(57)【要約】【課題】膵臓β細胞増殖及び／又はインスリン分泌に関与する新規なタンパク質、それをコードする核酸及び構築物、並びにそれを含む細胞の提供。ＴＭＥＭ２７タンパク質の診断及び治療用途へのその使用の提供。【解決手段】ＴＭＥＭ２７タンパク質をコードする遺伝子調節領域を含んでなる単離された核酸であって、前記調節領域が少なくとも１つのＴｃｆ１タンパク質に対する高親和性結合部位を含んでなる単離された核酸。分泌型のＴＭＥＭ２７タンパク質を含んでなる単離されたポリペプチド。またそれらを用いた膵臓β細胞量を増加させる方法、患者の糖尿病を阻害、抑制又は治療する方法、患者の膵島量を評価する方法、ＴＭＥＭ２７タンパク質と相互作用するタンパク質又はその分泌型タンパク質を同定する方法、患者の代謝を変化させる方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＭＥＭ２７タンパク質をコードする遺伝子調節領域を含んでなる単離された核酸であって、前記調節領域が少なくとも１つのＴｃｆ１タンパク質との高親和性結合部位を含んでなる単離された核酸。
【請求項２】
前記調節領域が配列番号１０又は１１に一致するか、又は相同性を有する核酸配列を有する、請求項１記載の単離された核酸。
【請求項３】
前記結合部位が配列番号１２、１３、１４又は１５に一致するか、又は相同性を有する核酸配列を含んでなる、請求項１記載の単離された核酸。
【請求項４】
請求項１記載の核酸を含んでなる細胞。
【請求項５】
前記細胞が膵臓β細胞である、請求項４記載の細胞。
【請求項６】
請求項１記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項７】
分泌型のＴＭＥＭ２７タンパク質を含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが約２５ｋＤａであり、配列番号１６に一致するか、又は相同性を有する配列のＮ末端断片を含んでなるポリペプチド。
【請求項８】
膵臓β細胞量を増加させる方法であって、膵臓β細胞又は膵臓β細胞への分化を誘導されうる細胞を、ＴＭＥＭ２７ポリペプチドと接触させることと、β細胞の増殖に適する条件を設定することを含んでなる方法。
【請求項９】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでの接触に供される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｖｏでの接触に供される、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が幹細胞又は前駆細胞である、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が糖尿病に罹患する患者又は糖尿病体質の患者から単離される、請求項８記載の方法。
【請求項１３】
前記患者に前記細胞を投与する処理を更に含んでなる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が前記患者に関して自己由来であるか又は同種由来である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴＭＥＭ２７ポリペプチドが全長タンパク質又はその断片を含んでなる、請求項８記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞をプロテアーゼ阻害剤と接触させる処理を更に含んでなる、請求項８記載の方法。
【請求項１７】
前記プロテアーゼ阻害剤がセリンプロテアーゼ阻害剤又はメタロプロテアーゼ阻害剤である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記プロテアーゼ阻害剤がＢＢ９４である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞をＴｃｆ１タンパク質又は前記Ｔｃｆ１タンパク質をコードする核酸と接触させる処理を更に含んでなる、請求項８記載の方法。
【請求項２０】
膵臓β細胞量を増加させる方法であって、膵臓β細胞又は膵臓β細胞への分化を誘導されうる細胞を、ＴＭＥＭ２７ポリペプチドをコードする核酸と接触させることと、前記核酸の発現に好適な条件を設定することを含んでなる方法。
【請求項２１】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでの接触に供される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｖｏでの接触に供される、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が幹細胞又は前駆細胞である、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が糖尿病に罹患する患者又は糖尿病体質の患者から単離される、請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
前記患者に前記細胞を投与する処理を更に含んでなる、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が前記患者に関して自己由来であるか又は同種由来である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記ＴＭＥＭ２７ポリペプチドが全長タンパク質又はその断片を含んでなる、請求項２０記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞をプロテアーゼ阻害剤と接触させる処理を更に含んでなる、請求項２０記載の方法。
【請求項２９】
前記プロテアーゼ阻害剤がセリンプロテアーゼ阻害剤又はメタロプロテアーゼ阻害剤である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記プロテアーゼ阻害剤がＢＢ９４である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞をＴｃｆ１タンパク質又は前記Ｔｃｆ１タンパク質をコードする核酸と接触させる処理を更に含んでなる、請求項２０記載の方法。
【請求項３２】
膵臓β細胞量を増加させる方法であって、膵臓β細胞又は膵臓β細胞への分化を誘導されうる細胞を、ＴＭＥＭ２７ポリペプチド又はそのＴＭＥＭ２７ポリペプチドをコードする核酸と接触させることと、β細胞の増殖に適する条件を設定することを含んでなる方法。
【請求項３３】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでの接触に供される、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｖｏでの接触に供される、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が幹細胞又は前駆細胞である、請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が前記患者におけるインスリン分泌を促進する、請求項３２記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が、糖尿病に罹患する患者又は糖尿病の体質を有する患者から単離されるか、当該患者に投与されるか、又はそれらの組み合わせである、請求項３２記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞が前記患者に関して自己由来であるか又は同種由来である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記ＴＭＥＭ２７ポリペプチドが全長タンパク質又はその断片を含んでなる、請求項３２記載の方法。
【請求項４０】
前記ＴＭＥＭ２７ポリペプチドが全長タンパク質又はその断片を含んでなる、請求項３２記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞をプロテアーゼ阻害剤と接触させる処理を更に含んでなる、請求項３２記載の方法。
【請求項４２】
前記プロテアーゼ阻害剤がセリンプロテアーゼ阻害剤又はメタロプロテアーゼ阻害剤である、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記プロテアーゼ阻害剤がＢＢ９４である、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞をＴｃｆ１タンパク質又は前記Ｔｃｆ１タンパク質をコードする核酸と接触させる処理を更に含んでなる、請求項３２記載の方法。
【請求項４５】
前記患者がインスリン抵抗性又はインスリン分泌低下に罹患する、請求項３２記載の方法。
【請求項４６】
前記患者が糖尿病患者又は糖尿病の体質の患者である、請求項３２記載の方法。
【請求項４７】
前記患者にスルホニル尿素、レプチン、メグリチナイド、ビグアナイド、チアジアゾリジンジオン、α−グルコシダーゼ阻害剤又はそれらの組み合わせを投与する処理を更に含んでなる、請求項３２記載の方法。
【請求項４８】
患者の糖尿病を阻害、抑制又は治療する方法であって、膵臓β細胞又は膵臓β細胞への分化を誘導されうる細胞を、ＴＭＥＭ２７ポリペプチド又はＴＭＥＭ２７ポリペプチドをコードする核酸と接触させることを含んでなる方法。
【請求項４９】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでの接触に供される、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｖｏでの接触に供される、請求項４８記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞が幹細胞又は前駆細胞である、請求項４８記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞が、糖尿病に罹患する患者又は糖尿病の体質を有する患者から単離されるか、当該患者に投与されるか、又はそれらの組み合わせである、請求項４８記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞が前記患者に関して自己由来であるか又は同種由来である、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞が前記患者のβ細胞増殖、インスリン分泌又はそれらの組み合わせを活性化する、請求項４８記載の方法。
【請求項５５】
前記ＴＭＥＭ２７ポリペプチドが全長タンパク質又はその断片を含んでなる、請求項４８記載の方法。
【請求項５６】
前記核酸が全長ＴＭＥＭ２７タンパク質又はその断片をコードする、請求項４８記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞をプロテアーゼ阻害剤と接触させる処理を更に含んでなる、請求項４８記載の方法。
【請求項５８】
前記プロテアーゼ阻害剤がセリンプロテアーゼ阻害剤又はメタロプロテアーゼ阻害剤である、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
前記プロテアーゼ阻害剤がＢＢ９４である、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞をＴｃｆ１タンパク質又は前記Ｔｃｆ１タンパク質をコードする核酸と接触させる処理を更に含んでなる、請求項４８記載の方法。
【請求項６１】
前記患者がインスリン抵抗性又はインスリン分泌低下に罹患する、請求項４８記載の方法。
【請求項６２】
前記患者が糖尿病の体質の患者である、請求項４８記載の方法。
【請求項６３】
前記患者が若年性糖尿病（ＭＯＤＹ）に罹患する、請求項４８記載の方法。
【請求項６４】
前記患者にスルホニル尿素、レプチン、メグリチナイド、ビグアナイド、チアジアゾリジンジオン、α−グルコシダーゼ阻害剤又はそれらの組み合わせを投与する処理を更に含んでなる、請求項４８記載の方法。
【請求項６５】
患者の膵島量を評価する方法であって、前記患者の血清中のＴＭＥＭ２７濃度を測定することと、前記濃度とコントロールのそれとを比較することを含んでなる方法。
【請求項６６】
ＴＭＥＭ２７タンパク質と相互作用するタンパク質又はその分泌型タンパク質を同定する方法であって、ＴＭＥＭ２７ポリペプチドと標的分子とを、所定時間、前記ポリペプチドと前記分子との間の特異的な相互作用が十分可能となる条件下で接触させ、前記標的分子を同定することを含んでなる方法。
【請求項６７】
膵臓β細胞量を増加させる方法であって、膵臓β細胞若しくは膵臓β細胞への分化を誘導されうる細胞であってＴＭＥＭ２７を発現するか若しくは発現を誘導されうる細胞を、セリンプロテアーゼ阻害剤又はメタロプロテアーゼ阻害剤と接触させることと、β細胞増殖に適する条件を設定することを含んでなる方法。
【請求項６８】
前記プロテアーゼ阻害剤が、ＢＢ９４（ＨＯＮＨ−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−ＦＡ−ＮＨ２）（ＯＡ−Ｈｙ、シス−Ｐ−オクタデセノイル−Ｎ−ヒドロキシルアミド、オレオイル−Ｎ−ヒドロキシルアミド）、｛Ｎ−［［（４，５−ジヒドロ−５−チオキソ−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル］−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル｝、｛ａ−［［［４，５−ジヒドロ−５−チオキソ−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル］アミノ］−（２−ピリジル）ピペラジニル）−（Ｓ）−ベンゼンプロパンアミド｝、｛（２Ｒ）−２−［（４−ビフェニルイルスルホニル）アミノ］−３−フェニルプロピオン酸｝、｛（２Ｒ）−［アミノ（４−ビフェニルイルスルホニル）］−Ｎ−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオンアミド｝、Ｈ−Ｃｙｓ１−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ１０−ＯＨ（ＳＢ−３ＣＴ）、（Ａｃ−ＲＣＧＶＰＤ−ＮＨ２、ストロメリシン−１阻害剤）、［Ｎ−イソブチル−Ｎ−（４−メトキシフェニルスルホニル）−グリシルヒドロキサミン酸、ＮＮＧＨ］、｛Ｎ−［［４，５−ジヒドロ−５−チオキソ−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル］−Ｌ−フェニルアラニン｝、｛ａ−［［［４，５−ジヒドロ−５−チオキソ−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル］アミノ］−Ｎ−（シクロヘキシルメチル）−（Ｓ）−ベンゼンプロパンアミド｝、４−ジベンゾフラン−２¢−イル−４−ヒドロキシイミノ酪酸）、［４−（４¢−ビフェニル）−４−ヒドロキシイミノ酪酸］、｛（３Ｒ）−（＋）−［２−（４−メトキシベンゼンスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−ヒドロキシサメート］｝、｛（３Ｓ）−（＋）−［２−（４−メトキシベンゼンスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−ヒドロキサメート］｝、［Ｎ−ヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）スルホニル−４−（４−ビフェニルカルボニル）ピペラジン−２−カルボキサミド］、［Ｎ−ヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）スルホニル−４−ベンジルオキシカルボニルピペラジン−２−カルボキサミド］、（１，１０−フェナントロリン一水和物）、マリマスタット、プリノマスタット、タノマスタット、ネオバスタット、ゾレドロン酸又はそれらの組み合わせである、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
前記プロテアーゼ阻害剤がＢＢ９４である、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
