(57)【要約】  本発明は、ウイルス様粒子の製造およびその中への組換えウイルスキャプシドタンパク質のインビトロ集合に向けられる。詳細には、本発明は、多価ウイルス様粒子を製造するための迅速で拡張可能かつ費用効果的方法であって、多価ウイルス様粒子の均質集団を製造するためにインビトロで結合される、様々な抗原性ペプチドインサートを含有するキャプシド融合ペプチドの個別集団を利用する方法を提供する。本発明により製造されるウイルス様粒子は、ヒトまたは動物において免疫学的応答を誘導するために利用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多価ウイルス様粒子を製造する方法であって：  ａ）インビトロで、    ｉ）少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含む少なくとも１つの第１ウイルスキャプシド融合ペプチドと；および    ｉｉ）少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含む少なくとも１つの第２ウイルスキャプシド融合ペプチドであって、前記第１ウイルスキャプシド融合ペプチド中には存在していない少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含む、少なくとも１つの第２ウイルスキャプシド融合ペプチドとを混合する工程と；および  ｂ）少なくとも１つの多価ウイルス様粒子を製造するために、前記少なくとも１つの第１ウイルスキャプシド融合ペプチドおよび前記少なくとも１つの第２ウイルスキャプシド融合ペプチドを集合させる工程とを含み、  このとき前記多価ウイルス様粒子には全長感染性ウイルス核酸が欠如する、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの第１ウイルスキャプシド融合ペプチドおよび前記少なくとも１つの第２ウイルスキャプシド融合ペプチドを集合させる工程は、精製工程の後に行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１ウイルスキャプシド融合ペプチドおよび前記第２ウイルスキャプシド融合ペプチドのウイルスキャプシドは、同一のウイルス分類群のメンバーまたは相違するウイルス分類群のメンバーに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１および／または第２ウイルスキャプシド融合ペプチドの前記ウイルスキャプシドは、二十面体ウイルスのアミノ酸配列に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記二十面体ウイルスは、ササゲクロロティックモットルウイルス（cowpea chlorotic mottle virus）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１および第２ウイルスキャプシド融合ペプチドの前記抗原性ペプチドインサートは、病原因子由来の抗原性ペプチドインサートを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１キャプシド融合ペプチドおよび第２キャプシド融合ペプチドの抗原性ペプチドインサートは、同一もしくは相違する病原因子由来である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルス様粒子にはウイルス核酸が欠如する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１および／または第２ウイルスキャプシド融合ペプチドは、事前にインビボで生成されたウイルスまたはウイルス様粒子に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
多価ウイルス様粒子を製造する方法であって：  ａ）インビトロで、    ｉ）少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含む少なくとも１つの第１ウイルスキャプシド融合ペプチドと；    ｉｉ）少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含む少なくとも１つの第２ウイルスキャプシド融合ペプチドであって、前記第１ウイルスキャプシド融合ペプチド中には存在していない少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含む、少なくとも１つの第２ウイルスキャプシド融合ペプチドと；および    ｉｉｉ）少なくとも１つの免疫刺激核酸であって、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列である免疫刺激核酸配列とを混合する工程と、および  ｂ）少なくとも１つの多価ウイルス様粒子を製造するために、前記少なくとも１つの第１ウイルスキャプシド融合ペプチド、前記少なくとも１つの第２ウイルスキャプシド融合ペプチド、および前記免疫刺激核酸を集合させる工程とを含み、  このとき前記多価ウイルス様粒子には全長感染性ウイルス核酸が欠如する、方法。
【請求項１１】
前記ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、ＡＡＣＧＴＴＣＧ（配列番号２４）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１ウイルスキャプシド融合ペプチドおよび前記第２ウイルスキャプシド融合ペプチドのウイルスキャプシドは、同一のウイルス分類群のメンバーまたは相違する分類群のメンバーに由来する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１および／または第２ウイルスキャプシド融合ペプチドのウイルスキャプシドは、二十面体ウイルスのアミノ酸配列に由来する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記二十面体ウイルスは、ササゲクロロティックモットルウイルスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１および第２ウイルスキャプシド融合ペプチドの前記抗原性ペプチドインサートは、病原因子由来の抗原性ペプチドインサートを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１キャプシド融合ペプチドおよび前記第２キャプシド融合ペプチドは、同一もしくは相違する病原因子由来の抗原性ペプチドインサートを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
多価ウイルス様粒子を製造する方法であって：  ａ）    ｉ）少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含む少なくとも１つの第１ウイルスキャプシド融合ペプチドを含む少なくとも１つの第１ウイルス様粒子と；および    ｉｉ）少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含む少なくとも１つの第２ウイルスキャプシド融合ペプチドを含む少なくとも１つの第２ウイルス様粒子とを提供する工程と、  ｂ）    ｉ）少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含む少なくとも１つの単離された第１ウイルスキャプシド融合ペプチドを提供するための前記第１ウイルス様粒子と；および    ｉｉ）少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含む少なくとも１つの単離された第２キャプシド融合ペプチドを提供するための前記第２ウイルス様粒子とを分解させる工程であって、このとき前記少なくとも１つの第２ウイルスキャプシド融合ペプチドは、前記第１ウイルスキャプシド融合ペプチド中には存在していない少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含む工程と、および  ｃ）インビトロで：    ｉ）前記少なくとも１つの第１ウイルスキャプシド融合ペプチドと；および    ｉｉ）前記少なくとも１つの第２ウイルスキャプシド融合ペプチドとを混合する工程と；および  ｄ）少なくとも１つの多価ウイルス様粒子を製造するために、前記少なくとも１つの第１ウイルスキャプシド融合ペプチド、および前記少なくとも１つの第２ウイルスキャプシド融合ペプチドを集合させる工程とを含み、  このとき前記多価ウイルス様粒子には全長感染性ウイルス核酸が欠如する、方法。
【請求項１８】
前記第１ウイルスキャプシド融合ペプチドおよび前記第２ウイルスキャプシド融合ペプチドのウイルスキャプシドは、同一または相違するウイルス分類群のメンバーに由来する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１ウイルスおよび／または第２キャプシド融合ペプチドのウイルスキャプシドは、二十面体ウイルスのアミノ酸配列に由来する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記二十面体ウイルスは、ササゲクロロティックモットルウイルスである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１および第２ウイルスキャプシド融合ペプチドの前記抗原性ペプチドインサートは、病原因子由来の抗原性ペプチドインサートを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１キャプシド融合ペプチドおよび前記第２キャプシド融合ペプチドは、同一もしくは相違する病原因子由来の異なる抗原性ペプチドインサートを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１および／または第２キャプシド融合ペプチドは、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）内での発現に由来する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
インビトロで、ｉｉｉ）少なくとも１つの免疫刺激核酸配列を混合する工程をさらに含み、前記免疫刺激配列はＣｐＧオリゴヌクレオチド配列である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、ＡＡＣＧＴＴＣＧ（配列番号２４）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
多価ウイルス様粒子であって、  ｉ）少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含む少なくとも１つの第１ササゲクロロティックモットルウイルスキャプシド融合ペプチドと；および  ｉｉ）少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含む少なくとも１つの第２ササゲクロロティックモットルウイルスキャプシド融合ペプチドであって、前記第１ウイルスキャプシド融合ペプチド中には存在していない少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含む、少なくとも１つの第２ウイルスキャプシド融合ペプチドとを含み；および  このとき前記多価ウイルス様粒子には全長感染性ウイルス核酸が欠如する、多価ウイルス様粒子。
【請求項２７】
前記第１キャプシド融合ペプチドおよび前記第２キャプシド融合ペプチドは、抗原性ペプチドインサートを含み、このとき前記抗原性ペプチドインサートは、同一もしくは相違する病原因子に由来する、請求項２６に記載の多価ウイルス様粒子。
【請求項２８】
前記生じた多価ウイルス様粒子は、ウイルス核酸が欠如する、請求項２６に記載の多価ウイルス様粒子。
【請求項２９】
前記ウイルス様粒子は、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載の多価ウイルス様粒子。
【請求項３０】
前記ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、ＡＡＣＧＴＴＣＧ（配列番号２４）を含む、請求項２６に記載の多価ウイルス様粒子。
【請求項３１】
多価ウイルス様粒子の溶解度を増加させる方法であって：インビトロで、少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含む少なくとも１つの第１ウイルスキャプシド融合ペプチドと、および少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含む少なくとも１つの第２ウイルスキャプシド融合ペプチドであって、前記第１ウイルスキャプシド融合ペプチド中には存在していない少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含む、少なくとも１つの第２ウイルスキャプシド融合ペプチドとを混合する工程と；および少なくとも１つの多価ウイルス様粒子を製造するために、前記少なくとも１つの第１ウイルスキャプシド融合ペプチドおよび前記少なくとも１つの第２ウイルスキャプシド融合ペプチドを集合させる工程とを含み、このとき生じた前記多価ウイルス様粒子には全長感染性ウイルス核酸が欠如する、方法。
【請求項３２】
請求項１に記載の多価ウイルス様粒子を含むワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ウイルス様粒子の製造およびその中への組換えウイルスキャプシドタンパク質のインビトロ集合に向けられる。詳細には、本発明は、多価ウイルス様粒子を製造するための迅速で拡張可能かつ費用効果的方法であって、多価ウイルス様粒子を製造するためにインビトロで結合される、様々な抗原性ペプチドインサートを含有するキャプシド融合ペプチドの個別集団を利用する方法を提供する。本発明により製造されるウイルス様粒子は、ヒトまたは動物において免疫学的応答を誘導するために利用できる。
【背景技術】
【０００２】  ワクチン接種は、病原因子による感染から動物およびヒトを保護するための最も効果的かつ効率的な方法の１つである。最近、２つ以上の病原因子に対するエピトープを含有するワクチン接種の使用が試験されてきた。そのような戦略の背後にある合理的理由には、免疫を誘導するために必要とされる接種回数の減少が含まれ、これは受診を減少させ、推奨されるワクチンプロトコールへのコンプライアンスを増加させることができる。例えば、ジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、およびＢ型肝炎に対する米国内初の五価ワクチンは、市販名Ｐｅｄｉａｒｉｘを付けてＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社によって開発されてきた。使用中もしくは開発中の他の多価ワクチンには：Ｃｏｍｖａｘ（Ｍｅｒｃｋ社、Ｂ型肝炎およびＨｉｂワクチンをワンショット（１回の注射）に結合）；ＴｒｉＨＩＢｉｔ（Ａｖｅｎｔｉｓ社、ＨｉｂおよびＤＴａＰを結合）；およびＴｗｉｎｒｉｘ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社、Ａ型肝炎とＢ型肝炎をワンショットに結合し、３回の連続投与として投与する）が含まれる。開発中の他の混合ワクチンには：ＭＭＲおよびＶａｒｉｖａｘ；ＤＴａＰおよびＩＰＶ；ＤＴａＰおよびＢ型肝炎；ＤＴａＰ、ＩＰＶ、およびＨｉｂ（Ｐｅｎｔａｖａｃ）；ＤＴａＰ、Ｂ型肝炎、およびＨｉｂ；ＤＴａＰ、ＩＰＶ、ＨｉｂおよびＢ型肝炎（Ｈｅｘａｖａｃ）；ならびにＤＴａＰ、Ｈｉｂ、ＩＰＶ、Ａ型肝炎、およびＢ型肝炎を結合した、単一接種材料が含まれる。【０００３】ウイルス様粒子  ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ワクチン物質として研究されてきた。一般に、キャプシドに包まれたウイルスには、ウイルス核酸を含有するために集合したタンパク質コートもしくは「キャプシド」が含まれる。多数のウイルスは、キャプシドがその中で発現する細胞内（「インビボ集合」）および単離および精製後に細胞外（「インビトロ集合」）の両方で、個別に発現したキャプシドタンパク質から「自己集合」してＶＬＰを形成することができる。【０００４】  ウイルス様粒子は、感染性物質を含有する必要を伴わずにウイルス粒子の全体的構造を模倣する。ＶＬＰは、ウイルスＤＮＡもしくはＲＮＡゲノムが欠如するが、真正ウイルスの三次元構造を維持している可能性がある。ＶＬＰは、Ｂ細胞媒介性応答、ＣＤ４増殖性応答および細胞毒性Ｔリンパ球応答を刺激する能力を有している。