(57)【要約】  検出用の磁気ラベルと磁気センサとを用いて、流体サンプルにおけるターゲットの濃度を決定する方法が提供される。信号が特定の閾値レベルに到達した直後に信号の決定を行うことにより、効率的で正確な測定が実行されることが驚くべきことに発見された。別の実施形態では、信号が所定の閾値レベルに到達するとすぐ、変位ステップが使用される。
2009536342.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
感知表面を有する磁気感知デバイスを用いて、少なくとも１つの種類の分極可能又は分極された磁気ラベルを含む流体における少なくとも１つの種類のターゲットの濃度を決定する方法において、
前記感知表面にわたり少なくとも１つの種類の磁気ラベルを有する流体を提供するステップと、
前記表面に向かって前記磁気ラベルを引くステップと、
前記ラベルにより生成される信号を決定するステップとを有し、
前記信号が所定の閾値レベルに到達するとすぐ、前記信号の決定ステップが開始される、方法。
【請求項２】
前記方法が、前記表面に特異的にバインディングしているビーズと、非特異的にバインディングしている又はバインディングしていないビーズとを区別するため、前記センサ表面から前記ラベルを除去する、又は前記センサ表面の片側へ前記ラベルを移動するステップを有する変位ステップを更に有し、前記変位ステップは、前記信号が所定の閾値レベルに到達するとすぐ実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
磁気ラベルを用いるインキュベーションの開始と、所定の閾値レベルに到達するか又は変位ステップの瞬間との間の時間により、ターゲットの濃度が少なくとも部分的に決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記所定の閾値レベルが、前記センサ表面に特異的に付着されるＮｂ磁気ビーズにより生成される信号であり、前記Ｎｂ磁気ビーズは、該方法によりラベルとして適用され、等しいターゲット濃度で実行されるとき、予想される分散が該方法の出力における特定された必要分散より小さいよう、ＮｂがＮｂ／ｓｑｒｔ(Ｎｂ)に基づき選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
所定の閾値レベルが、前記センサ表面に特異的に付着される、少なくとも１０００の磁気ビーズのＮｂの値に対して生成される信号である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ターゲットの濃度が、特異的に付着されるラベルの濃度と付着していないラベルの濃度との間の比を計算することにより決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ターゲット濃度の反応速度決定と組み合わされる、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感知デバイスを用いて流体における少なくとも１種類の分極可能又は分極された磁気ラベルの濃度を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体内及び体外用途の両方に対する医療及び食品診断といった生物医学診断、動物診断、健康及び病気の診断、又は品質コントロール用の診断といった診断学の分野において、バイオセンサ又はバイオチップの使用が良く知られている。これらのバイオセンサ又はバイオチップは一般に、生物エンティティの解析を可能にするバイオチップのマイクロアレイの形式で使用される。例えば、ＤＮＡ(デオキシリボ核酸)、ＲＮＡ(リボ核酸)、たんぱく質又はホルモン若しくは薬といった小さな分子の解析を可能にする。今日では、少量の生物エンティティ、生物分子、又は生物エンティティの断片を解析するのに使用される多くのタイプのアッセイが存在する。例えば、結合アッセイ、競合アッセイ、置換アッセイ、サンドイッチアッセイ、又は拡散アッセイなどがある。生化学検査における課題は、変化する背景物質の濃度は高いのに(例えば、mmol.l-1)、流体サンプルにおいて検出されることになるターゲット分子の濃度は低い(例えば、pmol.l-1及びそれ以下)ことにより表される。ターゲットは、ペプチド、代謝物、ホルモン、たんぱく質、核酸、ステロイド、酵素、抗原、ハプテン、薬物、細胞要素又は組織要素等の生物エンティティとすることができる。背景物質又はマトリクスは、尿、血液、血清、唾液、又は他の人間由来若しくは人間由来でない液体若しくは抽出物とすることができる。ターゲットに付けられるラベルは、ターゲットの検出限界を改善する。ラベルの例は、光学ラベル、カラービーズ、蛍光化学群、酵素、光学バーコード、又は磁気ラベルである。
