(57)【要約】本発明は、癒着を阻害する組成物および方法を提供する。該方法は、多糖誘導体、例えば、ヒアルロン酸、セルロースまたはデキストランの誘導体のようなヒドロゲル前駆体を含有する溶液を、例えば、外科的処置、傷害または感染の結果として癒着を形成し得る部位において被験体に投与する工程を含む。ヒドロゲル前駆体は、例えば、多糖誘導体はそれらの投与後に架橋されるようになって、組織分離を維持するヒドロゲルを形成する。本発明の特定の実施形態において、一方のまたは双方の溶液は、粒子を含有する複合ヒドロゲルが形成されるように、粒子、例えば、ポリマーナノ粒子またはマイクロ粒子を含有する。該溶液、粒子、またはその双方は、癒着の阻害に寄与する薬剤のような生物学的に活性な薬剤を含有することができる。生物学的に活性な薬剤はヒドロゲル前駆体に共有結合させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の身体内の位置へ第一のヒドロゲル前駆体を投与する工程；および、
該被験体の身体内の位置に第二のヒドロゲル前駆体を投与する工程；
を含み、ここに、該第一のヒドロゲル前駆体はセルロース誘導体またはデキストラン誘導であり；該第二のヒドロゲル前駆体はデキストラン誘導体であり；該第一および第二のヒドロゲル前駆体は架橋されて、互いに対する該ヒドロゲル前駆体の接触後にヒドロゲルを形成し；そして、該ヒドロゲルは癒着を阻害する、癒着を阻害する方法。
【請求項２】
前記第一のヒドロゲル前駆体は第一の官能基を含み；前記第二のヒドロゲル前駆体は第二の官能基を含み；そしてここに、該第一および第二の官能基が互いと反応して、生理学的条件下で共有結合を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一のヒドロゲル前駆体または前記第二のヒドロゲル前駆体のうちの少なくとも１つが非多糖部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記セルロース誘導体がＭＣ誘導体、ＣＭＣ誘導体およびＨＰＭＣ誘導体よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第一のヒドロゲル誘導体がＣＭＣ誘導体であり、前記第二のヒドロゲル誘導体がカルボキシメチルデキストラン誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第二のヒドロゲル前駆体がＣＭＤＸ−ＡＤＨであり、前記第一のヒドロゲル前駆体がＭＣ−ＣＨＯ、ＣＭＣ−ＣＨＯ、およびＨＰＭＣ−ＣＨＯよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第二のヒドロゲル前駆体がＣＭＤＸ−ＡＤＨであり、前記第一のヒドロゲル前駆体がＣＭＣ−ＣＨＯである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第一のヒドロゲル前駆体が第一のデキストラン誘導体であり、前記第二のヒドロゲル前駆体が第二のデキストラン誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第一のデキストラン誘導体がＣＭＤＸ−ＡＤＨであり、前記第二のデキストラン誘導体がＣＭＤＸ−ＣＨＯである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒドロゲル前駆体が溶液で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒドロゲル前駆体が内視鏡によるか、またはシリンジを用いて投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒドロゲルが、前記ヒドロゲル前駆体の互いとの接触後の１〜１００秒以内に形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒドロゲル前駆体が遊離架橋剤の実質的に非存在下で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法がセルロース誘導体を含む少なくとも１つの溶液を投与する工程を含み、ここに、該セルロース誘導体の濃度が５ｍｇ／ｍｌよりも大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法がセルロース誘導体を含む少なくとも１つの溶液を投与する工程を含み、該セルロース誘導体の濃度が２５ｍｇ／ｍｌよりも大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法がセルロース誘導体を含む少なくとも１つの溶液を投与する工程を含み、該セルロース誘導体の濃度が５０ｍｇ／ｍｌよりも大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法がデキストラン誘導体を含む少なくとも１つの溶液を投与する工程を含み、該デキストラン誘導体の濃度が５ｍｇ／ｍｌよりも大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法がデキストラン誘導体を含む少なくとも１つの溶液を投与する工程を含み、該デキストラン誘導体の濃度が２５ｍｇ／ｍｌよりも大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法がデキストラン誘導体を含む少なくとも１つの溶液を投与する工程を含み、該デキストラン誘導体の濃度が５０ｍｇ／ｍｌよりも大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記第一および第二のヒドロゲル前駆体の投与の前に、前記位置に存在する癒着を破壊する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が、ヒドロゲル前駆体を含む溶液中かまたは別々の溶液中の生物学的に活性な薬剤を投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記生物学的に活性な薬剤が：抗感染剤、抗炎症剤、抗増殖剤、抗新形成剤、抗酸化剤、脈管形成インヒビター、免疫抑制剤、免疫変調剤、抗凝集剤、タンパク質分解剤、タンパク質分解を増強する薬剤、フリーラジカルスカベンジャー、抗酸化剤、線維修復のインヒビター、およびＲＮＡｉ薬剤よりなる群から選択される治療剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物学的に活性な薬剤が抗炎症剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗炎症剤が非ステロイド性抗炎症剤である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記非ステロイド性抗炎症剤がセレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、サリチレート、フェノプロフェン、イブプロフェン、プルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロファメート、メクロフェナメート、メロキシカム、ナプロキセン、ピロキシカム、スリンダク、サルサレート、ナブメトン、アスピリン、オキサプロジンおよびトルメチンよりなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗炎症剤がステロイド性抗炎症剤である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記ステロイド性抗炎症剤がデキサメタゾン、フルオロメトロン、プレドニゾロン、ロテプレドノール、メドリゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ブデゾニド、コルチゾン、リメキソロン、クロベタゾール、ハロベタゾール、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、フルオシノロン、およびフルオシノニドよりなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第一および第二のヒドロゲル前駆体が重量で１：１０と１０：１との間の比率で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記ヒドロゲル前駆体のうちの少なくとも１つがそれに共有結合した生物学的に活性な薬剤を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記生物学的に活性な薬剤が抗感染剤、抗炎症剤、抗増殖剤、抗新形成剤、抗酸化剤、脈管形成インヒビター、免疫抑制剤、免疫変調剤、抗凝固剤、タンパク質分解剤、タンパク質分解を増強する薬剤、フリーラジカルスカベンジャー、抗酸化剤、線維修復のインヒビター、およびＲＮＡｉ薬剤よりなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記生物学的に活性な薬剤が抗炎症剤である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗炎症剤が非ステロイド性抗炎症剤である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記非ステロイド性抗炎症剤がセレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、サリチレート、フェノプロフェン、イブプロフェン、プルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロファメート、メクロフェナメート、メロキシカム、ナプロキセン、ピロキシカム、スリンダク、サルサレート、ナブメトン、アスピリン、オキサプロジンおよびトルメチンよりなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗炎症剤がステロイド性抗炎症剤である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記ステロイド性抗炎症剤がデキサメタゾン、フルオロメトロン、プレドニゾロン、ロテプレドノール、メドリゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ブデゾニド、コルチゾン、リメキソロン、クロベタゾール、ハロベタゾール、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、フルオシノロン、およびフルオシノニドよりなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
さらに、前記ヒドロゲル前駆体と共に複数の粒子を、該粒子が該ヒドロゲル前駆体の架橋によって形成されたヒドロゲルに捕捉されるように投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記粒子が：ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリカルボネート、ポリエステルアミド、ポリ（β−アミノエステル）、ポリ無水物、ポリ（アミド）、ポリ（アミノ酸）、ポリエチレングリコールおよびその誘導体、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリエーテルエステル、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（アルキレンアルキレート）、ポリエチレングリコールとポリオルトエステルとのコポリマー、生分解性ポリウレタン、ならびに任意の該ポリマーのブレンドまたはコポリマー、ならびにリポソームよりなる群から選択される物質を含むナノ粒子またはマイクロ粒子である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記粒子が、投与の前に、ヒドロゲル前駆体と共に溶液中に存在する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記粒子が生物学的に活性な薬剤を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記生物学的に活性な薬剤が抗感染剤、抗炎症剤、抗増殖剤、抗新形成剤、抗酸化剤、脈管形成インヒビター、免疫抑制剤、免疫変調剤、抗凝固剤、タンパク質分解剤、タンパク質分解を増強する薬剤、フリーラジカルスカベンジャー、抗酸化剤、線維修復のインヒビター、およびＲＮＡｉ薬剤よりなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記生物学的に活性な薬剤が抗炎症剤である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
（ａ）セルロース誘導体；
（ｂ）デキストラン誘導体；および
（ｃ）複数の粒子；
を含む組成物。
【請求項４３】
前記粒子が：ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリカルボネート、ポリエステルアミド、ポリ（β−アミノエステル）、ポリ無水物、ポリ（アミド）、ポリ（アミノ酸）、ポリエチレングリコールおよびその誘導体、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリエーテルエステル、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（アルキレンアルキレート）、ポリエチレングリコールとポリオルトエステルとのコポリマー、生分解性ポリウレタン、ならびに任意の該ポリマーのブレンドまたはコポリマー、ならびにリポソームよりなる群から選択される物質を含むナノ粒子またはマイクロ粒子である、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記粒子が生分解性である、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４５】
前記粒子が生物学的に活性な薬剤を含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４６】
前記生物学的に活性な薬剤が抗感染剤、抗炎症剤、抗増殖剤、抗新形成剤、抗酸化剤、脈管形成インヒビター、免疫抑制剤、免疫変調剤、抗凝固剤、タンパク質分解剤、タンパク質分解を増強する薬剤、フリーラジカルスカベンジャー、抗酸化剤、線維修復のインヒビター、およびＲＮＡｉ薬剤よりなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記生物学的に活性な薬剤が抗炎症剤である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４８】
前記組成物が、前記セルロース誘導体および前記デキストラン誘導体が互いに架橋したヒドロゲルである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４９】
前記セルロース誘導体または前記デキストラン誘導体がそれに共有結合した生物学的に活性な薬剤を有する、請求項４２に記載の組成物。
【請求項５０】
前記生物学的に活性な薬剤が抗感染剤、抗炎症剤、抗増殖剤、抗新形成剤、抗酸化剤、脈管形成インヒビター、免疫抑制剤、免疫変調剤、抗凝固剤、タンパク質分解剤、タンパク質分解を増強する薬剤、フリーラジカルスカベンジャー、抗酸化剤、線維修復のインヒビター、およびＲＮＡｉ薬剤よりなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
身体内の位置に粒子を投与する方法であって：
粒子、第一のヒドロゲル前駆体、および第二のヒドロゲル前駆体を含む組成物を該位置に投与する工程；
を含み、ここに、該第一のヒドロゲル前駆体はセルロース誘導体またはデキストラン誘導体であり；該第二のヒドロゲル前駆体はデキストラン誘導体であり；そして該第一および第二のヒドロゲル前駆体は、投与後にその中に粒子を捕捉するヒドロゲルを形成する、方法。
【請求項５２】
前記組成物が、１以上の溶液として投与され、該溶液のうちの少なくとも１つが粒子を含有する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記粒子が生物学的に活性な薬剤を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記粒子が：ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリカルボネート、ポリエステルアミド、ポリ（β−アミノエステル）、ポリ無水物、ポリ（アミド）、ポリ（アミノ酸）、ポリエチレングリコールおよびその誘導体、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリエーテルエステル、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（アルキレンアルキレート）、ポリエチレングリコールとポリオルトエステルとのコポリマー、生分解性ポリウレタン、ならびに任意の該ポリマーのブレンドまたはコポリマー、ならびにリポソームよりなる群から選択される物質を含むナノ粒子またはマイクロ粒子である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
生物学的に活性な薬剤、第一のヒドロゲル前駆体、および第二のヒドロゲル前駆体を含む組成物を位置に投与する工程；
を含み、ここに、該第一のヒドロゲル前駆体はセルロース誘導体またはデキストラン誘導体であり；ここに、該第二のヒドロゲル前駆体はデキストラン誘導体であり；そして該第一および第二のヒドロゲル前駆体は、その中に生物学的に活性な薬剤を捕捉するヒドロゲルを形成する、被験体に生物学的に活性な薬剤を投与する方法。
【請求項５６】
前記生物学的に活性な薬剤がヒトロゲル前駆体に共有結合している、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記生物学的に活性な薬剤が抗感染剤、抗炎症剤、抗増殖剤、抗新形成剤、抗酸化剤、脈管形成インヒビター、免疫抑制剤、免疫変調剤、抗凝固剤、タンパク質分解剤、タンパク質分解を増強する薬剤、フリーラジカルスカベンジャー、抗酸化剤、線維修復のインヒビター、およびＲＮＡｉ薬剤よりなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記生物学的に活性な薬剤が抗炎症剤である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記生物学的に活性な薬剤が粒子と物理的に結合している、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記生物学的に活性な薬剤が、ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリカルボネート、ポリエステルアミド、ポリ（β−アミノエステル）、ポリ無水物、ポリ（アミド）、ポリ（アミノ酸）、ポリエチレングリコールおよびその誘導体、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリエーテルエステル、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（アルキレンアルキレート）、ポリエチレングリコールとポリオルトエステルとのコポリマー、生分解性ポリウレタン、ならびに任意の該ポリマーのブレンドまたはコポリマー、ならびにリポソームよりなる群から選択される物質を含むナノ粒子またはマイクロ粒子と物理的に結合している、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、米国特許法１１９条（ｅ）の下で、米国仮特許出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／７９１，３６２（２００６年４月１２日出願）、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／８５７，５５７（２００６年１１月８日出願）、およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／９０１，２４１（２００７年２月１３日出願）（これらの全ては、本明細書に参考として援用される）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
（政府支援）
本明細書中に記載された成果は、部分的には、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈからの補助金（ＧＭ０７３６２６）によって支援された。合衆国政府は本発明において特定の権利を有することができる。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
癒着は組織、器官、または通常は互いから分離している他の解剖学的構造体の間の接着である。それらは、典型的には、瘢痕様組織の線維帯から構成され、しばしば、外科的処置、傷害または感染のような刺激の後に生じる。手術後癒着は一般的かつ潜在的に深刻な出来事である。なぜならば、それらは腹部および骨盤疼痛、不妊症、および腸閉塞のような重篤な合併症を含み得るからである。腹部外科的処置の８０％が癒着をもたらし、ヒトの苦痛および経済的出費の点で膨大なコストをもたらすと推定される。骨盤領域における外科的処置後に形成される癒着は、手術後骨盤疼痛、不妊症および小腸閉塞の主な原因の１つである。特に腹部または骨盤領域中の外傷および感染もまた癒着をもたらし得る。
【０００４】
癒着を予防または処置することに対する多数の薬理学的アプローチおよびバリアベースのアプローチが少なくとも動物モデルにおいて試験されており、後者のうちいくつかは商業的に使用されている。これらはＩｎｔｅｒｃｅｅｄ（ＴＣ７）吸収可能癒着バリア（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）およびＳｅｐｒａｆｉｌｍ（登録商標）、膜（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐ．）のような製品を含む。存在するバリアデバイスの多くは、少なくとも部分的には、架橋された多糖またはグリコサミノグリカンから構成される。
【０００５】
ヒアルロン酸（ＨＡ）はこれらの目的のための材料としてかなりの注目を受けている（その各々が本明細書に参考として援用される非特許文献１；非特許文献２；および非特許文献３）。ＨＡはβ−１，４−結合Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）とβ−１，３  Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）との二糖単位から構成される線状多糖であり、哺乳動物細胞外マトリックスの普遍的な構成要素である。その天然形態において、ＨＡは生体適合性、生分解性および比較的非免疫原性である。これらの望ましい特性にもかかわらず、デノボ癒着または再発性手術後癒着を阻害するための既存のＨＡベースのアプローチは、かなりの欠点に悩んでいる。例えば、溶液として適用する場合、ＨＡの有効性は、腹膜腔からの迅速なクリアランスによって損なわれてきた（本明細書で参考として援用される非特許文献４）。例えば、調製されたシートの形態である、単独か、または他の材料と組み合わせた、ＨＡの固体処方物は、フィルムの適用における困難性（例えば、取り扱いの困難性、乾燥されたフィルムのグローブへの癒着、不十分な柔軟性、除去の必要性）、腹腔鏡手法での不適合性、および望ましいよりも低い効力を含めた制限を有する。したがって、癒着を阻害するための改良された組成物、および方法に対する必要性が、当該分野に存在し続ける。
【非特許文献１】Ｂｕｒｎｓら．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｐｏｓｔｓｕｒｇｉｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｂｙ  ｐｒｅｃｏａｔｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９５；５９：６４４−６５２
【非特許文献２】Ｐｅｃｋら．Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｆｉｌｍｓ  ａｓ  ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｂａｒｒｉｅｒ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ．Ｉｎ：ｄｉＺｅｒｅｇａ  ＧＳ，ｅｄｉｔｏｒ．Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０００．ｐ．４９９−５２０
【非特許文献３】Ｒｏｄｇｅｒｓら．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ａｆｔｅｒ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．１９９７；６７（３）５５３−５５８
【非特許文献４】Ｓａｗｈｎｅｙら．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄ  ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１９９４；２８：８３１−８３８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、癒着を阻害するための組成物および方法を提供する。該組成物および方法は、身体中の任意の位置における癒着の形成、進行、または再発を阻害するのに用いることができるが、それらは腹膜癒着を阻害するのに特に用途を見出すと考えられる。
【０００７】
本発明の目的は、癒着の発生、進行、および／または再発を阻害するのに有用な身体中のインサイチュ重合に適した多糖誘導体、例えば、ＨＡ誘導体、セルロース誘導体、またはデキストラン誘導体を提供することにある。本発明のさらなる目的は、組織損傷または傷害の部位への適用後にインサイチュにて互いに迅速に架橋する多糖誘導体の投与により、癒着の形成、進行、および／または再発を阻害するヒドロゲルを形成することよって癒着の形成、進行、および／または再発を阻害する方法を提供することにある。
【０００８】
また、本発明の目的は、インサイチュでのそれらの適用に有利な時間枠にて迅速な架橋およびゲル化を受ける多糖誘導体およびその組合せを提供することにある。また、本発明の目的は、ゲル化時間および半減期のようなパラメーターに対する制御を与える架橋された多糖から形成されるヒドロゲルを生産する方法を提供することにある。
【０００９】
また、本発明の目的は、ハイブリッド多糖ベースのヒドロゲル組成物を提供することにあり、ここに、該組成物は生物学的に活性な薬剤、例えば、治療剤の、所望により維持された様式での身体への送達を提供する。特定の実施形態において、生物学的に活性な薬剤は抗炎症剤、例えば、グルココルチコイド（例えば、フレドニゾン、デキサメタゾン、ブデソニド）、および非ステロイド性抗炎症剤（例えば、イブプロフェン、アスピリン）である。特定の実施形態において、生物学的に活性な薬剤はプラスミノーゲンアクチベーターまたはストレプトキナーゼのようなフィブリン溶解剤である。これらの薬剤は、所望により、薬剤の延長されたかまたは制御された放出のためのポリマー材料またはマトリックスに取り込むことができる。特定の実施形態において、該薬剤はヒドロゲル、またはヒドロゲル前駆体の１つに直接的に結合体化される。
【００１０】
本発明の別の目的は、所望により、生物学的に活性な薬剤を身体に送達する粒子を含有するヒドロゲル組成物を提供することにある。１つの態様において、本発明は：第一のヒドロゲル前駆体および第二のヒドロゲル前駆体を被験体の身体内の位置に投与する工程を含み、ここに、該第一および第二のヒドロゲル前駆体は架橋するようになって、互いへの接触後にヒドロゲルを形成し、そして該ヒドロゲルは癒着を阻害する、癒着を阻害する方法を提供する。該第一および第二のヒドロゲル前駆体は１以上の溶液中にて提供することができる。本発明の特定の実施形態において、ヒドロゲル前駆体は多糖誘導体である。１つの態様において、本発明は：第一の多糖誘導体を被験体の身体内の位置に投与する工程；および、該被験体の身体内の位置に第二の多糖誘導体を投与する工程を含み、ここに、該第一および第二の多糖誘導体は架橋するようになって、多糖誘導体の互いに対する接触後にヒドロゲルを形成し、該ヒドロゲルは癒着を阻害する、癒着を阻害する方法を提供する。本発明の特定の実施形態において、該第一の多糖誘導体は第一の官能基を含み、該第二の多糖誘導体は第二の官能基を含み、そして該第一および第二の官能基は互いと反応して、生理学的条件下で共有結合を形成する。本発明の特定の実施形態において、官能基の１つはヒドラジドであって、官能基の１つはアルデヒドである。本発明の特定の実施形態において、多糖誘導体はＨＡ誘導体である。本発明の特定の実施形態において、多糖誘導体の１つはＨＡ誘導体であって、他の多糖誘導体はセルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルセルロース（ＭＣ））である。本発明の特定の他の実施形態において、多糖誘導体の１つはＨＡ誘導体であり、他の多糖誘導体はデキストラン誘導体である。特定の実施形態において、本発明は、第一の多糖誘導体を含む溶液を、被験体の身体内の位置に投与する工程；および、該被験体の身体内の位置へ、第二の多糖誘導体を含む第二の溶液を投与する工程を含む。
【００１１】
本発明の特定の実施形態において、多糖誘導体のうちの少なくとも１つは非多糖部分を含む。他の実施形態において、ヒドロゲル前駆体のうちの少なくとも１つは非多糖ポリマーである。
【００１２】
別の態様において、本発明は、溶液中のヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体を含む組成物を提供し、ここに、ＨＡ誘導体の濃度は５ｍｇ／ｍｌよりも大きい。別の実施形態において、本発明は、溶液中のヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体を含む組成物を提供し、ここに、ＨＡ誘導体の濃度は１０ｍｇ／ｍｌよりも大きい。別の実施形態において、本発明は溶液中のヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体を含む組成物を提供し、ここに、ＨＡ誘導体の濃度は１５ｍｇ／ｍｌよりも大きい。別の実施形態において、本発明は溶液中のヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体を含む組成物を提供し、ここに、ＨＡ誘導体の濃度は２５ｍｇ／ｍｌよりも大きい。本発明の特定の実施形態において、ＨＡ誘導体の濃度は１００ｍｇ／ｍｌ以下である。本発明の他の実施形態において、ＨＡ誘導体の濃度は５０ｍｇ／ｍｌと７５ｍｇ／ｍｌとの間である。
【００１３】
別の態様において、本発明は架橋されたＨＡ誘導体を含むヒドロゲルを提供し、ここに、該ヒドロゲルは１０Ｕ／ｍｌヒアルロニダーゼの存在下で少なくとも１０日の半減期を有する。特定の実施形態において、本発明はＨＡ−セルロース、ＨＡ−デキストラン、またはＨＡ−他の多糖誘導体を提供し、ここに、得られたヒドロゲルは対応するＨＡ−ＨＡヒドロゲルよりもヒアルロニダーゼに対して感受性が低い。特定の実施形態において、本発明は溶液中のセルロースまたはデキストラン誘導体を含む組成物を提供し、ここに、該セルロースまたはデキストラン誘導体の濃度は５ｍｇ／ｍｌよりも大きく、１０ｍｇ／ｍｌよりも大きく、１５ｍｇ／ｍｌよりも大きく、または２５ｍｇ／ｍｌよりも大きい。
【００１４】
別の態様において、本発明は第一の多糖誘導体；および複数の粒子を含む組成物を提供する。多糖誘導体はＨＡ誘導体、セルロース誘導体またはデキストラン誘導体であってよい。
【００１５】
別の態様において、本発明は第一および第二の多糖誘導体；および複数の粒子を含む組成物を提供する。本発明の特定の実施形態において、第一および第二の多糖誘導体は架橋されて、ヒドロゲルを形成する。該粒子は生物学的に活性な薬剤を含有することができる。特定の実施形態において、生物学的に活性な薬剤は抗炎症剤（例えば、デキサメタゾン、プレドニゾン、ブデゾニド、イブプロフェン、アスピリン等）である。他の実施形態において、生物学的に活性な薬剤はフィブリン溶解剤（例えば、プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ）である。
【００１６】
本発明は、複数の粒子および少なくとも１つの多糖誘導体を被験体の身体内の位置に投与する工程をさらに含み、ここに、該第一の多糖誘導体は、単独か、または第二の多糖誘導体と組合せて架橋されるようになって、ヒドロゲルを形成し、これは投与後に該粒子を捕捉する、癒着を阻害する方法を提供する。本発明の特定の実施形態において、該方法は、第一および第二の多糖誘導体を投与する工程を含み、ここに、少なくとも１つの誘導体はＨＡ誘導体である。本発明の特定の実施形態において、少なくとも１つの誘導体はセルロース誘導体である。本発明の特定の実施形態において、少なくとも１つの誘導体はデキストラン誘導体である。本発明の特定の実施形態において、少なくとも１つの誘導体は非多糖部分を含む。
【００１７】
本発明は、第一の多糖誘導体を含む第一の溶液を、被験体の身体内の位置に投与する工程；および、第二の多糖誘導体を含む第二の溶液を該位置に投与する工程をさらに含み、ここに、該溶液のいずれかまたはその双方は複数の粒子を含み、そして該多糖誘導体は架橋されるようになって、ヒドロゲルを形成し、これは投与後に粒子を捕捉する、癒着を阻害する方法を提供する。本発明の特定の実施形態において、第一の溶液は第一のＨＡ誘導体を含み、第二の溶液は第二のＨＡ誘導体を含む。本発明の特定の実施形態において、第一の溶液はＨＡ誘導体を含み、第二の溶液はセルロース誘導体を含む。本発明の特定の実施形態において、該第一の溶液はＨＡ誘導体を含み、第二の溶液はデキストラン誘導体を含む。本発明の特定の実施形態において、第一の溶液はＨＡ誘導体を含み、第二の溶液は別の多糖誘導体を含む。
【００１８】
別の態様において、本発明は、粒子を身体内の位置に投与する方法を提供し、該方法は；粒子および１以上のヒドロゲル前駆体を含む組成物を該位置に投与する工程を含み、ここに１以上のヒドロゲル前駆体は、その中に粒子を捕捉するヒドロゲルを形成する。本発明の特定の実施形態において、ヒドロゲル前駆体のうちの少なくとも１つは多糖誘導体である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（定義）
用語「脈管形成インヒビター」および「抗脈管形成剤」は、本明細書中においては、限定されるものではないが、内皮細胞増殖、内皮細胞生存、内皮細胞移動、前駆体細胞の内皮細胞への分化、および毛細管形成を含めた、脈管形成に関連する１以上のプロセスを阻害し得るか、または低下させ得る薬剤をいうために相互交換的に用いる。
【００２０】
本明細書中で用いる場合、「抗感染剤」とは、１以上の感染剤、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、蠕虫、吸虫類または他の寄生生物の増殖を阻害する任意の物質をいう。抗感染剤はインビトロ（すなわち、細胞培養において）、インビボ（すなわち、感染の危険性があるか、または感染に罹患した動物に投与する場合）、またはその双方において、阻害性活性を示すことができる。好ましくは、抗感染剤は治療的に許容される用量にてインビボ阻害性活性を有する。
【００２１】
本明細書中で用いる場合、「抗炎症剤」とは、炎症の１以上の兆候または症状を阻害する任意の物質をいう。
【００２２】
本明細書中で用いる場合、「水性媒体」は、水および、所望により、１以上の水混和性溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、およびヒドロカルビルアルコール、ジオール、またはグリセリド）を含有する液体媒体を意味する。水性媒体は容量にて少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の水を含有する。水性媒体はその中に溶解したか、分散したか、または懸濁した種々の物質を含有することができると認識されるであろう。
【００２３】
数に言及する用語「約」は、一般には、特に示されているか、または文脈から明らかである場合（そのような数は可能な値の１００％を超える場合を除き）を除いて、（当該数を超えるか、またはそれ未満の）該数のいずれかの方向の５％の範囲内に入る数を含む。
【００２４】
「生体適合性」とは、量および用いる位置におけるレシピエントの細胞に対して実質的に非毒性であり、また、用いる位置においてレシピエントの身体に対する著しく有害な効果または望まない効果、例えば、許容できない免疫学的反応または炎症反応、許容できない瘢痕組織形成を誘導するか、または引き起こさない物質をいう。
【００２５】
「生分解性」は、物質が、例えば、生理学的条件下で加水分解によって、および／または細胞内、もしくは体内に存在する酵素の作用のような天然の生物学的プロセスによって、そして／または溶解、分散等のようなプロセスによって、細胞内、または被験体の体内で物理的におよび化学的に分解されて、典型的には、代謝し、そして所望により、身体によって用いられ、そして／または排出され、そうでなければ捨てられ得るより小さな化学種を形成することができること意味する。好ましくは、生分解性化合物は生態適合性である。本発明の目的では、その分子量がモノマーの数の低下によるインビボにて経時的に減少するポリマーは生分解性であると考えられる。
【００２６】
「生物学的に活性な薬剤」は、所望の生物学的活性、例えば、インビボでの治療特性、診断特性および／または予防特性を有する任意の化合物または薬剤、あるいはその医薬上許容される塩である。該薬剤はそれが生物学的活性を発揮するように、粒子および／またはヒドロゲルから放出される必要があろうことは理解されるべきである。生物学的に活性な薬剤は、限定されるものではないが、本明細書中に記載された治療剤を含む。生物学的に活性な薬剤は、限定されるものではないが、人工的かまたは天然に生じる小分子、ペプチドまたはポリペプチド、免疫グロブリン（例えば、抗体）、核酸等であってよい。限定されるものではないが、ホルモン、成長因子、薬物、サイトカイン、ケモカイン、凝固因子および内因性凝固インヒビター等は、生物学的には活性な薬剤である。
【００２７】
用語「内視鏡」は、最初に侵襲的な外科的手法の間に可視化および操作で用いられる、身体おける切開を通じて挿入されるように設計された、通常、光ファイバーを使用する、小さな直径のチューブ様機器を意味する。該用語は、腹骨盤腔における組織および器官の可視化および操作のために設計された「腹腔鏡」、ならびに関節空間内の組織の可視化および操作のために設計された「関節鏡」を含む。
【００２８】
本明細書中で用いる場合、「フィブリン溶解剤」とは、フィブリンの分解に対して直接的または間接的に寄与する任意の物質をいう。
【００２９】
「ＨＡＸヒドロゲル」は、架橋したＨＡ誘導体から形成されたヒドロゲルである。
【００３０】
「ハイブリッドヒドロゲル」は、粒子および架橋した多糖誘導体よりなる複合ヒドロゲルである。
【００３１】
「ヒドロゲル」は、多量の水を含有する親水性ポリマーを含む三次元ネットワークである。ヒドロゲルは、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはさらに大きい量の水をｗ／ｗベースで含有することができる。「ヒドロゲル前駆体」は、水性媒体中に少なくとも部分的に可溶性であって、架橋するようになって、ヒドロゲルを形成することができるポリマーである。
【００３２】
「癒着を阻害すること」とは、投与なくして起こるであろう癒着の数、程度および／または重症度に対して癒着の数、癒着の程度（例えば、面積）、および／または癒着の重症度（例えば、厚さ、または機械的または化学的破壊に対する耐性）の低下を引き起こすような、組成物の投与および／または手法の実行をいう。該組成物または手法は癒着を促進する刺激後の癒着の形成、または成長を阻害することができ、癒着の進行を阻害することができ、そして／またはそれらの自然退行後の、または機械的または化学的破壊後の再発を阻害することができる。
【００３３】
「インサイチュ」は、ヒドロゲルが、他の場所で形成され次いで該ヒドロゲルが望まれる位置に適用されることよりもむしろ、該ヒドロゲルが望まれる位置において実質的に形成されることを意味する。例えば、被験体の身体上、または身体中でのヒドロゲルの形成は本発明の目的では「インサイチュ」であると考えられる。
【００３４】
「リポソーム」は、生物学的に活性な薬剤を含有することができる、水性区画を包む脂質二重層（または多層）によって形成された人工の微視的球状粒子である。
【００３５】
「延長された局所腹膜投与」とは、損傷の部位の境界から１０ｃｍの距離内に存在する面積に対して面積が少なくとも同等な腹膜の部分と組成物が集合的に接触するように、例えば、その面積が、損傷の部位の境界から１０ｃｍの距離内にある面積に対してその面積が少なくとも同等である腹膜の部分が、組成物に存在する多糖誘導体の架橋に際してヒドロゲル層によって被覆されるように、１以上の組成物を投与することをいう。損傷を受けた部位は、腹膜が視覚的に物理的または機能的に損なわれた任意の部位、例えば、外科的切開、傷害、感染が腹膜中での可視の物理的改変（例えば、炎症、浸出液等）をもたらした部位であってよい。被覆される領域は、例えば、損傷の部位と連続し、そしてそれを囲うことができるか、あるいは腹膜の反対表面に位置させることができる。例えば、損傷は、壁側腹膜が損傷するような腹膜壁における外科的切開であってよく、および被覆された領域は損傷の部位とは反対に位置する臓側腹膜上にあってもよい。
【００３６】
「汎腹膜投与」とは、組成物が投与後に（例えば、腹膜の表面積の少なくとも１０％において）腹膜の実質的部分と組成物が集合的に接触するように、例えば、腹膜の表面積の少なくとも１０％が、組成物に存在する多糖誘導体の架橋に際してヒドロゲル層によって被覆されるように、１以上の組成物を投与することをいう。
【００３７】
「粒子」とは物質の小さな物体、断片、または部分をいい、限定されるものではないが、ポリマー粒子、生分解性粒子、非生分解性粒子、単一エマルジョン粒子、二重エマルジョン粒子、コアセルベート、リポソーム、マイクロ粒子、ナノ粒子、巨視的粒子、ペレット、結晶、凝集体、複合体、微粉砕され、粉状化され、またはそうでなければ破壊されたマトリックス、架橋されたタンパク質または多糖分子（ＨＡＸを含む粒子を含む）を含む。粒子は、単一の物質または複数の物質から構成され得る。本発明の特定の実施形態において、粒子はウイルス粒子ではない。
【００３８】
用語「腹膜」とは、横隔膜の下側表面から骨盤床の上側表面まで伸びる、腹骨盤腔内の壁を内張りする漿膜をいう。さらに、腹膜は少なくとも部分的には種々の腹骨盤期間、例えば、腸、胃、肝臓、腎臓、副腎、脾臓、膀胱、子宮、卵巣、およびファロビウス官を覆う。流体のフィルムは腹膜の表面を潤滑し、別の内臓、または腹部もしくは骨盤壁に対する内臓の自由な運動を通常は容易とする。用語「腹膜癒着」とは、腹膜で起こる癒着をいう。腹膜癒着は器官または組織を互いか、または腹骨盤腔の壁に接着させる。
【００３９】
「癒着を予防すること」とは、癒着の形成の前に治療的な組成物および／または手法を投与または適用して、特定の傷、刺激または疾患に応答して癒着が形成される可能性を低下させることをいう。「癒着を予防すること」は、癒着形成の可能性が０まで低下することを必要としないことは認識されるであろう。その代わり、「癒着を予防すること」とは、特定の傷または刺激後の癒着形成の可能性の臨床的に有意な低下、例えば、特定の癒着を促進する傷、疾患または刺激に応答しての癒着の発生または数の臨床的に有意な低下をいう。
【００４０】
「小分子」とは、天然に生じるかまたは（例えば、化学合成を介して）人工的に作り出されるかにかかわらず、比較的低い分子量を有し、かつタンパク質、ポリペプチドまたは核酸ではない有機化合物をいう。典型的には、小分子は約１５００ｇ／モル未満の分子量を有する。また、小分子は、典型的には、多数の炭素−炭素結合を有する。
【００４１】
「溶解性」とは、特定の温度およびｐＨにおいて所定の容量の溶媒に溶解して、飽和溶液を形成する物質の量をいう。溶解性は、例えば、振盪−フラスコ溶解性方法（ＡＳＴＭ：Ｅ  １１４８−０２，Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ，Ｂｏｏｋ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １１．０５）を用いて決定することができる。溶解性は３．０と９．０との間、例えば、４．０と８．０との間、５．０と８．０との間、６．０と８．０との間、例えば、６．５と７．６との間、例えば、６．８〜７．４の間、例えば、７．０あるいは前記範囲の任意の中間に存在する値のｐＨで決定することができる。溶解性は２０℃と４０℃との間、例えば、約２５℃と３７℃との間、例えば、約３７℃、あるいは前記範囲の任意の中間に存在する値の温度で試験することができる。例えば、溶解性は約ｐＨ７．０〜７．４および約３７℃で決定することができる。
【００４２】
本明細書中で用いる場合、「被験体」とは、例えば、実験、診断、および／または治療目的で薬剤が送達されるべき個体をいう。好ましい被験体は哺乳動物、特に家畜哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ等）、霊長類、またはヒトである。医師または他の介護者の看護の下にある被験体を「患者」ということができる。
【００４３】
「維持放出処方物」は、その成分の１つとして生物学的に活性な薬剤を含み、そしてさらに、所望により、部分的には、処方物の物理的構造の結果として、治療剤の維持放出を提供するのに十分な１以上のさらなる成分、エレメント、または構造を含む組成物である。維持放出は長期間にわたって、例えば、少なくとも２、３、４、５または６日間、少なくとも１、２、４または６週間、約１、２、３、４、６、８、１０、１２、１５、１８または２４ヶ月間まで連続的にまたは間欠的に起こる放出または送達である。
【００４４】
「薬物」ともいわれる「治療剤」は、本明細書中においては、被験体に有害な疾患、障害、または他の臨床的に認識された状態を処置するためか、あるいは予防目的で、被験体に投与され、かつ該疾患、障害または状態を処置または予防する臨床的に顕著な効果を身体に対して有する薬剤をいうために用いられる。治療剤は、限定されるものではないが、合衆国薬局方（ＵＳＰ）、その公開後のＧｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ  Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，２００１；Ｋａｔｚｕｎｇ，Ｂ．（ｅｄ．）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ／Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ；８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２１，２０００）；Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、および／またはＴｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１７ｔｈ  ｅｄ．（１９９９）、または１８ｔｈ  ｅｄ（２００６）、Ｍａｒｋ  Ｈ．Ｂｅｅｒｓ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｂｅｒｋｏｗ（ｅｄｓ．），Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、あるいは動物の場合には、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，９ｔｈ  ｅｄ．，Ｋａｈｎ，Ｃ．Ａ．（ｅｄ．），Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，２００５に列挙された薬剤を含む。
【００４５】
本明細書中で用いる場合、「癒着を処置すること」とは、癒着の進行および／または重症度を逆行させ、軽減し、低下させ、および／または阻害し、あるいは癒着を破壊し、あるいは癒着の程度または重症度を低下させることを意図した手法後の再発癒着の再発の可能性および／または重症度を低下させる、組成物および／または手法の投与または適用をいう。「癒着を処置すること」とはまた、癒着の１以上の兆候（例えば、疼痛、腸閉塞、不妊症）の再発および重症度の進行を逆行させるか、軽減するか、低下させるか、阻害するか、またはその可能性を低下させる組成物および／または手法の投与または適用をいう。したがって、「癒着を処置すること」は、一旦癒着が傷または刺激の後にすでに形成されていれば、治療用組成物および／または手法の投与または適用を含む。
【００４６】
「腫瘍」とは、過剰な細胞分裂に由来する組織の異常な塊をいう。腫瘍は良性（癌性ではない）または悪性（癌性）であり得る。「腫瘍」は、造血系細胞の過剰な分裂によって特徴付けられる障害を含む。そのような障害は白血病、リンパ腫、骨髄腫、および骨髄増殖障害のような悪性および前悪性の血液学的障害を含む。腫瘍は、物理的診断、画像化実験、組織病理学（例えば、細胞または組織試料で行うもの）、生化学的試験等を含めた種々の当該分野で受容可能な方法のいずれかを用いて診断することができる。腫瘍の特定の非限定的例は肉腫、前立腺癌、乳癌、子宮内膜癌、血液学的腫瘍（例えば、白血病、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および他の形質細胞障害、骨髄増殖性障害）、脳腫瘍（例えば、低グレードの神経膠星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形性神経膠芽細胞腫、希突起膠腫、および上衣種）、および消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）を含む。肉腫は骨肉腫、ユーイング肉腫、軟組織肉腫、および平滑筋肉腫を含む。悪性腫瘍のさらなる例は小細胞肺癌および非小細胞肺癌、腎臓癌（例えば、腎臓細胞肉腫）、肝細胞癌種、膵臓癌、食道癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、精巣癌、甲状腺癌、頭頸部癌、甲状腺癌等を含む。「腫瘍」は本明細書中で用いる場合、原発性腫瘍からの転移を含む。
【００４７】
「粘度」とは、所定の温度における液体の濃厚性、または液体の流れに対する抵抗の測定値をいう。粘度が当該分野で知られた種々の方法および機器を用いて決定することができる。例えば、ポリマーは、先ず秤量され、次いで、適当な溶媒に溶解される。溶液および粘度計を、一定温度の水浴に入れる。熱平衡が溶液内で得られる。次いで、液体を粘度計の上部目盛線よりも上まで運ぶ。溶液が上部目盛線から下部目盛線まで流動する時間を記録する。ポリマーを含む溶液の粘度は、ＡＴＭＳ  Ｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｄｉｌｕｔｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（ＡＳＴＭ  Ｄ２８５７）、Ｖｏｌｕｍｅ  ０８．０１，２００５年６月、または具体的ポリマーについての関連ＡＳＴＭ標準に従って決定することができる。溶解性は、２０℃と４０℃との間、例えば、約２５℃〜３７℃、例えば、約３７℃、または前記範囲の中間にある値の温度で試験することができる。例えば、溶解性は約ｐＨ７．０〜７．４および３７℃で決定することができる。
【００４８】
（本発明の特定の実施形態の詳細な説明）
Ｉ．インサイチュ架橋可能な誘導体を含む抗癒着組成物
癒着は、通常は身体内で分離したままである組織が、通常、外科的外傷、傷害、または感染の結果として互いに接着するようになる複雑な炎症プロセスの結果として生じると考えられている。他の原因からの癒着を含めたこれらの癒着は、腸閉塞および不妊症のような重篤な合併症の主な原因である。他の癒着関連合併症は慢性腹骨盤疼痛、尿道閉塞、および排尿機能障害を含む。癒着形成において役割を果たすと疑われる炎症プロセスは、外傷組織における好中球の蓄積および活性化、フィブリン沈着および隣接組織の結合、マクロファージ進入、領域への線維芽細胞増殖、コラーゲン沈着、脈管形成、および永久的癒着組織の樹立を含む。現在の治療的アプローチは、抗ステロイド性薬物、抗炎症薬物、および組織分離を維持する試みにおけるフィルムまたは膜の適用を含む種々のバリアベースのアプローチの使用を含む。しかしながら、これらのアプローチの効力は限定されたままである。
【００４９】
本発明は、癒着を予防および／または処置するための組成物および方法を提供する。本発明は、部分的には、特定の多糖、例えば、ヒアルロン酸（ＨＡ）またはセルロースの誘導体が、溶液にて、身体内の部位、例えば、組織傷害または損傷の部位に投与された場合に、インサイチュにて（すなわち、身体内の投与のそれらの部位においてか、またはその近くにおいて）互いに架橋するようになって、癒着を阻害するヒドロゲルを形成するという本発明者らの発見から生じた。第一の態様において、本発明は、第一の多糖誘導体を被験体の身体内の位置に投与する工程；および、該被験体の身体内の位置に第二の多糖誘導体を投与する工程を含む、癒着を阻害する方法を提供し、ここに、該第一および第二の多糖誘導体は架橋するようになって、多糖誘導体の互いに対する接触の後にヒドロゲルを形成し、ここに、ヒドロゲルは癒着を阻害する。多糖誘導体はその投与の前に溶液に溶解される。該溶液は実質的に同時に被験体に投与することができる。溶液を混合して、投与の前に単一溶液を形成することができ、その場合、それらは好ましくは実質的に架橋が起こる前に投与される。ＨＡ、セルロースおよびデキストランの誘導体は本明細書中に簡潔に例示されるが、本発明は、癒着を阻害するための組成物および方法、ならびに本明細書中に記載された他の組成物および方法における、他の多糖およびその誘導体、ならびにまた、非多糖ポリマーヒドロゲル前駆体の使用が企図される。
【００５０】
互いに接触し、かつその間に従って癒着が発生する（例えば、創傷治癒のプロセスの間に）組織または構造の間でヒドロゲルが形成される。したがって、ヒドロゲルは傷害、外傷、外部環境への曝露、または任意の他の型の傷に付された組織または構造を分離するように働く。従って、本発明は、被験体の身体内の位置に第一の多糖誘導体を投与し、次いで、該被験体の身体内の位置に第二の多糖誘導体を投与する工程を含む、組織または構造の間の分離を維持する方法を提供し、ここに、該第一および第二の多糖誘導体は架橋するようになって、ヒドロゲル前駆体の互いに対する接触の後にヒドロゲルを形成し、ここに、該ヒドロゲルは、組織または構造の間に互いから離したままにするために位置する。
【００５１】
ヒドロゲルが、組織または構造の互いに対する組織または構造の癒着を阻害し、瘢痕様線維帯の発達を阻害する。該溶液は癒着を促進する刺激、すなわち、癒着の形成、進行および／または再発の可能性を増大させる任意の事象の後に投与することができる。癒着を促進する刺激の例は外科的処置、傷害および感染を含む。ヒドロゲルは身体内で分解し、したがって、除去する必要はない。
【００５２】
本発明は第一の多糖誘導体および第二の多糖誘導体を架橋することによって形成されたヒドロゲルを提供し、ここに、該第一および第二の多糖は異なる。例えば、該第一の多糖は第一の官能基を含むＨＡ誘導体であってよく、第二の多糖は第二の官能基を含むセルロース誘導体であってよい。しかしながら、別の例を挙げると、第一の多糖は第一の官能基を含むＨＡ誘導体であって、第二の多糖は第二の官能基を含むデキストラン誘導体である。該第一および第二の官能基は、アミン、アミド、アルデヒド、エステル、ヒドロキシまたはヒドラジドから選択することができる。
【００５３】
本発明は、さらに、第一の多糖誘導体および第二の多糖誘導体を架橋することによって形成されたヒドロゲルを提供し、ここに、該第一および第二の多糖は同一であり、該第一の多糖誘導体は第一の官能基を含み、該第二の多糖誘導体は第二の官能基を含み、ここに、該第一および第二の官能基は互いに架橋することができる。多糖は、例えば、ＨＡ、セルロース、デキストランまたはそのいずれかの誘導体であってよい。
【００５４】
種々の多糖誘導体を用いることができる。本発明の特定の実施形態において、多糖誘導体の少なくとも１つはＨＡ誘導体である。本発明の特定の実施形態において、多糖誘導体の双方はＨＡの誘導体である。したがって、（ｉ）第一のＨＡ誘導体を含む溶液を被験体の身体内の位置に投与し；そして、（ｉｉ）第二のＨＡ誘導体を含む溶液を該被験体の身体内の位置に投与する方法を提供し、ここに、該第一および第二のＨＡ誘導体が架橋するようになって、該溶液と互いとの接触の後にヒドロゲルを形成し、ここに、該ヒドロゲルは癒着の形成を阻害する。本発明の特定の実施形態において、該多糖はヒトに対して内因性である酵素によって特異的に分解しないものである。任意の理論に拘束されることを望まないが、そのような多糖の誘導体から少なくとも部分的には形成されたヒドロゲルは、ＨＡ誘導体から形成されたヒドロゲルよりも身体中でより長い半減期を有することができる。
【００５５】
本発明の特定の実施形態において、多糖誘導体の少なくとも１つはセルロースの誘導体である。例えば、本発明の特定の実施形態において、第一の多糖誘導体はＨＡの誘導体であって、第二の多糖誘導体はセルロースの誘導体である。
【００５６】
本発明の特定の実施形態において、多糖誘導体の少なくとも１つはデキストランの誘導体である。例えば、本発明の特定の実施形態において、第一の多糖誘導体はＨＡの誘導体であって、第二の多糖誘導体はデキストランの誘導体である。
【００５７】
ヒアルロナンまたはヒアルロネートとも呼ばれるＨＡは、Ｎ−アセチル−ＤグルコサミンおよびＤ−グルクロン酸から構成される反復する二糖サブユニットを含む非分枝状の多糖である（Ｌａｕｒｅｎｔ，Ｔ．Ｃ．（ｅｄ）．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，Ｌｏｎｄｏｎ：Ｐｏｒｔｌａｎｄ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８参照）。ＨＡの構造は以下に示されるように表すことができる。
【００５８】
【化１】
2009533455.tif 000002
本明細書中で用いる場合、用語「ヒアルロン酸」（ＨＡ）とは、ＨＡおよびその任意の塩、例えば、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸カルシウム等をいう。用語「ＨＡ誘導体」とは、前記で表した天然形態から化学的に修飾されたＨＡをいう。修飾は新しい官能基（例えば、アミン、アミド、アルデヒド、エステル、ヒドロキシ、ヒトラジド等）の付加または形成を含むことができる。修飾される二糖サブユニットの割合は、変化し得、そしてゲル化時間、半減期、固さ等のような特性を制御するために修飾の程度を選択され得る。特定の修飾は天然ＨＡ骨格構造を保有し、一方で他の修飾は糖環のうちの少なくともいくつかを開環する。例えば、特定の修飾はグルクロン酸分子の糖環のうちの少なくともいくつかを開環する。
