(57)【要約】  本発明は、インターロイキン３２（ＩＬ−３２）のモジュレーターをスクリーニングする方法、ＩＬ−３２のモジュレーター、およびそれらの使用に関する。プロテアーゼ３は、ＩＬ−３２を切断することができるＩＬ−３２結合タンパク質として同定された。ＩＬ−３２を処理するＰＲ３活性の阻害、または不活性なＰＲ３もしくはその断片によるＩＬ−３２の中和は、免疫調節疾患（たとえば炎症性疾患）におけるＩＬ−３２の影響を減少させ得る。
2009500639.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン３２（ＩＬ−３２）のプロテアーゼ３（ＰＲ−３）への結合に基づいた、ＩＬ−３２活性のモジュレーターのスクリーニング方法であって、候補モジュレーターの存在下におけるＩＬ−３２のＰＲ−３２への結合を測定すること、前記結合のレベルを、前記候補モジュレーターの非存在下におけるＩＬ−３２のＰＲ−３への結合のレベルと比較すること、および前記結合を阻害または増強することが可能なモジュレーターを選択することを含む方法。
【請求項２】
ＩＬ−３２のＰＲ−３への前記結合を、表面プラズモン共鳴によって測定する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記モジュレーターが、ＩＬ−３２のＰＲ−３への結合を阻害する請求項１および２記載の方法。
【請求項４】
モジュレーターが、ＩＬ−３２活性の阻害剤である請求項３記載の方法。
【請求項５】
モジュレーターが、ＩＬ−３２の炎症活性の阻害剤である請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記モジュレーターが、ＩＬ−３２のＰＲ−３への結合を増強する請求項１または２記載の方法。
【請求項７】
モジュレーターが、ＩＬ−３２活性の増強剤である請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項４または５記載のスクリーニング方法によって選択されるＩＬ−３２活性の阻害剤。
【請求項９】
請求項７記載のスクリーニング方法によって選択されるＩＬ−３２活性の増強剤。
【請求項１０】
インターロイキン３２（ＩＬ−３２）におけるプロテアーゼ３（ＰＲ−３）のタンパク質分解活性に基づくＩＬ−３２活性の阻害剤のスクリーニング方法であって、候補阻害剤の存在下におけるＰＲ−３によるＩＬ−３２のタンパク質分解を測定すること、およびＰＲ−３のタンパク質分解活性によって産出されるＩＬ−３２断片の発生または完全ＩＬ−３２の消失を阻害することが可能な阻害剤を選択することを含む方法。
【請求項１１】
前記阻害剤が、ＩＬ−３２の炎症活性を阻害する請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記ＩＬ−３２断片が、約１６ｋＤａのものである請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
前記ＩＬ−３２断片が、約１３ｋＤａのものである請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法によって選択されるＩＬ−３２活性の阻害剤。
【請求項１５】
インターロイキン３２（ＩＬ−３２）応答細胞におけるプロテアーゼ３（ＰＲ−３）によるＩＬ−３２仲介サイトカイン分泌の増強に基づくＩＬ−３２活性の阻害剤のスクリーニング方法であって、候補阻害剤の存在下におけるＩＬ−３２およびＰＲ−３を、ＩＬ−３２応答性細胞と接触させること、前記細胞の培養培地中のサイトカインの濃度を測定すること、前記候補阻害剤の非存在下における前記細胞の培養培地中の前記サイトカインの濃度と比較すること、および前記サイトカイン分泌を阻害することが可能な阻害剤を選択することを含む方法。
【請求項１６】
前記阻害剤が、ＩＬ−３２の炎症活性を阻害する請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ＩＬ−３２応答性細胞が、Ｔ細胞またはマクロファージ細胞である請求項１５または１６記載の方法。
【請求項１８】
サイトカインが、ＴＮＦ、ＩＬ−８およびＭＩＰ−２からなる群より選択される請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれか１項に記載のスクリーニング方法によって選択されるＩＬ−３２活性の阻害剤。
【請求項２０】
インターロイキン３２（ＩＬ−３２）の活性、またはその断片の活性のモジュレーターのスクリーニング方法であって、候補モジュレーターの存在下で、ＩＬ−３２にて、またはその断片にて、ＩＬ−３２応答性細胞を刺激すること、前記細胞の培養培地中に分泌されたサイトカインの濃度を測定すること、前記候補モジュレーターの非存在下における前記細胞の培養培地中に分泌された前記サイトカインの濃度と比較すること、および前記細胞からの前記サイトカインの分泌を阻害または増強することが可能なモジュレーターを選択することを含む方法。
