(57)【要約】本発明は、血管透過性を調節するための方法および組成物に関する。本発明は、血管透過性を上昇させることに関与するタンパク質およびシグナル伝達経路をブロックするための方法および組成物に関する。本発明は、ＰＡＫが血管外漏出を誘導するＭＬＣＫリン酸化を活性化する機序ならびにこの経路を調節するための組成物および方法を包含する。本発明は、血管透過性を調節する、特に血管透過性を阻害するための組成物および方法を対象とする。特に、本発明は、血管透過性の引き金を引くために重要なタンパク質の相互作用をブロックすることによって血管透過性を調節する方法を対象とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管透過性を調節する必要のある被験体において血管透過性を調節する方法であって、ＰＡＫ、ＰＩＸ、ＧＩＴ、ＭＥＫ、ＥｒｋおよびＭＬＣＫ調節経路から成る群より選択されるタンパク質調節経路の少なくとも１つのレギュレーターの有効量および医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物を該被験体に投与する工程を含み、該血管透過性は、ＰＡＫ、ＰＩＸ、ＧＩＴ、ＭＥＫ、ＥｒｋおよびＭＬＣＫから成る群より選択される少なくとも１つのタンパク質調節経路によって調節され、それによって血管透過性を調節する、方法。
【請求項２】
前記の少なくともレギュレーターが、前記タンパク質調節経路の少なくとも１つの阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レギュレーターが血管透過性を抑制する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記レギュレーターが血管透過性の上昇を抑制する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記阻害剤が、増殖因子が刺激する血管透過性の上昇を抑制する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記阻害剤が、サイトカインが刺激する血管透過性の上昇を抑制する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記阻害剤が、細菌毒素が刺激する血管透過性の上昇を抑制する、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記経路がＰＡＫ経路である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＡＫ経路がＰＡＫ−ＰＩＸ−ＧＩＴ−ＭＥＫ−Ｅｒｋ経路である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記阻害剤が、ペプチド、核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、キナーゼ阻害剤および抗体から成る群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドが、配列番号１、２、３、６および７、およびそれらの生物学的に活性なホモログ、誘導体および修飾物から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドが、細胞膜透過性を高めるためのアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｓｉＲＮＡがＧＩＴを対象とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ｓｉＲＮＡ配列が、配列番号８、９、１０および１１から成る群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記の少なくとも１つのレギュレーターの１つがＵＯ１２６である、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記阻害剤がタンパク質相互作用または複合体形成を阻害する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記タンパク質相互作用または複合体形成が、ＰＡＫ−ＰＩＸ、ＰＡＫ−ＭＥＫ、ＰＩＸ−ＧＩＴおよびＧＩＴ−ＭＥＫから成る群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＰＩＸがＰＩＸαまたはＰＩＸβである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＧＩＴがＧＩＴ１またはＧＩＴ２である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ＭＥＫがＭＥＫ１またはＭＥＫ２である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記阻害剤がＥｒｋ活性化を阻害する、請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
前記阻害剤がＭＬＣＫ活性化を阻害する、請求項１０に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸が単離核酸であり、該単離核酸は、配列番号１、２、４、６および７から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２４】
前記被験体が、組織損傷、虚血、炎症、発作、創傷治癒、急性呼吸窮迫症候群、高血圧、心筋梗塞、敗血症、低酸素症、感染、アレルギー反応、熱損傷、ｘ線照射および紫外線照射から成る群より選択される血管透過性関連疾患、障害または状態を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
血管透過性疾患、障害または状態を調節する化合物を投与するための、請求項１に記載の少なくとも１つの化合物を含有する医薬組成物、アプリケーター、およびそれらの使用のための指示書を含むキット。
【請求項２６】
血管透過性を抑制する化合物を同定する方法であって、該化合物は、ＰＡＫ、ＰＩＸ、ＧＩＴ、ＭＥＫ、ＥｒｋおよびＭＬＣＫ調節経路から成る群より選択される少なくとも１つのタンパク質調節経路を阻害し、該方法は、
該調節経路の少なくとも１つを含む試験細胞を試験化合物に接触させること；
該調節経路の少なくとも１つの活性または機能を測定すること；
を含み、該試験化合物と接触させなかったこと以外は同一の細胞における活性または機能のレベルと比較して、該試験細胞における活性または機能のより低いレベルが、該試験化合物が血管透過性を抑制することの指標である、方法。
【請求項２７】
前記調節経路がＰＡＫである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法がＰＡＫリン酸化を測定する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法が、細胞間結合へのＰＡＫの転位を測定する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記方法が血管透過性を測定する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法がインビボでの液体輸送を測定する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記方法が、タンパク質間相互作用または複合体形成を測定する、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府によって支援された研究または開発に関する声明）
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた、助成番号ＲＯ１  ＧＭ４７２１４およびＴ３２  ＨＬ０７２８４の下での米国政府援助を得て為された。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
血管からの液体および細胞の流動は様々な状況における炎症、組織損傷および死亡への重大な寄与因子である。これらは虚血性損傷、中毒性ショック、アレルギーおよび免疫反応を含む。血管透過性は、一部には、内皮細胞間の細胞間接着によって調節される。
【０００３】
血管構造を裏打ちする内皮細胞単層は、血液画分の完全性を維持する障壁を形成するが、可溶性因子と白血球の通過は、調節された方法で許容する。この過程の調節不全は、水腫を含む病的状態に関連する炎症を伴って、下にある組織への血管外漏出を生じさせる。血管透過性に関連する水腫はまた、発作および心筋梗塞の動物モデルにおいて組織損傷を増大させる、低酸素状態の組織による血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の分泌を原因とする虚血性損傷においても生じる。血管透過性は、変化した細胞間接触と隣接細胞間の傍細胞孔の出現によって特徴づけられる。内皮障壁の完全性は、一部には、皮質Ｆ−アクチンが細胞間接触を安定化し、一方細胞内ストレスファイバーが透過性を誘導する張力を及ぼす、アクチン細胞骨格の相反する役割によって調節される。
【０００４】
血管透過性は、免疫応答および創傷治癒に積極的に寄与し得る厳密に調節された機能である；しかし、液体および免疫細胞の組織内への流出は、様々な疾患において重大な生命を脅かす結果をもたらすことがある。呼吸機能不全を導く肺血管系の透過性上昇による肺内の液体蓄積は、急性呼吸窮迫症候群における鍵となる要素である。酸素欠乏組織によるＶＥＧＦの放出を原因とする発作または心筋梗塞後の血管外漏出は、これらの事象後の組織損傷を実質的に増大させる。血管漏出および組織水腫は、敗血症における臓器不全に寄与する。
【０００５】
肺損傷は、深刻で、しばしば致死的な医学的問題である（非特許文献１）。通常は感染によって引き起こされ、液体の肺への漏出の引き金を引く機械換気によって増悪されることがあり、呼吸機能不全を導き得る。急性肺損傷における死亡の発生率は３０−４０％であり、現在のところ使用可能な特異的治療はない。
【０００６】
低分子量ＧＴＰアーゼＲａｃは、多くの系において細胞−細胞接着の形成と機能を調節する。上皮および内皮細胞型では、Ｒａｃは、接着と密接な結合の構築、および細胞分散の間または透過性の引き金を引くアゴニストに応答したそれらの崩壊の両方にとって重要である。これらの複雑な作用は、異なるＲａｃエフェクター経路が区別的に細胞間結合を調節し得ることを示唆する。Ｒａｃの正確な時間的および空間的調節とそのエフェクター経路は、細胞間接着の強化と崩壊の間の均衡を決定するために決定的に重要であると考えられる。しかし、これらの作用を支配する下流経路はよく理解されていない。
【０００７】
ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）は、運動性、形態形成および血管新生を含む多くの細胞機能に関与するＲａｃおよびＣｄｃ４２の下流で活性化されるセリン／トレオニンキナーゼである。ＧＴＰ結合ＲａｃおよびＣｄｃ４２は、不活性ＰＡＫに結合して、ＰＡＫ自己阻害ドメインによって課せられる立体的制約を解き放ち、ＰＡＫの自己リン酸化と活性化を可能にする。活性化ＰＡＫについてのマーカーとして働く数多くの自己リン酸化部位が同定されている。著明なＰＡＫ下流標的は、コンフィリンへのその作用を通してアクチン重合を調節するＬＩＭキナーゼ、およびミオシン軽鎖（ＭＬＣ）を含む。ＰＡＫ２は、収縮性を高め、細胞収縮の引き金を引くＳｅｒ１９でのＭＬＣのモノリン酸化を触媒する。しかし、ＰＡＫはまた、ＭＬＣキナーゼを阻害し、それによってＭＬＣのリン酸化と収縮を制限することができる。ＰＡＫ２上のセリン１４１は、キナーゼの活性化の間にリン酸化されるＡＩＤ配列内の部位である。この部位のリン酸化は、自己阻害を解除するためにＡＩＤとキナーゼドメインの相互作用をブロックすることによって活性化に寄与する。内皮細胞において、触媒活性ＰＡＫ１の発現はＭＬＣリン酸化と細胞収縮性を上昇させ、一方ＰＡＫの阻害は細胞収縮性を低下させた。それゆえ、これらの細胞では、ＰＡＫの主要な作用は収縮性の促進であると思われる。
【０００８】
内皮細胞間結合におけるＰＡＫの活性化はサイトカインに応答して血管透過性を調節することが以前に明らかにされた（非特許文献２）。これは、細胞収縮を促進する、ミオシン軽鎖のリン酸化を制御することによって行われた。ＰＡＫはＥＲＫ１／２活性化を調節することが知られている（非特許文献３）。Ｅｒｋも血管透過性を調節することが公知である（非特許文献４：Ｌ３６０−７０；Ｂｏｒｂｉｅｖ  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００３  ２８５：Ｌ４３−５４）。
【０００９】
ＰＡＫはＰＩＸ（αまたはβアイソフォーム）と呼ばれるタンパク質に結合することができ、ＰＩＸは次にＧＩＴ（アイソフォーム１または２）と呼ばれる別のタンパク質に結合する（非特許文献５において総説されている）。ＧＩＴは、Ｅｒｋ  ＭＡＰキナーゼの活性化を促進するスキャフォールドタンパク質であると提案された（Ｙｉｎ  ２００４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２４：８７５−８８５）。ＰＡＫ経路は血管外漏出を刺激する多くの事象に関与すると思われる。ＧＩＴタンパク質は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質であるＡＤＰリボシル化因子（ＡＲＦ）についてのＧＴＰアーゼ活性化タンパク質である。
【００１０】
ＰＩＸαおよびＰＩＸβに結合するＰＡＫ内の配列は、ＰＰＰＶＩＡＰＲＰＥＨＴＫＳＶＹＴＲ（配列番号１）（Ｍａｎｓｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１９９８  １：２：１８３−９２）。ＧＩＴ１／２に結合するＰＩＸ内のコア配列は、ＰＩＸαについてのアミノ酸残基６８５−６９８およびＰＩＸβについてのアミノ酸残基５２７−５４２に対応する、ＡＡＬＥＥＤＡＱＩＬＫＶＩ（配列番号２）である（非特許文献６）。ＰＩＸタンパク質に結合するＧＩＴ１およびＧＩＴ２内のコア配列は、Ｓｐａ２相同性ドメイン（ＧＩＴ１内の２５５−３７５）およびコイルドコイル領域（ＧＩＴ１内の４２８−４８５）である（Ｐｒｅｍｏｎｔら、２００４，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  １６：１００１−１０１１）。ＭＥＫに結合するＧＩＴ１に関する領域もＳｐａ相同性ドメイン内（アミノ酸残基２５５−３７５）である（Ｈａｅｎｄｅｌｅｒら、２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：５０：４９９３６−４４）。
【００１１】
ＰＡＫキナーゼは低分子量ＧＴＰアーゼＲａｃおよびＣｄｃ４２によって活性化される。ＰＡＫキナーゼは、時として２つの他のタンパク質、すなわちＰＩＸ（αまたはβ）とＧＩＴ（１または２）との複合体中に認められる。Ｐａｋは、ＰＡＫ内の特殊なプロリンに富む配列を通してＰＩＸ  ＳＨ３ドメインに直接結合する。ＰＩＸは次に、ＰＩＸの極Ｃ末端およびＧＩＴ内の２つの領域：Ｓｐａ２相同性ドメイン（アミノ酸残基２７０−３６３）およびコイルドコイル（アミノ酸残基４２８−４８５）を通してＧＩＴタンパク質と結合する。ＧＩＴ１はまた、Ｅｒｋの活性化のためのスキャフォールドタンパク質であることが認められた。ＧＩＴ１は、Ｅｒｋ活性化のための上流キナーゼ、ＭＥＫ１／２に結合する。
【００１２】
ＰＡＫキナーゼは、増殖因子、炎症性サイトカインおよびトロンビンによる血管透過性の誘導のために重要であることが以前に出願人によって示された。ＰＡＫは、ミオシン軽鎖キナーゼのリン酸化の調節、および透過性障壁として働く細胞間接着を崩壊させる細胞収縮の上昇によって透過性を制御した。
【００１３】
血管透過性を調節するための組成物および方法に対する長年の強い需要が当技術分野に存在する。本発明はこれらの需要を満たすものである。
【非特許文献１】Ｏｒｆａｎｏｓら、２００４；  Ｌｉｏｎｅｔｔｉら、２００５
【非特許文献２】Ｓｔｏｃｋｔｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４６６２１−４６６３０
【非特許文献３】Ｆｒｏｓｔ，１９９７，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：６４２６−６４３８
【非特許文献４】Ｖｅｒｉｎ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００  ２７９
【非特許文献５】Ｔｕｒｎｅｒ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００１，１３：５９３−５９９
【非特許文献６】Ｆｅｎｇら、２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：５６４４−５６５０
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
ＰＡＫ、ＰＩＸ、ＧＩＴ１とＧＩＴ２およびＭＥＫを含むタンパク質の複合体は、多くのサイトカイン、増殖因子または機械的刺激に応答して内皮単層の透過性の引き金を引くために必須である。血管透過性は、急性肺損傷、発作、心筋梗塞および感染を含む、組織損傷および炎症に関わる多くの病的状態への主要寄与因子である。ＰＡＫは、おそらくいくつかの機構を通してＭＬＣＫリン酸化を活性化し得る。潜在的経路は、ミオシン（Ｃｈｅｗら、１９９８）またはカルデスモン（Ｆｏｓｔｅｒら、２０００）の直接リン酸化を含む。あるいは、この作用は、ＭＬＣＫを活性化し得る（Ｋｌｅｍｋｅら、１９９７）、Ｅｒｋを活性化するためのＲａｆまたはＭＥＫ１／２のリン酸化を含むと考えられる（Ｆｒｏｓｔら、１９９７；Ｋｉｎｇら、１９９８）。本発明は、ＰＡＫが血管外漏出を誘導するＭＬＣＫリン酸化を活性化する機序ならびにこの経路を調節するための組成物および方法を包含する。
【００１５】
本発明は、血管透過性を調節する、特に血管透過性を阻害するための組成物および方法を対象とする。特に、本発明は、血管透過性の引き金を引くために重要なタンパク質の相互作用をブロックすることによって血管透過性を調節する方法を対象とする。本発明は、ＰＡＫ−ＰＩＸ−ＧＩＴ−ＭＥＫ複合体を破壊するまたは細胞間結合から複合体を解離するための相互作用部位に関して競合する、ペプチド、およびその修飾物、フラグメント、誘導体、ホモログおよび類似体を提供する。そのようなペプチドをここでは競合ペプチドまたは配列と称する。本発明のペプチドは、ＰＡＫ、ＰＩＸ、ＧＩＴおよびＭＥＫの少なくとも１つと競合するまたは前記の少なくとも１つを調節する。それゆえ、本発明は、それによって血管透過性を調節する、ＰＡＫ、ＰＩＸ、ＧＩＴ、ＭＥＫ、ＥｒｋおよびＭＬＣＫから成る群より選択される少なくとも１つのタンパク質調節経路のレギュレーターの使用を含む、関連シグナル伝達経路によって血管透過性を調節することを包含する。
【００１６】
１つの態様では、本発明のペプチドはＰＩＸαへのＰＡＫの結合をブロックする。もう１つの態様では、本発明のペプチドはＰＩＸβへのＰＡＫの結合をブロックする。１つの態様では、本発明のペプチドはＧＩＴ１へのＰＩＸの結合をブロックする。もう１つの態様では、本発明のペプチドはＧＩＴ２へのＰＩＸの結合をブロックする。１つの態様では、本発明のペプチドはＧＩＴ１とＭＥＫの結合をブロックする。１つの態様では、ＭＥＫはＭＥＫ１またはＭＥＫ２である。１つの態様では、本発明のペプチドはＥｒｋの活性化をブロックする。もう１つの態様では、本発明のペプチドはＥｒｋ  ＭＡＰキナーゼをブロックする。１つの態様では、本発明のペプチドは、ＰＡＫからＥｒｋへ、および次にＭＬＣＫへのシグナル伝達をブロックする。本発明はさらに、ＰＡＫから下流でＥｒｋおよびＭＬＣＫを調節するための方法および組成物を包含する。
【００１７】
本発明の１つの実施形態では、本発明のペプチドは、タンパク質複合体の形成または相互作用をブロックする。１つの態様では、本発明のペプチドは、細胞間結合へのタンパク質複合体の局在化をブロックする。
【００１８】
１つの態様では、血管透過性は、その必要のある被験体において本発明のペプチドによってブロックされる。
【００１９】
以下のペプチドをここで使用する：
【００２０】
【化１】
2009508812.tif 000002
以下の核酸をここで使用する：
【００２１】
【化２】
2009508812.tif 000003
簡単に述べると、ここで使用する配列の機能および／または起源は以下の通りである：
配列番号１は、ＰＩＸに結合するＰＡＫ内の配列である。
【００２２】
配列番号２は、ＧＩＴ１およびＧＩＴ２に結合するＰＩＸ内のコア配列である。
【００２３】
配列番号３は、細胞膜透過性を与えるＴＡＴ配列である。
【００２４】
配列番号４は、配列番号１と３の組合せである。
【００２５】
配列番号５は、２個のアミノ酸突然変異／置換を含む、配列番号４の対照ペプチドである。
【００２６】
配列番号６は、細胞膜透過性を与えるＴＡＴ配列を含むＰＡＫ／Ｎｃｋブロッキングペプチドを生じさせる、配列番号３と７の組合せである。
【００２７】
配列番号７は、ＰＡＫの最初のプロリンに富むドメインからの配列から成る。
【００２８】
配列番号８−１１は、ここで使用するｓｉＲＮＡ  Ｓｍａｒｔｐｏｏｌの４個のセンス配列である。
【００２９】
１つの実施形態では、タンパク質阻害剤であるペプチドは、配列ＰＰＰＶＩＡＰＲＰＥＨＴＫＳＶＹＴＲ（配列番号１）（Ｍａｎｓｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１９９８  １：２：１８３−９２）、およびそのホモログ、修飾物、誘導体、類似体およびフラグメントを含む。配列番号１をＰＩＸ結合配列と称する。
【００３０】
