(57)【要約】  ニコチン性アセチルコリン受容体またはその機能的変異体の哺乳類α７サブユニットに結合し、また前記受容体または変異体の作動薬である、抗体またはその抗原結合性フラグメント。同抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む薬学的組成物。炎症状態を患う対象を治療する方法であり、本明細書で記載されるように、前記対象に抗体または抗原結合性フラグメントを投与するステップを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、配列番号３および配列番号４から成る群から選択される配列に対して、少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列から成るペプチドと特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
前記抗体またはフラグメントは、配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列から成るペプチドに特異的に結合する、請求項１の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
前記抗体またはフラグメントは、配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列から成るペプチドに特異的に結合する、請求項１の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
前記抗体またはフラグメントが、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列から成るペプチドに特異的に結合する、請求項１の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
前記抗体またはフラグメントは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２のフラグメント、配列番号３のフラグメント、およびＳ配列番号４のフラグメントから成る群から選択されるアミノ酸配列から成るペプチドに特異的に結合する、請求項１の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項６】
前記抗体またはフラグメントはヒト、ヒト化、またはキメラ化である、請求項１の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項７】
前記抗体またはフラグメントは単クローン性である、請求項１の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項８】
前記抗体またはフラグメントは多クローン性である、請求項１の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項９】
前記抗原結合性フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、およびＦｖフラグメントから成る群から選択される、請求項１の抗原結合性フラグメント。
【請求項１０】
配列番号２またはそのフラグメントから成るペプチドに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１１】
配列番号３またはそのフラグメントから成るペプチドに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１２】
配列番号４またはそのフラグメントから成るペプチドに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１３】
薬学的に許容できる担体または希釈剤、およびＳ配列番号２、配列番号３および配列番号４から成る群から選択される配列に対して、少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列から成るペプチドと特異的に結合する、抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
前記抗体または抗原結合性フラグメントは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２のフラグメント、配列番号３のフラグメント、および配列番号４のフラグメントから成る群から選択されるアミノ酸配列から成るペプチドに特異的に結合する、請求項１３の組成物。
【請求項１５】
前記抗体またはフラグメントはヒト、ヒト化、またはキメラ化である、請求項１３の組成物。
【請求項１６】
前記抗体または抗原結合性フラグメントは単クローン性である、請求項１３の組成物。
【請求項１７】
前記抗体または抗原結合性フラグメントは多クローン性である、請求項１３の組成物。
【請求項１８】
前記抗原結合性フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、およびＦｖフラグメントから成る群から選択される、請求項１３の組成物。
【請求項１９】
薬学的に許容できる担体または希釈剤と、配列番号２またはそのフラグメントから成るペプチドと特異的に結合する、抗体またはその抗原結合性フラグメントとを含む、薬学的組成物。
【請求項２０】
薬学的に許容できる担体または希釈剤と、配列番号３またはそのフラグメントから成るペプチドと特異的に結合する、抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む、薬学的組成物。
【請求項２１】
薬学的に許容できる担体または希釈剤と、配列番号４またはそのフラグメントから成るペプチドと特異的に結合する、抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む、薬学的組成物。
【請求項２２】
炎症状態を患う対象を治療する方法であって、
前記対象に、効果的な量の抗体またはその抗原結合性フラグメントを投与するステップを含み、
ここで、前記抗体または前記抗原結合性フラグメントは、配列番号２、配列番号３および配列番号４の群から選択される配列に対して、少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列から成るペプチドと特異的に結合する、前記方法。
【請求項２３】
前記抗体またはフラグメントは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２のフラグメント、配列番号３のフラグメント、配列番号４のフラグメントから成る群から選択されるアミノ酸配列から成るペプチドに特異的に結合する、請求項２２の方法。
【請求項２４】
前記状態は、虫垂炎、消化性、胃および十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸閉塞、やけど、アルツハイマー病、咽頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝臓炎、ウィップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシー・ショック、免疫複合体病、臓器虚血、再潅流傷害、器官神経症、枯草熱、敗血症、腐敗症、内毒素性ショック、悪液質、過高熱、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、感染流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、珪性肺塵症、肺胞炎、気管支梢炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウイルス感染、Ｃ型肝炎ウイルス感染、散在性菌血、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、やけど、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、静脈血栓症、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、骨膜炎、脳炎、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎疹、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、間接リウマチ、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植拒絶反応、移植片対宿主病、強直性脊椎炎、バージャー病、ライター症候群、およびホジキン病から成る群から選択される、請求項２２の方法。
【請求項２５】
前記状態は、腹膜炎、膵炎、敗血症、内毒素性ショック、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸閉塞、やけど、アルツハイマー病、成人呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、間接リウマチ、全身性エリテマトーデス、心筋虚血、同種移植拒絶反応、喘息、移植片対宿主病、鬱血性心不全、および嚢胞性線維症から成る群から選択される、請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記哺乳類はヒトである、請求項２２の方法。
【請求項２７】
前記抗体または抗原結合性フラグメントはヒト、ヒト化、またはキメラ化である、請求項２２の方法。
【請求項２８】
前記抗体またはフラグメントは単クローン性である、請求項２２の方法。
【請求項２９】
前記抗体またはフラグメントは多クローン性である、請求項２２の方法。
【請求項３０】
前記抗原結合性フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、およびＦｖフラグメントから成る群から選択される、請求項２２の方法。
【請求項３１】
炎症状態を患う対象を治療する方法であって、
前記対象に、効果的な量の抗体またはその抗原結合性フラグメントを投与するステップを含み、
ここで、前記抗体または抗原結合性フラグメントは、配列番号２またはそのフラグメントから成るペプチドに特異的に結合する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００５年１１月１５日出願の米国仮出願第６０／７３７，０４５号の利益を主張するものである。上記の出願の全体の内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の背景
哺乳類は、部分的に中枢神経の調整を通して炎症に反応する。一連の反応は、「コリン作動性抗炎症経路」と称される遠心性迷走神経シグナルを通る（Ｂｏｒｏｖｉｋｏｖａら、Ｖａｇｕｓ  ｎｅｒｖｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ（迷走神経の刺激によってエンドトキシンに対する全身炎症反応を軽減する）。Ｎａｔｕｒｅ：４０５：４５８−４６２（２０００））。α−ブンガロトキシン感受性のニコチン性アセチルコリン受容体（例：アセチルコリンによる）による遠心性迷走神経の刺激またはシグナリングは、全身炎症反応およびマクロファージのサイトカイン合成を軽減する（Ｂｅｒｎｉｋ，Ｔ．Ｒ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ（コリン作動抗炎症経路の薬理的刺激）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：７８１−７８８（２００２）；Ｔｒａｃｅｙら、Ｍｉｎｄ  ｏｖｅｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１５：１５７５−１５７６（２００１）；米国特許出願第０９／８５５，４４６号）。
【０００３】
