(57)【要約】  本発明は、中枢神経系又は末梢神経系神経支配随意筋の炎症性障害以外の炎症性障害を治療するためのアセチルコリンエステラーゼ（AChE）のコード領域に標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの新規使用に関する。より詳細には、本発明は、炎症性腸疾患を含む消化管の炎症性疾患を治療するために、AChE mRNAに標的化されたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性障害を治療する方法であって、その治療が必要な対象に、活性剤としてAChE mRNAに標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物の治療的有効量を投与することを含み、該炎症性障害が、中枢神経系又は末梢神経系神経支配随意筋の炎症性障害以外である、前記方法。
【請求項２】
前記炎症性障害が、炎症性胃腸障害である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記炎症性胃腸障害が、急性炎症性胃腸障害及び慢性炎症性胃腸障害から選択される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記慢性炎症性胃腸障害が炎症性腸疾患である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
前記炎症性腸疾患が、クローン病、結腸クローン病、クローン腸炎、及び潰瘍性大腸炎からなる群から選択される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
前記炎症性腸疾患がクローン病である、請求項4記載の方法。
【請求項７】
前記炎症性胃腸障害が、後天性免疫不全症候群、慢性肉芽腫性疾患、低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、白血球接着欠損症、周期性好中球減少症、Ib型糖原病、及びセリアック病からなる群から選択される障害に起因する、請求項2記載の方法。
【請求項８】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号1、3〜5からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドである、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが、ヌクレアーゼ耐性である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
前記アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの3'末端の最後のヌクレオチドの少なくとも1つが、2-O-メチル化されている、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
前記アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの3'末端の最後の3つのヌクレオチドが、2-O-メチル化されている、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
前記アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが、配列番号：2に記載のヌクレオチド配列を有する、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが、2つのヌクレオチド塩基を連結する少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１４】
前記アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが、該3'末端の2つの最後のヌクレオチド塩基を連結するホスホロチオエート結合を有する、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
前記医薬組成物の投与が、経口、静脈内、腹腔内、皮下、経皮、筋肉内、鼻腔内、又は吸入の投与経路により実施される、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
前記医薬組成物の投与が、経口投与経路で実施される、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
前記医薬組成物の投与が、連日投与により実施される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが、0.1mg〜20mgの日用量で投与される、請求項17記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中枢神経系又は末梢神経系神経支配随意筋の炎症性障害以外の炎症性障害を治療するための、アセチルコリンエステラーゼ（AChE）のコード領域に標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの新規使用に関する。より詳細には、本発明は、炎症性腸疾患を含む、消化管の炎症性疾患を治療するための、AChE mRNAに標的化されたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（本発明の背景）
炎症過程は、様々な型の負傷後の病原性侵入体に対する防御、並びに治癒及び回復において重要な役割を担う。自己免疫性疾患、神経変性、敗血症、外傷性傷害、及び他の病理的状態をもたらす過剰な炎症反応は有害であり得るので、炎症反応の規模及び持続時間はしっかりと制御されなければならない。
炎症過程の制御は、免疫応答（特に、抗炎症性サイトカインの分泌）、及び神経内分泌因子、特にグルココルチコイドの両方によって媒介されることが、長い間認識されてきた。最近、神経機構も限定的炎症反応に関与することが明らかになっている。具体的には、コリン作動性ニューロンが急性炎症を阻害し、迅速で、局在化され、かつ適応性の抗炎症性反射系を提供することが見出された。末梢において、アセチルコリン（ACh）は主に、遠心性迷走神経により放出される。アセチルコリンは、前炎症性サイトカインTNFα、インターロイキン-1β（IL-1β）、IL-6及びIL-18の産生を顕著に減弱させたが、抗炎症性サイトカインIL-10は減弱しなかった。IL-1がPC12細胞及びラットの皮質の両方においてアセチルコリンエステラーゼ（AChE）の過剰産生をもたらすことも見出され、これは閉じたループを示唆し、それによりAChがIL-1産生を抑制し、それゆえAChE産生の誘導がより低くなる。
【０００３】
多数の疾患が、自己免疫又は炎症性機構から生じると考えられている。そのうち重要なのが、クローン病又は炎症性腸疾患である。
クローン病（CD）は、病因の不明確な消化管の慢性炎症性疾患である。クローン病は小腸及び大腸の腫瘍形成を引き起こすが、口から肛門までの消化器系のあらゆる場所に影響を与え得る。様々な用語がCDを表すために使用され、かつ影響を受ける消化管の部位を反映する傾向がある。大腸（結腸）の関与は結腸クローン病又は肉芽腫性大腸炎とのみよばれ、小腸の関与はクローン腸炎とのみよばれている。小腸の末端部分、すなわち回腸における疾患は、クローン回腸炎とよばれている。小腸及び大腸の両方が関与する場合、該状態は、クローン腸結腸炎又は回結腸炎とよばれている。
CDは、結腸が関与する別の慢性炎症性状態である潰瘍性大腸炎に密接に関連する。同時に、CD及び潰瘍性大腸炎はしばしば、炎症性腸疾患（IBD）といわれる。潰瘍性大腸炎及びCDは治療法がなく、いったん該疾患が顕在化すると、寛解と再発との間でゆらぐ傾向がある。同時に、これらの状態は、米国で約500,000〜2,000,000人を冒している。
【０００４】
CDの進行は複数要因によるようであるが、遺伝的に前処理された宿主における病原性及び／又は常在性細菌に対する調節不全化免疫応答を必要とするようである。
細菌と、腸上皮表面及び／又は粘膜障壁の貫通との密接な関連は、CDにおけるシグナル伝達事象のカスケードを誘発する。これは、TNFα、IL-8、GROα、MCP-1を含むサイトカイン、シクロオキシゲナーゼ、プロスタグランジンE2及びF2α、一酸化窒素合成酵素の増強産生、及び接着分子ICAM-1の表面発現の増加を含む。上方制御されたサイトカイン発現は、NF-κBが関与する一般的なシグナル伝達経路により媒介される。サイトカインの局部的濃度の増加は、組織負傷をもたらす生化学的カスケードを開始させる。
現在のIBD薬剤療法は、不適切である。2つの最も広く使用されている薬剤ファミリーは、ステロイド及び5-アミノサリチル酸（5-ASA）薬剤であり、これらの両方が、腸の罹患部位の炎症を減少させる。6-メルカプトプリンなどの免疫抑制剤はますます、IBDの長期治療に使用されている。これらは特に、重篤かつ予測可能な副作用を伴う慢性型の高用量ステロイド療法に依存する患者に使用される。他の薬剤は、IL-6及びTNFなどの前炎症性サイトカインに対する抗体、又は抗生物質を含む。