もう１つの実施形態では、タンパク質複合体形成または相互作用を阻害するために使用する競合配列は、ＧＩＴ１／２に結合するＰＩＸ内のコア配列である（ＰＩＸαについてのアミノ酸残基６８５−６９８およびＰＩＸβについてのアミノ酸残基５２７−５４２に対応する；Ｆｅｎｇら、２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：５６４４−５６５０）、ＡＡＬＥＥＤＡＱＩＬＫＶＩ（配列番号２）である。１つの実施形態では、使用する競合ペプチドは、Ｓｐａ２相同性ドメイン（ＧＩＴ１の２５５−３７５）およびコイルドコイル領域（ＧＩＴ１の４２８−４８５）である、ＰＩＸタンパク質に結合するＧＩＴ１およびＧＩＴ２内のコア配列の１またはそれ以上を含む（Ｐｒｅｍｏｎｔら、２００４，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  １６：１００１−１０１１）。ＭＥＫに結合するＧＩＴ１に関する領域もＳｐａ相同性ドメイン内であり、本発明に包含される（アミノ酸残基２５５−３７５）（Ｈａｅｎｄｅｌｅｒら、２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：５０：４９９３６−４４）。ペプチドに細胞膜透過性を与えるＴＡＴ配列、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号３）または関連多塩基性配列はこれらの配列に連結されている（Ｓｔｏｃｋｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４，２７９：４５：４６６２１−４６６３０）。複合体形成または細胞間結合への局在化をブロックし、およびＰＡＫからＥｒｋへ、および次にＭＬＣＫへのシグナル伝達をブロックする、これらのタンパク質内の他の相互作用部位も本発明に包含される。１つの態様では、２以上のペプチド、およびそのホモログ、修飾物、誘導体、類似体およびフラグメントを、複合体形成または細胞間結合への局在化をブロックし、およびＰＡＫからＥｒｋへ、および次にＭＬＣＫへのシグナル伝達をブロックするために使用する。本発明の１つの態様では、本発明の１またはそれ以上のペプチドを、血管透過性を調節する１またはそれ以上の他の化合物と共に投与する。
【００３１】
本発明の１つの実施形態では、本発明のペプチドへの多塩基性ＴＡＴ配列または他の透過性配列の結合は、これらの構築物が細胞に進入することを可能にする。１つの態様では、透過性上昇配列はＴＡＴ配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号３）である。これらの複合化合物は、水腫および組織損傷をブロックするために損傷または炎症組織における血管透過性を抑制する。
【００３２】
１つの実施形態では、本発明は、配列番号３と配列番号１の組合せの結果であるペプチドを提供する。配列番号３とは１の組合せは、ここでは「ＰＩＸ結合ペプチド」として知られる配列番号４である。ＰＩＸ結合ペプチドはまた、ここでは「ＰＩＸブロッキングペプチド」とも称される。配列番号４は、それゆえ、配列
【００３３】
【化３】
2009508812.tif 000004
を有し、カルボキシ末端修飾と共にここで使用されるときは、
【００３４】
【化４】
2009508812.tif 000005
である。
【００３５】
ここで開示する対照ペプチドは、
【００３６】
【化５】
2009508812.tif 000006
であり、同じくここでは
【００３７】
【化６】
2009508812.tif 000007
として使用される（図６参照）。
もう１つの実施形態では、タンパク質複合体形成または相互作用を阻害するために使用する競合配列は、ＧＩＴ１／２に結合するＰＩＸ内のコア配列である（ＰＩＸαについてのアミノ酸残基６８５−６９８およびＰＩＸβについてのアミノ酸残基５２７−５４２に対応する；Ｆｅｎｇら、２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：５６４４−５６５０）、ＡＡＬＥＥＤＡＱＩＬＫＶＩ（配列番号２）である。１つの実施形態では、使用する競合ペプチドは、Ｓｐａ２相同性ドメイン（ＧＩＴ１の２５５−３７５）およびコイルドコイル領域（ＧＩＴ１の４２８−４８５）である、ＰＩＸタンパク質に結合するＧＩＴ１およびＧＩＴ２内のコア配列の１またはそれ以上を含む（Ｐｒｅｍｏｎｔら、２００４，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  １６：１００１−１０１１）。ＭＥＫに結合するＧＩＴ１に関する領域もＳｐａ相同性ドメイン内であり、本発明に包含される（アミノ酸残基２５５−３７５）（Ｈａｅｎｄｅｌｅｒら、２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：５０：４９９３６−４４）。それゆえ、本発明はさらに、これらのドメインのペプチド、およびそのホモログ、誘導体、フラグメントおよび修飾物を含むペプチドを包含する。複合体形成または細胞間結合への局在化をブロックし、およびＰＡＫからＥｒｋへ、および次にＭＬＣＫへのシグナル伝達をブロックする、これらのタンパク質内の他の相互作用部位も本発明に包含される。１つの態様では、２以上のペプチド、およびそのホモログ、修飾物、誘導体、類似体およびフラグメントを、複合体形成または細胞間結合への局在化をブロックし、およびＰＡＫからＥｒｋへ、および次にＭＬＣＫへのシグナル伝達をブロックするために使用する。本発明の１つの態様では、本発明の１またはそれ以上のペプチドを、血管透過性を調節する１またはそれ以上の他の化合物と共に投与する。
【００３８】
本発明の１つの実施形態では、本発明のペプチドへの多塩基性ＴＡＴ配列または他の透過性配列の結合は、これらの構築物が細胞に進入することを可能にする。１つの態様では、透過性上昇配列はＴＡＴ配列
【００３９】
【化７】
2009508812.tif 000008
である。これらの複合化合物は、水腫および組織損傷をブロックするために損傷または炎症組織における血管透過性を抑制する。
【００４０】
１つの態様では、ＴＡＴ−ペプチド構築物は、細胞と接触したとき血管透過性を阻害する。１つの態様では、細胞は内皮細胞である。１つの態様では、内皮細胞は培養下にある。もう１つの態様では、内皮細胞はインビボである。
【００４１】
１つの態様では、本発明は、血管透過性を低下させるためまたは血管透過性の上昇を阻害するために有用な組成物および方法を提供する。１つの態様では、本発明は、血管外漏出が、組織損傷、炎症、水腫、腫脹、ショック、疾患、または血管透過性異常に関連する他の状態または障害に寄与するまたは前記によって引き起こされる、疾患、障害または状態を治療するために被験体に投与し得る、タンパク質複合体の機能または活性の阻害剤を含む組成物を提供する。そのような疾患および損傷は、機械的または他の肺損傷、発作および心筋梗塞を含むが、これらに限定されない。１つの態様では、本発明は、急性肺損傷において液体輸送を阻害するための組成物および方法を提供する。もう１つの態様では、本発明は、インビボで炎症性物質によって誘導される組織での血管透過性を低下させるまたは血管透過性の上昇を阻害するための組成物および方法を提供する。１つの態様では、組織は肺組織である。本発明の化合物はまた、その必要のある被験体にもう１つ別の薬剤または薬物と共に投与することができる。
【００４２】
１つの実施形態では、本発明は、その必要のある被験体において、ＰＡＫ−ＰＩＸ−ＧＩＴ−ＭＥＫ複合体および相互作用を崩壊させ、炎症および損傷による血管透過性を阻害するための本発明のペプチドの投与を提供する。ＰＡＫ−ＰＩＸ−ＧＩＴ−ＭＥＫ複合体を崩壊させるまたは細胞間結合から複合体を解離するために相互作用部位に関して競合するタンパク質フラグメントおよびペプチドは、血管透過性を低下させる。これらの配列は、ＴＡＴ配列または細胞内へのタンパク質の輸送を促進する他の配列に融合することができる。これらの試薬は、血管外漏出が寄与因子である疾患において血管透過性を阻害するために使用できる。ＰＩＸαまたはＰＩＸベータへのＰＡＫの結合、ＧＩＴ１またはＧＩＴ２へのＰＩＸの結合、およびＧＩＴ１へのＭＥＫの結合をブロックするために内因性相互作用部位に関して競合するタンパク質フラグメントは、ＰＡＫをＥｒｋ活性化および細胞間結合の崩壊、ならびにＭＬＣＫへと結びつけるシグナル伝達経路を遮断する。
【００４３】
１つの実施形態では、ＰＡＫ阻害剤は、ドミナントネガティブ作用を及ぼすＰＡＫからの配列を含む短いペプチドである（Ｋｉｏｓｓｅｓら、２００２，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９０：６９７）。このペプチド
【００４４】
【化８】
2009508812.tif 000009
は、細胞への進入を促進するＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質からの多塩基性配列
【００４５】
【化９】
2009508812.tif 000010
（Ｓｃｈｗａｒｚｅら、１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５６９）に融合した、ＰＡＫの最初のプロリンに富むドメインからの配列
【００４６】
【化１０】
2009508812.tif 000011
から成る。前記ペプチド（配列番号６）は、完全長ドミナントネガティブ構築物と同様にＰＡＫ機能を阻害する。このペプチドはそれ自体ではＰＡＫキナーゼ活性をブロックせず、その代わりに細胞間結合を含む作用部位からＰＡＫを変位させ、これは細胞の収縮性、移動および透過性へのその作用を妨げるのに十分である。このペプチドを「ＰＡＫブロッキングペプチド」および「Ｎｃｋブロッキングペプチド」と称する。
【００４７】
もう１つの実施形態では、ＰＡＫ阻害剤は、ＰＡＫキナーゼ活性をブロックする、ＰＡＫの自己阻害ドメインを含む。
【００４８】
本開示はまた、本発明における使用のための他のＰＡＫレギュレーターを包含する。付加的なＰＡＫレギュレーターを同定するために有用なアッセイは、本文中、ならびにそれらの開示全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第６，２４８，５４９号および２００４年７月１５日公開の米国特許公開第２００４０１３８１３３号に述べられている。
【００４９】
もう１つの実施形態では、ＰＡＫ活性または機能のレギュレーターは、他のタンパク質または分子がＰＡＫと結合するのをブロックすることができる。１つの態様では、レギュレーターは他のタンパク質または分子と結合して、それらがＰＡＫと相互作用することを阻害する。もう１つの態様では、レギュレーターはＰＡＫと結合して、他のタンパク質または分子がＰＡＫと結合することを阻害する。
【００５０】
１つの実施形態では、本発明は、増殖因子、サイトカインおよび細菌毒素によって誘導される血管透過性上昇を抑制する方法を提供する。
【００５１】
当業者は、本発明の阻害剤が、対象標的部位と相互作用するまたは結合することによる競合的阻害によって、または三次構造の変化を誘導することなどの、分子の作用を阻害することまたは何らかの方法で複合体形成または相互作用をブロックすることによって間接的に、作用し得ることを認識する。
【００５２】
本発明はさらに、これらの相互作用およびシグナル伝達経路を崩壊させる他の種類の分子を提供する。１つの実施形態では、本発明は、本発明のペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸を提供する。もう１つの実施形態では、本発明は、ここで述べるシグナル伝達経路のタンパク質に対するｓｉＲＮＡを提供する。１つの態様では、ｓｉＲＮＡはＧＩＴに対する。１つの態様では、ｓｉＲＮＡは、配列番号８−１１から成る群より選択される配列を含む。もう１つの態様では、阻害剤はＭＥＫの阻害剤である。１つの態様では、ＭＥＫの阻害剤はＵＯ１２６である。
【００５３】
１つの実施形態では、本発明は、少なくとも１つの本発明のペプチドを被験体に投与するためのキットを提供する。
【００５４】
１つの実施形態では、本発明は、ここで述べるタンパク質調節経路の阻害剤を同定するためのアッセイおよび方法を提供する。
【００５５】
本発明の様々な態様と実施形態を以下でさらに詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
（発明の詳細な説明）
略語
ＡＩＤ−自己阻害ドメイン
ＡＲＦ−ＡＤＰリボシル化因子
ＢＡＥＣ−ウシ大動脈内皮細胞
ｄｎ−ドミナントネガティブ
ＥＣＬ−増感化学発光
ＥＲＫ−細胞外シグナル制御キナーゼ
ｂＦＧＦ−塩基性線維芽細胞増殖因子
ＦＡＫ−フォーカルアドヒージョン（接着域）キナーゼ
ＦＮ−フィブロネクチン
ＧＡＰ−ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質
ＧＩＴ−ＧＲＫ相互作用性ＡＲＦ  ＧＡＰ
ＧＲＫ−Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ
ＨＲＰ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＨＵＶＥＣ−ヒト臍帯静脈内皮細胞
ｉｐ−腹腔内
ＩＰ−免疫沈降法
ＭＥＫ−ＭＡＰ／ＥＲＫキナーゼ
ＭＬＣ−ミオシン軽鎖
ＭＬＣＫ−ミオシン軽鎖キナーゼ
ＰＡＫ−ｐ２１活性化プロテインキナーゼ
ＰＩＸ−ＰＡＫ相互作用性交換因子
ＰＫＬ−パキシリンキナーゼリンカータンパク質
ＰＢＳ−リン酸緩衝食塩水
ＳＨＤ−Ｓｐａ２相同性ドメイン
ＴＢＳ−トリス緩衝食塩水
ＴＮＦ−腫瘍壊死因子
ＶＥＧＦ−血管内皮増殖因子
ＷＣＬ−全細胞溶解産物
ｗｔ−野生型
定義
本発明を説明し、特許請求するとき、以下の用語を以下に述べる定義に従って使用する。
【００５７】
ここで使用する、「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的語の１または２以上、すなわち少なくとも１を指す。例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」は１エレメントまたは２以上のエレメントを意味する。
【００５８】
ここで使用する、「接着」という用語は、広く、もう１つ別の細胞、分子または他の基質への細胞の結合を指す。
【００５９】
ここで使用する、「罹患細胞」という用語は、疾患、損傷または障害に罹患した被験体の細胞を指し、罹患細胞は、疾患または障害に罹患していない被験体に比べて変化した表現型を有する。
【００６０】
細胞または組織は、それらが疾患または障害に罹患していない被験体における同じ細胞または組織に比べて変化した表現型を有する場合、疾患、損傷または障害に「罹患」している。
【００６１】
疾患、状態または障害は、疾患または障害の症状の重症度、そのような症状が患者によって経験される頻度、またはその両方が低減する場合、「緩和」される。
【００６２】
ここで使用する、「アミノ酸」は、以下の表に示すように、その正式名称によって、それに対応する３文字表記によって、またはそれに対応する１文字表記によって表される。
【００６３】
【化１１】
2009508812.tif 000012
ここで使用する「アミノ酸」という表現は、天然および合成アミノ酸、およびＤとＬの両方のアミノ酸を含むことが意図されている。「標準アミノ酸」は、天然に生じるペプチドにおいて一般的に認められる２０個の標準Ｌ−アミノ酸のいずれかを意味する。「非標準アミノ酸残基」は、合成によって作製されるかまたは天然ソースに由来するかに関わらず、標準アミノ酸以外の何らかのアミノ酸を意味する。ここで使用する、「合成アミノ酸」はまた、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）および置換体を含むがこれらに限定されない、化学修飾されたアミノ酸を包含する。本発明のペプチド内に含まれる、特にカルボキシまたはアミノ末端のアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、またはそれらの活性に有害な影響を及ぼさずにペプチドの循環半減期を変化させることができる他の化学基での置換によって修飾できる。付加的に、ジスルフィド結合が本発明のペプチド内に存在してもよくまたは存在しなくてもよい。
【００６４】
「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と交換可能に使用され、遊離アミノ酸およびペプチドのアミノ酸残基を表わし得る。遊離アミノ酸を指すかまたはペプチドの残基を指すかは、その用語が使用される文脈から明らかである。
【００６５】
アミノ酸は以下の一般構造：
【００６６】
【化１２】
2009508812.tif 000013
を有する。
【００６７】
アミノ酸は、側鎖Ｒに基づいて７つの群に分類し得る：（１）脂肪族側鎖；（２）ヒドロキシル（ＯＨ）基を含む側鎖；（３）硫黄原子を含む側鎖；（４）酸性またはアミド基を含む側鎖；（５）塩基性基を含む側鎖；（６）芳香環を含む側鎖；および（７）側鎖がアミノ基に融合しているイミノ酸である、プロリン。
【００６８】
ここで使用する、「保存的アミノ酸置換」は、以下の５つの群の１つの中での交換と定義される：
Ｉ．低分子脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性で負に荷電した残基およびそれらのアミド：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
ＩＩＩ．極性で正に荷電した残基：
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
ＩＶ．大型の脂肪族、非極性残基：  
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ
Ｖ．大型の芳香族残基：
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【００６９】
本発明のペプチド化合物を表わすために使用される用語は、アミノ基が各々のアミノ酸残基の左側に表示され、カルボキシ基が右側に表示される従来の慣例に従う。本発明の選択特定実施形態を示す式では、アミノおよびカルボキシ末端基は、特定して示さないが、異なる記載がない限り、それらが生理的ｐＨ値でとる形態であることが了解される。
【００７０】
ここで使用する、「塩基性」または「正に荷電した」アミノ酸という用語は、Ｒ基がｐＨ７．０で正味正電荷を有するアミノ酸を指し、標準アミノ酸リシン、アルギニンおよびヒスチジンを含むが、これらに限定されない。
【００７１】
ここで使用する、化合物の「類似体」は、例として、構造的にもう１つ別の化合物に類似するが、必ずしも異性体ではない化合物である（たとえば５−フルオロウラシルはチミンの類似体である）。
【００７２】
ここで使用する「抗体」という用語は、抗原上の特定エピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然ソースまたは組換えソースに由来する無傷免疫グロブリンであり得、および無傷免疫グロブリンの免疫反応性部分であり得る。抗体は、典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体を含む様々な形態で存在し得る（Ｈａｒｌｏｗら、１９９９，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗら、１９８９，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈｏｕｓｔｏｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；Ｂｉｒｄら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）。
【００７３】
ここで使用する「合成抗体」という用語により、たとえばここで述べるようなバクテリオファージによって発現される抗体などの、組換えＤＮＡ技術を用いて作製される抗体が意味される。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって作製され、前記ＤＮＡ分子が抗体タンパク質または抗体を規定するアミノ酸配列を発現する抗体を意味すると解釈されるべきであり、前記ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当技術分野において使用可能であり、周知である合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を用いて得られたものである。
【００７４】
ここで使用する、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、少なくともその一部が、正常細胞または罹患細胞中に存在する核酸に相補的である、核酸重合体を意味する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの他の修飾物を含むが、これらに限定されない。オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよびさもなければ修飾オリゴヌクレオチドを合成するための方法は当技術分野において周知である（米国特許第５，０３４，５０６号；Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７）。「アンチセンス」は、特に、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の非コード鎖の核酸配列、または非コード鎖に実質的に相同な配列を指す。ここで定義されるように、アンチセンス配列は、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的である。アンチセンス配列は、ＤＮＡ分子のコード鎖のコード部分にだけ相補的である必要はない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするＤＮＡ分子のコード鎖上で規定される、コード配列の発現を制御する調節配列に相補的であってもよい。
【００７５】
ここで使用する、ポリペプチドの「生物学的に活性なフラグメント」または「生物活性フラグメント」という用語は、それらの天然リガンドに特異結合することができるまたはタンパク質の機能を実行することができる、完全長タンパク質の天然または合成部分を包含する。
【００７６】
「対照」細胞は、試験細胞と同じ細胞型を有する細胞である。対照細胞は、たとえば試験細胞が検査されるのと厳密にまたはほぼ同時に検査され得る。対照細胞はまた、たとえば試験細胞が検査される時点と離れた時点で検査されてもよく、対照細胞の検査の結果は、記録された結果を試験細胞の検査によって得られた結果と比較し得るように記録され得る。
【００７７】
「試験」細胞は、検査される細胞である。
【００７８】
「病理指示」細胞は、組織中に存在するとき、その組織が位置する（またはその組織が得られた）動物が疾患または障害に罹患していることの指標である細胞である。
【００７９】
「病原性」細胞は、組織中に存在するとき、その組織が位置する（またはその組織が得られた）動物において疾患または障害を引き起こすあるいは疾患または障害に寄与する細胞である。
【００８０】
組織は、細胞の１またはそれ以上が疾患または障害に罹患していない動物の組織中に存在する場合、細胞を「正常に含む」。
【００８１】
「競合配列」という用語は、そのコグネイト結合部位に関してもう１つ別のペプチドと競合するペプチド、またはその修飾物、フラグメント、誘導体またはホモログを指す。
【００８２】