例えば、Schirmbeck et al (1996) Virus like particles induce MHC class I-restricted T-cell responses. Lessons learned from the hepatitis B small surface antigen. Intervirology 39, 111-119; Paliard et al (2000) Priming of strong, broad, and long lived HIV type I p55 gag-specific CD8+ cytotoxic T cells after administration of a virus like particle vaccine in rhesus macaques. AIDS Res. Hum. Retroviruses 16, 273-282; Murata et al. (2000) Immunization with hepatitis C virus like particles protects mice from recombinant hepatitis C virus-vaccinia infection. PNAS USA 100, 6753-6758を参照されたい。【０００５】  ＶＬＰは、ノーウォーク（Norwalk）、Ｂ型およびＣ型肝炎、パピローマウイルス、パルボウイルス、およびＡ型インフルエンザを含むヒトおよび他の動物に感染する３０種を超えるウイルスに対して製造されており、現在はＶＬＰを用いてヒトにおいて多数の臨床試験が進行中である。Koutsky et al. (2002) 「A controlled trial of a human papillomavirus type 16 vaccine,」 NEJM 347:1645-1651; Pinto et al. (2003) 「Cellular immune responses to human papillomavirus (HPV)-16 Ll in healthy volunteers immunized with recombinant HPV-16 Ll virus like particles,」 J. Infect. Dis 188:327-338; Tacket et al. (2003) 「Humoral, mucosal, and cellular immune responses to oral Norwalk virus like particles in volunteers,」 Clin. Immunol. 108:241-247を参照されたい。【０００６】  ウイルス様粒子は、さらにまた他の病原因子からエピトープを送達するための担体分子として作用するように操作することもできる。Noad et al. (2003) 「Virus like particles as immunogens,」 Trends in Microbiology 11(9), 438-444; Sadeyen et al. (2003) 「Insertion of a foreign sequence on capsid surface loops of human papillomavirus type 16 virus like particles reduces their capacity to induce neutralizing antibodies and delineates a conformational neutralizing epitope,」 Virology 309:32-40; WO 2005/005614;米国特許出願第２００４／００３３５８５号および第２００５／００４８０８２号;米国特許第６，４４８，０７０号;第６，１１０，４６６号;第６，１７１，５９１号;Brinkman et. al. (2004) 「Recombinant murine polyoma virus-like-particles induce protective anti-tumour immunity,」 Lett. Drug Des. & Disc. 1:137-147を参照されたい。キャプシドタンパク質は、組換えウイルスキャプシドタンパク質−抗原性ペプチド融合を生成する、抗原性ペプチドを含有するように修飾できる。この融合キャプシドタンパク質−抗原性ペプチド生成物は、次に宿主細胞中で発現させ、組換えウイルスもしくはウイルス様粒子を形成するためにインビボもしくはインビトロで集合させ、そして免疫応答を誘発するために宿主に投与することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】ＶＬＰの製造  理想的な多価ＶＬＰ製造方法は、様々な病原因子に由来するが偶発的感染性ウイルス核酸を含んでいない多数の抗原性ペプチドを含有する均質集団のＶＬＰの迅速で柔軟な、かつ制御された集合を許容するであろう。多価ＶＬＰを構築する現行方法には、ｉ）キャプシドタンパク質挿入の能力における固有の限界に起因して可能性のある抗原性インサートの組み合わせ数を減少させる、インビボでのＶＬＰ製造における柔軟性および制御の欠如、またはｉｉ）様々なインサートを含有する事前に集合させたＶＬＰの集団の単純なインビトロ混合に起因する不均質のＶＬＰ集団の生成のどちらかの難点がある。【０００８】  本発明は、拡張可能なインビトロウイルス様粒子（ＶＬＰ）集合方法であって、抗原性ペプチドインサートを含有しており、全長感染性ウイルス核酸ゲノムが欠如する組換えウイルスキャプシドタンパク質を用いる方法を提供する。本方法は、全長感染性ウイルス核酸ゲノムが欠如するＶＬＰへ、抗原性インサートを含有するウイルスキャプシドタンパク質を集合させる工程を含んでいる。詳細には、本方法は、インビトロで少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含有する第１ウイルスキャプシドタンパク質と、少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含有する少なくとも１つの第２ウイルスキャプシドタンパク質とを混合する工程であって、第２キャプシド融合ペプチドの少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートは、第１キャプシド融合ペプチドの少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートではなく、むしろ相違する抗原性ペプチド配列、または相違する病原因子に由来する工程と、およびウイルス様粒子を形成するためにインビトロの適正条件下でキャプシドタンパク質を集合させる工程とを含んでいる。集合したウイルス様粒子は、多価ウイルス様粒子を提供する少なくとも２つの相違する抗原性配列を含む。一部の実施形態では、相違する抗原性ペプチドインサートを含有する組換えキャプシド融合ペプチドの混合物は、特定比率の所望の抗原性ペプチドが集合したウイルス様粒子内で達成されるように制御できる。他の実施形態では、本発明により集合させたＶＬＰは、全長感染性ウイルス核酸を含有していない。他の実施形態では、本発明により集合させたＶＬＰは、ウイルス核酸を含有していない。本方法は、複数の抗原性ペプチドの組み合わせを含有するウイルス様粒子を製造する際の柔軟性を可能にする。これらの多価ＶＬＰは、動物において免疫応答を誘発するためのワクチン戦略を含むかなり多数の適用において使用できる。【０００９】  本方法は、抗原性ペプチドインサートを含有する組換えキャプシド融合ペプチドの混合物を利用して、感染性ウイルス核酸を必要としない多価ＶＬＰの単一集団を集合させる。ＶＬＰは相違する抗原性ペプチドを含有するキャプシドタンパク質とインビトロで集合させられるので、ＶＬＰ内に含有される抗原の所望の比率を制御できる。この技術を用いると、相違する抗原性ペプチドを含有するキャプシドタンパク質の広範囲の組み合わせおよび比率を混合し、迅速に集合させて多価ＶＬＰを製造することができる。そのような戦略は、所望の抗原性構成を反映するためにＶＬＰの含量を迅速に特別仕立てすることを可能にする。【００１０】  本発明は、任意の起源に由来する組換えキャプシド融合タンパク質を利用できる。例えば、インサートを含有する組換えキャプシドタンパク質は事前に集合させたウイルス様粒子に由来してよい。そのようなウイルス様粒子は、例えば、インビボ、またはインビトロで集合させることができる。または、事前にＶＬＰに集合させられていない組換えキャプシドタンパク質を利用することもできる。さらに、事前に集合させたＶＬＰ由来の組換えキャプシドタンパク質を、事前にＶＬＰに集合させられていない組換えキャプシドタンパク質と混合して多価ＶＬＰを製造することができる。【００１１】  本発明において使用するための組換えキャプシドタンパク質は、特に、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物、および植物宿主細胞系を含むがそれらに限定されない、そのようなペプチドを製造できる任意の宿主細胞発現系内で生成させることができる。所定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、原核宿主細胞内で発現させることができる。１つの実施形態では、原核宿主細胞は、細菌宿主細胞である。一部の実施形態では、キャプシド融合ペプチドは、可溶性キャプシドタンパク質または不溶性封入体として製造できる。所定の実施形態では、組換えキャプシドタンパク質は、可溶性キャプシド融合タンパク質としてシュードモナス-フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）細胞内で、または不溶性封入体内で発現させることができる。また別の実施形態では、キャプシドタンパク質は、真核宿主細胞内で発現させることができる。特定の実施形態では、真核宿主細胞は、植物細胞である。また別の実施形態では、キャプシド融合ペプチドは、植物全体で生成される。【００１２】  本発明は、相違するタイプの組換えキャプシド融合ペプチドを混合する方法であって、混合のために選択されるキャプシド融合ペプチドは、それに混合される他のキャプシド融合ペプチド内には存在していない少なくとも１つの抗原性ペプチドを含有する方法を提供する。抗原性ペプチドは、同一または相違する病原因子由来であってよい。一部の実施形態では、混合物から選択されるキャプシド融合ペプチドは、相違する病原因子由来の抗原性ペプチドを含有する。所定の実施形態では、混合物は、少なくとも２つの集団の組換えキャプシド融合ペプチドを含有していてよいが、このとき各組換えキャプシド融合ペプチド集団は、それが混合される任意の他の組換えキャプシド融合ペプチド中に存在していない相違する病原因子由来の少なくとも１つの相違する抗原性ペプチドを含有する。また別の実施形態では、混合物は、２つより多い集団の組換えキャプシド融合ペプチドを含有するが、このとき各組換えキャプシド融合ペプチド集団は、少なくとも１つの相違する病原因子由来の少なくとも１つの相違する抗原性ペプチドを含有する。一部の実施形態では、キャプシド融合ペプチドは複数の抗原性ペプチドインサートを含有する。一部の実施形態では、キャプシド融合ペプチドは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＣＴＬ細胞に対して向けられたエピトープを含むがそれらに限定されない、特定タイプの免疫エフェクター細胞を標的とする抗原性ペプチドを含有する。追加の実施形態では、混合物は野生型キャプシドタンパク質をさらに含有する。【００１３】  本発明において利用するウイルスキャプシドタンパク質は、ウイルス様粒子に再集合できる任意のタイプのウイルスに由来してよい。所定の実施形態では、混合されてＶＬＰに再集合した組換えウイルスキャプシドタンパク質全部が同一ウイルス由来であってよい。また別の実施形態では、混合されてＶＬＰに再集合した組換えウイルスキャプシドタンパク質は相違するウイルスに由来する。例えば、類似の形態学的キャプシド構造（すなわち、二十面体、らせん体など）を備える相違するウイルスに由来する組換えウイルスキャプシドタンパク質を混合して、ＶＬＰに再集合させることができる。【００１４】  本発明は、多価ワクチンの比率および組成を制御できるようにすることによって、多価ワクチンの効率的および柔軟性の製造を可能にする。本発明は、個別宿主細胞内での独立した生成から単離および精製した後に混合できるキャプシド融合ペプチドを含有する所望のエピトープを提供するので、所望の組み合わせの厳密な調節を達成できる。本発明は、混合物に加えられる組換えキャプシド融合ペプチドの各集団の量を調整する工程によって、組換えキャプシドタンパク質の任意の所望の抗原性成分比への再集合を可能にする。【００１５】  本発明のまた別の態様には、抗原性ペプチド以外の規定の官能性アミノ酸配列のウイルスキャプシドタンパク質内への挿入を含んでいる。これらの配列は、免疫応答を誘発する以外の機能を有していてよい。そのような配列の非限定的例は、標的アミノ酸配列、例えば受容体結合部位であり、本方法は、標的アミノ酸配列を含有するキャプシドタンパク質と、抗原性ペプチドインサートを含有する少なくとも１つのキャプシドタンパク質とを混合する工程を含んでいる。一部の実施形態では、そのような標的アミノ酸インサートは、集合した粒子を特定細胞に方向付ける、または細胞内への進入を可能にすることができる。【００１６】  本発明の追加の態様は、免疫刺激核酸配列、例えば本明細書に記載した方法によって製造された集合させたＶＬＰ粒子内のＣｐＧ配列の封入を提供する。【００１７】  本発明は、２つ以上の病原因子由来の抗原性インサートを含有するウイルス様粒子を利用して多価ワクチンの効率的および拡張可能な生産を増加させる方法を提供できる。【００１８】  本発明は、２つ以上の病原因子由来の抗原性インサートを含有する多価ＶＬＰを製造する方法であって、ＶＬＰ内に含有される抗原因子の比率を容易に制御できる方法もさらに提供できる。【００１９】  さらに、本発明は、全長感染性ウイルス核酸ゲノムを含有していない多価ＶＬＰを製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】Ｉ．組換えウイルスキャプシドタンパク質  ウイルスキャプシド  本発明の実施形態は、多価ウイルス様粒子を製造する方法であって、インビトロで少なくとも１つの抗原性ペプチドを含有する組換えキャプシド融合ペプチドの集団を混合する工程であって、各集団の組換えキャプシド融合ペプチドがそれと混合されるキャプシド融合ペプチド内に含有されていない少なくとも１つの抗原性ペプチドを含有している工程と、および多価ウイルス様粒子を製造するためにインビトロで規定比率にある混合された組換えキャプシド融合ペプチドを再集合させる工程とを含む方法を提供する。一部の実施形態では、生じたＶＬＰ内に含有された抗原性ペプチドは、相違する病原因子由来であってよい。【００２１】  本明細書で使用する用語「多価」は、再集合したウイルス様粒子内に少なくとも２つの相違する抗原性ペプチド配列が存在することを指示している。【００２２】  形態  本発明は、キャプシドタンパク質を引き出すために使用されるウイルスのタイプに依存しない。本発明では、抗原性ペプチドの挿入後に、ウイルス様粒子、またはケージ構造に再集合可能である任意のウイルスキャプシドタンパク質を利用できる。本発明の実施形態では、このキャプシドのアミノ酸配列は：二十面体（正二十面体、等積、準等積、および無性芽もしくは「双晶」を含む）、多面体（球形、卵形、およびレモン形）、桿状（棒状もしくは弾丸状、および紡錘状もしくは葉巻形を含む）、ならびにらせん形（ロッド形、円筒形、および糸状）を含む任意の形態を有すると分類されるウイルスのキャプシドから選択でき、それらのうちのいずれかは尾部が付いていてよい、および／または表面突起部、例えば棘もしくは瘤を含有していてよい。【００２３】  本発明の実施形態では、キャプシドのアミノ酸配列は形状がらせん形である実体のキャプシドから選択することができる。他の実施形態では、キャプシドのアミノ酸配列は二十面体である実体のキャプシドから選択することができる。所定の実施形態では、キャプシドのアミノ酸配列は正二十面体である実体のキャプシドから選択することができる。所定の実施形態では、キャプシドのアミノ酸配列は二十面体ウイルスのキャプシドから選択することができる。一部の実施形態では、キャプシドのアミノ酸配列は二十面体植物ウイルスのキャプシドから選択することができる。しかし、他の実施形態では、ウイルスキャプシドは植物には感染性ではない二十面体ウイルスに由来してよい。例えば、１つの実施形態では、ウイルスは哺乳動物に感染性のウイルスである。【００２４】  一般に、二十面体ウイルスのウイルスキャプシドは、二十面体（立方）対称性に配列された多数のタンパク質サブユニットから構成される。