(57)【要約】  多能性細胞は、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む無血清培養培地中で自己再生状態に維持される。多能性細胞はまた、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む無血清培養培地中で自己再生状態に維持される。
2009531054.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターを含む、培養培地。
【請求項２】
ＦＧＦレセプターのアンタゴニストをさらに含む、請求項１に記載の培養培地。
【請求項３】
前記ＭＥＫインヒビターが、ＭＥＫ１インヒビターである、請求項１または２に記載の培養培地。
【請求項４】
前記ＭＥＫインヒビターが、ＰＤ１８４３５２およびＰＤ９８０５９から選択される、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
【請求項５】
前記ＧＳＫ３インヒビターが、ＧＳＫ−３βのインヒビターである、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
【請求項６】
前記ＧＳＫ３インヒビターが、ｃｄｃ２および／またはｅｒｋ２よりもＧＳＫ３に対して選択性である、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
【請求項７】
前記ＧＳＫ３インヒビターが、ｃｄｃ２よりもＧＳＫ３に対して少なくとも１００倍選択性である、請求項６に記載の培養培地。
【請求項８】
前記ＧＳＫ３インヒビターが、ｃｄｃ２よりもＧＳＫ３に対して少なくとも２００倍選択性である、請求項６に記載の培養培地。
【請求項９】
前記ＧＳＫ３インヒビターが、ＣＨＩＲ９９０２１である、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
【請求項１０】
ｇｐ１３０アゴニストをさらに含む、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
【請求項１１】
前記ｇｐ１３０アゴニストが、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、カルジオトロフィン、オンコスタチンＭ、ＩＬ−６＋ｓＩＬ−６レセプターまたはハイパーＩＬ−６である、請求項１０に記載の培養培地。
【請求項１２】
前記ｇｐ１３０アゴニストが、（ａ）ＬＩＦ、（ｂ）ｓＩＬ−６ＲおよびＩＬ−６、または（ｃ）ハイパーＩＬ−６である、請求項１０に記載の培養培地。
【請求項１３】
前記ＦＧＦレセプターアンタゴニストが、ＦＧＦＲ１のアンタゴニストである、請求項２から１２のいずれかに記載の培養培地。
【請求項１４】
ＳＵ５４０２を含む、請求項１３に記載の培養培地。
【請求項１５】
ＰＤ１７３０７４を含む、請求項１３に記載の培養培地。
【請求項１６】
アポトーシスのインヒビターを含む、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
【請求項１７】
Ｎ２培地および／またはＢ２７培地を含む、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
【請求項１８】
ＰＤ１８４３５２、ＣＨＩＲ９９０２１およびＳＵ５４０２を含む、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
【請求項１９】
前記いずれかの請求項に記載の、ヒトＥＳ培養培地。
【請求項２０】
請求項１から１８のいずれかに記載の、マウスＥＳ細胞培養培地。
【請求項２１】
多能性細胞のための培養培地の製造におけるＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの使用。
【請求項２２】
多能性細胞のための培養培地の製造におけるＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの使用。
【請求項２３】
前記培地が、マウスＥＳ細胞の培養のためである、請求項２１または２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記培地が、ヒトＥＳ細胞の培養のためである、請求項２１または２２に記載の使用。
【請求項２５】
前記培地が、ラット多能性細胞の培養のためである、請求項２１または２２に記載の使用。
【請求項２６】
自己再生を促進するための多能性細胞の培養方法であって、請求項１から１８のいずれかに記載の培地中で該細胞を維持する工程を含む、方法。
【請求項２７】
前記培地が、血清を含まないおよび血清抽出物を含まない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞が、マウス細胞である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が、ラット細胞である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項３１】
ＥＳ細胞の培養方法であって、以下の工程：
必要に応じてフィーダー上で、培養物中でＥＳ細胞を多能性状態に維持する工程；
少なくとも１回該ＥＳ細胞を継代する工程；
培地から（存在する場合）血清または血清抽出物を除去しそして（存在する場合）該フィーダーを除去し、該培地がフィーダー、血清および血清抽出物を含まないようにする工程；および
続いて、ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下でＥＳ細胞を多能性状態に維持する工程、
を含む、方法。
【請求項３２】
前記細胞が、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫインヒビターおよびｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターの存在下で多能性状態に維持される、請求項３１に記載の培養方法。
【請求項３３】
前記細胞が、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターアンタゴニストの存在下で多能性状態に維持される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞が、マウス細胞である、請求項３１から３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項３１から３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
ＥＳ細胞のトランスフェクトされた集団を得る方法であって、
選択マーカーをコードする構築物でＥＳ細胞をトランスフェクトする工程；
該ＥＳ細胞をプレートする工程；
ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下で該ＥＳ細胞を培養する工程；および
該選択マーカーを発現する細胞を選択する工程、
を含む、方法。
【請求項３７】
前記ＥＳ細胞が、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫインヒビターおよびｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターの存在下で培養される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＥＳ細胞が、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターアンタゴニストの存在下で培養される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞が、マウス細胞である、請求項３６から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項３６から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
血清および血清抽出物を含まず、そして
基本培地；
ＭＥＫインヒビター；
ＧＳＫ３インヒビター；および
鉄トランスポーター、
を含む、細胞培養培地。
【請求項４２】
ｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターをさらに含む、請求項４１に記載の培養培地。
【請求項４３】
ＦＧＦレセプターのアンタゴニストをさらに含む、請求項４１または４２に記載の培養培地。
【請求項４４】
インスリン、アルブミンおよびトランスフェリンをさらに含む、請求項４１から４３のいずれかに記載の培養培地。
【請求項４５】
アポトーシスのインヒビターをさらに含む、請求項４１から４４のいずれかに記載の培養培地。
【請求項４６】
胚盤胞から多能性細胞を誘導する方法であって、
（１）胚盤胞を得る工程；
（２）ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下で該胚盤胞を培養して、内部細胞塊を得る工程；
（３）該内部細胞塊を解離する工程；
（４）該解離した内部細胞塊から１または複数の細胞を単離する工程；および
（５）該単離した１または複数の細胞を、ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下で培養する工程、
を含む、方法。
【請求項４７】
前記単離した１または複数の細胞が、ｇｐ１３０下流シグナリングのアクチベーター、ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下で培養される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記単離した１または複数の細胞が、ＦＧＦレセプターのアンタゴニスト、ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下で培養される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記胚盤胞をＬＩＦ中で、２〜４日の期間に亘って培養する工程を含む、請求項４６から４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
第１の容器および第２の容器を含むキットであって、該第１の容器がＧＳＫ３インヒビターを含み、そして該第２の容器がＭＥＫインヒビターを含む、キット。
【請求項５１】
ＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む第３の容器をさらに含む、請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
前記ＧＳＫ３インヒビター、前記ＭＥＫインヒビターおよび前記ＦＧＦＲアンタゴニストが、請求項３から９または１３から１５に定義される通りである、請求項３７に記載のキット。
【請求項５３】
ｇｐ１３０下流シグナリングのアクチベーターを含むさらなる容器を含む、請求項５０から５２のいずれかに記載のキット。
【請求項５４】
前記ｇｐ１３０アゴニストが、（ａ）ＬＩＦ、（ｂ）ｓＩＬ−６ＲおよびＩＬ−６、または（ｃ）ハイパーＩＬ−６である、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