「相補的」とは、２本の核酸鎖の領域の間または同じ核酸鎖の２つの領域の間での配列相補性の広い概念を指す。第一核酸領域のアデニン残基は、第一領域に逆平行である第二核酸領域の残基と、その残基がチミンまたはウラシルである場合特異的水素結合を形成することができる（塩基対合）ことは公知である。ここで使用する、「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対合規則によって関連づけられるポリヌクレオチド（すなわちヌクレオチドの配列）に関して使用される。たとえば配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」に関しては、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」が相補的である。
【００８３】
同様に、第一核酸鎖のシトシン残基は、第一鎖に逆平行である第二核酸鎖の残基と、その残基がグアニンである場合塩基対合できることは公知である。２つの領域を逆平行に配置したとき、第一領域の少なくとも１個のヌクレオチド残基が第二領域の残基と塩基対合できる場合、核酸の第一領域は、同じ核酸または異なる核酸の第二領域に相補的である。好ましくは、第一領域は第一部分を含み、第二領域は第二部分を含み、それにより、第一と第二部分を逆平行に配置したとき、第一部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が第二部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。より好ましくは、第一部分のすべてのヌクレオチド残基が第二部分内のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。
【００８４】
タンパク質に関してここで使用する、「複合体」という用語は、２またはそれ以上のタンパク質の結合または相互作用を指す。複合体形成または相互作用は、結合、三次構造の変化、およびリン酸化などの、あるタンパク質のもう１つ別のタンパク質による修飾を含み得る。
【００８５】
ここで使用する、「化合物」は、一般的に薬剤とみなされる何らかの種類の物質または作用因子、または薬剤としての使用のための候補物質、ポリペプチド、単離核酸、抗体、または本発明の方法において使用される他の物質、ならびにそれらの何らかの組合せを指す。
【００８６】
ここで使用する、「検出可能マーカー」または「レポーター遺伝子」は、マーカーを持たない類似化合物の存在下でマーカーを含む化合物の特異的検出を可能にする原子または分子である。検出可能マーカーまたはレポーター遺伝子は、たとえば放射性同位体、抗原決定基、酵素、ハイブリダイゼーションのために使用可能な核酸、発色団、発蛍光団、化学発光分子、電気化学的に検出可能な分子、および変化した蛍光−偏光または変化した光散乱を提供する分子を含む。
【００８７】
「疾患」は、動物がホメオスタシスを維持することができず、疾患が改善されない場合動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態である。
【００８８】
これに対し、動物における「障害」は、動物はホメオスタシスを維持することができるが、動物の健康状態が障害のない場合よりも良好でない、健康状態である。処置せずに放置した場合、障害は必ずしも動物の健康状態のさらなる低下を引き起すわけではない。
【００８９】
「コードする」は、ヌクレオチドの定義された配列（すなわちｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）またはアミノ酸の定義された配列をおよびそれらから生じる生物学的性質を有する、生物学的過程において他の重合体および高分子の合成のための鋳型として働く、
遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどの、ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの特定配列の固有の性質を指す。それゆえ、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物系においてタンパク質を生産する場合、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表において提供されるコード鎖、および遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方を、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると称することができる。
【００９０】
異なる記載がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を包含する。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチドはイントロンを含み得る。
【００９１】
「エンハンサー」は、転写開始部位に対するエンハンサーの距離または方向に関わりなく、転写の効率を高めることができるＤＮＡ調節エレメントである。
【００９２】
ここで使用する、特定タンパク質またはペプチドの「基本的に純粋な」製剤は、製剤中のタンパク質またはペプチド少なくとも約９５重量％、好ましくは少なくとも約９９重量％がその特定タンパク質またはペプチドである製剤である。
【００９３】
「フラグメント」または「セグメント」は、少なくとも１個のアミノ酸を含むアミノ酸配列の部分、または少なくとも１個のヌクレオチドを含む核酸配列の部分である。「フラグメント」および「セグメント」という用語は、ここでは交換可能に使用される。
【００９４】
ここで使用する、「機能性」生物分子は、その分子を特徴づける性質または活性を示す形態の生物分子である。機能性酵素は、たとえばその酵素を特徴づける特徴的な触媒活性を示すものである。
【００９５】
ここで使用する「相同」は、２個の重合体分子の間、たとえば２個の核酸分子、たとえば２個のＤＮＡ分子または２個のＲＮＡ分子の間、または２個のペプチド分子の間でのサブユニット配列類似性を指す。２個の分子の両方のサブユニット部分が同じ単量体サブユニットによって占められるとき、たとえば２個のＤＮＡ分子の各々におけるある位置がアデニンによって占められる場合、それらはその位置において相同である。２つの配列間の相同性は、マッチングの数または相同な位置の数の直接の関数であり、たとえば２つの化合物配列内の位置の半数（たとえば１０サブユニットの長さの高分子内の５つの位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同であり、位置の９０％、たとえば１０のうち９がマッチするまたは相同である場合、２つの配列は９０％の相同性を共有する。例として、ＤＮＡ配列３’ＡＴＴＧＣＣ５’と３’ＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を共有する。
【００９６】
ここで使用する、「相同性」は、「同一性」と同義に使用される。
【００９７】
２個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて実施できる。たとえば２個の配列を比較するために有用な数学的アルゴリズムは、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７）において修正された、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８）のアルゴリズムである。このアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれており、たとえばｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）の世界的ウエブサイトでアクセスできる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ここで述べる核酸に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウエブサイトでは「ｂｌａｓｔｎ」と称される）で以下のパラメータを用いて実施できる：ギャップペナルティ＝５；ギャップエクステンションペナルティ＝２；ミスマッチペナルティ＝３；マッチ加算＝１；期待値１０．０；およびワードサイズ＝１１。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ここで述べるタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウエブサイトでは「ｂｌａｓｔｎ」と称される）で以下のパラメータを用いて実施できる：期待値１０．０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るため、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）に述べられているようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−ＢｌａｓｔまたはＰＨＩ−Ｂｌａｓｔは、分子間の遠い関係（Ｉｄ．）および共通パターンを共有する分子間の関係を検出する反復検索を実施するために使用できる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢｌａｓｔおよびＰＨＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用するときは、それぞれのプログラム（たとえばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用できる。
【００９８】
２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを導入するかまたは導入せずに、上述したのと同様の手法を用いて決定することができる。パーセント同一性を算定するとき、典型的には正確なマッチを計数する。
【００９９】
ここで使用する、「阻害する」という用語は、化合物または何らかの物質が記述される機能を低下させるまたは妨げる能力を指す。好ましくは、阻害は少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、さらに一層好ましくは少なくとも５０％であり、最も好ましくは、機能が少なくとも７５％阻害される。
【０１００】
ここで使用する、「複合体を阻害する」という用語は、２またはそれ以上のタンパク質の複合体の形成または相互作用を阻害すること、ならびに複合体の機能または活性を阻害することを指す。この用語はまた、形成された複合体を崩壊させることを包含する。しかし、この用語は、これらの機能の各々すべてが同時に阻害されなければならないことを意味しない。
【０１０１】
ここで使用する、「タンパク質を阻害する」という用語は、タンパク質の合成、レベル、活性または機能を阻害する何らかの方法または手法、ならびに対象タンパク質の合成、レベル、活性または機能の誘導または刺激を阻害する方法を指す。この用語はまた、対象タンパク質の合成、レベル、活性または機能を調節することができる何らかの代謝または調節経路を指す。この用語は、他の分子との結合および複合体形成を含む。それゆえ、「タンパク質阻害剤」という用語は、その適用がタンパク質機能またはタンパク質経路機能の阻害を生じさせる、何らかの物質または化合物を指す。しかし、この用語は、これらの機能の各々すべてが同時に阻害されなければならないことを意味しない。
【０１０２】
「単離核酸」は、天然に生じる状態でそれに隣接している配列から分離された核酸セグメントまたはフラグメント、たとえば通常そのフラグメントに隣接している配列、たとえばそれが天然に生じるゲノム内でそのフラグメントに隣接している配列から取り出されたＤＮＡフラグメントを指す。この用語はまた、天然で核酸に付随する他の成分、たとえば細胞において天然で核酸に付随するＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質から実質的に精製された核酸にも適用される。この用語はそれゆえ、たとえばベクター、自律複製プラスミドまたはウイルス、または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた、または他の配列とは独立して別個の分子として（たとえばｃＤＮＡとしてあるいはＰＣＲまたは制限酵素消化によって生産されるゲノムまたはｃＤＮＡフラグメントとして）存在する、組換えＤＮＡを包含する。この用語はまた、付加的なポリペプチド配列をコードする雑種遺伝子の部分である組換えＤＮＡを含む。
【０１０３】
異なる記載がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を包含する。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチドはイントロンを含み得る。
【０１０４】
ここで使用する、「指示書（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｌ  ｍａｔｅｒｉａｌ）」は、ここで列挙する様々な疾患または障害の緩和を生じさせるためのキットにおいて本発明の化合物の有用性を伝えるために使用できる出版物、記録、図表、または他の表現媒体を含む。場合によりまたは選択的に、指示書は、哺乳動物の細胞または組織において疾患または障害を緩和する１またはそれ以上の方法を記述し得る。本発明のキットの指示書は、たとえば、同定された本発明の化合物を含む容器に貼付され得るかまたは同定された化合物を含む容器と共に発送され得る。あるいは、指示書は、指示書と化合物が受容者によって協調的に使用されることを意図して容器とは別に発送され得る。
【０１０５】
ここで使用する、「リガンド」は、標的化合物または分子に特異的に結合する化合物である。リガンドは、そのリガンドが不均一な化合物の試料中でその化合物の存在を決定する結合反応において機能するとき、化合物「に特異的に結合する」または化合物「と特異的に反応性である」。
【０１０６】
ここで使用する、「連結」という用語は、２つの群の間の結合を指す。結合は、イオン結合、水素結合、および疎水性／親水性相互作用を含むがこれらに限定されない、共有結合または非共有結合であり得る。
【０１０７】
ここで使用する、「リンカー」という用語は、たとえばイオンまたは水素結合またはファンデルワールス相互作用を通して、共有結合または非共有結合によって２個の他の分子を連結する分子を指す。
【０１０８】
ここで使用する、「核酸」という用語は、ＲＮＡならびに一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはｃＤＮＡを包含する。さらに、「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」という用語および類似の用語はまた、核酸類似体、すなわちホスホジエステル以外の骨格を有する類似体である。たとえば、当技術分野において公知であり、骨格内にホスホジエステル結合ではなくペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲内とみなされる。「核酸」とは、デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドから成り、およびホスホジエステル結合またはホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホルアミデート、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエートまたはスルホン結合などの修飾結合、およびそのような結合の組合せから成る、何らかの核酸を意味する。核酸という用語はまた、特に、５つの生物学的に生じる塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基から成る核酸を包含する。ここではポリヌクレオチド配列を表わすために従来の表示法を使用する：一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’末端である；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向を５’方向と称する。新生ＲＮＡ転写産物に対する５’から３’へのヌクレオチドの付加の方向を転写方向と称する。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖を「コード鎖」と称する；ＤＮＡ上の標準点に対して５’側に位置するＤＮＡ鎖上の配列を「上流配列」と称する；ＤＮＡ上の標準点に対して３’側にあるＤＮＡ鎖上の配列を「下流配列」と称する。
【０１０９】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的には短いポリヌクレオチド、一般に約５０以下のヌクレオチドを指す。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわちＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）によって表わされるとき、これはまた、「Ｕ」が「Ｔ」に取って代わるＲＮＡ配列（すなわちＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も包含することが了解される。
【０１１０】
「作動可能に連結された」は、成分がそれらの通常の機能を実行するように構成された並列を指す。それゆえ、コード配列に作動可能に連結された制御配列またはプロモーターは、コード配列の発現を生じさせることができる。２個のポリヌクレオチドを「作動可能に連結された」と表わすことにより、一本鎖または二本鎖核酸部分が、２個のポリヌクレオチドの少なくとも１個がそれを特徴づける生理的作用を他方に及ぼすことができるように核酸部分内に配置された２個のポリヌクレオチドを含むことが意味される。例として、遺伝子のコード領域に作動可能に連結されたプロモーターは、コード領域の転写を促進することができる。
【０１１１】
ここで使用する、「ＰＡＫ機能」という用語は、他の分子とのＰＡＫ結合、キナーゼ活性、自己リン酸化、トランスロケーション、他の分子による活性化等を含むがこれらに限定されない、ｐ２１活性化キナーゼの何らかの活性または機能を指す。「ＰＡＫ機能」は、ここでは「ＰＡＫ活性」と交換可能に使用される。ここで使用する、「ＰＡＫの阻害」は、ＰＡＫ合成を阻害することを含む、何らかのＰＡＫ活性または機能を阻害することを指す。
【０１１２】
「ＰＡＫブロッキングペプチド」、「ＴＡＴ−ＰＡＫ−Ｎ末端ペプチド」および「Ｎｃｋブロッキングペプチド」という用語は、配列番号６のペプチドを指し、これらの用語はここでは交換可能に使用される。配列番号の成分である、配列番号７。
【０１１３】
ここで述べる「ＰＩＸブロッキングペプチド」、「ＰＩＸ結合ペプチド」等の用語は、配列番号４のペプチドなどの、ＰＩＸとＰＡＫの相互作用をブロックするペプチドを指し、これらの用語はここでは交換可能に使用される。
【０１１４】
「ペプチド」という用語は、典型的には短いポリペプチドを指す。
【０１１５】
「ポリペプチド」は、アミノ酸残基、関連する天然に生じる構造変異体、およびペプチド結合によって連結されたその合成の非天然に生じる類似体、関連する天然に生じる構造変異体、およびその合成の非天然に生じる類似体から成る重合体を指す。合成ポリペプチドは、たとえば自動ポリペプチド合成装置を用いて合成することができる。
【０１１６】
「タンパク質」という用語は、大きなポリペプチドを指す。
【０１１７】
「組換えポリペプチド」は、組換えポリヌクレオチドの発現時に生産されるものである。
【０１１８】
ペプチドは、天然に生じるまたは合成（非天然に生じる）アミノ酸である、２またはそれ以上のアミノ酸の配列を含む。ペプチドミメティックは、以下の修飾の１またはそれ以上を有するペプチドを含む：
１．ペプチジル−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−結合の１またはそれ以上が、−ＣＨ２−カルバメート結合（−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−）、ホスホネート結合、−ＣＨ２スルホンアミド（−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−）結合、尿素（−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−）結合、−ＣＨ２−第二級アミン結合などの非ペプチジル結合によって、またはアルキル化ペプチジル結合（−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−）［式中、ＲはＣ１−Ｃ４アルキルである］で置換されたペプチド；
２．Ｎ末端が、−ＮＲＲ１基、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ基、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ基、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ基、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ基［式中、ＲおよびＲ１は、ＲとＲ１の両方が同時に水素ではないことを条件として、水素またはＣ１−Ｃ４アルキルである］に誘導体化されているペプチド；
３．Ｃ末端が、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２［式中、Ｒ２はＣ１−Ｃ４アルコキシから成る群より選択される］、および−ＮＲ３Ｒ４［式中、Ｒ３とＲ４は、水素およびＣ１−Ｃ４アルキルから成る群より独立して選択される］に誘導体化されているペプチド。
【０１１９】
ここで使用する、「透過性」という用語は、細胞および組織の間のまたは細胞および組織を通しての液体、細胞またはデブリの通過を指す。
【０１２０】
ここで使用する、「医薬的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水または水／油乳剤などの乳剤、および様々な種類の湿潤剤などの、標準的な医薬担体を含む。この用語はまた、ヒトを含む動物における使用に関して米国連邦政府の規制当局によって認可されたまたは米国薬局方に記載されている物質を包含する。
【０１２１】
ここで使用する、末端アミノ基に関する「保護基」は、ペプチド合成において伝統的に使用される様々なアミノ末端保護基のいずれかと結合している、ペプチドの末端アミノ基を指す。そのような保護基は、たとえばホルミル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、スクシニルおよびメトキシスクシニルなどのアシル保護基；ベンジルオキシカルボニルなどの芳香族ウレタン保護基；および脂肪族ウレタン保護基、たとえばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルまたはアダマンチルオキシカルボニルを含む。適切な保護基に関してはＧｒｏｓｓとＭｉｅｎｈｏｆｅｒ編集、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｖｏｌ．３，ｐ．３−８８（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１）参照。