【０００３】
バイオセンサは一般に、捕捉分子を具備する特殊なバインディングサイト２を用いる感知表面１を利用する。これらの捕捉分子は、流体に存在する他の分子又は分子複合体と特異的にバインドすることができる。他の捕捉分子３及びラベル４が検出を容易にする。これは図１に示され、図１には、捕捉分子が結合されるバイオセンサ感知表面１が、他の生物エンティティ、例えばターゲット分子６又はターゲット６に対するバインディングサイト２を提供することが示される。溶液５は、追加的な捕捉分子３が結合されるターゲット６及びラベル４を含む。
【０００４】
ターゲット６及びラベル４は、特異な態様でバイオセンサ感知表面１のバインディングサイト２にバインドすることが可能にされる。この態様は、以下本書で「特異的に付着される」と表現される。
【０００５】
図面には、バイオアクティブエンティティ(例えば、捕捉分子３又はバインディングサイト２)が、固体キャリア(例えば、センサ表面１又はラベル４)に直接結合されるものとして描かれる。従来において知られるように、斯かるバイオアクティブ層は一般に、例えばバッファ層又はスペーサ分子といった中間エンティティを介して固体キャリアに連結される。表面における分子の高密度及び高生体活動を実現するため、斯かる中間エンティティが追加される。明確さ及び簡単化のため、中間エンティティは図面において省略されている。
【０００６】
感知表面１へのこの生体的付着と対照的に、ラベル４が、非特異的又は非生体的態様で感知表面１に付着されることもできる。即ち、特殊なターゲット分子６の仲介無しに表面１にバインドすることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
磁気バイオセンサにおいて、表面に特異的にバインドされたビーズの濃度の測定は、バインドしていない又は非特異的にバインドされたビーズの存在により、かく乱されること可能性がある。従って、バインドしていない又は非特異的にバインドされたビーズが表面から除去されたときのみ、信頼性のあるデータポイントが採取されることができる。
【０００８】
更に、生物アッセイは一般に、均衡に達するのに非常に長い時間がかかる。実際に、測定は、均衡に達するずっと前に実行される。
【０００９】
測定時間を減らすのに適した１つの方法は、いわゆる反応速度測定である。この方法は、時間の関数として信号の測定を利用する。その方法は、本願の詳細な説明においてより詳細に説明される。
【００１０】
特異的にバインドされたビーズに対してのみ特異的な反応速度測定を実行することを可能とするため、以下のシーケンスが反復的な態様で一般に適用される。
−  ビーズを表面に向かって引っ張る。そこでバインディングが行われることができる。
−  その後、表面に特異的にバインドしているビーズと、非特異的にバインドしている又はバインドしていないビーズとを区別するため、ビーズがその表面から引きずり出される。
−  この変位ステップの後、実際の信号を測定することができる。
【００１１】
必要とされる箇所で行われる(point of need)検査において、例えば、交通安全のため唾液を用いた薬物汚染のための路上での窓越し(through-the-window)テストにおいて、日々の使用に適うよう十分に頑丈なテスト装置を提供すること、及び十分早くかつ正確な結果を生み出すテスト方法を提供することが重要である。
【００１２】
本発明の目的は、迅速かつ正確なターゲット解析のための方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の第１の側面によれば、感知表面１を有する磁気感知デバイスを用いて、少なくとも１つの種類の分極可能又は分極された磁気ラベル４を含む流体５における少なくとも１つの種類のターゲット６の濃度を決定する感知方法が与えられる。その方法は、
上記感知表面１にわたり少なくとも１つの種類の磁気ラベル４を有する流体５を提供するステップと、
上記表面に向かって上記磁気ラベルを引くステップと、
上記ラベルにより生成される信号を決定するステップとを有し、
上記信号が所定の閾値レベルに到達するとすぐ、上記信号の決定が開始される。
【００１４】