多能性幹細胞の自己再生の促進におけるＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの使用。
【請求項５６】
多能性幹細胞の自己再生の促進におけるＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの使用。
【請求項５７】
幹細胞集団を増殖させる方法であって、ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下で幹細胞を培養する工程を含む、方法。
【請求項５８】
幹細胞集団を増殖させる方法であって、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で幹細胞を培養する工程を含む、方法。
【請求項５９】
Ｎａｎｏｇを発現している多能性幹細胞の自己再生の促進におけるＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの使用。
【請求項６０】
Ｎａｎｏｇを発現している多能性幹細胞の自己再生の促進におけるＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの使用。
【請求項６１】
ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む、培養培地。
【請求項６２】
多能性細胞のための培養培地の製造におけるＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの使用。
【請求項６３】
自己再生を促進するための多能性細胞の培養方法であって、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む培地中で該細胞を維持する工程を含む、方法。
【請求項６４】
ＥＳ細胞の培養方法であって、以下の工程：
必要に応じてフィーダー上で、培養物中でＥＳ細胞を多能性状態に維持する工程；
少なくとも１回該ＥＳ細胞を継代する工程；
培地から（存在する場合）血清または血清抽出物を除去しそして（存在する場合）該フィーダーを除去し、該培地がフィーダー、血清および血清抽出物を含まないようにする工程；および
続いて、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのインヒビターの存在下でＥＳ細胞を多能性状態に維持する工程、
を含む、方法。
【請求項６５】
ＥＳ細胞のトランスフェクトされた集団を得る方法であって、
選択マーカーをコードする構築物でＥＳ細胞をトランスフェクトする工程；
該ＥＳ細胞をプレートする工程；
ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターアンタゴニストの存在下で該ＥＳ細胞を培養する工程；および
該選択マーカーを発現する細胞を選択する工程、
を含む、方法。
【請求項６６】
血清および血清抽出物を含まず、そして
基本培地；
ＭＥＫインヒビター；
ＦＧＦレセプターのアンタゴニスト；および
鉄トランスポーター、
を含む、細胞培養培地。
【請求項６７】
胚盤胞から多能性細胞を誘導する方法であって、
（１）胚盤胞を得る工程；
（２）ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で該胚盤胞を培養して、内部細胞塊を得る工程；
（３）該内部細胞塊を解離する工程；
（４）該解離した内部細胞塊から１または複数の細胞を単離する工程；および
（５）該単離した１または複数の細胞を、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で培養する工程、
を含む、方法。
【請求項６８】
第１の容器および第２の容器を含むキットであって、該第１の容器がＭＥＫインヒビターを含み、そして該第２の容器がＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含み、
該キットが、本明細書に記載される他の容器および／または構成成分もまた含み得る、キット。
【請求項６９】
多能性幹細胞の自己再生の促進におけるＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの使用。
【請求項７０】
Ｎａｎｏｇを発現している多能性幹細胞の自己再生の促進におけるＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの使用。
【請求項７１】
幹細胞集団を増殖させる方法であって、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で幹細胞を培養する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞における自己再生表現型の維持に関する。提供される方法および組成物は、多能性幹細胞、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、特に、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタおよびヒトを含む哺乳類の幹細胞の培養および単離に適する。特に、本発明は、ラット、マウスおよびヒトの多能性細胞の自己再生培養物、ならびにそのための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清および白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む培地の存在下でのインビトロ多能性幹細胞培養物の樹立および維持は、周知である（Smithら、（1998）Nature 336: 688-90）。このような方法は、「許容的」なマウスの系統から多くの継代に亘って多能性胚性幹（ＥＳ）細胞を維持するために用いられてきた。多能性幹細胞培養物の維持および自己再生は、フィーダー細胞またはその抽出物（通常はマウス線維芽細胞）の存在下で幹細胞が培養される場合にさらに支持される。このような条件下では、培養物中で多くの継代に亘ってヒトＥＳ細胞を多能性状態に維持し得る。
【０００３】
多くの場合において、ＥＳ細胞は、血清または血清抽出物を含む（したがって、非限定である）培地を用いる、またはヒトＥＳ細胞を維持するために用いられる線維芽細胞フィーダー細胞のような他の細胞の存在を必要とする細胞培養条件を用いる場合のみ、維持され得るか、あるいは最もよく維持される。しかし、何らかの不確定の構成成分は、培地中のものであろうとまたは例えばフィーダー細胞によって産生されるものであろうと、ＥＳ細胞の増殖および分化についての研究を潜在的に妨害し、または邪魔する。これは、ＥＳ細胞およびその子孫の治療および他の適用のための良好な製造実施の発展を妨げる。いくつかの限定されたＥＳ細胞培地が知られているが、代替のおよび好ましくは改良された限定培地が必要とされる。
【０００４】
本出願人による先の出願であるＷＯ−Ａ−０３／０９５６２８およびより後の未公開出願において、（１）ｇｐ１３０のアゴニスト（例えば、ＬＩＦ）および（２）ＴＧＦ−βスーパーファミリーのアゴニスト（例えば、ＢＭＰ４）またはＩｄシグナリング経路のアゴニストを含む無血清培地中でＥＳ細胞のような多能性幹細胞を培養することは、複数の継代に亘って幹細胞の自己再生を促進するために用いられる。ｇｐ１３０シグナリングの存在下では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーまたはＩｄシグナリング経路のアゴニストは、驚くべきことに、分化前のシグナルよりもむしろ自己再生の刺激を提供した。それにもかかわらず、多能性細胞を自己再生状態に維持する効率、およびフィーダー細胞から離してまたはフィーダー条件培地から離して多能性細胞を移すための培地は、常に改良されることが望まれる。
【０００５】
Ｓａｔｏ Ｎら、Nat. Med. 2004年1月 10(1) 55-63頁は、血清を含む培地中でのマウスおよびヒトＥＳ細胞に対する、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）インヒビターである６−ブロモインディルビン−３’−オキシムの効果を記載している。しかし、これらの効果は非常に短い時間枠に亘ってのみ観察され、あまりにも短いため確かな結論を引き出し得なかった。そして、その研究に用いられた非限定培地中の未知の因子の影響は重要であり得る。本発明の発明者らは、その結果を反復することを試みたがこれに失敗し、そして実際にはそれらの記載と反対の効果を見出した。
【０００６】
ＥＳ細胞の培養培地の調製のためには、個々の培地構成成分をできる限り純粋な形態で提供することが望まれる。しかし、ほとんどの培地構成成分はサイトカインであり、その純度は、それらを細胞系で製造し、次に生産ブロスから可能性のある汚染物質を除去する必要によって損なわれる。いくつかのサイトカインに伴う別の問題は、それらが効果的および無毒性である濃度範囲が狭いことである。より広い範囲の濃度を有しおよび／またはより高い濃度でより毒性が低い培地構成成分は、非常に有用である。サイトカインはまた、貯蔵において安定性が限定され得、そしてより安定な培地構成成分が求められる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、当該技術分野における問題を克服しまたは少なくとも改善すること、好ましくは代替の、より好ましくは改良された、多くの継代に亘って該幹細胞の自己再生を支持し得る、多能性幹細胞に適した培養方法および培養培地を提供することである。本発明のさらなる目的は、細胞の分化が制御される様式で誘導され得るまで多能性幹細胞培養物のインビトロでの維持を可能にする代替の培養系を提供することである。本発明のよりさらなる目的は、多能性幹細胞の誘導および単離を増強し、かつＥＳ細胞の単離に対して抵抗性の生物からまたは多能性幹細胞がまだ単離されていない生物からのそれらの誘導および単離を促進する方法および組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、ＥＳ細胞のような多能性幹細胞は、ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターを含む、またはＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む、（好ましくは無血清の）培地中で培養される。好ましくは、培地は、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニスト（例えば、小分子ＧＳＫ３インヒビターおよび小分子ＭＥＫインヒビターおよび小分子ＦＧＦＲアンタゴニスト）を含む。それによって、幹細胞の複数の継代に亘る自己再生が促進される。したがって、多能性細胞でのＧＳＫ３およびＭＥＫの阻害、ＭＥＫおよびＦＧＦレセプターシグナリングの阻害、またはＧＳＫ３、ＭＥＫおよびＦＧＦレセプターシグナリングの阻害は、自己再生の刺激を提供する。
【０００９】