患者の代謝を変化させる方法であって、膵臓β細胞若しくは膵臓β細胞への分化を誘導されうる細胞であってＴＭＥＭ２７を発現するか若しくは発現を誘導されうる細胞を、セリンプロテアーゼ阻害剤又はメタロプロテアーゼ阻害剤と接触させることを含んでなる方法。
【請求項７１】
前記プロテアーゼ阻害剤が、ＢＢ９４（ＨＯＮＨ−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−ＦＡ−ＮＨ２）、（ＯＡ−Ｈｙ、シス−９−オクタデセノイル−Ｎ−ヒドロキシルアミド、オレオイル−Ｎ−ヒドロキシルアミド）、｛Ｎ−［［（４，５−ジヒドロ−５−チオキソ−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル］−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル｝、｛ａ−［［［４，５−ジヒドロ−５−チオキソ−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル］アミノ］−（２−ピリジル）ピペラジニル）−（Ｓ）−ベンゼンプロパンアミド｝、｛（２Ｒ）−２−［（４−ビフェニルイルスルホニル）アミノ］−３−フェニルプロピオン酸｝、｛（２Ｒ）−［アミノ（４−ビフェニルイルスルホニル）］−Ｎ−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオンアミド｝、Ｈ−Ｃｙｓ１−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ１０−ＯＨ（ＳＢ−３ＣＴ）、（Ａｃ−ＲＣＧＶＰＤ−ＮＨ２、ストロメリシン−１阻害剤）、［Ｎ−イソブチル−Ｎ−（４−メトキシフェニルスルホニル）−グリシルヒドロキサミン酸、ＮＮＧＨ］｛Ｎ−［［４，５−ジヒドロ−５−チオキソ−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル］−Ｌ−フェニルアラニン｝、｛ａ−［［［４，５−ジヒドロ−５−チオキソ−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル］アミノ］−Ｎ−（シクロヘキシルメチル）−（Ｓ）−ベンゼンプロパンアミド｝、４−ジベンゾフラン−２¢−イル−４−ヒドロキシイミノ酪酸）、［４−（４¢−ビフェニル）−４−ヒドロキシイミノ酪酸］、｛（３Ｒ）−（＋）−［２−（４−メトキシベンゼンスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−ヒドロキシサメート］｝、｛（３Ｓ）−（＋）−［２−（４−メトキシベンゼンスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−ヒドロキサメート］｝、［Ｎ−ヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）スルホニル−４−（４−ビフェニルカルボニル）ピペラジン−２−カルボキサミド］、［Ｎ−ヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）スルホニル−４−ベンジルオキシカルボニルピペラジン−２−カルボキサミド］、（１，１０−フェナントロリン一水和物）、マリマスタット、プリノマスタット、タノマスタット、ネオバスタット、ゾレドロン酸又はそれらの組み合わせである、請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
前記プロテアーゼ阻害剤がＢＢ９４である、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
患者の糖尿病を阻害、抑制又は治療する方法であって、膵臓β細胞若しくは膵臓β細胞への分化を誘導されうる細胞であってＴＭＥＭ２７を発現するか若しくは発現を誘導されうる細胞を、セリンプロテアーゼ阻害剤又はメタロプロテアーゼ阻害剤と接触させることを含んでなる方法。
【請求項７４】
前記プロテアーゼ阻害剤がＢＢ９４又はそれらの組み合わせである、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
前記プロテアーゼ阻害剤がＢＢ９４である、請求項７４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は膵臓β細胞増殖及び／又はインスリン分泌に関与する新規なタンパク質、それをコードする核酸及び構築物、並びにそれを含む細胞の提供に関する。本発明はまた、ＴＭＥＭ２７タンパク質の診断及び治療用途への使用の提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓β細胞過形成は、生理学的な成長の間、及び肥満時において、正常血糖を維持するための重要な適応機構である。これまでの研究成果から考察すると、β細胞の量は通常変動し、またインスリン抵抗及び妊娠時にインスリン分泌が必要となる際にはβ細胞量が急速かつ顕著に変化しうることが示唆される。β細胞量は、β細胞の増殖（複製）とβ細胞死（アポトーシス）によって制御されるが、そのβ細胞量を制御する因子（分子レベル）に関しては未だ明らかでない。β細胞量がいかに制御されるかを理解することが、インスリン耐性状態における膵臓β細胞損失を防止し、また１型糖尿病におけるβ細胞移植に応用するための合理的手法の設計にとり重要である。
【０００３】
増殖の際、β細胞は膵臓の源となる細胞集団から発生する。元となる細胞から分化するβ細胞は有糸分裂後の細胞であり、また直接の子孫細胞の標識方法（ｌｉｎｅａｇｅ  ｔｒａｃｉｎｇ）により解析した結果、その元となる細胞集団が、胚形成を通じて維持され、新規なβ細胞の分化を可能にすることが示されている。新生児期には、新規なβ細胞は分化したβ細胞の複製により生じ、β細胞量の増大による塊が形成される。成人期には、必要性が増加しない限りβ細胞数にはほとんど増加しない。齧歯動物及びヒトの妊娠中には、β細胞の著しい過形成が観察される。これは、胎盤乳汁分泌ホルモン（ＰＬ）、プロラクチン（ＰＲＬ）及び成長ホルモン（ＧＨ）に曝露されたβ細胞が更に有糸分裂を行うことに起因する。病理学的なインスリン耐性症状における増殖刺激シグナルは十分に知られていない。
【０００４】
幾つかのインスリン抵抗及び糖尿病（例えばインスリン受容体基質−１（ＩＲＳ−１）の遺伝子の不活化又はインスリン受容体及びＩＲＳ−１の二重異種接合体（ＤＨ）ノックアウトにより作製されるｏｂ／ｏｂ及びｄｂ／ｄｂマウス又は変異体マウス）のマウスモデルでは、著しい膵島過形成を示す。対照的に、ＩＲＳ２機能の損失によりβ細胞の劇的な減少及び糖尿病に至る。グルコース自体β細胞複製を刺激することが公知であるが、上記のマウスモデルの多くでは検出可能な高血糖の発症前にそれらの総膵島量が増加する。更にほとんどの場合、過形成反応は高血糖のレベルとは関係なく、それはグルコースとは別の何らかの因子が膵島成長に関与していることを示唆する。
【０００５】
発生期における内分泌膵臓の増殖は多くの転写制御因子に依存し、それらは非常に特異的で、かつ空間的な発現パターンを示し、その結果細胞分化のメカニズムが制御される。初期の膵臓発生の間、内分泌前駆細胞のホルモン生成膵島細胞への細胞運命決定及び分化は、特異的な転写制御因子の経時的な発現によって高度に制御される。これらの因子の発現もまた、成人期の通常の膵臓β細胞機能の維持にとり重要である。例えば、幾つかの転写制御因子の突然変異により若年性糖尿病（ＭＯＤＹ）と呼ばれる２型糖尿病のサブタイプが生じ、それは常染色体優位な遺伝、若年における疾患−発症及びインスリン分泌における漸進性障害を伴う顕著な高血糖の進行を特徴とする。最も一般的な形態のＭＯＤＹは、肝細胞核因子（Ｔｃｆ１）をコードする遺伝子の突然変異によって生じる。Ｔｃｆ１機能の損失をもつ変異体マウス、並びに膵臓β細胞において天然のドミナントネガティブなヒトＨＮＦ−１（Ｐ２９１ｆｓｉｎｓＣ）を発現するトランスジェニックマウスでは、障害性のグルコース刺激によるインスリン分泌を原因とする、加齢に伴う漸進的な高血糖を示す。これらのマウスは、β細胞数、増殖速度及び膵臓におけるインスリン含有量の漸進的な減少を示す。これらのデータはＴｃｆ−１標的遺伝子もまた、通常のβ細胞量の維持に不可欠ことを示唆するが、それらの特性は未知である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は膵臓β細胞増殖及び／又はインスリン分泌に関与する新規なタンパク質、それをコードする核酸及び構築物、並びにそれを含む細胞の提供に関する。本発明はまた、ＴＭＥＭ２７タンパク質の診断及び治療用途への使用の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一実施態様では、本発明はＴＭＥＭ２７タンパク質をコードする遺伝子調節領域を含んでなる単離された核酸であって、前記調節領域が少なくとも１つのＴｃｆ１タンパク質に対する高親和性結合部位を含んでなる単離された核酸の提供に関する。一実施態様では、当該調節領域は、配列番号１０又は１１に一致するか、又はそれらとの相同性を有する核酸配列を有する。他の実施態様では、当該結合部位は、配列番号１２、１３、１４又は１５に一致するか、又はそれらとの相同性を有する核酸配列を含んでなる。他の実施態様では本発明の核酸を含んでなる細胞、又は他の実施態様では本発明の核酸を含んでなるベクターに関する。
【０００８】
本発明の他の実施態様は、分泌型のＴＭＥＭ２７タンパク質を含んでなる単離されたポリペプチドの提供に関し、前記ポリペプチドは約２５ｋＤａのサイズであり、配列番号１６の配列に対応するか、又はそれとの相同性を有する配列のＮ末端断片を有する。
【０００９】
本発明の他の実施態様は、膵臓β細胞量を増加させる方法の提供に関し、前記方法は膵臓β細胞又は膵臓β細胞への分化を誘導されうる細胞を、ＴＭＥＭ２７ポリペプチドと接触させることと、β細胞の増殖に適する条件を設定することを含んでなる。
【００１０】
本発明の他の実施態様は、膵臓β細胞量を増加させる方法の提供に関し、前記方法は、膵臓β細胞又は膵臓β細胞への分化を誘導されうる細胞を、ＴＭＥＭ２７ポリペプチドをコードする核酸と接触させることと、これらの核酸の発現に適する条件を設定することを含んでなる。
【００１１】
本発明の他の実施態様は、膵臓β細胞量を増加させる方法の提供に関し、前記方法は、膵臓β細胞又は膵臓β細胞への分化を誘導されうる細胞を、ＴＭＥＭ２７ポリペプチド又はそのＴＭＥＭ２７ポリペプチドをコードする核酸と接触させることを含んでなる。
【００１２】
本発明の他の実施態様では、患者の糖尿病を阻害、抑制又は治療する方法の提供に関し、前記方法は、膵臓β細胞又は膵臓β細胞への分化を誘導されうる細胞を、ＴＭＥＭ２７ポリペプチド又はＴＭＥＭ２７ポリペプチドをコードする核酸と接触させることを含んでなる。
【００１３】
本発明の他の実施態様は、患者の膵島量を評価する方法の提供に関し、前記方法は、前記患者の血清中のＴＭＥＭ２７濃度を測定することと、前記濃度とコントロールのそれとを比較することを含んでなる。
【００１４】
本発明の他の実施態様は、ＴＭＥＭ２７タンパク質と相互作用するタンパク質又はその分泌型タンパク質を同定する方法の提供に関し、前記方法は、ＴＭＥＭ２７ポリペプチドと標的分子とを、所定時間、前記ポリペプチドと前記分子との間の特異的な相互作用が十分可能となる条件下で接触させ、前記標的分子を同定することを含んでなる。
【００１５】
本発明の他の実施態様は、膵臓β細胞量を増加させる方法の提供に関し、膵臓β細胞又は膵臓β細胞への分化を誘導されうる細胞であって、ＴＭＥＭ２７を発現するか若しくは発現を誘導されうる細胞を、セリン又はメタロプロテアーゼ阻害剤と接触させることと、前記核酸の発現に適する条件を設定することを含んでなる方法。
【００１６】
本発明の他の実施態様では、患者の代謝を変化させる方法の提供に関し、前記方法は、膵臓β細胞又は膵臓β細胞への分化を誘導されうる細胞を、セリン又はメタロプロテアーゼ阻害剤と接触させることを含んでなる。
【００１７】
本発明の他の実施態様では、患者の糖尿病を阻害、抑制又は治療する方法の提供に関し、前記方法は、膵臓β細胞又は膵臓β細胞への分化を誘導されうる細胞を、セリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼ阻害剤と接触させることを含んでなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明を十分に理解させるため、以下の詳細な説明において多数の具体的な実施態様を示す。しかしながら、これらの具体的な詳細を行わなくとも本発明の実施が可能であることは当業者にとり自明である。また、本発明が不明確になるのを避けるため、公知の方法、処理及び構成要素は詳述していない。
【００１９】
本発明の一実施態様は、膵臓β細胞特異的なタンパク質、特にβ細胞増殖及びインスリン分泌に関与する前記タンパク質の提供に関する。
【００２０】
本願明細書に記載のように、一般的な形態のＭＯＤＹは、肝細胞核因子（Ｔｃｆ１）をコードする遺伝子の突然変異によって生じる。膵臓β細胞のＴｃｆ１機能を欠損する変異体マウスでは、障害性のグルコース刺激によるインスリン分泌による、加齢に伴う漸進性の高血糖を示す。当該マウスでは、β細胞数、増殖速度及び膵臓インスリン含有量の漸進的な減少が観察され、これはＴｃｆ−１標的遺伝子が通常のβ細胞量の維持において必要となることを示すものである。本願明細書に示されるように、Ｔｃｆ１はＴＭＥＭ２７転写の直接的な活性化物質である。ＴＭＥＭ２７は、ホルモン陽性の細胞における膵臓成長の間に発現し、また成熟した膵臓では膵臓β細胞に限定されることが本発明において示されている。ＴＭＥＭ２７は糖タンパク質であることが示され、膵臓においてβ細胞によって特異的に切断、放出され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでβ細胞の複製を刺激する。
【００２１】
一実施態様では、本発明はＴＭＥＭ２７タンパク質をコードする遺伝子調節領域を含んでなる単離された核酸であって、前記調節領域が少なくとも１つのＴｃｆ１タンパク質との高親和性結合部位を含んでなる単離された核酸の提供に関する。
【００２２】
一実施態様では、用語「調節領域」とはプロモーター、特にＤＮＡ配列であって、一実施態様では、コード配列の上流側に存在し、遺伝子の構成的及び／又は制御された転写にとって重要なものを指す。
【００２３】
一実施態様では、プロモーターは内在性プロモーターであって、少なくとも１つのＴｃｆ１タンパク質との高親和性結合部位を含んでなる。他の実施態様では、プロモーターは内在性プロモーターの変異体であって、少なくとも１つのＴｃｆ１タンパク質との高親和性結合部位を含んでなる。プロモーター配列の突然変異は、Ｔｃｆ１結合を強化、又は、別の実施態様ではＴｃｆ１放出を遅延、又は別の実施態様では何らかの手段を介してＴＭＥＭ２７プロモーターへのＴｃｆ１の結合を変化させ、その転写に影響を与えるものであってもよい。他の実施態様では、かかる変異体は、結果的なＴＭＥＭ２７の発現レベルの点から、それらのプロモーター活性に関して評価される。
【００２４】
一実施態様では、調節領域は配列番号１０又は１１に一致するか、又はそれらと相同性を有する核酸配列を有する。
【００２５】
本発明において使用する核酸はいかなる公知技術（例えば合成又は組換え方法）で調製してもよい。当該核酸は、公知技術によって、生物物理学的若しくは生理学的特性を変化させるために更に修飾してもよい。例えば、核酸を修飾して、ヌクレアーゼに対する安定性を増加させてもよく（例えばエンドキャッピング）、また親油性、可溶性又は相補的配列との結合アフィニティを改変してもよい。これらの核酸は、ベクター、発現カセット、プロモーター配列、目的遺伝子又はそれらのいかなる組み合わせを含んでなってもよい。
【００２６】
本発明に係るＤＮＡは、公知の方法で化学的に合成してもよい。例えば、公知の方法で、４つのヌクレオチドを用いてＤＮＡの全体又は一部を化学的に合成してもよい。かかる方法の例としては、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８５）に記載の方法が挙げられる。ＤＮＡは、重なり合う二本鎖オリゴヌクレオチドを調製して、ギャップを埋め、その末端をライゲーションすることにより合成してもよい（一般法はＳａｍｂｒｏｏｋその他（１９８９）及びＧｌｏｖｅｒその他（１９９５）を参照）。タンパク質の機能性ホモログを発現するＤＮＡを、部位特異的突然変異導入（Ｚｏｌｌｅｒその他（１９８２）、Ｚｏｌｌｅｒ（１９８３）、Ｚｏｌｌｅｒ（１９８４）、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（１９９１））を用いて、野生型ＤＮＡから調製してもよい。得られたＤＮＡを、公知の方法により増幅してもよい。１つの適切な方法は、Ｓａｉｋｉら（１９８８），Ｍｕｌｌｉｓら米国特許第４６８３１９５号及びＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。