【請求項２１】
ＩＬ−３２断片が、ＰＲ−３のタンパク質分解活性によって産出される約１６ｋＤａの断片である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ＩＬ−３２断片が、ＰＲ−３のタンパク質分解活性によって産出される約１３ｋＤａの断片である請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
ＩＬ−３２応答性細胞が、Ｔ細胞またはマクロファージ細胞である請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記候補モジュレーターが、請求項８、９、１４および１９の阻害剤および増強剤からなる群より選択される請求項２０〜２３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】
モジュレーターが、ＩＬ−３２の炎症活性の阻害剤である請求項２０〜２４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２６】
請求項２０〜２５のいずれか１項に記載のスクリーニング方法によって選択されるＩＬ−３２活性のモジュレーター。
【請求項２７】
請求項２５記載のスクリーニング方法によって選択されるＩＬ−３２炎症活性の阻害剤。
【請求項２８】
ＩＬ−３２またはその断片の、その発現細胞からの産生および／または分泌の増加によって、ヒトを含む哺乳動物内で引き起こされる、または悪化する疾患の治療のための医薬品の製造における、プロテアーゼ３（ＰＲ−３）の阻害剤の使用。
【請求項２９】
疾患が、ＩＬ−３２の断片の産生および／または分泌によって引き起こされる、または悪化する請求項２８記載の使用。
【請求項３０】
ＩＬ−３２断片が、約１６ｋＤａのものであり、かつＰＲ−３のタンパク質分解活性によって産出される請求項２８または２９記載の使用。
【請求項３１】
ＩＬ−３２断片が、約１３ｋＤａのものであり、かつＰＲ−３のタンパク質分解活性によって産出される請求項２８または２９記載の使用。
【請求項３２】
ＩＬ−３２またはその断片を発現する細胞が上皮細胞である請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３３】
阻害剤が、イソクマリン、ジクロロイソクマリン、スラミン、ヘキサスルホン化ナフチルウレア、１，２，５−チアジゾリジン−３−オン１，１−ジオキシド骨格およびそれらのスルホン誘導体に基づくペプチドミメティック薬剤、プロテアーゼ阻害剤、エラフィン、抗ロイコプロテアーゼエグリンＣ、ＭＮＥＩ（単球／好中球エラスターゼ阻害剤）、生物工学処理セルピンＬＥＸ０３２、および中和抗−ＰＲ−３抗体からなる群より選択される請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３４】
ＩＬ−３２またはその断片の、その発現細胞からの制御されていない産生および／または分泌によってヒトを含む哺乳動物内で引き起こされる、または悪化する疾患の治療のための医薬品の製造における、請求項８、９、１４、１９、２６および２７のいずれか１項に記載のＩＬ−３２の増強剤または阻害剤の使用。
【請求項３５】
疾患が、ＩＬ−３２の断片の制御されていない産生および／または分泌によって引き起こされる、または悪化する請求項３４記載の使用。
【請求項３６】
ＩＬ−３２断片が、約１６ｋＤａのものであり、かつＰＲ−３のタンパク質分解活性によって産出される請求項３４または３５記載の使用。
【請求項３７】
ＩＬ−３２断片が、約１３ｋＤａのものであり、かつＰＲ−３のタンパク質分解活性によって産出される請求項３４または３５記載の使用。
【請求項３８】
モジュレーターが、請求項８、１４、１９および２７から選択される阻害剤である請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３９】
ＩＬ−３２またはその断片の、その発現細胞からの産生または分泌が上方調節される請求項３８記載の使用。
【請求項４０】
ＩＬ−３２またはその断片を発現する細胞が上皮細胞である請求項３９記載の使用。
【請求項４１】
疾患が炎症性疾患である請求項４０記載の使用。
【請求項４２】
ＩＬ−３２またはその断片の、その発現細胞からの上方調節された産生および／または分泌によって、ヒトを含む哺乳動物内で引き起こされる、または悪化する疾患の治療方法であって、必要としているそのような動物に、有効量のプロテアーゼ３（ＰＲ−３）阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項４３】
