(57)【要約】自動配列決定システムと適合するアダプター配列による、ｍＲＮＡサンプルからｃＤＮＡライブラリーを作製するための高速処理用新規生化学プロトコールが提供される。提供される方法は、従来のｃＤＮＡライブラリー産生法に伴う３’バイアスを持たないｃＤＮＡライブラリーを産生する。ＤＮＡからＤＮＡライブラリーを産生するための新規方法も提供される。５’および３’末端に既知のアダプター配列を含む、得られる１本鎖ｃＤＮＡは、方向性情報を保持するので、ベクターまたは宿主細胞にクローンすることを要せずに、自動配列決定システムを用いて自動配列決定するのに好適である。2009508495.tif 000012
2009508495.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡからライブラリーを生成するための方法であって、
（ａ）前記ＲＮＡを断片化して断片化ＲＮＡを産生する工程；
（ｂ）前記断片化ＲＮＡに対し複数のプライマーをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズ・プライマーを形成する工程；
（ｃ）逆転写酵素によって前記ハイブリダイズ・プライマーを伸長させて、前記ＲＮＡから、５’末端に前記複数のプライマーを含む複数の、１本鎖ｃＤＮＡを形成する工程；
（ｄ）前記ｃＤＮＡの前記５’末端に、前記１本鎖ｃＤＮＡの５’末端に対して相補的な、オーバーハングした５’末端領域を含む、第１アダプターを連結し、前記ｃＤＮＡの３’末端に対して相補的な、オーバーハングした３’末端領域を含む第２アダプターを連結し、５’末端に第１アダプター、および３’末端に第２アダプターを含む１本鎖ｃＤＮＡを形成する工程；
（ｅ）前記１本鎖ｃＤＮＡを精製して、前記ｃＤＮＡライブラリーを形成する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記断片化工程が、サイズが２０塩基から１０ｋｂ塩基の間である断片化ＲＮＡを産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記断片化工程が、サイズが１００塩基から１０００塩基の間である断片化ＲＮＡを産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記断片化工程が、サイズが１５０ｂｐから５００ｂｐの断片化ＲＮＡを産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記断片化工程の後、前記断片化ＲＮＡをサイズ選択する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記サイズ選択工程が、１５０ｂｐから５００ｂｐの間のサイズのＲＮＡに関して濃縮することである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記伸長工程と前記連結工程との間に、ＲＮアーゼによって断片化ＲＮＡを消化する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記複数のプライマーが、既知の配列内容を有する一つ以上の非ランダムプライマー塩基を含むセミランダムプライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１アダプターが、１本鎖領域と、２本鎖領域とを含み、前記１本鎖領域が、ランダムな配列の中に既知の配列内容を有する一つ以上の非ランダムアダプター塩基を含むセミランダム１本鎖領域であり、前記非ランダムプライマー塩基が、前記非ランダムアダプター塩基に対し相補的である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数のプライマーがｘｎｎｘの配列を含み、前記第１アダプターの前記セミランダム１本鎖領域がｙｎｎｙの配列を含み、ｘとｙは相補的塩基であり、ｎがランダム塩基である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ｘｎｎｘがｔｎｎｔであり、ｙｎｎｙがａｎｎａである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プライマーが、ｔｎｎｔｎｎｎｎｎｎ（配列番号１）の配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１アダプター、または第２アダプターが、結合ペアの１メンバーをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記結合ペアが、ＦＬＡＧ／ＦＬＡＧ抗体、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、受容体／リガンド、抗原／抗体、受容体／リガンド、ポリＨＩＳ／ニッケル、タンパクＡ／抗体、およびその誘導体から成る群から選ばれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記精製工程が、前記結合ペアの１メンバーによって前記１本鎖ｃＤＮＡを精製することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記精製工程が、サイズ分画工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの非存在下で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記結合ペアの１メンバーがビオチンであり、前記精製工程が、ストレプトアビジン被覆固相支持体に、前記１本鎖ｃＤＮＡを結合させることによって実行される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１アダプターが、２本鎖の核酸を含み、前記結合ペアの１メンバーが、前記鎖の一方に付着する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２アダプターが、２本鎖の核酸を含み、前記結合ペアの１メンバーが、前記鎖の一方に付着する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記精製工程が、前記ｃＤＮＡを変性して、前記ｃＤＮＡにハイブリダイズされている任意の核酸を除去することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記変性工程が、前記ｃＤＮＡの５’および３’末端の第１および第２アダプターを変性する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記１本鎖ｃＤＮＡの、少なくとも部分的核酸配列を決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｃＤＮＡライブラリーに対しｃＤＮＡサブトラクションを実行する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＲＮＡが単一組織由来のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＲＮＡが、多数の組織、単一細胞、複数細胞、体液、単一生物体、複数生物体、環境サンプル、バイオフィルム、細菌、古細菌、真菌、植物、動物、ヒト、ウィルス、レトロウィルス、ファージ、寄生虫、腫瘍、腫瘍サンプル、または生物標本から成る群から選ばれる供給源由来のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＲＮＡが、同じ細胞周期の細胞由来のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１の方法によって産生される、増幅されない１本鎖ｃＤＮＡライブラリー。
【請求項２９】
請求項２８の方法によって産生される、サブトラクトされたｃＤＮＡライブラリー。
【請求項３０】
ＲＮＡからライブラリーを生成するための方法であって、
（ａ）前記ＲＮＡを断片化して断片化ＲＮＡを産生する工程；
（ｂ）アダプター配列を有する５’領域、および、前記断片化ＲＮＡに対してハイブリダイズさせる３’領域を含む複数のプライマーを、前記断片化ＲＮＡにハイブリダイズさせ、ハイブリダイズ・プライマーを形成する工程；
（ｃ）逆転写酵素によって前記ハイブリダイズ・プライマーを伸長させて、前記ＲＮＡから、５’末端に前記複数のプライマーを含む、複数の１本鎖ｃＤＮＡを形成する工程；
（ｄ）前記ｃＤＮＡの３’末端に対して相補的な、オーバーハングした３’末端領域を含む第２アダプターを連結し、３’末端にアダプターを含む１本鎖ｃＤＮＡを形成する工程；
（ｅ）前記１本鎖ｃＤＮＡを精製して、前記ｃＤＮＡライブラリーを生成する工程、
を含む、方法。
【請求項３１】
前記プライマーの前記３’領域が配列ｎｎｎｎｎｎを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記プライマーの前記３’領域が配列ｎｎｎｎｎｎｖを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記プライマーの前記３’領域が配列ｔｔｔｔｔｔｖを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記断片化工程が、サイズが２０塩基から１０ｋｂ塩基の間の断片化ＲＮＡを産生する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記断片化工程が、サイズが１００塩基から１０００塩基の間の断片化ＲＮＡを産生する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記断片化工程が、サイズが１５０ｂｐから５００ｂｐの間の断片化ＲＮＡを産生する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記断片化工程の後、前記断片化ＲＮＡをサイズ選択する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記サイズ選択工程が、１５０ｂｐから５００ｂｐの間のサイズのＲＮＡに関して濃縮する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＲＮＡが、ポリＡ  ＲＮＡに関して濃縮されているＲＮＡ集団である、請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
前記伸長工程と前記連結工程との間に、ＲＮアーゼによって断片化ＲＮＡを消化する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項４１】
前記プライマーまたは前記アダプターが、結合ペアの１メンバーをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記結合ペアが、ＦＬＡＧ／ＦＬＡＧ抗体、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、受容体／リガンド、抗原／抗体、受容体／リガンド、ポリＨＩＳ／ニッケル、タンパクＡ／抗体、およびその誘導体から成る群から選ばれる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記精製工程が、前記結合ペアの１メンバーによって前記１本鎖ｃＤＮＡを精製することを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記精製工程が、サイズ分画工程である、請求項３０に記載の方法。
【請求項４５】
前記方法が、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの非存在下で実行される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４６】
前記結合ペアの１メンバーがビオチンであり、前記精製工程が、前記１本鎖ｃＤＮＡをストレプトアビジン被覆固相支持体に結合させることによって実行される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記アダプターが、２本鎖の核酸を含み、前記結合ペアの１メンバーが、前記鎖の一方に付着する、請求項３０に記載の方法。
【請求項４８】
前記精製工程が、前記ｃＤＮＡを変性して、前記ｃＤＮＡにハイブリダイズされている任意の核酸を除去することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項４９】
前記変性工程が、前記ｃＤＮＡの３’末端においてアダプターを変性する、請求項３０に記載の方法。
【請求項５０】
前記１本鎖ｃＤＮＡの、少なくとも部分的核酸配列を決定する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項５１】
前記ｃＤＮＡライブラリーに対しｃＤＮＡサブトラクションを実行する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＲＮＡが単一組織由来のものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＲＮＡが、多数の組織、単一細胞、複数細胞、体液、単一生物体、複数生物体、環境サンプル、バイオフィルム、細菌、古細菌、真菌、植物、動物、ヒト、ウィルス、レトロウィルス、ファージ、寄生虫、腫瘍、腫瘍サンプル、または生物標本から成る群から選ばれる供給源由来のものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＲＮＡが、同じ細胞周期の細胞由来のものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項５５】
請求項３０に記載の方法によって産生される、増幅されない１本鎖ｃＤＮＡライブラリー。
【請求項５６】
請求項５５に記載の方法によって産生される、サブトラクトされたｃＤＮＡライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に分子生物学に関し、詳細には、ｃＤＮＡライブラリーおよびＤＮＡライブラリーの作製に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
配列決定による従来の転写物プロファイリング法は、全長ｃＤＮＡクローンのＳａｎｇｅｒ式配列決定法、および／または各ｍＲＮＡの５’末端または３’末端の小「タグ」の配列決定に限定される。これらの配列決定法は、手間がかかり、その広範な適用は、技術的制限によって阻まれている。
【０００３】
一般に、ｍＲＮＡの配列決定法は、ｃＤＮＡライブラリーの作製、およびｃＤＮＡライブラリーの挿入体の配列決定を含む。高速配列決定に好適な形でｃＤＮＡライブラリーを作製することは、いくつかの技術的に困難な工程を伴う、長い、退屈なプロセスである。要約すれば、細胞からｍＲＮＡを単離するための通常手順は、（１）細胞の破壊による細胞内容物の放出、（２）細胞からの全体ＲＮＡの単離、（３）抽出されたＲＮＡにオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを通過させることによるｍＲＮＡ集団の選択と、（４）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を用いてｃＤＮＡ第１鎖を合成することによるＲＮＡからのｃＤＮＡの合成、（５）ｃＤＮＡからの第２鎖の合成、すなわち、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）ｐｏｌ  Ｉクレノウ断片による２本鎖ｃＤＮＡの生成、（６）２本鎖ｃＤＮＡのベクターへのクローニング、および（７）宿主（例えば、細菌）に対するベクターのトランスフェクション、を必要とする。ＲＮＡが存在する全ての段階において、調製標本が、ＲＮＡを破壊する可能性のある、活性リボヌクレアーゼ酵素と接触することがないよう十分な注意が必要とされる。リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）酵素はきわめて安定であるので、ｍＲＮＡ調製標本の中にごく少量でも活性酵素が存在するならば、それは、ＲＮＡ分解のような問題を引き起こすことになる。ｃＤＮＡクローニング過程の目的は、遺伝子の全コード配列を含む「全長」ｃＤＮＡクローンを獲得することにあるのであるから、ｍＲＮＡの完全性を維持する手順を用いることはきわめて重要である。
【０００４】
ｃＤＮＡライブラリーの５’末端の低い抽出度は、従来技術に内在する限界であるが、いくつかの要因によってもたらされる。もっとも重要な要因の一つは、逆転写酵素による伸長過程におけるランダムな中断である。逆転写酵素が、ｍＲＮＡの３’から５’末端に向かって移動するにつれて、逆転写酵素の一定のパーセンテージがＲＮＡ鋳型から解離し、これが、ｃＤＮＡ合成の早すぎる停止を招く。もう一つの寄与要因は、逆転写酵素の、ｍＲＮＡ二次構造の複数の領域における休止、減速、または停止である。さらに、３’末端バイアスは、ｍＲＮＡの５’末端を分解によって除去する夾雑するＲＮアーゼによっても導入される。これらの要因の累積結果は、従来のｃＤＮＡライブラリーでは、ｍＲＮＡの３’末端の方が、５’末端に近い配列よりも、統計的により多く抽出される可能性が高いということになる。この３’バイアスは、長い転写物ではさらに強調される。なぜならば、転写物が長ければ長いほど、３’バイアス要因のそれぞれに対する感受性がより高くなるからである。
【０００５】
従来のｃＤＮＡライブラリー産生技術の、さらに別の欠点として、ライブラリーを増幅するためにクローニングベクターおよび宿主細胞を使用することが挙げられる。宿主ベクターの複製、および／または宿主細胞／ウィルスの増殖は、ｃＤＮＡ挿入体によって影響されることがあり、細菌またはウィルス性のｃＤＮＡライブラリーではある種の配列の抽出度が低くなる可能性がある。例えば、ｃＤＮＡが宿主細胞で複製される場合、長いｃＤＮＡ、および、多くの反復列または二次構造の可能性を持つｃＤＮＡは、再編成されたり、またはその抽出度が低くなることがある。さらに、ｃＤＮＡが致死性遺伝子をコードしている場合、宿主におけるその増殖が危うくなる可能性がある。さらに、ｃＤＮＡライブラリーが、大腸菌ｃＤＮＡライブラリーのような、一般的宿主細胞由来ものである場合、宿主細胞のＲＮＡが結果を汚染する可能性がある。全く宿主細胞を用いない方法は、この問題を回避することが可能である。
【０００６】
一般に、例えば、ウィルス、または小組織または細胞サンプルを用いる作業では、開始ＤＮＡまたはＲＮＡの利用可能な量はきわめて限定される（例えば、ナノグラムの桁である）。このような限定量の開始材料からＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを調製することはきわめて困難であり、現在用いられている方法では不可能ですらある場合がある。したがって、少量の開始核酸から高品質のＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを調製することを可能とする方法が従来技術において求められている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、開始ＲＮＡ（または、開始ＲＮＡ集団）を断片化すること、断片化された開始ＲＮＡにプライマーを付着させ、該ＲＮＡから１本鎖ｃＤＮＡを合成すること、および、この１本鎖ｃＤＮＡの両端にアダプター配列を連結することによって１本鎖ｃＤＮＡライブラリーを形成する新規方法を提供する。５’および３’末端に既知のアダプター配列を含む、得られる１本鎖ｃＤＮＡは、方向性情報を保持するので、ベクターまたは宿主細胞にクローンすることを要せずに、何らかの自動配列決定システム、例えば、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｒａｎｆｏｒｄ，コネチカット州によって開発された配列決定システムを用いて自動配列決定するのに好適である。
【０００８】
本発明の一実施態様は、開始ＲＮＡから１本鎖ＤＮＡライブラリー（例えば、ｃＤＮＡライブラリー）を生成するための方法を主題とする。この方法は、ＲＮＡを断片化して断片化ＲＮＡを産生する第１工程を含む。この断片化は、サイズが１００塩基と１０００塩基の間、例えば、１５０塩基から５００塩基の間のサイズを持つＲＮＡ断片を産生するように最適化されてもよい。ある最適工程では、公知の技術、例えば、ゲル電気泳動、またはクロマトグラフィーを用いて、ＲＮＡ断片をサイズ分画してもよい。このサイズ分画によって、１００から１０００塩基の間、または１５０から５００塩基の間のＲＮＡが産生されてもよい。
【０００９】
