(57)【要約】  本発明は、フィチン酸塩の６つのリン酸塩結合を加水分解するデバリオミセス カステリ（Debaryomyces castellii） フィターゼをコードする遺伝子に関する。本発明はまた、消化能および栄養価を向上させるための動物用の栄養添加物または食物中における前記フィターゼの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のポリペプチドから選択されたポリペプチドを含むことを特徴とするポリペプチド：
- 配列番号２のポリペプチド、
- フィターゼ活性を有する配列番号２のポリペプチドの断片、
- フィターゼ活性を有し、かつ配列番号２のポリペプチドと少なくとも90%の同一性を示すポリペプチド。
【請求項２】
フィターゼ活性をコードするポリヌクレオチドであって、以下のポリヌクレオチドから選択されることを特徴とするポリペプチド：
- その配列が配列番号１の位置1538および位置2923の間にあるポリヌクレオチド、
- 請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１の配列または配列番号１に相補的な配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項４】
転写の方向において、以下のものを含むことを特徴とする発現カセット：
- 宿主生物において機能的であるプロモーター;
- 請求項２によるポリヌクレオチド; および
- 同じ宿主生物のターミネーター配列。
【請求項５】
請求項２および３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項４による発現カセットを含むベクター。
【請求項６】
請求項２および３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項４に記載の発現カセットおよび／または請求項５に記載のベクターで形質転換された宿主生物。
【請求項７】
前記宿主生物が、酵母および糸状菌から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の宿主生物。
【請求項８】
前記宿主生物が、デバリオミセス カステリ（Debaryomyces castellii）、ピキア パストリス（Pichia pastoris）、ペニシリウム フニクロサム（Penicillium funiculosum）および分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）から選択されることを特徴とする請求項７に記載の宿主生物。
【請求項９】
請求項１に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする、動物のための栄養添加物。
【請求項１０】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の宿主生物および／または請求項６〜８のいずれか１項に記載の宿主生物の発酵生成物を含むことを特徴とする、動物のための栄養添加物。
【請求項１１】
前記栄養添加物が、液体形状または粉末形状にあることを特徴とする、請求項９または１０のいずれか１項に記載の動物のための栄養添加物。
【請求項１２】
動物のための栄養ベースおよび請求項９〜１１のいずれか１項に記載の動物のための栄養添加物を含むことを特徴とする動物飼料。
【請求項１３】
請求項１に記載のポリペプチド、請求項６〜８のいずれか１項に記載の宿主生物および／または請求項６〜８のいずれか１項に記載の宿主生物の発酵生成物を含むことを特徴とする動物飼料。
【請求項１４】
動物のための栄養添加物または動物飼料の製造のための、請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項６〜８のいずれか１項に記載の宿主生物の使用。
【請求項１５】
ミオイノシトール ヘキサキスホスファートを、無機一リン酸塩、より低度のリン酸化を含むミオイノシトール、および遊離ミオイノシトールに加水分解するための、請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項６〜８のいずれか１項に記載の宿主生物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、デバリオミセス カステリ（Debaryomyces castellii） フィターゼ、このフィターゼをコードする遺伝子、このフィターゼを発現する組み換え宿主生物、および特に動物栄養の分野におけるこれらの適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
フィチン酸の塩類(ミオイノシトール ヘキサキスホスファート)またはフィチン酸塩(ミオイノシトール ヘキサキス(二水素リン酸塩))は、穀類、マメ科植物および油性植物においてリンの主な貯蔵形態である。したがって、これらは、植物に基づいた動物飼料におけるリンの主な供給源、単胃動物(家禽およびブタ)の飼料の主要成分を構成する。しかしながら、飼料中のこのリンの生物学的利用能は、これらの動物では制限されている。これらは、彼らがフィチン酸塩の加水分解を可能にし、彼らが必要とする無機リン酸塩の量を与えるために十分な量のフィチン酸塩を分解する腸内酵素を有しないからである。動物栄養の文脈において、フィチン酸の２つの特徴は、重要な役割を演じる：(1) 単胃動物は、消化器系においてフィチン酸をあまり分解することができない; (2) フィチン酸は抗栄養因子であり、タンパク質およびイオン(Fe3+, Ca2+, Zn2+, Mg2+)と複合体を形成し、したがって、これらの要素の利用能を減少させてしまう。
【０００３】
したがって、家禽およびブタの飼料摂取は、無機リン酸塩で補わなければならないが、一方、フィチン酸塩からのリンは排出され、単胃の動物の集約的な育成の範囲における表層水の富栄養化の一因となる。
【０００４】
酵素をもつ単胃動物の飼料摂取の補充は、フィチン酸塩に結合されたリンの生物学的利用能を向上させ、無機リンを含む飼料の補充を減少させ、かつ集約的な育成の範囲におけるリンの排出を減少させるために現在使用されている溶液である。
【０００５】
フィターゼ(ミオイノシトール ヘキサキスホスファート 3- および6- ホスホヒドロラーゼ EC 3.1.3.8および3.1.3.26)は、ヒスチジン酸ホスファターゼのファミリーの一部である。これらは、ミオイノシトール ヘキサキスホスファート(フィチン酸、InsP6)を、無機一リン酸塩およびより低度のリン酸化(InsP5 - InsP1)のミオイノシトール リン酸塩および一定の場合における遊離のミオイノシトールに加水分解する触媒作用を示す。
【０００６】
動物飼料中における添加物として使用されるこれらの酵素は、第１に、フィチンのリンの利用能を増加させ、第２に、飼料の消化率を向上させる。さらに、フィチンのリン酸塩の遊離は、リン酸塩の補充によるコストをかなり減少させ、また、排出されたリン酸塩の過多によって引き起こされる汚染を減少させる。
【０００７】
フィターゼは、多種多様な生物：植物、動物および特に微生物によってもたらされる。フィターゼを生成する微生物の中で、以下のものがとりわけ言及されるであろう：アスペルギルス属（Aspergillus）、ペニシリウム属（Penicillium）、ケカビ属（Mucor）およびクモノスカビ属（Rhizopus）の菌類、  細菌：シュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.）、クレブシエラ エスピー（Klebsiella sp.）、大腸菌（Escherichia coli）、エンテロバクター エスピー（Enterobacter sp.）、枯草菌（Bacillus subtilis）、および酵母：サッカロミセス セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ トロピカリス（Candida tropicalis）、トルロプシス カンジダ（Torulopsis candida）、デバリオミセス カステリ（Debaryomyces castellii）、デバリオミセス オシデンタリス（Debaryomyces occidentalis）、クルイベロミセス フラギリス（Kluyveromyces fragilis）およびスクワニオミセス カステリ（Schwanniomyces castellii）。
【０００８】
酵母については、Lambrechtsらが(Biotechnology Letters, Vol. 14. No. 1, 61-66, 1992)、フィターゼ活性のある様々な株を同定したが、対応するフィターゼを特徴づけなかった。最も高い活性が、スクワニオミセス カステリ（Schwanniomyces castellii）株CBS2863について測定された。フィターゼ活性がまた、カンジダ ブルンプチ（Candida brumptii）CBS6145、カンジダ トロピカリス（C. tropicalis）CBS5696、デバリオミセス カステリ（Debaryomyces castellii）CBS 2923、クルイベロミセス フラギリス（Kluyveromyces fragilis）No. 111、クルイベロミセス フラギリス（K. fragilis）CBS1555、クルイベロミセス フラギリス（K. fragilis）CBS5795、サッカロミセス セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）CBS1253、スクワニオミセス カステリ（Schwanniomyces castellii）CBS2863、トルロプシス カンジダ（Torulopsis candida）CBS940、C.メリビオシカ（C.melibiosica） CBS584、K.lactis CBS2359、T.ボビナ（T.bovina）CBS 2760、およびジゴサッカロミセス フェルメンタチ（Zygosaccharomyces fermentati）CBS6772 について観察された。
【０００９】
同様に、Nakamura Yoshihiro (Biosci. Biotechnol. Biochem., Vol. 64, No. 4, 841-844, 2000)らが、様々なフィターゼを同定したが、これらを特徴づけなかった。
【００１０】
さらに、注目すべき点は、酵母の分類が調査されたことである。新しい分類 (Nakase T., Suzuki M., Phaff H.J. and Kurtzman C.P., 1998 p157-167 in C.P. Kurtzman and J.W. Fell (ed), The Yeasts, A taxonomic study, 4th Edition, Elsevier Sci. Publication Amsterdam) によれば、CBS 2923株は、デバリオミセス カステリ カプリオティ（Debaryomyces castellii Capriotti）に対応し、CBS 2863株は、デバリオミセス オシデンタリス クロッケル バル. オシデンタリス（Debaryomyces occidentalis Klocker var. occidentalis）、異名スクワンニオミセス カステリ カプリオティ（Schwanniomyces castellii Capriotti）およびスクワンニオミセス オシデンタリス クロッケル（Schwanniomyces occidentalis Klocker）に対応する。発明者らは、配列番号２のポリペプチドのアライメント、すなわち、デバリオミセス カステリ CBS 2923 フィターゼの配列が、スクワニオミセス オシデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）CBS 2863 フィターゼの配列と69.2%の同一性を与えることを示した。
【００１１】
多数の微生物フィターゼが既に研究され、様々な農工用の用途において使用されてきた。しかしながら、動物飼料のような多数の生物工学的用途における添加物としてのフィターゼの増加する使用は、以下の利点を増加させている：(1) 単離する新規な効率的なフィターゼを生成する微生物の利点、 (2) 効率的なフィターゼを得る利点、すなわち消化管において飼料からリン酸塩を遊離させるのに効率的であるフィターゼを得る利点（これらのフィターゼは、飼料製造工程および貯蔵の間に熱安定を示し、そのために生産コストが低い)。
【００１２】
さらに、これまでに記載されたフィターゼの大半は、単に部分的にフィチン酸を分解し、これらのいくつかは、非常に遅い速度論を示す。さらに、これらの加水分解の活性は、これらが使用される条件に大きく依存している。
【００１３】
現在まで、酵母の中で、酵母スクワンニオミセス オシデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）のフィターゼのみが、フィチン酸塩のすべてのリン酸基を加水分解するものとして記載されている(EP0699762 およびSegueilha L., Lambrechts C., Boze H., Moulin G., Galzy P., (1992) Purification and properties of a phytase from Schwanniomyces castellii, J. Ferm. Bioeng., 74, 7-11)。しかしながら、スクワンニオミセス オシデンタリス フィターゼは、カチオン(特に、ZnCl2およびCuCl2)に感受性であり、動物飼料中において使用することは好ましくない。これらのカチオンは、食物塊中に存在するからである(Segueilha et al., 1992)。さらに、この酵素は、2.7〜5のpHの範囲内において活性であり(EP0699762)、pCMBは、スクワンニオミセス オシデンタリス フィターゼの活性を大きく阻害し、このことは、SH基(ジスルフィド架橋)が酵素の活性部位に関係することを示唆している(Segueilha et al. 1992)。さらに、このフィターゼの生合成は、フィチン酸塩およびカルシウム塩の存在を必要とする(EP0699762)。したがって、酵素の活性は、酵素が存在する環境に大いに依存する。本発明が解決しようとする問題は、フィチン酸塩のすべてのリン酸基を加水分解し、かつその活性が酵素が使用される条件に依存されにくいフィターゼを提供することにある。
【００１４】
この問題は、配列番号２のフィターゼによって解決される。有利には、このフィターゼは、ミオイノシトールを遊離するまで、フィチン酸塩のすべてのリン酸基を加水分解することができる。また、広いスペクトルの活性を有し、したがって、多数の基質を加水分解する。有利には、このフィターゼの生合成は、カルシウム塩のない状態においてさえ、フィチン酸塩によって誘導される。有利には、このフィターゼは、広いpHの範囲(pH 3〜6.5)において活性を有し、かつカチオンまたはpCMBに対して感受性ではない。また、酵素は、66℃まで熱に安定である。したがって、発明の酵素は非常に強く、動物飼料における使用に好ましいだけでなく、他の産業用途においての使用にも適している。
【００１５】
本発明はまた、類似のまたは相同なフィターゼに関し、同じ特性を保存する配列番号２のフィターゼの変異体および断片に関する。
【配列の説明】
【００１６】
配列番号１：デバリオミセス カステリ（Debaryomyces castellii） CBS 2923 フィターゼ遺伝子のゲノム配列。
【００１７】
配列番号２：デバリオミセス カステリ CBS 2923 フィターゼの配列。
【００１８】
配列番号３：酸性ホスファターゼのコンセンサス配列。
【００１９】
配列番号４：配列番号３の酸性ホスファターゼのコンセンサス配列に対応するデバリオミセス カステリ フィターゼのモチーフ。
【００２０】
配列番号５〜１６：クローニング プライマー。
【００２１】
配列番号１７〜１８：遺伝子をクローニングするために使用されたデバリオミセス カステリ フィターゼペプチド。
【発明の説明】
【００２２】
本発明の対象は、以下のポリペプチドから選択されたポリペプチドを含むポリペプチドである：
- 配列番号２のポリペプチド、
- フィターゼ活性のある配列番号２のポリペプチドの断片、
- フィターゼ活性があり、かつ配列番号２のポリペプチドと少なくとも90%の同一性を示すポリペプチド。
【００２３】
また、本発明の対象は、以下のポリヌクレオチドから選択された、フィターゼ活性をコードするポリヌクレオチドである：
- その配列が配列番号１の位置1538と位置2923の間にあるポリヌクレオチド、
- 請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２４】
本発明はまた、配列番号１の配列または配列番号１に相補的な配列を有するポリヌクレオチドに関する。
【００２５】
本発明はまた、転写の方向において、以下のものを含む発現カセットに関する：
- 宿主生物において機能的であるプロモーター;
- 本発明によるポリヌクレオチド; および
- 同じ宿主生物のターミネーター配列。
【００２６】
本発明はまた、本発明によるポリヌクレオチドおよび／または本発明による発現カセットを含むベクターに関する。
【００２７】
本発明の他の対象は、本発明によるポリヌクレオチド、本発明による発現カセットおよび／または本発明によるベクターで形質転換された宿主生物である。
