(57)【要約】  本開示は、ワクチンの有効性を増強するために該ワクチンと組み合わせて使用される、動物飼料に加えられた組成物に関する。効果の中でも特に、該組成物は該ワクチンに対する抗体の力価を上昇させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチン有効性を増強するための組み合わせであって：
ワクチン；
β−グルカン、β−１，３（４）−エンドグルカノハイドロラーゼ、か焼珪藻土、粘土鉱物及びグルコマンナンを含んでなる組成物；を含んでなり、及び
前記組成物が、該ワクチンに対する抗体の力価を、前記組成物がない場合の前記抗体の力価と比較して増加させる、前記組み合わせ。
【請求項２】
前記組成物及び前記ワクチンが家畜に投与される、請求項１の組み合わせ。
【請求項３】
前記組成物が、乾燥重量ベースで前記飼料の約０．０１重量％〜約２．５重量％の範囲で動物の飼料に添加される、請求項１の組み合わせ。
【請求項４】
前記組成物が、前記動物の体重キログラム当たり約０．０１グラム〜前記動物の生体重キログラム当たり約１グラムの範囲で動物の飼料に添加される、請求項１の組み合わせ。
【請求項５】
前記ワクチン及び組成物がウシ家畜（bovine livestock）に投与される、請求項１の組み合わせ。
【請求項６】
前記組成物が、動物当たり、１日当たり約１０グラム〜約６０グラムの範囲でウシ家畜に投与される、請求項１の組み合わせ。
【請求項７】
前記ワクチン及び組成物がヒツジに投与される、請求項１の組み合わせ。
【請求項８】
前記組成物が、動物当たり、１日当たり約２グラム〜約１０グラムの範囲でヒツジに投与される、請求項１の組み合わせ。
【請求項９】
前記ワクチンが乳腺炎に対する抗体の産生を刺激する、請求項１の組み合わせ。
【請求項１０】
前記ワクチンがPfizer Ｊ５ワクチンである、請求項1の組み合わせ。
【請求項１１】
前記組成物が抗体のＩｇＧ１又はＩｇＧ２クラスの力価を、前記組成物がない場合の前記ＩｇＧ１又はＩｇＧ２抗体の力価と比較して増加させる、請求項１の組み合わせ。
【請求項１２】
前記組成物が抗体のＩｇＧ１クラスの力価を、前記組成物がない場合の前記ＩｇＧ１抗体の力価と比較して増加させる、請求項１の組み合わせ。
【請求項１３】
前記組成物が抗体のＩｇＧ２クラスの力価を、前記組成物がない場合の前記ＩｇＧ２抗体の力価と比較して増加させる、請求項１の組み合わせ。
【請求項１４】
抗体のＩｇＧ１又はＩｇＧ２クラスの前記力価が、前記組成物がない場合の前記ＩｇＧ１又はＩｇＧ２抗体の力価と比較して、前記動物の食餌からの前記組成物の除去後にも維持されている、請求項１の組み合わせ。
【請求項１５】
抗体のＩｇＧ１クラスの前記力価が、前記組成物がない場合の前記ＩｇＧ１抗体の力価と比較して、前記動物の食餌からの前記組成物の除去後にも維持されている、請求項１の組み合わせ。
【請求項１６】
ワクチンの有効性を増強するための方法であって：
ａ．一つ又はそれより多くのワクチン接種された個体を提供すること；及び
ｂ．β−グルカン、β−１，３（４）−エンドグルカノハイドロラーゼ、か焼珪藻土、粘土鉱物及びグルコマンナンを含んでなる組成物を個体に投与すること；
を含んでなる、前記方法。
【請求項１７】
前記組成物が前記個体に毎日投与される、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、乾燥重量ベースで前記飼料の約０．０１重量％〜約２．５重量％の範囲で前記個体の飼料に添加される、請求項１６の方法。
【請求項１９】
前記組成物が、前記動物の生体重のキログラム当たり約０．０１グラム〜生体重のキログラム当たり１グラムの範囲で前記個体の飼料に添加される、請求項１６の方法。
【請求項２０】
前記組成物が、抗体のＩｇＧ１又はＩｇＧ２クラスの力価を、前記組成物がない場合の前記ＩｇＧ１又はＩｇＧ２抗体の力価と比較して増加させる、請求項１６の方法。
【請求項２１】
前記組成物が、ＩｇＧ２クラス抗体の力価を、前記組成物がない場合の前記ＩｇＧ２抗体の力価と比較して増加させる、請求項１６の方法。
【請求項２２】
前記個体がウシ（cattle）であり、及びワクチン及び前記組成物が前記ウシに投与される、請求項１６の方法。
【請求項２３】
前記個体がウシ家畜であり、及び前記組成物が、動物当たり、１日当たり約１０グラム〜約６０グラムの範囲で前記ウシ家畜に投与される、請求項１６の方法。
【請求項２４】
前記個体がヒツジであり、及びワクチン及び前記組成物が前記ヒツジに投与される、請求項１６の方法。
【請求項２５】
前記個体がヒツジであり、及び前記組成物が動物当たり、１日当たり約２グラム〜約１０グラムの範囲で前記ヒツジに投与される、請求項１６の方法。
【請求項２６】
前記一つ又はそれより多くのワクチン接種される個体が、乳腺炎に対する抗体の産生を刺激するワクチンでワクチン接種されている、請求項１６の方法。
【請求項２７】