更なる側面においては、本発明は、上記表面に特異的にバインディングしているビーズと非特異的にバインディングしている又はバインディングしていないビーズとを区別するため、上記センサ表面から上記ラベルを除去する、又は上記センサ表面の片側へ上記ラベルを移動するステップを有する変位ステップを更に有する方法に関する。上記変位ステップは、上記信号が所定の閾値レベルに到達すると実行される。
【００１５】
請求項における方法において、ターゲット濃度は最も好ましくは、磁気ラベルを用いるインキュベーション(incubation)の開始と信号の決定との間の時間、又は磁気ラベルを用いるインキュベーションの開始と変位ステップとの間の時間を、その決定された時間と組み合わせることにより決定される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明が特定の実施形態及び特定の図面を参照して説明されることになるが、本発明はそれに限定されるものではなく、請求項によってのみ限定されるものである。記述される図面は、概略を表すものでしかなく、非限定的である。図面において、説明目的のため、いくつかの要素のサイズは、誇張される場合があり、実際のスケール通りに描かれていない場合がある。
【００１７】
単数名詞を参照するのに、「a」「an」「the」等の不定冠詞又は定冠詞が使用される場合、これは、特に記述が無い限り、その名詞の複数形を含む。
【００１８】
更に、明細書及び請求項における第１、第２、第３等の用語は、同様な要素間を識別するのに使用され、必ずしも順次的な順序又は実際の順序を表すものではない。そのように使用されるこれらの用語は、適切な環境下において互いに交換可能であり、本書に述べられる本発明の実施形態は、本書に説明又は図示される順序以外の他の順番で動作することができる点を理解されたい。
【００１９】
更に、明細書及び請求項におけるトップ(表面)、ボトム(底面)、オーバー(上)、アンダー(下)等の用語は、説明目的で使用されるものであり、必ずしも相対的な位置を表すものではない。そのように使用されるこれらの用語は、適切な環境下において交換可能であり、本書に述べられる本発明の実施形態は、本書に説明又は図示される方向以外の他の方向で動作することができる点を理解されたい。
【００２０】
明細書及び請求項における「comprising（有する）」という用語は、その後に記載される手段に限定されるものとして解釈されるべきではないことに留意されたい。即ち、その用語は、他の要素又はステップを除外するものではない。従って、「手段Ａ及び手段Ｂを有するデバイス」という表現の範囲は、要素Ａ及び要素Ｂのみからなるデバイスに限定されるべきではない。それは、本発明に関して、デバイスの関連要素がＡとＢとのみであることを意味する。
【００２１】
以下において、本発明は、主に磁気ビーズとも呼ばれる磁気ラベルを参照して説明されることになる。磁気ラベルは、必ずしも球状をしている必要はなく、球形、シリンダ、ロッド、立方体、卵形等の形状といった任意の適切な形状とすることができるか、又は規定された若しくは一定の形状を持たないものとすることができる。「磁気ラベル」という用語は、そのラベルが、１つ又は複数の磁気粒子の任意の適切な形式を含むことを意味する。その磁気粒子は、例えば、磁気、反磁性、常磁性体、超常磁性体、強磁性体といったものである。即ち、磁場において、永久的又は一時的のいずれかの態様で、磁気双極子を生成する任意の磁化の形式を含む。本発明を実行するために、磁気ラベルの形状に何ら制限はないが、現在のところ、信頼性高く製造するには、球状のラベルが最も簡単で安価である。磁気ラベルのサイズは、それ自体、本発明の限定要素ではない。しかしながら、バイオセンサにおける相互作用を検出するには、小さなサイズの磁気ラベルが有利となるであろう。ミクロンサイズの磁気ビーズが磁気ラベルとして使用されるとき、小型化を制限する。なぜなら、すべてのラベルが、少なくとも１μｍ２の領域を占有するからである。更に、小さな磁気ラベルは、より良い拡散特性を持ち、沈殿に対して、大きなビーズより低い傾向度を一般に示すからである。本発明によれば、１〜３０００ｎｍの間のサイズ範囲にある磁気ラベルが使用される。より好ましくは、５〜５００ｎｍの間が使用される。
【００２２】
本発明による方法は、流体における生物エンティティの濃度の決定に特に適している。
【００２３】