【００２８】
好ましくは、宿主生物は、酵母および糸状菌から選択される。
【００２９】
好ましくは、宿主生物は、デバリオミセス カステリ（Debaryomyces castellii）、ピキア パストリス（Pichia pastoris）、ペニシリウム フニクロサム（Penicillium funiculosum）および分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）から選択される。
【００３０】
本発明の対象は、本発明によるポリペプチドを含む、動物のための栄養添加物である。
【００３１】
発明の対象はまた、本発明による宿主生物および／または本発明による宿主生物の発酵産物を含む、動物のための栄養添加物である。
【００３２】
本発明の一実施態様において、動物のための栄養添加物は、液体形状または粉末形状にある。
【００３３】
本発明は、動物のための栄養ベース、および本発明による動物のための栄養添加物を含む動物飼料に関する。
【００３４】
本発明はまた、本発明によるポリペプチド、本発明による宿主生物および／または本発明による宿主生物の発酵産物を含む動物飼料に関する。
【００３５】
本発明はまた、動物のための栄養添加物または動物飼料の製造のための、本発明によるポリペプチドまたは本発明による宿主生物の使用に関する。
【００３６】
本発明の他の対象は、ミオイノシトール ヘキサキスホスファートを、無機一リン酸塩、より低度のリン酸化を含むミオイノシトール、および遊離ミオイノシトールに加水分解するための、本発明によるポリペプチド、または本発明による宿主生物の使用である。
【００３７】
ポリペプチド
したがって、本発明は、フィターゼ活性のあるポリペプチドに関する。好ましくは、これらのポリペプチドは、デバリオミセス カステリ（Debaryomyces castellii）から単離される。
【００３８】
デバリオミセス カステリ CBS 2923 フィターゼは、配列番号２において表わされる。
【００３９】
用語「フィターゼ」は、ミオイノシトール ヘキサキスホスファート 3- および6- ホスホヒドロラーゼ (EC 3.1.3.8および3.1.3.26)を意味する。これらの酵素は、ミオイノシトール ヘキサキスホスファート(フィチン酸、InsP6)を、無機一リン酸塩およびより低度のリン酸化(InsP5 - InsP1)のミオイノシトール リン酸塩および一定のフィターゼについては遊離のミオイノシトールに加水分解する触媒作用を示す。
【００４０】
配列番号２のデバリオミセス カステリ フィターゼは、3-フィターゼである。さらに、これは、フィチン酸のすべてのリン酸結合を加水分解する顕著な能力を有している。
【００４１】
配列番号２のフィターゼは、多くの酸性ホスファターゼの活性部位中にあるコンセンサス配列RHGXRXP(配列番号３)に対応するRHGERYPモチーフ(配列番号４)を含む。このモチーフは、配列番号２のアミノ酸72-78に見出される。配列番号２のフィターゼにはまた、多くのフィターゼ中にあるHDモチーフがある。このモチーフは、配列番号２のアミノ酸335-336のC-末端部位中に見出される。
【００４２】
発明の好ましい実施態様において、本発明によるポリペプチドには、モチーフRHGERYPまたはコンセンサス配列RHGXRXPに対応する他のモチーフがある。好ましくは、発明によるポリペプチドにはまた、HDモチーフがある。
【００４３】
好ましい実施態様において、本発明によるポリペプチドは、グリコシル化される。配列番号２のポリペプチドは、特に、アミノ酸Asn 97、Asn 158、Asn189、Asn 249、Asn 303、Asn 314、Asn 387、Asn 439およびAsn 453の推定上のN-糖鎖付加部位を有し； また、アミノ酸Thr 165、Ser 168、Thr 360およびSer 364の推定上のO-糖鎖付加部位を有する。好ましい実施態様において、配列番号２のポリペプチドは、これらの推定上のN-グリコシル化およびO-糖鎖付加部位の一以上でグリコシル化されている。一実施態様において、本発明によるポリペプチドはグリコシル化される。
【００４４】
配列番号２のフィターゼはまた、4つのジスルフィド架橋を形成することができる8つのシステインをもつ：Cys 62、Cys214、Cys 262、Cys 275、Cys 385、Cys 405、Cys 413およびCys 435。 一実施態様において、本発明によるポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド架橋をもつ。
【００４５】
デバリオミセス カステリ フィターゼは、この酵母によってその細胞外環境に分泌された酵素である。
【００４６】
組み換え宿主生物による発現および分泌については、配列番号２のフィターゼは、そのN-端子端部で、この宿主生物によって認識されるシグナル ペプチドと融合することができる。
【００４７】
本発明はまた、フィターゼ活性を保存する配列番号２のポリペプチドの断片に関する。
【００４８】
ポリペプチドの用語「断片」とは、それが由来するポリペプチドのすべてではない部分を含むポリペプチドを意味する。本発明は、配列番号２のポリペプチドの少なくとも100、200の、300または400アミノ酸の断片を含むポリペプチドに関する。
【００４９】
配列番号２のポリペプチドのこの断片は、そのフィターゼ活性を保持する。したがって、本発明は、配列番号２のポリペプチドの生物学的活性のある断片に関する。
【００５０】
用語「生物学的活性のある断片」とは、それが由来するポリペプチドの機能を保存するポリペプチドの断片を意味する。配列番号２のポリペプチドの生物学的活性のある断片は、配列番号２のデバリオミセス カステリ フィターゼの触媒特性を保存する。ポリペプチドの断片を調製する方法、およびまたフィターゼ活性を測定するための技術は、当業者に周知である。
【００５１】
本発明の対象は、フィターゼ活性を有し、配列番号２のポリペプチドと少なくとも90%の同一性を示すポリペプチドである。また、本発明の対象は、配列番号２のポリペプチドと少なくとも80%、90%、95%、98%および好ましくは少なくとも99%のアミノ酸の同一性を示すポリペプチドである。
【００５２】
好ましくは、これらのポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドと、同じ特性、特に、同じ触媒特性を有する。好ましくは、これらのポリペプチドは、デバリオミセス カステリの他の株または他の酵母から単離される。代わりに、これらのポリペプチドは、例えば、特定部位の突然変異誘発技術によって得ることができる。
【００５３】
用語「同一のアミノ酸」は、２つの配列間で変わらないアミノ酸を意味する。これらのポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドと比較して、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加または置換を示すことができる。
【００５４】
発明の対象はまた、配列番号２のポリペプチドと少なくとも80%、90%、95%、98%、および好ましくは少なくとも99%の類似性を示すポリペプチドである。好ましくは、これらのポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドと、同じ特性、特に、同じ触媒特性を有する。好ましくは、これらのポリペプチドは、デバリオミセス カステリの他の株または他の酵母から単離される。代わりに、これらのポリペプチドは、例えば、特定部位の突然変異誘発技術によって得ることができる。
【００５５】
用語「類似性」は、タンパク質または核酸配列間の類似の程度を意味する。これらのポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドと比較して、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加または置換を示すことができる。スコアによって定量化された、２つの配列間の類似の程度は、配列の同一性および／または保存的置換のパーセンテージに基づいている。
【００５６】
同一性の程度、およびポリペプチド間の類似性の程度を測定および同定するための方法は、当業者に知られている。例えば、ベクターNTi 9.1.0、AlignXアライメントプログラム(Clustal Wアルゴリズム)(Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com)を使用して作成されてもよい。デフォルト パラメーターが好ましくは使用される。
【００５７】
本発明によるポリペプチドは、これらの自然環境から単離されるかまたは精製される。ポリペプチドは、様々なプロセスによって調製することができる。これらの手順は、特に、天然の供給源、例えば、これらのポリペプチドを自然に発現する細胞からの精製、適切な宿主細胞による組み換えポリペプチドの産生およびその後の精製、化学合成による産生、または最後に、これらの様々な手法の組み合わせである。これらの様々な生産工程は、当業者に周知である。したがって、本発明のフィターゼは、デバリオミセス カステリから単離することができる。他の実施態様において、本発明のフィターゼは、本発明によるフィターゼを発現する組み換え宿主生物から単離される。
【００５８】
本発明の対象はまた、本発明によるポリペプチドを含む融合タンパク質、組換えタンパク質またはキメラタンパク質である。用語「ポリペプチド」はまた、タンパク質および修飾されたポリペプチドを意味する。
【００５９】
本発明によるポリペプチドには、フィターゼ活性がある。好ましくは、ポリペプチドは、3-フィターゼ活性を示し、フィチン酸のすべてのリン酸結合を加水分解する能力を有する。
【００６０】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明によるフィターゼをコードするポリヌクレオチドに関する。好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、配列番号２のデバリオミセス カステリ フィターゼをコードする。
【００６１】
本発明によれば、用語「ポリヌクレオチド」は、単鎖のヌクレオチド鎖またはこれに相補的な鎖を意味し、またはDNAまたはRNA型になりえる二本鎖ヌクレオチドを意味する。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、DNA型、特に二本鎖DNA型である。用語「ポリヌクレオチド」はまた、修飾されたポリヌクレオチドを意味する。
【００６２】
本発明のポリヌクレオチドは、これらの自然環境から単離されるかまたは精製される。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、Sambrookら(分子クローニング：実験手引き書、1989年)によって記載されるような従来の分子生物学技術または化学合成によって調製することができる。
【００６３】
第１の実施態様において、本発明は、その配列が配列番号１の位置1538と位置2923の間にあるポリヌクレオチドに関する。このポリヌクレオチドは、配列番号２のデバリオミセス カステリ フィターゼをコードする。
【００６４】
本発明はまた、その配列が配列番号１の位置1538と位置2923の間にあるポリヌクレオチドと、少なくとも80%、85%、90%、95%、98%および好ましくは少なくとも99%の同一性を示すポリヌクレオチドに関する。これらのポリヌクレオチドは、フィターゼ活性をコードする。好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、デバリオミセス カステリ フィターゼをコードする。
【００６５】
用語「同一のヌクレオチド」とは、２つの配列の間で変わらないヌクレオチドを意味する。これらのポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドと比較して、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、付加または置換を示すことができる。
【００６６】
本発明はまた、その配列が配列番号１の位置1538と位置2923の間にあるポリヌクレオチドと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、および好ましくは少なくとも99%の類似性を示すポリヌクレオチドに関する。これらのポリヌクレオチドは、フィターゼ活性をコードする。好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、デバリオミセス カステリ フィターゼをコードする。
【００６７】
用語「類似性」は、タンパク質または核酸配列間の類似の程度を意味する。これらのポリペプチドは、参照ポリヌクレオチドと比較して、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、付加または置換を示すことができる。スコアによって定量化された、２つの配列間の類似の程度は、配列の同一性および／または保存的置換のパーセンテージに基づいている。
【００６８】
同一性の程度、およびポリペプチド間の類似性の程度を測定および同定するための方法は、当業者に知られている。例えば、ベクターNTi 9.1.0、AlignXアライメントプログラム(Clustal Wアルゴリズム)(Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com
)を使用して作成されてもよい。デフォルト パラメーターが好ましくは使用される。
【００６９】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、同一性の程度または参照配列の機能を保存する参照ポリヌクレオチドとの類似性の程度を示す。この場合において、ポリヌクレオチドは、フィターゼ活性をコードする。
【００７０】
本発明はまた、その配列が配列番号１の位置1538と位置2923の間にあるポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドに関する。好ましくは、選択的なハイブリダイゼーションは、中程度のストリンジェンシーな条件、および好ましくは高度のストリンジェンシーな条件下で行われる。
【００７１】
発現「選択的にハイブリダイズできる配列」とは、本発明によれば、バックグラウンドノイズよりも著しく大きなレベルで参照配列とハイブリダイズする配列を意味する。選択的にハイブリダイズできる配列と参照配列の間の相互作用によって生成されたシグナルのレベルは、一般的には、バックグラウンドノイズを生成する他のDNA配列の相互作用のレベルの10倍、好ましくは100倍、またはそれ以上のレベルである。選択的なハイブリダイゼーションを可能にするストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知である。一般に、ハイブリダイゼーションおよび洗浄温度は、所与のpHおよび所与のイオン強度で、参照配列のTm値よりも少なくとも5℃以上低い。典型的には、ハイブリダイゼーション温度は、15〜50ヌクレオチドのポリヌクレオチドについては少なくとも30℃であり、50を超えるヌクレオチドのポリヌクレオチドについては少なくとも60℃である。例として、ハイブリダイゼーションは、以下のバッファーにおいて行われる：6× SSC、50mMトリス-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、0.02% PVP、0.02% フィコール、0.02% BSA、500μg/ml 変性サケ精子DNA。洗浄は、例えば、2× SSCバッファー(0.1%SDS)において低度のストリンジェンシーで、0.5× SSCバッファー(0.1%SDS)において中低度のストリンジェンシーで、そして、0.1× SSCバッファー(0.1%SDS)において高度のストリンジェンシーで連続的に行われる。ハイブリダイゼーションは、当然ながら、当業者に周知の他の通常の方法によって行うこともできる(特に、Sambrookら、分子クローニング：実験手引き書、1989年を参照)。
【００７２】
好ましくは、参照ポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、参照配列の機能を保存している。この場合において、その配列が配列番号１の位置1538と位置2923の間にあるポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、フィターゼ活性をコードする。好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、デバリオミセス カステリ フィターゼをコードする。
【００７３】
本発明は、一般的には、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。遺伝子コードの縮重のために、様々なポリヌクレオチドは、同じポリペプチドをコードすることができる。
【００７４】