ニコチン性アセチルコリン受容体は、リガンド依存性五量体イオンチャネル群である。ヒトにおいて、はっきりと異なる構造および薬理学的特性を持つ多数のホモ−およびヘテロ−五量体受容体を形成する１６の異なるサブユニット（α１−７、α９−１０、β１−４、δ、ε、およびγ）が、同定されている（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ、１９９５；ＬｅｏｎａｒｄおよびＢｅｒｔｒａｎｄ、２００１；Ｌｅ  ＮｏｖｅｒｅおよびＣｈａｎｇｅｕｘ、１９９５）。この受容体群の主な既知の機能は、神経筋接合部ならびに中枢および末梢神経系において、神経伝達物質アセチルコリンのシグナルを伝達することである（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｍ．「Ｈａｎｄ  Ｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ａｎｄ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ：Ｌｉｇａｎｄ−Ａｎｄ  Ｖｏｌｔａｇｅ−Ｇａｔｅｄ  Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ(受容体とチャンネルハンドブック：リガンドおよび電位依存性のイオンチャンネル)」、Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ(ニコチン性アセチルコリン受容体)、Ｒ．Ａｌａｎ  Ｎｏｒｔｈ編集。ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９５）；Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｓ．およびＢｅｒｔｒａｎｄ，Ｄ．、Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｆｒｏｍ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ（ニコチン性ニューロン受容体：構造から機能へ）．Ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ＆  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｒｅｓ．３：２０３−２２３（２００１）；Ｌｅ  Ｎｏｖｅｒｅ，Ｎ．  ＆  Ｃｈａｎｇｅｕｘ，Ｊ−Ｐ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ａｎ  ｅｘａｍｐｌｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  ｅｘｃｉｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌｓ(ニコチン性アセチルコリン受容体の分子進化：興奮性細胞における多重遺伝子族の一例)．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．４０：１５５−１７２（１９９５）、Ｍａｒｕｂｉｏ，Ｌ．Ｍ．およびＣｈａｎｇｅｕｘ，Ｊ−Ｐ．、Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ  ａｓ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ(受容体機能研究のための動物モデルとしてのニコチン性アセチルコリン受容体ノックアウトマウス)．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３９３：１１３−１２１（２０００）；Ｓｔｅｉｎｌｅｉｎ，Ｏ．、Ｎｅｗ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ？(ニコチン性アセチルコリンの新機能？)Ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．９５：３１−３５（１９９８））。
【０００４】
同時係属の公開米国特許出願第２００４／０２０４３５５号において、炎症反応の軽減の一次的原因となるアセチルコリン受容体のサブユニットの正体は、α７サブユニットであると開示された。しかしながら、α７サブユニットが作用する、および新たな抗炎症医薬品の設計を促進するであろうメカニズムは、未知のままであった。
【０００５】
しかしながら、最小限の副作用で種類特異的にアセチルコリン受容体を活性化することにより、コリン作動性抗炎症経路を活用することができる薬学的活性薬剤が引き続き必要とされている。
【０００６】
発明の開示
本発明は、ニコチン性受容体のα７サブユニットの特異的領域に結合することにより、コリン作動性抗炎症経路を活性化することができるという発見に基づく。具体的に、出願者は、受容体の特定のフラグメントと同種の抗体により、α７ニコチン性受容体に結合することで、コリン作動性抗炎症経路を活性化することを発見している（例４−７）。この発見に基づき、炎症状態の治療に役立つ同抗体を含む、新しい抗体および薬学的組成物が開示される。
【０００７】
一実施形態では、本発明は、配列番号２、配列番号３、およびＳ配列番号４の群から選択される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列から成るペプチドに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントである。
【０００８】
一実施形態では、本発明は、配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列から成るペプチドに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントである。
【０００９】
別の実施形態では、本発明は、配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列から成るペプチドに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントである。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列から成るペプチドに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントである。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、配列番号２またはそのフラグメントのアミノ酸配列によるペプチドに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントである。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、配列番号３またはそのフラグメントのアミノ酸配列によるペプチドに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントである。
【００１３】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号４またはそのフラグメントのアミノ酸配列によるペプチドに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントである。
【００１４】
一実施形態では、本発明は、薬学的に許容できる担体または希釈剤、および配列番号２、配列番号３、および配列番号４の群から選択される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列から成るペプチドに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む薬学的組成物である。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、薬学的に許容できる担体または希釈剤、および配列番号２またはそのフラグメントから成るペプチドに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む薬学的組成物である。
【００１６】
一実施形態では、本発明は、炎症状態を患う対象を治療する方法であり、前記対象に効果的な量の抗体またはその抗原結合性フラグメントを投与するステップを含む。抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号２、配列番号３、および配列番号４の群から選択される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列から成るペプチドに特異的に結合する。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、炎症状態を患う対象を治療する方法であり、前記対象に効果的な量の抗体またはその抗原結合性フラグメントを投与するステップを含む。抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号２またはそのフラグメントのアミノ酸配列から成るペプチドに特異的に結合する。
【００１８】
本明細書で開示される抗体は、生体外での炎症前サイトカインの生産を抑制（例５および６）、および盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）実験手順に起因するマウスの致死性を防ぐ（例７）。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、α７サブユニットの特異的領域の発見に基づき、それは同種の抗体への結合後、α７ニコチン性アセチルコリン受容体を刺激する。この刺激は、次に炎症状態の一因となるシグナル経路を抑制する。α７ニコチン性受容体にかかる刺激効果をもたらす抗体は、α７受容体作動薬である（以下も参照）。
【００２０】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は患者における炎症状態の治療方法である。方法は、対象に効果的な量の抗体またはその抗原結合性フラグメントを投与するステップを含み、ここで抗体またはその抗原結合性フラグメントは、α７ニコチン性受容体を刺激する。
【００２１】
ここで使用されるように、「α７ニコチン性受容体」とはα７サブユニットを含むニコチン性受容体である。受容体はα７サブユニットのみを含むことができる。あるいは、受容体はα７サブユニット、および他のニコチン性受容体のサブタイプからのサブユニットを含む。受容体はホモ五量体であることができる。あるいは、受容体はヘテロ五量体であることができる。「α７サブユニット」は、すべてのサブユニットのアイソフォームおよび／または変異体を含むよう意図されており、それには、限定されないが、Ｖｉｌｌｉｇｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２６：８６−９８（２００２）、およびＧａｕｌｔら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５２：１７３−８５（１９９８）に記載されるα７重複ニコチン性アセチルコリン受容体（「ｄｕｐα７」）、米国２００４０１５２１６０に記載されるスプライス変異体α７−２、および米国特許第６，８７５，６０６号に記載されるα７ニコチン性受容体のプロモーター変異体が含まれる。これらの出版物の関連する内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００２２】
ここで使用されるように、「α７ニコチン性受容体作動薬」および「α７受容体作動薬」は、生体内または生体外で、α７サブユニットを含む受容体に結合し、その生理作用を行うために受容体を誘発する化合物（抗体を含む）である。この誘発の結果として、ニコチン性受容体作動薬は、炎症前のシグナル経路を抑制し、したがって炎症を緩和または除去、および炎症状態を治療または治癒する。
【００２３】
抗体および抗体生産細胞
図１は、ヒトα７ニコチン性受容体サブユニットのアミノ酸配列を示す（配列番号１）。好ましくは、本発明の抗体はα７ニコチン性受容体の選択的作動薬である。
【００２４】