天然二十面体キャプシドは、例えば、結果として完全キャプシドを形成する６０サブユニットを生じさせる、キャプシドの各三角面を形成する３つのサブユニットを用いて構築できる。この小さなウイルス構造の代表は、例えばバクテリオファージφＸ１７４である。多数の二十面体ウイルスキャプシドは６０を超えるサブユニットを含有している。二十面体ウイルスの多数のキャプシドは、逆平行８本鎖のβバレルのフォールディングモチーフを含有している。このモチーフは、一方の側では４本のβ鎖（ＢＩＤＧと称する）および他方の側では４本鎖（ＣＨＥＦと称する）を備える楔形ブロックを有する。一方はβＣとβＤとの間にあり、他方はβＥとβＦとの間にある、２本の保存されたαヘリックス（ＡおよびＢと称する）もまた存在している。【００２５】  ウイルス  ウイルス分類学では、以下のキャプシドに包まれた粒子実体の分類群が認識されている：  ・第Ｉ群ウイルス、すなわちｄｓＤＮＡウイルス；  ・第ＩＩ群ウイルス、すなわちｓｓＤＮＡウイルス；  ・第ＩＩＩ群ウイルス、すなわちｄｓＲＮＡウイルス；  ・第ＩＶ群ウイルス、すなわちＤＮＡステージを伴わないｓｓＲＮＡ（＋）鎖ウイルス；  ・第Ｖ群ウイルス、すなわちｓｓＲＮＡ（−）鎖ウイルス；  ・第ＶＩ群ウイルス、すなわち、ｓｓＲＮＡ逆転写ウイルスであるＲＮＡレトロイドウイルス；  ・第ＶＩＩ群ウイルス、すなわち、ｄｓＤＮＡ逆転写ウイルスであるＤＮＡレトロイドウイルス；  ・デルタウイルス；  ・ウイロイド；および  ・サテライト核酸およびプリオンを除く、サテライトファージおよびサテライトウイルス。【００２６】  これらの分類群のメンバーは当業者にはよく知られており：H.V. Van Regenmortel et al. (eds.), Virus Taxonomy: Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (2000) (Academic Press/Elsevier, Burlington Mass., USA); the Virus Taxonomy web-page of the University of Leicester (UK) Microbiology & Immunology Department at http://wwwmicro.msb.le.ac.uk/3035/Virusgroups.html; and the on-line 「Virus」 and 「Viroid」 sections of the Taxonomy Browser of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) of the National Library of Medicine of the National Institutes of Health of the US Department of Health & Human Services (Washington, D.C., USA) at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/tax.htmlの中で概観されている。【００２７】  キャプシドのアミノ酸配列は、これらの分類群のいずれかの任意のメンバーのキャプシドから選択できる。これらの分類群のメンバーのキャプシドについてのアミノ酸配列は、例えば：the on-line 「Nucleotide」 (Genbank), 「Protein,」 and 「Structure」 sections of the PubMed search facility offered by the NCBI at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgiを含むがそれらに限定されない起源から入手できる。【００２８】  本発明の実施形態は、キャプシドのアミノ酸配列は以下の：酵母を含む真菌、植物、藻類を含む原生動物、無脊椎動物、脊椎動物、およびヒトの宿主のうちの少なくとも１つに対して特異的である分類群のメンバーから選択できることを含んでいる。追加の実施形態では、キャプシドのアミノ酸配列は：以下の第Ｉ群、第ＩＩ群、第ＩＩＩ群、第ＩＶ群、第Ｖ群、第ＶＩＩ群、ウイロイド、およびサテライトウイルスの分類群の任意の１つのメンバーから選択することができる。所定の実施形態では、キャプシドのアミノ酸配列は、６つの上述した宿主タイプのうちの少なくとも１つに対して特異的であるこれらの７つの分類群のうちの任意の１つのメンバーから選択できる。所定の実施形態では、キャプシドのアミノ酸配列は、第ＩＩ群、第ＩＩＩ群、第ＩＶ群、第ＶＩＩ群、およびサテライトウイルスのうちの任意の１つ；または第ＩＩ群、第ＩＶ群、第ＶＩＩ群、およびサテライトウイルスのうちの任意の１つのメンバーから選択できる。１つの実施形態では、ウイルスキャ��シドは、第ＩＶ群もしくは第ＶＩＩ群から選択される。一部の実施形態では、ウイルスキャプシドは、第ＩＶ群のウイルスから選択される。【００２９】  ウイルスキャプシド配列は、その中でキャプシド融合ペプチドが生成される細胞に対して天然感染因子ではないウイルス由来であってよい。本発明の実施形態は、細胞が所望の二十面体キャプシド以外の特別に選択されたウイルス由来のウイルスタンパク質を含んでいないことを含んでいる。一部の実施形態では、ウイルスキャプシドは、その中でキャプシド融合ペプチドが生成される細胞とは相違する族の有機体への向性を備えるウイルスに由来する。また別の実施形態では、ウイルスキャプシドは、その中でキャプシドペプチドが生成される宿主細胞とは相違する属の有機体への向性を備えるウイルスに由来する。また別の実施形態では、ウイルスキャプシドは、その中でキャプシド融合ペプチドが生成される宿主細胞とは相違する種の有機体への向性を備えるウイルスに由来する。【００３０】  本発明の実施形態は、ウイルスキャプシドが二十面体ウイルスから選択されることを含んでいる。二十面体ウイルスは、パピローマウイルス科（Papillomaviridae）、トティウイルス科（Totiviridae）、ディシストロウイルス科（Dicistroviridae）、ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）、トガウイルス科（Togaviridiae）、ポリオーマウイルス科（Polyomaviridiae）、ノダウイルス科（Nodaviridae）、テクティウイルス科（Tectiviridae）、レビウイルス科（Leviviridae）、ミクロウイルス科（Microviridae）、Sipoviridae、ノダウイルス科、ピコルナウイルス科（Picornoviridae）、パルボウイルス科（Parvoviridae）、カルシウイルス科（Calciviridae）、テトラウイルス科（Tetraviridae）、およびサテライトウイルスのうちのいずれかのメンバーから選択できる。【００３１】  本発明の所定の実施形態では、配列は、少なくとも１つの植物宿主に対して特異的である分類群のうちの任意の１つのメンバーから選択できる。一部の実施形態では、二十面体植物ウイルス種は、ブニヤウイルス科（Bunyaviridae）、レオウイルス科（Reoviridae）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、ルテオウイルス科（Luteoviridae）、ナノウイルス科（Nanoviridae）、パルティティウイルス科（Partitiviridae）、セキウイルス科（Sequiviridae）、ティモウイルス科（Tymoviridae）、ウルミアウイルス科（Ourmiavirus）、タバコネクローシスウイルスサテライト（Tobacco Necrosis Virus Satellite）、カリモウイルス科（Caulimoviridae）、ジェミニウイルス科（Geminiviridae）、コモウイルス科（Comoviridae）、ソベモウイルス（Sobemovirus）、トムブスウイルス科（Tombusviridae）、もしくはブロモウイルス科（Bromoviridae）分類群のいずれかである、またはそれらのメンバーである植物感染性ウイルス種であってよい。一部の実施形態では、二十面体植物ウイルス種は、ルテオウイルス科、ナノウイルス科、パルティティウイルス科、セキウイルス科、ティモウイルス科、ウルミアウイルス属、タバコネクローシスウイルスサテライト、カリモウイルス科、ジェミニウイルス科、コモウイルス科、ソベモウイルス属、トムブスウイルス科、もしくはブロモウイルス科分類群のいずれかである、またはそれらのメンバーである植物感染性ウイルス種である。一部の実施形態では、二十面体植物ウイル��種は、カリモウイルス科、ジェミニウイルス科、コモウイルス科、ソベモウイルス属、トムブスウイルス科、もしくはブロモウイルス科分類群のいずれかである、またはそれらのメンバーである植物感染性ウイルス種である。他の実施形態では、二十面体植物ウイルス種は、コモウイルス科、ソベモウイルス属、トムブスウイルス科、もしくはブロモウイルス科分類群のいずれかである、またはそれらのメンバーである植物感染性ウイルス種であってよい。さらに追加の実施形態では、二十面体植物ウイルス種は、コモウイルス科もしくはブロモウイルス科のメンバーである植物感染性ウイルス種であってよい。所定の実施形態では、ウイルスキャプシドは、ブロモウイルス科分類群の種に由来する。所定の実施形態では、キャプシドはイラルウイルス属もしくはアルファモウイルス属に由来する。所定の実施形態では、ウイルスキャプシドは、ササゲモザイクウイルス（Cowpea Mosaic Virus）もしくはササゲクロロティックモットルウイルスに由来する。他の実施形態では、キャプシドは、タバコ条斑ウイルス（Tobacco streak virus）、ブロムモザイクウイルス（Brome mosaic virus）、もしくはアルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）に由来する。【００３２】ＩＩ．抗原性ペプチドインサート  サイズ  本発明の実施形態は、ウイルスキャプシド配列に機能的に連結した抗原性ペプチドもしくはタンパク質が、少なくとも２つのアミノ酸を含有することを含んでいる。抗原性ペプチドは、動物へ有効量で投与されると免疫応答を発生するために十分なサイズであってよい。これらのペプチドは、長さが少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４５、５０、６０、６５、７５、８５、９５、９６、９９アミノ酸またはそれ以上であってよい。【００３３】  本発明の実施形態は、組換えキャプシド融合ペプチドが少なくとも１つの抗原性ペプチドを含有することを含んでいる。また別の実施形態では、組換えキャプシド融合ペプチドは２つ以上の抗原性ペプチドを含有する。一部の実施形態では、抗原性ペプチドは、少なくとも２つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５もしくは少なくとも２０の個別抗原性ペプチドから構成される。さらにまた別の実施形態では、抗原性ペプチドは、ウイルスキャプシドタンパク質内に挿入されるので、ウイルス様粒子を製造するためにキャプシドタンパク質が再集合させられるとそれは少なくとも1つの表面ループ上に露出させられる。【００３４】  抗原性ペプチド  本発明において使用するための抗原性ペプチドは、免疫応答を発生できる任意のペプチド配列であってよい。例えば、抗原性ペプチドは、ペプチドエピトープ、ハプテン、もしくは関連ペプチド（例、抗原性ウイルスペプチド；ウイルス関連ペプチド、例えばＨＩＶ関連ペプチド、肝炎関連ペプチド；抗体イディオタイプドメイン、細胞表面ペプチド；抗原性ヒト、動物、原生動物、植物、真菌、細菌、および／または古細菌ペプチド；アレルゲン性ペプチドおよびアレルゲン減感ペプチド）であってよい。抗原性ペプチドは、感染因子、寄生虫、癌細胞、および他の病原因子を含むヒトもしくは動物病原因子の抗原性ペプチドであるペプチドから選択できる。そのような病原因子には、毒性因子および病原因子、例えば、それらの因子の外毒素、内毒素などがさらに含まれる。病原因子は、任意のレベルの毒性を示すことができる、すなわち、それらは例えば毒性、無毒性、偽毒性、半毒性などであってよい。一部の実施形態では、抗原性ペプチドは、病原因子由来のエピトープアミノ酸配列を含有していてよい。追加の実施形態では、エピトープアミノ酸配列は、少なくとも１つのそのような因子の表面ペプチドの少なくとも一部分のアミノ酸配列を含んでよい。【００３５】  ２つ以上の抗原性ペプチドは、単一キャプシドタンパク質内に挿入するために選択することができ、その場合に結果として生じるウイルス様粒子は、複数の相違するキャプシド融合ペプチド由来の複数の相違する抗原性ペプチドを提示することができる。複数の抗原性ペプチドフォーマットの一部の実施形態では、様々な抗原性ペプチドは全部を同一病原因子由来の複数のエピトープから選択できる。多抗原性ペプチドフォーマットの他の実施形態では、選択される様々な抗原性ペプチドはすべてを密接に関連する複数の病原因子から、例えば同一種もしくは同一属の相違する種の相違する菌株、亜種、次亜種、病原型、血液型亜型、または遺伝子型から選択できる。また別の実施形態では、キャプシド融合ペプチド内に挿入するための抗原性ペプチドは、非関連性病原因子由来であってよい。【００３６】  本発明の実施形態は、病原因子が、以下の：病原性のバシラス種（Bacillus spp.）、例えば炭疽菌（Bacillus anthracis）；バルトネラ種（Bartonella spp.）、例えば五日熱バルトネラ（B. quintana）；ブルセラ種（Brucella spp.）；バークホルデリア種（Burkholderia spp.）、例えばバークホルデリア・シュードマレイ（B. pseudomallei）；カンピロバクター種（Campylobacter spp.）；クロストリジウム種（Clostridium spp.）、例えば、破傷風菌（C. tetani）、ボツリヌス菌（C. botulinum）；コクシエラ種（Coxiella spp.）、例えば、コクシエラ・バーネティイ（C. burnetii）；エドワードジエラ種（Edwardsiella spp.）、例えば、エドワードジエラ・タルダ（E. tarda）；エンテロバクター種（Enterobacter spp.）、例えば、エンテロバクター・クロアカエ（E. cloacae）；エンテロコッカス種（Enterococcus spp.）、例えば、エンテロコッカス・フェカーリス（E. faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）；エシェリキア種（Escherichia spp.）、例えば、大腸菌（E. coli）；フランシセラ種（Francisella spp.）、例えば、野兎病菌（F. tularensis）；ヘモフィルス種（Haemophilus spp.）、例えば、インフルエンザ菌（H. influenzae）；クレブシエラ種（Klebsiella spp.）、例えば、肺炎桿菌（K. pneumoniae）；レジオネラ種（Legionella spp.）；リステリア種（Listeria spp.）、例えば、リステリア菌（L. monocytogenes）；髄膜炎菌（Meningococci）および淋菌（Gonococci）、例えば、ナイセリア種（Neisseria spp.）；モラクセラ種（Moraxella spp.）；マイコバクテリウム種（Mycobacterium spp.）、例えば、ライ菌（M. leprae）、結核菌（M. tuberculosis）；肺炎球菌（Pneumococci）、例えば、肺炎双球菌（Diplococcus pneumoniae）；シュードモナス種（Pseudomonas spp.）、例えば、緑膿菌（P. aeruginosa）；リケッチア種（Rickettsia spp.）、例えば、発疹チフスリケッチア（R. prowazekii）、斑点熱リケッチア（R. rickettsii）、発疹熱リケッチア（R. typhi）；サルモネラ種（Salmonella spp.）、例えば、チフス菌（S. typhi）；ブドウ球菌種（Staphylococcus spp.）、例えば、黄色ブドウ球菌（S. aureus）；Ａ群連鎖球菌および溶血連鎖球菌を含む連鎖球菌種（Streptococcus spp.）、例えば、肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）；ストレプトマイセス種（Streptomyces spp.）；赤痢菌種（Shigella spp.）；ビブリオ菌種（Vibrio spp.）