本発明の他の対象は、その配列が配列番号１において表わされるポリヌクレオチドである。配列番号１のポリヌクレオチドは、デバリオミセス カステリ フィターゼ遺伝子のオープン リーディング フレーム(ORF)に隣接する配列を含む。これらは、特に、この遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列である。この遺伝子は、特に、デバリオミセス カステリまたは他の酵母の過剰発現のための、その相同的調節配列を使用して発現させることができる。
【００７５】
他の実施態様において、この遺伝子は、例えば、細菌、酵母および菌類のような様々な宿主生物中において発現させることができる。配列番号２のフィターゼをコードする遺伝子は、本発明の配列番号１のプロモーターの制御下または異種プロモーターの制御下で宿主生物中において発現させることができる。
【００７６】
発現カセット
本発明の一実施態様によれば、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当業者に周知のクローニング技術を使用して発現カセットに挿入される。この発現カセットは、本発明によるポリペプチドをコードする配列の転写および翻訳に必要な要素を含む。
【００７７】
有利には、この発現カセットは、宿主細胞にポリペプチドを産生させるための要素と、発現の制御に必要な要素の両方を含む。
【００７８】
これらの発現カセットは、転写の方向において、以下のものを含む：
- 宿主生物において機能的であるプロモーター; 
- 本発明によるポリヌクレオチド; および
- 同じ宿主生物におけるターミネーター配列。
【００７９】
任意のタイプのプロモーター配列は、本発明による発現カセットにおいて使用することができる。プロモーターの選択は、特に、対象の遺伝子の発現のために選択された宿主生物に特に依存するだろう。あるプロモーターは恒常的発現を可能にし、一方、他のプロモーターは、反対に誘発的である。菌類において機能的であるプロモーターの中では、特に、アスペルギルス ニズランス（Aspergillus nidulans）グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素のプロモーターで作製されている(Roberts et al., Current Genet.15:177-180, 1989)。細菌において機能的であるプロモーターの中では、特に、T7 バクテリオファージRNAポリメラーゼのプロモーターで作製されている(Studier et al., Methods in enzymology 185:60-89, 1990)。酵母において機能的であるプロモーターの中では、特に、Gal1遺伝子のプロモーター (Elledge et al., Proc Natl Acad Sciences, USA. 88:1731-1735, 1991)またはGAL4およびADHのプロモーターで作製されている。これらのプロモーターの全ては文献中に記載され、当業者に周知である。
【００８０】
ペニシリウム フニクロスム（Penicillium funiculosum）における発現については、H4.Bヒストン プロモーター、アスパルチル酸プロテアーゼ プロモーターまたはcsl13プロモーター(WO00/68401)を含む発現カセットが、例えば選択されるであろう。
【００８１】
酵母ピキア パストリス（Pichia pastoris）における発現について、メタノール誘導性AOX1プロモーター(Tschopp, J.F., Sverlow, G., Kosson, R., Craig, W. and Grinna, L. (1987) High-level secretion of glycosylated invertase in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris. Biotechnology 5, 1305-1308)または強力な恒常的なGAPプロモーター（Waterham, H.R., Digan, M.E., Koutz, P.J., Lair, S.V. and Cregg, J.M. (1997) Isolation of the Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and regulation and use of its promoter. Gene 186, 37-44）を含む発現カセットが、例えば、選択されるであろう。 
スキゾサクロミセス ポンブ（Schizosacchromyces pombe）における発現については、チアミンによって抑制され、チアミンのない状態において活性化されたNmt1制御プロモーターを含む発現カセット（Maundrell, K., (1989) Nmt1 of fission yeast. A highly transcribed gene completely repressed by thiamine. J. Biol. Chem. 265, 10857-10864）が、例えば選択されるであろう。
【００８２】
本発明による発現カセットはまた、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドの発現のために必要とされる任意の他の配列、例えば、制御エレメントまたは宿主生物によって産生されたポリペプチドの分泌のためのシグナル配列を含むことができる。発現カセットに挿入されたコード配列の発現のレベルを増加させることを可能にする任意の制御配列を、特に使用することができる。本発明によれば、特に、プロモーター制御配列と組み合わせて、プロモーターと転写アクチベータ(エンハンサー)のようなコード配列との間に位置する他の制御配列を使用することが可能になる。
【００８３】
さらに、本発明による発現カセットは、シグナル配列のような宿主生物によって産生されたポリペプチドの分泌のために必要とされる任意の他の配列を含むことができる。ピキア パストリス(Pichia pastoris)による分泌のために、α-因子配列を、例えば、分泌シグナルとして使用することができる。
【００８４】
多種多様のターミネーター配列は、本発明による発現カセットにおいて使用することができる; これらの配列は、転写終結およびmRNA ポリアデニル化を可能にする。選択された宿主生物において機能的である任意のターミネーター配列を使用することができる。
【００８５】
ペニシリウム フニクロスム（Penicillium funiculosum）における発現については、H4.Bヒストン ターミネーター、アスパルチル酸性プロテアーゼターミネーターまたはcsl13ターミネーター(WO00/68401)を含む発現カセットが、例えば、選択されるであろう。
【００８６】
本発明の対象はまた、本発明による発現カセットを含むポリヌクレオチドである; 有利には、本発明による発現カセットは、ベクター内に挿入される。
【００８７】
ベクター
したがって、本発明はまた、本発明による少なくとも１つのポリヌクレオチドまたは１つの発現カセットを含む、宿主生物の形質転換のための複製または発現ベクターに関する。このベクターは、特に、本発明によるポリヌクレオチドまたは発現カセットが挿入されたプラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスからなることができる。これらのベクターを構築するための、およびこれらのベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入するための技術は、当業者に周知である。一般に、特に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を誘導するために、宿主細胞内でそれ自身を維持、自己複製、または増殖することが可能な任意のベクターを使用することができる。当業者は、特に、形質転換される宿主生物、および使用される形質転換技術に従って、適切なベクターを選択するであろう。
【００８８】
本発明のベクターは、特に、ベクターの複製、および／または宿主生物における本発明によるポリペプチドの発現を目的として宿主生物を形質転換するために使用される。
【００８９】
本発明はまた、以下のステップを含む本発明によるポリペプチドを調製する方法に関する：
- 宿主生物を、本発明による発現カセットを含む発現ベクター、および／または本発明によるポリヌクレオチドで形質転換させるステップ、
- 宿主生物によって産生されたポリペプチドを単離するステップ。
【００９０】
宿主生物
本発明の対象はまた、本発明による少なくとも１つのポリヌクレオチド、または発現カセット、またはベクターの前記宿主生物への統合によって宿主生物を形質転換する方法である。ポリヌクレオチドは、宿主生物のゲノムに統合することができ、宿主生物内で安定して複製することができる。宿主生物を形質転換する方法は、当業者に周知であり、文献において広く記載されている。
【００９１】
本発明はまた、本発明によるポリヌクレオチド、発現カセットまたはベクターで形質転換された宿主生物に関する。
【００９２】
用語「宿主生物」は、特に、本発明による細菌、酵母、菌類および植物から選択された、より低度またはより高度の単細胞または多細胞生物を意味する。用語「宿主生物」は、ヒト以外の生物を意味する。
【００９３】
有利には、酵母は、ピキア パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミセス セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）、ヤロウィア リポリチカ（Yarrowia lipolytica）、スクワンニオミセス オシデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）およびスキゾサッカロミセス ポンブ（Schizosaccharomyces pombe）から選択される。 菌類は、アスペルギルス（Aspergillus） および ペニシリウムス（Penicilliums）、好ましくは ペニシリウム フニクロスム（Penicillium funiculosum）、トリコデルマ レセイ（Trichoderma reesei）、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス カワチ（Aspergillus kawachii）およびトリコデルマ コニンギ（Trichoderma koningii）から選択される。一実施態様において、宿主生物は、本発明によるフィターゼが発現するペニシリウム フニクロスム（Penicillium funiculosum）の株である。他の実施態様において、宿主生物は、本発明によるフィターゼが発現されるか過剰発現されるデバリオミセス カステリ（Debaryomyces castellii）の株である。本発明の好ましい実施態様において、宿主生物は、本発明によるフィターゼが発現するピキア パストリス（Pichia pastoris）またはスキゾサッカロミセス ポンブ（Schizosaccharomyces pombe）の株である。植物は、例えば、ライス(Oryza sativa L.)、タバコ、ダイズおよびコムギから選択される。
【００９４】
本発明によれば、宿主生物は、以下のポリヌクレオチドから選択されたポリヌクレオチドで形質転換される：
a) その配列が配列番号１の位置1538と位置2923の間にあるポリヌクレオチド、
b) 以下のポリペプチドから選択されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
- 配列番号２のポリペプチド、
- フィターゼ活性を有する、配列番号２のポリペプチドの断片、
- フィターゼ活性を有し、配列番号２のポリペプチドと少なくとも90%の同一性を示すポリペプチド。
【００９５】
野生型状態における宿主生物が上記に定義されたポリヌクレオチドを有する可能性もあるが、本発明は、形質転換された宿主生物に関する。本発明の一実施形態によれば、宿主生物は、本発明のポリペプチドを発現する目的のために、本発明のポリペプチドで形質転換される。本発明の他の実施態様によれば、宿主生物は、本発明のポリペプチドを過剰発現する目的のために本発明のポリヌクレオチドで形質転換される。
【００９６】
ベクターを構築するための、宿主生物を形質転換するための、およびこれらの生物において異種起源のタンパク質を発現するための技術は、文献中に広く記載されている (Ausubel F.M. et al., “Current Protocols in Molecular Biology” Volumes 1 and 2, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, 1989; T.Maniatis, E.F.Fritsch, J.Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Handbook, 1982)。
【００９７】
食事性添加物および動物飼料
本発明はまた、フィターゼ活性を提供する食事の添加物に関する。このタイプの酵素活性の供給は、飼料の消化率を向上させ、その栄養的価値を増強することを可能にする。
【００９８】
用語「栄養添加物」は、その栄養上の特徴またはその消化率を向上させるように、一般に少量において飼料に意図的に加えられる物質を意味する。動物のための栄養添加物には、例えば、ビタミン、ミネラル塩類、アミノ酸および酵素が含まれ得る。
【００９９】
典型的には、動物のための栄養添加物には、本発明によるポリペプチド、本発明による宿主生物、または本発明による宿主生物の培養上清/発酵物が含まれる。したがって、本発明によるフィターゼ活性を有するポリペプチドは、動物のための栄養添加物の生産のための、デバリオミセス カステリの株または組み換え宿主生物から精製または単離することができる。代わりに、デバリオミセス カステリの株または本発明によるフィターゼを産生する宿主生物は、動物のための栄養添加物の生産のために直接的に使用することができる。本発明の好ましい実施態様において、デバリオミセス カステリの株または本発明による宿主生物の培養上清/発酵物が、動物のための栄養添加物の生産のために使用される。この実施態様は、フィターゼがデバリオミセス カステリ株または宿主生物によって細胞外培地内に分泌される場合、特に有利である。通常、この培養上清は、栄養添加物の生産のために濃縮または凍結乾燥される。
【０１００】
したがって、本発明は、以下のステップを含むフィターゼを調製する方法に関する：
a) フィターゼの発現の誘導のための条件下において、デバリオミセス カステリの株または本発明による形質転換された宿主生物を培養するステップ、
b) フィターゼを含む培養上清を単離するステップ。
【０１０１】
この培養上清または発酵物は、その後、食事性添加物または動物飼料の処方のために濃縮または凍結乾燥することができる。この方法は、培養上清からのフィターゼの精製工程からなるさらなるステップを含むことができる。
【０１０２】
宿主生物がフィターゼを培養培地中に分泌しない場合、細胞を破裂させ、細胞抽出液を精製することからなるさらなるステップが必要となるであろう。
【０１０３】
本発明の栄養添加物は、本発明による少なくとも１つのフィターゼを含むが、ビタミン、アミノ酸またはミネラル塩のような他の栄養物質も含むことができる。
【０１０４】
本発明による添加物は、飼料の消化能を増加させ、それによって、特に、穀類(コムギ、オオムギ、トウモロコシ、オートムギ、ライムギなど)および油産生物(ダイズ、ヒマワリ、ナタネなど)に基づいた食事から増加した栄養的価値を得ることを可能にする。
【０１０５】
本発明はまた、本発明による栄養ベースおよび栄養添加物を含む動物飼料に関する。これらの飼料は、通常は本発明による添加物が組み込まれた食事および顆粒の形態をしている。
【０１０６】
本発明の対象はまた、本発明によるポリペプチド、本発明による宿主生物または本発明による宿主生物の発酵物質／培養上清を含む動物飼料である。
【０１０７】
用語「飼料」は、動物に食物を与えるために使用することができるものをすべてのものを意味する。
【０１０８】
本発明の一実施態様において、本発明による栄養添加物および動物飼料は、補足的な活性のある少なくとも２つのフィターゼの組み合わせを含む。これらの添加物およびこれらの飼料は、他のフィターゼと組み合わされた本発明による少なくとも１つのフィターゼを含む。本発明によるフィターゼと組み合わされたフィターゼは、例えば、以下の生物のフィターゼから選択することができる：スクワンニオミセス オシデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）、アスペルギルス アワモリ（Aspergillus awamori） (フィターゼ Aおよびフィターゼ B)、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger） (フィターゼ Aおよびフィターゼ B)、ペニシリウム フニクロスム（Penicillium funiculosum）、アスペルギルス オリザ（Aspergillus oryzae）、ペニオホラ リシイ（Peniophora lycii）、アスペルギルス フィクウム（Aspergillus ficuum）、アスペルギルス ニズランス（Aspergillus nidulans）、タラロミセス テルモフィルス（Talaromyces thermophilus）、アスペルギルス フミガタス（Aspergillus fumigatus）およびアスペルギルス テレウス（Aspergillus terreus）。
