(57)【要約】  哺乳類多能性幹細胞から内胚葉及び膵臓系列の細胞をより効率的に生産する方法が記載される。これらの方法は、研究又は治療用途のための膵臓細胞型の着実かつ大規模な生産を可能にする、明確にされた培地成分を使用した簡単で再現性のある培養プロトコルを提供する。【選択図】  図１
2009535058.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵臓系列細胞を産生するためのヒト多能性幹細胞の培養方法であって、(a)中内胚葉の方向に分化を誘導する条件下で幹細胞を培養し、ここで条件は有効量の骨形成タンパク質の存在を含み;(b)無傷の胚様体(EB)の形成に適した条件下でステップ(a)からの細胞を培養し、ここでEBは内臓卵黄嚢の層で囲まれ;(c)膵臓系列への細胞の最終分化に適した条件下でステップ(b)のEBからの細胞を培養するステップを含む前記方法。
【請求項２】
ステップ(c)における培養条件が、インスリン、トランスフェリン、セレン、FGF7、ニコチンアミドおよびエキセンディン-4を含有する無血清培地中でEB細胞を培養することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
骨形成タンパク質の量が約10ng/ml〜約100ng/mlである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
骨形成タンパク質がBMP4である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
BMP4の有効量が約50ng/mlである、請求項4記載の方法。
【請求項６】
ステップ(a)の幹細胞が、中内胚葉の方向に分化を誘導する線維芽細胞増殖因子の有効量の存在下でも培養される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
線維芽細胞増殖因子の量が約10ng/ml〜約200ng/mlである、請求項1記載の方法。
【請求項８】
線維芽細胞増殖因子がbFGFである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
bFGFの有効量が約100ng/mlである、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
上皮細胞接着マーカー(EpCAM)を陽性発現して腫瘍形成性の低下を示す膵臓系列細胞を保持するステップ(c)の細胞を選択するステップをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
選択が磁気活性化細胞分離により行われる、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
中内胚葉細胞がOct4およびBrachyury(T)を発現する、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
EBが、Foxa2+、Sox17+およびPDX1+細胞を含む、導管様構造物を有する最終的な胚葉細胞を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
最終分化細胞がインスリン、CペプチドおよびPDX1を同時に発現する、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
ヒト多能性幹細胞由来の培養物を内胚葉および膵臓系列細胞のために遂次的に富化させる方法であって。(a)中内胚葉の方向に分化を誘導する条件下で幹細胞を培養し、ここで条件は骨形成タンパク質および線維芽細胞増殖因子の有効量の存在を含み;(b)無傷の胚様体(EB)の形成に適した条件下でステップ(a)からの細胞を培養し、ここでEBは内臓卵黄嚢の層で囲まれ;(c)膵臓系列への細胞の最終分化に適した条件下でステップ(b)のEBからの細胞を培養するステップを含む前記方法。
【請求項１６】
ステップ(c)における培養条件が、インスリン、トランスフェリン、セレン、FGF7、ニコチンアミドおよびエキセンディン-4を含む無血清培地においてEB細胞を培養することを含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
上皮細胞接着分子(EpCAM)を陽性発現して腫瘍形成性の低下を示す膵臓系列細胞を保持するステップ(c)の細胞を選択するステップをさらに含む、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
選択が磁気活性化細胞分離により行われる、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
骨形成タンパク質の有効量が約10ng/ml〜約100ng/mlであり、線維芽細胞増殖因子の有効量が約20ng/ml〜約200ng/mlである、請求項15記載の方法。
【請求項２０】
腫瘍形成能力を有さない膵臓系列の細胞集団を作製するためのヒト多能性幹細胞の培養方法であって、(a)中内胚葉の方向に分化を誘導する条件下で幹細胞を培養し、ここで条件は骨形成タンパク質の有効量の存在を含み;(b)無傷の胚様体(EB)の形成に適した条件下でステップ(a)からの細胞を培養し、ここでEBは内臓卵黄嚢の層で囲まれ;(c)膵臓系列への細胞の最終分化に適した条件下でステップ(b)のEBからの細胞を培養し;(d)特定の分化系列の決定を示す細胞表面マーカーの発現に対して選択し、ここでマーカーはEpCAMであり、得られた細胞培養物は免疫不全マウスに注射するとき奇形腫を形成しないステップを含む前記方法。
【請求項２１】
Oct4およびBrachyury(T)の発現を特徴とする、請求項20ステップ(a)記載の単離された細胞集団である中内胚葉細胞。
【請求項２２】
Foxa2+、Sox17+およびPDX1+細胞を含む、導管様構造物を有する最終的な胚葉細胞を含む、請求項20ステップ(b)記載の単離された細胞集団であるEB。
【請求項２３】
インスリン、CペプチドおよびPDX1を同時に発現する、請求項20ステップ(c)記載の単離された細胞集団である最終分化細胞。
【請求項２４】
EpCAMを発現し、免疫不全マウスに注射するとき奇形腫を形成しない、請求項20ステップ(d)記載の単離された細胞集団である分化細胞。
【請求項２５】
最終分化膵臓系列細胞を含む、ヒト多能性幹細胞由来の単離された細胞集団であって、前記細胞はインスリン、CペプチドおよびPDX1の1以上を同時に発現する、前記ヒト多能性幹細胞由来の単離された細胞集団。
【請求項２６】
細胞の少なくとも50%がインスリン、CペプチドおよびPDX1の1以上を発現する、請求項25記載の単離された集団。
【請求項２７】
最終分化膵臓系列細胞を含む、ヒト多能性幹細胞由来の単離された細胞集団であって、前記細胞はインスリン、Cペプチド、PDX1およびEpCAMの1以上を同時に発現し、前記細胞は免疫不全マウスに注射されるとき奇形腫を形成しない、前記ヒト多能性幹細胞由来の単離された細胞集団。
【請求項２８】
細胞の少なくとも70%がインスリン、Cペプチド、PDX1およびEpCAMの1以上を発現する、請求項27記載の単離された集団。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】関連出願の相互参照  本願は、2006年5月2日に出願された米国仮出願第60/796,662号に基づく優先権を主張する。前記出願は、参照によりその全体が本願に組み込まれる。 
【０００２】連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載  本開示は、NIH DK042502の資金提供による連邦政府の支援を受けて行われた。アメリカ合衆国は本開示に一定の権利を有する。
【０００３】背景技術  I型糖尿病は、膵島β細胞の破壊により引き起こされるヒトの自己免疫疾患である。現在のところこの疾患は不可逆的であるが、その症状は外因性インスリンの投与により制御される。I型糖尿病はヒト集団において最もよく見られる自己免疫疾患の1つであり、ヒトの主な健康関心事の1つである。
【０００４】  全膵臓または単離された島細胞の移植は、免疫抑制療法と組み合わされるとき、インスリン非依存性を回復させるためのI型糖尿病の有効な治療であることがすでに明らかにされている。ヒト死体ドナー由来の単離された島を用いる現行の療法の成功は、ヒト糖尿病の細胞療法が成功しうることの原則的な証明である。しかしながら、入手可能な臓器または島細胞の不足により、この療法は大変限られた患者に限定されてきた。ヒト死体から採取しうる島細胞の量は大変限られている。従って、かなりの量の島細胞を産生しうる技術は、この疾患の潜在的療法の観点から大変望ましいと考えられる。
【０００５】  霊長類およびヒトの胚性幹細胞(ESC)は、単離され、培養下で増殖されている。胚性幹細胞は、培養下で自己複製および増殖により無期限に維持できるが、多くの異なる系列の細胞に自発的に分化する能力も保持している幹細胞である。非選択条件下で、マウスおよびヒトESCを含むさまざまな幹細胞は、膵臓系列を含む多くの系列の細胞に自発的に分化することがすでに明らかにされている。このような分化細胞は、膵臓系列を特定する転写因子であるpancreatic duodental homeobox 1(PDX1)遺伝子を発現でき、インスリンホルモンを発現できることもすでに明らかになっている。しかしながら、選択条件無しには、幹細胞はさまざまな異なる系列に自発的に分化し、小さい割合の細胞だけが特定の系列に分化する。