【０１２２】
ここで使用する、末端カルボキシ基に関する「保護基」は、様々なカルボキシル末端保護基のいずれかと結合している、ペプチドの末端カルボキシル基を指す。そのような保護基は、たとえばｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル、あるいはエステルまたはエーテル結合を通して末端カルボキシル基に連結された他の許容される基を含む。
【０１２３】
ここで使用される、「精製」という用語および同様の用語は、ある分子または化合物が天然環境において通常関連する他の成分と比較してその分子または化合物の富化に関する。「精製」という用語は、必ずしもその工程の間に特定分子の完全な純度が達成されることを指示しない。ここで使用する「高度精製」化合物は、９０％以上純粋である化合物を指す。
【０１２４】
ここで使用する、「タンパク質調節経路」という用語は、タンパク質を調節する上流調節経路、ならびにそのタンパク質が調節する下流事象の両方を指す。そのような調節は、対象タンパク質の転写、翻訳、レベル、活性、翻訳後修飾および機能、ならびにそのタンパク質が調節する下流事象を含むが、これらに限定されない。
【０１２５】
「タンパク質経路」および「タンパク質調節経路」という用語は、ここでは交換可能に使用される。
【０１２６】
「調節する」という用語は、対象機能または活性を刺激することまたは阻害することのいずれかを指す。
【０１２７】
ここで使用する、「特異的に結合する」という用語により、特定タンパク質を認識し、結合するが、試料中の他の分子を実質的に認識しないまたは結合しない化合物が意味されるか、またはこの用語は、細胞調節過程の一部として、試料中の他のタンパク質を実質的に認識しないまたは結合しない２またはそれ以上のタンパク質の間の結合を意味する。
【０１２８】
ここで使用する、「標準品」という用語は、比較のために使用される何らかのものを指す。たとえば標準品は、試料中のある化合物を測定するとき、結果を比較するために投与されるかまたは対照試料に添加されて使用される公知の標準物質または化合物であり得る。標準品はまた、既知量で試料に添加され、対象マーカーを測定する前に試料を処理するあるいは精製または抽出工程に供するとき、精製または回収率などの事項を測定する上で有用である物質または化合物などの「内部標準」も表わすことができる。
【０１２９】
診断または治療の「被験体」は、ヒトを含む哺乳動物である。
【０１３０】
ここで使用する、「治療する」という用語は、特定疾患、障害または状態の予防、あるいは特定疾患、障害または状態に関連する症状の緩和および／または前記症状を予防または排除することを含む。「予防的」処置は、疾患に関連する病変を発現する危険度を低下させるために、疾患の徴候を示していないまたは疾患の初期徴候だけを示している被験体に投与される治療である。
【０１３１】
「治療的」処置は、疾病の徴候を示している被験体に、それらの徴候を低減するまたは排除するために投与される治療である。
【０１３２】
化合物の「治療有効量」は、その化合物が投与される被験体に有益な作用を提供するために十分な化合物の量である。
【０１３３】
ここで使用する、「血管外漏出関連疾患または障害」等の語句は、血管外漏出を生じさせるまたは血管外漏出に関連する疾患、障害、損傷または病的状態を指す。それゆえこの語句は、血管外漏出が起こるいかなる状態も指す。血管外漏出または血管透過性の変化は、多くの疾患、障害、損傷および病的状態で起こる。たとえばそのような病的状態または刺激は、組織損傷、虚血、炎症、発作、創傷治癒、急性呼吸窮迫症候群、高血圧、心筋梗塞、敗血症、低酸素症、感染、アレルギー反応、熱損傷、ｘ線照射および紫外線照射を含むが、これらに限定されない。加えて、血管外漏出は多くの疾患において局所的組織炎症に結びつく。「血管外漏出関連疾患または障害」という用語は、ここでは「血管透過性関連疾患または障害」と交換可能に使用される。
【０１３４】
（発明の実施形態）
本発明は、血管透過性を調節するための組成物および方法を対象とする。本発明は、少なくとも一部には、ＰＡＫ機能をブロックすることが血管外への液体漏出を抑制するという発見に基づく。１つの態様では、損傷に応答した血管外液体漏出が抑制される。本発明はさらに、ミオシン軽鎖のリン酸化の誘導などのＰＡＫの活性がＭＥＫおよびＥｒｋによって媒介されることを開示する。本発明はさらに、ＥｒｋがＰＡＫによって活性化されることを開示する。本発明はさらに、Ｅｒｋの活性化がＰＡＫ、ＰＩＸおよびＧＩＴ１の間の複合体の完全性を必要とし、それが次にＭＥＫを通して作用することを開示する。本発明は、それゆえ、血管透過性の刺激を阻害するためにＰＡＫ／ＰＩＸ／ＧＩＴ１の複合体を崩壊させる、ならびに前記複合体がＭＥＫおよびＥｒｋ経路として働くのでそれを崩壊させる手段を対象とする。本発明はさらに、血管透過性上昇を抑制するための手段としてＥｒｋ活性化またはその経路を阻害することを包含する。
【０１３５】
１つの実施形態では、本発明は、ＰＩＸへのＰＡＫの結合をブロックすることによって血管透過性を抑制する方法を提供する。１つの態様では、本発明は、ＰＩＸへのＰＡＫの結合をブロックするペプチドを提供する。１つの態様では、ペプチドは、配列番号１および４、それらのホモログ、誘導体および修飾物から成る群より選択される配列を含む配列を有する。
【０１３６】
１つの実施形態では、本発明は、ＭＥＫとＧＩＴの相互作用を阻害することによって血管透過性を抑制する方法を提供する。本発明は、ペプチド、抗体およびｓｉＲＮＡを含むが、これらに限定されない阻害剤を提供する。
【０１３７】
１つの実施形態では、本発明は、ＧＩＴへのＰＩＸの結合をブロックすることによって血管透過性を抑制する方法を提供する。１つの態様では、ＧＩＴはＧＩＴ１である。もう１つの態様では、ＧＩＴはＧＩＴ２である。１つの態様では、本発明は、ＧＩＴへのＰＩＸの結合をブロックするペプチドを提供する。１つの態様では、ペプチドは配列番号２の配列を含む。１つの態様では、ＰＩＸはＰＩＸαである。もう１つの態様では、ＰＩＸはＰＩＸβである。
【０１３８】
本発明はまた、本発明における使用のための他のＰＡＫレギュレーターを包含する。付加的なＰＡＫレギュレーターを同定するために有用なアッセイは、本文中ならびにそれらの開示全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第６，２４８，５４９号および米国特許公開第２００４０１３８１３３号に述べられている。
【０１３９】
もう１つの実施形態では、ＰＡＫ活性または機能のレギュレーターは、他のタンパク質または分子がＰＡＫと結合するのをブロックすることができる。１つの態様では、レギュレーターは他のタンパク質または分子と結合して、それらがＰＡＫと相互作用するのを阻害する。もう１つの態様では、レギュレーターはＰＡＫに結合して、他のタンパク質または分子がＰＡＫと結合するのを阻害する。１つの態様では、本発明の阻害剤は、ＰＩＸとＰＡＫの相互作用を阻害する。１つの態様では、阻害剤はペプチドである。１つの態様では、ペプチドは、配列番号４、またはその生物学的に活性なフラグメント、ホモログ、修飾物または誘導体を含む配列を有する。もう１つの態様では、ペプチドは、配列番号４、またはその生物学的に活性なフラグメント、ホモログ、修飾物または誘導体である。
【０１４０】
１つの実施形態では、本発明の阻害剤はＰＩＸ−ＧＩＴ複合体の形成を阻害する。もう１つの態様では、ＰＩＸ−ＧＩＴ複合体の機能が阻害される。１つの態様では、本発明の阻害剤は、ＰＩＸ−ＧＩＴ複合体がＰＡＫの下流でＥｒｋ活性化を促進するのを阻害する。さらにもう１つの態様では、本発明の阻害剤は、ＰＩＸ−ＧＩＴ複合体がＰＡＫの下流でＭＬＣＫ活性化を促進するのを阻害する。１つの態様では、阻害剤はペプチドである。１つの態様では、ペプチドは、配列番号４、またはその生物学的に活性なフラグメント、ホモログ、修飾物または誘導体を含む配列を有する。
【０１４１】
１つの実施形態では、本発明の阻害剤はＰＡＫ／ＰＩＸ／ＧＩＴ複合体の形成を阻害する。もう１つの実施形態では、本発明の阻害剤は、ＰＡＫ／ＰＩＸ／ＧＩＴ／ＭＥＫ複合体の形成または機能を阻害する。
【０１４２】
本出願は、ここで同定する経路をブロックするためのｓｉＲＮＡの使用を開示する。１つの態様では、ｓｉＲＮＡはＧＩＴ１を対象とする。さらなる態様では、第一ｓｉＲＮＡを、第一ｓｉＲＮＡとわずかに異なる配列を有する第二ｓｉＲＮＡと組み合わせて使用することができ、あるいは第二ｓｉＲＮＡは全く異なる配列を対象とし得る。１つの態様では、ＧＩＴ１に対するｓｉＲＮＡは、配列番号８−１１から成る群より選択される配列を含む。本発明のｓｉＲＮＡはさらに、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ここで述べるペプチドをコードする核酸、アプタマー、抗体、キナーゼ阻害剤、および薬剤／作用物質／化合物などの、ここで述べるまたは当技術分野において公知の他のレギュレーターと共に使用することができる。
【０１４３】
当業者が、化合物がＰＡＫ、ＰＩＸ、ＧＩＴ、ＭＥＫ、ＥｒｋおよびＭＬＣＫのシグナル伝達および調節経路の成分を調節するかどうかを観測するための多くのアッセイおよび方法が、ここで述べられるかまたは当技術分野において公知であり、これらのアッセイおよび方法は本発明の方法に包含される。そのようなアッセイはまた、タンパク質および経路のレギュレーターを同定するために有用である。
【０１４４】
たとえばＰＡＫ活性および機能は、ＰＡＫリン酸化および細胞間結合へのトランスロケーションなどの事象を検定することによって観測できる。そのようなアッセイは、Ｓｃｈｗａｒｔｚら（その内容全体が参照によりここに組み込まれる、２００５年１０月２０日公開の米国特許公開第２００５／０２３３９６５号）に述べられている。ＰＡＫ−１、−２および−３は、ＡＩＤと命名された調節Ｎ末端内の配列とキナーゼドメインの相互作用によって不活性コンフォメーションに保持されている（Ｂｏｋｏｃｈら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００３，７２：７４３）。ＰＡＫへの活性化ＲａｃまたはＣｄｃ４２の結合は、ＰＡＫキナーゼ活性の持続的上昇を与えるいくつかの部位の自己リン酸化を導く（Ｇａｔｔｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４：３２５６５；Ｃｈｏｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１，２７６：１７３４７）。これらの部位の１つである、ＰＡＫ２内のＳｅｒ１４１（ＰＡＫ１内のＳｅｒ１４４に対応する）はＡＩＤ内であり、そのリン酸化は、キナーゼドメインとＡＩＤの相互作用をブロックすることによって活性化に寄与する。内皮細胞において活性化ＰＡＫを局在化するため、リン酸化Ｓｅｒ１４１部位を特異的に認識する抗体を使用することができる。
【０１４５】
試験化合物／阻害剤に応答した内皮細胞におけるＰＡＫリン酸化を評価するため、化合物を、１８時間血清飢餓させ（０．５％血清）、その後１０％血清で刺激し得る、集密ウシ大動脈およびヒト臍帯静脈内皮細胞（それぞれＢＡＥＣおよびＨＵＶＥＣ）を用いて血清の作用と比較することができる。抗ホスホ−ＰＡＫ  Ｓｅｒ１４１抗体によるウエスタンブロット法が、ＰＡＫリン酸化の変化を検定するために使用できる。同様に処置した細胞の抗ホスホ−ＰＡＫ  Ｓｅｒ１４１（ｐＰＡＫ）による蛍光染色は、タンパク質の活性画分が主として細胞間結合に局在するかどうかを検定することにより、血清、無処置および試験化合物に応答したＰＡＫリン酸化の変化を指示するために使用できる。
【０１４６】
本発明はさらに、ここで述べるタンパク質および経路のレギュレーターを同定するための酵母ツーハイブリッドシステムの使用を包含する。そのようなレギュレーターは、薬剤、化合物、ペプチド、核酸等であり得る。そのようなレギュレーターは、内因性レギュレーターを含み得る。
【０１４７】
一般に、酵母ツーハイブリッドアッセイは、新規タンパク質間相互作用およびそれらの相互作用を変化させる化合物を同定することができる。多くの異なるタンパク質を潜在的結合パートナーとして使用することにより、これまで特性決定されていなかった相互作用を検出することが可能である。第二に、酵母ツーハイブリッドアッセイは、起こることが既に知られている相互作用を特性決定するために使用できる。特性決定は、トランケート型タンパク質を使用することにより、どのタンパク質ドメインが相互作用の責任を担うか、または細胞内環境を変化させることにより、どのような条件下で相互作用が起こるかを判定することを含み得る。これらのアッセイはまた、相互作用の調節因子をスクリーニングするためにも使用できる。
【０１４８】
本発明は、ここで述べるタンパク質相互作用および経路のアゴニスト（刺激する）またはアンタゴニスト（阻害する）として働く化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法を包含する。アンタゴニスト化合物候補物質についてのスクリーニングアッセイは、ここで述べるペプチドと結合するまたは複合する、またはさもなければ他の細胞タンパク質とペプチドの相互作用に干渉する化合物を同定するように設計される。そのようなスクリーニングアッセイは、アッセイを、低分子薬剤候補物質を同定するために特に適したものにする、化学物質ライブラリーのハイスループットスクリーニングに適合させやすいアッセイを含む。
【０１４９】
アッセイは、当技術分野において広く特性決定されている、タンパク質間結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、免疫測定法、および細胞ベースのアッセイを含む、様々な形式で実施することができる。
【０１５０】
アンタゴニストについてのすべてのアッセイは、化合物または薬剤候補物質を、これら２つの成分が相互作用するために十分な条件下で十分な時間、ここで同定されるペプチドと接触させることを必要とするという点で共通する。
【０１５１】
結合アッセイでは、相互作用は結合であり、形成される複合体を反応混合物中で単離または検出することができる。特定実施形態では、ここで述べる複合体のペプチドの１つ、あるいは試験化合物または薬剤候補物質を、共有結合または非共有結合によって固相、たとえばマイクロタイタープレートに固定化する。非共有結合は一般に、固体表面をペプチドの溶液で被覆し、乾燥することによって達成される。あるいは、固定化するペプチドに特異的な固定化抗体、たとえばモノクローナル抗体が、ペプチドを固体表面につなぎ止めるために使用できる。アッセイは、検出可能標識によって標識され得る非固定化成分を、固定化成分、たとえばつなぎ止められた成分を含む被覆表面に添加することによって実施される。反応が完了したとき、非反応成分を、たとえば洗浄によって除去し、固体表面につなぎ止められた複合体を検出する。最初に非固定化成分が検出可能標識を担持するときは、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを指示する。最初に非固定化成分が標識を担持していない場合は、たとえば固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体を使用することによって複合体形成を検出することができる。
【０１５２】
候補化合物が、ここで同定される特定ペプチドと相互作用するが結合しない場合、候補化合物とそのペプチドの相互作用は、タンパク質間相互作用を検出するための周知の方法によって検定することができる。そのようなアッセイは、たとえば架橋、共免疫沈降、および勾配またはクロマトグラフィーカラムを通しての共精製などの伝統的アプローチを含む。加えて、タンパク質間相互作用は、ＣｈｅｖｒａｙとＮａｔｈａｎｓ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５７８９−５７９３（１９９１）によって開示されたように、Ｆｉｅｌｄｓと共同研究者たち（Ｆｉｅｌｄｓと  Ｓｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３４０：２４５−２４６（１９８９）；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：９５７８−９５８２  （１９９１））によって記述された酵母ベースの遺伝子系を用いることによって観測できる。ツーハイブリッド手法を用いて２個の特定タンパク質の間のタンパク質間相互作用を同定するための完全なキットが入手可能である。このシステムはまた、特定のタンパク質相互作用に関与するタンパク質ドメインを位置特定することならびにこれらの相互作用にとって決定的に重要なアミノ酸残基を正確に示すことに拡大できる。
【０１５３】
ここで同定するペプチドおよび他の細胞内または細胞外成分の相互作用に干渉する化合物を以下のように試験することができる：通常、遺伝子の産物および細胞内または細胞外成分を含む反応混合物を、２つの産物の相互作用と結合を許容する条件下と時間で調製する。候補化合物が結合を阻害する能力を調べるため、試験化合物の不在下と存在下で反応を実施する。加えて、陽性対照として使用するためのプラセボを３番目の反応混合物に添加し得る。試験化合物と混合物中に存在する細胞内または細胞外成分の間の結合（複合体形成）をここで上述したように観測する。対照反応では複合体が形成されるが、試験化合物を含む反応混合物では複合体が形成されないことは、試験化合物が試験化合物とその反応パートナーの相互作用を妨げることを指示する。
【０１５４】
アンタゴニストを検定するために、ペプチドを特定活性に関してスクリーニングする化合物と共に細胞に添加してもよく、化合物がペプチドの存在下で対象活性を阻害する能力は、化合物がペプチドに対するアンタゴニストであることを指示する。ペプチドは、放射能などによって標識することができる。
【０１５５】
ｐｈｙｌｏｍｅｒｓ（登録商標）の使用および逆酵母ツーハイブリッドアッセイ（Ｗａｔｔ，２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２４：１７７；Ｗａｔｔ，米国特許第６，９９４，９８２号；Ｗａｔｔ，米国特許効果第２００５／０２８７５８０号；Ｗａｔｔ，米国特許公開第６，５１０，４９５号；Ｂａｒｒら、２００４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９：４１：４３１７８−４３１８９参照；これらの出版物の各々の内容は、その全体が参照によりここに組み込まれる）などの、他のアッセイおよびライブラリーも本発明に包含される。Ｐｈｙｌｏｍｅｒｓ（登録商標）は天然タンパク質のサブドメインに由来し、それらを従来の短いランダムなペプチドよりも潜在的に安定にする。Ｐｈｙｌｏｍｅｒｓ（登録商標）は、ヒト起源ではない生物ゲノムから供給される。この特徴は、ヒトタンパク質標的に対してのＰｈｙｌｏｍｅｒｓ（登録商標）に関連する効力を有意に増強する。Ｐｈｙｌｏｇｉｃａの現在のＰｈｙｌｏｍｅｒｓ（登録商標）ライブラリー５０００万クローンの複雑度を有し、これはランダムペプチドまたは抗体Ｆａｂフラグメントライブラリーの数的複雑度に匹敵する。Ｂ４２活性化ドメインに融合した６３００万ペプチドから成る、相互作用ペプチドライブラリーは、正の酵母ツーハイブリッドスクリーニングにおいて標的タンパク質に結合することができるペプチドを単離するために使用できる。２番目は、逆ツーハイブリッドシステムを用いて特定タンパク質相互作用を崩壊させることができるペプチドをスクリーニングするために使用できる、２００万を超えるペプチドから構成されるブロッキングペプチドライブラリーである。
【０１５６】
Ｐｈｙｌｏｍｅｒｓ（登録商標）ライブラリーは、多種多様な細菌ゲノムから供給されたタンパク質フラグメントから成る。ライブラリーは、安定なサブドメイン（１５−５０アミノ酸長）が高度に富化されている。この技術は、ファージディスプレイおよび逆酵母ツーハイブリッドトラップなどのハイスループットスクリーニング手法と統合することができる。
【０１５７】
本発明のタンパク質、ポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントに対する抗体は、当技術分野において周知の方法を用いて作製し得る。たとえばその全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許出願第０７／４８１，４９１号は、ペプチドに対する抗体を惹起する方法を開示する。抗体の生産のために、ウサギ、マウスおよびラットを含むがこれらに限定されない、様々な宿主動物を、ポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントの注射によって免疫することができる。免疫応答を高めるため、宿主の種に依存して、フロイント（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチンなどの界面活性剤、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどの潜在的に有用なヒトアジュバントを含むがこれらに限定されない、様々なアジュバントを使用し得る。
【０１５８】
モノクローナル抗体の作製のために、培養下で連続継代性細胞系による抗体分子の産生を提供する何らかの手法を使用し得る。たとえばＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）によって最初に開発されたハイブリドーマ手法、トリオーマ手法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ手法（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ手法（Ｃｏｌｅら、１９８５，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐ．７７−９６）が、ヒトモノクローナル抗体を作製するために使用し得る。もう１つの実施形態では、モノクローナル抗体は、その全体が参照によりここに組み込まれる、国際公開番号第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５号に述べられている技術を用いて無菌動物において生産される。
【０１５９】