断片化後、断片化ＲＮＡは、該断片化ＲＮＡに対し複数部位において付着し、そこから伸長することが可能な複数のプライマーにハイブリダイズさせられる。このことは、第１プライマーが、そのハイブリダイゼーション領域にランダム配列を含み、かつ、そのようなプライマーの集団が、任意の配列にハイブリダイズすることが可能なメンバーを含むように選ばれている場合、可能となる。このハイブリダイズしたプライマーは、逆転写酵素によって伸長され、１本鎖ｃＤＮＡを形成する。１本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ）の合成後、このＲＮＡは、変性条件、ＮａＯＨ加水分解、熱処理、またはＲＮアーゼ処理によって除去されてもよい。ＲＮＡの除去後、第１ＤＮＡアダプターを、ｃＤＮＡの５’末端に連結させてもよい。好ましい実施態様では、第１アダプターは、２本鎖部分の外に、ｓｓｃＤＮＡの５’末端に対して相補的な、オーバーハングした（１本鎖の）５’末端領域を有する。さらに、１本鎖ｃＤＮＡの３’末端に対し相補的な、オーバーハングした３’末端領域を含む第２アダプターを、ｃＤＮＡの３’末端に連結させてもよい。
【００１０】
【化１】
2009508495.tif 000003
なお、注意すべきことは、ｃＤＮＡの５’末端における第１アダプターの連結が不要であることである。さらに、第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーは、非ランダム５’部分を組み込むように設計することも可能である。この非ランダム５’部分は、第１アダプターの配列を有してもよい（サンプルアダプターの配列については図２を参照）。結果として得られるいずれのｃＤＮＡも、既に５’末端に所望の配列を有すると考えられるので、５’末端に対する第１アダプターの追加の連結は不要である。
【００１１】
第１および第２アダプターは、ｃＤＮＡに対し同時に連結させてもよいし、あるいは、任意の時間順序で連結させてもよい。さらに、第１アダプター、第２アダプター、または両方とも、精製用として、結合ペアのメンバーを含んでもよい。結合ペアは、互いに特異的結合性を示す任意の二つの分子、例えば、ＦＬＡＧ／ＦＬＡＧ抗体、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、受容体／リガンド、抗原／抗体、受容体／リガンド、ポリＨＩＳ／ニッケル、タンパクＡ／抗体およびその誘導体であってもよい。結合ペアは、第１または第２アダプターのどちらか一方の鎖に付着させてもよい。さらにアダプターの両方の鎖が、結合ペアの同じメンバー（例えば、二つのビオチン）によって標識されてもよい。次に、第１および第２アダプターに連結される、１本鎖ｃＤＮＡが精製されてｃＤＮＡライブラリーを形成する。
【００１２】
ｓｓｃＤＮＡの精製は、ｃＤＮＡの方がアダプターまたはプライマーよりも長いので、サイズ分画によって実行してもよい。ｃＤＮＡが、結合ペアの一方のメンバー（例えば、後述のようにビオチン）に付着している場合、固相支持体に付着する結合ペアの第２メンバー（例えば、ストレプトアビジン、アビジンなど）を用いることによって精製することが可能である。
【００１３】
複数のプライマーは、既知の配列内容を持つ一つ以上の非ランダムプライマー塩基を含むセミランダムプライマーであってもよい。例えば、プライマーは１０塩基長であって、その内、第１塩基（５’末端から数えて）および第４塩基は既知の配列を持ち（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＵ）、その他の塩基（塩基２、３、および５〜１０）は、未知の配列を持ってもよい。好ましい一実施態様では、第１アダプターは、前記複数のプライマーの非ランダム塩基に対し相補的な１本鎖領域を含む（図１、アダプターＡを参照）。
【００１４】
複数のプライマーはさらに、セミランダムであって、非ランダム塩基が、あるサブセットの発現配列のメンバー、例えば、対象とする遺伝子ファミリーのメンバーに対して優先的に、または特異的にアニールするように設計されていてもよい。複数のプライマーはさらに、非ランダムであってもよい、すなわち、配列特異的であってもよい。プライマーが、特異的で、非ランダムな配列を有する場合、それらのプライマーは、得られるＤＮＡまたはｃＤＮＡを、特定の発現配列またはゲノム領域に、あるいは、関連発現配列またはゲノム領域の二つ以上のメンバーに偏向させる可能性がある。本発明の方法のいずれにおいても、オリゴヌクレオチドにおける任意のランダム塩基位置（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＵ）は、イノシン（Ｉ）、すなわち、一般塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＵのいずれともペアを形成することが可能な塩基によって占められてもよい。
【００１５】
ここに特許を請求する本発明の一利点は、ｃＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーが、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、クレノウ、ｐｏｌ  Ｉ）を用いることなく作製することが可能であるということである。すなわち、本法は、一つのポリメラーゼ、すなわち、逆転写酵素を用いるだけで実行が可能である。本発明のもう一つの利点は、ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーが、核酸の増幅工程なしに作製可能であるということである。
【００１６】
本発明はさらに、開示の方法によって産生される、増幅されない１本鎖ｃＤＮＡライブラリーを含む。さらに、本発明のライブラリーは、サブトラクション・ライブラリー、例えば、ｃＤＮＡサブトラクション・ライブラリーを産生するために使用してもよい。
【００１７】
必要であれば、ｓｓｃＤＮＡは、アダプターの連結後、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｐｏｌ  Ｉまたはクレノウポリメラーゼを加えることによって２本鎖としてもよい。本法ではこの工程は不要であるが、この工程を用いて、クローニング、またはその他の目的のために２本鎖ｃＤＮＡライブラリーを作製してもよい。
【００１８】
これらおよびその他の実施態様は、下記の詳細な説明において開示されるか、または下記の詳細な説明から明白であり、詳細な説明の中に含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
別様に定義しない限り、本明細書に使用される技術および科学用語は全て、本発明の関係する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実行には、本明細書に記載されるものと類似の、または等価的な、いくつかの方法および材料の使用が可能であるが、本明細書では、好ましい材料および方法が記載される。
【００２０】
本発明の方法は、既存のｃＤＮＡライブラリー産生法に優るいくつかの利益および利点を提供する。そのような利点として、（１）初期のｍＲＮＡ必要量の少ないこと（すなわち、５ｎｇから５００ｎｇ、典型的初回量は１０ｎｇから２００ｎｇ）、（２）従来のｃＤＮＡライブラリー産生法および配列決定法に比べ３’バイアスが排除されること、（４）調製の全体手間がより少なく処理過程が高速であること、（５）配列決定する材料のクローニングおよび増幅が除かれること、および、（６）ｃＤＮＡ産生プロセスの全体を通じて方向性情報（センスまたはアンチセンス方向）が保持されること、が挙げられる。
概観
本発明の方法は、得られるｃＤＮＡライブラリーが、全ての転写物のタイプについて含まれる３’バイアスが顕著に低減されるという点で、従来のｃＤＮＡ配列決定プロトコールに優る顕著な改良点を提供する。ここに提供される方法は、開始ＲＮＡを均一なサイズ範囲（１５０から５００ヌクレオチド）に断片化し、そうすることによって、逆転写酵素による早すぎる終結を招くことなく逆転写することを可能とし、それによって逆転写酵素の処理能力に関する内在的問題を解決する。開始ＲＮＡがｍＲＮＡである場合、断片は、サンプルに抽出される転写物それぞれの長さをランダムに持つと考えられる。次に、この断片化ＲＮＡプールに対し、セミランダムプライマー（５’−Ｐ−ＴＮＮＴＮ６−３’）（配列番号１）によって駆動される逆転写酵素反応を実行する。
【００２１】
このセミランダムプライマーを用いることによって、様々なｍＲＮＡ断片の全てについて均一なランダム逆転写が行われるが、そして、これが重要であるが、この技術は、ＲＮＡ（例えば、転写物）の５’末端に対し３’末端を優先することをしない。プライマーは、二つの理由でセミランダムとなるように設計される。第１に、ランダム性によって、ＲＮＡプール内の全ての断片に対しプライマー付着させることができるので、各転写物を完全にカバーすることが可能となる。第２に、プライマーのＴＮＮＴ部分（図１）を、その後の連結反応において方向性アンカー部位として使用することが可能である。
【００２２】
本法の一利点は、従来行われる、２本鎖ｃＤＮＡ作製のための第２鎖合成が実行されないということである。これは時間を節約し、さらに、インビトロ核酸合成によるアーチファクトを回避する。その代わりに、ｓｓｃＤＮＡに対し順行アダプター（またはＡ−アダプター）または逆行アダプター（またはＢ−アダプター）を付着させるために、連結反応が実行される。このＡおよびＢアダプターは、任意の下流配列決定プロトコールに対し方向性情報を提供する（図１）。
【００２３】
このアダプターセット（すなわち、ＡおよびＢアダプター）は、順行および逆行アダプターの方向性連結を可能とし、順行アダプターが、ｓｓｃＤＮＡ分子の５’末端に、逆行アダプターが、同ＤＮＡ分子の３’末端に付着されるように設計される。連結に用いられる各アダプターセットは、相補的な二つのプライマーから構成されるが、ただし、プライマーの内の一方は他方よりも長く、そのためオーバーハング・セグメントを生じる。連結反応に用いられるアダプターユニットの模式図を図１に示す。長い方のプライマーの非相補的部分は、ｓｓｃＤＮＡ分子にアニールするアンカー（固着）ユニットとして使用される。一旦この固着が実行されると、短い方のプライマーも、ｓｓｃＤＮＡの５’または３’末端に連結することが可能になる。ｓｓｃＤＮＡに対するアダプターユニットの方向性アニーリング、および連結の行われる場所を示す模式図を図１に示す。
【００２４】
非連結材料から連結ｓｓｃＤＮＡを単離するには、多くの方法の利用が可能である。好ましい一方法では、アダプターの一方または両方が、長鎖（非連結鎖）においてビオチン標識されてもよい。市販のストレプトアビジン磁気ビーズ、例えば、ＭｙＯｎｅ（Ｄｙｎａｌ）を用いて、連結反応から連結分子を単離する。磁気ビーズから非連結材料を洗い流した後、ｓｓｃＤＮＡ分子を融解して切り離す。このことは、アダプターの非連結鎖のみがビオチン化されているために可能となる。この融解によって、ｃＤＮＡに連結した連結鎖が分離され、連結鎖−ｃＤＮＡ構造が溶液に放出される。このｓｓｃＤＮＡを溶液から単離し、ただちに配列決定される最終的ｓｓｃＤＮＡライブラリーを生成するようにしてもよい。溶液からｓｓｃＤＮＡを精製するには多くの方法が知られる。ある実施態様では、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００カラムが精製のために使用される。ある好ましい実施態様では、ｓｓｃＤＮＡは、ＲＮＡｃｌｅａｎ（Ａｇｅｃｏｕｒｔ）によって精製される。これは、アダプターの非連結プライマーだけでなく、大部分のごく微小な断片を除去するのにも役立つ。
【００２５】
一実施態様では、Ｂアダプターがビオチン標識される。これによって、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを用いることによって、非連結ｓｓｃＤＮＡからばかりでなく、非連結アダプターからも、連結ｃＤＮＡ分子を単離することが可能になる。ｓｓｃＤＮＡはビーズから融解され、クリーンアップ工程を経て最終的ｓｓｃＤＮＡライブラリーを生成する。次に、このライブラリーは定量され、直接的配列決定に適切な濃度に希釈される。直接的配列決定は、例えば、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの配列決定プロトコールおよび装置を用いて実行してもよい。４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの技法を用いて配列決定することが好ましいが、この配列決定は、任意の技術、例えば、クローニングおよび手動による配列決定から成る従来技術を含む技術を用いて実行することが可能である。このような手動による配列決定法としては、マクサムギルバート配列決定法、サンガー配列決定法、合成配列決定法、例えば、ピロ配列決定法が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。もう一つの配列決定法は、ｓｓｃＤＮＡのどちらか一端の既知配列に対してハイブリダイズするように設計されたプライマー（すなわち、ＡアダプターおよびＢアダプター領域）を用いて個別のｓｓｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を行い、次いで配列決定することを含む。
【００２６】
ＲＮＡライブラリー生成の方策に関する概観を呈示したので、次に本発明の方法の個別の工程をさらに詳しく説明する。
開始ＲＮＡ
本発明の方法は、少なくともメッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、ウィルスＲＮＡ、およびｍｉｃｒｏ  ＲＮＡを含む、任意の天然または合成ＲＮＡの配列決定のために使用してよい。一つの好ましいＲＮＡ供給源は細胞ＲＮＡである。細胞ＲＮＡは、既知の方法、例えば、８ＭグアニジニウムＨＣｌ、またはＴｒｉｚｏｌ試薬使用の単離法によって単離してよい。当業者であれば、ＲＮＡ処理のために一般的に使用される技術、例えば、対象とするＲＮＡに接触する全ての溶液にジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水を使用することなどに精通する。ＲＮＡは、ポリ（Ａ）濃縮されていてもよいが、そうである必要はない。ポリ（Ａ）濃縮ＲＮＡが所望であるなら、ポリ（Ａ）ＲＮＡを生成する任意の方法を用いて獲得することが可能である。そのような方法として、例えば、オリゴ（ｄＴ）セルロース基質の上にポリ（Ａ）ＲＮＡの溶液を流して、結合させ、基質から未結合ＲＮＡを洗い流し、低イオン強度バッファー（低塩濃度バッファー）を用いて基質からポリ（Ａ）ＲＮＡを放出する方法が挙げられる。ポリ（Ａ）ＲＮＡを単離する、その他の方法としては、オリゴ（ｄＴ）結合磁気媒体、例えば、オリゴ（ｄＴ）をプライマー付着させた磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）の使用が挙げられる。
ＲＮＡの断片化
開始ＲＮＡは、従来技術で公知の任意の方法、例えば、機械的せん断、超音波処理、および噴霧処理を含む方法によって断片化してよい。
【００２７】
なお、断片化は、任意に選択される工程である。本発明の方法は、ＲＮＡを断片化することなく実行してもよい。
【００２８】
さらに、本発明の方法は、断片化されたものであれ、断片化無しで産生されたものであれ、１０塩基、２０塩基のＲＮＡから始め、１ｋｂ、１０ｋｂ以上のＲＮＡに至るまで、任意のサイズのＲＮＡに適用することが可能である。ＲＮＡサイズの上限は、ＲＮＡ逆転写酵素の処理能力に依存する。この上限は、新規ＲＮＡ逆転写酵素の発見、または、さらに高い処理能力を持つ遺伝子工学的に加工された逆転写酵素の出現によって上昇することが期待される。比較的低いサイズ範囲に入るＲＮＡの例としては、ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ、および断片化または分解されたＲＮＡが挙げられる。
【００２９】
開始ＲＮＡを断片化するための好ましい一つの方法は、カリウムおよびカルシウムイオン存在下におけるｍＲＮＡの熱誘発性断片化である。簡単に言うと、ＲＮＡを、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテート、１００ｍＭ酢酸カルシウム、および３１．５ｍＭ酢酸マグネシウムの溶液に移し、８２℃で、所望量の断片化が得られるまでインキュベートする。我々の知見では、上に参照したＴｒｉｓ／酢酸カリウム／酢酸マグネシウム溶液では、ＲＮＡを約１５０から５００塩基のサイズに短縮するのに２分のインキュベーションで十分であった。断片化は、例えば、ゲル電気泳動、またはＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によってモニタリングしてもよい。もちろん、様々な環境に断片化技術を適応させるためには、イオン濃度、インキュベーション温度、および時間調節も必要となる場合がある。
【００３０】
断片化後、ＲＮＡは、公知の技術を用いて精製してよい。ＲＮＡ精製の一方法は、ＲＮＡサンプルを脱塩することである。脱塩は、市場の供給業者、例えば、Ｑｉａｇｅｎから販売されるキット（例えば、スピンカラム）を用いて実現してもよい。
１本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ）の合成
断片化後、逆転写酵素を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する。好ましい一実施態様では、第１鎖ｃＤＮＡ合成は、配列５’−Ｐ−ＴＮＮＴＮＮＮＮＮＮ−３’（配列番号１）を有するセミランダムプライマーを用いて実行する。上の配列において、Ｎはランダム配列（Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）を表し、Ｐは５’リン酸塩である。プライマーは、３’ＮＮＮＮＮＮ領域（配列番号１７）を用い断片化ｍＲＮＡに対しランダムに付着するように設計される。このポリ（Ｎ）領域は、６塩基長であることが好ましいが、７塩基、８塩基、９塩基、または１０塩基のポリ（Ｎ）領域も考えられる。プライマーはさらに、その後の、順行アダプターの方向性連結のために使用されてもよいアダプター配列（５’−ＴＮＮＴ−３’）を含む。本明細書に開示されるプライマーの配列は、例示のために用いられるものであること、プライマー配列ＴＮＮＴＮＮＮＮＮＮ（配列番号１）の二つのＴは、既知の任意の二つの塩基によって置換されてもよいことが理解される。例えば、本発明の実施に当たり、下記のプライマーも同様に作動する。すなわち、ＡＮＮＡＮＮＮＮＮＮ（配列番号２）、ＧＮＮＧＮＮＮＮＮＮ（配列番号３）、ＣＮＮＣＮＮＮＮＮＮ（配列番号４）、ＡＮＮＧＮＮＮＮＮＮ（配列番号５）、ＡＮＮＣＮＮＮＮＮＮ（配列番号６）、ＡＮＮＴＮＮＮＮＮＮ（配列番号７）、ＧＮＮＡＮＮＮＮＮＮ（配列番号８）、ＧＮＮＣＮＮＮＮＮＮ（配列番号９）、ＧＮＮＴＮＮＮＮＮＮ（配列番号１０）、ＣＮＮＡＮＮＮＮＮＮ（配列番号１１）、ＣＮＮＧＮＮＮＮＮＮ（配列番号１２）、ＣＮＮＴＮＮＮＮＮＮ（配列番号１３）、ＴＮＮＡＮＮＮＮＮＮ（配列番号１４）、ＴＮＮＧＮＮＮＮＮＮ（配列番号１５）、およびＴＮＮＣＮＮＮＮＮＮ（配列番号１６）である。
【００３１】
本発明のプライマー、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、および核酸塩基のいずれも、従来技術で公知の一つ以上の化学的修飾および置換、例えば、ホスホロチオエート置換、修飾糖成分、例えば、２’−Ｏ−メチル、または２’−Ｏ−エチル置換糖、化学発光または蛍光標識、例えば、ただしこれらに限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ローダミン、フルオレセイン、および、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから市販されるＡｌｅｘａタグ、質量タグ、ブロッキングまたは保護基、ビオチンなどのハプテンを含んでもよい。
【００３２】
前述のように、（アダプターＡ）−ＮＮＮＮＮＮ（配列番号１７）から成る特異的な配列領域を有する５’プライマーの使用も考慮の対象となる。その５’末端にアダプター配列を有するこのようなプライマーは、その後の、第１アダプターの連結を不要にすると考えられる（すなわち、一連結工程を省く）。このようなプライマーによるｃＤＮＡ合成の後では、３’アダプターの連結だけが必要とされる。プライマーおよび逆転写酵素を用いて、断片化された開始ＲＮＡからｓｓｃＤＮＡを合成してもよい。アダプターの配列は、例えば、図２に見出される。
アダプターの連結
