(57)【要約】  本発明は、同じタイプの繰り返しユニットから成る、これまでに生成されている多糖と比較して、増加した粘度特性を示すジウタン多糖の生成、について記載する。そのような改善されたジウタン多糖を、ジウタン多糖の生合成に関する遺伝子がクローン化された、多コピーの広域宿主プラスミドを内包する、スフィンゴモナス属細菌ＡＴＣＣ  ５３１５９の誘導体の作製を通して生成する。このプラスミドは、宿主のスフィンゴモナス株内で、そのような多糖の合成のための遺伝子の多数のコピーを生成する能力を提供する。そのような方法で、標的のジウタン多糖の単に増加した生成だけでなく、その（上述のより高い粘度という）改善された物理的特性のジウタン多糖の生成の方法もまた提供する。そのようなジウタン多糖は、油田での適用において、およびセメント材料中での可能性ある増粘剤として特に有用であることが証明された。そのような改善されたジウタン多糖を生成する本発明の方法、ならびにそのような方法に含まれる、改善されたジウタンを生成するために必要な新規クローン化遺伝子もまた、本発明の範囲内に包括的に含まれる。加えて、必要とされるＤＮＡ配列を含む新規に遺伝子操作されたスフィンゴモナス株も、本発明の範囲内に包括的に含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１５０deciＬ/ｇより大きい固有粘度を示すジウタンガム。
【請求項２】
１５５deciＬ/ｇより大きい固有粘度を示す、請求項１に記載のジウタンガム。
【請求項３】
１６０deciＬ/ｇより大きい固有粘度を示す、請求項２に記載のジウタンガム。
【請求項４】
３５ダイヤル目盛り値より大きい海水３ｒｐｍの粘度を示すジウタンガム。
【請求項５】
３７ダイヤル目盛り値より大きい海水３ｒｐｍの粘度を示す、請求項４に記載のジウタンガム。
【請求項６】
４０ダイヤル目盛り値より大きい海水３ｒｐｍの粘度を示す、請求項５に記載のジウタンガム。
【請求項７】
４２ダイヤル目盛り値より大きい海水３ｒｐｍの粘度を示す、請求項６に記載のジウタンガム。
【請求項８】
３５，０００ｃｐより大きい海水０．３ｒｐｍの粘度を示すジウタンガム。
【請求項９】
３５，０００ｃｐより大きい海水０．３ｒｐｍの粘度を示す、請求項８に記載のジウタン。
【請求項１０】
３８，０００ｃｐより大きい海水０．３ｒｐｍの粘度を示す、請求項９に記載のジウタン。
【請求項１１】
４０，０００ｃｐより大きい海水０．３ｒｐｍの粘度を示す、請求項１０に記載のジウタン。
【請求項１２】
４１，０００ｃｐより大きい海水０．３ｒｐｍの粘度を示す、請求項１１に記載のジウタン。
【請求項１３】
３５００ｃｐより大きい、ポリエチレングリコール分散剤の存在下での低剪断速度の粘度を示すジウタンガム。
【請求項１４】
３７００ｃｐより大きい、ポリエチレングリコール分散剤の存在下での低剪断速度の粘度を示す、請求項１３に記載のジウタンガム。
【請求項１５】
３９００ｃｐより大きい、ポリエチレングリコール分散剤の存在下での低剪断速度の粘度を示す、請求項１４に記載のジウタンガム。
【請求項１６】
４０００ｃｐより大きい、ポリエチレングリコール分散剤の存在下での低剪断速度の粘度を示す、請求項１５に記載のジウタンガム。
【請求項１７】
ジウタンガムを生成する方法であって、
宿主のジウタン産生スフィンゴモナス生物体中に、少なくとも１つのジウタン生合成酵素のコード配列を導入する工程；
発酵条件下で宿主生物体を培養し、それにより該宿主生物体が、以下の特徴：
ａ）１５０ｄＬ/ｇより大きい固有粘度；
ｂ）３５ダイヤル目盛り値より大きい、海水３ｒｐｍの粘度；
ｃ）３５，０００センチポイズより大きい、海水０．３ｒｐｍの粘度；および
ｄ）３５００センチポイズより大きい、ポリエチレングリコール分散剤の存在下での低剪断速度の粘度
の少なくとも１つを示すジウタンガムを産生する工程
を含む方法。
【請求項１８】
少なくとも１つのジウタン生合成酵素がＤｐｓＧポリメラーゼである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つのジウタン生合成酵素が、ＤｐｓＧポリメラーゼ、ならびにグルコース−１−リン酸チミジリルトランスフェラーゼ；ｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−グルコース−３−５−エピメラーゼ；ｄＴＤＰ−Ｄ−グルコース−４，６−デヒドラターゼ；およびｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｌ−マンノース−デヒドロゲナーゼを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つのジウタン生合成酵素が、ＤｐｓＧポリメラーゼ、ならびにラムノシルトランスフェラーゼＩＶ；グルコシル−イソプレニルリン酸トランスフェラーゼＩ；ベータ−１，４−グルクロノシルトランスフェラーゼＩＩ；およびグルコシルトランスフェラーゼＩＩＩを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つのジウタン生合成酵素が、ＤｐｓＧポリメラーゼ、ならびに多糖排出タンパク質であるＤｓｐＤ、ＤｓｐＣ、およびＤｓｐＥを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１つのジウタン生合成酵素が、ラムノシルトランスフェラーゼＩＶ；ベータ−１，４−グルクロノシルトランスフェラーゼＩＩ；グルコシルトランスフェラーゼＩＩＩ；グルコース−１−リン酸チミジリルトランスフェラーゼ；グルコシル−イソプレニルリン酸トランスフェラーゼＩ；ｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−グルコース−３−５−エピメラーゼ；ｄＴＤＰ−Ｄ−グルコース−４，６−デヒドラターゼ；およびｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｌ−マンノース−デヒドロゲナーゼを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つのジウタン生合成酵素が、ポリメラーゼ；リアーゼ；ラムノシルトランスフェラーゼＩＶ；ベータ−１，４−グルクロノシルトランスフェラーゼＩＩ；グルコシルトランスフェラーゼＩＩＩ；多糖排出タンパク質；分泌タンパク質；グルコシル−イソプレニルリン酸トランスフェラーゼＩ；グルコース−１−リン酸チミジリルトランスフェラーゼ；ｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−グルコース−３−５−エピメラーゼ；ｄＴＤＰ−Ｄ−グルコース−４，６−デヒドラターゼ；ｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｌ−マンノース−デヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
より長い平均ポリマー長を有するスフィンガンガムを生成する方法であって、
宿主のスフィンガン産生スフィンゴモナス生物体中に、少なくとも１つのスフィンガンポリメラーゼ酵素のコード配列を導入する工程；
発酵条件下で該宿主生物体を培養し、それにより該宿主生物体が、コード配列の導入前にスフィンゴモナス生物体によって産生されるものより長い平均ポリマー長を有する、スフィンガンガムを産生する工程を含む、方法。
【請求項２５】
スフィンガンガムがＳ８８である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
スフィンガンガムがＳ６０である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
スフィンガンガムがＳ６５７である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
