(57)【要約】本発明は、試料中のHIV-1、HIV-2、B型肝炎、C型肝炎、RSV、ロタウイルスAなどのウイルス、および結核菌の存在および量を決定するための方法および組成物を提供する。また、被験体がHIVに感染しているかどうか、ならびにそのタイプを決定するための方法も提供する。方法は、被験体からの試料をPDZポリペプチド(PDZ)もしくは他のPL結合因子、および/またはPDZリガンド(PL)と接触させる段階、ならびにPDZまたは他の結合因子とPLとの間に結合相互作用が起こるかどうかを決定する段階を含む。抗ウイルス作用物質および抗細菌用物質を同定するためのアッセイ、ならびにウイルスまたは細菌に感染した細胞におけるPLに対するPDZ結合を変化させる組成物を使用するための方法も提供する。2009503439.tif 000024
2009503439.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結核菌(M. tuberculosis) PDZリガンド(PL)タンパク質が患者試料中に存在しているかどうかを決定する段階を含む、患者が結核菌に感染しているかどうかを識別するための方法であって、該タンパク質の存在が患者が結核菌に感染していることを示す、方法。
【請求項２】
前記決定する段階が、
患者試料を結核菌PLタンパク質に特異的に結合する作用物質に接触させる段階；および
作用物質とPLタンパク質との間の、結核菌の存在を示す特異的結合を検出する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
結核菌PLタンパク質がESXN、ESXS、またはESAT-6である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
PLタンパク質に特異的に結合する作用物質がPLモチーフに結合する、請求項2記載の方法。
【請求項５】
PLモチーフが、結核菌ESXNタンパク質についてはSSWA (SEQ ID NO:269)であり、結核菌ESXSタンパク質についてはYTGF (SEQ ID NO:270)であり、結核菌ESAT-6タンパク質についてはGMFA (SEQ ID NO:271)である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
結核菌ESXNタンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、TIP2、KIAA1526、およびPSD95 (p2)からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
結核菌ESXSタンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、MAST2、MAST3、Shank3、APXL1、およびシンテニン(syntenin)からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項5記載の方法。
【請求項８】
結核菌ESAT-6タンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、INADL (p3)、RIM2、およびTIP2からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項5記載の方法。
【請求項９】
結核菌のPLタンパク質におけるカルボキシ末端PLモチーフに特異的に結合する単離された抗体。
【請求項１０】
結核菌を検出するための、結核菌のPLタンパク質の使用。
【請求項１１】
結核菌を同定するための、結核菌のPLタンパク質に結合する抗体の使用。
【請求項１２】
結核菌を検出するための、結核菌のPLタンパク質に結合するPDZポリペプチドの使用。
【請求項１３】
結核を処置するために有用な活性について化合物をスクリーニングするための、結核菌由来のPLタンパク質および該PLタンパク質に結合するPDZタンパク質の使用。
【請求項１４】
HIV PDZリガンド(PL)タンパク質が患者試料中に存在しているかどうかを決定する段階を含む、患者がHIVに感染しているかどうかを識別するための方法であって、該タンパク質の存在が患者がHIVに感染していることを示す、方法。
【請求項１５】
前記決定する段階が、
患者試料をHIV PLタンパク質に特異的に結合する作用物質に接触させる段階；および
作用物質とPLタンパク質との間の、HIVの存在を示す特異的結合を検出する段階を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
HIVタンパク質がEnv、Nef、またはVifである、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
PLタンパク質に特異的に結合する作用物質がPLモチーフに結合する、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
PLモチーフが、HIV-1 EnvについてはRALL (SEQ ID NO:242)またはRILL (SEQ ID NO:243)であり、HIV-1 Nefタンパク質についてはFKNC (SEQ ID NO:244)、FKDC (SEQ ID NO:245)、YKNC (SEQ ID NO:246)、またはYKDC (SEQ ID NO:247)であり、HIV2 Envタンパク質についてはIALL (SEQ ID NO:248)、LALL (SEQ ID NO:249)、またはLTALL (SEQ ID NO:250)であり、およびHIV-2 Vifタンパク質についてはEILA (SEQ ID NO:251)、GILA (SEQ ID NO:252)、またはDILA (SEQ ID NO:253)である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
HIV-1のEnv PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、AIPC (p1)、GORASP1 (p1)、INADL (p3)、KIAA0316、KIAA1284、MAGI1 (p1)、MAST2、MINT1 (p1、2)、NSP、NOS1、PAR3 (p3)、PAR3L (p3)、PAR6β、RIM2、ロドフィリン(Rhodophilin)様、SITAC-18(p2)、SITAC-18 (p1)、KIAA1284、PICK1、Shank 1、Shank 2、Shank 3およびTIP1からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
HIV-1のNef PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、MINT1、SITAC-18、TIP1、およびPICK1からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
HIV-2のEnv PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、EBP50(p1)、KIAA1284、MAST2、NSP、PAR3、PICK1、Shank 1、Shank 2、Shank 3、およびTIP1からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
HIV-2のVif PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、INADL (p3)、RIM2、およびEBP50 (p1)からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
HIVのPLタンパク質におけるカルボキシ末端PLモチーフに特異的に結合する単離された抗体。
【請求項２４】
HIVを検出するための、HIVのPLタンパク質の使用。
【請求項２５】
HIVを検出するための、HIVのPLモチーフに結合する抗体の使用。
【請求項２６】
HIVを検出するための、HIVのPLタンパク質に結合するPDZポリペプチドの使用。
【請求項２７】
HIV感染を処置するために有用な活性について化合物をスクリーニングするための、HIV由来のPLタンパク質および該PLタンパク質に結合するPDZタンパク質の使用。
【請求項２８】
B型肝炎PDZリガンド(PL)タンパク質が患者試料中に存在するかどうかを決定する段階を含む、患者がB型肝炎に感染しているかどうかを識別するための方法であって、該タンパク質の存在が患者がB型肝炎に感染していることを示す、方法。
【請求項２９】
前記決定する段階が、
患者試料をB型肝炎PLタンパク質に特異的に結合する作用物質に接触させる段階；および
作用物質とPLタンパク質との間の、B型肝炎の存在を示す特異的結合を検出する段階を含む、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
B型肝炎タンパク質が、タンパク質X、またはS抗原である、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
PLタンパク質に特異的に結合する作用物質がPLモチーフに結合する、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
PLモチーフが、B型肝炎タンパク質XについてのFTSA (SEQ ID NO:254)であるか、またはB型肝炎S抗原についてのWVYI (SEQ ID NO:255)である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
B型肝炎タンパク質XのPLモチーフに特異的に結合する作用物質が、TIP2、KIAA1526、SITAC-18、MINT1 (p1、2)、DVL3、およびNOS1からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
B型肝炎S抗原PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、PTPL1 (p4)、HEMBA 1003117、AF6、AIPC、SYNTENIN、MUPP1 (p3、7、9、11)、DVL2 (01)、ZO-3 (p1)、SIP1、AIPC (p1)、GORASP1 (p1)、INADL (p3)、KIAA0316、KIAA1284、MAGI1 (p1)、MAST2、MINT1 (p1、2)、NSP、NOS1、PAR3 (p3)、PAR3L (p3)、PAR6β、RIM2、ロドフィリン様、SITAC-18 (p2)、SITAC-18 (p1)、KIAA1284、PICK1、Shank 1、Shank 2、Shank 3、およびTIP1からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項30記載の方法。
【請求項３５】
B型肝炎のPLタンパク質におけるカルボキシ末端PLモチーフに特異的に結合する単離された抗体。
【請求項３６】
B型肝炎ウイルスを検出するための、B型肝炎ウイルスのPLタンパク質の使用。
【請求項３７】
B型肝炎ウイルスを検出するための、B型肝炎ウイルスのPLモチーフに結合する抗体の使用。
【請求項３８】
B型肝炎ウイルスを検出するための、B型肝炎ウイルスのPLタンパク質に結合するPDZポリペプチドの使用。
【請求項３９】
B型肝炎感染を処置するために有用な活性について化合物をスクリーニングするための、B型肝炎ウイルス由来のPLタンパク質および該PLタンパク質に結合するPDZタンパク質の使用。
【請求項４０】
フラビウイルスPDZリガンド(PL)タンパク質が患者試料中に存在するかどうかを決定する段階を含む、患者がフラビウイルスに感染しているかどうかを識別するための方法であって、該タンパク質の存在が患者がフラビウイルスに感染していることを示す、方法。
【請求項４１】
前記決定する段階が、
患者試料をフラビウイルスPLタンパク質に特異的に結合する作用物質に接触させる段階；および
作用物質とPLタンパク質との間の、フラビウイルスの存在を示す特異的結合を検出する段階を含む、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
フラビウイルスタンパク質がカプシドCまたはE1である、請求項40記載の方法。
【請求項４３】
PLタンパク質に特異的に結合する作用物質がPLモチーフに結合する、請求項41記載の方法。
【請求項４４】
フラビウイルスがC型肝炎ウイルスであり、かつPLモチーフが、C型肝炎カプシドCタンパク質についてのPASA (SEQ ID NO:256)もしくはPVSA (SEQ ID NO:257)であるか、またはC型肝炎E1タンパク質についてのGVDA (SEQ ID NO:258)である、請求項41記載の方法。
【請求項４５】
C型肝炎カプシドC PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、TIP-2およびZO-1 (p2)からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
C型肝炎E1タンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、TIP2、RIM2、およびINADL (p3)からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項44記載の方法。
【請求項４７】
フラビウイルスが、C型肝炎ウイルス、西ナイルウイルス、デング熱、日本脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスからなる群より選択される、該フラビウイルスのPLタンパク質におけるカルボキシ末端モチーフに特異的に結合する単離された抗体。
【請求項４８】
任意でフラビウイルスがC型肝炎ウイルスである、フラビウイルスを検出するための、フラビウイルス由来のウイルス性PLタンパク質の使用。
【請求項４９】
任意でフラビウイルスがC型肝炎ウイルスである、フラビウイルスを検出するための、フラビウイルスのPLモチーフに結合する抗体の使用。
【請求項５０】
任意でフラビウイルスがC型肝炎ウイルスである、フラビウイルスを検出するための、フラビウイルスのPLタンパク質に結合するPDZポリペプチドの使用。
【請求項５１】
任意でフラビウイルスがC型肝炎である、フラビウイルス感染を処置するために有用な活性について化合物をスクリーニングするための、フラビウイルス由来のPLタンパク質および該PLタンパク質に結合するPDZタンパク質の使用。
【請求項５２】
RSV PDZリガンド(PL)タンパク質が患者試料中に存在するかどうかを決定する段階を含む、患者がRSVに感染しているかどうかを識別するための方法であって、該タンパク質の存在が患者がRSVに感染していることを示す、方法。
【請求項５３】
前記決定する段階が、
患者試料をRSV PLタンパク質に特異的に結合する作用物質に接触させる段階；および
作用物質とPLタンパク質との間の、RSVの存在を示す特異的結合を検出する段階を含む、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
RSVタンパク質が核タンパク質である、請求項52記載の方法。
【請求項５５】
PLタンパク質に特異的に結合する作用物質がPLモチーフに結合する、請求項53記載の方法。
【請求項５６】
PLモチーフが、RSV核タンパク質ついてのDVEL (SEQ ID NO:259)である、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
RSV核タンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、ZO-1 (p2)、RIM2、新規セリンプロテアーゼ、MINT1、EBP50 (p1)、AIPC (p1)、PAR3 (p3)、SIP1 (p1)、PTPL1 (p4)、HEMBA 1003117、AF6、AIPC、SYNTENIN、MUPP1 (p3、7、9、11)、DVL2(01)、ZO-3(p1)、SIPl、AIPC (p1)、GORASP1 (p1)、INADL (p3)、KIAA0316、KIAA1284、MAGI1 (p1)、MAST2、MINT1 (p1、2)、NSP、NOSl、PAR3 (p3)、PAR3L (p3)、PAR6β、RIM2、ロドフィリン様、SITAC-18 (p2)、SITAC-18 (p1)、KIAA1284、PICK1、Shank 1、Shank 2、Shank 3、およびTIP1からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
RSVのPLタンパク質におけるカルボキシ末端PLモチーフに特異的に結合する単離された抗体。
【請求項５９】
RSVを検出するための、RSV PLタンパク質の使用。
【請求項６０】
RSVを検出するための、RSVタンパク質のPLモチーフに結合する抗体の使用。
【請求項６１】
RSVを検出するための、RSVウイルスのPLタンパク質に結合するPDZポリペプチドの使用。
【請求項６２】
RSV感染を処置するために有用な活性について化合物をスクリーニングするための、RSV由来のPLタンパク質および該PLタンパク質に結合するPDZタンパク質の使用。
【請求項６３】
ロタウイルスA PDZリガンド(PL)タンパク質が患者試料中に存在するかどうかを決定する段階を含む、患者がロタウイルスAに感染しているかどうかを識別するための方法であって、該タンパク質の存在が患者がロタウイルスAに感染していることを示す、方法。
【請求項６４】
前記決定する段階が、
患者試料をロタウイルスA PLタンパク質に特異的に結合する作用物質に接触させる段階；および
作用物質とPLタンパク質との間の、ロタウイルスAの存在を示す特異的結合を検出する段階を含む、請求項63記載の方法。
【請求項６５】
ロタウイルスAタンパク質が、VP4、VP7、NSP2、またはNSP5である、請求項63記載の方法。
【請求項６６】
PLタンパク質に特異的に結合する作用物質がPLモチーフに結合する、請求項63記載の方法。
【請求項６７】
PLモチーフが、ロタウイルスA VP4タンパク質についてはQCKL (SEQ ID NO:260)またはQCRL (SEQ ID NO:261)、ロタウイルスA VP7タンパク質についてはYYRV (SEQ ID NO:262)またはYYRI(SEQ ID NO:263)、ロタウイルスA NSP2タンパク質についてはQVGI (SEQ ID NO:264)、HIGI (SEQ ID NO:265)、QIGI (SEQ ID NO:266)、またはRIGI (SEQ ID NO:267)、ロタウイルスA NSP5タンパク質についてはIKDL (SEQ ID NO:268)またはIEDL (SEQ ID NO:269)である、請求項63記載の方法。
【請求項６８】
ロタウイルスA VP4タンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、MAGI3 (p5)、LIMミスティーク(mystique)、LIM-RIL、ENIGMA、MAGI1 (p3)、MAST2、MAGI2 (p5)、LIMタンパク質、およびZO-1(p2)からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項67記載の方法。
【請求項６９】
ロタウイルスA VP7タンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、GRIP1 (p6)、PTPL1 (p4)、MAST1、MUPP1 (p3、7、9)、KIAA1719 (p6)、MAST2、PICK1、およびZO-1 (p2)からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項67記載の方法。
【請求項７０】
ロタウイルスA NSP2 PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、NOS1 (p1、2、3)、MINT1 (p2)、およびZO-1 (p2)からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項67記載の方法。
【請求項７１】
ロタウイルスA NSP5 PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、NOS1、RIM2、およびZO-1 (p2)からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項67記載の方法。
【請求項７２】
ロタウイルスA PLタンパク質におけるカルボキシ末端PLモチーフに特異的に結合する単離された抗体。
【請求項７３】
ロタウイルスAを検出するための、ロタウイルスa PLタンパク質の使用。
【請求項７４】
ロタウイルスAを同定するための、ロタウイルスA1タンパク質のPLモチーフに結合する抗体の使用。
【請求項７５】
ロタウイルスAを検出するための、ロタウイルスAのPLタンパク質に結合するPDZポリペプチドの使用。
【請求項７６】
ロタウイルスA感染を処置するために有用な活性について化合物をスクリーニングするための、ロタウイルスA由来のPLタンパク質および該PLタンパク質に結合するPDZタンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2005年7月1日出願の米国仮出願第60/696,221号の優先権を主張し、全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の背景
流行性ウイルス感染は、重大な世界的な人命損失の原因であり、かつ通常の感冒から生命を脅かすインフルエンザ、西ナイル熱、およびHIV感染に至る広範なヒト疾患に関係している。適時の検出および診断は、適切な治療の決定および疾患拡大の抑制の両方にとって重要である。迅速な診断法は、罹患患者および集団リスクの軽減に特に有用である。
【０００３】
微生物学的方法および免疫化学的方法が、ウイルス性の病原体の迅速な検出に有用であることは公知である。伝統的な微生物学的方法は、信頼性は比較的高いが、時間がかかり、労力を要し、かつ高価でもある。ヌクレオチドプローブ、PCR、および免疫アッセイをベースとした方法によるいくつかの解決策が提案されているが、これらのアッセイは、多くの場合病原性ウイルスの最も医学的に重要な株、ならびに特に慢性化して生命を脅かす疾患および癌に多くの場合関係するそれらの株を識別することができない。
【０００４】
医学技術分野では、医学的に重要な疾患の発生に最も多く関係している病原性ウイルスの特定株を検出することができる、改良された、廉価で、迅速で、正確でかつ識別力のある方法が相変わらず強く求められている。特に、資源が限られ、精巧な検査装置がさほど入手できない医師および獣医の診療所、学校、工場および開発途上国で、それほど訓練を受けていない個人が日常的に使用できる簡単なアッセイ方法論がまた特に求められている。
【発明の開示】
【０００５】
発明の簡単な概要
本発明は、被験体がウイルスに感染しているかどうかを決定するための方法を提供する。方法は、被験体からの試料をPDZ含有ポリペプチドと接触させる段階、およびPDZポリペプチドがウイルスPDZリガンドポリペプチドに結合するかどうかを決定する段階を含む。PDZ含有ポリペプチドとウイルスPDZリガンドポリペプチドとの間の結合は、被験体がウイルスに感染していることを示す。抗ウイルス作用物質および抗細菌作用物質を同定するためのアッセイもまた提供される。本発明は、様々な診断的および治療的な応用に用途を見出す。
【０００６】
本明細書では、結核菌(M. tuberculosis)PDZリガンド(PL)タンパク質の存在は患者が結核菌に感染していることを示すことから、該タンパク質が患者試料中に存在するかどうかを決定することによって、患者が結核菌に感染しているかどうかを識別するための方法を開示する。一つの局面では、前記決定は、患者試料を結核菌PLタンパク質に特異的に結合する作用物質に接触させる段階；および作用物質とPLタンパク質との特異的結合を検出する段階を含み、該特異的結合は結核菌の存在を示す。いくつかの局面では、結核菌PLタンパク質はESXN、ESXS、またはESAT-6である。いくつかの局面では、PLタンパク質に特異的に結合する作用物質は、PLモチーフに結合する。いくつかの局面では、方法は、結核菌ESXNタンパク質についてはPLモチーフSSWA (SEQ ID NO:269)を、または結核菌ESXSタンパク質についてはYTGF (SEQ ID NO:270)を、または結核菌ESAT-6タンパク質についてはGMFA (SEQ ID NO:271)を用いることを含む。結核菌ESXNタンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質がPDZタンパク質である場合は、それは次のもの、即ちTIP2、KIAA1526、およびPSD95 (p2)の一つであり得る。結核菌ESXSタンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質がPDZタンパク質である場合は、それは次のもの、MAST2、MAST3、Shank3、APXL1およびシンテニン(syntenin)の一つであり得る。結核菌ESAT-6タンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質がPDZタンパク質である場合は、それは次のもの、INADL (p3)、RIM2、およびTIP2の一つであり得る。本明細書では、結核菌のPLタンパク質におけるカルボキシ末端モチーフに特異的に結合する、単離された抗体を開示している。本明細書では、結核菌のPLタンパク質と細胞のPDZタンパク質との相互作用を阻害する作用物質の有効なレジメンを患者に施す段階、およびそれによって感染の処置または予防に効果を及ぼす段階を含む、結核に罹っているかまたは結核の危険がある患者の処置または予防のための方法を開示している。いくつかの局面では、作用物質は、PLタンパク質のPLモチーフに特異的に結合する抗体である。更なる局面では、作用物質は、下記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子、siRNA、およびジンクフィンガータンパク質のうちの一つであり、かつ作用物質は結核菌PLタンパク質またはそれと相互作用するPDZタンパク質のいずれかの発現を阻害する。細菌がマイコバクテリア(Mycobacteria)属のメンバーである場合は、PLタンパク質は、好ましくはESAT-6ファミリーのメンバーである。
【０００７】
本明細書では、HIV PLの存在は患者がHIVに感染していることを示すことから、HIV PDZリガンド(PL)タンパク質が患者試料中に存在するかどうかを決定することによって、患者がHIVに感染しているかどうかを識別する方法を開示する。いくつかの局面では、前記決定は、患者試料をHIV PLタンパク質に特異的に結合する作用物質と接触させる段階；および作用物質とPLタンパク質との間の特異的結合を検出する段階を含み、該特異的結合はHIVの存在を示す。HIV PLタンパク質としては、Env、Nef、またはVifが挙げられる。好ましくは、PLタンパク質に特異的に結合する作用物質は、PLモチーフに結合する。HIVタンパク質については下記のPLモチーフが同定されている：HIV-1 EnvについてはRALL (SEQ ID NO:242)またはRILL (SEQ ID NO:243)；HIV-1 Nefタンパク質についてはFKNC (SEQ ID NO:244)、FKDC (SEQ ID NO:245)、YKNC (SEQ ID NO:246)、またはYKDC (SEQ ID NO:247)；HIV2 Envタンパク質についてはIALL (SEQ ID NO:248)、LALL (SEQ ID NO:249)、またはLTALL (SEQ ID NO:250)；およびHIV-2 Vifタンパク質についてはEILA (SEQ ID NO:251)、GILA (SEQ ID NO:252)、またはDILA (SEQ ID NO:253)。いくつかの局面では、HIV-1のEnv PLモチーフに特異的に結合する作用物質は、好ましくは下記からなる群から選択されるPDZタンパク質である：AIPC (p1)、GORASPl (p1)、INADL (p3)、KIAA0316、KIAA1284、MAGI1 (p1)、MAST2、MINT1 (p1、2)、NSP、NOS1、PAR3 (p3)、PAR3L (p3)、PAR6β、RIM2、ロドフィリン(Rhodophilin)様、SITAC-18 (p2)、SITAC-18 (p1)、KIAA1284、PICK1、Shank 1、Shank 2、Shank 3、およびTIP1。いくつかの局面では、HIV-1のNef PLモチーフに特異的に結合する作用物質は、下記からなる群より選択されるPDZタンパク質である：MINTl、SITAC-18、TIP1、およびPICK1。いくつかの局面では、HIV-2のEnv PLモチーフに特異的に結合する作用物質は、下記からなる群より選択されるPDZタンパク質である：EBP50 (p1)、KIAA1284、MAST2、NSP、PAR3、PICK1、Shank 1、Shank 2、Shank 3、およびTIP1。いくつかの局面では、HIV-2のVif PLモチーフに特異的に結合する作用物質は、下記からなる群から選択されるPDZタンパク質である：INADL (p3)、RIM2、およびEBP50 (p1)。本明細書では、HIVのPLタンパク質におけるカルボキシ末端モチーフに特異的に結合する単離された抗体も開示している。本明細書では、HIVのPLタンパク質と細胞のPDZタンパク質との相互作用を阻害する作用物質の有効なレジメンを患者に施す段階、およびそれによって感染の処置または予防に効果を及ぼす段階によって、HIV感染に罹っているかまたはHIV感染の危険がある患者を処置または予防するための方法も開示している。いくつかの局面では、作用物質は、PLタンパク質のPLモチーフに特異的に結合する抗体である。いくつかの局面では、作用物質は、下記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子、siRNA、およびジンクフィンガータンパク質のうちの一つであり、かつ作用物質は、HIV-1 PLタンパク質またはそれと相互作用するPDZタンパク質のいずれかの発現を阻害する。HIVについてのPLタンパク質と同定されているPLタンパク質は、Env、Nef、およびVifを含む。
【０００８】
本明細書では、B型肝炎PDZリガンド(PL)タンパク質の存在は患者がB型肝炎に感染していることを示すことから、該タンパク質が患者試料に存在しているかどうかを決定することによって、患者がB型肝炎に感染しているかどうかを識別するための方法を開示している。いくつかの局面では、決定は、患者試料を、B型肝炎PLタンパク質に特異的に結合する作用物質と接触させる段階；および作用物質とPLタンパク質との特異的結合を検出する段階を含み、該特異的結合はB型肝炎の存在を示す。B型肝炎タンパク質について公知であるPLタンパク質は、タンパク質XまたはS抗原である。好ましくは、PLタンパク質に特異的に結合する作用物質は、PLモチーフに結合する。いくつかの局面では、PLモチーフは、B型肝炎タンパク質XについてはFTSA (SEQ ID NO:254)であるか、またはB型肝炎S抗原についてはWVYI (SEQ ID NO:255)である。いくつかの局面では、B型肝炎タンパク質X PLモチーフに特異的に結合する作用物質がPDZタンパク質の場合は、PDZタンパク質はTIP2、KIAA1526、SITAC-18、MINT1 (p1、2)、DVL3、およびNOS1の一つである。別の局面では、B型肝炎S抗原PLモチーフに特異的に結合する作用物質がPDZタンパク質である場合は、PDZタンパク質はPTPL1 (p4)、HEMBA 1003117、AF6、AIPC、SYNTENIN、MUPP1 (p3、7、9、11)、DVL2 (01)、ZO-3 (p1)、SIP1、AIPC (p1)、GORASP1 (p1)、INADL (p3)、KIAA0316、KIAA1284、MAGI1(p1)、MAST2、MINT1 (p1、2)、NSP、NOS1、PAR3 (p3)、PAR3L (p3)、PAR6β、RIM2、ロドフィリン様、SITAC-18 (p2)、SITAC-18 (p1)、KIAA1284、PICK1、Shank 1、Shank 2、Shank 3、またはTIP1である。本明細書では、また、B型肝炎のPLタンパク質におけるカルボキシ末端モチーフに特異的に結合する単離された抗体を開示する。本明細書では、また、B型肝炎のPLタンパク質と細胞のPDZタンパク質との相互作用を阻害する作用物質の有効なレジメンを患者に施す段階、およびそのようにして感染の処置または予防に効果を及ぼす段階を含む、B型肝炎感染に罹っているかまたはB型肝炎感染の危険がある患者を処置または予防するための方法を開示している。好ましくは、作用物質の少なくとも一つは、PLタンパク質のPLモチーフに特異的に結合する抗体である。一つの局面では、作用物質は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子、siRNA、またはジンクフィンガータンパク質であり、かつ作用物質はC型肝炎PLタンパク質またはそれと相互作用するPDZタンパク質のいずれかの発現を阻害する。いくつかの局面では、PLタンパク質はタンパク質XまたはS抗原である。
【０００９】
本明細書では、フラビウイルスPDZリガンド(PL)タンパク質の存在は患者がフラビウイルスに感染していることを示すことから、該タンパク質が患者試料中に存在するかどうかを決定することによって、患者がフラビウイルスに感染しているかどうかを識別する方法を開示している。いくつかの局面では、前記決定は、患者試料をフラビウイルスPLタンパク質に特異的に結合する作用物質と接触させる段階；および作用物質とPLタンパク質との特異的結合を検出する段階を含み、該特異的結合はフラビウイルスの存在を示す。フラビウイルスのC型肝炎ウイルスについて公知であるPLタンパク質は、C型肝炎カプシドCタンパク質についてはPASA (SEQ ID NO:256)、またはPVSA (SEQ ID NO:257)であるか、あるいはC型肝炎ウイルスE1タンパク質についてはGVDA (SEQ ID NO:258)である。好ましくは、C型肝炎カプシドC PLモチーフに特異的に結合する作用物質は、TIP-2およびZO-1 (p2)の少なくとも一つのPDZタンパク質であり、C型肝炎E1タンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質は、TIP2、RIM2、およびINADL (p3)の少なくとも一つである。本明細書では、また、フラビウイルスのPLタンパク質におけるカルボキシ末端モチーフに特異的に結合する単離された抗体を開示している。本明細書では、また、フラビウイルスのPLタンパク質と細胞のPDZタンパク質の相互作用を阻害する作用物質の有効なレジメンを患者に施す段階、およびそのようにして感染の処置または予防に効果を及ぼす段階を含む、フラビウイルス感染に罹っているかまたはフラビウイルス感染の危険がある患者を処置または予防する方法も開示している。好ましくは、作用物質の少なくとも一つは、PLタンパク質のPLモチーフに特異的に結合する抗体である。一つの局面では、作用物質は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子、siRNA、またはジンクフィンガータンパク質であり、かつ作用物質は、RSV PLタンパク質またはそれと相互作用するPDZタンパク質のいずれかの発現を阻害する。いくつかの局面では、PLタンパク質はカプシドCまたはE1タンパク質である。
【００１０】
本明細書では、RSV PDZリガンド(PL)タンパク質の存在は患者がRSVに感染していることを示すことから、該タンパク質が患者試料に存在しているかどうかを決定することによって患者がRSVに感染しているかどうかを識別するための方法を開示している。前記決定は、患者試料をRSV PLタンパク質に特異的に結合する作用物質に接触させる段階；および作用物質とPLタンパク質との特異的結合を検出する段階を含み、該特異的結合はRSVの存在を示す。公知のRSVタンパク質は核タンパク質である。いくつかの局面では、PLタンパク質に特異的に結合する作用物質は、PLモチーフに結合する。別の局面では、PLモチーフは、RSV核タンパク質についてはDVEL (SEQ ID NO:259)であり、およびRSV核タンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質は、下記のPDZタンパク質の一つ、即ち、ZO-1 (p2)、RIM2、新規セリンプロテアーゼ、MINT1、EBP50 (p1)、AIPC (p1)、PAR3 (p3)、SIP1 (p1)、PTPL1 (p4)、HEMBA 1003117、AF6、AIPC、SYNTENIN、MUPP1 (p3、7、9、11)、DVL2 (01)、ZO-3 (p1)、SIP1、AIPC (p1)、GORASP1 (p1)、INADL (p3)、KIAA0316、KIAA1284、MAGI1 (p1)、MAST2、MINT1 (p1、2)、NSP、NOS1、PAR3 (p3)、PAR3L (p3)、PAR6β、RIM2、ロドフィリン様、SITAC-18 (p2)、SITAC-18 (p1)、KIAA1284、PICK1、Shank 1、Shank 2、Shank 3、またはTIP1の一つである。また、RSVのPLタンパク質におけるカルボキシ末端モチーフに特異的に結合する単離された抗体も開示している。また、RSVのPLタンパク質と細胞のPDZタンパク質との相互作用を阻害する作用物質の有効なレジメンを患者に施す段階、およびそれによって感染の処置または予防に効果を及ぼす段階を含む、RSV感染に罹っているかまたはRSV感染の危険がある患者を処置または予防するための方法も開示している。いくつかの局面では、作用物質はPLタンパク質のPLモチーフに特異的に結合する抗体であり、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子、siRNA、またはジンクフィンガータンパク質であり得、かつ作用物質はロタウイルスA PLタンパク質またはそれと相互作用するPDZタンパク質のいずれかの発現を阻害する。いくつかの局面では、PLタンパク質は核タンパク質である。
【００１１】
本明細書では、ロタウイルスA PDZリガンド(PL)タンパク質の存在は患者がロタウイルスAに感染していることを示すことから、該タンパク質が患者試料に存在しているかどうかを決定することによって、患者がロタウイルスAに感染しているかどうかを識別する方法を開示している。前記決定は、患者試料をロタウイルスA PLタンパク質に特異的に結合する作用物質に接触させる段階；および作用物質とPLタンパク質との特異的結合を検出する段階を含み、該特異的結合はロタウイルスAの存在を示す。公知のロタウイルスAタンパク質は、VP4、VP7、NSP2、およびNSP5である。いくつかの局面では、PLタンパク質に特異的に結合する作用物質は、PLモチーフに結合する。いくつかの局面では、PLモチーフは下記のものの一つである：ロタウイルスA VP4タンパク質についてはQCKL (SEQ ID NO:260)またはQCRL (SEQ ID NO:261)；ロタウイルスA VP7タンパク質についてはYYRV (SEQ ID NO:262)またはYYRI (SEQ ID NO:263)；ロタウイルスA NSP2タンパク質についてはQVGI (SEQ ID NO:264)、HIGI (SEQ ID NO:265)、QIGI (SEQ ID NO:266)、またはRIGI (SEQ ID NO:267)；ロタウイルスA NSP5タンパク質についてはIKDL (SEQ ID NO:268)またはIEDL (SEQ ID NO:269)。いくつかの局面では、ロタウイルスA VP4タンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質は、MAGI3 (p5)、LIMミスティーク(mystique)、LIM-RIL、ENIGMA、MAGI1 (p3)、MAST2、MAGI2 (p5)、LIMタンパク質、およびZO-1(p2)などのPDZタンパク質である。いくつかの局面では、ロタウイルスA VP7タンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質は、GRIP1 (p6)、PTPL1 (p4)、MAST1、MUPP1 (p3、7、9)、KIAA1719 (p6)、MAST2、PICK1、およびZO-1 (p2)などのPDZタンパク質である。いくつかの方法では、ロタウイルスA NSP2 PLモチーフに特異的に結合する作用物質は、NOS1 (p1、2、3)、MINT1 (p2)、およびZO-1 (p2)からなる群より選択されるPDZタンパク質である。好ましくは、ロタウイルスA NSP5 PLモチーフに特異的に結合する作用物質は、NOS1、RIM2、およびZO-1 (p2)からなる群より選択されるPDZタンパク質である。本明細書では、ロタウイルスAのPLタンパク質におけるカルボキシ末端モチーフに特異的に結合する単離された抗体を開示している。本明細書では、ロタウイルスAのPLタンパク質と細胞のPDZタンパク質との相互作用を阻害する作用物質の有効なレジメンを患者に施す段階、およびそれによって感染の処置または予防に効果を及ぼす段階を含む、ロタウイルスA感染に罹っているかまたはロタウイルスA感染の危険がある患者を処置または予防するための方法を開示している。いくつかの局面では、作用物質はPLタンパク質のPLモチーフに特異的に結合する抗体である。いくつかの局面では、作用物質は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子、siRNA、またはジンクフィンガータンパク質であって、該作用物質は細菌またはウイルスのPLタンパク質、あるいはそれと相互作用するPDZタンパク質のいずれかの発現を阻害する。いくつかの局面では、PLタンパク質は、VP4、VP7、NSP2、またはNSP5である。
【００１２】
定義
別途定義しない限り、本明細書に使用する全ての技術的用語および科学的用語は、本発明に関する当業者が一般的に理解するものと同一の意味を有する。下記参照は、本発明に用いられる多くの用語の一般的定義を提供している：Singletonら、DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988)；およびHale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991)。本明細書に記載の方法および材料に類似するいかなる方法および材料も本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および材料を記載する。下記定義は、本発明の実施において読者を支援するために提供される。
【００１３】
本明細書に使用する用語「調節」は、例えば結合活性をアゴナイスすることによる上方制御(即ち活性化または刺激)、および、例えば結合活性をアンタゴナイズすることによる下方制御(即ち阻害または抑制)の両方を指す。本明細書で使用する用語「PDZリガンド結合モジュレーター」は、PDZリガンドポリペプチドに結合するPDZドメイン含有ポリペプチドのPDZドメインへの、PDZリガンドポリペプチドのPDZ-リガンド(即ち「PL」)の結合を変えることができる作用物質を指す。モジュレーターとしては、アクチベーターおよびインヒビターの両方が挙げられるが、これらに限定されない。インヒビターは結合の部分的または完全な阻害をもたらすことができる。
【００１４】
「PDZリガンド結合モジュレーター」は、一般的にはPDZリガンドポリペプチドとPDZドメイン含有ポリペプチドとの結合を、試験化合物を含まない対照に比べて少なくとも20%、例えば少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、約99%または100%減少させる。一般的には、関心対象の作用物質は、特定のアッセイでは、約1mMまたはそれ未満の範囲のIC50を示す作用物質である。より低いIC50、例えば約100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、1nM、またはさらに低い範囲のIC50を示す化合物は、結合介在性疾患を処置または予防する治療薬または予防薬として特に有用である。
【００１５】
「非天然」は、自然界に発生しない組成物を意味するのに用いられる。非天然組成物の代表例としては、実質的に精製された組成物、ならびに自然界には同一の化学的形式で出現しない、例えば化学的および遺伝的に調節されたタンパク質、核酸等の化合物を含む組成物が挙げられる。
【００１６】
「PDZドメイン」とは、近接アミノ酸約90個、好ましくは約80〜90個、より好ましくは、約70〜80個、より好ましくは約50〜70個が、脳シナプスタンパク質PSD-95、ショウジョウバエ中隔結合タンパク質Discs-Large (DLG)および/または上皮タイトジャンクションタンパク質ZO1 (ZO1)と相同である、アミノ酸配列を意味する。PDZドメインの代表的な例は、また、Discs-Largeホモロジー反復(「DHR」)および「GLGF」反復(SEQ ID NO:26)として当技術分野において公知である。PDZドメインの例は、グアニル酸キナーゼホモログのMAGUKファミリーのメンバー、いくつかのタンパク質ホスファターゼおよびキナーゼ、神経型一酸化窒素合成酵素、腫瘍抑制タンパク質、ならびに総称的にシントロフィンとして公知のいくつかのジストロフィン関連タンパク質を含む様々な膜結合タンパク質に見出される。本PDZドメインは、天然および非天然のアミノ酸配列の両方を包含する。PDZドメインの代表的な例としては、PDZタンパク質の多形変異体、ならびに二つのPDZタンパク質の一部を含むキメラPDZドメイン等が挙げられる。好ましくは、本PDZドメインは、全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願第10/485,788号(2004年2月3日出願)、国際特許出願PCT/US03/285/28508 (2003年9月9日出願)、国際特許出願PCT/US01/44138 (2001年11月9日出願)に開示されているドメインに実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。代表的な非天然PDZドメインとしては、アミノ酸配列に対応する遺伝子コードが突然変異して、例えばPLへの結合または結合特異性のいずれかを変えるアミノ酸の変化を生成するドメインが挙げられる。任意で、PDZドメインまたはその変異体は、脳シナプスタンパク質PSD-95、ショウジョウバエ中隔結合タンパク質Discs-Large (DLG)および/または上皮タイトジャンクションタンパク質ZO1 (ZO1)、ならびに動物ホモログの少なくとも一つに由来するPDZドメインと、少なくとも50、60、70、80、または90%の配列相同性を有している。任意で、天然PDZドメインの変異体は、天然PDZドメインと少なくとも90%の配列相同性を有している。PDZドメインの配列相同性は、PDZドメイン内の少なくとも70個のアミノ酸、好ましくは80個のアミノ酸、およびより好ましくは80〜100個のアミノ酸にわたり決定される。類似体のアミノ酸には、類似体およびヒト配列を最大に一致するように並べた時に、天然ヒト配列中の対応するアミノ酸と同一の番号が割り振られる。類似体は、典型的には、天然のペプチドとは、多くの場合、保存的置換によって一つ、二つ、または少数の位置で異なっている。用語「対立遺伝子変異体」は、同一種の異なる個体の遺伝子間の変異、および遺伝子がコードするタンパク質中の対応する変異を指すのに用いられる。
【００１７】
PDZドメイン変異体は、一般的には、野性型PDZドメインのアミノ酸配列と、少なくとも80%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、または特定の態様では少なくとも98%同一もしくは少なくとも99%同一である。換言すると、本明細書に記載する方法に使用する場合、PDZドメイン含有ポリペプチドは、野性型配列と比べて、アミノ酸置換を少なくとも1、2、3、4、もしくは5個またはそれ以上、およびある態様では最大10個まで含むことができる。置換は、保存的(即ち、あるアミノ酸を下記の群内の別のアミノ酸に置き換える：gly、ala；val、ile、leu；asp、glu；asn、gln；ser、thr；lys、arg；およびphe、tyr)、または非保存的であり得る。
【００１８】
「PDZタンパク質」は、「PDZドメイン-含有ポリペプチド」および「PDZポリペプチド」と互換的に用いられ、PDZドメインを有する天然または非天然のタンパク質を意味する(前記)。PDZタンパク質の代表例は既に開示されており(前記)、CASK、MPP1、DLG1、DLG2、PSD95、NeDLG、TIP-33、TIP-43、LDP、LIM、LIMK1、LIMK2、MPP2、AF6、GORASP1、INADL、KIAA0316、KIAA1284、MAGI1、MAST2、MINT1、NSP、NOS1、PAR3、PAR3L、PAR6β、PICK1、Shank 1、Shank 2、Shank 3、SITAC-18、TIP1およびZO-1を挙げることができる。スクリーニングアッセイに有用な本非天然PDZドメインポリペプチドは、例えば天然PDZドメインより小さなPDZドメインを含むことができる。例えば、非天然PDZドメインは、任意で「GLGF」モチーフ、即ちGLGFアミノ酸配列(SEQ ID NO：281)を有するモチーフを含んでもよく、このモチーフは典型的にはPDZドメインに隣接して、例えば、通常はN末端のアミノ酸約10〜20個内に存在する。PDZ結合活性には、多くの場合、後者のGLGFモチーフ (SEQ ID NO：X281)、およびGLGFモチーフ(SEQ ID NO：281)のN末端直近のアミノ酸3個を必要とすることが多い。同様に、非天然PDZドメインは、PDZドメインのC末端にあるβシートを欠くように構築してもよく、即ちこの領域は、多くの場合、PLの結合に影響しないように天然PDZドメインから削除してもよい。
【００１９】
「PDZリガンド」、略して「PL」は、PDZドメインと結合して分子相互作用複合体を形成するアミノ酸配列を有する天然のタンパク質を意味する。PLの代表例は、前出の米国および国際特許出願内に既に示されている(前記)。PLモチーフは、本明細書の表1に提供されている。
【００２０】
「PDZ作用物質」は、試験アッセイにおいてPDZリガンド(PL)ポリペプチドとPDZドメイン含有ポリペプチドとの間に起こる結合相互作用を、PDZ作用物質を含まない対照に比べて、少なくとも20%、例えば少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、最大約99%または100%妨害する化合物を意味する。任意の特定の作用メカニズムに限定するつもりはないが、本PDZ作用物質は、例えばそうでなければ細菌もしくはウイルスのPLリガンドと結合するPDZドメインに結合することによって干渉でき；または代わりにPLリガンドに直接結合することによってPDZタンパク質へのその結合を阻止することもできる。一般的には、後者のPDZ作用物質は、特定のアッセイにおいて約1mMまたはそれ以下の範囲のIC50を示す作用物質である。より低いIC50を示す化合物は、例えば、通常約100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、1nM、またはそれよりかなり低いIC50を有する。後者のPDZ作用物質は、本明細書に開示するようなウイルスまたは細菌による感染に起因する疾患の一つまたは複数の症状を緩和、処置、または予防するために投与される治療的および予防的医用組成物に有用である。
【００２１】
「PLモジュレーター」は、PDZ作用物質(前記)と関連して用いられ、ウイルスまたは細菌のPLタンパク質に結合してPDZドメインへのその結合を調節する化合物を意味する。
【００２２】
「PDZモジュレーター」はPDZ作用物質(前記)と関連して用いられ、PDZドメインに結合して、被験体のPDZドメイン部位へのPLタンパク質の結合を調節する化合物を意味する。本PDZモジュレーターおよびPLモジュレーターは、PDZドメインまたはPLにそれぞれ結合するように設計されたペプチドでも、ペプチド模倣物でも、低分子模倣物でもよい。PDZモジュレーターがPDZドメインに結合するかどうかを決定するためのアッセイは、AアッセイおよびGアッセイを含め、本明細書に詳細に記載されている。同様に、PLモジュレーターがPDZドメインに結合するかどうかを決定するアッセイも記載されており、例えば組換えPL融合タンパク質への組換えPDZドメイン融合タンパク質の結合が記載されている。
【００２３】
「PDZ介在性疾患」は、ウイルスまたは細菌タンパク質のPLが宿主細胞のPDZドメインに結合することに起因する、ウイルスまたは細菌に感染した被験体の一つまたは複数の症状を意味する。症状は、ウイルス性疾患または細菌性疾患に応じて変わる。
【００２４】
「病気」は、本明細書で用いる場合は、ヒト被験体での徴候および症状と異なっていてもよい徴候および症状を含む動物被験体を指す。しかしながら、あらゆる徴候および症状が、医師用卓上参考書(physician's desk reference)またはその他参考資料を利用して識別できる。または、例えば "Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 5th edition, 2004, World Organization for Animal Health" は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【００２５】
「PDZリガンドポリペプチド阻害」とは、「PDZリガンドポリペプチド阻害化合物」(例えば、PLタンパク質PLインヒビター化合物)と関連して、PDZリガンドポリペプチドの任意の活性、例えば結合活性を阻害する活性を有していることを意味する。
【００２６】
「PDZリガンド介在性疾患」とは、PDZリガンドを含有するタンパク質の活性により仲介される任意の疾患である。このような疾患としては、本明細書に開示している任意のウイルスまたは細菌の感染を原因とする症状が挙げられる。
【００２７】
本明細書に記載されるPDZドメインの例では、特定のPDZドメインの「病原体PL結合変異体」とは、病原体のPLリガンド結合活性を保持しているPDZドメイン変異体である。PDZドメイン変異体が病原体PLに結合できるかどうかを決定するためのアッセイは、下記に詳しく記載されており、特定のPDZドメイン内のどのアミノ酸の変化がPDZドメインを変異体に変えるかを識別するための手引きは、様々な資料に見出すことができるだろう。一つの例では、PDZドメインを本明細書に記載されている他のPDZドメインと比較することができ、例えば対応する位置のアミノ酸を置換することができる。別の例では、特定のPDZタンパク質のPDZドメイン配列は、別の種に由来する同等のPDZタンパク質の同等のPDZドメイン配列と比較することができる。例えば、ヒトPDZタンパク質由来のPDZドメイン配列は、他種(例えば、マウス、ラット等)由来の、他の公知および同等なPDZドメインと比較することができ、二つの配列間で変異している任意のアミノ酸をヒトPDZドメイン内で置換して、PDZドメインの変異体を作ることができる。例えば、ヒトDLG1 PDZドメイン1または2の配列を他の種に由来する同等のDLG1 PDZドメインと比較して、ヒトDLG PDZドメインの変異体を作るためにその中で置換できるアミノ酸を識別することができる。このような方法は、本明細書に記載されている任意のPDZドメインに応用できる。特定の変異体は、配列表に記載した配列と比べて、1個、5個まで、約10個まで、約15個まで、約20個まで、もしくは約30個まで、またはそれ以上、通常は約50個までのアミノ酸を交換できる。
【００２８】
スクリーニングアッセイで使用するPDZドメインポリペプチドは、例えば配列表に記載の例示のPDZドメインより小さいPDZドメインを含むことができる。例えば、PDZドメインは、PDZドメインのN末端に隣接する(典型的にはN末端のアミノ酸約10〜20個以内)「GLGF」モチーフ(即ち、GLGF (SEQ ID NO：X)を有するモチーフ)を含む。このモチーフおよび該モチーフのN末端直近にあるアミノ酸3個がPDZ結合活性に必要とされる。同様に、PDZドメインのC末端のβシートは、結合に影響を及ぼさずにPDZドメインから削除できる。
【００２９】
用語「作用物質」は、任意の物質、分子、要素、化合物、実体、またはそれらの組み合わせを含む。それは、例えばタンパク質、オリゴペプチド、有機小分子、多糖類、ポリヌクレオチド等を含むが、これらに限定されない。それは天然産物でも、合成化合物でも、または化学物質でも、または二つもしくはそれ以上の物質の組み合わせでもよい。特に明記しない限り、用語「作用物質」、「物質」および「化合物」は互換的に用いることができる。
【００３０】
用語「類似物」は、本明細書では関心対象の分子と構造が類似しているが、標的化され、かつ制御的な様式で、参照分子の特異的な置換基を別の置換基で置き換えることによって調節されている分子を指す。出発原料と比べ、類似物は、同一、類似、または改善された有用性を示す。改善された特性(標的分子へのより高い結合親和性またはより高い結合選択性、および非標的分子へのより低い活性レベルなど)を有する公知化合物の変異体を同定するための、類似物の合成およびスクリーニングは、製薬化学において周知である。
【００３１】
「接触させる」とは、その一般的な意味を有し、二つまたはそれ以上の作用物質(例えば、二つのタンパク質、ポリヌクレオチドと細胞等)を混合することを指す。接触は、細胞溶解物の存在下または非存在下で、インビトロ(例えば、試験化合物と細胞溶解物のような二つまたはそれ以上の作用物質を試験管または他の容器内で混合する)またはインサイチュー(例えば、二つのポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを細胞内で同時発現させることで、二つのポリペプチドを細胞内で接触させることができる)で行われ得る。
【００３２】
「生体高分子」は、その源を問わず、一つまたは複数のタイプの反復単位の高分子である。生体高分子は、生物系に見出すことができ、特にポリペプチドおよびポリヌクレオチド、ならびにアミノ酸、ヌクレオチド、またはその類似物を含有するような化合物を含む。用語「ポリヌクレオチド」は、10〜100ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドおよび100ヌクレオチド長を超えるポリヌクレオチドを含む、任意の長さのヌクレオチドまたはその類似物の高分子を指す。用語「ポリペプチド」は、6〜50個アミノ酸長の範囲のペプチド、および約50個アミノ酸長を超えるポリペプチドを含む、任意の長さのアミノ酸高分子を指す。
【００３３】
大部分の態様では、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、互換的に用いられる。用語「ポリペプチド」は、従来のバックボーンが非天然のまたは合成されたバックボーンで置き換えられたポリペプチド、および一つまたは複数の、従来のアミノ酸が非天然アミノ酸または合成アミノ酸の一つまたは複数で置き換えられたペプチドを含む。用語「融合タンパク質」または文法的にそれと同等な用語は、複数のポリペプチド成分からなるタンパク質に言及し、それは、それらが天然状態では結合されないが、ペプチド結合を介して、それぞれのアミノ末端とカルボキシル末端とが連結され、単一の連続するポリペプチドを形成している。融合タンパク質は、2、3、または4つもしくはそれ以上のタンパク質の組み合わせでよい。用語ポリペプチドは、融合タンパク質を含むが、N末端メチオニン残基を持っても持たなくともよい、異種アミノ酸配列を持つ融合タンパク質、異種および同種リーダー配列を有する融合物；免疫学的にタグを付けたタンパク質；検出可能な融合相手を有する融合タンパク質、例えば融合相手として蛍光タンパク質、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等を含む融合タンパク質を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
一般的に、ポリペプチドは任意の長さ、例えばアミノ酸2個より長い、アミノ酸4個より長い、アミノ酸約10個より長い、アミノ酸約20個より長い、アミノ酸約50個より長い、アミノ酸約100個より長い、アミノ酸約300個より長い、通常はアミノ酸約500もしくは1000個までまたはそれ以上でよい。「ペプチド」は、一般にはアミノ酸2個より長く、アミノ酸4個より長く、アミノ酸約10個より長く、アミノ酸約20個より長く、一般的にはアミノ酸約50個までである。いくつかの態様では、ペプチドはアミノ酸長5〜30個の間である。
【００３５】
用語「捕捉剤」は、作用物質が、様々な分析物の均質な混合物からの分析物に結合しかつ濃縮するのに十分である相互作用を通して分析物に結合する作用物質を指す。結合相互作用は、捕捉剤の親和性領域によって媒介されるだろう。代表的な捕捉剤としては、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドが挙げられ、例えば抗体、ペプチド、または単鎖もしくは二本鎖DNAの断片を用いることができる。捕捉剤は、通常は一つまたは複数の分析物に「特異的に結合する」。
【００３６】
したがって、用語「捕捉剤」は、ある分析物に特異的に結合できる分子または多分子複合体を指し、例えば、他の標的に結合することなく約10-6M未満の解離定数(KD)で捕捉剤に対する分析物に特異的に結合できる。
【００３７】
用語「特異的結合」は、様々な分析物の均質な混合物中に存在する特定の分析物に優先的に結合する捕捉剤の能力を指す。ある態様では、特異的結合相互作用は、試料中の所望される分析物と、いくつかの態様では約10〜100倍より多いかまたはそれ以上(例えば、1000倍または10,000倍以上)存在する、所望されない分析物とを識別する。ある態様では、捕捉剤と分析物との結合性は、それらが捕捉剤/分析物複合体中で特異的に結合する場合、10-6M未満、10-7M未満、10-8M未満、10-9M未満、通常は約10-10M未満のKD(解離定数)を特徴とする。
【００３８】
用語「実質的に同一」は、二つのペプチド配列が、プログラムのGAPまたはBESTFIT等によって、初期設定のギャップウエイトを用いて最適に並べた時に、少なくとも65パーセント配列相同性を、好ましくは少なくとも80または90パーセント配列相同性を、より好ましくは少なくとも95パーセント配列相同性またはそれ以上(例えば、99パーセント配列相同性もしくはそれ以上)を有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
【００３９】
「結合干渉」は、診断アッセイフォーマットにおいて複合体を形成するPLへのPDZドメインの第一結合相互作用に関して用いられる。ここで、本複合体はその後、要件である第二結合相互作用の中で検出され、即ち干渉は、第一結合相互作用が第二結合相互作用を阻害し、結果としてシグナル発生化合物によって生成されるシグナル強度の低下させた時に起きている。本発明の方法で、本組成物により発生されるシグナルが被る結合干渉は、15%未満；好ましくは10%未満；および最も好ましくは約5%未満である。
【００４０】
用語「捕捉剤/分析物複合体」は、捕捉剤と分析物との特異的結合によって生じた複合体、即ち「結合パートナーのペア」である。捕捉剤と該捕捉剤の分析物は、「特異結合に適切な条件」の下で互いに特異的に結合し、このような条件(塩濃度、pH、界面活性剤、タンパク質濃度、温度等に関する)は、捕捉剤と分析物との間の結合を可能にして溶液中で結合させる条件である。このような条件は、特にタンパク質に関しては、当技術分野で周知である(例えば、Harlow and Lane (Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)を参照されたい)。特異的結合に適切な条件は、典型的には解離定数(KD)が約10-6M未満を有する捕捉剤と標的のペアは相互に結合させるが、他の捕捉剤もしくは標的とは結合させない。
【００４１】
「結合パートナー」および同義語は、捕捉剤/分析物複合体中に見い出せる、即ち相互の特異的結合を示す分子のペアを指す。
【００４２】
「表面結合捕捉剤」という句は、固体基質の表面に固定された捕捉剤を指し、ここで、基質は様々な形状、例えばシート、ビーズ、またはウェルを有するプレートのような他の構造を取ることができる。ある態様では、本明細書で用いられる捕捉剤の集団は、同一担体の表面上に、例えば整列されて存在する。
【００４３】
「単離された」または「精製された」は、一般的には物質(化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物)が、それが存在している試料の有意なパーセント(例えば、2%を超える、5%を超える、10%を超える、20%を超える、50%を超える、またはそれ以上、通常は約90〜100%まで)を構成するように、単離されることを指す。ある態様では、実質的に精製された成分は、試料の少なくとも50%、80〜85%、または90〜95%を構成する。関心対象のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを精製するための技術は、当技術分野で周知であり、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度による沈降が挙げられる。一般的には、物質は、試料の他成分に比べて、それが試料中に天然では見い出せない量で存在する時、精製される。
【００４４】
用語「融合タンパク質」または文法的にそれと同等な用語は、典型的にはそれら本来の状態では結合していないが、一方、典型的にはペプチド結合によりそれぞれのアミノ末端およびカルボキシル末端を介して連結されて単一の連続するポリペプチドを形成している、複数のポリペプチド成分から構成されたタンパク質を意味する。融合タンパク質は、2つ、3つ、もしくはさらに4つまたはそれ以上のタンパク質の組み合わせでもよい。用語ポリペプチドは、異種アミノ酸配列との融合タンパク質、N末端にメチオニン残基を有しても有さなくともよい異種または同種のリーダー配列との融合物；免疫学的にタグを付けたタンパク質；検出可能な融合パートナーとの融合タンパク質、例えば蛍光タンパク質、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等を融合パートナーとして含む融合タンパク質；および同等物を含む融合タンパク質を包含するが、これらに限定されない。
【００４５】
用語「査定すること」は、あらゆる形の測定を包含し、およびある要素が存在するかしないかを決定することを含む。用語「決定すること」、「測定すること」、「評価すること」、「査定すること」、および「アッセイすること」は互換的に用いられ、定量的および/または定性的な決定を含んでよい。査定することとは、相対的でも絶対的でもよい。「結合を査定すること」は、結合の量を決定すること、および/または結合が起こったかどうか(即ち、結合が存在するか不在か)を決定することを含む。
【００４６】
用語「処置」、「処置すること」、「処置する」等は、所望の薬理学的および/または生理学的作用を得ることを指す。該作用は、疾患またはその症状を完全にもしくは部分的に防止することに関して予防的でもよく、ならびに/または、疾患および/もしくは疾患に帰する有害作用を部分的にまたは完全に治癒することに関して治療的でもよい。「処置」は、哺乳動物、特にヒトの疾患のあらゆる処置を対象とし、(a) 疾患に罹りやすいが、疾患に罹っているとはまだ診断されていない被験体での疾患の発生を防止すること；(b) 疾患を阻止すること、即ちその進行を停止すること；ならびに (c) 疾患から救済すること、即ち疾患を退行させこと、および/または一つもしくは複数の疾患症状を取り除くこと、を含む。「処置」はまた、疾患または状態がない場合においても、薬理学的作用を提供するための作用物質の送達も包含することを意味する。例えば「処置」は、被験体に増強されたまたは所望の作用(例えば、一つまたは複数の症状の重篤度を下げる等)を提供できるモジュレーターの送達を包含する。
【００４７】
「被験体」、「個体」、「宿主」および「患者」は、本明細書では互換的に用いられ、本発明の方法の治療を受けられる病的感染に罹りやすいか、または罹っている動物、ヒト、またはヒト以外を指す。一般的には、被験体は哺乳動物の被験体である。例示的な被験体としては、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、ウシ、ニワトリ、アヒル、トリ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコおよびウマが挙げられるが、これらに必ずしも限定されることはなく、ヒトが特に関心の対象である。
【００４８】
「シグナル発生化合物」、略して「SGC」は、PLまたはPDZと連結でき(例えば、以下でさらに開示されている化学的連結方法を用いて)、および反応して本開示のアッセイで検出可能な化学的または物理的実体(即ち、反応生成物)を形成できる分子を意味する。反応生成物の代表例としては、沈殿物、蛍光シグナル、色を持つ化合物等が挙げられる。代表的なSGCとしては、例えば生物発光化合物(例えば、ルシフェラーゼ)、フルオロフォア(例えば、下記のもの)、生物発光および化学発光化合物、放射性同位元素(例えば、131I、125I、14C、3H、35S、32P等)、酵素(例えば、下記のもの)、結合タンパク質(例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン等)、磁性粒子、化学反応性化合物(例えば、着色剤)、標識化オリゴヌクレオチド；分子プローブ(例えば、CY3、Research Organics, Inc.)等が挙げられる。代表的な蛍光体としては、フルオレセインイソチオシアナート、スクシニルフルオレセイン、ローダミンB、リサミン、9,10-ジフェニルアントラセン、ペリレン、ルブレン、ピレン、およびイソシアナート、イソチオシアナート、酸塩化物またはスルホニルクロリドなどのその蛍光誘導体、ウンベリフェロン、ユーロピウム(Eu)などのランタニド希土類キレート等が挙げられる。シグナル発生複合体中で有用な代表的なSGCとしては、酵素：IUB分類1、特に1.1.1および1.6 (例えば、アルコール脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース-6-リン酸脱水素酵素、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素等)；IUB分類1.11.1 (例えば、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ジアフォラーゼ、ウレアーゼ等)；IUB分類2、特に2.7および2.7.1(例えば、ヘキソキナーゼ等)；IUB分類3、特に3.2.1および3.1.3(例えば、α-アミラーゼ、セルラーゼ、β-ガラクトウロニダーゼ、アミログルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ等)；IUB分類4 (例えば、リアーゼ)；IUB分類5、特に5.3および5.4 (例えば、ホスホグルコースイソメラーゼ、トリオースホスファターゼイソメラーゼ、ホスホグルコースムターゼ等)が挙げられる。シグナル発生化合物は、また、その生成物が蛍光または化学発光波長で検出できるSGC、例えばルシフェラーゼ、152Euのような蛍光放射金属、または他のランタニド系列；ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム塩等の化合物；ルシフェリンなどの生物発光化合物；蛍光タンパク質等も含む。蛍光タンパク質としては、下記のものが挙げられるが、これらに限定されない：即ち、(i) 緑色蛍光タンパク質(GFP)、即ちヒトのコドンバイアスにより一致するように天然のヌクレオチド配列のコドンが交換されている「ヒト化」版のGFPが挙げられるが、これに限定されない；(ii)アエクオリア ヴィクトリア(Aequoria victoria)に由来するGFPおよびその誘導体、例えばEnhanced GFPのような「ヒト化」誘導体で、これは例えばClontech, Inc.から市販されている；(iii) WO 99/49019およびPeelle et al. (2001) J. Protein Chem. 20:507-519に記載されているようなレニラ レニフォルミス(Renilla reniformis)、レニラ ムレリ(Renilla mulleri)、またはプチロサルカス ギュエルニー(Ptilosarcus guernyi)のような他種由来のGFP；(iv)「ヒト化��組換えGFP (hrGFP) (Stratagene)；ならびに(v) Matz et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:969-973に記載されているような、花虫綱の種に由来する他蛍光および有色タンパク質等。本シグナル発生化合物は、PLまたはPDZドメインポリペプチドに結合されてもよい。ある種のSGCのタンパク質への取り付けは、EDTAのような金属キレート基(chelating group)によって達成できる。本SGCは、試験試料中のウイルスまたは細菌のPL分析物を検出および/または定量化できるようにする共通の特性を共有している。本SGCは、視覚的方法；好ましくは分光光学的方法、蛍光法、化学発光法、電気的ナノメトリック法(伝導率、インピーダンス、抵抗等の変化を含む)、および磁場法を用いて検出できる。
【００４９】
「固相」は、一つまたは複数の反応物が静電気的、疎水性的、または共有的に結合できる表面を意味する。代表的な固相としては、例えば：ナイロン6；ナイロン66；ポリスチレン；ラテックスビーズ；磁性ビーズ；ガラスビーズ；ポリエチレン；ポリプロピレン；ポリブチレン；ブタジエン-スチレンコポリマー；シラスチックゴム；ポリエステル；ポリアミド；セルロースおよび誘導体；アクリラート；メタクリラート；ポリビニル；塩化ビニル；塩化ポリビニル；フッ化ポリビニル；ポリスチレンのコポリマー；シリカゲル；シリカウェーハガラス；アガロース；デキストラン；リポソーム；不溶性タンパク質金属；ならびにニトロセルロースが挙げられる。代表的な固相は、ビーズ、チューブ、ストリップ、ディスク、フィルターペーパー、プレート等に形作られたものが挙げられる。フィルターは、例えば濾過物などの分析物を捕獲する役割を果たすことができ、または捕捉により働き、またはフィルター上にPLまたはPDZを共有結合させることにより働くことができる(例えば、下記実施例のセクション参照)。本発明のある態様によれば、使用者に配布するための固相捕獲試薬は、「捕獲試薬」(下記)でコーティングされ、生物試料中のウイルスまたは細菌のPL分析物への捕獲試薬の結合を保存および/または最大化するように包装された(例えば、窒素雰囲気下に)固相(前記)からなり得る。
【００５０】
「捕獲試薬」は、ウイルスまたは細菌のPLを結合できる、固定化されたPDZポリペプチド(またはペプチド)を意味する。本捕獲試薬は、PDZの溶液；または固相へのその結合を促進するように改良されたPDZ；または、例えば静電力、ファンデルワールス力、疎水性力、共有化学結合等(以下、さらに開示するような)によってPDZを固相(前記)に結合させて固定化された、固相表面上に既に固定されているPDZからなってもよい。PDZ捕獲試薬の代表例は、下記実施例のセクションに開示されており、例えばラテックスビーズディップスティックアッセイ(latex bead dipstick assay)中の可動性ラテックスビーズ上に固定されたPDZなどの可動性固相PDZ捕獲試薬を含む。
【００５１】
「検出試薬」は、PLまたはPDZのポリペプチドまたはペプチドに連結されたSGC；あるいはそれに代わってPLまたはPDZに特異的に結合できる抗体に連結されたSGCを含有する複合体を意味する。本検出試薬の代表例としては、一つまたは複数のPLもしくはPDZと一つまたは複数のSGC化合物との複合体、即ち高分子複合体が挙げられる。本検出試薬は、ラテックスビーズディップスティックアッセイ中の可動性ラテックスビーズなどの、可動性の固相検出試薬を含む。
【００５２】
「生物試料」は、生きている(または死んでいる)生物、例えば動物、魚、鳥、爬虫類、有袋類等から得た試料を意味する。生物試料は、例えばバイオテロの驚異等を評価するために、空気または水で運ばれかつそこで例えば濾過、遠心分離等によって集められた組織液、組織片、生物材料を含む。別の生物試料は、便または卵、卵黄および羊水から得ることができる。代表的な生物流体としては、例えば尿、血液、血漿、血清、脳脊髄液、精液、肺洗浄液、便、喀痰、粘液、生物材料等を担持する水が挙げられる。または、生物試料は、鼻咽頭スワブまたは口腔咽頭スワブ、鼻洗浄液、気管、肺、気嚢、小腸、脾臓、腎臓、脳、肝臓および心臓由来の組織、喀痰、粘液、生物材料を担持する水、排泄物スワブ、喀痰、鼻および口腔粘液等を含む。代表的生物試料は、食料品、例えば肉、加工食品、家禽、ブタ等の試料も含む。生物試料はまた、汚染溶液(例えば、食品処理溶液等)、外来患者施設、病院、診療所、食品調製施設(例えば、レストラン、屠殺場、冷蔵施設、スーパーマーケット包装施設等)から出るスワブ試料も含む。生物試料は、インサイチュー組織および体液(即ち、試験のために集められたものでない試料)も含み、例えば本法は、例えば結膜に直接用いる点眼剤、試験ストリップを用いた、例えば眼内のウイルス感染の有無または重症度の検出；または例えば被験体の口腔または鼻咽喉にインジケータカプセルを置くことによる、例えば肺感染の有無または程度の検出に有用な可能性がある。あるいは、スワブまたは試験ストリップを口腔内に置くことができる。生物試料は、被験体のいかなる組織、器官、または細胞群に由来してもよい。いくつかの態様では、被験体からは摩擦片、生検、または洗浄液が得られる。生物試料は、血液、尿、喀痰および口腔液のような体液；ならびに鼻の洗浄液、スワブ、または吸引物、気管吸引物、下疳スワブおよび便試料のような試料を含んでよい。関心対象の個々の病原体の検出に適切な生物検体を収集する方法は、例えば、呼吸器疾患の場合の鼻スワブ、洗浄液もしくは吸引液、または気管吸引物などの鼻咽喉検体、口腔スワブ等である。このように本発明の態様は、ウイルスまたは細菌の汚染または感染の存在または量について、様々なタイプの生物試料を試験するのに有用な方法を提供する。任意で、生物試料は、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンおよびマイコスタチンなどの抗生物質を含有する等張液に懸濁させてもよい。
【００５３】
「リガンド」は、PDZ結合部位に結合できるPL化合物を指す。リガンドの代表例としては、本明細書に開示しているようなPL含有ウイルスタンパク質およびPL含有細菌タンパク質が挙げられる。本リガンドは、PDZドメイン結合部位の結合部の三次元空間を満たして、静電斥力を最小化し、静電引力を最大化し、疎水結合力および水素結合力を最大化することができる。リガンドはPDZポリペプチドに特異的および飽和的な様式で結合し、結合親和性は以下にさらに開示するリガンド結合アッセイにより測定できる。
【００５４】
「特異性」は、本発明のある態様によるアッセイに関連して用いられる場合は、本アッセイが、本発明の段階にしたがって実施された際に生物試料のパネル(例えば、100試料のパネル)の中から「指示された」パーセンテージの試料を適切に識別できることを意味する。本試料のパネルは、全て一つまたは複数のムレイン分析物(例えば、細菌または真菌で汚染された陽性対照試料)を含む。好ましくは、この「指示」特異性は、85%より高く(例えば、アッセイは一つまたは複数のムレイン分析物を含む100試料のうち85より多い試料を指示できる)、最も好ましくは、本アッセイは、90%より高い指示特異性を有する。任意で、本アッセイは、「真の非ウイルス性または非細菌性の例」を識別でき、即ち生物試料パネル(例えば、100試料のパネル)の中から「指示された」パーセンテージの陰性試料を検出できる。好ましくは、本発明の本段階は、「真のウイルス性または細菌性の例」を適切に識別でき、かつ好ましくは、本発明の本段階は「真の低病原性のウイルスおよび細菌の例」を適切に識別できる。別の態様では、本試料の陰性対照パネルは、ウイルスもしくは細菌のPL分析物を含んでいないか、または他のウイルスもしくは細菌のPL分析物を含んでいるかのどちらかである。好ましくは、本特異性は85%より高く(例えば、アッセイは、100試料中85を超える試料を指示できる)、最も好ましくは、本アッセイは90%を超える特異性を有する。
【００５５】