【００２７】
他の実施態様では、Ｔｃｆ１結合部位は、配列番号１２、１３、１４、１５に一致するか、又はそれらとの相同性を有する核酸配列を含んでなる。
【００２８】
本発明の他の実施態様は、本発明の核酸を含んでなる細胞、他の実施態様ではベクターの提供に関する。
【００２９】
一実施態様では、用語「ベクター」とは、当該ベクター中にサブクローニングされた目的配列を含んでなる核酸構築物を指す。
【００３０】
本発明に係るベクターの構築において、ＴＭＥＭ２７制御領域、幾つかの実施態様ではＴＭＥＭ２７コーディング配列、幾つかの実施態様では他の目的配列をコードするポリヌクレオチドを、原核細胞又は真核細胞の形質導入／形質転換に適する、及び当該形質導入／形質転換された細胞における組換え生成物の発現誘導に適する、市販のベクター系にライゲーションして導入してもよい。かかる市販のベクター系を、一般的に用いられる組換え技術により容易に修飾できることは自明であり、それにより既存のプロモーター又はエンハンサ配列を置換、複製又は変異させ、及び／又はいかなるポリヌクレオチド配列（例えば更なる選択マーカーをコードする配列、又はリポーター遺伝子をコードする配列）を導入することができる。
【００３１】
本発明に係るベクターは、別の実施態様では、適当な選択可能なマーカーを更に含んでもよい。ベクターに、更なる複製開始点を存在させてシャトルベクターとしてもよく、それにより原核及び真核生物由来の細胞の両方において複製される。又は、選択した生物のゲノム中への組み込みが可能な態様でベクターを構築してもよい。他の一実施態様では、当該ベクターは例えばプラスミド、バクミド、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルス又は人工染色体であってもよい。他の実施態様では、当該ベクターは、本発明の核酸を含んでなるウイルス粒子である。他の実施態様では、本発明は、本発明の核酸及びベクターを含んでなるリポソームの提供に関する。かかるリポソームの調製方法は公知であり、例えば国際公開第９６／１８３７２号、国際公開第９３／２４６４０号、Ｍａｎｎｉｎｏ  ａｎｄ  Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６（７）：６８２−６９１、Ｒｏｓｅ  米国特許第５２７９８３３号、国際公開第９１／０６３０９号及びＦｅｉｇｎｅｒら、（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４１３−７４１４に記載の方法が挙げられる。
【００３２】
本発明の別の実施態様では、分泌型のＴＭＥＭ２７タンパク質を含んでなる単離されたポリペプチドの提供に関し、前記ポリペプチドは約２５ｋＤａのサイズで、配列番号１６に一致する、又はそれとの相同性を有する配列のＮ末端断片を含んでなる。一実施態様では、分泌型は１４２アミノ酸を含む。別の実施態様では、分泌型はＮ末端の１００アミノ酸、又は別の実施態様では、Ｎ末端の１０５アミノ酸を含む。又は他の一実施態様では、Ｎ末端の１１０アミノ酸、又は別の実施態様では、Ｎ末端の１１５のアミノ酸、又は別の実施態様では、Ｎ末端の１２５アミノ酸、又は別の実施態様では、Ｎ末端の１３０アミノ酸、又は別の実施態様では、Ｎ末端の１３５アミノ酸、又は別の実施態様では、Ｎ末端の１４０アミノ酸、又は別の実施態様ではＮ末端の１２０アミノ酸、又は別の実施態様では、Ｎ末端の１２２アミノ酸、又は別の実施態様ではＮ末端の１２７アミノ酸、又は別の実施態様では、Ｎ末端の１１７アミノ酸、又は別の実施態様では、Ｎ末端の１０８アミノ酸を含んでなる。
【００３３】
一実施態様では、ＴＭＥＭ２７タンパク質は、ＮＣＢＩのＥｎｔｒｅｚタンパク質データベースにおいて開示される、以下のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号の１つ：ＮＰ＿０６５６５１、ＡＡＨ５０６０６、ＡＡＨ１５０９９、ＸＰ＿４１６８２１、ＡＡＨ４９９１２又はＡＡＨ１４３１７と一致する又はそれとの相同性を有する配列を有する。一実施態様では、本発明のポリペプチドは、ＴＭＥＭ２７タンパク質の位置１−１４２の部分、又は別の実施態様ではそのＮ末端断片、又は他の実施態様ではそのホモログに対応するアミノ酸を含んでなる。
【００３４】
本発明の一実施態様では、用語「相同性」、「相同物（ホモログ）」又は「相同性を有する」とは、その配列が、アミノ酸配列の場合も核酸配列の場合も、示された配列と少なくとも７０％一致することを指す。他の実施態様では、アミノ酸配列又は核酸配列が、示された配列と少なくとも７２％一致することを指す。他の実施態様では、アミノ酸配列又は核酸配列が、示された配列と少なくとも７５％一致することを指す。他の実施態様では、アミノ酸配列又は核酸配列が、示された配列と少なくとも７７％一致することを指す。他の実施態様では、アミノ酸配列又は核酸配列が、示された配列と少なくとも８０％一致することを指す。他の実施態様では、アミノ酸配列又は核酸配列が、示された配列と少なくとも８２％一致することを指す。他の実施態様では、アミノ酸配列又は核酸配列が、示された配列と少なくとも８５％一致することを指す。他の実施態様では、アミノ酸配列又は核酸配列が、示された配列と少なくとも８７％一致することを指す。他の実施態様では、アミノ酸配列又は核酸配列が、示された配列と少なくとも９０％一致することを指す。他の実施態様では、アミノ酸配列又は核酸配列が、示された配列と少なくとも９２％一致することを指す。他の実施態様では、アミノ酸配列又は核酸配列が、示された配列と少なくとも９５％以上一致することを指す。他の実施態様では、アミノ酸配列又は核酸配列が、示された配列と９５％〜１００％一致することを指す。同様に、本願明細書では、ある特定の配列との一致性について言及するときは、本発明で定義する配列との直接的な一致の場合のみならず、相同性を有する場合も包含される。
【００３５】
用語「ポリペプチド」とは、一実施例ではタンパク質のことを指し、別の実施態様ではタンパク質断片のことを指し、更に別の実施態様ではアミノ酸配列のことを指す。一実施態様では、本発明のポリペプチドに関して「ペプチド」又は「ポリペプチド」というときは、天然のペプチド（分解生成物、合成ペプチド又は組換えペプチドのいずれも含む）及び擬態ペプチド（通常合成ペプチド）が包含され、例えばペプチドのアナログであるペプトイド及びセミペプトイドが挙げられ、それは例えば、生体内におけるペプチドの安定性、又は細胞への浸透性が高まる態様で修飾されてもよい。かかる修飾にはＮ末端、Ｃ末端又はペプチド結合の修飾（限定されないがバックボーン修飾及び残基修飾など）が含まれるが、これらに限定されず、それらのいずれも本発明の付加的な実施態様を表す。擬態ペプチドの合成方法は公知で、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，ＣＡ．Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に詳細に記載されている。
【００３６】
本願明細書に記載されているポリペプチドに対する構造的若しくは機能的相同性を有する、あらゆるアミノ酸（天然又は合成的に、いかなる手段で調製してもよい）の配列は、本発明の一部として包含されるものと理解すべきである。
【００３７】
一実施態様では、用語「相同性」とは、核酸配列に関するときは、候補配列のヌクレオチドと、それに対応する天然のヌクレオチドとで同一の核酸配列のパーセンテージを指す。
【００３８】
相同性は、従来技術において公知の方法を用いて、配列アラインメントを解析するコンピュータアルゴリズムにより決定できる。例えば、核酸又はアミノ酸配列相同性のコンピュータアルゴリズム解析は、利用可能ないかなるソフトウェアパッケージ（例えばＢＬＡＳＴ、ＤＯＭＡＩＮ、ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｕｔｉｌｉｔｙ）ＧＥＮＰＥＰＴ及びＴＲＥＭＢＬパッケージ）を利用して行ってもよい。
【００３９】
核酸の相同性を決定するその他の手段としては、候補配列とのハイブリッド形成の測定によって行ってもよく、その方法は従来技術において公知である（“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，Ｅｄｓ．（１９８５）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｖｏｌｕｍｅｓ１−３）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；及びＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙを参照）。例えばハイブリッド形成の方法は、適度条件からストリンジェントな条件において、天然のカスパーゼペプチドをコードするＤＮＡとの相補性を解析することにより行ってもよい。ハイブリッド形成条件としては例えば、４２℃で一晩にわたる、１０〜２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％のデキストラン硫酸及び２０μｇ／ｍｌ）の変性サーモン精液ＤＮＡ（せん断）を含んでなる溶液によるインキュベーションが挙げられる。
【００４０】
他の実施態様では、本発明は本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体の提供に関する。かかる抗体の生産は公知技術で、例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８に記載されている。一実施態様では、かかる抗体は当業者に周知のように機能性断片を含んでもよく、それは例えば抗体タンパク質の加水分解によって調製してもよく、又は抗体断片をコードするＤＮＡの大腸菌又は哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞培養又は他のタンパク質発現システム）における発現によって調製してもよい。
【００４１】
他の実施態様では、本発明は、本発明に係る細胞、ポリペプチド、抗体、核酸及びベクターを含んでなる組成物の提供に関する。組成物を含む製剤の具体的な有効投与量及び投与方法は、個別の用途に応じて変化させてもよい。投薬は、例えば使用するベクターのタイプ及び投与経路ルートと相関して変化しうる。
【００４２】
他の実施態様では、本発明は、本発明の核酸、ベクター又はポリペプチドを含んでなる細胞の提供に関する。一実施態様では、当該細胞は原核生物であり、別の実施態様では、当該細胞は真核生物である。細胞は本発明の単離された核酸及び／又はベクターを発現できるいかなる細胞であってもよく、それは当業者に周知である。一実施態様では、当該細胞に本発明のポリペプチドを過剰発現させてもよい。
【００４３】
他の実施態様では、当該細胞は本発明のポリペプチドに応答する。一実施態様では、当該細胞は膵臓β細胞であってもよく、又は当該細胞は膵臓β細胞に分化できる細胞であってもよい。一実施態様では、当該細胞は、ＴＭＥＭ２７へのばく露に（一実施態様では全長タンパク質で、別の実施態様では切断された分泌型タンパク質）により増殖するか、又は別の実施態様ではインスリンを分泌するか、又は別の実施態様ではその両方を行う。一実施態様では、当該細胞は最終的に分化していてもよく、又は別の実施態様では細胞分裂を行わないものであってもよい。他の実施態様では、当該細胞は細胞分裂を行う。
【００４４】
一実施態様では、本発明は核酸、ベクター、ポリペプチド、細胞及びそれらを含んでなる組成物の提供に関し、別の実施態様では、それは経口投与用に製剤化されてもよく、別の実施態様では、局所投与（例えば筋肉注射又は経真皮、エアゾール又は非経口投与）ように製剤化されてもよい。組成物は、投与方法に応じて、様々な単位用量形態で投与することができる。適切な単位用量形態としては、粉末、錠剤、ピル、カプセル、ロゼンジ、坐薬などが挙げられるが、これらに限定されない。経真皮投与は、クリームの塗布、リンス、ゲルなどによって、活性化合物を皮膚から透過させることにより行ってもよい。非経口投与経路としては、限定されないが、電気的若しくは直接注入（例えば中心静脈系への直接注入、静脈内、筋肉内、腹膜内、皮内、皮下注射）などが挙げられる。
【００４５】
本願明細書では新生児及び成人の膵臓の膵島β細胞におけるＴＭＥＭ２７発現を示し（図２）、ＴＭＥＭ２７タンパク質のＮ末端切断生成物が分泌されることを見出した（図４）。β細胞株はＴＭＥＭ２７に応答して増殖し（図６）、導入遺伝子の発現の結果としてそのタンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスでは、β細胞量の増加を示した（図７）。
【００４６】
一実施態様では、本発明は膵臓β細胞量を増加させる方法の提供に関し、当該方法はＴＭＥＭ２７ポリペプチドを細胞に接触させることを含んでなる。本発明の本態様及び一実施態様では、当該細胞は膵臓β細胞であるか、又はβ細胞増殖に適した条件を与えられることにより膵臓β細胞に誘導されうる細胞である。
【００４７】
一実施態様では、「細胞を接触させる」という用語は、本発明のペプチド、核酸又は組成物に、何らかの方法で細胞を曝露させることを指す。細胞を、従来公知の方法により本発明の化合物及び組成物と直接接触させてもよく、あるいは間接的に曝露してもよい。例えば、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培地中で増殖させること（当該培地には本発明のポリペプチド、核酸、ベクター又は組成物を添加する）は、細胞を接触させる方法の例であり、また本発明の一部と考えられる。他の実施態様では、細胞に接触させる方法としては、患者へのいかなる投与方法も包含され、例えば患者に対する本発明のペプチド、核酸、ベクター又は組成物の経口若しくは非経口投与が挙げられる。上記の投与により、体内の特異的な部位において、これらの材料でｉｎ  ｖｉｖｏで細胞が曝露される。
【００４８】
一実施態様では、接触を受ける細胞は初代培養細胞である。一実施態様では、「初代培養」とは、組織から単離された多くの異なる細胞タイプとの相互作用が可能な混合細胞集団を意味する。例えば、膵管細胞の初代培養細胞は、間充織及び上皮細胞との間で相互作用することができる。
【００４９】
他の実施態様では、初代培養細胞は、組織から単離されて精製された細胞集団であってもよい。一実施態様では、初代培養細胞は、特定の集団として純粋化されてもよい。一実施態様では、当該純粋化は、例えば蛍光測定による細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）などの公知技術の細胞ソーティング用いて、特定の細胞表面マーカーを発現するか、又は別の実施態様では特定の標識の細胞表面での発現が欠如した細胞集団をソーティングしてもよい。他の実施態様では、ｍａｎｅｔｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ方法を用いてもよく、又は別の実施態様では密度遠心分離方法（例えばフィコール・ハイパック又は蔗糖勾配分離）であってもよい。
【００５０】
一実施態様では、本発明の方法に従って接触させる細胞は幹細胞又は前駆細胞である。用語「前駆細胞」は「幹細胞」と同義的に用いられ、実施態様によっては未分化細胞を指すこともある。未分化細胞は増殖することができ、多数の母細胞を生成する能力を有する多くの前駆細胞を生じさせ、それにより分化した若しくは分化可能な娘細胞を生じさせることができる。一実施態様では、用語「前駆細胞」又は「幹細胞」は一般的な母細胞のことを指し、その子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）は、胚細胞及び組織の多様化においてみられるように、異なる形態へ分化すること（例えば全く別個の特性を得ること）によって通常特化する。細胞分化は、通常は多くの細胞分裂において生じる複雑なプロセスである。分化した細胞は多機能細胞（多機能細胞自身、及びその他の細胞に由来）から生じることもある。いずれの種類の細胞も、本発明の方法に使用でき、又は本発明の細胞を構成しうることを理解すべきである。かかる能力は先天的なものであってもよく、又は様々な因子による処理で人工的に誘導されてもよい。いずれもシナリオも、本発明の方法に使用できる、又は本発明の細胞を構成しうる細胞の一実施態様として考えられる。