配列番号：５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、および４３に示されるような少なくとも１つのジウタン生合成酵素、または配列番号：５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、および４３と少なくとも９５％同一である酵素をコードする、単離された核酸分子。
【請求項２９】
ジウタンポリメラーゼをコードする、請求項２８に記載の単離された核酸分子。
【請求項３０】
ジウタンポリメラーゼおよび多糖排出タンパク質をコードする、請求項２８に記載の単離された核酸分子。
【請求項３１】
ジウタンポリメラーゼ、ならびにラムノシルトランスフェラーゼＩＶ；グルコシル−イソプレニルリン酸トランスフェラーゼＩ；ベータ−１，４−グルクロノシルトランスフェラーゼＩＩ；およびグルコシルトランスフェラーゼＩＩＩをコードする、請求項２８に記載の単離された核酸分子。
【請求項３２】
ジウタンポリメラーゼ、ならびにグルコース−１−リン酸チミジリルトランスフェラーゼ；ｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−グルコース−３−５−エピメラーゼ；ｄＴＤＰ−Ｄ−グルコース−４，６−デヒドラターゼ；およびｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｌ−マンノース−デヒドロゲナーゼをコードする、請求項２８に記載の単離された核酸分子。
【請求項３３】
ジウタンポリメラーゼ；リアーゼ；ラムノシルトランスフェラーゼＩＶ；ベータ−１，４−グルクロノシルトランスフェラーゼＩＩ；グルコシルトランスフェラーゼＩＩＩ；多糖排出タンパク質；分泌タンパク質；グルコシル−イソプレニルリン酸トランスフェラーゼＩ；グルコース−１−リン酸チミジリルトランスフェラーゼ；ｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−グルコース−３−５−エピメラーゼ；ｄＴＤＰ−Ｄ−グルコース−４，６−デヒドラターゼ；およびｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｌ−マンノース−デヒドロゲナーゼをコードする、請求項２８に記載の単離された核酸分子。
【請求項３４】
配列番号１に記載の核酸配列を含む、請求項２８に記載の単離された核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、同じタイプの繰り返しユニットから成る、これまでに生成されている多糖と比較して、増加した粘度特性を示すジウタン(diutan)多糖の生成、について記載する。そのような改善されたジウタン多糖は、ジウタン多糖の生合成に関する遺伝子がクローン化されている、多コピーの広域宿主プラスミドを内包する、スフィンゴモナス属細菌(Sphingomonas sp.)ＡＴＣＣ  ５３１５９の誘導体の作製を通して生成する。このプラスミドは、宿主のスフィンゴモナス株内で、そのような多糖の合成のための遺伝子の多数のコピーを生成する能力を提供する。そのような方法で、標的のジウタン多糖の単に増加した生成だけでなく、その（上述のより高い粘度という）改善された物理的特性のジウタン多糖の生成の方法もまた提供する。そのようなジウタン多糖は、油田での適用において、およびセメント材料中での可能な増粘剤(viscosifier)として特に有用であることが証明された。そのような改善されたジウタン多糖を生成する本発明の方法、ならびにそのような方法に含まれる、改善されたジウタンを生成するために必要な新規クローン化遺伝子もまた、本発明の範囲内に包括的に含まれる。加えて、必要とされるＤＮＡ配列を含む新規に遺伝子操作されたスフィンゴモナス株も、本発明の範囲内に包括的に含まれる。
【０００２】
（発明の背景）
多糖またはガムは、主にゲル水溶液を増粘化するために使用されており、しばしば２つの群：増粘剤およびゲル化剤に分類される。典型的な増粘剤は、スターチ、キサンタンガム、ジウタンガム、ウェラン(Welan)ガム、グアーガム、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、メチルセルロース、カラヤガム、およびトラガカントガムを包含する。一般的なゲル化剤には、ゼラチン、ジェランガム、スターチ、アルギネート、ペクチン、カラギーナン、寒天およびメチルセルロースを含む。
【０００３】
一部の多糖、またはより特定して言えば、バイオガム、例えばキサンタン、ジェラン、ウェラン、およびジウタンは、長い間微生物からの発酵を介して生成されてきた。そのようなバイオガムは、多くの異なる適用上でのそれらの利用を可能にしてきた様々な特徴、例えば粘度を修飾する能力を示す。そのような適用リストに含まれるものとして、食品用、例えば菓子のゼリー、ジャムおよびゼリー、デザートのゲル、アイシング、および乳製品のゲル化剤、ならびに微生物の培地の成分が包含される。さらに増粘剤は、標的の液体の粘度を修飾する無数の最終用途としての適用に利用されている。特に興味深いのは、地下および/または水中の石油の採掘を促進するためにそれらに粘度に修飾を与える、そのようなガムの能力であるが、しかし多くのその他の異なる可能な最終用途（一例としてセメントの生産を含む）も挙げられる。異なる微生物原料から異なるバイオガムが、例えばXanthomonas campestrisからキサンタンガム、スフィンゴモナス・エロデア(Sphingomonas elodea)からジェランガム、スフィンゴモナス属細菌ＡＴＣＣ  ３１５５５からウェランガム、およびスフィンゴモナス属細菌ＡＴＣＣ  ５３１５９からジウタンガム（Ｓ−６５７）が、生成されている。そのような株の遺伝子修飾が、前述の発酵法を通して生成される結果として得られるガム材料における有意な変化を達成するため、過去に行われてきた。そのような修飾は、異なる物理的特性を示す異なるガムの材料を創出するため、アシル基の除去といった変化を可能にした。一般にそのような遺伝子修飾は、宿主生物内の変化した遺伝子発現を通して究極的に標的バイオガムの組成を変化させるタイプ、または遺伝子の増幅のみを示すプラスミドの導入を通して標的バイオガムの収量を増加させるタイプ（例えばPollockらに対する米国特許第５，８５４，０３４号、５，９８５，６２３号、および６，２８４，５１６号、およびPollock個人に対する米国特許第６，７０９，８４５号において）、のいずれかであった。
【０００４】
ジウタンガム（ヘテロ多糖Ｓ−６５７としても知られている）は、スフィンゴモナス属細菌株ＡＴＣＣ  ５３１５９の発酵により調製され、水溶液において増粘、懸濁、および安定化の特性を示す。ジウタンは一般に、骨格の４つの糖（グルコース−グルクロン酸−グルコース−ラムノース）、およびグルコース残基の１つに結合した２つのラムノース残基の側鎖、から成る６量体の繰り返しユニットを呈する。ジウタンガムの構造の詳細については、Chowdhury, T. A., B. Lindberg, U. Lindquist and J. Baird, Carbohydrate Research 164 (1987) 117-122による論文に見出してよい。ジウタンは、Diltz et al., Carbohydrate Research 331 (2001) 265-270において、１繰り返しユニット当たり２つのアセチル置換基を有することが示された。これらの参考文献の双方を本明細書によりそれらの全内容において参照として援用する。ジウタンガムを調製するための詳細は、米国特許第５，１７５，２７８号に見出され、同文献を本明細書によりその全内容において参照として援用する。ジウタンは、標準的な発酵技術、例えば炭水化物原料（非限定的例としてグルコース、マルトース、等）、窒素原料、および付加的な塩を使用する技術を利用することにより、スフィンゴモナス株から生成することができる。
【０００５】