前記ワクチンがPfizer Ｊ５ワクチンである、請求項２６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチンに対する抗体の力価を増大させる組成物及びワクチンの組み合わせ、及び該組み合わせを使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫応答は二つの異なるシステム：生得的システム及び後天的（抗体仲介）システムを含む。生得的システムは、感染を防止するために多様な戦略を使用する、進化的に古くからのシステムである。これらには、皮膚、消化管及び肺及び乳腺の内張りにより提供される上皮細胞障壁が含まれる。加えて、生得的システムには、胃（又は反芻動物における第４胃）の酸性障壁、及び胃、膵臓及び小腸の消化酵素が含まれる。最後に、生得的システムには白血球、マクロファージ及び好中球が含まれる。これらの細胞は最初に、病原体表面上の独特のマーカーの提示を介して病原体を認識し、次ぎに貪食しそして病原体を殺す。
【０００３】
生得的システムは初期免疫応答を提供し、特異的病原体と戦うために必要な抗体が応答する及び発生する後天的抗体システムに必要とされる時間を提供する。通常、抗体応答を発生するため、ヒト又は動物で１週間から数週間が必要とされる。この介在時間において、生物体は生得的システムに依存して感染を阻止している。
【０００４】
後天的免疫システムは、特異的病原体、毒素、化学物質又は生物体が抗原と認識するいずれかの分子に応答して抗体を発生することができる（即ち、免疫システムは抗原を非自己として認識する）。病原体がヒト又は動物に感染した場合、病原体に付随する特異的細胞マーカーが抗体産生細胞に提示される。後天的免疫システムは次ぎに、「クローナル増殖」と称されるプロセスを起こす。具体的には、このことは、病原体に付随する特異的抗原に向けられた抗体を産生する細胞の大量産生を可能にする。
【０００５】
抗体はＴ細胞及びＢ細胞によって合成される。Ｔ細胞は胸腺中で成熟し、それらの細胞外表面に結合された抗体を提示する。Ｔ細胞は次ぎに、血液中を及びリンパ管組織を介して自由に循環する。結合された抗体を介した病原体へのＴ細胞の結合は、病原体の同定及び引き続いての破壊を生じる。対照的に、Ｂ細胞により産生された抗体は血中に分泌され、そこで自由に循環する。Ｂ細胞産生抗体が病原体に結合した場合、病原体の同定及び死滅を生じる諸現象のカスケードを開始する。免疫化に応答して産生される抗体は、抗体アイソタイプに分類される。三つの最も重要な抗体アイソタイプには、ＩｇＭ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が含まれる。他のアイソタイプには、限定されるわけではないが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４及びＩｇＥアイソタイプ、及び家禽においてはＩｇＹアイソタイプが含まれる。
【０００６】
適応ＩｇＭ応答は、抗原に応答してＴ及びＢ細胞により産生される最初の抗体である；しかしながら、それは、限定された抗原に対する親和性及び特異的を有する比較的「弱い」抗体である。より「強力な」抗体応答は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２アイソタイプ内に含まれている；しかしながら、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２アイソタイプの発生は、より長い時間を必要とする。妊娠個体におけるＩｇＧアイソタイプ応答は、これらが出産時に初乳を介して母親から出生児に伝達され、それにより新生児に受動免疫を伝達する抗体のアイソタイプであるので特に重要である。
【０００７】
疾患に対するワクチン接種（免疫化とも称される）は、ヒト医療及び家畜産業で普通に実施されている。例えば、病原体に対してワクチン接種するには、動物に、病原体の非感染性バージョンの形態でワクチンを投与するか、又は病原体の一部のみを投与する。後天的免疫システムは、抗体を産生することによりワクチンに応答する。もし、動物が続いて生きている病原体に暴露されるならば、ワクチンに応答して作製された抗体が迅速に動員され、次ぎに認識し、及び病原体を破壊のための標的とする。
【０００８】
家畜産業は、真菌、ウイルス及び細菌感染症に起因する罹患率及び死亡率を最小化するため、家畜特異的疾患に対する免疫化プロトコールに頼っている。例えば、酪農業においては、大腸菌（E.coli）が乳腺感染（即ち、乳腺炎）の最も一般的な形態の一つであり、生産の減少、及び重症の場合にはウシの損失を起こすので、大腸菌に対して動物を免疫化するのが一般的である。
【０００９】
いくつかの問題が現在のワクチン接種プロトコールから生じている。例えば、ワクチン接種プロトコールの効力は個体によって異なる。具体的には、一部の個体は特定の免疫化プロトコールに応答して高い力価（抗体の高い血清濃度）を発生する一方で、他の個体は発生しないであろう。抗体の力価及び免疫システムの応答間には直接相関があり、一部の個体はワクチン接種されていても、病原体による感染に対する感受性が残っている。結果的に、動物集団において疾患の発生を減少させるワクチンの有効性を改良する必要が残っている。
【発明の開示】
【００１０】
発明の要旨
本開示は、ワクチンの有効性を増強するための組み合わせ、及び該組み合わせを使用するための方法に関する。本開示の組み合わせは、以下の構成物を有する組成物を使用する：β−１，３（４）−  エンドグルカノハイドロラーゼ、β−１，３（４）グルカン、珪藻土、粘土鉱物及びグルコマンナン。この組成物は、ワクチン接種プロトコールを受けようとしている、又はワクチン接種プロトコールを受けている動物に給餌する。