【００５１】
一実施態様では、本発明の細胞、及び本発明の方法への使用に係る当該細胞は、膵臓に由来してもよく、又は膵臓細胞に分化する細胞であってもよい。一実施態様では、用語「膵臓」とは一般に、脾臓及び十二指腸との間、胃の後で横断方向に存在する大型の（細長い）ブドウ状の分泌腺のことを指す。一実施態様では、本発明の細胞には組織切片又は全組織が包含されることもあり、それらは本願明細書に記載のポリペプチド、核酸、ベクター又は組成物を含んでなる。他の実施態様では、本発明の方法には目的の細胞集団を含んでなる培養された器官、又は別の実施態様では組織切片又は組織断片が包含される。一実施態様では、ランゲルハンス島が本発明の細胞として、また本発明の方法に用いられる。一実施態様では、当該細胞はβ細胞であり、膵島細胞の６０〜８０％を構成してもよく、及び／又は本発明の方法に使用してもよい。
【００５２】
一実施態様では、当該細胞は膵臓前駆細胞である。一実施態様では、用語「膵臓前駆細胞」とは、膵臓の細胞に分化できる細胞を指し、例えば、通常膵臓細胞によって作られるホルモン又は酵素を産生できる細胞のことを指す。例えば、膵臓前駆細胞は、少なくとも部分的に、α、β、γ又はδ膵島細胞に分化されうる細胞、又は外分泌するよう運命付けられた細胞が挙げられる。本発明の膵臓前駆細胞は、細胞増殖及び分化を促進する条件下で患者への投与前に培養してもよい。これらの条件は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖及びコンフルエンスとなるように細胞を培養し、その時点で細胞が疑似膵島様の凝集又はクラスターを形成し、インスリン、グルカゴン及び／又はソマトスタチンを分泌することが可能となる条件を含んでなる。
【００５３】
一実施態様では、本発明の細胞及び本発明の方法に用いられる細胞は、実質的に純粋な細胞集団であってもよい。一実施態様では、「実質的に純粋な」という用語は、全細胞集団に対して少なくとも約６５％、又は別の実施態様では少なくとも約７０％、又は別の実施態様では少なくとも約７５％、又は別の実施態様では少なくとも約８５％、又は別の実施態様では少なくとも約９０％、又は別の実施態様では少なくとも約９５％純粋である細胞集団のことを指す。
【００５４】
様々な技術を用いて組織から細胞（区別された及び未分化な）の懸濁液を調製し、本発明の細胞及び／又は本発明の方法に用いられる細胞を構成させてもよい。幾つかの実施態様では、当該単離方法は可能な限り細胞死をもたらさない方法が好ましい。例えば、機械的手段によって細胞を外植片サンプルから取り除いてもよく、ピペットで機械的に切り取る方法が挙げられる。他の例としては、全ての外植片又はその下部から、例えば外植片の酵素分解によって前駆細胞を分離し、更に活性化された前駆細胞集団を、例えば親和性分離技術又は蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用した特異的な細胞標識に基づいて単離してもよい。細胞を遠心分離によって液体サンプル（例えば血液）から得てもよい。
【００５５】
通常、組織はいかなる適切な方法を用いて調製してもよく、例えば、切除された組織を穏やかに分離することや、又は、コラゲナーゼ（例えばコラゲナーゼＡ）で切除された組織を消化（例えばダクトによる潅流又はコラゲナーゼを含んでなる適切なｐＨ及び浸透圧のバッファーで組織を単純にインキュベート）することによって行ってもよい。調製された組織を更に任意に、適切な方法及び材料（例えばフィコール濃度勾配による遠心分離）を用いて濃縮（及び部分的精製）してもよい。濃縮された組織を更に適切な容器（例えば組織培養ガラス製品又はプラスチック製品）に再懸濁する。特定の実施態様では、膵臓組織のサンプルはコンフルエントな単層培養組織として形成され、またそこからＮＡＣｓが形成される。他の好ましい実施態様では、細胞懸濁液を非付着型の組織培養容器に添加し、前駆細胞の塊を形成させる。
【００５６】
一実施態様では、細胞が由来する組織は、成人の組織、又は胎児の組織、又はいかなる発達段階における組織であってもよい。更に、当該方法は比較的少ない量の開始原料から実施してもよい。したがって、ドナーからの小さな組織検体を用いてもよく、ドナーを犠牲にするか又は重傷を負わせることもない。本発明の前駆細胞は、増殖させた後、組織サンプルから単離してもよい。
【００５７】
ある種の実施態様では、培養組織を、例えば成長因子又は当該成長因子（例えば有糸分裂成長因子）を含んでなる組成物と接触させてもよく、当該成長因子はＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＬＩＦ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、ＨＧＦ又はヘッジホックからなる群から選択される。他の実施態様において、当該成長因子はＴＧＦβスーパーファミリーを構成するものである。幾つかの実施態様では、本発明の方法は上記したように患者に組成物を投与することを含んでなり、当該組成物は、本発明の細胞、ポリペプチド、核酸及び／又はベクターを含んでなってもよく、更に本願明細書に記載の他のいかなる添加物（例えば糖尿病治療薬、成長因子、ｃＡＭＰ濃度上昇剤など）を含んでなってもよい。
【００５８】
幾つかの実施態様では、当該細胞又は培養組織中の細胞はｃＡＭＰ濃度上昇剤又はそれを含む組成物と接触させてもよく、ｃＡＭＰ濃度上昇剤としては、８−（４−クロロフェニルチオ）−アデノシン−３’：５’−サイクリック−モノリン酸（ＣＰＴ−ｃＡＭＰ）（Ｋｏｉｋｅ  Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏ−Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．ａｎｄ  Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔ．１６  ９５−１０６（１９９２）を参照）、ＣＰＴ−ｃＡＭＰ、フォルスコリン、Ｎａブチレート、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）及び、コレラ毒素（Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２３  １２０５−１２２０（１９９２））、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、ジブチリル−ｃＡＭＰ及びジオクタノイル−ｃＡＭＰ（例えば、Ｒｙｄｅｌら、ＰＮＡＳ８５：１２５７（１９８８）を参照）が挙げられる。
【００５９】
幾つかの実施態様では、当該細胞又は培養組織中の細胞を、ステロイド又は副腎皮質ステロイド（例えばヒドロコルチゾン、デオキシヒドロコルチゾン、フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン及びパラメタゾン、又はそれを含む組成物と接触させる。一般論はＴｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１５ｔｈ  Ｅｄ．ｐｐ．１２３９−１２６７及び２４９７−２５０６，Ｂｅｒｋｏｗら編、Ｒａｈｗａｙ  ＮＪ．，１９８７に記載されている。
【００６０】
ヒトを含む動物に由来する組織を培養するための多数の組織培養用の培地が存在する。幾つかの実施態様では、当該培養培地は単純媒体、例えばダルベッコの最小栄養培地（ＤＭＥＭ）であってもよい。他の実施態様では、細胞や組織などを、５％のＦＢＳを含むＩｓｏｃｏｖｅの修飾ＭＥＭ培地で培養してもよい。他の実施態様では、細胞や組織などを、長い期間無血清培地で維持してもよい。本発明の若干の一実施態様では、培養細胞の維持のために成長因子又は他の細胞分裂促進剤をｉｎ  ｖｉｔｒｏで初代培養の培地に含有させず、その後、細胞（例えば前駆細胞）集団を増殖させるために用いてもよい。
【００６１】
他の実施態様では、幹細胞は、培養組織面への付着（直接的又は間接的な）がなされない場合に成長するため、濃厚になる。幾つかの実施態様では、幹細胞は懸濁液に浮遊し、培養容器の表面、又は接触する他の細胞又は材料との固定若しくは半固定的な接触がなされない。
【００６２】
一実施態様では、本発明の細胞を用いることにより、本発明の方法において移植可能な細胞（前駆細胞集団が分化した形の子孫細胞）の供給源を提供することとなり、又は別の実施態様では、患者細胞は、例えば分泌型ＴＭＥＭ２７などの分泌因子の産生及び精製用の膵臓細胞の培養組織の調製に使用できる。他の実施態様では、培養細胞はインスリンの供給源として調製してもよい。
【００６３】
別の実施態様では、本発明は、膵臓β細胞量を増加させる方法の提供に関し、当該方法はＴＭＥＭ２７ポリペプチドをコードする核酸と細胞を接触させることを含んでなり、前記細胞は膵臓β細胞であるか、又は前記細胞は前記核酸の発現に好都合な条件を提供されたときに膵臓β細胞に分化することができる細胞であってもよい。
【００６４】
一実施態様では、β細胞量の増加は、β細胞の増殖の増加を経て生じる。一実施態様では、β細胞量の増加により、前駆体細胞のβ細胞系への分化の促進がもたらされる。一実施態様では、β細胞量の増加は、細胞のターンオーバー又は細胞死の減少を指す。他の実施態様では、β細胞量の増加は、上述した実施態様のいかなる組合せを指す場合もある。
【００６５】
従来技術において公知の、本願明細書においても例示されるいかなる方法を使用して細胞増殖を測定してもよく、例えば標識物質（例えば３Ｈチミジン）の取り込みを測定するなどの当業者に公知の方法で測定してもよい。
【００６６】
別の実施態様では、本発明は、患者の代謝変化させる方法の提供に関し、当該方法はＴＭＥＭ２７ポリペプチド又は前記ＴＭＥＭ２７ポリペプチドをコードする核酸と細胞とを接触させることを含んでなり、前記細胞は膵臓β細胞であるか、又は前記細胞は膵臓β細胞に分化されうる細胞であってもよい。
【００６７】
代謝を変化させることは、一実施態様では代謝を増加させることを指し、一方別の実施態様では、代謝を減少させることを指す。一実施態様では、糖代謝を変化させる。一実施態様では、細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで接触に供される。他の実施態様では、細胞はｉｎ  ｖｉｖｏで接触に供される。他の実施態様では、細胞は幹細胞又は前駆細胞である。他の実施態様では、細胞は糖尿病に罹患する、又はその体質を有する患者から単離された細胞である。
【００６８】
一実施態様では、当該方法は、接触させた細胞を患者に投与する処理（例えばｅｘ  ｖｉｖｏ細胞療法）を含んでなる。一実施態様では、患者に投与される細胞は自己由来であってもよく、別の実施態様では、患者に関して同種由来であってもよい。
【００６９】
一実施態様では、当該細胞をＴＭＥＭ２７ポリペプチドと接触させ、それは全長タンパク質又はその断片であってもよい。一実施態様では、当該断片は、分泌された形のＴＭＥＭ２７タンパク質を含んでなる。他の実施態様では、分泌型のものは約２５ｋＤａのサイズであって、ＴＭＥＭ２７タンパク質の１−１４２番目のアミノ酸、又はその断片、又はそれに相応する配列を含んでなる。
【００７０】
一実施態様では、細胞をプロテアーゼ阻害剤と接触させてもよい。一実施態様では、プロテアーゼ阻害剤は、プロテアーゼ活性若しくはその発現、又はそれらの両方を抑制するか、防止するか、減弱させるか、遅延させるか又は何らかの形で変化させる分子のことを指す。
【００７１】
一実施態様では、当該プロテアーゼ阻害剤は、セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）、メタロプロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、チオプロテアーゼ阻害剤、トリプシン阻害剤、トレオニンプロテアーゼ阻害剤、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤又はそれらの組み合わせである。
【００７２】
一実施態様では、当該プロテアーゼ阻害剤としては、（ＨＯＮＨ−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−ＦＡ−ＮＨ２）、（ＯＡ−Ｈｙ、シス−９−オクタデセノイル−Ｎ−ヒドロキシルアミド、オレオイル−Ｎ−ヒドロキシルアミド）、｛Ｎ−［［（４，５−ジヒドロ−５−チオキソ−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル］−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル｝、｛ａ−［［［４，５−ジヒドロ−５−チオキソ−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル］アミノ］−（２−ピリジル）ピペラジニル）−（Ｓ）−ベンゼンプロパンアミド｝、｛（２Ｒ）−２−［（４−ビフェニルイルスルホニル）アミノ］−３−フェニルプロピオン酸｝、｛（２Ｒ）−［アミノ（４−ビフェニルイルスルホニル）］−Ｎ−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオンアミド｝、Ｈ−Ｃｙｓ１−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ１０−ＯＨ（ＳＢ−３ＣＴ）、（Ａｃ−ＲＣＧＶＰＤ−ＮＨ２、ストロメリシン−１阻害剤）、［Ｎ−イソブチル−Ｎ−（４−メトキシフェニルスルホニル）−グリシルヒドロキサミン酸、ＮＮＧＨ］｛Ｎ−［［４，５−ジヒドロ−５−チオキソ−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル］−Ｌ−フェニルアラニン｝、｛ａ−［［［４，５−ジヒドロ−５−チオキソ−１，３，４−チアジアゾル−２−イル）アミノ］カルボニル］アミノ］−Ｎ−（シクロヘキシルメチル）−（Ｓ）−ベンゼンプロパンアミド｝、４−ジベンゾフラン−２¢−イル−４−ヒドロキシイミノ酪酸）、［４−（４¢−ビフェニル）−４−ヒドロキシイミノ酪酸］、｛（３Ｒ）−（＋）−［２−（４−メトキシベンゼンスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−ヒドロキシサメート］｝、｛（３Ｓ）−（＋）−［２−（４−メトキシベンゼンスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−ヒドロキサメート］｝、［Ｎ−ヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）スルホニル−４−（４−ビフェニルカルボニル）ピペラジン−２−カルボキサミド］、［Ｎ−ヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）スルホニル−４−ベンジルオキシカルボニルピペラジン−２−カルボキサミド］、（１，１０−フェナントロリン一水和物）、マリマスタット、プリノマスタット、タノマスタット、ネオバスタット、ゾレドロン酸又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００７３】
一実施態様では、阻害剤としては、α１−抗トリプシン、α１−抗キモトリプシン、α２−抗プラスミン（一実施態様では線維素溶解の阻害剤）、抗トロンビン（一実施態様では凝固阻害剤、特に因子Ｘ、因子ＥＸ及びトロンビン）、補体１−阻害剤、ニューロセルピン（一実施態様では痴呆の公知の形態における変異）、プラスミノーゲン活性化物質阻害剤−１及び２（一実施態様では線維素溶解の阻害剤）、プロテインＺ関連のプロテアーゼ阻害剤（ＺＰＩは一実施態様では因子Ｘａ及び因子ＸＩａを不活性化する）又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００７４】
