(57)【要約】  微粒子効果剤を体表面に適用するための方法が提供される。本方法では、ポリマーでコートされた微粒子効果剤が用いられる。ポリマーでコートされた効果剤は、ポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物の存在下で、毛髪または皮膚などの体表面に適用される。適用におけるポリマー結合ペプチドの存在は、コートされた微粒子効果剤の体表面上での結合寿命を延ばすのに役立つ。
2009508870.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ポリマーでコートされた微粒子効果剤を提供し、
ｂ）ポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物を提供し、そして
ｃ）（ａ）のコートされた微粒子効果剤を、（ｂ）の組成物とともに、体表面に、コートされた効果剤が体表面に結合するのに十分な時間適用する
ことを含んでなる微粒子効果剤を体表面に適用するための方法。
【請求項２】
体表面が毛髪および皮膚よりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
微粒子効果剤が、有機色素、無機色素、金属酸化物、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子、有機ナノ粒子、無機ナノ粒子、およびポリマーナノ粒子よりなる群から選択される材料を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
微粒子効果剤が、Ｄ＆ＣレッドＮｏ．３６、Ｄ＆ＣレッドＮｏ．３０、Ｄ＆ＣオレンジＮｏ．１７、グリーン３レーキ、Ｅｘｔ．イエロー７レーキ、オレンジ４レーキ、レッド２８レーキ；Ｄ＆ＣレッドＮｏ．７、１１、３１および３４のカルシウムレーキ、Ｄ＆ＣレッドＮｏ．１２のバリウムレーキ、ストロンチウムレーキＤ＆ＣレッドＮｏ．１３、ＦＤ＆ＣイエローＮｏ．５のアルミニウムレーキ、ＦＤ＆ＣイエローＮｏ．６のアルミニウムレーキ、ＦＤ＆ＣＮｏ．４０のアルミニウムレーキ、Ｄ＆ＣレッドＮｏ．２１、２２、２７、および２８のアルミニウムレーキ、ＦＤ＆ＣブルーＮｏ．１のアルミニウムレーキ、Ｄ＆ＣオレンジＮｏ．５のアルミニウムレーキ、Ｄ＆ＣイエローＮｏ．１０のアルミニウムレーキ；Ｄ＆ＣレッドＮｏ．３３のジルコニウムレーキ；クロモフタル（Ｃｒｏｍｏｐｈｔｈａｌ）（登録商標）イエロー、サンファースト（Ｓｕｎｆａｓｔ）（登録商標）マゼンタ、サンファースト（Ｓｕｎｆａｓｔ）（登録商標）ブルー、酸化鉄、炭酸カルシウム、水酸化アルミニウム、硫酸カルシウム、カオリン、フェロシアン化アンモニウム鉄、炭酸マグネシウム、カルミン、硫酸バリウム、雲母、オキシ塩化ビスマス、ステアリン酸亜鉛、マンガンバイオレット、酸化クロム、二酸化チタン、ブラック（ｂｌａｃｋ）二酸化チタン、二酸化チタンナノ粒子、酸化亜鉛、酸化バリウム、ウルトラマリンブルー、クエン酸ビスマス、ヒドロキシアパタイト、ケイ酸ジルコニウム、ならびにカーボンブラック粒子よりなる群から選択される材料を含んでなる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ポリマーが、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、ポリペプチド、リグニン、多糖類、ポリアミド、ポリイミド、ポリアラミド、ならびにメタクリレート、アクリレートまたはスチレンに由来する少なくとも１つのモノマーを含んでなるコポリマーよりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ポリマーに対して親和性を有するペプチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４６、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、および１１２よりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
体表面が毛髪であり、ここで毛髪結合ペプチドが、ポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなるステップ（ｂ）の組成物に、場合により添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
体表面が皮膚であり、ここで皮膚結合ペプチドが、ポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなるステップ（ｂ）の組成物に、場合により添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ポリマーに対して親和性を有するペプチドが、体表面に対して親和性を有するペプチドに、場合により共役される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
体表面に対して親和性を有するペプチドが、分子スペーサーを有するポリマーに対して親和性を有するペプチドに共役される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
体表面に対して親和性を有するペプチドが毛髪結合ペプチドである請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
体表面に対して親和性を有するペプチドが皮膚結合ペプチドである請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
毛髪結合ペプチドが、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイおよびコンビナトリアル固相ペプチド合成よりなる群から選択されるプロセスによりコンビナトリアルに生成される請求項７または１１に記載の方法。
【請求項１４】
皮膚結合ペプチドが、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイおよびコンビナトリアル固相ペプチド合成よりなる群から選択されるプロセスによりコンビナトリアルに生成される請求項８または１２に記載の方法。
【請求項１５】
毛髪結合ペプチドが実験的に生成される請求項７または１１に記載の方法。
【請求項１６】
皮膚結合ペプチドが実験的に生成される請求項８または１２に記載の方法。
【請求項１７】
実験的に生成された毛髪結合ペプチドが毛髪に対して親和性を有する正に帯電したアミノ酸を含んでなる請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
実験的に生成された皮膚結合ペプチドが皮膚に対して親和性を有する正に帯電したアミノ酸を含んでなる請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
毛髪結合ペプチドが、配列番号４７、４８、４９、５０、５１、５２、５８、５９、６０、６１、６２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、および８１よりなる群から選択される請求項７または１１に記載の方法。
【請求項２０】
皮膚結合ペプチドが、配列番号５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、および９３よりなる群から選択される請求項８または１２に記載の方法。
【請求項２１】
ポリマーでコートされた微粒子効果剤およびポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物が体表面に同時に適用される請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ポリマーでコートされた微粒子効果剤が、ポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物の適用に先立ち体表面に適用される請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物が、ポリマーでコートされた微粒子効果剤の適用に先立ち体表面に適用される請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
ポリマーに対して親和性を有するペプチドが、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイおよびコンビナトリアル固相ペプチド合成よりなる群から選択されるプロセスによって同時に生成される請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
ｄ）ポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物を体表面に再適用する
ステップをさらに含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
ｄ）ポリマーシーラントを含んでなる組成物を体表面に適用する
ステップをさらに含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
ポリマーシーラントが、ポリ（アリルアミン）、アクリレート、アクリレートコポリマー、メタクリレート、メタクリレートコポリマー、ポリウレタン、カルボマー、メチコン、ポリペプチド、アモジメチコン、ポリエチレングリコール、蜜ろう、およびシロキサンよりなる群から選択される請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ａ）ポリマーでコートされた微粒子効果剤と、
ｂ）ポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物と
を含んでなるパーソナルケア組成物。
【請求項２９】
微粒子効果剤が、有機色素、無機色素、金属酸化物、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子、有機ナノ粒子、無機ナノ粒子、およびポリマーナノ粒子よりなる群から選択される材料を含んでなる請求項２８に記載のパーソナルケア組成物。
【請求項３０】
微粒子効果剤が、Ｄ＆ＣレッドＮｏ．３６、Ｄ＆ＣレッドＮｏ．３０、Ｄ＆ＣオレンジＮｏ．１７、グリーン３レーキ、Ｅｘｔ．イエロー７レーキ、オレンジ４レーキ、レッド２８レーキ；Ｄ＆ＣレッドＮｏ．７、１１、３１および３４のカルシウムレーキ、Ｄ＆ＣレッドＮｏ．１２のバリウムレーキ、ストロンチウムレーキＤ＆ＣレッドＮｏ．１３、ＦＤ＆ＣイエローＮｏ．５のアルミニウムレーキ、ＦＤ＆ＣイエローＮｏ．６のアルミニウムレーキ、ＦＤ＆ＣＮｏ．４０のアルミニウムレーキ、Ｄ＆ＣレッドＮｏ．２１、２２、２７、および２８のアルミニウムレーキ、ＦＤ＆ＣブルーＮｏ．１のアルミニウムレーキ、Ｄ＆ＣオレンジＮｏ．５のアルミニウムレーキ、Ｄ＆ＣイエローＮｏ．１０のアルミニウムレーキ；Ｄ＆ＣレッドＮｏ．３３のジルコニウムレーキ；クロモフタル（Ｃｒｏｍｏｐｈｔｈａｌ）（登録商標）イエロー、サンファースト（Ｓｕｎｆａｓｔ）（登録商標）マゼンタ、サンファースト（Ｓｕｎｆａｓｔ）（登録商標）ブルー、酸化鉄、炭酸カルシウム、水酸化アルミニウム、硫酸カルシウム、カオリン、フェロシアン化アンモニウム鉄、炭酸マグネシウム、カルミン、硫酸バリウム、雲母、オキシ塩化ビスマス、ステアリン酸亜鉛、マンガンバイオレット、酸化クロム、二酸化チタン、ブラック二酸化チタン、二酸化チタンナノ粒子、酸化亜鉛、酸化バリウム、ウルトラマリンブルー、クエン酸ビスマス、ヒドロキシアパタイト、ケイ酸ジルコニウム、ならびにカーボンブラック粒子よりなる群から選択される材料を含んでなる請求項２８に記載のパーソナルケア組成物。
【請求項３１】
ポリマーが、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、ポリペプチド、リグニン、多糖類、ポリアミド、ポリイミド、ポリアラミド、ならびにメタクリレート、アクリレートまたはスチレンに由来する少なくとも１つのモノマーを含んでなるコポリマーよりなる群から選択される請求項２８に記載のパーソナルケア組成物。
【請求項３２】
ポリマーに対して親和性を有するペプチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４６、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、および１１２よりなる群から選択される請求項２８に記載のパーソナルケア組成物。
【請求項３３】
ポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物が毛髪結合ペプチドをさらに含んでなる請求項２８に記載のパーソナルケア組成物。
【請求項３４】
ポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物が皮膚結合ペプチドをさらに含んでなる請求項２８に記載のパーソナルケア組成物。
【請求項３５】
ポリマーに対して親和性を有するペプチドが、体表面に対して親和性を有するペプチドに、場合により共役される、請求項２８に記載のパーソナルケア組成物。
【請求項３６】
体表面に対して親和性を有するペプチドが、分子スペーサーを有するポリマーに対して親和性を有するペプチドに共役される請求項３５に記載のパーソナルケア組成物。
【請求項３７】
体表面に対して親和性を有するペプチドが毛髪結合ペプチドである請求項３５に記載のパーソナルケア組成物。
【請求項３８】
体表面に対して親和性を有するペプチドが皮膚結合ペプチドである請求項３５に記載のパーソナルケア組成物。
【請求項３９】
毛髪結合ペプチドが、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイおよびコンビナトリアル固相ペプチド合成よりなる群から選択されるプロセスにより同時に生成される請求項３３または３７に記載のパーソナルケア組成物。
【請求項４０】
皮膚結合ペプチドが、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイおよびコンビナトリアル固相ペプチド合成よりなる群から選択されるプロセスにより同時に生成される請求項３４または３８に記載のパーソナルケア組成物。
【請求項４１】
毛髪結合ペプチドが実験的に生成される請求項３３または３７に記載のパーソナルケア組成物。
【請求項４２】
皮膚結合ペプチドが実験的に生成される請求項３４または３８に記載のパーソナルケア組成物。
【請求項４３】
実験的に生成された毛髪結合ペプチドが、毛髪に対して親和性を有する正に帯電したアミノ酸を含んでなる請求項４１に記載のパーソナルケア組成物。
【請求項４４】
実験的に生成された皮膚結合ペプチドが、皮膚に対して親和性を有する正に帯電したアミノ酸を含んでなる請求項４２に記載のパーソナルケア組成物。
【請求項４５】
毛髪結合ペプチドが、配列番号４７、４８、４９、５０、５１、５２、５８、５９、６０、６１、６２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、および８１よりなる群から選択される請求項３３または３７に記載のパーソナルケア組成物。
【請求項４６】
皮膚結合ペプチドが、配列番号５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、および９３よりなる群から選択される請求項３４または３８に記載のパーソナルケア組成物。
【請求項４７】
ポリマーに対して親和性を有するペプチドが、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイおよびコンビナトリアル固相ペプチド合成よりなる群から選択されるプロセスにより同時に生成される請求項２８に記載のパーソナルケア組成物。
【請求項４８】
一般構造［（ＢＳＢＰ）ｍ−（ＰＢＰ）ｎ］ｘ（式中、
ａ）ＢＳＢＰは体表面結合ペプチドであり、
ｂ）ＰＢＰはポリマー結合ペプチドであり、そして
ｃ）ｍ、ｎ、およびｘは独立して１〜約１０の範囲である）
を有するジブロックのペプチドベースの複合体。
【請求項４９】
一般構造［［（ＢＳＢＰ）ｍ−Ｓｑ］ｘ−［（ＰＢＰ）ｎ−Ｓｒ］ｚ］ｙ（式中、
ａ）ＢＳＢＰは体表面結合ペプチドであり、
ｂ）ＰＢＰはポリマー結合ペプチドであり、
ｃ）Ｓは分子スペーサーであり、そして
ｄ）ｍ、ｎ、ｘおよびｚは独立して１〜約１０の範囲であり、ｙは１〜約５であり、かつｑおよびｒはｒとｑが両方とも０であることはないという条件で各々独立して０または１である）
を有するトリブロックのペプチドベースの複合体。
【請求項５０】
体表面結合ペプチドが、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイおよびコンビナトリアル固相ペプチド合成よりなる群から選択されるプロセスにより同時に生成される請求項４８または４９に記載のペプチドベースの複合体。
【請求項５１】
体表面結合ペプチドが毛髪結合ペプチドまたは皮膚結合ペプチドである請求項４８または４９に記載のペプチドベースの複合体。
【請求項５２】
毛髪結合ペプチドまたは皮膚結合ペプチドが、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイおよびコンビナトリアル固相ペプチド合成よりなる群から選択されるプロセスにより同時に生成される請求項５１に記載のペプチドベースの複合体。
【請求項５３】
毛髪結合ペプチドまたは皮膚結合ペプチドが実験的に生成される請求項５１に記載のペプチドベースの複合体。
【請求項５４】
実験的に生成された毛髪結合ペプチドまたは皮膚結合ペプチドが正に帯電したアミノ酸を含んでなる請求項５３に記載のペプチドベースの複合体。
【請求項５５】
毛髪結合ペプチドが、配列番号４７、４８、４９、５０、５１、５２、５８、５９、６０、６１、６２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、および８１よりなる群から選択される請求項５１に記載のペプチドベースの複合体。
【請求項５６】
皮膚結合ペプチドが、配列番号５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、および９３よりなる群から選択される請求項５１に記載のペプチドベースの複合体。
【請求項５７】
ポリマー結合ペプチドが、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイおよびコンビナトリアル固相ペプチド合成よりなる群から選択されるプロセスにより同時に生成される、請求項４８または４９に記載のペプチドベースの複合体。
【請求項５８】
ポリマー結合ペプチドが、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、ポリペプチド、リグニン、多糖類、ポリアミド、ポリイミド、ポリアラミド、ならびにメタクリレート、アクリレートまたはスチレンに由来する少なくとも１つのモノマーを含んでなるコポリマーよりなる群から選択されるポリマーに対して親和性を有する請求項４８または４９に記載のペプチドベースの複合体。
【請求項５９】
ポリマー結合ペプチドが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、および１１２よりなる群から選択される請求項４８または４９に記載のペプチドベースの複合体。
【請求項６０】
スペーサーが、エタノールアミン、エチレングリコール、６炭素原子の鎖長を有するポリエチレン、３〜６の反復単位を有するポリエチレングリコール、フェノキシエタノール、プロパノールアミド、ブチレングリコール、ブチレングリコールアミド、プロピルフェニル鎖、エチルアルキル鎖、プロピルアルキル鎖、ヘキシルアルキル鎖、ステリル（ｓｔｅｒｙｌ）アルキル鎖、セチルアルキル鎖、およびパルミトイルアルキル鎖よりなる群から選択される請求項４９に記載のトリブロックのペプチドベースの複合体。
【請求項６１】
スペーサーが１〜約５０個のアミノ酸を含んでなるペプチドである請求項４９に記載のトリブロックのペプチドベースの複合体。
【請求項６２】
スペーサーが、プロリン、リジン、グリシン、アラニン、セリン、およびこれらの混合物よりなる群から選択されるアミノ酸を含んでなる請求項６１に記載のトリブロックのペプチドベースの複合体。
【請求項６３】
スペーサーが、配列番号６３、６４、６５、６６、９４、９５、９６、および９７よりなる群から選択されるペプチド配列を含んでなる請求項６１に記載のトリブロックのペプチドベースの複合体。
【請求項６４】
トリブロックのペプチドベースの複合体が、配列番号６７、６８、６９、および７０よりなる群から選択される配列を有する請求項４９に記載のトリブロックのペプチドベースの複合体。
【請求項６５】
配列番号９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、および１１２よりなる群から選択されるポリメタクリル酸メチル結合ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２００５年９月１６日出願の米国仮特許出願第６０／７１８０３５号明細書から米国特許法第１１９条の下で優先権を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、微粒子効果剤の使用およびそれら効果剤の体表面への結合期間を延長させるための方法に関する。より詳細には、本発明は、ポリマーコーティングに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物の存在下でポリマーでコートされた粒子効果剤を提供することで、効果剤の体表面への結合効果が延長する。
【背景技術】
【０００３】
毛髪および皮膚を対象とするコンディショナーおよび着色剤は周知であり、パーソナルケア製品として用いられることが多い。現行のコンディショナーおよび非酸化着色剤に付随する主な問題は、それらが長期持続効果に必要な耐久性に欠けている点である。酸化毛髪染料は、長期持続する色を提供するが、それらが含有する酸化剤は毛髪の損傷を引き起こす。毛髪およびスキンケア組成物の耐久性を改善するため、ヘアコンディショナーおよび毛髪着色剤などのペプチドベースの効果剤が開発されている（ファン（Ｈｕａｎｇ）ら、同時係属および共同所有の特許文献１および特許文献２）。ペプチドベースの効果剤は、毛髪または皮膚に対して高い結合親和性を有する特定のペプチド配列とコンディショニング剤または着色剤などの効果剤との共役により調製される。ペプチド部分は毛髪または皮膚に結合し、それにより効果剤に強力に付着する。これらのペプチドベースの効果剤は改善された耐久性を提供するが、効果剤に対する結合ペプチドの共役を必要とする。無機サンスクリーンに共役された皮膚結合ペプチドを含んでなるペプチドベースのサンスクリーンは、同時係属および共同所有の特許文献３中でブーゼマン−ウィリアム（Ｂｕｓｅｍａｎ−Ｗｉｌｌｉａｍ）らによって記載されている。