【００１１】
本組み合わせは、ワクチンに対する抗体の血清濃度（力価）を増加させることによりワクチンの有効性を増加させる。抗体の増加した血清濃度は、組成物を動物の食餌から取り除いた後でさえも残っている。
【００１２】
要求に応じ、本組成物の詳細な態様が本明細書に開示されている；しかしながら、開示された態様は単に本発明の例示であり、それは多様な形態で具体化することができる。それ故、本明細書に開示された具体的な詳細は、制限しているものとして解釈されるべきではなく、単に特許請求のための根拠として、及び本組成物を実際上いずれかの適切な様式で多様に用いるために当業者に教示するための代表的根拠として解釈されるべきである。
【００１３】
本開示は、動物における免疫機能を増加させる組み合わせ、及び該組み合わせを使用するための方法に取り組む。一般的に、本開示の組み合わせは以下の構成物を有する組成物を使用する：β−１，３（４）−エンドグルカノハイドロラーゼ、β−１，３（４）グルカン、珪藻土、粘土鉱物及びグルコマンナン。該組成物は、動物による該組成物の摂取がワクチンの有効性を増強するように、ワクチンと組み合わせて使用される。本明細書で定義する「ワクチンが免疫システムを刺激する」とは、動物に投与された時の抗体の産生を含む。ワクチンの増強された有効性の一つの指標は、動物の血清中の、ワクチン抗原に対する抗体の増加した力価である。
【００１４】
該組み合わせは、ヒトを含む哺乳動物及びトリのような多くの種の個体又は動物のための飼料中で効果的に使用し得る。好ましい態様において、該組み合わせは家畜哺乳動物に使用される。該組み合わせは、反芻動物及び非反芻動物で同様に良好に使用し得る。反芻動物の例には、限定されるわけではないが、ウシ(cattle)、ヒツジ、ヤギ、雌ウシ(cow)、シカ、バイソン及びバッファローが含まれる。非反芻動物はブタ(pig)、ウマ、雌ブタ(sow)及びその他が含まれる。特に好ましい態様において、該組成物はヒツジ及びウシ(bovine)家畜のために使用される。
【００１５】
一つの態様において、該組成物は、動物がワクチン接種プロトコールを受けている期間に該動物に与える。典型的なワクチン接種プロトコールは、免疫システムの刺激及び抗体の産生を最大にするため、決められた期間にわたって少なくとも一回及び通常は数回の用量の投与を必要とする。好ましい態様において、該組成物は、ワクチン接種プロトコールの開始前から始め、そしてワクチン接種プロトコールの開始後継続して動物に毎日与える。代わりの態様において、該組成物は、ワクチン接種プロトコールの開始後又はプロトコールの開始と同時に、動物に与えることができる。
【００１６】
該組み合わせのワクチンは、病原体、毒素、薬物又は他の分子に対する応答を惹起することができる。該ワクチンは、抗原をコードするＤＮＡ分子が動物に投与され、抗原の合成及び引き続いての抗原に対する免疫応答が生じる、ＤＮＡワクチンであることができる。好ましい態様において、該組み合わせのワクチンは、疾患誘発病原体に対する抗体の産生を刺激する。特に好ましい態様において、該ワクチンは、乳腺炎の原因となる病原体に対する抗体の産生を刺激する。Ｊ５ワクチンは、こうした市販の乳腺炎ワクチンの一つである（Pfizer から入手可能）。
【００１７】
ヒト及び動物が普通にワクチン接種を受ける、及び効力を増強するプロトコールの恩恵を受けることができる、病原体及び疾患の他の例には、限定されるわけではないが、ウシ感染性鼻気管炎（ＩＢＲ）、パラインフルエンザ３型（ＰＩ３）、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ウシ呼吸系発疹ウイルス（ＢＲＳＶ）、ロタウイルス、コロナウイルス、カンピロバクター菌種、パスツレラ菌種、結膜炎、サルモネラ菌種、クロストリジウム菌種、レプトスピラ症、ブルセラ症、ニューカッスル病、鶏痘、丹毒、家禽コレラ、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニワトリ脳脊髄炎、コクシジウム症、鼻肺炎、ウマインフルエンザ、ストレプトコッカス・エクイ、ウマウイルス性動脈炎、ウマ単球性エールリヒア症、脳脊髄炎、西ナイル脳炎、狂犬病、パルボウイルス、アデノウイルス、ボルデテラ、ライム病、ジアルジア、百日咳、麻疹ウイルス、Ａ及びＢ型肝炎、ジフテリア及び灰白脊髄炎が含まれる。
【００１８】
該組み合わせ組成物の構成物は、当該技術分野で公知の方法により調製され、商業的供給源から得ることができる。β−１、３（４）−エンドグルカノハイドロラーゼは、トリコデルマ・ロンギブランキアタム（Trichoderma longibrachiatum）株の液内発酵から産生した。珪藻土は、市販の酸洗浄製品として入手可能であり、９５％のシリカ（ＳｉＯ２）及びその残りの成分はアッセイされていないが、主としてAssociation of Analytical Chemists(AOAC、 2002) により定義された灰分（ミネラル）から成る。β−１、３（４）グルカン及びグルコマンナンは主として不活性化酵母（サッカロミセス・セレビシエ）に由来する酵母細胞壁抽出物の市販調製物のものであることができ、表１に示した化学組成を有する：
【００１９】
【表１】
2009535354.tif 000002