本発明は、多くの適用を有する。ＧＳＫ３およびＭＥＫの阻害の組み合わせ、ＭＥＫおよびＦＧＦＲの阻害の組み合わせ、またはＧＳＫ３、ＭＥＫおよびＦＧＦＲの阻害の組み合わせが、多能性細胞、特にＥＳ細胞を増殖させるため、およびそれらがフィーダー上で誘導または増殖されていた場合、多能性細胞、特にＥＳ細胞を、フィーダー細胞またはフィーダー細胞の層（しばしばフィーダーまたはフィーダー細胞として言及される）を伴わずに増殖するように適応させるために用いられ得る。培養物中で幹細胞を増殖させる方法は、ＧＳＫ３インヒビターおよびＭＥＫインヒビターの存在下、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下、または好ましくはＧＳＫ３インヒビター、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で細胞を培養する工程を含む。１以上のＧＳＫ３インヒビターおよびＭＥＫインヒビター、１以上のＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦＲアンタゴニスト、ならびに必要に応じて１以上のＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦＲアンタゴニストを含む培養培地が調製され得る。ＥＳ細胞は、ＧＳＫ３インヒビターおよびＭＥＫインヒビターを用いて、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦＲアンタゴニストを用いて、またはＧＳＫ３インヒビター、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦＲアンタゴニストを用いて誘導され得る。
【００１０】
本発明の第１の局面によれば、多能性細胞でのＧＳＫ３およびＭＥＫの阻害、好ましくはＧＳＫ３およびＭＥＫおよびＦＧＦレセプターすべての阻害が、細胞の自己再生を促進するために用いられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
多能性細胞とは、胚性幹（ＥＳ）細胞と呼ばれるものを含むが、これに限定されない。多能性細胞（ＥＳ細胞を含む）に特有の性質としては、発生の多能性段階に関わる多重遺伝子の発現、供給源動物に存在するあらゆる組織タイプを代表する細胞に分化する能力、キメラを生じさせる能力、および、特にキメラの生殖系列を生じさせる能力が挙げられる。例えば、ＥＳ細胞のような真性多能性細胞は、多能性関連遺伝子Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＦＧＦ４、Ｓｏｘ−２およびアルカリフォスファターゼのすべてではないとしても多くを発現することが期待される。特に、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２の発現は、細胞がＥＳ細胞である決定的な最初の徴候を提供すると広く考えられている。キメラにおける生殖系列遺伝および３つの一次胚葉（すなわち、内胚葉、中胚葉および外胚葉）のすべてから分化した細胞を含む奇形種または奇形癌を生じる能力もまた、細胞がＥＳ細胞であることの決定的な徴候として広く考えられている。
【００１２】
ＧＳＫ３阻害とは、１以上のＧＳＫ３酵素の阻害をいう。したがって、ＧＳＫ３インヒビターはＧＳＫ３酵素ファミリーの１つのメンバー、いくつかのメンバー、またはすべてのメンバーを阻害し得る。ＧＳＫ３酵素ファミリーは周知であり、ＧＳＫ３−αおよびＧＳＫ３−βが挙げられるが、これらに限定されない。多くの変異型が記載されている（例えば、Schafferら; Gene 2003; 302（1-2）: 73-81参照）。特定の実施態様ではＧＳＫ３−βが阻害される。ＧＳＫ３−αインヒビターもまた適切であり、そして一般に本発明において使用されるインヒビターは両方ともを阻害する。広い範囲のＧＳＫ３インヒビターが公知である（例証として、インヒビターＣＨＩＲ９８０１４、ＣＨＩＲ９９０２１、ＡＲ−ＡＯ１４４−１８、ＴＤＺＤ−８、ＳＢ２１６７６３およびＳＢ４１５２８６）。他のインヒビターが公知であり、そして本発明において有用である。さらに、ＧＳＫ３−βの活性部位の構造は特徴づけられており、特異的なインヒビターおよび非特異的なインヒビターと相互作用する重要残基が同定されている（Bertrandら；J Mol Biol．2003；333（2）：393-407）。この構造特性によって、さらなるＧＳＫインヒビターが容易に同定され得る。
【００１３】
ある実施態様のインヒビターは、ＧＳＫ３−βおよびＧＳＫ３−αに特異的であり、実質的にｅｒｋ２を阻害せず、そして実質的にｃｄｃ２を阻害しない。インヒビターは、ＩＣ５０値の比として測定した場合、マウスｅｒｋ２および／またはヒトｃｄｃ２よりもヒトＧＳＫ３に対して、好ましくは少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも２００倍、非常に好ましくは少なくとも４００倍の選択性を有する。ここで、ＧＳＫ３ ＩＣ５０値とは、ヒトＧＳＫ３−βおよびＧＳＫ３−αについての平均値をいう。ＣＨＩＲ９９０２１およびＣＨＩＲ９８０１４について良好な結果が得られ、これらは両方ともＧＳＫ３に特異的である。ＧＳＫ３インヒビターの例は、Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｃら、J. Biol. Chem., 277巻, 34号, 2002年8月23日, 30998-31004頁およびＲｉｎｇ ＤＢら、Diabetes, 52巻, 2003年3月, 588-595頁に記載されている。ＣＨＩＲ９９０２１の使用に適した濃度は、０．０１〜１００、好ましくは０．１〜２０、より好ましくは０．３〜１０μＭの範囲にある。
【００１４】
ＧＳＫ３阻害はまた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて好都合に達成し得る。代表的に、ＧＳＫ３遺伝子のすべてまたは一部に対して相補的である２本鎖ＲＮＡ分子が多能性細胞に導入され、したがって、ＧＳＫ３をコードするｍＲＮＡ分子の特異的な分解を促進する。この転写後機構は、目的のＧＳＫ３遺伝子の発現を低減または停止させることとなる。ＲＮＡｉを用いてＧＳＫ３阻害を達成するための適切な技術およびプロトコールは公知である。
【００１５】
本明細書中においてＭＥＫインヒビターとは、一般的なＭＥＫインヒビターをいう。したがって、ＭＥＫインヒビターとは、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２およびＭＥＫ３を含むタンパク質キナーゼのＭＥＫファミリーメンバーの任意のインヒビターをいう。また、ＭＥＫ１インヒビター、ＭＥＫ２インヒビターおよびＭＥＫ３インヒビターをいう。ＭＥＫインヒビターは、ＭＥＫキナーゼファミリーの１つのメンバー、いくつかのメンバーまたはすべてのメンバーを阻害し得る。適切なＭＥＫインヒビターの例としては、当該技術分野で既に公知であり、ＭＥＫ１インヒビターであるＰＤ１８４３５２およびＰＤ９８０５９、ＭＥＫ１およびＭＥＫ２のインヒビターであるＵ０１２６およびＳＬ３２７、ならびに、Ｄａｖｉｅｓら（2000）（Davies SP, Reddy H, Caivano M, Cohen P. Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors. Biochem J. 351, 95-105）に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。特に、ＰＤ１８４３５２は、他の公知のＭＥＫインヒビターと比較した場合に、高い特異性および効力を有することが見出されている。他のＭＥＫインヒビターおよびＭＥＫインヒビターのクラスは、Ｚｈａｎｇら（2000）Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters; 10:2825-2828に記載されている。
【００１６】
ＭＥＫキナーゼの阻害はまた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて好都合に達成し得る。代表的に、ＭＥＫ遺伝子のすべてまたは一部に対して相補的である２本鎖ＲＮＡ分子が多能性細胞に導入され、したがって、ＭＥＫをコードするｍＲＮＡ分子の特異的な分解を促進する。この転写後機構は、目的のＭＥＫ遺伝子の発現を低減または停止させることとなる。ＲＮＡｉを用いてＭＥＫ阻害を達成するための適切な技術およびプロトコールは公知である。
【００１７】
キナーゼインヒビター（ＧＳＫ３インヒビターおよびＭＥＫインヒビターを含む）を同定するための多くのアッセイが、公知である。例えば、Ｄａｖｉｅｓら（2000）には、ペプチド基質および放射性標識ＡＴＰの存在下でキナーゼをインキュベートするキナーゼアッセイが記載されている。キナーゼによる基質のリン酸化は、基質への標識の取り込みを生じる。各反応のアリコートを、リン酸セルロース紙上に固定化し、そしてリン酸中で洗浄し、遊離ＡＴＰを除去する。次いでインキュベーション後の基質の活性を測定し、そしてキナーゼ活性の指標が提供される。キナーゼインヒビター候補の存在下および不在下における相対的なキナーゼ活性は、そのようなアッセイを用いることで容易に決定し得る。Ｄｏｗｎｅｙら（1996）J Biol Chem.；271（35）：21005-21011にもまた、キナーゼインヒビターの同定に用いられ得るキナーゼ活性についてのアッセイが記載されている。
【００１８】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）レセプター（ＦＧＦＲ）のアンタゴニストとは、代表的にＦＧＦＲ１および／またはＦＧＦＲ２を阻害する、ＦＧＦレセプターのポリペプチドまたは小分子または他のアンタゴニストをいう。したがって、ＦＧＦレセプターアンタゴニストは、ＦＧＦレセプターファミリーの１つのメンバー、いくつかのメンバー、またはすべてのメンバーのアンタゴニストであり得、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４が挙げられるがこれらに限定されない。ＦＧＦレセプターファミリーのメンバーは、代表的に、３つの免疫グロブリン様ドメインを含み、そして酸性アミノ酸領域（酸性ボックス）を提示し、この領域は、ＦＧＦファミリーメンバーのＦＧＦレセプターへの結合に関与し得る。ある場合には、２つの免疫グロブリン様ドメインのみを含む分子もまた、ＦＧＦレセプターとして機能し得る。多くのＦＧＦＲアンタゴニストが公知であり、ＳＵ５４０２およびＰＤ１７３０７４が挙げられるがこれらに限定されない。多くのＦＧＦＲアンタゴニストが公知である（例えば、ＳＵ５４０２およびＰＤ１７３０７４）。ＳＵ５４０２の適切な濃度はμＭの範囲であり、例えば０．１〜２０μＭ、好ましくは０．５〜１０μＭ、特に１〜５μＭの範囲である。発明者らは、ＰＤ１７３０７４がＳＵ５４０２の代わりに用いられ得ること、そしてＰＤ１７３０７４は約１００倍低い濃度で十分に効果的であり、このことはＦＧＦレセプターに対して、より高い親和性を有することと一致することを見出した。したがって、ＰＤ１７３０７４の適切な濃度は、１〜２００ｎＭの範囲、好ましくは５〜１００ｎＭ、特に１０〜５０ｎＭの範囲である。ドミナントネガティブ変異体ＦＧＦレセプターの導入遺伝子発現によってＦＧＦレセプターシグナリングを阻害することもまた公知である。しかし、本発明の実施態様では、遺伝子導入ベースの拮抗ではなく、小分子アンタゴニストの使用が好ましい。
【００１９】
ＦＧＦレセプターのアンタゴニストを同定するための適切なアッセイは公知である。例えば、ＦＧＦレセプター経由のシグナリングがレポーター遺伝子の発現を活性化する細胞系が、可能性のあるアンタゴニストの活性を評価するために用いられ得る。
