミニウム、コバルト、銅、又は任意の二価金属もしくは遷移金属イオンが挙げられる。Ｚｎ＋２はＣａ＋２よりもＥＤＴＡに対する結合選択性が強い。
【００２９】
Ｃ．製剤
上記の活性化合物類又はこれらの医薬として許容可能な塩は、活性化合物（類）が１種以上の医薬用として許容可能な担体、添加剤又は希釈剤と混合又は混和されている医薬組成物として投与することができる。好ましい実施態様として、インスリンは注射によって投与する。あるいは、上記組成物を経口、口腔、舌下、膣内、直腸又は鼻腔内投与によって投与することができる。
【００３０】
液剤
液剤は注射（ｓ．ｃ．、ｉ．ｍ．、ｉ．ｐ．）してもよいし、鼻腔内、舌下、膣内又は口腔投与では噴霧してもよい。注射用製剤は通常、滅菌水、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水又はグリセリンに懸濁する。他の好適な医薬用として許容可能な物質類も知られている。これらは通常、使用直前の凍結乾燥又は乾燥されたインスリンに加えるが、使用に先立って加えておいてもよい。溶解補助剤としては、ポリソルベート類、ポロキサマー類などの湿潤剤、非イオン性及びイオン性界面活性剤、食用酸及び塩基（例えば、重炭酸ナトリウム）、アルコール、並びにｐＨ調節用緩衝酸又は塩が挙げられる。図８には、Ｖｉａｊｅｃｔとインスリングラルギンの注射用合剤に関するヒト臨床試験のデータを示した。
【００３１】
固形剤
固形もしくは半固形ゲルをｓ．ｃ．注射用に製剤化（注射可能な低粘度ゲル）してもよいし、デュアル作用型インスリンの口腔、舌下、経口、直腸もしくは膣内投与用にフィルム状に乾燥させてもよい。これらは、イオン及び／又は共有結合によってゲル化又は固化する１種以上の親水性ポリマーを溶液に混合することで形成させることができる。好適な材料としては、デンプン、α化デンプン、ゼラチン、糖類（スクロース、グルコース、デキストロース、ラクトース、ソルビトールなど）、キトサン類（各種構造のもの）デキストリン、マルトデキストリン、ポリエチレングリコール、ワックス類、アカシア、グアーガム、トラガカント、アルギン酸塩、アルギン酸ナトリウムなどの天然及び合成ゴム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシルエチルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロースなどのセルロース類、ヴィーガム、Ｉ型水添植物油、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、並びにアクリル酸及びメタクリル酸コポリマー、カルボマー、メタクリル酸コポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリアクリル酸／ポリメタクリル酸、ポリビニルピロリドンなどの合成ポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一定の親水性を得るのに十分な混合又は共重合の実施は、これらの材料の湿潤度及び粘膜付着性を改善するのに役立ち得る。例えば、単量体の約５％〜約２０％は親水性単量体である。ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）などの親水性ポリマーは、この目的によく用いられる。好ましくは、これらのポリマーは生体侵食性であり、好ましい分子量は１，０００〜１５，０００Ｄａ、最も好ましくは２，０００〜５，０００Ｄａの範囲である。また、これらは、モノステアリン酸エチレングリコール、ミリスチン酸プロピレングリコール、モノステアリン酸グリセリル、ステアリン酸グリセリル、ポリグリセリル−４−オレアート、ソルビタンアシレート、スクロースアシレート、ラウリン酸ＰＥＧ−１５０、モノラウリン酸ＰＥＧ−４００、モノラウリン酸ポリオキシエチレン、ポリソルベート類、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ＰＥＧ−１０００セチルエーテル、ポリオキシエチレントリデシルエーテル、ポリプロピレングリコールブチルエーテル、ポロキサマ（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）（登録商標）４０１、ステアロイルモノイソプロパノールアミド、ポリオキシエチレン水添牛脂アミドなどの非イオン性ポリマーとすることができる。両性界面活性剤の例としては、Ｎ−ドデシル−β−アラニンナトリウム、Ｎ−ラウリル−β−イミノジプロピオネートナトリウム、ミリストアンホアセテート、ラウリルベタイン及びラウリルスルホベタインが挙げられる。
【００３２】
一実施態様として、製剤は、ポリビニルアルコール、グリセリン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、キトサン、必要に応じてポリエチレングリコールなどの添加剤及び水を含有する舌下投与用固形製剤である。この組成物は、透明又は不透明で軟質の薄い材質の形とすることができる。典型的な厚さは０．０１〜４ｍｍの範囲である。このフィルムは、円形、長円形、長方形又は正方形を含む任意の適切な形状を有することができる。このフィルムは、単層、二層又は三層フィルムとすることができる。好ましい実施態様として、このフィルムは舌下投与に適するように設計される。単層フィルムは、活性薬剤と１種以上の添加剤を含有する。二層フィルムは、第一の層に溶解補助剤及び／又は金属キレート化剤などの添加剤を１種以上、第二層に活性薬剤を含有する。この構造により、活性薬剤を添加剤から分離して保存することが可能となり、活性薬剤の安定性を高めることができ、必要であれば、添加剤と活性薬剤が単一層に含有される場合に比し、組成物の貯蔵安定性が高められる。三層フィルムは、３層のフィルムを有する。各層は異なったものとすることができ、或いは、最下層と最上層などの２層を実質的に同一の組成物を有するものとすることができる。一実施態様として、最下層と最上層に、活性薬剤を含有するコア層を囲ませる。最下層と最上層には、溶解補助剤、金属キレート化剤などの１種以上の添加剤を含ませることができる。最下層と最上層は同一の組成物を有することが好ましい。あるいは、最下層と最上層に、異なる添加剤、又は異なる量の同一添加剤を含有させることができる。コア層には、通常、インスリンを、必要に応じて１種以上の添加剤と共に含有させる。一実施態様として、上記フィルムは、１つの層にＥＤＴＡ及びクエン酸、別の層にインスリンを含有する二層フィルムである。各層には、グリセリン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、必要に応じて（ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１６００などの）ＰＥＧなどの追加の添加剤を含有させることができる。一実施態様として、インスリン層とその他の成分を含有する層との間に第３の層を配置して保存時に活性薬剤を他の層にある分解成分からさらに保護することができる。この保護層の好適な材料としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルナウバろう、酢酸フタル酸セルロース、セチルアルコール、粉砂糖、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、液状グルコース、マルトデキストリン、メチルセルロース、ミクロクリスタンワックス、ポリメタクリル酸エステル類、ポリビニルアルコール、セラック、スクロース、タルク、二酸化チタン、及びゼインが挙げられる。上記添加剤の組成を変えることによって、所望の吸収プロフィル及びその後の効果を達成するためすみやかに（３０秒未満で）又はゆっくりと（最大１５分で）溶解するようにフィルムを設計することができる。フィルムは、３〜５分、５〜８分又は８〜１５分の範囲の時間で溶解させることができる。好ましくは、このフィルムは２〜１０分の範囲の時間で溶解させる。
【００３３】
多くの着色剤及び香味料が市販されている。香味料としては、ミント、レモン、チェリー、バブルガム及び他の標準的な香味料が挙げられる。インスリン投与用に特に有利である非グルコース甘味料などの甘味料を添加することができる。着色剤は赤、青、緑、黄、橙黄などの標準的なＦＤＣ承認の色素とすることができる。
【００３４】