【０１０９】
有利には、本発明によるフィターゼは、フィチン酸のすべてのリン酸基を加水分解する。したがって、それは、すべてのリン酸基を加水分解するとは限らないフィターゼの活性を向上または補足するために使用することができる。好ましくは、本発明によるフィターゼは、アスペルギルス ニガー フィターゼ (Ullah, A.H.J. and Sethumadhavan, K., (2003) PhyA gene product of Aspergillus ficuum and Peniophora lycii produces dissimilar phytases. Biochemical and Biophysical Research Communications 303: 463-468) またはペニシリウム フニクロスムの株のフィターゼ (WO 03/054199, WO 99/57325)と組み合わされる。
【０１１０】
好ましくは、添加物および飼料は、アスペルギルス ニガー フィターゼまたはペニシリウム フニクロスム フィターゼと組み合わされた本発明によるフィターゼを含む。
【０１１１】
動物の集約的な育成について、動物飼料は、通常は栄養ベースおよび栄養添加物を含む。
【０１１２】
用語「栄養ベース」は、動物の飼料摂取の大半を構成するものを意味し、一例として、動物および／または植物起源の穀類、タンパク質および脂肪の混合物からなるものを意味する。
【０１１３】
動物のための栄養ベースは、これらの動物の食事に適しており、当業者に周知である。通常、これらの栄養ベースは、例えば、トウモロコシ、コムギ、エンドウおよびダイズを含む。これらの栄養ベースは、これらがそのために意図される様々な動物種の必要のために適している。これらの栄養ベースは、既にビタミン、ミネラル塩およびアミノ酸のような栄養添加物を含むことができる。
【０１１４】
好ましい実施態様において、本発明は、単胃動物、特に家禽およびブタのための飼料に関する。家禽には、特に、産卵鶏、食用鶏、七面鳥およびアヒルが含まれる。ブタには、特に、成長段階および成熟したブタおよび子ブタが含まれる。
【０１１５】
例
例１：デバリオミセス カステリ フィターゼの産生、生化学的特性および立体特異性
材料および方法
１. 生物
使用される株は、命名デバリオミセス カステリ CBS 2923として、Centraal bureau voor Schimmelculture [Central office for fungi culture] (Delft)にリストされている。
【０１１６】
２. 培養培地および状態
回分培養(MSA-B)のための合成培地：グルコース(10g/l); フィチン酸ナトリウムC6H6O24P6Na12(0.4g/l) 
ミネラル塩：(NH4)2SO4(3g/l)、MnSO4.H2O(7.5mg/l)、KCl(0.5g/l)、MgSO4.7H2O(0.5g/l)、CaCl2.2H2O (0.1g/l)
微量元素：H3BO4 (500μg/l)、CuSO4.5H2O (40μg/l)、Kl (100μg/l)、Na2MoO4.2H2O (200μg/l)、ZnSO4.7H2O (400μg/l)、FeCl3.6H2O (200μg/l)
ビタミン：パントテン酸塩Ca(2mg/l)、チアミン(B1)(2mg/l)、ミオイノシトール(2mg/l)、ピリドキシン(B6)(2mg/l)、ニコチン酸(PP)(0.5mg/l)、ビオチン(0.02mg/l)。
【０１１７】
連続培養(MSA-C)のための合成培地：MSA-B培地の組成物、様々な成分を、10倍以上に濃縮した。
【０１１８】
エルレンマイヤーフラスコにおける培養
最初の前培養は、YMPG(グルコース10g/l、酵母エキス3g/l、バクトペプトン5g/l、麦芽エキス3g/l)の状態下において行う。培養は、0.2M 酒石酸塩バッファーでpH 5.4で緩衝したMSA-B培地の存在下においてその体積の1/10まで満たされたエルレンマイヤーフラスコ中において行う。これらは、振盪機(毎分80回の振動、振幅7cm)上で28℃で通気された培地中において行う。
【０１１９】
発酵槽における培養
培養は、Applikon発酵槽(オランダ)（1.5Lの有効容積）またはBraun Biostat E発酵槽(3Lの有効容積)において行う。pHはIngold プローブで測定する。pHは2M 水酸化ナトリウムまたは1M 硫酸を添加して調節する。通気は、2v.v.m(空気の体積．（培養物の体積）-1．(分)-1)のろ過殺菌された空気の吹き込みによって行う。溶存酸素分圧は、Ingold ポーラログラフ プローブを使用して測定する。これは、振盪速度の差異による30%以上の値で維持する。温度は、28℃で維持する。データの制御および取得は、Bioexpert取得ソフトウェア(Applikon)を使用してオンラインで行う。
【０１２０】
発酵槽を離れるガスの分析
排ガス中のCO2濃度は、Beckman Industrial 870 赤外線アナライザーを使用して測定する。O2濃度は、Beckman Industrial 775Aアナライザーを使用して測定する。この検知器は、酸素分子の常磁性磁化能を利用している。
【０１２１】
培養の過程における炭素基質の分析
培養培地(グルコース、酢酸塩、エタノール)中に存在する基質および代謝物質は、FFJ (Waters) イオン排除カラムを使用した高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって単離および定量する。移動相は3mMリン酸であり、その流速は1ml/分である。培養培地のサンプルを２時間ごとに連続的に取得し、Applikon A-SEPろ過モジュールおよびWaters FAM 取得およびろ過モジュールを使用して接線方向に無菌ろ過を行う (Millipore 0.22 μm GVフィルタ)。炭素基質は屈折率測定器(Waters 410)によって検出する。このアセンブリーは、Waters 600 E 制御系によって制御されている。得られたクロマトグラフィーをMillenium software（Waters）を使用して分析する。
【０１２２】
標準レンジを1〜50 g/l範囲のスケールで各基質について作成した。
【０１２３】
３．精製
限外ろ過
遠心後に得られた培養上清について、Filtron 接線方向フロー限外ろ過カセット（表面積：836 cm2）で限外ろ過を行う前に、0.22μmのカットオフ閾値を示す膜（Mi1llipore）を通してろ過を行う。その排除閾値は、10kDaである。濃縮物を超純水で3回(V/V)洗浄し、次に、25の因子によって濃縮を行う。得られた抽出物は、精製のために使用される。
【０１２４】
疎水性クロマトグラフィー
タンパク質の単離は、16mmの内部直径および100mmの全長(体積20ml)をもつHiPrep 16/10フェニルFFカラム(Amersham)上で20℃で行う。
【０１２５】
精製ゲル上での注入の前に、サンプルを2M 硫酸アンモニウム中で平衡化する。その混合物は、2〜16時間にわたって4℃で放置され、その後、沈殿したタンパク質を除去するために遠心分離を行う(12000g、20分)。遠心分離後の上清は、ゲル上に載せられる抽出物を構成する。
【０１２６】
ゲルは、第１に、pH 6.1の50mM トリス-HClバッファーおよび2M 硫酸アンモニウムの溶液を使用して5カラム当量の体積で平衡化する。1〜5 mlのサンプルを注入する。
【０１２７】
未結合タンパク質は、硫酸アンモニウムバッファー平衡溶液で5カラム当量の体積を洗浄することによって除去される。
【０１２８】
溶出は、３つのリニアなセグメントの勾配を作り出すことによって行う：（１）1.5カラム時間当量の体積を越える2〜1.7M 硫酸アンモニウム、（２）4カラム時間当量の体積を越える1.7M硫酸アンモニウム、（３）0.1カラム時間当量の体積を越える1.7〜0M 硫酸アンモニウム。フィターゼを1.7Mの硫酸アンモニウムで溶出する。
【０１２９】
流速は5ml/分で固定する。4mlの画分をカラム出口で収集し、吸光度を280nmで測定する。
【０１３０】
活性画分を組み合わせ、超純水で洗浄し、限外ろ過(Milliporeの薄膜、カットオフ閾値10kDa)によって濃縮を行う。
【０１３１】
４．電気泳動 
変性および非変性状態下での電気泳動は、プレポアされた4%〜15%のアクリルアミド ゲル(Biorad)上で行う。タンパク質をクマシーブルーで検出する。
【０１３２】
フィターゼの特異的な視覚化は、200mgのα-ナフチルP（Sigma）および100mgのFast Garnet GBC (Sigma)および92mgのフィチン酸ナトリウムを含む、pH 5.5の100mlの250mM酢酸ナトリウムバッファー溶液中においてゲルをインキュベートすることによって行われる。α-ナフチル Pの加水分解後、褐色のα-ナフチル／Fast Garnet GBCの複合体が形成される。
【０１３３】
５．エンドグリコシダーゼ Hの消化
脱グリコシル化：1000単位のエンドグリコシダーゼ H(Biolab Ozyme P0702S)を、およそ20μgのタンパク質を含む変性サンプルに加える。この混合物を、ウォーターバスにおいて37℃で2時間にわたってインキュベートする。
【０１３４】
６．質量分析による分子量の測定 
この分析は、MALDI-TOF Biflex III scout 384 分光計(Bruker、Breme、Germany)を使用してSDS-PAGE上で精製されたフィターゼについて行われる。
【０１３５】
７．分析方法
7.1 固形物の測定 
細胞の濃度は、Beckman DU530分光測光器を使用して光学濃度(OD)を測定することによって得られる。１OD単位は0.570g/lのバイオマスに相当する。
【０１３６】
7.2 タンパク質分析
タンパク質含量は、Bradford法 (Bradford, M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of proteins utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254). (Biorad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, BIORAD 500-0006)によって決定され、吸光度は595nmで測定される(Beckman DU 530 UV/可視分光測光器)。較正はウシ血清アルブミンレンジで行われる。
【０１３７】
7.3 酵素方法
フィターゼ活性は、経時にわたる無機リン酸塩の放出後に測定される。
【０１３８】
活性は、37℃で1mMのCaCl2を含むpH 5.5またはpH 4の250mM 酢酸ナトリウムバッファー(5体積)中に溶解された8mMのフィチン酸ナトリウム(Sigma)の存在中において測定される。その反応は、酵素抽出物(1体積)の添加によって開始する。反応は、20%トリクロロ酢酸での培養液の酸性化によって停止する(1体積の反応培地＋1体積の酸)。放出されたリン酸塩の量を、異なるインキュベーション時間後に決定する。
【０１３９】
１酵素単位(U)は、１分間当りに1 μmolの無機リン酸塩を放出させる酵素の量として定義される。
【０１４０】
酵素の特性 
フィターゼ活性に対するpHの影響を、以下のバッファー溶液を使用して決定する： 200mMグリシンHCl、pH 2-3.5; 200mM酢酸ナトリウム-酢酸、pH 3.5-7; または200mMトリス-HCl、pH 7-9。この反応は基質としてフィチン酸塩を使用して+37℃で行なわれる。最適温度は+30℃〜+80℃まで温度を変えることにより決定される。その反応は基質としてフィチン酸塩を使用してpH 4(200mM酢酸ナトリウムバッファー)で行われる。熱安定性は、+37から+70℃までの温度で様々な時間について、125mM酢酸ナトリウムバッファー、pH 4中で酵素サンプルをインキュベーションすることによって決定される。熱処理後、混合物を氷中で冷却し、フィターゼ活性を基質としてフィチン酸塩を使用して決定する。,動態学的パラメーターを、フィチン酸ナトリウムでの実験については+37℃およびpH 4で決定し、p-NPPでの実験についてはpH 5.5で決定する。
【０１４１】
7.4 リン酸塩分析
放出されたリン酸塩の量を比色定量によって測定する。その場で調製された可視化溶液は、硫酸鉄(380mM、1体積)およびアンモニア塩基ヘプタモリブダート(12mM、4体積)を含んでいる。700nmの吸光度を、UV/可視化分光測光器(Beckman DU 530)を使用して、外界温度で可視化(1体積の反応媒体＋1体積の可視化溶液)した30分間後に測定する。
【０１４２】
検量線は、カリウム二水素リン酸塩で前もって確立しておく。
【０１４３】
7.5 立体特異性の研究のためのフィターゼ加水分解条件 
反応チューブは、2体積のフィチン酸ナトリウム(20mM)、2体積の酢酸塩バッファー、pH 4(0.25M)、および1体積の稀釈酵素(0.6U/ml 最終濃度)を含む。
【０１４４】
サンプルを6時間にわたる様々な時間に採取する。反応は100℃(10分)で加熱することによって停止させる。
【０１４５】
7.6 イノシトール リン酸塩の測定
7.6.1 HPICによる
これは、高機能のイオン クロマトグラフィー(HPIC)を使用し、フィターゼ研究によるフィチン酸の分解によって得られたイノシトール モノ-から六リン酸塩までを単離および決定する方法である(Hatzack, F., Hubel, F., Zhang, W., Hansen, P.E. and Rasmussen, S.K. (2001) Inositol phosphates from barley low-phytate grain mutants analysed by metal-dye detection HPLC and NMR. Biochem. J. 354, 473-480; Skoglund, E., Carlsson, N.G. and Sanberg, A.S., (1997) Determination of isomers of inositol mono to hexaphosphates in selected foods and intestinal contents using High-Performance Ion Chromotography. J. Agric. Food Chem. 45, 431-436; Turk, M., Sandberg, A.S., Carlsson, N.G. and Andlid, T. (2000) Inositol hexaphosphate hydrolysis by baker's yeast. Capacity, kinetics, and degradation products. J. Agric. Food Chem. 48, 100-104)。この方法は、溶出勾配を備えたHPLCによるイオン交換カラム上での様々なIns Pnの単離を含み、イノシトール リン酸塩が鉄と複合体を形成するポストカラム反応、290nmのUVによって検出される。このシステムは、Ins P2からIns P6までを検出することを可能にするが、Ins P4およびIns P5の様々な異性体のみを単離することができる。
【０１４６】
参照サンプルの調製
ピークを化学的加水分解後に同定する。50mgのフィチン酸ナトリウムを、16時間にわたって100℃で5mlのHCl(6M)中に静置する。25μ1アリコートをSpeed Vac中で乾燥させ、続いて1注入当り約300nmolを有するように100μlの0.025M HCl中に取る。
【０１４７】
サンプル分析
様々なピークを、Omni Pac PAX-100分析カラム(4×250 mm)およびPAX-100 ガードプレカラム(4×50mm) (Dionex Corp., Sunnyvale, CA)上の強力な陰イオン交換クロマトグラフィーによって分離する。流量は0.8ml/分である。注入ループは100μlである。Ins Pnは、超純水および有機溶媒(50%の2-プロパノール)と結合した5-98%のHCl(0.5M)の勾配で溶出される。溶出液は、下記の表１によって組み合わせられる：
【表１】
2009500029.tif 000002
【０１４８】
15分の時間は、各クロマトグラフィー後にカラムを平衡にするのに必要である。
【０１４９】
イノシトール リン酸塩を、UV分光測光器(Biocad、Sprint)を使用して、290nmの吸光度を測定することによってポストカラム反応後に検出する。溶出液を、ポストカラム反応中に、2% HClO4溶液中の0.1%のFe(NO3)3.9H2Oと混合する。反応ポンプ(Minipuls 3、Gilson)の流量は0.4ml/分である。テフロン（登録商標） コイル(0.25mm、4m)を介した輸送は、Ins Pn、および検出のための鉄を複合することを可能にする(Phillippy, B.Q. and Bland, J.M. (1988) Gradient ion chromatography of inositol phosphates. Anal. Biochem. 175, 162-166)。
【０１５０】
7.6.2 NMRによる
凍結乾燥後、HPIC(50-200 μg)によって単離されたイノシトールの様々なサンプルを、500μlのD2Oにおいて可溶化する。
【０１５１】