【０００６】  hESCのインスリン染色細胞への自発的分化を可能にする培養系が報告されている(Assady, S. et al., Insulin production by human embryonic stem cells. Diabetes 50, 1691-1697 (2001); およびSegev, H. et al., Differentiation of human embryonic stem cells into insulin-producing clusters. Stem Cells 22, 265-274 (2004))。しかしながら、これらの研究は、内胚葉マーカーの発現を調査しておらず、β細胞のステレオタイプな特徴であるCペプチドおよびpancreatic duodenal homeobox 1(PDX1)の同時発現を示す細胞の発生も明らかにしていない。pancreatic duodenal homeobox 1(PDX1)は膵臓形成に必要であり、インスリンプロモーターを同時活性化する(Jonsson, J. et al., Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature 371, 606-609 (1994))。神経細胞などの非β細胞がインスリンを発現することができ(Sipione, S. et al., Insulin expressing cells from differentiated embryonic stem cells are not beta cells. Diabetologia 47, 499-508 (2004))、培地中に存在するインスリンが特定の条件下in vitroで他の細胞型に取り込まれることができるため(Rajagopal, J. et al., Insulin staining of ES cell progeny from insulin uptake. Science 299, 363 (2003))、hESC由来のインスリン染色細胞の内胚葉および膵臓起源を確認することが重要である。
【０００７】  ヒトESCの自発的分化によりPDX1+/FOXA2+細胞が生じ、これらの分化細胞とマウス背側膵(E13.5)の同時移植によりPDX1+/インスリン+細胞が生じ、インスリンおよびCペプチドの同時染色が観察されることが最近報告された(Brolen, G. K. et al., Signals from the embryonic mouse pancreas induce differentiation of human embryonic stem cells into insulin-producing beta-cell-like cells. Diabetes 54, 2867-2874 (2005))。この報告は、胚性膵臓から発せられるシグナルにより自発的に分化するヒトESCから膵臓系列細胞を誘導することができることを明らかにした。しかしながら、この実験方法はハイスループット培養プロトコルに採用するには実際的ではなく、この研究によってはこの分子シグナルの性質は明らかにされなかった。加えて、選択されていない幹細胞集団は腫瘍形成性であり、このことは、免疫不全動物において未分化ES細胞が同様であるように、それらが奇形腫として知られる非悪性腫瘍を生じることを意味する。
【０００８】  ヒトESCの内胚葉への分化に対する増殖因子の効果をいくつかの研究が評価している(Schuldiner, M. et al., Effects of eight growth factors on the differentiation of cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 97, 11307-11312 (2000) およびD"Amour, K.A. et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat. Biotechnol. 23, 1534-1541 (2005)。今なお、最新技術であっても、膵臓前駆細胞および島細胞への再現性のある高い効率の分化は日常的に達成可能ではない。さらにまた、以前報告された方法を用いて作製されたインスリン産生細胞は、成人のヒトβ細胞よりもグルコースに対して感受性が低く(すなわち、機能的成熟が不十分)、むしろ未熟β細胞に近い表現型を有すると考えられる。総合すれば、内胚葉を膵臓前駆細胞に変換し、インスリン発現細胞を機能的に成熟したβ細胞に変換するためには、さらなるシグナルを必要としうることをこれらの研究は示している。胚モデルにおける膵臓発生の増殖因子による調節の研究は、hESCの膵臓系列への分化を指示するための重要な洞察を与えることができる(Wells, J.M. & Melton, D.A. Early mouse endoderm is patterned by soluble factors from adjacent germ layers. Development 127, 1563-1572 (2000))。例えば、ニワトリ-ウズラキメラシステムにおいて、BMP4は分化方向が決定されていない内胚葉においてpdx1発現を誘導し、nogginは分化方向を決定された内胚葉においてpdx1発現を阻害する事が明らかにされた(Kumar, M. et al., Signals from lateral plate mesoderm instruct endoderm toward a pancreatic fate. Dev. Biol. 259, 109-122 (2003))。
【０００９】  ヒトESCまたは他のヒト多能性細胞型の膵臓または膵島細胞への分化方法は、特許文献において説明されてきた。しかしながら、幹細胞培養技術は進歩するので、種々の分化細胞型を培養するための技術の改良は、これらの分化細胞の最終的な商業用途のために重要である。ヒトESCを培養して膵臓系列細胞に変換させることが報告されている従来の技術は、実験室規模の研究には適しているものの、研究または治療用途のためにスケールアップして多数の膵臓細胞型を常に確かに産生することは容易にはできない。従って、ヒト多能性幹細胞からの膵島分化を促進する、明確にされた成分を用いる簡単で再現性のある培養方法は、この分野への望ましい補強である。
【００１０】発明の概要  本発明は、広く、ヒト多能性幹細胞の内胚葉細胞および膵臓系列細胞への直接in vitro分化のための新規方法として要約される。本方法は、骨形成タンパク質の有効量を用いて幹細胞を培養し、中内胚葉(mesendoderm)の方向に分化を誘導することを含む。これらの中内胚葉細胞はさらに培養されて胚様体(EB)を形成し、この胚様体は明確にされた条件下で膵臓系列細胞に最終分化する。ヒト多能性幹細胞からの膵島分化を促進する明確にされた成分を用いることにより、本発明の方法は、研究または治療用途のための膵臓細胞型の大規模産生を可能にする簡単で再現性のある培養プロトコルを提供する。
【００１１】  関連した側面において、本方法は、骨形成タンパク質および線維芽細胞増殖因子の有効量中でヒト多能性幹細胞を培養して中内胚葉の方向に分化を誘導することを含む。最初の培養ステップに続いて、明確にされた条件下で細胞をさらに培養して膵臓系列細胞への分化が誘導される。
【００１２】  本明細書記載の直接分化方法のもう1つの特徴は、内胚葉および膵臓細胞(例えばβ細胞)を大規模に単離するその能力である。
【００１３】  本明細書記載の方法はまた、移植片のための幹細胞由来細胞の潜在的使用に対する最大の障害の1つである未分化幹細胞の腫瘍形成性を克服している。これらの方法は、宿主に移植されたとき奇形腫を形成しない膵島細胞集団を誘導するために使用できる。
【００１４】  一側面において、中内胚葉および内胚葉系列に分化方向を決定されたヒト多能性幹細胞由来の単離された細胞集団が開示される。この系列の細胞は、膵島細胞、適切にはβ細胞へさらに分化するそれらの能力を特徴とする。関連した側面において、最終分化膵臓系列細胞の少なくとも50%は、インスリン、CペプチドおよびPDX1マーカーの少なくとも1以上を同時に発現するそれらの能力を特徴とする。
【００１５】  特記しない限り、本明細書に記載のすべての学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に通常理解される意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試験のための適切な方法および材料は以下に述べられているが、当該分野で公知の、本明細書記載のものと同じまたは等価な他の方法および材料もまた使用できる。
【００１６】  本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の説明から明らかとなるであろう。