【００２０】
この組成物に使用された粘土鉱物（アルミノケイ酸）は、限定されるわけではないが、モンモリロナイト粘土、ベントナイト及びゼオライトを含む多様な市販の粘土のいずれかであることができる。
【００２１】
該組み合わせの好ましい態様において、β−１、３（４）−エンドグルカノハイドロラーゼ、珪藻土、グルカン及びグルコマンナン、及び粘土鉱物は、それぞれ約０．０５〜３％、１〜４０％、１〜２０％及び４０〜９２％の範囲の重量比で混合した。別の好ましい態様において、β−１、３（４）−エンドグルカノハイドロラーゼ、珪藻土、グルカン及びグルコマンナン、及び粘土鉱物は、それぞれ０．１〜３％、５〜４０％、２〜１５％及び４０〜８０％で混合した。特に好ましい態様において、β−１、３（４）−エンドグルカノハイドロラーゼ、珪藻土、グルカン及びグルコマンナン、及び粘土鉱物は、それぞれ０．２〜３％、２０〜４０％、４〜１０％及び５０〜７０％で混合した。
【００２２】
一つの態様において、該組成物は、市販の飼料、食品内へ直接含有に、又は混合飼料又は食餌のためのサプリメントとして適している乾燥、自由流動性粉末である。該粉末は、固形又は液体飼料又は水と混合することができる。別の態様において、該組成物はペレットに成形される。
【００２３】
一つの態様において、飼料の中に直接組み入れられた場合、該組成物は、トン（２０００ポンド）当たりの飼料に、約０．１ｋｇ〜約２０ｋｇの範囲の量で加えることができる。好ましい態様において、該組成物は、トン当たりの飼料に、約０．５ｋｇ〜約１０ｋｇの量で動物飼料又は食品に加えられる。特に好ましい態様において、該組成物は、トン当たりの飼料に、約１ｋｇ〜約５ｋｇの範囲の量を加えることができる。
【００２４】
飼料の乾燥物質のパーセンテージとして表現される場合、本組成物は、約０．０１〜約２．５重量％、好ましくは約０．０１２５％〜約２重量％の範囲の量で、動物飼料又は食品に加えることができる。好ましい態様において、該組成物は、約０、０５〜約１．５重量％、好ましくは約０．０６２５％〜約１重量％の量で動物飼料又は食品に加えられる。特に好ましい態様において、本組成物は、飼料の約０．１〜約０．７重量％、好ましくは約０．１２５％〜約０．５重量％の量で加えられる。
【００２５】
もしくは、本組み合わせの組成物は、1日当たり、生体重のキログラム当たり約０．０１グラム〜約１グラム、好ましくは、生体重のキログラム当たり約０．０１２グラム〜約０．５グラム、より好ましくは、生体重のキログラム当たり約０．０１６グラム〜約０．３７グラムの量で、サプリメントとして哺乳類又は鳥類に直接与えることができる。特に好ましい態様において、該組成物は、多くの種で使用するために、1日当たり、生体重のキログラム当たり約０．０５グラム〜約０．２０グラムの量で与えることができる。
【００２６】
例として、該組成物は1頭当たり、1日当たり約２グラム〜1頭当たり、1日当たり約８グラムの範囲でヒツジに与えることができる。ウシ動物のためには、該組成物は1頭当たり、1日当たり約１０グラム〜1頭当たり、1日当たり約６０グラムの範囲で与えることができる。当業者は、与えられる該組成物の量が、動物種、動物のサイズ及び該組成物が加えられる飼料のタイプに依存して変化し得ることを理解できるであろう。
【００２７】
該組成物の概念をある程度の具体性で例示するため、ここで実施例が提供される。
【実施例】
【００２８】
実施例１
実験は、免疫抑制動物における生得的免疫システムのマーカー、好中球Ｌ−セレクチンの発現を増加させる組成物の能力を決定することを目的に、ヒツジで実施した。動物（群当たり６頭）を２つの群に分割した：対照及び実験。対照群には、アドリブで得ることができる刻み干し草、1頭当たり、1日当たり１ポンドの粉砕トウモロコシ及び1頭当たり、1日当たり１ポンドの焼き小麦ミルラン、から成る高エネルギー飼料を、２８日間与えた。この間、それらは毎日２回の免疫抑制剤、デキサメタゾンの注射も受けた。実験群には、２８日間、本組成物（1頭当たり、1日当たり５グラム）を毎日摂取させ、及び対照と同一の食餌及びデキサメタゾン注射プロトコールを与えた。実験群のこの組成物は、６５．８重量％の粘土鉱物、０．２０重量％のエンドグルカノハイドロラーゼ、９．０重量％のグルカン及びグルコマンナン及び２５重量％のか焼珪藻土であった。実験終了時、血液サンプルを回収し、好中球をパーコール（Percoll）濃度勾配遠心分離を使用して精製した。好中球中に発現されたＬ−セレクチンの量は、ウェスタンブロッティング技術及びＬ−セレクチンについての特異的な抗体を使用して評価した。
【００２９】
図１の上のパネルに示されたように、本組成物を受けていない動物は、低い及び一定していないＬ−セレクチンの発現を有していた。図１の下のパネルに示されたように、本組成物を受けた動物は、Ｌ−セレクチン発現の一致した増加を示した。上のパネルは６頭の対照免疫抑制動物を表している。下のパネルは、食餌中の本組成物を受け取った６頭の実験免疫抑制動物を表している。
【００３０】
実施例２
