(57)【要約】  本発明は、新規のフルオレセイン誘導体、このような誘導体の製造方法、ならびに蛍光ペプチド、特にプロテアーゼ基質およびペプチドリガンドの合成のための該誘導体の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2009503054.tif 000011
（式中、
Ｗは、直鎖、分枝、または環式のＣ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、およびＣ６〜Ｃ１２アルキルアリールまたはアラルキルからなる群から選択される２価の基を表し、
Ｘは、Ｈ、直鎖、分枝、または環式のＣ１〜Ｃ１２アルキルまたはＣ２〜Ｃ１２アルケニル、フェニル、パラ−ニトロフェニルおよびベンジルからなる群の中から選択され、
Ｙは、直鎖、分枝、または環式のＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、フェニル、パラ−ニトロフェニル、ベンジル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、ならびにＯ、ＮおよびＳからなる群から選択される１つもしくはいくつかのヘテロ原子を場合により含有する、Ｃ６〜Ｃ１２アルキルアリールまたはアラルキルからなる群から選択される基を表し、
Ｚは、１つまたは複数の、以下の官能基：エーテル架橋−Ｏ−、アミノ架橋−ＮＨ−、エステル官能基−Ｏ−ＣＯ−、アミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−、硫黄架橋−Ｓ−、尿素官能基−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、オキシカルボニル官能基−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される１つまたはいくつかのヘテロ原子を場合により含有するＣ６〜Ｃ１０ヘテロアリール、ならびにＣ６〜Ｃ１２アルキルアリールまたはアラルキルにより介在されてもよい、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル鎖からなる群から選択される２価の基を表し、
フェニル環のＮＨは、環の３〜６位にあり、
Ｒは、Ｆｍｏｃ、ｔ−ＢｕＯ−ＣＯ−（Ｂｏｃ）、フェニル、ベンジル、アセチル、ベンゾイル、４−トルエンスルホニル、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、トリチル、４−メトキシトリチル、トリフルオロアセチル、ベンジルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニルからなる群から選択されるアミノ保護基であり、
Ｒ、ＸおよびＹ基は、ＲおよびＸを、互いから独立に、Ｙを脱保護せずに脱保護できるように選択される）
の蛍光化合物。
【請求項２】
Ｗが、２価のＣ１〜Ｃ４アルキル鎖基である、請求項１に記載の式（Ｉ）の蛍光化合物。
【請求項３】
Ｗが、−ＣＨ２−である、請求項２に記載の式（Ｉ）の蛍光化合物。
【請求項４】
Ｘが、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルから選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の蛍光化合物。
【請求項５】
ＸがＨである、請求項４に記載の式（Ｉ）の蛍光化合物。
【請求項６】
Ｘがｔｅｒ−ブチルである、請求項４に記載の式（Ｉ）の蛍光化合物。
【請求項７】
Ｙが、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである、前記請求項のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の蛍光化合物。
【請求項８】
Ｙが、メチルまたはエチルである、請求項７に記載の式（Ｉ）の蛍光化合物。
【請求項９】
Ｚが、エーテル架橋、アミド官能基およびエステル官能基からなる群から選択される、１種または２種の官能基を場合により含むＣ２〜Ｃ８アルキル鎖である、請求項８に記載の式（Ｉ）の蛍光化合物。
【請求項１０】
Ｚが、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−（ＣＨ２）２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−（ＣＨ２）３−ＣＨ２−、−ＣＨ２−（ＣＨ２）４−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ―ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ―ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＣＨ２−、および−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ―ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＣＨ２−からなる群から選択される、請求項９に記載の式（Ｉ）の蛍光化合物。
【請求項１１】
ＲがＦｍｏｃ基である、前記請求項のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の蛍光化合物。
【請求項１２】
以下の式：
【化２】
2009503054.tif 000012
の中から選択される、請求項１に記載の式（Ｉ）の蛍光化合物。
【請求項１３】
式（Ｄ）の化合物のキサンテン環の６’−ヒドロキシ官能基上にグラフトされた酸性官能基が脱保護されることにより、式（Ｅ）の化合物が得られる工程を少なくとも含む、ＸがＨである場合の請求項１から１２のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の蛍光化合物を作製する方法。
【化３】
2009503054.tif 000013
【請求項１４】
式（Ｄ）の化合物が、式（Ｃ）の化合物をＮＨ２官能基上で保護することにより得られる、請求項１３に記載の方法。
【化４】
2009503054.tif 000014
【請求項１５】
Ｚが２価のアルキル基であり、Ｒ−ＮＨ−Ｚ−ＣＯＯＨを、式（Ｃ）の化合物に対して、ペプチド結合が形成されるような条件で反応させる反応を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｚが、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−を表し、ｘが、１〜６の範囲にある整数であって、式Ｃの化合物をジグリコール酸無水物と反応させて、そのアミノ官能基上に−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＨ基でグラフトされた式（Ｃ）の誘導体を得る工程、次いで、この化合物とＲ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ２分子とを、アミノ官能基とカルボン酸官能基との間でのカップリングが得られる条件で反応させる工程からなる２工程反応を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
式（Ｃ）の化合物が、アルキルハロゲノ−アルキルカルボキシレート基Ｈａｌ−Ｗ−ＣＯ−ＯＸを使用する式（Ｂ）の化合物のアルキル化によって得られ、式中、ＷおよびＸは、ＸがＨでないことを除き、請求項１で定義した式（Ｉ）の場合と同じ定義を有し、Ｈａｌがハロゲン原子を表す、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
【化５】
2009503054.tif 000015
【請求項１８】
ＨａｌがＢｒである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
アルキルハロゲノ−アルキルカルボキシレート基が、ｔ−ブチルブロモアセテートである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
式（Ｂ）の化合物が、式（Ａ）の化合物と、Ｙが、請求項１で定義した式（Ｉ）の場合と同じ定義を有するアルコールＹ−ＯＨとのエステル化によって得られる、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
【化６】
2009503054.tif 000016
【請求項２１】
式（Ｄ）
【化７】
2009503054.tif 000017
（式中、Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺは、ＸがＨでないことを除き、請求項１で定義した式（Ｉ）の場合と同じ定義を有する）の蛍光化合物。
【請求項２２】
式（Ｃ）
【化８】
2009503054.tif 000018
（式中、Ｗ、ＸおよびＹは、ＸがＨでないことを除き、請求項１で定義した式（Ｉ）の場合と同じ定義を有する）の蛍光化合物。
【請求項２３】
式中、Ｗがメチルであり、Ｘがｔｅｒ−ブチルであり、Ｙがエチルである、請求項２２に記載の式（Ｃ）の蛍光化合物。
【請求項２４】
蛍光ペプチド合成のための、式（Ｉ）の蛍光化合物の使用。
【請求項２５】
ａ）式（Ｉ）の化合物を、ＮＨ２官能基を有する樹脂上にグラフトする工程、
ｂ）工程ａ）でグラフトされた式（Ｉ）の化合物のＮＨ２基上でペプチドを合成する工程、
ｃ）消光剤(quencher)を、工程ｂ）で合成されたペプチドのＮＨ２末端官能基にグラフトする工程
を含む、蛍光ペプチドを調製する方法。
【請求項２６】
式（Ｉ）の化合物が、ＮＨ２官能化極性リンカーに予めカップリングされた樹脂上にグラフトされる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＮＨ２官能化極性リンカーが、ＰＥＧ単位を２〜３００個含むＰＥＧリンカーからなる群の中から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
式（ＩＩ）の化合物：
【化９】
2009503054.tif 000019
（式中、
【化１０】
2009503054.tif 000020
は、樹脂を表し、
ＰＬは、極性リンカーを表し、
ｙは、０および１から選択される整数であり、
Ｆｌｕは、そのカルボン酸官能基によりグラフトされる、式（Ｉ）の化合物である）。
【請求項２９】
請求項２８で定義された式（ＩＩ）の化合物、および
消光分子
