(57)【要約】  本発明は、ストレプトコッカス・エクイの少なくとも１つのポリペプチドを含むことができるサブユニット免疫原性組成物又はサブユニットワクチン組成物、並びにそのような組成物を調製及び／又は製剤化する方法に関する。また、本発明は、そのようなサブユニット組成物の使用、例えば、免疫原性応答又は防御免疫応答を惹起するための方法にも関し、この方法は、組成物を連鎖球菌感染に感受性の哺乳動物に投与するステップを含んでもよい。
2009531464.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１８、２０、２２、２４、２６、４８、５０及び５２に示すアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチド、若しくはそのアナログ、又はその断片を含むワクチン。
【請求項２】
ポリペプチドが、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、５４、５６及び５８に示すアミノ酸配列を有する断片、又はそのアナログである、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
少なくとも１つの組換えベクターと、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、４８、５０及び５２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、若しくはそのアナログ、又はその断片をコードする、前記ベクター中に挿入された少なくとも１つのポリヌクレオチドとを含むワクチンであって、前記ベクターが、連鎖球菌感染に感受性の哺乳動物中で、前記ポリペプチドをインビボで発現することができるワクチン。
【請求項４】
ポリペプチドが、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、５４、５６及び５８に示すアミノ酸配列を有する断片、又はそのアナログである、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
少なくとも１つの組換えベクターと、該ベクター中に挿入された少なくとも１つのポリヌクレオチドとを含むワクチンであって、前記ポリヌクレオチドが、配列番号１７、１９、２１、２３、２５、３１、３３、３５、３７、３９、４７、４９、５１、５３、５５及び５７に示すヌクレオチド配列、又はそのアナログを有し、前記ベクターが、連鎖球菌感染に感受性の動物中で、前記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドをインビボで発現することができるワクチン。
【請求項６】
ベクターが発現ベクターである、請求項３〜５のいずれかに記載のワクチン。
【請求項７】
ベクターが、プラスミド、ウイルス、とりわけポックスウイルス、ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）、ヒトアデノウイルス、ウマ脳炎ウイルスである、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
ワクチンが、ストレプトコッカス・エクイの感染によって引き起こされる腺疫からウマ科動物を防御するワクチンである、請求項１〜７のいずれかに記載のワクチン。
【請求項９】
ストレプトコッカス・エクイの感染からウマ科動物を防御するサブユニットワクチンの製造における、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、４８、５０及び５２に示すアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチド、若しくはそのアナログ、又はその断片の使用。
【請求項１０】
ストレプトコッカス・エクイの感染からウマ科動物を防御するサブユニットワクチンの製造における、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、５４、５６及び５８に示すアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチド、又はそのアナログの使用。
【請求項１１】
ストレプトコッカス・エクイの感染からウマ科動物を防御する組換えワクチンの製造における、請求項３〜７のいずれかに記載の少なくとも１つの組換えベクターの使用。
【請求項１２】
請求項１又は２に記載のポリペプチド若しくはそのアナログ又はその断片に特異的な少なくとも１つの抗体を含む抗体調製物であって、前記抗体が、ポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体、又は前記抗体の断片である抗体調製物。
【請求項１３】
連鎖球菌による感染を検出するための診断用キットであって、請求項１又は２に記載の少なくとも１つのポリペプチド若しくはそのアナログ又はその断片、或いは請求項１２に記載の抗体調製物を含むキット。
【請求項１４】
連鎖球菌による感染を検出するための診断方法であって、請求項１３に記載の診断用キットを使用するステップと、ポリペプチド又は該ポリペプチドに特異的な抗体を試料中で検出するステップとを含む方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の抗体調製物を、連鎖球菌による感染に感受性である、又は連鎖球菌に感染した哺乳動物に投与するステップを含む受動免疫の方法。
【請求項１６】
抗体調製物を、ストレプトコッカス・エクイによる感染に感受性である、又はストレプトコッカス・エクイに感染したウマに投与するステップを含む、請求項１５に記載の受動免疫の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
参照による組入れ
本出願は、２００６年３月２９日に出願した特許文献１の利益を主張する。
【０００２】
前記出願、並びにそこで又はその審査中に引用された全ての文書（「出願引用文書」）及び出願引用文書において引用又は参照された全ての文書、並びに本明細書において引用又は参照された全ての文書（「本明細書引用文書」）及び本明細書引用文書において引用又は参照された全ての文書は、本明細書に言及する又は参照によって本明細書に組み入れられているいずれかの文書中のいずれかの製品に関する製造業者の指示書、説明書、製品の仕様書及び製品シートのいずれかと併せて、参照によって本明細書に組み入れられており、本明細書の実施において利用することができる。
【０００３】
本発明は、連鎖球菌の、より具体的には、ストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）のポリペプチドに関し、これを使用して、連鎖球菌感染を、予防、診断及び／又は治療することができる。
【背景技術】
【０００４】
ストレプトコッカス・エクイ（ストレプトコッカス・エクイ亜種エクイ（S. equi subsp. equi））は、大きな莢膜を有するグラム陽性球菌である。ストレプトコッカス・エクイは、ウマ科、イヌ科及びラクダ科、とりわけ、ウマ、ロバ、ラバ、イヌ、ラクダ及びヒトコブラクダにおける腺疫の原因物質である。腺疫は、上気道及びそれに関連するリンパ節の、伝染性が高い感染症である。ウマ科動物の場合、この疾患は、発熱、粘液膿性の濃厚な鼻汁、腫脹、並びに下顎下、顎下及び咽頭後のリンパ節の膿瘍化によって特徴付けられる。重症例では、感染が、内部及び外部の膿瘍形成を伴って散在する場合があり、最終的には死に至る恐れがある。腺疫は、年齢に関わらず、感受性のウマであれば発生し得る。伝染は、直接的な接触を介して、又は気道の分泌物若しくは唾液によって汚染されている媒介物を介して間接的に起こる。稀ではあるが、ストレプトコッカス・エクイは、ラクダ科（非特許文献１）及びウマとの接触によって感染したヒト（非特許文献２）の人畜共通伝染病の非常に重大な病原体である。ヒトの場合、死亡率は、特に、高齢患者並びに心内膜炎、髄膜炎及び播種性感染を有する患者において高かった（非特許文献３及び非特許文献４）。
【０００５】
感染後、ストレプトコッカス・エクイは、一般に、臨床的な徴候が現われるまでに、３〜１４日の潜伏期間を有する。この生物体は、粘膜からリンパのチャネル内に迅速に移動し、そこから局所のリンパ節のうちの１つ又は複数へと移動して、炎症及び腫脹を起こす。
【０００６】
腫脹するリンパ節は、間もなく、膿性の中心部に発達し、波動する液化を伴う。下顎下のリンパ節は、典型的には、皮膚を通して外部に破裂し、一方、咽頭後のリンパ節中に形成された膿瘍は、典型的には、喉嚢内に破裂する。これが生じるには、徴候が現われてから最長で２週間を要することがある。
【０００７】
大部分（７０％）の動物は、最初の感染から回復すると、腺疫のその後の攻撃に対しては免疫を有する。しかし、相当な割合の動物（３０％）が、２回目の腺疫に罹患する恐れがあり、これらのうちの一部は、腺疫に３回以上罹患する可能性がある（非特許文献５）。発症した動物の最大１０％が、臨床的な徴候が消散した後も長期間にわたり、ストレプトコッカス・エクイを断続的に発散し続ける。この保菌状態は、おそらく、咽頭後のリンパ節中に形成された膿瘍が破裂した後に、喉嚢（蓄膿）及び／又は副鼻腔からの浸出物が不完全にしか排液されなかったことが原因であろう（非特許文献６）。浸出物が乾燥して硬化すると、類軟骨と呼ばれる個別の物体が形成され、これは、喉嚢に数年間残留する場合がある。ストレプトコッカス・エクイは無症候状態で持続的に保菌されることが、この感染症が間欠的に大流行し続ける根本原因であるということを認識する傾向が世界的に強まりつつある（非特許文献７；非特許文献６；非特許文献８；非特許文献９）。最新のワクチンが登場しても、この状態は続いている（非特許文献１０）。
【０００８】
この疾患からの防御は、主として、上咽頭中で局所的に産生されるＩｇＡ及びＩｇＧのサブクラスの抗体によって媒介される。
【０００９】
ストレプトコッカス・エクイ（S. equi）に対する血清抗体を、ＥＬＩＳＡ（非特許文献１１）、マウス防御試験（非特許文献１２）、及びゲル拡散沈降素試験をはじめとする、多様なアッセイによって測定することができる。
【００１０】
熱により不活性化したバクテリン又はＭタンパク質が豊富な抽出物からなる市販のワクチンが、当技術分野で広範に使用されている。これらのワクチンは、血清の殺菌性抗体を刺激する効果があるものの、上咽頭の抗体を有用なレベルでは刺激しないらしく、したがって、ウマ集団において刺激された防御レベルは、極めて不十分である。最近になって、鼻腔内に投与したストレプトコッカス・エクイの非病原性の遺伝子改変株が、回復期の免疫を有するウマに見い出されるものに類似する、上咽頭の抗体を局所的に刺激することが示されている。ワクチン接種したウマは、病原性のストレプトコッカス・エクイを用いたその後の実験的な攻撃誘発に対して免疫を有した（非特許文献１３）。したがって、有効な腺疫ワクチンは、上咽頭の免疫応答を刺激することができるはずであることが明らかである。
【００１１】
バクテリン系のワクチンは、しばしば、浮腫、硬結、硬直、一過性の発熱及び好中球増多からなる望ましくない局所性及び全身性の反応を起こし、これは、おそらく細胞壁のペプチドグリカンによる作用であろう。さらに、連鎖球菌の抗体に以前に感作したウマにワクチン接種すると、出血性紫斑病を発症させる恐れがある。
【００１２】
ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス）（Streptococcus zooepidemicus (S. equi subsp. Zooepidemicus)）は、ウマ科動物における呼吸器疾患及び子宮炎の重要な原因である。ストレプトコッカス・ズーエピデミカスは、日和見病原性菌であり、乳離れしたばかりの子ウマ及び１歳ウマの膿性の呼吸器感染症、並びに高齢の雌ウマの子宮感染症を起こす。インフルエンザ感染と高熱又は輸送のストレスが同時に発生している状況では、ストレプトコッカス・ズーエピデミカスは、壊滅的であり且つ急速に命を奪う気道の病原体となる場合がある。稀ではあるが、ストレプトコッカス・ズーエピデミカスは、ラクダ科（非特許文献１４）、ウマとの接触によって感染したヒト（非特許文献１５及び非特許文献１６）、及び呼吸器疾患を有する、とりわけ、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）にすでに感染しているイヌ科動物（Chalker V J et al., Vet Microbiol, 2003, 95(1-2): 149-156）の人畜共通伝染病の非常に重大な病原体である。
【００１３】
ストレプトコッカス・エクイに襲われた哺乳動物は、この細菌を、中でも、喉嚢中に数カ月にわたって寄生させ、したがって、ストレプトコッカス・エクイを放出したり、その保菌源として作用したりする場合がある。ストレプトコッカス・エクイは、ペニシリン及びその他の抗生物質に対して非常に感受性であるが、抗生物質による治療は、種々の理由から大部分の場合無効である。この疾患と闘い且つ重大な臨床における合併症を軽減するために、主として、効率的なワクチンの開発を目指して研究が進められている。
【００１４】
ワクチンの開発は、思うようには進んでいない。これは、おそらく１つには、ワクチンは、顕著な免疫応答を引き起こすことなく、感染症を制御することができなければならないためであろう。
【特許文献１】米国仮特許出願第６０／７８６９３６号明細書
【非特許文献１】Sechi L A et al., New Microbiol, 1999, 22(4): 383-387
【非特許文献２】Elsayed S et al., Clin Microbiol Infect, 2003, 9(8): 869-872
【非特許文献３】Bradley S F et al., Rev Infect Dis, 1991, 13(2): 270-280
【非特許文献４】Popescu G A et al., South Med J, 2006, 99(2): 190-191
【非特許文献５】Todd A.G., J. Comp. Pathol. Ther., 1910, 23, 212-229
【非特許文献６】Newton J R et al., Vet Record, 1997, 140: 84-90
【非特許文献７】Fintl C et al., Vet Record, 2000, 147: 480-484
【非特許文献８】Newton J R et al., Equine Vet J, 2000, 32: 515-526
【非特許文献９】Timoney J F et al., Vet Record, 1998, 142: 648
【非特許文献１０】Newton R et al., Vet Record, 2005, 156: 291-292
【非特許文献１１】Reif et al., Proc. Am. Assoc. Equine Practitioners, 1982, 27, 33-40
【非特許文献１２】Bazely P.L., Aust. Vet. J., 1943, 19, 62-85
【非特許文献１３】Timoney and Galan, 1985, The protective response of the horse to an avirulent strain of Streptococcal equi. In Y. Kimura, S. Kotami and Y. Shokawa, eds., Recent Advances in Streptococci and Streptococcal disease. Reedbooks, Surrey, England, p. 294-295
【非特許文献１４】Younan M et al., J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health, 2005, 52(3): 142-146
【非特許文献１５】Downar J et al., J Clin Microbiol, 2001, 39(6): 2358-2359
【非特許文献１６】Ural O et al., Scand J Infect Dis, 2003, 35(3): 206-207
【非特許文献１７】Chalker V J et al., Vet Microbiol, 2003, 95(1-2): 149-156
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、高度な免疫原性を有し、副作用が限定的であり、又は全くない良好な安全性プロフィールを示すワクチンを開発することが望ましい。
【００１６】
いずれの場合も、本出願中に文書を引用又は特定することによって、そのような文書が、本発明の先行技術として利用可能であることを是認するものではない。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、サブユニット免疫原性組成物又はサブユニットワクチン組成物に関し、これらの組成物は、少なくとも１つの本発明のポリペプチド、例えば、ストレプトコッカス・エクイのポリペプチドを含むことができる。したがって、本発明はさらに、そのような組成物を調製及び／又は製剤化する、例えば、ポリペプチドを、獣医学的又は薬学的に許容される適切な担体、賦形剤、希釈剤又は媒体、及び／又はアジュバント、及び／又は安定化剤と混合するための方法にも関する。また、本発明は、そのようなサブユニット組成物の使用、例えば、免疫原性応答又は防御免疫応答を惹起するための方法にも関し、この方法は、組成物を連鎖球菌感染に感受性の哺乳動物に投与するステップを含むことができる。
【００１８】
本発明は、組換え免疫原性組成物又は組換えワクチン組成物に関し、これらの組成物は、少なくとも１つの組換え発現ベクターを含むことができ、このベクターは、少なくとも１つの本発明のポリペプチドをコードし、このペプチドを、連鎖球菌感染に感受性の哺乳動物中で、インビボで発現することができる。本明細書では、少なくとも１つの組換え発現ベクターを含むことができる、そのような免疫原性組成物又はワクチン組成物を、組換え免疫原性組成物又は組換えワクチン組成物と名付ける。したがって、本発明はさらに、そのようなベクターを調製する、例えば、本発明によるポリペプチドをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチドを、プラスミドベクター又はウイルスベクター中に挿入するための方法にも関し、それによって、ベクターは、宿主中で、ポリヌクレオチドを含有し、発現する。したがって、本発明はさらに、そのような組換え免疫原性組成物又は組換えワクチン組成物を製剤化する、例えば、ベクターを、獣医学的又は薬学的に許容される適切な担体、賦形剤、希釈剤又は媒体、及び／又はアジュバント、及び／又は安定化剤と混合するための方法にも関する。また、本発明は、そのような組換え免疫原性組成物又は組換えワクチン組成物の使用、例えば、免疫原性応答又は防御免疫応答を惹起するための方法にも関し、この方法は、組成物を連鎖球菌感染に感受性の哺乳動物に投与するステップを含むことができる。
【００１９】
定義により、連鎖球菌感染に感受性の哺乳動物は、ウマ（すなわち、ウマ、雌ウマ、子ウマ、ロバ及びラバ）、ラクダ（すなわち、ラクダ、ヒトコブラクダ）、イヌ（すなわち、イヌ、雌イヌ、子イヌ）、ウシ（すなわち、ウシ、雌ウシ、子ウシ）、ヒツジ（すなわち、ヒツジ、雌ヒツジ、子ヒツジ）、ヤギ（すなわち、ヤギ）、ブタ（すなわち、ブタ、雌ブタ、子ブタ）、並びにヒトを包含する。ストレプトコッカス・エクイ感染に感受性の哺乳動物は、ウマ（すなわち、ウマ、雌ウマ、子ウマ、ロバ及びラバ）、ラクダ（すなわち、ラクダ、ヒトコブラクダ）、イヌ（すなわち、イヌ、雌イヌ、子イヌ）、並びにヒトを包含する。ストレプトコッカス・ズーエピデミカス感染に感受性の哺乳動物は、ウマ（すなわち、ウマ、雌ウマ、子ウマ、ロバ及びラバ）、イヌ（すなわち、イヌ、雌イヌ、子イヌ）、ラクダ（すなわち、ラクダ、ヒトコブラクダ）、並びにヒトを包含する。
【００２０】
また、本発明は、組換え発現ベクターの使用、例えば、本発明のポリペプチドを産生するための方法にも関し、この方法は、組換え発現ベクターを含有し、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現に適した条件下で発現するように形質転換した原核細胞又は真核細胞を、培養、生育又は増殖するステップと、ポリペプチドを、それを発現するように形質転換した細胞から、収集又は単離又は分離するステップとを含むことができる。
【００２１】
本発明はさらに、ウマ、すなわち、ウマ、ロバ及びラバにおいて、ストレプトコッカス・エクイ又はストレプトコッカス・ズーエピデミカス等の連鎖球菌に対する免疫原性応答又は防御免疫応答を誘導する方法にも関し、この方法は、本発明のサブユニット免疫原性組成物又はサブユニットワクチン組成物、或いは本発明の組換え免疫原性組成物又は組換えワクチン組成物を、ウマに投与するステップを含むことができる。
【００２２】
本発明はさらに、イヌ、すなわち、イヌ、雌イヌ、子イヌにおいて、ストレプトコッカス・エクイ又はストレプトコッカス・ズーエピデミカス等の連鎖球菌に対する免疫原性応答又は防御免疫応答を誘導するための方法にも関し、この方法は、本発明のサブユニット免疫原性組成物又はサブユニットワクチン組成物、或いは本発明の組換え免疫原性組成物又は組換えワクチン組成物を、イヌに投与するステップを含むことができる。
【００２３】
本発明はさらに、ラクダ、すなわち、ラクダ、ヒトコブラクダにおいて、ストレプトコッカス・エクイ又はストレプトコッカス・ズーエピデミカス等の連鎖球菌に対する免疫原性応答又は防御免疫応答を誘導するための方法にも関し、この方法は、本発明のサブユニット免疫原性組成物又はサブユニットワクチン組成物、或いは本発明の組換え免疫原性組成物又は組換えワクチン組成物を、ラクダに投与するステップを含むことができる。
【００２４】
本発明はさらに、ヒトにおいて、ストレプトコッカス・エクイ又はストレプトコッカス・ズーエピデミカス等の連鎖球菌に対する免疫原性応答又は防御免疫応答を誘導するための方法にも関し、この方法は、本発明のサブユニット免疫原性組成物又はサブユニットワクチン組成物、或いは本発明の組換え免疫原性組成物又は組換えワクチン組成物を、ヒトに投与するステップを含むことができる。
【００２５】
本発明は、配列番号１７、１９、２１、２３及び２５として特定されるポリヌクレオチドからなる群から選択されたポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。本発明はさらに、配列番号１７、１９、２１、２３及び２５として特定されるポリヌクレオチドからなる群から選択されたポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の同一性を有するポリペプチドにも関する。本発明は、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、４８、５０及び５２として特定されるポリペプチドからなる群から選択されたポリペプチドに関する。本発明はさらに、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、４８、５０及び５２として特定されるポリペプチドからなる群から選択されたポリペプチドと、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の同一性を有するポリペプチドアナログにも関する。本発明はさらに、少なくとも１つのエピトープを含有するポリペプチド断片にも関し、この断片は、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、４８、５０及び５２として特定されるポリペプチド、又はそのアナログからなる群から選択されたポリペプチドの一部であり、且つとりわけ、少なくとも１つのエピトープを含有し、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、５４、５６及び５８として特定されるポリペプチドからなる群から選択された断片にも関する。さらに、本発明は、本明細書に記載するそのようなポリペプチド、そのアナログ又はその断片が関与する使用、組成物及び方法にも関する。
【００２６】