本発明の明細書及び請求項において、「生物エンティティ」という用語は、広く解釈されるべきである。それは、たんぱく質、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ，脂質、リン脂質、砂糖のような糖質等のバイオアクティブ分子を含む。「生物エンティティ」という用語は、細胞メンブレーンの一部、特に、レセプタを含むことができる細胞メンブレーンの一部といった細胞片も含む。生物エンティティという用語は、可能性として生物エンティティにバインドすることができる小さな複合体にも関する。例えば、ホルモン、薬物、リガンド、抑制因子、阻害物質、及びモジュレータである。生物エンティティは、アイソレートされた又は合成された分子とすることもできる。合成された分子は、変更されたアミノ酸又はヌクレオチドといった非自然的に生じた複合物を含むことができる。生物エンティティは、血液、血清、唾液、他の体液若しくは分泌物、抽出物、組織サンプル、細胞培養からのサンプル、又は肥料、飼料、水サンプル等の生物エンティティを有する任意の他のサンプルといった媒体又は流体においても生じることができる。
【００２４】
本発明は、複合生体サンプルにおける少なくとも１種類のターゲット、特に生物エンティティの濃度を決定する方法を与える。
【００２５】
本発明において、特異的に付着されたラベルの濃度と付着されていないラベルの濃度との比、即ち、(センサ表面における磁気ラベルの濃度により表される)バインディング率と(大量の液体における磁気ラベルの濃度により表される)露出率との比を計算することにより、ターゲットの濃度を決定することが特に好ましい。本発明によるターゲットの濃度は、パラメタεに比例する。これは、アッセイのタイプに依存して、ラベル４又はセンサ表面１にあるバインディング部分の部分占有を表すパラメタである。このパラメタは、アッセイに依存する態様で、流体におけるターゲット濃度に関連付けられる。
【００２６】
本発明のこれら及び他の特性、特徴及び利点は、例示を介して、本発明の原理を説明する対応する図面を考慮し、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。説明は、例示のためだけに与えられるものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。以下に示される参照符号は、添付された図面を参照してのものである。
【００２７】
生物アッセイにおいて、アッセイ媒体に追加される必要があるラベル化された複合物(例えば抗体)の量を慎重に調整することが普通に行われている。過度のラベルは、反応の良くないアッセイをもたらすことになる。なぜなら、あまりに多くのラベルが、非特異的な態様でセンサ表面にバインドすることをもたらすからである。ラベルの不足は、信号対ノイズ比の低減をもたらす。多くのアッセイにおいて、完了するまでアッセイは実行され、その完了後、最終信号が測定される。
【００２８】
驚くべきことに、再生可能アッセイ(reproducible assay)を得るには、特異的にバインドされた磁気ラベルにより生成される特異信号の測定のための開始時間、及び磁気洗浄(変位ステップ)のための開始時間は、測定時間によっては決定されることがないが、沈殿曲線の信号レベルをその信号に対する固定された所定の閾値レベルと比較することにより決定されることがわかった。これは、本発明による方法において、信号測定及びオプションの変位ステップの開始時間が、信号が所定の閾値レベルに到達することで決定されることを意味する。この閾値レベルは、センサ表面に特異的に連結される磁気ビーズの最小数を表す。反応速度測定と組み合わせて、これは、比較的短い時間フレームにおける正確な測定ポイントを与える。
【００２９】
従って、第１の側面において、本発明は、感知表面１を有する磁気感知デバイスを用いて、少なくとも１つの種類の分極可能又は分極された磁気ラベル４を含む流体５における少なくとも１つの種類のターゲット６の濃度を決定する方法に関し、その方法は、
その感知表面１にわたり少なくとも１つの種類の磁気ラベル４を有する流体５を提供するステップと、
その表面に向かって磁気ラベルを引くステップと、
そのラベルにより生成される信号を決定するステップとを有し、
その信号が所定の閾値レベルに到達するとすぐ、その信号の決定が開始される。
【００３０】
この所定の閾値レベルは、各磁気センサの設定に対して個別に決定されることができる。
【００３１】
本発明による方法は、以下の利点を提供する。
【００３２】
最初に、信号対温度ノイズ及び信号対統計ノイズの観点から、そのアッセイは捕捉されるビーズの数にあまり影響を受けなくなる(less sensitive)。第２に、そのアッセイは、最適化された短い時間フレームで実行されることができる。なぜなら、唯一の待ち時間は、テストの正確性要件を満たすのに必要な時間だからである。第３に、サイズ／磁化率格差があまり重要でなくなる。大きなビーズ又は高い磁化率を持つビーズがいくつか存在しても、合理的にうまく規定された数のビーズに対して平均化される。これは重要である。なぜなら、商業的に利用可能な磁気ビーズ調整品は、サイズ及び磁化率におけるかなりの格差を示す場合があるからである。