この研究において、実施例１の実験組成物がペレット状食餌で提供された場合の、ヒツジにおける生得的免疫システムの刺激を試験した。基本食餌は、２１．５５％オオムギ、１０、０％アブラナミール、５％蒸留粕（distillers grains ）、４０％粉砕トウモロコシ、１．５０％石灰石、０．０１％硫酸マンガン、０．０１％マイクロビタミンＥ、４．０％モラセス、０．２５％  モノキャル（mono-cal ）、０．２５％塩化カリウム、０．６０％塩化ナトリウム、０．０３％亜セレン酸ナトリウム、１５．７９％小麦ミルラン、０．０１％硫酸亜鉛、０．７５％硫酸アンモニウム及び０．２５％硫酸コバルトから成っていた。実験組成物をこの食餌に加える場合、小麦ミルランの一部を置き換え、０．６％で包含させた。２８頭のヒツジは、対照群、粉末形態の実験組成物を受けた群、ペレット形態の実験組成物を受けた群（ペレットは１６０°Ｆの温度で形成された）、及びペレット形態の実験組成物を受けた群（ペレットは１８０°Ｆの温度で形成された）、から成る４つの処置に帰属させた。全ての動物はデキサメタゾンの連日注射を介して免疫抑制した。
【００３１】
本研究は、実施例１と同一の方法を使用して実施した、但し、本組成物は、高温でペレットを形成させることにより製造したペレットで投与した。この研究を実施した根本的な理由は、本組成物の加熱（ペレット形成に必要とされるので）が生得的免疫を増加させる本組成物の能力を不活性化するかどうかを決定するためであった。図２に示されているように、本組成物を受けていないヒツジ（対照）は、好中球中のＬ−セレクチンを非常に低いレベルで発現した。ペレット化（加熱した）形態での実験組成物の提供でさえも、好中球Ｌ−セレクチンの発現を著しく増加させた。
【００３２】
図２において、最も上のパネルは、本組成物を含有していない対照食餌を給餌した免疫抑制動物における好中球Ｌ−セレクチン発現を表している。第二のパネル（粉末）は、実施例１（実験群）のような非加熱自由混合性形態の実験組成物を受けた免疫抑制動物におけるＬ−セレクチン発現を表している。パネル３及び４は、ペレット化形態の実験組成物を受けた免疫抑制動物における好中球Ｌ−セレクチン発現を表している。パネル３に使用されたペレットは１６０°Ｆに加熱することにより形成され、及びパネル４ペレットは飼料製造間に１８０°Ｆに加熱された。
【００３３】
実施例３
実験は、本組成物が非反芻動物モデルにおいて生得的免疫を増加させる能力を有しているかどうかを調べるため、ラットで実施した。この研究において、ラットは２つの処置の１つへ割り当てた：対照群（補充されていない食餌）及び実施例１の組成物を飼料乾燥重量の１％で食餌に添加した実験群。この実験において、実験組成物を含有する又は含有しない市販の粉砕ラット固形飼料をラットに給餌した。この研究においては、デキサメタゾン注射プロトコールを使用する免疫抑制は利用しなかった。１４日後、血液サンプルは心穿刺を介して麻酔ラットから摂取した。好中球は、パーコールを使用する濃度勾配遠心分離により血液サンプルから単離し、全ＲＮＡはTriZol を使用して単離した。
【００３４】
好中球ＲＮＡサンプル中の、ラットＬ−セレクチンをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の濃度を、ラットＬ−セレクチンのアッセイのため特別に開発されたプライマーを使用し、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ−ＰＣＲ）により決定した。Ｌ−セレクチンｍＲＮＡの量は、全細胞においてほぼ一定のレベルで発現されるβ-アクチンｍＲＮＡとの比率を示すことにより規格化した。図３に示されたように、及び実施例１及び２の結果と一致して、本組成物はＬ−セレクチンｍＲＮＡの発現を６倍より多く増加させた（Ｐ＜０．０５）。
【００３５】
この研究は、実施例１及び２においてウェスタンブロッティングにより示されたＬ−セレクチンタンパク質の増加した発現は、このタンパク質をコードするｍＲＮＡの増加により起こされたことを示している。このことは、本組成物がＬ−セレクチンをコードする遺伝子の転写の速度を変化させることを意味する。
【００３６】
実施例４
生得的免疫システムの細胞、好中球は、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）の分泌を介して、後天的免疫システムによる抗体産生のシグナルを発生し、及びそれにより上方制御することができる。好中球を誘導してＩＬ−１βの合成を増加させる本組成物の能力を調べるため、実施例１に記載したものと同一のヒツジから採取した好中球のＩＬ−１βの濃度を評価した。この研究を完結させるため、ウェスタンブロッティング及びＩＬ−１βに対する特異的抗体を使用した。
【００３７】
図４に示されたように、本組成物の毎日の供給を受けていない動物は、ＩＬ−１βを実質的に検出不能なレベルでしか含有していなかった；しかしながら、動物への本組成物の供給は、ＩＬ−１βの発現の顕著な増加を起こした（Ｐ＜０．０５）。図４において、上のパネルは、６頭の対照給餌免疫抑制動物を表している。下のパネルは、本組成物を受けた６頭の実験組成物給餌免疫抑制動物を表している。ＩＬ−１βの濃度は、ウェスタンブロット分析及びＩＬ−１βに対する特異的抗体を使用して決定した。
【００３８】
これらのデータは、本組成物は生得的免疫のマーカー（例えば、Ｌ−セレクチン；実施例１、２及び３）を増加させるだけでなく、適応免疫システムを上方制御する鍵となるシグナル分子（即ち、ＩＬ−１β）の発現も増加させる能力を有していることを示している。