したがって、本発明は、組換え発現ベクターに関し、当該ベクターは、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含有し、このポリヌクレオチドは、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、４８、５０及び５２、並びにそれらの組合せとして特定されるポリペプチドからなる群から選択されたポリペプチドをコードする。本発明はさらに、組換え発現ベクターにも関し、当該ベクターは、少なくとも１つのポリヌクレオチドを有し、このポリヌクレオチドは、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、４８、５０及び５２、並びにそれらの組合せとして特定されるポリペプチドからなる群から選択されたポリペプチドと、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の同一性を有するポリペプチドアナログをコードする。本発明はさらに、組換え発現ベクターにも関し、当該ベクターは、少なくとも１つのポリヌクレオチドを有し、このポリヌクレオチドは、少なくとも１つのエピトープを含有し、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、４８、５０及び５２として特定されるポリペプチド、又はそのアナログからなる群から選択されたポリペプチドの一部であるポリペプチド断片、並びにとりわけ、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、５４、５６及び５８として特定されるポリペプチドからなる群から選択された断片をコードする。本発明は、組換え発現ベクターに関し、当該ベクターは、配列番号１７、１９、２１、２３、２５、３１、３３、３５、３７、３９、４７、４９、５１、５３、５５及び５７、並びにそれらの組合せとして特定されるポリヌクレオチドからなる群から選択された、少なくとも１つのポリヌクレオチドを有する。本発明はさらに、組換え発現ベクターにも関し、当該ベクターは、配列番号１７、１９、２１、２３、２５、３１、３３、３５、３７、３９、４７、４９、５１、５３、５５及び５７、並びにそれらの組合せとして特定されるポリヌクレオチドからなる群から選択されたポリヌクレオチドと、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の同一性を有する、少なくとも１つのポリヌクレオチドを有する。さらに、本発明は、本明細書に記載するそのようなベクターが関与する使用、組成物及び方法にも関する。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション反応（例えば、ノーザンブロット若しくはサザンブロット、又は核酸マイクロアレイ若しくは「遺伝子チップ」中）において、或いは増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応又はＰＣＲ）において使用することができる。
【００２８】
本発明は、上記に記載した配列に相補的な配列を含むことができるポリヌクレオチドを提供することを理解されたい。
【００２９】
本発明によるポリヌクレオチドは、多くの方法で（例えば、化学的合成によって、ゲノムライブラリー若しくはｃＤＮＡライブラリーから、連鎖球菌それ自体から等）調製することができ、種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、プライマー、プローブ等）をとることができる。
【００３０】
本発明によるポリヌクレオチドは、例えば、放射性標識又は蛍光標識を用いて標識することができる。これは、特に、プライマー又はプローブとして有用である。
【００３１】
さらに、「ポリヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含み、且つ修飾した骨格を含有するもの等、それらのアナログもまた含む。
【００３２】
その上さらに、本発明は、抗体調製物（antibody preparations）も想定し、この調製物は、本発明のポリペプチドに特異的な、少なくとも１つの抗体を含むことができる。この抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。また、抗体調製物は、当該抗体の断片を含んでもよい。
【００３３】
また、本発明は、連鎖球菌による感染を検出するための診断用キットも含み、このキットは、本発明による、少なくとも１つのポリペプチド、又は本発明のポリペプチドに特異的な、少なくとも１つの抗体を含むことができる抗体調製物を含む。また、本発明は、哺乳動物における連鎖球菌による感染を検出するための診断方法も含み、この方法は、本発明の診断用キットを使用するステップと、ポリペプチド又はそのポリペプチドに特異的な抗体を試料中に検出するステップとを含む。
【００３４】
本発明はさらに、受動免疫の方法にも関し、この方法は、抗体調製物を、連鎖球菌による感染に感受性である、又は連鎖球菌に感染した哺乳動物に投与するステップを含む。特に、受動免疫の方法は、抗体調製物を、連鎖球菌による感染に感受性である、又は連鎖球菌に感染した、とりわけ、ストレプトコッカス・エクイによる感染に感受性である、又はストレプトコッカス・エクイに感染したウマに投与するステップを含む。
【００３５】
本開示、特に、特許請求の範囲において、「含む（comprises）」、「含んだ（comprised）」、「含んでいる（comprising）」等の用語は、米国特許法に基づく意味を有することができる、例えば、これらは、「含む（includes）」、「含んだ（included）」、「含んでいる（including）」等を意味することができること、並びに「から本質的になっている（consisting essentially of）」及び「から本質的になる（consists essentially of）」という用語は、米国特許法に基づく意味を有する、例えば、それらによって、明確には列挙されていない要素を許容するが、先行技術に見い出される又は本発明の基本的若しくは新規な特徴に影響を与える要素は排除することに留意されたい。
【００３６】
これら及びその他の実施形態は、以下の詳細な説明（Detailed Description）によって開示されるか、又はそれによって、明らかであり、且つ包含される。
【００３７】
以下の詳細な説明は、例示のために提供するのであって、本発明を、説明する特定の実施形態のみに限定する意図はなく、以下の付随する図面と併せると、最もよく理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明は、哺乳動物に投与した場合に、免疫原性応答又は防御免疫応答を惹起することができるストレプトコッカス・エクイのポリペプチドの同定、及びこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの同定に関する。これらのポリペプチドは、サブユニット免疫原性組成物又はサブユニットワクチンの産生のために有用である。これらのポリヌクレオチドは、ＤＮＡ免疫原性組成物、ＤＮＡワクチン、組換えウイルスベクター免疫原性組成物又は組換えウイルスベクターワクチンの産生のために有用である。
【００３９】
本発明は、ストレプトコッカス科の細菌によって引き起こされる、とりわけ、ストレプトコッカス・エクイによって引き起こされる感染症、例えば、ウマ科、ラクダ科、イヌ科及びヒトにおける腺疫、並びにウマ科、ラクダ科、イヌ科及びヒトにおける、ストレプトコッカス・ズーエピデミカスによって引き起こされる感染症に対する組成物、使用及び方法に関わる。
【００４０】
本発明は、ストレプトコッカス・エクイから得た又はそれに由来するポリペプチド、ポリヌクレオチド及び遺伝子に関わる。また、その他の連鎖球菌、とりわけ、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、ストレプトコッカス・ディスガラクチアエ（Streptococcus dysgalactiae）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pnuemoniae）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）から得た又はそれらに由来するポリペプチド、ポリヌクレオチド及び遺伝子にも関することができる。
【００４１】
本発明の特定の態様は、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、４８、５０及び５２のアミノ酸配列から選択されたポリペプチドである。
【００４２】
ストレプトコッカス・エクイの全ゲノムは、Ｓａｎｇｅｒデータベースにおいて入手可能である（http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_equi/）。
【００４３】
ポリペプチドは、Ｓｅ５０、Ｓｅ１４５９、Ｓｅ５９５、Ｓｅ５２８、Ｓｅ３５８、Ｓｅ１６３１、Ｓｅ１６８１及びＳｌａについてはそれぞれ、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、４８、５０及び５２として特定される。
【００４４】
本発明の特定の態様は、配列番号１７、１９、２１、２３及び２５のヌクレオチド配列から選択されたポリヌクレオチドである。
【００４５】
ポリヌクレオチドは、Ｓｅ５０、Ｓｅ１４５９、Ｓｅ５９５、Ｓｅ５２８及びＳｅ３５８についてはそれぞれ、配列番号１７、１９、２１、２３及び２５として特定される。
【００４６】
本発明の実施にあたっては、別段の記載がない限り、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術及び免疫学の従来の技法を利用し、これらは、当技術分野に属している。そのような技法は、文献に十分に説明されている。例えば、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring HarborPress；DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover ed. 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984)；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986)；Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)；及びHandbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)を参照されたい。
【００４７】
本発明を詳細に説明する前に、この発明は、特定のＤＮＡ、ポリペプチド配列及び処理パラメータに限定されるわけではなく、当然ながら、それらは変動することができることを理解されたい。また、本明細書に使用する用語法は、特定の本発明の実施形態を説明することが唯一の目的であり、限定的な意図はないことも理解されたい。
【００４８】
別段の定義がない限り、本明細書に使用する全ての科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同一の意味を有する。本明細書に記載するものと同様又は同等の、多くの方法及び材料を、本発明を実施するにあたって使用することができるが、好ましい材料及び方法を、本明細書に記載する。
【００４９】
「相補性」又は「相補的な」という用語によって、本明細書又は本特許請求の範囲の目的では、オリゴヌクレオチドにおいて、その配列中の相補的な塩基対の数が、増幅又は検出する遺伝子多型性の標的核酸配列と特異的に相互作用する（ハイブリダイズする）のに十分であることを意味する。当業者に知られているように、１００％である必要はないが、非常に高度の相補性が、ハイブリダイゼーションに関わる特異性及び感受性のために必要である。したがって、例えば、１つの塩基の変化又は置換以外は、本明細書に開示するオリゴヌクレオチドと、ヌクレオチド配列において同一であるオリゴヌクレオチドは、開示するオリゴヌクレオチドと同等に機能することができる。「相補ＤＮＡ」又は「ｃＤＮＡ」の遺伝子は、メッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ，messenger RNA」）の逆転写によって合成した組換え遺伝子を含む。
【００５０】
「ポリメラーゼ媒介サイクル反応」は、鋳型分子又は鋳型分子の集団を、定期的に繰り返しコピーして、相補的な鋳型分子又は相補的な鋳型分子の集団を生み出し、それによって、鋳型分子の数を、時間の経過と共に増加させる生化学反応を指す。
【００５１】
「検出可能な部分」という用語によって、本明細書又は本特許請求の範囲の目的では、オリゴヌクレオチド中に間接的又は直接的に組み入れられている（同位体又は非同位体の）標識分子を意味し、例えば、オリゴヌクレオチドを、増幅した遺伝子多型配列とハイブリダイズさせる場合に、標識分子によって、その標識分子が組み入れられているオリゴヌクレオチドの検出が促進される。したがって、「検出可能な部分」は、「標識分子」の同意語として使用される。オリゴヌクレオチドの合成は、当業者に知られているいくつかの方法のうちのいずれか１つによって達成することができる。検出に有用であるとして当業者に知られている標識分子は、化学発光分子、蛍光分子又は発光分子を含む。種々の蛍光分子が、当技術分野で知られており、それらは、本発明の方法のために核酸を標識するための使用に適している。そのような組入れのためのプロトコールは、使用する蛍光分子によって異なる場合がある。そのようなプロトコールは、当技術分野では、それぞれの蛍光分子について知られている。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「ＤＮＡ増幅」は、特異的なＤＮＡ配列のコピー数を、核酸配列を酵素的に増幅することによって増加させるいずれかの過程を指す。多様な過程が知られている。最も一般的に使用されているものの１つが、米国特許第４６８３１９５号明細書及び第４６８３２０２号明細書に記載されているMullisのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ，polymerase chain reaction）の過程である。また、米国特許第６９５１７２６号明細書；第６９２７０２４号明細書；第６９２４１２７号明細書；第６８９３８６３号明細書；第６８８７６６４号明細書；第６８８１５５９号明細書；第６８５５５２２号明細書；第６８５５５２１号明細書；第６８４９４３０号明細書；第６８４９４０４号明細書；第６８４６６３１号明細書；第６８４４１５８号明細書；第６８４４１５５号明細書；第６８１８４３７号明細書；第６８１８４０２号明細書；第６７９４１７７号明細書；第６７９４１３３号明細書；第６７９０９５２号明細書；第６７８３９４０号明細書；第６７７３９０１号明細書；第６７７０４４０号明細書；第６７６７７２４号明細書；第６７５００２２号明細書；第６７４４７８９号明細書；第６７３３９９９号明細書；第６７３３９７２号明細書；第６７０３２３６号明細書；第６６９９７１３号明細書；第６６９６２７７号明細書；第６６６４０８０号明細書；第６６６４０６４号明細書；第６６６４０４４号明細書；第ＲＥ３８３５２号明細書；第６６５０７１９号明細書；第６６４５７５８号明細書；第６６４５７２０号明細書；第６６４２０００号明細書；第６６３８７１６号明細書；第６６３２６５３号明細書；第６６１７１０７号明細書；第６６１３５６０号明細書；第６６１０４８７号明細書；第６５９６４９２号明細書；第６５８６２５０号明細書；第６５８６２３３号明細書；第６５６９６７８号明細書；第６５６９６２７号明細書；第６５６６１０３号明細書；第６５６６０６７号明細書；第６５６６０５２号明細書；第６５５８９２９号明細書；第６５５８９０９号明細書；第６５５１７８３号明細書；第６５４４７８２号明細書；第６５３７７５２号明細書；第６５２４８３０号明細書；第６５１８０２０号明細書；第６５１４７５０号明細書；第６５１４７０６号明細書；第６５０３７５０号明細書；第６５０３７０５号明細書；第６４９３６４０号明細書；第６４９２１１４号明細書；第６４８５９０７号明細書；第６４８５９０３号明細書；第６４８２５８８号明細書；第６４７５７２９号明細書；第６４６８７４３号明細書；第６４６５６３８号明細書；第６４６５６３７号明細書；第６４６５１７１号明細書；第６４４８０１４号明細書；第６４３２６４６号明細書；第６４２８９８７号明細書；第６４２６２１５号明細書；第６４２３４９９号明細書；第６４１０２２３号明細書；第６４０３３４１号明細書；第６３９９３２０号明細書；第６３９５５１８号明細書；第６３９１５５９号明細書；第６３８３７５５号明細書；第６３７９９３２号明細書；第６３７２４８４号明細書；第６３６８８３４号明細書；第６３６５３７５号明細書；第６３５８６８０号明細書；第６３５５４２２号明細書；第６３４８３３６号明細書；第６３４６３８４号明細書；第６３１９６７３号明��書；第６３１６１９５号明細書；第６３１６１９２号明細書；第６３１２９３０号明細書；第６３０９８４０号明細書；第６３０９８３７号明細書；第６３０３３４３号明細書；第６３０００７３号明細書；第６３０００７２号明細書；第６２８７７８１号明細書；第６２８４４５５号明細書；第６２７７６０５号明細書；第６２７０９７７号明細書；第６２７０９６６号明細書；第６２６８１５３号明細書；第６２６８１４３号明細書；第Ｄ４４５９０７号明細書；第６２６１４３１号明細書；第６２５８５７０号明細書；第６２５８５６７号明細書；第６２５８５３７号明細書；第６２５８５２９号明細書；第６２５１６０７号明細書；第６２４８５６７号明細書；第６２３５４６８号明細書；第６２３２０７９号明細書；第６２２５０９３号明細書；第６２２１５９５号明細書；第Ｄ４４１０９１号明細書；第６２１８１５３号明細書；第６２０７４２５号明細書；第６１８３９９９号明細書；第６１８３９６３号明細書；第６１８０３７２号明細書；第６１８０３４９号明細書；第６１７４６７０号明細書；第６１５３４１２号明細書；第６１４６８３４号明細書；第６１４３４９６号明細書；第６１４０６１３号明細書；第６１４０１１０号明細書；第６１０３４６８号明細書；第６０８７０９７号明細書；第６０７２３６９号明細書；第６０６８９７４号明細書；第６０６３５６３号明細書；第６０４８６８８号明細書；第６０４６０３９号明細書；第６０３７１２９号明細書；第６０３３８５４号明細書；第６０３１９６０号明細書；第６０１７６９９号明細書；第６０１５６６４号明細書；第６０１５５３４号明細書；第６００４７４７号明細書；第６００１６１２号明細書；第６００１５７２号明細書；第５９８５６１９号明細書；第５９７６８４２号明細書；第５９７２６０２号明細書；第５９６８７３０号明細書；第５９５８６８６号明細書；第５９５５２７４号明細書；第５９５２２００号明細書；第５９３６９６８号明細書；第５９０９４６８号明細書；第５９０５７３２号明細書；第５８８８７４０号明細書；第５８８３９２４号明細書；第５８７６９７８号明細書；第５８７６９７７号明細書；第５８７４２２１号明細書；第５８６９３１８号明細書；第５８６３７７２号明細書；第５８６３７３１号明細書；第５８６１２５１号明細書；第５８６１２４５号明細書；第５８５８７２５号明細書；第５８５８７１８号明細書；第５８５６０８６号明細書；第５８５３９９１号明細書；第５８４９４９７号明細書；第５８３７４６８号明細書；第５８３０６６３号明細書；第５８２７６９５号明細書；第５８２７６６１号明細書；第５８２７６５７号明細書；第５８２４５１６号明細書；第５８２４４７９号明細書；第５８１７７９７号明細書；第５８１４４８９号明細書；第５８１４４５３号明細書；第５８１１２９６号明細書；第５８０４３８３号明細書；第５８００９９７号明細書；第５７８０２７１号明細書；第５７８０２２２号明細書；第５７７６６８６号明細書；第５７７４４９７号明細書；第５７６６８８９号明細書；第５７５９８２２号明細書；第５７５０３４７号明細書；第５７４７２５１号明細書；第５７４１６５６号明細書；第５７１６７８４号明細書；第５７１２１２５号明��書；第５７１２０９０号明細書；第５７１０３８１号明細書；第５７０５６２７号明細書；第５７０２８８４号明細書；第５６９３４６７号明細書；第５６９１１４６号明細書；第５６８１７４１号明細書；第５６７４７１７号明細書；第５６６５５７２号明細書；第５６６５５３９号明細書；第５６５６４９３号明細書；第５６５６４６１号明細書；第５６５４１４４号明細書；第５６５２１０２号明細書；第５６５０２６８号明細書；第５６４３７６５号明細書；第５６３９８７１号明細書；第５６３９６１１号明細書；第５６３９６０６号明細書；第５６３１１２８号明細書；第５６２９１７８号明細書；第５６２７０５４号明細書；第５６１８７０３号明細書；第５６１８７０２号明細書；第５６１４３８８号明細書；第５６１００１７号明細書；第５６０２７５６号明細書；第５５９９６７４号明細書；第５５８９３３３号明細書；第５５８５２３８号明細書；第５５７６１９７号明細書；第５５６５３４０号明細書；第５５６５３３９号明細書；第５５５６７７４号明細書；第５５５６７７３号明細書；第５５３８８７１号明細書；第５５２７８９８号明細書；第５５２７５１０号明細書；第５５１４５６８号明細書；第５５１２４６３号明細書；第５５１２４６２号明細書；第５５０１９４７号明細書；第５４９４７９５号明細書；第５４９１２２５号明細書；第５４８７９９３号明細書；第５４８７９８５号明細書；第５４８４６９９号明細書；第５４７６７７４号明細書；第５４７５６１０号明細書；第５４４７８３９号明細書；第５４３７９７５号明細書；第５４３６１４４号明細書；第５４２６０２６号明細書；第５４２０００９号明細書；第５４１１８７６号明細書；第５３９３６５７号明細書；第５３８９５１２号明細書；第５３６４７９０号明細書；第５３６４７５８号明細書；第５３４０７２８号明細書；第５２８３１７１号明細書；第５２７９９５２号明細書；第５２５４４６９号明細書；第５２４１３６３号明細書；第５２３２８２９号明細書；第５２３１０１５号明細書；第５２２９２９７号明細書；第５２２４７７８号明細書；第５２１９７２７号明細書；第５２１３９６１号明細書；第５１９８３３７号明細書；第５１８７０６０号明細書；第５１４２０３３号明細書；第５０９１３１０号明細書；第５０８２７８０号明細書；第５０６６５８４号明細書；第５０２３１７１号明細書及び第５００８１８２号明細書に記載されている、方法、装置及び試薬を、本発明の実施にあたって利用することができる。ＰＣＲは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーとしての既知の配列、及び加熱サイクルを使用することになる。これによって、複製するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ，deoxyribonucleic acid）鎖を分離し、対象の遺伝子を指数関数的に増幅する。定量的ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、ＬＡＰＣＲ，マルチプレックスＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ等のいずれかの型のＰＣＲを使用することができる。リアルタイムＰＣＲを使用するのが有利である。一般に、ＰＣＲ増幅過程は、指数関数的な量の特異的な核酸配列を調製するための酵素的連鎖反応サイクルが関わる。これには、連鎖反応を開始するための少量の配列、及びその配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオ��ドプライマーが必要である。ＰＣＲでは、プライマーを、変性させた核酸にアニールさせ、その後、誘導剤（酵素）及びヌクレオチドを用いて伸長させる。この結果、新たに合成した伸長産物を得る。これらの新たに合成した配列が、プライマーの鋳型になるので、変性、プライマーのアニーリング及び伸長のサイクルを繰り返すと、増幅された特異的な配列が指数関数的に蓄積する。連鎖反応の伸長産物は、利用した特異的なプライマーの末端部に対応する末端を有する、個別の核酸の二本鎖である。
【００５３】
