(57)【要約】ヒト細胞発生および機能におけるシナプス接着分子の役割は、大部分が知られていない。本発明は、新規な付着および移動アッセイ方法の使用を介する天然の組織中のβ細胞を研究する方法を提供する。これらのアッセイ方法の使用を介して、発明者らは、初めてヒトβ細胞の接着、拡散および運動性に対するSAMの貢献を記載することができた。さらに、発明者らはこれらのアッセイ方法の結果を用いて、膵臓と関係する疾患の検出、治療および予防のための方法を開発した。
2009503116.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効な量の、シナプス接着分子を選択的に結合する作用物質をそれを必要とする哺乳動物に投与することを特徴とする膵臓疾患を治療する方法。
【請求項２】
膵臓疾患が糖尿病および膵臓癌よりなる群から選択される請求項1記載の方法。
【請求項３】
糖尿病が真性糖尿病であることを特徴とする請求項2記載の方法。
【請求項４】
シナプス接着分子が、ニューロリギン1、ニューロリギン2、ニューロリギン3、ニューロリギン4X、ニューロリギン4Y、ニューレキシン1α、ニューレキシン2α、ニューレキシン3α、ニューレキシン1β、ニューレキシン2β、ニューレキシン3β、SynCam、Thy-1およびニューロンペントレキシンよりなる群から選択されることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項５】
シナプス接着分子が、ニューロリギン1、ニューロリギン2、ニューロリギン3、ニューロリギン4X、ニューロリギン4Y、ニューレキシン1α、ニューレキシン2α、ニューレキシン3α、ニューレキシン1β、ニューレキシン2β、ニューレキシン3β、SynCam、Thy-1およびニューロンペントレキシンよりなる群から選択されるシナプス接着分子のフラグメント、アナログあるいは誘導体であることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項６】
作用物質が、抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびアプタマーよりなる群から選択されることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項７】
作用物質が、経口投与、静脈内投与、局所投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、皮内投与、腹腔内投与、吸入、硬膜外投与、眼内投与および直腸坐剤による投与よりなる群から選択される経路により投与されることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項８】
作用物質が医薬上許容される担体と共に投与されることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項９】
作用物質が第2の化合物にコンジュゲートした第1の化合物を含むことを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項１０】
第1の化合物がシナプス接着分子を選択的に結合し、第2の化合物が放射性同位体であることを特徴とする請求項9記載の方法。
【請求項１１】
第1の化合物が、抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびアプタマーよりなる群から選択されることを特徴とする請求項9記載の方法。
【請求項１２】
コンジュゲートした第1および第2の化合物が、経口投与、静脈内投与、局所投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、皮内投与、腹腔内投与、吸入、硬膜外投与、眼内投与および直腸坐剤による投与よりなる群から選択される経路により投与されることを特徴とする請求項9記載の方法。
【請求項１３】
第2の化合物にコンジュゲートした第1の化合物が医薬上許容される担体と共に投与されることを特徴とする請求項9記載の方法。
【請求項１４】
治療上有効な量の、ニューロピリン1を選択的に結合する作用物質をそれを必要とする哺乳動物に投与することを特徴とする膵臓疾患を治療する方法。
【請求項１５】
作用物質が、抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびアプタマーよりなる群から選択されることを特徴とする請求項14記載の方法。
【請求項１６】
作用物質が、経口投与、静脈内投与、局所投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、皮内投与、腹腔内投与、吸入、硬膜外投与、眼内投与および直腸坐剤による投与よりなる群から選択される経路により投与されることを特徴とする請求項14記載の方法。
【請求項１７】
作用物質が医薬上許容される担体と共に投与されることを特徴とする請求項14記載の方法。
【請求項１８】
作用物質が第2の化合物にコンジュゲートした第1の化合物を含むことを特徴とする請求項14記載の方法。
【請求項１９】
第1の化合物がシナプス接着分子を選択的に結合し、第2の化合物が放射性同位体であることを特徴とする請求項18記載の方法。
【請求項２０】
第1の化合物が、抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびアプタマーよりなる群から選択される請求項18記載の方法。
【請求項２１】
コンジュゲートした第1および第2の化合物が、経口投与、静脈内投与、局所投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、皮内投与、腹腔内投与、吸入、硬膜外投与、眼内投与および直腸坐剤による投与よりなる群から選択される経路により投与されることを特徴とする請求項18記載の方法。
【請求項２２】
第2の化合物にコンジュゲートした第1の化合物が、医薬上許容される担体と共に投与される請求項18記載の方法。
【請求項２３】
細胞をシナプス接着分子と選択的に結合する作用物質と接触させ;次いで、
作用物質を検出することを特徴とする、シナプス接着分子を発現する細胞を検出する方法。
【請求項２４】
細胞がベータ島細胞であることを特徴とする請求項23記載の方法。
【請求項２５】
ベータ島細胞が哺乳動物に含まれることを特徴とする請求項24記載の方法。
【請求項２６】
哺乳動物がヒトであることを特徴とする請求項25記載の方法。
【請求項２７】
シナプス接着分子が、ニューロリギン1、ニューロリギン2、ニューロリギン3、ニューロリギン4X、ニューロリギン4Y、ニューレキシン1α、ニューレキシン2α、ニューレキシン3α、ニューレキシン1β、ニューレキシン2β、ニューレキシン3β、SynCam、Thy-1およびニューロンペントレキシンよりなる群から選択されることを特徴とする請求項23記載の方法。
【請求項２８】
シナプス接着分子が、ニューロリギン1、ニューロリギン2、ニューロリギン3、ニューロリギン4X、ニューロリギン4Y、ニューレキシン1α、ニューレキシン2α、ニューレキシン3α、ニューレキシン1β、ニューレキシン2β、ニューレキシン3β、SynCam、Thy-1およびニューロンペントレキシンよりなる群から選択されるシナプス接着分子のフラグメント、アナログあるいは誘導体であることを特徴とする請求項23記載の方法。
【請求項２９】
作用物質が、抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびアプタマーよりなる群から選択されることを特徴とする請求項23記載の方法。
【請求項３０】
作用物質が、放射性同位体、常磁性イオン、標識抗体、標識抗体フラグメント、標識ポリペプチド、標識ポリヌクレオチドおよび標識アプタマーよりなる群から選択されることを特徴とする請求項23記載の方法。
【請求項３１】
作用物質がシナプス接着分子に指向された抗体であることを特徴とする請求項23記載の方法。
【請求項３２】
さらに、試料を標識された第2抗体と接触させることを含み、ここに、第2抗体はシナプス接着分子に指向された抗体に指向されることを特徴とする請求項31記載の方法。
【請求項３３】
作用物質が標識を含むことを特徴とする請求項23記載の方法。
【請求項３４】
標識がフルオロフォア、発色団、ハプテンおよび放射性核種よりなる群から選択されることを特徴とする請求項33記載の方法。
【請求項３５】
ハプテンがビオチンであって、方法が、試料をアビジン、ストレプトアビジン、およびビオチンに指向された抗体よりなる群から選択されるビオチンリガンドと接触させることをさらに含むことを特徴とする請求項34記載の方法。
【請求項３６】
ハプテンがジゴキシゲニンであって、方法が試料をジゴキシゲニンに対する抗体と接触させることをさらに含むことを特徴とする請求項35記載の方法。
【請求項３７】
放射性核種が3H、14C、32P、33P、35Sおよび131Iよりなる群から選択されることを特徴とする請求項34記載の方法。
【請求項３８】
細胞が磁気共鳴画像、コンピュータートモグラフィー、核磁気共鳴および陽電子放出断層撮影法よりなる群から選択される画像化法を用いて検出されることを特徴とする請求項23記載の方法。
【請求項３９】
作用物質が第2の化合物にコンジュゲートした第1の化合物を含むことを特徴とする請求項23記載の方法。
【請求項４０】
第1の化合物がシナプス接着分子を選択的に結合し、第2の化合物が放射性同位体であることを特徴とする請求項39記載の方法。
【請求項４１】
第1の化合物が抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびアプタマーよりなる群から選択されることを特徴とする請求項39記載の方法。
【請求項４２】
細胞を、ニューロピリン1を選択的に結合する作用物質と接触させ;次いで
作用物質を検出することを特徴とする、ニューロピリン1を発現する細胞を検出する方法。
【請求項４３】
細胞はベータ島細胞であることを特徴とする請求項42記載の方法。
【請求項４４】
ベータ島細胞が哺乳動物に含まれることを特徴とする請求項43記載の方法。
【請求項４５】
哺乳動物がヒトであることを特徴とする請求項44記載の方法。
【請求項４６】
作用物質が、抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびアプタマーよりなる群から選択されることを特徴とする請求項42記載の方法。
【請求項４７】
作用物質が、放射性同位体、常磁性イオン、標識抗体、標識抗体フラグメント、標識ポリペプチド、標識ポリヌクレオチドおよび標識アプタマーよりなる群から選択されることを特徴とする請求項46記載の方法。
【請求項４８】
作用物質が分子Xに指向された抗体であることを特徴とする請求項42記載の方法。
【請求項４９】
試料を標識された第2抗体と接触させることをさらに含み、ここに、第2抗体は分子Xに指向された抗体に指向されることを特徴とする請求項43記載の方法。
【請求項５０】
作用物質が標識を含むことを特徴とする請求項42記載の方法。
【請求項５１】
標識がフルオロフォア、発色団、ハプテンおよび放射性核種よりなる群から選択される請求項50記載の方法。
【請求項５２】
ハプテンがビオチンであって、方法が試料をアビジン、ストレプトアビジン、およびビオチンに指向された抗体よりなる群から選択されるビオチンリガンドと接触させることをさらに含むことを特徴とする請求項51記載の方法。
【請求項５３】
ハプテンがジゴキシゲニンであって、方法が試料をジゴキシゲニンに対する抗体と接触させることをさらに含むことを特徴とする請求項51記載の方法。
【請求項５４】
放射性核種が3H、14C、32P、33P、35Sおよび131Iよりなる群から選択される請求項51記載の方法。
【請求項５５】
細胞が、磁気共鳴画像、コンピュータートモグラフィー、核磁気共鳴および陽電子放出断層撮影法よりなる群から選択される画像化法を用いて検出されることを特徴とする請求項42記載の方法。
【請求項５６】
作用物質が第2の化合物にコンジュゲートした第1の化合物を含むことを特徴とする請求項42記載の方法。
【請求項５７】
第1の化合物がシナプス接着分子を選択的に結合し、第2の化合物が放射性同位体であることを特徴とする請求項56記載の方法。
【請求項５８】
第1の化合物が抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびアプタマーよりなる群から選択されることを特徴とする請求項56記載の方法。
【請求項５９】
治療上有効な量の、免疫学的シナプスの成分に結合する作用物質をそれを必要とする哺乳動物に投与することを特徴とする自己免疫性糖尿病を治療する方法。
【請求項６０】
免疫学的シナプスの成分が、SynCam、Thy-1およびニューロピリン1よりなる群から選択されることを特徴とする請求項59記載の方法。
【請求項６１】
作用物質が、抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびアプタマーよりなる群から選択されることを特徴とする請求項59記載の方法。
【請求項６２】
作用物質が、経口投与、静脈内投与、局所投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、皮内投与、腹腔内投与、吸入、硬膜外投与、眼内投与および直腸坐剤による投与よりなる群から選択される経路により投与されることを特徴とする請求項59記載の方法。
【請求項６３】
作用物質が医薬上許容される担体と投与されることを特徴とする請求項59記載の方法。
【請求項６４】
シナプス接着分子を供し；
シナプス接着分子をシナプス接着分子と結合することが知られた第1の作用物質と接触させ;
シナプス接着分子をシナプス接着分子と結合すると予測された第2の作用物質を接触させ;次いで
第1の作用物質の遊離を検出することを特徴とするシナプス接着分子を結合する作用物質を同定する方法。
【請求項６５】
シナプス接着分子が固定化されることを特徴とする請求項64記載の方法。
【請求項６６】
該シナプス接着分子が、ニューロリギン1、ニューロリギン2、ニューロリギン3、ニューロリギン4X、ニューロリギン4Y、ニューレキシン1α、ニューレキシン2α、ニューレキシン3α、ニューレキシン1β、ニューレキシン2β、ニューレキシン3β、SynCam、Thy-1およびニューロンペントレキシンよりなる群から選択されることを特徴とする請求項64記載の方法。
【請求項６７】
シナプス接着分子が、ニューロリギン1、ニューロリギン2、ニューロリギン3、ニューロリギン4X、ニューロリギン4Y、ニューレキシン1α、ニューレキシン2α、ニューレキシン3α、ニューレキシン1β、ニューレキシン2β、ニューレキシン3β、SynCam、Thy-1およびニューロンペントレキシンよりなる群から選択されるシナプス接着分子のフラグメント、アナログあるいは誘導体であることを特徴とする請求項64記載の方法。
【請求項６８】
シナプス接着分子を供し;
シナプス接着分子をそのシナプス接着分子を結合する作用物質を含む試料と接触させ;
試料をシナプス接着分子から分離し;次いで
シナプス接着分子に結合した作用物質を回収することを特徴とするシナプス接着分子を結合する作用物質を同定する方法。
【請求項６９】
シナプス接着分子が固定化されることを特徴とする請求項68記載の方法。
【請求項７０】
該シナプス接着分子がニューロリギン1、ニューロリギン2、ニューロリギン3、ニューロリギン4X、ニューロリギン4Y、ニューレキシン1α、ニューレキシン2α、ニューレキシン3α、ニューレキシン1β、ニューレキシン2β、ニューレキシン3β、SynCam、Thy-1およびニューロンペントレキシンよりなる群から選択されることを特徴とする請求項68記載の方法。
【請求項７１】
シナプス接着分子が、ニューロリギン1、ニューロリギン2、ニューロリギン3、ニューロリギン4X、ニューロリギン4Y、ニューレキシン1α、ニューレキシン2α、ニューレキシン3α、ニューレキシン1β、ニューレキシン2β、ニューレキシン3β、SynCam、Thy-1およびニューロンペントレキシンよりなる群から選択されるシナプス接着分子のフラグメント、アナログあるいは誘導体である請求項68記載の方法。
【請求項７２】
ニューロピリン1を供し；
ニューロピリン1をニューロピリン1に結合することが知られた第1の作用物質と接触させ;
ニューロピリン1をニューロピリン1に結合すると予測された第2の作用物質と接触させ;次いで
第1の作用物質の遊離を検出することを特徴とするニューロピリン1を結合する作用物質を同定する方法。
【請求項７３】
ニューロピリン1が固定化されることを特徴とする請求項72記載の方法。
【請求項７４】
ニューロピリン1を供し;
ニューロピリン1をニューロピリン1を結合する作用物質を含む試料と接触させ;
試料をニューロピリン1から分離し;次いで
ニューロピリン1に結合した作用物質を回収することを特徴とするニューロピリン1を結合する作用物質を同定する方法。
【請求項７５】
ニューロピリン1が固定化されることを特徴とする請求項74記載の方法。
【請求項７６】
シナプス接着分子を結合する作用物質を供し;
作用物質をベータ島細胞を含む試料と接触させ;次いで
作用物質に結合したベータ島細胞を回収することを特徴とする、ベータ島細胞を単離する方法。
【請求項７７】
作用物質が、抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびアプタマーよりなる群から選択されることを特徴とする請求項76記載の方法。
【請求項７８】
作用物質からベータ島細胞を分離することをさらに含むことを特徴とする請求項72記載の方法。
【請求項７９】
シナプス接着分子を結合する作用物質を含む、シナプス接着分子を検出するためのキット。
【請求項８０】
該シナプス接着分子が、ニューロリギン1、ニューロリギン2、ニューロリギン3、ニューロリギン4X、ニューロリギン4Y、ニューレキシン1α、ニューレキシン2α、ニューレキシン3α、ニューレキシン1β、ニューレキシン2β、ニューレキシン3β、SynCam、Thy-1およびニューロンペントレキシンよりなる群から選択される請求項79記載のキット。
【請求項８１】
シナプス接着分子が、ニューロリギン1、ニューロリギン2、ニューロリギン3、ニューロリギン4X、ニューロリギン4Y、ニューレキシン1α、ニューレキシン2α、ニューレキシン3α、ニューレキシン1β、ニューレキシン2β、ニューレキシン3β、SynCam、Thy-1およびニューロンペントレキシンよりなる群から選択されるシナプス接着分子のフラグメント、アナログあるいは誘導体であることを特徴とする請求項79記載の方法。
【請求項８２】
該作用物質が、抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびアプタマーよりなる群から選択される請求項79記載のキット。
【請求項８３】
ニューロピリン1分子を結合する作用物質を含むニューロピリン1を検出するためのキット。
【請求項８４】
該作用物質が、抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびアプタマーよりなる群から選択される請求項83記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、2005年8月4日に出願された米国仮出願第60/706,133号（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす）からの優先権を主張する。
【０００２】
（連邦委託研究または開発に関する記載）
本発明は、部分的に、国立衛生研究所助成DK02944下の国庫補助でなされた。政府は本発明においてある種の権利を有する。
【０００３】
（コンパクトディスクでの提出資料の参照による組込み）
適用可能でない。
【背景技術】
【０００４】
１．発明の分野
本発明は、シナプス接着分子、および膵島β細胞におけるそれらの役割、特に、その島を画像化、単離および検出する方法、ならびにβ細胞および膵臓異常に関連した疾患を抑制、治療および反転する方法に関する。
【０００５】
２．関連技術の記載
シナプス接着分子は、シナプス接合での細胞の付着に関与する異種ファミリーの細胞表面タンパク質である。シナプス接着分子の主成分は、カドヘリンファミリーおよび免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。シナプス接着分子は、付着および細胞シグナリングからシナプスの分化に及ぶ多数の機能に役立つと思われる。最近の研究は、シナプス接着分子SynCAMをシナプス接合部に位置した分子と同定した。2つの他の公知の群のシナプス接着分子は、ニューロリギン(例えば、ニューロリギン1、ニューロリギン2、ニューロリギン3、ニューロリギン4Xおよびニューロリギン4Y)およびニューレキシン(例えば、ニューレキシン1α、ニューレキシン2α、ニューレキシン3α、ニューレキシン1β、ニューレキシン2βおよびニューレキシン3β)を含む。これらのポリペプチドの配列は当該技術分野において知られており、全米バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information、「NCBI」)、http://www.ncbi.nlm.nih.govにてインターネットで入手可能である。
【０００６】
糖尿病の発生率が増加すると、より改善された診断および治療方法も必要となる。島β細胞移植は、1型糖尿病の治療における鍵となる療法として出現した。β細胞移植はいくらかの成功に遭遇したが、その治療は多数の問題を伴う。β細胞移植は多くの患者に最初は有効であるが、インスリン独立性を維持する受容者の能力がやがて縮小する。独立性のこの損失の原因は知られていないが、β細胞量の損失が1つ成因である考えられている。明確なβ細胞特異的表面蛋白はこれまで同定されていないため、これは正確な原因を決定することを困難にした。
【０００７】
in vivoにて島β細胞量を測定する能力は、研究者および臨床医にとって同様に大きな興味がある。膵臓癌、特に、真性糖尿病の領域における研究を妨げた、画像化および治療のための標的とされるのに特に十分な細胞表面タンパク質は、これまで得られていない。画像化および治療のために用いるのに十分に特異的である細胞表面タンパク質島β中で発現された公知の細胞表面マーカーはない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、シナプス接着分子、および膵島β細胞におけるそれらの役割、特に、その島を画像化、単離および検出する方法、ならびにβ細胞および膵臓異常に関連した疾患を抑制、治療および反転する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
結果的に、関連技術分野に関連したこれらおよび他の問題を克服することが本発明の目的である。これらおよび他の目的、特徴ならびに技術的な利点は、島β細胞上で発現されたシナプス接着分子を標的とすることにより達成され、それらは、β細胞の表面、特に膵島β細胞上のニューロリギン1、ニューロリギン2、ニューロリギン3、ニューロリギン4X、ニューロリギン4Y、ニューレキシン1α、ニューレキシン2α、ニューレキシン3α、ニューレキシン1β、ニューレキシン2β、ニューレキシン3β、SynCam、Thy-1およびニューロンペントラキシン (以下、「SAM」)および／またはニューロピリン1(NCBIで入手可能な配列、同上)を含む。
【００１０】
本発明のさらなる態様により、方法は、治療上有効な量の、SAMおよび／またはニューロピリン1を選択的に結合する作用物質（agent）をそれを必要とする哺乳動物に投与することにより糖尿病または島細胞癌のごとき膵臓疾患を治療するために提供される。提供される作用物質は、そのクラスの分子のいずれかであり、本明細書に記載した種々の経路によって送達され得る。