【００２０】
有利なことに、ＧＳＫ３インヒビターと組み合わせた、および好ましくはＦＧＦレセプターのアンタゴニストもまた組み合わせたＭＥＫインヒビターの使用は、ＥＳ細胞の増殖を改善することが見出された。
【００２１】
好ましい実施態様では、約０．１μＭと約２５μＭとの間のＭＥＫインヒビターが用いられる。さらに好ましくは、約０．１μＭと約５μＭとの間のＭＥＫインヒビターが用いられ、より好ましくは、０．２μＭから２μＭまでである。
【００２２】
本発明による特に好ましい培地は、０．８μＭのＰＤ１８４３５２、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１および／または３μＭのＳＵ５４０２を含む。特に好ましい培地は、０．８μＭのＰＤ１８４３５２、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１および３μＭのＳＵ５４０２を含み、好ましくはＮ２Ｂ２７培地中である。ＳＵ５４０２の濃度は、異なる多能性細胞系に合うように最適化され得、代表的には１〜５μＭの範囲（例えば、２μＭ）である。
【００２３】
以下の実施例において、発明者らは、自己再生を促進するために、ＭＥＫインヒビターとともに、および特定の実施例ではＦＧＦレセプターのアンタゴニストともともにＧＳＫ３インヒビターの存在下でマウスＥＳ細胞を培養した。他の特定の実施例において、培養物中でマウス多能性細胞の自己再生を促進する方法は、ＧＳＫ３およびＭＥＫを阻害する工程、またはＧＳＫ３、ＭＥＫおよびＦＧＦレセプターを阻害する工程を含む。
【００２４】
必要に応じて、ｇｐ１３０下流シグナリングの活性化は、ＧＳＫ３およびＭＥＫを阻害することによって自己再生の促進をさらに増強するためにもまた用いられ得る。ｇｐ１３０下流シグナリングの活性化分子は、時に、ｇｐ１３０アクチベーターまたはｇｐ１３０アゴニストとも言われる。１以上のｇｐ１３０下流シグナリング経路の活性化は、ｇｐ１３０を介して作用するサイトカイン、例えばＬＩＦレセプターのサイトカインまたは他のアゴニストの使用によって達成され得る。ｇｐ１３０を介して作用し得、したがってｇｐ１３０シグナル伝達を活性化し得るサイトカインとしては、ＬＩＦ、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン、オンコスタチンＭ、ＩＬ−６＋ｓＩＬ−６レセプター、ハイパーＩＬ−６およびＩＬ−１１が挙げられるが、これらに限定されない。適切なサイトカインには、ｇｐ１３０に結合し得および／またはｇｐ１３０を介してシグナリングを活性化し得る模倣物、融合タンパク質またはキメラが含まれる。血清存在下でｇｐ１３０を介して作用するサイトカインの役割は十分に確立されているが、血清不在下で未分化細胞を維持するそれらのサイトカインの能力は限られる。
【００２５】
本発明の利点は、ＧＳＫ３インヒビター、ＭＥＫインヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下では、多能性細胞が限定培地中で増殖し得ることである。ＧＳＫ３インヒビター、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの組み合わせを用いることによる特別な利点は、この培地がインスリン、Ｎ２Ｂ２７またはｇｐ１３０アゴニスト（例えば、ＬＩＦ）などの他の増殖因子を含有する必要がないことである。したがって、本発明は、血清、血清抽出物、フィーダー細胞およびフィーダー細胞抽出物を含まない培地中でのＥＳ細胞の代替のおよび／または改良された培養を可能にする。
【００２６】
マウス（Bradleyら、(1984) Nature 309: 255-56）、アメリカミンク（Mol Reprod Dev (1992) 12月; 33(4): 418-31）、ブタおよびヒツジ（J Reprod Fertil Suppl (1991); 43: 255-60）、ハムスター（Dev Biol (1988) 5月; 127(1): 224-7）およびウシ（Roux Arch Dev Biol (1992); 201: 134-141）を含む多くの哺乳類供給源から、目的の胚性幹細胞が報告されている。本明細書の特定の実施例は、マウスおよびヒトのＥＳ細胞を用い、そして一次派生物由来のラット細胞もまた用いる。本発明の方法および組成物が、したがって、霊長類（特にヒト）、齧歯類（特にマウスおよびラット）、および鳥類の多能性幹細胞、特にＥＳ細胞を含む他の哺乳類の多能性細胞培養物の培養への適応に適切であることが理解される。
【００２７】
本発明の第２の局面は、自己再生を促進するための多能性細胞、特にＥＳ細胞の培養方法を提供し、該方法は：
（１）ＧＳＫ３のインヒビター；および
（２）ＭＥＫのインヒビター、
を含む培地中で該細胞を維持する工程を含む。
【００２８】
好ましくは、該方法は：
（１）ＧＳＫ３のインヒビター；
（２）ＭＥＫのインヒビター；および
（３）ＦＧＦレセプターのアンタゴニスト、
を含む培地中で該細胞を維持する工程を含む。
【００２９】
本発明の方法は、血清を含まないおよび血清抽出物を含まない培地中で、多能性細胞を増殖（ＥＳ細胞の増殖を含む）させるために一般的に用いられ得、これらの細胞は、血清または血清抽出物の存在下で予め継代されている。好ましくは、このような方法はまた、フィーダー細胞および／またはフィーダー細胞抽出物の不在下で行われる。例えば、以下の工程を含むＥＳ細胞の培養が行われ得る：
必要に応じてフィーダー上で、培養物中でＥＳ細胞を多能性状態に維持する工程；
少なくとも１回該ＥＳ細胞を継代する工程；
該培地から血清または血清抽出物を除去しそして（存在する場合）該フィーダーを除去して、該培地がフィーダー、血清および血清抽出物を含まないようにする工程；および
続いて、ＧＳＫ３のインヒビター、ＭＥＫインヒビターおよび必要に応じてＦＧＦＲアンタゴニストの存在下でＥＳ細胞を多能性状態に維持する工程。
【００３０】
さらに、必要に応じて、細胞は、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターの存在下で多能性状態に維持され得る。
【００３１】
本発明は、ＥＳ細胞のトランスフェクトされた集団を得る方法もまた提供し、該方法は：
選択マーカーをコードする構築物でＥＳ細胞をトランスフェクトする工程；
該ＥＳ細胞をプレートする工程；
ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦＲアンタゴニストの存在下で該ＥＳ細胞を培養する工程；および
該選択マーカーを発現する細胞を選択する工程、
を含む。
【００３２】
さらに、必要に応じて、細胞は、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターの存在下で培養される。
【００３３】
選択マーカーは、例えばＥＰ−Ａ−０６９５３５１に記載のように抗生物質耐性、細胞表面マーカーまたは他の選択マーカーをコードし得、そして好ましくは所望の細胞で選択マーカーを優先的に発現するプロモーターに作動可能に連結した選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
さらなる実施態様において、本発明は、多能性（特にＥＳ）細胞の培養方法を提供し、該方法は、培養容器（例えばプレート上の個々のウェル）へ個々の細胞を移す工程、および、ＧＳＫ３インヒビター、ＭＥＫインヒビターおよび必要に応じてＦＧＦＲアンタゴニストの存在下で該細胞を培養する工程を含み、それにより、すべての細胞が単一細胞の子孫である多能性（特にＥＳ）細胞のクローン集団を得る。必要に応じて、細胞はまた、ｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターの存在下で培養され得る。
【００３５】
一旦、ＥＳ細胞の安定で均一な培養物が得られると、培養条件は、外胚葉、中胚葉または内胚葉の細胞の運命から選択される１以上の細胞タイプへ細胞の分化を方向づけるように変更され得る。サイトカインおよびシグナリング因子の添加または除去は、特定の分化した細胞集団の高い効率での誘導を可能にし得る。非神経外胚葉の運命へのＥＳ細胞の分化は、ｇｐ１３０を介して作用するサイトカイン、ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下でＥＳ細胞を維持すること、ならびに次いで、サイトカインを除去する一方、ＧＳＫ３インヒビターおよびＭＥＫインヒビターを維持すること、および／または分化を方向づけ得るさらなるシグナリング分子を添加することによって達成され得る。あるいは、細胞は、ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下で維持され得、次いで、該インヒビターの１つまたは両方を除去すること、および／または分化を方向づけ得るシグナリング分子を添加することによって分化を方向づけ得る。上記の方法はすべて、必要に応じて、プロセスの産物である分化した細胞を得る工程および／または単離する工程を含む。
【００３６】
本発明のさらなる局面は、細胞培養培地を提供する。ある培地は、多能性（特にＥＳ）細胞の自己再生のためであり、該培地は、ＧＳＫ３のインヒビター、ＭＥＫのインヒビターおよび必要に応じてＦＧＦＲアンタゴニストを含む。該培地は、必要に応じてｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターもまた含み得る。本発明の別の培地は、幹細胞培養培地であり、ＧＳＫ３のインヒビター、ＭＥＫインヒビターおよび必要に応じてＦＧＦＲアンタゴニストを含む。すべての培地は、好ましくはさらに基本培地を含む。いくつかの好ましい実施態様では、すべての培地はｇｐ１３０のアゴニストを含まず、したがって、好ましくはＬＩＦを含まない。
【００３７】
本発明は、血清および血清抽出物を含まない培地を提供する。１つのこのような培地は：
基本培地；
ＭＥＫインヒビター；
ＧＳＫ３インヒビター；および
鉄トランスポーター；
を含み、ここで、該培地は、必要に応じて、血清および血清抽出物を含まない。
【００３８】
培地は、好ましくはＦＧＦＲアンタゴニストもまた含む。培地は、必要に応じてｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターもまた含み得る。
【００３９】
多能性幹細胞（特にラットまたはマウス細胞）に好適な培地は、血清およびｇｐ１３０アゴニストを含まなくてよく、そしてＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む。培地構成成分の置換は、本明細書に記載のように行われ得る。
【００４０】
基本培地は、細胞のために炭素および／またはビタミンおよび／またはミネラルの必須供給源を供給する培地である。基本培地は、一般的にタンパク質を含まず、そして細胞の自己再生をそれ自体で支持し得ない。鉄トランスポーターは、鉄の供給源を提供し、または培養培地から鉄を取り込む能力を提供する。適切な鉄トランスポーターとしては、トランスフェリンおよびアポトランスフェリンが挙げられる。培地は、１以上のインスリンまたはインスリン様増殖因子、およびアルブミン（好ましくは組換え体）またはアルブミン代替物をさらに含み、そしてフィーダー細胞およびフィーダー細胞抽出物を含まないことが好ましい。培地は、アポトーシスのインヒビターまたは培養物中の多能性細胞の維持を促進する任意の他の構成成分もまた含み得る。