【０００５】
これらの薬剤は、多くの副作用を有し、かつ該疾患を成功的に短縮させることがないので、IBDの満足な治療を開発するための差し迫った必要性が存在している。
国際公開公報第03/002739号は、ヒトAChEのコード領域に標的化され、該酵素のAChE-Rアイソフォームの発現を選択的に抑制する、hEN101と命名されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示する。WO 03/002739はさらに、進行性の神経筋障害の治療又は予防のためのhEN101を含む医薬組成物を開示及び特許請求の範囲に記載しており、前記障害は、筋捻挫、筋肉再神経分布、又は神経筋性接合異常を含む。EN101で治療される障害のうち、重力筋無力症、イートン・ランバート病、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、及び多発性硬化症が開示されている。これらの治療標的は、神経筋性機能に関するアセチルコリン経路の損失の予防又は保持に基づく。具体的実施例は、実験的自己免疫性重力筋無力症（EAMG）ラットにける重力筋無力症の重篤性を減少させることにおけるhEN101の有効性を実証するために提供されている。
【０００６】
国際公開公報第WO 2005/039480号は、抗炎症剤としての、及び前炎症性サイトカイン放出のサプレッサーとしてのAChE発現阻害剤の使用を開示する。WO 2005/039480はさらに、関節、中枢神経系、消化管、心内膜、心膜、肺、眼、皮膚、及び泌尿生殖器系における炎症の治療及び予防のためのAChE発現阻害剤を含む医薬組成物を開示する。具体的実施例は、hEN101で処理したサルにおいて神経性前炎症性サイトカインを抑制するhEN101の能力を実証するために提供されている。しかしながら、中枢神経系（CNS）又は末梢神経系（PNS）神経支配随意筋に関連しない炎症性障害の治療におけるEN101の使用に関する具体的な使用可能性又は指針は提供されていない。
EN101による、実験的自己免疫性脳髄膜炎（EAE）すなわちCNS炎症性疾患の治療は、最近、Nizriらの文献. (Neuropharmacol. 2006, 50: 540-547)により開示された。Nizriの研究結果は、多発性硬化症などのCNS炎症性障害、並びにアルツハイマー病及び重力筋無力症などの神経学的障害におけるコリン作動性バランスの重要性を提起した。
それゆえ、CNS又はPNSに関連しない炎症性障害を患っている患者を治療するための効果的かつ安全な方法に関して、未だ対処されていない必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、中枢神経系又は末梢神経系神経支配随意筋の炎症性障害以外の炎症性障害を治療する方法を提供し、該方法は、その治療が必要な対象に、活性剤としてアセチルコリンエステラーゼ（AChE）mRNAに標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を投与することを含む。本発明は、配列番号：1に記載のヌクレオチド配列5'-CTGCCACGTTCTCCTGCACC-3'を有するヒトAChEリードスルーアイソフォームのmRNAに標的化されたEN101と命名されたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、及び特に（*）により記される3つの3'末端2-O-メチル基を含む配列番号：2記載のヌクレオチド配列5'-CTGCCACGTTCTCCTGCA*C*C*-3'を有するEN101のヌクレアーゼ耐性形態の投与が、動物モデルにおいて炎症性腸疾患（IBD）に関連する症状の改善を導くという、予期しない発見に基づいている。IBDに関連する症状を寛解させることにおけるEN101の有効性は非常に顕著であり、デキサメタゾンにより達成される有効性に匹敵する。EN101は、低容量でその治療効果を発揮し、それゆえ慢性炎症性障害、特に炎症性胃腸障害を治療することにおける高度な利点であることが見出されていた。
【０００８】
EN101は、重力筋無力症又は多発性硬化症などの神経筋性又は神経性変性障害を治療することにおいて効果的であることがすでに示されていたが、EN101が、中枢神経系（CNS）、又は神経性若しくは神経筋性変性に関連しない炎症性障害を治療することに効果的であることをここではじめて開示する。EN101は、胃腸障害を治療することにおいて特に有用であることを示す。
炎症性胃腸障害の原因又は発病が未解決であることは、理解されるべきである。いくつかの理論は、ストレス又はアレルギー誘導性細菌がこれらの疾患を誘発することを示唆し、それゆえステロイド又は抗生物質がこれらの障害を治療するために指示されるが、本発明は、AChE mRNAに標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが、意外にも、胃腸障害用の普及薬物として使用することができることを開示する。
【０００９】
第1の態様によると、本発明は、その必要のある対象に、活性剤としてアセチルコリンエステラーゼ（AChE）mRNAに標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、炎症性障害の治療方法であって、該炎症性障害が、中枢神経系（CNS）又は末梢神経系神経支配随意筋の炎症性障害以外の炎症性障害以外である、前記方法を提供する。
同実施態様によると、対象は、哺乳動物である。さらなる実施態様によると、哺乳動物はヒトである。
さらなる実施態様によると、炎症性障害は、炎症性胃腸障害である。さらなる実施態様において、炎症性胃腸障害は、慢性炎症性胃腸障害及び急性炎症性胃腸障害からなる群から選択される。さらなる実施態様において、慢性炎症性胃腸障害は、クローン病、結腸クローン病、クローン腸炎、及び潰瘍性大腸炎からなる群から選択される炎症性腸疾患である。さらなる実施態様において、炎症性胃腸障害は、免疫機能障害に起因する。そのような免疫機能障害の例には、後天性免疫不全症候群、慢性肉芽腫性疾患、低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、白血球接着欠損症、周期性好中球減少症、Ib型糖原病、セリアック病、感染性胃炎、又は腸結腸炎を含むが、これらに限定されない。
【００１０】
さらなる実施態様によると、AChE mRNAに標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：1、3〜5からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドである。さらなる実施態様によると、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性である。さらなる実施態様によると、ヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴヌクレオチドは、2-O-メチル化形態における3'末端の最後の3つのヌクレオチドの少なくとも1つを含む。好ましくは、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの3'末端の3つの最後のヌクレオチドは、2-O-メチル化されている。好ましい実施態様によると、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、配列番号：2に記載のヌクレオチド配列を有する。さらなる実施態様によると、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含む。さらなる実施態様によると、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、該3'末端の2つの最後のヌクレオチド塩基を連結するホスホロチオエート結合を含む。
【００１１】
さらなる実施態様によると、医薬組成物を投与することは、経口、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、経皮、筋肉内、鼻腔内、及び吸入の投与経路からなる群から選択される。好ましい実施態様によると、医薬組成物を投与することは、経口投与で実施される。
さらなる実施態様によると、医薬組成物は、ペレット、錠剤、カプセル、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、クリーム、経皮パッチ、及び持続性製剤からなる群から選択される形態で製剤される。
さらなる実施態様によると、本発明の医薬組成物は、1日1回投与される。さらなる実施態様によると、配列番号：2に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、1日あたり0.1 mg〜20 mgの投与量で投与される。