本発明の抗体は、多クローン性または単クローン性であることができ、用語「抗体」は、多クローン性および単クローン性抗体の両方を包含するよう意図されている。用語、多クローン性および単クローン性は、抗体調製の均質性の度合いを意味し、特定の生産方法に限定されるよう意図されていない。用語「抗体」はまた、ここで使用されるように、キメラ化、ヒト化、霊長類化、ベニヤ化、または単鎖抗体のフラグメントを含む、抗体の機能フラグメントを包含する。機能フラグメントは、哺乳類α７ニコチン性受容体に結合する抗原結合性フラグメントを含む。例えば、抗体はＩｇＧまたはＩｇＧの抗原結合性フラグメントであることができる。哺乳類α７ニコチン性受容体またはそのフラグメントに結合することができる抗体フラグメントは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを含むがそれらに限定されない。かかるフラグメントは、酵素的切断または組み換え技術によって生産することができる。例えば、パパインまたはペプシン切断は、それぞれＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成することができる。必須の基質特異性を持つ他のプロテアーゼもまた、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成するために使用できる。抗体もまた、１つ以上の終止コドンが自然停止位置の上流に誘発されている抗体遺伝子を使用して、様々な切断形態で生産することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖フラグメントをエンコードするキメラ化遺伝子は、ＣＨ１ドメインおよび重鎖のヒンジ領域をエンコードするＤＮＡ配列を含むよう設計することができる。
【００２５】
異なる種から得られたフラグメントを含む、単鎖抗体、およびキメラ化、ヒト化もしくは霊長類化（ＣＤＲ移植）、またはベニヤ化抗体、ならびにキメラ化、ＣＤＲ移植、またはベニヤ化単鎖抗体などはまた、本発明および用語「抗体」によって包含される。これらの抗体の様々なフラグメントは、従来の技術によって化学的に接合、または遺伝子工学技術を使用して隣接タンパク質として調製することができる。例えば、キメラ化またはヒト化鎖をエンコードする核酸は、隣接タンパク質を生産するために発現することができる。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許第０，１２５，０２３  Ｂ１号；Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓら、欧州特許第０，１２０，６９４  Ｂ１号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、ＷＯ  ８６／０１５３３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、欧州特許第０，１９４，２７６  Ｂ１号；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ、欧州特許第０，２３９，４００  Ｂ１号；Ｑｕｅｅｎら、欧州特許第０  ４５１  ２１６  Ｂ１号；およびＰａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．ら、ＥＰ  ０  ５１９  ５９６  Ａ１を参照。また、霊長類化抗体に関して、Ｎｅｗｍａｎ，Ｒ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１４５５−１４６０（１９９２）、および単鎖抗体に関して、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号、およびＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６（１９８８）を参照。
【００２６】
ヒト化抗体は、標準方法または他の適した技術を使用した合成または組み換えＤＮＡ技術を使用して生産することができる。ヒト化可変領域に対する核酸（例：ｃＤＮＡ）配列コーディングはまた、以前にヒト化された可変領域からのＤＮＡ鋳型のような、ヒトまたはヒト化鎖をエンコードするＤＮＡ配列を変更するために、ＰＣＲ変異誘発方法を使用して構成することができる（例えば、Ｋａｍｍａｎ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：５４０４（１９８９）；Ｓａｔｏ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：８５１−８５６（１９９３）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｂ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９（９）：２４７１−２４７６（１９９１）；ならびにＬｅｗｉｓ，Ａ．Ｐ．およびＪ．Ｓ．Ｃｒｏｗｅ，Ｇｅｎｅ，１０１：２９７−３０２（１９９１）を参照）。これら、または他の適した方法を使用して、変異体もまた容易に生産することができる。一実施形態では、クローン可変領域を変異することができ、望ましい特異性を持つ変異体をエンコードする配列を選択することができる（例：ファージライブラリーから；例えば、Ｋｒｅｂｂｅｒら、米国特許第５，５１４，５４８号；１９９３年４月１日公開のＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、ＷＯ  ９３／０６２１３を参照。）
【００２７】
哺乳類（例：ヒト）のα７ニコチン性受容体に対して特異的な抗体は、配列番号１またはそのフラグメントの分離および／または組み換えヒトタンパク質などの、適切な免疫原に対して産出されることができる（合成ペプチドのような合成分子を含む）。抗体はまた、マクロファージのようなα７ニコチン性受容体を発現する細胞で、適切な宿主（例：マウス）に免疫を与えることにより産出されることができる。さらに、トランスフェクト細胞などの組み換え哺乳類α７ニコチン性受容体を発現する細胞は、免疫原として、または受容体に結合する抗体のスクリーンニングにおいて使用することができる（例えば、Ｃｈｕｎｔｈａｒａｐａｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：１７８３−１７８９（１９９４）；Ｃｈｕｎｔｈａｒａｐａｉら、米国特許第５，４４０，０２１号を参照）。
【００２８】
免疫抗原の調製、ならびに多クローン性および単クローン性抗体の生産は、いかなる適切な技術を使用しても行うことができる。様々な方法が記載されてきた（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）、およびＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７６）；Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ２６６：５５０−５５２（１９７７）、Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉら、米国特許第４，１７２，１２４号；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＤ．Ｌａｎｅ、１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２（付録２７、９４年夏）、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編集、（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：ニューヨーク州ニューヨーク）、第１１章（１９９１）を参照）。一般的に、ハイブリドーマは抗体を生産する細胞を有する適切な永久細胞株（例：ＳＰ２／０、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、または異種骨髄腫などの骨髄腫細胞株）を融合することにより産出される。抗体を生産する細胞は、重要な抗原の免疫を持つヒトまたは他の適切な動物の末梢血、または好ましくは脾臓もしくはリンパ節から得ることができる。融合細胞（ハイブリドーマ）は、選択的培養条件を使用して単離、および希釈を制限することによりクローン化することができる。望ましい特異性を持つ抗体を生産する細胞は、適切なアッセイ（例：ＥＬＩＳＡ）により選択することができる。
【００２９】
必須の特異性の抗体（例：ヒト抗体または抗原結合性フラグメント）を生産または単離する他の適切な方法を使用することができ、例えば、ライブラリー（例：ファージ提示ライブラリー）から組み換え抗体を選択する方法、またはヒト抗体のレパートリーを生産することができる遺伝子導入動物（例：マウス）への免疫付与を利用する方法を含む（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ３  ９０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、米国特許第５，５４５，８０６号；Ｓｕｒａｎｉら、米国特許第５，５４５，８０７号；Ｌｏｎｂｅｒｇら、ＷＯ９７／１３８５２を参照）。
【００３０】
本発明はまた、哺乳類α７ニコチン性受容体、および少なくとも１つの他の抗原に結合する、二重特異性抗体またはその機能フラグメント（例：Ｆ（ａｂ’）２）に関連する（例えば、米国特許第５，１４１，７３６号（Ｉｗａｓａら）、米国特許第４，４４４，８７８号、５，２９２，６６８号、５，５２３，２１０号（すべてＰａｕｌｕｓら）、および米国特許第５，４９６，５４９号（Ｙａｍａｚａｋｉら）を参照）。
【００３１】
一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のフラグメントに特異的に結合する（図２は、ヒトニコチン性受容体のα７サブユニット内におけるこれらの配列の相対位置を図解する）。フラグメントは、５から１０のアミノ酸の長さ、１０から１５のアミノ酸の長さ、または１５から１９のアミノ酸の長さであることができる。
【００３２】
あるいは、抗体または抗原結合性フラグメントは、配列番号２、配列番号３、または配列番号４に特異的に結合する。
【００３３】
表１は、上記のアミノ酸配列を記載する。
【００３４】
【表１】
2009515982.tif 000002
【００３５】
一実施形態では、抗体または抗原結合性フラグメントは、以下に定義する配列番号１の機能的変異体、またはそのフラグメントに結合する。例えば、抗体または抗原結合性フラグメントは、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のペプチドに対して配列同一性を有するペプチドに結合することができる。抗体が結合するペプチドは、配列番号２、配列番号３、もしくは配列番号４、またはそのフラグメントから選択されたペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列類似性を、好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列類似性を、およびより好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列類似性を共有することができる。配列類似性を確認する方法は、以下に記載される。
【００３６】
本発明の抗体は、様々な適切な方法によって識別することができる。例えば、かかる抗体は、哺乳類α７ニコチン性受容体への結合をめぐって、先述の抗体のいずれかと競う能力に基づいて識別することができる。別の例では、かかる抗体の結合、および同一または同様のエピトープ特異性を持つ抗体の結合は、天然ペプチドまたは合成ペプチドによって抑制することができる。ペプチドは、５から約５０のアミノ酸を含むことができる。好ましくは、ペプチドは１０から約２０のアミノ酸を含む。さらに別の例では、先述のように抗体として同一または同様のエピトープ特異性を持つ抗体は、キメラ化受容体を使用して識別することができる（例えば、Ｒｕｃｋｅｒら、Ｃｅｌｌ  ８７：４３７−４４６（１９９６）を参照）。