野生型におけるそのようなジウタンバイオガムにより得られる物理的特徴は、特にその粘度修飾特性および/または水分保持の特徴に関して、ある種の産業により所望されている。残念ながらジウタンは、コスト効率的に生産するのは難しいことが判明している。さらに、そのようなコストの問題は、現在のところジウタンの広範な利用には不利に働いている、というのは、そのようなバイオガムにより示される粘度の程度では、より廉価であるが有効なバイオガム（例えば一例としてキサンタンガム）に取って代わるには十分ではないからである。そのような点で、せめてより低コストでそのような有効なジウタンを生成する方法を提供すること、および/またはその上に物理的特性の有意な改善を示すジウタンタイプのバイオガムを生成する方法を提供することが、確立された必要性であった。今日まで、あらゆるタイプの関連するスフィンガンの生成に関する唯一の記述（具体的にはジウタンに関しては何の実証もされていない）は、（上述のPollockらの特許における）より高い収量に関するものだけしかない。そのような生成法によって粘度測定における何らかの改善を示す、より高い分子量の改善されたジウタンガムを生成するための方法を提供する何らかのやり方について、いかなる議論も相応の示唆もなされてきていない。
【０００６】
（発明の簡単な説明）
宿主のスフィンゴモナス細菌内でのジウタンの生合成のための、ある種の新規の単離されたＤＮＡ配列の増幅は、宿主からのジウタンガムの増大した産生を可能にするだけでなく、増加した粘度特性を示すジウタンガムをまた産生することが、今回認識された。したがって、そのような新規ＤＮＡ配列（いずれかの周知の方法、例えば非限定的にプラスミドを介して、宿主生物内に導入される）は、ジウタン合成法のために追求されてきた所望の結果を提供する。プラスミド上で増幅されるこれら遺伝子のそのような利用に関する他と区別される利点は、そのような単離されたＤＮＡ配列をジウタン合成の製法に組み込むという、その比較的簡単な性質である。もう１つの利点は、標的ジウタンガムに関するそのようなより高い粘度特性を生成し、同時に、必要であれば発酵産生効率を潜在的に増大させる能力である。
【０００７】
したがって本発明は、いくつかの異なる粘度測定において改善を示すジウタンガムを含む。これらの測定には：ｉ）１５０ｄＬ/ｇより大きい、好ましくは１５５より高い、より好ましくは１６０より高い固有粘度；ｉｉ）海水３ｒｐｍの３５ダイヤル目盛り値より大きい、好ましくは３７より高い、より好ましくは４０より高い、および最も好ましくは４２より高い粘度；ｉｉｉ）海水０．３ｒｐｍの３５，０００センチポイズ（ｃＰ）より大きい、好ましくは３９，０００より高い、より好ましくは４０，０００より高い、および最も好ましくは４１，０００より高い粘度；ならびにＰＥＧ低剪断速度での３５００ｃＰより大きい、好ましくは３７００より高い、より好ましくは３９００より高い、および最も好ましくは４０００より高い粘度、を含む。本発明はまた、宿主のスフィンゴモナス生物体中に遺伝子の特定のクラスターを導入し、前記生物体の発酵が、結果として得られるジウタンガムを産生することを可能にすることによって、上の用語のいずれかで定義されたような、そのようなジウタンガムを産生する方法を包括的に含む。さらに本発明は、特定のＤＮＡ配列、およびより強いプロモーターの使用によって該遺伝子の多数のコピーまたは該遺伝子の増大した発現を提供する、あらゆるベクター（例えばプラスミド）を包括的に含む。加えて、そのような独特の単離されたＤＮＡ配列によって定義されるジウタン生合成遺伝子の多数のコピーを含有する、スフィンゴモナスの遺伝子修飾された株もまた包括的に含む。
【０００８】
そのような独特の単離されたＤＮＡ配列は、ＤｐｓＧポリメラーゼである少なくとも１つのジウタン生合成酵素を必要とすることが発見された。もう１つの可能な態様において、そのようなジウタンの生合成酵素は、ＤｐｓＧポリメラーゼ、ならびにグルコース−１−リン酸チミジリルトランスフェラーゼ；ｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−グルコース−３−５−エピメラーゼ；ｄＴＤＰ−Ｄ−グルコース−４，６−デヒドラターゼ；およびｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｌ−マンノース−デヒドロゲナーゼを含むものとする。なおもう１つの可能な態様において、そのようなジウタン生合成酵素は、ＤｐｓＧポリメラーゼ、ならびにラムノシルトランスフェラーゼＩＶ；ベータ−１，４−グルクロノシルトランスフェラーゼＩＩ；グルコシル−イソプレニルリン酸トランスフェラーゼＩ；およびグルコシルトランスフェラーゼＩＩＩを含む。まだもう１つの可能な態様において、そのようなジウタン生合成酵素は、ｄｐｓＧポリメラーゼ、ならびに多糖排出タンパク質であるｄｓｐＤ、ｄｓｐＣ、およびｄｓｐＥを含む。なおもう１つの可能な態様において、そのようなジウタン生合成酵素は、ラムノシルトランスフェラーゼＩＶ；ベータ−１，４−グルクロノシルトランスフェラーゼＩＩ；グルコシル−イソプレニルリン酸トランスフェラーゼＩ；グルコシルトランスフェラーゼＩＩＩ；グルコース−１−リン酸チミジリルトランスフェラーゼ；ｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−グルコース−３−５−エピメラーゼ；ｄＴＤＰ−Ｄ−グルコース−４，６−デヒドラターゼ；およびｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｌ−マンノース−デヒドロゲナーゼを含むものとする。一般に本発明の方法および本生成物の範囲内のジウタン生合成酵素は、ポリメラーゼ；リアーゼ；ラムノシルトランスフェラーゼＩＶ；ベータ−１，４−グルクロノシルトランスフェラーゼＩＩ；グルコシルトランスフェラーゼＩＩＩ；多糖排出タンパク質；分泌タンパク質；グルコシル−イソプレニルリン酸トランスフェラーゼＩ；グルコース−１−リン酸チミジリルトランスフェラーゼ；ｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−グルコース−３−５−エピメラーゼ；ｄＴＤＰ−Ｄ−グルコース−４，６−デヒドラターゼ；ｄＴＤＰ−６−デオキシ−Ｌ−マンノース−デヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせから成る群より選択してよい。次にさらに本発明に包含されるものとして、（標的染色体上に存在してよいＤＮＡに加えて）配列番号：５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、および４３に示されるような少なくとも１つのジウタン生合成酵素、または配列番号：５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、および４３と少なくとも９５％同一の酵素をコードする、単離された核酸分子がある。
【０００９】
このように本発明の方法（ならびにそれにより作成される産生物）は、非限定的にＳ８８、Ｓ６０、およびＳ６５７を含むスフィンガンガム、特にジウタンタイプに関する。
上に記したように、本発明は、ある種のスフィンゴモナス株内に多数のコピーで導入される特定のＤＮＡ配列が、高粘度のジウタン多糖の増大した生合成産生物を提供することができるという、開発と認識の蓄積である。増大した産生のためのそのような遺伝子を含有する遺伝子操作された細菌は、未操作の細菌と比較して有意により多量のジウタン多糖を産生し、そして前述の結果として得られる高粘度特性を創出する。
【００１０】
本発明によると（具体的な科学的理論に頼る訳では決してないが、分子量範囲特性の増加と考えられるものによる）、上記産生増大および粘度特性上昇を生じるように、（あらゆる周知された形、例えば再び非限定的例としてプラスミドとして）宿主生物体内に導入されるＤＮＡ配列は、当該技術分野において容易に利用できる技術により単離、回収、およびクローン化することができる。その後ＤＮＡは、多数のコピー（プラスミド、その他の公知の方法を介して）、または適切な、例えばより強力なプロモーターを介しての遺伝子の増大した発現という形で、スフィンゴモナス属の細菌中に送達される。標的細菌内への挿入後、遺伝子操作した細菌を発酵させ、産生される量および産生される質に関して収量を比較することにより、ジウタンの産生を決定することができる。増大した産生および粘度の増加は双方とも、野生型ジウタン産生株（ＡＴＣＣ  ５３１５９）との比較において、本発明の方法を介してのジウタンの産生を比較することにより、決定することができる。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