【０００４】
毛髪または皮膚に対して高い結合親和性を有するペプチドが、ファージディスプレイスクリーニング技術を用いて同定されている（ファン（Ｈｕａｎｇ）ら、上記；エステル（Ｅｓｔｅｌｌ）ら、特許文献４；ムレイ（Ｍｕｒｒａｙ）ら、特許文献５；ジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）ら、特許文献６；およびジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）ら、特許文献７）。さらに、正に帯電したアミノ酸に基づく実験的に生成された毛髪および皮膚結合ペプチドが報告されている（ローズ（Ｒｏｔｈｅ）ら、特許文献８）。
【０００５】
コーンウェル（Ｃｏｒｎｗｅｌｌ）ら（特許文献９）は、酸化的毛髪染料で処理された毛髪からの脱色を低減するための方法を記載し、この方法は酸化的毛髪染料による毛髪処理の前または後のいずれかに、毛髪と塩基性アミノ酸、尿素、グアニジン、およびそれらの塩または混合物などの有機アミノ化合物とを接触させるステップを含んでなる。しかし、その開示では、ポリマーでコートされた微粒子効果剤の体表面に対する耐久性を高めることを目的とした、特定のポリマー結合ペプチド、または毛髪または皮膚結合ペプチドに共役されるポリマー結合ペプチドを含んでなる複合体の使用についての記載がない。
【０００６】
ポリマーおよびプラスチック表面に対して結合親和性を有するペプチドが、ファージディスプレイを用いて同定されている。例えば、アデイ（Ａｄｅｙ）ら（非特許文献１）は、ポリスチレンおよびポリ塩化ビニルの表面に結合するペプチドについて記載している。さらに、ポリウレタン（マレイ（Ｍｕｒｒａｙ）ら、特許文献５）、ポリエチレンテレフタレート（オブライエン（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ）ら、同時係属および共同所有の特許文献１０）、ならびにポリスチレン、ポリウレタン、ポリカーボネート、およびナイロン（グリンスタッフ（Ｇｒｉｎｓｔａｆｆ）ら、特許文献１１）に結合するペプチドについての報告がなされている。しかし、微粒子効果剤の体表面上への結合力を高めることを目的としたかかるペプチドの使用については記載がない。
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／００５０６５６号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／０２２６８３９号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／０２４９６８２号明細書
【特許文献４】国際公開第０１７９４７９号パンフレット
【特許文献５】米国特許出願公開第２００２／００９８５２４号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００３／０１５２９７６号明細書
【特許文献７】国際公開第０４０４８３９９号パンフレット
【特許文献８】国際公開第２００４／０００２５７号パンフレット
【特許文献９】米国特許第６，５５１，３６１号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００５／００５４７５２号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００３／０１８５８７０号明細書
【非特許文献１】ジーン（Ｇｅｎｅ）１５６：２７−３１頁（１９９５年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、解決すべき課題は、実施が単純かつ容易な微粒子効果剤の毛髪および皮膚における耐久性を高めるための別の方法を提供することである。
【０００９】
出願人らは、微粒子効果剤上のポリマーコーティングに対して親和性を有するペプチドを用いることで体表面上での微粒子効果剤の耐久性が向上しうるという発見により、上述の課題に対処している。このアプローチは、多種のポリマーでコートされた微粒子効果剤と併用されるべき１種のポリマー結合ペプチドの使用を可能にし、それにより各粒子のタイプを対象とする異なる粒子結合ペプチドに対する必要がなくなる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
体表面上での微粒子効果剤の結合の寿命を延ばすための方法が開示される。ポリマーでコートされた微粒子効果剤が、ポリマー結合ペプチドの存在下で体表面に適用される。方法は、色素、微粒子コンディショナー、および無機サンスクリーンの毛髪または皮膚などの体表面への適用に特に適する。ポリマー結合ペプチドを、毛髪および皮膚などの体表面に対して親和性を有するペプチドを含んでなるキメラとして改質または使用可能である。ポリマー結合ペプチドの存在下でのポリマーでコートされた効果剤を、毛髪着色剤およびシャンプーなどの種々のパーソナルケア組成物中で使用可能である。
【００１１】
したがって、一実施形態では、本発明は、
ａ）ポリマーでコートされた微粒子効果剤を提供し、
ｂ）ポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物を提供し、そして
ｃ）（ａ）のコートされた微粒子効果剤を（ｂ）の組成物とともに、体表面に、コートされた効果剤が体表面に結合するのに十分な時間適用する
ことを含んでなる微粒子効果剤を体表面に適用するための方法を提供する。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、
ａ）ポリマーでコートされた微粒子効果剤と、
ｂ）ポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物と
を含んでなるパーソナルケア組成物を提供する。
【００１３】
別の実施形態では本発明は、一般構造［（ＢＳＢＰ）ｍ−（ＰＢＰ）ｎ］ｘ（式中、
ａ）ＢＳＢＰは体表面結合ペプチドであり、
ｂ）ＰＢＰはポリマー結合ペプチドであり、そして
ｃ）ｍ、ｎ、およびｘは独立して１〜約１０の範囲である）
を有するジブロックのペプチドベースの複合体を提供する。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、一般構造［［（ＢＳＢＰ）ｍ−Ｓｑ］ｘ−［（ＰＢＰ）ｎ−Ｓｒ］ｚ］ｙ（式中、
ａ）ＢＳＢＰは体表面結合ペプチドであり、
ｂ）ＰＢＰはポリマー結合ペプチドであり、
ｃ）Ｓは分子スペーサーであり、そして
ｄ）ｍ、ｎ、ｘおよびｚは独立して１〜約１０の範囲であり、ｙは１〜約５であり、かつｑおよびｒはｒとｑが両方とも０であることはないという条件で各々独立して０または１である）
を有するトリブロックのペプチドベースの複合体を提供する。
【００１５】
図面および配列記述の簡単な説明
本発明の様々な実施形態は、本願の一部を形成する以下の詳細な説明、図面および添付の配列記述からより十分に理解されうる。
【００１６】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を有する特許出願における要件−配列の規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、かつ、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）基準ＳＴ．２５（１９９８年）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表における要件（規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、ならびに実施細則の第２０８節および付録Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データにおいて用いられる記号および形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に示される規則に従う。
【００１７】
配列表は、本明細書の場合、コンパクトディスク上に提供される。配列表を有するコンパクトディスクの内容は、３７ＣＦＲ１．５２（ｅ）に従い、参照により本明細書中に援用される。コンパクトディスクは、３通りに提出されており、互いに同一である。ディスクは、「コピー１−配列表」、「コピー２−配列表」、およびＣＲＦというラベルが付されている。ディスクは、以下のサイズ：３４，０００バイトを有する以下のファイル：ＣＬ３１４５  Ｃｏｎｖ  Ｓｅｑ  Ｌｉｓｔ．ＳＴ２５を有しており、２００６年８月３１日に作成されたものである。
【００１８】
配列番号１〜１４はポリメタクリル酸メチル結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００１９】
配列番号１５〜２１はポリプロピレン結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００２０】
配列番号２２〜３０はポリテトラフルオロエチレン結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００２１】
配列番号３１〜３６はナイロン結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号３７〜４３はポリエチレン結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号４４〜４６はポリスチレン結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００２４】
配列番号４７〜５２および７３〜８１は毛髪結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号５３〜５７および８２〜９３は皮膚結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号５８〜６２は実験的に生成された毛髪および皮膚結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号６３〜６５および９４〜９７はペプチドスペーサーのアミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号６６はカスパーゼ３切断部位のアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号６７〜７０は複数のコピーの毛髪結合ペプチド／／ポリマー結合ペプチド複合体のアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号７１は、配列番号７０として与えられる、トリブロックのペプチドに基づく複数のコピーの毛髪結合ペプチド／／ポリマー結合ペプチド複合体を調製するのに用いられるヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列番号７２は、実施例１８で記載されるプラスミドｐＫＳＩＣ４−ＨＣＣ７７６２３のヌクレオチド配列である。
【００３２】
配列番号９８〜１１２はシャンプーに耐性を有するポリメタクリル酸メチル結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明は、ポリマーでコートされた微粒子効果剤をポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物と併用するステップを含む、微粒子効果剤の耐久性を高めるための方法に関する。本発明は、本方法を用いることで従来の方法と比べて耐久性が向上するという条件で、毛髪および皮膚を着色しかつ調整可能であることから有用である。
【００３４】
以下の定義は、本明細書中で用いられ、本明細書および特許請求の範囲を解釈するものとして示されるべきである。
【００３５】
本明細書で用いられる「発明」または「本発明」という用語は、限定されない用語であり、特定の発明の任意の単一の実施形態を示すように意図されていないが、本明細書および特許請求の範囲にて記載されるあらゆる有望な実施形態を包含する。
【００３６】
「ＰＢＰ」はポリマー結合ペプチドを意味する。
【００３７】
「ＢＳＢＰ」は体表面結合ペプチドを意味する。
【００３８】
「ＨＢＰ」は毛髪結合ペプチドを意味する。
【００３９】
「ＳＢＰ」は皮膚結合ペプチドを意味する。
【００４０】
「ＢＡ」は効果剤を意味する。
【００４１】
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに連結される２つもしくはそれ以上のアミノ酸を示す。
【００４２】
「毛髪結合ペプチド」という用語は、毛髪に対して高い親和性で結合するペプチド配列を示す。本発明の毛髪結合ペプチドは、約７アミノ酸長〜約５０アミノ酸長、より好ましくは約７アミノ酸長〜約２５アミノ酸長、最も好ましくは約７〜約２０アミノ酸長である。
【００４３】
「皮膚結合ペプチド」という用語は、皮膚に対して高い親和性で結合するペプチド配列を示す。本発明の皮膚結合ペプチドは、約７アミノ酸長〜約５０アミノ酸長、より好ましくは約７アミノ酸長〜約２５アミノ酸長、最も好ましくは約７〜約２０アミノ酸長である。
【００４４】
「ポリマー結合ペプチド」という用語は、ポリマーに対して高い親和性で結合するペプチド配列を示す。本発明のポリマー結合ペプチドは、約７アミノ酸長〜約５０アミノ酸長、より好ましくは約７アミノ酸長〜約２５アミノ酸長、最も好ましくは約７〜約２０アミノ酸長である。
【００４５】
「微粒子効果剤」という用語は、体表面に適用される場合、美容または予防効果をもたらす微粒子物質に関する一般用語である。微粒子効果剤は、パーソナルケア産業にて一般に用いられる他の微粒子物質とともに、典型的には色素、微粒子コンディショナー、無機サンスクリーンなどを含む。
【００４６】
「体表面」という用語は、微粒子効果剤の適用における基質としての機能を果たしうるヒト身体の任意の表面を意味する。典型的な体表面は、限定はされないが、毛髪、皮膚、爪、歯、歯肉、および角膜組織を含む。
【００４７】
本明細書で用いられる「毛髪」という用語は、ヒト毛髪、眉、およびまつげを示す。
【００４８】
本明細書で用いられる「皮膚」という用語は、ヒト皮膚、またはブタ皮膚、ビトロ−スキン（Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ）（登録商標）およびエピダーム（ＥｐｉＤｅｒｍ）（商標）などのヒト皮膚における代用物を示す。体表面として本明細書で用いられる皮膚は、一般に上皮細胞の層を含んでなり、かつさらに内皮細胞の層を含んでなる場合がある。
【００４９】
本明細書で用いられる「共役」および「共役される」という用語は、任意の化学的会合を示し、かつ共有および非共有相互作用の双方を含む。
【００５０】
「ペプチドベースの複合体」という用語は、体表面結合ペプチドとポリマー結合ペプチドとの直接的なまたは分子スペーサーを介する共役によって形成される組成物を示す。
【００５１】
「ストリンジェンシー」という用語は、本発明のポリマー結合ペプチドの選択に対して適用されると、ペプチドをポリマーから溶出するのに用いられる溶出剤の濃度を示す。溶出剤の濃度が高まると、より厳しい条件が与えられる。
【００５２】
「結合親和性」または「親和性」という用語は、結合ペプチドのその個別の基質との相互作用の強さを示す。結合親和性は、ＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイにて測定されるＭＢ５０値の観点で、本明細書中で定義される。
【００５３】
「ナノ粒子」という用語は、１〜５００ｎｍの平均粒径を有する粒子として本明細書中で定義される。好ましくは、粒子の平均粒径は約１〜２００ｎｍである。本明細書で用いられる「粒度」および「粒径」は同じ意味を有する。ナノ粒子は、限定はされないが、金属、半導体、ポリマー、あるいは他の有機または無機粒子、ならびに有機および無機色素を含む。
【００５４】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの塩基性化学構造単位を示す。以下の略語は、特定のアミノ酸を同定するために本明細書中で用いられる。
【００５５】
【表１】
2009508870.tif 000003
【００５６】
「遺伝子」は、コード配列の上流（５’非コード配列）および下流（３’非コード配列）の調節配列を含む、特定のタンパク質を発現する核酸断片を示す。「天然遺伝子」は、それ自身の調節配列とともに天然に見出される遺伝子を示す。「キメラ遺伝子」は、調節およびコード配列（共に天然に見出されることのない）を含んでなる、天然遺伝子ではない任意の遺伝子を示す。したがって、キメラ遺伝子は、異なるソースに由来する調節配列およびコード配列、または同じソースに由来するが天然に見出される様式とは異なる様式で整列される調節配列およびコード配列を含んでなる場合がある。「外来」遺伝子は、宿主生物内に通常見出されないが、遺伝子導入法によって宿主生物に導入される遺伝子を示す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入される天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなる可能性がある。
【００５７】
「合成遺伝子」は、当業者に既知の手順を用いて化学的に合成されるオリゴヌクレオチドの構成単位から構築されうる。これらの構成単位は、ライゲートされ、アニールされることで遺伝子セグメントが形成され、それは次いで酵素によって組織化されて遺伝子全体が作成される。ＤＮＡの配列に関連した「化学的に合成される」とは、ヌクレオチド成分がインビトロで構築されることを意味する。手動によるＤＮＡの化学合成が十分に確立された手順を用いて実施可能であり、あるいは自動化学合成が多数の市販の機械のうちの１つを用いて実施可能である。したがって、遺伝子をヌクレオチド配列の最適化に基づく最適な遺伝子発現に適合させることで、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることが可能である。当業者は、コドンの使用が宿主にとって好ましいコドンの方向にバイアスされるか否かといった遺伝子発現が成功する可能性について理解している。好ましいコドンについては、配列情報が使用可能な宿主細胞に由来する遺伝子の検討に基づいて判定可能である。
【００５８】
「ファージディスプレイ」という用語は、バクテリオファージまたはファージミド粒子の表面上への機能的外来ペプチドまたは小タンパク質の提示を示す。遺伝子操作されたファージを用い、その天然表面タンパク質のセグメントとしてペプチドを提示することが可能である。ペプチドライブラリーを、異なる遺伝子配列を有するファージの集団により生成可能である。
【００５９】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特定のＤＮＡセグメントを増幅するために用いられる技術である（米国特許第４，６８３，１９５号明細書および米国特許第４，８００，１５９号明細書）。
【００６０】
本明細書で用いられる標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、サムブルック，Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッチ，Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス，Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）、「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州（１９８９年）（以下では「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）；シルハヴィ，Ｔ．Ｊ．（Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．）、ベナン，Ｍ．Ｌ．（Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．）およびエンキスト，Ｌ．Ｗ．（Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．）、「エクスペリメンツ・ウイズ・ジーン・フュージョンズ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州（１９８４年）；およびアウスベル，Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ・アンド・ウイリー・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）により発行（１９８７年）に記載されている。
【００６１】
本発明は、毛髪および皮膚などの体表面上で色素、微粒子コンディショナー、および無機サンスクリーンなどの微粒子効果剤の耐久性を高めるための方法であって、ポリマーでコートされた微粒子効果剤を、ポリマーコーティングに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物と共に体表面に適用するステップを含んでなる、方法を提供する。ポリマーコーティングに対して親和性を有するペプチドは本明細書中で「ポリマー結合ペプチド」とも称され、ファージディスプレイなどのコンビナトリアルな方法を用いて同定可能である。さらに、ポリマーコーティングに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物は、毛髪または皮膚結合ペプチドなどの体表面結合ペプチドを遊離ペプチドまたは体表面結合ペプチドに共役されたポリマー結合ペプチドを含んでなる複合体のいずれかとして、さらに含んでなる場合がある。本発明の方法では、ポリマーコーティングに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物を、ポリマーでコートされた微粒子効果剤の適用と同時、効果剤の適用前または効果剤の適用後に適用し、効果剤の体表面へのシールが可能である。
【００６２】
微粒子効果剤