【００３７】
特定の実施形態では、二重特異性抗体またはその機能フラグメントは、配列番号２、配列番号３、または配列番号４、および少なくとも１つの他の抗体のペプチドに結合する抗体として、同一または同様のエピトープ特異性を有する。
【００３８】
α７ニコチン性受容体に対する抗体を生成する方法の限定されない方法は、α７受容体またはそのフラグメントで適切な実験動物に免疫を与え、α７サブユニットに結合する、免疫付与によって誘発された抗体を単離することである。免疫付与および単離の手順は、当業者にはよく知られている。
【００３９】
α７ニコチン性受容体に対する選択性は、少なくとも１つの他のニコチン性またはコリン作動性受容体への結合に対するスクリーニングによって、評価することができる。α７受容体に対する選択的作動薬と考えられる抗体は、サイトカイン放出の抑制、および／またはここに記載される１つ以上の炎症性疾患の治療におけるそれらの有効性について、例えば動物モデルにおける追加の生体外試験または生体内試験で、さらに評価してもよい。
【００４０】
作動薬である抗体は、例えば、単離抗体を、炎症前サイトカインを放出するために刺激を受けたマクロファージと組み合わせることによって、またはα７受容体の活性を評価するいかなる他の適切な方法によって、ここに記載される手順によって識別することができる。サイトカイン放出の抑制は作動薬の活性を示す。
【００４１】
一般にニコチン性受容体、および特にα７受容体に対する作動薬抗体を識別する方法は、以下に記載される。好ましい方法では、作動薬抗α７抗体の結合活性は、作動薬投与後、α７受容体のサブタイプまたは別の受容体のサブタイプ（例：α４β２）のいずれかを発現するアフリカツメガエル卵母細胞の活性（電流反応）によって測定する。α７受容体のサブタイプのより大きな活性化をもたらす作動薬は、α７選択的作動薬と決定される。
【００４２】
機能分析
哺乳類α７ニコチン性受容体またはその機能的変異体を含む組成物は、本発明の抗体を含む、受容体に結合することができる薬剤を検出および／または識別するために、結合アッセイにおいて使用することができる。
【００４３】
結合アッセイにおける使用に適した組成物は、例えば、哺乳類α７ニコチン性受容体またはその機能的変異体を自然に発現する細胞、および哺乳類α７ニコチン性受容体またはその機能的変異体を発現する組み換え細胞を含む。結合アッセイにおける使用に適した組成物はまた、哺乳類α７ニコチン性受容体またはその機能的変異体を含む膜標本を含む。かかる膜標本は、天然（例：プラズマ細胞膜）または合成膜を含むことができる。好ましくは、膜標本は、哺乳類α７ニコチン性受容体またはその機能的変異体を発現する細胞の膜画分である。
【００４４】
ここで使用されるように、「哺乳類α７ニコチン性受容体」は、ニコチン性受容体のα７サブユニットを含む、自然発生的または内在性哺乳類タンパク質、および自然発生的または内在性の対応する哺乳類のα７サブユニットタンパク質（例：組み換えタンパク質、合成タンパク質（すなわち、有機合成化学の方法を使用して生産））と同じアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。したがって、ここで定義するように、用語は成熟受容体タンパク質、多型または対立変異体、および哺乳類のα７サブユニットの他のアイソフォーム（例：選択的スプライシング、または他の細胞過程により生成）、ならびに前述の変性型または未変性型（例：脂質化、グリコシル化、未グリコシル化）を含む。自然発生的または内在性の哺乳類のα７サブユニットタンパク質は、成熟α７ニコチン性受容体、および哺乳類（例：ヒト、非ヒト霊長類）において自然発生する多型または対立変異体と他のアイソフォームなどの野生型タンパク質を含む。かかるタンパク質は、例えば、哺乳類のα７サブユニットを自然に生産する源から回収または単離することができる。
【００４５】
哺乳類α７ニコチン性受容体の「機能的変異体」は、適切な方法（例：突然変異生成（例：科学的突然変異生成、放射線突然変異生成）、遺伝子組み換え技術）を使用して生産することができる、機能フラグメント、機能的変異タンパク質、および／または機能的融合タンパク質を含む。「機能的変異体」は、結合活性、シグナル伝達活性、および／または細胞応答を刺激する能力のような、ここに記載される哺乳類α７ニコチン性受容体タンパク質の少なくとも１つの機能特性を有するタンパク質、またはポリペプチドである。好ましい機能的変異体は、リガンド（すなわち、アセチルコリン、または本発明の抗体などの１つ以上のリガンド）に結合することができる。
【００４６】
一般的に、哺乳類α７ニコチン性受容体のフラグメントは、成熟哺乳類α７ニコチン性受容体に関連したアミノ酸（すなわち、１つ以上のアミノ酸）の欠失（すなわち、１つ以上の欠失）を有するものを含む（Ｎ末端、Ｃ末端、または内部欠失など）。隣接アミノ酸のみが欠失している、または成熟哺乳類α７ニコチン性受容体に関連して非隣接アミノ酸が欠失しているフラグメントもまた、想定される。
【００４７】
突然変異哺乳類α７ニコチン性受容体は、１つ以上の隣接または非隣接アミノ酸残基（例：受容体キメラ）の添加、欠失、および／または置換によって異なる、哺乳類α７ニコチン性受容体の自然または人工変異体を含む。かかる突然変異は、例えば、保存領域（他のケモカイン受容体またはＧタンパク質共役受容体と比較して）、細胞外領域、細胞質領域、膜貫通領域などの、タンパク質上の１つ以上の位置で発生することができる。
【００４８】
融合タンパク質は、自然界で見られるような哺乳類α７サブユニットまたはα７ニコチン性受容体において発生しない、第２部分に共有結合（ペプチド結合）を通して連鎖している、第１部分としての哺乳類α７サブユニットまたはその変異体を含むポリペプチドを包含する。したがって、第２部分は、アミノ酸、オリゴペプチド、またはポリペプチドであることができる。第２部分は、例えば、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部のような適切な位置で、第１部分と連鎖することができる。一実施形態では、融合タンパク質は、第１部分として親和性リガンド（例：酵素、抗原、エピトープ標識、結合ドメイン）、ならびにリンカー配列およびヒトα７サブユニット、またはそのフラグメントを含む第２部分を含む。さらなる部分（例：第３、第４）は、必要に応じて存在することができる。
【００４９】
一実施形態では、哺乳類α７ニコチン性受容体サブユニットの機能的変異体（例：リガンド結合変異体）は、前記哺乳類α７サブユニットと少なくとも約８０％のアミノ酸配列類似性を、好ましくは前記哺乳類α７サブユニット（例：ヒトα７サブユニット（例：配列番号１））と少なくとも約９０％のアミノ酸配列類似性を、およびより好ましくは、少なくとも約９５％のアミノ酸配列類似性を共有する。別の実施形態では、機能的融合タンパク質は、哺乳類α７サブユニットと少なくとも約８５％の配列類似性を、好ましくは少なくとも約９０％の配列類似性を、およびより好ましくは、哺乳類α７サブユニットと少なくとも約９５％の配列類似性を共有する第１部分を含む。別の実施形態では、機能的哺乳類α７サブユニット、または哺乳類α７サブユニットの機能的変異体は、自然発生的ヒトα７サブユニットと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列類似性、好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列類似性、およびより好ましくは、少なくとも約９５％のアミノ酸配列を共有する。
【００５０】
アミノ酸配列類似性は、ＰＡＭ２５０残基重量表、１０のギャップペナルティ、１０のギャップ長さペナルティ、およびデフォルトパラメータ（対方式アラインメントパラメータ：ｋｔｕｐｌｅ＝１、ギャップペナルティ＝３、ウインドウ＝４、および対角＝５）でのクラスタル法を使用した、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥシステム（配列アセンブリおよびアラインメントのソフトウェア；ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州マディソン）などの、適切な配列アラインメントアルゴリズムを使用して、決定することができる。
【００５１】
別の実施形態では、機能的変異体は、自然発生的核酸配列とは異なるが、遺伝子コードの縮退によって哺乳類α７サブユニット、またはそのフラグメントをエンコードする、核酸配列によってエンコードされる。
【００５２】
一実施形態では、哺乳類α７ニコチン性受容体に結合する抗体を検出または識別する方法は、参照薬（例：既知の特異性のリガンド、または別の抗体）の結合を抑制する試験薬（例：抗体）の能力が評価される、競合的結合アッセイである。例えば、ここに記載されるような適切な標識で参照薬を標識付けし、アッセイにおいて存在するα７ニコチン性受容体を飽和させるために必要とされる標識参照薬の量を決定することができる。飽和量の標識参照薬、および様々な量の試験薬は、決定された結合および複合体形成に適した条件の下、哺乳類α７ニコチン性受容体、またはその機能的変異体を含む組成物と接触することができる。
【００５３】
上述のように抗原性ペプチドを含む、参照または試験薬のいずれか、およびα７ニコチン性受容体、またはその機能的変異体もしくはそのフラグメント間の複合体の形成は、適切な方法を使用して直接または間接的に、検出または測定することができる。例えば、薬剤は適切な標識で標識付けすることができ、複合体の形成は標識の検出によって決定することができる。複合体の特異性は、非標識薬剤または標識のみなどの適切な対照を使用して、決定することができる。薬剤および哺乳類α７ニコチン性受容体、またはその機能的変異体間の複合体の検出における使用に適した標識は、例えば、ラジオアイソトープ、エピトープ、親和性標識（例：ビオチン、アビジン）、スピン標識、酵素、蛍光基、または化学発光基を含む。
【００５４】
α７ニコチン性受容体に結合する、抗体などの試験薬の能力を決定するために使用される競合的結合アッセイに関して、かかる能力は、標識参照薬の特異的結合の５０％の抑制（ＩＣ５０値）に必要とされる試験薬の濃度として計上することができる。特異的結合は、好ましくは、非特異的結合を引いた総結合（例：複合体における総標識）として定義される。非特異的結合は、好ましくは、過剰の非標識参照薬の存在下で形成された複合体において、なお検出される標識の量として定義される。方法における使用に適した参照薬は、例えば、α７サブユニットのリガンド、または抗体などの、哺乳類α７サブユニットまたはその機能的変異体に特異的に結合する分子および化合物を含む。好ましい参照薬は、配列番号２、 配列番号 ３、および 配列番号 ４の群から選択されたヒトニコチン性受容体（ 配列番号 １）のα７サブユニットのフラグメントに対して、既知の特異性を有する抗体である。
【００５５】
本発明のＡｂの有効性の検証は、抗体が哺乳類細胞からの炎症前サイトカイン放出を抑制するかどうかを決定することによって、行うことができる。
【００５６】
これらの方法は、好ましくは、炎症前サイトカインカスケードを刺激する薬剤と共に抗体で、哺乳類細胞を処理するステップを含む。好ましい薬剤は、細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）である。化合物は、薬剤前、薬剤と同時、または薬剤後のいずれかに、哺乳類細胞に投与することができる。好ましくは、化合物は薬剤前に投与される。例えば、米国特許第６，６１０，７１３号を参照し、その関連する内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００５７】
これらの方法に対して、細胞は、炎症前サイトカインを生産するよう誘導することができる、いかなる細胞であることができる。好ましい実施形態では、細胞は、例えばマクロファージ、単球、または好中球などの免疫細胞である。最も好ましい実施形態では、細胞はマクロファージである。
【００５８】
抑制に関して測定される炎症前サイトカインは、細胞から放出されるよう誘導することができる、いかなる炎症前サイトカインであることができる。好ましい実施形態では、サイトカインはＴＮＦである。