【００１７】発明の詳細な説明  本発明は、広く、哺乳動物の多能性幹細胞の膵臓系列細胞への直接in vitro分化のための新規方法に関する。本方法は、有効量の骨形成タンパク質の存在下で幹細胞を培養して、中内胚葉の方向に分化を誘導することを含む。これらの中内胚葉細胞はさらに培養されて、最終的な内胚葉（definitive endoderm）に分化方向を決定された細胞が富化した胚様体(EB)を形成し、これは明確にされた条件下で膵臓系列細胞に最終分化する。膵島分化を促進する明確にされた培地成分を用いることにより、本明細書に記載の方法は、研究または治療用途のための膵臓細胞型の大規模産生を可能にする簡単で再現性のあるアプローチを提供する。
【００１８】  本明細書に記載の方法およびそれを取り巻く科学文献をよりよく理解するために、ヒト胚性幹細胞(hESC)を用いる最近の研究は、膵臓系列細胞の発生に対する第1ステップとして最終的な内胚葉の分化に焦点を合わせはじめたことに注意されたい。hESCからの最終的な内胚葉のアクチビンA誘導についての報告もなされている(D"Amour, K.A., et al. (2005)参照)。しかしながら、このプロトコルによっては、膵臓系列細胞は誘導されなかった。さらにまた、無血清培地におけるアクチビンA(5ng/ml、50ng/mlまたは100ng/ml)の試験の予備的な結果は、この処理単独では膵臓細胞の分化を誘導する事ができないことを示唆している。フィーダー細胞の非存在下でアクチビンAはhESCの多能性を維持できることが明らかにされたことを考慮すればこのことは驚くべきことではない(Beattie, G.M. et al., Activin A maintains pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Stem Cells 23, 489-495 (2005))。膵臓分化を評価する他のhESC研究は、インスリン染色細胞の起源に関して結論に達しないかまたは明確にされない条件でin vivo増殖期間を必要とするもの(Brolen, G.K. et al., (2005))であった。
【００１９】  hESCからのβ細胞の効率的な誘導を促進する培養条件を明らかにする目的で、hESC分化の異なる期において、FGF4(10または50ng/ml)、レチノイン酸(10-9M)、FGF10(10ng/ml)、アクチビンA(5ng/ml、50ng/mlまたは100ng/ml)、シクロパミン(1μMまたは10μM)およびBMP4(5ng/ml、50ng/mlまたは100ng/ml)を含む多くの増殖因子、サイトカインおよび発生関連分子を試験するために一連のパイロット実験がなされた。試験された因子の中で、MEF上で増殖させたhESCのBMP4処理がpdx1発現に対して群を抜いて最強の促進効果を示した。
【００２０】  細胞間情報伝達分子であるBMP4は、胚発生中、運命決定および系列発生に重要な役割をはたしていることが知られている。他の脊椎動物におけるいくつかの研究において、BMP4はESC培養において初期神経発生を抑制し、分化方向が決定されていない内胚葉からの膵臓内胚葉特異化(specification)を促進する事が示されている(Kumar, et al., Signals from lateral plate mesoderm instruct endoderm toward a pancreatic fate. Dev. Biol. 259, 109-122 (2003) and Finley, et al., BMP-4 inhibits neural differentiation of murine embryonic stem cells. J. Neurobiol. 40, 271-287 (1999))。これらの研究に基づいて、出願人は、BMP4はhESCからの内胚葉および膵臓分化を促進しうると仮説を立てた。さらに、実験を通じて、出願人は、hESCのBMP4処理が中内胚葉分化を促進し、続いて膵臓分化を後押しすることを示した。Xuらのデータと共に、出願人のデータは、hESCに対するBMP4の量的効果を明らかにするために用いられた。100ng/ml単独での処理はほぼすべてのhESCをトロホブラスト細胞に形質転換し、一方低投与量ではhESCの中内胚葉および最終的な内胚葉への分化を導くことができることが見いだされた。
【００２１】  中胚葉由来胚組織(すなわち脊索、背部大動脈、側板中胚葉)によりin vivoで媒介される特定の誘導事象は、分化方向が決定されていない前腸内胚葉のパターニングおよび膵臓運命の特異化に重要な役割を果たしていることが知られている(Wells, J.M. & Melton, D.A. (2000); and Kumar, et al. (2003))。さらなる内胚葉細胞の成熟およびhESCからのPDX1+細胞の産生には他の細胞型および胚葉の効果が必要でありうると出願人は考える。ESCからの膵臓細胞型の産生はおそらくは多段階プロセスであり、最終的な内胚葉誘導、内胚葉パターニングおよび膵臓上皮誘導の遂次段階を含むと考えられ、そのそれぞれは、可溶性増殖因子およびサイトカインなどの適切な環境因子を必要とし、そしておそらくは他の細胞型との直接接触を必要とする。
【００２２】  hESCをMEFと直接接触させるとき、PDX1+/FoxA2+細胞が産生され、マウス背側膵シグナルにin vivo暴露した後、PDX1+/FoxA2+細胞からインスリン産生細胞が産生されたことも報告された(Brolen, et al., (2005))。他方では、高度に精製したマウス最終的な内胚葉細胞は、短期間の培養後に膵臓マーカーを発現する事ができないことが最近報告された(Tada, S. et al., Characterization of mesendoderm: a diverging point of the definitive endoderm and mesoderm in embryonic stem cell differentiation culture. Development 132, 4363-4374 (2005))。同様に、アクチビンA誘導hESC由来内胚葉細胞の精製培養物はpdx1を発現せず、他のシグナルが必要な可能性があることが示された(D"Amour, et al., (2005)参照)。
【００２３】  それに反して、中間レベルのBMP4に使用は、多くの細胞による中内胚葉運命の選択(brachyury+)をもたらしたことを出願人は見いだした。BMP4およびMEFまたはBMP4およびbFGFを用いるhESCの初期処理中に内胚葉マーカーであるFoxA2が現れる。さらにまたFoxA2発現は全体の分化プロセスを通して増加し、EBにおける導管様構造物(duct-like structure)と関連している。その後のpdx1遺伝子発現およびPDX1+細胞出現もまたEB期に生じる。FoxA2発現は最終的な内胚葉に特有ではないが、(1)brachyury+細胞への細胞の近接、(2)Sox17との同時染色の観察、(3)sox1などの神経マーカーの欠如、(4)これらのEBにおけるトロホブラストマーカーの少ない存在量および(5)PDX1の同時発現は、FoxA2+細胞が前膵臓(pre-pancreatic)内胚葉または内胚葉由来細胞集団を示すと推定されることを示唆している。これらの結果は、図1に示される明確にされた培養条件を用いて、中内胚葉の初期BMP4およびbFGF誘導を含む多段階手順を用いることにより、hESCから最終的な内胚葉および膵臓系列細胞を順次誘導できることを示唆している。
【００２４】  よって、本発明の広い実施形態において、本方法は、有効量の骨形成タンパク質を含有する培地中でヒト多能性幹細胞を培養して中内胚葉方向に分化を誘導する方法を提供する。本明細書において、哺乳動物の多能性幹細胞は、Thomsonら(Science 282:1145, 1998)により記載された霊長類、好ましくはヒトの胚性幹細胞(hESC)を含む。これらの細胞は、適切な条件下で、3つの胚芽層(内胚葉、中胚葉および外胚葉)の全部の派生株であるいくつかの異なる細胞型を産生することができることで特徴付けられる。一般に認められた試験によれば、これらの多能性細胞は、8〜12週齢SCIDマウスにおいて奇形腫を形成する能力も有する。
【００２５】  本実施形態のある側面において、フィーダー細胞として照射したマウス胎児繊維芽細胞(MEF)を用い、ゼラチンコーティングされた組織培養表面上で多能性幹細胞が培養される。フィーダー細胞は、他の種類の細胞と共培養するとき、第2の種類の細胞が増殖できる環境を提供する1つの種類の細胞である。このステップの培養期間は約1日〜約10日間であり、好ましくは4日間である。限定するものではないが、骨形成の情報伝達経路の誘導因子は骨形成タンパク質(BMP)を含み、適切にはBMP2およびBMP7を含み、最も適切にはBMP4を含む。
【００２６】  本明細書において、BMPの有効量は、約10ng/ml〜約100ng/mlの濃度を含む。より多量のBMP4の投与は、ヒト多能性幹細胞の栄養外胚葉系列への分化を誘導することが示されているが、少量〜中間量、適切には50ng/mlのBMP4を用いる幹細胞コロニーの培養は、MEFまたは高濃度のbFGF(例えば100ng/ml)と相乗的に作用して、幹細胞の中内胚葉方向の分化を促進することが本明細書において開示されていることに注意されたい。