【００４１】
本発明の特定の培地は、さらなる基本培地を含んでまたは含まずに、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビター、インスリン、アルブミンおよびトランスフェリンを含む。この培地では、ＬＩＦが、必要に応じて含まれ得、そしてｇｐ１３０シグナリングの他のアクチベーターによって置換され得る。しかし、好ましい培地は、ｇｐ１３０レセプター結合サイトカインであるＬＩＦを含み、その適切な濃度は、一般的には１０Ｕ／ｍｌと１０００Ｕ／ｍｌとの間、より好ましくは５０Ｕ／ｍｌと５００Ｕ／ｍｌとの間、さらにより好ましくは１００Ｕ／ｍｌの範囲にある。ＧＳＫ３およびＭＥＫインヒビターは、好ましくは本明細書により詳細に記載の通りである。
【００４２】
本発明は、胚盤胞から多能性細胞を誘導する方法をさらに提供し、該方法は：
（１）胚盤胞を得る工程；
（２）ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で該胚盤胞を培養して、内部細胞塊を得る工程；
（３）該内部細胞塊を解離する工程；
（４）該解離した内部細胞塊から１または複数の細胞を単離する工程；および
（５）該単離した１または複数の細胞を、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で培養する工程、
を含む。
【００４３】
必要に応じて、該単離した１または複数の細胞は、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびｇｐ１３０下流シグナリングのアクチベーターの存在下で培養される。ＦＧＦレセプターのアンタゴニストもまた存在させ得る。
【００４４】
好ましくは、前記方法は、胚盤胞をＬＩＦ中で、より好ましくは２〜４日の期間に亘って培養する工程を含む。単離した１または複数の細胞は、好ましくは無血清培地中で培養される。代表的には、これらの細胞は、凝集塊として再プレートされる。胚盤胞はまた、好ましくは、無血清培地中で、必要に応じてＢＭＰレセプターのアゴニストの不在下で、培養される。
【００４５】
本発明によれば、細胞の培養は、接着培養で行われることがさらに好ましく、これは培養基材上に細胞接着タンパク質を含むことによって促進され得る。本発明によれば、単層培養で多能性細胞を培養することもまた好ましいが、必要に応じて、細胞を懸濁培養でまたはプレ細胞凝集塊として増殖させる；細胞をビーズ上であるいは他の適切な足場（例えば膜または他の３次元構造物）上でもまた増殖させ得る。
【００４６】
本発明の実施例において用いられる培養培地は、好ましくは血清アルブミンもまた含む。これは、精製された形態または好ましくは組換え体の形態で用いられ得、そして組換え体の形態の場合には、これはサイトカインなどの可能性のある混入因子の不在という利点を有する。培養培地は、血清アルブミンを含む必要はなく、そしてこの構成成分は除外され得、あるいは別のバルクタンパク質またはＷｉｌｅｓらに記載の合成ポリマー（ポリビニルアルコール）に置換され得る。
【００４７】
本発明の特に好ましい培地は、完全に限定されるものである。この培地は、不確定のいかなる構成成分、すなわち、その内容物が知られていない構成成分または特定されない不確定因子または変動因子を含み得る構成成分も含まない。完全限定培地を用いることの利点は、多能性細胞の培養および引き続く操作のための効率的および一貫したプロトコールが誘導され得ることである。さらに、細胞を多能性状態に維持することが、より高い効率およびより大きい予測性で達成可能であること、および限定培地を用いて培養される細胞で分化が誘導される場合、分化シグナルへの応答が、非限定培地が用いられる場合より均一であることがわかる。
【００４８】
本発明はまた、培養培地の調製を目的とする、培養培地の添加物として用いられ得る濃縮物、および構成成分のキットを提供し、得られる培地は、本発明と一致する。本発明の１つのキットは、第１の容器および第２の容器を含み、第１の容器はＭＥＫインヒビターを含み、そして第２の容器はＧＳＫ３インヒビターを含む。好ましくは、キットは、ＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む第３の容器を含む。キットはまた、必要に応じて、ｇｐ１３０下流シグナリングのアクチベーターを含むさらなる容器を含み得る。キットは、好ましくは、各容器の内容物が本発明の培養培地を得るように培養培地に添加され得るように処方される。キットは、好ましくは、それらのそれぞれの構成成分の濃縮されたストック溶液を含む。
【００４９】
本発明の方法はまた、分化した細胞を得る方法を含み、該方法は、記載のように多能性細胞を培養する工程、および細胞が分化することを可能にするまたは引き起こす工程を含む。ここで、細胞は、多能性幹細胞を含む他の細胞タイプと比較して所望の分化した細胞で差次的発現が可能である選択マーカーを含み、これによって、選択マーカーの差次的発現は、所望の分化した細胞の優先的な単離および／または生存および／または分裂をもたらす。選択マーカーは、所望の分化した細胞で発現し得るが他の細胞タイプでは発現しないか、あるいは所望の分化した細胞と他の細胞タイプとで発現レベルが異なり得、それによって選択マーカーの発現についての選択を可能にする。分化した細胞は、組織幹細胞または組織前駆細胞であり得、そして最終分化した細胞であり得る。
【００５０】
一般的に、本発明はまた、本明細書に記載の本発明の方法のいずれかに従うことにより得られる細胞にも及ぶ。本発明の細胞は、創薬のためのアッセイに用いられ得る。本発明の細胞はまた、細胞治療のために用いられ得、したがって、本発明の方法は、ＭＥＫの阻害、ＧＳＫ３の阻害および必要に応じてＦＧＦシグナリングの拮抗の組み合わせを用いて多能性細胞を誘導および／または維持する工程、そこから細胞治療のための細胞を誘導する工程および細胞治療でそれらの細胞を用いる工程を含む。必要に応じて、この組み合わせは、ｇｐ１３０下流シグナリングのアクチベーターの不在下で用いられる。
【００５１】
本発明のさらなる局面は、多能性細胞の自己再生を促進するための、ＭＥＫおよびＦＧＦレセプターの阻害の使用、必要に応じてＧＳＫ３の阻害との組み合わせでの使用に関する。発明者らは、ＭＥＫインヒビターとＦＧＦレセプターのアンタゴニストとの組み合わせが、添加サイトカインまたは増殖因子の不在下で無血清培地中で多能性細胞の増殖を支持する場合に効果的であることを見出した。
【００５２】
したがって、本発明のさらなる局面は、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む培養培地を提供する。ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターアンタゴニストは、本発明の他の局面に関連して記載される通りである。同様に、培養培地は、本発明の他の局面に関連して本明細書に記載されるさらなる構成成分または因子をさらに含み得る。
【００５３】
本発明のさらに他の局面は、多能性細胞のための培養培地の製造におけるＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの使用を提供する。
【００５４】
本発明は、多能性細胞を培養する方法、および多能性細胞のトランスフェクトされた集団を得る方法もまた提供し、これらは、本発明の他の局面について記載のように好都合に実施され得る。したがって、本発明のさらなる局面は、自己再生を促進するような多能性細胞の培養方法を提供し、該方法は、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む培地中で細胞を維持する工程を含む。
【００５５】
本発明の関連する局面は、多能性細胞の培養方法を提供し、該方法は以下の工程を含む：
必要に応じてフィーダー上で、培養物中でＥＳ細胞を多能性状態に維持する工程；
少なくとも１回該ＥＳ細胞を継代する工程；
培地から（存在する場合）血清または血清抽出物を除去しそして（存在する場合）該フィーダーを除去して、該培地がフィーダー、血清および血清抽出物を含まないようにする工程；および
続いて、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのインヒビターの存在下でＥＳ細胞を多能性状態に維持する工程。
【００５６】
本発明のさらなる局面は、ＥＳ細胞のトランスフェクトされた集団を得る方法を提供し、該方法は：
選択マーカーをコードする構築物でＥＳ細胞をトランスフェクトする工程；
該ＥＳ細胞をプレートする工程；
ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターアンタゴニストの存在下で該ＥＳ細胞を培養する工程、および
該選択マーカーを発現する細胞を選択する工程、
を含む。
【００５７】
また、血清および血清抽出物を含まない細胞培養培地が提供され、該培地は：
基本培地；
ＭＥＫインヒビター；
ＦＧＦレセプターのアンタゴニスト；および
鉄トランスポーター、
を含む。
【００５８】
ＭＥＫインヒビターとＦＧＦレセプターのアンタゴニストとの組み合わせは、新たな多能性細胞系の誘導にもまた有用である。したがって、本発明のさらなる局面は、胚盤胞から多能性細胞を誘導する方法を提供し、該方法は：
（１）胚盤胞を得る工程；
（２）ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で該胚盤胞を培養して、内部細胞塊を得る工程；
（３）該内部細胞塊を解離する工程；
（４）該解離した内部細胞塊から１または複数の細胞を単離する工程；および
（５）該単離した１または複数の細胞を、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で培養する工程、
を含む。
【００５９】
本発明はまた、第１の容器および第２の容器を含むキットを含み、第１の容器はＭＥＫインヒビターを含み、そして第２の容器はＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む。キットはまた、本明細書に記載される他の容器および／または構成成分を含み得る。
【００６０】
本発明のさらなる局面は、多能性幹細胞、特にＮａｎｏｇを発現する多能性幹細胞の自己再生の促進において、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの使用を提供する。関連する局面は、幹細胞集団を増殖させる方法を提供し、該方法は、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で幹細胞を培養する工程を含む。
【００６１】
本発明の多くの利点は、上記の通りでありまたは明らかである。比較的無毒性および細胞透過性である細胞培養構成成分が同定され得る。本発明の特定の実施態様において用いられるＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦＲアンタゴニストは、特に、例えばタンパク質サイトカインの精製と比較して、容易に精製され得る。組換えタンパク質は、作成が高価であり得、そして小分子の培地構成成分は、より安価に生産され、かつ貯蔵がより安定であり得、より広い有効濃度範囲を伴い得る。
【００６２】