【００５９】
サイトカイン産出の抑制の評価は、既知のいかなる手段でありうる。それには、 サイトカインの定量（例：ＥＬＩＳＡによる）、あるいは、バイオアッセイ（例：炎症前サイトカイン活性が減少するかどうか決定）、または炎症前サイトカインｍＲＮＡの測定によるものを含む。当業者は、必要以上の実験なしでこれらのアッセイのいずれも活用することができるであろう。また、この点において役立ついくつかのアッセイの例に関して、米国特許第６，６１０，７１３号を参照し、その関連する内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００６０】
これらの方法は、炎症前サイトカインカスケードを刺激する薬剤と共に化合物で、例えばラットなどの動物を処理するところの、生体内で実行することができ、炎症前サイトカインカスケードの誘発への薬剤の効果は、例えば血清ＴＮＦ濃度を測定することにより測定される。しかしながら、丸ごとの動物よりも細胞培養を使用してこれらの種類のアッセイを行うことが、相対的に容易であることから、方法は好ましくは、例えば、マクロファージ培養物を使用して生体外で実行する。
【００６１】
他の実施形態では、本発明は、抗体が炎症を抑制する能力を有するかどうかを決定する方法を目的とする。ある側面では、これらの方法は、抗体がα７ニコチン性受容体の作動薬であるかどうかを決定するステップを含む。好ましくは、方法は、抗体が少なくとも１つの他のニコチン性受容体を活性化する能力に関して試験を行うことによって、抗体がα７に対して選択的であるかどうかを決定するステップをさらに含む。これらの決定は、例えば抗体が、哺乳類細胞、好ましくはマクロファージからの炎症前サイトカインの放出を抑制するかどうかを決定することによって、前述のように行うことができる。
【００６２】
治療法
本発明は、サイトカイン放出のレベルを、α７受容体の活性化によって減少することができるところの、サイトカイン媒介性の炎症状態を治療することを目的とする。好ましい実施形態では、状態は、炎症サイトカインカスケードが、マクロファージからの炎症前サイトカインの放出を通して影響を受けたところの状態である。状態は、炎症サイトカインカスケードが、敗血性ショックを伴うなどの、全身性反応を引き起こすところの状態である可能性がある。あるいは、状態は、関節リウマチにあるような、限局性炎症サイトカインカスケードによって媒介される可能性がある。
【００６３】
本発明を使用して効果的に治療することができる状態の限定されない例は、虫垂炎、消化性、胃、または十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、急性または虚血性結腸炎、憩室炎、咽頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝臓炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む）、腸炎、ウィップル病、喘息、慢性閉塞性肺疾患、腸閉塞（例えば、術後腸閉塞を含む）、アレルギー、アナフィラキシー・ショック、免疫複合体病、臓器虚血、再潅流傷害、器官神経症、枯草熱、敗血症、腐敗症、内毒素性ショック、悪液質、過高熱、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、感染流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、珪性肺塵症、肺胞炎、気管支梢炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、ヘルペス、散在性菌血、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、やけど、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、蕁麻疹、疣、膨疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、静脈血栓症、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、骨膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓、ギランバレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎疹、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、間接リウマチ、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植拒絶反応、移植片対宿主病、１型糖尿病、強直性脊椎炎、バージャー病、２型糖尿病、ライター症候群、またはホジキン病を含む。
【００６４】
一実施形態では、状態は、虫垂炎、消化性、胃および十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、肝臓炎、喘息、アレルギー、アナフィラキシー・ショック、器官神経症、枯草熱、敗血症、腐敗症、内毒素性ショック、悪液質、感染流産、散在性菌血、やけど、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、間接リウマチ、全身性エリテマトーデス、心筋虚血、脳梗塞、脳塞栓、脊髄損傷、麻痺、同種移植拒絶反応、または移植片対宿主病から選択される。
【００６５】
他の実施形態では、状態は、腹膜炎、膵炎、敗血症、内毒素性ショック、成人呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、間接リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸閉塞、アルツハイマー病、やけど、心筋虚血、同種移植拒絶反応、喘息、移植片対宿主病、鬱血性心不全、および嚢胞性線維症から成る群から選択される。
【００６６】
これらの状態は、好ましくは、本明細書で開示される抗体、または本明細書で開示される抗体、およびα７ニコチン性受容体の１つ以上追加作動薬との組み合わせによって治療される。適切な追加作動薬は、例えば、同時係属の米国特許出願第１０／７２９，４２７号において開示される。米国特許出願第１０／７２９，４２７号の関連する内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００６７】
投与方法
α７受容体作動薬の投与経路は、治療される状態による。例えば、敗血性ショックなどの全身性疾患の治療には、静脈注射が好まれるであろうし、胃潰瘍などの胃腸疾患を治療するためには、経口投与が好まれることがある。
【００６８】
方法に応じて、本発明の１つ以上の抗体を単独で、または別の薬と組み合わせて、適切な経路で対象に投与することができる。効果的な量の薬剤（すなわち、α７受容体作動薬抗体、またはその抗原結合性フラグメント）が投与される。「効果的な量」は、例えば炎症反応の抑制、または炎症状態の緩和または治癒に十分な量などの、投与条件下で望ましい治療または予防効果を達成するために十分な量である。薬剤は、単回または反復投与によって投与することができる。投与量は、当技術分野で既知の方法によって決定することができ、例えば、選択された特定の薬剤、対象の年齢、薬への過敏性および耐性、および全般的健康に左右される。抗体の適切な投与量は、一回の治療につき約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重であることができる。
【００６９】
例えば、経口、食事／飼料、局所性、経皮、直腸、非経口（例：静脈、動脈、筋肉、皮下注射、皮内注射）、および吸入（例：気管支内、経鼻、または経口吸入、鼻内点滴）投与経路を含む、様々な投与経路が可能であり、薬剤、および治療される疾患または状態による。投与は記載のとおり、局所または全身であることができる。好ましい投与方法は、選択された特定の薬剤（α７受容体作動薬抗体、またはその抗原結合性フラグメント）、および治療される特定の状態（例：疾患）により異なりうる。静脈、経口または非経口投与が好ましい。
【００７０】
薬剤は、中性化合物として、または薬学的に許容できる塩として投与することができる。アミンまたは他の塩基性基を含む化合物の塩は、例えば、塩化水素、臭化水素、酢酸、過塩素酸などの適切な有機、または無機酸との反応によって得ることができる。第４アンモニウム基の化合物はまた、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、過塩素酸塩などの対アニオンを含む。カルボン酸または他の酸性官能基を含む化合物の塩は、例えば、水酸化基のような適切な塩基との反応によって調製することができる。酸性官能基の塩は、ナトリウム、カリウムなどの対陽イオンを含む。
【００７１】
ここで使用されるように、開示される化合物の「薬学的に許容できる塩」は、対象への投与に適した、酸または塩基のいずれかとの本発明の化合物の反応によるイオン結合含有の生成物である。例えば、アミンまたは他の塩基性基を含む化合物の酸性塩は、化合物を、塩化水素、臭化水素、酢酸、過塩素酸などの適切な有機、または無機酸と反応させることによって得ることができる。かかる塩の他の例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、メタルスルホン酸塩、硝酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩（例：（＋）−酒石酸塩、（−）−酒石酸塩、またはラセミ混合物を含む、それらの混合物）、琥珀酸塩、安息香酸塩、およびグルタミン酸などのアミノ酸を有する塩を含む。塩はまた、化合物が−ＣＯＯＨまたは−ＳＯ３Ｈなどの酸性官能基を有するとき、適切な有機塩基によって形成することができる。本発明の化合物での、薬学的に許容できる塩基添加塩の形成に適した、かかる塩基は、非中毒性で、酸性官能基と反応するのに十分な強い有機塩基を含む。かかる有機塩基は、当技術分野でよく知られており、アルギニンおよびリジンなどのアミノ酸、モノ−、ジ−、およびトリエタノールアミン、コリン、メチルアミン、ジメチルアミン、およびトリメチルアミンなどのモノ−、ジ−、およびトリアルキルアミン、グアニジン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、Ｎ−メチルグルコサミン、Ｎ−メチルピペラジン、モルホリン、エチレンジアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどを含む。
【００７２】
薬剤は、ニコチン性受容体作用の調節のための薬学的組成物の一部として、個人に投与することができ、それは、かかる作用の抑制剤 および薬学的に許容できる担体を含む。
【００７３】
ここで使用されるように、「薬学的組成物」は対象への投与に適した形での、開示される抗体、および薬学的に許容できる希釈剤または担体を含む剤形である。適した薬学的に許容できる担体は、不活固体賦形剤または希釈剤、および滅菌水溶液および有機溶液を含む。剤形は、選択された投与経路に応じて異なる（例：溶液、乳剤、カプセル）。適した薬学的担体は、ニコチン性受容体作用の促進剤（作動薬）または抑制剤（拮抗薬）と相互作用しない不活性成分を含むことができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルベニア州イーストンに記載のものなど、標準的な薬剤処方技術を採用することができる。非経口的投与のための適切な薬学的担体は、例えば、滅菌水、生理食塩水、静菌生理食塩水（約０．９％ｍｇ／ｍｌベンジルアルコールを含む生理食塩水）、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス溶液、乳酸加リンゲル液などを含む。組成物をカプセル化する方法（硬ゼラチンまたはシクロデキストランのコーティングなど）は、当技術分野で既知である（Ｂａｋｅｒら、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ（生理活性物質の制御放出）」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９８６）。吸入に関して、薬剤は可溶化し、投与のために適したディスペンサーに入れることができる（例：アトマイザー、ネブライザー、または加圧式エアゾールディスペンサー）。