安定剤は、例えば酸化反応を含む薬物分解反応を抑制又は遅延させるために用いられる。多くの安定剤を用いることができる。好適な安定剤としては、セルロース、セルロース誘導体などの多糖類、グリセロールなどの単純アルコール類、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベンなどの静菌剤、塩化ナトリウム、グリセロール、グルコースなどの等張剤、天然レシチン（例えば、卵黄レシチン又は大豆レシチン）、合成又は半合成レシチン（例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、又はジステアロイル−ホスファチジルコリン）などのレシチン類、ホスファチジン酸類、ホスファチジルエタノールアミン類、ジステアロイル−ホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジアラキドイルホスファチジルセリンなどのホスファチジルセリン類、ホスファチジルグリセロール類、ホスファチジルイノシトール類、カルジオリピン類、スフィンゴミエリン類、及びジオクタノイルホスファチジルコリン、ポリエチレン−ポリプロピレングリコールなどの合成界面活性剤などが挙げられる。他の好適な安定剤としては、アカシア、アルブミン、アルギン酸、ベントナイト、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、シクロデキストリン類、モノステアリン酸グリセリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ケイ酸アルミウニムマグネシウム、プロピレングリコール、アルギン酸プロピレングリコール、アルギン酸ナトリウム、白ろう、キサンタンガム、及び黄ろうが挙げられる。好ましい実施態様として、上記薬剤はインスリンであり、上記安定剤は、１種以上の多糖類と、グリセロール、静菌剤、等張剤、レシチン類もしくは合成界面活性剤とを組み合わせたものとすることができる。
【００３５】
ＩＩ．  製剤の作製方法
医薬組成物は、上記活性化合物を医薬として使用可能な製剤に加工するのを容易にする添加剤及び助剤を含む１種以上の生理学的に許容可能な担体を用いる従来の方法で製剤化することができる。薬物の製剤化については、例えば、Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｅ．、  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９７５）、ならびにＬｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．およびＬａｃｈｍａｎ，Ｌ．編  、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８０）において論じられている。適切な製剤化は、選択する投与経路によって決まる。
【００３６】
ＩＩＩ．製剤の使用方法
上記製剤は、種々の方法、例えば、注射、好ましくは皮下注射によって、又は経口、口腔、舌下、直腸、膣内、肺内もしくは眼内投与の場合のように粘膜表面へ局所的に投与することができる。皮下、口腔又は舌下が好ましい。投与後、こうした剤形は速やかに溶解して薬物を放出し、又は薬物を含み、必要に応じて１種以上の添加剤を含む小粒子を形成する。この製剤は、急速に吸収されて全身への送達のため血漿へ運ばれるように設計される。
【００３７】
好ましい実施態様として、この製剤は、医薬用として許容可能な液体担体及び１種以上の溶解補助剤を含有する液体希釈剤と粉末活性薬剤を混合することにより形成する。最も好ましい実施態様として、この活性薬剤はインスリンであり、上記希釈剤には生理食塩水又はグリセリン、ＥＤＴＡ及びクエン酸を含有させる。投与に先立って、これら粉末及び希釈剤を混合して注射用組成物を形成させる。
【００３８】
本発明は以下の限定されない実施例を参照することによってさらに理解されるだろう。
【実施例】
【００３９】
（実施例１）
上皮細胞多層からのインスリン吸収に対するＥＤＴＡの効果
目的：上皮細胞多層からのインスリン吸収に対する、クエン酸の存在下におけるＥＤＴＡの効果をインビトロで明らかにすること。
【００４０】
材料及び方法
１ｍｇ／ｍｌのインスリン、２ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡ及び２ｍｇ／ｍｌのクエン酸（「溶液１」）又は１ｍｇ／ｍｌのインスリン及び２ｍｇ／ｍｌのクエン酸（「溶液２」）を含有する２種の生理食塩液を混合した。対照（細胞なし）はＥＤＴＡ、クエン酸及びインスリンを含有した。トランスウェルプレートに不死化ヒト上皮細胞培養株を接種した（図２）。細胞を集密となるまで増殖させ、経上皮抵抗性を用いて膜統合性について試験した。０時間に、トランスウェルプレートの上室内の液を０．５ｍｌのインスリン溶液（即ち、溶液１又は溶液２）で置換した。溶液１の入ったプレート２枚、溶液２の入ったプレート２枚及び対照溶液（細胞なし）の入ったプレート１枚を同時に試験した。各プレートの下室には１．５ｍＬの生理食塩液を入れた。各時点で、下室から１００μＬの液を取り出し、インスリン酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で分析した。下室には、実験を通して１．５ｍＬの一定容量を維持するために、１００μＬの生理食塩水を添加した。各時点で下室から取り出したインスリンの量を前回（まで）の時点で取り出した量に加えて下室に回収されたインスリンの累積量を求めた。細胞は、実験の前後で染色して生存度を調べた。各プレートの細胞生存度に統計的な差は認められなかった。
【００４１】
結果
図３は上皮細胞を接種したトランスウェルプレートの下室における経時的（分）な平均インスリン蓄積量（μＵ）を示すグラフであり、ＥＤＴＡを含有するインスリン製剤（◆）の効果をＥＤＴＡ不含有の同製剤（■）及び細胞なしの対照（▲）と比較したものである。
【００４２】
ＥＤＴＡを含有する溶液１は、ＥＤＴＡ不含の溶液２よりも効果的に上記上皮細胞の多層中を移動した。従って、ＥＤＴＡとクエン酸の併用の効果は、吸収の速度及び量を増進することである。
【００４３】
（実施例２）
上皮細胞多層からのインスリンの吸収に対するアスパラギン酸及びクエン酸の効果
目的：ポリ酸が、細胞からの吸収の増加によって示されるような、ＥＤＴＡ含有インスリンに対する種々の親和性を有することを明らかにすること。
【００４４】
方法及び材料
トランスウェルプレートに接種した口腔上皮細胞を用い、実施例１に記載した様にして、
上記細胞多層からの吸収速度を求めた。インスリン（１ｍｇ／ｍｌ）をアスパラギン酸（０．２ｍｇ／ｍＬ）又はクエン酸（２ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、両者にＥＤＴＡ（２ｍｇ／ｍＬ）を添加した。クエン酸含有インスリン（ＥＤＴＡ不含）を対照とした。溶液のｐＨは約３．５〜４とし、生理食塩水を存在させることにより細胞の等張性環境を得た（ミクロスメット（Ｍｉｃｒｏｓｍｅｔｔｅ）（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）を用いた凝固点降下法による測定で２８０から３１０ｍＯｓｍの範囲を得るのに十分な０．８５％ＮａＣｌ）。試料は受液室から取って組換えヒトインスリン（μＵ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡ（Ｌｉｎｃｏ  Ｃｏｒｐ．）によりアッセイした。
【００４５】
結果：
細胞層からのインスリン／クエン酸吸収は、実施例２が示すように、ＥＤＴＡの添加によって増強された。しかしながら、アスパラギン酸は、図４が示すように、ＥＤＴＡの存在下でインスリン輸送を増強するのにさらに効力が強かった。
【００４６】
結論：ＥＤＴＡの存在下に各種ポリ酸は、恐らく荷電遮蔽の程度が異なるために、インスリンの吸収に対して種々の効果を示す。
【００４７】
（実施例３）
上皮細胞多層からのインスリン吸収に対するクエン酸、グルタミン酸、アジピン酸及びシュウ酸の効果の比較
材料及び方法
この実験には口腔上皮細胞を接種したトランスウェルプレートを用いた。ＥＤＴＡの効果はトランスウェルプレートの下室から得られるインスリンの量によってモニターした。
【００４８】
口腔上皮細胞は複数の（４〜５層の）細胞層が形成されるまで２週間トランスウェルインサートで増殖させた。輸送実験は、供液ウェルに上記の適切な溶液（全て１ｍｇ／ｍｌのヒトインスリンを含有させた）を添加し、１０分後に受液ウェルから試料を取り出すことにより行った。受液ウェル内のインスリン量はＥＬＩＳＡを用いて測定した。次の式を用いて見かけ透過率を算出した。見かけ透過率＝Ｑ／Ａ（Ｃ）ｔ（式中、Ｑ＝μｇ単位で表したインキュベーション時間中の総透過量、Ａ＝ｃｍ２単位で表したインサートの面積、Ｃ＝μｇ／ｃｍ３単位で表した供液ウェル内の初期濃度、及びｔ＝ｓｅｃ単位で表した全実験時間）。
【００４９】
ＥＤＴＡの濃度は全ての場合で０．４５ｍｇ／ｍＬとし、酸濃度は次の通りとする：クエン酸０．５７ｍｇ／ｍｌ、グルタミン酸０．７４ｍｇ／ｍＬ、アジピン酸０．４７ｍｇ／ｍＬ、シュウ酸０．３２ｍｇ／ｎＬ。溶液のｐＨはすべての場合で３．６とした。