を含む、ペプチド合成用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、新規のフルオレセイン誘導体、このような誘導体の製造方法、ならびに蛍光ペプチド、特にプロテアーゼ基質およびペプチドリガンドの合成のための該誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光色素は、標識および染色試薬として定性的かつ定量的な生物分析および化学分析に広く採用されている。多くのキサンテン誘導体は、蛍光色素として採用され、この中には、フルオレセインとカルボキシフルオレセイン、アミノフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートおよびアミノメチルフルオレセインを含めたフルオレセインの誘導体とが挙げられ得る。しかしながら、低光安定性および蛍光のｐＨ依存性は、フルオレセイン類似体の生物学的用途を制限する２つの最も重要な欠点である。実際、少量の蛍光分子および／または小容量の試料を取り扱う、免疫蛍光などの蛍光測定では、励起蛍光体の不可逆的破壊または光退色が、蛍光検出能を制限する要因となる。
【０００３】
フルオレセイン誘導体の改質への１つの明確な方法は、フェニル環上のカルボキシル基と求核剤とを結合させることである。しかしながら、このような官能基付与化学は、非蛍光性の閉環スピロラクトン型と蛍光性の開環キノイド型との間の互変異性平衡、ならびにフルオレセインの複数の（脱）プロトン化型のイオン平衡によって複雑になる（Ｋｌｏｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃ．，１９９６，６，１４７−１５９；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｕｍｉｎｅｓｃ．，１９７５，１０，３８１−３９０；Ｏｒｎｄｏｒｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９２７，４９，１２７２−１２８０；Ｆｏｍｐｅｙｄｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｕｌｌ．Ｓｏｃ．Ｃｈｉｍ．Ｆｒａｎｃｅ，１９８０，４５９−４６５）。これは、結果として、ｐＨおよび溶媒に依存する、非常に不均一な化学組成物となる。異なるスペクトル特性を有する多数のフルオレセイン型も、蛍光プローブとしてのこの利用を制限することに注目すべきである（Ｔｓｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８９，３０，１２７−１５６）。文献に記載されている互変異性の問題を避ける２つの方法には、フェニル環上のカルボキシル基の２級アミンへのカップリング（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００２，７４，６３９７−６４０１；Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００３，５，３２４５−３２４８）およびこのエステル化（Ｌｏｈｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１９９７，８（４），５０３−５０９；Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１９９９，１０（３），５４４−５４７）が挙げられる。ＮＮＮ’Ｎ’−テトラ置換ローダミンの２級アミドの形成は比較的高収率で進むが（前記引用したＮｇｕｙｅｎら）、この反応は、フルオレセインではより非効率であり、更なる活性化工程を必要とする（前記引用したＧａｏら）。一方、フルオレセインのフェニル環上のカルボキシル基のエステル化は、優れた収率を与えると報告されている（前記引用したＡｄａｍｃｚｙｋら）。
【０００４】
Ａｄａｍｃｚｙｋら（前記引用した）は、フルオレセインメチルエステルを得るための、メタノール中でのフルオレセインのエステル化、ならびにこうして得られたフルオレセインメチルエステルのキサンチニル環のヒドロキシル官能基とヒドロキシアルキルベンジルエステルとのカップリングによる３’−Ｏ−（カルボキシアルキル）フルオレセインメチルエステル標識の合成を開示している。次いでベンジルエステルの選択的加水分解（メチルエステルの切断なしに）の後、所望の３’−Ｏ−（カルボキシアルキル）フルオレセインメチルエステル標識が得られる。こうして得られるフルオレセイン標識は、ｐＨ４．８〜９．４でｐＨ非依存性である。
【０００５】
Ｇａｏら（前記引用した）およびＵＳ２００４／００５４１９５として公開されている米国特許出願１０／２５０９７５には、「キサントアミド（ｘａｎｔｈａｍｉｄｅ）」と称するフルオレセイン誘導体が開示されている。特に、２種の誘導体：キサンテン環上の６位にカルボキシメチルエーテルを含有し、フェニル環のカルボン酸官能基上にジメチルアミンの２級アミドを含有する第１の誘導体と、対応する６−メチルエーテルを含有し、フェニル環のカルボン酸官能基上にイソニペコチン酸の２級アミドを含有する第２の誘導体とが記載されている。したがって、これらの誘導体は、単独のカルボキシル基を含有する。カルボキシル基の、立体保護を与える２級アミドへの転換と併せて６−Ｏ−アルキル化することにより、このような誘導体は、フルオレセインと比べて光安定性であり、ｐＨ非依存性の蛍光性を示す。
【０００６】
しかしながら、従来技術に開示されている、上述のフルオレセイン誘導体は、蛍光ペプチドの合成に直接使用するのに適していない。
【０００７】
この利用分野では、Ｌｏｈｓｅら（前記引用した）は、蛍光ペプチドおよびＰＮＡオリゴマーの固相合成のためのフルオレセイン結合リシンモノマーの合成について開示した。フルオレセインエチルエステルを使用して、蛍光性のエステル／エーテル混合６−Ｏ−（カルボキシメチル）フルオレセインエチルエステルを調製し、こうしてリシンのアミノ基に結合することにより、Ｂｏｃ保護フルオレセイン結合リシンモノマーが得られた。Ｂｏｃ基の除去、次いでＦｍｏｃクロライドとの反応により、Ｆｍｏｃ保護モノマーが得られた。これらのＢｏｃおよびＦｍｏｃ保護フルオレセイン結合リシンは、固相合成中に、ペプチドおよびＰＮＡオリゴマー中に容易に組み込まれ、蛍光生成物が得られた。
【０００８】
しかしながら、この文献中に開示されている化合物は、全てリシン誘導体であり、この論文には、このような誘導体の光安定性に関連するデータは全く示されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、蛍光ペプチドの合成に適する一方、従来技術に開示されている幾つかの誘導体の欠点がなく、特に、フルオレセインより光安定性があり、一定のｐＨ非依存性蛍光を有し、互変異性化を受けない代替蛍光標識を開発する必要がある。ペプチド合成、特に任意のアミノ酸を伴う固相ペプチド合成に使用し得る標識を得ることが特に望まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の態様では、本発明は、式（Ｉ）：
【００１１】
【化１】
2009503054.tif 000002
【００１２】
（式中、
Ｗは、直鎖、分枝、または環式のＣ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、およびＣ６〜Ｃ１２アルキルアリールまたはアラルキルからなる群から選択される２価の基を表し、
Ｘは、Ｈ、直鎖、分枝、または環式のＣ１〜Ｃ１２アルキルまたはＣ２〜Ｃ１２アルケニル、フェニル、パラ−ニトロフェニルおよびベンジルからなる群の中から選択され、
Ｙは、直鎖、分枝、または環式のＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、フェニル、パラ−ニトロフェニル、ベンジル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、ならびにＯ、ＮおよびＳからなる群から選択される１つもしくはいくつかのヘテロ原子を場合により含有する、Ｃ６〜Ｃ１２アルキルアリールまたはアラルキルからなる群から選択される基を表し、
Ｚは、１つまたは複数の、以下の官能基：エーテル架橋−Ｏ−、アミノ架橋−ＮＨ−、エステル官能基−Ｏ−ＣＯ−、アミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−、硫黄架橋−Ｓ−、尿素官能基−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、オキシカルボニル官能基−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される１つまたはいくつかのヘテロ原子を場合により含有するＣ６〜Ｃ１０ヘテロアリール、ならびにＣ６〜Ｃ１２アルキルアリールまたはアラルキルにより介在されてもよい、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル鎖からなる群から選択される２価の基を表し、
フェニル環のＮＨは、環の３〜６位にあり、
Ｒは、Ｆｍｏｃ、ｔ−ＢｕＯ−ＣＯ−（Ｂｏｃ）、フェニル、ベンジル、アセチル、ベンゾイル、４−トルエンスルホニル、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、トリチル、４−メトキシトリチル、トリフルオロアセチル、ベンジルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニルからなる群から選択されるアミノ保護基であり、
Ｒ、ＸおよびＹ基は、ＲおよびＸを、互いから独立に、Ｙを脱保護せずに脱保護できるように選択される）
の蛍光化合物に関する。
【００１３】
本発明の化合物は、Ｘおよび／またはＲが除去される際に、除去されないような適当な保護基Ｙによりブロックされたカルボン酸基をフェニル環上に有する利点を持つ。したがって、本発明の化合物は、互変異性化を受けない。
【００１４】
一方、従来技術に開示される分子に反して、本発明の化合物は、Ｘ基により保護し得るカルボン酸官能基、およびＲ基により保護されるアミノ官能基を有し、前記の各基は、独立に除去し得る保護をもたらす。フルオレセイン分子のアミノ酸官能基のこの付与によって、ペプチド合成の通常の方法を使用するペプチド合成に式（Ｉ）の化合物を使用でき、特に、これらの化合物は、自動ペプチド固相合成で使用し得る。
【００１５】
Ｗは、２価のＣ１〜Ｃ４アルキル鎖基であることが好ましく、Ｗは、−ＣＨ２−であることが更により好ましい。
【００１６】
Ｘは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルから選択し得ることが好ましく、Ｈおよびメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒ−ブチルのようなＣ１〜Ｃ４アルキルから選択し得ることが更により好ましい。Ｘは、ｔｅｒ−ブチルであることが好ましい。