別の態様によると、本発明は、炎症性障害を治療するための薬剤の調製に関する本発明の原理に従う、AChE mRNAに標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供し、該炎症性障害は、中枢神経系（CNS）又は末梢神経系神経支配随意筋の炎症性障害以外である。
本発明のこれらの及び他の実施態様は、以下の図面、明細書、実施例及び特許請求の範囲に関連してより理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、アセチルコリンエステラーゼ（AChE）mRNAに標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの新規使用に関する。特に、本発明は、炎症性障害、特に炎症性胃腸障害を患っている患者における症候の緩和及び／又は寛解の誘導を提供する治療方法に関する。
本明細書で使用する用語「炎症性胃腸障害」 とは、消化管の粘膜層の炎症に関連する障害をいい、急性及び慢性の炎症状態を含む。急性炎症は、一般的に、短時間での発病、及び好中球の浸潤又は流入により特徴づけられる。
用語「慢性炎症性胃腸障害」とは、相対的により長い期間での発病により特徴づけられ、持続性であり（例えば、数日、数週、数ヶ月、又は数年から、該対象の生涯まで）、及び単核球の浸潤又は流入に関連した消化管の粘膜層の炎症をいい、さらに自発的寛解及び自発的発生の時期に関連し得る。それゆえ、慢性炎症性胃腸障害を有する対象は、長期の監督、観察、又は看護を必要とすることが予想され得る。慢性炎症性胃腸障害は、炎症性腸疾患（IBD）、クローン病、及び潰瘍性大腸炎を含むが、これらに限定されない。
【００１３】
「消化管の粘膜層」は、腸（小腸及び大腸を含む）、直腸、胃（stomach）（胃（gastric））の裏打ち、口腔などの粘膜を含むことを意図する。
本明細書で使用する「炎症性腸疾患」又は「IBD」とは、腸の全て又は一部の炎症により特徴づけられる様々な疾患のいずれかをいう。炎症性腸疾患の例は、クローン病、結腸クローン病、クローン回腸炎、及び潰瘍性大腸炎を含むが、これらに限定されない。
クローン病（限局性腸炎又は潰瘍性回腸炎としても知られる）は、腸のあらゆる部分を冒す、病因未知の慢性炎症性疾患である。該疾患の最も顕著な特徴は、顆粒状で赤紫色の腸壁の浮腫性肥厚である。炎症の進行に伴い、これらの肉芽腫はしばしば、それらの外接境界を失い、周辺組織に溶け込む。下痢、及び腸閉塞は、優性な臨床的特徴である。該疾患の経過は、継続的又は再発的、軽度若しくは重度であり得るが、腸の関与部分の切除によって治癒することはできない。クローン病を有するほとんどの患者は、ある時点で手術を必要とするが、引き続いての再発が一般的であり、継続的な薬物治療が通常である。
【００１４】
潰瘍性大腸炎は、大腸を冒す病因未知の慢性炎症性疾患である。疾患の経過は、継続的又は再発的、軽度若しくは重度であり得る。最初期の病変は、リーベルキューン腺窩の底部での膿瘍形成を伴う炎症性浸潤である。これらの膨張及び破裂した腺窩の癒合は、裏打ち粘膜をその血液供給から分断する傾向があり、潰瘍形成をもたらす。該疾患の徴候及び症状は、痙攣、下腹部痛、直腸性出血、及び主に血液、膿及び粘液からなり不十分な糞便粒子を有する頻回の軟便を含む。
潰瘍性大腸炎は、環境的傷害によってもたらされる可能性があり、又は化学療法、放射線療法などの投与などの治療的投与計画に関連する可能性がある。結腸炎は、慢性肉芽腫性疾患、セリアック病、セリアックスプルー（遺伝性疾患であって、腸の裏打ちが、グルテンとして知られるタンパク質の経口摂取に応答する炎症である）、食物アレルギー、胃炎、感染性胃炎又は腸結腸炎（例えば、ヘリコバクター・ピロリ感染性慢性活性胃炎）、及び感染性病原体によりもたらされる胃腸炎症性障害の他の形態などの状態に関連し得る。
【００１５】
炎症性胃腸障害はまた、後天性免疫不全症候群、低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、白血球接着欠損症、周期性好中球減少症、及びIb型糖原病を含む後天性又は遺伝性免疫機能障害に続発し得ることは理解されるべきである。
一態様によると、本発明は、CNS又はPNS神経支配随意筋における炎症性障害以外の炎症性障害を治療する方法を提供し、該方法は、その治療が必要な対象に、アセチルコリンエステラーゼ（AChE）mRNAに標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療的有効量及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む。
本発明は、AChEをコードする核酸分子の発現を調節すること、最終的にはAChEの産生量を調節することにおける使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用する。これは、AChEをコードするmRNAと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することにより達成される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドと、それがハイブリダイズするその相補的核酸標的との間の関連性は、一般に、「アンチセンス」といわれる。
【００１６】
AChE mRNAに標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくはヌクレアーゼ耐性である。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、AChE-R mRNAを選択的に阻害する。AChE-Rは、mRNAが偽イントロンI4を含むAChEの「リードスルー」アイソフォームを指定する。
本発明の原理に従って炎症性障害を治療するために使用され得る、AChE mRNAに標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、以下の配列を有する：
EN101又はヒトEN101（hEN101）と命名された5'-CTGCCACGTTCTCCTGCACC-3'（配列番号：1）；
ヌクレアーゼ耐性EN101又はhEN101と命名された5'-CTGCCACGTTCTCCTGCA*C*C* -3'（配列番号：2）（該配列中、3'末端の3残基は、2-O-メチル基（*）で修飾されている）；
マウスEN101（mEN101）と命名された5'-CTGCAATATTTTCTTGCACC-3'（配列番号：3）；
ラットEN101（rEN101）と命名された5'-CTGCCATATTTTCTTGTACC-3'（配列番号：4）；
hEN103と命名された5'-GGGAGAGGAGGAGGAAGAGG-3'（配列番号：5）。
【００１７】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくはオリゴデオキシヌクレオチドであるが、リボヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はこれらの混合物が本発明に包含されることは理解されるべきである。
AChE mRNAに標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO 03/002739、WO 2005/039480、米国特許第7,074,915号、及び米国特許公報第2006/0069051号に記載されており、それらの内容は本明細書に完全に記載されているかのように、引用により本明細書に組み込まれる。WO 03/002739は、重力筋無力症を治療するための、hEN101と命名されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を開示する。
ヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に既知の様々な方法で調製することができる。国際公開公報第WO98/26062号が参考文献であり、これは、オリゴヌクレオチドは、例えば、ホスホジエステルヌクレオチド間結合をホスホロチオエート結合で置換すること、1つ以上のヌクレオチドの2'ヒドロキシ基を2'-O-メチル基で置換すること、ヌクレオチドをフッ素化すること、又は生理的条件下でループ構造を形成し得るヌクレオチド配列をアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の3'末端に付加することによって、ヌクレアーゼ耐性にすることができることを開示する。
【００１８】