本発明に従って、ヒトハイブリドーマを利用することによって（Ｃｏｔｅら、１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２０２６−２０３０）またはインビトロでヒトＢ細胞をＥＢＶウイルスで形質転換することによって（Ｃｏｌｅら、１９８５，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐ．７７−９６）ヒト抗体を使用し、入手し得る。さらに、ＳＬＬＰポリペプチドのエピトープに特異的なマウス抗体分子からの遺伝子を適切な生物活性のヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生産のために開発された手法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４）が使用できる；そのような抗体は本発明の範囲内である。ひとたび特異的モノクローナル抗体が開発されれば、従来の手法によるその突然変異体および変異体の作製も可能である。
【０１６０】
１つの実施形態では、一本鎖抗体の生産のために記述された手法（その全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第４，９４６，７７８号）が、タンパク質特異的一本鎖抗体を生産するように適合される。もう１つの実施形態では、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のために記述された手法（Ｈｕｓｅら、１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１）が、特定抗原、本発明のタンパク質、誘導体または類似体に対して所望特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速で容易な同定を可能にするために利用される。
【０１６１】
抗体分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、公知の手法によって作製できる。たとえばそのようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって生産できるＦ（ａｂ’）２フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって作製できるＦａｂ’フラグメント；抗体分子をパパインと還元剤で処理することによって作製できるＦａｂフラグメント；およびＦｖフラグメントを含むが、これらに限定されない。
【０１６２】
ポリクローナル抗体の作製は、所望動物に抗原を接種し、抗原に特異的に結合する抗体をそこから単離することによって実施される。
【０１６３】
完全長タンパク質またはペプチドまたはそのペプチドフラグメントに対するモノクローナル抗体は、たとえばＨａｒｌｏｗら（１９８８，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）およびＴｕｓｚｙｎｓｋｉら（１９８８，Ｂｌｏｏｄ，７２：１０９−１１５）に述べられているような、何らかの周知のモノクローナル抗体作製手順を用いて作製し得る。大量の所望ペプチドも化学合成技術を用いて合成し得る。あるいは、所望ペプチドをコードするＤＮＡをクローニングし、大量のペプチドの作製に適した細胞において適切なプロモーター配列から発現させ得る。ペプチドに対するモノクローナル抗体は、ここで言及するような標準手順を用いてペプチドで免疫したマウスから作製される。
【０１６４】
ここで述べる手順を用いて得られたモノクローナル抗体をコードする核酸は、当技術分野において使用可能であり、たとえばＷｒｉｇｈｔら（１９９２，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（３，４）：１２５−１６８）およびその中で引用される参考文献に述べられている技術を用いて、クローニングし、配列決定し得る。さらに、本発明の抗体は、Ｗｒｉｇｈｔら（前出）およびその中で引用される参考文献、およびＧｕら（１９９７，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍａｔｏｃｙｓｔ  ７７（４）：７５５−７５９）に述べられている技術を用いて「ヒト化」し得る。
【０１６５】
ファージ抗体ライブラリーを作製するため、最初に、ファージ表面で発現されるべき所望タンパク質、たとえば所望抗体を発現する細胞、たとえばハイブリドーマから単離されるｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを得る。逆転写酵素を用いてｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを生産する。免疫グロブリンフラグメントを規定するｃＤＮＡをＰＣＲによって得て、免疫グロブリン遺伝子を規定するＤＮＡを含むバクテリオファージＤＮＡライブラリーを作製するために、生じたＤＮＡを適切なバクテリオファージベクターにクローニングする。異種ＤＮＡを含むバクテリオファージライブラリーを作製するための手順は当技術分野において周知であり、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）に記述されている。
【０１６６】
所望抗体をコードするバクテリオファージは、タンパク質が、その対応する結合タンパク質、たとえば抗体が対象とする抗原に結合するために使用可能であるようにその表面に提示されるように遺伝子操作し得る。それゆえ、特定抗体を発現するバクテリオファージを、対応抗原を発現する細胞の存在下でインキュベートしたとき、バクテリオファージは細胞に結合する。抗体を発現しないバクテリオファージは細胞に結合しない。そのようなパニング手法は当技術分野において周知である。
【０１６７】
上述したような工程は、Ｍ１３バクテリオファージディスプレイ（Ｂｕｒｔｏｎら、１９９４，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１９１−２８０）を用いたヒト抗体の生産のために開発された。基本的に、ｃＤＮＡライブラリーは、抗体産生細胞の集団から得られるｍＲＮＡから作製される。ｍＲＮＡは再編成された免疫グロブリン遺伝子をコードし、それゆえｃＤＮＡは同じものをコードする。増幅したｃＤＮＡをＭ１３発現ベクターにクローニングし、表面にヒトＦａｂフラグメントを発現するファージのライブラリーを作製する。対象抗体を提示するファージを抗原結合によって選択し、可溶性ヒトＦａｂ免疫グロブリンを生産するために細菌中で増殖させる。それゆえ、従来のモノクローナル抗体合成と異なり、この手順は、ヒト免疫グロブリンを発現する細胞ではなくヒト免疫グロブリンをコードするＤＮＡを不死化する。
【０１６８】
上述した手順は、抗体分子のＦａｂ部分をコードするファージの作製を述べるものである。しかし、本発明は、Ｆａｂ抗体をコードするファージの作製だけに限定されると解釈されるべきではない。むしろ、一本鎖抗体をコードするファージ（ｓｃＦｖ／ファージ抗体ライブラリー）も本発明に包含される。Ｆａｂ分子はＩｇ軽鎖全体を含み、それゆえ軽鎖の可変領域と定常領域の両方を含むが、重鎖の可変領域と第一定常領域ドメイン（ＣＨ１）だけを含む。一本鎖抗体分子は、Ｉｇ  Ｆｖフラグメントを含むタンパク質の一本鎖を含む。Ｉｇ  Ｆｖフラグメントは、抗体の重鎖と軽鎖の可変領域だけを含み、定常領域はその中に含まれない。ｓｃＦｖ  ＤＮＡを含むファージライブラリーは、Ｍａｒｋｓら、１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７に述べられている手法に従って作製し得る。所望抗体を単離するために、そのようにして作製されたファージのパニングを、Ｆａｂ  ＤＮＡを含むファージライブラリーについて述べたのと同様に実施する。
【０１６９】
本発明はまた、重鎖および軽鎖可変領域がほぼすべての可能な特異性を含むように合成され得る合成ファージディスプレイライブラリーを含むと解釈されるべきである（Ｂａｒｂａｓ，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １：８３７−８３９；ｄｅ  Ｋｒｕｉｆら、１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：９７−１０５）・
抗体の生産において、所望抗体についてのスクリーニングは、当技術分野において公知の手法、たとえばＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫検定法）によって実施できる。本発明に従って作製される抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ（すなわち「ヒト化」）、および一本鎖（組換え）抗体、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーによって生産されるフラグメントを含み得るが、これらに限定されない。
【０１７０】
本発明のペプチドは、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版、１９８４，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩｌｌｉｎｏｉｓにおいてＳｔｅｗａｒｔらによって述べられている、およびＴｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  ＹｏｒｋにおいてＢｏｄａｎｓｚｋｙとＢｏｄａｎｓｚｋｙによって述べられている、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）などの標準的な広く確立された手法によって容易に作製し得る。最初に、適切に保護されたアミノ酸残基をそのカルボキシル基を通して、架橋ポリスチレンまたはポリアミド樹脂などの誘導体化された不溶性高分子支持体に結合する。「適切に保護された」とは、アミノ酸のα−アミノ基および側鎖官能基の両方に保護基が存在することを指す。側鎖保護基は、合成全体を通じて使用される溶媒、試薬および反応条件に対して一般に安定であり、最終ペプチド産物に影響を及ぼさない条件下で除去し得る。オリゴペプチドの段階的合成は、最初のアミノ酸からのＮ保護基の除去、および所望ペプチドの配列内の次のアミノ酸のカルボキシル末端への結合によって実施される。このアミノ酸も適切に保護される。新たに付加されたアミノ酸のカルボキシルは、カルボジイミド、対称酸無水物またはヒドロキシベンゾトリアゾールまたはペンタフルオロフェニルエステルなどの「活性エステル」基の形成のような、反応性基の形成によって支持体結合アミノ酸のＮ末端と反応するように活性化することができる。固相ペプチド合成法の例は、α−アミノ保護基としてｔｅｒｔ−ブチルキシカルボニルを利用するＢＯＣ法、およびアミノ酸残基のα−アミノを保護するために９−フルオレニルメチルオキシカルボニルを利用するＦＭＯＣ法を含み、どちらの方法も当業者に周知である。
【０１７１】
Ｎおよび／またはＣ保護基の組込みはまた、固相ペプチド合成法に慣例的なプロトコールを用いて実施できる。Ｃ末端保護基の組込みのために、たとえば、所望ペプチドの合成は、典型的には樹脂からの開裂が所望Ｃ末端保護基を有するペプチドを生じるように化学修飾された支持樹脂を固相として使用して実施される。Ｃ末端が第一級アミノ保護基を担持するペプチドを提供するために、たとえば、合成は、ペプチド合成が完了したとき、フッ化水素酸による処理が所望Ｃ末端アミド化ペプチドを放出するように、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂を用いて実施される。同様に、Ｃ末端におけるＮ−メチルアミン保護基の組込みは、ＨＦ処理したときＮ−メチルアミド化Ｃ末端を担持するペプチドを放出する、Ｎ−メチルアミノエチル誘導体化ＤＶＢ樹脂を用いて達成される。エステル化によるＣ末端の保護も従来の手順を用いて実施できる。これは、エステル官能基を形成するために、所望アルコールとのその後の反応を可能にする、樹脂からの側鎖ペプチドの放出を許容する樹脂／保護基の組合せの使用を必要とする。ＦＭＯＣ保護基が、メトキシアルコキシベンジルアルコールまたは等価リンカーで誘導体化したＤＶＢ樹脂と組み合わせて、この目的のために使用でき、支持体からの開裂はジクロロメタン中のＴＦＡによって実施される。適切に活性化された、たとえばＤＣＣで活性化されたカルボキシル官能基のエステル化を、次に、所望アルコールの添加およびそれに続くエステル化ペプチド産物の脱保護と単離によって進行することができる。
【０１７２】
Ｎ末端保護基の組込みは、合成されたペプチドがまだ樹脂に結合している間に、たとえば適切な無水物と二トリルでの処理によって達成できる。Ｎ末端にアセチル保護基を組み込むために、たとえば、樹脂結合ペプチドをアセトニトリル中の２０％無水酢酸で処理することができる。Ｎ保護されたペプチド産物を、次に、樹脂から開裂し、脱保護して、その後単離することができる。
【０１７３】
化学的または生物学的合成手法から得られるペプチドが所望ペプチドであることを確実にするために、ペプチド組成物の分析を実施すべきである。そのようなアミノ酸組成物分析は、ペプチドの分子量を決定するために高分解能質量分析を用いて実施し得る。あるいはまたは選択的に、ペプチドのアミノ酸含量は、水性酸中でペプチドを加水分解し、ＨＰＬＣまたはアミノ酸分析装置を用いて混合物の成分を分離し、同定し、定量することによって確認できる。ペプチドを連続的に分解し、アミノ酸を順次同定するタンパク質配列決定装置も、ペプチドの配列を明確に決定するために使用し得る。その使用の前に、夾雑物を除去するためにペプチドを精製する。これに関して、ペプチドが、適切な規制当局によって定められた基準に合致するように精製されることは認識される。たとえばＣ４−、Ｃ８−またはＣ１８−シリカなどのアルキル化シリカカラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む、多くの従来の精製手順のいずれかが、必要なレベルの純度を達成するために使用し得る。漸増有機物含量の勾配移動相、たとえば、通常少量のトリフルオロ酢酸を含む、水性緩衝液中のアセトニトリルが、精製を実施するために一般的に使用される。イオン交換クロマトグラフィーも、ペプチドをそれらの電荷に基づいて分離するために使用できる。
【０１７４】
言うまでもなく、ペプチドまたは抗体、その誘導体またはフラグメントは、活性に影響を及ぼすことなく修飾されたアミノ酸残基を組み込み得る。たとえば末端を、保護基を含むように、すなわちＮおよびＣ末端を「望ましくない分解」から保護するおよび／または安定化するのに適した化学的置換基を含むように誘導体化してもよく、前記の「望ましくない分解」という用語は、化合物の機能に影響を及ぼす可能性がある、その末端での何らかの種類の化合物の酵素的、化学的または生化学的崩壊、すなわちその末端での化合物の連続的分解を包含することが意図されている。
【０１７５】
保護基（ブロッキング基）は、ペプチドのインビボ活性に有害な影響を及ぼさない、ペプチド化学の技術分野において慣例的に使用される保護基を含む。たとえば適切なＮ末端保護基は、Ｎ末端のアルキル化またはアシル化によって導入することができる。適切なＮ末端保護基の例は、Ｃ１−Ｃ５分枝または非分枝アルキル基、ホルミルおよびアセチル基などのアシル基、ならびにアセトアミドメチル（Ａｃｍ）基などのそれらの置換形態を含む。アミノ酸の脱アミノ類似体も有用なＮ末端保護基であり、ペプチドのＮ末端に結合し得るかまたはＮ末端残基の代わりに使用し得る。Ｃ末端のカルボキシル基が組み込まれているかまたは組み込まれていない、適切なＣ末端保護基は、エステル、ケトンまたはアミドを含む。エステルまたはケトンを形成するアルキル基、特にメチル、エチルおよびプロピルなどの低級アルキル基、および第一級アミン（−ＮＨ２）などのアミドを形成するアミノ基、およびメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノ等のようなモノ−およびジ−アルキルアミノ基はＣ末端保護基の例である。アグマチンなどの脱炭酸アミノ酸類似体も有用なＣ末端保護基であり、ペプチドのＣ末端に結合し得るかまたはその代わりに使用し得る。さらに、末端の遊離アミノおよびカルボキシル基が、ペプチド活性に影響を及ぼさずにその脱アミノおよび脱炭酸形態を生成するためにペプチドから完全に除去できることは認識される。
【０１７６】
他の修飾も、活性に有害な影響を及ぼさずに組み込むことができ、これらは、Ｄ異性体のアミノ酸による天然Ｌ異性体のアミノ酸の１またはそれ以上の置換を含むが、これらに限定されない。それゆえペプチドは、１またはそれ以上のＤ−アミノ酸残基を含んでもよく、またはすべてＤ型であるアミノ酸を含んでもよい。本発明に従ったレトロインベルソ形態のペプチド、たとえばすべてのアミノ酸がＤ−アミノ酸形態で置換された逆ペプチドも考慮される。
【０１７７】
本発明の酸付加塩も機能的等価物として考慮される。それゆえ、ペプチドの水溶性の塩を与えるために、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等のような無機酸、または酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等で処理した本発明に従ったペプチドは、本発明における使用に適する。
【０１７８】
本発明はまた、タンパク質およびペプチドのホモログを提供する。ホモログは、保存的アミノ酸配列相違によってまたは配列に影響を及ぼさない修飾によって、またはその両方によって、天然に生じるタンパク質またはペプチドと異なり得る。
【０１７９】
たとえば、タンパク質またはペプチドの一次配列を変化させるが、通常その機能を変化させない、保存的アミノ酸変化を導入し得る。そのために、１０またはそれ以上の保存的アミノ酸変化が、典型的にはペプチド機能に作用を及ぼさない。
【０１８０】
修飾（通常は一次配列を変化させない）は、ポリペプチドのインビボまたはインビトロでの化学的誘導体化、たとえばアセチル化又はカルボキシル化を含む。グリコシル化の修飾、たとえばポリペプチドのグリコシル化パターンをその合成とプロセシングの間にまたはさらなるプロセシング工程において改変することによって、たとえばグリコシル化に影響を及ぼす酵素、たとえば哺乳動物のグリコシル化または脱グリコシル化酵素にポリペプチドを暴露することによって、導入される修飾も含まれる。また、リン酸化アミノ酸残基、たとえばホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホトレオニンを有する配列も包含される。
【０１８１】
また、タンパク質分解に対する抵抗性を改善するためまたは溶解特性を最適化するためまたは治療薬としてより適したものにするために、通常の分子生物学的手法を用いて修飾されたポリペプチドまたは抗体フラグメントも包含される。そのようなポリペプチドのホモログは、天然に生じるＬ−アミノ酸以外の残基、たとえばＤ−アミノ酸または非天然に生じる合成アミノ酸を含むものを包含する。本発明のペプチドは、ここで列挙する特定例示工程のいずれかの産物に限定されない。
【０１８２】
ここで述べるようにして得られる実質的に純粋なタンパク質は、手順の各工程で精製を観測するために免疫学的、酵素的または他のアッセイを使用する、タンパク質精製のための以下の公知の手順によって精製し得る。タンパク質精製方法は当技術分野において周知であり、たとえばＤｅｕｔｓｃｈｅｒら（編集、１９９０，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）に述べられている。
【０１８３】
本発明はまた、本発明のペプチド、タンパク質および抗体をコードする核酸を提供する。「核酸」とは、デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドから成り、およびホスホジエステル結合またはホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホルアミデート、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエートまたはスルホン結合などの修飾結合、およびそのような結合の組合せから成る、何らかの核酸を意味する。核酸という用語はまた、特に、５つの生物学的に生じる塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基から成る核酸を包含する。
【０１８４】
本発明は使用する核酸の性質によって限定されることを意図しない。標的核酸は天然または合成核酸であり得る。核酸は、ウイルス、細菌、動物または植物源からであり得る。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、二本鎖、一本鎖または部分的二本鎖形態で存在し得る。さらに、核酸はウイルスまたは他の高分子の一部として認められ得る。たとえばＦａｓｂｅｎｄｅｒら、１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：６４７９−８９（アデノウイルスの形態のＤＮＡのポリリシン縮合）参照。
【０１８５】
本発明において有用な核酸は、限定ではなく例として、アンチセンスＤＮＡおよび／またはＲＮＡ；リボザイム；遺伝子治療のためのＤＮＡ；ウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むウイルスフラグメント；ＤＮＡおよび／またはＲＮＡキメラ；ｍＲＮＡ；プラスミド；コスミド；ゲノムＤＮＡ；ｃＤＮＡ；遺伝子フラグメント；一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、スーパーコイル状ＤＮＡおよび／または三重らせんＤＮＡを含む様々な構造形態のＤＮＡ；Ｚ−ＤＮＡ等のようなオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含む。核酸は、大量の核酸を作製するために典型的に使用される従来の何らかの手段によって作製し得る。たとえばＤＮＡおよびＲＮＡは、当技術分野において周知の方法により、市販の試薬と合成装置を用いて化学合成し得る（たとえばＧａｉｔ，１９８５，ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）参照）。ＲＮＡは、ＳＰ６５（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）などのプラスミドを使用してインビトロ転写によって高収率で生産し得る。
【０１８６】