【００２７】  本明細書において、中内胚葉細胞はBrachyuryおよびOct4核内転写因子マーカーの発現により明らかにされるが、それに限定されない(図1第1期参照)。中内胚葉細胞は、Wnt3およびFGF4(D’Amour et al. 2005)および/またはgoosecoid(Gsc)、Ecadherin、Mixl1およびFoxA2およびおそらくはSox17(Yasunaga et al. Nat. Biotechnol. 2005)の発現で特徴づけることもできる。
【００２８】  本実施形態の第2期において、培養物を誘導して、MEF馴化培地中で小型多能性幹細胞コロニーから胚様体(EB)を形成させる。適切には、EBは無傷であり、内臓卵黄嚢(VYS)の層に囲まれており、stage specific embryonic antigen-3(SSEA-3)を発現する。このステップの培養期間は約1日〜約4週間であり、好ましくは14日間である。本明細書において、EBは3次元構造の細胞群であり、EB細胞内でさらなる分化を誘導するように相互作用する(図1第2期参照)。適切なEBは、導管様構造物を有する最終的な内胚葉細胞を含み、それらはFoxa2、Sox17およびPDX1を発現する細胞を含む。これらの内胚葉細胞は膵臓系列細胞を生じさせると考えられる。本明細書において、膵臓系列細胞は、例えば、PDX1およびNkx6.1を同時に発現する細胞を含み、これらは膵上皮前駆細胞またはβ細胞のいずれかを示すことが知られている。これらの細胞は、マーカーのこの組み合わせまたは、正常β細胞または、一般にδ細胞を示すと理解される、ソマトスタチンを発現する細胞中同時に発現されることが知られているPDX1、インスリンおよびCペプチドを発現する、体内で2種類だけの細胞型である。
【００２９】  BMP4処理hESC由来のEB内細胞は、免疫染色および定量PCRにより、PDX1およびNkx6.1マーカーの両方を同時に発現するかなりの数のサブセットを含むとして特徴付けられた(図4参照)。細胞の一部は増殖性であることを示すKi67マーカーを発現していることも思われた。他のサブセットは、最終分化した内分泌系列に分化方向を決定されることができると思われる。
【００３０】  本実施形態の第3期において、内分泌系列細胞への最終分化を誘導する目的で、EBからの細胞を無血清培地(ウシ胎児血清(FBS)なし)を用いて組織培養プレート上にプレーティングする。このステップにおいて、細胞の培養期間は約7日〜約56日間であり、適切には28日間である。適切な最終分化細胞は、インスリン、CペプチドおよびPDX1の同時発現を特徴とする。グルカゴン発現細胞およびソマトスタチン発現細胞などの内分泌系列の他の細胞型もまた、ここにおいて、培養物のこれらの領域で出現する。これらの期(第2期および第3期)におけるPDX1+細胞のかなりの割合が、細胞表面マーカーである上皮細胞接着分子(epithelial cell adhesion marker)(EpCAM)を同時に発現することが見いだされる。
【００３１】  本明細書において、無血清培地は、ITSサプリメント(BD、5μg/mlインスリン+5μg/mlトランスフェリン+5ng/ml亜セレン酸)、10ng/ml FGF7(R&D)、10μMニコチンアミド(Sigma)、10nMエキセンディン-4(Sigma)および2g/L BSA(Sigma)を含む無血清DMEM/F12(17.5mMグルコース)培地を意味する。従って、この無血清培地をインスリン-トランスフェリン-セレン-FGF7-ニコチンアミド-エキセンディン4にちなんでITSFNEと名付ける(図1第3期参照)。エキセンジン-4の適切な濃度は約0.1mM〜約1mMである。同様に、ニコチンアミドの濃度は約1〜約25mMであることができる。
【００３２】  また、関連した、より適切な実施形態において、ヒト多能性幹細胞を、最初に、フィーダー細胞なしで、適切にはマトリゲル(Matrigel)(登録商標)上で培養することができる。hESCをマトリゲル上で培養する場合、細胞を中内胚葉方向に分化誘導するには、骨形成経路の誘導因子に加えて線維芽細胞増殖因子(FGF)の有効量を必要とすることを出願人は見いだした。FGFの濃度は約10〜約200ng/mlである。適切なbFGF濃度は100ng/mlである。この期において、MEFおよびそれが合成するまたは産生する因子が本誘導プロトコルにおけるFGFの機能と置き換えることができることもまた出願人は見いだした。第2期において培養物にbFGFを添加することにより多量の内胚葉および膵臓系列細胞が生じ、これらは適切なマーカーを発現する。FGF2などの他の適切な線維芽細胞増殖因子をこの培地に添加することができる。これら3つの発生期の細胞を特徴づけるために、種々の内胚葉および膵臓関連遺伝子に関するRNA発現の時間的経過を下記のように行った。
【００３３】  いくつかの実施形態において、本発明は、膵臓細胞が富化した細胞集団、適切には宿主に移植されたとき奇形腫を形成しないβ細胞を誘導する方法にも関する。よって、膵臓系列の第3期細胞は、出願人への米国特許出願公開第20050260749号に記載されているように細胞表面マーカーに基づいて細胞をソーティングすることにより非腫瘍形成性にできると考えられる。特に、その発現が内胚葉、膵臓または前腸系列に分化方向を決定されたヒト細胞を明らかにするための正の選択法に用いることができる細胞表面マーカーである、上皮細胞接着分子(EpCAM)の陽性発現に基づいて分化細胞がソーティングされる。この選択を行うために、蛍光表示式細胞分離器(FACS)または磁気活性化細胞分離(magnetic activated cell sorting(MACS))などの単一細胞をソーティングすることができる任意の装置をこの種類の細胞分離手順に適用することが可能であろう。後期の期の培養物中に残った未分化細胞を取り除くためのこのEpCAM/MACS選択プロトコルを用い、SSEA3またはSSEA4などの未分化幹細胞の細胞表面マーカーに対する抗体もまた用いて、幹細胞培養物の腫瘍形成傾向を効果的に抑制できることを出願人は見いだした。
【００３４】  免疫不全マウスに注射されるとき、組織構造をあまり持たない多くの異なる組織型からなる非悪性腫瘍または腫瘍である奇形腫を未分化ES細胞が形成することは、幹細胞文献から明らかである。奇形腫の発生は宿主の生命を危うくするとは考えられないが、奇形腫は大きなサイズに成長する場合があり、外観が悪く、宿主の代謝エネルギーを無駄遣いする。ヒトES細胞により形成される奇形腫の解析は、Gertow et al., Stem Cells and Development, 13:421-435 (2004)に見られる。もしヒトES細胞が最終的にヒト患者への細胞または組織移植に用いられるとしたら、このように導入される細胞は腫瘍形成能を有さないことがおそらくは好ましい。当該技術分野で、この能力を除去することが知られている主な技術は、ES細胞に外因性遺伝子構築物を挿入し、ついで導入した遺伝子の発現特性に基づいて分化細胞を選択することに基づく。しかしながら、ヒトES細胞培養物に挿入された外因性遺伝子の使用により、避けたほうが良い、安全上の懸念の他のセットが生じる。
【００３５】  本明細書記載の直接分化方法と細胞表面へのソーティング技術を組み合わせることにより、腫瘍形成性でない、奇形腫を形成しない幹細胞由来細胞培養物を実用的なレベルで産生することを、出願人は当然期待する。冗長かもしれないが、誤解を避けるために、腫瘍形成性という用語の使用は、ES細胞などの未分化ヒト未分化幹細胞の奇形腫形成性に適用されるものであって、任意の種類の悪性腫瘍を意味するものではない。これは、マウスに注射されるとき、ES細胞は明らかな悪性腫瘍を生じるものではないからである。直接分化および選択により単純に腫瘍形成性を除去することは、実験室モデルからの幹細胞派生株の有用なヒト療法への発展における他の重要なステップである。
【００３６】  他の実施形態において、本発明は、最終分化膵臓系列細胞を有するヒト多能性幹細胞由来の単離された細胞集団を提供する。この細胞集団の少なくとも50%は、インスリン、CペプチドおよびPDX1の1以上を同時に発現する。
【００３７】  さらに他の実施形態において、本発明はヒト多能性幹細胞由来の単離された非腫瘍形成性細胞集団を提供する。この細胞集団は、細胞の少なくとも70%がインスリン、Cペプチド、PDX1、NKX6.1およびEpCAMの1以上を同時に発現し、免疫不全マウスに注射されたとき細胞が奇形腫を形成しない最終分化膵臓系列細胞を有する。これらの細胞、適切にはβ細胞は内胚葉(FoxA2およびSox17)および膵臓前駆細胞(PDX1+、NKX6.1+、インスリン増殖性)の表現型を有する細胞を含む培養物から発生するので、それらはNKX2.2、NeurOD、Pax4およびIS11などの他のマーカーを発現することが予期される。
【００３８】  以下の実施例は、本発明の特定の実施形態の限定されないさらなる例示として提供される。
【００３９】実施例実施例1細胞培養および分化  図1に、一般的分化方法を単純化して示す。NIH認可hESC株であるH1(WA01)およびH9(WA09)を継代24〜40で用いた。未分化ESC培地は、1mM L-グルタミン、1%非必須アミノ酸、0.1mM2-メルカプトエタノールおよび4ng/ml bFGF(すべてInvitrogenから入手)を添加した、80%DMEM/F12および20%ノックアウト血清代替添加物(Knockout serum replacement)からなった。6ウェルプレート内の照射したマウス胎児繊維芽細胞(MEF)からなるフィーダー層上で、ESC培地(対照群)、ESC培地+50ng/ml BMP4(BMP4群;R&D systems)またはESC培地+50ng/ml BMP4+300ng/ml noggin(noggin群;R&D systems)のいずれかでhESCを4日間培養した。