本発明の方法は、パーソナルケアにおいて当該技術分野で既知の多種多様な微粒子効果剤と併用可能である。微粒子効果剤の例として、限定はされないが、色素、微粒子コンディショニング剤、および無機サンスクリーンが挙げられる。
【００６３】
本明細書で用いられる「色素」という用語は不可溶性着色剤を意味する。多種多様な有機および無機色素は、単独または併用で本発明にて使用可能である。毛髪および皮膚を着色するための色素は、当該技術分野で周知であり（例えばグリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら（国際公開第０１０７００９号パンフレット）、参照により本明細書中に援用、「ＣＦＴＡインターナショナル・カラー・ハンドブック（ＣＦＴＡ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｏｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」、第２版、ミセル・プレス（Ｍｉｃｅｌｌｅ  Ｐｒｅｓｓ）、英国（１９９２年）および「コスメティック・ハンドブック（Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」、米国食品医薬品局（ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、ＦＤＡ／ＩＡＳブックレット（ＦＤＡ／ＩＡＳ  Ｂｏｏｋｌｅｔ）（１９９２年））、様々なソースから市販されている（例えばベイヤー（Ｂａｙｅｒ）、ピッツバーグ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）、ペンシルバニア州；チバ−ガイギー（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ）、タリータウン（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ）、ニューヨーク州；ＩＣＩ、ブリッジウォーター（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ）、ニュージャージー州；サンドズ（Ｓａｎｄｏｚ）、ウィーン（Ｖｉｅｎｎａ）、オーストリア；ビーエーエスエフ（ＢＡＳＦ）、マウントオリーブ（Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ）、ニュージャージー州；およびヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、フランクフルト（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ）、ドイツ）。典型的な色素は、限定はされないが、Ｄ＆ＣレッドＮｏ．３６、Ｄ＆ＣレッドＮｏ．３０、Ｄ＆ＣオレンジＮｏ．１７、グリーン３レーキ、Ｅｘｔ．イエロー７レーキ、オレンジ４レーキ、およびレッド２８レーキ；Ｄ＆ＣレッドＮｏ．７、１１、３１および３４のカルシウムレーキ、Ｄ＆ＣレッドＮｏ．１２のバリウムレーキ、ストロンチウムレーキＤ＆ＣレッドＮｏ．１３、ＦＤ＆ＣイエローＮｏ．５のアルミニウムレーキ、ＦＤ＆ＣイエローＮｏ．６のアルミニウムレーキ、ＦＤ＆ＣＮｏ．４０のアルミニウムレーキ、Ｄ＆ＣレッドＮｏ．２１、２２、２７、および２８のアルミニウムレーキ、ＦＤ＆ＣブルーＮｏ．１のアルミニウムレーキ、Ｄ＆ＣオレンジＮｏ．５のアルミニウムレーキ、Ｄ＆ＣイエローＮｏ．１０のアルミニウムレーキ；Ｄ＆ＣレッドＮｏ．３３のジルコニウムレーキ；クロモフタル（Ｃｒｏｍｏｐｈｔｈａｌ）（登録商標）イエロー１３１ＡＫ（チバ・スペチャルティ・ケミカルズ（Ｃｉｂａ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））、サンファースト（Ｓｕｎｆａｓｔ）（登録商標）マゼンタ１２２（サンケミカル（Ｓｕｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ））およびサンファースト（Ｓｕｎｆａｓｔ）（登録商標）ブルー１５：３（サンケミカル（Ｓｕｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ））、酸化鉄、炭酸カルシウム、水酸化アルミニウム、硫酸カルシウム、カオリン、フェロシアン化アンモニウム鉄、炭酸マグネシウム、カルミン、硫酸バリウム、雲母、オキシ塩化ビスマス、ステアリン酸亜鉛、マンガンバイオレット、酸化クロム、二酸化チタン、ブラック（ｂｌａｃｋ）二酸化チタン、二酸化チタンナノ粒子、酸化亜鉛、酸化バリウム、ウルトラマリンブルー、クエン酸ビスマス、ならびにヒドロキシアパタイト、およびジルコン（Ｚｉｒｃｏｎ）（ケイ酸ジルコニウム）などの白色材料、およびカーボンブラック粒子を含む。
【００６４】
色素は、定義によると実質的に不可溶性であり、それ故に分散形態で用いられる。色素は分散剤を用いて分散されるかまたは自己分散色素が使用される場合がある。分散剤の使用により色素が分散させる場合、分散剤は、限定はされないが、下記すなわち例えばブリュックマン（Ｂｒｕｅｃｋｍａｎｎ）ら（米国特許第５，１２４，４３８号明細書）により記載されたタンパク質分散剤；および例えばオブライエン（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ）らにより記載されたペプチドベースの分散剤（同時係属および共同所有の米国特許出願公開第２００５／００５４７５２号明細書）といったランダムなまたは構造化された有機ポリマー分散剤を含む、当該技術分野で既知の任意の適切な分散剤でありうる。好ましいランダムな有機ポリマー分散剤は、アクリルポリマーおよびスチレン−アクリルポリマーを含む。構造化された分散剤が最も好ましく、それはＡＢ、ＢＡＢおよびＡＢＣブロックコポリマー、分枝重合体ならびにグラフト重合体を含む。好ましくは、有機ポリマーは、アクリレート、メタクリレート、ブチルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ベンジルメタクリレート、フェノキシエチルアクリレート、エトキシトリエチレングリコールメタクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、ポリエチレングリコールアクリレート、アクリル酸、メタクリル酸、メタクリルアミド、アクリルアミド、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、およびヒドロキシエチルメタクリレートよりなる群から選択されるモノマー単位を含んでなり、これは例えばニガン（Ｎｉｇａｎ）により記載されている（米国特許出願公開第２００４／０２３２３７７号明細書）。いくつかの有用な構造化されたポリマー分散剤は、米国特許第５，０８５，６９８号明細書、欧州特許出願公開第０５５６６４９号明細書および米国特許第５，２３１，１３１号明細書に記載されている（これらの開示内容は参照により本明細書中に援用される）。さらに、色素は、米国特許第４，４９４，９９４号明細書（参照により本明細書中に援用される）中でチオカ（Ｃｉｏｃａ）らによって記載されたリグニンスルホン酸およびポリペプチドを含んでなる表面活性物質を用いて分散可能である。
【００６５】
色素上の有機ポリマーは、一般に色素への適用後、場合により共有結合またはイオン結合によって架橋されうる。架橋はポリマーコーティングの恒久性および耐環境性を高める。
【００６６】
色素は、場合により有機ポリマーでのコーティングに先立って表面処理されうる。一般的な表面処理は、限定はされないが、アルキルシラン、シロキサン、メチコン、およびジメチコンを含む。表面処理は、色素表面に対して親和性を有するポリマーの範囲を拡大する。
【００６７】
自己分散色素は、表面改質されることで、独立した分散剤を伴わずに化学的付着により、基における安定な分散を実現する分散性状態となっている色素である。水性担体媒体中での分散においては、表面改質は親水基および最も典型的にはイオン性の親水基の付加を含む。自己分散色素は、物理的処理（真空プラズマなど）または化学的処理（例えば、オゾン、次亜塩素酸または類似のものによる酸化）による、官能基または官能基を有する分子の色素表面上への移植によって調製可能である。親水性官能基の単一種または複数種が、１つの色素粒子に接着されうる。自己分散色素は、例えば、米国特許第５，５７１，３１１号明細書、米国特許第５，６０９，６７１号明細書、米国特許第５，９６８，２４３号明細書、米国特許第５，９２８，４１９号明細書、米国特許第６，３２３，２５７号明細書、米国特許第５，５５４，７３９号明細書、米国特許第５，６７２，１９８号明細書、米国特許第５，６９，８０１６号明細書、米国特許第５，７１８，７４６号明細書、米国特許第５，７４９，９５０号明細書、米国特許第５，８０３，９５９号明細書、米国特許第５，８３７，０４５号明細書、米国特許第５，８４６，３０７号明細書、米国特許第５，８９５，５２２号明細書、米国特許第５，９２２，１１８号明細書、米国特許第６，１２３，７５９号明細書、米国特許第６，２２１，１４２号明細書、米国特許第６，２２１，１４３号明細書、米国特許第６，２８１，２６７号明細書、米国特許第６，３２９，４４６号明細書、米国特許第６，３３２，９１９号明細書、米国特許第６，３７５，３１７号明細書、米国特許第６，２８７，３７４号明細書、米国特許第６，３９８，８５８号明細書、米国特許第６，４０２，８２５号明細書、米国特許第６，４６８，３４２号明細書、米国特許第６，５０３，３１１号明細書、米国特許第６，５０６，２４５号明細書、および米国特許第６，８５２，１５６号明細書において記載されている。先の参考文献の開示内容は、参照により本明細書中に援用される。
【００６８】
金属および半導体ナノ粒子は、それらの光放射が強力であることからヘアカラーリング剤としても使用可能である（ヴィック（Ｖｉｃ）ら、米国特許出願公開第２００４／００１０８６４号明細書）。金属ナノ粒子は、限定はされないが、金、銀、白金、パラジウム、イリジウム、ロジウム、オスミウム、鉄、銅、コバルト、およびこれらの金属よりなる合金といった粒子を含む。「合金」は、本明細書中では２種類以上の金属の均質混合物として定義される。「半導体ナノ粒子」は、限定はされないが、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、硫化銀、硫化カドミウム、酸化亜鉛、硫化亜鉛、セレン化亜鉛、硫化鉛、ヒ化ガリウム、シリコン、酸化スズ、酸化鉄、およびリン化インジウムの粒子を含む。ナノ粒子は、適切な有機コーティングまたは単層により、安定化されかつ水溶化される。本明細書で用いられる単層で保護されたナノ粒子は、安定化されたナノ粒子の１種である。安定化された水溶性の金属および半導体ナノ粒子を調製するための方法は当該技術分野で既知であり、適切な例が同時係属および共同所有の米国特許出願公開第２００４／０１１５３４５号明細書（参照により本明細書中に援用される）中でファン（Ｈｕａｎｇ）らにより記載されている。ナノ粒子の色は粒子の大きさに依存する。したがって、ナノ粒子の大きさの制御により、異なる色を得ることができる。
【００６９】
微粒子効果剤は、有機ナノ粒子、シリカナノ粒子などの無機ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、ならびに金属および半導体ナノ粒子などのナノ粒子である場合があり、具体的には直毛化剤（ｈａｉｒ  ｓｔｒａｉｇｈｔｅｎｉｎｇ  ａｉｄｓ）、毛髪強化剤（ｈａｉｒ  ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｉｎｇ  ａｉｄｓ）および毛髪仕上げ剤（ｈａｉｒ  ｖｏｌｕｍｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）といった毛髪コンディショニング剤として役立つ。
【００７０】
微粒子効果剤は、２９０〜４００ナノメーターの波長で紫外光を吸収、反射、または散乱させる無機のＵＶサンスクリーンでもありうる。無機のＵＶサンスクリーン物質は、典型的には二酸化チタン（コグニス（Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏ．）から入手可能なサンスマート（ＳｕｎＳｍａｒｔ）など）、酸化亜鉛、および酸化鉄を含む（がこれらに限定されない）無機色素および金属酸化物である。好ましいサンスクリーンは二酸化チタンナノ粒子である。適切な二酸化チタンナノ粒子は、米国特許第５，４５１，３９０号明細書；米国特許第５，６７２，３３０号明細書；および米国特許第５，７６２，９１４号明細書において記載されている。二酸化チタンＰ２５は、デグサ（Ｄｅｇｕｓｓａ）（パーシッパニー（Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ）、ニュージャージー州）から入手可能な適切な市販製品の一例である。二酸化チタンナノ粒子における他の販売供給者は、ケミラ（Ｋｅｍｉｒａ）（ヘルシンキ（Ｈｅｌｓｉｎｋｉ）、フィンランド）、ザハトレーベン（Ｓａｃｈｔｌｅｂｅｎ）（ドゥイスブルグ（Ｄｕｉｓｂｕｒｇ）、ドイツ）およびテイカ（Ｔａｙｃａ）（大阪（Ｏｓａｋａ）、日本）を含む。
【００７１】
二酸化チタンナノ粒子は、典型的には１００ナノメートル（ｎｍ）未満の平均粒度径を有し、それは液体懸濁液中の粒子の粒度分布を測定する動的光散乱によって測定される。粒子は、典型的には約３ｎｍ〜約６０００ｎｍの範囲でありうる凝集体である。当該技術分野で既知の任意のプロセスを用い、かかる粒子の調製が可能である。プロセスは、二酸化チタンナノ粒子が生成されるという条件で、ハロゲン化チタンの気相酸化または可溶性のチタン錯体からの溶解沈殿を含みうる。
【００７２】
二酸化チタンナノ粒子を調製するための好ましいプロセスは、酸素およびハロゲン化チタン、好ましくは四塩化チタンの、典型的には４００〜２０００℃の範囲の高温反応ゾーンへの注入によるものである。反応ゾーン内に存在する高温条件下で、大きい表面積および狭いサイズ分布を有する二酸化チタンのナノ粒子が形成される。リアクター内のエネルギー源は、プラズマトーチなどの任意の加熱源でありうる。
【００７３】
ポリマーでコートされた微粒子効果剤
本発明における使用においては、微粒子効果剤がポリマーコーティングでコートされることで、下記のようなコンビナトリアルな方法によって同定される、ポリマーに対して親和性を有するペプチドがポリマーコーティングに結合することになる。ポリマーコーティングは、限定はされないが、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、ポリペプチド、リグニン、多糖類、ポリアミド、ポリイミド、ポリアラミド、ならびにメタクリレート、アクリレートまたはスチレンに由来する少なくとも１つのモノマーを含んでなるコポリマー（例えばブロックおよびグラフトコポリマー）を含む、多数の異なる有機および生体ポリマーから形成可能である。
【００７４】
上記のようにポリマー分散剤で分散された色素が微粒子効果剤として用いられる場合、ポリマー分散剤はポリマーコーティングとしての機能を果たしうる。上記のポリマー分散剤のいずれかが使用されうる。例えば、ポリアクリレートを含有する分散剤で分散された色素は、ポリアクリレート結合ペプチドと併用されうる。あるいは、分散された色素は、下記のような別のポリマーでコートされうる。
【００７５】
典型的にはポリマー分散剤と併用されない色素および自己分散色素ならびに他の微粒子効果剤においては、粒子は当該技術分野で既知の粒子コーティング方法を用いてポリマーでコートされうる。典型的には、コーティング粒子において用いられる方法は、ポリマーコーティング溶液の粒子表面上への適用とそれに続く溶媒の除去に依存する溶液に基づく方法である。例えば、微粒子効果剤は、粒子をポリマーを含有する溶液と粒子をコーティングするのに十分な時間、単純に混合し、次いで溶媒を除去することにより、ポリマーでコートされうる。さらに、微粒子効果剤は、例えばギグノン（Ｇｕｉｇｎｏｎ）ら（Ｄｒｙｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４１９−４４７頁（２００２年））により記載されたスプレーコーティング技術を用いてポリマーでコートされうる。コーティングはまた、ヴルスター（Ｗｕｒｓｔｅｒ）コーター（例えば、カルドゾ（Ｃａｒｄｏｚｏ）ら、米国特許出願公開第２００６／００１９８６０号明細書を参照）を用いて適用されうる。本発明の微粒子効果剤は、ロスカ（Ｒｏｓｃａ）ら（ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ）９９：２７１−２８０頁（２００４年））で記載のように乳化−溶媒蒸発技術を用いてもポリマーコーティング可能である。さらに、微粒子効果剤は、シュール（Ｓｃｈｕｒｒ）によって記載されたインジェクター・ミキサー（ｉｎｊｅｃｔｏｒ  ｍｉｘｅｒ）の方法および装置（米国特許第４，４３０，００１号明細書および国際公開第９７／００７８７９号パンフレット）を用いてポリマーでコートされうる。インジェクター・ミキサーの方法においては、ガス注入器内でコーティング液体の噴霧化および粒子の分散を同時に行うことにより、少ないレベルの添加物がパウダーと激しく混合される。この方法は、少ない水の使用および非常に短時間の接触時間の利点をもたらし、それにより高温での熱感受性材料のコーティングが可能になる。
【００７６】
ポリマー結合ペプチドの同定
本明細書中でポリマー結合ペプチド（ＰＢＰ）とも称される、ポリマーに対して親和性を有するペプチドは、ポリマー表面に強力に結合するペプチド配列である。本発明のポリマー結合ペプチドは、約７アミノ酸長〜約５０アミノ酸長、より好ましくは約７アミノ酸長〜約２５アミノ酸長、最も好ましくは約７〜約２０アミノ酸長である。適切なポリマー結合ペプチドは、当該技術分野で周知の方法を用いて選択されうる。
【００７７】
オブライエン（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ）ら（同時係属および共同所有の米国特許出願公開第２００５／００５４７５２号明細書）、アベイ（Ａｄｅｙ）ら（ジーン（Ｇｅｎｅ）１５６：２７−３１頁、（１９９５年））、マレイ（Ｍｕｒｒａｙ）ら（米国特許出願公開第２００２／００９８５２４号明細書）およびグリンスタッフ（Ｇｒｉｎｓｔａｆｆ）ら（米国特許出願公開第２００３／０１８５８７０号明細書）（これらすべては参照により本明細書中に援用される）で記載のように、ポリマー結合ペプチドはランダムに生成され、次いで特定のポリマー基質に対し、目的の基質に対するその結合親和性に基づいて選択されうる。ペプチドのランダムライブラリーの生成は周知であり、かつ細菌ディスプレイ（ケンプ，Ｄ．Ｊ．（Ｋｅｍｐ，Ｄ．Ｊ．）；プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）７８（７）：４５２０−４５２４頁（１９８１年）、およびヘルフマン（Ｈｅｌｆｍａｎ）ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８０（１）：３１−３５頁、（１９８３年））、酵母ディスプレイ（チェン（Ｃｈｉｅｎ）ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８８（２１）：９５７８−８２頁（１９９１年））、コンビナトリアル固相ペプチド合成（米国特許第５，４４９，７５４号明細書、米国特許第５，４８０，９７１号明細書、米国特許第５，５８５，２７５号明細書、米国特許第５，６３９，６０３号明細書）、ならびにファージディスプレイ技術（米国特許第５，２２３，４０９号明細書、米国特許第５，４０３，４８４号明細書、米国特許第５，５７１，６９８号明細書、米国特許第５，８３７，５００号明細書）を含む種々の技術によって実施可能である。かかる生体ペプチドライブラリーを生成するための技術は当該技術分野で周知である。典型的な方法は、ダニ，Ｍ．（Ｄａｎｉ，Ｍ．）、ジャーナル・オブ・リセプター・アンド・シグナル・トランスダクション・リサーチ（Ｊ．ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＆  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．）、２１（４）：４４７−４６８頁（２００１年）、シドゥ（Ｓｉｄｈｕ）ら、メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）３２８：３３３−３６３頁（２０００年）、ケイ（Ｋａｙ）ら、コンビナトリアル・ケミストリー・アンド・ハイスループット・スクリーニング（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）、第８巻：５４５−５５１頁（２００５年）、および「ファージディスプレイ・オブ・ペプチド・アンド・プロテイン、ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、ブライアンＫ．ケイ（Ｂｒｉａｎ  Ｋ．Ｋａｙ）、ジル・ウィンター（Ｊ��ｌｌ  Ｗｉｎｔｅｒ）、およびジョン・マッカファーティ（Ｊｏｈｎ  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）編；アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９６年において記載されている。さらに、ファージディスプレイライブラリーは、ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）（ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、マサチューセッツ州）などの企業から市販されている。
【００７８】
ペプチドをランダムに生成するための好ましい方法は、ファージディスプレイによるものである。ファージディスプレイはインビトロ選択技術であり、ここでは、ペプチドまたはタンパク質がバクテリオファージのコートタンパク質に遺伝的に融合される結果、融合ペプチドがファージビリオンの外表面上に提示される一方、融合体をコードするＤＮＡはビリオン内部に存在する。提示ペプチドとそれをコードするＤＮＡの間のこの物理的な連結により、膨大な数のペプチド変異体のスクリーニングが可能になり、ここで各々は「バイオパニング」と称される単純なインビトロ選択手順により対応するＤＮＡ配列に連結される。その最も単純な形態では、バイオパニングは、ファージに提示された変異体のプールとプレートまたはビーズ上に固定化されている目的の標的とのインキュベーション、未結合のファージの流出、および特異的に結合されたファージのファージと標的との間の結合相互作用の破壊による溶出によって行われる。次いで、溶出されたファージはインビボで増幅され、プロセスが繰り返される結果、最も強固な結合配列のためにファージプールが段階的に濃縮される。３回以上の選択／増幅後、個々のクローンはＤＮＡ配列決定によって特徴づけられる。