以下に記載の特定の実施態様は、無血清の完全限定培地でＣＨＩＲ９９０２１、ＰＤ１８４３５２および必要に応じてＳＵ５４０２の組み合わせを用い、そしてマウスＥＳ細胞の自己再生の改善を示し、ほとんど分化を示さなかった。ＢＭＰの存在下でＥＳ細胞を培養する場合、いくつかの神経発生があることが時々報告される。これは、本発明の実施例においては見られなかった。
【００６３】
本発明は、ここで、特定の実施例においてさらに説明され、図によって示される。
【００６４】
図１は、多能性ＥＳ−ＮＳハイブリッドコロニーの形成におけるＰＤ１８４３５２の効果の分析結果を示す。（Ａ−Ｃ）ＲＨ×ＮＳ  ＴＧＦＰ融合の赤色蛍光および緑色蛍光についてのＦＡＣＳ分析。（Ａ）ＰＥＧ処理の２４時間後の融合混合物；（Ｂ）ＡでゲートをかけたＦＡＣＳ分類されたハイブリッドの純度チェック。（Ｃ）Ａで分類されたハイブリッドをプレートして形成されたコロニーをプレートしたハイブリッドあたりのコロニーの比率（％）としてスコア付けた。これらのスコアは、ＦＡＣＳ分類された細胞の純度を考慮する。（Ｄ）データの概要。（Ｅ）ハイブリッドコロニー形態の例。
【００６５】
図２は、本発明にしたがって誘導および維持されたマウスのＥＳ細胞、ならびにこれらのＥＳ細胞による高効率なキメラ発生を示す。
【００６６】
図３は、本発明にしたがって増殖した４継代マウスＥＳ細胞を示す。
【００６７】
図４は、本発明にしたがって増殖したマウスＥＳ細胞がＯｃｔ４陽性であることを示す。
【００６８】
実施例において、用語２ｉ培地または２ｉは、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む培地を示すために用いられる。用語３ｉ培地または３ｉは、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む培地を示すために用いられる。
【実施例】
【００６９】
ＧＳＫ−３βインヒビター、ＭＥＫインヒビター、培養培地、およびＥＳ細胞の自己再生
マウスおよびヒトＥＳ細胞を、特に明記のない限りＮ２Ｂ２７培地を用いて、そしてＧＳＫ−３βインヒビターであるＣＨＩＲ９９０２１、ＡＲ−ＡＯ１４４−１８、ＳＢ２１６７６３およびＳＢ４１５２８６、ならびにＭＥＫインヒビターであるＰＤ１８４３５２の存在下または不在下で、種々の条件下で増殖させた。
【００７０】
Ｎ２Ｂ２７培地の調製：
Ｎ２ １００×ストック溶液。１０ｍｌについて：１ｍｌのインスリン（最終濃度２．５ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌのアポトランスフェリン（最終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）、０．６７ｍｌのＢＳＡ（最終濃度５ｍｇ／ｍｌ）、３３μｌのプロゲステロン（最終濃度２μｇ／ｍｌ）、１００μｌのプトレシン（最終濃度１．６ｍｇ／ｍｌ）、１０μｌの亜セレン酸ナトリウム（最終濃度３μＭ）および７．１８７ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２と混合する。４℃で貯蔵し、そして１カ月以内に使用する。
【００７１】
ＤＭＥＭ／Ｆ１２−Ｎ２培地：１００ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２に対して、１ｍｌのＮ２  １００×ストック溶液を添加する。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中のＮ２の各構成成分の最終濃度は：インスリン、２５μｇ／ｍｌ；アポトランスフェリン、１００μｇ／ｍｌ；プロゲステロン、６ｎｇ／ｍｌ；プトレシン、１６μｇ／ｍｌ；亜セレン酸ナトリウム、３０ｎＭ；ＢＳＡ  ５０μｇ／ｍｌである。４℃で貯蔵し、そして１カ月以内に使用する。
【００７２】
Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７培地：１００ｍｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地に対して、２ｍｌのＢ２７および０．５〜１ｍｌの２００ｍＭ  Ｌ−グルタミンを添加する。４℃で貯蔵し、そして１カ月以内に使用する。
【００７３】
Ｎ２Ｂ２７培地：ＤＭＥＭ／Ｆ１２−Ｎ２培地をＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７培地と１：１の比で混合する。０．１Ｍストックから０．１ｍＭの最終濃度になるまでβ−メルカプトエタノールを添加する。４℃で貯蔵し、そして１カ月以内に使用する。
【００７４】
実施例１
無血清培地中では、ＭＥＫインヒビター＋ＧＳＫ−３βインヒビターは、（１）Ｎ２Ｂ２７培地、および（２）完全限定培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２−Ｎ２）の両方で、マウスＥＳ細胞の自己再生を維持するのに十分であった（データは示さず）。ＥＳ細胞の自己再生は、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ−３βインヒビターおよびＬＩＦを含む培地中でさらに改善された（データは示さず）。
【００７５】
実施例２
ＰＤ１８４３５２（ＭＥＫのインヒビター）がＥＳ細胞中のＮａｎｏｇのレベルを増加させることが示された（データは示さず）。さらに、ＰＤ１８４３５２で処理されたＮａｎｏｇ−／−ＥＳ細胞がＥＳ細胞の自己再生の増強を示さなくなることが示された。実際、これらの細胞は分化した（データは示さず）。これにより、ＰＤ１８４３５２によるＥＳ自己再生表現型の増強がＮａｎｏｇによって仲介されることが立証された。
【００７６】
再プログラミングにおけるＰＤ１８４３５２の効果を、細胞融合の前後におけるＮＳ細胞の多分化能への変換を決定することによってもまた研究した。
【００７７】
ｄｓＲｅｄ蛍光タンパク質およびハイグロマイシン耐性を構成的に発現するＲＨ  ＥＳ細胞を、ＩＲＥＳを経てピューロマイシン耐性に連結した融合タンパク質ＴａｕＧＦＰを発現する胎児由来神経幹細胞（ＮＳ  ＴＧＦＰ）に融合した。融合の一方には、ＲＨ細胞を、融合の前後３日間、３μＭのＰＤ１８４３５２で処理した。コントロールには、ＰＤ１８４３５２を添加しなかった。融合２４時間後、処理した初代ハイブリッドおよび未処理の初代ハイブリッドを分類し、次いでプレートした（図１Ａ−Ｃ）。３日後、ハイグロマイシンおよびピューロマイシン選択をＥＳ培地に添加した。ｄｓＲｅｄ２およびＧＦＰ蛍光の発現およびＥＳ細胞形態の提示についてコロニーのスコアを付けた（図１Ｄおよび図１Ｅ）。結果は、ＰＤ１８４３５２がＥＳ−ＮＳハイブリッドコロニーの形成を４５倍増強することを示した。興味深いことに、ＰＤ１８４３５２で処理したＲＨ細胞中のプレートしたハイブリッドあたりのハイブリッドコロニー形成の比率（％）は、Ｎａｎｏｇを過剰発現させているＥＳ細胞と比較してちょうど２倍低かった（２．２５％対４％）。この結果は、ＰＤ１８４３５２がＥＳ細胞の自己再生を増強するだけでなく、細胞融合前後における再プログラミングもまた増強することを示している。この効果は、処理したＲＨ細胞におけるＮａｎｏｇのレベルの増加によって仲介されていると思われる。したがって、Ｎａｎｏｇが内生的に発現する場合、ＭＥＫインヒビターがＮａｎｏｇをアップレギュレートするために用いられ得、そして再プログラミングの増強などの付随効果を達成し得る。
【００７８】
実施例３
ヒトＥＳ細胞を、ＧＳＫ−３インヒビターであるＣＨＩＲ９９０２１およびＭＥＫインヒビターであるＰＤ１８４３５２を追加した培地で培養した。
【００７９】
培養培地へのＬＩＦの添加は、細胞の増殖をさらに改善した（データは示さず）。
【００８０】
実施例４
マウスＥＳ細胞を、ＧＳＫ−３インヒビターであるＣＨＩＲ９９０２１およびＭＥＫインヒビターであるＰＤ１８４３５２を追加した培地で培養した。
【００８１】
培養培地へのＬＩＦの添加は、細胞の増殖をさらに改善した（データは示さず）。
【００８２】
実施例５
マウスおよびヒトＥＳ細胞を、ＣＨＩＲ９９０２１、ＰＤ１８４３５２およびＳＵ５４０２を含む培地で増殖させ、該培地は以下のように調製した：
【００８３】
【表１】
2009531054.tif 000003
【００８４】
培地
ＤＭＥＭ／Ｆ１２−Ｎ２培地の調製
１００ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２（Gibco 42400-010）に対して、１ｍｌのＮ２  １００×ストック溶液を添加する。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中のＮ２の各構成成分の最終濃度は：
インスリン  ２５μｇ／ｍｌ
プトレシン  １６μｇ／ｍｌ
トランスフェリン  １００μｇ／ｍｌ
亜セレン酸ナトリウム  ３０ｎＭ
プロゲステロン  ６ｎｇ／ｍｌ
ＢＳＡ ５０μｇ／ｍｌ
である。
【００８５】
Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７の調製：
１００ｍｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Gibco 21103-049）に対して、２ｍｌのＢ２７（Gibco 17504-044）および１〜２Ｍ  Ｌ−グルタミン（ＴＣ保存  １：１００）を添加する。
【００８６】
Ｎ２Ｂ２７培地の調製：
ＤＭＥＭ／Ｆ１２−Ｎ２培地をＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７培地と１：１の比で混合する。この培地を、すべての化合物の希釈および細胞の増殖に用いた。
【００８７】
この培地は、ヒトＥＳ細胞の維持、ならびに１２９系統マウス由来のＥＳ細胞の誘導および維持に用い、そして非許容的なマウス系統であるＣＢＡおよびＣ５６／ＢＬ６由来のＥＳ細胞の誘導にもまた用いた。
【００８８】
実施例６
マウスＥＳ細胞を、ＦＧＦレセプターのインヒビターおよびＭＥＫインヒビターの存在下で培養した。選択的薬理学的インヒビターＳＵ５４０２およびＰＤ１８４３５２を、それぞれＦＧＦレセプターチロシンキナーゼの阻害およびＭＥＫ１／２を経たＥｒｋ１／２の活性化の阻害のために用いた。発明者らは、どちらのインヒビターの添加も、ＢＭＰ４を供給することなく、ＬＩＦを含むＮ２Ｂ２７培地中で強固にＥＳ細胞を増殖させるに十分であることを見出した（データは示さず）。未分化の培養物は、これらの条件において、多能性マーカーＯｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＲｅｘ１の発現を保持しながら継続的に継代され得る。ＬＩＦ＋ＢＭＰで維持された培養物中よりもＩｄ遺伝子の発現がはるかに低いにも関わらず、神経への運命づけは生じていない。
【００８９】
ＬＩＦを添加しないＮ２Ｂ２７培地にプレートされたＥＳ細胞（通常、効率的な神経への運命づけを引き出す条件）は、ＳＵ５４０２またはＰＤ１８４３５２のいずれが添加された場合も、数日間に亘ってＯｃｔ４陽性およびＳｏｘ１陰性のままである（データは示さず）。しかし、これらの細胞は、継代した後、変わらず分化および／または死滅する。毒性副作用の可能性を低減するために、発明者らは、２．５倍低い用量を用いて、２つのインヒビターを同時に併用した。０．８μＭのＰＤ１８４３５２＋２μＭのＳＵ５４０２を含むＮ２Ｂ２７中では、最初にいくらかの分化が観察されるが、継代後はＥＳ細胞が生き残って増殖する（データは示さず）。この２インヒビター（２ｉ）条件下では、ＬＩＦの存在下よりも生存率はより低く、集団倍加時間はより遅いが、分化は効果的に抑制される。この発見は、ＥＳ細胞の自己再生のための最少要件が、細胞増殖および生存率を損なわせることを避けながら、ＦＧＦレセプターおよびＥｒｋシグナリングから生じる分化シグナルをそらすことであり得る旨示唆している。