【００３３】
上述されたように、磁気バイオセンサは一般に、センサ表面に特異的にバインドされるビーズにできるだけ反応するように作られる。しかしながら、その表面に特異的にバインドされたビーズ(又はラベル)の濃度の測定は、バインドしていない又は非特異的にバインドされたビーズ(又はラベル)の存在によりかく乱される。従って、ラベル濃度を介してターゲット濃度を測定するための信頼性の高いデータポイントは好ましくは、バインドしていない及び／又は非特異的にバインドされたビーズが表面から除去されるとき取られる。非特異的にバインドされたビーズの表面からの斯かる除去は例えば、洗浄ステップとも呼ばれる変位ステップにおいてなされる。磁気センサにおいて、斯かる洗浄ステップはしばしば、磁気洗浄として実行される。磁気洗浄においては、非特異的にバインドされたビーズをセンサ表面からやさしく引き離すのに磁場が使用される。印加される力は、非特異的にバインドされたビーズを除去するには十分強く、特異的にバインドされたビーズをその場に保つよう十分弱いものである。
【００３４】
従って、続くシーケンス又はサイクルが好ましくは、一度又は繰り返しの態様で適用される。
ビーズが表面に向かって引かれる。それにより、バインディングが起こる。
その後、表面に特異的にバインディングしているビーズと非特異的にバインディングしている又はバインディングしていないビーズとを区別するため、ビーズがセンサ表面から除去されるか、又は片側へ移動されることができる。
この変位ステップの後、特異的にバインドされたビーズの実際の信号を測定することができる。
【００３５】
こうして、好ましい側面において、本発明は、表面に特異的にバインディングしているビーズと非特異的にバインディングしている又はバインディングしていないビーズとを区別するため、センサ表面からラベルを除去するか、又は片側へ移動するステップを有する変位ステップを更に有する方法に関する。その変位ステップは、信号が所定の閾値レベルに到達するとすぐ実行される。
【００３６】
好ましくは、信号を測定するため及び最適な磁気洗浄を開始するための所定の閾値レベルは、センサ表面に特異的に付着するＮｂ磁気ビーズにより生成される信号である。このビーズは、本方法においてラベルとして適用される。
【００３７】
信号が所定の閾値レベルに到達するのを待つことは、センサにおける磁気ビーズの最小数を保証する。これは、信号対温度ノイズ及び信号対統計ノイズの両方に対する最小の信号対ノイズ比を保証する。統計ノイズは、表面におけるビーズのランダムな到着過程によるものである。同じ条件(アンサンブル)にある多数回のテストに対する固定時間の後の表面におけるビーズ数のヒストグラムは、ポアソン分布をもたらすことになる。これは、ビーズ数における分散が、捕捉されたビーズＮｂの平均数に依存することを意味する。この分散は、信号対統計ノイズ比Ｎｂ／ｓｑｒｔ(Ｎｂ)をもたらすｓｑｒｔ(Ｎｂ)に等しい。３％の分散に対して、Ｎｂは、少なくとも１０００であることが必要である。なぜなら、１０００／ｓｑｒｔ(１０００)＝１０００／３２＝３２だからである。ここでは、１０００のビーズに対応する信号レベルを計算又は測定することができる。これは、３００及び１０００ｎｍ(図４参照)のビーズに対して実行される。このプロットから、(３００ｎｍのビーズに対して)１００のビーズが、０．５マイクロＶを与えることがわかる。即ち、１０００のビーズであれば、５マイクロＶを与えることになる。このプロットを得るのに使用されたセンサは、後述される。
【００３８】
温度ノイズは、電子機器が適切にデザインされる場合、センサの抵抗により与えられる(特定の例では、公称５００オームである)。平均二乗(ｒｍｓ)温度ノイズ電圧は、Ｕｎ＝ｓｑｒｔ(４ｋＴＲ＊ＢＷ)に等しい。ここで、ｋはボルツマン定数であり、Ｔは絶対温度であり、Ｒはセンサ抵抗であり、及びＢＷは測定の帯域幅(即ち、電子機器の帯域幅)である。これは、ｒｍｓ温度ノイズ電圧が２．８ｎＶ／ｓｑｒｔ(Ｈｚ)であることを意味する。これは、帯域幅が制限された状態において(ほとんどの場合、生体測定には十分である)、統計ノイズが支配的であることを意味する。好ましいシステムでは、Ｎｂは、特異的にバインドするビーズの数における統計的な変動が原因による変動が３％より小さくなることを実現するため１０００より大きくとられる。好ましい実施形態において、アッセイのための時間は、ターゲット濃度に応じて変動することに留意されたい。ターゲット濃度は、測定信号から、及び磁気ラベルを用いるインキュベーションの開始と信号の測定との間に必要とされる時間から、又は、測定信号から及び磁気ラベルを用いるインキュベーションの開始と変位ステップとの間に必要とされる時間から抽出されることができる。