第１鎖の合成後、ｓｓｃＤＮＡを精製し、連結反応に移行して、その５’および３’末端にアダプター配列を付加する。アダプターは、ある一定の方向性でｓｓｃＤＮＡにハイブリダイズし、連結するように（例えば、アダプターＡはｓｓｃＤＮＡの５’末端に、アダプターＢは３’末端に連結するように、図１参照）設計された、部分的１本鎖領域を有する短い核酸である。サンプルアダプターの構造を図６に示す。
【００３３】
アダプターＡは、オーバーハングした５’１本鎖領域を有する２本鎖ＤＮＡであってもよい。例えば、部分的１本鎖と、部分的２本鎖であるアダプターＡは、下記の配列を含んでもよい。
【００３４】
【化２】
2009508495.tif 000004
３’ジデオキシは、この鎖が、別の核酸に連結するのを阻止する。
【００３５】
この配列は、配列５’−Ｐ−ｔｎｎｔｎｎｎｎｎｎ−３’（配列番号１）のプライマーから伸長して作製されたｓｓｃＤＮＡの５’領域に特異的にハイブリダイズする（図１参照）。前述したように、アダプターＡの下線塩基は、プライマー配列の下線塩基に対し相補的となるように設計される。さらに別の具体例として、プライマー配列が５’−ｇｎｎｇｎｎｎｎｎｎ−３’（配列番号３）である場合は、アダプターＡは下記の配列を持たなければならない。
【００３６】
【化３】
2009508495.tif 000005
アダプターＢは、オーバーハングした３’領域を有する任意の２本鎖ＤＮＡであってもよい。例えば、アダプターＢは、下記の配列を持ってもよい。
【００３７】
【化４】
2009508495.tif 000006
このアダプターは、任意の１本鎖ＤＮＡの３’末端にハイブリダイズすることが可能であり、アダプターＢの短い方の鎖は、１本鎖ＤＮＡに連結することが可能である。
【００３８】
なお、図、および本開示の本文に示すジデオキシは、核酸の連結を阻止するためのブロッキング基を表す。これらのジデオキシ基は、機能的に等価な、任意のブロッキング基（すなわち、核酸鎖の連結を阻止することが可能なブロッキング基）と置換してもよい。それとは別に、ブロッキング基は使用しなくともよい。
【００３９】
アダプターＡおよびアダプターＢの２本鎖領域は、ランダム配列を含む任意の配列を含んでよい。好ましい実施態様では、アダプターＢは、その２本鎖領域の中に、制限酵素切断部位、配列既知のプライマー部位、またはその両方を含んでもよい。
【００４０】
より好ましい実施態様では、アダプターＡおよびアダプターＢの２本鎖領域は、プライマーのその後の精製のために、結合ペア−結合性成分の一方のメンバーを含んでもよい。アダプターＡおよびアダプターＢのそれぞれが、２本鎖において、１本鎖核酸と連結することが可能な鎖、および、連結するが可能ではない鎖（本明細書では、「連結鎖」および「非連結鎖」と呼ばれる２本鎖）を含む。好ましい実施態様では、アダプターＡまたはアダプターＢの非連結鎖は、結合ペアの一方のメンバー、例えば、ビオチンを含む。有用な結合ペアとしては、例えば、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ポリＨＩＳ領域／ＮＴＡ、ＦＬＡＧ／抗ＦＬＡＧ抗体、抗原／抗体または抗体断片などが挙げられる。精製は、コンカテマーの形成、例えば、プライマー・ダイマーの形成を顕著に低減する。
【００４１】
アダプターの連結後、１本鎖ｃＤＮＡライブラリーの生成は完了する。このｃＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリーを必要とする、任意の分子生物学的手法のために使用することが可能である。
【００４２】
一実施態様では、ｃＤＮＡは、単一組織のＲＮＡから産生される。別の実施態様では、ｃＤＮＡは、複数の組織、１種以上の細胞、体液、１種以上の生物体、環境サンプル、バイオフィルム、１種以上の細菌、１種以上の古細菌、１種以上の真菌、１種以上の植物、１種以上の動物、一人以上のヒト、ウィルス、レトロウィルス、ファージ、寄生虫、腫瘍または腫瘍サンプル、および／または生物標本のＲＮＡから産生されてもよい。全体ｃＤＮＡライブラリーの配列を決定することにより、研究者は、単一細胞、または単一組織における各遺伝子の発現レベルを定量すること（すなわち、転写プロファイリング）が可能になる。好ましい実施態様では、配列決定は、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから市販される方法および装置を用いて実行される。核酸の直接的配列決定法は、同時係属中の、２００４年１月２８日出願の米国特許出願第１０／７６７，７７９号；２００３年６月６日出願の米国特許仮出願第６０／４７６，６０２号；２００３年６月６日出願の米国特許仮出願第６０／４７６，５０４号；２００３年１月２９日出願の米国特許仮出願第６０／４４３，４７１号；２００３年６月６日出願の米国特許仮出願第６０／４７６，３１３号；２００３年６月６日出願の米国特許出願仮第６０／４７６，５９２号；２００３年４月２３日出願の米国特許出願仮第６０／４６５，０７１号、および、２００３年８月２５日出願の米国特許仮出願第６０／４９７，９８５号に記載されている。
生成されたｃＤＮＡライブラリーの精製
ｓｓｃＤＮＡは、任意の選択工程において精製されてもよい。一精製法はサイズ選択による。開始ＲＮＡから生成されるＲＮＡ断片は、サイズが１００塩基から１０００塩基、好ましくはサイズが１５０塩基から５００塩基であり、このＲＮＡ断片から生成されるｓｓｃＤＮＡは、同様のサイズを持つことが予想される。このサイズは、アダプターおよびプライマーのサイズよりも大きい。したがって、ｃＤＮＡは、サイズ分画によって精製してもよい。サイズ分画は、カラムクロマトグラフィー（スピンカラムを含む）、または、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル電気泳動、または、ＳＰＲＩビーズ（ＲＮＡｃｌｅａｎ、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）の使用によって実行してもよい。
【００４３】
結合成分が、連結鎖に組み込まれている場合、アフィニティー結合によってｓｓｃＤＮＡを回収してもよい。例えば、未連結のアダプター、および、アダプターの未連結鎖を、熱処理またはアルカリ処理などの変性条件によって除去してもよい。変性処理後、結合ペアの一方のメンバー（例えば、ビオチン）を含む連結ｓｓｃＤＮＡを、結合ペアの他方のメンバー（例えば、アビジン被覆磁気ビーズ）を含む固相支持体に結合させてもよい。洗浄して未結合核酸を除去した後、固相支持体から精製ｓｓｃＤＮＡを分離してもよい。
【００４４】
結合成分が、非連結鎖に組み込まれている場合、結合ペアの一メンバー（例えば、ビオチン）を含む非連結鎖を、結合ペアの他方メンバー（例えば、アビジン被覆磁気ビーズ）を含む固相支持体に結合させて、ｓｓｃＤＮＡを回収してもよい。洗浄後、ｓｓｃＤＮＡを変性条件によって収集してもよい。変性条件下では、非連結鎖にハイブリダイズしたｓｓｃＤＮＡは溶液中に放出されるが、一方、非連結鎖は、固相支持体に結合したままである。したがって、精製ｓｓｃＤＮＡと共に溶液を収集してもよい。
【００４５】
本発明の方法は、種々の用途、例えば、ただしこれらに限定されないが、サブトラクションｃＤＮＡライブラリーの構築、および転写プロファイリング（Ｓｈｉｍｋｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．“Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ  ａ  ｇｅｎｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｑｕｅｒｙ．”Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７（８）：７９８−８０３）を含む用途に使用してよい。
【００４６】
第二の実施態様では、本発明の方法は、転写物計数を主題としてもよい。転写物計数では、第１プライマーは、メッセンジャーＲＮＡのポリＡ尾部にハイブリダイズするように設計される。産生されるｃＤＮＡライブラリーは、ポリＡ尾部付近のｃＤＮＡ配列について濃縮されることが予想される。この方法では、前述の転写物配列決定（ＴＳＥＱ）プロトコールと同様にして断片化される。しかしながら、この場合、ポリＡ単離ＲＮＡを使用することがきわめて好ましい。ｃＤＮＡの第１の（そして、ほとんどの場合唯一の）鎖合成用プライマーは二つの領域を持つ。第１領域は、ポリＡ領域にハイブリダイズするように設計される５’領域である。これは、オリゴｄＴ領域であってもよい。第２領域は、図４ではＶＮで表されるアダプター配列を含む。
【００４７】
さらに別の任意の選択肢として、プライマーは、アダプター配列を含む、さらに別の５’領域を含んでもよい。したがって、プライマーの配列は下記：
５’−（アダプターＡ）−ｔｔｔｔｔｔｔｔｖ−３’（配列番号１９）
であってもよい。
【００４８】
より好ましい実施態様では、プライマー配列は下記：
５’−（アダプターＡ）−ｔｔｔｔｔｔｔｔｖｎ−３’（配列番号２０）
であってもよい。
【００４９】
本明細書を通じて、“ｖ”は、ａ、ｇ、またはｃである、ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基を表すのに用いられる。言い換えると、ｖは、ｔまたはｕ以外の任意の塩基である。
【００５０】
それとは別に、プライマーは、ライブラリー構築を、ある遺伝子サブセットに偏向させるために、遺伝子特異的、または遺伝子ファミリー特異的配列を含んでもよい。
【００５１】
プライマーがアダプター配列を含まない場合（すなわち、プライマーが、前掲の配列番号１９または配列番号２０で示した構造を持つが、「アダプターＡ」配列を欠く場合）、このアダプター配列を、ｃＤＮＡ合成後連結させてもよい。
【００５２】
ｃＤＮＡ合成後、アダプターＢおよびアダプターＢ’が相補的配列となる下記：
【００５３】
【化５】
2009508495.tif 000007
のアダプター構造を使用してもよい。このアダプター構造を、ｃＤＮＡの３’末端に連結させてもよい（図５参照）。連結後、一方の鎖はビオチン結合されるので、連結ｃＤＮＡは、ストレプトアビジンカラム、またはストレプトアビジンビーズによって精製が可能であることに注意されたい。
【００５４】
得られたｃＤＮＡは、前述のＴｓｅｑ配列決定と同様の方法で配列決定するために使用してもよい。
【００５５】
さらに別の実施態様では、開始ＲＮＡの断片化に次いで、その断片化ＲＮＡに対し、１本鎖オリゴヌクレオチドアダプター（ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい）を連結させてもよい（例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いて）。図１５に示すように、ＲＮＡの３’末端に連結されるアダプターはアダプターＡであってもよいし、ＲＮＡの５’末端に連結されるアダプターはアダプターＢ’であってもよい。続く逆転写は、アダプターＡに対して相補的なＲＴプライマーから開始されてもよい。逆転写後、本明細書に開示される方法の内のいずれか、例えば、加水分解、ＲＮアーゼＨ処理を用いてＲＮＡ鎖を除去してもよい。このようにして得られる最終的アダプター付着ｓｓｃＤＮＡは、５’末端にＡ’アダプター配列を、３’末端にＢアダプター配列を含む。
【００５６】
もう一つの実施態様では（図１６）、開始ＲＮＡの断片化後に、１本鎖オリゴヌクレオチドアダプター（これはＤＮＡでも、ＲＮＡであってもよい）を、断片化ＲＮＡの３’末端に（例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いて）連結してもよい。続いて、アダプターＡに対して相補的なＲＴプライマーから逆転写を開始してもよい。逆転写後、本明細書で開示される方法の内のいずれか、例えば、加水分解またはＲＮアーゼＨ処理を含む方法を用いてＲＮＡ鎖を除去してもよい。得られたＡ’アダプター付着ｓｓｃＤＮＡは、図１６に示すように、部分的に２本鎖のオリゴヌクレオチドアダプターセットＢに連結させてもよい。１本鎖のオリゴヌクレオチドアダプターセットＢは、その３’末端に、ランダムまたはセミランダムな配列から成る１本鎖部分を、その５’末端に、ビオチンまたは同様のアフィニティーラベルを含む。次に、アビジン、またはストレプトアビジンによってこの連結産物を捕捉し、さらに、本明細書の別の箇所で述べるように、最終的なＡ’−Ｂアダプター付着ｓｓｃＤＮＡを融解分離させてもよい（図１６）。
【００５７】
さらに別の実施態様では（図１７）、図１７に示すように、開始ＲＮＡの断片化後、部分的に２本鎖のオリゴヌクレオチドアダプターセットＡが、ＲＮＡの３’末端に連結される。オリゴヌクレオチドアダプターセットＡの１本鎖は、その３’末端にランダムまたはセミランダム配列から成る１本鎖部分、および、その５’末端にビオチン（または、他の適正なアフィニティーラベル）を含む。次に、アビジン、またはストレプトアビジン（または、他の適正な結合パートナー）によってこの連結産物を捕捉し、この連結ＤＮＡを融解分離してもよい。次いで、アダプターＡ配列に対し少なくとも部分的に相補的なＲＴプライマーから逆転写を開始させてもよい。逆転写後、本明細書で開示される方法の内のいずれか、例えば、加水分解またはＲＮアーゼＨ処理を含む方法を用いてＲＮＡ鎖を除去してもよい。その後、Ａアダプター付着ｓｓｃＤＮＡは精製される。このＡアダプター付着ｓｓｃＤＮＡの３’末端に、部分的に２本鎖のＤＮＡオリゴヌクレオチドアダプターセットＢが連結される（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって）。図１７に示すように、１本鎖のオリゴヌクレオチドアダプターセットＢは、その３’末端に、ランダムまたはセミランダムな配列から成る１本鎖部分を、その５’末端に、ビオチン（または、他の同様なアフィニティーラベル）を含む。次に、アビジン、またはストレプトアビジン（または、その他の適正な結合パートナー）によってこの連結産物を捕捉し、さらに、本明細書の別の箇所で述べるように、最終的なＡ’−Ｂアダプター付着ｓｓｃＤＮＡを融解分離させてもよい（図１７）。
【００５８】
本実施態様、および、本明細書に記載する他の実施態様において、当業者であれば、アダプター−アダプター連結事象は、不要で回避すべきものであるが、これは、オリゴヌクレオチドの３’末端および／または５’末端に、適宜、適切な化学的構造を配すること（例えば、リン酸基、またはジデオキシ基の有無）によって阻止することが可能であることが了解されるであろう。
【００５９】
本発明のある実施態様では、ｃＤＮＡライブラリーの調製法は、開始ＲＮＡの断片化を必要としない（例えば、図１８ＡおよびＢ）。これらの実施態様では、ランダムまたはセミランダム逆転写プライマーが、断片化されない開始ＲＮＡにアニールされて、逆転写が実行される。例えば、逆転写プライマーは、ランダムまたはセミランダムな５’部分、および定常な３’部分から構成されていてもよい。使用される逆転写酵素が、非鎖移動性である場合、逆転写は、各アニールしたプライマーから、次のアニールプライマーまで、または、ＲＮＡの５’末端に達するまで続けられる可能性がある。当業者であれば、得られるｓｓｃＤＮＡ断片の平均長は、何よりも、開始ＲＮＡに対するプライマーの比に依存することが了解されるであろう。逆転写後、本明細書で開示される方法の内のいずれか、例えば、加水分解またはＲＮアーゼＨ処理を含む方法を用いてＲＮＡ鎖を除去してもよい。その後、それぞれその５’末端に逆転写プライマーを含むｓｓｃＤＮＡが精製される。次に、このｓｓｃＤＮＡの５’末端を、部分的に２本鎖のＤＮＡオリゴヌクレオチドアダプターセットＡ’に（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの使用によって）連結する。アダプターセットＡ’は、その５’末端に、ランダムまたはセミランダム配列から成る１本鎖部分を有する１つの鎖を含む。ｓｓｃＤＮＡの３’末端は、部分的に２本鎖のオリゴヌクレオチドアダプターセットＢに（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの使用によって）連結させてもよい。アダプターセットＢは、その３’末端に、ランダムまたはセミランダムな配列から成る１本鎖部分を、その５’末端に、ビオチン（または、他の適正なアフィニティーラベル）を含む（図１８Ａ）。次に、アビジン、またはストレプトアビジン（または、その他の適正な結合パートナー）によってこの連結産物を捕捉し、さらに、本明細書の別の箇所で述べるように、最終的なＡ’−Ｂアダプター付着ｓｓｃＤＮＡを融解分離させてもよい（図１８Ｂ）。アダプターセットＡ’の「最下段」鎖（図１８による）も融解分離し、当技術分野において公知で、かつ、本明細書に開示されるいくつかのサイズ選択手法の内のいずれか、例えば、ＳＰＲＩビーズによって、所望の最終的Ａ’−Ｂアダプター付着ｓｓｃＤＮＡから分離が可能である。
【００６０】
本発明のある実施態様は、ｃＤＮＡライブラリーではなく、ＤＮＡライブラリーの生成を主題とする。これらの実施態様では、開始材料は、１本鎖ＤＮＡまたは２本鎖ＤＮＡのいずれかである。開始ＤＮＡは、いずれの生物（細胞またはウィルス）供給源、または合成供給源から得られたものであってもよい。開始ＤＮＡが１本鎖である場合、それは、例えば、変性２本鎖ＤＮＡから得られたものである可能性もあるし、あるいは、１本鎖ＤＮＡウィルスから単離された可能性もある。開始ＤＮＡ断片の長さが、所望のＤＮＡライブラリーに必要な長さを超えている場合には、酵素的であれ（例えば、制限酵素）、化学的であれ、または機械的であれ（例えば、せん断力）、その断片を、当技術分野で公知の任意の方法で断片化してよい。開始ＤＮＡが２本鎖である場合、例えば、熱処理によってその断片を変性し、ｓｓＤＮＡ断片を産生する。次に、このｓｓＤＮＡの５’末端を、部分的に２本鎖のオリゴヌクレオチドアダプターセットＡ’に（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて）連結してもよい。アダプターセットＡ’は、その５’末端にランダムまたはセミランダム配列の１本鎖部分を有する１つの鎖を含む。ｓｓＤＮＡの３’末端を、部分的に２本鎖のオリゴヌクレオチドアダプターセットＢに（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて）連結してもよい。アダプターセットＢは、その３’末端にランダムまたはセミランダム配列の１本鎖部分、およびその５’末端にビオチン（または、その他の適正なアフィニティーラベル）を有する１つの鎖を含む（図１９）。次に、アビジン、またはストレプトアビジン（または、その他の適正な結合パートナー）によってこの連結産物を捕捉し、さらに、本明細書の別の箇所で述べるように、最終的なＡ’−Ｂアダプター付着ｓｓｃＤＮＡを融解分離させてもよい。アダプターセットＡ’の「最下段」鎖（図１９による）も融解分離し、当技術分野で公知で、かつ、本明細書に開示されるいくつかのサイズ選択手法の内のいずれか、例えば、ＳＰＲＩビーズによって、所望の最終的Ａ’−Ｂアダプター付着ｓｓｃＤＮＡから分離される。
【００６１】
本開示を通じて、「ビオチン」、「アビジン」、または「ストレプトアビジン」という用語は、結合ペアのメンバーを記述するために用いられている。これらの用語は、単に、結合ペアを用いる一つの方法を例示するためのものであることを理解しなければならない。したがって、用語ビオチン、アビジン、またはストレプトアビジンは、結合ペアの任意の一員によって置換されてよい。結合ペアは、互いに特異的に結合する任意の二つの分子であってよく、少なくとも、ＦＬＡＧ／ＦＬＡＧ抗体、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、受容体／リガンド、抗原／抗体、受容体／リガンド、ポリＨＩＳ／ニッケル、タンパクＡ／抗体およびその誘導体のような結合ペアを含んでもよい。他の結合ペアも公知であり、文献に発表されている。
【００６２】
本開示に引用される特許、特許出願、および文献は、どこで引用されたものであれ全て参照によってその全体が本開示に含まれる。本発明の他の実施態様および利点も、一部は下記の説明に記載され、一部はその説明から明白であり、かつ、本発明を実施することによって教示されてもよい。
【００６３】
以下に、非限定的実施例を通じて本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００６４】
実施例１：材料および方法
２００ｎｇのｍＲＮＡ材料から作業を開始するようにプロトコールを開発した。このプロトコールの模式図を図２に示す。
【００６５】
プロセスのための開始容量は１０μｌである。サンプルを氷上に置き、２．５μｌの５Ｘ断片化バッファー（０．２Ｍ  Ｔｒｉｓアセテート、０．５Ｍ  酢酸カリウム、および１５７．５ｍＭ  酢酸マグネシウム）をサンプルに加え、よく混ぜ合わせた。サンプルをサーマルサイクラーに入れ、８２℃に加熱し、８２℃で２分インキュベートさせた。８２℃におけるインキュベーションの直後、サンプルを氷に戻した。
