(57)【要約】【課題】【解決手段】  天然源である廃棄卵殻からの、グルクロン酸単位およびＮ−アセチルグルコサミン単位を交互に有する式Ｉ【化１】2009531513.tif 000005（式中、Ｍは、一以上の位置では、Ｎａ、Ｃａ、Ｋ、Ｍｇであり、ｎは、２０〜４０の整数である）の低分子量アミノグリカン化合物の単離方法で、  （ａ）式Ｉの胚性の低分子量アミノグリカン化合物の抽出のために、水中の極性有機溶媒を使用して廃棄卵殻の前調製を行う工程と、  （ｂ）極性塩水溶液を使用して、水溶性塩として前記式Ｉの低分子量アミノグリカン化合物を抽出する工程と、  （ｃ）極性有機溶媒の使用によって前記水性塩混合物からゲルを形成し、続いて、ろ過又は遠心分離することによって、精製された式Ｉの低分子量アミノグリカン化合物を単離する工程と、  （ｄ）半乾燥ゲルに有機油を逐次導入することによって、前記単離されたアミノグリカンを安定化させて、式Ｉのアミノグリカン化合物を形成する工程とを含む。
2009531513.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
廃棄卵殻からの式Ｉ
【化１】
2009531513.tif 000004
（式中、Ｍは、一以上の位置では、Ｎａ、Ｃａ、Ｋ、Ｍｇであり、ｎは、２０〜４０の整数である。）の低分子量アミノグリカン化合物の単離方法であって、
（ａ）式Ｉの胚性の低分子量アミノグリカン化合物の抽出のために、水中の極性有機溶媒を使用して、廃棄卵殻の前調製を行う工程であって、前記前処理された卵殻を、２５℃〜４０℃の間の温度で１時間〜４時間、水中の前記極性有機溶媒と十分に混合し、次に上清をデカンテーションして、前記卵殻を抽出工程へと進める前調製工程と、
（ｂ）水溶性塩として前記式Ｉの低分子量アミノグリカン化合物を抽出する工程であって、工程（ａ）からの卵殻を、極性塩水溶液とともに２５℃〜４０℃で６〜２４時間激しく振とうさせ、次に、デカンテーション、ろ過、又は遠心分離して、溶解された式Ｉのアミノグリカン化合物を含有する水層を採取する抽出工程と、
（ｃ）極性有機溶媒を使用した前記水性塩混合物からのゲル形成により、前記精製された式Ｉの低分子量アミノグリカン化合物を単離する工程であって、工程（ｂ）からの溶液を、前記極性有機溶媒の７５％〜１５０％容量／容量の量、１０℃〜２０℃で１時間〜２時間、前記極性有機溶媒の逐次段階的添加にかけ、形成されるゲルを４〜１２時間放置して、析出を完了させ、次にデカンテーション、ろ過又は遠心分離して、４％〜８％の水分を含有する半乾燥の式Ｉのアミノグリカン化合物を単離する単離工程と、
（ｄ）前記半乾燥ゲルに有機油を逐次導入することによって、前記工程（ｃ）で単離された式Ｉのアミノグリカン化合物を安定化させて、式Ｉのアミノグリカン化合物を形成する工程とを含む方法。
【請求項２】
工程（ａ）で使用される前記極性有機溶媒が、アルコール、アセトン、メチルエチルケトン、又は１，４−ジオキサンからなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）で使用される前記極性塩水溶液が、クエン酸、グルタミン酸、酢酸、炭酸ピロリドン、酒石酸、グリシン酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、炭酸又はシュウ酸のナトリウム、カリウム、カルシウム又はマグネシウム塩からなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）で使用される前記極性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール又はブタノールから選ばれる低級アルコール、或いはジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、メチラール又はエチラールから選ばれる有機エーテルである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｄ）で使用される前記有機油が、植物源から得られる油である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記有機油が、ホホバ、アーモンド、セージ、ローズマリー、ラベンダー、ビャクダン又はアロエ油から選ばれる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｄ）で得られた安定化された式Ｉのアミノグリカン化合物に少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を添加する工程をさらに含み、シワ取り性を有する組成物を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法で製造される、１５０００ダルトンから２８０００ダルトンの範囲の分子量を有する、安定化された式Ｉのアミノグリカン化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、廃棄卵殻から簡単かつ効率的に超低分子量アミノグリカンを単離および安定化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の実施形態は、廃棄卵殻から低分子量アミノグリカンを単離、安定化および作成する方法に関する。アミノグリカン抽出物は、皮膚の保湿およびシワ取り性を有する化粧用クリームの調製に有用である。
【０００３】
ナカノら（Ｐｏｕｌｔ  Ｓｃｉ．、１９９１年、第７０巻（１２）、２５２４〜８ページ）は、単冠白色レグホン種の雄鶏のとさかや肉垂からのグリコサミノグリカン分画の化学組成は、軟骨補充療法に適用がある非常に高分子量のグリコサミノグリカンから成ることを示した。
【０００４】
バラージュ（Ｂａｌａｚｓ）ら（米国特許第４，１４１，９７３号）は、関節液および硝子体液の補充に有用な、１ＭＤから６ＭＤの範囲の分子量を有する純粋なヒアルロン酸の動物組織からの単離方法を記載した。
【０００５】
ヒーニー（Ｈｅａｎｅｙ）ら（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．、１９７６年、第１８巻；４５１（１）、１３３〜４４ページ）は、鶏の卵殻の有機部分は、おそらく糖タンパク質およびグリコサミノグリカンとして存在するコラーゲン、タンパク質および多糖から成ることを示した。彼らはさらに、クロマトグラフィーにより有機成分を同定し、３００００ダルトンの最少分子量を有するグリコサミノグリカンを得た。密度勾配における沈降速度分析により、その多糖は等モル量のグルコサミン（３６．３％ｓ／ｗ）およびグルクロン酸３５．６％ｗ／ｗを含有することが示された。分解産物の同定により、そのグリコサミノグリカンは主にヒアルロン酸であることが示された。
【０００６】
シュタール（Ｓｔａｈｌ）ら（米国特許第６，５３７，７９５号）は、連鎖球菌発酵の培養株からアミノグリカンを製造し単離する方法を記載した。これらのアミノグリカンは、６ＭＤを超える非常に高い分子量で特徴付けられ、軟骨補充療法に有用である。
【０００７】
他の天然源および動物組織からのグリコサミノグリカンの単離および精製に関連する方法はまた、米国特許第５，８２４，６５８号、米国特許第６，６６０，８５３号および米国特許第６，４５１，３２６号に見出される可能性がある。これら特許内で検討される文献は、参照により本書に援用される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の実施形態は、従来知られていなかった天然源である廃棄卵殻からの、グルクロン酸単位およびＮ−アセチルグルコサミン単位を交互に有する式Ｉ
【０００９】
【化１】
2009531513.tif 000003
【００１０】
（式中、Ｍは、一以上の位置では、Ｎａ、Ｃａ、Ｋ、Ｍｇであり、ｎは、２０〜４０の整数である）の低分子量アミノグリカン化合物の新規な単離方法を提供し、前記方法は、
（ａ）式Ｉの胚性の低分子量アミノグリカン化合物の抽出のために、水に溶解された極性有機溶媒を使用して、廃棄卵殻の前調製を行う工程と、
（ｂ）極性塩水溶液を使用して、水溶性塩として前記式Ｉの低分子量アミノグリカン化合物を抽出する工程と、
（ｃ）極性有機溶媒の使用によって前記水溶性塩混合物からゲルを形成し、続いてろ過又は遠心分離することによって、精製された式Ｉの低分子量アミノグリカン化合物を単離する工程と、
（ｄ）前記半乾燥ゲルに有機油を逐次導入することによって、前記単離されたアミノグリカン化合物を安定化させて、式Ｉのアミノグリカン化合物を形成する工程とを含む。