【００３９】
本発明による方法は好ましくは、ターゲット濃度の反応速度測定と結合される。反応速度測定は、以下に述べられる。
【００４０】
図５は、表面にバインドされるラベルと、センサの近傍におけるバインドされていないビーズとにある程度まで反応するセンサの信号を描く。信号は、時間の関数として描かれ、それは、表面バインディング曲線の傾きがどのように得られることができるかを示す。本発明の内容において、表面感知信号は、ターゲット依存センサ信号Ｓの生信号とも呼ばれる。点線で表される表面感知信号の傾きを決定するのに、上述のシーケンス又はサイクルが使用される。点線で表される信号は、ターゲット依存センサ信号Ｓと同一である。従って、この信号の測定される傾きは、流体サンプルにおけるターゲット濃度の決定をもたらす。上述したシーケンス又はサイクルが図５にも表され、ここでは、参照符号２１０が、表面付近のラベルを許可するステップ、又は表面にラベルを引くステップを表す。参照符号２２０は、ラベルを除去するステップ、又は表面からラベルを引くステップを表す。
【００４１】
参照符号２１０により表されるステップの間、センサ表面の近傍におけるバインドされていないビーズだけでなく、センサ表面にバインドしているビーズにより信号がもたらされる。参照符号２１０及び２２０により表されるステップの間の信号を用いて、バインドしていないビーズが原因による信号だけでなく、表面バインド信号が得られることができる。結果として、センサ表面にバインドされたラベルの濃度だけでなく、溶液におけるラベルの濃度も得られることができる。本発明によれば、これら２つの測定は、流体におけるターゲット濃度の非常に正確な決定をもたらす。
【００４２】
この好ましい実施形態において、曲線の傾きは、センサ表面に対するラベルのバインディング率に比例する。測定時間ｔｍの間の信号の平均勾配ｄＳ／ｄｔは、(ｔｍの終わりでの)信号Ｓを測定時間ｔｍで割ることにより与えられる。アッセイに依存する態様で、ターゲット濃度は、バインディング率に関連付けられる。信号が高い信号対ノイズ比で記録されるとき、ターゲット濃度は非常に正確に決定されることができる。磁気抵抗バイオセンサによる検出の場合、高い信号対ノイズ比は、高電流を使用することにより実現されることができる。高電流は、加熱又はバイオマテリアルの不可逆変化をもたらす可能性がある。しかしながら、信号がアッセイの終わりの時点で測定されるとき、加熱及びバイオマテリアルの変化は重要ではない。言い換えると、終了時点での信号(即ち、バインディングサイトの近傍における溶液中のバインドされたラベル及び／又はバインドされていないラベル)は、非常に高い信号対ノイズを用いて測定されることができる。このことは、ターゲット濃度の決定の精度を高める。これは、インキュベーションのための時間セット内にセンサ表面に実際に十分なビーズが特異的にバインドすることを必要とする点を理解されたい。
【００４３】
一般に、感知デバイスは、センサ表面の近傍にはあるものの特異的に付着はしていないラベルだけでなくセンサ表面に特異的に付着されるラベル(タイプ１バインディング。上記参照)に反応することになる。この第２の代替例は、タイプ２の態様でセンサ表面にバインドするラベル、又は表面の近傍には位置するがセンサ表面には付着していないラベルのいずれかによって実現されることができる。
【００４４】
本発明によれば、これらの異なる磁気ラベル濃度が独立に測定されるか、又は測定される信号が、バルク信号と比べて強く、バルク信号を測定する必要がないかのいずれかである。(例えば、異なる既知のターゲット濃度において複数の実験を実行することにより)特異的にバインドされたビーズからの信号とバルク信号との間の比を推定することは、当業者の能力の範囲内である。所定のレベルを決定するため、(変位後も残っている)特異的にバインドされたビーズの数の推定を生成するのに、上述した比の推定が使用されることができる。変位ステップの後、センサ表面に少なくともＮｂビーズが残ることを確実にするため、その所定のレベルで、その変位ステップが実行されるべきである。
【００４５】