【００６６】
脱塩工程でサンプルから塩を除去した。サンプルの脱塩法は周知である。本実施例で用いるプロトコールは、Ａｕｔｏｓｅｑ  Ｇ−５０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に、メーカーの指示に従ってサンプルを通過させることを含む。約２０μｌ容量の回収材料を、スピードバック（Ｓａｖａｎｔ  Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）において真空（２Ｔｏｒｒ）中４５℃で遠心することによって乾燥させ１０μｌまで下げた。
【００６７】
ｍＲＮＡ鋳型に対する逆転写酵素プライマーのアニーリングは、断片化ｍＲＮＡに２μｌの逆転写プライマー（２００μＭの５’−Ｐ−ＴＮＮＴＮＮＮＮＮＮ−３’で、Ｐはリン酸塩である、配列番号１）を加えることによって実行した。次に、サーマルサイクラーにおいてサンプルを７０℃で１０分加熱して、氷上で冷却した。
【００６８】
反応チューブに、８．５マイクロリットルの逆転写混合物（４．０μｌの、５Ｘ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ第１鎖バッファー、２．０μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ、１．０μｌのｄＮＴＰミックス（それぞれ１０ｍＭ）、１．０μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ酵素、５０単位／μｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および０．５μｌのＲＮａｓｅ  Ｏｕｔ、１２５単位／μｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を加えた。この反応チューブをよく混ぜ合わせ、４５℃で１時間インキュベートした。この反応後、１５μｌの変性溶液（０．５Ｍ  ＮａＯＨ、０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加え、混ぜ合わせ、６５℃で２０分インキュベートすることによってｓｓｃＤＮＡ分子を単離した。２０μｌの中和バッファーを加えて反応を停止させた。次に、溶出容量を除いてはメーカーの指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＤＮＡ精製カラムを用いて反応物を精製した。反応物は、１２μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５によって溶出した。
【００６９】
サンプルに、６．５μｌのライゲーションミックス（１．０μｌの２５μＭ  アダプターＡ、１．０μｌの５０μＭ  アダプターＢ、１．８μｌの１０Ｘ  Ｔ４リガーゼバッファー、２．２μｌの水、および０．５μｌの高濃度Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、２０００単位／μｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））を加えて、アダプターＡおよびアダプターＢの連結を設定した。サンプルを混ぜ合わせ、２２℃で１２時間インキュベートした。
【００７０】
連結した産物は、下記の手順に従って、ＭｙＯｎｅストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）に結合するビオチン標識Ｂアダプターを通じて単離した。ストレプトアビジンビーズのように、対応する結合ペアに結合するものであれば、いずれの形の磁気ビーズであっても有効であることが理解される。１Ｘ  ＴＥ  ｐＨ７．５を加えることによって連結反応容量を１００μｌに増す。次に、洗浄した磁気ビーズ１００μｌを含むスラリーをこのサンプルに加える。サンプルを、室温で１０から１５分混ぜ合わせ、次にビーズを洗浄し、未結合の材料を全て除去する。
【００７１】
ｓｓｃＤＮＡを融解し、１００μｌの溶出バッファー（２５ｍＭ  ＮａＯＨ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）にてビーズから溶出した。溶出材料を新しいチューブに移し、１０μｌの中和バッファー（２５０ｍＭ  ＨＣｌ、２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＣＬ、ｐＨ８．０）で中和した。中和バッファーの添加後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００クロマトグラフィーカラムの上にサンプルを通過させ、ｓｓｃＤＮＡサンプルから小断片を除去した。次に、メーカーのプロトコールに従って、Ｑｕｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムでサンプルを精製した。最終的に、１８μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５によってｓｓｃＤＮＡをカラムから溶出し、ライブラリーのＱＣには小分液を用いた。
【００７２】
マウス肝臓ｍＲＮＡサンプルにこのプロトコールを実行して調べたところ、あらゆるサイズの転写物をカバーする大量の配列データが得られた。比較的長い転写物の配列抽出度を定量するために、５０００ヌクレオチドを超える転写物の全てについて、領域当たりのヒット数をプロットした。これらの転写物の全長に渡って配列抽出度において均一な分布が見られた。これは、長さが５０００ヌクレオチドを超える転写物においても、３’バイアスがほとんど見られないことを示唆する（図３を参照）。
実施例２：ｃＤＮＡライブラリーの調製およびインフルエンザウィルスゲノムの配列決定
インフルエンザウィルスＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，マサチューセッツ州）から購入した。このインフルエンザゲノムは、８セグメントの１本鎖陰性センスＲＮＡを含むことが知られる。全てのセグメントの全長は１３５００ｎｔである。開始ＲＮＡ材料は、ウィルスＲＮＡセグメントに対応する明瞭なサイズ分画として存在することが判明した（図７）。ｃＤＮＡライブラリーの調製には、様々な量の（１０ｎｇ、２０ｎｇ、５０ｎｇ、または２００ｎｇ）ＲＮＡが用いられた。
【００７３】
ＲＮＡ断片化のために、１０μｌ容量とした開始量のＲＮＡを、２．５μｌの５ｘ断片化バッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテート、５００ｍＭ酢酸カリウム、１５７．５ｍＭ酢酸マグネシウム、ｐＨ８．１）に加え、短時間ボルテックスし、８２℃で２分インキュベートし、次いで氷上で急冷した。断片化ＲＮＡのクリーンアップのために、サンプル容量を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で５０μｌに調整した。１００μｌのＲＮＡＣｌｅａｎビーズミックス（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ，Ｂｅｖｅｒｙ，マサチューセッツ州）を加え、混ぜ合わせ、室温で１０分インキュベートした。次に、ビーズを、磁気粒子収集ユニットの上に収集した。上清を捨て、ビーズを、７０％エタノールで２回洗浄した。ビーズを空気乾燥し、次いで１１μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で溶出したところ、約９．５μｌの溶出物が得られた。この断片化によって、約５００ヌクレオチドにピークを持つ広範なサイズ範囲を有するＲＮＡが得られた（図８）。
【００７４】
次に、１本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ）を調製するために、全溶出物を、２μｌの、２００μＭプライマーＰ−ＴＮＮＴＮＮＮＮＮＮ（配列番号１）と混ぜ合わせ、７０℃で１０分加熱し、次いで氷上で急冷した。その後、８．５μｌの氷冷逆転写ミックス（４μｌの５Ｘ  ＳＳＩＩ第１鎖バッファー［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州］、２μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ、１μｌのｄＮＴＰミックス［各ｄＮＴＰについて１０ｍＭ］、１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］、および０．５μｌのＲＮａｓｅ  Ｏｕｔ［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］）を加え、次いで混ぜ合わせた。この混合物を４５℃で１時間インキュベートし、次いで氷上に移した。２０μｌの変性液（０．５Ｍ  ＮａＯＨ、０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ）を加え、混ぜ合わせ、６５℃で２０分インキュベートした。ｃＤＮＡ中和液（０．５Ｍ  ＨＣｌ、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ）を加えて（１０〜４０μｌ）、７〜８．５のｐＨを実現した。１．５容量のＲＮＡＣｌｅａｎミックスを加えてサンプルを精製し、室温で１０〜１５分インキュベートした。次に、ビーズを、磁気粒子収集ユニットの上に収集した。上清を捨て、ビーズを、７０％エタノールで２回洗浄した。ビーズを空気乾燥し、次いで２５μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５でｓｓｃＤＮＡを溶出した。このようにして得られたｓｓｃＤＮＡのサイズ分布は、約５００ヌクレオチドのピークの周囲に広がっていた（図９）。
【００７５】
アダプターの連結のために、ＳＡＤ１Ｆオリゴヌクレオチドを、ｓｓｃＤＮＡの５’末端に連結し、ＳＡＤ１Ｒオリゴヌクレオチドを、ｓｓｃＤＮＡの３’末端に連結した。このために、６μｌのアダプター／バッファーミックス（３μｌの１０Ｘ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼバッファー［Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ、マサチューセッツ州］、１μｌの５０μＭ  ＳＡＤ１Ｆ／ＳＡＤ１Ｆプライム（１．２：１）、１μｌの２００μＭ  Ｂｉｏ−ＳＡＤ１Ｒ／ＳＡＤ１Ｒプライム（１．２：１）、および１μｌのクイックリガーゼ、またはＴ４  ＤＮＡリガーゼ高濃度［Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ］）を、このｓｓｃＤＮＡサンプルに加え、２２℃で１２時間インキュベートした。このインキュベーション後、ＩＸ  ＴＥ（ｐＨ８．０）を加え、最終容量１００μｌを有する連結ミックスを得た。前記オリゴヌクレオチドの配列を表１に示す。
表１
【００７６】
【化６】
2009508495.tif 000008
部分的２本鎖オリゴヌクレオチドＳＡＤ１Ｆ／ＳＡＤ１Ｆプライムは、ＳＡＤ１ＦおおびＳＡＤ１Ｆプライム１本鎖オリゴヌクレオチドを、１：１．２モル比で混ぜ合わせ、下記の加熱プログラムを用いてアニールすることによって調製した。８０℃５分、６５℃７分、６０℃７分、５５℃７分、５０℃７分、４５℃７分、４０℃７分、３５℃７分、３０℃７分、２５℃７分、４℃不定時間。同様にして、ＳＡＤ１ＲおよびＳＡＤ１Ｒプライムから、部分的２本鎖オリゴヌクレオチドＳＡＤ１Ｒ／ＳＡＤ１Ｒプライムを調製した。
【００７７】
アダプター連結後ｓｓｃＤＮＡライブラリーを単離するために、先ず、サンプル当たり２０μｌのストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、Ｂ＆Ｗ  バッファー＋Ｔｗｅｅｎ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、２Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）において下記のように平衡させた。ビーズを、磁気粒子捕捉ユニットで液体から分離し、上清を捨てた。ビーズを、１ｍｌのＢ＆Ｗバッファー＋Ｔｗｅｅｎで洗浄し、磁気粒子捕捉ユニットで液体から分離し、上清を捨てた。次に、２０μｌの開始ビーズ当たり、１００μｌのＢ＆Ｗバッファー＋Ｔｗｅｅｎに再縣濁し、１００μｌの連結体ミックス（上記参照）に加え、１５分攪拌した。磁気粒子捕捉ユニットでビーズを液体から分離し、上清を捨てた。ビーズを、２００μｌの、０．５Ｘ  Ｂ＆Ｗバッファー＋Ｔｗｅｅｎにて洗浄し、磁気粒子捕捉ユニットで液体から分離し、上清を捨てた。ビーズを、２００μｌのビーズ洗浄バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で２度洗浄し、その度毎に、磁気粒子捕捉ユニットにて液体からビーズを分離し、上清を捨てた。１００μｌのビーズ溶出バッファー（２５ｍＭ  ＮａＯＨ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）を加え、サンプルを室温で１０分攪拌した。磁気粒子捕捉ユニットにてビーズを液体から分離し、上清（ｓｓｃＤＮＡライブラリーを含む）を新しいＰＣＲチューブに移した。
【００７８】
ｓｓｃＤＮＡライブラリーの精製のために、ビーズ溶出バッファーに溶解したｓｓｃＤＮＡに、１４０μｌのＲＮＡＣｌｅａｎミックスを加え、混ぜ合わせ、室温で１０分インキュベートした。磁気粒子捕捉ユニットにて液体からビーズを分離し、上清を捨てた。ビーズを７０％エタノールで２回洗浄し、次いで空気乾燥した。このｓｓｃＤＮＡを、３０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５で溶出した。４２μｌのＲＮＡＣｌｅａｎミックスで開始したことを除き、上記と同様のＲＮＡＣｌｅａｎ工程を繰り返し、最後に、ｓｓｃＤＮＡを、１２μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５で溶出した。
【００７９】
このようにして得られたｓｓｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。５μｌの、１０Ｘ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲバッファー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，カリフォルニア州）、１．０μｌのＳＡＤ１Ｆプライマー（２００μＭ）、１．０μｌのＳＡＤ１Ｒプライマー（２００μＭ）、２．０μｌの、各１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、および水に、上記のようにして得た最終的ｓｓｃＤＮＡ溶出液２から３μｌを、合計容量５０μｌとなるように加えた。次に、この反応混合物を、下記の熱サイクル処方で処理した。工程１：９０℃４分；工程２：９４℃３０秒；工程３：６４℃３０秒；工程４：工程２に戻る、１８回または２５回；工程５：６８℃２分；工程６：１４℃不定。増幅後、反応物を、ＡＭＰｕｒｅビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）によって精製した。ＰＣＲ反応物に８０μｌのＡＭＰｕｒｅビーズミックスを加え、磁気粒子捕捉ユニットにて液体からビーズを分離し、上清を捨てた。ビーズを７０％エタノールで２回洗浄し、次いで空気乾燥した。増幅した２本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓｃＤＮＡ）ライブラリーを、１２μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５で溶出した。
【００８０】
２５サイクルの増幅よりも、１８サイクルの増幅の方が好適であることが判明した。なぜならば、２５サイクル後には、増幅プライマーの重大な逸失のみならず、不要な産物が観察されたからである（１８サイクルではそういうことはない）（図１０Ａおよび１０Ｂ参照）。
【００８１】
１０、２０、５０、または２００ｎｇの開始ウィルスＲＮＡから得られたｄｓｃＤＮＡライブラリーのサイズ分布は、きわめて近似していることが観察された（図１３）。これは、本発明の方法が、微小量のＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを調製する点で驚くべき産生能力を有することを実証する。
【００８２】
このようにして得られたｃＤＮＡライブラリーに対し、次に、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ、コネチカット州）によって開発された配列決定技術によるヌクレオチド配列決定を行った。核酸の直接的配列決定のためのこれらの技術は、全て２００４年１月２８出願の、同時係属中の米国特許出願第１０／７６７，７７９；１０／７６７，８９９；１０／７６８７２９；および１０／７６７，７７９号、および、２００５年８月１日出願の米国特許出願第１１／１９５，２５４号に開示される。約１３６００個の高品質読み取りデータが得られた。これらの内、１２８２０個（９４．２６％）において、既知のインフルエンザウィルスＡ株ゲノムにおいて少なくとも３５ｎｔのＢＬＡＳＴヒットが見られた。１２８２０個のＢＬＡＳＴヒットの、８セグメントにおける、すなわち、インフルエンザウィルスＡ株のＲＮＡゲノムにおける分布を、表２に示す。
表２：ＢＬＡＳＴヒットを持つ、高品質読み取りデータの数を、インフルエンザウィルスＡ株のゲノムセグメント毎に掲げたもの。
【００８３】
【化７】
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インフルエンザウィルス株の８個のセグメントにおける網羅範囲の深度を図１１および１２に示す。これから、本発明の方法は、８個のセグメントのそれぞれから抽出を行うことが示される。
【００８４】
種々の開始ＲＮＡ量における本発明の方法の性能を評価するために、高品質読み取りデータ、ＢＬＡＳＴ陽性読み取りデータ、およびＢＬＡＳＴ陽性高品質読み取りデータのパーセンテージを比較した。これらのデータから、配列決定方向によらず、１０、２０、５０、または２００ｎｇの開始材料において、類似の結果が得られることが示された（表３および図１４）。
【００８５】
【化８】
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【００８６】
【化９】
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表３：１０、２０、５０、または２００ｎｇの開始ＲＮＡから得られた配列決定結果。配列決定は、５’から３’方向（Ａ；上段４列）、および３’から５’方向（Ｂ；下段４列）に行った。ＨＱ：高品質読み取りデータ；Ｂｌａｓｔ＞３５ｎｔ：既知のインフルエンザウィルスＡ株配列に対し、３５ヌクレオチドを超える、陽性ＢＬＡＳＴヒットを有する高品質読み取りデータ。％ＨＱ  ＢＬＡＳＴ＞３５ｎｔ：既知のインフルエンザウィルスＡ株配列に対し、３５ヌクレオチドを超える、陽性ＢＬＡＳＴヒットを有する高品質読み取りデータのパーセンテージ。このデータの一部は、図１４にグラフとして表される。
【００８７】
本発明の他の実施態様および用途も、ここに開示される本発明の明細書および実施例を考察することによって当業者には明白となろう。その理由が何であれ、本明細書で注記した特許、特許出願、および他の参考文献はすべて、参照することにより特に本明細書に含められる。本明細書および実施例は、単に例示のためであり、本発明の真の範囲および精神は、下記の特許請求項によってのみ示されるものと考えなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
下記の詳細な説明は、例示のために示されるものであって、説明される特定の実施態様に本発明を限定することを意図するものではないが、その説明は付属の図面と組み合わせることによって理解が促進されよう。なお、参照することにより図面を本説明に含める。
【図１】図１は、アダプター（ＡおよびＢ）の、１本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ）に対する方向性連結の一実施態様を示す。各アダプターは、ｓｓｃＤＮＡにアニールするように設計された１本鎖部分を持つ比較的長いオリゴヌクレオチドと、ｓｓｃＤＮＡの３’および５’末端に連結される比較的短いオリゴヌクレオチドから成る。
【図２】図２は、Ｔｓｅｑ（転写物配列決定用）ライブラリー調製の一実施態様を示す。
