(57)【要約】  本発明は、既存の組み換え生産方法の下では組み換え生産が難しい組み換えタンパク質の分泌生産を誘導することが可能なタンパク質融合因子（ＴＦＰ）の超高速選別技術に関する。
2009501020.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質に特異的なＴＦＰを発掘する方法であって、
（ｉ）レポータータンパク質の欠失した複数の宿主細胞に複数の線形ベクター、および目的タンパク質をコードする核酸配列を形質転換させ、形質転換された複数の宿主細胞を製造する段階であって、前記線形ベクターは、核酸断片ライブラリーの核酸断片、およびＮ末端アミノ酸の欠失したレポータータンパク質をコードする核酸配列を含み、前記目的タンパク質をコードする核酸配列は、３’末端には前記レポータータンパク質から欠失したＮ末端アミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、５’末端にはリンカーＤＮＡを含み、
（ｉｉ）前記形質転換された複数の宿主細胞を、前記線形ベクターおよび前記目的タンパク質をコードする核酸配列の細胞内(in vivo)組み換えが効率的に行われる条件の下で培養する段階と、
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）の形質転換された複数の宿主細胞から、レポータータンパク質の活性を示す細胞を選別する段階と、
（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）で選別された細胞から、前記目的タンパク質の分泌を誘導する核酸断片を含むＴＦＰを確認する段階とを含んでなる、方法。
【請求項２】
目的タンパク質に特異的なＴＦＰライブラリーを発掘する方法であって、
（ｉ）レポータータンパク質の欠失した複数の宿主細胞に複数の線形ベクター、および目的タンパク質をコードする核酸配列を形質転換させ、形質転換された複数の宿主細胞を製造する段階であって、前記線形ベクターは、核酸断片ライブラリーの核酸断片、およびＮ末端アミノ酸の欠失したレポータータンパク質をコードする核酸配列を含み、前記目的タンパク質をコードする核酸配列は、３’末端には前記レポータータンパク質から欠失したＮ末端アミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、５’末端にはリンカーＤＮＡを含み、
（ｉｉ）前記形質転換された複数の宿主細胞を、前記線形ベクターおよび前記目的タンパク質をコードする核酸配列の細胞内(in vivo)組み換えが効率的に行われる条件の下で培養する段階と、
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）の形質転換された複数の宿主細胞から、レポータータンパク質の活性を示す細胞を選別する段階と、
（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）で選別された細胞から、それぞれ前記目的タンパク質の分泌を誘導する核酸断片を含むＴＦＰライブラリーを確認する段階とを含んでなる、方法。
【請求項３】
前記核酸断片ライブラリーは、植物、バクテリア、酵母、カビまたは動物のゲノム性ＤＮＡまたはｃＤＮＡに由来したことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸断片ライブラリーは、組み換えＤＮＡに由来したことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記酵母は、カンジダ(Candida)、デバリョウミセス(Debaryomyces)、ハンセヌラ(Hansenula)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウイナ(Yarrowia)、サッカロミセス(Saccharomyces)、シュワニオミセス(Schwanniomyces)、およびアークスラ(Arxula)種よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記酵母は、カンジダウチリス(Candida utilis)、カンジダボイジニイ(Candida boidinii)、カンジダアルビカンス(Candida albicans)、クルイベロミセスラクチス(Kluyveromyces lactis)、ピキアパストリス(Pichia pastoris)、ピキアスチピチス(Pichia stipitis)、スキゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ハンセヌラポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ヤロウイナリポリティカ(Yarrowia lipolytica)、シュワニオミセスオキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)、およびアークスラアデニニボランス(Arxula adeninivorans)よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記カビは、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)、リゾプス(Rhizopus)、およびトリコデルマ(Trichoderma)種よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記バクテリアは、エシェリキア(Escherichia)、シュードモナス(Psudomonas)、およびバチルス(Bacillus)種よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記植物は、シロイナズナ、トウモロコシ、タバコおよびジャガイモよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記動物は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、犬、猫、猿および昆虫よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸断片ライブラリーは、予備選択された候補者ＴＦＰライブラリーであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記予備選択された候補者ＴＦＰライブラリーは、核酸断片ライブラリーおよびレポータータンパク質をコードする核酸を含む多様なベクターを、レポータータンパク質の欠失した複数の宿主細胞に形質転換させ、成長した細胞を集め、細胞からベクターを分離し、ベクターから核酸断片を分離してそれぞれレポータータンパク質の分泌を誘導する核酸断片を含むＴＦＰライブラリーを収得することにより構築されたライブラリーであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記予備選択された候補者ＴＦＰライブラリーは、（ｉ）予め確認された一つまたはそれ以上のＴＦＰと相同の予備分泌シグナルを含む遺伝子；（ｉｉ）分泌シグナル配列を含む遺伝子；（ｉｉｉ）小胞体を介して運搬されるタンパク質をコードする遺伝子を検索するためのゲノムデータベースで確認された配列から得られたことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記予備選択された候補者ＴＦＰライブラリーは、予め確認されたＴＦＰを多様化して得られたことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記予備選択された候補者ＴＦＰライブラリーは、予め確認されたＴＦＰ間にプリおよびプロシグナル配列を交換するように人為的に設計した核酸断片から得られたことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記予備選択された候補者ＴＦＰライブラリーは、一つまたはそれ以上の目的タンパク質に効果的な予め確認されたＴＦＰの集合である核心ＴＦＰライブラリーであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸断片は、１０００ｂｐより小さい大きさであることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸断片は、７００ｂｐより小さい大きさであることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸断片は、５００ｂｐより小さい大きさであることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸断片は、３００ｂｐより小さい大きさであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸断片ライブラリーは、ＤＮＡの酵素的切断によって製造されたことを特徴とする、請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸断片ライブラリーは、ｃＤＮＡ合成によって製造されたことを特徴とする、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸断片ライブラリーは、組み換えＤＮＡ合成技術によって製造されたことを特徴とする、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記組み換えＤＮＡ技術は、単方向性欠失(unidirectional deletion)を含むことを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記宿主細胞は、植物、バクテリア、カビ、酵母または動物細胞から選ばれることを特徴とする、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記酵母は、カンジダ(Candida)、デバリョウミセス(Debaryomyces)、ハンセヌラ(Hansenula)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウイナ(Yarrowia)、サッカロミセス(Saccharomyces)、シュワニオミセス(Schwanniomyces)、およびアークスラ(Arxula)種よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記酵母は、カンジダウチリス(Candida utilis)、カンジダボイジニイ(Candida boidinii)、カンジダアルビカンス(Candida albicans)、クルイベロミセスラクチス(Kluyveromyces lactis)、ピキアパストリス(Pichia pastoris)、ピキアスチピチス(Pichia stipitis)、スキゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ハンセヌラポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ヤロウイナリポリティカ(Yarrowia lipolytica)、シュワニオミセスオキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)、およびアークスラアデニニボランス(Arxula adeninivorans)よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記カビは、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)、リゾプス(Rhizopus)、およびトリコデルマ(Trichoderma)種よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記バクテリアは、エシェリキア(Escherichia)、シュードモナス(Psudomonas)、およびバチルス(Bacillus)種よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記植物は、シロイナズナ、トウモロコシ、タバコおよびジャガイモよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記動物は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、犬、猫、猿および昆虫よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記動物細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０およびＳｆ９よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記宿主細胞は酵母菌株であり、前記核酸断片は酵母のゲノムまたはｃＤＮＡから分離されたことを特徴とする、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記レポータータンパク質は、細胞の外部に分泌されるタンパク質であることを特徴とする、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記レポータータンパク質は、インベルターゼ(invertase)、スクラーゼ(sucrase)、セルラーゼ(cellulase)、キシラナーゼ(xylanase)、マルターゼ(maltase)、アミラーゼ(amylase)、グルコアミラーゼ(glucoamylase)、ガラクトシダーゼ(galactosidase)、ホスファターゼ、β−ラクタマーゼ(beta-lactamase)、リパーゼ(lipase)、およびプロテアーゼ(protease)よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ガラクトシダーゼは、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびメリビアーゼよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記レポーターアンパク質はメリビアーゼであることを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ホスファターゼはＰＨＯ５であることを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記宿主細胞は酵母であり、前記レポータータンパク質はインベルターゼであり、形質転換された宿主細胞はスクロースまたはラフィノースの存在下における生存能力で選別されたことを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記宿主細胞は酵母であり、前記レポータータンパク質はアミラーゼであり、酵母菌株は澱粉分解活性がなく、形質転換された宿主細胞は澱粉分解能力で選別されたことを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記レポータータンパク質の活性を示す細胞を選別する段階は、成長阻害剤に対して抵抗性を持つレポータータンパク質を用いて行うことを特徴とする、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記レポータータンパク質の活性を示す細胞を選別する段階は、２つまたはそれ以上のレポータータンパク質を用いて行うことを特徴とする、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記レポーターアンパク質の活性を示す細胞を選別する段階は、２つのレポータータンパク質を用いて行うことを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記２つのレポータータンパク質は、リパーゼおよびインベルターゼであることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記目的タンパク質は、植物、動物、または微生物に由来したことを特徴とする、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記目的タンパク質はヒトタンパク質であることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記目的タンパク質は、サイトカイン、血清蛋白質、コロニー刺激因子、成長因子、ホルモン、および酵素よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記目的タンパク質は、インターロイキン、凝固因子、インターフェロン−α、−βまたは−γ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織成長因子、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、血素板由来成長因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ） 、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、色素ホルモン、副甲状腺ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、炭水化物特異的酵素、タンパク質分解酵素、リパーゼ、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、脱離酵素(Lyases)、異性化酵素(Isomerases)、リガーゼ、免疫グロブリン、サイトカイン受容体、ラクトフェリン、ホスホリパーゼＡ２−活性化タンパク質、インスリン、腫瘍壊死因子、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、エンケパリン、ソマトメジン、エリスロポエチン、視床下部放出因子、プロラクチン、絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン、組織プラズミノゲン活性化物質、成長ホルモン分泌ペプチド、胸腺体液性因子、抗癌ペプチド、および抗生ペプチドよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記目的タンパク質は、ヒトインターロイキン−２、ヒトインターロイキン−１β、ヒトインターロイキン−６、ヒトインターロイキン−３２α、−３２βまたは−３２γ、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、ヒト血清アルブミン、ヒトインターフェロン−α、−βまたは−γ、ヒト顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒト成長ホルモン、ヒト血素板由来成長因子、ヒト線維芽細胞成長因子、ヒト上皮細胞成長因子、ヒトインスリン様成長因子、ヒト神経成長因子、ヒト変形性成長因子β−１、ヒト濾胞刺激ホルモン、グルコースオキシダーゼ(glucose oxidase)、グルコダーゼ(glucodase)、ガラクトシダーゼ(galactosidase)、グルコセレブロシダーゼ(glucocerebrosidase)、グルクロニダーゼ(glucuronidase)、アスパラギナーゼ(asparaginase)、アルギナーゼ(arginase)、アルギニンジイミナーゼ(arginine deaminase)、ペルオキシドディスムターゼ(peroxide dismutase)、エンドトキシナーゼ(ecdotoxinase)、カタラーゼ(catalase)、キモトリプシン(chymotrypsin)、ウリカーゼ(uricase)、アデノシン二リン酸(adenosine diphosphatase)、チロシナーゼ(tyrosinase)、ビリルビンオキシダーゼ(bilirubine oxidase)、牛ＧＡＬＴ(bovine galactose-1-phosphate uridyltransferase)、クラゲ緑色蛍光タンパク質、ＣＡＬＢ(Candida antarctica lipase B)、カンジダルゴサリパーゼ(Candida rugosa lipase)、カビクロロペルオキシダーゼ(fungal chloroperoxidase)、β−ガラクトシダーゼ(β-galactosidase)、レソルバーゼ(resolvase)、α−ガラクトシダーゼ(α-galactosidase)、β−グルコシダーゼ(β-glucosidase)、トレハロース合成酵素(trehalose synthase)、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ(cyclodextrin glycosyl transferase)、キシラナーゼ(xylanase)、フィターゼ(phytase)、ヒトラクトフェリン、ヒトエリスロポエチン、ヒトパラオキソナーゼ、ヒト分化成長因子１５（ｈＧＤＦ１５）、ヒトガラクチン−３結合タンパク質、ヒトセリンプロテアーゼ阻害剤、Ｋｕｎｉｔｚタイプ２、ヒトヤヌスキナーゼ２、ヒトＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、ヒトＹＭ１＆２、ヒトＣＥＭＩ、ヒトＤＧＡＴ(diacylglycerol acyltransferase)、ヒトレプチン、ヒトｍＬ２５９、ヒトプロテイナーゼ３、ヒトリソザイム、ヒトＤＥＡＤボックスプロチン４１、ヒトエトポキシド導入タンパク質２４、マウスカスパーゼ１、牛アンギオジェニン、およびミミズルンブロキナーゼよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記目的タンパク質は、従来の組み換え生産方法を用いて生産し難いタンパク質であることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記リンカーＤＮＡは２０ｂｐ長さ以上であることを特徴とする、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記リンカーＤＮＡは３０ｂｐ長さ以上であることを特徴とする、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記リンカーＤＮＡは４０ｂｐ長さ以上であることを特徴とする、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記リンカーＤＮＡは、プロテアーゼ認識配列をコードしてＴＦＰと目的タンパク質間の接合部位で切断を引き起こすことを特徴とする、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記リンカーＤＮＡは、酵母ｋｅｘ２ｐ−認識配列をコードすることを特徴とする、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記リンカーＤＮＡは、Ｌｙｓ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ａｒｇを含むアミノ酸配列をコードすることを特徴とする、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記リンカーＤＮＡは、Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号２１４）を含むアミノ酸配列をコードすることを特徴とする、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記リンカーＤＮＡは、哺乳動物フューリン認識配列をコードすることを特徴とする、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
前記リンカーＤＮＡは、Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇを含むアミノ酸配列をコードすることを特徴とする、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記リンカーＤＮＡは、Ｆａｃｔｏｒ−Ｘａ認識配列をコードすることを特徴とする、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
前記リンカーＤＮＡは、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号２１５）を含むアミノ酸配列をコードすることを特徴とする、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記リンカーＤＮＡは、エンテロキナーゼ−認識配列をコードすることを特徴とする、請求項５４に記載の方法。
【請求項６３】
前記リンカーＤＮＡは、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓを含むアミノ酸配列をコードすることを特徴とする、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記リンカーＤＮＡは、スブチリシン認識配列をコードすることを特徴とする、請求項５４に記載の方法。
【請求項６５】
前記リンカーＤＮＡは、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ（配列番号２１６）を含むアミノ酸配列をコードすることを特徴とする、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記リンカーＤＮＡは、タバコエッチウイルス認識配列をコードすることを特徴とする、請求項５４に記載の方法。
【請求項６７】
前記リンカーＤＮＡは、Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（配列番号２１７）を含むアミノ酸配列をコードすることを特徴とする、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記リンカーＤＮＡは、トロンビン認識配列をコードすることを特徴とする、請求項５４に記載の方法。
【請求項６９】
前記リンカーＤＮＡは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号２１８）を含むアミノ酸配列をコードすることを特徴とする、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記リンカーＤＮＡは、ユビキチン加水分解酵素認識配列をコードすることを特徴とする、請求項５４に記載の方法。
【請求項７１】
前記リンカーＤＮＡは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを含むアミノ酸配列をコードすることを特徴とする、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記リンカーＤＮＡは、新和性タグをコードすることを特徴とする、請求項１〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記新和性タグは、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＮｕｓＡ、チオレドキシン、ユビキチン、ＦＬＡＧ、ＢＡＰ、６ＨＩＳ、ＳＴＲＥＰ、ＣＢＰ、ＣＢＤ、およびＳ−タグよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記リンカーＤＮＡは、制限酵素認識部位をコードすることを特徴とする、請求項１〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記制限酵素認識部位はＳｆｉＩであることを特徴とする、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記リンカーＤＮＡは、さらにｋｅｘ２ｐ様プロテアーゼ−またはＫｅｘ２ｐ認識配列をコードすることを特徴とする、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
請求項１〜請求項７６のいずれか１項の方法によって確認されたＴＦＰまたはその断片またはその類似体。
【請求項７８】
前記ＴＦＰは、ＴＦＰ−９（配列番号２９）、 ＴＦＰ−１３（配列番号３１)、ＴＦＰ−１７（配列番号３３）、ＴＦＰ−１８（配列番号３５）、ＴＦＰ−１９（配列番号３７）、ＴＦＰ−２０（配列番号３９）、ＴＦＰ−２１（配列番号４１）、ＴＦＰ−２５（配列番号４３）、ＴＦＰ−２７（配列番号４５）、ＴＦＰ−１１（配列番号６１）、ＴＦＰ−２２（配列番号６３）、ＴＦＰ−２９（配列番号６５）、ＴＦＰ−３４（配列番号６７）、ＴＦＰ−３８（配列番号６９）、ＴＦＰ−３９（配列番号１２９）、ＴＦＰ−４３（配列番号１３１）、ＴＦＰ−４４（配列番号１３３）、ＴＦＰ−４８（配列番号１３５）、ＴＦＰ−５２（配列番号１３７）、ＴＦＰ−５４（配列番号１３９）、ＴＦＰ−４０（配列番号１７５）、ＴＦＰ−５０（配列番号１７７）、ＴＦＰ−５１（配列番号１７９）、ＴＦＰ−５７（配列番号１８１）、ＴＦＰ−５８（配列番号１８３）、ＴＦＰ−５９（配列番号１８５）、ＴＦＰ−５（配列番号２００）、ＴＦＰ−６（配列番号２０２）、ＴＦＰ−７（配列番号２０４）、ＴＦＰ−８（配列番号２０６）、ＰｐＴＦＰ−１（配列番号８４）、ＰｐＴＦＰ−２（配列番号８６）、ＰｐＴＦＰ−３（配列番号８８）、およびＰｐＴＦＰ−４（配列番号９０）よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
請求項１〜請求項７６のいずれか１項の方法によって確認された一つまたはそれ以上のＴＦＰまたはその断片またはその類似体を含む、ＴＦＰライブラリー。
【請求項８０】
ＴＦＰ−９（配列番号２９）、 ＴＦＰ−１３（配列番号３１）、ＴＦＰ−１７（配列番号３３）、ＴＦＰ−１８（配列番号３５）、ＴＦＰ−１９（配列番号３７）、ＴＦＰ−２０（配列番号３９）、ＴＦＰ−２１（配列番号４１）、ＴＦＰ−２５（配列番号４３）、ＴＦＰ−２７（配列番号４５）、ＴＦＰ−１１（配列番号６１）、ＴＦＰ−２２（配列番号６３）、ＴＦＰ−２９（配列番号６５）、ＴＦＰ−３４（配列番号６７）、ＴＦＰ−３８（配列番号６９）、ＴＦＰ−３９（配列番号１２９）、ＴＦＰ−４３（配列番号１３１）、ＴＦＰ−４４（配列番号１３３）、ＴＦＰ−４８（配列番号１３５）、ＴＦＰ−５２（配列番号１３７）、ＴＦＰ−５４（配列番号１３９）、ＴＦＰ−４０（配列番号１７５）、ＴＦＰ−５０（配列番号１７７）、ＴＦＰ−５１（配列番号１７９）、ＴＦＰ−５７（配列番号１８１）、ＴＦＰ−５８（配列番号１８３）、ＴＦＰ−５９（配列番号１８５）、ＴＦＰ−５（配列番号２００）、ＴＦＰ−６（配列番号２０２）、ＴＦＰ−７（配列番号２０４）、ＴＦＰ−８（配列番号２０６）、ＰｐＴＦＰ−１（配列番号８４）、ＰｐＴＦＰ−２（配列番号８６）、ＰｐＴＦＰ−３（配列番号８８）、およびＰｐＴＦＰ−４（配列番号９０）またはその類似体またはその断片よりなる群から選ばれる２つまたはそれ以上のＴＦＰを含むことを特徴とする、請求項７６に記載のＴＦＰライブラリー。
【請求項８１】
列挙されたＴＦＰまたはその断片またはその類似体のうち４つまたはそれ以上を含むことを特徴とする、請求項８０に記載のＴＦＰライブラリー。
【請求項８２】
列挙されたＴＦＰまたはその断片またはその類似体のうち６つまたはそれ以上を含むことを特徴とする、請求項８１に記載のＴＦＰライブラリー。
【請求項８３】
列挙されたＴＦＰまたはその断片またはその類似体のうち８つまたはそれ以上を含むことを特徴とする、請求項８２に記載のＴＦＰライブラリー。
【請求項８４】
列挙されたＴＦＰまたはその断片またはその類似体のうち１０つまたはそれ以上を含むことを特徴とする、請求項８３に記載のＴＦＰライブラリー。
【請求項８５】
列挙されたＴＦＰまたはその断片またはその類似体のうち１２つまたはそれ以上を含むことを特徴とする、請求項８４に記載のＴＦＰライブラリー。
【請求項８６】
ＴＦＰ−９（配列番号２９）、 ＴＦＰ−１３（配列番号３１)、ＴＦＰ−１７（配列番号３３）、ＴＦＰ−１８（配列番号３５）、ＴＦＰ−１９（配列番号３７）、ＴＦＰ−２０（配列番号３９）、ＴＦＰ−２１（配列番号４１）、ＴＦＰ−２５（配列番号４３）、ＴＦＰ−２７（配列番号４５）、ＴＦＰ−１１（配列番号６１）、ＴＦＰ−２２（配列番号６３）、ＴＦＰ−２９（配列番号６５）、ＴＦＰ−３４（配列番号６７）、ＴＦＰ−３８（配列番号６９）、ＴＦＰ−３９（配列番号１２９）、ＴＦＰ−４３（配列番号１３１）、ＴＦＰ−４４（配列番号１３３）、ＴＦＰ−４８（配列番号１３５）、ＴＦＰ−５２（配列番号１３７）、ＴＦＰ−５４（配列番号１３９）、ＴＦＰ−４０（配列番号１７５）、ＴＦＰ−５０（配列番号１７７）、ＴＦＰ−５１（配列番号１７９）、ＴＦＰ−５７（配列番号１８１）、ＴＦＰ−５８（配列番号１８３）、ＴＦＰ−５９（配列番号１８５）、ＴＦＰ−５（配列番号２００）、ＴＦＰ−６（配列番号２０２）、ＴＦＰ−７（配列番号２０４）、ＴＦＰ−８（配列番号２０６）、ＰｐＴＦＰ−１（配列番号８４）、ＰｐＴＦＰ−２（配列番号８６）、ＰｐＴＦＰ−３（配列番号８８）、ＰｐＴＦＰ−４（配列番号９０）、ＴＦＰ−１（配列番号２１９）、ＴＦＰ−２（配列番号２２１）、ＴＦＰ−３（配列番号２２３）、ＴＦＰ−４（配列番号２２５）、およびＴＦＰ３２（配列番号２０８）またはその類似体またはその断片よりなる群から選ばれる６つまたはそれ以上のＴＦＰを含むことを特徴とする、請求項７９に記載のＴＦＰライブラリー。