【００１１】
本発明のさらにもう一つの態様により、方法は、治療上有効な量の、免疫学的シナプスの成分を結合できる作用物質をそれを必要とする哺乳動物に投与することにより自己免疫性糖尿病の治療に提供される。標的とされた免疫学的シナプスの成分は、SynCam、Thy-1およびニューロピリン1よりなる群から選択され得る。
【００１２】
本発明は、膵島β細胞に特異的に結合できる作用物質で細胞を処理することを含む、SAMおよび／またはニューロピリン1を発現する細胞、特に、膵島β細胞を画像化、ターゲティング、検出、同定および分離する方法を提供する。本発明の１つの態様において、哺乳動物はヒトである。本発明のさらなる態様により、作用物質は、抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびアプタマーよりなる群から選択される。本発明の１つの態様において、作用物質は抗体である。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラおよび単鎖抗体よりなる群から選択され得る。抗体フラグメントは、FAbフラグメントあるいはFAb発現ライブラリーFAb発現ライブラリーよりなることができる。
【００１３】
本発明のさらにもう一つの態様において、作用物質は第1の化合物および第2の化合物のコンジュゲートであり得る。SAMおよび／またはニューロピリン1を発現する細胞を検出する、または疾患を治療する目的のために、第2の作用物質は放射性同位体または常磁性イオンであり得る。本発明のさらにもう一つの態様において、治療される疾患は、糖尿病、特に、真性糖尿病、より詳しくは自己免疫性糖尿病、膵臓癌、特に転移性膵臓癌であり得る。
【００１４】
本発明のさらなる態様により、島β細胞の表面上のSAMおよび／またはニューロピリン1を標的とする作用物質を用いて、β細胞量を決定し得る。β細胞量は、本発明の方法を用いて、反復された画像化によって経時的にモニターされ得る。
【００１５】
本発明のさらにもう一つの態様により、方法は、アッセイされる試料の存在下で、固定化したSAMおよび／またはニューロピリン1を供し、次いで、その固定化された分子をインキュベートすることにより、SAMおよび／またはニューロピリン1を結合できる作用物質を同定するために提供される。その固定化された分子は、試料から引き続いて取り出され、作用物質がそれに結合するかを決定される。
【００１６】
本発明のさらにもう一つの態様により、方法は、SAMおよび／またはニューロピリン1を結合できる、哺乳動物のβ細胞を画像化できる、および生成された画像の使用により腫瘍の存在または不存在を決定できる有効量の作用物質をそれを必要とする哺乳動物に投与することにより、β細胞腫瘍を検出するために提供される。経時的に、腫瘍の進行または退行はこの方法によりモニターされ得る。
【００１７】
本発明のさらにもう一つの態様において、前記およびさらに本明細書に記載した方法を行うのに必要な試薬を含有するキットが提供される。
【００１８】
図面の簡単な記載
図1A．β細胞特異的であるニューロリギン2およびニューレキシン1染色を示す。
図1B．β細胞特異的であるニューレキシン1染色のもう一つの視野を示す。
【００１９】
図2．SynCam特異性島特異性を示す。
図3．NL-2(ニューロリギン2)がβ細胞中で発現される。PCRデータ(ヒト脳および島cDNA、NT=ネガティブ対照)。INS-1は、膵島β細胞の生物学を研究するために用いた一般的に用いられる細胞系である。
【００２０】
図4．ウェスタンブロット: マウス脳、ラット脳（左）、ならびにα細胞系アルファ-TC6(第3レーン)ではなく、2つのインスリン産生β細胞（NITおよびINS-1;右）中のニューロリギン1。抗体はニューロリギン1に特異的なモノクローナル抗体(4C12)であった。
図5．NL-1免疫染色。ニューロリギン1はβ細胞系INS-1にある。
【００２１】
図6．NL-1に対する抗体は、ラット膵臓切片中の島を染色する。
図7．ニューレキシン1についての免疫染色。ニューレキシン1は、膵島(左; 膵臓染色は島特異的である)、およびインスリン産生INS-1β細胞系にある。
【００２２】
図8．SynCamについての免疫染色。SynCamは、島β細胞系INS-1の表面に存在する。
図9．遺伝子特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応は、ニューロリギン(NL)およびニューレキシン(Nrxn)がヒトの島(Is)およびラット由来ベータ細胞系INS-1(I)およびマウス由来ベータ細胞系Nit-1 (N)中で発現される。また、予測のごとく、遺伝子が脳(Br)中で発現される。
【００２３】
図10．ニューロリギン1および2はインスリン分泌に関与する。インスリン分泌の増加は、ベータ細胞系INS-1中のNL-1およびNL-2の(遺伝子トランスフェクションによる)過剰発現後に明らかである。「モック」はニューロリギン過剰発現がない対照である。
【００２４】
図11．ニューロリギン3および4はインスリン分泌に関与する。インスリン分泌の増加は、ベータ細胞系INS-1中のNL-1およびNL-2の(遺伝子トランスフェクションによる)過剰発現後に明らかである。「モック」はニューロリギン過剰発現がない対照である。
【００２５】
図12．島および島細胞系中のニューレキシン1およびニューロリギン1蛋白質の発現。ニューレキシンおよびニューロリギンの蛋白質が島において発現されるかを決定するために、ウエスタンブロット解析を、ニューレキシン1に対するヤギポリクローナル抗体およびニューロリギン1(4C12)に対するマウスモノクローナル抗体を用いて行った。ニューレキシン1bは、b-細胞系Ins-1およびNIT、ならびにヒトおよびラットの双方の島抽出物中で検出された。ニューロリギン1は単にINS-1およびNIT細胞に検出された。すべての実験において、ラット、マウスおよびヒトの脳からの蛋白質抽出物はポジティブ対照として用いた。ニューロリギン1がヒトまたはラットの島で検出されなかったので、発明者らは、島を単離するために用いた方法がその検出に影響したのではないか疑った。膵臓中で産生された消化酵素によりWB分析を介して細胞表面蛋白質を検出することは周知のごとく難しい。NL-1がこれらの酵素のうちのいくつかに感受性であることを決定するために、発明者らはトリプシンでβ細胞系NITを処理した。ここで、発明者らは、ニューロリギンがトリプシンに感受性であることを示す。また、発明者らは、ニューレキシンがそうではないことを示した。また、この実験を行う際に、発明者らはニューレキシンがNIT細胞の細胞表面上で発現されることを確認した。
【００２６】
図13．NIT b-細胞系におけるニューロリギン1の細胞表面発現。ニューロリギン1が細胞表面上で発現されるかを決定するために、NIT細胞をフラスコにプレートし、48時間培養して、トリプシンで、あるいはトリプシンなくして処理した。次いで、蛋白質を抽出し、ウエスタンブロット解析をモノクローナルニューロリギン1抗体を用いて等量の蛋白質で行った。ニューロリギン1は、トリプシンで処理した細胞中で減少し、これは、NIT細胞の細胞表面上で発現されることを示唆する。ネガティブ対照として、同じ実験を細胞内の蛋白質ゲフリン（gephryin）につきプロービングして行った。期待されるように、ゲフリンはトリプシンでの細胞の処理によって影響されなかった。(+、トリプシン; -、トリプシン未処理)。
【００２７】
図14．ヒトの膵島ならびにラットおよびマウスb-細胞系におけるニューレキシンおよびニューロリギンRNAの発現。ニューレキシンおよびニューロリギンのメッセージが島で発現するかを決定するために、RT-PCR分析を、すべてのニューレキシン(Nrxn)およびニューロリギン(NL)ファミリーメンバーに対する遺伝子特異的プライマーを用いて、(A)ヒト膵島、(B)INS-1細胞、(C)NIT細胞および(D)ヒト胎児膵臓で行った。すべての実験において、適当な種からの脳RNAをポジティブ対照として用いた。(Br、脳; Is;ヒト島;Nt、テンプレートなし;I、INS-1細胞;N、NIT細胞;P、ヒト胎児膵臓;Nrxn、ニューレキシン;NL、ニューロリギン)。
【００２８】
図15．ヒト膵細胞を用いて得た蛍光標示式細胞分取器(FACS)からのデータ。細胞は、プロインスリンに対する抗体およびSynCam(鶏卵起原の抗体)の細胞外領域に対する抗体で標識した。左パネル:対照トリ抗体(IgY)は、プロインスリン陽性細胞をソートできない、中央パネル:また、細胞外SynCam抗体(右方向)による高標識を有する細胞の大きな画分が、高プロインスリン抗体標識を示す（上部方向）。右パネル; 高アミラーゼ発現を持つ細胞(換言すれば、膵臓腺房[非島]細胞)は、SynCamで標識されなかった(腺房細胞は左方であった)。結論：SynCamでの膵細胞のソーティングは、膵臓腺房細胞(それらは非島である98%の膵臓の大部分を含む)からのインスリン産生島ベータ細胞の精製を可能にする。SynCamでソーティングは、β細胞につき非常に富化した細胞の集団を与える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
略語および定義
特記しない限りは、本明細書に用いた全ての技術用語が本発明が属する当該技術分野における当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学用語の一般的に理解される定義は、Riegerら, GLOSSARY OF GENETICS: CLASSICAL AND MOLECULAR, 5th edition, Springer-Verlag; New York, 1991; and Lewin, GENES V, Oxford University Press; New York, 1994に見出すことができる。本発明についての理解を促すために、本明細書に用いた多数の用語および略語は以下に定義される:
【００３０】
結合またはとの相互作用：本明細書に用いた「結合」または「との相互作用」なる用語は、ある分子が試料中の特定の第２の分子を認識およびそれに付着するが、実質的に試料中の他の構造上無関係な分子を認識も、それに付着もしない活性をいう。一般的に、第２の分子に「特異的に結合する」第１の分子は、その第２の分子について約105〜106を超える結合親和性を有する。
核酸または核酸分子もしくはポリヌクレオチド:本明細書に用いた「核酸」または「核酸分子」なる用語は、RNA(リボ核酸)およびDNA(デオキシリボ核酸)のごとき2以上のヌクレオチドの鎖をいう。
【００３１】
医薬上許容される:本明細書に用いた「医薬上許容される」なる用語は、国立(例えば、FDA)、超国家的(例えば、EMEA)または他の監督官庁、政府団体、倫理委員会、または規制当局の許可を与える委員会、あるいは州政府のいずれかの監督官庁または機関により承認されること、あるいは動物、より詳しくはヒトに用いる米国局方または他の一般的に認識された薬局方にリストされることをいう。
医薬上許容される担体:本明細書に用いた「医薬上許容される担体」なる用語は、作用物質が投与される希釈剤、アジュバンド、賦形剤またはビヒクルをいう。かかる担体は、落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油、トコフェロール等、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールあるいは他の合成溶剤のごとき、石油、動物、野菜あるいは合成起原のものを含めた水および油のごとき無菌液体であり得る。作用物質が静脈内投与される場合、水は好ましい担体である。また、食塩水ならびに水性のデキストロースおよびグリセリン溶液は特に注射溶液のための液体担体として使用できる。適当な賦形剤はデンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール・モノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、および／またはHandbook of Pharmaceutical Excipients (4th edition, Pharmaceutical Press)に見出される化合物等を含む。また、所望ならば、作用物質は、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいは酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩のごときpH緩衝剤を含むことができる。また、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのごとき抗菌剤;アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムのごとき抗酸化剤;エチレンジアミン四酢酸のごときキレート剤;および塩化ナトリウムまたはデキストロースのごとき張度の調整用の剤は、担体となり得る。
【００３２】
蛋白質またはポリペプチド:本明細書に用いた「蛋白質」または「ポリペプチド」なる用語は、長さあるいは翻訳後修飾、例えば、グリコシレーション、リン酸化にかかわらず、アミノ酸のいずれのペプチド連結鎖も意味する。
【００３３】
治療上有効な量:本明細書に用いた「治療上有効な量」なる用語は、対象の疾患または状態の性質および重篤度に徴した特定の対象に投与される場合に、所望の治療効果、例えば、標的疾患または状態を治療、予防、抑制、または少なくとも部分的に抑止または部分的に予防するであろう量をいう。
【００３４】
ベータ細胞疾患を治療および検出する方法
本発明は、島β細胞をその表面に存在するβ細胞特異的な分子を用いて、画像化、治療、分離および同定する方法に関する。本発明の１つの態様において、SAMとして集合的に知られたあるクラスの分子を利用する。SAMは以前にニューロン中でのみ発現されると考えられていた。しかしながら、かかる分子も膵島β細胞において発現されることが驚くべきことに発見された。本発明のもう一つの態様において、免疫学的シナプス(しかしシナプス接着分子ではない)のメンバーのニューロピリン1を本方法に用いる。
【００３５】
本発明のSAMおよびニューロピリン配列は以下を含む: ニューロリギン1 (NCBI受入番号: NM_014932, 配列番号: 1); ニューロリギン2 (NCBI受入番号: NM_020795およびAF376802, 配列番号: 2および3); ニューロリギン3 (NCBI受入番号: NM_018977, 配列番号: 4); ニューロリギン4Y (NCBI受入番号: AF376804, 配列番号: 5); ニューロリギン4X (NCBI受入番号: AF376803, 配列番号: 6); ニューレキシン1 アルファ(NCBI受入番号: NM_004801, 配列番号: 7); ニューレキシン1 ベータ (NCBI受入番号: NM_138735, 配列番号: 8); ニューレキシン2 アルファ (NCBI受入番号: NM_015080, NM_138732, 配列番号: 9および10); ニューレキシン2 ベータ (NCBI受入番号: NM_138734, 配列番号: 11); ニューレキシン3 アルファ (NCBI受入番号: NM_004796,NM_004796, 配列番号: 12および13); ニューレキシン3 ベータ (NCBI受入番号: NM_138970, 配列番号: 14); Syncam (NCBI受入番号: NM_014333, 配列番号: 15); THY-1 (NCBI受入番号: BC065559 , 配列番号: 16);ならびにニューロピリン1 (NCBI受入番号: NM_003873 NM_001024628  NM_001024629, 配列番号: 17, 18および19)。また、本発明は、後記されるSAMおよびニューロピリンの変異体、フラグメント、アナログ等を含めたSAMおよびニューロピリンの蛋白質を含む。
【００３６】
当該技術分野において従前に公開された文献は、ニューロピリン1が膵臓中で発現されないと主張した。この分子が実際に、膵臓のβ細胞中で発現されることが驚くべきことに判明した。SAMおよび／またはニューロピリン1が膵臓癌および糖尿病のごときある種の疾患に関係するので、β細胞上のSAMおよび／またはニューロピリン1の存在を利用して、β細胞の量、位置、存在および枯渇を評価し得る。
【００３７】
脳血液関門機能が神経組織−−免疫学的寛容部位−−への進入から体内に循環する高分子の透過を防止するように機能するために、特に、本方法は、膵臓島β細胞上のSAMのイメージング、同定、処理および分離を生じる。かくして、SAMは、膵臓疾患のイメージングおよび治療に好ましい標的である。
【００３８】
本発明は、膵臓島β細胞の表面上に存在するSAMおよび／またはニューロピリン1に選択的に結合できる作用物質を哺乳動物に投与することにより、in vitroおよびin vivoの双方にて、膵臓島β細胞を検出および画像化する方法を提供する。ポリメラーゼ連鎖反応を用いる実験は、島β細胞中で発現されたSAMが、ニューロリギン1、ニューロリギン2、ニューロリギン3、ニューロリギン4X、ニューロリギン4Y、ニューレキシン1α、ニューレキシン2α、ニューレキシン3α、ニューレキシン1β、ニューレキシン2β、ニューレキシン3β、SynCam、Thy-1およびニューロンペントラキシンを含むことを明らかにした。本発明のさらなる態様により、作用物質は、抗体、抗体フラグメント、抗体の可変領域、蛋白質、ポリペプチド、核酸、プローブ、オリゴヌクレオチドおよびリボザイムよりなる群から選択される。作用物質の種々の態様はより十分に後記される。
【００３９】
抗体
SAMおよび／またはニューロピリン1蛋白質を特異的に認識およびそれに結合する抗体は、本発明に有用である。例えば、かかる抗体は、SAM機能の検出および変調に用いることができる。本発明の範囲内の抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および抗体フラグメントを含む。種々のタイプの抗体のエンジニアリング、生産、精製、断片化および使用は、当該技術分野においてよく知られている。一般的には、Carter (2006) Nat Rev Immunol. 6(5), 343-357; Teillaud (2005) Expert Opin Biol Ther. 5(Supp. 1) S15-27; Subramanian, ed. (2004) Antibodies : Volume 1: Production and Purification, Springer, ISBN 0306482452; Lo, ed. (2003) Antibody Engineering Methods and Protocols, Humana Press, ISBN 1588290921; Ausubelら, ed. (2002) Short Protocols in Molecular Biology 5th Ed., Current Protocols, ISBN 0471250929; Brentら, ed. (2003) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, ISBN 047150338X; Coligan (2005) Short Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, ISBN 0471715786参照。
【００４０】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、免疫された動物、通常、血清から得られる抗体分子の不均質な集団である。ポリクローナル抗体は、当該技術分野において知られたおよび上にリストした多数の参考文献に記載された種々の温血動物から当業者により容易に生成し得る。
さらに、ポリクローナル抗体は種々の商業源から得ることができる。
【００４１】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は特定の抗原に対する抗体の均質な集団である。抗原のいくつかのエピトープに特異的である得るポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は、単一のエピトープに通常特異的である。一般的に、モノクローナル抗体は、抗原チャレンジされた動物(ここに、抗原は本明細書に記載した蛋白質を含む)の脾臓からB細胞を取り出し、次いで、培養において無制限に成長できる骨髄腫腫瘍細胞と融合することにより生成される。融合したハイブリッド細胞、またはハイブリドーマは、急速にかつ無制限に増加し、大量の抗体を生産できる。ハイブリドーマは、各々が1だけのタイプの抗体を産生する多数の異なるコロニーを得るように十分に希釈し、成長できる。次いで、異なるコロニーからの抗体は、抗原に結合するそれらの能力に続いて、最も有効なものの選択に関してテストできる。
【００４２】
特に、モノクローナル抗体は、前記にリストされた参考文献に記載されたもののごとき培養中の連続細胞系による抗体分子の産生を提供するいずれの技術によっても得ることができる。さらに、モノクローナル抗体は種々の商業源から得ることができる。
【００４３】
かかる抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびそのいずれのサブクラスも含めたいずれかの免疫グロブリンクラスであり得る。好ましくは、抗体はIgG免疫グロブリンクラスである。本発明のmAbを産生するハイブリドーマはin vitroまたはin vivoにて培養し得る。高力価のmAbをin vivoにて生成する能力は、これを特に有用な生成方法にする。MAbは、より大きな取込みに転換して、多数の抗体フラグメントより長い終末半減期を一般的に有し、治療適用に望ましくできる。
【００４４】
MAbは、それらの(a)特異性、(b)高い結合親和性、(c)アイソタイプおよび(d)安定性に基づいて選択できる。MAbは、Western Blotting (Koren, E.ら, Biochim. Biophys. Acta 876:91-100 (1986))および酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA) (Korenら, Biochim. Biophys. Acta 876:91-100 (1986))を含めた種々標準的な技術のいずれかを用いて特異性についてきスクリーニングおよびテストできる。
【００４５】
これらのモノクローナル抗体は、通常、少なくとも約1 mM、より通常には、少なくとも約300μM、典型的は少なくとも約10μM、より典型的には約30μM、好ましくは約10μM、より好ましくは約3μMまたはより良好なKDで結合するであろう。
【００４６】
抗体フラグメント
機能的な抗体フラグメント、例えば、Fab、F(ab')2、F(ab')2、F(ab')3、Fc、単鎖Fv (scFv)、scFV-Fc、(scFv)2、dsFv、Vh、Vl、Minibody、Diabody、Triabody、Tetrabodyを産生および使用することが望ましいかもしれない。一般的に、これらの代替抗体フォーマットは、12-150 kDaの分子量範囲；モノマー(n=1)、二量体(n=2)、三量体(n=3)、四量体またはさらに高い価数(n)範囲;および同じ抗原に対する１ないし３を超える抗体またはエピトープの抗原結合特異性に及び得る。
【００４７】