【図３】図３は、肝臓ｃＤＮＡライブラリーの配列読み取りの５’から３’分布の一実施態様を示す。図は、長さが５０００ヌクレオチドを超える転写物においても、Ｔｓｅｑ読み取りの均一な分布が得られることを示す。
【図４】図４は、一つの可能なプライマー配列を示す。“Ｎ”は任意の塩基を表し、“Ｖ”は、Ｔ以外の任意の塩基（すなわち、“Ｖ”は、ａ、ｇ、またはｃを表す）を表す。
【図５】図５は、図４のプライマーによって生成されるｃＤＮＡに対する３’アダプターのアニーリングを示す。
【図６】図６は、Ｔｓｅｑアダプター構造のいくつかの実施態様を示す。
【図７】図７は、インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株から得られたウィルスＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの記録トレースを示す。ピークの上の数は、ヌクレオチド数で表した近似サイズを表す。２５ｂｐのピークは、サイズの内部標準を表す。
【図８】図８は、インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株由来ウィルスＲＮＡの、断片化前（青色トレース）および断片化後（緑色トレース）における、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの記録トレースを示す。赤色トレースは標準サイズマーカーを表す。２５ｂｐのピークは、サイズの内部標準を表す。
【図９】図９は、インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株由来ウィルスＲＮＡから得られたｓｓｃＲＮＡの、特異的３’および５’アダプターに対する連結前における、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの記録トレース（赤色）を示す。赤色トレースは標準サイズマーカーを表す。２５ｂｐのピークは、サイズの内部標準を表す。
【図１０】図１０は、インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株由来ウィルスＲＮＡから得られたｄｓｃＤＮＡの、１８サイクルの増幅後（図１０Ａ）、および２５サイクルの増幅後（図１０Ｂ）における、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの記録トレースを示す。２５ｂｐのピークは、サイズの内部標準を表す。
【図１１Ａ】図１１は、インフルエンザウィルスＲＮＡのセグメント１〜４について得られた配列網羅範囲の深度のプロットを示す。
【図１１Ｂ】図１１は、インフルエンザウィルスＲＮＡのセグメント１〜４について得られた配列網羅範囲の深度のプロットを示す。
【図１１Ｃ】図１１は、インフルエンザウィルスＲＮＡのセグメント１〜４について得られた配列網羅範囲の深度のプロットを示す。
【図１１Ｄ】図１１は、インフルエンザウィルスＲＮＡのセグメント１〜４について得られた配列網羅範囲の深度のプロットを示す。
【図１２Ａ】図１２は、インフルエンザウィルスＲＮＡの、三つの異なるセグメントについて得られた配列網羅範囲の深度のプロットを示す。
【図１２Ｂ】図１２は、インフルエンザウィルスＲＮＡの、三つの異なるセグメントについて得られた配列網羅範囲の深度のプロットを示す。
【図１２Ｃ】図１２は、インフルエンザウィルスＲＮＡの、三つの異なるセグメントについて得られた配列網羅範囲の深度のプロットを示す。
【図１２Ｄ】図１２は、インフルエンザウィルスＲＮＡの、三つの異なるセグメントについて得られた配列網羅範囲の深度のプロットを示す。
【図１３】図１３は、それぞれ、開始インフルエンザウィルスＲＮＡ１０、２０、５０、または２００ｎｇから構築されるｄｓｃＤＮＡライブラリーのサイズ分布および相対的核酸量を示す、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの記録トレースを示す。２５ｂｐのピークは、サイズの内部標準を表す。
【図１４Ａ】図１４は、１０ｎｇ（青色）または２００ｎｇ（赤色）の開始ＲＮＡから得られた配列網羅範囲の深度のプロットを示す。データは、それぞれ、Ａセット（上段：開始ＲＮＡの５’から３’に向かって配列決定）およびＢセット（下段：３’から５’に向かって配列決定）の両方についてプロットされる。このデータを、表３にも示す。このプロットから、低いインプット（１０ｎｇ）の開始ＲＮＡからも、高いインプット（２００ｎｇ）の開始ＲＮＡからも、ほぼ等しい抽出パターンが得られることが明らかになった。
【図１４Ｂ】図１４は、１０ｎｇ（青色）または２００ｎｇ（赤色）の開始ＲＮＡから得られた配列網羅範囲の深度のプロットを示す。データは、それぞれ、Ａセット（上段：開始ＲＮＡの５’から３’に向かって配列決定）およびＢセット（下段：３’から５’に向かって配列決定）の両方についてプロットされる。このデータを、表３にも示す。このプロットから、低いインプット（１０ｎｇ）の開始ＲＮＡからも、高いインプット（２００ｎｇ）の開始ＲＮＡからも、ほぼ等しい抽出パターンが得られることが明らかになった。
【図１５】図１５は、１本鎖アダプターが、開始断片化ＲＮＡの５’および３’末端に連結される、本発明のｃＤＮＡライブラリー調製法の一実施態様を示す。
【図１６】図１６は、本発明のｃＤＮＡライブラリー調製法の一実施態様を示す。この実施態様では、１本鎖アダプターが、開始断片化ＲＮＡの３’末端に連結され、逆転写後、１本鎖５’末端アダプター（Ｂ）が付加される。
【図１７】図１７は、本発明のｃＤＮＡライブラリー調製法の一実施態様を示す。この実施態様では、部分的に２本鎖のアダプターが、開始断片化ＲＮＡの３’末端に連結され、逆転写後、部分的に２本鎖の５’末端アダプター（Ｂ）が付加される。
【図１８Ａ】図１８（ＡおよびＢ）は、本発明のｃＤＮＡライブラリー調製法の一実施態様を示す。この実施態様では、開始ＲＮＡは、逆転写前に断片化する必要がない。ランダムまたはセミランダムプライマーを用いてＲＮＡを逆転写し、得られたｓｓｃＤＮＡに対し、連結によってＡ’およびＢを付加する。
【図１８Ｂ】図１８（ＡおよびＢ）は、本発明のｃＤＮＡライブラリー調製法の一実施態様を示す。この実施態様では、開始ＲＮＡは、逆転写前に断片化する必要がない。ランダムまたはセミランダムプライマーを用いてＲＮＡを逆転写し、得られたｓｓｃＤＮＡに対し、連結によってＡ’およびＢを付加する。
【図１９】図１９は、本発明のＤＮＡライブラリー調製法の一実施態様を示す。この実施態様では、アダプター付着ＤＮＡライブラリーが、開始ＤＮＡから得られる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年4月17日(2008.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に分子生物学に関し、詳細には、ｃＤＮＡライブラリーおよびＤＮＡライブラリーの作製に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
配列決定による従来の転写物プロファイリング法は、全長ｃＤＮＡクローンのＳａｎｇｅｒ式配列決定法、および／または各ｍＲＮＡの５’末端または３’末端の小「タグ」の配列決定に限定される。これらの配列決定法は、手間がかかり、その広範な適用は、技術的制限によって阻まれている。
【０００３】
一般に、ｍＲＮＡの配列決定法は、ｃＤＮＡライブラリーの作製、およびｃＤＮＡライブラリーの挿入体の配列決定を含む。高速配列決定に好適な形でｃＤＮＡライブラリーを作製することは、いくつかの技術的に困難な工程を伴う、長い、退屈なプロセスである。要約すれば、細胞からｍＲＮＡを単離するための通常手順は、（１）細胞の破壊による細胞内容物の放出、（２）細胞からの全体ＲＮＡの単離、（３）抽出されたＲＮＡにオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを通過させることによるｍＲＮＡ集団の選択と、（４）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を用いてｃＤＮＡ第１鎖を合成することによるＲＮＡからのｃＤＮＡの合成、（５）ｃＤＮＡからの第２鎖の合成、すなわち、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）ｐｏｌ  Ｉクレノウ断片による２本鎖ｃＤＮＡの生成、（６）２本鎖ｃＤＮＡのベクターへのクローニング、および（７）宿主（例えば、細菌）に対するベクターのトランスフェクション、を必要とする。ＲＮＡが存在する全ての段階において、調製標本が、ＲＮＡを破壊する可能性のある、活性リボヌクレアーゼ酵素と接触することがないよう十分な注意が必要とされる。リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）酵素はきわめて安定であるので、ｍＲＮＡ調製標本の中にごく少量でも活性酵素が存在するならば、それは、ＲＮＡ分解のような問題を引き起こすことになる。ｃＤＮＡクローニング過程の目的は、遺伝子の全コード配列を含む「全長」ｃＤＮＡクローンを獲得することにあるのであるから、ｍＲＮＡの完全性を維持する手順を用いることはきわめて重要である。
【０００４】
ｃＤＮＡライブラリーの５’末端の低い抽出度は、従来技術に内在する限界であるが、いくつかの要因によってもたらされる。もっとも重要な要因の一つは、逆転写酵素による伸長過程におけるランダムな中断である。逆転写酵素が、ｍＲＮＡの３’から５’末端に向かって移動するにつれて、逆転写酵素の一定のパーセンテージがＲＮＡ鋳型から解離し、これが、ｃＤＮＡ合成の早すぎる停止を招く。もう一つの寄与要因は、逆転写酵素の、ｍＲＮＡ二次構造の複数の領域における休止、減速、または停止である。さらに、３’末端バイアスは、ｍＲＮＡの５’末端を分解によって除去する夾雑するＲＮアーゼによっても導入される。これらの要因の累積結果は、従来のｃＤＮＡライブラリーでは、ｍＲＮＡの３’末端の方が、５’末端に近い配列よりも、統計的により多く抽出される可能性が高いということになる。この３’バイアスは、長い転写物ではさらに強調される。なぜならば、転写物が長ければ長いほど、３’バイアス要因のそれぞれに対する感受性がより高くなるからである。
【０００５】
従来のｃＤＮＡライブラリー産生技術の、さらに別の欠点として、ライブラリーを増幅するためにクローニングベクターおよび宿主細胞を使用することが挙げられる。宿主ベクターの複製、および／または宿主細胞／ウィルスの増殖は、ｃＤＮＡ挿入体によって影響されることがあり、細菌またはウィルス性のｃＤＮＡライブラリーではある種の配列の抽出度が低くなる可能性がある。例えば、ｃＤＮＡが宿主細胞で複製される場合、長いｃＤＮＡ、および、多くの反復列または二次構造の可能性を持つｃＤＮＡは、再編成されたり、またはその抽出度が低くなることがある。さらに、ｃＤＮＡが致死性遺伝子をコードしている場合、宿主におけるその増殖が危うくなる可能性がある。さらに、ｃＤＮＡライブラリーが、大腸菌ｃＤＮＡライブラリーのような、一般的宿主細胞由来ものである場合、宿主細胞のＲＮＡが結果を汚染する可能性がある。全く宿主細胞を用いない方法は、この問題を回避することが可能である。
【０００６】
一般に、例えば、ウィルス、または小組織または細胞サンプルを用いる作業では、開始ＤＮＡまたはＲＮＡの利用可能な量はきわめて限定される（例えば、ナノグラムの桁である）。このような限定量の開始材料からＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを調製することはきわめて困難であり、現在用いられている方法では不可能ですらある場合がある。したがって、少量の開始核酸から高品質のＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを調製することを可能とする方法が従来技術において求められている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、開始ＲＮＡ（または、開始ＲＮＡ集団）を断片化すること、断片化された開始ＲＮＡにプライマーを付着させ、該ＲＮＡから１本鎖ｃＤＮＡを合成すること、および、この１本鎖ｃＤＮＡの両端にアダプター配列を連結することによって１本鎖ｃＤＮＡライブラリーを形成する新規方法を提供する。５’および３’末端に既知のアダプター配列を含む、得られる１本鎖ｃＤＮＡは、方向性情報を保持するので、ベクターまたは宿主細胞にクローンすることを要せずに、何らかの自動配列決定システム、例えば、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｒａｎｆｏｒｄ，コネチカット州によって開発された配列決定システムを用いて自動配列決定するのに好適である。
【０００８】
本発明の一実施態様は、開始ＲＮＡから１本鎖ＤＮＡライブラリー（例えば、ｃＤＮＡライブラリー）を生成するための方法を主題とする。この方法は、ＲＮＡを断片化して断片化ＲＮＡを産生する第１工程を含む。この断片化は、サイズが１００塩基と１０００塩基の間、例えば、１５０塩基から５００塩基の間のサイズを持つＲＮＡ断片を産生するように最適化されてもよい。ある最適工程では、公知の技術、例えば、ゲル電気泳動、またはクロマトグラフィーを用いて、ＲＮＡ断片をサイズ分画してもよい。このサイズ分画によって、１００から１０００塩基の間、または１５０から５００塩基の間のＲＮＡが産生されてもよい。
【０００９】
断片化後、断片化ＲＮＡは、該断片化ＲＮＡに対し複数部位において付着し、そこから伸長することが可能な複数のプライマーにハイブリダイズさせられる。このことは、第１プライマーが、そのハイブリダイゼーション領域にランダム配列を含み、かつ、そのようなプライマーの集団が、任意の配列にハイブリダイズすることが可能なメンバーを含むように選ばれている場合、可能となる。このハイブリダイズしたプライマーは、逆転写酵素によって伸長され、１本鎖ｃＤＮＡを形成する。１本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ）の合成後、このＲＮＡは、変性条件、ＮａＯＨ加水分解、熱処理、またはＲＮアーゼ処理によって除去されてもよい。ＲＮＡの除去後、第１ＤＮＡアダプターを、ｃＤＮＡの５’末端に連結させてもよい。好ましい実施態様では、第１アダプターは、２本鎖部分の外に、ｓｓｃＤＮＡの５’末端に対して相補的な、オーバーハングした（１本鎖の）５’末端領域を有する。さらに、１本鎖ｃＤＮＡの３’末端に対し相補的な、オーバーハングした３’末端領域を含む第２アダプターを、ｃＤＮＡの３’末端に連結させてもよい。
【００１０】
【化１】
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なお、注意すべきことは、ｃＤＮＡの５’末端における第１アダプターの連結が不要であることである。さらに、第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーは、非ランダム５’部分を組み込むように設計することも可能である。この非ランダム５’部分は、第１アダプターの配列を有してもよい（サンプルアダプターの配列については図２を参照）。結果として得られるいずれのｃＤＮＡも、既に５’末端に所望の配列を有すると考えられるので、５’末端に対する第１アダプターの追加の連結は不要である。
【００１１】
第１および第２アダプターは、ｃＤＮＡに対し同時に連結させてもよいし、あるいは、任意の時間順序で連結させてもよい。さらに、第１アダプター、第２アダプター、または両方とも、精製用として、結合ペアのメンバーを含んでもよい。結合ペアは、互いに特異的結合性を示す任意の二つの分子、例えば、ＦＬＡＧ／ＦＬＡＧ抗体、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、受容体／リガンド、抗原／抗体、受容体／リガンド、ポリＨＩＳ／ニッケル、タンパクＡ／抗体およびその誘導体であってもよい。結合ペアは、第１または第２アダプターのどちらか一方の鎖に付着させてもよい。さらにアダプターの両方の鎖が、結合ペアの同じメンバー（例えば、二つのビオチン）によって標識されてもよい。次に、第１および第２アダプターに連結される、１本鎖ｃＤＮＡが精製されてｃＤＮＡライブラリーを形成する。
【００１２】
ｓｓｃＤＮＡの精製は、ｃＤＮＡの方がアダプターまたはプライマーよりも長いので、サイズ分画によって実行してもよい。ｃＤＮＡが、結合ペアの一方のメンバー（例えば、後述のようにビオチン）に付着している場合、固相支持体に付着する結合ペアの第２メンバー（例えば、ストレプトアビジン、アビジンなど）を用いることによって精製することが可能である。
【００１３】
複数のプライマーは、既知の配列内容を持つ一つ以上の非ランダムプライマー塩基を含むセミランダムプライマーであってもよい。例えば、プライマーは１０塩基長であって、その内、第１塩基（５’末端から数えて）および第４塩基は既知の配列を持ち（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＵ）、その他の塩基（塩基２、３、および５〜１０）は、未知の配列を持ってもよい。好ましい一実施態様では、第１アダプターは、前記複数のプライマーの非ランダム塩基に対し相補的な１本鎖領域を含む（図１、アダプターＡを参照）。
【００１４】
複数のプライマーはさらに、セミランダムであって、非ランダム塩基が、あるサブセットの発現配列のメンバー、例えば、対象とする遺伝子ファミリーのメンバーに対して優先的に、または特異的にアニールするように設計されていてもよい。複数のプライマーはさらに、非ランダムであってもよい、すなわち、配列特異的であってもよい。プライマーが、特異的で、非ランダムな配列を有する場合、それらのプライマーは、得られるＤＮＡまたはｃＤＮＡを、特定の発現配列またはゲノム領域に、あるいは、関連発現配列またはゲノム領域の二つ以上のメンバーに偏向させる可能性がある。本発明の方法のいずれにおいても、オリゴヌクレオチドにおける任意のランダム塩基位置（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＵ）は、イノシン（Ｉ）、すなわち、一般塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＵのいずれともペアを形成することが可能な塩基によって占められてもよい。
【００１５】
ここに特許を請求する本発明の一利点は、ｃＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーが、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、クレノウ、ｐｏｌ  Ｉ）を用いることなく作製することが可能であるということである。すなわち、本法は、一つのポリメラーゼ、すなわち、逆転写酵素を用いるだけで実行が可能である。本発明のもう一つの利点は、ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーが、核酸の増幅工程なしに作製可能であるということである。
【００１６】
本発明はさらに、開示の方法によって産生される、増幅されない１本鎖ｃＤＮＡライブラリーを含む。さらに、本発明のライブラリーは、サブトラクション・ライブラリー、例えば、ｃＤＮＡサブトラクション・ライブラリーを産生するために使用してもよい。
【００１７】
必要であれば、ｓｓｃＤＮＡは、アダプターの連結後、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｐｏｌ  Ｉまたはクレノウポリメラーゼを加えることによって２本鎖としてもよい。本法ではこの工程は不要であるが、この工程を用いて、クローニング、またはその他の目的のために２本鎖ｃＤＮＡライブラリーを作製してもよい。
【００１８】
これらおよびその他の実施態様は、下記の詳細な説明において開示されるか、または下記の詳細な説明から明白であり、詳細な説明の中に含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
別様に定義しない限り、本明細書に使用される技術および科学用語は全て、本発明の関係する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実行には、本明細書に記載されるものと類似の、または等価的な、いくつかの方法および材料の使用が可能であるが、本明細書では、好ましい材料および方法が記載される。
【００２０】
本発明の方法は、既存のｃＤＮＡライブラリー産生法に優るいくつかの利益および利点を提供する。そのような利点として、（１）初期のｍＲＮＡ必要量の少ないこと（すなわち、５ｎｇから５００ｎｇ、典型的初回量は１０ｎｇから２００ｎｇ）、（２）従来のｃＤＮＡライブラリー産生法および配列決定法に比べ３’バイアスが排除されること、（４）調製の全体手間がより少なく処理過程が高速であること、（５）配列決定する材料のクローニングおよび増幅が除かれること、および、（６）ｃＤＮＡ産生プロセスの全体を通じて方向性情報（センスまたはアンチセンス方向）が保持されること、が挙げられる。