以下の用語は、本発明に関連して本明細書を通して使用され、以下に示す意味を有するものとする：
“スフィンゴモナス”という用語は、本明細書を通して、スフィンゴモナス属由来のグラム陰性菌の株を参照するために使用される。
【００１２】
“増大した産生株”または“増大した産生”という用語は、本明細書を通して、同一株の野生型細菌と比較して、有意により多量の（重量に基づいて重量で少なくとも約５％より多い）ジウタン多糖を産生する、同一株から単離されたＤＮＡ配列の多数のコピーを含有する、遺伝子操作された細菌を記述するために使用される。
【００１３】
“単離された”という用語は、微生物から取り出して、少なくともある程度の精製、すなわち１回またはそれより多くの精製ステップを行ったＤＮＡ、および制限酵素により開裂もしくは切断し、多数のコピーにクローン化する、またはプラスミドベクター中に挿入する、またはそうでなければ細菌中に挿入もしくは組み込むことのできるＤＮＡ、を記述するために使用される。
【００１４】
“配列”という用語は、そのヌクレオチドユニットにより同定される、ＤＮＡの特定セグメントを記述するために使用される。“挿入された”という用語は、本明細書を通して、ジウタン産生スフィンゴモナス株の染色体ＤＮＡから単離されたＤＮＡセグメントを、（１つの非限定的例としてプラスミドを介して）スフィンゴモナス株中に転移する過程および結果を記述するために使用される。そのような単離されたＤＮＡは、再び１つの非限定的可能性として、所望のプラスミド（ここではｐＬＡＦＲ３）中に、当該技術分野における周知の技術によって最初に導入した後、例えばレシピエントのスフィンゴモナス細菌内への接合または可動化により転移してよい。レシピエントのスフィンゴモナス細菌中への挿入後、関連するＤＮＡ配列を含有するプラスミドを、レシピエントの細胞内で複製させて、高い粘度の（再び、高い分子量の範囲であると考えられる）ジウタン多糖の増大した産生に必要な、ＤＮＡセグメントのいくつか（少なくとも２および通常４−１０）のコピーを得る。プラスミドベクターをレシピエントの細菌内に転移するために、接合または可動化を使用することが、一般には有効である。精製ＤＮＡを持つコンピテント細胞の電気穿孔または化学的形質転換もまた使用してよい。他のベクターまたはバクテリオファージを使用して、ＤＮＡを宿主細胞内に転移することもできる。レシピエントのジウタン−産生スフィンゴモナスにおいて、プラスミド（または他の周知の送達ベクター）上にＤＮＡセグメントを維持することは、必要ではない。ＤＮＡセグメントの付加的なコピーを細菌染色体中に導入するのはルーチン的手法であり、その結果セグメントは、細菌ＤＮＡを複製する同じ機序によって各世代毎に複製される。あるいはその遺伝子の増大した発現を、より強いプロモーターエレメントを使用することにより達成してもよい。
【００１５】
“遺伝子の増幅”という用語は、例えば標的遺伝子を多コピープラスミド（例えば４から１０コピー）上にクローニングすることによる、または細菌ゲノム内への遺伝子の多数（例えば４から１０）のコピーの挿入による遺伝子の増加したコピー、あるいは遺伝子発現を増大するためのプロモーターエレメントの修飾による遺伝子の増大した発現、のいずれかを参照するために使用される。これらの方法の双方とも、およびその他の方法から、増大した量のコードされたタンパク質を結果的に得ることができる。
【００１６】
“生合成”という用語は、本明細書を通して、スフィンゴモナス細菌によるジウタンの生物学的生成または合成を記述するために使用される。ジウタン多糖は、細菌の多数の酵素によってコントロールされる一連のステップにおいて、個々の炭水化物ユニットから合成される。
【００１７】
選択されたあらゆる形（例えば再び、好ましくは、しかし必ずしもそうでなくてもよいが、プラスミドの形）で、レシピエントの細菌内に組み込まれる関連するＤＮＡ配列は、増大した産生および増加した分子量のジウタン多糖の生合成に有益、または必須であることが知られている、遺伝子情報をコードする。加えて、しかし特定の本発明の（例えばプラスミドｐＳ８内の）ＤＮＡ配列は、特定の科学的理論に頼る訳ではないが、単に増大した産生を誘導するだけでなく、ジウタンそれ自体の個々のポリマー内でポリマー化される繰り返しユニットの数の増加もまた誘導すると考えられる。結果として、そのような繰り返しユニットの増加は、驚くことにジウタンガムによって提供される、結果として得られる高い粘度特性を生成すると考えられる。分子量の増加は、べき法則の関連性によって分子量に関連する固有粘度の測定値の増加により、仮定された。（ジウタンガムのような）直鎖ポリマーに関して、このように固有粘度はその点において本質的には分子量に比例することが知られている。
【００１８】
本発明の方法を基本とする、そして増加した粘度のジウタン多糖を産生する、関連するＤＮＡ配列の単離は、標準的な技術および方法を介して達成される。したがってそのような配列は、標準的な製法を使用して培養されたジウタン−産生スフィンゴモナス株から作製してよい。次にそのＤＮＡの抽出を、例えば細菌細胞の最初の遠心および再懸濁の後、精製カラムを通してのＤＮＡの引き続いての溶出を通して、行うことができる。精製が完了した後、単離されたＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼで消化し、所望のプラスミドまたは他の送達ベクター中にクローン化し、その後レシピエントの株に転移することができる。当該技術分野に公知であるようなその他の技術も、非限定的に使用することができる。
【００１９】
本発明のＤＮＡのクローニングは、当該技術分野で標準となっている一般的な技術および方法に依存する。本発明によるＤＮＡセグメントをクローン化するために、あらゆる方法をしてよく、本発明は、例えばプラスミドクローニングベクターの使用に限定されないことを特に言及しておく。例えばＤＮＡ画分は、バクテリオファージベクター内への挿入によりクローン化してもよい。
【００２０】
次にクローン化したＤＮＡ配列を、プラスミドまたはその他の送達ベクターを介してスフィンゴモナス株に導入することができる。その後遺伝子修飾されたスフィンゴモナス株を使用して、発酵によりジウタンを産生することができる。基本的には発酵のための適切な培地は、炭素原料、例えばグルコース、ラクトース、スクロース、マルトース、またはマルトデキストリンを含む炭水化物、窒素原料、例えば無機アンモニウム、無機硝酸塩、有機アミノ酸またはタンパク質性の材料、例えば加水分解酵母、大豆粉もしくはカゼイン、蒸留の可溶性成分(distiller’s solubles)またはトウモロコシ浸出液、および無機塩を含有する、水溶性培地である。広く多様な発酵培地が、本発明によるジウタンの産生を支持することになる。
【００２１】
炭水化物は、多様な量で、しかし通常は、発酵培地の重量の約１および１０％（好ましくは２−８％）の間で、発酵ブロスに含めることができる。炭水化物は発酵の前に、あるいは発酵時に加えてよい。窒素の量は、水性培地の重量の約０．０１％から約０．４％の範囲としてよい。単一の炭素原料又は窒素原料を使用すればよいが、同様にこれら原料の混合物を使用してもよい。スフィンゴモナス菌を発酵する上での使用が見出されている無機塩に、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、硝酸塩、カルシウム、リン酸塩、硫酸塩、塩化物、炭酸塩、および類似のイオンを含有する塩がある。微量元素、例えばマグネシウム、マンガン、コバルト、鉄、亜鉛、銅、モリブデン、ヨウ化物およびホウ酸塩もまた、有利なものとして含めてよい。