【００５０】
結果
図５は、ＥＤＴＡを含有させた場合と含有させなかった場合で試験した各種有機ポリ酸による見かけ透過率の変化を示したものである。これらの結果から明らかなように、クエン酸及びグルタミン酸とした場合の酸／インスリンにＥＤＴＡを添加すると、インスリンの累積見かけ透過量が増加する。このことは全ての有機ポリ酸に当てはまるわけではなかった。アジピン酸及びシュウ酸はこのような反応を示さなかった。
【００５１】
（実施例４）
ラットに直腸内投与したポリマーゲルからのインスリンの吸収に対する酸の効果
目的：インビボモデルで酸及びＥＤＴＡの効果を観察すること。
【００５２】
材料及び方法
試料
ＰＶＡ（０．５％）、カルボポル（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（２．７％）、ＣＭＣ（０．００５％）及びＰＥＧ４００（０．１４％）、グリセリン（０．１４％）並びにＥＤＴＡ（０．００５％）からなるゲルをインスリン／アスパラギン酸又はインスリン／ＨＣｌと混合することによって、インスリンをこのゲル中に取り込ませた。インスリン／アスパラギン酸ゲル中のインスリンの最終濃度は０．７ｍｇ／ｇ、インスリン／ＨＣｌゲル中のインスリン濃度は１．７ｍｇ／ｇであった。
【００５３】
ラット直腸による実験
ラットを一夜絶食させ、温水浣腸で糞便を全て除去した。次いで、上記ゲル製剤を直腸に挿入し、ラットの血糖を８時間にわたってモニターした。
【００５４】
結果：
結果は、アスパラギン酸及びＥＤＴＡ含有インスリンとＨＣｌ及びＥＤＴＡ含有インスリンとの比較で、ベースラインからのグルコース低下百分率として図６に示した。この結果から、ＨＣｌを含むインスリンと比較してアスパラギン酸を含むインスリンでは、グルコースの低下が有意に促進されることが分かる。
【００５５】
（実施例５）
糖尿病ミニブタにおけるＥＤＴＡ含有インスリンの吸収に対するＨＣｌとクエン酸の効果の比較
目的：ＥＤＴＡと併せてポリ酸又は有機酸と共にインスリンを注射した場合のグルコース反応の時期を調べること。
【００５６】
材料及び方法
前記解離後インスリンが速やかに作用するには酸の種類が重要であることをさらに明らかにするために、糖尿病ミニブタにおいてクエン酸とＨＣｌとの比較を行った。インスリン（０．９ｍｇ／ｍＬ）は、クエン酸（１．８ｍｇ／ｍＬ）、ＥＤＴＡ（１．８ｍｇ／ｍＬ）及び防腐剤としてのｍ−クレゾールを含有するｐＨ約４の澄明等張溶液として調製した。比較溶液は、クエン酸の代わりにＨＣｌ（０．００１Ｎ）を用い、ＮａＯＨでｐＨを約４に調整して同様の方法で調製した。
【００５７】
糖尿病ミニブタには実験の日は餌を与えず、上記ＨＣｌ製剤を用いて３回０．０８Ｕ／ｋｇを投与した。比較のために、上記クエン酸製剤をこの用量の場合で２回、０．１２５Ｕ／ｋｇの高用量で４回用いた。採血を行って８時間の実験期間にわたりインスリン及びグルコースを測定した。
【００５８】
結果：
図７に示した結果は、糖尿病ミニブタにインスリンを投与した後、最低のグルコース濃度（最下点）に達する時間を比較したものである。クエン酸製剤は、ＨＣｌを用いて作製した同一製剤よりも最下点に達するのが常に速かった。
【００５９】
（実施例６）
糖尿病患者へのインスリングラルギン及びＶｉａｊｅｔ（商標）の同時投与及び個別投与
材料及び方法
９名の患者（男性５名及び女性４名、年齢４０±１０歳、ボディマス指数（「ＢＭＩ」）２４．０±２．０ｋｇ／ｍ２）の血糖（「ＢＧ」）をグルコースクランプによって安定化させた（目標ＢＧ値１２０ｍｇ／ｄｌ）。投薬前に、このグルコース注入を止めた。投与を順不同に行うクロスオーバーデザインを用いて、同一患者に特異的な用量のＶｉａｊｅｔ（商標）及びランタスを食事の直前にｓ．ｃ．注射した。ある場合には、これらの薬剤を同じ注射で同時に投与した。別の場合には、同一用量の各インスリンを２回の注射で別々に投与した。血糖は８時間連続的にモニターし、ＢＧが６０ｍｇ／ｄｌ未満となった場合にはグルコース注入を再開した。血漿インスリン濃度については本実験を通して測定した。
【００６０】
結果：
図８には最初の３時間にわたる平均血糖値のデータを示した。最初の３時間は極めてよく似たプロフィルを示しているが、これは食事後のＶｉａｊｅｔ（商標）の即効作用に典型的なものである。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】荷電しているインスリンの3次元概略図である。
【図２】口腔上皮細胞をとおしてのインスリン吸収を測定するために用いるトランスウェル装置の略図である。
【図３】上皮細胞を接種したトランスウェルメンブランプレートの下室における経時的（分）な平均インスリン蓄積量（μＵ）を示すグラフであり、ＥＤＴＡを含有するインスリン製剤（◆）の効果をＥＤＴＡ不含の同製剤（■）及び細胞なしの対照（▲）と比較したものである。
【図４】ＥＤＴＡ含有及び不含のクエン酸試料について分単位で表した経時的累積インスリン（Ｕ）をＥＤＴＡ含有アスパラギン酸試料の場合と対比して示したグラフである。
【図５】クエン酸、グルタミン酸、アジピン酸及びシュウ酸を含有する各試料についてＥＤＴＡ含有（中実部）及び不含（斜線部）インスリンのインスリン見かけ透過度を分単位で経時的に示したグラフである。
【図６】アスパラギン酸及びＥＤＴＡをともなうインスリンとＨＣｌ及びＥＤＴＡをともなうインスリンとを比較した、ラットにおけるベースラインからのグルコース低下百分率を分単位で経時的に示したグラフである。
【図７】ＥＤＴＡ及びクエン酸をともなうインスリンとＥＤＴＡ及びＨＣｌをともなうインスリンとの比較で、ミニブタにおける平均グルコース濃度を経時的に示したグラフである。
【図８】インスリングラルギン（ランタス（登録商標））及びＶＩＡｊｅｃｔを個別に（２回注射）又は１回の注射で組合わせて同時に投与したヒト臨床試験からの経時的（時間）な連続的血糖値のグラフである。
【図１】
2009533471.tif 000002
【図２】
2009533471.tif 000003
【図３】
2009533471.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年12月2日(2008.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
注射可能な製剤であって、以下
（ａ）  速効型インスリンまたは即効型インスリンを含み、
（ｂ）  長時間作用型インスリンを含み、そして
（ｃ）  患者によるインスリンの取り込みの速度または量を増加させるのに有効な量で、亜鉛キレート化剤および酸性化剤を含む注射可能な製剤であって、該製剤が、３．０と４．２の間のｐＨ、好ましくは３．８と４．１の間のｐＨを有する、製剤。
【請求項２】
即効型インスリンを長時間作用型インスリンと組み合わせで含む、請求項１の製剤。
【請求項３】
前記キレート化剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である請求項１の製剤。
【請求項４】
酸がクエン酸である、請求項３の製剤。
【請求項５】
前記酸性化剤が荷電化合物であり、そして前記キレート化剤および酸性化剤がインスリン上の荷電を遮蔽するのに有効な量で存在する、請求項１の製剤。
【請求項６】
前記酸性化剤がアスパラギン酸、グルタミン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、およびクエン酸からなる群から選ばれる酸である、請求項１の製剤。
【請求項７】
前記速効型インスリンが天然型ヒトインスリン、または組換え型ヒトインスリンである、請求項１の製剤。
【請求項８】
肺内投与に適した、請求項１の製剤。
【請求項９】
前記製剤が、患者に投与されることで特徴付けられる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１０】
請求項８に記載の製剤が、患者の肺領域に投与されることで特徴付けられる、請求項９に記載の製剤。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の製剤が、注射により投与されることで特徴づけられる、請求項９に記載の製剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に即効型および長時間作用型インスリン製剤を組み合わせた製剤に関するものである。
【０００２】