【００４０】  マトリゲル(登録商標)を用いる実験において、MEFの代わりに増殖因子枯渇マトリゲル(登録商標)(BD Biosciences)を用いてhESCを増殖させ、培地にはMEF馴化培地(CM、対照群)、CM+50ng/ml BMP4またはCM+50ng/ml BMP4+100ng/ml bFGFを用いた。2mg/mlディスパーゼ(dispase)(Invitrogen)でインキュベートすることによりコロニーを移し、ついでプレートから細胞をすすぎ落とし、ピペッティングにより小片にし、70μm cell strainerで濾過した。コロニーの小片を含む濾液をシェーカー上のCMを含む100mm無処理浮遊培養ディッシュに入れ、14日間胚様体(EB)を形成させた。ついでEBをITSサプリメント(BD、5μg/mlインスリン+5μg/mlトランスフェリン+5ng/ml亜セレン酸)、10μMニコチンアミド(Sigma)、10ng/ml FGF7(R&D)、10nMエキセンディン-4(Sigma)および2g/L BSA(Sigma)を含む無血清DMEM/F-12(17.5mMグルコース)培地に置き換えて、14、21または28日間おき、次いで採取した。各培養物の一部分をRT-PCRおよびQ-PCRに用い、残りの細胞をOCT(EB14;Tissue-Tek)に埋め込むかまたは免疫染色のためにカバースリップ(EB14+14、EB14+21およびEB14+28)上に固定した。
【００４１】実施例2定量PCRおよびRT-PCR  全細胞RNAをTriZol(Invitrogen)で抽出した。SuperScript First-Strand Synthesisキット(Invitrogen)を用い、1μgの全RNAからcDNAを合成した。ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems)によりAssay-on-demand試薬(Applied Biosystems)を用いて、以下の転写産物:foxa2、sox17、brachyury、ngn3、pdx1、インスリン、グルカゴン、glut2および内部対照であるβ-アクチンを用いて定量リアルタイムRT-PCR(Q-PCR)を行った。Q-PCRは、装置製造業者の使用説明書に従って行った。相対定量は、供給業者の推奨するcomparative cycle threshold(CT)法を用いて行った。倍率変化は、2-ΔΔCTとして算出した。Q-PCR分析からの平均ΔΔCT値を不対両側スチューデントt検定を用いて比較した。p値<0.05を有意と見なした。
【００４２】  非定量RT-PCRのために、Genebank配列を用いてヒト転写産物に対するオリゴヌクレオチドプライマー対を作製した(図12参照)。2つの異なるエクソンからプライマーを選択し、少なくとも1つのイントロン配列にまたがっていた。HotStarTaq DNAポリメラーゼ(Qiagen)を用いてPCRを行い、反応条件には最初に95℃で15分間変性し、ついで94℃で30秒間、アニーリング温度で30秒間、72℃で1分間でサイクルし、そして最後に72℃で10分間を用いた。pdx1(56℃)、sox17(55℃)およびfoxa2(50℃;QiagenのQ-solutionを用いて)以外は、プライマーを53℃でアニーリングした。逆転写酵素なしの対照サンプル(-RT)をすべての場合GAPDHプライマーで増幅し、ヒト成人膵臓RNAを陽性対照として用いた。
【００４３】実施例3免疫蛍光染色  カバースリップの免疫蛍光染色を既述のように行った(Kahan, B.W. et al., Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes 52, 2016-2024 (2003))。以下の一次抗体を記載されている希釈度で用いた:PDX1ウサギ抗マウス血清抗体1:4000(C. Wrightの提供);インスリンマウスモノクローナル抗体10μg/ml(ATCC番号:HB124);グルカゴンマウスモノクローナル抗体1:2000(Sigma);ソマトスタチンマウスモノクローナル抗体1:2000(Novonordisk);Ki-67マウスモノクローナル抗体1:25(BD Pharmingen);Cペプチドラットモノクローナル抗体1:3000(BCBC1921);Brachyuryヤギ抗ヒト抗体1:20(R&D);OCT4ヤギ抗マウス抗体1:100(Santa Cruz);Sox17ヤギ抗ヒト抗体1:40(R&D);FOXA2ウサギ抗ラット抗体1:4000(R.Costaの提供)。二次抗体(Alexa Fluor488標識ヤギ抗マウスlgG抗体、1:2000;Alexa Fluor568標識ヤギ抗ウサギ抗体、1:4000;Alexa Fluor488標識ヤギ抗ラット抗体、1:2000;Alexa Fluor647標識ヤギ抗ウサギ抗体、1:4000;568標識ヤギ抗マウス抗体、1:2000;Alexa Fluor568標識ロバ抗ヤギ抗体、1:2000;Alexa Fluor488標識ロバ抗マウス抗体、1:2000)は、Molecular probes(Eugene, OR)から入手した。
【００４４】実施例4hESCをMEF上でBMP4を用いて処理することによる中内胚葉誘導  図1に全般的に示されるように、hESC分化プロセスはMEF上でhESCをBMP4を用いて処理することにより開始された。特に、事前研究において、マトリゲル(登録商標)上で100ng/ml BMP4を用いて7日間hESCを処理することにより、ほぼ100%の細胞がヒト胎盤性性腺刺激ホルモン(hCG)発現トロホブラスト細胞に分化することが示された(Xu, R.H. et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature Biotechnology. 20, 1261-1264 (2002))。
【００４５】  これらの結果は図2に示すように再現され、マトリゲル上でBMP4100ng/mlを単独で用いて7日間処理した後、hCGを豊富に発現し、hCGタンパク質を分泌する細胞型が産生された(図2aおよびb)。具体的には、マトリゲル(MG)上で増殖させた未分化hESCを、7群に分割し、(1)10ng/ml BMP4(B10);(2)50ng/ml BMP4(B50);(3)100ng/ml BMP4(B100);(4)10ng/ml BMP4+100ng/ml bFGF(B10F);(5)50ng/mlBMP4+100ng/ml bFGF(B50F);(6)100ng/ml BMP4+100ng/ml bFGF(B100F);(7)対照(ctrl)(増殖因子を添加せず);で1日、4日および7日間処理した。前述のように、B100群において、hCG分泌および遺伝子発現が大変増加した(図2a〜b)。7日目までに、培地における平均hCG分泌は21000mIU/mlになり、hCG遺伝子発現は対照群よりも13000倍の増加を示した(図2における統計分析は、同じ群の1日目の対照と比較した値を用いて行った)。BMP4の低めの濃度(10ng/ml、50ng/ml)は実際上同程度のhCG誘導効果を示した。他方では、bFGFは明らかにBMP4のhCG誘導効果を抑制する。例えば、B10群における7日目の平均hCG分泌は29000mIU/mlであったが、B10F群においては51mIU/mlであった(図2a)。同時に、BMP4/bFGF処理hESCにおいて、時間に依存してT発現が大きく誘導された(図2c)。B10F群では、4日目にこの誘導は1000倍増加してピークに達し、B50F群においては約200倍増加した。BMP4/bFGF-処理hESCにおいて、Sox17およびfoxa2の発現もまた増加した(図2e〜f)。他方では、Oct4発現は、特に4日目のBMP4処理群に置いてのみ顕著に減少した(図2d)。
【００４６】  出願人はまた、MEFまたはbFGF(100ng/ml)のいずれかの存在下で、未分化hESCを50ng/ml BMP4を用いて4日間処理した。この処理は細胞を形態的に変化させた。この処理をしない細胞は均一な外観を維持していたが、処理した細胞は不均一となり、明確にそれらの形態が変化した(図3a〜b)。BMP4処理により、一部の細胞においてBrachyury+細胞への分化がもたらされ、それらには同じ細胞クラスター中に比較的少ないFoxA2+細胞が混在している(図3c〜e)。出願人は、BMP4処理培養物中に、15mmカバースリップあたり平均10のこのようなクラスターを見いだしたが、未処理のhESCにおいてはこのようなクラスターは検出されなかった。Brachyury+細胞はまた少なくとも一過性にOCT4+でもある(図3i〜k)。その一方、FoxA2+細胞はOCT4+ではなく(図3l〜n)、ほぼ全部のFoxA2+細胞はSox17と同時に染色される(図3f〜h)。