「感度」は、本発明のある態様によるアッセイに関連して用いられる場合、本アッセイが、本発明の段階にしたがって実施された際に、陽性対照(前記)および陰性対照(即ち、PL分析物を欠いているもの)の両方を含む試料パネル内から、ウイルスまたは細菌のPL分析物を含有する試料を「指示された」パーセンテージで識別できることを意味する。好ましくは、この「指示された」感度は、85%より高く、最も好ましくは、90%より高い。任意で、本アッセイは、試料パネル内から「真のウイルス性または細菌性の例」を、ウイルスまたは細菌のPL分析物を含有する試料について「指示された」パーセンテージで識別できる。好ましくは、本発明の本段階は、「真のウイルス性または細菌性の例」を適切に識別でき、最も好ましくは、本発明の本段階は、「真の病原性のウイルスまたは細菌の例」を適切に識別できる。別の態様では、試料の本陽性対照パネルはウイルスもしくは細菌のPL分析物を含むか、または病原性の高いウイルスまたは細菌の「PLタンパク質を含んでいるかのどちらかである。好ましくは、この「指示された」感度は、約70%より高く、より好ましくは約80%より高い。よりさらに好ましくは、感度は対照の感度の85%より高く、最も好ましくは約90%より高い。あるいは、感度は同一タンパク質を識別するPCR反応の感度に関して測定され得る。
【００５６】
これまでに決定され、NCBIのGenbankデータベースに電子的に寄託されている核酸およびタンパク質の配列は、本明細書ではGenbankアクセッション番号(GI)で参照される。これらGenbank登録に記載された配列は、全ての目的について全体として参照により本明細書に組み入れられる。出願者は、後に明細書を修正して、これら配列の一つまたは複数、あるいはその指示した部分を具体的に引用する権利を確保することを明確にする。
【００５７】
本明細書に参照される様々な生化学および分子生物学的方法は、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. Second (1989) and Third (2000) Editions、およびCurrent Protocols in Molecular Biology, (Ausubel, F.M. et al., eds.) John Wiley & Sons, Inc., New York (1987-1999)に記載されている。
【００５８】
本明細書に引用されている方法は、理論的に可能である引用された事象の任意の順番、ならびに引用された通りの事象の順番に実施できる。さらには、数値範囲が示されている場合は、その範囲の上限と下限の間にある全ての中間値、および他に記載の値またはその記載範囲内の中間値は本発明に包含されることが理解されると考えられる。また、記載された本発明の変形の任意の特徴は、独立して、または本明細書に記載されている任意の一つまたは複数の特徴と組み合わせて記載および請求できることが熟慮される。
【００５９】
単数の項目を参照する場合、同一項目が複数存在する可能性も含まれる。より具体的には、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形の「a」、「an」、「said」および「the」は、別途文書により明瞭に示されていない限り複数の参照も含む。さらには、特許請求の範囲は、いかなる任意要素も排除して書かれてもよいことを指摘しておく。このように、この記述は、請求要素の再度の引用または「消極的」限定の使用と結びついて、「solely (単に)」、「only (のみ、だけ)」等の限定的な術語の使用の根拠として役割を果たすことを意図したものである。
【００６０】
発明の詳細な説明
本発明は、被験体がウイルスまたは細菌に感染しているかどうかを決定するための方法を提供する。本発明は、多くの病原性のウイルスおよび細菌を含む非常に多様な病原体が、PDZリガンド(即ち、PDZドメイン含有ポリペプチドが特異的に結合するリガンド)を含むタンパク質をコードするという発見に一部基づいている。それによりこれら病原体は、PDZドメインを利用して、試料中で検出できる。例示的方法は、被験体からの試料をPDZ含有ポリペプチドと接触させる段階、およびPDZポリペプチドがウイルスまたは細菌のPDZリガンドポリペプチドに結合しているかどうかを決定する段階を含む。PDZ含有ポリペプチドとウイルスPDZリガンドポリペプチドとの間の結合は、被験体がウイルスまたは細菌に感染していることを示す。
【００６１】
診断目的へのPDZ-PL相互作用の利用は、多くの異なる試験形式に応用できる。診断試験は、妊娠検査に用いるようなディップスティック試験、試験試料とインキュベートできるフィルム試験、その上にまたは他の媒体に乗せることができるスライド試験等のようなELISAアッセイの形式にできる。このような形式は、米国特許第6,180,417号、第4,703,017号および第5,591,645号に記載されている。抗ウイルス作用物質および抗細菌作用物質を同定するためのアッセイも提供される。本発明は、様々な診断および治療的な用途に使用できる。
【００６２】
I. ウイルスおよび細菌病原体
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、AIDS(後天性免疫不全病症候群)の原因となる媒介物であり、該疾患の全ての症例に見出される。その主たる標的は、活性化CD4+ T4ヘルパーリンパ球であるが、マクロファージを含むいくつかの他のタイプの細胞にも感染できる。HIVは、レトロウイルスの分類の一つであるレンチウイルスである。レンチウイルスという名前は、遅いウイルスを意味し、疾患の発症に長時間かかることからそのように命名されている。大部分のレンチウイルスは、免疫系の細胞を標的とし、したがって疾患は、多くの場合、免疫不全として特徴付けられる。レンチウイルスには、霊長類、羊およびヤギ、ウマ、ネコ、ならびにウシに感染する、五種類の血清群が知られている。二種類のHIV、即ちHIV-1およびHIV-2が存在する。これらは、疾患の発症時間がHIV-2の方が長いものの、臨床的には識別できない疾患を引き起こす。HIVおよびAIDSの世界的流行はHIV-1が原因である。HIV-2は、西アフリカにほぼ限定されている。感染患者においてHIVは、これまでは抗HIV抗体の存在、またはウイルスRNAを検出するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いてウイルスそのものの存在によって検出されてきた。PCRは非常に高感度であり、免疫学的に発見できない状態のHIVも示すことができる。1970年代後半以降、HIVおよびAIDSは米国および世界中に広がった。サハラ砂漠以南のアフリカでは、2500万人を超える人々がHIVに感染した状態で生活し、世界中では毎年300万人がAIDSで死亡している。ヒト免疫不全ウイルスHIV-1およびHIV-2は、遺伝子構造、ヌクレオチド配列および病原性に関して、様々な霊長類に存在しているレトロウイルス、SIVに似ている。
【００６３】
成熟したHIVウイルスは、ウイルスゲノム、即ち短い二本鎖のリボ核酸(RNA)を、酵素、即ち逆転写酵素、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼおよびインテグラーゼと一緒に含む棒状の電子密度の高いコアからなり、これらは全て、CD4レセプターを有する標的細胞へのウイルスの結合を助ける抗原、gp120を含む72個の表面突起を持つ外側の脂質エンベロープ内に封入されている。HIVのゲノムは、一般的なレトロウイルスと同様に、三種類の主要遺伝子、即ちgag、polおよびenvを含んでいる。envがコードする主要な構造成分としては、外側のエンベロープ糖タンパク質gp120および糖タンパク質前駆体gp160に由来する膜貫通糖タンパク質gp41を含むエンベロープ糖タンパク質が挙げられる。gag遺伝子がコードする主要成分としては、コアヌクレオカプシドタンパク質p55、p40、p24 (カプシド、または「コア」抗原)、p17 (マトリックス)およびp7 (ヌクレオカプシド)が挙げられ、polがコードする重要タンパク質は、酵素タンパク質p66およびp51 (逆転写酵素)、p11 (プロテアーゼ)およびp32 (インテグラーゼ)である。大部分の主要HIVウイルスタンパク質は、p24 (コア抗原)およびgp41 (エンベロープ抗原)を含めて免疫原性が高く、抗体反応はウイルスの負荷および宿主の免疫反応能に応じて変わる。これら各種成分の免疫原性は、大部分のHIV検査の基礎となる、抗体検出のための手段を提供している。
【００６４】
HIVは、逆転写酵素のエラー率を主な原因とする突然変異を容易に起こすさらなる能力も有しており、これが取り込まれるヌクレオチド2000当たり約1つの突然変異を誘発する。この高い突然変異率が、免疫攻撃に耐えることができ、細胞毒性がより強く、より容易に合胞体を作ることができ、または薬物治療に抵抗することができるHIV変異体を感染患者の細胞内に出現させる。時間と共に様々な体組織が様々なHIV株を持つことになり得る。
【００６５】
HIV-1およびHIV-2の遺伝子配列は、部分的にしか相同性ではない。HIV-2、またはまだ特徴付けされていないHIV群ウイルスのメンバーは、HIV-1抗体についての各種検査試験を用いた場合、必ずしも検出されない。HIV-2は遺伝的にはHIV-1よりもサル免疫不全ウイルス(SIV)とより近い関係にある。
【００６６】
B型肝炎は、このウイルスを排除できない患者に急性肝炎および慢性肝炎の両方を引き起こす。確認されている伝染の方法としては、血液、輸血(現在は稀)、入れ墨(アマチュアまたは専門家が行った場合の両方)、水平伝播(性的にまたは血液もしくは体液との接触を通して)、または垂直伝播(母親からその胎児へ)が挙げられる。しかしながら、約半数の例では、感染源は決定できない。B型肝炎はヘパドナウイルスであり、直径42nmの糖タンパク質エンベロープ(表面抗原)に囲まれた直径27nmの正20面体のヌクレオカプシド(コア抗原)に封入されている、一部が二本鎖の一本鎖DNAゲノムである。即ちウイルスは二つの殻を持っている。コア抗原は肝臓には見られるが、血液中には見られない。抗コア抗体は、血中に検出される。表面抗原は、ウイルスによって大量に産生され、直径22nmの、全体が糖タンパク質から構成された小球体および棒状体として血流中に流入する。その中の、電子顕微鏡下、直径42nmの大型の球体は、未変性ビリオンのデーン(Dane)粒子である。HEタンパク質は、キャリアーの血液中に存在し、ウイルス血症と関係している。
【００６７】
C型肝炎(元々は「非A非B肝炎」と呼ばれた)は、血液との接触(性的接触を含む)を通して伝染する。それは最終的に硬変に至る慢性型の肝炎を起こすことがある。それは、10〜20年間無症候状態を続けることもある。C型肝炎にはワクチンはない。C型肝炎患者は、A型肝炎またはB型肝炎のいずれかと接触すると、重症肝炎化しやすく、そのために全てのC型肝炎患者は、まだ免疫されていない場合には、A型肝炎およびB型肝炎に対し免疫化すべきである。しかしながらC型肝炎そのものが非常に致死的なウイルスであり、肝硬変の原因となる。ウイルスは、初期に発見された場合は、インターフェロンと抗ウイルス剤のリバビリンの併用により治療できる。この治療レジメンに対する反応は、感染しているウイルスの遺伝子型により変わる。ウイルスは、約10,000ヌクレオチドの一本鎖RNAゲノム、カプシド、マトリックスおよびエンベロープを含む。それは、3つの構造タンパク質(C、E1、E2)および下記の抗原：c100、c22、c33、c300、5-1-1を形成する4〜6つの非構造タンパク質(NS1、NS2、NS3、NS4、NS5)に断片化される単一のポリタンパク質前駆体をコードしている。他の成分は、プロテアーゼ、RNAポリメラーゼおよび転写酵素であるが、逆転写酵素ではない。HCVの構造は、血中および組織中のウイルス粒子の濃度が非常に低いため、ウイルスを電子顕微鏡で見ることができないために分かっていない。おそらく血液中では、1ml当たり1〜10ビリオンしか存在していないだろう。HCVは、その原型は黄熱病ウイルスであり、特に動物に急性の病気だけを引き起こすフラビウイルスに似ている。HCVは、B型肝炎ウイルスのように宿主DNAの中に組み込まれない。HCVは非常に高い突然変異率を有しており、多くの類似種を産生する。この変異性が、抗体に対する耐性の原因である。
【００６８】
RSVは、麻疹、パラインフルエンザおよび流行性耳下腺炎ウイルスを含むパラミクソウイルス科のメンバーである。RSウイルス(RSV)は、主に小児に下部気道感染を起こすマイナス鎖RNAウイルスである。このウイルス感染の処置に利用可能なワクチンまたは有効な治療剤(therapeutic)は今のところ存在しない。ウイルスRNAの転写および複製にはいくつかのタンパク質が関与している。RSVがコードするリンタンパク質は、ウイルスの複製に必要である。リンタンパク質は、オリゴマーを形成し、構成的にリン酸化される。しかしながら、これら事象の機能的意義はまだ決定されていない。RSVは、パラミクソウイルス科の他のメンバーのようなHN (ヘマグルチニンノイロミニダーゼ)タンパク質を持っていないが、その代わりGタンパク質を持っている。マトリックスタンパク質Mは、エンベロープの内面を裏打ちしている。Fタンパク質は、細胞融合に関与する。
【００６９】
ロタウイルスAロタウイルスは、レオウイルス科の直径70nmの正20面体カプシドを有する非エンベロープウイルスである。その名称は、電子顕微鏡で見た時の車輪に似たその外観に由来するものである(ロタとはラテン語で車輪を意味する)。そのゲノムは、三層のウイルスの内側のコア内に保持された11の二本鎖RNAのセグメントから出来ている。ゲノムは、6つのウイルスタンパク質(VP1、2、3、4、6、7)および6つの非構造タンパク質(NSP1〜6)をコードしている。一度小腸内に入ると、ウイルスは変化して柔毛に対し感染性となる。すると、タンパク質が宿主細胞内への侵入およびウイルスゲノムの複製を媒介する。
【００７０】
結核菌は、結核の原因となる媒介物であり、マイコバクテリア属のメンバーである。他のメンバーとしては、ハンセン病の原因となる媒介物であるライ菌(M. leprae)がある。マイコバクテリアは、増殖が非常に遅い傾向があり、結核菌は絶対好気性菌である。結核(TB)は第一の全世界的な致死的感染病である。世界保健機構(The World Health Organization)は、20億人が潜在的TBであり、その他に世界中で毎年300万人の人々がTBで死亡していると推定している。TBは多くの抗生物質を用いて治療されているが、それらに対し直ぐに耐性になる。平均すると、イソニアジド(INH)耐性率は約10%であり、リファンピン耐性率は約1%であり、TBプログラムが良好な国ほど数値は低く、TBプログラムが不良な国ほど数値は高い。ヒトは、結核菌について知られている唯一の保菌体である。TBは飛沫核により伝染し、飛沫核には10未満の桿菌が含まれるだろう。TBへの暴露は、感染している患者と空気空間を共有することによって起こる。吸入されると、飛沫核は肺の末端空気空間に沈積する。桿菌に出会うと、マクロファージはこれを摂食し、菌を局所のリンパ節に運ぶ。
【００７１】
II. ウイルスおよび細菌のPL領域
本発明者らは、一つまたは複数のPLモチーフを同定し、PDZタンパク質に結合することを示すことによって、ウイルスおよび細菌のPLタンパク質を発見した。これらのタンパク質は、様々なPLモチーフを有している。指定されたウイルスおよび細菌について以下のPLタンパク質が同定され、そのPLモチーフを表1に示した。本発明者らにより同定されたPDZ結合パートナーを表1および2に示す。
【００７２】
次に、いくつかのウイルスおよび細菌のタンパク質の活性について説明する。関係するウイルスおよび細菌、例えば同じ科のウイルスおよび同じ属の細菌は、同一のPLタンパク質、かつ同一のPLモチーフも有すると思われている。しかしながら、表1AおよびBに見られるように、HIV-1およびHIV-2のEnvタンパク質について同定されたモチーフは異なっていた。この差異は、診断アッセイでのHIV-1またはHIV-2の鑑別に用いることができる。
【００７３】
本発明者らは、HIVタンパク質Nefが、モチーフFKNC (SEQ ID NO:244)、FKDC (SEQ ID NO:245)、YKNC (SEQ ID NO:246)およびYKDC (SEQ ID NO:247)を有するPLタンパク質であることを発見し、多くのPDZタンパク質結合パートナーを同定した。HIV-1 Nefは、元々は「ネガティブファクター」と命名されていたが、ウイルスの複製および病因に積極的役割を有していることが示されている。Nefは、宿主のシグナル伝達タンパク質と相互作用して、感染T細胞に長期の生存、および非感染T細胞の破壊(アポトーシスを誘導することによって)もたらすウイルスタンパク質である。Nefは、また、CD4およびMHCタンパク質(CD4はT細胞活性化で機能する膜内タンパク質であり、HIVウイルスのレセプターである)を含む細胞表面タンパク質のエンドサイトーシスおよび分解を進める。この作用は、おそらくは細胞傷害性T細胞の機能を障害し、それによってウイルスの宿主免疫反応の侵害を助けているだろう(例えばSchwartz, et al., 1996)。このようにしてこの多機能タンパク質は、高いウイルス負荷の維持および宿主免疫防御の克服を助け、AIDSの進行を助長している。Nef遺伝子を欠損しているHIV-1株に感染したヒトが、HIV標準株に感染したヒトに比べAIDS症状の進行が遙かに遅いことは驚くに値しない。それ故にNefは、AIDS進行の薬学的介入にとって有用な標的になるだろう。Nefは、感染後の組み込みに関与する27kDのN末端がミリスチル化されたアクセサリータンパク質である。Nefは、ウイルス粒子内に見出され、宿主細胞侵入後に最初に検出されるタンパク質の一つである。
【００７４】
本発明者らは、HIVタンパク質のVifがモチーフEILA (SEQ ID NO:251)、GILA (SEQ ID NO:252)、およびDILA (SEQ ID NO:253)を有するPLタンパク質であることを発見し、多くのPDZ結合パートナーを同定している。1型ヒト免疫不全ウイルス(HIV-1)のVifタンパク質は、一次リンパ細胞および骨髄細胞内でのウイルス複製には必須であるが、いくつかの形質転換したT細胞株ならびにHeLaおよび293Tなど非リンパ細胞株内での効率的な複製にとって重要ではない。Vif欠損HIV-1(HIV-1ΔVif)の複製をサポートできない細胞は「非許容性」と呼ばれ、一方HIV-1ΔVifの複製をサポートできる細胞は「許容性」と呼ばれる。非許容性細胞と許容性細胞の融合により作られたヘテロカリオンが非許容性の表現系を示すという観察から、非許容性細胞は、許容性細胞ではこれを欠いているが、ウイルスVifタンパク質で遮断されるHIV-1複製のインヒビターを発現する、という仮説が立てられた。HIV-2のヌクレオカプシド(NC)タンパク質(NCp8)は、ジンクフィンガーモチーフ(ZFM)として働く二つのCys-His列を含む。
【００７５】
本発明者らは、Envが両HIVウイルスのPLタンパク質であることを発見した。HIV-2タンパク質Envは、モチーフIALL (SEQ ID NO:248)、LALL (SEQ ID NO:249)、およびLTLL (SEQ ID NO:250)を有することが見出された。HIV-1 Envは以下のPLモチーフ、RALL (SEQ ID NO:242)およびRILL (SEQ ID NO:243)を有していた。レンチウイルスファミリーだけでなくレトロウイルスファミリーの関連ウイルスでは、ウイルスタンパク質Nef、Vif、およびEnvは、同一の機能および関連PLモチーフを有すると思われる。
【００７６】
本発明者らは、RSV核タンパク質NPがPLモチーフDVEL (SEQ ID NO:265)を有するPLタンパク質であることを確認し、多くのPDZ結合パートナーを同定した。RSV NPは、RNAゲノムに密接に関係して見出すことができる。RSVタンパク質NPは、本明細書において、モチーフDVEL (SEQ ID NO:265)を有するPLタンパク質であることが見出されている。
【００７７】
本発明者らは、ロタウイルスVP4およびVP7がPLタンパク質であることを発見し、VP4についてはQCKL (SEQ ID NO:266)およびQCRL (SEQ ID NO:267)を、VP7についてはYYRV (SEQ ID NO:268)およびYYRI (SEQ ID NO:269)を含む、これらに関係する多くのPLモチーフを同定した。VP4およびVP7は、ロタウイルスの外側カプシドを作り上げている。VP4は、二量体化してウイルス表面に60個のスパイクを作る88kDaのタンパク質である。VP4は、膵臓の酵素トリプシンにより開裂されVP5およびVP8をが形成される。VP4およびその開裂生成物は、細胞接着および侵入と関連しており、感染には開裂が必要である。VP4は抗原性であり、中和抗体を誘導する。このタンパク質の特異的な構造を用いて、ロタウイルスPの血清型、ならびに宿主特異性、毒性および防御免疫が決定される。このことは、また、細胞侵入中の熱ショック同族タンパク質、hsc70にも関係付けられている。この37kDの糖タンパク質は、外側カプシドの平滑部分を作り上げている。それは、中和抗体を誘導し、G血清型を決定することができる。それはまた再集合、およびウイルスの動物株間でクロスオーバーが可能と思われる可変性の高いウイルス部分でもある。VP7は、熱ショック同族タンパク質(hsc70)およびいくつかのインテグリンとも関係しており、これらは共にウイルスの細胞侵入に関係している。
【００７８】
同定された別のロタウイルスタンパク質PLは、NSP2およびNSP5であり、NSP2についてはQVGI (SEQ ID NO:270)、HIGI (SEQ ID NO:271)、QIGI (SEQ ID NO:272)、およびRIGI (SEQ ID NO:273)を、NSP5についてはIKDL (SEQ ID NO:274)およびIEDL (SEQ ID NO:275)のPLモチーフを有している。NSP2は、NSP5と一緒にウイルスRNAの合成およびパッケージング、ならびにビロプラズム(viroplasm)の作製に関与している。NSP2は、複製中間体である。NSP5リンタンパク質は、RNA合成およびパッケージングにNSP2と共に作用し、ビロプラズムを誘導する。これも複製中間体である。
【００７９】
本発明者らは、結核菌について、NSXNについてはSSWA (SEQ ID NO:276)、ESXSについてはYTGF (SEQ ID NO:277)、およびESAT-6についてはGMFA (SEQ ID NO:279)のPLモチーフを有する三つのPLタンパク質を同定した。結核菌に由来する6-kDaの初期分泌抗原性標的(ESAT-6)および10-kDaの培養濾過タンパク質(CFP-10)は、感染初期におけるT細胞の二つの主要標的である。よりさらには、ESAT-6が、サブユニットまたはDNAワクチンのいずれかとして投与された時に、防御免疫を誘導することが最近証明された。ESAT-6よびCFP-10 (それぞれesxおよびlhp)をコードする遺伝子は、オペロン様構造の中に互いに隣り合って存在している。M.ボビス(M.bovis)でのESAT-6およびCFP-10の二重ノックアウトは、病原体の毒性を低下させ、このことはこれら二つの分子が免疫病原性および毒性に重要な役割を果たしている可能性を示唆している。ESXNおよびESXSは、ESAT-6ファミリーの2つのメンバーである。
【００８０】
B型肝炎が二つのPLタンパク質を含むことが本発明者らにより見出されており、タンパク質XはFTSA (SEQ ID NO:260)であり、S抗原はPLモチーフWVYI (SEQ ID NO:261)を有していた。B型肝炎はヘパドナウイルス科のメンバーである。
【００８１】
C型肝炎は、二つのPLタンパク質を含むことが本発明者らによって見出されており、カプシドCは、PASA (SEQ ID NO:262)およびPVSA (SEQ ID NO:263)を含む複数のPLモチーフを有し、E1aは、PLモチーフGVDA (SEQ ID NO:264)を有していた。HCVは、黄熱病ウイルス、デング熱、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎および西ナイルウイルスを含む他のファミリー構成メンバーと共にフラビウイルスと呼ばれている。
【００８２】
III. PDZタンパク質
PDZドメインは、原形質膜のタンパク質複合体の中心となる形成体であることが最近明らかになった。PDZドメインは、元々は、シナプス後高密度タンパク質(postsynaptic density protein)PSD95/SAP90、ショウジョウバエ腫瘍抑制因子dlg-A、およびタイトジャンクションタンパク質ZO-1内に保存されている配列要素として同定された。元々はGLGF (SEQ ID NO:281)またはDHRモチーフと呼ばれていたが、それらは現在、これら三つの初期PDZ含有タンパク質を表す頭文字で知られている(PDZ: PSD95/DLG/ZO-1)。現在これら80〜90アミノ酸配列は、75を超えるタンパク質に同様に同定されており、単一タンパク質内に複数のコピーが特徴的に発現している。National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.gov)によって、PDZドメインは、例えばPfamのファミリーとして認識されている。それらは原生動物、植物および細菌といった様々な生物に、系統樹全体で見出されている。このような広範囲の種に分布することはこのドメインに特有であるが、おそらくPDZドメインを最も際立たせる特徴は、これらを含むタンパク質の圧倒的大多数が、原形質膜に関係しているという知見である。PDZドメインは多くの様々な構造に見出せるが、各PDZタンパク質は、一般的にはシナプス、細胞間接触、または頂部、基部、もしくは側部細胞表面などの特定の細胞下ドメインに限定されている。このことは、PDZドメインが初期に進化して、原形質膜ドメインの形成に中心的な役割を提供したという推測をもたらす。PDZドメインの最も一般的な機能は、それらのリガンドを適切な原形質膜ドメインに局在化させることであろう。極性化した上皮細胞では、PDZドメインは、はっきり区別される頂部、基部-側部および接合部の膜ドメインに明瞭に局在しており、多くの場合、それらの膜貫通および細胞質内結合パートナーと共存している。PDZタンパク質は、また、明らかに、膜貫通タンパク質を特定の細胞下ドメイン内に空間的に集合させて固定するという基本的な役割も有している。
【００８３】
本発明者らは、以下を含む、表1に見られるウイルスおよび細菌のPLの結合パートナーであるPDZタンパク質を同定した：AF6、AIPC、AIPC (PDZ #1)、GORASP1 (PDZ #1)、INADL (PDZ #3)、KIAA0316、KIAA1284、EBP50 (PDZ #1)、(Shank1; Shank2; Shank3; シンテニン; Magil (PDZ #1); Tip1; Mint1 (PDZ #1,2); 新規セリンプロテアーゼ; MUPP1 (PDZ#3,7,9,11)、MAST2、NSP、NOS1、PAR3 (PDZ #3)、PAR3L (PDZ #3)；PAR5β、RiM2、ロドフィリン様、SIP-1、SITAC-18 (PDZ #2)、SITAC-18 (PDZ #1)、SIP1、ZO-1 (PDZ #1)、ZO-3 (PDZ #1)、DVL3、DVL2 (PDZ #1)、PTPL1 (PDZ #4)、HEMBA 10003117、Pick1 (アクセッション番号は表2に示す)。
【００８４】
PDZドメインは、5〜6つのβ-ストランドおよび2つのα-ヘリックスからなるβサンドイッチを有する構造に折り畳まれる約80〜90残基を含む。ペプチドリガンドは、β-ストランド(bB)、α-ヘリックス、およびペプチドのカルボキシラート基を結合するループから構成された疎水性間隙内で結合する。ペプチドは、bBストランドに逆平行の形で結合し、C末端残基が疎水性ポケットを占有する。PDZヘテロダイマーは、パートナータンパク質の一つに内部認識を含む直線状の頭-尾型の配置を形成する。PDZドメインタンパク質は、当技術分野で公知であり、タンパク質の配列を決定することおよびPDZドメインの存在を識別することによって、新規タンパク質がPDZドメインを有すると識別することができる。PDZタンパク質は詳細に説明されており、多くの例が2004年8月2日出願の米国特許出願第10/485,788号に示されている。あるいは、PDZタンパク質と思われるタンパク質は、様々なPLタンパク質またはPLタンパク質PL分類との結合について試験できる。PDZドメインの例は、表2に見ることができる。
【００８５】
表2に掲載したPDZタンパク質は、野性型PDZドメインを含む天然のタンパク質である。機能的変異体PDZドメインを含むポリペプチドは、PDZドメインが構造レベルで十分に特徴付けされていることから、容易に設計される。例えば、PDZドメインの三次元構造はDoyle (Cell 1996 95:1067-1076)に詳しく記載および論じられており、複数のPDZドメインの構造が結晶学によって決定されている。
【００８６】
本明細書において特定のPDZドメイン含有ポリペプチドを参照する場合、例えばDLG1 PDZドメイン含有ポリペプチドを参照する場合、参照は野性型PDZドメインを含むポリペプチド、およびPDZリガンド結合活性を保持しているその変異体を包含するものとする。
【００８７】
(表1Ａ)実験的に決定された相互作用
2009503439.tif 000003
【００８８】
(表1Ｂ)予想相互作用
2009503439.tif 000004
2009503439.tif 000005
【００８９】
IV. PDZタンパク質とPLタンパク質の相互作用
表1Aおよび1Bは、実施例1で互いに結合することが識別されたPDZドメイン含有タンパク質(「PDZタンパク質」)および病原体PDZリガンドタンパク質(「PLタンパク質」)のリストである。各病原体PLタンパク質は、少なくとも一つのPDZタンパク質に対し結合親和性を有している。表1Aおよび1Bの第1縦列は、PLタンパク質由来の病原体を記載しており；第2縦列は、PL含有の遺伝子を記載しており；第3縦列は各タンパク質のGenBank識別番号(GI番号)を示しており(データベース登録は、その中に記載されているあらゆる注釈を含めて、参照によって本明細書に組み入れられる)；第4縦列は、PLタンパク質のC末端の4つのアミノ酸を示しており；第5縦列はPLのSEQ ID NOを記載しており、第6縦列は各PLに結合親和性を有しているPDZタンパク質を記載している。表1Aおよび1Bに示したタンパク質は、ウイルスおよび細菌のPLタンパク質の代表例である。表1Aは、実施例1〜5の方法を用いて実験的に識別されたPDZ/PL相互作用を示す。表1Bは、PDZアレイ研究および相互作用に基づくARBOR VITA専用データベースを用いたC末端配列分析に基づいて実施された相互作用予測を示す。
【００９０】
表1Aおよび1Bは、HIV-1およびHIV-2の場合には、様々なサブグループまたは株に特徴的な配列も含んでいる、いくつかのレトロウイルス、フラビウイルス、およびパラミクソウイルスのエンベロープタンパク質のC末端配列を示している。例えば、HIV-1およびHIV-2エンベロープタンパク質の場合は、各株のコンセンサス配列が示されている。表に示したPDZパートナーの多くは、両方のPLモチーフに結合できるが、いくつかは、本明細書の実施例において二つのHIV-1 PLペプチドを用いて示されるように、どちらか一方のみに結合する。
【００９１】
表2は、表1のウイルスおよび細菌のPLタンパク質への結合についてスクリーニングされたPDZタンパク質のリストである。表2はまた、PLタンパク質への結合について試験できる他のPDZタンパク質のリストでもある。表2はまた、GST-PDZ融合タンパク質産生のためにベクター(PGEX-3Xベクター) (Pharmacia)内にクローニングしたPDZドメインの配列も記載している。より具体的には、「遺伝子名」と題する第1縦列(左から右)は、PDZドメインを含む遺伝子の名称を記載している。「GIまたはAcc#」と名付けられた第2縦列は、記載した配列のPCR増幅のためのプライマーを設計するために用いる遺伝子の固有Genbank識別子である。次の「PDZ#」と印された縦列は、遺伝子のアミノ末端からカルボキシ末端方向に番号を付けた場合の、Pfam予測PDZドメイン番号を示す。「GSTコンストラクトに融合した配列」と題した最後の縦列は、コンストラクトのDNAシーケンシングで決定したGST-PDZ発現ベクター内に挿入された実際のアミノ酸配列を示している。PDZタンパク質は、それらが活性PDZドメインを有する限り、融合タンパク質として産生できる。
【００９２】
PDZドメインポリペプチドと候補のPDZリガンドポリペプチドとの間の結合を検出するための二種類の補完的アッセイ(AおよびGアッセイ)は、2004年8月2日出願の米国特許出願第10/485,788号、2003年11月14日出願の第10/714,537号に詳しく記載されている。二種類のアッセイそれぞれでは、一つまたは複数のPDZドメインに結合すると予想されるタンパク質のC末端に相当する配列を有するペプチド(即ちPLペプチド候補)と、PDZドメインポリペプチド(典型的にはPDZドメインを含む融合タンパク質)との間の結合が検出される。
【００９３】
A. PDZドメインポリペプチドとNMDAレセプターPLタンパク質との間の相互作用を検出するためのアッセイ
PDZドメインポリペプチドとPDZリガンド候補との間の結合を検出するために、「A」および「G」と呼ぶ二種類の補完的アッセイを開発した。二種類のアッセイそれぞれでは、一つまたは複数のPDZドメインに結合すると予想されるタンパク質のC末端に相当する配列を有するペプチド(即ちPLペプチド候補)と、PDZドメインポリペプチド(典型的にはPDZドメインを含む融合タンパク質)との間の結合が検出される。「A」アッセイでは、PLペプチド候補は固定されており、該固定されたペプチドへの可溶性PDZドメインポリペプチドの結合が検出される(「A」アッセイは、一つの態様でペプチドの固定にアビジン(avidin)表面を使用するという事実について名付けられている)。「G」アッセイでは、PDZドメインポリペプチドが固定されており、可溶性PLペプチドの結合が検出される(「G」アッセイは、PDZドメインポリペプチドの固定にGST結合表面を用いることから命名されている)。例示的アッセイを下記に記載する。
【００９４】
I. 「Aアッセイ」固定化PLペプチドを用いたPDZリガンド結合の検出
アッセイは下記のものを含む。ビオチン化PLペプチド候補はアビジンコーティングした表面に固定される。次にこの表面へのPDZドメイン融合タンパク質の結合を測定する。
【００９５】
(1)アビジンを、表面、例えばタンパク質結合表面に結合する。任意で、アビジンを、ポリスチレン製の96ウェルプレート(例えばNunc Polysorb (カタログ#475094))に、20μg/mLアビジン(Pierce)の、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝食塩水、pH 7.4(「PBS」、GibcoBRL)の溶液を4℃で12時間、1ウェル当たり100μL加えることで結合する。次に100mL当たり2gのプロテアーゼフリーのウシ血清アルブミンを含むPBS(「PBS/BSA」)を1ウェル当たり200μL加えて4℃で2時間プレートを処理し、非特異的相互作用をブロックする。次に、プレートの各ウェルに、1ウェル当たり200μLのPBSを繰り返し加えることによってプレートをPBSで3回洗浄し、次にプレートの中身を廃棄容器に捨て、プレートの乾燥表面を軽くたたく。
【００９６】
(2)4℃で30分間、0.4μMのペプチドのPBS/BSA溶液を1ウェル当たり50μL加えることによって、プレートのウェル表面にビオチン化PLペプチド(またはPLペプチド候補)を固定する。通常、多重測定(例えば、二回測定および別のものを用いた測定も(GST/PDZドメイン融合タンパク質およびGST単独の陰性対照)が行えるように、異なるペプチドそれぞれを少なくとも8つのウェルに加え、かつペプチドを固定化していない追加の陰性対照ウェルも準備する。PLペプチドを表面に固定化したらプレートをPBSで3回洗浄する。
【００９７】
(3)GST/PDZドメイン融合タンパク質を、5μg/mLのGST/PDZドメイン融合タンパク質を含むPBS/BSA溶液を1ウェル当たり50μL、4℃で2時間加えることによって、表面と反応させる。陰性対照として、GST単独(即ち融合タンパク質なし)を指定されたウェル、一般的には固定化ペプチドそれぞれについて少なくとも二つのウェル(即ち二回測定)に加える。2時間反応させた後、プレートをPBSで3回洗浄して未結合の融合タンパク質を取り除く。
【００９８】
(4)アビジン-ビオチン化ペプチド表面へのGST/PDZドメイン融合タンパク質の結合は、当技術分野で公知である様々な方法および検出装置を用いて検出できる。一つの態様では、抗GST抗体のPBS/BSA (例えば、2.5μg/mLのポリクローナルヤギ抗GST抗体、Pierce)を1ウェル当たり50μLプレートに加え、4℃で20分間反応させる。プレートをPBSで3回洗浄し、検出可能な標識第二抗体を加える。一つの態様では、2.5μg/mLの西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ポリクローナルウサギ抗ヤギ免疫グロブリン抗体を1ウェルあたり50μLプレートに加えて、4℃で20分間反応させる。プレートを0.2%のTween 20を含む50mMのTris、pH8.0で5回洗浄し、HRP基質液(TMB、Dako)を1ウェル当たり100μL加えて室温(RT)で20分間発色させる。HRPとその基質の反応を、1Mの硫酸を1ウェル当たり100μL加えて停止させ、プレートの各ウェルの光学密度(O.D.)を450nmで読みとる。
【００９９】
(5)PLペプチドとPDZドメインポリペプチドの特異的結合は、PLペプチドとPDZドメインポリペプチドが混合されたウェルから、シグナルとバックグラウンドシグナルを比較することによって検出される。バックグラウンドシグナルは、陰性対照に見られるシグナルである。典型的には、特異的または選択的反応は、バックグラウンドの少なくとも2倍、より典型的にはバックグラウンドより5倍より高く、最も典型的にはバックグラウンドより10倍以上高いと考えられる。これに加えて、統計学的に有意な反応は、シグナルとバックグラウンドが少なくとも2標準誤差、より典型的には標準誤差、および最も典型的には6またはそれ以上の標準誤差の違いを示す反応の多重測定を含む。したがって、シグナルの反復測定をバックグラウンドの反復測定と比較する統計学的検定(例えばT検定)は、P値＜0.05、より典型的にはP値＜0.01、および最も典型的にはP値＜0.001またはそれ以下を示すと考えられる。前述した通り、「A」アッセイの態様では、PLペプチドに曝されていない(即ち被覆されていない)アビジン表面へのGST/PDZドメイン融合タンパク質の結合からのシグナルは、一つの適切な陰性対照である(「B」と呼ばれることもある)。PLペプチドに曝された(即ち被覆されている)アビジンコーティング表面へのGSTポリペプチド単独の結合からのシグナルは、第二の適切な陰性対照(「B2」と呼ばれることがある)である。全ての測定が多数回(即ち少なくとも二回)測定されることから、結合の決定には数回の測定値の相加平均(または同等に、平均)が用いられ、結合測定の確率誤差の決定には平均値の標準誤差が用いられる。N回測定の平均値の標準誤差は、以下の平方根に等しい：各測定値と平均値の差の二乗の合計を、(N)と(N-1)の積で除したもの。即ち、一つの態様では、プレートに結合したPLペプチドへのPDZタンパク質の特異的結合は、特定のPL-PDZの組み合わせの平均シグナル(「平均S」)および該シグナルの標準誤差(「SE」)を平均値B1および/または平均値B2と比較することによって決定される。
【０１００】
II. 「Gアッセイ」-固定PDZドメイン融合ポリペプチドを用いたPDZリガンド結合の検出
一つの局面では、本発明は、GST/PDZ融合タンパク質が表面に固定されたアッセイ(「G」アッセイ)を提供する。次に、この表面への標識化PLペプチド(例えば表1に記載のそれらの一つ)の結合を測定する。好ましい態様では、アッセイは以下のようにして実施される。
【０１０１】
(1)PDZドメインポリペプチドを、表面、例えばタンパク質結合表面に結合させる。好ましい態様では、一つまたは複数のPDZドメインを含むGST/PDZドメイン融合タンパク質をポリスチレン製の96ウェルプレートに結合する。GST/PDZ融合タンパク質は、様々な標準的方法のどれによってもプレートに結合できるが、融合タンパク質をプレートへ結合する工程がPDZドメインのリガンド結合特性を変えないように注意を払わなければならない。一つの態様では、GST/PDZ融合タンパク質は、96ウェルプレート上にコーティングされた抗GST抗体を介して結合する。プレートへの適切な結合は、以下の場合に達成できる。
a. ポリスチレン製96ウェルプレートに、5μg/mLのヤギ抗GSTポリクローナル抗体(Pierce)のPBS溶液を1ウェル当たり100μL、4℃で12時間加える。
b. PBS/BSAを1ウェル当たり200μL、4℃で2時間加えることによりプレートをブロッキングする。
c. プレートをPBSで3回洗浄する。
d. 5μg/mLのGST/PDZ融合タンパク質)または陰性対照としてGSTポリペプチドのみ(即ち融合タンパク質でない)のPBS/BSAを1ウェル当たり50μL、プレートに4℃で2時間加える。
e. プレートを再度PBSで3回洗浄する。
【０１０２】
(2)ビオチン化PLペプチドを、ビオチン化ペプチドのPBS/BSAの20μM溶液を1ウェル当たり50μL、4℃で10分間加え、続いて25℃でさらに20分間インキュベートして表面と反応させる。プレートを、氷冷したPBSで3回洗浄する。
【０１０３】
(3)GST/PDZ融合タンパク質表面へのビオチン化ペプチドの結合は、様々な方法および検出装置を用いて検出できる。例示的手順では、BSA/PBSに溶解した0.5μg/mLのストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)複合体を1ウェル当たり100μL加えて、4℃で20分間反応させる。次にプレートを0.2%のTween 20を含む50mMのTris、pH8.0で5回洗浄し、HRP基質液(TMB、Dako)を1ウェル当たり100μL加えて室温(RT)で20分間発色させる。HRPとその基質の反応を、1Mの硫酸を1ウェル当たり100μL加えて停止させ、プレートの各ウェルの光学密度(O.D.)を450umで読みとる。
【０１０４】
(4)PLペプチドとPDZドメインポリペプチドの特異的結合は、PLペプチドおよびPDZドメインポリペプチドが混合されているウェルからのシグナルと、バックグラウンドシグナルを比較することによって検出される。バックグラウンドシグナルは、陰性対照に見られるシグナルである。典型的には、特異的または選択的反応は、バックグラウンドの少なくとも2倍、より典型的にはバックグラウンドより5倍より高く、最も典型的にはバックグラウンドより10倍またはそれ以上高い。これに加えて、統計学的に有意な反応は、シグナルとバックグラウンドが少なくとも2標準誤差、典型的には4標準誤差より大きな、最も典型的には6またはそれ以上の標準誤差の違いを示す反応の多重測定を含む。したがって、シグナルの反復測定をバックグラウンドの反復測定と比較する統計学的検定(例えばT検定)は、P値＜0.05、より典型的にはP値＜0.01、および最も典型的にはP値＜0.001またはそれ以下を示すだろう。前述した通り、「G」アッセイの態様では、所与のPLペプチドの固定化された(表面結合)GSTポリペプチド単独への結合からのシグナルは、一つの適切な陰性対照である(「B1」と呼ばれることもある)。全ての測定が多数回(即ち少なくとも二回)測定されることから、結合の決定には数回の測定値の相加平均(または同等の平均)が用いられ、結合測定の確率誤差の決定には平均値の標準誤差が用いられる。N回測定の平均値の標準誤差は、以下の平方根に等しい：各測定値と平均値の差の二乗の合計を、(N)と(N-1)の積で除したもの。即ち、一つの態様では、プレート結合ペプチドへのPDZタンパク質の特異的結合は、特定のPL-PDZの組み合わせの平均シグナル(「平均S」)および該シグナルの標準誤差(「SE」)を平均値B1と比較することによって決定される。
【０１０５】
i) 「G'アッセイ」および「G”アッセイ」
「Gアッセイ」に関する前記特定条件について、二つの特異的な変更が特に有用である。変更されたアッセイでは、前記特定条件に比べると使用する標識化PLペプチドが少なく、PDZリガンド結合の検出に関する生化学的要件が若干異なる。
【０１０６】
本節に記載するアッセイ条件は、「G'アッセイ」および「G”アッセイ」と呼び、該Gアッセイの節に記載された特異的条件は「G0アッセイ」と呼ぶ。「G'アッセイ」は、段階(2)でのペプチド濃度が20uMでなく10uMである以外は「G0アッセイ」と同一である。その結果、親和性が低い、および/または解離速度が速い相互作用の検出感度が若干低くなる。したがって、検出された相互作用が、親和性が十分なものであり、半減期が生物学的に重要であり、かつ治療標的として有用であることの確実性が若干高くなる。
【０１０７】
「G”アッセイ」は、段階(2)でのペプチド濃度が20μMではなく1μMであること、およびインキュベーション(例えば、4℃で10分間に続き25℃で20分間ではなく)が25℃で60分間行われること以外は「G0アッセイ」と同一である。その結果、親和性が低く、解離速度が速く、および/または親和性が4℃よりも25℃で低い相互作用の検出感度が低くなる。相互作用は、(我々がPDZリガンド結合については概ね当てはまることを見出しているように)反応エントロピーが負の場合(即ち生成物のエントロピーが反応物のエントロピーよりも低い)には、4℃よりも25℃で親和性が低くなるだろう。これに対して、会合および分離速度が遅い相互作用については、PDZ-PL複合体が「G”アッセイ」の長いインキュベーション中に蓄積するために、PDZ-PL結合シグナルは「G”アッセイ」と「G0アッセイ」で似たものになるだろう。かくして「G”アッセイ」および「G0アッセイ」の結果の比較を用いて、各種PDZ-PL相互作用の相対エントロピー、エンタルピーおよび動態を推定できる。(エントロピーおよびエンタルピーは、方程式ΔG = RT ln (Kd) = ΔH - TΔSが導かれる結合親和性に関係し、式中のΔG、HおよびSはそれぞれ反応自由エネルギー、エンタルピー、およびエントロピーであり、Tはケルビン単位の温度であり、Rは気体定数であり、Kdは平衡解離定数である)。特に「G0アッセイ」だけに検出されるか、またははるかに強く検出される相互作用は、一般的に25℃での速い解離速度(t1/2<10分間)および負の反応エンタルピーを有しているのに対し、「G”アッセイ」でも同様に強く検出される相互作用は、一般的に25℃において遅い解離速度(t1/2>10分間)を有している。PDZ-PL相互作用の熱力学および動態の大まかな推定(「G0アッセイ」対「G”アッセイ」の結果を前記概略したように比較することで達成できる)は、相互作用の効率的なインヒビターの設計に利用できる。例えば、所与のPDZドメインからゆっくり解離する(「G”アッセイ」での結合が「G0アッセイ」での結合に似ていることで証明される) PLの化学構造に基づく低分子インヒビターは、それ自身ゆっくり解離することから、親和性は高いだろう。
【０１０８】
このようにして、「Gアッセイ」の段階(2)の温度および期間を変えることで、PDZリガンド結合反応の動態および熱力学、ならびに反応のインヒビターの設計について洞察することができる。
【０１０９】
本発明の検出可能な標識物は、分子(上記したような)に直接的にまたは間接的に結合される任意の検出可能な化合物または組成物であり得る。標識物は、それ自体検出可能であるか(例えば、放射性同位元素標識物または蛍光標識物)、または酵素標識物の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒することができる。好ましい標識物は、非放射活性の呈色試薬の色変化を触媒する酵素標識物である。
【０１１０】
しばしば、標識物を、抗体に間接結合させることがある。例えば、抗体をビオチンに結合させることができ、かつ上述の任意の部類の標識物にアビジンを結合させることができるか、またはその逆ができる(上記「A」および「G」アッセイも参照されたい)。ビオチンはアビジンに選択的に結合することから、したがって、この間接的な様式で標識物を抗体に結合することができる。ビオチン-アビジン結合および類似のアッセイを含む技術の考察については、前記Ausubelを参照されたい。あるいは、標識物と抗体との間接的な結合を達成するためには、抗体に小型のハプテン(例えばジゴキシン)を結合し、上述の別のタイプの標識物の一つを抗ハプテン抗体に結合させる(例えば抗ジゴキシン抗体)。そうすることで、抗体と標識物との間接的結合を達成できる。
【０１１１】
アッセイの変形は、様々な洗浄段階を含み得る。「洗浄」とは、固相を、そこから未結合物質(例えば、非接着細胞、非接着捕捉剤、未結合のリガンド、レセプター、レセプターコンストラクト、細胞溶解物、またはHRP抗体)が除去されるように、水性液(通常は緩衝液または細胞培地)に曝すことを意味する。バックグラウンドノイズを下げるためには、洗浄液に界面活性剤(例えば、Triton X)を加えると好都合である。通常、水性洗浄溶液は、洗浄後にアッセイプレートのウェルから移される。好都合には、洗浄は、自動洗浄装置を用いて行うことができる。しばしば、複数の洗浄段階(例えば、約1〜10回の洗浄段階)が求められることもある。
【０１１２】
PDZ-PL検出アッセイには、様々な緩衝液も用いることができる。例えば、各種ブロッキング緩衝液を用いて、アッセイのバックグラウンドを下げることができる。用語「ブロッキング緩衝液」は、PLまたはPDZでコーティングされていない基質の露出面に結合できる、少なくとも一つのブロッキング化合物を含む、水性の、pH緩衝化された溶液を指す。ブロッキング化合物は、通常は、ウシ血清アルブミン(BSA)、ゼラチン、カゼイン、または粉乳のようなタンパク質であり、アッセイのどの試薬とも交差反応しない。ブロック緩衝液は、一般的には、約7〜7.5の間のpHで提供され、リン酸塩およびTRISを含む適切な緩衝化剤である。
【０１１３】
PDZ-PL相互作用の検出には、様々な酵素-基質の組み合わせも用いることができる。酵素−基質の組み合わせの例としては、例えば以下のものが挙げられる。
(i) 水素ペルオキシダーゼが染料前駆体(例えばオルトフェニレンジアミン［OPD］または3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンヒドロクロリド［TMB］)を酸化する(上記)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRPO)と基質としての水素ペルオキシダーゼの組み合わせ。
(ii) アルカリホスファターゼ(AP)と発色基質としてのパラ-ニトロフェニルホスファートの組み合わせ。
(iii) β-D-ガラクトシダーゼ(βD-Gal)と発色基質(例えばp-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシダーゼ)または蛍光基質、4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシダーゼの組み合わせ。他の様々な酵素-基質の組み合わせが利用できる。これらの一般的評論については、共に参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第4,275,149号および第4,318,980号を参照されたい。
【０１１４】
(表２)例示的ヒトPDZドメイン
2009503439.tif 000006
2009503439.tif 000007
2009503439.tif 000008
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2009503439.tif 000019
＊：このPDZドメイン含有タンパク質は、ラットShank3配列をヒトゲノムクローンAC000036に用いてコンピュータ上でクローニングし、ヌクレオチド6400-6496、6985-7109。7211-7400と一緒にインシリコでスプラシングして作製した理論上のヒトShank3であることから、GI番号は無い。
【０１１５】
VI. 他のPL結合作用物質のスクリーニング
診断アッセイに使用される適切なPL結合作用物質としては、一つまたは複数のPLモチーフに特異的に結合する任意の作用物質が挙げられる。このような作用物質は、抗ウイルス作用物質および抗細菌作用物質のスクリーニング方法で開示したものと同じ方法を用いて同定できる。例えば、作用物質は、PLモチーフを含むタンパク質を用いて同定できる。試験化合物は、例えば発現ライブラリーおよび低分子ライブラリーを含む任意のタイプのライブラリーを用いて同定できる。治療剤または治療リードのためのスクリーニングに使用する試験化合物の適切な供給源は、ファージディスプレイライブラリーである。たとえば、Devlin、WO 91/18980；Key, B.K., et al., eds., Phage Display of Peptides and Proteins, A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA, 1996を参照されたい。ファージディスプレイは、108〜109種類の配列を含むライブラリーから、ファージ遺伝学を用いて所望する特徴のペプチドまたはタンパク質を選択および増幅することができる強力な技術である。ライブラリーは、所望する位置のアミノ酸配列の多様性を選択して設計でき、ライブラリーを所望する特徴に偏向させることができる。ライブラリーは、ペプチドがバクテリオファージ表面上に表示される融合タンパク質として発現するように設計される。所望する特徴を持つペプチドを提示しているファージを選択し、再増殖させて拡大することができる。ペプチドはファージを継代することで増幅されるので、選択されたファージのDNAは容易に配列決定でき、選択されたペプチドの迅速な分析を容易にする。
【０１１６】
ペプチドインヒビターをコードするファージは、PDZドメインタンパク質および/またはPLタンパク質PLに特異的に結合するファージを選択することによって選択できる。ライブラリーは、ファージの表面に発現する、遺伝子IIIなどのタンパク質と融合して生成される。ライブラリーは、様々な長さを持つ、直線状もしくは二個のCysアミノ酸を含むことによって束縛されているか、ファージタンパク質と融合するか、または足場のような追加のタンパク質にも融合することができる、ペプチドから構成され得る。ライブラリーは、本明細書に開示したPL領域に偏向させるか、または最初のライブラリーからの結合ファージの選択から得たペプチド配列に偏向させ、追加の試験インヒビター化合物が得られるように設計することもできる。
【０１１７】
VII. 診断および治療使用のための抗体
本発明のPLタンパク質、PLタンパク質PL、PDZおよびPDZ PL結合ドメインポリペプチドは、診断および治療に使用するための抗体の生成に有用である。抗体は、ポリクローナル抗体でも、個別のモノクローナル抗体でも、または様々なエピトープ特性を有するプールしたモノクローナル抗体でもよい。モノクローナル抗体は、抗体のタイプにしたがって、標準的な方法により抗原を含むタンパク質の断片から作られる(例えばKohler, et al., Nature, 256:495, (1975); およびHarlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (C.S.H.P., NY, 1988) Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)、ならびにWO 90/07861；Dower et al., WO 91/17271およびMcCafferty et al., WO 92/01047 (それぞれは参照により、全ての目的について組み入れられる)を参照されたい)。ファージディスプレイ技術は、本発明のペプチドに親和性を有することが事前に示されている抗体のCDR領域を突然変異させるためにも用いることができる。いくつかの抗体は、ある形のPLタンパク質またはPDZタンパク質に存在するエピトープには結合するが、他のエピトープには結合しない。例えば、いくつかの抗体は、PLタンパク質のC末端のPL部位内のあるエピトープに結合する。特異的なPLタンパク質PLモチーフに結合するこれらの抗体は、PLタンパク質PLクラス特異的抗体として分類できる。さらには、いくつかの抗体は、PDZタンパク質のPDZドメイン内のエピトープに結合する。いくつかの抗体は、表2に示すようなPDZポリペプチドに特異的に結合するが、他には結合しない。いくつかの抗体は表1に示すようなPLタンパク質上のPLモチーフに特異的に結合する。抗体は、例えば、それに対し抗体を産生させたポリペプチドまたはペプチドが結合している支持体に結合させてから溶出することによって精製できる。
【０１１８】
用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、未変性抗体およびその結合断片を包含して用いられる。典型的には、断片は独立した重鎖、軽鎖Fab、Fab' F(ab')2、FabcおよびFvを含み、抗原断片への特異的結合に関してそれが由来する未変性抗体と競合する。断片は、組換えDNA技術によって、または未変性免疫グロブリンを酵素によりもしくは化学的に分離することによって産生できる。用語「抗体」はまた、他のタンパク質と化学的に結合されているか、または融合タンパク質として発現する、一つまたは複数の免疫グロブリン鎖も包含する。用語「抗体」はまた、二重特異性抗体も包含する。二重特異性抗体または二機能性抗体は、二種類の重/軽鎖のペア、および二つの結合部位を有する人工のハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合、またはFab'断片の連結を含む様々な方法によって産生することができる。例えばSongsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990)；Kostelnyら、J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)を参照されたい。
【０１１９】
抗体は、ウイルス感染および細菌感染ならびにそのサブタイプの予後診断および診断のための試薬(例えば、前もって包装されたキット)として利用できる。ウイルス感染および細菌感染の予後診断および診断には様々な方法を用いることができる。
【０１２０】
B. PDZタンパク質の代用となるモノクローナル抗体
上記かつ実施例に示すように、ウイルスおよび細菌のPLタンパク質のPLモチーフを認識して結合する非常に多様なPDZタンパク質が存在する。同一モチーフを認識する抗体は、また、これらPDZタンパク質の代用物としても用いることができる。好ましくは、PDZタンパク質は次のものの一つである：AF6、AIPC、AIPC (PDZ #1)、GORASP1 (PDZ #1)、INADL (PDZ #3)、KIAA0316、KIAA1284、EBP50 (PDZ #1)、(Shank1; Shank2; Shank3; シンテニン; Magil (PDZ #1); Tip1; Mint1 (PDZ #1,2); 新規セリンプロテアーゼ; MUPP1 (PDZ#3,7,9,11)、MAST2、NSP、NOS1、PAR3 (PDZ #3)、PAR3L (PDZ #3)；PAR5β、RiM2、ロドフィリン様、SIP-1、SITAC-18 (PDZ #2)、SITAC-18 (PDZ #1)、SIP1、ZO-1 (PDZ #1)、ZO-3 (PDZ #1)、DVL3、DVL2 (PDZ #1)、PTPL1 (PDZ#4)、HEMBA 10003117、Pick1、または類似体もしくは断片。より好ましくは、抗体は、下記のウイルスおよび細菌についてのPLモチーフを特異的に認識する任意のPDZタンパク質を模倣する：HIV-1 EnvについてはRALLまたはRILL、HIV-1 Nefタンパク質についてはFKNC、FKDC、YKNCまたはYKDC、HIV2 Envタンパク質についてはIALL、LALL、またはLTALL、HIV-2 Vifタンパク質についてはEILA、GILA、またはDILA、B型肝炎タンパク質XについてはFTSA、B型肝炎S抗原についてはWVYI、C型肝炎カプシドCタンパク質についてはPASAまたはPVSA、C型肝炎E1タンパク質についてはGVDA、RSV核タンパク質についてはDVEL、ロタウイルス A VP4タンパク質についてはQCKLまたはQCRL、ロタウイルス A VP7タンパク質についてはYYRVまたはYYRI、ロタウイルス A NSP2タンパク質についてはQVGI、HIGI、QIGI、またはRIGI、ロタウイルス A NSP5タンパク質についてはIKDLまたはIEDL、結核菌ESXSタンパク質についてはSSWA、結核菌ESXNタンパク質についてはYTGF、および結核菌ESAT-6タンパク質についてはGMFA。特定のPLタンパク質PLモチーフを認識する抗体代用物は、PLクラス特異的と呼ぶことができる。例えば、PLモチーフである結核菌ESXSタンパク質についてYTGFを認識する抗体は、ESXS PLクラス特異的と呼ぶことができる。
【０１２１】
C. 抗体と他の結合作用物質の混合物
抗体とPDZタンパク質(および/またはアプタマー)の混合物は、任意のアッセイに用いることができる。PDZタンパク質および抗体は、PLタンパク質の様々なサブタイプの同定、本明細書で教示されるウイルスおよび細菌の同定、ならびに病原性の低い形態と比べた場合の病原性の形態の識別に用いることができる。いくつかのアッセイでは、抗体およびPDZタンパク質は混合されて、一緒に試料に与えられる。別のアッセイでは、抗体およびPDZタンパク質は、二種類のサブタイプを同定するため、またはサブタイプの同定を確認するために、分けられて異なる試料に結合させられる。
【０１２２】
VIII. アプタマー
アプタマーは、結合ポケットを形成することによって特定のリガンドを認識する、無秩序な配列の大集団からインビトロで選択された、RNA分子およびDNA分子である。アロステリックリボザイムは、活性部位とは離れて存在しているアプタマードメインにエフェクター分子が結合することによってその活性が調節されるRNA酵素である。これらのRNAは、特異的エフェクターの有無によって制御される、正確な分子スイッチとして働く。アプタマーは核酸、タンパク質、および完全な生物体にさえ結合できる。アプタマーは抗体と別のものであるが、それらは様々な診断形式において、抗体の特性を模倣する。かくして、アプタマーを、抗体および/またはPDZタンパク質の、代わりにまたは組み合わせて用いて、一般的および特異的なPLタンパク質PL領域の存在を同定できる。
【０１２３】
X. 診断試験
本明細書には、各種タイプの生物試料中のHIV、B型肝炎、C型肝炎、RSV、ロタウイルスA、結核菌およびそれらの産生物を含めた、細菌およびウイルスを同定するためのアッセイ法に有用な診断用の捕捉試薬および検出試薬が提供されている。これらウイルスおよび細菌の検出に有用な代表的なアッセイ形式としては、酵素結合固相吸着アッセイ、放射標識結合アッセイ、蛍光PDZ-結合およびPL-結合アッセイ、時間分解PDZおよびPL蛍光アッセイ、ならびにサンドイッチ酵素カスケードアッセイ形式が挙げられる。本アッセイでの使用に適合可能な、免疫アッセイ技術由来の例示的方法としては、ホモジニアスおよびヘテロジニアスアッセイ形式；競合および非競合アッセイ形式；酵素結合固相アッセイ形式、蛍光アッセイ形式、時間分解蛍光アッセイ形式、生物発光アッセイ形式、カスケード酵素アッセイ等が挙げられる。
【０１２４】
ある例示的手順では、一つまたは複数のPDZタンパク質を捕捉剤として用い、生物試料から一つまたは複数のPL分析物を単離する。別の例示的手順では、一つまたは複数のPDZタンパク質を、一つまたは複数のシグナル発生化合物に結合して、生物試料中の一つまたは複数のPL分析物の存在または量を識別するための検出試薬として用いる。さらに別の例示的手順では、PLタンパク質およびPLペプチドを、シグナル発生化合物に結合し(PL-SGC)、競合的リガンド阻害アッセイ、即ちウイルスPLの存在がPDZへの一つまたは複数のPL-SGCの結合と競合するアッセイに用いる。好ましくは、PDZタンパク質は、表1のウイルスまたは細菌のPLと結合することが分かっているPDZタンパク質の少なくとも一つである。表1は、どのPDZがどのPLタンパク質に結合するかを示すために、複数のボックスにさらに分けられている。同じボックスの中に一つまたは複数のPLモチーフが示されているPDZは、該PLモチーフの少なくとも一つと特異的に結合する。例えば、表の第4縦列に示されているどのHIV-1 Env PLについても、PDZタンパク質は、該HIV-1 Envが記載されているものと同じボックスの第6縦列から選ばれる。記載されているPDZタンパク質は、Envの一つまたは両方のPLモチーフに結合する。HIV-1のEnvタンパク質の検出には、同一ボックスの第6縦列の任意のPDZタンパク質を用いることができるが、これは該PDZタンパク質がEnv中の一つのPLモチーフに結合すれば十分であるからである。HIV-1のNefタンパク質を検出するには、表1の一つまたは両方のPLモチーフについて、HIV-1 Nefと同じボックスの第6縦列の任意のPDZタンパク質を用いることができる。HIV-2のEnvタンパク質を検出するには、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。HIV-2のVifタンパク質を検出するには、表1の第4縦列のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。B型肝炎のタンパク質Xの検出には、表1のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。B型肝炎のS抗原の検出には、表1の一つまたは両方のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。C型肝炎のカプシドCの検出には、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。C型肝炎のE1タンパク質の検出については、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。RSVの核タンパク質の検出には、表1の第4縦列のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。ロタウイルスAのVP4の検出には、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。ロタウイルスAのVP7の検出には、表1の第4縦列一つまたは両方のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。ロタウイルスAのNSP2の検出には、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。ロタウイルスAのNSP5の検出には、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。結核菌のESXNタンパク質の検出には、表1の第4縦列のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。結核菌のESXSタンパク質の検出には、表1の第4縦列のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。結核菌のESAT-6タンパク質の検出には、表1の第4縦列のPLモチーフについて、ESAT-6タンパク質が含まれるものと同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。他のフラビウイルスの検出には、C型肝炎に同定されたPLタンパク質(カプシドCおよびE1)に相当するPLタンパク質を、PDZタンパク質、特に表1の第6縦列に識別されているPDZタンパク質への結合について用いて、かつ試験することができる。他のレンチウイルスの試験には、HIV-1およびHIV-2に同定されたPLタンパク質(Env、NefおよびVif)に相当するPLタンパク質を、PDZタンパク質、特に表1の第6縦列に識別されているPDZタンパク質への結合について用いて、かつ試験することができる。他のマイコバクテリア種の試験には、結核菌に同定されたPLタンパク質(ESAT-6ファミリーおよび関連タンパク質)に相当するPLタンパク質を、PDZタンパク質、特に表1の第6縦列に識別されているPDZタンパク質への結合について用いて、かつ試験することができる。PDZタンパク質、抗体および他の結合作用物質の混合物は、タンパク質、全ての株もしくはサブタイプ、および/または科もしくは種の全てのメンバーに関係する全てのPLを同定する試験に用いることができる。例えば、混合物は、全てのHIV-1 Envタンパク質(両方のPLを同定する混合物)、全てのHIV-1株またはサブタイプ(これにはPL他パク質の混合物に結合する原因菌が含まれる可能性がある)、全てのHIV(HIV-2を含む)、全てのレンチウイルス、全てのレトロウイルスを同定するために用いることができる。HIV-1 Envを一般的に同定する試験の場合、例えば、PDZタンパク質と抗体の混合物を用いて、両方のPLを同定できる。これらおよび他の試験については、PDZタンパク質は、上記の一つを、他の病原体特異的またはHIV特異的なPLモチーフを認識する別のものと一緒に混合物内に含むことができる。
【０１２５】
本発明は、試料中の病原体のPLタンパク質を検出する方法を提供し、被験体のウイルス感染診断に有用性を見出している。多くの例示的な手順では、生物試料は被験体から得られ、試料中の病原体PLタンパク質の存在が決定される。試料中に病原体PLタンパク質が検出可能な量存在することは、個体が特定のウイルスに感染していることを示す。他の例示的手順では、生物試料中の病原体PLタンパク質のレベルが決定され、試料中の対照の量と比較される。試料中の病原体PLタンパク質の相対量は、病原体感染の重篤度を示す。好ましくは、PLタンパク質およびPLモチーフは下記の少なくとも一つである：HIV-1 EnvについてはRALL (SEQ ID NO:242)またはRILL (SEQ ID NO:243)、HIV-1 Nefタンパク質についてはFKNC (SEQ ID NO:244)、FKDC (SEQ ID NO:245)、YKNC (SEQ ID NO:246)またはYKDC (SEQ ID NO:247)、HIV2 Envタンパク質についてはIALL (SEQ ID NO:248)、LALL (SEQ ID NO:249)またはLTALL (SEQ ID NO:250)、HIV-2 Vifタンパク質についてはEILA (SEQ ID NO:251)、GILA (SEQ ID NO:252)またはDILA (SEQ ID NO:253)、B型肝炎タンパク質XについてはFTSA (SEQ ID NO:254)、B型肝炎S抗原についてはWVYI (SEQ ID NO:255)、C型肝炎カプシドCタンパク質についてはPASA (SEQ ID NO:256)またはPVSA (SEQ ID NO:257)、C型肝炎E1タンパク質についてはGVDA (SEQ ID NO:258)、RSV核タンパク質についてはDVEL (SEQ ID NO:259)、ロタウイルスA VP4タンパク質についてはQCKL (SEQ ID NO:260)またはQCRL (SEQ ID NO:261)、ロタウイルスA VP7タンパク質についてはYYRV (SEQ ID NO:262)またはYYRI (SEQ ID NO:263)、ロタウイルスA NSP2タンパク質についてはQVGI (SEQ ID NO:264)、HIGI (SEQ ID NO:265)、QIGI (SEQ ID NO:266)、またはRIGI (SEQ ID NO:267)、ロタウイルスA NSP5タンパク質についてはIKDL (SEQ ID NO:268)またはIEDL (SEQ ID NO:269)、結核菌ESXNタンパク質についてはSSWA (SEQ ID NO:269)、結核菌ESXSタンパク質についてはYTGF (SEQ ID NO:270)、結核菌ESAT-6タンパク質についてはGMFA (SEQ ID NO:271)。
【０１２６】
方法は、ウイルスおよび/または細菌のPLタンパク質に特異的な二種類の結合パートナーを用いることができ、その内の一つは上記のPDZドメインポリペプチドである。一般的には、方法は、(a) 結合パートナーの一つを用いて、試料から病原体PLを単離する段階、および（b) もう一方の結合パートナーを用いて病原体PLタンパク質を検出する段階を含む。
【０１２７】
A. ELISAサンドイッチヘテロジニアスアッセイ形式
本PDZ捕捉物およびモノクローナル抗PLタンパク質を用いて、生物試料中のウイルスおよび細菌株を検出するサンドイッチアッセイを構築する。本アッセイは、1〜1,000ng/mlの範囲の感度、即ち生物試料中のウイルスまたは細菌のタイプまたは量を検出する商業用途に十分な感度を有するが、以下の点に留意する。即ち、
(a) 免疫アッセイは、HIV-1、HIV-2、B型肝炎、C型肝炎、ロタウイルスA、RSV、および結核菌の微生物中のPLタンパク質を区別できる。
(b) 異なるアッセイ形式の交差反応性プロファイルは多様であり、検出対象となる具体的なウイルスまたは細菌、ならびに細胞溶解物を含む生物試料での絶対感度にも依存し；かつ
(c) 今日、診断装置の当技術分野では、様々なアッセイ形式の検出限界を決定することは日常的な作業である。
【０１２８】
本方法では様々な競合および非競合アッセイ形式が使用可能であると思われるが、サンドイッチアッセイ形式が立証された性能特性および様々な十分に確立されたシグナル増幅法を有することから、目下のところ該アッセイ形式が好ましい。目下のところ好ましいサンドイッチ免疫アッセイの手順では、特異的な高い親和性を持つ非天然のPDZタンパク質を用いて、生物試料内から天然のウイルスPLタンパク質を捕捉し；抗PLタンパク質マウスモノクローナル抗体を用いて、結合したPLタンパク質抗原を検出し；結合した抗PLタンパク質抗体の存在を、シグナル発生化合物、例えば酵素結合第二抗体(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体；HRP)またはビオチン化第二抗体およびストレプトアビジン-酵素複合体(例えば、HRP)のいずれかを用いて検出する。
【０１２９】
一般的には、本発明の方法は、(i) 第一の結合作用物質、即ち捕捉剤を用いて、複合生物試料内から天然ウイルスPLタンパク質分析物を分離(即ち単離)する段階；および(ii) 単離されたPL分析物を、第二の結合作用物質、即ち検出剤を用いて検出する段階を含む。分離段階および検出段階は、PL分析物に対する特異性のレベルが異なる結合パートナーを用いて達成することができ、例えば捕捉剤の特異性が高い場合には、検出試薬には低い特異性のものを用い、逆の場合も同様である。ある例示的手順では、捕捉剤は好ましくはPDZドメインポリペプチドである。より好ましくは、捕捉剤は表1および/または表2に掲載された捕捉剤の一つである。別の例示的手順では、これらの例示的手順において検出試薬の少なくとも一成分がPDZポリペプチド、例えば捕捉/単離されたPL分析物に結合するPDZタンパク質検出剤であり、次に複合体中のその存在がシグナル発生化合物と結合した抗PDZ抗体を用いて検出されるという条件の下では、第一の結合パートナーは抗病原体PLタンパク質抗体または抗体の混合物である。ある例示的な手順では、PDZ捕捉剤は、直接的にまたはリンカーを介して固相に結合している。例えば一つの非限定的な例では、PDZドメインポリペプチドは、磁性ビーズに結合している。後の例では、生物試料と接触した場合に、磁性ビーズ状に固定されたPDZ捕捉剤は、試料中の細菌またはウイルスのPLタンパク質と共にPDZ-PL相互作用複合体を形成するのに有効である。次に磁場を印加し、相互作用複合体を、結合した細菌またはウイルスのPLタンパク質と一緒に試料から単離する。別の非限定的な例では、PDZドメインポリペプチド捕捉剤をマイクロタイタープレートの表面に固定し；細菌またはウイルスのPLタンパク質を含む生物試料を固定化された捕捉試薬に接触させ、プレート表面にPLの結合を生じさせ；プレートを緩衝液で洗浄してPL以外のウイルスまたは細菌分析物をプレートから取り除き；こうして固定されたPL分析物を生物試料から単離する。例えば、磁場の利用、洗浄等などの様々な分離/単離手段が公知である。実際に用いる手段は、具体的なアッセイ形式に依存する。例えば、分離は、洗浄；磁気手段；遠心分離；濾過；分子篩、イオン交換およびアフィニティーを含むクロマトグラフィー；電場での分離；例えばラテラルフロー試験ストリップでなどの毛細管現象；免疫沈降；およびさらに下記に開示する方法を含むが、これらに限定されない様々な方法で達成できる。
【０１３０】
ある例示的手順では、細菌またはウイルスのPLタンパク質を、生物試料の一部を試験ストリップの一端と接触させることによって生物試料内の他のウイルスまたは細菌および細胞性タンパク質から分離し、次に該タンパク質を、例えばラテラルフローなどの毛細管現象によって試験ストリップ上を移動させる。本方法は、アッセイ中に一つまたは複数のPDZポリペプチド作用物質、抗体、および/またはアプタマーが、捕捉および/または検出試薬として存在すること、ウイルスまたは細菌株の存在または量を特異的に同定できる能力をアッセイに付与することによって、従来技術の免疫アッセイ法と区別される。本方法は、本方法が抗体以外の患者試料中に存在する細菌またはウイルスのタンパク質を同定するという事実によって、従来の免疫アッセイ法から区別される。ラテラルフローでの分離、検出、および定量のための方法および装置は、当技術分野、例えば全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,942,981号、第5,569,608号；第6,297,020号；および第6,403,383号で公知である。一つの非限定的な例では、試験ストリップは、試料を添加させるための近位領域、ならびにPDZポリペプチド捕捉剤、および緩衝試薬、および移動中の生物試料中のPDZポリペプチドと任意のPLタンパク質との間の結合相互作用を確立するのに適切な添加物を含む遠位試験領域を含む。例示的手順では、試験ストリップは、異なるPDZドメインポリペプチド、即ちそれぞれが異なるウイルスおよび/または細菌のPLタンパク質分析物と特異的に相互作用できるPDZドメインポリペプチドを含む試験領域を2カ所含む。
【０１３１】
上記開示の方法によれば、ウイルスまたは細菌のPLタンパク質分析物は生物試料中の他のタンパク質から、即ち試料中の分析物が検出および/または定量化に適切なような様式で分離される。PDZポリペプチド、シグナル発生化合物、抗体、アプタマー等が結合したPDZポリペプチドを用いた単離されたPLタンパク質を検出するための新規の方法が提供される。いくつかの例示的手順によれば、PDZ捕捉剤、抗体、および/またはアプタマーに結合したウイルスまたは細菌のPL分析物は、病原体PLタンパク質に特異的な一つまたは複数の抗体、例えばシグナル発生化合物を結合させた抗体を用いて結合される。もちろん診断技術の分野では様々な検出法が公知であり、本(非限定的)開示は全ての周知の代替法を記載するものではない。むしろ本開示は、本発明を実施する最良の形態を記載する必要条件を満たし、代替法に導く一般的な参照となるものである。
【０１３２】
いくつかの例示的手順では、SGC(シグナル発生化合物)と結合したPDZドメインを用いて、ホモジニアスアッセイ形式、即ち分離段階を必要としない形式で試料中の病原体PLタンパク質分析物の存在を検出する。このアッセイ法では、PDZドメインへのPLの結合によりSGCが生じるシグナルに変化を、例えば蛍光異方性に変化を引き起こす。
【０１３３】
いくつかの例示的手順では、生物試料中の細菌またはウイルスのPL分析物の検出には、ヘテロジニアス固相アッセイ形式(前記に開示)が有用である。上記本発明の背景の節で記したように、PDZタンパク質はPLを含む細胞性タンパク質を結合する。同様に、感染細胞では、PLを含むウイルス性または細菌性のタンパク質は、宿主細胞のPDZタンパク質に結合する。これらの相互作用は、通常は診断アッセイ形式では結合を巡り競合することが予想されるが、予想外にも、界面活性剤で抽出された細胞溶解物の中ではこれら後者の天然相互作用の親和性および質量平衡は十分に弱いか、または十分に破壊されているので、ウイルスまたは細菌のPL分析物が本診断アッセイ形式で検出できることがここにさらに提供される。したがって、Tween-20またはTriton X100のような界面活性剤を約0.5%未満；好ましくは約0.2%未満；および最も好ましくは約0.1%未満存在する状態で溶解物を調製し、アッセイを実施することができる。
【０１３４】