疾患がＩＬ−３２の断片の制御されていない産生および／または分泌によって引き起こされるまたは悪化する請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
ＩＬ−３２断片が、約１６ｋＤａのものであり、かつＰＲ−３のタンパク質分解活性によって産出される請求項４２または４３記載の方法。
【請求項４５】
ＩＬ−３２断片が、約１３ｋＤａのものであり、かつＰＲ−３のタンパク質分解活性によって産出される請求項４２または４３記載の方法。
【請求項４６】
ＩＬ−３２またはその断片を発現する細胞が上皮細胞である請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
ＰＲ−３阻害剤が、イソクマリン、ジクロロイソクマリン、スラミン、ヘキサスルホン化ナフチルウレア、１，２，５−チアジゾリジン−３−オン１，１−ジオキシド骨格およびそれらのスルホン誘導体に基づくペプチドミメティック薬剤、プロテアーゼ阻害剤、エラフィン、抗ロイコプロテアーゼエグリンＣ、ＭＮＥＩ（単球／好中球エラスターゼ阻害剤）、生物工学処理セルピンＬＥＸ０３２、および中和抗−ＰＲ−３抗体からなる群より選択される請求項４２〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
ＩＬ−３２またはその断片の、その発現細胞からの制御されていない産生および／または分泌によって、ヒトを含む哺乳動物内で引き起こされる、または悪化する疾患の治療方法であって、必要としているそのような動物に、有効量の請求項８、９、１４、１９および２６のいずれか１項に記載のモジュレーターを投与することを含む方法。
【請求項４９】
疾患が、ＩＬ−３２の断片の上方調節された産生および／または分泌によって引き起こされるまたは悪化する請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
ＩＬ−３２を発現する細胞が上皮細胞である請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
ＩＬ−３２断片が、約１６ｋＤａのものであり、かつＰＲ−３のタンパク質分解活性によって産出される請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
ＩＬ−３２断片が、約１３ｋＤａのものであり、かつＰＲ−３のタンパク質分解活性によって産出される請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
プロテアーゼ３（ＰＲ−３）によるＩＬ−３２のタンパク質分解によって得られるＩＬ−３２のポリペプチド断片。
【請求項５４】
ＩＬ−３２断片が、プロテアーゼ３（ＰＲ−３）によるＩＬ−３２のタンパク質分解によって得られる約１６ｋＤａ、そのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分からなる請求項５３記載のポリペプチド断片。
【請求項５５】
ＩＬ−３２断片が、プロテアーゼ３（ＰＲ−３）によるＩＬ−３２のタンパク質分解によって得られる約１３ｋＤａ、そのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分からなる請求項５３記載のポリペプチド断片。
【請求項５６】
請求項５３〜５５のいずれか１項に記載のポリペプチド断片および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項５７】
配列番号１のＩＬ−３２のポリペプチド断片、そのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分。
【請求項５８】
配列番号２のＩＬ−３２のポリペプチド断片、そのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分。
【請求項５９】
配列番号１のＩＬ−３２のポリペプチド断片、そのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分、および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項６０】
配列番号２のＩＬ−３２のポリペプチド断片、そのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分、および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項６１】