「酵素的に増幅する」又は「増幅する」という用語によって、本明細書又は本特許請求の範囲の目的では、ＤＮＡ増幅、すなわち、核酸配列が数の上で増幅される過程を意味する。核酸配列を酵素的に増幅するためのいくつかの手段がある。現時点で最も一般的に使用されている方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。その他の増幅方法には、ＤＮＡリガーゼ、及び増幅すべきＤＮＡ配列に相補的であるＤＮＡセグメントの２つの半分からなるプローブ、酵素ＱＢレプリカーゼ、並びにコピーすべきＤＮＡに相補的なプローブに結合しているリボ核酸（ＲＮＡ，ribonucleic acid）配列鋳型を利用し、そのコピーすべきＤＮＡを使用して相補的なＲＮＡの指数関数的な産生用のＤＮＡ鋳型を作製するリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ，ligase chain reaction）；鎖置換増幅（ＳＤＡ，strand displacement amplification）；Ｑβレプリカーゼ増幅（ＱβＲＡ，Qβ replicase amplification）；自己維持複製（３ＳＲ，self-sustained replication）；及び核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ，nucleic acid sequence-based amplification）があり、これらは、増幅すべき核酸配列であるＲＮＡ上又はＤＮＡ上で行うことができる。
【００５４】
タンパク質又は核酸等の分子の「断片」は、アミノ酸又はヌクレオチド遺伝子配列のいずれかの部分を指すことを意味する。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「ゲノム」という用語は、特定の生物体の染色体中の全ての遺伝子物質を指す。その大きさは、一般的に、塩基対の総数として示される。ゲノム内では、「遺伝子」という用語は、特異的な機能性の産物（例えば、タンパク質分子又はＲＮＡ分子）をコードする、特定の染色体の特定の位置に位置するヌクレオチドの順序付けられた配列を指す。一般に、ゲノムのヌクレオチド配列によって定義される、動物の遺伝的な特徴は、「遺伝子型」として知られ、一方、動物の物理的な形質は、「表現型」として記載される。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「ハイブリダイゼーション」又は「ハイブリダイズする」によって、ポリヌクレオチドのセグメントの断片のヌクレオチド配列と、オリゴヌクレオチドの相補的なヌクレオチド配列との間のＡ−Ｔ塩基対及びＣ−Ｇ塩基対の形成を意味する。相補的なとは、断片配列中の各Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴ（若しくはリボヌクレオチドの場合はＵ）の遺伝子座位において、オリゴヌクレオチド配列がそれぞれ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＡを有することを意味する。ハイブリダイズした断片／オリゴヌクレオチドは、「二本鎖」と呼ばれる。
【００５７】
サンドイッチアッセイ中等の「ハイブリダイゼーション複合体」は、少なくとも標的核酸とセンサープローブとを含む核酸分子の複合体を意味する。また、これは、アンカープローブも含むことができる。
【００５８】
「融解温度」は、ハイブリダイズした二本鎖が、デハイブリダイズし、一本鎖状態に戻る温度を意味する。同様に、得られた二本鎖の融解温度を超える温度では、そもそも、２つのオリゴヌクレオチドの間、又は本明細書の場合には、オリゴヌクレオチドと断片との間では、ハイブリダイゼーションが起こらない。本発明の有利な点といえば、本発明のオリゴヌクレオチド−断片の二本鎖の融点温度の差は、約１℃〜約１０℃であり、したがって、検出が容易であることである。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを使用して産生したＤＮＡ又はＲＮＡのアナログ、並びにそれらの誘導体、断片及び相同体を含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよいが、二本鎖ＤＮＡが有利である。「ＤＮＡ」は、デオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン又はシトシン）の一本鎖の形態又は二本鎖のらせんのいずれかの重合体を指す。この用語は、分子の一次構造及び二次構造のみを指し、分子を何らかの特定の三次の形態に限定することはない。したがって、この用語は、とりわけ、直鎖ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、ウイルス、プラスミド及び染色体中に見い出される二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論する場合に、本明細書では、ＤＮＡの未転写の鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿う５’〜３’方向の配列のみを示す慣例に従って、配列を記載することができる。「単離された」核酸分子は、核酸の天然の源に存在するその他の核酸分子から分離した分子である。
【００６０】
「ヌクレオシド」は、糖に連結している塩基を指す。塩基は、アデニン（Ａ，adenine）、グアニン（Ｇ，guanine）（又はその代用物、イノシン（Ｉ，inosine））、シトシン（Ｃ，cytosine）、或いはチミン（Ｔ，thymine）（又はその代用物、ウラシル（Ｕ，uracil））でよい。糖は、リボース（ＲＮＡ中の天然のヌクレオチドの糖）又は２−デオキシリボース（ＤＮＡ中の天然のヌクレオチドの糖）でよい。「ヌクレオチド」は、単一のリン酸基に連結しているヌクレオシドを指す。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、一連の連結されたヌクレオチド残基を指し、このヌクレオチドは、ＰＣＲ反応で使用するのに十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列若しくはｃＤＮＡ配列に基づく、又はそれから設計することができ、特定の細胞又は組織中の同一の、類似する若しくは相補的なＤＮＡ又はＲＮＡの存在を、増幅、確認又は明らかにするために使用する。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成することができ、プライマー又はプローブとして使用することができる。オリゴヌクレオチドは、標的核酸の検出又は同定を促進するために使用する４塩基以上の長さのいずれかのヌクレオチドを意味し、これには、プローブ及びプライマーが含まれる。
【００６２】
「ポリメラーゼ」は、単量体単位の重合体鎖への順次付加を触媒する、又は２つ以上の単量体単位を連結して重合体鎖を開始する酵素である。「ポリメラーゼ」が、単量体単位を付加することによって働き、この単量体単位の同一性は、特異的な配列の鋳型分子により決定され、この単量体単位は、特異的な配列の鋳型分子に相補的である。例えば、ＤＮＡ  ｐｏｌ  １ポリメラーゼ及びTaqポリメラーゼ等のＤＮＡポリメラーゼは、鋳型に依存する様式で、デオキシヌクレオチドをポリヌクレオチド鎖の３’末端に付加し、それによって、鋳型分子に相補的である核酸を合成する。ポリメラーゼを使用して、プライマーを１回又は繰り返して伸長すること、或いは２つのプライマーを使用する、２本の相補鎖の繰り返しのプライミングによってポリヌクレオチドを増幅することのいずれもが可能である。「熱安定性ポリメラーゼ」は、１００℃に近い温度等の極度の高温に耐えることができるＤＮＡポリメラーゼ酵素又はＲＮＡポリメラーゼ酵素を指す。しばしば、熱安定性ポリメラーゼは、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）等、極端な温度中に生存する生物体から得る。熱安定性ポリメラーゼの例として、Taq、Tth、Pfu、Vent、deep vent、UlTma、並びにそれらの変異体及び誘導体が挙げられる。
【００６３】
「ポリヌクレオチド」は、１つのヌクレオシドの３’ヒドロキシル基と第２のヌクレオシドの５’ヒドロキシル基との間のホスホジエステル結合によって接続されているヌクレオチドの直鎖を指す。第２のヌクレオシドの５’ヒドロキシル基は、順に、３’ヒドロキシル基によって、第３のヌクレオシドの５’ヒドロキシル基に連結し、このようにして、ホスホジエステル骨格によって連結されるヌクレオシドからなる重合体を形成する。「修飾ポリヌクレオチド」は、１つ又は複数の天然のヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドで、部分的に、相当な部分が又は完全に置換されているポリヌクレオチドを指す。
【００６４】
「プライマー」は、オリゴヌクレオチド、すなわち、増幅又は複製する鋳型ＤＮＡのセグメントに相補的である配列の少なくとも一部の配列である。典型的には、プライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う場合に使用する。プライマーは、鋳型ＤＮＡとハイブリダイズし（鋳型ＤＮＡにアニールし）、ポリメラーゼ酵素によって、複製／増幅の過程のための出発点として使用される。本明細書では、プライマーは、特定の標的ＤＮＡ配列の異なる鎖に「本質的に」相補的であるように選択する。これは、プライマーが、それぞれの鎖とハイブリダイズするように十分に相補的でなければならないことを意味する。したがって、プライマー配列は、鋳型の的確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド断片を、プライマーの５’末端に結合させ、プライマー配列の残りの部分は、鎖に相補的となすことができる。或いは、プライマー配列とハイブリダイズし、それによって、伸長産物の合成のための鋳型を形成する鎖の配列に対して、プライマー配列が十分な相補性を有するのであれば、非相補的な塩基又はより長い配列を、このプライマー内に散在させることができる。
【００６５】
「プローブ」は、ハイブリダイゼーションによる、同一の、類似する又は相補的な核酸配列の検出に使用する、可変の長さのオリゴヌクレオチド核酸配列を指す。検出プローブとして使用するオリゴヌクレオチド配列は、検出可能な部分を用いて標識することができる。
【００６６】
以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子若しくは遺伝子断片、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれかの配列の単離されたＤＮＡ、いずれかの配列の単離されたＲＮＡ、核酸のプローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチド及びヌクレオチドアナログ等の修飾ヌクレオチド、ウラシル、フルオロリボース及びチオレート等のその他の糖及び連結基、並びにヌクレオチドの枝を含むことができる。ヌクレオチドの配列を、重合後に、標識成分との結合などによってさらに修飾してもよい。この定義に含まれるその他の型の修飾は、キャップ、天然に生じるヌクレオチドのうちの１つ又は複数の、アナログを用いた置換、及びポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、その他のポリヌクレオチド又は固体の支持体に結合させるための手段の導入である。
【００６７】
「単離された」ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、天然の環境においては付随している物質を本質的に含まないポリヌクレオチド又はポリペプチドである。本質的に含まないとは、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、有利には、少なくとも７０％、少なくとも７５％、より有利には、少なくとも８０％、少なくとも８５％、さらにより有利には、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、最も有利には、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、これらの物質を含まないことを意味する。
【００６８】
「単離された」核酸分子は、核酸分子が天然では一緒に存在する全体の生物体から分離しており、且つ個別である核酸分子；又は天然では通常は核酸分子と結合している配列の全部又は一部を欠く核酸分子；又は天然に存在する配列であるが、それと結合する異種性の配列（以下に定義する）を有する配列である。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「タンパク質をコードするポリヌクレオチド」という用語は、タンパク質をコードするＤＮＡ断片又は単離されたＤＮＡ分子、或いはそれに相補的な鎖を指すが、ＲＮＡを排除するわけではない。これは、当技術分野では、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ，thymidine）は、ＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）に等しいとみなされると理解されているからである。したがって、本発明における使用のため、例えば、ＲＮＡベクターにおける使用のためのＲＮＡ配列は、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）が、ＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）に等しいとみなすことによって、ＤＮＡ配列から引き出すことができる。
【００７０】
ＤＮＡの「コード配列」又は特定のタンパク質を「コードするヌクレオチド配列」は、適切な調節エレメントの制御下に置いた場合、ポリペプチドにインビトロ又はインビボで転写及び翻訳されるＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は、これらに限定されないが、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列までをも含む。転写終止配列は、通常、コード配列の３’に位置する。
【００７１】
「相同性」は、２つのポリヌクレオチド部分又は２つのポリペプチド部分のパーセント同一性を指す。配列が、分子の規定された長さにわたり、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、好ましくは、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、最も好ましくは、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％の配列同一性を示す場合に、２つのＤＮＡ又は２つのポリペプチド配列は、相互に「本質的に相同」である。本明細書で使用する場合、本質的に相同とは、特定のＤＮＡ配列又はポリペプチド配列に対して、完全な同一性（１００％配列同一性）を示す配列もまた指す。
【００７２】
相同性は、相同な領域の間で安定な二本鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイズさせ、その後、一本鎖に特異的なヌクレアーゼ（複数のヌクレアーゼ）を用いて消化し、消化した断片の大きさを決定することによって決定することができる。本質的に相同であるＤＮＡ配列は、サザンハイブリダイゼーション実験中で、例えば、特定の系について定義された厳密な条件下で同定することができる。適切なハイブリダイゼーションの条件を定義することは、当技術分野に属する。例えば、Sambrook et al.、上記；DNA Cloning、上記；Nucleic Acid Hybridization、上記を参照されたい。
【００７３】
２つの核酸断片が、（ｉ）例えば、Sambrook et al.、上記及びNucleic Acid Hybridization、上記に記載されているような、典型的なハイブリダイゼーション及び洗浄の条件下で、（ii）最大約２５〜３０％の塩基対のミスマッチを許す、厳密度の低下した洗浄条件、例えば、２×SSC、０．１％SDS、室温、各３０分を２回；次いで、２×SSC、０．１％SDS、３７℃、３０分を１回；次いで、２×SSC、室温、各１０分を２回を使用して、又は（iii）（例えば、Saiki, et al. (1988) Science 239:487-491に記載されている）標準的な条件下での典型的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における使用のためにプライマーを選択して：核酸又はその変異体に特異的にハイブリダイズし、或いはポリメラーゼ連鎖反応を特異的にプライミングすることができる場合には、これらは、ポリヌクレオチドに対して「選択的にハイブリダイズすることが可能である」とみなされる。
【００７４】
本明細書で使用する場合、「厳密な条件下でハイブリダイズすることができる」という用語は、以下に定義する厳密な条件下で、第１の核酸を第２の核酸にアニールさせることを指す。厳密なハイブリダイゼーション条件は、典型的には、ハイブリダイゼーション反応中でプローブとして使用する核酸分子と、少なくとも７０％の核酸配列同一性を有する核酸分子のハイブリダイゼーションを可能にする。例えば、第１の核酸は、試験試料又はプローブであることができ、第２の核酸は、核酸又はその断片のセンス鎖又はアンチセンス鎖であることができる。第１の核酸と第２の核酸とのハイブリダイゼーションを、異なるヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに不利になる傾向がある厳密な条件、例えば、高温及び／又は低塩含有量下で行うことができる。或いは、第１の核酸と第２の核酸とのハイブリダイゼーションを、異なるヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに有利になる傾向がある厳密度の低下した条件、例えば、低温及び／又は高塩含有量下で行うことができる。低厳密度のハイブリダイゼーション条件に、高厳密度の条件又は中間の厳密度の条件を続けて、第１の核酸と第２の核酸との結合の選択性を増加させてもよい。ハイブリダイゼーション条件は、異なるヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションにその上さらに不利になるように、これらに限定されないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ，dimethyl sulfoxide）、又はホルムアミド等の試薬をさらに含むことができる。適切なハイブリダイゼーションのプロトコールでは、例えば、水溶液中、６×SSC（但し、１×SSCは、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム及び０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む）、６５℃でハイブリダイズさせ、その後、１×SSC、６５℃で洗浄することになる。２つの核酸分子の間の３０％以下のミスマッチを許すハイブリダイゼーションを達成するための適切なハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を計算する式は、例えば、Meinkoth et al. (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284に開示されており、この全内容が、参照によって本明細書に組み入れられている。ハイブリダイゼーションの技法に関するプロトコールは、当業者にはよく知られており、標準的な分子生物学のマニュアルを参考にして、過度の実験をせずとも、適切なハイブリダイゼーションのプロトコールを選択することができる。例えば、全内容が、参照によって本明細書に組み入れられている、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring HarborPressを参照されたい。
【００７５】
典型的には、厳密な条件とは、塩濃度が、約１．５Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には、約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（又はその他の塩）、約ｐＨ７．０〜約ｐＨ８．３であり、温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０個のヌクレオチド）の場合には、少なくとも約３０℃、及び長いプローブ（例えば、５０個超のヌクレオチド）の場合には、少なくとも約６０℃である条件である。また、厳密な条件は、ホルムアミド等の不安定化剤を添加して達成することもできる。例示的な低厳密度の条件として、３７℃で、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ  NaCl、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ，sodium dodecyl sulphate）の緩衝液を用いるハイブリダイゼーション、及び５０〜５５℃で、１〜２×SSC中の洗浄が挙げられる。例示的な中等度の厳密度の条件として、３７℃で、４０〜４５％ホルムアミド、１Ｍ  NaCl、１％SDS中のハイブリダイゼーション、及び５５〜６０℃で、０．５〜１×SSC中の洗浄が挙げられる。例示的な高厳密度の条件として、３７℃で、５０％ホルムアミド、１Ｍ  NaCl、１％SDS中のハイブリダイゼーション、及び６０〜６５℃で、０．１×SSC中の洗浄が挙げられる。
【００７６】
また、本発明は、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、４８、５０及び５２の配列から選択されたポリペプチドの断片も包含する。本発明の実施にあたっては、過度の実験をせずとも、ポリペプチドの断片及びエピトープを決定する手順、例として、重複ペプチドライブラリーの産生（Hemmer B. et al., Immunology Today, 1998, 19(4), 163-168）、Ｐｅｐｓｃａｎ（Geysen H. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1984, 81(13), 3998-4002；Geysen H. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1985, 82(1), 178-182；Van der Zee R. et al., Eur. J. Immunol., 1989, 19(1), 43-47；Geysen H. M., Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 1990, 21(4), 523-533；Multipinep（登録商標）Peptide Synthesis Kits de Chiron）、及びアルゴリズム（De Groot A. et al., Nature Biotechnology, 1999, 17, 533-561）を使用することができる。
【００７７】
ポリペプチド又はその断片は、インビトロでの発現によって産生されると有利である。本発明の別の態様は、発現、及びペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質、又はより一般的には、発現産物、例えば、免疫原、抗原若しくはエピトープの産生のための、本発明によるポリヌクレオチドの使用である。ある実施形態では、これらのポリヌクレオチドがコードするポリペプチド又はペプチド又はタンパク質を、免疫原性組成物又はワクチン中で、サブユニット免疫原又は抗原又はエピトープとして使用することができる。また、本発明は、鎖が、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、例えば少なくとも３０個、有利には少なくとも５０個、より有利には少なくとも７０個のアミノ酸のポリペプチドである、これらのポリペプチドの免疫原性断片、例えば、少なくとも８個の近接アミノ酸のポリペプチド、少なくとも１０個の近接アミノ酸のポリペプチド、有利には、少なくとも２０個、例えば少なくとも３０個、より有利には少なくとも５０個の近接アミノ酸のポリペプチド、さらにより有利には少なくとも７０個の近接アミノ酸のポリペプチドを含有するポリペプチドの断片も包含する。もちろん、断片は、全ポリペプチドよりは小さい。断片を、その他のポリペプチドと、例えば、融合ポリペプチド中に組み合わせることができる。例を挙げると、本発明のポリペプチド又はその断片を、別の部分（別のポリペプチド）、例えば、免疫原性を増強する部分及び／又は分泌を増強する部分、例として、免疫原性を増強するリポタンパク質部分、具体的には、Ｔ細胞エピトープペプチド又はシグナル配列若しくはリーダー配列の部分を含む、融合ペプチドの一部とする（すなわち、グルタチオンＳトランスフェラーゼ遺伝子（ＧＳＴ，glutathione S-transferase）（Chanter N et al., Microb. Pathog., 1999, 27(3): 133-143）、又はコレラ毒素（Sheoran A S et al., Vaccine, 2002, 20(11-12): 1653-1659）に融合させる）ことができる。したがって、本発明は、融合体として、例えば、融合ポリペプチド、例として、リポタンパク質等の免疫原性を増強する部分及び／又はシグナル配列若しくはリーダー配列の部分等の分泌を増強する部分を含むと有利である融合ポリペプチドの一部としての、本明細書に特定する配列若しくはその断片、又は本発明のベクターとは異種性であるもののいずれかの、ポリペプチド、タンパク質、抗原、免疫原又はエピトープの発現を想定する。