いくつかの例示的手順では、試料中のウイルスPLタンパク質のレベルを定量化するおよび/または対照と比較することができる。適切な陰性対照試料は、例えば健康であることが分かっている個体、例えばアッセイ対象の特定の細菌感染またはウイルス感染に罹っていないことが分かっている個体から得る。特異性対照は、関連するウイルスもしくは細菌に感染していることが分かっている個体(該ウイルスもしくは細菌が特異的PLタンパク質を有していない場合)、またはより低い病原性の株に感染している個体から採集できる。対照試料は、試験対象となる被験体と遺伝的な関係にある個体から得られるが、遺伝的に無関係な個体からも得られる。適切な陰性対照試料はまた、感染初期段階、即ち試験試料を採取した時点よりも早い段階の個体から採集された試料でもよい。いくつかの例示的手順はまた、非感染性の陽性対照、即ち細菌PLまたはウイルスPLのアミノ酸配列を有する組換えタンパク質も含む。
【０１３５】
初期にウエスタンブロットを用いて、生物試料中のPLタンパク質のレベルが、各種の可能な免疫アッセイ形式でこれら抗原を検出できるのに十分であることを示すことができる。しかしながら、実際の生物試料中のPLタンパク質のレベルが実際の免疫アッセイ形式での検出を制限することが証明された場合は、一つの別の例示的手順として、インビトロで細胞に感染させるか、または細菌を適切な培地の上もしくは中で増殖させることによって、生物試料中で生きているウイルスを増幅することができる、すなわちウイルス増幅試料中のPLタンパク質は約6〜約12時間で検出可能であるべきである。他の例示的手順では、生物試料およびウイルス増幅試料中のPLタンパク質抗原の収率を改善するための方法として、プロテアーゼインヒビターおよびプロテアソームインヒビター、例えばMG132の使用が挙げられる。
【０１３６】
B. 試薬の調製
PLペプチド、PDZドメインポリペプチドおよびアプタマーは、当技術分野で公知であるように合成(即ち機器を使用して)または組換え手段を用いて作ることができる。例えば、組換えタンパク質の発現のための方法および条件は、例えば、Sambrook、前記、およびAusubel、前記に記載されている。哺乳動物の組織細胞培養を用いたポリペプチドを発現は、Winnacker, "From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987；およびAusubel、前記に広く論じられている。
【０１３７】
結合アッセイの詳細は、2003年7月29日に出願され、US20040018487として公開された米国特許出願第10/630,590号および米国特許第6,942,981号にも開示されている。
【０１３８】
細胞を基本とするアッセイは、一般的には、組換え発現系を用いた本PDZドメインポリペプチドおよびウイルスPLまたは細菌PLの同時産生(即ち、それらが産生される時間を問わない、同一細胞内での産生)を含む。真核細胞での本ポリペプチドの産生に適切な細胞は、以下の実施例の節に開示している。本PDZドメインポリペプチドおよびウイルスまたは細菌のPLの発現に適切である可能性を有する細胞のタイプとして以下のものが挙げられる：例えばサル腎臓細胞(COS細胞)、SV40で形質転換されたサル腎臓CVI細胞(COS-7、ATCC CRL 165 1)；ヒト胚腎臓細胞(HEK-293、Graham et al. J. Gen Virol. 36:59 (1977))；HEK-293T細胞；新生児ハムスター腎臓細胞(BHK, ATCC CCL 10)；チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4216, (1980)；マウスセルトリ細胞(TM4、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980))；サル腎臓細胞(CVI ATCC CCL 70)；アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76、ATCC CRL-1587)；ヒト子宮頚癌細胞(HELA、ATCC CCL 2)；イヌ腎臓細胞(MDCK, ATCC CCL 34)；バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442)；ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75)；ヒト肝臓細胞(hep G2、HB 8065)；マウス乳腺腫瘍(MMT 060562、ATCC CCL 51)；TRI細胞(Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci 383:44-68 (1982))；NIH/3T3細胞(ATCC CRL-1658)；およびマウスL細胞(ATCC CCL-1)。それ以外の細胞株は明らかであろう。多種多様な細胞株がAmerican Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209より入手できる。
【０１３９】
C. 試料調製
検出可能な濃度のPLタンパク質、好ましくは本明細書に開示したウイルスまたは細菌のPLタンパク質を含むいかなる試料も用いることができる。使用可能な試料の例は、例えば肺滲出物、細胞抽出物(呼吸器、上皮に裏打ちされた鼻)、血液、粘液および鼻スワブである。
【０１４０】
PDZタンパク質および/または抗体へのPLタンパク質の結合は、実施例において、0.03%および0.01%を含む、最大0.05%までのSDSが存在する状態で起こることが示された。それ故に、鼻または他の体部の分泌物がラテラルフロー形式で容易に使用できないと思われる場合には、それをSDSで処理することができる。好ましくは、加えるSDSの量は、最終濃度で0.01%、より好ましくは0.03%、さらにより好ましくは0.05%までである。PDZタンパク質の結合に干渉しない他の界面活性剤等も用いることができる。緩衝液または水による希釈を含め、タンパク質/タンパク質相互作用に干渉しない他の試料処理法も用いることができる。
【０１４１】
H. 血清抗体に関する試験
特定のPLタンパク質PLモチーフに結合する血清抗体の存在を識別する試験は、いかなる形式の診断法にも用いることができる。特異的なPLタンパク質PLペプチドは、ラテラルフローまたは他の形式において、捕捉試薬として用いることができる。
【０１４２】
I. 流行状態でのアッセイの使用
例えば競合アッセイ形式において競合リガンドのレベルを下げることによって、サンドイッチアッセイ等において捕捉剤および検出試薬の量を変更することによって、アッセイの感度および特異性を変えて、生物試料中のウイルスまたは細菌のPLタンパク質の絶対検出レベルを変更することができる。このように、本試験法は、以下の実施例の節で描くように、多様な使われ方での様々なニーズに合った様々な性能属性を有する多様なアッセイを包含する。例えば、典型的な流行状態では、最も高い陽性予測値(PPV)が記録されるのが普通であり、陽性試験結果はより真実であろうと思われ、つまり陰性予測値(NPV)は最も低く、偽陰性結果が起こりやすいだろう。また、ヒト、動物、またはトリ被験体におけるウイルスまたは細菌の流行のモニタリングでも、現在、検査のために全ての試料を基準検査所に提出することが一般的である。本スクリーニングアッセイにおいて真の陽性試料を同定することによって、例えば現場または医療施設で、本試験アッセイは、検査のために基準検査所に提出しなければならない試料の数を減少させる用途を見出す、つまり、流行期の試験量が多い時に特に有用である。現在の作業では、動物はそれらが感染しているかどうかに関わらず全て殺されることになっているため、比較的高い偽陽性率は受け入れられるが、それに伴って偽陰性率も比較して低いことが好ましい。ある例示的な手順では、本発明は、流行時に使用するための、本明細書では「流行期試験法」と呼ばれる様々な特異性、感度、PPVおよびNPVを有する試験キットを提供する。本流行期試験法は、現在のニーズに適合するためには、以下のアッセイ性能を有するのが好まししい：即ち、約65%より高い特異性；約90%より高い感度；約85%より高いPPV；約65%より高いNPV；約25%未満の偽陽性率、および約5%未満の偽陰性率。
【０１４３】
これに対し、動物、保菌体、またはヒト被験体での細菌性またはウイルス性の疾患発生率が低い時期では、最低のPPVが通常記録され、偽陽性試験結果が多くなりやすく、NPVが最高となり、陰性試験結果が多く、かつ真である傾向が高くなる。この低発生率の時期には、スクリーニングの目的は、潜在的な感染動物を迅速に同定し、確認試験が、例えば基準検査所で完了するまでそれら動物を隔離することである。このように、ある例示的な手順では、モニタリングが不可欠であり、細菌性またはウイルス性の疾患の頻度が低い時期に使用するための、感度およびNPVを高くした試験法、即ち本明細書では「モニタリング試験法」と呼ばれる試験法が提供される。好ましくは、本モニタリング試験法は、以下のアッセイ性能を有する：即ち、約65%より高い特異性；約90%より高い感度；約85%より高いPPV；約65%より高いNPV；約20%未満の偽陽性率、および約5%未満の偽陰性率。本モニタリング試験法を用いて、メンバー数が100を超える群をスクリーニングする場合、該群全体のPPVは、任意の一つの特定のアッセイで得られる予測値よりも有意に高い。かくしてモニタリング試験法で陽性結果が得られた場合、前記流行期試験法を用いて群の該メンバーを再試験することが有益であることが分かるだろう。
【０１４４】
動物ではなくヒトの場合、試験の目的は勿論異なる。細菌感染またはウイルス感染の適時の証拠は、重要な症例管理的意味を有しており、例えば小児または高齢被験体での抗菌作用物質または抗ウイルス作用物質の早期投与が促進できる。一般的にヒト用診断製品については、高度の特異性および感度が必要とされ、例えば90%より高い特性および90% PPVより高い感度が必要とされる。しかしながら特定の流行状態では、例えばPPVが高く；偽陽性の確率が低く、偽陰性の確率が高い巡航船での感染といった場合、試料を確認試験のために提出する時、偽陰性試験結果をよりさらに低くする、例えば約5%未満まで低くするために、65%といったより低い特異性を持つことが望ましい場合もある。
【０１４５】
J. 診断および治療キット
本方法を実施するためのキットが提供される。ある例示的手順では、PDZタンパク質を用いて、試料、例えば病原性媒介物に感染した細胞試料中のPLタンパク質の存在を検出する。PL配列をコードしている病原性媒介物の例としては、ウイルスおよび細菌、例えばHIV-1、HIV-2、HTLV-1およびHTLV-2などのレトロウイルス；B型肝炎などのヘパドナウイルス；C型肝炎、デング熱、日本脳炎、ダニ媒介性脳炎、西ナイル熱、および黄熱病などのフラビウイルス；ロタウイルスなどのレオウイルス、RSウイルス(RSV)などのパラミクソウイルス、ならびに結核菌、ヘリコバクター ピロリ(Helicobacter pylori)、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、および化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)などの細菌が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４６】
本発明は、試料中の病原体PLタンパク質を検出する方法を提供し、被験体のウイルス感染または細菌感染の診断に用途を見出す。例示的手順では、生物試料を被験体から得て、試料中の病原体PLタンパク質の存在を決定する。検出可能な量の病原体PLの存在は、個体が特定のウイルスまたは細菌に感染していることを示す。いくつかの例示的な手順では、生物試料内の病原体PLタンパク質のレベルが決定され、試料中の対照の量と比較される。試料中の病原体PLタンパク質の相対量は、病原体の感染の強さを示す。
【０１４７】
方法は、一般的に病原体PLタンパク質の二つの結合パートナーを含み、その内の一つは上記したようにPDZドメインポリペプチドである。一般的には、方法は、(a) 結合パートナーの一つを用いて試料から病原体PLを単離する段階、および（b) 他の結合パートナーを用いて病原体PLタンパク質を検出する段階を含む。
【０１４８】
本キットは、少なくとも一つまたは複数の(i) PDZドメインポリペプチド、および(ii) PDZドメインポリペプチドを用いて、生物試料中の細菌株またはウイルス株を同定するアッセイを実施するための指示書の存在によって、免疫アッセイキットと区別される。キットは、抗体以外の患者試料内の細菌またはウイルスのタンパク質の同定を可能にし、これがキットを感染個体にとってより特異的にしている。本キットは、任意で、一つまたは複数の前記開示した試薬、緩衝液、または添加成分もしくは試薬を含んでもよく；特定の例示的手順では、キットはまた、細菌PLまたはウイルスPL、好ましくはPLタンパク質に特異的な抗体を含んでもよい。さらに別の例示的手順では、本キットは、生物試料中の他の潜在的干渉物質から細菌またはウイルスのPLを取り除くための手段、例えば装置またはシステムをさらに含むことができる。本キットはさらに、望まれる場合には、アッセイの実施に有用な、一つまたは複数の各種構成要素：例えば一つまたは複数のアッセイ容器；一つもしくは複数の対照またはキャリブレータ；その上でアッセイを実施する、一つまたは複数の固相表面；または一つもしくは複数の緩衝剤、添加物、または検出試薬または抗体；一つまたは複数の印刷された指示書、例えばアッセイの実施に用いられている各成分の量、ならびにアッセイ結果の評価の指針を示すための添付文書および/または容器ラベル、を含むことができる。本キットは、例えば試験ストリップ、サンドイッチELISA、ウエスタンブロットアッセイ、ラテックス凝集等を含む多種多様なタイプのアッセイ形式の実施に有用な構成要素を含むことができる。本キット内の本参照物、対照およびキャリブレータは、例えば一つまたは複数の天然および非天然のウイルスPLタンパク質または細菌PLタンパク質、組換えPLポリペプチド、合成PLペプチド、PDZドメインポリペプチド、PDZドメインペプチド、ならびに/または本方法の性能および正確性を評価するための適切な比色分析標準物質および酵素標準物質を含むことができる。
【０１４９】
本方法を実施するための指示は、通常は適切な記録媒体に記録され、キットの中に、例えば添付文書として納められる。例えば、指示は紙またはプラスチックといった被印刷物に印刷できる。別の態様では、指示は電子的なコンピュータ読み取り可能な記憶媒体、例えばCD-ROM、フロッピーディスク等にデジタル記録できる。さらに別の態様では、本法を実施するための指示は、使用者が遠隔のデジタルソース、例えばインターネットウェブサイトから、ダウンロード可能な文書ファイルの形式で得ることができる。
【０１５０】
任意で、キットは、種特異的試験だけでなくHIVの一般試験を実施するための試薬を含むこともできる。例えば、ラテラルフロー試験は、一般HIVウイルスの存在を同定するためのレーン、およびウイルスがHIV-1またはHIV-2であるか識別するためのレーンを含むことができる。一般試験は、PLタンパク質の存在に関する試験を含むHIVウイルスの存在が同定される任意の試験であり得る。含めることが可能な別のタイプの一般HIV試験は、任意のHIV特異的タンパク質を同定できる。あるいは、HIVもしくは他のウイルスまたは細菌の存在は、患者血液中の抗体の存在から同定できる。最後に、PCR試験を用いて、HIVまたは他のウイルスもしくは細菌の存在を広く同定することができる。
【０１５１】
K. アレイ
さらに他の例示的手順では、PDZ、抗体、および/またはアプタマーアレイは、固相上の識別可能に選ばれた位置に固定された各種PDZポリペプチド、抗体、および/もしくはアプタマーまたは同等の結合剤から構成されて提供される。アレイ中に固定されたPDZポリペプチド、抗体、および/またはアプタマーのそれぞれは、PLリガンドに対し確定した結合親和性および特異性を有しており、つまり、細菌タンパク質またはウイルスタンパク質のPLと確認済みの結合相互作用を含む。アレイの鑑別活性は、(i) 各種PDZポリペプチド、抗体、および/またはアプタマーの結合親和性；(ii) PLに関する各種PDZポリペプチド、抗体、および/またはアプタマーの結合特異性；ならびに(iii) アッセイ条件、例えばイオン強度、時間、pH等の寄与を受ける。PDZドメインは非常に特異的であり、たとえばMAST205のPDZドメインは、TDVおよびSDVを含むC末端PL配列を区別できる。同様に、同一PDZタンパク質内にある別のドメインはそれぞれ異なる結合特異性および親和性を有しており、即ちPSD-95ドメイン-1、-2および-3は異なる結合特異性および親和性を有している。出願者らは、先願の米国特許出願の中で、ヒトゲノムの全体の90%を超えるPDZドメインを含む255種類を超えるヒトPDZドメイン配列をクローニングし、発現し、開示した。PDZドメイン融合タンパク質と各種PLペプチドの相互作用のマッピングを基に、本ウイルスおよび/または細菌PLアレイの具体的なメンバーを選択する。予想外にも、アレイの選択は、以下の発見に基づいている：(i) 様々な細菌およびウイルス中の特徴的に異なるPLアミノ酸配列モチーフ；およびそれと合わせて(ii) 様々な細菌およびウイルスタンパク質中の様々なPL配列モチーフ、つまり、Env、Vif、Nef、NA、M1、核タンパク質、タンパク質X、S抗原、カプシドC、E1、VP4、VP7、NSP2、NSP5、ESXN、ESXS、ESAT-6等。
【０１５２】
試験試料中のHIVウイルスまたは他レトロウイルスの各種の株を、ウイルスタンパク質、例えばEnv、Nef、Vif等中のPLの構成的結合特性に基づいて区別するための例示的な手順および方法が提供され、ここで、HIVまたはレトロウイルスの各種の株および/またはサブタイプがアレイ上で異なる結合パターンを作り出す。方法は次の段階を含む：(a) 試験試料の一部を、前もってアレイ内に規定された様々な位置に接触させる段階；(b) アレイの特定位置の結合の有無を検出する段階；(c) アレイの結合パターンから、(i) 試験試料中にHIV PLが存在すること、および(ii) アレイのPL結合パターンがHIVウイルスの特定の株を区別するサインを構成していることを決定する段階。アレイに基づいて区別できるHIVウイルスの代表例としては、例えばHIV-1およびHIV-2が挙げられる。好ましくは、アレイは、PLタンパク質PLへの結合に少なくとも部分的に基づく。より好ましくは、PDZ、抗体および/またはアプタマーのアレイは、表1のPLタンパク質PLの少なくとも一つの存在を特異的に同定する。好ましくは、PDZタンパク質は、表1または2から選択されたPDZタンパク質の少なくとも一つ、断片、または類似体である。より好ましくは、アレイは、表1および2に列挙されている任意のPDZタンパク質を模倣する少なくとも一つの、PDZタンパク質、抗体、アプタマーを含む。好ましくは、PLタンパク質は、第4縦列に示すPLモチーフを有する第二縦列のものから選択され、PDZタンパク質は各ウイルスまたは細菌について、第6縦列に列挙したPDZタンパク質から選択される。アレイは、ウイルスまたは細菌の様々な株または種を特異的に同定できるか、またはより一般的な診断については、多様なウイルスおよび細菌に関するPLタンパク質を含むように配置できる。
【０１５３】
L. ラテラルフロー設計
家庭用妊娠試験と同様に、特異的生物材料で処理した試験ストリップに液体を作用させるラテラルフロー装置が有効である。対応する生物材料で標識されたリン光体が、液体試料によって運ばれてストリップの中を流れ、それらは、それらが特定領域に流入した時に捕捉され得る。ストリップに見出されるリン光体シグナルの量は、標的分析物の量に比例する。
【０１５４】
本明細書に開示されたウイルス、細菌、または関連微生物の一つを含むことが疑われる試料は、いくつかの手段によってラテラルフロー装置に加えられ、その試料を拡散によって移動させ、そしてラインまたは着色域がウイルスまたは細菌の存在を示す。ラテラルフローは、典型的には、下記3ヶ所の特異領域を含む固相支持体(例えばニトロセルロース膜)を含む：試料付加領域；固定された一つまたは複数のPDZタンパク質および抗体を含む捕捉領域；ならびに各領域が一つまたは複数の標識物を含んでいる一カ所または複数カ所の領域を含む読み出し領域。ラテラルフローはまた、陽性対照および陰性対照を含み得る。かくして、例えば、ある例示的な手順のラテラルフロー装置では、次のように作動する。つまり、生物試料の一部を試験ストリップの一端部に接触させ、次にタンパク質を、例えばラテラルフローのような毛細管作用によって試験ストリップの上を移動させることによって、生物試料中の他の細菌、ウイルス、および細胞性タンパク質からウイルスまたは細菌のPLタンパク質が分離される。一つまたは複数の、PDZポリペプチド作用物質、抗体、および/またはアプタマーといったPL結合剤が、捕捉試薬および/または検出試薬として加えられる。ラテラルフローでの分離、検出、および定量化のための方法および装置は、当技術分野、例えば全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,569,608号；第6,297,020号；および第6,403,383号において周知である。一つの非限定的な例では、試験ストリップは、試料を添加するための基部領域(試料添加領域)およびPDZポリペプチド捕捉剤および緩衝試薬ならびに移動中の生物試料中のPDZポリペプチドと任意のウイルスPLタンパク質または細菌PLタンパク質との間の結合相互作用を確立するのに適切な添加物を含む遠位試験領域を含む。別の例示的手順では、試験ストリップは、各種PDZドメインポリペプチドを含む、即ちそれぞれが各種ウイルスまたは細菌のPLタンパク質分析物と特異的に相互作用できるPDZドメインポリペプチドを含む二カ所の試験領域を備えている。ラテラルフローは、任意で例えば表1に示したような、各種多様なウイルスおよび細菌の試験を含むことができる。
【０１５５】
A. 病原体PLタンパク質の分離
一般的には、試料から未変性の病原体PLタンパク質を分離する(即ち単離する)段階を含む方法が提供される。この分離は、通常は、病原体PLタンパク質のための第一の結合パートナーを用いることで達成される。第一の結合パートナーは、PDZドメインポリペプチド、または抗病原体PLタンパク質抗体もしくは抗体の混合物でよい。
【０１５６】
いくつかの例示的手順では、結合パートナーの一つは、直接的にまたはリンカーを介して不溶性支持体に結合している。不溶性支持体は、当技術分野で公知であり、ビーズ(例えば磁性ビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ等)；膜等が挙げられるが、これらに限定されない。一つの非限定的な例では、PDZドメインポリペプチドは磁性ビーズに結合している。磁性ビーズに結合しているPDZドメインポリペプチドは、試料と接触し、試料中の抗体および任意の病原体PLタンパク質との間に複合体を形成させた後に磁場を加え、前記複合体を試料から取り除く。PDZドメインポリペプチドが膜などの不溶性支持体に結合する場合は、膜を取り除くか、または試料を別の容器に移すことによって、PDZドメインポリペプチドに結合した病原体PLタンパク質を試料から取り除く。PDZドメインポリペプチドがビーズに結合している場合は、遠心分離または濾過によって、ビーズに結合した病原体PLタンパク質を試料から取り除く。このような態様は、種々の病原体PL結合パートナー、例えば抗体を用いることが考えられる。
【０１５７】
一般的には、適切な分離手段は、分離を行うのに適したプラットホームと一緒に用いられる。例えば、病原体PLタンパク質を、PDZドメインポリペプチドへ結合させて分離する場合は、分離はアフィニティーカラムクロマトグラフィー、毛細管作用もしくはラテラルフロー試験ストリップ、免疫沈降等を含むがこれらに限定されない各種プラットホームのどれかを用いて実施される。
【０１５８】
ある例示的手順では、病原体PLタンパク質は、試料を試験ストリップの一端部に加えて、タンパク質を毛細管作用もしくはラテラルフローによって移動させることによって試料中の他のタンパク質から分離される。ラテラルフロー分離、検出、および定量化のための方法および装置は、当技術分野で公知である。例えば米国特許第5,569,608号；第6,297,020号；および第6,403,383号を参照されたい。これらの態様では、試験ストリップは、基端部から遠位端部に向かって、試料添加のための領域(試料添加領域)および病原体PLタンパク質結合パートナーを含む試験領域、例えばPDZドメインポリペプチドを含む領域、または別の態様では病原体PLタンパク質抗体を含む領域を含む。試料は、試料添加領域に添加され、試験ストリップの近位端部は緩衝液の中に置かれる。病原体PLタンパク質は、第一の試験領域内の結合抗体に捕捉される。別の例示的手順では、試験ストリップは、異なる病原体PL結合パートナー、例えばHIV-1、HIV-2、B型肝炎、C型肝炎、RSV、ロタウイルスA、結核菌を特異的に認識するPDZドメインポリペプチドを含む2カ所の試験領域を含む。捕捉したタンパク質の検出は、下記のように実施する。例えば、捕捉した病原体PLタンパク質の検出は、検出可能に標識された、病原体PLタンパク質のエピトープに特異的な抗体を用いて行われる。別の例示的手順では、抗病原体PLタンパク質抗体は試験領域に存在することができ、抗体に結合した病原体PLタンパク質の検出には標識されたPDZドメインポリペプチドを用いる。
【０１５９】
B. ウイルスPLタンパク質および細菌PLタンパク質の検出および定量化
ひとたび病原体PLタンパク質が試料中の他のタンパク質から分離されれば、該タンパク質を検出し、および/またはタンパク質のレベルもしくは量が決定される(例えば測定される)。上記で論じたように、病原体PLタンパク質は、一般的には結合パートナー、例えば病原体PLタンパク質に特異的な抗体、あるいはPDZドメインポリペプチドを用いて検出される。
【０１６０】
特異的抗体を用いた検出は、周知の方法を用いて実施される。一般的には、結合パートナーは、直接的にまたは間接的のいずれかで検出可能に標識されている。直接標識物としては、放射性同位元素(例えば、125I、35S等)；その産物が検出可能な酵素(例えば、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等)；蛍光標識物(例えば、フルオロセインイソチオシアナート、ローダミン、フィコエリスリン等)；蛍光放射物質、例えばEDTAなどの金属キレート基を用いて抗体に結合された152Euもしくは他のランタニド系物質；例えばルミノール、イソルミノール、アクリジニウム塩等の化学発光化合物；ルシフェリンのような生物発光化合物；蛍光タンパク質等が挙げられる。蛍光タンパク質としては、例えば天然のヌクレオチド配列のコドンを変えてヒトコドンバイアスにより近づけた「ヒト化」バージョンの緑色蛍光タンパク質(GFP)；アエクオリア ヴィクトリア由来のGFP、またはその誘導体、例えばClontech, Inc.から市販されているEnhanced GFPなどの「ヒト化」誘導体；例えばWO 99/49019およびPeelle et al. (2001) J. Protein Chem. 20:507-519に記載されているような、レニラ レニフォルミス、レニラ ムレリ、またはプチロサルカス ギュエルニーなどの別種由来のGFP;「ヒト化」組換えGFP (hrGFP) (Stratagene)；例えばMatz et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:969-973に記載されているような花虫綱の種由来の各種蛍光および有色タンパク質の全てを含むが、これらに限定されないGFPが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６１】
間接的標識物としては、上記のように標識されている、抗病原体PLタンパク質抗体に特異的な第二抗体；および特異的結合ペアのメンバー、例えばビオチン-アビジン等が挙げられる。
【０１６２】
いくつかの例示的手順では、病原体PLタンパク質のレベルが定量化される。定量化は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)；放射免疫アッセイ(RIA)等を含むが、これらに限定されない任意の公知の方法を用いて実施できる。一般的には、定量化は試料中に検出された発現産物のレベルを標準曲線と比較することによって達成される。
【０１６３】
いくつかの例示的手順では、病原体PLタンパク質は、上記のように試験ストリップ上で分離される。これらの例示的手順では、病原体PLタンパク質は、病原体PLタンパク質に結合する検出可能に標識された結合パートナーを用いて検出される。病原体PLタンパク質は、例えば反射分光光度計を用いて、または肉眼で定量化できる。
【０１６４】
病原体PLタンパク質は、それらのPDZドメインへの結合能力によって検出できる。これは、単一検出段階法、または感受性および特異性を上げるために第二段階もしくは「サンドイッチ」法として発展させることができる。
【０１６５】
一段階の手順については、表1A、1Bおよび2に開示したような病原体PLタンパク質を特異的に認識する「タグ付き」バージョンのPDZドメインを用いて、試料中の病原体PLタンパク質の存在を直接探索することができる。前記したように、この例は、試験試料を固相(例えば、宿主細胞または組織は、スライド上にコーティングさせて「固定」し、細胞膜を透過性にすることができる)に付着させ、試料をタグの付いた「PL検出体」タンパク質(PDZドメイン融合物)と適切な条件の下でインキュベートし、未結合のPL検出体を洗い流し、試料内の「タグ」の存在についてアッセイするものである。しかしながら、PDZドメインは内因性の細胞性タンパク質にも結合できることに注意しなければならない。それ故に、結合頻度を、病原体PLタンパク質を含まない対照細胞と比較しなければならないか、または「PL検出体」を改良して、それが任意の内因性の宿主細胞PLタンパク質に比べて病原体PLタンパク質に有意により特異的であるようにしなければならない。
【０１６６】
二段階またはサンドイッチ法では、PL検出体は、捕捉したタンパク質の捕捉または検出のいずれかの第二の方法と組み合わせて用いられる。第二の方法は、病原体PLタンパク質に結合する抗体、または病原体PLタンパク質上にあって病原体PL配列の利用可能性を下げない位置で病原体PLタンパク質に結合できる第二の化合物もしくはタンパク質を用いることができる。このようなタンパク質としては、病原体PLタンパク質に結合する抗体、他のウイルスもしくは細菌のタンパク質、または人工的に作られた(engineered)化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６７】
本発明の方法を用いて分析する生物試料は、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、アヒルおよびガチョウを含むが、これらに限定されない脊椎動物から得られる。特定の例示的手順では、生物試料は、例えばヒトまたはヒト以外の動物モデル、あるいはその培養細胞から得られる。多くの例示的手順では、生物試料は、生きている被験体、ヒト、または動物から得られる。
【０１６８】
いくつかの例示的手順では、試料を得た被験体は見かけ上は健康であり、分析は通常のスクリーニングの一環として実施される。別の例示的手順では、被験体はウイルス感染または細菌感染に罹りやすい被験体である(例えば、家族歴；特定の環境要因に暴露した等から判断されるような)。別の例示的手順では、被験体はウイルス感染または細菌感染の症状を有している(例えば、咳等)。他の態様では、被験体は、暫定的にウイルス感染または細菌感染に罹っている(または、例えば感染した動物に曝されたことがある等リスクのある)と診断されている(例えば、PCRに基づく別の試験によって決定されたような)。
【０１６９】
生物試料は、被験体のいかなる組織、器官、または細胞群に由来してもよい。いくつかの例示的手順では、被験体からは摩擦片、生検、または洗浄液が得られる。生物試料は、血液、尿、喀痰および口腔液のような体液；ならびに鼻洗浄液、スワブ、または吸引物、気管吸引物、下疳スワブおよび便試料のような試料を含むことができる。関心対象の個々の病原体の検出に適切な生物検体を収集する方法、例えば呼吸器疾患に関係するウイルスまたは細菌(例えばRSV、結核菌)の場合の鼻スワブ、洗浄液もしくは吸引物、または気管吸引物のような鼻咽喉検体；血液試料(例えばHIV、B型肝炎、C型肝炎の検出)、胃疾患に関係するウイルスまたは細菌(例えばロタウイルス、ヘリコバクター・ピロリ)検出のための便試料；HIV検出のための口腔スワブ、ならびに梅毒検出のための下疳スワブ、は公知である。
【０１７０】
いくつかの例示的手順では、当技術分野において標準である方法を用いて生物試料を処理し、例えば本発明のアッセイ方法を干渉することがある特定成分を除去する。いくつかの例示的手順では、例えば塩沈殿等によって生物試料を処理し、タンパク質を濃縮する。ある例示的手順では、試料を処理して宿主細胞を破壊して開放し、ウイルスタンパク質または細菌タンパク質を宿主細胞から放出させる(例えば溶解または超音波処理によって)。ある例示的手順では、試料は、細菌またはウイルスタンパク質の分解を阻害するためにプロテアーゼインヒビター存在下で処理される。
【０１７１】
いくつかの例示的なアッセイ法では、試料中のウイルスPLタンパク質または細菌PLタンパク質のレベルは定量化でき、および/または対照と比較できる。適切な対照試料は、健康であることが分かっている個体、例えば細菌またはウイルスに感染していないことが分かっている個体から得られる。対照試料は、試験対象となる被験体と遺伝的な関係にある個体から得ることができるが、遺伝的に無関係な個体からも得ることができる。適切な対照試料はまた、試験試料を採取した時点よりも早い時点で個体から採集された試料、例えばウイルス感染または細菌感染の可能性のある症状を示す前に個体より得た生物試料も含む。
【０１７２】
XI. 薬学的組成物
上記スクリーニング工程は、薬学的組成物に組み入れることができる一つまたは複数のタイプの化合物を同定できる。これらの化合物は、少なくとも一つのPLタンパク質、または少なくとも一つのPDZタンパク質のいずれかの転写、翻訳、または翻訳後プロセッシングのインヒビターである作用物質を含む。作用物質はまた、PLタンパク質およびPDZタンパク質、またはそれらの混合物の結合を阻害または遮断できる。これらの化合物はまた、一つもしくは複数のPLタンパク質、一つもしくは複数のPDZタンパク質、またはPLタンパク質とPDZタンパク質との間の相互作用いずれかのインヒビターであり、かつ固有の呼吸および/または消化または上皮細胞特異的活性または造影活性を有する作用物質も含む。化合物はまた、薬学的作用物質または造影成分が、PLタンパク質、PDZタンパク質、PLタンパク質とPDZタンパク質との間の相互作用のいずれかの阻害と関連している複合体も包含する。作用物質が望ましくない副作用を起こさないように非感染細胞内への作用物質の運搬を減らすことを目的として、薬理学的活性を持つ作用物質、および作用物質だけの場合に比べ、PDZタンパク質に対する基質能力を低下させた複合体成分を含む複合体もまた提供される。好ましくは、化合物または作用物質は、次のPLの少なくとも一つの、PDZタンパク質への結合を阻害または阻止する：HIV-1 EnvについてはRALL (SEQ ID NO:242)またはRILL (SEQ ID NO:243)、HIV-1 Nefタンパク質についてはFKNC (SEQ ID NO:244)、FKDC (SEQ ID NO:245)、YKNC (SEQ ID NO:246)またはYKDC (SEQ ID NO:247)、HIV2 Envタンパク質についてはIALL (SEQ ID NO:248)、LALL (SEQ ID NO:249)またはLTALL (SEQ ID NO:250)、HIV-2 Vifタンパク質についてはEILA (SEQ ID NO:251)、GILA (SEQ ID NO:252)またはDILA (SEQ ID NO:253)、B型肝炎タンパク質XについてはFTSA (SEQ ID NO:254)、B型肝炎S抗原についてはWVYI (SEQ ID NO:255)、C型肝炎カプシドCタンパク質についてはPASA (SEQ ID NO:256)またはPVSA (SEQ ID NO:257)、C型肝炎E1タンパク質についてはGVDA (SEQ ID NO:258)、RSV核タンパク質についてはDVEL (SEQ ID NO:259)、ロタウイルスA VP4タンパク質についてはQCKL (SEQ ID NO:260)またはQCRL (SEQ ID NO:261)、ロタウイルスA VP7タンパク質についてはYYRV (SEQ ID NO:262)またはYYRI (SEQ ID NO:263)、ロタウイルスA NSP2タンパク質についてはQVGI (SEQ ID NO:264)、HIGI (SEQ ID NO:265)、QIGI (SEQ ID NO:266)、またはRIGI (SEQ ID NO:267)、ロタウイルスA NSP5タンパク質についてはIKDL (SEQ ID NO:268)またはIEDL (SEQ ID NO:269)、結核菌ESXNタンパク質についてはSSWA (SEQ ID NO:269)、結核菌ESXSタンパク質についてはYTGF (SEQ ID NO:270)、結核菌ESAT-6タンパク質についてはGMFA (SEQ ID NO:271)。より好ましくは、PLタンパク質はRALL (SEQ ID NO:242)である。より好ましくはPLタンパク質は、HIV-1 EnvについてはRALL (SEQ ID NO:242)またはRILL (SEQ ID NO:243)、HIV-1 Nefタンパク質についてはFKNC (SEQ ID NO:244)、FKDC (SEQ ID NO:245)、YKNC (SEQ ID NO:246)、またはYKDC (SEQ ID NO:247)、HIV2 Envタンパク質についてはIALL (SEQ ID NO:248)、LALL (SEQ ID NO:249)またはLTALL (SEQ ID NO:250)、HIV-2 Vifタンパク質についてはEILA (SEQ ID NO:251)、GILA (SEQ ID NO:252)またはDILA (SEQ ID NO:253)である。好ましくは、化合物または作用物質は、表1または2のPDZタンパク質の少なくとも1つへの結合を阻害する。より好ましくは、阻害されるPDZタンパク質または相互作用は、表1に識別された、第4縦列の特定のウイルスPLまたは細菌PLと、同じボックス内の第6縦列に列挙されているPDZタンパク質から選択されるPDZタンパク質、または任意のPDZタンパク質を模倣した類似体もしくは断片および/もしくは抗体(もしくはアプタマー)との間のPDZ/PL相互作用の少なくとも一つである。
【０１７３】
一つまたは複数の上記実体は、動物またはヒトへの投与向けに調合される薬学的組成物に一般的に用いられるビヒクルとして定義されている、薬学的に許容される、無毒の担体または希釈剤と組み合わせることができる。希釈剤は、組み合わせの生物活性に影響しないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、緩衝水、生理学的食塩水、リン酸緩衝食塩水(PBS)、リンガー溶液、デキストロース溶液、およびハンクス液である。これに加えて、薬学的組成物または製剤には、他の担体、補助剤、または無毒で非治療的な非免疫原性安定化剤、賦形剤等も含んでもよい。組成物はまた、pH調節剤および緩衝化剤、毒性調節剤、湿潤剤、界面活性剤等の生理学的状態に近づけるための追加の物質を含むことができる(例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985); 薬物送達の方法の簡単な総説については Langer, Science 249:1527-1533 (1990)を参照されたい；これらの参照は各々、全体として参照により組み入れられる)。
【０１７４】
経口投与のための薬学的組成物は、例えば錠剤、ピル、粉末、ロゼンジ、サッシェ、カシェ剤、エリキシル剤、坐剤、乳剤、溶剤、またはシロップの形態でもよい。適切な賦形剤のいくつかの例としては、ラクトース、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジナート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、無菌水、シロップおよびメチルセルロースが挙げられる。メチル-およびプロピルヒドロキシ-ベンゾアートなどの保存剤；甘味剤；および芳香剤を含めることもできる。処方次第で、患者に投与された後の組成物の活性成分放出を迅速にし、持続させるか、または遅延させることができる。高分子材料は、経口持続放出送達に用いることができる("Medical Applications of Controlled Release," Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)；"Controlled Drug Bioavailability," Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)；Ranger and Peppas, 1983, J Macromol. Sci. Rev. Macromol Chem. 23:61; see also Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105を参照されたい)。持続放出は、複合体をカプセル内、または低速溶解高分子内に封入することによって達成できる。好ましい高分子としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびヒドロキシエチルセルロース(最も好ましいのは、ヒドロキシプロピルメチルセルロース)が挙げられる。他の好ましいセルロースエーテルも記載されている(Alderman, Int. J. Pharm. Tech. & Prod. Mfr., 1984, 5(3) 1-9)。当技術分野では、薬物放出に影響する要因が記載されている(Bamba et al., Int. J. Pharm., 1979, 2, 307)。吸入投与では、本明細書に開示した使用のための化合物は、適切な推進剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガスを用いた加圧パックまたは噴霧器から、あるいは推進剤を使用しないドライパウダー吸入器から、エアゾールスプレー調製物の形で都合良く送達される。加圧エアゾールの場合、投与単位は、一定量を送り出すバルブを提供することで決定できる。吸入器または注入器で使用するための、例えばゼラチンの、カプセルおよびカートリッジは、化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末ベースの粉末混合物を含んで製剤化され得る。
【０１７５】
薬学的組成物の有効投与量およびレジメン(投与の量および頻度)は、いくつかの確立されたプロトコールの任意の一つによって容易に決定される。例えば、通常は動物研究(例えばマウス、ラット)を用いて、体重1キログラム当たりの生物活性作用物質の最大耐性用量を決定する。一般的には、試験される動物種の少なくとも一つは哺乳動物である。動物研究の結果を外挿して、例えばヒトなどの他の種で使用する場合の用量を決定することができる。
【０１７６】
化合物は、予防および/または治療処置のために患者に投与され得る。治療量とは、何らかの形で、疾患状態または症状を軽減する、さもなければ疾患の進行または望ましくない他の症状を防止、阻止、遅滞、または逆行させるのに十分な量である。予防的応用では、化合物は、特定の疾患または感染に感受性であるか、またはさもなければリスクがある患者に投与される。したがって、「予防有効」量とは、疾患状態またはその症状を防止、阻止、または遅滞させるのに十分な量である。いずれの場合も、組成物に含まれる化合物の正確な量は、患者の健康状態および体重に依存する。
【０１７７】
薬学的組成物の適切量は、例えば、体重1キログラム当たりの生物活性作用物質の最大耐性用量の決定に普通に用いられる動物研究(例えばマウス、ラット)を用いて決定される。一般的には、試験される動物種の少なくとも一つは、哺乳動物である。動物研究の結果を外挿して、例えばヒトのような他の種に使用する場合の用量を決定することができる。
【０１７８】
薬学的組成物の成分は、好ましくは、非常に純粋であり、潜在的に有害な汚染物(少なくともNational Food (NF)等級、一般的には少なくとも分析等級、およびより典型的には少なくとも薬学等級)を実質的に含まない。
【０１７９】
得られた生成物が、典型的には、合成または精製工程中に存在する可能性のあるいかなる潜在的な有毒作用物質も、特にいかなるエンドトキシンも実質的に含まない程度まで、所与の化合物は使用する前に合成されなければならない。組成物は、通常は、GMP条件の下で作られる。経口投与のための組成物は、通常は無菌であり、実質的に等張である。
【０１８０】
A. 抗ウイルス作用物質および抗細菌作用物質
本発明での使用に適切な薬学的組成物は、活性作用物質が有効量で含まれている組成物を含む。抗ウイルス作用物質および抗細菌作用物質としては、好ましくはPLタンパク質またはPDZ mRNAまたはタンパク質レベルの少なくとも30、50、75、95、もしくは99%を阻害する、PLタンパク質、PDZ、および/またはPLタンパク質/PDZ相互作用のインヒビターを含む。タンパク質発現は、タンパク質に特異的に結合する抗体を用いて免疫学的分析を行い(forming)、続いて抗体とタンパク質との間に形成された複合体を検出することによって定量化できる。mRNAレベルは、例えばドットブロット分析、インサイチューハイブリダイゼーション、RT-PCR、定量的逆転写PCR(即ち、いわゆる「TaqMan」法)、ノーザンブロット、および核酸プローブアレイ法によって定量化できる。好ましくは、インヒビターの同定に用いるPLタンパク質PLは次のものの一つである：HIV-1 EnvについてはRALL (SEQ ID NO:242)またはRILL (SEQ ID NO:243)、HIV-1 Nefタンパク質についてはFKNC (SEQ ID NO:244)、FKDC (SEQ ID NO:245)、YKNC (SEQ ID NO:246)またはYKDC (SEQ ID NO:247)、HIV2 Envタンパク質についてはIALL (SEQ ID NO:248)、LALL (SEQ ID NO:249)またはLTALL (SEQ ID NO:250)、HIV-2 Vifタンパク質についてはEILA (SEQ ID NO:251)、GILA (SEQ ID NO:252)またはDILA (SEQ ID NO:253)、B型肝炎タンパク質XについてはFTSA (SEQ ID NO:254)、B型肝炎S抗原についてはWVYI (SEQ ID NO:255)、C型肝炎カプシドCタンパク質についてはPASA (SEQ ID NO:256)またはPVSA (SEQ ID NO:257)、C型肝炎E1タンパク質についてはGVDA (SEQ ID NO:258)、RSV核タンパク質についてはDVEL (SEQ ID NO:259)、ロタウイルスA VP4タンパク質についてはQCKL (SEQ ID NO:260)またはQCRL (SEQ ID NO:261)、ロタウイルスA VP7タンパク質についてはYYRV (SEQ ID NO:262)またはYYRI (SEQ ID NO:263)、ロタウイルスA NSP2タンパク質についてはQVGI (SEQ ID NO:264)、HIGI (SEQ ID NO:265)、QIGI (SEQ ID NO:266)またはRIGI (SEQ ID NO:267)、ロタウイルスA NSP5タンパク質についてはIKDL (SEQ ID NO:268)またはIEDL (SEQ ID NO:269)、結核菌ESXNタンパク質についてはSSWA (SEQ ID NO:269)、結核菌ESXSタンパク質についてはYTGF (SEQ ID NO:270)、結核菌ESAT-6タンパク質についてはGMFA (SEQ ID NO:271)。より好ましくは、PLタンパク質PLはRALL (SEQ ID NO:2)である。より好ましくは、PLタンパク質は、HIV-1 EnvについてはRALL (SEQ ID NO:242)またはRILL (SEQ ID NO:243)、HIV-1 Nefタンパク質についてはFKNC (SEQ ID NO:244)、FKDC (SEQ ID NO:245)、YKNC (SEQ ID NO:246)またはYKDC (SEQ ID NO:247)、HIV2 Envタンパク質についてはIALL (SEQ ID NO:248)、LALL (SEQ ID NO:249)またはLTALL (SEQ ID NO:250)、HIV-2 Vifタンパク質についてはEILA (SEQ ID NO:251)、GILA (SEQ ID NO:252)またはDILA (SEQ ID NO:253)である。好ましくは、インヒビターの同定に用いるPDZタンパク質は、表1または2から選択されるPDZタンパク質、断片、または類似体の少なくとも一つである。より好ましくは、インヒビターの同定に用いられるPDZタンパク質は、表1の第6縦列中のPDZタンパク質の一つであり、それは各ウイルスまたは各細菌の第2縦列のウイルスタンパク質に関し、第4縦列のPLモチーフの一つとペアになる。PL/PDZのHIV-2のEnvタンパク質への結合を阻害する作用物質の同定には、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて用いることができる。HIV-2のVifタンパク質に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の第4縦列のPLモチーフについて用いることが��きる。B型肝炎のタンパク質Xに関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1のPLモチーフについて用いることができる。B型肝炎のS抗原に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の一つまたは両方のPLモチーフについて用いることができる。C型肝炎のカプシドCに関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて用いることができる。C型肝炎のE1タンパク質に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて用いることができる。RSVの核タンパク質に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の第4縦列のPLモチーフについて用いることができる。ロタウイルスAのVP4に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて用いることができる。ロタウイルスAのVP7に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて用いることができる。ロタウイルスAのNSP2に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて用いることができる。ロタウイルスAのNSP5に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定では、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて用いることができる。結核菌のESXNタンパク質に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定では、表1の第4縦列のPLモチーフについて第6縦列の任意のPDZタンパク質を用いることができる。結核菌のESXSタンパク質に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の第4縦列のPLモチーフについて用いることができる。結核菌のESAT-6タンパク質に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の第4縦列のPLモチーフについて用いることができる。他のフラビウイルスに関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、C型肝炎(カプシドCおよびE1)で同定されたPLタンパク質に相当するPLタンパク質を、PDZタンパク質、特に表1の第6縦列で同定されたそれらへの結合に関して使用および試験することができる。他のレンチウイルスに関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、HIV-1およびHIV-2(Env、NefおよびVif)で同定されたPLタンパク質に相当するPLタンパク質を、PDZタンパク質、特に表1の第6縦列で同定されたそれらへの結合に関して使用および試験することができる。他のマイコバクテリア種に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、結核菌(ESAT-6ファミリーおよび関連タンパク質)について同定されたPLタンパク質に相当するPLタンパク質を、PDZタンパク質、特に表1の第6縦列で同定されたそれらへの結合に関して使用および試験することができる。
【０１８１】
抗ウイルス作用物質は、ウイルスPLタンパク質または細菌PLタンパク質と相互作用するPDZタンパク質に結合するものとして同定されたPLペプチド治療剤を含み得る。C末端のPLを残す、その保存的置換物または切断物であるペプチドは、ウイルス性疾患または細菌性疾患の処置に適切である。例えば、PLペプチドのC末端配列(3〜20アミノ酸長、またはより好ましくは5〜10アミノ酸長)は、ペプチド配列のN末端にトランスポーターペプチド(タンパク質誘導ドメイン)を取り付けることによって治療剤に変換され得る。C末端の3アミノ酸が保存されている少なくとも5アミノ酸長、好ましくは少なくとも6アミノ酸長、7アミノ酸長、8アミノ酸長、9アミノ酸長および10アミノ酸長のこれらペプチドの細断片は、ウイルスPL/PDZ相互作用の治療インヒビターとして用いられる。好ましくは少なくともC末端の4個のアミノ酸が保存され、より好ましくはC末端の5個のアミノ酸、C末端の6個のアミノ酸、またはC末端の7個のアミノ酸が保存される。ペプチド治療剤はまた、ペプチド模倣物中にアミノ酸の保存的置換を含有するペプチドも含む。しかしながら、保存的置換は、最後の3または4アミノ酸以外の領域であることが好ましい。Tatおよびアンテナペディアを含むいくつかのトランスポーターペプチド配列を用いることができる。同様に、低分子およびCOX2インヒビターは、ウイルスまたは細菌のPLタンパク質とPDZとの相互作用を阻害するものとして同定され、かつ抗ウイルス治療剤として用いることができる。次にPLペプチド治療インヒビターは、インビトロおよびインビボで阻害作用について試験される。
【０１８２】
B. 抗ウイルス作用物質および抗細菌作用物質のスクリーニング法
本明細書ではPLタンパク質および/またはPDZタンパク質に結合する作用物質のスクリーニング法を開示する。作用物質は、PLタンパク質PLまたはPDZタンパク質のPDZドメインへの結合について最初にスクリーニングされる。次にそれらは、PDZ/PL相互作用を阻害する能力について試験される。これらの方法はまた、下記「B. 抗ウイルス作用物質および抗細菌作用物質のアッセイ」でも提供されている。結合アッセイは、天然または合成のPLタンパク質を用いてインビトロで実施できる。あるいは、天然または合成のPDZドメイン含有タンパク質を用いて、特定のPDZタンパク質に結合できる作用物質を同定できる。
【０１８３】
本明細書に開示した抗ウイルス作用物質および抗細菌作用物質のスクリーニング法は、ウイルスPLと、それと相互作用する任意のPDZタンパク質との間の相互作用を遮断または阻害する作用物質を同定する。インヒビターおよびそれらをコードするDNAが、PLタンパク質および/またはPDZの発現を阻害し、それによりそれらの相互作用を間接的に阻害する能力についてもスクリーニングできる。初期スクリーニングを行って、PDZ/PL相互作用を阻害または停止できる作用物質のサブセットを選択できる。このようなアッセイは、単離されたPDZタンパク質およびPLタンパク質、または互いを結合させることができるそれらの断片を用いてインビトロで実施できる。次にこのようなスクリーニングにより同定された作用物質は、機能的にアッセイすることができる。作用物質はまた、PLタンパク質を発現している細胞で、かつPDZタンパク質を本来発現しているかまたはPDZタンパク質を発現するように形質転換された細胞のいずれかでもスクリーニングされ得る。
【０１８４】
上記で開示および例示した診断アッセイに加えて、細菌またはウイルスが感染した細胞の中での、細菌またはウイルスのPLと宿主細胞のPDZポリペプチドとの間で起こる一つまたは複数の結合相互作用を調節できる抗ウイルス作用物質候補または抗細菌作用物質候補を同定するアッセイが提供される。本方法は、対照PLの、例えば合成PLペプチドのPDZドメインポリペプチドへの、例えば組換えPDZ融合タンパク質への結合を、抗ウイルス試験作用物質または抗細菌試験作用物質の存在下に試験することを含む。抗ウイルス作用物質候補または抗細菌作用物質候補は、対照PLとPDZドメインポリペプチドとの間の結合を調節する。出願者らは、対照PLとPDZドメインポリペプチドとの間の結合相互作用を測定するためのアッセイをこれまでに米国および国際特許出願、例えば全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,569,608号；第6,297,020号；および第6,403,383号に開示している。
【０１８５】
特に有用なスクリーニングアッセイは、一つまたは複数のウイルスまたは細菌のPLタンパク質PL、および一つまたは複数のPDZドメインタンパク質の両方を発現する細胞を用いる。このような細胞は、タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを使った細胞のコトランスフェクションによって組換え体として作製することが出来るか、または元々タンパク質の一つを含んでいる細胞に第二のタンパク質をトランスフェクションすることで作製することができる。細胞はマルチウェル型培養皿の中で増殖させることができ、実験的に決定できる、事前に決定された時間で、様々な濃度の、試験化合物に曝される。全細胞溶解物、培地、または細胞膜を、PL/PDZ相互作用の阻害についてアッセイする。対照(下記に論ずる)に比べて活性を有意に阻害する試験化合物は、治療剤候補と考えられる。作用物質は、作用物質が目的とするウイルスまたは細菌を感染させた動物モデルに於けるウイルス負荷または細菌負荷を軽減する能力についても試験され得る。未処置の対照動物に比べた負荷の低下は、作用物質が抗菌活性または抗ウルイス活性を有していることを示す。
【０１８６】
単離されたPDZドメインタンパク質またはそのPL結合断片は、治療化合物をスクリーニングするために、様々な薬物スクリーニング技術のいずれにも用いることができる。あるいは、単離されたPLタンパク質PLタンパク質またはPLモチーフを含む断片を用いることもできる。このような試験に用いるタンパク質は、膜に結合し、溶液中に遊離し、個体支持体に固定され、細胞表面に担持されるか、または細胞内に局在し得る。PDZドメインまたはPLタンパク質PLと試験対象となる作用物質との間の結合複合体の形成は、測定され得る。より具体的には、相互作用が、試験化合物非存在下に測定された相互作用に比べて有意に低ければ、試験化合物はPDZ/PL相互作用のインヒビターと見なせる。この場合、用語「有意に低い」とは、試験化合物存在下では、PDZ/PL相互作用が、試験化合物非存在下で測定した場合に比べて、アッセイ法の信頼限界の範囲内で測定可能な程度に低いことを意味する。
【０１８７】
ペプチドまたは他の化合物のランダムライブラリーもまた、PDZ/PL結合のインヒビターとしての適合性について、またはPDZドメインタンパク質またはPLタンパク質PLタンパク質のいずれかへの単純結合についてスクリーニングされ得る。コンビナトリアルライブラリーは、段階的様式で合成できる多くのタイプの化合物について生成することが出来る。このような化合物としては、ポリペプチド、βターン模倣物、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーN置換グリシンおよびオリゴカルバマートが挙げられる。化合物の大規模なコンビナトリアルライブラリーは、Affymax、WO 95/12608、Affymax、WO 93/06121、Columbia University、WO 94/08051、Pharmacopeia、WO 95/35503およびScripps、WO 95/30642(これらの各々は、参照により全ての目的について組み入れられる)に記載されているコード化(encoded)合成ライブラリー(ESL)法により構築できる。
【０１８８】
治療剤または治療リード化合物のスクリーニングに使用するための試験化合物の好ましい供給源は、ファージディスプレイライブラリーである。例えば、Devlin、WO 91/18980；Key, B.K., et al., eds., Phage Display of Peptides and Proteins, A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego,CA, 1996を参照されたい。ファージディスプレイは、ファージ遺伝学を用いて、108〜109種類の配列を含むライブラリーから、所望する特性のペプチドまたはタンパク質を選択および増幅できるようにする強力な技術である。ライブラリーは、所望位置にあるアミノ酸配列を選択的に多様化し、ライブラリーを所望特性に偏向させるように設計することができる。ライブラリーは、ペプチドがバクテリオファージ表面上に提示されるタンパク質に融合して発現するように設計される。所望特性を持つペプチドを提示するファージを選択し、再増殖して拡張する。ペプチドはファージを継代することで増幅されるので、選択されたファージからのDNAの配列は容易に決定され、選択されたペプチドの迅速分析を容易にできる。
【０１８９】
ペプチドインヒビターをコードするファージは、PDZドメインタンパク質および/またはウイルスもしくは細菌のPLタンパク質PLに特異的に結合するファージを選択することによって選択できる。ライブラリーは、ファージの表面に発現する遺伝子IIなどのタンパク質と融合して生成される。ライブラリーは、様々な長さを持つ、直線状または2個のCysアミノ酸を含むことによって束縛された、ファージタンパク質と融合するか、または足場のような追加のタンパク質にも融合するペプチドから構成することができる。ライブラリーは、本明細書に開示したPL領域に偏向させるか、または最初のライブラリーからの結合ファージ選択から得たペプチド配列に偏向させて、追加の試験インヒビター化合物が得られるように設計することもできる。
【０１９０】
上記の例示の検出アッセイに加えて、本発明はまた、病原体PLと宿主細胞PDZポリペプチドとの間の結合を阻害する抗ウイルス作用物質および抗細菌作用物質を同定するための様々なアッセイも提供する。一般的には、方法は、試験作用物質存在下で、PDZドメインを有するポリペプチドへのPDZリガンドポリペプチドの結合を試験することを含む。PDZリガンドポリペプチドとPDZドメインを有するポリペプチドとの間の結合を調節する試験作用物質は、該二種類のタンパク質との間の結合を調節する(即ち、増加または低下させる、廃止も含む)。下記に記載するように、該二つのペプチド間の結合は、様々な手段で査定できる。これもまた以下でさらに詳細に記載するように、アッセイは、単離されたポリペプチドを使って無細胞環境(即ち「インビトロ」)で実施され得る。アッセイは、試験作用物質存在下で細胞内のポリペプチドの結合を評価する細胞アッセイであり得る。このように様々なアッセイプラットフォームが利用できる。
【０１９１】
ポリペプチドの結合を、当技術分野で周知である方法を用いてアッセイすることができる。例えば、結合は生化学的にアッセイすることができ、または、別の例示的手順では、二つのタンパク質は、タンパク質が結合し一緒になった場合にのみ発生するシグナルを検出することによってアッセイできる。候補作用物質の試験では、このようなシグナルは、二つのタンパク質間の結合を査定するために評価され得る。例えば、本アッセイで使用される場合、ポリペプチドは、アッセイ可能な蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)システム、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)システム、または比色分析シグナル生成システムを形成することができる。
【０１９２】
アッセイは、それがインビトロまたは細胞内環境で行われるかを問わず、一般的には、(a) PDZリガンドを含むポリペプチド、および（b) PDZドメインを含むポリペプチドを必要とする。ポリペプチドの少なくとも一つは、ポリペプチド間の結合の検出を容易にする融合タンパク質であり得る。したがって、ポリペプチドの一つは、例えば親和性タグドメインまたは光学的に検出できるレポータードメインを含むことができる。
【０１９３】
適切な親和性タグとしては、別の成分に、通常は別のポリペプチドに、最も一般的には抗体に特異的に結合できる任意のアミノ酸配列を含む。適切な親和性タグとしては、例えばV5タグ、FLAGタグ、HAタグ(ヘマグルチニンインフルエンザウイルス由来)、mycタグ等のエピトープタグが挙げられる。適切な親和性タグはまた、その結合基質が公知であるドメインも含み、例えばHIS、GST、およびMBPタグであり、特異的結合パートナーが他のタンパク質、例えば抗体、特にモノクローナル抗体に由来するドメインも利用できる。適切な親和性タグは、IgG Fc領域などの任意のタンパク質-タンパク質相互作用ドメインも含み、それらは適切な結合パートナー、例えばIgG Fcレセプターを用いて特異的に結合および検出することができる。
【０１９４】
適切なレポータードメインは、例えば光を放射するか、または発色することによってポリペプチドの存在を光学的に知らせることができる任意のドメインを含む。適切な光放射レポータードメインとしては、ルシフェラーゼ(例えば、ホタル、バルグラ(Vargula)、レニラ レニフォルミス、もしくはレニラ ムエレリ(Renilla muelleri)由来のもの)、またはその光放射変異体が挙げられる。他の適切レポータードメインとしては、蛍光タンパク質(例えばアエクオリア(Aequoria)、レニラ(Renilla)、プチロサルカス(Ptilosarcus)、スチルアツラ(Stylatula)種に由来する蛍光タンパク質といったクラゲ、サンゴおよび他腔腸動物由来のもの)またはその光放射変異体が挙げられる。これらレポータータンパク質の光放射変異体は、天然のレポータータンパク質に比べ、明るく、調光でき、または異なる励起および/または発光スペクトルを有することがある。例えば、いくつかの変異体は、もはや緑色には見えず、青、シアン、黄色、強い黄赤色(それぞれBFP、CFP、YFP eYFPおよびRFPと呼ばれる)に見えるか、または当技術分野で周知なような他の発光スペクトルを持つように変えられる。別の適切なレポータードメインとしては、生化学的変化または色変化を通してポリペプチドの存在を知らせることができるドメイン、例えばβ-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、および分泌された胚アルカリホスファターゼが挙げられる。レポータードメインは、レニラ ルシフェラーゼ(例えば、pRLCMV；Promega、カタログ番号E2661)であり得る。
【０１９５】
親和性タグまたはレポータードメインは、関心対象ポリペプチド中の任意の場所に存在し得る。しかしながら、ある場合には、それらはポリペプチドのC末端またはN末端に存在する。
【０１９６】
特定の例示的手順では、ポリペプチドの一つまたは両方がタグまたはレポーターを含み得る。例えばFRETまたはBRET法を用いる場合、両方のポリペプチドに、異なる自己蛍光ポリペプチドを用いてタグを付けることができる。
【０１９７】
PDZドメイン含有ポリペプチドは、病原体PLを結合するものとして、少なくともポリペプチドのPDZドメインを含んでいる。PDZドメインは、「野性型」PDZ含有ポリペプチドのPDZドメイン、または関心対象PDZリガンドとの結合能力を保持しているその変異体を含むことができる。野性型PDZドメインのPDZドメインの配列を、表2に示す。本発明では、どのような長さのPDZドメインも用いることができる。
【０１９８】
病原体PDZリガンド含有ポリペプチドは、少なくともPDZリガンド、病原体タンパク質、例えばPLタンパク質を含む。PDZリガンドは、「野性型」ポリペプチドのPDZリガンド、または使用するPDZドメインに結合する能力を保持しているその変異体を含むことができる。本発明では、どのような長さのPDZドメインも用いることができる。
【０１９９】
このようなポリペプチドは、当技術分野で公知であるように、合成(即ち、機械を使用して)または組換え手法を用いて作ることができる。組換えタンパク質発現の方法および条件は、例えばSambrook、前記、およびAusubel、前記に記載されている。典型的には、本発明で使用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターを用いて発現される。発現ベクターは、典型的には転写および/または翻訳制御シグナル(例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、およびATG開始コドン)を含む。これに加えて、使用する細胞系に適切なエンハンサーを加えることによって、発現効率を高めることができる。例えば、SV40エンハンサーまたはCMVエンハンサーは、哺乳動物宿主細胞での発現を高めるのに用いることができる。典型的には、本発明のポリペプチドをコードするDNAは、インビトロで、細菌(例えば大腸菌(E. coli)、枯草菌(Bacillus subtilus))、酵母(例えばサッカロマイセス（Saccharomyces))、昆虫(例えば、スポドプテラ フルギペルダ（Spodoptera frugiperda))、または哺乳動物細胞培養系などの宿主細胞に導入でき、かつ発現が可能なDNAコンストラクトに挿入される。哺乳動物細胞系は、多くの応用にとって好ましい。本発明のポリペプチドの発現および製造に有用な哺乳動物細胞培養系としては、ヒト胚腎臓細胞株(293；Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36:59)；CHO (ATCC CCL 61およびCRL 9618)；ヒト子宮頚癌細胞(HeLa、ATCC CCL 2)；および当技術分野で公知な他の系)が挙げられる。ポリペプチド発現への哺乳動物細胞培養系の使用は、Winnacker、FROM GENES TO CLONES(VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987)およびAusubel、前記で一般的に論じられている。いくつかの例示的手順では、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが、例えば哺乳動物細胞株での発現に用いられる。適切なプロモーターは、構成的で、細胞タイプ特異的、ステージ特異的、および/または調節可能もしくは制御可能(例えば、グルココルチコイドなどのホルモンによって)なものであり得る。有用なプロモーターとしては、当技術分野で公知の、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導MMTVプロモーター、SV40プロモーター、およびプロモーター -エンハンサーの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２００】
上記のように、本アッセイを、インビトロ(即ち、ここで、ポリペプチドは細胞ではなく溶液中に存在する)、または細胞環境(ここで、ポリペプチドが細胞内に存在する)で実施することができる。
【０２０１】
インビトロアッセイ
インビトロアッセイを、さまざまな方法を用いて行うことができる。ある方法は、第一のポリペプチド(PDZドメインポリペプチドかPDZリガンドポリペプチドのどちらか)を共有結合または非共有結合のいずれかで基質に連結させること、基質に結合したポリペプチドを第二のポリペプチドと接触させること、および第二のポリペプチドの存在を検出することを含む。方法は、試験作用物質存在下で実施され得る。第二のポリペプチドが検出可能に標識されている場合(例えば光学的に検出可能な融合タンパク質)、第二のポリペプチドの存在は、標識物を検出することによって検出される。
【０２０２】
基質は、固体、半固体、または不溶性支持体を含み、それはポリペプチドへの連結に適し、かつ使用する検出方法を干渉しない任意の材料から作られている。当業者が理解するように、可能性のある親和性基質の多くは非常に大きい。可能性のある基質としては、ガラスおよび修飾されたもしくは官能性をもたせたガラス、プラスチック(アクリル、ポリスチレン、およびスチレンと他材料のコポリマー、プロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン等を含む)、多糖類、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、シリカまたはシリコンおよび変性シリコンを含むシリカを基本とする材料、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、セラミック、ならびに各種の他ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。一つの例示的な手順では、基質は光学的検出を可能にするが、それ自体には蛍光がなく、または光を発しない。これに加えて、当技術分野で公知であるように、基質は、デキストラン、アクリルアミド、ゼラチン、アガロースなどの高分子、ウシおよび他の哺乳動物の血清アルブミンを含むタンパク質などの生物適合基材を含む様々な材料でコーティングされ得る。
【０２０３】
ある例示的手順では、基質は、基質へのポリペプチドの特異的結合(直接的または間接的のいずれか)を容易にする作用物質でコーティングされる。例えば、基質はストレプトアビジンでコーティングされ、関心対象ポリペプチドに対する親和性を持つビオチン化ポリペプチドを結合することができる。別の例では、基質はポリペプチドに特異的な抗体で直接的または間接的にコーティングされる(例えば、プロテインAを介して)。
【０２０４】
上記のように、第一のポリペプチドを基質に連結した後、第二のポリペプチドを基質に接触させ、第一のポリペプチドへの第二のポリペプチドの特異的結合に適切な条件の下で、典型的には試験作用物質が存在する状態で、第二のポリペプチドは維持される。第二のポリペプチドは、第一および第二のポリペプチドが複合体を形成した場合にだけ基質上で検出可能である。第二のポリペプチドの検出は、第一および第二のポリペプチドが複合体を形成することを示す。親和性基質に結合した第二のポリペプチドの検出は、直接的(第二のポリペプチドが基質に結合している間)または間接的(例えば、基質からポリペプチドを溶出した後で)に行われる。
【０２０５】
第二のポリペプチドがレポータードメインを含む場合は、第二のポリペプチドを、レポーター活性を検出することによって検出できる。レポーター活性を決定する方法、例えばルシフェラーゼおよびGFP活性は、例えばRamsay et al., Br. J. Pharmacology, 2001, 133:315-323に記載されている。第二のポリペプチドの検出はまた、抗体、例えば標識抗体を用いて達成され得る。抗体を用いたポリペプチドを検出する方法は、例えば、Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995；およびHarlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, First Edition 1988 Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されている)。
【０２０６】
試験作用物質が、前記ポリペプチド間の結合を調節するかを決定するために、上記アッセイを試験作用物質の存在下または非存在下で実施してもよい。
【０２０７】
PDZドメインポリペプチドと候補PDZリガンドとの間の結合を検出するために、「A」および「G」と呼ばれる、二つの相補的なアッセイが開発された。前記二種類のアッセイそれぞれにおいて、結合は、一つまたは複数のPDZドメインに結合することが予想されるタンパク質のC末端に相当する配列を有するペプチド(即ち候補PLペプチド)と、PDZドメインポリペプチド(典型的にはPDZドメインを含む融合タンパク質)との間に検出される。「A」アッセイでは、候補PLペプチドは固定されており、この固定化されたポリペプチドへの可溶性PDZドメインポリペプチドの結合が検出される(「A」アッセイは、典型的には、アビジン表面を用いてペプチドが固定化されることからそう名付けられた)。「G」アッセイでは、PDZドメインポリペプチドが固定化され、可溶性PLペプチドの結合が検出される(「G」アッセイは、典型的には、GST結合表面を用いてPDZドメインポリペプチドが固定化されることからそう名付けられた)。
【０２０８】
AアッセイおよびGアッセイの詳細は、2003年7月29日に出願され、US20040018487として公開された米国特許出願第10/630,590号および下記の説明に記載される。
【０２０９】
細胞アッセイ
細胞アッセイは、一般的には、組換えDNAを用いた、本ポリペプチドの同時産生(即ち、それらが産生される時間に関係なく、同一細胞で産生すること)を含む。本ポリペプチドの産生に適切な細胞としては、原核細胞、例えば細菌細胞、ならびに真核細胞、例えば動物細胞(例えば、昆虫、哺乳動物、魚類、両生類、鳥類、または爬虫類細胞)、植物細胞(例えば、トウモロコシまたはアラビドプシス属(Arabidopsis)細胞)、あるいは真菌細胞(例えば、S.セレビシエ(S. cerevisiae)細胞)が挙げられる。本ポリペプチドをコードする核酸の発現に適切な任意の細胞を宿主細胞として用いることができる。通常は、動物宿主細胞株を用いるが、その例は次の通りである：サル腎臓細胞(COS細胞)、SV40で形質転換したサル腎臓CVI細胞(COS-7、ATCC CRL 165 1)；ヒト胚腎臓細胞(HEK-293、Graham et al. J. Gen Virol. 36:59 (1977))；HEK-293T cells；新生児ハムスター腎臓細胞(BHK、ATCC CCL 10)；チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4216, (1980)；マウスセルトリ細胞(TM4、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980))；サル腎臓細胞(CVI ATCC CCL 70)；アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76、ATCC CRL-1587)；ヒト子宮頚癌細胞(HELA, ATCC CCL 2)；イヌ腎臓細胞(MDCK, ATCC CCL 34)；バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442)；ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75)；ヒト肝臓細胞(hep G2、HB 8065)；マウス乳腺腫瘍(MMT 060562、ATCC CCL 51)；TRI細胞(Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci 383:44-68 (1982))；NIH/3T3細胞(ATCC CRL-1658)；およびマウスL細胞(ATCC CCL-1)。多種多様な細胞株がAmerican Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209より入手できる。
【０２１０】
この場合も、多種多様なプラットホームを用いて、細胞中で本ポリペプチド間の結合を検出できる。例えば、いわゆる「ツーハイブリッド」法を用いることができる、多種多様な蛍光を基本とする方法、例えばFRETもしくはBRETを基本とする方法を用いることができる。一般的には、本ポリペプチドを生成する細胞を試験作用物質と接触させること、および試験作用物質が本ポリペプチド間の結合に何らかの作用を有するか決定することを含む。
【０２１１】
GAL4システムを用いて、本ポリペプチド間の結合を調節する作用物質をスクリーニングに用いることができる。このような方法は、二種類のポリペプチド：PDZドメインまたはPDZリガンドのいずれかを含むDNA結合ドメインポリペプチド、およびDNA結合ドメインポリペプチドに存在しない領域を含むDNA活性化ドメインポリペプチドをコードするベクター(またはベクター系)を用いることができる。PDZドメインとPDZリガンドとの間の相互作用は、レポーター遺伝子または選択可能マーカーの発現を活性化する。α-またはβ-ガラクトシダーゼ、β-ラクタマーゼのレベルは、それらの酵素活性を、オルトメチルフェニルチオガラクトシド(OMTP)またはX-galなどの呈色基質を用いて定量化することによって測定され、光のレベル、例えば蛍光は分光光学的、例えば蛍光計により査定できる。作用物質のプールまたは個別の作用物質はウェル内の培地に加えられ、作用物質による相互作用の阻害または促進のレベルは、レポーター遺伝子活性のレベルから決定される。