これらのフラグメントは、抗原分子上の1つの特定の部位についての抗体の特異性を担う相補性決定領域として知られたアミノ酸配列の伸張を含む超変異部を一般的に含む。種々の抗体フォーマットを創製するのに用いることができるビルディングブロックは、約15までのアミノ酸残基のペプチドリンカーによって連結された、重鎖および軽鎖(VHおよびVLドメイン)からのVドメインを含む単鎖の可変(V)−ドメイン抗体フラグメント (scFv)である。好ましくは、scFV抗体フラグメントは、VLドメインペプチド・リンカー-VHドメイントポロジーあるいはVHドメインペプチド・リンカーVLドメイントポロジーからなる。
【００４８】
抗体フラグメントを設計、生成、精製、スクリーニングするための技術は、前記に引用された多数の参考文献に記載されたごとく、当該技術分野においてよく知られている。例えば、ヒトのVHの大きな組合せのライブラリーを発現する線状ファージディスプレイは、特定のフラグメントを選択するのを可能とする(例えば、Hoogenboom (2002) Methods Mol. Biol. 178, 1-37参照、それは抗体ファージディスプレー技術の総説を提供する)。また、ファージディスプレー選択技術を利用して、例えば、結合親和性を最適化でき;種交差反応性のごとき特異的結合特性につき選択でき;あるいは、組合せの特性あるいは非常に高力価を同定するのに特異的な抗体の大きな収集(例えば、1,000以上)を得ることができる。ファージディスプレーを介して産生された抗体フラグメントは、当該技術分野において知られたIgGのごとき種々の他の形態の抗体に高処理方法によって再編成できる。もう一つの例として、高親和性抗体の生成および単離は、超変異するB細胞系の使用、および非常に低親和性閾値にて始められた選択プロセスに基づくことができる(例えば、Cumberら (2002) Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134参照)。さらなる例として、抗体フラグメントを抗体フラグメントmRNAの選択、回収、増幅および発現を含めたリボソーム・ディスプレイ・ライブラリスクリーニングによって産生でき、所望により、VHおよびVLを再構成できる(例えば、Hanes ら. (2000) Nat. Biotechnol. 18, 1287-1292参照)。まだもう一つの例として、サッカロミケスセレビシア（Saccharomyces cerevisiae）の接合（mating）接着受容体へのC末端融合に関与する多重イスート・ライブラリスクリーニングを用いて、ランダムに変異したライブラリーからの抗体フラグメントを選択および分離できる(例えば、Feldhaus ら. (2003) Nat. Biotechnol. 21, 163-170参照)。
【００４９】
また、本明細書に記載した抗体フラグメントは、例えば、IgG分子に高処理方法によって再編成できる。例えば、Carter ら. (2006) Nat Rev Immunol. 6(5), 343-357, 347参照。抗体フラグメントは、Fc依存性エフェクター機能を回避するのに望ましくなり得る。そして、PEG化後、抗体フラグメントは広範囲の薬物動態学的特性を示すことができる。より効率的な腫瘍浸透およびより速いクリアランスのために、抗体フラグメントはイメージング適用に望ましくなり得る。そして、一価抗体フラグメントは、架橋のない受容体へのリガンド結合をブロックでき、潜在的に、受容体を活性化できる受容体拮抗薬として使用するために、IgGのごとき二価の形態より望ましくなり得る。
【００５０】
抗体ベースの融合分子
二機能性の活性を持つ少なくとも2つの異なるモジュールを示す抗体ベースの融合分子は、当該技術分野において知られた分子設計技術から生成できる。設計された融合分子は、2つのモジュール間の柔軟なリンカーを含む。リンカーは、例えば、IgGアイソトープのヒンジ領域、(Gly4Ser)3モチーフのごとき疎水性アミノ酸の小さな伸張、あるいはDNA酵素制限部位に対応するいくつかのアミノ酸から誘導できる。
【００５１】
一般的には、２つのタイプの抗体ベースの融合分子を設計できる。第１のタイプの抗体ベースの融合分子は、酵素、毒素、成長因子、ケモキネス、サイトカイン等に融合した抗体特異性を保持する分子である。目標認識モジュールは、抗体フラグメントあるいは全体の抗体であり得る。例えば、標的モジュールは、シュードモナス毒素、リシン、ジフテリア毒素あるいは当該技術分野において知られた他の毒素のごとき毒素モジュールに融合できる。もう一つの例として、標的モジュールは、酵素、好ましくは、プロドラッグからの毒性生成物を生成するために用いた酵素に融合できる。ADPET(抗体指向性酵素プロドラッグ療法)というこの戦略は、例えば、全身注射され、正常組織から除去するのを可能とする融合分子による腫瘍細胞のプレターゲッティングに基づいている。グリコシル化は、非標的組織部位からの制御およびクリアランスを改善できる。次いで、非毒性プロドラッグは注入され、標的部位で生物活性の作用物質への酵素によって変形される。もう一つの例として、種々のELISA用の融合試薬は、アルカリホスファターゼと抗体を融合させることにより生成できる。
【００５２】
二機能性分子の代替物は、エフェクターおよび標的細胞を架橋する二重特異性抗体(BsAb)を含む(例えば、Weiner and Adams (2000) Oncogene 19, 6144-6151参照）。BsAbは、BsAbが最初に注入され、放射標識されたハプテン、薬物またはサイトカインのごとき分子が注入にされたプレターゲティング戦略を促し、それは、BsAbが結合した細胞におけるエフェクター分子を集中することを可能にする(例えば、Chang ら. (2002) Mol. Cancer Ther. 1, 553-563参照)。
【００５３】
第2のタイプの抗体ベースの融合分子は、リガンド結合用の表面分子の競合物、あるいは可溶のリガンドを捕らえるための可溶のデコイ受容体として作用する(例えば、Teillaud (2005) Expert Opin Biol Ther. 5(Suppl 1) S15-27参照)。一般的に、これらの融合分子は、Fc領域(例えば、IgG1またはIgG4に由来したFc)を含み、Fc領域中に存在する3つのシステインを介して発現された各単鎖融合蛋白質間のジスルフィド架橋の形成によりCHOまたはNS1細胞のごとき哺乳動物細胞によって二量体形態下で分泌される。この二量体の組換え形態は標的分子を一価の等価物より高い結合力で結合できる。さらに、Fc領域は血清中半減期および組織拡散を増加させ、免疫複合体の除去を促進し、および／または免疫細胞によって発現されたFcγRとの相互作用によりその標的抗原との融合分子の相互作用を安定化させる。
【００５４】
免疫原性低下用抗体の設計
キメラのヒト化および完全なヒトMAbは、非ヒト源に由来した抗体の使用に対する潜在的な制限を有効に克服でき、これは、最適化されたエフェクター機能を持つ減少した免疫原性を提供する。かかる作用物質は、蛋白質工学(例えば、相補性決定領域移植)を介して、ライブラリー技術(例えば、ファージ、イスートあるいはリボソームディスプレイ)を介して、あるいはトランスジェニックマウスにおけるMAb生成により産生できる。
【００５５】
一般的に、キメラおよびヒト化された抗体は、このサブクラスが免疫の介在に適当な特性(FcγR結合、血清半減期)および機能特性(ADCC、食作用、エンドサイトーシス、補体活性化)を示すために、ヒトIgG1に由来したFc領域を含むであろう。エフェクター機能(すなわち、FcγR結合によりトリガーされた補体活性化および機能特性)のトリガーリングを回避し、かつ正常組織への非特異性の結合を減少させるために、ヒトIgG2あるいはIgG4のFc領域を使用することが好ましい。キメラおよびヒト化された抗体を開発するのに用いる抗体フラグメントは、限定されるものではないが、ファージディスプレー・ライブラリスクリーニング、超変異B細胞系、リボソーム・ディスプレイ・ライブラリスクリーニングおよびイスート・ディスプレイ・ライブラリスクリーニングを含めた前記のいずれかの方法により産生できる。
【００５６】
キメラ抗体は、ヒト重鎖および軽鎖の不変ドメインに、例えば、マウスモノクローナル抗体の可変ドメインを連結することにより得ることができる。かかるアプローチは、ヒトにおける外来性蛋白質の時々の高免疫原性、非ヒト抗体がヒト補体およびFcγRと有することができる弱い相互作用および非効率的エフェクター機能、およびヒト系で生じかない非ヒト抗体の終末半減期の低下を扱うことができる。発現ベクターは、げっ歯動物リーダー重鎖可変ドメイン(VH)cDNAおよびリーダー軽鎖可変ドメイン(VL)cDNA、ヒトのIgG Fc領域およびCκドメインを各々コードするDNA塩基配列の5'のインフレームクローニングを可能とする適当なクローニング部位を含むように構築できる。かくして、リーダー配列と一緒の再成形されたVHおよびVLcDNAは、ヒトの不変部ドメインを含む発現ベクターへクローニングできる。
【００５７】
ヒト化抗体は、ヒトのVHおよびVLフレームワーク(FR)上に所望の特異性を持つマウス抗体に由来した相補性決定領域(CDR)を移植することにより得ることができる(例えば、Teillaud (2005) Expert Opin. Biol. Ther. 5(1), S15-S27参照)。さらに、親マウス抗体からの1以上のフレームワーク領域残基のトランスファーの結果、抗原につき高結合親和性を持つヒト化された抗体を生成できる。抗体のヒト化は、一般的にナチゲン結合部位形成に関与する残基を同定するようなマウス可変ドメインの一次アミノ酸配列の分析を必要とする。あるいは、可変ドメイン再表面形成において、マウスmAbのヒト化は、マウスおよびヒトの可変領域におけるアミノ酸残基の溶媒接触性分布を決定するための公知の抗体構造の組織分析に基づくことができる(例えば、Roguska ら. (1994) Proc. Natl. Acad. Ci. USA 91, 969-973; Delagrave ら. (1999) Protein Eng. 12, 357-362参照)。同定されたマウス表面の残基パターンは、ほんの少数のアミノ酸変更でヒトのパターンに変換できる。
【００５８】
種交差反応的な抗体を得て、抗体の生物学的機能が疾患の動物モデルにおいて評価および／または利用されることを可能にすることはしばしば望ましいことである。種交差反応性を持つヒト化された抗体の選択は、例えば、ファージディスプレーライブラリーで達成できる。
【００５９】
完全なヒト化抗体は、当該技術分野において知られたいくつかの手段によって誘導できる。例えば、、もう一つの例としてのファージディスプレイ、遺伝子不活性化および、マウス生殖系列における酵母人工染色体またはヒト染色体フラグメントからの大きなヒトのDNA断片の挿入は、免疫後の完全なヒト化抗体を産生できるトランスジェニックマウスを生成できる(例えば、Tomizuka ら. (2000) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 97, 722-727参照)。かかるマウスは、ヒトの配列免疫グロブリンのレパートリーを生成でき、加えて、それらの脾臓細胞は高親和性を示すヒトIgG抗原特異性抗体を分泌するハイブリドーマを生成するためのマウス骨髄腫細胞に融合できる。あるいは、二重のトランス−染色体/二重ノックアウトマウスのごときトランスジェニックマウスは、免疫後の抗原特異性ヒト化抗体応答を組み込むことができ、ヒト特異mAbを生成できる(例えば、Tomizuka ら. (2000) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 97, 722-727参照)。ヒト化抗体の生成の他の例は、ファージ、リボソーム、mRNAディスプレイおよびイスートディスプレイライブラリー、ならびに患者からのヒトハイブリドーマ、および抗原上で選択された単一のリンパ球からの抗体-cDNAクローニングを含む（例えば、Carter ら. (2006) Nat Rev Immunol. 6(5), 343-357, 346-347参照。
【００６０】
一般的に用いるIgG1以外の異なるIgアイソタイプが、生成された抗体を異なる適用に調整するようにヒト化されたマウスを用いて生成できる。例えば、ヒトのIgG4は、免疫細胞のエフェクター機能を活性化する能力を限定し、限定された免疫の賦活を持つ標的をブロックするように好ましくは用いることができる。放射標識されたIgG4 mAbは、正常組織への低下した非特異性の結合がFcγRへのその貧弱な結合によりこのアイソトープで達成できるので、放射免疫療法および画像化のために特に好ましい。もう一つの例として、IgAは好ましい抗感染性試薬であり、加えて、ADCCおよび食作用のごとき免疫機能の強力な活性化因子である。
【００６１】
抗体のFcγR機能の最適化
種々の抗体は、それらのFc領域および異なるFc受容体(FcRs)間の相互作用に続くエフェクター機能を誘発する。Fc領域を含む抗体の治療的効力は、Fc領域および種々のFcR(例えば、FcγR)間の相互作用を設計することにより最適化または低下できる。例えば、FcγRの活性化の関与の増加および抑制FcγRへの結合の低下を持つ細胞毒性mAbは、抗腫瘍および／または抗ウイルス性効力の増加を誘発できる。もう一つの例として、優先的に抑制FcγRを補充および活性化するmAbは、自己免疫疾患の治療に用いることができる。さらなる例として、Fc含有融合分子は、いくらかのFcγRとの最小の相互作用およびいくらかのFcRへの結合の増加のために設計できる。さらにもう一つの例として、Fc融合蛋白質は、FcγR関与によりトリガーされた細胞毒性および細胞溶解が生じないように変異できる。
【００６２】
Fc-FcR相互作用は、例えば、Fcのアミノ酸残基を置換するおよび／またはグリコシル化パターンを改変することにより調整できる。(例えば、ヒトIgG1の)Fcの多数の特定のアミノ酸残基が、FcγR相互作用に非常に重要であることが当該技術分野において知られている(例えば、Shields ら. (2001) J. Biol. Chem. 276, 6591-6604参照)。これらのアミノ酸残基を置換して、所望の所望のFcRs結合プロフィールを達成できる。Fc領域のグリコシレーション・パターンは、分子のエフェクター機能に重要である。このFc領域グリコシレーション・パターンの改変は、分子の効力を増加または減少できる(例えば、 Teillaud (2005) Expert Opin Biol Ther. 5(Suppl 1) S15-27参照)。例えば、Fc領域における各CH2ドメインの保存されたAsn297の脱グリコシルは、FcγR結合を防止するドメインコンフォメーション変更を引き起こす。
【００６３】
アプタマー
アプタマーは、特定の標的分子に結合すべき大きなランダム配列プールから選択されたオリゴ核酸またはペプチド分子である。小さなサイズのアプタマーは、それらを合成および化学的に改変するのをより容易にし、それらがそうでなければブロックまたは隠れ得るエピトープにアクセスすることを可能にする。そして、アプタマーは、内因性分子に対するそれらの密接な類似性のために一般的に非毒性で弱い抗原である。
【００６４】
DNAまたはRNAのアプタマーはオリゴヌクレオチドの(通常短い)鎖からなる。オリゴヌクレオチド・アプタマーは、例えば、指数的富化(SELEX)によってリガンドの系統的の進化として知られた組合せアプローチを介して、広大な集団のランダム配列から選択されたDNAあるいはRNA分子である。選択された配列は、結合ポケットの形成により特定のリガンドを認識する能力を有し、核酸、蛋白質あるいは小さな有機化合物に結合できる。アプタマーの生成、選択および送達は、当該技術分野の技量内にある(例えば、Lee ら. (2006) Curr Opin Chem Biol. 10, 1-8参照)。例えば、キャピラリー電気泳動を用いて、非常に十分に定義された親和性プロフィールを持つアプタマーを選択できる。アプタマーは、精製された標的または抗原だけでなく、全体の細胞のごとき異種の標的に対しても選択できる(例えば、Yan ら. (2005) Front Biosci 10, 1802-1827参照)。細胞表面のごとき複合標的に対する選択は、公知のバイオマーカーの不存在下でさえアプタマーの同定を可能とする。さらに、全体の細胞でのネガティブ選択手順は、異なる細胞タイプ、例えば、形質転換および通常の細胞間で細かく区別できるアプタマーを与えることができる。アプタマーへの改変されたヌクレオチドの組み込みは、増加した親和性および低下した不安定性を持つアプタマーの選択を可能とする。
【００６５】
ペプチドアプタマーは、例えば、細胞内部の他の蛋白質相互作用と干渉するように設計された蛋白質である(例えば、Hoppe-Seyler and Butz (2000) J Mol Med. 78(8), 426-430参照、ペプチドアプタマーを概説)。ペプチドアプタマーは、両端にて蛋白質骨格に付着した短い可変ペプチドドメインからなる。それらは、両端で蛋白質骨格に付着した可変ペプチド・ループからなる。この二重構造の制約は、ペプチドアプタマーの結合親和性を抗体(ナノモル範囲)に匹敵するレベルまで大きく増加させる。可変ループ長は、典型的に10〜20のアミノ酸で構成され、骨格は良好な溶解性および緻密性特性を有するいずれかの蛋白質であり得る。例えば、細菌蛋白チオレドキシン-Aは、骨格蛋白質として用いることができ、その可変ループは還元活性部位内に挿入され、それは野生型蛋白質において-Cys-Gly-Pro-Cys-ループであり、その２つのシステイン側鎖は、ジスルフィド架橋を形成できる。ペプチドアプタマー選択は、酵母ツーハイブリッド系を含めた種々のシステムを用いて作成できる。また、蛋白質アプタマーを用いて、細胞および生物における蛋白質機能を一時的でかつ空間的に調節できる。例えば、リガンド調節ペプチド(LiRP)系は、細胞内ペプチドの結合活性が細胞浸透性低分子によって制御される一般的な方法を提供する(例えば、Binkowski (2005) Chem & Biol. 12(7), 847-55参照)。
【００６６】
抗体産生
種々のタイプの抗体の設計、生成およびスクリーニングが当該技術分野においてよく知られている。例えば、Carter (2006) Nat Rev Immunol. 6(5), 343-357; Teillaud (2005) Expert Opin Biol Ther. 5(Suppl 1) S15-27; Subramanian, ed. (2004) Antibodies : Volume 1: Production and Purification, Springer, ISBN 0306482452; Subramanian, ed. (2001) Manufacturing of Gene Therapeutics - Methods, Processing, Regulation and Validation, Springer, ISBN 0306466805; Lo, ed. (2003) Antibody Engineering Methods and Protocols, Humana Press, ISBN 1588290921参照。これらの方法は、同様の親和性および特異性を有し、実施例に用いたものに機能的に等価である抗体の生成につき一般的に用いることができる。
【００６７】
抗体療法は、哺乳動物細胞−一般的にチャイニーズハムスター卵巣細胞、NS0マウス骨髄腫細胞あるいはハイブリドーマ細胞−において通常産生されるが、産生のための代替宿主(例えば、大腸菌、他の微生物、昆虫細胞、ならびに遺伝子導入植物および動物)も使用できる。一般的に、Carter ら. (2006) Nat Rev Immunol. 6(5), 343-357参照。例えば、抗体フラグメントは大腸菌発酵によって1リットル当たりのグラム力価で産生できる。
【００６８】
一旦産生されたならば、免疫ペプチドは、前記の参考文献に記載された標準的な方法によるウェスタンブロットあるいは免疫沈降分析を含めた種々の手順により、SAMおよび／またはニューロピリン認識につきテストできる。好ましい抗原結合親和性は、例えば、0.001〜100 nM、0.01〜50 nMおよび0.08 nM〜32 nMのKdの範囲にある。
【００６９】
本明細書に記載した抗体の多数の相互依存特性を調整して、それらの臨床的および／または診断的有効性を改善できる。これらの特性は、限定されるものではないが、免疫原性、抗原結合の特異性および親和性、エフェクター機能および他の生物活性、薬物動態学、分子構造、細胞結合後の内部移行（internalization）および生物物理学的特性を含む。例えば、ディスプレイライブラリーおよび構造ベースの設計（すなわち、合理的設計)を、抗体治療の最適化のために、個々または組み合わせて用いることができる。例えば、Carter ら. (2006) Nat Rev Immunol. 6(5), 343-357, 348; Wu ら. (2005) Nature Biotech 23(9), 1137-1146参照。かかる最適化は、例えば、有害な免疫原性リスクの最小化;抗原選択性の改善;種交差反応性の増加;抗原結合親和性の増加もしくは減少;効力の増加;エフェクター機能の増加もしくは減少;血漿中半減期の増加もしくは減少; 内部移行効率の増加もしくは減少;化学的、蛋白質分解および熱力学的の安定性の増加;ならびに溶解性およびフォールディングキネティックスの改善を含むことができる。特定の例として、ファージディスプレーライブラリーを用いて、頑強な発現、高安定性および溶解性についての最適化された抗体フラグメントを選択できる。もう一つの特定の例として、ファージディスプレーライブラリーを、抗体の親和性成熟に用いることができ、in vitroでの生物学的有効性を増加できる。例えば、Carter ら. (2006) Nat Rev Immunol. 6(5), 343-357, 350参照。かかる増加は、効力を増加でき、ならびに投与の量または頻度を減少できる。
【００７０】
血漿中の抗体の終末半減期は、広範囲にわたり調整して、臨床目的に適合できる。抗体半減期は、数分から数週間の間となるように設計できる。また、効力を改善する、投与の用量もしくは頻度を減少させる、あるいは標的への局在化を改善するために抗体の終末半減期を増加させることが望ましいかもしれない。あるいは、逆にして−すなわち、抗体の終末半減期を減少させて−全身曝露を低下させるかまたは標的−対−非標的の結合比を改善することは有利で有り得る。
【００７１】
モノクローナル抗体フラグメントは、薬物動態学を調整し、画像化または治療法のごとき種々の適用のための最適化バージョンの選択を可能とするように設計できる。例えば、Wu ら. (2005) Nature Biotech 23(9) 1137-1146参照。例えば、scFV(約25 kDa)は初回通過腎クリアランスについての閾値未満の二重特異性抗体(約55 kDa)であり、例えば、数時間のオーダーの終末半減期を示すことができる。ミニボディあるいは小さな免疫蛋白質(例えば、IgGの単一の不変ドメインに融合したscFV、80 kDa)のごときより大きなフラグメントは、中間のクリアランス率を示し、より高い組織取り込みレベルに達する。さらに大きなフラグメントは、完全なFcドメイン(scFV-Fc、110-120 kDa)へ融合したscFVを含み、新生児Fc受容体結合部位を含めたFc領域のために、無傷のモノクローナル抗体に対して同様の薬物動力学を有する。
【００７２】