陽子スペクトルを、クリオプローブ(1H、13Cおよび15N)およびZ軸に沿った勾配を備えたBruker Avance分光計上において500または600MHzで記録した。リン非結合陽子スペクトルおよび相関性スペクトル1H-31P(HMQC)を、TBIプローブを備えたBruker Avance 400MHz分光計上において記録した。残余の水シグナルを1sの期間にわたる選択的な前飽和によって除去した。すべてのスペクトルを17℃で記録した。陽子スペクトルを、ナトリウム-d4(トリメチルシリル)-3-プロピオン酸塩(TSP、0ppm)と比較して、または残余の水シグナル(17℃で4.914ppm)と比較して検量する。陽子共鳴割当てについて、COSYおよびTOCSYの試験は512時間増分で記録された。TOCSYのために使用された接触時間は50msである。HMQC試験は64時間増分で得られた。
【０１５２】
陽子スペクトル割当ては、COSYおよびTOCSY試験の分析によって行われるだろう。対称面を有する一定の異性体については、H1およびH3陽子ならびにH4およびH6陽子が分化することができないことに留意すべきである。この場合、これらは周知のH1(またはH3)およびH4(またはH6)になるだろう。いったん割当てが得られると、リン酸化された位置がその後に決定される。後者は、２つの異なる試験によって、第１にリン非結合陽子スペクトルによって、および第２にHMQC試験によって決定されるだろう。リン非結合の有無の陽子スペクトルの比較によって、3JHCOP8.5-10Hz結合を有するシグナルおよびリン酸化位置を同定することができる。
【０１５３】
1H―31P HMQC試験は、3JHCOP結合定数によって、その一部について、陽子-リン相関性を同定することを可能にする。プロトン共鳴割当てがわかっている場合、リン非結合スペクトルおよびHMQCは、リン酸化された位置を明白に同定することを可能にする。リン酸基の位置はまた、陽子スペクトル結合定数の分析によって確認される。
【０１５４】
7.6.3 NMRによって追従される加水分解の動態
NMRによって加水分解に続くために使用されるサンプルは、InsP6/リン酸塩バッファー、D2O中96/700mMの原液から調製される。典型的には、20μlのこの溶液を、480μlのD2O(稀釈25)に加え、3.8mMのInsP6、および28mMの酢酸ナトリウムバッファーおよび内部基準としてTSPを含むサンプルを得る。加水分解の所望の速度に応じて、多量または少量の酵素(3U/mlでの1〜20μlの原液)を加える。動態は、20時間にわたって3分ごとにスペクトルを記録(32スキャン)することによって17℃で行われる（400スペクトル）。事前に決定された様々なイノシトール リン酸塩のスペクトル特性を使用して、全動態にわたってこれらの出現および消失を追跡することができる。
【０１５５】
結果
１−デバリオミセス カステリ フィターゼの生合成の研究
フィターゼの生合成を、最適な産生条件を決定するために、バッチ培養および連続培養中において行った。培養は合成培地(材料および方法を参照)上で行う。先行の研究は、我々が5g/lのバイオマスを産生するために0.4g/lのフィチン酸塩の最適濃度を決定することを可能にする。この濃度は、最大の細胞増殖を保証し、フィターゼ生合成を抑制しないという点において必要かつ十分である。サンプルは経時にわたって取り; バイオマスおよびフィターゼ活性を測定する。
【０１５６】
1.1 バッチ培養産物
５つのバッチ培養を、10g/lのグルコースおよびMSA-B培地の存在下においてpH 3、4、5、6および7で行う。最大のバイオマスはpH 5で得られ、増殖速度はpH 3およびpH 7で20%まで減少する。培養上清中で測定された最大のフィターゼ活性はpH 4で得られ、活性はpH 3では検出されない。フィターゼ活性は静止期の開始12時間後におよそ20%まで増加する。フィターゼのいくつかはパリエタール(parietal)であり、非増殖期において培地中に放出される可能性がある。我々は、同じレベルの誘導がカルシウム塩の存在下または不存在下において得られたことを確認した。
【０１５７】
1.2 連続培養産物
連続培養を、100g/lのグルコース、およびMSA-C培地の存在下において、pH 4で行う。バイオマスおよびフィターゼ活性の測定を、発酵槽の少なくとも３回の更新の後に行う。
【０１５８】
バイオマスの産生は、0.20h-1の希釈率まで50%のYバイオマス/基質(g/g)の収量で一定であり、細胞代謝は酸化的であり、呼吸係数(QR)は１に等しい。フィターゼ産生は希釈率とともに増加する。0.25h1の希釈率(D)では、増殖収量は40%まで減少し、QRは１より大きくなり、細胞代謝はオキシド発酵になり、酢酸塩やエタノールのような二次代謝産物の形成がみられる。フィターゼ産生はまた、５の因子(a factor of 5)によって減少する。
【０１５９】
最良の産生(1487 U/l)は、D=0.20h-1で得られる。フィターゼの20%が細胞と結合していることに留意すべきである; 少なくとも4時間にわたって4℃で培養物を維持することによって、培養液中に酵素を放出させることができる。
【０１６０】
２−フィターゼの研究
2.1 精製
デバリオミセス カステリ フィターゼを精製するための様々なステップについて表２に概説する。
【表２】
2009500029.tif 000003
【０１６１】
粗抽出物は、11.4U/mlの比活性を有する。濃縮および限外ろ過のステップの後、抽出物を疎水性クロマトグラフィーによって精製する。フィターゼは、59%の収量で、13の因子によって単一ステップにおいて精製される。比活性は156U/mgである。SDS-PAGE電気泳動上の単一のタンパク質バンドの存在は、酵素が純粋であることを示している。
【０１６２】
2.2 モル質量および構造
2.2.1 電気泳動またはゲル透過クロマトグラフィーによるモル質量の測定
SDS-PAGE電気泳動によって、フィターゼのモル質量を77kDaと推定し、かつエンドグリコシダーゼ Hでの処理によって脱グリコシル化された酵素のモル質量を51kDa、すなわち34%のグリコシル化を推定することができる。非変性条件下では、フィターゼのモル質量は、塗沫の存在により決定するのがより難しく; 440と150kDaの間にある。脱グリコシル化された酵素は、87kDaである。特定の採色によって、脱グリコシル化されたフィターゼが活性のあることを示すことができる。
【０１６３】
ゲル透過クロマトグラフィー(Pharmacia HR 200 カラム)によって決定されたモル質量は、グリコシル化されたフィターゼについては318kDaであり、脱グリコシル化されたフィターゼについては218kDaである。
【０１６４】
2.2.2 質量分析
質量分析による質量の測定は、SDS-PAGE電気泳動によって得られた結果、すなわち、フィターゼについては74kDa、および脱グリコシル化された酵素については53kDa、すなわち28.4%のグリコシル化を追認している。
【０１６５】
したがって、天然フィターゼは、同一質量の4つのモノマーからなると思われる。
【０１６６】
2.2.3 結晶学
プライオリティの年に、デバリオミセス カステリの構造(461残基)を、2.3Åの解像度で結晶学によって決定した。
【０１６７】
それは、10分子のN-アセチルグルコサミンおよび1256分子の水を含む四量体である。
【０１６８】
構造は、次のbdbコード：2GFIでRCSBプロテインデータバンクのサイトからアクセス可能である。
【０１６９】
３−酵素の特性
3.1 pHの影響
フィターゼに対するpHの影響を、様々なバッファーの存在下、すなわち、pH 2〜3.5 (グリシン バッファー)について、pH 3.5〜7 (酢酸ナトリウムバッファー)について、およびpH7〜7.5 (トリスHClバッファー)について酵素活性を測定することによって決定する(図1)。フィターゼは2.5〜6.5のpH値において活性であり、pH 4〜4.5で最大となる。フィターゼ活性に対するバッファーの性質の影響は、pH 3.5で認められる。すなわち、酢酸ナトリウムバッファーは、グリシン バッファーと比較して抑制剤になる。
【０１７０】
3.2 温度の影響
最適温度を、様々な温度：30〜80℃でフィターゼ活性を測定することによって天然のフィターゼについて決定する(図2)。
【０１７１】
フィターゼの最適温度は、55と60℃との間にある。Arrheniusによって計算された活性化エネルギーは38kJ/molである。
【０１７２】
3.3 エフェクターの作用
試験された様々なカチオンの中で、Mn2+のみが72%の強い阻害を引き起こす。カチオンCo2+、Zn2+、Cu2+およびMg2+の存在下において、活性は58〜22%まで抑制される。カルシウムの存在がこの酵素の活性に必要ではないことに留意されたい（表３）
【表３】
2009500029.tif 000004
【０１７３】
試験対照の６つの阻害剤の中で、N-ブロモスクシンイミド(これは、トリプトファン、チロシンおよびヒスチジン基上で作用する)のみが、フィターゼ活性を完全に阻害する。トリプトファンの付加によって活性は回復する。ヨウ素(これは、チロシン基に特異的である)もまた、強い阻害性を示す(75%)。トリプトファンおよびチロシンは、酵素の触媒部位に深く関与しているように思われる。
【０１７４】
他方、ヨード酢酸(これは、システインおよびヒスチジン基上に作用する)は、活性の阻害を引き起こさない。
【０１７５】
2-メルカプトエタノール、ヨード酢酸塩、およびpCMBの影響の欠如は、-SH基がおそらく触媒部位に関与していないことを示している。
【０１７６】
3.4 安定性の研究
温度
様々な温度での熱変性の研究は、それが水中にあるときに酵素が60℃で１時間にわたって安定であることと、それが125mM 酢酸塩バッファー、pH 4にあるときに酵素が66℃で１時間にわたって安定であることを示している(図3)。それは68℃を超えると変性し、70℃で１時間後には活性の70%を失う。Arrheniusの表現によって計算された変性の活性化のためのエネルギーは、606kJ/molである。
【０１７７】
pH
フィターゼは、5未満のpHで、-20℃で21日間にわたる貯蔵後に完全に変性する。他方、5〜7のpHでは、同じ温度で67日間にわたる貯蔵後にも変性は認められない。
【０１７８】
pHおよび温度
フィターゼ活性を、そのpHが2〜8の間にあるバッファー中において2つの温度(40および60℃)で酵素をインキュベーションした後に測定する(図4)。２点の両端のpH(2および8)については、活性の完全な欠失が接触の1時間後に観察される。他方、3〜7のpHでは、80〜100%の活性が40℃で保存される。60℃では、フィターゼは、pH 3およびpH 8でより強く変性する。pH 8でバッファーの性質による強い影響があることに留意されたい; 酢酸塩バッファーの存在下において、変性は完全であるが、トリスHClバッファーの存在下では、変性はわずかに50%である。
【０１７９】
周囲のイオン強度
酵素は、様々な添加物の存在下において、60分間にわたって20℃および66.5℃で、1mM塩化カルシウムを含む250mM 酢酸塩バッファー、pH 4中にプレインキュベートされる。処理の最後に、抽出物を+4℃の水中で冷却する。その後、活性をpH 4、250mMバッファーで20分間にわたって37℃で測定する（表４）。
【０１８０】
3つのタイプの要素について試験を行う：
- 砂糖または糖アルコール：スクロース、ラクトーゼ、トレハロース、アラビノース、グリセロール、
- カルシウムの欠如、
- バッファーのモル濃度。
【０１８１】
酵素は、様々な添加物の存在下において、60分間にわたって20℃および66.5℃で、1mMカルシウムを含む250mM酢酸塩バッファー、pH4中にプレインキュベートされる。処理の最後に、抽出物を+4℃の水中で冷却する。
【０１８２】
その後、活性を、1mMカルシウムを含むpH 4、250mM酢酸塩バッファーで20分間にわたって37℃で測定する (材料および方法を参照)。
【表４】
2009500029.tif 000005
【０１８３】
2つの要素が非常に重要である：カルシウムおよびイオン強度。カルシウムは酵素活性に影響はないが、非常に重要な保護的役割を果たす; 変性はカルシウムがない状態において完全になる。バッファーのイオン強度における増加は、その温度により250mMで50%まで変性を増加させる。
【０１８４】
４−速度論の研究
特異性の研究
速度定数は、２基質上で決定する。
【０１８５】
フィターゼの親和性は、p−ニトロフェニル リン酸塩(pNPP)の存在下においてよりもカルシウムフィチン酸塩の存在下において４倍も大きい（表５）。
【表５】
2009500029.tif 000006
【０１８６】
このフィターゼは、pNPPの、ホスホエノールピルビン酸塩の、ATPおよびADPの優先的加水分解と共に、活性の広域スペクトルを有する（表６Ａ）。これは、A.fumigatusおよびE.nidulansのフィターゼのような広域スペクトルのフィターゼの種類に属する。
【０１８７】
これはまた、Ins(2)P1を分解する（表６Ｂ）。これはフィチン酸分子上のそのアキシャルな位置によりフィターゼによって加水分解されることはほとんどない。その機能は1.3mMのKiでリン酸塩によって抑制される。
【０１８８】
表６：様々な基質の存在下におけるD.castelliiフィターゼの特異性の比較。
【０１８９】
(A) 基質の濃度は4mMである。リン酸塩の放出速度は、250mM酢酸ナトリウムバッファー、1mM CaCl2、pH 4中、37℃で決定される。
【表６−１】
2009500029.tif 000007
(B) D カステリ フィターゼによる様々なイノシトール リン酸塩の加水分解。リン酸塩放出速度は、250mM 酢酸ナトリウムバッファー、1mM CaCl2、pH 4において決定される。その測定は、37℃で30分間にわたる加水分解後に行われる。
【表６−２】
2009500029.tif 000008
５−立体特異性
5.1 クロマトグラフィー(HPIC)によるイノシトール リン酸塩の単離および同定
ミオイノシトール リン酸塩異性体を、5%〜98%勾配のHCl(0.5M)およびH2O/2-プロパノール(v/v)を使用するOmni Pac-100分析カラム上で単離する。溶出液を、ポストカラム反応器中で0.1% Fe(NO3)3.9H2Oおよび2% HClO4の溶液と混合する(Phillippy, B.Q. and Bland, J.M. (1988) Gradient ion chromatography of inositol phosphates. Anal. Biochem. 175, 162-166)。全流量は1.2ml/分である。これらの条件は、様々なIns Ps(Ins P6〜Ins P1)を単離し、Ins P5およびIns P4の様々な異性体を同定することを可能にする。
【０１９０】
様々な異性体は、(1) 同一の条件下で得られた文献において記載されたもの(Skoglund, E., Carlsson, N.G. and Sanberg, A.S. (1997) Determination of isomers of inositol mono- to hexaphosphates in selected foods and intestinal contents using High-Performance Ion Chromatography. J. Agric. Food Chem. 45, 431-436)、(2) 化学的加水分解によって得られた化合物(Turk, M., Sandberg, A.S., Carlsson, N.G. and Andlid, T. (2000) Inositol hexaphosphate hydrolysis by baker’s yeast. Capacity, kinetics, and degradation products. J. Agric. Food Chem. 48, 100-104)、および(3) A. nigerおよびP. lyciiのフィターゼによるフィチン酸の加水分解の生成物(Lassen, S.F., Bech, L., Fuglsang, C.C., Ohmann, A., Breinholt, J. and Stergaard, P.R. (2000), US Patent 6060298)、で得られたクロマトグラムの比較によって同定される。
【０１９１】
5.1.2 化学的加水分解
化学的な加水分解(6M HCl、100℃、16時間)の後、得られたクロマトグラムから、Ins P5およびIns P4の中の12の異性体を同定することが可能である。Ins P3、Ins P2およびIns P1の異性体は、この方法によって単離されない。
【０１９２】
5.1.3 D.castellii フィターゼによるフィチン酸の加水分解中に形成されたイノシトール リン酸塩の識別
加水分解条件は、材料および方法において記載されている。様々なIns Pnの出現が経時にわたってモニターされる。加水分解の15分間後、Ins P6は実質的に消失し、4つの主要なピークが検出され、Ins(1、2、4、5、6)P5、Ins(1、2、5、6)P4、およびこの方法によって同定されないIns P3、Ins P2およびIns P1のピークに相当する。Ins P5およびIns P4の割当ては、標準のイノシトール サンプルの付加によって確認される。加水分解の120分後、Ins P3およびIns P1ピークが優位になる。これは、Ins P4、5および6と比較したIns P3の加水分解のはるかに遅い速度を反映している。加水分解の300分後、分析されたリン酸塩の量は、フィチン酸塩分子の100％の潜在的リン酸塩に相当する。酵素は、全てのリン酸塩を放出する。クロマトグラフィーによって分離されたIns Pn画分の特性は、NMR分析によって行う。