本願は、Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｓ．ＳｔｅｉｎｅｒおよびＲｏｄｅｒｉｋｅ  Ｐｏｈｌにより２００６年４月１２日に出願された米国特許第６０／７４４，６８７号（題名、“Ｒａｐｉｄ  Ａｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ａｃｔｉｎｇ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”）、Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｓ．ＳｔｅｉｎｅｒおよびＲｏｄｅｒｉｋｅ  Ｐｏｈｌにより２００６年９月２９日に出願された米国特許第１１／５３７，３３５号（題名、“Ｒａｐｉｄ  Ａｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  Ａｃｔｉｎｇ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ”）、およびＳｏｌｏｍｏｎ  Ｓ．ＳｔｅｉｎｅｒおよびＲｏｄｅｒｉｋｅ  Ｐｏｈｌにより２００７年４月２日に出願された米国特許第１１／６９５，５６２号（題名、“Ｒａｐｉｄ  Ａｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ａｃｔｉｎｇ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”）に対する優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病の集中的なインスリン療法は、理想的には２４時間にわたり血中に均一な濃度で存在する基礎インスリン、及び毎食に伴って消化により増加する炭水化物負荷をカバーするボーラス又は食事時間（食事時）インスリンを提供するものである。
【０００４】
１９３６年、Ｈａｎｓ  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ＨａｇｅｄｏｒｎとＢ．Ｎｏｒｍａｎ  Ｊｅｎｓｅｎは、カワマスの「魚精」すなわち精液から得られるプロタミンの添加によってインスリン注射の効果を延長することができることを発見した。この場合、インスリンは上記プロタミンに加えられ、得られた溶液はｐＨ７に調整して注射された。１９４６年、ノルディスク社（Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ）は、プロタミン及びインスリンの結晶を形成させるのに成功し、１９５０年、ＮＰＨ（中性プロタミン・ハゲドルン（Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ  Ｈａｇｅｄｏｒｎ)、「ＮＰＨ」）インスリンとして上市した。ＮＰＨインスリンには、これを作用発現のより速いインスリンと混合して持続性のより長い作用を与えることができるという利点がある。最終的には動物のインスリンは全て組換え型ヒトインスリンに切り替えられた。
【０００５】
ごく最近まで、また今日の多くの地域では、基礎インスリンは、通常、ＮＰＨインスリンを１２時間間隔の１日２回の用量で投与することにより供給されている。１日３回食事を摂り、ＮＰＨインスリンを基礎インスリンとして使用している患者では、１日当たり５回の注射、即ち、３度の食事のそれぞれで１回の注射及び朝１回と就寝時１回の２回のＮＰＨインスリン注射が必要となる。患者が打たねばならない注射の回数を減らすために、朝の用量のＮＰＨインスリンは、短時間作用型インスリン、（組換え型ヒトインスリン）又はリスプロなどの即効型インスリン類似体と組み合わせて用いられている。代表的な組合せは、７０％のＮＰＨ対３０％の即効型インスリン類似体の合剤である。その結果、患者は注射回数を日に５回から日に４回に減らすことができる。例えば、非特許文献１を参照されたい。
【０００６】
最近になって、「超長時間作用型」インスリン類似体であるインスリングラルギン（商品名ランタス（登録商標））が使用可能になった。これは注射後約１時間で血糖を低下させ始め、２４時間均等に作用し続ける。Ｊ．Ｒｏｓｅｎｓｔｏｃｋとその共同研究者らは、インスリングラルギンを打った患者はＮＰＨインスリンを打った患者よりも低血糖（低血糖症）になるリスクがはるかに低いことを見出した。
【０００７】
グラルギンは他の短時間作用型又は即効型インスリンと混合して用いることはできない。何故なら、その混合により注射の前にグラルギンが沈殿し、沈殿したインスリンを投与すると、既知の確実な用量を投与することが事実上不可能になるからである。グラルギンの製造業者はユーザーに対し、グラルギンを如何なる他のインスリンとも混合しないよう警告している。
【０００８】
従って、本発明の目的は、毎日の注射回数を3回に減らすために用いることができるインスリン製剤を提供することにある。
【０００９】
本発明の別の目的は、基礎/ボーラスインスリン製剤を提供することにある。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、即時及び長時間放出性を有する安定なインスリン製剤を提供することにある。
【非特許文献１】Ｇａｒｂｅｒ，  Ｄｒｕｇｓ  ６６（１）：ｐ．３１−４９  （２００６）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の要旨
速効型又は即効型／長時間作用型組合せインスリン製剤であって、速効型又は即効型インスリンのｐＨを調整して、即効型及び長時間作用型インスリンがいずれも、混合された場合に可溶性のままであるようにしたインスリン製剤を開発した。好ましい実施態様に含まれるのは、低ｐＨで任意の中時間、長時間又は超長時間作用型インスリンと混合した任意の超即効型、即効型又は速効型インスリン製剤である。別の実施態様として、任意の超即効型、即効型又は速効型インスリンをキレート化剤の存在下に低ｐＨで任意の中時間、長時間又は超長時間作用型インスリンと混合することができる。最も好ましい実施態様として、血中インスリン濃度の急激な初期スパイクを生じさせて食事の消化により吸収されている炭水化物をカバーし、血中基礎インスリン濃度の持続を継続させるために、ＶＩＡｊｅｃｔ（商標）（超即効型インスリン）をｐＨ４でインスリングラルギンと混合する。
【００１２】
注射用基礎ボーラスインスリン製剤を朝食前に即効型又は超即効型インスリンと同時投与すると、その食事をカバーするのに適切なインスリンのボーラス濃度が達成され、食後に低血糖が起こらず、２４時間適切な基礎インスリン濃度が得られる。昼食及び夕食は、速効型もしくは即効型又は超即効型インスリンの２回のボーラス注射によってカバーすることができる。以上の結果、集中的なインスリン療法を用いる患者は、１日当たり４回ではなく、３回注射するだけということになる。
【００１３】
六量体インスリンにアスパラギン酸、グルタミン酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸などの特定の酸を加えて吸収の速度及び量を高め、二量体／単量体への解離後に生物活性を維持させることの重要性を証明する実験を行った。これらはキレート化剤、好ましくはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）とともに添加する。多価酸はその分子の大きさ及び構造に基づき選択してインスリン表面の水素結合部位との会合を最適化し、原料（天然型インスリン、組換え型インスリン、長時間作用型インスリン、ブタインスリン、ウシインスリン、インスリン誘導体及びこれらの類似体など）とは無関係に荷電アミノ酸残基を効果的に遮蔽した（図１）。これらの酸は最適な荷電遮蔽効果が得られる濃度で用いた（実施例に示したように、好ましい酸はアスパラギン酸、グルタミン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸及びクエン酸である）。上記インスリン製剤にこうした好ましい酸とキレート化剤を共に混合することがインスリンの速やかな吸収に関与するものと思われる。ＥＤＴＡは全ての酸で有効というわけではなかった。アジピン酸、シュウ酸又はＨＣｌと共に用いると、インスリンの吸収速度に明らかな増加は認められなかった。以上の研究は、インビトロ（ヒト口腔上皮細胞）並びにインビボ（ラット、ブタ及びヒト）での検討の両者において酸とキレート化剤の重要性を立証するものである。これらの知見は、（クエン酸及びＥＤＴＡと組み合わせた）超即効型インスリン並びに基礎インスリングラルギンで治療した糖尿病患者で認められた結果を裏付けるものである。
【００１４】
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）  中時間作用型又は長時間作用型インスリンとの組合せで速効型、即効型又は超即効型インスリンを含む組成物であって、該組成物のｐＨが該長時間作用型インスリンを可溶化するように調整される組成物。