【００７９】
具体的には、ポリマー結合ペプチドは、以下の方法を用いて選択されうる。ファージペプチドの適切なライブラリーは、上記の方法を用いて生成されるかまたはライブラリーは供給業者から購入される。ファージペプチドのライブラリーが生成された後、ライブラリーは適量のポリマー基質と接触される。ファージペプチドのライブラリーは、基質と接触させるために適切な溶液中に溶解される。試験基質は、溶液中に懸濁されうるかまたはプレートまたはビーズ上に固定化されうる。好ましい溶液は、界面活性剤を含有する緩衝化された生理食塩水溶液である。適切な溶液は、０．５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０を有するトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）である。ペプチドのポリマー基質への物質移動速度を高めるために溶液を任意の手段によってさらに撹拌することで、結合を最大に至らせるのに必要な時間を短縮することが可能である。
【００８０】
接触時に多数のランダムに生成されたファージペプチドがポリマー基質に結合することで、ファージペプチド−ポリマー複合体が形成されることになる。未結合のファージペプチドは、洗浄により除去されうる。あらゆる未結合の材料が除去された後、ポリマー基質に対して様々な程度の結合親和性を有するファージペプチドは、様々なストリンジェンシーを有する緩衝液中での選択された洗浄により断片化されうる。使用される緩衝液のストリンジェンシーを高めると、ファージペプチド−基質複合体におけるファージペプチドとポリマー基質の間の求められる結合力が高まる。
【００８１】
多数の物質を用いることで、限定はされないが、酸性ｐＨ（１．５〜３．０）；塩基性ｐＨ（１０〜１２．５）を含む、選択ペプチドにおける緩衝溶液のストリンジェンシー；ＭｇＣｌ２（３〜５Ｍ）およびＬｉＣｌ（５〜１０Ｍ）；水；エチレングリコール（２５〜５０％）；ジオキサン（５〜２０％）；チオシアネート（１〜５Ｍ）；グアニジン（２〜５Ｍ）；尿素（２〜８Ｍ）などの高塩濃度；ならびに、ＳＤＳ（ナトリウムドデシルサルフェート）、ＤＯＣ（デオキシコール酸ナトリウム）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０（ここではトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０が好ましい）などの異なる界面活性剤の様々な濃度を変化させることが可能である。これらの物質は、限定はされないが、トリス−ＨＣｌ、トリス緩衝生理食塩水、トリス−ホウ酸塩、トリス−酢酸、トリエチルアミン、リン酸塩緩衝液、およびグリシン−ＨＣｌ（ここではトリス緩衝生理食塩溶液が好ましい）を含む緩衝溶液中で調製可能である。
【００８２】
ポリマー基質に対して高まった結合親和性を有するファージペプチドが、ストリンジェンシーが高まった状態の緩衝液を用いる選択プロセスを繰り返すことによって溶出可能であることが理解されるであろう。溶出されたファージペプチドを、当該技術分野で既知の任意の手段によって同定し配列決定してもよい。
【００８３】
一実施形態では、本発明のポリマー結合ペプチドを生成するための以下の方法が用いられうる。コンビナトリアルに生成されたファージペプチドのライブラリーが目的のポリマー基質と接触されることで、ファージペプチド−基質複合体が形成される。ファージペプチド−基質複合体は、不完全なペプチドおよび未結合の基質から分離され、かつファージペプチド−基質複合体に由来する結合されたファージペプチドは、好ましくは酸処理により複合体から溶出される。次いで、溶出されたファージペプチドは同定され、配列決定される。あるポリマー基質に結合しても別の基質に結合しないペプチド配列を同定するため、サブトラクティブ（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ）なパニングステップの追加が可能である。具体的には、コンビナトリアルに生成されたファージペプチドのライブラリーが最初に非標的と接触されることで、それに結合するファージペプチドが除去される。次いで、非結合ファージペプチドは所望のポリマー基質と接触され、上記プロセスが続く。あるいは、コンビナトリアルに生成されたファージペプチドのライブラリーは、非標的および所望のポリマー基質と同時に接触されうる。次いで、ファージペプチド−基質複合体はファージペプチド−非標的複合体から分離され、所望のファージ−基質複合体において上記の方法が続く。
【００８４】
あるいは、ポリマー基質に対する親和性が高まった状態のペプチドを単離するための改良されたファージディスプレイスクリーニング方法が用いられうる。改良された方法では、ファージペプチド−基質複合体は上記のように形成される。次いで、これらの複合体は溶出緩衝液で処理される。上記の溶出緩衝液のいずれかの使用が可能である。好ましくは、溶出緩衝液は酸性溶液である。次いで、残存する溶出に耐性を有するファージペプチド−基質複合体を用い、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８などの細菌宿主細胞に直接感染または形質移入する。感染された宿主細胞は、ＬＢ（ルリア−ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ））培地などの適切な成長培地内で成長され、かつこの培養物はＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）およびＳ−Ｇａｌ（商標）を有するＬＢ培地などの適切な成長培地を有する寒天上に延展される。成長後、プラークはＤＮＡの単離および配列決定のために採取され、目的の基質に対して高い結合親和性を有するペプチド配列が同定される。あるいは、ＰＣＲを用い、上記の改良されたファージディスプレイスクリーニング方法から、溶出に耐性を有するファージペプチドを、ジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）ら、米国特許出願公開第２００３／０１５２９７６号明細書（参照により本明細書中に援用される）で記載のように適切なプライマーを用いてファージペプチド−基質複合体上でＰＣＲを直接実施することにより同定可能である。
【００８５】
さらに、シャンプーに耐性を有するポリマー結合ペプチドを、シャンプーに耐性を有する毛髪結合ペプチドの選択を目的に改良されたバイオパニング方法を用いて選択可能であり、それはオブライエン（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ）らにより記載されている（同時係属および共同所有の米国特許出願公開第２００６／００７３１１１号明細書、参照により本明細書中に援用）。同様に、ヘアコンディショナーに耐性を有するポリマー結合ペプチドは、ヘアコンディショナーに耐性を有する毛髪結合ペプチドの選択を目的に改良された方法を用いて同定可能であり、それはワン（Ｗａｎｇ）らにより記載されている（同時係属および共同所有の米国特許出願第１１／３５９１６３号明細書）。シャンプーおよびヘアコンディショナーに耐性を有するポリマー結合ペプチドは、各々シャンプーまたはヘアコンディショナー処理に耐える能力があることから、毛髪の処理において特に有用である。シャンプーまたはヘアコンディショナーに耐性を有するポリマー結合ペプチドを同定するための方法では、ファージペプチドの初期ライブラリーは、ポリマー基質と接触するために目的のマトリックス（すなわち、シャンプーマトリックスまたはヘアコンディショナーマトリックス）中に溶解される。あるいは、ファージペプチド−基質複合体は、上記のようにポリマー基質とファージペプチドのライブラリーとの接触による形成後、目的のマトリックスと接触される。ファージペプチド−基質複合体と目的のマトリックスとの接触は１回もしくはそれ以上の回数繰り返されうる。それに続くバイオパニング方法は、上記のように行われる。シャンプーマトリックスまたはヘアコンディショナーマトリックスは、フルストレングス（ｆｕｌｌ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）の製品またはその希釈物でありうる。シャンプーに耐性を有するポリメタクリル酸メチル結合ペプチドの選択についての詳細な説明が実施例２１で示される。
【００８６】
上記の方法を用いて同定されたポリマー結合ペプチドの適切な例は、限定はされないが、配列番号１〜１４で与えられるポリメタクリル酸メチル結合ペプチド、配列番号９８〜１１２で与えられるシャンプーに耐性を有するポリメタクリル酸メチル結合ペプチド、配列番号１５〜２１で与えられるポリプロピレン結合ペプチド、配列番号２２〜３０で与えられるポリテトラフルオロエチレン結合ペプチド、配列番号３１〜３６で与えられるナイロン結合ペプチド、配列番号３７〜４３で与えられるポリエチレン結合ペプチド、および配列番号４４〜４６で与えられるポリスチレン結合ペプチドを含む。さらに、アデイ（Ａｄｅｙ）らにより開示されたポリスチレンおよびポリ塩化ビニル結合ペプチド（ジーン（Ｇｅｎｅ）１５６：２７−３１頁、（１９９５年））、マレイ（Ｍｕｒｒａｙ）らにより開示されたポリウレタン結合ペプチド（米国特許出願公開第２００２／００９８５２４号明細書）、オブライエン（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ）らにより開示されたポリエチレンテレフタレート結合ペプチド（同時係属および共同所有の米国特許出願公開第２００５／００５４７５２号明細書）、ならびにグリンスタッフ（Ｇｒｉｎｓｔａｆｆ）らにより開示されたポリスチレン、ポリウレタン、ポリカーボネート、およびナイロン結合ペプチド（米国特許出願公開第２００３／０１８５８７０号明細書）など、当該技術分野で既知のポリマー結合ペプチドの使用が可能である。２つもしくはそれ以上のポリマー結合ペプチドを直接にまたはスペーサーを介して互いに連結し、ペプチドとポリマー基質との相互作用を高めることが望ましい場合がある。複数のペプチド組成物および適切なスペーサーを調製するための方法が下記に示される。
【００８７】
ポリマー結合ペプチドの生成
本発明のポリマー結合ペプチドは、標準のペプチド合成方法を用いて調製可能であり、それは当該技術分野で周知である（例えば、スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら、「ソリッド・フェーズ・ペプチド・シンセシス（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、ピアス・ケミカル（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ州、１９８４年；ボダンスキー（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）、「プリンシプル・オブ・ペプチド・シンセシス（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、シュプリンガー−フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク（ＮｅｗＹｏｒｋ）、１９８４年；およびペニントン（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ）ら、「ペプチド・シンセシス・プロトコール（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）、ニュージャージー州、１９９４年を参照）。さらに、多数の企業がカスタムのペプチド合成サービスを提供している。
【００８８】
あるいは、本発明のポリマー結合ペプチドは、組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を用いて調製可能である。ポリマー結合ペプチドのコード遺伝子は、ファン（Ｈｕａｎｇ）ら（米国特許出願公開第２００５／００５０６５６号明細書）およびオブライエン（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ）ら（上記）で記載のように、異種の宿主細胞内、特に微生物宿主の細胞内で生成可能である。ペプチドは、組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術によって調製される場合、Ｎ末端でプロリン（Ｐ）残基および場合によりＣ末端でアスパラギン酸（Ｄ）残基をさらに含んでなる場合がある。これらの付加残基はＤＰ切断部位の使用に起因することから、所望のペプチド配列は封入体形成の促進に用いられるペプチドタグ、およびペプチド配列の縦列反復の間から分離される（実施例１８を参照）。
【００８９】
体表面結合ペプチド
ポリマー結合ペプチドは、限定はされないが、毛髪および皮膚結合ペプチドを含む体表面結合ペプチドと併用されうる。本明細書中で定義される体表面結合ペプチド（ＢＳＢＰ）は、体表面に対して高い親和性で結合するペプチド配列である。体表面結合ペプチドは、上記およびファン（Ｈｕａｎｇ）ら（同時係属および共同所有の米国特許出願公開第２００５／００５０６５６号明細書および米国特許出願公開第２００５／０２２６８３９号明細書）、エステル（Ｅｓｔｅｌｌ）ら（国際公開第０１７９４７９号パンフレット）；マレイ（Ｍｕｒｒａｙ）ら（米国特許出願公開第２００２／００９８５２４号明細書）；ジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）ら、（米国特許出願公開第２００３／０１５２９７６号明細書）；およびジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）ら、（国際公開第０４０４８３９９号パンフレット）で記載のコンビナトリアルな方法を用いて生成されうる。さらに、シャンプーに耐性を有する毛髪結合ペプチドは、同時係属および共同所有の米国特許出願公開第２００６／００７３１１１号明細書中のオブライエン（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ）らにより記載の改良されたバイオパニング方法を用いて選択されうる。同様に、ヘアコンディショナーに耐性を有する毛髪結合ペプチドおよびスキンケア組成物に耐性を有する皮膚結合ペプチドは、それぞれワン（Ｗａｎｇ）ら（同時係属および共同所有の米国特許出願第１１／３５９１６３号明細書）およびワン（Ｗａｎｇ）ら（同時係属および共同所有の米国特許出願第１１／３５９１６２号明細書）で記載の方法を用いて同定されうる。それらの方法では、ファージペプチドの初期ライブラリーのいずれかは、基質との接触のために目的のマトリックス（すなわち、シャンプーマトリックス、ヘアコンディショナーマトリックス、またはスキンケア組成物マトリックス）中に溶解されるか、あるいはファージペプチド基質複合体は、上記のように基質とファージペプチドのライブラリーとの接触により形成されてから目的のマトリックスと接触される。それに続くバイオパニング方法は、上記のように行われる。シャンプーマトリックス、ヘアコンディショナーマトリックス、またはスキンケア組成物マトリックスは、フルストレングスの製品またはその希釈物でありうる。適切なコンビナトリアルに生成された体表面結合ペプチドの例として、限定はされないが、配列番号４７〜５２および７３〜８１として与えられる毛髪結合配列、ならびに配列番号５３〜５７および８２〜９３として与えられる皮膚結合配列が挙げられる（表Ａ参照）。これらの体表面結合ペプチドは、上記の方法を用いて調製されうる。
【００９０】
あるいは、毛髪および皮膚結合ペプチド配列は、ローズ（Ｒｏｔｈｅ）ら（国際公開第２００４／０００２５７号パンフレット）で記載のように、静電相互作用を介して毛髪および皮膚に結合可能である正に帯電したアミノ酸を含んでなるペプチドの設計により実験的に生成されうる。実験的に生成された毛髪および皮膚結合ペプチドは、約７アミノ酸〜約５０アミノ酸を有し、かつ、リジン、アルギニン、およびヒスチジンなど、少なくとも約４０モル％の正に帯電したアミノ酸を含んでなる。ＨＲＫ、ＲＨＫ、ＨＫＲ、ＲＫＨ、ＫＲＨ、ＫＨＲ、ＨＫＸ、ＫＲＸ、ＲＫＸ、ＨＲＸ、ＫＨＸおよびＲＨＸなどのトリペプチドモチーフを含有するペプチド配列が、Ｘが任意の天然アミノ酸でありうるが最も好ましくはグリシン、アラニン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびフェニルアラニンなどの中性側鎖アミノ酸から選択される場合、最も好ましい。さらに、ペプチド配列が、配合された生成物中での溶解度、粘度および他の成分との相溶性における要件を含む、エンドユースにおける他の機能的要件を満たさなければならず、それ故に用途における需要に応じて変化することになることは理解されるべきである。いくつかの場合では、ペプチドは最大６０モル％のアミノ酸を含有し、ヒスチジン、リジンまたはアルギニンを含有しない場合がある。適切な実験的に生成された毛髪および皮膚結合ペプチドは、限定はされないが、配列番号５８〜６２として与えられるペプチド配列を含む（表Ａ参照）。
【００９１】
【表２】
2009508870.tif 000004
【００９２】
【表３】
2009508870.tif 000005
【００９３】
体表面結合ペプチドは、本発明のポリマー結合ペプチドとの併用により、様々な意味で粒子ベースの効果剤の効果の促進が可能である。体表面結合ペプチドは、下記のとおり、ポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物に添加されうる。あるいは、ポリマー結合ペプチドに共役された体表面結合ペプチドを含んでなる複合体が使用されうる。共役相互作用は、共有結合または水素結合、静電相互作用、疎水性相互作用、またはファンデルワールス相互作用などの非共有相互作用でありうる。非共有相互作用の場合、ペプチドベースの複合体は、体表面結合ペプチドをポリマー結合ペプチドおよび任意のスペーサーと混合し、相互作用の発生にとっての十分な時間を確保することにより調製されうる。未結合の材料は、当該技術分野で既知の方法、例えばクロマトグラフィー法を用い、生成されたペプチドベースの複合体から分離されうる。
【００９４】
ペプチドベースの複合体は、米国特許出願公開第２００５／００５０６５６号明細書中でファン（Ｈｕａｎｇ）らによって記載のように、特定の体表面結合ペプチド、例えば毛髪または皮膚結合ペプチドをポリマー結合ペプチドに直接にまたは分子スペーサーを介して共有結合することによっても調製可能である。任意の適切な既知のペプチドまたはタンパク質とのコンジュゲーションケミストリー（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を用い、本発明のペプチドベースの複合体の形成が可能である。コンジュゲーションケミストリーは当該技術分野で周知である（例えば、ハーマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、「バイオコンジュゲート・テクニックス（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９９６年）を参照）。適切なカップリング剤は、限定はされないが、カルボジイミドカップリング剤、酸塩化物、イソシアネート、エポキシド、マレイミド、ならびにペプチド上の末端アミン基および／またはカルボキシル酸基、および水硫基に向けて反応性を示す他の機能的カップリング試薬を含む。さらに、ペプチド上の反応性のアミンまたはカルボキシル酸基を保護し、ペプチドベースの複合体にとって所望の構造を生成することが必要な場合がある。ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）などのアミノ酸における保護基の使用は当該技術分野で周知である（例えば、スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら、上記；ボダンスキー（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）、上記；およびペニントン（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ）ら、上記を参照）。
【００９５】
体表面結合ペプチドをポリマー結合ペプチドに分子スペーサーを介して共役することが望ましい場合もある。スペーサーは、ペプチド配列を分離し、それらがペプチドの体表面またはポリマーでコートされた効果剤への結合に干渉しないことを保証するのに役立つ。分子スペーサーは、アルキル鎖、フェニル化合物、エチレングリコール、アミド、エステルなどの種々の分子のいずれかでありうる。好ましいスペーサーは、親水性を示し、１〜約１００個の原子、より好ましくは２〜約３０個の原子の鎖長を有する。好ましいスペーサーの例として、限定はされないが、エタノールアミン、エチレングリコール、６個の炭素原子の鎖長を有するポリエチレン、３〜６個の反復単位を有するポリエチレングリコール、フェノキシエタノール、プロパノールアミド、ブチレングリコール、ブチレングリコールアミド、プロピルフェニル鎖、ならびにエチル、プロピル、ヘキシル、ステリル（ｓｔｅｒｙｌ）、セチル、およびパルミトイルアルキル鎖が挙げられる。分子スペーサーは、上記のカップリング化学物質（ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ）のいずれかを用いてペプチドに共有結合しうる。スペーサーの取り込みを促進するため、ペプチドに共役するためにスペーサーおよび反応基を両末端に有する二官能性カップリング剤の使用が可能である。適切な二官能性カップリング剤は当該技術分野で周知であり、かつ、限定はされないが、１，６−ジアミノヘキサンなどのジアミン；グルタルアルデヒドなどのジアルデヒド；エチレングリコール−ビス（コハク酸Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル）、ジサクシニミジルグルタレート、ジサクシニミジルスベレート、およびエチレングリコール−ビス（サクシニミジルサクシネート）などのビスＮ−ヒドロキシサクシニミドエステル；ヘキサメチレンジイソシアネートなどのジイソシアネート；１，４ブタネジイルジグリシジルエーテルなどのビスオキシラン；サクシニルジサリシレート（ｓｕｃｃｉｎｙｌｄｉｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）などのジカルボキシル酸などを含む。異なる反応基を各末端に有するヘテロ二官能性カップリング剤の使用も可能である。