抗体終末半減期の減少は、例えば、陽電子放出断層撮影法による腫瘍イメージングを可能にできる。例えば、IgGの終末半減期は、IgGおよびそのサルベージ受容体、FcRnの間の相互作用の調整により増加または減少できる。例えば、Carter ら. (2006) Nat Rev Immunol. 6(5), 343-357, 353参照。非フラグメントより通常短い抗体フラグメントの終末半減期は、IgGおよび血清アルブミンのごときより長命の分子との結合または、ポリエチレングリコールのごとき分子へのコンジュゲーション(すなわち、PEG化)により延長できる。PEG化された抗体フラグメントは、例えば、望ましくないFc媒介効果の欠如、免疫原性のリスクにおける減少および適度な原価低減という利点を供する。
【００７３】
抗体は効率的な抗体内部移行を達成するように変更または選択できる。さらに、抗体薬物コンジュゲートは、抗体内部移行の効率を増加できる。効率的な抗体内部移行は、細胞毒性薬物および免疫リポソームの送達についてのようにある種の適用に望ましくできる。細胞表面からの標的抗原の除去は、いずれかのリガンドのさらなる結合を防止し、従って、例えば、抗体療法において、受容体アンタゴニストを用いる場合に望ましい結果とできる。対照的に、治療戦略がエフェクター機能を必要とする場合、細胞結合後の急速な抗体内部移行は不適当になり得る。
【００７４】
薬物、毒素および放射性核種を含めた種々の作用物質に対する抗体のコンジュゲーションは、当該技術分野においてよく知られている。一般的には、Wu ら. (2005) Nat Biotechnol. 23(9), 1137-1146; McCarron ら. (2005) Mol Interv 5(6), 368-380; Niemeyer (2004) Bioconjugation Protocols, Strategies and Methods, Humana Press, ISBN 1588290980; Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques, Academic Press, ISBN 0123423368参照。
【００７５】
抗体使用
本明細書に記載した抗体についての種々の用途は、例えば、機能的阻害剤、発現阻害剤、検出用剤、診断用剤、精製用剤、治療剤および造影剤である。
【００７６】
本発明の抗体は、SAMおよび／またはニューロピリン1の機能および発現の阻害剤として用いることができる。例えば、インスリン分泌経路の抗体阻害剤は、膵島ホルモン放出の促進を生じる生物学的カスケードに関与するいずれかの因子または成分を直接的あるいは間接的に標的とできる。SAMおよび／またはニューロピリン1の阻害剤は、ニューロリギン1、ニューロリギン2、ニューロリギン3、ニューロリギン4X、ニューロリギン4Y、ニューレキシン1α、ニューレキシン2α、ニューレキシン3α、ニューレキシン1β、ニューレキシン2β、ニューレキシン3β、SynCam、Thy-1およびニューロンペントラキシンおよび／またはニューロピリン1を標的とする阻害剤を含む。抗体を用いる標準方法を用いて、限定されるものではないが、放射免疫アッセイ、受容体アッセイ、酵素免疫アッセイ、細胞化学生物検定、リガンドアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光免疫アッセイおよび酵素結合免疫吸着アッセイを含めて、SAMおよび／またはニューロピリン1発現を検出および定量できる。
【００７７】
本明細書に記載した抗体を用いて、それらが生起された物質の存在および量を検出できる。例えば、本発明の抗体を用いて、生物学的試料中のSAMおよび／またはニューロピリン1蛋白質を検出できる。当該技術分野においてよく知られた種々のプロトコールは、限定されるものではないが、ウェスタンブロットテスト(溶液中の物質の検出するため）あるいは免疫蛍光テスト(全体の細胞における物質を検出するため)を含めた、これらの目的に利用できる。例えば、本明細書に記載した抗体を免疫アッセイに用いて、(例えば、SAMおよび／またはニューロピリン1蛋白質の量もしくは細胞内の位置を決定するために)哺乳動物によって産生されたSAMおよび／またはニューロピリン1のレベル蛋白質をモニターできる。
【００７８】
生化学的適用において、抗体は、例えば、ウェスタンブロット方法を用いて、蛋白質の免疫学的同定に用いることができる。同様の技術はELISPOTおよびELISAアッセイにおいて用いることができ、ここに、検出抗体を用いて、サイトカインまたは抗体のごとき細胞分泌を検出する。また、抗体を用いて、細胞可溶化物中の他の分子からの蛋白質(およびそれらに結合したいずれかのもの)を分離できる。また、抗体は、免疫組織化学的染色に用いることができる。
【００７９】
また、本発明の抗体を用いて、免疫沈降およびアフィニティークロマトグラフィーのごとき技術で物質を精製できる。
【００８０】
本明細書に記載した抗体は、単独またはもう一つの活性剤にコンジュゲートさせて、治療薬として用いることができる。抗体の治療的使用は、当該技術分野において知られている。例えば、Carter (2006) Nat Rev Immunol. 6(5), 343-357; Subramanian, ed. (2004) Antibodies vol. 2 Novel Technologies and Therapeutic Use, Springer, ISBN 0306483157参照。抗体は、細胞特異的な抗原に結合し、標的細胞、例えば、島ベータ細胞に対する免疫学的応答を誘導するそれらの能力の性質により治療上用いることができる。また、かかる抗体は、例えば、毒素、放射性同位体、サイトカインあるいは他の活性コンジュゲートの送達のために改変できる。また、二重特異性抗体は、標的抗原およびコンジュゲートまたはエフェクター細胞の双方にそれらのFab領域と結合するように設計できる。
【００８１】
本発明の抗体は種々の画像化および／または局所適用に用いることができる。
【００８２】
前記に言及した方法はよく知られ、抗体および抗原間の相互作用および抗体による抗原の検出を最適化するための合理的な量の実験を必要とするために当業者によって理解されるであろう。例えば、Wild (2005) The Immunoassay Handbook, 3d ed., Elsevier Science, ISBN 0080445268; Coligan (2005) Short Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, ISBN 0471715786; Brent ら., ed. (2003) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, ISBN 047150338X; Ausubel ら., ed. (2002) Short Protocols in Molecular Biology 5th Ed., Current Protocols, ISBN 0471250929参照。
【００８３】
ラジオイメージングおよび放射免疫療法
放射性ヌクレオチドは本明細書に記載した抗体に結合し、かくして、種々のイメージングおよび治療のプロトコールを促すことができる。例えば、Wu ら. (2005) Nature Biotech 23(9), 1137-1146参照。イメージングの例として、ガンマカメラを用いるラジオシンチグラフィーまたは単一光子放射型断層撮影法は、抗体へのガンマ放出アイソトープ(例えば、99mTc、123I、111In)のカップリングを必要とする。ポジトロン放射断層撮影法(PET)は、抗体に対するポジトロン放射体(例えば、18F、64Cu、68Ga、86Y、124I)の付着に依拠する。ベータ放射体(例えば、131I、90Y、177Lu、67Cu)または抗体へのコンジュゲーションを介するアルファ放出放射性ヌクレオチド(例えば、213Bi、211At) の標的送達は、有効な放射免疫療法手順のための標準である。放射免疫イメージングはターゲティングおよび線量測定を評価する手段として放射免疫療法と共に用いることができる。一般的に、抗体フラグメントは、それらの比較的より短い循環半減期、組織浸透および組織内のより均質な分布により適用を免疫イメージングすることが望ましい。
【００８４】
抗体は、放射免疫療法適用のための放射性核種にカップリングできる。一般的に、標的に送達された用量は、放射に対する正常な器官および組織の曝露に対してバランスされる。種々のエネルギー伝達特性、半減期および放射率を持つ、アルファおよびβ放射体の双方が、放射免疫療法に用いることができる。例えば、Milenic ら. (2004) Nat Rev Drug Discov 3, 488-499。抗体にカップリングできる毒性放射性核種の例は、131I、90Yおよび177Luを含む。
【００８５】
放射性の核種および蛋白質のカップリングは、当該技術分野においてよく知られ、例えば、抗体中に存在するかまたは一般的に導入されたシステイン残基へのコンジュゲーションを介して達成できる。例えば、Wu ら. (2005) Nature Biotech 23(9), 1137-1146.; McCarron ら. (2005) Mol Interv 5(6), 368-380; Niemeyer (2004) Bioconjugation Protocols, Strategies and Methods, Humana Press, ISBN 1588290980; Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques, Academic Press, ISBN 0123423368参照。他の例は、ヘキサヒスチジン標識組換え蛋白質の標識、およびリガンド結合のためのモノクローナル抗体結合部位の共有結合改変を含む。さらなるカップリングの例は、外因性または内因性の酵素による切断で、循環するコンジュゲートからのコンジュゲートした放射性金属の遊離およびクリアランスを可能とする放射性金属および抗体間の酵素的に安定なリンカーの組み込みである。
【００８６】
また、プレターゲッティング放射免疫療法を利用することが望ましいかもしれない。このアプローチ下で、抗体指向の局在化および放射性核種送達は物理的および一時的に分離される。最初に、抗体コンジュゲートは標的を結合するように投与される。クリーニング剤は血液を明瞭にするために適用できる。次いで、抗体コンジュゲートを結合する低分子量放射性リガンドは投与される。このアプローチは、放射性同位体標識リガンドの迅速な結合および消失から抗体部分の遅い分布を有効に分離する。例えば、抗体-ストレプトアビジンコンジュゲートに続けて、放射標識されたビオチン誘導体を、第一工程に使用できる。例えば、Sharkey ら. (2005) Clin Cancer Res 11, 7109s-7121s参照。
用いることができる。
【００８７】
また、抗体指向の酵素プロドラッグ療法(ADEPT)を利用することが望ましいかもしれない。例えば、Wu ら. (2005) Nature Biotech 23(9), 1137-1146参照。プレターゲッティングのこの代替形態は二工程プロセスであり、ここに、最初に、標的中あるいはその標的上に局在し、体循環から経時的に除去される抗体酵素コンジュゲートが投与される。一旦標的/非標的定量が十分に高ければ、標的とされた酵素によって活性薬物に変換されるプロドラッグが与えられる。このアプローチの1つの利点は標的とされていない形態であまりにも毒性であるプロドラッグを用いる能力である。
【００８８】
抗体投与
本明細書に記載した生体分子は、外因性物質または内因性物質のいずれとしての治療上用いることができる。外因性の作用物質は、身体の外部で生成または製造され、身体に投与されるものである。内因性の作用物質は、体内または体内の他の器官への送達のためのいくつかのタイプのデバイス（生物学的または他の）により体内において生成または製造されるものである。
【００８９】
種々の方法による生体分子の投与は、当該技術分野においてよく知られている。投与は、例えば、直接的注射(例えば、全身性または定位固定)、注目する因子を分泌するように設計された細胞移植、薬物放出生体材料、埋込型マトリックスデバイス、埋込型ポンプ、注射ゲル剤およびヒドロゲル、リポソーム、ミセル(例えば、30μｍまで)、ミクロスフェア(例えば、1-100μｍ)、貯蔵デバイス等に関する方法を含めることができる。
【００９０】
安全でかつ有効な量の抗SAMおよび／またはニューロピリン1抗体は、例えば、望ましくない副作用を最小限にしつつ患者における所望の治療効果を生じる量である。投与計画は、患者の治療されるべき疾患の正確な性質、疾患の重篤度、年齢および一般的な身体状況等のごとき因子に基づいて、熟練した臨床医によって決定されるであろう。
【００９１】
本発明の組成物は、該化合物の1以上の医薬上許容されるビヒクルを含むことができる。かかる医薬製剤は、以下に深く検討される。
【００９２】
対象における抗体投与に対する副作用は当該技術分野において知られた種々の方法で軽減できる。例えば、注入反応(例えば、発熱、悪寒、頭痛、嘔吐および下痢)は、ヒト化、エフェクター機能の減弱(例えば、抗体依存性細胞媒介細胞毒性および補体依存性細胞毒性)、前投薬、および抗体処方の注入速度における増加性の増加により軽減できる。例えば、Carter ら. (2006) Nat Rev Immunol. 6(5), 343-357参照。もう一つの例として、急性でかつ重篤なインフルエンザ様症候群のごときFc媒介反応は、抗体のFc部分および患者により発現された抗体(例えば、IgG受容体; FcγR)についての受容体間の相互作用を軽減することにより大部分は克服できる。一般的に、抗体の効力の増加または血漿中のその半減期の延長は、投与の用量または頻度が低下されるのを可能とし、それは生活の質の改善および／または患者のための便宜および／または薬物の費用の低下という関連した利益がある。
【００９３】
非経口
本明細書に記載した生体分子は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内注射を含めた非経口的に投与できる。
【００９４】
また、溶解エンハンサー、浸透剤、緩衝剤および保存剤を含めた小薬物分子の非経口送達に一般的に用いられる賦形剤を、生体分子処方に含むことができる。界面活性剤およびアルブミンのごとき抗凝集および抗吸着剤の包含は、生体分子を処方および送達する場合、安定性の増加を加えることができ、変性、凝集および／または沈澱に導きかねないインターフェースと相互作用する活性生体分子のリスクを減少できる。生体分子は、貯蔵中に安定性の追加のために凍結乾燥でき、非経口投与前に再処理できる。
【００９５】
例えば、抗体送達は、静脈注射、通常要する複数回投与によることができる。また、抗体送達のための局所的な放出制御方法は、当該技術分野において知られている（例えば、Raza ら. (2005) Expert Opin Biol Ther. 5(4), 477-494; Stayton ら. (2005) Orthod Craniofacial Res 8, 219-225; Grainger (2004 Expert Opin Biol Ther. 4(7), 1029-44; Varde and Pack (2004) Expert Opin Biol Ther. 4(1), 35-51; Whittlesey and Shea (2004) Exp Neurol. 190(1), 1-16参照）。
【００９６】
抗体は、例えば、注射当たり約[[0.05 mg〜約2.5 mg]]の量で投与できる。もう一つの例として、抗体は、注射当たり約[[0.1 mg〜約1 mg]]の濃度で注射できる。好ましくは、免疫ペプチド阻害剤は、注射当たり約[[0.3 mg〜約0.5 mg]]の濃度で注射される。
【００９７】
細胞移植
前記の抗体は、抗体を産生するハイブリドーマ細胞の移植により送達できる（例えば、Bromsamle ら. (2000) J. Neuroscience 20, 8061-8068参照）。
【００９８】
経口
本明細書に記載した生体分子作用物質の経口投与は、投与の容易さならびに作用物質の全身分布を達成する能力を提供する。本発明の比較的脆弱なバイオ剤の分解を回避する種々の手段が、当該技術分野において知られている。生体分子送達用の担体ベースのシステムは経口送達と共に用いることができる。例えば、腸上皮に付着する生体接着システムが利用可能である(例えば、Ramdas ら. (1999) J. Biomater. Appl. 13, 290-296参照, 腸の薬物送達用のアルギン酸被包性生体接着キトサンミクロスフェアを記載する)。もう一つの例として、数日または数週間の間腸において処方を放出できるある種のデバイスが利用可能である。
【００９９】
肺
本明細書に記載した生体分子のごとき高分子および／または薬物の肺性送達は、体循環のための循環系、気道表面および／または気道細胞への比較的容易で非侵入性の投与を供する(例えば、Cryan (2004) AAPS J. 7(1) article 4, E20-41, 肺性送達技術の総説を提供する)。肺性送達の利点は、非侵襲性、吸収のための大きな表面積(約75 m2)、薄い(約0.1〜0.5μｍ）肺胞上皮透過急速吸収、初回通過代謝の不存在、蛋白質分解活性の減少、急速な作用開始および高い生物学的利用能を含む。肺性送達のための薬物処方は、賦形剤および／または分散液体の有無で、当該技術分野において知られている。高分子送達システム、リポソームおよび微粉化炭水化物のごとき生体分子送達用の担体ベースのシステムは、肺性送達と共に用いることができる。経皮吸収促進剤(例えば、界面活性剤、胆汁酸塩、シクロデキストリン、酵素阻害剤(例えば、キモスタチン、ロイペプチン、バシトラシン)、および担体(例えば、ミクロスフェアおよびリポソーム)を用いて、全身分布のための肺胞上皮細胞を横切る取り込みを増強できる。
【０１００】
本明細書に記載した生体分子を送達するために用いることができる、定量噴霧式吸入器、噴霧器および乾燥粉末吸入器のごとき種々の吸入送達デバイスは、当該技術分野において知られている(例えば、AErx (Aradigm, CA); Respimat (Boehringer, Germany); AeroDose (Aerogen Inc., CA))。当該技術分野において知られているように、デバイス選択は使用される生体分子(例えば、溶液または乾燥粉末)の状態、貯蔵の方法および状態、賦形剤の選定、および処方およびデバイス間の相互作用に依存し得る。
【０１０１】
乾燥粉末吸入デバイスは、蛋白質ベースの作用物質の肺性送達につき特に好ましい (例えば、Spinhaler (Fisons Pharmaceuticals, NY); Rotohaler (GSK, NC); Diskhaler (GSK, NC); Spiros (Dura Pharmaceuticals, CA); Nektar (Nektar Pharmaceuticals, CA))。良好なフロー、分散性および安定性を供する活性の生物学的成分の乾燥粉末処方は、当業者に知られている。
【０１０２】
ポンプ
本明細書に記載した生体分子は、例えば、外科的に埋め込まれた浸透ポンプまたはカニューレシステムを介して送達できる。
【０１０３】
担体送達システム
担体送達システムは、注目する生体分子を被包し、長期間にわたる作用物質の放出制御を提供する。一般的に、担体は、生体分子剤にコンジュゲートした、生体分子剤と混合したまたは生体分子剤を被包するために用いた分子を含む。生体分子作用物質送達用の担体ベースのシステムは:生体分子/剤放出速度を調整できる;その作用部位に達する生体分子の割合を増加できる;その作用部位への薬物の輸送を改善できる;他の作用物質または賦形剤と共に局在化した沈着を可能とできる;作用物質の安定性をin vivoにて改善できる;クリアランスの低下によりその作用部位での作用物質の滞留時間を延長できる;非標的組織への作用物質の非特異性の送達を減少できる;作用物質によって引き起こされた刺激を減少できる;作用物質の高い初回用量により毒性を減少できる;作用物質の免疫原性を変更できる; 投与頻度を減少できる、生成物の味を改善できる;および／または生成物の有効期間を改善できる。
【０１０４】
高分子放出システムを用いて、低分子薬物、薬理学的剤、蛋白質、酵素、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、抗体、ウイルスおよび非ウイルスベクター等を、前記した種々の目的のために送達できる(Whittlesey and Shea (2004) Experimental Neurology 190, 1-16参照)。また、高分子システムは、細胞プロセスに相乗的または順次に作用できる多数の生体分子を送達するように設計できる。高分子送達システムは、治療レベルの本明細書に記載した生体分子剤を維持でき、有害な副作用を低減でき、必要とされる生体分子の量を減少でき、投薬数を減少でき、短いin vivo半減期を持った作用物質の送達を促すことができ、および低い経口および経皮的な生物学的利用能に関連した障壁を克服できる。放出速度は、非分解性の合成ポリマーEVAcおよび分解性の合成高分子ポリエステルPLGAのごとき合成ポリマーの孔径、構造およびポリマー含量の変更により制御できる。さらに、物質自体の分解は、放出プロフィールを支配するように機能して、放出速度上のさらなるレベルの制御を供する。本明細書に記載した高分子送達システムは、送達分子の物理的および化学的特性、使用されたポリマーおよび製造中に用いた加工プロセスに依存して、例えば、分、時間、日、週、および年さえの放出期間で調整できる。
【０１０５】
天然（例えば、コラーゲン)および合成ポリマー(例えば、シリコーン、ポリ−ラクチド−コ−グリコシド(PLGA)およびポリエチレンビニル−コ−アセテート(EVAc))の双方は、生体分子の局所および全身性送達に利用できる。生分解性ポリマーは、デバイスがやがて消失し、外科的回復の必要性を排除するために生体分子送達に好ましい。PLGAは、その商業的利用可能性、制御可能な分解速度、証明された生体適合性、およびFDAの承認により広く用いられている生体高分子である(例えば、Lu ら. (2000) Biomaterials 21, 1837-1845参照)。ポリ無水物は生体分子送達に用いることができる同様のクラスの分解可能なポリマーである。
【０１０６】
ミクロスフェア
高分子のミクロスフェアは、本明細書に記載した生体分子の送達を促進できる。例えば、持続送達ミクロスフェアを定位固定で注射して、標的部位でコードされた蛋白質を過剰発現でき、またはその蛋白質の生体分子阻害剤を放出できる。ミクロスフェアは、0.1〜500μmのサイズ範囲における微粒子系を生成するように自然発生または合成のポリマーを用いて生成される。一般的に、ミクロスフェアは、リポソームより物理的および化学的に安定し、より高い作用物質負荷を可能とする。高分子ミセルおよびポリマローム（polymerome）はミクロスフェアに対して同様の特性を持つ高分子送達ビヒクルであり、本明細書に記載した生体分子の被包および送達をさらに促進できる。
【０１０７】
種々の生体分子ペイロード用ミクロスフェアの作成、被包および安定化は、当該技術分野の技量内にある(例えば、Varde & Pack (2004) Expert Opin.  Biol. 4(1)35-51参照)。ミクロスフェアを形成するのに有用なポリマー材料は、PLA、PLGA、DPPCで被覆されたPLGA、DPPC、DSPC、EVAc、ゼラチン、アルブミン、キトサン、デキストラン、DL-PLG、SDLM、PEG(例えば、ProMaxx)、ヒアルロン酸ナトリウム、ジケトピペラジン誘導体(例えば、Technosphere）、リン酸カルシウム-PEG粒子およびオリゴ糖誘導体DPPG(例えば、Solidose)を含む。被包は、例えば、水/油の単一のエマルジョン方法、水油水エマルジョン方法、または凍結乾燥を用いて、達成できる。いくつかの商業的被包技術は利用可能である(例えば、ProLeaseR、Alkerme)。
【０１０８】
ミクロスフェアの放出速度は、ポリマーのタイプ、ポリマー分子量、共重合体組成、ミクロスフェア処方に加えた賦形剤およびミクロスフェアサイズによって調整できる。
【０１０９】
ポリマーのタイプおよびそれが分解様式は、作用物質放出動力学に影響する。PLGAのごときバルク浸食ポリマーは、マトリックスの全体にわたるポリマー分解でポリマーマトリックスへの水の浸透を容易にさせる。バルク侵食は典型的には二相または三相性の放出プロフィールを生じる。対照的に、ポリ無水物のごとき表面を浸食するポリマーは、不安定な結合によって連結した比較的疎水性のモノマーよりなる結果、加水分解を介してポリマー/水界面にてポリマーバルクへの水浸透に抵抗性であるが、急速に分解する。典型的には、被包された作用物質は、表面の分解から放出され、開始にての最大速度で、表面積が減少するにつれて、漸近的に減少する。
【０１１０】
一般的に、被包された作用物質放出速度は、バルク浸食ポリマーにおけるポリマー分子量の増加で減少するが、表面浸食ポリマーにおいてはほとんど効果を有さない。また、ミクロスフェアサイズは放出速度に影響し、マトリックスからの生体分子の流動速度は、粒子サイズの減少で増加する。ミクロスフェアは1以上のポリマーを含むように処方でき、各モノマー単位の相対的な比は放出速度に影響できる。
【０１１１】
賦形剤をミクロスフェア処方に添加して、製造中にエマルジョンを安定化でき、製造および／または放出中に生体分子を安定化できる。ミクロスフェアに被包された蛋白質の場合には、PEG、炭水化物および緩衝塩(例えば、水酸化マグネシウム)のごとき賦形剤の添加は、凝集を防止でき、折り畳み蛋白質構造を安定化できる。もう一つの例として、親水性賦形剤マンニトールの存在下でPLGAミクロスフェア中に被包された蛋白質生体分子は、生体分子安定性を増強できる。また、賦形剤は放出速度に影響できる。例えば、生体分子溶液中のPVAは、一次乳剤を安定でき、マトリックスの全体にわたってより均質な分布を供し、内部の水相液滴の融合を防止し、最初の放出爆発および全体的な放出速度を減少できる。ミクロスフェアのコーティングを用いて、in vivoの特性を変更できる。例えば、DPPCでの被覆PLGAミクロスフェアは、マクロファージへの生体分子カーゴの取り込みを減少できる。もう一つの例として、キトサンのごとき粘膜付着性のポリマーで覆う粒子およびヒドロキシプロピルセルロースは、肺性の担体の滞在時間を増加できる。
【０１１２】
本明細書に記載した生体分子を被包するミクロスフェアは、非経口、経口、肺性、埋込みおよびポンプデバイスを含めた種々の手段において投与できる。単壁の高分子ミクロスフェアでは、生物活性分子の二相放出速度は、被包された薬物に対する表面関連の比に依存する。典型的には、最初の「突発放出」（その結果、被包された生体分子が、ミクロスフェアの表面に残される)に続いて、より延長した放出(すなわち、二相放出)であり、速度は、用いたポリマーによって決定される。二重壁の高分子ミクロスフェアはより多数の線形の放出速度を呈する(例えば、Yang ら. (2003) J. Controlled Release 88, 201-213参照)。
【０１１３】
ヒドロゲル
また、コラーゲン、フィブリンおよびアルギン酸塩のごとき親水性のポリマーよりなる高分子ヒドロゲルは、取込まれた生体分子の徐放性のために用いることができる(例えば、 Sakiyama ら. (2001) FASEB J. 15, 1300-1302参照)。ヒドロゲルに組み入れられた生体分子は、マトリックスまたは次の放出から細胞機能を直接的に刺激できる。
【０１１４】
高分子埋込剤
ミリメートル〜センチメートルスケールでの三次元の高分子埋込剤は、生体分子で負荷できる(例えば、Teng ら (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 3024-3029参照)。これらの高分子埋込剤は、生体分子の放出制御を提供しつつ、細胞接着および組織形成についての構造として機能できる。高分子の埋込みは、典型的には生理活性因子のより大きな貯蔵を提供する。また、埋込剤は、構造支持体に製造でき、適用に幾何学(例えば、形、サイズ、有孔性)を調整する。骨格の有孔性は、細胞シーディングおよび周囲の組織からの細胞浸潤に影響できる。細胞外マトリックス蛋白質は骨格中または骨格上に組み込み、細胞接着および移動に影響できる。例えば、ガイダンスチャネルまたはブリッジのごとき構造的支持体に成形された高分子の送達ビヒクルは、構築的な組織化および生化学的因子を供して、組織形成を刺激できる。もう一つの例として、高分子の送達システムは、1以上の蛋白質または他の生体分子の放出と結び付けられた幹細胞付着のための支持構造を供して、分化を特定細胞運命に刺激できる。三次元の高分子埋込剤は、例えば、ポリマーおよび薬物の直接的なキャスティングにより、または負荷したミクロスフェアを三次元構造にプロセッシングすることにより形成できる。生体分子送達のための三次元の高分子の埋込剤は当該技術分野において知られた種々の手段で処方でき、それは、限定されるものではないが、エマルジョン方法、溶媒キャスティングおよび二酸化炭素泡立プロセスを含む(例えば、WhittleseyおよびShea (2004) Experimental Neurology 190, 1-16参照)。また、埋込可能なマトリックスベースの送達システムは、種々のサイズおよび送達プロフィールにおいて商業的に入手可能である(例えば、Innovative Research of America, Sarasota, FL)。
【０１１５】
放出に対する代替物として、生体分子は高分子送達システム上または該システムにおいて固定化できる。このアプローチは、基質媒介送達および固相送達を含む。一般的に、高分子基質が機能して、細胞接着を支持し、細胞の微環境に生体分子カーゴを直接的に入れる(例えば、Whittlesey and Shea (2004) Experimental Neurology 190, 1-16参照)。基質媒介送達を用いて、非ウイルスおよびウイルスベクターの双方を送達できる。このアプローチは、かかるベクターが細胞の結合および内部移行を促進する手段としての細胞間マトリックスに関連する方法を模倣するので、ウイルスベクター送達に特に望ましい。例えば、アデノウイルス修飾コラーゲンゲルの埋込みの結果、直接的注射と比較して、異なる送達プロフィールを持つマトリックスの全体にわたる形質導入を生じさせ、かくして、遺伝子送達を局在化し、遠位の副作用を回避できる(例えば、Levy ら. (2001) Gene Ther. 8, 659-667参照)。もう一つの例として、生体分子はポリマー被覆したステントおよびマイクロコイルから送達できる(例えば、Abrahams ら. (2002) Stroke 33, 1376-132; Klugherz ら. (2002) Hum. Gene Ther. 13, 443-454参照。
【０１１６】
高分子の放出システムの処方において、種々の添加剤を含めて、送達されるべき生体分子を安定化できる。かかる添加剤および手段は、例えば、炭水化物糖、ポリエチレングリコール、金属イオンとの錯化、および分解中にpH低下を最小限にするための弱塩基との同被包を含む。
【０１１７】
「スマート」高分子担体
本明細書に記載した生体分子治療剤は、いわゆる「スマート」高分子の担体を介して細胞内の標的に送達できる。例えば、Stayton ら. (2005) Orthod Craniofacial Res 8, 219-225; Wu ら. (2005) Nature Biotech (2005) 23(9), 1137-1146参照。一般的に、このタイプの担体は、生理的なpHで親水性およびステルス様であるが、それらが細胞質中へのカーゴ分子の放出を増強するエンドゾーム成分(すなわち、エンドゾームpH勾配からの酸性刺激)への取り込み後に疎水性でかつ膜不安定化するようになるポリマーを利用する。スマート高分子担体の設計は、pH感知機能性、疎水性細胞膜を不安定化する基、薬物取り込みを可能とする多目的のコンジュゲーションおよび／または錯体生成エレメント、および所望の細胞標的成分を組み込むことができる。潜在的な治療の巨大分子カーゴは、限定されるものではないが、ペプチド、蛋白質、抗体、ポリヌクレオチド、プラスミドDNA(pDNA)、アプタマー、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(ASODN)、サイレンシングRNAおよびリボザイムを含む。例として、スマート高分子担体は、受容体媒介エンドサイトーシスを介して内部移行した抗体標的コンジュゲートの細胞質送達を増強できる。もう一つの例として、スマート高分子担体は、蛋白質療法の細胞質送達を増強できる。
【０１１８】
高分子担体は、例えば、ポリ(アルキルアクリル酸)ポリマーのファミリーを含み、特定の例は、アルキル基が、１つのメチレン基により次第に増加したポリ(エチルアクリル酸)(PEAA)、ポリ(プロピルアクリル酸)(PPAA)およびポリ(ブチルアクリル酸)(PBAA)を含む。
【０１１９】
かかる高分子担体は、ある範囲のpHプロフィールおよび膜不安定化活性を供するように設計して、それらの分子特性が、特定の薬物および負荷範囲に対合するのを可能とする。例えば、pHプロフィールは、アルキルアクリル酸モノマーの選定、およびカルボキシラート含有アルキルアクリル酸モノマー−対−アルキルアクリレートモノマーの比によってコントロールできる。同様に、膜不安定化活性は、アルキルアクリル酸モノマーおよびアルキルアクリレートモノマーに対するアルキルセグメントの長さにより制御できる。
【０１２０】
強力なｐＨ応答性の膜不安定化活性を持つスマート高分子担体は、腎排泄サイズ限界未満であるように設計できる。例えば、ポリ(EAA-co-BA-co-PDSA)およびポリ(PAA-co-BA-co-PDSA)ポリマーは、各々、9および12 kDaの低分子量にて高い溶血性/膜不安定化活性を示す。
【０１２１】
種々のリンカー化学は、蛋白質、核酸および標的部分についての分解性コンジュゲーション部位を供するように利用できる。例えば、ピリジルジスルフィドアクリレート(PDSA)モノマーは、療法のエンドゾームの転位後に細胞質中で低下できるジスルフィド結合を介して効率的なコンジュゲーション反応を可能とする。
【０１２２】
リポソーム
リポソームの薬物運搬能力および放出速度は、脂質組成、サイズ、荷電、薬物/脂質比率および送達方法に依存できる。通常のリポソームは中性またはアニオンの脂質(天然または合成)よりなる。一般的に用いた脂質は、(ホスファチジルコリン)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール(PG)およびホスファチジルイノシトール(PI)のごときレシチンである。一般的に用いられている被包方法は、生体分子溶液での脂質フィルムの再水和に続いての凍結融解および押出しである。生体分子リポソームを形成するための他の技術は、リポソーム技術(例えば、Galovic ら. (2002) Eur. J. Pharm. Sci. 15, 441-448参照)およびクロスフローインジェクション技術(例えば、Wagner ら. (2002) J. Liposome Res. 12, 259-270参照)を含む。リポソーム被包効率は、示差走査熱量測定を含めた当該技術分野において知られた種々の手順を通じてモニターおよび最適化できる(例えば、Lo ら. (199%) J. Pharm. Sci. 84, 805-814参照)。
【０１２３】
また、標的とされたリポソームおよび反応性リポソームを用いて、本発明の生体分子を送達できる。標的とされたリポソームは、それらの表面に付着したモノクローナル抗体またはレクチンのごとき標的リガンドを有し、特定の受容体および／または細胞タイプとの相互作用を可能とする。反応性または多形性のリポソームは、広範囲のリポソームを含み、その共通特性は、特定の相互作用(例えば、pH感受性リポソーム)に際してそれらの相および構造を変更するそれらの傾向である(例えば、Lasic (1997) Liposomes in Gene Delivery, CRC Press, FL参照)。
【０１２４】
SAMおよびニューロピリン1蛋白質 
他の態様において、本発明は、SAMおよびニューロピリン1核酸または遺伝子によってコードされた精製されたSAMおよびニューロピリン1蛋白質を利用する。SAMおよびニューロピリン1の好ましい形態は、配列番号1-19の推定アミノ酸配列を有する精製された天然のSAMおよびニューロピリン1蛋白質である。また、天然のSAMおよびニューロピリン1蛋白質のフラグメント、アナログおよび誘導体のごとき天然のSAMおよびニューロピリン1蛋白質の変異体も本発明内にある。かかる変異体は、例えば、天然のSAMもしくはニューロピリン1遺伝子の自然発生の対立形質の変異体によってコードされたポリペプチド、天然のSAMもしくはニューロピリン1遺伝子の代替的スプライス形態によりコードされたポリペプチド、天然のSAMもしくはニューロピリン1遺伝子のホモログによりコードされたポリペプチド、および天然のSAMもしくはニューロピリン1遺伝子の非自然発生の変異体によりコードされたポリペプチドを含む。
【０１２５】
SAMおよびニューロピリン1蛋白質変異体は、天然のSAMもしくはニューロピリン1蛋白質とは1以上のアミノ酸において異なるペプチド配列を有する。かかる変異体のペプチド配列は、天然のSAMもしくはニューロピリン1ポリペプチドの1以上のアミノ酸の欠失、付加または置換を特徴とできる。アミノ酸挿入は、好ましくは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24ないし25の連続アミノ酸のものであり、欠失は、好ましくは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24ないし25の連続アミノ酸のものである。いくつかの適用において、変異体SAMおよびニューロピリン1蛋白質は、実質的にSAMもしくはニューロピリン1蛋白質の機能的な活性(例えば、糖尿病および膵臓癌を含めた膵臓疾患との関連)を維持する。他の適用では、変異体SAMおよびニューロピリン1蛋白質は、SAMおよびニューロピリン1蛋白質の機能的な活性のかなりの減少を欠くかまたは特徴とする。天然のSAMもしくはニューロピリン1蛋白質の機能的な活性を保持することが望ましい場合、SAMおよびニューロピリン1蛋白質変異体は、サイレントもしくは保存的な変更を特徴とする核酸分子の発現により作成できる。機能的な活性における実質的な変化を持つ変異体SAMおよびニューロピリン1蛋白質は、保存的より小さな変化を特徴とする本発明内の核酸分子の発現により作成できる。
【０１２６】
1以上の特定のモチーフおよび／またはドメイン、またはいずれかのサイズ、例えば、長さが少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、75、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200のアミノ酸に対応するSAMおよびニューロピリン1蛋白質フラグメントは、本発明の範囲内にあることが意図される。SAMおよびニューロピリン1蛋白質の単離された部分は、かかるペプチドをコードする核酸の対応するフラグメントから組換え的に生成されたペプチドをスクリーニングすることにより得ることができる。加えて、フラグメントは、従来のMerrifield固相f-Mocまたはt-Boc化学のごとき当該技術分野において知られた技術を用いて化学的に合成できる。例えば、本発明のSAMもしくはニューロピリン1蛋白質は、フラグメントの重なりのない所望の長さのフラグメントに任意に分割されるか、または好ましくは、所望の長さの重なるフラグメントに分割され得る。フラグメントを生成(組換え的にまたは化学合成によって)およびテストして、天然のSAMおよびニューロピリン1蛋白質のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして機能できるそれらのフラグメントを同定できる。
【０１２７】
本発明のもう一つの態様は、SAMおよびニューロピリン1蛋白質の組換え形態に関する。天然のSAMおよびニューロピリン1蛋白質に加えて本発明による好ましい組換えポリペプチドは、配列番号1-19を有する蛋白質をコードする遺伝子配列を持つ少なくとも85%の配列同一性(例えば、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%および99%）を有する核酸によってコードされる。好ましい具体例において、変異体SAMおよびニューロピリン1蛋白質は、天然のSAMもしくはニューロピリン1蛋白質の1以上の機能的な活性を有する。
【０１２８】
SAMおよびニューロピリン1蛋白質変異体は、当該技術分野において知られた種々の技術によって生成できる。例えば、SAMおよびニューロピリン1蛋白質変異体は、離散性点変異の導入によって、またはトランケーションによってのように変異誘発によって作成できる。変異は、実質的に同一または単にサブセットの天然SAMもしくはニューロピリン1蛋白の機能的な活性を有するSAMもしくはニューロピリン1蛋白質変異体を生起できる。あるいは、SAMおよびニューロピリン1蛋白質と相互作用するもう一つの分子と競合的に結合することによってのごとく、蛋白質の自然発生形態の機能を阻害できる蛋白質のアンタゴニスト形態を生成できる。加えて、１以上のSAMもしくはニューロピリン1の機能的活性を構成的に発現する蛋白質のアゴニスト形態が生成され得る。生成できるSAMおよびニューロピリン1蛋白質の他の変異体は、例えば、プロテアーゼ標的配列を改変する変異により、蛋白質切断に抵抗性であるものを含む。ペプチドのアミノ酸配列の変化の結果、SAMもしくはニューロピリン1蛋白質の１以上の機能的活性を有するSAMもしくはニューロピリン1蛋白質変異体を生じるかは、その変異体を天然のSAMもしくはニューロピリン1蛋白質の機能的活性につきテストすることにより容易に決定できる。
【０１２９】
もう一つの例として、SAMもしくはニューロピリン1蛋白質変異体は、縮重オリゴヌクレオチド配列から生成できる。縮重遺伝子配列の化学合成は自動DNA合成装置で行うことができ、次いで、合成遺伝子を適当な発現ベクターに連結できる。縮重セットの遺伝子についての1つの目的は、1つの混合物において、潜在的なSAMもしくはニューロピリン1蛋白質配列の所望のセットをコードする配列のすべてを提供することである。縮重オリゴヌクレオチドの合成は当該技術分野においてよく知られている（例えば、Narang, S A (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura ら. (1981) RECOMBINANT DNA, PROC 3RD CLEVELAND SYMPOS. MACROMOLECULES, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp 273-289; Itakura ら. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura ら. (1984) Science 198:1056; Ike ら. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477参照。かかる技術は、他の蛋白質の指令された展開に使用した(例えば、Scott ら. (1990) Science 249:386-390; Roberts ら. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2429-2433; Devlin ら. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla ら. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382; 並びに米国特許第5,223,409号; 第5,198,346号;および第5,096,815号参照)。
【０１３０】
同様に、コード配列フラグメントのライブラリーは、1以上の天然のSAMもしくはニューロピリン1蛋白質機能的活性を有するフラグメントのスクリーニングおよび引き続いて選択用の多様性集団のSAMもしくはニューロピリン1蛋白質フラグメントを生成するためにSAMもしくはニューロピリン1蛋白質遺伝子クローン化に提供できる。種々の技術は化学合成を含めたかかるライブラリーの生成につき当該技術分野において知られている。1つの具体例において、コード配列フラグメントのライブラリーは、(i)SAMもしくはニューロピリン1遺伝子コード配列の二本鎖のPCRフラグメントを、ニッキングが分子当たり約１回だけ生じる条件下でヌクレアーゼで処理し;(ii)二本鎖DNAを変性し;(iii)異なるニックされた産物からのセンス/アンチセンス対を含むことができる二本鎖DNAを形成するためにDNAを復元し;(iv) SIヌクレアーゼでの処置により改良された二本鎖から単鎖部分を取り出し;次いで(v)得られたフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することにより生成できる。この例示的な方法により、種々のサイズのN末端、C末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導できる。
【０１３１】
点変異またはトランケーションにより作成された組合せライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、およびある特性を有する遺伝子産物用のcDNAライブラリーをスクリーニングための広範囲の技術は、当該技術分野において知られている。かかる技術は、SAMもしくはニューロピリン1遺伝子変異体の組合せ変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに一般的に適応可能であろう。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための最も広く用いられている技術は、典型的には、複製可能な発現ベクターへの遺伝子ライブラリーのクローニング、ベクターの得られたライブラリーでの適当な細胞の形質転換、および所望の活性の検出がその生成物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を促進する条件下での組合せ遺伝子の発現を含む。
【０１３２】
組合せ変異誘発は、変異蛋白質の非常に大きなライブラリーを生成するポテンシャルを有する。多数の蛋白質変異体をスクリーニングするために、ランダムライブラリーにおける機能を持たない蛋白質の非常に高い割合を回避し、単に機能的蛋白質の頻度を増強する(かくして、配列スペースの有用なサンプリングを達成するのに必要な複雑さを減少させる)ことを可能にする技術を用いることができる。例えば、適当な選択またはスクリーニング法が使用される場合のライブラリーにおける機能的な変異体の頻度を増強するアルゴリズムの再帰的なアンサンブル変異誘発(REM)を使用し得る。Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Yourvan ら. (1992) Parallel Problem Solving from Nature, Maenner and Manderick, eds., Elsevier Publishing Co., Amsterdam, pp. 401-410; Delgrave ら. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331.