【００２２】
発酵は、約２５と４０℃の間の温度で、好ましくは約２７℃と３５℃の温度範囲で行うことができる。接種菌は、震盪フラスコ培養および小さなスケールの液内培養撹拌発酵を含む、容量のスケールアップの標準的な方法により調製することができる。接種菌を調製するための培地は、産生培地と同じであることができるが、または当該技術分野で周知されているいくつかの標準的な培地のいずれか１つ、例えばLuriaブロスまたはＹＭ培地であることもできる。１つまたはそれより多くの種菌の段階を使用して、接種用の所望の容量を得てよい。典型的な接種容量は、総最終発酵容量の約０．５％から約１０％の範囲である。
【００２３】
発酵容器は、内容物を撹拌するための撹拌器を含有してよい。容器はまた、自動ｐＨコントロールおよび発泡コントロールを備えていてもよい。産生培地を容器に加え、加熱によりその場で殺菌することができる。あるいは炭水化物または炭素原料を、添加前に別々に殺菌してもよい。予め成長させておいた種菌の培養液を、（一般に約２７℃から約３５℃の好ましい発酵温度の）冷却した培地に加え、撹拌培養液を、約４８時間から約１１０時間の間発酵させ、高粘度のブロスを生成することができる。ジウタン多糖は、アルコール、一般にはイソプロピルアルコールを用いて、標準的な沈澱法によりブロスから回収することができる。
【００２４】
（図面の詳細な記載を含む発明の好ましい態様）
以下の実施例は、本発明を説明するために提供する。実施例の記載は、多少なりとも本発明の範囲を限定するものと誤って解釈されるべきではない。
【００２５】
ＤＮＡ配列の単離/プラスミドの生成
最初の単離を行い、先に記載した本発明の結果を得るための適当な配列を決定するため、ＡＴＣＣ  ５３１５９生物体の遺伝子ライブラリーを以下の様に構築した：スフィンゴモナス属細菌ＡＴＣＣ  ５３１５９から染色体ＤＮＡを単離し、Ｓａｕ３ＡＩ制限エンドヌクレアーゼで部分的に消化した。１５から５０ｋｂの範囲のＤＮＡフラグメントを、寒天ゲルから精製し、大腸菌株ＪＺ２７９から単離したＢａｍＨＩ消化したコスミドクローニングベクターｐＬＡＦＲ３（Staskawicz, et al., “Molecular characterization of cloned avirulence genes from race 0 and race 1 of Pseudomonas syrinae pv. Glycinea”, J. Bacteriology. 1987, 169: 5789-94に従って）中に連結した（Harding, et al., “Genetic and physical analysis of a cluster of genes essential for xanthan gum biosynthesis in Xanthomonas campestris”, J. Bacteriology. 1987. 169: 2854-61による）。連結反応はλファージ粒子中に（Stratagene, La Jolla, CA からのGigapack III Gold packaging extractを用いて）パッケージングし、Library Efficiency 大腸菌ＤＨ５αＭＣＲ細胞（Life Technologies, Rockville, MD）中に形質移入した。およそ１０，０００のテトラサイクリン耐性コロニーをプールして、遺伝子ライブラリーを形成した。このライブラリーから、次に個々の配列を単離した。この場合に行った研究は、スフィンゴモナスＡＴＣＣ  ５３１５９生物体由来の多糖生合成のための特定の遺伝子の単離を伴うものであった。
【００２６】
多糖の生合成に関するそのような遺伝子は、典型的には多糖の生合成において欠損のある変異、特に最初のステップであるグリコシルトランスフェラーゼＩにおいて遮断されている変異との相補性により同定する。最初にＡＴＣＣ  ５３１５９のトランスフェラーゼＩ欠損変異を入手できなかったため、スフィンゴモナス・エロデアおよびXanthomonas campestrisトランスフェラーゼＩ欠損変異の相補性を利用して、ジウタン多糖生合成に関する遺伝子を同定した。プラスミドｐＬＡＦＲ３は、（Ditta et al,., “Broad host range DNA cloning system for gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti”, Proc. Natl. Acad. Sci. 1980 77: 7347-51に従って）ＩｎｃＰ転移機能を供給するヘルパープラスミドを使用して三親交雑接合により、その大腸菌宿主から、他のグラム陰性細菌に転移することができる。ＲＫ２タイプのプラスミドは、１染色体あたり５から７の推定コピー数を大腸菌中に有する（Figurski et al., “Suppression of ColE1 replication properties by the Inc P-1 plasmid RK2 in hybrid plasmids constructed in vitro”, J. Mol. Biol. 1979 133: 295-318）。
【００２７】
大腸菌中のＡＴＣＣ  ５３１５９染色体ＤＮＡの遺伝子ライブラリーを、三親交雑接合により、スフィンゴモナス・エロデアＡＴＣＣ  ３１４６１の非ムコイド変異体（ＧＰＳ２）中に転移し、テトラサイクリン耐性およびストレプトマイシン耐性について選択した。使用したヘルパープラスミドは、ｐＲＫ２０１３（大腸菌株ＪＺ２７９中）であり、これは、狭域宿主の複製開始点を含有するが、ｐＬＡＦＲ３を可動化するために必要なトランス作用機能を呈する。プラスミドｐＲＫ２０１３は、スフィンゴモナス株中では複製されなかった。スフィンゴモナス・エロデアＡＴＣＣ  ３１４６１は、多糖ジェランを産生する。ジェランおよびジウタンの双方の多糖は、[→４]−α−Ｌ−ラムノース−（１→３）−β−Ｄ−グルコース−（１→４）−β−Ｄ−グルクロン酸−（１→４）−β−Ｄ−グルコース（１→]から構成される、同じ四糖繰り返しユニットを有する。しかしジウタンはまた、グルコース残基の１つに結合した２つのラムノース分子から構成される側鎖を含み、アセチルにより修飾されるが、一方ジェランは側鎖の糖を持たず、アセチルおよびグリセリルで修飾される。変異体ＧＰＳ２は、多糖生合成の第一段階において、すなわちグルコシルトランスフェラーゼＩ酵素による、ＵＤＰ−Ｄ−グルコースからバクトプレニルリン酸脂質(bactoprenyl phosphate lipid)担体へのグルコース−１−リン酸の転移に欠損がある。テトラサイクリン選択プレートから、多糖産生（ムコイド）コロニーを非ムコイドコロニーのバックグラウンドより単離した。多糖産生を保持するクローンは、おそらくグルコシルトランスフェラーゼＩをコードするＡＴＣＣ  ５３１５９遺伝子、に加えてほぼ２０−２５ｋｂの隣接ＤＮＡを含有していた。プラスミドＤＮＡは、８つのムコイドＧＰＳ２接合完了体から単離し、電気穿孔により大腸菌株ＤＨ５α（Life Technologies）に転移した。プラスミドを大腸菌から単離して、制限エンドヌクレアーゼ、ＨｉｎｄＩＩＩ/ＥｃｏＲＩ（ポリリンカーのＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位のいずれかの側を切断する）での二重消化に十分なＤＮＡを得、ベクターから挿入ＤＮＡを切り取った。クローン中の挿入ＤＮＡのサイズは、ゲル電気泳動により決定した。いくつかのプラスミドの最終的な配列は、ベクターのＢａｍＨＩ部位に隣接するプラスミド配列に特異的なプライマーから配列決定により決定した。この配列をＢＬＡＳＴＸを用いて、コンピュータデータベース中の配列と比較することにより分析した。これらプラスミドの２つ、すなわちｐＳ８およびｐＳ６を図１に示す。同様に、ＡＴＣＣ  ５３１５９遺伝子ライブラリーを、トランスフェラーゼＩに欠損のあるリファムピシン耐性非ムコイドX. campestris変異体（ＣＸＣ１０９）（例えばHarding et al., 上記参考文献）中に、三親交雑接合を通して転移し、テトラサイクリン耐性およびリファムピシン耐性について選択した。X. campestrisは、キサンタン多糖を産生し、その合成もまた、トランスフェラーゼＩ酵素によるＵＤＰ−Ｄ−グルコースからバクトプレニルリン酸脂質担体への、グルコース−１−リン酸の転移によって開始される（Ielpi et al., “Sequential assembly and polymerization of the polyprenol-linked pentasaccharide repeating unit of the xanthan polysaccharide in Xanthomonas campestris”, J. Bacteriology. 1993. 175: 2490-500）。プラスミドを、ムコイド接合完了体から精製し、最終的な配列を上に記載したように決定した。２つのこれらのプラスミド、ｐＸ６およびｐＸ４を図１に表す。