【００４７】  BMP4単独で処理した細胞とは対照的に、低および中間量のBMP4(10ng/mlおよび50ng/ml)で4日間処理した細胞はhCGの発現またはhCGタンパク質の産生を示さず、代わりに、同じ時点での対照細胞と比較して、細胞はかなり大量のbrachyuryおよびsox17転写産物を発現し、一方でかなり低レベルのOct4転写産物を発現することを図2は示している(図2c〜e)。
【００４８】  BMP4で処理されていない培養物において、細胞はOCT4+であったが、Brachyuryを発現しなかった(図3o〜q)。これらのOCT4染色データは、OCT4発現低下により多能性の喪失および栄養外胚葉への脱分化が誘導されるが、OCT4レベルの上昇は原始内胚葉および中胚葉への分化を引き起こすことを明らかにした最近の報告と呼応している(Niwa, H. et al., Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 24, 372-376 (2000))。BrachyuryおよびFoxa2の転写産物レベルはこの染色データを支持している。非定量(図3r)および定量RT-PCR(図3sおよびt)のいずれも、MEF上の培養物がBMP4で処理されるときbrachyuryおよびFoxa2転写産物の増加を示している。BMP4処理により、brachyury遺伝子発現がおおよそ170倍増加し(図3s)、foxa2発現がおおよそ5倍増加する(図3t)ことを出願人は見いだした。合わせて、これらのデータは、hESCから連続した一組の胚期が発生することを予言している。最初にbrachyury+ならびにbrachyuryおよびOct4同時発現細胞(おそらくは、移行状態を反映している)が現れ、これは中内胚葉を示す。ついで数日以内に細胞は他の迅速な移行を経由してFoxA2およびSox17を同時に発現し、一方でbrachyury発現を喪失する。
【００４９】実施例5in vitroでhESCからの初期膵臓細胞系列分化のためのいくつかのさらなる必須成分が明らかにされる。  in vitroでhESCから膵臓細胞の発生を促進する培養条件および培地添加剤をさらに明らかにするために、BMP4処理期間中のMEFの必要条件を出願人は評価した。マトリゲル(登録商標)上で増殖させたBMP4処理細胞において、brachyury、foxa2、pdx1およびglut2を含む試験した遺伝子に関して転写産物はなにも検出されなかったが(図4c)、MEFにおいて増殖させたBMP4処理細胞においてはそれらの遺伝子は容易に検出された。加えて、MEFまたはマトリゲル(登録商標)上で増殖させた細胞由来のhEBは、形態的に異なっていた(図4d〜g)。マトリゲル(登録商標)上で増殖させた細胞は、MEFの存在下で増殖させたBMP4処理細胞由来のEBよりも、より小さく、より小型でより不透明なEBを生じた。従って、本プロトコルにおいて、MEFは膵臓系列特異化に重要な役割を果たしている。
【００５０】  高濃度のbFGFはhESCの増殖にMEF様の効果を示すことが最近報告されたので(Ludwig, T.E., et al., Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat. Biotechnol. 24, 185-187 (2006) and Levenstein, M.E., et al., Basic FGF Support of Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal. Stem Cells (2005))、培養プロトコルにおいて、MEFをbFGFに置き換えることができないかどうかを出願人は試験した。これを決定するために、hESCに50ng/ml BMP4および100ng/ml bFGFを添加し、マトリゲル(登録商標)上で4日間増殖させ;ついで細胞を採取して遺伝子発現解析を行った。未処理hESCと比較して、BMP4およびbFGF処理hESCにおいて、brachyury遺伝子発現は〜1000倍高かった。BMP4およびbFGF処理細胞由来のEBは、MEF上で増殖させBMP4で処理したhESCからのEBに対して、同様な形態ならびに似たレベルのbrachyury、foxa2、pdx1およびglut2遺伝子発現を示したが(図4cおよび4e、4g)、このことは、bFGFが内胚葉特異化および/または膵臓系列細胞分化において初期の重要な役割を果たしていることを示唆している。
【００５１】  hESCからの中内胚葉形成に対するBMP4の誘導効果がカノニカルBMP情報伝達に依存しているかどうかを決定するために、培地への可溶性nogginの添加によりBMP4処理の効果を無効にする事ができるかどうかを出願人は試験した。50ng/ml BMP4単独またはBMP4+300ng/ml nogginのいずれかを用い、hESCを4日間処理した後、RT-PCR(図4a)およびQ-PCR(図4b)によりEB14における遺伝子発現を試験した。BMP4処理hESC培養物においては、nogginおよびBMP4の同時添加により、brachyury、sox17、foxa2、pdx1およびglut2遺伝子発現を完全に抑制することができる。nogginの効果は用量依存的であった(データは示さず)。noggin処理細胞におけるfoxa2およびglut2の転写産物レベルは非BMP4処理細胞よりもいっそう低く、hESC培地におけるまたはhESC自身により作られた最小のBMP4様効果が存在することが示唆されることは注目に値する。
【００５２】実施例6BMP4処理hESCの胚様体(EB)浮遊培養は内胚葉および膵臓系列細胞分化を促進する。  ニワトリ胚における膵臓特異化におけるBMP4の明確にされた役割に基づいて、出願人は、BMP4処理がhESCからの中内胚葉および膵臓細胞の分化を促進するかどうかを決定することに目標を定めた。従って、未処理hESCまたは、50ng/ml BMP4で4日間処理したhESCからEBを形成させた。初期胚葉中3次元で生じる組織相互作用により誘導が生じるEB期中の分化は、2次元条件下の分化と比較して膵臓系列細胞の発生に影響を積極的に及ぼすことを、出願人の以前の実験は示した(Xu et al., Endoderm and pancreatic lineage differentiation from human embryonic stem cells, Cloning and Stem Cells, 8, 96-107, (2006)))。
【００５３】  未処理hESCにおいて、転写産物の分析によりpdx1発現は検出されなかった。EBとして14日間細胞を増殖させた後、対照群においてpdx1 mRNAが出現し始めた。EB14における未処理群と比較して、BMP4処理は、sox17(11倍)、foxa2(12倍)、tat(7倍)、pdx1(22倍)、brachyury(8倍)およびglut2(19倍)を含む遺伝子の顕著なアップレギュレーションを誘導した。EB14(14倍)において細胞を分析したとき、BMPによるbrachyury誘導は依然として顕著ではあったが、ESC期(170倍、処理hESC対未処理hESC)におけるよりも増加の強度はずっと低かった。出願人は、2つの異なるhESC株(H1およびH9)を用い、多くの(15を超える)独立した実験においてBMP4の効果を再現性よく観察した。
【００５４】  この件に関して、図5(a〜c)は、hESC由来EB14における内胚葉および膵臓関連遺伝子の発現レベルを示す。図5(b〜c)は、hESC由来EBにおいて、14日間の増殖後(EB14+BF対EB14、ctrl)、BMP4/bFGF処理は内胚葉および膵臓関連遺伝子の顕著な発現を誘導することを示す。同様に、EB期(+F)における100ng/ml bFGFの添加は、brachyury(T)転写産物の減少をもたらし、(a)一方ではこれに反してfoxa2およびpdx1の発現を大きく促進し(bおよびc);b)foxa2転写産物レベルは未分化hESCの219倍から(EB期にbFGFを加えないで)未分化hESCの873倍まで(EB期にbFGFを加えて)増加しc)pdx1転写産物レベルは未分化hESCの26倍から(EB期にbFGFを加えないで)未分化hESCの312倍まで(EB期にbFGFを加えて))増加した。特に、QPCR試験からのpdx1の平均デルタCT値は7.7であったが、これはヒト膵島調製品(おおよそ純度50%)におけるpdx1発現レベルと類似していた。
【００５５】  さらにまた、図5(d〜o)は、EB期にbFGFを加え、50%を超える細胞がPDX1で染色された、EB14の免疫染色を示す。強い染色が認められ、核および細胞はしばしばクラスターを形成している。PDX1+細胞はSOX17抗体で同時染色されないが(図5d〜f)、一部のPDX1+細胞はNKX6.1抗体で同時染色される(図5g〜i)。一部のPDX1+細胞はKi67+でもあり(図5j〜i)、これは増殖性PDX1+細胞の存在を示唆している。
【００５６】  EB14細胞の免疫染色はまた、PDX1およびKi67を発現する、分裂活性を有する膵臓前駆細胞にhESCが分化できたことも明らかにした(図5j〜l)。BMP4処理群において多くのPDX1+細胞が観察され、その大部分はKi67+でもあったので、これらの細胞は増殖活性を有することが示唆された。加えて、かなりの割合のPDX1発現細胞はNkx6.1も同時発現したが(図5g〜i)、その大部分は、この期においてインスリンを発現しなかった(図5m〜o)。PDX1/インスリン同時染色は、EB14において出現し始めた(図5m〜o)。とりわけ、EB期のbFGFは、brachyury発現細胞から膵臓系列へ分化方向を決定された細胞の出現への移行を促進するように思われる。