ＩＬ−３２を結合可能であるが、ＩＬ−３２を切断可能ではないＰＲ−３の断片を含む、ＩＬ−３２活性のモジュレーター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン３２（ＩＬ−３２）のモジュレーターをスクリーニングする方法、ＩＬ−３２のモジュレーター、およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−３２（ＩＬ−３２）は最初に、ナチュラルキラー細胞転写物４（ＮＫ４）と名付けられた、サイトカイン様分子として、Dahlらによって１９９２年に同定された。１９９２年におけるその最初の同定以来、ＮＫ４は広く研究されてはおらず、用語ＮＫ４（またはＮＫ−４）は、他の関連しないタンパク質に対しても指定された［Kim,1989; Smart, 1989; Date, 1997］。
【０００３】
悪性メラノーマに対する高用量ＩＬ−２治療を受けている患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において、ＮＫ４の遺伝子発現の増加が報告されたが、その機能は決定されてこなかった［Panelli, 2002］。
【０００４】
組換えＮＫ４でのＲａｗ２６４．７マクロファージ細胞の刺激によって、それらの細胞中で大量のＴＮＦ−αの分泌が誘導されたことが、Kimら(2005)によって最近報告された。したがって、ＮＫ４は、前炎症性サイトカインとして認識され、ＩＬ−３２と新たに命名された［Kim, 2005］。
【０００５】
ＩＬ−３２をコードしている遺伝子は、ヒト染色体１６ｐ１３．３に存在する。ＩＬ−３２遺伝子は、８つのエキソンを含む。ＩＬ−３２α、ＩＬ−３２β、Ｌ−３２δおよびＩＬ−３２γアイソフォームをコードする、４つのＩＬ−３２ｍＲＮＡスプライス変異体が、ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞にて検出され、ＩＬ−３２γアイソフォームが、ＮＫ４転写物として先に報告された転写物と同一であることが同定された［Kim, 2005］。エキソン３および４を含むＩＬ−３２γ転写物は、Ｎ末端にて４６個の追加アミノ酸を含むタンパク質アイソフォームをコードしている。ＩＬ−３２δ転写物では、第二のエキソンは存在せず、翻訳の開始は、第三のエキソンに存在するＡＴＧコドンにて起こる。他の変異体とは異なり、ＩＬ−３２α転写物はエキソン７および８を欠き、そのＣ末端にて５７個のアミノ酸残基を欠くタンパク質アイソフォームをコードしている。４つのＩＬ−３２転写物のうち、ＩＬ−３２α転写物がもっとも豊富であり、したがってＩＬ−３２αがより広く特徴付けされている。ＩＬ−３２αアイソフォームのアミノ酸配列の解析によって、３つの可能性あるＮ−ミリストイル化部位および１つのＮ−グルコシル化部位が明らかになった［Kim, 2005］。
【０００６】
ＩＬ−３２αおよびβが、用量依存的様式にて、ＰＭＡ−分化ＴＨＰ−１細胞から、およびマウスＲａｗ細胞から、有意な量の腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）およびマクロファージ炎症性タンパク質−２（ＭＩＰ−２）の分泌を誘導することが報告された。組換えＩＬ−３２αおよびβ（ｒＩＬ−３２−αおよびβ）が、非分化ヒト単球ＴＨＰ−１細胞においてＩＬ−８産生を誘導することが報告された。ｒＩＬ−３２βに対するモノクローナル抗体のＦａｂ断片が、用量依存様式にて、７０％まで、ｒＩＬ−３２αの生物学的活性を減少させることが発見された。転写レベルにて、１．２ＫＢ  ＩＬ−３２ｍＲＮＡが種々の組織で検出されたが、非免疫組織においてよりも、免疫細胞にてより顕著であった（Kim, 2005）。
【０００７】
ほとんどＴ細胞を含む、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、ＣｏｎＡでの刺激（主にＴ細胞刺激を誘導する）の後に、ＩＬ−３２を産生し、分泌した。ＩＬ−３２の産出または分泌は、ＰＢＭＣのリポ多糖刺激（主にマクロファージ刺激を誘導する）後検出されなかった。これらの結果によって、Ｔ細胞がＩＬ−３２の主な産生細胞であることが示唆される。それにもかかわらず、ＩＦＮ−γによる上皮細胞株の刺激が、ＩＬ−３２産生を誘導することが発見された。
【０００８】
ＩＬ−３２の前炎症性活性は、ＮＦ−κＢの活性化を導く、Ｉ−κＢの分解を介して調節されるようである。しかしながら、ＩＬ−３２αによるＭＡＰキナーゼの活性化もまた報告されている［Kim, 2005］。
【０００９】
プロテアーゼ３（ＰＲ−３、ミエロブラスチン、好中球ＰＲ−３およびウェーグナー自己抗原としても知られている）は、好中球／単球によって産生される顆粒セリンプロテアーゼであり、多数の生物学的基質を処理可能である［Baggiolini, 1978; Kao, 1988］。ＰＲ−３は、エラスチン、フィブロネクチン、ＩＶ型コラーゲンおよびラミニンを含む、種々の細胞外マトリックスタンパク質を分解し、ｐ６５ＮＦ−κＢを不活性化する［Preston, 2002］。ＰＲ−３は、アンジオテンシノーゲン、ＴＧＦ−β１、ＩＬ−１β、ＩＬ−８および膜結合ＴＮＦ−αを含む多くのプロ−ホルモンおよびサイトカインを、それらの活性型に切断する［Ramaha,2002; Csernok, 1996; Coeshott, 1999; Padrines, 1994; Robache-Gallea, 1995］。実際、高いタイターのＰＲ−３自己抗体（以下を参照のこと）が、ＴＮＦ−αの切断を完全にブロックすることが発見された。