【００１１】
本発明の実施形態における特にステップ（ｂ）において、選択的ゲル化および単離に適した式Ｉのアミノグリカンを含有する溶液を得るために、前記極性塩水溶液は、クエン酸、グルタミン酸、酢酸、炭酸ピロリドン、酒石酸、グリシン酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、炭酸、シュウ酸のナトリウム、カリウム、カルシウム又はマグネシウム塩であってもよい。
【発明の効果】
【００１２】
本明細書に記載の方法は、廃棄卵殻から選択的かつ簡単に式Ｉの低分子量アミノグリカン化合物を得るための新規な方法である。より具体的には、本発明の方法は、従来技術で開示されたアミノグリカンの単離手順と比較すると、以下の点で区別される。
【００１３】
ａ）これまで使用されなかった（使用されたとしても処分が難しく、環境へ重大な影響を及ぼす）新規原料である、卵殻廃棄物を見出したこと。
ｂ）有害なタンパク質およびヌクレオチドを非常に低濃度で含有すること。
ｃ）卵殻廃棄物からの有機および無機物質の高価で非能率的な分離を必要としないこと。
ｄ）穏やかな試薬および溶媒物質を伴う、より簡単な抽出を含むこと。
ｅ）化粧品への適用に必要とされる所望の粘性および糸引き特性を達成するために、アセチル化又は他の誘導体化、例えば、米国特許第５，６７９，６５７号に記載されるような無水酢酸および硫酸を使用することを必要としないこと。
【００１４】
式Ｉのアミノグリカン化合物は、分子量が非常に低く、さらに、誘導体化なしで安定化されて優れた皮膚透過性を与えて皮膚の表面のシワを減少させる上に、優れた柔軟および保湿効果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
卵加工産業からでる卵殻廃棄物は、通常、埋立処分する前に溶媒で洗浄され、処理されて、不快臭が除去される。殻の炭酸カルシウムは、多大な分離および洗浄手順を経たもののみ使用可能であり、これにより、この方法は商業的に不経済となる。本発明の方法は、マクニール（米国特許第６，１７６，３７６号）により記載された純粋な炭酸カルシウムを得るための複雑な方法および装置におけるような卵殻からの内膜の分離に依存しないので、狭隘な範囲に卵殻を粉砕する必要が特にない。
【００１６】
我々は、費用のかかる有機および無機成分の分離なしで、破砕された卵殻から貴重な有機化合物、具体的には式Ｉのアミノグリカン化合物を選択的に単離するための方法を見出した。
【００１７】
破砕された卵殻を、温水又は暖かい５％エタノール溶液で処理し、ろ過して、殻の表面に付着した有機廃棄物を除去する。炭酸カルシウムに対する有機分の比率は１％〜１５％ｗ／ｗの間であってもよい。より大きな有機分の比率は、破砕された卵殻中に洗浄されていない卵分があることを意味しており、この洗浄されていない成分は有害なタンパク質およびヌクレオチド生成物がアミノグリカン抽出物中に存在することにつながり得る。なお、動物組織や発酵培養液などの従来技術で知られるような他のアミノグリカン源と違い、本明細書で示される廃棄卵殻の使用は、抽出された媒体中に重大な抗原性タンパク質およびヌクレオチド成分がなく、精製された式Ｉのアミノグリカン化合物のより容易な抽出方法につながるので、独特のものである。液体洗浄の後でさえも存在している可能性のある微生物を滅するために、卵殻をさらに紫外線光で前処理してもよい。
【００１８】
次の工程は、上記卵殻分を、水溶性塩の形態で炭水化物成分の高度選択的な抽出に供することを含む。その方法は、卵殻分を、クエン酸、グルタミン酸、酢酸、炭酸ピロリドン、酒石酸、グリシン酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、炭酸およびシュウ酸のナトリウム、カリウム、カルシウム又はマグネシウム塩を５〜４０重量％含有する塩水溶液、或いは必要に応じて上記塩溶液の組み合わせに、容量で１：２〜１：１０の割合いで懸濁することを伴う。より具体的には、有機酸の一価の塩が好ましい。懸濁液を、１０〜３５℃の間の範囲の温度で定期的に激しく振とうさせ、１〜２４時間、より好ましくは６〜１２時間、保持する。その懸濁液を、続いて、ろ過又は遠心分離し、式Ｉのアミノグリカン化合物の適切な塩を含有する水溶液を採取する。このようにして分離された卵殻分では、卵殻に膜が非常に緩く結合している。従って、その分離された卵殻分を、当該技術分野で公知の方法を用いてより簡単に処理して、純粋な炭酸カルシウムを含有する卵殻を有機残渣から分離できる可能性がある。