、例えば、コレラ菌（V. cholerae）；およびエルシニア菌種（Yersinia spp.）、例えば、ペスト菌（Y. pestis）、エルシニア・エンテロコリチカ（Y. enterocolitica）を含むがそれらに限定されない細菌およびマイコプラズマ因子、病原性のアルテルナリア種（Alternaria spp.）；アスペルギルス種（Aspergillus spp.）；ブラストマイセス種（Blastomyces spp.）、例えば、ブラストマイセス・デルマティティディス（B. dermatiditis）；カンジダ種（Candida spp.）、例えば、カンジダ・アルビカンス（C. albicans）；クラドスポリウム種（Cladosporium spp.）；コクシジオイデス種（Coccidiodes spp.）、例えば、コクシジオイデス・イミチス（C. immitis）；クリプトコッカス種（Cryptococcus spp.）、例えば、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（C. neoformans）；ヒストプラスマ種（Histoplasma spp.）、例えば、ヒストプラスマ・カプスラーツム（H. capsulatum）；およびスポロトリクス種（Sporothrix spp.）、例えば、スポロトリックス・シェンキイ（S. schenckii）を含むがそれらに限定されない真菌および酵母因子の群のうちの少なくとも１つに属していてよいことを含んでいる。【００３７】  本発明の実施形態は、病原因子は、病原性のアカトアメーバ種（Acanthamoeba spp.）、アメーバ（Amoeba spp.）、ネグレリア種（Naegleria spp.）、エントアメーバ（Entamoeba spp.）、例えば、赤痢アメーバ種（E. histolytica）；クリプトスポリジウム種（Cryptosporidium spp.）、例えば、クリプトスポリジウム・パルブム（C. parvum）；シクロスポラ種（Cyclospora spp.）；エンセファリトゾーン種（Encephalitozoon spp.）、例えば、エンセファリトゾーン・インテスティナリス（E. intestinalis）；エンテロサイトゾーン種（Enterocytozoon spp.）；ジアルジア種（Giardia spp.）、例えば、ランブル鞭毛虫（G. lamblia）；イソスポラ種（Isospora spp.）；マイクロスポリジウム種（Microsporidium spp.）；プラスモジウム種（Plasmodium spp.）、例えば、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）、卵形マラリア原虫（P. ovale）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）；トキソプラズマ種（Toxoplasma spp.）、例えば、トキソプラズマ原虫（T. gondii）；およびトリパノソーマ種（Trypanosoma spp.）、例えば、トリパノソーマ・ブルーセイ（T. brucei）を含むアメーバを含むがそれらに限定されない原生生物因子由来であってよいことを含んでいる。【００３８】  本発明の実施形態は、病原因子が、病原性のアスカリス種（Ascaris spp.）、例えば、回虫（A. lumbricoides）；ドラクンクルス種（Dracunculus spp.）、例えば、メジナ虫（D. medinensis）；オンコセルカ種（Onchocerca spp.）、例えば、回旋糸状虫（O. volvulus）；住血吸虫種（Schistosoma spp.）；旋毛虫種（Trichinella spp.）、例えば、旋毛虫（T. spiralis）；および鞭虫種（Trichuris spp.）、例えば、ヒト鞭虫（T. trichiura）を含むがそれらに限定されない寄生因子（例えば、蠕虫寄生虫）由来であってよいことを含んでいる。【００３９】  他の実施形態では、病原因子は、病原性のアデノウイルス：アレナウイルス、例えば、ラッサ熱ウイルス；アストロウイルス；ブンヤウイルス；例えば、ハンタウイルス；リフト・バレー熱ウイルス；コロナウイルス、デルタウイルス；サイトメガロウイルス；エプスタイン・バーウイルス、ヘルペスウイルス、水痘ウイルス；フィロウイルス、例えば、エボラ熱ウイルス、マールブルグウイルス；フラビウイルス、例えば、デング熱ウイルス、西ナイル熱ウイルス、黄熱病ウイルス；肝炎ウイルス；インフルエンザウイルス；レンチウイルス；Ｔ細胞リンパ病ウイルス；その他の白血病ウイルス；ノーウォークウイルス；パピローマウイルス、その他の腫瘍ウイルス；パラミクソウイルス、例えば、麻疹ウイルス、流行浅耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、肺炎ウイルス、センダイウイルス；パルボウイルス；ピコルナウイルス、例えば、カルジオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、その他のエンテロウイルス；ポックスウイルス、例えば、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、パラポックスウイルス；レオウイルス、例えば、コルティウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス；ラブドウイルス、例えば、リッサウイルス、水疱性口内炎ウイルス；およびトガウイルス、例えば、風疹ウイルス、シンドビスウイルス、西部脳炎ウイルスを含むがそれらに限定されないウイルス因子由来であってよい。【００４０】  本発明の実施形態は、抗原性ペプチドが、イヌパルボウイルスペプチド、炭疽菌保護抗原（ＰＡ）抗原性ペプチド、および東部ウマ脳炎ウイルス抗原性ペプチドからなる群から選択されることを含む。他の実施形態では、抗原性ペプチドは、イヌパルボウイルス由来ペプチドである。追加の実施形態では、抗原性ペプチドは、配列番号４、６、８、もしくは１０のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを備える炭疽菌保護抗原（ＰＡ）抗原性ペプチドであることを含んでいる。さらに他の実施形態では、抗原性ペプチドは、配列番号１１もしくは１３のうちの１つのアミノ酸配列を備える東部ウマ脳炎ウイルス抗原性ペプチドである。【００４１】  当該の抗原性ペプチドのためのコーディング配列は、規定部位でウイルスキャプシドもしくはコートタンパク質のためのコーディング配列内に挿入できる。一部の実施形態では、ペプチドは、ＶＬＰの形成中にループとして発現できるようにキャプシドコーディング配列内に挿入される。【００４２】  ペプチドは、キャプシド内の２つ以上の挿入部位で挿入されてよい。そこで、ペプチドはキャプシドの２つ以上の表面ループモチーフ内に挿入されてよい；ペプチドは、所定のループモチーフ内の複数の部位でさらに挿入されてよい。インサートの個別機能的および／または構造的ペプチド、および／または全ペプチドインサートは、開裂部位、すなわちタンパク質を開裂もしくは加水分解する物質がキャプシド構造もしくは集合の残りからペプチドを分離するために作用できる部位によって分離されてよい。【００４３】  ペプチドは、外部に面するループおよび／または内部に面するループ内に、すなわち、キャプシドの中心から各々反れる、または中心に面するキャプシドの��ープ内に挿入されてよい。キャプシドの表面ループ内の任意のアミノ酸もしくはペプチド結合は、ペプチドの挿入として機能できる。典型的には、挿入部位は、ループのほぼ中心で、すなわち折り畳まれたキャプシドペプチドの三次構造の中心から最も遠位に位置する位置で選択できる。ペプチドコーディング配列は、選択されたループのこのほぼ中心に対応するキャプシドコーディング配列の位置内に機能的に挿入されてよい。これは、ペプチド挿入部位の下流で合成されるキャプシドのそのペプチド配列の部分に対するリーディングフレームの保持を含んでいる。【００４４】  他の実施形態では、ペプチドはキャプシドのアミノ末端で挿入できる。ペプチドは、１つまたは複数のリンカー配列を通してキャプシドに連結されてよい。一部の他の実施形態では、ペプチドはキャプシドのカルボキシ末端で挿入できる。ペプチドは、化学的もしくは酵素的加水分解によって開裂可能である１つまたは複数のリンカーを通してカルボキシ末端に連結することもできる。追加の実施形態では、ペプチド配列はアミノおよびカルボキシ末端の両方で、または１つの末端および少なくとも１つの内部位置、例えばその三次元立体構造内のキャプシドの表面上で発現する場所で連結される。本発明の他の実施形態については、少なくとも１つの抗原性ペプチドは、少なくとも１つの内部ループ内、またはＶＬＰの少なくとも１つの外面ループ内で発現する。【００４５】  ウイルスキャプシドの２つ以上のループは修飾できる。一部の実施形態では、抗原性ペプチドは、ウイルス様粒子の少なくとも２つの表面ループ上に露出させられる。他の実施形態では、少なくとも２つの抗原性ペプチドはキャプシドタンパク質内に挿入され、ウイルスキャプシド、ケージもしくはウイルス様粒子の少なくとも２つの表面ループ上に露出させられる。他の実施形態では、少なくとも３つの抗原性ペプチドはキャプシドタンパク質内に挿入され、ウイルス様粒子の少なくとも３つの表面ループ上に露出させられる。表面ループ内の組換えペプチドは、同一アミノ酸配列を有していてよい。追加の実施形態では、表面ループ内の組換えペプチドのアミノ酸配列は相違する。【００４６】  ウイルスキャプシドもしくはタンパク質をコードする核酸配列もまたＶＬＰの構成を変化させるために修飾できる（例えば、Brumfield, et al. (2004) J. Gen. Virol. 85: 1049- 1053を参照されたい）。例えば、３つの一般クラスの修飾が、ＶＬＰ集合を修飾するために最も典型的に発生させられる。これらの修飾は、集合したタンパク質ケージ内の内部、外部もしくは隣接サブユニット間の界面を変化させるように設計される。これを遂行するために：（ｉ）Ｎ末端内の塩基性残基（例、Ｋ、Ｒ）を酸性グルタミン酸と置換することによってウイルス核酸結合領域の内部表面電荷を変化させる（Douglas et al, 2002b）；（ｉｉ）Ｎ末端からの内部残基を抹消する（ＣＣＭＶ中で、通常は残基４〜３７）；（ｉｉｉ）１１アミノ酸ペプチド細胞ターゲティング配列をコードするｃＤＮＡ（Graf et al., 1987）を表面露出ループ内に挿入する；および（ｉｖ）金属結合部位（ＣＣＭＶ中で、残基８１／１４８突然変異体）を変化させることによってウイルスサブユニット間の相互作用を修飾するために、���然変異誘発プライマーを使用できる。【００４７】  本発明の実施形態は、抗原性ペプチドをササゲクロロティックモットルウイルス（ＣＣＭＶ）に由来するキャプシド内に挿入できることを含んでいる。一部の実施形態では、ペプチドは、ＣＣＭＶウイルスのアミノ酸１２９で挿入できる。また別の実施形態では、ペプチド配列は、ＣＣＭＶウイルスのアミノ酸６０、６１、６２もしくは６３で挿入できる。さらにまた別の実施形態では、ペプチドは、ＣＣＭＶウイルスのアミノ酸１２９およびアミノ酸６０〜６３の両方で挿入できる。【００４８】  本発明の実施形態は、当該の抗原性ペプチドに隣接する、またはウイルスキャプシドタンパク質の一部分に連結したタグ配列もまた含められることを含んでいる。本発明の実施形態では、このタグ配列は、組換えキャプシドタンパク質融合ペプチドの精製を可能にすることができる。タグ配列は、親和性タグ、例えばヘキサ−ヒスチジン親和性タグであってよい。また別の実施形態では、親和性タグは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ分子であってよい。このタグは、さらに蛍光分子、例えばＹＦＰもしくはＧＦＰ、またはそのような蛍光タンパク質のアナログであってもよい。このタグは、さらに抗体分子の一部分、または精製のために有用である知られている結合パートナーのための知られている抗原もしくはリガンドであってもよい。【００４９】ＩＩＩ．組換えキャプシドタンパク質融合ペプチドの製造  本発明は、多価ＶＬＰのその後の集合において使用するための組換えキャプシド融合ペプチドを製造するために、合成もしくは任意のタイプの生物学的発現系の使用を企図している。キャプシドタンパク質発現の本方法は、昆虫細胞発現系、細菌細胞発現系、例えば大腸菌、枯草菌、およびシュードモナス・フルオレッセンス、植物および植物細胞培養発現系、酵母発現系、例えばサッカロミセス・セレビジエ（S. cervisiae）およびピチア・パストリス（P. Pastoris）、ならびに哺乳動物発現系を含んでいる。【００５０】  本発明の実施形態は、組換えキャプシド融合ペプチドが植物細胞および植物全体で生成されることを含んでいる。所定の実施形態では、キャプシド融合ペプチドは可溶性タンパク質として製造できる。また別の実施形態では、キャプシド融合ペプチドは感染性ウイルス粒子に集合させられる。また別の実施形態では、キャプシド融合ペプチドはＶＬＰとして集合させられる。【００５１】  本発明の実施形態は、組換えキャプシドタンパク質融合ペプチドが細菌細胞培養中で生成されることを含んでいる。実施形態では、組換えキャプシド融合ペプチドは宿主細胞内の不溶性封入体として統合できる。また別の実施形態では、キャプシドタンパク質融合ペプチドは宿主細胞内の可溶性分子として生成される。他の実施形態では、組換えキャプシド融合ペプチドは、シュードモナス・フルオレッセンス細胞を含むシュードモナス属菌宿主細胞内で生成される。【００５２】  本発明において使用するための組換えキャプシドタンパク質融合ペプチドは、当技術分野においてよく知られている技術を利用して生物学的発現系において製造できる。例えば、少なくとも１つの抗原性ペプチドに機能的に連結したウイルスキャプシドタンパク質の融合��プチドをコードする核酸構築物を、宿主細胞内に導入して発現させることができる。転写および翻訳調節エレメント、例えば転写エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列、プロモーター、内部リボソーム進入部位を含むリボソーム進入部位、アクチベーター、翻訳開始および停止シグナル、転写ターミネーター、シストロン調節因子、ポリシストロン調節因子、タグ配列、例えばＨｉｓ−タグ、Ｆｌａｇ−タグ、Ｔ７−タグ、Ｓ−タグ、ＨＳＶ−タグ、Ｂ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ポリアルギニン、ポリシステイン、ポリフェニルアラニン、ポリアスパラギン酸、（Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ）ｎ、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、シクロマルトデキストリングルコノトランスフェラーゼ、ＣＴＰ：ＣＭＰ−Ｓ−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソン酸シチジルトランスフェラーゼ、ｔｒｐＥもしくはｔｒｐＬＥ、アビジン、ストレプトアビジン、Ｔ７遺伝子１０、Ｔ４  ｇｐ５５、ブドウ球菌タンパク質Ａ、連鎖球菌タンパク質Ｇ、ＧＳＴ、ＤＨＦＲ、ＣＢＰ、ＭＢＰ、ガラクトース結合ドメイン、カルモジュリン結合ドメイン、ＫＳＩ、ｃ−ｍｙｃ、ｏｍｐＴ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ＮｕｓＡ、ユビキチン、ｈｅｘ−ヒスチジン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、もしくはそのような蛍光タンパク質のアナログ、抗体分子、ヘモシリンＡ、または知られている抗原もしくは精製のために有用であることが知られている結合パートナーのためのリガンドを含む、例えば発現した組換えキャプシドタンパク質融合ペプチドの同定、分離、精製もしくは単離を促進するヌクレオチド配列「タグ」および「タグ」ペプチドコーディング配列は、宿主細胞の作用によって調節エレメントが組換えキャプシドタンパク質融合ペプチドの発現を指令できるように上述した配列に共有結合させることができる。【００５３】  発酵プロセスでは、組換えキャプシド融合ペプチドの発現が誘導されると、キャプシド融合ペプチドの製造効率を最大化するために高レベルの製造率を有することが理想的である。【００５４】ＩＶ．組換えキャプシドタンパク質融合ペプチドの精製  組換えキャプシドタンパク質融合ペプチド、ウイルス様粒子もしくはケージ状構造が生成されると、それらは次に単離して当技術分野においてよく知られている標準技術によって実質的純粋へ精製することができる。【００５５】  単離および精製技術は、キャプシドタンパク質融合ペプチドを製造するために利用できる宿主細胞に依存してよい。