高いヌクレアーゼ安定性が所望される場合のような、一部の状況では、改変されたヌクレオシド間結合を有する核酸が好ましいと考えられる。改変ヌクレオシド間結合を含む核酸も、当技術分野で周知の試薬と方法を用いて化学合成し得る。たとえばホスホネートホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデートメトキシエチルホスホルアミデート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、ジイソプロピルシリル、アセトアミデート、カルバメート、ジメチレン−スルフィド（−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２）、ジインエチレン−スルホキシド（−ＣＨ２−ＳＯ−ＣＨ２）、ジメチレン−スルホン（−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２）、２’−Ｏ−アルキル、および２’−デオキシ２’−フルオロホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む核酸を合成するための方法は、当技術分野において周知である（Ｕｈｌｍａｎｎら、１９９０，Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．９０：５４３−５８４；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９０，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３１：３３５およびその中で引用される参考文献参照）。
【０１８７】
核酸は、当技術分野で周知である、何らかの適切な手段によって精製し得る。たとえば核酸は、逆相またはイオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動によって精製できる。言うまでもなく、当業者は、精製の方法が、一部には、精製しようするＤＮＡの大きさに依存することを認識する。
【０１８８】
核酸という用語はまた、特に、５つの生物学的に生じる塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基から成る核酸を包含する。
【０１８９】
本発明は有用なアプタマーを対象とする。１つの実施形態では、アプタマーは、もう１つ別の化合物（この場合は同定されたタンパク質）に選択的に結合するためにインビトロで選択される化合物である。１つの態様では、ランダムな配列が多数のヌクレオチドまたはアミノ酸（どちらも天然に生じるかまたは合成によって作製される）から容易に生成され得るので、アプタマーは核酸またはペプチドであるが、言うまでもなくアプタマーはこれらに限定される必要はない。もう１つの態様では、核酸アプタマーは、タンパク質標的に結合するＤＮＡの短い鎖である。１つの態様では、アプタマーはオリゴヌクレオチドアプタマーである。オリゴヌクレオチドアプタマーは、対象とする特定タンパク質配列に結合することができるオリゴヌクレオチドである。アプタマーを同定する一般的な方法は、部分的縮重オリゴヌクレオチドから出発し、その後何千ものオリゴヌクレオチドを所望タンパク質に結合する能力に関して同時にスクリーニングすることである。結合オリゴヌクレオチドをタンパク質から溶出し、特異的認識配列を同定するために配列決定することができる。大量の化学的に安定化されたアプタマーの細胞への導入は、対象ポリペプチドへの特異的結合を生じさせ、それによってその機能をブロックすることができる［たとえば、アプタマーのインビトロ選択を説明する以下の出版物参照：Ｋｌｕｇら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２０：９７−１０７（１９９４）；Ｗａｌｌｉｓら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５４３−５５２（１９９５）；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．４：４２７−４２９（１９９４）；Ｌａｔｏら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：２９１−３０３（１９９５）；Ｃｏｎｒａｄら、Ｍｏｌ．Ｄｉｖ．１：６９−７８（１９９５）；およびＵｐｈｏｆｆら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：２８１−２８７（１９９６）］。
【０１９０】
ここで使用する、アンタゴニストまたはブロッキング剤は、限定を伴わずに、抗体、その抗原結合部分または特定標識タンパク質に結合する生合成抗体結合部位；標的タンパク質をコードする核酸またはそれに関連する調節エレメントにインビボでハイブリダイズするアンチセンス分子、あるいは標的タンパク質に結合するおよび／または標的タンパク質を阻害する、または標的タンパク質をコードする核酸に結合するおよび／または核酸を阻害する、核酸の発現を低下させるまたは調節する、リボザイム、アプタマーまたは低分子を含み得る。
【０１９１】
アプタマーは、標的遺伝子機能に人為的に干渉する、他のオリゴヌクレオチドに基づくアプローチに比べて、高い親和性と特異性でこれらの遺伝子のタンパク質産物に結合する能力のゆえに利益を提供する。しかし、ＲＮＡアプタマーは、ヌクレアーゼ抵抗性アプタマーであっても細胞内分画に効率よく進入しないため、細胞内タンパク質を標的するそれらの能力は限定され得る。さらに、ベクターに基づくアプローチを通して哺乳動物細胞内でＲＮＡアプタマーを発現する試みは、それらの機能的高次構造を変化させ得る、発現されたＲＮＡアプタマー内の付加的な隣接配列の存在によって妨げられた。
【０１９２】
タンパク質分子を標的するために一本鎖核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡアプタマー）を使用するという概念は、高い親和性と特異性で標的タンパク質に結合することを可能にする独自の三次元構造へと折りたたまれる短い配列（２０量体から８０量体）の能力に基づく。ＲＮＡアプタマーは、酵母および多細胞生物などの真核細胞内で成功裏に発現され、細胞環境においてそれらの標的タンパク質に阻害作用を及ぼすことが示された。
【０１９３】
本出願は、ここで述べるタンパク質を阻害するための組成物および方法を開示し、当技術分野において公知である開示されていないものも本発明に包含される。たとえば様々なレギュレーター／エフェクター、たとえば抗体、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ分子などの生物学的に活性な核酸、またはリボザイム、アプタマー、ペプチドまたは前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを認識する低分子量有機化合物が公知である。
【０１９４】
本発明はまた、本発明の血管透過性調節化合物を含有する医薬組成物を対象とする。より詳細には、そのような化合物は、当業者に公知の標準的な医薬的に許容される担体、充填剤、可溶化剤および安定剤を使用して医薬組成物として製剤され得る。
【０１９５】
本発明はまた、本発明の化合物を被験体に投与する方法を対象とする。１つの実施形態では、本発明は、血管外漏出または透過性関連疾患、障害または状態を有する被験体を、本発明の説明する方法を用いて同定される化合物を投与することによって治療する方法を提供する。化合物は、血管外漏出を抑制するために化合物が使用されない対照と比較して少なくとも１０％血管外漏出を抑制することが好ましい。化合物が、未処置対照と比較して少なくとも２５％血管外漏出を抑制することがより好ましい。化合物が、未処置対照と比較して少なくとも５０％血管外漏出を抑制することがさらに好ましい。本発明の化合物が、未処置対照と比較して少なくとも７５％血管外漏出を抑制することがさらに一層好ましい。また、本発明の化合物が、未処置対照と比較して少なくとも９０％血管外漏出を抑制することが好ましい。さらにもう１つの態様では、本発明の化合物が、未処置対照と比較して少なくとも９５％血管外漏出を抑制することが好ましい。本発明の１つの態様では、血管外漏出は、ＰＡＫ機能または活性の阻害によって抑制される。「阻害（抑制）する」および「ブロックする」という用語は、ここでは交換可能に使用される。
【０１９６】
本発明の化合物を含有する医薬組成物は、局所、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下または直腸的手段を含むがこれらに限定されない、数多くの経路によって、その必要のある個体に投与される。
【０１９７】
１つの実施形態に従って、そのような治療を必要とする被験体において血管透過性関連疾患、障害または状態を治療する方法が提供される。その方法は、本発明の少なくとも１つの血管透過性調節化合物を含有する医薬組成物をその必要のある患者に投与することを含む。血管透過性を調節する、本発明の方法によって同定される化合物は、既知の血管透過性化合物または他の薬剤と共に投与することもできる。好ましくは、化合物はヒトに投与される。
【０１９８】
本発明はまた、本発明の方法を実施するための、適切な化合物、そのホモログ、フラグメント、類似体または誘導体の医薬組成物の使用を包含し、前記組成物は、少なくとも１つの適切な化合物、そのホモログ、フラグメント、類似体または誘導体および医薬的に許容される担体を含有する。
【０１９９】
本発明を実施するために有用な医薬組成物は、１ｎｇ／ｋｇ／日から１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量を送達するために投与し得る。本発明の方法において有用な医薬組成物は、経口固体製剤、点眼薬、坐薬、エーロゾル、局所または他の同様の製剤として全身的に投与し得る。適切な化合物に加えて、そのような医薬組成物は、医薬的に許容される担体、および薬剤の投与を増強および促進することが知られる他の成分を含有し得る。ナノ粒子、リポソーム、再封孔（ｒｅｓｅａｌｅｄ）された赤血球、および免疫学に基づくシステムなどの他の可能な製剤も、本発明の方法に従って適切な化合物を投与するために使用し得る。
【０２００】
ここで述べる方法のいずれかを用いて同定され、ここで開示する疾患の治療のために製剤され、哺乳動物に投与される化合物を説明する。
【０２０１】
本発明は、ここで開示する状態、障害および疾患の治療のために有用な化合物を有効成分として含有する医薬組成物の製造および使用を包含する。そのような医薬組成物は、被験体への投与に適する形態の、有効成分単独から成るか、または医薬組成物は、有効成分と１またはそれ以上の医薬的に許容される担体、１またはそれ以上の付加的な成分、またはこれらの何らかの組合せを含有し得る。有効成分は、当技術分野において周知であるように、生理的に許容される陽イオンまたは陰イオンとの組合せなどの、生理的に許容されるエステルまたは塩の形態で医薬組成物中に存在し得る。
【０２０２】
ここで使用する、「生理的に許容される」エステルまたは塩という用語は、組成物が投与される被験体に対して有害でない、医薬組成物の他のいかなる成分とも適合性である有効成分のエステルまたは塩形態を意味する。
【０２０３】
ここで述べる医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野において公知であるまたは今後開発される何らかの方法によって製造し得る。一般に、そのような製造方法は、有効成分を担体あるいは１またはそれ以上の他の付属成分と組み合わせ、その後、必要な場合または望ましい場合は、生成物を所望の単回投与または多回投与単位に成形するまたは包装する工程を含む。
【０２０４】
ここで提供する医薬組成物の説明は主としてヒトへの処方投与に適する医薬組成物を対象とするが、そのような組成物は、一般にすべての種類の動物への投与に適することが当業者に了解される。組成物を様々な動物への投与に適するようにするための、ヒトへの投与に適する医薬組成物の修正は広く理解されており、通常技術を有する動物薬理学者は、必要である場合も単に常套的な実験で、そのような修正を設計し、実施することができる。本発明の医薬組成物の投与が考慮される被験体は、ヒトおよび他の霊長動物、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコおよびイヌなどの商業的に重要な哺乳動物を含む哺乳動物、ニワトリ、アヒル、ガチョウおよびシチメンチョウなどの商業的に重要な鳥類を含むが、これらに限定されない。
【０２０５】
本発明の方法において有用な医薬組成物は、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻内、口腔、点眼、髄腔内または別の投与経路に適した製剤として製造、包装、または販売され得る。他の考慮される製剤は、有効成分を含有する、予測されるナノ粒子、リポソーム製剤、再封孔赤血球、および免疫学に基づく製剤を含む。
【０２０６】
本発明の医薬組成物は、単一単位用量としてまたは複数の単一単位用量として、製造され、包装され、またはバルクで販売され得る。ここで使用する、「単位用量」は、あらかじめ定められた量の有効成分を含有する医薬組成物の個別量である。有効成分の量は、一般に、被験体に投与される有効成分の用量に等しいかまたは、たとえばそのような用量の２分の１または３分の１などの、そのような用量の好都合な分画に等しい。
【０２０７】
本発明の医薬組成物中の有効成分、医薬的に許容される担体および付加的な成分の相対量は、治療される被験体の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、大きさおよび状態に依存して、およびさらに組成物が投与される経路に依存して異なる。例として、組成物は０．１％−１００％（重量／重量）の有効成分を含有し得る。
【０２０８】
有効成分に加えて、本発明の医薬組成物は、１またはそれ以上の付加的な医薬活性物質を含有し得る。特に考慮される付加的な物質は、鎮吐薬およびシアン化物およびシアン酸塩スカベンジャーなどのスカベンジャーを含む。
【０２０９】
本発明の医薬組成物の制御または持続放出製剤は、従来の技術を用いて製造し得る。経口投与に適する本発明の医薬組成物の製剤は、各々あらかじめ定められた量の有効成分を含有する、錠剤、硬または軟カプセル、カシェ剤、トローチまたはロゼンジを含むが、これらに限定されない、個別固体用量単位の形態で製造、包装、または販売され得る。経口投与に適する他の製剤は、粉末または顆粒製剤、水性または油性懸濁液、水性または油性溶液、または乳剤を含むが、これらに限定されない。
【０２１０】
ここで使用する、「油性」液体は、炭素含有液体分子を含み、水より低い極性を示すものである。
【０２１１】
有効成分を含有する錠剤は、たとえば有効成分を、場合により１またはそれ以上の付加的な成分と共に、圧縮するまたは成形することによって製造され得る。圧縮錠剤は、粉末または顆粒製剤などの自由流動形態の有効成分を、場合により１またはそれ以上の結合剤、潤滑剤、賦形剤、界面活性剤および分散剤と混合して、適切な装置で圧縮することによって製造し得る。成形錠剤は、有効成分、医薬的に許容される担体、および少なくとも混合物を湿潤化するのに十分な液体の混合物を、適切な装置で成形することによって製造し得る。錠剤の製造において使用される医薬的に許容される賦形剤は、不活性希釈剤、造粒および崩壊剤、結合剤、および潤滑剤を含むが、これらに限定されない。公知の分散剤は、ジャガイモデンプンおよびデンプングリコール酸ナトリウムを含むが、これらに限定されない。公知の界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウムを含むが、これに限定されない。公知の希釈剤は、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、微結晶セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびリン酸ナトリウムを含むが、これらに限定されない。公知の造粒および崩壊剤は、トウモロコシデンプンおよびアルギン酸を含むが、これらに限定されない。公知の結合剤は、ゼラチン、アカシア、プレゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースを含むが、これらに限定されない。公知の潤滑剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカおよび滑石を含むが、これらに限定されない。
【０２１２】
錠剤は被覆されなくてもよく、または被験体の胃腸管において遅延崩壊を達成し、それによって有効成分の持続性放出と吸収を提供するために公知の方法を用いて被覆されてもよい。例として、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの材料が錠剤を被覆するために使用し得る。さらなる例として、錠剤は、浸透圧による制御放出錠剤を形成するために米国特許第４，２５６，１０８号；同第４，１６０，４５２号；および同第４，２６５，８７４号に述べられている方法を用いて被覆し得る。錠剤はさらに、医薬的に上品で口当たりのよい製剤を提供するために甘味料、香味料、着色料、防腐剤またはこれらの何らかの組合せを含み得る。
【０２１３】
有効成分を含有する硬カプセルは、ゼラチンなどの生理的に分解性の組成物を用いて製造し得る。そのような硬カプセルは有効成分を含み、さらに、たとえば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンなどの不活性固体希釈剤を含む付加的な成分を含有し得る。
【０２１４】
有効成分を含有する軟ゼラチンカプセルは、ゼラチンなどの生理的に分解性の組成物を用いて製造し得る。そのような軟カプセルは、水あるいは落花生油、流動パラフィンまたはオリーブ油などの油性媒質と混合し得る、有効成分を含有する。
【０２１５】
経口投与に適する本発明の医薬組成物の液体製剤は、液体形態あるいは使用前に水または別の適切な媒質で再溶解することを意図した乾燥生成物の形態で製造され、包装され、販売され得る。
【０２１６】
液体懸濁液は、水性または油性媒質中の有効成分の懸濁液を作製するための従来の方法を用いて製造し得る。水性媒質は、たとえば水および等張食塩水を含む。油性媒質は、たとえばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、落花生油、オリーブ油、ゴマ油またはヤシ油などの植物油、分別（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ）植物油、および流動パラフィンなどの鉱物油を含む。液体懸濁液はさらに、懸濁化剤、分散または湿潤剤、乳化剤、粘滑薬、防腐剤、緩衝剤、塩、香味料、着色料および甘味料を含むがこれらに限定されない、１またはそれ以上の付加的な成分を含み得る。油性懸濁液は、増粘剤をさらに含み得る。公知の懸濁化剤は、ソルビトールシロップ、硬化食用油、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アラビアゴム、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体を含むが、これらに限定されない。
【０２１７】
公知の分散または湿潤剤は、レシチンなどの天然に生じるホスファチド、脂肪酸、長鎖脂肪族アルコール、脂肪酸とヘキシトールから誘導される部分エステル、または脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとアルキレンオキシドの縮合物（たとえばそれぞれ、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、およびモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）を含むが、これらに限定されない。公知の乳化剤は、レシチンおよびアラビアゴムを含むが、これらに限定されない。公知の防腐剤は、メチル、エチルまたはｎ−プロピルパラヒドロキシベンゾエート、アスコルビン酸およびソルビン酸を含むが、これらに限定されない。公知の甘味料は、たとえばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、スクロースおよびサッカリンを含む。油性懸濁液のための公知の増粘剤は、たとえば蜜ろう、固形パラフィンおよびセチルアルコールを含む。
【０２１８】
水性または油性溶媒中の有効成分の液体溶液は、液体懸濁液と実質的に同じように製造し得るが、主要な相違は、有効成分を溶媒に懸濁するのではなく溶解することである。本発明の医薬組成物の液体溶液は、液体懸濁液に関して述べた成分の各々を含有し得るが、懸濁化剤が必ずしも溶媒中への有効成分の溶解を助けないことは了解される。水性溶媒は、たとえば水および等張食塩水を含む。油性溶媒は、たとえばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、落花生油、オリーブ油、ゴマ油またはヤシ油などの植物油、分別植物油、および流動パラフィンなどの鉱物油を含む。
【０２１９】
本発明の医薬組成物の粉末および顆粒製剤は公知の方法を用いて製造し得る。そのような製剤は、直接被験体に投与され得るか、たとえば錠剤を形成する、カプセルに充填する、またはそれに水性または油性媒質を添加することによって水性または油性懸濁液または溶液を調製するために使用され得る。これらの製剤の各々は、１またはそれ以上の分散または湿潤剤、懸濁化剤および防腐剤をさらに含有し得る。充填剤などの付加的な賦形剤および甘味料、香味料または着色料もこれらの製剤に含まれ得る。
【０２２０】
本発明の医薬組成物はまた、水中油型乳剤または油中水型乳剤の形態で製造、包装、または販売され得る。油相は、オリーブ油または落花生油などの植物油、流動パラフィンなどの鉱物油、またはこれらの組合せであり得る。そのような組成物は、アラビアゴムまたはトラガカントゴムなどの天然に生じるゴム、ダイズまたはレシチンホスファチドなどの天然に生じるホスファチド、モノオレイン酸ソルビタンなどの脂肪酸とヘキシトール無水物の組合せから誘導されるエステルまたは部分エステル、およびモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンなどの、そのような部分エステルとエチレンオキシドの縮合物のような、１またはそれ以上の乳化剤をさらに含み得る。これらの乳剤はまた、たとえば甘味料または香味料を含む、付加的な成分を含有し得る。
【０２２１】
本発明の医薬組成物はまた、直腸投与、膣投与、非経口投与に適した製剤で製造、包装、または販売され得る。
【０２２２】
医薬組成物は、無菌注射用水性または油性懸濁液または溶液の形態で製造、包装、または販売され得る。この懸濁液または溶液は公知の技術に従って製造でき、有効成分に加えて、ここで述べる分散剤、湿潤剤または懸濁化剤などの付加的な成分を含有し得る。そのような無菌注射用製剤は、たとえば水または１，３−ブタンジオールなどの非毒性で非経口的に許容される希釈剤または溶媒を用いて製造し得る。他の許容される希釈剤および溶媒は、リンガー液、等張塩化ナトリウム溶液、および合成モノまたはジグリセリドなどの固定油を含むが、これらに限定されない。有用な他の非経口的に投与可能な製剤は、微結晶形態で、リポソーム製剤中で、または生分解性高分子系の成分として有効成分を含有するものを含む。持続放出または移植のための組成物は、乳剤、イオン交換樹脂、難溶性高分子、または難溶性の塩などの医薬的に許容される高分子または疎水性材料を含み得る。