【００７４】
薬学的組成物は、大量または単一投与形態であることができる。単一投与形態は、例えば、カプセル、静注袋、タブレット、エアゾール吸入器上の単回使用ポンプ、またはバイアルなどを含む、様々な形態のいずれかであることができる。組成物の単位用量における活性成分の分量（すなわち、開示される化合物、またはその塩の剤形）は効果的な量であり、関連する特定の治療に応じて異なってもよい。患者の年齢および状態によって、投与量に定期的変化を加えることが必要であろうことは、理解されよう。用量は投与経路に依存する。
【００７５】
ここで使用されるように、「対象」は、例えば、ヒト、コンパニオン・アニマル（例：犬、猫、鳥など）、家畜（例：牛、羊、豚、馬、鳥類など）、および実験動物（例：ラット、マウス、モルモットなど）などの哺乳類を含む。開示される方法の好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【００７６】
本発明の実行は、他に指示がない限り、当技術分野の範囲内である細胞培養、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および免疫学の従来の技術を採用する。かかる技術は、文献において十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験室の手引き）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９５）、「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における短い手順）」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（酵素学の方法）（複数巻）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（細胞生物学の方法）（複数巻）、およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学の方法）（複数巻）を参照。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態は、以下の例に記載される。本明細書の請求項の範囲内の他の実施形態は、ここに開示されるように本発明の仕様または実行の考察から、当業者には明らかとなるであろう。例と共に仕様は、例に続く請求項によって示される本発明の範囲および精神内で、例示的なものとしてのみ見なされることを意図とする。
【００７８】
（実施例）
実施例１．ニコチン性受容体α７サブユニットを発現するマクロファージ
実施例の要約
我々は、ニコチン性受容体のα７サブユニットが、マクロファージＴＮＦ放出のアセチルコリンによる抑制に必要とされることを以前報告した（同時係属の米国特許出願第１０／７２９，４２７号を参照）。以下に要約されるように、α−ブンガロトキシンは、初代ヒトマクロファージの表面で発現した分離型受容体クラスターに結合し、したがって、α７特異的抗体でのα−ブンガロトキシン共役ビーズへの付着によって単離したタンパク質の免疫ブロット法が、α−ブンガロトキシン結合受容体サブユニットの識別を、α７サブユニットと確認した。
【００７９】
結果および考察
初代ヒトマクロファージは、アセチルコリン受容体のサブセットに結合するペプチド拮抗薬、ＦＩＴＣ−α−ブンガロトキシンで標識付けされた。α−ブンガロトキシンの強力な結合がマクロファージ表面で認められた（図３Ａ）。ニコチンの前処理が、結合の強度を著しく低減した（図３Ｂ）。神経筋接合部および神経シナプスでは、ニコチン性受容体が、速いシグナル伝送を促進する受容体会合体またはクラスターを形成する。α−ブンガロトキシン結合の分離型クラスターは、マクロファージの表面で、特に細胞体の表面に集中して、高倍率の下ではっきりと認めることができる（図３Ｃ、Ｄ）。
【００８０】
今日まで、α１、α７、およびα９は、ヒト細胞において既知のα−ブンガロトキシン結合ニコチン性受容体サブユニットである（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ，  Ｊ．  Ｍ．、「Ｈａｎｄ  Ｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ａｎｄ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ：  Ｌｉｇａｎｄ−  Ａｎｄ  Ｖｏｌｔａｇｅ−Ｇａｔｅｄ  Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ（受容体とチャンネルの手引き：リガンド依存性および電位依存性イオンチャンネル）」Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ニコチン性アセチルコリン受容体）、Ｒ．  Ａｌａｎ  Ｎｏｒｔｈ編集、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．（１９９５）；Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｓ．およびＢｅｒｔｒａｎｄ，Ｄ．、Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｆｒｏｍ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ（ニコチン性ニューロン受容体：構造から機能へ）．Ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ＆  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｒｅｓ．３：２０３−２２３（２００１））。β１、δ、およびε（成人）またはγ（胎児）のいずれかと共にα１は、筋肉収縮を調整するヘテロ五量体ニコチン性受容体を形成し、α７およびα９はそれぞれ、ホモ五量体ニコチン性受容体を形成する。これらの受容体サブユニットがマクロファージにおいて発現しているかどうか決定するために、我々は、生体外で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から分化した初代ヒトマクロファージからＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。実験の感度および特異性を増加するために、我々は、各サブユニットに特異的な入れ子プライマーを使用して、逆転写後２回のＰＣＲを行った。ＰＣＲ生成物の識別は、順序つけによって確認された。α１、α１０（データは図示せず）、およびα７（図４Ａ）ｍＲＮＡの発現は、無関係の供血者から得られたヒトマクロファージにおいて検出された。同じＲＴ−ＰＣＲ方法は、マクロファージにおけるα９サブユニットｍＲＮＡの発現を検出しなかった（データは図示せず）。
【００８１】
次に、α１およびα７サブユニットのタンパク質発現を、ウエスタンブロット法によって検査した。α７特異的抗体は、分化初代マクロファージ、および分化ＰＢＭＣ（データは図示せず）の両方から、約５５ｋＤの見掛け分子量の明らかなバンドを認めた（Ｐｅｎｇ，Ｘ．ら、Ｈｕｍａｎ  α７  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  α７  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  α７  ｈｏｍｏｍｅｒｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｏｏｃｙｔｅｓ（ヒトα７アセチルコリン受容体：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株からのα７サブユニットのクローニングおよびアフリカツメガエル卵母細胞において発現された自然受容体および機能性を持つα７ホモマーの薬学的特性の決定）．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５：５４６−５５４（１９９４））で報告されたα７タンパク質に対する分子量に相似）。α１タンパク質の発現は、マクロファージへのＰＢＭＣの生体外分化の間、検出不可能なレベルに下方制御された（データは図示せず）。α１へテロ五量体ニコチン性アセチルコリン受容体の必要成分である、δサブユニットは、この入れ子ＲＴ−ＰＣＲ方法では検出することができなった（データは図示せず）。マクロファージにおける正のシグナルが、α−ブンガロトキシンに結合するα７ニコチン性受容体を表したことを確認するために、我々は、ヒトマクロファージまたはＰＣ１２細胞（α７ホモ五量体を発現することが示されている、ラット褐色細胞腫の細胞）のいずれかから調製されたタンパク質をプルダウンするために、α−ブンガロトキシン共役ビーズを使用した。残留タンパク質は、ヒトおよびラットα７タンパク質（ヒトおよびラットα７タンパク質は、同数のアミノ酸、および９４％の同一性を有する）の両方を認めた多クローン性、または単クローン性α７特異性抗体を使用して、ウエスタンブロット法により分析した。結果は、ヒトマクロファージが、ＰＣ１２細胞におけるα７サブユニットと同様の見掛け分子量の、α−ブンガロトキシン結合α７タンパク質を発現することをはっきりと示した（図４Ｂ）。マクロファージα７サブユニットの識別は、ＲＴ−ＰＣＲ法により全長のマクロファージより発現されたα７をクローン化することによって確認した。マクロファージにおける全長ニコチン性アセチルコリンα７サブユニットは、神経細胞において発現したニコチン性アセチルコリンα７サブユニットと同一の、エクソン１から１０を含む（Ｇａｕｌｔ，Ｊ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉａｌ  ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  α７  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  （ＣＨＲＮＡ７）（ヒトα７神経ニコチン性アセチルコリン受容体遺伝子のゲノム機構および部分複製（ＣＨＲＮＡ７））．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５２：１７３−１８５（１９９８））。これらを総合して、これらのデータは、ニコチン性アセチルコリンα７サ��ユニットを、ヒトマクロファージの表面で発現したα−ブンガロトキシン結合受容体であると認める。
【００８２】
実施例２  α７ニコチン性受容体に対するウサギ多クローン性抗体の調製
α７ニコチン性受容体の細胞外ドメインおよび特異的ペプチドに対する多クローン性抗体は、カスタム多クローン性抗体生産（Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｉｎｃ．、ペンシルベニア州デンバー）の１１８日プロトコルに応じて、ウサギにおいて生成した。手短に、ペプチドは無菌食塩水で希釈し、同量の完全フロインドアジュバントと組み合わせた。不完全フロインドアジュバントにおける０．１２５ｍｇの抗原（抗原は、以下に記載するペプチド、およびＧＳＴ  Ｎ末端細胞外ドメインを含む）を、０日目の前採血後、３、６、９、１２、および１５週目に、ウサギに６回皮下注射した。９、１２、および１５週目の注射の１０日後に、耳静脈から血液を採取した。適定量に関して、ウエスタンブロット法によってウサギからの血清を検査した。製造会社の指示に応じて、プロテインＡアガロースを使用してＩｇＧを抗ａ７抗血清から精製した［Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス］。
【００８３】
抗体１９１８および１９２０を生成するために、ペプチドであるＫＥＬＶＫＮＹＮＰＬＥＲＰＶＡＮＤＳＯＰ（配列番号２、配列番号１のアミノ酸３１−５０に対応）を２匹の異なるウサギに注射した。抗体１９２１および１９２２を生成するために、ペプチドであるＷＫＰＤＩＬＬＹＮＳＡＤＥＲＦＤＡＴＦＨ（配列番号３、配列番号１のアミノ酸１０８−１２７に対応）を２匹の異なるウサギに注射した。抗体１９２３および１９２４を生成するために、ペプチドであるＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＹＴＹＴ（配列番号４、配列番号１のアミノ酸２０４−２２３に対応）を２匹の異なるウサギに注射した。アミノ酸１−２２７（α７の細胞外ドメインに対応）は、大腸菌におけるＧＳＴ融合タンパク質として発現した。ＧＳＴ融合タンパク質を精製し、抗体１９７３から１９８２を生成するために、１０匹の異なるウサギに注射した。
【００８４】
結果は図５に示され、それは、配列番号１の様々なフラグメントに対して産出された多くのウサギ多クローン性抗体の結合特異性を示す、ウエスタンブロットの写真を示す。抗体１９７３−１９８１は、位置２３から２５０に及ぶ配列番号１の様々なフラグメントに対して産出された。抗体１９１８は、配列番号２のペプチドに対して産出され、抗体１９２１は、配列番号３のペプチドに対して産出された。
【００８５】
実施例３  細胞株におけるニコチン性受容体のα７サブユニットの発現
細胞株および初代ヒトマクロファージにおけるα７サブユニットの発現を、抗体１９１８を使用して、ウエスタンブロットによって、スクリーニング検査した。
【００８６】
マウスマイクロファージ様ＲＡＷ  ２６４．７、ジャーカット細胞、ヒーラ細胞、Ｕ９３７細胞、およびＰＣ１２細胞が、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、メリーランド州ロックビル）から得られた。５％のＣＯ２および９５％の大気の加湿インキュベーター内の１０％加熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１ｘペニシリン、およびストレプトマイシンが追加された、ＲＰＭＩ  １６４０またはＤＭＥＭ培地で、細胞を培養した。初代ヒトマクロファージを、３人の供血者の血液から単離した。
【００８７】
冷溶菌バッファー（１％のＢｒｉｊ  ９７、５０ｍＭのトリス、ρＨ７．５、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、それぞれ１ｍｇ／ｍｌのロイペプチンおよびペプスタチン、１ｍＭのＰＭＳＦ、および１０ｍＭのフッ化ナトリウム）で細胞を培養することによって、細胞溶解物を調製した。各細胞溶解物（２ｘ１０５細胞相当）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、抗体１９１８で免疫ブロットした。製造会社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、イリノイ州アーリントンハイツ）の指示に従って、ＥＣＬキットを使用してシグナルを検出した。
【００８８】
この実験の結果を図６に示す。
【００８９】
実施例４  配列番号２を含むニコチン性受容体のα７サブユニットのフラグメントに対して産出された抗体は、ＬＰＳによって刺激されたマクロファージにおけるＴＮＦαおよびＩＬ−８生産を抑制する
ヒトマクロファージ培養物を次のように調製した。健常な供血者の血液から軟膜を採取した。Ｆｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州）での密度勾配遠心分離法によって、初代血中単核細胞を単離、１０％加熱不活性化ヒト血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州カラバサス）を追加したＰＲＭＩ  １６４０培地で懸濁（８ｘ１０６細胞／ｍｌ）、およびフラスコ（ＰＲＩＭＡＲＩＡ；Ｂｅｃｋｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）で播種した。３７℃で２時間培養した後、付着細胞を広範囲にわたり洗浄、１０ｍＭのＥＤＴＡで簡単に処理、分離、ＰＲＭＩ培地（１０％ヒト血清）において再懸濁（１０６細胞／ｍｌ）し、ヒトマクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス；２ｎｇ／ｍｌ）を追加、および２４ウェルの組織培養皿（ＰＲＩＭＡＲＩＡ；Ｆａｌｃｏｎ）（１０６細胞／ウェル）で播種した。細胞を、ｍＣＳＦの存在下で７日間分化させた。７日目に、１ｘダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ロックビル）で、細胞を３回洗浄し、ｍＣＳＦを持たない新鮮培地を追加し、示されるように実験を行った。
【００９０】
マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）の存在下で、ヒト末梢血単核細胞を培養することによって、初代ヒトマクロファージ培養物を確立した。ＬＰＳへの４時間の暴露によって調整されたマクロファージ培養物における、ＴＮＦαおよびＩＬ−８レベルへの本発明の抗体の影響を決定するために、これらの細胞を実験に使用した。
【００９１】
これらの実験では、抗体１９１８（配列番号２のペプチドに対して産出）、１９２１（配列番号３のペプチドに対して産出）、および抗体１９２４、１９７３、１９７４、および１９７６（配列番号１の様々なフラグメントに対して産出）、ならびに対照（無関係なＩｇＧ抗体）を、示されるように４０μｇ／ｍｌまたは５μｇ／ｍｌのいずれかの濃度で、３０分間ヒトマクロファージ培養物に添加した（図７Ａ−Ｄ）。ＬＰＳを３０分後に添加し（５ｎｇ／ｍｌ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）による次の分析のために、２．５時間の刺激後、調整済みの上清を採取した。すべての実験条件を３回実行した。９つの個々のマクロファージ調製からのデータを、平均＋／‐標準誤差；ｎ＝９として示す。
【００９２】
図７Ａ−Ｄからわかるように、すべての試験済み抗体は、無関係な抗体の対照と比較したとき、４０μｇ／ｍｌで抑制活性（すなわち、アセチルコリン受容体に対する作動薬活性）活動を示した。５μｇ／ｍｌでさえ、抗体１９１８、１９２１および１９２４は、対照と比較して、ＴＮＦαおよびＩＬ−８放出の著しい抑制を示した。
【００９３】
実施例５  配列番号２を含むニコチン性受容体のα７サブユニットのフラグメントに対して産出された抗体は、ＬＰＳ刺激性ＲＡＷ細胞からのＴＮＦ放出を抑制する
マウスＲＡＷ  ２６４．７マクロファージ様細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国メリーランド州ロックビル）を、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを追加したＤＭＥＭ下で成長させた。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  １培地における２４ウェルの組織培養皿で細胞を播種、および９０％コンフルエンスで使用した。示されるように、ＬＰＳ（５ｎｇ／ｍｌ）で細胞を２．５時間処理した。示されるように、４０μｇ／ｍｌの抗体１９１８（配列番号２のペプチドに対して産出）で、細胞を３０分間前処理した。上清を採取し、マウスＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス）を使用して、ＴＮＦ濃度を測定した。
【００９４】
結果は図８に示され、それは、抗体１９１８がＲＡＷ細胞におけるＴＮＦα生産を抑制したことを、はっきりと示す。
【００９５】
実施例６  配列番号２を含むニコチン性受容体のα７サブユニットのフラグメントに対して産出された抗体は、用量依存性の形で、ＬＰＳ刺激性マクロファージからのＴＮＦαおよびＨＭＧＢ−１放出を抑制する
マクロファージを、上記の例４に記載したように成長させた。
【００９６】
ＴＮＦα放出への、抗体１９１８（配列番号２のペプチドに対して産出）の抑制効果が決定された実験では、０、２．５、５、１０、２０、４０、８０、および１６０μｇ／ｍｌで、抗体が添加された。ＨＭＧＢ−１放出への抗体１９１８の抑制効果が決定された実験では、０、１０、５０、および１００μｇ／ｍｌで、抗体が添加された。
【００９７】
抗体１９１８の添加の３０分後に、５．０ｎｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳで、培養物を処理した。培地を１８時間後に採取した。培地をＣｅｎｔｒｉｃｏｎＴＭ１０フィルターで濃縮した。ヒトＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス）を使用して、ＴＮＦαレベルを分析した。米国特許第６，３０３，３２１号（その関連する内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載のように、抗ＨＭＧＢ−１多クローン性抗血清を使用して、ウエスタンブロットによってＨＭＧＢ−１レベルを分析した。ＴＮＦα抑制の結果を、ＬＰＳ処理のみの刺激に対する百分率として図９Ａに示す。ＨＭＧＢ−１抑制の結果を、バンド強度の漸減として図９Ｂに示す。
【００９８】
図９Ａおよび９Ｂは、抗体１９１８が、用量依存性の形でＴＮＦαおよびＨＭＧＢ−１放出を抑制したことを、はっきりと示す。
【００９９】
実施例７  配列番号２のペプチドに対して産出された作動薬抗体は、ＣＬＰに起因するマウスの致死性を防ぐ
ＦｉｎｋおよびＨｅａｒｄ，Ｊ．、Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．４９：１８６−１９６（１９９０）、Ｗｉｃｈｍａｎら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２６：２０７８−２０８６（１９９８）、およびＲｅｍｉｃｋら、Ｓｈｏｃｋ  ４：８９−９５（１９９５）に記載されるように、盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）を実行した。一時的に、７５ｍｇ／ｋｇのケタミン（Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ、アイオワ州フォートドッジ）、および２０ｍｇ／ｋｇのキシラジュン（Ｂｏｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、ミズーリ州セントジョセフ）を用い、筋肉注射でＢａｌｂ／ｃマウスを麻酔した。正中切開を行い、盲腸を分離した。回盲弁から離れた盲腸の先端から５．０ｍｍのレベルで、６−０プロレン縫合結紮を置いた。
【０１００】
次に、排泄物の直接押し出しなしで、２２ゲージ針で一度結紮した盲腸断端を刺した。次に、盲腸をその正常な腹内の位置に戻した。次に腹部を、６−０プロレンの連続縫合で、液体の漏れを防ぐために腹膜および筋膜と別々に二層に閉じた。すべての動物を、２０ｍｌ／ｋｇ体重で皮下注射した生理食塩水で蘇生した。手術の３０分後、各マウスにイミペネム（０．５ｍｇ／マウス）（プリマキシン、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、ペンシルベニア州ウエストポイント）の皮下注射を施した。次に、動物を回復させた。
【０１０１】
１８０ｍｇ／マウスの抗体１９１８（配列番号２のペプチドに対して産出）を１日２回、または１８０ｍｇ／マウスの対照ＩｇＧ抗体を１日２回のいずれかで、マウスを処理した。作動薬および対照抗体を、示された日数の間１日２回、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ（ｉ．ｐ．））投与した。死亡率を、１４日間毎日術後に観察した。結果は図１０に示され、それは、作動薬１９１８抗体、または無関係な対照のいずれかによる処理後の生存動物の割合(％)を示す。図１０に示すように、ＣＬＰ後７日目に、ＩｇＧ対照抗体で処理されたマウスの約１０％が生存した一方で、抗体１９１８で処理されたマウスの５０％が生存した。これらの結果は、α７サブユニットの特異的領域に対して産出された作動薬抗体が、敗血症マウスＣＬＰモデルにおける生存を著しく改善したことを示す。