そのような技術には、ＰＥＧ、アンモニウムサルフェートもしくはエタノール沈降法、酸抽出法、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ニッケルクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ、レクチンクロマトグラフィー、分取電気泳動法、界面活性剤可溶化法、カラムクロマトグラフィーのような物質を用いる選択的沈降法、免疫精製法、サイズ排除クロマトグラフィ、免疫精製法、遠心分離法、超遠心分離法、密度勾配遠心分離法（例えば、スクロース上もし���は塩化セシウム（ＣｓＣｌ）上での勾配）、サイズ排除フィルターを通しての限外濾過、および当技術分野において知られている任意の他のタンパク質単離法が含まれ得るがそれらに限定されない。例えば、確立された分子接着特性を有するキャプシドタンパク質融合ペプチドは、リガンドへ可逆的に融合させることができる。適切なリガンドを用いると、キャプシドタンパク質融合ペプチドは精製カラムへ選択的に吸着させ、次に相当に純粋な形状でカラムから遊離させることができる。キャプシドタンパク質は、次に酵素活性によって除去される。さらに、キャプシドタンパク質融合ペプチドは、イムノアフィニティーカラムもしくはＮｉ−ＮＴＡカラムを用いて精製できる。【００５６】  一般的技術はさらに、例えば、R. Scopes, Peptide Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag: N.Y. (1982); Deutscher, Guide to Peptide Purification, Academic Press (1990);米国特許第４，５１１，５０３号; S. Roe, Peptide Purification Techniques: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford Press (2001); D. Bollag, et al, Peptide Methods, Wiley-Lisa, Inc. (1996); AK Patra et al., Peptide Expr Purif, 18(2): p/ 182-92 (2000); and R. Mukhija, et al., Gene 165(2): p. 303-6 (1995)に記載されている。さらに、例えば、Ausubel, et al. (1987 and periodic supplements); Deutscher (1990) 「Guide to Peptide Purification,」 Methods in Enzymology vol. 182, and other volumes in this series; Coligan, et al. (1996 and periodic Supplements) Current Protocols in Peptide Science Wiley/Greene, NY;およびペプチド精製生成物の使用に関する製造業者、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社（ニュージャージー州ピスカタウェイ）またはＢｉｏ−Ｒａｄ社（カリフォルニア州リッチモンド）の参考文献も参照されたい。組換え技術との組み合わせは、適切なセグメント、例えば、ＦＬＡＧ配列もしくはプロテアーゼ除去可能配列を介して融合できる同等物への融合を可能にする。さらに、例えば、Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli (1990) 「Purification of Recombinant Peptides with Metal Chelate Absorbent」 in Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12:87-98, Plenum Press, NY; and Crowe, et al. (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Peptide Purification System QIAGEN, Inc., Chatsworth, Calif.も参照されたい。【００５７】  一部の実施形態では、宿主細胞、詳細には細菌宿主細胞中で発現したキャプシドタンパク質融合ペプチドは不溶性集合体（「封入体」）を形成できる。封入体からペプチドを精製するためには数種のプロトコールが適合する。例えば、封入体の精製は、典型的には、宿主細胞の崩壊による、５０ｍＭ ＴＲＩＳ／ＨＣＬ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＡＴＰ、および１ｍＭ ＰＭＳＦのバッファー中でのインキュベーションによる封入体の抽出、分離および／または精製を含んでいる。細胞懸濁液は、典型的にはフレンチプレスの２〜３回の通過を用いて溶解させられる。細胞懸濁液は、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（Brinknan Instruments社）を用いて均質化する、または氷上で超音波処理することもできる。また別の細菌を溶解する方法は当業者には明白である（例えば、Sambrook et al., supra; Ausubel et al., supraを参照されたい）。【００５８】  必要であれば、封入体を可溶化し、溶解した細胞懸濁液は典型的には望ましくない不溶性物質を除去するために遠心することができる。封入体を形成し��キャプシドタンパク質融合ペプチドは、適合するバッファーを用いた希釈もしくは透析によって復元することができる。適切な溶媒には、ウレア（約４Ｍ〜約８Ｍ）、ホルムアミド（少なくとも約８０％、容積／容積ベース）、およびグアニジンヒドロクロライド（約４Ｍ〜約８Ｍ）が含まれるがそれらに限定されない。グアニジンヒドロクロライドおよび類似の物質は変性剤であるが、この変性は非可逆性ではなく、変性剤の除去（例えば、透析による）または希釈が行われると復元が発生する可能性がある。その他の適切なバッファーは、当業者には知られている。【００５９】  または、組換えキャプシドタンパク質融合ペプチド、ウイルス様粒子、またはケージ構造を宿主ペリプラスムから精製することが可能である。宿主細胞の溶解後、組換えペプチドが宿主細胞のペリプラスム内へ運び出されると、細菌のペリプラスム分画は、当業者に知られている他の方法に加えて低温浸透圧性ショックによって単離できる。ペリプラスムから組換えペプチドを単離するためには、例えば、細菌細胞を遠心するとペレットを形成できる。ペレットは、２０％スクロースを含有するバッファー中に再懸濁させることができる。細胞を溶解させるために、細菌を遠心し、ペレットを氷温５ｍＭ ＭｇＳＯ4中に再懸濁させ、氷浴中に約１０分間維持できる。細胞懸濁液は遠心し、上清をデカンテーションして保存できる。上清中に存在する組換えペプチドは、当業者によく知られている標準分離技術によって宿主ペプチドから分離することができる。【００６０】  初期塩分別蒸留は、多数の望ましくない宿主細胞ペプチド（もしくは細胞培養培地から引き出されたペプチド）を、当該の組換えキャプシドタンパク質融合ペプチドから分離できる。１つのそのような例は、アンモニウムサルフェートであってよい。アンモニウムサルフェートは、ペプチド混合物中の水の量を効果的に減少させることによってペプチドを沈降させる。ペプチドは、次にそれらの溶解度に基づいて沈降する。ペプチドがより疎水性であるほど、より低いアンモニウムサルフェート濃度で沈降する確率が高くなる。典型的なプロトコールは、生じたアンモニウムサルフェート濃度が２０〜３０％となるようにペプチド溶液に飽和アンモニウムサルフェートを加える工程を含んでいる。この濃度は、ペプチドのほとんどの疎水分を沈降させることができる。沈降物は、次に廃棄され（当該のペプチドが疎水性でない限り）、アンモニウムサルフェートが、当該のキャプシドタンパク質融合ペプチドを沈降させることが知られている濃度へ上清に加えられる。沈降物は次にバッファー中に溶解され、過剰な塩は、必要であれば透析もしくはダイアフィルトレーションのいずれかを通して除去される。ペプチドの溶解度に基づく、低温エタノール沈降法などの他の方法は当業者にはよく知られており、複合キャプシドタンパク質融合ペプチド混合物を分画化するために使用できる。【００６１】  組換えキャプシドタンパク質融合ペプチドの分子量を使用すると、相違する孔径の膜（例えば、ＡｍｉｃｏｎもしくはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ膜）に通す限外濾過を用いて、より大きなサイズおよび小さなサイズのペプチドから単離することができる。第１工程として、キャプシドタンパク質融合ペプチド混合物は、当該の組換えキャプシド融合ペプチドの分子量より小さい分子量カットオフを有する孔径を備える膜に通して限外濾過することができる。次に限外濾過の濃縮水を、当該のキャプシドタンパク質融合ペプチドの分子量より大きい分子量カットオフを備える膜に対して限外濾過することができる。組換えキャプシドタンパク質融合ペプチドは、この膜を通って濾液内に通過できる。濾液は、次に以下に記載するようにクロマトグラフィにかけることができる。【００６２】  組換えキャプシドタンパク質融合ペプチドは、そのサイズ、正味表面電荷、疎水性、およびリガンドに対する親和性に基づいて他のペプチドから分離することもできる。さらに、キャプシドタンパク質に対して立てられた抗体はカラム基質にコンジュゲート化させ、キャプシドタンパク質を免疫精製することができる。これらの方法は全部が、当技術分野においてよく知られている。クロマトグラフィ技術は任意の規模で、そして多数の様々な製造業者（例、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）からの装置を用いて実施できることは当業者には明白である。【００６３】Ｖ．集合したウイルス様粒子の分解  本発明の１つの態様では、事前にウイルス様粒子に集合させた組換えキャプシドタンパク質融合ペプチドを本発明において利用できるが、このときウイルス様粒子は分解させられ、ウイルス様粒子の組換えキャプシドタンパク質融合ペプチドは単離および精製され、引き続いて多価ウイルス様粒子の形成に利用される。【００６４】  分解プロセスは、当技術分野においてよく知られている。例えば、Ｔｒｉｓ、ＥＧＴＡ、ＤＴＴ、およびＮａＣｌを含有する解離バッファーを利用すると、事前に集合させたウイルス様粒子を分解させることができる。例えば、Brady et al. (1977) 「Dissociation of polyoma virus by the chelation of calcium ions found associated with purified virions,」 J. Virology 23(3):717-724を参照されたい。さらに、高レベルのスルフヒドリル還元剤、例えばβ−メルカプトエタノール、グルタチオン、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、システイン、ハイドロゲンスルフィド、およびそれらの混合物への長時間の曝露を利用すると、事前に集合させたＶＬＰを分解することができる。例えば、米国特許第６，１４６，９４５号を参照されたい。分解方法、例えば実施例に記載した方法もまた本発明において使用できる。【００６５】ＶＩ．ＶＬＰの再集合  抗原ペプチドインサートを含有する組換えキャプシド融合ペプチドの様々な集団をインビトロで混合し、再集合させるとウイルス様粒子を製造することができる。本発明の１つの態様では、全長感染性ウイルス核酸ゲノムが欠如するＶＬＰへ抗原性インサートを含有するウイルスキャプシドタンパク質が再集合させられる。全長感染性ウイルス核酸は、細胞内でのウイルス複製のために必要とされる全ヌクレオチド配列を含有するウイルスのゲノム核酸である。これらのエレメントには、（ｉ）コーディング領域、（ｉｉ）非コーディング領域、および（ｉｉｉ）調節領域が含まれる。ウイルスゲノム核酸は、ＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい。非コーディング領域は、ウイルス核酸の５’および３’末端に位置してよい、またはそれらはコーディング領域の間��位置してもよい。コーディング領域は、重複していても重複していなくてもよく、多官能であってよい。非コーディングおよびコーディング領域はどちらも調節機能を有していてよく、調節エレメント、例えばウイルスの複製、翻訳、またはエンカプシデーションおよび粒子形成のために必要な配列を含有していてよい。【００６６】  追加の実施形態では、ＶＬＰはウイルスＲＮＡの存在下で再集合させることができる。また別の実施形態では、ＶＬＰはウイルス核酸の不在下で再集合させられる。また別の実施形態では、ＶＬＰは非ウイルス核酸の存在下で再集合させられる。また別の実施形態では、ＶＬＰは免疫刺激核酸配列、例えばＣｐＧ配列の存在下で再集合させられる。【００６７】  本発明の１つの態様では、相違する抗原性ペプチドインサートを含有する組換えキャプシド融合ペプチド集団の個別集団がインビトロで混合されて、多価ウイルス様粒子に集合させられる。個別集団は、各々それが混合される任意の他の組換えキャプシド融合ペプチド中に存在していない、少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含有している。【００６８】  １つの実施形態では、組換えキャプシド融合は、同一比率、例えば１：１、１：１：１の比で混合される。また別の実施形態では、組換えキャプシド融合は、相違する比率、例えば１：２、１：３、１：２：１、２：１：３：１で混合される。比率は、混合物中に含まれる抗原性インサートを含有するキャプシド融合ペプチドの相違するタイプの数によって決定できる。一部の実施形態では、組換えキャプシド融合ペプチドの混合物は、少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含有する少なくとも第１ウイルスキャプシドタンパク質、および少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含有する第２ウイルスキャプシドタンパク質を含有しており、このとき第２キャプシド融合ペプチドの少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートは、第１キャプシド融合ペプチドの少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートとは相違する抗原性ペプチド配列または相違する病原因子由来である。本発明の一部の実施形態では、抗原性ペプチド由来のインサートを含有する組換えキャプシド融合ペプチドの少なくとも２つの集団が混合されるが、このとき各集団は、それが混合されるキャプシド融合ペプチド中には存在していない少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含有する。抗原性ペプチドインサートは、同一または相違する病原因子由来であってよい。一部の実施形態では、組換えキャプシド融合ペプチドの３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１８、２０、もしくは２０を超える集団が混合されるが、このとき各集団は、それが混合される任意の他の組換えキャプシド融合ペプチド集団中には存在していない少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含有している。本発明の他の実施形態では、非抗原性ペプチドインサートを含有するキャプシドタンパク質もまた混合物中に含めることができる。そのような非抗原性ペプチドインサートには、ターゲティングペプチド、免疫系調節因子として作用する、例えばサイトカインおよびケモカインなどのペプチド、および合成手段に由来するアジュバントとして機能するペプチドが含まれ��がそれらに限定されない。【００６９】  さらに、非ウイルス核酸配列、例えばＶＬＰ中に含有される抗原性ペプチドインサートに対する免疫応答を増強することに有用な可能性がある免疫刺激配列を、混合物に加えることができる。免疫刺激核酸、例えばＣｐＧ配列は、細菌ＤＮＡに対する先天性免疫応答を模倣する短鎖オリゴヌクレオチドである。ＣｐＧは、非メチル化シトシン残基を備える、１つまたは複数のシトシン−リン酸塩−グアニン（ＣｐＧ）ジヌクレオチド含有モチーフを含有している。細菌中では一般的であるが哺乳動物のＤＮＡ中では一般的ではないＤＮＡ含有非メチル化ＣｐＧモチーフは、インビトロおよびインビボの両方で強度のＴＨ１−偏光免疫応答を誘導することが証明されている。