それゆえ、特定の実施態様において、本発明のヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、2'-O-メチル化された少なくとも1つの最後の3つの3'末端ヌクレオチドを有し、好ましくは最後の3つの3'末端ヌクレオチドは2'-O-メチル化されている。好ましくは、AChEアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、配列番号：2に記載されているヌクレオチド配列を有する。代替的実施態様において、本発明のヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、フッ素化された少なくとも1つの最後の3'末端ヌクレオチドを有する。さらなる代替的実施態様において、本発明のヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、最後の3'末端ヌクレオチド塩基の少なくとも2つの間を連結するホスホロチオエート結合を含み、好ましくはホスホロチオエート結合は、最後の4つの3'末端ヌクレオチド塩基間を連結する。さらなる代替的実施態様において、ヌクレアーゼ耐性は、生理的条件下で、ループ構造を形成し得るヌクレオチド配列を、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド配列の3'末端に付加することによって達成される。ループを形成する構造の例は、配列5'-CGCGAAGCG-3'（配列番号：6）であり、該配列を所与のアンチセンスオリゴヌクレオチドの3'末端に付加してヌクレアーゼ耐性を付与することができる。
【００１９】
ホスホロチオエートで修飾したオリゴヌクレオチドは、一般的に、安全であり、かつ副作用がないとみなされている。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、部分的にホスホロチオエートとして有効であり、かつ部分的に2'-O-メチル保護化オリゴヌクレオチドとしてさらにより有効であることが見出されている。WO 98/26062は、約20個のヌクレオチド間結合のうちに3つのホスホロチオエート結合を含むAChEアンチセンスオリゴヌクレオチドが、一般的に、約1〜10μMの濃度での使用に安全であることを教示している。しかしながら、長期の適用に関して、分解された場合に毒性基を放出しないオリゴヌクレオチドが好ましいであろう。これらは、2'-O-メチル保護化オリゴヌクレオチドを含むが、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは含まない。ホスホロチオエート保護を超える2'-O-メチル保護化のさらなる利点は、AChE抑制に必要とされるオリゴヌクレオチド量の低下である。この差は、2'-O-メチル保護化オリゴヌクレオチドが使用された場合に得られる二重鎖の安定性の向上に関連していると考えられている（Lesnik, E. A. 及び Freierの文献, S. M., Biochemistry 37,6991-7, 1998）。2'-O-メチルオリゴヌクレオチドのより優れた有効性の代替的例示は、この修飾が、細胞膜を介するオリゴヌクレオチド鎖の浸透を促進させ得ることである。2'-O-メチル保護のさらなる利点は、2'-O-メチル保護が付与する、ヌクレアーゼ介在性分解に対するより強力な保護であり、それゆえ、この方法で保護されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの有用存続期間が延びる。
【００２０】
本発明の医薬組成物が、活性剤として、本発明で定義した少なくとも2つのアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその機能的類似体、誘導体、若しくはフラグメントの組み合わせを含み得ることは理解されるべきである。
本発明のオリゴヌクレオチド配列の「フラグメント」とは、AChE発現を阻害し得るオリゴヌクレオチドの任意のヌクレオチド部分集合をいうことが意図される。オリゴヌクレオチドの「バリアント」とは、天然型オリゴヌクレオチドと実質的に類似する、好ましくは、完全なオリゴヌクレオチド又はそのフラグメントのいずれかに対して、少なくとも60％の相同性、少なくとも70％の相同性、少なくとも80％の相同性、より好ましくは少なくとも90％の相同性、及び最も好ましくは少なくとも95％の相同性を有することをいうことが意図される。オリゴヌクレオチドの「類似体」は、同種由来の相同分子、又は異種由来の相同分子に限定されないものであり得る。
【００２１】
AChE mRNA配列に相補的であるオリゴヌクレオチド配列の部分に加え、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドも酵素的核酸分解活性を有するRNA配列を含み得る。好ましい核酸分解配列は、mRNA転写産物と特異的に相互作用することが示されたリボザイム配列である。好ましいリボザイムは、ハンマーヘッド型リボザイムである。別の好ましいリボザイムはヘアピンリボザイム構造であり、例えばタバコ輪斑ウイルスのサテライトRNA由来のものである。
本発明のAChE mRNAに標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが、交差種特異性を有し、齧歯類又は霊長類において毒性を引き起こさないことは理解されるべきである。
血管を介しての本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの浸透を改良するために、当業者に既知の様々な修飾を導入することができる。例えば、オリゴヌクレオチド分子を、任意に、部分不飽和脂肪族炭化水素鎖、及び／又はカルボン酸基、エステル基、若しくはアルコール基などの1以上の極性又は荷電基を含む基に連結することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドを、ペプチド構造、好ましくは膜向性ペプチドに連結することができる。そのような修飾型オリゴヌクレオチドは、より容易に膜を浸透し、これはそれらの機能に決定的に重要であり、かつそれゆえにそれらの活性を顕著に増大させ得る。パルミチル連結型オリゴヌクレオチドが記載されている。ゲラニオール連結型オリゴヌクレオチドも記載されている。ペプチド、例えばタンパク質膜向性ペプチドに連結されたオリゴヌクレオチド及びその製造は、Soukchareunらの文献. (Bioconjug. Chem. 9: 466-75, 1998)に記載されている。分子を特定の細胞に標的化させ、前記細胞によるオリゴヌクレオチドの取込みを促進させるアンチセンス分子の修飾が、Wang, J.の文献 (Controlled Release 53: 39-48, 1998)に記載されている。
【００２２】
投与されるべき医薬組成物は、医薬として許容し得る担体を含む。用語「医薬として許容し得る」は、動物及びより詳細にはヒトにおける使用に関して、連邦政府又は州政府の監督庁により承認されていること、又は米国薬局方若しくは他の一般的に認知された薬局方に収載されていることを意味する。用語「担体」とは、アンチセンスオリゴヌクレオチドと共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又は媒体をいう。そのような医薬担体は、水又は油などの滅菌液であり得、石油、動物油、植物油又は合成起源、例えばピーナツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油など、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレン グリコール、又は他の合成溶媒のものを含む。水は、医薬組成物が静脈内投与される場合に好ましい担体である。生理食塩水溶液及びブドウ糖水溶液並びにグリセロール溶液も、液体担体として、特に注射液用に使用することができる。適切な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、コメ、コムギ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、エタノールなどを含む。所望であれば、本組成物は、少量の湿潤剤又は乳化剤、若しくは酢酸、クエン酸、又はリン酸などのpH緩衝剤も含むことができる。ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗細菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；及び、塩化ナトリウム又はブドウ糖などの浸透圧の調整剤；も意図される。
【００２３】
本組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル、粉末剤、クリーム、徐放性製剤などの形態で摂取できる。本組成物は、従来型の結合剤及び担体、例えば、トリグリセリド、微結晶性セルロース、トラガカントゴム、又はゼラチンなどと共に、坐薬として製剤できる。経口製剤は、標準的な担体、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、マグネシウム ステアリン酸、ナトリウム サッカリン、セルロース、マグネシウム炭酸塩などを含み得る。適切な医薬担体の例は、E.W. Martinによる文献「レミントンの薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」に記載されている。そのような組成物は、治療的有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを適切な量の担体と共に含み、対象への適切な投与のための形態を提供するであろう。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドをリポソーム内に封入し、そのようにして投与することもできる。リポソームの調製及び使用は当業者に周知である。例えば、DOTAP (Roche Diagnostics社)、リポフェクチン、リポフェクタム、及びトランスフェクタムなどの形質移入試薬が市販されており、これらはオリゴヌクレオチドの取込みを促進させるために使用される。リポソームを得る他の方法は、センダイウイルス又は他のウイルスの使用を含む。