【請求項８７】
列挙されたＴＦＰまたはその断片またはその類似体のうち８つまたはそれ以上を含むことを特徴とする、請求項８６に記載のＴＦＰライブラリー。
【請求項８８】
列挙されたＴＦＰまたはその断片またはその類似体のうち１０つまたはそれ以上を含むことを特徴とする、請求項８７に記載のＴＦＰライブラリー。
【請求項８９】
列挙されたＴＦＰまたはその断片またはその類似体のうち１２つまたはそれ以上を含むことを特徴とする、請求項８８に記載のＴＦＰライブラリー。
【請求項９０】
列挙されたＴＦＰまたはその断片またはその類似体のうち１５つまたはそれ以上を含むことを特徴とする、請求項８９に記載のＴＦＰライブラリー。
【請求項９１】
請求項１２の方法によって確認された１０またはそれ以上の核酸断片を含む、核酸断片ライブラリー。
【請求項９２】
請求項１２の方法によって確認された５０またはそれ以上の核酸断片を含むことを特徴とする、請求項９１に記載の核酸断片ライブラリー。
【請求項９３】
請求項１２の方法によって確認された１００またはそれ以上の核酸断片を含むことを特徴とする、請求項９２に記載の核酸断片ライブラリー。
【請求項９４】
請求項１２の方法によって確認された５００またはそれ以上の核酸断片を含むことを特徴とする、請求項９３に記載の核酸断片ライブラリー。
【請求項９５】
請求項１２の方法によって確認された１０００またはそれ以上の核酸断片を含むことを特徴とする、請求項９４に記載の核酸断片ライブラリー。
【請求項９６】
請求項１２の方法によって確認された２０００またはそれ以上の核酸断片を含むことを特徴とする、請求項９５に記載の核酸断片ライブラリー。
【請求項９７】
請求項１３の方法によって確認された１０またはそれ以上の核酸断片を含む、核酸断片ライブラリー。
【請求項９８】
請求項１３の方法によって確認された５０またはそれ以上の核酸断片を含むことを特徴とする、請求項９７に記載の核酸断片ライブラリー。
【請求項９９】
請求項１３の方法によって確認された１００またはそれ以上の核酸断片を含むことを特徴とする、請求項９８に記載の核酸断片ライブラリー。
【請求項１００】
請求項１４の方法によって確認された１０またはそれ以上の核酸断片を含む、核酸断片ライブラリー。
【請求項１０１】
請求項１４の方法によって確認された５０またはそれ以上の核酸断片を含むことを特徴とする、請求項１００に記載の核酸断片ライブラリー。
【請求項１０２】
請求項１４の方法によって確認された１００またはそれ以上の核酸断片を含むことを特徴とする、請求項１０１に記載の核酸断片ライブラリー。
【請求項１０３】
請求項１４の方法によって確認された５００またはそれ以上の核酸断片を含むことを特徴とする、請求項１０２に記載の核酸断片ライブラリー。
【請求項１０４】
請求項１４の方法によって確認された１０００またはそれ以上の核酸断片を含むことを特徴とする、請求項１０３に記載の核酸断片ライブラリー。
【請求項１０５】
請求項１５の方法によって確認された１０またはそれ以上の核酸断片を含む、核酸断片ライブラリー。
【請求項１０６】
請求項１５の方法によって確認された５０またはそれ以上の核酸断片を含むことを特徴とする、請求項１０５に記載の核酸断片ライブラリー。
【請求項１０７】
請求項１５の方法によって確認された１００またはそれ以上の核酸断片を含むことを特徴とする、請求項１０６に記載の核酸断片ライブラリー。
【請求項１０８】
請求項１５の方法によって確認された５００またはそれ以上の核酸断片を含むことを特徴とする、請求項１０７に記載の核酸断片ライブラリー。
【請求項１０９】
ＴＦＰまたはその類似体またはその断片をコードする核酸配列および目的タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸であって、前記ＴＦＰは、ＴＦＰ−９（配列番号２９）、 ＴＦＰ−１３（配列番号３１)、ＴＦＰ−１７（配列番号３３）、ＴＦＰ−１８（配列番号３５）、ＴＦＰ−１９（配列番号３７）、ＴＦＰ−２０（配列番号３９）、ＴＦＰ−２１（配列番号４１）、ＴＦＰ−２５（配列番号４３）、ＴＦＰ−２７（配列番号４５）、ＴＦＰ−１１（配列番号６１）、ＴＦＰ−２２（配列番号６３）、ＴＦＰ−２９（配列番号６５）、ＴＦＰ−３４（配列番号６７）、ＴＦＰ−３８（配列番号６９）、ＴＦＰ−３９（配列番号１２９）、ＴＦＰ−４３（配列番号１３１）、ＴＦＰ−４４（配列番号１３３）、ＴＦＰ−４８（配列番号１３５）、ＴＦＰ−５２（配列番号１３７）、ＴＦＰ−５４（配列番号１３９）、ＴＦＰ−４０（配列番号１７５）、ＴＦＰ−５０（配列番号１７７）、ＴＦＰ−５１（配列番号１７９）、ＴＦＰ−５７（配列番号１８１）、ＴＦＰ−５８（配列番号１８３）、ＴＦＰ−５９（配列番号１８５）、ＴＦＰ−５（配列番号２００）、ＴＦＰ−６（配列番号２０２）、ＴＦＰ−７（配列番号２０４）、ＴＦＰ−８（配列番号２０６）、ＰｐＴＦＰ−１（配列番号８４）、ＰｐＴＦＰ−２（配列番号８６）、ＰｐＴＦＰ−３（配列番号８８）、およびＰｐＴＦＰ−４（配列番号９０）よりなる群から選ばれる、核酸。
【請求項１１０】
前記目的タンパク質は、ＩＬ−２、ＩＬ−３２、ヒト成長ホルモン、およびヒトカスパーゼ−１のＰ１０小単位よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ＴＦＰはＴＦＰ−９（配列番号２９）、ＴＦＰ−１３（配列番号３１）、ＴＦＰ−１７（配列番号３３）、ＴＦＰ−１８（配列番号３５）、ＴＦＰ−１９（配列番号３７）、ＴＦＰ−２０（配列番号３９）、ＴＦＰ−２１（配列番号４１）、ＴＦＰ−２５（配列番号４３）、ＴＦＰ−２７（配列番号４５）、ＰｐＴＦＰ−１（配列番号８４）、ＰｐＴＦＰ−２（配列番号８６）、ＰｐＴＦＰ−３（配列番号８８）、およびＰｐＴＦＰ−４（配列番号９０）よりなる群から選ばれ、前記目的タンパク質はＩＬ−３２αであることを特徴とする、請求項１０９に記載の核酸。
【請求項１１２】
前記ＴＦＰは、ＴＦＰ−１１（配列番号６１）、ＴＦＰ−２２（配列番号６３）、ＴＦＰ−２９（配列番号６５）、ＴＦＰ−３４（配列番号６７）、およびＴＦＰ−３８（配列番号６９）よりなる群から選ばれ、前記目的タンパク質はＩＬ−２であることを特徴とする、請求項１０９に記載の核酸。
【請求項１１３】
前記ＴＦＰは、ＴＦＰ−９（配列番号２９）、ＴＦＰ−１３（配列番号３１）、ＴＦＰ−１７（配列番号３３）、ＴＦＰ−１８（配列番号３５）、ＴＦＰ−１９（配列番号３７）、ＴＦＰ−２０（配列番号３９）、ＴＦＰ−２１（配列番号４１）、ＴＦＰ−２５（配列番号４３）、ＴＦＰ−２７（配列番号４５）、ＴＦＰ−１１（配列番号６１）、ＴＦＰ−２２（配列番号６３）、ＴＦＰ−２９（配列番号６５）、ＴＦＰ−３４（配列番号６７）、およびＴＦＰ−３８（配列番号６９）よりなる群から選ばれ、前記目的タンパク質はヒト成長ホルモンであることを特徴とする、請求項１０９に記載の核酸。
【請求項１１４】
請求項１〜７６のいずれか１項の方法によって選別されたＴＦＰまたはその断片またはその類似体をコードする核酸配列と作動可能に連結された目的タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターを準備する段階と、前記ベクターを宿主細胞に形質転換させる段階と、目的タンパク質を生産することが可能な条件の下に宿主細胞を培養する段階とを含むことを特徴とする、目的タンパク質を生産する方法。
【請求項１１５】
前記ベクターは、請求項１０７の核酸を含むことを特徴とする、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記目的タンパク質は、ＩＬ−２、ＩＬ−３２、ヒト成長ホルモン、およびヒトカスパーゼ−１のＰ１０小単位よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
核酸断片ライブラリーからの核酸断片、およびＮ末端アミノ酸の欠失したレポータータンパク質をコードする核酸配列を含む、線形ベクター。
【請求項１１８】
目的タンパク質をコードする核酸配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１１７に記載の線形ベクター。
【請求項１１９】
複数の線形ベクターおよび目的タンパク質をコードする核酸で形質転換させたレポータータンパク質の欠失した複数の宿主細胞であって、前記各線形ベクターは、核酸断片ライブラリーからの核酸断片、およびＮ末端アミノ酸の欠失したレポータータンパク質をコードする核酸配列を含み、前記目的タンパク質をコードする核酸は、３’末端には前記レポータータンパク質から欠失したＮ末端アミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、５’末端にはリンカーＤＮＡを含む、宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、組み換えタンパク質発現に関する。より具体的に、本発明は、既存の組み換え生産方法の下では組み換え生産が難しい組み換えタンパク質の分泌生産を誘導することが可能なタンパク質融合因子(translational fusion partner：ＴＦＰ)の超高速選別方法に関する。  
【０００２】
〔背景技術〕
所望のタンパク質の組み換え発現は、研究目的または治療的およびその他の商業的利用のためにタンパク質を大量生産するための方法として広く用いられる。細菌、酵母および哺乳動物宿主細胞システムなどの多様な組み換え発現システムが当業界に知られており、このようなシステムで多くのタンパク質が成功的に生産されている。しかし、多くのタンパク質が現在の発現システムを用いて生産され難いため、タンパク質発現および分泌量が少ないかまたは無い。特定の目的タンパク質において、目的タンパク質と元々よく分泌されるタンパク質とを融合させ、合成されたリンカー配列を付加した融合タンパク質を用いて、組み換え発現されたタンパク質の分泌を向上させる方法が幾分成功した。ところが、全てのタンパク質の分泌生産に一律的に適用できる効率的技術は未だ確立されていない状態である。
【０００３】
分泌タンパク質および新規の分泌シグナル配列を解明しようとする試みとして、シグナル配列トラップシステムが多数開発された。米国登録特許第６，２２８，５９０号は、レポータータンパク質と融合された哺乳動物コーディング配列を含む核酸ライブラリーをレポータータンパク質の欠失した酵母に形質転換させ、レポータータンパク質を分泌する細胞を探知することにより、哺乳動物シグナル配列を選別する方法について記述している。インベルターゼの欠失した酵母およびインベルターゼレポータータンパク質を使用する類似のシステムがＥＰ０９０７７２７に開示されている。酵母を基にしたシグナル配列トラップは、ヒトＤＮＡから分泌されるタンパク質(Klein et at, Proc. Natl. Acad. ScL USA 23:7108 (1996); Jacobs et at, Gene 198:289 (1997))、マウスＤＮＡから分泌されるタンパク質(Gallicioti et at, J. Membrane Biol. 183:115 (2001))、しま模様の魚(zebrafish)ＤＮＡから分泌されるタンパク質(Crosier et at, Dev. Dynamics 222:631 (2001))、シロイヌナズナ(Arabidopsis)ＤＮＡから分泌されるタンパク質(Goo et at, Plant Mot Biol. 41:415 (1999))、ジャガイモＤＮＡから分泌されるタンパク質(Surpili et at, Anais de Academia Brasileira de Ciencias 74:599 (2002))、およびカンジダアルビカンス(Candida albicans)ＤＮＡから分泌されるタンパク質(Monteoliva et at, Eukaryotic Cell 7:514 (2002))の確認に使用されてきた。哺乳動物宿主細胞(Gallicioti et at, J. Membrane Biol. 183:115 (2001))およびバクテリア宿主細胞(Ferguson et at, Cancer Res. 55:8209 (2000))を用いた類似のトラップシステムが開発された。シグナル配列トラップ内で使用されるレポータータンパク質には、インベルターゼ(Klein et at, Proc. Natl. Acad. ScL USA 93:1108, (1996))、アルファアミラーゼ（米国登録特許第６，２２８，５９０号）、酸性ホスファターゼ(Surpili et at, Anais de Academia Brasileira de Ciencias 74:599 (2002))、およびβ−ラクタマーゼ(Ferguson et at, Cancer Res. 55:8209 (2000))などが含まれる。
【０００４】
国際公開特許ＷＯ２００５／０６８６５８は、目的タンパク質の分泌に有用なタンパク質融合因子を選別する方法を開示している。この方法は、（ｉ）レポータータンパク質をコードする核酸配列と融合された目的タンパク質をコードする核酸配列のライブラリーを含む多様なベクターをレポータータンパク質の欠失した宿主細胞に形質転換させた複数の宿主細胞を得る段階と、（ｉｉ）宿主細胞からそれぞれ目的タンパク質の分泌を誘導する核酸断片を含むＴＦＰライブラリーを選別する段階とを含む。
【０００５】
〔発明の開示〕
本発明は、目的タンパク質の分泌を効果的に誘導するＴＦＰを確認するための迅速且つ効率的な自動選別方法に関する。本発明は、既存の組み換え発現システムの下で発現されない或いは発現率の非常に低い目的タンパク質を含んでいずれのタンパク質でも宿主細胞から分泌されるようにすることができる。
【０００６】
具体的な一例として、本発明は、目的タンパク質に特異的なＴＦＰを確認する方法に関するもので、（ｉ）レポータータンパク質の欠失した複数の宿主細胞に複数の線形ベクター、および目的タンパク質をコードする核酸配列を形質転換させ、形質転換された複数の宿主細胞を製造する段階であって、前記線形ベクターは、核酸断片ライブラリーの核酸断片、およびＮ末端アミノ酸の欠失したレポータータンパク質をコードする核酸配列を含み、前記目的タンパク質をコードする核酸配列は、３’末端には前記レポータータンパク質から欠失したＮ末端アミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、５’末端にはリンカーＤＮＡを含み、（ｉｉ）前記形質転換された複数の宿主細胞を、前記線形ベクターおよび前記目的タンパク質をコードする核酸配列の生体内(in vivo)組み換えが効率的に行われる条件の下で培養する段階と、（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）の形質転換された複数の宿主細胞から、レポータータンパク質の活性を示す細胞を選別する段階と、（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）で選別された細胞から、前記目的タンパク質の分泌を誘導する核酸断片を含むＴＦＰを確認する段階とを含む。
【０００７】
他の具体的な一例として、本発明は、目的タンパク質に特異的なＴＦＰライブラリーを確認する方法に関するもので、（ｉ）レポータータンパク質の欠失した複数の宿主細胞に複数の線形ベクター、および目的タンパク質をコードする核酸配列を形質転換させ、形質転換された複数の宿主細胞を製造する段階であって、前記線形ベクターは、核酸断片ライブラリーの核酸断片、およびＮ末端アミノ酸の欠失したレポータータンパク質をコードする核酸配列を含み、前記目的タンパク質をコードする核酸配列は、３’末端には前記レポータータンパク質から欠失したＮ末端アミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、５’末端にはリンカーＤＮＡを含み、（ｉｉ）前記形質転換された複数の宿主細胞を、前記線形ベクターおよび前記目的タンパク質をコードする核酸配列の生体内組み換えが効率的に行われる条件の下で培養する段階と、（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）の形質転換された複数の宿主細胞から、レポータータンパク質の活性を示す細胞を選別する段階と、（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）で選別された細胞から、それぞれ前記目的タンパク質の分泌を誘導する核酸断片を含むＴＦＰライブラリーを確認する段階とを含む。
【０００８】
また、本発明は、本発明の方法によって確認されたＴＦＰまたはＴＦＰライブラリーに関する。
【０００９】
また、本発明は、ＴＦＰをコードする核酸断片、またはＴＦＰをコードする核酸断片のライブラリーを含む。
【００１０】
また、本発明は、ＴＦＰをコードする核酸配列、および目的タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸を含む。
【００１１】
また、本発明は、本発明のＴＦＰを用いて目的タンパク質を生産する方法に関する。
【００１２】
また、本発明は、核酸断片ライブラリーの核酸断片、およびＮ末端アミノ酸の欠失したレポータータンパク質をコードする核酸配列を含む線形ベクターに関する。
【００１３】
また、本発明は、線形ベクターライブラリーおよび目的タンパク質をコードする核酸配列で形質転換させた、レポータータンパク質の欠失した複数の宿主細胞を含む。
【００１４】
本発明の前記および他の目的、特徴および利点は、添付図面を参照する次の説明からさらに明確に理解されるであろう。
【００１５】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、目的タンパク質の分泌を最大化するために、目的タンパク質に特異的に適用することが可能なＴＦＰを確認する迅速且つ効率的な選別技術の必要性によるものである。本発明は、全てのタンパク質の組み換え発現の最適化に有用に適用され、特に既存の公知の発現システム下では発現率が非常に低くて少ない費用で大量生産が不可能なタンパク質の生産に有用に適用できる。
【００１６】
したがって、一つの様態として、本発明は、目的タンパク質に特異的なＴＦＰを確認する方法に関するもので、（ｉ）レポータータンパク質の欠失した複数の宿主細胞に複数の線形ベクター、および目的タンパク質をコードする核酸配列を形質転換させ、形質転換された複数の宿主細胞を製造する段階であって、前記線形ベクターは、核酸断片ライブラリーの核酸断片、およびＮ末端アミノ酸の欠失したレポータータンパク質をコードする核酸配列を含み、前記目的タンパク質をコードする核酸配列は、３’末端には前記レポータータンパク質から欠失したＮ末端アミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、５’末端にはリンカーＤＮＡを含み、（ｉｉ）前記形質転換された複数の宿主細胞を、前記線形ベクターおよび前記目的タンパク質をコードする核酸配列の生体内組み換えが効率的に行われる条件の下で培養する段階と、（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）の形質転換された複数の宿主細胞から、レポータータンパク質の活性を示す細胞を選別する段階と、（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）で選別された細胞から、前記目的タンパク質の分泌を誘導する核酸断片を含むＴＦＰライブラリーを確認する段階とを含む。
【００１７】
別の様態として、本発明は、目的タンパク質に特異的なＴＦＰライブラリーを確認する方法に関するもので、（ｉ）レポータータンパク質の欠失した複数の宿主細胞に複数の線形ベクター、および目的タンパク質をコードする核酸配列を形質転換させ、形質転換された複数の宿主細胞を製造する段階であって、前記線形ベクターは、核酸断片ライブラリーの核酸断片、およびＮ末端アミノ酸の欠失したレポータータンパク質をコードする核酸配列を含み、前記目的タンパク質をコードする核酸配列は、３’末端には前記レポータータンパク質から欠失したＮ末端アミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、５’末端にはリンカーＤＮＡを含み、
（ｉｉ）前記形質転換された複数の宿主細胞を、前記線形ベクターおよび前記目的タンパク質をコードする核酸配列の生体内組み換えが効率的に行われる条件の下で培養する段階と、
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）の形質転換された複数の宿主細胞から、レポータータンパク質の活性を示す細胞を選別する段階と、
（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）で選別された細胞から、それぞれ前記目的タンパク質の分泌を誘導する核酸断片を含むＴＦＰライブラリーを確認する段階とを含む。
【００１８】
核酸断片ライブラリーは、ゲノム性ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよび組み換えＤＮＡなどの全てのタイプのＤＮＡから得ることができる。また、ＤＮＡの他に、ＲＮＡおよび非自然的に発生する核酸などの核酸を使用することもできる。
【００１９】
ＴＦＰは、バクテリア、カビ（例えば酵母）、植物および動物（例えば、哺乳動物）を含む全ての原核および真核生物のＤＮＡから選別できる。適したバクテリアは、エシェリキア(Escherichia)、シュードモナス(Psudomonas)およびバチルス(Bacillus)種を含むが、これに限定されない。適した酵母は、カンジダ(Candida)、デバリョウミセス(Debaryomyces)、ハンセヌラ(Hansenula)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウイナ(Yarrowia)、サッカロミセス(Saccharomyces)、シュワニオミセス(Schwanniomyces)、およびアークスラ(Arxula)種を含むが、これに限定されない。具体的な種の例としては、カンジダウチリス(Candida utilis)、カンジダボイジニイ(Candida boidinii)、カンジダアルビカンス(Candida albicans)、クルイベロミセスラクチス(Kluyveromyces lactis)、ピキアパストリス(Pichia pastoris)、ピキアスチピチス(Pichia stipitis)、スキゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ハンセヌラポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ヤロウイナリポリティカ(Yarrowia lipolytica)、シュワニオミセスオキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)、およびアークスラアデニニボランス(Arxula adeninivorans)を含む。ＤＮＡの提供源として使用できるカビとしては、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)、リゾプス(Rhizopus)、およびトリコデルマ(Trichoderma)種を含むが、これに限定されない。ＤＮＡの提供源として使用できる植物は、シロイヌナズナ(Arabidopsis)、トウモロコシ、タバコおよびジャガイモを含むが、これに限定されない。適した動物としてはヒト、マウス、ラット、ウサギ、犬、猫および猿を含むが、これに限定されない。
【００２０】
核酸断片は、全体ゲノム性ＤＮＡおよびｃＤＮＡライブラリーなどの生物体全体ゲノムから得ることができる。また、核酸断片は、ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄライブラリーまたはｓｉｚｅｄライブラリーなどの全体ゲノムサブセットから得ることができる。
【００２１】
具体的な一例として、核酸断片は、以前選別段階で確認されたＴＦＰを含むライブラリーなどのＴＦＰ予備選別候補者ライブラリーから得ることができる。より具体的に、ＴＦＰ予備選別候補者ライブラリーは、一つまたはそれ以上の目的タンパク質に対して効率的なＴＦＰと確認された核心ＴＦＰのライブラリーであり得る。
【００２２】
別の一例として、ＴＦＰ予備選別候補者ライブラリーは、核酸断片およびレポータータンパク質をコードする核酸配列のライブラリーを含む多様なベクターを、レポータータンパク質の欠失した宿主細胞に形質転換させ、成長した細胞を集め、細胞からベクターを分離し、ベクターから核酸断片を分離してそれぞれレポータータンパク質の分泌を誘導する核酸断片を含むＴＦＰライブラリーを収得することにより構築することができる。
【００２３】
別の一例として、ＴＦＰ予備選別候補者ライブラリーは、（ｉ）予め確認された一つまたはそれ以上のＴＦＰと相同の予備分泌シグナルを含む遺伝子；（ｉｉ）分泌シグナル配列を含む遺伝子；（ｉｉｉ）小胞体（例えば、細胞壁タンパク質、排泄タンパク質、細胞膜タンパク質、液胞タンパク質または胚芽タンパク質）を介して運搬されるタンパク質をコードする遺伝子を検索するためのゲノムデータベースで確認された配列から得ることができる。
【００２４】
別の一例として、ＴＦＰ予備選別候補者ライブラリーは、予め選別されたＴＦＰの多様化、例えば単方向欠失、突然変異、機能配列の付加（例えば、糖化部位）またはＴＦＰ間のプリおよびプロシグナル配列(pre- and pro- signal sequence)の交換によって得ることができる。
【００２５】
別の一例として、核酸断片は１０００ｂｐ以下の大きさ、例えば７００、５００または３００ｂｐであり得る。また、核酸断片ライブラリーは、ＤＮＡの酵素的切断、ｃＤＮＡ合成または組み換えＤＮＡ技術（例えば、単方向欠失、突然変異誘発）によって構築できる。
【００２６】
本発明の線形ベクターは、選別された宿主細胞において機能的な全てのベクターを含む。本発明において、用語「ベクター」とは、連結されている他の核酸を運搬することが可能な核酸分子をいう。ベクターの一つの類型である「プラスミド」は、内部に追加的にＤＮＡ断片を連結させることが可能な環状の二重鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの別の類型であるウイルスベクターは、追加的なＤＮＡをウイルスゲノム内に連結させることができる。あるベクターは、宿主細胞内に導入されたときに自己複製が可能である（例えば、複製原点を持つバクテリアベクターおよび哺乳動物エピソームベクター）。あるベクターは、宿主細胞内に導入されたときに宿主細胞ゲノム内に挿入されて（例えば、哺乳動物非−エピソームベクター）宿主ゲノムと共に複製される。本発明のベクターは、作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子の発現を指示することができるが、このようなベクターを「発現ベクター」という。一般に、組み換えＤＮＡ技術の使用において、発現ベクターはプラスミド形態である。本発明において、「プラスミド」と「ベクター」は、プラスミドを意味する用語であって、互いに入れ替えて使用することが可能な用語であるが、ベクターの形で最も一般に使用される。ところが、本発明はウイルスベクター（例えば、複製欠乏レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノウイルス依存ウイルス）のように同一の機能を行う他の形態の発現ベクターも含む。
【００２７】
原核生物におけるタンパク質の発現は、目的タンパク質とレポータータンパク質との融合タンパク質の発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含むベクターによって行われ得る。適した大腸菌(E.coli)発現ベクターは、ｐＴｒｃ(Arnrann et al, Gene <5P:301-315 ,1988)、およびｐＥＴ(Studier et al, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. 60-89, 1990)を含む。
【００２８】
酵母菌株における発現に適した酵母発現ベクターは、ｐＹｅｐＳｅｃｌ(Baldari et al, EMBO J, 5:229-234, 1987)、ｐＭＦａ(Kurjan et al, Cell 30:933-943, 1982)、ｐＪＲＹ８８(Schultz et al, Gene 54:113-123, 1987)、ｐＹＥＳ２(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)、およびｐｉｃＺ(Invitrogen Corp, San Diego, CaL)を含むが、これに限定されない。
【００２９】
昆虫細胞における発現にはバキュロウイルスが使用できる。バキュロウイルスは、ｐＡＣシリーズ(Smith et al, MoI. Cell. Biol. 5:2156-2165, 1983)、およびｐＶＬシリーズ(Lucklow et al, Virology 770:31-39, 1989)を含む、培養された昆虫細胞におけるタンパク質の発現に利用できる。
【００３０】
別の具体的例として、宿主細胞は哺乳動物細胞であり、ベクターは哺乳動物発現ベクターであり得る。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８(Seed, Nature 329:840, 1987))およびｐＭＴ２ＰＣ(Kaufinan et al., EMBO J. 6: 187-195, 1987を含む。哺乳動物で使用されたとき、発現ベクターの統制機能は、ウイルス調節配列によって提供されることもある。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびＳＶ４０由来のプロモーターである。原核細胞および真核細胞に全て適用されるその他の適した発現システムの例は、例えばＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ(Sambrook et al, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.)を参照することができる。
【００３１】
好ましいベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミッド、エピソーム、ウイルス粒子またはウイルス、および挿入可能なＤＮＡ断片（すなわち、相同組み換えによって宿主細胞ゲノム内に挿入可能な断片）を含むが、これに限定されない。好ましいウイルス粒子は、アデノウイルス、バキュロウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、ワクシニアウイルス、およびレトロウイルスを含むが、これに限定されない。適した発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含むが、これに限定されない。その他の発現ベクターとしては、ｐＳＰＯＲＴTMベクター、ｐＧＥＭTMベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＰＲＯＥＸベクターTM（ＬＴＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTMベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＱＥTMベクター（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＳＥ４２０TM（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＹＥＳ２TM（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むが、これに限定されない。
【００３２】