【００１９】
次の工程は、前記水溶液から適切な塩形態の式Ｉのアミノグリカン化合物のゲルを析出することを含む。その方法は水溶液に、アルコール、アセトン、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリジノン又は１，４−ジオキサン等の何らかの水混和性有機溶媒を逐次添加することにより、水溶液の極性を減少させ、式Ｉのアミノグリカン化合物の溶解度を減少させることを含む。有機溶媒を、穏やかに撹拌し、そして２０℃〜２５℃の間に反応温度が維持されるように冷却しながらロットごとに添加し、水層中に懸濁された白色のゲルを得る。ゲル形成が完了するまで、溶液を２〜２４時間放置する。そして、ゲルをろ過又は遠心分離し、式Ｉのアミノグリカン化合物の半乾燥抽出物を得る。次に実施される安定化方法では一定量の水相が必要であるので、抽出物を完全に乾燥してしまわないことが重要である。
【００２０】
最後の工程は、親油性の環境中の分子が、従来技術（米国特許第５，６７９，６５７号）に記述されているようなアセチル化されていない低分子量アミノグリカンに特徴的な架橋しないようにすることによって、式Ｉの低分子量アミノグリカン化合物を安定化させることを含む。この方法の工程は、２つの油の逐次添加を含む。第１の油は、本質的にはより疎水性で、植物の実に典型的に見出される油から選択されてもよい。具体的には、アーモンド油又はホホバ油が第１の油としてより好ましい。第２の油は、本質的にはより親水性で、植物の成長力のある部分からのハーブおよびスパイスから典型的に単離される油から選択されてもよい。具体的には、セージ油、ローズマリー油、又はラベンダー油が第２の油としてより好ましい。油の添加量の合計は、抽出されたアミノグリカンの重量の５％〜５０％の間であってもよく、また、２つの油の比率は０．１：１〜１：０．１であってもよい。
【００２１】
このように単離された式Ｉのアミノグリカン化合物の分子量は直接測定することが困難であるので、固有粘度を測定して、分子量を決定した（ローラン（Ｌａｕｒｅｎｔ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、第４２巻、４７６ページ、１９６０年）。式Ｉのアミノグリカン化合物を含有する種々の溶液の固有粘度は、４ｃｍ３／ｇｍ〜７ｃｍ３／ｇｍの間にあることが分かり、ヒアルロン酸塩の標準溶液（分子量：約１．２ＭＤ）に対してプロットした場合において、１５０００ダルトン〜２８０００ダルトンの範囲の間の式Ｉの特有の天然超低分子量のアミノグリカン化合物が特定された。天然源からの式Ｉの超低分子量アミノグリカン化合物は、（例えば、米国特許第４，５８２，８６５号中でバラージュ（Ｂａｌａｚｓ）らにより要約されているような）従来技術において、先に記載されたものではない。
【００２２】
実験結果
実施例１
５００ｇの前処理された約１０％有機含有量の卵殻廃棄物を、ねじ蓋付き開口ガラス容器に添加した。これに、クエン酸ナトリウムの５％水溶液７５０ｍｌを添加し、容器を、密閉して中程度の速度の振とう機の上に２４時間置いた。２４時間後、全混合物をろ過漏斗に移し、固形の卵殻廃棄物を水性懸濁液から分離した。固形物を５％クエン酸ナトリウム水溶液で洗浄（１×２５０ｍｌ）し、合わせた水層を塩化メチレン２５０ｍｌで１回洗浄して、潜在する蛋白質物質を除去し、水層をその後２Ｌビーカーに移した。ビーカーを冷水浴内に置き、ゆっくりと撹拌しながら無水メタノールをゆっくりと添加した。約２００ｍｌのメタノール添加が完了した後、濁った白色の析出物が生じ始め、撹拌を止めた。同じ追加量のメタノールをゆっくりと添加し、ビーカーを１２時間放置して、ゲル形成が完了することを確かめた。塊を全部ろ過漏斗に移し、ろ過して、式Ｉのアミノグリカン化合物のクリーム色のゲルを得た。５〜７％の含水量が測定されるまで析出物を乾燥した。式Ｉのアミノグリカン化合物のゲルの最終重量は４２ｇであった。
【００２３】
実施例２