【００９０】
実施例７
発明者らは、２ｉ培地中におけるＥＳ細胞の増殖の減少は、ｐＥｒｋの下流のＲｓｋによる阻害的リン酸化の解放の結果生じるグリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ−３）活性の増加によるものであり得ると結論づけた。ＣＨＩＲ９９０２１は、ＧＳＫ−３の十分に特徴づけられた高選択性小分子インヒビターであり、これはＧＳＫ−３活性を完全にブロックする濃度でサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）と交差反応しない。発明者らは、血清存在下の培養物に添加した場合、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）は、ＬＩＦの存在下であっても、実際に分化を促進することを見出した。無血清のＮ２Ｂ２７培地中では、分化応答は減少し、そしていくつかのコロニーは、数日間、形態的に未分化であるように見える。しかし、継代した後、未分化細胞は生き残らない。同様の結果が、広く用いられる他の２つのＧＳＫ−３インヒビターであるＳＢ２１６７６３およびＳＢ４１５２８６でも、（どちらもＥＳ細胞にいくぶん有毒のようであったが）得られた。
【００９１】
しかしながら、ＣＨＩＲ９９０２１を２ｉと併用した場合、分化応答は完全に失われる。さらに、ＣＨＩＲ９９０２１は、ＥＳ細胞がＬＩＦ＋血清／ＢＭＰ中または２ｉ中で代表的に見られる平坦な単層よりもむしろ密集した３次元のコロニーとして増殖するように、２ｉへの応答を変化させた。３つのインヒビター（３ｉ）中での分化は無視できる程度であり、そしてＥＳ細胞は急速に増殖した。最も重要なことに、継代した後、未分化コロニーが高効率で増殖した。２つの独立した親ＥＳ細胞系Ｅ１４Ｔｇ２ａおよびＣＧＲ８の派生体は、３ｉ中で強固な長期増殖を示し、かつ明白な分化はほとんどあるいは全くなかった（データは示さず）。これらは、Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＲｅｘ１を発現し、系統運命づけマーカーであるＧａｔａ４、Ｓｏｘ１またはbrachyuryの発現は、それほど示さない（データは示さず）。バルク培養では、ＥＳ細胞は、３ｉ中でＬＩＦ＋ＢＭＰ中に匹敵する倍加率で増殖し、Ｏｃｔ４−ＧＦＰ陽性の未分化細胞の比率は、依然として９０％を超える。
【００９２】
したがって、３ｉ培地は、血清または添加サイトカインの不在下で、分化することなくＥＳ細胞を培養するために用いられ得る。
【００９３】
実施例８
培養処方物が十分にＥＳ細胞の自己再生を持続させるかに関する厳密な試験は、個々の細胞による未分化コロニーの形成である。単一細胞の堆積の後、Ｎ２Ｂ２７＋３ｉ中のコロニー形成率は２５％（９８／３８４）であり、ＬＩＦ＋ＢＭＰ（１１％、２３／１９２）よりも高い（データは示さず）。これらのコロニーはＯｃｔ４−ＧＦＰを発現し、そして未分化ＥＳ細胞として継代可能である。したがって、ＭＥＫインヒビター、ＦＧＦレセプターのインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターを含む培地は、単一細胞に由来する未分化ＥＳ細胞コロニーの形成を持続させることが可能である。
【００９４】
実施例９
発明者らは、３ｉが、胚から直接新たなＥＳ細胞を誘導する十分な能力を有したのか、あるいは確立した系の適応を反映したのかを検討した。許容的な１２９系統からの胚盤胞を、ゼラチンコートされたプラスチック上のＮ２Ｂ２７＋３ｉ中に直接プレートし、５日間培養した。続く内部細胞塊の解離および再プレートの後、１２個の胚のうち７個からＥＳ細胞コロニーが得られた。これらのうち３個を増殖させ、胚盤胞に注入した。すべてにおいて、キメリズムおよび生殖系列遺伝が高い比率で得られた（表２）。続いて、発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６および非許容的なＣＢＡおよびＭＦ１系統から複数のＥＳ細胞を誘導し、３ｉが胚盤葉上層細胞からＥＳ細胞への移行を容易にすることを示した。発明者らは、３ｉが、発生能を選択または損失させることなく、外因性のＬＩＦおよびＢＭＰ／血清の要求からＥＳ細胞を解放すると結論付ける。
【００９５】
【表２】
2009531054.tif 000004
【００９６】
したがって、ＥＳ細胞は、ＧＳＫ３インヒビターおよびＭＥＫインヒビターの組み合わせ、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの組み合わせ、または必要に応じてＧＳＫ３インヒビター、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの組み合わせで維持され、そして本発明はまた、培養方法およびそのための培地を提供する。  
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１Ａ−Ｃ】多能性ＥＳ−ＮＳハイブリッドコロニーの形成におけるＰＤ１８４３５２の効果の分析に関し、ＲＨ×ＮＳ  ＴＧＦＰ融合の赤色蛍光および緑色蛍光についてのＦＡＣＳ分析：（Ａ）ＰＥＧ処理の２４時間後の融合混合物；（Ｂ）ＡでゲートをかけたＦＡＣＳ分類されたハイブリッドの純度チェック；（Ｃ）Ａで分類されたハイブリッドをプレートして形成されたコロニーをプレートしたハイブリッドあたりのコロニーの比率（％）を示す。
【図１Ｄ】多能性ＥＳ−ＮＳハイブリッドコロニーの形成におけるＰＤ１８４３５２の効果の分析のデータの概要を示す。
【図１Ｅ】多能性ＥＳ−ＮＳハイブリッドコロニーの形成におけるＰＤ１８４３５２の効果の分析のハイブリッドコロニー形態の例を示す。
【図２】本発明にしたがって誘導および維持されたマウスのＥＳ細胞、ならびにこれらのＥＳ細胞による高効率なキメラ発生を示す。
【図３】本発明にしたがって増殖した４継代マウスＥＳ細胞を示す。
【図４】本発明にしたがって増殖したマウスＥＳ細胞がＯｃｔ４陽性であることを示す。
【図１Ａ−Ｃ】
2009531054.tif 000005
【図１Ｄ】
2009531054.tif 000006
【図１Ｅ】
2009531054.tif 000007
【図２】
2009531054.tif 000008
【図３】
2009531054.tif 000009
【図４】
2009531054.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月7日(2007.12.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む、培養培地。
【請求項２】
前記ＭＥＫインヒビターが、ＭＥＫ１インヒビター、ＭＥＫ２インヒビターまたはＭＥＫ３インヒビターである、請求項１に記載の培養培地。
【請求項３】
前記ＭＥＫインヒビターが、ＭＥＫ１インヒビターである、請求項１または２に記載の培養培地。
【請求項４】
前記ＭＥＫインヒビターが、ＰＤ１８４３５２およびＰＤ９８０５９から選択される、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
【請求項５】
前記ＧＳＫ３インヒビターが、ＧＳＫ−３βのインヒビターである、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
【請求項６】
前記ＧＳＫ３インヒビターが、ｃｄｃ２および／またはｅｒｋ２よりもＧＳＫ３に対して選択性である、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
【請求項７】
前記ＧＳＫ３インヒビターが、ｃｄｃ２よりもＧＳＫ３に対して少なくとも１００倍選択性である、請求項６に記載の培養培地。
【請求項８】
前記ＧＳＫ３インヒビターが、ｃｄｃ２よりもＧＳＫ３に対して少なくとも２００倍選択性である、請求項６に記載の培養培地。
【請求項９】
前記ＧＳＫ３インヒビターが、ＣＨＩＲ９９０２１である、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
【請求項１０】
ｇｐ１３０アゴニストをさらに含む、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
【請求項１１】
前記ｇｐ１３０アゴニストが、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、カルジオトロフィン、オンコスタチンＭ、ＩＬ−６＋ｓＩＬ−６レセプターまたはハイパーＩＬ−６である、請求項１０に記載の培養培地。
【請求項１２】
前記ｇｐ１３０アゴニストが、（ａ）ＬＩＦ、（ｂ）ｓＩＬ−６ＲおよびＩＬ−６、または（ｃ）ハイパーＩＬ−６である、請求項１０に記載の培養培地。
【請求項１３】
前記ＦＧＦレセプターアンタゴニストが、ＦＧＦＲ１のアンタゴニストである、請求項１から１２のいずれかに記載の培養培地。
【請求項１４】
ＳＵ５４０２を含む、請求項１３に記載の培養培地。
【請求項１５】
ＰＤ１７３０７４を含む、請求項１３に記載の培養培地。
【請求項１６】
アポトーシスのインヒビターを含む、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
【請求項１７】
Ｎ２培地および／またはＢ２７培地を含む、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
【請求項１８】
ＰＤ１８４３５２、ＣＨＩＲ９９０２１およびＳＵ５４０２を含む、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
【請求項１９】
前記いずれかの請求項に記載の、ヒトＥＳ培養培地。
【請求項２０】
請求項１から１８のいずれかに記載の、マウスＥＳ細胞培養培地。
【請求項２１】
多能性細胞のための培養培地の製造におけるＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの使用。
【請求項２２】
多能性細胞のための培養培地の製造におけるＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの使用。
【請求項２３】
前記培地が、マウスＥＳ細胞の培養のためである、請求項２１または２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記培地が、ヒトＥＳ細胞の培養のためである、請求項２１または２２に記載の使用。
【請求項２５】
前記培地が、ラット多能性細胞の培養のためである、請求項２１または２２に記載の使用。
【請求項２６】
自己再生を促進するための多能性細胞の培養方法であって、請求項１から１８のいずれかに記載の培地中で該細胞を維持する工程を含む、方法。
【請求項２７】