具体的な一例として、発現ベクターは、目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列が適切な宿主に目的タンパク質を効果的に発現させることができる適切な調節配列と作動可能に連結された複製可能なＤＮＡ作製物である。本発明において、用語「作動可能に連結された(operably linked)」は、ＤＮＡ領域が他の領域と機能的に連結されていることをいう。例えば、プロモーターが配列の転写を調節することが可能なコーディング配列と作動可能に連結される。ベクターの増幅は、調節ドメインの発現とは関係がなく、通常複製原点によって生ずる宿主における複製能力および形質転換体の認知を容易にする選別遺伝子と関係がある。発現ベクターにおける調節配列の必要性は、宿主の種類および形質転換方法の種類によって異なる。一般に、調節配列は転写プロモーター、エンハンサー、転写調節のための選択的なオペレータ配列、ポリアデニル化シグナル、リボソームに結合する適切なｍＲＮＡコーディング配列、および転写と翻訳の終結を調節する配列を含むが、これに限定されない。このような調節配列は、例えばＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ１８５(Goeddel, Academic Press, San Diego, Calif, 1990)に記述されている。調節配列は、多くの類型の宿主細胞における核酸配列の直接的な構成的発現(constitutive expression)、および一部の宿主細胞における核酸配列の直接的な発現（例えば、組織特異的調節配列）を含む。また、当業者は、形質転換させるべき宿主細胞の選択やタンパク質の好適な発現水準などの要素を考慮してベクターを設計することができる。
【００３３】
本発明の発現ベクターは、宿主細胞内に導入され、本発明で記述される核酸配列によってコードされた融合タンパク質またはペプチドなどのタンパク質またはペプチドを生産することができる。好ましくは、ベクターは、宿主生物体によって認知されるプロモーターを含有することができる。本発明のプロモーター配列は、原核または真核またはウイルスに由来したものであり得る。原核に由来した配列の例としては、バクテリオファージラムダ(The bacteriophage Lambda, Hershey, A. D., Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1973; Lambda II, Hendrix, R. W., Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1980)のＰＲおよびＰＬプロモーター、大腸菌(E.coli)のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋおよびｌａｃＺプロモーター、並びにＳＶ４０初期プロモーター(Benoist et at, Nature, 290:304-310, 1981)を含む。酵母に適切なプロモーターは、ＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ、ＡＤＨ、ＰＨ０５、ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０を含むが、これに限定されない。その他に、プロモーターは、マウス腫瘍ウイルス(Mouse Mammary Tumor Virus、ＭＭＴＶ)、ヒト免疫欠乏ウイルスの長い末端反復(long terminal repeat、ＬＴＲ)、マローニーウイルス(Maloney virus)、サイトメガロウイルス前初期プロモーター(cytromegalovirus immediate early promoter)、ＥＢウイルス(Epstein Barr virus)、ラウス肉腫ウイルス(Rous sarcoma virus)、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、およびヒトメタロチオネインを含むが、これに限定されない。
【００３４】
好ましくは、ベクターは追加的な調節配列を含むことができる。適切な調節配列の例は、ファージＭＳ−２のレプリカーゼ遺伝子のシャイン−ダルガーノ(Shine-Dalgarno)配列およびバクテリオファージラムダのｃＩＩのシャイン−ダルガーノ配列が代表的である。
【００３５】
また、好ましい発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選別に必要な適切なマーカーを含むことができる。宿主の形質転換は、当業界に広く知られている多様な技術およびＳａｍｂｒｏｏｋの文献に記述されている技術の一つを用いて行なわれる。
【００３６】
複製原点は、外来の起源を含むベクターの構成によって、或いは宿主細胞染色体複製メカニズムによって提供されることができるが、ベクターが宿主細胞の染色体内に統合されると、後者は充足される。一方、ウイルス複製原点を含有するベクターを使用する代わりに、当業者は選別マーカーおよび目的タンパク質ＤＮＡで共同形質転換させる方法によって哺乳動物を形質転換させることもできる。適切なマーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素(dihydrofolate reductase、ＤＨＦＲ)またはチミジンキナーゼ(thymidine kinase)がある（米国登録特許第４，３９９，２１６号）。
【００３７】
従来の組み換え技術は、結合のための非粘着性末端(blunt end)または粘着性末端(staggered end)、適切な末端を提供するための制限酵素の分解、粘着性末端(cohesive end)の適切な位置への充填、不適な連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および適切なリガーゼによる連結などの過程を含むが、目的タンパク質をコードする核酸配列は、このような従来の技術によってベクターＤＮＡと組み換えられる。そのような工程技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋの文献によく記述されている。哺乳動物発現ベクターの製造方法は、例えば文献「Okayama et al, MoI. Cell. Biol. 5:280 (1983)」、文献「Cosman et al, MoI. Immunol. 25:935 (1986)」、文献「Cosman et al, Nature 312:768 (1984)」、ヨーロッパ公開特許ＥＰ−Ａ−０３６７５６６、および国際公開特許ＷＯ９１／１８９８２に記述されている。
【００３８】
本発明に使用される宿主細胞は、当業界に広く知られている宿主細胞であればいずれでもよい。好ましい宿主細胞は、バクテリア、カビ（例えば、酵母）、植物または動物（例えば、哺乳動物または昆虫）細胞を含む。好ましい酵母は、カンジダ(Candida)、デバリョウミセス(Debaryomyces)、ハンセヌラ(Hansenula)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウイナ(Yarrowia)、サッカロミセス(Saccharomyces)、シュワニオミセス(Schwanniomyces)、およびアークスラ(Arxula)種を含む。具体的な種の例としては、カンジダウチリス(Candida utilis)、カンジダボイジニイ(Candida boidinii)、カンジダアルビカンス(Candida albicans)、クルイベロミセスラクチス(Kluyveromyces lactis)、ピキアパストリス(Pichia pastoris)、ピキアスチピチス(Pichia stipitis)、スキゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ハンセヌラポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ヤロウイナリポリティカ(Yarrowia lipolytica)、シュワニオミセスオキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)、およびアークスラアデニニボランス(Arxula adeninivorans)を含む。好ましいカビとしては、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)、リゾプス(Rhizopus)、およびトリコデルマ(Trichoderma)種を含む。バクテリアは、エシェリキア(Escherichia)、およびバチルス(Bacillus)種を含む。好ましい植物はシロイヌナズナ、トウモロコシ、タバコ、およびジャガイモを含むが、これに限定されない。動物細胞としてはヒト、マウス、ラット、ウサギ、犬、猫、猿、および昆虫を含む。例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、およびＳｆ９細胞を含む。
【００３９】
具体的な様態として、宿主細胞は酵母菌株であり、核酸断片は酵母のゲノムまたはｃＤＮＡから分離された核酸断片である。
【００４０】
本発明のポリヌクレオチドは、環状プラスミドの一部として、或いは分離されたタンパク質コーディング領域を含む線形ＤＮＡまたはウイルスベクターとして宿主細胞内に導入できる。ＤＮＡを宿主細胞内に導入する方法は、当業界に公知になっており、一般に形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、核注入、または例えばリポソーム、ミセル、幽霊細胞および原形質体などの運搬体との融合などを用いて行われる。
【００４１】
本発明では、迅速且つ効率的に選別可能なレポータータンパク質を使用することができる。具体的な一例として、レポータータンパク質は自動選別過程で陽性的に選別できる活性を持つ。別の一例として、レポータータンパク質は、細胞の外部に分泌されるタンパク質、例えばインベルターゼ(invertase)、スクラーゼ(sucrase)、セルラーゼ(cellulose)、キシラナーゼ(xylanase)、マルターゼ(maltase)、アミラーゼ(amylase)、グルコアミラーゼ(glucoamylase)、ガラクトシダーゼ(galactosidase)（例えば、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、メリビアーゼ）、ホスファターゼ（例えば、ＰＨＯ５）、β−ラクタマーゼ(beta-lactamase)、リパーゼ(lipase)またはプロテアーゼ(protease)を含む。具体的に、分泌タンパク質は、細胞が特定の基質で成長する。哺乳動物細胞のレポーターシステムの例として、ＣＤ２／ネオマイシン−ホスホトランスフェラーゼ（Ｃｅｏ）遺伝子がマウスの胚幹細胞で分泌経路遺伝子をトラップして抗生剤Ｇ４１８培地で分泌レポーターとして使用できる(De-ZoIt et al., Nucleic Acid Res. 34:e25, 2006)。
【００４２】
具体的な様態として、宿主細胞は酵母であり、レポータータンパク質はインベルターゼであり、形質転換された酵母菌株はスクロースまたはラフィノース存在下における生存能力で選別される。別の具体的な様態として、宿主細胞は酵母であり、レポータータンパク質はメリビアーゼであり、形質転換された酵母菌株はメリビアーゼの存在下における生存能力で選別される。別の具体的な様態として、宿主細胞は酵母であり、レポータータンパク質はアミラーゼ（例えば、エンドアミラーゼ、エキソアミラーゼ、β−アミラーゼ、またはグルコアミラーゼ）であり、酵母菌株は澱粉分解活性がなく、形質転換された酵母菌株は澱粉分解能力で選別される。別の具体的な様態として、レポータータンパク質活性を示す細胞を選別する段階は、抗生剤などの成長阻害剤に対して抵抗性を持つレポータータンパク質を使用することができる。別の具体的な様態として、レポータータンパク質は、視覚的に探知することが可能なタンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼなどである。また、レポータータンパク質活性を示す細胞を選別する段階は、例えばリパーゼおよびインベルターゼなどの２つまたはそれ以上のレポータータンパク質を使用することができる。
【００４３】
本発明において、宿主細胞は、レポータータンパク質の活性を示さない。具体的に、宿主細胞は、自然的な状態ではレポータータンパク質を発現しない。他の具体例として、レポータータンパク質をコードする遺伝子は、全体または一部が欠失しているか、突然変異されて発現されないか、或いは不活性化された形で発現される。特定のタンパク質に対して不完全な細胞を作る方法としては、当業界の公知の方法を使用することができる(Sambrook et al)。酵母では公知の遺伝子置換技術を用いてレポーター遺伝子を欠損させることができる(Rothstein, Meth. Enzymol. 194:281, 1991)。
【００４４】
本発明において、線形ベクターは、核酸断片、およびＮ末端アミノ酸の欠失したレポータータンパク質をコードする核酸配列を含む。Ｎ末端アミノ酸の欠失は、レポータータンパク質活性を実質的に除去するのに十分な程度の長さが欠失したものであり得る。例えば、レポーター遺伝子のＮ末端アミノ酸は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０またはそれ以上のアミノ酸が欠失できる。
【００４５】
本発明の方法は、組み換え発現水準を高めようとするいずれの目的タンパク質でも使用することができる。目的タンパク質は、研究目的または商業的目的、例えば治療的または産業的目的で生産しようとするタンパク質であり得る。目的タンパク質は、いずれの植物、動物または微生物にも由来することができ、自然に生産したものまたはいずれの方式でも変形できるものであり、核酸によってコードできる程度の長さを持つ。具体的な様態として、目的タンパク質は、サイトカイン、血清蛋白質、コロニー刺激因子、成長因子、ホルモンまたは酵素を含む。例えば、目的タンパク質は、インターロイキン、凝固因子、インターフェロン−α、−βまたは−γ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織成長因子、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、血素板由来成長因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ） 、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、色素ホルモン、副甲状腺ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、炭水化物特異的酵素、タンパク質分解酵素、リパーゼ、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、脱離酵素(Lyases)、異性化酵素(Isomerases)、リガーゼ、免疫グロブリン、サイトカイン受容体、ラクトフェリン、ホスホリパーゼＡ２−活性化タンパク質、インスリン、腫瘍壊死因子、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、エンケパリン、ソマトメジン、エリスロポエチン、視床下部放出因子、プロラクチン、絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン、組織プラズミノゲン活性化物質、成長ホルモン分泌ペプチド、胸腺体液性因子、抗癌ペプチド、または抗生ペプチドから選択できる。具体的な例として、ヒトインターロイキン−２、ヒトインターロイキン−１β、ヒトインターロイキン−６、ヒトインターロイキン−３２α、−３２βまたは−３２γ、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、ヒト血清アルブミン、ヒトインターフェロン−α、−βまたは−γ、ヒト顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒト成長ホルモン、ヒト血素板由来成長因子、ヒト線維芽細胞成長因子、ヒト上皮細胞成長因子、ヒトインスリン様成長因子、ヒト神経成長因子、ヒト変形性成長因子β−１、ヒト濾胞刺激ホルモン、グルコースオキシダーゼ(glucose oxidase)、グルコダーゼ(glucodase)、ガラクトシダーゼ(galactosidase)、グルコセレブロシダーゼ(glucocerebrosidase)、グルクロニダーゼ(glucuronidase)、アスパラギナーゼ(asparaginase)、アルギナーゼ(arginase)、アルギニンジイミナーゼ(arginine deaminase)、ペルオキシドディスムターゼ(peroxide dismutase)、エンドトキシナーゼ(ecdotoxinase)、カタラーゼ(catalase)、キモトリプシン(chymotrypsin)、ウリカーゼ(uricase)、アデノシン二リン酸(adenosine diphosphatase)、チロシナーゼ(tyrosinase)、ビリルビンオキシダーゼ(bilirubine oxidase)、牛ＧＡＬＴ(bovine galactose-1-phosphate uridyltransferase)、クラゲ緑色蛍光タンパク質、ＣＡＬＢ(Candida antarctica lipase B)、カンジダルゴサリパーゼ(Candida rugosa lipase)、カビクロロペルオキシダーゼ(fungal chloroperoxidase)、β−ガラクトシダーゼ(β-galactosidase)、レソルバーゼ(resolvase)、α−ガラクトシダーゼ(α-galactosidase)、β−グルコシダーゼ(β-glucosidase)、トレハロ��ス合成酵素(trehalose synthase)、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ(cyclodextrin glycosyl transferase)、キシラナーゼ(xylanase)、フィターゼ(phytase)、ヒトラクトフェリン、ヒトエリスロポエチン、ヒトパラオキソナーゼ、ヒト分化成長因子１５（ｈＧＤＦ１５）、ヒトガラクチン−３結合タンパク質、ヒトセリンプロテアーゼ阻害剤、Ｋｕｎｉｔｚタイプ２、ヒトヤヌスキナーゼ２、ヒトＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、ヒトＹＭ１＆２、ヒトＣＥＭＩ、ヒトＤＧＡＴ(diacylglycerol acyltransferase)、ヒトレプチン、ヒトｍＬ２５９、ヒトプロテイナーゼ３、ヒトリソザイム、ヒトＤＥＡＤボックスプロチン４１、ヒトエトポキシド導入タンパク質２４、マウスカスパーゼ１、牛アンギオジェニン、およびミミズルンブロキナーゼを含むが、これに限定されない。
【００４６】
具体的な例として、目的タンパク質は、従来の組み換え生産方法では生産が不可能であり或いは生産率が非常に低いタンパク質である。別の一例として、目的タンパク質は、公知の発現システムを使用すると容易には生産されるが、その発現率を高めようとするタンパク質である。
【００４７】
目的タンパク質をコードする核酸は、当業界に広く知られている一般な供給源、例えばゲノム性ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリー、ＰＣＲ増幅、または化学的合成法で得ることができる。
【００４８】
本発明で使用される目的タンパク質をコードする核酸配列は、本発明の線形ベクターと生体内で組み換えさせるのに用いられる５’末端リンカーＤＮＡを含み、また、レポータータンパク質のＮ末端アミノ酸の一部をコードする３’末端核酸配列を追加的に含むが、３’末端核酸配列は、線形ベクターから欠失したＮ末端、および宿主細胞内に導入されて細胞内で目的タンパク質をコードする核酸配列と線形ベクター間の組み換えを生じさせるのに十分な付加的アミノ酸を含む。具体的に、レポータータンパク質のＮ末端の一部をコードする配列は、線形ベクターのレポータータンパク質をコードする３０または４０ｂｐの配列とオーバーラップする少なくとも２０ｂｐを含む。５’リンカーおよび３’レポータータンパク質配列を、目的タンパク質をコードする核酸配列に付加することは、通常のＤＮＡ技術、例えばＰＣＲおよび／または制限酵素切断および連結で行うことができる。
【００４９】
本発明のリンカーＤＮＡは、十分な長さでなければならず、宿主細胞内に導入されて細胞内で目的タンパク質をコードする核酸配列と線形ベクター間の組み換えを生じさせることが可能な線形ベクターの核酸配列の一部と十分な配列相同性を有する。具体的に、リンカーＤＮＡは２０ｂｐ以上の長さ、例えば３０または４０ｂｐ以上の長さを持つ。より具体的に、リンカーＤＮＡは線形ベクターと少なくとも８０程度の相同性を有し、８５％、９０％、９５％または９９％の相同性を有することもできる。
【００５０】
一例として、リンカーＤＮＡは、プロテアーゼ認識配列をコードしてＴＦＰと目的タンパク質間の接合部位で切断を引き起こす。例えば、リンカーＤＮＡは酵母ｋｅｘ２ｐまたはｋｅｘ２ｐ様プロテアーゼ認識配列（例えば、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、またはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号２１４）を含むアミノ酸配列）、哺乳動物フューリン認識配列（Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇを含むアミノ酸配列）、Ｆａｃｔｏｒ−Ｘａ認識配列（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号２１５）を含むアミノ酸配列）、エンテロキナーゼ認識配列（Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓを含むアミノ酸配列）、スブチリシン認識配列（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ（配列番号２１６）を含むアミノ酸配列）、タバコエッチイルス認識配列（Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（配列番号２１７）を含むアミノ酸配列）、ユビキチン加水分解酵素認識配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを含むアミノ酸配列）、またはトロンビン認識配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号２１８）を含むアミノ酸配列）をコードすることができる。
【００５１】
別の一例として、リンカーＤＮＡはＧＳＴ、ＭＢＰ、ＮｕｓＡ、チオレドキシン、ユビキチン、ＦＬＡＧ、ＢＡＰ、６ＨＩＳ、ＳＴＲＥＰ、ＣＢＰ、ＣＢＤ、またはＳ−タグなどの親和性タグ(affinity tag)をコードすることができる。
【００５２】
別の一例として、リンカーＤＮＡは、ＳｆｉＩのような制限酵素認識部位をコードすることができる。別の一例として、リンカーＤＮＡは、制限酵素認識部位およびプロテアーゼ認識配列（例えば、ｋｅｘ２ｐ様プロテアーゼ−またはｋｅｘ−２ｐ−認識配列）をコードすることができる。
【００５３】
本発明は、本発明の方法によって選別されたＴＦＰまたはその類似体またはその断片に関する。具体的に、ＴＦＰは、ＴＦＰ−９（配列番号２９）、ＴＦＰ−１３（配列番号３１）、ＴＦＰ−１７（配列番号３３）、ＴＦＰ−１８（配列番号３５）、ＴＦＰ−１９（配列番号３７）、ＴＦＰ−２０（配列番号３９）、ＴＦＰ−２１（配列番号４１）、ＴＦＰ−２５（配列番号４３）、ＴＦＰ−２７（配列番号４５）、ＴＦＰ−１１（配列番号６１）、ＴＦＰ−２２（配列番号６３）、ＴＦＰ−２９（配列番号６５）、ＴＦＰ−３４（配列番号６７）、ＴＦＰ−３８（配列番号６９）、ＴＦＰ−３９（配列番号１２９）、ＴＦＰ−４３（配列番号１３１）、ＴＦＰ−４４（配列番号１３３）、ＴＦＰ−４８（配列番号１３５）、ＴＦＰ−５２（配列番号１３７）、ＴＦＰ−５４（配列番号１３９）、ＴＦＰ−４０（配列番号１７５）、ＴＦＰ−５０（配列番号１７７）、ＴＦＰ−５１（配列番号１７９）、ＴＦＰ−５７（配列番号１８１）、ＴＦＰ−５８（配列番号１８３）、ＴＦＰ−５９（配列番号１８５）、ＴＦＰ−５（配列番号２００）、ＴＦＰ−６（配列番号２０２）、ＴＦＰ−７（配列番号２０４）、ＴＦＰ−８（配列番号２０６）、ＰｐＴＦＰ−１（配列番号８４）、ＰｐＴＦＰ−２（配列番号８６）、ＰｐＴＦＰ−３（配列番号８８）、およびＰｐＴＦＰ−４（配列番号９０）またはその類似体またはその断片よりなる群から選択される。
【００５４】
また、本発明は、本発明の方法によって選別された２つまたはそれ以上のＴＦＰまたはその断片またはその類似体を含むＴＦＰライブラリーに関する。具体的に、ＴＦＰライブラリーは、特定の目的タンパク質に効果的なＴＦＰを含む。または、ＴＦＰライブラリーは一つ以上の目的タンパク質に効果的なＴＦＰを含む。具体的に、ＴＦＰライブラリーは、ＴＦＰ−９（配列番号２９）、ＴＦＰ−１３（配列番号３１）、ＴＦＰ−１７（配列番号３３）、ＴＦＰ−１８（配列番号３５）、ＴＦＰ−１９（配列番号３７）、ＴＦＰ−２０（配列番号３９）、ＴＦＰ−２１（配列番号４１）、ＴＦＰ−２５（配列番号４３）、ＴＦＰ−２７（配列番号４５）、ＴＦＰ−１１（配列番号６１）、ＴＦＰ−２２（配列番号６３）、ＴＦＰ−２９（配列番号６５）、ＴＦＰ−３４（配列番号６７）、ＴＦＰ−３８（配列番号６９）、ＴＦＰ−３９（配列番号１２９）、ＴＦＰ−４３（配列番号１３１）、ＴＦＰ−４４（配列番号１３３）、ＴＦＰ−４８（配列番号１３５）、ＴＦＰ−５２（配列番号１３７）、ＴＦＰ−５４（配列番号１３９）、ＴＦＰ−４０（配列番号１７５）、ＴＦＰ−５０（配列番号１７７）、ＴＦＰ−５１（配列番号１７９）、ＴＦＰ−５７（配列番号１８１）、ＴＦＰ−５８（配列番号１８３）、ＴＦＰ−５９（配列番号１８５）、ＴＦＰ−５（配列番号２００）、ＴＦＰ−６（配列番号２０２）、ＴＦＰ−７（配列番号２０４）、ＴＦＰ−８（配列番号２０６）、ＰｐＴＦＰ−１（配列番号８４）、ＰｐＴＦＰ−２（配列番号８６）、ＰｐＴＦＰ−３（配列番号８８）、およびＰｐＴＦＰ−４（配列番号９０）またはその類似体またはその断片よりなる群から選ばれる２つまたはそれ以上（例えば４、６、８、１０または１２またはそれ以上）のＴＦＰを含む。
【００５５】
より具体的に、ＴＦＰライブラリーは、ＴＦＰ−９（配列番号２９）、ＴＦＰ−１３（配列番号３１）、ＴＦＰ−１７（配列番号３３）、ＴＦＰ−１８（配列番号３５）、ＴＦＰ−１９（配列番号３７）、ＴＦＰ−２０（配列番号３９）、ＴＦＰ−２１（配列番号４１）、ＴＦＰ−２５（配列番号４３）、ＴＦＰ−２７（配列番号４５）、ＴＦＰ−１１（配列番号６１）、ＴＦＰ−２２（配列番号６３）、ＴＦＰ−２９（配列番号６５）、ＴＦＰ−３４（配列番号６７）、ＴＦＰ−３８（配列番号６９）、ＴＦＰ−３９（配列番号１２９）、ＴＦＰ−４３（配列番号１３１）、ＴＦＰ−４４（配列番号１３３）、ＴＦＰ−４８（配列番号１３５）、ＴＦＰ−５２（配列番号１３７）、ＴＦＰ−５４（配列番号１３９）、ＴＦＰ−４０（配列番号１７５）、ＴＦＰ−５０（配列番号１７７）、ＴＦＰ−５１（配列番号１７９）、ＴＦＰ−５７（配列番号１８１）、ＴＦＰ−５８（配列番号１８３）、ＴＦＰ−５９（配列番号１８５）、ＴＦＰ−５（配列番号２００）、ＴＦＰ−６（配列番号２０２）、ＴＦＰ−７（配列番号２０４）、ＴＦＰ−８（配列番号２０６）、ＰｐＴＦＰ−１（配列番号８４）、ＰｐＴＦＰ−２（配列番号８６）、ＰｐＴＦＰ−３（配列番号８８）、およびＰｐＴＦＰ−４（配列番号９０）、ＴＦＰ−１（配列番号２１９）、ＴＦＰ−２（配列番号２２１）、ＴＦＰ−３（配列番号２２３）、ＴＦＰ−４（配列番号２２５）、およびＴＦＰ３２（配列番号２０８）またはその類似体またはその断片よりなる群から選ばれる６つまたはそれ以上（例えば、８、１０または１５またはそれ以上）のＴＦＰを含む。
【００５６】
また、本発明は、本発明の方法によって選別されたＴＦＰをコードする核酸またはその類似体またはその断片に関する。具体的に、ＴＦＰをコードする核酸は、ＴＦＰ−９（配列番号２９）、ＴＦＰ−１３（配列番号３１）、ＴＦＰ−１７（配列番号３３）、ＴＦＰ−１８（配列番号３５）、ＴＦＰ−１９（配列番号３７）、ＴＦＰ−２０（配列番号３９）、ＴＦＰ−２１（配列番号４１）、ＴＦＰ−２５（配列番号４３）、ＴＦＰ−２７（配列番号４５）、ＴＦＰ−１１（配列番号６１）、ＴＦＰ−２２（配列番号６３）、ＴＦＰ−２９（配列番号６５）、ＴＦＰ−３４（配列番号６７）、ＴＦＰ−３８（配列番号６９）、ＴＦＰ−３９（配列番号１２９）、ＴＦＰ−４３（配列番号１３１）、ＴＦＰ−４４（配列番号１３３）、ＴＦＰ−４８（配列番号１３５）、ＴＦＰ−５２（配列番号１３７）、ＴＦＰ−５４（配列番号１３９）、ＴＦＰ−４０（配列番号１７５）、ＴＦＰ−５０（配列番号１７７）、ＴＦＰ−５１（配列番号１７９）、ＴＦＰ−５７（配列番号１８１）、ＴＦＰ−５８（配列番号１８３）、ＴＦＰ−５９（配列番号１８５）、ＴＦＰ−５（配列番号２００）、ＴＦＰ−６（配列番号２０２）、ＴＦＰ−７（配列番号２０４）、ＴＦＰ−８（配列番号２０６）、ＰｐＴＦＰ−１（配列番号８４）、ＰｐＴＦＰ−２（配列番号８６）、ＰｐＴＦＰ−３（配列番号８８）、およびＰｐＴＦＰ−４（配列番号９０）またはその類似体またはその断片よりなる群から選ばれるＴＦＰをコードする。また、核酸は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、６２、６４、６６、６８、７０、８５、８７、８９、９１、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、２０１、２０３、２０５、または２０７またはその類似体またはその断片よりなる群から選ばれる核酸配列を含む。
【００５７】
また、本発明は、本発明の方法によって選別された２つまたはそれ以上のＴＦＰまたはその類似体またはその断片をコードする核酸のライブラリーに関する。具体的に、核酸ライブラリーは、特定の目的タンパク質に効果的なＴＦＰをコードする。または、核酸ライブラリーは、一つ以上の目的タンパク質に効果的なＴＦＰをコードする。具体的に、核酸ライブラリーは、ＴＦＰ−９（配列番号２９）、ＴＦＰ−１３（配列番号３１）、ＴＦＰ−１７（配列番号３３）、ＴＦＰ−１８（配列番号３５）、ＴＦＰ−１９（配列番号３７）、ＴＦＰ−２０（配列番号３９）、ＴＦＰ−２１（配列番号４１）、ＴＦＰ−２５（配列番号４３）、ＴＦＰ−２７（配列番号４５）、ＴＦＰ−１１（配列番号６１）、ＴＦＰ−２２（配列番号６３）、ＴＦＰ−２９（配列番号６５）、ＴＦＰ−３４（配列番号６７）、ＴＦＰ−３８（配列番号６９）、ＴＦＰ−３９（配列番号１２９）、ＴＦＰ−４３（配列番号１３１）、ＴＦＰ−４４（配列番号１３３）、ＴＦＰ−４８（配列番号１３５）、ＴＦＰ−５２（配列番号１３７）、ＴＦＰ−５４（配列番号１３９）、ＴＦＰ−４０（配列番号１７５）、ＴＦＰ−５０（配列番号１７７）、ＴＦＰ−５１（配列番号１７９）、ＴＦＰ−５７（配列番号１８１）、ＴＦＰ−５８（配列番号１８３）、ＴＦＰ−５９（配列番号１８５）、ＴＦＰ−５（配列番号２００）、ＴＦＰ−６（配列番号２０２）、ＴＦＰ−７（配列番号２０４）、ＴＦＰ−８（配列番号２０６）、ＰｐＴＦＰ−１（配列番号８４）、ＰｐＴＦＰ−２（配列番号８６）、ＰｐＴＦＰ−３（配列番号８８）、およびＰｐＴＦＰ−４（配列番号９０）またはその類似体またはその断片よりなる群から選ばれる２つまたはそれ以上（例えば、４、６、８、１０または１２またはそれ以上）のＴＦＰをコードする。また、核酸ライブラリーは、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、６２、６４、６６、６８、７０、８５、８７、８９、９１、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、２０１、２０３、２０５、または２０７またはその類似体またはその断片よりなる群から選ばれる２つまたはそれ以上（例えば、４、６、８、１０または１２またはそれ以上）の核酸配列を含む。
【００５８】