【００５７】  上記の一群のマーカーは、大部分のβ細胞が形成される第2移行期の前後の妊娠中期中に増殖および拡大する増殖性膵臓上皮に類似した膵臓前駆細胞期を細胞が示していることを示唆している。さらにまた、多数のFoxA2+細胞は導管様構造物に見られ、一部の細胞はKi67+でもあった。EB期に形成されるこれらの構造は、PDX1+細胞の誘導に重要な役割を果たしている可能性がある。それに対して、BMP4処理なしでは、hESC分化のこれらの期においてPDX1+およびFoxA2+細胞は見られなかった(データは示さず)。
【００５８】  ESCからの最終的な内胚葉分化(D"Amour, K.A., et al. (2005))および膵臓系列細胞発生(Gao, R., et al., Characterization of endocrine progenitor cells and critical factors for their differentiation in human adult pancreatic cell culture. Diabetes 52, 2007-2015 (2003))に血清が阻害作用を有することが知られている。15%血清含有培地にEBがプレーティングされた培養物は、pdx1発現の漸減ならびに他の内胚葉および膵臓系列関連遺伝子の発現を示す(Xu et al., Cloning and Stem Cells, 2006)。それに対して、増殖因子が補充された無血清培地において、pdx1転写産物レベルは維持および/または増加された。
【００５９】実施例7ヒトESCはPDX1/インスリン/Cペプチド同時染色を示す細胞を生じる。  BMP4処理hESCが完全に分化したホルモン含有膵島細胞になる能力を有するかどうかを決定するために、出願人は無血清ITSFNE培地中のゼラチンコーティングされたカバースリップ上に14日目のEBをプレーティングし、さらに14、21および28日おいた。この時間的経過にわたる転写プロフィールをRT-PCR(図6)およびQ-PCRにより測定した。プレーティング後(EB14+14、EB14+21およびEB14+28)、BMP4処理細胞において、未処理細胞と比較して、foxa2、pdx1、ngn3、インスリン、グルカゴンおよびglut2を含む内胚葉および膵臓関連遺伝子転写産物が顕著に増加した。Q-PCRデータは、foxa2(未処理EB14と比較して、時間的経過EB14+14、EB14+21およびEB14+28にわたって、それぞれ18、21および37倍の増加)、pdx1(179、155および541倍の増加)およびglut2(47、97および224倍の増加)の転写産物レベルの増加を示した。重要なことには、未処理EB14細胞においてはインスリンおよびグルカゴン転写産物は検出されなかった。
【００６０】  それにひきかえ、BMP4処理培養物において、時間とともにインスリンおよびグルカゴンmRNAレベルは劇的に増加した。インスリンmRNAのためのQ-PCR反応サイクルは、EB14未処理細胞における50(検出されない)から、EB分化後の時間的経過にわたって、BMP4処理細胞における28、27および25サイクルに変化した。グルカゴンに関しては、変化は46サイクルからto22、21および20サイクルであった。すべての実験において、β-アクチンサイクル回数はおおよそ15サイクルであった。膵島ホルモン転写産物の存在量の増加と対照的に、これらの後期期間中、brachyury mRNAは継続的に減少し、EB14未処理細胞におけるレベルとはかなり異なった。hESCにおける以前の研究と合致して、トロホブラストマーカーであるhCGはEB14におけるBMP4処理細胞において発現されたが(Xu,R.H.,et al.(2002))、BMP4で処理されなかった、hESCから生成されたEBにおいては発現されなかった。EBを無血清培地にプレーティングした後には、hCG mRNAレベルは劇的に低下した(図6)。
【００６１】  胚およびmESCにおける以前の所見とも呼応して、BMP4処理細胞において神経外胚葉マーカーであるsox1は検出されなかったが、未処理hESCコロニーで誘導された分化培養物においてはsox1は誘導された(図6)。これらのデータは、1)無血清条件はトロホブラスト分化よりも膵島ホルモン細胞分化に有利である(例えば、無血清条件下で、時間と共に膵島ホルモン遺伝子発現を保持し、時間と共にhCG遺伝子発現を消失する);2)BMP4処理により神経分化が阻害されるらしいおよび/またはBMP4処理により神経前駆細胞が選択されない、3)無血清条件はOct4発現未分化細胞の生存および/または増殖を阻害する、4)TAT-発現細胞、例えば肝細胞などはこれらの無血清条件で扶養または維持されないことを示唆している。
【００６２】  遺伝子発現結果と一致して、免疫染色データは、BMP4処理培養物がプレーティング後にPDX1+細胞の大きなクラスターを含有していたことを示している。EB中に見いだされるPDX1+細胞と対照的に、細胞の大部分がもはやKi67で同時染色されず(図7d〜f)、細胞が最終分化を開始したことを示唆した。PDX1+細胞の大きなクラスター内に、PDX1およびインスリンまたはPDX1、インスリンおよびCペプチドのいずれかで同時染色される細胞が出現した。EBのプレーティング後14日までに、17のうち5つ(29%)のEBがインスリン+細胞を示し、これは時間と共に増加して、プレーティング後28日までには、16のうち10(63%)のEBがインスリン+細胞を含有し、EBあたりの陽性細胞の平均#は増加した。常にPDX1を同時に発現し、PDX1+クラスター内に局在化する多数のインスリン/Cペプチドで免疫染色された細胞を出願人が観察した事実およびインスリンmRNAの顕著な増加は、真性β細胞の表現型特性を示唆している。BMP4処理培養物において、グルカゴンおよびソマトスタチン染色もまた観察された(図8)。成人内分泌細胞型に予期されるように、グルカゴン+およびソマトスタチン+細胞は、Cペプチドとは同時染色されなかった。PDX1または膵島ホルモンのいずれかの染色を示す細胞は、対照群細胞においては観察されなかった。
【００６３】実施例8EpCAMに基づくMACSソーティングは、内胚葉および膵臓に分化方向を決定された細胞の培養物をさらに富化した  BMP4/bFGF処理培養物がEpCAMおよびPDX1に対して染色されるとき、両方のマーカーを同時に発現する細胞を含有する多数の細胞クラスターが観察されることを出願者は検出した(図10a)。この検出により、EpCAM発現およびMACSソーティングに基づく、PDX1+細胞を選択的に選択する機会が提供された。この仮説を試験するために、BMP4/bFGF処理プロトコルによって分化した細胞を抗EpCAM抗体で標識し、ついで適切な二次抗体を用いて標識し、ついでソーティングする。分化したhESCの子孫のEpCAM+ソーティング後に、pdx1およびEpCAMのレベルと同様にsox17およびfoxa2の転写産物レベルは増加する(図10b)。この点に関して、EpCAMのMACSソーティングは、分化したESC培養物を富化または精製して、非選択的培養条件の結果として現れる非内胚葉細胞を除去するために使用できる。EpCAMのソーティングは、〜95%の細胞がEpCAM+である集団をもたらす(図7c)。2以上の種類の組み合わせ(EpCAMに基づく選択およびSSEA3または4+細胞の除去)により、内胚葉/膵臓前駆細胞の培養物をさらに富化し、同時に培養物から未分化の奇形腫形成細胞を除去することになると仮定する。
【００６４】  要約すれば、本発明の方法は、hESCのβ細胞またはβ様細胞に大変良く似た細胞への再現性のある分化を促進することができる。この分化細胞は、糖尿病患者の治療に使用することができる、膵臓β細胞の有望な供給元である。しかしながら、ヒトにおける膵臓分化を制御する細胞および分子事象はほとんど知られていない。それはそれとして、本明細書は、信頼性のあるロバストなPDX1陽性細胞の誘導をもたらし、PDX1およびインスリン/Cペプチドを同時に発現する細胞クラスターを生じる直接分化プロセスのいくつかの成分を記載している。全分化プロセスは、in vitroで無血清培地中で行われる。初期のbrachyury発現により特徴付けられる中内胚葉はhESCが50ng/ml BMP4および100ng/ml bFGFで処理されたとき誘導され、内胚葉および初期増殖性膵臓系列細胞はこれらの培養物から作られたEBにおいて特異化される。インスリン、トランスフェリン、セレン、FGF7、ニコチンアミドおよびエキセンディン-4を含有する無血清培地に細胞が移された後、さらなる分化が起こる。in vitroで作製されたこの膵臓細胞は、β細胞の特徴であるPDX1およびCペプチドを発現する。これらの創意に富んだ所見は、治療目的に適した膵臓β細胞集団の産生に本分野を一歩近づけ、膵臓発生のin vitroモデルとしてのヒト多能性幹細胞の使用を促進する。