実施例１の式Ｉのアミノグリカン化合物を含有するゲル材料を、１５℃〜２０℃で４ｇのホホバ油と混合し、２０分間激しく撹拌した。得られたゲルを２５℃まで温め、１時間静かに撹拌した。この塊に、１ｇのセージ油を添加し、得られたゲルをさらに１０分間静かに撹拌した。その後、ゲルを４時間かけて１０℃までゆっくりと冷却し、空気を循環させない室温下で少なくとも３か月間安定している式Ｉのアミノグリカン化合物を得る。
【００２４】
実施例３
１０％酒石酸カリウム水溶液を用い上記の実施例１を繰り返して、４６ｇの式Ｉのアミノグリカン化合物のゲルを得た。
【００２５】
実施例４
２０％酢酸ナトリウム溶液を用い上記の実施例１を繰り返して、４３ｇの式Ｉのアミノグリカン化合物のゲルを得た。
【００２６】
実施例５
完全なゲル形成のためにメタノールの代わりにエタノールを使用した以外は上記の実施例１を繰り返して、４７ｇの式Ｉのアミノグリカン化合物のゲルを得た。
【００２７】
実施例６
完全なゲル形成のためにメタノールの代わりにアセトンを使用した以外は上記の実施例１を繰り返して、４１ｇの式Ｉのアミノグリカン化合物のゲルを得た。
【００２８】
実施例７
１０％炭酸ナトリウム溶液を用い上記の実施例１を繰り返して、２４ｇの式Ｉのアミノグリカン化合物のゲルを得た。
【００２９】
実施例８
２５％炭酸カルシウム溶液を用い上記の実施例１を繰り返して、１４ｇの式Ｉのアミノグリカン化合物のゲルを得た。
【００３０】
実施例９
実施例２で示された手順によって作成した上記安定化されたゲル１０ｇを３ｍｌのグリセリンを含有する５０ｍｌの蒸留水に添加し、均一な懸濁液に撹拌した。この懸濁液に、１０ｇの乳化ろうと、１０ｇのパラフィンろうと、４ｇの白ろうと、アーモンド、ラベンダー、ビャクダンおよびくるみ油などの美容上有用な植物油の混合物１３ｇとからなる融液を添加し、混合物を激しく撹拌して、物理的特性およびシワ取り性に優れた均一なクリームを得た。
【００３１】
上記の単離され安定化された式Ｉのアミノグリカン化合物のゲルに関して、次の分析そして有用性試験を行なった。
【００３２】
コンドロイチン硫酸の非存在
従来技術において、アミノグリカンの全ての商業源が、通常、コンドロイチン硫酸などの他の組織成分と緊密に関連していることが知られている（アーキンス（Ａｒｋｉｎｓ）およびシーハン（Ｓｈｅｅｈａｎ）、ヒアルロン酸の構造、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ、２３５、２５３、１９７２年、ならびにベッテルハイム（Ｂｅｔｔｅｌｈｅｉｍ）およびフィルポット（Ｐｈｉｌｐｏｔｔ）、ヒアルロン酸の電子顕微鏡的研究−タンパク質ゲル、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ３４、１２４、１９５９年）。上述の方法によって単離されたゲル抽出物は、おそらく本発明で単離された極めて小さいサイズの式１のアミノグリカン化合物との可能な限りの低い会合により、２％未満のコンドロイチン硫酸を含む。
【００３３】
タンパク質の非存在
タンパク質は潜在的に抗原性であるので、化粧用製剤のためには、タンパク質を本質的に含んでいないどんなアミノグリカンゲルでも単離することが必須である。実施例１のゲル抽出物を、ローリー（Ｌｏｗｒｙ）ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、１９３、２６５〜２７５、１９５１年）により記載されたタンパク質の存在の検出のための高感受性比色試験に供した。陽性結果は得られず、これはタンパク質の存在は０．１重量％未満にすぎないということを示している。タンパク質濃度が少しも感知されなかったことは、雄鶏のとさか及び発酵培養液のような他の天然源から単離された他のグリコアミノグリカン化合物との明確な違いである。これらのアミノグリカンは、通常、タンパク質と共有結合して、プロテオグリカンを形成することが報告されている（クルダス（Ｋｌｕｄａｓ）、米国特許第５，０５５，２９８号）。ヒトの皮膚の成分ではないこれらのタンパク質すべての臨床的に適切な除去は、困難であり、容易に達成されないということが証明されている。種々の他のアミノグリカン抽出物中におけるこれらのタンパク質の存在は、肌表面の著しい炎症反応の原因として認識されており、それらの化粧用製剤での使用を困難にしている。