【００５９】
本発明の第一および第二のＡＨ誘導体が、各々、互いに反応して、該第一および第二のＨＡ誘導体を互いに接合する共有結合を形成する、第一および第二の官能基を含む。溶液は、したがって、液体として適用され、互いに接触され、所望により、投与の直前、または投与時のいずいれかにおいて一緒に混合されか、あるいは投与後において互いに接触する。十分な数の架橋の形成は、液体からの半固体またはゲル様状態への転移を引き起こす。
【００６０】
本発明の特定の実施形態において、少なくとも２つの異なる官能基を含むＨＡ誘導体が使用され、ここに、該官能基は互いと反応して、生理学的条件下で架橋を形成する。官能基は、ｐＨ、温度、および／または塩濃度の生理学的条件に曝露されるまで、それらが実質的に互いに反応しないように選択することができる。したがって、本発明は２つの区別可能なＨＡ誘導体を必要としないが、その代わり、架橋されたようになることができる複数の異なる官能基を含む単一の種を使用できると認識されるであろう。
【００６１】
種々の異なるＨＡ誘導体は本発明で用いられる。適当な誘導体の重要な特徴は、該第一および第二の官能基が、溶液の互いとの接触後に時間枠内でヒドロゲルの形成を可能とするのに十分な量にて、かつ十分な迅速性で反応しなければならないことである。本発明の特定の実施形態において、ヒドロゲルは、溶液と互いとの接触後、例えば、投与後の１〜３秒と５分との間に、１〜３秒と３分との間、１〜３秒と６０秒との間、１〜３秒と３０秒との間、１〜３秒と１５秒との間に形成される。典型的には、溶液は身体内の部位へのそれらの投与の直前、または投与と同時に混合される。例えば、溶液は複数バレル注入デバイス、例えば、複数バレルシリンジを用いて投与することができ、ここに、各溶液は、投与の前に別々のレセプタクルまたはバレルに含有される。溶液は、投与のプロセスの間、および／または投与後に互いと接触することができる。好ましくは、誘導体は、生理学的条件下、例えば、６．０と８．０との間のｐＨにおける水性環境において架橋するようになる。
【００６２】
適当なＨＡ誘導体の第二の重要な特徴は、得られたヒドロゲルが癒着の発生、炎症、または他の望ましくない効果に対してそれ自体がかなり寄与すべきであるということである。種々のＨＡ誘導体は、組織接着剤または接着剤としての使用が提案されてきた。本発明のＨＡ誘導体とは対照的に、そのような誘導体は、その領域に寄与するというよりもむしろ癒着の問題を悪化させ得る。細胞の成長および浸潤についての適当な環境を提供する種々のＨＡ誘導体は、組織再生のための足場として提案されてきた。しかしながら、癒着を阻害する目的では、細胞の浸潤および／または増幅を増強させる環境は望ましくないであろう。本発明は、迅速なインサイチュ架橋および癒着を阻害するヒドロゲルの形成に適した多糖誘導体、例えば、ＨＡ誘導体を同定する。
【００６３】
種々の架橋可能な多糖誘導体、およびそれらを形成する方法を使用することができる。本発明の特定の実施形態において、多糖誘導体は、別の架橋剤を必要とすることなく互いに架橋するようになり、例えば、第一および第二の誘導体は、互いに反応して共有結合を形成する官能基を含む。本発明の特定の実施形態において、多糖誘導体は互いと反応して、非毒性の生体適合性産物、例えば、水を生じる。本発明の特定の実施形態において、多糖誘導体はいずれも、架橋剤を用いることによって修飾されない。本発明の特定の実施形態において、多糖誘導体は光を必要とすることなく架橋するようになる。
【００６４】
広範な種々のＨＡ誘導体を本発明の１以上の態様で使用することができる。本発明の特定の実施形態において、例えば、本明細書で参考として援用される米国特許第６，６３０，４５７号、および本明細書で参考として援用されるＢｕｌｐｉｔｔ，Ｐ．ａｎｄ  Ａｅｓｃｈｌｉｍａｎｎ，Ｄ．，（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｓｔｅｒ．Ｒｅｓ．，４７，１５２−１６９において記載されているように、官能基は、グルクロン酸部分のカルボキシル基（ＣＯＯＨ）において活性なエステルを形成し、そして一方の末端における求核性基、および他方の末端における保護された官能基を含有する側鎖との引き続いての置換を行うことによってＨＡに導入される。このアプローチは、例えば、アミン官能基またはアルデヒド官能基を含むＨＡ誘導体を生じさせることができる。ＨＡの活性なエステルは、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）またはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドを用い、次いで、カップリングのためのカルボジイミド（例えば、ＥＤＣ）を使用して形成することができる。ＨＯＢＴによって形成されたエステル中間体と反応することができるアミンは、それらが酸性ｐＨ（例えば、約５．５〜７．０）において保護されていないように、ヒドラジン、および適当な範囲のｐＫａを有するエチレンジアミンのような活性化されたアミンを含む。Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドの使用は、カップリングが、約７．０〜８．５のｐＨで行われることを可能とし、第一級アミンの使用を可能にする。これらのアプローチを用いて、以下の反応を行うことができる。
【００６５】
【化２】
2009533455.tif 000003
ＲおよびＲ’は、酸素、窒素および硫黄のようなヘテロ原子を含有することができる、水素、アルキル、アリール、アルキルアリール、またはアリールアルキルのような広範な種々の部位のいずれでもあり得る。側鎖は分枝状または非分枝状であり得、そして飽和であっても、１以上の複数の結合を含んでもよい。側鎖の炭素原子は連続的であっても、酸素原子、ケト基、アミノ基、オキシカルボニル基などのような１以上の官能基によって分けられてもよい。側鎖はアリール部位または水素原子で置換されていても、全体がまたは部分的にシクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなどのような環構造によって形成されていてもよい。側鎖は、アルデヒド、アミン、アリールアジド、ヒドラジド、マレイミド、スルフヒドリル、エステル、カルボキシレート、イミドエステル、ヒドロキシルなどのような架橋のための末端官能基を有することができる。したがって、任意の多数の異なる官能基を含むＨＡ誘導体は、この方法を用いて生成され得る。
【００６６】
ＨＡ誘導体を形成するために用いるための適当なカルボジイミドは以下の通りに表すことができる：
【００６７】
【化３】
2009533455.tif 000004
ＲおよびＲ’は、例えば、上記のような広範な種々の部分のいずれかであり得る。例えば、ＲおよびＲ’は：水素、置換されたヒドロカルビルを含めた１〜２５個の炭素原子のヒドロカルビル、アルコキシ、アリールオキシ、アルカリールオキシなどよりなる群から独立して選択することができる。例えば、ＲおよびＲ’はアルキル、シクロアルキル、アリールまたはその置換された形態であり得る。本発明の特定の実施形態において、例えば、約２０〜８０℃の範囲の温度において水性媒体に少なくとも部分的に可溶性であるカルボジイミドが用いられる。例示的なカルボジイミドはＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド；ＥＴＣ（１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドメチオジド）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド；Ｎ−アリル−Ｎ’−（β−ヒドロキシエチル）カルボジイミド；Ｎ−（α−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルカルボジイミド；Ｎ−（α−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−（β−ブロモアリル）カルボジイミド；１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−（６−ベンゾイルアミノヘキシル）カルボジイミド、およびＮ−シクロヘキシル−Ｎ’−β−（４−メチルモルホリニウム）エチルカルボジイミド（ＣＭＣ）などを含む。
【００６８】
本発明の特定の実施形態において、側鎖はジヒドラジドを含む。ジヒドラジドを含むＨＡ誘導体は上記のように形成することができる。ヒドラジド官能基を含むＨＡ誘導体を形成するための他の方法も用いることができる。例えば、本明細書で参考として援用される米国特許第５，６１６，５６８号は、ジヒドラジドでＨＡを官能性化して、ジヒドラジド−ＨＡを形成する方法を教示する。ジヒドラジドをまずＨＡに付加し、続いて、カルボジイミドを付加する。反応は約４−０のｐＨで行うことができ、以下のように表すことができる。
【００６９】
【化４】
2009533455.tif 000005
広範な種々のジヒドラジドを上記反応で使用することができ、ここに、Ａは可変スペーサーを表す。例えば、Ａはヒドロカルビル、ヘテロカルビル、置換されたヒドロカルビル、置換されたヘテロカルビルなどであってよく、ここに、これらの用語は米国特許第５，６１６，５６８号に記載されており、例示されている。本発明の特定の実施形態において、ジヒドラジドは以下の式：
ＮＨ２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＮＨ２（ＶＩ）
式中、ｎ＝１〜１８
を有する。
【００７０】
例えば、有用なジヒドラジドは、ｎ＝２０までの、コハク酸（ブタン二酸）（ｎ＝２）、アジピン酸（ヘキサン二酸）（ｎ＝４）、スベリン酸（オクタン二酸）（ｎ＝６）、シュウ酸（エタン二酸）（ｎ＝０）、マロン酸（プロパン二酸）（ｎ＝１）、グルタル酸（ペンタン二酸）（ｎ＝３）、ピメリン酸（ヘプタン二酸）（ｎ＝５）、アゼライン酸（ノナン二酸）（ｎ＝７）、セバチン酸（デカン二酸）（ｎ＝８）、ドデカン二酸（ｎ＝１０）、ブラシル酸（トリデカン二酸）（ｎ＝１１）などを含む。適当なカルボジイミドは上記で考察した。
【００７１】
ジヒドラジド（アジピン酸ジヒドラジド）で官能性化した適当なＨＡ誘導体の構造を下に示し、本明細書中においてはＨＡ−ＡＤＨという。矢印は、ＨＡが修飾された（すなわち、グルクロン酸部分のカルボキシル基における）位置を示す。
【００７２】
【化５】
2009533455.tif 000006
本発明の特定の実施形態において、グルクロン酸部分のカルボキシル基を修飾するよりもむしろ、アルデヒド官能基を含むＨＡ誘導体は、グルクロン酸部分のヒドロキシル基を酸化して、アルデヒド基を形成することによって形成される。種々の酸化剤、例えば、過ヨウ素酸の塩、例えば、過ヨウ素酸カリウム（ＫＩＯ４）、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）またはＨＩＯ４を用いることができる。他の酸化剤は過マンガン酸塩、クロム酸塩、または二クロム酸塩を含む。
【００７３】
この酸化されたＨＡ誘導体の構造を以下に示し、本明細書中においては、ＨＡ−ＣＨＯという。矢印は修飾の部位を示す。
【００７４】
【化６】
2009533455.tif 000007
上記修飾スキームのいずれかにおいて、ＨＡ中の糖部分の一部のみが修飾されるようになる。修飾の程度は変化させることができる。例えば、本発明の特定の実施形態において、関連糖部分（例えば、上記の修飾の場合においてはグルクロン酸部分）の５％と９９〜１００％との間が修飾される。本発明の特定の実施形態において、関連糖部分の１０％と７５％との間が修飾される。修飾の程度は種々の方法によって制御することができる。例えば、試薬（例えば、カルボジイミド、アミド、ジヒドラジドなど）の濃度をそうできるように、その間に反応を進行させることができる温度、ｐＨおよび時間を変化させることができる。高い程度の修飾を達成するためには、過剰の修飾剤、例えば、ジヒドラジドおよび／またはカルボジイミドを用いることができる。例えば、１つの実施形態において、１０〜１００倍過剰のジヒドラジドを、ＨＡを含む溶液に加え、そして／または２〜１００倍過剰のカルボジイミド試薬を、次いで、その反応混合物に加える。本発明の特定の実施形態において、これらのパラメーターに対する値は、修飾の比較的高い程度を達成するように選択され、例えば、関連糖部分の５０％と９９％〜１００％との間が修飾される。例えば、関連糖部分の５０％と８０％との間を修飾することができる。しかしながら、修飾の程度は、容易な操作および注射可能性（ｓｙｒｉｎｇｉｂｉｌｉｔｙ）のためには粘性となり過ぎるよりもむしろ、溶液が適切に流体状態であるのに十分に低く維持される。本発明の特定の実施形態においては、関連糖部分の１０％と３０％との間、または３０％と５０％との間が修飾される。
【００７５】
上記のように官能性化されたＨＡ誘導体が、異なる官能基を含む誘導体が互いに反応できるようにすることによって架橋させることができる。例えば、（ｉ）アルデヒドを含む第一のＨＡ誘導体は、アミンを含む第二のＨＡ誘導体と反応させることができ；（ｉｉ）ＮＨＳエステルのような活性なエステルを含む第一のＨＡ誘導体を、アミンを含む第二のＨＡ誘導体と反応させることができ；（ｉｉｉ）マレイミドを含む第一のＨＡ誘導体を、スルフヒドリル基を含む第二のＨＡ誘導体と反応させることができ；（ｉｖ）ヒドラジドを含む第一のＨＡ誘導体は、アルデヒドを含む第二のＨＡ誘導体と反応させることができる。本発明の特定の実施形態において、ＨＡ誘導体は、ジスルフィド結合以外の結合によって互いに結合される。特に目的とする１つの実施形態において、第一の溶液は、ジヒドラジドで官能性化されるグルクロン酸部分を含むＨＡ誘導体を含有し、そして第二の溶液は、ＨＡのグルクロン酸部分のヒドロキシル基において酸化されて、アルデヒド基を形成するＨＡ誘導体を含有する。第一および第二のＨＡ誘導体は、以下に模式的に示されるように、架橋されるようになってヒドラゾン化合物を形成し、ここに、Ｒ１およびＲ２はＨＡの部分（本発明の特定の実施形態におけるセルロース誘導体のような別の多糖）を表す。
【００７６】
【化７】
2009533455.tif 000008
本発明者らは、特定のＨＡ誘導体の架橋によってインサイチュ形成されるヒドロゲルが、被験体の１００％がヒドロゲルの非存在下において癒着を発症する条件下においてさえ、癒着を阻害する顕著な能力を呈することを示した（実施例参照）。驚くべきことに、天然ＨＡ骨格構造の破壊は組成物をインビボにて炎症誘発性および／または免疫原性とすると予測されるが、天然ＨＡ骨格構造がグルクロン酸環の酸化によって改変されるＨＡ誘導体を含む特定のヒドロゲルが、癒着を阻害し、低い細胞傷害性および良好な生体適合性を呈する。
【００７７】
本発明の１つの態様は、ゲル化時間、およびＨＡ誘導体のような多糖誘導体の架橋によって形成されたヒドロゲルの分解速度のようなある重要なパラメーターが、例えば、溶液中の多糖誘導体の濃度および／または分子量を改変することによって制御することができるという発見である。本発明の１つの態様は、溶液中の高い濃度のＨＡ誘導体が、未修飾ＨＡの分子量、および／または修飾の程度の適切な選択によって達成することができる。特に、未修飾ＨＡ誘導体の分子量を低下させることによって、ＨＡを修飾することにより生成したＨＡ誘導体の達成できる濃度を増加させることができることが見出された。したがって、より低い分子量のＨＡを修飾することによって生成したＨＡ誘導体の溶解性は、より高い分子量のＨＡに対して同一の修飾を行い、それにより、容易な操作および注射可能性のために組成物を過度に粘性とすることなくより高い濃度を達成できるようにすることによって生じた誘導体の溶解性よりも大きい。本発明は、溶液中にＨＡ誘導体を含む組成物を提供し、ここに、ＨＡ誘導体の濃度は５ｍｇ／ｍｌよりも大きく、例えば、１５０ｍｇ／ｍｌまでである。特定の実施形態において、ＨＡ誘導体の濃度は１０ｍｇ／ｍｌよりも大きい。他の実施形態において、ＨＡ誘導体の濃度は１５ｍｇ／ｍｌよりも大きいか、または２５ｍｇ／ｍｌよりも大きい。濃度は少なくとも２６ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌなどであり得る。本発明の目的では、２５ｍｇ／ｍｌよりも大きなＨＡ誘導体の濃度は、「高濃度」と称される。本発明は、さらに、溶液中にＨＡ誘導体を含む組成物を提供し、ここに、ＨＡ誘導体の濃度は５０ｍｇ／ｍｌと１００ｍｇ／ｍｌとの間、例えば、５０ｍｇ／ｍｌと７５ｍｇ／ｍｌとの間である。溶液は、好ましくは、それが容易に操作できるように、例えば、容易な注射可能性が存在するように十分に低い粘度を有する。ＨＡ誘導体は、上記のＨＡ誘導体のいずれでもあり得る。例えば、ＨＡ誘導体はＨＡ−ＡＤＨまたはＨＡ−ＣＨＯであり得る。本発明の特定の実施形態において、ＨＡ誘導体は水性媒体に溶解される。本発明は、さらに、第一のＨＡ誘導体を含む第一の溶液および第二のＨＡ誘導体を含む第二の溶液を互いに接触させることを含むヒドロゲルを作製するための方法を提供し、ここに、溶液の少なくとも１つは高濃度のＨＡ誘導体を有する。ヒドロゲルは本明細書中に記載された目的のいずれかで用いることができ、所望により、生物学的に活性な薬剤および／または粒子を含む。
【００７８】
本発明はさらに、第一のＨＡ誘導体を含む第一の溶液、および第二のＨＡ誘導体を含む第二の溶液を接触させ、該誘導体は（所望によりインサイチュにて）架橋されたようなることによって形成されたヒドロゲルを形成し、ここに、第一の溶液中の第一のＨＡ誘導体の濃度、第二の溶液中の第二のＨＡ誘導体の濃度、またはその双方は、５ｍｇ／ｍｌよりも大きく、１０ｍｇ／ｍｌよりも大きく、１５ｍｇ／ｍｌよりも大きく、または２５ｍｇ／ｍｌよりも大きい。本発明の特定の実施形態において、第一の溶液中の第一のＨＡ誘導体の濃度、第二の溶液中の第二のＨＡ誘導体の濃度、またはその双方は、５０ｍｇ／ｍｌおよび１００ｍｇ／ｍｌの間、例えば、５０ｍｇ／ｍｌおよび７５ｍｇ／ｍｌの間である。実施例に記載されたように、驚くべきことに、高濃度の少なくとも１つのＨＡ誘導体を含む溶液から形成されたヒドロゲルは、（ｉ）（ＨＡ誘導体が架橋されて、互いの接触の後にゲルを形成するのに必要な時間を意味する）「ゲル化時間」の減少；（ｉｉ）分解の低下した速度、したがって、（ヒドロゲル湿潤質量が５０％だけ減少するのに必要な時間を意味する）半減期の増大；または（ｉｉｉ）減少したゲル化および低下した分解速度の双方を呈することが見出された。例えば、第一および第二のＨＡ誘導体（ＨＡ−ＡＤＨおよびＨＡ−ＣＨＯ）を架橋することによって形成されたヒドロゲルの半減期は、ＨＡ−ＡＤＨおよびＨＡ−ＣＨＯ溶液の濃度が、各々、２０ｍｇ／ｍｌから７５ｍｇ／ｍｌおよび３０ｍｇ／ｍｌまで増加する場合には５日から１１日まで増加し、そして濃度が７５ｍｇ／ｍｌおよび６０ｍｇ／ｍｌまで増加する場合には、２２．５または５１日まで増加する（実施例）。本発明は、従って、ＨＡ誘導体を架橋することによって形成されるヒドロゲルを提供し、ここに、ヒドロゲルは１０日よりも長い、例えば、約１０日と約５０日との間の半減期を有する。
【００７９】
種々の異なる方法を用いて、ゲル化時間および分解速度を測定することができると認識される。適当な方法がここに提供される。しかしながら、本明細書中で使用される特定の方法は、濃度および／または分子量を改変する効果を定量するのに有用であるが、ゲル化および分解速度を制御することに関する一般的な知見は、これらのパラメーターを評価するのに用いる特定の方法から独立していることは、理解されるべきである。また、特定のＨＡ誘導体は本発明のこれらの態様を示すのに用いられるが、本発明は、決して、それらの特定の誘導体に制限されないことも理解されるべきである。本発明は、さらに、セルロースおよびデキストランのような他の多糖の誘導体を含む組成物を提供し、多糖誘導体の濃度はＨＡ誘導体について上記の通りである。以下の実施例１２および１３参照。そのような誘導体は、限定されるものではないが、官能性化セルロースまたは官能性化セルロース誘導体を含むことができる。用いることができる他の誘導体は、限定されるものではないが、官能性化デキストランおよび官能性化デキストラン誘導体を含む。他の天然多糖および合成多糖、ならびにその誘導体を用いて、本発明の組成物を調製することもできる。したがって、本発明は、他のヒドロゲル前駆体、例えば、本明細書中に言及されたものを含めた他の多糖誘導体、例えば、セルロース誘導体およびデキストラン誘導体に適用されるように、ＨＡ誘導体について本明細書中に記載されたものと同様な組成物および方法を含む。
【００８０】
癒着を阻害する、インサイチュにて多糖誘導体を架橋することによって形成されたヒドロゲルの顕著な能力はＨＡの誘導体に制限されない。本発明者らは、特定のＨＡ誘導体および特定のセルロース誘導体の架橋によってインサイチュにて形成されたヒドロゲルが同様な癒着阻害効果を有することを示した（実施例１１および１２）。例えば、ＨＡ誘導体、および天然セルロース骨格構造が糖環の酸化によって改変される種々のセルロース誘導体のいずれかを架橋することによって形成されたヒドロゲルはまた、腹膜において癒着を阻害し、良好な生体適合性を呈する（実施例１１および１２）。
【００８１】
本発明は、さらに、（ｉ）ＨＡ誘導体を被験体の身体内の位置に投与する工程；および、（ｉｉ）セルロース誘導体を該被験体の身体内の位置に投与する工程を含む、癒着を阻害する方法を提供し、ここに、該ＨＡ誘導体および該セルロース誘導体は架橋するようになって、互いの接触の後にヒドロゲルを形成し、該ヒドロゲルは癒着を阻害する。該ＨＡ誘導体および該セルロース誘導体は別個の溶液に溶解させることができ、この溶液は、実質的に同時に被験体に投与される。
【００８２】
セルロースは、互いに連結されたβ−Ｄ−グルコピラノース単位の線状ポリマーである（Ｋａｍｉｄｅ，Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２００５）。用語「セルロース誘導体」とは、この天然形態から化学的に修飾されているセルロースをいう。本発明の特定の実施形態において、多糖はメチルセルロース（ＭＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシメチルセルロース（ＨＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、またはヒドロキシプロピルメチルセルロール（ＨＰＭＣ）のようなセルロース誘導体であり、ここに、ＯＨ基の１以上はＯＲによって置き換えられており、ここに、Ｒは種々の部分のいずれかを表す。上記のセルロース誘導体のいずれかにおけるいくつかの、しかしながら典型的には全てではないがグルコース部分は修飾されていると認識されるであろう（図１２参照）。一般には、架橋可能なセルロース誘導体は、ＨＡ誘導体について上記と同様に作製することができる。例えば、セルロースまたはセルロース誘導体のいずれかを修飾して、官能性化セルロース誘導体を形成し、これはアミン、アミド、アルデヒド、エステル、ヒドロキシ、またはヒドラジドのような官能基を含み、これは適当な第二の官能基、例えば、ＨＡ誘導体上の官能基と共有結合するようになることができる。例えば、アルデヒド官能基を含むセルロース誘導体は、グルコース部分のいくつかのヒドロキシル基を酸化して、ＨＡについてここに記載されたアルデヒド基を形成することによって形成される。グルコース部分のヒドロキシル基を酸化して、アルデヒド基を形成することによって形成されたＭＣ、ＣＭＣおよびＨＰＭＣの誘導体とは、本明細書中においては、各々、ＭＣ−ＣＨＯ、ＣＭＣ−ＣＨＯ、およびＨＰＭＣ−ＣＨＯという（図１２参照）。同様な命名法を他のセルロース誘導体について使用することができる。
【００８３】
本発明は、溶液中のセルロース誘導体を含む組成物を提供し、ここにセルロース誘導体の濃度は５ｍｇ／ｍｌよりも大きく、例えば、１５０ｍｇ／ｍｌまでである。特定の実施形態において、セルロース誘導体の濃度が１０ｍｇ／ｍｌよりも大きい。他の実施形態において、セルロース誘導体の濃度が１５ｍｇ／ｍｌよりも大きく、２０ｍｇ／ｍｌよりも大きく、または２５ｍｇ／ｍｌよりも大きい。本発明の目的では、２５ｍｇ／ｍｌよりも大のセルロース誘導体を「高濃度」という。該溶液は、好ましくは、それが容易に操作できるように、例えば、容易な注射可能性が存在するような十分に低い粘度を有する。セルロース誘導体は、本明細書中に記載されたセルロース誘導体のいずれかであり得る。例えば、セルロース誘導体はＭＣ−ＣＨＯ、ＣＭＣ−ＣＨＯ、およびＨＰＭＣ−ＣＨＯであり得る。
【００８４】
本発明の特定の実施形態において、ジヒドラジド官能基を含むＨＡ誘導体、およびアルデヒド基を含むセルロース誘導体を用いて、ヒドロゲルを形成する。例えば、第一の溶液はＨＡ−ＡＤＨを含むことができ、第二の溶液はＭＣ−ＣＨＯ、ＣＭＣ−ＣＨＯ、またはＨＰＭＣ−ＣＨＯを含むことができる。ＨＡおよびセルロース誘導体は架橋するようになって以下のヒドラゾン化合物：ＨＡ−ＣＭＣ、ＨＡ−ＨＰＭＣ、およびＨＡ−ＭＣを形成する。
【００８５】
さらに、本発明者らは、特定のＨＡ誘導体および特定のデキストラン誘導体の架橋によってインサイチュで形成されたヒドロゲルは、同様な癒着阻害効果を有することも示した（実施例１３）。例えば、ＨＡ、セルロース、または他のデキストラン誘導体、および天然デキストラン骨格構造が改変されたデキストラン誘導体を架橋することによって形成されたヒドロゲルは、やはり、腹膜中で癒着を阻害し、および良好な生体適合性を呈する（実施例１３）。
【００８６】
本発明は、さらに、（ｉ）ＨＡまたはセルロース誘導体を被験体の身体内の位置に投与し、次いで、（ｉｉ）デキストラン誘導体を該被験体の身体内の位置に投与する工程を含む癒着を阻害する方法を提供し、ここに、該ＨＡまたはセルロース誘導体および該デキストラン誘導体は、互いの接触の後にヒドロゲルを形成するように架橋され、該ヒドロゲルは癒着を阻害する。該ＨＡまたはセルロース誘導体および該デキストラン誘導体は別個の溶液に溶解させることができ、これらは、被験体に実質的に同時に投与される。
【００８７】
デキストランは複雑な分枝した多糖である。デキストランはα１→６グリコシド結合を介して一緒に連結されて、直鎖を形成する多くのグルコース部分を含む。分枝は、典型的には、α１→３結合から開始するが、それらはα１→２またはα１→４結合から開始してもよい。デキストランの直鎖部分の構造は図２２に示される。用語「デキストラン誘導体」とは、この天然形態から化学的に修飾されているデキストランをいう。本発明の特定の実施形態において、多糖はデキストラン誘導体であり、ここに、ＯＨ基の１以上はＯＲによって置きかえられ、ここに、Ｒは種々の部位のいずれかを表す。他の実施形態において、デキストラン誘導体はアルデヒド含有誘導体であり、ここに、デキストランは過ヨウ素酸塩で処理されている。上記のデキストラン誘導体のいずれかにおけるいくつかの、しかしながら典型的には全てではないグルコース部分が修飾されていると認識されるであろう（図２２参照）。一般に、架橋可能なデキストラン誘導体は、ＨＡ誘導体またはセルロース誘導体について上記と同様に作製することができる。例えば、デキストランまたはデキストラン誘導体のいずれかを修飾して、適当な第二の官能基、例えば、ＨＡ、セルロース、またはデキストランの誘導体上の官能基に共有結合するようになることができる、アミン、アミド、アルデヒド、エステル、ヒドロキシ、またはヒドラジドのような官能基を含む官能性化セルロース誘導体を形成する。例えば、アルデヒド官能基を含むデキストラン誘導体は、グルコース部分のいくつかのヒドロキシル基を酸化して、ＨＡおよびセルロースについて本明細書中に記載されたアルデヒド基を形成することによって形成される。グルコース部分のヒドロキシル基を酸化して、アルデヒド基を形成することによって形成されたデキストランの誘導体は、本明細書中においては、ＤＸ−ＣＨＯという（図２２参照）。ヒドラジド基で修飾されたカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤＸ）の誘導体をＣＭＤＸ−ＡＤＨという（図２２参照）。
【００８８】
本発明は、溶液中にデキストラン誘導体を含む組成物を提供し、ここに、該デキストラン誘導体の濃度は５ｍｇ／ｍｌよりも大きく、例えば、１５０ｍｇ／ｍｌまでである。特定の実施形態において、デキストラン誘導体の濃度は１０ｍｇ／ｍｌよりも大きい。他の実施形態において、デキストラン誘導体の濃度は１５ｍｇ／ｍｌよりも大きいか、２０ｍｇ／ｍｌよりも大きいか、または２５ｍｇ／ｍｌよりも大きい。本発明の目的では、２５ｍｇ／ｍｌよりも大きいデキストラン誘導体の濃度を「高濃度」という。溶液は、好ましくは、それが容易に操作できるように、例えば、容易な注射可能性が存在するように十分に低濃度を有する。デキストラン誘導体は、本明細書中に記載されたデキストラン誘導体のいずれでもあり得る。例えば、デキストラン誘導体はＤＸ−ＣＨＯ、またはＣＭＤＸ−ＡＤＨであり得る。
【００８９】
本発明の特定の実施形態において、ジヒドラジド官能基を含むＨＡまたはセルロース誘導体、およびアルデヒド基を含むデキストラン誘導体が用いられる。例えば、第一の溶液はＨＡ−ＡＤＨを含むことができ、第二の溶液はＤＸ−ＣＨＯを含むことができる。ＨＡ誘導体およびデキストラン誘導体は架橋するようになってＨＡ−ＤＸを形成する。本発明の特定の実施形態において、ジヒドラジド官能基を含むセルロース誘導体、およびアルデヒド基を含むデキストラン誘導体を用いる。例えば、第一の溶液はＣＭＣ−ＡＤＨを含むことができ、第二の溶液はＤＸ−ＣＨＯを含むことができる。しかしながら別の例を挙げれば、第一の溶液はＣＭＤＸ−ＡＤＨを含むことができ、第二の溶液はＣＭＣ−ＣＨＯを含むことができる。セルロールおよびデキストラン誘導体は架橋するようになって、ＣＭＣ−ＤＸを形成する。本発明の特定の実施形態において、ジヒドラジド官能基を含むデキストラン誘導体、およびアルデヒド基を含む別のデキストラン誘導体を用いる。例えば、第一の溶液はＣＭＤＸ−ＡＤＨを含むことができ、第二の溶液はＤＸ−ＣＨＯを含むことができる。セルロールおよびデキストラン誘導体は架橋するようになって、ＣＭＤＸ−ＤＸを形成する。
【００９０】
上記実施形態のいずれにおいても、第一および第二の多糖誘導体上の利用可能な官能基の一部のみが架橋するようになるのは認識されよう。架橋密度は、例えば、多糖誘導体の分子量を適切に選択することによって制御することができる。例示的な架橋密度は、約１×１０６〜約１×１０８ｍｏｌ／ｃｍ３の範囲である。特定の実施形態において、架橋密度は３〜５０×１０７ｍｏｌ／ｃｍ３の範囲である。
【００９１】
本発明の特定の実施形態において、多糖誘導体が、溶液で投与されるよりもむしろ、それらの投与の前に、ヒドロゲルマイクロ粒子に形成される。ヒドロゲル粒子は液体媒体に懸濁され、身体中の位置に投与され得る。
【００９２】
本発明の特定の実施形態において、インサイチュで架橋して、癒着を阻害する組成物を形成するため、および／または本明細書中に記載された他の目的のいずれかに適した多糖誘導体の少なくとも１つは、非多糖ポリマーを含む部分を含み、例えば、多糖誘導体が、１以上の非多糖ポリマーに共有結合した多糖またはその誘導体を含む。非多糖は、ポリマーが重量、数、またはその双方にて、１％未満の糖モノマーを含有する、例えば、ポリマーが実質的に糖を含有しないことを意味する。本発明の特定の実施形態において、非多糖部分は１重量％と１０重量％〜９０重量％との間のポリマー、および／または１重量％および１０重量％〜９０重量％との間のモノマーが非糖モノマーである。結合は多糖鎖における任意の位置、例えば、鎖の末端のいずれか、あるいは線状構造または分枝構造のいずれかをもたらす内部に位置した糖部分のいずれかの１つにおいて起こり得る。非多糖ポリマーは種々のポリマーのいずれか、例えば、多糖誘導体に共有結合した場合、ヒドロゲル前駆体として働くことができる任意の非多糖ポリマーであり得る。典型的には、ポリマーは親水性ポリマーであり、すなわち、それは水に対する親和性を有し、水に可溶性である。適当な非多糖ポリマーは、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）のようなポリエーテル、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ゼラチン、ポリ（ｌ−グルタミン酸）、ポリリジン（ＰＬＬ）およびこれらの任意の誘導体のようなポリペプチド、あるいはこれらのいずれかを含む結合体、ブレンドまたは複合体を含む。例えば、１つの実施形態において、多糖誘導体の少なくとも１つはそれに共有結合したＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体を有するＨＡ誘導体であり、ここに、ＨＡ部分またはＰＥＧ部分いずれかは第一の官能基を含む。第二の多糖誘導体は、第一の官能基と反応する官能基を含む任意の多糖誘導体であり得る。例えば、１つの実施形態において、ＨＡ誘導体はＰＥＧ−ＨＡ−ＡＤＨであり、第二の多糖誘導体はジヒドラジドと反応する官能基、例えば、ＨＡ−ＣＨＯを含む。適当な官能基を含んで共有結合の形成を容易とする種々のＰＥＧ誘導体は商業的に入手可能である。例えば、多数のこれらの化合物を記載するＮｅｋｔａｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ  ２００５−２００６  製品カタログ、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ参照。
【００９３】
本発明の特定の実施形態において、第一および第二の架橋可能なヒドロゲル前駆体が使用され、ここに、ヒドロゲル前駆体の１つがＨＡ誘導体、セルロース誘導体またはデキストラン誘導体のような多糖誘導体を含むか、またはそれよりなり、他のヒドロゲル前駆体は非多糖ポリマーを含むか、またはそれよりなる（すなわち、ポリマーの１重量％未満、またはモノマーの１重量％未満は糖である）。多糖誘導体に架橋して、ヒドロゲルを形成するようになることができる例示的な非多糖ポリマーは、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはプロピレングリコール（ＰＰＧ）のようなポリエーテル、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ゼラチン、キトサン、またはポリ（ｌ−グルタミン酸）、およびこれらの任意の誘導体のようなポリペプチド、あるいはこれらのいずれかを含む結合体、ブレンドまたは複合体を含む。例示的な実施形態において、第一の架橋可能なヒドロゲル前駆体はＨＡ−ＡＤＨであって、第二の架橋可能なヒドロゲル前駆体は、アルデヒド基を含むＰＥＧ誘導体である。
【００９４】
多糖誘導体は本明細書中においては本発明を例示するために詳細に記載されるが本発明のなお他の実施形態においては、ヒドロゲルは２つの非多糖ポリマーをインサイチュにて架橋することによって形成され、その結果、癒着を阻害するヒドロゲルを得る。非多糖ポリマーの各々は官能基を含み、ここに、官能基は互いに反応して、共有結合を形成する。適当な官能基は、多糖誘導体を架橋するための上記のものである。例示的な非多糖ポリマーは、架橋のための適切な官能基を含有するか、または含有するように修飾することができる上記のものを含む。
【００９５】
ＩＩ．架橋可能な多糖誘導体および生物学的に活性な薬剤を含む組成物
本発明は、さらに、ヒドロゲルが、生物学的に活性な薬剤を含むヒドロゲルを生成するようにヒドロゲル前駆体を架橋することによって形成される上記の組成物を提供する。例えば、第一の多糖を含有する溶液、第二の多糖誘導体を含有する溶液のいずれか、またはその双方は、１以上の生物学的に活性な薬剤を含む。第一および第二の多糖誘導体を架橋することによって形成されたヒドロゲルは、従って、１以上の生物学的に活性な薬剤を含有する。本発明のいくつかの実施形態において、溶液の各々は異なる生物学的に活性な薬剤を含む。それから形成されたヒドロゲルは２以上の生物学的に活性な薬剤を含有する。あるいは、第一および第二のヒドロゲル前駆体を含有する溶液を、各々が１以上の生物学的に活性な薬剤を含有する１以上のさらなる溶液と組み合わせることができる。別の実施形態において、生物学的に活性な薬剤は、第一および第二の溶液を組み合わせることによって形成された組成物に直ちに加えられる。
【００９６】
多糖誘導体は、例えば、ＨＡ誘導体、セルロース誘導体、デキストラン誘導体などであり得る。本発明の特定の実施形態において、第一および第二の多糖誘導体はＨＡ誘導体である。本発明の特定の実施形態において、第一および第二の多糖誘導体はセルロース誘導体である。本発明の特定の実施形態において、第一および第二の多糖誘導体はデキストラン誘導体である。本発明の特定の実施形態において、第一の多糖誘導体はＨＡ誘導体であって、第二の多糖誘導体はセルロース誘導体である。本発明の特定の実施形態において、第一の多糖誘導体はＨＡ誘導体であって、第二の多糖誘導体はデキストラン誘導体である。本発明の特定の実施形態において、第一の多糖誘導体はセルロース誘導体であって、第二の多糖誘導体はデキストラン誘導体である。本発明の特定の実施形態において、ヒドロゲルは３以上の多糖誘導体から形成される。ＨＡ誘導体、セルロース誘導体、デキストラン誘導体、他の多糖誘導体、または他のポリマーの任意の組合せを架橋して、本発明のヒドロゲルを形成することができる。
【００９７】
任意の生物学的に活性な薬剤を、多糖誘導体を架橋することによって形成されたヒドロゲルに含めることができる。本発明は、従って、広範な種々の生物学的に活性な薬剤をいずれかを含有するヒドロゲルを提供する。本発明は、さらに、ＨＡ誘導体、セルロース誘導体またはデキストラン誘導体のような多糖誘導体、および広範な種々の生物学的に活性な薬剤いずれかを含有する溶液を提供する。
【００９８】
本発明は、さらに、生物学的に活性な薬剤を含むヒドロゲルを調製する方法を提供し、該方法は：第一の多糖誘導体を含む第一の溶液、および第二の多糖誘導体を含む第二の溶液を接触させる工程を含み、ここに、溶液の少なくとも１つは生物学的に活性な薬剤を含み、該第一および第二の多糖誘導体は互いに架橋する官能基を含む。本発明は、さらに、生物学的に活性な薬剤を含むヒドロゲルを調製する方法を提供し、該方法は：第一の多糖誘導体を含む第一の溶液、第二の多糖誘導体を含む第二の溶液、および生物学的に活性な薬剤を互いに接触させる工程を含み、ここに、該第一および第二の多糖誘導体は互いに架橋する官能基を含む。所望により、生物学的に活性な薬剤は溶液中にある。本発明の特定の実施形態において、ヒドロゲルは、被験体に溶液を投与することによって調製され、ここに、ヒドロゲル前駆体は互いに架橋して、生物学的に活性な薬剤を封入するヒドロゲルを形成する。
【００９９】
本発明の特定の実施形態において、生物学的に活性な薬剤は治療剤である。生物学的に活性な薬剤の有用なクラスは、抗感染剤、抗炎症剤、抗増殖剤（例えば、細胞傷害性薬剤）、抗新形成剤（すなわち、悪性細胞の増殖を阻害するか、または妨げ、そして／あるいは腫瘍の成長または拡大を阻害するか、または妨げる薬剤）、鎮痛剤（すなわち、疼痛を軽減する薬剤）、抗酸化剤、脈管形成インヒビター、免疫抑制剤、免疫変調剤、抗凝固剤（すなわち、抗血栓形成剤ともいう、血餅の形成を阻害するか、または妨げるが、存在する血餅を溶解させない薬剤）、タンパク質分解剤、またはタンパク質分解を増強させる薬剤（そのうちいくつかは抗血栓形成剤でもある）、フリーラジカルスカベンジャー、抗酸化剤、線維修復のインヒビター（例えば、抗ＴＧＦ−β剤、Ｄ−ペニシラミン、ペントキシフィリン）などを含む。治療剤の他の有用なクラスは睡眠剤、鎮静剤、トランキライザー、抗痙攣剤、筋肉弛緩剤、抗発作剤、交感神経刺激剤、心血管剤（例えば、抗不整脈剤、強心薬）などを含む。本発明の特定の実施形態において、生物学的に活性な薬剤は麻酔剤ではない。本発明の特定の実施形態において、生物学的に活性な薬剤は抗増殖剤ではない。特定の実施形態において、生物学的に活性な薬剤は抗炎症剤である。特定の実施形態において、生物学的に活性な薬剤は非ステロイド性抗炎症剤である。特定の実施形態において、生物学的に活性な薬剤はステロイド性抗炎症剤（例えば、グルココルチコイド、コルチコステロイド）である。
【０１００】
生物学的に活性な物質は好ましくは、多糖誘導体および／または非多糖ポリマーを含む適当な量の溶液を被験体に投与した場合に変化させることができる医薬上有効である量にて加える。該薬剤は癒着を阻害してもしなくてもよい。いくつかの薬剤は１を超えるクラスに入り、１を超える作用機構を有することができると認識される。クラスのメンバーとしての特定の薬剤のリストは限定されることを意図しない。
【０１０１】
本発明で用いる例示的なクラスの抗感染剤は、キノロン、β−ラクタム（例えば、ペニシリンまたはセファロスポリン）、カルバペネム、アミノグリコシド、マクロライド、リンコサミド、ケトリド、テトラサイクリン、グリシシクリン、リンコマイシン、オキサゾリジノン、アンフェニコール、アンサマイシン、ポリミキシン、アミノメチルシクリン、リンコサミド、ストレプトグラミン、２，４−ジアミノピリミジン、ニトロフラン、スルホンアミド、スルホン、リファブチン、ダプソン、ペプチド、グリコペプチド、およびヌクレオシドアナログを含む。本発明の特定の実施形態において、抗感染剤は種々の細菌種に対する広いスペクトルの活性を持つものである。いくつかの実施形態において、薬剤はグラム陽性菌の１以上の種、グラム陰性菌１以上の種、またはその双方に対して有効である。本発明の特定の実施形態において、薬剤は、外科的創傷または傷害を汚染するようである細菌または真菌に対して有効である。例えば、薬剤は皮膚上で、または胃腸管中で通常見出される細菌または真菌に対して有効であり得る。
【０１０２】
用いることができる特定の抗感染剤の例は、限定されるものではないが、エリスロマイシン、ナフシリン、セファゾリン、イミペネム、アズトレオナム、ゲンタマイシン、スルファメトキサゾール、バンコマイシン、シプロフロキサシン、トリメトプリム、リファンピン、メトロニダゾール、クリンダマイシン、テイコプラミン、ムピロシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、オフロキサシン、ロメフロキサシン、ノルフロキサシン、ナリジクス酸、スパルフロキサシン、ペフロキサシン、アミフロキサシン、ガチフロキサシン、モキシフロキサシン、ゲミフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、ミノサイクリン、リメゾリド、テマフロキサシン、トスフロキサシン、クリナフロキサシン、スルバクタム、クラブラン酸、アンホテリシンＢ、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾールおよびナイスタチンを含む。
【０１０３】
本発明で用いる例示的なクラスの抗炎症剤は広範な種々の非ステロイド性抗炎症剤（例えば、シクロオキシゲナーゼ−１インヒビター）、コルチコステロイド、グルココルコイド、および抗炎症抗生物質またはポリペプチドを含む。
【０１０４】
例示的な抗炎症剤はプレドニゾロン；デキサメタゾン、フルオロメトロン；プレドニゾロン；メチルプレドニゾロン；クロベタゾール；ハロベタゾール；ヒドロコルチゾン；トリアムシノロン；ベタメタゾン；フルオシノロン；フルオシノニド；ロテプレドノール；メドリゾン；リメキソロン；セレコキシブ；葉酸；ジクロフェナク；ジフルニザール；フェノプロフェン；フルルビプロフェン；インドメタシン；ケトプロフェン；メクロフェナメート；メクロファメート；ピロキシカム；スリンダク；サルサレート；ナブメトン；オキサプロジン；トルメチン；硫酸ヒドロキシクロロキン；ロフェコキシブ；エタネルセプト；インフリキシマブ；レフルノマイド；ナプロキセン；オキサプロジン；ピロキシカム；サリチレート；バルデコキシブ；スルファサラジン；メチルプレドニゾロン；イブプロフェン；ブデゾナイド；メロキシカム；酢酸メチルプレドニゾロン；金チオリンゴ酸ナトリウム；アスピリン；アザチオプリン；トリアムシノロンアセトニド；プロポキシフェンナプシレート／ａｐａｐ；葉酸塩；ナブメトン；ジクロフェナク；ケトロラク；ピロキシカム；エトドラク；ジクロフェナクナトリウム；ジクロフェナクカリウム；オキサプロジン；メトトレキサート；ミノサイクリン；タクロリムス（ＦＫ−５０６）；シロリムス（ラパマイシン）およびラパマイシンアナログ；フェニルブタゾン；ジクロフェナクナトリウム／ミソプロストール；アセトアミノフェン；インドメタシン；グルコサミン硫酸／コンドロイチン；およびシクロスポリンまたはそのアナログなどを含む。例示的な非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）はセレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニザール、エトドラク、サリチレート、フェノプロフェン、イブプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケテロラク、メクロファメート、メクロフェナメート、メロキシカム、ナプロキセン、ピロキシカム、スリンダク、サルサレート、ナブメトン、アスピリン、オキサプロジン、およびトルメチンを含む。例示的な抗炎症性ステロイド剤はデキサメタゾン、フルオロメトロン、プレドニゾロン、ロテプレドノール、メドリソン、プレドニゾン、メチルプレドニゾン、コルチゾン、ブデゾニド、リメキソロン、クロベタゾール、ハロベタゾール、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、フルオシノロン、およびフルオシノニドを含む。注目するさらなる抗炎症剤は、ＴＮＦ−αに結合する抗体（例えば、インフリキシマブ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、および可溶性ＴＮＲ−α受容体であるポリペプチド（例えば、エタネルセプト；Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））を含む。
【０１０５】
抗炎症剤のさらなる例はサイトカイン抑制性抗炎症薬物（ＣＳＡＩＤ）；抗ＴＮＦα抗体（例えば、本明細書で参考として援用される米国公開番号２００４０１２６３７２参照）；ｃＡ２／インフリキシマブ（キメラ抗ＴＮＦα抗体；セントコール）；ＩＬ−４（抗炎症サイトカイン；ＩＬ−１０；ＩＬ−１０および／またはＩＬ−４アゴニスト（例えば、アゴニスト抗体または小分子）；ＩＬ−１受容体アンタゴニスト；ＴＮＦ−ｂｐ／ｓ−ＴＮＦ（可溶性ＴＮＦ結合タンパク質；ホスホジエステラーゼＩＶ型インヒビター；サリドマイドおよびサリドマイド関連薬物；レフルノミド；トラネキサム酸、およびプラスミノーゲン活性化の他のインヒビター；プロスタグランジンＥ１、テニダップ、抗ＩＬ−１２抗体；抗ＩＬ−１８抗体；インターロイキン−１１；インターロイキン−１３；インターロイキン−１７インヒビター；金；ペニシラミン；クロロキン；ヒドロキシクロロキン；クロラムブシル；シクロホスファミド；シクロスポリン；全リンパ系照射；抗胸腺細胞グロブリン；抗ＣＤ４抗体；ＣＤ５−トキシン；経口投与されるペプチドおよびコラーゲン；ロベンザリッド２ナトリウム；ＩＣＡＭ−１短干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチド；可溶性補体受容体１を含む。
【０１０６】
本発明で用いる脈管形成インヒビターは、「抗ＶＥＧＦ剤」と本明細書中では称される、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）またはその受容体を阻害するか、またはそれに拮抗する薬剤を含む。有用な薬剤は、例えば、１以上のＶＥＧＦイソ形態またはＶＥＧＦ受容体に結合する抗体、抗体断片、および核酸を含む。該結合は、例えば、１以上のＶＥＧＦイソ形態とその受容体との相互作用を阻害することができる。アバスタチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、ＶＥＧＦにも結合する全長ヒト化抗体である（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ．，２５（４）：５８１−６１１，２００４中で概説されている）。ルセンティス（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）に結合し、それを阻害するヒト化抗体断片である（Ｇａｕｄｒｅａｕｌｔ，Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４６，７２６−７３３（２００５）およびその中の文献）。マクゲン（Ｍａｃｕｇｅｎ）（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｅｙｅｔｅｃｈ）は、ＶＥＧＦ１６５（米国特許第６，０５１，６９８号）に結合し、それを阻害する（アプタマーともいわれる）ＶＥＧＦ核酸リガンドである。これらおよび他のアプタマー、または１以上のＶＥＧＦイソ形態に結合する抗体は本発明で用いられる。
【０１０７】
他の脈管形成インヒビターは、アンジオスタチン、アレステン、カンスタチン、コムブスタチン、エンドスタチン、トロンボスポンジン、およびツムスタチンのような種々の内因性または合成ペプチドを含む。他の抗脈管形成分子はサリドマイド、およびｉＭｉＤのようなその抗脈管形成誘導体を含む（Ｂａｍｉａｓ  Ａ，Ｄｉｍｏｐｏｕｌｏｓ  ＭＡ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．１４（８）：４５９−４６９，２００３；Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ＪＢ，Ｄｒｅｄｇｅ  Ｋ，Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ  ＡＧ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．４（４）：３１４−２２，２００４）。
【０１０８】
例示的なクラスの抗増殖剤はアルカリ化剤またはアルキル化剤、アルキルスルホネート、アジリジン、エチレンイミンおよびメチルアメラミン、ナイトロゲンマスタード、抗生物質、抗代謝産物、葉酸アナログ、プリンアナログ、ピリミジンアナログ、アンドロゲン、抗アンドロゲン、抗アドレナル、アラビノシド、抗エストロゲン、タキソイド、白金アナログ、微小管インヒビター（例えば、微小管脱重合剤または安定化剤）、トポイソメラーゼインヒビター、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）インヒビター、アグレソームインヒビター、プロテアソームインヒビター、アポトーシス促進剤、キナーゼインヒビター、放射性同位体、動物、植物、または細菌の毒素などを含む。
【０１０９】
これらのクラスに入る薬剤の具体的例はチオテパおよびシクロホスファミドのようなアルカリ化またはアルキル化剤；ブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファンのようなアルキルスルホネート；ベンゾドパ、カルボクオン、メツレドパ、およびウレドパのようなアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスフォルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラニンを含めたエチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；クロラムブシル、クロマファジン、クロホスファミド、エストラムシン、イホスファミド、メクロタミン、メクロルエタミンオキシド塩酸、メルファラン、ノベムビキン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンのようなニトロソ尿素；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアザ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンのような抗生物質；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような抗代謝産物；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキセートのような葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルルビジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵのようなピリミジンアナログ；カルステロン、ドロモスタノロンプロピオン酸、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン、抗アンドロゲン、例えば、スピノロラクトン、フルタミド、フィナステリドのようなアンドロゲン受容体アンタゴニスト；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗アドレナル；フロリン酸のような葉酸補充物；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリム；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；マイトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；マイトブロニトール；マイトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクタキセルおよびドセタキセル；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンのような白金アナログ；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビンブラスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフテリアトキシン；リシン；シュードモナストキシンＡ；コノトキシン；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；ＨＥＲ−２抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））；Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）のようなキナーゼインヒビター、および上記の任意の医薬上許容される塩、酸または誘導体を含む。
【０１１０】
本発明で用いるのに適したタンパク質分解剤は、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）／プラスミンカスケードの成分を含む。ｔＰＡ／プラスミンカスケードの成分は組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）およびその改変体、プラスミノーゲンならびにプラスミンのようなプラスミノーゲンアクチベーターを含む。プラスミノーゲンアクチベーター（ＰＡ）は、２つのジスルフィド架橋によって連結されたままである２つの鎖を生じる単一ペプチド結合（Ｒ５６１−Ｖ５６２）の切断によって、プラスミノーゲンのプラスミンへの変換を触媒するセリンプロテアーゼである（Ｖａｓｓａｌｌｉ  １９９１）。プラスミンは、インビボでのその主な基質が、血餅のタンパク質性成分であるフィブリンである強力なセリンプロテアーゼである。ｔＰＡによるプラスミノーゲン活性化は、フィブリンの存在下で刺激される。プラスミンは広い基質範囲を有し、ＥＣＭで見出されるほとんどのタンパク質を含んだ多くの他のタンパク質を直接的または間接的に切断することができる。本明細書中で用いる場合、「直接的」は、プロテアーゼが、切断されるポリペプチドと物理的に相互作用することを意味し、一方で、「間接的」は、プロテアーゼが切断されるポリペプチドと物理的に相互作用せず−その代わり、それが別の分子、例えば、該ポリペプチドを直接的または間接的に切断する別のプロテアーゼと相互作用することを意味する。プラスミンは、メタロプロテアーゼ前駆体を活性化することもできる。メタロプロテアーゼは、今度は、ＥＣＭ分子を分解する。メタロプロテアーゼは、本発明の特定の実施形態でやはり用いられる。
【０１１１】
２つのＰＡ、組織型ＰＡ（ｔＰＡ）およびウロキナーゼ型ＰＡ（ｕＰＡ）は哺乳動物において同定されている。ＰＡの主な生理学的機能は、プラスミノーゲンを、フィブリンを溶解するプラスミンへ活性化することによって血餅の溶解を誘発することである。本発明で用いるｔＰＡは、いずれの種からのものであってもよいが、ヒトへの投与では、一般には、ヒトｔＰＡまたはその改変体を用いるのが好ましい。特に興味深い実施形態において、生物学的に活性な薬剤は、ｔＰＡである。実施例１０に記載されているように、ｔＰＡを含有するヒドロゲルは、複数の損傷事象後に形成できるもののような頑強な癒着の関係で癒着を阻害する増大した能力を呈した。改良された特性を持つ改変体を含めた、ｔＰＡおよびその有用な改変体は、米国特許第６，２８４，２４７号；同第６，２６１，８３７号；同第５，８６９，３１４号；同第５，７７０，４２６号；同第５，７５３，４８６号；同第５，７２８，５６６号；同第５，７２８，５６５号；同第５，７１４，３７２号；同第５，６１６，４８６号；同第５，６１２，０２９号；同第５，５８７，１５９号；同第５，５２０，９１３号；同第５，５２０，９１１号；同第５，４１１，８７１号；同第５，３８５，７３２号；同第５，２６２，１７０号；同第５，１８５，２５９号；同第５，１０８，９０１号；同第４，７６６，０７５号；同第４，８５３，３３０号、およびＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．に譲渡された他の特許に記載されている。例えば、限定されるものではないが、ｔＰＡ改変体は天然に生じるｔＰＡに対してプロテアーゼドメインの改変を有することができ、そして／または天然に生じるｔＰＡに対して、Ｎ末端における１以上のアミノ酸の欠失を有することができる。ｔＰＡ改変体は天然に生じるｔＰＡに対して１以上のさらなるグリコシル化部位を有することができ、そして／または真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞において発現させた場合に、天然に生じるｔＰＡにおいて通常生じるであろうグリコシル化を破壊する改変を有することができる。用いることができる特性は、限定されるものではないが、フィブリンに対する、増大した半減期、増大した活性、増大した親和性または特異性等を含む。
【０１１２】
ヒトｔＰＡは、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅデータベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＮＣＢＩ）においてＧｅｎｅ  ＩＤ  ５３２７が割り当てられており、全長アミノ酸、ｍＲＮＡ、および遺伝子配列についてのＧｅｎＢａｎｋエントリーは、各々、ＡＡＡ９８８０９，Ｋ０３０２１，およびＮＭ＿０００９３０である。しかしながら、例えば、米国特許第４，８５３，３３０号に記載されたような、シグナル配列ペプチドを欠如したｔＰＡの成熟形態、またはその改変体を用いるのが好ましいであろうことを注記する。