【０１３３】
また、本発明は、SAMもしくはニューロピリン1蛋白質の低下を供して、天然のSAMもしくはニューロピリン1蛋白質が相互作用する他の蛋白質または分子へのSAMもしくはニューロピリン1蛋白質の結合を破壊できるミメティック、例えば、ペプチド、非ペプチド剤を生成する。かくして、また、本明細書に記載した技術を用いて、SAMもしくはニューロピリン1蛋白質のどの決定因子が、例えば、SAMもしくはニューロピリン1蛋白質の上流にて機能し得る他の蛋白質（例えば、SAMもしくはニューロピリン1機能的活性のアクチベーターもしくはリプレッサー）に対する、あるいはSAMもしくはニューロピリン1蛋白質の下流にて機能し得る蛋白質または核酸に対するSAMもしくはニューロピリン1蛋白質の結合、およびかかる分子がSAMもしくはニューロピリン1蛋白質によりポジティブまたはネガティブに調節されるかに関与する分子間相互作用に加わるかをマッピングできる。例えば、SAMもしくはニューロピリン1蛋白質あるいはSAMもしくはニューロピリン1蛋白質の上流または下流の他の成分の分子認識に関与する、前記のRGDモチーフに類似するSAMもしくはニューロピリン1蛋白質の非常に重要な残基を決定でき、それを用いて、その部分へのSAMもしくはニューロピリン1蛋白質の結合を競合的に阻害するSAMもしくはニューロピリン1蛋白質由来ペプチドミメティックを生成できる。他の細胞外蛋白質を結合するにに関与するSAMもしくはニューロピリン1蛋白質のアミノ酸残基をマッピングする走査変異誘発を用いることによって、天然のSAMもしくはニューロピリン1蛋白質のそれらの残基を模倣するペプチドミメティック化合物を生成できる。次いで、かかるミメティックを用いて、SAMもしくはニューロピリン1蛋白質の通常の機能と干渉できる。
【０１３４】
例えば、かかる残基の非加水分解ペプチドアナログはベンゾジアゼピン(例えば、Freidinger ら. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988参照)、アゼピン (例えば、Huffman ら. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988参照)、置換ガンマラクタム環 (Garvey ら. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988)、ケト−メチレン偽ペプチド (Ewenson ら. (1986) J. Med. Chem. 29:295; および Ewenson ら. in Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, Ill., 1985)、ベータターンペプチドコア(Nagai ら. (1985) Tetrahedron Lett 26:647; and Sato ら. (1986) J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 1: 1231)、およびベータアミノアルコール (Gordon ら. (1985) Biochem. Biophys. Res. Commun. 126:419; and Dann ら. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 134:71)を用いて生成できる。また、SAMもしくはニューロピリン1蛋白質を化学的に修飾して、グリコシル基、脂質、リン酸塩、アセチル基等のごとき他の化学基での共有または凝集コンジュゲートを形成することにより、SAMもしくはニューロピリン1蛋白質誘導体を創製し得る。SAMもしくはニューロピリン1蛋白質の共有誘導体は、蛋白質のアミノ酸側鎖上またはそのポリペプチドのＮ末端またはＣ末端の官能基に化学基を連結することにより調製できる。
【０１３５】
本発明は、さらにSAMもしくはニューロピリン1蛋白質を産生する方法に関する。例えば、対象ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を指令する核酸ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を、ペプチドの発現が生じることを可能にする適当な条件下で培養できる。細胞は、収穫され、溶解され、蛋白質を単離し得る。組み換えのSAMもしくはニューロピリン1蛋白質は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動およびかかる蛋白質に特異的な抗体での免疫親和性精製を含めた蛋白質の精製のための当該技術分野において知られた技術を用いて宿主細胞から単離できる。
【０１３６】
例えば、SAMもしくはニューロピリン1蛋白質が細胞中で発現した後、それをいずれかのイムノアフィニティークロマトグラフィーを用いて単離できる。より詳細には、抗SAMもしくはニューロピリン1抗体(例えば、後記のごとく生成された)をカラムクロマトグラフィー・マトリックス上に固定でき、そのマトリックスをイムノアフィニティークロマトグラフィーに用いて、標準方法(例えば、Ausubelら、前記参照)により細胞可溶化物からSAMもしくはニューロピリン1蛋白質を精製できる。イムノアフィニティークロマトグラフィー後に、SAMもしくはニューロピリン1蛋白質を、蛋白質の標準的方法、例えば、高速液体クロマトグラフィーによりさらに生成できる(例えば、Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, Work and Burdon, eds., Elsevier, 1980参照)。もう一つの具体例において、SAMもしくはニューロピリン1蛋白質を、その精製を促進するアフィニティータグ(例えば、GST)を含有する融合蛋白質として発現する。
【０１３７】
SAMもしくはニューロピリン1蛋白質と会合する蛋白質
また、本発明は、SAMもしくはニューロピリン1蛋白質と会合できるポリペプチドを同定する方法を特徴とする。蛋白質間相互作用を検出するのに適当であるいずれの方法を使用しても、SAMもしくはニューロピリン1蛋白質と会合するポリペプチドを検出できる。かかる方法の例は、細胞可溶化物および細胞可溶化物から得られた蛋白質の勾配またはクロマトグラフィーカラムを介して共同免疫沈降、架橋および共精製、およびSAMもしくはニューロピリン1蛋白質と相互作用する可溶化物中の蛋白質を同定するための、SAMもしくはニューロピリン1蛋白質の使用を含む。これらのアッセイでは、SAMもしくはニューロピリン1蛋白質は、全長SAMもしくはニューロピリン1蛋白質、SAMもしくはニューロピリン1蛋白質の特定のドメイン、またはSAMもしくはニューロピリン1蛋白質のいくつかの他の適当なフラグメントで有り得る。一旦単離されたならば、かかる相互作用する蛋白質を同定およびクローニングし、次いで、それを標準的方法と共に用いて、相互作用する蛋白質の活性を改変できる。例えば、SAMもしくはニューロピリン1蛋白質と相互作用する蛋白質のアミノ酸配列の少なくとも一部分をエドマン分解法によってのように当業者によく知れられた技術を用いて確認できる。得られたアミノ酸配列は、相互作用する蛋白質をコードする遺伝子配列をスクリーニングするためのガイドとして用いることができるオリゴヌクレオチド混合物の生成に用いることができる。スクリーニングは、例えば、標準ハイブリダイゼーションまたはPCR技術によって達成できる。オリゴヌクレオチド混合物の生成およびスクリーニングの技術はよく知られている(Ausubel ら., supra; and PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis ら., eds. Academic Press, Inc., NY, 1990)。
【０１３８】
加えて、SAMもしくはニューロピリン1蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする遺伝子の同定を直接的に生じる方法を用いることができる。これらの方法は、標識されたSAMもしくはニューロピリン1蛋白質あるいはSAMもしくはニューロピリン1融合蛋白質、例えば、酵素、蛍光色素、発光蛋白質のごときマーカー、またはIgFcドメインに融合したSAMもしくはニューロピリン1蛋白質またはドメインを用いて、例えば、lgt11ライブラリーの抗体プロービングのよく知られた技術に同様の方法での発現ライブラリーのスクリーニングを含む。
【０１３９】
また、in vivoでの蛋白質間相互作用を検出できる利用可能な方法がある。例えば、本明細書に記載のごとく、2-ハイブリッド系を用いて、in vivoでのかかる相互作用を検出できる。例えば、Chien ら., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578, 1991参照。略言すると、かかるシステムを利用する1つの例として、以下の2つのハイブリッド蛋白質をコードするプラスミドが構築される：1つのプラスミドは、SAMもしくはニューロピリン1蛋白質、SAMもしくはニューロピリン1蛋白質変異体またはフラグメント、またはSAMもしくはニューロピリン1融合蛋白をコードするヌクレオチド配列に融合した転写アクチベーター蛋白質のDNA結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、他方のプラスミドは、cDNAライブラリーの一部分としてこのプラスミドに再結合した知られていない蛋白質をコードするcDNAに融合した転写アクチベーター蛋白質の活性ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。DNA結合ドメイン融合プラスミドおよびcDNAライブラリーは、その制御領域が転写活性化因子の結合部位を含むレポーター遺伝子(例えば、HBSまたはlacZ)を含む酵母Saccharomyces cerevisiae株に形質転換される。ハイブリッド蛋白質は、どちらも単独でレポーター遺伝子の転写を活性化できない: DNA結合ドメインハイブリッドは活性化機能を提供しないためにできない、また、活性化ドメインハイブリッドは活性化因子の結合部位に局在できないためにできない。2つのハイブリッド蛋白質の相互作用は、機能的なアクチベーター蛋白質を再構成し、その結果、レポーター遺伝子を発現させ、それはレポーター遺伝子産物のための分析によって検出される。
【０１４０】
2-ハイブリッド系または関連する方法を用いて、「ベート」遺伝子産物と相互作用する蛋白質用の活性化ドメインライブラリーをスクリーニングできる。例示により、制限なくして、SAMもしくはニューロピリン1蛋白質をベートとして用いてもよい。合計のゲノムまたはcDNAの配列は活性化ドメインをコードするDNAに融合される。このライブラリー、およびDNA結合ドメインに融合したベートSAMもしくはニューロピリン1蛋白質のハイブリッドをコードするプラスミドは、酵母リポーター株に共形質転換され、得られた形質転換体は、レポーター遺伝子を発現させるものにつきスクリーニングされる。例えば、SAMもしくはニューロピリン1蛋白質またはSAMもしくはニューロピリン1蛋白質のドメインのコードするようなベートSAMもしくはニューロピリン1遺伝子配列を、それがGAL4蛋白質のDNA結合ドメインをコードするDNAに翻訳上融合されるようなベクターにクローニングできる。これらのコロニーが精製され、レポーター遺伝子発現を担うライブラリー・プラスミドが単離される。次いで、DNA塩基配列決定を用いて、ライブラリー・プラスミドによってコードされた蛋白質を同定する。
【０１４１】
ベートSAMもしくはニューロピリン1蛋白質と相互作用する蛋白質が検出される細胞系のcDNAライブラリーは、当該技術分野において日常的に行われる方法を用いて作成できる。本明細書に記載された特定の系により、例えば、cDNAフラグメントをGAL4の転写活性化ドメインに翻訳上融合されるようなベクターに挿入できる。このライブラリーは、SAMもしくはニューロピリン1、またはSAMもしくはニューロピリン1-GAL4コード融合プラスミドと共にGAL4活性化配列を含むプロモーターによって駆動されたlacZ遺伝子を含む酵母株に共形質転換できる。ベートSAMもしくはニューロピリン1蛋白質と相互作用するGAL4転写活性化ドメインに融合された蛋白質をコード化したcDNAは、活性のGAL4蛋白質を再構成し、それによりHIS3遺伝子の発現を駆動するであろう。次いで、HIS3を発現するコロニーをこれらの株から精製でき、それを用いて、当該技術分野において日常的に行われる技術を用い、ベートSAMもしくはニューロピリン1蛋白質相互作用蛋白質を産生および単離できる。
【０１４２】
真性糖尿病
真性糖尿病は、細胞島β細胞の進行性の損失によって特徴づけられ、正常血糖を維持する身体能力の損失を付随する。本発明は、真性糖尿病をモニター、検出および同定する方法を提供する。SAMおよび／またはニューロピリン1を特異結合ならびに画像化デバイスによる検出の双方ができる作用物質を真性糖尿病を持つ患者に投与でき、イメージは画像化装置により創製できる。得られたイメージを用いて、膵臓中の合計β細胞量を決定できる。この合計の細胞量から、その病気の範囲を、もしあれば、決定できる。記載された方法を用いる連続の時間ポイントで生成されたイメージを比較でき、疾患の進行をモニターできる。加えて、記載された方法を用いて、合計β細胞量の損失を増加、維持または反転させる目的で投与された治療の効力をモニターできる。
【０１４３】
さらに、本発明のもう一つの態様において、SAMがインスリン放出の点から重要であることを決定した。かくして、本発明のもう一つの態様は、真性糖尿病の治療に有用な薬物療法用のこれらの特定の分子を標的とすることを含む。
【０１４４】
膵臓癌
膵臓癌において、大部分の癌においてのように、転移性拡散は、患者の生存における重要な低下に導く癌進行のプロセスにおける非常に重要な閾値であると考えられる。外科的様式は好ましい介在であるが、その疾患の潜在性の転移性拡散のポテンシャルはしばしば全身療法の適用を必要とする。全身療法を受ける患者のいくらかは、一次および局所の転移性病巣の外科的切除が治癒的であるように不必要になされる。反対に、実際、潜在性の転移性または微転移性病変を宿す場合、いくらかの患者はいずれの全身治療を受けないかもしれない。
【０１４５】
島細胞癌腫は膵島β細胞に由来し、しばしばそれらが生起するβ細胞と同一の多数の細胞表面蛋白質を発現する。本発明は、潜在性の転移性病巣の検出および膵臓癌の早期検出に重要な診断法を提供する。
【０１４６】
本発明は、SAMおよび／またはニューロピリン1を発現する一次膵臓癌から生起される局所および遠位の転移性病巣を位置付ける方法を提供する。方法は、SAMおよび／またはニューロピリン1を特異的に結合できる、および画像化デバイスによって検出できる双方の作用物質を哺乳動物に投与することを含む。方法によって生成された得られたイメージを分析でき、SAMおよび／またはニューロピリン1を発現する潜在的な転移性病巣を同定できる。加えて、一次または転移性病巣の成長速度を決定するか、限定されるものではないが、手術、放射線、化学療法、医薬療法等を含めた介在する様式の効力を評価する期間にわたり反復できる。
【０１４７】
移植
膵島細胞の移植が、糖尿病の治療用の新しい療法として出現している。膵島細胞の移植は、多数の患者がインスリン独立性になることを可能とする；しかしながら、これらの患者のいくらかは後でインスリン依存性に戻るであろう。これらの復帰の潜在的な原因は知られていないが、移植された島細胞量の損失が主な因子であると考えられる。in vivoでのこれらの島細胞量をイメージングする有効な方法の欠如は、インスリン依存性へのこれらの復帰の原因および潜在的な治療についての研究を妨害した。
【０１４８】
本発明は、合計の移植β細胞量を決定する方法を提供する。移植に引き続いて、SAMおよび／またはニューロピリン1に選択的に結合する作用物質を投与でき、イメージが撮影できる。方法によって生成された得られたイメージを分析でき、合計β細胞量を評価できる。移植前および移植後の双方で生成したイメージを比較して、移植後の合計β細胞の増加を決定できる。継続された追跡イメージを用いて、移植細胞の安定性を評価できる。
【０１４９】
コンジュゲートした作用物質
本発明の１つの非限定の態様は、第2の作用物質にコンジュゲートする第１の作用物質をそれを必要とする哺乳動物に投与することを含み、ここに、第1の作用物質はSAMおよび／またはニューロピリン1に特異的に結合でき、第2の作用物質は、外部の画像化デバイスにより検出できるリポーター剤である。イメージングする目的のために、第2の作用物質を放射性同位体、蛍光性タグ、常磁性イオン、酵素を含む群から選択し得る。限定されるものではないが、ヨウ素131、イットリウム90、ヨード124、ジルコニウム89、テクネシウム-99およびインジウム111を含めたいくつかの放射性同位体を用いることができる。放射性同位体および常磁性イオンをコンジュゲートさせる方法は、当該技術分野においてよく知られている。加えて、放射性同位体および常磁性イオンをイメージングする方法も当該技術分野においてよく知られている。あるいは、第1および第2の作用物質は、第1の作用物質がSAMおよび／またはニューロピリン1に結合することを可能とし、次いで、第2の作用物質を投与し、第1の作用物質に結合するのを可能とするように別々に投与できる。
【０１５０】
結合能を持った複数の作用物質
作用物質のいくつかの層が可能であることがさらに認識される。例えば、本発明の1つの非限定の態様において、SAMおよび／またはニューロピリン1に結合できる第1の作用物質に続いて、第3の作用物質にコンジュゲートする第1の作用物質を結合できる第2の作用物質が哺乳動物に投与される。このシナリオにおいて、第3の作用物質は、画像化デバイスにより検出できる放射性同位体、蛍光性タグ、常磁性イオンまたは酵素からなる。
【０１５１】
画像化デバイス
画像化デバイスを利用する本明細書に記載した種々の方法のいずれにおいても、いずれの適当な画像化デバイスも使用し得る。当該技術分野において現在知られたデバイスは、限定されるものではないが、核磁気共鳴、磁気共鳴画像、コンピュータートモグラフィーおよび陽電子放出断層撮影法用のデバイスを含む。画像化のための他の方法は、放射性同位体、常磁性イオン、標識抗体、標識抗体フラグメント、標識ポリペプチド、標識された核酸、標識されたプローブ、蛍光画像化方法等の使用を含む。本明細書に言及されるように、画像化デバイスまたは方法は、SAMおよび／またはニューロピリン1に直接的に結合した第1の作用物質を検出でき、または本明細書に記載された第1のものに結合した第2または第3の作用物質を検出できる。いくつかの例において、本明細書に記載のごとく、3を超える作用物質を用いて層とし得る。
【０１５２】
膵臓疾患を治療する方法
本発明は、SAMおよび／またはニューロピリン1を選択的に結合する作用物質をそれを必要とする哺乳動物に投与することを含む、疾患を治療する方法を提供する。本発明のさらなる態様により、作用物質は、抗体、抗体フラグメント、抗体の可変領域、蛋白質、ポリペプチド、核酸、プローブ、オリゴヌクレオチドおよびリボザイムよりなる群から選択される。
【０１５３】
コンジュゲートした第1の作用物質
本発明の非限定の1つの態様は、第2の作用物質にコンジュゲートする第1の作用物質をそれを必要とする哺乳動物に投与することを含み、第1の作用物質はSAMおよび／またはニューロピリン1に特異的に結合できる。抗SAMおよび／または抗ニューロピリン1抗体がSAMおよび／またはニューロピリン1を発現する細胞(例えば、膵臓疾患に苦しむ患者からの細胞)を選択的に結合するために、それらを方法に用いて、かかるSAMもしくはニューロピリン1を発現する細胞を標的としおよび／または破壊できる。かくして、第2の作用物質は、例えば、細胞毒性剤、放射性同位体、毒素、細胞老化を誘導できる作用物質、酵素、または第1の作用物質に結合した場合に所望の結果を提供できる他の作用物質よりなる群から選択され得る。例えば、シナプス接着分子に関連する膵臓疾患を治療するために、抗シナプス接着分子抗体を細胞毒性剤(例えば、リシン)、または放射性同位体で標識でき、(例えば、腫瘍内注射により)膵臓疾患を有する動物に投与できる。さらに、ニューロピリン1関連膵臓疾患を治療するために、抗ニューロピリン1抗体を、前記のごとく細胞毒性剤または放射性同位体で標識でき、膵臓疾患を有する動物に投与できる。
【０１５４】
また、本発明は、抗体指向酵素プロドラッグ療法として当該技術分野において知られた治療に良好に適合される。この態様において、第2のコンジュゲートした作用物質は、プロドラッグの第3の作用物質を生物学上活性の生成物に変換できる酵素からなる。第3の作用物質は、第2の作用物質の酵素の作用により改変された場合に、細胞毒性または細胞増殖抑制性の特性を持つ生成物を生成する作用物質の群から選定し得る。
【０１５５】
自己免疫性糖尿病および／または他の自己免疫疾患を防止する方法
SAMおよび／またはニューロピリン1を結合する、ブロックする、または干渉する抗体、ポリペプチドまたは他の作用物質を用いて、自己免疫性糖尿病を持つ患者を治療するか、あるいはそれを予防的に用いて、自己免疫性糖尿病についてのリスクがある個体をその障害に罹ることから防止し得る。かかる作用物質は、インスリン産生島β細胞に対する免疫攻撃を防止することにより多数の方法で機能し得る。抗体、抗体フラグメント、抗体の可変領域、蛋白質、ポリペプチド、核酸、プローブ、オリゴヌクレオチド、蛋白質メチル化化合物およびリボザイムを含めたいずれの適当な作用物質も、前記のように用いることができる。「免疫学的シナプス」の一部分として機能する種々のSAMのいずれも、SynCamおよびThy-1を含めたこの方法で標的とし得る。加えて、ニューロピリン1は本発明のこの態様において標的とされ得る。
【０１５６】
他の作用物質
治療目的のために、本発明の多数の態様において抗体を用い得る。抗体は、本発明に特に適合する特性を有する。具体的には、それらは、蛋白質、炭水化物、糖蛋白質、リポ蛋白質および／または脂質よりなる線形および立体配座のエピトープを含めたほとんど無限のエピトープを認識する能力を有する。
【０１５７】