【００１７】
Ｙは、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであることが好ましく、メチルまたはエチルであることが更により好ましい。
【００１８】
Ｚは、少なくとも２個の炭素原子を含む鎖であることが好ましい。Ｚは、エーテル架橋、アミド官能基およびエステル官能基からなる群から選択される、１種または２種の官能基を場合により含むＣ２〜Ｃ８アルキル鎖となり得る。例えば、Ｚは、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−（ＣＨ２）２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−（ＣＨ２）３−ＣＨ２−、−ＣＨ２−（ＣＨ２）４−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＣＨ２−からなる群から選択し得る。
【００１９】
Ｒは、Ｆｍｏｃ基であることが好ましい。
【００２０】
式（Ｉ）の好ましい化合物は、以下のものである。
【００２１】
【化２】
2009503054.tif 000003
【００２２】
第２の態様では、本発明は、本発明による蛍光化合物を製造する方法に関する。この方法は、以下の反応スキーム１に従って行われ、この場合、Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺは、特に示されない限り、上記の式（Ｉ）の場合と同じ定義を有する。
【００２３】
【化３】
2009503054.tif 000004
【００２４】
工程ｉ：アミノフルオレセイン（式（Ａ）の化合物）は、例えば参照番号０７９８０および０７９８５でＦｌｕｋａより販売されている市販の分子である。しかしながら、１，３−ジヒドロキシベンゼンと３−ニトロフタル酸との縮合と、その後のニトロ基の還元を伴う、アミノフルオレセイン合成のための公知の費用効果的経路があることに留意すべきである（Ｃｏｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９５０，９１（１），１−１３  ｏｒ  ３１−３８；Ｂｏｒｅｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．，１９８８，１４（３），３３３−３３９；Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＧＢ  ８４６６７４）。
【００２５】
式（Ａ）の化合物は、以下の２式によって表し得る。
【００２６】
【化４】
2009503054.tif 000005
【００２７】
溶液中では、４−アミノ−２−（６’−ヒドロキシ−３’−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９’−イル）安息香酸および５−アミノ−２−（６’−ヒドロキシ−３’−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９’−イル）安息香酸は、それぞれ、これらのスピロラクトン互変異性体、即ち、以下の式に相当する、６−アミノフルオレセインおよび５−アミノフルオレセインと平衡状態にある。
【００２８】
【化５】
2009503054.tif 000006
【００２９】
アミノフルオレセイン（式（Ａ）の化合物）は、メタノールまたはエタノールなどのアルコールＹ−ＯＨを酸性条件で還流させる際に、最初にエステル化され、対応するフルオレセインエステル（式（Ｂ）の化合物）が得られる。
【００３０】
本発明の好ましい特徴によれば、このエステル化は、Ｈ２ＳＯ４の存在下で（例えばアミノフルオレセイン１ｍｍｏｌに対しＨ２ＳＯ４を５ｍｍｏｌ使用して）、エタノール中で行う。
【００３１】
こうして得られる化合物は、当業者に周知の任意の従来法を使用して、例えばシリカゲル上のクロマトグラフィーを使用して適宜精製する。
【００３２】
スキーム１に示す式（Ｂ）の化合物は、式（Ｉ）の化合物の合成における重要な中間体である。これらは、新規であり、本発明の他の目的を構成する。
【００３３】
工程ｉｉ：カルボン酸部分は、アルキルハロゲノ−アルキルカルボキシレート基Ｈａｌ−Ｗ−ＣＯ−ＯＸを使用する、式（Ｂ）の化合物のアルキル化によって導入され、式中、ＷおよびＸは、ＸがＨでないことを除き、上記式（Ｉ）の場合と同じ定義を有し、ＨａｌがＣｌ、Ｂｒ、Ｉなどのハロゲン原子を表す。ＨａｌはＢｒであることが好ましい。
【００３４】
この反応は、塩基性条件下で行うことにより、式（Ｃ）の化合物が得られる。アルキル化は、キサンテン環上の６’−ＯＨ官能基上で選択的に進行し、アミノ基を巻き込まない。
【００３５】
工程ｉｉは、非プロトン性極性溶媒中において、塩基性条件下で行うことが好ましい。この条件は、例えばＣｒｉｓｐらによる、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９７，５３，１５０５−１５２２；Ｚａｉｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，１２（２），３０７−３１３）に記載のように、一般的にはフェノール、特にフルオレセインのアルキル化のための最善の方法である。例えば、使用すべき好ましい溶媒は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）である。
【００３６】
こうして得られる化合物は、当業者に周知の任意の従来法を使用して、例えばシリカゲル上のクロマトグラフィーを使用して適宜精製する。
【００３７】
好ましくはアルキルブロモアセテート、更により好ましくはｔ−ブチルブロモアセテートを、工程ｉｉのアルキル化を行うために使用する。
【００３８】
スキーム１に示す式（Ｃ）の化合物は、式（Ｉ）の化合物の合成において重要な中間体である。これらは、新規であり、本発明の他の目的を構成する。
【００３９】
更に、式（Ｃ）の化合物は、本発明の変法によるペプチド合成に使用できよう。即ち、ＮＨ２保護アミノ酸は、その酸官能基を介して、式（Ｃ）の化合物のＮＨ２官能基と反応することができる。こうして得られるアミノ酸鎖は、更にペプチド合成に使用することができる。
【００４０】
工程ｉｉｉ：工程ｉｉから得られる式（Ｃ）の化合物は、１工程または２工程反応でＮＨ２官能基が保護され、ＸがＨではない、式（Ｉ）の特定の化合物に対応する式（Ｄ）の化合物が得られる。
【００４１】
Ｚが２価のアルキル基である場合、Ｒ−ＮＨ−Ｚ−ＣＯＯＨを、式（Ｃ）の化合物に対して、ペプチド結合が形成するような条件で反応させる。このような条件は、当業者に周知である。例えば、このカップリングは、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を補足して、もしくは酸塩化物Ｒ−ＮＨ−Ｚ−ＣＯＣｌで、またはＲ−ＮＨ−Ｚ−ＣＯＯＨのスクシンイミドエステルで、あるいは任意の適切なカップリング法により行い得る。
【００４２】
Ｚは、１種または複数種の官能基により介在されるアルキル鎖である場合、上記開示の方法は、当業者によって適合化される。例えば、Ｚが−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−を表し、ｘが１〜６の範囲にある整数である場合、適切な方法は、式Ｃの化合物をジグリコール酸無水物と反応させて、そのアミノ官能基上に−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＨ基でグラフトした式（Ｃ）の誘導体を得ることにある。次いで、この化合物と、Ｒ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ２分子とを、アミノ官能基とカルボン酸官能基との間でのカップリングを得る条件で反応させる。
【００４３】
こうして得られる化合物は、当業者に周知の任意の従来法を使用して、例えばシリカゲル上のクロマトグラフィーを使用して適宜精製する。
【００４４】
本発明の他の実施形態によれば、蛍光化合物の製造方法の工程ｉｉｉを、当業者に公知の方法に従って、Ｚ鎖中の官能基に適合された数工程の手順で行うことができる。
【００４５】
異なる工程から得られる化合物は、当業者に周知の任意の従来法を使用して、例えばシリカゲル上のクロマトグラフィーを使用して適宜精製する。
【００４６】
工程ｉｖ：式（Ｄ）の化合物のキサンテン環の６’−ヒドロキシ官能基上にグラフトされた酸性官能基は、脱保護されることにより、ＸがＨである、式（Ｉ）の特定の化合物に相当する式（Ｅ）の化合物が得られる。
【００４７】
式（Ｄ）の化合物の保護基Ｘを選択的に脱保護するという条件付きで、任意の従来の脱保護法を使用して工程ｉｖを行うことができる。酸性条件下の加水分解は、このような脱保護法として挙げることができ、例えばＸがｔｅｒ−ブチル基である場合、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用する。
【００４８】
Ｘが別の官能基を有する場合、キサンテン環の６’−ＯＨ位上のカルボキシル官能基の脱保護法は、当業者によって適合化される。
【００４９】
別の態様では、本発明は、蛍光ペプチドの合成のための、本発明による蛍光化合物の使用に関する。
【００５０】
特に、本発明による蛍光化合物は、蛍光プロテアーゼ基質またはペプチドリガンドの合成に使用し得る。フルオレセイン化合物は、固相合成中に、ＰＮＡオリゴマーまたは他の化合物中にも組み込むことができる。
【００５１】
式（Ｉ）の蛍光化合物は、固相ペプチド合成に直接使用できる。
【００５２】
式（Ｉ）の化合物を、蛍光ペプチドの調製に使用する場合、スキーム２に示す工程に従い得る。
【００５３】
【化６】
2009503054.tif 000007
【００５４】
例えば、Ｗａｎｇ樹脂マトリックス、Ｒｉｎｋ樹脂マトリックス、ＴｅｎｔａＧｅｌマトリックス、ＰＥＧＡマトリックス、Ｓａｓｒｉｎ（Ｂａｃｈｅｍ）マトリックスなどに基づく、市販のＮＨ２樹脂のような、ＮＨ２官能基を有する樹脂を準備する。その他の方法では、Ｆｍｏｃ保護ＮＨ２基を含有するリンカーを、選択した樹脂中に導入し得る。次いで、式（Ｉ）の化合物を、ペプチド合成の通常のカップリング法を使用して、樹脂上にグラフトする。前記化合物は、スキーム２上では（Ｆｌｕ）として示される。
【００５５】
ＮＨ２官能化極性リンカー（スキーム２でＰＬとして示される）は、樹脂にカップリングされ、式（Ｉ）の化合物は、ＮＨ２官能化極性リンカー上にグラフトされることが好ましい。
【００５６】