単一の理論に限定しようとするものではないが、ＴＨ１応答の誘導は、ＣｐＧを含有する免疫刺激配列（ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド）がマクロファージおよび樹状細胞によるＩＬ−１２およびＩＬ−１８の活性化および分泌を誘導する能力の結果であると考えられる。これらのサイトカインは、次にナチュラルキラー細胞およびＴ細胞によるＩＦＮ−γ産生を誘導するように相乗作用する。さらに、ＣｐＧは、未成熟樹状細胞が抗原応答性天然Ｔ細胞を活性化できるプロフェッショナル抗原提示細胞へ成熟することを引き起こす。ＣｐＧは、さらにまたＢリンパ球が増殖して免疫グロブリン産生を刺激するように直接的に駆動することもできる。【００７０】  １つの実施形態では、再集合させたＶＬＰは、式５’−Ｒ1Ｒ2ＣＧＹ1Ｙ2−３’（配列番号１９）（式中、Ｒ1はプリン（Ｇのために好ましい）であり、Ｒ2はプリンもしくはＴであり、およびＹ1およびＹ2はピリミジンである）に従うパリンドロームヘキサマー内に非メチル化ＣｐＧ配列を含んでいる。１つの実施形態では、ＶＬＰは、５’−ＧＡＣＧＴＣ−３’（配列番号２０）、５’−ＡＧＣＧＣＴ−３’（配列番号２１）、および５’−ＡＡＣＧＴＴ−３’（配列番号２２）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣｐＧ配列を含んでいる。１つの実施形態では、ＶＬＰは、５’  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴ  ３’（配列番号２３）を含むＣｐＧ配列を含んでいる。また別の実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、ＡＡＣＧＴＴＣＧ（配列番号２４）である。【００７１】  生じたウイルス様粒子、または上述したように組換えキャプシド融合ペプチドの混合集団の再集合の後に形成されるケージ構造は、少なくとも混合された集団と同一数の相違する抗原性ペプチドを含有している。例えば、各集団が他の集団中には存在していない少なくとも１つの抗原性ペプチドを含有する組換えキャプシド融合ペプチドの２つの集団が混合されると、生じたウイルス様粒子は少なくとも２つの相違する抗原性ペプチドインサートを含有することができる。【００７２】  本発明のまた別の態様では、少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含有する組換えキャプシド融合ペプチドの個別集団がインビトロで混合されてＶＬＰを形成するが、このとき混合される組換えキャプシド融合ペプチドの各集団は、それが混合される任意の他の組換えキャプシド融合ペプチドとは相違するウイルス由来の少なくと���１つのキャプシドタンパク質を含有する。他の実施形態では、組換えキャプシド融合ペプチドの混合物は、少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含有する少なくとも第１ウイルスキャプシドタンパク質、および少なくとも１つの抗原性ペプチドインサートを含有する第２ウイルスキャプシドタンパク質を含有することができるが、このとき第１ウイルスキャプシドタンパク質のキャプシドタンパク質は、第２ウイルスキャプシドタンパク質のキャプシドタンパク質とは相違するウイルス由来である。他の実施形態では、抗原性ペプチドインサートは、同一または相違するペプチド配列であってよい。さらに追加の実施形態では、抗原性ペプチドインサートは、同一または相違する病原因子由来であってよい。一部の実施形態では、組換えキャプシド融合ペプチドの３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１８、２０、もしくは２０を超える集団が混合されるが、このとき各集団は、それが混合される任意の他の組換えキャプシド融合ペプチド集団中には存在していない引き出されたウイルスキャプシドタンパク質を含有している。本発明の追加の実施形態では、非抗原性ペプチドインサートを含有するキャプシドタンパク質は、上述したように混合物中に含めることができる。さらに、非ウイルス核酸配列、例えばＶＬＰ中に含有される抗原性ペプチドインサートに対する免疫応答を増強することに有用な可能性があるＣｐＧ配列を、混合物に加えることができる。【００７３】  本発明の実施形態は、ペプチドインサート（野生型キャプシドタンパク質）を含有していないキャプシド融合タンパク質もまた上述した混合物に加えることができることを含んでいる。野生型ウイルスキャプシドタンパク質は、任意のウイルスに由来してよいが、それには抗原性ペプチドインサートを含有するキャプシド融合ペプチドを引き出すために使用されるウイルスと同一もしくは相違するウイルスが含まれる。【００７４】  キャプシド融合ペプチドの再集合は、ウイルス様粒子またはケージ構造を生じさせることができる。一部の実施形態では、ＶＬＰもしくはケージ構造は混合キャプシドのマルチマー集合であり、３〜約１，０００個またはそれ以上のキャプシドを含んでいる。他の実施形態では、ＶＬＰもしくはケージ構造は、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも９０、少なくとも１２０個のキャプシド、または少なくとも２００個のキャプシドを含んでいる。また別の実施形態では、各ＶＬＰもしくはケージ構造は、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、または少なくとも１８０個のキャプシドを含んでいる。【００７５】  本発明の実施形態は、ＶＬＰが二十面体構造として再集合させることができることを含んでいる。また別の実施形態は、ＶＬＰはキャプシド配列が由来する天然ウイルスと同一形状に再集合させられる。しかし別個の実施形態では、ＶＬＰは天然ウイルスと同一形状を有していない。一部の実施形態では、例えば、この構造は多数のキャプシドから形成されるが天然型ＶＬＰ構造を形成しない粒子内で形成される。例えば、３個という少数のウイルスキャプシドのケージ構造を形成できる。別個の実施形態では、約６、９、１２、１５���１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、または６０個のキャプシドのケージ構造を形成できる。【００７６】  一部の態様では、本発明は、混合段階で再集合させたＶＬＰに含有される抗原性ペプチドインサートの比率を制御および指令する能力を提供する。ＶＬＰ中に含有される抗原性ペプチドインサートの比率は、集合に先行して混合物に加えられる量を調整できる。この方法で、本発明は、ＶＬＰがインビボで集合させられる場合に達成可能な調節および制御よりも、再集合させられるＶＬＰ内に含有される一部の抗原性ペプチドの量のより厳密な調節および制御を可能にする。そのような制御は、例えば、動物において最初に接種菌として使用される１つの抗原性ペプチド、および抗原性ペプチドが事前に動物において接種菌として使用されているので「ブースター」として使用される第２抗原性ペプチドを含有するＶＬＰを利用するワクチン戦略において有用なことがある。この場合には、例えば「ブースター」抗原性ペプチドは他の抗原性ペプチドより少ない量で存在していてよく、そして本方法を用いると、「ブースター」抗原性ペプチドを含有する組換えキャプシド融合ペプチド集団は、他の抗原性ペプチドインサートを含有する集団より少ない量で混合物に加えられてよい。他の実施形態では、再集合させたＶＬＰ構造のうちの少なくとも１つは、混合物に加えられる各集団由来の少なくとも１つのキャプシド融合ペプチドを含んでいる。追加の実施形態では、再集合させたＶＬＰ構造は、混合物に加えられる各集団由来のほぼ同等比率の各キャプシド融合ペプチドを含んでいる。または、比率は、所望通りに調製できるが、このとき混合物の不均衡な比率が達成される。【００７７】  ウイルス様粒子の集合には、正確に折り畳まれたキャプシドタンパク質を必要とする。しかし、ＶＬＰの調製および安定性のためには、特にｐＨ、イオン強度、ジスルフィド結合、二価カチオン結合を含む重要な追加の因子が存在することがある。例えば、Brady et al, (1977) 「Dissociation of polyoma virus by the chelation of calcium ions found associated with purified virions,」 J. Virol. 23(3):717-724; Gajardo et al, (1997) 「Two proline residues are essential in the calcium binding activity of rotavirus VP7 outer capsid protein,」 J. Virol., 71:2211-2216; Walter et al, (1975) 「Intermolecular disulfide bonds: an important structural feature of the polyoma virus capsid,」 Cold Spring Har. Symp. Quant. Biol., 39:255-257 (1975); Christansen et al, (1977) 「Characterization of components released by alkali disruption of simian virus 40,」 J Virol., 21:1079-1084; Salunke et al, (1986) 「Self-assembly of purified polyomavirus capsid protein VPl,」 Cell 46:895-904; Salunke et al, (1989) 「Polymorphism in the assembly of polyomavirus capsid protein VP,」 Biophys. J., 56:887- 900; Garcea et al, (1983) 「Host range transforming gene of polyoma virus plays a role in virus assembly,」 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:3613-3617; Xi et al, (1991) 「Baculovirus expression of the human papillomavirus type 16 capsid proteins: detection of L1-L2 protein complexes,」 J. Gen. Virol., 72:2981-2988を参照されたい。再集合のために利用できる技術は当技術分野においてよく知られており、実施例において記載する技術が含まれるが、それらに限定されない。【００７８】  キャプシド融合ペプチドの再集合は、ウイルス様粒子またはケージ構造を生じさせ��。他の実施形態では、ＶＬＰもしくはケージ構造は混合キャプシド融合ペプチドのマルチマー集合であり、３〜約１，０００個またはそれ以上のキャプシドを含んでいる。追加の実施形態では、ＶＬＰもしくはケージ構造は、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも９０、少なくとも１２０のキャプシド、または少なくとも２００個のキャプシドを含んでいる。また別の実施形態では、各ＶＬＰもしくはケージ構造は、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、または少なくとも１８０個のキャプシドを含んでいる。【００７９】  本発明の実施形態は、ＶＬＰが二十面体構造として再集合させられることを含んでいる。他の実施形態では、ＶＬＰはキャプシド配列が由来する天然ウイルスと同一形状に再集合させられてよい。追加の実施形態では、ＶＬＰは天然ウイルスと同一形状を有していない。一部の実施形態では、例えば、この構造は多数のキャプシドから形成されるが天然型ＶＬＰ構造を形成しない粒子内で形成される。例えば、３個という少数のウイルスキャプシドのケージ構造を形成できる。別個の実施形態では、約６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、または６０個のキャプシドのケージ構造を形成できる。【００８０】ＶＩＩ．ワクチン接種  本発明の一部の態様では、再集合させた多価ＶＬＰは、動物またはヒトにおいて免疫応答を誘導するための戦略において利用できる。本発明の実施形態は、キャプシド融合ペプチドに利用されるウイルスキャプシドタンパク質がＣＣＭＶウイルスに由来することを含んでいる。一部の実施形態では、ＶＬＰに含有される抗原性インサートには、炭疽菌（Bacillus anthracis）由来の「保護抗原」、または東部ウマ脳炎（Eastern Equine Encephalitis）のＥ２グリコプロテインが含まれる。【００８１】  一般に、免疫応答を誘導するために十分である有効量のＶＬＰが動物またはヒトに投与される。そのような応答を誘導するために投与される量は、当技術分野において一般に知られている技術によって決定できる。一部の実施形態では、投与されるＶＬＰの量は、有益には個別の動物またはヒトにつき１０〜５００μｇである。投与されるＶＬＰの量は、投与経路および個体の体重の関数として変動してよい。【００８２】  ＶＬＰを含有するワクチンは、医薬上許容される担体を介して投与されてよい。医薬上許容される担体は、医薬品を調製する際に有用である、当業者に知られている任意の生理学的担体であってよい。一部の実施形態では、医薬担体は液体であってよく、ＶＬＰを含有するワクチンは液剤の形状であろう。さらに別の実施形態では、医薬担体はゲルであり、ＶＬＰを含有するワクチンは、坐剤もしくはクリーム剤の形状にある。さらにまた別の実施形態では、ＶＬＰを含有するワクチンは、医薬上許容される経皮パッチの一部として調製されてよい。【００８３】  液体担体は、液剤、懸濁剤、エマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤および加圧組成物を調製する際に使用される。ＶＬＰは、医薬上許容される液体担体、例えば水、有機溶媒、両方の混合物または医薬上許容される油もしくは脂肪中に懸濁させることができる。液体担体は��他の適切な医薬添加物、例えば可溶化剤、乳化剤、バッファー、保存料、甘味料、フレーバー剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、粘度調節剤、安定剤または浸透圧調節剤を含有していてよい。経口および非経口投与のために適合する液体担体の例には、水（部分的に上述のような添加物、例えばセルロース誘導体、カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を含有する）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコール）およびそれらの誘導体、ならびに油（例えば、分画されたヤシ油およびラッカセイ油）が含まれる。非経口投与のためには、担体はさらにまた油性エステル、例えばエチルオレエートおよびイソプロピルミリステートであってよい。無菌液体担体は、非経口投与のための無菌液体形組成物において有用である。加圧組成物のための液体担体は、ハロゲン添加炭水化物または他の医薬上許容される噴射剤であってよい。一般に、液体担体は再集合させたＶＬＰの折り畳みを妨害しない。【００８４】  ＶＬＰを含有するワクチンは、当技術分野において現在利用されている、例えば経口、経粘膜、静脈内、筋肉内、気管内、硬膜外、腹腔内または皮下を含む任意の技術を用いて投与することができる。一部の実施形態では、ＶＬＰは鼻もしくは口を通して経粘膜的に送達される。他の実施形態では、再集合されたＶＬＰはＣＣＭＶ由来のキャプシドタンパク質から構成され、経粘膜的に送達される。  （実施例）【００８５】  これらの実施例では、ササゲクロロティックモットルウイルス（ＣＣＭＶ）がペプチド担体として使用されており、シュードモナス・フルオレッセンスが発現宿主として使用されている。ＣＣＭＶは、ブロモウイルス属のブロモウイルス群のメンバーである。ブロモウイルスは、２５〜２８ｎｍ径の二十面体ウイルスであり、４成分からなるプラス鎖の一本鎖ＲＮＡゲノムを備える。ＲＮＡ１およびＲＮＡ２はレプリカーゼ酵素をコードする。ＲＮＡ３は、植物宿主内のウイルス移動に関係するタンパク質をコードする。ＲＮＡ４（ＲＮＡ３に由来するサブゲノムＲＮＡ）、すなわちｓｇＲＮＡ４は、２０ｋＤａのキャプシドタンパク質（ＣＰ）（配列番号１）をコードする。【表１】