【０２１２】
あるいは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を用いて、細胞内での二つのポリペプチド間の結合を検出することができる。互いに非常に接近させた、適切な発光および励起スペクトルを有する蛍光分子は、FRETを示すことができる。蛍光分子は、一方の分子(ドナー分子)の発光スペクトルがもう一方の分子の励起スペクトル(アクセプター分子)と重なるように選ばれる。ドナー分子は、ドナー励起スペクトル内にある適切な強度の光で励起される。するとドナーは吸収したエネルギーを蛍光として放射する。ドナーが産生する蛍光エネルギーは、アクセプター分子によって消滅される。FRETは、ドナーからの蛍光シグナルの強度低下、その励起状態の寿命の短縮、および/またはアクセプターに特徴的なより長い波長(より低いエネルギー)での蛍光の再放射として現れ得る。蛍光タンパク質が物理的に分離すると、FRET効果は消滅または排除される(その開示が全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,981,200号を参照されたい)。
【０２１３】
例えば、シアン蛍光タンパク質は、おおよそ425〜450nmの波長の光で励起され、450〜500nmの範囲の光を放射する。黄色蛍光タンパク質は、おおよそ500〜525nmの光で励起されて、525〜500nmの光を放射する。これら二つのタンパク質が一つの細胞内に、近接せずに存在している場合は、シアンおよび黄色の蛍光が別々に見られる。しかしながら、これら二つのタンパク質が互いに近接させられると、蛍光特性はFRETによって変えられるであろう。CFPが発した青みがかった光はYFPによって吸収され、黄色の光として再放射される。FRETは、典型的には、ドナーの励起範囲内の光刺激に対する反応で放射された光のスペクトルを測定することによって、およびドナー放射光とアクセプター放射光間の比を計算することによってモニタリングされる。ドナー：アクセプター放射比が高い場合、FRETは起こらず、二つの蛍光タンパク質は近接していない。ドナー：アクセプター放射比が低い場合は、FRETが起こっており、二つの蛍光タンパク質は近接している。このようにして、第一および第二の反応モジュールがそれぞれドナーおよびアクセプター蛍光分子である、第一および第二の反応モジュールに融合している第一および第二のペプチドとの間の相互作用を測定することができる。このように、二つのポリペプチドは、FRETを提供するシステムを含むことができ、例えば一方のポリペプチドはGFPを含み、他方のポリペプチドはYFPを含む。
【０２１４】
更なる態様では、第一および第二のポリペプチドは、生物発光共鳴エネルギー転移(BRET)システムを提供する。このようなシステムでは、関心対象の一方のポリペプチドは、蛍光生成物(または基質)を生成(または破壊)し、他方の関心対象ポリペプチドは、蛍光生成物(または異質)により共鳴エネルギー転移を起こす蛍光タンパク質である。一つの例示的手順では、BRETシステムは、レニラ由来のルシフェラーゼおよびGFPを含む。例示的BRETの方法論は、Kroeger et al., J Biol Chem. 2001 Apr 20;276(16): 12736-43およびXu et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1999 January 5;96(1):151-6に記載されている。様々な比色計測シグナル生成システムもまた用いることができる。
【０２１５】
本方法で用いられる試験作用物質は、任意のタイプの化合物であり得る。候補作用物質または試験化合物は、天然および合成、有機および無機の両方の、高分子(例えば、オリゴペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチド)、低分子(即ち、約500Da以下の分子量)、抗体、糖、脂肪酸、ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体、天然構造物の類似体(例えば、模倣ペプチド、核酸類似体等)、ならびに様々な他の化合物を含む、多種多様な任意の化合物であり得る。試験作用物質は、ランダムペプチドまたはコンビナトリアルペプチドまたは非ペプチドライブラリーを含む多様なライブラリーから調製できる。使用可能な多くのライブラリー、例えば化学合成ライブラリー、組換え体(例えばファージディスプレイライブラリー)、およびインビトロ翻訳ベースライブラリーが当技術分野では公知である。化学合成ライブラリーの例は、Fodor et al., 1991, Science 251:767-773；Houghten et al., 1991, Nature 354:84-86; Lam et al., 1991, Nature 354:82-84；Medynski, 1994, Bio/Technology 12:709-710；Gallop et al., 1994, J. Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251；Ohlmeyer et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926；Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426; Houghten et al., 1992, Biotechniques 13:412；Jayawickreme et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618; Salmon et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712; PCT Publication No. WO 93/20242; およびBrenner and Lerner, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383に記載されている。ファージディスプレイライブラリーの例は、Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390；Devlin et al., 1990, Science, 249:404-406；Christian, R.B. et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:711-718); Lenstra, 1992, J. Immunol. Meth. 152:149-157; Kay et al., 1993, Gene 128:59-65; および1994年8月18日付けのPCT Publication No. WO 94/18318に記載されている。インビトロ翻訳ベースライブラリーは、1991年4月18日付けのPCT Publication No. WO 91/05058；およびMattheakisら、1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026に記載されているが、これらに限定されない。非ペプチドライブラリーの例としては、ベンゾジアゼピンライブラリー(例えばBunin et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712を参照されたい)が使用に適合し得る。ペプトイドライブラリー(Simon et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371)も用いることができる。ペプチド中のアミド官能基が過メチル化されて、化学変換されたコンビナトリアルライブラリーを生成している、使用可能なライブラリーの別の例がOstresh et al.によって記載されている(1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-11142)。
【０２１６】
試験作用物質は、試験対象のPLに結合するPDZドメインか、またはその類似体でよい。
【０２１７】
一旦、本PDZポリペプチドへの本PLポリペプチドの結合を調節する作用物質として、即ち結合調節作用物質として同定されると、該作用物質は、無細胞アッセイ、細胞アッセイおよび動物またはその単離された器官を用いるアッセイを含む様々なアッセイで試験することができる。例えば、結合調節作用物質を試験して、該作用物質が組織培養中の細胞で、または例えばニワトリもしくは別のトリなどの試験動物で、適切な任意の系で、ウイルス毒性または病原性かどうかを決定できる。
【０２１８】
C. 抗ウイルス作用物質および抗細菌作用物質のタイプ
以下に記載のどの作用物質も、スクリーニング法で同定されたもとのとしてだけでなく医薬品としても用いることができる。インヒビターは、RNA発現ライブラリー、バクテリオファージ発現ライブラリー、低分子ライブラリー、ペプチドライブラリーを含むどのタイプのライブラリーからも同定できる。インヒビターはまた、遺伝子発現を制御することが知られている公知の核酸および/またはポリペプチド配列を用いても生成できる。化合物はまた、遺伝子発現を制御することが知られているいくつかのカテゴリーの分子、例えばジンクフィンガータンパク質、リボザイム、siRNAおよびアンチセンスRNAも含む。
【０２１９】
(a)siRNAインヒビター
siRNAは、相補的mRNA転写の発現を阻害する、比較的短い、少なくとも一部が二重鎖のRNA分子である。本発明の実施にとって、そのメカニズムを理解することは必要ないが、siRNAは、相補的mRNA転写物の分解を誘導することによって機能すると信じられている。siRNAの設計および使用に関する原理は、WO 99/32619、Elbashir, EMBO J. 20, 6877-6888 (2001)およびNykanen et al., Cell 107, 309-321 (2001); WO 01/29058に概して記載されている。
【０２２０】
本発明のsiRNAは、それぞれの鎖が好ましくは10〜30、15〜25、または17〜23、または19〜21ヌクレオチド長であり、少なくとも一部が相補的である二本鎖RNAから形成される。鎖は、好ましくはその全長にわたって互いに完全に相補的であり得、または他の二本鎖分子の一方の端にまたは両端に単鎖の3'オーバーハングを有し得る。単鎖のオーバーハングは、存在する場合には、通常1〜6塩基であり、1または2塩基であることが好ましい。siRNAのアンチセンス鎖は、PLタンパク質またはPDZ転写物に対し実質的に相補的(例えば、少なくとも80、90、95%、好ましくは100%)になるように選択される。任意のミスマッチ塩基は、siRNA鎖の端部または端部近くで起こるのが好ましい。端部でのミスマッチ塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり得る。siRNAのセンス鎖も、PLタンパク質またはPDZ転写物の相補セグメントに対し同様の関係を示す。各鎖が完全に相補的な19塩基を有し、かつセンス鎖の3'端には2個のミスマッチ塩基があり、アンチセンス鎖の3'端には1個のミスマッチ塩基がある二本鎖を有するsiRNAが特に適切である。
【０２２１】
siRNAがこのように投与されるものである場合、siRNAをコードするDNAの形状から明らかなように、siRNAの鎖は一つまたは複数のヌクレオチド類似体を含むことができる。ヌクレオチド類似体は、インヒビター活性が実質的に影響を受けない場所、例えば5'端および/または3'端の領域内、特には単鎖のオーバーハング領域内に配置される。好ましいヌクレオチド類似物は、糖修飾されたまたはバックボーン修飾されたリボヌクレオチドである。核酸塩基修飾リボヌクレオチド、即ち天然核酸塩基に代わって、下記の非天然核酸塩基を含むリボヌクレオチドなどもまた適切である：5-位置が修飾されたウリジンまたはシチジン、例えば5-(2-アミノ)プロピルウリジン、5-ブロモウリジン；8位置が修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例えば8-ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば7-デアザ−アデノシン；O-およびN-アルキル化ヌクレオチド、例えばN6-メチルアデノシン。好ましい糖修飾リボヌクレオチドでは、2'OH-基は、H、OR、R、halo、SH、SR、NH2、NHR、NR2、またはCNから選択される基で置換されており、この時のRは、C1〜C6アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、ハロはF、CI、Br、またはIである。好ましいバックボーン修飾されたリボヌクレオチドでは、隣接するリボヌクレオチドに結合しているリンエステル基は、修飾基、例えばホスチオアート基で置換されている。更なる好ましい修飾は、siRNAの5'ヒドロキシド残基にリン酸基を導入する修飾である。このような基は、siRNAをATPおよびT4キナーゼで処理することで導入できる。天然RNAのホスホジエステル結合もまた、少なくとも一個の窒素または硫黄ヘテロ原子を含むように変更できる。RNA構造の変更は、目的に合わせて調整でき、dsRNAにより生ずる一部生物での全身性のパニック反応を回避しながら、特異的な遺伝子阻害を可能にすることができる。同様に、塩基を修飾して、アデノシンデアミナーゼの活性を遮断することもできる。
【０２２２】
PLタンパク質またはPDZ転写物内の多くのセグメントが、siRNAの設計の適切な標的である。PLタンパク質PLの選択セグメントを用いて、あるサブタイプを選択的に目標とする場合、セグメントは、好ましくは転写物内の他のPLタンパク質PL領域と完全な配列相同性を持たないことを示す。好ましくは、PLタンパク質またはPDZタンパク質の選択セグメントは、PLタンパク質PLの対応するセグメント(存在する場合)と少なくとも1、2、3、4、またはそれ以上のヌクレオチドの違いを示す。標的部位は、いくつかの例では、PLタンパク質またはPDZコーディング領域、5'UTRおよび3'UTRから選ぶことができ、PLタンパク質のPL部位が好ましい。好ましい標的部位は、PLタンパク質PLと呼ばれるsiRNAの標的部位である(実施例を参照されたい)。この部位は、C末端にあり、細菌またはウイルスのサブタイプに特異的である。他の好ましい部位としては、PDZタンパク質のPL結合部位が挙げられる。
【０２２３】
siRNAは、siRNAをコードしているDNAセグメントを、挿入されたセグメントを逆方向に転写させるように配置されている一対のプロモーターの間に挿入することによって組換え技術により合成できる。このようなプロモーターの転写からは、二本の相補的なRNA鎖が生成され、それらはその後アニーリングして所望するdsRNAを形成できる。このようなシステムで用いる例示的プラスミドとしては、プラスミド(PCR 4.0 TOPO) (Invitrogenから入手可能)が挙げられる。別の例は、反対に配置されたプロモーターがT7およびSP6であるベクターpGEM-T (Promega, Madison, WI)である；T3プロモーターもまた用いることができる。あるいは、siRNAの鎖をコードするDNAセグメントは、単一プロモーターの下流に挿入される。このシステムでは、siRNAのセンスおよびアンチセンス鎖は同時に転写され、自己相補的であり、したがってdsRNAを形成できる単鎖RNA鎖を生じる。siRNAをコードするベクターは、インビトロまたは細胞培養で転写でき、あるいはインサイチューで発現させるためにトランスジェニック動物または患者に導入できる。適切なベクターを下記に記載する。組換え発現のためのプロモーターおよび任意の他の制御配列を選択することで、発現の組織特異性を決定できる。例えば、中枢神経系での発現には、PDGF、プリオン、中性エノラーゼ、またはthy-1のプロモーターが適切である。
【０２２４】
siRNAの鎖は、有機化学合成によって合成し、インビトロでアニーリングすることもできる。化学的に合成するかまたはインビトロで酵素合成する場合、RNAを、細胞に導入する前に精製することができる。例えば、RNAは、溶媒を用いた抽出または樹脂沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー；またはそれらの組み合わせを用いて混合物から精製できる。RNAは保存のために乾燥させること、または水溶液に溶解することができる。溶液は、アニーリングおよび/または二本鎖の安定化を促進するために、緩衝剤または塩を含むことができる。siRNAは、細胞または生物内に、下記に記載するような様々な方法によって、RNAまたはRNAをコードするDNAのいずれかの形で導入できる。
【０２２５】
(b)アンチセンスポリヌクレオチド
アンチセンスポリヌクレオチドは、センスmRNAに結合して、その翻訳に干渉することによって、RNA前駆体の転写、プロセッシングまたは局在化に干渉することによって、mRNAの転写を抑制することによって、またはいくつかの他のメカニズムを通して抑制を引き起こすことができる。アンチセンス分子が発現を低下させる具体的なメカニズムは重要ではない。
【０２２６】
典型的には、アンチセンスポリヌクレオチドは、遺伝子のmRNAの配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも7〜10、典型的には20またはそれ以上のヌクレオチドの単鎖アンチセンス配列を含む。いくつかのアンチセンスポリヌクレオチドは、約10〜約50ヌクレオチド長、または約14〜約35ヌクレオチド長である。いくつかのアンチセンスポリヌクレオチドは、約100ヌクレオチド未満、または約200ヌクレオチド未満である。一般的には、アンチセンスポリヌクレオチドは、安定な二重鎖を形成するのに十分な長さを有するが、必要に応じて、送達の様式に応じた、インビボ投与できるほど十分に短いものでなければならない。標的配列への特異的ハイブリダイゼーションに必要なポリヌクレオチドの最短長は、とりわけ、G/C含有量、ミスマッチ塩基の配置(ある場合)、標的ポリヌクレオチド集団と比較した配列特異度、およびポリヌクレオチドの化学的性質(例えばメチルホスフォナートバックボーン、ペプチド核酸、ホスホロチオエート)などいくつかの要因に依存する。
【０２２７】
特異的ハイブリダイゼーションを保証するために、アンチセンス配列は、少なくとも標的mRNAのセグメントまたはそれをコードする遺伝子と実質的に相補的である。いくつかのアンチセンス配列は、それらの目標とする標的配列に対し完全に相補的である。しかしながら、RNAまたはその遺伝子に対応する関係標的配列への特異的結合が、ポリヌクレオチドの機能的特性として保持される限りは、アンチセンスポリヌクレオチドは、ヌクレオチド置換、付加、欠失、移動、転移、または修飾、あるいは他の核酸配列または非核酸成分を含んでよい。PLタンパク質またはPDZタンパク質の発現を阻害することを目的とするアンチセンスポリヌクレオチドは、特定のPLタンパク質またはPDZ遺伝子もしくは転写物に対し、配列相同性の完全なまたは実質的な程度を示し、かつ別のPDZ遺伝子に対しては配列相同性の不完全で、かつ低い程度を示すように設計される。
【０２２８】
いくつかのアンチセンス配列は、mRNAの比較的利用できる配列(例えば二次構造を比較的欠く)と相補的である。このことは、予測されたRNAの二次構造を、例えばMFOLDプログラム(Genetics Computer Group, Madison WI)を用いて分析し、当技術分野で公知であるようにインビトロまたはインビボで試験することによって決定され得る。有効なアンチセンス組成物を同定するための別の有用な方法は、オリゴヌクレオチドのコンビナトリアルアレイを用いる(例えばMilner et al., 1997, Nature Biotechnology 15:537を参照されたい)。
【０２２９】
アンチセンス核酸(DNA、RNA、変更物、類似物等)は、本明細書に開示する化学合成および組換え法のような、核酸生成に適切な任意の方法を用いて作ることができる。アンチセンスRNAは、そのままか、またはアンチセンスRNAをコードするDNAの形態で送達できる。アンチセンスRNAをコードするDNAは、下記に記載するようにベクターの構成要素、または非複製型で送達できる。
【０２３０】
(c)ジンクフィンガータンパク質
ジンクフィンガータンパク質もまた、PLタンパク質もしくはPDZタンパク質もしくは核酸、または特異的PLタンパク質サブタイプの発現の抑制に用いることができる。ジンクフィンガータンパク質は、標的遺伝子内の任意の所望標的部位に結合するように遺伝子工学を利用して作られ得るか、または選択され得る。いくつかの方法では、標的部位はプロモーターまたはエンハンサー内に存在する。他の方法では、標的部位は、構造遺伝子内に存在する。いくつかの方法では、ジンクフィンガータンパク質は、ヒトKOX-1タンパク質由来のKRABのような抑制ドメイン転写レプレッサーに連結している(Thiesen et al., New Biologist 2, 363-374 (1990); Margolin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4509-4513 (1994); Pengue et al., Nucl. Acids Res. 22:2908-2914 (1994); Witzgall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4514-4518 (1994))。ジンクフィンガータンパク質が標的とするのに適切な標的部位を選択するための方法、および選択した標的部位に結合するようにジンクフィンガータンパク質を設計するための方法は、WO 00/00388に記載されている。ファージディスプレイを用いて標的に結合するジンクフィンガータンパク質を選択するための方法は、EP.95908614.1に記載されている。ジンクフィンガータンパク質の設計に用いる標的部位は、典型的には9〜19ヌクレオチド程度である。PLタンパク質もしくはPDZタンパク質またはポリヌクレオチドの阻害については、標的部位は、上記で論じたように、他のPDZ遺伝子または転写物との実質的な配列相同性が不完全であるか、または欠いているPLタンパク質もしくはPDZタンパク質またはポリヌクレオチドの中から選ばれる。ジンクフィンガータンパク質を用いて内因性遺伝子を制御するための方法は、WO 00/00409に記載されている。ジンクフィンガータンパク質は、タンパク質としてまたはジンクフィンガーをコードする核酸の形態で投与できる。後者の場合、核酸は、下記のベクターを用いて、または非複製型で投与できる。
【０２３１】
(d)リボザイム
リボザイムは、酵素として働き、他のRNA分子を特定の部位で開裂するように遺伝子工学で作ることができるRNA分子である。リボザイム自体は、このプロセスで消費されず、触媒的に働いてmRNA標的分子の複数のコピーを開裂できる。標的RNAをトランスで開裂するリボザイムの設計に関する一般的ルールは、Haseloff & Gerlach, (1988) Nature 334:585-591およびUhlenbeck, (1987) Nature 328:596-603およびUS 5,496,698に記載されている。
【０２３２】
リボザイムは、典型的には、転写物上(標的サブサイト)の二カ所に相補性を示し、かつ結合する二つのフランキングセグメント、およびフランキングセグメント間にある触媒領域を含む。フランキングセグメントは、典型的には5〜9ヌクレオチド長であり、最適には6〜8ヌクレオチド長である。リボザイムの触媒領域は、一般的には22ヌクレオチド長である。mRNA標的は、標的サブサイト間に、一般式NUN、好ましくはGUCであるコンセンサス開裂部位を含んでいる(Kashani-Sabet and Scanlon, (1995) Cancer Gene Therapy 2:213-223；Perriman, et al., (1992) Gene (Amst.) 113:157-163；Ruffner, et al., (1990) Biochemistry 29: 10695-10702)；Birikh, et al., (1997) Eur. J.Biochem. 245:1-16; Perrealt, et al., (1991) Biochemistry 30:4020-4025))。
【０２３３】
リボザイムの特異性は、標的サブサイトを選択し、それと共にこのようなサブサイトに相補的なリボザイムのフランキングセグメントを選択することによって制御され得る。PLタンパク質またはPDZタンパク質のインヒビターについては、標的サブサイトは、他のPDZタンパク質と完全に一致するサブサイトが存在しないように、好ましくは実質的な配列相同性を持つサブサイトと一致しないように選ぶのが好ましい。リボザイムは、下記のように、RNA分子として、または複製可能なベクターの成分としてリボザイムをコードするDNAの形態、または非複製型、のいずれかで送達され得る。
【０２３４】
(e)抗体
化合物は、本発明の遺伝子がコードしているタンパク質に特異的に結合する、完全体およびFab、Fvsのようなその結合断片の両方の抗体を含む。抗体は、ポリクローナル抗体も組換え技術により発現できるが、通常はモノクローナル抗体である(米国特許第6,555,310号を参照されたい)。発現可能な抗体の例としては、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ベニヤ(veneered)抗体、およびヒト抗体が挙げられる。キメラ抗体は、その軽鎖および重鎖遺伝子が、典型的には、別種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから、遺伝子工学によって構築された抗体である(例えば、Boyce et al., Annals of Oncology 14:520-535 (2003)を参照されたい)。例えば、マウスモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変(V)セグメントは、ヒト定常(C)セグメントに結合できる。このように典型的なキメラ抗体は、マウス抗体由来のV、または抗原結合ドメインとヒト抗体由来のCまたはエフェクタードメインとからなるハイブリッドタンパク質である。ヒト化抗体は、ヒト抗体(アクセプター抗体と呼ばれる)に実質的に由来する可変領域フレームワーク残基、およびマウス抗体(ドナー免疫グロブリンと呼ばれる)に実質的に由来する相補性決定領域を有する。Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)およびWO 90/07861、米国特許第5,693,762号、米国特許第5,693,761号、米国特許第5,585,089号、米国特許第5,530,101号およびWinter、米国特許第US 5,225,539号を参照されたい。定常領域もまた、存在する場合には、実質的にまたは完全にヒト免疫グロブリンに由来する。抗体は、従来のハイブリドーマ手法、ファージディスプレイによって(例えば、Dower et al.、WO 91/17271およびMcCafferty et al.、WO 92/01047を参照されたい)、とりわけヒト免疫系を持つトランスジェニックマウスを使って(Lonberg et al.、WO93/12227 (1993))得ることができる。免疫グロブリン鎖をコードする核酸は、抗体を産生しているハイブリドーマまたは細胞株から、または公開されている文献中の免疫グロブリンの核酸またはアミノ酸の配列に基づいて得ることができる。
【０２３５】
(f)模倣化合物
インヒビター化合物は、本PDZドメインまたはPDZリガンドの模倣物、即ち本PDZドメインまたはPDZリガンドと実質的に同一の構造および/または機能特性を有する合成化合物でもあり得る。模倣物は、完全にアミノ酸の合成的で非天然類似物から構成されるか、または一部が天然ペプチドアミノ酸であり一部がアミノ酸の非天然類似物であるキメラ分子のいずれかであり得る。模倣物にはまた、天然アミノ酸の保存的置換を、該置換が模倣物の構造および/または阻害活性もしくは結合活性を実質的に変えない限り、どのような量でも組み入れることができる。保存的変異体である本発明のポリペプチドを用いる場合、模倣物が本発明の範囲に在るかどうか、即ちその構造および/または機能が実質的に変えられていないかは通常の実験により決定されると考えられる。かくして、模倣組成物は、それが本ポリペプチド間の結合を阻害できれば本発明の範囲内である。
【０２３６】
模倣物は、非天然構造成分の任意の組み合わせを含むことができるが、それは、典型的には三つの構造群： (a) 天然のアミド結合(「ペプチド結合」)連結以外の残基連結群；（b) 天然アミノ酸残基に代わる非天然残基；または (c) 二次構造模倣を誘導する、即ち二次構造、例えばβターン、γターン、βシート、αヘリックス立体構造等を誘導するまたは安定化する残基、に由来する。
【０２３７】
ポリペプチドは、その残基の全てまたはいくつかが天然のペプチド結合以外の化学的手段で結合される場合、模倣物として特徴付けることができる。個々のペプチド模倣残基は、ペプチド結合、他の化学結合、またはカップリング手段、例えばグルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル類、二官能性マレイミド、N,N=-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、もしくはN,N=-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)などによって結合することができる。従来のアミド結合（「ペプチド結合」）連結の代替であり得る連結基は、例えばケトメチレン(例えば、-C(=O)-NH-の代わりに-C(=O)-CH2-)、アミノメチレン(CH2-NH)、エチレン、オレフィン(CH=CH)、エーテル(CH2-O)、チオエーテル(CH2-S)、テトラゾール(CN4-)、チアゾール、レトロアミド、チオアミドまたはエステルなどを含む(例えば、Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, A Peptide Backbone Modifications, Marcell Dekker, NYを参照されたい)。
【０２３８】
ポリペプチドは、また天然アミノ酸残基の代わりに全てのまたはいくつかの非天然残基を含有することによって、模倣物として特徴付けることができる。非天然残基は、科学文献および特許文献によく記載されており、天然アミノ酸残基の模倣物およびガイドラインとして有用な非天然組成物のいくつかの例は、以下に記載されている。
【０２３９】
芳香族アミノ酸の模倣物は、例えば下記によって置き換えることによって生成することができる：D-またはL-ナフィルアラニン; D-またはL-フェニルグリシン; D-またはL-2チエネイルアラニン; D-またはL-1、-2、3-、もしくは4-ピレネイルアラニン; D-またはL-3チエネイルアラニン; D-またはL-(2-ピリジニル)-アラニン; D-またはL-(3-ピリジニル)-アラニン; D-またはL-(2-ピラジニル)-アラニン; D-またはL-(4-イソプロピル)-フェニルグリシン; D-(トリフルオロメチル)-フェニルグリシン; D-(トリフルオロメチル)-フェニルアラニン; D-p-フルオロフェニルアラニン; D-またはL-p-ビフェニルフェニルアラニン; K-またはL-p-メトキシビフェニルフェニルアラニン; D-またはL-2-インドール(アルキル)アラニン; およびD-またはL-アルキルアイニン、ここで、アルキルは、置換もしくは非置換メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソ-ブチル、sec-イソチル、イソ-ペンチルまたは非酸性アミノ酸であり得る。非天然アミノ酸の芳香族環は、例えばチアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンズイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリルおよびピリジル芳香族環を含む。
【０２４０】
酸性アミノ酸の模倣物は、例えば負荷電を維持しながら非カルボキシラートアミノ酸；(ホスホノ)アラニン；スルファート化スレオニンによって置換することで生成することができる。カルボキシル側鎖(例えば、アスパルチルまたはグリタミル)もまた、例えば、1-シクロヘキシル-3(2-モルホリニル-(4-エチル)カルボジイミド、または1-エチル-3(4-アゾニア-4,4-ジメトールペンチル)カルボジイミドなどのカルボジイミド(R=-N-C-N-R=)を用いた反応により選択的に変更できる。アスパルチルまたはグルタミルはまた、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換できる。
【０２４１】
塩基性アミノ酸の模倣物は、例えば(リジンおよびアルギニンに加えて)アミノ酸のオルニチン、シトルリン、または(グアニジノ)-酢酸、またはアルキルが上記に定義されたとおりの(グアニジノ)アルキル-酢酸を用いた置換によって生成できる。ニトリル誘導体(例えば、COOHに代わってCN-成分を含む)は、アスパラギンまたはグルタミンの代わりになり得る。アスパラギニル残基およびグルタミニル残基は、対応するアスパルチル残基またはグルタミル残基に脱アミノ化できる。
【０２４２】
アルギニン残基模倣物は、アルギニルを、例えば一つまたは複数の従来の試薬、例えばフェニルグリオキサール、2,3-ブタジエン、1,2-シクロヘキサンジオン、またはニンヒドリンを含む試薬と、好ましくはアルカリ条件下で反応させることによって生成できる。
【０２４３】
チロシン残基模倣物は、チロシルを、例えば芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンと反応させることによって生成できる。N-アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを用いて、それぞれO-アセチルチロシル種および3-ニトロ誘導体を形成できる。
【０２４４】
システイン残基模倣物は、システイニル残基を、例えば2-クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのα-ハロアセタート、および対応するアミンと反応させて、カルボキシルメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得て生成できる。システイン残基模倣物は、システイニル残基を、例えばブロモ-トリフルオロアセトン、α-ブロモ-β-(5-イミドゾイル)プロピオン酸；クロロアセチルリン酸、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド；2-ピリジルジスルフィドメチル；p-クロロメルクリ安息香酸塩；2-クロロメルクリ-4-ニトロフェノール；またはクロロ-7-ニトロベンゾ-オキサ-1,3-ジアゾールと反応させることによっても生成できる。
【０２４５】
リジン模倣物は、リシニルを、例えば無水コハク酸または他の無水カルボン酸と反応させることによって生成できる(およびアミノ末端残基が変化し得る)。リジンおよび他のα-アミノ-含有残基模倣物はまた、メチルピコリンイミダート、リン酸ピリドキサール、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、O-メチルイソウレア、2,4,ペンタジオンのようなイミドエステルとの反応、およびグリコシラートとのトランスアミダーゼ触媒反応によっても生成できる。
【０２４６】
メチオニン模倣物は、例えばメチオニンスルホキシドとの反応によって生成できる。プロリンの模倣物としては、例えばピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、3-または4-ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリン、3-または4-メチルプロリン、または3,3-ジメチルプロリンが挙げられる。ヒスチジン残基模倣物は、ヒスチジルを、例えばジメチルプロカルボナートまたはパラブロモフェナシルブロミドと反応させることによって生成できる。
【０２４７】
他の模倣物としては、例えば、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化；セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化；リジン、アルギニンおよびヒスチジンのα-アミノ基のメチル化；N末端アミンのアセチル化；バックボーンアミド残基のメチル化またはN-メチルアミノ酸による置換；あるいはC末端カルボキシル基のアミド化によって生成された模倣物が挙げられる。
【０２４８】
本ポリペプチドのアミノ酸はまた、逆のキラル性を有するアミノ酸(またはペプチド模倣残基)によって置き換えることもできる。かくして天然ではL型で生じるいずれのアミノ酸(化学物質の構造によってRまたはSとも呼ばれる)も、同一タイプの化学構造を持つが、一般的にD-アミノ酸と呼ばれる、キラル性が逆の、さらにR-型またはS-型とも呼ばれることがあるアミノ酸、またはペプチド模倣物で置き換えることができる。
【０２４９】
本発明の模倣物にはまた、構造を模倣した残基、特にβターン、βシート、αヘリックス構造、γターン等の二次構造を誘導するかまたは模倣する残基を含有している組成物も含むことができる。例えば、ペプチド内の天然アミノ酸をD-アミノ酸：N-α-メチルアミノ酸；C-α-メチルアミノ酸；またはデヒドロアミノ酸によって置換すると、βターン、γターン、βシート、またはαヘリックスの立体構造を誘導または安定化できる。βターン模倣構造は、例えばNagai (1985) Tet. Lett. 26:647-650; Feigl (1986) J. Amer. Chem. Soc. 108:181-182；Kahn (1988) J. Amer. Chem. Soc. 110:1638-1639; Kemp (1988) Tet. Lett. 29:5057-5060；Kahn (1988) J. Molec. Recognition 1:75-79に記載されている。βシート模倣構造は、例えばSmith (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114:10672-10674に記載されている。例えば、シスアミドサロゲートである1,5-二置換テトラゾールで誘導されたVI βターン型がBeusen (1995) Biopolymers 36:181-200によって記載されている。アミド結合置換としてのポリメチチレン単位を生成するためのアキラルなω-アミノ酸残基の組込みは、Banerjee (1996) Biopolymers 39:769-777によって記載されている。ポリペプチドの二次構造は、例えば高磁場1H NMRまたは2D NMR分光法によって分析することができ、例えばHiggins (1997) J. Pept. Res. 50:421-435を参照されたい。またHruby (1997) Biopolymers 43:219-266, Balaji et al., 米国特許第5,612,895号も参照されたい。
【０２５０】
本化合物を、さらに修飾して化合物をより可溶性にするか、細胞内への侵入を容易にすることができる。例えば、化合物は任意の位置でPEG化され得るか、または化合物は膜貫通トランスポーター領域を含むことができる。
【０２５１】
当技術分野では、多くのペプチド配列が、これらの配列に連結したペプチドが原形質膜を通って細胞内へ侵入することを容易にするものとして記載されている(Derossi et al., 1998, Trends in Cell Biol. 8:84)。本発明の目的に関して、このようなペプチドはまとめて膜貫通トランスポーターペプチドと呼ばれる。これらペプチドの例としては、HIV由来のtat (Vives et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:16010; Nagahara et al., 1998, Nat. Med. 4:1449)、ショウジョウバエ由来のアンテナペディア(Derossi et al., 1994, J. Biol. Chem. 261: 10444)、単純ヘルペスウイルス由来のVP22 (Elliot and D'Hare, 1997, Cell 88:223-233)、抗DNA抗体の相補性決定領域(CDR) 2および3 (Avrameas et al., 1998, Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 95:5601- 5606)、70 KDa熱ショックタンパク質(Fujihara, 1999, EMBO J. 18:411-419)、およびトランスポルトラン(transportan)(Pooga et al., 1998, FASEB J. 12:67-77)が挙げられるが、これらに限定されない。切断型のHIV tatペプチドも用いることができる。
【０２５２】
D. 抗ウイルス作用物質および抗細菌作用物質の改良
選択した細胞内への抗ウイルス作用物質または抗細菌作用物質の受け入れ、および導入の改良については、多くの公知の方法が存在する。例えばタンパク質のPEG化を用いて、それらを免疫系に対してより耐性にすることができる。あるいは、細胞内シグナルまたは細胞内部分は、タンパク質およびベクターに加えて、それらを選択した細胞内に入りやすくすることができる。タンパク質またはベクターを、感染細胞に特異的に取り込まれるようにする部分、この場合、呼吸器細胞が発現するレセプターに特異的であるリガンドを加えることができる。この部分は、ウイルス感染細胞または細菌感染細胞に特異的であり、例えばレセプターまたは細胞タイプ特異的レセプターである。
【０２５３】
本治療化合物をさらに改変して、化合物をより可溶性にまたは細胞内に入りやすくすることができる。例えば化合物は、任意の位置でPEG化され得るか、または化合物を、tat、アンテナペディア、または、U. Langel,“Cell Penetrating Peptides”, CRC Press, Boca Rotan, 2002(即ち全体として参照により本明細書に組み入れられる)に記載されているようなシグナル配列膜転移ペプチドに結合することができる。
【０２５４】
当技術分野では、多くのペプチド配列が、これらの配列に連結したペプチドが原形質膜を通って細胞内へ侵入することを容易にするものとして記載されている(Derossi et al., 1998, Trends in Cell Biol. 8:84)。本発明の目的に関して、このようなペプチドはまとめて「膜貫通トランスポーターペプチド」と呼ばれるが、これは「細胞貫通ペプチド」と互換的に用いられる。後者の細胞貫通ペプチドの例としては、HIV由来のtat (Vives et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:16010; Nagahara et al., 1998, Nat. Med. 4:1449)、ショウジョウバエ由来のアンテナペディア(Derossi et al., 1994, J. Biol. Chem. 261:10444)、単純ヘルペスウイルス由来のVP22 (Elliot and D'Hare, 1997, Cell 88:223-233)、抗DNA抗体の相補性決定領域(CDR) 2および3 (Avrameas et al., 1998, Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 95:5601-5606)、70 KDa熱ショックタンパク質(Fujihara, 1999, EMBO J. 18:411-419)およびトランスポルトラン(Pooga et al., 1998, FASEB J. 12:67-77)が挙げられるが、これらに限定されない。切断型のHIV tatペプチドも用いることができる。
【０２５５】
F. 処置の方法
本明細書に開示している薬学的組成物は、細菌性疾患またはウイルス性疾患の処置または予防の方法に用いられる。
【０２５６】
上記開示から理解されるように、本発明は広範な応用性を有している。例えば、PLタンパク質、PDZタンパク質、またはPLとPDZタンパク質との間の相互作用のいずれかのインヒビターを使用して、トランスポーターと相互作用し、かつ感染細胞内に入ることができる作用物質または複合体を同定することができる。PLタンパク質、PDZタンパク質、またはPLタンパク質とPDZタンパク質との間の相互作用のいずれかのインヒビターをまた使用して、感染細胞に結合する複合体成分を同定すること、および作用物質に複合体成分を連結することによって、感染細胞に結合する作用物質の能力を高めることができる。
【０２５７】
予防的応用では、薬学的組成物または薬剤は、細菌感染またはウイルス感染に罹りやすいか、または発症する恐れがある患者に、感染を防止、軽減、または停止するのに十分な量で投与される。治療的応用では、組成物または薬剤は、ウイルス性疾患または細菌性疾患の発症が疑われるか、または既に罹っている患者に、細菌感染またはウイルス感染の症状を逆行させる、停止させる、または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与される。予防および治療レジメンの両方で、PLタンパク質、PDZ、および/またはPL-PDZ相互作用のインヒビターの形態の本発明の活性作用物質は、通常、十分な反応が達成されるまで数回の用量で投与される。しかしながら、予防および治療レジメンの両方で、活性作用物質を、十分な反応が得られるまで単回投与で投与することもできる。典型的には、処置はモニタリングされ、繰り返し投与が行われる。さらには、処置レジメンは、細菌感染またはウイルス感染の処置、または細菌感染またはウイルス感染の進行の処置に用いられるものと同様の用量；投与経路、および投与頻度を用いることができる。
【０２５８】
PLタンパク質、PDZタンパク質、および/またはPL/PDZ相互作用のインヒビターの量、ならびに担体材料と組み合わせて単回用量の形態をとることができる他の活性作用物質の量は、処置される疾患、哺乳動物種、および投与の具体的様態によって変わる。どの特定患者においても、「有効投与量」、「薬学的に許容される用量」、または「薬学的に許容される量」は、患者が動物かヒトか等にかかわらず、使用する具体的な化合物の活性、処置対象患者の種、年齢、体重、全身健康状態、性および食事；投与時間および投与経路；代謝速度または排出速度；現在または以前に投与されたことのある他の薬剤；疾患のタイプおよび重篤度；副作用の強さを含む様々な要因に依存し得る。通常患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含むヒト以外の哺乳動物も処置できる。完全長の活性化合物またはその活性断片は、有効投与量で投与され得る。
【０２５９】
PLタンパク質、PDZタンパク質、および/またはPLタンパク質/PDZ相互作用、ならびに本発明の方法で用いられる他の活性作用物質のいずれのインヒビターについても、ヒトに対する有効用量はヒト以外の動物モデルから最初に推定できる。有効量は、当技術分野で公知のパラメータを用いて、臨床医によって決定される。一般的には、投与は、最適有効用量より若干少ない量から開始される。そうしてその後、有効投与量に達するまで、用量は少しずつ増加される。(参照によって、本明細書に組み入れられるThe Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 16th Edition, §22, 1992, Berkow, Merck Research Laboratories, Rahway, New Jerseyを参照されたい)。
【０２６０】
投与量は、滴定して安全性および効果を最適化する必要がある。本明細書に記載した化合物の毒性および治療効果は、実験動物において、標準的な薬学的手順、例えばLD50(試験集団の50%に致死的な用量)およびED50 (試験集団の50%に治療的に有効な用量)を決定することによって決めることができる。毒性と治療効果との間の用量比は治療指数であり、LD50とED50との間の比として表現できる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これらヒト以外の動物研究から得られたデータは、ヒトでの使用において有毒でない投与量範囲の処方に利用できる。このような化合物の投与量は、毒性がほとんど、または全く無いED50を含む血中濃度範囲内にあることが好ましい。正確な処方、投与経路、および投与量は、患者の状態を見ながら個々の医師によって選ばれ得る。(例えば、参照によって本明細書に組み入れられる、Fingl et al. (1975) In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Chapter 1を参照されたい)。
【０２６１】
G. 投与方法
PLタンパク質、PDZタンパク質、および/またはPLタンパク質/PDZ相互作用、ならびに他の活性作用物質のインヒビターは、哺乳動物、例えばヒト患者または被験体に、その有効投与量が、単独で、薬学的に許容される塩または加水分解可能なその前駆体の形態で、あるいは化合物が適切な担体または賦形剤と一緒に混合されている薬学的組成物の形態で、送達または投与することができる。有効レジメンとは、薬物または薬物の組み合わせが、適切な経路から十分な量および頻度で投与され、細菌感染またはウイルス感染の少なくとも一つの症状の発生を少なくとも検知可能に防止、遅延、阻害、または逆行させることを意味する。「有効投与量」、「薬学的に許容される用量」、「薬学的に許容される量」は、PLタンパク質もしくは発現、PDZタンパク質もしくは発現、および/またはPL/PDZタンパク質相互作用のインヒビター、他の活性作用物質と組み合わさったPL、PDZタンパク質、および/またはPL/PDZタンパク質相互作用の活性作用物質またはインヒビターが、適切なレジメンで投与された場合に所望する結果、例えば細菌感染もしくはウイルス感染の症状、または細菌感染もしくはウイルス感染の進行を防止、遅延、阻害、または逆行させるのに十分な量で存在していることを意味する。
【０２６２】
本発明の方法で用いられる、細菌由来またはウイルス由来のPLタンパク質、一つまたは複数のPDZタンパク質、およびPL/PDZタンパク質相互作用のインヒビター、ならびに他の活性作用物質は、PLタンパク質、PDZタンパク質および/またはPL/PDZタンパク質相互作用のインヒビター、または活性作用物質を、様々な他の薬学的に許容される成分と一緒に含んでいる薬学的組成物として投与できる。薬学的組成物は、固体(粉末、顆粒、ドラジェ、錠剤、またはピルなど)、半固体(ジェル、スラリー、または軟膏など)、液体、または気体(エアゾールまたは吸入剤のような)の形態であり得る。
【０２６３】
本発明での使用に適切な製剤は、参照により本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company 1985) Philadelphia, PA, 17th edition)およびLanger, Science (1990) 249:1527-1533に見出される。本明細書に記載の薬学的組成物は、従来の様式、例えば混合、溶解、顆粒状化、ドラジェ化、粉末化、乳化、カプセル化、封入化、または凍結乾燥工程で製造できる。
【０２６４】
PLタンパク質、PDZタンパク質、およびPL/PDZタンパク質相互作用のインヒビター、ならびに他の活性作用物質は、一般的な賦形剤、希釈剤、または担体と製剤化され得、錠剤に圧縮して、または経口投与のためのエリキシル剤または溶剤として製剤化され得る。PLタンパク質、PDZタンパク質、およびPL/PDZタンパク質相互作用のインヒビター、ならびに他の活性作用物質は、持続放出投与形態等としても製剤化され得る。
【０２６５】
化合物の投与は、経口、口腔内、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内、静脈内、および筋肉内投与を含む様々な経路で達成され得る。化合物は、全身的よりはむしろ局所的に、デポーまたは持続放出製剤として投与され得る。これに加えて化合物は、リポソームの形態でも投与され得る。よりさらには、化合物は遺伝子治療によっても投与され得る。
【０２６６】
口腔内投与では、組成物は、従来の様式により製剤化された錠剤またはロゼンジの形にすることができる。
【０２６７】
吸入による投与では、本発明による使用のための化合物は、加圧パック、噴霧器、またはシリンジスプレーから、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガスを用いるか、あるいは無噴射剤式の乾燥粉末吸入器から、エアゾールスプレー調製物の形態で都合良く送達される。加圧エアゾールの場合、投与量の単位は、一定量を送達する弁を備えることによって、決定され得る。カプセルおよびカートリッジは、例えば吸入器または吹き入れ器を用いる場合はゼラチン、化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末ベースの粉末混合物を含むように製剤化され得る。
【０２６８】
化合物は、注射、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与向けに製剤化され得る。注射用製剤は、例えばアンプルまたは複数回投与容器に、追加の保存剤と一緒に単位投与量であり得る。組成物は、油を基本とするか、または水性媒体の懸濁液、溶液、または乳液といった形態をとることができ、かつ懸濁剤、安定化剤、および/または分散化剤のような調合剤を含むことができる。組成物は、無菌で、実質的に等張で、かつ米国食品医薬品局の全てのGood Manufacturing Practice (GMP)規則を遵守するように製剤化される。
【０２６９】
PLタンパク質、PDZタンパク質、およびPL/PDZタンパク質相互作用のインヒビター、ならびに他の活性作用物質を、例えばココアバター、カーボワックス、ポリエチレングリコール、または他のグリセリドなどの、全て体温で溶解するが室温では固まる、通常の坐薬基剤を含む坐剤または停留浣腸などの直腸用組成物に製剤化することもできる。
【０２７０】
これまでに記した製剤に加えて、化合物はまた、デポー調製物としても製剤化され得る。このような長期作用製剤は、埋め込み(例えば、皮下または筋肉内)あるいは筋肉内注射によって投与され得る。かくして化合物は、例えば、適切な高分子または疎水性材料(例えば、許容可能なオイルのエマルジョンとして)、またはイオン交換樹脂を使って製剤化され得、または、例えばやや溶けにくい可溶性の塩のようなやや溶けにくい可溶性誘導体として製剤化され得る(例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Urquhart et al., (1984), Ann Rev. Pharmacol. Toxicol. 24:199; Lewis, ed., 1981, Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals, Plenum Press, New York, N.Y.、米国特許第3,773,919号、および第3,270,960号を参照されたい)。
【０２７１】
あるいは、疎水性の薬学的化合物向けの他の送達システムを用いることができる。リポソームおよびエマルジョンは、疎水性薬物向け送達ビヒクルまたは担体の例である。いくつかの方法では、長期循環型、即ちステルス型リポソームを用いることができる。このようなリポソームは、Woodleら、米国特許第5,013,556号に概して記載されており、その教示は参照によって本明細書に組み入れられる。本発明の化合物は、米国特許第3,845,770号；第3,916,899号；第3,536,809号；第3,598,123号；および第4,008,719号に記載され；制御放出様式および/または送達装置によっても投与でき、これらの開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２７２】
遺伝子治療による投与では、関心対象の遺伝物質(例えばDNAまたはRNA)が宿主内に移入され、細菌感染またはウイルス感染を処置または予防する。本発明では、関心対象の遺伝物質は、PLタンパク質、PDZタンパク質およびPL/PDZタンパク質相互作用のインヒビター、活性作用物質、またはそれらの断片をコードする。本発明の一つの局面では、遺伝物質は治療的に有効でなければならない。多くのこのようなタンパク質、ベクター、DNAは、それ自体公知である(Culver, K. W., "Gene Therapy", 1994, p. xii, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, New York, N.Y.参照、これは全体として参照により本明細書に組み入れられる)。例示のみを目的として、ベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスベクター、組織特異的プロモータを持つアデノウイルスベクター、単純ヘルペスベクター、ワクシニアベクター、人工染色体、レセプター仲介遺伝子送達および上記ベクターの混合物からなる群より選択される。遺伝子治療ベクターは、Chiron, Inc., Emeryville, Calif.; Genetic Therapy, Inc., Gaithersburg, Md.; Genzyme, Cambridge, Mass.; Somtax, Alameda, Calif；Targeted Genetics, Seattle, Wash.; Viagene and Vical, San Diego, Calif.のような様々な研究所から市販されている。
【０２７３】
アデノウイルスは、PLタンパク質、PDZおよび/またはPL/PDZ相互作用のインヒビター、活性作用物質、またはそれらの断片をコードする遺伝物質にとって、有望な遺伝子治療ベクターである。アデノウイルスは、それが所望の遺伝子産物(例えばPL、PDZおよび/またはPL/PDZ相互作用のインヒビターあるいはそれらの断片)をコードおよび発現し、同時にウイルスの正常な生活環のなかでのその複製能力を不活性化するように操作され得る。アデノウイルスの発現は、ウイルスDNAが組み込まれなくとも達成されることから、挿入によって突然変異が誘導される恐れは低くなる。さらには、アデノウイルスは、長年にわたり優れた安全性プロファイルを持つ腸肝ワクチンとして用いられている(Schwartz, A. R. et al. (1974) Am. Rev. Respir. Dis. 109:233-238)。最後に、アデノウイルスが仲介する遺伝子移入は、コットンラットへのα-1-アンチトリプシンおよびCFTRの移入(Rosenfeld, M. A. et al. (1991) Science 252:431-434; Rosenfeld et al., (1992) Cell 68:143-155)を含む多くの例で実証されている。さらには、アデノウイルスをヒト癌の原因として確立しようとした膨大な数の研究の結果は、一様に否定的であった(Green, M. et al. (1979) PNAS USA 76:6606)。
【０２７４】
薬学的組成物はまた、適切な固体またはゲル相担体または賦形剤を含み得る。これら担体または賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリエチレングリコールのような高分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７５】
実施例
下記の実施例は、本発明の実施および使用方法の完全な開示および記載を提供するために提出されるが、本発明の範囲を限定するものではない。使用した数値(例えば量、温度等)については、正確性の確保に努めたが、いくつかのある程度の実験誤差および変動は存在するだろう。他に示さない限り、割合は重量比であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧またはそれに近いものである。
【０２７６】
実施例1
PDZ分析
本実施例は、様々な細菌およびウイルスのPLモチーフへのPDZタンパク質の結合を記載する。PDZタンパク質は、改良されたELISAを用いて査定された。簡単に説明すると、PDZタンパク質の全PDZドメインを含むGST-PDZ融合体が生成された。分析に用いた具体的なPDZ/PLのペア(表1)およびPDZタンパク質の配列(表2)については表1および2を参照されたい。これに加えて、様々なウイルス株および細菌株のPLタンパク質のC末端20アミノ酸に対応したビオチン化ペプチドを合成し、HPLCで精製した。これら物質と物質の結合は、アビジン-HRPを用いビオチンおよびペルオキシダーゼ基質を結合する比色分析アッセイである、「G」アッセイにより検出した。具体的なウイルスおよび細菌のPLタンパク質の配列は表1に示されている。
【０２７７】
PLタンパク質PL(またはC末端)のヒトPDZタンパク質への結合は、下記の両方を用いて決定した：(i)特定のPLタンパク質PL(またはC末端)配列の模倣物から選択されたビオチン化合成20-merペプチド；および(ii)組換えシステムで、合成遺伝子、即ち合成され、発現系でMBP免疫化学タグ(マルトース結合タンパク質；NEB；製造元の指示書にしたがって生成した)をコードしている配列に融合されたPLタンパク質のDNAがコードしている、組換えPLタンパク質。
【０２７８】
マトリックスグラフペプチド(Matrix graphPeptide)およびタンパク質を、ヒトゲノムにおける様々なPDZドメイン全てのほぼ完全なセット(255)を構成するアレイ形式で試験した。各PDZドメインポリペプチドを、市販のグルタチオンS-トランスフェラーゼタグ付き発現系で組換えGST-PDZポリペプチドとして発現させた。ビオチン化PLペプチドのPDZドメインポリペプチドに対する特異的結合を、ストレプトアビジン-HRPおよびTMB基質を用いて検出した。同様に、PLタンパク質-MBP融合タンパク質のPDZドメインポリペプチドに対する特異的結合は、ビオチン化抗MBP、ストレプトアビジン-HRP、およびTMB基質を用いて可視化された。相対的な結合の強度を分析し、各PLについて強く結合するものと弱く結合するものを示す。PLタンパク質を捕捉するかまたは識別するために用いられる場合、より強く結合するPDZタンパク質が望ましい。
【０２７９】
実施例2
HIVペプチド試験プロトコール
二つの異なるタイプのELISAアッセイを用いてHIVペプチド1904および1905を試験した。ライブラリーの全てのPDZタンパク質を対象に、Gアッセイを改良した一次MATRIXスクリーニングを、プレインキュベーション条件の下で実施した。プレインキュベーションアッセイは、PDZコーティングプレートに混合物を加える前に、ペプチドをHRP-ストレプトアビジンと一緒にインキュベートした。続いてペプチドの関心対象のPDZに対する滴定を、通常のELISA Gアッセイの条件で行った。通常条件では、HRP-ストレプトアビジンの後付加の前に、ペプチドをPDZコーティングプレート上でインキュベートする。両アッセイの試薬および供給物、ならびに二種類のプロトコールは下記に示す。
【０２８０】
滴定にはPRISM Matrix ELISA Gアッセイを用いた。試薬および供給物は下記の通りである。Nunc Maxisorp 96ウェルイムノプレート、Nuncカタログ#62409-002、PBS pH 7.4 (リン酸緩衝食塩水、8g NaCl、0.29g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4を1LのH2Oに加えたもの、pH 7.4；0.2μフィルター)アッセイ緩衝液：2% BSA PBS溶液(PBS1リットル当たり20gのウシ血清アルブミン、フラクションV、ICN Biomedicals, カタログ#ICl5142983、ヤギ抗-GSTポリクローナル抗体、保存液5mg/ml、4℃保存、Amersham Pharmaciaカタログ#27-4577-01。PBSで1:1000に希釈、最終濃度5μg/ml。HRP-ストレプトアビジン、2.5mg/2ml保存液、4℃で保存、Zymedカタログ#43-4323、アッセイ緩衝液で1:2000に希釈、最終[0.5μg/ml]。ビオチン化ペプチド(Anaspecより入手、-20℃冷凍庫に貯蔵)、GST-PRISMタンパク質(保存液は-80℃で貯蔵、初回溶解後は-10℃冷凍庫に貯蔵)、TMB (3,3',5,5',テトラメチルベンシジン)、Sigmaカタログ#T5525-100AB、0.18M H2SO4、Sigmaカタログ#S1526、12-wマルチチャンネルピペッター、Raininカタログ#L12-200、200μL LTSチップ、VWRカタログ#37001-602、50 ml試薬容器、Costar#4870、 50本のポロプロピレン製円錐チューブ、SARSTEDTカタログ#62.547.004、15mLポリプロピレン丸底チューブ、Falconカタログ#352059、1.5mLマイクロチューブ、SARSTEDTカタログ#72.690、Costar Transtar 96 Costar#7605、Transtar 96 Cartridge Costar#7610、Molecular Devicesマイクロタイターリーダー(450 nmフィルター)、SoftMax Proソフトウエア、*4℃でまたは-20℃で貯蔵した試薬を使用する場合は、試薬を取り出し氷の上に置く。
【０２８１】
プロトコールは次の通りである。
1. プレートを、50ul/ウェルの抗GSTで直接コーティングし、4℃でインキュベートする。
2. プレートから液を捨てて、プレートをペーパータオルの上で軽くたたく。
3. プレートを200ul/ウェルの割合で1×PBS/2% BSAを用いて室温で1〜2時間ブロッキングする。
4. 5μg/mlのタンパク質の1×PBS溶液を調製する。
5. タンパク質を1ウェル当たり50μl加え、4℃で1〜2時間インキュベートする。
6. アッセイ緩衝液を使ってペプチド溶液を調製する。
7. プレートを3回、冷PBS＊で洗浄する。
8. ペプチドを1ウェル当たり50μl加える(プレートに時間を書き込む)。
9. 4℃で10分間、その後室温で2分間インキュベートする。
10. ストレプトアビジン-HRPを1:2000に調製する。
11. プレートを3回、冷PBS＊で洗浄する。
12. HRPを1ウェル当たり100μl加える(プレートに時間を書き込む)
13. 4℃で20分間インキュベートする。
14. プレートを読み取り装置にかけ、ファイルを準備する。
15. プレートを、室温で、1×PBSを用いて5回、迅速に洗浄する。
16. TMB基質を1ウェル当たり100μl加える(プレートに時間を書き込む)。
17. 暗所、室温で、最長30分間インキュベートする。
18. TMB添加から30分後に100μlの0.18M H2SO4を用いて反応を停止する。
19. 反応停止後直ちに450nmで最後の読み取りを行う。
＊プレートは乾燥させてはならない。
【０２８２】
プレインキュベーションおよびMATRIXアッセイには、PRISM Matrix ELISA改良型Gアッセイも用いた。プロトコールは次の通りである。
1. プレートを、100ul/ウェルの抗GSTで直接コーティングし、4℃でインキュベートする。
2. プレートから液を捨てて、プレートをペーパータオルの上で軽くたたく。
3. プレートを200μlのアッセイ緩衝液で、室温にて1〜2時間ブロッキングする。
4. アッセイ緩衝液でタンパク質の溶液を調製する。
5. プレートを3回、冷PBS＊で洗浄する。
6. ペプチドを1ウェル当たり50μl加え、4℃で1〜2時間インキュベートする。
7. アッセイ緩衝液でペプチド溶液を調製する。
− 所望濃度の二倍の濃度を持つ、必要量の半量のペプチドを調製する。
− HRP(1:1000)を半量容積(ペプチドの場合と同じ量)に希釈し、次にペプチドと混合する。
− ペプチド-HRP混合物を、室温で20分間インキュベートする。
8. プレートを3回、冷PBS＊で洗浄する。
9. ペプチド-HRP混合物を1ウェル当たり50μl加える(プレートに時間を書き込む)。
10. 最後のペプチドを加えた後、正確に30分間室温でインキュベートする。
11. プレートを読み取り装置にかけ、ファイルを準備する。
12. プレートを、室温のPBSを用いて5回、迅速に洗浄する。 
13. TMB基質を1ウェル当たり100μl加える(プレートに時間を書き込む)。
14. 暗所、室温で、最長30分間インキュベートする。
15. TMB添加から30分後に100μlの0.18M H2SO4を用いて反応を停止する。
16. 反応停止後直ちに450nmで最後の読み取りを行う。
＊プレートは乾燥させてはならない。
【０２８３】
実施例3
PDZタンパク質へのHIV-1ペプチド1904の結合
図1および2は、配列YGRKKRRQRRRRQGLERILL (SEQ ID NO:280)を持つHIV-1のペプチド1904の結合分析を示す。ペプチド1904は、RILL (SEQ ID NO:243)に対応するPLを有している。分析は、多数のGST PDZ融合物を用いて実施した。PDZタンパク質がペプチドに結合することを確認した後、滴定を行ってEC50を決定した。図1および2は、同じ三種類のGST/PDZ融合物について、二種類のアッセイ、即ち通常のGアッセイおよび改良型Gアッセイを用いて行った実験である。図1Aは、GアッセイでのHIVペプチド1904の滴定に対するGSTバックグラウンドを示す。X軸は、バックグラウンドレベルを示す。Y軸は、μMでのペプチド濃度を表す。図1Bは、EC50が0.17μMであることを示す、PDZタンパク質ZO-1 d2 (ドメイン2)への結合に関する滴定分析を示す。図1Cは、EC50が0.41μMであることを示す、PDZタンパク質Rim2への結合に関する滴定分析を示す。図1Dは、EC50が0.26μMであることを示す、PDZタンパク質NSPに対する結合に関する滴定分析を示す。このようにペプチド1904は、PDZタンパク質ZO-1 d2、Rim2およびNSPに対し強い結合を示す。図2Aは、改良型GアッセイでのHIVペプチド1904の滴定に対するGSTバックグラウンドを示す。図2Bは、EC50が0.025μMであることを示す、PDZタンパク質ZO-1 d2 (ドメイン2)への結合に関する滴定分析を示す。図2Cは、EC50が0.03μMであることを示す、PDZタンパク質Rim2への結合に関する滴定分析を示す。図2Dは、EC50が0.0149μMであることを示す、PDZタンパク質NSPに対する結合に関する滴定分析を示す。他のPDZタンパク質の分析は、表3に見ることができる。
【０２８４】
(表３)ペプチド1904(YGRKKRR1RRRRQGLERILL - SEQ ID NO:280)
2009503439.tif 000020
【０２８５】
実施例5
PDZタンパク質へのHIV-1ペプチド1905の結合
図3〜5は、配列
2009503439.tif 000021
を持つHIV-1のペプチド1905の結合分析を示す。ペプチド1905は、RALL (SEQ ID NO:242)に対応するPLを有している。分析は、多数のGST PDZ融合物を用いて実施した。PDZタンパク質がペプチドに結合することを確認した後、滴定を行ってEC50を決定した。図3〜5は、三種類のPDZタンパク質の三回の分析である。図3Aは、改良型GアッセイでのHIVペプチド1905の滴定に対するGSTバックグラウンドを示す。X軸は、バックグラウンドレベルを示す。Y軸は、μMで表したペプチド濃度である。図3Bは、EC50が0.0028μMであることを示す、PDZタンパク質ZO-1 d2(ドメイン2)への結合に関する滴定分析を示す。図3Cは、EC50が0.014μMであることを示す、PDZタンパク質Rim2への結合に関する滴定分析を示す。図3Dは、EC50が0.008μMであることを示す、PDZタンパク質NSPに対する結合に関する滴定分析を示す。図4Aは、GアッセイでのHIVペプチド1905の滴定に対するGSTバックグラウンドを示す。図4Bは、EC50が0.184μMであることを示す、PDZタンパク質ZO-1 d2(ドメイン2)への結合に関する滴定分析を示す。図4Cは、EC50が0.182μMであることを示す、PDZタンパク質Rim2への結合に関する滴定分析を示す。図4Dは、EC50が0.1664μMであることを示す、PDZタンパク質NSPに対する結合に関する滴定分析を示す。図5Aは、改良型GアッセイでのHIVペプチド1905の滴定に対するGSTバックグラウンドを示す。図5Bは、EC50が0.036μMであることを示す、PDZタンパク質ZO-1 d2(ドメイン2)への結合に関する滴定分析を示す。図3Cは、EC50が0.068μMであることを示す、PDZタンパク質Rim2への結合に関する滴定分析を示す。図3Dは、EC50が0.03μMであることを示す、PDZタンパク質NSPに対する結合に関する滴定分析を示す。このようにペプチド1905は、PDZタンパク質ZO-1 d2、Rim2およびNSPに対し強い結合を示す。他のPDZタンパク質の分析は、表4に見ることができる。
【０２８６】
実施例6
ラテラルフロー
PDZ捕捉後のモノクローナル抗体検出、またはモノクローナル捕捉後のPDZ検出を用いたPLタンパク質を検出するためのラテラルフロー形式の例を示す。全ての例で、組換えPDZドメインタンパク質または抗体をストリッパーを用いてRF120 Millipore膜に、典型的には約1mg/mlの濃度で沈積させる。ヤギ抗マウス抗体(GAM)から構成された対照バンドも、0.5mg/mlで沈積させる。PLタンパク質を、100ulの容積のTBS-T緩衝液中で、金結合モノクローナル抗-PL抗体と混合する。いくつかの組換えPLタンパク質を陽性対照として用い、対照のレーンはPLタンパク質を含んでいない。全ての例で、試料は、指示通りに食塩水またはM4で希釈されて保存される。試料を、金結合抗体(またはPDZタンパク質)と直接混合する。
【０２８７】
捕捉剤としてPDZを用いる場合、PDZは膜上にストライプ状に付けられ、膜を試料に挿入して、毛細管作用および吸い上げパッドによってフローが開始される。任意で、複数の異なるモノクローナル抗体を、ラテラルフロー装置だけに沈積させても、または捕捉剤として組み合わせてもよい。試料は金結合PDZタンパク質と混合し、ラテラルフロー装置に使用する。ウイルスまたは細菌が存在すると、ストリップにラインが形成される。結合の強さは、次のシンボルを用いて定量化される：結合が無い場合(-)、弱い結合の場合(+)、強い結合の場合(+++)、中間の結合の場合(++)。
【０２８８】
使用される材料としては、ヤギ抗マウス/PDZタンパク質が前もってストライプ状に付けられたストリップ；TBST/ 2% BSA/ 0.25% Tween 20緩衝液；ウイルスまたは細菌のPLタンパク質、HIV試験の場合はHIV-1 Env、HIV-1 Nef、HIV-2 EnvおよびHIV-2 Vifの保存物、金結合モノクローナル抗体；およびMaxisorp ELISAプレートが挙げられる。手順は次の通りに進められる。
1) 保存PLタンパク質をTBST/ 2% BSA/ 0.25% Tween 20を用いてlOOng/uLに希釈する(希釈には5uL以上のタンパク質を使用する)。
2) タンパク質(100ng/μl) 10uLを10uLのTBST/ 2% BSA/ 0.25% Tween 20に加えて、希釈液100ng/uLを50ng/uLに希釈する。
3) 金結合抗体のTBST/ 2% BSA/ 0.25% Tween 20緩衝液の保存溶液を調製する。4uLの抗体を100uLの緩衝液全てに加え、6つの100uL反応に十分な量の緩衝液を調製する(余分なデッドボリュームも含まれる)。
4) 抗体/緩衝液混合液98uLを、ELISAプレートの別々のウェルに加える。
5) PLタンパク質希釈液2uLを緩衝液の入ったウェルに加える(ウェル一つあたり一つのPL)。
6) 一つのウェルには、抗体および緩衝液だけを加え、陰性「PLなし」対照とする。
7) ELISAプレートを数回軽くたたいてウェルの中身をよく混合する。
8) 前もってストライプを付けたストリップをウェルに入れ、展開を観察する。約30分後、ウェルからストリップを取り出し、コンピュータ中でスキャンする。
【０２８９】
混合ウイルス試験は次のように調製する。B型肝炎についてはGST-TIP2タンパク質を膜上に3mg/mLでストライプ状に付けるか、それに代わって二種類のモノクローナル抗体の混合物を用いることができる(約2mg/mLのモノクローナル抗体)。試験捕捉ラインには、1mg/mLのポリクローナルヤギ抗マウス抗体の第二ラインを用いる。段階を下記に示す。
1. 膜および吸い上げパッドの付いたカードを準備する。
2. 膜にPDZタンパク質および/または抗体を使ってストライプをつける(濃度については上記参照)。
3. 膜を一晩、56度で乾燥させ、カードを幅4.26mmのストリップにカットする。
4. グラスファイバー製試料パッドをストリップの底に取付け、ストリップ全体を試験用カセットに入れる。
5. 試験対象となる試料を溶解し、試料80μLを20μlの緩衝液に加える。数回ピペッティングして混合する。
6. 金結合(Au-)検出試薬8μlを勢いよく試料/緩衝液溶液に加えて、混合する。この検出試薬混合物は、PLタンパク質の場合、8μlのAu-モノクローナル抗体である。数回ピペッティングして混合する。
7. 調製した試料100μlをカセットのサンプルウェルに加える。
8. 試料を加えた15分後にカセットの試験およびコントロールラインを読みとる。確実に試験結果が読みとれる場合は、必ずコントロールラインがはっきり見える。上の矢印は対照を指しており、下の矢印は試験を指している。
【０２９０】
(表４)ペプチド1905
2009503439.tif 000022
2009503439.tif 000023
【０２９１】
本明細書に引用した全ての刊行物および特許は、参照によって、あたかも各個別の刊行物または特許が引用によって組み入れられることが明確かつ個別に指示されたかのように本明細書に組み入れられる。GIDまたはアクセッション番号で参照されるGenbank記録は、特に任意のポリペプチド配列、ポリヌクレオチド配列、またはその注釈も引用によって本明細書に組み入れられる。引用刊行物はどれも出願日前に開示されているが、先行発明により、本発明がこのような刊行物に先行しないとすることを認めたと解釈してはならない。
【０２９２】
本発明は、その特定の態様を参照して記載されているが、様々な変更が可能であり、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく均等物によって置き換えることができる。これに加えて、特別な状況、材料、物質組成、工程、一つまたは複数の工程段階、本発明の目的、精神、および範囲に適応するために、多くの変更が可能である。このような変更の全ては、ここに添付された特許請求の範囲内にあると解釈される。
【図面の簡単な説明】
【０２９３】
【図１】図1A〜Dは、ペプチド1904のPDZタンパク質結合分析を示す。図1Aは、Gアッセイに関するGSTのバックグラウンドを示し、図1Bは、ZO-1 d2へのペプチド1904の結合の滴定曲線を示し、図1Cは、Rim2へのペプチド1904の結合の滴定曲線を示し、図1DはNSPへのペプチド1904の結合の滴定曲線を示す。
【図２】図2A〜Dは、ペプチド1904へのPDZタンパク質の結合を識別する第二の実験を示す。図2Aは、Gアッセイに関するGSTのバックグラウンドを示し、図2Bは、ZO-1 d2へのペプチド1904の結合の滴定曲線を示し、図2Cは、Rim2へのペプチド1904の結合の滴定曲線を示し、図2DはNSPへのペプチド1904の結合の滴定曲線を示す。
【図３】図3A〜Dは、ペプチド1905のPDZタンパク質結合分析を示す。図3Aは、Gアッセイに関するGSTのバックグラウンドを示し、図3Bは、ZO-1 d2へのペプチド1904の結合の滴定曲線を示し、図3Cは、Rim2へのペプチド1904の結合の滴定曲線を示し、図3DはNSPへのペプチド1904の結合の滴定曲線を示す。
【図４】図4A〜Dは、ペプチド1905へのPDZタンパク質の結合を識別する第二の実験を示す。図4Aは、Gアッセイに関するGSTのバックグラウンドを示し、図4Bは、ZO-1 d2へのペプチド1904の結合の滴定曲線を示し、図4Cは、Rim2へのペプチド1904の結合の滴定曲線を示し、図4DはNSPへのペプチド1904の結合の滴定曲線を示す。
【図５】図5A〜Dは、ペプチド1905へのPDZタンパク質の結合を識別する第三の実験を示す。図5Aは、Gアッセイに関するGSTのバックグラウンドを示し、図5Bは、ZO-1 d2へのペプチド1904の結合の滴定曲線を示し、図5Cは、Rim2へのペプチド1904の結合の滴定曲線を示し、図5DはNSPへのペプチド1904の結合の滴定曲線を示す。
【図１】
2009503439.tif 000025
【図２】
2009503439.tif 000026
【図３】
2009503439.tif 000027
【図４】
2009503439.tif 000028
【図５】
2009503439.tif 000029