より具体的に、核酸ライブラリーは、ＴＦＰ−９（配列番号２９）、ＴＦＰ−１３（配列番号３１）、ＴＦＰ−１７（配列番号３３）、ＴＦＰ−１８（配列番号３５）、ＴＦＰ−１９（配列番号３７）、ＴＦＰ−２０（配列番号３９）、ＴＦＰ−２１（配列番号４１）、ＴＦＰ−２５（配列番号４３）、ＴＦＰ−２７（配列番号４５）、ＴＦＰ−１１（配列番号６１）、ＴＦＰ−２２（配列番号６３）、ＴＦＰ−２９（配列番号６５）、ＴＦＰ−３４（配列番号６７）、ＴＦＰ−３８（配列番号６９）、ＴＦＰ−３９（配列番号１２９）、ＴＦＰ−４３（配列番号１３１）、ＴＦＰ−４４（配列番号１３３）、ＴＦＰ−４８（配列番号１３５）、ＴＦＰ−５２（配列番号１３７）、ＴＦＰ−５４（配列番号１３９）、ＴＦＰ−４０（配列番号１７５）、ＴＦＰ−５０（配列番号１７７）、ＴＦＰ−５１（配列番号１７９）、ＴＦＰ−５７（配列番号１８１）、ＴＦＰ−５８（配列番号１８３）、ＴＦＰ−５９（配列番号１８５）、ＴＦＰ−５（配列番号２００）、ＴＦＰ−６（配列番号２０２）、ＴＦＰ−７（配列番号２０４）、ＴＦＰ−８（配列番号２０６）、ＰｐＴＦＰ−１（配列番号８４）、ＰｐＴＦＰ−２（配列番号８６）、ＰｐＴＦＰ−３（配列番号８８）、ＰｐＴＦＰ−４（配列番号９０）、ＴＦＰ−１（配列番号２１９）、ＴＦＰ−２（配列番号２２１）、ＴＦＰ−３（配列番号２２３）、ＴＦＰ−４（配列番号２２５）、およびＴＦＰ−３２（配列番号２０８）またはその類似体またはその断片よりなる群から選ばれる６またはそれ以上（例えば、８、１０、１２または１５またはそれ以上）のＴＦＰをコードする。また、核酸ライブラリーは、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、６２、６４、６６、６８、７０、８５、８７、８９、９１、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２２０、２２２、２２４、または２２６またはその類似体またはその断片よりなる群から選ばれる６またはそれ以上（例えば、８、１０、１２または１５またはそれ以上）の核酸配列を含む。
【００５９】
本発明において、ＴＦＰに関する用語「その断片」は、目的タンパク質と融合されたときに目的タンパク質の分泌を誘導することができる十分な機能を持つ断片であって、ＴＦＰのアミノ酸配列のいずれの部分でも含むペプチドのことをいう。
【００６０】
ＴＦＰに関する用語「その類似体」は、目的タンパク質と融合されたときに目的タンパク質の分泌を誘導することができる十分な機能を持つポリペプチドであって、ＴＦＰのアミノ酸と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を構成するポリペプチドのことをいう。具体的に、類似体は、ＴＦＰアミノ酸と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。類似体は、ＴＦＰアミノ酸配列の付加、欠失、置換または組合せを含む。付加または置換は人為的なことを含む。
【００６１】
好ましくは、置換は保存的アミノ酸置換であり得る。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を持つアミノ酸残基で代替されることをいう。類似の側鎖を持つアミノ酸残基は、当業界によく知られており、基本的な側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電した極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、
セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトパン）、β−分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香性側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトパン、ヒスチジン）を含む。
【００６２】
ＴＦＰをコードする核酸に関する用語「その類似体」は、ＴＦＰをコードする核酸の核酸配列と少なくとも７０％の相同性を有する核酸配列で構成された核酸のことをいい、類似体(derivative)によってコードされたポリペプチドは、目的タンパク質と融合されたときに目的タンパク質の分泌を誘導することができる十分な機能を持つ。具体的に、類似体は、ＴＦＰをコードする核酸の核酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有する核酸配列を含む。類似体はＴＦＰをコードする核酸の核酸配列の付加、欠失、置換または組合せを含む。
【００６３】
配列相同性の計算は、比較対象となる部位が最適に整列された２つの配列を比較し、２つの配列で相同性のあるアミノ酸残基またはヌクレオチドの位置を決定してマッチされる位置の数を求め、マッチされる位置の数を比較対象部位の総数で割り（すなわち、ウィンドウサイズ）、その結果に１００をかけて配列相同性のパーセントを求めることにより計算することができる。一つの様態として、１００アミノ酸またはヌクレオチド長さにおける４つのギャップが最大整列に導入できるとき、パーセント相同性は、比較対象配列の相同性のあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを整列した２つの配列より小さい配列におけるアミノ酸残基、またはヌクレオチドのパーセントで計算される(Dayhoff, in Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5, p. 124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C, 1972)。相同性は、当業界に知られているコンピュータ相同性プログラムで決定される。プログラムの例としてはＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを使用した初期値の設定を用いるギャッププログラムがある(Adv. Appl. Math., 1981, 2: 482-489)。
【００６４】
類似体の例としては、欠失突然変異（例えば、単方向欠失）、機能的配列の付加（例えば、糖化部位、制限酵素部位）、およびＴＦＰに対するプロ配列またはプリ配列の欠失または付加（例えば、スワッピング）がある。当業者は、当業界によく知られている突然変異誘発技術、例えば前記文献に開示された方法を用いてＴＦＰまたはＴＦＰコーティング核酸の類似体を作ることができ、目的タンパク質と融合されたときに目的タンパク質の分泌を誘導することができる十分な機能を持つ類似体を確認することができる。
【００６５】
本発明において、用語「目的タンパク質と融合されたときに目的タンパク質の分泌を誘導することができる十分な機能を持つ」とは、目的タンパク質と融合されたときに目的タンパク質の分泌を誘導することが可能なＴＦＰ機能の５０％以上を持つＴＦＰの類似体または断片をいう。また、融合された目的タンパク質の分泌誘導能力の６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５％を持つ類似体または断片であり得る。目的タンパク質分泌誘導能力は、当業界に公知の技術または前記の技術によって決定できる。
【００６６】
本発明は、ＴＦＰをコードする核酸断片ライブラリーに関するもので、核酸断片ライブラリーは、本発明の方法によって選別された１０またはそれ以上の核酸断片（例えば、５０、１００、５００、１０００または２０００またはそれ以上）を含み、予備選別された候補者ＴＦＰのライブラリーは、最終選別に使用できる。
【００６７】
また、本発明は、ＴＦＰをコードする核酸断片ライブラリーに関するもので、核酸断片ライブラリーは、本発明の方法によって選別された１０またはそれ以上の核酸断片（例えば、５０または１００またはそれ以上）を含み、予備選別された候補者ＴＦＰのライブラリーは、レポーター遺伝子が欠乏した複数の宿主細胞を核酸断片、およびレポータータンパク質をコードする核酸配列に形質転換させ、成長した細胞を集め、細胞からベクターを分離し、ベクターから核酸断片を分離してそれぞれレポータータンパク質の分泌を誘導する核酸断片を含むＴＦＰライブラリーを収得することにより構築することができ、このような予備選別された候補者ＴＦＰのライブラリーは、最終選別に使用できる。
【００６８】
また、本発明は、ＴＦＰをコードする核酸断片ライブラリーに関するもので、核酸断片ライブラリーは、本発明の方法によって選別された１０またはそれ以上の核酸断片（例えば、５０、１００、５００または１０００またはそれ以上）を含み、予備選別された候補者ＴＦＰのライブラリーは、（ｉ）予め確認された一つまたはそれ以上のＴＦＰと相同性を有するＰｒｅ−分泌シグナルを含む遺伝子、（ｉｉ）分泌シグナル配列を含む遺伝子、（ｉｉｉ）小胞体（例えば、細胞壁タンパク質、排泄タンパク質、細胞膜タンパク質、液胞タンパク質または胚芽タンパク質）を介して運搬されるタンパク質をコードする遺伝子を検索するためのゲノムデータベースで確認された配列から得ることができ、このような予備選別された候補者ＴＦＰのライブラリーは、最終選別に使用できる。
【００６９】
また、本発明は、ＴＦＰをコードする核酸断片ライブラリーに関するもので、核酸断片ライブラリーは、本発明の方法によって選別された１０またはそれ以上の核酸断片（例えば、５０、１００または５００またはそれ以上）を含み、予備選別された候補者ＴＦＰのライブラリーは、予め選別されたＴＦＰの多様化によって得ることができ、このような予備選別された候補者ＴＦＰのライブラリーは、最終選別に使用できる。
【００７０】
本発明は、本発明の方法によって選別されたＴＦＰをコードする核酸配列を含む核酸および目的タンパク質をコードする核酸配列に関する。具体的に、ＴＦＰは、ＴＦＰ−９、 ＴＦＰ−１３、ＴＦＰ−１７、ＴＦＰ−１８、ＴＦＰ−１９、ＴＦＰ−２０、ＴＦＰ−２１、ＴＦＰ−２５、ＴＦＰ−２７、ＴＦＰ−１１、ＴＦＰ−２２、ＴＦＰ−２９、ＴＦＰ−３４、ＴＦＰ−３８、ＴＦＰ−３９、ＴＦＰ−４３、ＴＦＰ−４４、ＴＦＰ−４８、ＴＦＰ−５２、ＴＦＰ−５４、ＴＦＰ−４０、ＴＦＰ−５０、ＴＦＰ−５１、ＴＦＰ−５７、ＴＦＰ−５８、ＴＦＰ−５９、ＴＦＰ−５、ＴＦＰ−６、ＴＦＰ−７、およびＴＦＰ−８またはその類似体またはその断片よりなる群から選ばれる。また、目的タンパク質は、ＩＬ−２、ＩＬ−３２、ヒト成長ホルモンおよびヒトカスパーゼ−１のＰ１０小単位から選択される。具体的に、ＴＦＰはＴＦＰ−９、ＴＦＰ−１３、ＴＦＰ−１７、ＴＦＰ−１８、ＴＦＰ−１９、ＴＦＰ−２０、ＴＦＰ−２１、ＴＦＰ−２５、ＴＦＰ−２７、ＰｐＴＦＰ−１、ＰｐＴＦＰ−２、ＰｐＴＦＰ−３、ＰｐＴＦＰ−４またはその類似体またはその断片であり、目的タンパク質はＩＬ−２であり得る。または、ＴＦＰはＴＦＰ−１１、ＴＦＰ−２２、ＴＦＰ−２９、ＴＦＰ−３４、またはＴＦＰ−３８またはその類似体またはその断片であり、目的タンパク質はＩＬ−３２であり得る。また、ＴＦＰはＴＦＰ−９、ＴＦＰ−１３、ＴＦＰ−１７、ＴＦＰ−１８、ＴＦＰ−１９、ＴＦＰ−２０、ＴＦＰ−２１、ＴＦＰ−２５、ＴＦＰ−２７、ＴＦＰ−１１、ＴＦＰ−２２、ＴＦＰ−２９、ＴＦＰ−３４、またはＴＦＰ−３８またはその類似体またはその断片であり、目的タンパク質は成長ホルモンであり得る。
【００７１】
本発明は、本発明のＴＦＰを用いて目的タンパク質を組み換え的に生産する方法に関する。一例として、本発明の方法は、ＴＦＰをコードする核酸配列またはその類似体またはその断片と作動可能に連結された目的タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターを準備し、宿主細胞にベクターを形質転換させ、宿主細胞から目的タンパク質を生産し分泌することが可能な条件の下に宿主細胞を培養する段階を含む。具体的に、ＴＦＰは、ＴＦＰ−９（配列番号２９）、ＴＦＰ−１３（配列番号３１）、ＴＦＰ−１７（配列番号３３）、ＴＦＰ−１８（配列番号３５）、ＴＦＰ−１９（配列番号３７）、ＴＦＰ−２０（配列番号３９）、ＴＦＰ−２１（配列番号４１）、ＴＦＰ−２５（配列番号４３）、ＴＦＰ−２７（配列番号４５）、ＴＦＰ−１１（配列番号６１）、ＴＦＰ−２２（配列番号６３）、ＴＦＰ−２９（配列番号６５）、ＴＦＰ−３４（配列番号６７）、ＴＦＰ−３８（配列番号６９）、ＴＦＰ−３９（配列番号１２９）、ＴＦＰ−４３（配列番号１３１）、ＴＦＰ−４４（配列番号１３３）、ＴＦＰ−４８（配列番号１３５）、ＴＦＰ−５２（配列番号１３７）、ＴＦＰ−５４（配列番号１３９）、ＴＦＰ−４０（配列番号１７５）、ＴＦＰ−５０（配列番号１７７）、ＴＦＰ−５１（配列番号１７９）、ＴＦＰ−５７（配列番号１８１）、ＴＦＰ−５８（配列番号１８３）、ＴＦＰ−５９（配列番号１８５）、ＴＦＰ−５（配列番号２００）、ＴＦＰ−６（配列番号２０２）、ＴＦＰ−７（配列番号２０４）、ＴＦＰ−８（配列番号２０６）、ＰｐＴＦＰ−１（配列番号８４）、ＰｐＴＦＰ−２（配列番号８６）、ＰｐＴＦＰ−３（配列番号８８）、およびＰｐＴＦＰ−４（配列番号９０）またはその類似体またはその断片よりなる群から選択できる。また、目的タンパク質はＩＬ−２、ＩＬ−３２、ヒト成長ホルモンまたはヒトカスパーゼ−１のＰ１０小単位から選択できる。
【００７２】
目的タンパク質は、当業界によく知られている全ての発現システムを用いて組み換え的に生産できる。好ましくは、目的タンパク質は。バクテリア、酵母または哺乳動物細胞の培養の下に組み換え的に発現できる。組み換え発現は、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを準備し、宿主細胞内にベクターを運搬し、目的タンパク質が発現される条件の下に宿主細胞を培養し、目的タンパク質を分離する段階を含む。組み換えベクターを準備し、そのベクターを宿主細胞に形質転換させ、宿主細胞内でベクターを複製し、生物学的活性のある外来ポリペプチドおよびタンパク質を発現させる方法および材料は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ(Sambrook Sambrook et al, Cold Spring Harbor Laboratory, 3rd edition, 2001)およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ(Ausubel et al, John Wiley & Sons, New York 3rd edition, 2000)によく記述されている。
【００７３】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を用いて原核または真核細胞に導入できる。本発明において、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入する当業界の技術をいい、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿法、電気穿孔法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介法、またはリホフェクションなどを含む。宿主細胞に形質転換またはトランスフェクションさせる適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等の文献(MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)、およびその他の実験マニュアルによく記述されている。
【００７４】
哺乳動物細胞への安定的なトランスフェクションは、使用された発現ベクターおよびトランスフェクション技術によっていると知られており、一部の細胞のみが外来ＤＮＡを自分のゲノムに挿入させることができる。このような挿入体を確認し選別するために、選別マーカー（例えば、抗生剤抵抗性）をコードする遺伝子を関心のある遺伝子と共に宿主細胞に導入することができる。多様な選別マーカーは、薬物抵抗性を与えるＧ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートを含む。選別マーカーをコードする核酸は、例えば目的タンパク質をコードする核酸などのベクターまたは他のベクターに連結されて導入できる。安定的にトランスフェクションされた細胞は、薬物選別によって確認できる（例えば、選別マーカーを持つ細胞は生存し、そうでない細胞は死ぬであろう。）。
【００７５】
目的タンパク質は、当業界に公知の精製方法、例えば免疫親和性クロマトグラフィー、受容体新和性クロマトグラフィー、疎水性作用クロマトグラフィー、レクチン新和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および逆相ＨＰＬＣなどを含む従来のクロマトグラフィー方法によって、宿主細胞が成長する培地から分離できる。また、所望のタンパク質が特異的タグ、ラベルまたはキレート部分を持つ融合タンパク質であって、特異的結合パートナーまたは製剤によって認識して精製する方法がある。精製されたタンパク質は、所望のタンパク質部分に切断されるか、それ自体のままで残ることが可能である。融合タンパク質の切断によって、切断過程では付加的なアミノ酸を持つ所望のタンパク質形態が作られることができる。
【００７６】
分離されたタンパク質が生物学的活性を持たない場合には、リフォールディングするか、或いは３次構造でポリペプチドを変形し、或いは二硫化結合を生成させるなどの方法で生物学的活性を回復させることができる。当業界に公知の方法は、可溶性ポリペプチドのｐＨをｐＨ７以上に調整し、或いは特定の濃度のカオトロープ(chaotrope)の存在下に置く方法を含む。カオトロープの選択は、封入体(inclusion body)溶解のための選択と類似であるが、さらに低い濃度であり、溶解に使用されるのと同様のカオトロープである必要はない。タンパク質のシステインブリッジを形成させる二硫化シャッフリングを起す特定の酸化還元電位を発生させるためには、還元剤または特定の割合の還元剤および還元剤の酸化形態を使用しなければならない。酸化還元カップル(redox couple)は、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第２銅、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）を使用し、リフォールディング効率を増加させるためには、グリセロール、多様な分子量のポリエチレングリコール、およびアルギニンなどの共溶媒(cosolvent)を使う必要がある。
【００７７】
本発明は、核酸断片ライブラリーからの核酸断片、およびＮ末端アミノ酸の欠失したタンパク質をコードする核酸配列を含む線形ベクターに関する。また、線形ベクターは、目的タンパク質をコードする核酸配列をさらに含むことができる。
【００７８】
本発明は、本発明の線形ベクターライブラリーで形質転換させた、複数のレポータータンパク質欠失宿主細胞に関する。また、宿主細胞は、目的タンパク質をコードする核酸で形質転換できる。
【００７９】
本発明の方法および組成物は下記の実施例によってより具体的に説明されるが、これらに限定されない。本発明は、臨床的治療において多様な条件およびパラメータを適切に変形または適用させることができ、当業界に自明なそれらの変形または適用は本発明の範囲に該当する。
【００８０】
<実施例１>酵母インベルターゼ欠如変異株の製造
難発現性タンパク質に対するタンパク質融合因子を超高速で選別するために酵母インベルターゼをレポーターとして用いてスクロース培地における細胞成長有無を用いた自動選別システムを製造した。
【００８１】
有用なＴＦＰの陽性選別のためにインベルターゼ遺伝子をレポーターとして用いるためには、インベルターゼ活性の欠如した酵母が必要であり、このために野生型の染色体に存在するＳＵＣ２遺伝子を欠失させた。遺伝子欠失誘導用カセットの製造のためにプラスミドｐＲＢ５８(Carlson et al., Cell 20:145(1982))を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで処理してＳＵＣ２コーディング遺伝子を回収し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位に導入してｐＢＩＵを製造した。図１に示すように、ｐＢＩＵに含まれたＳＵＣ２遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ部位に１９０ｂｐの反復配列（Ｔｃ１９０）を両末端に含むＵＲＡ３遺伝子(Bae et al., Yeast 21:437(2004))を挿入してｐＢＩＵを製造した。ｐＢＩＵを制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩで処理した後、サッカロミセスセレビシエＹ２８０５（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ＳＵＣ２ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ＧＡＬ１ ｃａｎ１）およびＹ２８０５Δｇａｌ１（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ＳＵＣ２ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ｇａｌ１ ｃａｎ１）菌株(SK Rhee, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)にリチウムアセテート法で形質転換してウラシルのない選択培地で形質転換体Ｙ２８０５Δｓｕｃ２Ｕ（Ｍａｔ ａ ｓｕｃ２：：ＵＲＡ３ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ＧＡＬ１ ｃａｎ１）およびＹ２８０５Δｇａｌ１Δｓｕｃ２Ｕ（Ｍａｔ ａ ｓｕｓ２：：ＵＲＡ３ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ｇａｌ１ ｃａｎ１）を選別した。
【００８２】
選別された形質転換体のインベルターゼ活性が消滅したか否かを確認するために、単一コロニーを、グルコースとスクロースを単一炭素源として供給したそれぞれの培地で培養した結果、グルコースでは正常的に成長し、スクロースにおいても対照区に比べて成長が非常に遅かったが成長することができた。培養中に培地に分泌されるインベルターゼの量を調査するために、ＳＵＣ２＋菌株とΔｓｕｃ２菌株をＹＰＤ培地（１％酵母抽出液、２％バクトペプトンおよび２％グルコース）で培養し、培養上清液に存在するタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ゲルをスクロース溶液で３０分間反応させ、その後ＴＴＣ(2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride)で発色したザイモグラム(zymogram)分析をした結果（図２）、Δｓｕｃ２菌株の場合、大部分のインベルターゼ活性が消失したことが分かった。ところが、スクロース培地で非常に遅いが成長するという問題があるが、これはミトコンドリアの機能によるグルコース新生(gluconeogenesis)によって細胞が部分的に成長するものと推定された。したがって、かかる問題を除去するために、ミトコンドリア電子伝達系作用抑制物質であるアンチマイシンＡを添加した後、インベルターゼの発現がない菌株の成長有無を確認した結果、アンチマイシンＡを含むＹＰＳＡ（１％酵母抽出液、２％バクトペプトン、２％スクロース、１μｇ／ｍＬアンチマイシンＡ、および２％寒天）またはＹＰＳＧＡ（１％酵母抽出液、２％バクトペプトン、２％スクロース、１μｇ／ｍＬアンチマイシンＡ、および２％寒天）培地で菌株の成長を完全に抑制することができた（図３）。
【００８３】
選別されたＹ２８０５Δｓｕｃ２Ｕ（Ｍａｔ ａ ｓｕｃ２：：ＵＲＡ３ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ＧＡＬ１ ｃａｎ１）およびＹ２８０５Δｇａｌ１Δｓｕｃ２Ｕ（Ｍａｔ ａ ｓｕｃ２：：ＵＲＡ３ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ＧＡＬ１ ｃａｎ１）菌株にヒトｃＤＮＡライブラリーを含有するＵＲＡ３ベクターを再び形質転換させるためには、ＳＵＣ２遺伝子欠失用として用いたＵＲＡ３遺伝子を除去する必要があるが、このために培養細胞をフルオロオルチン酸（５−ＦＯＡ）培地で培養してＵＲＡ３遺伝子がポップアウト(pop-out)された菌株Ｙ２８０５Δｓｕｃ２（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ｓｕｃ２：：Ｔｃ１９０ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ＧＡＬ１ ｃａｎ１）およびＹ２８０５Δｇａｌ１Δｓｕｃ２（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ｓｕｃ２：：Ｔｃ１９０ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ｇａｌ１ ｃａｎ１）を選別した（図１）。染色体上のＳＵＣ２遺伝子が予想したように欠失し、ＵＲＡ３遺伝子がさらにポップアウトされたか否かをサザンブロットを介して確認した（図４）。Ｙ２８０５菌株の染色体をＥｃｏＲＩで処理し、ＳＵＣ２遺伝子をプローブとして用いる場合、約４．３ｋｂの切片が確認されるが、ＵＲＡ３遺伝子が挿入された後（Ｙ２８０５Δｇａｌ１Δｓｕｃ２Ｕ）、約５．０ｋｂに増加してからＵＲＡ３遺伝子がポップアウトされると（Ｙ２８０５Δｇａｌ１Δｓｕｃ２）、約３．７ｋｂに減少する。図４の結果より、ＳＵＣ２遺伝子が予想したように正確に欠失し、ＵＲＡ３遺伝子がポップアウトされたことを確認した。
【００８４】
<実施例２>インベルターゼとの融合による自動選別システムの確認
インベルターゼ遺伝子の欠失した菌株でインベルターゼと融合されたタンパク質の発現によってスクロース培地における自動選別を確認するために、酵母でよく発現するヒトタンパク質としての血清アルブミン(human serum albumin、ＨＳＡ)と難発現タンパク質としてのヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）を用いた。
【００８５】
スクロース培地における自動選別を確認するために、３つのプラスミドであるｐＹＧＡＰ−ＳＮＳ−ＳＵＣ２、ｐＹＧＡＰ−ＨＳＡ−ＳＵＣ２、およびｐＹＧＡＰ−ｈＩＬ２−ＳＵＣ２を製造した。酵母ＧＡＰＤＨプロモーターの調節下にあるインベルターゼ遺伝子（ＳＵＣ２、ＹＩＬ１６２Ｗ）発現カセットを含有しているｐＹＧＡＰ−ＳＵＣ２を製造するために、プライマーＳＵＣ−Ｆ（配列番号１）およびＳＵＣ−Ｒ（配列番号２）を用いて、ｐＢＩΔＢＸ（図１）から増幅されたＳＵＣ２遺伝子を含むＰＣＲ産物をｐＳＴ−Ｂｌｕｅ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）にサブクローニングしてｐＳＴ−ＳＵＣ２を先ず製造した。ＰＣＲはＰｆｕ重合酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）またはＥｘ−Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素（ＴａＫａＲａ Ｋｏｒｅａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．，Ｓｅｏｕｌ、韓国）を用いて行った。ＰＣＲ条件は９４℃で５分間１回；９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃で２分間１回とした。ｐＳＴ−ＳＵＣ２からのＳＵＣ２を含んでいるＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ切片を、ＹＥＧα−ＨＩＲ５２５のＧＡＬ１０プロモーターの代わりに、ＧＡＰＤＨプロモーターを持っているＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ処理されたＹＧＡＰα−ＨＩＲに挿入して、ｐＹＧＡＰ−ＳＵＣ２を製造した。分泌される間にＳＵＣ２と外来遺伝子との融合を促進し、酵母ジペプチジルペプチジダーゼＫｅｘ２ｐ(Mizuno K et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 156:246 (1988))によって融合されたタンパク質の生体内切断を誘導するために、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ認識部位に対する人工配列およびＫｅｘ２ｐ切断部位（Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号２１４））コーディング配列を、ＰＣＲによるＳＵＣ２の分泌シグナル配列（１９個のアミノ酸）とＳＵＣ２成熟配列（５１３個のアミノ酸）との間にｉｎ−ｆｒａｍｅにて挿入した。２つのＰＣＲ切片、すなわちＧＡＰＤＨプロモーターおよびプライマーＧＡＰ−Ｆ（配列番号３）とＳＵＣＳＳ−Ｒ（配列番号４）を用いて増幅されたＳＵＣ２分泌シグナル配列を含むＰＣＲ−Ａと、プライマーＳＵＣＭ−Ｆ（配列番号５）およびＳＵＣ−Ｒ（配列番号２）を用いてｐＹＧＡＰ−ＳＵＣ２から増幅されたＳＵＣ２の成熟部位を含むＰＣＲ−Ｂが、それぞれｐＹＧＡＰ−ＳＵＣ２から増幅した。前記２つの切片をｐＳＴ−Ｂｌｕｅ−１内に挿入し、ＰＣＲ−ＡはＳａｃＩ−ＮｏｔＩで処理し、ＰＣＲ−ＢはＮｏｔＩ−ＳａｌＩで処理した。酵素処理したＰＣＲ−ＡおよびＰＣＲ−Ｂを、ＳａｃＩ−ＳａｌＩ処理されたｐＹＧＡＰ−ＳＵＣ２に共に連結してプラスミドｐＹＧＡＰ−ＳＮＳ−ＳＵＣ２を得た。ヒト血清アルブミン(human serum albumim、ＨＳＡ)とＳＵＣ２との間にインフレーム融合された遺伝子を含むプラスミドｐＹＧＡＰ−ＨＳＡ−ＳＵＣ２を製造するために、プライマーＨＳＡ−Ｆ（配列番号６）およびＨＳＡ−Ｒ（配列番号７）を用いてＨＳＡ遺伝子をｐＹＨＳＡ５(Kang et al, J. Microbiol. Biotechnol 8:42 (1998))から増幅した後、ｐＳＴ−Ｂｌｕｅ−１に挿入した。ＨＳＡ遺伝子を含むＳｆｉＩ処理されたＤＮＡをＳｆｉＩ処理されたｐＹＧＡＰ−ＳＮＳ−ＳＵＣ２ベクターに挿入してｐＹＧＡＰ−ＨＳＡ−ＳＵＣ２を得た。ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）とＳＵＣ２との間に���ンフレーム融合された遺伝子を含むプラスミドｐＹＧＡＰ−ｈＩＬ２−ＳＵＣ２を製造するために、プライマーＩＬ２−Ｆ（配列番号８）およびＩＬ２−Ｒ（配列番号９）を用いてｈＩＬ２遺伝子をｐＴ７−ｈＩＬ２(JK Jung, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)から増幅した後、ｐＳＴ−Ｂｌｕｅ−１に挿入した。そして、ＨＳＡ遺伝子を含むＳｆｉＩ処理されたｈＩＬ２切片を、ＳｆｉＩ処理されたｐＹＧＡＰ−ＳＮＳ−ＳＵＣ２ベクターに挿入して、ｐＹＧＡＰ−ｈＩＬ２−ＳＵＣ２を得た。
【００８６】
ヒト血清アルブミンとインベルターゼとの融合タンパク質を発現するｐＹＧＡＰ−ＨＳＡ−ＳＵＣ２ベクター、ＩＬ−２とインベルターゼとの融合タンパク質を発現するｐＹＧＡＰ−ｈＩＬ２−ＳＵＣ２、およびインベルターゼのみを発現するｐＹＧＡＰ−ＳＮＳ−ＳＵＣ２を、それぞれ内生インベルターゼ遺伝子が欠損してスクロース培地で生長することができない酵母菌株（Ｙ２８０５Δｓｕｃ２）に形質転換させた。形質転換された細胞は、グルコースを唯一の炭素源として添加したＵＤプレート（０．６７％アミノ酸のない酵母ナイトロジェンベース、０．７７ｇ／Ｌアミノ酸混合物、２％グルコース、および２％寒天）およびスクロースを唯一の炭素源として添加したＹＰＳＡ培地（１％酵母抽出液、２％バクトペプトン、２％スクロース、１μｇ／ｍＬアンチマイシンＡ、および２％寒天）上に塗抹して各形質転換体の生長を観察した（図５）。細胞を、インベルターゼのみを発現するｐＹＧＡＰ−ＳＮＳ−ＳＵＣ２で形質転換させた場合、２つの炭素源の全てで正常的に成長した。また、細胞を、インベルターゼのＮ末端にＨＳＡを融合させたｐＹＧＡＰ−ＨＳＡ−ＳＵＣ２で形質転換させた場合にも、２つの炭素源を全て利用しながら成長した。ところが、ＨＳＡの代わりにＩＬ２で融合させたｐＹＧＡＰ−ｈＩＬ２−ＳＵＣ２で形質転換させた場合には、グルコース培地では正常的に成長するが、スクロース培地では殆ど成長しなかった。ｐＹＧＡＰ−ｈＩＬ２−ＳＵＣ２で形質転換させた細胞がスクロース培地で成長できないということは、インターロイキン−２が細胞内で分泌不可能であって、これに融合されたインベルターゼも分泌できないためと判断された。したがって、インベルターゼ遺伝子が欠失してスクロース培地で成長することができない菌株に、インベルターゼ遺伝子およびヒトＩＬ２などの難発現性タンパク質の分泌を増加させる融合パートナー（タンパク質融合因子、ＴＦＰ）を形質転換させてその発現有無を用いて自動選別可能であることが分かった。
【００８７】
<実施例３>タンパク質融合因子ライブラリー製作用ベクターの製造