【００６５】  内胚葉または膵臓前駆細胞集団の単離された集団は、成人療法を向上させることができる。例えば、これらの前駆細胞はヒト成人の島細胞または肝細胞と同時移植する事ができる。これらの前駆細胞集団は、最初に最終分化ステップを経ずに単独で移植されることもできる。この治療的アプローチにおいて、前駆細胞は患者において対象の機能細胞または組織に分化することが予期される。このような内胚葉または膵臓前駆細胞から出発した全組織の再生もまた考えられる。
【００６６】  本明細書に記載のすべての特許、特許出願および出版は参照によりその全体が本願に組み込まれる。
【００６７】  本開示に記載の本発明の特定の適応は当業者には通常の最適化であり、本発明の精神または添付の特許請求の範囲の範囲から逸脱することなく実施できることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図1に、ヒトES細胞から膵臓系列細胞を作製するための一般法を要約したフローチャートを示す。
【図２】図2(a〜f)を含む図2に、遺伝子発現:(a)BMP4/bFGF処理hESCの培養からの分泌hCGタンパク質レベル;(b)ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、(c)brachyury(T)、(d)oct4、(e)sox17および(f)foxa2、の時間的経過を示す。
【図３】図3(a〜t)を含む図3は、BMP4が、Brachyury、Foxa2およびSox17の発現を特徴とする中内胚葉分化を開始させたことを示す。図3(a〜n)はBMP4処理hESCの顕微鏡写真であり、図3(o〜q)は未処理hESCの顕微鏡写真である。(a)MEF上で4日間増殖させたhESCの均一なコロニー。(b)4日間MEF上で増殖させ50ng/ml BMP4で処理したhESCは不均一になり、細胞形態の変化を示す(第1期)。(c〜e)BMP4処理hESCは、FOXA2陽性細胞の混在したbrachyury(BRACH)陽性細胞のクラスターを示す。(f〜h)FOXA2細胞はSOX17と同時に染色される。(i〜k)BMP4処理hESCにおけるBRACH陽性細胞クラスターにおいて、多くの細胞はOCT4で同時染色される。(l〜n)FOXA2およびOCT4の同時染色は観察されない。(o〜q)未処理hESCはOCT4で染色されるが、BRACHでは染色されない。図3(r〜t):RT-PCR(r)およびQ-PCR(s、t)は、brachyury(T)およびFoxa2のmRNAレベルの変化を示す。(a〜b)に対するスケールバーは100μmであり、(c〜q)に対するスケールバーは50μmである。
【図４】図4(a〜g)を含む図4は、内胚葉および膵臓関連遺伝子発現ならびにEB形態に対するhESCのBMP4およびbFGF処理の効果を示す。図4(a)RT-PCRおよび(b)Q-PCR分析は、未処理、50ng/ml BMP4での処理または50ng/ml BMP4および300ng/ml Nogginでの処理のいずれかのhESCのEB14での内胚葉(sox17、foxa2、pdx1)および膵臓関連(pdx1、glut2、インスリン)遺伝子の発現変化を示す。図4(c)は、MEF上で増殖させ50ng/ml BMP4で処理したhESCまたはマトリゲル(登録商標)上で増殖させ50ng/ml BMP4単独で処理もしくは50ng/ml BMP4および100ng/ml bFGFの両方で処理しEB14期で分析したhESCからのmRNAレベルを示す。図4(d〜g)は、以下の未処理または処理hESC:(d)MEF上で増殖させた未処理hESCからのEB;(e)MEF上で増殖させたBMP4処理hESCからのEB;(f)マトリゲル(登録商標)上で増殖させたBMP4処理hESCからのEB;(g)マトリゲル(登録商標)上で増殖させ、BMP4およびbFGFの両方で処理したhESCからのEB;からの14日間EB浮遊培養物の代表的位相コントラスト画像である。スケールバーは100μmである。
【図５】図5(a〜o)を含む図5は、EBまたは第2期細胞を特徴づける。図5(a〜c)は、hESC由来EB14における内胚葉および膵臓関連遺伝子の発現レベルを示すグラフである。図5(d〜o)はEB14の免疫染色を示す。EB期にbFGFを添加し、細胞の50%以上がPDX1で染色される。
【図６】図6は、無傷のEBをプレーティングし、増殖因子補充無血清ITSFNE培地中14、21および28日間培養した後の遺伝子発現の時間的経過を示す(第3期)。EBは、MEF上で増殖させた未処理(-)またはBMP4処理(+)hESC由来であった。初期神経系(sox1)、中内胚葉(T)、未分化ESC(oct4)、トロホブラスト(ヒト胎盤性性腺刺激ホルモン、hCG)、最終的な内胚葉(foxa2、pdx1)、肝臓(チロシンアミノトランスフェラーゼ、TAT)および膵島内分泌細胞型(ngn3、インスリン、グルカゴン、glut2)を特徴づける遺伝子の発現をRT-PCRにより分析した。
【図７】図7(a〜p)を含む図7は、第3期、すなわち未分化細胞のBMP4処理、14日間のEB形成期間およびプレーティングしたEBのさらなる分化後における培養物中にPDX1+/インスリン+細胞が存在することを示す顕微鏡写真である。図7(a〜c)は、ITSFNE培地中に14日間プレーティングしたEBがPDX1およびインスリンの同時染色を示すことを示している。図7(d〜f)は、この期では大部分のPDX1-陽性細胞はもはやKI67と同時染色しないことを示している。EB14+28によりPDX1+インスリン+同時染色細胞のより大きなクラスターが出現していることを図7(g〜i)は示している。BMP4で以前に処理されていない培養物中でPDX1またはインスリン染色は観察されないことを図7(j〜l)は示している。EB14+28において、細胞がインスリン、CペプチドおよびPDX1で同時染色したことを図7(m〜p)は示している。このパターンは正常β細胞を示す。スケールバーは50μmである。
【図８】図8(a〜h)を含む図8は、グルカゴン陽性およびソマトスタチン陽性細胞が以前にBMP4で処理した培養物中のEB14+28に存在することを示す顕微鏡写真である。図8(a〜d)は、正常成人α細胞で予期されるように、グルカゴン陽性細胞がCペプチドおよびPDX1で同時染色されることを示している。図8(e〜h)は、正常成人δ細胞で予期されるように、ソマトスタチン陽性細胞がCペプチドで同時染色されないが、一部がPDX1で同時染色されると思われることを示している。スケールバーは50μmである。
【図９】図9は、異なる濃度の増殖因子(BMP4およびbFGF)がどのように異なる系列を導くかを示す図である:(左)高bFGFおよび低BMP4(またはBMPの内部供給元を阻害するNogginを用いて)はhESCを未分化状態に維持する;(中央)高bFGFおよび中程度BMP4は内胚葉および膵臓系列細胞への分化を導く;そして(右)低bFGFおよび高BMP4は栄養外胚葉/トロホブラスト細胞を導く。
【図１０】図10(a〜c)を含む図10は、EpCAM+細胞に対するMACSソーティングがEpCAMならびに内胚葉および膵臓関連転写産物の培養物の富化をもたらすことを示している。(A)分化hESCはEpCAM(緑)およびPDX1(赤)を同時に発現する。ほぼすべてのPDX1+細胞はEpCAMを同時に発現する;PDX1を同時に発現しない一部のEpCAM+細胞もまた観察される。(B)2つの独立した実験からの、分化EpCAMソート細胞とソートされていない細胞との比較のQPCR分析からの倍率変化値。(C)BMP4/bFGFプロトコルによるhESCの分化に続くEpCAM発現のFACS分析。EpCAMに対するMACSソーティング前および後に細胞を分析した。EpCAMに対するMACSソーティング後に、EpCAM+細胞の割合は〜35%から〜95%に増加する。
【図１１】図11は、遺伝子発現の定量および非定量PCR分析のために用いたApplied Biosystems TaqMan Assayのリストを示す表である。
【図１２】図12は、遺伝子発現の定量および非定量PCR分析のために用いたプライマー配列を列挙する表である。
【図１】
2009535058.tif 000003
【図２ａ】
2009535058.tif 000004
【図２ｂ】
2009535058.tif 000005
【図２ｃ】
2009535058.tif 000006
【図２ｄ】
2009535058.tif 000007
【図２ｅ】
2009535058.tif 000008
【図２ｆ】
2009535058.tif 000009
【図３】
2009535058.tif 000010
【図４】
2009535058.tif 000011
【図５】
2009535058.tif 000012
【図６】
2009535058.tif 000013
【図７】
2009535058.tif 000014
【図８】
2009535058.tif 000015
【図９】
2009535058.tif 000016
【図１０】
2009535058.tif 000017
【図１１】
2009535058.tif 000018
【図１２】
2009535058.tif 000019
【配列表】
2009535058000001.app
【国際調査報告】
2009535058.tif 000020
2009535058.tif 000021
2009535058.tif 000022
2009535058.tif 000023