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月13日(2007.8.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結核菌(M. tuberculosis) PDZリガンド(PL)タンパク質が患者試料中に存在しているかどうかを決定する段階を含む、患者が結核菌に感染しているかどうかを識別するための方法であって、該タンパク質の存在が患者が結核菌に感染していることを示す、方法。
【請求項２】
前記決定する段階が、
患者試料を結核菌PLタンパク質に特異的に結合する作用物質に接触させる段階；および
作用物質とPLタンパク質との間の、結核菌の存在を示す特異的結合を検出する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
結核菌PLタンパク質がESXN、ESXS、またはESAT-6である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
PLタンパク質に特異的に結合する作用物質がPLモチーフに結合する、請求項2記載の方法。
【請求項５】
PLモチーフが、結核菌ESXNタンパク質についてはSSWA (SEQ ID NO:270)であり、結核菌ESXSタンパク質についてはYTGF (SEQ ID NO:271)であり、結核菌ESAT-6タンパク質についてはGMFA (SEQ ID NO:272)である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
結核菌ESXNタンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、TIP2、KIAA1526、およびPSD95 (p2)からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
結核菌ESXSタンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、MAST2、MAST3、Shank3、APXL1、およびシンテニン(syntenin)からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項5記載の方法。
【請求項８】
結核菌ESAT-6タンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、INADL (p3)、RIM2、およびTIP2からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項5記載の方法。
【請求項９】
結核菌のPLタンパク質におけるカルボキシ末端PLモチーフに特異的に結合する単離された抗体。
【請求項１０】
結核菌を検出するための、結核菌のPLタンパク質の使用。
【請求項１１】
結核菌を同定するための、結核菌のPLタンパク質に結合する抗体の使用。
【請求項１２】
結核菌を検出するための、結核菌のPLタンパク質に結合するPDZポリペプチドの使用。
【請求項１３】
結核を処置するために有用な活性について化合物をスクリーニングするための、結核菌由来のPLタンパク質および該PLタンパク質に結合するPDZタンパク質の使用。
【請求項１４】
HIV PDZリガンド(PL)タンパク質が患者試料中に存在しているかどうかを決定する段階を含む、患者がHIVに感染しているかどうかを識別するための方法であって、該タンパク質の存在が患者がHIVに感染していることを示す、方法。
【請求項１５】
前記決定する段階が、
患者試料をHIV PLタンパク質に特異的に結合する作用物質に接触させる段階；および
作用物質とPLタンパク質との間の、HIVの存在を示す特異的結合を検出する段階を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
HIVタンパク質がEnv、Nef、またはVifである、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
PLタンパク質に特異的に結合する作用物質がPLモチーフに結合する、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
PLモチーフが、HIV-1 EnvについてはRALL (SEQ ID NO:242)またはRILL (SEQ ID NO:243)であり、HIV-1 Nefタンパク質についてはFKNC (SEQ ID NO:244)、FKDC (SEQ ID NO:245)、YKNC (SEQ ID NO:246)、またはYKDC (SEQ ID NO:247)であり、HIV2 Envタンパク質についてはIALL (SEQ ID NO:248)、LALL (SEQ ID NO:249)、またはLTLL (SEQ ID NO:250)であり、およびHIV-2 Vifタンパク質についてはEILA (SEQ ID NO:251)、GILA (SEQ ID NO:252)、またはDILA (SEQ ID NO:253)である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
HIV-1のEnv PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、AIPC (p1)、GORASP1 (p1)、INADL (p3)、KIAA0316、KIAA1284、MAGI1 (p1)、MAST2、MINT1 (p1、2)、NSP、NOS1、PAR3 (p3)、PAR3L (p3)、PAR6β、RIM2、ロドフィリン(Rhodophilin)様、SITAC-18(p2)、SITAC-18 (p1)、KIAA1284、PICK1、Shank 1、Shank 2、Shank 3およびTIP1からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
HIV-1のNef PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、MINT1、SITAC-18、TIP1、およびPICK1からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
HIV-2のEnv PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、EBP50(p1)、KIAA1284、MAST2、NSP、PAR3、PICK1、Shank 1、Shank 2、Shank 3、およびTIP1からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
HIV-2のVif PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、INADL (p3)、RIM2、およびEBP50 (p1)からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
HIVのPLタンパク質におけるカルボキシ末端PLモチーフに特異的に結合する単離された抗体。
【請求項２４】
HIVを検出するための、HIVのPLタンパク質の使用。
【請求項２５】
HIVを検出するための、HIVのPLモチーフに結合する抗体の使用。
【請求項２６】
HIVを検出するための、HIVのPLタンパク質に結合するPDZポリペプチドの使用。
【請求項２７】
HIV感染を処置するために有用な活性について化合物をスクリーニングするための、HIV由来のPLタンパク質および該PLタンパク質に結合するPDZタンパク質の使用。
【請求項２８】
B型肝炎PDZリガンド(PL)タンパク質が患者試料中に存在するかどうかを決定する段階を含む、患者がB型肝炎に感染しているかどうかを識別するための方法であって、該タンパク質の存在が患者がB型肝炎に感染していることを示す、方法。
【請求項２９】
前記決定する段階が、
患者試料をB型肝炎PLタンパク質に特異的に結合する作用物質に接触させる段階；および
作用物質とPLタンパク質との間の、B型肝炎の存在を示す特異的結合を検出する段階を含む、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
B型肝炎タンパク質が、タンパク質X、またはS抗原である、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
PLタンパク質に特異的に結合する作用物質がPLモチーフに結合する、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
PLモチーフが、B型肝炎タンパク質XについてのFTSA (SEQ ID NO:254)であるか、またはB型肝炎S抗原についてのWVYI (SEQ ID NO:255)である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
B型肝炎タンパク質XのPLモチーフに特異的に結合する作用物質が、TIP2、KIAA1526、SITAC-18、MINT1 (p1、2)、DVL3、およびNOS1からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
B型肝炎S抗原PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、PTPL1 (p4)、HEMBA 1003117、AF6、AIPC、SYNTENIN、MUPP1 (p3、7、9、11)、DVL2 (01)、ZO-3 (p1)、SIP1、AIPC (p1)、GORASP1 (p1)、INADL (p3)、KIAA0316、KIAA1284、MAGI1 (p1)、MAST2、MINT1 (p1、2)、NSP、NOS1、PAR3 (p3)、PAR3L (p3)、PAR6β、RIM2、ロドフィリン様、SITAC-18 (p2)、SITAC-18 (p1)、KIAA1284、PICK1、Shank 1、Shank 2、Shank 3、およびTIP1からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項30記載の方法。
【請求項３５】
B型肝炎のPLタンパク質におけるカルボキシ末端PLモチーフに特異的に結合する単離された抗体。
【請求項３６】
B型肝炎ウイルスを検出するための、B型肝炎ウイルスのPLタンパク質の使用。
【請求項３７】
B型肝炎ウイルスを検出するための、B型肝炎ウイルスのPLモチーフに結合する抗体の使用。
【請求項３８】
B型肝炎ウイルスを検出するための、B型肝炎ウイルスのPLタンパク質に結合するPDZポリペプチドの使用。
【請求項３９】
B型肝炎感染を処置するために有用な活性について化合物をスクリーニングするための、B型肝炎ウイルス由来のPLタンパク質および該PLタンパク質に結合するPDZタンパク質の使用。
【請求項４０】
フラビウイルスPDZリガンド(PL)タンパク質が患者試料中に存在するかどうかを決定する段階を含む、患者がフラビウイルスに感染しているかどうかを識別するための方法であって、該タンパク質の存在が患者がフラビウイルスに感染していることを示す、方法。
【請求項４１】
前記決定する段階が、
患者試料をフラビウイルスPLタンパク質に特異的に結合する作用物質に接触させる段階；および
作用物質とPLタンパク質との間の、フラビウイルスの存在を示す特異的結合を検出する段階を含む、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
フラビウイルスタンパク質がカプシドCまたはE1である、請求項40記載の方法。
【請求項４３】
PLタンパク質に特異的に結合する作用物質がPLモチーフに結合する、請求項41記載の方法。
【請求項４４】
フラビウイルスがC型肝炎ウイルスであり、かつPLモチーフが、C型肝炎カプシドCタンパク質についてのPASA (SEQ ID NO:256)もしくはPVSA (SEQ ID NO:257)であるか、またはC型肝炎E1タンパク質についてのGVDA (SEQ ID NO:258)である、請求項41記載の方法。
【請求項４５】
C型肝炎カプシドC PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、TIP-2およびZO-1 (p2)からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
C型肝炎E1タンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、TIP2、RIM2、およびINADL (p3)からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項44記載の方法。
【請求項４７】
フラビウイルスが、C型肝炎ウイルス、西ナイルウイルス、デング熱、日本脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスからなる群より選択される、該フラビウイルスのPLタンパク質におけるカルボキシ末端モチーフに特異的に結合する単離された抗体。
【請求項４８】
任意でフラビウイルスがC型肝炎ウイルスである、フラビウイルスを検出するための、フラビウイルス由来のウイルス性PLタンパク質の使用。
【請求項４９】
任意でフラビウイルスがC型肝炎ウイルスである、フラビウイルスを検出するための、フラビウイルスのPLモチーフに結合する抗体の使用。
【請求項５０】
任意でフラビウイルスがC型肝炎ウイルスである、フラビウイルスを検出するための、フラビウイルスのPLタンパク質に結合するPDZポリペプチドの使用。
【請求項５１】
任意でフラビウイルスがC型肝炎である、フラビウイルス感染を処置するために有用な活性について化合物をスクリーニングするための、フラビウイルス由来のPLタンパク質および該PLタンパク質に結合するPDZタンパク質の使用。
【請求項５２】
RSV PDZリガンド(PL)タンパク質が患者試料中に存在するかどうかを決定する段階を含む、患者がRSVに感染しているかどうかを識別するための方法であって、該タンパク質の存在が患者がRSVに感染していることを示す、方法。
【請求項５３】
前記決定する段階が、
患者試料をRSV PLタンパク質に特異的に結合する作用物質に接触させる段階；および
作用物質とPLタンパク質との間の、RSVの存在を示す特異的結合を検出する段階を含む、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
RSVタンパク質が核タンパク質である、請求項52記載の方法。
【請求項５５】
PLタンパク質に特異的に結合する作用物質がPLモチーフに結合する、請求項53記載の方法。
【請求項５６】
PLモチーフが、RSV核タンパク質ついてのDVEL (SEQ ID NO:259)である、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
RSV核タンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、ZO-1 (p2)、RIM2、新規セリンプロテアーゼ、MINT1、EBP50 (p1)、AIPC (p1)、PAR3 (p3)、SIP1 (p1)、PTPL1 (p4)、HEMBA 1003117、AF6、AIPC、SYNTENIN、MUPP1 (p3、7、9、11)、DVL2(01)、ZO-3(p1)、SIPl、AIPC (p1)、GORASP1 (p1)、INADL (p3)、KIAA0316、KIAA1284、MAGI1 (p1)、MAST2、MINT1 (p1、2)、NSP、NOSl、PAR3 (p3)、PAR3L (p3)、PAR6β、RIM2、ロドフィリン様、SITAC-18 (p2)、SITAC-18 (p1)、KIAA1284、PICK1、Shank 1、Shank 2、Shank 3、およびTIP1からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
RSVのPLタンパク質におけるカルボキシ末端PLモチーフに特異的に結合する単離された抗体。
【請求項５９】
RSVを検出するための、RSV PLタンパク質の使用。
【請求項６０】
RSVを検出するための、RSVタンパク質のPLモチーフに結合する抗体の使用。
【請求項６１】
RSVを検出するための、RSVウイルスのPLタンパク質に結合するPDZポリペプチドの使用。
【請求項６２】
RSV感染を処置するために有用な活性について化合物をスクリーニングするための、RSV由来のPLタンパク質および該PLタンパク質に結合するPDZタンパク質の使用。
【請求項６３】
ロタウイルスA PDZリガンド(PL)タンパク質が患者試料中に存在するかどうかを決定する段階を含む、患者がロタウイルスAに感染しているかどうかを識別するための方法であって、該タンパク質の存在が患者がロタウイルスAに感染していることを示す、方法。
【請求項６４】
前記決定する段階が、
患者試料をロタウイルスA PLタンパク質に特異的に結合する作用物質に接触させる段階；および
作用物質とPLタンパク質との間の、ロタウイルスAの存在を示す特異的結合を検出する段階を含む、請求項63記載の方法。
【請求項６５】
ロタウイルスAタンパク質が、VP4、VP7、NSP2、またはNSP5である、請求項63記載の方法。
【請求項６６】
PLタンパク質に特異的に結合する作用物質がPLモチーフに結合する、請求項63記載の方法。
【請求項６７】
PLモチーフが、ロタウイルスA VP4タンパク質についてはQCKL (SEQ ID NO:260)またはQCRL (SEQ ID NO:261)、ロタウイルスA VP7タンパク質についてはYYRV (SEQ ID NO:262)またはYYRI(SEQ ID NO:263)、ロタウイルスA NSP2タンパク質についてはQVGI (SEQ ID NO:264)、HIGI (SEQ ID NO:265)、QIGI (SEQ ID NO:266)、またはRIGI (SEQ ID NO:267)、ロタウイルスA NSP5タンパク質についてはIKDL (SEQ ID NO:268)またはIEDL (SEQ ID NO:269)である、請求項63記載の方法。
【請求項６８】
ロタウイルスA VP4タンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、MAGI3 (p5)、LIMミスティーク(mystique)、LIM-RIL、ENIGMA、MAGI1 (p3)、MAST2、MAGI2 (p5)、LIMタンパク質、およびZO-1(p2)からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項67記載の方法。
【請求項６９】
ロタウイルスA VP7タンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、GRIP1 (p6)、PTPL1 (p4)、MAST1、MUPP1 (p3、7、9)、KIAA1719 (p6)、MAST2、PICK1、およびZO-1 (p2)からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項67記載の方法。
【請求項７０】
ロタウイルスA NSP2 PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、NOS1 (p1、2、3)、MINT1 (p2)、およびZO-1 (p2)からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項67記載の方法。
【請求項７１】
ロタウイルスA NSP5 PLモチーフに特異的に結合する作用物質が、NOS1、RIM2、およびZO-1 (p2)からなる群より選択されるPDZタンパク質である、請求項67記載の方法。
【請求項７２】
ロタウイルスA PLタンパク質におけるカルボキシ末端PLモチーフに特異的に結合する単離された抗体。
【請求項７３】
ロタウイルスAを検出するための、ロタウイルスa PLタンパク質の使用。
【請求項７４】
ロタウイルスAを同定するための、ロタウイルスA1タンパク質のPLモチーフに結合する抗体の使用。
【請求項７５】
ロタウイルスAを検出するための、ロタウイルスAのPLタンパク質に結合するPDZポリペプチドの使用。
【請求項７６】
ロタウイルスA感染を処置するために有用な活性について化合物をスクリーニングするための、ロタウイルスA由来のPLタンパク質および該PLタンパク質に結合するPDZタンパク質の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2005年7月1日出願の米国仮出願第60/696,221号の優先権を主張し、全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の背景
流行性ウイルス感染は、重大な世界的な人命損失の原因であり、かつ通常の感冒から生命を脅かすインフルエンザ、西ナイル熱、およびHIV感染に至る広範なヒト疾患に関係している。適時の検出および診断は、適切な治療の決定および疾患拡大の抑制の両方にとって重要である。迅速な診断法は、罹患患者および集団リスクの軽減に特に有用である。
【０００３】
微生物学的方法および免疫化学的方法が、ウイルス性の病原体の迅速な検出に有用であることは公知である。伝統的な微生物学的方法は、信頼性は比較的高いが、時間がかかり、労力を要し、かつ高価でもある。ヌクレオチドプローブ、PCR、および免疫アッセイをベースとした方法によるいくつかの解決策が提案されているが、これらのアッセイは、多くの場合病原性ウイルスの最も医学的に重要な株、ならびに特に慢性化して生命を脅かす疾患および癌に多くの場合関係するそれらの株を識別することができない。
【０００４】
医学技術分野では、医学的に重要な疾患の発生に最も多く関係している病原性ウイルスの特定株を検出することができる、改良された、廉価で、迅速で、正確でかつ識別力のある方法が相変わらず強く求められている。特に、資源が限られ、精巧な検査装置がさほど入手できない医師および獣医の診療所、学校、工場および開発途上国で、それほど訓練を受けていない個人が日常的に使用できる簡単なアッセイ方法論がまた特に求められている。
【発明の開示】
【０００５】
発明の簡単な概要
本発明は、被験体がウイルスに感染しているかどうかを決定するための方法を提供する。方法は、被験体からの試料をPDZ含有ポリペプチドと接触させる段階、およびPDZポリペプチドがウイルスPDZリガンドポリペプチドに結合するかどうかを決定する段階を含む。PDZ含有ポリペプチドとウイルスPDZリガンドポリペプチドとの間の結合は、被験体がウイルスに感染していることを示す。抗ウイルス作用物質および抗細菌作用物質を同定するためのアッセイもまた提供される。本発明は、様々な診断的および治療的な応用に用途を見出す。
【０００６】
本明細書では、結核菌(M. tuberculosis)PDZリガンド(PL)タンパク質の存在は患者が結核菌に感染していることを示すことから、該タンパク質が患者試料中に存在するかどうかを決定することによって、患者が結核菌に感染しているかどうかを識別するための方法を開示する。一つの局面では、前記決定は、患者試料を結核菌PLタンパク質に特異的に結合する作用物質に接触させる段階；および作用物質とPLタンパク質との特異的結合を検出する段階を含み、該特異的結合は結核菌の存在を示す。いくつかの局面では、結核菌PLタンパク質はESXN、ESXS、またはESAT-6である。いくつかの局面では、PLタンパク質に特異的に結合する作用物質は、PLモチーフに結合する。いくつかの局面では、方法は、結核菌ESXNタンパク質についてはPLモチーフSSWA (SEQ ID NO:270)を、または結核菌ESXSタンパク質についてはYTGF (SEQ ID NO:271)を、または結核菌ESAT-6タンパク質についてはGMFA (SEQ ID NO:272)を用いることを含む。結核菌ESXNタンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質がPDZタンパク質である場合は、それは次のもの、即ちTIP2、KIAA1526、およびPSD95 (p2)の一つであり得る。結核菌ESXSタンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質がPDZタンパク質である場合は、それは次のもの、MAST2、MAST3、Shank3、APXL1およびシンテニン(syntenin)の一つであり得る。結核菌ESAT-6タンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質がPDZタンパク質である場合は、それは次のもの、INADL (p3)、RIM2、およびTIP2の一つであり得る。本明細書では、結核菌のPLタンパク質におけるカルボキシ末端モチーフに特異的に結合する、単離された抗体を開示している。本明細書では、結核菌のPLタンパク質と細胞のPDZタンパク質との相互作用を阻害する作用物質の有効なレジメンを患者に施す段階、およびそれによって感染の処置または予防に効果を及ぼす段階を含む、結核に罹っているかまたは結核の危険がある患者の処置または予防のための方法を開示している。いくつかの局面では、作用物質は、PLタンパク質のPLモチーフに特異的に結合する抗体である。更なる局面では、作用物質は、下記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子、siRNA、およびジンクフィンガータンパク質のうちの一つであり、かつ作用物質は結核菌PLタンパク質またはそれと相互作用するPDZタンパク質のいずれかの発現を阻害する。細菌がマイコバクテリア(Mycobacteria)属のメンバーである場合は、PLタンパク質は、好ましくはESAT-6ファミリーのメンバーである。
【０００７】
本明細書では、HIV PLの存在は患者がHIVに感染していることを示すことから、HIV PDZリガンド(PL)タンパク質が患者試料中に存在するかどうかを決定することによって、患者がHIVに感染しているかどうかを識別する方法を開示する。いくつかの局面では、前記決定は、患者試料をHIV PLタンパク質に特異的に結合する作用物質と接触させる段階；および作用物質とPLタンパク質との間の特異的結合を検出する段階を含み、該特異的結合はHIVの存在を示す。HIV PLタンパク質としては、Env、Nef、またはVifが挙げられる。好ましくは、PLタンパク質に特異的に結合する作用物質は、PLモチーフに結合する。HIVタンパク質については下記のPLモチーフが同定されている：HIV-1 EnvについてはRALL (SEQ ID NO:242)またはRILL (SEQ ID NO:243)；HIV-1 Nefタンパク質についてはFKNC (SEQ ID NO:244)、FKDC (SEQ ID NO:245)、YKNC (SEQ ID NO:246)、またはYKDC (SEQ ID NO:247)；HIV2 Envタンパク質についてはIALL (SEQ ID NO:248)、LALL (SEQ ID NO:249)、またはLTLL (SEQ ID NO:250)；およびHIV-2 Vifタンパク質についてはEILA (SEQ ID NO:251)、GILA (SEQ ID NO:252)、またはDILA (SEQ ID NO:253)。いくつかの局面では、HIV-1のEnv PLモチーフに特異的に結合する作用物質は、好ましくは下記からなる群から選択されるPDZタンパク質である：AIPC (p1)、GORASPl (p1)、INADL (p3)、KIAA0316、KIAA1284、MAGI1 (p1)、MAST2、MINT1 (p1、2)、NSP、NOS1、PAR3 (p3)、PAR3L (p3)、PAR6β、RIM2、ロドフィリン(Rhodophilin)様、SITAC-18 (p2)、SITAC-18 (p1)、KIAA1284、PICK1、Shank 1、Shank 2、Shank 3、およびTIP1。いくつかの局面では、HIV-1のNef PLモチーフに特異的に結合する作用物質は、下記からなる群より選択されるPDZタンパク質である：MINTl、SITAC-18、TIP1、およびPICK1。いくつかの局面では、HIV-2のEnv PLモチーフに特異的に結合する作用物質は、下記からなる群より選択されるPDZタンパク質である：EBP50 (p1)、KIAA1284、MAST2、NSP、PAR3、PICK1、Shank 1、Shank 2、Shank 3、およびTIP1。いくつかの局面では、HIV-2のVif PLモチーフに特異的に結合する作用物質は、下記からなる群から選択されるPDZタンパク質である：INADL (p3)、RIM2、およびEBP50 (p1)。本明細書では、HIVのPLタンパク質におけるカルボキシ末端モチーフに特異的に結合する単離された抗体も開示している。本明細書では、HIVのPLタンパク質と細胞のPDZタンパク質との相互作用を阻害する作用物質の有効なレジメンを患者に施す段階、およびそれによって感染の処置または予防に効果を及ぼす段階によって、HIV感染に罹っているかまたはHIV感染の危険がある患者を処置または予防するための方法も開示している。いくつかの局面では、作用物質は、PLタンパク質のPLモチーフに特異的に結合する抗体である。いくつかの局面では、作用物質は、下記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子、siRNA、およびジンクフィンガータンパク質のうちの一つであり、かつ作用物質は、HIV-1 PLタンパク質またはそれと相互作用するPDZタンパク質のいずれかの発現を阻害する。HIVについてのPLタンパク質と同定されているPLタンパク質は、Env、Nef、およびVifを含む。
【０００８】
本明細書では、B型肝炎PDZリガンド(PL)タンパク質の存在は患者がB型肝炎に感染していることを示すことから、該タンパク質が患者試料に存在しているかどうかを決定することによって、患者がB型肝炎に感染しているかどうかを識別するための方法を開示している。いくつかの局面では、決定は、患者試料を、B型肝炎PLタンパク質に特異的に結合する作用物質と接触させる段階；および作用物質とPLタンパク質との特異的結合を検出する段階を含み、該特異的結合はB型肝炎の存在を示す。B型肝炎タンパク質について公知であるPLタンパク質は、タンパク質XまたはS抗原である。好ましくは、PLタンパク質に特異的に結合する作用物質は、PLモチーフに結合する。いくつかの局面では、PLモチーフは、B型肝炎タンパク質XについてはFTSA (SEQ ID NO:254)であるか、またはB型肝炎S抗原についてはWVYI (SEQ ID NO:255)である。いくつかの局面では、B型肝炎タンパク質X PLモチーフに特異的に結合する作用物質がPDZタンパク質の場合は、PDZタンパク質はTIP2、KIAA1526、SITAC-18、MINT1 (p1、2)、DVL3、およびNOS1の一つである。別の局面では、B型肝炎S抗原PLモチーフに特異的に結合する作用物質がPDZタンパク質である場合は、PDZタンパク質はPTPL1 (p4)、HEMBA 1003117、AF6、AIPC、SYNTENIN、MUPP1 (p3、7、9、11)、DVL2 (01)、ZO-3 (p1)、SIP1、AIPC (p1)、GORASP1 (p1)、INADL (p3)、KIAA0316、KIAA1284、MAGI1(p1)、MAST2、MINT1 (p1、2)、NSP、NOS1、PAR3 (p3)、PAR3L (p3)、PAR6β、RIM2、ロドフィリン様、SITAC-18 (p2)、SITAC-18 (p1)、KIAA1284、PICK1、Shank 1、Shank 2、Shank 3、またはTIP1である。本明細書では、また、B型肝炎のPLタンパク質におけるカルボキシ末端モチーフに特異的に結合する単離された抗体を開示する。本明細書では、また、B型肝炎のPLタンパク質と細胞のPDZタンパク質との相互作用を阻害する作用物質の有効なレジメンを患者に施す段階、およびそのようにして感染の処置または予防に効果を及ぼす段階を含む、B型肝炎感染に罹っているかまたはB型肝炎感染の危険がある患者を処置または予防するための方法を開示している。好ましくは、作用物質の少なくとも一つは、PLタンパク質のPLモチーフに特異的に結合する抗体である。一つの局面では、作用物質は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子、siRNA、またはジンクフィンガータンパク質であり、かつ作用物質はC型肝炎PLタンパク質またはそれと相互作用するPDZタンパク質のいずれかの発現を阻害する。いくつかの局面では、PLタンパク質はタンパク質XまたはS抗原である。
【０００９】
本明細書では、フラビウイルスPDZリガンド(PL)タンパク質の存在は患者がフラビウイルスに感染していることを示すことから、該タンパク質が患者試料中に存在するかどうかを決定することによって、患者がフラビウイルスに感染しているかどうかを識別する方法を開示している。いくつかの局面では、前記決定は、患者試料をフラビウイルスPLタンパク質に特異的に結合する作用物質と接触させる段階；および作用物質とPLタンパク質との特異的結合を検出する段階を含み、該特異的結合はフラビウイルスの存在を示す。フラビウイルスのC型肝炎ウイルスについて公知であるPLタンパク質は、C型肝炎カプシドCタンパク質についてはPASA (SEQ ID NO:256)、またはPVSA (SEQ ID NO:257)であるか、あるいはC型肝炎ウイルスE1タンパク質についてはGVDA (SEQ ID NO:258)である。好ましくは、C型肝炎カプシドC PLモチーフに特異的に結合する作用物質は、TIP-2およびZO-1 (p2)の少なくとも一つのPDZタンパク質であり、C型肝炎E1タンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質は、TIP2、RIM2、およびINADL (p3)の少なくとも一つである。本明細書では、また、フラビウイルスのPLタンパク質におけるカルボキシ末端モチーフに特異的に結合する単離された抗体を開示している。本明細書では、また、フラビウイルスのPLタンパク質と細胞のPDZタンパク質の相互作用を阻害する作用物質の有効なレジメンを患者に施す段階、およびそのようにして感染の処置または予防に効果を及ぼす段階を含む、フラビウイルス感染に罹っているかまたはフラビウイルス感染の危険がある患者を処置または予防する方法も開示している。好ましくは、作用物質の少なくとも一つは、PLタンパク質のPLモチーフに特異的に結合する抗体である。一つの局面では、作用物質は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子、siRNA、またはジンクフィンガータンパク質であり、かつ作用物質は、RSV PLタンパク質またはそれと相互作用するPDZタンパク質のいずれかの発現を阻害する。いくつかの局面では、PLタンパク質はカプシドCまたはE1タンパク質である。
【００１０】
本明細書では、RSV PDZリガンド(PL)タンパク質の存在は患者がRSVに感染していることを示すことから、該タンパク質が患者試料に存在しているかどうかを決定することによって患者がRSVに感染しているかどうかを識別するための方法を開示している。前記決定は、患者試料をRSV PLタンパク質に特異的に結合する作用物質に接触させる段階；および作用物質とPLタンパク質との特異的結合を検出する段階を含み、該特異的結合はRSVの存在を示す。公知のRSVタンパク質は核タンパク質である。いくつかの局面では、PLタンパク質に特異的に結合する作用物質は、PLモチーフに結合する。別の局面では、PLモチーフは、RSV核タンパク質についてはDVEL (SEQ ID NO:259)であり、およびRSV核タンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質は、下記のPDZタンパク質の一つ、即ち、ZO-1 (p2)、RIM2、新規セリンプロテアーゼ、MINT1、EBP50 (p1)、AIPC (p1)、PAR3 (p3)、SIP1 (p1)、PTPL1 (p4)、HEMBA 1003117、AF6、AIPC、SYNTENIN、MUPP1 (p3、7、9、11)、DVL2 (01)、ZO-3 (p1)、SIP1、AIPC (p1)、GORASP1 (p1)、INADL (p3)、KIAA0316、KIAA1284、MAGI1 (p1)、MAST2、MINT1 (p1、2)、NSP、NOS1、PAR3 (p3)、PAR3L (p3)、PAR6β、RIM2、ロドフィリン様、SITAC-18 (p2)、SITAC-18 (p1)、KIAA1284、PICK1、Shank 1、Shank 2、Shank 3、またはTIP1の一つである。また、RSVのPLタンパク質におけるカルボキシ末端モチーフに特異的に結合する単離された抗体も開示している。また、RSVのPLタンパク質と細胞のPDZタンパク質との相互作用を阻害する作用物質の有効なレジメンを患者に施す段階、およびそれによって感染の処置または予防に効果を及ぼす段階を含む、RSV感染に罹っているかまたはRSV感染の危険がある患者を処置または予防するための方法も開示している。いくつかの局面では、作用物質はPLタンパク質のPLモチーフに特異的に結合する抗体であり、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子、siRNA、またはジンクフィンガータンパク質であり得、かつ作用物質はロタウイルスA PLタンパク質またはそれと相互作用するPDZタンパク質のいずれかの発現を阻害する。いくつかの局面では、PLタンパク質は核タンパク質である。
【００１１】
本明細書では、ロタウイルスA PDZリガンド(PL)タンパク質の存在は患者がロタウイルスAに感染していることを示すことから、該タンパク質が患者試料に存在しているかどうかを決定することによって、患者がロタウイルスAに感染しているかどうかを識別する方法を開示している。前記決定は、患者試料をロタウイルスA PLタンパク質に特異的に結合する作用物質に接触させる段階；および作用物質とPLタンパク質との特異的結合を検出する段階を含み、該特異的結合はロタウイルスAの存在を示す。公知のロタウイルスAタンパク質は、VP4、VP7、NSP2、およびNSP5である。いくつかの局面では、PLタンパク質に特異的に結合する作用物質は、PLモチーフに結合する。いくつかの局面では、PLモチーフは下記のものの一つである：ロタウイルスA VP4タンパク質についてはQCKL (SEQ ID NO:260)またはQCRL (SEQ ID NO:261)；ロタウイルスA VP7タンパク質についてはYYRV (SEQ ID NO:262)またはYYRI (SEQ ID NO:263)；ロタウイルスA NSP2タンパク質についてはQVGI (SEQ ID NO:264)、HIGI (SEQ ID NO:265)、QIGI (SEQ ID NO:266)、またはRIGI (SEQ ID NO:267)；ロタウイルスA NSP5タンパク質についてはIKDL (SEQ ID NO:268)またはIEDL (SEQ ID NO:269)。いくつかの局面では、ロタウイルスA VP4タンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質は、MAGI3 (p5)、LIMミスティーク、LIM-RIL、ENIGMA、MAGI1 (p3)、MAST2、MAGI2 (p5)、LIMタンパク質、およびZO-1(p2)などのPDZタンパク質である。いくつかの局面では、ロタウイルスA VP7タンパク質PLモチーフに特異的に結合する作用物質は、GRIP1 (p6)、PTPL1 (p4)、MAST1、MUPP1 (p3、7、9)、KIAA1719 (p6)、MAST2、PICK1、およびZO-1 (p2)などのPDZタンパク質である。いくつかの方法では、ロタウイルスA NSP2 PLモチーフに特異的に結合する作用物質は、NOS1 (p1、2、3)、MINT1 (p2)、およびZO-1 (p2)からなる群より選択されるPDZタンパク質である。好ましくは、ロタウイルスA NSP5 PLモチーフに特異的に結合する作用物質は、NOS1、RIM2、およびZO-1 (p2)からなる群より選択されるPDZタンパク質である。本明細書では、ロタウイルスAのPLタンパク質におけるカルボキシ末端モチーフに特異的に結合する単離された抗体を開示している。本明細書では、ロタウイルスAのPLタンパク質と細胞のPDZタンパク質との相互作用を阻害する作用物質の有効なレジメンを患者に施す段階、およびそれによって感染の処置または予防に効果を及ぼす段階を含む、ロタウイルスA感染に罹っているかまたはロタウイルスA感染の危険がある患者を処置または予防するための方法を開示している。いくつかの局面では、作用物質はPLタンパク質のPLモチーフに特異的に結合する抗体である。いくつかの局面では、作用物質は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子、siRNA、またはジンクフィンガータンパク質であって、該作用物質は細菌またはウイルスのPLタンパク質、あるいはそれと相互作用するPDZタンパク質のいずれかの発現を阻害する。いくつかの局面では、PLタンパク質は、VP4、VP7、NSP2、またはNSP5である。
【００１２】
定義
別途定義しない限り、本明細書に使用する全ての技術的用語および科学的用語は、本発明に関する当業者が一般的に理解するものと同一の意味を有する。下記参照は、本発明に用いられる多くの用語の一般的定義を提供している：Singletonら、DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988)；およびHale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991)。本明細書に記載の方法および材料に類似するいかなる方法および材料も本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および材料を記載する。下記定義は、本発明の実施において読者を支援するために提供される。
【００１３】
本明細書に使用する用語「調節」は、例えば結合活性をアゴナイスすることによる上方制御(即ち活性化または刺激)、および、例えば結合活性をアンタゴナイズすることによる下方制御(即ち阻害または抑制)の両方を指す。本明細書で使用する用語「PDZリガンド結合モジュレーター」は、PDZリガンドポリペプチドに結合するPDZドメイン含有ポリペプチドのPDZドメインへの、PDZリガンドポリペプチドのPDZ-リガンド(即ち「PL」)の結合を変えることができる作用物質を指す。モジュレーターとしては、アクチベーターおよびインヒビターの両方が挙げられるが、これらに限定されない。インヒビターは結合の部分的または完全な阻害をもたらすことができる。
【００１４】
「PDZリガンド結合モジュレーター」は、一般的にはPDZリガンドポリペプチドとPDZドメイン含有ポリペプチドとの結合を、試験化合物を含まない対照に比べて少なくとも20%、例えば少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、約99%または100%減少させる。一般的には、関心対象の作用物質は、特定のアッセイでは、約1mMまたはそれ未満の範囲のIC50を示す作用物質である。より低いIC50、例えば約100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、1nM、またはさらに低い範囲のIC50を示す化合物は、結合介在性疾患を処置または予防する治療薬または予防薬として特に有用である。
【００１５】
「非天然」は、自然界に発生しない組成物を意味するのに用いられる。非天然組成物の代表例としては、実質的に精製された組成物、ならびに自然界には同一の化学的形式で出現しない、例えば化学的および遺伝的に調節されたタンパク質、核酸等の化合物を含む組成物が挙げられる。
【００１６】
「PDZドメイン」とは、近接アミノ酸約90個、好ましくは約80〜90個、より好ましくは、約70〜80個、より好ましくは約50〜70個が、脳シナプスタンパク質PSD-95、ショウジョウバエ中隔結合タンパク質Discs-Large (DLG)および/または上皮タイトジャンクションタンパク質ZO1 (ZO1)と相同である、アミノ酸配列を意味する。PDZドメインの代表的な例は、また、Discs-Largeホモロジー反復(「DHR」)および「GLGF」反復(SEQ ID NO:275)として当技術分野において公知である。PDZドメインの例は、グアニル酸キナーゼホモログのMAGUKファミリーのメンバー、いくつかのタンパク質ホスファターゼおよびキナーゼ、神経型一酸化窒素合成酵素、腫瘍抑制タンパク質、ならびに総称的にシントロフィンとして公知のいくつかのジストロフィン関連タンパク質を含む様々な膜結合タンパク質に見出される。本PDZドメインは、天然および非天然のアミノ酸配列の両方を包含する。PDZドメインの代表的な例としては、PDZタンパク質の多形変異体、ならびに二つのPDZタンパク質の一部を含むキメラPDZドメイン等が挙げられる。好ましくは、本PDZドメインは、全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願第10/485,788号(2004年2月3日出願)、国際特許出願PCT/US03/285/28508 (2003年9月9日出願)、国際特許出願PCT/US01/44138 (2001年11月9日出願)に開示されているドメインに実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。代表的な非天然PDZドメインとしては、アミノ酸配列に対応する遺伝子コードが突然変異して、例えばPLへの結合または結合特異性のいずれかを変えるアミノ酸の変化を生成するドメインが挙げられる。任意で、PDZドメインまたはその変異体は、脳シナプスタンパク質PSD-95、ショウジョウバエ中隔結合タンパク質Discs-Large (DLG)および/または上皮タイトジャンクションタンパク質ZO1 (ZO1)、ならびに動物ホモログの少なくとも一つに由来するPDZドメインと、少なくとも50、60、70、80、または90%の配列相同性を有している。任意で、天然PDZドメインの変異体は、天然PDZドメインと少なくとも90%の配列相同性を有している。PDZドメインの配列相同性は、PDZドメイン内の少なくとも70個のアミノ酸、好ましくは80個のアミノ酸、およびより好ましくは80〜100個のアミノ酸にわたり決定される。類似体のアミノ酸には、類似体およびヒト配列を最大に一致するように並べた時に、天然ヒト配列中の対応するアミノ酸と同一の番号が割り振られる。類似体は、典型的には、天然のペプチドとは、多くの場合、保存的置換によって一つ、二つ、または少数の位置で異なっている。用語「対立遺伝子変異体」は、同一種の異なる個体の遺伝子間の変異、および遺伝子がコードするタンパク質中の対応する変異を指すのに用いられる。
【００１７】
PDZドメイン変異体は、一般的には、野性型PDZドメインのアミノ酸配列と、少なくとも80%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、または特定の態様では少なくとも98%同一もしくは少なくとも99%同一である。換言すると、本明細書に記載する方法に使用する場合、PDZドメイン含有ポリペプチドは、野性型配列と比べて、アミノ酸置換を少なくとも1、2、3、4、もしくは5個またはそれ以上、およびある態様では最大10個まで含むことができる。置換は、保存的(即ち、あるアミノ酸を下記の群内の別のアミノ酸に置き換える：gly、ala；val、ile、leu；asp、glu；asn、gln；ser、thr；lys、arg；およびphe、tyr)、または非保存的であり得る。
【００１８】
「PDZタンパク質」は、「PDZドメイン-含有ポリペプチド」および「PDZポリペプチド」と互換的に用いられ、PDZドメインを有する天然または非天然のタンパク質を意味する(前記)。PDZタンパク質の代表例は既に開示されており(前記)、CASK、MPP1、DLG1、DLG2、PSD95、NeDLG、TIP-33、TIP-43、LDP、LIM、LIMK1、LIMK2、MPP2、AF6、GORASP1、INADL、KIAA0316、KIAA1284、MAGI1、MAST2、MINT1、NSP、NOS1、PAR3、PAR3L、PAR6β、PICK1、Shank 1、Shank 2、Shank 3、SITAC-18、TIP1およびZO-1を挙げることができる。スクリーニングアッセイに有用な本非天然PDZドメインポリペプチドは、例えば天然PDZドメインより小さなPDZドメインを含むことができる。例えば、非天然PDZドメインは、任意で「GLGF」モチーフ、即ちGLGFアミノ酸配列(SEQ ID NO：275)を有するモチーフを含んでもよく、このモチーフは典型的にはPDZドメインに隣接して、例えば、通常はN末端のアミノ酸約10〜20個内に存在する。PDZ結合活性には、多くの場合、後者のGLGFモチーフ (SEQ ID NO：275)、およびGLGFモチーフ(SEQ ID NO：275)のN末端直近のアミノ酸3個を必要とすることが多い。同様に、非天然PDZドメインは、PDZドメインのC末端にあるβシートを欠くように構築してもよく、即ちこの領域は、多くの場合、PLの結合に影響しないように天然PDZドメインから削除してもよい。
【００１９】
「PDZリガンド」、略して「PL」は、PDZドメインと結合して分子相互作用複合体を形成するアミノ酸配列を有する天然のタンパク質を意味する。PLの代表例は、前出の米国および国際特許出願内に既に示されている(前記)。PLモチーフは、本明細書の表1に提供されている。
【００２０】
「PDZ作用物質」は、試験アッセイにおいてPDZリガンド(PL)ポリペプチドとPDZドメイン含有ポリペプチドとの間に起こる結合相互作用を、PDZ作用物質を含まない対照に比べて、少なくとも20%、例えば少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、最大約99%または100%妨害する化合物を意味する。任意の特定の作用メカニズムに限定するつもりはないが、本PDZ作用物質は、例えばそうでなければ細菌もしくはウイルスのPLリガンドと結合するPDZドメインに結合することによって干渉でき；または代わりにPLリガンドに直接結合することによってPDZタンパク質へのその結合を阻止することもできる。一般的には、後者のPDZ作用物質は、特定のアッセイにおいて約1mMまたはそれ以下の範囲のIC50を示す作用物質である。より低いIC50を示す化合物は、例えば、通常約100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、1nM、またはそれよりかなり低いIC50を有する。後者のPDZ作用物質は、本明細書に開示するようなウイルスまたは細菌による感染に起因する疾患の一つまたは複数の症状を緩和、処置、または予防するために投与される治療的および予防的医用組成物に有用である。
【００２１】
「PLモジュレーター」は、PDZ作用物質(前記)と関連して用いられ、ウイルスまたは細菌のPLタンパク質に結合してPDZドメインへのその結合を調節する化合物を意味する。
【００２２】
「PDZモジュレーター」はPDZ作用物質(前記)と関連して用いられ、PDZドメインに結合して、被験体のPDZドメイン部位へのPLタンパク質の結合を調節する化合物を意味する。本PDZモジュレーターおよびPLモジュレーターは、PDZドメインまたはPLにそれぞれ結合するように設計されたペプチドでも、ペプチド模倣物でも、低分子模倣物でもよい。PDZモジュレーターがPDZドメインに結合するかどうかを決定するためのアッセイは、AアッセイおよびGアッセイを含め、本明細書に詳細に記載されている。同様に、PLモジュレーターがPDZドメインに結合するかどうかを決定するアッセイも記載されており、例えば組換えPL融合タンパク質への組換えPDZドメイン融合タンパク質の結合が記載されている。
【００２３】
「PDZ介在性疾患」は、ウイルスまたは細菌タンパク質のPLが宿主細胞のPDZドメインに結合することに起因する、ウイルスまたは細菌に感染した被験体の一つまたは複数の症状を意味する。症状は、ウイルス性疾患または細菌性疾患に応じて変わる。
【００２４】
「病気」は、本明細書で用いる場合は、ヒト被験体での徴候および症状と異なっていてもよい徴候および症状を含む動物被験体を指す。しかしながら、あらゆる徴候および症状が、医師用卓上参考書(physician's desk reference)またはその他参考資料を利用して識別できる。または、例えば "Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 5th edition, 2004, World Organization for Animal Health" は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【００２５】
「PDZリガンドポリペプチド阻害」とは、「PDZリガンドポリペプチド阻害化合物」(例えば、PLタンパク質PLインヒビター化合物)と関連して、PDZリガンドポリペプチドの任意の活性、例えば結合活性を阻害する活性を有していることを意味する。
【００２６】
「PDZリガンド介在性疾患」とは、PDZリガンドを含有するタンパク質の活性により仲介される任意の疾患である。このような疾患としては、本明細書に開示している任意のウイルスまたは細菌の感染を原因とする症状が挙げられる。
【００２７】
本明細書に記載されるPDZドメインの例では、特定のPDZドメインの「病原体PL結合変異体」とは、病原体のPLリガンド結合活性を保持しているPDZドメイン変異体である。PDZドメイン変異体が病原体PLに結合できるかどうかを決定するためのアッセイは、下記に詳しく記載されており、特定のPDZドメイン内のどのアミノ酸の変化がPDZドメインを変異体に変えるかを識別するための手引きは、様々な資料に見出すことができるだろう。一つの例では、PDZドメインを本明細書に記載されている他のPDZドメインと比較することができ、例えば対応する位置のアミノ酸を置換することができる。別の例では、特定のPDZタンパク質のPDZドメイン配列は、別の種に由来する同等のPDZタンパク質の同等のPDZドメイン配列と比較することができる。例えば、ヒトPDZタンパク質由来のPDZドメイン配列は、他種(例えば、マウス、ラット等)由来の、他の公知および同等なPDZドメインと比較することができ、二つの配列間で変異している任意のアミノ酸をヒトPDZドメイン内で置換して、PDZドメインの変異体を作ることができる。例えば、ヒトDLG1 PDZドメイン1または2の配列を他の種に由来する同等のDLG1 PDZドメインと比較して、ヒトDLG PDZドメインの変異体を作るためにその中で置換できるアミノ酸を識別することができる。このような方法は、本明細書に記載されている任意のPDZドメインに応用できる。特定の変異体は、配列表に記載した配列と比べて、1個、5個まで、約10個まで、約15個まで、約20個まで、もしくは約30個まで、またはそれ以上、通常は約50個までのアミノ酸を交換できる。
【００２８】
スクリーニングアッセイで使用するPDZドメインポリペプチドは、例えば配列表に記載の例示のPDZドメインより小さいPDZドメインを含むことができる。例えば、PDZドメインは、PDZドメインのN末端に隣接する(典型的にはN末端のアミノ酸約10〜20個以内)「GLGF」モチーフ(即ち、GLGF (SEQ ID NO：275)を有するモチーフ)を含む。このモチーフおよび該モチーフのN末端直近にあるアミノ酸3個がPDZ結合活性に必要とされる。同様に、PDZドメインのC末端のβシートは、結合に影響を及ぼさずにPDZドメインから削除できる。
【００２９】
用語「作用物質」は、任意の物質、分子、要素、化合物、実体、またはそれらの組み合わせを含む。それは、例えばタンパク質、オリゴペプチド、有機小分子、多糖類、ポリヌクレオチド等を含むが、これらに限定されない。それは天然産物でも、合成化合物でも、または化学物質でも、または二つもしくはそれ以上の物質の組み合わせでもよい。特に明記しない限り、用語「作用物質」、「物質」および「化合物」は互換的に用いることができる。
【００３０】
用語「類似物」は、本明細書では関心対象の分子と構造が類似しているが、標的化され、かつ制御的な様式で、参照分子の特異的な置換基を別の置換基で置き換えることによって調節されている分子を指す。出発原料と比べ、類似物は、同一、類似、または改善された有用性を示す。改善された特性(標的分子へのより高い結合親和性またはより高い結合選択性、および非標的分子へのより低い活性レベルなど)を有する公知化合物の変異体を同定するための、類似物の合成およびスクリーニングは、製薬化学において周知である。
【００３１】
「接触させる」とは、その一般的な意味を有し、二つまたはそれ以上の作用物質(例えば、二つのタンパク質、ポリヌクレオチドと細胞等)を混合することを指す。接触は、細胞溶解物の存在下または非存在下で、インビトロ(例えば、試験化合物と細胞溶解物のような二つまたはそれ以上の作用物質を試験管または他の容器内で混合する)またはインサイチュー(例えば、二つのポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを細胞内で同時発現させることで、二つのポリペプチドを細胞内で接触させることができる)で行われ得る。
【００３２】
「生体高分子」は、その源を問わず、一つまたは複数のタイプの反復単位の高分子である。生体高分子は、生物系に見出すことができ、特にポリペプチドおよびポリヌクレオチド、ならびにアミノ酸、ヌクレオチド、またはその類似物を含有するような化合物を含む。用語「ポリヌクレオチド」は、10〜100ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドおよび100ヌクレオチド長を超えるポリヌクレオチドを含む、任意の長さのヌクレオチドまたはその類似物の高分子を指す。用語「ポリペプチド」は、6〜50個アミノ酸長の範囲のペプチド、および約50個アミノ酸長を超えるポリペプチドを含む、任意の長さのアミノ酸高分子を指す。
【００３３】
大部分の態様では、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、互換的に用いられる。用語「ポリペプチド」は、従来のバックボーンが非天然のまたは合成されたバックボーンで置き換えられたポリペプチド、および一つまたは複数の、従来のアミノ酸が非天然アミノ酸または合成アミノ酸の一つまたは複数で置き換えられたペプチドを含む。用語「融合タンパク質」または文法的にそれと同等な用語は、複数のポリペプチド成分からなるタンパク質に言及し、それは、それらが天然状態では結合されないが、ペプチド結合を介して、それぞれのアミノ末端とカルボキシル末端とが連結され、単一の連続するポリペプチドを形成している。融合タンパク質は、2、3、または4つもしくはそれ以上のタンパク質の組み合わせでよい。用語ポリペプチドは、融合タンパク質を含むが、N末端メチオニン残基を持っても持たなくともよい、異種アミノ酸配列を持つ融合タンパク質、異種および同種リーダー配列を有する融合物；免疫学的にタグを付けたタンパク質；検出可能な融合相手を有する融合タンパク質、例えば融合相手として蛍光タンパク質、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等を含む融合タンパク質を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
一般的に、ポリペプチドは任意の長さ、例えばアミノ酸2個より長い、アミノ酸4個より長い、アミノ酸約10個より長い、アミノ酸約20個より長い、アミノ酸約50個より長い、アミノ酸約100個より長い、アミノ酸約300個より長い、通常はアミノ酸約500もしくは1000個までまたはそれ以上でよい。「ペプチド」は、一般にはアミノ酸2個より長く、アミノ酸4個より長く、アミノ酸約10個より長く、アミノ酸約20個より長く、一般的にはアミノ酸約50個までである。いくつかの態様では、ペプチドはアミノ酸長5〜30個の間である。
【００３５】
用語「捕捉剤」は、作用物質が、様々な分析物の均質な混合物からの分析物に結合しかつ濃縮するのに十分である相互作用を通して分析物に結合する作用物質を指す。結合相互作用は、捕捉剤の親和性領域によって媒介されるだろう。代表的な捕捉剤としては、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドが挙げられ、例えば抗体、ペプチド、または単鎖もしくは二本鎖DNAの断片を用いることができる。捕捉剤は、通常は一つまたは複数の分析物に「特異的に結合する」。
【００３６】
したがって、用語「捕捉剤」は、ある分析物に特異的に結合できる分子または多分子複合体を指し、例えば、他の標的に結合することなく約10-6M未満の解離定数(KD)で捕捉剤に対する分析物に特異的に結合できる。
【００３７】
用語「特異的結合」は、様々な分析物の均質な混合物中に存在する特定の分析物に優先的に結合する捕捉剤の能力を指す。ある態様では、特異的結合相互作用は、試料中の所望される分析物と、いくつかの態様では約10〜100倍より多いかまたはそれ以上(例えば、1000倍または10,000倍以上)存在する、所望されない分析物とを識別する。ある態様では、捕捉剤と分析物との結合性は、それらが捕捉剤/分析物複合体中で特異的に結合する場合、10-6M未満、10-7M未満、10-8M未満、10-9M未満、通常は約10-10M未満のKD(解離定数)を特徴とする。
【００３８】
用語「実質的に同一」は、二つのペプチド配列が、プログラムのGAPまたはBESTFIT等によって、初期設定のギャップウエイトを用いて最適に並べた時に、少なくとも65パーセント配列相同性を、好ましくは少なくとも80または90パーセント配列相同性を、より好ましくは少なくとも95パーセント配列相同性またはそれ以上(例えば、99パーセント配列相同性もしくはそれ以上)を有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
【００３９】
「結合干渉」は、診断アッセイフォーマットにおいて複合体を形成するPLへのPDZドメインの第一結合相互作用に関して用いられる。ここで、本複合体はその後、要件である第二結合相互作用の中で検出され、即ち干渉は、第一結合相互作用が第二結合相互作用を阻害し、結果としてシグナル発生化合物によって生成されるシグナル強度の低下させた時に起きている。本発明の方法で、本組成物により発生されるシグナルが被る結合干渉は、15%未満；好ましくは10%未満；および最も好ましくは約5%未満である。
【００４０】
用語「捕捉剤/分析物複合体」は、捕捉剤と分析物との特異的結合によって生じた複合体、即ち「結合パートナーのペア」である。捕捉剤と該捕捉剤の分析物は、「特異結合に適切な条件」の下で互いに特異的に結合し、このような条件(塩濃度、pH、界面活性剤、タンパク質濃度、温度等に関する)は、捕捉剤と分析物との間の結合を可能にして溶液中で結合させる条件である。このような条件は、特にタンパク質に関しては、当技術分野で周知である(例えば、Harlow and Lane (Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)を参照されたい)。特異的結合に適切な条件は、典型的には解離定数(KD)が約10-6M未満を有する捕捉剤と標的のペアは相互に結合させるが、他の捕捉剤もしくは標的とは結合させない。
【００４１】
「結合パートナー」および同義語は、捕捉剤/分析物複合体中に見い出せる、即ち相互の特異的結合を示す分子のペアを指す。
【００４２】
「表面結合捕捉剤」という句は、固体基質の表面に固定された捕捉剤を指し、ここで、基質は様々な形状、例えばシート、ビーズ、またはウェルを有するプレートのような他の構造を取ることができる。ある態様では、本明細書で用いられる捕捉剤の集団は、同一担体の表面上に、例えば整列されて存在する。
【００４３】
「単離された」または「精製された」は、一般的には物質(化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物)が、それが存在している試料の有意なパーセント(例えば、2%を超える、5%を超える、10%を超える、20%を超える、50%を超える、またはそれ以上、通常は約90〜100%まで)を構成するように、単離されることを指す。ある態様では、実質的に精製された成分は、試料の少なくとも50%、80〜85%、または90〜95%を構成する。関心対象のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを精製するための技術は、当技術分野で周知であり、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度による沈降が挙げられる。一般的には、物質は、試料の他成分に比べて、それが試料中に天然では見い出せない量で存在する時、精製される。
【００４４】
用語「融合タンパク質」または文法的にそれと同等な用語は、典型的にはそれら本来の状態では結合していないが、一方、典型的にはペプチド結合によりそれぞれのアミノ末端およびカルボキシル末端を介して連結されて単一の連続するポリペプチドを形成している、複数のポリペプチド成分から構成されたタンパク質を意味する。融合タンパク質は、2つ、3つ、もしくはさらに4つまたはそれ以上のタンパク質の組み合わせでもよい。用語ポリペプチドは、異種アミノ酸配列との融合タンパク質、N末端にメチオニン残基を有しても有さなくともよい異種または同種のリーダー配列との融合物；免疫学的にタグを付けたタンパク質；検出可能な融合パートナーとの融合タンパク質、例えば蛍光タンパク質、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等を融合パートナーとして含む融合タンパク質；および同等物を含む融合タンパク質を包含するが、これらに限定されない。
【００４５】
用語「査定すること」は、あらゆる形の測定を包含し、およびある要素が存在するかしないかを決定することを含む。用語「決定すること」、「測定すること」、「評価すること」、「査定すること」、および「アッセイすること」は互換的に用いられ、定量的および/または定性的な決定を含んでよい。査定することとは、相対的でも絶対的でもよい。「結合を査定すること」は、結合の量を決定すること、および/または結合が起こったかどうか(即ち、結合が存在するか不在か)を決定することを含む。
【００４６】
用語「処置」、「処置すること」、「処置する」等は、所望の薬理学的および/または生理学的作用を得ることを指す。該作用は、疾患またはその症状を完全にもしくは部分的に防止することに関して予防的でもよく、ならびに/または、疾患および/もしくは疾患に帰する有害作用を部分的にまたは完全に治癒することに関して治療的でもよい。「処置」は、哺乳動物、特にヒトの疾患のあらゆる処置を対象とし、(a) 疾患に罹りやすいが、疾患に罹っているとはまだ診断されていない被験体での疾患の発生を防止すること；(b) 疾患を阻止すること、即ちその進行を停止すること；ならびに (c) 疾患から救済すること、即ち疾患を退行させこと、および/または一つもしくは複数の疾患症状を取り除くこと、を含む。「処置」はまた、疾患または状態がない場合においても、薬理学的作用を提供するための作用物質の送達も包含することを意味する。例えば「処置」は、被験体に増強されたまたは所望の作用(例えば、一つまたは複数の症状の重篤度を下げる等)を提供できるモジュレーターの送達を包含する。
【００４７】
「被験体」、「個体」、「宿主」および「患者」は、本明細書では互換的に用いられ、本発明の方法の治療を受けられる病的感染に罹りやすいか、または罹っている動物、ヒト、またはヒト以外を指す。一般的には、被験体は哺乳動物の被験体である。例示的な被験体としては、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、ウシ、ニワトリ、アヒル、トリ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコおよびウマが挙げられるが、これらに必ずしも限定されることはなく、ヒトが特に関心の対象である。
【００４８】
「シグナル発生化合物」、略して「SGC」は、PLまたはPDZと連結でき(例えば、以下でさらに開示されている化学的連結方法を用いて)、および反応して本開示のアッセイで検出可能な化学的または物理的実体(即ち、反応生成物)を形成できる分子を意味する。反応生成物の代表例としては、沈殿物、蛍光シグナル、色を持つ化合物等が挙げられる。代表的なSGCとしては、例えば生物発光化合物(例えば、ルシフェラーゼ)、フルオロフォア(例えば、下記のもの)、生物発光および化学発光化合物、放射性同位元素(例えば、131I、125I、14C、3H、35S、32P等)、酵素(例えば、下記のもの)、結合タンパク質(例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン等)、磁性粒子、化学反応性化合物(例えば、着色剤)、標識化オリゴヌクレオチド；分子プローブ(例えば、CY3、Research Organics, Inc.)等が挙げられる。代表的な蛍光体としては、フルオレセインイソチオシアナート、スクシニルフルオレセイン、ローダミンB、リサミン、9,10-ジフェニルアントラセン、ペリレン、ルブレン、ピレン、およびイソシアナート、イソチオシアナート、酸塩化物またはスルホニルクロリドなどのその蛍光誘導体、ウンベリフェロン、ユーロピウム(Eu)などのランタニド希土類キレート等が挙げられる。シグナル発生複合体中で有用な代表的なSGCとしては、酵素：IUB分類1、特に1.1.1および1.6 (例えば、アルコール脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース-6-リン酸脱水素酵素、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素等)；IUB分類1.11.1 (例えば、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ジアフォラーゼ、ウレアーゼ等)；IUB分類2、特に2.7および2.7.1(例えば、ヘキソキナーゼ等)；IUB分類3、特に3.2.1および3.1.3(例えば、α-アミラーゼ、セルラーゼ、β-ガラクトウロニダーゼ、アミログルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ等)；IUB分類4 (例えば、リアーゼ)；IUB分類5、特に5.3および5.4 (例えば、ホスホグルコースイソメラーゼ、トリオースホスファターゼイソメラーゼ、ホスホグルコースムターゼ等)が挙げられる。シグナル発生化合物は、また、その生成物が蛍光または化学発光波長で検出できるSGC、例えばルシフェラーゼ、152Euのような蛍光放射金属、または他のランタニド系列；ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム塩等の化合物；ルシフェリンなどの生物発光化合物；蛍光タンパク質等も含む。蛍光タンパク質としては、下記のものが挙げられるが、これらに限定されない：即ち、(i) 緑色蛍光タンパク質(GFP)、即ちヒトのコドンバイアスにより一致するように天然のヌクレオチド配列のコドンが交換されている「ヒト化」版のGFPが挙げられるが、これに限定されない；(ii)アエクオリア ヴィクトリア(Aequoria victoria)に由来するGFPおよびその誘導体、例えばEnhanced GFPのような「ヒト化」誘導体で、これは例えばClontech, Inc.から市販されている；(iii) WO 99/49019およびPeelle et al. (2001) J. Protein Chem. 20:507-519に記載されているようなレニラ レニフォルミス(Renilla reniformis)、レニラ ムレリ(Renilla mulleri)、またはプチロサルカス ギュエルニー(Ptilosarcus guernyi)のような他種由来のGFP；(iv)「ヒト化��組換えGFP (hrGFP) (Stratagene)；ならびに(v) Matz et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:969-973に記載されているような、花虫綱の種に由来する他蛍光および有色タンパク質等。本シグナル発生化合物は、PLまたはPDZドメインポリペプチドに結合されてもよい。ある種のSGCのタンパク質への取り付けは、EDTAのような金属キレート基(chelating group)によって達成できる。本SGCは、試験試料中のウイルスまたは細菌のPL分析物を検出および/または定量化できるようにする共通の特性を共有している。本SGCは、視覚的方法；好ましくは分光光学的方法、蛍光法、化学発光法、電気的ナノメトリック法(伝導率、インピーダンス、抵抗等の変化を含む)、および磁場法を用いて検出できる。
【００４９】
「固相」は、一つまたは複数の反応物が静電気的、疎水性的、または共有的に結合できる表面を意味する。代表的な固相としては、例えば：ナイロン6；ナイロン66；ポリスチレン；ラテックスビーズ；磁性ビーズ；ガラスビーズ；ポリエチレン；ポリプロピレン；ポリブチレン；ブタジエン-スチレンコポリマー；シラスチックゴム；ポリエステル；ポリアミド；セルロースおよび誘導体；アクリラート；メタクリラート；ポリビニル；塩化ビニル；塩化ポリビニル；フッ化ポリビニル；ポリスチレンのコポリマー；シリカゲル；シリカウェーハガラス；アガロース；デキストラン；リポソーム；不溶性タンパク質金属；ならびにニトロセルロースが挙げられる。代表的な固相は、ビーズ、チューブ、ストリップ、ディスク、フィルターペーパー、プレート等に形作られたものが挙げられる。フィルターは、例えば濾過物などの分析物を捕獲する役割を果たすことができ、または捕捉により働き、またはフィルター上にPLまたはPDZを共有結合させることにより働くことができる(例えば、下記実施例のセクション参照)。本発明のある態様によれば、使用者に配布するための固相捕獲試薬は、「捕獲試薬」(下記)でコーティングされ、生物試料中のウイルスまたは細菌のPL分析物への捕獲試薬の結合を保存および/または最大化するように包装された(例えば、窒素雰囲気下に)固相(前記)からなり得る。
【００５０】
「捕獲試薬」は、ウイルスまたは細菌のPLを結合できる、固定化されたPDZポリペプチド(またはペプチド)を意味する。本捕獲試薬は、PDZの溶液；または固相へのその結合を促進するように改良されたPDZ；または、例えば静電力、ファンデルワールス力、疎水性力、共有化学結合等(以下、さらに開示するような)によってPDZを固相(前記)に結合させて固定化された、固相表面上に既に固定されているPDZからなってもよい。PDZ捕獲試薬の代表例は、下記実施例のセクションに開示されており、例えばラテックスビーズディップスティックアッセイ(latex bead dipstick assay)中の可動性ラテックスビーズ上に固定されたPDZなどの可動性固相PDZ捕獲試薬を含む。
【００５１】
「検出試薬」は、PLまたはPDZのポリペプチドまたはペプチドに連結されたSGC；あるいはそれに代わってPLまたはPDZに特異的に結合できる抗体に連結されたSGCを含有する複合体を意味する。本検出試薬の代表例としては、一つまたは複数のPLもしくはPDZと一つまたは複数のSGC化合物との複合体、即ち高分子複合体が挙げられる。本検出試薬は、ラテックスビーズディップスティックアッセイ中の可動性ラテックスビーズなどの、可動性の固相検出試薬を含む。
【００５２】
「生物試料」は、生きている(または死んでいる)生物、例えば動物、魚、鳥、爬虫類、有袋類等から得た試料を意味する。生物試料は、例えばバイオテロの驚異等を評価するために、空気または水で運ばれかつそこで例えば濾過、遠心分離等によって集められた組織液、組織片、生物材料を含む。別の生物試料は、便または卵、卵黄および羊水から得ることができる。代表的な生物流体としては、例えば尿、血液、血漿、血清、脳脊髄液、精液、肺洗浄液、便、喀痰、粘液、生物材料等を担持する水が挙げられる。または、生物試料は、鼻咽頭スワブまたは口腔咽頭スワブ、鼻洗浄液、気管、肺、気嚢、小腸、脾臓、腎臓、脳、肝臓および心臓由来の組織、喀痰、粘液、生物材料を担持する水、排泄物スワブ、喀痰、鼻および口腔粘液等を含む。代表的生物試料は、食料品、例えば肉、加工食品、家禽、ブタ等の試料も含む。生物試料はまた、汚染溶液(例えば、食品処理溶液等)、外来患者施設、病院、診療所、食品調製施設(例えば、レストラン、屠殺場、冷蔵施設、スーパーマーケット包装施設等)から出るスワブ試料も含む。生物試料は、インサイチュー組織および体液(即ち、試験のために集められたものでない試料)も含み、例えば本法は、例えば結膜に直接用いる点眼剤、試験ストリップを用いた、例えば眼内のウイルス感染の有無または重症度の検出；または例えば被験体の口腔または鼻咽喉にインジケータカプセルを置くことによる、例えば肺感染の有無または程度の検出に有用な可能性がある。あるいは、スワブまたは試験ストリップを口腔内に置くことができる。生物試料は、被験体のいかなる組織、器官、または細胞群に由来してもよい。いくつかの態様では、被験体からは摩擦片、生検、または洗浄液が得られる。生物試料は、血液、尿、喀痰および口腔液のような体液；ならびに鼻の洗浄液、スワブ、または吸引物、気管吸引物、下疳スワブおよび便試料のような試料を含んでよい。関心対象の個々の病原体の検出に適切な生物検体を収集する方法は、例えば、呼吸器疾患の場合の鼻スワブ、洗浄液もしくは吸引液、または気管吸引物などの鼻咽喉検体、口腔スワブ等である。このように本発明の態様は、ウイルスまたは細菌の汚染または感染の存在または量について、様々なタイプの生物試料を試験するのに有用な方法を提供する。任意で、生物試料は、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンおよびマイコスタチンなどの抗生物質を含有する等張液に懸濁させてもよい。
【００５３】
「リガンド」は、PDZ結合部位に結合できるPL化合物を指す。リガンドの代表例としては、本明細書に開示しているようなPL含有ウイルスタンパク質およびPL含有細菌タンパク質が挙げられる。本リガンドは、PDZドメイン結合部位の結合部の三次元空間を満たして、静電斥力を最小化し、静電引力を最大化し、疎水結合力および水素結合力を最大化することができる。リガンドはPDZポリペプチドに特異的および飽和的な様式で結合し、結合親和性は以下にさらに開示するリガンド結合アッセイにより測定できる。
【００５４】
「特異性」は、本発明のある態様によるアッセイに関連して用いられる場合は、本アッセイが、本発明の段階にしたがって実施された際に生物試料のパネル(例えば、100試料のパネル)の中から「指示された」パーセンテージの試料を適切に識別できることを意味する。本試料のパネルは、全て一つまたは複数のムレイン分析物(例えば、細菌または真菌で汚染された陽性対照試料)を含む。好ましくは、この「指示」特異性は、85%より高く(例えば、アッセイは一つまたは複数のムレイン分析物を含む100試料のうち85より多い試料を指示できる)、最も好ましくは、本アッセイは、90%より高い指示特異性を有する。任意で、本アッセイは、「真の非ウイルス性または非細菌性の例」を識別でき、即ち生物試料パネル(例えば、100試料のパネル)の中から「指示された」パーセンテージの陰性試料を検出できる。好ましくは、本発明の本段階は、「真のウイルス性または細菌性の例」を適切に識別でき、かつ好ましくは、本発明の本段階は「真の低病原性のウイルスおよび細菌の例」を適切に識別できる。別の態様では、本試料の陰性対照パネルは、ウイルスもしくは細菌のPL分析物を含んでいないか、または他のウイルスもしくは細菌のPL分析物を含んでいるかのどちらかである。好ましくは、本特異性は85%より高く(例えば、アッセイは、100試料中85を超える試料を指示できる)、最も好ましくは、本アッセイは90%を超える特異性を有する。
【００５５】
「感度」は、本発明のある態様によるアッセイに関連して用いられる場合、本アッセイが、本発明の段階にしたがって実施された際に、陽性対照(前記)および陰性対照(即ち、PL分析物を欠いているもの)の両方を含む試料パネル内から、ウイルスまたは細菌のPL分析物を含有する試料を「指示された」パーセンテージで識別できることを意味する。好ましくは、この「指示された」感度は、85%より高く、最も好ましくは、90%より高い。任意で、本アッセイは、試料パネル内から「真のウイルス性または細菌性の例」を、ウイルスまたは細菌のPL分析物を含有する試料について「指示された」パーセンテージで識別できる。好ましくは、本発明の本段階は、「真のウイルス性または細菌性の例」を適切に識別でき、最も好ましくは、本発明の本段階は、「真の病原性のウイルスまたは細菌の例」を適切に識別できる。別の態様では、試料の本陽性対照パネルはウイルスもしくは細菌のPL分析物を含むか、または病原性の高いウイルスまたは細菌の「PLタンパク質を含んでいるかのどちらかである。好ましくは、この「指示された」感度は、約70%より高く、より好ましくは約80%より高い。よりさらに好ましくは、感度は対照の感度の85%より高く、最も好ましくは約90%より高い。あるいは、感度は同一タンパク質を識別するPCR反応の感度に関して測定され得る。