【００２４】
消化管における炎症性障害の治療において有効であるアンチセンスオリゴヌクレオチドの量は、該障害の性質又は状態次第であり、標準的な臨床技術で決定することができる。処方に使用されるべき適切な用量も、投与経路、該疾患又は障害の重篤性、及び患者の臨床状態次第であり、医師の判断及び患者の状況に従って決定されるべきである。
一般当業者は、体液又は組織中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの測定濃度に基づいて、投与量を容易に見積もることができる。成功的治療の後、患者は、病状の再発を予防するために、該オリゴヌクレオチドが、体重kgあたり0.01μg〜100gにわたる維持用量で、
毎日1回以上〜毎月又は毎年1回投与される維持療法を受けることが望ましいであろう。
いくつかの実施態様によると、本発明の医薬組成物は、そのような治療が必要な患者に、約0.001μg/g〜約50μg/gの活性成分投与量で毎日投与することができる。好ましくは、治療及び／又は予防は、約0.01〜約5.0μg/gの活性成分投与量で投与することを含む。最も好ましくは、前記活性成分投与量は、約0.05〜約0.50μg/gであり、さらに最も好ましくは、投与量は、患者体重の0.15〜0.50μg/gである。
治療すべき状態の重篤性及び応答性次第で、用量は、数日から数週間、又は対象の臨床状態の悪化の減少が達成されるまで続く一連の治療を伴う、単回投与又は複数回投与であり得る。
【００２５】
AChE mRNAに標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物の投与方法は、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、眼、及び経口の経路を含むが、これらに限定されない。本組成物は、任意の都合のよい経路によって、例えば、注入又は急速静注法によって、上皮裏打ちを介する吸収（例えば、口腔粘膜、直腸又は腸の粘膜、経皮など）によって投与することができ、他の治療活性剤と共に投与できる。現在の典型的実施態様によると、投与は、経口経路によるものである。肺投与には、例えば、吸入器又は噴霧器の使用、及びエアロゾル化剤を有する製剤も使用できる。
本発明の医薬組成物を、治療の必要のある領域に局所的に投与することが望ましいであろう；これは、方法を限定するものではないが、例えば手術時の局部的注入、例えば手術後の創傷包帯と併用しての局所適用によって、注射によって、カテーテルを用いて、坐薬を用いて、又は、浸透性、非浸透性又はゼラチン性材料の移植片を用いて達成され得る。いくつかの好ましい実施態様によると、投与は、炎症部位での、例えば注射器を介しての直接注射によるものであり得る。
【００２６】
直接的な内部局所適用に関して、本医薬組成物は、錠剤又はカプセルの形態であり得、これらは以下の成分のいずれか、又は同様の性質の化合物を含み得る：微結晶性セルロース、トラガカントゴム、又はゼラチンなどの結合剤；デンプン又はラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、プリモゲル（Primogel）、又はコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；又は、コロイド性二酸化ケイ素などの流動促進剤。投与量単位形態がカプセルである場合、上記の型の材料に加え、脂肪油などの液体担体を含むことができる。さらに、投与量単位形態は、投与量単位の物理形態を修飾する様々な他の材料、例えば、糖、シェラックの被覆剤、又は他の腸への作用物質を含み得る。
注射に関して、本医薬組成物の活性成分としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、水溶液、好ましくはハンク溶液、リンガー溶液、又は生理食塩緩衝液などの生理的適合緩衝液で製剤することができる。経粘膜投与に関して、浸透すべき障壁に対して適切な浸透剤を本製剤に使用する。そのような浸透剤は、一般的に当業者に既知である。
【００２７】
経口投与に関して、本医薬組成物は、活性成分を当業者に周知の医薬として許容し得る担体と混合することによって、容易に製剤することができる。そのような担体は、本医薬組成物が、患者による経口摂取用に、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤されることを可能にする。経口使用のための薬理学的調製物は、所望の適切な助剤を添加した後に、固形賦形剤を使用し、任意に結果として得られた混合物を粉砕し、及び顆粒の混合物を加工して、錠剤又は糖衣錠コアを得ることで製造することができる。適切な賦形剤は、特に：ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖などの充填剤；例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ポテトデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、及びカルボメチルセルロースナトリウムなどのセルロース調製物；及び／又は、ポリビニルピロリドン（PVP）などの生理的に許容し得る重合体；である。所望であれば、架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を添加してもよい。
AChE mRNAに標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの「治療的有効量」という用語は、該アンチセンスオリゴヌクレオチドが投与される対象に有益な効果を提供するのに十分なアンチセンスオリゴヌクレオチドの量、すなわち、炎症性胃腸障害などの炎症性障害に関連する症状を寛解させるか、又は治療される対象の生存期間を延長させるのに十分な量をいう。
【００２８】
所望の治療的活性のために、並びに治療的に有効な投与量の決定のために、AChE mRNAに標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、インビボで試験することができる。例えば、そのようなオリゴヌクレオチドは、ヒトでの試験に先立ち、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなどを含むが、これらに限定されない適切な動物モデル系で試験することができる。インビボ試験に関しては、ヒトへの投与に先立ち、当業者に既知の任意の動物モデル系を使用することができる（本明細書の以下に記載の実施例を参照されたい）。
「治療的」活性は、病理徴候を示す対象に投与した場合に、それらの徴候の減弱又は解消をもたらすアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性である。
本発明の医薬組成物によって治療することができる消化管の炎症性障害は、慢性炎症性胃腸障害及び急性炎症性胃腸障害を含む。慢性炎症性胃腸障害は、クローン病、炎症性腸疾患、及び潰瘍性大腸炎を含むが、これらに限定されない。他の実施態様において、胃腸障害は、免疫機能障害に関連する。そのような免疫機能障害の例は、後天性免疫不全症候群、慢性肉芽腫性疾患、低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、白血球接着欠損症、周期性好中球減少症、及びIb型糖原病を含むが、これらに限定されない。
【００２９】
本明細書に記載の本発明の治療方法の有効性は、治療を受ける患者における顕著な臨床的改善によって示される。臨床的改善とは、任意の程度の患者の症状、生化学的指標、及び病理徴候が、当業者に既知の方法で評価されるものとして改善、解消又は低減することを意味する。患者の症状は、腹痛、直腸痛、慢性又は断続的な下痢、体重減少、発熱、直腸出血、組織の膨張、及び直腸部位の圧痛を含む。生化学的指標は、白血球数、沈降速度、赤血球数、酵素レベル、C反応性タンパク質を含むタンパク質レベル、及び身体のミネラル濃度を含む。胃腸潰瘍、膿瘍、亀裂及び瘻孔の病理的重篤性を評価するために使用される可視化技術は、Ｘ線、大腸内視鏡検査、S状結腸鏡検査、コンピュータ処理化軸方向トポグラフィー（computerized axial topography）、及びビデオカプセル内視鏡検査（video capsule endoscopy）を含む。