【００３９】
実施例５
この実験の目的は、分娩前後の乳牛に本組成物を給餌した後、どの遺伝子が好中球中で差次的に発現されるのかを決定することである。この本研究において、本組成物が好中球中でのＩＬ−１βの発現を増加させる機構（一つ又は複数）を試験した。分娩前後の乳牛は、妊娠のストレスが免疫抑制を導き、雌ウシを感染に対して特に感受性にしているので、良いモデルである。
【００４０】
この実験において、８頭の分娩前後の乳牛を、実験組成物を含んでいない対照食餌に割り当て、８頭の乳牛を、食餌中の実施例１の組成物を受ける（1頭当たり、1日当たり５６グラム）実験群に割り当てた。動物には分娩までおよそ２８日間、食餌を給餌した。分娩１２〜１５時間後、頚静脈穿刺を介して５００ｍｌの血液サンプルを採取し、好中球を大規模パーコール濃度勾配遠心分離により調製した。
【００４１】
ＲＮＡはTriZol法を使用して好中球から単離し、次ぎに、逆転写酵素を使用してｃＤＮＡに逆転写した。逆転写の間、２つの異なった処置（対照及び実験）群から合成された相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が異なった色を取り込むように、異なって色付けされたヌクレオチド塩基色素（Ｃｙ３及びＣｙ５）を用いた。実験及び対照群からのｃＤＮＡサンプルをBoTL-5 マイクロアレイスライドに適用した。このマイクロアレイは、Center for Animal Functional Genomics at Michigan State University で調製されており、ガラススライド上に１５００の遺伝子を含有する（それぞれ３重に配列されている）。実験及び対照群サンプルから発生されたｃＤＮＡがアレイ上の１５００遺伝子と結合するのを完了させ、遺伝子の相対的発現は、アレイ上の各スポットのＣｙ３及びＣｙ５シグナルの相対的存在量を比較することにより評価した。データを次ぎに統計的に分析し、差次的に発現された遺伝子を同定した（Ｐ＜０．０５の遺伝子）。
【００４２】
結果は、実験群から採取したウシ好中球において２０を超える遺伝子が差次的に発現されたことを示した（Ｐ＜０．０５）。インターロイキン変換酵素（ＩＣＥ）は、このような上方制御された遺伝子の１つである。このことは、ＱＲＴ−ＰＣＲ及びウシＩＣＥ配列に特異的なプライマーを使用して確認された。ＩＣＥは、不活性プロＩＬ−１βから活性分泌ＩＬ−１βへの変換における律速酵素である。それ故、本組成物は、好中球ＩＣＥ活性の発現及び結果的にＩＬ−１βの分泌を増加させるその能力を介して、適応免疫を上方制御すること（即ち、抗体力価を増加させること）ができる。
【００４３】
実施例６
本組成物がワクチンの有効性を増強するという仮説を試験するため、ワクチン接種プロトコール後の力価の発生を試験した。１８頭の肉牛（各群６頭のウシ）を３つの処置の１つに割り当てた：対照、処置１（1頭当たり、1日当たり食餌中に１５グラムの組成物）及び処置２（1頭当たり、1日当たり３０グラムの組成物）。動物の食餌は、１４％粗タンパク質、３％粗脂肪及び２０％粗繊維を提供するデイリーサプリメント（daily  supplement）（表２）と、アドリブで与えられた牧草の干し草から成っていた。動物には試験を通して、1頭当たり、1日当たり１２ポンドのこのサプリメントが与えられた。処置１及び２のウシにそれぞれ、1頭当たり、1日当たり食餌中に１５グラム及び1頭当たり、1日当たり３０グラムの予想摂取で送達されるように、実施例１の実験組成物がこのサプリメントに直接混合された。
【００４４】
動物にこれらの食餌処置を５６日間行い、その後本組成物は、処置１及び２の食餌から取り除かれた。すべての動物は、８４日目まで本組成物を含まない同一の対照食餌で維持した。第７日、２１日及び３５日の全ての実験動物に、大腸菌Ｊ５ワクチン（Pfizer）を投与した。このワクチン接種プロトコール（即ち、１４日離して３回注射）は製造元の推奨に従っていた。このワクチンは、大腸菌型乳腺炎の可能性を減少させる手段として酪農業において商業的に使用されている。このワクチン、及びほとんどの他のワクチンの限界は、力価が一定ではなく及び限定された応答であることである。
【００４５】
０、１４、２８、４２日目及び動物の食餌から本組成物が取り除かれる５６日目に、頸静脈穿刺を使用して血液サンプルを採取した。すべての動物は、８４日目まで本組成物を含んでいない共通の食餌にした。本組成物により誘導された力価のいずれかの変化が、食餌からのその離脱に続いて維持されていたかどうかを決定するため、８２日目にも血液サンプルを採取した。血清を、遠心分離により全ての動物から調製した。大腸菌Ｊ５ワクチン接種に対する特異的抗体の濃度は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、３つの異なった免疫グロブリン分画（ＩｇＭ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２）で評価した。ＩｇＭ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２免疫グロブリン分画における大腸菌Ｊ５力価をアッセイするため、大腸菌の培養物（Dr. Jeanne Burton, Center for Animal Functional Genomics, Department of Animal Sciences,- Michigan State University から入手）を増殖させ、収集し、そして９６ウェルプレートを被覆するために使用した。続いて、動物からの血清サンプル（１：５０００希釈）を、被覆プレートの個々のウェルに加え、１時間インキュベートさせ、動物血清中の抗体を大腸菌Ｊ５抗原に結合させた。ＥＬＩＳＡプレートをTween-20 含有リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。