実際、ペプチド合成に使用すべき式（Ｉ）の好ましい蛍光化合物は、保護アミノ基と蛍光体との間に極性リンカーが入る化合物である。特に、極性リンカーが、ＰＥＧ単位を２〜３００個含むＰＥＧリンカーからなる群の中から選択されることが好ましい。例えば、ＰＥＧ（７）は、使用すべき特に好ましい極性リンカーを表す。
【００５７】
式（ＩＩ）
【００５８】
【化７】
2009503054.tif 000008
【００５９】
（式中、
【００６０】
【化８】
2009503054.tif 000009
【００６１】
は、樹脂を表し、
ＰＬは、例えばＰＥＧ鎖のような極性リンカーを表し、
ｙは、０および１から選択される整数であり、
Ｆｌｕは、（Ｘが共有結合である場合）このカルボン酸官能基によりグラフトされる式（Ｉ）の化合物である）
に相当する化合物は、新規であり、本発明の別の目的である。
【００６２】
次いで、ペプチド合成を、当業者に公知の方法に従って、式（Ｉ）の化合物のＮＨ２基上で行う。アミノ酸を、スキーム２でＡＡ１、ＡＡ２、．．．ＡＡｉ（ｉ＝整数とする）と名付ける。ペプチド合成終了後、消光剤（スキーム２で（Ｑｕ）と印す）を、ペプチドのＮＨ２末端官能基にグラフトする。消光剤は、Ｆｌｕの励起／発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有する任意の分子、または任意の常磁性分子となり得る。有用な消光剤は、当技術分野で公知であり、例えば以下のもの：メチルレッド、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）またはダーククエンチャー（ｄａｒｋ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ）の中から選択され、より正確には、以下の消光剤、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）１、２および３（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｎａｎｏｇｏｌｄ  Ｐａｒｔｉｃｕｌｅｓ（登録商標）（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ）、Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｅｌｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（Ｏｓｗｅｌｌ）、マラカイトグリーンと、ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９およびＱＳＹ（登録商標）２１の各色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用し得る。消光剤は、メチルレッド発色団であることが好ましい。
【００６３】
樹脂上にグラフトされた蛍光ペプチドは、蛍光ペプチド中に極性リンカーを使用したヘキサペプチドの場合を表すスキーム３に示されるように、プロテアーゼを使用する酵素アッセイに直接使用し得る。
【００６４】
その他の方法では、蛍光ペプチドは、樹脂から切断し、クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、溶液中で均一タンパク質分解アッセイに使用し得る。
【００６５】
ペプチドが２つに分断されると、式（Ｉ）の化合物または（Ｆｌｕ）に結合するペプチド部分から明るい蛍光（Ｆｌｕ）＊の発光が誘起される。
【００６６】
【化９】
2009503054.tif 000010
【００６７】
変法によれば、ペプチドは、当業者に公知の方法により樹脂から分離した後、酵素アッセイに使用し得る。
【００６８】
蛍光プロテアーゼ基質を樹脂ビーズ上にグラフトする際、ビーズ蛍光の分布測定は、圧電分注器を使用することにより顕微鏡スライドの表面上にビーズ懸濁液をスポットすることによって行い得る。
【００６９】
更に、このビーズを、スポットする前にプロテアーゼと共に予めインキュベーションできるか、またはプロテアーゼを、配列されたビーズに直接添加できる。
【００７０】
最後に、ビーズ結合基質のタンパク質分解を、マイクロアレイスキャナまたは蛍光顕微鏡を使用することにより測定し得る。
【００７１】
本発明による幾つかの蛍光化合物の合成と、これらの蛍光化合物の１種および蛍光消光剤としてのメチルレッドを主体とする蛍光性パパイン基質の合成、ならびにＴｅｎｔａＧｅｌビーズ上でパパイン活性を直接測定するための該基質の適用についての実証に関する、以下の実施例によって、本発明を更に説明する。これらの実施例は、例示のためにのみ提示され、本発明を限定しようとするものではないことに注意されたい。
【実施例】
【００７２】
材料．全ての化学物質は、示されない限りＦｌｕｋａ製であった。カラムクロマトグラフィーを、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０で行った。薄層クロマトグラフィーを、Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４プレートで実施した。１ＨＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ（３００ＭＨｚ）で記録し、ＵＶ−可視スペクトルをＶａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  ３００走査型分光光度計で、蛍光発光スペクトルをＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ−５０Ｂ発光分光計で得た。ｓｃｉＦＬＥＸＡＲＲＡＹＥＲ圧電分注器（Ｓｃｉｅｎｉｏｎ）を、ビーズスポットに使用した。Ｈａｍａｍａｔｓｕ  ＯＲＣＡ  ＲカメラおよびＯｌｙｍｐｕｓ  Ｕ−ＲＦＬ−Ｔランプを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１顕微鏡を、光退色研究およびビーズ画像処理に使用した。ＧｅｎｅＴＡＣ  ＬＳ  ＩＶスキャナ（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を使用してビーズスキャナ画像を得た。ＩＭＳＴＡＲソフトウェア（Ｋｈｏｍｙａｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００４，５０，２１７−２２４）を使用して顕微鏡画像を定量分析し、Ｇｅｎｅｐｉｘ  Ｐｒｏ  ４．０ソフトウェアを使用してスキャナ画像を分析した。
実施例１：本発明によるフルオレセイン化合物の合成
ａ）  ５−アミノ−２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）安息香酸エチルエステル（式Ｂの化合物）。
【００７３】
Ｈ２ＳＯ４（２６６μｌ、５．０ｍｍｏｌ）を、室温で、（５−アミノ−２−（６’−ヒドロキシ−３’−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９’−イル）安息香酸のスピロラクトン型である）５−アミノフルオレセイン（３４７ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ  １０ｍｌ懸濁液に滴下した。還流で２４ｈ攪拌後、ＥｔＯＨを蒸発させ、生じた混合物をＣＨＣｌ３で希釈した。気体の発生が止まるまで、固体のＮａＨＣＯ３を溶液に添加した。不均質混合物を濾過し、この有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１：９）を使用してシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけ、３２６ｍｇ（８７％）が得られた。1H NMR ((CD3)2SO, ppm): 0.80 (t, 3H, J=7.5 Hz), 3.87 (q, 2H, J=7.5 Hz), 5.86 (br.s, 2H), 6.55 (m, 4H), 6.90 (m, 3H), 7.04 (m, 1H), 7.33 (m, 1H).
ｂ）  ４−アミノ−２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）安息香酸エチルエステル（式Ｂの化合物）
このような化合物は、（４−アミノ−２−（６’−ヒドロキシ−３’−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９’−イル）安息香酸のスピロラクトン型である）６−アミノフルオレセインから開始したことを除き、ａ）の合成に使用される場合と同じ方法で得られ、収量は３１９ｍｇ（８５％）であった。1H NMR ((CD3)2SO, ppm): 0.83 (t, 3H, J=7.5 Hz), 3.83 (q, 2H, J=7.5 Hz), 5.85 (br.s, 2H), 6.47 (m, 1H), 6.78 (m, 1H), 7.02 (m, 2H), 7.07 (m, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.92 (m, 1H).
ｃ）  ５−アミノ−２−（６−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）安息香酸エチルエステル（式Ｃの化合物）。
【００７４】
ＢｒＣＨ２ＣＯＯＢｕｔ（２１５ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を、室温で、化合物ａ）（３７５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）とＫ２ＣＯ３（１５０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）とのＤＭＦ５ｍｌ中混合物に添加した。３時間攪拌後、反応混合物を、Ｈ２ＯおよびＥｔＯＡｃで希釈し、振盪した。この有機層を分離し、１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。この残留物を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１：９）を使用してシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけ、４５５ｍｇ（９３％）が得られた。1H NMR ((CD3)2SO, ppm): 0.82 (t, 3H, J=7.5 Hz), 1.42 (s, 9H), 3.88 (m, 2H), 4.85 (s, 2H), 5.87 (br.s, 2H), 6.20 (m, 1H), 6.37 (m, 1H), 6.82-7.05 (m, 5H), 7.14 (m, 1H), 7.35 (s, 1H).