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【００８６】  各ＣＣＭＶ粒子は、約１８０コピーまでのＣＣＭＶ  ＣＰを含有する。ＣＣＭＶ  ＣＰをコードする典型的なＤＮＡ配列は配列番号２に示されている。【表２】
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【００８７】  ＣＣＭＶの結晶構造は解明されている。この構造は、粒子の安定性および力学に極めて重要であると思われるコートタンパク質相互作用のより明確な像を提供し、挿入部位の合理的設計を誘導することに役立ってきた。以前に行なわれた試験は、ＣＣＭＶコートタンパク質は、異質なペプチドが粒子を形成する能力を妨害せずにそれらを有するように遺伝子組換えできることを証明している。多数の適切な挿入部位が同定されている。【００８８】  ＣＣＭＶ  ＣＰ内の単一挿入部位が使用された場合に、総計約１８０コピーまでの異質なペプチドユニット（個別ペプチドであってもコンカテマーであっても）をＣＣＭＶ粒子内に挿入できると考えられる。現在までにＣＣＭＶ  ＣＰ内で同定された挿入部位は、様々な長さのペプチドに適応できる。さらに、ペプチドのマルチマー形を挿入部位に挿入できる。さらに、多重挿入部位は、同一粒子内／上で同一もしくは相違するペプチドを発現させるために同時に使用できる。ペプチドインサートは、長さが約２００アミノ酸残基以下、より典型的には約１８０まで、いっそうより典型的には約１５０まで、さらにより典型的には約１２０まで、およびなおより典型的には長さが約１００アミノ酸残基までであってよい。一部の実施形態では、ペプチドインサートは、長さが約５アミノ酸残基またはそれ以上であってよい。他の実施形態では、ペプチドインサートは、長さが約５〜約２００、約５〜約１５０、約５〜約１２０、より典型的には約５〜約１００アミノ酸残基であってよい。【００８９】材料および方法  他に特に言及しない限り、分子生物学の分野において知られている標準の技術、ベクター、制御配列エレメントおよびその他の発現系エレメントを、核酸操作、形質転換、および発現のために使用する。そのような標準技術、ベクター、およびエレメントは、例えば、Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (1995) (John Wiley & Sons); Sambrook, Fritsch, & Maniatis (eds.), Molecular Cloning (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY); Berger & Kimmel, Methods in Enzymology 152: Guide to Molecular Cloning Techniques (1987) (Academic Press); and Bukhari et al. (eds.), DNA Insertion Elements, Plasmids and Episomes (1977) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)の中に見いだすことができる。【００９０】プラスミドマップの構築  すべてのプラスミドマップは、ＶＥＣＴＯＲＮＴＩ（ＩｎｆｏｒＭａｘ  Ｉｎｃ．、米国メリーランド州フレデリック）を用いて構築した。【００９１】ＤＮＡの抽出  大腸菌からの全プラスミドＤＮＡ抽出は、Ｑｉａｇｅｎ社（ドイツ）製のミニ、ミディ、およびマキシキットを製造業者の取扱書にしたがって使用して実施した。【００９２】実験戦略  以下の手順に従った。Ｐ．フルオレッセンス宿主細胞は、キメラウイルスコートタンパク質−標的ペプチドインサート融合をコードする発現プラスミドを用いて形質転換させた。形質転換した細胞を所望の密度へ増殖させ、キメラウイルスコートタンパク質−ペプチド融合を発現するように誘導した。次に細胞を溶解させ、それらの含量を分析した。
【実施例１】
【００９３】ペプチドの合成およびＣＣＭＶ  ＣＰ内へのクローニング１．Ａ．保護抗原のクローニング  ４種の相違する炭疽菌保護抗原（「ＰＡ」）ペプチド（ＰＡ１〜ＰＡ４）を独立してＣＣＭＶ  ＶＬＰ内で発現させた。ＰＡ１〜ＰＡ４をコードする核酸は、合成オリゴヌクレオチドのＳＯＥ（オーバーラップ伸長によるスプライシング）によって合成した。インサートの各々は、以下で詳述するサーモサイクリングプログラムを用いてオーバーラッピングＤＮＡオリゴによって合成した：【表３】
2009501001.tif 000004
【００９４】  生じた核酸は、ＢａｍＨＩ認識部位末端を含有していた。これらのＰＡペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびアミノ酸配列は、各々以下のとおりであった：１）ＰＡ１については配列番号３および４；２）ＰＡ２については配列番号５および６；３）ＰＡ３については配列番号７および８；ならびに４）ＰＡ４については配列番号９および１０。生じた核酸は、シャトルベクター内へクローニングするための付着末端を作製するためにＢａｍＨＩを用いて消化した。生じたＰＡインサートの１つ１つをＣＣＭＶ  １２９  ＣＤＳのＢａｍＨＩ部位でｐＥＳＣ−ＣＣＭＶ１２９  ＢａｍＨＩシャトルプラスミド内へクローニングした。生じた各シャトルプラスミドはＳｐｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を用いて消化した。所望のキメラＣＣＭＶ  １２９−ＰＡをコードする各フラグメントは、ゲル精製によって単離した。【表４】
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【００９５】  生じたキメラＣＣＭＶ  １２９−ＰＡポリヌクレオチドは、各々ｔａｃプロモーターに機能的に連結しているブイブイコーディング配列の代わりにｐＭＹＣ１８０３発現プラスミド内に挿入した。生じた発現プラスミドは、インサートの存在についてＳｐｅＩおよびＸｈｏＩを用いた制限消化によってスクリーニングした。【００９６】１．Ｂ．東部ウマ脳炎のＥ２グリコプロテイン  ２種の相違するＥＥＥペプチド（ＥＥＥ−１−２５およびＥＥＥ−２３８−２６２）を独立して、東部ウマ脳炎ウイルスのＥ２グリコプロテインの２５ＡＡペプチドを提示しているＣＣＭＶ  ＶＬＰ内で発現させた。ＥＥＥ−１−２５ペプチド配列：ＤＬＤＴＨＦＴＱＹＫＬＡＲＰＹＩＡＤＣＰＮＣＧＨＳ（配列番号１１）ＥＥＥ−１−２５核酸配列：５’−ｇａｃｃｔｇｇａｃａｃｃｃａｃｔｔｃａｃｃｃａｇｔａｃａａｇｃｔｇｇｃｃｃｇｃｃｃｇｔａｃａｔｃｇｃｃｇａｃｔｇｃｃｃｇａａｃｔｇｃｇｇｃｃａｃａｇｃ−３’（配列番号１２）ＥＥＥ−２３８−２６２ペプチド配列：ＧＲＬＰＲＧＥＧＤＴＦＫＧＫＬＨＶＰＦＶＰＶＫＡＫ（配列番号１３）ＥＥＥ−２３８−２６２核酸配列：５’ｇｇｃｃｇｃｃｔｇｃｃｇｃｇｃｇｇｃｇａａｇｇｃｇａｃａｃｃｔｔｃａａｇｇｇｃａａｇｃｔｇｃａｃｇｔｇｃｃｇｔｔｃｇｔｇｃｃｇｇｔｇａａｇｇｃｃａａｇ−３’（配列番号１４）【００９７】  ＥＥＥ−１−２５およびＥＥＥ−２３８−２６２をコードする核酸は、合成オリゴヌクレオチドのＳＯＥによって合成した。生じた核酸は、ＢａｍＨＩ認識部位末端を含有していた。インサートを合成するためのセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーは、ＢａｍＨＩ制限部位を含んでおり、以下のとおりであった：ＥＥＥ１．Ｓ：５’−ｃｇｇ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ｔｇｇ  ａｃｃ  ｔｇｇ  ａｃａ  ｃｃｃ  ａｃｔ  ｔｃａ  ｃｃｃ  ａｇｔ  ａｃａ  ａｇｃ  ｔｇｇ  ｃｃｃ  ｇｃｃ  ｃｇｔ  ａｃ−３’（配列番号１５）ＥＥＥｌ．ＡＳ：５’−ｃｇｃ  ａｇｇ  ａｔｃ  ｃｃｇ  ｃｔｇ  ｔｇｇ  ｃｃｇ  ｃａｇ  ｔｔｃ  ｇｇｇ  ｃａｇ  ｔｃｇ  ｇｃｇ  ａｔｇ  ｔａｃ  ｇｇｇ  ｃｇｇ  ｇｃｃ  ａｇｃ−３’（配列番号１６）ＥＥＥ２．Ｓ：５’−ｃｇｇ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ｔｇｇ  ｇｃｃ  ｇｃｃ  ｔｇｃ  ｃｇｃ  ｇｃｇ  ｇｃｇ  ａａｇ  ｇｃｇ  ａｃａ  ｃｃｔ  ｔｃａ  ａｇｇ  ｇｃａ  ａｇｃ−３’（配列番号１７）ＥＥＥ２．ＡＳ：５’−ｃｇｃ  ａｇｇ  ａｔｃ  ｃｃｃ  ｔｔｇ  ｇｃｃ  ｔｔｃ  ａｃｃ  ｇｇｃ  ａｃｇ  ａａｃ  ｇｇｃ  ａｃｇ  ｔｇｃ  ａｇｃ  ｔｔｇ  ｃｃｃ  ｔｔｇ−３’（配列番号１８）【００９８】  生じた核酸は、ｐＥＳＣ−ＣＣＭＶ１２９  ＢａｍＨＩシャトルプラスミド内へクローニングするための付着末端を作製するために、ＢａｍΗＩを用いて消化した。【００９９】  生じたＥＥＥインサートの１つ１つを、ＣＣＭＶ  １２９  ＣＤＳのＢａｍＨＩ部位でｐＥＳＣ−ＣＣＭＶ１２９  ＢａｍＨＩシャトルプラスミド内へクローニングした。生じた各シャトルプラスミドはＳｐｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を用いて消化した。所望のキメラＣＣＭＶ  １２９−ＥＥＥをコードする各フラグメントは、ゲル精製によって単離した。【０１００】  生じたキメラＣＣＭＶ  １２９−ＥＥＥポリヌ���レオチドフラグメントは、各々ｔａｃプロモーターに機能的に結合しているブイブイコーディング配列の代わりに、ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩを用いて制限されたｐＭＹＣ１８０３発現プラスミド内に挿入した。生じた発現プラスミドは、インサートの存在についてＳｐｅＩおよびＸｈｏＩを用いた制限消化によってスクリーニングした。
【実施例２】
【０１０１】組換えＣＣＭＶキャプシド融合ペプチドの発現  ＣＣＭＶ１２９融合ペプチド発現プラスミドを、以下のプロトコールにしたがってシュードモナス・フルオレッセンスＭＢ２１４宿主細胞内に形質転換させた。宿主細胞は、氷上に保持したバイアル内で徐々に解凍させた。各形質転換のために、１μＬの精製した発現プラスミドＤＮＡを宿主細胞に加え、生じた混合物を混合するためにピペットを使用して静かに回転させ、次に氷上で３０分間インキュベートした。この混合物をエレクトロポレーション用のディスポーザブルキュベット（ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ、０．２  ｃｍ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｇａｐ、製品番号１６５−２０８６）に移した。キュベットは、２００Ω、２５μファラッド、２．２５ｋＶに設定したＢｉｏｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ内に配置した。細胞に短時間（約１〜２秒間）パルスした。次に低温ＬＢ培地を直ちに加え、生じた懸濁液を３０℃で２時間インキュベートした。次に細胞をＬＢ  ｔｅｔ１５（テトラサイクリンを補給したＬＢ培地）アガロース上でプレーティングし、３０℃で一晩増殖させた。【０１０２】  各プレートから１コロニーを収穫し、収穫したサンプルはバッフル付き攪拌フラスコ内の５０ｍL ＬＢ種培養中に接種した。液体懸濁培地を２５０ｒｐｍで攪拌しながら３０℃で一晩増殖させた。生じた各種培養１０ｍＬを次に使用して、１Ｌのバッフル付き攪拌フラスコ内に２００ｍＬの攪拌フラスコ培地（すなわち、酵母抽出物ならびに微量元素、ナトリウムシトレート、およびグリセロールを含む塩、ｐＨ６．８）を接種した。選択のためにテトラサイクリンを加えた。接種した培養を２５０ｒｐｍで攪拌しながら３０℃で一晩増殖させ、ＣＣＭＶ１２９融合ペプチドキメラコートタンパク質を発現させるためにＩＰＴＧを用いて誘導した。各攪拌フラスコ培養からの１ｍＬのアリコートを遠心して細胞をペレット化した。細胞ペレットは、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する０．７５ｍＬの低温５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）中に再懸濁させた。次に０．１％量の１０％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００界面活性剤を加え、さらに最終濃度が０．２ｍｇ／ｍＬとなるようにリゾチームを加えた。細胞を氷上で２時間インキュベートすると、透明で粘性の細胞溶解液が出現するはずである。【０１０３】  この溶解液に、１／２００量の１Ｍ ＭｇＣｌ2を加え、次に１／２００量の２ｍｇ／ｍＬ ＤＮＡｓｅＩを加え、次に氷上で１時間にわたりインキュベートすると、溶解液ははるかに低粘性の液体となるはずである。処理した溶解液を次に卓上用遠心分離器の最高速度で３０分間、４℃で回転させ、上清を清潔な試験管内にデカンテーションした。デカンテーションされた上清は「可溶性」タンパク質分画である。残留しているペレットは次に０．７５ｍＬのＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁された。再懸濁されたペレットは「不溶性」分画である。【０１０４】  これらの「可溶性」および「不溶性」分画を次に、１．０ｍｍ×１５ウエルを有するＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、製品番号ＮＰ０３２３）上で製造業者の取扱説明書に��たがって電気泳動法にかけた。５μＬの各分画を５μＬの２Ｘ還元用ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーと結合し、ゲル上でランさせる前に５分間沸騰させた。ゲルはＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、製品番号ＬＣ６０６０）を用いて染色し、水を用いて一晩脱染色した。ウェスタンブロット検出には、ＣＣＭＶ  ＩｇＧ（アクセッション番号ＡＳ００１１、ドイツ国ＤＳＭＺ由来）およびＷＥＳＴＥＲＮ  ＢＲＥＥＺＥキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、製品番号ＷＢ７１０５）を、製造業者のプロトコールにしたがって使用した。【０１０５】  図１は、不溶性分画内でＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ３、およびＰＡ４ペプチドインサートを発現するように遺伝子操作された、組換えＣＣＭＶキャプシドタンパク質の発現を示している。組換えキャプシド融合ペプチドは矢印で指示した。図２は、可溶性分画内でＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ３、およびＰＡ４ペプチドインサートを発現するように遺伝子操作された組換えＣＣＭＶ融合ペプチドの発現を示している。
【実施例３】