【００２８】
プラスミドｐＳ８およびｐＸ６中にクローン化したＳ６５７  ＤＮＡは、Lark Technologies Inc., (Houston, TX)で二本鎖ショットガン配列決定法により、完全に配列決定した。これらの配列を分析して、ジウタン生合成のための遺伝子（図１に表した）を同定した。遺伝子の機能は、データベース中の他の遺伝子、特にＳ−８８スフィンガンの生合成に関する公開された遺伝子（例えば前述の‘５１６ Pollock et al. 特許）であるGenBank アクセション番号Ｕ５１１９７、およびジェラン（GenBank ＡＹ２１７００８およびＡＹ２２００９９）との相同性に基づいてデザインした。骨格の４つの糖に関するトランスフェラーゼをコードする遺伝子、およびｄＴＤＰ−ラムノース合成に関する４つの遺伝子を同定した（図１）。多糖の分泌に関する遺伝子は、他の多糖の生合成に関する遺伝子との相同性を基本とした。２つの遺伝子が、タンパク質の分泌に関与するタンパク質と相同のタンパク質をコードする。２つの遺伝子が、ポリメラーゼおよびリアーゼを推定的にコードする。プラスミドｐＸ６の挿入断片は、トランスフェラーゼＩ（ジウタン合成の最初のステップを開始する）をコードする遺伝子ｄｐｓＢを含む１７の遺伝子、分泌に関する遺伝子、およびｄＴＤＰ−ラムノース合成に関する４つの遺伝子を含有するが、トランスフェラーゼＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶに関する遺伝子、ならびにポリメラーゼおよびリアーゼに関する推定遺伝子を含まない。プラスミドｐＳ８は、４つすべての骨格の糖のトランスフェラーゼに関する遺伝子を含むｄｐｓ遺伝子クラスターの２０遺伝子、ｄＴＤＰ−ラムノース合成に関する４つの遺伝子、およびポリメラーゼおよびリアーゼに関する推定遺伝子を含む多糖の分泌に関する遺伝子を含有するが、機能の判明していない遺伝子であるｏｒｆ６およびｏｒｆ７の遺伝子は含まない。プラスミドｐＳ６は、分泌および４つの糖のトランスフェラーゼに関する遺伝子を含有するが、ｄＴＤＰ−ラムノース合成に関するすべての遺伝子、またはポリメラーゼに関する遺伝子を持っていない。プラスミドｐＸ４は、ｄｐｓ領域の小部分のみしか含有しないが、スフィンゴモナス株における多糖の産生の増大をもたらすには十分であるとPollockらにより報告された、トランスフェラーゼＩをコードする遺伝子、およびｄＴＤＰ−ラムノース合成に関する４つの遺伝子を含む。
【００２９】
株の生成
次に上に記載した４つのプラスミドを、上に記載したような三親交雑接合により、スフィンゴモナス株ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５３１５９内に導入し、新規のＳ６５７の遺伝子操作した株（Ｓ６５７/ｐＳ８、Ｓ６５７/ｐＳ６、Ｓ６５７/ｐＸ６、およびＳ６５７/ｐＸ４）を形成した。その後、以下に記すようなバイオガム材料を生成するため、上に記載したように発酵を続いて行った。４つのすべてのプラスミドは、ジウタンの生産性において有益な効果を有した；しかしｐＳ８プラスミドは驚くことに、ジウタン粘度の極めて大きな増加、および分子量の増加もまた提供した。ｐＳ８のＤＮＡ配列のＤＮＡ配列（２６２７８ｂｐ）（ＤＮＡ配列番号１）を提供し、このコード化遺伝子を以下の表１、および図１に図表の形で列記する。プラスミドｐＳ８の挿入ＤＮＡは、ｄｐｓＧからｒｍｌＤまで通しての遺伝子、および遺伝子ｄｐｓＳおよびｏｒｆ７の部分を含む。
【００３０】
以下の遺伝子の表は基本的には、図１に提供したプラスミドｐＳ８中の挿入用ＤＮＡ配列によって表される、遺伝子のリストである。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
ジウタンの産生
プラスミドを含まないＳ６５７野生型株と比較しての、遺伝子操作されたプラスミド含有スフィンゴモナスＳ６５７株によるジウタンの産生を、撹拌および通気を伴うApplikon ２０Ｌ発酵器にて、同じ液体培地中での発酵を３セット行って決定した。プラスミド含有株に関して、５ｍｇ/Ｌの抗生物質テトラサイクリンを発酵を通して加え、プラスミドの保持を確かなものとした。ｐＨをコントロールする必要がある場合には、ＫＯＨを加えた。２つの種菌の段階を、１％から６％の接種転移で使用した。発酵に使用する培地は、炭水化物原料としてトウモロコシシロップ、同化できる窒素原料、および塩を含有した。発酵に使用することのできる栄養素は、当該技術分野において周知されており、炭水化物、例えばグルコース、スクロース、マルトース、またはマルトデキストリン、窒素原料、例えば、無機窒素（例えばアンモニウムまたは硝酸塩）、有機窒素（例えばアミノ酸、加水分解酵母抽出物、大豆タンパク質、またはトウモロコシ浸出液）、および例えば塩化物、リン酸塩、硫酸塩、カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、または亜鉛を含有する付加塩を含む。
【００３３】
結果として得られるジウタンの産生の測定として、ブロスの粘度および沈澱した繊維を決定した。発酵ブロスの粘度は、Brookfield粘度計により、スピンドル＃４、６０ｒｐｍでランして測定した。結果を表２に示す。発酵の最後に、周知のグルコアミラーゼ酵素の導入によりブロスを処理して、コーンシロップ由来のあらゆる残存オリゴ糖を加水分解した。その後産生されたジウタンガムを、２倍量のイソプロピルアルコールを用いてブロスのアリコートから沈殿させた。繊維は濾過して集め、乾燥させた。表２において、ＤＷＹという用語は、コーンシロップ由来の余分なオリゴ糖の加水分解後の、バイオガムの沈澱可能な総乾燥収量(dry weight yields)を意味する。
【００３４】
結果として得られる材料は、明らかに表に示したジウタン生合成のための遺伝子の付加的なコピーを保有するプラスミド、ｐＸ４、ｐＸ６、ｐＳ６、またはｐＳ８を用いることで、より高い収量となる。しかしｐＳ８プラスミドを用いた場合、乾燥重量の収量の増加に比してブロスの粘度において予想外の高い増加が認められ、産生されるジウタンの量の増加に加えて何らかの因子が粘度に影響していることを示した。
【００３５】
【表２】
2009515512.tif 000003
【００３６】
表に示した４つのプラスミドのいずれかを用いることで、明らかに結果として得られる材料のより高い収量が認められたが、それに対してｐＳ８およびｐＳ６のプラスミドは、ブロスの粘度の予想外の高い増加を可能にし、したがってその上に産生物の高い品質を示した。得られるジウタンガム産生物の品質、すなわち粘度を、次に決定した。
【００３７】
適用検査におけるジウタンの流体力学
次にこれらのジウタンガムのサンプルを、２つの異なる領域、すなわち石油の回収のための油田への添加物、ならびに水分保持および迅速なセットアップのためのセメントへの添加物、における潜在的な有益な使用に関して分析した。
【００３８】