【００３４】
ヌクレオチドの非存在
本発明で抽出された式Ｉのアミノグリカン化合物中に潜在的に抗原性のＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドが含まれていないことを示すために、紫外分光法を使用した。１０％塩化ナトリウム溶液中で実施例１のアミノグリカン抽出物の１％溶液を調製した。この溶液を２５７ｎｍで紫外分光分析に供し、溶液のヌクレオチドレベルを測定した。この波長での吸収が少しもなかったことは、実施例１のアミノグリカン抽出物中にヌクレオチドがないことの指標として解釈された。
【００３５】
粘度
ゲルの小標本を凍結乾燥し、糸様構造を有する水にゆっくりと溶解する白色固形物を得た。この粉末１ｍｇの溶液を、１０００ｍｌのリン酸緩衝液でｐＨ７に調製した。粘度を２５℃の温度でオストワルド粘度計を用いて決定した。溶液の相対粘度は０．７６〜０．８０と測定された。公知のより高分子量のアミノグリカンと比較すると、この粘度測定より、式Ｉのアミノグリカン化合物の分子量は、１５０００ダルトン〜２８０００ダルトンの間となる。
【００３６】
グルコサミンの存在
式Ｉのアミノグリカン化合物中のグルコサミンの存在は、５Ｎの塩酸により１００℃で６時間加水分解され、蒸発乾固された物質でのエルソン（Ｅｌｓｏｎ）およびモルガン（Ｍｏｒｇａｎ）（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ、第２７巻、１９３３年、１８９４ページ）の方法により決定された。式Ｉのアミノグリカン化合物のグルコサミン含量は、３８％〜４１％の間であり、予想した計算値と一致した。
【００３７】
ウロン酸の存在
式Ｉのアミノグリカン化合物中のウロン酸の存在は、ヒアルロニダーゼによる消化により決定した。抽出された式Ｉのアミノグリカン化合物を、蒸留水で洗浄し、１０ｍｌの１０ｍＭ ＣａＣｌ２／５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液中でｐＨ７．６、４８時間、３７℃でストレプトミセスヒアルロニダーゼ（アミノグリカン１ｇあたり酵素１ｍｇ）で加水分解した。プロテイナーゼ阻害剤、すなわち、フッ化フェニルメタンスルホニル（２ｍＭ）およびＮ−エチルマレイミド（１０ｍＭ）を試料に添加し、非特異的蛋白質分解を阻害した。尿素を最終濃度が６Ｍになるまで添加し、加水分解を停止した。加水分解物を４０００ｇで遠心分離し、上清（ヒアルロニダーゼ消化物）を除去し、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析により標準ウロン酸とマッチングした。
【００３８】
糸形成能
糸形成能がより高いほど、アミノグリカンの保湿効果が高いことが、従来技術中で十分に裏付けられている。アセチル化および共重合化のような高および中分子量アミノグリカンの多くの誘導体（米国特許５６７９６５７号）が、動物および細菌源から単離されたアミノグリカンの固有の糸引き値を高めるために使用されている。本発明で単離された式Ｉの超低分子量アミノグリカン化合物が、非常に高い糸形成能を示し、観察される高いシワ取り効果の要因の一部となる可能性があることが予想外に観察される。２５℃の温度、５０％の相対湿度の湿度室中で、１ｃｍのガラス棒を実施例１のアミノグリカン抽出物の１％水溶液中に浸漬し、１０ｃｍ／ｍｉｎの速度でビーカーを下げた時に得られる糸の長さを観察した。観察された本発明の式Ｉのアミノグリカン化合物の糸の長さは２．８ｃｍ〜３．５ｃｍの間であり、これは市販のヒアルロン酸ナトリウムで観察される０．８ｃｍ〜１．３ｃｍよりもかなり長く、誘導体化アミノグリカンで観察される長さよりもなお良好である。
【００３９】
シワ取り性
実施例９に記載した方法によって製造されたクリームのシワ取り性は、３Ｄ画像システムを使用して、表面のしわの深さを測定して試験した。ジャスパース（Ｓ．Ｊａｓｐｅｒｓ）らにより記述された方法（「新しいデジタル光学投影システムによる生体内でのヒトの皮膚のマイクロトポメトリー測定」、プレプリント、第５回国際皮膚イメージング学会、ウィーン、１９９７年）を用い、４週間毎日使用した後、シワの深さが２５％〜３８％減少したことが示された。