（項目２）  インスリングラルギンを含む請求項１の組成物。
（項目３）  さらに即効型インスリンを含む請求項１の組成物。
（項目４）  さらに中時間作用型インスリンを含む請求項１の組成物。
（項目５）  ３．０〜４．２のｐＨを有する請求項１の組成物。
（項目６）  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジメルカプロール（ＢＡＬ）、ペニシラミン、アルギン酸、クロレラ、シラントロ、アルファリポ酸、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ジメルカプトプロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）及びシュウ酸からなる群から選ばれるキレート化剤を含む請求項１の組成物。
（項目７）  前記キレート化剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である請求項６の組成物。
（項目８）  アスパラギン酸、グルタミン酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸及びクエン酸からなる群から選ばれる酸を含む請求項１の組成物。
（項目９）  即効型インスリン、長時間作用型インスリン及びこれらの組合せからなる群から選ばれるインスリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸又はクエン酸からなる群から選ばれる酸、インスリン、並びにキレート化剤を含むインスリン製剤。
（項目１０）  ＥＤＴＡを含む請求項９の製剤。
（項目１１）  クエン酸を含む請求項９の製剤。
（項目１２）  即効型インスリンを１：２：２の比率で含む請求項９の製剤。
（項目１３）  前記インスリンが天然型ヒトインスリン、組換え型ヒトインスリン、ブタインスリン、ウシインスリン、ヒトインスリン誘導体、又はヒトへの投与に適したヒトインスリン類似体である請求項９の製剤。
（項目１４）  請求項１〜１３のいずれかの組成物を個体に投与することを含む、患者をインスリンで治療する方法。
（項目１５）  前記インスリンが注射によって投与される請求項１４の方法。
（項目１６）  前記インスリンが舌下、経口、基礎、口腔、直腸又は膣内投与用の製剤の形である請求項１４の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
Ｉ．  組成物
Ａ．  インスリン
本組成物は、速効型、即効型又は超即効型インスリン及び中時間又は長時間作用型インスリンを含む。その即効型インスリンは、長時間作用型インスリンが、これらを混合した場合に長時間作用型インスリンに対する即効型インスリンの比率の広い範囲にわたっても沈殿しないような低いｐＨで供給される。
【００１６】
糖尿病患者にはいく種類かの異なる市販インシュリンが入手可能である。こうした種類のインスリンは、（１）これらが血流に到達して血中グルコース濃度を低下させ始めるのにどのくらいの時間がかかるか、（２）このインスリンがどのくらいの時間最大の強さで作用するか、及び（３）このインスリンが血糖に対する効果をどのくらいの時間示し続けるか、によって異なる。
【００１７】
速効型インスリン
速効型インスリンは、食事時の炭水化物の摂取に由来するグルコースに対して反応させるためのものである。速効型インスリンは１〜２０分以内に作用し始め、約１時間後にピークに達し、３〜５時間持続する。速効型インスリンは、全身循環に完全に吸収されるのに約２時間かかる。速効型インスリンとしては、組換え型ヒトレギュラーインシュリン（リリー（Ｌｉｌｌｙ）より上市のヒュームリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ）（登録商標）、ノボノルディスク（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ）より上市のノバリン（Ｎｏｖａｌｉｎ）（登録商標）など）が挙げられ、これらはｐＨ７の等張溶液として投与される。ヒトインスリンに対して数個のアミノ酸が異なるが、ヒトにおいて活性のあるウシ及びブタインスリンも速効型インスリンである。
【００１８】
即効型インスリン
糖尿病患者の中には食事時には即効型インスリン、「バックグラウンド」の持続性インスリン用には長時間作用型インスリンを使用する者がいる。このグループには、吸収速度を高めるために修飾され、又はアミノ酸の位置が変更されたインスリンが含まれる。
【００１９】
現在、３種類の市販即効型インスリン類似体、即ち、リスプロインスリン（ヒューマログ（ＨＵＭＡＬＯＧ）（登録商標）としてイーライリリー（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）から市販のリジン／プロリンインスリン）、グルリジンインスリン（アピドラ（ＡＰＩＤＲＡ）（登録商標）としてサノフィ−アベンティス（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）から市販）及びアスパルトインスリン（ノボログ（ＮＯＶＯＬＯＧ）としてノボノルディスクより発売）が入手可能である。
【００２０】
超即効型インスリン
ビオデル（Ｂｉｏｄｅｌ）社は、上記即効型インスリン類似体よりもさらにより即効性であるヒトレギュラーインスリンの独自開発インスリン製剤ＶＩＡＪＥＣＴ（商標）を持っている。これは、ＥＤＴＡ及びクエン酸とヒトレギュラーインスリンを組み合わせたｐＨ４の製剤である。
【００２１】
中時間作用型インスリン
中時間作用型インスリンは、短時間作用型インスリンよりも寿命が長いが、作用の開始がより遅く、最大の強度に達するのにより時間がかかる。通常、中時間作用型インスリンは注射後２〜４時間以内に作用し始め、４〜１４時間の間でピークに達し、２４時間まで有効性が存続する。中時間作用型インスリンの種類としては、ＮＰＨ（Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ  Ｈａｇｅｄｏｒｎ（中性プロタミン・ハゲドルン））及びＬＥＮＴＥインスリンが挙げられる。ＮＰＨインスリンは、吸収速度を低下させることによってインスリンが血流に達するのにより時間がかかり、ピーク及び寿命が長くなるようにするプロタミンを含有している。中時間作用型インスリンには、１日当たりの総注射回数を減らすために、中性ｐＨで即効型インスリンを混合することができる。
【００２２】
長時間作用型インスリン
ＬＡＮＴＵＳ（商標）（インスリングラルギン）は、最長２４時間の持続時間を示し得る組換え型ヒトインスリン類似体である。これは、２１番目の位置のアスパラギンの代わりにグリシンを有し、ベータ鎖のカルボキシ末端に２個のアルギニンが付加されていることで、ヒトインスリンと異なる。ＬＡＮＴＵＳ（商標）は澄明な液体に溶解されているインスリングラルギン（インスリン１００ＩＵ、３．６３７８ｍｇ、亜鉛３０マイクログラム、ｍ−クレゾール２．７ｍｇ、８５％グリセロール２０ｍｇに水を加えて１ｍｌとしたもの）からなる。そのｐＨはＨＣｌで４に調整されている。
【００２３】
注射と薬理効果の終点との間の時間の中央値は、注射後最大２４時間である。この注射と薬理効果の終点との間の時間の中央値は、インスリングラルギンでは２４時間、ＮＰＨヒトインスリンでは１４．５時間であった。
【００２４】
添付文書には、多くの即効型及び中時間作用型インスリンと異なり、ＬＡＮＴＵＳ（商標）を如何なる他の種類のインスリンとも、混合時に沈殿を生じるため、混合しないようにと記載されている。
【００２５】
インスリングラルギンの場合、Ｖｉａｊｅｃｔ（商標）と混合しても、これがインスリングラルギンと一致してｐＨ４であるので、沈殿が形成されない。詰まるところ、この組合せによって超即効型インスリンが供給されて患者はボーラスインスリンを少なくした食事により支えられる。というのは、超即効型インスリンが極めて速やかに吸収され、食事の消化後すぐに除去されることで、低血糖の起きる確率が減少し、２４時間持続性基礎インスリンが供給されるからである。これにより、最終的に、１日当たり必要な注射回数は４回から３回へ減少する。
【００２６】
Ｂ．  酸安定剤およびキレート化剤
酸安定剤
六量体結晶インスリンを効果的に可溶化する酸は、その分子の大きさ及びｐＫａに基づいて選択され、単量体又は二量体へ解離するときに暴露されるインスリン分子上の荷電（図１）を遮蔽するのに最も効果的であると予測される。特定の酸は、生物活性を保護し、効果的に遮蔽をかけ、六量体インスリンの単量体への解離後の吸収速度を増加させる。