【０１９３】
5.2 NMR (図８−１１)
5.2.1 サンプルの処理
D.castellii フィターゼによるIns P6の加水分解の様々な生成物を、前節において使用される方法によるイオン交換クロマトグラフィーによって分離する。注入された量は、369.5μgのIns P6に相当する。ポストカラム試薬を水と交換し、12 クロマトグラフィーを行う。
【０１９４】
Ins P5、Ins P4、Ins P3、Ins P2およびIns P1に対応する画分を収集し、組み合わせて凍結乾燥する。凍結乾燥体を0.5mlのD2Oで再水和し、17℃でNMRによって分析する。
【０１９５】
5.2.2 InsP 分析
材料および方法において詳細に記載されたように、様々なイノシトール画分が、陽子スペクトル(1Dおよび2D COSYおよびTOCSY)、およびこれらの31P-1H相関性スペクトル(HMQC)の分析によって特徴づけられる。非鏡像である立体異性体を識別することは可能であるが、鏡像および同一のスペクトルを与えるエナンチオマーを区別することはできない。 
結果として、加水分解産物のNMRの特性決定は、3-フィターゼを1-フィターゼから、そして6-フィターゼを4 フィターゼから区別することができない。従来、文献によれば、3-または1-結合が最初に加水分解されたとき、命名3-フィターゼが与えられる; 同様に、6-または4-結合については、命名6-フィターゼが与えられる。
【０１９６】
5.2.2.1 Ins P1を含むHPLC画分の分析
陽子スペクトルは、3つの生成物の混合物の存在を示し、そのスピン方法がTOCSYおよびCOSY試験によって同定された。これらの3つの生成物は以下のとおりである：Ins(2)P1(36%)、Ins(1または3)P1(16%)およびイノシトール(48%)。リンスペクトルは、十分なシグナルによって特徴づけられる無機リンの存在を示す。HMQCは、これらのうちの2つが１リン酸化され、3番目がそうではない、すなわちイノシトールであることを確認する。
【０１９７】
5.2.2.2 Ins P2を含むHPLC画分の分析
陽子スペクトルは、支配的な生成物(約90%)の存在を示す。シグナルからの開始は、H2陽子(4.741ppm)に対応し、COSYはスペクトルを割り当てることを可能にする。結合定数の分析は、2-および1-位置(または2-および3-位置)がリン酸化され、支配的な生成物がIns(2、1または2、3)P2に相当することを示している。31Pの非結合スペクトルおよびHMQCはこの割当てを確認する。微量な生成物、少なくとも２は、同定されなかった。
【０１９８】
5.2.2.3 Ins P3を含むHPLC画分の分析
陽子スペクトルは、事実上純粋な生成物の存在を示す。スペクトルの分析は、Ins(2、1、6または2、3と4)P3に相当することを示す。これらの3つの連続的な位置のリン酸化は、31P非結合スペクトル、およびHMQCによって確認される。
【０１９９】
5.2.2.4 Ins P4を含むHPLC画分の分析
陽子スペクトルは、Ins(2、1、6、5または2、3、4、5)P4であると分かる、支配的な生成物(約90%)の存在を示す。結合定数(3JHCOP= 8-10Hz)の分析から推定されたリン酸基の位置は、31P非結合試験およびHMQC試験によって確認される。微量な生成物は同定されなかった。
【０２００】
5.2.2.5 Ins P5の特性決定
InsP5が最初の形成された生成物であり、かつそれがInsP4に直ちに分解されるならば、NMRによってそれを特徴づけることができるように、HPLCによってそれを十分に単離することはできない。この困難を回避するために、Ins P5は、少量のフィターゼを含む17℃で行われた加水分解動態中にin situにおいて特徴づけられた(以下を参照)。これらの条件下では、Ins P5の陽子スペクトル(COSY、TOCSYおよび1D差分スペクトル)を得ることができるであろう。すべてのこれらのスペクトルは、Ins(1、2、4、5、6)P5を特徴づけることができ、3位(または1位)が脱リンを受ける最初の位置であることを示している。Ins P5の31Pスペクトルは記録されなかった(図8)。
【０２０１】
5.2.3 InsP6の加水分解の速度
予備的な研究は、第１に、酵素が重水素の存在に非感受性であったことを示し、第２に、観察の技術的な制約に関して、速すぎずも遅すぎずもない速度を示す酵素の濃度を調節することを可能にする。
【０２０２】
温度(この場合17℃)および酵素の濃度によって、速度は遅くなりうる(1μlの酵素)。また、最初の中間物の出現が容易に観察された。この条件下では、InsP5のスペクトル特性が得られ、Ins P5、Ins P4およびIns P3の連続した出現がはっきり認められた。
【０２０３】
5μlの酵素の存在下では、Ins P2、Ins P1およびイノシトールの形成が観察される。中間フェーズにおいて、得られたスペクトルの複合性は、Ins Pnsの混合性を説明する。10時間後、加水分解は完全ではない。20μlの酵素の存在下では、完全な加水分解が、およそ4時間において得られた。これらの動態の結果は、事前に観察された6つのリン酸結合の加水分解を確認する。これらは、最後の2つの結合の加水分解が他のものよりも明らかに遅いことを明確に示している。培地中において蓄積するリン酸塩の阻害作用がこの部分的原因であると考えられる(図9、10および11)。
【０２０４】
この研究において、我々は、D.castellii フィターゼによるフィチン酸の加水分解の経路を説明した。クロマトグラフィーによる分析、およびホモおよびヘテロ核NMRにおる分析は、形成された成分および様々なIns Ps：Ins P5、Ins P4、Ins P3、Ins P2およびIns P1の構造を明白に決定することを可能にする。脱リン酸化の順序が図５において示されている。これは、形態3/4/5/6/1、2において要約することができる。位置1および3および4および6の異性体はNMRによって識別可能ではないが、我々は、HPIC分析によって、3位および次に4位のリン酸基が加水分解される最初の2つであることを決定することができた。NMRによって追従された速度論は、この観察を確証あるものにしている。後の加水分解は水酸基に隣接したリン酸塩上にある。最後の2つのリン酸結合Ins(1,2)P2の加水分解は、同時に起こる。しかしながら、2位の加水分解の速度は、1位(または3位)の加水分解の速度と比較して1/2程度と低い。最後に、使用される方法(酵素的、HPLCまたはNMR)に関係なく、加水分解後のイノシトールの量的産生は、6つのリン酸結合が酵母D.castelliiのフィターゼによって加水分解されることを示している。このフィターゼは多くの微生物フィターゼと同様に3-フィターゼ(EC 3.1.3.8)として分類することができる。
【０２０５】
例２：組み換えフィターゼのクローニング、過剰発現および生化学的特性決定
材料および方法
生物、ベクターおよびオリゴヌクレオチド配列
この研究において使用される株、プラスミドおよびプライマーは、表７に記載されている。
【表７】
2009500029.tif 000009
【０２０６】
酵母デバリオミセス カステリ CBS 2923は、好気性の条件下および28℃でこれらの容積の1/10まで充填されたエルレンマイヤーフラスコにおいて培養される。ゲノムDNAが抽出される場合、株は、500mlのYPD培地または20mlのMSA培地の存在下において培養される。
【０２０７】
DNA増幅に使用される大腸菌株、XL1-Blue MRF'は、アンピシリン(100mg/l)を補充したルリア-ベルターニ培地(Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA)の存在下において、あるいはそのpHが水酸化ナトリウムで7.5に調節され、ゼオシン(25mg/l)を補充された「低塩」ルリア-ベルターニ培地(5g/l NaCl)の存在下において、好気性条件下および37℃でこれらの容積の1/10まで充填されたエルレンマイヤーフラスコにおいて培養される。培養が固形培地において行われる場合、上述の培地は15g/lのBacto寒天が補充される。
【０２０８】
酵母株Pichia pastoris X33は、フィターゼをコードする遺伝子の異種起源の発現に使用される。形質転換体は、ゼオシン(100mg/l)を補充したYPDS寒天培地上で28℃の好気性条件下で選択される。
【０２０９】
ベクターpGEM-T(Promega)は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅された断片の大腸菌でのクローニングのために、およびDNAの配列決定のために使用される。このプラスミド中における選択マーカーは、アンピシリン耐性遺伝子である。２つの発現ベクター、pPICzαBおよびpGAPZαBが使用される(表７)。ベクターpPICzαBは、P.pastorisにおいて対象の遺伝子の高レベルの発現を得ることができ、かつ組換え型タンパク質の発現がメタノール誘導性であるアルコール(メタノール)オキシダーゼ遺伝子(AOX1)のプロモーターを含む。(Cereghino, J.L. and Cregg, J.M. (2000) Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Fems Microbiology Reviews 24, 45-66)。ベクターpGAPZαBは、P.pastorisにおいて組換え型タンパク質の恒常的な発現を高レベルで可能にするグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GAP)遺伝子のプロモーターを含む(Waterham, H.R., Digan, M.E., Koutz, P.J., Lair, S.V. and Cregg, J.M. (1997) Isolation of the Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and regulation and use of its promoter. Gene 186, 37-44)。また、これらの2つのベクターには、細菌の複製に必要な配列がある。これらのベクターで形質転換されたクローンの選択は、選択マーカー、ゼオシンに基づいており、この選択は、P.pastorisおよび大腸菌の両方において適用することができる。さらに、組換え型タンパク質は、S.cerevisiaeα因子のシグナル配列を備えた融合体として発現する。
【０２１０】
培地
D. castellii CBS 2923は、100mMフタル酸バッファーでpH 5.4でバッファーされたYPD培地(10g/l酵母エキス、20g/lペプトン、20g/lグルコース)またはMSA-B培地(例1、材料および方法を参照)の存在下において培養される。形質転換後、P.pastoris X33形質転換体は、固体のYPDS培地(10g/l酵母エキス、20g/lペプトン、20g/lグルコース、1Mソルビトール、20g/l Bacto寒天)上で選択される。寒天培地における産生クローンの選別中、P.pastoris形質転換体は、100ml/l FM21塩(10× FM21: 1.5g/l CaSO4.2H2O、 23.8g/l K2SO4、19.5g/l MgSO4.7H2O、6.5g/l KOH、H3PO4 85% 3.5% v/v)、、10ml/l PTM1微量元素(100× PTM1: 2g/l ZnCl2、6.5g/l Fe(SO4).7H2O、0.6g/l CuSO4. 5H2O、0.3g/l MnSO4.H2O、10mg/l KI、2mg/l H3BO4、20mg/l Na2MoO4、H2SO4 96% 0.2%)、4g/l(NH4)2SO4、12g/l H2PO4NH4および80μg/l D-ビオチンを、200mM 酒石酸塩リン酸バッファーでpH 5.4でバッファーした0.5%、20g/l Bacto寒天でグルコースまたはメタノールを含む合成固形培地上で培養される。産生クローンを液体培地中において選択する場合、P.pastoris形質転換体は、200mM 酒石酸塩リン酸バッファーでpH 5.4でバッファーされた炭素源(10g/lグルコース、20g/lグリセリンまたは3.9g/lメタノール)、100ml/l FM21塩、10ml/l PTM1微量元素、4g/l(NH4)2SO4、12g/l H2PO4NH4および80μg/l D-ビオチンを含む合成培地の存在下において培養される。培養をバイオリアクターにおいて行う場合、前培養は、YMPG培地(3g/l酵母エキス、3g/l麦芽エキス、5g/lペプトン、10g/lグルコース)の存在下において行われ、その後、合成培地：200mM酒石酸塩リン酸バッファーでpH 5.4でバッファーされた40g/lグリセロール、100ml/l FM21塩、10ml/l PTM1微量元素、4g/l(NH4)2SO4、12g/l H2PO4NH4および80μg/l D-ビオチンの存在下において行われる（Klein et al., 1998）。バッチ モード培養は、40g/lグリセロールまたは20g/lグルコース、100ml/l FM21塩、10ml/l PTM1微量元素および80ug/l Dビオチンを含む合成培地の存在下において行われる。第２のバッチ培養が行われる場合、グリセロールの溶液は40g/lのグリセロールの最終濃度を有するように発酵槽に加えられる。この付加は、最初に存在するグリセロールの完全な消費の後に行われ、溶存酸素量の急激な増加によってこれを視覚化することができる。流加バッチ モード培養は、400g/lグリセロール、400g/lグルコースまたは780g/lメタノール、50ml/l PTM1微量元素および1mg/l Dビオチンを含む合成培地が供給される。連続モード培養は、合成培地：66.67g/l メタノール、50ml/l FM21塩、25ml/l PTM1微量元素および500μg/l Dビオチンが供給される。
【０２１１】
ゲノムDNA抽出物
ゲノムDNA(gDNA)の急激な抽出
MSA培地の存在下においてD.castellii CBS 2923の培養物に由来する細胞を、培養の9時間後に採取し、遠心分離機にかけ(3500×g、20分、+4℃)、10mlの滅菌水中において洗浄する。その後、細胞を、200μlの溶解バッファー(10mMトリス=HCl、pH 8、1mM EDTA、100mM NaCl、2% v/v トリトンX-100、1% w/v SDS)、200μlのガラスビーズ(直径0.45-0.5mm)およびフェノール/クロロホルム/イソアミル アルコール(25/24/1; v/v/v)の200μlの混合液に再懸濁する。細胞溶解は、3分間にわたる激しい撹拌によって行われ、その後に200μlのTEバッファー(10 mMトリス-HCl、1mM EDTA、pH 8)が加えられる。この溶液を遠心分離機にかける(8000×g、5分、+4℃)。タンパク質は、１体積のクロロホルム/イソアミル アルコール(24/1; v/v)の混合液および遠心分離(8000×g、2分、+4℃)で水相から抽出される。ゲノムDNAを、1mlの無水エタノール(-20℃)、遠心分離(12000×g、5分、+4℃)で沈殿させ、370μlのTEバッファー中において再溶解させる。RNAは75μg/mlのRNase Aの存在下において+37℃で15分間にわたるインキュベーションによって除去される。その後、DNAを無水エタノール(-20℃)で再懸濁し、50μlのTEバッファー中において再懸濁し、-20℃で保存した。
【０２１２】
液体の高分子量酵母DNAの調製
500mlのYPD培地の存在下におけるD.castellii CBS 2923の培養物に由来する細胞を、対数期中に採取し、遠心分離機にかけ(6000×g、15分、+4℃)、40mlの滅菌水中において洗浄する。ペレットを、40μlの2M ジチオトレイトールおよび5mg(5000単位)のチモラーゼ 100T(ICN、Biomedical、32093)を含む3.5mlのSCE溶液(1M ソルビトール、0.1M クエン酸ナトリウム、60mM EDTA)に再溶解させ、+37℃で1時間にわたってインキュベートする。7mlの溶解溶液(0.5M トリス-HCl、pH 6.5、3.2% w/v ナトリウムサルコシル、0.2M EDTA、100 μg/ml プロテイナーゼK (Roche Diagnostics, Meylan, France))をその後に加え、その懸濁液を+65℃で15分間にわたってインキュベートし、その後、周囲温度に急冷する。
【０２１３】
スクロース勾配は、超遠心分離用チューブ内に11mlの20%w/v スクロース、11mlの15% w/vスクロースおよびその後に3mlの50%w/vスクロースを連続的に注ぐことによって調製する。溶解した細胞懸濁液を、勾配上にゆっくりと載せ、続いて+20℃で26000rpm、3時間にわたって超遠心分離機にかけた(Centrikon T-1075超遠心分離機(Kontron Instrument)。勾配中に雲を形成するDNAを、ピペットで回収し、エタノールで沈殿させ、100μlのTEバッファー(10のmMトリス=HCl、1mM EDTA、pH 8)に再懸濁する。RNAは、50μg/mlのRNase Aの存在下において+37℃で3時間にわたるインキュベーションによって除去される。gDNAを、エタノールで再度沈殿させ、続いて200μlのTEバッファー中に再懸濁し、-20℃で保存する。