概観
本発明の方法は、得られるｃＤＮＡライブラリーが、全ての転写物のタイプについて含まれる３’バイアスが顕著に低減されるという点で、従来のｃＤＮＡ配列決定プロトコールに優る顕著な改良点を提供する。ここに提供される方法は、開始ＲＮＡを均一なサイズ範囲（１５０から５００ヌクレオチド）に断片化し、そうすることによって、逆転写酵素による早すぎる終結を招くことなく逆転写することを可能とし、それによって逆転写酵素の処理能力に関する内在的問題を解決する。開始ＲＮＡがｍＲＮＡである場合、断片は、サンプルに抽出される転写物それぞれの長さをランダムに持つと考えられる。次に、この断片化ＲＮＡプールに対し、セミランダムプライマー（５’−Ｐ−ＴＮＮＴＮ６−３’）によって駆動される逆転写酵素反応を実行する。
【００２１】
このセミランダムプライマーを用いることによって、様々なｍＲＮＡ断片の全てについて均一なランダム逆転写が行われるが、そして、これが重要であるが、この技術は、ＲＮＡ（例えば、転写物）の５’末端に対し３’末端を優先することをしない。プライマーは、二つの理由でセミランダムとなるように設計される。第１に、ランダム性によって、ＲＮＡプール内の全ての断片に対しプライマー付着させることができるので、各転写物を完全にカバーすることが可能となる。第２に、プライマーのＴＮＮＴ部分（図１）を、その後の連結反応において方向性アンカー部位として使用することが可能である。
【００２２】
本法の一利点は、従来行われる、２本鎖ｃＤＮＡ作製のための第２鎖合成が実行されないということである。これは時間を節約し、さらに、インビトロ核酸合成によるアーチファクトを回避する。その代わりに、ｓｓｃＤＮＡに対し順行アダプター（またはＡ−アダプター）または逆行アダプター（またはＢ−アダプター）を付着させるために、連結反応が実行される。このＡおよびＢアダプターは、任意の下流配列決定プロトコールに対し方向性情報を提供する（図１）。
【００２３】
このアダプターセット（すなわち、ＡおよびＢアダプター）は、順行および逆行アダプターの方向性連結を可能とし、順行アダプターが、ｓｓｃＤＮＡ分子の５’末端に、逆行アダプターが、同ＤＮＡ分子の３’末端に付着されるように設計される。連結に用いられる各アダプターセットは、相補的な二つのプライマーから構成されるが、ただし、プライマーの内の一方は他方よりも長く、そのためオーバーハング・セグメントを生じる。連結反応に用いられるアダプターユニットの模式図を図１に示す。長い方のプライマーの非相補的部分は、ｓｓｃＤＮＡ分子にアニールするアンカー（固着）ユニットとして使用される。一旦この固着が実行されると、短い方のプライマーも、ｓｓｃＤＮＡの５’または３’末端に連結することが可能になる。ｓｓｃＤＮＡに対するアダプターユニットの方向性アニーリング、および連結の行われる場所を示す模式図を図１に示す。
【００２４】
非連結材料から連結ｓｓｃＤＮＡを単離するには、多くの方法の利用が可能である。好ましい一方法では、アダプターの一方または両方が、長鎖（非連結鎖）においてビオチン標識されてもよい。市販のストレプトアビジン磁気ビーズ、例えば、ＭｙＯｎｅ（Ｄｙｎａｌ）を用いて、連結反応から連結分子を単離する。磁気ビーズから非連結材料を洗い流した後、ｓｓｃＤＮＡ分子を融解して切り離す。このことは、アダプターの非連結鎖のみがビオチン化されているために可能となる。この融解によって、ｃＤＮＡに連結した連結鎖が分離され、連結鎖−ｃＤＮＡ構造が溶液に放出される。このｓｓｃＤＮＡを溶液から単離し、ただちに配列決定される最終的ｓｓｃＤＮＡライブラリーを生成するようにしてもよい。溶液からｓｓｃＤＮＡを精製するには多くの方法が知られる。ある実施態様では、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００カラムが精製のために使用される。ある好ましい実施態様では、ｓｓｃＤＮＡは、ＲＮＡｃｌｅａｎ（Ａｇｅｃｏｕｒｔ）によって精製される。これは、アダプターの非連結プライマーだけでなく、大部分のごく微小な断片を除去するのにも役立つ。
【００２５】
一実施態様では、Ｂアダプターがビオチン標識される。これによって、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを用いることによって、非連結ｓｓｃＤＮＡからばかりでなく、非連結アダプターからも、連結ｃＤＮＡ分子を単離することが可能になる。ｓｓｃＤＮＡはビーズから融解され、クリーンアップ工程を経て最終的ｓｓｃＤＮＡライブラリーを生成する。次に、このライブラリーは定量され、直接的配列決定に適切な濃度に希釈される。直接的配列決定は、例えば、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの配列決定プロトコールおよび装置を用いて実行してもよい。４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの技法を用いて配列決定することが好ましいが、この配列決定は、任意の技術、例えば、クローニングおよび手動による配列決定から成る従来技術を含む技術を用いて実行することが可能である。このような手動による配列決定法としては、マクサムギルバート配列決定法、サンガー配列決定法、合成配列決定法、例えば、ピロ配列決定法が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。もう一つの配列決定法は、ｓｓｃＤＮＡのどちらか一端の既知配列に対してハイブリダイズするように設計されたプライマー（すなわち、ＡアダプターおよびＢアダプター領域）を用いて個別のｓｓｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を行い、次いで配列決定することを含む。
【００２６】
ＲＮＡライブラリー生成の方策に関する概観を呈示したので、次に本発明の方法の個別の工程をさらに詳しく説明する。
開始ＲＮＡ
本発明の方法は、少なくともメッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、ウィルスＲＮＡ、およびｍｉｃｒｏ  ＲＮＡを含む、任意の天然または合成ＲＮＡの配列決定のために使用してよい。一つの好ましいＲＮＡ供給源は細胞ＲＮＡである。細胞ＲＮＡは、既知の方法、例えば、８ＭグアニジニウムＨＣｌ、またはＴｒｉｚｏｌ試薬使用の単離法によって単離してよい。当業者であれば、ＲＮＡ処理のために一般的に使用される技術、例えば、対象とするＲＮＡに接触する全ての溶液にジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水を使用することなどに精通する。ＲＮＡは、ポリ（Ａ）濃縮されていてもよいが、そうである必要はない。ポリ（Ａ）濃縮ＲＮＡが所望であるなら、ポリ（Ａ）ＲＮＡを生成する任意の方法を用いて獲得することが可能である。そのような方法として、例えば、オリゴ（ｄＴ）セルロース基質の上にポリ（Ａ）ＲＮＡの溶液を流して、結合させ、基質から未結合ＲＮＡを洗い流し、低イオン強度バッファー（低塩濃度バッファー）を用いて基質からポリ（Ａ）ＲＮＡを放出する方法が挙げられる。ポリ（Ａ）ＲＮＡを単離する、その他の方法としては、オリゴ（ｄＴ）結合磁気媒体、例えば、オリゴ（ｄＴ）をプライマー付着させた磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）の使用が挙げられる。
ＲＮＡの断片化
開始ＲＮＡは、従来技術で公知の任意の方法、例えば、機械的せん断、超音波処理、および噴霧処理を含む方法によって断片化してよい。
【００２７】
なお、断片化は、任意に選択される工程である。本発明の方法は、ＲＮＡを断片化することなく実行してもよい。
【００２８】
さらに、本発明の方法は、断片化されたものであれ、断片化無しで産生されたものであれ、１０塩基、２０塩基のＲＮＡから始め、１ｋｂ、１０ｋｂ以上のＲＮＡに至るまで、任意のサイズのＲＮＡに適用することが可能である。ＲＮＡサイズの上限は、ＲＮＡ逆転写酵素の処理能力に依存する。この上限は、新規ＲＮＡ逆転写酵素の発見、または、さらに高い処理能力を持つ遺伝子工学的に加工された逆転写酵素の出現によって上昇することが期待される。比較的低いサイズ範囲に入るＲＮＡの例としては、ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ、および断片化または分解されたＲＮＡが挙げられる。
【００２９】
開始ＲＮＡを断片化するための好ましい一つの方法は、カリウムおよびカルシウムイオン存在下におけるｍＲＮＡの熱誘発性断片化である。簡単に言うと、ＲＮＡを、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテート、１００ｍＭ酢酸カルシウム、および３１．５ｍＭ酢酸マグネシウムの溶液に移し、８２℃で、所望量の断片化が得られるまでインキュベートする。我々の知見では、上に参照したＴｒｉｓ／酢酸カリウム／酢酸マグネシウム溶液では、ＲＮＡを約１５０から５００塩基のサイズに短縮するのに２分のインキュベーションで十分であった。断片化は、例えば、ゲル電気泳動、またはＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によってモニタリングしてもよい。もちろん、様々な環境に断片化技術を適応させるためには、イオン濃度、インキュベーション温度、および時間調節も必要となる場合がある。
【００３０】
断片化後、ＲＮＡは、公知の技術を用いて精製してよい。ＲＮＡ精製の一方法は、ＲＮＡサンプルを脱塩することである。脱塩は、市場の供給業者、例えば、Ｑｉａｇｅｎから販売されるキット（例えば、スピンカラム）を用いて実現してもよい。
１本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ）の合成
断片化後、逆転写酵素を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する。好ましい一実施態様では、第１鎖ｃＤＮＡ合成は、配列５’−Ｐ−ＴＮＮＴＮＮＮＮＮＮ−３’を有するセミランダムプライマーを用いて実行する。上の配列において、Ｎはランダム配列（Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）を表し、Ｐは５’リン酸塩である。プライマーは、３’ＮＮＮＮＮＮ領域を用い断片化ｍＲＮＡに対しランダムに付着するように設計される。このポリ（Ｎ）領域は、６塩基長であることが好ましいが、７塩基、８塩基、９塩基、または１０塩基のポリ（Ｎ）領域も考えられる。プライマーはさらに、その後の、順行アダプターの方向性連結のために使用されてもよいアダプター配列（５’−ＴＮＮＴ−３’）を含む。本明細書に開示されるプライマーの配列は、例示のために用いられるものであること、プライマー配列ＴＮＮＴＮＮＮＮＮＮの二つのＴは、既知の任意の二つの塩基によって置換されてもよいことが理解される。例えば、本発明の実施に当たり、下記のプライマーも同様に作動する。すなわち、ＡＮＮＡＮＮＮＮＮＮ、ＧＮＮＧＮＮＮＮＮＮ、ＣＮＮＣＮＮＮＮＮＮ、ＡＮＮＧＮＮＮＮＮＮ、ＡＮＮＣＮＮＮＮＮＮ、ＡＮＮＴＮＮＮＮＮＮ、ＧＮＮＡＮＮＮＮＮＮ、ＧＮＮＣＮＮＮＮＮＮ、ＧＮＮＴＮＮＮＮＮＮ、ＣＮＮＡＮＮＮＮＮＮ、ＣＮＮＧＮＮＮＮＮＮ、ＣＮＮＴＮＮＮＮＮＮ、ＴＮＮＡＮＮＮＮＮＮ、ＴＮＮＧＮＮＮＮＮＮ、およびＴＮＮＣＮＮＮＮＮＮである。
【００３１】
本発明のプライマー、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、および核酸塩基のいずれも、従来技術で公知の一つ以上の化学的修飾および置換、例えば、ホスホロチオエート置換、修飾糖成分、例えば、２’−Ｏ−メチル、または２’−Ｏ−エチル置換糖、化学発光または蛍光標識、例えば、ただしこれらに限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ローダミン、フルオレセイン、および、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから市販されるＡｌｅｘａタグ、質量タグ、ブロッキングまたは保護基、ビオチンなどのハプテンを含んでもよい。
【００３２】
前述のように、（アダプターＡ）−ＮＮＮＮＮＮから成る特異的な配列領域を有する５’プライマーの使用も考慮の対象となる。その５’末端にアダプター配列を有するこのようなプライマーは、その後の、第１アダプターの連結を不要にすると考えられる（すなわち、一連結工程を省く）。このようなプライマーによるｃＤＮＡ合成の後では、３’アダプターの連結だけが必要とされる。プライマーおよび逆転写酵素を用いて、断片化された開始ＲＮＡからｓｓｃＤＮＡを合成してもよい。アダプターの配列は、例えば、図２に見出される。
アダプターの連結
第１鎖の合成後、ｓｓｃＤＮＡを精製し、連結反応に移行して、その５’および３’末端にアダプター配列を付加する。アダプターは、ある一定の方向性でｓｓｃＤＮＡにハイブリダイズし、連結するように（例えば、アダプターＡはｓｓｃＤＮＡの５’末端に、アダプターＢは３’末端に連結するように、図１参照）設計された、部分的１本鎖領域を有する短い核酸である。サンプルアダプターの構造を図６に示す。
【００３３】
アダプターＡは、オーバーハングした５’１本鎖領域を有する２本鎖ＤＮＡであってもよい。例えば、部分的１本鎖と、部分的２本鎖であるアダプターＡは、下記の配列を含んでもよい。
【００３４】
【化２】
2009508495.tif 000041
３’ジデオキシは、この鎖が、別の核酸に連結するのを阻止する。
【００３５】
この配列は、配列
【化２−Ａ】
2009508495.tif 000042
のプライマーから伸長して作製されたｓｓｃＤＮＡの５’領域に特異的にハイブリダイズする（図１参照）。前述したように、アダプターＡの下線塩基は、プライマー配列の下線塩基に対し相補的となるように設計される。さらに別の具体例として、プライマー配列が
【化２−Ｂ】
2009508495.tif 000043
である場合は、アダプターＡは下記の配列を持たなければならない。
【００３６】
【化３】
2009508495.tif 000044
アダプターＢは、オーバーハングした３’領域を有する任意の２本鎖ＤＮＡであってもよい。例えば、アダプターＢは、下記の配列を持ってもよい。
【００３７】
【化４】
2009508495.tif 000045
このアダプターは、任意の１本鎖ＤＮＡの３’末端にハイブリダイズすることが可能であり、アダプターＢの短い方の鎖は、１本鎖ＤＮＡに連結することが可能である。
【００３８】
なお、図、および本開示の本文に示すジデオキシは、核酸の連結を阻止するためのブロッキング基を表す。これらのジデオキシ基は、機能的に等価な、任意のブロッキング基（すなわち、核酸鎖の連結を阻止することが可能なブロッキング基）と置換してもよい。それとは別に、ブロッキング基は使用しなくともよい。
【００３９】
アダプターＡおよびアダプターＢの２本鎖領域は、ランダム配列を含む任意の配列を含んでよい。好ましい実施態様では、アダプターＢは、その２本鎖領域の中に、制限酵素切断部位、配列既知のプライマー部位、またはその両方を含んでもよい。
【００４０】
より好ましい実施態様では、アダプターＡおよびアダプターＢの２本鎖領域は、プライマーのその後の精製のために、結合ペア−結合性成分の一方のメンバーを含んでもよい。アダプターＡおよびアダプターＢのそれぞれが、２本鎖において、１本鎖核酸と連結することが可能な鎖、および、連結するが可能ではない鎖（本明細書では、「連結鎖」および「非連結鎖」と呼ばれる２本鎖）を含む。好ましい実施態様では、アダプターＡまたはアダプターＢの非連結鎖は、結合ペアの一方のメンバー、例えば、ビオチンを含む。有用な結合ペアとしては、例えば、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ポリＨＩＳ領域／ＮＴＡ、ＦＬＡＧ／抗ＦＬＡＧ抗体、抗原／抗体または抗体断片などが挙げられる。精製は、コンカテマーの形成、例えば、プライマー・ダイマーの形成を顕著に低減する。
【００４１】
アダプターの連結後、１本鎖ｃＤＮＡライブラリーの生成は完了する。このｃＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリーを必要とする、任意の分子生物学的手法のために使用することが可能である。
【００４２】
一実施態様では、ｃＤＮＡは、単一組織のＲＮＡから産生される。別の実施態様では、ｃＤＮＡは、複数の組織、１種以上の細胞、体液、１種以上の生物体、環境サンプル、バイオフィルム、１種以上の細菌、１種以上の古細菌、１種以上の真菌、１種以上の植物、１種以上の動物、一人以上のヒト、ウィルス、レトロウィルス、ファージ、寄生虫、腫瘍または腫瘍サンプル、および／または生物標本のＲＮＡから産生されてもよい。全体ｃＤＮＡライブラリーの配列を決定することにより、研究者は、単一細胞、または単一組織における各遺伝子の発現レベルを定量すること（すなわち、転写プロファイリング）が可能になる。好ましい実施態様では、配列決定は、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから市販される方法および装置を用いて実行される。核酸の直接的配列決定法は、同時係属中の、２００４年１月２８日出願の米国特許出願第１０／７６７，７７９号；２００３年６月６日出願の米国特許仮出願第６０／４７６，６０２号；２００３年６月６日出願の米国特許仮出願第６０／４７６，５０４号；２００３年１月２９日出願の米国特許仮出願第６０／４４３，４７１号；２００３年６月６日出願の米国特許仮出願第６０／４７６，３１３号；２００３年６月６日出願の米国特許出願仮第６０／４７６，５９２号；２００３年４月２３日出願の米国特許出願仮第６０／４６５，０７１号、および、２００３年８月２５日出願の米国特許仮出願第６０／４９７，９８５号に記載されている。
生成されたｃＤＮＡライブラリーの精製
ｓｓｃＤＮＡは、任意の選択工程において精製されてもよい。一精製法はサイズ選択による。開始ＲＮＡから生成されるＲＮＡ断片は、サイズが１００塩基から１０００塩基、好ましくはサイズが１５０塩基から５００塩基であり、このＲＮＡ断片から生成されるｓｓｃＤＮＡは、同様のサイズを持つことが予想される。このサイズは、アダプターおよびプライマーのサイズよりも大きい。したがって、ｃＤＮＡは、サイズ分画によって精製してもよい。サイズ分画は、カラムクロマトグラフィー（スピンカラムを含む）、または、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル電気泳動、または、ＳＰＲＩビーズ（ＲＮＡｃｌｅａｎ、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）の使用によって実行してもよい。
【００４３】
結合成分が、連結鎖に組み込まれている場合、アフィニティー結合によってｓｓｃＤＮＡを回収してもよい。例えば、未連結のアダプター、および、アダプターの未連結鎖を、熱処理またはアルカリ処理などの変性条件によって除去してもよい。変性処理後、結合ペアの一方のメンバー（例えば、ビオチン）を含む連結ｓｓｃＤＮＡを、結合ペアの他方のメンバー（例えば、アビジン被覆磁気ビーズ）を含む固相支持体に結合させてもよい。洗浄して未結合核酸を除去した後、固相支持体から精製ｓｓｃＤＮＡを分離してもよい。
【００４４】
結合成分が、非連結鎖に組み込まれている場合、結合ペアの一メンバー（例えば、ビオチン）を含む非連結鎖を、結合ペアの他方メンバー（例えば、アビジン被覆磁気ビーズ）を含む固相支持体に結合させて、ｓｓｃＤＮＡを回収してもよい。洗浄後、ｓｓｃＤＮＡを変性条件によって収集してもよい。変性条件下では、非連結鎖にハイブリダイズしたｓｓｃＤＮＡは溶液中に放出されるが、一方、非連結鎖は、固相支持体に結合したままである。したがって、精製ｓｓｃＤＮＡと共に溶液を収集してもよい。
【００４５】
本発明の方法は、種々の用途、例えば、ただしこれらに限定されないが、サブトラクションｃＤＮＡライブラリーの構築、および転写プロファイリング（Ｓｈｉｍｋｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．“Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ  ａ  ｇｅｎｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｑｕｅｒｙ．”Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７（８）：７９８−８０３）を含む用途に使用してよい。