本発明の１つの実施形態によれば、例えば、特異的に付着されたラベル対非特異的に付着されたラベル及び付着されていないラベルでの回転的及び／又は並進的動きにおける差を介して他のラベルと特異的に付着された磁気ラベルとを区別することが可能である。例えば、磁場を印加することが可能であり、動き依存の信号を決定することが可能である。例えば、電流ワイヤ又は磁石により、斯かる磁場は、磁気ラベルをセンサ表面へと引き付けたり、磁気ラベルをセンサ表面から遠ざけたり、又はセンサ表面にわたり磁気ラベルを動かすよう、変調されることもできる。磁気ラベルの異なる位置に対する磁気センサ要素の信号の比較は、センサ表面の近傍における移動する磁気ラベルの数の決定を可能にする。上記移動する磁気ラベルは、測定されることになる溶液に存在するものである。
【００４６】
本発明の更に好ましい実施形態において、磁場生成手段は、センサデバイスに位置する構造体を備える２次元ワイヤ構造体である。
【００４７】
前述されたように、感知デバイスは、例えばタイプ２のラベルバインディングのようにセンサ表面の近傍にはあるものの特異的に付着はしていないラベル、又はセンサ表面の近傍にはあるがセンサ表面に付着していないラベルだけでなく、センサ表面に特異的に付着されるラベル(タイプ１バインディング)に反応することになる。本発明によれば、これらの異なる磁気ラベル濃度は好ましくは、独立に測定される。
【００４８】
感知デバイスのすべての実施形態に対して、磁気センサ要素は、ＡＭＲ(異方性磁気抵抗)、ＧＭＲ(巨大磁気抵抗)、又はＴＭＲ(トンネル磁気抵抗)センサ要素のいずれかとすることができる。もちろん、ホールセンサ要素又はＳＱＵＩＤ(超伝導量子干渉デバイス)といった他の原理に基づかれる磁気抵抗要素も、本発明による使用に適している。
【００４９】
そのデバイスは、競合、阻害、置換、サンドイッチアッセイ等の幅広い種々のアッセイ形式のために用意されることができる。従来技術において知られるように、生化学又は化学種(例えば、ターゲット、ターゲット状分子、ラベル、バインディングサイト)は、一度又はシーケンシャルに一緒に持ち運ばれることができる。速度を上げるため、試薬を一度に一緒に持ち運ぶことが有利である。後者の場合、その過程の反応速度及びバインディング処理の事実上のシーケンスは、例えば、拡散及びバインディング速度に依存する。
【００５０】
センサ又はチップ基板は、例えばガラス、プラスチック、シリコン又はこれらの結合といった有機又は無機物質の任意の適切な機械的担体とすることができる点に留意されたい。感知デバイス１０の好ましい実施形態において、電子回路３０が、基板２０に与えられる。その電子回路３０は、基板２０に位置する磁気センサ要素１１により収集又は測定される信号又はデータを収集するために与えられる。本発明の別の実施形態では、電子回路３０は、基板２０の外側にも配置されることができる。
【００５１】
磁場生成手段１３は、例えば、(回転する又は回転しない)磁気物質、及び／又は電流ワイヤ１３といったコンダクタとすることができる。上述の実施形態において、磁場生成手段１３は好ましくは、電流ワイヤを用いて生成される。ラベル４の回転及び／又は並進的運動の検出は好ましくは、磁気的に行われることができる。本発明の第１の実施形態だけでなくそれ以降の実施形態において、磁気検出は好ましくは、一体化された磁気センサ要素１１を用いることにより実行されることができる。さまざまなタイプのセンサ要素１１が使用されることができる。例えば、ホールセンサ、磁気インピーダンス、ＳＱＵＩＤ、又は任意の適切な磁気センサである。磁気センサ要素１１は好ましくは、磁気抵抗要素として与えられる。例えば、ＧＭＲ、ＴＭＲ又はＡＭＲセンサ要素１１である。回転する磁場を生成する手段が、感知デバイス１０の基板２０に一体化される電流生成手段だけでなく、電流ワイヤを用いて与えられることができる。磁気センサ要素１１は、例えば、細長い(長くて細い)ストリップ構造を持つことができる。回転磁場は従って、その一体化された電流ワイヤにおける電流を用いて磁気ラベル４に印加されることができる。好ましくは、電流ワイヤは、それらが、磁気ラベル４が存在するボリュームにおいて磁場を生成するという態様で配置されることができる。
【００５２】
好ましい実施形態において、次のセンサが適用される。これは、図４のデータを得るのに使用されたセンサである。
【００５３】
チップ表面に磁気ラベルを備えるセンサの断面のスケッチが、図６に与えられる。一体化されたコンダクタを流れる励起電流が、励起場を生み出す。励起場により磁化されるラベルからの浮遊磁場が、結果としてＧＭＲセンサの抵抗変動を生じさせる。