【０２１４】
フィターゼ遺伝子のクローニング
遺伝子の第１の断片の増幅
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、鋳型として急速なゲノムDNA抽出方法によって得られたD.castellii CBS 2923 gDNAを使用して行われる。一対のプライマーphyt-Nter-for/phyt-pep1-rev は、タンパク質の配列に基づいて設計され、縮重度を最大まで制限する（表７）。DNAは、Minicyclerサーモサイクラー(MJ Research)を使用して、Taqポリメラーゼ(Promega)によって増幅される。+94℃で3分間にわたるgDNAの第１の変性後、増幅は以下の温度プログラムに従って30サイクルにおいて行われる：+94℃で1分間の変性、+45℃で1分間のハイブリダイゼーション、その後に+72℃で1分間の重合。これらのサイクルは、+72℃で10分間のプラトーによって追従される。
【０２１５】
フィターゼ遺伝子の完全な配列のクローニング
遺伝子の完全な配列は、供給者の指示書に従った「ゲノム ウォーキング」技術(Universal Genome Walker  Kit, BD Biosciences)を使用して得る。「液体の酵母高分子量DNA調製」方法によって抽出されたD.castellii CBS 2923 gDNA(2.5 μg)は、4つの制限酵素で+37℃で16時間にわたって別々に消化される(50単位のDraI、EcoRV、PvuIIまたはStuI)。各断片は平滑末端を有する。断片は、フェノール/クロロホルムでの抽出によって精製され、エタノールで沈殿する。その後、断片は+16℃で16時間にわたって「ゲノム ウォーキング」キットで提供されたアダプターにライゲートされる。ライゲーションは、+70℃で5分間にわたって加熱することによって停止し、続いて9体積のTEバッファーの添加を行う。4つのライブラリーがこのように構築され、「DraI、EcoRV、PvuIIおよびStuIライブラリー」と命名される。第１のゲノム ウォーキング サイクルは、鋳型およびアダプターに特異的なプライマーAP1を含む１対のプライマーおよび遺伝子に特異的なプライマー5phyt-spe-1/3phyt-spe-1として各ライブラリーを使用して行われる(表7)。この最初のPCRのサイクルの効率は、1.5% LEアガロース電気泳動ゲル上で確認される。最初のPCRに由来する混合物は、50倍に稀釈され、第2のPCRサイクルに鋳型として使用される。この第2のサイクルは、第2のアダプターに特異的なプライマーAP2および遺伝子に特異的なプライマー5phyt-spe-2/3phyt-spe-2を使用して行われる(表7)。このように増幅された断片は、1.2%の低融点アガロース電気泳動ゲル上で分離され、「GeneClean」キットを使用して精製され、配列化するためにベクターpGEM-Tにクローンされる。第２のゲノム ウォーキング サイクルは、遺伝子の完全な配列を得るために必要である。各ライブラリーについて、2つのPCR増幅サイクルが、プライマーAP1/3bisphyt-spe-1を第１のサイクルに使用し、かつAP2/3bisphyt-spe-2を第２のサイクルに使用して事前に行われる(表7)。
【０２１６】
発現プラスミドの構築
発現ベクターpPICZαBおよびpGAPZαBを使用してP.pastoris中のphytDc遺伝子をクローニングするために、遺伝子の完全な配列がPCRによって増幅される。このPCRは、鋳型として、Pfu Turbo ポリメラーゼ(Stratagene)を使用する急速なゲノムDNA抽出方法によって抽出されたD.castellii CBS 2923 gDNAを使用して行われる。この増幅の間、使用される一対のプライマー、phytDc-PstI-forおよびphytDc-XbaI-rev (表7)は、遺伝子の位置'5および3'において、PstIおよびXbaI 制限部位の生成をそれぞれ可能にした。+95℃で2分間にわたるgDNAの第１の変性後、増幅が、以下の温度プログラムに従って25サイクルにおいて行われる：+95℃で30秒間の変性、+55℃で30秒間のハイブリダイゼーション、続いて+72℃で1.5分間の重合。これらのサイクルは、+72℃で10分間のプラトーによって追従される。変異の欠如は配列によって確認される。
【０２１７】
形質転換
大腸菌 XL1-blue MRF'細胞は、Sambrook et al.(Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA)に記載されたようなヒートショックによって形質転換される。P.pastoris X33細胞は、エレクトロポレーション(Invitrogen instruction manual pPICZαA, B and C, version E or Invitrogen instruction manual pGAPZαA, B and C, version F, Invitrogen Ltd., UK)によって形質転換される。形質転換は、1.5kVの電圧および25μFのキャパシタンスで設定された遺伝子パルサー装置(Biorad)、および200ohmsに設定されたパルス コントローラー(Biorad)を使用して行われる。
【０２１８】
配列の合成および分析
PCRプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、会社MWG-Biotech(ドイツ)によって合成された。N-末端配列およびフィターゼの内部ペプチドのマイクロシークエンスは、メーカーに推奨された試薬および方法を使用して、タンパク質マイクロシークエンサー(Beckman/porton LF 3000)を使用して行われた。マイクロシークエンサーは、268nmでのUV検知器(Beckman 166)を含むRP-HPLC クロマトグラフィーシステム(Beckman 125S)に直接接続される。データは、Gold V8.20ソフトウェアで処理される。ヌクレオチドまたはタンパク質配列と標準化されたデータベースとの間の局所的なアライメントについての捜索が、BLAST2(Basic Local Alignment Search Tool)およびFASTAソフトウェアで行なわれる。2つの配列間の比較は、核酸またはタンパク質LALIGNおよびFASTAパッケージのLFASTAプログラムで行なわれる。これらのプログラムは、Infobiogenサーバー(http://www.infobiogen.fr)で利用可能である。シグナル ペプチドの予測、およびタンパク質配列からの理論的なpHi値の計算は、Antheprot 2000 V5.2リリース1.1.6ソフトウェアで行われる。糖鎖付加部位は、NetNGlyc 1.0、DictyOGlyc 1.1およびNetOGlyc 2.0サーバーを使用して予測される（Centre for Biological Sequence Analysis, Technical University of Denmark）。
【０２１９】
液体培地における産生クローンの選択
P.pastoris pGAPphyt 形質転換体を、10g/lのグルコースを含む5mlの合成培地の存在下において+28℃で培養する。48時間後、培養液を1676×gで5分間にわたって遠心分離する。上澄みを+4℃で保存する。P.pastoris pPICphyt形質転換体は、グルコースの代わりに20g/lのグリセロールを含む5mlの同一の培地の存在下において+28℃で培養される。48時間後、培養液を1676×gで5分間にわたって遠心分離する。recPhytの産生は、グルコースの代わりに、3.9g/lのメタノールを含む2.5mlの同一培地を、細胞を含むチューブに加えることによって誘導される。誘導の24時間後、培養液を1676×gで5分間にわたって遠心分離し、グルコースの代わりに、3.9g/lのメタノールを含む2.5mlの同一培地を、細胞を含むチューブに加える。誘導の24時間後、細胞を1676×gで5分間にわたって遠心分離する。上澄みを+4℃で保存する。これらの培養は13ml無菌チューブにおいて行われる。
【０２２０】
組み換えのフィターゼの産生
エルレンマイヤーフラスコにおける前培養
前培養を、これらの体積の1/10まで充填されたエルレンマイヤーフラスコ中においてYMPG培地の存在下において行う。これらを24時間にわたって振盪しながら(1分間当たり80振動、振幅7cm)、+28℃でインキュベートする。その後、前培養物を24時間にわたって合成培地の存在下において産生する。
【０２２１】
バイオリアクターにおける培養
バッチ、流加および連続モード培養は、1 lまたは3 lのApplikon発酵槽(オランダ)において行われる。pHは、16%(v/v) NH3または2N H2SO4の自動添加によって4に調節され、また、温度は+28℃で維持される。泡の形成を防ぐために、Biospumex 153K泡止め(Cognis Dusseldorf、ドイツ)を培養液中に加える：流加 モード培養については5% v/v泡止めまたは連続モード培養については1%(v/v)。溶存酸素分圧を、Applisensプローブ(オランダ)を使用して測定し、撹拌および通気の制御によって30%を越える値で維持する。
【０２２２】
培養物のデータの収集および立証は、Applikon BioExpertソフトウェアを使用して行われる。
【０２２３】
培養条件
例１(発酵槽における培養)を参照されたい。
【０２２４】
バイオマスの濃度の測定
細胞濃度を、600nmで分光測光器(DU530, Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA, USA)を使用して光学濃度(OD)によって測定する。
【０２２５】
１つのOD単位は、グリセロール上の0.462gの固体/l(g S/l)、メタノール上の0.442 gS/lおよびグルコース上の0.491g S/lに相当する。
【０２２６】
組み換えフィターゼの精製
例1、材料および方法3を参照されたい。
【０２２７】
SDS-PAGE電気泳動
例1、材料および方法4を参照されたい。
【０２２８】
タンパク濃度の測定
例1、材料および方法7.2を参照されたい。
【０２２９】
酵素の技術
寒天培地におけるフィターゼ活性の検出
フィターゼ活性については、ポリアクリルアミドゲルにおいてホスファターゼの特異的視覚化のために修飾されたKim et al. (Kim, Y.O., Kim, H.K., Bae, K.S., Yu, J.H. and Oh, T.K. (1998) Purification and properties of a thermostable phytase from Bacillus sp. DS11. Enzyme Microb. Technol. 22, 2-7)の方法を使用して検出する。P.pastoris形質転換体は、使用するベクターに基づいて、0.5%のグルコースまたはメタノールを含む固体の合成培地上で+30℃の好気条件下で培養される。これらの培養物を、3日間にわたってインキュベートする。修飾されたベクターpPICzαBで形質転換されたP.pastorisクローンの場合には、50μlのメタノールを3日目からペトリ皿のふたに毎日加える。視覚化溶液(10g/l Bacto寒天、2g/l α-ナフチルホスファート、1g/l FastGarnetGBC、0.92g/lフィチン酸ナトリウム、0.25M酢酸ナトリウムバッファーでpH 5.5でバッファーされた)を、使用の直前に調製し、45℃まで冷却し、微細な層としてのコロニー上に注入した。フィターゼ産生クローンの染色(茶色、濃赤色)が直ちに現われる。
【０２３０】
フィチン酸塩加水分解によるフィターゼ活性の測定
例１、材料および方法7.3を参照されたい。
【０２３１】
p-ニトロフェニル リン酸塩(p-NPP)加水分解によるフィターゼ活性の測定
活性は、酵素速度の現実化することによって決定される。pH 5.5(125mM酢酸ナトリウム)でバッファーされた反応培地(合計において２体積)は、6mMのp-ニトロフェニルホスファート、および稀釈された酵素抽出物を含む、あるいは含まない(１体積)。周囲温度での様々なインキュベーション期間の後、0.3 N水酸化ナトリウム(１体積)を加えて反応を停止させ、培地を塩基化して染色を明らかにする。吸光度を、Sanofi Pasteur PR 2100マイクロプレート リーダ分光測光器を使用して450nmで測定する。酵素の単位(U)は、定義された条件：周囲温度、pH 5.5のもとでp-ニトロフェニルホスファートの溶液から毎分１マイクロモルのp-ニトロフェノールを放出する酵素の量として定義される。測定ラインは、p-ニトロフェニルホスファート(0.012-0.12 μmol)で前もって確立された。
【０２３２】
速度論の研究
例1、7.5および7.6を参照されたい。
【０２３３】
配列
フィターゼ遺伝子の特性決定
D.castellii CBS 2923のフィターゼ遺伝子のクローニング
純粋なD.castellii フィターゼの内部ペプチドおよびN-末端のペプチドをシークエンスした。これらのペプチド配列から、PCRプライマーを縮重度を最大まで制限して設計する（表７）。PCRを、鋳型としてD.castellii CBS 2923 gDNAを使用して行う。従って、約300塩基対(bp)の断片を増幅することができる。D.castellii CBS 2923 フィターゼ遺伝子の完全な配列をクローニングするために、我々は、「ゲノムウォーキング」技術を使用することを選択する。事前に得られた300bp断片の配列から、断片の終端に対応し、かつこの断片に隣接する配列の増幅を可能にするプライマーを合成する（表７)。PCRを鋳型としてD.castellii CBS 2923 gDNAライブラリーを使用して行う。最初のサイクルは、EcoRVおよびPvuIIライブラリーの各々から、300bp配列の約1600bp上流および約1100bp下流の断片を増幅することを可能にする。従って、我々は、3'位においてトランケートされた1325bpのオープン リーディング フレーム(ORF)を含む約3000bpの断片を再構築することができた。第２のPCRサイクルは、第１のPCR中に得られた断片の3'終端から設計された新しいプライマーを使用して行われた。このPCRは、EcoRVライブラリーから約100bpの断片を増幅することを可能にした。我々は、1386bpオープン リーディング フレームを再構築することができた。このORFから推定されたタンパク質配列は、事前にシークエンスされた２つのペプチドを含み、この遺伝子がD.castellii CBS 2923 フィターゼ(配列番号１を参照)をコードする遺伝子に対応することを確認することができる。配列を検証するために、遺伝子の終端に対応するプライマーを合成した（表７)。完全な遺伝子をPCRによって増幅し、その配列から事前に得られた配列を確認した。
【０２３４】
ヌクレオチドおよびタンパク質配列の分析
「ゲノムウォーキング」試験によって、2990bp断片を再構築することができる。この断片は、「phytDc配列」と呼ばれる1386bpのオープン リーディング フレームを含む。対応する461 アミノ酸タンパク質配列は、いくつかのモチーフ(配列番号２)を含む。RHGERYPモチーフは、多くの高い分子量酸性ホスファターゼの活性部位中に存在するRHGXRXPコンセンサス配列に対応する。配列はまたC-末端部位中にHDモチーフを有し、多くのフィターゼ配列中に存在するモチーフである。N-末端の配列は、推定されたタンパク質の第２のアミノ酸から始まる。これは、このタンパク質が、排出されるが、シグナル ペプチドを持っていないことを示すようである。この観察は、Antheprotソフトウェアを使用して潜在的なシグナル ペプチド切断部位を探索するときにネガティブな結果が得られたという事実によって支持される。推定されたタンパク質は51.2 KDaの測定された分子量を有する。D.castellii CBS 2923において発現したタンパク質を使用して質量分析によって実験的に得られた質量(53/55 kDa)と同様、エンドグリコシダーゼ Hにまで精製および脱グリコシル化される。質量における差異は、エンドグリコシダーゼHによって除去されない、N-アセチルグルコサミン残基またはO-グリコシル化モチーフの存在によって説明することができる。タンパク質配列の分析は、9つの潜在的なN-グリコシル化部位および4つの潜在的なO-グリコシル化部位の存在を示す。このタンパク質のpHiは、4.3と測定される。データベースでの相同性のための探索は、D.castellii CBS 2923 フィターゼが酵母または菌起源の様々なフィターゼで21〜36%の相同性を有することを示す。これらのフィターゼの配列のサイズは非常に類似しており(440-480のアミノ酸)、D.castellii CBS 2923 フィターゼは、その配列の全長にわたって完全にアライメントしない。phytDc配列は、その全長にわたって、S.occidentalis フィターゼの配列と69.2%の相同を有する。S.occidentalis フィターゼをコードする遺伝子の配列が相補的DNAから得られたので、このアライメントから、我々はD.castellii フ