酵母遺伝体またはｃＤＮＡライブラリーからタンパク質融合因子ライブラリーを構築するために、ライブラリー構築用ベクターを製作した。ｃＤＮＡからタンパク質融合因子ライブラリーを構築するためのベクターとしてＹＧａＩＮＶを製作した（図６）。ｐＹＧＡＰ−ｈＩＬ２−ＳＵＣ２からインベルターゼをコードするＤＮＡ切片を増幅するために、２つのプライマーであるＳｆｉｌ−ＳＵＣ−Ｆ（配列番号１０）およびＳＵＣ−Ｘｈｏ−Ｒ（配列番号１１）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間１回；９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃２分間の反応を２５回；７２℃で７分間１回とした。そして、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ処理されたＰＣＲ切片をＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ処理されたＹＥＧα−ＨＩＲ５２５に連結してプラスミドＹＧａＩＮＶを製作した（図６）。ゲノム性ＤＮＡからタンパク質融合因子ライブラリーを構築するためのベクターとしては、相異なる３つのＳＵＣ２リーディングフレームのいずれか一つを持つベクターＹＧａＦ０ＩＮＶ、ＹＧａＦ１ＩＮＶおよびＹＧａＦ２ＩＮＶを製作した（図７）。ＹＧａＩＮＶを鋳型とし、一般的なセンスプライマーＧａＩ１００−Ｆ（配列番号１２）および相異なるリーディングフレームを持つ３つのアンチセンスプライマーＸｈｏ−Ｆ０−Ｒ（配列番号１３）、Ｘｈｏ−Ｆ１−Ｒ（配列番号１４）、およびＸｈｏ−Ｆ２−Ｒ（配列番号１５）を用いて、３回のＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲはＰｆｕ重合酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）を使用し、９４℃で５分間１回；９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃２分間の反応を２５回；７２℃で７分間１回の条件にして行った。アガロースゲルから回収した３つのＰＣＲ切片をＳｆｉＩ酵素で処理した後、ＳｆｉＩで処理されたＹＧａＩＮＶとそれぞれ結合して３つのプラスミドＹＧａＦ０ＩＮＶ、ＹＧａＦ１ＩＮＶおよびＹＧａＦ２ＩＮＶをそれぞれ製造した（図７）。
【００８８】
<実施例４>酵母インベルターゼと融合されたｃＤＮＡライブラリーの製造
ｃＤＮＡライブラリーを製作するために酵母サッカロミセスセレビシエＹ２８０５（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ｈｉｓ３ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ｃａｎ１）由来のＲＮＡを用いた。ＹＰＤ培地（２％酵母抽出物、１％バクトペプトン、２％グルコース）で対数期まで培養した菌株を回収した後、Ｅｌｉｏｎなどの方法(Elion et al, cell, 1984, 39;663)によって全体ＲＮＡを回収した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）を用いて全体ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）+ｍＲＮＡのみを回収し、ＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡ合成キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）を用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを製造した。前記ＳＭＡＲＴキット（図８）のマニュアルによる方法でｍＲＮＡから逆転写によって第１鎖ｃＤＮＡを合成するとき、ＳｆｉＩ認識部位および無作為的な６つの塩基を含んでいるプライマーＡＳＡ２４Ｎ６を使用した。プライマーＡＳＡ２４Ｎ６は、無作為的な６つの塩基を持っているため、ｍＲＮＡのいずれの部位にでも無作為的に結合することができ、このような方法で増幅された第１鎖ｃＤＮＡの大部分は酵母遺伝子のＮ末端の一部をコードする５’部分配列を含む。５’部分配列を持つ第１鎖ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＳＭＡＲＴキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）に含まれた５’ＰＣＲプライマーとＡＳＡ２４（配列番号１７）プライマーを用いて２鎖ｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ産物は両末端にＳｆｉＩ部位を含むｃＤＮＡの５’部分切片を多数含む。この際、使用した増幅条件はキットで提示する条件（９５℃で２０秒間１回；９５℃で３０秒間、６８℃で６分間２０回）によって増幅した。増幅されたｃＤＮＡは、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）溶液で抽出した後、０．１体積の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）と２体積のエタノールを添加して沈殿する方法で回収した。ｃＤＮＡを制限酵素ＳｆｉＩで５０℃で２時間処理した後、アガロースゲルで電気泳動し、０．５〜１ｋｂサイズの断片をアガロースゲル抽出キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて回収した。回収したｃＤＮＡを、ＳｆｉＩで処理したＹＧａＩＮＶベクター（図６）と連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換させ、アンピシリン含有ＬＢ培地（１％バクトペプトン、０．５％酵母抽出液、１％ ＮａＣｌ、アンピシリン５０μｇ／ｍＬ）に塗抹した後、３７℃で一日培養した。５×１０4個のコロニーを滅菌蒸留水を用いて回収し、回収された菌体から、ＳＵＣ２遺伝子と融合されたランダムプライマー製造ｃＤＮＡを含む全体プラスミドをプラスミド抽出キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて分離した。
【００８９】
<実施例５>酵母インベルターゼが融合されたゲノム性ＤＮＡライブラリーの製造
実施例４で製造されたｃＤＮＡを用いたタンパク質分泌因子ライブラリーの製造方法は、細胞培養中にｍＲＮＡで発現される遺伝子が主に確保され、特に発現率の高い遺伝子であるほど、タンパク質融合因子として回収される可能性が高い。したがって、酵母内で発現率が非常に低いタンパク質遺伝子または全く発現されない遺伝子由来のタンパク質融合因子を得るためには、ゲノム性ＤＮＡからのライブラリー構築も必要である。図９に示すように、酵母サッカロミセスセレビシエＹ２８０５の染色体を制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分切断した後、７０℃で１０分間処理して制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを不活性化させ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰとクレノウ断片(klenow fragment)で２５℃で１時間反応させた後、アガロースゲルで０．５〜１．０ｋｂサイズのＤＮＡを回収した。ＹＧａＦ０ＩＮＶ、ＹＧａＦ１ＩＮＶおよびＹＧａＦ２ＩＮＶ（図７）をＸｈｏＩでそれぞれ切断した後、７０℃で１０分間処理して制限酵素ＸｈｏＩを不活性化させ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰとクレノウ断片で２５℃で１時間反応させた後、アガロースゲルでベクターＤＮＡをそれぞれ回収した。回収したそれぞれのベクターを部分切断されたゲノム性ＤＮＡと連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、アンピシリンの含まれたＬＢ培地（１％バクトペプトン、０．５％酵母抽出物、１％ＮａＣｌ、アンピシリン５０μｇ／ｍＬ）に塗抹した後、３７℃で一日培養した。それぞれのベクターから製造されたライブラリーＤＮＡを用いて約２×１０5細胞の形質転換体ライブラリーを確保した。全ての形質転換体を滅菌蒸留水を用いて回収し、回収された菌体から、ＳＵＣ２遺伝子と融合されたゲノム性ライブラリーＤＮＡを含む全体プラスミドをプラスミド抽出キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて分離した。
【００９０】
<実施例６>インベルターゼを分泌させるタンパク質融合因子ライブラリーの製造
実施例４および実施例５で製造されたゲノム性ライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーに存在するインベルターゼを分泌することが可能なＴＦＰライブラリーを１次的に選別するために、ライブラリーＤＮＡを酵母サッカロミセスセレビシエＹ２８０５Δｇａｌ１ΔＳＵＣ２（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ｓｕｃ２：：Ｔｃ１９０ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ｇａｌ１ ｃａｎ１）に酢酸リチウム方法(Hills et al,m Nucleic Acids Res. 19:5791(1991))で形質転換させた。Ｙ２８０５Δｇａｌ１ΔＳＵＣ２は、遺伝子欠失によってスクロースおよびガラクトースを炭素源として使用することができない。形質転換させた細胞をＵＤプレート（０．６７％アミノ酸のない酵母ナイトロジェンベース、０．７７ｇ／Ｌアミノ酸混合物、２％グルコースおよび２％寒天）とＹＰＳＧＡ培地（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％スクロース、０．３％ガラクトース、１μｇ／ｍＬアンチマイシンＡ）にそれぞれ塗抹して３０℃で４〜６日間培養した。ｃＤＮＡライブラリーから約３０００個の形質転換体を得、ゲノム性ＤＮＡライブラリーから約１０００個の形質転換体を得た。ＹＰＳＧＡ培地で成長した全ての形質転換体をＵＤ培地に移して３０℃で２日間培養した後、形成された菌体を全て回収し、ガラス玉(glass bead)を用いて細胞を破砕し、エタノールでＤＮＡを沈殿させて、プラスミドを含む全てのＤＮＡを形質転換体から分離した。分離されたＤＮＡをさらに大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、アンピリシンの含まれたＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母抽出物、１％ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍＬアンピシリン）に塗抹した後、３７℃で一日培養した。約２×１０4個の大腸菌形質転換体を滅菌蒸留水を用いて回収し、形成された全てのコロニーからプラスミド抽出キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いてプラスミドを分離し、インベルターゼを分泌させることが可能なタンパク質分泌因子ライブラリーを確保した。その結果、それぞれのインベルターゼ分泌を誘導することが可能な４０００個のＴＦＰを含むＴＦＰプールが構築された。ライブラリーから無作為的に選別されたプラスミドの核酸配列を分析した結果、分析された全てのＴＦＰが、相異なる分泌タンパク質をコードする酵母遺伝子に由来したことを確認することができた。
【００９１】
<実施例７>細胞内組み換えによって多数の目的タンパク質に適用することが可能なタンパク質融合因子ライブラリーベクターの開発
インベルターゼを分泌させることが可能な約４０００個のＴＦＰが実施例６で確保された。いずれの目的遺伝子にも容易に適用することが可能なＴＦＰライブラリーベクターを開発するために、簡単な細胞内組み換えによるクローニングシステムを構築した。まず、細胞内組み換えによってＴＦＰライブラリーとＳＵＣ２遺伝子との間でいずれの目的遺伝子でもインフレームにて連結させることが可能なＹＧａｄＶ４５（図１０）ベクターを製造した。ＹＧａｄＶ４５は、インベルターゼアミノ末端の４５個のアミノ酸が除去された不完全な形態のインベルターゼ遺伝子(defective SUC2、ｄＳＵＣ２)を含んでおり、インベルターゼ活性を持たない。また、ベクターは、細胞内組み換えによってＴＦＰライブラリーおよび目的遺伝子を簡便に挿入するために、ｄＳＵＣ２の前にＮｏｔＩと２つのＳａｌＩ認識部位、相同組み換えに使用するためのリンカーＤＮＡおよびＳｗａＩ制限酵素認識部位を含む。ＹＧａＩＮＶを鋳型とし、センスプライマーＩＮＶ４５−Ｆ（配列番号１８）および相異なるリーディングフレームを持つ３つのアンチセンスプライマーＳＵＣ−Ｘｈｏ−Ｒ（配列番号１１）およびＰｆｕ重合酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で３分間１回；９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃９０秒間の反応を２５回；７２℃で７分間１回の条件にして行ってＮ末端の欠損したインベルターゼ遺伝子切片を得た。ＮｏｔＩ−ＳａｌＩ処理されたＰＣＲ切片を、ＮｏｔＩ−ＳａｌＩ処理されたベクターＹＧａＩＮＶに挿入して（図６）、プラスミドＹＧａｄＶ４５を製造した。ＹＧａｄＶ４５でＴＦＰライブラリーを製造するために、実施例６で確保されたＴＦＰライブラリーをＳｆｉＩ制限酵素で処理した後、アガロースゲル電気泳動して０．５〜１ｋｂ ＤＮＡ断片をアガロースゲル抽出キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて回収した。回収したＤＮＡをＳｆｉＩで処理したＹＧａｄＶ４５ベクターに連結（図１０）した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、アンピシリンの含まれたＬＢ培地（１％バクトペプトン、０．５％酵母助抽出物、１％ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍＬアンピシリン）に塗抹した後、３７℃で一日培養した。約５×１０4個の大腸菌形質転換体を滅菌蒸留水を用いて回収し、回収された菌体から全体プラスミドをプラスミド抽出キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて分離した。分離されたベクターは、ｄＳＵＣ２と融合された、実施例６で選別したＴＦＰを含んでいる。したがって、これらのＴＦＰライブラリーベクターをサッカロミセスセレビシエＹ２８０５Δｇａｌ１Δｓｕｃ２（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ｓｕｃ２：：Ｔｃ１９０ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ｇａｌ１ ｃａｎ１）に形質転換させ、形質転換させた細胞をＵＤプレート（０．６７％アミノ酸のない酵母ナイトロジェンベース、０．７７ｇ／Ｌアミノ酸混合物、２％グルコースおよび２％寒天）とＹＰＳＧＡ培地（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％スクロース、０．５％ガラクトース、および２％寒天）とＹＰＳＧＡ培地（１％酵母抽出物、２％バクタペプトン、２％スクロース、０．３％ガラクトース、１μｇ／ｍＬアンチマイシンおよび２％寒天）に培養すると、数千個の形質転換体を得ることができた。したがって、ＹＰＳＧＡ培地で選別の水準に急激に減少させることができた。目的タンパク質をＴＦＰとＳＵＣ２との間にインフレームにて挿入したベクターを持つ細胞のみが生体内組み換えの後にＹＰＳＧＡ培地で成長することができた。ＴＦＰライブラリーベクターは、ＴＦＰライブラリーと不活性インベルターゼ遺伝子（ｄＳＵＣ２）との間に制限酵素ＳｗａＩ部位とリンカー配列を含んでいるため、相同組み換えによってベクターを線形化することができる。
【００９２】
<実施例８>目標タンパク質の分泌を誘導するタンパク質融合因子の自動選別
前述した方法で製造されたＴＦＰライブラリーベクターに目的タンパク質をインフレームにて連結するために、目的タンパク質遺伝子の５’末端にはリンカーＤＮＡを、３’部位には不活性インベルターゼの機能を復元させることが可能な５’インベルターゼ遺伝子断片を連結しなければならない。このような目的を達成するための方法として、２つ以上の遺伝子をＰＣＲで連結するオーバーラップエクステンション(overlap extension)方法を使用した。センスプライマーＫＲ−ｔａｒｇｅｔ-Ｆ（配列番号１９）とアンチセンスプライマーＴａｒｇｅｔ−ＩＮＶ−Ｒ（配列番号１７）を用いて、目的遺伝子を含むプラスミドから、成熟タンパク質をコードする目的遺伝子をＰＣＲ増幅させた。また、センスプライマーＫＲ−Ｉｎｖ−Ｆ（配列番号２１）とアンチセンスプライマーＩｎｖ５００−Ｒ（配列番号２２）を用いて、ＹＧａＩＮＶから、目的遺伝子の３’末端に融合されるＳＵＣ２遺伝子のＮ末端の一部をＰＣＲで増幅させた（図６）。ＰＣＲは、Ｐｆｕ重合酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）を用いて９４℃で３分間１回；９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で９０秒間の反応を２５回；７２℃で７分間１回の条件にして行った。そして、センスプライマーＬＮＫ４０（配列番号２３）とアンチセンスプライマーＩｎｖ５００−Ｒ（配列番号２２）を用いて、前記ＰＣＲで増幅された２つのＤＮＡ断片に対してＰＣＲを行った。前記の方法で得られた挿入断片は、５’末端に４０個のヌクレオチドリンカーＤＮＡが連結され、３’末端にＫｅｘ２ｐ認識部位（Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号２１４））をコードする５００ｂｐ ＤＮＡ、およびインベルターゼＮ末端の一部が連結されるようにした。実施例７で製作したＴＦＰライブラリーベクターをＳｗａＩで処理して線形化されたＴＦＰライブラリーベクターと、前記で製造した挿入断片とを１：２の割合で混ぜた後、酵母サッカロミセスセレビシエＹ２８０５Δｇａｌ１Δｓｕｃ２（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ｓｕｃ２：：Ｔｃ１９０ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ｇａｌ１ ｃａｎ１）に形質転換させた後（図１１）、形質転換された細胞をＹＰＳＧＡ培地（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％スクロース、０．３％ガラクトース、１μｇ／ｍＬアンチマイシンＡおよび２％寒天）にそれぞれ塗抹し、５日間培養した。適切なＴＦＰを含むベクターに目的遺伝子が細胞内組み換えによってインフレームにて連結された場合にのみ、ＹＰＳＧＡ培地で細胞成長が行われるので、このような方法を用いて容易に目標タンパク質の分泌を誘導する最適のＴＦＰを選別することができた。
【００９３】
<実施例９>リパーゼとインベルターゼを二重レポーターとして用いたタンパク質融合因子の自動選別
実施例８でのようにインベルターゼのみを自動選別レポーターとして用いる場合には、実施例２のようにヒトインターロイキン−２が３’末端に融合されているインベルターゼの分泌を完璧に遮断する場合には、最適のタンパク質融合因子の選定のための自動選別レポーターとして適する。約数十個のコロニーがスクロース培地で成長することができるため、ＴＦＰライブラリーから最適のＴＦＰ選別することが非常に容易である。ところが、幾つかの目的タンパク質の場合には、活性の弱いＴＦＰと連結されても、インベルターゼを細胞外に分泌する。インベルターゼの分泌を完璧に遮断しなければ、スクロース培地で成長することができるので、結果的にスクロースを用いたスクリーニングプレートに現れた形質転換体の数が多くなるという問題がある。形質転換体の数が多くなる場合、各菌体を全て培養し、培地に分泌されたタンパク質の量を分析し、高分泌菌体をさらに選択しなければならない煩わしい過程が要求される。したがって、かかる問題を解決するために、本発明者らは、形質転換プレートで直接分泌活性を比較し得るように形質転換プレート上でタンパク質の分泌度合いをｈａｌｏの大きさで区分することが可能なリパーゼを用いるシステムを開発した。この際、リパーゼとインベルターゼとが融合された形態の二重レポーターを使用することにより、インベルターゼによって、スクロース培地で成長する菌体を選別して融合タンパク質の分泌有無を判断することができ、また、リパーゼの活性によって、トリブチリン(tributyrin)を含有したスクリーニングプレートで現れたｈａｌｏの大きさを用いて融合タンパク質の分泌度合いを視覚的に区分することができるようにした。まず、リパーゼをコードする遺伝子（ＣａｌＢ、カンジタアンタルティカ(candida antartica)）由来のリパーゼＢをインベルターゼの５’末端にインフレームにて連結した。このような二重レポーターシステムを用いて、トリブチリンを含有するＹＰＳＧＡ培地でインベルターゼとリパーゼ活性を同時に持つ形質転換体を選別することができる。タンパク質を高分泌するコロニーは、コロニーの周辺に形成されたｈａｌｏの大きさで簡単に決定できる。図１２に示すように、二重レポーターシステムは、３段階のＰＣＲによって製造される。まず、ＣａｌＢセンスプライマーＫＲ−ＣａｌＢ−Ｆ（配列番号２４）とアンチセンスプライマーＣａｌＢ−Ｉｎｖ−Ｒ（配列番号２５）を用いて、突然変異ＣａｌＢ遺伝子を含むプラスミドｐＬＧＫ−Ｌｉｐ１４＊から、ＣａｌＢを含む１ｋｂ ＰＣＲ断片を増幅した(SY Kim, Ph. D. thesis, Yonsei University, Korea, 2001)。また、センスプライマーＫＲ−Ｉｎｖ−Ｆ（配列番号２１）およびアンチセンスプライマーＩｎｖ５００−Ｒ（配列番号２２）を用いて、ＹＧａＩＮＶ（図６）から、ＳＵＣ２遺伝子の５’断片を含む０．５ｋｂ ＰＣＲ断片をそれぞれ増幅させた。ＰＣＲは、Ｐｆｕ重合酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）を用いて９４℃で３分間１回；９４℃で３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃で９０秒間の反応を２５回；７２℃で７分間１回の条件にして行った。そして、センスプライマーＫＲ−ＣａＩＢ−Ｆ（配列番号２４）とアンチセンスプライマーＩｎｖ５００−Ｒ（配列番号２２）を用いて、��記一番目のＰＣＲで増幅された２つのＤＮＡ断片に対して２番目のＰＣＲを行った。また、プライマーＫＲ−Ｔａｒｇｅｔ−Ｆ（配列番号１９）およびＴａｒｇｅｔ−ＣａｌＢ−Ｒ（配列番号２６）を用いて、実施例８に記述した目的遺伝子を含むプラスミドから目的遺伝子をそれぞれ増幅させた。そして、センスプライマーＬＮＫ４０（配列番号２３）とアンチセンスプライマーＩｎｖ５００−Ｒ（配列番号２２）を用いて、目的遺伝子およびＳＵＣ２遺伝子断片が融合されたＣａｌＢの混合物を鋳型として３番目のＰＣＲを行った。前記方法によって得られた挿入断片は、４０個のヌクレオチドリンカーＤＮＡ、目的遺伝子、Ｋｅｘ２ｐ切断部位（Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号２１４））、ＣａｌＢ、Ｋｅｘ２ｐ切断部位（Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号２１４））、および５００ｂｐのインベルターゼ遺伝子５’部位の順序で連結されている。実施例７で製作したＴＦＰライブラリーベクターをＳＷａＩで処理して線形化されたライブラリーと、前記で製造した挿入断片とを１：２の割合で混ぜた後、酵母サッカロミセスセレビシエＹ２８０５Δｇａｌ１Δｓｕｃ２（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ｓｕｃ２：：Ｔｃ１９０ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ｇａｌ１ ｃａｎ１）に形質転換させた後、インベルターゼ活性を持つ形質転換細胞を選別するためにＹＰＳＧＡ培地（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％スクロース、０．３％ガラクトース、１μｇ／ｍＬアンチマイシンＡおよび２％寒天）に塗抹した。インベルターゼおよびリパーゼ活性を全て持つ形質転換細胞を選別するためには、ＹＰＳＧＡＴ培地（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％スクロース、０．３％ガラクトース、１μｇ／ｍＬアンチマイシンＡ、１％トリブチリンおよび２％寒天）にそれぞれ塗抹して、３０℃で５日間培養した。目的タンパク質を分泌するコロニーは、ＹＰＧＳＡおよびＹＰＧＳＡＴプレートの全てで成長し、リパーゼ活性を示した。また、予想したように、コロニー毎に相異なる大きさのｈａｌｏを形成した。このような透明ｈａｌｏの大きさはリパーゼの分泌度合いと比例するため、目的タンパク質の分泌能に優れたコロニーを形質転換プレートから容易に選別することができた（図１３）。
【００９４】
<実施例１０>タンパク質融合因子ライブラリーからヒトインターロイキン−２分泌生産のために選別された新規タンパク質融合因子
本発明の方法を用いて目的タンパク質に対する最適のＴＦＰ選別可能性を確認するために、一例として、難分泌タンパク質であるヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）を対象としてＩＬ−２を分泌生産することが可能なタンパク質融合因子を発掘した。実施例８の方法通りにＰＣＲを行ってヒトＩＬ２遺伝子および５００ｂｐのＳＵＣ２ Ｎ末端断片を含む挿入断片を増幅させた（図１１）。すなわち、ＰＣＲは、センスプライマーＫＲ−ＩＬ２−Ｆ（配列番号２７）およびアンチセンスプライマーＩＬ２−ＩＮＶ−Ｒ（配列番号２８）を用いてｐＴ７−ｈＩＬ−２（ＪＫ Ｊｕｎｇ、韓国生命工学研究院）を鋳型として行った。また、センスプライマーＫＲ−Ｉｎｖ−Ｆ（配列番号２１）とアンチセンスプライマーＩｎｖ５００−Ｒ（配列番号２２）を用いて、ＹＧａＩＮＶから、ＩＬ２遺伝子の３’末端に融合されるＳＵＣ２ Ｎ末端断片をそれぞれＰＣＲ増幅させた（図６）。そして、センスプライマーＬＮＫ４０（配列番号２３）とアンチセンスプライマーＩｎｖ５００−Ｒ（配列番号２２）を用いて、前記ＰＣＲで増幅された２つのＤＮＡ断片に対して２番目のＰＣＲを行った。前述した方法によって得られた挿入断片は、Ｋｅｘ２ｐ認識配列（Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号２１４））を含む４０個のヌクレオチドリンカーＤＮＡ、ＩＬ２、追加的なＫｅｘ２ｐ認識配列、インベルターゼのＮ末端断片が順次連結されている。前記挿入断片を、実施例７で製作したＳｗａＩで処理されたＴＦＰライブラリーベクターと共に酵母サッカロミセスセレビシエＹ２８０５Δｇａｌ１Δｓｕｃ２（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ｓｕｃ２：：Ｔｃ１９０ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ｇａｌ１ ｃａｎ１）に共同形質転換させた後（図１１）、形質転換された細胞をＵＤ培地（０．６７％アミノ酸のない酵母ナイトロジェンベース、０．７７ｇ／Ｌアミノ酸混合物、２％グルコースおよび２％寒天）とＹＰＳＧＡ培地（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％スクロース、０．３％ガラクトース、１μｇ／ｍＬアンチマイシンＡおよび２％寒天）に塗抹して、３０℃で５日間培養した。ＵＤ培地では約２×１０4個の形質転換体が形成されたが、ＹＰＳＧＡ培地では約１００余個の形質転換体が形成された。ＹＰＳＧＡ培地で無作為的に選別した３０個の形質転換体をＹＰＤ培地で培養して全体ＤＮＡを分離し、これを大腸菌ＤＨ５αに再び形質転換し、形質転換された大腸菌をアンピシリンの含まれたＬＢ培地（１％バクトペプトン、０．５％酵母抽出液、１％ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍＬアンピシリン）に塗抹した後、３７℃で一日培養した。各大腸菌形質転換体からプラスミドをプラスミド抽出キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて分離した。各ＴＦＰの配列を分析するために、ＧＡＬ１０プロモーターに結合するＧＡＬ１００−Ｆ（配列番号１２）プライマーを使用した。塩基配列は、Ｇｅｎｏｔｅｃｈ社（大田、韓国）の自動塩基配列分析器（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７；ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、米国）を用いて分析した。塩基配列はサッカロミセスゲノムデータベース( HYPERLINK "http://www.yeastgenome.org" www.yeastgenome.org)のＢＬＡＳＴ検索によって分析した。その結果、ＹＰＳＧＡ培地で生長した３０個のコロニーから９個の新規ＴＦＰおよび公知のＴＦＰ（ＴＦＰ−３）（ＷＯ２００５／０６８６５８）が確認された。分離されたプラスミドはそれぞれｐＹＨＴＳ−ＴＦＰ９、ｐＹＨＴＳ−ＴＦＰ１３、ｐＹＨＴＳ−ＴＦＰ１７、ｐＹＨＴＳ−ＴＦＰ１８、ｐＹＨＴＳ−ＴＦＰ１９、ｐＹＨＴＳ−ＴＦＰ２０、ｐＹＨＴＳ−ＴＦＰ２１、ｐＹＨＴＳ−ＴＦＰ２５、およびｐＹＨＴＳ−ＴＦＰ２７と命名し、各プラスミドに含有された９個の新規ＴＦＰは表１に示す。
【００９５】
【表１】
2009501020.tif 000003
【００９６】
<実施例１１>選別されたタンパク質融合因子を用いたヒトインターロイキン−２の分泌確認
選別されたタンパク質融合因子を用いて酵母においてヒトインターロイキン−２の分泌活性を直接確認するために、ＰＣＲを用いて、各ＴＦＰとＩＬ２とが融合された遺伝子を増幅し、各ＴＦＰベクターの５’−ＵＴＲおよびＳＵＣ２遺伝子が除去されたベクターを製作した（図１４）。９個のセンスプライマーであるＢａｍＨ−ＹＧＲ−Ｆ（配列番号４７）、ＢａｍＨ−ＳＩＭ−Ｆ（配列番号４８）、ＢａｍＨ−ＹＮＬ−Ｆ（配列番号４９）、ＢａｍＨ−ＥＣＭ−Ｆ（配列番号５０）、ＢａｍＨ−ＡＴＧ−Ｆ（配列番号５１）、ＢａｍＨ−ＧＡＳ−Ｆ（配列番号５２）、ＢａｍＨ−ＹＯＲ−Ｆ（配列番号５３）、ＢａｍＨ−ＯＳＴ−Ｆ（配列番号５４）、ＢａｍＨ−ＵＴＨ−Ｆ（配列番号５５）と共通のアンチセスプライマーであるＩＬ２−ＴＧＡ−Ｒ（配列番号５６）を用いてプラスミドｐＹＨＴＳ−ＴＦＰ９、ｐＹＨＴＳ−ＴＦＰ１３、ｐＹＨＴＳ−ＴＦＰ１７、ｐＹＨＴＳ−ＴＦＰ１８、ｐＹＨＴＳ−ＴＦＰ１９、ｐＹＨＴＳ−ＴＦＰ２０、ｐＹＨＴＳ−ＴＦＰ２１、ｐＹＨＴＳ−ＴＦＰ２５、およびｐＹＨＴＳ−ＴＦＰ２７からそれぞれＰＣＲを行った。９個のＰＣＲ増幅断片をそれぞれＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで処理し、アガロースゲル電気泳動を行った。また、センスプライマーＳａｃ−ＧＡＬ−Ｆ（配列番号５７）およびアンチセンスプライマーＧＡＬ−ＢａｍＨ−Ｒ（配列番号５８）を用いてＹＥＧα−ＨＩＲ５２５からＰＣＲを行ってＧＡＬプロモーターを増幅した(Sohn et al., Process Biochem. 30:653(1995))。ＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ処理されたＧＡＬプロモーターおよびＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ処理された９個の断片をＳａｃＩ−Ｓａｌ処理されたＹＥＧα−ＨＩＲ５２５に共に連結させ、その結果得られたプラスミドをそれぞれｐＹＧＴ９−ＩＬ２（図１５Ａ）、ｐＹＧＴ１３−ＩＬ２（図１５Ｂ）、ｐＹＧＴ１７−ＩＬ２（図１５Ｃ）、ｐＹＧＴ１８−ＩＬ２（図１６Ａ）、ｐＹＧＴ１９−ＩＬ２（図１６Ｂ）、ｐＹＧＴ２０−ＩＬ２（図１６Ｃ）、ｐＹＧＴ２１−ＩＬ２（図１７Ａ）、ｐＹＧＴ２５−ＩＬ２（図１７Ｂ）、およびｐＹＧＴ２７−ＩＬ２（図１７Ｃ）と命名した。ヒトＩＬ２発現ベクターであるｐＹＧＴ９−ＩＬ２（大腸菌ＤＨ５α／ｐＹＧＴ９−ＩＬ２、図１５Ａ）およびｐＹＧＴ１７−ＩＬ２（大腸菌ＤＨ５α／ｐＹＧＴ１７−ＩＬ２、図１５Ｃ）は、それぞれ国際寄託機関である韓国大田市儒城区魚慇洞５２番地所在のＫＣＴＣ(Korean Collection for Type Cultures)に２００５年７月２１日付でそれぞれ受託番号ＫＣＴＣ１０８２８ＢＰおよびＫＣＴＣ１０８２９ＢＰで寄託した。製造された各ベクターは、塩基配列分析によってＴＦＰおよびＩＬ−２遺伝子がインフレームにて適切に連結されたことを確認し、それぞれをサッカロミセスセレビシエＹ２８０５（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ＳＵＣ２ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ＧＡＬ１ ｃａｎ１）に形質転換させ、形質転換された細胞をＵＤ培地（０．６７％アミノ酸のない酵母ナイトロジェンベース、０．７７ｇ／Ｌのアミノ酸混合物、２％グルコースおよび２％寒天）に塗抹して、３０℃で３日培養した。各形質転換体の単一コロニーをＹＰＤＧ培地（１％酵母抽出液、２％バクトペプトン、１％グルコースおよび１％ガラクトース）に接種し、３０℃で４０時���培養した。培養した上清液（０．６ｍＬ）に最終濃度が４０％となるようにアセトンを添加した。−２０℃で２時間放置した後、タンパク質を１０，０００×ｇで１５分間遠心分離した。凍結乾燥したペレットを１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）に再び懸濁させ、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。ゲルをゲル染色試薬（ＰｈａｓｔＧｅｌ Ｂｌｕｅ Ｒ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、米国）で染色した。その結果、図１８に示すように、ヒトインターロイキン−２の分泌度合いは、ＴＦＰの種類によって相当な差異を示したが、いずれもヒトインターロイキン−２を培養培地に分泌することができた。ＴＦＰ１−ヒトＩＬ２遺伝子を含むプラスミドｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−４（ＷＯ２００５／０６８６５８）が対照群として使用された。ＴＦＰ９、１３、２１および２７はヒトＩＬ２に非常に有用に使用できることが分かった（図１８）。