【００５６】
これまでに決定され、NCBIのGenbankデータベースに電子的に寄託されている核酸およびタンパク質の配列は、本明細書ではGenbankアクセッション番号(GI)で参照される。これらGenbank登録に記載された配列は、全ての目的について全体として参照により本明細書に組み入れられる。出願者は、後に明細書を修正して、これら配列の一つまたは複数、あるいはその指示した部分を具体的に引用する権利を確保することを明確にする。
【００５７】
本明細書に参照される様々な生化学および分子生物学的方法は、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. Second (1989) and Third (2000) Editions、およびCurrent Protocols in Molecular Biology, (Ausubel, F.M. et al., eds.) John Wiley & Sons, Inc., New York (1987-1999)に記載されている。
【００５８】
本明細書に引用されている方法は、理論的に可能である引用された事象の任意の順番、ならびに引用された通りの事象の順番に実施できる。さらには、数値範囲が示されている場合は、その範囲の上限と下限の間にある全ての中間値、および他に記載の値またはその記載範囲内の中間値は本発明に包含されることが理解されると考えられる。また、記載された本発明の変形の任意の特徴は、独立して、または本明細書に記載されている任意の一つまたは複数の特徴と組み合わせて記載および請求できることが熟慮される。
【００５９】
単数の項目を参照する場合、同一項目が複数存在する可能性も含まれる。より具体的には、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形の「a」、「an」、「said」および「the」は、別途文書により明瞭に示されていない限り複数の参照も含む。さらには、特許請求の範囲は、いかなる任意要素も排除して書かれてもよいことを指摘しておく。このように、この記述は、請求要素の再度の引用または「消極的」限定の使用と結びついて、「solely (単に)」、「only (のみ、だけ)」等の限定的な術語の使用の根拠として役割を果たすことを意図したものである。
【００６０】
発明の詳細な説明
本発明は、被験体がウイルスまたは細菌に感染しているかどうかを決定するための方法を提供する。本発明は、多くの病原性のウイルスおよび細菌を含む非常に多様な病原体が、PDZリガンド(即ち、PDZドメイン含有ポリペプチドが特異的に結合するリガンド)を含むタンパク質をコードするという発見に一部基づいている。それによりこれら病原体は、PDZドメインを利用して、試料中で検出できる。例示的方法は、被験体からの試料をPDZ含有ポリペプチドと接触させる段階、およびPDZポリペプチドがウイルスまたは細菌のPDZリガンドポリペプチドに結合しているかどうかを決定する段階を含む。PDZ含有ポリペプチドとウイルスPDZリガンドポリペプチドとの間の結合は、被験体がウイルスまたは細菌に感染していることを示す。
【００６１】
診断目的へのPDZ-PL相互作用の利用は、多くの異なる試験形式に応用できる。診断試験は、妊娠検査に用いるようなディップスティック試験、試験試料とインキュベートできるフィルム試験、その上にまたは他の媒体に乗せることができるスライド試験等のようなELISAアッセイの形式にできる。このような形式は、米国特許第6,180,417号、第4,703,017号および第5,591,645号に記載されている。抗ウイルス作用物質および抗細菌作用物質を同定するためのアッセイも提供される。本発明は、様々な診断および治療的な用途に使用できる。
【００６２】
I. ウイルスおよび細菌病原体
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、AIDS(後天性免疫不全病症候群)の原因となる媒介物であり、該疾患の全ての症例に見出される。その主たる標的は、活性化CD4+ T4ヘルパーリンパ球であるが、マクロファージを含むいくつかの他のタイプの細胞にも感染できる。HIVは、レトロウイルスの分類の一つであるレンチウイルスである。レンチウイルスという名前は、遅いウイルスを意味し、疾患の発症に長時間かかることからそのように命名されている。大部分のレンチウイルスは、免疫系の細胞を標的とし、したがって疾患は、多くの場合、免疫不全として特徴付けられる。レンチウイルスには、霊長類、羊およびヤギ、ウマ、ネコ、ならびにウシに感染する、五種類の血清群が知られている。二種類のHIV、即ちHIV-1およびHIV-2が存在する。これらは、疾患の発症時間がHIV-2の方が長いものの、臨床的には識別できない疾患を引き起こす。HIVおよびAIDSの世界的流行はHIV-1が原因である。HIV-2は、西アフリカにほぼ限定されている。感染患者においてHIVは、これまでは抗HIV抗体の存在、またはウイルスRNAを検出するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いてウイルスそのものの存在によって検出されてきた。PCRは非常に高感度であり、免疫学的に発見できない状態のHIVも示すことができる。1970年代後半以降、HIVおよびAIDSは米国および世界中に広がった。サハラ砂漠以南のアフリカでは、2500万人を超える人々がHIVに感染した状態で生活し、世界中では毎年300万人がAIDSで死亡している。ヒト免疫不全ウイルスHIV-1およびHIV-2は、遺伝子構造、ヌクレオチド配列および病原性に関して、様々な霊長類に存在しているレトロウイルス、SIVに似ている。
【００６３】
成熟したHIVウイルスは、ウイルスゲノム、即ち短い二本鎖のリボ核酸(RNA)を、酵素、即ち逆転写酵素、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼおよびインテグラーゼと一緒に含む棒状の電子密度の高いコアからなり、これらは全て、CD4レセプターを有する標的細胞へのウイルスの結合を助ける抗原、gp120を含む72個の表面突起を持つ外側の脂質エンベロープ内に封入されている。HIVのゲノムは、一般的なレトロウイルスと同様に、三種類の主要遺伝子、即ちgag、polおよびenvを含んでいる。envがコードする主要な構造成分としては、外側のエンベロープ糖タンパク質gp120および糖タンパク質前駆体gp160に由来する膜貫通糖タンパク質gp41を含むエンベロープ糖タンパク質が挙げられる。gag遺伝子がコードする主要成分としては、コアヌクレオカプシドタンパク質p55、p40、p24 (カプシド、または「コア」抗原)、p17 (マトリックス)およびp7 (ヌクレオカプシド)が挙げられ、polがコードする重要タンパク質は、酵素タンパク質p66およびp51 (逆転写酵素)、p11 (プロテアーゼ)およびp32 (インテグラーゼ)である。大部分の主要HIVウイルスタンパク質は、p24 (コア抗原)およびgp41 (エンベロープ抗原)を含めて免疫原性が高く、抗体反応はウイルスの負荷および宿主の免疫反応能に応じて変わる。これら各種成分の免疫原性は、大部分のHIV検査の基礎となる、抗体検出のための手段を提供している。
【００６４】
HIVは、逆転写酵素のエラー率を主な原因とする突然変異を容易に起こすさらなる能力も有しており、これが取り込まれるヌクレオチド2000当たり約1つの突然変異を誘発する。この高い突然変異率が、免疫攻撃に耐えることができ、細胞毒性がより強く、より容易に合胞体を作ることができ、または薬物治療に抵抗することができるHIV変異体を感染患者の細胞内に出現させる。時間と共に様々な体組織が様々なHIV株を持つことになり得る。
【００６５】
HIV-1およびHIV-2の遺伝子配列は、部分的にしか相同性ではない。HIV-2、またはまだ特徴付けされていないHIV群ウイルスのメンバーは、HIV-1抗体についての各種検査試験を用いた場合、必ずしも検出されない。HIV-2は遺伝的にはHIV-1よりもサル免疫不全ウイルス(SIV)とより近い関係にある。
【００６６】
B型肝炎は、このウイルスを排除できない患者に急性肝炎および慢性肝炎の両方を引き起こす。確認されている伝染の方法としては、血液、輸血(現在は稀)、入れ墨(アマチュアまたは専門家が行った場合の両方)、水平伝播(性的にまたは血液もしくは体液との接触を通して)、または垂直伝播(母親からその胎児へ)が挙げられる。しかしながら、約半数の例では、感染源は決定できない。B型肝炎はヘパドナウイルスであり、直径42nmの糖タンパク質エンベロープ(表面抗原)に囲まれた直径27nmの正20面体のヌクレオカプシド(コア抗原)に封入されている、一部が二本鎖の一本鎖DNAゲノムである。即ちウイルスは二つの殻を持っている。コア抗原は肝臓には見られるが、血液中には見られない。抗コア抗体は、血中に検出される。表面抗原は、ウイルスによって大量に産生され、直径22nmの、全体が糖タンパク質から構成された小球体および棒状体として血流中に流入する。その中の、電子顕微鏡下、直径42nmの大型の球体は、未変性ビリオンのデーン(Dane)粒子である。HEタンパク質は、キャリアーの血液中に存在し、ウイルス血症と関係している。
【００６７】
C型肝炎(元々は「非A非B肝炎」と呼ばれた)は、血液との接触(性的接触を含む)を通して伝染する。それは最終的に硬変に至る慢性型の肝炎を起こすことがある。それは、10〜20年間無症候状態を続けることもある。C型肝炎にはワクチンはない。C型肝炎患者は、A型肝炎またはB型肝炎のいずれかと接触すると、重症肝炎化しやすく、そのために全てのC型肝炎患者は、まだ免疫されていない場合には、A型肝炎およびB型肝炎に対し免疫化すべきである。しかしながらC型肝炎そのものが非常に致死的なウイルスであり、肝硬変の原因となる。ウイルスは、初期に発見された場合は、インターフェロンと抗ウイルス剤のリバビリンの併用により治療できる。この治療レジメンに対する反応は、感染しているウイルスの遺伝子型により変わる。ウイルスは、約10,000ヌクレオチドの一本鎖RNAゲノム、カプシド、マトリックスおよびエンベロープを含む。それは、3つの構造タンパク質(C、E1、E2)および下記の抗原：c100、c22、c33、c300、5-1-1を形成する4〜6つの非構造タンパク質(NS1、NS2、NS3、NS4、NS5)に断片化される単一のポリタンパク質前駆体をコードしている。他の成分は、プロテアーゼ、RNAポリメラーゼおよび転写酵素であるが、逆転写酵素ではない。HCVの構造は、血中および組織中のウイルス粒子の濃度が非常に低いため、ウイルスを電子顕微鏡で見ることができないために分かっていない。おそらく血液中では、1ml当たり1〜10ビリオンしか存在していないだろう。HCVは、その原型は黄熱病ウイルスであり、特に動物に急性の病気だけを引き起こすフラビウイルスに似ている。HCVは、B型肝炎ウイルスのように宿主DNAの中に組み込まれない。HCVは非常に高い突然変異率を有しており、多くの類似種を産生する。この変異性が、抗体に対する耐性の原因である。
【００６８】
RSVは、麻疹、パラインフルエンザおよび流行性耳下腺炎ウイルスを含むパラミクソウイルス科のメンバーである。RSウイルス(RSV)は、主に小児に下部気道感染を起こすマイナス鎖RNAウイルスである。このウイルス感染の処置に利用可能なワクチンまたは有効な治療剤(therapeutic)は今のところ存在しない。ウイルスRNAの転写および複製にはいくつかのタンパク質が関与している。RSVがコードするリンタンパク質は、ウイルスの複製に必要である。リンタンパク質は、オリゴマーを形成し、構成的にリン酸化される。しかしながら、これら事象の機能的意義はまだ決定されていない。RSVは、パラミクソウイルス科の他のメンバーのようなHN (ヘマグルチニンノイロミニダーゼ)タンパク質を持っていないが、その代わりGタンパク質を持っている。マトリックスタンパク質Mは、エンベロープの内面を裏打ちしている。Fタンパク質は、細胞融合に関与する。
【００６９】
ロタウイルスAロタウイルスは、レオウイルス科の直径70nmの正20面体カプシドを有する非エンベロープウイルスである。その名称は、電子顕微鏡で見た時の車輪に似たその外観に由来するものである(ロタとはラテン語で車輪を意味する)。そのゲノムは、三層のウイルスの内側のコア内に保持された11の二本鎖RNAのセグメントから出来ている。ゲノムは、6つのウイルスタンパク質(VP1、2、3、4、6、7)および6つの非構造タンパク質(NSP1〜6)をコードしている。一度小腸内に入ると、ウイルスは変化して柔毛に対し感染性となる。すると、タンパク質が宿主細胞内への侵入およびウイルスゲノムの複製を媒介する。
【００７０】
結核菌は、結核の原因となる媒介物であり、マイコバクテリア属のメンバーである。他のメンバーとしては、ハンセン病の原因となる媒介物であるライ菌(M. leprae)がある。マイコバクテリアは、増殖が非常に遅い傾向があり、結核菌は絶対好気性菌である。結核(TB)は第一の全世界的な致死的感染病である。世界保健機構(The World Health Organization)は、20億人が潜在的TBであり、その他に世界中で毎年300万人の人々がTBで死亡していると推定している。TBは多くの抗生物質を用いて治療されているが、それらに対し直ぐに耐性になる。平均すると、イソニアジド(INH)耐性率は約10%であり、リファンピン耐性率は約1%であり、TBプログラムが良好な国ほど数値は低く、TBプログラムが不良な国ほど数値は高い。ヒトは、結核菌について知られている唯一の保菌体である。TBは飛沫核により伝染し、飛沫核には10未満の桿菌が含まれるだろう。TBへの暴露は、感染している患者と空気空間を共有することによって起こる。吸入されると、飛沫核は肺の末端空気空間に沈積する。桿菌に出会うと、マクロファージはこれを摂食し、菌を局所のリンパ節に運ぶ。
【００７１】
II. ウイルスおよび細菌のPL領域
本発明者らは、一つまたは複数のPLモチーフを同定し、PDZタンパク質に結合することを示すことによって、ウイルスおよび細菌のPLタンパク質を発見した。これらのタンパク質は、様々なPLモチーフを有している。指定されたウイルスおよび細菌について以下のPLタンパク質が同定され、そのPLモチーフを表1に示した。本発明者らにより同定されたPDZ結合パートナーを表1および2に示す。
【００７２】
次に、いくつかのウイルスおよび細菌のタンパク質の活性について説明する。関係するウイルスおよび細菌、例えば同じ科のウイルスおよび同じ属の細菌は、同一のPLタンパク質、かつ同一のPLモチーフも有すると思われている。しかしながら、表1AおよびBに見られるように、HIV-1およびHIV-2のEnvタンパク質について同定されたモチーフは異なっていた。この差異は、診断アッセイでのHIV-1またはHIV-2の鑑別に用いることができる。
【００７３】
本発明者らは、HIVタンパク質Nefが、モチーフFKNC (SEQ ID NO:244)、FKDC (SEQ ID NO:245)、YKNC (SEQ ID NO:246)およびYKDC (SEQ ID NO:247)を有するPLタンパク質であることを発見し、多くのPDZタンパク質結合パートナーを同定した。HIV-1 Nefは、元々は「ネガティブファクター」と命名されていたが、ウイルスの複製および病因に積極的役割を有していることが示されている。Nefは、宿主のシグナル伝達タンパク質と相互作用して、感染T細胞に長期の生存、および非感染T細胞の破壊(アポトーシスを誘導することによって)もたらすウイルスタンパク質である。Nefは、また、CD4およびMHCタンパク質(CD4はT細胞活性化で機能する膜内タンパク質であり、HIVウイルスのレセプターである)を含む細胞表面タンパク質のエンドサイトーシスおよび分解を進める。この作用は、おそらくは細胞傷害性T細胞の機能を障害し、それによってウイルスの宿主免疫反応の侵害を助けているだろう(例えばSchwartz, et al., 1996)。このようにしてこの多機能タンパク質は、高いウイルス負荷の維持および宿主免疫防御の克服を助け、AIDSの進行を助長している。Nef遺伝子を欠損しているHIV-1株に感染したヒトが、HIV標準株に感染したヒトに比べAIDS症状の進行が遙かに遅いことは驚くに値しない。それ故にNefは、AIDS進行の薬学的介入にとって有用な標的になるだろう。Nefは、感染後の組み込みに関与する27kDのN末端がミリスチル化されたアクセサリータンパク質である。Nefは、ウイルス粒子内に見出され、宿主細胞侵入後に最初に検出されるタンパク質の一つである。
【００７４】
本発明者らは、HIVタンパク質のVifがモチーフEILA (SEQ ID NO:251)、GILA (SEQ ID NO:252)、およびDILA (SEQ ID NO:253)を有するPLタンパク質であることを発見し、多くのPDZ結合パートナーを同定している。1型ヒト免疫不全ウイルス(HIV-1)のVifタンパク質は、一次リンパ細胞および骨髄細胞内でのウイルス複製には必須であるが、いくつかの形質転換したT細胞株ならびにHeLaおよび293Tなど非リンパ細胞株内での効率的な複製にとって重要ではない。Vif欠損HIV-1(HIV-1ΔVif)の複製をサポートできない細胞は「非許容性」と呼ばれ、一方HIV-1ΔVifの複製をサポートできる細胞は「許容性」と呼ばれる。非許容性細胞と許容性細胞の融合により作られたヘテロカリオンが非許容性の表現系を示すという観察から、非許容性細胞は、許容性細胞ではこれを欠いているが、ウイルスVifタンパク質で遮断されるHIV-1複製のインヒビターを発現する、という仮説が立てられた。HIV-2のヌクレオカプシド(NC)タンパク質(NCp8)は、ジンクフィンガーモチーフ(ZFM)として働く二つのCys-His列を含む。
【００７５】
本発明者らは、Envが両HIVウイルスのPLタンパク質であることを発見した。HIV-2タンパク質Envは、モチーフIALL (SEQ ID NO:248)、LALL (SEQ ID NO:249)、およびLTLL (SEQ ID NO:250)を有することが見出された。HIV-1 Envは以下のPLモチーフ、RALL (SEQ ID NO:242)およびRILL (SEQ ID NO:243)を有していた。レンチウイルスファミリーだけでなくレトロウイルスファミリーの関連ウイルスでは、ウイルスタンパク質Nef、Vif、およびEnvは、同一の機能および関連PLモチーフを有すると思われる。
【００７６】
本発明者らは、RSV核タンパク質NPがPLモチーフDVEL (SEQ ID NO:259)を有するPLタンパク質であることを確認し、多くのPDZ結合パートナーを同定した。RSV NPは、RNAゲノムに密接に関係して見出すことができる。RSVタンパク質NPは、本明細書において、モチーフDVEL (SEQ ID NO:259)を有するPLタンパク質であることが見出されている。
【００７７】
本発明者らは、ロタウイルスVP4およびVP7がPLタンパク質であることを発見し、VP4についてはQCKL (SEQ ID NO:260)およびQCRL (SEQ ID NO:261)を、VP7についてはYYRV (SEQ ID NO:262)およびYYRI (SEQ ID NO:263)を含む、これらに関係する多くのPLモチーフを同定した。VP4およびVP7は、ロタウイルスの外側カプシドを作り上げている。VP4は、二量体化してウイルス表面に60個のスパイクを作る88kDaのタンパク質である。VP4は、膵臓の酵素トリプシンにより開裂されVP5およびVP8をが形成される。VP4およびその開裂生成物は、細胞接着および侵入と関連しており、感染には開裂が必要である。VP4は抗原性であり、中和抗体を誘導する。このタンパク質の特異的な構造を用いて、ロタウイルスPの血清型、ならびに宿主特異性、毒性および防御免疫が決定される。このことは、また、細胞侵入中の熱ショック同族タンパク質、hsc70にも関係付けられている。この37kDの糖タンパク質は、外側カプシドの平滑部分を作り上げている。それは、中和抗体を誘導し、G血清型を決定することができる。それはまた再集合、およびウイルスの動物株間でクロスオーバーが可能と思われる可変性の高いウイルス部分でもある。VP7は、熱ショック同族タンパク質(hsc70)およびいくつかのインテグリンとも関係しており、これらは共にウイルスの細胞侵入に関係している。
【００７８】
同定された別のロタウイルスタンパク質PLは、NSP2およびNSP5であり、NSP2についてはQVGI (SEQ ID NO:264)、HIGI (SEQ ID NO:265)、QIGI (SEQ ID NO:266)、およびRIGI (SEQ ID NO:267)を、NSP5についてはIKDL (SEQ ID NO:268)およびIEDL (SEQ ID NO:269)のPLモチーフを有している。NSP2は、NSP5と一緒にウイルスRNAの合成およびパッケージング、ならびにビロプラズム(viroplasm)の作製に関与している。NSP2は、複製中間体である。NSP5リンタンパク質は、RNA合成およびパッケージングにNSP2と共に作用し、ビロプラズムを誘導する。これも複製中間体である。
【００７９】
本発明者らは、結核菌について、NSXNについてはSSWA (SEQ ID NO:270)、ESXSについてはYTGF (SEQ ID NO:271)、およびESAT-6についてはGMFA (SEQ ID NO:272)のPLモチーフを有する三つのPLタンパク質を同定した。結核菌に由来する6-kDaの初期分泌抗原性標的(ESAT-6)および10-kDaの培養濾過タンパク質(CFP-10)は、感染初期におけるT細胞の二つの主要標的である。よりさらには、ESAT-6が、サブユニットまたはDNAワクチンのいずれかとして投与された時に、防御免疫を誘導することが最近証明された。ESAT-6よびCFP-10 (それぞれesxおよびlhp)をコードする遺伝子は、オペロン様構造の中に互いに隣り合って存在している。M.ボビス(M.bovis)でのESAT-6およびCFP-10の二重ノックアウトは、病原体の毒性を低下させ、このことはこれら二つの分子が免疫病原性および毒性に重要な役割を果たしている可能性を示唆している。ESXNおよびESXSは、ESAT-6ファミリーの2つのメンバーである。
【００８０】
B型肝炎が二つのPLタンパク質を含むことが本発明者らにより見出されており、タンパク質XはFTSA (SEQ ID NO:254)であり、S抗原はPLモチーフWVYI (SEQ ID NO:255)を有していた。B型肝炎はヘパドナウイルス科のメンバーである。
【００８１】
C型肝炎は、二つのPLタンパク質を含むことが本発明者らによって見出されており、カプシドCは、PASA (SEQ ID NO:256)およびPVSA (SEQ ID NO:257)を含む複数のPLモチーフを有し、E1aは、PLモチーフGVDA (SEQ ID NO:258)を有していた。HCVは、黄熱病ウイルス、デング熱、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎および西ナイルウイルスを含む他のファミリー構成メンバーと共にフラビウイルスと呼ばれている。
【００８２】
III. PDZタンパク質
PDZドメインは、原形質膜のタンパク質複合体の中心となる形成体であることが最近明らかになった。PDZドメインは、元々は、シナプス後高密度タンパク質(postsynaptic density protein)PSD95/SAP90、ショウジョウバエ腫瘍抑制因子dlg-A、およびタイトジャンクションタンパク質ZO-1内に保存されている配列要素として同定された。元々はGLGF (SEQ ID NO:275)またはDHRモチーフと呼ばれていたが、それらは現在、これら三つの初期PDZ含有タンパク質を表す頭文字で知られている(PDZ: PSD95/DLG/ZO-1)。現在これら80〜90アミノ酸配列は、75を超えるタンパク質に同様に同定されており、単一タンパク質内に複数のコピーが特徴的に発現している。National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.gov)によって、PDZドメインは、例えばPfamのファミリーとして認識されている。それらは原生動物、植物および細菌といった様々な生物に、系統樹全体で見出されている。このような広範囲の種に分布することはこのドメインに特有であるが、おそらくPDZドメインを最も際立たせる特徴は、これらを含むタンパク質の圧倒的大多数が、原形質膜に関係しているという知見である。PDZドメインは多くの様々な構造に見出せるが、各PDZタンパク質は、一般的にはシナプス、細胞間接触、または頂部、基部、もしくは側部細胞表面などの特定の細胞下ドメインに限定されている。このことは、PDZドメインが初期に進化して、原形質膜ドメインの形成に中心的な役割を提供したという推測をもたらす。PDZドメインの最も一般的な機能は、それらのリガンドを適切な原形質膜ドメインに局在化させることであろう。極性化した上皮細胞では、PDZドメインは、はっきり区別される頂部、基部-側部および接合部の膜ドメインに明瞭に局在しており、多くの場合、それらの膜貫通および細胞質内結合パートナーと共存している。PDZタンパク質は、また、明らかに、膜貫通タンパク質を特定の細胞下ドメイン内に空間的に集合させて固定するという基本的な役割も有している。
【００８３】
本発明者らは、以下を含む、表1に見られるウイルスおよび細菌のPLの結合パートナーであるPDZタンパク質を同定した：AF6、AIPC、AIPC (PDZ #1)、GORASP1 (PDZ #1)、INADL (PDZ #3)、KIAA0316、KIAA1284、EBP50 (PDZ #1)、(Shank1; Shank2; Shank3; シンテニン; Magil (PDZ #1); Tip1; Mint1 (PDZ #1,2); 新規セリンプロテアーゼ; MUPP1 (PDZ#3,7,9,11)、MAST2、NSP、NOS1、PAR3 (PDZ #3)、PAR3L (PDZ #3)；PAR5β、RiM2、ロドフィリン様、SIP-1、SITAC-18 (PDZ #2)、SITAC-18 (PDZ #1)、SIP1、ZO-1 (PDZ #1)、ZO-3 (PDZ #1)、DVL3、DVL2 (PDZ #1)、PTPL1 (PDZ #4)、HEMBA 10003117、Pick1 (アクセッション番号は表2に示す)。
【００８４】
PDZドメインは、5〜6つのβ-ストランドおよび2つのα-ヘリックスからなるβサンドイッチを有する構造に折り畳まれる約80〜90残基を含む。ペプチドリガンドは、β-ストランド(bB)、α-ヘリックス、およびペプチドのカルボキシラート基を結合するループから構成された疎水性間隙内で結合する。ペプチドは、bBストランドに逆平行の形で結合し、C末端残基が疎水性ポケットを占有する。PDZヘテロダイマーは、パートナータンパク質の一つに内部認識を含む直線状の頭-尾型の配置を形成する。PDZドメインタンパク質は、当技術分野で公知であり、タンパク質の配列を決定することおよびPDZドメインの存在を識別することによって、新規タンパク質がPDZドメインを有すると識別することができる。PDZタンパク質は詳細に説明されており、多くの例が2004年8月2日出願の米国特許出願第10/485,788号に示されている。あるいは、PDZタンパク質と思われるタンパク質は、様々なPLタンパク質またはPLタンパク質PL分類との結合について試験できる。PDZドメインの例は、表2に見ることができる。
【００８５】
表2に掲載したPDZタンパク質は、野性型PDZドメインを含む天然のタンパク質である。機能的変異体PDZドメインを含むポリペプチドは、PDZドメインが構造レベルで十分に特徴付けされていることから、容易に設計される。例えば、PDZドメインの三次元構造はDoyle (Cell 1996 95:1067-1076)に詳しく記載および論じられており、複数のPDZドメインの構造が結晶学によって決定されている。
【００８６】
本明細書において特定のPDZドメイン含有ポリペプチドを参照する場合、例えばDLG1 PDZドメイン含有ポリペプチドを参照する場合、参照は野性型PDZドメインを含むポリペプチド、およびPDZリガンド結合活性を保持しているその変異体を包含するものとする。
【００８７】
(表1Ａ)実験的に決定された相互作用
2009503439.tif 000030
【００８８】
(表1Ｂ)予想相互作用
2009503439.tif 000031
2009503439.tif 000032
【００８９】
IV. PDZタンパク質とPLタンパク質の相互作用
表1Aおよび1Bは、実施例1で互いに結合することが識別されたPDZドメイン含有タンパク質(「PDZタンパク質」)および病原体PDZリガンドタンパク質(「PLタンパク質」)のリストである。各病原体PLタンパク質は、少なくとも一つのPDZタンパク質に対し結合親和性を有している。表1Aおよび1Bの第1縦列は、PLタンパク質由来の病原体を記載しており；第2縦列は、PL含有の遺伝子を記載しており；第3縦列は各タンパク質のGenBank識別番号(GI番号)を示しており(データベース登録は、その中に記載されているあらゆる注釈を含めて、参照によって本明細書に組み入れられる)；第4縦列は、PLタンパク質のC末端の4つのアミノ酸を示しており；第5縦列はPLのSEQ ID NOを記載しており、第6縦列は各PLに結合親和性を有しているPDZタンパク質を記載している。表1Aおよび1Bに示したタンパク質は、ウイルスおよび細菌のPLタンパク質の代表例である。表1Aは、実施例1〜5の方法を用いて実験的に識別されたPDZ/PL相互作用を示す。表1Bは、PDZアレイ研究および相互作用に基づくARBOR VITA専用データベースを用いたC末端配列分析に基づいて実施された相互作用予測を示す。
【００９０】
表1Aおよび1Bは、HIV-1およびHIV-2の場合には、様々なサブグループまたは株に特徴的な配列も含んでいる、いくつかのレトロウイルス、フラビウイルス、およびパラミクソウイルスのエンベロープタンパク質のC末端配列を示している。例えば、HIV-1およびHIV-2エンベロープタンパク質の場合は、各株のコンセンサス配列が示されている。表に示したPDZパートナーの多くは、両方のPLモチーフに結合できるが、いくつかは、本明細書の実施例において二つのHIV-1 PLペプチドを用いて示されるように、どちらか一方のみに結合する。
【００９１】
表2は、表1のウイルスおよび細菌のPLタンパク質への結合についてスクリーニングされたPDZタンパク質のリストである。表2はまた、PLタンパク質への結合について試験できる他のPDZタンパク質のリストでもある。表2はまた、GST-PDZ融合タンパク質産生のためにベクター(PGEX-3Xベクター) (Pharmacia)内にクローニングしたPDZドメインの配列も記載している。より具体的には、「遺伝子名」と題する第1縦列(左から右)は、PDZドメインを含む遺伝子の名称を記載している。「GIまたはAcc#」と名付けられた第2縦列は、記載した配列のPCR増幅のためのプライマーを設計するために用いる遺伝子の固有Genbank識別子である。次の「PDZ#」と印された縦列は、遺伝子のアミノ末端からカルボキシ末端方向に番号を付けた場合の、Pfam予測PDZドメイン番号を示す。「GSTコンストラクトに融合した配列」と題した最後の縦列は、コンストラクトのDNAシーケンシングで決定したGST-PDZ発現ベクター内に挿入された実際のアミノ酸配列を示している。PDZタンパク質は、それらが活性PDZドメインを有する限り、融合タンパク質として産生できる。
【００９２】
PDZドメインポリペプチドと候補のPDZリガンドポリペプチドとの間の結合を検出するための二種類の補完的アッセイ(AおよびGアッセイ)は、2004年8月2日出願の米国特許出願第10/485,788号、2003年11月14日出願の第10/714,537号に詳しく記載されている。二種類のアッセイそれぞれでは、一つまたは複数のPDZドメインに結合すると予想されるタンパク質のC末端に相当する配列を有するペプチド(即ちPLペプチド候補)と、PDZドメインポリペプチド(典型的にはPDZドメインを含む融合タンパク質)との間の結合が検出される。
【００９３】
A. PDZドメインポリペプチドとNMDAレセプターPLタンパク質との間の相互作用を検出するためのアッセイ
PDZドメインポリペプチドとPDZリガンド候補との間の結合を検出するために、「A」および「G」と呼ぶ二種類の補完的アッセイを開発した。二種類のアッセイそれぞれでは、一つまたは複数のPDZドメインに結合すると予想されるタンパク質のC末端に相当する配列を有するペプチド(即ちPLペプチド候補)と、PDZドメインポリペプチド(典型的にはPDZドメインを含む融合タンパク質)との間の結合が検出される。「A」アッセイでは、PLペプチド候補は固定されており、該固定されたペプチドへの可溶性PDZドメインポリペプチドの結合が検出される(「A」アッセイは、一つの態様でペプチドの固定にアビジン(avidin)表面を使用するという事実について名付けられている)。「G」アッセイでは、PDZドメインポリペプチドが固定されており、可溶性PLペプチドの結合が検出される(「G」アッセイは、PDZドメインポリペプチドの固定にGST結合表面を用いることから命名されている)。例示的アッセイを下記に記載する。
【００９４】
I. 「Aアッセイ」固定化PLペプチドを用いたPDZリガンド結合の検出
アッセイは下記のものを含む。ビオチン化PLペプチド候補はアビジンコーティングした表面に固定される。次にこの表面へのPDZドメイン融合タンパク質の結合を測定する。
【００９５】
(1)アビジンを、表面、例えばタンパク質結合表面に結合する。任意で、アビジンを、ポリスチレン製の96ウェルプレート(例えばNunc Polysorb (カタログ#475094))に、20μg/mLアビジン(Pierce)の、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝食塩水、pH 7.4(「PBS」、GibcoBRL)の溶液を4℃で12時間、1ウェル当たり100μL加えることで結合する。次に100mL当たり2gのプロテアーゼフリーのウシ血清アルブミンを含むPBS(「PBS/BSA」)を1ウェル当たり200μL加えて4℃で2時間プレートを処理し、非特異的相互作用をブロックする。次に、プレートの各ウェルに、1ウェル当たり200μLのPBSを繰り返し加えることによってプレートをPBSで3回洗浄し、次にプレートの中身を廃棄容器に捨て、プレートの乾燥表面を軽くたたく。
【００９６】
(2)4℃で30分間、0.4μMのペプチドのPBS/BSA溶液を1ウェル当たり50μL加えることによって、プレートのウェル表面にビオチン化PLペプチド(またはPLペプチド候補)を固定する。通常、多重測定(例えば、二回測定および別のものを用いた測定も(GST/PDZドメイン融合タンパク質およびGST単独の陰性対照)が行えるように、異なるペプチドそれぞれを少なくとも8つのウェルに加え、かつペプチドを固定化していない追加の陰性対照ウェルも準備する。PLペプチドを表面に固定化したらプレートをPBSで3回洗浄する。
【００９７】
(3)GST/PDZドメイン融合タンパク質を、5μg/mLのGST/PDZドメイン融合タンパク質を含むPBS/BSA溶液を1ウェル当たり50μL、4℃で2時間加えることによって、表面と反応させる。陰性対照として、GST単独(即ち融合タンパク質なし)を指定されたウェル、一般的には固定化ペプチドそれぞれについて少なくとも二つのウェル(即ち二回測定)に加える。2時間反応させた後、プレートをPBSで3回洗浄して未結合の融合タンパク質を取り除く。
【００９８】
(4)アビジン-ビオチン化ペプチド表面へのGST/PDZドメイン融合タンパク質の結合は、当技術分野で公知である様々な方法および検出装置を用いて検出できる。一つの態様では、抗GST抗体のPBS/BSA (例えば、2.5μg/mLのポリクローナルヤギ抗GST抗体、Pierce)を1ウェル当たり50μLプレートに加え、4℃で20分間反応させる。プレートをPBSで3回洗浄し、検出可能な標識第二抗体を加える。一つの態様では、2.5μg/mLの西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ポリクローナルウサギ抗ヤギ免疫グロブリン抗体を1ウェルあたり50μLプレートに加えて、4℃で20分間反応させる。プレートを0.2%のTween 20を含む50mMのTris、pH8.0で5回洗浄し、HRP基質液(TMB、Dako)を1ウェル当たり100μL加えて室温(RT)で20分間発色させる。HRPとその基質の反応を、1Mの硫酸を1ウェル当たり100μL加えて停止させ、プレートの各ウェルの光学密度(O.D.)を450nmで読みとる。
【００９９】
(5)PLペプチドとPDZドメインポリペプチドの特異的結合は、PLペプチドとPDZドメインポリペプチドが混合されたウェルから、シグナルとバックグラウンドシグナルを比較することによって検出される。バックグラウンドシグナルは、陰性対照に見られるシグナルである。典型的には、特異的または選択的反応は、バックグラウンドの少なくとも2倍、より典型的にはバックグラウンドより5倍より高く、最も典型的にはバックグラウンドより10倍以上高いと考えられる。これに加えて、統計学的に有意な反応は、シグナルとバックグラウンドが少なくとも2標準誤差、より典型的には標準誤差、および最も典型的には6またはそれ以上の標準誤差の違いを示す反応の多重測定を含む。したがって、シグナルの反復測定をバックグラウンドの反復測定と比較する統計学的検定(例えばT検定)は、P値＜0.05、より典型的にはP値＜0.01、および最も典型的にはP値＜0.001またはそれ以下を示すと考えられる。前述した通り、「A」アッセイの態様では、PLペプチドに曝されていない(即ち被覆されていない)アビジン表面へのGST/PDZドメイン融合タンパク質の結合からのシグナルは、一つの適切な陰性対照である(「B」と呼ばれることもある)。PLペプチドに曝された(即ち被覆されている)アビジンコーティング表面へのGSTポリペプチド単独の結合からのシグナルは、第二の適切な陰性対照(「B2」と呼ばれることがある)である。全ての測定が多数回(即ち少なくとも二回)測定されることから、結合の決定には数回の測定値の相加平均(または同等に、平均)が用いられ、結合測定の確率誤差の決定には平均値の標準誤差が用いられる。N回測定の平均値の標準誤差は、以下の平方根に等しい：各測定値と平均値の差の二乗の合計を、(N)と(N-1)の積で除したもの。即ち、一つの態様では、プレートに結合したPLペプチドへのPDZタンパク質の特異的結合は、特定のPL-PDZの組み合わせの平均シグナル(「平均S」)および該シグナルの標準誤差(「SE」)を平均値B1および/または平均値B2と比較することによって決定される。
【０１００】
II. 「Gアッセイ」-固定PDZドメイン融合ポリペプチドを用いたPDZリガンド結合の検出
一つの局面では、本発明は、GST/PDZ融合タンパク質が表面に固定されたアッセイ(「G」アッセイ)を提供する。次に、この表面への標識化PLペプチド(例えば表1に記載のそれらの一つ)の結合を測定する。好ましい態様では、アッセイは以下のようにして実施される。
【０１０１】
(1)PDZドメインポリペプチドを、表面、例えばタンパク質結合表面に結合させる。好ましい態様では、一つまたは複数のPDZドメインを含むGST/PDZドメイン融合タンパク質をポリスチレン製の96ウェルプレートに結合する。GST/PDZ融合タンパク質は、様々な標準的方法のどれによってもプレートに結合できるが、融合タンパク質をプレートへ結合する工程がPDZドメインのリガンド結合特性を変えないように注意を払わなければならない。一つの態様では、GST/PDZ融合タンパク質は、96ウェルプレート上にコーティングされた抗GST抗体を介して結合する。プレートへの適切な結合は、以下の場合に達成できる。
a. ポリスチレン製96ウェルプレートに、5μg/mLのヤギ抗GSTポリクローナル抗体(Pierce)のPBS溶液を1ウェル当たり100μL、4℃で12時間加える。
b. PBS/BSAを1ウェル当たり200μL、4℃で2時間加えることによりプレートをブロッキングする。
c. プレートをPBSで3回洗浄する。
d. 5μg/mLのGST/PDZ融合タンパク質)または陰性対照としてGSTポリペプチドのみ(即ち融合タンパク質でない)のPBS/BSAを1ウェル当たり50μL、プレートに4℃で2時間加える。
e. プレートを再度PBSで3回洗浄する。
【０１０２】
(2)ビオチン化PLペプチドを、ビオチン化ペプチドのPBS/BSAの20μM溶液を1ウェル当たり50μL、4℃で10分間加え、続いて25℃でさらに20分間インキュベートして表面と反応させる。プレートを、氷冷したPBSで3回洗浄する。
【０１０３】
(3)GST/PDZ融合タンパク質表面へのビオチン化ペプチドの結合は、様々な方法および検出装置を用いて検出できる。例示的手順では、BSA/PBSに溶解した0.5μg/mLのストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)複合体を1ウェル当たり100μL加えて、4℃で20分間反応させる。次にプレートを0.2%のTween 20を含む50mMのTris、pH8.0で5回洗浄し、HRP基質液(TMB、Dako)を1ウェル当たり100μL加えて室温(RT)で20分間発色させる。HRPとその基質の反応を、1Mの硫酸を1ウェル当たり100μL加えて停止させ、プレートの各ウェルの光学密度(O.D.)を450umで読みとる。
【０１０４】
(4)PLペプチドとPDZドメインポリペプチドの特異的結合は、PLペプチドおよびPDZドメインポリペプチドが混合されているウェルからのシグナルと、バックグラウンドシグナルを比較することによって検出される。バックグラウンドシグナルは、陰性対照に見られるシグナルである。典型的には、特異的または選択的反応は、バックグラウンドの少なくとも2倍、より典型的にはバックグラウンドより5倍より高く、最も典型的にはバックグラウンドより10倍またはそれ以上高い。これに加えて、統計学的に有意な反応は、シグナルとバックグラウンドが少なくとも2標準誤差、典型的には4標準誤差より大きな、最も典型的には6またはそれ以上の標準誤差の違いを示す反応の多重測定を含む。したがって、シグナルの反復測定をバックグラウンドの反復測定と比較する統計学的検定(例えばT検定)は、P値＜0.05、より典型的にはP値＜0.01、および最も典型的にはP値＜0.001またはそれ以下を示すだろう。前述した通り、「G」アッセイの態様では、所与のPLペプチドの固定化された(表面結合)GSTポリペプチド単独への結合からのシグナルは、一つの適切な陰性対照である(「B1」と呼ばれることもある)。全ての測定が多数回(即ち少なくとも二回)測定されることから、結合の決定には数回の測定値の相加平均(または同等の平均)が用いられ、結合測定の確率誤差の決定には平均値の標準誤差が用いられる。N回測定の平均値の標準誤差は、以下の平方根に等しい：各測定値と平均値の差の二乗の合計を、(N)と(N-1)の積で除したもの。即ち、一つの態様では、プレート結合ペプチドへのPDZタンパク質の特異的結合は、特定のPL-PDZの組み合わせの平均シグナル(「平均S」)および該シグナルの標準誤差(「SE」)を平均値B1と比較することによって決定される。
【０１０５】
i) 「G'アッセイ」および「G”アッセイ」
「Gアッセイ」に関する前記特定条件について、二つの特異的な変更が特に有用である。変更されたアッセイでは、前記特定条件に比べると使用する標識化PLペプチドが少なく、PDZリガンド結合の検出に関する生化学的要件が若干異なる。
【０１０６】
本節に記載するアッセイ条件は、「G'アッセイ」および「G”アッセイ」と呼び、該Gアッセイの節に記載された特異的条件は「G0アッセイ」と呼ぶ。「G'アッセイ」は、段階(2)でのペプチド濃度が20uMでなく10uMである以外は「G0アッセイ」と同一である。その結果、親和性が低い、および/または解離速度が速い相互作用の検出感度が若干低くなる。したがって、検出された相互作用が、親和性が十分なものであり、半減期が生物学的に重要であり、かつ治療標的として有用であることの確実性が若干高くなる。
【０１０７】
「G”アッセイ」は、段階(2)でのペプチド濃度が20μMではなく1μMであること、およびインキュベーション(例えば、4℃で10分間に続き25℃で20分間ではなく)が25℃で60分間行われること以外は「G0アッセイ」と同一である。その結果、親和性が低く、解離速度が速く、および/または親和性が4℃よりも25℃で低い相互作用の検出感度が低くなる。相互作用は、(我々がPDZリガンド結合については概ね当てはまることを見出しているように)反応エントロピーが負の場合(即ち生成物のエントロピーが反応物のエントロピーよりも低い)には、4℃よりも25℃で親和性が低くなるだろう。これに対して、会合および分離速度が遅い相互作用については、PDZ-PL複合体が「G”アッセイ」の長いインキュベーション中に蓄積するために、PDZ-PL結合シグナルは「G”アッセイ」と「G0アッセイ」で似たものになるだろう。かくして「G”アッセイ」および「G0アッセイ」の結果の比較を用いて、各種PDZ-PL相互作用の相対エントロピー、エンタルピーおよび動態を推定できる。(エントロピーおよびエンタルピーは、方程式ΔG = RT ln (Kd) = ΔH - TΔSが導かれる結合親和性に関係し、式中のΔG、HおよびSはそれぞれ反応自由エネルギー、エンタルピー、およびエントロピーであり、Tはケルビン単位の温度であり、Rは気体定数であり、Kdは平衡解離定数である)。特に「G0アッセイ」だけに検出されるか、またははるかに強く検出される相互作用は、一般的に25℃での速い解離速度(t1/2<10分間)および負の反応エンタルピーを有しているのに対し、「G”アッセイ」でも同様に強く検出される相互作用は、一般的に25℃において遅い解離速度(t1/2>10分間)を有している。PDZ-PL相互作用の熱力学および動態の大まかな推定(「G0アッセイ」対「G”アッセイ」の結果を前記概略したように比較することで達成できる)は、相互作用の効率的なインヒビターの設計に利用できる。例えば、所与のPDZドメインからゆっくり解離する(「G”アッセイ」での結合が「G0アッセイ」での結合に似ていることで証明される) PLの化学構造に基づく低分子インヒビターは、それ自身ゆっくり解離することから、親和性は高いだろう。
【０１０８】
このようにして、「Gアッセイ」の段階(2)の温度および期間を変えることで、PDZリガンド結合反応の動態および熱力学、ならびに反応のインヒビターの設計について洞察することができる。
【０１０９】
本発明の検出可能な標識物は、分子(上記したような)に直接的にまたは間接的に結合される任意の検出可能な化合物または組成物であり得る。標識物は、それ自体検出可能であるか(例えば、放射性同位元素標識物または蛍光標識物)、または酵素標識物の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒することができる。好ましい標識物は、非放射活性の呈色試薬の色変化を触媒する酵素標識物である。
【０１１０】
しばしば、標識物を、抗体に間接結合させることがある。例えば、抗体をビオチンに結合させることができ、かつ上述の任意の部類の標識物にアビジンを結合させることができるか、またはその逆ができる(上記「A」および「G」アッセイも参照されたい)。ビオチンはアビジンに選択的に結合することから、したがって、この間接的な様式で標識物を抗体に結合することができる。ビオチン-アビジン結合および類似のアッセイを含む技術の考察については、前記Ausubelを参照されたい。あるいは、標識物と抗体との間接的な結合を達成するためには、抗体に小型のハプテン(例えばジゴキシン)を結合し、上述の別のタイプの標識物の一つを抗ハプテン抗体に結合させる(例えば抗ジゴキシン抗体)。そうすることで、抗体と標識物との間接的結合を達成できる。
【０１１１】
アッセイの変形は、様々な洗浄段階を含み得る。「洗浄」とは、固相を、そこから未結合物質(例えば、非接着細胞、非接着捕捉剤、未結合のリガンド、レセプター、レセプターコンストラクト、細胞溶解物、またはHRP抗体)が除去されるように、水性液(通常は緩衝液または細胞培地)に曝すことを意味する。バックグラウンドノイズを下げるためには、洗浄液に界面活性剤(例えば、Triton X)を加えると好都合である。通常、水性洗浄溶液は、洗浄後にアッセイプレートのウェルから移される。好都合には、洗浄は、自動洗浄装置を用いて行うことができる。しばしば、複数の洗浄段階(例えば、約1〜10回の洗浄段階)が求められることもある。
【０１１２】
PDZ-PL検出アッセイには、様々な緩衝液も用いることができる。例えば、各種ブロッキング緩衝液を用いて、アッセイのバックグラウンドを下げることができる。用語「ブロッキング緩衝液」は、PLまたはPDZでコーティングされていない基質の露出面に結合できる、少なくとも一つのブロッキング化合物を含む、水性の、pH緩衝化された溶液を指す。ブロッキング化合物は、通常は、ウシ血清アルブミン(BSA)、ゼラチン、カゼイン、または粉乳のようなタンパク質であり、アッセイのどの試薬とも交差反応しない。ブロック緩衝液は、一般的には、約7〜7.5の間のpHで提供され、リン酸塩およびTRISを含む適切な緩衝化剤である。
【０１１３】
PDZ-PL相互作用の検出には、様々な酵素-基質の組み合わせも用いることができる。酵素−基質の組み合わせの例としては、例えば以下のものが挙げられる。
(i) 水素ペルオキシダーゼが染料前駆体(例えばオルトフェニレンジアミン［OPD］または3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンヒドロクロリド［TMB］)を酸化する(上記)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRPO)と基質としての水素ペルオキシダーゼの組み合わせ。
(ii) アルカリホスファターゼ(AP)と発色基質としてのパラ-ニトロフェニルホスファートの組み合わせ。
(iii) β-D-ガラクトシダーゼ(βD-Gal)と発色基質(例えばp-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシダーゼ)または蛍光基質、4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシダーゼの組み合わせ。他の様々な酵素-基質の組み合わせが利用できる。これらの一般的評論については、共に参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第4,275,149号および第4,318,980号を参照されたい。
【０１１４】
(表２)例示的ヒトPDZドメイン
2009503439.tif 000033
2009503439.tif 000034
2009503439.tif 000035
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＊：このPDZドメイン含有タンパク質は、ラットShank3配列をヒトゲノムクローンAC000036に用いてコンピュータ上でクローニングし、ヌクレオチド6400-6496、6985-7109。7211-7400と一緒にインシリコでスプラシングして作製した理論上のヒトShank3であることから、GI番号は無い。
【０１１５】
VI. 他のPL結合作用物質のスクリーニング
診断アッセイに使用される適切なPL結合作用物質としては、一つまたは複数のPLモチーフに特異的に結合する任意の作用物質が挙げられる。このような作用物質は、抗ウイルス作用物質および抗細菌作用物質のスクリーニング方法で開示したものと同じ方法を用いて同定できる。例えば、作用物質は、PLモチーフを含むタンパク質を用いて同定できる。試験化合物は、例えば発現ライブラリーおよび低分子ライブラリーを含む任意のタイプのライブラリーを用いて同定できる。治療剤または治療リードのためのスクリーニングに使用する試験化合物の適切な供給源は、ファージディスプレイライブラリーである。たとえば、Devlin、WO 91/18980；Key, B.K., et al., eds., Phage Display of Peptides and Proteins, A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA, 1996を参照されたい。ファージディスプレイは、108〜109種類の配列を含むライブラリーから、ファージ遺伝学を用いて所望する特徴のペプチドまたはタンパク質を選択および増幅することができる強力な技術である。ライブラリーは、所望する位置のアミノ酸配列の多様性を選択して設計でき、ライブラリーを所望する特徴に偏向させることができる。ライブラリーは、ペプチドがバクテリオファージ表面上に表示される融合タンパク質として発現するように設計される。所望する特徴を持つペプチドを提示しているファージを選択し、再増殖させて拡大することができる。ペプチドはファージを継代することで増幅されるので、選択されたファージのDNAは容易に配列決定でき、選択されたペプチドの迅速な分析を容易にする。
【０１１６】
ペプチドインヒビターをコードするファージは、PDZドメインタンパク質および/またはPLタンパク質PLに特異的に結合するファージを選択することによって選択できる。ライブラリーは、ファージの表面に発現する、遺伝子IIIなどのタンパク質と融合して生成される。ライブラリーは、様々な長さを持つ、直線状もしくは二個のCysアミノ酸を含むことによって束縛されているか、ファージタンパク質と融合するか、または足場のような追加のタンパク質にも融合することができる、ペプチドから構成され得る。ライブラリーは、本明細書に開示したPL領域に偏向させるか、または最初のライブラリーからの結合ファージの選択から得たペプチド配列に偏向させ、追加の試験インヒビター化合物が得られるように設計することもできる。
【０１１７】
VII. 診断および治療使用のための抗体
本発明のPLタンパク質、PLタンパク質PL、PDZおよびPDZ PL結合ドメインポリペプチドは、診断および治療に使用するための抗体の生成に有用である。抗体は、ポリクローナル抗体でも、個別のモノクローナル抗体でも、または様々なエピトープ特性を有するプールしたモノクローナル抗体でもよい。モノクローナル抗体は、抗体のタイプにしたがって、標準的な方法により抗原を含むタンパク質の断片から作られる(例えばKohler, et al., Nature, 256:495, (1975); およびHarlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (C.S.H.P., NY, 1988) Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)、ならびにWO 90/07861；Dower et al., WO 91/17271およびMcCafferty et al., WO 92/01047 (それぞれは参照により、全ての目的について組み入れられる)を参照されたい)。ファージディスプレイ技術は、本発明のペプチドに親和性を有することが事前に示されている抗体のCDR領域を突然変異させるためにも用いることができる。いくつかの抗体は、ある形のPLタンパク質またはPDZタンパク質に存在するエピトープには結合するが、他のエピトープには結合しない。例えば、いくつかの抗体は、PLタンパク質のC末端のPL部位内のあるエピトープに結合する。特異的なPLタンパク質PLモチーフに結合するこれらの抗体は、PLタンパク質PLクラス特異的抗体として分類できる。さらには、いくつかの抗体は、PDZタンパク質のPDZドメイン内のエピトープに結合する。いくつかの抗体は、表2に示すようなPDZポリペプチドに特異的に結合するが、他には結合しない。いくつかの抗体は表1に示すようなPLタンパク質上のPLモチーフに特異的に結合する。抗体は、例えば、それに対し抗体を産生させたポリペプチドまたはペプチドが結合している支持体に結合させてから溶出することによって精製できる。
【０１１８】
用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、未変性抗体およびその結合断片を包含して用いられる。典型的には、断片は独立した重鎖、軽鎖Fab、Fab' F(ab')2、FabcおよびFvを含み、抗原断片への特異的結合に関してそれが由来する未変性抗体と競合する。断片は、組換えDNA技術によって、または未変性免疫グロブリンを酵素によりもしくは化学的に分離することによって産生できる。用語「抗体」はまた、他のタンパク質と化学的に結合されているか、または融合タンパク質として発現する、一つまたは複数の免疫グロブリン鎖も包含する。用語「抗体」はまた、二重特異性抗体も包含する。二重特異性抗体または二機能性抗体は、二種類の重/軽鎖のペア、および二つの結合部位を有する人工のハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合、またはFab'断片の連結を含む様々な方法によって産生することができる。例えばSongsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990)；Kostelnyら、J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)を参照されたい。
【０１１９】
抗体は、ウイルス感染および細菌感染ならびにそのサブタイプの予後診断および診断のための試薬(例えば、前もって包装されたキット)として利用できる。ウイルス感染および細菌感染の予後診断および診断には様々な方法を用いることができる。
【０１２０】
B. PDZタンパク質の代用となるモノクローナル抗体
上記かつ実施例に示すように、ウイルスおよび細菌のPLタンパク質のPLモチーフを認識して結合する非常に多様なPDZタンパク質が存在する。同一モチーフを認識する抗体は、また、これらPDZタンパク質の代用物としても用いることができる。好ましくは、PDZタンパク質は次のものの一つである：AF6、AIPC、AIPC (PDZ #1)、GORASP1 (PDZ #1)、INADL (PDZ #3)、KIAA0316、KIAA1284、EBP50 (PDZ #1)、(Shank1; Shank2; Shank3; シンテニン; Magil (PDZ #1); Tip1; Mint1 (PDZ #1,2); 新規セリンプロテアーゼ; MUPP1 (PDZ#3,7,9,11)、MAST2、NSP、NOS1、PAR3 (PDZ #3)、PAR3L (PDZ #3)；PAR5β、RiM2、ロドフィリン様、SIP-1、SITAC-18 (PDZ #2)、SITAC-18 (PDZ #1)、SIP1、ZO-1 (PDZ #1)、ZO-3 (PDZ #1)、DVL3、DVL2 (PDZ #1)、PTPL1 (PDZ#4)、HEMBA 10003117、Pick1、または類似体もしくは断片。より好ましくは、抗体は、下記のウイルスおよび細菌についてのPLモチーフを特異的に認識する任意のPDZタンパク質を模倣する：HIV-1 EnvについてはRALLまたはRILL(SEQ ID NOS:242および243)、HIV-1 Nefタンパク質についてはFKNC、FKDC、YKNCまたはYKDC(SEQ ID NOS:244、245、246および247)、HIV2 Envタンパク質についてはIALL、LALL、またはLTLL(SEQ ID NOS:248、249および250)、HIV-2 Vifタンパク質についてはEILA、GILA、またはDILA(SEQ ID NOS:251、252および253)、B型肝炎タンパク質XについてはFTSA(SEQ ID NO:254)、B型肝炎S抗原についてはWVYI(SEQ ID NO:255)、C型肝炎カプシドCタンパク質についてはPASAまたはPVSA(SEQ ID NOS:256および257)、C型肝炎E1タンパク質についてはGVDA(SEQ ID NO:258)、RSV核タンパク質についてはDVEL(SEQ ID NO:259)、ロタウイルス A VP4タンパク質についてはQCKLまたはQCRL(SEQ ID NOS:260および261)、ロタウイルス A VP7タンパク質についてはYYRVまたはYYRI(SEQ ID NOS:262および263)、ロタウイルス A NSP2タンパク質についてはQVGI、HIGI、QIGI、またはRIGI(SEQ ID NOS:264、265、266および267)、ロタウイルス A NSP5タンパク質についてはIKDLまたはIEDL(SEQ ID NOS:268および269)、結核菌ESXSタンパク質についてはSSWA(SEQ ID NO:270)、結核菌ESXNタンパク質についてはYTGF(SEQ ID NO:271)、および結核菌ESAT-6タンパク質についてはGMFA(SEQ ID NO:272)。特定のPLタンパク質PLモチーフを認識する抗体代用物は、PLクラス特異的と呼ぶことができる。例えば、PLモチーフである結核菌ESXSタンパク質についてYTGF(SEQ ID NO:271)を認識する抗体は、ESXS PLクラス特異的と呼ぶことができる。
【０１２１】
C. 抗体と他の結合作用物質の混合物
抗体とPDZタンパク質(および/またはアプタマー)の混合物は、任意のアッセイに用いることができる。PDZタンパク質および抗体は、PLタンパク質の様々なサブタイプの同定、本明細書で教示されるウイルスおよび細菌の同定、ならびに病原性の低い形態と比べた場合の病原性の形態の識別に用いることができる。いくつかのアッセイでは、抗体およびPDZタンパク質は混合されて、一緒に試料に与えられる。別のアッセイでは、抗体およびPDZタンパク質は、二種類のサブタイプを同定するため、またはサブタイプの同定を確認するために、分けられて異なる試料に結合させられる。
【０１２２】
VIII. アプタマー
アプタマーは、結合ポケットを形成することによって特定のリガンドを認識する、無秩序な配列の大集団からインビトロで選択された、RNA分子およびDNA分子である。アロステリックリボザイムは、活性部位とは離れて存在しているアプタマードメインにエフェクター分子が結合することによってその活性が調節されるRNA酵素である。これらのRNAは、特異的エフェクターの有無によって制御される、正確な分子スイッチとして働く。アプタマーは核酸、タンパク質、および完全な生物体にさえ結合できる。アプタマーは抗体と別のものであるが、それらは様々な診断形式において、抗体の特性を模倣する。かくして、アプタマーを、抗体および/またはPDZタンパク質の、代わりにまたは組み合わせて用いて、一般的および特異的なPLタンパク質PL領域の存在を同定できる。
【０１２３】
X. 診断試験
本明細書には、各種タイプの生物試料中のHIV、B型肝炎、C型肝炎、RSV、ロタウイルスA、結核菌およびそれらの産生物を含めた、細菌およびウイルスを同定するためのアッセイ法に有用な診断用の捕捉試薬および検出試薬が提供されている。これらウイルスおよび細菌の検出に有用な代表的なアッセイ形式としては、酵素結合固相吸着アッセイ、放射標識結合アッセイ、蛍光PDZ-結合およびPL-結合アッセイ、時間分解PDZおよびPL蛍光アッセイ、ならびにサンドイッチ酵素カスケードアッセイ形式が挙げられる。本アッセイでの使用に適合可能な、免疫アッセイ技術由来の例示的方法としては、ホモジニアスおよびヘテロジニアスアッセイ形式；競合および非競合アッセイ形式；酵素結合固相アッセイ形式、蛍光アッセイ形式、時間分解蛍光アッセイ形式、生物発光アッセイ形式、カスケード酵素アッセイ等が挙げられる。
【０１２４】
ある例示的手順では、一つまたは複数のPDZタンパク質を捕捉剤として用い、生物試料から一つまたは複数のPL分析物を単離する。別の例示的手順では、一つまたは複数のPDZタンパク質を、一つまたは複数のシグナル発生化合物に結合して、生物試料中の一つまたは複数のPL分析物の存在または量を識別するための検出試薬として用いる。さらに別の例示的手順では、PLタンパク質およびPLペプチドを、シグナル発生化合物に結合し(PL-SGC)、競合的リガンド阻害アッセイ、即ちウイルスPLの存在がPDZへの一つまたは複数のPL-SGCの結合と競合するアッセイに用いる。好ましくは、PDZタンパク質は、表1のウイルスまたは細菌のPLと結合することが分かっているPDZタンパク質の少なくとも一つである。表1は、どのPDZがどのPLタンパク質に結合するかを示すために、複数のボックスにさらに分けられている。同じボックスの中に一つまたは複数のPLモチーフが示されているPDZは、該PLモチーフの少なくとも一つと特異的に結合する。例えば、表の第4縦列に示されているどのHIV-1 Env PLについても、PDZタンパク質は、該HIV-1 Envが記載されているものと同じボックスの第6縦列から選ばれる。記載されているPDZタンパク質は、Envの一つまたは両方のPLモチーフに結合する。HIV-1のEnvタンパク質の検出には、同一ボックスの第6縦列の任意のPDZタンパク質を用いることができるが、これは該PDZタンパク質がEnv中の一つのPLモチーフに結合すれば十分であるからである。HIV-1のNefタンパク質を検出するには、表1の一つまたは両方のPLモチーフについて、HIV-1 Nefと同じボックスの第6縦列の任意のPDZタンパク質を用いることができる。HIV-2のEnvタンパク質を検出するには、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。HIV-2のVifタンパク質を検出するには、表1の第4縦列のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。B型肝炎のタンパク質Xの検出には、表1のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。B型肝炎のS抗原の検出には、表1の一つまたは両方のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。C型肝炎のカプシドCの検出には、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。C型肝炎のE1タンパク質の検出については、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。RSVの核タンパク質の検出には、表1の第4縦列のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。ロタウイルスAのVP4の検出には、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。ロタウイルスAのVP7の検出には、表1の第4縦列一つまたは両方のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。ロタウイルスAのNSP2の検出には、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。ロタウイルスAのNSP5の検出には、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。結核菌のESXNタンパク質の検出には、表1の第4縦列のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。結核菌のESXSタンパク質の検出には、表1の第4縦列のPLモチーフについて、同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。結核菌のESAT-6タンパク質の検出には、表1の第4縦列のPLモチーフについて、ESAT-6タンパク質が含まれるものと同じボックスの第6縦列内の任意のPDZタンパク質を用いることができる。他のフラビウイルスの検出には、C型肝炎に同定されたPLタンパク質(カプシドCおよびE1)に相当するPLタンパク質を、PDZタンパク質、特に表1の第6縦列に識別されているPDZタンパク質への結合について用いて、かつ試験することができる。他のレンチウイルスの試験には、HIV-1およびHIV-2に同定されたPLタンパク質(Env、NefおよびVif)に相当するPLタンパク質を、PDZタンパク質、特に表1の第6縦列に識別されているPDZタンパク質への結合について用いて、かつ試験することができる。他のマイコバクテリア種の試験には、結核菌に同定されたPLタンパク質(ESAT-6ファミリーおよび関連タンパク質)に相当するPLタンパク質を、PDZタンパク質、特に表1の第6縦列に識別されているPDZタンパク質への結合について用いて、かつ試験することができる。PDZタンパク質、抗体および他の結合作用物質の混合物は、タンパク質、全ての株もしくはサブタイプ、および/または科もしくは種の全てのメンバーに関係する全てのPLを同定する試験に用いることができる。例えば、混合物は、全てのHIV-1 Envタンパク質(両方のPLを同定する混合物)、全てのHIV-1株またはサブタイプ(これにはPL他パク質の混合物に結合する原因菌が含まれる可能性がある)、全てのHIV(HIV-2を含む)、全てのレンチウイルス、全てのレトロウイルスを同定するために用いることができる。HIV-1 Envを一般的に同定する試験の場合、例えば、PDZタンパク質と抗体の混合物を用いて、両方のPLを同定できる。これらおよび他の試験については、PDZタンパク質は、上記の一つを、他の病原体特異的またはHIV特異的なPLモチーフを認識する別のものと一緒に混合物内に含むことができる。
【０１２５】
本発明は、試料中の病原体のPLタンパク質を検出する方法を提供し、被験体のウイルス感染診断に有用性を見出している。多くの例示的な手順では、生物試料は被験体から得られ、試料中の病原体PLタンパク質の存在が決定される。試料中に病原体PLタンパク質が検出可能な量存在することは、個体が特定のウイルスに感染していることを示す。他の例示的手順では、生物試料中の病原体PLタンパク質のレベルが決定され、試料中の対照の量と比較される。試料中の病原体PLタンパク質の相対量は、病原体感染の重篤度を示す。好ましくは、PLタンパク質およびPLモチーフは下記の少なくとも一つである：HIV-1 EnvについてはRALL (SEQ ID NO:242)またはRILL (SEQ ID NO:243)、HIV-1 Nefタンパク質についてはFKNC (SEQ ID NO:244)、FKDC (SEQ ID NO:245)、YKNC (SEQ ID NO:246)またはYKDC (SEQ ID NO:247)、HIV2 Envタンパク質についてはIALL (SEQ ID NO:248)、LALL (SEQ ID NO:249)またはLTLL (SEQ ID NO:250)、HIV-2 Vifタンパク質についてはEILA (SEQ ID NO:251)、GILA (SEQ ID NO:252)またはDILA (SEQ ID NO:253)、B型肝炎タンパク質XについてはFTSA (SEQ ID NO:254)、B型肝炎S抗原についてはWVYI (SEQ ID NO:255)、C型肝炎カプシドCタンパク質についてはPASA (SEQ ID NO:256)またはPVSA (SEQ ID NO:257)、C型肝炎E1タンパク質についてはGVDA (SEQ ID NO:258)、RSV核タンパク質についてはDVEL (SEQ ID NO:259)、ロタウイルスA VP4タンパク質についてはQCKL (SEQ ID NO:260)またはQCRL (SEQ ID NO:261)、ロタウイルスA VP7タンパク質についてはYYRV (SEQ ID NO:262)またはYYRI (SEQ ID NO:263)、ロタウイルスA NSP2タンパク質についてはQVGI (SEQ ID NO:264)、HIGI (SEQ ID NO:265)、QIGI (SEQ ID NO:266)、またはRIGI (SEQ ID NO:267)、ロタウイルスA NSP5タンパク質についてはIKDL (SEQ ID NO:268)またはIEDL (SEQ ID NO:269)、結核菌ESXNタンパク質についてはSSWA (SEQ ID NO:270)、結核菌ESXSタンパク質についてはYTGF (SEQ ID NO:271)、結核菌ESAT-6タンパク質についてはGMFA (SEQ ID NO:272)。
【０１２６】
方法は、ウイルスおよび/または細菌のPLタンパク質に特異的な二種類の結合パートナーを用いることができ、その内の一つは上記のPDZドメインポリペプチドである。一般的には、方法は、(a) 結合パートナーの一つを用いて、試料から病原体PLを単離する段階、および（b) もう一方の結合パートナーを用いて病原体PLタンパク質を検出する段階を含む。
【０１２７】
A. ELISAサンドイッチヘテロジニアスアッセイ形式
本PDZ捕捉物およびモノクローナル抗PLタンパク質を用いて、生物試料中のウイルスおよび細菌株を検出するサンドイッチアッセイを構築する。本アッセイは、1〜1,000ng/mlの範囲の感度、即ち生物試料中のウイルスまたは細菌のタイプまたは量を検出する商業用途に十分な感度を有するが、以下の点に留意する。即ち、
(a) 免疫アッセイは、HIV-1、HIV-2、B型肝炎、C型肝炎、ロタウイルスA、RSV、および結核菌の微生物中のPLタンパク質を区別できる。
(b) 異なるアッセイ形式の交差反応性プロファイルは多様であり、検出対象となる具体的なウイルスまたは細菌、ならびに細胞溶解物を含む生物試料での絶対感度にも依存し；かつ
(c) 今日、診断装置の当技術分野では、様々なアッセイ形式の検出限界を決定することは日常的な作業である。
【０１２８】
本方法では様々な競合および非競合アッセイ形式が使用可能であると思われるが、サンドイッチアッセイ形式が立証された性能特性および様々な十分に確立されたシグナル増幅法を有することから、目下のところ該アッセイ形式が好ましい。目下のところ好ましいサンドイッチ免疫アッセイの手順では、特異的な高い親和性を持つ非天然のPDZタンパク質を用いて、生物試料内から天然のウイルスPLタンパク質を捕捉し；抗PLタンパク質マウスモノクローナル抗体を用いて、結合したPLタンパク質抗原を検出し；結合した抗PLタンパク質抗体の存在を、シグナル発生化合物、例えば酵素結合第二抗体(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体；HRP)またはビオチン化第二抗体およびストレプトアビジン-酵素複合体(例えば、HRP)のいずれかを用いて検出する。
【０１２９】
一般的には、本発明の方法は、(i) 第一の結合作用物質、即ち捕捉剤を用いて、複合生物試料内から天然ウイルスPLタンパク質分析物を分離(即ち単離)する段階；および(ii) 単離されたPL分析物を、第二の結合作用物質、即ち検出剤を用いて検出する段階を含む。分離段階および検出段階は、PL分析物に対する特異性のレベルが異なる結合パートナーを用いて達成することができ、例えば捕捉剤の特異性が高い場合には、検出試薬には低い特異性のものを用い、逆の場合も同様である。ある例示的手順では、捕捉剤は好ましくはPDZドメインポリペプチドである。より好ましくは、捕捉剤は表1および/または表2に掲載された捕捉剤の一つである。別の例示的手順では、これらの例示的手順において検出試薬の少なくとも一成分がPDZポリペプチド、例えば捕捉/単離されたPL分析物に結合するPDZタンパク質検出剤であり、次に複合体中のその存在がシグナル発生化合物と結合した抗PDZ抗体を用いて検出されるという条件の下では、第一の結合パートナーは抗病原体PLタンパク質抗体または抗体の混合物である。ある例示的な手順では、PDZ捕捉剤は、直接的にまたはリンカーを介して固相に結合している。例えば一つの非限定的な例では、PDZドメインポリペプチドは、磁性ビーズに結合している。後の例では、生物試料と接触した場合に、磁性ビーズ状に固定されたPDZ捕捉剤は、試料中の細菌またはウイルスのPLタンパク質と共にPDZ-PL相互作用複合体を形成するのに有効である。次に磁場を印加し、相互作用複合体を、結合した細菌またはウイルスのPLタンパク質と一緒に試料から単離する。別の非限定的な例では、PDZドメインポリペプチド捕捉剤をマイクロタイタープレートの表面に固定し；細菌またはウイルスのPLタンパク質を含む生物試料を固定化された捕捉試薬に接触させ、プレート表面にPLの結合を生じさせ；プレートを緩衝液で洗浄してPL以外のウイルスまたは細菌分析物をプレートから取り除き；こうして固定されたPL分析物を生物試料から単離する。例えば、磁場の利用、洗浄等などの様々な分離/単離手段が公知である。実際に用いる手段は、具体的なアッセイ形式に依存する。例えば、分離は、洗浄；磁気手段；遠心分離；濾過；分子篩、イオン交換およびアフィニティーを含むクロマトグラフィー；電場での分離；例えばラテラルフロー試験ストリップでなどの毛細管現象；免疫沈降；およびさらに下記に開示する方法を含むが、これらに限定されない様々な方法で達成できる。
【０１３０】
ある例示的手順では、細菌またはウイルスのPLタンパク質を、生物試料の一部を試験ストリップの一端と接触させることによって生物試料内の他のウイルスまたは細菌および細胞性タンパク質から分離し、次に該タンパク質を、例えばラテラルフローなどの毛細管現象によって試験ストリップ上を移動させる。本方法は、アッセイ中に一つまたは複数のPDZポリペプチド作用物質、抗体、および/またはアプタマーが、捕捉および/または検出試薬として存在すること、ウイルスまたは細菌株の存在または量を特異的に同定できる能力をアッセイに付与することによって、従来技術の免疫アッセイ法と区別される。本方法は、本方法が抗体以外の患者試料中に存在する細菌またはウイルスのタンパク質を同定するという事実によって、従来の免疫アッセイ法から区別される。ラテラルフローでの分離、検出、および定量のための方法および装置は、当技術分野、例えば全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,942,981号、第5,569,608号；第6,297,020号；および第6,403,383号で公知である。一つの非限定的な例では、試験ストリップは、試料を添加させるための近位領域、ならびにPDZポリペプチド捕捉剤、および緩衝試薬、および移動中の生物試料中のPDZポリペプチドと任意のPLタンパク質との間の結合相互作用を確立するのに適切な添加物を含む遠位試験領域を含む。例示的手順では、試験ストリップは、異なるPDZドメインポリペプチド、即ちそれぞれが異なるウイルスおよび/または細菌のPLタンパク質分析物と特異的に相互作用できるPDZドメインポリペプチドを含む試験領域を2カ所含む。
【０１３１】
上記開示の方法によれば、ウイルスまたは細菌のPLタンパク質分析物は生物試料中の他のタンパク質から、即ち試料中の分析物が検出および/または定量化に適切なような様式で分離される。PDZポリペプチド、シグナル発生化合物、抗体、アプタマー等が結合したPDZポリペプチドを用いた単離されたPLタンパク質を検出するための新規の方法が提供される。いくつかの例示的手順によれば、PDZ捕捉剤、抗体、および/またはアプタマーに結合したウイルスまたは細菌のPL分析物は、病原体PLタンパク質に特異的な一つまたは複数の抗体、例えばシグナル発生化合物を結合させた抗体を用いて結合される。もちろん診断技術の分野では様々な検出法が公知であり、本(非限定的)開示は全ての周知の代替法を記載するものではない。むしろ本開示は、本発明を実施する最良の形態を記載する必要条件を満たし、代替法に導く一般的な参照となるものである。
【０１３２】
いくつかの例示的手順では、SGC(シグナル発生化合物)と結合したPDZドメインを用いて、ホモジニアスアッセイ形式、即ち分離段階を必要としない形式で試料中の病原体PLタンパク質分析物の存在を検出する。このアッセイ法では、PDZドメインへのPLの結合によりSGCが生じるシグナルに変化を、例えば蛍光異方性に変化を引き起こす。
【０１３３】
いくつかの例示的手順では、生物試料中の細菌またはウイルスのPL分析物の検出には、ヘテロジニアス固相アッセイ形式(前記に開示)が有用である。上記本発明の背景の節で記したように、PDZタンパク質はPLを含む細胞性タンパク質を結合する。同様に、感染細胞では、PLを含むウイルス性または細菌性のタンパク質は、宿主細胞のPDZタンパク質に結合する。これらの相互作用は、通常は診断アッセイ形式では結合を巡り競合することが予想されるが、予想外にも、界面活性剤で抽出された細胞溶解物の中ではこれら後者の天然相互作用の親和性および質量平衡は十分に弱いか、または十分に破壊されているので、ウイルスまたは細菌のPL分析物が本診断アッセイ形式で検出できることがここにさらに提供される。したがって、Tween-20またはTriton X100のような界面活性剤を約0.5%未満；好ましくは約0.2%未満；および最も好ましくは約0.1%未満存在する状態で溶解物を調製し、アッセイを実施することができる。
【０１３４】
いくつかの例示的手順では、試料中のウイルスPLタンパク質のレベルを定量化するおよび/または対照と比較することができる。適切な陰性対照試料は、例えば健康であることが分かっている個体、例えばアッセイ対象の特定の細菌感染またはウイルス感染に罹っていないことが分かっている個体から得る。特異性対照は、関連するウイルスもしくは細菌に感染していることが分かっている個体(該ウイルスもしくは細菌が特異的PLタンパク質を有していない場合)、またはより低い病原性の株に感染している個体から採集できる。対照試料は、試験対象となる被験体と遺伝的な関係にある個体から得られるが、遺伝的に無関係な個体からも得られる。適切な陰性対照試料はまた、感染初期段階、即ち試験試料を採取した時点よりも早い段階の個体から採集された試料でもよい。いくつかの例示的手順はまた、非感染性の陽性対照、即ち細菌PLまたはウイルスPLのアミノ酸配列を有する組換えタンパク質も含む。