【０１０２】
実施例８  抗体１９１８は、ＲＡＷ  ２６４．７細胞におけるエンドトキシン誘発ＴＮＦ放出を抑制する
ＲＡＷ細胞を、ＩｇＧまたはＡｂ１９１８（２０ｍｇ／ｍｌ）の存在下で、ＬＰＳに暴露した。１．５時間後に、抗ＴＮＦ抗体での免疫染色によって、細胞中におけるＴＮＦを分析した。結果を図１１Ａに示す。蛍光の減少からわかるように（右下のパネル）、Ａｂ１９１８での処理は、ＬＰＳ処理によって誘発されたＴＮＦのレベルを著しく低減した。
【０１０３】
図１１Ｂは、Ａｂ１９１８によるＴＮＦ放出の用量依存的な抑制を示す。初代ヒトマクロファージを、ＩｇＧまたはＡｂ１９１８（１−１８０ｍｇ／ｍｌ）の存在下でＬＰＳに暴露し、２時間後、培地内のＴＮＦをＥＬＩＳＡによって分析した。
【０１０４】
実施例９  抗体１９１８は、ＲＡＷ  ２６４．７からのＬＰＳ誘発ＨＭＧＢ１放出を抑制する
ＲＡＷ細胞を、Ａｂ１９１８（５−１００ｍｇ／ｍｌ）の存在下、あるいは、その存在なしでＬＰＳに暴露した。２４時間後、ウエスタンブロットによって、分泌されたＨＭＧＢ１を培地から決定した。結果は、Ａｂ１９１８によるＨＭＧＢ１生産の用量依存的な抑制を示す図１２Ａ、およびＡｂ１９１８での処理後のＲＡＷ  ２６４．７細胞による、ＬＰＳ誘発ＨＭＧＢ１生産の著しい低減を示す図１２Ｂに示される。
【０１０５】
実施例９  アセチルコリン受容体のα７サブユニットに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、初代マクロファージからのＴＮＦ放出へのＡｂ１９１８の効果を抑制する
Ａｂ１９１８が、アセチルコリン（Ａｃｈ）受容体のα７サブユニットとの結合によって、ＴＮＦ放出を抑制することを示すために、アンチセンスオリゴヌクレオチドで前処理されたＬＰＳ刺激性初代ヒトマクロファージからの、Ａｃｈ受容体の異なるα７サブユニットへのＴＮＦ放出を測定した。Ａｂ１９１８を使用したウエスタンブロットによって、α７サブユニットを検出し、培地内のＴＮＦをＥＬＩＳＡによって分析した。結果は図１３に示され、それは、α７サブユニット合成がアンチセンスオリゴヌクレオチドによって抑制されたとき、Ａｂ１９１８での処理がＴＮＦ生産を低減しなかったことを示し、それは、無抗体または無関係な抗体の処理のそれに相当するレベルのままであった。
【０１０６】
実施例１０  抗体１９１８は、内毒素血症マウスにおける全身性ＴＮＦを抑制する
ＬＰＳ（７．０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）投与の１２時間前に、マウス（１群につきｎ＝１１）を、ＩｇＧ（対照）またはＡｂ１９１８（７．２ｍｇ／ｋｇ）で腹腔内処理（ｉ．ｐ．）した。１．５時間に得られた血液中において、ＥＬＩＳＡによって血清ＴＮＦレベルを分析した（＊Ｐ＜０．０５対対照）。結果は図１４（Ａ）に示され、それは、Ａｂ１９１８の投与後の血清ＴＮＦレベルの低減を示す。
【０１０７】
ＬＰＳ投与の１．５時間後に、抗ＴＮＦ抗体での免疫染色によって、脾臓中のＴＮＦレベルを分析した。結果は図１４（Ｂ）に示され、それは、Ａｂ１９１８で処理されたマウスの脾臓における、ＬＰＳ誘発ＴＮＦレベルの著しい低減を示す。
【０１０８】
実施例１１  Ａｂ１９１８は、全身性ＨＭＧＢ１レベルを抑制し、盲腸結紮穿刺誘発性の重度敗血症のマウスの生存を改善する
盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）後２日間、マウスをＩｇＧ（対照）またはＡｂ１９１８（１群につきｎ＝７）で、１日２回（７．２ｍｇ／ｋｇ）ｉ．ｐ．処理した。血清ＨＭＧＢ１を、ウエスタンブロットによって分析した（＊Ｐ＜０．０５対対照）。結果は図１５Ａに示され、それは、Ａｂ１９１８の処理後の、血清ＨＭＧＢ１レベルの著しい低減を示す。
【０１０９】
生存実験では、手術の２４時間後から始まり、３日間、マウス（ｎ＝２４）をＩｇＧまたはＡｂ１９１８（７．２ｍｇ／ｋｇ）で処理した（＊Ｐ＜０．０００８対対照）。結果は図１５Ｂに示され、それは、無関係なＩｇＧでの偽処理を受けたマウスと比較して、Ａｂ１９１８で処理されたマウスの生存率が著しく改善されたことを示す。
【０１１０】
本発明が、その好ましい実施形態を参照して特に示され、記載されてきたが、添付の請求項によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更がその中で行われてもよいことは、当業者によって理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１は、受入番号Ｐ３６５４４でＧｅｎＢａｎｋに蓄積されているニコチン性アセチルコリン受容体のヒトα７サブユニットのアミノ酸配列（配列番号１）を図解する。
【図２】図２は、α７サブユニットに対する抗体を生産するために、免疫原として使用されたペプチド（配列番号２、配列番号３、および配列番号４）を図解する。
【図３】図３は、α−ブンガロトキシン結合ニコチン性受容体が、マクロファージの表面でクラスター化することを明らかにする蛍光顕微鏡写真である。初代ヒトマクロファージを、ＦＩＴＣ標識α−ブンガロトキシン（α−ｂｇｔ、１．５μｇ／ｍｌ）で染色し、蛍光共焦点顕微鏡で観察した。パネルＡおよびＢは、低倍率の顕微鏡写真を示す。パネルＡ：細胞はα−ブンガロトキシンのみで染色された。パネルＢ：５００μＭのニコチンが、α−ブンガロトキシンの添加の前に添加された。パネルＣおよびＤは、受容体クラスターを明らかにするために、高倍率の顕微鏡写真を示す。パネルＣ：焦点面は、中央（３つの下部の細胞）に近い、または細胞の表面（上部の細胞）に近い内層上であった。パネルＤ：焦点面は、細胞の上面であった。
【図４】図４は、初代ヒトマクロファージにおけるα７およびα１ニコチン性受容体のｍＲＮＡおよびタンパク質発現を示すゲルの写真、およびウエスタンブロットを示す。パネルＡは、８４３ｂｐ  α７バンドを生成した、α７特異的プライマーでのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。ＰＣＲ生成物は、配列することにより確認された（データは図示せず）。ＭＡＣ１およびＭＡＣ２：２つの血縁関係を持たないドナーから得られたマクロファージ。パネルＢは、ウエスタンブロットを示す。ＰＣ１２細胞またはヒトマクロファージ（ＭＡＣ）からの細胞溶解物を、対照のセファロースビーズまたはα−ブンガロトキシンに抱合されたセファロースビーズのいずれかで培養した。次に、図のように、α７特異的多クローン性または単クローン性抗体により、結合タンパクを分析した。
【図５】図５は、ＳＥＱ  配列番号１の様々なフラグメントに対して産出された多くのウサギ多クローン性抗体の結合特異性を示すウエスタンブロットの写真である。抗体１９７３−１９８１は、配列番号１の様々なフラグメントに対して産出され、位置２３から２５０に及ぶ。抗体１９１８は配列番号２のペプチドに対して産出され、抗体１９２１は配列番号３のペプチドに対して産出された。
【図６】図６は、示されている細胞株におけるα７サブユニットの発現を示すウエスタンブロットの写真である。使用された一次抗体は、配列番号２の配列を有するペプチドに対して産出された抗体１９１８であった。
【図７Ａ】図７Ａは、異なる濃度での本発明の選択された抗体の活性を示す棒グラフである。活性は、ＬＰＳ刺激初代ヒトマクロファージからのサイトカイン放出の抑制百分率として表される。図７Ａ：抗体の４０μｇ／ｍｌでのＴＮＦ放出の抑制。
【図７Ｂ】図７Ｂは、異なる濃度での本発明の選択された抗体の活性を示す棒グラフである。活性は、ＬＰＳ刺激初代ヒトマクロファージからのサイトカイン放出の抑制百分率として表される。図７Ｂ：抗体の４０μｇ／ｍｌでのＩＬ−８放出の抑制。
【図７Ｃ】図７Ｃは、異なる濃度での本発明の選択された抗体の活性を示す棒グラフである。活性は、ＬＰＳ刺激初代ヒトマクロファージからのサイトカイン放出の抑制百分率として表される。図７Ｃ：抗体の５μｇ／ｍｌでのＴＮＦ放出の抑制。
【図７Ｄ】図７Ｄは、異なる濃度での本発明の選択された抗体の活性を示す棒グラフである。活性は、ＬＰＳ刺激初代ヒトマクロファージからのサイトカイン放出の抑制百分率として表される。図７Ｄ：抗体の５μｇ／ｍｌでのＩＬ−８放出の抑制。
【図８】図８は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に包含されるニコチン性受容体（配列番号１）のヒトα７サブユニットのフラグメントに対して産出された１９１８の抗体のα７作動薬活性を示す棒グラフである。活性は、ＬＰＳ刺激ＲＡＷ細胞からのＴＮＦ放出の抑制百分率として表される。
【図９】図９ＡおよびＢは、配列番号２によって包含されるニコチン性受容体（配列番号１）のヒトα７サブユニットのフラグメントに対して産出された、α７抗体１９１８によるマクロファージからのＴＮＦα（図９Ａ）およびＨＭＧＢ−１（図９Ｂ）放出の抑制の用量依存性を図解する。図９Ａは、抗体濃度の関数として、ＴＮＦα放出の抑制百分率のグラフである。図９Ｂは、ＨＭＧＢ−１に対応するバンドの強度の用量依存性減少を示すウエスタンブロットの写真である。
【図１０】図１０は、盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）手順を受けたマウスの生存百分率を、ＣＬＰ後の日数の関数として示したグラフである。マウスの２つの群が示される：（配列番号２のペプチドに対して産出された）抗体１９１８で処理された群、および無関係のＩｇＧ（対照）で処理された群。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＬＰＳによるＴＮＦ誘発後の、Ａｂ１９１８または無関係のＩｇＧ細胞のいずれかで処理されたＲＡＷ２６４．７細胞におけるＴＮＦ生産の免疫染色顕微鏡写真を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＬＰＳで処理されたＲＡＷ２６４．７細胞における、Ａｂ１９１８によるＴＮＦ生産の用量依存性抑制を図解するグラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＬＰＳで処理されたＲＡＷ２６４．７細胞における、Ａｂ１９１８によるＨＭＧＢ１の用量依存性抑制を図解するグラフである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＬＰＳによるＨＭＧＢ１誘発後の、Ａｂ１９１８または無関係のＩｇＧ細胞のいずれかで処理されたＲＡＷ２６４．７細胞におけるＨＭＧＢ１生産の免疫染色顕微鏡写真を示す。
【図１３】図１３は、アセチルコリン受容体の異なるサブユニットに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理後の、初代ヒトマクロファージにおけるＬＰＳ誘発ＴＮＦ生産（対照のパーセントとして）を表す棒グラフである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、Ａｂ１９１８での処理後の、マウスにおけるＬＰＳ誘発ＴＮＦ血清濃度を表す棒グラフである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＬＰＳによるＴＮＦ誘発後の、Ａｂ１９１８または無関係のＩｇＧ細胞のいずれかで処理されたマウスから採取された、脾臓組織切片の免疫染色顕微鏡写真を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、Ａｂ１９１８での処理後の、盲腸結紮穿刺を受けたマウスにおける、ＬＰＳ誘発ＨＭＧＢ−１血清濃度を表す棒グラフである。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、Ａｂ１９１８または無関係のＩｇＧのいずれかでの処理後の、盲腸結紮穿刺を受けたマウスの生存率を比較するグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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