ｄ）  ４−アミノ−２−（６−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）安息香酸エチルエステル（式Ｃの化合物）
このような化合物は、化合物ｂ）から開始したことを除き、ｃ）の合成に使用される場合と同じ方法によって得られ、収量は４４５ｍｇ（９１％）であった。1H NMR ((CD3)2SO, ppm): 0.85 (t, 3H, J=7.5 Hz), 1.42 (s, 9H), 3.84 (m, 2H), 4.85 (s, 2H), 6.22 (m, 1H), 6.30 (br.s, 2H), 6.37 (m, 1H), 6.44 (m, 1H), 6.77 (m, 1H), 6.88-6.96 (m, 3H), 7.15 (m, 1H), 7.90 (m, 1H).
ｅ）  ５−アセチルアミノ−２−（６−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）安息香酸エチルエステル（式Ｄの化合物のモデル）。
【００７５】
Ａｃ２Ｏ（４７μｌ、０．５ｍｍｏｌ）を、室温で、アミンｃ）（９８ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（８８μｌ、０．５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ  ５ｍｌ溶液に添加した。一晩中攪拌した後、ＤＣＭを蒸発させ、この残留物をＨ２ＯおよびＥｔＯＡｃで希釈し、この混合物を攪拌した。この有機層を分離し、１Ｍ  ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。この残留物を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１：９）を使用して、クロマトグラフィーのシリカにかけ、７１ｍｇ（６７％）が得られた。1H NMR ((CD3)2SO, ppm): 0.85 (t, 3H, J=7.5 Hz), 1.42 (s, 9H), 2.12 (s, 3H), 3.94 (m, 2H), 4.86 (s, 2H), 6.22 (m, 1H), 6.38 (m, 1H), 6.85-6.95 (m, 3H), 7.13 (m, 1H), 7.46 (m, 1H), 8.08 (m, 1H), 8.41 (s, 1H), 10.46 (s, 1H).
ｆ）  ４−アセチルアミノ−２−（６−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）安息香酸エチルエステル（式Ｄの化合物のモデル）
このような化合物は、アミンｄ）から開始したことを除き、ｅ）の合成に使用される場合と同じ方法によって得られ、収量は７４ｍｇ（７０％）であった。1H NMR ((CD3)2SO, ppm): 0.85 (t, 3H, J=7.5 Hz), 1.41 (s, 9H), 2.08 (s,  3H), 3.85 (m, 2H), 4.93 (s, 2H), 6.41 (m, 1H), 6.54 (m, 1H), 7.95-7.02 (m, 3H), 7.29 (m, 1H), 7.72 (m, 1H), 7.88 (m, 1H), 8.19 (m, 1H), 10.52 (s, 1H).
ｇ）  ２−（６−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−［３−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）プロピオニルアミノ］安息香酸エチルエステル（式Ｄの化合物）。
【００７６】
ＤＣＣ（４１２ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を、室温でｆｍｏｃ−β−アラニン（６２２ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ  １０ｍｌ溶液に添加し、３０分間攪拌後、アミンｃ）（４８９ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ  ５ｍｌ溶液を混合液に添加した。２日間攪拌後、ＤＣＭを蒸発させ、残留物をＨ２ＯおよびＥｔＯＡｃで希釈し、この混合物を振盪した。この有機層を、１Ｍ  ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。この残留物を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）、ＥｔＯＡｃを使用することによりシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけ、３５２ｍｇ（４５％）が得られた。1H NMR ((CD3)2SO, ppm): 0.85 (t, 3H, J=7.5 Hz), 1.41 (s, 9H), 2.55 (m, 2H), 3.35 (m, 2H), 3.96 (m, 2H), 4.21 (m, 1H), 4.60 (m, 2H), 4.92 (s, 2H), 6.18 (m, 1H), 6.22 (s, 1H), 6.38 (m, 1H), 6.49-6.61 (m, 3H), 6.69 (m, 1H), 6.96 (m, 1H), 7.15 (m, 1H), 7.26-7.39 (m, 4H), 7.64 (m, 2H), 7.86 (m, 1H), 7.88 (m, 2H), 10.48 (s, 1H).
ｈ）  ２−（６−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−４−［３−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）プロピオニルアミノ］安息香酸エチルエステル（式Ｄの化合物）
このような化合物は、アミンｄ）から開始したことを除き、ｇ）の合成に使用される場合と同じ方法によって得られ、収量は３７５ｍｇ（４８％）であった。1H NMR ((CD3)2SO, ppm): 0.86 (t, 3H, J=7.5 Hz), 1.42 (s, 9H), 2.38 (m, 2H), 3.39 (m, 2H), 3.92 (m, 2H), 4.19 (m, 1H), 4.58 (m, 2H), 4.85 (s, 2H), 6.21 (m, 1H), 6.30 (s, 1H), 6.42 (m, 1H), 6.78 (m, 1H), 6.84-6.97 (m, 3H), 7.17 (m, 1H), 7.23 (m, 2H), 7.25-7.42 (m, 4H), 7.64 (m, 2H), 7.87 (m, 2H), 10.53 (s,1H).
ｉ）  ２−（６−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−（２−｛［２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）エチルカルバモイル］メトキシ｝アセチルアミノ］安息香酸エチルエステル（式Ｄの化合物）。
中間体酸１の合成：２−（６−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−（２−カルボキシメトキシアセチルアミノ）安息香酸エチルエステル。
【００７７】
ＤＩＥＡ（３５μｌ、０．２ｍｍｏｌ）を、室温で、アミンｃ）（９８ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、ジグリコール酸無水物（２３ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（２４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ  ５ｍｌ溶液に添加した。一晩中攪拌後、ＤＣＭを蒸発させ、残留物をＨ２ＯおよびＥｔＯＡｃで希釈し、この混合液を振盪した。この有機層を分離し、１Ｍ  ＨＣｌ、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。この残留物を、ＤＣＭ、ＡｃＯＨ／ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１：５：１００）を使用することによりシリカゲル上のクロマトグラフィーによって精製し、９１ｍｇ（７５％）が得られた。1H NMR ((CD3)2SO, ppm): 0.83 (t, 3H, J=7.5 Hz), 1.42 (s, 9H), 3.95 (m, 2H), 4.22 (s, 2H), 4.24 (s, 2H), 4.87 (s, 2H), 6.23 (m, 1H), 6.39 (m, 1H), 6.84-6.92 (m, 3H), 7.17 (m, 1H), 7.44 (m, 1H), 8.12 (m, 1H), 8.52 (m, 1H), 10.42 (s, 1H).
２−（６−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−（２−｛［２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）エチルカルバモイル］メトキシ｝アセチルアミノ］安息香酸エチルエステル（式Ｄの化合物）の合成。
【００７８】
ＤＣＣ（４１ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、室温で、中間体酸１（１２１ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ  ５ｍｌ溶液に添加し、３０分間攪拌後、Ｆｍｏｃ−エチレンジアミン（５６ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ  ２ｍｌ溶液を混合液に添加した。一晩中攪拌後、ＤＣＭを蒸発させ、残留物をＨ２ＯおよびＥｔＯＡｃで希釈し、この混合物を振盪した。この有機層を分離し、１Ｍ  ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。この残留物を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）、ＥｔＯＡｃ、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１：２０）を使用して、シリカゲル上のクロマトグラフィーによって精製し、１０１ｍｇ（５８％）が得られた。1H NMR ((CD3)2SO, ppm): 0.85 (t, 3H, J=7.5 Hz), 1.42 (s, 9H), 3.11 (m, 2H), 3.19 (m, 2H), 3.92 (m, 2H), 4.08 (s, 2H), 4.16 (m, 1H), 4.21 (s, 2H), 4.28 (m, 2H), 4.86 (s, 2H), 6.24 (m, 1H), 6.37 (m, 1H), 6.80-6.97 (m, 3H), 7.19 (m, 1H), 7.27-7.42 (m, 4H), 7.65 (m, 2H), 7.64 (m, 1H), 7.88 (m, 2H), 7.82 (m, 1H), 8.05 (m, 1H), 10.49 (s, 1H).
ｊ）２−（６−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−４−（２−｛［２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）エチルカルバモイル］メトキシ｝アセチルアミノ］安息香酸エチルエステル（式Ｄの化合物）
中間体酸２  （２−（６−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−４−（２−カルボキシメトキシアセチルアミノ）安息香酸エチルエステル）は、アミンｄ）から開始したことを除き、上述の中間体酸１の合成に使用される場合と同じ方法によって得られ、収量は８５ｍｇ（７０％）であった。1H NMR ((CD3)2SO, ppm): 0.87 (t, 3H, J=7.5 Hz), 1.42 (s, 9H), 3.93 (m, 2H), 4.11 (s, 2H), 4.18 (s, 2H), 4.86 (s, 2H), 6.24 (m, 1H), 6.39 (m, 1H), 6.83-6.96 (m, 3H), 7.19 (m, 1H), 7.76 (m, 1H), 8.03 (m, 1H), 8.18 (m, 1H), 10.48 (s, 1H).