【００７８】
本明細書で使用する場合、「抗原」又は「免疫原」という用語は、宿主動物において、特異的な免疫応答を誘導する物質を意味する。抗原は、死滅させた、弱毒化した又は生の全生物体；生物体のサブユニット又は一部；免疫原性を有する挿入断片を含有する組換えベクター；宿主動物への提示の際に免疫応答を誘導することができるＤＮＡの小片又は断片；タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、エピトープ、ハプテン、或いはいずれかのそれらの組合せを含むことができる。或いは、免疫原又は抗原は、毒素又は抗毒素を含むこともできる。
【００７９】
また、本明細書で使用する場合、「免疫原性のタンパク質又はペプチド」という用語は、宿主に投与すると、タンパク質に向けて、液性及び／又は細胞性の免疫応答を惹起することができるという意味において、免疫学的に活性であるペプチド及びポリペプチドも含む。好ましくは、タンパク質断片は、全タンパク質と本質的に同一の免疫学的な活性を有するようになされる。したがって、本発明によるタンパク質断片は、少なくとも１つのエピトープ又は抗原決定基を含む、或いは少なくとも１つのエピトープ又は抗原決定基から本質的になる、或いは少なくとも１つのエピトープ又は抗原決定基からなる。エピトープという用語は、液性（Ｂ細胞）及び／又は細胞性（Ｔ細胞）の免疫反応を誘導することができるタンパク質の部位を指す。
【００８０】
「免疫原性のタンパク質又はペプチド」という用語は、ポリペプチドが、本明細書で定義する免疫学的応答を生じるように機能する限り、配列に対する欠失、付加及び置換もさらに意図する。この点に関しては、特に好ましい置換は、一般に、保存的な性質のものである、すなわち、所与のアミノ酸のファミリーの中で生じる置換である。例えば、アミノ酸は、一般に、４つのファミリー：（１）酸性―アスパラギン酸及びグルタミン酸；（２）塩基性―リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性―アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；並びに（４）無電荷、極性―グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシンに分類される。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、時には、芳香族アミノ酸として分類される。ロイシンのイソロイシン若しくはバリンによる、又はその逆；アスパラギン酸のグルタミン酸による、又はその逆；スレオニンのセリンによる、又はその逆の単一置換、或いはアミノ酸の構造的に関連のあるアミノ酸による同様の保存的置換は、生物学的な活性に対して際立った効果を及ぼさないと合理的に予測できる。したがって、参照分子としては本質的に同一のアミノ酸配列を有するが、タンパク質の免疫原性に本質的に影響することはない軽微なアミノ酸置換を有するタンパク質は、参照ポリペプチドの定義の範囲内に入る。
【００８１】
「エピトープ」という用語は、特異的なＢ細胞及び／又はＴ細胞が応答する抗原又はハプテンの上の部位を指す。また、この用語は、「抗原決定基」又は「抗原決定部位」と交換可能に使用される。同一のエピトープを認識する抗体を、１つの抗体の、別の抗体が標的抗原に結合するのを遮断する能力を示す簡単なイムノアッセイ中で同定することができる。
【００８２】
組成物又はワクチンに対する「免疫学的応答」は、宿主において、対象の組成物又はワクチンに対して、細胞性の免疫応答及び／又は抗体が媒介する免疫応答が生じることである。通常、「免疫学的応答」は、これらに限定されないが、以下の作用のうちの１つ又は複数を含む：対象の組成物又はワクチンの中に含まれる抗原又は複数の抗原に特異的に向けられた、抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞及び／又は細胞障害性Ｔ細胞の産生。好ましくは、宿主は、治療的又は防御的のいずれかの免疫学的応答を示し、それによって、新しい感染に対する抵抗性が増強され、且つ／又は疾患の臨床的な重症度が低減するであろう。そのような防御は、感染した宿主が通常示す症状の低減若しくは消散のいずれか、回復時間の短縮、及び／又は感染した宿主中のウイルス力価の減少によって実証されるであろう。
【００８３】
また、本明細書で使用する場合、「免疫原性の」タンパク質又はポリペプチドという用語は、上記に記載した免疫学的応答を惹起するアミノ酸配列も指す。本明細書で使用する場合、「免疫原性の」タンパク質又はポリペプチドは、完全長配列のタンパク質、そのアナログ、又はその免疫原性断片を含む。「免疫原性断片」とは、１つ又は複数のエピトープを含み、したがって、上記に記載した免疫学的応答を惹起するタンパク質の断片を意味する。そのような断片は、当技術分野でよく知られている、エピトープのマッピングの多くの技法を使用して同定することができる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N.J.を参照されたい。例えば、直鎖状のエピトープは、例えば、タンパク質分子の部分に対応する、多数のペプチドを、固体の支持体上で同時に合成し、ペプチドが支持体に結合しているままの状態で、それらのペプチドを抗体と反応させることによって決定することができる。そのような技法は、当技術分野では知られており、例えば、米国特許第４７０８８７１号明細書；Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002；Geysen et al. (1986) Malec. Immunol. 23:709-715に記載されている。それらはいずれも、全内容が参照によって本明細書に組み入れられている。同様に、立体構造的なエピトープも、例えば、Ｘ線結晶解析及び二次元核磁気共鳴によって等、アミノ酸の空間的な立体構造を決定することによって、容易に同定することができる。例えば、Epitope Mapping Protocols、上記を参照されたい。
【００８４】
また、合成抗原も、本定義の範囲内に含まれ、例えば、ポリエピトープ、隣接エピトープ及びその他の組換え抗原が挙げられる。例えば、Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781；Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157:3242-3249；Suhrbier, A. (1997) Immunol. and Cell Biol. 75:402-408；Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, Jun. 28-Jul. 3, 1998を参照されたい。免疫原性の断片は、本発明の目的では、通常、少なくとも約３個のアミノ酸、好ましくは、少なくとも約５個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも約１０〜１５個のアミノ酸、最も好ましくは、２５個以上のアミノ酸の分子を含む。断片の長さについては、決定的に重要な意味をもつ上限はなく、断片は、ほとんど完全長のタンパク質配列、又はタンパク質の少なくとも１つのエピトープを含む融合タンパク質でさえ含むことができるであろう。
【００８５】
したがって、エピトープを発現させるポリヌクレオチドの最小限の構造は、対象のタンパク質又はポリタンパク質のエピトープ又は抗原決定基をコードするヌクレオチドを含む、或いは対象のタンパク質又はポリタンパク質のエピトープ又は抗原決定基をコードするヌクレオチドから本質的になる、或いは対象のタンパク質又はポリタンパク質のエピトープ又は抗原決定基をコードするヌクレオチドからなる。全タンパク質又はポリタンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドは、より有利には、全タンパク質又はポリタンパク質をコードする配列のうちの最低２１個のヌクレオチド、有利には、少なくとも４２個のヌクレオチド、好ましくは、少なくとも５７個、８７個若しくは１５０個の連続した若しくは隣接するヌクレオチドを含む、或いは全タンパク質又はポリタンパク質をコードする配列のうちの最低２１個のヌクレオチド、有利には、少なくとも４２個のヌクレオチド、好ましくは、少なくとも５７個、８７個若しくは１５０個の連続した若しくは隣接するヌクレオチドから本質的になる、或いはタンパク質又はポリタンパク質をコードする配列のうちの最低２１個のヌクレオチド、有利には、少なくとも４２個のヌクレオチド、好ましくは、少なくとも５７個、８７個若しくは１５０個の連続した若しくは隣接するヌクレオチドからなる。本発明の実施にあたっては、過度の実験をせずとも、いずれも全内容が参照によって本明細書に組み入れられている、重複ペプチドライブラリーの産生（Hemmer B. et al., Immunology Today, 1998, 19(4), 163-168）、Pepscan（Geysen. et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81, 3998-4002；Geysen. et al., (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82, 178-182；Van der Zee R. et al., (1989) Eur. J. Immunol., 19, 43-47；Geysen H. M., (1990) Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 21, 523-533；Multipin RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron）、及びアルゴリズム（De Groot A. et al., (1999) Nature Biotechnology, 17, 533-561）、並びにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２６０５号パンフレット等、エピトープを決定する手順を使用することができる。本明細書に引用されている又は組み入れられているその他の文書もまた、免疫原又は抗原のエピトープ、及びしたがって、そのようなエピトープをコードする核酸分子を決定するのに用いる方法のために参考にすることができる。
【００８６】
一実施形態では、ポリペプチドの断片は、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、５４、５６及び５８の配列から選択される。これらはそれぞれ、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、５３、５５及び５７のヌクレオチド配列がコードする。配列番号３２、３４、３６、３８、４０、５４、５６及び５８の、ポリペプチドの断片はそれぞれ、Ｓｅ５０、Ｓｅ１４５９、Ｓｅ５９５、Ｓｅ５２８、Ｓｅ３５８、Ｓｅ１６３１、Ｓｅ１６８１及びＳｌａの部分である。
【００８７】
本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのアナログ又はその断片は、プロモーター、リボゾーム結合領域及びターミネーター等の調節エレメント、並びに開始コドン及び停止コドンに連結させて、ベクター中に挿入する。
【００８８】
ポリペプチド、そのアナログ及びその断片は、宿主細胞中で、インビトロで産生することができる。インビトロ発現ベクターは、タンパク質を適切な細胞系中でインビトロで発現させるために使用する発現ベクターである。これは、原核生物の宿主細胞、すなわち、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）（Mahona F et al., Biochimie 1994, 46(1): 9-14；Watt M A et al., Cell Stress Chaperones 1997, 2(3): 180-90；Frey J Res. Microbiol. 1992, 143(3): 263-9）、又は乳酸桿菌（Seegers J F, Trends Biotechnol. 2002, 20(12): 508-515；Pouwels P H et al., Methods Enzymol. 2001, 336: 369-389）、或いは真核生物の宿主細胞、すなわち、酵母（Gerngross T U, Nat Biotechnol. 2004, 22(11): 1409-1414；Malissard M et al., Glycoconj J. 1999, 16(2): 125-139）、昆虫細胞（Oker-Blom C et al., Brief Funet Genomic Proteomic. 2003, 2(3), 244-253）、哺乳動物細胞又は鳥類細胞の中で産生することができる。
【００８９】
エシェリキア・コリの場合、異なる菌株、とりわけ、BL21(DE3)株（Novagen社製又はInvitrogen社製；Hedayati M A et al., Protein Expr Purif, 2005, 43(2): 133-139を参照）、Origami2(DE3)株（Novagen社製又はInvitrogen社製）、Y1089（Galan J E et al., Infect Immun, 1987, 55(12): 3181-3187）を使用することができる。ベクターは、有利には、プラスミド、すなわち、pGEXプラスミド（GE Healthcare社製）、pETプラスミド（Novagen社製又はInvitrogen社製）（Jiang X Y et al., J Biochem Mol Biol. 2006, 39(1): 22-25；Hedayati M A et al., Protein Expr Purif, 2005, 43(2): 133-139；Jedrzejas M J et al., Protein Expr Purif, 1998, 13(1): 83-89）である。また、ベクターは、ウイルス、とりわけ、バクテリオファージ、すなわち、lambda-gt11ファージ（Galan J E et al., Infect Immun, 1987, 55(12): 3181-3187）であってもよい。別のアプローチとして、連鎖球菌のタンパク質とエシェリキア・コリのタンパク質、とりわけ、リポタンパク質との間のキメラのタンパク質（Cullen P A et al., Plasmid, 2003, 49(1): 18-29）、又はＧＳＴとのキメラのタンパク質（Zhao G et al., Protein Expr Purif, 1999, 16(2): 331-339）を産生するための融合遺伝子の使用がある。連鎖球菌の挿入断片は、プロモーター、すなわち、バクテリオファージＴ７プロモーター（Yamamoto M et al., FEMS Microbiol Lett, 1995, 132(3): 209-213）、単一ペプチド配列、すなわち、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorgeri）の外表面プロテインＡシグナルペプチド（De B K et al., Vaccine, 2000, 18(17): 1811-1821）、エシェリキア・コリの主要外膜リポタンパク質シグナル配列（Cullen P A et al., Plasrnid, 2003, 49(1): 18-29）に連結することができる。
【００９０】
乳酸桿菌の場合、異なる菌株、とりわけ、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）を使用することができる（Seegers J F, Trends Biotechnol., 2002, 20(12): 508-515）。サカシンＰの産生に関与するプロモーター及び調節遺伝子は、乳酸桿菌中での誘導性の、高レベルの遺伝子発現を確立するのに適している（Mathiesen G et al., Lett Appl Microbiol., 2004, 39(2): 137-143）。又は、ラクトースオペロンプロモーターもそうである（Oliveira M L et al., FEMS Microbiol Lett., 2003, 227(1): 25-31）。別のアプローチとして、乳酸桿菌のタンパク質と連鎖球菌のタンパク質との間のキメラのタンパク質を産生するための融合遺伝子の使用がある（Hung J et al., FEMS Microbial Lett., 2002, 211(1): 71-75）。
【００９１】
昆虫細胞中でのインビトロ発現のためには、ベクターは、有利には、ウイルス、すなわち、バキュロウイルス（例えば、米国特許第４７４５０５１号明細書；Vialard J. et al., J. Virol., 1990 64(1), 37-50；Verne A., Virology, 1988, 167, 56-71；Oker-Blom C et al., Brief Funct Genomic Proteomic. 2003, 2(3), 244-253を参照）、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角病ウイルスＡｃＮＰＶ（Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus）であり、昆虫細胞は、Ｓｆ９スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１；また、米国特許第６２２８８４６号明細書、米国特許第６１０３５２６号明細書も参照）である。タンパク質の産生は、哺乳細胞へのプラスミドによる形質移入によって、哺乳動物細胞又は鳥類細胞の上でのウイルスベクターの増殖性の複製を伴わない複製又は発現によって起こすことができる。使用することができる哺乳動物細胞は、有利には、ハムスター細胞（例えば、ＣＨＯ若しくはＢＨＫ−２１）、又はサル細胞（例えば、ＣＯＳ若しくはＶＥＲＯ）、又はウシ細胞（例えば、ＭＤＢＫ）、すなわち、ＭＤＢＫ細胞中（Ibrahim el S M et al., Microbiol. Immunol., 2004, 48(11): 831-842）若しくはベロ細胞中（US-A-4,110,433）のＥＨＶ−１ベクターの培養物、又はＢＨＫ細胞中のＶＥＥＶレプリコンの培養物（Lee J S et al., Infect. Immun., 2001, 69(9): 5709-5715）である。
【００９２】
宿主細胞をインビトロで培養するための条件は、特定の遺伝子によって変化すること、及び宿主細胞によっては、タンパク質を培養するための最適条件を決定するために、日常的な実験が時には必要であることを、当業者には理解されたい。「宿主細胞」は、遺伝子が改変されている、又は組換えプラスミド若しくは組換えベクター等の外因性のポリヌクレオチドの投与によって遺伝子を改変することができる原核細胞又は真核細胞を意味する。遺伝子を改変した細胞に言及する場合、この用語は、元々の改変された細胞及びその子孫の両方を指す。
【００９３】
インビトロ発現ベクターは、複製及び増幅に適した宿主細胞中に導入することができる。対象のポリヌクレオチドを含有するベクターを、直接的な取込み、エンドサイトーシス、形質移入、ｆ−接合、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン又はその他の物質を利用する形質移入；微粒子銃；リポフェクシン；及び感染（ベクターが感染性の場合、例えば、レトロウイルスベクター）をはじめとする、多くの適切な手段のうちのいずれかによって、宿主細胞中に導入することができる。導入するベクター又はポリヌクレオチドの選択は、しばしば、宿主細胞の特色によって決まる。
【００９４】
発現したタンパク質は、分泌後の又は分泌後でない培養上清中で又はそこから（分泌が生じない場合には、典型的には、細胞溶解が生じるか、細胞溶解を行う）収集し、場合により、限外ろ過等の濃縮方法によって濃縮すること、及び／又はアフィニティー、イオン交換若しくはゲルろ過性のクロマトグラフィーの方法、とりわけ、アフィニティークロマトグラフィー、すなわち、Ni NTA Superflow（Qiagen社製）若しくはNi Sepharose fastflow（Amersham社製）、又はゲルろ過、すなわち、Sephacryl（登録商標）若しくはSuperdex（登録商標）（Amersham GE Healthcare社製）を使用する等の精製手段によって精製することができる。
【００９５】
また、ポリペプチド及びその断片は、連鎖球菌、とりわけ、ストレプトコッカス・エクイの粗培養物からの、抽出、とりわけ、酸による抽出又はムタノリシンによる抽出（Boschwitz J S et al., Cornell Vet., 1991, 81(1): 25-36）、及び精製、とりわけ、免疫沈降（Erickson E D et al., Can J Comp Med., 1975, 39(2): 110-115）によって得ることもできる。
【００９６】
また、ポリペプチド及びその断片は、化学的に合成することもできる（Luo Y et al., Vaccine 1999, 17(7-8): 821-31）。
【００９７】
「サブユニットワクチン組成物」とは、少なくとも１つの免疫原性ポリペプチド、又は対象の病原体からの抗原に由来する、若しくは相同する、全部とは限らないが、少なくとも１つの抗原を発現することができるポリヌクレオチドを含有する組成物を意味する。そのような組成物は、無処置の病原体の細胞若しくは粒子も、そのような細胞又は粒子の溶菌液も本質的に含まない。したがって、「サブユニットワクチン組成物」は、少なくとも部分的に精製された（好ましくは、本質的に精製された）、病原体からの免疫原性ポリペプチド又はその組換えアナログから調製する。サブユニットワクチン組成物は、対象のサブユニット抗原又は複数のサブユニット抗原を含むことができ、これは、病原体からのその他の抗原及びポリペプチドを本質的に含まない。
【００９８】
本発明の目的は、サブユニット免疫原性組成物又はサブユニットワクチンであり、これは、本発明による、少なくとも１つのポリペプチド、そのアナログ又はその断片と、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は媒体と、場合により、アジュバント及び／又は安定化剤とを含む。
【００９９】
サブユニット免疫原性組成物又はサブユニットワクチン組成物は、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、４８、５０及び５２の配列からなる群から選択された少なくとも１つのポリペプチ、若しくはそのアナログ、又はその断片ドを含むことができる。サブユニット免疫原性組成物又はサブユニットワクチン組成物は、有利には、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、４８、５０及び５２の配列からなる群から選択された２つ若しくは３つ若しくは４つ若しくは５つのポリペプチド、若しくはそのアナログ、又はその断片を含むことができる。
【０１００】
サブユニット免疫原性組成物又はサブユニットワクチン組成物は、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、５４、５６及び５８の配列からなる群から選択された少なくとも１つのポリペプチド、又はそのアナログを含むことができる。
【０１０１】