【０１１３】
ｔＰＡがそのメンバーであるキモトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼは、通常、一本鎖タンパク質として分泌され、ポリペプチド鎖中の特定の部位におけるタンパク質分解によって活性化されて、２鎖形態を生じる。一本鎖および２鎖形態は、共に、プラスミノーゲンに対して活性であるが、２鎖形態の活性がより大きい。プラスミンは一本鎖ｔＰＡを２鎖形態へと活性化し、したがって、正のフィードバックループがもたらされる。ｔＰＡの一本鎖または２鎖形態のいずれか、あるいはその組合せを本発明で用いることができる。
【０１１４】
ｔＰＡおよびその改変体は商業的に入手可能であって、種々の疾患についてヒトへの投与で認可されている。例えば、アルテプラーゼ（Ａｃｔｉｖａｓｅ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）は組換えヒトｔＰＡである。レテプラーゼ（Ｒｅｔａｖａｓｅ（登録商標）、Ｒａｐｉｌｙｓｉｎ（登録商標）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｒｏｃｈｅ  Ｃｅｎｔｏｒｏｒ）は、当該分子が、元のタンパク質の５２７アミノ酸のうち３５５を含有するように遺伝子工学により作製されているヒトｔＰＡの組換え非グリコシル化形態である。テネクテプラーゼ（ＴＮＫａｓｅ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、３つのアミノ酸置換を有するだけ、天然に生じるヒトｔＰＡとは異なるヒトｔＰＡの５２７アミノ酸糖タンパク質誘導体である。これらの置換は血漿クリアランスを減少させ、フィブリン結合を増加させ（それにより、フィブリン特異性を増加させ）およびプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ−１）に対する耐性を増加させる。アニステレプラーゼ（Ｅｍｉｎａｓｅ（登録商標），ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）は、なお別の商業的に入手可能なヒトｔＰＡである。
【０１１５】
代替プラスミノーゲンアクチベーターは、その双方が商業的に入手可能であるストレプトキナーゼ（Ｓｔｒｅｐｔａｓｅ（登録商標），Ｋａｂｉｋｉｎａｓｅ（登録商標））およびウロキナーゼ（Ａｂｂｏｋｉｎａｓｅ（登録商標））を含む。
【０１１６】
本発明で用いる他のタンパク質分解増強剤は、吸血コウモリ唾液に由来するＤｅｓｍｏｄｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ唾液プラスミノーゲンアクチベーター（ＤＳＰＡ）デスモテプラーゼ（Ｐａｉｏｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のようなｔＰＡアクチベーターを含む（本明細書で参考として援用されるＬｉｂｅｒａｔｏｒｅ  ＧＴ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｍｐｉｒｅ  ｂａｔ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖｅｔｏｒ（ｄｅｓｍｏｔｅｐｌａｓｅ）：ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ｔｈａｔ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｎｅｕｔｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．  Ｓｔｒｏｋｅ．２００３  Ｆｅｂ；３４（２）：５３７−４３）。４つの区別されるプロテアーゼが特徴付けられており、Ｄ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ唾液プラスミノーゲンアクチベーター（ＤＳＰＡ）という。全長吸血コウモリプラスミノーゲンアクチベーター（ＤＳＰＡ１）は最も鋭意研究された改変体であって、ヒトｔＰＡに対して＞７２％アミノ酸配列同一性を呈する。しかしながら、２つの重要な機能の差は明らかである。まず、ＤＳＰＡは、２つの鎖形態に切断されない一本鎖分子として存在する。第二に、ＤＳＰＡの触媒活性は、フィブリン補因子に依存するように見える。レスクパーゼ（Ｓａｒｕｐｌａｓｅ（登録商標），Ｇｒｕｎｅｎｔｈａｌ）、およびミクロプラスミン（プラスミノーゲンの切断産物）のようなウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターもまた本発明の種々の実施形態で用いられる。アルフィメプラーゼ（Ｎｕｖｅｌｏ）は、本発明で用いられるなお別のタンパク質分解増強剤である。アルフィメプラーゼは、南アメリカマムシ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ）の毒から最初に単離された公知の直接的にフィブリン分解性の亜鉛メタロプロテイナーゼである、フィブロラーゼの組換えにより生産された切断形態である（本明細書で参考として援用されるＴｏｏｍｂｓ  ＣＦ．（２００１）Ａｌｆｉｍｅｐｒａｓｅ：ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ．３１（３−６）：１４１−７）。これらの酵素はフィブリンを直接的に分解する。フィブロラーゼそれ自体もまた、本発明で用いられる。また、スタフィロキナーゼおよびストレプトドルナーゼも用いられる。
【０１１７】
本発明のいくつかの実施形態において、プラスミンまたはミニ−プラスミンは、ｔＰＡの代わりに、またはそれに加えて投与される。プラスミン様活性を有する種々の他の薬剤も用いることができる。一般に、そのような物質は、プラスミンに対する便宜にアッセイされた色原体基質である合成基質Ｓ−２２５１ＴＭ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）、および活性化されたプラスミノーゲンのような典型的なプラスミン基質を切断することができる。ｔＰＡ様活性を有する、例えば、プラスミノーゲンを切断することができ、それをｔＰＡと同様に活性化する他の薬剤も用いることができる。
【０１１８】
ルンブロキナーゼ（ｌｕｍｂｒｏｋｉｎａｓｅ）は、ミミズＬｕｍｂｒｉｃｕｓ  ｒｕｂｅｌｌｕｓに由来するフィブリン溶解性酵素または酵素の群である。例えば、ルンブロキナーゼをコードする遺伝子（ＰＩ２３９，ＧｅｎＢａｎｋアクセセション番号ＡＦ４３３６５０）のクローニングの報告参照（本明細書で参考として援用される、（Ｇｅら．，（２００５）Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ（ｌｕｍｂｒｏｋｉｎａｓｅ）ｆｒｏｍ  ｅａｒｔｈｗｏｒｍ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．２００５  Ｊｕｌ；４２（１）：２０−８）。ミミズから単離された他のフィブリン溶解プロテアーゼも用いられる（本明細書で参考として援用される、Ｃｈｏ，ＩＨ，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｘ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ  ｓｅｒｉｎｅ−ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｅａｒｔｈｗｏｒｍ  Ｌｕｍｂｒｉｃｕｓ  ｒｕｂｅｌｌｕｓ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００４  Ｍａｒ  ３１；３７（２）：１９９−２０５）。また、ナットウキナーゼも用いられる。
【０１１９】
種々の虫、昆虫および寄生生物から単離されている種々のフィブリン溶解酵素が用いられる。例えば、ヒルに存在する酵素であるデスタビラーゼはフィブリン架橋を加水分解する（その各々が本明細書に参考として援用される、Ｚａｖａｌｏｖａ，Ｌ．，（１９９６）  Ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｌｅｅｃｈ（Ｈｉｒｕｄｏ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｔｈａｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｃｌｅａｖｅ  ｅｎｄｏ−ｅｐｓｉｌｏｎ（ｇａｍｍａ−Ｇｌｕ）−Ｌｙｓ  ｉｓｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ  ａｎｄ  ｈｅｌｐ  ｔｏ  ｄｉｓｓｏｌｖｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｌｏｔｓ．Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．２５３（１−２）：２０−５；Ｚａｖａｌｏｖａ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ−ｆｉｂｒｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｂｌｏｏｄｓｕｃｋｅｒｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ）．６７（１）：１３５−４２）。
【０１２０】
本発明のいくつかの実施形態において、プラスミノーゲンがｔＰＡの代わりに、またはそれに加えて投与される。
【０１２１】
さらなるタンパク質分解剤、あるいはタンパク質分解を増強する薬剤はパパイン、パパーゼ、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、およびヒアルロニダーゼを含む。
【０１２２】
抗凝固剤または抗血栓形成活性を有する他の薬剤はヘパリン、ヒルジン、アンクロッド、ジクマロール、シンクマール、イロプロスト、Ｌ−アルギニン、ジピラミドール、および他の血小板機能インヒビター、ポリエチレンオキシドのようなポリエーテル等を含む。
【０１２３】
フリーラジカルスカベンジャーまたは抗酸化剤は、ビタミンＡ、ビタミンＥ、アロプリノール、スーパーオキシドジスムターゼ、ジメチルスルホキシド、カタラーゼ、トレメタジジン、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、メチレンブルー、ラザロイド、マンガン−デスフェロキサミンを含む。
【０１２４】
鎮痛剤は局所麻酔剤（例えば、ナトリウムチャネルブロッカー）、麻薬性薬剤のような中枢に作用する薬剤（例えば、モルフィンのようなオピエート）、非ステロイド性抗炎症剤、ピラゾロンおよびサリチル酸誘導体、パラセタモール（アセトアミノフェン）、トラマドール等を含む。通常は鎮痛剤と考えられていない薬物のいくつかの他のクラス、例えば、三環系抗鬱剤および特定の抗痙攣剤等は、神経障害疼痛を処置するのに用いられる。
【０１２５】
本発明の特定の実施形態において、生物学的に活性な薬剤は、ＲＮＡｉ干渉機構によって遺伝子発現を阻害するものである。ＲＮＡｉは、長さが典型的には約１７〜２９ヌクレオチド、例えば、長さが約１９〜２１ヌクレオチドの二本鎖部分、および所望により、１または２の一本鎖突出を含有する短い核酸によって誘発される内因性細胞配列−特異的遺伝子−サイレンシング機構であり、ここに、二本鎖部分の鎖の１つは標的遺伝子に対応し、それに対して相互的である（本明細書で参考として援用されるＳｈａｎｋａｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．ＪＡＭＡ．（２００５）２９３（１１）：１３６７−７３）。（本明細書中においては、ＲＮＡｉ薬剤といわれる）ＲＮＡｉによって遺伝子サイレンシングを引き起こすことができる薬剤は、短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、および細胞内で加工して、ｓｉＲＮＡを生成させることができる短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のような分子を含む。種々のＲＮＡｉ薬剤は、ｍＲＮＡの配列特異的分解を誘発することができ、あるいは翻訳を阻害することができる。１つの実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤は、そのうち１つが標的遺伝子に対して相補的である、２つの相補的な核酸鎖を含むｓｉＲＮＡであり、ここに、鎖は長さが約１９〜２３ヌクレオチドであり、各鎖は長さが１〜３ヌクレオチドの３’突出を含む。ＲＮＡｉ薬剤および標的遺伝子の間の、またはＲＮＡｉ薬剤における二重鎖の２つの部分の間の完全な相補性は要求されないが、但し、十分な相補性がハイブリダイゼーションが起こるのを可能とするために存在するものとすると認識されるであろう。典型的には、相補性の程度は少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１５の連続したヌクレオチドよりも多いであろう。特定の実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤は０、１、２または３のミスマッチを有する少なくとも１９ヌクレオチド長の二重鎖を含有し、ここに、鎖の１つは、０、１、２または３のミスマッチを有する少なくとも１９ヌクレオチド長の二重鎖を形成するように標的遺伝子とハイブリダイズする。内因的に合成されたＲＮＡｉ薬剤は典型的にはＲＮＡよりなるが、化学合成を用いて製造されたＲＮＡｉ薬剤は、ホスホジエステル結合によって連結されたリボヌクレオチドに加えて、またはその代わりに、１以上のデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ修飾された骨格構造等を含むことができると認識されるであろう。
【０１２６】
本発明はＲＮＡｉ薬剤を被験体に送達する新規な方法を提供し、該方法は第一および第二のヒドロゲル前駆体およびＲＮＡｉ薬剤を被験体に投与する工程を含み、ここに、ヒドロゲル前駆体は被験体への投与後に架橋されるようになって、ヒドロゲルを形成し、ヒドロゲルはＲＮＡｉ薬剤を封入する。本発明は、さらに、ＲＮＡｉ薬剤を含む組成物を提供する。組成物は、本明細書中に記載されたヒドロゲル前駆体を含有するヒドロゲルまたは溶液のいずれかである。ヒドロゲル組成物は、身体中の種々の位置のいずれか、例えば、腹骨盤腔、関節空間、中枢神経系または末梢神経系、またはその部分（例えば、脳、脊髄、末梢神経）へＲＮＡｉ薬剤を局所的に送達するのに用いられる。ＲＮＡｉ薬剤は、ゲルからの拡散によって、またはゲルが分解するにつれ、ヒドロゲルから放出される。
【０１２７】
任意のＲＮＡｉ薬剤も投与することができる。本発明の特定の実施形態において，ＲＮＡｉ薬剤は先に考察したクラスの任意の治療剤である。重要な実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤は癒着阻害効果を有する。例えば、ＲＮＡｉ薬剤は、脈管形成誘発性、炎症誘発性、またはフィブリン溶解誘発性のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を阻害することができる。
【０１２８】
生物学的に活性な薬剤は、典型的には、溶液が互いに接触するようになる前に、および／または溶液の投与の前に、１以上の溶液に加えられる。例えば、生物学的に活性な薬剤は、溶液を、溶液を投与するのに用いられるデバイスに充填する前に、第一のＨＡ誘導体を含有する溶液に加える。生物学的に活性な薬剤およびＨＡ誘導体は同時に、重複する時間間隔の間に、または連続的（１つの物質が第二の物質が加えられる前に溶解されることを意味する）に、液体媒体に溶解させることができる。溶液を混合するか、または撹拌して、薬剤の均一な分布を確実にすることができる。用いる生物学的に活性な薬剤の合計量は変化させることができる。例えば、第一または第二の溶液へそれを加えた後の薬剤の濃度は、１μｇ／ｍｌ〜１．０ｇ／ｍｌの範囲とすることができる。本発明の特定の実施形態において、濃度は１０μｇ／ｍｌと１００ｍｇ／ｍｌとの間、または１００μｇ／ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌとの間である。本発明の特定の実施形態において、第一または第二の溶液へそれを加えた後の薬剤の濃度は、０．１ｎＭと１０ｍＭとの間、例えば、１ｎＭと１ｍＭとの間、例えば、１０ｎＭと１００ｎＭとの間の範囲である。第一および第二の多糖誘導体の架橋の後に形成されたヒドロゲル中の生物学的に活性な薬剤の濃度は、溶液の各々中のその濃度、および用いる溶液の相対的容量に依存するであろう。ヒドロゲルの形成は生物学的に活性な薬剤を捕捉し、これは、拡散によって、および／またはヒドロゲル材料が体内中で分解するにつれて、ヒドロゲルからゆっくりと放出され得る。
【０１２９】
本発明の他の実施形態において、多糖誘導体、例えば、ＨＡ誘導体の１以上はそれに共有結合した生物学的に活性な薬剤を有する。いずれの広範な種々の方法を用いても、多糖誘導体および生物学的に活性な薬剤の間で共有結合を形成することができる。生物学的に活性な薬剤および多糖誘導体は、例えば、第一および第二のＨＡ誘導体の反応について上記のように、互いに反応することができる官能基を含むことができるか、または含むように修飾することができる。あるいは、ホモ二官能性架橋剤またはヘテロ二官能性架橋剤を用いることができる。結合体化および架橋のための一般的な方法は、ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍを有するウェブサイトで入手可能であり、かつＷｏｎｇ  ＳＳ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９１；およびＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９５において、１９９４−９５  Ｐｉｅｒｃｅカタログおよびそこに引用された文献において最初に公開された「ＣｒｏｓｓＬｉｎｋｉｎｇ」、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙに記載されている。例えば、本発明の特定の実施形態によると、二官能性架橋剤を用いて、生物学的に活性な薬剤を、ＨＡ誘導体、セルロース誘導体、またはデキストラン誘導体のような多糖誘導体にカップリングさせる。一般に、二官能性架橋剤は２つの反応性基を含有し、それにより、２つの標的基を共有結合により連結させる手段を提供する。化学架橋試薬における反応性基は、典型的には、スクシンイミジルエステル、マレイミド、ピリジルジスルヒドおよびヨードアセタミドのような種々のクラスに属する。特定の実施形態において、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはＤＣＩのような薬剤を用いて、引き続いての結合体化のためにエステルを活性化させる。
【０１３０】
あるいは、上記のように、生物学的に活性な薬剤上の官能基を、多糖誘導体上の官能基と直接的に反応させることができる。もし生物学的に活性な薬剤が適当な官能基を含有しないならば、そのような官能基を、当該分野で公知の種々の方法のいずれかを用いて加えることができる。例えば、もし生物学的に活性な薬剤がポリペプチドであれば、リジン残基または末端アミンを付加して、アミン基を提供することができる。あるいは、ポリペプチドは、システイン残基を含むように修飾し、それにより、スルフヒドリル基を提供することができる。
【０１３１】
好ましくは、生物学的に活性な薬剤の多糖誘導体への結合は、薬剤の生物学的活性を有用なレベル未満まで低下させず、あるいは第一および第二の多糖誘導体の架橋に有意に干渉しない。生物学的に活性な薬剤の結合のために、および２つの多糖誘導体の架橋反応のために、異なる官能基を使用するのが望ましいであろう。
【０１３２】
特に注目する実施形態において、デキサメタゾンまたは他のグルココルチコイドを、ＨＡ誘導体、セルロース誘導体またはデキストラン誘導体に結合体化させる。多糖誘導体は、非多糖ポリマー部分、例えば、ＰＥＧ部分を含有することができる。特に注目する別の実施形態において、デキサメタゾンをＨＡまたはＨＡ誘導体に結合体化させる。特に注目する別の実施形態において、デキサメタゾンをセルロースまたはセルロース誘導体に結合体化させる。特に注目する別の実施形態において、デキサメタゾンはデキストランまたはデキストラン誘導体に結合体化させる。
【０１３３】
特に注目する実施形態において、イブプロフェンまたは他のＮＳＡＩＤをＨＡ誘導体、セルロース誘導体またはデキストラン誘導体に結合体化させる。多糖誘導体は、非多糖ポリマー部分、例えば、ＰＥＧ部分を含有することができる。特に注目する別の実施形態において、ＮＳＡＩＤをＨＡまたはＨＡ誘導体に結合体化させる。特に注目する別の実施形態において、ＮＳＡＩＤをセルロースまたはセルロース誘導体に結合体化させる。特に注目する別の実施形態において、ＮＳＡＩＤをデキストランまたはデキストラン誘導体に結合体化させる。
【０１３４】
本発明の特定の実施形態において、治療剤を、生理学的条件下で加水分解的におよび／または酵素的に不安定である結合を介して多糖誘導体に共有結合させる。不安定な結合はエステル、アミド、アミドエステル、チオエステル、酸無水物、カルバミド、カルボネート、セミカルバゾン、ヒドラゾン、オキシム、イミノカルボネート、リン酸エステル、ホスファゼン、ウレタン、および無水物結合を含む。インビトロにて容易に切断される他の結合は、内因的または外因的に提供されるプロテアーゼによって認識され、切断される部位を含有するポリペプチドを含む。例示的なプロテアーゼはセリンプロテアーゼ、アルパルチルプロテアーゼ、酸プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ（例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ）、カルボキシペプチダーゼアミノペプチダーゼ、システインプロテアーゼ等を含む。これらのプロテアーゼについての切断部位は当該分野で公知である。
【０１３５】
本発明は、さらに、ヒドロゲル前駆体のうちの少なくとも１つが、非多糖ポリマー部分を含む多糖誘導体である組成物（生物学的に活性な薬剤を含むヒドロゲルおよび溶液）を提供する。非多糖ポリマー部分を含む多糖誘導体はセクションＩに記載されたもののいずれかであり得る。多糖誘導体は、典型的には、１以上の非多糖ポリマーに共有結合した多糖またはその誘導体を含む。
【０１３６】
なお他の実施形態において、本発明は、ヒドロゲルが２つの非多糖ポリマーを架橋することによって形成される、１以上の生物学的に活性な薬剤を含むヒドロゲルを提供する。非多糖ポリマーは、典型的には、多糖誘導体について上記のように溶液に溶解させ、ここに、溶液の一方または双方は生物学的に活性な薬剤を含有する。溶液は、例えば、それらを被験体に投与することによって互いに接触させる。非多糖ポリマーの各々は官能基を含み、ここに、該官能基は互いに反応して、共有結合を形成することができる。適当な官能基は、多糖誘導体の架橋について上記のものである。例示的な非多糖ポリマーは、架橋のために適当な官能基を含有するか、または含有するように修飾することができるセクションＩに記載されたものを含む。
【０１３７】
ＩＩＩ．多糖誘導体および粒子を含むハイブリッド組成物
本発明は、さらに、多糖誘導体および複数の粒子を含む組成物を提供する。例えば、本発明は、第一のＨＡ誘導体；および複数の粒子を含む組成物を提供する。多糖誘導体は第二の官能基とで共有結合を形成することができる官能基を含む。本発明の特定の実施形態において、組成物は液体媒体、例えば、水性媒体、第一の多糖誘導体、および複数の粒子を含む。粒子は媒体に懸濁させるか、または分散させることができる。本発明の特定の実施形態において、組成物は、そのいずれかまたは双方がＨＡ誘導体であってよい第一および第二の多糖誘導体を架橋することによって作製されたヒドロゲルである。例えば、ＨＡ誘導体を含み、そしてさらに、複数の粒子を含む第一の溶液を、第二の多糖誘導体を含む第二の溶液と接触させる。本発明の特定の実施形態において、第二の多糖誘導体は第二のＨＡ誘導体である。第一および第二のＨＡ誘導体は、官能基を介して互いに反応して、その間に共有結合架橋を形成し、したがって、その中に粒子を捉えたヒドロゲルを形成する。本発明の特定の実施形態において第二の多糖誘導体はセルロース誘導体である。本発明の特定の実施形態において、第二の多糖誘導体はデキストラン誘導体である。ＨＡ誘導体およびセルロースまたはデキストラン誘導体は官能基を介して互いに反応して、その間に共有結合架橋を形成し、したがって、その中に粒子を捕捉するヒドロゲルを形成する。本発明は、断じて、粒子を捕捉するヒドロゲルが形成された方法によって制限されないことに注意すべきである。
【０１３８】
特定の実施形態において、本発明は、ヒドロゲル前駆体および複数の粒子を含む組成物を提供し、ここに、ヒドロゲル前駆体は、例えば、生理学的条件下で第二のヒドロゲル前駆体との接触後に１秒間〜５分間以内にヒドロゲルを形成することができる。特に注目する実施形態において、ヒドロゲルは、被験体への投与の後、１秒間〜５分間の間、例えば、１秒間〜１分間の間、１秒間〜３０秒間の間、または１秒間〜１５秒間の間にヒドロゲルが形成される。本発明の特定の実施形態において、ヒドロゲル前駆体は非多糖ポリマー部分を含むか、あるいは非多糖ポリマーである。
【０１３９】
広範な種々の粒子のいずれも組成物に、例えば、多糖誘導体、例えば、ＨＡ誘導体、セルロース誘導体、またはデキストラン誘導体のようなヒドロゲル前駆体を含む液体媒体に取り込むことができ、よって、第一および第二のヒドロゲル前駆体（例えば、多糖誘導体または非多糖ポリマー）を架橋することによって作製されたヒドロゲルに取り込むことができる。粒子は、例えば、ポリマーマイクロ粒子またはポリマーナノ粒子あるいはリポソームであり得る。
【０１４０】
生分解性であり得る種々のポリマー、例えば、生体適合性ポリマーを用いて、粒子を作製することができる。ポリマーは、直鎖、分枝鎖または架橋されたホモポリマー（ブロックコポリマーを含めた）コポリマーであってよい。その多数が生分解性である適当な生体適合性ポリマーは、例えば、ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリカルボネート、ポリエステルアミド、ポリ（β−アミノエステル）、ポリ無水物、ポリ（アミド）、ポリ（アミノ酸）、ポリエチレングリコールおよびその誘導体、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリエーテルエステル、ポリ（ジオキサン）、ポリ（アルキレンアルキレート）、ポリエチレングリコールとポリオルトエステルとのコポリマー、生分解性ポリウレタンを含む。他のポリマーはポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレングリコール）、およびポリ（テトラメチレンオキシド）のようなポリ（エーテル）；メチル、エチル、他のアルキル、ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリル酸およびメタクリル酸のようなビニルポリマーポリ（アクリレート、およびポリ（メタクリレート）およびポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）およびポリ（酢酸エチル）のようなその他のもの；ポリ（ウレタン）；アルキル、ヒドロキシアルキル、エーテル、エステル、ニトロセルロース、および種々のセルロースアセテートのようなセルロースおよびその誘導体；ポリ（シロキサン）等を含む。他のポリマー物質は、多糖（例えば、アルギネートキトサン、アガロース、ヒアルロン酸）、ゼラチン、コラーゲン、および／または他のタンパク質のような天然に生じる物質、ならびにその混合物および／または修飾された形態に基づくものを含む。本明細書中に開示されたポリマーの任意の化学的誘導体または生物学的誘導体（例えば、当業者によって慣用的に作製される化学基、例えば、アルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、および他の修飾）も含まれる。さらに、これらのポリマーの任意のブロックコポリマーを含めた、ブレンド、グラフトポリマー、およびコポリマーを用いることができる。コポリマーは種々の比率の異なるサブユニットを含有することができる。例えば、モノマーＡおよびモノマーＢを含むコポリマーは、５％と９５％との間のモノマーＡ、および５％と９５％との間のモノマーＢを含有することができる（ここに、パーセンテージとはモノマーの数に基づいたパーセンテージをいい、合計して１００％である）。これらのポリマーの特定のものは重合するために適当な開始剤または架橋剤の使用を必要とするのは理解されるであろう。
【０１４１】
さらなる例示的なポリマーはカルボキシメチルセルロースのようなセルロース誘導体、ポリカルバメートまたはポリ尿素、架橋されたポリ（酢酸ビニル）等、エチレン−ビニルエステルコポリマー、エチレン−ビニルヘキサノエートコポリマー、エチレン−ビニルプロピオネートコポリマー、エチレン−ビニルブチレートコポリマー、エチレン−ビニルペンタノエートコポリマー、エチレン−ビニルトリメチルアセテートコポリマー、エチレン−ビニルジエチルアセテートコポリマー、エチレン−ビニル３−メチルブタノエートコポリマー、エチレン−ビニル３−３−ジメチルブタノエートコポリマー、およびエチレン−ビニルベンゾエートコポリマー、またはその混合物を含む。
【０１４２】
架橋およびモノマー濃度のような特徴は、粒子の分解の望まれる速度、および／またはその中に封入または捕捉されたか、あるいは表面に吸着された生物学的に活性な薬剤の放出を提供する用に選択することができる。
【０１４３】
本発明の特定の実施形態において、粒子は、それ自体、架橋された多糖誘導体、例えば、ＨＡ誘導体、デキストラン誘導体、および／またはセルロース誘導体よりなる。
【０１４４】
本発明で用いるマイクロ粒子とナノ粒子は、一定範囲の寸法を有することができる。一般には、マイクロ粒子は５００ミクロン以下、例えば、１ミクロンと５００ミクロンとの間、５０ミクロンと５００ミクロンとの間、１００ミクロンと２５０ミクロンとの間、２０ミクロンと５０ミクロンとの間、１ミクロンと２０ミクロンとの間、１ミクロンと１０ミクロンとの間等の直径を有し、ナノ粒子は１ミクロン未満、例えば、１０ｎｍと１００ｎｍとの間、１００ｎｍと２５０ｎｍとの間、１００ｎｍと５００ｎｍとの間、２５０ｎｍと５００ｎｍとの間、２５０ｎｍと７５０ｎｍとの間、５００ｎｍと７５０ｎｍとの間の直径を有する。上記方法のいずれかによって調製された粒子が所望の範囲の外側のサイズ範囲を有する場合、粒子は、例えば、ふるいを用いてサイズ分けすることができる。粒子はサイズ（例えば、直径）または形状が実質的に均一であっても、サイズおよび／または形状が不均一であってもよい。それらは実質的に球形であっても、他の形状、例えば、円筒、楕円、またはピラミッド−形状を有してもよく、その場合、関連寸法が直径よりもむしろ最も長い真っ直ぐな寸法であろう。
【０１４５】
ナノ粒子またはマイクロ粒子は、限定されるものではないが、噴霧乾燥、相分離、単一エマルジョンおよび二重エマルジョン、溶媒蒸発、溶媒抽出、ならびに単純コアセルベーションなおよび複雑コアセルベーションを含めた当該分野で知られたいずれの方法を用いて作製することもできる。粒状ポリマー組成物を、造粒、押出し、および／または球形化を用いて作製することもできる。本発明の特定の実施形態において、多層粒子を用いる。例えば、粒子はコア、および該コアを被覆する１以上の層を含有してもよい。コアおよび層は同一の材料または異なる材料を用いて作製してもよい。粒子を作製するための材料および方法は、文献中に、例えば、本明細書で参考として援用される米国特許第４，２７２，３９８号；本明細書で参考として援用される米国特許第６，４２８，８１５号およびその中の文献に記載されている。
【０１４６】
粒子を調製するのに用いる条件は、所望のサイズまたは特性（例えば、疎水性、親水性、外部形態、「粘着性」、形状）の粒子を生じるように改変してもよい。粒子を調製する方法、および用いる条件（例えば、溶媒、温度、濃度、気流速度等）は、治療剤および／またはポリマーマトリックスの組成に依存してもよい。
【０１４７】
本発明で用いるリポソームは、超音波処理、キレート透析、ホモゲナイゼーション、押出とカップリングさせた溶媒注入、凍結−解凍押出、ミクロ乳化ならびにその他のような種々の慣用的なリポソーム調製技術のいずれか１つを用いて調製することができる。これらの技術ならびにその他は、例えば、その各々が本明細書に参考として援用される、米国特許第４，７２８，５７８号、英国特許願Ｇ．Ｂ．２１９３０９５Ａ、米国特許第４，５３３，２５４号；同第４，７２８，５７５号；同第４，７３７，３２３号；同第４，７５３，７８８号；同第４，９３５，１７１号において考察されている。また、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｅｓ，Ｇ．（ｅｄ．），Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１−３，ＣＲＣ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９８４；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｅｓ，Ｇ．（ｅｄｄ．）Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆  Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，１９８８，１９８４；Ｌａｓｉｃ，Ｄ．Ｄ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｆｒｏｍ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｔｏ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９３；Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．＆Ｌａｓｅｃ，Ｄ．（ｅｄｓ．）Ｓｔｅａｌｔｈ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，ＣＲＣ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９５；Ｗｏｏｄｌｅ，Ｍ．Ｃ＆Ｓｔｏｒｍ，Ｇ．（ｅｄｓ．），Ｌｏｎｇ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｏｌｄ  Ｄｒｕｇｓ，Ｎｅｗ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，１９９７；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｖ．Ｐ．＆Ｗｅｉｓｓｉｇ  Ｖ．（ｅｄｓ．），Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２００３も参照されたし。
【０１４８】
本発明のリポソームを調製することにおいて利用することができる材料は、リポソーム構築において適当な当業者に知られた材料のいずれか、またはその組合せを含む。用いる脂質は天然または合成起源いずれかであってよい。そのような材料は、限定されるものではないが、コレステロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、リソ脂質（ｌｙｓｏｌｉｐｉｄ）、脂肪酸、スフィンゴミエリン、グリコスフィンゴ脂質、糖脂質、グリコリピド、スルファチド、アミド、エーテルおよびエステル−連結脂肪酸を持つ脂質、重合成脂質、およびその組合せのような脂質を含む。
【０１４９】
組成物は粒子の複数の集団を含有することができ、ここに、集団は異なる材料、または異なる比率の同一材料で作製され、および／またはサイズまたは形状のような特性が異なる。
【０１５０】
多糖誘導体、例えば、ＨＡ誘導体、セルロース誘導体、またはデキストラン誘導体を含有する溶液中の粒子の濃度、および多糖誘導体の重量に対する粒子の重量の比率は変化させることができる。例えば、多糖誘導体を含有する溶液は１００μｇ／ｍｌおよび１０ｇ／ｍｌの間の粒子、例えば、１ｍｇ／ｍｌおよび１．０ｇ／ｍｌの間、または１ｍｇ／ｍｌおよび１００ｍｇ／ｍｌの間の粒子を含有することができる。溶液中の多糖誘導体の重量に対する粒子の重量の比率は、例えば、１：１００〜１００：１で変化させることができる。例えば、比率は１：１０と１０：１との間、または１：５と５：１との間、または１：２と２：１との間、例えば、約１：１であり得る。
【０１５１】
本発明の特定の実施形態において、生物学的に活性な薬剤は粒子と物理的に結合しており、一方で、本発明の他の実施形態において、粒子はそれに結合した生物学的に活性な薬剤を有する。物理的な結合は共有結合、または非共有結合であり得る。結合は、特異的または非特異的であってよい。好ましくは、物理的結合は安定なままであるものであり、一方で、粒子は操作され、溶液中の多糖誘導体と合わされ、少なくとも組成物が被験体に投与されるまで安定なままであり、典型的には、その後可変で所望により制御可能な期間にわたって安定なままである。生物学的に活性な薬剤は、イオン相互作用、水素結合、疎水性相互作用等のような１以上の非共有結合相互作用機構を介して粒子と結合してもよい。例えば、１以上の薬剤を粒子内に捕捉し、包埋し、包み、または封入してもよい。粒子には薬剤を含浸させてもよく、そして／または薬剤は粒子の表面に吸着させてもよい。薬剤は拡散によって、または粒子が身体中で分解するにつれて、粒子から放出され得る。放出は数時間、数日間、数週間、数ヶ月間等にわたって起こり得る。
【０１５２】
粒子は上記の生物学的に活性な薬剤の任意の１以上、例えば、上記の治療剤のいずれかを含有することができる。本発明のいくつかの実施形態において、多糖誘導体を含有する溶液、あるいは第一および第二の多糖誘導体を架橋することによって形成されたヒドロゲルは粒子の少なくとも２つの区別される集団を含有する。集団は、多数のパラメーターのいずれかに関与して互いから区別され得る。例えば、粒子は、それが作製された材料、それらが含有する生物学的に活性な薬剤、それらの寸法等の点で異なってもよい。例えば、１つの実施形態において、第一の集団は第一の生物学的に活性な薬剤を含有する粒子を含むか、またはそれよりなり、そして第二の集団は、第二の生物学的に活性な薬剤を含有する粒子を含むか、またはそれよりなる群から選択される。本発明の特定の実施形態において、多糖誘導体のいずれかまたは双方はＨＡ誘導体である。本発明の特定の実施形態において、第一の溶液は第一のＨＡ誘導体および第一の粒子の集団を含有し、第二の溶液は第二のＨＡ誘導体および第二の粒子の集団を含有する。第一および第二のＨＡ誘導体の架橋の結果、第一および第二の粒子の集団を含有するヒドロゲルの形成がもたらされる。本発明の特定の実施形態において、第一の溶液はＨＡ誘導体および第一の粒子の集団を含有し、第二の溶液はセルロース誘導体および第二の粒子の集団を含有する。本発明の特定の実施形態において第一の溶液はＨＡ誘導体、および第一の粒子の集団を含有し、第二の溶液はデキストラン誘導体および第二の粒子の集団を含有する。ＨＡ誘導体およびセルロースまたはデキストラン誘導体の架橋の結果、第一および第二の粒子の集団を含有するヒドロゲルの形成がもたらされる。これらの実施形態のいずれかにおいて、第一および第二の溶液中の第一および第二の粒子の集団の濃度は、ヒドロゲル中の所望の最終粒子濃度を達成するように選択することができる。本発明のいくつかの実施形態において、全部ではないが粒子のいくつかは生物学的に活性な薬剤を含む。もちろん、溶液の各々は１を超える粒子の区別される集団、例えば、２、３、４以上の粒子の区別される集団を含有することができる。
【０１５３】
当業者に明らかなように、生物学的に活性な薬剤はそれらの形成の間、またはその後に粒子に負荷することができる。生物学的に活性な薬剤はポリマーマトリックスによって捕捉するか、包埋するか、または封入することができ、あるいはリポソームの水性コアに包むことができ、そして／または粒子の表面を被覆することができる。生物学的に活性な薬剤の粒子はポリマーマトリックスを通じて分散させることができる。生物学的に活性な薬剤は、好ましくは、粒子の約０．０１重量％と９０重量％との間、例えば、粒子の約１重量％〜約８０重量％、または約１０重量％〜約７０重量％を構成する。特定の実施形態において、生物学的に活性な薬剤は粒子の約１０重量％〜２０重量％または約３０重量％〜５０重量％を含む。当業者であれば、適当なポリマーおよび製造の方法を選択することにおいて、生物学的に活性な薬剤の安定性と適合する材料および方法を選択するのが重要であることを理解するであろう。例えば、生物活性の喪失をもたらし得る薬剤の実質的な分解または変性をもたらすようである加工温度を回避するのが望ましいであろう。また、所望の期間にわたって薬剤が十分な量で放出されることを確実とするように組成物を試験するのが望ましいであろう。
【０１５４】
本発明の特定の実施形態において、生物学的に活性な薬剤は粒子の成分に、例えば、ポリマーまたは脂質成分に共有結合させる。そのような共有結合を形成するための種々の方法のいずれかを用いることができる。生物学的に活性な薬剤はポリマーまたは脂質上の官能基と反応することができる官能基を含むことができる。ポリマーもしくは脂質のいずれか、生物学的に活性な薬剤、またはその双方を修飾して、適当な官能基を含めてもよい。あるいは、架橋剤を用いることができる。関連方法は、生物学的に活性な薬剤を多糖誘導体に共有結合させるための上記のものと同様である。好ましくは、結合が薬剤の生物学的活性を有用なレベル未満まで低下させず、あるいは粒子形成に干渉しない。本発明の特定の実施形態において、生物学的に活性な薬剤は、生理学的条件下で加水分解的におよび／または酵素的に不安定である結合を介して粒子のポリマーまたは脂質成分に共有結合させる。結合の切断は生物学的に活性な薬剤の粒子から放出させるか、またはその放出を容易とする。
【０１５５】
本発明の特定の実施形態において、粒子は、１以上の生物学的に活性な薬剤に加えて、１以上のさらなる薬剤、例えば、賦形剤、緩衝液、球形化剤、充填剤、界面活性剤、崩壊剤、結合剤、可塑剤、またはコーティングを含有する。さらなる薬剤は有意な生物学的効果をそれ自体が有しなくてもよいが、生物学的に活性な薬剤の生物学的効果を変調してもよい。例示的な材料は本明細書で参考として援用される米国特許第５，８４６，５６５号に記載されている。適当な薬剤は、例えば、炭水化物、アミノ酸、脂肪酸、界面活性剤、塩、金属イオン、および増量剤を含み、これらが当業者に知られている。用いる賦形剤の量は、重量ベースで、生物学的に活性な薬剤に対する賦形剤の比率に基づくことができる。アミノ酸、脂肪酸、塩、および炭水化物（例えば、スクロース、ラクトース、マンニトール、デキストランおよびヘパリン）については、生物学的に活性な薬剤に対する炭水化物の比率は、本発明の特定の実施形態においては、約１：１０および約２０：１の間である。界面活性剤については、生物学的に活性な薬剤に対する界面活性剤の比率は、本発明の特定の実施形態においては約１：１０００および約１：２０の間である。
【０１５６】
特定の実施形態において、さらなる薬剤は、本明細書中においては、「放出変調剤」という、粒子からの生物学的に活性な薬剤の放出特性を改変するものである。生物学的に活性な薬剤および放出変調剤を含有する粒子からの生物学的に活性な薬剤の放出の動態は、放出変調剤を含有しないか、そうでなければ同一の粒子からの生物学的に活性な薬剤の放出の動態とは異なる。動態は多数の方法の内いずれかで改変することができる。例えば、放出変調剤は放出を遅延させるか、または放出を増大させることができる。放出の速度は、放出が起こる期間の部分または全ての間に増大するか、または減少させることができる。例えば、放出変調剤の存在は、生物学的に活性な薬剤の有意な割合が粒子と液体との接触の後に短時間内に放出される初期「バースト」効果を低下させるか、または妨げることができる。ある粒子は、液体との接触後の所望の期間内にそれらのペイロードのかなりの割合を放出するが、後の時点においてさらなる薬剤の放出を継続しなくてもよい。放出変調剤は、粒子から放出されるべき生物学的に活性な薬剤の指定されたパーセンテージに必要な時間を変化させることができる。例えば、放出変調剤は、放出すべき生物学的に活性な薬剤の１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、または実質的に全ての放出に必要な時間を増大させるか、または減少させることができる。例えば、該時間は０．１倍と１０倍との間のファクターだけ増加させるか、または減少させることができる。例示的な放出変調剤は疎水性物質、例えば、ポロキサマーのような疎水性界面活性剤を含む。他の例示的な放出変調剤がリン脂質、コレステロール、ポリメタクリレート、糖、タンパク質、Ｅｕｄａｇｒｉｔ  Ｅ−１００および関連化合物のようなアクリレートブロックコポリマー、および亜鉛である。放出変調剤は、ポリマーマトリックス中の細孔を形成するか、またはそれを充填するものであってよい。
【０１５７】
本発明は、さらに、（ａ）１以上の架橋された多糖誘導体（例えば、ＨＡ誘導体）を含むマイクロ粒子；および（ｂ）複数のナノ粒子を含む組成物を提供する。マイクロ粒子は媒体中に懸濁させることができ、身体中の位置に、例えば、腹膜に直接的に適用することができる。ナノ粒子は生物学的に活性な薬剤を含有することができる。したがって、組成物は架橋された多糖誘導体よりなるマイクロ粒子を含み、ここに、マイクロ粒子はナノ粒子を封入する。本発明の１つの実施形態において、１以上のＨＡ誘導体を含むマイクロ粒子は、油および乳化剤を含む連続相中の第一のＨＡ誘導体、生物学的に活性な薬剤、および第二のＨＡ誘導体の溶液を連続的に加え、それをホモゲナイズすることによって調製される。ホモゲナイゼーションは１０００〜９０００ｒｐｍにて１〜２０分間行う。次いで、エマルジョンを４０〜５０℃にて一晩撹拌して、水を分散した相から蒸発させる。マイクロ粒子をイソプロピルアルコールで３〜６回洗浄し、続いて、残存するイソプロピルアルコールを蒸発させる。生物学的に活性な薬剤はミクロ封入の前にナノ粒子中に予め封入することができる。ナオ粒子はポリマーまたはナノ粒子リポソームであり得る。
【０１５８】
本発明の別の実施形態において、マイクロ粒子は、ＨＡ誘導体、生物学的に活性な薬剤、および放出変調剤を噴霧乾燥することによって調製することができる。
【０１５９】
本発明は、さらに、ヒドロゲル前駆体のうちの少なくとも１つが、非多糖ポリマー部分を含む多糖誘導体である組成物（ヒドロゲル前駆体および複数の粒子を含むヒドロゲルおよび溶液）を提供する。非多糖ポリマー部分を含む多糖誘導体はセクションＩに記載されたもののいずれかであり得る。多糖誘導体は、典型的には、１以上の非多糖ポリマーに共有結合した多糖またはその誘導体を含む。粒子は上記の粒子のいずれかであり得る。
【０１６０】
なお他の実施形態において、本発明は複数の粒子を含むヒドロゲルを提供し、ここに、ヒドロゲルは２つの非多糖ポリマーを架橋することによって形成される。非多糖ポリマーは、典型的には、多糖誘導体について上記のように溶液に溶解させ、ここに、溶液の一方または双方は粒子を含有する。溶液は、例えば、それらを被験体に投与することによって互いに接触させる。非多糖ポリマーの各々は官能基を含み、ここに、官能基は互いと反応して共有結合を形成することができる。適当な官能基は、多糖誘導体の架橋について上記のものである。例示的な非多糖ポリマーは、架橋のために適当な官能基を含有するか、または含有するように修飾することができるセクションＩに記載されたものを含む。粒子は上記の粒子のいずれでもあり得る。
【０１６１】
上記の実施形態のいずれにおいても、粒子はヒドロゲル前駆体を含有する溶液中に提供することができ、あるいは別々の溶液中にて、または乾燥形態にて提供することができる。
【０１６２】
ＩＶ．適用
本発明の組成物および方法は、限定されるものではないが、癒着の予防および治療、および治療剤の投与を含めた多数の用途を有する。これらの適用のいずれについても、ヒドロゲル前駆体、例えば、多糖誘導体は、投与の前に、乾燥形態で提供することができ、（例えば、凍結乾燥することができ）、適当な液体媒体、例えば、水または生理食塩水に溶解させることができる。あるいは、ヒドロゲル前駆体（例えば、多糖誘導体）は溶液中にて提供することができる。生物学的に活性な薬剤および／または（所望により、１以上の生物学的に活性な薬剤を含んでもよい）粒子を、投与の前に、適用に応じて、種々の量で乾燥ポリマーまたは溶液に加えることができる。あるいは、多糖誘導体、および生物学的に活性な薬剤または粒子を含む組成物は乾燥形態で提供することができ、続いて、液体媒体に加えることができる。
【０１６３】
Ａ．投与の態様
上記のように、本発明は、被験体の身体中の位置にヒドロゲル前駆体を投与する工程を含む種々の方法を提供し、ここに、ヒドロゲル前駆体は架橋されるようになって、投与の後にヒドロゲルを形成する。ヒドロゲル前駆体は、典型的には、溶液で投与される。溶液は、種々の方法のいずれかで投与することができる。例えば、複数バレル注入デバイス（例えば、複数バレルシリンジ、デュアルバルブアプリケーター）を用いて、多数の溶液を所望の位置へ実質的に同時に送達することができる。本発明の特定の実施形態において、デバイスは、多数の溶液を一時的に噴射させ、混合が投与の前に起こり得るチャンバーを含む。本発明は、身体中で互いに接触する別個の溶液中のヒドロゲル前駆体を投与する工程を含む。本発明は、２以上の溶液を実質的に同時に投与する工程を含む。２つの溶液は投与の間に互いに接触させることができる。また、本発明は、多数の溶液から形成される単一溶液を投与することによって、各々がヒドロゲル前駆体を含む多数の溶液を投与する工程を含む。溶液は、典型的には、投与の間に殆どかまたは全く架橋が起こらず、かつ組成物が流体状態のままであるように、投与の直前に合わせられる。例えば、（ａ）第一の多糖誘導体を含む第一のヒドロゲル前駆体を被験体の身体内の位置に投与し、（ｂ）第二の多糖誘導体または非多糖ポリマーを含む第二のヒドロゲル前駆体を該被験体の体内の位置に投与する工程を含む癒着を阻害する方法において、本発明は、ヒドロゲル前駆体は溶液に溶解され、それは投与の直前に互いと接触され、そして／または互いと混合される実施形態を含む。また、本発明は、ヒドロゲル前駆体が別個の溶液に溶解され、それは、約１〜６０秒、例えば、１〜３０秒にわたり、５〜２０秒にわたり、約１０秒の１以上の分離または連続した時間にわたって実質的に同時に投与される実施形態も含む。また、本発明は、ヒドロゲル前駆体が別々の溶液中で投与され、それは投与後に互いに接触される実施形態も含む。溶液は、複数バレル注入デバイスのバレルからそれらを押出すことによるような種々の方法によって実質的に同時に投与することができる。３以上の組成物が投与される本発明の実施形態において、組成物のいずれか２以上は実質的に同時に投与することができる。組成物は、単一の時間にわたってか、またはその各々が別個の投与であると考えることができる多数の分離した時間にわたって投与することができる。多数の区別される時間は数分間、数時間等にわたって行うことができる。例えば、汎腹膜投与または複雑な脊髄または頭蓋骨外科的処置は数時間の時間にわたる多数の分離した投与を含むことができる。
【０１６４】
図１３は、溶液を投与するのに用いる例示的なデバイスを示す。図１４は、４つまでの異なる成分、例えば、４つの異なる溶液を投与するのに有用な複数チャネルデバイスを示す。溶液のいくつかはヒドロゲル前駆体、例えば、多糖誘導体を含有し、一方で、他の溶液はヒドロゲル前駆体を含有する必要はない。例えば、溶液のいくつかは粒子を含有することができる。あるいは、粒子は液体の非存在下においてデバイスのチャネルに負荷され、投与の間に溶液と混合され得る。図１５は、噴霧器またはアトマイザーのような液滴形成デバイスに装着された二重バレルデバイスを示す。図面の右側の部分は、デバイスの部分の拡大である。そのようなデバイスは、例えば、汎腹膜適用のために、組成物を比較的大きな面積に迅速に投与するのに特に用いることができる。
【０１６５】
あるいは、個々の注射デバイス（シリンジ、カテーテル、カニューレ等）を用いることができるが、溶液がその後間もなく投与されるので、それらが互いに接触することを可能とするように注意を払うものとする。内視鏡、例えば、腹腔鏡、関節鏡を用いることができる。例えば、複数チャネルを有するスコープが適当である。１つの実施形態において、二重注入腹腔鏡または関節鏡を用いる。１つの実施形態において、組成物は画像化の指針、例えば、蛍光測定の指針下で適用される。別の実施形態において、第一および第二の溶液は、容器中で単純に混合することができ、次いで、所望の位置に注ぎ、噴霧するか、または噴出させることができる。溶液を混合器具で混合することができるか、または広げる機器、例えば、スパチュラー様機器で投与後に広げることができる。
【０１６６】
本発明の特定の実施形態において、ヒドロゲル前駆体、例えば、ＨＡ誘導体のような多糖誘導体を含む溶液は検出可能な物質を含む。物質は視覚的に検出可能とすることができ、例えば、染料または着色剤であり、あるいは別の手段によって検出することができる（例えば、物質は放射性であってよい）。好ましくは、検出可能な物質は、（その作用機構が正常ならびに望ましくない細胞に対する毒性を含む抗増殖または抗新形成剤のような物質であるのでなければ）身体に対して有害ではない。検出可能な物質の存在は、組成物を個々に投与することが、投与された物質をより容易に同定することを可能とし、従って、投与をガイドするのに用いられる。特定の検出可能な物質を用いて、それらを投与して、例えば、それらの分解をモニターした後に多糖誘導体を追跡することができる。
【０１６７】
Ｂ．癒着の予防および処置
本発明の組成物を投与して、広範な種々の外科的処置の型の任意の関係で癒着を処置または予防することができる。本発明の組成物および方法が用いられる外科的手法の非限定的例は、腹骨盤、眼科、整形外科、胃腸、喉、頭蓋骨、頭頚部、心血管、婦人科医学、関節（例えば、関節鏡）、泌尿器、形成、復元、筋肉骨格、および神経筋肉外科処置を含む。特定の腹部手法は、例えば、１以上の腹骨盤器官またはその部分を除去するか、または修復するための外科的処置を含む。その例は胃、腸（例えば、十二指腸、空腸、回腸、結腸、直腸）、盲腸、膀胱、胆嚢、肝臓、腎臓、膀胱、尿道、および前立腺に対する外科的処置を含む。また、腹骨盤外科的処置はヘルニア修復、動脈瘤修復、および腹膜癒着の溶解を含む。婦人科医学手法は、例えば、卵巣、ファロビウス管および繊毛に接着した癒着を持つ卵管疾患による不妊症を処置するための外科的処置を含む。そのような外科的処置は卵管開口術、卵管剥離術および卵巣摘出を含む。婦人科医学外科的処置は卵巣摘出、子宮摘出、子宮内膜症の除去、デノボ癒着形成の予防、異所性妊娠の治療、子宮または基底部の筋腫摘出を含む。さらなる外科的処置は失禁または膣器官脱出を処置するための外科的処置を含む。産科の外科的処置は帝王切開を含む。筋肉骨格外科的処置は腰静脈ラミネクトミー、腰静脈椎間板切除、屈筋腱外科的処置、脊髄融合、および関節置換または修復を含む。神経筋肉外科的処置は神経を修復し、神経を切除するか、または捕捉された神経を遊離させるために行われるものを含む。胸骨切開を含む喉外科的処置の結果、心臓または大動脈、および喉腔の上皮層内張りの間の癒着形成がもたらされかねない。喉外科的処置は食道に対する外科的処置、肺外科的処置（例えば、肺減少（ｌｕｎｇ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）または腫瘍の除去）、バイパス外科的処置、動脈瘤修復、および心臓弁置換を含む。また、外科的処置は除細動器のような種々の補綴デバイスまたは移植デバイスのいずれかを移植するために行われるものを含む。頭蓋骨外科的処置手法は腫瘍、癲癇のための外科的処置を含み、１を超える手法を必要とする。これらの手法は、しばしば、頭蓋骨、髄膜および／または皮質に関連する癒着をもたらす。目外科的処置は斜視についての外科的処置、緑内障濾過外科的処置および涙腺排出系手法を含む。
【０１６８】
したがって、本発明の特定の実施形態において、組成物を投与して、腹膜癒着を処置または予防する。本発明の他の実施形態において、組成物を投与して、胸膜癒着、例えば、肺の葉の間の、および／または内臓および壁側胸膜の間の線維状癒着を処置または予防する。本発明の他の実施形態において、組成物を投与して、心臓心膜（例えば、心外膜、内臓または壁側心臓心膜、線維状心臓心膜）に関連する癒着を処置または予防する。本発明のなお他の実施形態において、組成物を投与して、硬膜外癒着（硬膜外空間における、硬膜に関与する癒着）を処置または予防する。
【０１６９】
典型的には、組成物は、最初の切開が行われた時点、および外科的閉合が完了したか、または最後の内視鏡機器を被験体の身体から引き抜いた時点の間の、いずれか遅く起こるいくつかの時点に投与される。組成物は、十全には癒着を発症していなかった被験体に投与することができるか、または癒着を発症した被験体に投与することができる。１つの実施形態において、組成物は、予め存在する癒着を低下させるための手法を受けている被験体に投与される。例えば、手法は、予め存在する癒着の機械的もしくは化学的溶解または破壊、続いて、癒着の再発を予防するための本発明の組成物の適用を含むことができる。
【０１７０】
被験体へ投与される組成物の合計容量は、種々の因子、主として、ヒドロゲル層によって被覆することを意図した面積、所望のヒドロゲルの厚さ、投与の部位、および組成物が治療剤を含むか否かに基づいて変化させることができる。例示的な用量は０．１ｍｌと５００ｍｌとの間、例えば、０．５ｍｌと１０００ｍｌとの間、１ｍｌと５００ｍｌとの間、１０ｍｌと１００ｍｌとの間の範囲であり、これらの容量は近似値であって、全ての下位範囲が含まれることが理解される。
【０１７１】
投与される物質、またはそれから形成されるヒドロゲルは損傷の部位、例えば、外科的切開または傷害の部位を被覆するように、または上皮の部分、例えば、損傷の部位と反対に位置する腹膜、胸膜、硬膜を被覆するように、組成物を投与することができる。被覆される領域は損傷の部位から、または損傷の部位から反対に位置する組織に位置する領域から可変な距離だけ外側を囲い、そこまで伸びることができる。例えば、被覆される領域は、約１、２、３、４、５ｃｍ以上までの平均距離だけ損傷の部位から外側に伸びることができる。投与された物質、またはそれから形成されるヒドロゲルによって被覆される合計面積は、約０．１ｃｍ２腹膜のほぼ全面積まで、例えば、約１．５〜２．０ｍ２までの範囲とすることができる。例えば、被覆される合計面積は約１．０ｃｍ２〜約１．０ｍ２まで、例えば、約５．０ｃｍ２〜約０．５ｍ２までの範囲とすることができる。組成物を、連続領域に、または被覆されない領域によって分類された多数の区別される領域に適用することができる。