【００９７】
<実施例１２>タンパク質融合因子ライブラリーからヒトインターロイキン−３２分泌のために選別された新規のタンパク質融合因子
本発明の方法を用いて目標タンパク質に対する最適のＴＦＰを確認するために、一例として、難分泌タンパク質である新規のヒトサイトカインとしてのインターロイキン−３２α（ＩＬ−３２α）(Kim et al., Immunity 22:131, 2005)を対象としてＩＬ−３２αを分泌生産することが可能なタンパク質融合因子を発掘した。実施例８の方法通りにＰＣＲを行ってヒトＩＬ−３２α遺伝子および５００ｂｐのＳＵＣ２Ｎ末端断片を含む挿入断片を増幅した（図１１）。すなわち、ＰＣＲは、センスプライマーＫＲ−ＩＬ３２α−Ｆ（配列番号５９）およびアンチセンスプライマーＩＬ３２α−ＩＮＶ−Ｒ（配列番号６０）を用いてｐＰｒｏＥｘＨＴａ−ＩＬ３２α（ＤＹ Ｙｏｏｎ、建国大学校）を鋳型として行った。また、センスプライマーＫＲ−Ｉｎｖ−Ｆ（配列番号２１）とアンチセンスプライマーＩｎｖ５００−Ｒ（配列番号２２）を用いて、ＹＧａＩＮＶから、ＩＬ２遺伝子の３’末端に融合されたＳＵＣ２Ｎ末端断片をそれぞれＰＣＲ増幅させた（図６）。そして、センスプライマーＬＮＫ４０（配列番号２３）とアンチセンスプライマーＩｎｖ５００−Ｒ（配列番号２２）を用いて、前記ＰＣＲで増幅された２つのＤＮＡ断片に対して２番目のＰＣＲを行った。前述した方法によって得られた挿入断片は、Ｋｅｘ２ｐ認識配列（Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号２１４））を含む４０個のヌクレオチドリンカーＤＮＡ、ＩＬ−３２α、追加的なＫｅｘ２ｐ認識配列、インベルターゼのＮ末端断片が順次連結されている。前記挿入断片を、実施例７で製作したＳｗａＩで処理されたＴＦＰライブラリーベクターと共に酵母サッカロミセスセレビシエＹ８０５Δｇａｌ１Δｓｕｃ２（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ｓｕｃ２：：Ｔｃ１９０ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ｇａｌ１ ｃａｎ１）に同時形質転換させた後（図１１）、形質転換された細胞をＵＤ培地（０．６７％アミノ酸のない酵母ナイトロジェンベース、０．７７ｇ／Ｌアミノ酸混合物、２％グルコースおよび２％寒天）とＹＰＳＧＡ培地（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％スクロース、０．３％ガラクトース、１μｇ／ｍＬアンイマイシンＡおよび２％寒天）に塗抹し、３０℃で５日間培養した。ＵＤ培地では約２×１０4個の形質転換体が形成されたが、ＹＰＳＧＡ培地では約２５０余個の形質転換体が形成された。ＹＰＳＧＡ培地で無作為的に選別した３８個の形質転換体をＹＰＤＧ培地（１％酵母抽出液、２％バクトペプトン、１％グルコースおよび１％ガラクトース）にそれぞれ接種し、３０℃で４０時間培養した。培養した上清液（０．６ｍＬ）に最終濃度が４０％となるようにアセトンを添加した。−２０℃で２時間放置した後、タンパク質を１０，０００×ｇで１５分間遠心分離した。ペレットを凍結乾燥させた後、１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）に再び懸濁し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った（図１９）。形質転換体の大部分は約２０ｋＤａのタンパク質バンドでヒトＩＬ−３２αを分泌することができた。そのうち、ＩＬ−３２α分泌能に優れた１７個の形質転換体を選別し、挿入されているＴＦＰの塩基配列を分析した。このために、各形質転換体をＹＰＤ培地で培養し、全体ＤＮＡを分離し、これを大腸菌ＤＨ５αに���び形質転換させた。形質転換された大腸菌は、アンピシリンの含まれたＬＢ培地（１％バクトペプトン、０．５％酵母抽出液、１％ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍＬアンピシリン）に塗抹した後、３７℃で一日培養した。各大腸菌形質転換体からプラスミドをプラスミド抽出キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて分離した。各プラスミド配列を分析するために、ＧＡＬ１０プロモーターに結合するＧＡＬ１００−Ｆ（配列番号１２）プライマーを使用した。塩基配列はＧｅｎｏｔｅｃｈ社（大田、韓国）の自動塩基配列分析器（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７；ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、米国）を用いて分析した。塩基配列はサッカロミセスゲノムデータベース( HYPERLINK "http://www.yeastgenome.org" www.yeastgenome.org)のＢＬＡＳＴ検索によって分析した。その結果、１７種の選別された酵母菌株から分離されたプラスミドから９個の新規ＴＦＰが確認された。分離されたプラスミドは、それぞれｐＹＨＴＳ−ＩＬ３２−ＴＦＰ３、ｐＹＨＴＳ−ＩＬ３２−ＴＦＰ１１、ｐＹＨＴＳ−ＩＬ３２−ＴＦＰ１３、ｐＹＨＴＳ−ＩＬ３２−ＴＦＰ２１、ｐＹＨＴＳ−ＩＬ３２−ＴＦＰ２２、ｐＹＨＴＳ−ＩＬ３２−ＴＦＰ２５、ｐＹＨＴＳ−ＩＬ３２−ＴＦＰ２９、ｐＹＨＴＳ−ＩＬ３２−ＴＦＰ３４、およびｐＹＨＴＳ−ＩＬ３２−ＴＦＰ３８と命名した。このうち、ＴＦＰ３、ＴＦＰ１３、ＴＦＰ２１およびＴＦＰ２５はヒトＩＬ２（ＷＯ２００５／０６８６５８）に対する最適のＴＦＰとして既に確保されたものであり、実施例１０（表１）に示されている。ＩＬ３２αに対する５個の新規ＴＦＰを表２に示した。
【００９８】
【表２】
2009501020.tif 000004
【００９９】
<実施例１３>選別されたタンパク質融合因子を用いたヒトインターロイキン−３２αの分泌確認
選別されたタンパク質融合因子を用いて酵母においてヒトインターロイキン−３２αの分泌活性を直接確認するために、ＰＣＲを用いて、実施例１２で選別したプラスミドから各ＴＦＰの５’−ＵＴＲおよびＳＵＣ２を除去した。６個のセンスプライマーであるＢａｍＨ−ＣＩＳ−Ｆ（配列番号７１）、ＢａｍＨ−ＳＥＤ−Ｆ（配列番号７２）、ＢａｍＨ−ＳＩＭ−Ｆ（配列番号７３）、ＢａｍＨ−ＹＯＲ２４７Ｗ−Ｆ（配列番号７４）、ＢａｍＨ−ＨＳＰ−Ｆ（配列番号７５）、ＢａｍＨ−ＯＳＴ−Ｆ（配列番号７６）、および共通のアンチセスプライマーであるＩＬ３２−ＴＧＡ−Ｒ（配列番号７７）を用いてプラスミドｐＹＨＴＳ−ＩＬ３２−ＴＦＰ３、ｐＹＨＴＳ−ＩＬ３２−ＴＦＰ１１、ｐＹＨＴＳ−ＩＬ３２−ＴＦＰ１３、ｐＹＨＴＳ−ＩＬ３２−ＴＦＰ２１、ｐＹＨＴＳ−ＩＬ３２−ＴＦＰ２２、およびｐＹＨＴＳ−ＩＬ３２−ＴＦＰ２５からそれぞれＰＣＲを行った。６個のＰＣＲ増幅断片にＢａｍＨＩおよびＳａｌＩを処理し、アガロースゲル電気泳動を行った。また、センスプライマーＳａｃ−ＧＡＬ−Ｆ（配列番号５７）およびアンチセンスプライマーＧＡＬ−ＢａｍＨ−Ｒ（配列番号５８）を用いてＹＥＧα−ＨＩＲ５２５からＰＣＲを行ってＧＡＬプロモーターを増幅した(Sohn et al., Proess Biochem. 30:653(1995))。ＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ処理されたＧＡＬプロモーターおよびＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ処理された６個の断片をＳａｃＩ−ＳａｌＩ処理されたＹＥＧα−ＨＩＲ５２５に共に連結させ、その結果得られたプラスミドをそれぞれｐＹＧＴ３−ＩＬ３２α、ｐＹＧＴ１１−ＩＬ３２α、ｐＹＧＴ１３−ＩＬ３２α、ｐＹＧＴ２１−ＩＬ３２α、ｐＹＧＴ２２−ＩＬ３２α、およびｐＹＧＴ２５−ＩＬ３２αと命名した。製造された各ベクターは、塩基配列分析によってＴＦＰおよびＩＬ３２α遺伝子がインフレームにて適切に連結されたことを確認し、それぞれをサッカロミセスセレビシエＹ２８０５（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ＳＵＣ２ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ＧＡＬ１ ｃａｎ１）に形質転換させ、形質転換された細胞をＵＤ培地（０．６７％アミノ酸のない酵母ナイトロジェンベース、０．７７ｇ／Ｌのアミノ酸混合物、２％グルコースおよび２％寒天）に塗抹し、３０℃で３日培養した。各形質転換体の単一コロニーをＹＰＤＧ培地（１％酵母抽出液、２％バクトペプトン、１％グルコースおよび１％ガラクトース）に接種し、３０℃で４０時間培養した。培養上清液（０．６ｍＬ）に最終濃度が４０％となるようにアセトンを添加した。これを−２０℃で２時間放置した後、タンパク質を１０，０００×ｇで１５分間遠心分離した。ペレットを凍結乾燥させた後、１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）に再び懸濁させ、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った（図２０）。ゲルはゲル染色試薬（ＰｈａｓｔＧｅｌ Ｂｌｕｅ Ｒ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、米国）で染色した。分泌されたＩＬ３２αは、ＩＬ３２αの単一クローン抗体を用いたウエストンブロットによって詳細に分析した。ＣＡＰバッファ（２．２ｇ ｐｅｒ ｌｉｔｅｒ ＣＡＰＳ、ＭｅＯＨ１０％、ＮａＯＨで調節したｐＨ１１）を含むｓｍａｌｌ ｔａｎｋ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｋｉｔ（Ｈｏｅｆｅｒ、米国）を用い���、タンパク質を３００ｍＡで９０分間ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）に移した後、ヒトＩＬ３２α抗体で探知した（ＤＹ Ｙｏｏｎ、建国大学校）。タンパク質を含むＰＶＤＦ膜を、５％脱脂乳を含有するＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、２ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、ＨＣｌで調節したｐＨ７．４）内で４℃で一晩放置した。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し、３４％脱脂乳を含有するＰＢＳで希釈した１次抗体と共に常温で１時間培養した。膜を３回洗浄した後、３％脱脂乳を含有するＰＢＳで希釈した抗マウス２次抗体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，米国）と共に常温で１時間追加培養した。さらに膜を３回洗浄した後、Ｓｉｇｍａ Ｆａｓｔ ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，米国）を用いて発色反応した。その結果、図２０に示すように、選別された全てのＴＦＰがヒトＩＬ３２αを培養培地に分泌することができることを確認した。これらの中でもＴＦＰ３、１３、２１および２２がヒトＩＬ３２αの分泌に適することが分かった。
【０１００】
<実施例１４>流加培養式発酵によるヒトＩＬ３２αの生産
ヒトＩＬ３２αの分泌生産性を確認するために、ｐＹＧＴ３−ＩＬ３２αで形質転換させた組み換え酵母菌株を５Ｌの発酵槽で流加培養した。２００ｍＬの種培養を１Ｌフラスコの最小培地（０．６７％アミノ酸のない酵母ナイトロジェンベース、０．５％カザミノ酸および２％グルコース）で行い、これを初期発酵培地（４％酵母抽出液、１％ペプトンおよび２％グルコース）に接種して細胞濃度がＯＤ６００を基準として約１５になるまで培養した後、細胞生長速度に応じて流加培養式培地（１５％酵母抽出液、３０％グルコース）を追加供給した。細胞濃度がＯＤ６００を基準として約１３０に到達した後、ガラクトース（３０％ガラスクトース）を細胞生長速度に応じて適切な割合で供給した。培養７２時間経過後、細胞濃度がＯＤ６００を基準として約２２０に到達した（図２１Ａ）。培養時間別に取った試料約１５μＬの培地をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析し、分泌されたタンパク質の量を評価した。ＢＣＡタンパク質分析試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）およびデンシトメータ(Densitometer)を用いて測定した結果、３００ｍｇ／Ｌ以上のｈＩＬ３２αが培地に分泌されることを確認した。
【０１０１】
<実施例１５>酵母ゲノムデータのＢＡＬＳＴ検索による新規ＴＦＰの発掘
発掘されたＴＦＰ配列を基にして酵母ゲノムから新規ＴＦＰを選別するために、選別された１８個（ＷＯ２００５／０６８６５８から４個、実施例１０から９個、および実施例１２から５個）のＴＦＰのｐｒｅ−分泌シグナルのアミノ酸配列をサッカロミセスゲノムデータベースのＢＬＡＳＴ検索のためのＱｕｅｒｙ配列として使用した(www.yeastgenome.org)。ＢＡＬＳＴＰ検索において低い予想境界値（１００または１０００）を用いて、７０％以上の相同性を有する数百個のＯＲＦを確認した。そのうち、Ｎ末端に近い配列相同性を有するＯＲＦを選別し、ＳｉｇｎａｌＰ(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/)分析によって、選別シグナルを持つＯＲＦを選別した。その結果、１８個のＯＲＦをＴＦＰ候補として選別した。１８個の選別されたＯＲＦは、ＹＧＲ２７９Ｃ（ＳＣＷ４、細胞壁タンパク質）、ＹＬＲ０３７Ｃ（ＤＡＮ２、細胞壁マンノタンパク質）、ＹＬＲ１１０Ｃ（ＣＣＷ１２、細胞壁タンパク質）、ＹＯＲ３８３Ｃ（ＦＩＴ３、細胞壁マンノタンパク質）、ＹＩＬ０１１Ｗ（ＴＩＲ３、細胞壁マンノタンパク質）、ＹＨＲ２１４Ｗ（潜在的な膜タンパク質）、ＹＮＬ１６０Ｗ（ＹＧＰｌ、細胞壁関連分泌糖タンパク質）、ＹＧＲ２９６Ｃ−Ａ（ｄｕｂｉｏｕｓオープンリーディングフレーム）、ＹＯＬ１５４Ｗ（ＺＰＳｌ、潜在的なＧＰＩアンカータンパク質）、ＹＰＬ１８７Ｗ（ＭＦα、交配フェロモンアルファ因子）、ＹＨＲ２１４Ｗ（潜在的な膜タンパク質）、ＹＫＲ０１３Ｗ（ＰＲＹ２、機能が知られていないタンパク質）、ＹＨＲ１３９Ｃ（ＳＰＳ１００、胞子壁突然変異に必要なタンパク質）、ＹＩＬ１６９Ｃ（機能が知られていない潜在的なタンパク質）、ＹＯＬ１５５Ｃ（特定されていないＯＲＦ）、ＹＭＲ３２５Ｗ（ＰＡＵ１９、仮想タンパク質）、ＹＤＲ１３４Ｗ（仮想タンパク質）およびＹＬＲ３００Ｗ（ＥＸＧｌ、細胞壁エキソ−１，３−β−グルカナーゼ）である。各ＯＲＦは、ＰＣＲプライマー対である、ＹＧＲ２７９Ｃに対するＹＧＲ２７９Ｃ−Ｆ（配列番号９２）およびＹＧＲ２７９Ｃ−Ｒ（配列番号９３）、ＹＬＲ０３７Ｃに対するＹＬＲ０３７Ｃ−Ｆ（配列番号９４）およびＹＬＲ０３７Ｃ−Ｒ（配列番号９５）、ＹＬＲ１１０Ｃに対するＹＬＲ１１０Ｃ−Ｆ（配列番号９６）およびＹＬＲ１１０Ｃ−Ｒ（配列番号９７）、ＹＯＲ３８３Ｃに対するＹＯＲ３８３Ｃ−Ｆ（配列番号９８）およびＹＯＲ３８３Ｃ−Ｒ（配列番号９９）、ＹＩＬ０１１Ｗに対するＹＩＬ０１１Ｗ−Ｆ（配列番号１００）およびＹＩＬ０１１Ｗ−Ｒ（配列番号１０１）、ＹＨＲ２１４Ｗに対するＹＨＲ２１４Ｗ−Ｆ（配列番号１０２）およびＹＨＲ２１４Ｗ−Ｒ（配列番号１０３）、ＹＮＬ１６０Ｗに対するＹＮＬ１６０Ｗ−Ｆ（配列番号１０４）およびＹＮＬ１６０Ｗ−Ｒ（配列番号１０５）、ＹＧＲ２９６Ｃ−Ａに対するＹＧＲ２９６Ｃ−Ａ−Ｆ（配列番号１０６）およびＹＧＲ２９６Ｃ−Ａ−Ｒ（配列番号１０７）、ＹＯＬ１５４Ｗに対するＹＯＬ１５４Ｗ−Ｆ（配列番号１０８）およびＹＯＬ１５４Ｗ−Ｒ（配列番号１０９）、ＹＰＬ１８７Ｗに対するＹＰＬ１８７Ｗ−Ｆ（配列番号１１０）およびＹＰＬ１８７Ｗ−Ｒ（配列番号１１１）、ＹＨＲ２１４Ｗに対するＹＨＲ２１４Ｗ−Ｆ（配列番号１１２）およびＹＨＲ２１４Ｗ−Ｒ（配列番号１１３）、ＹＫＲ０１３Ｗに対するＹＫＲ０１３Ｗ−Ｆ（配列番号１１４）およびＹＫＲ０１３Ｗ−Ｒ（配列番号１１５）、ＹＨＲ１３９Ｃに対するＹＨＲ１３９Ｃ−Ｆ（配列番号１１６）およびＹＨＲ１３９Ｃ−Ｒ（配列番号１１７）、ＹＩＬ１６９Ｃに対するＹＩＬ１６９Ｃ−Ｆ（配列番号１１８）およびＹＩＬ１６９Ｃ−Ｒ（配列番号１１９)、ＹＯＬ１５５Ｃに対するＹＯＬ１５５Ｃ−Ｆ（配列番号１２０）およびＹＯＬ１５５Ｃ−Ｒ（配列番号１２１）、ＹＭＲ３２５Ｗに対するＹＭＲ３２５Ｗ−Ｆ（配列番号１２２）およびＹＭＲ３２５Ｗ−Ｒ（配列番号１２３）、ＹＤＲ１３４Ｗに対するＹＤＲ１３４Ｗ−Ｆ（配列番号１２４）およびＹＤＲ１３４Ｗ−Ｒ（配列番号１２５）、およびＹＬＲ３００Ｗに対するＹＬＲ３００Ｗ−Ｆ（配列番号１２６）およびＹＬＲ３００Ｗ−Ｒ（配列番号１２７）をそれぞれ用いてサッカロミセスセレビシエＹ２８０５（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ＳＵＣ２ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ＧＡＬ１ ｃａｎ１）から増幅した。ＰＣＲは、Ｐｆｕ重合酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）を使用し、９４℃で３分間１回；９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間の反応を２５回；７２℃で７分間１回の条件にして行った。各増幅されたＰＣＲ断片は、Ｇｅｎｏｔｅｃｈ社（大田、韓国）の自動塩基配列分析器（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７；ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、米国）を用いて分析した。１８個のＯＲＦからＴＦＰを発掘するために、図２４に示すように、ＰＣＲ断片混合物の単方向欠失を行った後、これをＹＧａｄＶ４５ベクターに導入した（図２４）。単一鎖鋳型は、プライマーＳｆｉＡ−Ｆ（配列番号１２８）を用いて、１８ＯＲＦからなる鋳型から単方向ＰＣＲによって得た。ＰＣＲは、ＥｘＴａｑ（Ｔａｋａｒａ Ｋｏｒｅａ、韓国）を使用し、９４℃で３分間１回；９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間の反応を２５回；７２℃で７分間１回の条件にして行った。ＰＣＲ精製キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、単一鎖ＤＮＡを含むＰＣＲ産物を精製し、大腸菌ＤＮＡ重合酵素Ｉ（ＮＥＢ、Ｅｎｇｌａｎｄ）およびランダムヘキサメリックプライマーＡＳＡ２４Ｎ６（配列番号１６）を用いて二重鎖ＤＮＡを作った。鋳型ＤＮＡ２０μＬを含む反応混合物、ＡＳＡ２４Ｎ６プライマー１μＬ、１０×大腸菌ＤＮＡ重合酵素Ｉバッファ３μＬ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ５μＬ、および大腸菌ＤＮＡ重合酵素Ｉ１μＬを３７℃で１時間培養した。ＰＣＲ精製キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いてＤＮＡをカラム精製し、プライマーＳｆｉＡ−Ｆ（配列番号１２８）およびＡＳＡ２４（配列番号１７）を用いてＰＣＲ増幅した。増幅したＤＮＡはさらにカラム精製し、ＳｆｉＩで処理した後、アガロースゲル電気泳動した。ＳｆｉＩ処理したＤＮＡ０．５〜１．０ｋｂを、不活性インベルターゼ遺伝子（ｄＳＵＣ２）を含むＳｆｉＩ処理したＹＧａｄＶ４５に挿入した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた。形質転換された大腸菌をアンピシリンの含まれたＬＢ培地（１％バクトペプトン、０．５％酵母抽出液、１％ＮａＣｌ、アンピシリン５０μｇ／ｍＬ）に塗抹した後、３７℃で一日培���した。約１×１０4個の大腸菌コロニーを滅菌蒸留水を用いて回収し、回収された菌体から、ＹＧａｄＶ４５の１８ＯＲＦの単方向欠失したＤＮＡ断片ライブラリーを含む全体プラスミドをプラスミド抽出キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて分離した。１８ＯＲＦの単方向欠失したＤＮＡ断片ライブラリーから適切なＴＦＰを選別するために、ヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ２）をコードする遺伝子をライブラリーとｄＳＵＣ２との間に挿入した。ｈＩＬ２遺伝子および５００ｂｐのＳＵＣ２Ｎ末端断片を含む挿入断片を、実施例８で記述したＰＣＲ方法によって増幅した。前記挿入断片を、１８ＯＲＦの単方向欠失したＤＮＡ断片ライブラリーを含むＳｗａＩで処理されたベクターと共に酵母サッカロミセスセレビシエＹ２８０５Δｇａｌ１Δｓｕｃ２（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ＳＵＣ２：：Ｔｃ１９０ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ｇａｌ１ ｃａｎ１）に同時形質転換させた後、形質転換された細胞をＵＤ培地（０．６７％アミノ酸のない酵母ナイトロジェンベース、０．７７ｇ／Ｌアミノ酸混合物、２％グルコースおよび２％寒天）とＹＰＳＧＡ培地（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％スクロース、０．３％ガラクトース、１μｇ／ｍＬンチマイシンＡおよび２％寒天）に塗抹して、３０℃で５日間培養した。ＵＤ培地では約２×１０4個の形質転換体が形成されたが、ＹＰＳＧＡ培地では数百個の形質転換体のみが形成された。ＹＰＳＧＡ培地で無作為的に選別した２９個の形質転換体をＹＰＤＧ培地（１％酵母抽出液、２％バクトペプトン、１％グルコスおよび１％ガラクトース）で３０℃で４０時間培養した。培養した上清液（０．６ｍＬ）に最終濃度が４０％となるようにアセトンを添加した。−２０℃で２時間放置した後、タンパク質を１０，０００×ｇで１５分間遠心分離した。ペレットを凍結乾燥させた後、１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）に再び懸濁し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った（図２５）。その結果から分かるように、多数の形質転換体がｈＩＬ２を培養培地に分泌した。各大腸菌形質転換体からプラスミドをプラスミド抽出キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて分離した。各ＴＦＰ配列を分析するために、ＧＡＬ１０プロモーターに結合するプライマーＧＡＬ１００−Ｆ（配列番号１２）を、ＴＦＰを含む全体プラスミドのシーケンシングプライマーとして使用した。塩基配列は、Ｇｅｎｏｔｅｃｈ社 （大田、韓国）の自動塩基配列分析器（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７；ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａ、米国）を用いて分析した。塩基配列をサッカロミセスゲノムデータベース( HYPERLINK "http://www.yeastgenome.org" www.yeastgenome.org)のＢＬＡＳＴ検索によって分析した。その結果、ｈＩＬ２を分泌する１２種の形質転換体から分離されたプラスミドから６個の新規ＴＦＰが確認された。分離されたプラスミドは、それぞれｐＹＩＬ−ＴＦＰ３９、ｐＹＩＬ−ＴＦＰ４３、ｐＹＩＬ−ＴＦＰ４４、ｐＹＩＬ−ＴＦＰ４８、ｐＹＩＬ−ＴＦＰ５２、およびｐＹＩＬ−ＴＦＰ５４と命名し、６個の新規ＴＦＰを表３に示した。
【０１０２】
【表３】
2009501020.tif 000005
【０１０３】
<実施例１６>単方向欠失による核心−ＴＦＰの変形
実施例１０および実施例１１でＩＬ−２およびＩＬ−３２αを用いて選別した１４個のＴＦＰ（核心ＴＦＰ）およびＷＯ２００５／０６８６５８で既に確認された３つのＴＦＰの効用性を多様化するために、１７個のゲノム由来のＯＲＦ、ＴＦＰ−１に対するＹＡＲ０６６Ｗ、ＴＦＰ−２に対するＹＦＲ０２６Ｃ、ＴＦＰ３に対するＹＪＬ１５８Ｃ、ＴＦＰ−９に対するＹＧＲ１０６Ｃ、ＴＦＰ−１１に対するＹＤＲ０７７Ｗ、ＴＦＰ１３に対するＹＩＬ１２３Ｗ、ＴＦＰ−１７に対するＹＮＬ１９０Ｗ、ＴＦＰ１８に対するＹＢＲ０７８Ｗ、ＴＦＰ−１９に対するＹＪＬ１７８Ｃ、ＴＦＰ−２０に対するＹＭＲ３０７Ｗ、ＴＦＰ−２１に対するＹＯＲ２４７Ｗ、ＴＦＰ−２２に対するＹＪＬ１５９Ｗ、ＴＦＰ−２５に対するＹＯＲ０８５Ｗ、ＴＦＰ−２７に対するＹＫＲ０４２Ｗ、ＴＦＰ２９に対するＹＥＬ０６０Ｃ、ＴＦＰ−３４に対するＹＬＲ３９０Ｗ−Ａ、およびＴＦＰ−３８に対するＹＭＲ２５１Ｗ−ＡをＰＣＲを用いて増幅し、実施例１５に記述した通りに単方向欠失させた。各ＯＲＦをＰＣＲプライマー対である、ＹＡＲ０６６Ｗに対するＹＡＲ０６６Ｗ−Ｆ（配列番号１４１）およびＹＡＲ０６６Ｗ−Ｒ（配列番号１４２）、ＹＦＲ０２６Ｃに対するＹＦＲ０２６Ｃ−Ｆ（配列番号１４３）およびＹＦＲ０２６Ｃ−Ｒ（配列番号１４４）、ＹＪＬ１５８Ｃに対するＹＪＬ１５８Ｃ−Ｆ（配列番号１４５）およびＹＪＬ１５８Ｃ−Ｒ（配列番号１４６）、ＹＧＲ１０６Ｃに対するＹＧＲ１０６Ｃ−Ｆ（配列番号１４７）およびＹＧＲ１０６Ｃ−Ｒ（配列番号１４８）、ＹＤＲ０７７Ｗに対するＹＤＲ０７７Ｗ−Ｆ（配列番号１４９）およびＹＤＲ０７７Ｗ−Ｒ（配列番号１５０）、ＹＩＬ１２３Ｗに対するＹＩＬ１２３Ｗ−Ｆ（配列番号１５１）およびＹＩＬ１２３Ｗ−Ｒ（配列番号１５２）、ＹＮＬ１９０Ｗに対するＹＮＬ１９０Ｗ−Ｆ（配列番号１５３）およびＹＮＬ１９０Ｗ−Ｒ（配列番号１５４）、ＹＢＲ０７８Ｗに対するＹＢＲ０７８Ｗ−Ｆ（配列番号１５５）およびＹＢＲ０７８Ｗ−Ｒ（配列番号１５６）、ＹＪＬ１７８Ｃに対するＹＪＬ１７８Ｃ−Ｆ（配列番号１５７）およびＹＪＬ１７８Ｃ−Ｒ（配列番号１５８）、ＹＭＲ３０７Ｗに対するＹＭＲ３０７Ｗ−Ｆ（配列番号１５９）およびＹＭＲ３０７Ｗ−Ｒ（配列番号１６０）、ＹＯＲ２４７Ｗに対するＹＯＲ２４７Ｗ−Ｆ（配列番号１６１）およびＹＯＲ２４７Ｗ−Ｒ（配列番号１６２）、ＹＪＬ１５９Ｗに対するＹＪＬ１５９Ｗ−Ｆ（配列番号１６３）およびＹＪＬ１５Ｗ−Ｒ（配列番号１６４）、ＹＯＲ０８５Ｗに対するＹＯＲ０８５Ｗ−Ｆ（配列番号１６５）およびＹＯＲ０８５Ｗ−Ｒ（配列番号１６６）、ＹＫＲ０４２Ｗに対するＹＫＲ０４２Ｗ−Ｆ（配列番号１６７）およびＹＫＲ０４２Ｗ−Ｒ（配列番号１６８）、ＹＥＬ０６０Ｃに対するＹＥＬ０６０Ｃ−Ｆ（配列番号１６９）およびＹＥＬ０６０Ｃ−Ｒ（配列番号１７０）、ＹＬＲ３９０Ｗ−Ａに対するＹＬＲ３９０Ｗ−Ａ−Ｆ（配列番号１７１）およびＹＬＲ３９０Ｗ−Ａ−Ｒ（配列番号１７２）、ＹＭＲ２５１Ｗ−Ａに対するＹＭＲ２５１Ｗ−Ａ−Ｆ（配列番号１７３）およびＹＭＲ２５１Ｗ−Ａ−Ｒ（配列番号１７４）を用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｙ２８０５（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ＳＵＣ２ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ＧＡＬ１ ｃａｎ１）のゲノム性ＤＮＡから増幅した。ＰＣＲは、Ｐｆｕ重合酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）を使用し、９４℃で３分間１回；９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃２分間の反応を２５回；７２℃で７分間１回の条件にして行った。各増幅されたＰＣＲ断片の塩基配列は、Ｇｅｎｏｔｅｃｈ社（大田、韓国）の自動塩基配列分析器（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７；ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、米国）を用いて確認した。
１７個の核心ＴＦＰを含む１７個のＯＲＦの中から追加的なＴＦＰを選別するために、１７ＰＣＲ断片混合物の単方向欠失を行い、ＹＧａｄＶ４５を用いてＴＦＰライブラリーを製造した（図２４）。単一鎖鋳型は、プライマーＳｆｉＡ−Ｆ（配列番号１２８）を用いて、１７個のＯＲＦからなる鋳型から単方向ＰＣＲによって得た。ＰＣＲは、ＥｘＴａｑ（Ｔａｋａｒａ Ｋｒｅａ、韓国）を使用し、９４℃で３分間１回；９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃２分間の反応を２５回；７２℃で７分間１回の条件にして行った。ＰＣＲ精製キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、単一鎖ＤＮＡを含むＰＣＲ産物を精製し、大腸菌ＤＮＡ酵素Ｉ（ＮＥＢ、Ｅｎｇｌａｎｄ）およびランダムヘキサメリックプライマーＡＳＡ２４Ｎ６（配列番号１６）を用いて二重鎖ＤＮＡを作った。鋳型ＤＮＡ２０μＬを含む反応混合物、ＡＳＡ２４Ｎ６プライマー１μＬ、１０×大腸菌ＤＮＡ重合酵素Ｉバッファ３μＬ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ５μＬ、および大腸菌ＤＮＡ重合酵素Ｉ１μＬを３７℃で１時間培養した。ＰＣＲ精製キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いてＤＮＡをカラム精製し、プライマーＳｆｉＡ−Ｆ（配列番号１２８）およびＡＳＡ２４（配列番号１７）を用いてＰＣＲ増幅した。増幅したＤＮＡはさらにカラム精製し、ＳｆｉＩで処理した後、アガロースゲル電気泳動した。ＳｆｉＩ処理したＤＮＡ０．５〜１．０ｋｂを、不活性インベルターゼ遺伝子（ｄＳＵＣ２）を含むＳｆｉＩ処理したＹＧａｄＶ４５に挿入した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた。形質転換された大腸菌をアンピシリンの含まれたＬＢ培地（１％バクトペプトン、０．５％酵母抽出液、１％ＮａＣｌ、アンピシリン５０μｇ／ｍＬ）に塗抹した後、３７℃で一日培養した。約１×１０4個の大腸菌コロニーを滅菌蒸留水を用いて回収し、回収された菌体から、１７個のＯＲＦの単方向欠失したＤＮＡ断片ライブラリーを含むＹＧａｄＶ４５プラスミドをプラスミド抽出キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて分離した。１７個のＯＲＦからの単方向欠失したＤＮＡライブラリーと、実施例１５で製造された１８個のＯＲＦから製造されたＤＮＡライブラリーとを混合したＤＮＡライブラリーを製造した。
【０１０４】