ヒトへの抗体の投与の場合において、抗体が完全にヒト化された抗体を含み得る。非ヒト源から由来した抗体は、一次、二次および三次構造の抗体、特に、結晶化できるフラグメントが異種間の変異に付されるために、一般的に、ヒトに投与できない。大部分の例において、ヒト免疫系はこれらの変異を外来性のものと認識する。抗体の産生のための方法は当該技術分野において知られている。かかる抗体は、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、FAbフラグメントおよびFAb発現ライブラリーを含む。加えて、特定の蛋白質を標的とするペプチドミメティックの使用は当該技術分野において知られている。
【０１５８】
他の態様において、本発明はSAMおよび／またはニューロピリン1に結合できる蛋白質を利用する。本発明の1つの非限定の態様において、SAMおよび／またはニューロピリン1に結合できる蛋白質は、SAMおよび／またはニューロピリン1の精製された天然のリガンドである。SAMの天然のリガンドは、限定されるものではないが、ニューロリギン2、ニューレキシン1、ニューレキシン2、SynCam、Thy-1およびニューロンペントラキシンを含む。また、天然のリガンドのフラグメント、アナログおよび誘導体のごときこれらの天然のリガンドの変異体は、本発明の範囲内にある。かかる変異体は、例えば、天然のリガンドの自然発生の対立形質変異体によってコードされたポリペプチド、天然のリガンドの代替的なスプライス形態によりコードされたポリペプチド、天然のリガンドのホモログによってコードされたポリペプチド、および天然のリガンドの非自然発生の変異体によってコードされたポリペプチドの形態を含む。
【０１５９】
天然のリガンドの単離されたペプチジル部分は、かかるペプチドをコードする核酸の対応するフラグメントから組換え的に産生されたペプチドをスクリーニングすることにより得ることができる。加えて、フラグメントは、従来のMerrifield固相f-Mocまたはt-Boc化学のごとき当該技術分野において知られた技術を用いて化学合成できる。例えば、本発明のシナプス接着分子またはニューロピリン1蛋白質は、フラグメントの重なりのない所望の長さのフラグメントに任意に分割されるか、または好ましくは、所望の長さの重なるフラグメントに分割され得る。そのフラグメントを(組換えまたは化学合成によって)生成およびテストして、シナプス接着分子またはニューロピリン1蛋白質を結合できるペプチジルフラグメントを同定するできる。
【０１６０】
シナプス接着分子またはニューロピリン1リガンドの変異体は、当該技術分野において知られた種々の技術によって生成できる。例えば、リガンド変異体は離散性点変異（群）の導入によって、またはトランケーションによってのように変異誘発によって作成できる。変異は、リガンドの機能的活性を実質的に有する、または単にリガンドの機能的活性のサブセットを有するリガンド変異体を生じることができる。生成できるリガンドの他の変異体は、例えば、プロテアーゼ標的配列を改変する変異により、蛋白質切断に抵抗性であるものを含む。ペプチドのアミノ酸配列における変化の結果、リガンド変異体が天然のリガンドの1以上の機能的活性を有するかは、天然のシナプス接着分子またはニューロピリン1蛋白質の機能的な活性につき変異体をテストすることにより容易に決定できる。
【０１６１】
組合せ変異誘発は、変異蛋白質の非常に大きなライブラリーを生成するポテンシャルを有する。多数の蛋白質変異体をスクリーニングするために、ランダムライブラリーにおける非常に高い割合の非機能的蛋白質を回避し、単に、機能的蛋白質の頻度を増強する（かくして、配列スペースの有用なサンプリングを達成するのに必要とされる複雑さを減少する）のを可能とする技術を用いることができる。例えば、適当な選択またはスクリーニング方法が使用される場合、ライブラリーにおける機能的な変異体の頻度を増強するアルゴリズムの繰返しアンサンブル変異誘発(REM)を用い得る。Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Yourvan ら. (1992) Parallel Problem Solving from Nature, Maenner and Manderick, eds., Elsevier Publishing Co., Amsterdam, pp. 401-410; Delgrave ら. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331.
【０１６２】
また、本発明は、SAMおよび／またはニューロピリン1に対するリガンド、抗体、またはSAMもしくはニューロピリン1を特異的に結合できる他の蛋白質の低下を供して、SAMおよび／またはニューロピリン1を結合できるミメティック、例えば、ペプチド、非ペプチド剤を生成できる他の蛋白質の低下を提供する。
【０１６３】
例えば、かかる残基の非加水分解性ペプチド・アナログは、ベンゾジアゼピン(例えば、Freidinger ら. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988参照)、アゼピン (例えば、Huffman ら. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988参照)、置換ガンマラクタム環(Garvey ら. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988)、ケト−メチレン偽ペプチド(Ewenson ら. (1986) J. Med. Chem. 29:295; and Ewenson ら. in Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, Ill., 1985)、ベータ−ターンジペプチドコア (Nagai ら. (1985) Tetrahedron Lett 26:647; and Sato ら. (1986) J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 1: 1231)、およびベータ−アミノアルコール(Gordon ら. (1985) Biochem. Biophys. Res. Commun. 126:419; and Dann ら. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 134:71)を用いて生成できる。また、リガンドを化学的に修飾して、グリコシル基、脂質、リン酸塩、アセチル基等のごとき他の化学基を持つ共有結合または凝集コンジュゲートの形成により、リガンド誘導体を創製し得る。リガンドの共有結合性誘導体は、化学基を蛋白質のアミノ酸側鎖上、またはポリペプチドのN末端もしくはC末端の官能基に連結することにより調製できる。
【０１６４】
同定および分離
本発明は、SAMもしくはニューロピリン1を発現しない細胞からSAMおよび／またはニューロピリン1を発現する哺乳動物細胞を同定および分離する方法であって、細胞をSAMを結合できる作用物質と組み合わせて、作用物質を結合できない細胞から作用物質を結合できる細胞を分離することを特徴とする該方法を提供する。シナプス接着分子は、ニューロリギン1、ニューロリギン2、ニューロリギン3、ニューロリギン4X、ニューロリギン4Y、ニューレキシン1α、ニューレキシン2α、ニューレキシン3α、ニューレキシン1β、ニューレキシン2β、ニューレキシン3β、SynCam、Thy-1およびニューロンペントラキシンを含み得る。さらに、ニューロピリン1を利用し得る。本発明のさらなる態様により、作用物質は、抗体、抗体フラグメント、抗体の可変領域、蛋白質、ポリペプチド、核酸、プローブ、オリゴヌクレオチドおよびリボザイムよりなる群から選択される。
【０１６５】
本発明の1つの非限定の態様において、単離される細胞は組織から得られる。組織外植片から細胞を単離する方法は、当業者によってよく知られている。
【０１６６】
分離および移植
膵臓からの島β細胞の移植は、真性糖尿病の治療用の潜在的治療として出現している。移植手順はドナーからの膵臓組織の収穫からなる。次いで、β細胞は、細胞の残余の集団から同定および分離される。島β細胞の得られた集団は、受容者へ直接的に移植されるか、またはin vitroにて拡張し、次いで移植される。移植は門脈への注射によって生じ、肝臓組織中の島塊の形成が得られる。
【０１６７】
現在の技術は、細胞の混合物からβ細胞を単離する方法あって、SAMおよび／またはニューロピリン1を結合できる作用物質を細胞の混合物に添加し、次いで、作用物質を結合する細胞の能力に基づいて、その作用物質に結合できる細胞を、作用物質を結合できないものから分離することを特徴とする方法を提供する。島β細胞の得られた集団をそれを必要とする受容者への移植に用いることができる。加えて、本発明を用いて、幹細胞の試料から幹細胞を発現するシナプス接着分子の集団を分離できる。
【０１６８】
膵細胞
本発明の1つの非限定の態様は、膵臓組織またはそれから得られた細胞を、SAMおよび／またはニューロピリン1を結合できる作用物質と組み合わせ、次いで、その作用物質を結合しない細胞から作用物質を結合する細胞を分離することを含む。SAMおよび／またはニューロピリン1を発現する膵細胞の分離は多数の目的に有用で有り得る。例えば、SAMおよび／またはニューロピリン1を発現する、単離された膵癌細胞を癌ワクチンの調製に用いることができる。単離は種々の方法によって得ることができることが認められている。
【０１６９】
作用物質に対する親和性
本発明の１つの態様において、細胞は、固体表面上で固定化されるかまたは溶液中にないSAMおよび／またはニューロピリン1を結合できる作用物質と混合される。次いで、固定化された作用物質を結合する細胞は、固定化された作用物質に対するSAMおよび／またはニューロピリン1を発現する細胞の親和性に基づいて非結合細胞から分離される。本発明に用いた固相はかかる方法に一般的に用いられるいずれの表面でも有り得る。例えば、固相は微粒子で有り得;それはビーズ、例えば、ガラス、ポリスチレンビーズの表面で有り得るか、またはそれは、いずれかの種々の容器、例えば、特に、遠心分離管、カラム、マイクロタイタープレートウェル、フィルター、膜および管等のいずれかの固体壁表面で有り得る。
【０１７０】
本発明の１つの態様において、作用物質は常磁性粒子のごとき磁気または磁化できる粒子上に固定される。細胞の試料が粒子に加えられ、常磁性粒子に結合した作用物質に対するSAMおよび／またはニューロピリン1を発現する細胞の親和性に基づいて分離が生じる。外部磁界の適用は、未結合の細胞からの結合細胞を持つ常磁性粒子の分離を助ける。次いで、試料は緩衝液で洗浄され、固定化された作用物質に結合したままである細胞が保持される。
【０１７１】
FACS分析
本発明の１つの態様において、分離の方法は蛍光標識細胞分取(FACS)である。この具体例において、細胞試料は、作用物質、好ましくは、蛍光性タグにコンジュゲートする抗体で処理されるであろう。次いで、その集団はFACSアナライザーに入れられ、抗体を結合する細胞は、放射された蛍光性発光の強度に基づいて非結合細胞から分離されるであろう。
【０１７２】
細胞選別のこの方法が当該技術分野において容易に知られているので、いくつかの実体のない置換をこの具体例になすことができることが認められる。例えば、SAMおよび／またはニューロピリン1に結合できるコンジュゲートしていない一次抗体の使用に続いての区別される種の動物から由来するコンジュゲートした二次抗体の添加は、当業者に容易に知られている。加えて、励起および放射波長を変更させるいずれの数の蛍光タグも用いることができ、それは当業者に容易に知られているであろう。
【０１７３】
同定
本発明は、SAMおよび／またはニューロピリン1を発現する哺乳動物細胞を同定する方法であって、細胞の試料とSAMおよび／またはニューロピリン1を結合できる作用物質とを組み合わせて、作用物質に結合できる細胞を直接的または間接的に同定する方法を提供する。シナプス接着分子は、ニューロリギン1、ニューロリギン2、ニューロリギン3、ニューロリギン4X、ニューロリギン4Y、ニューレキシン1α、ニューレキシン2α、ニューレキシン3α、ニューレキシン1β、ニューレキシン2β、ニューレキシン3β、SynCam、Thy-1およびニューロンペントラキシンよりなる群から選択され得る。さらに、ニューロピリン1を用い得る。本発明のさらなる態様により、作用物質は、抗体、抗体フラグメント、抗体の可変領域、蛋白質、ポリペプチド、核酸、プローブ、オリゴヌクレオチドおよびリボザイムよりなる群から選択される。
【０１７４】
本発明の1つの非限定の態様において、第1の作用物質を、シグナルを直接的または間接的に生成できる第2の作用物質にコンジュゲートし、そのシグナルは、視覚的にまたは画像化デバイスの助けで知覚可能である。第2の作用物質は、蛍光性タグ、放射性同位体、酵素または常磁性イオンよりなる群から選択され得る。
【０１７５】
医薬製剤および投与方法
前記の抗体の投与に加えて、他の同定された作用物質は、膵臓疾患を治療、抑制、制御および／または予防、あるいは少なくとも部分的に阻止または部分的に予防し、それを膵臓疾患により生じた損傷のための抑制、防止、予防または治療のための治療有効用量にて対象に投与できる。本発明の作用物質は、治療上有効量の抗体、抗体フラグメント、抗体の可変領域、蛋白質、ポリペプチド、核酸、プローブ、オリゴヌクレオチド、リボザイム、およびそれらのいずれかの組合せ、ならびにSAMおよび／またはニューロピリン1を結合する他の化合物を含み、その用語は、治療上、阻害、防止および予防的に有効量の本発明の作用物質を含み、より具体的に後記される。いずれかの特定の理論に結び付けることなくして、出願人は、これらの医薬剤が、β細胞接着、拡散および移動を変調することにより関連する疾患に苦しむ対象に投与される場合に膵臓疾患に惹起された損傷を防止すると推測する。対象は、限定されるものではないが、哺乳動物、爬虫類、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタおよびニワトリを含めた動物であり、特にヒトである。
【０１７６】
治療上有効用量
かかる作用物質の毒性および治療の効力は、LD50(集団の50%の致死用量)、およびED50(集団の50%に有効な治療上の用量)の測定のための細胞培養物または実験動物における標準的医薬手順によって決定できる、毒性および治療効果間の用量比は、比LD50/ED50として表現できる治療指数である。大きな治療指数を示す作用物質が好ましい。有毒副作用を示す作用物質を用い得るが、影響されない細胞への潜在的な損害を最小限にし、かつ副作用を低下させるために疾患または障害によって影響を受けた部位にかかる作用物質を標的とする送達システムを設計するように対処がされるべきである。
【０１７７】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータをヒトおよび他の哺乳動物において用いるある範囲の用量を処方するのに用いることができる。かかる作用物質の用量は、ほとんどまたは全く毒性がないED50を含むある範囲の循環血漿または他の体液濃度内に好ましくは位置する。用量は、使用した投与形態および利用された投与経路に依存してこの範囲内で変更し得る。本発明のいずれかの作用物質について、治療上有効量は、細胞培養アッセイから最初に見積もることができる。用量を動物モデルにおいて処方して、細胞培養物において決定されるようなIC50(症状の最大半量の抑制を達成するテスト剤の濃度)を含む循環する血漿中濃度範囲を達成し得る。かかる情報を用いて、ヒトおよび他の哺乳動物における有用な量をより正確に決定できる。血漿中の作用物質レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【０１７８】
単一用量を生成するために医薬上許容される担体と組み合わ得る作用物質の量は、治療される宿主および投与の特定の様式に依存して変化するであろう。各投与形態の個々の用量に含有された作用物質の単位含量は、必要な治療上有効な量が多数の個々の用量の投与によって到達できるので、それ自体で治療上有効な量を構成しないことが当業者により認められるであろう。用量の選択は、当業者の決定による、利用された投与形態、治療されるべき疾患、および達成される特定の目的に依存する。
【０１７９】
本発明の作用物質および／または作用物質組合せでの病気または疾患を治療するための投与方法は、患者のタイプ、年齢、体重、性別、食事および病状、投与経路、使用される特定の作用物質の活性、効力、薬物動態学および毒物学プロフィール、作用物質送達システムが利用されるか、および作用物質がプロドラッグまたは薬物組合せの一部として投与されるかを含めた種々の因子に応じて選択される。かくして、実際に使用した投与方法は、対象毎に広範囲に変更し得る。
【０１８０】
処方および使用
本発明の作用物質は、限定されるものではないが、非経口、経口、局所的、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および眼内経路を含めた種々の経路を用いる、対象への投与のための公知の方法によって処方し得る。また、個々の作用物質は、本発明の1以上のさらなる作用物質と組み合わせて、および／または他の生物学的活性または生物学上不活性の作用物質と一緒に(「作用物質組合せ」)投与され得る。かかる生物学上活性または不活性の作用物質は、流体または作用物質（群）との機械的コミュニケーションに有り得るか、またはイオン、共有結合、ファンデルワールス、疎水性、親水性もしくは他の物理的力により作用物質（群）に付着し得る。投与が対象において局在化されることが好ましいが、投与が全身性でもあり得る。
【０１８１】
作用物質または作用物質組合せは、1以上の医薬上許容される担体および／または賦形剤を用いて、いずれかの通常方法によって処方され得る。かくして、作用物質およびそれらの医薬上許容される塩および溶媒和物は、例えば、吸引もしくは吸入(口または鼻のいずれかを介する)または経口、バッカル、非経口、直腸投与によって投与のために特に処方され得る。作用物質または作用物質組合せは、荷電、中性および／または他の医薬上許容される塩形態の形態を取り得る。医薬上許容される担体の例は、限定されるものではないが、Remington's Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 20th edition, Williams & Wilkins PA, USA (2000)に記載されたものを含む。
【０１８２】
また、作用物質は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、制御または持続した放出処方等の形態を取り得る。かかる作用物質は、患者への適当な投与のための形態を供するような適当な量の担体と一緒に、好ましくは精製された形態で、治療上有効な量の作用物質を含有するであろう。その処方は、投与の様式に適するであろう。
【０１８３】
非経口投与
作用物質または作用物質組合せは、注射により、例えば、ボーラス注射もしくは持続注入によって非経口投与のために処方され得る。注射用の処方は、所望の保存剤を添加した、アンプル中の単位投与形態、または複数投与容器内で与えられ得る。非経口の製剤はガラス、プラスチック等で作成られたアンプル、ディスポーザブル注射筒または複数投与用バイアルに入れることができる。作用物質は、油性または水性の賦形剤中で懸濁、溶液または乳剤のごとき形態を取り得て、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤のごとき処方剤を含有し得る。
【０１８４】
例えば、非経口製剤は、非毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒中(例えば、1,3-ブタンジオール中の溶液として)の無菌注射溶液または懸濁物で有り得る。使用され得る許容できる賦形剤および溶剤には、水、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液が含まれる。加えて、無菌不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として通常通りに使用される。この目的のために、合成モノ−またはジグリセリドを含めたいずれのブランドの不揮発性油も使用し得る。加えて、オレイン酸のごとき脂肪酸は非経口製剤に用い得る。
【０１８５】
あるいは、作用物質は、使用前に、発熱性物質除去水のごとき適当なビヒクルで構成のための粉末形態で有り得る。例えば、非経口投与に適当な作用物質は、作用物質または作用物質組合せの容量当たり0.1重量パーセントおよび90重量パーセント間で含有する無菌等張セーライン溶液を含み得る。一例として、溶液は、作用物質の約5パーセント〜約20パーセント、より好ましくは約5パーセントから約17パーセント、より好ましくは約8〜約14パーセント、依然としてより好ましくは約10パーセントを含有し得る。また、液剤または散剤の製剤は、可溶化剤および注射部位での痛みを緩和するためのリグノカインのごとき局所麻酔剤を含み得る。作用物質の非経口送達の他の方法は当業者に知られ、本発明の範囲内にある。
【０１８６】
経口投与
経口投与については、作用物質または作用物質組合せは、結合剤、増量剤、滑沢剤および崩壊剤のごとき医薬上許容される賦形剤での通常の手段によって調製された錠剤またはカプセル剤の形態を取り得る:
【０１８７】
A. 結合剤
結合剤は、限定されるものではないが、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプンまたは他のデンプン、ゼラチン、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸、他のアルギン酸塩、トラガント末、グアーガムのごとき天然および合成ガム、セルロースおよびその誘導体(例えば、エチルセルロース、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシルメチルセルロースナトリウム)、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、予めゼラチン化されたデンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、(例えば、番号2208、2906、2910)、微結晶性セルロースおよびそれらの混合物を含む。微結晶性セルロースの適当な形態は、例えば、AVICEL-PH-101、AVICEL-PH-103およびAVICEL-PH-105(FMC Corporation, American Viscose Division, Avicel Sales, Marcus Hook, Pennsylvania, USAから入手可能)として販売された材料を含む。典型的な適当なバインダーは、FMC CorporationによってAVICEL RC-581として販売された微結晶性セルロースおよびカルボキシルメチルセルロースナトリウムの混合物である。