【０１７２】
粒子を含む組成物の場合には、送達されない粒子の容量および重量もまた変化することができ、投与される溶液の合計容量および溶液中の粒子の濃度に依存するであろう。これらのパラメーターを調整して、所望の合計粒子容量または合計粒子重量を送達することができる。本発明の特定の実施形態において、粒子は０．１ｍｇ／ｋｇと２ｇ／ｋｇとの間の量にて被験体に投与される。例示的な量は１ｍｇ／ｋｇと１０００ｍｇ／ｋｇとの間、例えば、５ｍｇ／ｋｇと７００ｍｇ／ｋｇとの間の範囲である。送達される粒子の量は、被験体の体重に基づく必要はないが、その代わり、絶対量換算で表すことができる。例示的な量は、０．１ｍｇと５００ｇとの間、例えば、１ｍｇと１００ｇとの間、または１０ｍｇと１ｇとの間の範囲である。
【０１７３】
Ｃ．薬物送達
上記のように形成された任意のヒドロゲルが（所望により、粒子に物理的に結合した）治療剤を含有する組成物は、広範な種々の疾患、障害および状態の処置目的、または予防目的で用いることができる。本発明の特定の実施形態において、ヒドロゲルは治療剤の維持放出を提供する。ヒドロゲル前駆体および薬剤の単回投与は、もし同一量の薬剤をヒドロゲル前駆体の非存在下で投与したならば、および／またはヒドロゲル系の使用が過度な副作用を引き起こすことなくより大きな合計用量が投与されるのを可能とするならば結果として起こる限り、少なくとも２、３、５、１０、２０倍、またはそれ以上の期間にわたって薬剤の有効な濃度を提供することができる。本発明の特定の実施形態において、放出の速度は、ヒドロゲルおよび／または粒子が分解する速度を制御することによって制御される。本発明は、したがって、溶液中のヒドロゲル前駆体および治療剤を含む組成物を提供し、ここに、ヒドロゲル前駆体は本明細書中に記載されたヒドロゲル前駆体のいずれかであり、本明細書中に記載された濃度範囲のいずれかにおいて提供される。
【０１７４】
組成物は、限定されるものではないが、癒着を阻害する関係で先に考察した位置を含めた被験体の身体内の任意の位置に投与することができる。例えば、組成物は、主として、腹骨盤腔内の発現を伴う疾患または障害を処置するために、または全身病を処置するために腹膜に投与することができる。腹膜薬物送達は、少なくとも部分的には、薬剤の吸収で利用できる腹膜の大きな表面積のため、全身疾患の処置のための種々の治療剤についての魅力的な選択肢である。本発明の特定の実施形態において、抗感染剤を含む組成物を用いて、感染を処置するか、あるいは予防的には、例えば、外科的処置後の感染の可能性を低下させる。腸壁が損なわれ得る外科的手法を受ける患者は感染、例えば、腹膜炎の特別な危険性がある。１つの実施形態において、組成物は、腹外科的処置の間に、またはその後に、被験体の腹骨盤腔に投与される。組成物は、腹骨盤腔内のどこかに、直接的に１以上の腹部器官および／または隣接組織に、または腹器官のほぼ反対に位置する壁側腹膜に投与して、ヒドロゲルを形成することができ、これは器官を被覆する内臓腹膜を壁側腹膜から分離する。組成物は、延長された局所的腹膜投与を用いて、または汎腹膜投与することができる。
【０１７５】
別の実施形態において、本発明の組成物を用いて、抗新形成剤を投与する。抗新形成剤を投与して、腹骨盤腔中に位置する腫瘍、例えば、腹または骨盤器官の腫瘍を処置することができる。１つの実施形態において、組成物は、外科的処置の前、その間、またはその後に被験体に投与して、腹骨盤腔に位置する腫瘍を除去する。組成物は汎腹膜投与することができる。任意の理論に拘束されることを望まないが、本発明の組成物の投与は転移の発生を低下させることができ、そして／または腫瘍の腹膜シーディングを阻害することができる。別の実施形態において、本発明の組成物は、腹骨盤腔中の腫瘍に罹患している被験体に投与される。組成物は抗新形成剤の維持放出を提供する。例えば、薬剤は、少なくとも１、２、３、４、６または８週間以上の間にわたって放出することができる。組成物は、腫瘍が位置する器官に適用することができ、あるいはより広く適用することができる。したがって、本発明は、本発明の組成物を被験体に投与する工程を含む、腫瘍に罹患したか、または腫瘍を発症する危険性がある被験体を処置する方法を提供し、ここに、組成物は抗新形成剤を含む。少なくとも１つのヒドロゲル前駆体、例えば、本明細書中に記載されたＨＡ誘導体のような多糖誘導体を含む組成物のいずれかを使用することができ、ここに、少なくとも１つのヒドロゲル前駆体は架橋するようになって、被験体への投与後にヒドロゲルを形成する。治療剤は本明細書中に記載された型の任意の粒子に物理的に結合させることができる。腫瘍は腹骨盤腔に位置し得る。
【０１７６】
なお別の実施形態において、本発明の組成物を用いて、治療剤を被験体の関節に投与する。被験体は、例えば、関節炎に罹患し得る。関節の空間への投与に適した例示的な治療剤は、抗炎症剤および鎮痛剤を含む。したがって、本発明は、本発明の組成物を関節に投与する工程を含む関節を冒す疾患または状態に罹患しているか、またはそれを発症する危険性がある被験体を処置する方法を提供し、ここに、組成物は疾患を処置または予防するのに選択する治療剤を含む。組成物は、例えば、滑液腔に注入することができる。本明細書中に記載された少なくとも１つのヒドロゲル前駆体を含む組成物のいずれかを使用することができ、ここに、少なくとも１つのヒドロゲル前駆体は別のヒドロゲル前駆体と架橋するようになって、被験体への投与後にヒドロゲルを形成する。治療剤は、本明細書中に記載された型の任意の粒子と物理的に結合することができる。
【０１７７】
組成物は、種々の経路、例えば、皮内、皮下、筋肉内等のいずれかを用いて投与することができる。任意の体の組織を、１以上のヒドロゲル前駆体、例えば、多糖誘導体および複数の粒子を含む組成物のためのデポーとして用いることができ、ここに、ヒドロゲル前駆体は架橋するようになって、投与後にヒドロゲルを形成する。
【０１７８】
Ｄ．迅速なヒドロゲル形成
上記のように、本発明の１つの態様は、ヒドロゲル前駆体を迅速に架橋して、インサイチュにてヒドロゲルを形成することによって提供される利点、およびそれによって迅速なインサイチュヒドロゲル形成を達成する適当な組成物および方法の開発の認識である。本発明の実施形態のいずれかを、ヒドロゲル前駆体の互いの接触後の１〜５秒と６０秒との間、１〜５秒と３０秒との間、１〜１５秒と２０秒との間、または１〜５秒と１０秒との間内にヒドロゲルを形成するヒドロゲル前駆体を含有する組成物で実施することができる。本発明の実施形態のいずれかを、ヒドロゲル前駆体を含有する溶液の互いの接触後の１〜５秒と６０秒との間、１〜５秒と３０秒との間、１〜１５秒と２０秒との間、または１〜５秒と１０秒との間内にヒドロゲルを形成するヒドロゲル前駆体を含有する組成物で実施することができる。本発明の任意の実施形態、ヒドロゲル前駆体の被験体への投与後に１〜５秒と６０秒との間、１〜５秒と３０秒との間、１〜１５秒と２０秒との間、または１〜５秒と１０秒との間内にヒドロゲルを形成するヒドロゲル前駆体を含有する組成物で実施することができる。
【０１７９】
Ｖ．パッケージまたはキット
本発明は、容器中に本明細書中に記載された１以上の組成物を含むパッケージまたはキットを提供する。例えば、容器は乾燥（例えば、凍結乾燥）形態の、または溶液中にＨＡ誘導体を含むことができる。もしＨＡ誘導体が乾燥形態で提供されるならば、製品パッケージは適当な溶媒または希釈剤、例えば、注射用滅菌水を含む容器を含むことができる。パッケージは、典型的には、医療機器、医薬および／または生物製剤の製造、使用または販売を規制する政府当局によって規定された形態にて容器に付随した注意書きを含むことができ、それにより、注意書きは、癒着疾患を処置するためにヒト投与または動物投与について、または（例えば、外科的処置後感染の予防または処置として）癒着を処置することに加えて、またはその代わりに、１以上の適応症につき、組成物の当局による認可を反映する。薬剤または組成物の使用のための指示書を含めることもできる。そのような指示書はＨＡ溶液の再構成、それへの粒子の付加、送達デバイスの充填、適当な量および投与の態様等に関連する情報を含むことができる。
【０１８０】
本発明の特定の実施形態において、パッケージは、各々が、乾燥形態または溶液中のＨＡ誘導体を含有する複数の個々の容器を含有するであろう。例えば、第一の容器は第一のＨＡ誘導体を含有し、第二の容器は第二のＨＡ誘導体を含有する。第一および第二のＨＡ誘導体は、溶液中にて互いに接触させた場合に、それらが所望の特徴を有するヒドロゲルを形成するように所定量で提供することができる。パッケージは、投与の前に、ＨＡ誘導体と合わせるべき生物学的に活性な薬剤を含有する１以上の容器を含むことができる。
【０１８１】
特定の実施形態において、パッケージは、セルロースまたはデキストラン誘導体のような他の多糖誘導体を含有する。特定の実施形態において、パッケージは、所望のヒドロゲルを形成することにおいて用いるＨＡ誘導体、セルロース誘導体、および／またはデキストラン誘導体の組合せを含む。パッケージは、合成ポリマーのような他のポリマーも含むことができる。パッケージは、タンパク質を含むこともできる。
【０１８２】
医薬パッケージは、多糖誘導体、例えば、ＨＡ誘導体、セルロース誘導体またはデキストラン誘導体と共に溶液に含めるべき粒子を含有するレセプタクルを含むことができる。あるいは、レセプタクルは、例えば、所定の比率で誘導体および粒子を含有することができる。粒子は生物学的に活性な薬剤を含有することができる。
【０１８３】
複数の容器を、比較的密接に封じ込めるのに、単一のより大きな容器、例えば、プラスチックまたは発泡スチロールの箱で提供することができる。
【０１８４】
パッケージは多糖誘導体、例えば、ＨＡ誘導体、セルロース誘導体またはデキストラン誘導体を含有する溶液の調製のためのデバイスまたはレセプタクルを含むことができる。デバイスは、例えば、測定または混合デバイスであってよい。
【０１８５】
パッケージは本発明の組成物を投与するためのデバイスを含むことができる。例示的なデバイスはシリンジ、例えば、複数バレルシリンジ、カテーテル、内視鏡、関節鏡、腹腔鏡を含む。内視鏡、関節鏡または腹腔鏡は、複数の個々の溶液の投与を可能とするための多数のチャネルを有することができる。含めることができる他のデバイスは、本発明の組成物に便宜な投与を可能とする内視鏡または腹腔鏡機器のための付属品である。勿論、そのようなデバイスは別々に提供することもできる。
【実施例】
【０１８６】
（実施例１：ヒアルロン酸誘導体および架橋されたヒドロゲルの調製および特徴付け）
材料および方法
ヒアルロン酸：ヒアルロン酸（ＨＡ、公証１．３６ＭＤ：高ＭＷおよび４９０ｋＤ：中程度ＭＷ）はＧｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から購入した。ＨＡ（公証５０ｋＤ：低ＭＷ）はＬｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．（Ｃｈａｓｋａ，ＭＮ）から購入した。全ての他の試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。
【０１８７】
架橋可能なヒアルロン酸の調製：インサイチュ架橋可能なＨＡ誘導体は従前に報告された方法に従って合成した（本明細書で参考として援用される、Ｊｉａ  Ｘ，Ｃｏｌｏｍｂｏ  Ｇ，Ｐａｄｅｒａ  Ｒ，Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ，Ｋｏｈａｎｅ  ＤＳ．Ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃｉａｔｉｃ  ｎｅｒｖｅ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｂｙ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００４；２５（１９）：４７９７−４８０４）。簡単に述べれば、ＨＡ−アジピン酸ジヒドラジド（ＨＡ−ＡＤＨ）は、室温にてｐＨ６．８で、１−エチル−３−カルボジイミド（ＥＤＣ）および１−ヒドロキシベンジトリアゾール（ＨＯＢｔ）の存在下で、ＨＡ（特に断りのない限り中程度ＭＷ）を３０倍モル過剰のアジピン酸ジヒドラジドと反応させることによって調製した。生成物は十分な透析およびエタノール沈殿によって精製した。ＨＡ−アルデヒド（ＨＡ−ＣＨＯ）は、暗所にて、ＨＡ（特に断りのない限り、高ＭＷ）を等モルの過ヨウ素酸ナトリウムと室温にて２時間反応させることによって調製した。反応はエチレングリコールを加えることによって停止させた。生成物は十分な透析によって精製した。精製された生成物を凍結乾燥し、４℃にて貯蔵した。架橋可能なＨＡ誘導体の分子量（ＭＷ）は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて決定した。ＧＰＣはＵｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ  Ｌｉｎｅａｒカラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）、および移動相（０．８ｍｌ／分）としての０．２Ｍ  ＮａＣｌを含有する０．０５Ｍ酢酸水溶液（ｐＨ６．７）で行った。ＭＷ較正曲線を一連のプルラン標準で調製した。修飾の程度が、１Ｈ  ＮＭＲ分析（Ｖａｒｉａｎ  Ｍｅｒｃｕｒｙ  ３００  ＭＨｚ，ＨＡ−ＡＤＨについて）（本明細書で参考として援用されるＪｉａ  Ｘ，  Ｃｏｌｏｍｂｏ  Ｇ，Ｐａｄｅｒａ  Ｒ，Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ，Ｋｏｈａｎｅ  ＤＳ．Ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃｉａｔｉｃ  ｎｅｒｖｅ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｂｙ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００４；２５（１９）：４７９７−４８０４）およびアルデヒドアッセイ（ＨＡ−ＣＨＯについて）（本明細書で参考として援用されるＫｏｈａｎｅ  ＤＳ，Ｌｉｐｐ  Ｍ，Ｋｉｎｎｅｙ  ＲＣ，Ａｎｔｈｏｎｙ  ＤＣ，Ｌｏｕｉｓ  ＤＮ，Ｌｏｔａｎ  Ｎ，ｅｄ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｕｇａｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｐｉｎｅｕｒｉｕｍ．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２；５９（３）：４５０−４５９）を用いて報告された方法に従って決定した。
【０１８８】
ＨＡＸヒドロゲルの特徴付け：ヒドロゲルのインサイチュゲル化時間は以下のように測定した。磁性撹拌バー（テフロン（登録商標）フルオロカーボン樹脂、５×２ｍｍ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ペトリ皿中の生理食塩水（２０ｍｇ／ｍｌ）の１００μｌ液滴のＨＡ−ＡＤＨ溶液の中心に入れた。次いで、１００μｌのＨＡ−ＣＨＯ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）をＨＡ−ＡＤＨ液滴に加え、ＣｏｒｎｉｎｇモデルＰＣ−３２０ホットプレート／スターラーを用い、溶液を１５５ｒｐｍで攪拌した。ゲル化時間は、皿の底から完全に分離された固体球を溶液が形成した時間と考えた。結果を４つの独立した測定の平均および標準偏差として報告する。凍結乾燥されたＨＡＸゲルの形態は、走査型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ  ＪＳＭ６０６０，ＪＥＯＬ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｐｅａｂｏｄｙ，ＭＡ）によって観察した。液体窒素中での冷却後に凍結乾燥されたゲルを破砕して、ゲル内部の構造を露出させた。破砕した試料を、観察の前に、パラジウムおよび金（１００Åの厚さ）でスパッタ−コートした。
【０１８９】
実施例１〜５についての統計学的解析。数的データは常には正規分布に従わなかったので、それを２５番目および７５番目のパーセンタイルでの中央値として表した。統計学的推定は、ＳＰＳＳソフトウエア（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を用い、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−検定、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、またはＦｉｓｈｅｒの正確確率検定を用いて行った。両側検定でのｐ値＜０．０５は統計学的に有意と考えた。
【０１９０】
結果
架橋可能なＨＡ誘導体、ＨＡ−アジピン酸ジヒトラジド（ＨＡ−ＡＤＨ）およびＨＡ−アルデヒド（ＨＡ−ＣＨＯ）は種々の異なる方法によって特徴付ける。元のＨＡおよび修飾されたＨＡのＭＷを表１にまとめる。ピーク平均ＭＷ（Ｍｐ）はわずかに増大し、ポリマーの多分散はＡＤＨ修飾後に２倍を超えて増大した。アルデヒド（ＣＨＯ）修飾の結果、ＭＷは有意に低下した。ＣＨＯ修飾後、ＨＡ（高ＭＷ）およびＨＡ（中程度ＭＷ）のＭＷ（Ｍｐ）は、各々、公証１．３６ＭＤおよび４７８ｋＤから１８８および２５３ｋＤまで減少し、これは、従前の報告と合致する（本明細書で参考として援用されるＪｉａ  Ｘ，Ｃｏｌｏｍｂｏ  Ｇ，Ｐａｄｅｒａ  Ｒ，Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ，Ｋｏｈａｎｅ  ＤＳ．Ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃｉａｔｉｃ  ｎｅｒｖｅ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｂｙ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００４；２５（１９）：４７９７−４８０４）。この結果は、２時間の酸化反応が、元のＭＷにかかわらず、有意な糖環切断を誘導したことを示した。１Ｈ  ＮＭＲおよびアルデヒドアッセイの結果は、各々、ＡＤＨのＨＡへの５２．９±４．７％の結合体化（ｎ＝４）、およびＨＡの各反復単位中の１６．６±４．８％のアルデヒド基の形成（ｎ＝７）を示した。
【０１９１】
ＨＡＸゲルは２つのＨＡ誘導体の接触に際して迅速に形成された。方法に記載されたように２つの成分の一定攪拌下で、ＨＡＸゲル（２０ｍｇ／ｍｌ）が３．５±０．６秒内に形成された。架橋されたＨＡＸゲルの形態は凍結乾燥後にＳＥＭで調べた（図１）。架橋されたヒドロゲルは、１０〜２０μｍの直径を持つ、架橋されたヒドロゲルに典型的である、連続的な円形または多角形の細孔を有した（本明細書で参考として援用されるＪｉａ  Ｘ，Ｂｕｒｄｉｃｋ  ＪＡ，Ｋｏｂｌｅｒ  Ｊ，Ｃｌｉｆｔｏｎ  ＲＪ，Ｒｏｓｏｗｓｋｉ  ＪＪ，Ｚｅｉｔｅｌｓ  ＳＭ，ら．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋａｂｌｅ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ−Ｂａｓｅｄ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｖｏｃａｌ  Ｆｏｌｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００４；３７（９）：３２３９−３２４８）。
【０１９２】
表１．元のおよび修飾されたＨＡの分子量のまとめ
【０１９３】
【表１】
2009533455.tif 000009
１．製造業者によって提供
２．ピーク平均分子量
３．重量平均分子量
４．数平均分子量
５．多分散指標＝Ｍｗ／Ｍｎ
（実施例２：インビトロでのＨＡＸヒドロゲルの生体適合性）
材料および方法
インビトロ細胞生存率アッセイ：ヒト中皮細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−９４４４）は、Ｅａｒｌｅ塩、Ｌ−グルタミン、および２．２ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウムを含有し、かつ３．３ｎＭ上皮成長因子、４００ｎＭヒドロコルチゾン、８７０ｎＭインスリン、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および１０％ウシ胎仔血清を補充した培地１９９中で培養した。継代５〜２５からの細胞を以下の実験で用いた。中皮細胞を、１ｍｌの培養基中のウェル当たり５０，０００個の細胞の密度にて２４ウェルプレートに撒いた。一晩のインキュベーンション後、培養基を新鮮な培地、または１０Ｕ／ｍｌヒアルロニダーゼで交換し、１００μｌの円筒状（直径：５ｍｍ、高さ：５．１ｍｍ）ＨＡＸゲル（２０ｍｇ／ｍｌ）を滅菌調製し、各ウェルに加えた。ヒドロゲルの存在下での種々の時間のインキュベーション後に、細胞生存率をＭＴＴアッセイキットで評価した（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）。結果を、非処理対照細胞の吸光度に対して正規化された測定された吸光度の２５番目および７５番目のパーセンタイルでの中央値として報告した（％正規化細胞生存率＝１００×培地中の試料の存在下で成長させた細胞についての吸光度／培地中で成長させた細胞の吸光度）
結果
本発明者らは、中皮細胞上でのＨＡＸゲルのインビトロ細胞傷害性を決定した（本明細書で参考として援用されるｄｉＺｅｒｅｇａ  ＧＳ．Ｐｅｒｉｔｏｎｅｕｍ，ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｈｅａｌｉｎｇ，ａｎｄ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｉｎ：ｄｉＺｅｒｅｇａ  ＧＳ，ｅｄｉｔｏｒ．Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０００．ｐ．３−３７）。これらを、ＨＡＸゲルを分解する１０単位／ｍｌのヒアルロニダーゼを含むまたは含まない培地中で２０ｍｇ／ｍｌ  ＨＡＸ  １００μｌゲル（方法参照）の存在下で３日間まで成長させた。ＨＡＸの存在は、３日後のヒアルロニダーゼの存在下でのＨＡＸに曝露された細胞における生存率のわずかな（１６％）減少（ｐ＝０．０４２）を除いて、ＭＴＴアッセイで評価したようにいずれの群における細胞生存率に対しても統計学的に有意な効果を有さなかった（図２）。インビトロ細胞増殖アッセイは、ＨＡＸゲルが非分解条件（単純培地）および分解条件（１０Ｕ／ｍｌヒアルロニダーゼを含有する培地）の双方において中皮細胞と適合したことを示した。
（実施例３：インサイチュ架橋されたＨＡＸゲルによる腹膜癒着の予防）
材料および方法
ＨＡＸゲルのインビボ適用。動物を、実験室動物の世話および使用についてのＮＩＨガイドライン（ＮＩＨ公表番号８５−２８、１９８５年改定）に合致した、動物ケアについての技術委員会のマサチューセッツ制度によって認可されたプロトコルに従ってケアした。雌白ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ；Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｈａｚｌｅｔｏｎ，ＰＡ）（３±０．５ｋｇ）をモデル動物として用いた。ケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｍ．）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｍ．）を用いて麻酔を誘導した；気管内管を介して投与された酸素中の１〜３％イソフルランを用いて維持を達成した。無菌技術を全体を通じて用いた。動物に外科的処置を通じて乳酸加リンゲル液を供し、連続的に活力のある兆候をモニターした。１０ｃｍ長の中線切開を腹壁脳白線に沿って行い、腹膜を開いた。腹膜癒着は、文献に報告された方法を修飾してそれに従って誘導した（本明細書で参考として援用されるＯｒｉｔａ  Ｈ，Ｆｕｋａｓａｗａ  Ｍ，Ｇｉｒｇｉｓ  Ｗ，ｄｉＺｅｒｅｇａ  ＧＳ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｓｔｓｕｒｇｉｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ：ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｆｅｒｔｉｌ  １９９１；３６（３）：１７２−１７７）。右側の腹壁に、壁側腹膜および筋肉の層（約１ｍｍの厚さ）を含む３×４ｃｍ欠損を、中線から１ｃｍで出発して切り出した。引き続いて、盲腸を外に取り出し、腸間膜反対側の（第１２結腸膨起に対して回腸と盲腸の接合の末端側の第６結腸膨起で開始して）７つの結腸膨起を摘出し、出血をもたらす滅菌外科ブラシを用いて８０〜１６０ストロークの間、二方向に磨耗させた。
【０１９４】
２０匹の動物を実験群：（ｉ）処理無し（ｎ＝１２）；（ｉｉ）１０ｍｌの架橋したＨＡでの切開した腹壁および磨耗させた盲腸表面の被覆（ｎ＝８）にランダムに割り当てた。適用の前に、２時間の殺菌性ＵＶ照射によって材料を滅菌し、滅菌生理食塩水に溶解させた。ゲル前駆体溶液（５ｍｌのＨＡ−ＡＤＨ（２０ｍｇ／ｍｌ）および５ｍｌのＨＡ−ＣＨＯ（２０ｍｇ／ｍｌ））を別々の滅菌１０ｍｌシリンジに入れ、これをＢａｘｔｅｒデュアルバルブアプリケーターに連結し、１５ゲージの針を通して同時に押出した。液体前駆体は瞬間的にゲル化を開始し、適用した領域の形状に適合した。肉眼で調べるために、ゲル化を３分未満に完了させ：ヒドロゲルはその地点を超えて流動しなかった。
【０１９５】
傷害した領域の処置後、腹膜および腹部壁を、各々、２−１０エチロン（Ｅｔｈｉｌｏｎ）および３−０デキソン（Ｄｅｘｏｎ）で閉じた。皮膚を２−１０エチロン（Ｅｔｈｉｌｏｎ）で閉じた。動物を覚醒させ、食物および水を自由に摂取させた。ブプレノルフィン０．０２〜０．０３ｍｇ／ｋｇを外科的処置から８時間後に皮下投与した。
【０１９６】
該手法から１週間後に、動物をペントバルビタールナトリウム１００ｍｇ／ｋｇ  ＩＶで安楽死させた。癒着は、報告された方法の修飾を用いてスコア取りした（本明細書で参考として援用されるＢｕｒｎｓ  ＪＷ，Ｓｋｉｎｎｅｒ  Ｋ，Ｃｏｌｔ  Ｊ，Ｓｈｅｉｄｌｉｎ  Ａ，Ｂｒｏｎｓｏｎ  Ｒ，Ｙａａｃｏｂｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｐｏｓｔｓｕｒｇｉｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｂｙ  ｐｒｅｃｏａｔｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９５；５９：６４４−６５２）。スコア０＝癒着無し、スコア１＝重力で分離される組織癒着、スコア２＝鈍的切開によって分離可能な組織癒着、スコア３＝鋭的切開（ｓｈａｒｐ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）を必要とする癒着。剖検から回収された組織を１０％ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋し、薄片を作製し、標準的な技術を用いて組織学的調査のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【０１９７】
結果
２０匹の動物は、方法に記載されたように、盲腸磨耗および部分的腹壁切開を受けた。ＨＡＸゲルで処理しなかった２０匹の動物（対照）は、外科的処置から第１週後の間に体重の５．７±４．６％を喪失した。１２匹のウサギのうち１０匹（８３％）はスコア３の癒着を発症した（図３Ｃ）。１０匹のウサギのうち、６匹は腹壁切開に対して直線的に並んだ癒着を発症し、２匹は切開のエッジに関連する癒着を発症し、１匹は多数の腸セグメントに関連する癒着を発症し；後者の動物において、外科的処置の間に有意な局所的出血があった。１匹のウサギは、切り出された腹壁とは独立した中線腹縫合に対する癒着を発症した。
【０１９８】
１０ｍｌのＨＡＸゲルで処理した８匹の動物は、外科的処置から第１週後の間に体重の９．０±７．４％を喪失した（ｐ＝未処理対照と比較して有意でない）。２匹の動物（２５％）のみがスコア３の癒着を発症した（未処理対照と比較してｐ＝０．０１９、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定）。８匹の動物のうち４匹が癒着を示さなかった（図３Ｂ）。１匹の動物は、重力で分離した癒着を有した（スコア１）。２匹の動物は腹縫合部位において癒着を発症し（スコア２および３）、１匹の動物は磨耗した結腸膨起と非磨耗回盲腸接合との間にスコア３の癒着を発症した。しかしながら、それらのうちいずれも傷害した腹壁を含まなかった。ＨＡＸゲルを適応しない場合には、スコア２および１つのスコア３癒着は縫合部位に関連したことに注意されたし。同様に、腸の２つのループの間の他のスコア３癒着もまた唯一の処理された表面を含んだ。切開の時点において、ＨＡＸゲル材料は処理された部位（傷害した腹壁および／または磨耗した盲腸表面）に依然として存在した。肉眼による検査を行うために、材料の量および弾性を有意に低下させた。
【０１９９】
未処理動物からのデータから、腹壁に対する傷害は、癒着を発症することにおいて重要な役割を果たすように見えるであろう。盲腸表面の磨耗の効果は、有意性が低いようであった。癒着に関与しなかった磨耗盲腸表面は、いずれの認識可能なマークも残すことなく１週間以内に治癒し、癒着は、しばしば、磨耗されたおよび磨耗されていない結腸膨起双方を含んだ。さらに、直腸を磨耗したが、腹壁は損傷せず、または温和に磨耗したに過ぎない場合のいくつかのパイロット実験においては、癒着の発生は非常に低かった（データは示さず）。
【０２００】
光学顕微鏡観察では、未処理動物における癒着部位から採取した試料は、腸の筋肉層の腹壁筋肉系への密接な並置を示し、介在炎症および線維症の種々の厚さのものであり、ならびに筋肉傷害の証拠（節、小さな暗い染色細胞、中央化核）があった（図４Ａおよび４Ｂ）。対照的に、癒着無しの処理された動物における傷害部位から採取した試料は青味がかった染色物質のコーティングを示し、炎症細胞、ほとんどはマクロファージの温和〜中程度の浸潤が伴ったが、いくつかの好中球ではそうでなかった（図４Ｃ）。癒着を発症したＨＡＸで処理した２匹の動物における癒着部位からの試料は、未処理動物からの癒着部位と同一の外観を有した。ここに、２匹の動物からの試料ではコーティングは観察されず；それらの癒着は、コーティングされなかった部位においてたまたま発生したことに注意すべきである。
【０２０１】
この実験の結果を表２にまとめる。結果は、腹膜癒着を低下させることにおいてＨＡＸゲルのインビボ効果を示す。癒着を妨げるためのゲルの能力は、切断によってのみ分離できるしっかりとした連結であったスコア３の癒着の罹患率を比較した場合に特に明瞭であった；より低いグレードの癒着は、外科的に関連する意味において癒着よりもむしろ疾患の異なるグレードであった。処理していない対照群における１２匹の動物のうち１０匹（８３％）は、外科的処置から７日後以内にスコア３の癒着を発症した。組織学的調査により、スコア３の癒着は炎症および線維症の結果であったことが確認された。対照的に、スコア３癒着は、傷害した部位に適用されたＨＡＸゲルで処理された８匹の動物のうち２匹（２５％）において起こったに過ぎなかった。処理群で見られたスコア３癒着の双方は、縫合された切開、あるいはＨＡＸで処理されていない２つの盲腸表面の間に関連した。コーティングされていない領域への癒着が分析から排除された場合、対照および処理群における３癒着の発生率は、各々、８２％（１１匹のうち９匹）および０％（６匹のうち０匹）である。
【０２０２】
注目すべきは、分析は、本発明者らの架橋されたＨＡＸゲルが腹膜中で生体適合性であることを示した。本発明者らは、従前に、この系が腹膜中で生体適合性であることを示した（本明細書で参考として援用されるＪｉａ  Ｘ，Ｃｏｌｏｍｂｏ  Ｇ，Ｐａｄｅｒａ  Ｒ，Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ，Ｋｏｈａｎｅ  ＤＳ．Ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃｉａｔｉｃ  ｎｅｒｖｅ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｂｙ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００４；２５（１９）：４７９７−４８０４）。しかしながら、１つの組織における生体適合性は、腹膜における生体適合性を必ずしも予測しない。例えば、ポリマーミクロスフィアは腹膜（本明細書で参考として援用されるＫｏｈａｎｅ  ＤＳ，Ｌｉｐｐ  Ｍ，Ｋｉｎｎｅｙ  ＲＣ，Ａｎｔｈｏｎｙ  ＤＣ，Ｌｏｕｉｓ  ＤＮ，Ｌｏｔａｎ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｕｇａｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｐｉｎｅｕｒｉｕｍ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２；５９（３）：４５０−４５９）および多くの他の組織において生体適合性であるがそれらが腹膜中で癒着を引き起こす傾向がある（本明細書で参考として援用されるＫｏｈａｎｅ  ＤＳ，Ｔｓｅ  ＪＹ，Ｙｅｏ  Ｙ，Ｐａｄｅｒａ  Ｒ，Ｓｈｕｂｉｎａ  Ｍ，Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ａｎｄ  ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｔｏｎｅｕｍ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５：Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）。
【０２０３】
表２．腹膜癒着の評価
【０２０４】
【表２】
2009533455.tif 000010
（実施例４：ｔＰＡおよびＰＡＩ−１生産に対するＨＡ分解産物の効果）
フィブリン溶解と抗フィブリン溶解活性との間のバランスは、癒着の発生を媒介することにおいて重要であることが示されている（その各々が本明細書に参考として援用されるＦａｌｋ  Ｋ，Ｂｊｏｒｑｕｉｓｔ  Ｐ，Ｓｔｒｏｍｑｖｉｓｔ  Ｍ，Ｈｏｌｍｄａｈｌ  Ｌ．Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｙｐｅ  １．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２００１；８８：２８６−２８９；Ｂｉｎｄａ  ＭＭ，Ｍｏｌｉｎａｓ  ＣＲ，Ｋｏｎｉｎｃｋｘ  ＰＲ．Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｎｄ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ２００３；１８（１２）：２５０３−２５０７）。漿膜フィブリン溶解は、主として、ｔ−ＰＡおよびＰＡＩの中皮放出によって調節される（本明細書で参考として援用されるＴｉｅｔｚｅ  Ｌ，Ｅｉｂｒｅｃｈｔ  Ａ，Ｓｃｈａｕｅｒｔｅ  Ｃ，Ｋｌｏｓｔｅｒｈａｌｆｅｎ  Ｂ，Ａｍｏ−Ｔａｋｙｉ  Ｂ，Ｇｅｈｌｅｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏ−  ａｎｄ  ａｎｔｉｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａｌ（ＴＧＦ−ｂｅｔａ１），ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ（ＴＮＦ−ａｌｐｈａ）ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １ｂｅｔａ（ＩＬ−１ｂｅｔａ）．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １９９８；７９（２）：３６２−３７０）。本発明者らは、ＨＡＸの分解産物が、ＨＡＸゲルからの癒着形成における低下を説明するであろう、ｔＰＡおよびＰＡＩ−１の中皮生産の変化を引き起こしたか否かを調べた。３７℃において１０Ｕ／ｍｌヒアルロニダーゼ中でインキュベートした架橋ＨＡＸゲルはそのような分解産物の定常放出を供した（図５Ａ）。中皮細胞は、１００μｌ生理食塩水、または２０ｍｇ／ｍｌのＨＡ（４９０ｋＤまたは５０ｋＤ  ＭＷ）、またはＨＡの２つのモノマー構成要素（Ｄ−グルクロン酸またはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）の１つを補充した、または補充しない、１ｍｌ培地中でインキュベートした。図５Ｂは、未処理または生理食塩水処理対照と比較して、異なるＭｗのヒアルロン酸およびモノマーで成長させた中皮細胞におけるｔＰＡ生産の統計学的に有意であるが小さな減少を示す（ｐ＝０．１５）。ＨＡまたはモノマーで処理された群の間の差は統計学的に有意でなかった（ｐ＝０．１１２）。同様に、ＰＡ１−１生産はいずれの処理によっても有意に影響されなかった（データを示さず）。任意の理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、ＨＡＸゲルでの癒着形成の有意な低下は、大部分が、ＨＡＸゲルのバリア機能によるものであったようであると考えられる。しかしながら、癒着形成の病因は広い範囲の生物学的事象によって媒介されるので、ＨＡＸゲル（可溶性Ｈ��、モノマー）の潜在的可溶性浸出物はｔＰＡ生産を増加させず、あるいはインビトロにてＰＡＩ−１レベルに影響しなかったという事実は、同様に、生物学的効果の可能性を排除できない。
【０２０５】
（実施例５：ＨＡＸゲル分解に対するモノマー濃度および分子量の効果）
材料および方法
ヒアルロニダーゼにおけるＨＡＸゲルの分解：一定範囲の分子量を有する種々の濃度のＨＡ−ＡＤＨおよびＨＡ−ＣＨＯよりなる群から選択されるＨＡＸゲルを調製し、ヒアルロニダーゼにおけるゲルの分解を経時的にモニターした。ＨＡＸゲルは、ボルテックスミキサーを用いて２ｍｌの微量遠心管中で種々の濃度およびＭｗの１５０μｌのＨＡ−ＡＤＨおよび１５０μｌのＨＡ−ＣＨＯを即座に混合することによって調製し、次いで、ヒアルロニダーゼ（ＰＢＳ中５０Ｕ／ｍｌ）中の３７℃インキュベーションに付した。所定の時点において、ヒアルロニダーゼ緩衝液は完全に除去され、残存するＨＡＸゲルの湿潤質量は重量分析により決定した。結果は、各時点における％ゲル質量／元の湿潤ゲル質量  対  時間としてプロットした。
【０２０６】
結果
マトリックスの架橋密度を変化させることによってＨＡＸゲルの特性のさらなる最適化および対照についての潜在能力を評価するために、本発明者らは、種々の濃度のゲルの効果を調べた。上記で用いたＨＡは非常に粘性であって、ＨＡを２０ｍｇ／ｍｌを超えて溶解させるのは困難であった。従って、ＨＡの濃度を増加させるために、本発明者らはより低いＭｗの前駆体を調製した。これを行うために、本発明者らは、（４９０ｋＤの代わりに）５０ｋＤ  ＨＡからＨＡ−ＨＤＨを、および（１．３６ＭＤの代わりに）４９０ｋＤ  ＨＡからＨＡ−ＣＨＯを調製した。これは、７５ｍｇ／ｍｌ  ＨＡ−ＡＤＨおよび６０ｍｇ／ｍｌ  ＨＡ−ＣＨＯの処方を可能とした。ゲル分解プロセスを加速し、合理的な期間中にゲル質量の肉眼的変化を観察するために、５０Ｕ／ｍｌのヒアルロニダーゼを用いて分解実験を行った。
【０２０７】
全ての濃度のＨＡＸゲルは最初に膨潤し、次いで、濃度（図６Ａ）および分子量（図６Ｂ）に依存する速度で分解した。５０％だけヒドロゲル湿潤質量が減少する時間（「半減期」）は、ＨＡ−ＡＤＨおよびＨＡ−ＣＨＯ溶液の濃度が、各々、２０ｍｇ／ｍｌから７５ｍｇ／ｍｌおよび３０ｍｇ／ｍｌまで増加した場合には５日から１１日に増加し、濃度が７５ｍｇ／ｍｌおよび６０ｍｇ／ｍｌまで増加した場合には２２．５日まで増加した（図６Ａ）。（後者の比較においては、ＨＡ−ＣＨＯの濃度は唯一可変であったことに注意されたし）。ＨＡ−ＡＤＨおよびＨＡ−ＣＨＯの濃度を一定に保った場合、半減期は、より高いＭｗに由来するＨＡ−ＣＨＯで作製されたゲルについてはより長かった（１．３６ＭＤ  ＨＡ−ＣＨＯについては＞５０日  対  ４９０ｋＤ  ＨＡ−ＣＨＯについては２２日；図６Ｂ）。これらの実験においては、ＨＡＸゲルを微量遠心管に注ぎ、ここに、ゲルの片側のみがヒアルロニダーゼ溶液に面した。したがって、ここに示された絶対半減期は、本明細書中に記載された他の実験に直接的には関連できず、ここに、ゲルは全ての表面の酵素溶液に曝露された。
【０２０８】
本発明実施例に提示された結果は、一旦形成されれば、例えば、内因性ヒアルロニダーゼによって結局は分解されるまで、（ゲル成分の濃度および分子量に依存して；図６参照）数日〜数週間継続し得る持続性物理的バリアを表す。分解の時間経過は本発明者らのアプローチに従ってこれらのパラメーターを変化させることによって制御可能に変調できるという事実は、バリア機能が望まれる時間の長さに依存して、これらの系が特定の適用のために調整されることを可能とする。
【０２０９】
（実施例６：ハイブリッドＨＡ／ナノ粒子ヒドロゲルの調製および特徴付け）
材料および方法
材料。ヒアルロン酸（ＨＡ，１．３６ＭＤａおよび４９０ｋＤａ）はＧｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から購入した。ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール）酸（ＰＬＧＡ，ラクチド：グリコリド＝６５：３５、Ｍｗ９０，０００はＡｌｋｅｒｍｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から得られた。ポリビニルアルコール（ＰＶＡ，Ｍｗ６０００）はＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）から購入した。全ての他の試薬は、特に断りのない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。
【０２１０】
架橋可能なヒアルロン酸およびＰＬＧＡナノ粒子の調製。インサイチュ架橋可能なＨＡ誘導体は実施例１に記載したように合成した。ブランクＰＬＧＡナノ粒子は、単一のエマルジョン方法によって調製した。ＰＬＧＡ  ２００ｍｇを、塩化メチレンおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の３：２混合液の５ｍｌに溶解させた。ポリマー溶液を２０ｍｌの５％ＰＶＡに直接的に加えた。次いで、混合物を超音波処理機（Ｖｉｂｒａｃｅｌｌ  ＶＣ−２５０，Ｓｏｎｉｃｓ＆Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｄｕｎｂｕｒｙ，ＣＴ）を用いて１分間ホモゲナイズして、油−水エマルジョンを得た。形成されたエマルジョンを１００ｍｌの蒸留水に加え、室温にて一晩攪拌した。残存する溶媒を減圧下で除去した。Ｌ８−７０Ｍ超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）、およびＳＷ２８振動バケットローターを用い、２５，０００ｒｐｍにおける２０分間の遠心によってナノ粒子を収集し、凍結乾燥の前に限外濾過膜（Ｕｌｔｒａｃｅｌ  Ａｍｉｃｏｎ  ＹＭ１００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を通すことによってさらに精製した。粒子サイズは、ＺｅｔａＰＡＬＳゼータ電位アナライザー（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ）で測定した。
【０２１１】
ヒドロゲルの調製。ナノ粒子無しの架橋されたヒアルロン酸ヒドロゲル（「ＨＡＸ」）は、ゲル前駆体（ＨＡ−ＡＤＨおよびＨＡ−ＣＨＯ）の２０ｍｇ／ｍｌ溶液を混合することによって調製した。ＰＬＧＡナノ粒子を含有する複合体ＨＡＸゲル（「ハイブリッド」）は、２０ｍｇ／ｍｌのＰＬＧＡナノ粒子懸濁液中でゲル前駆体の２０ｍｇ／ｍｌ溶液を混合することによって調製した。
【０２１２】
走査型電子顕微鏡測定。ＰＬＧＡナノ粒子の表面形態学および凍結乾燥されたヒドロゲルの内部構造は、走査型電子顕微鏡観察によって調べた。ヒドロゲルは、蒸留水中で調製された等容量の前駆体溶液を混合することによって作製した。次いで、ヒドロゲルを凍結乾燥し、液体窒素中での冷却後破砕させた。試料をパラジウムおよび金でスパッタ−コーティングし（１００Å厚さ）、走査型電子顕微鏡測定（ＪＥＯＬ  ＪＳＭ  ６３２０，ＪＥＯＬ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｐｅａｂｏｄｙ，ＭＡ）を用いて観察した。
【０２１３】
ゲル化時間。ＰＬＧＡナノ粒子を含有する１００μｌのＨＡ−ＡＤＨ溶液（双方のＨＡ−ＡＤＨおよびＰＬＧＡナノ粒子は生理食塩水中２０ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌであった）を、磁性撹拌バー（テフロン（登録商標）フルオロカーボン樹脂、５×２ｍｍ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有した８×３５ｍｍガラスバイアルに加えた。次いで、ＰＬＧＡナノ粒子を含有する１００μｌのＨＡ−ＣＨＯ溶液（双方のＨＡ−ＣＨＯおよびＰＬＧＡナノ粒子は生理食塩水中２０ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌいずれかであった）をバイアルに加え、溶液を、ハイブリッドゲルが形成されるまで、ＣｏｒｎｉｎｇモデルＰＣ−３２０ホットプレート／スターラーを用いて１５５ｒｐｍで攪拌した。ゲル化時間は、皿の底から完全に分離した固体小球を溶液が形成した時間であると考えられた。比較のために、ＨＡＸゲルの形成も試験した。結果は、４つの独立した測定の平均および標準偏差として報告する。
【０２１４】
レオロジー試験。円筒形ＨＡＸおよびハイブリッドゲルは、１ｍｌシリンジおよびＢａｘｔｅｒデュアルバルブアプリケーターを用いて２０ｍｇ／ｍｌゲル前駆体溶液を、２つのスライドガラスの間にサンドイッチにされたゴム金型に加えることによって調製した。調製したヒドロゲルの直径および厚さは、各々、８ｍｍおよび３．５ｍｍであった。次いで、レオロジー測定のために、ゲルをＡＲ１０００Ｎレオメーター（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）に移した。全ての実験は、室温にて平行８ｍｍ直径プレートを用いて行った。剛性率Ｇはクリープ試験および応力スイ−プ試験によって測定した。クリープ試験では、ヒドロゲルを一定剪断応力（５、１０、２０または４０Ｐａ）に９０秒間に供し、次いで、９０秒間開腹させた。各クリープおよび開腹工程における〜６０秒後に、歪みは一定値に到達した。Ｇは（開腹工程の最後に読んだ）歪み  対  応力曲線の傾きの逆数として決定した。応力スイープ試験では、振動応力を一定周波数（０．１Ｈｚ）において範囲１〜１００Ｐａにて適用した。４０Ｐａで得られた弾性係数Ｇ’をＧの近似値として用いた。なぜならば、粘性係数Ｇ’’は０に近かったからである。結果を４つの独立した測定の平均および標準偏差として報告する。
【０２１５】
実施例６〜８についての統計学的解析。レオロジー測定を、平均および標準偏差として報告し、スチューデントｔ−検定を用いて比較する。細胞培養データは２５番目および７５番目のパーセンタイルで中央値として表した。なぜならば、それらは常に正規分布に従わなかったからである；また、スコアがこのようにして報告した。これらについては、統計学的推定は、ＳＰＳＳソフトウエア（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を用い、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−検定、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、またはＦｉｓｈｅｒの正確確率検定を用いて行った。両側検定についてのｐ値＜０．０５を統計学的に有意と考えた。
【０２１６】
結果
ハイブリッドゲルの特徴付け。ＰＬＧＡナノ粒子の平均直径およびゼータ電位は、各々、２７８．４±１８．７ｎｍおよび−１８．１±４．０ｍＶであった。走査型電子顕微鏡測定に対しては、粒子サイズの分布は、５０ｎｍ〜３００ｎｍの比較的広い範囲であった（図７Ａ）。凍結乾燥されたハイブリッドゲルマトリックスは、ＨＡＸゲル（図７Ｃ）に匹敵した５〜１０μｍの範囲の直径を持つ連続細孔を有した（図７Ｂ）。ハイブリッドゲルは粗い表面を有し（図７Ｂ挿入図）、これは、ゲルマトリックスに包埋されたナノ粒子を示す。本明細書中に記載するように、癒着バリアとしてのＨＡＸゲルの利点の１つは、それらが癒着の処理のための適当な時間枠内でインサイチュにて架橋できることである。ポリマーナノ粒子の取込みがゲル化に干渉するか否かを評価するために、本発明者らは、ＨＡＸおよびハイブリッドゲルのゲル化時間を比較した。双方の系は、２つの間の統計学的にまたは現実的に有意な差なくして、混合に際して迅速にゲル化した（表３）。同様に、本発明者らは、ナノ粒子がゲルの機械的特性に影響したか否かを確認したかった。剛性率はナノ粒子によって影響されなかった（表３）。
【０２１７】
表３．ＨＡＸおよびハイブリッドゲルのゲル化時間および剛性率の比較
【０２１８】
【表３】
2009533455.tif 000011
（実施例７：ハイブリッドＨＡ／ナノ粒子ヒドロゲルの生体適合性）
材料および方法
ヒドロゲル。ハイブリッドＨＡ／ナノ粒子ヒドロゲルは実施例６に記載されたように調製した。
【０２１９】
細胞増殖アッセイ。ヒト中皮細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−９４４４）を、Ｅａｒｌｅ塩、Ｌ−グルタミン、および２．２ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウムを含有し、かつ３．３ｎＭ上皮成長因子、４００ｎＭヒドロコルチゾン、８７０ｎＭインスリン、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した培地１９９中で培養した。細胞を、１ｍｌの培養基中のウェル当たり５０，０００個の細胞の密度にて２４ウェルプレートに撒いた。一晩後、１００μｌの円筒形ハイブリッドゲルまたは生理食塩水を各ウェルに加えた。ヒドロゲルの存在下における種々のインキュベーション時間後、細胞生存率をＭＴＴアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６非放射性細胞増殖アッセイ）で評価した。結果を、処理していない対照細胞の吸光度に対して正規化された測定吸光度の２５番目および７５番目のパーセンタイルでの中央値として報告した（％正規化細胞生存率＝１００×培地中の試料の存在下で成長した細胞についての吸光度／培地中で成長した細胞についての吸光度）。
【０２２０】
結果
インビトロ中皮細胞生存率に対するハイブリッドゲルの効果をＭＴＴアッセイで評価した。細胞を円筒形１００μｌハイブリッドゲル（２０ｍｇ／ｍｌ  ＨＡＸ＋２０ｍｇ／ｍｌ  ＰＬＧＡナノ粒子）の存在下で成長させ、３日までの間、３．５ｍｍ×８ｍｍ直径を測定した。これは、ＨＡＸを分解する酵素である１０単位／ｍｌヒアルロニダーゼを含むまたは含まない培地中で行った（対照において、それは生存率を正規化するための基準を提供し、１００μｌの通常の生理食塩水をゲルの代わりに加えた）。ヒアルロニダーゼの存在とは無関係に、細胞生存率は、１日および３日のインキュベーションにおいて良好に維持された。図８に示す群の間で統計学的に有意な差はなかった。
【０２２１】
（実施例８：インサイチュ架橋ハイブリッドＨＡ／ナノ粒子ゲルによるマウスモデルにおける癒着の予防）
材料および方法
ヒドロゲル。ハイブリッドＨＡ／ナノ粒子ヒドロゲルは実施例６に記載されたように調製した。
【０２２２】
ハイブリッドゲルのインビボの適用。実験動物のケアおよび使用についてのＮＩＨガイドライン（ＮＩＨ公表番号８５−２３、１９８５年改定）に適合させ、動物ケアについての技術委員会のマサチューセッツ州制度によって認可されたプロトコルに従って動物を世話した。
【０２２３】
マウス腹腔内注射モデル。体重２０〜３５ｇの雄ＳＶ１２９マウスを用いた。１ｍｌの滅菌ハイブリッドゲルを、左下方１／４における単一穿刺を介して腹膜に注射した。適応の前に、材料を殺微生物ＵＶ照射によって２時間滅菌し、滅菌生理食塩水に溶解させた。ＰＬＧＡナノ粒子０．５ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌ  ＨＡ−ＡＤＨおよび２０ｍｇ／ｍｌナノ粒子）を含むＨＡ−ＡＤＨ、およびＨＡ−ＣＨＯ  ０．５ｍｌ（２０ｍｇ／ｍｌナノ粒子を含有する１０ｍｇ／ｍｌ）を別の滅菌１ｍｌシリンジに入れ、これをＢａｘｔｅｒデュアルバルブアプリケーターに連結し、２０ゲージ針を通して同時に押出した。注射から２または７日後に、動物を二酸化炭素で安楽死させた。動物を、癒着が存在するか否か、およびハイブリッドゲル残渣が目に見えるか否かに関して調べた。
【０２２４】
組織学的調査。剖検から回収した組織を１０％ホルマリン中に固定し、パラフィンに包埋し、薄片とし、標準的技術を用いてヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【０２２５】
結果
腹膜薬物送達に対する新しいアプローチの開発。腹膜癒着の予防および／または処置のための、および他の目的での腹膜薬物を送達する方法の開発にかなりの興味がある。しかしながら、腹膜への薬物送達は迅速なクリアランスによって妨げられる。本発明者らは、腹膜薬物送達が、ポリマーベースの制御された放出技術の適用によって改良できるか否かを決定することを求めた。本発明者らは、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール）酸（ＰＬＧＡ）のミクロ−およびナノ粒子、制御された薬物放出で通常用いられる一般に優れた生体適合性を持つ生分解性ポリマーの腹膜使用に対する適合性を調べた。本発明者らは、１０〜１００ｍｇの用量にて、直径が５〜２５０μｍの９０ｋＤａ  ＰＬＧＡマイクロ粒子をマウスの腹膜に注射した（群当たりｎ＝３〜５）。本発明者らは、注射から２週間後にポリマー残渣および癒着の高い発生を見出した（例えば、５０ｍｇの５μｍのマイクロ粒子が動物の８３％で癒着を引き起こした）。組織学は、直径が＞５ｕｍの粒子が顕著な外来性の体巨細胞を伴う慢性炎症を明らかにした。５４、５７、および１０ｋＤａ  ＰＬＧＡ（γ照射）から作製された５μｍのミクロスフィアは、残渣の同様な発生率を伴うより少数の癒着（１６７％）を引き起こした。９０ｋＤａ  ＰＬＧＡのナノ粒子（２６５ｎｍ）はかなり少数の癒着（動物の６．３％）を引き起こした。恐らくは、それらは２日以内に腹膜から除去され、泡沫マクロファージが認められる脾臓および肝臓に隔離されたからである。これらの実験は、本発明者らが試験したマイクロ粒子またはナノ粒子のいずれも、単独で、腹膜で用いる許容されるポリマー薬物送達系を提供しないであろうことを示唆した。本発明者らは、粒子がインサイチュ架橋可能なヒアルロン酸ヒドロゲル内に捕捉された腹腔内薬物送達のための複合ヒドロゲル系は、ポリマーベースの薬物送達の効果的な使用を可能としつつ、バリアとして作用して、癒着の形成を阻害すると仮定した。特に、本発明者らは、そうでなければ癒着形成に寄与するであろう粒子の場合において、ヒドロゲルが、少なくとも部分的には、包まれた粒子が癒着形成に寄与することを妨げるであろう仮定した。そうでなければ迅速に腹膜から除去されるであろう粒子の場合には、ヒドロゲルは腹膜内に粒子を保持するであろう。
【０２２６】
マウスの腹腔内注射モデルにおける生態適合性。ＨＡＸが、腹膜内にナノ粒子を維持し、同時に、高分子量ＰＬＧＡの存在から癒着の形成を妨げるであろうという仮説を検定するために、マウス腹膜に、２０ｍｇのＰＬＧＡナノ粒子を含有する１ｍｌの１０または２０ｍｇ／ｍｌ  ＨＡＸを注射した。ＨＡＸの非存在下においてナノ粒子を注射した動物は、２日以内腹膜を残し、殆どポリマー残渣を残さず、頻繁に、泡沫マクロファージを伴う拡大された変色脾臓を有することが従前に示されている（データは示さず）。
【０２２７】
注射から２日後の剖検では（表４）、ＨＡＸ  １０ｍｇ／ｍｌを含有するハイブリッドゲルは、周囲の腹部内容物から容易に分離された離散塊として注射部位に留まった（図９Ａ）。ＨＡＸ  ２０ｍｇ／ｍｌを含有するハイブリッドゲルは腹部内容物により接着しているようであったが、接触する器官から依然として容易に分離可能であったが、それらは幾らかの残渣を残した（図９Ｂ）。癒着あるいは脾臓のサイズまたは色における異常性はいずれの群においても認められなかった。２０ｍｇ／ｍｌ  ＨＡＸを含有するさらなるハイブリッド群を注射から７日後に屠殺した。ゲルは４匹のマウスの内、３匹で見られ（図９Ｃ）、ゲル塊は２日後に回収されたものと匹敵した。この群で見られた癒着の単一の場合においては、殆どまたは全くゲルは目に見えず、これは、ゲルの可能な腔内注射（および糞中の推測可能な引き続いてのクリアランス）を伴い、腸が貫通されたことを示唆する。ここに、また、脾臓は肉眼では正常に見えた。泡沫マクロファージが、多くの動物の腹腔から回収されたゲルの染色されたスライドの光学顕微鏡観察で認められ、保持されたナノ粒子の存在を示唆する（図１１Ｂ、挿入図）。泡沫マクロファージは肝臓または脾臓で観察されなかった。図９の全てのパネルにおいて観察できるように、増大した血管分布は多くのゲルの周囲に認められた。
【０２２８】
表４．マウスモデルにおけるハイブリッドゲルの生体適合性
【０２２９】
【表４】
2009533455.tif 000012
（実施例９：インサイチュ架橋ハイブリッドＨＡ／ナノ粒子ゲルによるウサギ磨耗モデルにおける腹膜癒着の予防）
材料および方法
ヒドロゲル。ハイブリッドＨＡ／ナノ粒子ヒドロゲルは実施例６に記載されたように調製した。
【０２３０】
ハイブリッドゲルのインビボの適用。実験室動物の世話および使用のためのＮＩＨガイドライン（ＮＩＨ公表番号８５−２３、１９８５年改定）に適合して、動物ケアについての技術委員会のマサチューセッツ制度によって認可されたプロトコルに従って動物を世話した。
【０２３１】
ウサギ側壁欠損−盲腸癒着モデル。雌シロウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ；Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｈａｚｌｅｔｏｎ，ＰＡ）（３±０．５ｋｇ）をモデル動物として用いた。外科的処置後の癒着は実施例３に記載するように誘導された。簡単に述べれば、腹膜が腹壁上の白線に沿って１０ｃｍの長さの中線切開によって開かれた後に、体腔壁腹膜および筋肉の層（約１ｍｍの厚さ）を含む３×４ｃｍ欠損を、中線から１ｃｍで出発して右側腹壁に作製した。引き続いて、盲腸の腸間膜反対側を、出血をもたらす滅菌外科ブラシを用い、回盲腸接合から末端側の第６結腸膨起から第１２番結腸膨起に８０〜１６０回、両方向に磨耗させた。