サブユニット免疫原性組成物又はサブユニットワクチン組成物は、有利には、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、５４、５６及び５８の配列からなる群から選択された２つ若しくは３つ若しくは４つ若しくは５つのポリペプチド、又はそのアナログを含むことができる。
【０１０２】
本発明の別の目的は、組換え免疫原性組成物又は組換えワクチンであり、これは、少なくとも１つの組換えインビボ発現ベクターと、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は媒体と、場合により、アジュバント及び／又は安定化剤とを含む。組換えインビボ発現ベクターは、ポリヌクレオチド又はその断片を含むベクターであり、このポリヌクレオチド又はその断片は、ベクター中に挿入されており、このベクターは、このポリヌクレオチド又はその断片がコードするポリペプチドを、標的哺乳動物中でインビボで発現することができる。ＤＮＡ免疫原性組成物及びＤＮＡワクチンの場合は、ベクターは、ポリヌクレオチドベクターでもよく、プラスミドでもよい（EP-A2-1001025；Chaudhuri P Res. Vet. Sci. 2001, 70(3), 255-6）。或いは、組換えウイルスベクター免疫原性組成物及び組換えウイルスベクターワクチンの場合は、ベクターは、ウイルスでもよい（例えば、ヘルペスウイルス、例として、ウマヘルペスウイルス１型（Trapp S et al., J. Virol. 2005, 79(9): 5445-5454）、ウマヘルペスウイルス２型、ウマヘルペスウイルス４型；ポックスウイルス、例として、ワクシニアウイルス、又は鶏痘（US-A-5,174,993；US-A-5,505,941及びUS-A-5,766,599）若しくはカナリアポックス（US-A-5,756,103）のようなトリポックスウイルス；アデノウイルス、例として、ヒトアデノウイルス（Chroboczek J et al., Virol. 1992, 186: 280-285）；脳炎ウイルス、例として、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Pushko P et al. Virol. 1997, 239: 389-401；Davis N L et al. J. Virol. 2000, 74: 371-378））。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチド又はその断片を、組換えインビボ発現細菌ベクター、とりわけ、サルモネラ属中に挿入して、生の細菌性の組換え免疫原性組成物又は組換えワクチンを産生することができる。
【０１０３】
プラスミドという用語は、いずれかのＤＮＡ転写単位を対象とし、これは、本発明によるポリヌクレオチドと、所望の宿主又は標的の細胞又は複数の細胞中でのインビボでの発現に必要なエレメントとを含む。この点に関しては、スーパーコイル又は非スーパーコイルの環状プラスミド、及び直鎖状の形態が、本発明の範囲内に入ることを意図することを留意されたい。特異的で、非限定的な例では、pVR1020又は1012のプラスミド（VICAL Inc.社製；Luke C. et al., Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91-97；Hartikka J. et al., Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217）を、ポリヌクレオチド配列の挿入のためのベクターとして利用することができる。pVR1020プラスミドは、pVR1020に由来し、ヒトｔＰＡシグナル配列を含有する。各プラスミドは、ポリヌクレオチド若しくはそのアナログ又はその断片を含み、或いはポリヌクレオチド若しくはそのアナログ又はその断片を含有し、或いはポリヌクレオチド若しくはそのアナログ又はその断片から本質的になり、このポリヌクレオチド若しくはそのアナログ又はその断片は、プロモーターに動作可能に連結しているか、プロモーターの制御下にあるか、プロモーターに依存性である。一般に、真核細胞において機能する強力なプロモーターを利用すると有利である。好ましい強力なプロモーターは、ヒト若しくはマウスを起源とする、又は場合により、ラット若しくはモルモット等の別の起源を有するサイトメガロウイルスの最初期（ＣＭＶ−ＩＥ，immediate early cytomegalovirus）プロモーターである。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、実際のプロモーター部分を含むことができ、このプロモーター部分は、エンハンサー部分と、結合していてもよいし、結合していなくてもよい。EP-A-260 148、EP-A-323 597、米国特許第５１６８０６２号明細書、米国特許第５３８５８３９号明細書、及び米国特許第４９６８６１５号明細書、並びにＰＣＴ出願第ＷＯ−Ａ−８７／０３９０５号パンフレットを参照することができる。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、有利には、ヒトＣＭＶ−ＩＥ（Boshart M. et al., Cell, 1985, 41, 521-530）、又はマウスＣＭＶ−ＩＥである。より一般的な条件では、プロモーターは、ウイルス又は細胞のいずれかの起源を有する。本発明の実施にあたって有用に利用することができる、ＣＭＶ−ＩＥ以外の強力なウイルス性のプロモーターは、ＳＶ４０の初期／後期のプロモーター、又はラウス肉腫ウイルスのＬＴＲプロモーターである。本発明の実施にあたって有用に利用することができる、強力な細胞性のプロモーターは、例えば、デスミンプロモーター（Kwissa M. et at., Vaccine, 2000, 18, 2337-2344）、又はアクチンプロモーター（Miyazaki J. et al., Gene, 1989, 79, 269-277）等の細胞骨格の遺伝子のプロモーターである。これらのプロモーターの機能性のサブ断片、すなわち、適切な促進活性を維持する、これらのプロモーターの部分は、本発明の範囲内に含まれ、例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ−Ａ−９８／００１６６パンフレット又は米国特許第６１５６５６７号明細書による切断したＣＭＶ−ＩＥプロモーターを、本発明の実施にあたって使用することができる。ひいては、本発明を実施する場合のプロモーターは、適切な促進活性、好ましくは、誘導体又はサブ断片が由来する実際の又は完全長のプロモーターの活性に本質的に類似��る促進活性を維持する完全長のプロモーターの誘導体及びサブ断片を含み、したがって、プロモーターとして機能する。例えば、米国特許第６１５６５６７号明細書の切断したＣＭＶ−ＩＥプロモーターの活性は、完全長のＣＭＶ−ＩＥプロモーターと同種である。したがって、本発明を実施する場合のＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、完全長のプロモーターのプロモーター部分及び／又は完全長のプロモーターのエンハンサー部分、並びに誘導体及びサブ断片を含む、或いは完全長のプロモーターのプロモーター部分及び／又は完全長のプロモーターのエンハンサー部分、並びに誘導体及びサブ断片から本質的になる、或いは完全長のプロモーターのプロモーター部分及び／又は完全長のプロモーターのエンハンサー部分、並びに誘導体及びサブ断片からなることができる。有利には、プラスミドは、その他の発現制御エレメントを含む、又は本質的にその他の発現制御エレメントからなる。安定化配列、例えば、イントロン配列（複数のイントロン配列）、好ましくは、ｈＣＭＶ−ＩＥの第１イントロン（ＰＣＴ出願第ＷＯ−Ａ−８９１０１０３６号パンフレット）、ウサギβグロブリン遺伝子のイントロンII（van Ooyen et al., Science, 1979, 206, 337-344）を組み入れると特に有利である。プラスミド及びポックスウイルス以外のウイルスベクターのためのポリアデニル化シグナル（ポリＡ）に関しては、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ，bovine growth hormone）遺伝子のポリＡシグナル（米国特許第５１２２４５８号明細書を参照）、又はウサギβグロブリン遺伝子のポリＡシグナル、又はＳＶ４０ウイルスのポリＡシグナルを、より使用することができる。
【０１０４】
ウマヘルペスウイルスに基づいた組換えベクターの場合、特に、弱毒化菌株（すなわち、ＥＨＶ−１ KyA株（Zhang Y et al., Virology, 2000, 268(2): 482-492））、或いは病原性に関与する遺伝子の変異若しくは欠失によって（Kirisawa R et al., Vet. Microbiol., 2003, 95(3): 159-174）、又は連続継代培養によって（US-A-4,110,433）弱毒化したものを使用することができる。ＥＨＶ−１の場合、ＯＲＦ６２とＯＲＦ６３との間の遺伝子間領域に、挿入を設けてもよいし（Ibrahim el S M et al., Microbiol. Immunol., 2004, 48(11): 831-842；Csellner H et al., Arch. Virol., 1998, 143(11): 2215-2231）、遺伝子、すなわち、チミジンキナーゼ（ＴＫ，thymidine kinase）遺伝子、遺伝子1若しくは７１（Kirisawa R et al., Vet. Microbiol., 2003, 95(3): 159-174）、糖タンパク質Ｉ遺伝子及び糖タンパク質Ｅ遺伝子（Matsumura T. et al., Virology, 1998, 242(1): 68-79）、ＩＲ６タンパク質遺伝子（Osterrieder N et al., Virology, 1996, 217(2): 442-451）、遺伝子１５（EP-B1-0,668,355）の中の部分的又は完全な欠失の後に、最終的に、遺伝子内に挿入を設けてもよい。ＥＨＶ−４の場合、糖タンパク質Ｉ遺伝子及び糖タンパク質Ｅ遺伝子（Damiani A M et al., Virus Res., 2000, 67(2): 189-202）、ＵＳ２又はＴＫ又は糖タンパク質Ｅの遺伝子（US-A-5,741,696；US-A-5,731,188）中に、遺伝子の部分的又は完全な欠失の後に、最終的に、挿入を設けることができる。一実施形態では、発現させるポリヌクレオチドを、真核細胞において機能するプロモーター、有利には、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター（ヒト又はマウス）の制御下に挿入する。ポリＡ配列及びターミネーター配列、例えば、ウシ成長ホルモン又はウサギβグロブリンの遺伝子のポリアデニル化シグナルを、発現させるポリヌクレオチドの下流に挿入することができる。
【０１０５】
ポックスウイルスに基づいた組換えベクターの場合、ワクシニアウイルス又は弱毒化ワクシニアウイルス（例えば、Ankaraワクチン株をトリ胚の線維芽細胞上で５７０回超継代後に得た修飾Ankara株であるＭＶＡ（modified Ankara strain）；Stickl & Hochstein-Mintzel, Munch. Med. Wschr., 1971, 113, 1149-1153；Sutter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992, 89, 10847-10851を参照；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１５０８として入手可能；又はNYVAC、米国特許第５４９４８０７号明細書を参照、例えば、米国特許第５４９４８０７号明細書の実施例１〜６及びそれ以降には、NYVACの構築、及びコペンハーゲン株ワクシニアウイルスゲノムから追加のＯＲＦを欠失したNYVACの変異体、及び異種性のコード核酸分子の、この組換え体の部位中への挿入、及び適合したプロモーターの使用も議論されている；国際公開第ＷＯ−Ａ−９６／４０２４１号パンフレットもまた参照）、トリポックスウイルス又は弱毒化トリポックスウイルス（例えば、カナリアポックス、鶏痘ポックス、ハトポックス（dovepox）、ハトポックス（pigeonpox）、ウズラポックス、ALVAC又はTROVAC；例えば、米国特許第５５０５９４１号明細書、米国特許第５４９４８０７号明細書を参照）を使用することができる。弱毒化カナリアポックスウイルスは、米国特許第５７５６１０３号明細書（ALVAC）、及び国際公開第ＷＯ−Ａ−０１／０５９３４号パンフレットに記載されている。また、弱毒化鶏痘株であるTROVACに関連する米国特許第５７６６５９９号明細書も参照されたい。ＡＴＣＣから、アクセッション番号ＶＲ−１１１の下で入手可能なカナリアポックスを参照されたい。また、多数の鶏痘ウイルスワクチン接種株、例えば、MERIAL社が販売しているDIFTOSEC CT株、及びINTERVET社が販売しているNOBILIS VARIOLEワクチンも入手可能である。それらの組換え体を産生する方法及びそれらの組換え体の投与方法に関する情報については、当業者であれば、本明細書に引用する文書、及び国際公開第ＷＯ−Ａ−９０／１２８８２号パンフレットを参照することができる。例えば、ワクシニアについては、とりわけ、米国特許第４７６９３３０号明細書、米国特許第４７２２８４８号明細書、米国特許第４６０３１１２号明細書、米国特許第５１１０５８７号明細書、米国特許第５４９４８０７号明細書及び米国特許第５７６２９３８号明細書で言及されている。鶏痘については、とりわけ、米国特許第５１７４９９３号明細書、米国特許第５５０５９４１号明細書及び米国特許第５，７６６，５９９号明細書で言及されている。カナリアポックスについては、とりわけ、米国特許第５７５６１０３号明細書で言及されている。発現ベクターがワクシニアウイルスである場合には、発現させるポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチドのための、１つ又は複数の挿入部位は、有利には、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子挿入部位、赤血球凝集素（ＨＡ，hemagglutinin）遺伝子挿入部位であり、その領域は、Ａ型の封入体（ＡＴＩ，inclusion body of the A type）をコードする。また、本明細書に引用する文書、特に、ワクシニアウイルスに関連する文書も参照されたい。カナリアポックスの場合、有利には、挿入の部位又は複数の部位は、Ｃ３、Ｃ５及び／又はＣ６のＯＲＦ（複数のＯＲＦ）である。また、本明細書に引用する文書、特に、カナリア���ックスウイルスに関連する文書も参照されたい。鶏痘の場合、有利には、挿入の部位又は複数の部位は、Ｆ７及び／又はＦ８のＯＲＦである。また、本明細書に引用する文書、特に、鶏痘ウイルスに関連する文書も参照されたい。ＭＶＡウイルスの場合の挿入の部位又は複数の部位は、有利には、Carroll M. W. et al., Vaccine, 1997, 15(4), 387-394；Stittelaar K. J. et al., J. Virol., 2000, 74(9), 4236-4243；Sutter G. et al., 1994, Vaccine, 12 (11), 1032-1040をはじめとする、種々の刊行物中に示されている。この点に関しては、また、ＭＶＡの完全なゲノムが、Antoine G., Virology, 1998, 244, 365-396に記載されていることにも留意されたい。このおかげで、当業者であれば、その他の挿入部位又はその他のプロモーターを使用することができる。有利には、発現させるポリヌクレオチドは、特異的なポックスウイルスのプロモーター、例えば、とりわけ、ワクシニアプロモーター７．５ｋＤａ（Cochran et al., J. Virology, 1985, 54, 30-35）、ワクシニアプロモーターＩ３Ｌ（Riviere et al., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434）、ワクシニアプロモーターＨＡ（Shida, Virology, 1986, 150, 451-457）、牛痘プロモーターＡＴＩ（Funahashi et al., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47）、ワクシニアプロモーターＨ６（Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6, 504-508；Guo P. et al. J. Virol., 1989, 63, 4189-4198；Perkus M. et al., J. Virol., 1989, 63, 3829-3836）の制御下に挿入する。
【０１０６】
アデノウイルスベクターに基づいた組換えベクターの場合、ヒトアデノウイルス（ＨＡＶ）、有利には、ヒトアデノウイルス血清型５（Ａｄ５，adenovirus serotype 5）ベクター、Ｅ１が欠失した及び／又は破壊されたアデノウイルス、Ｅ３が欠失した及び／又は破壊されたアデノウイルス、或いはＥ１及びＥ３が欠失した及び／又は破壊されたアデノウイルスを使用することができる。場合により、上記のアデノウイルスのうちのいずれかから、Ｅ４を、欠失させる且つ／又は破壊することができる。例えば、Yarosh et al.及びLutze-Wallace et al.に記載されているヒトＡｄ５ベクターを使用することができる（例えば、Yarosh et al., Vaccine. 1996 Sep;14(13):1257-64及びLutze-Wallace et al., Biologicals. 1995 Dec;23(4):271.7を参照）。一実施形態では、ウイルスベクターは、ウイルスゲノムのＥ１領域中の欠失によって複製できないようにしたヒトアデノウイルス、特に、血清型５アデノウイルスである。欠失型アデノウイルスを、Ｅ１を発現する２９３細胞又はＰＥＲ細胞、特に、PER.C6（F. Falloux et al Human Gene Therapy 1998, 9, 1909-1917）中で増殖させる。ヒトアデノウイルスは、Ｅ１領域中の欠失と組み合わせて、最終的に、Ｅ３領域中に欠失を生じさせることができる（例えば、J. Shriver et at. Nature, 2002, 415, 331-335、F. Graham et al Methods in Molecular Biology Vol. 7: Gene Transfer and Expression Protocols Edited by E. Murray, The Human Press Inc, 1991, p 109-128；Y. Ilan et al Proc. Natl. Acad. Sci. 1997, 94, 2587-2592；S. Tripathy et al Proc. Natl. Acad. Sci. 1994, 91, 11557-11561；B. Tapnell Adv. Drug Deliv. Rev.1993, 12, 185-199；X. Danthinne et al Gene Thrapy 2000, 7, 1707-1714；K. Berkner Bio Techniques 1988, 6, 616-629；K. Berkner et al Nucl. Acid Res. 1983, 11, 6003-6020；C. Chavier et al J. Virol. 1996, 70, 4805-4810を参照）。Ｅ１領域及び／又はＥ３領域の部分的又は完全な欠失の後に、最終的に、挿入部位は、Ｅ１遺伝子座位及び／又はＥ３遺伝子座位であることができる。有利には、発現ベクターが、アデノウイルスである場合、発現させるポリヌクレオチドは、真核細胞において機能するプロモーター、例として、強力なプロモーター、好ましくは、サイトメガロウイルスの最初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ，cytomegalovirus immediate-early）の制御下に挿入する。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、有利には、マウス又はヒトを起源とする。また、伸長因子１αのプロモーターも使用することができる。また、筋肉に特異的なプロモーターも使用することができる（X. Li et al Nat. Biotechnol. 1999, 17, 241-245）。また、プラスミドベクターに関する強力なプロモーターも、本明細書で議論する。ポリＡ配列及びターミネーター配列、例えば、ウシ成長ホルモン遺伝子又はウサギβグロブリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを、発現させるポリヌクレオチドの下流に挿入することができる。
【０１０７】
脳炎ウイルスに基づいた組換えベクターの場合、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ，venezuelean equine encephalitis virus）（Nelson E L et al., Breast Cancer Res. Treat., 2003, 82(3): 169-183）を、特に、レプリコンとして、すなわち、ＶＥＥＶの非構造遺伝子の全部及びＶＥＥＶの構造遺伝子の代わりにマルチクローニングサイトを含有する自己複製性のＲＮＡとして使用することができる（Lee J S et al., Infect. Immun., 2003, 71(3): 1491-1496；Velders M P et al., Cancer Res., 2001, 61(21): 7861-7867）。発現させるポリヌクレオチドを、このマルチクローニングサイトに挿入する。このマルチクローニングサイトは、場合により、分泌配列又は組織プラスミノーゲン活性化因子分泌配列をコードするヌクレオチド配列に連結している。また、発現させるポリヌクレオチドは、ウイルスＶＥＥＶ構造遺伝子に代わるサブゲノム２６Ｓプロモーターの下流に挿入することもできる（Lee J S et al., Infect. Immun., 2001, 69(9): 5709-5715；Pushko P et al., Vaccine, 2000, 19(1): 142-153）。
【０１０８】
細菌、すなわち、サルモネラ属に基づいた組換えベクターの場合、とりわけ、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）（Yang X L et al., Biomed. Environ. Sci., 2005, 18(6): 411-418；Dunstan S Jet al., FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2003, 37(2-3): 111-119）、サルモネラ・チフィ（Salmonella typhi）（Santiago-Machuca A E et al., Plasmid., 2002, 47(2): 108-119）を使用することができる。発現させるポリヌクレオチドを、サルモネラのフラジェリン遺伝子内（Chauhan N et al., Mol Cell Biochem., 2005, 276(1-2): 1-6）、又はａｒｏＣ遺伝子内（Santiago-Machuca A E et al., Plasmid., 2002, 47(2): 108-119）に挿入することができる。また、発現させるポリヌクレオチドを、嫌気的に誘導性のnirBプロモーターの制御下に挿入することもできる（Santiago-Machuca A E et al., Plasmid., 2002, 47(2): 108-119）。
【０１０９】