【０２２３】
局所投与に適する製剤は、塗布剤、ローション、クリーム、軟膏またはペーストなどの水中油型または油中水型乳剤、および溶液または懸濁液などの液体または半液体製剤を含むが、これらに限定されない。局所的に投与可能な製剤は、たとえば約１％−約１０％（重量／重量）の有効成分を含有し得るが、有効成分の濃度は溶媒中の有効成分の溶解度限界まで高くてもよい。局所投与のための製剤は、ここで述べる付加的な成分の１またはそれ以上をさらに含有し得る。
【０２２４】
本発明の医薬組成物は、口腔を通しての肺投与に適した製剤として製造、包装、または販売され得る。そのような製剤は、有効成分を含有し、約０．５−約７ナノメートル、好ましくは約１−約６ナノメートルの範囲の直径を有する乾燥粒子を含み得る。そのような組成物は、好都合には、推進薬の流れが粉末を分散させるように方向づける乾燥粉末貯蔵容器を含む装置を用いる、または密封容器内の低沸点推進薬に溶解または懸濁した有効成分を含む装置などの自己推進性溶媒／粉末配薬容器を用いる投与のための乾燥粉末の形態である。好ましくは、そのような粉末は、粒子の少なくとも９８重量％が０．５ナノメートル以上の直径を有し、および粒子数の少なくとも９５％が７ナノメートル未満の直径を有する粒子を含む。より好ましくは、粒子の少なくとも９５重量％が１ナノメートル以上の直径を有し、および粒子数の少なくとも９０％が６ナノメートル未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、好ましくは糖などの固体微粉末希釈剤を含み、好都合には単位用量形態で提供される。
【０２２５】
低沸点推進薬は、一般に大気圧で６５°Ｆ以下の沸点を有する液体推進薬を含む。一般に、推進薬は組成物の５０−９９．９％（重量／重量）を構成し、有効成分は組成物の０．１−２０％（重量／重量）を構成し得る。推進薬は、液体非イオン性または固体陰イオン界面活性剤または固体希釈剤などの付加的な成分（好ましくは有効成分を含有する粒子と同じ位数の粒径を有する）をさらに含み得る。
【０２２６】
肺送達用に製剤される本発明の医薬組成物はまた、溶液または懸濁液の小滴の形態で有効成分を提供し得る。そのような製剤は、有効成分を含有する、場合により無菌の、水性または希薄アルコール溶液または懸濁液として製造、包装、または販売され得、何らかの噴霧化または微粒化装置を用いて好都合に投与され得る。そのような製剤は、サッカリンナトリウムなどの香味料、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤、またはメチルヒドロキシベンゾエートなどの防腐剤を含むがこれらに限定されない、１またはそれ以上の付加的な成分をさらに含み得る。この投与経路によって供給される小滴は、約０．１−約２００ナノメートル範囲の平均直径を有する。
【０２２７】
肺送達のために有用であるとここで述べる製剤はまた、本発明の医薬組成物の鼻内送達のためにも有用である。鼻内投与に適するもう１つの製剤は、有効成分を含有し、約０．２−５００マイクロメートルの平均粒子を有する粗粉末である。そのような製剤は、嗅剤が服用される方法で、すなわち外鼻孔の近くに保持された粉末の容器から鼻道を通しての迅速吸入によって投与される。
【０２２８】
鼻投与に適する製剤は、たとえばわずかに０．１％（重量／重量）から１００％（重量／重量）までの有効成分を含有することができ、ここで述べる付加的な成分の１またはそれ以上をさらに含み得る。
【０２２９】
本発明の医薬組成物は、口腔投与に適した製剤として製造、包装または販売され得る。そのような製剤は、たとえば従来の方法を用いて作製される錠剤またはロゼンジの形態であり得、たとえば０．１−２０％（重量／重量）の有効成分を含むことができ、そのバランスは、経口的に溶解性または分解性の組成物および、場合により、ここで述べる付加的な成分の１またはそれ以上を含む。あるいは、口腔投与に適する製剤は、有効成分を含有する粉末あるいはエーロゾル化または噴霧化された溶液または懸濁液を含み得る。そのような粉末またはエーロゾル製剤は、分散したとき、好ましくは約０．１−約２００ナノメートルの範囲の平均粒径または小滴サイズを有し、ここで述べる付加的な成分の１またはそれ以上をさらに含み得る。
【０２３０】
本発明の医薬組成物は、点眼投与に適する製剤として製造、包装または販売され得る。そのような製剤は、たとえば水性または油性液体担体中に有効成分の０．１／１．０％（重量／重量）溶液または懸濁液を含む点眼薬の形態であり得る。そのような点眼薬は、緩衝剤、塩、あるいはここで述べる他の付加的な成分の１またはそれ以上を含み得る。有用な他の点眼によって投与可能な製剤は、微結晶形態またはリポソーム製剤中に有効成分を含有するものを含む。
【０２３１】
ここで使用する、「付加的な成分」は、以下の１またはそれ以上を含むが、これらに限定されない：賦形剤；界面活性剤；分散剤；不活性希釈剤、造粒および崩壊剤；結合剤；潤滑剤；甘味料；香味料；着色料；防腐剤；ゼラチンなどの生理的に分解性の組成物；水性媒質および溶媒；油性媒質および溶媒；懸濁化剤；分散または湿潤剤；乳化剤、粘滑薬；緩衝剤；塩；増粘剤；充填剤；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；安定剤；および医薬的に許容される高分子または疎水性物質。本発明の医薬組成物に含まれ得る他の「付加的な成分」は当技術分野において公知であり、たとえば参照によりここに組み込まれる、Ｇｅｎａｒｏ編集、１９８５，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに述べられている。
【０２３２】
典型的には、動物、好ましくはヒトに投与し得る本発明の化合物の用量は、被験体の体重１キログラム当たり１μｇ−約１００ｇの範囲の量である。投与される正確な用量は、治療される動物の種類および疾患の種類、動物の年齢および投与経路に依存して異なる。好ましくは、化合物の用量は動物の体重１キログラム当たり約１ｍｇ−約１０ｇの範囲である。より好ましくは、用量は被験体の体重１キログラム当たり約１０ｍｇ−約１ｇの範囲である。
【０２３３】
化合物は、１日数回の頻度で被験体に投与し得るか、または１日１回、１週間に１回、２週間ごとに１回、月に１回などのより少ない頻度で、または数ヵ月ごとに１回または１年に１回またはそれ以下などのさらに一層少ない頻度で投与し得る。投与の頻度は当業者に容易に明らかであり、治療される疾患の種類および重症度、被験体の種類および年齢等などの、但しこれらに限定されない、多くの因子に依存する。
【０２３４】
本発明はまた、本発明の化合物および組成物を被験体の細胞または組織に投与することを説明する指示書を含むキットを包含する。もう１つの実施形態では、このキットは、化合物を被験体に投与する前に本発明の組成物を溶解するまたは懸濁するのに適した（好ましくは滅菌）溶媒を含む。本発明はまた、ｐ２１活性化キナーゼを含む組織または細胞の試料、ｐ２１活性化キナーゼの標準レギュレーター、アプリケーターおよびそれらの使用のための指示書を含む、ここで述べる血管透過性のレギュレーターを同定するためにキットを提供する。
【０２３５】
さらなる説明を必要とせずに、当業者は、前記説明および以下の実施例を使用して、本発明の化合物を製造し、利用する、および特許請求される方法を実施することができると考えられる。以下の実施例はそれゆえ、本発明の好ましい実施形態を具体的に示すものであり、いかなる意味においても残りの開示を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２３６】
本発明を、ここで、以下の実施例を参照して説明する。これらの実施例は例示のみを目的として提供するものであり、本発明は、いかなる意味においてもこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、ここで提供する教示の結果として明らかになる、ありとあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。
【０２３７】
ここで述べる実験は、ＥｒｋがＰＡＫ経路においてＰＡＫの下流にあるかどうかを検討した。ＰＩＸ結合領域が欠失しているＧＩＴ１構築物（ＧＩＴ１−△ＳＨＤ）、およびＧＩＴ結合領域が決しているβＰＩＸ構築物（ＰＩＸ−△ＧＢＤ）をこれらの実験で使用した。特定の理論に縛られるのは望むところではないが、ＥｒｋへのＰＡＫの作用はＰＩＸおよびＧＩＴのアダプター機能を必要とし得ると仮定した。この仮説を試験するため、２つの異なる手段によって複合体からＰＡＫを除去するはずである、互いに結合することができないＰＩＸおよびＧＩＴの変異体を発現させた。
【０２３８】
実験方法
細胞培養およびトランスフェクション
ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）を、記述されているように（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  ２００４）１０％子ウシ血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）、１００μｇ／ｍｌジヒドロストレプトマイシンおよび６０Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加した低グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で増殖させた。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＤｒ．Ｂｒｅｔｔ  Ｂｌａｃｋｍａｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｇｉｎｉａ）より入手し、製造者の“ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ”添加物プラス１０％ウシ胎仔血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を添加したＥＧＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）で増殖させ、３−１０継代で使用した。
【０２３９】
図面の説明に示すようにフィルターでの一部の透過性アッセイのために、１００ｍｍ組織培養皿の０．５％ＣＳ−ＤＭＥＭ中の集密ＢＡＥＣを、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅを製造者の指示に従って使用して、指示されているｃＤＮＡ合計５μｇでトランスフェクトした。一晩インキュベートした後、１０％血清を添加したＤＭＥＭに細胞を移し、４８時間目に使用した。一部のアッセイについては、説明に示すように、細胞をヌクレオポレーションによってトランスフェクトした。集密度９０％の２つの１５ｃｍプレートから細胞を分離し、ヌクレオフェクション緩衝液（１０ｍＭ  ＨＰＥＳを含むフェノールレッド不含Ｍ１９９）１．５ｍｌに再懸濁した。各々のトランスフェクションについて、０．２μｌキュベット中の細胞懸濁液１００μｌにＤＮＡ２．５μｇを添加した。Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ  Ｍ３プログラムサイクルを用いてヌクレオフェクションを実施した後、細胞を、増殖培地５ｍｌを含む６０ｍｍプレートに移し、４８時間目に使用した。免疫蛍光のために、皿はＦＮ被覆したカバーガラススリップを含んだ。ＰＡＫペプチドは、Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＶｉｒｇｉｎｉａまたはＥＺ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔｆｉｅｌｄ  ＩＮ）によって合成され、１回のＨＰＬＣによって精製された。
【０２４０】
βＰＩＸおよびＧＩＴ１構築物はＤｒ．Ａ．Ｆ．Ｈｏｒｗｉｔｚより入手した。△ＧＢＤ  βＰＩＸ（ＧＩＴ１結合に関して突然変異した）およびＧＩＴ１の△ＳＨＤ突然変異体（ＰＩＸおよびＭＥＫ結合に関して突然変異した）は記述されている通りであった（Ｚｈａｎｇら、２００３）。ドミナントネガティブＭＥＫ１は記述されている通りであった（Ｒｅｎｓｈａｗら、１９９７）。ヒト配列に対するＧＩＴ１  Ｓｍａｒｔｐｏｏｌ  ｓｉＲＮＡオリゴはＤｈａｒｍａｃｏｎより入手し、ＨＵＶＥＣにおいて実験を実施した。Ｓｍａｒｔｐｏｏｌ混合物は４つの異なるｓｉＲＮＡオリゴを含んだ。４つの異なるセンス配列は次の通りである：
【０２４１】
【化１３】
2009508812.tif 000014
ＬＰＳ−誘導の肺微小血管透過性
すべての動物実験は、Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｇｉｎｉａによる承認を受けた。野生型雄性マウス（Ｃ５７Ｂ１／６、８−１２週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）をエールゾル化したＬＰＳ（腸炎菌、Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に３０分間暴露した。これは微小血管透過性の有意の上昇を生じさせる（Ｒｅｕｔｅｒｓｈａｎら、２００５）。対照動物には食塩水を吸入させた。一部のマウスに、処置の３０分前にＰＡＫ阻害ペプチドまたは対照ペプチドを腹腔内（ｉｐ）注射した。インビボでのＭＥＫの役割を調べるため、７０μＭ  ＵＯ１２６  ０．５ｍｌをｉｐ注射した。エバンスブルー染料血管外遊出手法（Ｇｒｅｅｎら、１９８８）を用いて６時間目に透過性を分析した。簡単に述べると、エバンスブルー（２０ｍｇ／ｋｇ；Ｓｉｇｍａ）を静脈内注射して、３０分後に安楽死させた。血管内染料を除去するために自発的に拍動している右心室を通して肺を灌流した。記述されているように（Ｐｅｎｇら、２００４）肺を切除し、エバンスブルーを抽出した。エバンスブルーの吸収を６２０ｎｍで測定し、ヘム色素の存在に関して補正した：Ａ６２０（補正済み）＝Ａ６２０−（１．４２６×Ａ７４０＋０．０３０）（Ｗａｎｇ  ｌｅら、２００２）。血管外遊出したエバンスブルーを標準曲線に対して算定した（肺１グラム当たりのエバンスブルーマイクログラム）。
【０２４２】
免疫沈降およびウエスタンブロット法
細胞を刺激し、低温ＰＢＳで洗って、低温免疫沈降（ＩＰ）緩衝液（２０ｍＭトリスｐＨ７．６、０．５％ＮＰ４０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、３ｍＭ  ＥＧＴＡ；プラスＳｉｇｍａプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル）０．５ｍｌで１０分間抽出した。それらを１８ゲージ針に３回通し、微量遠心機において１２，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清をプロテインＧ−アガロースビーズ２５μｌであらかじめ清澄化し、指示されている一次抗体と共に４℃で２時間インキュベートした。抗ホスホＰＡＫはＢｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより入手した；抗全ＰＡＫはＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｓからであった；抗ホスホ−Ｅｒｋおよび全ＥｒｋはＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇからであった。抗ＧＩＴ１および抗βＰＩＸはＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからであった。プロテインＡ−またはプロテインＧ−アガロースビーズ２５μｌを添加し、４℃で回転させながらさらに２時間インキュベートした。ビーズを沈降させ、ＩＰ緩衝液０．５ｍｌで３回洗って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ペプチドへの結合のために、ビオチン標識ペプチド２５μｇをストレプトアビジンビーズ２５μｌと共に３０分間インキュベートし、その後洗浄して、細胞溶解産物０．５と共に３０分間インキュベートした。結合タンパク質を、指示されている抗体でのウエスタンブロット法によって検出した。βＰＩＸについては、細胞をＨＡ−ＰＩＸでトランスフェクトし、抗ＨＡを用いてブロットをプローブした。タンパク質を電気泳動によってＰＶＤＦ膜に移し、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）中の５％乳でブロックして、同じ緩衝液中の一次抗体で一晩プローブした。膜を４回洗い、二次抗体で２時間プローブして、その後化学発光（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて視覚化した。
【０２４３】
インビトロでの透過性
集密に近い、ＦＮ被覆した３μｍフィルター上のＢＡＥＣを、上述したようにＥｆｆｅｃｔｅｎｅを用いてｃＤＮＡ０．５μｇでトランスフェクトした。４８時間目に、指示されているＰＡＫペプチドで細胞を６０分間前処置した。一部の実験については、細胞をヌクレオフェクトし、その後フィルターにプレートして、集密まで４８時間増殖させた。次にフィルターを、フェノールレッドまたは血清を含まない新鮮ＤＭＥＭ培地５００μｌと共に外側のウエルに入れた。各々のフィルターウエルに、上述したように培地２００μｌプラス、サイトカインを含むまたは含まない１．５μｇ／ｍｌホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）５０μｌを添加した。３０分後、フィルターを取り出して固定し、記述されているように（Ｓｔｏｃｋｔｏｎら、２００３）より低いウエル中の培地をＨＲＰに関して検定した。数値を対照未処置ウエルに基準化した。
【０２４４】
免疫蛍光
細胞を３．５％ホルムアルデヒド中に６０分間固定し、洗浄して、０．２％ＴＸ１００中で１０分間透過性上昇させた。１０％ヤギ血清を含むＰＢＳでカバーガラスを６０分間ブロックし、その後４℃にて以下の抗体を含む２００μｌで８時間プローブした：１：５００のホスホ−ＥＲＫ；１：５００のホスホ−ＭＥＫ；１：５００のホスホ−ＰＡＫ；１：５００のホスホ−ＭＬＣ（すべてＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより）；１：２００のβＰＩＸまたは１：２００のＧＩＴ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。カバーガラスを洗浄し、４℃にて１：１０００の抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ５６８または１：１０００の抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で一晩プローブした。カバーガラスを洗浄し、ＦｌｕｏｒｏＭｏｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて封入した。
【０２４５】
免疫組織化学
マウス肺を、定圧（２０ｃｍ  Ｈ２Ｏ）でのＰＦＡ４％の気管内点滴注入で１５分間膨張させた。次に肺を切除し、ＰＦＡ４％中に２４時間固定し、パラフィンに包埋した。ＩＨＣのために切片（５μｍ）を切断し、抗原賦活化溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処理した。切片をモノクローナルウサギ抗ｐ−ＥＲＫ（１：４００  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で一晩染色し、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で検出した。ＤＡＢ（Ｄａｋｏ  Ｃｏｒｐ）で視覚化を行い、ヘマトキシリンで対比染色した。ＩｍａｇｅＰｒｏソフトウエアプログラムを使用して、デジタルカメラ（ＤＰ７０型；Ｏｌｙｍｐｕｓ）を備えた顕微鏡（ＢＸ５１型；Ｏｌｙｍｐｕｓ）で２０または４０倍対物レンズを用いて画像を取得した。
【０２４６】
結果
ＰＡＫを阻害することはマウスでの急性肺損傷において液体輸送を低下させる
これまでの試験は、インビトロでの内皮結合の完全性の調節にＰＡＫを関係づけたが（Ｚｅｎｇら、２０００；Ｓｔｏｃｋｔｏｎら、２００４）、インビボでの血管透過性との関連は測定されなかった。ＰＡＫの阻害がインビボで血管外漏出を低下させるかどうかを試験するため、エーロゾル化リポ多糖（ＬＰＳ）の吸入が肺における液体蓄積の引き金となる、急性ハイブリダイゼーション損傷のマウスモデルを使用した（Ｒｅｕｔｅｒｓｈａｎら、２００５）。ＬＰＳは主として、多数のサイトカインの放出の引き金を引くために常在型肺マクロファージに作用する。ＰＡＫキナーゼ活性の上昇に関連するＰＡＫ上のリン酸化部位に対する抗体を用いたウエスタンブロット法は、ＬＰＳに暴露したマウスからの肺におけるリン酸化上昇を示した（図１Ａ）。基準化した上昇は、対照、ｎ＝２に比べて２．１±０．５であり、この系におけるＰＡＫ活性化を明らかにした。
【０２４７】
完全長ドミナントネガティブＰＡＫ阻害作用が、ＮｃｋのＳＨ３ドメインに結合するＮ末端のプロリンに富む配列に位置することが以前に認められた（Ｋｉｏｓｓｅｓら、１９９９）。この配列がＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質からの多塩基性配列に連結したペプチドは、容易に細胞に進入し、ドミナントネガティブＰＡＫの発現と同様にＰＡＫ機能をブロックする（Ｋｉｏｓｓｅｓら、２００１）。前記ペプチドは、増殖因子または炎症性サイトカインで刺激した内皮細胞培養物における透過性も阻害した（Ｓｔｏｃｋｔｏｎら、２００４）。
【０２４８】
それゆえ、マウスにＴＡＴ−ＰＡＫ  Ｎ末端ペプチドを注射し、ＬＰＳの吸入後の肺へのエバンスブルー染料の漏出を検査した。Ｎｃｋ結合ペプチドは染料の蓄積を強力に阻害したが、一方ＳＨ３結合にとって必須の２個のプロリンをアラニンで置換した対照ペプチドは作用を及ぼさなかった（図１Ｂ）。このペプチドが他のＳＨ３タンパク質に結合するまたはＰＡＫ以外のＮｃｋ標的に影響を及ぼすことは排除できないが、データは、インビボで透過性を調節する上でのＰＡＫの役割を示唆する。
【０２４９】
インビトロでの血管透過性におけるＥｒｋの役割
次に、Ｅｒｋ経路が関与し得るかどうかを検討した。最初のアッセイとして、培養下の集密ウシ大動脈内皮細胞においてＥｒｋの局在化と活性化を測定した。ＶＥＧＦによる刺激は活性化Ｅｒｋについての全染色の上昇を誘導し、実質的な分画が細胞間境界に局在した（図２Ａ）。この染色はＭＥＫ阻害剤ＵＯ１２６での前処理によってほぼ排除され、そのシグナルが特異的であることを明らかにした。ＰＡＫ阻害ペプチドを、次に、Ｅｒｋがこの経路においてＰＡＫの下流であるかどうかを試験するために使用した。全細胞溶解産物のウエスタンブロット法は、ＶＥＧＦによるＥｒｋの活性化がＰＡＫ  Ｎ末端ペプチドによってほぼブロックされ、ならびにＭＥＫ阻害剤ＵＯ１２６によってブロックされることを示した（図２Ｂ）。活性化Ｅｒｋについての免疫染色も、細胞間境界におけるホスホＥｒｋの低下を示した（図２Ａ）。ｂＦＧＦに関しても同様の結果を得た（データは示していない）。