前記培地が、血清を含まないおよび血清抽出物を含まない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞が、マウス細胞である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が、ラット細胞である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項３１】
ＥＳ細胞の培養方法であって、以下の工程：
必要に応じてフィーダー上で、培養物中でＥＳ細胞を多能性状態に維持する工程；
少なくとも１回該ＥＳ細胞を継代する工程；
培地から（存在する場合）血清または血清抽出物を除去しそして（存在する場合）該フィーダーを除去し、該培地がフィーダー、血清および血清抽出物を含まないようにする工程；および
続いて、ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下でＥＳ細胞を多能性状態に維持する工程、
を含む、方法。
【請求項３２】
前記細胞が、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫインヒビターおよびｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターの存在下で多能性状態に維持される、請求項３１に記載の培養方法。
【請求項３３】
前記細胞が、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターアンタゴニストの存在下で多能性状態に維持される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞が、マウス細胞である、請求項３１から３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項３１から３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
ＥＳ細胞のトランスフェクトされた集団を得る方法であって、
選択マーカーをコードする構築物でＥＳ細胞をトランスフェクトする工程；
該ＥＳ細胞をプレートする工程；
ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下で該ＥＳ細胞を培養する工程；および
該選択マーカーを発現する細胞を選択する工程、
を含む、方法。
【請求項３７】
前記ＥＳ細胞が、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫインヒビターおよびｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターの存在下で培養される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＥＳ細胞が、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターアンタゴニストの存在下で培養される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞が、マウス細胞である、請求項３６から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項３６から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
血清および血清抽出物を含まず、そして
基本培地；
ＭＥＫインヒビター；
ＧＳＫ３インヒビター；
ＦＧＦレセプターのアンタゴニスト；および
鉄トランスポーター、
を含む、細胞培養培地。
【請求項４２】
ｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターをさらに含む、請求項４１に記載の培養培地。
【請求項４３】
ＬＩＦを含む、請求項４１に記載の培養培地。
【請求項４４】
インスリン、アルブミンおよびトランスフェリンをさらに含む、請求項４１から４３のいずれかに記載の培養培地。
【請求項４５】
アポトーシスのインヒビターをさらに含む、請求項４１から４４のいずれかに記載の培養培地。
【請求項４６】
胚盤胞から多能性細胞を誘導する方法であって、
（１）胚盤胞を得る工程；
（２）ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下で該胚盤胞を培養して、内部細胞塊を得る工程；
（３）該内部細胞塊を解離する工程；
（４）該解離した内部細胞塊から１または複数の細胞を単離する工程；および
（５）該単離した１または複数の細胞を、ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下で培養する工程、
を含む、方法。
【請求項４７】
前記単離した１または複数の細胞が、ｇｐ１３０下流シグナリングのアクチベーター、ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下で培養される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記単離した１または複数の細胞が、ＦＧＦレセプターのアンタゴニスト、ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下で培養される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記胚盤胞をＬＩＦ中で、２〜４日の期間に亘って培養する工程を含む、請求項４６から４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
第１の容器、第２の容器および第３の容器を含むキットであって、該第１の容器がＧＳＫ３インヒビターを含み、該第２の容器がＭＥＫインヒビターを含み、そして該第３の容器がＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む、キット。
【請求項５１】
前記容器が、それらのそれぞれの構成成分の濃縮されたストック溶液を含む、請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
前記ＧＳＫ３インヒビター、前記ＭＥＫインヒビターおよび前記ＦＧＦＲアンタゴニストが、請求項３から９または１３から１５に定義される通りである、請求項３７に記載のキット。
【請求項５３】
ｇｐ１３０下流シグナリングのアクチベーターを含むさらなる容器を含む、請求項５０から５２のいずれかに記載のキット。
【請求項５４】
前記ｇｐ１３０アゴニストが、（ａ）ＬＩＦ、（ｂ）ｓＩＬ−６ＲおよびＩＬ−６、または（ｃ）ハイパーＩＬ−６である、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
多能性幹細胞の自己再生の促進におけるＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの使用。
【請求項５６】
多能性幹細胞の自己再生の促進におけるＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの使用。
【請求項５７】
幹細胞集団を増殖させる方法であって、ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下で幹細胞を培養する工程を含む、方法。
【請求項５８】
幹細胞集団を増殖させる方法であって、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で幹細胞を培養する工程を含む、方法。
【請求項５９】
Ｎａｎｏｇを発現している多能性幹細胞の自己再生の促進におけるＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの使用。
【請求項６０】
Ｎａｎｏｇを発現している多能性幹細胞の自己再生の促進におけるＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの使用。
【請求項６１】
多能性細胞のための培養培地の製造におけるＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの使用。
【請求項６２】
自己再生を促進するための多能性細胞の培養方法であって、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む培地中で該細胞を維持する工程を含む、方法。
【請求項６３】
ＥＳ細胞の培養方法であって、以下の工程：
必要に応じてフィーダー上で、培養物中でＥＳ細胞を多能性状態に維持する工程；
少なくとも１回該ＥＳ細胞を継代する工程；
培地から（存在する場合）血清または血清抽出物を除去しそして（存在する場合）該フィーダーを除去し、該培地がフィーダー、血清および血清抽出物を含まないようにする工程；および
続いて、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのインヒビターの存在下でＥＳ細胞を多能性状態に維持する工程、
を含む、方法。
【請求項６４】
ＥＳ細胞のトランスフェクトされた集団を得る方法であって、
選択マーカーをコードする構築物でＥＳ細胞をトランスフェクトする工程；
該ＥＳ細胞をプレートする工程；
ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターアンタゴニストの存在下で該ＥＳ細胞を培養する工程；および
該選択マーカーを発現する細胞を選択する工程、
を含む、方法。
【請求項６５】
血清および血清抽出物を含まず、そして
基本培地；
ＭＥＫインヒビター；
ＦＧＦレセプターのアンタゴニスト；および
鉄トランスポーター、
を含む、細胞培養培地。
【請求項６６】
胚盤胞から多能性細胞を誘導する方法であって、
（１）胚盤胞を得る工程；
（２）ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で該胚盤胞を培養して、内部細胞塊を得る工程；
（３）該内部細胞塊を解離する工程；
（４）該解離した内部細胞塊から１または複数の細胞を単離する工程；および
（５）該単離した１または複数の細胞を、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で培養する工程、
を含む、方法。
【請求項６７】
第１の容器および第２の容器を含むキットであって、該第１の容器がＭＥＫインヒビターを含み、そして該第２の容器がＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含み、
該キットが、本明細書に記載される他の容器および／または構成成分もまた含み得る、キット。
【請求項６８】
多能性幹細胞の自己再生の促進におけるＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの使用。
【請求項６９】
Ｎａｎｏｇを発現している多能性幹細胞の自己再生の促進におけるＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの使用。
【請求項７０】
幹細胞集団を増殖させる方法であって、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で該幹細胞を培養する工程を含む、方法。
【国際調査報告】
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