【００９６】
さらに、分子スペーサーは、任意のアミノ酸およびその混合物を含んでなるペプチドでありうる。好ましいペプチドスペーサーは、アミノ酸のプロリン、リジン、グリシン、アラニン、およびセリン、ならびにそれらの混合物よりなる。ペプチドスペーサーは、１〜約５０アミノ酸長、好ましくは１〜約２０アミノ酸長でありうる。典型的なペプチドスペーサーは、限定はされないが、配列番号６３〜６５、および９４〜９７を含む。さらに、ペプチドスペーサーは、配列番号６６として与えられるプロテアーゼカスパーゼ３部位などの特定の酵素切断部位を有する場合があり、それは微粒子効果剤の体表面からの酵素的除去を可能にする。これらのペプチドスペーサーは、当該技術分野で既知の任意の方法により結合ペプチド配列に連結可能である。例えば、ペプチドベースの複合体全体は、上記の標準ペプチド合成方法を用いて調製されうる。さらに、結合ペプチドおよびペプチドスペーサーブロックは、カルボジイミドカップリング剤（例えば、ハーマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、「バイオコンジュゲート・テクニックス（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、アカデミック・プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９９６年）を参照）、二酸塩化物、ジイソシアネート、ならびにペプチド上の末端アミン基および／またはカルボキシル酸基に反応性を示す他の二官能性カップリング試薬を用いて結合されうる。あるいは、ペプチドベースの複合体全体は、上記の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を用いて調製されうる。スペーサーは、ペプチドスペーサー分子と有機スペーサー分子の組み合わせである場合もあり、それは上記の方法を用いて調製されうる。
【００９７】
ファン（Ｈｕａｎｇ）ら（米国特許出願公開第２００５／００５０６５６号明細書）で記載のように、互いに共役された体表面結合ペプチドおよびポリマー結合ペプチドの複数のコピーを有し、ペプチドベースの複合体とポリマーでコートされた効果剤と体表面との間の相互作用を高めることが望ましい場合もある。同じ体表面結合ペプチドおよびポリマー結合ペプチドの複数のコピーまたは異なる体表面結合ペプチドとポリマー結合ペプチドの組み合わせの使用が可能である。複数のコピーのペプチドベースの複合体は、上記のような様々なスペーサーを含んでなる場合がある。典型的な複数のコピーの表面結合ペプチド／／ポリマー結合ペプチド複合体は、配列番号６７〜７０として与えられる複数のコピーの毛髪結合ペプチド／／ポリマー結合ペプチド複合体を含むがこれらに限定されない。
【００９８】
本発明の一実施形態では、ペプチドベースの複合体は、体表面結合ペプチド（ＢＳＢＰ）およびポリマー結合ペプチド（ＰＢＰ）を含んでなるジブロック組成物であり、一般構造［（ＢＳＢＰ）ｍ−（ＰＢＰ）ｎ］ｘ（式中、ｎおよびｍは独立して１〜約１０、好ましくは１〜約５の範囲であり、かつｘは１〜約１０でありうる）を有する。
【００９９】
別の実施形態では、ペプチドベースの複合体は、上記のように体表面結合ペプチドをポリマー結合ペプチドから分離する分子スペーサー（Ｓ）を含んでなる。体表面結合ペプチドおよびポリマー結合ペプチドの複数のコピーは使用可能でもあり、かつ体表面結合ペプチドおよびポリマー結合ペプチドの複数のコピーは分子スペーサーによりそれら自体および相互から分離可能である。この実施形態では、ペプチドベースの複合体は、体表面結合ペプチド、スペーサー、およびポリマー結合ペプチドを含んでなるトリブロック組成物であり、一般構造［［（ＢＳＢＰ）ｍ−Ｓｑ］ｘ−［（ＰＢＰ）ｎ−Ｓｒ］ｚ］ｙ（式中、ｍ、ｎ、ｘおよびｚは独立して１〜約１０の範囲であり、ｙは１〜約５であり、かつｑおよびｒはｒとｑが両方とも０であることはないという条件で各々独立して０または１である）を有する。
【０１００】
別の実施形態では、体表面結合ペプチドは毛髪結合ペプチドであり、かつペプチドベースの複合体は、毛髪結合ペプチド（ＨＢＰ）およびポリマー結合ペプチド（ＰＢＰ）を含んでなるジブロック組成物であり、一般構造［（ＨＢＰ）ｍ−（ＰＢＰ）ｎ］ｘ（式中、ｎおよびｍは独立して１〜約１０、好ましくは１〜約５の範囲であり、かつｘは１〜約１０でありうる）を有する。
【０１０１】
別の実施形態では、体表面結合ペプチドは毛髪結合ペプチドであり、かつペプチドベースの複合体は、毛髪結合ペプチド（ＨＢＰ）、スペーサー（Ｓ）、およびポリマー結合ペプチド（ＰＢＰ）を含んでなるトリブロック組成物であり、一般構造［［（ＨＢＰ）ｍ−Ｓｑ］ｘ−［（ＰＢＰ）ｎ−Ｓｒ］ｚ］ｙ（式中、ｍ、ｎ、ｘおよびｚは独立して１〜約１０の範囲であり、ｙは１〜約５であり、かつｑおよびｒはｒとｑが両方とも０であることはないという条件で各々独立して０または１である
）を有する。
【０１０２】
別の実施形態では、体表面結合ペプチドは皮膚結合ペプチドであり、かつペプチドベースの複合体は、皮膚結合ペプチド（ＳＢＰ）およびポリマー結合ペプチド（ＰＢＰ）を含んでなるジブロック組成物であり、一般構造［（ＳＢＰ）ｍ−（ＰＢＰ）ｎ］ｘ（式中、ｎおよびｍは独立して１〜約１０、好ましくは１〜約５の範囲であり、かつｘは１〜約１０でありうる）を有する。
【０１０３】
別の実施形態では、体表面結合ペプチドは皮膚結合ペプチドであり、かつペプチドベースの複合体は、皮膚結合ペプチド（ＳＢＰ）、スペーサー（Ｓ）、およびポリマー結合ペプチド（ＰＢＰ）を含んでなるトリブロック組成物であり、一般構造［［（ＳＢＰ）ｍ−Ｓｑ］ｘ−［（ＰＢＰ）ｎ−Ｓｒ］ｚ］ｙ（式中、ｍ、ｎ、ｘおよびｚは独立して１〜約１０の範囲であり、ｙは１〜約５であり、かつｑおよびｒはｒとｑが両方とも０であることはないという条件で各々独立して０または１である）を有する。
【０１０４】
本明細書で用いられるＢＳＢＰ、ＨＢＰ、ＳＢＰ、およびＰＢＰが総称であり、かつ各々、単一の体表面結合ペプチド、毛髪結合ペプチド、皮膚結合ペプチド、またはポリマー結合ペプチド配列を示すことを意味しないことは理解されるべきである。上で用いられるｍ、ｎ、ｘまたはｚが１より大きい場合、異なる配列の一連の体表面結合ペプチド（例えば毛髪または皮膚結合ペプチド）および異なる配列のポリマー結合ペプチドが組成物の一部を形成しうる状況がもたらされることは、十分に本発明の範囲内である。さらに、「Ｓ」もまた総称であり、単一のスペーサーを示すことを意味しない。上で用いられるｑ、ｘ、ｒ、またはｚが１より大きい場合、多数の異なるスペーサーが組成物の一部を形成しうる状況がもたらされることは、十分に本発明の範囲内である。さらに、これらの構造が必ずしもペプチドと任意の分子スペーサーとの間の共有結合を示すとは限らないことは理解されるべきである。上記のように、ペプチドと任意のスペーサーとの間のカップリング相互作用は共有または非共有結合でありうる。
【０１０５】
ポリマー結合ペプチドを含んでなる組成物
ポリマーに対して親和性を有するペプチドは、水溶液またはパーソナルケア組成物などの様々な組成物から体表面に適用可能である。例えば、ポリマー結合ペプチドは、ポリマー結合ペプチドを含んでなる水溶液から毛髪に適用可能である。あるいは、ポリマー結合ペプチドは、ヘアケア組成物（下記）から毛髪に適用可能である。いずれの場合でも、ポリマー結合ペプチドは、組成物の総重量を基準にして約０．０１重量％〜約１０重量％、好ましくは約０．０１重量％〜約５重量％の濃度で組成物中で用いられる。適切なポリマー結合ペプチドは上記のとおりである。さらに、異なるポリマー結合ペプチドの混合物が組成物中で用いられうる。混合物中のペプチドは、薬効を軽減させるペプチド間の相互作用が全くないように選択される必要がある。ポリマー結合ペプチドの適切な混合物については、当業者により通常の実験を用いて決定されうる。ポリマー結合ペプチドの混合物が組成物中で用いられる場合、ポリマー結合ペプチドの総濃度は、組成物の総重量を基準にして約０．０１重量％〜約１０重量％である。
【０１０６】
別の実施形態では、毛髪結合ペプチドを、ポリマー結合ペプチドを含んでなる組成物に添加することが可能である。組成物中の毛髪結合ペプチドの濃度は、組成物の総重量を基準にして約０．０１％〜約１０％、好ましくは約０．０１％〜約５％である。さらに、異なる毛髪結合ペプチドの混合物の使用が可能である。もし毛髪結合ペプチドの混合物が用いられる場合、組成物中の毛髪結合ペプチドの総濃度は、組成物の総重量を基準にして約０．０１％〜約１０％、好ましくは約０．０１％〜約５％である。
【０１０７】
別の実施形態では、ポリマー結合ペプチドはペプチドベースの複合体の形態で用いられ、ここでポリマー結合ペプチドは上記のように毛髪結合ペプチドに共役される。
【０１０８】
ヘアケア組成物は、限定はされないが、シャンプー、コンディショナー、リンス、ローション、エアロゾル、ゲル、ムース、および毛髪染料を含む、毛髪を処理するための組成物として本明細書中で定義される。ヘアケア組成物は、ヘアケア組成物として美容的に許容できる媒体を含んでなる場合があり、その例は、例えば米国特許第６，２８０，７４７号明細書中でフィリップ（Ｐｈｉｌｉｐｐｅ）ら、米国特許第６，１３９，８５１号明細書中でオムラ（Ｏｍｕｒａ）ら、および米国特許第６，０１３，２５０号明細書中でキャネル（Ｃａｎｎｅｌｌ）ら（これらすべては参照により本明細書中に援用される）により記載されている。例えば、これらのヘアケア組成物は、水溶液、アルコール溶液または水性アルコール溶液であり、アルコールは好ましくは水性アルコール溶液における総重量を基準にして約１〜約７５重量％の割合のエタノールまたはイソプロパノールでありうる。さらに、ヘアケア組成物は、限定はされないが、抗酸化剤、保護剤、充填剤、界面活性剤、ＵＶＡおよび／またはＵＶＢサンスクリーン、香料、増粘剤、浸潤剤およびアニオン、非イオン性または両性ポリマー、ならびに染料または色素を含む、１つもしくはそれ以上の従来の化粧用または皮膚用の添加物またはアジュバントを含有しうる。
【０１０９】
同様に、ポリマー結合ペプチドは、ポリマー結合ペプチドを含んでなる水溶液から皮膚に適用可能である。あるいは、ポリマー結合ペプチドは、スキンケア組成物（下記）から皮膚に適用可能である。いずれの場合でも、皮膚結合ペプチドは、組成物の総重量を基準にして約０．０１重量％〜約１０重量％、好ましくは約０．０１重量％〜約５重量％の濃度で組成物中で用いられる。適切なポリマー結合ペプチドは上記のとおりである。さらに、異なるポリマー結合ペプチドの混合物が組成物中で用いられうる。混合物中のペプチドは、有益な効果を軽減させることになると思われるペプチド間の相互作用が全くないように選択される必要がある。ポリマー結合ペプチドの適切な混合物については、当業者により通常の実験を用いて決定されうる。ポリマー結合ペプチドの混合物が組成物中で用いられる場合、ペプチドの総濃度は組成物の総重量を基準にして約０．０１重量％〜約１０重量％である。
【０１１０】
別の実施形態では、皮膚結合ペプチドはポリマー結合ペプチドを含んでなる組成物に添加されうる。組成物中の皮膚結合ペプチドの濃度は、組成物の総重量を基準にして約０．０１％〜約１０％、好ましくは約０．０１％〜約５％である。さらに、異なる皮膚結合ペプチドの混合物が用いられうる。皮膚結合ペプチドの混合物が用いられる場合、組成物中の皮膚結合ペプチドの総濃度は、組成物の総重量を基準にして約０．０１％〜約１０％、好ましくは約０．０１％〜約５％である。
【０１１１】
別の実施形態では、ポリマー結合ペプチドはペプチドベースの複合体の形態で用いられ、ここでポリマー結合ペプチドは上記のように皮膚結合ペプチドに共役される。
【０１１２】
スキンケア組成物については、限定はされないが、スキンケア、スキンクレンジング、化粧品、サンスクリーン、および皺取り製品を含む、皮膚を処理するための組成物として本明細書中で定義される。スキンケア組成物は、スキンケア組成物用の美容的に許容できる媒体を含んでなる場合があり、その例は、例えばフィリップ（Ｐｈｉｌｉｐｐｅ）ら、上記により記載されている。例えば、美容的に許容できる媒体は、一般に組成物の総重量を基準にして約１０〜約９０重量％の割合で脂肪物質を含有する無水組成物である場合があり、ここで脂肪相は少なくとも１つの液体、固体または半固体の脂肪物質を含有する。脂肪物質は、限定はされないが、オイル、ワックス、ゴム、およびいわゆる粥状脂肪物質を含む。あるいは、組成物は油中水または水中油エマルジョンなどの安定なディスパージョンの形態でありうる。さらに、組成物は、限定はされないが、抗酸化剤、保護剤、充填剤、界面活性剤、ＵＶＡおよび／またはＵＶＢサンスクリーン、香料、増粘剤、浸潤剤およびアニオン、非イオン性または両性ポリマー、ならびに染料または色素を含む、１つもしくはそれ以上の従来の化粧用または皮膚用の添加物またはアジュバントを含有しうる。
【０１１３】
微粒子効果剤を体表面に適用するための方法
本発明の方法に従い、ポリマー結合ペプチドを用い、体表面上で、例えば、色素、微粒子コンディショナー、および無機サンスクリーンといった一般の微粒子効果剤の耐久性を高めることが可能である。本発明での使用においては、微粒子効果剤は上記のようにポリマーでコートされる。一般に、ポリマーでコートされた微粒子効果剤は、コートされた効果剤が体表面に結合しかつポリマー結合ペプチドが微粒子効果剤上のポリマーコーティングに結合するのに十分な時間、ポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物の前に、後に、またはそれと同時に体表面に適用される。微粒子効果剤を毛髪または皮膚に適用するための様々な方法が、下記により詳細に記載されている。
【０１１４】
一実施形態では、ポリマーでコートされた微粒子効果剤は毛髪に適用される。コートされた効果剤は、水溶液などの任意の適切な溶液または従来のヘアケア組成物、例えば着色組成物から毛髪に適用可能である。これらのヘアケア組成物は当該技術分野で周知であり、適切な組成物は上記のとおりである。ポリマーでコートされた微粒子効果剤は、微粒子効果剤が毛髪に結合するのに十分な時間、典型的には約５秒〜約６０分間毛髪上に残され、場合により毛髪をすすいで毛髪に結合されていない微粒子効果剤が除去されうる。次いで、ポリマーコーティングに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物が、ポリマー結合ペプチドがポリマーコーティングに結合するのに十分な時間、好ましくは約５秒〜約６０分間毛髪に適用される。ポリマー結合ペプチドを含んでなる組成物は、毛髪からすすがれるかまたは毛髪上に残される場合がある。
【０１１５】
別の実施形態では、ポリマーコーティングに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物が、ポリマー結合ペプチドが毛髪に結合するのに十分な時間、好ましくは約５秒〜約６０分間毛髪に適用される。ポリマー結合ペプチドを含んでなる未結合の組成物は、毛髪からすすがれるかまたは毛髪上に残される場合がある。次いで、ポリマーでコートされた微粒子効果剤は、微粒子効果剤がポリマー結合ペプチドに結合するのに十分な時間、典型的には約５秒〜約６０分間毛髪に適用される。場合により毛髪をすすぐことで、ポリマー結合ペプチドに結合されていない微粒子効果剤が除去されうる。
【０１１６】
別の実施形態では、ポリマーでコートされた微粒子効果剤およびポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物は同時に、微粒子効果剤が毛髪に結合しかつポリマー結合ペプチドが微粒子効果剤上のポリマーコーティングに結合するのに十分な時間、典型的には約５秒〜約６０分間毛髪に適用される。場合により、毛髪をすすぐことで、未結合の微粒子効果剤およびポリマー結合ペプチドを含んでなる組成物が毛髪から除去されうる。
【０１１７】
別の実施形態では、ポリマーでコートされた微粒子効果剤は、ポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物の一部として提供される。その実施形態では、微粒子効果剤およびポリマー結合ペプチドを含んでなる組成物は、微粒子効果剤が毛髪に結合しかつポリマー結合ペプチドが微粒子効果剤上のポリマーコーティングに結合するのに十分な時間、典型的には約５秒〜約６０分間毛髪に適用される。微粒子効果剤およびポリマー結合ペプチドを含んでなる組成物は、毛髪からすすがれるかまたは毛髪上に残される場合がある。
【０１１８】
別の実施形態では、ポリマーでコートされた微粒子効果剤は皮膚に適用される。コートされた効果剤は、水溶液などの任意の適切な溶液または従来のスキンケア組成物、例えば当該技術分野で周知の、皮膚着色剤、スキンコンディショナー、サンスクリーン、または同種のものから皮膚に適用可能である。ポリマーでコートされた微粒子効果剤は、微粒子効果剤が皮膚に結合するのに十分な時間、典型的には約５秒〜約６０分間皮膚上に残される。場合により、皮膚をすすぐことで、皮膚に結合していない微粒子効果剤が除去されうる。次いで、微粒子効果剤上のポリマーコーティングに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物が、ポリマー結合ペプチドがポリマーコーティングに結合するのに十分な時間、好ましくは約５秒〜約６０分間皮膚に適用される。ポリマー結合ペプチドを含んでなる組成物は、皮膚からすすがれるかまたは皮膚上に残される場合がある。
【０１１９】
別の実施形態では、ポリマーコーティングに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物が、ポリマー結合ペプチドが皮膚に結合するのに十分な時間、好ましくは約５秒〜約６０分間皮膚に適用される。ポリマー結合ペプチドを含んでなる組成物は、皮膚からすすがれるかまたは皮膚上に残される場合がある。次いで、ポリマーでコートされた微粒子効果剤は、微粒子効果剤がポリマー結合ペプチドに結合するのに十分な時間、典型的には約５秒〜約６０分間皮膚に適用される。場合により、皮膚をすすぐことで、ポリマー結合ペプチドに結合されていない微粒子効果剤が除去されうる。
【０１２０】
別の実施形態では、ポリマーでコートされた微粒子効果剤およびポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物は同時に、微粒子効果剤が皮膚に結合しかつポリマー結合ペプチドが微粒子効果剤上のポリマーコーティングに結合するのに十分な時間、典型的には約５秒〜約６０分間皮膚に適用される。場合により、皮膚をすすぐことで、未結合の微粒子効果剤およびポリマー結合ペプチドを含んでなる組成物が皮膚から除去されうる。
【０１２１】
別の実施形態では、ポリマーでコートされた微粒子効果剤は、ポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物の一部として提供される。その実施形態では、微粒子効果剤およびポリマー結合ペプチドを含んでなる組成物は、微粒子効果剤が皮膚に結合しかつポリマー結合ペプチドが微粒子効果剤上のポリマーコーティングに結合するのに十分な時間、典型的には約５秒〜約６０分間皮膚に適用される。微粒子効果剤およびポリマー結合ペプチドを含んでなる組成物は、皮膚からすすがれるかまたは皮膚上に残される場合がある。
【０１２２】
上記の方法のいずれにおいても、ポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物は、効果剤の耐久性をさらに高めるため、ポリマーでコートされた微粒子効果剤を含んでなる組成物およびポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物の適用後、場合により体表面に再適用可能である。
【０１２３】
さらに、上記の方法のいずれにおいても、ポリマーシーラントを含んでなる組成物が、効果剤の耐久性をさらに高めるため、ポリマーでコートされた微粒子効果剤を含んでなる組成物およびポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物の適用後、場合により体表面に適用可能である。ポリマーシーラントを含んでなる組成物は、ポリマーシーラントを含んでなる水溶液あるいはヘアケアまたはスキンケア組成物でありうる。典型的には、ポリマーシーラントは、組成物の総重量を基準にして約０．２５重量％〜約１０重量％の濃度で組成物中に存在する。ポリマーシーラントは、パーソナルケア製品に関する当該技術分野で周知であり、かつ、限定はされないが、ポリ（アリルアミン）、アクリレート、アクリレートコポリマー、メタクリレート、メタクリレートコポリマー、ポリウレタン、カルボマー、メチコン、アモジメチコン、ポリペプチド、ポリエチレングリコール、蜜ろう、シロキサンなどを含む。ポリマーシーラントの選択は、用いられる特定の微粒子効果剤およびポリマー結合ペプチドに依存ずる。最適なポリマーシーラントは、当業者により通常の実験を用いて容易に決定されうる。
【０１２４】
パーソナルケア組成物
本発明は、ポリマーでコートされた微粒子効果剤およびポリマーに対して親和性を有するペプチドを含んでなる組成物を含んでなるパーソナルケア組成物も提供する。パーソナルケア組成物は、上記のヘアケアおよびスキンケア組成物など、体表面に適用することで美容的または予防的効果がもたらされる任意の組成物でありうる。
【実施例】
【０１２５】
本発明は、以下の実施例においてさらに規定される。これらの実施例が本発明の好ましい実施形態を示す一方であくまで例示目的で示されることが理解されるべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明における本質的な特性を確認でき、かつ、その趣旨および範囲から逸脱することなく本発明の様々な変更および改良を行い、様々な用途および条件にそれを適合させることができる。
【０１２６】