AChEに対して標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、単独で、又は他の治療様式と併せて投与することができる。例えば免疫抑制剤を含む薬物療法などの他の治療法が関与する治療投与計画の一部として、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することは適切である。
【実施例】
【００３０】
（実施例１）
（炎症性腸疾患（IBD）におけるhEN101の効果）
結腸炎は、炎症性腸疾患（IBD）としても知られる腸の慢性炎症である。この状態は、TNF-α及びIL-10などの病理的炎症性サイトカインの過剰産生によって、少なくとも部分的に特徴づけられる。最新のプロトコルは、重篤な結腸炎を誘発するために2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）の直腸内投与を実施し、これは、ヒトにおけるIBDに多くの巨視的及び組織学的類似性を有する非常に有効なモデルを表す。研究は、TNBS誘導性結腸炎が、スルファサラジン又は5-アミノサラシル酸（5-aminosalacylic acid）などのIBDに対する現在の治療法の多くに都合よく反応することを示している。この研究において、結腸炎におけるEN101の効果が研究された。
BALB/Cマウス（6〜8週齢の雄マウス）を、90〜120分間麻酔した（マウス1匹あたり、85% ケタミン、15% セラシン（cellasine）2% 溶液；30μl IM/IP）。150 mg/kg（40μlの0.9% NaClに溶解し、40μlの50％エタノールと混合した）のTNBS を、（1ml注射器に連結した供給針を介して）直腸内経路により投与した。
配列番号：2に記載のヌクレアーゼ耐性EN101を、終体積200μlの生理食塩水で1日1回経口投与し、これは、結腸炎誘導後1日目又は2日目のいずれかに開始した。
マウスには適宜、市販の齧歯類用食餌（Harlan Teklad TRM Ra/Mouse Diet）を与え、高圧蒸気滅菌済み水に自由にアクセスさせた。
【００３１】
処理は下記の通りであった：
【表１】
2009533421.tif 000002
連日投与は、結腸炎誘導後1日目に開始した。
【００３２】
【表２】
2009533421.tif 000003
連日投与は、結腸炎誘導後２日目に開始した。
【００３３】
毎日、マウスの体重、及び下痢、直腸脱、及び直腸出血を含む疾病の徴候を検査した。TNBS投与後7日目に、該マウスを屠殺した。
研究の最後に、結腸を解剖顕微鏡（X5）下で調べ、Wallace基準に従って、巨視的病変を評価した。Wallaceスコアは、腸の充血、肥厚、及び腫瘍形成の程度などの炎症を反映する基準に基づき、0〜10のスケールで巨視的な結腸病変を評価する（Wallace, J.L.らの文献,1989, Gastroenterology, 96:29）。
図1は、結腸炎誘導後1日目か2日目のいずれかに経口投与した場合における、IBDを治療するためのヌクレアーゼ耐性EN101の有効性を示す。結腸炎の症状を軽減する配列番号：2のEN101の有効性は顕著であり、デキサメタゾンの有効性に匹敵する。
【００３４】
別の実験において、BALB/cマウスを以下のように処理した：
【表３】
2009533421.tif 000004
連日投与は、結腸炎誘導前1日目に開始した。
【００３５】
図2は、結腸炎誘導前1日目に開始し、かつそれに続く7日間の配列番号：2のヌクレアーゼ耐性EN101の経口連日投与が、特に低用量で、すなわち10〜100μg/Kgで、該動物を該疾患の顕在化から保護したことを示す。
ヌクレアーゼ耐性EN101の高用量の効果を次に測定した。マウスを以下のように処理した：
【表４】
2009533421.tif 000005
連日投与は、結腸炎誘導前1日目に開始した。
【００３６】
図3は、結腸炎誘導前1日目に開始し、かつそれに続く7日間投与した場合に、100μg/Kgのヌクレアーゼ耐性EN101が、処理マウスにおける結腸炎症状を中程度に保護したことを示す。しかしながら、EN101の高用量、すなわち200又は500μg/Kgは、効果が低かった。
図4は、上記の処理マウスから得られた結腸切片の顕微鏡写真を示す。図4A〜4Cに示すように、TNBS処理マウスにおける結腸の組織学は、結腸炎特有である：すなわち該組織は破壊され、絨毛構造は損傷し、かつ該細胞は顆粒化している。図4D及び4Eは、TNBS処理マウスにおける結腸構造上のデキサメタゾンの効果を示す。マウスにおけるTNBSによる結腸炎誘導後2日目に、デキサメタゾンを100μgで連日投与した。図4D及び4Eに示すように、デキサメタゾンは、結腸の絨毛構造を修復することができた（図4D及び4E）。図4F及び4Gは、マウスにおけるTNBS誘導結腸炎でのEN101の効果を示す。マウスにおけるTNBSによる結腸炎誘導後2日目に、EN101を50μg/Kgで連日投与した。図4F及び4Gに示すように、結腸の組織学は、無処置の結腸と類似していた：すなわち、よく組織化された絨毛を有していた。これらの結果は、EN101が、IBDの治療にきわめて有効であることを立証する。デキサメタゾンのステロイド性有害作用がないので、EN101がデキサメタゾンよりも有益であることは留意されるべきである。
（実施例２）
（ヒトでの潰瘍性大腸炎におけるEN101の効果）
潰瘍性大腸炎を患っているヒト対象を、体重の10、25、50又は100μg/Kgの用量の配列番号：2に記載のEN101を用いて、8週間、1日1回処理する。別の対象群を、体重の10、25、50又は100μg/Kgの用量の配列番号：2に記載のEN101を用いて、8週間、1日2回の分割用量で処理する。処理の8週後、該対象を測定して、その臨床状態を評価する。
【００３７】
（実施例３）
（エンドトキシン誘導性ブドウ膜炎（EIU）におけるhEN101の効果）
LPSの亜致死用量の全身注射は、ラット及びマウスの感受性種において、両側性急性眼球炎症を誘導する。このエンドトキシン誘導性ブドウ膜炎（EIU）は、ヒトにおける急性前部ブドウ膜炎に関する動物モデルである。一般的に、EIUは、LPS注射後24時間にピークを有し、それに続く96時間以内に鎮静する。EIUは、血清からのタンパク質の浸出によって、並びにマクロファージ及び好中球の眼への浸潤によって特徴づけられる。EIUを有するルイスラットにおいて、急性炎症が主に前房において発症し（虹彩毛様体炎）、及び炎症性細胞も硝子体及び網膜に浸潤する可能性がある。該マウスにおいて、前房における炎症は重篤性が低く、相対的に多数の好中球及びマクロファージが、視神経頭部の網膜性血管のまわりの硝子体に蓄積する（後部硝子体炎）。
0日目に、0.05mlのPBS中の0.2mgのネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）LPSエンドトキシン（Difco Laboratories, Detroit, MI）を後足蹠に単回皮下注射することによって、5〜8匹の雄C57BLマウスの群にEIUを誘導する。hEN101で処理したマウスにおいて、配列番号：2のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、LPSと共に、経口投与するか又は皮下注射する。コントロールマウスは、0.05mlのPBSを後足蹠に注射する。注射後24±0.5時間（1日目）又は72時間±0.5時間（3日目）にマウスを殺す。実験に使用するまで、全てのマウスを、12時間明／12時間暗のサイクルの空調部屋で維持し、水及び餌に自由にアクセスさせる。
【００３８】
（組織病理学）
マウスの右目を摘出し、組織病理学に使用する。眼を、4% グルタルアルデヒドに30分間浸漬し、10% 緩衝液化ホルマリン中で少なくとも24時間固定し、その後、メタクリレートに包埋する。瞳孔視神経軸を横断する4〜6μmの垂直切片を切り出し、ヘマトキシリン及びエオシン（H&E）で染色する。前房及び後部硝子体における浸潤炎症性細胞を計数し、眼球病理学者によるマスクされた様式で組織学的に同定する。
（酵素結合免疫吸着測定法（ELISA））
血清サンプルを回収し、各時間点由来をプールする。IL-1α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α、MIP-1α、及びMIP-2の発現を、市販のキット（R&D Systems, Minneapolis, MN）を使用するELISAにより測定する。先のデータは、これらのサイトカインが、前部ブドウ膜炎の動物モデル、又は急性前部ブドウ膜炎を有する患者のいずれにおいても誘導されるので、該サイトカインを試験する。
【００３９】
（実施例４）
（活性化腹膜マクロファージの生存及びサイトカイン分泌におけるhEN101の効果）