２−（６−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−（２−｛［２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）エチルカルバモイル］メトキシ｝アセチルアミノ］安息香酸エチルエステル（式Ｄの化合物）の合成は、中間体酸２を使用することを除き、ｉ）の合成に使用される場合と同じ方法によって得られ、収量は１１１ｍｇ（６４％）であった。1H NMR ((CD3)2SO, ppm): 0.86 (t, 3H, J=7.5 Hz), 1.42 (s, 9H), 3.07 (m, 2H), 3.15 (m, 2H), 3.91 (m, 2H), 4.04 (s, 2H), 4.16 (m, 1H), 4.19 (s, 2H), 4.26 (m, 2H), 4.85 (s, 2H), 6.22 (m, 1H), 6.48 (m, 1H), 6.82-6.95 (m, 3H), 7.17 (m, 1H), 7.27-7.41 (m, 4H), 7.64 (m, 2H), 7.77 (m, 1H), 7.86 (m, 2H), 8.00 (m, 1H), 8.16 (m, 1H), 10.49 (s, 1H).
ｋ）５−アセチルアミノ−２−（６−カルボキシメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）安息香酸エチルエステル（式Ｅの化合物のモデル：色素１５）。
【００７９】
ＴＦＡ（２．０ｇ、１．３ｍｌ）を、室温で、エステルｅ）（５３ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２．０ｇ、１．５ｍｌ）溶液に添加した。３時間後、ＤＣＭおよびＴＦＡを蒸発させ、残留物をＥｔ２Ｏで希釈し、形成された固体沈殿物を濾過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、乾燥させて所望の酸４５ｍｇ（９５％）が得られた。NMR ((CD3)2SO, ppm): 0.85 (t, 3H, J=7.5 Hz), 2.12 (s, 3H), 3.96 (m, 2H), 4.87 (s, 2H), 6.22 (m, 1H), 6.39 (m, 1H), 6.84-6.92 (m, 3H), 7.17 (m, 1H), 7.40 (m, 1H), 8.04 (m, 1H), 8.40 (s, 1H), 10.45 (s, 1H).
ｌ）  ４−アセチルアミノ−２−（６−カルボキシメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）安息香酸エチルエステル（式Ｅの化合物のモデル：色素１６）
このような化合物は、エステルｆ）から開始したことを除き、ｋ）の合成に使用される場合と同じ方法によって得られ、収量は４４ｍｇ（９３％）であった。1H NMR ((CD3)2SO, ppm): 0.83 (t, 3H, J=7.5 Hz), 2.10 (s, 3H), 3.83 (m, 2H), 4.93 (s, 2H), 6.41 (m, 1H), 6.55 (m, 1H), 6.95-7.02 (m, 3H), 7.29 (m, 1H), 7.72 (m, 1H), 7.89 (m, 1H), 8.19 (m, 1H), 10.52 (s, 1H).
ｍ）  ２−（６−カルボニルメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−［３−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）プロピオニルアミノ］安息香酸エチルエステル（式Ｅの化合物）。
【００８０】
ＴＦＡ（２．０ｇ、１．３ｍｌ）を、室温で、エステルｇ）（７８２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２．０ｇ、１．５ｍｌ）溶液に添加した。３時間後、ＤＣＭおよびＴＦＡを蒸発させ、残留物をＥｔ２Ｏで希釈し、形成された固体沈殿物を濾過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、乾燥させて所望の酸７０４ｍｇ（９７％）が得られた。1H NMR ((CD3)2SO, ppm): 0.85 (t, 3H, J=7.5 Hz), 2.58 (m, 2H), 3.39 (m, 2H), 3.93 (m, 2H), 4.32 (m, 1H), 4.66 (m, 2H), 4.87 (s, 2H), 6.21 (m, 1H), 6.24 (s, 1H),  6.40 (m, 1H), 6.50-6.59 (m, 3H), 6.69 (m, 1H), 6.70 (m, 1H), 7.15 (m, 1H), 7.26-7.39 (m, 4H), 7.64 (m, 2H), 7.88 (m, 1H), 7.89 (m, 2H), 10.49 (s, 1H).
ｎ）  ２−（６−カルボニルメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−４−［３−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）プロピオニルアミノ］安息香酸エチルエステル（式Ｅの化合物）
このような化合物は、エステルｈ）から開始したことを除き、ｍ）の合成に使用される場合と同じ方法によって得られ、収量は６９０ｍｇ（９５％）であった。1H NMR ((CD3)2SO, ppm): 0.85 (t, 3H, J=7.5 Hz), 2.36 (m, 2H), 3.23 (m, 2H), 3.92 (m, 2H), 4.25 (m, 1H), 4.51 (m, 2H), 4.85 (s, 2H), 6.21 (m, 1H), 6.33(s, 1H), 6.44 (m, 1H), 6.80 (m, 1H), 6.83-6.95 (m, 3H), 7.15 (m, 1H), 7.22 (m, 2H), 7.26-7.42 (m, 4H), 7.64 (m, 2H), 7.85 (m, 2H), 10.50 (s, 1H).
ｏ）  ２−（６−カルボニルメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−（２−｛［２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）エチルカルバモイル］メトキシ｝アセチルアミノ］安息香酸エチルエステル（式Ｅの化合物）。
【００８１】
ＴＦＡ（２．０ｇ、１．３ｍｌ）を、室温で、エステルｉ）（８７ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２．０ｇ、１．５ｍｌ）溶液に添加した。３時間後、ＤＣＭおよびＴＦＡを蒸発させ、残留物をＥｔ２Ｏで希釈し、形成された固体沈殿物を濾過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、乾燥させて所望の酸７７ｍｇ（９５％）が得られた。1H NMR ((CD3)2SO, ppm): 0.85 (t, 3H, J=7.5 Hz), 3.07 (m, 2H), 3.15 (m, 2H), 3.95 (m, 2H), 4.04 (s, 2H), 4.16 (m, 1H), 4.19 (s, 2H), 4.26 (m, 2H), 4.85 (s, 2H), 6.32 (m, 1H), 6.43 (m, 1H), 6.94-7.00 (m, 3H), 7.26 (m, 1H), 7.24-7.36 (m, 4H), 7.64 (m, 2H), 7.78 (m, 1H), 7.86 (m, 2H), 8.01 (m, 1H), 8.28 (m, 1H), 10.49 (s, 1H).
ｐ）  ２−（６−カルボニルメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−４−（２−｛［２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）エチルカルバモイル］メトキシ｝アセチルアミノ］安息香酸エチルエステル（式Ｅの化合物）
この化合物は、エステルｊ）から開始したことを除き、ｏ）の合成に使用される場合と同じ方法によって得られ、収量は７３ｍｇ（９０％）であった。1H NMR ((CD3)2SO, ppm): 0.87 (t, 3H, J=7.5 Hz), 3.05 (m, 2H), 3.15 (m, 2H), 3.93 (m, 2H), 4.02 (s, 2H), 4.18 (m, 1H), 4.19 (s, 2H), 4.25 (m, 2H), 4.86 (s, 2H), 6.42 (m, 1H), 6.53 (m, 1H), 6.93-6.99 (m, 3H), 7.25 (m, 1H), 7.29-7.40 (m, 4H), 7.64 (m, 2H), 7.80 (m, 1H), 7.85 (m, 2H), 7.99 (m, 1H), 8.18 (m, 1H), 10.51 (s, 1H).