【００４６】
ウシＩｇＭ、ＩｇＧ１か又はＩｇＧ２に特異的に結合する二次抗体（西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヒツジ抗ウシ）（Beth Laboratories, Montgomery, TX）を洗浄したプレート添加した。二次抗体は西洋わさびペルオキシダーゼにコンジュゲートされている。二次抗体とさらに1時間インキュベーション後、プレートをＰＢＳ及びTween-20 で再び洗浄した。ペルオキシダーゼ基質ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）をプレートに加え、生じた呈色反応を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用し、４５０ｎｍの吸光度を測定することにより定量した。
【００４７】
表３に示したように、実験組成物はＩｇＭ抗体アイソタイプに関連する大腸菌Ｊ５力価の発生には何の効果もなかった（Ｐ＞０．０５の閾値で）。しかしながら、本組成物は、図５及び６及び表４及び５に示されているように、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２抗体アイソタイプのＪ５力価を刺激し及び維持した。処置１及び処置２の両方を受けた動物において、第５６日目にＩｇＧ１力価が増加した（Ｐ＜０．０５）（表４及び図５）。８２日目までに、対照動物の力価は実験前（０日目）のレベルに後退した。しかしながら、処置１又は処置２で給餌した動物は、対照動物と比較して上昇したＪ５力価を有していた（Ｐ＜０．０５）。実際、処置１又は処置２を受けた動物は、５６日以後に食餌から本発明の組成物が除去されても、ＩｇＧ１力価の喪失を示さなかった（表４及び図５）。
【００４８】
表５及び図６に示されたように、ＩｇＧ２分画に関しては、本組成物の1頭当たり、1日当たり１５ｇ（処置１）又は1頭当たり、1日当たり３０ｇ（処置２）の添加は、４２日目にＪ５  ＩｇＧ２力価の段階的増加を起こしたが（即ち、対照と比較して、より高い投与量は５７％及び低い投与量は３０％力価を増加させた）、この効果はＰ＜０．０５で統計的に有意ではなかった（Ｐ値は０．１６であった）。５６日目以後、処置２（本組成物のより高い投与量）はＪ５力価の有意な上昇を起こした（Ｐ＜０．０５）。処置１（本組成物の低い投与量）は、この時点でＩｇＧ２分画内のＪ５力価の上昇を起こしたが、この効果はＰ＜０．０５の閾値で統計的に有意ではなかった（Ｐ値＝０、１２）。食餌から本組成物がすでに取り除かれた後の本研究の第８２日目、本組成物のより高い投与量を給餌した動物は、ＩｇＧ２分画内に上昇した力価を有していた（対照と比較して１４％の増加）；しかしながら、この効果はＰ＜０．０５の閾値で有意ではなかった（Ｐ値は＝０．０９）。
【００４９】
これらのデータは、本組成物がＩｇＧ１分画中の力価を増加させ、そしてさらに、食餌から本組成物を除去した後もその力価を維持する能力を有することを示している（Ｐ＜０．０５）。本組成物は、ＩｇＧ２分画内の力価の発生を増加させる能力も有する（Ｐ＜０．０５）。
【００５０】
ＩＬ−１β濃度も、ＩＬ−１βのためのＥＬＩＳＡ（R+D Systems Minneapolis, MN）を使用し、対照、処置１及び処置２動物からの血清サンプルにおいて試験した。図７に示されているように、結果は、処置１及び処置２の両方が、２８日後にＩＬ−１βの血清濃度を増加させたことを示している。５６日後、本組成物の低い投与量もＩＬ−１βの血清濃度を有意に上昇させた（Ｐ＜０．０５）。本組成物の高い投与量は、研究の第５６日目に、血清ＩＬ−１βの数値の上昇を起こした；しかしながら、この効果はＰ＜０．０５で有意ではなかった（Ｐ値＝０．２３）。理論に拘束されようとは思わないが、本組成物は生得的免疫システム（例えば、好中球活性化を介して）及び好中球を刺激することができ、次ぎにＩＬ−１βの分泌により後天的免疫システムを刺激することができる。ＩＬ−１βは、ＩｇＧ２力価の発生の速度を増加させ、及びＩｇＧ１分画内の力価を維持するＢ細胞の能力を特異的に増加させた。
【００５１】
好中球Ｌ−セレクチンのタンパク濃度も、図８に示したようにウェスタンブロッティングを使用して評価した。Ｌ−セレクチンについてのｍＲＮＡ濃度もラット研究（実施例４）のように決定したが、但しウシ特異的プライマーを使用した。処置１（１５ｇの実験組成物／頭／日）及び処置２（３０ｇの実験組成物／頭／日）の両方が、対照と比較して、好中球Ｌ−セレクチンの濃度を増加させたことが（Ｐ＜０．０５）、決定された。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