【０１８８】
B. 増量剤
増量剤は、限定されるものではないが、タルク、炭酸カルシウム(例えば、顆粒または粉末)、ラクトース、微結晶性セルロース、粉末セルロース、デキストレート、カオリン、マンニトール、ケイ酸、ソルビトール、デンプン、予めゼラチン化されたデンプンおよびそれらの混合物を含む。
【０１８９】
C. 滑沢剤
滑沢剤は、限定されるものではないが、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、軽鉱油、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール、他のグリコール、ステアリン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、硬化植物油(例えば、落花生油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、オリーブオイル、トウモロコシ油およびダイズ油)、ステアリン酸亜鉛、オレイン酸エチル、ラウリン酸エチル、寒天およびそれらの混合物を含む。さらなる滑沢剤は、例えば、シロイド（syloid）シリカゲル(AEROSIL 200, W.R. Grace Co. of Baltimore, Maryland, USAにより製造)、合成シリカの凝集エアゾール(Deaussa Co. of Plano, Texas, USAにより販売)、CAB-O-SIL(Cabot Co. of Boston, Massachusetts, USAによって販売された発熱性二酸化ケイ素生成物)およびそれらの混合物を含む。
【０１９０】
D. 崩壊剤
崩壊剤は、限定されるものではないが、寒天、アルギン酸、炭酸カルシウム、微結晶性セルロース、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポラクリリンカリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、他のデンプン、予めゼラチン化されたデンプン、他のデンプン、粘土、他のアルギン、他のセルロース、ガム、およびそれらの混合物を含む。
【０１９１】
錠剤またはカプセル剤は、当該技術分野においてよく知られた方法によって所望によりコーティングし得る。結合剤および／または増量剤が本発明の作用物質と共に用いられる場合、それらは、典型的には、作用物質の約50〜約99重量パーセントとして処方される。好ましくは、崩壊剤の約0.5〜約5重量パーセント、好ましくは崩壊剤の約1〜約5重量パーセントを作用物質中で用い得る。滑沢剤は、典型的には、作用物質の約1未満の重量パーセントの量で所望により添加し得る。固体経口投与形態を作成するための技術および医薬上許容される賦形剤は、Marshall, Solid Oral Dosage Forms, Modern Pharmaceutics (Banker and Rhodes, Eds.), 7:359-427 (1979)に記載されている。他のそれほど典型的でない処方は当該技術分野において知られている。
【０１９２】
経口投与用液体製剤は、液剤、シロップ剤または懸濁剤の形態を取り得る。あるいは、液体製剤は使用前に水または他の適当なビヒクルで構成のための乾燥した生成物として示され得る。かかる液体製剤は、懸濁化剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂)；乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア);非水性ビヒクル(例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコールまたは分留された植物油);および／または保存剤(例えば、メチルもしくはプロピル-p-オキシ安息香酸エステルまたはソルビン酸)のごとき医薬上許容される添加剤での通常の手段によって調製し得る。また、製剤は、必要に応じて、緩衝塩、矯味剤、着色剤、芳香剤および甘味剤を含み得る。また、経口投与用の製剤は、作用物質の放出制御を達成するために処方され得る。経口処方は、好ましくは、10%〜95%の作用物質を含む。加えて、本発明の作用物質は、通常方法で処方された錠剤またはロゼンジ剤の形態でのバッカル投与のために処方され得る。作用物質の経口送達の他の方法は当業者に知られ、本発明の範囲内にある。
【０１９３】
放出制御投与
放出制御(または徐放性)製剤を処方して、作用物質または作用物質組合せの活性を延長し、投与頻度を低下し得る。また、放出制御製剤を用いて、作用物質の血中レベルのごとき作用または他の特性の開始時間に影響でき、結果的に、副作用の発生に影響できる。
【０１９４】
放出制御製剤は、所望の治療効果を生成する作用物質の量を最初に放出し、他の量の作用物質を連続して放出して、長期間にわたる治療効果のレベルを維持するように設計し得る。体内でほぼ一定のレベルの作用物質を維持するために、代謝されるおよび／または体内から排泄される作用物質の量を置換する速度で投与形態から作用物質を放出できる。作用物質の放出制御は、種々の誘導因子、例えば、ｐＨの変化、温度、酵素、水または他の生理学的な条件もしくは分子の変化によって刺激され得る。
【０１９５】
放出制御システムは、例えば、特定の器官または腫瘍にインスリンまたは化学療法を送達するために用いたものと同様の方法で作用物質を投与するために用いられ得る輸液ポンプを含む得る。典型的には、かかるシステムを用いて、作用物質は、選択された部位で制御された期間にわたり作用物質を放出する生物分解性の生物学的適合性の高分子の埋込みと組み合わせて投与される。高分子材料の例は、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエチレン酢酸ビニル、ならびにそれらの共重合体およびブレンドを含む。加えて、放出制御システムは、治療の標的の近接に配置し、それにより、全身性用量の一部分だけを必要とできる。
【０１９６】
本発明の作用物質は、当業者によく知られた他の放出制御手段または送達デバイスによって投与され得る。これらは、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリクス、ゲル、透過性膜、浸透システム、多層コーティング、微粒子、リポソーム、ミクロスフェア等、または割合の変更における所望の放出プロフィールを提供するための前記のいずれかの組合せを含む。作用物質の放出制御送達の他の方法は当業者に知られ、本発明の範囲内にある。
【０１９７】
吸入投与
また、作用物質または作用物質組合せは、吸入によって肺に直接的に投与され得る。吸入による投与については、作用物質は、多数の異なるデバイスによって肺に好都合に送達され得る。例えば、適当な低沸点噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスを含むキャニスターを利用する定量噴霧式吸入器(「MDI」)を用いて、肺に作用物質を直接的に送達し得る。MDIデバイスは、3M Corporation, Aventis, Boehringer Ingleheim, Forest Laboratories, Glaxo-Wellcome, Schering Plough and Vecturaのごとき多数の供給者から入手可能である。
【０１９８】
あるいは、乾燥粉末吸入器(DPI)デバイスを用いて、肺へ作用物質を投与し得る。DPIデバイスは、典型的にはガスのバーストのごときメカニズムを用いて、容器内部の乾燥粉末の濁りを作成し、次いで、それは患者によって吸入され得る。また、DPIデバイスは当該技術分野においてよく知られ、例えば、Fisons, Glaxo-Wellcome, Inhale Therapeutic Systems, ML Laboratories, Qdose and Vecturaを含む多数のベンダーから購入され得る。ポピュラーな変化は複数回投与DPI(「MDDPI」)システムであり、それは、1を超える治療用量の送達を可能とする。MDDPIデバイスは、AstraZeneca, GlaxoWellcome、IVAX、Schering Plough, SkyePharmaおよびVecturaのごとき会社から入手可能である。例えば、吸入器または注入器で用いられるゼラチンのカプセル剤およびカートリッジは、化合物の粉末混合物およびこれらのシステムのためのラクトースまたはデンプンのごとき適当な粉末基剤を含んで、処方され得る。
【０１９９】
肺に作用物質を送達するために用い得るもう一つのタイプのデバイスは、例えば、Aradigm Corporationによって供給される液体のスプレーデバイスである。液体スプレーシステムは、非常に小さなノズル孔を用いて、液体の作用物質処方をエアロゾル化し、次いで肺へ直接的に吸入される得る。例えば、噴霧器デバイスを用いて、肺に作用物質を送達し得る。噴霧器は、例えば、容易に吸入され得る微粉末を形成する超音波エネルギーを用いることにより、液体の作用物質処方からエアゾール剤を創製する。噴霧器の例は、Sheffield/Systemic Pulmonary Delivery Ltd.、AventisおよびBatelle Pulmonary Therapeuticsによって供給されるデバイスを含む。
【０２００】
もう一つの例において、電気流体力学(「EHD」)エアロゾルデバイスを用いて、肺に作用物質を送達し得る。EHDエアロゾルデバイスは電気的エネルギーを用いて、液体の作用物質溶液または懸濁物をエアロゾル化する。作用物質処方の電気化学的特性は、EHDエアロゾルデバイスで肺にこの作用物質を送達する場合に最適化する重要なパラメーターである。かかる最適化は、当業者によって日常的に行なわれる。作用物質の肺内送達の他の方法は当業者に知られ、本発明の範囲内にある。
【０２０１】
噴霧器および液体スプレーデバイスならびにEHDエアロゾルデバイスでの使用に適当な液体の作用物質処方は、典型的には医薬上許容される担体を含む剤を含むであろう。1つの典型的な具体例において、医薬上許容される担体は、アルコール、水、ポリエチレングリコールまたはパーフルオロカーボンのごとき液体である。所望により、もう一つの物質を添加して、作用物質の溶液または懸濁物のエアロゾル特性を改変し得る。例えば、この物質は、アルコール、グリコール、ポリグリコールまたは脂肪酸のごとき液体で有り得る。エアロゾルデバイスにおける使用に適当な液体の作用物質溶液または懸濁物を処方する他の方法は、当業者に知られている。
【０２０２】
デポ投与
また、作用物質または作用物質組合せは、デポ製剤として処方され得る。かかる長時間作用性の処方は、埋込み(例えば、皮下または筋肉内)、または筋肉内注射によって投与され得る。結果的に、作用物質は、許容できる油またはイオン交換樹脂中の乳剤のごとき適当な高分子または疎水性物質と共に、またはやや溶けにくい塩のごときやや溶けにくい誘導体として処方し得る。作用物質のデポ送達の他の方法は当業者に知られ、本発明の範囲内にある。
【０２０３】
局所投与
局所適用については、作用物質または作用物質組合せは、例えば、1.0μM〜1.0 mMの有効量の範囲にある所望の活性に基づいて、有効用量が送達されるように担体と組み合わせ得る。1つの具体例において、局所剤は皮膚に適用される。担体は、例えば、限定されずに、軟膏、クリーム、ゲル、ベースト、フォーム、エアロゾル、坐薬、パッドまたはゲル化スティックの形態で有り得る。
【０２０４】
また、局所的処方は、緩衝セーライン、鉱油、トウモロコシまたはラッカセイ油のごとき植物油、ワセリン、Miglyol 182、アルコール溶液またはリポソームもしくはリポソーム様生成物のごとき眼科的に許容できる賦形剤中の治療上有効な量の作用物質よりなり得る。また、いずれのこれらの作用物質も、保存剤、抗酸化剤、抗生物質、免疫抑制剤および作用物質に有害な効果を与えない他の生物学上または医薬上有効な作用物質を含み得る。作用物質の局所的の送達の他の方法は当業者に知られ、本発明の範囲内にある。
【０２０５】
坐薬投与
また、作用物質または作用物質組合せは、カカオ脂または他のグリセリドのごとき通常の坐剤基剤およびトリグリセリド、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンのごとき結合剤および担体を含む坐剤または持続性浣腸剤のごとき直腸の処方で処方され得る。坐剤は0.5重量%〜10重量%の範囲で作用物質を含有し得る。作用物質の坐薬送達の他の方法は当業者に知られ、本発明の範囲内にある。
【０２０６】
他の投与システム
種々の他の送達システムは当該技術分野において知られており、本発明の作用物質を投与するために用いることができる。さらに、これらおよび他の送達システムを組み合わせおよび／または改変して、本発明の作用物質の投与を最適化し得る。本発明の作用物質を用いる典型的な処方を後記する(本発明の作用物質は有効成分として示されるが、当業者は、プロドラッグおよび作用物質組合せもこの用語により包含されることを意味することを認識するであろう)。
【０２０７】
生物学的方法
通常の分子生物学技術に関する方法は、当該技術分野において一般的に知られており、OLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook ら., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989;および CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, ed. Ausubel ら., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (定期的アップデート)のごとき方法論文に詳細に記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いる種々の技術は、例えば、Innis ら., PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic Press: San Diego, 1990に記載されている。PCRプライマー対は、その目的を意図したコンピュータプログラムを用いるような公知の技術によって公知の配列に由来できる。免疫学的方法(例えば、抗原特異性抗体、免疫沈降および免疫ブロット法の調製)は、例えば、Current Protocols in Immunology, ed. Coligan ら., John Wiley & Sons, New York, 1991; and Methods of Immunological Analysis, ed. Masseyeff ら., John Wiley & Sons, New York, 1992に記載されている。各参考文献をここに出典明示してその全てを本明細書の一部とみなす。
【０２０８】
他の具体例
前記の詳細な記載は、当業者が本発明を実施するのを助けるために提供される。しかしながら、本明細書に記載され特許請求された発明は、これらの具体例が本発明のいくつかの態様の例示として意図されるために、本明細書に開示された特定の具体例によって範囲において制限されるものではない。いずれの等価な具体例も、本発明の範囲内にあることが意図される。実際に、本明細書に示され、記載されたものに加えた本発明の種々の変形は、現在の特許性のある発見の精神または範囲から逸脱しない前記の記載から当業者には明白になるであろう。また、かかる変異は、添付した特許請求の範囲内にあることが意図される。
【０２０９】
引用された参考文献
本願に引用された全ての刊行物、特許、特許出願および他の参考文献は、各刊行物、特許、特許出願および他の参考文献が全ての目的のためにここに出典明示して本明細書の一部とみなすことを特におよび個々に示すような同一範囲まで、その全ての目的のためにここに出典明示してその全てを本明細書の一部とみなす。
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１Ａ】β細胞特異的であるニューロリギン2およびニューレキシン1染色を示す。
【図１Ｂ】β細胞特異的であるニューレキシン1染色のもう一つの視野を示す。
【図２】SynCam特異性島特異性を示す。
【図３】NL-2(ニューロリギン2)がβ細胞中で発現される。PCRデータ(ヒト脳および島cDNA、NT=ネガティブ対照)。INS-1は、膵島β細胞の生物学を研究するために用いた一般的に用いられる細胞系である。
【図４】ウェスタンブロット: マウス脳、ラット脳（左）、ならびにα細胞系アルファ-TC6(第3レーン)ではなく、2つのインスリン産生β細胞（NITおよびINS-1;右）中のニューロリギン1。抗体はニューロリギン1に特異的なモノクローナル抗体(4C12)であった。
【図５】NL-1免疫染色。ニューロリギン1はβ細胞系INS-1にある。
【図６】NL-1に対する抗体は、ラット膵臓切片中の島を染色する。
【図７】ニューレキシン1についての免疫染色。ニューレキシン1は、膵島(左; 膵臓染色は島特異的である)、およびインスリン産生INS-1β細胞系にある。
【図８】SynCamについての免疫染色。SynCamは、島β細胞系INS-1の表面に存在する。
【図９】遺伝子特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応は、ニューロリギン(NL)およびニューレキシン(Nrxn)がヒトの島(Is)およびラット由来ベータ細胞系INS-1(I)およびマウス由来ベータ細胞系Nit-1 (N)中で発現される。また、予測のごとく、遺伝子が脳(Br)中で発現される。
【図１０】ニューロリギン1および2はインスリン分泌に関与する。インスリン分泌の増加は、ベータ細胞系INS-1中のNL-1およびNL-2の(遺伝子トランスフェクションによる)過剰発現後に明らかである。「モック」はニューロリギン過剰発現がない対照である。
【図１１】ニューロリギン3および4はインスリン分泌に関与する。インスリン分泌の増加は、ベータ細胞系INS-1中のNL-1およびNL-2の(遺伝子トランスフェクションによる)過剰発現後に明らかである。「モック」はニューロリギン過剰発現がない対照である。
【０２１１】
【図１２】島および島細胞系中のニューレキシン1およびニューロリギン1蛋白質の発現。ニューレキシンおよびニューロリギンの蛋白質が島において発現されるかを決定するために、ウエスタンブロット解析を、ニューレキシン1に対するヤギポリクローナル抗体およびニューロリギン1(4C12)に対するマウスモノクローナル抗体を用いて行った。ニューレキシン1bは、b-細胞系Ins-1およびNIT、ならびにヒトおよびラットの双方の島抽出物中で検出された。ニューロリギン1は単にINS-1およびNIT細胞に検出された。すべての実験において、ラット、マウスおよびヒトの脳からの蛋白質抽出物はポジティブ対照として用いた。ニューロリギン1がヒトまたはラットの島で検出されなかったので、発明者らは、島を単離するために用いた方法がその検出に影響したのではないか疑った。膵臓中で産生された消化酵素によりWB分析を介して細胞表面蛋白質を検出することは周知のごとく難しい。NL-1がこれらの酵素のうちのいくつかに感受性であることを決定するために、発明者らはトリプシンでβ細胞系NITを処理した。ここで、発明者らは、ニューロリギンがトリプシンに感受性であることを示す。また、発明者らは、ニューレキシンがそうではないことを示した。また、この実験を行う際に、発明者らはニューレキシンがNIT細胞の細胞表面上で発現されることを確認した。
【図１３】NIT b-細胞系におけるニューロリギン1の細胞表面発現。ニューロリギン1が細胞表面上で発現されるかを決定するために、NIT細胞をフラスコにプレートし、48時間培養して、トリプシンで、あるいはトリプシンなくして処理した。次いで、蛋白質を抽出し、ウエスタンブロット解析をモノクローナルニューロリギン1抗体を用いて等量の蛋白質で行った。ニューロリギン1は、トリプシンで処理した細胞中で減少し、これは、NIT細胞の細胞表面上で発現されることを示唆する。ネガティブ対照として、同じ実験を細胞内の蛋白質ゲフリン（gephryin）につきプロービングして行った。期待されるように、ゲフリンはトリプシンでの細胞の処理によって影響されなかった。(+、トリプシン; -、トリプシン未処理)。
【図１４】ヒトの膵島ならびにラットおよびマウスb-細胞系におけるニューレキシンおよびニューロリギンRNAの発現。ニューレキシンおよびニューロリギンのメッセージが島で発現するかを決定するために、RT-PCR分析を、すべてのニューレキシン(Nrxn)およびニューロリギン(NL)ファミリーメンバーに対する遺伝子特異的プライマーを用いて、(A)ヒト膵島、(B)INS-1細胞、(C)NIT細胞および(D)ヒト胎児膵臓で行った。すべての実験において、適当な種からの脳RNAをポジティブ対照として用いた。(Br、脳; Is;ヒト島;Nt、テンプレートなし;I、INS-1細胞;N、NIT細胞;P、ヒト胎児膵臓;Nrxn、ニューレキシン;NL、ニューロリギン)。
【図１５】ヒト膵細胞を用いて得た蛍光標示式細胞分取器(FACS)からのデータ。細胞は、プロインスリンに対する抗体およびSynCam(鶏卵起原の抗体)の細胞外領域に対する抗体で標識した。左パネル:対照トリ抗体(IgY)は、プロインスリン陽性細胞をソートできない、中央パネル:また、細胞外SynCam抗体(右方向)による高標識を有する細胞の大きな画分が、高プロインスリン抗体標識を示す（上部方向）。右パネル; 高アミラーゼ発現を持つ細胞(換言すれば、膵臓腺房[非島]細胞)は、SynCamで標識されなかった(腺房細胞は左方であった)。結論：SynCamでの膵細胞のソーティングは、膵臓腺房細胞(それらは非島である98%の膵臓の大部分を含む)からのインスリン産生島ベータ細胞の精製を可能にする。SynCamでソーティングは、β細胞につき非常に富化した細胞の集団を与える。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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