油田産業では、石油の回収用のガムに関する受容可能な性能の見積りとして、“海水の粘度（ＳＷＶ）”検査と言われる方法に頼っている。そのような検査が、基本的には（例えば海底からの回収を複製するための）水の塩水条件下での粘度を増加するガムの有効性の指標である。
【００３９】
石油の回収目的のための適当な粘度の修飾物質としての、結果として得られるガムの利用可能性の予測は、一般に検査用の海水調製物の粘度の修飾という観点で受け入れられている。そのような“合成海水”調製物は、９８００グラムの脱イオン水中に４１９．５３グラムの海水塩(ASTM D-1141-52)を混合することにより生成する。海水粘度検査用には、０．８６ｇのサンプルのガムを３０７．０ｇの合成海水に加え、Fann Multimixer (モデル９Ｂ５、品番Ｎ５０２０)中でおよそ１１，５００ｒｐｍで３５分間混合する。３５分の終了時、溶液をおよそ２６℃に冷却し、粘度を測定する。３−ｒｐｍの目盛り値(reading)に関しては、サンプルをFannサンプルプラットフォーム（Fannモデル３５Ａ;Torsin spring MOC 34/35 F0.2b; Bob B1; Roter R1）に置き、モーターを低スピードで回転させ、ギアシフトを中程度の位置に設定することにより、スピードを３ｒｐｍに調整する。その後そのまま放置して目盛りを安定化させ、剪断応力値をダイヤルから読み取り、ＳＷＶ  ３ｒｐｍダイヤル目盛り値（dial reading, ＤＲ）として記録する。０．３ｒｐｍ目盛り値に関しては、Brookfield 粘度計（Brookfield LV DV-IIまたはDV-II粘度計、LV-2Cスピンドルにて）を使用して、粘度を測定する。スピンドルの速さを０．３ｒｐｍに設定し、スピンドルを少なくとも６分間回転させて放置した後、粘度をＳＷＶ−０．３ｒｐｍの目盛り値として記録し、センチポイズ（ｃＰ）で表す。セメントへの適用に関しては、ＰＥＧ  ＬＳＲＶ検査（以下に概説する様に分散剤としてポリエチレングリコールを使用しての低剪断速度の粘度）により、その産業に対する粘度修飾物質の性能の有効性としての指標を提供する。そのような検査は、標準的な水道水（Standard Tap Water, ＳＴＷ）中のバイオガムの０．２５％溶液の粘度を測定する。ＳＴＷは、１０リットルの脱イオン水に、１０．０グラムのＮａＣｌおよび１．４７グラムのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを加えることにより調製する。粘度の測定のため、０．７５グラムのバイオガムを、４００ｍＬビーカー中の４．５グラムのポリエチレングリコール２００（ＣＡＳ２５３２２−６８−３）に加え、完全に分散させる。その後２９９グラムのＳＴＷをビーカーに加え、低ピッチのプロペル型の撹拌器を８００±２０ｒｐｍで使用して、およそ４時間混合する。４時間の混合時間後、ビーカーを２５℃の水浴中に置き、およそ３０分間静置した。次に、２．５＋トルクのバネをセットしたBrookfield ＬＶ粘度計（または同等の装置、例えばモデルＤＶＥ２．５＋）を使用して、３ｒｐｍで、ＬＶ１スピンドルを使用してスピンドルを３分間回転させ、センチポイズ（ｃＰ）を表示させた後、粘度を測定した。上で産生されたジウタンサンプルは、この方法で検査し、結果は以下の通りであった：
【００４０】
【表３】
2009515512.tif 000004
【００４１】
予想外なことに、遺伝子操作したプラスミド含有株のいくつかによって産生された本発明のジウタンガムにより示された粘度に、明らかな増加が認められた。しかし最も驚いたことには、ｐＳ８株に関して３ｒｐｍのＳＷＶの粘度の増加が８０％であるのに対して、ｐＸ６株に関して行った同じ分析では、野生型の結果をわずか９．６％上回るだけであった。プラスミドｐＳ６およびｐＸ４は有意な増加はなかった。同様により低いＳＷＶｒｐｍ検査は、ｐＳ８タイプに関しては野生型を上回って５１．５％の増加を明らかにしたのに対して、ｐＸ６に関しては単に２％上回るだけであった。最後にポリエチレングリコールＬＳＲＶ検査は、ｐＸ６ジウタンでは１６％未満の増加、そしてｐＸ４では７．２％の増加、およびプラスミドｐＳ６では有意な増加は認められなかったのと比較して、ｐＳ８の結果は、野生型ガムを上回って７７％を超える粘度の増加が認められた。再び、これらの点におけるかなり予想外の結果は、標的ジウタン産生細菌内に必要とされる遺伝子配列を導入する１つの方法として、ｐＳ８プラスミド内への例示したそのような配列の利用を介して、ジウタンガムの産生に与えられた飛躍的な改善を示すものである。
【００４２】
このようにｐＳ８の導入を介して産生された本発明のジウタンは、３つのすべての測定カウント値において、特に野生型およびｐＸ６プラスミド産生変異種と比較して、驚くほど増加した粘度測定結果を示した。したがって、そのような新規ジウタンは、典型的な油田条件下およびセメントへの適用において極めて良好に機能するであろうと予測された。
【００４３】
流体力学の改善に関する基礎的な説明
これまでの実施例は、Ｓ６５７/ｐＳ８株由来のジウタンが流体力学のパラメータにおける有意な増加を示すことを示した。したがって海水およびＰＥＧ低剪断速度の粘度測定におけるそのような実質的な増加は、ｐＸ６株もまた、大きくはないにしても、類似の収量の結果を示しているため、生産性だけの増加に起因させることはできない。事実、表２に示した先の実施例において、乾燥重量の収量（アルコール沈澱可能な物質）は８．０％増加したが、一方流体力学的パラメータは、Ｓ６５７/ｐＳ８株に関しては有意により大きく増加した（５２−８０％）。なぜ流体力学的改善が、野性型株を上回って株Ｓ６５７/ｐＳ８を用いて得られるのかを説明するため、基礎的な研究を続けた。
【００４４】
固有粘度は、高分子の分子量を推論するための、高分子科学における周知の技術である（C. Tanford, 1961. Physical Chemistry of Macromolecules. John Wiley & Sons, New York）。固有粘度は、溶液の濃度に対して還元粘度（濃度に対して標準化した粘度）をプロットし、データの直線回帰をゼロ濃度に外挿する（プロットのｙ切片）ことにより得られる。驚くことに、結果として得られるガムは、以下の表において下に示すような固有粘度の増加を示した。
【００４５】
５つのジウタンサンプル、すなわち野生型株由来の２つ（コントロール１、コントロール２）およびＳ６５７/ｐＳ８株由来の３つ（サンプル１、サンプル２、サンプル３）を、固有粘度、中性糖、および有機酸の分析について評価した。３つのサンプルは、アルコール沈澱、再水和、次亜塩素酸塩による処理、グルコアミラーゼによる処理、リゾチームによる処理、そして最後にプロテアーゼによる処理（この順序で）により、精製した。次にこれらを、４：１のＣＢＭ：ブロス比で回収し、乾燥および粉砕した。ＣＢＭは、重量で〜８２％のイソプロピルアルコールを含む共沸のイソプロピルアルコール/水の混合物である。
【００４６】
サンプルは、以下の処置を行うことにより水分含有量について検査した：一般に０．７グラムのアリコートの２つのサンプルを、Mettler HB 43ハロゲン水分バランスを使用して検査した。その後２つの試みの結果を平均し、これらの結果を水分の補正に利用した。
【００４７】
水分データを得た後、ガムの０．２％溶液を０．０１ＭＮａＣｌ中に、水分の補正に基づいて調製した。これらのトライアルでは、総計２００グラムの０．２％溶液を調製した。ガムは、約(the nearest)１０００分の１０刻みで分析用天秤で計量し、約１０００分の１刻みで計量した水に加えた。サンプルは、４００ｍｌの縦長の形のビーカー中で、直径２．５インチのプロペラ撹拌器を使用して、１０００ｒｐｍで２時間撹拌した。
【００４８】
最初の加水分解に続いて、各サンプルを０．０１Ｍ  ＮａＣｌを使用して０．０２％に希釈した。この操作は、４００ｍｌビーカー中に０．２％溶液を２０グラム計量した後、１８０ｍｌの希釈液を加えることにより行った。希釈したサンプルを、さらに３０分間混合した。最終的に固有粘度の決定に使用する最後の希釈は、このサンプルから調製した。各ジウタンサンプルを、以下の濃度：０．００４％、０．００８％、０．０１０％および０．０１２％について評価した。