【０１３５】
初期にウエスタンブロットを用いて、生物試料中のPLタンパク質のレベルが、各種の可能な免疫アッセイ形式でこれら抗原を検出できるのに十分であることを示すことができる。しかしながら、実際の生物試料中のPLタンパク質のレベルが実際の免疫アッセイ形式での検出を制限することが証明された場合は、一つの別の例示的手順として、インビトロで細胞に感染させるか、または細菌を適切な培地の上もしくは中で増殖させることによって、生物試料中で生きているウイルスを増幅することができる、すなわちウイルス増幅試料中のPLタンパク質は約6〜約12時間で検出可能であるべきである。他の例示的手順では、生物試料およびウイルス増幅試料中のPLタンパク質抗原の収率を改善するための方法として、プロテアーゼインヒビターおよびプロテアソームインヒビター、例えばMG132の使用が挙げられる。
【０１３６】
B. 試薬の調製
PLペプチド、PDZドメインポリペプチドおよびアプタマーは、当技術分野で公知であるように合成(即ち機器を使用して)または組換え手段を用いて作ることができる。例えば、組換えタンパク質の発現のための方法および条件は、例えば、Sambrook、前記、およびAusubel、前記に記載されている。哺乳動物の組織細胞培養を用いたポリペプチドを発現は、Winnacker, "From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987；およびAusubel、前記に広く論じられている。
【０１３７】
結合アッセイの詳細は、2003年7月29日に出願され、US20040018487として公開された米国特許出願第10/630,590号および米国特許第6,942,981号にも開示されている。
【０１３８】
細胞を基本とするアッセイは、一般的には、組換え発現系を用いた本PDZドメインポリペプチドおよびウイルスPLまたは細菌PLの同時産生(即ち、それらが産生される時間を問わない、同一細胞内での産生)を含む。真核細胞での本ポリペプチドの産生に適切な細胞は、以下の実施例の節に開示している。本PDZドメインポリペプチドおよびウイルスまたは細菌のPLの発現に適切である可能性を有する細胞のタイプとして以下のものが挙げられる：例えばサル腎臓細胞(COS細胞)、SV40で形質転換されたサル腎臓CVI細胞(COS-7、ATCC CRL 165 1)；ヒト胚腎臓細胞(HEK-293、Graham et al. J. Gen Virol. 36:59 (1977))；HEK-293T細胞；新生児ハムスター腎臓細胞(BHK, ATCC CCL 10)；チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4216, (1980)；マウスセルトリ細胞(TM4、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980))；サル腎臓細胞(CVI ATCC CCL 70)；アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76、ATCC CRL-1587)；ヒト子宮頚癌細胞(HELA、ATCC CCL 2)；イヌ腎臓細胞(MDCK, ATCC CCL 34)；バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442)；ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75)；ヒト肝臓細胞(hep G2、HB 8065)；マウス乳腺腫瘍(MMT 060562、ATCC CCL 51)；TRI細胞(Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci 383:44-68 (1982))；NIH/3T3細胞(ATCC CRL-1658)；およびマウスL細胞(ATCC CCL-1)。それ以外の細胞株は明らかであろう。多種多様な細胞株がAmerican Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209より入手できる。
【０１３９】
C. 試料調製
検出可能な濃度のPLタンパク質、好ましくは本明細書に開示したウイルスまたは細菌のPLタンパク質を含むいかなる試料も用いることができる。使用可能な試料の例は、例えば肺滲出物、細胞抽出物(呼吸器、上皮に裏打ちされた鼻)、血液、粘液および鼻スワブである。
【０１４０】
PDZタンパク質および/または抗体へのPLタンパク質の結合は、実施例において、0.03%および0.01%を含む、最大0.05%までのSDSが存在する状態で起こることが示された。それ故に、鼻または他の体部の分泌物がラテラルフロー形式で容易に使用できないと思われる場合には、それをSDSで処理することができる。好ましくは、加えるSDSの量は、最終濃度で0.01%、より好ましくは0.03%、さらにより好ましくは0.05%までである。PDZタンパク質の結合に干渉しない他の界面活性剤等も用いることができる。緩衝液または水による希釈を含め、タンパク質/タンパク質相互作用に干渉しない他の試料処理法も用いることができる。
【０１４１】
H. 血清抗体に関する試験
特定のPLタンパク質PLモチーフに結合する血清抗体の存在を識別する試験は、いかなる形式の診断法にも用いることができる。特異的なPLタンパク質PLペプチドは、ラテラルフローまたは他の形式において、捕捉試薬として用いることができる。
【０１４２】
I. 流行状態でのアッセイの使用
例えば競合アッセイ形式において競合リガンドのレベルを下げることによって、サンドイッチアッセイ等において捕捉剤および検出試薬の量を変更することによって、アッセイの感度および特異性を変えて、生物試料中のウイルスまたは細菌のPLタンパク質の絶対検出レベルを変更することができる。このように、本試験法は、以下の実施例の節で描くように、多様な使われ方での様々なニーズに合った様々な性能属性を有する多様なアッセイを包含する。例えば、典型的な流行状態では、最も高い陽性予測値(PPV)が記録されるのが普通であり、陽性試験結果はより真実であろうと思われ、つまり陰性予測値(NPV)は最も低く、偽陰性結果が起こりやすいだろう。また、ヒト、動物、またはトリ被験体におけるウイルスまたは細菌の流行のモニタリングでも、現在、検査のために全ての試料を基準検査所に提出することが一般的である。本スクリーニングアッセイにおいて真の陽性試料を同定することによって、例えば現場または医療施設で、本試験アッセイは、検査のために基準検査所に提出しなければならない試料の数を減少させる用途を見出す、つまり、流行期の試験量が多い時に特に有用である。現在の作業では、動物はそれらが感染しているかどうかに関わらず全て殺されることになっているため、比較的高い偽陽性率は受け入れられるが、それに伴って偽陰性率も比較して低いことが好ましい。ある例示的な手順では、本発明は、流行時に使用するための、本明細書では「流行期試験法」と呼ばれる様々な特異性、感度、PPVおよびNPVを有する試験キットを提供する。本流行期試験法は、現在のニーズに適合するためには、以下のアッセイ性能を有するのが好まししい：即ち、約65%より高い特異性；約90%より高い感度；約85%より高いPPV；約65%より高いNPV；約25%未満の偽陽性率、および約5%未満の偽陰性率。
【０１４３】
これに対し、動物、保菌体、またはヒト被験体での細菌性またはウイルス性の疾患発生率が低い時期では、最低のPPVが通常記録され、偽陽性試験結果が多くなりやすく、NPVが最高となり、陰性試験結果が多く、かつ真である傾向が高くなる。この低発生率の時期には、スクリーニングの目的は、潜在的な感染動物を迅速に同定し、確認試験が、例えば基準検査所で完了するまでそれら動物を隔離することである。このように、ある例示的な手順では、モニタリングが不可欠であり、細菌性またはウイルス性の疾患の頻度が低い時期に使用するための、感度およびNPVを高くした試験法、即ち本明細書では「モニタリング試験法」と呼ばれる試験法が提供される。好ましくは、本モニタリング試験法は、以下のアッセイ性能を有する：即ち、約65%より高い特異性；約90%より高い感度；約85%より高いPPV；約65%より高いNPV；約20%未満の偽陽性率、および約5%未満の偽陰性率。本モニタリング試験法を用いて、メンバー数が100を超える群をスクリーニングする場合、該群全体のPPVは、任意の一つの特定のアッセイで得られる予測値よりも有意に高い。かくしてモニタリング試験法で陽性結果が得られた場合、前記流行期試験法を用いて群の該メンバーを再試験することが有益であることが分かるだろう。
【０１４４】
動物ではなくヒトの場合、試験の目的は勿論異なる。細菌感染またはウイルス感染の適時の証拠は、重要な症例管理的意味を有しており、例えば小児または高齢被験体での抗菌作用物質または抗ウイルス作用物質の早期投与が促進できる。一般的にヒト用診断製品については、高度の特異性および感度が必要とされ、例えば90%より高い特性および90% PPVより高い感度が必要とされる。しかしながら特定の流行状態では、例えばPPVが高く；偽陽性の確率が低く、偽陰性の確率が高い巡航船での感染といった場合、試料を確認試験のために提出する時、偽陰性試験結果をよりさらに低くする、例えば約5%未満まで低くするために、65%といったより低い特異性を持つことが望ましい場合もある。
【０１４５】
J. 診断および治療キット
本方法を実施するためのキットが提供される。ある例示的手順では、PDZタンパク質を用いて、試料、例えば病原性媒介物に感染した細胞試料中のPLタンパク質の存在を検出する。PL配列をコードしている病原性媒介物の例としては、ウイルスおよび細菌、例えばHIV-1、HIV-2、HTLV-1およびHTLV-2などのレトロウイルス；B型肝炎などのヘパドナウイルス；C型肝炎、デング熱、日本脳炎、ダニ媒介性脳炎、西ナイル熱、および黄熱病などのフラビウイルス；ロタウイルスなどのレオウイルス、RSウイルス(RSV)などのパラミクソウイルス、ならびに結核菌、ヘリコバクター ピロリ(Helicobacter pylori)、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、および化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)などの細菌が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４６】
本発明は、試料中の病原体PLタンパク質を検出する方法を提供し、被験体のウイルス感染または細菌感染の診断に用途を見出す。例示的手順では、生物試料を被験体から得て、試料中の病原体PLタンパク質の存在を決定する。検出可能な量の病原体PLの存在は、個体が特定のウイルスまたは細菌に感染していることを示す。いくつかの例示的な手順では、生物試料内の病原体PLタンパク質のレベルが決定され、試料中の対照の量と比較される。試料中の病原体PLタンパク質の相対量は、病原体の感染の強さを示す。
【０１４７】
方法は、一般的に病原体PLタンパク質の二つの結合パートナーを含み、その内の一つは上記したようにPDZドメインポリペプチドである。一般的には、方法は、(a) 結合パートナーの一つを用いて試料から病原体PLを単離する段階、および（b) 他の結合パートナーを用いて病原体PLタンパク質を検出する段階を含む。
【０１４８】
本キットは、少なくとも一つまたは複数の(i) PDZドメインポリペプチド、および(ii) PDZドメインポリペプチドを用いて、生物試料中の細菌株またはウイルス株を同定するアッセイを実施するための指示書の存在によって、免疫アッセイキットと区別される。キットは、抗体以外の患者試料内の細菌またはウイルスのタンパク質の同定を可能にし、これがキットを感染個体にとってより特異的にしている。本キットは、任意で、一つまたは複数の前記開示した試薬、緩衝液、または添加成分もしくは試薬を含んでもよく；特定の例示的手順では、キットはまた、細菌PLまたはウイルスPL、好ましくはPLタンパク質に特異的な抗体を含んでもよい。さらに別の例示的手順では、本キットは、生物試料中の他の潜在的干渉物質から細菌またはウイルスのPLを取り除くための手段、例えば装置またはシステムをさらに含むことができる。本キットはさらに、望まれる場合には、アッセイの実施に有用な、一つまたは複数の各種構成要素：例えば一つまたは複数のアッセイ容器；一つもしくは複数の対照またはキャリブレータ；その上でアッセイを実施する、一つまたは複数の固相表面；または一つもしくは複数の緩衝剤、添加物、または検出試薬または抗体；一つまたは複数の印刷された指示書、例えばアッセイの実施に用いられている各成分の量、ならびにアッセイ結果の評価の指針を示すための添付文書および/または容器ラベル、を含むことができる。本キットは、例えば試験ストリップ、サンドイッチELISA、ウエスタンブロットアッセイ、ラテックス凝集等を含む多種多様なタイプのアッセイ形式の実施に有用な構成要素を含むことができる。本キット内の本参照物、対照およびキャリブレータは、例えば一つまたは複数の天然および非天然のウイルスPLタンパク質または細菌PLタンパク質、組換えPLポリペプチド、合成PLペプチド、PDZドメインポリペプチド、PDZドメインペプチド、ならびに/または本方法の性能および正確性を評価するための適切な比色分析標準物質および酵素標準物質を含むことができる。
【０１４９】
本方法を実施するための指示は、通常は適切な記録媒体に記録され、キットの中に、例えば添付文書として納められる。例えば、指示は紙またはプラスチックといった被印刷物に印刷できる。別の態様では、指示は電子的なコンピュータ読み取り可能な記憶媒体、例えばCD-ROM、フロッピーディスク等にデジタル記録できる。さらに別の態様では、本法を実施するための指示は、使用者が遠隔のデジタルソース、例えばインターネットウェブサイトから、ダウンロード可能な文書ファイルの形式で得ることができる。
【０１５０】
任意で、キットは、種特異的試験だけでなくHIVの一般試験を実施するための試薬を含むこともできる。例えば、ラテラルフロー試験は、一般HIVウイルスの存在を同定するためのレーン、およびウイルスがHIV-1またはHIV-2であるか識別するためのレーンを含むことができる。一般試験は、PLタンパク質の存在に関する試験を含むHIVウイルスの存在が同定される任意の試験であり得る。含めることが可能な別のタイプの一般HIV試験は、任意のHIV特異的タンパク質を同定できる。あるいは、HIVもしくは他のウイルスまたは細菌の存在は、患者血液中の抗体の存在から同定できる。最後に、PCR試験を用いて、HIVまたは他のウイルスもしくは細菌の存在を広く同定することができる。
【０１５１】
K. アレイ
さらに他の例示的手順では、PDZ、抗体、および/またはアプタマーアレイは、固相上の識別可能に選ばれた位置に固定された各種PDZポリペプチド、抗体、および/もしくはアプタマーまたは同等の結合剤から構成されて提供される。アレイ中に固定されたPDZポリペプチド、抗体、および/またはアプタマーのそれぞれは、PLリガンドに対し確定した結合親和性および特異性を有しており、つまり、細菌タンパク質またはウイルスタンパク質のPLと確認済みの結合相互作用を含む。アレイの鑑別活性は、(i) 各種PDZポリペプチド、抗体、および/またはアプタマーの結合親和性；(ii) PLに関する各種PDZポリペプチド、抗体、および/またはアプタマーの結合特異性；ならびに(iii) アッセイ条件、例えばイオン強度、時間、pH等の寄与を受ける。PDZドメインは非常に特異的であり、たとえばMAST205のPDZドメインは、TDVおよびSDVを含むC末端PL配列を区別できる。同様に、同一PDZタンパク質内にある別のドメインはそれぞれ異なる結合特異性および親和性を有しており、即ちPSD-95ドメイン-1、-2および-3は異なる結合特異性および親和性を有している。出願者らは、先願の米国特許出願の中で、ヒトゲノムの全体の90%を超えるPDZドメインを含む255種類を超えるヒトPDZドメイン配列をクローニングし、発現し、開示した。PDZドメイン融合タンパク質と各種PLペプチドの相互作用のマッピングを基に、本ウイルスおよび/または細菌PLアレイの具体的なメンバーを選択する。予想外にも、アレイの選択は、以下の発見に基づいている：(i) 様々な細菌およびウイルス中の特徴的に異なるPLアミノ酸配列モチーフ；およびそれと合わせて(ii) 様々な細菌およびウイルスタンパク質中の様々なPL配列モチーフ、つまり、Env、Vif、Nef、NA、M1、核タンパク質、タンパク質X、S抗原、カプシドC、E1、VP4、VP7、NSP2、NSP5、ESXN、ESXS、ESAT-6等。
【０１５２】
試験試料中のHIVウイルスまたは他レトロウイルスの各種の株を、ウイルスタンパク質、例えばEnv、Nef、Vif等中のPLの構成的結合特性に基づいて区別するための例示的な手順および方法が提供され、ここで、HIVまたはレトロウイルスの各種の株および/またはサブタイプがアレイ上で異なる結合パターンを作り出す。方法は次の段階を含む：(a) 試験試料の一部を、前もってアレイ内に規定された様々な位置に接触させる段階；(b) アレイの特定位置の結合の有無を検出する段階；(c) アレイの結合パターンから、(i) 試験試料中にHIV PLが存在すること、および(ii) アレイのPL結合パターンがHIVウイルスの特定の株を区別するサインを構成していることを決定する段階。アレイに基づいて区別できるHIVウイルスの代表例としては、例えばHIV-1およびHIV-2が挙げられる。好ましくは、アレイは、PLタンパク質PLへの結合に少なくとも部分的に基づく。より好ましくは、PDZ、抗体および/またはアプタマーのアレイは、表1のPLタンパク質PLの少なくとも一つの存在を特異的に同定する。好ましくは、PDZタンパク質は、表1または2から選択されたPDZタンパク質の少なくとも一つ、断片、または類似体である。より好ましくは、アレイは、表1および2に列挙されている任意のPDZタンパク質を模倣する少なくとも一つの、PDZタンパク質、抗体、アプタマーを含む。好ましくは、PLタンパク質は、第4縦列に示すPLモチーフを有する第二縦列のものから選択され、PDZタンパク質は各ウイルスまたは細菌について、第6縦列に列挙したPDZタンパク質から選択される。アレイは、ウイルスまたは細菌の様々な株または種を特異的に同定できるか、またはより一般的な診断については、多様なウイルスおよび細菌に関するPLタンパク質を含むように配置できる。
【０１５３】
L. ラテラルフロー設計
家庭用妊娠試験と同様に、特異的生物材料で処理した試験ストリップに液体を作用させるラテラルフロー装置が有効である。対応する生物材料で標識されたリン光体が、液体試料によって運ばれてストリップの中を流れ、それらは、それらが特定領域に流入した時に捕捉され得る。ストリップに見出されるリン光体シグナルの量は、標的分析物の量に比例する。
【０１５４】
本明細書に開示されたウイルス、細菌、または関連微生物の一つを含むことが疑われる試料は、いくつかの手段によってラテラルフロー装置に加えられ、その試料を拡散によって移動させ、そしてラインまたは着色域がウイルスまたは細菌の存在を示す。ラテラルフローは、典型的には、下記3ヶ所の特異領域を含む固相支持体(例えばニトロセルロース膜)を含む：試料付加領域；固定された一つまたは複数のPDZタンパク質および抗体を含む捕捉領域；ならびに各領域が一つまたは複数の標識物を含んでいる一カ所または複数カ所の領域を含む読み出し領域。ラテラルフローはまた、陽性対照および陰性対照を含み得る。かくして、例えば、ある例示的な手順のラテラルフロー装置では、次のように作動する。つまり、生物試料の一部を試験ストリップの一端部に接触させ、次にタンパク質を、例えばラテラルフローのような毛細管作用によって試験ストリップの上を移動させることによって、生物試料中の他の細菌、ウイルス、および細胞性タンパク質からウイルスまたは細菌のPLタンパク質が分離される。一つまたは複数の、PDZポリペプチド作用物質、抗体、および/またはアプタマーといったPL結合剤が、捕捉試薬および/または検出試薬として加えられる。ラテラルフローでの分離、検出、および定量化のための方法および装置は、当技術分野、例えば全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,569,608号；第6,297,020号；および第6,403,383号において周知である。一つの非限定的な例では、試験ストリップは、試料を添加するための基部領域(試料添加領域)およびPDZポリペプチド捕捉剤および緩衝試薬ならびに移動中の生物試料中のPDZポリペプチドと任意のウイルスPLタンパク質または細菌PLタンパク質との間の結合相互作用を確立するのに適切な添加物を含む遠位試験領域を含む。別の例示的手順では、試験ストリップは、各種PDZドメインポリペプチドを含む、即ちそれぞれが各種ウイルスまたは細菌のPLタンパク質分析物と特異的に相互作用できるPDZドメインポリペプチドを含む二カ所の試験領域を備えている。ラテラルフローは、任意で例えば表1に示したような、各種多様なウイルスおよび細菌の試験を含むことができる。
【０１５５】
A. 病原体PLタンパク質の分離
一般的には、試料から未変性の病原体PLタンパク質を分離する(即ち単離する)段階を含む方法が提供される。この分離は、通常は、病原体PLタンパク質のための第一の結合パートナーを用いることで達成される。第一の結合パートナーは、PDZドメインポリペプチド、または抗病原体PLタンパク質抗体もしくは抗体の混合物でよい。
【０１５６】
いくつかの例示的手順では、結合パートナーの一つは、直接的にまたはリンカーを介して不溶性支持体に結合している。不溶性支持体は、当技術分野で公知であり、ビーズ(例えば磁性ビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ等)；膜等が挙げられるが、これらに限定されない。一つの非限定的な例では、PDZドメインポリペプチドは磁性ビーズに結合している。磁性ビーズに結合しているPDZドメインポリペプチドは、試料と接触し、試料中の抗体および任意の病原体PLタンパク質との間に複合体を形成させた後に磁場を加え、前記複合体を試料から取り除く。PDZドメインポリペプチドが膜などの不溶性支持体に結合する場合は、膜を取り除くか、または試料を別の容器に移すことによって、PDZドメインポリペプチドに結合した病原体PLタンパク質を試料から取り除く。PDZドメインポリペプチドがビーズに結合している場合は、遠心分離または濾過によって、ビーズに結合した病原体PLタンパク質を試料から取り除く。このような態様は、種々の病原体PL結合パートナー、例えば抗体を用いることが考えられる。
【０１５７】
一般的には、適切な分離手段は、分離を行うのに適したプラットホームと一緒に用いられる。例えば、病原体PLタンパク質を、PDZドメインポリペプチドへ結合させて分離する場合は、分離はアフィニティーカラムクロマトグラフィー、毛細管作用もしくはラテラルフロー試験ストリップ、免疫沈降等を含むがこれらに限定されない各種プラットホームのどれかを用いて実施される。
【０１５８】
ある例示的手順では、病原体PLタンパク質は、試料を試験ストリップの一端部に加えて、タンパク質を毛細管作用もしくはラテラルフローによって移動させることによって試料中の他のタンパク質から分離される。ラテラルフロー分離、検出、および定量化のための方法および装置は、当技術分野で公知である。例えば米国特許第5,569,608号；第6,297,020号；および第6,403,383号を参照されたい。これらの態様では、試験ストリップは、基端部から遠位端部に向かって、試料添加のための領域(試料添加領域)および病原体PLタンパク質結合パートナーを含む試験領域、例えばPDZドメインポリペプチドを含む領域、または別の態様では病原体PLタンパク質抗体を含む領域を含む。試料は、試料添加領域に添加され、試験ストリップの近位端部は緩衝液の中に置かれる。病原体PLタンパク質は、第一の試験領域内の結合抗体に捕捉される。別の例示的手順では、試験ストリップは、異なる病原体PL結合パートナー、例えばHIV-1、HIV-2、B型肝炎、C型肝炎、RSV、ロタウイルスA、結核菌を特異的に認識するPDZドメインポリペプチドを含む2カ所の試験領域を含む。捕捉したタンパク質の検出は、下記のように実施する。例えば、捕捉した病原体PLタンパク質の検出は、検出可能に標識された、病原体PLタンパク質のエピトープに特異的な抗体を用いて行われる。別の例示的手順では、抗病原体PLタンパク質抗体は試験領域に存在することができ、抗体に結合した病原体PLタンパク質の検出には標識されたPDZドメインポリペプチドを用いる。
【０１５９】
B. ウイルスPLタンパク質および細菌PLタンパク質の検出および定量化
ひとたび病原体PLタンパク質が試料中の他のタンパク質から分離されれば、該タンパク質を検出し、および/またはタンパク質のレベルもしくは量が決定される(例えば測定される)。上記で論じたように、病原体PLタンパク質は、一般的には結合パートナー、例えば病原体PLタンパク質に特異的な抗体、あるいはPDZドメインポリペプチドを用いて検出される。
【０１６０】
特異的抗体を用いた検出は、周知の方法を用いて実施される。一般的には、結合パートナーは、直接的にまたは間接的のいずれかで検出可能に標識されている。直接標識物としては、放射性同位元素(例えば、125I、35S等)；その産物が検出可能な酵素(例えば、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等)；蛍光標識物(例えば、フルオロセインイソチオシアナート、ローダミン、フィコエリスリン等)；蛍光放射物質、例えばEDTAなどの金属キレート基を用いて抗体に結合された152Euもしくは他のランタニド系物質；例えばルミノール、イソルミノール、アクリジニウム塩等の化学発光化合物；ルシフェリンのような生物発光化合物；蛍光タンパク質等が挙げられる。蛍光タンパク質としては、例えば天然のヌクレオチド配列のコドンを変えてヒトコドンバイアスにより近づけた「ヒト化」バージョンの緑色蛍光タンパク質(GFP)；アエクオリア ヴィクトリア由来のGFP、またはその誘導体、例えばClontech, Inc.から市販されているEnhanced GFPなどの「ヒト化」誘導体；例えばWO 99/49019およびPeelle et al. (2001) J. Protein Chem. 20:507-519に記載されているような、レニラ レニフォルミス、レニラ ムレリ、またはプチロサルカス ギュエルニーなどの別種由来のGFP;「ヒト化」組換えGFP (hrGFP) (Stratagene)；例えばMatz et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:969-973に記載されているような花虫綱の種由来の各種蛍光および有色タンパク質の全てを含むが、これらに限定されないGFPが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６１】
間接的標識物としては、上記のように標識されている、抗病原体PLタンパク質抗体に特異的な第二抗体；および特異的結合ペアのメンバー、例えばビオチン-アビジン等が挙げられる。
【０１６２】
いくつかの例示的手順では、病原体PLタンパク質のレベルが定量化される。定量化は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)；放射免疫アッセイ(RIA)等を含むが、これらに限定されない任意の公知の方法を用いて実施できる。一般的には、定量化は試料中に検出された発現産物のレベルを標準曲線と比較することによって達成される。
【０１６３】
いくつかの例示的手順では、病原体PLタンパク質は、上記のように試験ストリップ上で分離される。これらの例示的手順では、病原体PLタンパク質は、病原体PLタンパク質に結合する検出可能に標識された結合パートナーを用いて検出される。病原体PLタンパク質は、例えば反射分光光度計を用いて、または肉眼で定量化できる。
【０１６４】
病原体PLタンパク質は、それらのPDZドメインへの結合能力によって検出できる。これは、単一検出段階法、または感受性および特異性を上げるために第二段階もしくは「サンドイッチ」法として発展させることができる。
【０１６５】
一段階の手順については、表1A、1Bおよび2に開示したような病原体PLタンパク質を特異的に認識する「タグ付き」バージョンのPDZドメインを用いて、試料中の病原体PLタンパク質の存在を直接探索することができる。前記したように、この例は、試験試料を固相(例えば、宿主細胞または組織は、スライド上にコーティングさせて「固定」し、細胞膜を透過性にすることができる)に付着させ、試料をタグの付いた「PL検出体」タンパク質(PDZドメイン融合物)と適切な条件の下でインキュベートし、未結合のPL検出体を洗い流し、試料内の「タグ」の存在についてアッセイするものである。しかしながら、PDZドメインは内因性の細胞性タンパク質にも結合できることに注意しなければならない。それ故に、結合頻度を、病原体PLタンパク質を含まない対照細胞と比較しなければならないか、または「PL検出体」を改良して、それが任意の内因性の宿主細胞PLタンパク質に比べて病原体PLタンパク質に有意により特異的であるようにしなければならない。
【０１６６】
二段階またはサンドイッチ法では、PL検出体は、捕捉したタンパク質の捕捉または検出のいずれかの第二の方法と組み合わせて用いられる。第二の方法は、病原体PLタンパク質に結合する抗体、または病原体PLタンパク質上にあって病原体PL配列の利用可能性を下げない位置で病原体PLタンパク質に結合できる第二の化合物もしくはタンパク質を用いることができる。このようなタンパク質としては、病原体PLタンパク質に結合する抗体、他のウイルスもしくは細菌のタンパク質、または人工的に作られた(engineered)化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６７】
本発明の方法を用いて分析する生物試料は、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、アヒルおよびガチョウを含むが、これらに限定されない脊椎動物から得られる。特定の例示的手順では、生物試料は、例えばヒトまたはヒト以外の動物モデル、あるいはその培養細胞から得られる。多くの例示的手順では、生物試料は、生きている被験体、ヒト、または動物から得られる。
【０１６８】
いくつかの例示的手順では、試料を得た被験体は見かけ上は健康であり、分析は通常のスクリーニングの一環として実施される。別の例示的手順では、被験体はウイルス感染または細菌感染に罹りやすい被験体である(例えば、家族歴；特定の環境要因に暴露した等から判断されるような)。別の例示的手順では、被験体はウイルス感染または細菌感染の症状を有している(例えば、咳等)。他の態様では、被験体は、暫定的にウイルス感染または細菌感染に罹っている(または、例えば感染した動物に曝されたことがある等リスクのある)と診断されている(例えば、PCRに基づく別の試験によって決定されたような)。
【０１６９】
生物試料は、被験体のいかなる組織、器官、または細胞群に由来してもよい。いくつかの例示的手順では、被験体からは摩擦片、生検、または洗浄液が得られる。生物試料は、血液、尿、喀痰および口腔液のような体液；ならびに鼻洗浄液、スワブ、または吸引物、気管吸引物、下疳スワブおよび便試料のような試料を含むことができる。関心対象の個々の病原体の検出に適切な生物検体を収集する方法、例えば呼吸器疾患に関係するウイルスまたは細菌(例えばRSV、結核菌)の場合の鼻スワブ、洗浄液もしくは吸引物、または気管吸引物のような鼻咽喉検体；血液試料(例えばHIV、B型肝炎、C型肝炎の検出)、胃疾患に関係するウイルスまたは細菌(例えばロタウイルス、ヘリコバクター・ピロリ)検出のための便試料；HIV検出のための口腔スワブ、ならびに梅毒検出のための下疳スワブ、は公知である。
【０１７０】
いくつかの例示的手順では、当技術分野において標準である方法を用いて生物試料を処理し、例えば本発明のアッセイ方法を干渉することがある特定成分を除去する。いくつかの例示的手順では、例えば塩沈殿等によって生物試料を処理し、タンパク質を濃縮する。ある例示的手順では、試料を処理して宿主細胞を破壊して開放し、ウイルスタンパク質または細菌タンパク質を宿主細胞から放出させる(例えば溶解または超音波処理によって)。ある例示的手順では、試料は、細菌またはウイルスタンパク質の分解を阻害するためにプロテアーゼインヒビター存在下で処理される。
【０１７１】
いくつかの例示的なアッセイ法では、試料中のウイルスPLタンパク質または細菌PLタンパク質のレベルは定量化でき、および/または対照と比較できる。適切な対照試料は、健康であることが分かっている個体、例えば細菌またはウイルスに感染していないことが分かっている個体から得られる。対照試料は、試験対象となる被験体と遺伝的な関係にある個体から得ることができるが、遺伝的に無関係な個体からも得ることができる。適切な対照試料はまた、試験試料を採取した時点よりも早い時点で個体から採集された試料、例えばウイルス感染または細菌感染の可能性のある症状を示す前に個体より得た生物試料も含む。
【０１７２】
XI. 薬学的組成物
上記スクリーニング工程は、薬学的組成物に組み入れることができる一つまたは複数のタイプの化合物を同定できる。これらの化合物は、少なくとも一つのPLタンパク質、または少なくとも一つのPDZタンパク質のいずれかの転写、翻訳、または翻訳後プロセッシングのインヒビターである作用物質を含む。作用物質はまた、PLタンパク質およびPDZタンパク質、またはそれらの混合物の結合を阻害または遮断できる。これらの化合物はまた、一つもしくは複数のPLタンパク質、一つもしくは複数のPDZタンパク質、またはPLタンパク質とPDZタンパク質との間の相互作用いずれかのインヒビターであり、かつ固有の呼吸および/または消化または上皮細胞特異的活性または造影活性を有する作用物質も含む。化合物はまた、薬学的作用物質または造影成分が、PLタンパク質、PDZタンパク質、PLタンパク質とPDZタンパク質との間の相互作用のいずれかの阻害と関連している複合体も包含する。作用物質が望ましくない副作用を起こさないように非感染細胞内への作用物質の運搬を減らすことを目的として、薬理学的活性を持つ作用物質、および作用物質だけの場合に比べ、PDZタンパク質に対する基質能力を低下させた複合体成分を含む複合体もまた提供される。好ましくは、化合物または作用物質は、次のPLの少なくとも一つの、PDZタンパク質への結合を阻害または阻止する：HIV-1 EnvについてはRALL (SEQ ID NO:242)またはRILL (SEQ ID NO:243)、HIV-1 Nefタンパク質についてはFKNC (SEQ ID NO:244)、FKDC (SEQ ID NO:245)、YKNC (SEQ ID NO:246)またはYKDC (SEQ ID NO:247)、HIV2 Envタンパク質についてはIALL (SEQ ID NO:248)、LALL (SEQ ID NO:249)またはLTLL (SEQ ID NO:250)、HIV-2 Vifタンパク質についてはEILA (SEQ ID NO:251)、GILA (SEQ ID NO:252)またはDILA (SEQ ID NO:253)、B型肝炎タンパク質XについてはFTSA (SEQ ID NO:254)、B型肝炎S抗原についてはWVYI (SEQ ID NO:255)、C型肝炎カプシドCタンパク質についてはPASA (SEQ ID NO:256)またはPVSA (SEQ ID NO:257)、C型肝炎E1タンパク質についてはGVDA (SEQ ID NO:258)、RSV核タンパク質についてはDVEL (SEQ ID NO:259)、ロタウイルスA VP4タンパク質についてはQCKL (SEQ ID NO:260)またはQCRL (SEQ ID NO:261)、ロタウイルスA VP7タンパク質についてはYYRV (SEQ ID NO:262)またはYYRI (SEQ ID NO:263)、ロタウイルスA NSP2タンパク質についてはQVGI (SEQ ID NO:264)、HIGI (SEQ ID NO:265)、QIGI (SEQ ID NO:266)、またはRIGI (SEQ ID NO:267)、ロタウイルスA NSP5タンパク質についてはIKDL (SEQ ID NO:268)またはIEDL (SEQ ID NO:269)、結核菌ESXNタンパク質についてはSSWA (SEQ ID NO:270)、結核菌ESXSタンパク質についてはYTGF (SEQ ID NO:271)、結核菌ESAT-6タンパク質についてはGMFA (SEQ ID NO:272)。より好ましくは、PLタンパク質はRALL (SEQ ID NO:242)である。より好ましくはPLタンパク質は、HIV-1 EnvについてはRALL (SEQ ID NO:242)またはRILL (SEQ ID NO:243)、HIV-1 Nefタンパク質についてはFKNC (SEQ ID NO:244)、FKDC (SEQ ID NO:245)、YKNC (SEQ ID NO:246)、またはYKDC (SEQ ID NO:247)、HIV2 Envタンパク質についてはIALL (SEQ ID NO:248)、LALL (SEQ ID NO:249)またはLTLL (SEQ ID NO:250)、HIV-2 Vifタンパク質についてはEILA (SEQ ID NO:251)、GILA (SEQ ID NO:252)またはDILA (SEQ ID NO:253)である。好ましくは、化合物または作用物質は、表1または2のPDZタンパク質の少なくとも1つへの結合を阻害する。より好ましくは、阻害されるPDZタンパク質または相互作用は、表1に識別された、第4縦列の特定のウイルスPLまたは細菌PLと、同じボックス内の第6縦列に列挙されて��るPDZタンパク質から選択されるPDZタンパク質、または任意のPDZタンパク質を模倣した類似体もしくは断片および/もしくは抗体(もしくはアプタマー)との間のPDZ/PL相互作用の少なくとも一つである。
【０１７３】
一つまたは複数の上記実体は、動物またはヒトへの投与向けに調合される薬学的組成物に一般的に用いられるビヒクルとして定義されている、薬学的に許容される、無毒の担体または希釈剤と組み合わせることができる。希釈剤は、組み合わせの生物活性に影響しないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、緩衝水、生理学的食塩水、リン酸緩衝食塩水(PBS)、リンガー溶液、デキストロース溶液、およびハンクス液である。これに加えて、薬学的組成物または製剤には、他の担体、補助剤、または無毒で非治療的な非免疫原性安定化剤、賦形剤等も含んでもよい。組成物はまた、pH調節剤および緩衝化剤、毒性調節剤、湿潤剤、界面活性剤等の生理学的状態に近づけるための追加の物質を含むことができる(例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985); 薬物送達の方法の簡単な総説については Langer, Science 249:1527-1533 (1990)を参照されたい；これらの参照は各々、全体として参照により組み入れられる)。
【０１７４】
経口投与のための薬学的組成物は、例えば錠剤、ピル、粉末、ロゼンジ、サッシェ、カシェ剤、エリキシル剤、坐剤、乳剤、溶剤、またはシロップの形態でもよい。適切な賦形剤のいくつかの例としては、ラクトース、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジナート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、無菌水、シロップおよびメチルセルロースが挙げられる。メチル-およびプロピルヒドロキシ-ベンゾアートなどの保存剤；甘味剤；および芳香剤を含めることもできる。処方次第で、患者に投与された後の組成物の活性成分放出を迅速にし、持続させるか、または遅延させることができる。高分子材料は、経口持続放出送達に用いることができる("Medical Applications of Controlled Release," Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)；"Controlled Drug Bioavailability," Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)；Ranger and Peppas, 1983, J Macromol. Sci. Rev. Macromol Chem. 23:61; see also Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105を参照されたい)。持続放出は、複合体をカプセル内、または低速溶解高分子内に封入することによって達成できる。好ましい高分子としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびヒドロキシエチルセルロース(最も好ましいのは、ヒドロキシプロピルメチルセルロース)が挙げられる。他の好ましいセルロースエーテルも記載されている(Alderman, Int. J. Pharm. Tech. & Prod. Mfr., 1984, 5(3) 1-9)。当技術分野では、薬物放出に影響する要因が記載されている(Bamba et al., Int. J. Pharm., 1979, 2, 307)。吸入投与では、本明細書に開示した使用のための化合物は、適切な推進剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガスを用いた加圧パックまたは噴霧器から、あるいは推進剤を使用しないドライパウダー吸入器から、エアゾールスプレー調製物の形で都合良く送達される。加圧エアゾールの場合、投与単位は、一定量を送り出すバルブを提供することで決定できる。吸入器または注入器で使用するための、例えばゼラチンの、カプセルおよびカートリッジは、化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末ベースの粉末混合物を含んで製剤化され得る。
【０１７５】
薬学的組成物の有効投与量およびレジメン(投与の量および頻度)は、いくつかの確立されたプロトコールの任意の一つによって容易に決定される。例えば、通常は動物研究(例えばマウス、ラット)を用いて、体重1キログラム当たりの生物活性作用物質の最大耐性用量を決定する。一般的には、試験される動物種の少なくとも一つは哺乳動物である。動物研究の結果を外挿して、例えばヒトなどの他の種で使用する場合の用量を決定することができる。
【０１７６】
化合物は、予防および/または治療処置のために患者に投与され得る。治療量とは、何らかの形で、疾患状態または症状を軽減する、さもなければ疾患の進行または望ましくない他の症状を防止、阻止、遅滞、または逆行させるのに十分な量である。予防的応用では、化合物は、特定の疾患または感染に感受性であるか、またはさもなければリスクがある患者に投与される。したがって、「予防有効」量とは、疾患状態またはその症状を防止、阻止、または遅滞させるのに十分な量である。いずれの場合も、組成物に含まれる化合物の正確な量は、患者の健康状態および体重に依存する。
【０１７７】
薬学的組成物の適切量は、例えば、体重1キログラム当たりの生物活性作用物質の最大耐性用量の決定に普通に用いられる動物研究(例えばマウス、ラット)を用いて決定される。一般的には、試験される動物種の少なくとも一つは、哺乳動物である。動物研究の結果を外挿して、例えばヒトのような他の種に使用する場合の用量を決定することができる。
【０１７８】
薬学的組成物の成分は、好ましくは、非常に純粋であり、潜在的に有害な汚染物(少なくともNational Food (NF)等級、一般的には少なくとも分析等級、およびより典型的には少なくとも薬学等級)を実質的に含まない。
【０１７９】
得られた生成物が、典型的には、合成または精製工程中に存在する可能性のあるいかなる潜在的な有毒作用物質も、特にいかなるエンドトキシンも実質的に含まない程度まで、所与の化合物は使用する前に合成されなければならない。組成物は、通常は、GMP条件の下で作られる。経口投与のための組成物は、通常は無菌であり、実質的に等張である。
【０１８０】
A. 抗ウイルス作用物質および抗細菌作用物質
本発明での使用に適切な薬学的組成物は、活性作用物質が有効量で含まれている組成物を含む。抗ウイルス作用物質および抗細菌作用物質としては、好ましくはPLタンパク質またはPDZ mRNAまたはタンパク質レベルの少なくとも30、50、75、95、もしくは99%を阻害する、PLタンパク質、PDZ、および/またはPLタンパク質/PDZ相互作用のインヒビターを含む。タンパク質発現は、タンパク質に特異的に結合する抗体を用いて免疫学的分析を行い(forming)、続いて抗体とタンパク質との間に形成された複合体を検出することによって定量化できる。mRNAレベルは、例えばドットブロット分析、インサイチューハイブリダイゼーション、RT-PCR、定量的逆転写PCR(即ち、いわゆる「TaqMan」法)、ノーザンブロット、および核酸プローブアレイ法によって定量化できる。好ましくは、インヒビターの同定に用いるPLタンパク質PLは次のものの一つである：HIV-1 EnvについてはRALL (SEQ ID NO:242)またはRILL (SEQ ID NO:243)、HIV-1 Nefタンパク質についてはFKNC (SEQ ID NO:244)、FKDC (SEQ ID NO:245)、YKNC (SEQ ID NO:246)またはYKDC (SEQ ID NO:247)、HIV2 Envタンパク質についてはIALL (SEQ ID NO:248)、LALL (SEQ ID NO:249)またはLTLL (SEQ ID NO:250)、HIV-2 Vifタンパク質についてはEILA (SEQ ID NO:251)、GILA (SEQ ID NO:252)またはDILA (SEQ ID NO:253)、B型肝炎タンパク質XについてはFTSA (SEQ ID NO:254)、B型肝炎S抗原についてはWVYI (SEQ ID NO:255)、C型肝炎カプシドCタンパク質についてはPASA (SEQ ID NO:256)またはPVSA (SEQ ID NO:257)、C型肝炎E1タンパク質についてはGVDA (SEQ ID NO:258)、RSV核タンパク質についてはDVEL (SEQ ID NO:259)、ロタウイルスA VP4タンパク質についてはQCKL (SEQ ID NO:260)またはQCRL (SEQ ID NO:261)、ロタウイルスA VP7タンパク質についてはYYRV (SEQ ID NO:262)またはYYRI (SEQ ID NO:263)、ロタウイルスA NSP2タンパク質についてはQVGI (SEQ ID NO:264)、HIGI (SEQ ID NO:265)、QIGI (SEQ ID NO:266)またはRIGI (SEQ ID NO:267)、ロタウイルスA NSP5タンパク質についてはIKDL (SEQ ID NO:268)またはIEDL (SEQ ID NO:269)、結核菌ESXNタンパク質についてはSSWA (SEQ ID NO:270)、結核菌ESXSタンパク質についてはYTGF (SEQ ID NO:271)、結核菌ESAT-6タンパク質についてはGMFA (SEQ ID NO:272)。より好ましくは、PLタンパク質PLはRALL (SEQ ID NO:242)である。より好ましくは、PLタンパク質は、HIV-1 EnvについてはRALL (SEQ ID NO:242)またはRILL (SEQ ID NO:243)、HIV-1 Nefタンパク質についてはFKNC (SEQ ID NO:244)、FKDC (SEQ ID NO:245)、YKNC (SEQ ID NO:246)またはYKDC (SEQ ID NO:247)、HIV2 Envタンパク質についてはIALL (SEQ ID NO:248)、LALL (SEQ ID NO:249)またはLTLL (SEQ ID NO:250)、HIV-2 Vifタンパク質についてはEILA (SEQ ID NO:251)、GILA (SEQ ID NO:252)またはDILA (SEQ ID NO:253)である。好ましくは、インヒビターの同定に用いるPDZタンパク質は、表1または2から選択されるPDZタンパク質、断片、または類似体の少なくとも一つである。より好ましくは、インヒビターの同定に用いられるPDZタンパク質は、表1の第6縦列中のPDZタンパク質の一つであり、それは各ウイルスまたは各細菌の第2縦列のウイルスタンパク質に関し、第4縦列のPLモチーフの一つとペアになる。PL/PDZのHIV-2のEnvタンパク質への結合を阻害する作用物質の同定には、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて用いることができる。HIV-2のVifタンパク質に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の第4縦列のPLモチーフについて用いることが��きる。B型肝炎のタンパク質Xに関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1のPLモチーフについて用いることができる。B型肝炎のS抗原に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の一つまたは両方のPLモチーフについて用いることができる。C型肝炎のカプシドCに関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて用いることができる。C型肝炎のE1タンパク質に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて用いることができる。RSVの核タンパク質に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の第4縦列のPLモチーフについて用いることができる。ロタウイルスAのVP4に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて用いることができる。ロタウイルスAのVP7に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて用いることができる。ロタウイルスAのNSP2に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて用いることができる。ロタウイルスAのNSP5に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定では、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の第4縦列の一つまたは両方のPLモチーフについて用いることができる。結核菌のESXNタンパク質に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定では、表1の第4縦列のPLモチーフについて第6縦列の任意のPDZタンパク質を用いることができる。結核菌のESXSタンパク質に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の第4縦列のPLモチーフについて用いることができる。結核菌のESAT-6タンパク質に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、第6縦列の任意のPDZタンパク質を、表1の第4縦列のPLモチーフについて用いることができる。他のフラビウイルスに関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、C型肝炎(カプシドCおよびE1)で同定されたPLタンパク質に相当するPLタンパク質を、PDZタンパク質、特に表1の第6縦列で同定されたそれらへの結合に関して使用および試験することができる。他のレンチウイルスに関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、HIV-1およびHIV-2(Env、NefおよびVif)で同定されたPLタンパク質に相当するPLタンパク質を、PDZタンパク質、特に表1の第6縦列で同定されたそれらへの結合に関して使用および試験することができる。他のマイコバクテリア種に関するPDZ/PL結合インヒビターの同定については、結核菌(ESAT-6ファミリーおよび関連タンパク質)について同定されたPLタンパク質に相当するPLタンパク質を、PDZタンパク質、特に表1の第6縦列で同定されたそれらへの結合に関して使用および試験することができる。
【０１８１】
抗ウイルス作用物質は、ウイルスPLタンパク質または細菌PLタンパク質と相互作用するPDZタンパク質に結合するものとして同定されたPLペプチド治療剤を含み得る。C末端のPLを残す、その保存的置換物または切断物であるペプチドは、ウイルス性疾患または細菌性疾患の処置に適切である。例えば、PLペプチドのC末端配列(3〜20アミノ酸長、またはより好ましくは5〜10アミノ酸長)は、ペプチド配列のN末端にトランスポーターペプチド(タンパク質誘導ドメイン)を取り付けることによって治療剤に変換され得る。C末端の3アミノ酸が保存されている少なくとも5アミノ酸長、好ましくは少なくとも6アミノ酸長、7アミノ酸長、8アミノ酸長、9アミノ酸長および10アミノ酸長のこれらペプチドの細断片は、ウイルスPL/PDZ相互作用の治療インヒビターとして用いられる。好ましくは少なくともC末端の4個のアミノ酸が保存され、より好ましくはC末端の5個のアミノ酸、C末端の6個のアミノ酸、またはC末端の7個のアミノ酸が保存される。ペプチド治療剤はまた、ペプチド模倣物中にアミノ酸の保存的置換を含有するペプチドも含む。しかしながら、保存的置換は、最後の3または4アミノ酸以外の領域であることが好ましい。Tatおよびアンテナペディアを含むいくつかのトランスポーターペプチド配列を用いることができる。同様に、低分子およびCOX2インヒビターは、ウイルスまたは細菌のPLタンパク質とPDZとの相互作用を阻害するものとして同定され、かつ抗ウイルス治療剤として用いることができる。次にPLペプチド治療インヒビターは、インビトロおよびインビボで阻害作用について試験される。
【０１８２】
B. 抗ウイルス作用物質および抗細菌作用物質のスクリーニング法
本明細書ではPLタンパク質および/またはPDZタンパク質に結合する作用物質のスクリーニング法を開示する。作用物質は、PLタンパク質PLまたはPDZタンパク質のPDZドメインへの結合について最初にスクリーニングされる。次にそれらは、PDZ/PL相互作用を阻害する能力について試験される。これらの方法はまた、下記「B. 抗ウイルス作用物質および抗細菌作用物質のアッセイ」でも提供されている。結合アッセイは、天然または合成のPLタンパク質を用いてインビトロで実施できる。あるいは、天然または合成のPDZドメイン含有タンパク質を用いて、特定のPDZタンパク質に結合できる作用物質を同定できる。
【０１８３】
本明細書に開示した抗ウイルス作用物質および抗細菌作用物質のスクリーニング法は、ウイルスPLと、それと相互作用する任意のPDZタンパク質との間の相互作用を遮断または阻害する作用物質を同定する。インヒビターおよびそれらをコードするDNAが、PLタンパク質および/またはPDZの発現を阻害し、それによりそれらの相互作用を間接的に阻害する能力についてもスクリーニングできる。初期スクリーニングを行って、PDZ/PL相互作用を阻害または停止できる作用物質のサブセットを選択できる。このようなアッセイは、単離されたPDZタンパク質およびPLタンパク質、または互いを結合させることができるそれらの断片を用いてインビトロで実施できる。次にこのようなスクリーニングにより同定された作用物質は、機能的にアッセイすることができる。作用物質はまた、PLタンパク質を発現している細胞で、かつPDZタンパク質を本来発現しているかまたはPDZタンパク質を発現するように形質転換された細胞のいずれかでもスクリーニングされ得る。
【０１８４】
上記で開示および例示した診断アッセイに加えて、細菌またはウイルスが感染した細胞の中での、細菌またはウイルスのPLと宿主細胞のPDZポリペプチドとの間で起こる一つまたは複数の結合相互作用を調節できる抗ウイルス作用物質候補または抗細菌作用物質候補を同定するアッセイが提供される。本方法は、対照PLの、例えば合成PLペプチドのPDZドメインポリペプチドへの、例えば組換えPDZ融合タンパク質への結合を、抗ウイルス試験作用物質または抗細菌試験作用物質の存在下に試験することを含む。抗ウイルス作用物質候補または抗細菌作用物質候補は、対照PLとPDZドメインポリペプチドとの間の結合を調節する。出願者らは、対照PLとPDZドメインポリペプチドとの間の結合相互作用を測定するためのアッセイをこれまでに米国および国際特許出願、例えば全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,569,608号；第6,297,020号；および第6,403,383号に開示している。
【０１８５】
特に有用なスクリーニングアッセイは、一つまたは複数のウイルスまたは細菌のPLタンパク質PL、および一つまたは複数のPDZドメインタンパク質の両方を発現する細胞を用いる。このような細胞は、タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを使った細胞のコトランスフェクションによって組換え体として作製することが出来るか、または元々タンパク質の一つを含んでいる細胞に第二のタンパク質をトランスフェクションすることで作製することができる。細胞はマルチウェル型培養皿の中で増殖させることができ、実験的に決定できる、事前に決定された時間で、様々な濃度の、試験化合物に曝される。全細胞溶解物、培地、または細胞膜を、PL/PDZ相互作用の阻害についてアッセイする。対照(下記に論ずる)に比べて活性を有意に阻害する試験化合物は、治療剤候補と考えられる。作用物質は、作用物質が目的とするウイルスまたは細菌を感染させた動物モデルに於けるウイルス負荷または細菌負荷を軽減する能力についても試験され得る。未処置の対照動物に比べた負荷の低下は、作用物質が抗菌活性または抗ウルイス活性を有していることを示す。
【０１８６】
単離されたPDZドメインタンパク質またはそのPL結合断片は、治療化合物をスクリーニングするために、様々な薬物スクリーニング技術のいずれにも用いることができる。あるいは、単離されたPLタンパク質PLタンパク質またはPLモチーフを含む断片を用いることもできる。このような試験に用いるタンパク質は、膜に結合し、溶液中に遊離し、個体支持体に固定され、細胞表面に担持されるか、または細胞内に局在し得る。PDZドメインまたはPLタンパク質PLと試験対象となる作用物質との間の結合複合体の形成は、測定され得る。より具体的には、相互作用が、試験化合物非存在下に測定された相互作用に比べて有意に低ければ、試験化合物はPDZ/PL相互作用のインヒビターと見なせる。この場合、用語「有意に低い」とは、試験化合物存在下では、PDZ/PL相互作用が、試験化合物非存在下で測定した場合に比べて、アッセイ法の信頼限界の範囲内で測定可能な程度に低いことを意味する。
【０１８７】
ペプチドまたは他の化合物のランダムライブラリーもまた、PDZ/PL結合のインヒビターとしての適合性について、またはPDZドメインタンパク質またはPLタンパク質PLタンパク質のいずれかへの単純結合についてスクリーニングされ得る。コンビナトリアルライブラリーは、段階的様式で合成できる多くのタイプの化合物について生成することが出来る。このような化合物としては、ポリペプチド、βターン模倣物、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーN置換グリシンおよびオリゴカルバマートが挙げられる。化合物の大規模なコンビナトリアルライブラリーは、Affymax、WO 95/12608、Affymax、WO 93/06121、Columbia University、WO 94/08051、Pharmacopeia、WO 95/35503およびScripps、WO 95/30642(これらの各々は、参照により全ての目的について組み入れられる)に記載されているコード化(encoded)合成ライブラリー(ESL)法により構築できる。
【０１８８】
治療剤または治療リード化合物のスクリーニングに使用するための試験化合物の好ましい供給源は、ファージディスプレイライブラリーである。例えば、Devlin、WO 91/18980；Key, B.K., et al., eds., Phage Display of Peptides and Proteins, A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego,CA, 1996を参照されたい。ファージディスプレイは、ファージ遺伝学を用いて、108〜109種類の配列を含むライブラリーから、所望する特性のペプチドまたはタンパク質を選択および増幅できるようにする強力な技術である。ライブラリーは、所望位置にあるアミノ酸配列を選択的に多様化し、ライブラリーを所望特性に偏向させるように設計することができる。ライブラリーは、ペプチドがバクテリオファージ表面上に提示されるタンパク質に融合して発現するように設計される。所望特性を持つペプチドを提示するファージを選択し、再増殖して拡張する。ペプチドはファージを継代することで増幅されるので、選択されたファージからのDNAの配列は容易に決定され、選択されたペプチドの迅速分析を容易にできる。
【０１８９】
ペプチドインヒビターをコードするファージは、PDZドメインタンパク質および/またはウイルスもしくは細菌のPLタンパク質PLに特異的に結合するファージを選択することによって選択できる。ライブラリーは、ファージの表面に発現する遺伝子IIなどのタンパク質と融合して生成される。ライブラリーは、様々な長さを持つ、直線状または2個のCysアミノ酸を含むことによって束縛された、ファージタンパク質と融合するか、または足場のような追加のタンパク質にも融合するペプチドから構成することができる。ライブラリーは、本明細書に開示したPL領域に偏向させるか、または最初のライブラリーからの結合ファージ選択から得たペプチド配列に偏向させて、追加の試験インヒビター化合物が得られるように設計することもできる。
【０１９０】
上記の例示の検出アッセイに加えて、本発明はまた、病原体PLと宿主細胞PDZポリペプチドとの間の結合を阻害する抗ウイルス作用物質および抗細菌作用物質を同定するための様々なアッセイも提供する。一般的には、方法は、試験作用物質存在下で、PDZドメインを有するポリペプチドへのPDZリガンドポリペプチドの結合を試験することを含む。PDZリガンドポリペプチドとPDZドメインを有するポリペプチドとの間の結合を調節する試験作用物質は、該二種類のタンパク質との間の結合を調節する(即ち、増加または低下させる、廃止も含む)。下記に記載するように、該二つのペプチド間の結合は、様々な手段で査定できる。これもまた以下でさらに詳細に記載するように、アッセイは、単離されたポリペプチドを使って無細胞環境(即ち「インビトロ」)で実施され得る。アッセイは、試験作用物質存在下で細胞内のポリペプチドの結合を評価する細胞アッセイであり得る。このように様々なアッセイプラットフォームが利用できる。
【０１９１】
ポリペプチドの結合を、当技術分野で周知である方法を用いてアッセイすることができる。例えば、結合は生化学的にアッセイすることができ、または、別の例示的手順では、二つのタンパク質は、タンパク質が結合し一緒になった場合にのみ発生するシグナルを検出することによってアッセイできる。候補作用物質の試験では、このようなシグナルは、二つのタンパク質間の結合を査定するために評価され得る。例えば、本アッセイで使用される場合、ポリペプチドは、アッセイ可能な蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)システム、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)システム、または比色分析シグナル生成システムを形成することができる。
【０１９２】
アッセイは、それがインビトロまたは細胞内環境で行われるかを問わず、一般的には、(a) PDZリガンドを含むポリペプチド、および（b) PDZドメインを含むポリペプチドを必要とする。ポリペプチドの少なくとも一つは、ポリペプチド間の結合の検出を容易にする融合タンパク質であり得る。したがって、ポリペプチドの一つは、例えば親和性タグドメインまたは光学的に検出できるレポータードメインを含むことができる。
【０１９３】
適切な親和性タグとしては、別の成分に、通常は別のポリペプチドに、最も一般的には抗体に特異的に結合できる任意のアミノ酸配列を含む。適切な親和性タグとしては、例えばV5タグ、FLAGタグ、HAタグ(ヘマグルチニンインフルエンザウイルス由来)、mycタグ等のエピトープタグが挙げられる。適切な親和性タグはまた、その結合基質が公知であるドメインも含み、例えばHIS、GST、およびMBPタグであり、特異的結合パートナーが他のタンパク質、例えば抗体、特にモノクローナル抗体に由来するドメインも利用できる。適切な親和性タグは、IgG Fc領域などの任意のタンパク質-タンパク質相互作用ドメインも含み、それらは適切な結合パートナー、例えばIgG Fcレセプターを用いて特異的に結合および検出することができる。
【０１９４】
適切なレポータードメインは、例えば光を放射するか、または発色することによってポリペプチドの存在を光学的に知らせることができる任意のドメインを含む。適切な光放射レポータードメインとしては、ルシフェラーゼ(例えば、ホタル、バルグラ(Vargula)、レニラ レニフォルミス、もしくはレニラ ムエレリ(Renilla muelleri)由来のもの)、またはその光放射変異体が挙げられる。他の適切レポータードメインとしては、蛍光タンパク質(例えばエクオリア(Aequoria)、レニラ(Renilla)、プチロサルカス(Ptilosarcus)、スチルアツラ(Stylatula)種に由来する蛍光タンパク質といったクラゲ、サンゴおよび他腔腸動物由来のもの)またはその光放射変異体が挙げられる。これらレポータータンパク質の光放射変異体は、天然のレポータータンパク質に比べ、明るく、調光でき、または異なる励起および/または発光スペクトルを有することがある。例えば、いくつかの変異体は、もはや緑色には見えず、青、シアン、黄色、強い黄赤色(それぞれBFP、CFP、YFP eYFPおよびRFPと呼ばれる)に見えるか、または当技術分野で周知なような他の発光スペクトルを持つように変えられる。別の適切なレポータードメインとしては、生化学的変化または色変化を通してポリペプチドの存在を知らせることができるドメイン、例えばβ-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、および分泌された胚アルカリホスファターゼが挙げられる。レポータードメインは、レニラ ルシフェラーゼ(例えば、pRLCMV；Promega、カタログ番号E2661)であり得る。
【０１９５】
親和性タグまたはレポータードメインは、関心対象ポリペプチド中の任意の場所に存在し得る。しかしながら、ある場合には、それらはポリペプチドのC末端またはN末端に存在する。
【０１９６】
特定の例示的手順では、ポリペプチドの一つまたは両方がタグまたはレポーターを含み得る。例えばFRETまたはBRET法を用いる場合、両方のポリペプチドに、異なる自己蛍光ポリペプチドを用いてタグを付けることができる。
【０１９７】
PDZドメイン含有ポリペプチドは、病原体PLを結合するものとして、少なくともポリペプチドのPDZドメインを含んでいる。PDZドメインは、「野性型」PDZ含有ポリペプチドのPDZドメイン、または関心対象PDZリガンドとの結合能力を保持しているその変異体を含むことができる。野性型PDZドメインのPDZドメインの配列を、表2に示す。本発明では、どのような長さのPDZドメインも用いることができる。
【０１９８】
病原体PDZリガンド含有ポリペプチドは、少なくともPDZリガンド、病原体タンパク質、例えばPLタンパク質を含む。PDZリガンドは、「野性型」ポリペプチドのPDZリガンド、または使用するPDZドメインに結合する能力を保持しているその変異体を含むことができる。本発明では、どのような長さのPDZドメインも用いることができる。
【０１９９】
このようなポリペプチドは、当技術分野で公知であるように、合成(即ち、機械を使用して)または組換え手法を用いて作ることができる。組換えタンパク質発現の方法および条件は、例えばSambrook、前記、およびAusubel、前記に記載されている。典型的には、本発明で使用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターを用いて発現される。発現ベクターは、典型的には転写および/または翻訳制御シグナル(例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、およびATG開始コドン)を含む。これに加えて、使用する細胞系に適切なエンハンサーを加えることによって、発現効率を高めることができる。例えば、SV40エンハンサーまたはCMVエンハンサーは、哺乳動物宿主細胞での発現を高めるのに用いることができる。典型的には、本発明のポリペプチドをコードするDNAは、インビトロで、細菌(例えば大腸菌(E. coli)、枯草菌(Bacillus subtilus))、酵母(例えばサッカロマイセス（Saccharomyces))、昆虫(例えば、スポドプテラ フルギペルダ（Spodoptera frugiperda))、または哺乳動物細胞培養系などの宿主細胞に導入でき、かつ発現が可能なDNAコンストラクトに挿入される。哺乳動物細胞系は、多くの応用にとって好ましい。本発明のポリペプチドの発現および製造に有用な哺乳動物細胞培養系としては、ヒト胚腎臓細胞株(293；Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36:59)；CHO (ATCC CCL 61およびCRL 9618)；ヒト子宮頚癌細胞(HeLa、ATCC CCL 2)；および当技術分野で公知な他の系)が挙げられる。ポリペプチド発現への哺乳動物細胞培養系の使用は、Winnacker、FROM GENES TO CLONES(VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987)およびAusubel、前記で一般的に論じられている。いくつかの例示的手順では、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが、例えば哺乳動物細胞株での発現に用いられる。適切なプロモーターは、構成的で、細胞タイプ特異的、ステージ特異的、および/または調節可能もしくは制御可能(例えば、グルココルチコイドなどのホルモンによって)なものであり得る。有用なプロモーターとしては、当技術分野で公知の、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導MMTVプロモーター、SV40プロモーター、およびプロモーター -エンハンサーの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２００】
上記のように、本アッセイを、インビトロ(即ち、ここで、ポリペプチドは細胞ではなく溶液中に存在する)、または細胞環境(ここで、ポリペプチドが細胞内に存在する)で実施することができる。
【０２０１】
インビトロアッセイ
インビトロアッセイを、さまざまな方法を用いて行うことができる。ある方法は、第一のポリペプチド(PDZドメインポリペプチドかPDZリガンドポリペプチドのどちらか)を共有結合または非共有結合のいずれかで基質に連結させること、基質に結合したポリペプチドを第二のポリペプチドと接触させること、および第二のポリペプチドの存在を検出することを含む。方法は、試験作用物質存在下で実施され得る。第二のポリペプチドが検出可能に標識されている場合(例えば光学的に検出可能な融合タンパク質)、第二のポリペプチドの存在は、標識物を検出することによって検出される。
【０２０２】
基質は、固体、半固体、または不溶性支持体を含み、それはポリペプチドへの連結に適し、かつ使用する検出方法を干渉しない任意の材料から作られている。当業者が理解するように、可能性のある親和性基質の多くは非常に大きい。可能性のある基質としては、ガラスおよび修飾されたもしくは官能性をもたせたガラス、プラスチック(アクリル、ポリスチレン、およびスチレンと他材料のコポリマー、プロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン等を含む)、多糖類、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、シリカまたはシリコンおよび変性シリコンを含むシリカを基本とする材料、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、セラミック、ならびに各種の他ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。一つの例示的な手順では、基質は光学的検出を可能にするが、それ自体には蛍光がなく、または光を発しない。これに加えて、当技術分野で公知であるように、基質は、デキストラン、アクリルアミド、ゼラチン、アガロースなどの高分子、ウシおよび他の哺乳動物の血清アルブミンを含むタンパク質などの生物適合基材を含む様々な材料でコーティングされ得る。
【０２０３】
ある例示的手順では、基質は、基質へのポリペプチドの特異的結合(直接的または間接的のいずれか)を容易にする作用物質でコーティングされる。例えば、基質はストレプトアビジンでコーティングされ、関心対象ポリペプチドに対する親和性を持つビオチン化ポリペプチドを結合することができる。別の例では、基質はポリペプチドに特異的な抗体で直接的または間接的にコーティングされる(例えば、プロテインAを介して)。
【０２０４】
上記のように、第一のポリペプチドを基質に連結した後、第二のポリペプチドを基質に接触させ、第一のポリペプチドへの第二のポリペプチドの特異的結合に適切な条件の下で、典型的には試験作用物質が存在する状態で、第二のポリペプチドは維持される。第二のポリペプチドは、第一および第二のポリペプチドが複合体を形成した場合にだけ基質上で検出可能である。第二のポリペプチドの検出は、第一および第二のポリペプチドが複合体を形成することを示す。親和性基質に結合した第二のポリペプチドの検出は、直接的(第二のポリペプチドが基質に結合している間)または間接的(例えば、基質からポリペプチドを溶出した後で)に行われる。
【０２０５】
第二のポリペプチドがレポータードメインを含む場合は、第二のポリペプチドを、レポーター活性を検出することによって検出できる。レポーター活性を決定する方法、例えばルシフェラーゼおよびGFP活性は、例えばRamsay et al., Br. J. Pharmacology, 2001, 133:315-323に記載されている。第二のポリペプチドの検出はまた、抗体、例えば標識抗体を用いて達成され得る。抗体を用いたポリペプチドを検出する方法は、例えば、Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995；およびHarlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, First Edition 1988 Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されている)。
【０２０６】
試験作用物質が、前記ポリペプチド間の結合を調節するかを決定するために、上記アッセイを試験作用物質の存在下または非存在下で実施してもよい。
【０２０７】
PDZドメインポリペプチドと候補PDZリガンドとの間の結合を検出するために、「A」および「G」と呼ばれる、二つの相補的なアッセイが開発された。前記二種類のアッセイそれぞれにおいて、結合は、一つまたは複数のPDZドメインに結合することが予想されるタンパク質のC末端に相当する配列を有するペプチド(即ち候補PLペプチド)と、PDZドメインポリペプチド(典型的にはPDZドメインを含む融合タンパク質)との間に検出される。「A」アッセイでは、候補PLペプチドは固定されており、この固定化されたポリペプチドへの可溶性PDZドメインポリペプチドの結合が検出される(「A」アッセイは、典型的には、アビジン表面を用いてペプチドが固定化されることからそう名付けられた)。「G」アッセイでは、PDZドメインポリペプチドが固定化され、可溶性PLペプチドの結合が検出される(「G」アッセイは、典型的には、GST結合表面を用いてPDZドメインポリペプチドが固定化されることからそう名付けられた)。
【０２０８】
AアッセイおよびGアッセイの詳細は、2003年7月29日に出願され、US20040018487として公開された米国特許出願第10/630,590号および下記の説明に記載される。
【０２０９】
細胞アッセイ
細胞アッセイは、一般的には、組換えDNAを用いた、本ポリペプチドの同時産生(即ち、それらが産生される時間に関係なく、同一細胞で産生すること)を含む。本ポリペプチドの産生に適切な細胞としては、原核細胞、例えば細菌細胞、ならびに真核細胞、例えば動物細胞(例えば、昆虫、哺乳動物、魚類、両生類、鳥類、またはは爬虫類細胞)、植物細胞(例えば、トウモロコシまたはアラビドプシス属(Arabidopsis)細胞)、あるいは真菌細胞(例えば、S.セレビシエ(S. cerevisiae)細胞)が挙げられる。本ポリペプチドをコードする核酸の発現に適切な任意の細胞を宿主細胞として用いることができる。通常は、動物宿主細胞株を用いるが、その例は次の通りである：サル腎臓細胞(COS細胞)、SV40で形質転換したサル腎臓CVI細胞(COS-7、ATCC CRL 165 1)；ヒト胚腎臓細胞(HEK-293、Graham et al. J. Gen Virol. 36:59 (1977))；HEK-293T cells；新生児ハムスター腎臓細胞(BHK、ATCC CCL 10)；チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4216, (1980)；マウスセルトリ細胞(TM4、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980))；サル腎臓細胞(CVI ATCC CCL 70)；アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76、ATCC CRL-1587)；ヒト子宮頚癌細胞(HELA, ATCC CCL 2)；イヌ腎臓細胞(MDCK, ATCC CCL 34)；バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442)；ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75)；ヒト肝臓細胞(hep G2、HB 8065)；マウス乳腺腫瘍(MMT 060562、ATCC CCL 51)；TRI細胞(Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci 383:44-68 (1982))；NIH/3T3細胞(ATCC CRL-1658)；およびマウスL細胞(ATCC CCL-1)。多種多様な細胞株がAmerican Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209より入手できる。
【０２１０】
この場合も、多種多様なプラットホームを用いて、細胞中で本ポリペプチド間の結合を検出できる。例えば、いわゆる「ツーハイブリッド」法を用いることができる、多種多様な蛍光を基本とする方法、例えばFRETもしくはBRETを基本とする方法を用いることができる。一般的には、本ポリペプチドを生成する細胞を試験作用物質と接触させること、および試験作用物質が本ポリペプチド間の結合に何らかの作用を有するか決定することを含む。
【０２１１】
GAL4システムを用いて、本ポリペプチド間の結合を調節する作用物質をスクリーニングに用いることができる。このような方法は、二種類のポリペプチド：PDZドメインまたはPDZリガンドのいずれかを含むDNA結合ドメインポリペプチド、およびDNA結合ドメインポリペプチドに存在しない領域を含むDNA活性化ドメインポリペプチドをコードするベクター(またはベクター系)を用いることができる。PDZドメインとPDZリガンドとの間の相互作用は、レポーター遺伝子または選択可能マーカーの発現を活性化する。α-またはβ-ガラクトシダーゼ、β-ラクタマーゼのレベルは、それらの酵素活性を、オルトメチルフェニルチオガラクトシド(OMTP)またはX-galなどの呈色基質を用いて定量化することによって測定され、光のレベル、例えば蛍光は分光光学的、例えば蛍光計により査定できる。作用物質のプールまたは個別の作用物質はウェル内の培地に加えられ、作用物質による相互作用の阻害または促進のレベルは、レポーター遺伝子活性のレベルから決定される。
【０２１２】