組換え免疫原性組成物又は組換えワクチン組成物は、少なくとも１つの組換え発現ベクターを含有することができ、この組換え発現ベクターは、少なくもと１つのポリヌクレオチドを含有し、このポリヌクレオチドは、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、４８、５０及び５２の配列、若しくはそのアナログ又はその断片からなる群から選択されたポリペプチドをコードする。組換え免疫原性組成物又は組換えワクチン組成物は、少なくとも１つの組換え発現ベクターを含有することができ、この組換え発現ベクターは、少なくもと１つのポリヌクレオチドを含有し、このポリヌクレオチドは、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、５４、５６及び５８の配列、又はそのアナログからなる群から選択されたポリペプチドをコードする。組換え免疫原性組成物又は組換えワクチン組成物は、有利には、少なくとも１つの組換え発現ベクターを含有することができ、この組換え発現ベクターは、少なくもと１つのポリヌクレオチドを含有し、このポリヌクレオチドは、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、５４、５６及び５８の配列、又はそのアナログからなる群から選択された、２つ若しくは３つ若しくは４つ若しくは５つのポリペプチドをコードする。
【０１１０】
本発明のベクターは、少なくとも１つの異種性のヌクレオチドをさらに含むことができる。これは、インビボ又はインビトロのいずれかで、異種性のポリヌクレオチドを再生又は複製するため、及び／或いは異種性のポリヌクレオチドを発現させるために有用である。また、そのようなベクターは、多価の免疫原性組成物又はワクチン組成物、とりわけ、多価のＤＮＡ免疫組成物又はＤＮＡワクチン、及び多価の組換えウイルスベクター免疫原性組成物又は組換えウイルスベクターワクチンを調製するためにも有用である。異種性の核酸配列は、有利には、病原性のあるウイルス性、寄生生物性又は細菌性因子由来の免疫原、抗原又はエピトープをコードする。そのような細菌生物は、連鎖球菌とは、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクリオチドの起源において異なる。この異種性の配列は、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ，western equine encephalitis）、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ，eastern equine encephalitis）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、ウマインフルエンザウイルス、ウマヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１，equine herpesvirus type 1）、ウマヘルペスウイルス２型（ＥＨＶ−２，equine herpesvirus type 2）、ウマヘルペスウイルス４型（ＥＨＶ−４，equine herpesvirus type 4）、ウマ関節炎ウイルス（ＥＡＶ，equine arthritis virus）、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ，West Nile virus）、破傷風、ロドコッカス由来の免疫原、抗原又はエピトープをコードすることができる。特定の実施形態では、異種性の配列は、ウマインフルエンザウイルスから、並びにＥＨＶ−１及び／又はＥＨＶ−４由来の免疫原、抗原又はエピトープをコードすることができる。免疫原又は抗原は、病原体又は病原体が分泌する抗原に対して免疫応答を誘導することができるタンパク質又はポリペプチドであり、１つ又は複数のエピトープを含有する。エピトープは、病原体又は病原体が分泌する抗原に対して免疫応答を誘導することができるペプチド又はポリペプチドである。
【０１１１】
場合により、本発明のサブユニット免疫原性組成物又はサブユニットワクチンは、その他の病原性のある微生物又はウイルスから選択された、１つ又は複数の免疫原、抗原又はエピトープと組み合わせて、多価のサブユニット免疫原性組成物又はサブユニットワクチンを形成することができる。ウマ科動物では、そのような多価のサブユニット免疫原性組成物又はサブユニットワクチンは、少なくとも１つの本発明によるポリペプチドと、ＷＥＥＶ、ＥＥＥＶ、ＶＥＥＶ、ウマインフルエンザウイルス、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−４、ＥＡＶ、ＷＮＶ、破傷風、ロドコッカスからの、少なくとも１つの免疫原、抗原又はエピトープとを含むことができる。特定の実施形態では、そのような多価のサブユニット免疫原性組成物又はサブユニットワクチンは、少なくとも１つの本発明によるポリペプチドと、ウマインフルエンザウイルスから、並びにＥＨＶ−１及び／又はＥＨＶ−４からの、少なくとも１つの免疫原、抗原又はエピトープとを含むことができる。
【０１１２】
薬学的又は獣医学的に許容される賦形剤、希釈剤又は媒体は、水又は食塩水、緩衝液であることができるが、また、例えば、連鎖球菌の培養のための培地を含むこともできる。
【０１１３】
薬学的又は獣医学的に許容される担体又は媒体又は賦形剤は、当業者にはよく知られている。例えば、薬学的又は獣医学的に許容される担体又は媒体又は賦形剤は、０．９％NaCl（例えば、食塩水）溶液又はリン酸緩衝液であることができる。本発明の方法のために使用することができる、その他の薬学的又は獣医学的に許容される担体又は媒体又は賦形剤として、これらに限定されないが、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）又はポリビニルピロリドンが挙げられる。薬学的又は獣医学的に許容される担体又は媒体又は賦形剤は、ベクター（又は考案のベクターからインビトロで発現させたタンパク質）の投与を促進する、いずれかの化合物又は化合物の組合せであることができる。有利には、担体、媒体又は賦形剤は、形質移入を促進すること、及び／又はベクター（若しくはタンパク質）の保存を改善することができる。投与量及び投与容量は、本明細書では、一般的な説明において議論し、また、当技術分野の知識と併せて本開示を読むことによっても、過度の実験をせずとも、当業者であれば決定することができる。
【０１１４】
四級アンモニウム塩を含むカチオン性の脂質は、必ずしもそうとは限らないが、有利には、プラスミドに適し、これらは、有利には、以下の式を有するものである。
【０１１５】
【化１】
2009531464.tif 000003
【０１１６】
式中、Ｒ１は、１２〜１８個の炭素原子を有する、飽和又は不飽和の直鎖脂肪族ラジカルであり、Ｒ２は、２〜３個の炭素原子を含有する、別の脂肪族ラジカルであり、Ｘは、アミン基又はヒドロキシル基、例えば、ＤＭＲＩＥである。別の実施形態では、カチオン性の脂質は、中性の脂質、例えば、ＤＯＰＥと会合させることができる。
【０１１７】
これらのカチオン性の脂質の間では、好ましいのは、ＤＭＲＩＥ（N−メチル（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシロオキシ）−１−プロパンアンモニウム；国際公開第ＷＯ９６／３４１０９号パンフレット）であり、これは、有利には、中性の脂質、有利には、ＤＯＰＥ（ジオレオイル−ホスファチジル−エタノールアミン；Behr J. P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389）と会合して、ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥを形成する。
【０１１８】
有利には、プラスミドのアジュバントとの混合物を、用時に、有利には、調製物の投与に合わせて又は調製物の投与の直ぐ前に形成する。例えば、投与の直ぐ前又は前に、有利には、混合物が複合体を形成する十分な時間が投与の前にあるように、例えば、投与前約１０分と約６０分との間、例として、投与前約３０分に、プラスミド−アジュバントの混合物を形成する。
【０１１９】
ＤＯＰＥが存在する場合、ＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥのモル比は、有利には、約９５：約５〜約５：約９５、より有利には、約１：約１、例えば、１：１である。
【０１２０】
ＤＭＲＩＥ又はＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥのアジュバント：プラスミドの重量比は、約５０：約１と約１：約１０との間、例として、約１０：約１及び約１：約５、有利には、約１：約１及び約１：約２、例えば、１：１及び１：２であることができる。
【０１２１】
本発明による免疫原性組成物及びワクチンは、１つ又は複数のアジュバントを含む、或いは１つ又は複数のアジュバントから本質的になることができる。本発明の実施にあたって使用に適したアジュバントは、（１）アクリル酸若しくはメタクリル酸、無水マレイン酸とアルケニル誘導体重合体との重合体、（２）免疫賦活性の配列（ＩＳＳ，immunostimulating sequence）、例として、１つ若しくは複数の非メチル化ＣｐＧ単位を有するオリゴデオキシリボヌクレオチド配列（Klinman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1996, 93, 2879-2883；国際公開第ＷＯ９８／１６２４７号パンフレット）、（３）水中油型乳濁液、例として、"Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" published by M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995の１４７頁に記載されているSPT乳濁液、及び同上の１８３頁に記載されている乳濁液MF59、（４）四級アンモニア塩を含有するカチオン脂質、例えば、ＤＤＡ、（５）サイトカイン、（６）水酸化アルミニウム若しくはリン酸アンモニウム、（７）サポニン、又は（８）本出願中に引用し参照によって組み入れたいずれかの文書中で議論されているその他のアジュバント、或いは（９）それらのいずれかの組合せ又は混合物である。
【０１２２】
（３）の水中油型乳濁液は、ウイルスベクターに特に適しており、軽流動パラフィン油（欧州薬局方のタイプ）；イソプレノイド油、例として、スクアラン、スクアレン；アルケン、例えば、イソブテン又はデセンのオリゴマー化によって得られる油；直鎖アルキル基を有する酸又はアルコールのエステル、例として、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコール、ジ（カプリル酸／カプリン酸）、トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセロール、及びジオレイン酸プロピレングリコール；或いは分枝の脂肪アルコール又は脂肪酸のエステル、特に、イソステアリン酸エステルを基剤とすることができる。
【０１２３】
油を、乳化剤と組み合わせて使用して、乳濁液を形成する。乳化剤は、非イオン性界面活性剤であることができる：例えば、一方が、ソルビタン、マンナイド（例えば、無水マンニトールオレイン酸エステル）、グリセロール、ポリグリセロール又はプロピレングリコールであり、他方が、オレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸又はヒドロキシステアリン酸であるエステルであり、当該エステルは、場合により、エトキシ化されているか、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン共重合体ブロック、例として、Pluronic、例えば、L121である。（１）型のアジュバント重合体の間では、好ましいのは、架橋されたアクリル酸又はメタクリル酸、特に、糖又はポリアルコールのポリアルケニルエーテルによって架橋されたものである。これらの化合物は、カルボマーの名の下で知られている（Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, June 1996）。また、当業者であれば、米国特許第２９０９４６２号明細書を参照することができ、これは、少なくとも３個のヒドロキシル基、好ましくは、７個以下のヒドロキシル基を有し、少なくとも３個のヒドロキシル基のうちの水素原子が、少なくも２個の炭素原子を有する不飽和の脂肪族ラジカルで置換されている、ポリヒドロキシル化合物によって架橋された、そのようなアクリル重合体を提供している。好ましいラジカルは、２〜４個の炭素原子を含有するラジカル、例えば、ビニル基、アリル基及びその他のエチレン系不飽和基である。また、不飽和ラジカルは、メチル等のその他の置換基を含有することもできる。Carbopolの名の下で販売されている製品（BF Goodrich社製、オハイオ州、米国）が、特に適する。それらは、アリルサッカロースによって、又はアリルペンタエリスリトールによって架橋されている。それの間で、Carbopol 974P、934P、及び971Ｐが参照される。無水マレイン酸−アルケニル誘導体の共重合体に関しては、ＥＭＡ（Monsanto社製）が参照され、これらは、直鎖又は架橋されたエチレン−無水マレイン酸の共重合体であり、それらは、例えば、ジビニルエーテルによって架橋されている。また、J. Fields et al., Nature 186: 778-780, June 4, 1960も参照される。
【０１２４】
構造に関しては、アクリル酸又はメタクリル酸の重合体、及びＥＭＡは、好ましくは、以下の式を有する基本単位によって形成される。
【０１２５】
【化２】
2009531464.tif 000004
【０１２６】
式中、
＊Ｒ１及びＲ２は、同一でもよく、又は異なってもよく、Ｈ又はＣＨ３であり、
＊ｘ＝０又は１、好ましくは、ｘ＝１であり、
＊ｙ＝１又は２であり、且つｘ＋ｙ＝２である。
【０１２７】
ＥＭＡの場合は、ｘ＝０及びｙ＝２であり、カルボマーの場合は、ｘ＝ｙ＝１である。
これらの重合体は、水又は生理的食塩溶液（２０ｇ／ｌ  NaCl）に可溶性であり、ｐＨを、７．３〜７．４に、例えば、ソーダ（NaOH）によって調整して、発現ベクター（複数の発現ベクター）を組み入れることができるアジュバント溶液を得ることができる。最終的なワクチン組成物中の重合体濃度は、０．０１％ｗ／ｖと１．５％ｗ／ｖとの間、有利には、０．０５〜１％ｗ／ｖ、好ましくは、０．１〜０．４％ｗ／ｖの範囲であることができる。
【０１２８】
（５）のサイトカイン又は複数のサイトカインは、免疫原性組成物又はワクチン組成物中のタンパク質の形態であってもよいし、宿主中で、免疫原若しくは複数の免疫原又はそのエピトープ（複数のエピトープ）と共に同時発現させてもよい。好ましいのは、サイトカイン又は複数のサイトカインの同時発現であり、これは、免疫原若しくは複数の免疫原又はそのエピトープ（複数のエピトープ）を発現させるベクターと同一のベクターによる、或いはそのための別々のベクターによるのいずれかで行う。
【０１２９】
本発明は、そのような組合せ組成物の調製を包含する。これは、例えば、活性成分を、有利には、アジュバント、担体、サイトカイン及び／又は希釈剤と一緒に混合することによって調製する。
【０１３０】
本発明において使用することができるサイトカインとして、これらに限定されないが、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ，granulocyte colony stimulating factor）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ，granulocyte/macrophage colony stimulating factor）、インターフェロンα（ＩＦＮα，interferon α）、インターフェロンβ（ＩＦＮβ，interferonβ）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ，interferonγ）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α，interleukin-1α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β，interleukin-1β）、インターロイキン−２（ＩＬ−２，interleukin-2）、インターロイキン−３（ＩＬ−３，interleukin-3）、インターロイキン−４（ＩＬ−４，interleukin-4）、インターロイキン−５（ＩＬ−５，interleukin-5）、インターロイキン−６（ＩＬ−６，interleukin-6）、インターロイキン−７（ＩＬ−７，interleukin-7）、インターロイキン−８（ＩＬ−８，interleukin-8）、インターロイキン−９（ＩＬ−９，interleukin-9）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０，interleukin-10）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１，interleukin-11）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２，interleukin-12）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα，tumor necrosis factorα）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ，tumor necrosis factorβ）、及び形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ，transforming growth factorβ）が挙げられる。サイトカインは、本発明の免疫原性組成物又はワクチン組成物と、同時投与及び／又は逐次投与できることを理解されたい。したがって、また、例えば、本発明のワクチンは、適切なサイトカイン、例えば、ワクチン接種する又は免疫学的応答を惹起するこの宿主に適合したサイトカイン（例えば、イヌに投与する調製物のためのイヌのサイトカイン）をインビボにおいて発現する外因性の核酸分子を含むこともできる。
【０１３１】
有利には、本発明による薬学的及び／又は治療的な組成物並びに／或いは薬学的及び／又は治療的な製剤は、本明細書で議論する、１つ若しくは複数の発現ベクター及び／又は１つ若しくは複数のポリペプチドの治療的応答を惹起するのに有効な量を含む、或いは本明細書で議論する、１つ若しくは複数の発現ベクター及び／又は１つ若しくは複数のポリペプチドの治療的応答を惹起するのに有効な量から本質的になる、或いは本明細書で議論する、１つ若しくは複数の発現ベクター及び／又は１つ若しくは複数のポリペプチドの治療的応答を惹起するのに有効な量からなる。有効量は、本明細書に組み入れられている文書をはじめとする、本開示及び当技術分野の知識から、過度の実験をせずとも決定することができる。
【０１３２】
本発明による組換えウイルスベクター免疫原性組成物及び組換えウイルスベクターワクチンは、有利には、安定化剤と共に凍結乾燥することができる。凍結乾燥は、周知の標準的な凍結乾燥の手順に従って実施することができる。薬学的又は獣医学的に許容される安定化剤は、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、ラクトース、スクロース、グルコース、デキストラン、トレハロース）、グルタミン酸ナトリウム（Tsvetkov T et al., Cryobiology 1983, 20(3): 318-23；Israeli E et al., Cryobiology 1993, 30(5): 519-23）、ペプトン、アルブミン、ラクトアルブミン又はカゼイン等のタンパク質、スキムミルク等のタンパク質含有物質（Mills C K et al., Cryobiology 1988, 25(2): 148-52；Wolff E et al., Cryobiology 1990, 27(5): 569-75）、及び緩衝剤（例えば、リン酸緩衝剤、リン酸アルカリ金属緩衝剤）であることができる。アジュバントを使用して、可溶性の凍結乾燥調製物を作製することができる。
【０１３３】
さらに、本発明は、連鎖球菌感染に対する、哺乳動物、とりわけ、ウマ科、イヌ科及びヒトの種の治療及び／又はワクチン接種のための、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、４８、５０及び５２に示すアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチド、若しくはそのアナログ、又はその断片の使用にも関する。一実施形態では、これらの断片は、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、５４、５６及び５８の配列、又はそのアナログからなる群から選択される。特定の実施形態は、腺疫の疾患に対するウマの治療及び／又はワクチン接種のための、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、３２、３４、３６、３８、４０、４８、５０、５２、５４、５６及び５８の配列からなる群から選択された少なくとも１つのポリペプチド、又はそのアナログの使用に関わる。好ましい実施形態は、腺疫の疾患に対するウマの治療及び／又はワクチン接種のための、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、５４、５６及び５８の配列からなる群から選択された少なくとも１つのポリペプチド、又はそのアナログの使用に関わる。
【０１３４】
さらなる実施形態は、ウマ科動物をストレプトコッカス・エクイの感染から防御するサブユニットワクチンの製造（preparation）のための、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、４８、５０及び５２に示すアミノ酸配列を有する、若しくはそのアナログの、又はその断片の、少なくとも１つのポリペプチドの使用に関わる。このさらなる実施形態は、好ましくは、ウマ科動物をストレプトコッカス・エクイの感染から防御するサブユニットワクチンの製造のための、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、５４、５６及び５８に示すアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチド又はそのアナログの使用に関わる。
【０１３５】
別のさらなる実施形態は、ストレプトコッカス・エクイの感染からウマ科動物を防御する組換えワクチンの製造のための、少なくとも１つの組換えベクターと、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、４８、５０及び５２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、若しくはそのアナログ、又はその断片をコードする、ベクター中に挿入された少なくとも１つのポリヌクレオチドとの使用に関し、当該ベクターは、連鎖球菌感染に感受性の哺乳動物中で、このポリペプチドをインビボで発現することができる。このさらなる実施形態は、好ましくは、ストレプトコッカス・エクイの感染からウマ科動物を防御する組換えワクチンの製造のための、少なくとも１つの組換えベクターと、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、５４、５６及び５８に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はそのアナログをコードする、ベクター中に挿入された少なくとも１つのポリヌクレオチドとの使用に関し、当該ベクターは、連鎖球菌感染に感受性の哺乳動物中で、このポリペプチドをインビボで発現することができる。
【０１３６】
追加の実施形態は、ストレプトコッカス・エクイの感染からウマ科動物を防御する組換えワクチンの製造のための、少なくとも１つの組換えベクターと、ベクター中に挿入する、少なくとも１つのポリヌクレオチドとの使用に関し、当該ポリヌクレオチドは、配列番号１７、１９、２１、２３、２５、３１、３３、３５、３７、３９、４７、４９、５１、５３、５５及び５７に示すヌクレオチド配列、又はそのアナログを有し、当該ベクターは、連鎖球菌感染に感受性の哺乳動物中で、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドをインビボで発現することができる。
【０１３７】