実施例は、インビトロ（ヒト口腔上皮細胞）並びにインビボ（ラット、ブタ及びヒト）の両者においてこの酸の重要性を立証するものである。レギュラーヒトインスリン（ヒュームリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ）（登録商標）Ｒ）は、ＨＣｌで可溶化し、生理的ｐＨで製剤化される。このインスリンの薬理学的プロフィールから、このインスリンはあまり速やかに吸収されず、投与後約２時間にピークインスリン濃度を示すことが分かる。
【００２７】
好ましい酸は「多酸性」であり、即ち、複数の酸性残基を有する。好ましい多酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸及びクエン酸が挙げられる。有用な濃度範囲は、インスリンを０．５〜４ｍｇ／ｍｌ含有する溶液の場合、酸が０．１〜３ｍｇ／ｍｌである。ｐＨの範囲は３．０〜４．２であるが、好ましい範囲は３．８〜４．１である。これらの酸は、任意の即効型インスリンと併用してｐＨを下げ、ランタスとの混合後これらを可溶性にすることができる。
【００２８】
キレート化剤
好ましい実施態様として、キレート化剤を上記活性薬剤と混合する。また、このキレート化剤は、キレート化における本来の役割の他に、インスリンと水素結合することによってその荷電を遮蔽しインスリンの吸収を促進すると考えられている。キレート化剤によってインスリンから亜鉛が引き離されることにより、皮下組織（例えば、粘膜又は脂肪組織）への注射後、インスリンの四量体より単量体の方が有利になると考えられている。これにより、インスリンを単量体に維持することでその吸収が容易になる。その上、キレート化剤は、インスリン分子の暴露された表面荷電を覆い隠し、又は荷電遮蔽することで、さらに吸収を促進する。
【００２９】
キレート化剤はイオン性であっても非イオン性であってもよい。好適なキレート化剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、ジメルカプロール（ＢＡＬ）、ペニシラミン、アルギン酸、クロレラ、シラントロ、アルファリポ酸、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ジメルカプトプロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）及びシュウ酸が挙げられる。好ましい実施態様として、キレート化剤はＥＤＴＡである。イオンは、活性薬剤の一部であっても、安定剤に添加しても、キレート化剤に混合しても、及び／又はコーティングに含ませてもよい。代表的なイオンとしては、亜鉛、カルシウム、鉄、マンガン、マグネシウム、アルミニウム、コバルト、銅、又は任意の二価金属もしくは遷移金属イオンが挙げられる。Ｚｎ＋２はＣａ＋２よりもＥＤＴＡに対する結合選択性が強い。
【００３０】
Ｃ．製剤
上記の活性化合物類又はこれらの医薬として許容可能な塩は、活性化合物（類）が１種以上の医薬用として許容可能な担体、添加剤又は希釈剤と混合又は混和されている医薬組成物として投与することができる。好ましい実施態様として、インスリンは注射によって投与する。あるいは、上記組成物を経口、口腔、舌下、膣内、直腸又は鼻腔内投与によって投与することができる。
【００３１】
液剤
液剤は注射（ｓ．ｃ．、ｉ．ｍ．、ｉ．ｐ．）してもよいし、鼻腔内、舌下、膣内又は口腔投与では噴霧してもよい。注射用製剤は通常、滅菌水、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水又はグリセリンに懸濁する。他の好適な医薬用として許容可能な物質類も知られている。これらは通常、使用直前の凍結乾燥又は乾燥されたインスリンに加えるが、使用に先立って加えておいてもよい。溶解補助剤としては、ポリソルベート類、ポロキサマー類などの湿潤剤、非イオン性及びイオン性界面活性剤、食用酸及び塩基（例えば、重炭酸ナトリウム）、アルコール、並びにｐＨ調節用緩衝酸又は塩が挙げられる。図８には、Ｖｉａｊｅｃｔとインスリングラルギンの注射用合剤に関するヒト臨床試験のデータを示した。
【００３２】
固形剤
固形もしくは半固形ゲルをｓ．ｃ．注射用に製剤化（注射可能な低粘度ゲル）してもよいし、デュアル作用型インスリンの口腔、舌下、経口、直腸もしくは膣内投与用にフィルム状に乾燥させてもよい。これらは、イオン及び／又は共有結合によってゲル化又は固化する１種以上の親水性ポリマーを溶液に混合することで形成させることができる。好適な材料としては、デンプン、α化デンプン、ゼラチン、糖類（スクロース、グルコース、デキストロース、ラクトース、ソルビトールなど）、キトサン類（各種構造のもの）デキストリン、マルトデキストリン、ポリエチレングリコール、ワックス類、アカシア、グアーガム、トラガカント、アルギン酸塩、アルギン酸ナトリウムなどの天然及び合成ゴム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシルエチルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロースなどのセルロース類、ヴィーガム、Ｉ型水添植物油、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、並びにアクリル酸及びメタクリル酸コポリマー、カルボマー、メタクリル酸コポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリアクリル酸／ポリメタクリル酸、ポリビニルピロリドンなどの合成ポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一定の親水性を得るのに十分な混合又は共重合の実施は、これらの材料の湿潤度及び粘膜付着性を改善するのに役立ち得る。例えば、単量体の約５％〜約２０％は親水性単量体である。ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）などの親水性ポリマーは、この目的によく用いられる。好ましくは、これらのポリマーは生体侵食性であり、好ましい分子量は１，０００〜１５，０００Ｄａ、最も好ましくは２，０００〜５，０００Ｄａの範囲である。また、これらは、モノステアリン酸エチレングリコール、ミリスチン酸プロピレングリコール、モノステアリン酸グリセリル、ステアリン酸グリセリル、ポリグリセリル−４−オレアート、ソルビタンアシレート、スクロースアシレート、ラウリン酸ＰＥＧ−１５０、モノラウリン酸ＰＥＧ−４００、モノラウリン酸ポリオキシエチレン、ポリソルベート類、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ＰＥＧ−１０００セチルエーテル、ポリオキシエチレントリデシルエーテル、ポリプロピレングリコールブチルエーテル、ポロキサマ（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）（登録商標）４０１、ステアロイルモノイソプロパノールアミド、ポリオキシエチレン水添牛脂アミドなどの非イオン性ポリマーとすることができる。両性界面活性剤の例としては、Ｎ−ドデシル−β−アラニンナトリウム、Ｎ−ラウリル−β−イミノジプロピオネートナトリウム、ミリストアンホアセテート、ラウリルベタイン及びラウリルスルホベタインが挙げられる。
【００３３】
一実施態様として、製剤は、ポリビニルアルコール、グリセリン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、キトサン、必要に応じてポリエチレングリコールなどの添加剤及び水を含有する舌下投与用固形製剤である。この組成物は、透明又は不透明で軟質の薄い材質の形とすることができる。典型的な厚さは０．０１〜４ｍｍの範囲である。このフィルムは、円形、長円形、長方形又は正方形を含む任意の適切な形状を有することができる。このフィルムは、単層、二層又は三層フィルムとすることができる。好ましい実施態様として、このフィルムは舌下投与に適するように設計される。単層フィルムは、活性薬剤と１種以上の添加剤を含有する。二層フィルムは、第一の層に溶解補助剤及び／又は金属キレート化剤などの添加剤を１種以上、第二層に活性薬剤を含有する。この構造により、活性薬剤を添加剤から分離して保存することが可能となり、活性薬剤の安定性を高めることができ、必要であれば、添加剤と活性薬剤が単一層に含有される場合に比し、組成物の貯蔵安定性が高められる。三層フィルムは、３層のフィルムを有する。各層は異なったものとすることができ、或いは、最下層と最上層などの２層を実質的に同一の組成物を有するものとすることができる。一実施態様として、最下層と最上層に、活性薬剤を含有するコア層を囲ませる。最下層と最上層には、溶解補助剤、金属キレート化剤などの１種以上の添加剤を含ませることができる。