【０１０６】ＶＬＰの再集合３．Ａ．ＲＮＡを用いないＶＬＰの再集合：  ウイルス様粒子を集合させるために、組換えキャプシド融合ペプチドを発現するシュードモナス・フルオレッセンス宿主細胞の５０ｍＬ培養をフレンチプレスにかけ、可溶性および不溶性分画を遠心によって分離した。不溶性封入体は２回洗浄した。可溶性および不溶性分画からのサンプルを採取して−８０℃で保存した。不溶性分画は、８Ｍウレアを含有する４℃のバッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ）中で一晩再懸濁させた。８Ｍウレア溶液を最終濃度が２．０ＭウレアとなるようにバッファーＢを用いて０．２５Ｍの増分で希釈した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を最終濃度が０．０３３％となるまで加え、この溶液を氷上で１０分間インキュベートした。ウレアを完全に除去するまで一晩かけて上清をバッファーＢに対して透析した（バッファーを３回交換）。上清を２７，０００×ｇで３０分間遠心した。【０１０７】  組換えＣＣＭＶキャプシド融合ペプチドの最終収率を決定するために、上清は、溶液中のキャプシド融合タンパク質の量を定量するための遊離キャプシドタンパク質についての減衰係数１．２０を用いて、２８０ｎｍの吸光度によって分析した。【０１０８】  １０μＭのキャプシド融合ペプチド溶液を４℃で２時間にわたり、空集合バッファー（５０ｍＭアセテートナトリウム、ｐＨ５．２、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ)に対してバッファーＢ（４ｍＬにつき１ｍｇのキャプシド融合ペプチドを使用する）中で透析した。集合した粒子は、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１００マイクロ濃縮器を使用して空集合バッファーを用いて洗浄した。集合させたＶＬＰを含有するサンプル濃縮水は、ＶＬＰ収率を決定するために２８０ｎｍの吸光度によって測定した。サンプルの一部分はＶＬＰ集合を決定するためにスクロース密度勾配上に装填し、残りの部分はウイルスバッファー（０．１Ｍアセテートナトリウム、ｐＨ５．２）中で濃縮させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でランした。【０１０９】３．Ｂ．ＲＮＡを用いたＶＬＰ集合：  ウイルス様粒子を集合させるために、組換えキャプシド融合ペプチドを発現するシュードモナス・フルオレッセンス宿主細胞の５０ｍＬ培養をフレンチプレスにかけ、可溶性および不溶性分画を遠心によって分離した。不溶性封入体は２回洗浄した。可溶性および不溶性分画からのサンプルを採取して−８０℃で保存した。不溶性分画は、８Ｍウレアを含有する４℃のバッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ）中で一晩再懸濁させた。８Ｍウレア溶液を最終濃度が２．０ＭウレアとなるようにバッファーＢを用いて０．２５Ｍの増分で希釈した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を最終濃度が０．０３３％となるまで加え、この溶液を氷上で１０分間インキュベートした。上清を２７，０００×ｇで３０分間遠心した。ウレアを完全に除去するまで一晩かけて上清をバッファーＢに対して透析した（バッファーを３回交換）。【０１１０】  組換えＣＣＭＶキャプシド融合ペプチドの最終収率を決定するために、上清は、溶液中のキャプシド融合タンパク質の量を定量するための遊離キャプシドタンパク質に���いての減衰係数１．２０を用いて、２８０ｎｍの吸光度によって分析した。集合のためには５：１の重量対重量のキャプシド融合ペプチド対ＣＣＭＶ ＲＮＡ比を使用した。ＲＮＡの起源は、インビトロ転写させたＣＣＭＶ ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３、またはサブゲノムＲＮＡ４もしくはそれらの任意の部分であった。または、ＣＣＭＶに感染した植物から単離したＣＣＭＶウイルスＲＮＡ、またはインビトロもしくはインビボで産生したブロモモザイクウイルスＲＮＡを使用できる。または、有機物、例えば植物もしくはシュードモナス・フルオレッセンスから単離したランダムｍＲＮＡを使用できる。キャプシド融合ペプチドの濃度は１０μＭ（４ｍＬ中で１ｍｇ）であった。１０μＭのキャプシド融合ペプチドおよびＲＮＡ溶液は、４℃で２〜１２時間にわたり集合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＤＴＴ）に対して透析した。生じた集合した粒子は、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１００マイクロ濃縮器を使用して集合バッファーを用いて洗浄した。サンプル濃縮水の一部分を採取し、ＶＬＰ収率を決定するために２８０ｎｍの吸光度によって測定した。濃縮水の一部分はＶＬＰ集合を決定するためにスクロース密度勾配上に装填し、残りの部分はウイルスバッファー（０．１Ｍアセテートナトリウム、ｐＨ５．２）中で濃縮させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でランした。【０１１１】  図３は、スクロース密度勾配法でＲＮＡを用いた、および用いないＣＣＭＶ−ＰＡ３ ＶＬＰの分離を示している。図４は、スクロース密度勾配から単離されたＲＮＡを用いた、および用いないＣＣＭＶ−ＰＡ１およびＣＣＭＶ−ＰＡ２ ＶＬＰバンドのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。図５は、ＲＮＡの不在下でＣＣＭＶ−ＰＡ４キャプシド融合ペプチドから再集合させたＶＬＰの電子顕微鏡写真である。
【実施例４】
【０１１２】多数の組換えＣＣＭＶキャプシド融合ペプチドを含有するＶＬＰの再集合。  同一もしくは相違する病原体（実施例１に記載したとおり）からの抗原性ペプチドを含有する組換えＣＣＭＶキャプシド融合ペプチドは、シュードモナス・フルオレッセンス中で封入体として製造できる。封入体は単離し、様々な組換えＣＣＭＶキャプシド融合ペプチドを溶解させ、実施例３に記載したように再折り畳みさせることができる。同一もしくは相違する病原因子由来の抗原性インサートを含有するＣＣＭＶキャプシド融合ペプチドの様々な組み合わせは、集合の前に様々な比率で混合できる。再集合反応は、実施例３に記載したようにＲＮＡの存在下もしくは不在下で実施できる。生じた多価ＶＬＰは、様々な抗原性インサートを含有する組換えＣＣＭＶキャプシド融合ペプチドの多数の集団を含有している。抗原性ペプチドの比率は、集合反応の前に混合物に加えられる様々な抗原性ペプチドインサートを含有する、組換えＣＣＭＶキャプシド融合ペプチドの各集団の量を調節することによって調節できる。図６は、保護抗原−３（「ＰＡ−３」）およびＰＡ−４抗原性ペプチドを含有する個別の組換えＣＣＭＶキャプシド融合ペプチドから構成される多価ＶＬＰの発現および再集合を示した図である。
【実施例５】
【０１１３】植物中でのＣＣＭＶウイルス粒子の産生、植物で産生したＣＣＭＶウイルス粒子の分解、および植物ＣＣＭＶキャプシドタンパク質のＶＬＰへの再集合。  植物中でのＣＣＭＶウイルス粒子の産生：ＣＣＭＶ ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、およびＲＮＡ３のカクテルミックスを使用してササゲ植物を感染させた。ササゲ種子であるＣｏｗｐｅａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｂｌａｃｋｅｙｅ（＃５）種子（Ｆｅｒｒｙ−Ｍｏｒｓｅ  Ｓｅｅｄ社、ケンタッキー州）を発芽させ、Ｍｉｒａｃｌｅ−Ｇｒｏ培養土ミックス（Ｍｉｒａｃｌｅ−Ｇｒｏ  Ｌａｗｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、オハイオ州）を備える６インチポットに移植した。ササゲ植物は双葉段階（発芽後ほぼ第７日）で感染させた。少量のカーボランダム粉末４００グリット（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、製品番号409-21-2）を各植物の１枚の葉に塗布した。ＲＮＡカクテルミックスをカーボランダム層上に塗布した。手袋をはめた指で静かにこすることで葉を擦過した。感染は、接種後第７〜１４日に確立した。葉の組織を採取し、その後の処理時まで−８０℃で冷凍した。葉の組織をウイルスバッファー（０．２Ｍ アセテートナトリウム（ｐＨ５．２）；１０ｍＭ ＥＤＴＡ.０）中で混合することによって破壊した。生じたホモジネートを３層のチーズ・クロスに通して圧搾し、次に４℃で１５分間、１５，０００×Ｇで遠心した。生じた上清を取り除いた。各上清にＰＥＧ８０００を最終濃度が１０％となるまで加え、この溶液を氷上で１時間、または４℃で一晩インキュベートした。次に、この溶液を４℃で１０分間、１５，０００×Ｇで遠心した。沈降したペレットを初期上清の１／１０量のウイルスバッファー中に再懸濁させ、再懸濁したサンプルを４℃で１０分間、１５，０００×Ｇで遠心した。上清を回収し、第２ラウンドのＰＥＧ沈降法にかけた。ＰＥＧ８０００を最終濃度が１５％となるまで加え、４℃で２時間攪拌した。この溶液を次に１０分間にわたり１５，０００×Ｇで遠心し、ペレットを少量のウイルスバッファー中に再懸濁させた。再懸濁したＶＬＰ溶液は、３００Ｋの分子量カットオフ値を備えるＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−２０上に装填し、４，０００×Ｇで５分間回転させた。【０１１４】  濃縮したＶＬＰサンプルを、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびポリクローナル抗ＣＣＭＶ抗体を用いるウェスタンブロッティングによって分析した。または、ウイルス粒子をスクロース密度勾配で精製した。精製したウイルス粒子は、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）−ＨＰＬＣによって分析した（図８）。【０１１５】  植物生成ＣＣＭＶウイルス粒子の分解：精製したＣＣＭＶは、４℃で１６〜２９時間にわたりバッファーＡ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ）に対する透析によって分解した。分解したウイルスは、ウイルスＲＮＡをペレット化するために４℃で１５分間にわたり１４，０００ｒｐｍで遠心した。残っている上清は、４℃で２時間にわたりバッファーＢ（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ）に対して透析した。ＣＣＭＶはキャプシドタンパク質ダイマーに分解したので、これ���さらにＦＰＬＣ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２サイズ排除クロマトグラフィによって精製した。分解したＣＣＭＶは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した（図８）。【０１１６】  ＣＣＭＶ  ＶＬＰの集合：ＣＣＭＶ  ＶＬＰは、４℃で低塩集合バッファー（１００ｍＭアセテートナトリウム（ｐＨ４．８）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ）に対して、精製したダイマーを一晩透析することによって集合された。再集合したＣＣＭＶ  ＶＬＰは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した（図８）。
【実施例６】
【０１１７】様々な有機体中で産生したＶＬＰの分解および再集合  同一もしくは相違する病原因子由来の様々な抗原性インサートを含有する、事前にインビトロもしくはインビボで集合されたＣＣＭＶ粒子は、植物および／またはシュードモナス・フルオレッセンス中で個別に産生させることができる。集合させたＶＬＰ粒子は、インビトロで単離して分解することができる。同一もしくは相違する病原因子由来の抗原性ペプチドを含有する、生じたＣＣＭＶキャプシド融合ペプチドは、規定の比率で混合し、引き続いて実施例３に記載したようにＲＮＡの存在下または不在下で再集合されることができる。生じた多価ＶＬＰは、個別の組換えＣＣＭＶキャプシド融合ペプチドから構成され、多数のインサートを含有している。抗原性ペプチドの比率は、集合反応の前に混合物に加えられる様々な抗原性ペプチドインサートを含有する組換えＣＣＭＶキャプシド融合ペプチドの各集団の量を調節することによって調節できる。野生型キャプシドタンパク質もまた、集合に先立って再集合混合物に加えることができる。
【実施例７】
【０１１８】ＣｐＧの存在下でのＶＬＰの再集合。  集合反応は、図７に示したようにＣｐＧの存在下で実施できる。生じた多価ＶＬＰは、個別の組換えＣＣＭＶキャプシド融合ペプチドから構成され、多数のインサートを含有しており、さらにＣｐＧを粒子の内側に封入する。ＣｐＧは、粘膜アジュバントとして作用し、共投与された抗原に対するＴｈ１免疫応答を誘導できる。ＶＬＰとともにＣｐＧ配列を封入する工程の長所には、低用量要件、ＣｐＧ共投与に結び付いた副作用の減少、およびＣｐＧおよびＶＬＰの安定性の増加が含まれ得る。図７は、集合反応中のＶＬＰ内へのＣｐＧのパッケージングを示している。植物生成ＣＣＭＶは、実施例５に記載したように分解した。バッファーＢ中の分解したＣＣＭＶダイマー（０．５ｍｇ／ｍＬ）をＣｐＧオリゴヌクレオチド（１２０ｎｍｏｌ／ｍＬ）と混合した。標準オリゴヌクレオチドおよびＤＮａｓｅ保護主鎖を備えるオリゴヌクレオチドの両方を使用した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、アイオワ州コーラルビル）。ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、５’  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴ  ３’（配列番号２３）であった。この溶液は、実施例３Ｂに記載したように４℃で２〜１２時間にわたり集合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＤＴＴ）に対して透析した。生じた集合した粒子は、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１００マイクロ濃縮器を使用して集合バッファーを用いて洗浄し、さらにバッファーをウイルスバッファー（０．１Ｍ アセテートナトリウム（ｐＨ５．２）に交換した。サンプルは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ上でランした（図９）。結果は、標準オリゴヌクレオチドの存在下およびＤＮａｓｅ保護主鎖を備えるオリゴヌクレオチドの存在下のどちらにおいても、ダイマーがＶＬＰに集合することを示した。これらのサンプルをさらに０．８％〜１．２％アガロースゲル上で分析した。ＣｐＧオリゴヌクレオチドの存在を検出するためにアガロースゲルをＥｔＢｒによって、および続いてＣＣＭＶ  ＣＰの存在を検出するためにタンパク質染色によって染色した（図１０）。これらの結果は、再集合されたＶＬＰが粒子の内側へＣｐＧを封入することを確証した。レーン１は分子量マーカー、レーン２は封入された標準ＣｐＧを含むＣＣＭＶ  ＶＬＰサンプル、およびレーン３はＤＮａｓｅ保護主鎖を含有する封入されたＣｐＧを含むＣＣＭＶ  ＶＬＰサンプルを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】不溶性分画内でＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ３、およびＰＡ４ペプチドインサートを発現するように組み換えられたＣＣＭＶキャプシド融合ペプチドを用いた、シュードモナス・フルオレッセンスＭＢ２１４宿主細胞由来の不溶性タンパク質分画のウェスタンブロットを示した図である。細胞は、０、１２および４４時間で溶解させた。キメラキャプシド融合ペプチドは矢印で指示した。
【図２】可溶性分画内でＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ３、およびＰＡ４ペプチドインサートを発現するように組み換えられたＣＣＭＶキャプシド融合ペプチドを用いた、シュードモナス・フルオレッセンスＭＢ２１４宿主細胞由来の可溶性タンパク質分画のウェスタンブロットを示した図である。細胞は、０、１２および４４時間で溶解させた。
【図３】ＲＮＡを用いた、および用いないＣＣＭＶ−ＰＡ３  ＶＬＰの分離を示しているスクロース密度勾配の図である。
【図４】スクロース密度勾配から単離されたＲＮＡを用いた、および用いないＣＣＭＶ−ＰＡ１およびＣＣＭＶ−ＰＡ２  ＶＬＰバンドのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの図である。
【図５】ＲＮＡの不在下でＣＣＭＶ−ＰＡ４から再集合させたＶＬＰの電子顕微鏡写真である。
【図６】複数の保護抗原（「ＰＡ」）エピトープを含有する多価ＶＬＰの発現および再集合の図である。
【図７】集合反応中のＶＬＰ内へのＣｐＧのパッケージングを例示している図である。
【図８Ａ】ＶＬＰの製造段階のＨＰＬＣ分析である。植物生成ＣＣＭＶウイルス粒子のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を例示している。
【図８Ｂ】ＶＬＰの製造段階のＨＰＬＣ分析である。植物生成ＣＣＭＶウイルス粒子のダイマーへの分解を例示している。
【図８Ｃ】ＶＬＰの製造段階のＨＰＬＣ分析である。単離されたＣＣＭＶダイマーのＶＬＰへの再集合を示している。
【図９】封入されたＣｐＧオリゴヌクレオチドを含有する、精製されて分解されたＣＣＭＶダイマーおよび再集合したＣＣＭＶ  ＶＬＰのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析である。
【図１０】封入された標準ＣｐＧオリゴヌクレオチドもしくは保護された主鎖を備えるＣｐＧを含有するＣＣＭＶ  ＶＬＰのＥｔＢｒ（上）およびタンパク質染色（下）で染色した１．２％アガロースゲルの図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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