特に、腺疫の疾患に対するウマ科動物の治療及び／又はワクチン接種のために使用するポリペプチドの組合せは、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、３２、３４、３６、３８、４０、４８、５０、５２、５４、５６及び５８、若しくはそのアナログ、又はその組合せからなるポリペプチドの第１群から選択された、少なくとも１つのポリペプチドと、第１群中には存在しない、少なくとも１つの別のストレプトコッカス・エクイの免疫原、とりわけ、ＦＮＺタンパク質、ＥＡＧタンパク質、ＳＦＳタンパク質、ＳＥＣタンパク質、ＳＦＳＣ１断片、ＦＮＺＮ断片、ＳＥＣ２．１６断片、ＳＥＣ１．１８断片、ＳｃｌＣ１断片、（国際公開第ＷＯ−Ａ−２００４１０３２９５７号パンフレット）、及び配列番号２８、３０若しくはそのアナログ又はその断片、或いはその組合せからなるポリペプチドの第２群から選択された、少なくとも１つの免疫原との組合せである。ポリペプチドの好ましい組合せの場合、この第１群は、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、５４、５６及び５８若しくはそのアナログ又はその組合せである。さらに、また、本発明は、ストレプトコッカス・エクイの感染からウマを防御するサブユニットワクチンの製造のための、これらの組み合わせたペプチドの使用にも関する。これらの実施形態では、ポリペプチドの使用を、当該ポリペプチドをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、本発明による組換え発現ベクターの使用で置き換えることができる。特に、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、３２、３４、３６、３８、４０、４８、５０、５２、５４、５６及び５８、又はそのアナログからなるポリペプチドの第１群から選択された、少なくとも１つのポリペプチドをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチドと、第１群中には存在しない、少なくとも１つの別のストレプトコッカス・エクイの免疫原、とりわけ、ＦＮＺタンパク質、ＥＡＧタンパク質、ＳＦＳタンパク質、ＳＥＣタンパク質、ＳＦＳＣ１断片、ＦＮＺＮ断片、ＳＥＣ２．１６断片、ＳＥＣ１．１８断片、ＳｃｌＣ１断片（国際公開第ＷＯ−Ａ−２００４／０３２９５７号パンフレット）、及び配列番号２８、３０若しくはそのアナログ又はその断片、或いはその組合せからなるポリペプチドの第２群から選択された、少なくとも１つの免疫原をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチドとを含む、少なくとも１つの組換え発現ベクターを、腺疫の疾患に対するウマの治療及び／又はワクチン接種のために使用する。好ましい実施形態では、この第１群は、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、５４、５６及び５８若しくはそのアナログ又はその組合せからなる。さらに、また、本発明は、ストレプトコッカス・エクイの感染からウマを防御する組換えワクチンの製造のための、これらの組換え発現ベクターの使用にも関する。
【０１３８】
特定の実施形態では、腺疫の疾患に対するウマ科動物の治療及び／又はワクチン接種のために使用するポリペプチドの組合せは、配列番号５２、４８、２２及び２６のポリペプチド若しくはそのアナログ又はその断片の組合せである。より好ましい実施形態では、腺疫の疾患に対するウマ科動物の治療及び／又はワクチン接種のために使用するポリペプチドの組合せは、配列番号５８、５４、３６及び４０のポリペプチド又はそのアナログの組合せである。
【０１３９】
特定の実施形態では、腺疫の疾患に対するウマ科動物の治療及び／又はワクチン接種のために使用するポリペプチドの組合せは、配列番号５２、４８、２２、２６及び５０のポリペプチド若しくはそのアナログ又はその断片の組合せである。より好ましい実施形態では、腺疫の疾患に対するウマ科動物の治療及び／又はワクチン接種のために使用するポリペプチドの組合せは、配列番号５８、５４、３６、４０及び５６のポリペプチド又はそのアナログの組合せである。
【０１４０】
特定の実施形態では、腺疫の疾患に対するウマ科動物の治療及び／又はワクチン接種のために使用するポリペプチドの組合せは、配列番号５２、４８、２２、２６及び２０のポリペプチド若しくはそのアナログ又はその断片の組合せである。より好ましい実施形態では、腺疫の疾患に対するウマ科動物の治療及び／又はワクチン接種のために使用するポリペプチドの組合せは、配列番号５８、５４、３６、４０及び３４のポリペプチド又はそのアナログの組合せである。
【０１４１】
特定の実施形態では、腺疫の疾患に対するウマ科動物の治療及び／又はワクチン接種のために使用するポリペプチドの組合せは、配列番号５２、４８、２２、２６及び１８のポリペプチド若しくはそのアナログ又はその断片の組合せである。より好ましい実施形態では、腺疫の疾患に対するウマ科動物の治療及び／又はワクチン接種のために使用するポリペプチドの組合せは、配列番号５８、５４、３６、４０及び３２のポリペプチド又はそのアナログの組合せである。
【０１４２】
さらに、本発明は、哺乳動物、好ましくは、ウマ科、イヌ科及びヒトの種において、連鎖球菌感染に対して免疫感作する、又は連鎖球菌感染を予防する方法にも関する。これらの方法に従って、（１）本発明のサブユニット免疫原性組成物若しくはサブユニットワクチン、又は（２）本発明の組換え免疫原性組成物若しくは組換えワクチン、或いはそれらの組合せを投与する。もちろん、本発明の実施形態を、本発明ではない、その他のワクチン又は免疫原性組成物と共に利用することができる。例えば、抗原刺激−追加免疫の過程において、例として、本発明のワクチン又は免疫原性組成物を、最初に投与し、その後、異なるワクチン又は免疫原性組成物を投与する、或いはその逆の場合がある。特定の抗原刺激−追加免疫の過程として、本発明のサブユニットワクチン又はサブユニット免疫原性組成物を、最初に投与し、その後、本発明の組換えワクチン又は組換え免疫原性組成物を投与する、或いはその逆の場合があり得る。
【０１４３】
投与は、とりわけ、筋肉内（ＩＭ，intramuscular）、皮内（ＩＤ，intradermal）、皮下（ＳＣ，subcutaneous）、又は経皮の注射によって、或いは鼻腔内、気管内、経口の投与によって、或いは耳又は唇を通して行うことができる。本発明による免疫原性組成物又はワクチンは、シリンジ、マイクロニードルを付けたシリンジ（すなわち、BDTM Intradermal Delivery System、Becton, Dickinson and Company社製、Franklin Lakes、ニュージャージ州、米国）、無針装置（例えば、Pigjet、Avijet、Dermojet又はBiojector（Bioject社製、オレゴン州、米国）、US-A-2006/0034867を参照）、又はスプレーによって投与する。投与は、好ましくは、シリンジを用いたＩＭ注射によって、又は無針装置を用いた若しくはマイクロニードルを付けたシリンジ（すなわち、BDTM Intradermal Delivery System）を用いた経皮注射によって、又はスプレーを用いた、すなわち、本発明のワクチンの液体噴霧による鼻腔内若しくは経口の投与によって、又は本発明による凍結乾燥ワクチンの微粒子化粉末の経口若しくは経鼻の投与によって行う。
【０１４４】
免疫原性組成物又はワクチンの量は、当業者であれば、本開示及び当技術分野の知識から、過度の実験をせずとも、決定及び最適化することができる。一般に、動物（ヒトを含む）には、本発明の組換えウイルス免疫原性組成物又は組換えウイルスワクチンを、単回用量単位として、約１０４〜１０９ＣＦＵ、有利には、約１０５〜１０８ＣＦＵ、より有利には、約１０６〜１０８ＣＦＵで；本発明の組換えＤＮＡ免疫原性組成物又は組換えＤＮＡワクチンを、単回用量単位として、１つのプラスミドの型あたり、約１０ｎｇ〜１ｍｇ、有利には、約１００ｎｇ〜５００μｇ、より有利には、約１μｇ〜２５０μｇで；本発明のサブユニット免疫原性組成物又はサブユニットワクチンを、単回用量単位として、約５μｇ〜１ｍｇ、有利には、約５０μｇ〜５００μｇ、より有利には、１００μｇ〜２００μｇで投与することができる。
【０１４５】
プラスミドベクターに基づいた治療的及び／又は薬学的な組成物の場合は、一般的には、１回投与量は、対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを発現するプラスミドの、約１μｇ〜約２０００μｇ、有利には、約５０μｇ〜約１０００μｇ、より有利には、約１００μｇ〜約８００μｇを含み、それから本質的になり、又はそれからなることができる。プラスミドベクターに基づいた治療的及び／又は薬学的な組成物を、エレクトロポレーションを用いて投与する場合には、プラスミドの投与量は、一般に、約０．１μｇと約１ｍｇとの間、有利には、約１μｇと約１００μｇとの間、有利には、約２μｇと約５０μｇとの間である。投与容量は、約０．１ｍｌと約２ｍｌとの間、有利には、約０．２ｍｌと約１ｍｌとの間であることができる。これらの投与量及び投与容量は、治療する哺乳動物の標的の種に適している。
【０１４６】
シリンジによる単回用量単位の容量は、約０．２ｍｌと約５．０ｍｌとの間、有利には、約０．５ｍｌと約２．０ｍｌとの間、より有利には、約１．０ｍｌであることができる。無針装置による単回用量単位の容量は、約０．１ｍｌと約１．０ｍｌとの間、有利には、約０．２ｍｌと約０．５ｍｌとの間であることができる。液体スプレーによる単回用量単位の容量は、約２．０ｍｌと約１０．０ｍｌとの間、有利には、約５．０ｍｌであることができる（粉末スプレーの場合には、投与する量は、同等の容量に対応する）。
【０１４７】
特定の方法では、子ウマ、すなわち、２〜６月齢、好ましくは、３〜４月齢のウマに、ＣＴＢ及び／又はＣＴＡ及び／又はCarbopol（登録商標）のアジュバントを加えた、本発明のサブユニットワクチンを、鼻腔内又は経口の経路からワクチン接種する。
【０１４８】
別の特定の方法では、子ウマに、Carbopol（登録商標）のアジュバントを加えた、又は加えない、本発明の組換えウイルスワクチンを、経口経路から、スプレー及び液体噴霧を用いてワクチン接種する。好ましくは、これらの組換えウイルスワクチンのウイルスベクターは、ＥＨＶ−４又はＥＨＶ−２又はＥＨＶ−１である。
【０１４９】
別の特定の方法では、子ウマに、本発明の組換えウイルスワクチンを、唇からシリンジを用いてワクチン接種する。好ましくは、これらの組換えウイルスワクチンのウイルスベクターは、ＥＨＶ−４又はＥＨＶ−２又はＥＨＶ−１である。
【０１５０】
ウマ及び雌ウマのワクチン接種のためには、好ましくは、Carbopol（登録商標）及び／又はCpG、並びに／或いは乳濁液のアジュバントを加えた、本発明のサブユニットワクチンを、シリンジを用いてＩＭ注射によって、２回投与する。追加免疫投与を、６カ月又は毎年注射で行うことができる。妊娠中の雌ウマの場合には、追加免疫投与を、子ウマを生む予定日前２〜４週に注射で行うことができる。
【０１５１】
また、本発明のポリペプチド及びその断片は、治療に使用することもできる。
【０１５２】
また、ポリペプチド及び断片は、抗体−抗原の反応における試薬として使用することもできる。したがって、本発明の別の態様は、連鎖球菌による感染を検出するための診断方法及び／又は診断キットである。キット、例えば、ＥＬＩＳＡは、少なくとも１つの本発明によるポリペプチド又は断片（例えば、本明細書の配列によって特定された、少なくとも１つのポリペプチド、又は本明細書で議論する、その断片）を含むことができる。
【０１５３】
本明細書のポリペプチド又は断片（例えば、本明細書の配列によって特定されたポリペプチド、又は本明細書で議論する、その断片）に対する抗体を、診断用試薬として、或いは受動免疫若しくはワクチン接種又は治療において使用することができる。受動免疫において投与する抗体の量は、当技術分野の知識から等、当技術分野で使用する量と同一の又はそれに類似する量であることができ、当業者であれば、過度の実験をせずとも、受動免疫を実施することができる。
【０１５４】
本発明の新規ウイルスがコードするタンパク質又はそれらの断片を使用して、抗体、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を産生することができる。ポリクローナル抗体が望まれる場合には、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等）を、本発明の抗原若しくはその断片又は変異させた抗原を用いて免疫感作する。免疫感作した動物からの血清を採取し、既知の手順に従って処理する。例えば、Jurgens et al. (1985) J. Chrom. 348:363-370を参照されたい。ポリクローナル抗体を含有する血清を使用する場合には、ポリクローナル抗体を、免疫親和性クロマトグラフィーによって、既知の手順を使用して精製することができる。
【０１５５】
本発明の別の態様は、本発明によるポリペプチド又は断片に特異的な抗体を含む抗体調製物、及びそれを使用する診断方法である。所与のポリペプチドに特異的な抗体とは、抗体が、当該ポリペプチドに優先的に結合する、例えば、抗体が、当該ポリペプチドに結合するが、その他のポリペプチドには結合しない、又は抗体が、当該ポリペプチドに対して特異性を有し、これは、当該ポリペプチドに関して満足に特有であり、その結果、抗体を使用して、当該ポリペプチドを試料から単離すること、或いは当該ポリペプチドが試料中に存在することを、当技術分野で知られている技法又はSambrook、下記をはじめとする、本明細書に引用した文書中に議論されている技法を使用して、５％以下の偽陽性で検出することができることを意味する。
【０１５６】
抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。
【０１５７】
ポリクローナル抗体が望まれる場合には、選択された動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等）を、ポリペプチド又は断片を用いて免疫感作する。免疫感作した動物からの血清を採取し、既知の手順に従って処理し、場合により、精製する。例えば、Jurgens et al. J. Chrom., 1985, 348: 363-370を参照されたい。
【０１５８】
また、タンパク質及びその断片に対するモノクローナル抗体も、当業者であれば、容易に産生することができる。モノクローナル抗体を、ハイブリドーマ技術を使用することによって作製するための一般的な方法は、よく知られている。不死の抗体産生細胞系を、細胞融合によって生み出すことができ、また、その他の技法、例として、Ｂリンパ球の癌遺伝子ＤＮＡを用いた直接的な形質転換、又はエプスタイン・バーウイルスを用いた形質移入によっても生み出すことができる。例えば、M. Schreier et al., Hybridoma Techniques (1980)；Hammerling et at., Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas (1981)；Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980)を参照されたい。また、米国特許第４３４１７６１号明細書；米国特許第４３９９１２１号明細書；米国特許第４４２７７８３号明細書；米国特許第４４４４８８７号明細書；米国特許第４４５２５７０号明細書；米国特許第４４６６９１７号明細書；米国特許第４４７２５００号明細書，米国特許第４４９１６３２号明細書；及び米国特許第４４９３８９０号明細書も参照されたい。所望のタンパク質又はその断片に対して産生したモノクローナル抗体のパネルを、種々の特性、すなわち、アイソタイプ、エピトープ、親和性等についてスクリーニングすることができる。モノクローナル抗体は、免疫親和性の技法を使用する、モノクローナル抗体がそれらに対して作られている個々の抗原の精製において有用である。また、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を、受動免疫のために使用してもよいし、サブユニットワクチン調製物と組み合わせて、免疫応答を増強してもよい。また、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、診断の目的でも有用である。
【０１５９】
本発明の一実施形態は、動物において、対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドに対する免疫応答を惹起する方法であり、この方法は、組換えワクチンを、免疫応答を惹起するのに有効な量で送達して、発現させるための製剤を投与するステップを含む。本発明のさらに別の実施形態は、動物において、免疫学的応答又は防御応答を誘導する方法であり、この方法は、対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを送達して、発現させるのに有効な量の製剤を、動物に投与するステップを含み、当該製剤は、組換えワクチンと、薬学的又は獣医学的に許容される担体、媒体又は賦形剤とを含む。
【０１６０】
本発明は、動物、有利には、哺乳動物又は脊椎動物の免疫応答を惹起、誘導又は刺激する方法に関する。
【０１６１】
本発明の別の実施形態は、動物において、対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドに対する免疫学的応答又は防御応答を誘導する方法を実施するためのキットであり、このキットは、組換えワクチンと、動物において免疫応答を惹起するのに有効な量で送達する方法を実施するための指示書とを含む。
【０１６２】
以下に、本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。
［実施例］
【実施例１】
【０１６３】
ストレプトコッカス・エクイのポリペプチドのＥＬＩＳＡ研究
ストレプトコッカス・エクイ株4047を鼻腔内から４回投与して攻撃誘発したポニーから得た血清中のストレプトコッカス・エクイの細胞表面タンパク質に対するＩｇＧ抗体の応答を、ＥＬＩＳＡによって決定した。これらのストレプトコッカス・エクイのタンパク質を、エシェリキア・コリ中でインビトロで発現させることによって得た。３×１０７ｃｆｕ及び３×１０５ｃｆｕのより高い用量を投与した６匹のポニーからの血清中の抗体の応答を、平均して、ストレプトコッカス・エクイ4047の３０００ｃｆｕ及び３０ｃｆｕを用いて攻撃誘発したポニーからの血清中の抗体の応答と比較した。より高い用量を投与したポニーは、腺疫を発症した。低い用量を投与したポニーは、研究を通して、健康を維持した。この研究の結果に基づいて、ストレプトコッカス・エクイのポリペプチドを、エシェリキア・コリ中での発現のため、並びにマウス及びポニーにおける有効性を試験するために選択した。
【実施例２】
【０１６４】
組換えストレプトコッカス・エクイのポリペプチドのエシェリキア・コリ中での発現
Ｓｅ５０、Ｓｅ１４５９及びＳｅ３５８の断片をコードするポリヌクレオチドを、Vent  ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs（登録商標）Inc.社製）を使用して、変性ステップ、５分に続く、５０〜５５℃でのアニーリング、３０秒、７２℃での伸長、１分、及び９５℃での第２の変性、３０秒を使用する３５サイクルを用いる、製造業者が推奨する条件で産生した。７２℃での伸長、４分を用いて、産物を完成させた。それぞれの場合の鋳型は、ストレプトコッカス・エクイ株4047の染色体ＤＮＡであった。Ｓｅ５０、Ｓｅ１４５９及びＳｅ３５８の断片はそれぞれ、配列番号３２、３４及び４０と名付けた断片である。
【０１６５】
Ｓｅ５２８及びＳｅ５９５の断片をコードするポリヌクレオチドを、pfuポリメラーゼを使用して、７２℃での伸長時間を２分に延長する以外は、上記と同一の条件を用いて産生した。Ｓｅ５２８及びＳｅ５９５の断片はそれぞれ、配列番号３８及び３６と名付けた断片である。
【０１６６】
【表１】
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【０１６７】
全てのＰＣＲ産物を、Qiaquick ＰＣＲ 精製キット（Qiagen社製）を使用して、３２μｌの溶出容量を用いて精製し、次いで、EcoRI用緩衝液（３．５μｌ）（New England Biolabs（登録商標）Inc.社製）、BamHI（０．７５μｌ）、及びEcoRI（０．７５μｌ）を添加して、３７℃で２時間消化した。また、１μｇのpGEX-3Xプラスミド（GE Healthcare社製）も、上記に従って、EcoRI及びBamHIを用いて消化した。pGEX-3Xプラスミドは、ＧＳＴ融合タンパク質の産生、並びにその単離及び精製のために、マルチクローニングサイト、ｔａｃプロモーター、グルタチオンＳトランスフェラーゼ遺伝子（ＧＳＴ）、及び停止コドンを、全ての３つのフレームに有する。
【０１６８】
全ての消化産物は、０．７％TAEアガロースゲル上に流し、所望の制限産物を、Qiaquickゲル抽出キット（Qiagen社製）を使用して、３５μｌの最終溶出量を用いて、切り取り、精製した。
【０１６９】
ライゲーション反応を、１６．５μｌの精製した消化ＰＣＲ産物及び１μｌのpGEX-3Xプラスミドを使用し、２μｌのリガーゼ用緩衝液及び０．５μｌのリガーゼを加えて始め、室温（ｒｔｐ）で一晩インキュベートした。
【０１７０】
ライゲーション反応物を、エシェリキア・コリDH10B株中に形質転換し、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを補充したL−寒天プレート上に蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。形質転換体を、挿入断片の存在について、コロニーＰＣＲによって試験した。単一のコロニーを、４μｌの水中に再懸濁し、この２μｌを、対象のポリヌクレオチドのための適切なクローン化プライマーを含有する、Taq  ＤＮＡポリメラーゼＰＣＲ反応に添加し、上記の記載に従って、３５サイクルの伸長を行った（Ｓｅ５０、Ｓｅ１４５９及びＳｅ３５８の場合は、１分、並びにＳｅ５９５及びＳｅ５２８の場合は、２分）。所望の挿入断片の存在を、ＰＣＲ反応物を０．７％TAEアガロースゲル上に流すことによって確認した。
【０１７１】
それぞれのクローンのプラスミドを調製し、クローンの全てについて、５’及び３’のpGEX-3X  ＰＣＲプライマーを使用して配列決定した（表１）。また、サイズが理由であるが、Ｓｅ５９５は、上記に列挙した追加のプライマー（表１）も使用して、配列決定した。クローン化したポリヌクレオチドの全てが、ストレプトコッカス・エクイ株4047の構築されたゲノム配列（http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_equi/）と同一の配列を有することを確認した。
【０１７２】
Ｓｅ１４５９、Ｓｅ５９５、Ｓｅ５２８、Ｓｅ５０及びＳｅ３５８のクローンを、発現のために、以下のプロトコールを使用して誘導した。単一のコロニーを、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する、５０ｍｌの２×YT培地中に播種し、３７℃で、２２０ｒｐｍで振とうしながら一晩増殖させた。次いで、この培養物を、５００ｍｌのあらかじめ加温し（３７℃）、且つあらかじめガス処理した２×YT培地に添加して、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１７３】
全ての培養物について、１時間後、２００μｌを取り出し、細胞を、分析のために採取し（これを、誘導前の試料とする）、イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ，isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside）を、０．１ｍＭの最終濃度で添加して、温度を２８℃まで下げた。培養物をさらに４時間誘導した後、１００μｌの試料を分析のために取り出し、続いて、細胞を遠心分離によって収集し、−７０℃で保存した。
【０１７４】
全ての試料を、１０％SDS-PAGEを使用して分析した。
【０１７５】