【表３】
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【００５４】
【表４】
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【００５５】
【表５】
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【００５６】
実施例７
実験はヒツジで行い、実施例６で用いられた、Ｊ５大腸菌ワクチン接種プロトコールに応答した適応免疫を増加させる実施例１の実験組成物の能力を調べた。動物（処置当たり１２匹の動物）を３つの処置に割り振った：対照、処置１（実施例１の実験組成物を1頭当たり、1日当たり３グラム）又は処置２（実施例１の実験組成物を1頭当たり、1日当たり６グラム）。動物にこれらの食餌を７５日間与え、試験の７、２１及び３５日目にPfizerＪ５ワクチンをワクチン接種した。血液サンプルを０、３５及び７５日目に採取した。この組成物が力価を維持するための能力を有していたかどうかを決定するため、処置１又は処置２組成物が食餌から取り除かれた後、第９０日目にも血液サンプルを採取した。
【００５７】
この研究においては、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ヒツジアイソタイプの両方を認識する二次抗体（ＨＲＰコンジュゲートウサギ抗ヒツジＩｇＧ：Beth Laboratories, Montgomery, Texas）を使用した。表６及び図９は、合併したヒツジＩｇＧ１及びＩｇＧ２分画からのデータを示している。ＥＬＩＳＡを実施するためにこの研究で使用した方法は、代わりに抗ヒツジＩｇＧ抗体（VMRD, Pullman, WA）を使用したことを除いて、実施例６に概説した方法と同一であった。
【００５８】
第３５日目に、実験組成物の高投与量は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２力価の総量での上昇を起こした。第７５日目に、組成物の低及び高投与量は、Ｊ５力価の段階的な増加を起こした。具体的には、低投与量は、力価に１７％の増加を起こし、高投与量はＪ５力価に３１％の増加を起こした。第９０日目には、処置１の動物は、対照給餌動物と比較して力価の上昇を有していなかった。しかしながら、本組成物の高投与量を受けた処置２の動物は、Ｊ５力価に２４％の上昇を示した。
【００５９】
これらのデータは、実験組成物の投与がＩｇＧ１及びＩｇＧ２分画内の力価の発生を増加させ、そしてさらに１５日間、食餌からの実験組成物の除去後にも力価を維持していたという、実験６の観察を支持している。
【００６０】
【表６】
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【００６１】
記載されてきた本組成物の態様は、本組成物の原理のいくつかの応用の例示であることが理解されるであろう。多数の改変を、本組成物の真の精神及び範囲から離れることなく行うことができる。本明細書に記載された多様な特色を、いずれの組み合わせでも使用することが可能であり、本明細書で特別に概説された組み合わせを得ることに限定されるわけではない。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、実施例１に記載されている好中球Ｌ−セレクチンの発現に対する、本組成物の効果を実証する、ウェスタンブロッティング実験からの結果を示している。
【図２】図２は、実施例２に記載されている好中球Ｌ−セレクチンの発現に対する、非加熱及び加熱（ペレット化）形態の本組成物の効果を実証する、ウェスタンブロッティング実験からの結果を示している。
【図３】図３は、実施例３に記載されているラット好中球における、Ｌ−セレクチンをコードするｍＲＮＡの発現に対する、本組成物の効果を要約しているグラフである。
【図４】図４は、実施例４に記載されている好中球インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）の発現に対する、本組成物の効果を実証する、ウェスタンブロッティング実験からの結果を示している。
【図５】図５は、実施例６に記載されているＪ５ワクチンに対するＩｇＧ１力価を定量するために使用したＥＬＩＳＡの結果を要約する棒グラフである。
【図６】図６は、実施例６に記載されているＪ５ワクチンに対するＩｇＧ２力価を定量するために使用したＥＬＩＳＡの結果を要約する棒グラフである。
【図７】図７は、実施例６に記載されている肉牛におけるインターロイキン−１βの発現に対する本組成物の低（１５グラム／日）及び高投与量（３０グラム／日）の効果を例示する棒グラフである。
【図８】図８は、実施例６に記載されている肉牛における好中球Ｌ−セレクチンの発現に対する本組成物の効果を実証する、ウェスタンブロッティング実験からの結果を示している。
【図９】図９は、実施例７に記載されているＩｇＧ１及びＩｇＧ２力価の総量を定量するために使用したＥＬＩＳＡの結果を要約した棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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