最下層と最上層は同一の組成物を有することが好ましい。あるいは、最下層と最上層に、異なる添加剤、又は異なる量の同一添加剤を含有させることができる。コア層には、通常、インスリンを、必要に応じて１種以上の添加剤と共に含有させる。一実施態様として、上記フィルムは、１つの層にＥＤＴＡ及びクエン酸、別の層にインスリンを含有する二層フィルムである。各層には、グリセリン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、必要に応じて（ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１６００などの）ＰＥＧなどの追加の添加剤を含有させることができる。一実施態様として、インスリン層とその他の成分を含有する層との間に第３の層を配置して保存時に活性薬剤を他の層にある分解成分からさらに保護することができる。この保護層の好適な材料としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルナウバろう、酢酸フタル酸セルロース、セチルアルコール、粉砂糖、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、液状グルコース、マルトデキストリン、メチルセルロース、ミクロクリスタンワックス、ポリメタクリル酸エステル類、ポリビニルアルコール、セラック、スクロース、タルク、二酸化チタン、及びゼインが挙げられる。上記添加剤の組成を変えることによって、所望の吸収プロフィル及びその後の効果を達成するためすみやかに（３０秒未満で）又はゆっくりと（最大１５分で）溶解するようにフィルムを設計することができる。フィルムは、３〜５分、５〜８分又は８〜１５分の範囲の時間で溶解させることができる。好ましくは、このフィルムは２〜１０分の範囲の時間で溶解させる。
【００３４】
多くの着色剤及び香味料が市販されている。香味料としては、ミント、レモン、チェリー、バブルガム及び他の標準的な香味料が挙げられる。インスリン投与用に特に有利である非グルコース甘味料などの甘味料を添加することができる。着色剤は赤、青、緑、黄、橙黄などの標準的なＦＤＣ承認の色素とすることができる。
【００３５】
安定剤は、例えば酸化反応を含む薬物分解反応を抑制又は遅延させるために用いられる。多くの安定剤を用いることができる。好適な安定剤としては、セルロース、セルロース誘導体などの多糖類、グリセロールなどの単純アルコール類、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベンなどの静菌剤、塩化ナトリウム、グリセロール、グルコースなどの等張剤、天然レシチン（例えば、卵黄レシチン又は大豆レシチン）、合成又は半合成レシチン（例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、又はジステアロイル−ホスファチジルコリン）などのレシチン類、ホスファチジン酸類、ホスファチジルエタノールアミン類、ジステアロイル−ホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジアラキドイルホスファチジルセリンなどのホスファチジルセリン類、ホスファチジルグリセロール類、ホスファチジルイノシトール類、カルジオリピン類、スフィンゴミエリン類、及びジオクタノイルホスファチジルコリン、ポリエチレン−ポリプロピレングリコールなどの合成界面活性剤などが挙げられる。他の好適な安定剤としては、アカシア、アルブミン、アルギン酸、ベントナイト、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、シクロデキストリン類、モノステアリン酸グリセリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ケイ酸アルミウニムマグネシウム、プロピレングリコール、アルギン酸プロピレングリコール、アルギン酸ナトリウム、白ろう、キサンタンガム、及び黄ろうが挙げられる。好ましい実施態様として、上記薬剤はインスリンであり、上記安定剤は、１種以上の多糖類と、グリセロール、静菌剤、等張剤、レシチン類もしくは合成界面活性剤とを組み合わせたものとすることができる。
【００３６】
ＩＩ．  製剤の作製方法
医薬組成物は、上記活性化合物を医薬として使用可能な製剤に加工するのを容易にする添加剤及び助剤を含む１種以上の生理学的に許容可能な担体を用いる従来の方法で製剤化することができる。薬物の製剤化については、例えば、Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｅ．、  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９７５）、ならびにＬｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．およびＬａｃｈｍａｎ，Ｌ．編  、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８０）において論じられている。適切な製剤化は、選択する投与経路によって決まる。
【００３７】
ＩＩＩ．製剤の使用方法
上記製剤は、種々の方法、例えば、注射、好ましくは皮下注射によって、又は経口、口腔、舌下、直腸、膣内、肺内もしくは眼内投与の場合のように粘膜表面へ局所的に投与することができる。皮下、口腔又は舌下が好ましい。投与後、こうした剤形は速やかに溶解して薬物を放出し、又は薬物を含み、必要に応じて１種以上の添加剤を含む小粒子を形成する。この製剤は、急速に吸収されて全身への送達のため血漿へ運ばれるように設計される。
【００３８】
好ましい実施態様として、この製剤は、医薬用として許容可能な液体担体及び１種以上の溶解補助剤を含有する液体希釈剤と粉末活性薬剤を混合することにより形成する。最も好ましい実施態様として、この活性薬剤はインスリンであり、上記希釈剤には生理食塩水又はグリセリン、ＥＤＴＡ及びクエン酸を含有させる。投与に先立って、これら粉末及び希釈剤を混合して注射用組成物を形成させる。
【００３９】
本発明は以下の限定されない実施例を参照することによってさらに理解されるだろう。
【実施例】
【００４０】
（実施例１）
上皮細胞多層からのインスリン吸収に対するＥＤＴＡの効果
目的：上皮細胞多層からのインスリン吸収に対する、クエン酸の存在下におけるＥＤＴＡの効果をインビトロで明らかにすること。
【００４１】
材料及び方法
１ｍｇ／ｍｌのインスリン、２ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡ及び２ｍｇ／ｍｌのクエン酸（「溶液１」）又は１ｍｇ／ｍｌのインスリン及び２ｍｇ／ｍｌのクエン酸（「溶液２」）を含有する２種の生理食塩液を混合した。対照（細胞なし）はＥＤＴＡ、クエン酸及びインスリンを含有した。トランスウェルプレートに不死化ヒト上皮細胞培養株を接種した（図２）。細胞を集密となるまで増殖させ、経上皮抵抗性を用いて膜統合性について試験した。０時間に、トランスウェルプレートの上室内の液を０．５ｍｌのインスリン溶液（即ち、溶液１又は溶液２）で置換した。溶液１の入ったプレート２枚、溶液２の入ったプレート２枚及び対照溶液（細胞なし）の入ったプレート１枚を同時に試験した。各プレートの下室には１．５ｍＬの生理食塩液を入れた。各時点で、下室から１００μＬの液を取り出し、インスリン酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で分析した。下室には、実験を通して１．５ｍＬの一定容量を維持するために、１００μＬの生理食塩水を添加した。各時点で下室から取り出したインスリンの量を前回（まで）の時点で取り出した量に加えて下室に回収されたインスリンの累積量を求めた。細胞は、実験の前後で染色して生存度を調べた。各プレートの細胞生存度に統計的な差は認められなかった。
【００４２】
結果
図３は上皮細胞を接種したトランスウェルプレートの下室における経時的（分）な平均インスリン蓄積量（μＵ）を示すグラフであり、ＥＤＴＡを含有するインスリン製剤（◆）の効果をＥＤＴＡ不含有の同製剤（■）及び細胞なしの対照（▲）と比較したものである。
【００４３】
ＥＤＴＡを含有する溶液１は、ＥＤＴＡ不含の溶液２よりも効果的に上記上皮細胞の多層中を移動した。従って、ＥＤＴＡとクエン酸の併用の効果は、吸収の速度及び量を増進することである。
【００４４】
（実施例２）
上皮細胞多層からのインスリンの吸収に対するアスパラギン酸及びクエン酸の効果
目的：ポリ酸が、細胞からの吸収の増加によって示されるような、ＥＤＴＡ含有インスリンに対する種々の親和性を有することを明らかにすること。
【００４５】
方法及び材料