【００４９】
粘度測定は、Vilastic（登録商標）ＶＳシステムを使用して行った。測定の前に、Vilasticを水で２．０％未満のエラーとなるよう較正した。サンプルは、タイマープログラムを使用して、２Ｈｚ、１の歪み(strain)、およびおよそ１２１/秒の剪断速度で、すべて２３℃の一定温度で測定した。各サンプルについて５回測定し平均した。次に平均の粘度データを使用して、固有粘度を算出した。図２および以下の表４は、これらの試みの最終的な結果を提供する。
【００５０】
【表４】
2009515512.tif 000005
【００５１】
これらの結果は、Ｓ６５７/ｐＳ８株が有意により高い固有粘度を有するジウタンを、一貫して産生したことを示す；事実、すべて類似の測定固体レベルで、本発明の株に関する平均還元粘度は１６５．２であったのに対して、コントロールは１４０．７であった。この発見は、Ｓ６５７/ｐＳ８によって産生されるジウタンが、野生型のコントロールより分子量が大きいことを示す。
【００５２】
図２は、コントロールおよび本発明の株間で、類似の固体含有量で一貫してより高い固有粘度が測定されたことを示す、これらの傾向をグラフで示す。
Ｓ６５７/ｐＳ８由来のより高い粘度のジウタンガムが、野生株由来のジウタンと同じ組成を有するかどうかを決定するため、中性糖および有機酸について検査することにより組成を決定した。固有粘度測定に使用した精製サンプルを、中性糖の分析に使用した。各精製サンプルのアリコートを、トリフルオロ酢酸を用いての加水分解（１００℃/〜１８時間）により、糖成分に加水分解した。加水分解物の中性糖は、電流測定の検出を備えた高速陰イオン交換クロマトグラフィーにより定量した。加水分解物の有機酸は、化学的に抑制された伝導度の検出を備えた高速イオン排出クロマトグラフィーにより定量した。表５に中性糖の分析の結果をまとめる。表に示したように、Ｓ６５７/ｐＳ８株に関する中性糖のプロフィールは、Ｓ６５７野生型株の中性糖のプロフィールとほぼ同一である。双方の結果とも理論値とは異なるが、これらの結果は、ｐＳ８を使用して産生されたジウタンガムの繰り返しユニットの構造が、野生型のそれと同じであり、ｐＳ８という材料によって得られた粘度のいかなる増加も、より長い鎖によるものであって、より高い分子量を意味することを示す。
【００５３】
【表５】
2009515512.tif 000006
【００５４】
このように、Ｓ６５７/ｐＳ８の遺伝子操作された株によって産生されたジウタンの、大きく改善された海水粘度およびＰＥＧ低剪断速度の粘度は、ジウタン分子の分子量または長さの増加、すなわち一分子当たりのより多くの繰り返しユニット数によるものであり、その組成の変化によるのではなく、したがって繰り返し構造そのものの変化によるものでもない。この改善された流体力学は、単に産生されるジウタンの量の増大によるものとすることはできない。クローン化されたジウタン生合成のための遺伝子クラスターの異なる部分を持つ、４つのプラスミド、すなわちｐＳ６、ｐＳ８、ｐＸ４、およびｐＸ６を評価し、すべてが生産性における何らかの増加を示したが、プラスミドｐＳ８のみが、回収されたジウタン産生物の流体力学パラメータにおいて、予想外のそして非常に高い増加を示した。
【００５５】
検査したプラスミド中にクローン化されたジウタン生合成に関する遺伝子の比較は、分子量の増加の原因となる最も可能性の高い遺伝子が、遺伝子ｄｐｓＧであることを示唆する。というのは、この遺伝子はｐＳ８中に存在するが、他のプラスミドには存在しないからである。遺伝子ｄｐｓＧは、多糖合成に関与する他の膜タンパク質と強い相同性を持つ疎水性膜タンパク質をコードする。このタンパク質の一部は、繰り返しユニットの連結を触媒して高分子量の多糖を形成する酵素である、ポリメラーゼに関するタンパク質との相同性を有する。Ｓ６０中の相同の遺伝子ｇｅｌＧは、ジェラン合成に関するポリメラーゼとして機能すると推定されている（Harding, N. E. et al. 2004. “Organization of genes required for gellan polysaccharide biosynthesis in Sphingomonas elodea ATCC31461”. J. Ind. Microbiol. Biotech. 31: 70-82. Sa-Correia, I. et al. 2002. “Gellan gum biosynthesis in Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461: Genes, enzymes and exopolysaccharide production engineering”. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 29: 170-176）。ｄｐｓＧの相同体はまた、多糖のＳ８８およびＳ７を産生するスフィンゴモナス株ＡＴＣＣ  ３１５５４およびＡＴＣＣ  ２１４２３からも単離されている（Pollock et al. 米国特許第５，８５４，０３４号、５，９８５，６２３号、および６，２８４，５１６号、ならびにPollock T. J. 米国特許第６，７０９，８４５号）。したがってポリメラーゼに関する遺伝子の付加的なコピーで、ジウタン分子の分子長を増加する効果を有するかもしれない可能性は非常に高い。ジウタンの生合成の遺伝子クラスター中の他の遺伝子が、観察された粘度の増加を達成するために、ｄｐｓＧとの組み合わせで必要とされるかもしれないことは除外できない。可能性の高い候補として、糖のトランスフェラーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶをコードする、遺伝子ｄｐｓＢ、ｄｐｓＬ、ｄｐｓＫおよびｄｐｓＱ、特に繰り返しユニットの最初の糖を脂質担体に付加するトランスフェラーゼＩをコードする遺伝子ｄｐｓＢが、挙げられよう。他の重要な遺伝子は、多コピープラスミドで増幅した時にキサンタンの分子量を増加することが示されている、遺伝子ｇｕｍＢおよびｇｕｍＣと相同のｄｐｓＤ、ｄｐｓＣおよびｄｐｓＥであると思われる。プラスミドｐＳ８中にクローン化されたすべての遺伝子が、粘度の飛躍的な増加を達成するために必要であるかもしれない、という可能性もある。
【００５６】
本発明は、ある種の好ましい態様および実践に関連して記載し開示するが、本発明をこれらの特定の態様に限定することを意図する訳では決してなく、むしろ添付の請求項およびその均等物の範囲によって定義されると思われる、構造的均等物およびすべての代わりの態様および修飾を包括することを意図する。
【００５７】
（寄託）
以下の細菌株を、微生物の寄託の国際認識に関するブダペスト条約(the Budapest Treaty for the International Recognition of the Deposit of Microorganisms)に従って、２００５年１０月２１日に、10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110,のthe American Type Culture Collection の特許寄託センター(the Patent Depository)に寄託した：
プラスミドｐＳ８を含むスフィンゴモナス株Ｓ６５７。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、ジウタンガム生合成のための単離された遺伝子の図表である。推定または公知の遺伝子を示す。異なるプラスミドに挿入されたセグメントもまた示す。
【図２】図２は、そのような本発明のジウタンバイオガム材料によって達成された固有粘度測定の改善を表すグラフである。
【配列表】
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【国際調査報告】
2009515512.tif 000096