Ｓｅ１４５９、Ｓｅ５９５、Ｓｅ５２８、Ｓｅ５０及びＳｅ３５８について、ペレットを、２０ｍｌ中の氷冷PBS（Oxoid Limited社製、カタログ番号ＢＲ００１４Ｇ）中に再懸濁し、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ，phenylmethyl sulphonyl fluoride）を、０．１ｍＭの最終濃度で添加した後、細胞を、氷上で、１０秒間のパルスを用いる６回の超音波処理によって溶解させた。パルスとパルスとの間にはそれぞれ、１０秒間の休止を設けた。Triton X-100を０．１％（ｖ／ｖ）まで添加し、不溶性及び未変化の細胞を、遠心分離（１１，０００ｇ、５分、４℃）によって除去した。細菌の可溶性溶菌液及び不溶性物質の試料を、SDS-PAGEによって分析した。ジチオスレイトール（ＤＴＴ、dithiothreitol；Cleland's reagent社製）（５ｍＭ）を添加し、１．３ｍｌのグルタチオンセファロース4Bを添加した（１ｍｌのビーズに相当する。これは、２０ｍｌのPBSで３回あらかじめ洗浄した）。混合物を、室温で１時間インキュベートし、次いで、ビーズを、遠心分離（８００ｇ、２分、ｒｔｐ）によって収集した後、５０ｍｌの氷冷PBST（０．１％ｖ／ｖ  Triton X-100を有するPBS）で３回洗浄した。各洗浄（洗浄１〜３）の試料を、ビーズに結合した融合タンパク質の試料として、SDS-PAGEによる分析のために得た。全ての試料を、１０％SDS-PAGEを使用して分析した。
【０１７６】
ＧＳＴ担体の除去を、全ての融合タンパク質について、プロテアーゼによる切断によって行った。
【０１７７】
Ｓｅ１４５９、Ｓｅ５９５、Ｓｅ５２８、Ｓｅ５０及びＳｅ３５８について、切断反応を、グルタチオンセファロースビーズに結合した融合タンパク質を用いて行った。ビーズを、最初に、２０ｍｌの洗浄用緩衝液（Tris-HCL、５０ｍＭ、ｐＨ７．５、NaCl、１５０ｍＭ）で１回、次いで、２０ｍｌの切断用緩衝液（CaCl2、１．０ｍＭを有する洗浄用緩衝液）で２回平衡化し、最後に、１ｍｌの切断用緩衝液中に再懸濁した。第Ｘａ因子（New England Biolabs（登録商標）Inc.社製）（５０単位）を添加して、回転式攪拌機上において、室温で１６時間インキュベートした。放出されたタンパク質を、グルタチオンビーズをペレット化し（８００ｇ、２分、ｒｔｐ）、上清を留保することによって回収した。ビーズを、１ｍｌの洗浄用緩衝液で２回洗浄し、毎回、上清を留保した。各上清の一定分量及び残存するグルタチオンビーズを、SDS-PAGEによって分析した。ビーズを、洗浄用緩衝液２（Tris-HCL、５０ｍＭ、ｐＨ８．０）で３回洗浄し、３ｍｌの、５．０ｍＭ還元型グルタチオンを含有する洗浄用緩衝液２を用いて、室温で２分間溶出させ、その後、ビーズをペレット化し（８００ｇ、２分、ｒｔｐ）、上清を留保した。この溶出を、２回繰り返し、各分画の純度をSDS-PAGEによって分析した。
【０１７８】
全部のタンパク質を、５リットルの２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４中、４℃で一晩かけて、２回透析した。
【０１７９】
透析後、いずれの不溶性物質も、遠心分離（１００００ｇ、２分、４℃）によって取り出し、次いで、−７０℃で保存した。
【実施例３】
【０１８０】
マウスにおける、サブユニットワクチン投与及びストレプトコッカス・エクイによる攻撃誘発後の防御
この研究の目的は、ストレプトコッカス・エクイのサブユニットワクチンを用いたワクチン接種が、それに続くストレプトコッカス・エクイの鼻腔内からの攻撃誘発から、マウスを防御するか否かを決定することであった。
【０１８１】
Ｓｅ５９５、Ｓｅ３５８、Ｓｅ１４５９、Ｓｅ５０及びＳｅ５２８の５種のストレプトコッカス・エクイのサブユニットワクチンを使用した。全てのこれらのワクチンは、実施例２で得たストレプトコッカス・エクイのタンパク質を使用した。Ｓｅ５９５、Ｓｅ３５８、Ｓｅ１４５９、Ｓｅ５０及びＳｅ５２８の組換えストレプトコッカス・エクイのタンパク質は、緩衝液を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４に交換した後、濃縮して、可能な場合には、１０μｇ／ｌでのＳｅ３５８のモル濃度と同等の濃度を得ることによって精製した。Ｓｅ５９５及びＳｅ５２８のタンパク質は、所望の濃度では、溶けなかった。実際に使用したタンパク質の濃度を、表２に示す。
【０１８２】
【表２】
2009531464.tif 000006
【０１８３】
２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中の精製したタンパク質を、投与前に、ＴＳ６アジュバント（US-A-2005/0079185の実施例１）中で、１：３に希釈した。
【０１８４】
BalbCマウス、３〜４週齢、雌の２０匹を１群として、これらのマウスに、第０日（Ｄ０）に、５種のストレプトコッカス・エクイのサブユニットワクチンのそれぞれを用いてワクチン接種した。ワクチン接種は、大腿中及び鼻腔内への筋肉注射によって行った。これらのマウスは、４週間後（Ｄ２８）には、追加免疫し、その２週間後（Ｄ４２）に、ストレプトコッカス・エクイを用いて攻撃誘発した。また、ワクチンを接種しない追加の対照群も含め、これは、Ｄ４２に攻撃誘発した。５匹の対照マウスからなる群には、ワクチン接種も、ストレプトコッカス・エクイを用いた攻撃誘発も施さなかった（表３を参照）。
【０１８５】
群の大きさは、ワクチン接種したマウスの５０％の防御、及び対照の８０％の感染を検出するのに十分であった。血液を、ワクチン接種の前、追加免疫の前、攻撃誘発の前、及び安楽死の際に得て、ワクチン接種及び攻撃誘発に対する抗体の応答レベルを決定した。
【０１８６】
ストレプトコッカス・エクイ株4047を、攻撃誘発のために、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ，foetal calf serum）を補充したTodd Hewittブロス（ＴＨＢ，Todd Hewitt broth）中で増殖させた。一晩経過した培養物を１：２０で希釈して、新鮮な、あらかじめ加温及びガス処理したＴＨＢ＋１０％FCSに播種し、培養物を、ＯＤ６００ｎｍが０．３に達するまで増殖させた。この時点で、培養物を希釈した。ストレプトコッカス・エクイ株4047の必要とする用量の調製に続いて、マウスを、１００ｍｇ／ｋｇのKetasetを筋肉内注射して鎮静させた後、約１×１０４ｃｆｕのストレプトコッカス・エクイを含有する、１０μｌの攻撃誘発用接種菌液の鼻腔内投与によって攻撃誘発した。
【０１８７】
攻撃誘発の直後に、投与した用量を逆滴定によって定量化し、０．９×１０４ｃｆｕを含有することを見い出した。
【０１８８】
全てのマウスを、注意深くモニターして、確実に鎮静から回復させ、疾患の臨床的な徴候の出現を定期的に調べた。これらには、倦怠、振戦又は毛皮の凝視が含まれ、これらは、中等度の作用の徴候とみなされ、より重症の作用が出現する恐れがあった。最終的には、マウスを安楽死させた。
【０１８９】
臨床的な観察を、研究を通して毎日記録し、ワクチン接種前、追加免疫前、攻撃誘発前、次いで、攻撃誘発後は毎日、マウスの体重を測定した。攻撃誘発後のマウスから鼻の拭き取りを得て、ストレプトコッカス・エクイの脱落のレベルを定量化した。死後の観察を、全てのマウスについて行った。
【０１９０】
【表３】
2009531464.tif 000007
【０１９１】
ワクチン接種段階は、何事もなく進行し、全ての群で、対照と同様に、体重が増加した。注射部位の有害反応は、特定されなかった。投与したワクチン接種に対して、全てのマウスで抗体陽転した。
【０１９２】
攻撃誘発後、Ｓｅ５９５、Ｓｅ３５８、Ｓｅ１４５９、Ｓｅ５２８及びＳｅ５０を用いてワクチン接種した群は、一般に、対照と比較して、疾患の臨床的な徴候が減少し、体重減少が低下し、その上体重が増加し、鼻の細菌叢が減少し、生存が改善した。各マウスを、攻撃誘発の日及びその後の７日間毎日、ストレプトコッカス・エクイに関連する症状（嗜眠、体重減少、くしゃみ、立毛、身を縮こめる、内耳不均衡）の発生について調べた。マウスは、少なくとも１日に４回調べた。以下の記録及びスコア化の方法を適用した（表４）。
【０１９３】
【表４】
2009531464.tif 000008
【０１９４】
例えば、静かで、身を縮こめ、不動な、立毛を有するマウスのスコアは、３＋３＋５＋１０＝２１となるであろう。
【０１９５】
マウスの体重を、集計表上で毎日分析して、攻撃誘発の日に対するパーセント体重減少を決定した。
【０１９６】
攻撃誘発後は毎日、各マウスの鼻を、明確にラベルを付けた連鎖球菌選択性の寒天プレート（bioMerieux社製）上に触れされた。プレートに、画線して、生存ストレプトコッカス・エクイ菌が存在するか否かを決定した。ストレプトコッカス・エクイの脱落のレベルを、以下の４点スコア化システムに従って段階付けた；０＝増殖無し、１＝１〜１０個のコロニーが存在する、２＝１１〜１００個のコロニーが存在する、３＝１００個超のコロニーが存在する、及び４＝コンフルエントな増殖。
【０１９７】
血液試料を、大腿静脈から得た。血清を調製して、−２０℃以下で使用まで保存した。
【０１９８】
疾患の臨床的な徴候が、Ｄ４４、すなわち、攻撃誘発の２日後から認められた。ワクチン接種群は、一般的に、対照群よりも低い臨床的な徴候を示した。Ｓｅ５０及びＳｅ３５８を用いてワクチン接種したマウスは、最も低い、疾患の臨床的な徴候を示した。Ｓｅ５９５を用いてワクチン接種したマウスは、疾患の臨床的な徴候を、対照と比較して、より短い期間示した（図１）。攻撃誘発後の体重のパーセント変化の平均を、攻撃誘発の日（Ｄ４２）と比較して調べると、Ｓｅ５２８、Ｓｅ１４５９及びＳｅ５０を用いてワクチン接種した群では、体重減少がわずかに低下することが明らかであった。しかし、Ｓｅ３５８及びＳｅ５９５を用いてワクチン接種したマウスが、最も防御されるように見えた（図２）。
【０１９９】
予想されたように、鼻の拭き取りから単離したβ溶血性細菌の数の平均は、攻撃誘発後に増加し、Ｄ４５（攻撃誘発の３日後）に頂点に達した。Ｄ４５には、Ｓｅ３５８、Ｓｅ５９５、Ｓｅ５０及びＳｅ１４５９を用いてワクチン接種した群において、鼻の拭き取りスコアが最低となった。ワクチン接種群は、一般に、対照群よりも低いスコアを有した。例外は、Ｓｅ３５８を用いてワクチン接種したマウスであり、Ｄ４６で、頂点に達した（図３）。
【０２００】
【表５】
2009531464.tif 000009
【実施例４】
【０２０１】
組換えストレプトコッカス・エクイのＳｅ１６３１、Ｓｅ１６８１及びＳｌａのポリペプチドのエシェリキア・コリ中での発現
Ｓｅ１６３１、Ｓｅ１６８１及びＳｌａの断片をコードするポリヌクレオチドを、Vent  ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs（登録商標）Inc.社製）を使用して、変性ステップ、５分に続く、５０〜５５℃でのアニーリング、３０秒、７２℃での伸長、１分、及び９５℃での第２の変性、３０秒を使用する３５サイクルを用いる、製造業者が推奨する条件で産生した。７２℃での伸長、４分を用いて、産物を完成させた。それぞれの場合の鋳型は、ストレプトコッカス・エクイ株4047の染色体ＤＮＡであった。
【０２０２】
Ｓｅ１６３１、Ｓｅ１６８１及びＳｌａの断片はそれぞれ、配列番号５３、５５及び５７と名付けた断片である。
【０２０３】
【表６】
2009531464.tif 000010
【０２０４】
全てのＰＣＲ産物を、Qiaquick ＰＣＲ 精製キット（Qiagen社製）を使用して、３２μｌの溶出容量を用いて精製し、次いで、EcoRI用緩衝液（３．５μｌ）（New England Biolabs（登録商標）Inc.社製）、BamHI（０．７５μｌ）、及びEcoRI（０．７５μｌ）を添加して、３７℃で２時間消化した。また、１μｇのpGEX-3Xプラスミド（GE Healthcare社製）も、上記に従って、EcoRI及びBamHIを用いて消化した。pGEX-3Xプラスミドは、ＧＳＴ融合タンパク質の産生、並びにその単離及び精製のために、マルチクローニングサイト、ｔａｃプロモーター、グルタチオンＳトランスフェラーゼ遺伝子（ＧＳＴ）、及び停止コドンを、全ての３つのフレームに有する。
【０２０５】
全ての消化産物は、０．７％TAEアガロースゲル上に流し、所望の制限産物を、Qiaquickゲル抽出キット（Qiagen社製）を使用して、３５μｌの最終溶出量を用いて、切り取り、精製した。
【０２０６】
ライゲーション反応を、１６．５μｌの精製した消化ＰＣＲ産物及び１μｌのpGEX-3Xプラスミドを使用し、２μｌのリガーゼ用緩衝液及び０．５μｌのリガーゼを加えて始め、室温（ｒｔｐ）で一晩インキュベートした。
【０２０７】
ライゲーション反応物を、エシェリキア・コリDH10B株中に形質転換し、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを補充したL−寒天プレート上に蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。形質転換体を、挿入断片の存在について、コロニーＰＣＲによって試験した。単一のコロニーを、４μｌの水中に再懸濁し、この２μｌを、対象のポリヌクレオチドのための適切なクローン化プライマーを含有する、Taq  ＤＮＡポリメラーゼＰＣＲ反応に添加し、上記の記載に従って、３５サイクルの伸長を行った。所望の挿入断片の存在を、ＰＣＲ反応物を０．７％TAEアガロースゲル上に流すことによって確認した。
【０２０８】
それぞれのクローンのプラスミドを調製し、クローンの全てについて、５’及び３’のpGEX-3X  ＰＣＲプライマーを使用して配列決定した（表６）。クローン化したポリヌクレオチドの全てが、ストレプトコッカス・エクイ株4047の構築されたゲノム配列（http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_equi/）と同一の配列を有することを確認した。
【０２０９】
全てのクローンを、発現のために、以下のプロトコールを使用して誘導した。単一のコロニーを、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する、５０ｍｌの２×YT培地中に播種し、３７℃で、２２０ｒｐｍで振とうしながら一晩増殖させた。次いで、この培養物を、５００ｍｌのあらかじめ加温し（３７℃）、且つあらかじめガス処理した２×YT培地に添加して、３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、２００μｌを取り出し、細胞を、分析のために採取し（これを、誘導前の試料とする）、ＩＰＴＧ（イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を、０．１ｍＭの最終濃度で添加して、温度を２８℃まで下げた。培養物をさらに４時間誘導した後、１００μｌの試料を分析のために取り出し、続いて、細胞を遠心分離によって収集し、−７０℃で保存した。
【０２１０】
全ての試料を、１０％SDS-PAGEを使用して分析した。
【０２１１】
ペレットを、２０ｍｌ中の氷冷ＰＢＳ（Oxoid Limited社製、カタログ番号ＢＲ００１４Ｇ）中に再懸濁し、ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）を、０．１ｍＭの最終濃度で添加した後、細胞を、氷上で、１０秒間のパルスを用いる６回の超音波処理によって溶解させた。パルスとパルスとの間にはそれぞれ、１０秒間の休止を設けた。Triton X-100を０．１％（ｖ／ｖ）まで添加し、不溶性及び未変化の細胞を、遠心分離（１１，０００ｇ、５分、４℃）によって除去した。細菌の可溶性溶菌液及び不溶性物質の試料を、SDS-PAGEによって分析した。ＤＴＴ（ジチオスレイトール；Cleland's reagent社製）（５ｍＭ）を添加し、１．３ｍｌのグルタチオンセファロース４Ｂを添加した（１ｍｌのビーズに相当する。これは、２０ｍｌのPBSで３回あらかじめ洗浄した）。混合物を、室温で１時間インキュベートし、次いで、ビーズを、遠心分離（８００ｇ、２分、ｒｔｐ）によって収集した後、５０ｍｌの氷冷ＰＢＳＴ（０．１％ｖ／ｖ  Triton X-100を有するＰＢＳ）で３回洗浄した。各洗浄（洗浄１〜３）の試料を、ビーズに結合した融合タンパク質の試料として、SDS-PAGEによる分析のために得た。全ての試料を、１０％SDS-PAGEを使用して分析した。
【０２１２】
ＧＳＴ担体の除去を、全ての融合タンパク質について、プロテアーゼによる切断によって行った。
【０２１３】
切断反応を、グルタチオンセファロースビーズに結合した融合タンパク質を用いて行った。ビーズを、最初に、２０ｍｌの洗浄用緩衝液（Tris-HCL、５０ｍＭ、ｐＨ７．５、NaCl、１５０ｍＭ）で１回、次いで、２０ｍｌの切断用緩衝液（CaCl2、１．０ｍＭを有する洗浄用緩衝液）で２回平衡化し、最後に、１ｍｌの切断用緩衝液中に再懸濁した。第Ｘａ因子（New England Biolabs（登録商標）Inc.社製）（５０単位）を添加して、回転式攪拌機上において、室温で１６時間インキュベートした。放出されたタンパク質を、グルタチオンビーズをペレット化し（８００ｇ、２分、ｒｔｐ）、上清を留保することによって回収した。ビーズを、１ｍｌの洗浄用緩衝液で２回洗浄し、毎回、上清を留保した。各上清の一定分量及び残存するグルタチオンビーズを、SDS-PAGEによって分析した。ビーズを、洗浄用緩衝液２（Tris-HCL、５０ｍＭ、ｐＨ８．０）で３回洗浄し、３ｍｌの、５．０ｍＭ還元型グルタチオンを含有する洗浄用緩衝液２を用いて、室温で２分間溶出させ、その後、ビーズをペレット化し（８００ｇ、２分、ｒｔｐ）、上清を留保した。この溶出を、２回繰り返し、各分画の純度をSDS-PAGEによって分析した。
【０２１４】
ビーズを、洗浄用緩衝液２（Tris-HCL、５０ｍＭ、ｐＨ８．０）で３回洗浄し、３ｍｌの、５．０ｍＭ還元型グルタチオンを含有する洗浄用緩衝液２を用いて、室温で２分間溶出させ、その後、ビーズをペレット化し（８００ｇ、２分、ｒｔｐ）、上清を留保した。この溶出を、２回繰り返し、各分画の純度をSDS-PAGEによって分析した。
【０２１５】
全部のタンパク質を、５リットルの２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４中、４℃で一晩かけて、２回透析した。
【０２１６】
透析後、いずれの不溶性物質も、遠心分離（１００００ｇ、２分、４℃）によって取り出し、次いで、−７０℃で保存した。
【実施例５】
【０２１７】
マウスにおける、Ｓｅ１６３１、Ｓｅ１６８１又はＳｌａのサブユニットワクチン投与及びストレプトコッカス・エクイによる攻撃誘発後の防御
BalbCマウス、３／４週齢、雌の２０匹を１群として、これらのマウスに、Ｓｅ１６３１、Ｓｅ１６８１及びＳｌａのストレプトコッカス・エクイのペプチドのそれぞれを用いてワクチン接種し、ＧＳＴ＋アジュバントの対照群を含めた。この群の大きさは、マウスの５０％の防御、及び対照の８０％の感染を検出するのに十分であった。ワクチン接種も、攻撃誘発も施さない５匹のマウスの追加の対照群も含めた（表７を参照）。
【０２１８】
Ｓｅ１６３１、Ｓｅ１６８１３５８及びＳｌａの３種のストレプトコッカス・エクイのサブユニットワクチンを使用した。全てのこれらのワクチンは、実施例４で得たストレプトコッカス・エクイのタンパク質を使用した。
【０２１９】
組換えタンパク質を、ワクチン接種のために、０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中で１．５ｍｇ／ｍｌにセントリコンによって濃縮し、ＴＳ６アジュバント（US-A-2005/0079185の実施例１）の２部を添加することによって調製した。
【０２２０】
マウスに、第０日にワクチン接種し、第２８日には追加免疫した。ＩＭワクチン接種は、以下の表に従って、第０日には左後肢に、第２８日には右後肢に投与した。ＩＭワクチン接種は、ピペットから、マウスの鼻孔上に投与するものとする。
【０２２１】
血液を、ワクチン接種の前、追加免疫の前、及び攻撃誘発の前に得て、ワクチン接種に対する抗体の応答レベルを決定した。
【０２２２】
マウスを、さらに２週間が経過してからストレプトコッカス・エクイを用いて攻撃誘発した。ストレプトコッカス・エクイ株4047は、実施例３の記載に従って調製した。必要な用量まで希釈した後、閉鎖環境中で、１０μｌを、鎮静させたマウスに鼻腔内経路から投与した。マウスを、注意深くモニターして、確実に鎮静から回復させ、疾患の臨床的な徴候の出現を定期的に調べた。これらには、倦怠、振戦又は毛皮の凝視が含まれ、これらは、中等度の作用の徴候とみなされ、より重症の作用が出現する恐れがあった。
【０２２３】
【表７】
2009531464.tif 000011
【０２２４】
臨床的な観察を、研究を通して毎日記録し（スコア化の方法については、表４を参照）、ワクチン接種前、追加免疫前、攻撃誘発前、次いで、攻撃誘発後は毎日、マウスの体重を測定した。攻撃誘発後のマウスから鼻の拭き取りを得て、ストレプトコッカス・エクイの脱落のレベルを定量化した。
【０２２５】
疾患の臨床的な徴候が、Ｄ４４、すなわち、攻撃誘発の２日後から認められた。ワクチン接種群は、一般的に、対照群よりも低い臨床的な徴候を示した。Ｓｅ１６３１を用いてワクチン接種したマウスは、最も低い、疾患の臨床的な徴候を示した。Ｓｅ１６８１及びＳｌａを用いてワクチン接種したマウスは、疾患の臨床的な徴候を、対照と比較して、より短い期間示した（図４）。
【０２２６】
攻撃誘発後の体重のパーセント変化の平均を、攻撃誘発の日（Ｄ４２）と比較して調べると、Ｓｅ１６８１、Ｓｅ１６３１及びＳｌａを用いてワクチン接種した群では、体重減少がわずかに低下することが明らかであった。Ｓｌａを用いてワクチン接種したマウスは、防御の程度が低いように見えた（図５）。
【０２２７】
予想されたように、鼻の拭き取りから単離したβ溶血性細菌の数の平均は、攻撃誘発後に増加し、対照群の場合には、Ｄ４９（攻撃誘発の７日後）に頂点に達した。Ｄ４９には、Ｓｅ１６３１及びＳｅ１６８１を用いてワクチン接種した群において、鼻の拭き取りスコアが最低となった。ワクチン接種群は、一般に、対照群よりも低いスコアを有した。例外は、Ｓｌａを用いてワクチン接種したマウスであり、Ｄ４８で、頂点に達した（図６）。生存しており、体重の減少が７％以下であるマウスの割合を調べると（図７）、対照群と比較して、Ｓｅ１６３１、Ｓｅ１６８１及びＳｌａを用いてワクチン接種した群の体重減少はより少なく、生存率はより高いことが明らかであった。
【０２２８】
以上、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明してきたが、上記の段落によって定義される本発明は、上記の説明に記載する特定の詳細に限定されるわけではなく、多くのそれらの明らかな変形形態が、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、可能であることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０２２９】
【図１】ストレプトコッカス・エクイを用いて攻撃誘発した後の、ワクチン接種マウス及び対照マウスの臨床スコアの平均を示すグラフである。
【図２】ストレプトコッカス・エクイによる攻撃誘発後の、ワクチン接種マウス及び対照マウスの体重のパーセント変化の平均を示すグラフである。
【図３】ストレプトコッカス・エクイによる攻撃誘発後の、ワクチン接種マウス及び対照マウスの鼻の拭き取りスコアの平均を示すグラフである。
【図４】ストレプトコッカス・エクイによる攻撃誘発後の、Ｓｅ１６３１，Ｓｅ１６８１、Ｓｌａによるワクチン接種マウス及び対照マウスの臨床スコアの平均を示すグラフである。
【図５】ストレプトコッカス・エクイによる攻撃誘発後の、Ｓｅ１６３１，Ｓｅ１６８１、Ｓｌａによるワクチン接種マウス及び対照マウスの体重のパーセント変化の平均を示すグラフである。
【図６】ストレプトコッカス・エクイによる攻撃誘発後の、Ｓｅ１６３１，Ｓｅ１６８１、Ｓｌａによるワクチン接種マウス及び対照マウスの鼻の拭き取りスコアの平均を示すグラフである（コロニー形成単位（ｃｆｕ）で表す）。
【図７】ストレプトコッカス・エクイによる攻撃誘発後の、Ｓｅ１６３１，Ｓｅ１６８１、Ｓｌａによるワクチン接種マウス及び対照マウスについて、生存しており、体重の減少が７％以下であるマウスのパーセントを示すグラフである。
【図１】
2009531464.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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