【０２３２】
２０匹の動物を実験群：（ｉ）処理無し（ｎ＝１２）；（ｉｉ）１０ｍｌの滅菌ハイブリッドゲルで、切り出した腹壁および盲腸表面を被覆；にランダムに割り当てた。ＰＬＧＡナノ粒子（２０ｍｇ／ｍｌ  ＨＡ−ＡＤＨおよび２０ｍｇ／ｍｌナノ粒子）を持つ５ｍｌのＨＡ−ＡＤＨ、および５ｍｌのＨＡ−ＣＨＯ（２０ｍｇ／ｍｌ  ＨＡ−ＣＨＯおよび２０ｍｇ／ｍｌナノ粒子）を別の滅菌１０ｍｌシリンジに入れ、これをＢａｘｔｅｒデュアルバルブアプリケーターに連結し、１５ゲージ針を通して同時に押出した。液体前駆体は即座にゲル化を開始し、適応領域の形状に適合した。肉眼での調査に対し、ゲル化は３分以内に完了し：ヒドロゲルはその点を越えては流動しなかった。
【０２３３】
手術後ケアを実施例３に記載されているように行った。該手法から１週間後に、動物をペントバルビタールナトリウムで安楽死させた。癒着は、報告された方法（本明細書で参考として援用されるＢｕｒｎｓ  ＪＷ，Ｓｋｉｎｎｅｒ  Ｋ，Ｃｏｌｔ  Ｊ，Ｓｈｅｉｄｌｉｎ  Ａ，Ｂｒｏｎｓｏｎ  Ｒ，Ｙａａｃｏｂｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｐｏｓｔｓｕｒｇｉｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｂｙ  ｐｒｅｃｏａｔｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９５；５９：６４４−６５２）を修飾してそれに従ってスコア取りした。スコア−０は癒着無しを表し、スコア−１は重力で分離される組織癒着を表し、スコア−２は鈍的切開によって分離可能な組織癒着を表し、スコア−３は鋭的切開を必要とする癒着を表す。癒着の位置（それらが縫合部位を含むか否かを問わず；癒着に関連する盲腸膨起の位置および数）および重量の変化も記録した。
【０２３４】
組織学的調査。剖検から回収された組織を１０％ホルマリン中で固定し、パラフィン中に包埋し、薄片を作製し、標準的技術を用いてヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【０２３５】
結果
ウサギにおける腹側壁欠損−盲腸磨耗モデルでのハイブリッドゲルの生体適合性および有効性。８匹のウサギは、方法に記載したように、盲腸が磨耗され、隣接腹壁のセグメントが切り出される開腹術を受けた。ハイブリッドゲル（１０ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌ  ＨＡＸ中の２０ｍｇのナノ粒子）を傷害した部位に塗った。１週間後の剖検の時点において（表５）、それらの体重減少は対照群におけるそれに匹敵した（同一傷害、処理無し、ｎ＝１２）。中央値癒着スコアは処理された群において劇的により低かった（ｐ＝０．００２、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−検定；０．００１、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定）。対照群における動物の８３．３％はスコア３癒着を発症したが（切断によってのみ分離できたしっかりとした連結）（実施例３）、処理群においてはいずれもスコア３癒着を発症しなかった（ｐ＜０．００１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−検定；ｐ＝０．００１、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定）。処理群における８匹の動物の内５匹（６２．５％）は、対照群における１２匹の内の２匹（１６．７％）と比較して、全く組織癒着を示さなかった（図１０Ｂ）（０．０４、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−検定；ｐ＝０．０３５、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定）。
【０２３６】
スコア２の癒着を発症した３匹の動物の内、１匹は縫合部位の近くの盲腸表面および切り出された腹壁の間にあり、１匹は磨耗された盲腸および磨耗されていない盲腸の間にあり、および１匹は磨耗された盲腸および磨耗されていない盲腸の間であって、盲腸表面および縫合部位近くの傷害した腹壁の間に２つのスコア２癒着を発症した。従って、これらのスコア２癒着が起こった部位の多くは、ハイブリッドゲルで被覆されなかった部位であった。剖検に際して、ハイブリッドゲルは依然として、それらが適用された部位に存在したと認められたが、量および機械的特性は有意に低下した。いくつかの場合において、ハイブリッドゲルの残留物によって被覆された盲腸表面は、元の磨耗から痕跡量の古い血液を保持した。光学顕微鏡観察において、ポリマーデブリを含有すると推定される泡沫マクロファージは、ゲル残渣の染色されたスライド中に認められ（図１１ＡおよびＢ）；遊離ポリマー（明るいスポット）も認められた。泡沫マクロファージは肝臓または脾臓において見出されなかった（示さず）。それらは癒着を有さない傷害した腹壁の表面にも見出され（図１１ＣおよびＤ）、そこでは、ハイブリッドゲルが適用されていた。
【０２３７】
表５．ウサギモデルにおける腹膜癒着の評価
【０２３８】
【表５】
2009533455.tif 000013
括弧に入れた２５番目および７５番目パーセンタイルでの中央値
本発明者らのデータはハイブリッド系が腹膜中皮細胞に対してインビトロで低い細胞傷害性を有し、インビボで腹膜中で生体適合性であって、癒着を固有に妨げることができることを示す。後者に関しては、それは少なくとも同様にＨＡＸを実行する（実施例３）。ＨＡＸへのナノ粒子の取込みは、ゲル系のゲル化時間または剛性率に対して実質的に効果を有しなかった。ＨＡＸは、ゲル残存物中での泡沫マクロファージの存在、および肝臓および脾臓におけるそのような細胞の欠如によって見られるように、実験の持続の間、腹膜内にナノ粒子を首尾よく維持した−ここに、それらはＨＡＸ無しのナノ粒子の匹敵する塊を注射したマウスにおいて認められた。ＨＡＸは保持されたポリマーからの癒着の形成をやはり妨げた。
【０２３９】
インサイチュにて形成されるこのゲル系は、二重バレルのシリンジまたは同様なデバイスで用いるのが容易である。相対的に迅速なゲル化は、使用者が、隣接する領域へこぼれることなくゲルを特異的場所に適用することを可能とする。先に考察したように、ゲル化時間は、ポリマー濃度および／または分子量または架橋密度を変化させることによって修飾することができる。従って、この系は、腹腔鏡によって、または経皮注射によって容易に適用することができる。潜在的用途は腹膜に制限されず、それを用いて、癒着の形成を阻害する薬剤、および／または他の望ましい効果を有する薬剤を含めた広範な種々の治療剤を投与することができる。
【０２４０】
ハイブリッドゲルは、ウサギ側壁欠損−盲腸磨耗モデルにおいて腹膜癒着を妨げるのに非常に有効であった。これは、鋭的切開によってのみ分離できたしっかりとした連結であったスコア３癒着が優勢であることを比較した場合に特に明瞭であった。未処理動物における８３．３％の発生率と比較して、ハイブリッドゲルで処理された動物においてスコア３癒着はなかった（実施例３）。；同様に、処理された動物の６２．５％は対照における１７％と比較して癒着を示さなかった。（鈍的切開によって分離可能な）スコア−２組織癒着の３つの場合が、縫合部位の近く、または（その内１つは磨耗させなかった）２つの盲腸表面の間のいずれかで起こり、全ての癒着は、ハイブリッドゲルによって被覆されなかった領域を含んだ。ここに、ゲルを傷害の部位の境界内に適用された。より大きな表面領域にわたっての系の適用は、さらに、有効性を増大させることができる。結論として、本明細書中に記載されたハイブリッドＨＡＸ−ナノ粒子系は、適切な腹腔内薬物送達系、ならびに外科的処置後癒着を妨げるための有効なバリアであるようである。
【０２４１】
（実施例１０：ｔＰＡを含有するインサイチュ架橋ＨＡゲルによる反復された開腹術モデルにおける腹膜癒着の防止）
材料および方法
ゲル濃度の最適化。ＨＡ−ＡＤＨおよびＨＡ−ＣＨＯは上記のように調製した。ＨＡＸゲルは、最大達成可能濃度を含めた異なる濃度の種々のＭｗのＨＡ−ＡＤＨおよびＨＡ−ＣＨＯの溶液で調製した。ＨＡＸゲルは、ボルテックスミキサーを用いて２ｍｌの微量遠心管中で１５０μｌのＨＡ−ＡＤＨおよび１５０μｌのＨＡ−ＣＨＯ溶液を混合し、次いで、ヒアルロニダーゼ（ＰＢＳ中５０Ｕ／ｍｌ）中で３７℃にてインキュベートすることによって調製した。所定の時点において、ヒアルロニダーゼ緩衝液を完全に除去し、残存するＨＡＸゲルの湿潤塊を重量測定により決定した。
【０２４２】
反復開腹術モデル。雌シロウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ；Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ）（３±０．５ｋｇ）を用いた。第一の開腹術および手術後ケアは上記のように行った。第二の開腹術は１週間後に行った。第二の開腹術前の調査では、動物は、以下：（ｉ）第一の開腹術以来の１５％を超える体重減少；（ｉｉ）乏しい摂食を第二の開腹術から排除した。開腹術に際しては、従前のように癒着をスコア取りし、次いで、溶解（切断）した。従前に切り出された腹壁は１方向に５０回、再度磨耗させ、６〜１２番膨起の間の盲腸表面を、出血床が得られるまで滅菌ブラシを用いて両方向に１５０〜２００回、再度磨耗させた。
【０２４３】
３０匹の動物を実験群にランダムに割り当て、試験材料を傷害した領域に適用した。オペレーターは材料の性質いついては知らされていなかった。ＨＡ−ＡＤＨおよびＨＡ−ＣＨＯを殺微生物ＵＶ照射によって２時間滅菌し、各々、５ｍｌ滅菌生理食塩水に溶解させた。１０ｍｌのゲルを、従前のように、デュアルバルブアプリケーターで傷害した部位に適用した。対照として、動物の群は処理を受け、別の群は１０ｍｌの生理食塩水を受けた。
【０２４４】
傷害した領域の処理の後、腹膜および腹壁を各々、２−０エチロン（Ｅｔｈｉｌｏｎ）および３−０デッキソン（Ｄｅｘｏｎ）で閉じた。皮膚を２−０エチロンで閉じた。動物を覚醒させ、食物および水を自由に摂取させた。外科的処置後４８時間まで、ブプレノルフィン０．０２〜０．０３ｍｇ／ｋｇを８〜１２時間間隔で皮下投与した。第二の開腹術後１週間に、ペントバルビタールナトリウムの静脈内注射によって動物を屠殺した。癒着は２つの方法でスコア取りした。（ｉ）癒着の質は以下のようにスコア取りした：報告された方法の修飾を用いて癒着をスコア取りした（本明細書で参考として援用されるＢｕｒｎｓ  ＪＷ，Ｓｋｉｎｎｅｒ  Ｋ，Ｃｏｌｔ  Ｊ，Ｓｈｅｉｄｌｉｎ  Ａ，Ｂｒｏｎｓｏｎ  Ｒ，Ｙａａｃｏｂｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｐｏｓｔｓｕｇｉｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｂｙ  ｐｒｅｃｏａｔｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９５；５９：６４４−６５２）。スコア０＝癒着無し、スコア１＝重力で分離するであろう組織癒着、スコア２＝鈍的切開によって分離可能な組織癒着、スコア３＝鋭的切開を必要とする癒着。異なるスコアの多数の癒着がある場合、本発明者らは、代表的なスコアとしてより高いのを選択する。（ｉｉ）スコア２または３の癒着の領域を、癒着の量的評価のために測定した。癒着の位置（それらが縫合部位を含むか否かは問わない；癒着に関与する盲腸膨起の位置および数）および体重変化を記録した。剖検から回収した組織を１０％ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋し、薄片を作製し、組織学的調査のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【０２４５】
結果
従前に使用されたＨＡ溶液の濃度の増加は、それらの粘度によって妨げられた（特に、ＨＡ−ＡＤＨ）。濃度をさらに増大させるために、本発明者らは、より低いＭｗのＨＡを用いて修飾されたＨＡを調製した。表６に示すように、（ピペットまたはシリンジで操作することができる）最大の現実的な濃度はＨＡの減少するＭｗに伴って増大した。
【０２４６】
表６．修飾されたＨＡ溶液の最大濃度
【０２４７】
【表６】
2009533455.tif 000014
＊列挙されたＭｗは元のＨＡの公証Ｍｗであることを注記する。
【０２４８】
ゲル濃度最適化。増大した濃度を持つ全てのＨＡＸゲルは、２０ｍｇ／ｍｌ  ＨＡＸゲルよりも有意に長く継続した（表７）。最長に継続したのは最高の濃度ではなかったことを注記する。高い密度にもかかわらず、（骨格上に多くのニックを有する）低いＭｗ  ＨＡよりなるゲルは、より遅い段階の分解において速い質量損失を受けてしまったようであった。試験したＨＡ組合せのうちで、７５ｍｇ／ｍｌ  ＨＡ−Ａ（５０ｋＤ）および６０ｍｇ／ｍｌ  ＨＡ−Ｂ（１．３６ＭＤ）は、最もゆっくりと分解するＨＡＸゲルを提供した（５０  ｕ／ｍｌ  ＨＡｓｅにおけるｔ１／２：５１日）。７５ｍｇ／ｍｌ  ＨＡ−ＡＤＨ（５０ｋＤ）＋６０ｍｇ／ｍｌ  ＨＡ−ＣＨＯ（１．３６ＭＤ）から形成されたゲルをＨＡＸｈｘという。
【０２４９】
表７．５０ｕ／ｍｌ  ＨＡｓｅにおけるＨＡＸゲルの半減期
【０２５０】
【表７】
2009533455.tif 000015
ａ．ヒドロゲル湿潤質量が５０％だけ減少する時間
ｂ．外挿によって決定
反復開腹モデルの開発。このモデルは広範囲の再現性がある癒着を生じる。それは普通に用いられない。なぜならば、それが作り出す豊富な癒着は、処置するのに極端に困難だからである。反復された開腹モデルにより、本発明者らは、商業的な製品が限定された効果を示すに過ぎなかった、重篤な癒着および／または再発癒着を妨げることにおいて本発明者らの候補材料の有効性を評価することが可能となる。さらに、このモデルにより、本発明者らは、これまでの例に記載されたものより効果的である材料を同定することが可能となる。
【０２５１】
３０匹の動物のうち、２９匹は、最初の開腹後にスコア−３癒着（また、部分的にスコア２）を発症した（９６．７％）。癒着は切り出された腹部壁および磨耗された盲腸膨起に最も関係したが、しばしば、磨耗していない盲腸に関係した（ほとんど回盲腸接合の周り；なぜならば、その位置はそれを切り出された腹壁と接触させるからである）。動物は、最初の開腹から第１週間の間に体重の−６．１±３．９％を喪失した。癒着は、鋭的切開または鈍的切開によって注意深く溶解させた。溶解は、しばしば、腹壁上の深い傷害および引き続いての出血をもたらした。再度磨耗した盲腸は、最初の磨耗におけるよりも容易に出血した。切開がいずれの処置もなくして閉じた場合、１００％（ｎ＝６）は、１週間後に再度調査するとスコア３の癒着を発症した。癒着は傷害した位置に限定されないが、腹壁、傷害していない盲腸表面、および／または盲腸間、盲腸間−基部側結腸表面の縫合線を含んだ。癒着の中央値合計面積は１２．７（２５％：９．４，７５％：１６．６）ｃｍ２であった。第二の開腹後の１週間の生存期間の間に、動物は体重の−３．５±７．４％を喪失した。
【０２５２】
ヒドロゲルのインビボ効果。ｔＰＡ−ＨＡＸｈｘゲルのインビボ効力は、反復された開腹モデルを用いて試験し、ＨＡＸのそれ、および１：１粒子：ＨＡ誘導体比率（ｗ／ｗ）のＰＬＧＡナノ粒子を含有するハイブリッドゲルのそれと比較した。さらなる対照として、本発明者らは、ｔＰＡが熱処理によって不活化されたｔＰＡ−ＨＡＸｈｘゲル；（ｉｉ）ＨＡＸの非存在下におけるｔＰＡ溶液のボーラスを投与した。実験プロトコルを以下にまとめる：
【０２５３】
【化８】
2009533455.tif 000016
結果を表８にまとめる。簡単に述べれば、高濃度のＨＡ誘導体を用いて達成された高い架橋密度（「ｈｘ」）を持つｔＰＡ−ＨＡＸは、二重傷害モデルにおいて癒着を妨げるのに最も効果的であった。ＨＡＸ（ｈｘ）は有意に効果的でなかったが（ｔＰＡはそうでなかった）、不活性なｔＰＡ−ＨＡＸ（ｈｘ）およびボーラスｔＰＡ（ｔＰＡ溶液は傷害された組織に適用された）は、共に、癒着面積の低下に寄与した。いずれの理論に拘束されることを望まないが、この効果はアクチバーゼ（Ａｃｔｉｖａｓｅ）（ｔＰＡ，Ｇｅｎｚｙｍｅ）における不活性な成分に関するものであってよい。１００ｍｇのｔＰＡを含有するアクチバーゼは３．５ｇ  Ｎ−アルギニン、１ｇのリン酸、ポリソルベート８０（＜１１ｍｇ）を含有する。したがって、これらの薬剤は、個々に、または組合せて本発明のヒドロゲルに含めるのに適している。
【０２５４】
まとめると、ＨＡＸおよびハイブリッドゲルはこのモデルにおいて高グレードの癒着の比較的中程度の低下（約１７％）を行い、一方で、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）を含有するＨＡＸは６０％だけ高グレードの癒着の発生を劇的に低下させ、それらの癒着の表面積を１００倍低下させた。重要なことには、この治療的利益は、遊離ｔＰＡの使用で報告された主な問題であった全身出血をこうむることなく得られた。
【０２５５】
表８：ｔＰＡを含有するＨＡＸゲルの効力
【０２５６】
【表８】
2009533455.tif 000017
１  ｔＰＡはＧｅｎｚｙｍｅによって供給された通りに用いた（２２ｍｇアクチバーゼ＋Ｌ−アルギニン＋リン酸＋ポリソルベート８０）
２  ｔＰＡは２０分間の煮沸によって不活化された。タンパク質の立体配座の破壊はＥＬＩＳＡによって確認した。
【０２５７】
（実施例１１：ＨＡおよびセルロース誘導体のインサイチュ架橋によって形成されえたヒドロゲルによる経口癒着の予防）
本実施例は、ＨＡ、およびＣＮＣ（カルボキシメチルセルロース）、ＭＣ（メチルセルロース）、およびＨＰＭＣ（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）のようなセルロース誘導体よりなるインサイチュ架橋可能ヒドロゲルの開発を記載する。
【０２５８】
材料および方法
ＨＡ−ＡＤＨ、ＨＡ−ＣＨＯ、ＣＭＣ−ＣＨＯ、ＭＣ−ＣＨＯ、ＨＰＭＣ−ＣＨＯの調製：プロトコルは、上記のＨＡ−ＣＨＯの合成で用いたものと実質的に同一であった。
【０２５９】
ディスクヒドロゲルの調製：２重量％ＨＡ−ＡＤＨおよび２重量％ＨＡ−ＣＨＯ、ＣＭＣ−ＣＨＯ、ＨＰＭＣ−ＣＨＯ、またはＭＣ−ＣＨＯの水性溶液を、二重シリンジを用いて２つのスライドガラスの間にサンドイッチにしたゴム金型中で混合した。調製されたヒドロゲルの直径および厚さは、各々、１．２ｃｍおよび３．５ｍｍであった。
【０２６０】
結果
ＣＭＣ−ＣＨＯ、ＨＰＭＣ−ＣＨＯ、およびＭＣ−ＣＨＯの合成および特徴付け。成功した合成はＮＭＲおよびＦＴ−ＩＲによって示した。ＧＰＣによって測定された重量平均分子量Ｍｗは１０３〜１０７であった。ＨＡ−ＣＨＯ、ＣＭＣ−ＣＨＯ、ＨＰＭＣ−ＣＨＯ、およびＭＣ−ＣＨＯの修飾度は約５０％であった。
【０２６１】
ＨＡ−ＣＭＣ、ＨＡ−ＨＰＭＣ、およびＨＡ−ＭＣのゲル化時間：種々のヒドロゲルを、ＨＡ−ＡＤＨ、およびＣＭＣ−ＣＨＯ、ＭＣ−ＣＨＯ、およびＨＰＭＣ−ＣＨＯのような異なるアルデヒド多糖の架橋によって形成した。（ＨＡ−ＡＤＨおよびＨＡ−ＣＨＯを架橋することによって形成された）ＨＡＸ、ＨＡ−ＨＰＭＣ、ＨＡ−ＭＣ、およびＨＡ−ＣＭＣのゲル化時間は、表９に示すように約３〜１８秒の範囲であり、これは、インサイチュ架橋についてそれらの適合性を示す。
【０２６２】
ＨＡ−ＣＭＣ、ＨＡ−ＨＰＭＣ、およびＨＡ−ＭＣの剛性率Ｇ：レオメーターによって測定されたＧ測定値を表９に示した。ＨＡ−ＨＰＭＣおよびＨＡ−ＭＣは比較的高い値を示した。
【０２６３】
表９．ＨＡ−ＣＭＣ、ＨＡ−ＨＰＭＣ、およびＨＡ−ＭＣのゲル化時間および剛性率
【０２６４】
【表９】
2009533455.tif 000018
ヒドロゲルの腹膜への注射。０．５ｍｌ  ２重量％ＨＡ−ＡＤＨおよび０．５ｍｌ  ２重量％ＣＭＣ−ＣＨＯ（またはＭＣ−ＣＨＯ、ＨＰＭＣ−ＣＨＯ）よりなる１ｍｌのヒドロゲルをマウス腹膜に注射した。これらのヒドロゲルは、マウスの腹膜への注射の後に非常に生体適合性であった。注射から４日後に、ＨＡ−ＨＰＭＣゲルは粘着性の塊として見出された。他方、ＨＡ−ＣＭＣおよびＨＡＸはキャビティを通じて広げ、全ての器官を被覆した。ＨＡ−ＭＣは中程度の構造／コンシステンシーを有した。注射から２週間後に、ＨＡＸを注射した動物においてほとんど残渣はなかった。ＨＡ−ＨＰＭＣゲルは、依然として、２週間においてそのままであった。ＨＡ−ＣＭＣゲルもまた依然として存在し、薄層として内臓を被覆した。これらのゲルの注射は、表１０に示したように、腹膜癒着を引き起こさなかった。
【０２６５】
表１０：癒着の罹患率
【０２６６】
【表１０】
2009533455.tif 000019
実施例３に記載されたウサギ磨耗モデルにおいて癒着を阻害する、ＨＡ誘導体およびセルロース誘導体の架橋によって形成された複合ヒドロゲルの能力も試験した。簡単に述べれば、ＨＡ−ＡＤＨをＣＭＣ−ＣＨＯ、ＭＣ−ＣＨＯ、およびＨＰＭＣ−ＣＨＯと一緒に投与して、２重量％のＨＡ−ＣＭＣ、ＨＡ−ＭＣ、ＨＡ−ＨＰＭＣヒドロゲルを形成した。生理食塩水注射を対照として用いた。表１１に示すように、ＨＡ−ＣＭＣ、ＨＡ−ＭＣ、およびＨＡ−ＨＰＭＣは、良好な腹膜癒着予防効果を示した。
【０２６７】
表１１：ウサギ試験の結果（群当たり４匹のウサギ）
【０２６８】
【表１１】
2009533455.tif 000020
（実施例１２：ヒアルロン酸（ＨＡ）およびセルロース誘導体のインサイチュ架橋ヒドロゲルによる腹膜癒着の予防）
緒言
手術後腹膜癒着は骨盤疼痛、腸閉塞および不妊症を引き起こしかねない（本明細書で参考として援用されるＤｉＺｅｒｅｇａ，Ｇ．Ｓ．，Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ．１９９９．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）。多数の膜バリアデバイスが、種々の程度の成功度をもって商業的に開発されている（本明細書で参考として援用されるＤｉＺｅｒｅｇａ，Ｇ．Ｓ．，Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ．１９９９．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）。２つの異なるポリマーの単純な混合によってインサイチュで形成されたゲルはこの目的で魅力的である。なぜならば、それらは室温で扱うのが容易であって、放射光源または毒性架橋剤を必要としないからである（本明細書で参考として援用されるＪｏｈｎｓ，Ｄ．Ｂ．；Ｒｏｄｇｅｒｓ，Ｋ．Ｅ．；Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｗ．Ｄ．；Ｋｉｏｒｐｅｓ，Ｔ．Ｃ．；ｄｉＺｅｒｅｇａ，Ｇ．Ｓ．，Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｏｎｉｃａｌｌｙ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  １９９７；６８（１）：３７−４２；Ｌｉ，Ｈ．；Ｌｉｕ，Ｙ．Ｃ．；Ｓｈｕ，Ｘ．Ｚ．；Ｇｒａｙ，Ｓ．Ｄ．；Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ，Ｇ．Ｄ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ−ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００４；５（３）：８９５−９０２；Ｌｉｕ，Ｙ．Ｃ．；Ｌｉ，Ｈ．；Ｓｈｕ，Ｘ．Ｚ．；Ｇｒａｙ，Ｓ．Ｄ．；Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ，Ｇ．Ｄ．，Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ  ｒｅｄｕｃｅ  ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ．Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  ２００５；８３：１２７５−１２８３；Ｏｈ，Ｓ．Ｈ．；Ｋｉｍ，Ｊ．Ｋ．；Ｓｏｎｇ，Ｋ．Ｓ．；Ｎｏｈ，Ｓ．Ｍ．；Ｇｈｉｌ，Ｓ．Ｈ．；Ｙｕｋ，Ｓ．Ｈ．；Ｌｅｅ，Ｊ．Ｈ．，Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｓｔｓｕｒｇｉｃａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇ−ｌｏａｄｅｄ  ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｏｌ−ｇｅｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｂｅｈａｖｉｏｒ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ  ２００５；７２（３）：３０６−１６；Ｙｅｏ，Ｙ．；Ｈｉｇｈｌｅｙ，Ｃ．；Ｂｅｌｌａｓ，Ｅ．；Ｉｔｏ，Ｔ．；Ｍａｒｉｎｉ，Ｒ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．，Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６；２７：４６９８−４７０５；Ｂｕｌｐｉｔｔ，Ｐ．；Ａｅｓｃｈｌｉｍａｎｎ，Ｄ．，Ｎｅｗ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９；４７（２）：１５２−１６９；Ｊｉａ，Ｘ．Ｑ．；Ｃｏｌｏｍｂｏ，Ｇ．；Ｐａｄｅｒａ，Ｒ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．Ｓ．，Ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃｉａｔｉｃ  ｎｅｒｖｅ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｂｙ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｂｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００４；２５（１９）：４７９７−４８０４）。それらは、一般には、特に、それらが単純なシートで被覆するのが困難である場合、または面積が非常に大きい場合、傷害した領域に適応するのがより容易である。
【０２６９】
ヒアルロン酸（ＨＡ）はそのような適用のための良好な候補材料である（その各々が本明細書に参考として援用されるＪｏｈｎｓ，Ｄ．Ｂ．；Ｒｏｄｇｅｒｓ，Ｋ．Ｅ．；Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｗ．Ｄ．；Ｋｉｏｒｐｅｓ，Ｔ．Ｃ．；ｄｉＺｅｒｅｇａ，Ｇ．Ｓ．，Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｏｎｉｃａｌｌｙ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  １９９７；６８（１）：３７−４２；Ｌｉ，Ｈ．；Ｌｉｕ，Ｙ．Ｃ．；Ｓｈｕ，Ｘ．Ｚ．；Ｇｒａｙ，Ｓ．Ｄ．；Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ，Ｇ．Ｄ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ−ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００４；５（３）：８９５−９０２；Ｌｉｕ，Ｙ．Ｃ．；Ｌｉ，Ｈ．；Ｓｈｕ，Ｘ．Ｚ．；Ｇｒａｙ，Ｓ．Ｄ．；Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ，Ｇ．Ｄ．，Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ  ｒｅｄｕｃｅ  ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ．Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  ２００５；８３：１２７５−１２８３；Ｙｅｏ，Ｙ．；Ｈｉｇｈｌｅｙ，Ｃ．；Ｂｅｌｌａｓ，Ｅ．；Ｉｔｏ，Ｔ．；Ｍａｒｉｎｉ，Ｒ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．，Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６；２７：４６９８−４７０５；Ｂｕｌｐｉｔｔ，Ｐ．；Ａｅｓｃｈｌｉｍａｎｎ，Ｄ．，Ｎｅｗ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９；４７（２）：１５２−１６９；Ｊｉａ，Ｘ．Ｑ．；Ｃｏｌｏｍｂｏ，Ｇ．；Ｐａｄｅｒａ，Ｒ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．Ｓ．，Ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃｉａｔｉｃ  ｎｅｒｖｅ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｂｙ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｂｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００４；２５（１９）：４７９７−４８０４）。なぜならば、ＨＡは腹膜において生体適合性であることがよく知られており（本明細書で参考として援用されるＤｉＺｅｒｅｇａ，Ｇ．Ｓ．，Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ．１９９９．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、化学的に架橋されたＨＡヒドロゲル（ＨＡＸ）はウサギモデルにおいて腹膜癒着を妨げることができるからである（本明細書で参考として援用されるＹｅｏ，Ｙ．；Ｈｉｇｈｌｅｙ，���．；Ｂｅｌｌａｓ，Ｅ．；Ｉｔｏ，Ｔ．；Ｍａｒｉｎｉ，Ｒ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．，Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６；２７：４６９８−４７０５）。ヒアルロン酸は、内因性ヒアルロニダーゼによって（本明細書で参考として援用されるＫｎｅｐｐｅｒ，Ｐ．Ａ．；Ｆａｒｂｍａｎ，Ａ，Ｉ．；Ｔｅｌｓｅｒ，Ａ．Ｇ．，Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅｓ  Ａｎｄ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ−Ａｃｉｄ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｅｙｅ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８４；２５（３）：２８６−２９３）、およびヒドロゲルラジカルによって（その各々が本明細書に参考として援用されるＳｏｌｔｅｓ，Ｌ．；Ｍｅｎｄｉｃｈｉ，Ｒ．；Ｋｏｇａｎ，Ｇ．；Ｓｃｈｉｌｌｅｒ，Ｊ．；Ｓｔａｎｋｏｖｓｋａ，Ｍ．；Ａｒｎｈｏｌｄ，Ｊ．，Ｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｎ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００６；７（３）：６５９−６６８；Ｙｕｉ，Ｎ．；Ｏｋａｎｏ，Ｔ．；Ｓａｋｕｒａｉ，Ｙ．，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ−Ａｃｉｄ  Ｇｅｌｓ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ  １９９２；２２（２）：１０５−１１６）分解される。本発明者らは、ＨＡＸゲルが実質的に１週間以内に分解し、かなり低下した量のゲルを腹膜に残すことを示した（本明細書で参考として援用されるＹｅｏ，Ｙ．；Ｈｉｇｈｌｅｙ，Ｃ．；Ｂｅｌｌａｓ，Ｅ．；Ｉｔｏ，Ｔ．；Ｍａｒｉｎｉ，Ｒ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．，Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６；２７：４６９８−４７０５）。傷害の重症度または面積に依存して、しかしながら、腹膜においてより長く継続することができるヒドロゲルを設計するのは有益であろう。本発明者らは、ＨＡと、ヒトにおいて酵素により分解されない他の生体適合性多糖とのハイブリダイゼーションは、ＨＡの優れた生体適合性を維持しつつ分解を遅らせることができると仮定した。カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（その各々が本明細書に参考として援用されるＥｌｋｉｎｓ，Ｔ．Ｅ．；Ｂｕｒｙ，Ｒ．Ｊ．；Ｒｉｔｔｅｒ，Ｊ．Ｌ．；Ｌｉｎｇ，Ｆ．Ｗ．；Ａｈｏｋａｓ，Ｒ．Ａ．；Ｈｏｍｓｅｙ，Ｃ．Ａ．；Ｍａｌｉｎａｋ，Ｌ．Ｒ．，Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｂｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｒａｔ．１．Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒ���ｌ  １９８４；４１（６）９２６−９２８；Ｌｉｕ，Ｌ．Ｓ．；Ｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．，Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｂａｒｒｉｅｒｓ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｇｅｌｓ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２；６３（３）：３２６−３３２；Ｌｅｈｒ，Ｃ．Ｍ．；Ｂｏｕｗｓｔｒａ，Ｊ．Ａ．；Ｓｃｈａｃｈｔ，Ｅ．Ｈ．；Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｅ．，Ｉｎｖｉｔｒｏ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ｃｈｉｔｏｓａｎ  Ａｎｄ  Ｓｏｍｅ  Ｏｔｈｅｒ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  １９９２；７８（１）：４３−４８；Ｌｅａｃｈ，Ｒ．Ｅ．；Ｂｕｒｎｓ，Ｊ．Ｗ．；Ｄａｗｅ，Ｅ．Ｊ．；ＳｍｉｔｈＢａｒｂｏｕｒ，Ｍ．Ｄ．；Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｍ．Ｐ．，Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｓｔｓｕｒｇｉｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｂｂｉｔ  ｕｔｅｒｉｎｅ  ｈｏｒｎ  ｍｏｄｅｌ  ｗｉｔｈ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ／ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｇｅｌ．Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  １９９８；６９（３）：４１５−４１８）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）（本明細書で参考として援用されるＬｅｈｒ，Ｃ．Ｍ．；Ｂｏｕｗｓｔｒａ，Ｊ．Ａ．；Ｓｃｈａｃｈｔ，Ｅ．Ｈ．；Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｅ．，Ｉｎｖｉｔｒｏ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ｃｈｉｔｏｓａｎ  Ａｎｄ  Ｓｏｍｅ  Ｏｔｈｅｒ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  １９９２；７８（１）：４３−４８）のようなセルロース誘導体も、腹膜において良好な生体適合性を有することも知られている。腹膜におけるメチルセルロース（ＭＣ）の生体適合性は知られていないが、ＭＣおよびＨＡの混合物はくも膜下腔注射において生体適合性であることが報告されている（本明細書で参考として援用されるＧｕｐｔａ，Ｄ．；Ｔａｔｏｒ，Ｃ．Ｈ．；Ｓｈｏｉｃｈｅｔ，Ｍ．Ｓ．，Ｆａｓｔ−ｇｅｌｌｉｎｇ  ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  ｂｌｅｎｄ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｊｕｒｅｄ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６；２７：２３７０−２３７９）。
【０２７０】
本発明者らは、ＨＡ、およびＣＭＣ，ＨＰＭＣおよびＭＣのようなセルロース誘導体よりなる群から選択されるインサイチュ架橋注射ヒドロゲルを合成した。本発明者らは、これらのヒドロゲルをインビトロで特徴付け、細胞培養においてそれらの細胞傷害性を研究し、マウス腹膜においてそれらの生体適合性を研究した。最後に、本発明者らは、ウサギモデルにおいて腹膜癒着の防止におけるそれらの有効性を検討した。
【０２７１】
材料および方法
ポリマーおよびヒドロゲルの合成
試薬：ＨＡ（ＭＷ＝４９０ｋＤａおよび１．４ＭＤａ）はＧｅｎｚｙｍｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から購入した。ＣＭＣ（製品番号：Ｃ４８８８）、ＨＰＭＣ（製品番号：Ｈ９２６２）、ＭＣ（製品番号：Ｍ０３８７）、ヒアルロニダーゼ、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）、１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−カルボジイミド（ＥＤＣ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、過ヨウ素酸ナトリウム、エチレングリコール、ｔｅｒｔ−ブチルカルバザート（ｔ−ＢＣ）、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、および酢酸はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。Ｓｈｏｗａ  Ｄｅｎｋｏ（日本）から購入したプルランを、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）のための標準として用いた。
【０２７２】
アルデヒドポリマーの調製：１．４ＭＤａ  ＨＡ、ＣＭＣ、ＨＰＭＣ、およびＭＣは、図１２に示したように、アルデヒド形態（各々、ＨＡ−ＣＨＯ、ＣＭＣ−ＣＨＯ、ＨＰＭＣ−ＣＨＯ、およびＭＣ−ＣＨＯ）に修飾した。プロトコルは、ＨＡ−ＣＨＯで従前に用いられたものと同様であった（その各々が本明細書に参考として援用されるＫｏｈａｎｅ  ＤＳ，Ｌｉｐｐ  Ｍ，Ｋｉｎｎｅｙ  ＲＣ，Ａｎｔｈｏｎｙ  ＤＣ，Ｌｏｕｉｓ  ＤＮ，Ｌｏｔａｎ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｕｇａｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｐｉｎｅｕｒｉｕｍ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２；５９（３）：４５０−４５９；Ｋｏｈａｎｅ  ＤＳ，Ｔｓｅ  ＪＹ，Ｙｅｏ  Ｙ，Ｐａｄｅｒａ  Ｒ，Ｓｈｕｂｉｎａ  Ｍ，Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ．  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ａｎｄ  ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｔｏｎｅｕｍ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５：Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ；Ｏｒｉｔａ  Ｈ，Ｆｕｋａｓａｗａ  Ｍ，Ｇｉｒｇｉｓ  Ｗ，ｄｉＺｅｒｅｇａ  ＧＳ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｓｔｓｕｒｇｉｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ：ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｆｅｒｔｉｌ  １９９１；３６（３）：１７２−１７７）。簡単に述べれば、１．５ｇのＨＡ、ＣＭＣ、ＨＰＭＣ、またはＭＣを１５０ｍｌの水に溶解させ、８０２ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウムを加え、２時間攪拌した。２００μｌのエチレングリコールを加え、反応を停止させ、混合物を水に対して直ちに透析した。精製された産物を凍結乾燥し、４℃に維持した。
【０２７３】
ヒドラジドポリマーの調製：４９０ｋＤａ  ＨＡを、従前に記載された方法を用いてアジピン酸ジヒドラジドＨＡ（ＨＡ−ＡＤＨ）に修飾した（その各々を、本明細書に参考として援用されるＹｅｏ，Ｙ．；Ｈｉｇｈｌｅｙ，Ｃ．；Ｂｅｌｌａｓ，Ｅ．；Ｉｔｏ，Ｔ．；Ｍａｒｉｎｉ，Ｒ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．，Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６；２７：４６９８−４７０５；Ｂｕｌｐｉｔｔ，Ｐ．；Ａｅｓｃｈｌｉｍａｎｎ，Ｄ．，Ｎｅｗ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９；４７（２）：１５２−１６９；Ｊｉａ，Ｘ．Ｑ．；Ｃｏｌｏｍｂｏ，Ｇ．；Ｐａｄｅｒａ，Ｒ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．Ｓ．，Ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃｉａｔｉｃ  ｎｅｒｖｅ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｂｙ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｂｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００４；２５（１９）：４７９７−４８０４）。
【０２７４】
ディスクヒドロゲルの調製：ＰＢＳ中の２重量％ＨＡ−ＡＤＨ、およびＰＢＳ中の２重量％  ＨＡ−ＣＨＯ、ＣＭＣ−ＣＨＯ、ＨＰＭＣ−ＣＨＯ、またはＭＣ−ＣＨＯを、二重−ばれるシリンジ（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）を用いて２つのスライドガラスの間にサンドイッチにされたゴム金型に注入した。調製されたヒドロゲルの直径および厚さは、各々、１．２ｃｍおよび３．５ｍｍであった。以下、これらの架橋されたヒドロゲルを、各々、ＨＡＸ、ＨＡ−ＣＭＣ、ＨＡ−ＨＰＭＣ、およびＨＡ−ＭＣと呼ぶ。
【０２７５】
ポリマーおよびヒドロゲルの特徴付け
ポリマーの特徴付け：Ｄ２Ｏ中のＨＡ−ＡＤＨ、ＨＡ−ＣＨＯ、ＣＭＣ−ＣＨＯ、ＨＰＭＣ−ＣＨＯおよびＭＣ−ＣＨＯの１０ｍｇ／ｍｌ溶液の１Ｈ−ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ：Ｕｎｉｔｙ３００分光光度計、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）分光分析を行った。アルデヒドポリマー（ＨＡ−ＣＨＯ、ＣＭＣ−ＣＨＯ、ＨＰＭＣ−ＣＨＯ、およびＭＣ−ＣＨＯ）を、Ｊｉａ，Ｘ．Ｑ．；Ｃｏｌｏｍｂｏ，Ｇ．；Ｐａｄｅｒａ，Ｒ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．Ｓ．，Ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃｉａｔｉｃ  ｎｅｒｖｅ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｂｙ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００４；２５（１９）：４７９７−４８０４に記載されたようにｔ−ＢＣと反応させた後に分析した。ｔ−ＢＣに反応したポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルをＤ２Ｏにおいて測定した。
【０２７６】
多糖の分子量を、ＧＰＣを用いて測定した。カラムはＵｌｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ  Ｌｉｎｅａｒ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）であり、屈折率（ＲＩ）は屈折率計（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＯＰＴＩＬＡＢ  ＤＳＰ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）によって検出した。移動相は０．０５Ｍナトリウムおよび０．２Ｍ塩化ナトリウムの混合液（ｐＨ＝６．７）であり、その流速は０．８ｍｌ／分であった。プルラン（Ｓｈｏｄｅｘ，Ｐｕｌｌｕｌａｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｐ５−Ｐ８００，日本）を分子量の標準として用いた。
【０２７７】
ヒドロゲルの特徴付け：ゲル化時間は以下のプロトコルによって測定した。１００μリットルの水性ＨＡ−ＣＨＯ、ＣＭＣ−ＣＨＯ、ＨＰＭＣ−ＣＨＯ、またはＭＣ−ＣＨＯ溶液を１００μｌの水性ＨＡ−ＡＤＨ溶液に加え、これを、ホットプレート／スターラー（Ｃｏｒｎｉｎｇ：Ｍｏｄｅｌ  ＰＣ−３２０，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を用いて１５５ｒｐｍにおいてペトリ皿上の磁性撹拌バーで混合した。ゲル化時間が、混合物が小球となるまでの時間であった；それを試料当たり４回測定した。
【０２７８】
調製されたディスクゲルの剛性率をレオメーター（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ：ＡＲ１０００，Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）で測定した。ディスクゲルをＰＢＳ中に５日間浸漬させ、平衡するまで膨潤させた。クループおよび緩和試験を異なる剪断応力で行った。剪断を３分間適用し、続いて、３分緩和させた。歪み値はクリープ試験の間に一定に到達し、次いで、各測定において緩和試験の間に０まで復帰した。剛性率Ｇは、応力および歪みの間の直線関係の傾きから計算した。応力および歪みの間のフィットさせた線のＲ２値は０．９５を超えた。
【０２７９】
ゲルディスクの膨潤の時間経過は、３７℃にてＰＢＳ中で重量測定により測定した。ゲル化後のヒドロゲルの重量Ｗｓは、ＰＢＳ中での５日間の浸漬後に測定した。ゲル化直後のヒドロゲルの初期重量Ｗｉに対するＷｓの膨潤比率ＱはＱ＝Ｗｓ／Ｗｉとして計算された。
【０２８０】
分解動態は以下のように測定された：４つのヒドロゲルディスクは、１０単位／ｍｌのヒアルロニダーゼ中で３７℃にてＰＢＳ中でインキュベートした。各時点において、ゲルディスクを秤量し、ヒアルロニダーゼ溶液を交換した。測定は１４日にわたって行った。初期容量に対する各時点におけるヒドロゲルの容量の比率を決定した（ヒドロゲルの容量（％））。
【０２８１】
細胞傷害性アッセイ
ＨＡ−ＣＨＯ、ＣＭＣ−ＣＨＯ、ＭＣ−ＣＨＯ、およびＨＰＭＣ−ＣＨＯの存在下におけるインビトロ細胞生存率は、ヒト中皮細胞系（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−９４４４，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）およびマクロファージ細胞系Ｊ７７４．Ａ１（ＡＴＣＣ：ＴＩＢ−６７ＴＭ）を用いるＭＴＴアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって調べた。
【０２８２】
中皮細胞を成長させ、５％ＣＯ２中で３７℃にて、完全成長培地（ＧＩＢＣＯを：３．３ｎＭ上皮成長因子、４００ｎＭヒドロコルチゾン、８７０ｎＭインスリン、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１０％ウシ胎仔血清を補充した、ＥａｒｎｅのＢＳＳ、０．７５ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１．２５  ｇ／ｌ炭酸水素ナトリウム）中で維持した。マクロファージを、ＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣを：１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭカタログ番号１０５６９−０１０）中で成長させ、維持した。５×１０４個の細胞を２４ウェルプレートの各ウェル中に入れ、５％ＣＯ２中で３７℃にて一晩インキュベートし、次いで、培地を、異なる濃度のＨＡ−Ｂ、ＣＭＣ−Ｂ、ＨＰＭＣ−Ｂ、およびＭＣ−Ｂを含有する培地と交換した。中皮細胞の場合に材料を加えた後、３日目、またはＪ７７４．Ａ１細胞の場合には２日目に、ＭＴＴアッセイを行った。１００μｌのテトラゾリウム塩溶液を各ウェルに加え、３７℃にて４時間インキュベートした。活性なミトコンドリアによって生産された紫色ホルマザンを、１ｍｌ洗剤溶液を用いて可溶化させ、次いで、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ：ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ３８４，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって５７０ｎｍで読んだ。吸光度値を、細胞をポリマーで処理していなかったウェルに対して正規化した。
【０２８３】
インビボ実験
全ての動物を、テクノロジーのマサチューセッツ制度の動物ケアおよび使用委員会および実験施設動物ケアの原則（ＮＩＨ公表＃８５−２３、１９８５年改定）によって認可されたプロトコルに従って世話した。
【０２８４】
ヒドロゲルのマウス腹膜への注入
２５ｇの体重のＳＶ１２９マウスはＴａｃｏｎｉｃ（Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＹ）から購入し６  ＡＭ−６  ＰＭ明−暗サイクルにてグループで収容した。
【０２８５】
ポリマーをＵＶ照射によって２時間滅菌し、次いで、２重量％濃度の生理食塩水に溶解させた。５０ｍｇ／ｋｇケタミンおよび１０ｍｇ／ｋｇキシラジンで麻酔を誘導し、５ｍｍ皮膚切開を行い、半透明腹壁を明らかとした。２４ゲージカテーテル（Ｔｅｒｕｍｏ：Ｓｕｒｆｌａｓｈ  Ｉ．Ｖ．Ｃａｔｈｅｔｅｒ，日本）を腹壁を通じて入れ、０．３ｍｌの空気を吹き込んで、位置決定を確認した。次いで、カテーテルを１ｃｍ進行させ、０．５ｍｌのアルデヒド多糖（ＨＡ−ＣＨＯ、ＣＭＣ−ＣＨＯ、ＨＰＭＣ−ＣＨＯ、またはＭＣ−ＣＨＯ）および０．５ｍｌのＨＡ−ＡＤＨを、デュアルシリンジアプリケーター（Ｂａｘｔｅｒ：Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）を用いて注射した。
【０２８６】
マウスを注射から４日、１週間、２週間および３週間後に屠殺し、残渣および癒着の存在を評価した。解剖者には、いずれの処置を個々のマウスが受けたかに関しては知らせなかった。腹内容物を必要に応じてサンプリングし、１０％ホルマリン中に固定し、標準技術を用いて組織学（ヘマトキシリン−エオシン染色スライド）のために処理した。
【０２８７】
ウサギ側壁欠損−腸磨耗モデルによる腹膜癒着−予防効果の評価
腹膜癒着を記載したように誘導した（本明細書で参考として援用されるＹｅｏら．，Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６；２７：４６９８−４７０５）。雌白兎（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ；Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｈａｚｌｅｔｏｎ，ＰＡ）（３±０．５ｋｇ）を、ケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｍ．）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｍ．）を用いて麻酔し；残りの酸素中の１〜３％イソフルランを用いて維持を達成した。１０ｃｍ長の中線切開を白線に沿って行い、腹膜を開いた。腹膜癒着を、右側腹壁に３×４ｃｍ欠損を作製し、出血表面が得られるまで、盲腸の７つの膨起を磨耗することによって誘導した。
【０２８８】
４匹の動物を各実験群：（ｉ）生理食塩水；（ｉｉ）切り出された腹壁、および磨耗された盲腸表面を１０ｍｌの架橋されたＨＡ−ＣＭＣ、ＨＡ−ＨＰＭＣ、またはＨＡ−ＭＣで被覆；にランダムに割り当てた。適応の前に、殺微生物ＵＶ照射によって材料を２時間滅菌し、滅菌生理食塩水に溶解させた。ゲル前駆体溶液（５ｍｌのＨＡ−ＡＤＨ（２０ｍｇ／ｍｌ）および５ｍｌのＣＭＣ−ＣＨＯ、ＨＰＭＣ−ＣＨＯまたはＭＣ−ＣＨＯ（２０ｍｇ／ｍｌ））を別々の滅菌された１０ｍｌのシリンジに入れ、これをデュアルシリンジアプリケーターに連結し、１５ゲージ針を通って同時に押出した。液体前駆体は即座にゲル化を開始し、標的領域の形状に合致させた。
【０２８９】
外科的処置後の動物の世話は従前に記載されているように送達した（本明細書で参考として援用されるＹｅｏ，Ｙ．；Ｈｉｇｈｌｅｙ，Ｃ．；Ｂｅｌｌａｓ，Ｅ．；Ｉｔｏ，Ｔ．；Ｍａｒｉｎｉ，Ｒ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．，Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６；２７：４６９８−４７０５）。該手法から１週間後に、動物をペントバルビタールナトリウム１００ｍｇ／ｋｇ  ｉｖで安楽死させた。報告された方法を用いて癒着のスコアをつけた：スコア０＝癒着なし、スコア１＝重力で分離するであろう組織癒着、スコア２＝鈍的切開によって分離可能な組織癒着、スコア３＝鋭的切開を必要とする癒着。２および３のスコアを持つ癒着の面積も測定した。注目する組織をサンプリングし、上記の組織学のために調製した。
【０２９０】
統計学的解析
データを、ＡＮＯＶＡが先行するスチューデントのｔ−検定によって解析した。Ｗｉｌｃｏｘｏｎランク−合計検定を、各ヒドロゲルおよび対照の間の癒着スコアで行った。統計学的検定をＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（登録商標）（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）で行った。ｐ値＜０．０５は統計学的に有意と考えられた。
【０２９１】
結果
ＨＡ−ＡＤＨ、ＨＡ−ＣＨＯ、ＣＭＣ−ＣＨＯ、ＨＰＭＣ−ＣＨＯ、およびＭＣ−ＣＨＯの合計および特徴付け
ＨＡ−ＡＤＨの合成は、アジピン酸ジヒドラジドのメチレンプロトンによって確認された（１．６２ｐｐｍにおける単一ピーク、および２．２５ｐｐｍおよび２．３８ｐｐｍにおける二重ピーク）（その各々が本明細書に参考として援用されるＹｅｏ，Ｙ．；Ｈｉｇｈｌｅｙ，Ｃ．；Ｂｅｌｌａｓ，Ｅ．；Ｉｔｏ，Ｔ．；Ｍａｒｉｎｉ，Ｒ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．，Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６；２７：４６９８−４７０５；Ｂｕｌｐｉｔｔ，Ｐ．；Ａｅｓｃｈｌｉｍａｎｎ，Ｄ．，Ｎｅｗ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９；４７（２）：１５２−１６９；Ｊｉａ，Ｘ．Ｑ．；Ｃｏｌｏｍｂｏ，Ｇ．；Ｐａｄｅｒａ，Ｒ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．Ｓ．，Ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃｉａｔｉｃ  ｎｅｒｖｅ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｂｙ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００４；２５（１９）：４７９７−４８０４）。修飾の程度は、１．６２ｐｐｍにおけるアジピン酸ジヒドラジドのメチレンプロトンについてのものに対するＨＡのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基についてのピーク（２．０ｐｐｍにおける一重線ピーク）の比率から計算した；修飾の程度は４８．４％であった。
【０２９２】
酸化反応によって形成されたアルデヒド基の分析については、アルデヒドポリマーを１Ｈ−ＮＭＲ分析の前にｔ−ＢＣと反応させた。アルデヒド−修飾多糖の各々においては、ｔ−ブチル基の化学シフトが出現し（１．２０ｐｐｍにおける単一ピークおよび１．４３ｐｐｍにおける単一ピーク）、ＨＡ−ＣＨＯ、ＣＭＣ−ＣＨＯ、ＨＰＭＣ−ＣＨＯ、およびＭＣ−ＣＨＯの成功した合成を示す。ＨＡのＭｗおよびＭｗ／Ｍｎは１４３２ｋＤａおよび５．２であった。ＣＭＣ、ＨＰＭＣ、およびＭＣのＭｗは＞１ＭＤａであった。アルデヒドポリマーのＭｗは１０９および２３９ｋＤａの間であり、これはＨＡ−ＡＤＨのそれよりも低かった（表１２．１）。
【０２９３】
表１２．１．修飾されたポリマーの分子量