【００５４】
検出プラットホームは通常、ＧＭＲに対して１ＭＨｚの周波数(ｆｓ)を備える１．１ｍＡＲＭＳの正弦曲線感知電流と、１．０５ＭＨｚの周波数(ｆｅ)を備える２５ｍＡＲＭＳの正弦曲線感知電流とをセンサの両方の励起ワイヤに供給する。これは、結果として、磁気信号として表される、５０ｋＨｚでの異なった信号を生じさせる。感知電流及び励起電流の周波数は、磁気信号の周波数(ｆｍ)が、増幅を容易にするためできるだけ低くなるよう選択される。しかしながら、最適なＳＮＲを維持するため、磁気信号の周波数は、アンプ(Ａ)により生成される１／ｆノイズが、温度ノイズに対して支配的であるような範囲の外側にあるべきである。センサ抵抗に重畳されるＧＭＲの１／ｆノイズは、スペクトルにおいてシフトし、感知電流周波数(ｆｓ)の周囲に存在する点に留意されたい。大きな感知信号と(ｆｅでの)クロストークを抑制するため、受動的な低域フィルタ(ＬＰＦ１)が採用される。それにより、検出された信号のダイナミックレンジが減らされる。５０ｋＨｚの磁気信号が、その後に低ノイズアンプにより増幅され、ベースバンド信号を得るため５０ｋＨｚの基準信号(Ｖｒｅｆ)により復調される。そのベースバンド信号の帯域幅は、生物アッセイの速度により決定される。センサ表面へのビーズバインディングの処理は、比較的ゆっくりしているので、ベースバンド信号の帯域幅は通常、数Ｈｚのみである。第２の低域フィルタ(ＬＰＦ２)が、帯域外ノイズを抑制する。その信号は、デジタル領域に変換され、追加的な評価のためＰＣとの間で通信される。
【００５５】
商業的に利用可能なビーズが使用される。即ち、直径３００ｎｍで、磁化率４・１０−２０ｍ３であるＡｄｅｍｔｅｃｈ粒子である。
【００５６】
本発明では、イムノアッセイへの本発明の適用に重きがおかれている。他のターゲット及び他のバインディングエンティティを備えるアッセイが使用されることができる点は、当業者には明らかであろう。例えば、核酸及びハイブリダイジングエンティティ(hybridizing entity)を利用するアッセイなどである。
【００５７】
上述の発明は、センサマルチプレキシング及び／又はラベルマルチプレキシングと結合されることができる点に留意されたい。センサマルチプレキシングでは、センサが異なるタイプのバインディングサイト２と共に使用される。またラベル４における捕捉分子３が、異なるタイプとすることもできる。ラベルマルチプレキシングでは、異なるタイプのラベル４が使用される。例えば、異なるサイズ又は異なる磁気特性を持つラベルが使用される。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】第２の捕捉分子が結合されるターゲットとラベルとを有する溶液において第１の捕捉分子が結合されるバイオセンサを示す図である。
【図２】バイオセンサの感知表面へのラベル４の可能なバインディング構成のいくつかの例を示す図である。
【図３】バイオセンサの感知表面へのラベル４の可能なバインディング構成のいくつかの例を示す図である。
【図４】ビーズ数対信号のプロットを示す図である。
【図５】表面にバインドされるラベルに反応し、かつセンサ表面の近傍においてバインドしていないビーズにある程度まで反応するセンサの信号を示す図であって、信号が時間の関数として描かれ、表面バインディング曲線の傾きがどのように得られることができるかを示す図である。
【図６】チップ表面に磁気ラベルを備えるセンサ断面を示す図である。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３．１ａ】
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【図３．１ｂ】
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【図３．２ａ】
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【図３．２ｂ】
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【図３．２ｃ】
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【図３．３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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