トランスウェルプレートに接種した口腔上皮細胞を用い、実施例１に記載した様にして、
上記細胞多層からの吸収速度を求めた。インスリン（１ｍｇ／ｍｌ）をアスパラギン酸（０．２ｍｇ／ｍＬ）又はクエン酸（２ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、両者にＥＤＴＡ（２ｍｇ／ｍＬ）を添加した。クエン酸含有インスリン（ＥＤＴＡ不含）を対照とした。溶液のｐＨは約３．５〜４とし、生理食塩水を存在させることにより細胞の等張性環境を得た（ミクロスメット（Ｍｉｃｒｏｓｍｅｔｔｅ）（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）を用いた凝固点降下法による測定で２８０から３１０ｍＯｓｍの範囲を得るのに十分な０．８５％ＮａＣｌ）。試料は受液室から取って組換えヒトインスリン（μＵ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡ（Ｌｉｎｃｏ  Ｃｏｒｐ．）によりアッセイした。
【００４６】
結果：
細胞層からのインスリン／クエン酸吸収は、実施例２が示すように、ＥＤＴＡの添加によって増強された。しかしながら、アスパラギン酸は、図４が示すように、ＥＤＴＡの存在下でインスリン輸送を増強するのにさらに効力が強かった。
【００４７】
結論：ＥＤＴＡの存在下に各種ポリ酸は、恐らく荷電遮蔽の程度が異なるために、インスリンの吸収に対して種々の効果を示す。
【００４８】
（実施例３）
上皮細胞多層からのインスリン吸収に対するクエン酸、グルタミン酸、アジピン酸及びシュウ酸の効果の比較
材料及び方法
この実験には口腔上皮細胞を接種したトランスウェルプレートを用いた。ＥＤＴＡの効果はトランスウェルプレートの下室から得られるインスリンの量によってモニターした。
【００４９】
口腔上皮細胞は複数の（４〜５層の）細胞層が形成されるまで２週間トランスウェルインサートで増殖させた。輸送実験は、供液ウェルに上記の適切な溶液（全て１ｍｇ／ｍｌのヒトインスリンを含有させた）を添加し、１０分後に受液ウェルから試料を取り出すことにより行った。受液ウェル内のインスリン量はＥＬＩＳＡを用いて測定した。次の式を用いて見かけ透過率を算出した。見かけ透過率＝Ｑ／Ａ（Ｃ）ｔ（式中、Ｑ＝μｇ単位で表したインキュベーション時間中の総透過量、Ａ＝ｃｍ２単位で表したインサートの面積、Ｃ＝μｇ／ｃｍ３単位で表した供液ウェル内の初期濃度、及びｔ＝ｓｅｃ単位で表した全実験時間）。
【００５０】
ＥＤＴＡの濃度は全ての場合で０．４５ｍｇ／ｍＬとし、酸濃度は次の通りとする：クエン酸０．５７ｍｇ／ｍｌ、グルタミン酸０．７４ｍｇ／ｍＬ、アジピン酸０．４７ｍｇ／ｍＬ、シュウ酸０．３２ｍｇ／ｎＬ。溶液のｐＨはすべての場合で３．６とした。
【００５１】
結果
図５は、ＥＤＴＡを含有させた場合と含有させなかった場合で試験した各種有機ポリ酸による見かけ透過率の変化を示したものである。これらの結果から明らかなように、クエン酸及びグルタミン酸とした場合の酸／インスリンにＥＤＴＡを添加すると、インスリンの累積見かけ透過量が増加する。このことは全ての有機ポリ酸に当てはまるわけではなかった。アジピン酸及びシュウ酸はこのような反応を示さなかった。
【００５２】
（実施例４）
ラットに直腸内投与したポリマーゲルからのインスリンの吸収に対する酸の効果
目的：インビボモデルで酸及びＥＤＴＡの効果を観察すること。
【００５３】
材料及び方法
試料
ＰＶＡ（０．５％）、カルボポル（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（２．７％）、ＣＭＣ（０．００５％）及びＰＥＧ４００（０．１４％）、グリセリン（０．１４％）並びにＥＤＴＡ（０．００５％）からなるゲルをインスリン／アスパラギン酸又はインスリン／ＨＣｌと混合することによって、インスリンをこのゲル中に取り込ませた。インスリン／アスパラギン酸ゲル中のインスリンの最終濃度は０．７ｍｇ／ｇ、インスリン／ＨＣｌゲル中のインスリン濃度は１．７ｍｇ／ｇであった。
【００５４】
ラット直腸による実験
ラットを一夜絶食させ、温水浣腸で糞便を全て除去した。次いで、上記ゲル製剤を直腸に挿入し、ラットの血糖を８時間にわたってモニターした。
【００５５】
結果：
結果は、アスパラギン酸及びＥＤＴＡ含有インスリンとＨＣｌ及びＥＤＴＡ含有インスリンとの比較で、ベースラインからのグルコース低下百分率として図６に示した。この結果から、ＨＣｌを含むインスリンと比較してアスパラギン酸を含むインスリンでは、グルコースの低下が有意に促進されることが分かる。
【００５６】
（実施例５）
糖尿病ミニブタにおけるＥＤＴＡ含有インスリンの吸収に対するＨＣｌとクエン酸の効果の比較
目的：ＥＤＴＡと併せてポリ酸又は有機酸と共にインスリンを注射した場合のグルコース反応の時期を調べること。
【００５７】
材料及び方法
前記解離後インスリンが速やかに作用するには酸の種類が重要であることをさらに明らかにするために、糖尿病ミニブタにおいてクエン酸とＨＣｌとの比較を行った。インスリン（０．９ｍｇ／ｍＬ）は、クエン酸（１．８ｍｇ／ｍＬ）、ＥＤＴＡ（１．８ｍｇ／ｍＬ）及び防腐剤としてのｍ−クレゾールを含有するｐＨ約４の澄明等張溶液として調製した。比較溶液は、クエン酸の代わりにＨＣｌ（０．００１Ｎ）を用い、ＮａＯＨでｐＨを約４に調整して同様の方法で調製した。
【００５８】
糖尿病ミニブタには実験の日は餌を与えず、上記ＨＣｌ製剤を用いて３回０．０８Ｕ／ｋｇを投与した。比較のために、上記クエン酸製剤をこの用量の場合で２回、０．１２５Ｕ／ｋｇの高用量で４回用いた。採血を行って８時間の実験期間にわたりインスリン及びグルコースを測定した。
【００５９】
結果：
図７に示した結果は、糖尿病ミニブタにインスリンを投与した後、最低のグルコース濃度（最下点）に達する時間を比較したものである。クエン酸製剤は、ＨＣｌを用いて作製した同一製剤よりも最下点に達するのが常に速かった。
【００６０】
（実施例６）
糖尿病患者へのインスリングラルギン及びＶｉａｊｅｔ（商標）の同時投与及び個別投与
材料及び方法
９名の患者（男性５名及び女性４名、年齢４０±１０歳、ボディマス指数（「ＢＭＩ」）２４．０±２．０ｋｇ／ｍ２）の血糖（「ＢＧ」）をグルコースクランプによって安定化させた（目標ＢＧ値１２０ｍｇ／ｄｌ）。投薬前に、このグルコース注入を止めた。投与を順不同に行うクロスオーバーデザインを用いて、同一患者に特異的な用量のＶｉａｊｅｔ（商標）及びランタスを食事の直前にｓ．ｃ．注射した。ある場合には、これらの薬剤を同じ注射で同時に投与した。別の場合には、同一用量の各インスリンを２回の注射で別々に投与した。血糖は８時間連続的にモニターし、ＢＧが６０ｍｇ／ｄｌ未満となった場合にはグルコース注入を再開した。血漿インスリン濃度については本実験を通して測定した。
【００６１】
結果：
図８には最初の３時間にわたる平均血糖値のデータを示した。最初の３時間は極めてよく似たプロフィルを示しているが、これは食事後のＶｉａｊｅｔ（商標）の即効作用に典型的なものである。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】荷電しているインスリンの3次元概略図である。
【図２】口腔上皮細胞をとおしてのインスリン吸収を測定するために用いるトランスウェル装置の略図である。
【図３】上皮細胞を接種したトランスウェルメンブランプレートの下室における経時的（分）な平均インスリン蓄積量（μＵ）を示すグラフであり、ＥＤＴＡを含有するインスリン製剤（◆）の効果をＥＤＴＡ不含の同製剤（■）及び細胞なしの対照（▲）と比較したものである。
【図４】ＥＤＴＡ含有及び不含のクエン酸試料について分単位で表した経時的累積インスリン（Ｕ）をＥＤＴＡ含有アスパラギン酸試料の場合と対比して示したグラフである。
【図５】クエン酸、グルタミン酸、アジピン酸及びシュウ酸を含有する各試料についてＥＤＴＡ含有（中実部）及び不含（斜線部）インスリンのインスリン見かけ透過度を分単位で経時的に示したグラフである。
【図６】アスパラギン酸及びＥＤＴＡをともなうインスリンとＨＣｌ及びＥＤＴＡをともなうインスリンとを比較した、ラットにおけるベースラインからのグルコース低下百分率を分単位で経時的に示したグラフである。
【図７】ＥＤＴＡ及びクエン酸をともなうインスリンとＥＤＴＡ及びＨＣｌをともなうインスリンとの比較で、ミニブタにおける平均グルコース濃度を経時的に示したグラフである。
【図８】インスリングラルギン（ランタス（登録商標））及びＶＩＡｊｅｃｔを個別に（２回注射）又は１回の注射で組合わせて同時に投与したヒト臨床試験からの経時的（時間）な連続的血糖値のグラフである。
【国際調査報告】
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