【００４６】
第二の実施態様では、本発明の方法は、転写物計数を主題としてもよい。転写物計数では、第１プライマーは、メッセンジャーＲＮＡのポリＡ尾部にハイブリダイズするように設計される。産生されるｃＤＮＡライブラリーは、ポリＡ尾部付近のｃＤＮＡ配列について濃縮されることが予想される。この方法では、前述の転写物配列決定（ＴＳＥＱ）プロトコールと同様にして断片化される。しかしながら、この場合、ポリＡ単離ＲＮＡを使用することがきわめて好ましい。ｃＤＮＡの第１の（そして、ほとんどの場合唯一の）鎖合成用プライマーは二つの領域を持つ。第１領域は、ポリＡ領域にハイブリダイズするように設計される５’領域である。これは、オリゴｄＴ領域であってもよい。第２領域は、図４ではＶＮで表されるアダプター配列を含む。
【００４７】
さらに別の任意の選択肢として、プライマーは、アダプター配列を含む、さらに別の５’領域を含んでもよい。したがって、プライマーの配列は下記：
５’−（アダプターＡ）−ｔｔｔｔｔｔｔｔｖ−３’（配列番号１）
であってもよい。
【００４８】
より好ましい実施態様では、プライマー配列は下記：
５’−（アダプターＡ）−ｔｔｔｔｔｔｔｔｖｎ−３’（配列番号２）
であってもよい。
【００４９】
本明細書を通じて、“ｖ”は、ａ、ｇ、またはｃである、ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基を表すのに用いられる。言い換えると、ｖは、ｔまたはｕ以外の任意の塩基である。
【００５０】
それとは別に、プライマーは、ライブラリー構築を、ある遺伝子サブセットに偏向させるために、遺伝子特異的、または遺伝子ファミリー特異的配列を含んでもよい。
【００５１】
プライマーがアダプター配列を含まない場合（すなわち、プライマーが、前掲の配列番号１または配列番号２で示した構造を持つが、「アダプターＡ」配列を欠く場合）、このアダプター配列を、ｃＤＮＡ合成後連結させてもよい。
【００５２】
ｃＤＮＡ合成後、アダプターＢおよびアダプターＢ’が相補的配列となる下記：
【００５３】
【化５】
2009508495.tif 000046
のアダプター構造を使用してもよい。このアダプター構造を、ｃＤＮＡの３’末端に連結させてもよい（図５参照）。連結後、一方の鎖はビオチン結合されるので、連結ｃＤＮＡは、ストレプトアビジンカラム、またはストレプトアビジンビーズによって精製が可能であることに注意されたい。
【００５４】
得られたｃＤＮＡは、前述のＴｓｅｑ配列決定と同様の方法で配列決定するために使用してもよい。
【００５５】
さらに別の実施態様では、開始ＲＮＡの断片化に次いで、その断片化ＲＮＡに対し、１本鎖オリゴヌクレオチドアダプター（ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい）を連結させてもよい（例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いて）。図１５に示すように、ＲＮＡの３’末端に連結されるアダプターはアダプターＡであってもよいし、ＲＮＡの５’末端に連結されるアダプターはアダプターＢ’であってもよい。続く逆転写は、アダプターＡに対して相補的なＲＴプライマーから開始されてもよい。逆転写後、本明細書に開示される方法の内のいずれか、例えば、加水分解、ＲＮアーゼＨ処理を用いてＲＮＡ鎖を除去してもよい。このようにして得られる最終的アダプター付着ｓｓｃＤＮＡは、５’末端にＡ’アダプター配列を、３’末端にＢアダプター配列を含む。
【００５６】
もう一つの実施態様では（図１６）、開始ＲＮＡの断片化後に、１本鎖オリゴヌクレオチドアダプター（これはＤＮＡでも、ＲＮＡであってもよい）を、断片化ＲＮＡの３’末端に（例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いて）連結してもよい。続いて、アダプターＡに対して相補的なＲＴプライマーから逆転写を開始してもよい。逆転写後、本明細書で開示される方法の内のいずれか、例えば、加水分解またはＲＮアーゼＨ処理を含む方法を用いてＲＮＡ鎖を除去してもよい。得られたＡ’アダプター付着ｓｓｃＤＮＡは、図１６に示すように、部分的に２本鎖のオリゴヌクレオチドアダプターセットＢに連結させてもよい。１本鎖のオリゴヌクレオチドアダプターセットＢは、その３’末端に、ランダムまたはセミランダムな配列から成る１本鎖部分を、その５’末端に、ビオチンまたは同様のアフィニティーラベルを含む。次に、アビジン、またはストレプトアビジンによってこの連結産物を捕捉し、さらに、本明細書の別の箇所で述べるように、最終的なＡ’−Ｂアダプター付着ｓｓｃＤＮＡを融解分離させてもよい（図１６）。
【００５７】
さらに別の実施態様では（図１７）、図１７に示すように、開始ＲＮＡの断片化後、部分的に２本鎖のオリゴヌクレオチドアダプターセットＡが、ＲＮＡの３’末端に連結される。オリゴヌクレオチドアダプターセットＡの１本鎖は、その３’末端にランダムまたはセミランダム配列から成る１本鎖部分、および、その５’末端にビオチン（または、他の適正なアフィニティーラベル）を含む。次に、アビジン、またはストレプトアビジン（または、他の適正な結合パートナー）によってこの連結産物を捕捉し、この連結ＤＮＡを融解分離してもよい。次いで、アダプターＡ配列に対し少なくとも部分的に相補的なＲＴプライマーから逆転写を開始させてもよい。逆転写後、本明細書で開示される方法の内のいずれか、例えば、加水分解またはＲＮアーゼＨ処理を含む方法を用いてＲＮＡ鎖を除去してもよい。その後、Ａアダプター付着ｓｓｃＤＮＡは精製される。このＡアダプター付着ｓｓｃＤＮＡの３’末端に、部分的に２本鎖のＤＮＡオリゴヌクレオチドアダプターセットＢが連結される（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって）。図１７に示すように、１本鎖のオリゴヌクレオチドアダプターセットＢは、その３’末端に、ランダムまたはセミランダムな配列から成る１本鎖部分を、その５’末端に、ビオチン（または、他の同様なアフィニティーラベル）を含む。次に、アビジン、またはストレプトアビジン（または、その他の適正な結合パートナー）によってこの連結産物を捕捉し、さらに、本明細書の別の箇所で述べるように、最終的なＡ’−Ｂアダプター付着ｓｓｃＤＮＡを融解分離させてもよい（図１７）。
【００５８】
本実施態様、および、本明細書に記載する他の実施態様において、当業者であれば、アダプター−アダプター連結事象は、不要で回避すべきものであるが、これは、オリゴヌクレオチドの３’末端および／または５’末端に、適宜、適切な化学的構造を配すること（例えば、リン酸基、またはジデオキシ基の有無）によって阻止することが可能であることが了解されるであろう。
【００５９】
本発明のある実施態様では、ｃＤＮＡライブラリーの調製法は、開始ＲＮＡの断片化を必要としない（例えば、図１８ＡおよびＢ）。これらの実施態様では、ランダムまたはセミランダム逆転写プライマーが、断片化されない開始ＲＮＡにアニールされて、逆転写が実行される。例えば、逆転写プライマーは、ランダムまたはセミランダムな５’部分、および定常な３’部分から構成されていてもよい。使用される逆転写酵素が、非鎖移動性である場合、逆転写は、各アニールしたプライマーから、次のアニールプライマーまで、または、ＲＮＡの５’末端に達するまで続けられる可能性がある。当業者であれば、得られるｓｓｃＤＮＡ断片の平均長は、何よりも、開始ＲＮＡに対するプライマーの比に依存することが了解されるであろう。逆転写後、本明細書で開示される方法の内のいずれか、例えば、加水分解またはＲＮアーゼＨ処理を含む方法を用いてＲＮＡ鎖を除去してもよい。その後、それぞれその５’末端に逆転写プライマーを含むｓｓｃＤＮＡが精製される。次に、このｓｓｃＤＮＡの５’末端を、部分的に２本鎖のＤＮＡオリゴヌクレオチドアダプターセットＡ’に（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの使用によって）連結する。アダプターセットＡ’は、その５’末端に、ランダムまたはセミランダム配列から成る１本鎖部分を有する１つの鎖を含む。ｓｓｃＤＮＡの３’末端は、部分的に２本鎖のオリゴヌクレオチドアダプターセットＢに（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの使用によって）連結させてもよい。アダプターセットＢは、その３’末端に、ランダムまたはセミランダムな配列から成る１本鎖部分を、その５’末端に、ビオチン（または、他の適正なアフィニティーラベル）を含む（図１８Ａ）。次に、アビジン、またはストレプトアビジン（または、その他の適正な結合パートナー）によってこの連結産物を捕捉し、さらに、本明細書の別の箇所で述べるように、最終的なＡ’−Ｂアダプター付着ｓｓｃＤＮＡを融解分離させてもよい（図１８Ｂ）。アダプターセットＡ’の「最下段」鎖（図１８による）も融解分離し、当技術分野において公知で、かつ、本明細書に開示されるいくつかのサイズ選択手法の内のいずれか、例えば、ＳＰＲＩビーズによって、所望の最終的Ａ’−Ｂアダプター付着ｓｓｃＤＮＡから分離が可能である。
【００６０】
本発明のある実施態様は、ｃＤＮＡライブラリーではなく、ＤＮＡライブラリーの生成を主題とする。これらの実施態様では、開始材料は、１本鎖ＤＮＡまたは２本鎖ＤＮＡのいずれかである。開始ＤＮＡは、いずれの生物（細胞またはウィルス）供給源、または合成供給源から得られたものであってもよい。開始ＤＮＡが１本鎖である場合、それは、例えば、変性２本鎖ＤＮＡから得られたものである可能性もあるし、あるいは、１本鎖ＤＮＡウィルスから単離された可能性もある。開始ＤＮＡ断片の長さが、所望のＤＮＡライブラリーに必要な長さを超えている場合には、酵素的であれ（例えば、制限酵素）、化学的であれ、または機械的であれ（例えば、せん断力）、その断片を、当技術分野で公知の任意の方法で断片化してよい。開始ＤＮＡが２本鎖である場合、例えば、熱処理によってその断片を変性し、ｓｓＤＮＡ断片を産生する。次に、このｓｓＤＮＡの５’末端を、部分的に２本鎖のオリゴヌクレオチドアダプターセットＡ’に（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて）連結してもよい。アダプターセットＡ’は、その５’末端にランダムまたはセミランダム配列の１本鎖部分を有する１つの鎖を含む。ｓｓＤＮＡの３’末端を、部分的に２本鎖のオリゴヌクレオチドアダプターセットＢに（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて）連結してもよい。アダプターセットＢは、その３’末端にランダムまたはセミランダム配列の１本鎖部分、およびその５’末端にビオチン（または、その他の適正なアフィニティーラベル）を有する１つの鎖を含む（図１９）。次に、アビジン、またはストレプトアビジン（または、その他の適正な結合パートナー）によってこの連結産物を捕捉し、さらに、本明細書の別の箇所で述べるように、最終的なＡ’−Ｂアダプター付着ｓｓｃＤＮＡを融解分離させてもよい。アダプターセットＡ’の「最下段」鎖（図１９による）も融解分離し、当技術分野で公知で、かつ、本明細書に開示されるいくつかのサイズ選択手法の内のいずれか、例えば、ＳＰＲＩビーズによって、所望の最終的Ａ’−Ｂアダプター付着ｓｓｃＤＮＡから分離される。
【００６１】
本開示を通じて、「ビオチン」、「アビジン」、または「ストレプトアビジン」という用語は、結合ペアのメンバーを記述するために用いられている。これらの用語は、単に、結合ペアを用いる一つの方法を例示するためのものであることを理解しなければならない。したがって、用語ビオチン、アビジン、またはストレプトアビジンは、結合ペアの任意の一員によって置換されてよい。結合ペアは、互いに特異的に結合する任意の二つの分子であってよく、少なくとも、ＦＬＡＧ／ＦＬＡＧ抗体、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、受容体／リガンド、抗原／抗体、受容体／リガンド、ポリＨＩＳ／ニッケル、タンパクＡ／抗体およびその誘導体のような結合ペアを含んでもよい。他の結合ペアも公知であり、文献に発表されている。
【００６２】
本開示に引用される特許、特許出願、および文献は、どこで引用されたものであれ全て参照によってその全体が本開示に含まれる。本発明の他の実施態様および利点も、一部は下記の説明に記載され、一部はその説明から明白であり、かつ、本発明を実施することによって教示されてもよい。
【００６３】
以下に、非限定的実施例を通じて本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００６４】
実施例１：材料および方法
２００ｎｇのｍＲＮＡ材料から作業を開始するようにプロトコールを開発した。このプロトコールの模式図を図２に示す。
【００６５】
プロセスのための開始容量は１０μｌである。サンプルを氷上に置き、２．５μｌの５Ｘ断片化バッファー（０．２Ｍ  Ｔｒｉｓアセテート、０．５Ｍ  酢酸カリウム、および１５７．５ｍＭ  酢酸マグネシウム）をサンプルに加え、よく混ぜ合わせた。サンプルをサーマルサイクラーに入れ、８２℃に加熱し、８２℃で２分インキュベートさせた。８２℃におけるインキュベーションの直後、サンプルを氷に戻した。
【００６６】
脱塩工程でサンプルから塩を除去した。サンプルの脱塩法は周知である。本実施例で用いるプロトコールは、Ａｕｔｏｓｅｑ  Ｇ−５０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に、メーカーの指示に従ってサンプルを通過させることを含む。約２０μｌ容量の回収材料を、スピードバック（Ｓａｖａｎｔ  Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）において真空（２Ｔｏｒｒ）中４５℃で遠心することによって乾燥させ１０μｌまで下げた。
【００６７】
ｍＲＮＡ鋳型に対する逆転写酵素プライマーのアニーリングは、断片化ｍＲＮＡに２μｌの逆転写プライマー（２００μＭの５’−Ｐ−ＴＮＮＴＮＮＮＮＮＮ−３’で、Ｐはリン酸塩である）を加えることによって実行した。次に、サーマルサイクラーにおいてサンプルを７０℃で１０分加熱して、氷上で冷却した。
【００６８】
反応チューブに、８．５マイクロリットルの逆転写混合物（４．０μｌの、５Ｘ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ第１鎖バッファー、２．０μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ、１．０μｌのｄＮＴＰミックス（それぞれ１０ｍＭ）、１．０μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ酵素、５０単位／μｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および０．５μｌのＲＮａｓｅ  Ｏｕｔ、１２５単位／μｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を加えた。この反応チューブをよく混ぜ合わせ、４５℃で１時間インキュベートした。この反応後、１５μｌの変性溶液（０．５Ｍ  ＮａＯＨ、０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加え、混ぜ合わせ、６５℃で２０分インキュベートすることによってｓｓｃＤＮＡ分子を単離した。２０μｌの中和バッファーを加えて反応を停止させた。次に、溶出容量を除いてはメーカーの指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＤＮＡ精製カラムを用いて反応物を精製した。反応物は、１２μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５によって溶出した。
【００６９】
サンプルに、６．５μｌのライゲーションミックス（１．０μｌの２５μＭ  アダプターＡ、１．０μｌの５０μＭ  アダプターＢ、１．８μｌの１０Ｘ  Ｔ４リガーゼバッファー、２．２μｌの水、および０．５μｌの高濃度Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、２０００単位／μｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））を加えて、アダプターＡおよびアダプターＢの連結を設定した。サンプルを混ぜ合わせ、２２℃で１２時間インキュベートした。
【００７０】
連結した産物は、下記の手順に従って、ＭｙＯｎｅストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）に結合するビオチン標識Ｂアダプターを通じて単離した。ストレプトアビジンビーズのように、対応する結合ペアに結合するものであれば、いずれの形の磁気ビーズであっても有効であることが理解される。１Ｘ  ＴＥ  ｐＨ７．５を加えることによって連結反応容量を１００μｌに増す。次に、洗浄した磁気ビーズ１００μｌを含むスラリーをこのサンプルに加える。サンプルを、室温で１０から１５分混ぜ合わせ、次にビーズを洗浄し、未結合の材料を全て除去する。
【００７１】
ｓｓｃＤＮＡを融解し、１００μｌの溶出バッファー（２５ｍＭ  ＮａＯＨ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）にてビーズから溶出した。溶出材料を新しいチューブに移し、１０μｌの中和バッファー（２５０ｍＭ  ＨＣｌ、２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＣＬ、ｐＨ８．０）で中和した。中和バッファーの添加後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００クロマトグラフィーカラムの上にサンプルを通過させ、ｓｓｃＤＮＡサンプルから小断片を除去した。次に、メーカーのプロトコールに従って、Ｑｕｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムでサンプルを精製した。最終的に、１８μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ７．５によってｓｓｃＤＮＡをカラムから溶出し、ライブラリーのＱＣには小分液を用いた。
【００７２】
マウス肝臓ｍＲＮＡサンプルにこのプロトコールを実行して調べたところ、あらゆるサイズの転写物をカバーする大量の配列データが得られた。比較的長い転写物の配列抽出度を定量するために、５０００ヌクレオチドを超える転写物の全てについて、領域当たりのヒット数をプロットした。これらの転写物の全長に渡って配列抽出度において均一な分布が見られた。これは、長さが５０００ヌクレオチドを超える転写物においても、３’バイアスがほとんど見られないことを示唆する（図３を参照）。
実施例２：ｃＤＮＡライブラリーの調製およびインフルエンザウィルスゲノムの配列決定
インフルエンザウィルスＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株を、Ｃｈａｒｌｅｓ
Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，マサチューセッツ州）から購入した。このインフルエンザゲノムは、８セグメントの１本鎖陰性センスＲＮＡを含むことが知られる。全てのセグメントの全長は１３５００ｎｔである。開始ＲＮＡ材料は、ウィルスＲＮＡセグメントに対応する明瞭なサイズ分画として存在することが判明した（図７）。ｃＤＮＡライブラリーの調製には、様々な量の（１０ｎｇ、２０ｎｇ、５０ｎｇ、または２００ｎｇ）ＲＮＡが用いられた。
【００７３】
ＲＮＡ断片化のために、１０μｌ容量とした開始量のＲＮＡを、２．５μｌの５ｘ断片化バッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテート、５００ｍＭ酢酸カリウム、１５７．５ｍＭ酢酸マグネシウム、ｐＨ８．１）に加え、短時間ボルテックスし、８２℃で２分インキュベートし、次いで氷上で急冷した。断片化ＲＮＡのクリーンアップのために、サンプル容量を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で５０μｌに調整した。１００μｌのＲＮＡＣｌｅａｎビーズミックス（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ，Ｂｅｖｅｒｙ，マサチューセッツ州）を加え、混ぜ合わせ、室温で１０分インキュベートした。次に、ビーズを、磁気粒子収集ユニットの上に収集した。上清を捨て、ビーズを、７０％エタノールで２回洗浄した。ビーズを空気乾燥し、次いで１１μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で溶出したところ、約９．５μｌの溶出物が得られた。この断片化によって、約５００ヌクレオチドにピークを持つ広範なサイズ範囲を有するＲＮＡが得られた（図８）。