腹膜マクロファージの単離は、Rossiらの文献、及びChinoらの文献（J. Leukoc. Biol. 78: 985-991, 2005；Int. Immunopharmacol. 5: 871-882, 2005）の方法に従って実施した。手短にいうと、C57BL6マウスに、0.5gr/リットルの滅菌チオグリコール酸（TG）媒体（Novamed, Israel）を腹腔内注射した。3日後、腹膜を冷却リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄することにより、腹膜浸出細胞（PEC）を回収した。PECをそれから、10cmプレート内の、10% 胎児性仔ウシ血清、2mM of L-グルタミン、100単位/ml ペニシリン及び100mg/ml ストレプトマイシンを補充したRPMI1640培地（GIBCO）に播いた。37℃、5% CO2での2時間後、細胞をPBSで2回洗浄し、非接着細胞を除去した。腹膜マクロファージ（PM）とみなされる接着細胞を、完全培地中、37℃、5% CO2で72時間培養した。
【００４０】
その後、PMを12ウエルプレート（Corning 106細胞/ウエル）に播き、4時間のインキュベーションの後、LPS (0.1μg/ml)、CpG配列(配列番号：7に記載のTCC ATG ACG TTC CTG ACG TT；1及び10μg/ml)、非CpGコントロール配列 (配列番号：8に記載のTCC ATG AGC TTC CTG AGC TT；1及び10μg/ml)、並びに0.1、1、10及び100μg/mlの濃度の配列番号：2 のヌクレアーゼ耐性EN101 (Avecia Limited；Lot: AMZ-01G-003-M)を細胞に添加した。24、48及び72時間後に上清を回収し、下記のサイトカイン：TNF-α(Elisa kit from R&D, Minneapolis, MN)、IL-6 (Elisa kit from R&D, Minneapolis, MN)、IL-1α(Elisa kit from PeproTech Asia)、及びケモカインMIP-2 (Elisa kit from R&D, Minneapolis, MN)を、製造業者の取扱説明書に従ったELISAで測定した。培養物中のCD11b (MAC-1)細胞の生存率及び数を、72時間後にFACS解析を使用して試験した。高レベルのMAC-1（活性化マクロファージの特徴であるマーカー）を発現し、かつ高い前方散乱（FSC）を有するPMが、活性化マクロファージと定義されていることに留意されたい。
【００４１】
（結果）
FACS解析は、培養72時間後に回収されたPMが、高いFSCを提示することを示した（図4A）。全マクロファージのうち、17.4%が、高レベルのMAC-1を発現した（図4B）。
図5AはPMの総数を示し、図5Bは活性化PM、すなわちMAC1の数を示す（図5B）。図5A-Bに示すことができたように、CpG、非CpGコントロール、及びLPSのそれぞれは、総数及び活性化腹膜マクロファージの数が増加した；CpGが最も高い活性を発揮したが、LPSは最も低い活性を発揮した。驚くべきことに、低濃度のEN101は、これらの細胞の生存／増殖を阻害した。
活性化PMの上清中のIL-6（図6A）、TNF-α（図6B）、MIP-2（図6C）及びIL-1α（図6D）のレベルをELISAで試験した。示されているように、TNF-α、IL-6及びMIP-2のレベルは、CpG及びLPSによって強力に上昇され、CpGコントロール配列によっては低度に上昇した。低濃度（0.1及び1μg/ml）の配列番号：2のEN101は、IL-6、TNF-α及びMIP-2の分泌を誘導しなかったが、100μg/mlのEN101は、MIP-2の中程度の分泌を誘導した。IL-1αは、他のサイトカインと比較して、全ての刺激物質により差動的に制御されていた。
当該結果は、EN101が、免疫細胞に影響を与えることを実証するものである。Toll様受容体（TLR）は、全ての同様の細胞内シグナル伝達経路に関連し、かつMyD88依存的経路の活性化を介して、IL-6、TNF-α及びMIP-2などの前炎症性サイトカインの産生を含む同様の細胞性反応を活性化するので、 EN101が、TLR-MyD88依存的経路を介して該効果を媒介するかという疑問を次に検討した。
【００４２】
（実施例５）
（hEN101の効果はTLR-My88シグナル伝達経路を介して媒介される）
この一連の実験の目的は、EN101活性におけるTLRシグナル伝達経路の役割を試験することであった。該技法は、ヌクレアーゼ耐性EN101で処理した後、野生型マウス (C57BL6)、TLR9ノックアウト(KO)マウス、又はmyd88 KOマウス(C57BL6をバックグラウンドとする)由来の腹膜マクロファージ（PM）からの前炎症性サイトカイン、特にMIP-2の分泌を測定することに基づいた。C57BL6バックグラウンドにおけるMyD88-/-は、Akira Sらの文献によって初めて作成された（Immunity, 9:143-150, 1998）。
腹膜マクロファージの単離は、Rossiらの文献、及びChinoらの文献(J Leukoc. Biol. 78: 985-991, 2005；Int. Immunopharmacol. 5: 871-882, 2005)の方法に従って実施した。手短にいうと、C57BL6又はKOマウスに、0.25gr/l 又は0.5gr/リットルの滅菌チオグリコール酸（TG）媒体（Novamed, Israel）を腹腔内注射した。3日後、腹膜を冷却リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄することにより、腹膜浸出細胞（PEC）を回収した。PECをそれから、10cmプレート内の、10% 胎児性仔ウシ血清、2mM of L-グルタミン、100単位/ml ペニシリン及び100mg/ml ストレプトマイシンを補充したRPMI1640培地（GIBCO）に播いた。37℃、5% CO2での2時間後、細胞をPBSで2回洗浄し、非接着細胞を除去した。腹膜マクロファージ（PM）とみなされる接着細胞を、完全培地中、37℃、5% CO2で72時間培養した。
【００４３】
その後、PMを12ウエルプレート（Corning 106細胞/ウエル）に播き、4時間のインキュベーションの後、LPS (0.1μg/ml)、CpG配列(1及び10μg/ml)、非CpGコントロール配列 (1及び10μg/ml)、並びに0.1、1、10及び100μg/mlの濃度の配列番号：2 のヌクレアーゼ耐性EN101 (Avecia Limited；Lot: AMZ-01G-003-M)を細胞に添加した。24、48及び72時間後に上清を回収し、下記のサイトカイン：TNF-α(Elisa kit from R&D, Minneapolis, MN)、IL-6 (Elisa kit from R&D, Minneapolis, MN)、IL-1α(Elisa kit from PeproTech Asia)、及びケモカインMIP-2 (Elisa kit from R&D, Minneapolis, MN)を、製造業者の取扱説明書に従ったELISAで測定した。培養物中のCD11b (MAC-1)細胞の生存率及び数を、72時間後にFACS解析を使用して試験した。高レベルのMAC-1を発現し、かつ高い前方散乱（FSC）を有するPMが、活性化マクロファージと定義されている。
【００４４】
（結果）
WTマウス（C57BL6）（図7A）、又はMyD88 KOマウス（図7B）におけるMAC-1陽性細胞の総数を示す。MAC-1陽性細胞の数は、LPS又はCpGでの処理後に増加したが、EN101ではほとんど効果がなかった（図7A）。対照的に、Myd88 KOマウスにおいて、LPS、CpG及びEN101処理後のMAC-1陽性細胞の数は、顕著に減少していた。
WTマウス(C57BL6)（図8A-B）又はMyD88 KOマウス（図8C-D）由来のPMの上清中のケモカインMIP-2のレベルをELISAによって試験した。図8Aで示すことができるように、MIP-2のレベルは、CpG及びLPSにより上昇した。対照的に、EN101（1μg/ml）は、MIP-2分泌を阻害した（図8B）。CpG、LPS及びEN101の効果は、MyD88 KOマウスではほぼ全面的に阻害された（図8C-D）。
当該結果は、LPS及びCpGが、マクロファージ活性を誘導し、かつ顕著なMIP-2分泌を誘発することを実証するものである。CpGによって（図8）又はLPSによって（図8）誘導されるMIP-2分泌が、MyD88 KOマウスにおいて阻害されたので、マクロファージの活性化、及びMIP-2の分泌は、MyD88依存性であることが示された。
【００４５】
さらに、MIP-2分泌におけるEN101の効果はMyD88 KOにおいて阻害されており、これは、MIP-2分泌におけるEN101の効果がMyD88-TLR依存的経路により媒介されていることを示唆した。
無処理WT (C57BL6)マウス又はTLR9 KOマウスにおける細胞の全数（図9A-B）若しくはMAC-1陽性細胞（図9C-D）を示す。図9に示すように、全細胞数又はMAC-1陽性細胞は、CpGでの処理後に増加した（図9B、9D）。ヌクレアーゼ耐性EN101は、低用量でのマクロファージ細胞数増加に無効性であり、かつ高用量（100μg/ml）で中程度の効果を有した。対照的に、TLR9 KOマウスにおいて、総数及びMAC-1陽性細胞は顕著に減少した。