混合されたＤＮＡ断片ライブラリーから適切なＴＦＰを選別するために、ヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ２）をコードする遺伝子をＤＮＡライブラリーとｄＳＵＣ２との間に挿入した。ｈＩＬ２遺伝子および５００ｂｐのＳＵＣ２Ｎ末端断片を含む挿入断片を、実施例８で記述したＰＣＲ方法によって増幅した（図１１）。前記挿入断片を、３５ＯＲＦの単方向欠失したＤＮＡ断片ライブラリーを含むＳｗａＩで処理されたベクターと共に酵母サッカロミセスセレビシエＹ２８０５Δｇａｌ１Δｓｕｃ２（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ＳＵＣ２：：Ｔｃ１９０ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ｇａｌ１ ｃａｎ１）に同時形質転換させた後、形質転換された細胞をＵＤ培地（０．６７％アミノ酸のない酵母ナイトロジェンベース、０．７７ｇ／Ｌアミノ酸混合物、２％グルコースおよび２％寒天）とＹＰＳＧＡ培地（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％スクロース、０．３％ガラクトース、１μｇ／ｍＬンチマイシンＡおよび２％寒天）に塗抹して、３０℃で５日間培養した。ＵＤ培地では約２×１０4個の形質転換体が形成されたが、ＹＰＳＧＡ培地では数百個の形質転換体のみが形成された。ＹＰＳＧＡ培地で無作為的に選別した２４個の形質転換体をＹＰＤＧ培地（１％酵母抽出液、２％バクトペプトン、１％グルコスおよび１％ガラクトース）に接種して３０℃で４０時間培養した。培養した上清液（０．６ｍＬ）に最終濃度が４０％となるようにアセトンを添加した。−２０℃で２時間放置した後、タンパク質を１０，０００×ｇで１５分間遠心分離した。ペレットを凍結乾燥させた後、１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）に再び懸濁し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った（図２６）。多数の形質転換体がそれぞれ異なる量でｈＩＬ２を培養培地に分泌した。ｈＩＬ２を分泌する各形質転換体から全体ＤＮＡを分離し、これを大腸菌ＤＨ５αにさらに形質転換した。各大腸菌形質転換体からプラスミドをプラスミド抽出キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて分離した。各ＴＦＰ配列を分析するために、ＧＡＬ１０プロモーターに結合するプライマーＧＡＬ１００−Ｆ（配列番号１２）を、ＴＦＰを含む全体プラスミドのシーケンシングプライマーとして使用した。塩基配列は、Ｇｅｎｏｔｅｃｈ社（大田、韓国）の自動塩基配列分析器（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７ｌ；ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａ、米国）を用いて分析した。塩基配列は、サッカロミセスゲノムデータベース( HYPERLINK "http://www.yeastgenome.org" www.yeastgenome.org)のＢＬＡＳＴ検索によって分析した。その結果、ｈＩＬ２を分泌する１８種の形質転換体から分離されたプラスミドから６個の新規ＴＦＰが確認された。分離されたプラスミドは、それぞれｐＹＩＬ−ＴＦＰ４０、ｐＹＩＬ−ＴＦＰ５０、ｐＹＩＬ−ＴＦＰ５１、ｐＹＩＬ−ＴＦＰ５７、ｐＹＩＬ−ＴＦＰ５８、およびｐＹＩＬ−ＴＦＰ５９と命名し、６個の新規ＴＦＰを表４に示した。
【０１０５】
【表４】
2009501020.tif 000006
【０１０６】
<実施例１７>核心ＴＦＰのプリおよびプロシグナル配列の交換を用いた人工ＴＦＰの製造
酵母において多様な組み換えタンパク質の分泌のために酵母交配因子アルファ（ＭＦα）遺伝子由来の分泌シグナルが広く使用されている(Romanos et al., Yeast 8:423(1992))。ＭＦα分泌シグナルは、１９個のアミノ酸のプリシグナルと６６個のアミノ酸からなるプロシグナルを含む。プロシグナルの機能は、明確に解明されてはいないが、正確なフォールディングを助けて幾つかのタンパク質の分泌に必須的なものと知られており、多くの組み換えタンパク質の分泌に活用されている(Chaudhuri et al., Eur. J. Biochem. 206:193(1992))。本発明では、２つの分泌融合因子ＴＦＰ−３およびＴＦＰ−２２がプリ−プロタイプと確認された。本発明で選別されたＴＦＰの有用性を拡大するために、相異なる由来のプリおよびプロシグナルを持つ人為的なＴＦＰを製作した。ＴＦＰ−１、２、３、および４のプリシグナルおよび交配因子アルファの一般なプロシグナルを用いて４つの人為的なＴＦＰを製造し、それぞれＴＦＰ−５、６、７および８と命名した。４つの相異なるプリシグナルおよび共通のプロシグナルを融合させるために、オーバーラップエクステンションＰＣＲを行った。
【０１０７】
プライマー対である、Ｔ１−Ｆ（配列番号１８７）およびＴ１−Ｒ（配列番号１８８）、Ｔ２−Ｆ（配列番号１８９）およびＴ２−Ｒ（配列番号１９０）、Ｔ３−Ｆ（配列番号１９１）およびＴ３−Ｒ（配列番号１９２）、Ｔ４−Ｆ（配列番号１９３）およびＴ４−Ｒ（配列番号１９４）をそれぞれ用いてプラスミドｐＹＩＬ−ＫＲＴＦＰ１、２、３および４（ＷＯ２００５／０６８６５８）から４つのＴＦＰの４つの相異なるプリシグナルをＰＣＲ増幅した。また、プライマーＭＦ−Ｐｒｏ−Ｆ（配列番号１９５）およびＭＦ−Ｒ（配列番号１９６）を用いてプラスミドＹＥＧα−ＨＩＲ５２５から約１９０ｂｐの交配因子アルファプロシグナルをＰＣＲ増幅した。そして、センスプライマーとしてＴ１−Ｆ（配列番号１８７）、Ｔ２−Ｆ（配列番号１８９）、Ｔ３−Ｆ（配列番号１９１）およびＴ４−Ｆ（配列番号１９３）、および共通のアンチセンスプライマーＭＦ−Ｒ（配列番号１９６）を用いて前記のＤＮＡ断片、すなわち４つのプリシグナルおよび共通の交配因子アルファプロシグナルの４つのグループから４つの相異なるプリおよびプロシグナルをＰＣＲ増幅した。各人為的プリおよびプロシグナル配列と交配因子アルファのプリおよびプロシグナルの効率性を比較するために、プライマーＭＦ−Ｐｒｅ−Ｆ（配列番号１９７）およびＭＦ−Ｒ（配列番号１９６）を用いてＹＥＧα−ＨＩＲ５２５から交配因子アルファのプリおよびプロシグナルをＰＣＲ増幅した。
【０１０８】
５つのプリおよびプロシグナル配列の効果を確認するために、目的タンパク質であるヒトインスリン様成長因子（ｈＩＧＦ）を使用した。交配因子アルファのプロシグナルはヒトインスリン様成長因子の効果的な分泌のために必須的であると報告されている(Cliaudhuri et al, Eur. J. Biochem. 206:793 (1992)) 。ｈＩＧＦ遺伝子をプライマーＫＲ−ＩＧＦ−Ｆ（配列番号１９８）およびＩＧＦ−Ｒ（配列番号１９９）を用いてヒトｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅し（ＥＳ Ｃｈｏｉ、 Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、韓国）、ＬＮＫ４０（配列番号２３）およびＩＧＦ−Ｒ（配列番号１９９）を用いて２番目のＰＣＲを行った。センスプライマーとしてＴ１−Ｆ（配列番号１８７）、Ｔ２−Ｆ（配列番号１８９）、Ｔ３−Ｆ（配列番号１９１）、Ｔ４−Ｆ（配列番号１９３）、ＭＦ−Ｐｒｅ−Ｆ（配列番号１９７）および共通のアンチセンスプライマーとしてＩＧＦ−Ｒ（配列番号１９９）を用いて、ＩＦＧを含むＤＮＡ断片を、プリおよびプロシグナルを含む既に増幅された５個のＰＣＲ断片に融合させた。全ての融合されたＰＣＲ断片は、ＳｆｉＩおよびＳａｌＩで処理し、ＳｆｉＩ−ＳａｌＩで処理されたベクターＹＧａ１ＩＮＶ内に挿入し（図６）、その結果生成されたプラスミドをそれぞれｐＹＧａ−Ｔ１α−ＩＧＦ、ｐＹＧａ−Ｔ２α−ＩＧＦ、ｐＹＧａ−Ｔ３α−ＩＧＦ、ｐＹＧａ−Ｔ４α−ＩＧＦおよびｐＹＧａ−ＭＦα−ＩＧＦと命名した。５つのプラスミドをサッカロミセスセレビシエＹ２８０５Δｇａｌ１Δｓｕｃ２（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ＳＵＣ２：：Ｔｃ１９０ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ｇａｌ１ ｃａｎ１）に形質転換させた後、形質転換された細胞をＵＤ培地（０．６７％アミノ酸のない酵母ナイトロジェンベース、０．７７ｇ／Ｌアミノ酸混合物、２％グルコースおよび２％寒天）とＹＰＳＧＡ培地（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％スクロース、０．３％ガラクトース、１μｇ／ｍＬアンチマイシンＡおよび２％寒天）に塗抹した。各形質転換体の単一コロニーを分離してＹＰＤＧ（１％酵母抽出液、２％バクトペプトン、１％グルコスおよび１％ガラクトース）で３０℃で４０時間培養した。培養した上清液（０．６ｍＬ）に最終濃度が４０％となるようにアセトンを添加した。−２０℃で２時間培養した後、タンパク質を１０，０００×ｇで１５分間遠心分離した。ペレットを凍結乾燥させた後、１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）に再び懸濁し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。選別されたＩＧＦはｈＩＧＦに対する抗体を用いてウエスタンブロットで追加分析した。分析された全てのプリおよびプロ分泌シグナルは、それぞれ異なる量でｈＩＧＦを培養培地に分泌した。５個のプリおよびプロシグナルの中で、Ｔ３α（ＴＦＰ−３からのプリシグナルおよびＭＦαからのプロシグナル）およびＴ４α（ＴＦＰ−４からのプリシグナルおよびＭＦαからのプロシグナル）がｈＩＧＦ分泌に効果的であった。４つの人為的なＴＦＰおよび新規のＴＦＰを表５に示した。
【０１０９】
【表５】
2009501020.tif 000007
【０１１０】
<実施例１８>多数の目的遺伝子に適用可能な細胞内組み換え用ＴＦＰベクターの製造
本発明で選別された３５個のＴＦＰ（核心ＴＦＰ、すなわちＷＯ２００５／０６８６５８に記述された４個のＴＦＰ、実施例１０および実施例１１に記述されたヒトＩＬ２およびＩＬ３２αを用いて選別された１４個のＴＦＰ、実施例１５でＢＡＬＳＴ検索によって選別されたＯＲＦからの６個のＴＦＰ、実施例１６で選別された６個のＴＦＰ、実施例１７で製造された５個の人工ＴＦＰ）は、本発明で使用した目標タンパク質以外の他の目標タンパク質の分泌にも有用に使用できる。したがって、このようなベクターを多くの目的遺伝子に容易に適用させるために、選別された核心ＴＦＰベクターを、目的タンパク質遺伝子との細胞内組み換えが容易であるように製造した。プラスミドＹＧａＳＷを製造するために、プライマーＧＡＬ１００−Ｆ（配列番号１２）およびＨ７７−１−Ｒ（配列番号７８）を用いてＹＧａｄＶ４５からＥｃｏＲＩ、２ＳｆｉＩ、ＮｏｔＩ、Ｋｅｘ２認識部位を含むリンカーＤＮＡ、ＳｗａＩおよびＳａｌＩ部位を含む１７０ｂｐ断片をＰＣＲ増幅した（図１０）。ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ処理されたＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ処理されたＹＧａｄＶ４５内に挿入して製造されたプラスミドをＹＧａＳＷと命名した。プラスミドＹＧａＳＷは、ＥｃｏＲＩ、ＳｆｉＩ、ＮｏｔＩ、４０ｂｐのリンカーおよびＧＡＬ１０プロモーターとＧＡＬ７ターミネータとの間にＳｗａＩおよびＳａｌＩ制限部位を持っている。３５個の核心ＴＦは、各ＴＦＰを含むプラスミドにＳｆｉを処理して得た。各核心ＴＦＰは、ゲル精製し、ＳｆｉＩ処理されたＹＧａＳＷ内に挿入した後、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ１、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ２、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ３、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ４、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ５、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ６、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ７、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ８、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ９、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ１１、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ１３、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ１７、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ１８、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ１９、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ２０、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ２１、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ２２、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ２５、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ２７、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ２９、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ３２、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ３４、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ３８、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ３９、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ４０、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ４３、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ４４、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ４８、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ５０、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ５１、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ５２、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ５４、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ５７、ＹＧａＳＷ−ＴＦＰ５８、およびＹＧａＳＷ−ＴＦＰ５９と命名された３５個のプラスミドを得た。
【０１１１】
<実施例１９>ヒト成長ホルモンを活用した核心ＴＦＰの効率性分析
本発明で選別された核心ＴＦＰをヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の分泌にも使用することができか追加実験を行った。ヒト成長ホルモンをプライマーｈＧＨ−Ｆ（配列番号７９）およびｈＧＨ−Ｒ（配列番号８０）を用いてヒトｃＤＮＡライブラリー（ＥＳ Ｃｈｏｉ、 Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、韓国）から増幅し、ｐＳＴ−Ｂｌｕｅ１（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）にクローニングしてプラスミドｐＳＴ−ｈＧＨを製造した。また、プライマーＫＲ−ｈＧＨ−Ｆ（配列番号８１）およびｈＧＨ−Ｓａｌ−Ｒ（配列番号８２）を用いてｐＳＴ−ｈＧＨから２番目のＰＣＲを行った。実施例１８で製造したＹＧａＳＷ−ＴＦＰベクターに相同配列を付加するために、ｈＧＨ遺伝子を含むＰＣＲ産物は、プライマーＬＮＫ４０（配列番号２３）およびＧＴ７０−Ｒ（配列番号８３）を用いて３番目のＰＣＲを行った。増幅されたＰＣＲ断片は、ＳｗａＩ処理されたＹＧａＳＷ−ＴＦＰベクターと２：１の割合で混ぜた後、細胞内組み換えによって酵母サッカロミセスセレビシエＹ２８０５（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ＳＵＣ２ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ＧＡＬ１ ｃａｎ１）に形質転換させた後、形質転換された細胞をＵＤ培地（０．６７％アミノ酸のない酵母ナイトロジェンベース、０．７７ｇ／Ｌアミノ酸混合物、２％グルコースおよび２％寒天）で３０℃で３日間培養した。各形質転換体の単一コロニーをＹＰＤＧ培地（１％酵母抽出液、２％バクトペプトン、１％グルコスおよび１％ガラクトース）に接種して３０℃で４０時間培養した。培養した上清液（０．６ｍＬ）に最終濃度が４０％となるようにアセトンを添加した。−２０℃で２時間放置した後、タンパク質を１０，０００×ｇで１５分間遠心分離した。ペレットを凍結乾燥させた後、１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）に再び懸濁し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。図２２に示すように、大部分のＴＦＰはヒト成長ホルモンを培養培地に分泌した。これらのうち、ｐＹＧＴ２１−ｈＧＨ菌株を選別し、流加式発酵培養を介して最終分泌率を実験した。培養時間別に１０μＬの上清液に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施した結果（図２３）、約５００ｍｇ／Ｌのヒト成長ホルモンが培養培地に分泌されることを確認することができた。
【０１１２】
<実施例２０>ヒトカスパーゼ−１サブユニットＰ１０を用いた核心ＴＦＰの効率性分析
本発明で選別された核心ＴＦＰをヒトカスパーゼ−１サブユニットＰ１０（ｈＰ１０）の分泌にも使用することができるか追加実験を行った。ヒトｈＰ１０遺伝子をプライマーＫＲ−ｈＰ１０−Ｆ（配列番号２１０）およびｈＰ１０−Ｓａｌ−Ｒ（配列番号２１１）を用いてヒトｃＤＮＡライブラリー（ＥＳ Ｃｈｏｉ、 Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、韓国）から増幅した。また、実施例１８で製造したＹＧａＳＷ−ＴＦＰベクターに相同配列を付加するために、ｈＰ１０遺伝子を含むＰＣＲ産物は、プライマーＬＮＫ４０（配列番号２３）およびＧＴ７０−Ｒ（配列番号８３）を用いて２番目のＰＣＲを行った。増幅されたＰＣＲ断片は、ＳｗａＩ処理されたＹＧａＳＷ−ＴＦＰベクターと２：１の割合で混ぜた後、細胞内組み換えによって酵母サッカロミセスセレビシエＹ２８０５（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ＳＵＣ２ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ＧＡＬ１ ｃａｎ１）に形質転換させた後、形質転換された細胞をＵＤ培地（０．６７％アミノ酸のない酵母ナイトロジェンベース、０．７７ｇ／Ｌアミノ酸混合物、２％グルコースおよび２％寒天）で３０℃で３日間培養した。各形質転換体の単一コロニーをＹＰＤＧ培地（１％酵母抽出液、２％バクトペプトン、１％グルコスおよび１％ガラクトース）に接種して３０℃で４０時間培養した。培養した上清液（０．６ｍＬ）に最終濃度が４０％となるようにアセトンを添加した。−２０℃で２時間培養した後、タンパク質を１０，０００×ｇで１５分間遠心分離した。ペレットを凍結乾燥させ、１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）に再び懸濁し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。図２８に示すように、プリ−プロシグナルを含む４つの人工ＴＦＰのみがｈＰ１０を培養培地に分泌した。ｈＩＧＦの場合での如く、ヒトカスパーゼ−１サブユニットＰ１０の場合にも、酵母での適切な分泌のためにはプロシグナルが必要であることが分かった。
【０１１３】
<実施例２１>ヒトインターロイキン−３２γを用いた核心ＴＦＰの効率性分析
本発明で選別された核心ＴＦＰをヒトインターロイキン−３２γ（ｈＩＬ３２γ）の分泌にも使用することができか追加実験を行った。ヒトインターロイキン−３２のスプライシング変形体であるヒトインターロイキン−３２γをコードする遺伝子をプライマーＫＲ−ｈＩＬ３２ｇ−Ｆ（配列番号２１２）およびｈＩＬ３２ｇ−Ｓａｌ−Ｒ（配列番号２１３）を用いてｐＧＭＴ−ＩＬ３２γ（ＤＹ Ｙｏｏｎ、建国大学校）から増幅した。また、実施例１８で製造したＹＧａＳＷ−ＴＦＰベクターに相同配列を付加するために、ｈＩＬ３２γ遺伝子を含むＰＣＲ産物は、プライマーＬＮＫ４０（配列番号２３）およびＧＴ７０−Ｒ（配列番号８３）を用いて２番目のＰＣＲを行った。増幅されたＰＣＲ断片は、ＳｗａＩ処理されたＹＧａＳＷ−ＴＦＰベクターと２：１の割合で混ぜた後、細胞内組み換えによって酵母サッカロミセスセレビシエＹ２８０５（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ＳＵＣ２ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ＧＡＬ１ ｃａｎ１）に形質転換させた後、形質転換された細胞をＵＤ培地（０．６７％アミノ酸のない酵母ナイトロジェンベース、０．７７ｇ／Ｌアミノ酸混合物、２％グルコースおよび２％寒天）で３０℃で３日間培養した。各形質転換体の単一コロニーをＹＰＤＧ培地（１％酵母抽出液、２％バクトペプトン、１％グルコスおよび１％ガラクトース）に接種して３０℃で４０時間培養した。培養した上清液（０．６ｍＬ）に最終濃度が４０％となるようにアセトンを添加した。−２０℃で２時間培養した後、タンパク質を１０，０００×ｇで１５分間遠心分離した。ペレットを凍結乾燥させ、１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）に再び懸濁し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。確認したＴＦＰのうち、ＴＦＰ３およびＴＦＰ２７がｈＩＬ３２γの分泌に効果的であることを確認した（図２９）。
【０１１４】
<実施例２２>酵母ピキアパストリス由来のＴＦＰライブラリー
本発明のＴＦＰ選別方法は、別の生物体由来のゲノム性またはｃＤＮＡライブラリーにも適用できる。その例として、酵母ピキアパストリスに対して実験してみた。ｃＤＮＡライブラリーを製造するために、ピキアパストリスＧＳ１１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）から全体ＲＮＡを分離した。酵母をＹＰＤ培地（２％酵母抽出物、１％バクトペプトン、２％グルコース）で対数期まで培養した菌株を回収した後、Ｅｌｉｏｎなどの方法(Elion et al., cell, 1984, 39:663)によって全体ＲＮＡを回収した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）を用いて全体ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）+ｍＲＮＡのみを回収し、ＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡ合成キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）を用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを製造した。ｍＲＮＡから第１鎖ＤＮＡを合成するとき、キットに含まれたプライマーを使用せず、特に設計されたプライマーＡＳＡ２４Ｎ６（配列番号１６）を使用した。プライマーＡＳＡ４Ｎ６は、無作為的な６つの塩基を持っているため、ｍＲＮＡのいずれの部位でも無作為的に結合することができ、このような方法で増幅された第１鎖ｃＤＮＡの大部分は酵母遺伝子のＮ末端の一部をコードする５’部分配列を含む。５’部分配列を持つ第１鎖ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＳＭＡＲＴキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）に含まれた５’ＰＣＲプライマーとＡＳＡ２４（配列番号１７）プライマーを用いて２鎖ｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ産物は、両末端にＳｆｉＩ部位を含むｃＤＮＡの５’部分切片を多数含む。この際、使用した増幅条件は、キットで提示する条件（９５℃で２０秒間１回；９５℃で３０秒間、６８℃で６分間２０回）であった。増幅されたｃＤＮＡは、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）溶液で抽出した後、０．１体積の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）と２体積のエタノールを添加して沈殿する方法で回収した。ｃＤＮＡを制限酵素ＳｆｉＩで５０℃で２時間処理した後、アガロースゲルで電気泳動し、０．５〜１ｋｂサイズの断片をアガロースゲル抽出キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて回収した。回収したｃＤＮＡをＳｆｉＩで処理したＹＧａＩＮＶベクター（図６）と連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換させ、アンピシリンの含まれたＬＢ培地（１％バクトペプトン、０．５％酵母抽出液、１％ＮａＣｌ、アンピシリン５０μｇ／ｍＬ）に塗抹した後、３７℃で一日培養した。約４×１０4個のコロニーを滅菌蒸留水を用いて回収し、回収された菌体から、ＳＵＣ２遺伝子と融合されたランダムプライマー製造ｃＤＮＡを含む全体プラスミドをプラスミド抽出キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて分離した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓから、インベルターゼを分泌するＴＦＰライブラリーを選別するために、ライブラリーＤＮＡをサッカロミセスセレビシエＹ２８０５Δｇａｌ１Δｓｕｃ２（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ｓｕｃ２：：Ｔｃ１９０ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ｇａｌ１ ｃａｎ１）に酢酸リチウム法(Hill et al., Nucleic Acids Res. 19:5191(1991))に形質転換させた後、形質転換された細胞をＵＤ培地（０．６７％アミノ酸のない酵母ナイトロジェンベース、０．７７ｇ／Ｌアミノ酸混合物、２％グルコースおよび２��寒天）とＹＰＳＧＡ培地（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％スクロース、０．３％ガラクトース、１μｇ／ｍＬアンチマイシンＡおよび２％寒天）に塗抹して、３０℃で４〜６日間培養した。ｃＤＮＡライブラリーから約１０００個の形質転換体が生成された。ＹＰＳＧＡ培地から無作為的に５個の形質転換体を選別し、ガラス玉を用いて細胞を破砕し、エタノールでＤＮＡを沈殿させて、プラスミドを含む全てのＤＮＡを形質転換体から分離した。分離されたＤＮＡを大腸菌ＤＨ５αにさらに形質転換し、形質転換された大腸菌をアンピシリン含有ＬＢ培地（１％バクトペプトン、０．５％酵母抽出液、１％ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍＬアンピシリン）に塗抹した後、３７℃で一日培養した。各大腸菌形質転換体からプラスミドをプラスミド抽出キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて分離した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのｃＤＮＡから得られた各ＴＦＰの配列を分析するために、ＧＡＬ１０プロモーターに結合するプライマーＧＡＬ１００−Ｆ（配列番号１２）を、ＴＦＰを含む全体プラスミドのシーケンシングプライマーとして使用した。塩基配列は、Ｇｅｎｏｔｅｃｈ社（大田、韓国）の自動塩基配列分析器（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７；ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、米国）を用いて分析した。塩基配列は、国立生命工学情報センター（ＮＣＢＩ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）配列データベース( HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov" www.ncbi.nlm.nih.gov)のＢＡＬＳＴ検索によって分析した。その結果、選別された５個の菌株から分離されたプラスミドからＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの４つの相異なるＴＦＰが確認された。分離されたプラスミドは、それぞれｐＹＨＴＳ−ＰｐＴＦＰ１、ｐＹＨＴＳ−ＰｐＴＦＰ２、ｐＹＨＴＳ−ＰｐＴＦＰ３、およびｐＹＨＴＳ−ＰｐＴＦＰ４と命名し、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓから分離された４つのＴＦＰを表６に示した。
【０１１５】
【表６】
2009501020.tif 000008
【０１１６】
<実施例２３>ヒトインターロイキン−２を用いたピチアパストリス由来のタンパク質融合因子の効率性分析
表６に示した４個のピキアパストリスタンパク質融合因子を用いて酵母サッカロミセスセレビシエでヒトインターロイキン−２の分泌活性を分析した。プライマー対である、ＰｐＴＦＰ１−Ｆ（配列番号２２７）およびＰｐＴＦＰ１−Ｒ（配列番号２２８）、ＰｐＴＦＰ２−Ｆ（配列番号２２９）およびＰｐＴＦＰ−２−Ｒ（配列番号２３０）、ＰｐＴＦＰ３−Ｆ（配列番号２３１）およびＰｐＴＦＰ３−Ｒ（配列番号２３２）、ＰｐＴＥＧＰ４−Ｆ（配列番号２３３）およびＰｐＴＦＰ４−Ｒ（配列番号２３４）を用いてプラスミドＰＹＨＴＳ−ＰｐＴＦＰ１、ｐＹＨＴＳ−ＰｐＴＦＰ２、ｐＹＨＴＳ−ＰｐＴＦＰ３およびｐＹＨＴＳ−ＰｐＴＦＰ４から各ＰｐＴＦＰに対してそれぞれＰＣＲを行った。ゲル精製されたＰＣＲ断片をＳｆｉＩ処理し、ＳｆｉＩ処理されたＹＧａＳＷベクター（図１０）にクローニングして製造されたプラスミドをそれぞれＹＧａＳＷ−ＰｐＴＦＰ１、ＹＧａＳＷ−ＰｐＴＦＰ２、ＹＧａＳＷ−ＰｐＴＦＰ３、およびＹＧａＳＷ−ＰｐＴＦＰ４と命名した。
【０１１７】
ＹＧａＳＷ−ＰｐＴＦＰベクターと相同配列を有するヒトＩＬ−２遺伝子を含む増幅されたＰＣＲ断片をＳｗａＩ処理されたＹＧａＳＷ−ＰｐＴＦＰと２：１の割合で混合した後、サッカロミセスセレビシエＹ２８０５（Ｍａｔ ａ ｕｒａ３ ＳＵＣ２ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ＧＡＬ１ ｃａｎ１）に細胞内組み換えで形質転換させ、形質転換された細胞をＵＤ培地（０．６７％アミノ酸のない酵母ナイトロジェンベース、０．７７ｇ／Ｌアミノ酸混合物、２％グルコースおよび２％寒天）に塗抹して、３０℃で３日間培養した。各形質転換体の単一コロニーをＹＰＤＧ培地（１％酵母抽出液、２％バクトペプトン、１％グルコース、および１％ガラクトース）に接種して３０℃で４０時間培養した。培養した上清液（０．６ｍＬ）に最終濃度が４０％となるようにアセトンを添加した。−２０℃で２時間培養した後、タンパク質を１０，０００×ｇで１５分間遠心分離した。ペレットを凍結乾燥させ、１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）に再び懸濁し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。その結果、図３０に示すように、全てのＰｐＴＥＰがヒトインターロイキン−２を培養培地に分泌することができた。このような結果は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のＴＦＰ酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいても作動することができることを示す。