実施例２：本発明によるフルオレセイン化合物の物理化学特性決定
式Ｅの化合物ｋ）（色素１５）および化合物ｌ）（色素１６）を、実施例１に述べたように合成し、合成フルオレセイン化合物の光化学特性について、式（Ｉ）の化合物のモデルとして使用した。実際、本発明ｍ）〜ｐ）によるフルオレセイン化合物は、モデル化合物ｋ）およびｌ）と同じ蛍光体核構造を有し、したがって類似の光化学特性を有すると予測される。
【００８２】
ａ）ＵＶ吸収スペクトル
標準のＵＶ−可視および蛍光スペクトルを、ｐＨ９．８の５０ｍＭ四ホウ酸ナトリウム緩衝液中で、蛍光化合物の濃度０．５〜１０μＭで記録した。この蛍光化合物の蛍光量子収率を、Ａｄａｍｃｚｙｋら（前記引用した）により記載されているように、参照試料としてフルオレセインのアルカリ性溶液（φ＝０．９２）（全て前記引用した、Ｌｏｈｓｅら、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｋｌｏｎｉｓら、およびＭａｒｔｉｎら）を使用して決定した。
【００８３】
化合物ｋ）（灰色線）、化合物ｌ）（黒線）およびフルオレセイン（灰色点線）の吸光度および蛍光スペクトルを例示する図１Ａに示すように、化合物ｋ）とｌ）の双方のＵＶ−可視吸光度スペクトルは、４５６ｎｍおよび４８１ｎｍで２つの吸光度極大点を示す。４８１ｎｍでの極大点は、フルオレセインの４９０ｎｍでの吸光度極大点に対応し、このことは、これらの蛍光体を励起させるために同じ光源を使用できることを示す。短波長側の４５６ｎｍでの極大点は、３−Ｏ−フルオレセインエーテルに特徴的なものであり（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｓｐｅｃｔｓ，１９９８，１４２，４９−５７）、２’−エステル（前記引用した、Ｌｏｈｓｅら、Ａｄａｍｃｚｙｋら）または２’−２級アミド残基（前記引用したＧｏａら）を有する様々なフルオレセインエーテルの吸光度スペクトルにおいて認められている。
【００８４】
また、４５６ｎｍで測定される、ｋ）についてのモル吸光係数（２．２×１０４Ｌ・ｍｏｌ−１・ｃｍ−１）およびｌ）についてのモル吸光係数（２．３×１０４Ｌ・ｍｏｌ−１・ｃｍ−１）は、３−Ｏ−アルキルフルオレセイン２’−エステルについて報告された値（（前記引用した）Ａｄａｍｃｚｙｋらの２．０〜３．５×１０４Ｌ・ｍｏｌ−１・ｃｍ−１）に近接している。これは、４−または５−アミド基の存在が、３−Ｏ−アルキルフルオレセインの電子特性には大して影響を及ぼさないことを意味する。
【００８５】
化合物ｋ）およびｌ）の蛍光発光スペクトルは、フルオレセインの蛍光発光スペクトル（λｍａｘ＝５１２ｎｍ）に比して幅が広がり、レッドシフトしている（λｍａｘ＝５２０ｎｍ）。ｋ）について測定される蛍光量子収率（φ＝０．１９）およびｌ）についての蛍光量子収率（φ＝０．１８）は、フルオレセインのジアニオンの量子収率（φ＝０．９２〜０．９３）（Ｋｌｏｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ  ｃｉｔｅｄ；Ｆｌｅｍｍｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７７，９９，４３０６−４３１１）より著しく低く、他の３−Ｏ−アルキルフルオレセインエーテル（φ＝０．１８〜０．３１）（前記引用したＬｏｈｓｅら、Ａｄａｍｃｚｙｋら）について報告された値と一致した。
【００８６】
ｂ）ｐＨ依存性
蛍光に対するｐＨの影響を測定するために、５０ｍＭ  四ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）中の、蛍光化合物ｋ）（色素１５）またはｌ）（色素１６）の５０ｎＭ溶液を、ＨＣｌでゆっくり滴定し、ｐＨ９．８〜４で一定分量を取り、λｅｘｃ４８８ｎｍ／λｅｍ５１５ｎｍで蛍光を測定した。
【００８７】
化合物ｋ）（色素１５）（△）、化合物ｌ）（色素１６）（■）およびフルオレセイン（○）の蛍光強度のｐＨ依存性を示す図１Ｂに示すように、化合物ｋ）（色素１５）およびｌ）（色素１６）について測定された、蛍光および量子収率は、ｐＨ４．０〜１０．０の範囲内で実質的にｐＨ非依存性である。このことは、２’−エステル化により、互変異性キノイド型に捕捉された３−Ｏ−アルキルフルオレセイン誘導体にはイオン平衡が存在しないことにより説明される。２’−エステルのアルカリ加水分解安定性も、吸光度および蛍光スペクトルを追跡することによって確認した。蛍光体ｋ）（色素１５）およびｌ）（色素１６）をｐＨ９．８の水性緩衝液中で数時間インキュベーションした後、有意な変化は認められなかった。これらの蛍光体により示されるｐＨ非依存性は、様々な環境での、蛍光強度の定量化および比較を必要とする用途に有利であり、この相応しい例は、酸性細胞内コンパートメント中の蛍光測定（Ｆａｌｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８１，１０３，７３９６−７３９８；Ｇａｌｌｏｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８３，８０，３３３４−３３３８）、および蛍光基質を使用する酵素活性のｐＨ依存性の研究（Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８０，１９，５４９４−５０００；Ｆｉｏｒｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９７，４０８，８５−８８）である。
【００８８】
ｃ）光安定性
３０μｍ厚テフロン（登録商標）被膜により区分けされている、直径２ｍｍの円形ウェルを４０個有するＳｕｐｅｒ−Ｔｅｆｌｏｎスライドガラス（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、色素の光安定性の研究に使用した。ウェルを、ｐＨ９．８の５０ｍＭ四ホウ酸ナトリウム緩衝液中の、フルオレセイン化合物ｋ）（色素１５）またはｌ）（色素１６）の５μＭ溶液１μｌで満たし、カバーガラスで密閉した。
【００８９】
ウェル容量全体を、標準「フルオレセイン」フィルターセット付きの顕微鏡の下で照射した。光源からスライドの表面上に発せられた光強度を、ＣＯＨＥＲＥＮＴ  ＬａｓｅｒＣｈｅｃｋプローブを使用して測定し、４８８ｎｍで〜６ｍＷ／ｃｍ2であることがわかった。ウェル画像を、ＩＭＳＴＡＲソフトウェアで定期的に記録し、平均蛍光強度を算出した。スナップショットは、８〜１２０ｍｓかかり、この時間は、光退色速度の特性時間ｔ１／２＞１４ｓよりかなり短かった。
【００９０】
蛍光顕微鏡でシグナルが得られる条件下における、蛍光体の光安定性の比較については、この試料を、３０μｍ厚テフロン（登録商標）被膜により区分けされている、直径２ｍｍの円形ウェルを４０個含有するスライドガラスの表面上のウェル中に置いた。次いで、このウェルを、カバーガラスで密閉して、〜３８０ｎｌの容量の、円筒形の試料チャンバーを作製した。このスライドを顕微鏡ステージ上に取り付け、このウェルを、標準「フルオレセイン」フィルターセットを使用して照射した。不均一な光退色および関連するマクロディフュージョン（ｍａｃｒｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）現象を防ぐ目的として、試料チャンバー全体を照射するように対物レンズを調節した。チャンバーレベルで得られた光強度は、〜６ｍＷ／ｍｍ２と測定された。様々な時間でウェルの蛍光画像を撮り、ＩＭＳＴＡＲソフトウェア（前記引用したＫｈｏｍｙａｋｏｖａら）を使用して平均の蛍光強度を算出した。
【００９１】
化合物ｋ）（色素１５）（△）、化合物ｌ）（色素１６）（■）およびフルオレセイン（○）の色素光退色の検討を示す図１Ｃに見られるように、これらの条件下では、フルオレセインは、５０％減衰の特性時間ｔ１／２が〜１４ｓで急速に退色した。化合物ｋ）（色素１５）およびｌ）（色素１６）は、顕著な光安定性を示した。即ち、双方の蛍光体の場合、６分間の照射後、蛍光が〜１０％しか減衰しないことが認められた。
実施例３：本発明によるフルオレセイン化合物を使用する、蛍光基質の固相合成
蛍光基質の固相合成のための、本発明による合成蛍光体の有用性を実証するために、システインプロテアーゼのパパイン用蛍光基質を設計した。
【００９２】
この基質は、ペプチド配列ＧＧＦＧＬＧにより隔てられている、Ｆｍｏｃ保護蛍光化合物ｎ）とメチルレッド（ＭＲ）発色団とから構成され、Ｇ−Ｌ結合で切断される良好なパパイン基質として記載されてきた（Ｌｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２９９７−３００２）。パパインについての特異性は、Ｐ２位でのフェニルアラニンおよびＰ１’位でのロイシンによって決定される（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９６８，３２，８９８−９０２）。ＭＲ色素は、フルオレセイン誘導体の蛍光を消光するのに好適であることが示されている（ＭｃＫｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，１，２２６７−２２７５）。この基質は、ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂（２０μｍビーズ）上でのＦｍｏｃ化学によって合成した。簡潔で、可能性のあるハイスループット用途のために、本発明者らは、ビーズ上でのプロテアーゼスクリーニングの妥当性を評価した。このような異相スクリーニングアッセイの主な関心は、生体分子への樹脂透過性であり、これは、酵素に対する樹脂結合基質の接近性を決定する。ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂は、ビーズ上での酵素スクリーニングに最適ではないことが示されているが（前記引用したＬｅｏｎら）、有機媒体および水性媒体中での優れた膨潤特性、機械安定性および狭域分布などの幾つかの重要な利点を有する（Ｏｌｉｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  ２００３，４，１２４２−１２４５；Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９７，９７，４１１−４４８）。更に、ポリエチレングリコールリンカーＰＥＧ（７）は、蛍光基質をプロテアーゼ切断部により接近させるように、ペプチドとＴｅｎｔａＧｅｌの官能基との間に導入された。蛍光体ｎ）は、図２に示すように、リンカーの後に最初にカップリングした後、ペプチド配列および消光剤ＭＲをカップリングしたが、ＭＲは、この合成の最後で、リシンの側鎖にカップリングした。図２では、ペプチド配列の最初のＧは、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯによって表される。