用いられる略語の意味は以下のとおりである。すなわち、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｃｍ」はセンチメートルを意味し、「μｍ」はマイクロメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「ｒｐｍ」は毎分回転数を意味し、「ｐｆｕ」はプラーク形成単位を意味し、「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを意味し、「ＥＬＩＳＡ」は酵素結合免疫吸着アッセイを意味し、「ＩＰＴＧ」はイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを意味し、「Ａ」は吸光度を意味し、「Ａ４５０」は４５０ｎｍの波長で測定された吸光度を意味し、「ＴＢＳ」はトリス緩衝生理食塩水を意味し、「ＴＢＳＴ−Ｘ」は「Ｘ」がトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０の重量パーセントである場合でトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０を含有するトリス緩衝生理食塩水を意味し、「Ｘｇａｌ」は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを意味し、「ＳＥＭ」は平均値の標準誤差を意味し、「ｖｏｌ％」は容量パーセントを意味し、「ａｔｍ」は大気を意味し、「ｋＰａ」はキロパスカルを意味し、「ＳＬＰＭ」は１分当たりの標準リットルを意味し、「ｐｓｉ」は１平方インチ当たりのポンドを意味し、「ＲＣＦ」は相対遠心力を意味する。
【０１２７】
一般的方法
実施例で用いられる標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、サムブルック，Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッチ，Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス，Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州、１９８９年、Ｔ．Ｊ．シルハヴィ（Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベナン（Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ）およびＬ．Ｗ．エンキスト（Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ）、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州、１９８４年、およびアウスベルＦ．Ｍ．（ＡｕｓｕｂｅｌＦ．Ｍ．）ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ・アンド・ウイリー・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク州、１９８７年で記載されている。
【０１２８】
細菌培養物の維持および成長に適する材料および方法もまた当該技術分野で周知である。以下の実施例における使用に適する技術については、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、フィリップ  ゲルハート（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレイ（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ  Ｎ．コスティロー（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージン  Ｗ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリス  Ａ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエル  Ｒ．クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）およびＧ．ブリッグス  フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、アメリカ微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントンＤＣ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ）、１９９４年、またはトーマス  Ｄ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版、シナウアー・アソシエイツ（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）、マサチューセッツ州、１９８９年において見出されうる。
【０１２９】
細菌細胞の成長および維持において用いられるすべての試薬、制限酵素および物質を、他に指定がない限り、アルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）、ウィスコンシン州）、ＢＤ  ダイアグノスティック・システムズ（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（スパークス（Ｓｐａｒｋｓ）、メリーランド州）、ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ロックヴィル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド州）、またはシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ミズーリ州）から入手した。
【０１３０】
ファージディスプレイペプチドライブラリー
以下の実施例では、６つのファージディスプレイペプチドライブラリーを用いた。３つのペプチドライブラリー、すなわちＰｈ．Ｄ．（商標）−１２ファージディスプレイペプチドライブラリーキット（１２−ｍｅｒの線形ペプチドライブラリー）、Ｐｈ．Ｄ．（商標）−７ファージディスプレイライブラリーキット（７−ｍｅｒの線形ペプチドライブラリー）、およびＰｈ．Ｄ．（商標）−Ｃ７Ｃファージディスプレイライブラリーキット（７−ｍｅｒの拘束された（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチドライブラリー）を、ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）（ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、マサチューセッツ州）から購入した。これらのキットは、Ｍ１３ファージの小コートタンパク質（ｐＩＩＩ）に融合されたランダムペプチド７または１２−ｍｅｒのコンビナトリアルライブラリーに基づくものであった。３つ全部のライブラリー内のランダム化されたペプチド配列が小コートタンパク質ｐＩＩＩのＮ末端で発現される結果、ビリオン当たり、提示ペプチドにおける結合価が５価のコピーが生成される。Ｐｈ．Ｄ．−７およびＰｈ．Ｄ．−１２ライブラリーの双方ではペプチド−ｐＩＩＩ融合体の第１の残基が第１のランダム化された位置である一方、Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃライブラリー内の第１のランダム化された位置に対してＡｌａ−Ｃｙｓが先行する。すべてのライブラリーは、提示ペプチドとｐＩＩＩの間に４つのアミノ酸からなる短いリンカー配列を有する。Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃライブラリーのランダム化されたセグメントに１対のシステイン残基が隣接し、それらはジスルフィド結合へのファージ構築の間に酸化され、結果として提示ペプチドがループとして標的に提示される。３つ全部のライブラリーは約３×１０９の配列よりなる。容量１０μＬには、各ペプチド配列の約５５のコピーが含有される。
【０１３１】
３つの他のファージディスプレイペプチドライブラリー、すなわち、１５−ｍｅｒのランダムな線形ペプチド配列を有するもの、２０−ｍｅｒのランダムな線形ペプチド配列を有する別のもの、位置３および１１にシスチン残基を有する１４−ｍｅｒのジスルフィドで拘束されたランダムなペプチド配列を有する３番目を、ケイ（Ｋａｙ）らにより記載の方法（コンビナトリアル・ケミストリー・アンド・ハイスループット・スクリーニング（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）、第８巻、５４５−５５１頁（２００５年））を用いて調製した。この方法は、大腸菌株ＣＪ２３６（ｄｕｔ−  ｕｎｇ−）を用いてウリジンを有する一本鎖ファージミドＤＮＡ（Ｕ−ｓｓＤＮＡ）が生成されるという、シドゥ（Ｓｉｄｈｕ）らにより報告された方法（メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）  ３２８：３３３−３６３頁（２０００年））を改良したものである。このＤＮＡは、第二鎖のプライマーとしてだけでなくランダムアミノ酸をコードするものを挿入するための、オリゴヌクレオチドを用いる第二鎖合成用の鋳型として用いられた。第二鎖合成の完了時、二本鎖（ｄｓＤＮＡ）は野生型株に形質転換された。任意のＵ−ｓｓＤＮＡが宿主細胞によって分解され、それ故にファージ粒子を生成するための組換え鎖のみが残された。この方法を用い、ペプチド融合体または変異体をＭ１３コートタンパク質に対して生成してもよい。ケイ（Ｋａｙ）らの方法では、遺伝子ＩＩＩの開始点でアンバー停止コドンが用いられる。ＤＮＡ配列のランダム化されたストレッチを有するオリゴヌクレオチドを、ランダム化された領域が停止コドンと一致するように一本鎖ファージゲノムにアニールした。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を共有結合で閉じた環状ｄｓＤＮＡに酵素的に変換し、次いで大腸菌の非サプレッサー株にエレクトロポレートした。新たに合成されたＤＮＡ鎖（マイナス鎖）は、宿主細胞内でプラス鎖を生成するための鋳型としての機能を果たし、それを、ウイルス遺伝子を転写／翻訳するために用い、かつウイルス粒子内にパッケージ化した。
【０１３２】
実施例１
バイオパニングを用いたポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）結合ペプチドの選択
この実施例の目的は、改良されたファージディスプレイバイオパニング方法を用いてポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）に結合するファージペプチドを同定することであった。
【０１３３】
この実施例では、Ｐｈ．Ｄ．（商標）−１２ファージディスプレイペプチドライブラリーキットおよびＰｈ．Ｄ．（商標）−７ファージディスプレイライブラリーキットを用いた。何らかのバイアスが結果に導入されることを回避するため、各実験の第１回目を製造業者から提供されたオリジナルのライブラリーを用いて実施した。
【０１３４】
ＰＭＭＡ表面に対するバイオパニング
使用したＰＭＭＡ材料は、ルサイト（Ｌｕｃｉｔｅ）（登録商標）メチルメタクリレートポリマーシート（イー・アイ・デュポン・ドゥ・ヌムール・アンド・カンパニー（Ｅ．Ｉ．ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏ．）、ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）、デラウェア州から入手）の１／８インチ（３２ｍｍ）厚、１／２インチ（１２．７ｍｍ）直径のディスクおよびドットブロット装置（シュライヒャー・アンド・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）、キーン（Ｋｅｅｎｅ）、ニューハンプシャー州から入手）であった。ＰＭＭＡディスクに対するバイオパニングにおいては、以下のプロトコルを用いた。ＰＭＭＡディスクを９０％イソプロパノール５ｍＬで満たしたチューブ内に室温で３０分間入れ、次いで各々を１０分間、脱イオン水で５回洗浄した。次いで、０．５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０（ＴＢＳＴ−０．５％）を含有するＴＢＳＴ中の１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡよりなるブロッキング緩衝液５ｍＬをチューブに添加し、４℃で１時間インキュベートした。
【０１３５】
ディスクをＴＢＳＴ−０．５％で５回洗浄し、次いで１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有するＴＢＳＴ−０．５％  ２ｍＬを各ウェルに添加した。次いで、オリジナルのファージライブラリー（２×１０１１ｐｆｕ）１０μＬすなわち１２−ｍｅｒまたは７−ｍｅｒのライブラリーをディスクに添加し、室温で１５分間インキュベートした。ディスクをＴＢＳＴ−０．５％で１０回洗浄した。次いで、ディスクをクリーンチューブに移し、０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２中の１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡよりなる非特異的な溶出緩衝液２ｍＬをチューブに添加し、１０分間インキュベートした。ディスクを溶出緩衝液でさらに３回洗浄し、次いでＴＢＳＴ−０．５％で３回洗浄した。酸耐性を有するファージペプチドをさらに付着させたディスクを使用し、ファージ増幅のため、宿主細胞の大腸菌ＥＲ２７３８（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、マサチューセッツ州）に直接感染させた。ディスクをＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地内で１：１００に一晩で希釈した大腸菌ＥＲ２７３８培養物とともに３７℃で４．５時間インキュベートした。この時間経過後、細胞培養物を３０秒間遠心し、上清の上部８０％を新しいチューブに移し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ（シグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ミズーリ州から入手した２０％ポリエチレングリコール−８００、２．５Ｍ塩化ナトリウム）の１／６容量を添加し、ファージを４℃で一晩沈殿させておいた。沈殿物を４℃、１０，０００×ｇでの遠心分離により回収し、得られたペレットをＴＢＳ１ｍＬ中に再懸濁した。次いで、この増幅された第１回目のファージストックを下記の方法に従って滴定（ｔｉｔｅｒ）した。バイオパニングの次のラウンドにおいては、第１回目から得た２×１０１１ｐｆｕを超えるファージストックを使用した。バイオパニングプロセスを実験によっては３〜４回繰り返した。
【０１３６】
バイオパニングの最終ラウンドでの酸洗浄ステップ後、ＰＭＭＡディスクを用い、５００μＬの中間−ログ（ｍｉｄ−ｌｏｇ）段階の細菌宿主細胞、大腸菌ＥＲ２７３８に直接感染させ、次いでＬＢ培地内で２０分間成長させ、次いで３ｍＬのアガローストップ（５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．７％アガロースを有するＬＢ培地）と４５℃で混合した。この混合物をＬＢ培地／ＩＰＴＧ／Ｓ−Ｇａｌ（商標）プレート（１５ｇ／Ｌ寒天、０．０５ｇ／Ｌ  ＩＰＴＧ、および０．０４ｇ／Ｌ  Ｓ−Ｇａｌ（商標）を有するＬＢ培地）上に延展し、３７℃で一晩インキュベートした。ブラックプラークを計数し、ファージ力価を計算した。ＤＮＡの単離および配列決定分析においては、単一のブラックプラークをランダムに採取した。これらの高親和性を示すＰＭＭＡ結合ファージペプチドのアミノ酸配列を表１に示す。
【０１３７】
【表４】
2009508870.tif 000006
【０１３８】
実施例２
ＥＬＩＳＡによるＰＭＭＡ結合ファージペプチドクローンの特徴づけ
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用い、対照としての機能を果たす皮膚−１ファージクローンＴＰＦＨＳＰＥＮＡＰＧＳ（配列番号５３で与えられる）とともに実施例１で同定した選択されたファージペプチドクローンのＰＭＭＡとの結合親和性を評価した。
【０１３９】
空の９６ウェル装置、シュライヒャー・アンド・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎｃ．）（キーン（Ｋｅｅｎｅ）、ニューハンプシャー州）から入手したミニフォールド（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ）Ｉドット−ブロット（Ｉ  Ｄｏｔ−Ｂｌｏｔ）システムをＰＭＭＡ表面として用いた。試験対象の各クローンにおいては、ウェルをＴＢＳ中の２％の無脂肪粉乳よりなるブロッキング緩衝液２００μＬとともに室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を、システムを反転して除去し、ブロットしてペーパータオルで乾燥させた。ウェルをＴＢＳＴ−０．５％よりなる洗浄緩衝液で６回すすいだ。ウェルを１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有するＴＢＳＴ−０．５％  ２００μＬで満たし、次いで精製したファージストック１０μＬ（１０１２を超えるコピー）を各ウェルに添加した。試料をゆっくり振とうさせながら３７℃で１５分間インキュベートした。結合していないファージを、ウェルをＴＢＳＴ−０．５％で１０〜２０回洗浄して除去した。次いで、ブロッキング緩衝液中で１：５００に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ／抗−Ｍ１３抗体複合体（米国アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＵＳＡ）、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー州）１００μＬを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。複合体溶液を除去し、ウェルをＴＢＳＴ−０．０５％で６回洗浄した。ピアス・バイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ州）から入手したＴＭＢ基質（２００μＬ）を各ウェルに添加し、色を５〜３０分間、典型的には１０分間室温で展開させておいた。次いで、停止溶液（２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４  ２００μＬ）を各ウェルに添加し、溶液を９６ウェルプレートに移し、Ａ４５０をマイクロプレート分光光度計（モレキュラー・デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、サニーベイル（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）、カリフォルニア州）を用いて測定した。少なくとも３つの反復試験（ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）の平均として報告された、得られた吸光度値と平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表２に示す。
【０１４０】
【表５】
2009508870.tif 000007
【０１４１】
結果は、試験対象のＰＭＭＡ結合ファージペプチドのすべてがＰＭＭＡに対して対照の皮膚−１ペプチドよりも有意に高い結合親和性を有していたことを示している。
【０１４２】
実施例３
ＰＭＭＡ結合ペプチドにおけるＰＭＭＡとの結合親和性の測定
この実施例の目的は、ＥＬＩＳＡアッセイを用い、ＰＭＭＡ結合ペプチドのＰＭＭＡ表面に対する親和性を測定（ＭＢ５０値として測定）することであった。
【０１４３】
ＰＭＭＡ結合ペプチドＡ０９を、シンペップ（Ｓｙｎｐｅｐ  Ｉｎｃ．）（ダブリン（Ｄｕｂｌｉｎ）、カリフォルニア州）によって合成した。検出目的で、ペプチドをアミノ酸結合配列のＣ末端でのビオチン化リジン残基の付加によってビオチン化し、アミド化システインを配列のＣ末端に付加した。試験対象のペプチドのアミノ酸配列を配列番号１３として示す。
【０１４４】
ＰＭＭＡ結合ペプチドＡ０９におけるＭＢ５０の測定
ＰＭＭＡに結合するビオチン化ペプチドＡ０９（配列番号１３）におけるＭＢ５０の測定を、実施例２に記載の９６ウェル装置を用いて実施した。９６ウェルを、ブロッキング緩衝液（ピアス・ケミカル（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ州から入手したスーパーブロック（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ）（商標））を用いて室温で１時間ブロッキングした後、各々を室温で２分間、ＴＢＳＴ−０．５％で６回洗浄した。様々な濃度のビオチン化された結合ペプチドを各ウェルに添加し、３７℃で１５分間インキュベートし、各々を室温で２分間、ＴＢＳＴ−０．５％で６回洗浄した。次いで、ストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体（ピアス・ケミカル（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ州）を各ウェルに添加し（１ウェル当たり１．０μｇ）、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェルを室温で２分間、ＴＢＳＴ−０．５％で６回洗浄した。最後に、色の展開および吸光度の測定を実施例２に記載のように行った。
【０１４５】
結果を、グラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）４．０（グラフパッド・ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州）を用いてＡ４５０対ペプチドの濃度としてプロットした。ＭＢ５０値をスカッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）プロットから計算したものを表３に示す。
【０１４６】
四量体ＰＭＭＡ結合ペプチドＡ０９におけるＭＢ５０の測定