【０２９４】
【表１２−１】
2009533455.tif 000021
＊以前に報告されたもの（本明細書で参考として援用されるＫｏｈａｎｅ  ＤＳ，Ｌｉｐｐ  Ｍ，Ｋｉｎｎｅｙ  ＲＣ，Ａｎｔｈｏｎｙ  ＤＣ，Ｌｏｕｉｓ  ＤＮ，Ｌｏｔａｎ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｕｇａｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｐｉｎｅｕｒｉｕｍ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２；５９（３）：４５０−４５９）
Ｍｗ：重量−平均分子量、Ｍｎ：数−平均分子量
インサイチュヒドロゲルのインビトロ物理化学的特性
ＨＡ−ＡＤＨおよびアルデヒド修飾セルロース誘導体は、全て、許容される短期の時間枠内でゲルを形成した（表１２．２）。ＨＡ−ＣＭＣのゲル化時間は、残りのものよりも有意に長かった（ＨＡ−ＣＭＣおよび他のアルデヒド多糖の間でｐ＜０．０００１）。
【０２９５】
表１２．２．架橋されたヒドロゲルの物理的特性
【０２９６】
【表１２−２】
2009533455.tif 000022
＊リン酸緩衝化生理食塩水における浸漬の５日目に測定
データは平均±標準偏差（ｎ＝４）
ヒドロゲルは膨潤し、ＰＢＳ中の浸漬から１日後に平衡に到達し、続いての４日間一定なままであった（データは示さず）。全体を通じて、膨潤比率（表１２．２）は以下の順序であった：ＨＡＸ、ＨＡ−ＣＭＣ＞ＨＡ−ＭＣ（ｐ＜０．００１）＞ＨＡ−ＨＰＭＣ（ｐ＝０．００５３）。
【０２９７】
ＨＡＸの剛性率（表１２．２）Ｇは、ＨＡ−ＣＭＣ、ＨＡ−ＨＰＭＣ、またはＨＡ−ＭＣ（ｐ＜０．０５）よりも低かった。ＨＡ−ＣＭＣの剛性率はＨＡ−ＨＰＭＣまたはＨＡ−ＭＣ（ｐ＜０．０５）のそれよりも低かった。ＨＡ−ＭＣおよびＨＰＭＣ（ｐ＝０．９３）の間にＧの統計学的差はなかった。
【０２９８】
ヒアルロリダーゼ溶液における分解動態
ヒアルロリダーゼ溶液中のヒドロゲルの分解動態に差があった（図１７）。ＨＡＸはもっとも迅速に分解した（１日および２日のＨＡ−ＣＭＣに対してｐ＜０．００１）。ＨＡＸおよびＨＡ−ＣＭＣは、各々、４日および５日までに完全に分解した。対照的に、ＨＡ−ＭＣおよびＨＡ−ＨＰＭＣは２週間で完全に分解しなかった。これらの差についての１つの可能な理由は、ＨＡ−ＭＣおよびＨＡ−ＨＰＭＣが、ＨＡＸよりも架橋したことである。別の理由は、ヒアルロリダーゼがＨＡ−ＭＣおよびＨＡ−ＨＰＭＣ中に効果的に拡散しなかったことであり得る。なぜならば、それらはＨＡＸおよびＨＡ−ＣＭＣほどは多く膨潤しなかったからである。
【０２９９】
中皮細胞およびマクロファージの生存率に対するポリマーの効果
中皮細胞は、アルデヒドポリマーの濃度の一定範囲の存在下において培養した。全てのポリマーについての細胞生存率に用量依存性低下はなかった。細胞生存率は０．３％（ｗ／ｖ）（ｐ＞０．０５）においてＨＡ−ＣＨＯおよびＭＣ−ＣＨＯによって低下せず（図１８Ａ）、一方で、ＨＰＭＣ−ＣＨＯ（ｐ＝０．００１１）およびＣＭＣ−ＣＨＯ（ｐ＝０．０４４）は細胞生存率において小さな差を引き起こした。より高い濃度において、ＨＡ−ＣＨＯが細胞生存率の小さな減少を示し、一方で、セルロース誘導体はより大きい減少を示した：３日間のインキュベーション後の細胞生存率の順位序列はＨＡ−ＣＨＯ＞ＣＭＣ−ＣＨＯ＞ＭＣ−ＣＨＯ＞ＨＰＭＣ−ＣＨＯであった（０．９％（ｗ／ｖ）における任意の対においてｐ＜０．０１）。
【０３００】
アルデヒド−修飾ポリマーは、マクロファージにおける細胞生存率に対して用量依存性効果を示した（図１８Ｂ）。ここに、ＨＡおよびセルロース誘導体の間の細胞生存率の差は観察されなかった。いくつかの濃度において化合物の間にいくつかの統計学的差はあったが、全体として、細胞生存率は群の間で同様であった。
【０３０１】
マウス腹膜中でのインサイチュヒドロゲルの生体適合性
マウス（ｎ＝４〜６）に１ｍｌのゲル前駆体を注射した。動物を次の３週間にわたって所定の間隔で屠殺して、癒着形成を評価した（表１２．３）。全ての２０匹の動物において、膀胱と他の内臓との間に唯一の癒着があった。癒着の部位における瘢痕および血餅の存在を仮定すれば、それはゲルの注射の間における直接的外傷によるものと考えられた。
【０３０２】
表１２．３．マウスにおけるヒドロゲルの腹腔内注射後の癒着
【０３０３】
【表１２−３】
2009533455.tif 000023
腹腔中の残存ゲルの量を定量することはできなかった。肉眼による調査に際して、他のものにおけるよりもＨＡ−ＭＣを注射した動物においてかなり多くのヒドロゲル残渣があるようであった（図１９）。３週間後、ＨＡＸが完全に消失し、小容量のＨＡ−ＨＰＭＣが分離したゲルとして見出された。ＨＡ−ＣＭＣは内臓を被覆する薄い層としてのみ存在した。腹膜および内臓の組織学は全ての試料において正常であった。
【０３０４】
腹膜癒着の予防
癒着は、盲腸の磨耗、および隣接する腹壁のセクションの切り出しによって癒着をウサギにおいて誘導した（表１２．４）。対照動物において、生理食塩水をその代わりに適用した。生理食塩水群における全ての動物は、大きな領域にわたって癒着を発生した（図１９Ｂ）。癒着の領域は、ＨＡ−ＣＭＣ（ｐ＝０．００１１）、ＨＡ−ＭＣ（ｐ＜０．０００１）、およびＨＡ−ＨＰＭＣ（ｐ＜０．０００１）で処理した群において大きく低下した。そのパラメーターにおけるゲルの間に統計学的に有意な差はなかった。癒着スコアの減少の統計学的有意性は、ＨＡ−ＭＣ（ｐ＝０．０２３）で示されたに過ぎなかった（図１９Ｃ）。注目すべきことには、ＨＡ−ＨＰＭＣで処理したウサギにおいては、スコア３癒着の２つが腹中線上に、すなわち、ゲルが適用された疾患の外側の切開線上に形成された。本発明者らは、腹膜癒着を他の箇所において予防することにおけるＨＡＸの有効性を記載した（Ｙｅｏ，Ｙ．；Ｈｉｇｈｌｅｙ，Ｃ．；Ｂｅｌｌａｓ，Ｅ．；Ｉｔｏ，Ｔ．；Ｍａｒｉｎｉ，Ｒ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．，Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６；２７：４６９８−４７０５）。
【０３０５】
表１２．４．ウサギにおける腹膜癒着を予防するにおけるヒドロゲルの有効性
【０３０６】
【表１２−４】
2009533455.tif 000024
動物体重減少とは、外科的処置の週における喪失をいう。癒着面積は、２および３のスコアを持つ癒着の合計面積である。重量の変化および癒着面積は、平均±標準偏差として表される（群当たりｎ＝４）。
【０３０７】
生理食塩水−処理動物における癒着部位の組織学的分析は、盲腸および腹壁を連結する組織において線維芽細胞および炎症細胞を示した（図２０Ａ）。架橋可能なゲルで処理した動物において、好中球およびマクロファージはヒドロゲル残渣において見出された（図２０Ｂ）。癒着が妨げられた場合、傷害の部位は再度上皮化された（図２０Ｃ）が、線維芽細胞は正常な腹壁と比較して下にある層に依然として優性であった（図２０Ｄ）。同様な結果は全ての３つのセルロース誘導体で観察された。
【０３０８】
考察
ここに提示されたハイブリッドＨＡ−セルロース誘導体ヒドロゲルは、腹膜において使用するのに適していた。ゲル化時間、機械的強度、水分含有量、膨潤動態および分解動態を含めたそれらの物理学的特性は、予測された使用に適していた。これは外科的処置の間における良好な取り扱い特性によって、および生物学的な結果によって確認された。前駆体ポリマーはインビトロにていくつかの細胞傷害性を示したが、インビボでは明らかな局所的毒性はなかった。１つの可能な説明は、迅速な架橋はほとんど遊離前駆体を残さないことである。これらの処方の良性性質は、マウスおよびウサギモデルにおいてそれらの生体適合性によって示されるが、長期安全性および効力は示されないままである。最後に、ヒドロゲルは、癒着形成を低下させることにおいて顕著な効果を示した。本発明者らは、ウサギで起こった癒着の多くは、処理を適用した領域の外側に位置したことを認識する。従って、重要な答えられていない疑問が、本明細書中でなされるように、これらの材料は傷害の部位に制限されないように良好に適用され、またはより広くは腹膜全体で良好に適用されるか否かである。
【０３０９】
関連する組成物を有する腹膜癒着の防止のための商業的に入手可能な材料がある。ＳＥＰＲＡＦＩＬＭ（登録商標）（Ｇｅｎｚｙｍｅ）は、塩酸１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドで架橋されたＨＡおよびＣＭＣの予め形成されたヒドロゲルシートである（その各々が本明細書に参考として援用されるＤｉａｍｏｎｄら．，Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｕｔｅｒｉｎｅ  ｍｙｏｍｅｃｔｏｍｙ  ｂｙ  Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＨＡＬ−Ｆ）：Ａ  ｂｌｉｎｅｄ，ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ，ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ．Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  Ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  １９９６；６６（６）：９０４−９１０；Ｋｌｉｎｇ，Ｊ．，Ｇｅｎｚｙｍｅ’ｓ  Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ  ｇｅｔｓ  ＦＤＡ  ｍａｒｋｅｔｉｎｇ  ｎｏｄ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９６；１４（５）：５７２−５７２）。ＩＮＴＥＲＣＥＥＤ（登録商標）（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）は、酸化された再生セルロースの予め形成されたシートである（本明細書で参考として援用されるＰａｇｉｄａｓ，Ｋ．；Ｔｕｌａｎｄｉ，Ｔ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ  Ｏｆ  Ｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｃｔａｔｅ，Ｉｎｔｅｒｃｅｅｄ（Ｔｃ７）  Ａｎｄ  Ｇｏｒｅ−Ｔｅｘ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｏｎ  Ｐｏｓｔｓｕｒｇｉｃａｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  Ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  １９９２；５７（１）：１９９−２０１）。その架橋によって放出された分子ＳＥＰＲＡＦＩＬＭ（登録商標）はカルボジイミドを放出し、一方で、本明細書中に記載された材料は水を放出する）、および組成物を架橋する化学におけるそれらのデバイスと本発明者らのデバイスとの間に差がある。しかしながら、最も重要な差は、これらの材料が固体シートとして適用されなければならず、一方で、本明細書中で提示された処方は架橋剤を用いることなくインサイチュゲル化によって形成されることである。
【０３１０】
インサイチュで架橋するヒドロゲルは、適用可能性の容易性、それらを適用することができるデバイスの型、および恐らくは、処理することができる表面の型の点について慣用的なバリアデバイスよりも利点を有する。本明細書中に提示された材料は、一定範囲の物理化学的特性を有する。（ＨＡ−ＡＤＨの代わりに）セルロース誘導体のヒドラジドバージョンの使用は、例えば、得られたゲルを酵素加水分解に対してなおより耐性とすることによって、特性にさらに影響するであろう。また、本発明者らは、セルロース誘導体とヒアルロン酸の間にコストのかなりの差があることを注記する。
【０３１１】
本明細書中で試験したゲルのうち、ＨＡ−ＭＣゲルは腹膜癒着を妨げることにおいて最も効果的であった。これは、ＨＡ−ＭＣが腹膜に存在する酵素であるヒアルロニダーゼにおいてインビトロにてＨＡ−ＣＭＣおよびＨＡＸよりもゆっくりと分解し、したがって、より延長されたバリア効果を有するという事実に関連し得る。癒着を妨げる種々のヒドロゲルの有効性の差は、ＨＡで当てはまることができるように、疑われていない固有の生物学的活性の差によるものであろう。癒着の防止の有効性は、ゲルの物理学的特性をさらに最適化することによって変化させることができた。
【０３１２】
本発明者らは、ゲル化時間、機械的強度、水分含有量、膨潤動態、および分解動態を含めたヒドロゲルの物理化学的特性を調べた。これらの特性は互いに関連し、粘度、電荷、立体配座、溶解性、修飾の程度、溶液の濃度、混合の容易性その他の特性に多いに依存する。種々のポリマーの間の性能の差は、恐らくは、これらのパラメーターの差によるものであるが、本発明者らの結果は、本発明者らが機構を認識することを可能としない。
【０３１３】
膨潤比率、ポリマー濃度および剛性率（その各々が本明細書に参考として援用されるＡｎｓｅｔｈ，Ｋ．Ｓ．；Ｂｏｗｍａｎ，Ｃ．Ｎ．；ＢｒａｎｎｏｎＰｅｐｐａｓ，Ｌ．，Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９９６，１７（１７）：１６４７−１６５７；Ｐｅｐｐａｓ，Ｎ．Ａ．；Ｍｅｒｒｉｌｌ，Ｅ．Ｗ．，Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ−Ａｌｃｏｈｏｌ）Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  Ａｓ  Ｓｗｏｌｌｅｎ  Ｅｌａｓｔｉｃ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｏｌｙｍ  Ｓｃｉ  １９７７；２１（７）：１７６３−１７７０）の間の関係を仮定すれば、上記の物理化学的特性は、ＨＡ−ＨＰＭＣおよびＨＡ−ＭＣはＨＡＸおよびＨＡ−ＣＭＣよりも高度に架橋するであろうことを示唆する。より高い架橋密度は、部分的には、ＨＡ−ＣＨＯおよびＣＭＣ−ＣＨＯでのものよりもヒドラジドポリマーおよびアルデヒドポリマーの間により低い静電反発があるように、ＭＣ−ＣＨＯおよびＨＰＭＣ−ＣＨＯはアニオン性でないという事実から得ることができるものである。この解釈は、ＨＡ−ＣＭＣと比較して、ＨＡ−ＭＣおよびＨＡ−ＨＰＭＣの迅速なゲル化に合致する。
【０３１４】
結論
本明細書中に記載されたＨＡおよびセルロース誘導体のハイブリッドヒドロゲルは、二重バレルのシリンジを介して適用し、迅速に架橋することができ、開いた外科的処置および開腹術の双方での、臨床的設定における適応の容易性を示唆する。アルデヒド媒介セルロース誘導体はインビトロにていつくかの細胞傷害性を示したが、マウス腹膜において良好な生体適合性があった。これらの処方は、ウサギ盲腸傷害−側壁欠損モデルにおいて腹膜癒着を妨げることにおいて効果的であった。
【０３１５】
（実施例１３：腹膜癒着を妨げるためのデキストランベースのインサイチュ架橋された注射可能なヒドロゲル）
緒言
腹膜癒着は腹および胎盤外科的処置の深刻な結果であり、重篤な疼痛、腸閉塞および不妊症を引き起こし得る。２つのポリマーの混合によって形成されたインサイチュ架橋ゲルは、腹膜で適用するのが容易であって、非常に有効であり得る。ヒアルロン酸（ＨＡ）、酸化されたセルロース、およびセルロース誘導体のような生体材料は、腹膜において優れた生体適合性を示した。デキストランは、インサイチュ架橋性マトリックスのための別の魅力的な基材である。デキストラン（ＤＸ）は、グルコース部分が主としてα−１，６−結合によって連結される多糖である。４０ｋＤａおよび７０ｋＤａデキストランは、血漿容量エキスパンダーとして、かつ抗凝固療法のために血管閉塞を妨ぐために臨床的に用いられてきた。デキストランは腹膜において生体適合性が判明している。７０ｋＤａデキストランの３２％溶液は１９８０年代に腹膜癒着を妨げるのに臨床的に用いられたが、デキストランは不使用に陥った。なぜならば、成功したおよび成功していない双方の臨床的試験があったからである。
【０３１６】
本実験において、本発明者らは、腹膜癒着の防止のために新規なデキストランベースの注射ヒドロゲルを合成した。ヒドラジド基（ＣＭＤＸ−ＡＤＨ）で修飾されたカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤＸ）を、室温にて、アルデヒド基（ＤＸ−ＣＨＯまたはＣＭＣ−ＣＨＯ）で修飾されたＤＸまたはＣＭＣいずれかに架橋した。本発明者らは、インビトロにて得られたヒドロゲルを特徴付け、細胞培養におけるプレ−ポリマー細胞傷害性およびウサギ側壁欠損−腸摩耗モデルにおいて腹膜癒着を妨ぐことにおけるそれらの有効性を検討した。
【０３１７】
材料および方法
ポリマーおよびヒドロゲルの合成
試薬：Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓからの７０ｋＤａ（製品番号：Ｄ４７５１）、５００ｋＤａ（製品番号：Ｄ１０３７）、および２ＭＤａ（製品番号：Ｄ５３７６）デキストラン、ＣＭＣ（製品番号：Ｃ４８８８）アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）、１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−カルボジイミド（ＥＤＣ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、過ヨウ素酸ナトリウム、エチレングリコール、ｔｅｒｔ−ブチルカルバザート（ｔ−ＢＣ）、クロロ酢酸、水酸化ナトリウム、塩化ナトリウム、および塩酸をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【０３１８】
カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤＸ）の調製：７０ｋＤａおよび５００ｋＤａデキストランを、従前の方法［Ｙｉｎｇの論文およびＢｙｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  １９９７］でカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤＸ）に修飾した。簡単に述べれば１０ｇのデキストランを１００ｍｌの蒸留水に一晩溶解させ、次いで、２４．０ｇの水酸化ナトリウムおよび３０．２ｇのクロロ酢酸の双方を加えた。溶液を７０℃にて１４５分間還流し、６Ｎ塩酸でｐＨ＝７．０に素早く中和させ、蒸留水に対して３日間透析し、次いで、凍結乾燥した。収率は７５〜８０％であった。
【０３１９】
アジピン酸ジヒドラジドカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤＸ−ＡＤＨ）の調製：７０ｋＤａおよび５００ｋＤａ  ＣＭＤＸを、従前に報告されているように、アジピン酸ジヒドロジドヒアルロン酸の同一プロトコルにおいて、アジピン酸ジヒドロジドＣＭＤＸ（ＣＭＤＸ−ＡＤＨ）に修飾した。
【０３２０】
アルデヒドデキストラン（ＤＸ−ＣＨＯ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ−ＣＨＯ）の調製：２ＭＤａ  ＤＸ、７０ｋＤａ  ＤＸ、およびＣＭＣを、各々、アルデヒド７０ｋＤａ  ＤＸ（７０ｋＤａ  ＤＸ−ＣＨＯ）、２ＭＤａ  ＤＸ（２ＭＤａ  ＤＸ−ＣＨＯ）、およびアルデヒドＣＭＣ（ＣＭＣ−ＣＨＯ）に修飾した。プロトコルは本発明者らの従前の報告と同一であった。
【０３２１】
ディスクヒドロゲルの調製：２重量％ＣＭＤＸ−ＡＤＨ  ＰＢＳ−緩衝液溶液およびＤＸ−ＣＨＯおよびＣＭＣ−ＣＨＯ  ＰＢＳ−緩衝溶液のような２重量％アルデヒドポリマーを、二重シリンジ（Ｂａｘｔｅｒ：Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）を用いて２つのスライドガラスの間にサンドイッチされたゴム金型に注入した。調製されたヒドロゲルの直径および厚さは、各々、１．２ｃｍおよび３．５ｍｍであった。これらのディスクヒドロゲルは、各々、ＣＭＤＸ−ＤＸおよびＣＭＤＸ−ＣＭＣと呼ばれる。
【０３２２】
ポリマーおよびヒドロゲルの特徴付け
ポリマーの特徴付け：１Ｈ−ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ  ３００分光光度計）分光分析を用いて合成を確認した。Ｄ２Ｏ中の１０ｍｇ／ｍｌ  ＣＭＤＸ、ＣＭＤＸ−ＡＤＨ、ＤＸ−ＣＨＯ、およびＣＭＣ−ＣＨＯを測定した。次に、１０倍モル過剰のｔ−ＢＣを純水中のＤＸ−ＣＨＯおよびＣＭＣ−ＣＨＯ多糖に加え、アルデヒド基をｔ−ＢＣと反応させた。水に対して透析し、凍結乾燥した後、反応したポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルをＤ２Ｏ中で測定した。元素分析を行って、元素の組成を決定した。
【０３２３】
ＣＭＤＸ、ＣＭＤＸ−ＡＤＨ、ＤＸ−ＣＨＯ、およびＣＭＣ−ＣＨＯのＦＴ−ＩＲスペクトル多くは、各ポリマーのＫＢｒ錠剤を調製した後に測定した。
【０３２４】
元素分析はＣＭＤＸ−ＡＤＨで行った。
【０３２５】
ヒドロゲルの特徴付け：ゲル化時間は、報告されたプロトコルによって測定した。ＣｏｒｎｉｎｇモデルＰＣ−３２０ホットプレート／スターラーを用い、１５５ｒｐｍにおけるペトリ皿上の攪拌バーを用いて攪拌しつつ、水性０．１ｍｌ  ＤＸ−ＣＨＯまたはＣＭＣ−ＣＨＯ溶液を水性０．１ｍｌ  ＣＭＤＸ−ＡＤＨ溶液に加えた。溶液の混合物が小球ヒドロゲルとなるまでの時間を５回測定した。
【０３２６】
調製されたディスクゲルの膨潤の時間経過は、ＰＢＳ緩衝液中で３７℃にて重量分析により測定した。ゲル化後のヒドロゲルの重量Ｗｓは、ＰＢＳ緩衝液中に５日間浸漬させた後に測定した。ゲル化直後のヒドロゲルの初期重量Ｗｉに対する膨潤比率ＱはＱ＝Ｗｓ／Ｗｉとして計算し、ヒドロゲルの写真を撮った。
【０３２７】
細胞傷害性アッセイ
ＤＸ、ＣＭＣ、ＣＭＤＸ−ＡＤ、ＤＸ−ＣＨＯおよびＣＭＣ−ＣＨＯの存在下におけるインビトロ細胞生存率は、ヒト中皮細胞系（ＣＲＬ−９４４４：ＡＴＣＣ）およびマクロファージ細胞系Ｊ７７４．Ａ１（ＴＩＢ−６７ＴＭ：ＡＴＣＣ）を用いるＭＴＴアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって調査した。プロトコルは従前の報告「ＨＡ−ＣＭＣ論文」と同一であった。簡単に述べれば、中皮細胞を成長させ、完全成長培地（３．３ｎＭ）上皮成長因子、４００ｎＭヒドロコルチゾン、８７０ｎＭインスリン、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１０％ウシ胎仔血清を補充したＥａｒｌｅのＢＳＳ、０．７５ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１．２５ｇ／ｌ炭酸水素ナトリウムを含む培地１９９）中にて、５％ＣＯ２中で３７℃に維持した。マクロファージを成長させ、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ  （Ｇｉｂｃｏ  Ｃａｔ  ＃１０５６９−０１０）中に維持した。材料を加えた後に中皮細胞において３日目、またはマクロファージにおいて２日目にＭＴＴアッセイを行った。ＤＸ−ＣＨＯのみがＭＴＴアッセイを乱し、したがって、アッセイを開始する直前に培地を新鮮な培地と交換した。値は、何も細胞に加えなかった対照実験によって正規化する。
【０３２８】
ヒドロゲルのマウス腹膜への注入
プロトコルは本発明者らの従前の方法と同一であった（本明細書で参考として援用されるＦａｌｋ  Ｋ，Ｂｊｏｒｑｕｉｓｔ  Ｐ，Ｓｔｒｏｍｑｖｉｓｔ  Ｍ，Ｈｏｌｍｄａｈｌ  Ｌ．Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｙｐｅ  １．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２００１；８８：２８６−２８９）。約２５ｇの体重のＳＶ１２９マウスをＴａｃｏｎｉｃ（Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＹ）から購入し、０．５ｍｌのＣＭＤＸ−ＡＤＨ（５％  ｗ／ｖ）および０．５ｍｌのＣＭＤＸ−ＤＸ  ＤＸ−ＣＨＯ（２％  ｗ／ｖ）よりなる１．０ｍｌのＣＭＤＸ−ＤＸゲルを、二重シリンジ（Ｂａｘｔｅｒ：Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）を用いてカテーテルを通して腹膜に注射した。マウスの開腹術は注射から２週間後に行った。解剖者は、いずれのヒドロゲルが各マウスに注射されたかについて知らされていなかった。癒着の存在は解剖者によって評価された。
【０３２９】
ウサギ側壁欠損−腸摩耗モデルによる腹膜癒着−予防効果の評価
プロトコルは本発明者らの方法と同一であった。実施例１２参照。雌白兎（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ；Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｈａｚｌｅｔｏｎ，ＰＡ）（３±０．５ｋｇ）をモデル動物として用いた。１２匹の動物を実験群：１０ｍｌの（ｉ）７０ｋＤａ−ＣＭＤＸ−ＤＸゲル（ｎ＝４）、（ｉｉ）７０ｋＤａ−ＣＭＤＸ−ＣＭＣゲル（ｎ＝４）、および（ｉｉｉ）５００ｋＤａ−ＣＭＤＸ−ＣＭＣゲル（ｎ＝４）にランダムに割り当てた。
【０３３０】
腹膜癒着は、右側腹壁上の３×４ｃｍ欠損、および８０〜１６０ストロークの間の７つの膨起の結腸の摩耗の双方によって誘導した。ゲル前駆体溶液（５ｍｌのＣＭＤＸ−ＡＤＨ（７０ｋＤａ−ＣＭＤＸ−ＡＤＨについての５０ｍｇ／ｍｌ、または５００ｋＤａ−ＣＭＤＸ−ＡＤＨについての４０ｍｇ／ｍｌ）および５ｍｌのＤＸ−ＣＨＯ（２５ｍｇ／ｍｌ）またはＣＭＣ−ＣＨＯ（６０ｍｇ／ｍｌ））を別々の滅菌１０ｍｌシリンジに入れ、これをＢａｘｔｅｒデュアルバルブアプリケーターに連結させ、１５ゲージ針を通して同時に押出した。
【０３３１】
該手法から１週間後に、動物を安楽死させた。癒着は以下のようにスコア取りした：スコア０＝癒着無し、スコア１＝重力で分離される組織癒着、スコア２＝鈍的切開によって分離可能な組織癒着、スコア３＝鋭的切開を必要とする癒着。剖検から回収した組織を１０％ホルマリン中で固定し、組織学的調査のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【０３３２】
統計学的解析。データはスチューデントのｔ−検定によって基本的には分析した。ＡＮＯＶＡはｔ−検定前に行った。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定は、各ヒドロゲルと対照との間の癒着スコアについて行った。カテゴリー変数は以下のように割り当てた：スコア０＝１、スコア１＝２、スコア２＝３、およびスコア３＝４。全ての統計学的検定はＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（登録商標）（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて行った。ｐ値＜０．０５は統計学的に有意であると考えられた。
【０３３３】
結果
ＣＭＤＸ、ＣＭＤＸ−ＡＤＨ、ＤＸ−ＣＨＯおよびＣＭＣ−ＣＨＯの合成および特徴付け
ＣＭＤＸ、ＣＭＤＸ−ＡＤＨの合成はＦＴ−ＩＲ（図２３）および１Ｈ  ＮＭＲ（図２４）によって確認した。結果は双方のデキストラン（７０ｋＤａおよび５００ｋＤａ）について同一であった。
【０３３４】
ＦＴＩＲについて、デキストランは図２３に示すように１６５０ｃｍ−１において吸収ピークを有する［Ｌｉｎｏ論文］。ＣＭＤＸに対する修飾は、１６０８ｃｍ−１における新しいピークを示すことによって確認し、カルボキシル基によるＣ＝Ｏ伸縮を反映した。ＣＭＤＸ−ＡＤＨに対するさらなる修飾は、１６４４ｃｍ−１における新しいピークによって示され、アミド基によるＣ＝Ｏ伸縮を反映する。
【０３３５】
デキストランは３．０ｐｐｍ未満であって、５．２ｐｐｍを超える領域においてＮＭＲピークを有しない。ＣＭＤＸにおいては、新しいピークは５．１３ｐｐｍにおいて出現した。ＣＭＤＸ−ＡＤＨにおいては、新しいピークは２．０９および２．３２ｐｐｍ（二重線，４Ｈ，Ｎ−（ＣＨ２）−Ｃ）において、および１．６０ｐｐｍ（一重線，４Ｈ，Ｃ−（ＣＨ２）−Ｃ）において出現した。
【０３３６】
ＣＭＤＸ−ＡＤＨの元素分析によって、炭素、水素および窒素の重量パーセンテージは、各々、７０ｋＤａ  ＣＭＤＸ−ＡＤＨにおいては４４．４％、６．６％、および９．９％、および５００ｋＤａ  ＣＭＤＸ−ＡＤＨにおいては４４．７％、６．３％、および９．７％であった。炭素に対する窒素の比率から見積もったアジピン酸ジヒドラジドでのＣＭＤＸ−ＡＤＨの修飾の程度は、７０ｋＤａ  ＣＭＤＸ−ＡＤＨにおいて４６％であって、５００ｋＤａ  ＣＭＤＸ−ＡＤＨにおいて４４％であった。
【０３３７】
ＦＴ−ＩＲ、およびＤＸ−ＣＨＯのＮＭＲ分析の結果は従前に記載されたデータと同一であり、合成を確認する。ＣＭＣ−ＣＨＯを生産し、報告されたように特徴付けた。
【０３３８】
インサイチュヒドロゲルのインビトロ特定
すべての水素ゲル化時間は、迅速なゲル化時間が高濃度（図２５）のアルデヒド修飾プレポリマーおよびヒドラジド修飾プレポリマーの双方において全てのヒドロゲルについて得ることができた。ＣＭＤＸ−ＤＸゲルは、各濃度においてＣＭＤＸ−ＣＭＣゲルのそれよりも短かった（図２５）。
【０３３９】
ＣＭＤＸ−ＤＸゲルはゲル化後に収縮し、一方で、例えば、７０ｋＤａ−ＣＭＤＸ−ＣＭＣ（５％／６％）の膨潤容量がＣＭＤＸ−ＤＸ（５％／６％）よりも高いようにゲル化後に膨潤した（図２６Ａ）。ヒドロゲルの物理的外観はかなり異なった（図２６Ｂ）：ＣＭＤＸ−ＤＸ黄色みがっており、わずかに不透明であり、一方で、７０ｋＤａ−ＣＭＤＸ−ＣＭＣは透明であって、清澄であった。５００ｋＤａ−ＣＭＤＸ−ＣＭＣ（５％／６％）の膨潤は、７０ｋＤａ−ＣＭＤＸ−ＣＭＣの膨潤とＣＭＤＸ−ＤＸの膨潤との間の中間であった。
【０３４０】
インサイチュヒドロゲルインビトロアッセイの生体適合性
修飾されていない出発材料は細胞培養において最小の細胞の傷害性を示したが、いくつかの修飾は細胞の生存率に影響した。
【０３４１】
中皮細胞を一定範囲の濃度の架橋されていないプレポリマーＣＭＤＸ−ＡＤＨ、ＤＸ−ＣＨＯ、およびＣＭＣ−ＣＨＯの存在下で培養した（図２８Ａ）。ＣＭＤＸ−ＡＤＨおよびＣＭＣ−ＣＨＯは温和な用量依存的細胞傷害性を示し、一方で、ＤＸ−ＣＨＯはかなり毒性であった。
【０３４２】
細胞傷害性効果の総じてのパターンはマクロファージにおいて同様であった（図２８Ｂ）。デキストランのアルデヒド誘導体は、ＣＭＣ−ＣＨＯのように非常に細胞傷害性であった。７０ｋＤａ−および５００ｋＤａ−ＣＭＤＸ−ＡＤＨは高濃度においてさえマクロファージ生存率に対して効果を有しなかった。修飾されていないＣＭＣおよびＤＸは全ての濃度において細胞生存率を増大させた。
【０３４３】
双方の細胞系のＮＴＴアッセイからＣＭＤＸ−ＡＤＨは非常に生体適合性であって、また、そのヒドロゲルは腹膜において非常に生体適合性と予測できる。
【０３４４】
インサイチュヒドロゲルの腹膜癒着予防機能
ＣＭＤＸ−ＤＸで処理された全ての４匹のウサギは癒着を発症し、癒着領域は対照実験のそれよりも大きかった（ｐ＝０．００２７；表１３．１、図３０Ａ−１）。ヒドロゲルデブリは、時々、癒着内に捕捉された腹膜中の単離された凝集塊として見出された。従って、これは傷害の部位に存在するにかかわらずバリアとして機能しなかった。ゲルデブリは、膨潤試験において観察されたように、黄色味がかっておりかつしっかりとしていた。それは、本発明者らが実験した他のインサイチュ架橋ゲルとは異なり、組織にしっかりと癒着していた（図３０Ａ−２）。
【０３４５】
表１３．１
【０３４６】
【表１３−１】
2009533455.tif 000025
対照的に、７０ｋＤａ−および５００ｋＤａ−ＣＭＤＸ−ＣＭＣは共に腹膜を通じて分布していることが見出されたが、時々図９Ｂに示されたように部分的には連続的な塊のままであった。材料の赤味がかった色調は血液の混入によるものであった（図３０Ｃ−２）。ヒドロゲルは、対照と比較して癒着形成の面積の劇的な低下を引き起こした（表１、図３０Ｂ、Ｃ−１）（７０ｋＤａ−および５００ｋＤａ−ＣＭＤＸ−ＣＭＣ双方についてｐ＜０．０００１）。
【０３４７】
両方のＣＭＤＸ−ＣＭＣ群についての中央値癒着スコアは未処理対照またはＣＭＤＸ−ＤＸゲルいずれかのそれよりもかなり小さいが、試料のサイズは統計学的有意性を示すのに余りにも小さかった。２つのＣＭＤＸ−ＣＭＣ群からのプールされたデータの比較は、０．００９のｐ値で生じた。両方のＣＭＤＸ−ＣＭＣ群の中央値癒着スコアは同様であって、統計学的に有意な差はなかった。
【０３４８】
組織学においては、ＣＭＤＸ−ＤＸゲルは正常および傷害した盲腸表面に対してかなり癒着しており（図３０Ａ）、下の結合組織への炎症細胞への顕著な浸潤を伴った（図３０Ｂ）。対照的に、中皮はＣＭＤＸ−ＣＭＣで処理した動物において回収された（図３０Ｃ）が、結合組織のかなり厚くなった下の層を伴った（図３０Ｄ）。
【０３４９】
ＣＭＤＸ−ＤＸゲルの腹腔内注入
癒着を妨げるＣＭＤＸ−ＤＸの無能力は、癒着を妨げることにおける有効性の欠如によるものであるか、あるいはそれらを引き起こすにおいて直接的効果によるものであろう。材料それ自体が有害か否かを評価するために、二重バレルのシリンジを通じて４匹のマウスにＣＭＤＸ−ＡＤＨおよびＤＨ−ＣＨＯを腹腔内注射し、インサイチュにてＣＭＤＸ−ＤＸを形成した。注射から２週間後に、動物を屠殺し、それらの腹腔を調査する。ＣＭＤＸ−ＤＸは腹膜癒着を引き起こさなかったが、組織に対してしっかりと癒着した堅い黄色凝集塊中に見出された（図２９）。
【０３５０】
考察
デキストランは、腹膜適用に適した非常に生体適合性であって低いコストの材料である。ここに、本発明者らは、低分子量架橋剤に対する必要性なくして形成される２つのデキストランベースのヒドロゲルを合成した。双方はＣＭＤＸ−ＡＤＨ部位を共有するが、それらは、顕著に異なる特性を有した。
【０３５１】
ＣＭＤＸ−ＤＸのゲル化時間はＣＭＤＸ−ＣＭＣのそれよりもかなり短かった。粘度、ヒドラジドまたはアルデヒドでの修飾の程度その他を含めたこの差に対するいくつかの可能な理由があるが、主な理由はデキストランおよびＣＭＣの間の水性溶解度の差であり得る。３ｗ／ｖ％  ５００ｋＤａ−ＣＭＤＸ−ＣＭＣゲルのゲル化時間は６５．８±５．０秒のように非常にゆっくりであったが、２ｗ／ｖ％  ４９０ｋＤａ−ＨＡ（ヒアルロン酸）−ＣＭＣゲルのそれは本発明者らの従前の実験において１８．５±１．７のように非常に迅速であった。ＨＡ−ＡＤＨおよびＣＭＤＸ−ＡＤＨの修飾の程度および分子量はほぼ等しく、したがってＤＸおよびＣＭＣの溶解性は極端に乏しい可能性がある。他方、ＣＭＤＸ−ＤＸゲルのゲル化時間は非常に速かった。何故ならば、ＣＭＤＸ−ＡＤＨおよびＤＨ−ＣＨＯは同一ＤＸから合成された。同一ポリマー骨格を有するポリマーは容易に互いに混合することができる。
【０３５２】
ＣＭＤＸ−ＤＸは収縮し、一方で、ＣＭＤＸ−ＣＭＣはゲル化後に由着した。これは、ＣＭＣ−ＣＨＯの負の電荷の間の静電排斥によって説明することができ、一方で、ＤＸ−ＣＨＯは電荷を有しない。
【０３５３】
２つの材料は、腹膜癒着を妨げることにおいてその性能が危機的に異なった。ＣＭＤＸ−ＤＸは癒着を悪くし、一方で、ＣＭＤＸ−ＣＭＣはそれらを妨げた。インビトロで示したようにＤＸ−ＣＨＯの細胞傷害性は癒着を妨げることにおいて効果のその欠如に寄与した可能性がある。しかしながら、その毒性は（マクロファージの場合には）２日の曝露、（中皮細胞については）３日の曝露にわたって起こった。それは、架橋（数秒かかった）後に組織損傷を引き起こすために十分に高いレベルの遊離ＣＭＤＸ−ＤＸが存在することにはならない。架橋された材料それ自体は有害であろう。
【０３５４】
かなりの成功がバリアデバイスとして用いられるインサイチュ架橋ヒドロゲルによって達成されてきたが、それらの分解時間は比較的簡単な、特に、ヒアルロン酸に基づくものであり得る。しかしながら、バリアデバイスを所定の場所に存在させて癒着形成を回避するのに必要な時間の長さは知られていない。その関係で、ＣＭＤＸ−ＤＸは、剖検で見出される多量の残存材料は存在する点で有利なことが判明し、ゆっくりとした分解動態を示唆するであろう。このゆっくりとした分解は比較的高いポリマー濃度、比較的低い膨潤容量、およびデキストランを分解するデキストラナーゼが基本的には肝臓に位置するに過ぎないという事実によるものであろう。
【０３５５】
結論
ヒドラジド−修飾カルボキシメチルデキストランおよびアルデヒド−修飾カルボキシメチルセルロースの架橋されたヒドロゲルは、腹膜癒着を妨げることにおいて有効性を示した。これらのゲルのゆっくりとした分解速度および低コストは、腹膜癒着の予防において可能な役割を示唆する。
【０３５６】
（実施例１４：ヒアルロン酸およびデキサメタゾンのインサイチュ架橋可能結合体ヒドロゲルの抗炎症活性）
緒言
手術後腹膜癒着は疼痛、腸閉塞および不妊症を引き起こしかねない（本明細書で参考として援用されるＤｉＺｅｒｅｇａ，Ｇ．Ｓ．Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９）。種々の多糖ベースのヒドロゲルバリア系を用いて、種々の成功度でもって癒着を妨げてきた（本明細書で参考として援用されるＤｉＺｅｒｅｇａ，Ｇ．Ｓ．Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９）。インサイチュ架橋によって形成されるヒドロゲルはバリアとして潜在的に有用であり（本明細書で参考として援用されるＪｏｈｎｓ，Ｄ．Ｂ．，Ｒｏｄｇｅｒｓ，Ｋ．Ｅ．，Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｗ．Ｄ．，Ｋｉｏｒｐｅｓ，Ｔ．Ｃ．，ａｎｄ  ｄｉＺｅｒｅｇａ，Ｇ．Ｓ．Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｏｎｉｃａｌｌｙ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  Ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  ６８（１９９７）３７−４２）（本明細書で参考として援用されるＬｉ，Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｙ．Ｃ．，Ｓｈｕ，Ｘ．Ｚ．，Ｇｒａｙ，Ｓ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ，Ｇ．Ｄ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ−ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ５（２００４）８９５−９０２）、（本明細書で参考として援用されるＬｉｕ，Ｙ．Ｃ．，Ｌｉ，Ｈ．，Ｓｈｕ，Ｘ．Ｚ．，Ｇｒａｙ，Ｓ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ，Ｇ．Ｄ．Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ  ｒｅｄｕｃｅ  ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ．Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  Ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  ８３（２００５）１２７５−１２８３）、（本明細書で参考として援用されるＯｈ，Ｓ．Ｈ．，Ｋｉｍ，Ｊ．Ｋ．，Ｓｏｎｇ，Ｋ．Ｓ．，Ｎｏｈ，Ｓ．Ｍ．，Ｇｈｉｌ，Ｓ．Ｈ．，Ｙｕｋ，Ｓ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｊ．Ｈ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｓｔｓｕｒｇｉｃａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇ−ｌｏａｄｅｄ  ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｏｌ−ｇｅｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｂｅｈａｖｉｏｒ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ  ７２（２００５）３０６−１６）、（本明細書で参考として援用されるＹｅｏ，Ｙ．，Ｈｉｇｈｌｅｙ，Ｃ．，Ｂｅｌｌａｓ，Ｅ．，Ｉｔｏ，Ｔ．，Ｍａｒｉｎｉ，Ｒ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２７（２００６）４６９８−４７０５）、予め形成されたシートよりも適用するのが容易になり得る。特に、ヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体は腹���において頻繁に使用される。薬物を加えたか、または加えていないインサイチュ化学的修飾ＨＡヒドロゲルはこの目的で用いられてきた（本明細書で参考として援用されるＪｏｈｎｓ，Ｄ．Ｂ．，Ｒｏｄｇｅｒｓ，Ｋ．Ｅ．，Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｗ．Ｄ．，Ｋｉｏｒｐｅｓ，Ｔ．Ｃ．，ａｎｄ  ｄｉＺｅｒｅｇａ，Ｇ．Ｓ．Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｏｎｉｃａｌｌｙ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  Ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  ６８（１９９７）３７−４２）、（本明細書で参考として援用されるＬｉ，Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｙ．Ｃ．，Ｓｈｕ，Ｘ．Ｚ．，Ｇｒａｙ，Ｓ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ，Ｇ．Ｄ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ−ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ５（２００４）８９５−９０２）、（本明細書で参考として援用されるＬｉｕ，Ｙ．Ｃ．，Ｌｉ，Ｈ．，Ｓｈｕ，Ｘ．Ｚ．，Ｇｒａｙ，Ｓ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ，Ｇ．Ｄ．Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ  ｒｅｄｕｃｅ  ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ．Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  Ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  ８３（２００５）１２７５−１２８３）、（本明細書で参考として援用されるＹｅｏ，Ｙ．，Ｈｉｇｈｌｅｙ，Ｃ．，Ｂｅｌｌａｓ，Ｅ．，Ｉｔｏ，Ｔ．，Ｍａｒｉｎｉ，Ｒ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２７（２００６）４６９８−４７０５）。現在、本発明者らは、ヒドラゾン架橋アルデヒド−およびヒドラジド−修飾ＨＡから構成されるインサイチュ架橋可能ヒドロゲル（本明細書で参考として援用されるＢｕｌｐｉｔｔ，Ｐ．，ａｎｄ  Ａｅｓｃｈｌｉｍａｎｎ，Ｄ．Ｎｅｗ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４７（１９９９）１５２−１６９）、（本明細書で参考として援用されるＪｉａ，Ｘ．Ｑ．，Ｃｏｌｏｍｂｏ，Ｇ．，Ｐａｄｅｒａ，Ｒ．．Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．Ｓ．Ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃｉａｔｉｃ  ｎｅｒｖｅ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｂｙ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２５（２００４）：４７９７−４８０４）がウサギ側壁欠損−盲腸磨耗モデルにおいて腹膜癒着を妨げるのに効果的であったことを示した（本明細書で参考として援用されるＹｅｏ，Ｙ．，Ｈｉｇｈｌｅｙ，Ｃ．，Ｂｅｌｌａｓ，Ｅ．，Ｉｔｏ，Ｔ．，Ｍａｒｉｎｉ，Ｒ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２７（２００６）４６９８−４７０５）。
【０３５７】
これらのデバイスの大部分は、生体適合性バリアとして作用し、治癒の間に傷害した表面を分離し、デバイスの能力を開発する。ここに、本発明者らは、癒着形成の病理生理学を直接的に取組むためにヒドロゲルを修飾した。炎症は、腹膜癒着の形成に寄与すると考えられる。炎症それ自体の潜在的に組織−破壊性効果とはかなり別に、炎症細胞は腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）インターロイキン−１および−６（ＩＬ−１および−６）のようなサイトカインを放出する。これらのサイトカインは、プラスミノーゲンアクチベーター（ＰＡ）の活性を低下させ、フィブリンの分解を示す中皮細胞からのプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１および２（ＰＡＩ−１およびＰＡＩ−２）の生産を誘導する（本明細書で参考として援用されるＷｈａｗｅｌｌ，Ｓ．Ａ．，Ｓｃｏｔｔｃｏｏｍｂｅｓ，Ｄ．Ｍ．，Ｖｉｐｏｎｄ，Ｍ．Ｎ．，Ｔｅｂｂｕｔｔ，Ｓ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｏｆ  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１  Ｂｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８１（１９９４）２１４−２１６）、（本明細書で参考として援用されるＷｈａｗｅｌｌ，Ｓ．Ａ．，ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｏｆ  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１  Ｂｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １６１（１９９５）３１５−３１８）、（本明細書で参考として援用されるＶａｎｈｉｎｓｂｅｒｇｈ，Ｖ．Ｗ．Ｍ，Ｂａｕｅｒ，Ｋ．Ａ．，Ｋｏｏｉｓｔｒａ，Ｔ．，Ｋｌｕｆｔ，Ｃ．，Ｄｏｏｉｊｅｗａａｒｄ，Ｇ．，Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｚｅｎ，Ｗ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｏｆ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ−Ｎｅｃｒｏｓｉｓ−Ｆａｃｔｏｒ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ−Ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  Ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｙｐｅ  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ，Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｔｙｐｅ−１，Ａｎｄ  Ｆｉｂｒｉｎ（Ｏｇｅｎ）  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｂｌｏｏｄ  ７６（１９９０）２２８４−２２８９）、（本明細書で参考として援用されるＭｕｌｌａｒｋｙ，Ｉ．Ｋ．，Ｓｚａｂａ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｅｒｇｇｒｅｎ，Ｋ．Ｎ．，Ｋｕｍｍｅｒ，Ｌ．Ｗ．，Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｌ．Ｂ．，Ｐａｒｅｎｔ，Ｍ．Ａ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｓｍｉｌｅｙ，Ｓ．Ｔ．Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｇａｍｍａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ  ｏｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｂｕｒｄｅｎ，ｄｉｃｔａｔｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｆｉｂｒｉｎ  ｄｅｐｏｓｉｔｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉ���ｙ  ７４（２００６）１１８１−１１８８）。これらのプロセスは癒着形成を促進することができる。炎症誘発性サイトカイン放出の緩和は腹膜癒着の予防を増強することができる。この理由で、幾人かの調査者は、イブプロフェンのような非ステロイド性抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）（本明細書で参考として援用されるＯｈ，Ｓ．Ｈ．，Ｋｉｍ，Ｊ．Ｋ．，Ｓｏｎｇ，Ｋ．Ｓ．，Ｎｏｈ，Ｓ．Ｍ．，Ｇｈｉｌ，Ｓ．Ｈ．，Ｙｕｋ，Ｓ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｊ．Ｈ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｓｔｓｕｒｇｉｃａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇ−ｌｏａｄｅｄ  ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｏｌ−ｇｅｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｂｅｈａｖｉｏｒ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ  ７２（２００５）３０６−１６）（本明細書で参考として援用されるＢａｔｅｍａｎ，Ｂ．Ｇ．，Ｎｕｎｌｅｙ，Ｗ．Ｃ．，Ｊｒ．ａｎｄ  Ｋｉｔｃｈｉｎ，Ｊ．Ｄ．，３ｒｄ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ．Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  ３８（１９８２）１０７−８）、（本明細書で参考として援用されるＮｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｋ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ  ｄｉＺｅｒｅｇａ，Ｇ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｓｔｓｕｒｇｉｃａｌ  ｗｏｕｌｄ  ｒｅｐａｉｒ：ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ．Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ  ３４（１９８３）２１９−２６）、（本明細書で参考として援用されるＲｏｄｇｅｒｓ，Ｋ．，Ｇｉｒｇｉｓ，Ｗ．，ｄｉＺｅｒｅｇａ，Ｇ．Ｓ．，Ｂｒａｃｋｅｎ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｒｉｃｈｅｒ，Ｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｓｔｓｕｒｇｉｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｂｙ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｆｅｒｔｉｌ  ３５（１９９０）３１５−２０）、（本明細書で参考として援用されるＬｅＧｒａｎｄ，Ｅ，Ｋ．，Ｒｏｄｇｅｒｓ，Ｋ．Ｅ．，Ｇｉｒｇｉｓ，Ｗ．，Ｃａｍｐｅａｕ，Ｊ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｄｉｚｅｒｅｇａ，Ｇ．Ｓ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎ−ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｓｕｒｇ  ８（１９９５）１８７−９４）、（本明細書で参考として援用されるＬｅｅ，Ｊ．Ｈ．，Ｇｏ，Ａ．Ｋ．，Ｏｈ，Ｓ．Ｈ．，Ｌｅｅ，Ｋ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｙｕｋ，Ｓ．Ｈ．Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｔｉ−ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ−ｌｏａｄｅｄ  ＰＬＬＡ−ＰＥＧ  ｄｉｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｆｉｌｍｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２６（２００５）６７１−８およびデキサメタゾンのようなグルココルチコイド（本明細書で参考として援用されるＨｏｃｋｅｌ，Ｍ���，Ｏｔｔ，Ｓ．，Ｓｉｅｍａｎｎ，Ｕ．，ａｎｄ  Ｋｉｓｓｅｌ，Ｔ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｗｉｔｈ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  Ｂｙ  Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ．Ａｎｎａｌｅｓ  Ｃｈｉｒｕｒｇｉａｅ  Ｅｔ  Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｉａｅ  ７６（１９８７）３０６−３１３）、（本明細書で参考として援用されるＢｕｃｋｅｎｍａｉｅｒ，Ｃ．Ｃ．，Ｐｕｓａｔｅｒｉ，Ａ．Ｅ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ  Ｈｅｔｚ，Ｓ．Ｐ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉａｄｈｅｓｉｖｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｕｒｇｅｏｎ  ６５（１９９９）２７４−２８２）、（本明細書で参考として援用されるＫｕｃｕｋｏｚｋａｎ，Ｔ．，Ｅｒｓｏｙ，Ｂ．，Ｕｙｇｕｒ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｇｕｎｄｏｇｄｕ，Ｃ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｂｙ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｒｏｍｏｇｌｙｃａｔｅ，ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，ｓａｌｉｎｅ  ａｎｄ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ  ａｆｔｅｒ  ｐｅｌｖｉｃ  ｓｕｒｇｅｒｙ．ＡＮＺ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  ７４（２００４）１１１１−５を含めた腹膜癒着に対する抗炎症薬物の有効性を試験した。これらはリポソーム）、（本明細書で参考として援用されるＲｏｄｇｅｒｓ，Ｋ．，Ｇｉｒｇｉｓ，Ｗ．，ｄｉＺｅｒｅｇａ，Ｇ．Ｓ．，Ｂｒａｃｋｅｎ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｒｉｃｈｅｒ，Ｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｓｔｓｕｒｇｉｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｂｙ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｆｅｒｔｉｌ  ３５（１９９０）３１５−２０）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ジブロックコポリマーフィルム（本明細書で参考として援用されるＬｅｅ，Ｊ．Ｈ．，Ｇｏ，Ａ．Ｋ．，Ｏｈ，Ｓ．Ｈ．，Ｌｅｅ，Ｋ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｙｕｋ，Ｓ．Ｈ．Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｔｉ−ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ−ｌｏａｄｅｄ  ＰＬＬＡ−ＰＥＧ  ｄｉｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｆｉｌｍｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２６（２００５）６７１−８）、ポロキサマーおよびアルジネートヒドロゲルの混合物）、（本明細書で参考として援用されるＯｈ，Ｓ．Ｈ．，Ｋｉｍ，Ｊ．Ｋ．，Ｓｏｎｇ，Ｋ．Ｓ．，Ｎｏｈ，Ｓ．Ｍ．，Ｇｈｉｌ，Ｓ．Ｈ．，Ｙｕｋ，Ｓ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｊ．Ｈ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｓｔｓｕｒｇｉｃａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇ−ｌｏａｄｅｄ  ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｏｌ−ｇｅｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｂｅｈａｖｉｏｒ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ  ７２（２００５）３０６−１６）、およびポリ（ラクチド−抗グリコリド（ＰＬＧＡ）マイクロ粒子）、（本明細書で参考として援用されるＨｏｃｋｅｌ，Ｍ．，Ｏｔｔ，Ｓ．，Ｓｉｅｍａｎｎ，Ｕ．，ａｎｄ  Ｋｉｓｓｅｌ，Ｔ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｗｉｔｈ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  Ｂｙ  Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ．Ａｎｎａｌｅｓ  Ｃｈｉｒｕｒｇｉａｅ  Ｅｔ  Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｉａｅ  ７６（１９８７）３０６−３１３）のようなマトリックス材料に取り込まれている。本発明者らは、ヒドロゲルベースの系は、一般には、疎水性ポリマーデバイスよりも腹膜中でより生態的合成であり（ＰＬＧＡよりなるもの））、（本明細書で参考として援用されるＹｅｏ，Ｙ．，Ｈｉｇｈｌｅｙ，Ｃ．，Ｂｅｌｌａｓ，Ｅ．，Ｉｔｏ，Ｔ．，Ｍａｒｉｎｉ，Ｒ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２７（２００６）４６９８−４７０５）、（本明細書で参考として援用されるＫｏｈａｎｅ，Ｄ．Ｓ．，Ｔｓｅ，Ｊ．Ｙ．，Ｙｅｏ，Ｙ．，Ｐａｄｅｒａ，Ｒ．，Ｓｈｕｂｉｎａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ａｎｄ  ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｔｏｎｅｕｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｔ  Ａ  ７７Ａ（２００６）３５１−３６１）、しかしながら、かなりより迅速な放出動態を有する。なぜならば、低分子量薬物はヒドロゲルマトリックスを通じて迅速に拡散するからである。この問題を制御するための１つのアプローチは、ヒドロゲルに小分子を結合体化させることであり、（本明細書で参考として援用されるＭｃＬｅｏｄ，Ａ．Ｄ．，Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｔｏｚｅｒ，Ｔ．Ｎ．Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  Ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  
Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  Ｆｏｒ  Ｃｏｌｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ−Ｓｔｅａｄｙ−Ｓｔａｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｒａｔ．Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ＆  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  １５（１９９４）１５１−１６１）、（本明細書で参考として援用されるＭｃＬｅｏｄ，Ａ．Ｄ．，Ｆｒｉｅｎｄ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｔｏｚｅｒ，Ｔ．Ｎ．Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  Ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  Ｆｏｒ  Ｃｏｌｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ−Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  Ｉｎ  Ｒａｔ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ−Ｔｒａｃｔ  Ｃｏｎｔｅｎｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８３（１９９４）１２８４−１２８８）、（本明細書で参考として援用されるＺｈｏｕ，Ｓ．Ｙ．，Ｍｅｉ，Ｑ．Ｂ．，Ｌｉｕ，Ｌ．，Ｇｕｏ，Ｘ．，Ｑｉｕ，Ｂ．Ｓ．，Ｚｈａｏ，Ｄ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｃｈｏ，Ｃ．Ｈ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｉｎ  ｒａｔ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ．Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ  ２２（２００１）７６１−７６４）、（本明細書で参考として援用されるＰａｎｇ，Ｙ．Ｎ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，Ｚ．Ｒ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｎ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｇｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ８（２００２）９１３−９１７）、（本明細書で参考として援用されるＰｏｕｙａｎｉ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ，Ｇ．Ｄ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ−Ａｃｉｄ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ−Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５（１９９４）３３９−３４７）、（本明細書で参考として援用されるＰｒｅｓｔｗｉｃｈら．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒａｚｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５３（１９９８）９３−１０３）、（本明細書で参考として援用されるＲａｊｅｗｓｋｉら．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｎｄ  Ｎｏｎｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  Ｏｆ  Ａ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｐｒｏｄｒｕｇ−Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ  Ｅｓｔｅｒｓ  Ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ−Ａｃｉｄ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ８２（１９９２）２０５−２１３）、（本明細書で参考として援用されるＥｖｅｒｔｓら．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌ���ｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｉｎｔｏ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６８（２００２）８８３−８８９）、（本明細書で参考として援用されるＭｅｌｇｅｒｔら．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｔｏ  Ｋｕｐｆｆｅｒ  ｃｅｌｌｓ：Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３４（２００１）７１９−７２８）。これらの結合体は放出動態を制御することができるが、結合体ポリマーそれ自体は腹膜から迅速に除去することができる。
【０３５８】
ヒドロゲルマトリックスからの抗炎症薬物放出および腹膜からのヒドロゲル拡散の問題に取り込むために、本発明者らは、インサイチュ架橋特性を薬物結合体化と組み合わせたヒドロゲルを設計し、合成した（本明細書で参考として援用されるＰｏｕｙａｎｉ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ，Ｇ．Ｄ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ−Ａｃｉｄ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ−Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５（１９９４）３３９−３４７）。優れた合成グルコルチコイドアゴニストデキサメタゾンに対してエステル結合を介して結合体し、それらがヒドラゾン結合によって他のＨＡに架橋したように、ヒドラジドまたはアルデヒド基で修飾されたＨＡを生産した。ここに、本発明者らは、インビトロおよびインビボにてこれらの材料を特徴付け、それらの抗炎症活性を示した。
【０３５９】
材料および方法
材料
デキサメタゾン、コハク酸無水物、エタノール、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）、４−ジメチルアミノピリジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、無水アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、過ヨウ素酸ナトリウム、エチレングリコール、ｔｅｒｔ−ブチルカルバザート、塩化ナトリウム、リン酸、およびナトリウムはＡｌｄｒｉｃｈから購入した。ＨＡ（Ｍｗ＝４９０ｋＤａまたは１．３６ＭｋＤａ）はＧｅｎｚｙｍｅから購入した。
【０３６０】
方法
ヒアルロン酸−アジピン酸ジヒドラジド（ＨＡ−ＡＤＨ）およびヒアルロン酸−アルデヒド（ＨＡ−ＡＬＤ）の合成
合成は上記のように行った（本明細書で参考として援用されるＹｅｏら．，Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２７（２００６）４６９８−４７０５）、（本明細書で参考として援用されるＢｕｌｐｉｔｔら．Ｎｅｗ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４７（１９９９）１５２−１６９、（本明細書で参考として援用されるＪｉａ，Ｘ．Ｑ．，Ｃｏｌｏｍｂｏ，Ｇ．，Ｐａｄｅｒａ，Ｒ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．Ｓ．Ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃｉａｔｉｃ  ｎｅｒｖｅ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｂｙ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２５（２００４）４７９７−４８０４）。ＨＡ−ＡＤＨおよびＨＡ−ＡＬＤは、各々、１．３６ＭＤａ  ＨＡおよび４９０ｋＤａ  ＨＡから合成した。
【０３６１】
デキサメタゾン−スクシネート（ｄｅｘ−ｓｕｃ）の合成
この手法は従前の報告に基づいた（本明細書で参考として援用されるＰａｎｇ，Ｙ．Ｎ．，Ｚｈａｎｇ  Ｙ．，ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，Ｚ．Ｒ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｄｒｕｇおよびｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｎ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．  Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ８（２００２）９１３−９１７）、（本明細書で参考として援用されるＥｖｅｒｔｓ，Ｍ．，Ｋｏｋ，Ｒ．Ｊ．，Ａｓｇｅｉｒｓｄｏｔｔｉｒ，Ｓ．Ａ．，Ｍｅｌｇｅｒｔ，Ｂ．Ｎ．，Ｍｏｏｌｅｎａａｒ，Ｔ．Ｊ．Ｍ．，Ｋｏｎｉｎｇ，Ｇ．Ａ．，ｖａｎ  Ｌｕｙｎ，Ｍ．Ｊ．Ａ．，Ｍｅｉｊｅｒ，Ｄ．Ｋ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍｏｌｅｍａ，Ｇ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｉｎｔｏ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６８（２００２）８８３−８８９）。２．４５５ｇのデキサメタゾン（６．２５ミリモル）、１０．５２ｇコハク酸無水物および０．７９５ｇの４−ジメチルアミノピリジンは窒素ガス下で４００ｍｌの無水アセトンに溶解させた。溶液は室温にて一晩攪拌した。アセトンの蒸発後、白色結晶を３６ｍｌエタノールに溶解させ、次いで、８４ｍｌの純粋を徐々に加えた。溶液を４℃にて２日間維持し、白色針−形状結晶が沈殿した。それを濾過し、減圧下で乾燥した。この再沈殿を２回行った（収率：９０〜９５％）。
【０３６２】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドデキサメタゾン−スクシネートの合成（ＮＨＳ−ｄｅｘ−ｓｕｃ）
この手法は従前の報告に基づいた（本明細書で参考として援用される（Ｐｏｕｙａｎｉ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ，Ｇ．Ｄ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ−Ａｃｉｄ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ−Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５（１９９４）３３９−３４７）。１．３９３０ｇのｄｅｘ−ｓｕｃ、０．３５５５ｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、および０．６０４０ｍｇジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を８０ｍｌのアセトンに溶解させ、室温にて１６時間撹拌し、白色の結晶沈殿を生じた。結晶を濾過によって回収し、アセトンを蒸発によって除去し、乾燥した白色結晶が得られ、さらに精製することなく用いた（収率：９０〜９５％）。
【０３６３】
ヒアルロン酸−アジピン酸ジヒドラジド−デキサメタゾン−スクシネート（ＨＡ−ＤＥＸ）の合成
この手法は従前の報告に基づいた（本明細書で参考として援用されるＰｏｕｙａｎｉ，Ｔ．，  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ，Ｇ．Ｄ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ−Ａｃｉｄ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  −  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５（１９９４）３３９−３４７）。１００ｍｇ  ＨＡ−ＡＤＨを１３．３３ｍｌＮａＨＣＯ３  緩衝液（ｐＨ＝８．５）に溶解させた。１２５．８ｍｇのＮＨＳ−ｄｅｘ−ｓｕｃを２６．６７ｍｌのＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）に溶解させた。ＮＨＳ−ｄｅｘ−ｓｕｃ溶液を３０分間にわたってＨＡ−ＡＤＨ溶液に注ぎ、室温にて１８時間攪拌した。ポリマーを再度３００ｍｌのアセトンに沈殿させ、次いで、水に対して３日間透析させた。精製された産物を凍結乾燥し、次いで、４℃にて貯蔵した（収率：７０〜８０％）。
【０３６４】
ディスクヒドロゲルの調製（ＨＡＸおよびＨＡＸ−ＤＥＸ）
ＨＡ−ＡＬＤ（ＨＡＸ−ＤＥＸ）に架橋したＨＡ−ＤＥＸのディスク−形状ヒドロゲルを調製した。ＨＡ−ＤＥＸおよびＨＡ−ＡＬＤの２％（ｗ／ｖ）水性溶液を、二重シリンジ（Ｂａｘｔｅｒ：Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）を用いて２つのスライドガラスの間にサンドイッチされたゴム金型に注入した。調製したヒドロゲルの直径および厚さは、各々、１．２ｃｍおよび３．５ｍｍであった。ＨＡ−ＡＬＤ（ＨＡＸ）に架橋したＨＡ−ＡＤＨのディスク−形状ヒドロゲルは同様にして調製した。
【０３６５】
ポリマーの特徴付け
デキサメタゾンおよびＤＥＸ−スクシネートをｄ６−ＤＭＳＯに溶解させ、ＨＡ−ＡＤＨおよびＨＡ−ＤＥＸをＤ２Ｏに溶解させ、１Ｈ−ＮＭＲ分光分析（Ｖａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ  ３００分光光度計）によって分析した。
【０３６６】
ｄｅｘ−ｓｕｃ、ＮＨＳ−ｄｅｘ−ｓｕｃ、ＨＡ−ＡＤＨ、およびＨＡ−ＤＥＸの合成および純度は、Ａｔｌａｎｔｉｓ  ｄＣ１８分析カラム（ｄＣ１８；４．６×２５０ｍｍ；粒子サイズ５μｍ）を用いて高速液体クロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ  １１００）によって証明した。移動相はアセトニトリルおよびＮａＨ２ＰＯ４／Ｈ３ＰＯ４緩衝液の混合物（６０／４０；ｐＨ３．８）であった。流速は１ｍｌ／分であり、ＵＶ吸収は２４６ｎｍにおいて測定した（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ：Ｇ１３１４Ａ）。ＨＡにカップリングさせたデキサメタゾンの量は、報告されているようにスクシネートリンカーのアルカリ性加水分解後にＨＰＬＣによって分析した（本明細書で参考として援用される、Ｅｖｅｒｔｓら．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｉｎｔｏ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｅｎｄｔｈｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６８（２００２）８８３−８８９）。
【０３６７】
ヒドロゲルの特徴付け
ゲル化時間は本発明者らが報告したように測定した（本明細書で参考として援用されるＹｅｏ，Ｙ．，Ｈｉｇｈｌｅｙ，Ｃ．，Ｂｅｌｌａｓ，Ｅ．，Ｉｔｏ，Ｔ．，Ｍａｒｉｎｉ，Ｒ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２７（２００６）４６９８−４７０５）。簡単に述べれば、水性溶液中の０．１ｍｌの２％（ｗ／ｖ）ＨＡ−ＡＬＤを、磁性バーを用いて撹拌しつつ０．１ｍｌの２％ｗ／ｖ水性ＨＡ−ＤＥＸまたはＨＡ−ＡＤＨ溶液に加え、混合物がヒドロゲルの小球となるまでの時間を測定した。
【０３６８】
ゲルディスクの剛性率はレオメーター（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ：ＡＲ１０００，Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）によって測定した。ヒドロゲルディスクは上記のように調製し、次いで、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）中に５日間膨潤させて、膨潤した容量を重量分析により測定した。クリープおよび緩和試験は異なる剪断応力で行った。剛性率Ｇは、応力および歪みの間の直線的な関係の傾きから計算した。応力および歪みの間のフィットさせた線のＲ２値は０．９５を超えた。
【０３６９】
生存率アッセイ
ＨＡ、ＨＡ−ＡＤＨ、ＨＡ−ＡＬＤ、およびＨＡ−ＤＥＸの存在下におけるインビトロ細胞生存率は、ヒト中皮細胞系（ＣＲＬ−９４４４；ＡＴＣＣ）を用いるＭＴＴアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。細胞を成長させ、完全成長培地（３．３ｎＭ上皮成長因子、４００ｎＭヒドロコルチゾン、８７０ｎＭインスリン、２０ｎＭ  ＨＥＰＥＳおよび１０％ウシ胎仔血清を補充したＥａｒｌｅのＢＳＳ、０．７５ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１．２５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムを含む培地１９９）中に５％ＣＯ２中にて３７℃に維持した。５×１０４  細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに入れ、５％ＣＯ２中に３７℃にて一晩インキュベートした。培地を異なる濃度のＨＡ、ＨＡ−ＡＤＨ、ＨＡ−ＤＥＸ、およびＨＡ−ＡＬＤを含有する培地と交換した。材料を加えた後、第三日目に、ＭＴＴアッセイを行った。１００μｌのテトラゾリウム塩溶液を各ウェルに加え、３７℃にて４時間インキュベートした。活性なミトコンドリアによって生じた紫色ホルマザンを、１ｍｌの洗剤溶液を用いて可溶化させ、次いで、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ３８４）によって５７０ｎｍで測定した。吸光度値を、試験物質を培地に加えなかったウェルに対して正規化した。
【０３７０】
デキサメタゾン放出およびＨＡＸ−ＤＥＸ分解の動態
ディスク形状のＨＡＸ−ＤＥＸヒドロゲルは、２％（ｗ／ｖ）ゲル前駆体溶液を用いて上記のように調製した。ディスク形状のヒドロゲルは４ｍｌのＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地：ＧＩＢＣを、カタログ番号１０５６９−０１０）、０．５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン（Ａｌｄｒｉｃｈ））を含むＤＭＥＭ、（１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清：ＧＩＢＣを、カタログ番号１００８２−１４７）中に浸漬し、３７℃にて８日間インキュベートした。培地を第１日、２日、３日および５日に真正な培地で完全に交換し、細胞に加える前に−８０℃で貯蔵した。
【０３７１】
ＨＡＸおよびＨＡＸ−ＤＥＸディスクの分解の時間経過を重量分析により測定した。ヒドロゲルの重量Ｗｓは何回かの時点において測定した。膨潤容量Ｑ（％）はＱ＝Ｗ２／Ｗｉとして計算し、ここに、Ｗｉはヒドロゲルの初期重量である。
【０３７２】
マウスからの初代マクロファージの調製
Ｃ５７／Ｂ１６マウスはＴａｃｏｎｉｃ（Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＹ）から購入した。２ｍｌの３％（ｗ／ｖ）滅菌チオグリコレート溶液（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）を腹膜腔に注入した。注射から４日後に、マウスをＣＯ２によって安楽死させ、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する６ｍｌの表例ＰＢＳを注射した。ピンセットで腹膜を振動させた後、マクロファージ含有溶液を吸引した。線状、カウンティングおよびプレーティングの前に、細胞を直ちに氷上の冷たいＤＭＥＭに入れた。マウス当たり約１０７細胞が得られ、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中の５×１０５細胞を９６−ウェルプレートの各ウェルに加え、５％ＣＯ２中にて３７℃で一晩インキュベートした。
【０３７３】
リポ多糖（ＬＰＳ）−挑戦マクロファージによるサイトカインの生産
非接着細胞を２００μｌ／ウェルのＰＢＳ緩衝液で洗浄することによって除去した。次いで、１００μｌの１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを、およびヒドロゲル（Ｓｅｃ．２．２．９）と共に予めインキュベートした１００μｌの培地、または記地の濃度のデキサメタゾンを各ウェル中の接着性マクロファージに加えた。５％ＣＯ２中の３７℃における２４時間のインキュベーション後、２５μｌの９００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ｃａｔａｌｏｇ  ＃Ｌ−４３９１）を各ウェルに１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで加えた。さらに１６時間の間のインキュベーション後、培地を収集し、分析するまで−８０℃で貯蔵した。培地中のＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびデキサメタゾンの濃度は、ＥＬＩＳＡ（酵素−結合免疫吸着検定法）によって測定した。ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびデキサメタゾンについてのＥＬＩＳＡキットは、各々、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＤｕｏＳｅｔ，Ｃａｔ  ＤＹ４０６）、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ  ＭＡＸＴＭ  Ｓｅｔ（Ｄｅｌｕｘｅ））、およびＮｅｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。
【０３７４】
インビボ実験
動物は、実験動物の世話および使用のためのＮＩＨガイドライン（ＮＩＨ公開番号８５−２３、１９８５年改定）に適合させ、動物ケアについての技術委員会のマサチューセッツ制度によって認可されたプロトコルに従って世話した。２５〜３０ｇの体重の雄ＳＶ１２９マウスを酸素中の２〜３％イソフルランで麻酔した。背面中線を剃り、水中の７０％イソプロパノールで洗浄した。１ｍｌのＨＡＸ−ＤＥＸは、二重バレルのシリンジ（１つのシリンジ中の０．５ｍｌのＨＡ−ＤＥＸ、他方における０．５ｍｌのＨＡ−ＡＬＤ）から背面中線にて皮下注射した。注射から２日後、動物を屠殺し、標準技術を用いて組織学のために処理した。
【０３７５】
統計学的解析
データはＷｅｌｃｈのｔ−検定（群間の不均等な偏差を持つｔ−検定）によって解析した。放出動態試験における培地効果を比較するために、ＡＮＯＶＡを、Ｗｅｌｃｈのｔ−検定前に行った。対ｔ−検定を、同一の培地およびゲルの異なる時点の間に比較で用いた。全ての統計学的検定はＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（登録商標）（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて行った。ｐ値＜０．０５は統計学的に有意であると考えた。
【０３７６】
結果
ポリマー（ＨＡ−ＡＤＨおよびＨＡ−ＤＥＸ）の特徴付け
図３２中のスキームに従い、全ての材料を合成した。
【０３７７】
ｄｅｘ−ｓｕｃの合成はＮＭＲスペクトルによって、各々、４．４８および４．７０ｐｐｍ〜４．７８および５．０３ｐｐｍにおけるデキサメタゾンの２１−メチレンプロトンの化学シフトによって確認された。また、２４−メチレンおよび２５−メチレンプロトンの化学シフトは２．５９ｐｐｍにおいて出現した。ＨＰＬＣによるデキサメタゾンｄｅｘ−ｓｕｃ、およびＮＨＤ−ｄｅｘ−ｓｕｃの溶出時間は、各々、４．９分、５．５分、および７．９分だった。ＨＰＬＣによると、デキサメタゾンのｄｅｘ−ｓｕｃおよびＮＨＸ−ｄｅｘ−ｓｕｃへの変換の効力は、各々、＞９９％および９６％であった。
【０３７８】
ＨＡ−ＡＤＨの合成は１Ｈ−ＮＭＲスペクトルによって確認し；Ｄ−グルクロン酸残基の４８．４％はＡＤＨによって修飾された（本明細書で参考として援用されるＹｅｏ，Ｙ．，Ｈｉｇｈｌｅｙ，Ｃ．，Ｂｅｌｌａｓ，Ｅ．，Ｉｔｏ，Ｔ．，Ｍａｒｉｎｉ，Ｒ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２７（２００６）４６９８−４７０５）。これは、２．００ｐｐｍにおけるＮ−アセチル−Ｄグルコサミン残基のメチルプロトンのそれに対する１．６２ｐｐｍにおけるＡＤＨ残基のメチルプロトンについてのピークの積分値の比率から計算された。
【０３７９】
ＨＡ−ＡＤＨからのＨＡ−ＤＥＸの合成はＨＰＬＣおよび１Ｈ−ＮＭＲによって確認された。ＨＡ−ＤＥＸは、ＨＡ−ＡＤＨがそうでなかった、ＨＰＬＣ測定による２４６ｎｍにおけるＵＶ吸収ピークを有した。ＨＡ−ＤＥＸの保持時間は３．０分であった。ＨＡ−ＤＥＸのＨＡ−ＡＤＨからの合成はまた、２．６３ｐｐｍにおけるｄｅｘ−スクシネートのスクシネートリンカーの２４−メチレンおよび２５−メチレンプロトンの化学シフトの出現によってＮＭＲスペクトルで確認した。本発明者らは、２．００ｐｐｍにおけるＮ−アセチル−Ｄグルコサミン残基のメチルプロトンのそれに対する２．６３ｐｐｍにおけるスクシネートリンカー残基のメチレンプロトンからのピークの積分値の比率から、Ｄ−グルクロン酸残基の１３．１％がＮＨＳ−ｄｅｘ−ｓｕｃのスクシネートリンカーと反応したことを決定した。これより、本発明者らは、ＡＤＨ残基の３５．３％（＝４８．４％−１３．１％）はスクシネートリンカーによって修飾されず、ＨＡ−ＡＤＨ残基の２７％（＝１３．１％／４８．４％）はＮＨＳ−ｄｅｘ−ｓｕｃと反応したと計算した。
【０３８０】
パイロット実験は、このＨＡ−デキサメタゾン産物が、化合物の高い能力のため生物学的に望ましくなかった短い時間にわたってのそのデキサメタゾンの大きな割合を放出したことを示した。さらに、いくつかのポリマー系（例えば、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール）酸マイクロスフィア（本明細書で参考として援用されるＫｏｈａｎｅ，Ｄ．Ｓ．，Ｔｓｅ，Ｊ．Ｙ．，Ｙｅｏ，Ｙ．，Ｐａｄｅｒａ，Ｒ．，Ｓｈｕｂｉｎａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ａｎｄ  ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｔｏｎｅｕｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｔ  Ａ  ７７Ａ（２００６）３５１−３６１）での本発明者らの実験は、この物質の増大した疎水性が（例えば、腹膜における）いくつかの所望の使用に対するその生体適合性に好都合でなかったことを示唆した。結果として、本発明者らは、徹底的な透析によるデキサメタゾン負荷を低下させた。最終産物のＨＰＬＣ分析については、最終産物におけるデキサメタゾンにカップリングされたＨＡ−ＡＤＨのパーセンテージは０．１〜０．２％（ｎ＝３）に過ぎず、これは、そのほとんど全てが透析の間にスクシネートリンカーの加水分解によって放出されることを示唆する。デキサメタゾンでのＨＡの修飾のこの非常に低い最終の程度であっても、溶液中の物質の増大した濁度によって証明されるように、水中の結合体の溶解度に対する効果を有した。ＨＡ−ＤＥＸと以下でいうのはこの最終産物である。
【０３８１】
ヒドロゲル（ＨＡＸおよびＨＡＸ−ＤＥＸ）の特徴付け
ＨＡＸ−ＤＥＸ（２２．３±０．５秒）のゲル化時間は、恐らくは、架橋で利用可能なＨＡ−ＡＤＨについてのヒドラジド基の数はデキサメタゾンでの修飾によって２７％だけ減少したので、ＨＡＸのそれ（３．５±１．０；各群においてｎ＝４、ｐ＜０．０００１）よりも長かった。
【０３８２】
ＰＢＳ中で架橋した場合、ＨＡＸおよびＨＡＸ−ＤＥＸは共に、ＰＢＳ緩衝液への５日間の浸漬後にそれらの初期容量と比較して、２０６．２±１４．９％および２３５．６±３６．９％（ｎ＝４、ｐ＝０．２１）膨潤した。
【０３８３】
ＨＡＸおよびＨＡＸ−ＤＥＸの剪断応力値は、各々、３２．４±１７．２Ｐａ（ｎ＝４）および２２．１±１３．５Ｐａ（ｎ＝４）であったが、差は統計学的に有意でなかった。これらの値はヒドロゲルの双方がかなり変形可能であることを示し、ＨＡＸ−ＤＥＸはＨＡＸとほぼ同程度に架橋したことを示唆する。
【０３８４】
中皮細胞生存率についての合成されたポリマーの効果
ＨＡＸおよびＨＡＸ−ＤＥＸゲルは、それらの分解の間に、ＨＡ−ＡＤＨ、ＨＡ−ＡＬＤまたはＨＡ−ＤＥＸのようなポリマー断片を放出する。ＭＴＴアッセイは、中皮細胞生存率に対する合成されたポリマーの効果を調べるために行った。修飾されていないＨＡ、ＨＡ−ＡＬＤ、およびＨＡ−ＡＤＨ（全てについてｎ＝４）は、細胞生存率において小さな低下を示した（図３３）。（修飾されていないＨＡおよびＨＡ−ＡＬＤ、全ての濃度において対照と比較してｐ＜０．００５）。ＨＡ−ＡＬＤでは、各々、０．３、０．６、０．９および１．５％においてｐ＝０．４、０．０７、０．０１７、および０．００３）。ＨＡ−ＤＥＸ（ｎ＝４）は、中皮細胞の生存率においてより大きな低下を引き起こした（例えば、ＨＡ−ＡＤＨおよびＨＡ−ＤＥＸの間の比較：全ての濃度においてｐ＜０．００５）（図３３）。
【０３８５】
デキサメタゾンの放出動態、および細胞培養基におけるヒドロゲル容量の時間経過
ＨＡＸ−ＤＥＸゲルは細胞培養基（ＤＭＥＭ）においてインキュベートした。１、２、３、５および８日において、培地を変化させ、放出されたデキサメタゾンの濃度は方法に記載されたようにＥＬＩＳＡを用いて測定した（図３４）。別々の群において、本発明者らは、生理学的に関連する流体のより代表的なもの：０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または１０％ウシ胎仔血清（ＰＢＳ）であった培地を用いた。デキサメタゾンの放出は、最初の３日間について比較的一定速度で起こり、次いで、全ての３つの条件において徐々に減衰した。合計放出デキサメタゾンは、各々、ＤＭＥＭにおいて０．９４±０．２０μｇであり、ＢＳＡを含むＤＭＥＭにおいて１．３３±０．３９μｇ、およびＦＢＳを含むＤＭＥＭにおいて１．０２±０．４１μｇであり、これは、各々、ＤＭＥＭにおいて放出された合計の結合体化デキサメタゾンの１７．８±３．８％、ＢＳＡを含むＤＭＥＭにおいて２５．３±７．４％、およびＰＢＳを含むＤＭＥＭにおいて１９．３±７．８％二対応した。したがって、デキサメタゾンの約２０％は、放出実験の間にスクシネートリンカーの切断によって遊離薬物として放出された。実験の最後において、残ったゲル塊はなく；本発明者らは、デキサメタゾンの残りの８０％はポリマー断片に結合体化されて放出されたと推測する。放出培地のＧＰＣはデキサメタゾンで誘導体化されたマクロマーの存在を示したが、このようにして放出された量は直接的に定量することが可能でなかった。ＢＳＡ培地中のデキサメタゾン濃度は純粋なＤＭＥＭ（ｐ＝０．０３１）およびＰＢＳ培地（ｐ＝０．００９）におけるよりも高い場合、第５日を除いていずれの時点においても異なる培地中でのデキサメタゾン濃度の統計学的に有意な差はなかった。
【０３８６】
ＨＡＸおよびＨＡＸ−ＤＥＸヒドロゲルの膨潤および分解は細胞培養基中で続けた（図３５）。双方は数日にわたって膨潤を示した。最初の日においてはＨＡＸおよびＨＡＸ−ＤＥＸの間の膨潤の統計学的に有意な差はなかったが、３日までに、ＨＡＸ−ＤＥＸはＤＭＥＭ＋ＢＳＡおよびＤＭＥＭ＋ＦＢＳにおいてはＨＡＸよりも膨潤した（ｐ＜０．０５）。ＨＡＸ−ＤＥＸの分解速度は、ＨＡＸ−ＤＥＸゲルの容量が５日に顕著に低下したようにＨＡＸのそれよりも早かった。
【０３８７】
ＨＡＸ−ＤＥＸの抗炎症効果
デキサメタゾンは、リポ多糖（ＬＰＳ）で刺激したマクロファージにおけるＩＬ−６およびＴＮＦ−αの生産において用量依存性の低下を生じた（図３６）。デキサメタゾンを含まないＬＰＳで刺激した細胞におけるＩＬ−６およびＴＮＦ−αの濃度は、各々、７７３±１３ｎｇ／ｍｌおよび１１７２３±８７ｐｇ／ｍｌであった（ｎ＝４）。１０−９Ｍよりも低いデキサメタゾン濃度はこれらの２つの分子の生産に対して効果が得られた。
【０３８８】
ＨＡＸ−ＤＥＸの抗炎症効果を調べるために、ＬＰＳ−刺激初代腹膜マクロファージは、これまでのセクションにおける実験でのＨＡＸおよびＨＡＸ−ＤＥＸによって生じた放出培地で処理した。培地におけるＩＬ−６（図３７）およびＴＮＦ−α（図３８）の濃度は、腹膜マクロファージに対する曝露後に測定した。図３６の図３７および図３８に対する比較は、ＨＡＸでの放出実験に由来する培地がＩＬ−６またはＴＮＦ−αの生産を有意に減衰させなかったことを明らかにする。対照的に、ＨＡＸ−ＤＥＸからのものへの曝露は双方において顕著な低下を生じた。腹膜マクロファージによるＩＬ−６（図３７）およびＴＮＦ−α（図３８）の生産の統計学的に有意な抑制を、各々、３および５日についてＨＡＸと比較したＨＡＸ−ＤＥＸで見られた。
【０３８９】
生体適合性および組織反応
雄ＳＶ１２９マウスは、ＨＡＸまたはＨＡＸ−ＤＥＸいずれかの１ｍｌで皮下注射した（各々、ｎ＝４）。注射から２日後に、動物を安楽死させ、毛を剃った。ＨＡＸ−ＤＥＸのポケットの輪郭は、皮膚を通じて、および切開に際して皮下組織において見られたＨＡＸのそれよりも明瞭に一線が画された。ＨＡＸゲルは幾分粘着性であるが、それらはより流動的であって、組織面に広がった。ＨＡＸ−ＤＥＸゲルは離散的存在としてそれらのカプセルから容易に除去できた（摘出された）（図３９Ａ）。ＨＡＸ−ＤＥＸゲルはＨＡＸゲルよりも明瞭であった。これらの治験は上記で示したインビトロ結果とは対照的であり、ここに、ＨＡＸ−ＤＥＸはＨＡＸよりも迅速に分解した。ＨＡＸ−ＤＥＸゲルのスミアーの全ての染色されたセクションは、白色細胞による浸潤のほとんど完全な存在を示し、一方で、ＨＡＸゲルの１つを除いて全てのスミアーは好中球およびマクロファージの密なコレクションを有した。さらに、ゲル−組織界面における組織および残存ゲルは、ＨＡＸ−ＤＥＸゲルよりもＨＡＸにおいてより激しい細胞浸潤物を示した（図３９Ｂ〜Ｄ）。
【０３９０】
考察
ここに、本発明者らは、結合体化デキサメタゾンを放出する架橋されたＨＡヒドロゲルの合成および特徴付けを記載した。この系は、腹膜において適用し、執拗に存在することを容易とするような特徴を有する。デキサメタゾンでのヒドロゲルの負荷は意図的に非常に低かった。上記のように、１つの関心は、マトリックスの過剰な疎水性がＨＡマトリックスの生物学的適合性を損なうであろうことであった。さらに、デキサメタゾンは損なわれた創傷治癒、免疫抑制、高血圧、胃腸出血その他を含む非常に優れた効果を有する。従って、最小化は、全身効果、または創傷近くの裂けを最小化しつつ、局所的抗炎症活性を提供することを可能とするのが重要であった。この非常に低い負荷であってさえ、ヒドロゲルは数日間、透析除去されるデキサメタゾンによって引き起こされたかなりのバースト放出なくして臨床的に有効な濃度の薬物を放出した。逆に、負荷に関してこれらの考慮の重要性が、ＨＡＸと比較してＨＡＸ−ＤＥＸの温和に増大した細胞傷害性によって確認された。しかしながら、本発明者らは、インビトロで得られた遊離ＨＡＸ−ＤＥＸの濃度が、架橋されたヒドロゲルのゆっくりとした分解を仮定すればインビボで起こらないようであることを注記する。
【０３９１】
多数の調査者が、腹膜癒着の形成を妨げることにおいてステロイドグルココルチコイド受容体アゴニストの有効性を報告した（本明細書で参考として援用されるＨｏｃｋｅｌら．
Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｗｉｔｈ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  Ｄｅｌｉｂｅｒｅｄ  Ｂｙ  Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ．Ａｎｎａｌｅｓ  Ｃｈｉｒｕｒｇｉａｅ  Ｅｔ  Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｉａｅ  ７６（１９８７）３０６−３１３）、（本明細書で参考として援用されるＢｕｃｋｅｎｍａｉｅｒら．  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉａｄｈｅｓｉｖｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｕｒｇｅｏｎ  ６５（１９９９）２７４−２８２）、（本明細書で参考として援用されるＫｕｄｕｋｏｚｋａｎら．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｂｙ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｒｏｍｏｇｌｙｃａｔｅ、ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、ｓａｌｉｎｅおよびａｐｒｏｔｉｎｉｎ  ａｆｔｅｒ  ｐｅｌｖｉｃ  ｓｕｒｇｅｒｙ．ＡＮＺ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  ７４（２００４）１１１１−５）。これらの化合物は、機構の中でも、中皮細胞および腹膜マクロファージによってサイトカインの生産を低下させることによって作用すると報告されている。ここに、本発明者らは、デキサメタゾン放出の有効性の尺度として２つのサイトカインを検討した。ＴＮＦ−αは急性炎症および腹膜癒着形成において重要なサイトカインである（本明細書で参考として援用されるＨｏｍｄａｈｌ，Ｌ．，およびＩｖａｒｓｓｏｎ、Ｍ．Ｌ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ、およびｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｐａｉｒ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １６５（１９９９）１０１２−１０１９）、（本明細書で参考として援用されるＭｕｔｓａｅｒｓ，Ｓ．Ｅ．Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：Ｔｈｅｉｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｓｅｒｏｓａｌ  ｒｅｐａｉｒ．Ｒｅｓｐｉｒｏｌｏｇｙ  ７（２００２）１７１−１９１）。それは、種々のメディエーター：フィブリン溶解を遅延させる（本明細書で参考として援用される、Ｖａｎｈｉｎｓｂｅｒｇｈ，Ｖ．Ｗ．Ｍ，Ｂａｕｅｒ，Ｋ．Ａ．，Ｋｏｏｉｓｔｒａ，Ｔ．，Ｋｌｕｆｔ，Ｃ．，Ｄｏｏｉｊｅｗａａｒｄ，Ｇ．，Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｚｅｎ，Ｗ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｏｆ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ−Ｎｅｃｒｏｓｉｓ−Ｆａｃｔｏｒ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ−Ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  Ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｙｐｅ  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ，Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｔｙｐｅ−１，  Ａｎｄ  Ｆｉｂｒｉｎ（Ｏｇｅｎ）Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｂｌｏｏｄ  ７６（１９９０）２２８４−２２８９）、（本明細書で参考として援用されるＭｕｌｌａｒｋｙら．Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｇａｍｍａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ  ｏｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｂｕｒｄｅｎ，ｄｉｃｔａｔｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｆｉｂｒｉｎ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７４（２００６）１１８１−１１８８）プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（ＰＡＩ）（本明細書で参考として援用されるＷｈａｗｅｌｌら．Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｏｆ  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１  Ｂｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８１（１９９４）２１４−２１６）、（Ｗｈａｗｅｌｌ，Ｓ．Ａ．，ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｏｆ  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１  Ｂｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １６１（１９９５）３１５−３１８；腹膜炎症を加速する、ＩＬ−１、ＩＬ−６（本明細書で参考として援用されるＭｕｔｓａｅｒｓ，Ｓ．Ｅ．Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：Ｔｈｅｉｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｓｅｒｏｓａｌ  ｒｅｐａｉｒ．Ｒｅｓｐｉｒｏｌｏｇｙ  ７（２００２）１７１−１９１）、およびプロスタグランジン（本明細書で参考として援用されるＴｏｐｌｅｙ，Ｎ．，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ，Ｒ．，Ｎｅｕｂａｕｅｒ，Ａ．，Ｓｔｙｌｉａｎｏｕ，Ｅ．，Ｋａｅｖｅｒ，Ｖ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｍ．，Ｃｏｌｅｓ，Ｇ．Ａ．，Ｊｏｒｒｅｓ，Ａ．，ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｄ．Ｈｕｍａｎ  Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  −  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ−Ｒｎａ  Ｂｙ  Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ４６（１９９４）９００−９０９）；好中球および単球動因を誘導する、ＩＬ−８（本明細書で参考として援用されるＭｕｔｓａｅｒｓ，Ｓ．Ｅ．Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：Ｔｈｅｉｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｓｅｒｏｓａｌ  ｒｅｐａｉｒ．Ｒｅｓｐｉｒｏｌｏｇｙ  ７（２００２）１７１−１９１）、単球化学走性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）（本明細書で参考として援用されるＭｕｔｓａｅｒｓ，Ｓ．Ｅ．Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：Ｔｈｅｉｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｓｅｒｏｓａｌ  ｒｅｐａｉｒ．Ｒｅｓｐｉｒｏｌｏｇｙ  ７（２００２）１７１−１９１）その他を中皮細胞が分泌するように刺激する。従って、ＴＮＦ−α活性の抑制は、腹膜癒着を抑制することにおいて潜在的価値がある。ＩＬ−６はマクロファージ、線維芽細胞、および中皮細胞を含めた多数の細胞によって生産される。その生産はＩＬ−１およびＴＮＦ−αによって中皮細胞に���って用量−依存的に誘導される（本明細書で参考として援用されるＴｏｐｌｅｙら．Ｈｕｍａｎ  Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６−Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｂｙ  ＩＩ−１−Ｂｅｔａ  Ａｎｄ  Ｔｎｆ−Ａｌｐｈａ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ４３（１９９３）２２６−２３３）。それは、中皮細胞がＰＡＩを分泌させる刺激（本明細書で参考として援用されるＷｈａｗｅｌｌら．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｏｆ  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１  Ｂｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １６１（１９９５）３１５−３１８）、中皮細胞増殖の阻害（本明細書で参考として援用されるＬａｎｆｒａｎｃｏｎｅら．Ｈｕｍａｎ  Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ｐｒｏｄｕｃｅ  Ｍａｎｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  Ｃｏｌｏｎｙ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ［Ｃｓｆ］，Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｍｏｎｏｃｙｔｅ−Ｃｓｆ，Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｃｓｆ，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１［ＩＩ−１］，Ａｎｄ  ＩＩ−６）Ａｎｄ  Ａｒｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ａｎｄ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｔｏ  Ｇｒｏｗ  Ｂｙ  ＩＩ−１．Ｂｌｏｏｄ  ８０（１９９２）２８３５−２８４２）、および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）放出の誘導、したがって、ＴＮＦ−αまたはＴＧＦ−βのような脈管形成の促進（本明細書で参考として援用されるＣｏｈｅｎら．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ６  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１（１９９６）７３６−７４１）を含めた癒着形成に関連する多数の効果を有する。
【０３９２】
腹膜におけるＨＡベースのマトリックスの生体適合性、および、事実、腹膜癒着を阻害するにおけるそれらの適用性は記載されている（本明細書で参考として援用されるＹｅｏら．Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２７（２００６）４６９８−４７０５）。デキサメタゾンは、正確にその能力のためＨＡマトリックスへの結合体化について選択され、従って、生物学的に良性なマトリックスの最低の可能な改変でもって与えられた炎症効果を達成することができ−特に、本発明者らはそれを疎水性とすることを避けたい。ビヒクルの生体適合性は重要であり；１つの研究は、デキサメタゾンの低い負荷でもって疎水性ポリマーポリ−ＦＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＧＡ）から構成されるマイクロスフィアは癒着を悪化させ、一方で、デキサメタゾンのより高い負荷を伴うマイクロスフィアは癒着形成を減少させたことを示した。これは、癒着を妨げることにおけるデキサメタゾンの効果が、引き続いて確認される特性である、ポリマーミクロスフィアの癒着を引き起こす効果によって相殺されたことを示唆した（本明細書で参考として援用されるＫｏｈａｎｅら．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ａｎｄ  ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｔｏｎｅｕｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｔ  Ａ  ７７Ａ（２００６）３５１−３６１）。プレ−ポリマーＨＡ−ＤＥＸはここで用いる他の前駆体マクロ分子よりも低い細胞生存率を引き起こすように見えるが、デキサメタゾンの薬理学的効果およびアッセイの性質を仮定すれば、これは直接的毒性効果よりもむしろ抗増殖効果を反映できることを注記するのは重要である。さらに、架橋されていないＨＡ−ＤＥＸの濃度は混合後にここで試験されるものよりもかなり低いようである。事実、本発明者らの結果は、ＨＡＸ−ＤＥＸの生体適合性がＨＡＸのそれと匹敵し、より温和な炎症応答さえ引き起こすことを示す。
【０３９３】
結論
ヒアルロン酸およびデキサメタゾンのインサイチュ架橋可能な結合体ヒドロゲルは、マクロファージＴＮＦ−αおよびＩＬ−６生産の抑制で示されるように、適当な取扱特徴を有し、生物学的に有効なデキサメタゾンを放出した。インビボにおいて、ＨＡＸ−ＤＥＸゲルは、ＨＡＸゲルからのものよりも少ない炎症細胞浸潤物と結合した。
【０３９４】
（実施例１５：インサイチュ架橋可能なヒアルロナンヒドロゲル送達ブデソニドでの腹膜癒着の予防）
緒言
本実施例は、グルココルチコイド受容体アゴニストブデソニドを含有するインサイチュ架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル（バリアーデバイス）を記載する。ブデソニドは、癒着形成における炎症の公知の役割のため選択した。ヒアルロン酸、腹膜におけるその公知の生体適合性のため。２つの架橋可能な前駆体液体を含む系は、二重バレルのシリンジを用い、１０秒未満にフレキシブルかつ耐久性のヒドロゲルを形成する。本発明者らは、この処方または対照を、ウサギにおける腹膜癒着形成の重篤な反復側壁欠損−盲腸磨耗モデルにおける第二の傷害後に傷害した部位に適用した。大きな癒着が全ての生理食塩水−処理動物において発症した。癒着形成および領域は、ヒドロゲルなくして生理食塩水またはヒドロゲル中のブデソニドで処理した動物においてわずかに緩和された。癒着の発生および領域は、ヒドロゲルにおけるブデソニドで処理した動物において劇的に低下した。ラットにおける皮下注射では、本発明者らは、ヒドロゲル中のブデソニドがヒドロゲル単独と比較して炎症を低下させたことを示した。まとめると、ヒアルロン酸ヒドロゲル中のブデソニドは、本発明者らの広い反復した傷害モデルにおいて癒着を予防するのに便利かつ高度に効果的である。それは外科的処置後癒着予防のための潜在的に融合な系であり；したがって、本発明は、バリアデバイスの有効性が同時薬物送達によって大いに増強させることができるという認識を含む。
【０３９５】