【００７４】
次に、１本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ）を調製するために、全溶出物を、２μｌの、２００μＭプライマーＰ−ＴＮＮＴＮＮＮＮＮＮと混ぜ合わせ、７０℃で１０分加熱し、次いで氷上で急冷した。その後、８．５μｌの氷冷逆転写ミックス（４μｌの５Ｘ  ＳＳＩＩ第１鎖バッファー［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州］、２μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ、１μｌのｄＮＴＰミックス［各ｄＮＴＰについて１０ｍＭ］、１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］、および０．５μｌのＲＮａｓｅ  Ｏｕｔ［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］）を加え、次いで混ぜ合わせた。この混合物を４５℃で１時間インキュベートし、次いで氷上に移した。２０μｌの変性液（０．５Ｍ  ＮａＯＨ、０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ）を加え、混ぜ合わせ、６５℃で２０分インキュベートした。ｃＤＮＡ中和液（０．５Ｍ  ＨＣｌ、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ）を加えて（１０〜４０μｌ）、７〜８．５のｐＨを実現した。１．５容量のＲＮＡＣｌｅａｎミックスを加えてサンプルを精製し、室温で１０〜１５分インキュベートした。次に、ビーズを、磁気粒子収集ユニットの上に収集した。上清を捨て、ビーズを、７０％エタノールで２回洗浄した。ビーズを空気乾燥し、次いで２５μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５でｓｓｃＤＮＡを溶出した。このようにして得られたｓｓｃＤＮＡのサイズ分布は、約５００ヌクレオチドのピークの周囲に広がっていた（図９）。
【００７５】
アダプターの連結のために、ＳＡＤ１Ｆオリゴヌクレオチドを、ｓｓｃＤＮＡの５’末端に連結し、ＳＡＤ１Ｒオリゴヌクレオチドを、ｓｓｃＤＮＡの３’末端に連結した。このために、６μｌのアダプター／バッファーミックス（３μｌの１０Ｘ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼバッファー［Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ、マサチューセッツ州］、１μｌの５０μＭ  ＳＡＤ１Ｆ／ＳＡＤ１Ｆプライム（１．２：１）、１μｌの２００μＭ  Ｂｉｏ−ＳＡＤ１Ｒ／ＳＡＤ１Ｒプライム（１．２：１）、および１μｌのクイックリガーゼ、またはＴ４  ＤＮＡリガーゼ高濃度［Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ］）を、このｓｓｃＤＮＡサンプルに加え、２２℃で１２時間インキュベートした。このインキュベーション後、ＩＸ  ＴＥ（ｐＨ８．０）を加え、最終容量１００μｌを有する連結ミックスを得た。前記オリゴヌクレオチドの配列を表１に示す。表１
【００７６】
【化６】
2009508495.tif 000047
部分的２本鎖オリゴヌクレオチドＳＡＤ１Ｆ／ＳＡＤ１Ｆプライムは、ＳＡＤ１ＦおおびＳＡＤ１Ｆプライム１本鎖オリゴヌクレオチドを、１：１．２モル比で混ぜ合わせ、下記の加熱プログラムを用いてアニールすることによって調製した。８０℃５分、６５℃７分、６０℃７分、５５℃７分、５０℃７分、４５℃７分、４０℃７分、３５℃７分、３０℃７分、２５℃７分、４℃不定時間。同様にして、ＳＡＤ１ＲおよびＳＡＤ１Ｒプライムから、部分的２本鎖オリゴヌクレオチドＳＡＤ１Ｒ／ＳＡＤ１Ｒプライムを調製した。
【００７７】
アダプター連結後ｓｓｃＤＮＡライブラリーを単離するために、先ず、サンプル当たり２０μｌのストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、Ｂ＆Ｗ  バッファー＋Ｔｗｅｅｎ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、２Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）において下記のように平衡させた。ビーズを、磁気粒子捕捉ユニットで液体から分離し、上清を捨てた。ビーズを、１ｍｌのＢ＆Ｗバッファー＋Ｔｗｅｅｎで洗浄し、磁気粒子捕捉ユニットで液体から分離し、上清を捨てた。次に、２０μｌの開始ビーズ当たり、１００μｌのＢ＆Ｗバッファー＋Ｔｗｅｅｎに再縣濁し、１００μｌの連結体ミックス（上記参照）に加え、１５分攪拌した。磁気粒子捕捉ユニットでビーズを液体から分離し、上清を捨てた。ビーズを、２００μｌの、０．５Ｘ  Ｂ＆Ｗバッファー＋Ｔｗｅｅｎにて洗浄し、磁気粒子捕捉ユニットで液体から分離し、上清を捨てた。ビーズを、２００μｌのビーズ洗浄バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で２度洗浄し、その度毎に、磁気粒子捕捉ユニットにて液体からビーズを分離し、上清を捨てた。１００μｌのビーズ溶出バッファー（２５ｍＭ  ＮａＯＨ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）を加え、サンプルを室温で１０分攪拌した。磁気粒子捕捉ユニットにてビーズを液体から分離し、上清（ｓｓｃＤＮＡライブラリーを含む）を新しいＰＣＲチューブに移した。
【００７８】
ｓｓｃＤＮＡライブラリーの精製のために、ビーズ溶出バッファーに溶解したｓｓｃＤＮＡに、１４０μｌのＲＮＡＣｌｅａｎミックスを加え、混ぜ合わせ、室温で１０分インキュベートした。磁気粒子捕捉ユニットにて液体からビーズを分離し、上清を捨てた。ビーズを７０％エタノールで２回洗浄し、次いで空気乾燥した。このｓｓｃＤＮＡを、３０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５で溶出した。４２μｌのＲＮＡＣｌｅａｎミックスで開始したことを除き、上記と同様のＲＮＡＣｌｅａｎ工程を繰り返し、最後に、ｓｓｃＤＮＡを、１２μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５で溶出した。
【００７９】
このようにして得られたｓｓｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。５μｌの、１０Ｘ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲバッファー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，カリフォルニア州）、１．０μｌのＳＡＤ１Ｆプライマー（２００μＭ）、１．０μｌのＳＡＤ１Ｒプライマー（２００μＭ）、２．０μｌの、各１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、および水に、上記のようにして得た最終的ｓｓｃＤＮＡ溶出液２から３μｌを、合計容量５０μｌとなるように加えた。次に、この反応混合物を、下記の熱サイクル処方で処理した。工程１：９０℃４分；工程２：９４℃３０秒；工程３：６４℃３０秒；工程４：工程２に戻る、１８回または２５回；工程５：６８℃２分；工程６：１４℃不定。増幅後、反応物を、ＡＭＰｕｒｅビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）によって精製した。ＰＣＲ反応物に８０μｌのＡＭＰｕｒｅビーズミックスを加え、磁気粒子捕捉ユニットにて液体からビーズを分離し、上清を捨てた。ビーズを７０％エタノールで２回洗浄し、次いで空気乾燥した。増幅した２本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓｃＤＮＡ）ライブラリーを、１２μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５で溶出した。
【００８０】
２５サイクルの増幅よりも、１８サイクルの増幅の方が好適であることが判明した。なぜならば、２５サイクル後には、増幅プライマーの重大な逸失のみならず、不要な産物が観察されたからである（１８サイクルではそういうことはない）（図１０Ａおよび１０Ｂ参照）。
【００８１】
１０、２０、５０、または２００ｎｇの開始ウィルスＲＮＡから得られたｄｓｃＤＮＡライブラリーのサイズ分布は、きわめて近似していることが観察された（図１３）。これは、本発明の方法が、微小量のＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを調製する点で驚くべき産生能力を有することを実証する。
【００８２】
このようにして得られたｃＤＮＡライブラリーに対し、次に、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ、コネチカット州）によって開発された配列決定技術によるヌクレオチド配列決定を行った。核酸の直接的配列決定のためのこれらの技術は、全て２００４年１月２８出願の、同時係属中の米国特許出願第１０／７６７，７７９；１０／７６７，８９９；１０／７６８７２９；および１０／７６７，７７９号、および、２００５年８月１日出願の米国特許出願第１１／１９５，２５４号に開示される。約１３６００個の高品質読み取りデータが得られた。これらの内、１２８２０個（９４．２６％）において、既知のインフルエンザウィルスＡ株ゲノムにおいて少なくとも３５ｎｔのＢＬＡＳＴヒットが見られた。１２８２０個のＢＬＡＳＴヒットの、８セグメントにおける、すなわち、インフルエンザウィルスＡ株のＲＮＡゲノムにおける分布を、表２に示す。
表２：ＢＬＡＳＴヒットを持つ、高品質読み取りデータの数を、インフルエンザウィルスＡ株のゲノムセグメント毎に掲げたもの。
【００８３】
【化７】
2009508495.tif 000048
インフルエンザウィルス株の８個のセグメントにおける網羅範囲の深度を図１１および１２に示す。これから、本発明の方法は、８個のセグメントのそれぞれから抽出を行うことが示される。
【００８４】
種々の開始ＲＮＡ量における本発明の方法の性能を評価するために、高品質読み取りデータ、ＢＬＡＳＴ陽性読み取りデータ、およびＢＬＡＳＴ陽性高品質読み取りデータのパーセンテージを比較した。これらのデータから、配列決定方向によらず、１０、２０、５０、または２００ｎｇの開始材料において、類似の結果が得られることが示された（表３および図１４）。
【００８５】
【化８】
2009508495.tif 000049
【００８６】
【化９】
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表３：１０、２０、５０、または２００ｎｇの開始ＲＮＡから得られた配列決定結果。配列決定は、５’から３’方向（Ａ；上段４列）、および３’から５’方向（Ｂ；下段４列）に行った。ＨＱ：高品質読み取りデータ；Ｂｌａｓｔ＞３５ｎｔ：既知のインフルエンザウィルスＡ株配列に対し、３５ヌクレオチドを超える、陽性ＢＬＡＳＴヒットを有する高品質読み取りデータ。％ＨＱ  ＢＬＡＳＴ＞３５ｎｔ：既知のインフルエンザウィルスＡ株配列に対し、３５ヌクレオチドを超える、陽性ＢＬＡＳＴヒットを有する高品質読み取りデータのパーセンテージ。このデータの一部は、図１４にグラフとして表される。
【００８７】
本発明の他の実施態様および用途も、ここに開示される本発明の明細書および実施例を考察することによって当業者には明白となろう。その理由が何であれ、本明細書で注記した特許、特許出願、および他の参考文献はすべて、参照することにより特に本明細書に含められる。本明細書および実施例は、単に例示のためであり、本発明の真の範囲および精神は、下記の特許請求項によってのみ示されるものと考えなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
下記の詳細な説明は、例示のために示されるものであって、説明される特定の実施態様に本発明を限定することを意図するものではないが、その説明は付属の図面と組み合わせることによって理解が促進されよう。なお、参照することにより図面を本説明に含める。
【図１】図１は、アダプター（ＡおよびＢ）の、１本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ）に対する方向性連結の一実施態様を示す。各アダプターは、ｓｓｃＤＮＡにアニールするように設計された１本鎖部分を持つ比較的長いオリゴヌクレオチドと、ｓｓｃＤＮＡの３’および５’末端に連結される比較的短いオリゴヌクレオチドから成る。
【図２】図２は、Ｔｓｅｑ（転写物配列決定用）ライブラリー調製の一実施態様を示す。
【図３】図３は、肝臓ｃＤＮＡライブラリーの配列読み取りの５’から３’分布の一実施態様を示す。図は、長さが５０００ヌクレオチドを超える転写物においても、Ｔｓｅｑ読み取りの均一な分布が得られることを示す。
【図４】図４は、一つの可能なプライマー配列（配列番号２）を示す。“Ｎ”は任意の塩基を表し、“Ｖ”は、Ｔ以外の任意の塩基（すなわち、“Ｖ”は、ａ、ｇ、またはｃを表す）を表す。
【図５】図５は、図４のプライマーによって生成されるｃＤＮＡに対する３’アダプターのアニーリングを示す。
【図６】図６は、Ｔｓｅｑアダプター構造のいくつかの実施態様を示す。
【図７】図７は、インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株から得られたウィルスＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの記録トレースを示す。ピークの上の数は、ヌクレオチド数で表した近似サイズを表す。２５ｂｐのピークは、サイズの内部標準を表す。
【図８】図８は、インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株由来ウィルスＲＮＡの、断片化前（青色トレース）および断片化後（緑色トレース）における、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの記録トレースを示す。赤色トレースは標準サイズマーカーを表す。２５ｂｐのピークは、サイズの内部標準を表す。
【図９】図９は、インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株由来ウィルスＲＮＡから得られたｓｓｃＲＮＡの、特異的３’および５’アダプターに対する連結前における、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの記録トレース（赤色）を示す。赤色トレースは標準サイズマーカーを表す。２５ｂｐのピークは、サイズの内部標準を表す。
【図１０】図１０は、インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株由来ウィルスＲＮＡから得られたｄｓｃＤＮＡの、１８サイクルの増幅後（図１０Ａ）、および２５サイクルの増幅後（図１０Ｂ）における、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの記録トレースを示す。２５ｂｐのピークは、サイズの内部標準を表す。
【図１１Ａ】図１１は、インフルエンザウィルスＲＮＡのセグメント１〜４について得られた配列網羅範囲の深度のプロットを示す。
【図１１Ｂ】図１１は、インフルエンザウィルスＲＮＡのセグメント１〜４について得られた配列網羅範囲の深度のプロットを示す。
【図１１Ｃ】図１１は、インフルエンザウィルスＲＮＡのセグメント１〜４について得られた配列網羅範囲の深度のプロットを示す。
【図１１Ｄ】図１１は、インフルエンザウィルスＲＮＡのセグメント１〜４について得られた配列網羅範囲の深度のプロットを示す。
【図１２Ａ】図１２は、インフルエンザウィルスＲＮＡの、三つの異なるセグメントについて得られた配列網羅範囲の深度のプロットを示す。
【図１２Ｂ】図１２は、インフルエンザウィルスＲＮＡの、三つの異なるセグメントについて得られた配列網羅範囲の深度のプロットを示す。
【図１２Ｃ】図１２は、インフルエンザウィルスＲＮＡの、三つの異なるセグメントについて得られた配列網羅範囲の深度のプロットを示す。
【図１２Ｄ】図１２は、インフルエンザウィルスＲＮＡの、三つの異なるセグメントについて得られた配列網羅範囲の深度のプロットを示す。
【図１３】図１３は、それぞれ、開始インフルエンザウィルスＲＮＡ１０、２０、５０、または２００ｎｇから構築されるｄｓｃＤＮＡライブラリーのサイズ分布および相対的核酸量を示す、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの記録トレースを示す。２５ｂｐのピークは、サイズの内部標準を表す。
【図１４Ａ】図１４は、１０ｎｇ（青色）または２００ｎｇ（赤色）の開始ＲＮＡから得られた配列網羅範囲の深度のプロットを示す。データは、それぞれ、Ａセット（上段：開始ＲＮＡの５’から３’に向かって配列決定）およびＢセット（下段：３’から５’に向かって配列決定）の両方についてプロットされる。このデータを、表３にも示す。このプロットから、低いインプット（１０ｎｇ）の開始ＲＮＡからも、高いインプット（２００ｎｇ）の開始ＲＮＡからも、ほぼ等しい抽出パターンが得られることが明らかになった。
【図１４Ｂ】図１４は、１０ｎｇ（青色）または２００ｎｇ（赤色）の開始ＲＮＡから得られた配列網羅範囲の深度のプロットを示す。データは、それぞれ、Ａセット（上段：開始ＲＮＡの５’から３’に向かって配列決定）およびＢセット（下段：３’から５’に向かって配列決定）の両方についてプロットされる。このデータを、表３にも示す。このプロットから、低いインプット（１０ｎｇ）の開始ＲＮＡからも、高いインプット（２００ｎｇ）の開始ＲＮＡからも、ほぼ等しい抽出パターンが得られることが明らかになった。
【図１５】図１５は、１本鎖アダプターが、開始断片化ＲＮＡの５’および３’末端に連結される、本発明のｃＤＮＡライブラリー調製法の一実施態様を示す。
【図１６】図１６は、本発明のｃＤＮＡライブラリー調製法の一実施態様を示す。この実施態様では、１本鎖アダプターが、開始断片化ＲＮＡの３’末端に連結され、逆転写後、１本鎖５’末端アダプター（Ｂ）が付加される。
【図１７】図１７は、本発明のｃＤＮＡライブラリー調製法の一実施態様を示す。この実施態様では、部分的に２本鎖のアダプターが、開始断片化ＲＮＡの３’末端に連結され、逆転写後、部分的に２本鎖の５’末端アダプター（Ｂ）が付加される。
【図１８Ａ】図１８（ＡおよびＢ）は、本発明のｃＤＮＡライブラリー調製法の一実施態様を示す。この実施態様では、開始ＲＮＡは、逆転写前に断片化する必要がない。ランダムまたはセミランダムプライマーを用いてＲＮＡを逆転写し、得られたｓｓｃＤＮＡに対し、連結によってＡ’およびＢを付加する。
【図１８Ｂ】図１８（ＡおよびＢ）は、本発明のｃＤＮＡライブラリー調製法の一実施態様を示す。この実施態様では、開始ＲＮＡは、逆転写前に断片化する必要がない。ランダムまたはセミランダムプライマーを用いてＲＮＡを逆転写し、得られたｓｓｃＤＮＡに対し、連結によってＡ’およびＢを付加する。
【図１９】図１９は、本発明のＤＮＡライブラリー調製法の一実施態様を示す。この実施態様では、アダプター付着ＤＮＡライブラリーが、開始ＤＮＡから得られる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2009508495.tif 000059
【図１０】
2009508495.tif 000060
【図１１Ａ】
2009508495.tif 000061
【図１１Ｂ】
2009508495.tif 000062
【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
2009508495.tif 000067
【図１２Ｄ】
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【図１３】
2009508495.tif 000069
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【国際調査報告】
2009508495.tif 000078
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