ペプチドＡ０９四量体におけるＭＢ５０の測定においては、ＰＭＭＡ表面およびすべての結合状態は上記と同様であった。四量体−Ａ０９ペプチド複合体を、ストレプトアビジン−ＨＲＰとビオチン化ペプチドＡ０９（配列番号１３）を１：４のモル比で混合することによって調製した。すべてのブロッキングおよび洗浄ステップ後、様々な濃度のストレプトアビジン／（Ａ０９）４複合体を各ウェルに添加し、３７℃で１５分間インキュベートし、各々を室温で２分間、ＴＢＳＴ−０．５％で６回洗浄した。次いで、色の展開および吸光度の測定を実施例２に記載のように行った。結果を、グラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）４．０（グラフパッド・ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州）を用いてＡ４５０対ペプチド複合体の濃度としてプロットした。ＭＢ５０値をスカッチャードプロットから計算したしたものを表３に示す。
【０１４７】
【表６】
2009508870.tif 000008
【０１４８】
結果は、ＰＭＭＡ結合ペプチドＡ０９、およびストレプトアビジン／Ａ０９四量体複合体のＰＭＭＡに対する結合親和性が高かったことを示している。Ａ０９四量体複合体内での結合ペプチドの複数のコピーの使用により、結合親和性が１０倍超高まった。
【０１４９】
実施例４
メタクリル酸を含有する高分子分散剤で分散させた色素にＰＭＭＡ結合ペプチドを併用したヘアカラーリング
この実施例の目的は、メタクリル酸を含有する高分子分散剤で分散させたカーボンブラック色素にＰＭＭＡ結合ペプチドを併用したヘアカラーリングについて示すことであった。
【０１５０】
カーボンブラックディスパージョンの調製
カーボンブラックディスパージョンを、まず以下の原料、すなわち（ｉ）２１０．４重量部（ｐｂｗ）の脱イオン水、（ｉｉ）８０．３ｐｂｗの４１．５ｗｔ％（固体）のアニオンポリマー分散剤、および（ｉｉｉ）９．２４ｐｂｗのジメチルエタノールアミンを十分に混合することによって調製した。アニオンポリマー分散剤は、米国特許出願公開第２００３０１２８２４６号明細書（パラグラフ０１２２〜０１２５）（参照により本明細書中に援用される）中の「分散剤１の調製」に従ってＰＯＥＡ（フェノキシエチルアクリレート）／−ｇ−ＥＴＥＧＭＡ（エトキシトリエチレングリコールメタクリレート）／ＭＡＡ（メタクリル酸）が６６．３／−ｇ−４．２／２９．５に調製されたグラフトコポリマーであり、ここではモノマーの比が公報中で示された６１．６／５．８／３２．６の重量パーセント比ではなく６６．３／４．２／２９．５の重量パーセント比を得るように調節した。これに１００ｐｂｗの黒色色素（ニペックス（Ｎｉｐｅｘ）１８０ＩＱ、デグサ（Ｄｅｇｕｓｓａ））を徐々に添加した。色素の混和後、１００ｐｂｗの脱イオン水を混入し、ミルベースを形成し、それを破砕のために媒体ミルにより循環させた。次いで、脱イオン水（５５．４ｐｂｗ）を希釈のために添加して最終強度にした。この黒色のディスパージョン（２７６ｇ）を、２００ｇのグリセリン、１２０ｇのエチレングリコール、１．６ｇのプロクセル（Ｐｒｏｘｅｌ）（アーク・ケミカルズ（Ａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、チェシャー（Ｃｈｅｓｈｉｒｅ）、コネチカット州）、１４３．６ｇの脱イオン水および２．５ｇのスルフィノール（Ｓｕｒｆｙｎｏｌ）（登録商標）４８５（エアー・プロダクツ（Ａｉｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、アレンタウン（Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ）、ペンシルバニア州）と混合し、黒色着色剤の基材を形成した。着色剤配合物のｐＨを、必要に応じ、１０％リン酸または１０％水酸化ナトリウム溶液の添加により７．０に調整した。水性カーボンブラックストック溶液を、毛髪の耐久性試験において使用するため、この着色剤の基材を水で希釈して調製し、１重量％〜２重量％の炭素配合量を得た。
【０１５１】
配列番号１４として与えられる、Ｃ末端に付加されたアミド化システインを有するＰＭＭＡ結合ペプチドＡ０９をシンペップ（ＳｙｎＰｅｐ  Ｉｎｃ．）（ダブリン（Ｄｕｂｌｉｎ）、カリフォルニア州）から入手した。このペプチド（１００ｍｇ）を１０ｇの１％カーボンブラックディスパージョンに添加し、溶液を室温で数時間撹拌した。
【０１５２】
ヘアカラーリング
インターナショナル・ヘア・インポーターズ・アンド・プロダクツ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈａｉｒ  Ｉｍｐｏｒｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（ベルローズ（Ｂｅｌｌｅｒｏｓｅ）、ニューヨーク州）から入手した天然白髪の毛髪見本（２．６０ｇ）を３ｍｍ×１００ｍｍの試験管に入れ、ＰＭＭＡ結合ペプチドを含有するカーボンブラックディスパージョン７〜８ｍＬを添加した。混合物をマグネチックスターラーを用いて３０分間撹拌し、色素ディスパージョンと毛髪との接触が良好であることを確認した。毛髪見本を試験管から取り出し、３０分間風乾状態にした。
【０１５３】
ヘアカラーの耐久性を、毛髪を脱イオン水ですすぐことによって試験した。毛髪見本を、水ですすぐ間、手でマッサージした。水すすぎ後、毛髪見本は黒色の大部分を保持した。
【０１５４】
実施例５（比較）
ＰＭＭＡ結合ペプチドの非存在下でのメタクリル酸を含有する高分子分散剤で分散させた色素を用いるヘアカラーリング
この実施例の目的は、ＰＭＭＡ結合ペプチドの非存在下でのカーボンブラック色素を用いて得られるヘアカラーリングの耐久性を評価し、かつそれを実施例４で得られた耐久性と比較することであった。
【０１５５】
カーボンブラックディスパージョンを実施例４に記載のように調製したが、ＰＭＭＡ結合ペプチドを添加しなかった。１０ｇのカーボンブラックディスパージョンおよび２．３０ｇの毛髪見本を用い、実施例４に記載のように毛髪を着色し、水ですすいだ。
【０１５６】
水すすぎ後、黒色がわずかに残存した。この結果は、実施例４で得られた結果と比較すると、カーボンブラック色素がＰＭＭＡ結合ペプチドと併用される場合に改善された耐久性が得られることを示している。
【０１５７】
実施例６（比較）
メタクリル酸を含有する高分子分散剤で分散させた色素にシロキサンシーラントを併用したヘアカラーリング
この実施例の目的は、カーボンブラック色素と従来のシロキサンシーラントとの併用で得られるヘアカラーリングの耐久性を評価しかつそれを実施例４で得られた耐久性と比較することであった。
【０１５８】
カーボンブラックディスパージョンを実施例４に記載のように調製したが、ＰＭＭＡ結合ペプチドを添加しなかった。１ｇのデカメチルシクロペンタシロキサン（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）、ウィスコンシン州；製品番号４４、４２７−８；ＣＡＳ番号５４１−０２−６）を９ｇのカーボンブラックディスパージョンに添加した。このカーボンブラックディスパージョンおよび２．３０ｇの毛髪見本を用い、実施例４に記載のように毛髪を着色し、水ですすいだ。
【０１５９】
水すすぎ後、黒色のすべてが洗い出された。この結果は、実施例４で得られた結果と比較すると、カーボンブラック色素がＰＭＭＡ結合ペプチドと併用される場合に得られる耐久性が同色素が従来のシロキサンシーラントと併用される場合と比較して改善されることを示している。
【０１６０】
実施例７
メタクリル酸を含有する高分子分散剤で分散させた色素にＰＭＭＡ結合ペプチドおよびポリ（アリルアミン）シーラントを併用したヘアカラーリング
この実施例の目的は、ポリマーシーラントとしてのポリ（アリルアミン）とカーボンブラック色素およびＰＭＭＡ結合ペプチドとの併用で得られるヘアカラーの耐久性が向上することを示すことであった。
【０１６１】
炭素ディスパージョンを実施例４に記載のように調製し、ＰＭＭＡ結合ペプチドと併用した。ヘアカラーリングを、２．６６ｇの毛髪見本を用いて実施例４に記載のように行った。毛髪見本を着色して３０分間乾燥させた後、毛髪試料を（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）；製品番号４７９１７７；ＣＡＳ番号３０５５１−８９−４から入手した、ポリ（アリルアミン）の２０ｗｔ％水溶液を水で希釈することにより調製した）ポリ（アリルアミン）の４ｗｔ％溶液中に浸した。毛髪見本を実施例４に記載のように速やかにすすぎ、次いでシャンプーで処理した（パンテーン・プロ−Ｖ・シア・ボリューム（Ｐａｎｔｅｎｅ  Ｐｒｏ−Ｖ  Ｓｈｅｅｒ  Ｖｏｌｕｍｅ）、プロクター・アンド・ギャンブル（Ｐｒｏｃｔｏｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ）、シンシナティ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ）、オハイオ州）。シャンプー処理は、シャンプーの１／４サイズの滴を毛髪に添加するステップと、シャンプーを毛髪上に一様に分布させるステップと、毛髪を３０秒間強くマッサージするステップとを含んだ。次いで、毛髪見本を脱イオン水ですすぎ、シャンプーを除去した。
【０１６２】
水ですすぎかつシャンプーで処理した後、毛髪見本は黒色の約５０％を保持した。強力なシャンプー処理に対して色が残存したという結果は、シーラントとしてのポリ（アリルアミン）とカーボンブラック色素およびＰＭＭＡ結合ペプチドとの併用により、カーボンブラック色素およびＰＭＭＡ結合ペプチドのみの場合に得られる耐久性と比べると耐久性の向上が得られることを示している。
【０１６３】
実施例８〜１２
メタクリル酸を含有する高分子分散剤で分散させた色素にＰＭＭＡ結合ペプチドを併用したヘアカラーリング
これらの実施例の目的は、メタクリル酸を含有する高分子分散剤で分散させたカーボンブラック色素とＰＭＭＡ結合ペプチドとの併用で得られるヘアカラーの耐久性が向上することを示し、かつそれをカーボンブラック色素のみの場合に得られる耐久性と比較することであった。さらに、ポリ（アリルアミン）シーラントの適用によってさらなる向上が得られることが示された。色保持を、分光光度測定技術を用いて定量した。
【０１６４】
カーボンブラックディスパージョンを実施例４に記載のように調製した。ヘアカラーリングを、ＰＭＭＡ結合ペプチド（配列番号１４）を併用する場合と併用しない場合で実施例４に記載のように行った。ポリ（アリルアミン）シーラントの効果を実施例７に記載のように試験した。
【０１６５】
（実施例４に記載のように行った）水すすぎ後および（実施例７に記載のように行った）シャンプー処理後における色強度を、Ｘ−Ｒｉｔｅ（登録商標）ＳＰ７８（商標）スフィア・スペクトロフォトメーター（Ｓｐｈｅｒｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）（エックスライト（Ｘ−Ｒｉｔｅ，Ｉｎｃ．）、グランヴィル（Ｇｒａｎｄｖｉｌｌｅ）、ミシガン州）を用い、着色された毛髪試料を光センサ内に入れて光度計の応答を示すＬ＊、ａ＊およびｂ＊パラメータを計算することによって測定した。初期ベースラインＬ＊値を未着色の毛髪において測定し、すべての測定値は３つの個別測定値の平均であった。ΔＥ値を下記の方程式１を用いて計算した。
ΔＥ＝（（Ｌ＊１−Ｌ＊２）２＋（ａ１−ａ２）２＋（ｂ１−ｂ２）２）１／２  （１）
（式中、Ｌ＊＝明度変数、ａ＊およびｂ＊はインターナショナル・コミッション・オブ・イルミネ−ション（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）（ＣＩＥ）によって定義されたＣＩＥＬＡＢ色空間の色度座標である（ミノルタ（Ｍｉｎｏｌｔａ）、「Ｐｒｅｃｉｓｅ  Ｃｏｌｏｒ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ−Ｃｏｌｏｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｆｒｏｍ  Ｆｅｅｌｉｎｇ  ｔｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ」、ミノルタ・カメラ（Ｍｉｎｏｌｔａ  Ｃａｍｅｒａ  Ｃｏ．）、１９９６年））。より大きいΔＥ値はより良好な色保持を示す。結果を表４にまとめる。
【０１６６】
【表７】
2009508870.tif 000009
【０１６７】
結果は、ＰＭＭＡ結合ペプチドとメタクリレートでコートされたカーボンブラック色素の併用の結果、水すすぎ（実施例８）とシャンプー処理（実施例１０）の双方を行った後、カーボンブラックの単独使用の場合（比較の実施例９および１２）と比べ、ヘアカラーの保持において有意な向上がもたらされたことを示している。さらに、ポリ（アリルアミン）シーラントの使用により、シャンプー処理後、色保持においてさらなる向上がもたらされた（実施例１１）。
【０１６８】
実施例１３
バイオパニングを用いたポリプロピレン結合ペプチドの選択
この実施例の目的は、改良されたファージディスプレイバイオパニング方法を用いてポリプロピレン（ＰＰ）に結合するファージペプチドを同定することであった。
【０１６９】
ポリプロピレン結合ペプチドを、実施例１に記載のバイオパニング方法を用いて同定した。バイオパニング方法にて用いられるポリプロピレン基質は、ポリプロピレンメッシュ材料、具体的には（デイボール（Ｄａｖｏｌ  Ｉｎｃ．）、クランストン（Ｃｒａｎｓｔｏｎ）、ロードアイランド州、  Ｃ．Ｒ．バード（Ｃ．Ｒ．Ｂａｒｄ  Ｉｎｃ．）の子会社から入手した）ヘルニア・リペア／リコンストラクティブ・サージェリー・プロステティクス・パッチ（Ｈｅｒｎｉａ  Ｒｅｐａｉｒ／Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  Ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃｓ  Ｐａｔｃｈ）であった。ポリプロピレンメッシュを、１ｃｍ四方に切断し、室温で３０分間、９０％イソプロパノールで前処理した後、パニングプロセス前に各々を１０分間、脱イオン水で５回洗浄した。全部で４回のバイオパニングを行い、表５に高親和性のポリプロピレン−結合ファージペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１７０】
【表８】
2009508870.tif 000010
【０１７１】
実施例１４
バイオパニングを用いたポリテトラフルオロエチレン結合ペプチドの選択
この実施例の目的は、改良されたファージディスプレイバイオパニング方法を用い、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）に結合するファージペプチドを同定することであった。
【０１７２】
実施例１に記載のバイオパニング方法を用い、ポリテトラフルオロエチレン結合ペプチドを同定した。バイオパニング方法にて用いられるポリテトラフルオロエチレン基質は、（デイボール（Ｄａｖｏｌ  Ｉｎｃ．）、クランストン（Ｃｒａｎｓｔｏｎ）、ロードアイランド州、  Ｃ．Ｒ．バード（Ｃ．Ｒ．Ｂａｒｄ  Ｉｎｃ．）の子会社から入手した）ｅＰＴＦＥフィルム材料であった。ポリテトラフルオロエチレンフィルムを１ｃｍ四方に切断し、室温で３０分間、９０％イソプロパノールで前処理した後、パニングプロセス前に各々を１０分間、脱イオン水で５回洗浄した。全部で４回のバイオパニングを行い、表６に高親和性のＰＴＦＥ−結合ファージペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１７３】
【表９】
2009508870.tif 000011
【０１７４】
実施例１５
バイオパニングを用いたナイロン６，６結合ペプチドの選択
この実施例の目的は、改良されたファージディスプレイバイオパニング方法を用いてナイロン６，６に結合するファージペプチドを同定することであった。
【０１７５】
実施例１に記載のバイオパニング方法を用い、ナイロン６，６結合ペプチドを同定した。バイオパニング方法における基質として用いられるナイロン６，６のビーズは、添加物を含有せず、当該技術分野で周知の標準のナイロン重合プロセスを用いて調製した（コーハン  Ｍ．Ｉ．（Ｋｏｈａｎ  Ｍ．Ｉ．）、「ナイロン・プラスチックス・ハンドブック（Ｎｙｌｏｎ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」、ハンセン／ガードナー・パブリケーションズ（Ｈａｎｓｅｎ／Ｇａｒｄｎｅｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）  ［１９９５年］  １７−２０頁および３４−４５頁を参照）。ナイロンビーズを室温で３０分間、９０％イソプロパノールで前処理した後、パニングプロセス前に各々を１０分間、脱イオン水で５回洗浄した。全部で４回のバイオパニングを行い、表７に高親和性のナイロン６，６−結合ファージペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１７６】
【表１０】
2009508870.tif 000012
【０１７７】
実施例１６
バイオパニングを用いたポリエチレン結合ペプチドの選択
この実施例の目的は、改良されたファージディスプレイバイオパニング方法を用いてポリエチレン（ＰＥ）に結合するファージペプチドを同定することであった。
【０１７８】
実施例１に記載のバイオパニング方法を用い、ポリエチレン結合ペプチドを同定した。超高分子量のポリエチレンテープをバイオパニング方法における基質として用いた。類似のテープが、デイボール（Ｄａｖｏｌ  Ｉｎｃ．）（クランストン（Ｃｒａｎｓｔｏｎ）、ロードアイランド州）から入手可能である。ＰＥテープを１ｃｍ四方に切断し、これを室温で３０分間、９０％イソプロパノールで前処理した後、パニングプロセス前に各々を１０分間、脱イオン水で５回洗浄した。全部で４回のバイオパニングを行い、表８に高親和性のＰＥ−結合ファージペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１７９】
【表１１】
2009508870.tif 000013
【０１８０】
実施例１７
バイオパニングを用いたポリスチレン結合ペプチドの選択
この実施例の目的は、改良されたファージディスプレイバイオパニング方法を用いてポリスチレン（ＰＳ）に結合するファージペプチドを同定することであった。
【０１８１】
実施例１に記載のバイオパニング方法を用い、ポリスチレン結合ペプチドを同定した。ポリスチレン（ＰＳ）結合ペプチドを、可溶性タイプＩコラーゲンでコートされた９６ウェルのポリスチレンプレート（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）、アクトン（Ａｃｔｏｎ）、マサチューセッツ州）に対するバイオパニング実験の間に発見した。９６ウェルを１００ｎｇ／ｍｌの可溶性タイプＩコラーゲン（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、セントルイス（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ）、ミズーリ州）でコートした。全部で４回のバイオパニングを行った。３種の非常に豊富なファージペプチドを同定し、それらは後にＰＳによく結合し、コートされたタイプＩコラーゲンに結合しないことが確認された。表９に高親和性のＰＳ−結合ファージペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０１８２】
【表１２】
2009508870.tif 000014
【０１８３】
実施例１８
トリブロックのペプチドベースの複合体の生物学的生成
この実施例の目的は、組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を用いてトリブロックのペプチドベースの複合体を調製することであった。トリブロックのペプチドベースの複合体は、複数の毛髪結合ペプチド、ペプチドスペーサー、およびＰＭＭＡ結合ペプチドブロックから構成された。ペプチドを大腸菌内で封入体として発現させた。封入体の形成を促進するため、追加のアミノ酸配列（すなわちペプチドタグ）をトリブロックのペプチドベースの複合体配列に融合した。酸に不安定なＡｓｐ−Ｐｒｏ（ＤＰ）配列をペプチドタグとトリブロックのペプチドベースの複合体配列との間に挿入し、トリブロックのペプチドのペプチドタグからの単離を促進した。
【０１８４】
産生株の作成
トリブロックのペプチドベースの複合体の配列を表１０に示す。ＤＮＡ配列を、大腸菌に対して好ましいコドンを用いてこのペプチド配列をコードし、かつ配列リピートおよびｍＲＮＡの二次構造を回避するように設計した。遺伝子ＤＮＡ配列は、ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．（メンロパーク（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ）、カリフォルニア州）により、グスタフソン（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ）ら（トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）２２（７）：３４６−３５５頁（２００４年））により記述された独自仕様のソフトウェアを用いて設計された。アミノ酸配列のコード配列の後に、２つの終止コドンおよびエンドヌクレアーゼＡｓｃＩにおける認識部位が続いた。Ｎ末端のＧＳアミノ酸配列は、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩにおける認識部位によってコードされた（ＧＧＡ／ＴＣＣ）。ＤＮＡ配列は配列番号７１によって与えられる。
【０１８５】
【表１３】
2009508870.tif 000015
【０１８６】
遺伝子は、ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．により、合成オリゴヌクレオチドから構築され、標準のプラスミドクローニングベクターにクローニングされた。配列は、ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．により、ＤＮＡ配列決定によって検証された。
【０１８７】