別の実施態様では、プロテアーゼ阻害剤はロイペプチン、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド塩酸（ＡＥＢＳＦ）、アプロチニン、キモスタチン、アンチトロンビンＩＨ、３，４−ジクロロイソクマリン、Ｌ−１−クロロ−３−［４−トシル−アミド］−７−アミノ−２−ヘプタノン−ＨＣｌ（ＴＬＣＫ）、ＴＰＣＫ、ジイソプロピルホスホロフルオリデート（ＤＩＦＰ）、アンチパイン、４−アミジノフェニルメタンスルホニル−フッ化物−ＨＣｌ（ＡＰＭＳＦ）、フェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、３，４−ジクロロイソクマリン（ＤＣＩ）、α−トルエンスルホニルフッ化物、ＢＢ９４、α２−マクログロブリン又はそれらの組み合わせである。
【００７５】
一実施態様では、プロテアーゼ阻害剤は、ＥＤＴＡ、バナジウム、モリブデン酸塩、１，１０−フェナントロリン、ホスホラミドン、アマスタチン、ベスタチン、アクチノニン、ジプロチン、ＢＢ９４、α２−マクログロブリン又はそれらの組み合わせである。
【００７６】
一実施態様では、プロテアーゼ阻害剤は、Ｎ−エチルマレイミド、ロイペプチン、Ｌ−トランスエポキシ−スクシニル−ロイシル−アミド−（４−グアニジノ）−ブタン（Ｅ−６４）、キモスタチン、アンチパイン、α２−マクログロブリン、ＰＭＳＦ、ＰＥＦＡＢＬＯＣ又はそれらの組み合わせである。
【００７７】
一実施態様では、プロテアーゼ阻害剤は、ペプスタチンＡ、α２−マクログロブリン又はそれらの組み合わせである。他の実施態様では、プロテアーゼ阻害剤はＢＢ９４又はバチマスタットであり、一実施態様ではセリン又はメタロプロテアーゼ阻害剤である。一実施態様では、プロテアーゼ阻害剤は可逆的であり、一方、別の実施態様では、プロテアーゼ阻害剤は不可逆的である。
【００７８】
別の実施態様では、当該細胞は、ＰＫＣ阻害剤と接触させてもよく、一実施態様では、サフィンゴル（Ｌ−スレオ−ジヒドロスフィンゴシン）、Ｒｏ−１、Ｒｏ３２−０４３２（ビスインドリルマレイミド  第三級アミン）、ＵＣＮ−０１（７−ＯＨ−スタウロスポリン）、フラボピリドール（Ｌ８６−８２７５）、ブリオスタチン１（大環状ラクトン）、ビスインドリルマレイミドＩ、ＩｎＳｏｌｕｔｉｏｎ（商標）ビスインドリルマレイミドＩ、ビスインドリルマレイミドＩ塩酸、ビスインドリルマレイミドＩＩ、ビスインドリルマレイミドＩＩＩ塩酸、ビスインドリルマレイミド阻害剤セット、ビスインドリルマレイミドＩＶ、ビスインドリルマレイミドＶ、カルフォスチンＣ、クラドスポリウム  クラドスポリオイド、カルディオトキシン、ナジャ  ニグリコリス、塩化ケレリスリン、塩化デカリニウム、エラグ酸二水和物、Ｇ６９７６、ＩｎＳｏｌｕｔｉｏｎ（商標）Ｇ６９７６、Ｇ６９８３、Ｇ７８７４塩酸、Ｈ−７ジヒドロクロライド、Ｉｓｏ−Ｈ−７ジヒドロクロライド、ＨＢＤＤＥ、ヒスピジン、ヒペリシン、Ｋ−２５２ａ  ノカルジオプシス属ＩｎＳｏｌｕｔｉｏｎ（商標）、Ｋ−２５２ａ  ノカルジオプシス属、Ｋ−２５２ｂ  ノカルジオプシス属−２５２ｃ、メリチン、ＮＧＩＣ−Ｉ、フロレチン、ピセアタノル、ＰＫＣｂＩＩ／ＥＧＦＲ阻害剤、スタウロスポリン、Ｎ−ベンゾイルＰＫＱ３阻害剤、ポリミキシンＢ硫酸、プロテインキナーゼＣ阻害剤２０−２８（細胞透過型、ミリストイル化）、プロテインキナーゼＣ阻害剤ペプチド１９−３１、プロテインキナーゼＣ阻害剤ペプチド１９−３６、プロテインキナーゼＣ阻害剤セット、プロテインキナーゼＣ阻害剤ＥＧＦ−Ｒフラグメント６５１−６５８（ミリストイル化）、プロテインキナーゼＣｅ転移阻害剤ペプチド、プロテインキナーゼＣｅ転移阻害剤ペプチド（ネガティブコントロール）、プロテインキナーゼＣｚ不完全基質阻害剤、プロテインキナーゼＣ２不完全基質阻害剤（ミリストイル化）、プロテインキナーゼＣｈ不完全基質阻害剤（ミリストイル化）、プロテインキナーゼＣｑ不完全基質阻害剤、プロテインキナーゼＣｑ不完全基質阻害剤（ミリストイル化）、シュードヒペリシン、Ｒｏ−３１−７５４９（固定化）、Ｒｏ−３１−７５４９、Ｒｏ−３１−８２２０、ＩｎＳｏｌｕｔｉｏｎ（商標）Ｒｏ−３１−８２２０、Ｒｏ−３１−８４２５、Ｒｏ−３２−０４３２、ロットレリン、サフィンゴル、サンギバマイシン、サイトネミン、リングビア属、セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤セット、Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン、ジヒドロ−、Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン遊離型塩基、ウシ脳（有利型塩基、高純度）、Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−スタウロスポリン、ストレプトマイセス属、タモキシフェンクエン酸塩、タモキシフェン、４−ヒドロキシ−（Ｚ）−ＴＥＲ１４６８７（ビタミンＥスクシネート、又はプロテインキナーゼＣの発現を阻害できるアンチセンスヌクレオチドである。
【００７９】
一実施態様では、プロテアーゼはトリプシン、キモトリプシン及びエラスターゼを含む。一実施態様では、システインプロテアーゼはパパイン、カルパイン及びリソソームカテプシンを含む。一実施態様では、アスパラギン酸プロテアーゼはペプシン及びレンニンを含む。一実施態様では、メタロ−プロテアーゼはサーモリシン及びカルボキシペプチダーゼＡを含む。
【００８０】
一実施態様では、本願明細書に記載の組成物及び／又は本発明の方法には、阻害剤のいかなる組合せによる使用も含まれうる。
【００８１】
他の実施態様では、当該細胞はＴｃｆ１タンパク質又は前記Ｔｃｆ１タンパク質をコードする核酸と接触させてもよい。
【００８２】
一実施態様では、Ｔｃｆ１タンパク質はＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号）：ＣＡＩ５９５５７、Ｐ１５２５７、Ｐ２２３６１、Ｐ２０８２３、ＮＰＪＢ３３５３、ＮＰ＿０３６８０１、ＮＰ＿７３９５７０又はＮＰ＿０００５３６のアミノ酸配列、又はそれらのホモログであってもよい。
【００８３】
他の実施態様では、本発明は膵臓β細胞量を増加させる方法の提供に関し、当該方法は膵臓β細胞又は膵臓β細胞に分化させることができる細胞（前記細胞はＴＭＥＭ２７を発現するか、又は発現を誘導することができる）を、セリン又はメタロプロテアーゼ阻害剤と接触させることと、β細胞増殖に適した条件を提供することを含んでなる。
【００８４】
他の実施態様では、本発明は患者の代謝を変化させる方法の提供に関し、当該方法は膵臓β細胞又は膵臓β細胞への分化を誘導されうる細胞をセリン又はメタロプロテアーゼ阻害剤と接触させることを含んでなり、前記細胞はＴＭＥＭ２７を発現するか、又はその発現を誘導されうる。
【００８５】
他の実施態様では、本発明は患者の糖尿病を阻害、抑制又は治療する方法の提供に関し、当該方法はＴＭＥＭ２７ポリペプチド又は前記ＴＭＥＭ２７ポリペプチドをコードする核酸と細胞とを接触させることを含んでなり、前記細胞は膵臓β細胞であるか、又は前記細胞は膵臓β細胞への分化を誘導されうる。
【００８６】
他の実施態様では、本発明は、患者の糖尿病を阻害、抑制又は治療する方法の提供に関し、当該方法は、膵臓β細胞又は膵臓β細胞への分化を誘導されうる細胞と、セリン又はメタロプロテアーゼ阻害剤を有するプロテアーゼ阻害剤とを接触させることを含んでなり、前記細胞はＴＭＥＭ２７を発現するか又はその発現を誘導されうる。
【００８７】
一実施態様では、「治療する」とは、治療的な処理及び予防的な処理の両方であって、その目的が、上記の目標とされた病理学的症状又は障害を予防又は減少させることであるものを指す。すなわち、一実施態様では、当該治療には、抑制、阻害、防止、処置又はそれらの組み合わせが包含されうる。すなわち、一実施態様では、「治療する」とは、特に疾病進行の時間の長期化、緩解の促進、緩解の誘発、緩解の増強、回復速度の上昇、代替療法の有効性増強若しくは抵抗性の抑制、又はそれらの組み合わせを指す。一実施態様では、「抑制する」又は「阻害する」とは、特に症状発現の遅延、疾患再発の防止、症状の再発の回数又は頻度の減少、症状と症状との間の時間の長期化、症状の重症度の減少、急性の症状の重症度の減少、症状の数の減少、疾患関連の症状の発生率の減少、症状の潜伏期間の短縮化、症状の改善、二次症状の減少、二次感染の減少、患者の生存期間の長期化又はそれらの組み合わせのことを指す。
【００８８】
一実施態様では、症状は原発性の症状である場合もあり、別の実施態様では二次的な症状である場合もある。一実施態様では、「原発性の」という用語は糖尿病の直接的な結果である症状のことを指し、一方、一実施態様では、「二次的」とは、原発性の結果に由来する又はその結果としての症状のことを指す。一実施態様では、本発明に用いられる化合物は、糖尿病に関連する原発性若しくは二次的症状、又は二次合併症を治療する。
【００８９】
他の実施態様では、「症状」とは、いかなる疾患又は病的症状としての表れであってもよく、一実施態様では糖尿病であり、頻尿、過度の喉の渇き、過度の空腹感、異常な体重減少、疲労の増加、癇癪、眼の霞み、低インスリン濃度、高い血液中若しくは尿中グルコースレベル、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００９０】
一実施態様では、用語「糖尿病」とは、哺乳類の患者における原発性の、又は他の実施態様では二次的な糖尿病、又は別の実施態様では１型ＮＩＤＤＭ（一過性）、又は別の実施態様では１型ＩＤＤＭ、又は別の実施態様では２型ＩＤＤＭ（一過性）、又は別の実施態様では２型ＮＩＤＤＭ、又は別の実施態様では２型ＭＯＤＹ（Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１４ｔｈ  ｅｄ．１９９８）を有する疾患のことを指す。
【００９１】
本発明の本態様によれば、一実施態様では、当該患者はインスリン抵抗性又は、別の実施態様では、インスリン低分泌に罹患する患者である。他の実施態様では、当該患者は糖尿病の体質を有する。他の実施態様では、当該患者は若年性糖尿病（ＭＯＤＹ）に罹患する患者である。
【００９２】
他の実施態様では、本発明の方法は、併用療法の一部として、患者に追加的な抗糖尿病剤を投与する処理を更に含んでなってもよい。一実施態様では、抗糖尿病剤としてはスルホニル尿素、レプチン、メグリチナイド、ビグアナイド、チアジアゾリジンジオン、α−グルコシダーゼ阻害剤又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００９３】
他の実施態様では、本発明の方法は、ＧＬＰ−Ｉレセプタアゴニストを患者に投与すること、又は別の実施態様では患者において当該アゴニストを細胞と接触させることを更に含んでなってもよい。一実施態様では、当該ＧＬＰ−ＩのアゴニストとしてはＧＬＰ−Ｉ、エキセンディン−３及びエキセンディン−４（米国特許第５４２４２８６号、米国特許第５７０５４８３号、米国特許第５９７７０７１号、米国特許第５６７０３６０号、米国特許第５６１４４９２号）、ＧＬＰ−Ｉアナログ又は誘導体、並びに米国特許第５４５６１８号及び米国特許第５９８１４８８号に記載のような天然ペプチド及び小分子のアナログが挙げられる。ＧＬＰ−Ｉレセプタアゴニストは、米国特許第５９８１４８８号にて説明した方法で活性を試験してもよい。
【００９４】
他の実施態様では、本発明の方法はＰＤＸ−１若しくはＰＹＹ、又はそれをコードする核酸を投与することを更に含んでなってもよい。
【００９５】
本願明細書で記載した本発明の細胞、組成物、ポリペプチド、核酸又はベクターに関するいかなる実施態様も本発明の方法に使用でき、また本発明の実施態様に包含されると理解すべきである。
【００９６】
一実施態様では、本発明は患者の膵島量を評価する方法の提供に関し、当該方法は、前記患者の血清中のＴＭＥＭ２７の濃度を測定し、前記濃度とコントロールのそれを比較する処理を含んでなる。
【００９７】
他の実施態様では、本発明は、高インスリン血症、低インスリン血症、糖尿病又は治療に対する反応を評価し、上記症状の治療の用に供する診断用ツール及び／又は方法の提供に関する。一実施態様では、ＴＭＥＭ２７はバイオマーカーとして機能し、体液（血清、プラズマ又は尿）中のその濃度が、例えば高インスリン血症、低インスリン血症又は顕著な糖尿病の指標となる。一実施態様では、分泌型ＴＭＥＭ２７がバイオマーカーである。本発明の本態様における一実施態様では、ＴＭＥＭ２７タンパク質又はその断片若しくは分泌型形態のレベルを、例えばＥＬＩＳＡアッセイなどの標準的なアッセイ方法により測定することを特徴とする診断方法である。一実施態様では、重症度がそのポリペプチドの発現量を指標として診断される。他の実施態様では、ポリペプチドの発現（タンパク質又はＲＮＡレベルのいずれか）の変化は、治療方法（例えば本願明細書に提供される処理方法）に対する反応との間で相関関係を示す。他の実施態様では、発現量の比較的変化を本発明の核酸又はベクターの輸送との相関として評価してもよく、またそれは本発明の治療方法を表すこともある。一実施態様では、本発明の方法は本発明の抗体若しくは抗体断片、又はそれを含んでなる組成物の使用を含んでなってもよい。本発明の抗体、核酸、ベクター、細胞及び／又は組成物を含んでなるキットも本発明に包含される。
【００９８】
他の実施態様では、本発明はタンパク質の同定方法の提供に関し、当該タンパク質はＴＭＥＭ２７タンパク質（又はその分泌型）と相互作用するものであり、当該方法は、ＴＭＥＭ２７ポリペプチドと目的の分子とを、一定時間、前記ポリペプチドと前記分子との間の相互作用を行わせるのに十分な条件下で接触させる処理と、目的の前記分子を同定する処理とを含んでなる。
【００９９】
一実施態様では、ＴＭＥＭ２７をホルモンとして機能させてもよく、相互作用するタンパク質が、当該ホルモンと反応する未確認のレセプターを含んでなることもありうる。一実施態様では、当該相互作用するタンパク質は、患者の代謝経路に関与する周知のレセプターを含んでなることもありうる。
【０１００】
一実施態様では、かかるスクリーニング方法は公知技術であり、２つの物質の間における相互作用の直接的又は間接的な評価方法を含んでなってもよく、例えば変性条件対非変性条件によるゲル電気泳動結果の解析、化学的架橋剤の使用、又は他の分子生物学的手段（例えばイースト２ハイブリッドシステムの使用）が挙げられる。
【０１０１】
本発明のＴＭＥＭ２７タンパク質と相互作用するパートナー物質を決定するいかなる手段も本発明を実施可能にし、本発明の一部をなすと考えられ、また相互作用するパートナー物質、並びに本願明細書に記載の条件下におけるかかるパートナー物質の役割（例えば正の代謝的効果、（例えば膵臓β細胞量の増加に対する効果）、又は別の実施態様では有害な代謝効果、（例えば高インスリン血症の進行））の同定も包含されることを意味すると理解される。
【０１０２】
以下に本発明を実施する手段としての材料、方法及び実施例を示すが、それらは例示を目的するものであり、本発明の範囲を限定することを目的とするものではない。
【実施例】
【０１０３】
材料及び方法：
動物：
ＡＵモデル動物を、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆＡｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＬＡＲＣ）（ロックフェラー大学の病原菌フリーの動物収容施設）に収容した。動物を１２時間の明／暗サイクルで維持し、標準的な齧歯動物用の食餌を与えた。変異マウスの遺伝子タイピングは、３週齢のマウスから単離したＤＮＡを用いたＰＣＲで実施した。
【０１０４】
抗体２つのペプチド：
抗Ｃｏｌ−３：
ＶＱＳＡＩＲＫＮＲＮＲＩＮＳＡＦＦＬＤ（配列番号：１）
抗Ｃｏｌ−４：
ＧＩＰＣＤＰＬＤＭＫＧＧＨＩＮＤＧＦＬＴ（配列番号：２）
を合成して＞９０％純度にし、ＫＬＨとコンジュゲートし、ウサギ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｔｅｘａｓ）に免疫した。抗血清をアフィニティ精製し、ウエスタンブロッティング及び免疫組織化学により試験した。アフィニティ精製した抗血清を全ての試験に用いた。イムノブロッティング及び免疫組織化学に用いる他の抗体は、以下の供給源から得た。抗インスリン（Ｌｉｎｃｏ社）、抗グルカゴン（Ｌｉｎｃｏ社）、抗Ｖ５（インビトロゲン社）、ローダミンレッド−コンジュゲート−ロバ抗ギニアピッグ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ社）、Ａｌｅｘａ４８８ロバ抗ウサギ（Ｍｏｌｅｃｕｒｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）。