腹膜癒着は、腹部と骨盤との間における構造に持続的な組織結合があり、これは外科的外傷または感染の後に形成され得る。外科的処置後の癒着の発生率は８０％と高く、しばしば、疼痛、不妊症、または腸閉塞のような重篤な臨床的結果に導く（本明細書で参考として援用されるｄｉＺｅｒｅｇａ  ＧＳ．Ｐｅｒｔｏｎｅｕｍ，ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｈｅａｌｉｎｇ，  ａｎｄ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｉｎ：ｄｉＺｅｒｅｇａ  ＧＳ，ｅｄｉｔｏｒ．Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０００．ｐ．３−３７）。癒着を妨げる努力において、多数の調査者は、癒着形成における臨床的事象と共に介在する薬理学的剤を適用した（本明細書で参考として援用されるｄｉＺｅｒｅｇａ  ＧＳ．Ｐｅｒｔｏｎｅｕｍ，ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｈｅａｌｉｎｇ，  ａｎｄ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｉｎ：ｄｉＺｅｒｅｇａ  ＧＳ，ｅｄｉｔｏｒ．Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０００．ｐ．３−３７）。癒着形成の病因の炎症成分は、種々のステロイド性抗炎症薬物を使用する薬理療法についての共通の標的であった（その全てが本明細書に参考として援用されるＫｕｃｕｋｏｚｋａｎ  Ｔ，Ｅｒｓｏｙ  Ｂ，Ｕｙｇｕｒ  Ｄ，Ｇｕｎｄｏｇｄｕ  Ｃ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｂｙ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｒｏｍｏｇｌｙｃａｔｅ，ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，ｓａｌｉｎｅ  ａｎｄ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ  ａｆｔｅｒ  ｐｅｌｖｉｃ  ｓｕｇｅｒｙ．ＡＮＺ  Ｊ  Ｓｕｒｇ２００４；７４（１２）：１１１１−１１１５；Ｈｏｃｋｅｌ  Ｍ，Ｏｔｔ  Ｓ，Ｓｉｅｍａｎｎ  Ｕ，Ｋｉｓｓｅｌ  Ｔ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｗｉｔｈ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  Ｂｙ  Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ．Ａｎｎａｌｅｓ  Ｃｈｉｒｕｇｉａｅ  Ｅｔ  Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｉａｅ  １９８７；７６：３０６−３１３；Ｂｕｃｋｅｎｍａｉｅｒ  ＣＣ，Ｐｕｓａｔｅｒｉ  ＡＥ，Ｈａｒｒｉｓ  ＲＡ，Ｈｅｔｚ  ＳＰ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉａｄｈｅｓｉｖｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｕｒｇｅｏｎ  １９９９；６５：２７４−２８２；Ｍａｕｒｅｒ  Ｊ，Ｂｏｎａｖｅｎｔｕｒａ  Ｌ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｏｎ  ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  １９８３；３９（４）：４８５−４８９；Ｇａｚｚａｎｉｇａ  Ａ，Ｊａｍｅｓ  Ｊ，Ｓｈｏｂｅ  Ｊ，Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ  Ｅ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ，ｐｒｏｍｅｔｈａｚｉｎｅ，ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｎ．Ａｒｃｈ  Ｓｕｒｇ  １９７５；１１０（４）：４２９−４３２；ａｎｄ  Ｊａｎｓｅｎ  Ｒ．Ｆａｉｌｕｒｅ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ａｄｊｕｎｃｔｓ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｐｅｌｖｉｃ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｙｏｕｎｇ  ｗｏｍｅｎ．Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １９８５；１５３（４）：３６３−３７１）。しかしながら、有効性は、特に再発癒着を阻害することにおいて（本明細書で参考として援用されるＬａｒｓｓｏｎ  Ｂ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｌｖｉｃ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ．Ｉｎ：Ｔｒｅｕｔｎｅｒ  ＫＨ，Ｓｃｈｕｍｐｅｌｉｃｋ  Ｖ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎｓ．Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｔｅｌｏｓ，１９９７．ｐ．３３１−３３４）、動物モデル（本明細書で参考として援用されるＧａｚｚａｎｉｇａ  Ａ，Ｊａｍｅｓ  Ｊ，Ｓｈｏｂｅ  Ｊ，Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ  Ｅ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ，ｐｒｏｍｅｔｈａｚｉｎｅ，ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｎ．Ａｒｃｈ  Ｓｕｒｇ  １９７５；１１０（４）：４２９−４３２）、および臨床試験（本明細書で参考として援用されるＪａｎｓｅｎ  Ｒ．Ｆａｉｌｕｒｅ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ａｄｊｕｎｃｔｓ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｐｅｌｖｉｃ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｙｏｕｎｇ  ｗｏｍｅｎ．Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １９８５；１５３（４）：３６３−３７１）において合致していなかった。
【０３９６】
腹膜からの薬物の迅速な除去は、腹膜内適用薬物の限定された有効性の原因であろう。薬物が高い局所的濃度を維持することを可能とする適切な送達系はそれらの生物学的効果を最大化するであろう。本実施例においては、本発明者らは、抗炎症化合物について薬物送達系としてインサイチュ架橋可能なヒアルロナンヒドロゲル（ＨＡＸ）を選択した。従前の実施例において、本発明者らは、ＨＡＸが、ナノ粒子の存在にかかわらず、ウサギ側壁欠損−盲腸磨耗モデルにおいて腹膜癒着を妨げるのに優れた有効性を有することを示した（その双方が本明細書に参考として援用されるＹｅｏ  Ｙら．Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６；２７：４６９８−４７０５；ａｎｄ  Ｙｅｏ  Ｙ，Ｉｔｏ  Ｔ，Ｂｅｌｌａｓ  Ｅ，Ｈｉｇｈｌｅｙ  ＣＢ，Ｍａｒｉｎｉ  Ｒ，Ｋｏｈａｎｅ  ＤＳ．Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ．Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  ２００６：Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ；）。ブデソニドは、デキサメタゾンのそれに匹敵する優れたグルココルチコイド活性を有し（本明細書で参考として援用されるＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＰＤＲ，２００６）、全身吸収に際して不活性な代謝産物に迅速に変換される（本明細書で参考として援用されるＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＰＤＲ，２００６）。ブデソニドの抗癒着活性は、激しく反復された傷害動物モデルを用いて本実施例において示される。生体適合性ＨＡＸの使用はその抗癒着活性を有意に改良し、試験された動物の大部分において完全に癒着を妨げる。
【０３９７】
材料および方法
インサイチュ架橋可能ＨＡ誘導体の調製
インサイチュ架橋可能ＨＡ誘導体を合成し、従前に報告された方法に従って分析した（その全てが本明細書に参考として援用されるＹｅｏ  Ｙ，Ｈｉｇｈｌｅｙ  ＣＢ，Ｂｅｌｌａｓ  Ｅ，Ｉｔｏ  Ｔ，Ｍａｒｉｎｉ  Ｒ，Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６；２７：４６９８−４７０５；Ｂｕｌｐｉｔｔ  Ｐ，Ａｅｓｃｈｌｉｍａｎｎ  Ｄ．Ｎｅｗ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ：ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９；４７：１５２−１６９；ａｎｄ  Ｊｉａ  Ｘ，Ｃｏｌｏｍｂｏ  Ｇ，Ｐａｄｅｒａ  Ｒ，Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ，Ｋｏｈａｎｅ  ＤＳ．Ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃｉａｔｉｃ  ｎｅｒｖｅ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｂｙ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００４；２５（１９）：４７９７−４８０４）。簡単に述べれば、ＨＡ−アジピン酸ジヒドラジド（ＨＡ−ＡＤＨ）はアジピン酸ジヒドラジドをＨＡ骨格においてカルボン酸基に結合体化させることによって調製し、ＨＡ−アルデヒド（ＨＡ−ＣＨＯ）は、ＨＡを過ヨウ素酸ナトリウムと反応させることによって調製した。
【０３９８】
ブデソニド−生理食塩水およびブデソニド−ＨＡＸの調製
ブデソニドをまずエタノールに溶解させ，８．２ｍｇ／ｍｌストック溶液を作製した。ブデソニド−生理食塩水は、０．１６ｍｌのストック溶液を１０ｍｌ生理食塩水に加えることによって調製した。ブデソニド−ＨＡＸについては、０．０８ｍｌをブデソニドストック溶液を、各々、５ｍｌ  ＨＡ−ＡＤＨ（２０ｍｇ／ｍｌ）および５ｍｌ  ＨＡ−ＣＨＯ（２０ｍｇ／ｍｌ）に加えた。ブデソニド−ＨＡＸゲルは、Ｂａｘｔｅｒ二重バレルのシリンジを用いる共通の出口を通って２つの前駆体溶液を溶出させることによって調製した。ブデソニド−生理食塩水およびブデソニド−ＨＡＸは共に０．０１３ｍｇ／ｍｌブデソニドを含有した。
【０３９９】
ブデソニド−ＨＡＸの特徴付け
ブデソニド−ＨＡＸのインサイチュゲル化時間は従前に記載されているように室温で測定した（本明細書で参考として援用されるＹｅｏ  Ｙら．Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６；２７：４６９８−４７０５）。簡単に述べれば、２０ｍｇ／ｍｌ  ＨＡ−ＡＤＨおよびＨＡ−ＣＨＯ溶液を生理食塩水中で調製した。ブデソニドを、上記のように、各溶液に０．１３ｍｇ／ｍｌまで加えた。１００μｌのＨＬ−ＡＤＨ溶液は、一定撹拌下で、１００μｌのＨＡ−ＣＨＯ溶液と混合した。ゲル化時間は、溶液が皿の底から分離した固体小球を形成した時点であると考えられた。凍結乾燥したブデソニド−ＨＡＸの内部構造の形態は、走査型電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）によって調べた。ブデソニド−ＨＡＸゲルは凍結乾燥し、液体窒素中での冷却後に破砕した。試料を白金および金（１５０Åの厚さ）スパッタ−コートし、走査型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ  ＪＳＭ  ６３２０，ＪＥＯＬ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｐｅａｂｏｄｙ，ＭＡ）を用いて観察した。
【０４００】
生理食塩水中のブデソニド溶解性の測定
生理食塩水中のブデソニドの最大溶解性は、記載されているように決定した（本明細書で参考として援用されるＧｅｎｎａｒｏ  ＡＲ，ｅｄｉｔｏｒ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．２０ｔｈ  ｅｄ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００）。まず、増大させる量のブデソニドを生理食塩水と混合して、２５ｍｇ／ｍｌ〜０．００２ｍｇ／ｍｌの系におけるブデソニド濃度を提供した。混合物を３７℃にて２４時間一定に撹拌し、次いで、１２，０００ｒｐｍにて５分間遠心して、溶液の相を固体相から分離した。溶液相中のブデソニド濃度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定した。生理食塩水中のブデソニドの飽和溶解性は、その傾きが０である直線セグメントをｙ−軸外挿することによって決定した。
【０４０１】
別々の実験において、ブデソニド−生理食塩水０．１３ｍｇ／ｍｌを上記のように調製し、１ｍｌアリコートに分割し、一定に撹拌して３７℃でインキュベートした。適時の間隔にてブデソニド−生理食塩水のアリコートを採取し、１２，０００ｒｐｍにて５分間遠心して、ＨＰＬＣ分析のために８ｍｌの上清を分離した。潜在的に、沈殿したブデソニドを含有する残りの０．２ｍｌを０．８ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、ＨＰＬＣで分析した。
【０４０２】
インビトロブデソニド放出動態
ディスク−形状ブデソニド−ＨＡＸを２つのスライドガラスの間にサンドイッチされたゴム金型中で調製した。調製されたヒドロゲルの直径および厚さは、各々、８ｍｍおよび３．５ｍｍ（約１５０μｌ）であった。ブデソニド−ＨＡＸゲルを秤量し、１０Ｕ／ｍｌヒアルロニダーゼを含有する１ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を加えたエッペンドルフチューブに入れ、３７℃にて一定に回転してインキュベートした。放出媒体０．５ｍｌの簡単な回転沈降の後サンプリングし、０．５ｍｌの新鮮な培地を交換した。放出試料をＨＰＬＣ分析まで凍結した。
【０４０３】
ブデソニドのＨＰＬＣ分析
クロマトグラフィー系は、自動インジェクターおよびＵＶディテクターを備えたＨＰＬＣ溶媒送達系よりなるものであった（１１００シリーズ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）。分析カラムはＡｔｌａｎｔｉｓ  ｄＣ１８（ｄＣ１８；４．６×２５０ｍｍ：粒子サイズ５μｍ）。移動相は０．１％酢酸およびアセトニトリルの３０：７０混合物であり、流速は１ｍｌ／分であった。試料５μｌを予め平衡化したカラムに注入し、続いて、移動相で１０分間洗浄した。ＵＶディテクターは２４８ｎｍにおいて設定した。較正曲線は、クロマトグラム中のピーク面積およびブデソニド標準の濃度を相関させることによって作成した。滞留時間：６．１分。検出限界：０．２μｇ／ｍｌ。
【０４０４】
ブデソニド−ＨＡＸのインビボ適用
動物は、実験室動物の世話および使用についてのＮＩＨガイドライン（ＮＩＨ公表番号８５−２３、１９８５年改定）と適合させ、動物ケアについての技術委員会のマサチューセッツ制度によって認可されたプロトコルに従って世話した。
【０４０５】
ブデソニド−ＨＡＬの皮下適用
雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（３２０ｇ〜４２０ｇ）は酸素中の２〜３％イソフルランで麻酔した。１ｍｌのブデソニド−ＨＡＸまたはＨＡＸを二重バレルのシリンジから注入した（１つのシリンジ中に０．５ｍｌのＨＡ−ＡＤＨ、他方シリンジ中の０．５ｍｌのＨＡ−ＣＨＯ）。ブデソニド−ＨＡＸは上記のように０．１３ｍｇ／ｍｌブデソニドを含有するように調製した。したがって、ラットに与えられたブデソニドの合計用量は、０．３〜０．４ｍｇ／ｋｇであった。ＨＡＸ陰性対照は、ブデソニドストック溶液の代わりにエタノールを加えることによって調製した。ブデソニド−ＨＡＸまたはＨＡＸは背後中線に皮下投与した。注射から２日（ｎ＝５）または５日（ｎ＝４）後に、組織反応の調査のために動物を屠殺した。標準的な技術を用いて組織を組織学のために処理した。
【０４０６】
ブデソニド−ＨＡＸによる腹膜内癒着の予防
腹膜癒着を、本発明者らの従前の研究［ｔＰＡ］において記載された反復開腹を介して雌白ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ；Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ）（３±０．５ｋｇ）において誘導した。簡単に述べれば、盲腸磨耗および腹壁の切り出しを行って、デノボ癒着を誘導した（本明細書で参考として援用されるＹｅｏ  Ｙら．Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６；２７：４６９８−４７０５）。第二の開腹術を１週間後に行って、癒着を切断し、第一の開腹術において傷害したのと同一の位置にさらなる傷害を導入した。傷害からの過剰の血液を除去し、次いで、Ｂａｘｔｅｒ二重バレルのシリンジを用いて再度磨耗させた領域に１０ｍｌのブデソニド−生理食塩水またはブデソニド−ＨＡＸを適用した（ｎ＝６）。双方の処方は１．３ｍｇのブデソニド（０．４４ｍｇ／ｋｇ）を含有した。オペレーターは処理の同一性について知らされていなかった。
【０４０７】
手術後ケアは他の箇所に記載されたように行った（本明細書で参考として援用されるＹｅｏ  Ｙら．Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６；２７：４６９８−４７０５）。ペントバルビタールナトリウムの静脈内注射による第二の開腹から一週間後に動物を屠殺した。癒着は、報告された方法の修飾を用いてスコア取りした（本明細書で参考として援用されるＢｕｒｎｓら．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｐｏｓｔｓｕｒｇｉｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｂｙ  ｐｒｅｃｏａｔｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ  １９９５；５９：６４４−６５２）：スコア０＝癒着無し；スコア１＝重力で分離されるであろう組織癒着；スコア２＝鈍的切開によって分離可能な組織癒着；およびスコア３＝鋭的切開を必要とする癒着。もし異なるスコアの複数の癒着があれば、本発明者らは、代表的なスコアとしてより高いものを選択する。スコア２または３の癒着の面積は、癒着の量的な評価のために測定した。評価者は、各動物が受けた処理に関しては知らされていなかった。剖検から回収された組織は１０％ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋し、薄片とし、組織学的調査のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【０４０８】
統計学的解析
インビボ実験からのデータは、２５番目および７５番目のパーセンタイルでの中央値として表した。なぜならば、それらは常には正規分布に従わなかったからであり、かつ統計学的推定は、ＳＰＳＳソフトウェア（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を用い、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定の後にＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−検定を用いて、あるいはＦｉｓｈｅｒの正確確率検定を用いて行った。両側検定でのｐ値＜０．０５は統計学的に有意であると考えられた。
【０４０９】
結果
ブデソニド−ＨＡＸゲルの形成
０．１３ｍｇ／ｍｌブデソニドを共に含有する二つのＨＡ誘導体（２０ｍｇ／ｍｌ）溶液は、一定に撹拌しつつ混合に際して４．１±１．７秒内にブデソニド−ＨＡＸゲルを形成し、これは、ブデソニド無しのＨＡＸゲルについてのゲル化時間と同様であった（３．９±１．１秒、両側ｔ−検定でｐ＝０．７２）。ＳＥＭ（図４０）下で、凍結乾燥したブデソニド−ＨＡＸゲルは、架橋されたヒドロゲルに典型的な多孔性ネットワークを示した（その双方が本明細書に参考として援用されるＪｉａ  Ｘ，Ｂｕｒｄｉｃｋ  ＪＡ，Ｋｏｂｌｅｒ  Ｊ，Ｃｌｉｆｔｏｎ  ＲＪ，Ｒｏｓｏｗｓｋｉ  ＪＪ，Ｚｅｉｔｅｌｓ  ＳＭ，ら．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋａｂｌｅ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ−Ｂａｓｅｄ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｖｏｃａｌ  Ｆｏｌｄ  Ｒｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００４；３７（９）：３２３９−３２４８；ａｎｄ  Ｙｅｏ  Ｙ，Ｂｕｒｄｉｃｋ  ＪＡ，Ｈｉｇｈｌｅｙ  ＣＢ，Ｍａｒｉｎｉ  Ｒ，Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ，Ｋｏｈａｎｅ  ＤＳ．Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ａｎｄ  ＵＶ−ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｃｈｉｔｏｓａｎ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６；７８Ａ（４）：６６８−６７５）。
【０４１０】
生理食塩水中のブデソニドの溶解性
ブデソニドは、合衆国薬局法分類に従って水に「実質的に不溶性」である。（溶解度：＜０．１ｍｇ／ｍｌ）（合衆国薬局法、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ：Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．本明細書中で検討した処方におけるブデソニドの可溶性画分を推定するために、３７℃における生理食塩水中のその溶解性を測定した。種々の量のブデソニド粉末を、３７℃において一晩溶解させた。溶解していない固体相から分離した溶液中のブデソニド濃度は、３７℃の生理食塩水中のブデソニドの飽和溶解度として定義される、０．０２７ｍｇ／ｍｌにおいてプラトーに到達した（図４１Ａ）。
【０４１１】
本発明者らは、癒着予防のためにデキサメタゾンを用いた従前の実験を参照してインビボ研究のためにブデソニドの用量として０．４４ｍｇ／ｋｇを選択する（その全てが本明細書に参考として援用されるＫｕｃｕｋｏｚｋａｎ  Ｔ，Ｅｒｓｏｙ  Ｂ，Ｕｙｇｕｒ  Ｄ，Ｇｕｎｄｏｇｄｕ  Ｃ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｂｙ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｒｏｍｏｇｌｙｃａｔｅ，ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，ｓａｌｉｎｅ  ａｎｄ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ  ａｆｔｅｒ  ｐｅｌｖｉｃ  ｓｕｇｅｒｙ．ＡＮＺ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  ２００４；７４（１２）：１１１１−１１１５；Ｈｏｃｋｅｌ  Ｍ，Ｏｔｔ  Ｓ，Ｓｉｅｍａｎｎ  Ｕ，Ｋｉｓｓｅｌ  Ｔ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｗｉｔｈ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  Ｂｙ  Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ．Ａｎｎａｌｅｓ  Ｃｈｉｒｕｇｉａｅ  Ｅｔ  Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｉａｅ  １９８７；７６：３０６−３１３；ａｎｄ  Ｂｕｃｋｅｎｍａｉｅｒ  ＣＣ，Ｐｕｓａｔｅｒｉ  ＡＥ，Ｈａｒｒｉｓ  ＲＡ，Ｈｅｔｚ  ＳＰ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉａｄｈｅｓｉｖｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｕｒｇｅｏｎ  １９９９；６５：２７４−２８２）。それらの実験において、デキサメタゾン用量は、０．３３〜４ｍｇ／ｋｇの範囲であった。ブデソニドのグルココルチコイド能力がデキサメタゾンのそれ（本明細書で参考として援用されるＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ｄｅｓｋ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＰＤＲ，２００６）に匹敵すると仮定し（コルチゾルよりも全身投与で４０倍よりも優れている）、本明細書中で用いるブデソニドの用量は、他の実験で用いたデキサメタゾン用量の範囲の下限におけるものと同等であった。３ｋｇのウサギに対する１０ｍｌのブデソニド−生理食塩水またはブデソニド−ＨＡＸとしての用量を提供するために、本発明者らは、０．１３ｍｇ／ｍｌブデソニドを含有するようにブデソニド−生理食塩水およびブデソニド−ＨＡＸの双方を調製した。３７℃においてブデソニドの溶液濃度の変化を測定するために、ブデソニド−生理食塩水は３７℃でインキュベートし、溶液相を経時的に分析した。調製の直後に、ブデソニド−生理食塩水は溶液層中に０．１３±０．００４ｍｇ／ｍｌブデソニド（＝系中に９８．５±３．５％の合計ブデソニド）を含有した。ブデソニド濃度は、３７℃でのインキュベーションに際して２時間以内に迅速に減少し、１２時間以内に０．０３４±０．００１ｍｇ／ｍｌ（＝系中に２５．２±０．７％の合計ブデソニド）に到達した（図４１Ｂ）。残渣は、沈殿として残りの０．２ｍｌ中に回収された（図４１Ｂ）。
【０４１２】
インビトロブテソニド放出動態
ＨＡＸからのブデソニドの放出動態を、本発明者らの従前の研究における傷害した腹膜でのそれに匹敵するインビトロゲル分解速度を提供した１０単位／ｍｌヒアルロニダーゼを含有するＰＢＳ中で調べた（その双方が本明細書に参考として援用されるＹｅｏ  Ｙら．Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６；２７：４６９８−４７０５；ａｎｄ  Ｙｅｏ  Ｙ，Ｉｔｏ  Ｔ，Ｂｅｌｌａｓ  Ｅ，Ｈｉｇｈｌｅｙ  ＣＢ，Ｍａｒｉｎｉ  Ｒ，Ｋｏｈａｎｅ  ＤＳ．Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ．Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  ２００６：Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）。放出動態が溶解したブデソニドの放出を反映するために、本発明者らは、その飽和溶解度（０．０２７ｍｇ／ｍｌ）未満の薬物の量を取り込む。
【０４１３】
予測されたブデソニドの６２．６±６．８％をＨＡＸゲルから２４時間以内に放出した（図４２）。ゲルが完全に分解した後でさえ、有意なさらなる放出が続いた。負荷された量と合計放出量との間の差は、サンプリングの間における、半固体であった分解ＨＡＸゲルの喪失によって説明することができる。ゲルそれ自体は、少量のみの緩いゲルデブリが８日までに依然として観察されるように次の日にわたって分解した。
【０４１４】
ブデソニド−ＨＡＸのインビボ適用
ブデソニド−ＨＡＸによる腹膜癒着の予防
ブデソニド−生理食塩水およびブデソニド−ＨＡＸの抗癒着効力を評価することにおいて、本発明者らは反復された傷害モデルを用いた。慣用的な側壁欠損−盲腸磨耗モデルよりも激しい癒着を誘導したモデルの使用は魅力的であった。なぜならば、それは、本発明者らが既にかなり効果的であることを示したＨＡＸそれ自体と比較して改良された抗癒着効果を示すことを容易とするからである（本明細書で参考として援用されるＹｅｏ  Ｙら．Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６；２７：４６９８−４７０５）。
【０４１５】
ウサギ盲腸を磨耗させ、側壁欠損を上記のように作り出した。１週間後に、１００％動物はスコア２および／または３癒着を発症した。癒着を溶解させ、盲腸および側壁傷害の部位を再度磨耗させた。ブデソニド−生理食塩水またはブデソニド−ＨＡＸを再傷害領域にわたって適用した。組織学的な対照は、同時実験からの、生理食塩水単独（ｎ＝６）またはＨＡＸ単独（ｎ＝６）で処理した動物によって提供された。１週間後に、動物を剖検のために安楽死させた。２つの群は生存期間の間に同様な体重減少を受けた（図４３Ａ）（ｐ＝０．３７８）；双方は生理食塩水またはＨＡＸ単独で処理した組織学的対照群におけるものと匹敵した（各々，ｎ＝６；ｐ＝０．２７２、Ｋｒｕｓｋａｉ  Ｗａｌｌｉｓ検定）。スコア３癒着は、ブデソニド−生理食塩水で処理した動物の８３％において発症した（図４３Ｂ）。癒着スコアは生理食塩水−処理対照のそれとは統計学的に異ならず、一方で、癒着の面積は約３倍低下した（ｐ＝０．０１）。
【０４１６】
ＨＡＸにおけるブデソニドは癒着スコアおよび面積を共に顕著に低下させ、ブデソニド−処理動物のそれを上回りさえしていた。癒着は、試験した動物の６７％において完全に妨げられた。残りの動物（ｎ＝２）においては、癒着面積は１．６および４．６ｃｍ２であり、これは、生理食塩水−処理対照［ｔＰＡ］（ｐ＝０．００３）、ブデソニド−生理食塩水（ｐ＝０．０４６）、およびＨＡＸ［ｔＰＡ］（ｐ＝０．０２２）のそれよりも有意に小さかった。
【０４１７】
組織学的調査に際して、癒着から取られた試料は、盲腸の平滑筋を腹壁の骨格筋層に連結する線維状結合組織であった。ブデソニド−生理食塩水およびブデソニド−ＨＡＸ群の双方において、本発明者らは、冒されていない腹膜表面のそれに匹敵する治癒された盲腸および腹壁の表面の再上皮化を観察した（図４４）。２つの群の間の下の顆粒化組織の厚さおよび細胞組成における見掛けの差はなかった。
【０４１８】
皮下ブデソニド−ＨＡＸに対する組織反応
ブデソニド−ＨＡＸの抗炎症効果を証明するために、ブデソニドの有りまたは無しにおいて雄Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットにＨＡＸの皮下注射を与え、分離した膨らみを形成した。注射から２日および５日後に、盲検解剖者によってゲルが収穫された。肉眼による切開に際して、ＨＡＸゲルは、舌の皮膚なくして切開できなかったインプラントをよく見えなくする過血管形成半透明または不透明組織の厚い層を伴い（図４５Ｂ）、かなりの程度の炎症（図４５Ａ）を示した。対照的に、ブデソニドゲルは、透明なゲルを見ることができ（図４５Ｃ）、かつほとんどの場合に出現するようにかなり少ない血管形成および炎症が、周囲の組織なくして切開できることを示した（図４５Ｄ）。組織学的評価は、それらが盲検観察者に容易に区別できるように、注射から２日後に２つのヒドロゲルの間のコントラストを明らかにした。ブデソニド無しの試料において、ヒドロゲルによって占められる空間は、炎症細胞、特に好中球によって取り除かれた（図４５Ｅ）。ブデソニドを含む試料においては、ヒドロゲルがかなり完全であるように、炎症反応はかなり低下した（図４５Ｆ）。５日目において、群は肉眼切開または組織学的のいずれにおいても、もはや区別できなかった。
【０４１９】
考察
ここに、本発明者らは、ブデソニドの抗癒着効力が、傷害した表面において高い局所的薬物濃度を維持できる薬物送達系を使用することによって有意に改善できたことを示す。
【０４２０】
ブデソニドは現実的には水不溶性化合物であって、３７℃において０．０２７ｍｇ／ｍｌの生理食塩水中の飽和溶解度を有する。その溶解度限界を超えるブデソニド−生理食塩水のフラクションは、２時間にわたって迅速に沈殿した（図４１Ｂ）。したがって、腹膜に適用されたブデソニド−生理食塩水は、飽和溶液およびブデソニド沈殿の懸濁液の現実的には混合物であった。もしそれが腹膜中に保持されれば、沈殿それ自体は連続的薬物放出のためのデポーとして働くであろう。ブデソニド−生理食塩水は生理食塩水−処理対照と比較して癒着の面積を有意に低下させたが、スコア３癒着の頻度は対照とは異ならなかった。薬物の有効性が比較的低い用量によって制限され、そして／またはブデソニド−生理食塩水は腹膜から迅速に排出された可能性がある。しかしながら、ＨＡＸと組み合わせた場合に、同一用量はかなり有効であった。
【０４２１】
ラットモデルにおいて、ＰＬＧＡマイクロ粒子を用いるデキサメタゾンの局所的維持送達は、癒着を妨げることにおいてデキサメタゾン結晶懸濁液よりも効果的であった（本明細書で参考として援用されるＨｏｃｋｅｌ  Ｍ，Ｏｔｔ  Ｓ，Ｓｉｅｍａｎｎ  Ｕ，Ｋｉｓｓｅｌ  Ｔ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｗｉｔｈ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  Ｂｙ  Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ．Ａｎｎａｌｅｓ  Ｃｈｉｒｕｇｉａｅ  Ｅｔ  Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｉａｅ  １９８７；７６：３０６−３１３）が、高用量のデキサメタゾン（４ｍｇ／ｋｇ）を提供する大量のマイクロ粒子を用いた場合のみであった。より少量のマイクロ粒子は癒着を悪化させた。本発明者らは、従前に、ＰＬＧＡマイクロ粒子それ自体が腹膜癒着を誘導したことを示した（本明細書で参考として援用されるＫｏｈａｎｅ  ＤＳ，Ｔｓｅ  ＪＹ，Ｙｅｏ  Ｙ，Ｐａｄｅｒａ  Ｒ，Ｓｈｕｂｉｎａ  Ｍ，Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ａｎｄ  ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｔｏｎｅｕｍ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６；７７Ａ（２）：３５１−３６１）。これらの報告の１つの解釈は、デキサメタゾンの癒着予防効果はビヒクルの癒着促進効果によって相殺されたことである。本明細書中に記載された系の有効性は、部分的には、ビヒクルそれ自体が癒着を引き起こさず、事実、固有の抗癒着活性を有するという事実に帰すことができる（本明細書で参考として援用されるＹｅｏ  Ｙら．Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｂｌｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６；２７：４６９８−４７０５）。
【０４２２】
皮下実験は、ブデソニドゲルの抗炎症効果が、５日未満であるが少なくとも２日間継続したようであり、これはインビトロ実験からのブデソニドの放出の持続に大まかに等しいという点で有益である。したがって、薬物放出のこの比較的短い期間は、ブデソニドを含むかまたは含まないヒドロゲルの間の結果の差を説明するように見える。これは、癒着形成における重要な事象はしばしば最初の２〜３日に起こるという観察に合致し、癒着予防に必要な薬物放出の持続はかなり短いであろうことを示唆する。
【０４２３】
接着予防の多くの方法は、実験室動物における印象的な効力にかかわらず臨床試験で失敗している。１つの寄与する理由は、それらが比較的許容される動物モデルで評価され、ここに、癒着予防は比較的容易であるという可能性がある（本明細書で参考として援用されるＷｉｓｅｍａｎ  ＤＭ．Ａｎｉｍａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｄｅｌｓ：ｄｅｓｉｇｎ，ｖａｒｉａｂｌｅｓ，ａｎｄ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ．Ｉｎ：ｄｉＺｅｒｅｇａ  ＧＳ，ｅｄｉｔｏｒ．Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０００．ｐ．４５９−４７６）。それが、本発明者らがより挑戦的な反復傷害モデルを使用した１つの理由である。
【０４２４】
ブデソニド−ＨＡＸは、調製および取り扱いが容易であり、血液および腹膜流体の存在下において効果的であって、開腹または腹腔鏡検査いずれかを介して適用することができる。
【０４２５】
同等物および範囲
当業者であれば、慣用的実験を用いることなく、本明細書中に記載された発明の実施形態に対する多くの同等物を認識するか、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記明細書に限定される意図はないが、むしろ、添付の特許請求の範囲に記載された通りである。
【０４２６】
特許請求の範囲において、「ある（ａ）」および「該（ｔｈｅ）」のような冠詞は、反対のことが示されていたり、またはそうでなければ文脈から明らかでない限り、１以上を意味することができる。１以上の数の群の間に「または」を含む請求項または記載は、群メンバーの１、１を超えて、または全てが与えられた物またはプロセスに存在し、そこに使用されるか、またはそうでなければそれに関連する場合、反対であるか、またはそうでなければ文脈から明らかに示されていない限り、満足されると考えられる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが、与えられた物またはプロセスに存在するか、そこに使用されるか、またはそうでなければそれに関連する実施形態を含む。さらに、本発明は、群メンバーの１を超えて、または全てが与えられた物またはプロセスに存在するか、そこで使用されるか、またはそうでなければ底に関連する実施形態も含む。さらに、１以上の請求項からの、または明細書の関連部分からの１以上の限定、エレメント、文節、記載的項目が別の請求項に導入された全ての変形、組合せ、および順列を含む。例えば、別の請求項に従属するいずれの請求項も、同一の基本的請求項に従属するいずれの他の請求項に見出される１以上の制限を含むように修飾できる。さらに、請求項が組成物を引用する場合、本明細書中に開示された目的のいずれかについての組成物を用いる方法、および本明細書中に開示された作製方法のいずれかによる組成物の作製方法、または当該分野で公知の他の方法が、そうでないことが示されていない限り、または矛盾または不一致が起こるであろうことが当業者に明らかであるのでなければ、含まれることは理解されるべきである。例えば、本発明の組成物のいずれも、位置のいずれかにおける癒着の形成、進行、および／または再発を阻害するため、ならびに／あるいは本明細書中に考察されたか、または当該分野で知られた原因にいずれかのために用いられ得ることが理解されるべきである。また、本明細書中に開示された組成物を調製する方法に従って作製された組成物のいずれも、位置のいずれかにおいて癒着の形成、進行、および／または再発を阻害するため、ならびに／あるいは本明細書中に考察されたか、または当該分野で公知のいずれかのため用いることができるのは理解されるべきである。さらに、本発明は、本明細書中に開示された組成物を調製する方法のいずれかに従って作製された組成物を含む。
【０４２７】
エレメントは、例えば、マーカッシュ群形式にてリストとして示される場合、該エレメントの各下位群も開示され、いずれのエレメントも群から除去できると理解されるべきである。用語「含む」は、開かれていることを意図し、さらなるエレメントまたは工程を含むことを許容することも注記する。一般に、本発明、または本発明の態様は、特定のエレメント、特徴、工程等を含むものという場合、本発明の特定の実施形態、または本発明の態様はそのようなエレメント、特徴、工程等よりなるか、または実質的にそれよりなると理解されるべきである。簡明性の目的のために、それらの実施形態は、本明細書中においては、こういう言葉で具体的に記載されていなかった。したがって、１以上のエレメント、特徴、工程等を含む本発明の各実施形態については、本発明は、それらのエレメント、特徴、工程等よりなるか、または実質的にそれらよりなる実施形態も提供する。
【０４２８】
範囲が与えられた場合、終点が含まれる。さらに、そうでないことが示されていたり、文脈および／または当業者の理解からそうでなければ明らかであるのでなければ、範囲として表された値は、文脈が明瞭にそうでないことを指令するのでなければ、範囲の下限の単位の１／１０まで、本発明の異なる実施形態において述べられた範囲内のいずれの特定の値も取ることができる。また、そうでないことが示されたり、または文脈から、そして／または当業者の理解からそうでなければ明らかであるのでなければ、範囲として表現された値は与えられた範囲内のいずれの下位範囲もとることができると理解されるべきであり、ここに、下位範囲の終点は、範囲の下限の単位の１／１０と同一の正確な程度まで表現されていると理解されるべきである。
【０４２９】
加えて、本発明の任意の特定の実施形態は、請求の範囲のいずれの１以上からの明示的に排除することができると理解されるべきである。本発明の組成物および／または方法のいずれの実施形態、エレメント、特徴、適用、または態様（例えば、任意のヒドロゲル前駆体、任意の多糖誘導体または非多糖ポリマー、例えば、任意のＨＡ誘導体またはセルロース誘導体、任意の分子量の範囲、任意の架橋剤、ヒドロゲル前駆体の間の共有結合の任意の型、生物学的に活性な薬剤または特定の薬剤の任意のクラス、任意の粒子サイズおよび／または材料組成物、任意の投与の経路または位置、組成物が投与される任意の目的等）も、任意の１以上の請求項から排除される。例えば、本発明の特定の実施形態において、生物学的に活性な薬剤は抗増殖剤ではない。簡明性の目的で、１以上のエレメント、特徴、目的、または態様が排除される実施形態の全ては本明細書中においては明示的に記載されていない。
【図面の簡単な説明】
【０４３０】
【図１】ＨＡＸゲルの走査型電子顕微鏡写真。スケールバー＝１０μｍ。
【図２】ＨＡＸゲル（２０ｍｇ／ｍｌ）の存在下における中皮細胞の生存率。白色バーおよび灰色バーは、各々、単純培地および１０Ｕ／ｍｌヒアルロニダーゼを含有する培地中で成長した細胞を示す。データは２５番目および７５番目のパーセンタイルでの中央値である（ｎ＝４）。
【図３Ａ】（Ａ）傷害した腹部壁および盲腸に適用されたＨＡＸ。矢印は適用された部位に接着性のゲルを示す。（Ｂ）ＨＡＸで処理された動物で観察された癒着無し。（Ｃ）処理無しの対照において観察されたスコア３の癒着。ＡＷ＝腹部壁。
【図３Ｂ】（Ａ）傷害した腹部壁および盲腸に適用されたＨＡＸ。矢印は適用された部位に接着性のゲルを示す。（Ｂ）ＨＡＸで処理された動物で観察された癒着無し。（Ｃ）処理無しの対照において観察されたスコア３の癒着。ＡＷ＝腹部壁。
【図３Ｃ】（Ａ）傷害した腹部壁および盲腸に適用されたＨＡＸ。矢印は適用された部位に接着性のゲルを示す。（Ｂ）ＨＡＸで処理された動物で観察された癒着無し。（Ｃ）処理無しの対照において観察されたスコア３の癒着。ＡＷ＝腹部壁。
【図４】組織学的調査。（Ａ）未処理動物からの癒着（５×）。矢印は傷害した筋肉細胞を示す；（Ｂ）別の未処理動物からの癒着の拡大したイメージ（１０×）。炎症および線維症を示す高細胞集団のバンドに注意されたし。（Ｃ）２０ｍｇ／ｍｌ  ＨＡＸで処理された動物からの癒着無しの腹部壁（２０×）。腔側の青みがかったコーティングに注意されたし。ＡＷ＝腹部壁筋肉、Ｓｍ＝平滑筋。
【図５】（Ａ）１０Ｕ／ｍｌヒアルロニダーゼにおけるＨＡＸゲルの分解の間におけるグルクロン酸放出（ｎ＝５）。（Ｂ）ヒアルロン酸（ＨＡ）およびそのモノマー成分の存在下における中皮細胞によるｔＰＡ生産。
【図６】肉眼的ゲル分解動態に対するＨＡ−ＣＨＯの（Ａ）濃度および（Ｃ）Ｍｗの効果。脚注は、Ｍｗ、およびｍｇ／ｍｌで表したＨＡ−ＡＤＨまたはＨＡ−ＣＨＯの濃度を示す。値は４つの測定の平均および標準偏差として示す。
【図７】（Ａ）ＰＬＧＡナノ粒子、（Ｂ）凍結乾燥されたＨＡＸゲル、および（Ｃ）凍結乾燥されたハイブリッドゲルのＳＥＭ図。
【図８】ハイブリッドゲル（２０ｍｇ／ｍｌ  ＨＡＸ，ＰＬＧＡ）ナノ粒子の存在下における中皮細胞の生存率。白色バーおよび灰色バーは、各々、単純培地および１０Ｕ／ｍｌヒアルロニダーゼを含有する培地中で成長した細胞を示す。データは、２５番目、および７５番目のパーセンタイルでの中央値である（ｎ＝４）。
【図９】注射から２日または７日後における腹膜に残存する（矢印によって示される）ハイブリッドゲル。（Ａ）１０ｍｇ／ｍｌ  ＨＡＸ＋２０ｍｇ／ｍｌ  ＰＬＧＡナノ粒子（ＢおよびＣ）２０ｍｇ／ｍｌ  ＨＡＸ＋２０ｍｇ／ｍｌ  ＰＬＧＡ。（Ａ）における挿入図は腹膜から分離されたハイブリッドゲルを示す。Ｂ＝腸、ＡＷ＝腹部壁。
【図１０】（Ａ）傷害した腹部壁および盲腸に適用されたハイブリッドゲル。矢印は、適用された部位に接着性のハイブリッドゲルを示す。（Ｂ）ハイブリッドゲルで処理された動物において癒着は観察されない。ＡＷ＝腹部壁。
【図１１Ａ】組織学的調査。（Ａ）外科的処置から７日後のウサギから回収されたハイブリッドゲル（２００×）。泡沫マクロファージに注意されたし。（Ｂ）注射から７日後におけるマウスにおいて見出されたゲル残渣におけるそれと同様な泡沫マクロファージの拡大されたイメージ（４００×）。（Ｃ）ハイブリッドゲルで処理されたウサギからの無癒着腹部筋肉壁（２００×）；（Ｄ）外科的処置の間においてハイブリッドゲルで被覆された腹部筋肉壁表面の拡大されたイメージ（４００×）。マクロファージの泡沫性に注意されたし。ＡＷ＝磨耗された腹部壁筋肉。
【図１１Ｂ】組織学的調査。（Ａ）外科的処置から７日後のウサギから回収されたハイブリッドゲル（２００×）。泡沫マクロファージに注意されたし。（Ｂ）注射から７日後におけるマウスにおいて見出されたゲル残渣におけるそれと同様な泡沫マクロファージの拡大されたイメージ（４００×）。（Ｃ）ハイブリッドゲルで処理されたウサギからの無癒着腹部筋肉壁（２００×）；（Ｄ）外科的処置の間においてハイブリッドゲルで被覆された腹部筋肉壁表面の拡大されたイメージ（４００×）。マクロファージの泡沫性に注意されたし。ＡＷ＝磨耗された腹部壁筋肉。
【図１１Ｃ】組織学的調査。（Ａ）外科的処置から７日後のウサギから回収されたハイブリッドゲル（２００×）。泡沫マクロファージに注意されたし。（Ｂ）注射から７日後におけるマウスにおいて見出されたゲル残渣におけるそれと同様な泡沫マクロファージの拡大されたイメージ（４００×）。（Ｃ）ハイブリッドゲルで処理されたウサギからの無癒着腹部筋肉壁（２００×）；（Ｄ）外科的処置の間においてハイブリッドゲルで被覆された腹部筋肉壁表面の拡大されたイメージ（４００×）。マクロファージの泡沫性に注意されたし。ＡＷ＝磨耗された腹部壁筋肉。
【図１１Ｄ】組織学的調査。（Ａ）外科的処置から７日後のウサギから回収されたハイブリッドゲル（２００×）。泡沫マクロファージに注意されたし。（Ｂ）注射から７日後におけるマウスにおいて見出されたゲル残渣におけるそれと同様な泡沫マクロファージの拡大されたイメージ（４００×）。（Ｃ）ハイブリッドゲルで処理されたウサギからの無癒着腹部筋肉壁（２００×）；（Ｄ）外科的処置の間においてハイブリッドゲルで被覆された腹部筋肉壁表面の拡大されたイメージ（４００×）。マクロファージの泡沫性に注意されたし。ＡＷ＝磨耗された腹部壁筋肉。
【図１２】図１２は、種々の合成された多糖誘導体の化学的構造を示す。（Ａ）ＨＡ−ＡＤＨ；（Ｂ）ＨＡ−ＡＬＤ；（Ｃ）ＣＭＣ−ＡＬＤ（Ｒ＝ＣＨ２ＣＯＯＨまたはＨ），ＨＰＭＣ−ＡＬＤ（Ｒ＝ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３またはＨ）、またはＭＣ−ＡＬＤ（Ｒ＝ＣＨ３またはＨ）。
【図１３】図１３は、架橋可能な多糖誘導体を含有する溶液を投与するのに有用なデバイスを示す。
【図１４】図１４は、架橋可能な多糖誘導体を含有する溶液を投与するのに有用な複数チャネルデバイスを示す。
【図１５】図１５は、架橋可能な多糖誘導体を含有する溶液を投与するのに有用な複数バレルデバイスを示す。
【図１６】図１６は、癒着を阻害する、ＨＡ誘導体およびセルロース誘導体によって形成された種々のヒドロゲルの能力を示す棒グラフである。
【図１７】３７℃におけるＰＢＳ中の１０単位／ｍｌヒアルロニダーゼにおけるヒドロゲルの分解動態。ヒドロゲルの容量（％）は、パーセンテージとして表された、初期容量に対する各時点でのヒドロゲルの容量の比率である。データは平均±標準偏差である（ｎ＝４）。
【図１８】ＭＴＴアッセイによって測定した細胞生存率に対するアルデヒドポリマー（ＨＡ−ＣＨＯ，ＣＭＣ−ＣＨＯ，ＭＣ−ＣＨＯ，およびＨＰＭＣ−ＣＨＯ）の効果。（Ａ）ポリマーとのインキュベーションから３日後における中皮細胞。（Ｂ）ポリマーとのインキュベーションから２日後におけるマクロファージ（Ｊ７７４．Ａｌ）細胞系。データは平均±標準偏差である（ｎ＝４）。
【図１９】ヒドロゲルの注射から１週間後におけるマウスの腹膜。（Ａ）ＨＡＸ：残渣無し。（Ｂ）ＨＡ−ＣＭＣ：ゲル様物質の薄いコーティングに注意されたし。（Ｃ）ＨＡ＝ＭＣ：残存物質の増大した量はその直下に沈んだピンセットを示したことに注意されたし。
【図２０】ウサギ磨耗モデルにおける腹膜癒着の予防。（Ａ）癒着の誘導。腹部壁の欠損（矢印）、および盲腸の出血する表面に注意されたし。（Ｂ）生理食塩水で処理した動物における１週間後の切開で見られた癒着。（Ｃ）ＨＡ−ＭＣで処理された動物における１週間後の癒着の非存在。
【図２１Ａ】ウサギ側壁欠損−腸磨耗モデルにおける傷害から１週間後に回復した組織の顕微鏡写真。（Ａ）生理食塩水−処理動物における磨耗の断面。盲腸腔（ＣＥ）は写真の左上隅におけるものである。盲腸平滑筋は、腹部筋肉系（ＡＭ）の縞状筋肉に融合されている。倍率１００×。（Ｂ）炎症細胞（優勢的にはマクロファージおよびリンパ球）を伴う、ＨＡ−ＭＣで処理された動物から回収されたヒドロゲル。倍率１００×。（Ｃ）ＨＡ−ＭＣで処理された動物における腹部壁欠損の部位。該欠損は、治癒組織（優勢的に線維芽細胞）の下にある層と共に、再上皮化されている（矢印）。倍率４００×。（Ｄ）正常な未処理壁側腹膜。中皮（矢印）は結合組織（ＣＴ）および腹部筋肉の上に存在する。
【図２１Ｂ】ウサギ側壁欠損−腸磨耗モデルにおける傷害から１週間後に回復した組織の顕微鏡写真。（Ａ）生理食塩水−処理動物における磨耗の断面。盲腸腔（ＣＥ）は写真の左上隅におけるものである。盲腸平滑筋は、腹部筋肉系（ＡＭ）の縞状筋肉に融合されている。倍率１００×。（Ｂ）炎症細胞（優勢的にはマクロファージおよびリンパ球）を伴う、ＨＡ−ＭＣで処理された動物から回収されたヒドロゲル。倍率１００×。（Ｃ）ＨＡ−ＭＣで処理された動物における腹部壁欠損の部位。該欠損は、治癒組織（優勢的に線維芽細胞）の下にある層と共に、再上皮化されている（矢印）。倍率４００×。（Ｄ）正常な未処理壁側腹膜。中皮（矢印）は結合組織（ＣＴ）および腹部筋肉の上に存在する。
【図２１Ｃ】ウサギ側壁欠損−腸磨耗モデルにおける傷害から１週間後に回復した組織の顕微鏡写真。（Ａ）生理食塩水−処理動物における磨耗の断面。盲腸腔（ＣＥ）は写真の左上隅におけるものである。盲腸平滑筋は、腹部筋肉系（ＡＭ）の縞状筋肉に融合されている。倍率１００×。（Ｂ）炎症細胞（優勢的にはマクロファージおよびリンパ球）を伴う、ＨＡ−ＭＣで処理された動物から回収されたヒドロゲル。倍率１００×。（Ｃ）ＨＡ−ＭＣで処理された動物における腹部壁欠損の部位。該欠損は、治癒組織（優勢的に線維芽細胞）の下にある層と共に、再上皮化されている（矢印）。倍率４００×。（Ｄ）正常な未処理壁側腹膜。中皮（矢印）は結合組織（ＣＴ）および腹部筋肉の上に存在する。
【図２１Ｄ】ウサギ側壁欠損−腸磨耗モデルにおける傷害から１週間後に回復した組織の顕微鏡写真。（Ａ）生理食塩水−処理動物における磨耗の断面。盲腸腔（ＣＥ）は写真の左上隅におけるものである。盲腸平滑筋は、腹部筋肉系（ＡＭ）の縞状筋肉に融合されている。倍率１００×。（Ｂ）炎症細胞（優勢的にはマクロファージおよびリンパ球）を伴う、ＨＡ−ＭＣで処理された動物から回収されたヒドロゲル。倍率１００×。（Ｃ）ＨＡ−ＭＣで処理された動物における腹部壁欠損の部位。該欠損は、治癒組織（優勢的に線維芽細胞）の下にある層と共に、再上皮化されている（矢印）。倍率４００×。（Ｄ）正常な未処理壁側腹膜。中皮（矢印）は結合組織（ＣＴ）および腹部筋肉の上に存在する。
【図２２Ａ】（Ａ）ＤＸ；（Ｂ）ＤＸ−ＣＨＯ；（Ｃ）ＣＭＤＸ；（Ｄ）ＣＭＤＸ−ＡＤＨ；（Ｅ）ＣＭＣ；および（Ｆ）ＣＭＣ−ＣＨＯの化学構造。
【図２２Ｂ】（Ａ）ＤＸ；（Ｂ）ＤＸ−ＣＨＯ；（Ｃ）ＣＭＤＸ；（Ｄ）ＣＭＤＸ−ＡＤＨ；（Ｅ）ＣＭＣ；および（Ｆ）ＣＭＣ−ＣＨＯの化学構造。
【図２２Ｃ】（Ａ）ＤＸ；（Ｂ）ＤＸ−ＣＨＯ；（Ｃ）ＣＭＤＸ；（Ｄ）ＣＭＤＸ−ＡＤＨ；（Ｅ）ＣＭＣ；および（Ｆ）ＣＭＣ−ＣＨＯの化学構造。
【図２２Ｄ】（Ａ）ＤＸ；（Ｂ）ＤＸ−ＣＨＯ；（Ｃ）ＣＭＤＸ；（Ｄ）ＣＭＤＸ−ＡＤＨ；（Ｅ）ＣＭＣ；および（Ｆ）ＣＭＣ−ＣＨＯの化学構造。
【図２２Ｅ】（Ａ）ＤＸ；（Ｂ）ＤＸ−ＣＨＯ；（Ｃ）ＣＭＤＸ；（Ｄ）ＣＭＤＸ−ＡＤＨ；（Ｅ）ＣＭＣ；および（Ｆ）ＣＭＣ−ＣＨＯの化学構造。
【図２２Ｆ】（Ａ）ＤＸ；（Ｂ）ＤＸ−ＣＨＯ；（Ｃ）ＣＭＤＸ；（Ｄ）ＣＭＤＸ−ＡＤＨ；（Ｅ）ＣＭＣ；および（Ｆ）ＣＭＣ−ＣＨＯの化学構造。
【図２３】（Ａ）ＤＸ；（Ｂ）ＣＭＤ；および（Ｃ）ＣＭＤ−ＡＤＨのＦＴ−ＩＲスペクトル。
【図２４】３７℃のＰＢＳ緩衝液中のヒドロゲルの膨潤容量。測定された値は平均±標準偏差である（Ｎ＝４）。
【図２５】ヒドロゲルのゲル化時間。測定された値は平均±標準偏差である（Ｎ＝５）。
【図２６】３７℃のＰＢＳ緩衝溶液のヒドロゲルの膨潤容量。測定された値は平均±標準偏差である（Ｎ＝４）。
【図２７】３７℃のＰＢＳ緩衝液に浸漬させてから５日後におけるヒドロゲルの図。（Ａ）７０ｋＤａ−ＣＭＤＸ−ＤＸ（５％（ｗ／ｖ）／６％（ｗ／ｖ））、（Ｂ）７０ｋＤａ−ＣＭＤＸ−ＣＭＣ（５％（ｗ／ｖ）／６％（ｗ／ｖ））。
【図２８】ＭＴＴアッセイによって測定された細胞生存率に対する修飾されていないポリマー、および合成されたポリマー（ＤＸ、ＣＭＣ、ＣＭＤＺ−ＡＤＨ、ＣＭＣ−ＣＨＯ、およびＤＸ−ＣＨＯ）の効果。データは平均±標準偏差である（Ｎ＝４）。（Ａ）ポリマーとのインキュベーションから３日後における中皮細胞。ＣＭＣ−ＣＨＯのデータを実施例１２において上に記載する。（Ｂ）ポリマーと共にインキュベーションしてから２日後におけるＪ７７４．Ａｌ，マクロファージ細胞系。
【図２９】７０ｋＤａ−ＣＭＤＸ−ＤＸの注射から２週間後におけるマウスの腹膜。
【図３０】ウサギ磨耗モデルによる癒着予防試験の腹膜。開腹は、癒着を誘導する外科的処置から１週間後に行った。（Ａ−１、Ａ−２）７０ｋＤａ−ＣＭＤＸ−ＤＸ（２％（ｗ／ｖ）／５％（ｗ／ｖ））。ＣＭＤＸ−ＤＸゲルは腹膜癒着を悪化させた。（Ｂ）７０ｋＤａ−ＣＭＤＸ−ＣＭＣ（５％（ｗ／ｖ）／６％（ｗ／ｖ））（Ｃ−１、Ｃ−２）５００ｋＤａ−ＣＭＤＸ−ＣＭＣ（４％（ｗ／ｖ）／６％（ｗ／ｖ））ＣＭＤＸ−ＣＭＣゲルは腹膜癒着を低下させた。対照実験の結果を本発明者らの以前の研究から引用した。
【図３１】ウサギ側壁欠損−腸磨耗モデル実験の組織学的図。（Ａ）ＣＭＤＸ−ＤＸゲルは盲腸の膨起１４に固着した（５×）。（Ｂ）パネルＡの固着した表面の拡大（４０×）。（Ｃ）ＣＭＤＸ−ＤＸゲルの場合における回復した腹部膜（５×）。（Ｄ）５００ｋＤａ−ＣＭＤＸ−ＣＭＣゲルにおける正常な腹部壁（５×）。
【図３２】デキサメタゾンを含有する架橋されたヒアルロン酸ヒドロゲル（ＨＡＸ−ＤＥＸ）の合成の模式図。最終のヒドロゲルは、アルデヒド誘導体化ヒアルロン酸をヒアルロン酸−アジピン酸ジヒドラジド−デキサメタゾンスクシネート（陰影を付した化合物）と混合することによって形成される。
【図３３】ＭＴＴアッセイによって決定された、異なる濃度の合成されたポリマーと共にインキュベートされたヒト中皮細胞の生存率。データは標準偏差を伴う平均である。
【図３４】放出された培地中のデキサメタゾンの濃度の時間経過。データは標準偏差を伴う平均である。
【図３５】ＨＡＸおよびＨＡＸ−ＤＥＸの膨潤容量の時間経過。データは標準偏差を伴う平均である。
【図３６】初代マウスのマクロファージからのＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の生産に対するデキサメタゾンの効果。値は２回の測定の平均である。
【図３７】初代マウスマクロファージからのＩＬ−６の生産の時間経過。データは標準偏差を伴う平均である。
【図３８】初代マウスのマクロファージからのＴＮＦ−αの生産の時間経過である。データは標準偏差を伴う平均である。
【図３９】注射から２日後に取り出されたヒドロゲル。（Ａ）エクスビボにおけるＨＡＸ−ＤＥＸヒドロゲル。（Ｂ）舌の筋肉（底部）と共にＨＡＸ−ＤＥＸゲル（頂部）の代表的なヘマトキシリン−エオシン染色試料、２０×。（Ｃ）および（Ｄ）各々、２０×および４０×の、ＨＡＸゲル中、およびその周りの炎症性細胞の２つの例。青色の相対的に均一な物質はゲルである（Ｇ）。
【図４０】凍結乾燥されたブデゾニド−ＨＡＸの走査型電子顕微鏡写真。スケールバー＝１００μｍ。
【図４１】３７℃の生理食塩水へのブデゾニドの溶解性。（Ａ）相−可溶性ダイヤグラム。（Ｂ）経時的なブデゾニド濃度および沈殿物の質量。データは平均および標準偏差である（ｎ＝４）。
【図４２】ブデゾニド−ＨＡＸからのブデゾニドのインビトロ放出動態。データは平均および標準偏差である（ｎ＝４）。
【図４３】（Ａ）第二の開腹後における（出発体重のパーセンテージとしての）体重減少。（Ｂ）各癒着スコアでの動物のパーセンテージ。スコア０＝癒着無し、スコア２＝鈍的切開によって分離可能な組織癒着、スコア３＝鋭的切開を必要とする癒着。（Ｃ）スコア２および３の癒着を持つ領域の合計（ｃｍ２）。体重減少および癒着領域は２５および７５のパーセンタイルでの中央値として表される（ｎ＝６）。＊は生理食塩水対照からの統計学的差を示し、および†および‡は比較した群の間の統計学的差を示す。生理食塩水処理対照およびＨＡＸ群は参照［ｔＰＡ］からのものである。
【図４４Ａ】ブデゾニド−生理食塩水で処理された動物からの組織および正常組織。（Ａ）腹部壁表面（２００×）。（Ｂ）盲腸表面（２００×）；および（Ｃ）盲腸表面（４００×）。ＳＫ：腹部壁骨格筋；ＳＭ：内臓平滑筋；Ｍｅ：中皮層。
【図４４Ｂ】ブデゾニド−生理食塩水で処理された動物からの組織および正常組織。（Ａ）腹部壁表面（２００×）。（Ｂ）盲腸表面（２００×）；および（Ｃ）盲腸表面（４００×）。ＳＫ：腹部壁骨格筋；ＳＭ：内臓平滑筋；Ｍｅ：中皮層。
【図４４Ｃ】ブデゾニド−生理食塩水で処理された動物からの組織および正常組織。（Ａ）腹部壁表面（２００×）。（Ｂ）盲腸表面（２００×）；および（Ｃ）盲腸表面（４００×）。ＳＫ：腹部壁骨格筋；ＳＭ：内臓平滑筋；Ｍｅ：中皮層。
【図４５】注射から２日後に取り出されたヒドロゲル。（Ａ）〜（Ｄ）切開の目視による外観。（Ａ）インサイチュでのＨＡＸ。炎症および顕著な血管分布に注意されたし。（Ｂ）インサイチュでのブデゾニド−ＨＡＸ。（Ｃ）皮膚から分離できないエクスビボでのＨＡＸ。（Ｄ）意図して残した小さな外皮を除いて皮膚から分離したブデゾニド−ＨＡＸ。（Ｅ）および（Ｆ）ヘマトキシリン−エオシン染色切片（共に４０×）。（Ｅ）ＨＡＸ。広範囲な炎症反応に注意されたし。（Ｆ）ブデゾニド−ＨＡＸ。炎症の相対的非存在に注意されたし。ＥおよびＦにおいて、腔中の淡い青みがかった物質は、好酸球カプセルによって囲まれたヒドロゲルである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ−１】
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【図３０Ａ−２】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ−１】
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【図３０Ｃ−２】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４５Ｃ】
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【図４５Ｄ】
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【図４５Ｅ】
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【図４５Ｆ】
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【国際調査報告】
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