【０１１８】
本発明の全般にわたって記述されたものは、当業者が均等な条件、製剤および本発明の効果に影響を与えない範囲内における他のパラメータを用いて同一に行うことができる。本発明に引用された全ての登録特許、特許出願および公開特許はその全体を参照して本発明と統合できる。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１はインベルターゼ遺伝子の欠失過程および選別マーカーのポップアウト過程を示す図である。
【図２】図２はインベルターゼ活性の測定のためのザイモグラムである（レーン１、２、３：野生型サッカロミセスセレビシエ(Saccaromyces cerevisiae)Ｙ２８０５；レーン４、５、６：インベルターゼ欠失変異株（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｙ２８０５Δｓｕｃ２）。
【図３】図３は炭素源による酵母菌体の成長を示す写真である（ＳＵＣ２：野生型Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｙ２８０５；Δｓｕｃ２：インベルターゼ欠失変異株（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｙ２８０５Δｓｕｃ２）。
【図４】図４はインベルターゼ遺伝子欠失確認のためのサザンブロット結果である（レーン１、２：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｙ２８０５（ｕｒａ３ΔＳＵＣ２）；レーン３、４：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｙ２８０５Δｓｕｃ２（ＵＲＡ３Δｓｕｃ２）；レーン５、６：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｙ２８０５Δｓｕｃ２（ｕｒａ３Δｓｕｃ２）。
【図５】図５はグルコースおよびスクロース培地でプラスミドｐＹＧＡＰ−ＳＮＳ−ＳＵＣ２、ｐＹＧＡＰ−ＨＳＡ−ＳＵＣ２およびｐＹＧＡＰ−ｈＩＬ２−ＳＵＣ２を含む酵母菌体の成長有無を確認した写真である。
【図６】図６はＧＡＬ１０プロモーターと成熟したインベルターゼ遺伝子との間にｃＤＮＡライブラリーを挿入するためのマルチクローニング部位を含むプラスミドＹＧａＩＮＶを図式した図である。
【図７】図７は３つの異なるリーディングフレームと、ＧＡＬ１０プロモーターと成熟したインベルターゼ遺伝子との間にｃＤＮＡライブラリーを挿入するためのマルチクローニング部位を含むプラスミドＹＧａＦ０ＩＮＶ、ＹＧａＦ１ＩＮＶおよびＹＧａＦ２ＩＮＶを図式した図である。
【図８】図８はＴＦＰ選別ベクターＹＧａＩＮＶにおける、ランダムプライマーを使用したｃＤＮＡライブラリーの合成およびｃＤＮＡライブラリーの製造過程を示す図である。
【図９】図９はＴＦＰ選別ベクターＹＧａＦ０ＩＮＶ、ＹＧａＦ１ＩＮＶおよびＹＧａＦ２ＩＮＶにおけるゲノム性ＤＮＡライブラリーの製造過程を示す図である。
【図１０】図１０はＳＵＣ２が欠失し且つＴＦＰライブラリーがサブクローニングされたＹＧａｄＶ４５のプラスミドマップを示す図である。
【図１１】図１１はインベルターゼを用いて細胞内組み換えによってＴＦＰライブラリーからターゲット遺伝子のＴＦＰを選別する過程を示す図である。
【図１２】図１２はリパーゼおよびインベルターゼを二重レポーターとして用いて細胞内組み換えによってＴＦＰライブラリーからターゲット遺伝子のＴＦＰを選別する過程を示す図である。
【図１３】図１３は形質転換体が形成するｈａｌｏを含むトリブチリンブレートを示すものである。（Ａ）形質転換によって直接得たｈａｌｏ形成プレート（ＹＰＳＧＡとトリブチリン）、（Ｂ）トリブチリンプレートで相異なるｈａｌｏの大きさを示す選別された形質転換体。
【図１４】図１４は９種の選別されたＴＦＰを用いてヒトＩＬ−２を発現するベクターの製造過程を図式した図である。
【図１５】図１５はヒトＩＬ−２発現ベクターである（Ａ）ｐＹＧＴ９−ＩＬ２、（Ｂ）ｐＹＧＴ１３−ＩＬ２および（Ｃ）ｐＹＧＴ１７−ＩＬ２のマップを示す図である。
【図１６】図１６はヒトＩＬ−２発現ベクターである（Ａ）ｐＹＧＴ１８−ＩＬ２、（Ｂ）ｐＹＧＴ１９−ＩＬ２および（Ｃ）ｐＹＧＴ２０−ＩＬ２のマップを示す図である。
【図１７】図１７はヒトＩＬ−２発現ベクターである（Ａ）ｐＹＧＴ２１−ＩＬ２、（Ｂ）ｐＹＧＴ２５−ＩＬ２および（Ｃ）ｐＹＧＴ２７−ＩＬ２のマップを示す図である。
【図１８】図１８はヒトＩＬ−２を分泌する酵母菌株の培地上清液に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す図である。（レーンＭ：タンパク質サイズマーカー；レーン１：ＩＬ２分泌の対照群としてｐＹＩＬ−ＫＲＴ１−４（ＷＯ２００５／０６８６５８）を含有する酵母菌株の培地上清液；レーン２：ｐＹＧＴ９−ＩＬ２を含有する酵母菌株の培地上清液；レーン３：ｐＹＧＴ２１−ＩＬ２を含有する酵母菌株の培地上清液；レーン４：ｐＹＧＴ１３−ＩＬ２を含有する酵母菌株の培地上清液；レーン５：ｐＹＧＴ１７−ＩＬ２を含有する酵母菌株の培地上清液；レーン６：ｐＹＧＴ２５−ＩＬ２を含有する酵母菌株の培地上清液；レーン７：ｐＹＧＴ１９−ＩＬを含有する酵母菌株の培地上清液；レーン８：ｐＹＧＴ１８−ＩＬ２を含有する酵母菌株の培地上清液；レーン９：ｐＹＧＴ２７−ＩＬ１２を含有する酵母菌株の培地上清液）。
【図１９】図１９はヒトＩＬ３２αのＴＦＰ選別過程で得られた３８種の酵母菌株の培地上清液に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す図である（レーンＭ：タンパク質サイズマーカー；レーン１〜３９：酵母形質転換体）。
【図２０】図２０はヒトＩＬ３２αを分泌する酵母菌株の培地上清液に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット結果を示す図である（レーンＭ：タンパク質サイズマーカー；レーン１：ｐＹＧＴ３−ＩＬ３２αを含有する酵母菌株の培地上清液；レーン２：ｐＹＧＴ２１−ＩＬ３２αを含有する酵母菌株の培地上清液；レーン３：ｐＹＧＴ１３−ＩＬ３２αを含有する酵母菌株の培地上清液；レーン４：ｐＹＧＴ２５−ＩＬ３２αを含有する酵母菌株の培地上清液；レーン５：ｐＹＧＴ２２−ＩＬ３２αを含有する酵母菌株の培地上清液；レーン６：ｐＹＧＴ１１−ＩＬ３２αを含有する酵母菌株の培地上清液）。
【図２１】図２１の（Ａ）はｐＹＧＴ３−ＩＬ３２αを含有する組み換え酵母菌株の流加培養式発酵プロファイルを示す図、（Ｂ）は発酵時間に応じて培地に分泌されるタンパク質をＳＤＰ−ＰＡＧＥで分析した結果を示す図である。
【図２２】図２２はヒト成長ホルモンを分泌する酵母菌株の培地上清液に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す図である。（レーンＭ：タンパク質サイズマーカー；レーンＮ：陰性対照群として形質転換されていない酵母菌株の培地上清液；レーン１：ｐＹＧＴ１−ｈＧＨを含有する酵母菌株の培地上清液；レーン２：ｐＹＧＴ２−ｈＧＨ；レーン３：ｐＹＧＴ３−ｈＧＨ；レーン４：ｐＹＧＴ４−ｈＧＨ；レーン５：ｐＹＧＴ５−ｈＧＨ；レーン６：ｐＹＧＴ６−ｈＧＨ；レーン７：ｐＹＧＴ７−ｈＧＨ；レーン８：ｐＹＧＴ８−ｈＧＨ；レーン９：ｐＹＧＴ９−ｈＧＨ；レーン１０：ｐＹＧＴ２１−ｈＧＨ；レーン１１：ｐＹＧＴ１３−ｈＧＨ；レーン１２：ｐＹＧＴ２５−ｈＧＨ；レーン１３：ｐＹＧＴ１７−ｈＧＨ；レーン１４：ｐＹＧＴ２２−ｈＧＨ；レーン１５：ｐＹＧＴ３２−ｈＧＨ；レーン１６：ｐＹＧＴ１９−ｈＧＨ；レーン１７：ｐＹＧＴ２７−ｈＧＨ；レーン１８：ｐＹＧＴ１１−ｈＧＨ；レーン１９：ｐＹＧＴ４０−ｈＧＨ；レーン２０：ｐＹＧＴ４３−ｈＧＨ；レーン２１：ｐＹＧＴ４４−ｈＧＨ）
【図２３】図２３の（Ａ）はｐＹＧＴ１８−ｈＧＨを含有する組み換え酵母菌株の流加培養式発酵プロファイルを示す図、（Ｂ）は発酵時間に応じて培地に分泌されるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示す図である。
【図２４】図２４は単方向欠損法(unidirectional deletion method)を用いて選別されたＯＲＦからＴＦＰライブラリーを製造する過程を示す図である。
【図２５】図２５はＢＬＡＳＴサッチによって選別されたＯＲＦから単方向欠失したＴＦＰライブラリーを構築して酵母菌株に形質転換させた後、無作為的に選別された酵母形質転換体の培地上清液に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。
【図２６】図２６は３５種の選別されたＯＲＦから単方向欠失したＴＦＰライブラリーを構築して酵母菌株に形質転換させた後、無作為的に選別された酵母形質転換体の培地上清液に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。
【図２７】図２７はヒトインスリン様成長因子を分泌する酵母菌株の培地上清液に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット（抗−ｈＩＧＦ）を示す図である（レーンＭ：タンパク質サイズマーカー；レーン１：ｐＹＧａ−ＭＦａ−ｈｌＧＦを含有する酵母菌株の培地上清液；レーン２：ｐＹＧａ−Ｔｌα−ＩＧＦ；レーン３：ｐＹＧａ−Ｔ２α−ＩＧＦ；レーン４：ｐＹＧａ−Ｔ３α−ＩＧＦ；レーン５：ｐＹＧａ−Ｔ４α−ＩＧＦ）。
【図２８】図２８はヒトカスパーゼ−１およびサブユニットＰ１０を分泌するＴＦＰベクターで形質転換させた酵母菌株の培地上清液に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である（レーンＭ：タンパク質サイズマーカー；レーン１：ｐＹＧＴ１−ｈＰ１Ｏを含有する酵母菌株の培地上清液；レーン２：ｐＹＧＴ２−ｈＰ１０；レーン３：ｐＹＧＴ３−ｈＰ１０；レーン４：ｐＹＧＴ４−ｈＰ１０；レーン５：ｐＹＧＴ５−ｈＰ１０；レーン６：ｐＹＧＴ６−ｈＰ１０；レーン７：ｐＹＧＴ７−ｈＰ１０；レーン８：ｐＹＧＴ８−ｈＰ１０；レーン９：ｐＹＧＴ９−ｈＰ１０；レーン１０：ｐＹＧＴ２１−ｈＰ１０；レーン１１：ｐＹＧＴ１３−ｈＰ１０；レーン１２：ｐＹＧＴ２５−ｈＰ１０；レーン１３：ｐＹＧＴ１７−ｈＰ１０；レーン１６：ｐＹＧＴ２２−ｈＰ１０；レーン１８：ｐＹＧＴ１８−ｈＰ１０；レーン１９：ｐＹＧＴ３３−ｈＰ１０；レーン１９：ｐＹＧＴ３３−ｈＰ１０；レーン２０：ｐＹＧＴ１９−ｈＰ１０；レーン２１：ｐＹＧＴ２７−ｈＰ１０；レーン２２：ｐＹＧＴ１１−ｈＰ１０；レーン２４：ｐＹＧＴ３９−ｈＰ１０；レーン２５：ｐＹＧＴ４０−ｈＰ１０；レーン２８：ｐＹＧＴ４３−ｈＰ１０；レーン２９：ｐＹＧＴ４４−ｈＰ１０；レーン３２：陰性対照群）。
【図２９】図２９はヒトＩＬ−３２ガンマを分泌する酵母菌株の培地上清液に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット（抗−ｈＩＬ３２）結果を示す図である（レーンＭ：タンパク質サイズマーカー；レーンＣ：陰性対照群として形質転換されていない酵母菌株の培地上清液；レーン１：ｐＹＧＴ１−ＩＬ３２γ；レーン２：ｐＹＧＴ２−ＩＬ３２γ；レーン３：ｐＹＧＴ３−ＩＬ３２γ；レーン４：ｐＹＧＴ４−ＩＬ３２γ；レーン５：ｐＹＧＴ５−ＩＬ３２γ；レーン６：ｐＹＧＴ６−ＩＬ３２γ；レーン７：ｐＹＧＴ７−ＩＬ３２γ；レーン８：ｐＹＧＴ８−ＩＬ３２γ；レーン９：ｐＹＧＴ９−ＩＬ３２γ；レーン１０：ｐＹＧＴ２１−ＩＬ３２γ；レーン１１：ｐＹＧＴ１３−ＩＬ３２γ；レーン１２：ｐＹＧＴ２５−ＩＬ３２γ；レーン１３：ｐＹＧＴ１７−ＩＬ３２γ；レーン１６：ｐＹＧＴ２２−ＩＬ３２γ；レーン１８：ｐＹＧＴ１８−ＩＬ３２γ；レーン１９：ｐＹＧＴ３３−ＩＬ３２γ；レーン２０：ｐＹＧＴ１９−ＩＬ３２γ；レーン２１：ｐＹＧＴ２７−ＩＬ３２γ；レーン２２：ｐＹＧＴ１１−ＩＬ３２γ；レーン２４：ｐＹＧＴ３９−ＩＬ３２γ；レーン２５：ｐＹＧＴ４０−ＩＬ３２γ；レーン２８：ｐＹＧＴ４３−ＩＬ３２γ；レーン２９：ｐＹＧＴ４４−ＩＬ３２γ；レーン３３：ｐＹＧＴ４８−ＩＬ３２γ；レーン３５：ｐＹＧＴ５０−ＩＬ３２γ；レーン３６：ｐＹＧＴ５１−ＩＬ３２γ；レーン３７：ｐＹＧＴ５２−ＩＬ３２γ；レーン３９：ｐＹＧＴ５４−ＩＬ３２γ）。
【図３０】図３０はヒトＩＬ−２を分泌する酵母菌株の培地上清液に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット（抗−ｈＩＬ２）結果を示す図である（レーンＭ：タンパク質サイズマーカー；レーン１：ＹＧａＳＷ−ｐＳＵＮ−ＩＬ２を含有する酵母菌株の培養上清液；レーン２：ＹＧａＳＷ−ｐＳＥＤ−ＩＬ２；レーン３：ＹＧａＳＷ−ｐＵＮＫ−ＩＬ２；レーン４：ＹＧａＳＷ−ｐＭＵＣ−ＩＬ２）。
【図１】
2009501020.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2009501020.tif 000029
【図２２】
2009501020.tif 000030
【図２３】
2009501020.tif 000031
【図２４】
2009501020.tif 000032
【図２５】
2009501020.tif 000033
【図２６】
2009501020.tif 000034
【図２７】
2009501020.tif 000035
【図２８】
2009501020.tif 000036
【図２９】
2009501020.tif 000037
【図３０】
2009501020.tif 000038
【配列表】
2009501020000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月12日(2008.3.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質に特異的なＴＦＰを発掘する方法であって、
（ｉ）レポータータンパク質の欠失した複数の宿主細胞に複数の線形ベクター、および目的タンパク質をコードする核酸配列を形質転換させ、形質転換された複数の宿主細胞を製造する段階であって、前記線形ベクターは、核酸断片ライブラリーの核酸断片、およびＮ末端アミノ酸の欠失したレポータータンパク質をコードする核酸配列を含み、前記目的タンパク質をコードする核酸配列は、３’末端には前記レポータータンパク質から欠失したＮ末端アミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、５’末端にはリンカーＤＮＡを含み、
（ｉｉ）前記形質転換された複数の宿主細胞を、前記線形ベクターおよび前記目的タンパク質をコードする核酸配列の細胞内(in vivo)組み換えが効率的に行われる条件の下で培養する段階と、
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）の形質転換された複数の宿主細胞から、レポータータンパク質の活性を示す細胞を選別する段階と、
（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）で選別された細胞から、前記目的タンパク質の分泌を誘導する核酸断片を含むＴＦＰを確認する段階とを含んでなる、方法。
【請求項２】
目的タンパク質に特異的なＴＦＰライブラリーを発掘する方法であって、
（ｉ）レポータータンパク質の欠失した複数の宿主細胞に複数の線形ベクター、および目的タンパク質をコードする核酸配列を形質転換させ、形質転換された複数の宿主細胞を製造する段階であって、前記線形ベクターは、核酸断片ライブラリーの核酸断片、およびＮ末端アミノ酸の欠失したレポータータンパク質をコードする核酸配列を含み、前記目的タンパク質をコードする核酸配列は、３’末端には前記レポータータンパク質から欠失したＮ末端アミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、５’末端にはリンカーＤＮＡを含み、
（ｉｉ）前記形質転換された複数の宿主細胞を、前記線形ベクターおよび前記目的タンパク質をコードする核酸配列の細胞内(in vivo)組み換えが効率的に行われる条件の下で培養する段階と、
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）の形質転換された複数の宿主細胞から、レポータータンパク質の活性を示す細胞を選別する段階と、
（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）で選別された細胞から、それぞれ前記目的タンパク質の分泌を誘導する核酸断片を含むＴＦＰライブラリーを確認する段階とを含んでなる、方法。
【請求項３】
前記核酸断片ライブラリーは、植物、バクテリア、酵母、カビまたは動物のゲノム性ＤＮＡまたはｃＤＮＡに由来したことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸断片ライブラリーは、組み換えＤＮＡに由来したことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸断片ライブラリーは、予備選択された候補者ＴＦＰライブラリーであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記予備選択された候補者ＴＦＰライブラリーは、核酸断片ライブラリーおよびレポータータンパク質をコードする核酸を含む多様なベクターを、レポータータンパク質の欠失した複数の宿主細胞に形質転換させ、成長した細胞を集め、細胞からベクターを分離し、ベクターから核酸断片を分離してそれぞれレポータータンパク質の分泌を誘導する核酸断片を含むＴＦＰライブラリーを収得することにより構築されたライブラリーであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記予備選択された候補者ＴＦＰライブラリーは、（ｉ）予め確認された一つまたはそれ以上のＴＦＰと相同の予備分泌シグナルを含む遺伝子；（ｉｉ）分泌シグナル配列を含む遺伝子；（ｉｉｉ）小胞体を介して運搬されるタンパク質をコードする遺伝子を検索するためのゲノムデータベースで確認された配列から得られたことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記予備選択された候補者ＴＦＰライブラリーは、予め確認されたＴＦＰを多様化して得られたことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記予備選択された候補者ＴＦＰライブラリーは、予め確認されたＴＦＰ間にプリおよびプロシグナル配列を交換するように人為的に設計した核酸断片から得られたことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記予備選択された候補者ＴＦＰライブラリーは、一つまたはそれ以上の目的タンパク質に効果的な予め確認されたＴＦＰの集合である核心ＴＦＰライブラリーであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸断片は、１０００ｂｐより小さい大きさであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸断片ライブラリーは、ＤＮＡの酵素的切断によって製造されたことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸断片ライブラリーは、ｃＤＮＡ合成によって製造されたことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸断片ライブラリーは、組み換えＤＮＡ合成技術によって製造されたことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記組み換えＤＮＡ技術は、単方向性欠失(unidirectional deletion)を含むことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞は、植物、バクテリア、カビ、酵母または動物細胞から選ばれることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記宿主細胞は酵母菌株であり、前記核酸断片は酵母のゲノムまたはｃＤＮＡから分離されたことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記レポータータンパク質は、細胞の外部に分泌されるタンパク質であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
前記レポータータンパク質は、インベルターゼ(invertase)、スクラーゼ(sucrase)、セルラーゼ(cellulase)、キシラナーゼ(xylanase)、マルターゼ(maltase)、アミラーゼ(amylase)、グルコアミラーゼ(glucoamylase)、ガラクトシダーゼ(galactosidase)、ホスファターゼ、β−ラクタマーゼ(beta-lactamase)、リパーゼ(lipase)、およびプロテアーゼ(protease)よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主細胞は酵母であり、前記レポータータンパク質はインベルターゼであり、形質転換された宿主細胞はスクロースまたはラフィノースの存在下における生存能力で選別されたことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記宿主細胞は酵母であり、前記レポータータンパク質はアミラーゼであり、酵母菌株は澱粉分解活性がなく、形質転換された宿主細胞は澱粉分解能力で選別されたことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記レポータータンパク質の活性を示す細胞を選別する段階は、成長阻害剤に対して抵抗性を持つレポータータンパク質を用いて行うことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
前記レポータータンパク質の活性を示す細胞を選別する段階は、２つまたはそれ以上のレポータータンパク質を用いて行うことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記目的タンパク質は、植物、動物、または微生物に由来したことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
前記目的タンパク質はヒトタンパク質であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記目的タンパク質は、サイトカイン、血清蛋白質、コロニー刺激因子、成長因子、ホルモン、および酵素よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記目的タンパク質は、従来の組み換え生産方法を用いて生産し難いタンパク質であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記リンカーＤＮＡは２０ｂｐ長さ以上であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項２９】
前記リンカーＤＮＡは、プロテアーゼ認識配列をコードしてＴＦＰと目的タンパク質間の接合部位で切断を引き起こすことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項３０】
前記リンカーＤＮＡは、酵母ｋｅｘ２ｐ−認識配列、哺乳動物フューリン認識配列、Ｆａｃｔｏｒ−Ｘａ認識配列、エンテロキナーゼ認識配列、スブチリシン認識配列、タバコエッチウイルス認識配列、トロンビン認識配列またはユビキチン加水分解酵素認識配列をコードすることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記リンカーＤＮＡは、新和性タグをコードすることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項３２】
前記リンカーＤＮＡは、制限酵素認識部位をコードすることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項３３】
前記リンカーＤＮＡは、さらにｋｅｘ２ｐ様プロテアーゼ−またはＫｅｘ２ｐ認識配列をコードすることを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項２の方法によって確認されたＴＦＰまたはその断片またはその類似体。
【請求項３５】
前記ＴＦＰは、ＴＦＰ−９（配列番号２９）、ＴＦＰ−１３（配列番号３１）、ＴＦＰ−１７（配列番号３３）、ＴＦＰ−１８（配列番号３５）、ＴＦＰ−１９（配列番号３７）、ＴＦＰ−２０（配列番号３９）、ＴＦＰ−２１（配列番号４１）、ＴＦＰ−２５（配列番号４３）、ＴＦＰ−２７（配列番号４５）、ＴＦＰ−１１（配列番号６１）、ＴＦＰ−２２（配列番号６３）、ＴＦＰ−２９（配列番号６５）、ＴＦＰ−３４（配列番号６７）、ＴＦＰ−３８（配列番号６９）、ＴＦＰ−３９（配列番号１２９）、ＴＦＰ−４３（配列番号１３１）、ＴＦＰ−４４（配列番号１３３）、ＴＦＰ−４８（配列番号１３５）、ＴＦＰ−５２（配列番号１３７）、ＴＦＰ−５４（配列番号１３９）、ＴＦＰ−４０（配列番号１７５）、ＴＦＰ−５０（配列番号１７７）、ＴＦＰ−５１（配列番号１７９）、ＴＦＰ−５７（配列番号１８１）、ＴＦＰ−５８（配列番号１８３）、ＴＦＰ−５９（配列番号１８５）、ＴＦＰ−５（配列番号２００）、ＴＦＰ−６（配列番号２０２）、ＴＦＰ−７（配列番号２０４）、ＴＦＰ−８（配列番号２０６）、ＰｐＴＦＰ−１（配列番号８４）、ＰｐＴＦＰ−２（配列番号８６）、ＰｐＴＦＰ−３（配列番号８８）、およびＰｐＴＦＰ−４（配列番号９０）よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項２の方法によって確認された一つまたはそれ以上のＴＦＰまたはその断片またはその類似体を含む、ＴＦＰライブラリー。
【請求項３７】
ＴＦＰ−９（配列番号２９）、ＴＦＰ−１３（配列番号３１）、ＴＦＰ−１７（配列番号３３）、ＴＦＰ−１８（配列番号３５）、ＴＦＰ−１９（配列番号３７）、ＴＦＰ−２０（配列番号３９）、ＴＦＰ−２１（配列番号４１）、ＴＦＰ−２５（配列番号４３）、ＴＦＰ−２７（配列番号４５）、ＴＦＰ−１１（配列番号６１）、ＴＦＰ−２２（配列番号６３）、ＴＦＰ−２９（配列番号６５）、ＴＦＰ−３４（配列番号６７）、ＴＦＰ−３８（配列番号６９）、ＴＦＰ−３９（配列番号１２９）、ＴＦＰ−４３（配列番号１３１）、ＴＦＰ−４４（配列番号１３３）、ＴＦＰ−４８（配列番号１３５）、ＴＦＰ−５２（配列番号１３７）、ＴＦＰ−５４（配列番号１３９）、ＴＦＰ−４０（配列番号１７５）、ＴＦＰ−５０（配列番号１７７）、ＴＦＰ−５１（配列番号１７９）、ＴＦＰ−５７（配列番号１８１）、ＴＦＰ−５８（配列番号１８３）、ＴＦＰ−５９（配列番号１８５）、ＴＦＰ−５（配列番号２００）、ＴＦＰ−６（配列番号２０２）、ＴＦＰ−７（配列番号２０４）、ＴＦＰ−８（配列番号２０６）、ＰｐＴＦＰ−１（配列番号８４）、ＰｐＴＦＰ−２（配列番号８６）、ＰｐＴＦＰ−３（配列番号８８）、およびＰｐＴＦＰ−４（配列番号９０）またはその類似体またはその断片よりなる群から選ばれる２つまたはそれ以上のＴＦＰを含むことを特徴とする、請求項３６に記載のＴＦＰライブラリー。
【請求項３８】
ＴＦＰ−９（配列番号２９）、ＴＦＰ−１３（配列番号３１）、ＴＦＰ−１７（配列番号３３）、ＴＦＰ−１８（配列番号３５）、ＴＦＰ−１９（配列番号３７）、ＴＦＰ−２０（配列番号３９）、ＴＦＰ−２１（配列番号４１）、ＴＦＰ−２５（配列番号４３）、ＴＦＰ−２７（配列番号４５）、ＴＦＰ−１１（配列番号６１）、ＴＦＰ−２２（配列番号６３）、ＴＦＰ−２９（配列番号６５）、ＴＦＰ−３４（配列番号６７）、ＴＦＰ−３８（配列番号６９）、ＴＦＰ−３９（配列番号１２９）、ＴＦＰ−４３（配列番号１３１）、ＴＦＰ−４４（配列番号１３３）、ＴＦＰ−４８（配列番号１３５）、ＴＦＰ−５２（配列番号１３７）、ＴＦＰ−５４（配列番号１３９）、ＴＦＰ−４０（配列番号１７５）、ＴＦＰ−５０（配列番号１７７）、ＴＦＰ−５１（配列番号１７９）、ＴＦＰ−５７（配列番号１８１）、ＴＦＰ−５８（配列番号１８３）、ＴＦＰ−５９（配列番号１８５）、ＴＦＰ−５（配列番号２００）、ＴＦＰ−６（配列番号２０２）、ＴＦＰ−７（配列番号２０４）、ＴＦＰ−８（配列番号２０６）、ＰｐＴＦＰ−１（配列番号８４）、ＰｐＴＦＰ−２（配列番号８６）、ＰｐＴＦＰ−３（配列番号８８）、ＰｐＴＦＰ−４（配列番号９０）、ＴＦＰ−１（配列番号２１９）、ＴＦＰ−２（配列番号２２１）、ＴＦＰ−３（配列番号２２３）、ＴＦＰ−４（配列番号２２５）、およびＴＦＰ３２（配列番号２０８）またはその類似体またはその断片よりなる群から選ばれる６つまたはそれ以上のＴＦＰを含むことを特徴とする、請求項３６に記載のＴＦＰライブラリー。
【請求項３９】
請求項６の方法によって確認された１０またはそれ以上の核酸断片を含む、核酸断片ライブラリー。
【請求項４０】
請求項７の方法によって確認された１０またはそれ以上の核酸断片を含む、核酸断片ライブラリー。
【請求項４１】
請求項８の方法によって確認された１０またはそれ以上の核酸断片を含む、核酸断片ライブラリー。
【請求項４２】
請求項９の方法によって確認された１０またはそれ以上の核酸断片を含む、核酸断片ライブラリー。
【請求項４３】
ＴＦＰまたはその類似体またはその断片をコードする核酸配列および目的タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸であって、前記ＴＦＰは、ＴＦＰ−９（配列番号２９）、 ＴＦＰ−１３（配列番号３１）、ＴＦＰ−１７（配列番号３３）、ＴＦＰ−１８（配列番号３５）、ＴＦＰ−１９（配列番号３７）、ＴＦＰ−２０（配列番号３９）、ＴＦＰ−２１（配列番号４１）、ＴＦＰ−２５（配列番号４３）、ＴＦＰ−２７（配列番号４５）、ＴＦＰ−１１（配列番号６１）、ＴＦＰ−２２（配列番号６３）、ＴＦＰ−２９（配列番号６５）、ＴＦＰ−３４（配列番号６７）、ＴＦＰ−３８（配列番号６９）、ＴＦＰ−３９（配列番号１２９）、ＴＦＰ−４３（配列番号１３１）、ＴＦＰ−４４（配列番号１３３）、ＴＦＰ−４８（配列番号１３５）、ＴＦＰ−５２（配列番号１３７）、ＴＦＰ−５４（配列番号１３９）、ＴＦＰ−４０（配列番号１７５）、ＴＦＰ−５０（配列番号１７７）、ＴＦＰ−５１（配列番号１７９）、ＴＦＰ−５７（配列番号１８１）、ＴＦＰ−５８（配列番号１８３）、ＴＦＰ−５９（配列番号１８５）、ＴＦＰ−５（配列番号２００）、ＴＦＰ−６（配列番号２０２）、ＴＦＰ−７（配列番号２０４）、ＴＦＰ−８（配列番号２０６）、ＰｐＴＦＰ−１（配列番号８４）、ＰｐＴＦＰ−２（配列番号８６）、ＰｐＴＦＰ−３（配列番号８８）、およびＰｐＴＦＰ−４（配列番号９０）よりなる群から選ばれる、核酸。
【請求項４４】
請求項２の方法によって選別されたＴＦＰまたはその断片またはその類似体をコードする核酸配列と作動可能に連結された目的タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターを準備する段階と、前記ベクターを宿主細胞に形質転換させる段階と、目的タンパク質を生産することが可能な条件の下に宿主細胞を培養する段階とを含むことを特徴とする、目的タンパク質を生産する方法。
【請求項４５】
核酸断片ライブラリーからの核酸断片、およびＮ末端アミノ酸の欠失したレポータータンパク質をコードする核酸配列を含む、線形ベクター。
【請求項４６】
複数の線形ベクターおよび目的タンパク質をコードする核酸で形質転換させたレポータータンパク質の欠失した複数の宿主細胞であって、前記各線形ベクターは、核酸断片ライブラリーからの核酸断片、およびＮ末端アミノ酸の欠失したレポータータンパク質をコードする核酸配列を含み、前記目的タンパク質をコードする核酸は、３’末端には前記レポータータンパク質から欠失したＮ末端アミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、５’末端にはリンカーＤＮＡを含む、宿主細胞。
【国際調査報告】
2009501020.tif 000039
2009501020.tif 000040
2009501020.tif 000041