【０１０５】
細胞培養
ＭＩＮ６細胞を、２５ｍＭのグルコース、１５％のウシ胎児血清及び５．５μｍの２−メルカプトエタノールを含有するＤＭＥＭ培地で培養した。ＩＮＳ−１細胞は、２５ｍＭのグルコース及び５％のウシ胎児血清及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。ＨｅｐＧ２細胞は、２５ｍＭのグルコース及び１０％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地で培養した。
【０１０６】
トランジェントなトランスフェクション及びルシフェラーゼアッセイ
ＨｅｐＧ２細胞の場合にはＦｕｇｅｎｅ試薬（ロシュ）を、ＭＩＮ６細胞の場合にはリポフェクトアミン２０００（インビトロゲン）を用い、業者の使用説明に従い、トランジェントなトランスフェクションを実施した。０．５μｇのルシフェラーゼリポーター構築物、発現ベクター及びＣＭＶ−ＬａｃＺを３５ｍｍペトリ皿に添加した。ルシフェラーゼは、対応するβ−ガラクトシダーゼ活性に基づいてトランスフェクション効率を標準化した（ＡｌａｍＪ．，Ｃｏｏｋ，Ｊ．Ｌ．：Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８８：２４５−２５４，１９９０）。
【０１０７】
ルシフェラーゼ構築物の場合、８１５ｂｐプロモーター領域をルシフェラーゼプロモーターの上流にクローニングし、Ｔｃｆ１発現ベクターと共発現させた。ＴＭＥＭ２７プロモーター配列（マウス）は配列番号１７に示す通りである：ａｔｇｔｃａｔｔｇｃ  ａｃｃｃａａｔｇａｃ  ｔｔｔａａｃｇｃｔｃ  ａｇｔｃｃｔｔｇｇａ  ｔａｃｃｃｃａｃａｔ  ｇｔｇａｇａｃｇｇｔ  ｔｇｔａａｃｃａｃｔ  ｇｔａａｇｇａｔｔｔ  ｇａｇａａａｔａａｔ  ｃａｇｇｇａｇｃｃｔ  ａｇｃｔｃａｃａｇｔ  ａａｇｔａｇｔｔｃｔ  ｔａｇｔｃａｔｔｇｔ  ｔａａａｔａｇｔｔｇ  ｃｇｃｔｇａａｃａａ  ｔｇｔｔｇｔｃａｃｔ  ａｇｃａｃｔｇｔｇｔ  ａｇｃａａｃｔｔａａ  ｃｔａａａｔｇａｃａ  ｇｇｔｔｃｔｔａｇｃ  ａｇｔｔｃｔａｇｃｃ  ｃｃｔｔｔｔａａａｇ  ｇｇｔｔａｇｃａｔｔ  ｃａｔｔｔｃｔｔｃｃ  ｔａｇｔｇｇｃａｃｃ  ａｇｇａｃａｇａｇｃ  ａｃｔｇｔｔｃａｇｇ  ｇａａｇｇｔａｔｃａ  ｃｃａｔｃａｃｃａｔ  ｃａｃｃａｔｃａｃｃ  ａｔｃｇｔｃａｔｃａ  ｃｃａｔｃａｃｃａｔ  ｃｇｔｃａｔｃａｃｃ  ｃａａｔｇａｔｃａｔ  ｃａｔｃｔｃｃａｇｃ  ｇｔｇａｇｇｃｔｔｔ  ａｔａｔｃａｔｔａａ  ｔｇｔｔｇａｇｔｔｔ  ｔａｇａｃａｇｔａｇ  ｃｃａｇａｔｃｔｔａ  ｇａｇｔｔｔａａｃｃ  ｔａｇｃｃａｔｃｃｔ  ｃｔａｇｔｔｇｇｇａ  ａｔｔｇｔｔａａｃｃ  ａａｃｃａａｃａｇｔ  ｃｔａｇｇａａｇｔｃ  ｔｔｇｔｔｃｃｃｔｔ  ｔａｃｔｃｔｃｃａｇ  ａｇｇｔｇａａａａａ  ｇｇａｇｔｔａｔａｔ  ｔｔｇｔｔｔｃｃｔａ  ａｇｔａｔｇｇｔａｇ  ｃｃｔｇｔｃｔｔｔｇ  ａａｔｃａｇａｔｔｇ  ｇｔｔａｇｃｃｔｇａ  ａａｇｇｇｃａｃａａ  ａｇａｔｔａｔｇｃｃ  ａａａｇａａａａｃｔ  ｃｃａｔｇｃｔｃｔｃ  ｃａｃｇｔｔｔａｇｃ  ｔｔａａｃｃａａａｃ  ａａｃｔａｃａｇｇａ  ｇｇｃａｇｇｔｇｇｇ  ａｇｇｃｔｔｃｔｇａ  ｔｔｇｔｇｔｃａｇｃ  ｔｃａｇｇａａａｃａ  ｔｔｃｔｔａｔｇａｇ  ｇｔａｇａｇｔｔｔｇ  ａｇｇａａｇａａｃｃ  ｃａｃｔａａｃｃｔｇ  ｃｔｔｃｔｃａａａｔ  ａｇａｔｔｔｔｃｇｔ  ａａａｔａａｃｔｇａ  ｃａｇｇｇｇａｔｇｇ  ｔｔｃｇｃｔｔｃｔａ  ｔｇｇａｃｇｔａｔｔ  ａａｃｃｃａａｃｔｇ  ａｔｇｇｇｃｇｔｔａ  ａｔｔａｔｔａａａｃ  ｃｔｔｔｔａｇａｔｇ  ｇｔｇｇｃｔｃｇｃｔ  ｇａｔｔｔ。
【０１０８】
更に、ＴＭＥＭ２７プロモーターを以下の通りにＴｃｆ１部位（Ｍ１及びＭ２プロモーター配列と呼ばれる）特異的変異導入した。
【０１０９】
ＴＭＥＭ２７−Ｍ１プロモーター（マウス）の配列（配列番号：１８）：ａｔｇｔｃａｔｔｇｃ  ａｃｃｃａａｔｇａｃ  ｔｔｔａａｃｇｃｔｃ  ａｇｔｃｃｔｔｇｇａ  ｔａｃｃｃｃａｃａｔ  ｇｔｇａｇａｃｇｇｔ  ｔｇｔａａｃｃａｃｔ  ｇｔａａｇｇａｔｔｔ  ｇａｇａａａｔａａｔ  ｃａｇｇｇａｇｃｃｔ  ａｇｃｔｃａｃａｇｔ  ａａｇｔａｇｔｔｃｔ  ｔａｇｔｃａｔｔｇｔ  ｔａａａｔａｇｔｔｇ  ｃｇｃｔｇａａｃａａ  ｔｇｔｔｇｔｃａｃｔ  ａｇｃａｃｔｇｔｇｔ  ａｇｃａａｃｔｔａａ  ｃｔａａａｔｇａｃａ  ｇｇｔｔｃｔｔａｇｃ  ａｇｔｔｃｔａｇｃｃ  ｃｃｔｔｔｔａａａｇ  ｇｇｔｔａｇｃａｔｔ  ｃａｔｔｔｃｔｔｃｃ  ｔａｇｔｇｇｃａｃｃ  ａｇｇａｃａｇａｇｃ  ａｃｔｇｔｔｃａｇｇ  ｇａａｇｇｔａｔｃａ  ｃｃａｔｃａｃｃａｔ  ｃａｃｃａｔｃａｃｃ  ａｔｃｇｔｃａｔｃａ  ｃｃａｔｃａｃｃａｔ  ｃｇｔｃａｔｃａｃｃ  ｃａａｔｇａｔｃａｔ  ｃａｔｃｔｃｃａｇｃ  ｇｔｇａｇｇｃｔｔｔ  ａｔａｔｃａｔｔａａ  ｔｇｔｔｇａｇｔｔｔ  ｔａｇａｃａｇｔａｇ  ｃｃａｇａｔｃｔｔａ  ｇａｇｔｔｔａａｃｃ  ｔａｇｃｃａｔｃｃｔ  ｃｔａｇｔｔｇｇｇａ  ａｔｔｇｔｔａａｃｃ  ａａｃｃａａｃａｇｔ  ｃｔａｇｇａａｇｔｃ  ｔｔｇｔｔｃｃｃｔｔ  ｔａｃｔｃｔｃｃａｇ  ａｇｇｔｇａａａａａ  ｇｇａｇｔｔａｔａｔ  ｔｔｇｔｔｔｃｃｔａ  ａｇｔａｔｇｇｔａｇ  ｃｃｔｇｔｃｔｔｔｇ  ａａｔｃａｇａｔｔｇ  ｇｔｔａｇｃｃｔｇａ  ａａｇｇｇｃａｃａａ  ａｇａｔｔａｔｇｃｃ  ａａａｇａａａａｃｔ  ｃｃａｔｇｃｔｃｔｃ  ｃａｃｇｔｔｔａｇｃ  ｔｔａａｃｃａａａｃ  ａａｃｔａｃａｇｇａ  ｇｇｃａｇｇｔｇｇｇ  ａｇｇｃｔｔｃｔｇａ  ｔｔｇｔｇｔｃａｇｃ  ｔｃａｇｇａａａｃａ  ｔｔｃｔｔａｔｇａｇ  ｇｔａｇａｇｔｔｔｇ  ａｇｇａａｇａａｃｃ  ｃａｃｔａａｃｃｔｇ  ｃｔｔｃｔｃａａａｔ  ａｇａｔｔｔｔｃｇｔ  ａａａｔａａｃａｃｔ  ｇａｇｇｇｇａｔｇｇ  ｔｔｃｇｃｔｔｃｔａ  ｔｇｇａｃｇｔａｔｔ  ａａｃｃｃａａｃｔｇ  ａｔｇｇｇｃｇｔｔａ  ａｔｔａｔｔａａａｃ  ｃｔｔｔｔａｇａｔｇ  ｇｔｇｇｃｔｃｇｃｔ  ｇａｔｔｔ。
【０１１０】
ＴＭＥＭ２７−Ｍ２プロモーター（マウス）の配列（配列番号：１９）：ａｔｇｔｃａｔｔｇｃ  ａｃｃｃａａｔｇａｃ  ｔｔｔａａｃｇｃｔｃ  ａｇｔｃｃｔｔｇｇａ  ｔａｃｃｃｃａｃａｔ  ｇｔｇａｇａｃｇｇｔ  ｔｇｔａａｃｃａｃｔ  ｇｔａａｇｇａｔｔｔ  ｇａｇａａａｔａａｔ  ｃａｇｇｇａｇｃｃｔ  ａｇｃｔｃａｃａｇｔ  ａａｇｔａｇｔｔｃｔ  ｔａｇｔｃａｔｔｇｔ  ｔａａａｔａｇｔｔｇ  ｃｇｃｔｇａａｃａａ  ｔｇｔｔｇｔｃａｃｔ  ａｇｃａｃｔｇｔｇｔ  ａｇｃａａｃｔｔａａ  ｃｔａａａｔｇａｃａ  ｇｇｔｔｃｔｔａｇｃ  ａｇｔｔｃｔａｇｃｃ  ｃｃｔｔｔｔａａａｇ  ｇｇｔｔａｇｃａｔｔ  ｃａｔｔｔｃｔｔｃｃ  ｔａｇｔｇｇｃａｃｃ  ａｇｇａｃａｇａｇｃ  ａｃｔｇｔｔｃａｇｇ  ｇａａｇｇｔａｔｃａ  ｃｃａｔｃａｃｃａｔ  ｃａｃｃａｔｃａｃｃ  ａｔｃｇｔｃａｔｃａ  ｃｃａｔｃａｃｃａｔ  ｃｇｔｃａｔｃａｃｃ  ｃａａｔｇａｔｃａｔ  ｃａｔｃｔｃｃａｇｃ  ｇｔｇａｇｇｃｔｔｔ  ａｔａｔｃａｔｔａａ  ｔｇｔｔｇａｇｔｔｔ  ｔａｇａｃａｇｔａｇ  ｃｃａｇａｔｃｔｔａ  ｇａｇｔｔｔａａｃｃ  ｔａｇｃｃａｔｃｃｔ  ｃｔａｇｔｔｇｇｇａ  ａｔｔｇｔｔａａｃｃ  ａａｃｃａａｃａｇｔ  ｃｔａｇｇａａｇｔｃ  ｔｔｇｔｔｃｃｃｔｔ  ｔａｃｔｃｔｃｃａｇ  ａｇｇｔｇａａａａａ  ｇｇａｇｔｔａｔａｔ  ｔｔｇｔｔｔｃｃｔａ  ａｇｔａｔｇｇｔａｇ  ｃｃｔｇｔｃｔｔｔｇ  ａａｔｃａｇａｔｔｇ  ｇｔｔａｇｃｃｔｇａ  ａａｇｇｇｃａｃａａ  ａｇａｔｔａｔｇｃｃ  ａａａｇａａａａｃｔ  ｃｃａｔｇｃｔｃｔｃ  ｃａｃｇｔｔｔａｇｃ  ｔｔａａｃｃａａａｃ  ａａｃｔａｃａｇｇａ  ｇｇｃａｇｇｔｇｇｇ  ａｇｇｃｔｔｃｔｇａ  ｔｔｇｔｇｔｃａｇｃ  ｔｃａｇｇａａａｃａ  ｔｔｃｔｔａｔｇａｇ  ｇｔａｇａｇｔｔｔｇ  ａｇｇａａｇａａｃｃ  ｃａｃｔａａｃｃｔｇ  ｃｔｔｃｔｃａａａｔ  ａｇａｔｔｔｔｃｇｔ  ａａａｔａａｃｔｇａ  ｃａｇｇｇｇａｔｇｇ  ｔｔｃｇｃｔｔｃｔａ  ｔｇｇａｃｇｔａｔｔ  ａａｃｃｃａａｃｔｇ  ａｔｇｇｇｃｃａａｔ  ａｔｔａｔｔａａａｃ  ｃｔｔｔｔａｇａｔｇ  ｇｔｇｇｃｔｃｇｃｔ  ｇａｔｔｔ。
【０１１１】
細胞溶解液中のタンパク質の架橋
ＭＩＮ６細胞（６枚のウェルプレートにおける９０％のコンフルエンシー（細胞密度））を回収し、５０μｌの反応バッファー及び試薬に再懸濁し、４℃で２時間インキュベートした。５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）溶液を添加して氷上で１０分間インキュベートし、反応を停止させた。更に細胞をＰＢＳで洗浄し、４℃で１５分間プロテアーゼ阻害剤の存在下、ＲＩＰＡバッファーで溶解させた。細胞溶解液を１０，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を還元的及び非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、イムノブロッティングを行った。架橋試薬及びバッファーの組成は、ＢＭＨ（Ｐｉｅｒｃｅ社）をＤＭＳＯ中に溶解させ、ＰＢＳ中でインキュベートし、ＤＴＢＰ（Ｐｉｅｒｃｅ社）を水に溶解させ、０．２Ｍのトリエタノールアミン（ｐＨ８．０）中でインキュベートした。
【０１１２】
Ｎ−グリコシル化の阻害及び酵素分解
ｐＶ５−ＴＭＥＭ２７を発現するＭＩＮ６細胞を、ＤＭＳＯ中に溶解させた所定濃度のツニカマイシン（Ｓｉｇｍａ社）、及びＤＭＳＯのみと、３７℃で１２時間インキュベートした。更に細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗Ｖ５抗体を用いてイムノブロッティングした。
【０１１３】
完全なＮ結合グリカンを、組換えＮ−グリカナーゼ酵素（Ｐｒｏｚｙｍｅ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）で分泌型のＴＭＥＭ２７部分から除去した。ＭＩＮ６細胞及び膵島からの上清を１００℃で５分間、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、０．１％のＳＤＳ及び５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール溶液中で加熱変性させた。ＮＰ−４０を０．７５％の最終濃度で添加し、反応液を３７℃で３時間Ｎ−グリカナーゼでインキュベートした。
【０１１４】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）及びクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）
結合バッファー（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、１０％のグリセロール、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ）中で、全細胞抽出液１０μｇを用いてＥＭＳＡ分析を実施した。全細胞抽出液を、野生型若しくは変異型のＨＮＦ−Ｉ結合部位を含んでなるＴＭＥＭ２７プロモーターの３２Ｐ−ラベル二本鎖オリゴヌクレオチドプローブとインキュベートした。配列番号３：５’−ＧＧＡＧＡＴＴＴＴＣＧＴＡＡＡＴＡＡＣＴＧＡＣＡ−３’、配列番号４：５’−ＧＧＧＣＧＴＴＡＡＴＴＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＴＡ−３’、配列番号５：５’−ＧＧＧＣＡＧＡＧＡＴＴＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＴＡ−３’。抗Ｔｃｆ１抗体（Ｇｅｎｅｋａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、モントリオール、カナダ）を用いてスーパーシフトを実施した。Ｃ５７／Ｂ６マウス又はＭＩＮ６細胞から単離した初代肝細胞を使用し、製造業者（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）のＣｈＩＰアッセイキットのプロトコルに従い、ＣｈＩＰ分析を実施した。Ｔｃｆ１を抗−ＨＮＦ−１α抗体で沈殿させ、ＤＮＡをプライマーｘ及びｙを使用して増幅した。配列番号６：５’−ＡＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＧＴＧＧＧＡＧＧＣＴＴＣＴ−３’、配列番号７：５’−ＣＣＣＧＧＡＴＴＡＧＧＧＴＡＴＣＧＧＡＧＡＡ−３’。ａｐｏＭのプライマーは以下の通りである。配列番号８：５’−ＧＧＧＣＴＣＡＧＣＴＴＴＣＣＴＣＣＴＡ−３’、配列番号９：５’−ＣＴＣＣＧＣＣＴＴＡＡＣＴＧＴＴＣＴＣＴＧＡＴＧ−３’。
【０１１５】
全細胞抽出液の調製
ＭＩＮ６細胞を、１５０ｍｍの組織培養皿で９０％の集密度（コンフルエンシー）となるまで増殖させた。細胞を一度氷冷ＰＢＳで洗浄し、３ｍｌのＰＢＳで掻き取った。細胞を４，０００×ｇで４分間遠心分離し、２倍容の高塩濃度の抽出バッファー（４００ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、２０％のグリセロール、２ｍＭのＤＴＴ、１×コンプリート（商標）プロテアーゼ阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ社）及び２０μｇ／ｍＬアプロチニンに再懸濁した。細胞溶解液を凍結・解凍させ、細胞破片を４℃で１０分間１６，０００×ｇで遠心分離して除去した。
【０１１６】
ホルモン測定値
インスリン及びグルカゴンを、酸性エタノール（無水エタノール中の１０％氷酢酸）で膵臓から抽出し、１０分間超音波破壊し、４℃、１２，０００×ｇで１０分間、２回遠心分離した。上清を回収し、−２０℃保存し、感受性インスリン又はグルカゴンＲＩＡキット（Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いてインスリン濃度を測定した。
【０１１７】
膵島及びＲＮＡの単離
膵島を６〜８週間齢のマウスから単離した。コラゲナーゼによる消化及びフィコール勾配による遠心分離を使用した。更に全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を使用して、製造業者の指示に従い抽出した。混入するゲノムＤＮＡを、ＲＮＡ５μｇあたり１μｌのＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ−Ｉ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）を使用して除去した。
【０１１８】
膵島の形態観察
膵臓をパラホルムアルデヒドで固定し、上記の通りにインスリン及びグルカゴンに関して染色した。全ての膵臓断面（７μｍ）を採取し、全ての第６断面を形態観察に使用した。オーバーラップしない少なくとも２８８の画像（ピクセルサイズ：０．８８μｍ）を、共焦レーザー読取り顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０、ドイツ）を使用してスキャンした。この実験で測定されるパラメータを、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ社、ＰＡ）の統合形態観察装置を使用して分析した。インスリン又はグルカゴンで着色した細胞で覆われた視野に、３ピクセルより大きいサイズの染色物質を使用して取り込ませた。
【０１１９】
ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡをＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して抽出し、１０μｇのＲＮＡを５ＵのＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅ−Ｉ（Ａｍｂｉｏｎ社）で処理した。ｄＮＴＰｓ及びランダム六量体プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で、Ｍｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを合成した。上記ｃＤＮＡｓを使用し、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ及びＴａｑポリメラーゼの存在下で、特異的なプライマーを使用したＰＣＲ用の鋳型とした（Ｓｈｉｈ  ＤＱ，Ｓｃｒｅｅｎａｎ  Ｓ，Ｍｕｎｏｚ  ＫＮ，Ｐｈｉｌｉｐｓｏｎ  Ｌ，Ｐｏｎｔｏｇｌｉｏ  Ｍ，Ｙａｎｉｖ  Ｍ，Ｐｏｌｏｎｓｋｙ  ＫＳ，Ｓｔｏｆｆｅｌ  Ｍ．（２００１）Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ＨＮＦ−Ｉ  ａｌｐｈａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０：２４７２−８０を参照）。
【０１２０】
イムノブロッティング及び免疫組織化学
サイトソル中のタンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１５％）で分離し、エレクトロブロッティングを行いニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ社）に転写した。ＴＭＥＭ２７を抗−Ｃｏｌ３及び抗Ｃｏｌ４抗血清（１：５００）により検出した。４℃で一晩、一次抗体を用いて膜をインキュベートした。二次抗体を含んでなるインキュベーションを室温で１時間実施した。非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＤＴＴをサンプルバッファから除外することにより実施した。
【０１２１】
ＭＩＮ６細胞をコーティング済のスライド（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔ．）にプレーティングし、４℃で２０分間、４％のパラホルムアルデヒドで固定した。スライドを室温で３０分間、３％の通常ロバ血清を含むＰＢＳ中の０．０１％サポニンとインキュベートし、抗Ｃｏｌ３及び抗Ｃｏｌ４（１：２０）を添加し、４℃で一晩添加した。二次抗体を添加し、室温で３０分間インキュベートした。
【０１２２】
膵臓を４℃で４時間４％のパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した。７μｍの切片を調製し、パラフィン除去の後、０．０１Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中でスライドを電子レンジで処理し、抗原のマスキング除去を行った。断面に０．１％のトリトンＸ−１００を浸透させ、３０分間、３％の通常ロバ血清を含むＰＢＳ中の０．０１％サポニンとインキュベートした。上記と同様に染色を行った。
【０１２３】
電子顕微鏡検査検討
ＭＩＮ６細胞を、０．１Ｍのカコジル酸バッファー（ｐＨ７．４）中の４％のパラホルムアルデヒド及び０．０２％のグルタルアルデヒドで固定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％のゼラチンに包埋し、上記と同様に再度固定した。細胞ペレットをＰＢＳ中の２Ｍスクロース溶液を使用してクリオ保護し、使用までの間サンプルを液体窒素中で保存した（Ｔｏｋｕｙａｓｕ，Ｋ．Ｔ．１９７３．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５７−５５１−５６５）。クリオ極薄切片を、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ  ＦＣ−４Ｅ  ｃｒｙｏｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｔｏｍｅのガラスナイフを使用して調製した。Ｆｏｒｍｖａｒ−カーボンコーティングニッケルグライドに切片を回収し、１％のＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングし、１：１０希釈した抗ｃｏｌ４でインキュベートした。ＰＢＳで２回（各１５分）洗浄してインキュベーションを終了させた。更に切片を、１０ｎｍ金粒子（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  ＩＬ）とコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧでインキュベートした。グライドを、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９８３．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．９６：４６６−４８５に記載の方法従って処理し、染色した。
【０１２４】
チミジン取込の解析
２４ウェル培養プレート上の５×１０４細胞／ウェルにおける、［３Ｈ］チミジン取り込みを以下の通りにアッセイした。エレクトロポレーションの４８時間後に細胞を更に２４時間、成長停止培地（０．５％ＦＣＳ）中でインキュベートし、更に通常の成長培地で２４時間インキュベートした。インキュベーションの最後の４時間において、０．５μＣｉ／ウェルで［３Ｈ］エチルチミジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を添加した。添加後、細胞を氷冷ＰＢＳで二回リンスし、２０分間氷上で、１０％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）でインキュベートした。１０％のＴＣＡで洗浄した後、細胞を室温で１０分間、０．２ＭのＮａＯＨ／１％のＳＤＳで溶解させた。ＴＣＡ不溶性物質を０．２ＭのＨＣｌで中和し、液体シンチレーションカウンタにより放射能を測定した。
【０１２５】
ＲＮＡ干渉
合成ｓｉＲＮＡｓは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）により合成された。マウスのＴＭＥＭ２７（ＮＭ０２０６２６）、ＰＣ１／３（ＮＭ０１３６２８）、ＰＣ２（ＮＭ００８７９２）、ｆｕｒｉｎ（ＮＭ０１１０４６）及びカルボキシペプチダーゼＥ（ＮＭ０１３４９４）配列に対するｓｉＲＮＡｓを設計した。１×１０６のＭＩＮ６細胞に対して各ｓｉＲＮＡの３μｇをエレクトロポレーションした。
【０１２６】
統計分析
平均±ＳＤとして結果を提供した。統計分析はスチューデントｔ検定を用いて実施し、帰無仮説を０．０５のレベルで拒絶した。
【０１２７】
＜実施例１＞Ｔｃｆ１は膵臓β細胞の新規タンパク質の発現を制御する：
膵臓β細胞中の分裂促進因子を同定するため、Ｔｃｆ１−／−野生型同腹仔から単離した膵島細胞の遺伝子発現を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（商標）オリゴヌクレオチド発現配列を使用して比較した。この分析により膜貫通型タンパク質（ＴＭＥＭ２７）をコードする遺伝子が同定され、コントロールと比較し、Ｔｃｆ１−／−マウスでは発現レベルが１６倍減少していた。この結果は、独立した動物群のＲＴ−ＰＣＲにより確認された（図１ａ）。Ｔｃｆ１がＴＭＥＭ２７転写の直接的な活性化物質であるかどうかを検討するため、ＴＭＥＭ２７プロモーターを解析し、２つの保存された高親和性結合部位がその調節領域に存在することを確認した（図１ｂ）。ヒト（配列番号１０）及びマウス（配列番号１１）の上流側調節領域はそれぞれ、ヒトではＴｃｆ結合部位の約−１１７〜約−１０２（配列番号１２及び配列番号１３）、及びマウスでは−６２〜約−４７（配列番号１４及び配列番号１５）であった。
【０１２８】
８１５ｂｐのプロモーター領域（配列番号１７）を、ルシフェラーゼプロモーターの上流にクローニングし、Ｔｃｆ１発現ベクターと共発現させた。Ｔｃｆ１及びＴＭＥＭ２７プロモーターのトランジェントなコトランスフェクションにより、ルシフェラーゼ活性が５倍以上活性化された（図１ｃ）。ＴＭＥＭ２７プロモーターの各Ｔｃｆ１部位を選択的に変異させたとき、転写活性が７０〜８０％減少した（図１ｃ）。Ｔｃｆ結合部位を含んでなる二本鎖３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドとＭＩＮ６細胞の抽出液を使用して電気泳動的によるゲル移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を行い、ＤＮＡ／タンパク質複合体を検出した（図１ｄ）。これらの部位に対するタンパク質の結合特異性を、非標識オリゴヌクレオチドを用いた競合アッセイ、更には特異的な抗Ｔｃｆ１抗血清を用いたＤＮＡ−Ｔｃｆ１複合体のシフトにより測定した（図１ｄ）。Ｔｃｆ１が直接ＴＭＥＭ２７の発現を増加させるか否かを解析するため、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を実施した。Ｔｃｆ１はＭＩＮ６細胞のＴＭＥＭ２７プロモーターの結合部位と結合したが、ＴＭＥＭ２７が発現されない肝細胞では結合しなかった（図１ｅ）。これらのデータにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴｃｆ１結合部位の機能が確認され、またＴｃｆ１が膵臓β細胞のＴＭＥＭ２７の発現に必要であることを示すものである。
【０１２９】
＜実施例２＞ＴＭＥＭ２７の発現は、膵臓成長の間に制御される：
免疫組織化学的な分析を行い、マウス膵臓成長の間のＴＭＥＭ２７の発現パターンを観察した。新生児及び成体の膵臓において、ＴＭＥＭ２７の発現は膵島β細胞のみに限定された。膵臓の成長の間、ホルモン陽性が顕著である場合（主にグルカゴン陽性細胞）には、ＴＭＥＭ２７は最も初期の時期に発現していた。胚時期のＥ１１．５及びＥ１２．５日において、ＴＭＥＭ２７発現は、グルカゴン及びインスリン発現細胞において局所的であった。内分泌細胞の膨張ピーク時期（胎児期１３．５〜１８．５日）において、ＴＭＥＭ２７は主に、Ｅ１８．５日（出生の直前）までグルカゴンと共局所化しており、またインスリン陽性細胞においても検出された。新生児及び成体の膵臓では、ＴＭＥＭ２７は膵島のα−細胞においてはもはや検出されず、発現はβ細胞に限定されていた（図２）。
【０１３０】
＜実施例３＞ＴＭＥＭ２７はＮ結合型糖タンパク質であり、Ｉｎ  Ｖｉｖｏで二量体を形成する：
ＴＭＥＭ２７は、アミノ酸残基７６及び９３において２つの予想Ｎ−グリコシル化部位を含んでなる。ＭＩＮ６細胞をツニカマイシンで処理し、それによりＮ−グリコシル化が阻害された。ツニカマイシンの濃度を増加させて細胞をインキュベートし、タンパク質抽出物を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、イミムノブロッティングを行った。ツニカマイシン処理を行った場合、電気泳動移動度の増加した２つのバンドが出現し、一方高分子量側のタンパク質が消失した（図３ａ）。この結果は、Ｎ−グリカナーゼ（完全なＮ結合グリカンを放出させる酵素）を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより確認した。この酵素でインキュベートしたＭＩＮ６細胞抽出液のウエスタンブロット分析において、ツニカマイシン処理と同様の結果が示された（図３ｂ）。
【０１３１】
ＴＭＥＭ２７タンパク質が多量体として存在するか否かを解析するため、化学架橋結合実験を実施した。次の２つの異なる架橋結合試薬の存在下で、ＭＩＮ６細胞抽出液をインキュベートした。ＢＭＨ（ビスマレイミドヘキサン、膜透過性、分離不可能な化合物）、及びＤＴＢＰ（ジメチル３、３’−ジチオビスプロピオンイミデート、浸透性膜、還元的及び非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の実施前に分離可能な化合物）。非還元的ウエスタンブロッティングにより、還元条件下でのウエスタンブロッティングにおけるＴＭＥＭタンパク質のちょうど２倍の分子量のバンドが出現した。ＢＭＨで処理した細胞抽出液では、還元及び非還元条件におけるブロッティングで二量体タンパク質が出現した。しかしながら、ＤＴＢＰの存在下では、タンパク質二量体が還元条件下で消失していた（図３ｂ）。同様の結果が、内因的にＴＭＥＭ２７を発現するＭＩＮ６細胞、及びＴＭＥＭ２７発現ベクター（データ示さず）でトランジェントにトランスフェクションしたＮ２Ａ細胞において観察された。
【０１３２】
これらのデータから、ＴＭＥＭ２７タンパク質はＮグリコシル化され、二量体として存在することが示された。
【０１３３】
＜実施例４＞ＴＭＥＭ２７はプロセシングされ、膵臓β細胞から分泌される：
ＴＭＥＭ２７は、Ｎ末端の細胞外領域を有する膜貫通タンパク質であると予測された。タンパク質の細胞外及び細胞内領域のペプチドを認識する２つの抗体（α−Ｃｏｌ−３及びα−Ｃｏｌ−４）をそれぞれ調製した。ウエスタンブロット実験において、α−Ｃｏｌ−４ではＭＩＮ６細胞（図４ａ）の全細胞溶解液において２つのバンドが検出された。グリコシル化された全長タンパク質の予測された分子量に対応するバンドが、高分子量側に存在した。低分子量側にバンド（≒２５ｋＤ）が検出されたが、Ｃ末端Ｖ５−Ｔａｇ融合タンパク質を発現するベクター（ｐ−ＴＭＥＭ２７．Ｖ５−Ｈｉｓ）によるトランスフェクション、及び抗Ｖ５抗体（図４ｂ）を用いた細胞溶解液のウエスタンブロットにより検出できたことより、特異的なものである。
【０１３４】
２５ｋＤバンドが切断型のＴＭＥＭ２７のＣ末端の一部であるか否か、及び／又は分泌されたか否かを示す目的で、異なる細胞系からの上清（ニューロンＮ２Ａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｋ２９３及びＭ−１細胞、腎臓の集合管に由来し、ＴＭＥＭ２７を内生的に発現する）をα−Ｃｏｌ−３抗体を用いて解析した。細胞を血清フリーの培地で４８時間培養し、α−Ｃｏｌ−３を使用してウエスタンブロットで解析し、β細胞系のＭＩＮ６及びＩＮＳ１Ｅクローン（図４ｃ、データ示さず）において、約２５ｋＤａタンパク質に対応するバンドが検出された。この推定の切断及び分泌されたタンパク質は、単離されたマウス膵島とインキュベートした培地において検出してもよい（図４ｄ）。興味深いことに、細胞溶解液における全長タンパク質の強い発現にもかかわらず、ＴＭＥＭ２７発現ベクター（ｐ−ＴＭＥＭ２７）でトランジェントにトランスフェクションした非−β細胞株の培地では、ウエスタンブロット分析によりこのバンドが検出できなかった。
【０１３５】
対照的に、ＭＴＮ６及びＩＮＳ１Ｅ細胞のＴＭＥＭ２７の過剰発現により、それぞれの培地中に分泌されたタンパク質量が増加していた。ｓｉＲＮＡによるＴＭＥＭ２７タンパク質濃度の減少は、ＭＩＮ６細胞上清中の分泌型ＴＭＥＭ２７のレベルの減少と相関していた（図４ｅ）。最後に、ＴＭＥＭ２７のＮ末端部分がβ細胞から切断され、分泌されることを更に強力に裏付けるため、発現ベクター（ｐＨＡ−ＴＭＥＭ２７、９つのアミノ酸によるＨＡ−エピトープタグがＴＭＥＭ２７タンパク質のアミノ酸残基３９及び４０との間に挿入されている）を構築し、このベクターでＭＴＮ６細胞をトランスフェクションし、抗−ＨＡ抗体で検出し、上清中に同程度のサイズを有するタンパク質が分泌されていることを検出した。このタンパク質は、タグを有さないタンパク質（図４ｆ）を発現するコントロール細胞では検出されなかった。これらのデータから、ＴＭＥＭ２７が膵臓β細胞特異的な、切断及び分泌型の膜貫通タンパク質であることが明らかとなった。
【０１３６】
＜実施例５＞ＴＭＥＭ２７は、インスリン分泌細胞及び形質膜に局在化する：
抗Ｃｏｌ−３及び４の抗体を使用した免疫蛍光アッセイにより、膵臓β細胞におけるＴＭＥＭ２７の局在化が示された。ＭＩＮ６細胞をスライド上で増殖させ、固定し、一次抗体を透過させた。特異的な染色が、原形質膜のみならず、核周辺領域及び顆粒において検出された（図５ａ）。この結果は、ＴＭＥＭ２７がインスリン分泌顆粒において局所化し、それがこれらの小嚢を経て原形質膜に運搬されることと整合する。免疫・金−標識抗−Ｃｏｌ−４抗体を使用した電子顕微鏡観察により、インスリン分泌顆粒内でＴＭＥＭ２７の局在化が示された（図５ｂ）。ナノ金粒子は小嚢／膜融合現象（図５ｃ）の付近で原形質膜と結合し、これはＴＭＥＭ２７がインスリン分泌顆粒と共に共共局在化する形質膜タンパク質であることを示すものである。