合成遺伝子をエンドヌクレアーゼ制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｓｃＩでクローニングベクターから切断し、標準の組換えＤＮＡ方法を用いて発現ベクターにライゲートした。ベクターｐＫＳＩＣ４−ＨＣ７７６２３は、市販のベクターｐＤＥＳＴ１７（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア州）から得られた。それは酵素ケトステロイドイソメラーゼ（ＫＳＩ）の断片をコードする市販のベクターｐＥＴ３１ｂ（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州）に由来する配列を含む。ＫＳＩ断片を融合パートナーとして含め、大腸菌内で不可溶性の封入体へのペプチドの分割を促進した。ｐＥＴ３１ｂに由来するＫＳＩのコード配列を標準の突然変異誘発方法（クイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）ＩＩ、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラ・ホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）、カリフォルニア州）を用いて修飾し、野生型ＫＳＩ配列内に見出される１つのＣｙｓコドンに加えて３つの追加のＣｙｓコドンを含めた。配列番号７２で与えられかつ図１中に示されるプラスミドｐＫＳＩＣ４−ＨＣ７７６２３を、当業者に周知である標準の組換えＤＮＡ方法を用いて作成した。
【０１８８】
トリブロックのペプチドベースの複合体（表１）をコードするＤＮＡ配列を、ＢａｍＨＩ部位とＡｓｃＩ部位との間のベクター内の配列と置換することによってｐＫＳＩＣ４−ＨＣ７７６２３に挿入した。ペプチドのコード配列を有するプラスミドＤＮＡおよびベクターＤＮＡをエンドヌクレアーゼ制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｓｃＩで消化し、次いでペプチドのコード配列およびベクターＤＮＡを混合し、当業者に周知である標準のＤＮＡクローニング方法を用い、ファージＴ４ＤＮＡリガーゼによりライゲートした。トリブロックのペプチドベースの複合体のコード配列がｐＫＳＩＣ４−ＨＣ７７６２３に挿入された、正確なコンストラクトを、標準的方法を用い、制限分析により同定し、ＤＮＡ配列決定により検証した。
【０１８９】
このコンストラクトでは、ペプチド複合体のコード配列をＨＣ７７６２３のコード配列と置換した。配列をバクテリオファージＴ７遺伝子１０プロモーターに作動可能に連結し、変異体のＫＳＩパートナーと融合された融合タンパク質として発現させた。
【０１９０】
ペプチドベースの複合体の発現を試験するため、発現プラスミドをＢＬ２１−ＡＩ大腸菌株（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号Ｃ６０７０−０３）に形質転換した。組換え融合ペプチドを生成するため、ＬＢ−アンピシリン培養液（１０ｇ／Ｌのバクト−トリプトン、５ｇ／Ｌのバクト−酵母抽出物、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン、ｐＨ７．０）５０ｍＬに形質転換された細菌を接種し、培養物を３７℃でＯＤ６００が０．６に達するまで振とうした。発現を、０．５ｍＬの２０ｗｔ％  Ｌ−アラビノースの培養物への添加によって誘発し、振とうをさらに４時間持続させた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動による細胞タンパク質の分析により、融合ペプチドの生成が示された。
【０１９１】
発酵
上記の組換え大腸菌株を６Ｌの発酵物中で、初期にはバッチモード、次いでフェドバッチモードで成長させた。発酵培地の組成物を表１１に示す。発酵培地のｐＨは６．７であった。発酵培地をオートクレーブ滅菌し、その後、以下の滅菌成分、すなわち塩酸チアミン（４．５ｍｇ／Ｌ）、グルコース（２２．１ｇ／Ｌ）、微量元素、表１２を参照（１０ｍＬ／Ｌ）、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）、および接種材料（種）（１２５ｍＬ）を添加した。ｐＨを、必要に応じて水酸化アンモニウム（２０容量％）またはリン酸（２０容量％）を用いて調整した。添加成分をオートクレーブまたは濾過により滅菌した。
【０１９２】
【表１４】
2009508870.tif 000016
【０１９３】
【表１５】
2009508870.tif 000017
【０１９４】
発酵のための作動条件を表１３にまとめる。グルコースの初期濃度は２２．１ｇ／Ｌであった。初期の残留グルコースが失われた場合、予定された指数関数的なグルコースの供給を発酵運転のフェドバッチ段階から開始した。供給されたグルコース（表１４および１５を参照）は５００ｇ／Ｌのグルコースを含有し、それに５ｇ／Ｌの酵母抽出物を補充した。供給培地の成分をオートクレーブまたは濾過のいずれかにより滅菌した。目標は、０．２５ｇ／ｇの収率係数（バイオマス対グルコース）を前提として０．１３時間−１の特定の成長速度を持続させ、かつ発酵容器内の酢酸レベルを非常に低い値（すなわち０．２ｇ／Ｌ未満）に維持することであった。グルコースの供給は、運転の終了まで持続した。誘発を、選択された時間（すなわち１５時間の発酵経過時間）で２ｇ／ＬのＬ−アラビノースのボーラスによって開始した。発酵培養液１リットル当たり５ｇの酵母抽出物を送達するためのボーラスを、以下の時刻、すなわち誘導の１時間前、誘導時刻、および誘導時間の１時間後に、発酵容器に添加した。発酵運転を、発酵経過時間の１９．９７時間後および誘導時間の４．９７時間後に終了させた。
【０１９５】
【表１６】
2009508870.tif 000018
【０１９６】
【表１７】
2009508870.tif 000019
【０１９７】
【表１８】
2009508870.tif 000020
【０１９８】
ペプチドの単離および精製
発酵運転の終了後、発酵培養液全体を、ＡＰＶモデル２０００ガウリン（Ｇａｕｌｉｎ）型ホモジナイザーに１２，０００ｐｓｉ（８２，７００ｋＰａ）で３回通過させた。培養液を、それぞれの均質化に先立ち５℃未満に冷却した。均質化した培養液を、ウエストファリア（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ）ウィスパーフューゲ（ＷｈｉｓｐｅｒＦｕｇｅ）（商標）（ウエストファリア・セパレーター（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ  Ｉｎｃ．）、ノースヴェール（Ｎｏｒｔｈｖａｌｅ）、ニュージャージー州）積層ディスク型遠心分離機により７００ｍＬ／分および１２，０００ＲＣＦで速やかに処理し、封入体を懸濁された細胞残渣および溶解された不純物から分離させた。回収されたペーストを水中に１５ｇ／Ｌ（無水ベース）で再懸濁し、ｐＨをＮａ２ＣＯ３／ＮａＯＨ緩衝液を用いて８．０〜１０．０の値に調整した。ｐＨを選択し、封入体タンパク質の溶解を伴わずに封入体からの細胞残渣の除去を促進した。懸濁液をＡＰＶ２０００ガウリン（Ｇａｕｌｉｎ）型ホモジナイザーに１２，０００ｐｓｉ（８２，７００ｋＰａ）においてワンパスで通過させることで徹底的な混合がもたらされた。均質化した高ｐＨ懸濁液を、ウエストファリア（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ）ウィスパーフューゲ（ＷｈｉｓｐｅｒＦｕｇｅ）（商標）積層ディスク型遠心分離機内で、７００ｍＬ／分および１２，０００ＲＣＦで速やかに処理し、洗浄された封入体を懸濁された細胞残渣および溶解された不純物から分離させた。回収されたペーストを純水中に１５ｇ／Ｌ（無水ベース）で再懸濁した。懸濁液をＡＰＶ２０００ガウリン（Ｇａｕｌｉｎ）型ホモジナイザーに１２，０００ｐｓｉ（８２，７００ｋＰａ）においてワンパスで通過させることで、徹底的な洗浄がもたらされた。均質化された懸濁液を、ウエストファリア（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ）ウィスパーフューゲ（ＷｈｉｓｐｅｒＦｕｇｅ）（商標）積層ディスク型遠心分離機内で、７００ｍＬ／分および１２，０００ＲＣＦで速やかに処理し、洗浄された封入体を残存する懸濁された細胞残渣およびＮａＯＨから分離させた。
【０１９９】
回収されたペーストを純水中に２５ｇ／Ｌ（無水ベース）で再懸濁し、混合物のｐＨを、ＨＣｌを用いて２．２に調整した。酸性化懸濁液を５〜１４時間、７０℃に加熱してＤＰ部位の切断を完了させ、融合ペプチドを生成物ペプチドから標的ペプチドの損傷を伴うことなく分離させた。生成物スラリーをＮａＯＨを用いてｐＨ５．１に調整し（注：ここで用いられるｐＨは回収されるペプチドの溶解度に応じて変化しうる）、次いで５℃に冷却して１２時間保持した。混合物を９０００ＲＣＦで３０分間遠心し、上清をデカントした。次いで、上清を０．４５μｍの膜で濾過した。一部の低溶解度のペプチドにおいては、ペプチドの回収を増大させるため、複数回のペレットの洗浄が必要である場合がある。
【０２００】
濾過された生成物を回収し、凍結乾燥前に２：１の因子で真空蒸発により濃縮した。２２０および２７８ｎｍでの分光光度検出を用い、生成物ペプチドの溶出を監視し追跡した。
【０２０１】
実施例１９および２０
メタクリル酸を含有する高分子分散剤で分散させた色素にトリブロックのペプチドベースの複合体を併用したヘアカラーリング
これらの実施例の目的は、メタクリル酸を含有する高分子分散剤で分散させたカーボンブラック色素にトリブロックのペプチドベースの複合体を併用して得られるヘアカラーの耐久性が向上することを実証し、それをカーボンブラック色素単独の場合に得られる耐久性と比較することであった。ペプチド複合体は、複数の毛髪結合ペプチド、スペーサー、およびＰＭＭＡ結合ペプチド配列を含んでなるものであった。
【０２０２】
カーボンブラックディスパージョンを実施例４に記載のように調製した。実施例１８に記載された、配列番号７０で与えられるトリブロックのペプチドベースの複合体を用いた。ペプチド複合体（２０ｍｇ）を脱イオン水１ｍＬに添加し、混合物を氷上に置いてソニケーターで１分間分散させた。分散されたペプチド複合体を、４０ｍｇのカーボンブラックディスパージョンを有する２０ｍＬのシンチレーションバイアルに添加し、脱イオン水３ｍＬを添加して最終容量を約４ｍＬにした。得られたカーボンブラックディスパージョンを、氷上に置いて３分間超音波処理した。
【０２０３】
ヘアカラーリング
インターナショナル・ヘアー・インポーターズ・アンド・プロダクツ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈａｉｒ  Ｉｍｐｏｒｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（ベルローズ（Ｂｅｌｌｅｒｏｓｅ）、ニューヨーク州）から入手した天然白髪（約１．００ｇ）の毛髪見本を２０ｍＬのシンチレーションバイアルに入れ、ペプチド複合体を含有するカーボンブラックディスパージョン８ｍＬを添加した。混合物を、インキュベーターシェーカーを用いて室温で３０分間、１００ｒｐｍで振とうさせ、色素ディスパージョンと毛髪との接触が良好であることを確認した。毛髪見本をバイアルから取り出し、脱イオン水ですすいだ。水すすぎ後、毛髪見本における黒色の大部分が保持された。
【０２０４】
上記のステップを、ペプチド複合体を含有しないカーボンブラックディスパージョンを用いて繰り返した。水すすぎ後、両方の毛髪試料の色強度を実施例８〜１２に記載のように測定した。結果を表１６に示す。
【０２０５】
【表１９】
2009508870.tif 000021
【０２０６】
表１６に示される結果は、複数の毛髪結合ペプチド、スペーサー、およびＰＭＭＡ結合ペプチド配列を含んでなるペプチド複合体とメタクリレートでコートされたカーボンブラック色素の併用の結果、水すすぎ後のヘアカラーの保持において、カーボンブラックの単独使用の場合（比較実施例２０）と比べて有意な向上が得られた（実施例１９）ことを示している。
【０２０７】
実施例２１
バイオパニングを用いるシャンプーに耐性を有するポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）結合ペプチドの選択
この実施例の目的は、改良されたファージディスプレイバイオパニング方法を用い、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）に結合しかつシャンプー洗浄に耐性を有するファージペプチドを同定することであった。ＰＭＭＡ基質とファージライブラリーとの接触後、得られたファージペプチド−ＰＭＭＡ複合体を希釈したシャンプーで洗浄した。
【０２０８】
バイオパニング実験にて用いたＰＭＭＡ材料は、アルトグラス・インターナショナル、アルケマ（Ａｌｔｕｇｌａｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ａｒｋｅｍａ  Ｉｎｃ．）、フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）、ペンシルバニア州から入手したポリマー樹脂、プレキシグラス（Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ）ＶＳ１００（約３ｍｍ直径のビーズ）であった。ＰＭＭＡビーズに対するバイオパニングにおいては、以下のプロトコルを用いた。３個のＰＭＭＡビーズからなる３セットを３つのチューブ内に分布させ、各々を０．５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０（ＴＢＳＴ−０．５％）を含有するＴＢＳＴ中の１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡよりなるブロッキング緩衝液１ｍＬで満たし、４℃で１時間インキュベートした。ビーズをＴＢＳＴ−０．５％で５回洗浄し、次いで１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有するＴＢＳＴ−０．５％  １ｍＬを各チューブに添加した。次いで、３つのうちの１つのプールされたファージライブラリー（各チューブ内、４×１０１１ｐｆｕ）１０μＬを３つのチューブに添加し（すなわち３個のＰＭＭＡビーズを有する１つのチューブ当たり１つのプールされたライブラリー）、ビーズを３７℃で１５分間インキュベートした。３つのプールされたファージライブラリーは、以下のファージペプチドライブラリー（一般的方法のセクションで記載される）、すなわち１２−ｍｅｒの線形ライブラリー（Ｐｈ．Ｄ．（商標）−１２ファージディスプレイペプチドライブラリー）および７−ｍｅｒの線形ライブラリー（Ｐｈ．Ｄ．（商標）−７ファージディスプレイライブラリー）、１５−ｍｅｒの線形ライブラリーおよび２０−ｍｅｒの線形ライブラリー、ならびに拘束された７−ｍｅｒのライブラリー（Ｐｈ．Ｄ．（商標）−Ｃ７Ｃファージディスプレイライブラリー）および拘束された１４−ｍｅｒのライブラリーにおける１：１混合物よりなるものであった。ビーズをＴＢＳＴ−０．５％で１０回洗浄した。次いで、ビーズをクリーンチューブに移し、０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２中の１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡよりなる非特異的な溶出緩衝液１ｍＬを各チューブに添加し、チューブを１０分間インキュベートした。インキュベーション後、１Ｍトリス塩基、ｐＨ９．１よりなる中和緩衝液１５０μＬを各チューブに添加した。各チューブからのビーズに由来する溶出液を使用し、ファージ増幅のために宿主細胞の大腸菌ＥＲ２７３８（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、マサチューセッツ州）に感染させた。溶出液を、ＬＢ培地内で１：１００に一晩かけて希釈した大腸菌ＥＲ２７３８培養物とともに３７℃で４．５時間インキュベートした。この時間経過後、細胞培養物を３０秒間遠心し、上清の上部８０％を新しいチューブに移し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ（シグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ミズーリ州から入手した２０％ポリエチレングリコール−８００、２．５Ｍ塩化ナトリウム）の１／６容量を添加し、ファージを４℃で一晩沈殿させておいた。沈殿物を、４℃、１０，０００×ｇでの遠心分離により回収し、得られたペレットをＴＢＳ��ｍＬ中に再懸濁した。これはストック増幅の第１回目であった。
【０２０９】
次いで、増幅された第１回目のファージストックを下記の方法に従って滴定した。バイオパニングの第２回目においては、第１回目から得た２×１０１１ｐｆｕを超えるファージストックを使用した。バイオパニングプロセスを第１回目における記載のように繰り返した。第３回目から、ファージ結合ステップ（すなわちファージペプチド−ＰＭＭＡ複合体の形成）後にシャンプー洗浄ステップを追加した。具体的には、ニュートロジーナ（Ｎｅｕｔｒｏｇｅｎａ）（登録商標）リプレニッシング（Ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｉｎｇ）シャンプーとＴＢＳ緩衝液の１：１混合物よりなるシャンプー溶液を用い、ビーズを１〜２秒のボルテックスで６回洗浄後、ＴＢＳＴ−０．５％で６回洗浄した。次いで、ビーズをクリーンチューブに移し、残りのステップは先行するラウンドのステップと同一であった。パニングの第４回目または第５回目を第３回目での記載と同様に行った。
【０２１０】
バイオパニングの最終ラウンドでの溶出ステップ後、各チューブからの溶出液の一部（１〜２μＬ）を用い、２００μＬの中間−ログ段階の細菌宿主細胞である大腸菌ＥＲ２７３８に感染させ、次いでそれをＬＢ培地内で２０分間成長させ、次いで３ｍＬのアガローストップ（５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．７％アガロースを有するＬＢ培地）と４５℃で混合した。この混合物をＬＢ培地／ＩＰＴＧ／Ｓ−Ｇａｌ（商標）プレート（１５ｇ／Ｌ寒天、０．０５ｇ／Ｌ  ＩＰＴＧ、および０．０４ｇ／Ｌ  Ｓ−Ｇａｌ（商標）を有するＬＢ培地）上に延展し、３７℃で一晩インキュベートした。ブラックプラークを計数し、ファージ力価を計算した。ＤＮＡの単離および配列決定分析において、単一のブラックプラークをランダムに採取した。これらのシャンプーに耐性を有するＰＭＭＡ結合ファージペプチドのアミノ酸配列を表１７に示す。
【０２１１】
【表２０】
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【０２１２】
実施例２２
シャンプーに耐性を有するＰＭＭＡ結合ファージクローンの結合親和性の定量的特徴づけ
この実施例の目的は、ファージクローンの結合親和性を滴定（ｔｉｔｅｒｉｎｇ）によって定量することであった。特定のペプチドを提示するファージクローンを、異なるペプチド配列の結合特性を比較するために用いた。力価に基づくアッセイを用い、ファージ結合を定量した。このアッセイでは、１つのＰＭＭＡビーズの表面によって保持される出力ｐｆｕ（３つの別々のビーズの平均）を測定した。すべてのファージクローンにおける入力は、１０１２ｐｆｕ／ビーズ／チューブであった。このアッセイで測定されたのがペプチドを発現するファージ粒子の結合であって単離ペプチドの結合ではないことは強調されるべきである。
【０２１３】
１チューブ当たり１個のプレキシグラス（Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ）ＶＳ１００ビーズを使用し、各チューブをＴＢＳＴ−０．５％中に１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有するブロッキング緩衝液で満たし、４℃で１時間インキュベートした。各ビーズをＴＢＳＴ−０．５％で５回洗浄した。次いで、チューブを１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有する１ｍＬのＴＢＳＴ−０．５％で満たし、次いで精製したファージクローン（１０１２ｐｆｕ）を各チューブに添加した。実施例２１に記載のように、ビーズ試料を３７℃で１５分間インキュベートし、次いでシャンプー溶液で６回洗浄した後、ＴＢＳＴ−０．５％で６回洗浄した。各ビーズをクリーンチューブに移し、ｐＨ２．２の０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ中の１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡよりなる非特異的な溶出緩衝液１００μＬを添加した。試料を１０分間インキュベートし、次いで中和緩衝液（１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．２）１５μＬを各チューブに添加した。滴定および配列決定分析において、各チューブから溶出されたファージを新しいチューブに移した。
【０２１４】
結合されたファージを滴定するため、溶出されたファージをＳＭ緩衝液で希釈し、１０１〜１０８で１０倍連続希釈して調製した。各希釈物のうちの１０μＬの一定分量を中間−ログ段階の大腸菌ＥＲ２７３８（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ））２００μＬとともにインキュベートし、ＬＢ培地内で２０分間成長させ、次いで３ｍＬのアガローストップ（５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．７％アガロースを有するＬＢ培地）と４５℃で混合した。この混合物をＬＢ培地／ＩＰＴＧ／Ｘｇａｌプレート（１５ｇ／Ｌ寒天、０．０５ｇ／Ｌ  ＩＰＴＧ、および０．０４ｇ／Ｌ  Ｘｇａｌを有するＬＢ培地）上に延展し、３７℃で一晩インキュベートした。ブループラークを計数してファージ力価を計算し、それを３つの別々のビーズで得られた３つの測定値の平均として表１８に示す。
【０２１５】
【表２１】
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【０２１６】
表１８中の結果は、ファージクローンが様々な程度の親和性でＰＭＭＡに結合することを示している。配列番号１０１および１０９は最高の力価を有した。
【図面の簡単な説明】
【０２１７】
【図１】実施例１８に記載されるベクターｐＫＳＩＣ４−ＨＣ７７６２３のプラスミドマップである。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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