WT(C57BL6)マウス又はTLR9 KOマウスのPMの上清中のケモカインMIP-2のレベルを次に測定した。図10に示すように、MIP-2のレベルは、CpGによって（1、5μg/ml）、又はコントロール無処理C57BL6マウスにおける配列番号：2のEN101によって強力に上昇したが、TLR9 KOマウスでは上昇しなかった。
上記に示したインビボ及びインビトロの結果を合わせると、本発明のインビトロの結果が、IBDの治療におけるEN101の作用機序に部分的な洞察を提供することは、強調されるべきである。
本発明は、EN101が、IBDなどの随意筋を神経支配する中枢神経系又は末梢神経系に関連するもの以外の炎症性障害を治療するために使用することができることを、はじめて示すものである。
本発明が、本明細書の先に具体的に示しかつ記載したものによって限定されないことは、当業者によって認識されるであろう。むしろ、本発明の範囲は、下記の（上記の）特許請求の範囲によって規定される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】結腸炎に顕在化におけるEN101の経口投与の効果を示す。結腸炎誘導マウスを、毎日、結腸炎誘導後1日目又は2日目に開始し、それに続く7日間、様々な用量のEN101で処理した。該疾患スコアを評価した。
【図２】結腸炎誘導マウスにおけるEN101の濃度の増加の効果を示す。EN101を、毎日、結腸炎誘導マウスに、結腸炎誘導前1日目及びそれに続く7日間投与した。該疾患スコアを評価した。
【図３】結腸炎誘導マウスにおける高用量のEN101の効果を示す。100、200又は500 mg/KgのEN101を、毎日、結腸炎誘導マウスに、結腸炎誘導前1日目及びそれに続く7日間投与した。該疾患スコアを評価した。
【図４】図4A〜Gは、結腸炎誘導マウス由来の結腸切片の顕微鏡写真を示す。図4A〜Cは、非処理結腸炎誘導マウス由来の結腸切片の顕微鏡像を示す。図4D及び4Eは、デキサメタゾン処理した結腸炎誘導マウス由来の結腸切片の顕微鏡像を示す。図4F及び4Gは、EN101処理した結腸炎誘導マウス由来の結腸切片の顕微鏡像を示す。
【図５】図5A-Bは、腹膜マクロファージのFACS解析を示す。腹膜マクロファージの総数は前方散乱の表現法で示し（FCS；図5A）、活性化マクロファージの数は、MAC-1の発現により検出した（図5B）。
【００４７】
【図６】図6A-Bは、LPS、CpG、CpGのコントロール配列、及びEN101のいずれかで72時間処理した後の、腹膜マクロファージの総数（図6A）又は活性化マクロファージの数（図6B）を示す。
【図７】図7A〜Dは、腹膜マクロファージからのIL-6 (図7A)、TNF-α(図7B)、MIP-2 (図7C)、及びIL-1α(図7D)の分泌における、LPS、CpG、CpGのコントロール配列、及びEN101の効果を示す。
【図８】図8A-Bは、LPS、CpG、及びEN101での処理後の、野生型マウス(C57BL6)（図8A）又はMyD88 KOマウス（図8B）由来のMAC-1腹膜マクロファージの数を示す。培地のみでインキュベートしたコントロール群（CNRL）も示す。
【図９】図9A〜Dは、LPS、CpG、及びEN101での処理後の、野生型マウス(C57BL6)（図9A、B）又はMyD88 KOマウス（図9C、D）由来の腹膜マクロファージの上清中のMIP-2レベルを示す。培地のみでインキュベートしたコントロール群（CNRL）も示す。
【図１０】図10A〜Dは、CpG (1又は5μg/ml)又はEN101 (0.1、1又は100μg/ml)での処理の72時間後の、腹膜マクロファージ（図10A-B）の総数、若しくは活性化マクロファージ（図10C-D）の数を示す。
【図１１】図11A-Bは、EN101又はCpGでの処理の24若しくは72時間後の、WT C57BL6マウス（図11A）又はTLR9 KOマウス（図11B）由来の腹膜マクロファージの上清中のケモカインMIP-2のレベルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年3月9日(2009.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年6月30日(2009.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性剤としてAChE mRNAに標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド及び医薬として許容し得る担体を含む、炎症性障害を治療するための医薬組成物であって、該炎症性障害が、随意筋を神経支配する中枢神経系又は末梢神経系の炎症性障害以外のものである、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記炎症性障害が、炎症性胃腸障害である、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記炎症性胃腸障害が、急性炎症性胃腸障害及び慢性炎症性胃腸障害から選択される、請求項2記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記慢性炎症性胃腸障害が炎症性腸疾患である、請求項3記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記炎症性腸疾患が、クローン病、結腸クローン病、クローン腸炎、及び潰瘍性大腸炎からなる群から選択される、請求項4記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記炎症性腸疾患がクローン病である、請求項4記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記炎症性胃腸障害が、後天性免疫不全症候群、慢性肉芽腫性疾患、低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、白血球接着欠損症、周期性好中球減少症、Ib型糖原病、及びセリアック病からなる群から選択される障害に起因する、請求項2記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号1、3〜5からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドである、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが、ヌクレアーゼ耐性である、請求項8記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの3'末端の最後のヌクレオチドの少なくとも1つが、2-O-メチル化されている、請求項9記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの3'末端の最後の3つのヌクレオチドが、2-O-メチル化されている、請求項9記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが、配列番号：2に記載のヌクレオチド配列を有する、請求項11記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが、2つのヌクレオチド塩基を連結する少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含む、請求項9記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが、該3'末端の2つの最後のヌクレオチド塩基を連結するホスホロチオエート結合を有する、請求項13記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記医薬組成物が、経口、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、経皮、筋肉内、鼻腔内、又は吸入の投与経路用に製剤されている、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記医薬組成物が、経口投与経路用に製剤されている、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記医薬組成物が、連日投与用に製剤されている、請求項16記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが、0.1mg〜20mgの日用量で製剤されている、請求項17記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2009533421.tif 000028
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