【００９３】
ａ）基質の合成
Ｂｏｈｄａｎ  ＭｉｎｉＢｌｏｃｋシンセサイザー（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ）を使用して、基質をＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｓ  ＮＨ２樹脂（２０μｍビーズ、０．２５ｍｍｏｌ／ｇ）上に半手作業で合成した。無水ＤＣＭ中に３時間予め膨潤させた樹脂（１００ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ２ｍｌ中に再懸濁し、Ｂｏｃ−ＰＥＧ−酸（ｎ＝７）（４４ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（１６ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１７ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（３ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ０．５ｍｌ溶液を加えた。この反応液を、室温で一晩中振盪した。この樹脂を、無水ＤＭＦ（３×３ｍｌ）および無水ＤＣＭ（３×３ｍｌ）で洗浄し、酸無水物（１８μｌ、０．２ｍｍｏｌ）、ピリジン（１６μｌ、０．２ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ２ｍｌ中混合物で２時間処理した。ニンヒドリン試験で明らかなように、この手法により、樹脂上に残存する未反応アミノ基を全てキャッピングした。無水ＤＭＦおよび無水ＤＣＭで完全に洗浄し終えた後、この樹脂を、ＤＣＭ中２０％ＴＦＡで脱保護した。
【００９４】
生じたＴｅｎｔａＧｅｌ−ＰＥＧ（７）−ＮＨ２樹脂は、標準Ｆｍｏｃプロトコル（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００２）によって、基質合成に使用した。１０倍過剰量のＦｍｏｃ保護化合物を、各カップリングサイクルに２時間使用して、ペプチドカップリング反応を確実に完結させた（Ｆｍｏｃ保護蛍光アミノ酸ｎ）の場合、３倍過剰量で一晩中）。各逐次カップリングを、ニンヒドリン試験および樹脂重量測定によって検証した。ＭＲカップリングの前に、合成配列をＥｄｍａｎ配列決定法によって確認した。ＭＲを結合させるために、Ｎε−Ｂｏｃリシンをペプチド鎖に導入した。Ｎε−Ｂｏｃ保護基を、最終のＮα−Ｆｍｏｃ脱保護の前に、ＤＣＭ中２０％ＴＦＡで除去した。この樹脂を２ｍｌの無水ＤＣＭ中に再懸濁し、ＭＲ（３４ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）、ＤＩＣ（１６ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１７ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（３ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ０．５ｍｌ溶液で処理した。この反応液を室温で６時間振盪した。この樹脂を無水ＤＭＦおよび無水ＤＣＭで完全に洗浄した後、ＤＣＭ中５０％ＴＦＡで完全に脱保護した。
【００９５】
ｂ）ビーズ上でのタンパク質分解アッセイ
使用する生化学モデルに関わらず、ビーズ上でのスクリーニングアッセイは、「ポジティブ」ビーズの定量法および分析法を必要とする。本実施例では、タンパク質分解を受けやすいペプチド配列は、固相担体から切断されることにより、ＭＲ消光部分を放出し、結果として樹脂結合蛍光体の蛍光が強化されるはずである。したがって、タンパク質分解活性を検出するために、蛍光性のタンパク質分解ビーズは、プロテアーゼの官能化を受けなかった対照ビーズと区別されるはずである。
【００９６】
ビーズを、０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中で一晩中膨潤させ、遠心分離し、８ｍＭ  ＤＴＴおよび４ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する同じ該緩衝液中に再懸濁した（Ｓｚａｂｅｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．２００１，４８，９９５−１００２）。ビーズ懸濁液の試料を、０．５μＭパパインと共に２時間インキュベーションし、次いで洗浄し、蛍光について試験した。阻害剤アッセイについては、５μＭパパインストック溶液を、１ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）と共に１５分間３７℃で予めインキュベーションしてからビーズに添加した。
【００９７】
ビーズ画像処理については、ビーズ試料を、圧電分注器を使用することによりＳｕｐｅｒ−Ｔｅｆｌｏｎスライドガラス上のウェル中にスポットし、カバーガラスで密閉した。３０μｍ厚テフロン（登録商標）枠を有する、パターン化されている４０ウェルのスライドガラスを使用してビーズ溶液を区分けしたが、より高密度のフォーマット（ペルフルオロ化ガラス表面上にパターン化されている数千の親水性ウェル）も使用できる。圧電ピペットの詰まりを避けるために、ビーズを超音波パルスによって懸濁液中に保持した。これらの条件下で、ビーズ濃度に依存し、１滴当たり５〜５００個である、ビーズの幾分均一な分注を達成し得た。ビーズの蛍光分布測定を、カバーをせずに、配列された液滴中で実施したが、蒸発を防ぐために、グリセロールをビーズ懸濁液に添加すべきである。
【００９８】
ビーズ結合基質のタンパク質分解は、マイクロアレイスキャナまたは蛍光顕微鏡を使用することによって測定する。４８８ｎｍアルゴンイオンレーザーおよび５１２ｎｍ発光フィルター（５１２ＢＰ）を使用してＧｅｎｅＴＡＣ  ＬＳ  ＩＶスキャナ上でスキャンを行う。通常の装置設定は、ゲイン＝２６．０、ブラック＝１．５、およびスキャン分解能５μｍであった。得られた画像を、Ｇｅｎｅｐｉｘ  Ｐｒｏ  ４．０ソフトウェアで分析した。顕微鏡測定を、標準「フルオレセイン」フィルターセット付のＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１蛍光顕微鏡で実施した。２００個のビーズのランダム母集団を各試料について分析した。
【００９９】
図３Ａは、２つのビーズ母集団の５μｍ分解能スキャナ画像を示す：０．５μＭパパイン（「パパイン」と印した）またはＮＥＭ阻害パパイン（「対照」と印した）と共にインキュベーションした蛍光性パパイン基質を有する２０μｍ  ＴｅｎｔａＧｅｌビーズ。
【０１００】
自動化蛍光顕微鏡は、フルオレセインフィルターセットで得られるビーズの蛍光顕微鏡写真の図３Ｂ、および図３Ｂの場合と同じビーズ母集団の明視野像を示す図３Ｃに示すように、ビーズ母集団内での輝度変動に関して正確なデータを与える。これらの結果は、パパインと共にインキュベーションしたビーズが、対照ビーズより著しく明るくスキャナ画像上に現れたことを明確に実証している。
【０１０１】
個別のビーズを、ＩＭＳＴＡＲソフトウェアを使用して自動的に局在化させ、蛍光強度を測定した。データを、所与の強度範囲内に蛍光を有するビーズ母集団の比率（％）を表すヒストグラムに変換した。これらの定量データにより、目視試験では不可能である、ビーズ輝度の小さな変化を検知できる。これらの結果を、対照およびパパイン処理ビーズ母集団（各々の場合、ビーズ２００個）におけるビーズ輝度の分布のヒストグラムを示す図３Ｄに示す。
【０１０２】
したがって、これらの２つのビーズ母集団の分析から、０．５μＭパパイン溶液と共にビーズを２時間インキュベーションした結果、平均蛍光は〜２．７倍増加し、輝度分布の標準偏差（Ｓ．Ｄ．）は幾らか増加することが示された。このようなビーズ輝度の上昇は、Ｎ−エチルマレイミド阻害パパインでは認められず、このことから、この上昇は、酵素による樹脂結合基質の切断に起因することが示唆された。したがって、Ｓ．Ｄ．の増大を通じて測定された、輝度不均一性の上昇は、基質の切断における、ビーズ間のばらつきによって説明できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１Ａは、化合物ｋ）（灰色線）、化合物ｌ）（黒線）およびフルオレセイン（灰色点線）の吸光度および蛍光スペクトルを例示する。
【図２】図２は、リンカーの後に最初にカップリングした後、ペプチド配列および消光剤ＭＲをカップリングしたものを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、２つのビーズ母集団の５μｍ分解能スキャナ画像を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、フルオレセインフィルターセットで得られるビーズの蛍光顕微鏡写真を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、図３Ｂの場合と同じビーズ母集団の明視野像を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、対照およびパパイン処理ビーズ母集団（各々の場合、ビーズ２００個）におけるビーズ輝度の分布のヒストグラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【国際調査報告】
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