ィターゼをコードする遺伝子がイントロンを有しないという考えに至る。さらに、この配列は、ホスファターゼとの相同性を示している。
【０２３５】
組み換えフィターゼの過剰産生体であるP.pastorisクローンの選択
phytDc遺伝子を、PCRによって増幅し、発現ベクターpPICZαBおよびpGAPZαBに挿入した。形質転換体を、ゼオシンを含むYPDS培地上で選択した。形質転換の割合は、1μgのDNA当り102 形質転換体である。ベクターpPICZαBで得られたクローンは、「PICクローン」と呼ばれ、ベクターpGAPZαBで得られたクローンは「GAP クローン」と呼ばれる。各形質転換について、100クローンを任意にサンプリングし、その組み換えフィターゼ(recPhyt)の産生を、寒天培地中で評価した。視覚化の後、最も高い産生体であるクローンには、コロニーの周囲に褐色の環が現れる。96%のPICクローンと66%のGAPクローンは産生体である。最も高い産生体であるクローンの中で、10 GAPクローンおよび10 PICクローンがエルレンマイヤーフラスコ中の合成培地上で試験された。各クローンについては、培養上清中のフィターゼ活性(p-NPPの加水分解によって測定)に対するバイオマスの割合(ODを測定することによって評価)が決定された。その割合は、PICクローンの中では0〜0.48、GAPクローンについては1.28〜6.07に及ぶ。これらの培養条件下では、GAPクローンが最良の産生体である。Waterhamら(Waterham, H.R., Digan, M.E., Koutz, P.J., Lair, S.V. and Cregg, J.M. (1997) Isolation of the Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and regulation and use of its promoter. Gene 186, 37-44)によれば、グルコース上で培養中のGAPプロモーターは、エルレンマイアー培養中、メタノール上での培養におけるAOX1プロモーターよりも強く見える。
【０２３６】
第１に、この選択過程を完全にするために、PIC81およびPIC61クローンについて、および第２に、GAP29およびGAP66のクローンについて発酵槽中において試験した。PICクローンについては、グリセロール(40g/l)上の2つの連続的なバッチが、流加培養 モード中のメタノール(780g/l)での誘導前に高いバイオマスを得ることを可能にする。GAPクローンについては、グルコース(20g/l)上の第１のバッチ培養が、グルコース400g/l上での流加培養モードにおける産生のフェーズによって追従される。PIC81クローンは、81g S/lの最終バイオマスを得ることを可能にする。しかし、PIC61クローンの最終バイオマスは、わずかに65g S/lである。他方、２つのクローンは、同量のrecPhyt(100 U/ml)を実質的に産生する。GAPクローンは、培養の終わりに同一の増殖(100g S/l)を示す。しかし、得られた生成物は、GAP29クローンについては11 U/mlであり、GAP66クローンについては9U/mlである。得られた組み換え株は、それぞれ野生型のD.castellii CBS 2923株と比較して100倍(PIC株)および10倍(GAP株)以上のフィターゼを生成する。PIC81およびGAP29クローンによる産生は、発酵槽中において最適化された。
【０２３７】
組み換えフィターゼの産生
恒常的発現 - GAPクローンによる産生上での炭素源および特定の増殖速度の影響
recPhytの産生について、流加培養モードにおけるグルコース(400g/l)、グリセロール(400g/l)およびメタノール(780g/l)上での培養において研究した。結果は表８に与える。
【０２３８】
表８： GAP29クローン 流加培養中に得られたパラメーターの比較。
【０２３９】
すべての試験について、バッチ フェーズは、40g/lのグリセロールを含む同一培地上で行われた。
【表８】
2009500029.tif 000010
【０２４０】
a：    これらの値は各フェーズ中で得られた値に相当する。
【０２４１】
b：    これらの値は培養の最終時点での値に相当する。
【０２４２】
第１の２つの基質について、グリセロール(40 g/l)上でのシングル バッチは、20g/lのバイオマスおよび0.2／時間の特定の増殖速度に達することを可能にする。流加培養前の定常フェーズの期間に依存して、recPhytの産生が異なる：12時間の定常フェーズにわたる7U/ml、すなわち340U/g Sの領域において、3時間の定常フェーズにわたる5.5U/ml、すなわち275U/g Sにおいて。0.01／時間の課された特定の増殖速度のグルコースおよびグリセロール上での流加 モードにおける産生は、55g/lのバイオマス、16.5U/ml、すなわち280 U/g Sのフィターゼ産生に達することを可能にする。グリセロール(40g/l)および0.01／時間の課された特定の増殖速度での２つのバッチの後のメタノール上での流加培養中、達したバイオマスは84g/lであり、フィターゼ産生は14.5U/ml、すなわち112U/g Sである。0.04／時間の課された特定の増殖速度のグルコースおよびグリセロール上での硫加培養モードにおける産生は、80g/lのバイオマスおよび16.5U/ml、すなわち200U/g Sのフィターゼ産生に達することを可能にする。
【０２４３】
フィターゼ産生がGAP プロモーターの制御下にある場合、グルコースおよびグリセロールは、メタノールと比較して組み換え体フィターゼの産生のためのより優れた基質であり、増殖により有利である。
【０２４４】
誘導性発現 - PICクローンによる産生での特定の増殖速度の影響
PIC81クローンによる産生は、流加培養モード(図６および表９)、および連続培養モード(図６および表９)中において研究された。
【表９】
2009500029.tif 000011
【０２４５】
a：    これらの値は各フェーズ中に得られた値に相当する。
【０２４６】
b：    これらの値は培養の最終時点の値に相当する。
【０２４７】
c：    各希釈率について、測定は、発酵槽内容物の少なくとも３回の更新後に行なわれた。
【０２４８】
流加培養において、２つの特定の増殖速度(μ)の値を課した(0.01／時間および0.03／時間)。得られたバイオマスは、μ=0.01／時間(52 g/l)よりもμ=0.03／時間(82 g/l)で1.5倍高い。フィターゼ産生は、２フェーズ中において起こる（表９）。0.01／時間の課された特定の増殖速度について、第１のフェーズは、1105U/g Sのフィターゼの産生で28.8g/lのバイオマスの産生をもたらす。第２のフェーズ中、22.9g/lのバイオマスが得られ、フィターゼ産生が2342 U/g S、すなわち107U/mlに達する。同様の結果がμ=0.03／時間で得られ、フィターゼ産生が第１のフェーズ中の472 U/g Sから第２のフェーズ中の880 U/g S、すなわち64U/mlまでになる。特定の増殖速度における増加は、組み換えフィターゼの産生に対するよりも細胞増殖により優位である。連続培養において、４つの希釈速度が課された（表９)。0.053／時間よりも大きい希釈率値について、平衡でのバイオマスは27g/lであるが、0.032時間の希釈率でわずか21.6g/lである。流加培養モードの培養におけるように、希釈率の増加は、バイオマスの産生には好意的であるが、組換え型タンパク質の産生には有害である。極大値、2700U/g S、すなわち57.7U/mlは、0.032時間の希釈率のために得られる。誘導性システム(AOX1プロモーター、PIC81クローン)および恒常的システム(GAP プロモーター、GAP29 クローン)によるフィターゼの産生の比較は、AOX1プロモーターがGAP プロモーターよりも明白に優れていることを示している。PIC81株は、107 U/mlの組み換えフィターゼ、すなわち、GAP29株(16U/ml)の7倍量を得ることを可能にした。特定の産生体は、それぞれ、2700 U/g S(PIC81)および340 U/g S(GAP29)、すなわち、D.castellii株よりも、すなわち100および10倍大きい。
【０２４９】
精製
材料および方法の項目において記載されるように、PIC81クローンの１つの流加培養モード後に得られた上清が、１ステップにおいて精製された。特定のフィターゼ活性が、粗製抽出物において101 U/mgのタンパク質、および精製された抽出物において182 U/mgのタンパク質である。したがって、精製因子は1.8である。この比較的低い値は、組み換え体フィターゼが粗製抽出物において支配的なタンパク質であることを示唆している。この仮説は、SDS-PAGE 電気泳動を行なうことによって確認された。ゲル上において、組み換えフィターゼに対応するバンドが、全タンパク質の60%に表わす。さらに、精製後、単一のバンドが観察され、それにより、均質なタンパク質の精製を確認する。
【０２５０】
精製後に得られた特定の活性は、P.pastoris(43U/mgのタンパク質)(Rodriguez, E., Mullaney, E.J. and Lei, X.G. (2000) Expression of the Aspergillus fumigatus phytase gene in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 268, 373-378)におけるアスペルギルス フミガタス（Aspergillus fumigatus）フィターゼの発現中に得られたものよりも大きい。
【０２５１】
組み換えフィターゼの特性決定
pHの影響
RecPhytは、2〜6.5のpH値について活性であり、最適値は4〜4.5の間にある。D.castellii CBS 2923 フィターゼは、同様の特性を示す。
【０２５２】
温度の影響
様々な温度でのフィターゼ活性の測定は、組み換えフィターゼがD.castellii CBS 2923 フィターゼのように+60℃での最適値で高温のためにより活性であることを示す。最適温度について前述した値の大半は、いくつかの菌類および酵母、例えば、アスペルギルス フィクウム（Aspergillus ficuum）(+58℃) (Ullah, A.H.J. and Gibson, D.M. (1987) Extracellular phytase (EC 3.1.3.8) from Aspergillus ficuum NRRL 3135: purification and characterization. Prep. Biochem. 17, 63-91)、アスペルギルス テレウス（Aspergillus terreus）(+70℃) (Yamada, K., Minoda, Y. and Yamamoto, S. (1968) Phytase from Aspergillus terreus. I. Production, purification and some general properties of the enzyme. Agric. Biol. Chem. 32, 1275-1282) および S.カステリ（S. castellii）(+77°C) (Segueilha, L., Lambrechts, C., Boze, H., Moulin, G. and Galzy, P. (1992) Purification and properties of the phytase from Schwanniomyces castellii. J. Ferment. Bioeng. 74, 7-11)を除いて、+45℃未満である。アレニウスの表現は、反応の活性エネルギー、E=37.9 kJ/molを計算することを可能にする。熱変性の研究は、組み換えフィターゼが+67℃未満の温度で安定であり、かつ+70℃を超える温度で強く変性することを示す。アレニウスの表現によって計算された活性化エネルギーはE=794.2 kJ/molである。D.castellii CBS 2923 フィターゼは、同様の熱耐性特性を示す。
【０２５３】
基質特異性
組み換えフィターゼは、0.24mMのKm、フィチン酸ナトリウム上の137.8U/mgのVm、2.05mMのKm、およびp-NPPの274.6U/mgのVmと共に、ミハエリス メンテン速度論に続く。したがって、酵素は、フィチン酸塩についてのより大きな親和性を示す。D.castellii CBS 2923 フィターゼは、同様のKm値を有する。
【０２５４】
速度論の研究
InsP6の分解の主生成物は、DL Ins(1、2、4、5、6)P5およびDL-Ins(1、2、5、6)P4である。したがって、組み換えフィターゼは3-フィターゼである。さらに、クロマトグラムは、InsP6が消耗される以前であってもInsP5、InsP4、InsP3およびInsP2の分解が始まり、InsP3の蓄積があることを示している。これは、組み換えのフィターゼがInsP4、InsP5およびInsP6よりもInsP3について弱い親和性を有することを示唆している。D.castellii CBS 2923 フィターゼは、同じクロマトグラフィープロファイルを示している。
【図面の簡単な説明】
【０２５５】
【図１】図１：pH (pH 3〜3.5、200mM グリシン バッファー; pH 3.5〜7、200mM 酢酸ナトリウムバッファー; pH 7〜7.5、200mM トリス-HCl バッファー)の関数としてのD.カステリ（D. castellii）フィターゼの活性。pH3.5の２つの異なるバッファーで得られた各値は、フィターゼ活性についてのバッファーの性質の影響を示している。
【図２】図２：温度の関数としてのD.カステリ（D. castellii）フィターゼの活性。活性はpH 4、37℃で20分間にわたって測定される。
【図３】図３：D.カステリ（D. castellii）フィターゼの熱変性。その抽出物を、様々な温度で1、10、20、40、60および120分間にわたって、水中(実線)またはpH4の125mM 酢酸塩バッファー(点線)においてプレインキュベートする。その後、活性は37℃で20分間にわたって測定される。
【図４】図４：pH安定性および温度安定性の調査。D.カステリ（D. castellii）のフィターゼ活性は、２つの温度(40℃または60℃)で１時間にわたって様々なpHでの抽出物の処理後に測定される。その活性はpH 4で測定される。
【図５】図５：D.カステリ（D. castellii）フィターゼによるフィチン酸加水分解のスキーム。
【図６】図６：流加（A）および連続（B）モードにおける培養中の増殖速度の関数としての組み換えフィターゼ(丸)およびバイオマス（四角）の観点における収量の展開。
【図７】図７：加水分解の15、75および120分後のD.カステリ（D. castellii）フィターゼによるInsP6の化学加水分解および酵素加水分解後のクロマトグラフィーによる様々なイノシトールリン酸塩の出現のモニタリング。
【図８】図８：InsP1、InsP2、InsP3およびInsP4 を含む４つの加水分解画分のスペクトルの組み合わせおよび比較。代替の割り当ては、イタリック体である。ケミカルシフトのスケールにおいて、この比較を完了するために、速度の開始時点での差異によって得られたInsP5のスペクトルがまた表わされる。プラスのシグナルはInsP5のものであり、2つのマイナスのシグナルは最初のInsP6に対応する。様々なイノシトール リン酸塩の特徴的なこれらのスペクトルは、加水分解速度論の過程において様々な産物の出現および消失を可能にする。
【図９】図９：  遅い速度論を、1.7mMのInsP6の溶液、pH4の10mMの酢酸塩バッファー(500 μl H2O/D2O、16/84  v/v)および1μlの酵素溶液で500MHzおよび17℃で行った。2つのスペクトル間の時間期間は23分である。終夜期間後、反応を加速させるために20μlの酵素を添加した。16時間後、加水分解は完了し、イノシトールのスペクトル特性が得られた（一番上のスペクトル）。これらの速度論は、はっきりとInsP5、InsP4およびInsP3の連続的外観を示す。
【図１０】図１０：より速い速度論は、InsP6の完全な加水分解を行うことを可能にする (600MHz、17℃、500 μl D2O、3.8mMのInsP6、pH4.0、5μlの酵素)。スペクトルを20時間にわたって3分毎に記録した(400スペクトル)。10時間後、加水分解は実質的に完了する。プロットされたスペクトルは、10のうちの１つのスペクトルに対応する(2つのスペクトル間で30分)。いくつかの特性シグナルが注釈される。
【図１１】図１１：加水分解の過程における様々な産物の５時間を越える濃度の展開。このグラフは、各々の産物のための最適な濃度がどの時間に達成されるのかを決定することを可能にする。コメント：各々の化合物のNMRシグナルの特性の高さは、濃度における変化を評価するために使用された。使用されたシグナルは、必ずしも同じ数のプロトンを表わしておらず、必ずしも同じ多様性を有していない。結果として、その濃度は、互いに比較することができない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009500029.tif 000025
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