【０２５０】
インビトロでの血管透過性への作用を検討するため、３μｍ細孔を有するフィルターで内皮細胞を増殖させ、単層を横切るホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の輸送を検定した。ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはヒスタミンによって誘導される透過性は、ＵＯ１２６によってまたはドミナントネガティブＭＥＫでのトランスフェクションによって、ならびにＰＡＫ  Ｎ末端ペプチドによってブロックされた（図２Ｃ）。
【０２５１】
次に、培養内皮細胞に関するこれらの結果がインビボで血管系に適用し得るかどうかを検討した。最初に、肺切片をホスホＥｒｋに対する抗体で染色した。未処置マウスからの肺では、肺の大部分が、肺胞壁にわずかに分布する細胞（小さな矢印；図３Ａ）を除いて、ほとんどシグナルを示さなかった。これらの細胞の同一性は不明であるが、常在型マクロファージまたは樹状細胞の可能性が高いと思われる。ＬＰＳ処置マウスでは、多くの細胞型においてＥｒｋ活性化の著明な上昇が存在し、血管壁に沿った特定部位の血管内皮が最も顕著であった（大きな矢印）。肺胞も陽性に染まったが、血管ほど顕著ではなかった。この染色は肺胞毛細血管または内皮であると考えられるが、詳細な細胞型は光学顕微鏡では解明できない。Ｎｃｋ−ＰＡＫ相互作用をブロックするペプチドによるマウスの処置は主としてＥｒｋ活性化を妨げ、ＥｒｋがＰＡＫの下流であることを示唆した。対照として、マウスをＭＥＫ阻害剤ＵＯ１２６によっても前処置し、この物質も組織全体でＥｒｋ活性化をブロックした（図３Ａ）。Ｅｒｋがこの系における血管外漏出のために必要であるかどうかを判定するため、肺透過性へのＵＯ１２６の作用を検定した。ＭＥＫ阻害剤は、このモデルにおいてＬＰＳによる血管外漏出の誘導を有意にブロックした（図３Ｂ）。特定の理論に縛られるのは望むところではないが、データは、ＭＥＫ−Ｅｒｋ経路が血管透過性へのＰＡＫの作用を媒介することを示唆する。
【０２５２】
βＰＩＸおよびＧＩＴ１の関与
次に、特異的タンパク質相互作用がＰＡＫの下流のＥｒｋの活性化を促進し得る可能性を検討した。ＰＡＫは、ＰＡＫ内の特殊なプロリンに富む配列がＰＩＸのＳＨ３ドメインに結合することを通してＰＩＸタンパク質に結合することが知られている（Ｍａｎｓｅｒら、１９９８）。ＰＩＸはまた、ＲａｃおよびＣｄｃ４２についてのヌクレオチド交換活性を有する中央ＤＨ／ＰＨモジュール、およびＧＩＴ１に結合するＣ末端近くの領域を含む（Ｂａｇｒｏｄｉａら、１９９９；Ｚｈａｏら、２０００）。ＧＩＴ１は、ＰＩＸに結合するＳｐａ２相同性ドメイン（ＳＨＤ）ならびにそのＮ末端のＡｒｆ  ＧＡＰドメインを含む（Ｔｕｒｎｅｒら、２００１）。このＳＨＤ領域はまた、ＭＥＫ１および２にも結合する（Ｐｒｅｍｏｎｔら、２００４；Ｙｉｎら、２００４）。それゆえ、ＰＩＸ−ＧＩＴ複合体は、ＭＥＫの活性化を促進し得る、ＰＡＫとＭＥＫを近接させる潜在的可能性を有する。
【０２５３】
βＰＩＸおよびＧＩＴ１に対する抗体での内皮単層の染色は、これらのタンパク質の一部が細胞間境界に存在することを示した（図４Ａ）。肺切片の染色も、内皮における両方のタンパク質の発現を示した（データは示していない）。これらの相互作用の機能的関与を試験するため、内皮細胞をＷＴ  βＰＩＸまたはＣ末端ＧＩＴ結合領域が欠失した突然変異型についてのベクターでトランスフェクトした。付加的に、細胞をＷＴ  ＧＩＴ１またはＰＩＸおよびＭＥＫに結合するＳＨＤが欠失した突然変異型でトランスフェクトした。突然変異型βＰＩＸまたはＧＩＴ１の発現は、細胞間結合へのホスホ−Ｓ１４１  ＰＡＫの局在化を完全にブロックしたが、ＷＴ構築物は作用を及ぼさなかった（図４Ｂ）。突然変異型構築物はまた、ＥｒｋおよびＭＬＣの活性化もブロックしたが、ＷＴ構築物は活性化を上昇させるかまたは作用を及ぼさなかった（図４ＣおよびＤ）。最後に、突然変異型βＰＩＸおよびＧＩＴ１はどちらも、ＶＥＧＦ（図５Ａ）およびｂＦＧＦ（データは示していない）に応答した、インビトロでの内皮単層を横切る透過性の上昇を効率的にブロックした。これに対し、ＷＴ構築物の発現は透過性を上昇させた。我々は、ＰＩＸ−ＧＩＴ複合体はＰＡＫの下流でＥｒｋおよびＭＬＣ活性化を促進する上で決定的に重要な役割を果たすと結論する。
【０２５４】
これらの結果は、ＧＩＴ１のノックダウンがトロンビンに応答した血管透過性を増強すると報告した、Ｂｅｒｋとその共同研究者達の結果と相容れないと思われる（ｖａｎ  Ｎｉｅｕｗ  Ａｍｅｒｏｎｇｅｎら、２００４）。この不一致を調べるため、多数のサイトカインに応答したインビトロでの透過性へのＧＩＴ１ノックダウンの作用をここで検討した。ＨＵＶＥＣにおいて、ＧＩＴ１を標的するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、基線値を低下させ、ｂＦＧＦおよびヒスタミンによって誘導される透過性上昇を効率的にブロックしたが、トロンビン誘導の透過性には統計的に有意の作用がなかった（図５Ｂ）。これまでに認められた透過性の増強（ｖａｎ  Ｎｉｅｕｗ  Ａｍｅｒｏｎｇｅｎら、２００４）は本試験では見られなかったが、ＧＩＴ１がサイトカインと比較してトロンビン経路において異なる役割を果たすことは明らかである。増強が存在しなかったことは、実験条件の相違または異なる細胞ソースが原因であると考えられる。
【０２５５】
ＰＩＸ−ＧＩＴ複合体のペプチド阻害
ＰＡＫ−ＰＩＸ−ＧＩＴ複合体の機能的関連性をさらに調べるため、ＰＡＫ−ＰＩＸ相互作用のペプチド阻害剤を使用した（図６Ａ）。ＰＡＫは、ＳＨ３結合についてのコンセンサス配列に適合しない非定型のプロリンに富む領域を通してＰＩＸ  ＳＨ３ドメインに結合する（Ｍａｎｓｅｒら、１９９８）。細胞内へのその進入を促進するため、この配列がそのＮ末端でＨＩＶ  Ｔａｔ多塩基性領域に融合されたペプチドを合成した（Ｓｃｈｗａｒｚｅら、１９９９）。我々はまた、プルダウンアッセイのために検出と固定化を容易にするべくそのＣ末端にビオチン標識を付加した。
【０２５６】
細胞溶解産物をストレプトアビジンビーズに結合したペプチドと共にインキュベートしたとき、ＰＩＸ結合ペプチドは高い効率でβＰＩＸに結合した（図６Ｂ）。２個の鍵となる残基が突然変異した対照ペプチドに対してはβＰＩＸの結合は認められなかった。多くの他のＳＨ３含有タンパク質は結合を示さなかったが、コルタクチンは、弱いが再現可能な結合を示した。より高い量の細胞溶解産物を使用したとき、ＣＤ２ＡＰの弱いが特異的な結合およびＤＯＣＫ１８０の弱いが非特異的な結合も検出することができた（データは示していない）。ペプチドは、それゆえ、ＰＩＸに選択であると思われるが、他のより低い親和性相互作用も有する。
【０２５７】
ＰＡＫとＰＩＸの間の相互作用を分断するその能力を調べるため、内皮細胞を、２０μｇ／ｍｌのＰＩＸ結合ペプチドまたは細胞への進入を可能にするＴＡＴ配列に融合した突然変異型対照ペプチドと共にインキュベートした。次に細胞を洗浄し、界面活性剤で抽出して、βＰＩＸを免疫沈降させた。ペプチドはＰＩＸの量に作用を及ぼさなかったが、沈殿物中のＰＡＫを約７０％減少させた（図６Ｃ）。ペプチドを溶解の前に洗い流したので、この結果は阻害の程度を過小評価させ得ると考えられ、それゆえ我々は、免疫沈降の間に何らかの再結合が起こった可能性を排除できない。Ｅｒｋ活性化を検定したとき、ＰＩＸブロッキングペプチドはＶＥＧＦ刺激を効率的に阻害したが、対照ペプチドは作用を及ぼさなかった（図６Ｄ）。ｂＦＧＦによるＥｒｋの刺激もブロックされた（データは示していない）。ｂＦＧＦ（図６Ｅ）またはＶＥＧＦ（示していない）に応答したアクチン細胞骨格の再編成も検討した。これらの増殖因子は、処置細胞においてアクチンストレスファイバーの上昇の引き金を引き、これは活性ペプチドによってブロックされたが、突然変異型ペプチドではブロックされなかった。２０μｇ／ｍｌのＰＩＸ結合ペプチドも、ウシ内皮細胞（図７Ａ）およびＨＵＶＥＣ（示していない）においてＶＥＧＦに応答したインビトロでの透過性上昇を約８０％ブロックした。ｂＦＧＦについても同様の結果を得た（示していない）。
【０２５８】
インビボでのＰＩＸブロッキングペプチド
インビボでの血管透過性がＰＡＫとＰＩＸの間の相互作用を必要とするかどうかを調べるため、ＬＰＳの吸入後にマウスを検査した。これらの実験のために、ビオチンおよび３個のＣ末端残基を欠くＴＡＴ−ＰＡＫペプチドを、これらの残基がＰＩＸとの相互作用に関与しないことを示すＮＭＲ構造に基づいて（Ｍｏｔｔら、２００５）、使用した。ＰＩＸブロッキングペプチドの注射は、肺へのエバンスブルー染料の漏出を用量依存的に有意に低下させ（１ｍｇで６２％、２ｍｇで８５％）、一方対照ペプチドは有意の作用を及ぼさなかった（図７Ｂ）。肺切片試料においてホスホ−Ｅｒｋ染色の阻害も認められた（図７Ｃ；図３Ａ、＋ＬＰＳ試料と比較する。矢印は血管を示す）。肺炎症のインビボモデルにおいて、ＰＡＫとＰＩＸの複合体がＥｒｋの活性化および血管外漏出の誘導のために必要であるとここで結論される。
【０２５９】
結論
Ｅｒｋを活性化し、血管透過性を誘導するＰＡＫの能力は、ＰＡＫ−ＰＩＸ−ＧＩＴ複合体の完全性に依存する。この必要条件は、炎症、血栓および血管新生メディエイタに関連する。この結論は、関連成分の細胞間境界への共局在、および阻害性構築物、ｓｉＲＮＡノックダウンおよび細胞透過性ペプチドによる経路の破壊に基づく。現在の公表データに基づくモデルを図８に示す。このモデルでは、サイトカインがＰＡＫの活性化の引き金を引き（Ｓｔｏｃｋｔｏｎら、２００４）、ＰＡＫはβＰＩＸに結合される。ＧＩＴ１はＰＩＸおよびＭＥＫ１または２の両方に結合して、活性名ＰＡＫをＭＥＫに近接させる。ＰＡＫは、次に、ｓｅｒ２９８上のＭＥＫをリン酸化し、これはＭＥＫ結合とＲａｆによる活性化を増強する（Ｆｒｏｓｔら、１９９７）。リン酸化されたＭＥＫはＥｒｋを活性化し、それが、先に述べられているように（Ｋｌｅｍｋｅら、１９９７）ＭＬＣＫを活性化して、ミオシン依存性の収縮性を促進し、細胞間結合の崩壊を導くと推測される（Ｓｔｏｃｋｔｏｎら、２００４）。しかし、ＭＥＫがＥｒｋとは無関係に血管透過性を刺激することも報告されている（Ｗｕら、２００５）。特定の理論に縛られるのは望むところではないが、Ｅｒｋの特定サブ分画が、これらの作用を媒介するために適切なスカフォールドタンパク質に結合すると仮定される。フォーカルアドヒージョン（接着域）に局在するＥｒｋの小分画は全活性Ｅｒｋとは異なる性質を有するので（Ｈｕｇｈｅｓら、２００２）、この概念には先例がある。
【０２６０】
ＬＰＳ吸入モデルにおけるＰＡＫの活性化は、様々な因子を分泌するいくつかの細胞型を含むカスケードによるものであると考えられる。血管壁におけるＥｒｋ活性化の限局性は、白血球との局所的相互作用が決定的に重要である可能性が高いことを示唆する。種々の因子が血管透過性を誘導するために異なるシグナル伝達経路を利用することの証拠が存在する。ＶＥＧＦは、たとえば、ｓｒｃ依存性経路に頼るが、ｂＦＧＦはこれに依存しない（Ｅｌｉｃｅｉｒｉら、１９９９）。トロンビンの作用は主としてＲｈｏおよびＲｈｏキナーゼによって媒介される（Ｅｓｓｌｅｒら、１９９８；ｖａｎ  Ｎｉｅｕｗ  Ａｍｅｒｏｎｇｅｎら、２００４）。しかし、ＰＡＫとＥｒｋは、これらの因子すべてによって共有される共通のシグナル伝達中間体であると思われる。ＧＩＴ１の完全なノックダウンがＰＡＫ−ＰＩＸ−ＧＩＴ複合体の崩壊とは異なる作用を及ぼすことは興味深い。ＧＩＴ１ノックダウンは、トロンビン誘導の透過性を増強する（ｖａｎ  Ｎｉｅｕｗ  Ａｍｅｒｏｎｇｅｎら、２００４）かまたは作用を及ぼさない（本出願）が、複合体の崩壊は明らかにブロックする。ＧＩＴ１の他の活性がトロンビン応答を調節することに関与する可能性が高い。たとえばＧＩＴ１はＡｒｆ  ＧＡＰ活性を有し、これはフォーカルアドヒージョンの解除を刺激することができる（Ｔｕｒｎｅｒら、２００１）。この概念と一致して、ＧＩＴ１発現の抑制はトロンビン処置細胞においてフォーカルアドヒージョンを増強した（ｖａｎ  Ｎｉｅｕｗ  Ａｍｅｒｏｎｇｅｎら、２００４）。しかし、ＰＡＫ−ＰＩＸ−ＧＩＴ相互作用の特異的分断は異なる作用を有すると思われる。
ここで引用する一つ一つの特許、特許出願および公表文献の開示は、それらの全体が参照によりここに組み込まれる。
【０２６１】
見出しは、参照のためおよび一定の章を見出すのを助けるためにここに含まれる。これらの見出しは、その見出しの下で述べられる概念の範囲を限定することを意図せず、これらの概念は、本明細書全体を通じて他の章においても適用性を有し得る。
【０２６２】
開示した実施形態のこれまでの説明は、当業者が本発明を実施するまたは使用することを可能にするために提供されるものである。これらの実施形態の様々な修正が当業者には容易に明らかであり、ここで定義する一般的な原理が、本発明の精神または範囲から逸脱することなく他の実施形態にも適用され得る。従って、本発明は、ここで示す実施形態に限定されることを意図せず、ここで開示する原理および新規特徴に一致する最も広い範囲を与えられるべきである。
【０２６３】
【化１４】
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【０２６４】
【化１５】
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【図面の簡単な説明】
【０２６５】
【図１】図１は、肺炎症における血管透過性。
【０２６６】
Ａ．マウスに、事前にＮｃｋブロッキングペプチド（ＰＡＫブロッキングペプチドとも称される；配列番号７を含む）または対照ペプチド１ｍｇを腹腔内注射してまたは注射せずに、エーロゾル化したＬＰＳを吸入させた。６時間目に、肺を切除し、抽出して、ウエスタンブロット法によってｐＳｅｒ１４１および全ＰＡＫ２に関して分析した。２つの実験は類似の結果を生じた。
【０２６７】
Ｂ．マウスに、Ａにおけるように対照またはＮｃｋブロッキングペプチドと共にＬＰＳを吸入させた。６時間目に、エバンスブルー染料を注射し、１時間目に肺への漏出を検定した。数値は平均±Ｓ．Ｄ．であり、ｎ＝少なくとも４である。＊は、統計的有意性、すなわちペプチドなしのＬＰＳ処置マウスに比べてｐ＜０．０１を示す。
【図２Ａ】ＥｒｋはＰＡＫの下流である。
【０２６８】
Ａ．ＢＡＥＣを、２０μｇ／ｍｌのＮｃｋ結合をブロックするＮ末端ＰＡＫペプチド、突然変異対照ペプチド、またはＭＥＫ阻害剤ＵＯ１２６（２５μＭ）で前処置した。１時間後、ＶＥＧＦ２５ｎｇ／ｍｌを３０分間添加した。その後細胞を固定し、活性化Ｅｒｋに関して染色した。
【図２Ｂ】Ｂ．Ａにおけるように細胞を抽出し、ウエスタンブロット法によってＥｒｋリン酸化に関して分析した。
【図２Ｃ】Ｃ．３μｍフィルター上のＢＡＥＣをドミナントネガティブＭＥＫ１（ＤＮ  ＭＥＫ）でトランスフェクトし、２０μｇ／ｍｌのＰａｋＮ末端ペプチドまたは突然変異対照ペプチドで１時間前処置するか、またはＵＯ１２６  ２５μＭで前処置した。細胞を未処置のまま放置するか、またはＶＥＧＦ２５ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ５０ｎｇ／ｍｌまたはヒスタミン１０μＭで１時間刺激した。フィルターを横切るホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の漏出を「実験方法」において述べるように検定した。
【図３Ａ】インビボでのＥｒｋ  Ａ．マウスにＮｃｋブロッキングペプチド（１ｍｇ；配列番号７を含む）、対照ペプチド（１ｍｇ）またはＵＯ１２６（７０μＭ  ０．５ｍｌ）を注射し、その後図１におけるようにＬＰＳで処置するかまたは処置しなかった。６時間後、肺を切除し、切片にして、ｐＴ２０２／ｐＹ２０４抗体を用いて活性化Ｅｒｋに関して染色した。小さな矢印は、陽性染色される対照肺の同定されない細胞を示す。大きな矢印は、導管血管を示す。
【図３Ｂ】Ｂ．マウスを、ＭＥＫ阻害剤ＵＯ１２６（７０μＭ  ０．５ｍｌ）を事前に注射してまたは注射せずに、ＬＰＳで処置した。エバンスブルー染料の漏出をＡにおけるように検定した。＊は、統計的有意性、すなわちＵＯ１２６なしのＬＰＳ処置マウスに比べてｐ＜０．０５を示す。ｎ＝少なくとも４。
【図４Ａ】βＰＩＸおよびＧＩＴ１についての必要条件。
【０２６９】
Ａ．ＶＥＧＦで刺激したＢＡＥＣを固定し、ＧＩＴ１またはβＰＩＸに関して免疫染色した。
【図４Ｂ】Ｂ．ＢＡＥＣを、８０−９０％のトランスフェクション効率を与えるヌクレオポレーションプロトコールを用いてＷＴ  ＧＩＴ１、βＰＩＸに結合しないＳＰＡ２相同性ドメイン（ＳＨＤ）欠失を有するＧＩＴ１、ＷＴ  βＰＩＸ、またはＧＩＴ１に結合しない△ＧＢＤ欠失を有するβＰＩＸでトランスフェクトした。細胞をＶＥＧＦで３０分間刺激し、その後固定して、ホスホ−Ｓ１４１  ＰＡＫに関して染色した。
【０２７０】
ＣおよびＤ．細胞をＢにおけるようにトランスフェクトし、ＶＥＧＦで刺激して、その後界面活性剤抽出し、Ｅｒｋリン酸化（Ｃ）およびミオシン軽鎖（ＭＬＣ）ｓｅｒ１９リン酸化（Ｄ）を検出するためにウエスタンブロット法によって分析した。
【図４Ｃ】Ｂ．ＢＡＥＣを、８０−９０％のトランスフェクション効率を与えるヌクレオポレーションプロトコールを用いてＷＴ  ＧＩＴ１、βＰＩＸに結合しないＳＰＡ２相同性ドメイン（ＳＨＤ）欠失を有するＧＩＴ１、ＷＴ  βＰＩＸ、またはＧＩＴ１に結合しない△ＧＢＤ欠失を有するβＰＩＸでトランスフェクトした。細胞をＶＥＧＦで３０分間刺激し、その後固定して、ホスホ−Ｓ１４１  ＰＡＫに関して染色した。
【０２７１】
ＣおよびＤ．細胞をＢにおけるようにトランスフェクトし、ＶＥＧＦで刺激して、その後界面活性剤抽出し、Ｅｒｋリン酸化（Ｃ）およびミオシン軽鎖（ＭＬＣ）ｓｅｒ１９リン酸化（Ｄ）を検出するためにウエスタンブロット法によって分析した。
【図４Ｄ】Ｂ．ＢＡＥＣを、８０−９０％のトランスフェクション効率を与えるヌクレオポレーションプロトコールを用いてＷＴ  ＧＩＴ１、βＰＩＸに結合しないＳＰＡ２相同性ドメイン（ＳＨＤ）欠失を有するＧＩＴ１、ＷＴ  βＰＩＸ、またはＧＩＴ１に結合しない△ＧＢＤ欠失を有するβＰＩＸでトランスフェクトした。細胞をＶＥＧＦで３０分間刺激し、その後固定して、ホスホ−Ｓ１４１  ＰＡＫに関して染色した。
【０２７２】
ＣおよびＤ．細胞をＢにおけるようにトランスフェクトし、ＶＥＧＦで刺激して、その後界面活性剤抽出し、Ｅｒｋリン酸化（Ｃ）およびミオシン軽鎖（ＭＬＣ）ｓｅｒ１９リン酸化（Ｄ）を検出するためにウエスタンブロット法によって分析した。
【図５Ａ】インビトロでのＧＩＴ１およびβＰＩＸ対照透過性。
【０２７３】
Ａ．図４Ｃにおけるようにトランスフェクトした細胞を集密密度で３．０μｍ細孔のフィルターにプレートした。培養物をＶＥＧＦで刺激し、ＨＲＰに対する透過性を「実験方法」で述べるように検定した。
【図５Ｂ】Ｂ．ＨＵＶＥＣを、ＧＩＴ１に特異的なｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは対照であるスクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。７２時間目の全細胞溶解産物をウエスタンブロット法によってＧＩＴ１発現に関して分析した（上部）。フィルター上の細胞を、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ヒスタミン（１０μＭ）またはトロンビン（０．２Ｕ／ｍｌ）による処置後にＨＲＰに対する透過性に関して分析した。
【図６Ａ】ＰＡＫとＰＩＸの間の相互作用のブロッキング。
【０２７４】
Ａ．ＰＩＸ  ＳＨ３ブロッキングペプチドおよび突然変異対照の配列。透過性上昇配列は配列番号３であり、ＰＩＸ結合配列は配列番号１であり、および２つの配列の組合せであるＰＩＸ結合ペプチドは配列番号４である。配列番号４と共に使用する対照ペプチドは配列番号５を有する。
【図６Ｂ】Ｂ．細胞溶解産物をストレプトアビジンビーズに固定化したペプチドと共にインキュベートし、全細胞溶解産物（ＷＣＬ）または結合タンパク質をウエスタンブロット法によって分析した。
【図６Ｃ】Ｃ．ＢＡＥＣを２０μｇ／ｍｌのＰＩＸブロッキングペプチドまたは対照ペプチドと共に１時間インキュベートし、その後ＶＥＧＦで３０分間刺激した。細胞を洗浄し、溶解して、βＰＩＸを免疫沈降させた。ＩＰをウエスタンブロット法によって分析した。
【図６Ｄ】Ｄ．ＢＡＥＣをペプチドと共にインキュベートし、ＣにおけるようにＶＥＧＦで刺激して、その後溶解し、ウエスタンブロット法によってＥｒｋ活性化に関して分析した。
【図６Ｅ】Ｅ．細胞をＣにおけるようにペプチドと共にインキュベートし、ｂＦＧＦで６０分間刺激して、Ｆ−アクチンに関して染色した。
【図７Ａ】ＰＩＸ−ＰＡＫ相互作用のペプチドブロッキング。
【０２７５】
Ａ．３．０μｍ細孔のフィルター上のＢＡＥＣを２０μｇ／ｍｌのＰＩＸブロッキングペプチドまたは対照ペプチドで１時間前処置し、その後ＶＥＧＦで３０分間刺激した。単層を横切るＨＲＰの運動を「実験方法」で述べるように検定した。
【図７Ｂ】Ｂ．マウスに、指示量のＰＩＸブロッキングペプチドまたは対照ペプチドを腹腔内注射した。マウスをエーロゾル化ＬＰＳで６時間処置し、エバンスブルー染料の肺への漏出を「実験方法」で述べるように検定した。数値は平均±Ｓ．Ｄ．であり、ｎ＝４−８である。ペプチドなしのＬＰＳ処置マウスと比較して、＊はｐ＜０．０２、＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図７Ｃ】Ｃ．図３ＡにおけるようにＰＩＸブロッキングペプチド１ｍｇ／ｍｌで前処置し、ＬＰＳに暴露したマウスからの肺をホスホ−Ｅｒｋに関して染色した。比較し得る未処置およびＬＰＳ処置試料に関して図３Ａ参照。矢印は導管血管を示す。
【図８】血管透過性のＰＡＫ誘導についてのモデル。ＰＡＫは、炎症、血栓および血管新生刺激に応答して活性化される。ＰＡＫ内の非定型のプロリンに富む配列はβＰＩＸ  ＳＨ３ドメインに結合する。ＰＩＸは、ＰＩＸのＣ末端の配列およびＧＩＴ１のＳｐａ２相同性ドメイン（ＳＨＤ）を通してＧＩＴ１に結合する。ＳＨＤはまた、ＭＥＫ１／２に結合する。ＰＡＫは、ＲａｆによるＭＥＫの活性化を促進する、ｓｅｒ２９８上のＭＥＫをリン酸化する。その後のＭＥＫによるＥｒｋの活性化は、細胞間結合を崩壊させる、ミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）の活性化および収縮性を導く。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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