【０１３７】
＜実施例６＞Ｏｂ／Ｏｂ島におけるＴＭＥＭ２７の発現増加、及びＩｎ  ＶｉｔｒｏにおけるＢ細胞の増殖
コントロールと比較した、ｏｂ／ｏｂ及びａＰ２−Ｓｒｅｂｐ−ｌｃトランスジェニックマウスの肥大した膵島におけるＴＭＥＭ２７の相対的な発現量を評価した。６〜８週齢のマウスから膵島を単離し、遺伝子発現レベルをそれらの野生型同腹仔と比較した。半定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイにより、コントロール値（図６ａ及び６ｂ）と比較して、ｏｂ／ｏｂ及びａＰ２−Ｓｒｅｂｐ−１ｃ膵島においてＴＭＥＭ２７レベルのそれぞれ２．１倍及び１．７倍の増加が確認された。更にｏｂ／ｏｂ及びａＰ２−Ｓｒｅｂｐ−１ｃマウスから単離した膵島では、野生型同腹仔（図６ｃ、データ示さず）における通常のサイズの膵島と比較し、切断されたＴＭＥＭ２７の培地中への分泌が顕著に増加した。ＴＭＥＭ２７が膵臓β細胞複製を刺激するか否かを解析するため、ＭＩＮ６細胞におけるＴＭＥＭ２７発現の急激な増加による効果を評価した。細胞を、プラスミドｐＴＭＥＭ２７又はＴＭＥＭ２７を標的とするｓｉＲＮＡｓと共に電気泳動した。細胞の複製は、細胞を計数し、エレクトロポレーションの４８時間後における［３Ｈ］チミジンの取込を測定することにより評価した（図６ｄ−ｇ）。ｐＴＭＥＭ２７でトランスフェクションしたＭＩＮ６細胞ではｐｃＤＮＡ３でトランスフェクションした細胞と比較し約５倍の過剰発現が示され、［３Ｈ］チミジン取込が約３倍増加し、プレーティングの４８時間後において細胞密度の増加が確認された（図６ｅ、ｇ）。一方、ｓｉＲＮＡ処理後のタンパク質発現の顕著な減少を示すＭＩＮ６細胞では、顕著に低い［３Ｈ］チミジン取込及び細胞密度を示した（図６ｄ、ｆ）。更に、ＴＭＥＭ２７の発現の増減にも関わらず、細胞のアポトーシスには変化が観察されず（データ示さず）、これはその発現が細胞死に影響を及ぼさないことを示すものである。これらの結果は、ＴＭＥＭ２７がＭＴＮ６細胞の細胞増殖を制御することを示す。
【０１３８】
＜実施例７＞膵島においてＴＭＥＭ２７を発現するトランスジェニックマウスでは膵島肥大が観察された：
マウスＴＭＥＭ２７  ｃＤＮＡをマウスインスリンプロモータの制御下となるようなベクター中に挿入し、その構築物を前核マイクロインジェクションし、膵臓β細胞特異的なトランスジェニックマウスを作製した。ＲＴ−ＰＣＲ及びイムノブロット分析により、野生型の同腹仔と比較して、ＴＭＥＭ２７発現がトランスジェニックマウスにおいて４倍増加したことが示された（図７Ａ）。８〜１２週齢のトランスジェニック動物の膵島形態観察によって膵島質量を解析した。トランスジェニックマウスでは通常の膵島の形態（免疫組織化学を使用したインスリン／グルカゴン共染色に基づく）を示したが、野生型同腹仔と比較し、膵島質量の約２倍の増加が見られた（図７Ｂ及び７Ｃ）。更に膵島質量の増加を、トランスジェニック及び野生型マウスにおける総インスリン含有量を測定することによって確認した。総インスリン含有量は、ＴＭＥＭ２７（図７Ｄ）を過剰発現するトランスジェニックマウスにおいても顕著に増加した。空腹時及び食後の血漿中グルコース及びインスリン濃度は、トランスジェニックマウスとコントロールマウスにおいて同様であり、これはトランスジェニックマウスの膵臓β細胞ではグルコースの大きな異常が検出できなかったことを示す（データ示さず）。これらのデータから、ＴＭＥＭ２７が膵島成長をｉｎ  ｖｉｖｏで制御することが明らかとなった。
【０１３９】
＜実施例８＞ＢＢ９４はＴＭＥＭ２７の分離を阻害する：
膵臓β細胞系のＭＥＭ６細胞を、２５ｍＭのグルコース、１５％のウシ胎児血清及び５．５μＭ  ２−メルカプトエタノールを含有するＤＭＥＭ培地で培養した。ＭＩＮ６細胞を１２ウェルプレート中で５０％の集密度（コンフルエンシー）となるようにプレーティングし、２４時間インキュベートした。細胞をＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で洗浄し、３７℃で１５分間、ＯＰＴＴ−ＭＥＭ中にＤＭＳＯ又はプロテアーゼ阻害剤ＢＢ９４（１μＭ）を添加してインキュベートした。上記のインキュベーション後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ中にＤＭＳＯ、ＰＭＡ（ＳｉｇｍａＰ８１３９）、ＢＢ９４又はＰＭＡ＋ＢＢ９４を添加し、細胞を２時間インキュベートした。上清を各３０μｌサンプリングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＴＭＥＭ２７（図８）のＮ末端（切断部分）を認識する抗ＴＭＥＭ２７抗体を使用してイムノブロッティングを実施した。抗Ｖ５抗体（ＴＭＥＭ２７のＣ末端（細胞内）部分を認識する）をコントロールとして使用してイムノブロッティングを行った結果、ＰＭＡ及びＢＢ９４がＴＭＥＭ２７（図８）の発現レベルを変化させないことが示された。ＢＢ９４（ＰＭＡでない）では、ＴＭＥＭ２７のＣ末端の発現レベルは一定であったが、ＴＭＥＭ２７のＮ末端の発現レベルは減少した（図８）。ＢＢ９４はセリンプロテアーゼ及びメタロプロテアーゼの周知の阻害剤であるため、ＴＭＥＭ２７がセリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼのファミリーに属するプロテアーゼの基質であることを示唆すると考えられる。
【０１４０】
本発明の具体的な特徴を本願明細書に記載・例示したが、当業者であればそれに対する多くの修飾、置換、変更及び同等技術を想起しうると考えられる。ゆえに、本発明の技術的思想の範囲内に含まれるこれらの全ての改変及び変形は、特許請求の範囲に包含されるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１ａ】Ｔｃｆ１により制御されるＴＭＥＭ２７発現を示す。同腹の野生型の同腹仔コントロールと比較し、Ｔｃｆ１−／−マウスの膵島においてＴＭＥＭ２７発現が減少している。ＲＴ−ＰＣＲによって発現レベルを測定し、ＧＡＰＤＨをコントロールとして用いた。
【図１ｂ】プロモーター解析を行い、ヒト（配列番号：１０）及びマウス（配列番号：１１）ＴＭＥＭ２７遺伝子の上流の調節領域（転写開始部位に対して−６０〜１１７塩基）に存在する２つの保存されたＴｃｆ結合部位を予測した。ヒト及びマウスのプロモーター配列をアラインメントし、Ｔｃｆ結合部位を青色のボックスとして示す。第２の部位（赤色のボックス）は推定のＰｄｘ−１結合部位を示す。強調された配列（緑色）はＴｃｆ結合部位の変異部位を示す。
【図１ｃ】ｐｃＤＮＡ３又はｐＴｃｆ１、ｐＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼ、並びに８１５塩基のＴＭＥＭ２７マウスプロモーターを使用するルシフェラーゼリポーター遺伝子使用してトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞における転写活性化アッセイを示す。リポーターベクター中のＴｃｆ結合部位のプロモーター配列に個々に変異させ、ＭＩＮ６細胞をベクターｐＴ２７１ｕｃ−ｗｔ、ｐＴ２７１ｕｃ−ｍｌ又はｐ２７１ｕｃ−ｍ２でトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性はβ−ガラクトシダーゼ活性に基づき標準化した。各数値は８回の独立した実験の平均を意味する。
【図１ｄ】Ｔｃｆ結合部位１及び２のオリゴヌクレオチド、並びにＭＩＮ６細胞の全細胞抽出液を使用したＥＭＳＡ分析を示す。競合物質とは、結合部位１及び２に対して５０倍過剰の、非標識の二本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。暗い楔形は３２Ｐ−標識プローブとＴｃｆ１との相互作用を意味し、明るい楔形はα−Ｔｃｆ１抗体の添加後の、この相互作用物のスーパーシフトを示す。この相互作用物が抗Ｐｄｘｌ抗体によりシフトすることから、Ｐｄｘｌも部位２と結合ことが示される。
【図１ｅ】ＭＩＮ６細胞のＣｈＩＰアッセイにおける、ＴＭＥＭ２７のプロモーターとＴｃｆ１とのｉｎ  ｖｉｖｏでの相互作用を示す。結合部位１及び２にわたる１５０塩基の領域をＰＣＲで増幅した。この相互作用は、ＴＭＥＭ２７を発現しない初期の肝細胞では検出されなかった。初期の肝細胞におけるＴｃｆ１のＣｈＩＰを、Ｔｃｆ１結合部位にわたるＡｐｏＭプロモーター領域の増幅によって確認した。
【図２】分化しているマウス膵臓におけるＴＭＥＭ２７発現を示す。マウスの成長期の所定の時点における、パラフィン包埋した膵臓組織の、抗Ｃｏｌ−４、抗インスリン及び抗グルカゴン抗体で封埋した際の免疫蛍光を示す。
【図３ａ】ＴＭＥＭ２７がＮグリコシル化タンパク質であり、二量体を形成することを示す。ＭＩＮ６細胞はツニカマイシンの量を増加させてインキュベートし、それによるアスパラギン残基におけるグリコシル化が阻害された。細胞にＤＭＳＯのみを添加したときには効果がなかった。
【図３ｂ】ＭＩＮ６細胞から調製した上清をＮ−グリカナーゼとインキュベートした。ウエスタンブロットにおける分子量のシフトは、当該酵素が分泌されたＴＭＥＭ２７から糖部分を除去したことを示す。分泌されたタンパク質を、抗−Ｃｏｌ−３抗体で検出した。
【図３ｃ】ＭＩＮ６細胞溶解液を、ＰＢＳ、又は架橋試薬ＤＴＢＰ及びＢＭＨでインキュベートした。非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗−Ｃｏｌ−４抗体を使用したイムノブロッティングにより、全長のＴＭＥＭ２７の２倍の分子量のバンドが示された。還元条件下では、ＰＢＳ及びＤＴＢＰ処理された細胞溶解液においてモノマーだけが検出された。対照的に、ＢＭＨ処理されたサンプルでは二量体が残り、ＢＭＨ架橋結合が可逆的でないことを示す。
【図４ａ】ＴＭＥＭ２７が切断され、膵島のβ細胞から分泌されることを示す。抗−Ｃｏｌ−４抗体を用いたＭＩＮ６細胞のウエスタンブロットにおいて、ＴＭＥＭ２７の２つのバンドを検出した。ｐＴＭＥＭ２７．Ｖ５−Ｈｉｓを過剰発現させる細胞で、２５ｋＤａのバンドが濃くなった。
【図４ｂ】α−Ｖ５抗体をプローブとする、（ａ）の細胞溶解液のイムノブロットを示す。Ｖ５エピトープに対する抗体により、ｐＴＭＥＭ２７．Ｖ５−Ｈｉｓでトランスフェクションした細胞では両方のバンドが検出されたが、ｐｃＤＮＡ３でトランスフェクションした細胞では検出されなかった。
【図４ｃ】列記する細胞系を用い、ｐｃＤＮＡ３又はｐＴＭＥＭ２７でトランスフェクションし、抗Ｃｏｌ−４抗体を用いた細胞溶解液のウエスタンブロットを行い、全長タンパク質を検出した。抗Ｃｏｌ−３を用いた結果、分泌されたタンパク質は、ＭＥＳＴ６細胞の上清においてのみ検出された。ＭＩＮ６細胞においてのみ、全長タンパク質の発現増加による分泌タンパク質の増加が検出された。
【図４ｄ】マウス膵島を単離し、７２時間インキュベートした。上清を回収し、膵島を溶解緩衝液に添加した。抗Ｃｏｌ−４を用いた溶解物のウエスタンブロットを行い、全長タンパク質を検出し、また等しい量の上清をロードして抗Ｃｏｌ−３を用いたウエスタンブロットを行い、分泌タンパク質を検出した。
【図４ｅ】ＭＩＮ６細胞に対して、ＧＦＰ又はＴＭＥＭ２７を標的とするｓｉＲＮＡｓでエレクトロポレーションを行った。ｓｉ−ＴＭＥＭ２７＃１及び＃２でエレクトロポレーションした細胞において、エレクトロポレーションの４８時間後におけるＴＭＥＭ２７タンパク質の濃度減少が、抗Ｃｏｌ−４抗体を用いて検出された。同じ細胞からの等しい量の上清を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗Ｃｏｌ−３抗体により、分泌タンパク質の濃度減少が検出された。
【図４ｆ】ＭＩＮ６細胞を、ｐｃＤＮＡ３、ｐＴＭＥＭ２７又はｐＴＭＥＭ２７−ＨＡを用いてエレクトロポレーションした。抗−Ｃｏｌ−４抗体を用いて細胞溶解液のウエスタンブロットを行い、ＴＭＥＭ２７の過剰発現を検出した。同じ細胞から調製した上清を用い、抗ＨＡエピトープ抗体によるウエスタンブロットを行った。
【図５ａ】ＴＭＥＭ２７が膵臓β細胞の小胞体及び原形質膜上に存在することを示す。０．０１％のサポニンでＭＩＮ６細胞の透過性を高め、抗−Ｃｏｌ−４抗体で染色した。抗−Ｃｏｌ−３抗体を用いた免疫蛍光顕微鏡検査においても同様の結果を示した。
【図５ｂ】抗−Ｃｏｌ−４抗体を有するＭＩＮ６細胞の電子顕微鏡観察により、小胞体におけるＴＭＥＭ２７の局在化が観察された。１０ｎｍの金粒子とコンジュゲートしたＩｇＧを用い、抗体の検出を行った。
【図５ｃ】（Ｂ）と同じ方法を使用して、原形質膜と融合するＴＭＥＭ２７を含む小嚢を検出した。
【図６ａ】ＴＭＥＭ２７がｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてβ細胞の複製を増加させることを示す。半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、ＴＭＥＭ２７発現レベルを、ｏｂ／ｏｂマウス及び野生型の同腹仔コントロールから単離した膵島に関して測定した。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして用いた。
【図６ｂ】上記と同様に、トランスジェニックａＰ−Ｓｒｅｂｐｌｃマウス及びそれらの野生型の同腹仔コントロールから単離した膵島を用い、ＴＭＥＭ２７発現レベルを測定した。
【図６ｃ】野生型及びｏｂ／ｏｂマウスから単離した膵島を、数及びサイズに関して一致させ、等量の培地中で７２時間インキュベートした。分泌されたタンパク質を、抗Ｃｏｌ−３抗体で検出した。
【図６ｄ】ＭＩＮ６細胞を、ルシフェラーゼ又はＴＭＥＭ２７を標的とするｓｉＲＮＡｓでエレクトロポレーションした。細胞の代表的な画像を倍率２０×で撮影した。エレクトロポレーションの４８時間後に細胞をトリプシン処理し、トリパンブルー染色し、血球計数板でカウントした。各数値は、６つの独立の実験における平均値を意味する。
【図６ｅ】ＭＩＮ６細胞を、ｐｃＤＮＡ３、ｐＴＭＥＭ２７でエレクトロポレーションし、上記の実験を繰り返した。
【図６ｆ】上記の通りＭＤＳＴ６細胞をエレクトロポレーションし、細胞分裂を［３Ｈ］チミジン取込みにより測定した。
【図７ａ】膵臓β細胞におけるＴＭＥＭ２７の発現増加に応答した、膵島量の増加を示す。ＴＭＥＭ２７の発現増加を、ＲＩＰ−ＴＭＥＭ２７トランスジェニックマウス及び野生型の同腹仔コントロールから単離した膵島の抗Ｃｏｌ−４抗体によるウエスタンブロットにより検出した。
【図７ｂ】トランスジェニック及びコントロール動物（ｎ＝３）から調製した全膵臓をパラフィンに包埋し、インスリンに関して染色した。各遺伝子型を代表する画像（５×拡大）を示す。
【図７ｃ】７μｍの切片におけるインスリン染色を、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアを使用して定量した。各膵臓の２００μｍより大きい断面に関して、少なくとも５０の膵島をそれぞれ定量した。
【図７ｄ】トランスジェニック及び野生型マウス（ｎ＝３）からの全膵臓を単離し、酸／エタノール中にホモジナイズした。膵臓重量当りのインスリン含有量として標準化した。
【図８】ＴＭＥＭ２７がセリン及び／又はメタロプロテアーゼの基質であることを示す。セリンプロテアーゼ及びメタロプロテアーゼ阻害剤ＢＢ９４とインキュベートしたＭＩＮ６細胞では、ホルボールエステルであるホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ＰＭＡ）、又はＢＢ９４＋ＰＭＡの両方とインキュベートしたＭＩＮ６細胞と比較し、抗体認識される切断されたＮ末端のレベルが低下していた。抗Ｖ５抗体で標識した細胞（ＴＭＥＭ２７のＣ末端を標識）では、全ての群において顕著なバンドが示された。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図４ｇ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【図７ｆ】
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【図８】
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【配列表】
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