あるいは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を用いて、細胞内での二つのポリペプチド間の結合を検出することができる。互いに非常に接近させた、適切な発光および励起スペクトルを有する蛍光分子は、FRETを示すことができる。蛍光分子は、一方の分子(ドナー分子)の発光スペクトルがもう一方の分子の励起スペクトル(アクセプター分子)と重なるように選ばれる。ドナー分子は、ドナー励起スペクトル内にある適切な強度の光で励起される。するとドナーは吸収したエネルギーを蛍光として放射する。ドナーが産生する蛍光エネルギーは、アクセプター分子によって消滅される。FRETは、ドナーからの蛍光シグナルの強度低下、その励起状態の寿命の短縮、および/またはアクセプターに特徴的なより長い波長(より低いエネルギー)での蛍光の再放射として現れ得る。蛍光タンパク質が物理的に分離すると、FRET効果は消滅または排除される(その開示が全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,981,200号を参照されたい)。
【０２１３】
例えば、シアン蛍光タンパク質は、おおよそ425〜450nmの波長の光で励起され、450〜500nmの範囲の光を放射する。黄色蛍光タンパク質は、おおよそ500〜525nmの光で励起されて、525〜500nmの光を放射する。これら二つのタンパク質が一つの細胞内に、近接せずに存在している場合は、シアンおよび黄色の蛍光が別々に見られる。しかしながら、これら二つのタンパク質が互いに近接させられると、蛍光特性はFRETによって変えられるであろう。CFPが発した青みがかった光はYFPによって吸収され、黄色の光として再放射される。FRETは、典型的には、ドナーの励起範囲内の光刺激に対する反応で放射された光のスペクトルを測定することによって、およびドナー放射光とアクセプター放射光間の比を計算することによってモニタリングされる。ドナー：アクセプター放射比が高い場合、FRETは起こらず、二つの蛍光タンパク質は近接していない。ドナー：アクセプター放射比が低い場合は、FRETが起こっており、二つの蛍光タンパク質は近接している。このようにして、第一および第二の反応モジュールがそれぞれドナーおよびアクセプター蛍光分子である、第一および第二の反応モジュールに融合している第一および第二のペプチドとの間の相互作用を測定することができる。このように、二つのポリペプチドは、FRETを提供するシステムを含むことができ、例えば一方のポリペプチドはGFPを含み、他方のポリペプチドはYFPを含む。
【０２１４】
更なる態様では、第一および第二のポリペプチドは、生物発光共鳴エネルギー転移(BRET)システムを提供する。このようなシステムでは、関心対象の一方のポリペプチドは、蛍光生成物(または基質)を生成(または破壊)し、他方の関心対象ポリペプチドは、蛍光生成物(または異質)により共鳴エネルギー転移を起こす蛍光タンパク質である。一つの例示的手順では、BRETシステムは、レニラ由来のルシフェラーゼおよびGFPを含む。例示的BRETの方法論は、Kroeger et al., J Biol Chem. 2001 Apr 20;276(16): 12736-43およびXu et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1999 January 5;96(1):151-6に記載されている。様々な比色計測シグナル生成システムもまた用いることができる。
【０２１５】
本方法で用いられる試験作用物質は、任意のタイプの化合物であり得る。候補作用物質または試験化合物は、天然および合成、有機および無機の両方の、高分子(例えば、オリゴペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチド)、低分子(即ち、約500Da以下の分子量)、抗体、糖、脂肪酸、ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体、天然構造物の類似体(例えば、模倣ペプチド、核酸類似体等)、ならびに様々な他の化合物を含む、多種多様な任意の化合物であり得る。試験作用物質は、ランダムペプチドまたはコンビナトリアルペプチドまたは非ペプチドライブラリーを含む多様なライブラリーから調製できる。使用可能な多くのライブラリー、例えば化学合成ライブラリー、組換え体(例えばファージディスプレイライブラリー)、およびインビトロ翻訳ベースライブラリーが当技術分野では公知である。化学合成ライブラリーの例は、Fodor et al., 1991, Science 251:767-773；Houghten et al., 1991, Nature 354:84-86; Lam et al., 1991, Nature 354:82-84；Medynski, 1994, Bio/Technology 12:709-710；Gallop et al., 1994, J. Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251；Ohlmeyer et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926；Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426; Houghten et al., 1992, Biotechniques 13:412；Jayawickreme et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618; Salmon et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712; PCT Publication No. WO 93/20242; およびBrenner and Lerner, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383に記載されている。ファージディスプレイライブラリーの例は、Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390；Devlin et al., 1990, Science, 249:404-406；Christian, R.B. et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:711-718); Lenstra, 1992, J. Immunol. Meth. 152:149-157; Kay et al., 1993, Gene 128:59-65; および1994年8月18日付けのPCT Publication No. WO 94/18318に記載されている。インビトロ翻訳ベースライブラリーは、1991年4月18日付けのPCT Publication No. WO 91/05058；およびMattheakisら、1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026に記載されているが、これらに限定されない。非ペプチドライブラリーの例としては、ベンゾジアゼピンライブラリー(例えばBunin et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712を参照されたい)が使用に適合し得る。ペプトイドライブラリー(Simon et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371)も用いることができる。ペプチド中のアミド官能基が過メチル化されて、化学変換されたコンビナトリアルライブラリーを生成している、使用可能なライブラリーの別の例がOstresh et al.によって記載されている(1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-11142)。
【０２１６】
試験作用物質は、試験対象のPLに結合するPDZドメインか、またはその類似体でよい。
【０２１７】
一旦、本PDZポリペプチドへの本PLポリペプチドの結合を調節する作用物質として、即ち結合調節作用物質として同定されると、該作用物質は、無細胞アッセイ、細胞アッセイおよび動物またはその単離された器官を用いるアッセイを含む様々なアッセイで試験することができる。例えば、結合調節作用物質を試験して、該作用物質が組織培養中の細胞で、または例えばニワトリもしくは別のトリなどの試験動物で、適切な任意の系で、ウイルス毒性または病原性かどうかを決定できる。
【０２１８】
C. 抗ウイルス作用物質および抗細菌作用物質のタイプ
以下に記載のどの作用物質も、スクリーニング法で同定されたもとのとしてだけでなく医薬品としても用いることができる。インヒビターは、RNA発現ライブラリー、バクテリオファージ発現ライブラリー、低分子ライブラリー、ペプチドライブラリーを含むどのタイプのライブラリーからも同定できる。インヒビターはまた、遺伝子発現を制御することが知られている公知の核酸および/またはポリペプチド配列を用いても生成できる。化合物はまた、遺伝子発現を制御することが知られているいくつかのカテゴリーの分子、例えばジンクフィンガータンパク質、リボザイム、siRNAおよびアンチセンスRNAも含む。
【０２１９】
(a)siRNAインヒビター
siRNAは、相補的mRNA転写の発現を阻害する、比較的短い、少なくとも一部が二重鎖のRNA分子である。本発明の実施にとって、そのメカニズムを理解することは必要ないが、siRNAは、相補的mRNA転写物の分解を誘導することによって機能すると信じられている。siRNAの設計および使用に関する原理は、WO 99/32619、Elbashir, EMBO J. 20, 6877-6888 (2001)およびNykanen et al., Cell 107, 309-321 (2001); WO 01/29058に概して記載されている。
【０２２０】
本発明のsiRNAは、それぞれの鎖が好ましくは10〜30、15〜25、または17〜23、または19〜21ヌクレオチド長であり、少なくとも一部が相補的である二本鎖RNAから形成される。鎖は、好ましくはその全長にわたって互いに完全に相補的であり得、または他の二本鎖分子の一方の端にまたは両端に単鎖の3'オーバーハングを有し得る。単鎖のオーバーハングは、存在する場合には、通常1〜6塩基であり、1または2塩基であることが好ましい。siRNAのアンチセンス鎖は、PLタンパク質またはPDZ転写物に対し実質的に相補的(例えば、少なくとも80、90、95%、好ましくは100%)になるように選択される。任意のミスマッチ塩基は、siRNA鎖の端部または端部近くで起こるのが好ましい。端部でのミスマッチ塩基は、デオキシリボヌクレオチドであり得る。siRNAのセンス鎖も、PLタンパク質またはPDZ転写物の相補セグメントに対し同様の関係を示す。各鎖が完全に相補的な19塩基を有し、かつセンス鎖の3'端には2個のミスマッチ塩基があり、アンチセンス鎖の3'端には1個のミスマッチ塩基がある二本鎖を有するsiRNAが特に適切である。
【０２２１】
siRNAがこのように投与されるものである場合、siRNAをコードするDNAの形状から明らかなように、siRNAの鎖は一つまたは複数のヌクレオチド類似体を含むことができる。ヌクレオチド類似体は、インヒビター活性が実質的に影響を受けない場所、例えば5'端および/または3'端の領域内、特には単鎖のオーバーハング領域内に配置される。好ましいヌクレオチド類似物は、糖修飾されたまたはバックボーン修飾されたリボヌクレオチドである。核酸塩基修飾リボヌクレオチド、即ち天然核酸塩基に代わって、下記の非天然核酸塩基を含むリボヌクレオチドなどもまた適切である：5-位置が修飾されたウリジンまたはシチジン、例えば5-(2-アミノ)プロピルウリジン、5-ブロモウリジン；8位置が修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例えば8-ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば7-デアザ−アデノシン；O-およびN-アルキル化ヌクレオチド、例えばN6-メチルアデノシン。好ましい糖修飾リボヌクレオチドでは、2'OH-基は、H、OR、R、halo、SH、SR、NH2、NHR、NR2、またはCNから選択される基で置換されており、この時のRは、C1〜C6アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、ハロはF、CI、Br、またはIである。好ましいバックボーン修飾されたリボヌクレオチドでは、隣接するリボヌクレオチドに結合しているリンエステル基は、修飾基、例えばホスチオアート基で置換されている。更なる好ましい修飾は、siRNAの5'ヒドロキシド残基にリン酸基を導入する修飾である。このような基は、siRNAをATPおよびT4キナーゼで処理することで導入できる。天然RNAのホスホジエステル結合もまた、少なくとも一個の窒素または硫黄ヘテロ原子を含むように変更できる。RNA構造の変更は、目的に合わせて調整でき、dsRNAにより生ずる一部生物での全身性のパニック反応を回避しながら、特異的な遺伝子阻害を可能にすることができる。同様に、塩基を修飾して、アデノシンデアミナーゼの活性を遮断することもできる。
【０２２２】
PLタンパク質またはPDZ転写物内の多くのセグメントが、siRNAの設計の適切な標的である。PLタンパク質PLの選択セグメントを用いて、あるサブタイプを選択的に目標とする場合、セグメントは、好ましくは転写物内の他のPLタンパク質PL領域と完全な配列相同性を持たないことを示す。好ましくは、PLタンパク質またはPDZタンパク質の選択セグメントは、PLタンパク質PLの対応するセグメント(存在する場合)と少なくとも1、2、3、4、またはそれ以上のヌクレオチドの違いを示す。標的部位は、いくつかの例では、PLタンパク質またはPDZコーディング領域、5'UTRおよび3'UTRから選ぶことができ、PLタンパク質のPL部位が好ましい。好ましい標的部位は、PLタンパク質PLと呼ばれるsiRNAの標的部位である(実施例を参照されたい)。この部位は、C末端にあり、細菌またはウイルスのサブタイプに特異的である。他の好ましい部位としては、PDZタンパク質のPL結合部位が挙げられる。
【０２２３】
siRNAは、siRNAをコードしているDNAセグメントを、挿入されたセグメントを逆方向に転写させるように配置されている一対のプロモーターの間に挿入することによって組換え技術により合成できる。このようなプロモーターの転写からは、二本の相補的なRNA鎖が生成され、それらはその後アニーリングして所望するdsRNAを形成できる。このようなシステムで用いる例示的プラスミドとしては、プラスミド(PCR 4.0 TOPO) (Invitrogenから入手可能)が挙げられる。別の例は、反対に配置されたプロモーターがT7およびSP6であるベクターpGEM-T (Promega, Madison, WI)である；T3プロモーターもまた用いることができる。あるいは、siRNAの鎖をコードするDNAセグメントは、単一プロモーターの下流に挿入される。このシステムでは、siRNAのセンスおよびアンチセンス鎖は同時に転写され、自己相補的であり、したがってdsRNAを形成できる単鎖RNA鎖を生じる。siRNAをコードするベクターは、インビトロまたは細胞培養で転写でき、あるいはインサイチューで発現させるためにトランスジェニック動物または患者に導入できる。適切なベクターを下記に記載する。組換え発現のためのプロモーターおよび任意の他の制御配列を選択することで、発現の組織特異性を決定できる。例えば、中枢神経系での発現には、PDGF、プリオン、中性エノラーゼ、またはthy-1のプロモーターが適切である。
【０２２４】
siRNAの鎖は、有機化学合成によって合成し、インビトロでアニーリングすることもできる。化学的に合成するかまたはインビトロで酵素合成する場合、RNAを、細胞に導入する前に精製することができる。例えば、RNAは、溶媒を用いた抽出または樹脂沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー；またはそれらの組み合わせを用いて混合物から精製できる。RNAは保存のために乾燥させること、または水溶液に溶解することができる。溶液は、アニーリングおよび/または二本鎖の安定化を促進するために、緩衝剤または塩を含むことができる。siRNAは、細胞または生物内に、下記に記載するような様々な方法によって、RNAまたはRNAをコードするDNAのいずれかの形で導入できる。
【０２２５】
(b)アンチセンスポリヌクレオチド
アンチセンスポリヌクレオチドは、センスmRNAに結合して、その翻訳に干渉することによって、RNA前駆体の転写、プロセッシングまたは局在化に干渉することによって、mRNAの転写を抑制することによって、またはいくつかの他のメカニズムを通して抑制を引き起こすことができる。アンチセンス分子が発現を低下させる具体的なメカニズムは重要ではない。
【０２２６】
典型的には、アンチセンスポリヌクレオチドは、遺伝子のmRNAの配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも7〜10、典型的には20またはそれ以上のヌクレオチドの単鎖アンチセンス配列を含む。いくつかのアンチセンスポリヌクレオチドは、約10〜約50ヌクレオチド長、または約14〜約35ヌクレオチド長である。いくつかのアンチセンスポリヌクレオチドは、約100ヌクレオチド未満、または約200ヌクレオチド未満である。一般的には、アンチセンスポリヌクレオチドは、安定な二重鎖を形成するのに十分な長さを有するが、必要に応じて、送達の様式に応じた、インビボ投与できるほど十分に短いものでなければならない。標的配列への特異的ハイブリダイゼーションに必要なポリヌクレオチドの最短長は、とりわけ、G/C含有量、ミスマッチ塩基の配置(ある場合)、標的ポリヌクレオチド集団と比較した配列特異度、およびポリヌクレオチドの化学的性質(例えばメチルホスフォナートバックボーン、ペプチド核酸、ホスホロチオエート)などいくつかの要因に依存する。
【０２２７】
特異的ハイブリダイゼーションを保証するために、アンチセンス配列は、少なくとも標的mRNAのセグメントまたはそれをコードする遺伝子と実質的に相補的である。いくつかのアンチセンス配列は、それらの目標とする標的配列に対し完全に相補的である。しかしながら、RNAまたはその遺伝子に対応する関係標的配列への特異的結合が、ポリヌクレオチドの機能的特性として保持される限りは、アンチセンスポリヌクレオチドは、ヌクレオチド置換、付加、欠失、移動、転移、または修飾、あるいは他の核酸配列または非核酸成分を含んでよい。PLタンパク質またはPDZタンパク質の発現を阻害することを目的とするアンチセンスポリヌクレオチドは、特定のPLタンパク質またはPDZ遺伝子もしくは転写物に対し、配列相同性の完全なまたは実質的な程度を示し、かつ別のPDZ遺伝子に対しては配列相同性の不完全で、かつ低い程度を示すように設計される。
【０２２８】
いくつかのアンチセンス配列は、mRNAの比較的利用できる配列(例えば二次構造を比較的欠く)と相補的である。このことは、予測されたRNAの二次構造を、例えばMFOLDプログラム(Genetics Computer Group, Madison WI)を用いて分析し、当技術分野で公知であるようにインビトロまたはインビボで試験することによって決定され得る。有効なアンチセンス組成物を同定するための別の有用な方法は、オリゴヌクレオチドのコンビナトリアルアレイを用いる(例えばMilner et al., 1997, Nature Biotechnology 15:537を参照されたい)。
【０２２９】
アンチセンス核酸(DNA、RNA、変更物、類似物等)は、本明細書に開示する化学合成および組換え法のような、核酸生成に適切な任意の方法を用いて作ることができる。アンチセンスRNAは、そのままか、またはアンチセンスRNAをコードするDNAの形態で送達できる。アンチセンスRNAをコードするDNAは、下記に記載するようにベクターの構成要素、または非複製型で送達できる。
【０２３０】
(c)ジンクフィンガータンパク質
ジンクフィンガータンパク質もまた、PLタンパク質もしくはPDZタンパク質もしくは核酸、または特異的PLタンパク質サブタイプの発現の抑制に用いることができる。ジンクフィンガータンパク質は、標的遺伝子内の任意の所望標的部位に結合するように遺伝子工学を利用して作られ得るか、または選択され得る。いくつかの方法では、標的部位はプロモーターまたはエンハンサー内に存在する。他の方法では、標的部位は、構造遺伝子内に存在する。いくつかの方法では、ジンクフィンガータンパク質は、ヒトKOX-1タンパク質由来のKRABのような抑制ドメイン転写レプレッサーに連結している(Thiesen et al., New Biologist 2, 363-374 (1990); Margolin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4509-4513 (1994); Pengue et al., Nucl. Acids Res. 22:2908-2914 (1994); Witzgall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4514-4518 (1994))。ジンクフィンガータンパク質が標的とするのに適切な標的部位を選択するための方法、および選択した標的部位に結合するようにジンクフィンガータンパク質を設計するための方法は、WO 00/00388に記載されている。ファージディスプレイを用いて標的に結合するジンクフィンガータンパク質を選択するための方法は、EP.95908614.1に記載されている。ジンクフィンガータンパク質の設計に用いる標的部位は、典型的には9〜19ヌクレオチド程度である。PLタンパク質もしくはPDZタンパク質またはポリヌクレオチドの阻害については、標的部位は、上記で論じたように、他のPDZ遺伝子または転写物との実質的な配列相同性が不完全であるか、または欠いているPLタンパク質もしくはPDZタンパク質またはポリヌクレオチドの中から選ばれる。ジンクフィンガータンパク質を用いて内因性遺伝子を制御するための方法は、WO 00/00409に記載されている。ジンクフィンガータンパク質は、タンパク質としてまたはジンクフィンガーをコードする核酸の形態で投与できる。後者の場合、核酸は、下記のベクターを用いて、または非複製型で投与できる。
【０２３１】
(d)リボザイム
リボザイムは、酵素として働き、他のRNA分子を特定の部位で開裂するように遺伝子工学で作ることができるRNA分子である。リボザイム自体は、このプロセスで消費されず、触媒的に働いてmRNA標的分子の複数のコピーを開裂できる。標的RNAをトランスで開裂するリボザイムの設計に関する一般的ルールは、Haseloff & Gerlach, (1988) Nature 334:585-591およびUhlenbeck, (1987) Nature 328:596-603およびUS 5,496,698に記載されている。
【０２３２】
リボザイムは、典型的には、転写物上(標的サブサイト)の二カ所に相補性を示し、かつ結合する二つのフランキングセグメント、およびフランキングセグメント間にある触媒領域を含む。フランキングセグメントは、典型的には5〜9ヌクレオチド長であり、最適には6〜8ヌクレオチド長である。リボザイムの触媒領域は、一般的には22ヌクレオチド長である。mRNA標的は、標的サブサイト間に、一般式NUN、好ましくはGUCであるコンセンサス開裂部位を含んでいる(Kashani-Sabet and Scanlon, (1995) Cancer Gene Therapy 2:213-223；Perriman, et al., (1992) Gene (Amst.) 113:157-163；Ruffner, et al., (1990) Biochemistry 29: 10695-10702)；Birikh, et al., (1997) Eur. J.Biochem. 245:1-16; Perrealt, et al., (1991) Biochemistry 30:4020-4025))。
【０２３３】
リボザイムの特異性は、標的サブサイトを選択し、それと共にこのようなサブサイトに相補的なリボザイムのフランキングセグメントを選択することによって制御され得る。PLタンパク質またはPDZタンパク質のインヒビターについては、標的サブサイトは、他のPDZタンパク質と完全に一致するサブサイトが存在しないように、好ましくは実質的な配列相同性を持つサブサイトと一致しないように選ぶのが好ましい。リボザイムは、下記のように、RNA分子として、または複製可能なベクターの成分としてリボザイムをコードするDNAの形態、または非複製型、のいずれかで送達され得る。
【０２３４】
(e)抗体
化合物は、本発明の遺伝子がコードしているタンパク質に特異的に結合する、完全体およびFab、Fvsのようなその結合断片の両方の抗体を含む。抗体は、ポリクローナル抗体も組換え技術により発現できるが、通常はモノクローナル抗体である(米国特許第6,555,310号を参照されたい)。発現可能な抗体の例としては、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ベニヤ(veneered)抗体、およびヒト抗体が挙げられる。キメラ抗体は、その軽鎖および重鎖遺伝子が、典型的には、別種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから、遺伝子工学によって構築された抗体である(例えば、Boyce et al., Annals of Oncology 14:520-535 (2003)を参照されたい)。例えば、マウスモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変(V)セグメントは、ヒト定常(C)セグメントに結合できる。このように典型的なキメラ抗体は、マウス抗体由来のV、または抗原結合ドメインとヒト抗体由来のCまたはエフェクタードメインとからなるハイブリッドタンパク質である。ヒト化抗体は、ヒト抗体(アクセプター抗体と呼ばれる)に実質的に由来する可変領域フレームワーク残基、およびマウス抗体(ドナー免疫グロブリンと呼ばれる)に実質的に由来する相補性決定領域を有する。Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)およびWO 90/07861、米国特許第5,693,762号、米国特許第5,693,761号、米国特許第5,585,089号、米国特許第5,530,101号およびWinter、米国特許第US 5,225,539号を参照されたい。定常領域もまた、存在する場合には、実質的にまたは完全にヒト免疫グロブリンに由来する。抗体は、従来のハイブリドーマ手法、ファージディスプレイによって(例えば、Dower et al.、WO 91/17271およびMcCafferty et al.、WO 92/01047を参照されたい)、とりわけヒト免疫系を持つトランスジェニックマウスを使って(Lonberg et al.、WO93/12227 (1993))得ることができる。免疫グロブリン鎖をコードする核酸は、抗体を産生しているハイブリドーマまたは細胞株から、または公開されている文献中の免疫グロブリンの核酸またはアミノ酸の配列に基づいて得ることができる。
【０２３５】
(f)模倣化合物
インヒビター化合物は、本PDZドメインまたはPDZリガンドの模倣物、即ち本PDZドメインまたはPDZリガンドと実質的に同一の構造および/または機能特性を有する合成化合物でもあり得る。模倣物は、完全にアミノ酸の合成的で非天然類似物から構成されるか、または一部が天然ペプチドアミノ酸であり一部がアミノ酸の非天然類似物であるキメラ分子のいずれかであり得る。模倣物にはまた、天然アミノ酸の保存的置換を、該置換が模倣物の構造および/または阻害活性もしくは結合活性を実質的に変えない限り、どのような量でも組み入れることができる。保存的変異体である本発明のポリペプチドを用いる場合、模倣物が本発明の範囲に在るかどうか、即ちその構造および/または機能が実質的に変えられていないかは通常の実験により決定されると考えられる。かくして、模倣組成物は、それが本ポリペプチド間の結合を阻害できれば本発明の範囲内である。
【０２３６】
模倣物は、非天然構造成分の任意の組み合わせを含むことができるが、それは、典型的には三つの構造群： (a) 天然のアミド結合(「ペプチド結合」)連結以外の残基連結群；（b) 天然アミノ酸残基に代わる非天然残基；または (c) 二次構造模倣を誘導する、即ち二次構造、例えばβターン、γターン、βシート、αヘリックス立体構造等を誘導するまたは安定化する残基、に由来する。
【０２３７】
ポリペプチドは、その残基の全てまたはいくつかが天然のペプチド結合以外の化学的手段で結合される場合、模倣物として特徴付けることができる。個々のペプチド模倣残基は、ペプチド結合、他の化学結合、またはカップリング手段、例えばグルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル類、二官能性マレイミド、N,N=-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、もしくはN,N=-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)などによって結合することができる。従来のアミド結合（「ペプチド結合」）連結の代替であり得る連結基は、例えばケトメチレン(例えば、-C(=O)-NH-の代わりに-C(=O)-CH2-)、アミノメチレン(CH2-NH)、エチレン、オレフィン(CH=CH)、エーテル(CH2-O)、チオエーテル(CH2-S)、テトラゾール(CN4-)、チアゾール、レトロアミド、チオアミドまたはエステルなどを含む(例えば、Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, A Peptide Backbone Modifications, Marcell Dekker, NYを参照されたい)。
【０２３８】
ポリペプチドは、また天然アミノ酸残基の代わりに全てのまたはいくつかの非天然残基を含有することによって、模倣物として特徴付けることができる。非天然残基は、科学文献および特許文献によく記載されており、天然アミノ酸残基の模倣物およびガイドラインとして有用な非天然組成物のいくつかの例は、以下に記載されている。
【０２３９】
芳香族アミノ酸の模倣物は、例えば下記によって置き換えることによって生成することができる：D-またはL-ナフィルアラニン; D-またはL-フェニルグリシン; D-またはL-2チエネイルアラニン; D-またはL-1、-2、3-、もしくは4-ピレネイルアラニン; D-またはL-3チエネイルアラニン; D-またはL-(2-ピリジニル)-アラニン; D-またはL-(3-ピリジニル)-アラニン; D-またはL-(2-ピラジニル)-アラニン; D-またはL-(4-イソプロピル)-フェニルグリシン; D-(トリフルオロメチル)-フェニルグリシン; D-(トリフルオロメチル)-フェニルアラニン; D-p-フルオロフェニルアラニン; D-またはL-p-ビフェニルフェニルアラニン; K-またはL-p-メトキシビフェニルフェニルアラニン; D-またはL-2-インドール(アルキル)アラニン; およびD-またはL-アルキルアイニン、ここで、アルキルは、置換もしくは非置換メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソ-ブチル、sec-イソチル、イソ-ペンチルまたは非酸性アミノ酸であり得る。非天然アミノ酸の芳香族環は、例えばチアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンズイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリルおよびピリジル芳香族環を含む。
【０２４０】
酸性アミノ酸の模倣物は、例えば負荷電を維持しながら非カルボキシラートアミノ酸；(ホスホノ)アラニン；スルファート化スレオニンによって置換することで生成することができる。カルボキシル側鎖(例えば、アスパルチルまたはグリタミル)もまた、例えば、1-シクロヘキシル-3(2-モルホリニル-(4-エチル)カルボジイミド、または1-エチル-3(4-アゾニア-4,4-ジメトールペンチル)カルボジイミドなどのカルボジイミド(R=-N-C-N-R=)を用いた反応により選択的に変更できる。アスパルチルまたはグルタミルはまた、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換できる。
【０２４１】
塩基性アミノ酸の模倣物は、例えば(リジンおよびアルギニンに加えて)アミノ酸のオルニチン、シトルリン、または(グアニジノ)-酢酸、またはアルキルが上記に定義されたとおりの(グアニジノ)アルキル-酢酸を用いた置換によって生成できる。ニトリル誘導体(例えば、COOHに代わってCN-成分を含む)は、アスパラギンまたはグルタミンの代わりになり得る。アスパラギニル残基およびグルタミニル残基は、対応するアスパルチル残基またはグルタミル残基に脱アミノ化できる。
【０２４２】
アルギニン残基模倣物は、アルギニルを、例えば一つまたは複数の従来の試薬、例えばフェニルグリオキサール、2,3-ブタジエン、1,2-シクロヘキサンジオン、またはニンヒドリンを含む試薬と、好ましくはアルカリ条件下で反応させることによって生成できる。
【０２４３】
チロシン残基模倣物は、チロシルを、例えば芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンと反応させることによって生成できる。N-アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを用いて、それぞれO-アセチルチロシル種および3-ニトロ誘導体を形成できる。
【０２４４】
システイン残基模倣物は、システイニル残基を、例えば2-クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのα-ハロアセタート、および対応するアミンと反応させて、カルボキシルメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得て生成できる。システイン残基模倣物は、システイニル残基を、例えばブロモ-トリフルオロアセトン、α-ブロモ-β-(5-イミドゾイル)プロピオン酸；クロロアセチルリン酸、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド；2-ピリジルジスルフィドメチル；p-クロロメルクリ安息香酸塩；2-クロロメルクリ-4-ニトロフェノール；またはクロロ-7-ニトロベンゾ-オキサ-1,3-ジアゾールと反応させることによっても生成できる。
【０２４５】
リジン模倣物は、リシニルを、例えば無水コハク酸または他の無水カルボン酸と反応させることによって生成できる(およびアミノ末端残基が変化し得る)。リジンおよび他のα-アミノ-含有残基模倣物はまた、メチルピコリンイミダート、リン酸ピリドキサール、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、O-メチルイソウレア、2,4,ペンタジオンのようなイミドエステルとの反応、およびグリコシラートとのトランスアミダーゼ触媒反応によっても生成できる。
【０２４６】
メチオニン模倣物は、例えばメチオニンスルホキシドとの反応によって生成できる。プロリンの模倣物としては、例えばピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、3-または4-ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリン、3-または4-メチルプロリン、または3,3-ジメチルプロリンが挙げられる。ヒスチジン残基模倣物は、ヒスチジルを、例えばジメチルプロカルボナートまたはパラブロモフェナシルブロミドと反応させることによって生成できる。
【０２４７】
他の模倣物としては、例えば、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化；セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化；リジン、アルギニンおよびヒスチジンのα-アミノ基のメチル化；N末端アミンのアセチル化；バックボーンアミド残基のメチル化またはN-メチルアミノ酸による置換；あるいはC末端カルボキシル基のアミド化によって生成された模倣物が挙げられる。
【０２４８】
本ポリペプチドのアミノ酸はまた、逆のキラル性を有するアミノ酸(またはペプチド模倣残基)によって置き換えることもできる。かくして天然ではL型で生じるいずれのアミノ酸(化学物質の構造によってRまたはSとも呼ばれる)も、同一タイプの化学構造を持つが、一般的にD-アミノ酸と呼ばれる、キラル性が逆の、さらにR-型またはS-型とも呼ばれることがあるアミノ酸、またはペプチド模倣物で置き換えることができる。
【０２４９】
本発明の模倣物にはまた、構造を模倣した残基、特にβターン、βシート、αヘリックス構造、γターン等の二次構造を誘導するかまたは模倣する残基を含有している組成物も含むことができる。例えば、ペプチド内の天然アミノ酸をD-アミノ酸：N-α-メチルアミノ酸；C-α-メチルアミノ酸；またはデヒドロアミノ酸によって置換すると、βターン、γターン、βシート、またはαヘリックスの立体構造を誘導または安定化できる。βターン模倣構造は、例えばNagai (1985) Tet. Lett. 26:647-650; Feigl (1986) J. Amer. Chem. Soc. 108:181-182；Kahn (1988) J. Amer. Chem. Soc. 110:1638-1639; Kemp (1988) Tet. Lett. 29:5057-5060；Kahn (1988) J. Molec. Recognition 1:75-79に記載されている。βシート模倣構造は、例えばSmith (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114:10672-10674に記載されている。例えば、シスアミドサロゲートである1,5-二置換テトラゾールで誘導されたVI βターン型がBeusen (1995) Biopolymers 36:181-200によって記載されている。アミド結合置換としてのポリメチチレン単位を生成するためのアキラルなω-アミノ酸残基の組込みは、Banerjee (1996) Biopolymers 39:769-777によって記載されている。ポリペプチドの二次構造は、例えば高磁場1H NMRまたは2D NMR分光法によって分析することができ、例えばHiggins (1997) J. Pept. Res. 50:421-435を参照されたい。またHruby (1997) Biopolymers 43:219-266, Balaji et al., 米国特許第5,612,895号も参照されたい。
【０２５０】
本化合物を、さらに修飾して化合物をより可溶性にするか、細胞内への侵入を容易にすることができる。例えば、化合物は任意の位置でPEG化され得るか、または化合物は膜貫通トランスポーター領域を含むことができる。
【０２５１】
当技術分野では、多くのペプチド配列が、これらの配列に連結したペプチドが原形質膜を通って細胞内へ侵入することを容易にするものとして記載されている(Derossi et al., 1998, Trends in Cell Biol. 8:84)。本発明の目的に関して、このようなペプチドはまとめて膜貫通トランスポーターペプチドと呼ばれる。これらペプチドの例としては、HIV由来のtat (Vives et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:16010; Nagahara et al., 1998, Nat. Med. 4:1449)、ショウジョウバエ由来のアンテナペディア(Derossi et al., 1994, J. Biol. Chem. 261: 10444)、単純ヘルペスウイルス由来のVP22 (Elliot and D'Hare, 1997, Cell 88:223-233)、抗DNA抗体の相補性決定領域(CDR) 2および3 (Avrameas et al., 1998, Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 95:5601- 5606)、70 KDa熱ショックタンパク質(Fujihara, 1999, EMBO J. 18:411-419)、およびトランスポルトラン(transportan)(Pooga et al., 1998, FASEB J. 12:67-77)が挙げられるが、これらに限定されない。切断型のHIV tatペプチドも用いることができる。
【０２５２】
D. 抗ウイルス作用物質および抗細菌作用物質の改良
選択した細胞内への抗ウイルス作用物質または抗細菌作用物質の受け入れ、および導入の改良については、多くの公知の方法が存在する。例えばタンパク質のPEG化を用いて、それらを免疫系に対してより耐性にすることができる。あるいは、細胞内シグナルまたは細胞内部分は、タンパク質およびベクターに加えて、それらを選択した細胞内に入りやすくすることができる。タンパク質またはベクターを、感染細胞に特異的に取り込まれるようにする部分、この場合、呼吸器細胞が発現するレセプターに特異的であるリガンドを加えることができる。この部分は、ウイルス感染細胞または細菌感染細胞に特異的であり、例えばレセプターまたは細胞タイプ特異的レセプターである。
【０２５３】
本治療化合物をさらに改変して、化合物をより可溶性にまたは細胞内に入りやすくすることができる。例えば化合物は、任意の位置でPEG化され得るか、または化合物を、tat、アンテナペディア、または、U. Langel,“Cell Penetrating Peptides”, CRC Press, Boca Rotan, 2002(即ち全体として参照により本明細書に組み入れられる)に記載されているようなシグナル配列膜転移ペプチドに結合することができる。
【０２５４】
当技術分野では、多くのペプチド配列が、これらの配列に連結したペプチドが原形質膜を通って細胞内へ侵入することを容易にするものとして記載されている(Derossi et al., 1998, Trends in Cell Biol. 8:84)。本発明の目的に関して、このようなペプチドはまとめて「膜貫通トランスポーターペプチド」と呼ばれるが、これは「細胞貫通ペプチド」と互換的に用いられる。後者の細胞貫通ペプチドの例としては、HIV由来のtat (Vives et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:16010; Nagahara et al., 1998, Nat. Med. 4:1449)、ショウジョウバエ由来のアンテナペディア(Derossi et al., 1994, J. Biol. Chem. 261:10444)、単純ヘルペスウイルス由来のVP22 (Elliot and D'Hare, 1997, Cell 88:223-233)、抗DNA抗体の相補性決定領域(CDR) 2および3 (Avrameas et al., 1998, Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 95:5601-5606)、70 KDa熱ショックタンパク質(Fujihara, 1999, EMBO J. 18:411-419)およびトランスポルトラン(Pooga et al., 1998, FASEB J. 12:67-77)が挙げられるが、これらに限定されない。切断型のHIV tatペプチドも用いることができる。
【０２５５】
F. 処置の方法
本明細書に開示している薬学的組成物は、細菌性疾患またはウイルス性疾患の処置または予防の方法に用いられる。
【０２５６】
上記開示から理解されるように、本発明は広範な応用性を有している。例えば、PLタンパク質、PDZタンパク質、またはPLとPDZタンパク質との間の相互作用のいずれかのインヒビターを使用して、トランスポーターと相互作用し、かつ感染細胞内に入ることができる作用物質または複合体を同定することができる。PLタンパク質、PDZタンパク質、またはPLタンパク質とPDZタンパク質との間の相互作用のいずれかのインヒビターをまた使用して、感染細胞に結合する複合体成分を同定すること、および作用物質に複合体成分を連結することによって、感染細胞に結合する作用物質の能力を高めることができる。
【０２５７】
予防的応用では、薬学的組成物または薬剤は、細菌感染またはウイルス感染に罹りやすいか、または発症する恐れがある患者に、感染を防止、軽減、または停止するのに十分な量で投与される。治療的応用では、組成物または薬剤は、ウイルス性疾患または細菌性疾患の発症が疑われるか、または既に罹っている患者に、細菌感染またはウイルス感染の症状を逆行させる、停止させる、または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与される。予防および治療レジメンの両方で、PLタンパク質、PDZ、および/またはPL-PDZ相互作用のインヒビターの形態の本発明の活性作用物質は、通常、十分な反応が達成されるまで数回の用量で投与される。しかしながら、予防および治療レジメンの両方で、活性作用物質を、十分な反応が得られるまで単回投与で投与することもできる。典型的には、処置はモニタリングされ、繰り返し投与が行われる。さらには、処置レジメンは、細菌感染またはウイルス感染の処置、または細菌感染またはウイルス感染の進行の処置に用いられるものと同様の用量；投与経路、および投与頻度を用いることができる。
【０２５８】
PLタンパク質、PDZタンパク質、および/またはPL/PDZ相互作用のインヒビターの量、ならびに担体材料と組み合わせて単回用量の形態をとることができる他の活性作用物質の量は、処置される疾患、哺乳動物種、および投与の具体的様態によって変わる。どの特定患者においても、「有効投与量」、「薬学的に許容される用量」、または「薬学的に許容される量」は、患者が動物かヒトか等にかかわらず、使用する具体的な化合物の活性、処置対象患者の種、年齢、体重、全身健康状態、性および食事；投与時間および投与経路；代謝速度または排出速度；現在または以前に投与されたことのある他の薬剤；疾患のタイプおよび重篤度；副作用の強さを含む様々な要因に依存し得る。通常患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含むヒト以外の哺乳動物も処置できる。完全長の活性化合物またはその活性断片は、有効投与量で投与され得る。
【０２５９】
PLタンパク質、PDZタンパク質、および/またはPLタンパク質/PDZ相互作用、ならびに本発明の方法で用いられる他の活性作用物質のいずれのインヒビターについても、ヒトに対する有効用量はヒト以外の動物モデルから最初に推定できる。有効量は、当技術分野で公知のパラメータを用いて、臨床医によって決定される。一般的には、投与は、最適有効用量より若干少ない量から開始される。そうしてその後、有効投与量に達するまで、用量は少しずつ増加される。(参照によって、本明細書に組み入れられるThe Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 16th Edition, §22, 1992, Berkow, Merck Research Laboratories, Rahway, New Jerseyを参照されたい)。
【０２６０】
投与量は、滴定して安全性および効果を最適化する必要がある。本明細書に記載した化合物の毒性および治療効果は、実験動物において、標準的な薬学的手順、例えばLD50(試験集団の50%に致死的な用量)およびED50 (試験集団の50%に治療的に有効な用量)を決定することによって決めることができる。毒性と治療効果との間の用量比は治療指数であり、LD50とED50との間の比として表現できる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これらヒト以外の動物研究から得られたデータは、ヒトでの使用において有毒でない投与量範囲の処方に利用できる。このような化合物の投与量は、毒性がほとんど、または全く無いED50を含む血中濃度範囲内にあることが好ましい。正確な処方、投与経路、および投与量は、患者の状態を見ながら個々の医師によって選ばれ得る。(例えば、参照によって本明細書に組み入れられる、Fingl et al. (1975) In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Chapter 1を参照されたい)。
【０２６１】
G. 投与方法
PLタンパク質、PDZタンパク質、および/またはPLタンパク質/PDZ相互作用、ならびに他の活性作用物質のインヒビターは、哺乳動物、例えばヒト患者または被験体に、その有効投与量が、単独で、薬学的に許容される塩または加水分解可能なその前駆体の形態で、あるいは化合物が適切な担体または賦形剤と一緒に混合されている薬学的組成物の形態で、送達または投与することができる。有効レジメンとは、薬物または薬物の組み合わせが、適切な経路から十分な量および頻度で投与され、細菌感染またはウイルス感染の少なくとも一つの症状の発生を少なくとも検知可能に防止、遅延、阻害、または逆行させることを意味する。「有効投与量」、「薬学的に許容される用量」、「薬学的に許容される量」は、PLタンパク質もしくは発現、PDZタンパク質もしくは発現、および/またはPL/PDZタンパク質相互作用のインヒビター、他の活性作用物質と組み合わさったPL、PDZタンパク質、および/またはPL/PDZタンパク質相互作用の活性作用物質またはインヒビターが、適切なレジメンで投与された場合に所望する結果、例えば細菌感染もしくはウイルス感染の症状、または細菌感染もしくはウイルス感染の進行を防止、遅延、阻害、または逆行させるのに十分な量で存在していることを意味する。
【０２６２】
本発明の方法で用いられる、細菌由来またはウイルス由来のPLタンパク質、一つまたは複数のPDZタンパク質、およびPL/PDZタンパク質相互作用のインヒビター、ならびに他の活性作用物質は、PLタンパク質、PDZタンパク質および/またはPL/PDZタンパク質相互作用のインヒビター、または活性作用物質を、様々な他の薬学的に許容される成分と一緒に含んでいる薬学的組成物として投与できる。薬学的組成物は、固体(粉末、顆粒、ドラジェ、錠剤、またはピルなど)、半固体(ジェル、スラリー、または軟膏など)、液体、または気体(エアゾールまたは吸入剤のような)の形態であり得る。
【０２６３】
本発明での使用に適切な製剤は、参照により本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company 1985) Philadelphia, PA, 17th edition)およびLanger, Science (1990) 249:1527-1533に見出される。本明細書に記載の薬学的組成物は、従来の様式、例えば混合、溶解、顆粒状化、ドラジェ化、粉末化、乳化、カプセル化、封入化、または凍結乾燥工程で製造できる。
【０２６４】
PLタンパク質、PDZタンパク質、およびPL/PDZタンパク質相互作用のインヒビター、ならびに他の活性作用物質は、一般的な賦形剤、希釈剤、または担体と製剤化され得、錠剤に圧縮して、または経口投与のためのエリキシル剤または溶剤として製剤化され得る。PLタンパク質、PDZタンパク質、およびPL/PDZタンパク質相互作用のインヒビター、ならびに他の活性作用物質は、持続放出投与形態等としても製剤化され得る。
【０２６５】
化合物の投与は、経口、口腔内、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内、静脈内、および筋肉内投与を含む様々な経路で達成され得る。化合物は、全身的よりはむしろ局所的に、デポーまたは持続放出製剤として投与され得る。これに加えて化合物は、リポソームの形態でも投与され得る。よりさらには、化合物は遺伝子治療によっても投与され得る。
【０２６６】
口腔内投与では、組成物は、従来の様式により製剤化された錠剤またはロゼンジの形にすることができる。
【０２６７】
吸入による投与では、本発明による使用のための化合物は、加圧パック、噴霧器、またはシリンジスプレーから、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガスを用いるか、あるいは無噴射剤式の乾燥粉末吸入器から、エアゾールスプレー調製物の形態で都合良く送達される。加圧エアゾールの場合、投与量の単位は、一定量を送達する弁を備えることによって、決定され得る。カプセルおよびカートリッジは、例えば吸入器または吹き入れ器を用いる場合はゼラチン、化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末ベースの粉末混合物を含むように製剤化され得る。
【０２６８】
化合物は、注射、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与向けに製剤化され得る。注射用製剤は、例えばアンプルまたは複数回投与容器に、追加の保存剤と一緒に単位投与量であり得る。組成物は、油を基本とするか、または水性媒体の懸濁液、溶液、または乳液といった形態をとることができ、かつ懸濁剤、安定化剤、および/または分散化剤のような調合剤を含むことができる。組成物は、無菌で、実質的に等張で、かつ米国食品医薬品局の全てのGood Manufacturing Practice (GMP)規則を遵守するように製剤化される。
【０２６９】
PLタンパク質、PDZタンパク質、およびPL/PDZタンパク質相互作用のインヒビター、ならびに他の活性作用物質を、例えばココアバター、カーボワックス、ポリエチレングリコール、または他のグリセリドなどの、全て体温で溶解するが室温では固まる、通常の坐薬基剤を含む坐剤または停留浣腸などの直腸用組成物に製剤化することもできる。
【０２７０】
これまでに記した製剤に加えて、化合物はまた、デポー調製物としても製剤化され得る。このような長期作用製剤は、埋め込み(例えば、皮下または筋肉内)あるいは筋肉内注射によって投与され得る。かくして化合物は、例えば、適切な高分子または疎水性材料(例えば、許容可能なオイルのエマルジョンとして)、またはイオン交換樹脂を使って製剤化され得、または、例えばやや溶けにくい可溶性の塩のようなやや溶けにくい可溶性誘導体として製剤化され得る(例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Urquhart et al., (1984), Ann Rev. Pharmacol. Toxicol. 24:199; Lewis, ed., 1981, Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals, Plenum Press, New York, N.Y.、米国特許第3,773,919号、および第3,270,960号を参照されたい)。
【０２７１】
あるいは、疎水性の薬学的化合物向けの他の送達システムを用いることができる。リポソームおよびエマルジョンは、疎水性薬物向け送達ビヒクルまたは担体の例である。いくつかの方法では、長期循環型、即ちステルス型リポソームを用いることができる。このようなリポソームは、Woodleら、米国特許第5,013,556号に概して記載されており、その教示は参照によって本明細書に組み入れられる。本発明の化合物は、米国特許第3,845,770号；第3,916,899号；第3,536,809号；第3,598,123号；および第4,008,719号に記載され；制御放出様式および/または送達装置によっても投与でき、これらの開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２７２】
遺伝子治療による投与では、関心対象の遺伝物質(例えばDNAまたはRNA)が宿主内に移入され、細菌感染またはウイルス感染を処置または予防する。本発明では、関心対象の遺伝物質は、PLタンパク質、PDZタンパク質およびPL/PDZタンパク質相互作用のインヒビター、活性作用物質、またはそれらの断片をコードする。本発明の一つの局面では、遺伝物質は治療的に有効でなければならない。多くのこのようなタンパク質、ベクター、DNAは、それ自体公知である(Culver, K. W., "Gene Therapy", 1994, p. xii, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, New York, N.Y.参照、これは全体として参照により本明細書に組み入れられる)。例示のみを目的として、ベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスベクター、組織特異的プロモータを持つアデノウイルスベクター、単純ヘルペスベクター、ワクシニアベクター、人工染色体、レセプター仲介遺伝子送達および上記ベクターの混合物からなる群より選択される。遺伝子治療ベクターは、Chiron, Inc., Emeryville, Calif.; Genetic Therapy, Inc., Gaithersburg, Md.; Genzyme, Cambridge, Mass.; Somtax, Alameda, Calif；Targeted Genetics, Seattle, Wash.; Viagene and Vical, San Diego, Calif.のような様々な研究所から市販されている。
【０２７３】
アデノウイルスは、PLタンパク質、PDZおよび/またはPL/PDZ相互作用のインヒビター、活性作用物質、またはそれらの断片をコードする遺伝物質にとって、有望な遺伝子治療ベクターである。アデノウイルスは、それが所望の遺伝子産物(例えばPL、PDZおよび/またはPL/PDZ相互作用のインヒビターあるいはそれらの断片)をコードおよび発現し、同時にウイルスの正常な生活環のなかでのその複製能力を不活性化するように操作され得る。アデノウイルスの発現は、ウイルスDNAが組み込まれなくとも達成されることから、挿入によって突然変異が誘導される恐れは低くなる。さらには、アデノウイルスは、長年にわたり優れた安全性プロファイルを持つ腸肝ワクチンとして用いられている(Schwartz, A. R. et al. (1974) Am. Rev. Respir. Dis. 109:233-238)。最後に、アデノウイルスが仲介する遺伝子移入は、コットンラットへのα-1-アンチトリプシンおよびCFTRの移入(Rosenfeld, M. A. et al. (1991) Science 252:431-434; Rosenfeld et al., (1992) Cell 68:143-155)を含む多くの例で実証されている。さらには、アデノウイルスをヒト癌の原因として確立しようとした膨大な数の研究の結果は、一様に否定的であった(Green, M. et al. (1979) PNAS USA 76:6606)。
【０２７４】
薬学的組成物はまた、適切な固体またはゲル相担体または賦形剤を含み得る。これら担体または賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリエチレングリコールのような高分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７５】
実施例
下記の実施例は、本発明の実施および使用方法の完全な開示および記載を提供するために提出されるが、本発明の範囲を限定するものではない。使用した数値(例えば量、温度等)については、正確性の確保に努めたが、いくつかのある程度の実験誤差および変動は存在するだろう。他に示さない限り、割合は重量比であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧またはそれに近いものである。
【０２７６】
実施例1
PDZ分析
本実施例は、様々な細菌およびウイルスのPLモチーフへのPDZタンパク質の結合を記載する。PDZタンパク質は、改良されたELISAを用いて査定された。簡単に説明すると、PDZタンパク質の全PDZドメインを含むGST-PDZ融合体が生成された。分析に用いた具体的なPDZ/PLのペア(表1)およびPDZタンパク質の配列(表2)については表1および2を参照されたい。これに加えて、様々なウイルス株および細菌株のPLタンパク質のC末端20アミノ酸に対応したビオチン化ペプチドを合成し、HPLCで精製した。これら物質と物質の結合は、アビジン-HRPを用いビオチンおよびペルオキシダーゼ基質を結合する比色分析アッセイである、「G」アッセイにより検出した。具体的なウイルスおよび細菌のPLタンパク質の配列は表1に示されている。
【０２７７】
PLタンパク質PL(またはC末端)のヒトPDZタンパク質への結合は、下記の両方を用いて決定した：(i)特定のPLタンパク質PL(またはC末端)配列の模倣物から選択されたビオチン化合成20-merペプチド；および(ii)組換えシステムで、合成遺伝子、即ち合成され、発現系でMBP免疫化学タグ(マルトース結合タンパク質；NEB；製造元の指示書にしたがって生成した)をコードしている配列に融合されたPLタンパク質のDNAがコードしている、組換えPLタンパク質。
【０２７８】
マトリックスグラフペプチド(Matrix graphPeptide)およびタンパク質を、ヒトゲノムにおける様々なPDZドメイン全てのほぼ完全なセット(255)を構成するアレイ形式で試験した。各PDZドメインポリペプチドを、市販のグルタチオンS-トランスフェラーゼタグ付き発現系で組換えGST-PDZポリペプチドとして発現させた。ビオチン化PLペプチドのPDZドメインポリペプチドに対する特異的結合を、ストレプトアビジン-HRPおよびTMB基質を用いて検出した。同様に、PLタンパク質-MBP融合タンパク質のPDZドメインポリペプチドに対する特異的結合は、ビオチン化抗MBP、ストレプトアビジン-HRP、およびTMB基質を用いて可視化された。相対的な結合の強度を分析し、各PLについて強く結合するものと弱く結合するものを示す。PLタンパク質を捕捉するかまたは識別するために用いられる場合、より強く結合するPDZタンパク質が望ましい。
【０２７９】
実施例2
HIVペプチド試験プロトコール
二つの異なるタイプのELISAアッセイを用いてHIVペプチド1904および1905を試験した。ライブラリーの全てのPDZタンパク質を対象に、Gアッセイを改良した一次MATRIXスクリーニングを、プレインキュベーション条件の下で実施した。プレインキュベーションアッセイは、PDZコーティングプレートに混合物を加える前に、ペプチドをHRP-ストレプトアビジンと一緒にインキュベートした。続いてペプチドの関心対象のPDZに対する滴定を、通常のELISA Gアッセイの条件で行った。通常条件では、HRP-ストレプトアビジンの後付加の前に、ペプチドをPDZコーティングプレート上でインキュベートする。両アッセイの試薬および供給物、ならびに二種類のプロトコールは下記に示す。
【０２８０】
滴定にはPRISM Matrix ELISA Gアッセイを用いた。試薬および供給物は下記の通りである。Nunc Maxisorp 96ウェルイムノプレート、Nuncカタログ#62409-002、PBS pH 7.4 (リン酸緩衝食塩水、8g NaCl、0.29g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4を1LのH2Oに加えたもの、pH 7.4；0.2μフィルター)アッセイ緩衝液：2% BSA PBS溶液(PBS1リットル当たり20gのウシ血清アルブミン、フラクションV、ICN Biomedicals, カタログ#ICl5142983、ヤギ抗-GSTポリクローナル抗体、保存液5mg/ml、4℃保存、Amersham Pharmaciaカタログ#27-4577-01。PBSで1:1000に希釈、最終濃度5μg/ml。HRP-ストレプトアビジン、2.5mg/2ml保存液、4℃で保存、Zymedカタログ#43-4323、アッセイ緩衝液で1:2000に希釈、最終[0.5μg/ml]。ビオチン化ペプチド(Anaspecより入手、-20℃冷凍庫に貯蔵)、GST-PRISMタンパク質(保存液は-80℃で貯蔵、初回溶解後は-10℃冷凍庫に貯蔵)、TMB (3,3',5,5',テトラメチルベンシジン)、Sigmaカタログ#T5525-100AB、0.18M H2SO4、Sigmaカタログ#S1526、12-wマルチチャンネルピペッター、Raininカタログ#L12-200、200μL LTSチップ、VWRカタログ#37001-602、50 ml試薬容器、Costar#4870、 50本のポロプロピレン製円錐チューブ、SARSTEDTカタログ#62.547.004、15mLポリプロピレン丸底チューブ、Falconカタログ#352059、1.5mLマイクロチューブ、SARSTEDTカタログ#72.690、Costar Transtar 96 Costar#7605、Transtar 96 Cartridge Costar#7610、Molecular Devicesマイクロタイターリーダー(450 nmフィルター)、SoftMax Proソフトウエア、*4℃でまたは-20℃で貯蔵した試薬を使用する場合は、試薬を取り出し氷の上に置く。
【０２８１】
プロトコールは次の通りである。
1. プレートを、50ul/ウェルの抗GSTで直接コーティングし、4℃でインキュベートする。
2. プレートから液を捨てて、プレートをペーパータオルの上で軽くたたく。
3. プレートを200ul/ウェルの割合で1×PBS/2% BSAを用いて室温で1〜2時間ブロッキングする。
4. 5μg/mlのタンパク質の1×PBS溶液を調製する。
5. タンパク質を1ウェル当たり50μl加え、4℃で1〜2時間インキュベートする。
6. アッセイ緩衝液を使ってペプチド溶液を調製する。
7. プレートを3回、冷PBS＊で洗浄する。
8. ペプチドを1ウェル当たり50μl加える(プレートに時間を書き込む)。
9. 4℃で10分間、その後室温で2分間インキュベートする。
10. ストレプトアビジン-HRPを1:2000に調製する。
11. プレートを3回、冷PBS＊で洗浄する。
12. HRPを1ウェル当たり100μl加える(プレートに時間を書き込む)
13. 4℃で20分間インキュベートする。
14. プレートを読み取り装置にかけ、ファイルを準備する。
15. プレートを、室温で、1×PBSを用いて5回、迅速に洗浄する。
16. TMB基質を1ウェル当たり100μl加える(プレートに時間を書き込む)。
17. 暗所、室温で、最長30分間インキュベートする。
18. TMB添加から30分後に100μlの0.18M H2SO4を用いて反応を停止する。
19. 反応停止後直ちに450nmで最後の読み取りを行う。
＊プレートは乾燥させてはならない。
【０２８２】
プレインキュベーションおよびMATRIXアッセイには、PRISM Matrix ELISA改良型Gアッセイも用いた。プロトコールは次の通りである。
1. プレートを、100ul/ウェルの抗GSTで直接コーティングし、4℃でインキュベートする。
2. プレートから液を捨てて、プレートをペーパータオルの上で軽くたたく。
3. プレートを200μlのアッセイ緩衝液で、室温にて1〜2時間ブロッキングする。
4. アッセイ緩衝液でタンパク質の溶液を調製する。
5. プレートを3回、冷PBS＊で洗浄する。
6. ペプチドを1ウェル当たり50μl加え、4℃で1〜2時間インキュベートする。
7. アッセイ緩衝液でペプチド溶液を調製する。
− 所望濃度の二倍の濃度を持つ、必要量の半量のペプチドを調製する。
− HRP(1:1000)を半量容積(ペプチドの場合と同じ量)に希釈し、次にペプチドと混合する。
− ペプチド-HRP混合物を、室温で20分間インキュベートする。
8. プレートを3回、冷PBS＊で洗浄する。
9. ペプチド-HRP混合物を1ウェル当たり50μl加える(プレートに時間を書き込む)。
10. 最後のペプチドを加えた後、正確に30分間室温でインキュベートする。
11. プレートを読み取り装置にかけ、ファイルを準備する。
12. プレートを、室温のPBSを用いて5回、迅速に洗浄する。 
13. TMB基質を1ウェル当たり100μl加える(プレートに時間を書き込む)。
14. 暗所、室温で、最長30分間インキュベートする。
15. TMB添加から30分後に100μlの0.18M H2SO4を用いて反応を停止する。
16. 反応停止後直ちに450nmで最後の読み取りを行う。
＊プレートは乾燥させてはならない。
【０２８３】
実施例3
PDZタンパク質へのHIV-1ペプチド1904の結合
図1および2は、配列YGRKKRRQRRRRQGLERILL (SEQ ID NO:274)を持つHIV-1のペプチド1904の結合分析を示す。ペプチド1904は、RILL (SEQ ID NO:243)に対応するPLを有している。分析は、多数のGST PDZ融合物を用いて実施した。PDZタンパク質がペプチドに結合することを確認した後、滴定を行ってEC50を決定した。図1および2は、同じ三種類のGST/PDZ融合物について、二種類のアッセイ、即ち通常のGアッセイおよび改良型Gアッセイを用いて行った実験である。図1Aは、GアッセイでのHIVペプチド1904の滴定に対するGSTバックグラウンドを示す。X軸は、バックグラウンドレベルを示す。Y軸は、μMでのペプチド濃度を表す。図1Bは、EC50が0.17μMであることを示す、PDZタンパク質ZO-1 d2 (ドメイン2)への結合に関する滴定分析を示す。図1Cは、EC50が0.41μMであることを示す、PDZタンパク質Rim2への結合に関する滴定分析を示す。図1Dは、EC50が0.26μMであることを示す、PDZタンパク質NSPに対する結合に関する滴定分析を示す。このようにペプチド1904は、PDZタンパク質ZO-1 d2、Rim2およびNSPに対し強い結合を示す。図2Aは、改良型GアッセイでのHIVペプチド1904の滴定に対するGSTバックグラウンドを示す。図2Bは、EC50が0.025μMであることを示す、PDZタンパク質ZO-1 d2 (ドメイン2)への結合に関する滴定分析を示す。図2Cは、EC50が0.03μMであることを示す、PDZタンパク質Rim2への結合に関する滴定分析を示す。図2Dは、EC50が0.0149μMであることを示す、PDZタンパク質NSPに対する結合に関する滴定分析を示す。他のPDZタンパク質の分析は、表3に見ることができる。
【０２８４】
(表３)ペプチド1904(YGRKKRR1RRRRQGLERILL - SEQ ID NO:274)
2009503439.tif 000047
【０２８５】
実施例5
PDZタンパク質へのHIV-1ペプチド1905の結合
図3〜5は、配列
2009503439.tif 000048
を持つHIV-1のペプチド1905の結合分析を示す。ペプチド1905は、RALL (SEQ ID NO:242)に対応するPLを有している。分析は、多数のGST PDZ融合物を用いて実施した。PDZタンパク質がペプチドに結合することを確認した後、滴定を行ってEC50を決定した。図3〜5は、三種類のPDZタンパク質の三回の分析である。図3Aは、改良型GアッセイでのHIVペプチド1905の滴定に対するGSTバックグラウンドを示す。X軸は、バックグラウンドレベルを示す。Y軸は、μMで表したペプチド濃度である。図3Bは、EC50が0.0028μMであることを示す、PDZタンパク質ZO-1 d2(ドメイン2)への結合に関する滴定分析を示す。図3Cは、EC50が0.014μMであることを示す、PDZタンパク質Rim2への結合に関する滴定分析を示す。図3Dは、EC50が0.008μMであることを示す、PDZタンパク質NSPに対する結合に関する滴定分析を示す。図4Aは、GアッセイでのHIVペプチド1905の滴定に対するGSTバックグラウンドを示す。図4Bは、EC50が0.184μMであることを示す、PDZタンパク質ZO-1 d2(ドメイン2)への結合に関する滴定分析を示す。図4Cは、EC50が0.182μMであることを示す、PDZタンパク質Rim2への結合に関する滴定分析を示す。図4Dは、EC50が0.1664μMであることを示す、PDZタンパク質NSPに対する結合に関する滴定分析を示す。図5Aは、改良型GアッセイでのHIVペプチド1905の滴定に対するGSTバックグラウンドを示す。図5Bは、EC50が0.036μMであることを示す、PDZタンパク質ZO-1 d2(ドメイン2)への結合に関する滴定分析を示す。図3Cは、EC50が0.068μMであることを示す、PDZタンパク質Rim2への結合に関する滴定分析を示す。図3Dは、EC50が0.03μMであることを示す、PDZタンパク質NSPに対する結合に関する滴定分析を示す。このようにペプチド1905は、PDZタンパク質ZO-1 d2、Rim2およびNSPに対し強い結合を示す。他のPDZタンパク質の分析は、表4に見ることができる。
【０２８６】
実施例6
ラテラルフロー
PDZ捕捉後のモノクローナル抗体検出、またはモノクローナル捕捉後のPDZ検出を用いたPLタンパク質を検出するためのラテラルフロー形式の例を示す。全ての例で、組換えPDZドメインタンパク質または抗体をストリッパーを用いてRF120 Millipore膜に、典型的には約1mg/mlの濃度で沈積させる。ヤギ抗マウス抗体(GAM)から構成された対照バンドも、0.5mg/mlで沈積させる。PLタンパク質を、100ulの容積のTBS-T緩衝液中で、金結合モノクローナル抗-PL抗体と混合する。いくつかの組換えPLタンパク質を陽性対照として用い、対照のレーンはPLタンパク質を含んでいない。全ての例で、試料は、指示通りに食塩水またはM4で希釈されて保存される。試料を、金結合抗体(またはPDZタンパク質)と直接混合する。
【０２８７】
捕捉剤としてPDZを用いる場合、PDZは膜上にストライプ状に付けられ、膜を試料に挿入して、毛細管作用および吸い上げパッドによってフローが開始される。任意で、複数の異なるモノクローナル抗体を、ラテラルフロー装置だけに沈積させても、または捕捉剤として組み合わせてもよい。試料は金結合PDZタンパク質と混合し、ラテラルフロー装置に使用する。ウイルスまたは細菌が存在すると、ストリップにラインが形成される。結合の強さは、次のシンボルを用いて定量化される：結合が無い場合(-)、弱い結合の場合(+)、強い結合の場合(+++)、中間の結合の場合(++)。
【０２８８】
使用される材料としては、ヤギ抗マウス/PDZタンパク質が前もってストライプ状に付けられたストリップ；TBST/ 2% BSA/ 0.25% Tween 20緩衝液；ウイルスまたは細菌のPLタンパク質、HIV試験の場合はHIV-1 Env、HIV-1 Nef、HIV-2 EnvおよびHIV-2 Vifの保存物、金結合モノクローナル抗体；およびMaxisorp ELISAプレートが挙げられる。手順は次の通りに進められる。
1) 保存PLタンパク質をTBST/ 2% BSA/ 0.25% Tween 20を用いてlOOng/uLに希釈する(希釈には5uL以上のタンパク質を使用する)。
2) タンパク質(100ng/μl) 10uLを10uLのTBST/ 2% BSA/ 0.25% Tween 20に加えて、希釈液100ng/uLを50ng/uLに希釈する。
3) 金結合抗体のTBST/ 2% BSA/ 0.25% Tween 20緩衝液の保存溶液を調製する。4uLの抗体を100uLの緩衝液全てに加え、6つの100uL反応に十分な量の緩衝液を調製する(余分なデッドボリュームも含まれる)。
4) 抗体/緩衝液混合液98uLを、ELISAプレートの別々のウェルに加える。
5) PLタンパク質希釈液2uLを緩衝液の入ったウェルに加える(ウェル一つあたり一つのPL)。
6) 一つのウェルには、抗体および緩衝液だけを加え、陰性「PLなし」対照とする。
7) ELISAプレートを数回軽くたたいてウェルの中身をよく混合する。
8) 前もってストライプを付けたストリップをウェルに入れ、展開を観察する。約30分後、ウェルからストリップを取り出し、コンピュータ中でスキャンする。
【０２８９】
混合ウイルス試験は次のように調製する。B型肝炎についてはGST-TIP2タンパク質を膜上に3mg/mLでストライプ状に付けるか、それに代わって二種類のモノクローナル抗体の混合物を用いることができる(約2mg/mLのモノクローナル抗体)。試験捕捉ラインには、1mg/mLのポリクローナルヤギ抗マウス抗体の第二ラインを用いる。段階を下記に示す。
1. 膜および吸い上げパッドの付いたカードを準備する。
2. 膜にPDZタンパク質および/または抗体を使ってストライプをつける(濃度については上記参照)。
3. 膜を一晩、56度で乾燥させ、カードを幅4.26mmのストリップにカットする。
4. グラスファイバー製試料パッドをストリップの底に取付け、ストリップ全体を試験用カセットに入れる。
5. 試験対象となる試料を溶解し、試料80μLを20μlの緩衝液に加える。数回ピペッティングして混合する。
6. 金結合(Au-)検出試薬8μlを勢いよく試料/緩衝液溶液に加えて、混合する。この検出試薬混合物は、PLタンパク質の場合、8μlのAu-モノクローナル抗体である。数回ピペッティングして混合する。
7. 調製した試料100μlをカセットのサンプルウェルに加える。
8. 試料を加えた15分後にカセットの試験およびコントロールラインを読みとる。確実に試験結果が読みとれる場合は、必ずコントロールラインがはっきり見える。上の矢印は対照を指しており、下の矢印は試験を指している。
【０２９０】
(表４)ペプチド1905
2009503439.tif 000049
2009503439.tif 000050
【０２９１】
本明細書に引用した全ての刊行物および特許は、参照によって、あたかも各個別の刊行物または特許が引用によって組み入れられることが明確かつ個別に指示されたかのように本明細書に組み入れられる。GIDまたはアクセッション番号で参照されるGenbank記録は、特に任意のポリペプチド配列、ポリヌクレオチド配列、またはその注釈も引用によって本明細書に組み入れられる。引用刊行物はどれも出願日前に開示されているが、先行発明により、本発明がこのような刊行物に先行しないとすることを認めたと解釈してはならない。
【０２９２】
本発明は、その特定の態様を参照して記載されているが、様々な変更が可能であり、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく均等物によって置き換えることができる。これに加えて、特別な状況、材料、物質組成、工程、一つまたは複数の工程段階、本発明の目的、精神、および範囲に適応するために、多くの変更が可能である。このような変更の全ては、ここに添付された特許請求の範囲内にあると解釈される。
【図面の簡単な説明】
【０２９３】
【図１】図1A〜Dは、ペプチド1904のPDZタンパク質結合分析を示す。図1Aは、Gアッセイに関するGSTのバックグラウンドを示し、図1Bは、ZO-1 d2へのペプチド1904の結合の滴定曲線を示し、図1Cは、Rim2へのペプチド1904の結合の滴定曲線を示し、図1DはNSPへのペプチド1904の結合の滴定曲線を示す。
【図２】図2A〜Dは、ペプチド1904へのPDZタンパク質の結合を識別する第二の実験を示す。図2Aは、Gアッセイに関するGSTのバックグラウンドを示し、図2Bは、ZO-1 d2へのペプチド1904の結合の滴定曲線を示し、図2Cは、Rim2へのペプチド1904の結合の滴定曲線を示し、図2DはNSPへのペプチド1904の結合の滴定曲線を示す。
【図３】図3A〜Dは、ペプチド1905のPDZタンパク質結合分析を示す。図3Aは、Gアッセイに関するGSTのバックグラウンドを示し、図3Bは、ZO-1 d2へのペプチド1904の結合の滴定曲線を示し、図3Cは、Rim2へのペプチド1904の結合の滴定曲線を示し、図3DはNSPへのペプチド1904の結合の滴定曲線を示す。
【図４】図4A〜Dは、ペプチド1905へのPDZタンパク質の結合を識別する第二の実験を示す。図4Aは、Gアッセイに関するGSTのバックグラウンドを示し、図4Bは、ZO-1 d2へのペプチド1904の結合の滴定曲線を示し、図4Cは、Rim2へのペプチド1904の結合の滴定曲線を示し、図4DはNSPへのペプチド1904の結合の滴定曲線を示す。
【図５】図5A〜Dは、ペプチド1905へのPDZタンパク質の結合を識別する第三の実験を示す。図5Aは、Gアッセイに関するGSTのバックグラウンドを示し、図5Bは、ZO-1 d2へのペプチド1904の結合の滴定曲線を示し、図5Cは、Rim2へのペプチド1904の結合の滴定曲線を示し、図5DはNSPへのペプチド1904の結合の滴定曲線を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月4日(2008.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009503439000001.app
【国際調査報告】
2009503439.tif 000051
2009503439.tif 000052
2009503439.tif 000053
2009503439.tif 000054
2009503439.tif 000055
2009503439.tif 000056