【００１０】
可溶性型および細胞膜型両方でみられるＰＲ−３は、ウェーグナー肉芽腫症（ＷＧ）における主要な自己抗原である。ウェーグナー肉芽腫症は、成人における全身性血管炎を壊死させるもっとも一般的な自己免疫であり、主に呼吸器官および腎臓にて顕著である［Lamprecht, 2004; Frosch, 2004］。
【００１１】
「抗好中球細胞質自己抗体」（ＡＮＣＡ）として知られるＰＲ−３に対する自己抗体は、ＷＧの診断ホールマークである［van Rossum, 2003; Jennette, 1997］。膜ＰＲ−３（ｍＰＲ−３）−高表現型の頻度は、ＡＮＣＡ−関連血管炎の患者、およびリウマチ様関節の患者において、有意に高いことが発見された。したがって、膜ＰＲ−３発現は、血管炎およびリウマチ様関節炎に対するリスク因子である［Witko-Sarsat, 1999］。好中球細胞の膜におけるＰＲ−３の発現は、ＰＲ−３−抗好中球細胞質自己抗体（ＡＮＣＡ）−関連血管炎における再発に関連する。小血管血管炎の患者は、その血漿中での循環ＰＲ−３タンパク質のレベルが増加している［Ohlsson, 2003］。好中球の膜上の高レベルのＰＲ−３発現もまた、ＷＧリスク因子であり、ＷＧ疾患の再発に関連する（Rarok AA, Stegeman CA, Limburg PC, Kallenberg CG, J.Am Soc Nephrol.2002 Sep;13(9):2232-8）。
【００１２】
明らかに、ＷＧの病因は、好中球および単球の表面に存在するＰＲ−３抗体へのＡＮＣＡの結合によって誘導される。ＡＮＣＡの好中球および単球への結合は、細胞活性化、呼吸バースト、ならびに毒性酸素ラジカルおよびタンパク質分解酵素の放出を引き起こす。細胞表面でのＰＲ−３の暴露、およびＰＲ−３自己抗体の好中球への結合は、自己免疫化、および好中球誘導血管炎症の増幅を促進することが明らかである。
【００１３】
腎臓で顕著なＡＮＣＡ疾患を患っている患者からの末梢成熟好中球および単球の遺伝子発現プロファイルが、通常は骨髄前駆細胞のみにて発現される遺伝子の一群の転写のレベルの増加を示した（「左シフト」）。ＰＲ−３転写物は、増加した遺伝子のこの群に含まれ、ＰＲ−３発現の増加が、疾患活性および糸球体腎炎と相関する［Muller Kobold, 1998; Yang, 2004; Yang, 2002］。
【００１４】
嚢胞性線維症（ＣＦ）患者では、肺疾患再熱の時点で、循環単球におけるＰＲ−３ｍＲＮＡが増加する［Just, 1999］。表面タンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）は、ＣＦの影響を受けた患者の肺にて存在する重要な先天性宿主防御分子であり、ＣＦ−関連病因と相互作用する［von Bredow, 2003］。ＳＰ−Ｄは、ＰＲ−３とっての標的タンパク質である。したがって、ＣＦ患者において、宿主防御は、ＰＲ−３によるＳＰ−Ｄのタンパク質分解によって弱められることが明らかであり、したがってこれらの患者における肺の感染の発生率が増加する。
【００１５】
炎症を起こした歯茎を有する患者において、機能的ＰＲ−３が、口上皮細胞中に発現することが発見され、ＡＮＣＡが患者の血清で発見された。機能的ＰＲ−３を発現している前記上皮細胞が、歯肉炎および歯周炎を含む歯茎の炎症工程に関与することが明らかである［Uehara, 2004］。
【００１６】
細胞表面、および細胞外空間にて作用することに加えて、ＰＲ−３が内皮細胞に入り、そこでたとえば、ＮＦ−κＢを切断し、維持されたＪＮＫ活性化を誘導することによって、カスパーゼを摸倣することができる。ＰＲ−３はまた、主要細胞周期阻害剤ｐ２１Waf1/Cip1/Sdi1を切断し、不活性化する。高レベルのＰＲ−３およびｐ２１切断産物が、クローン病患者から、および潰瘍性大腸炎からとった、炎症ヒト組織にて発見された［Pendergraft, 2004］。
【００１７】
ジペプチジルペプチダーゼＩ（ＤＰＰＩ）は、ＰＲ−３などの好中球由来セリンプロテアーゼの完全活性化に必要である。ＰＲ−３ノックアウトマウスは入手できないが、ＤＰＰＩ−欠損マウスは首尾良く産出された［Adkison, 2002］。ＤＰＰＩノックアウトマウスは、抗コラーゲン抗体による関節炎誘導に対して耐性であることが発見され、それらの関節において好中球を蓄積しなかった。好中球エラスターゼ（−／−）×カセプシンＧ（−／−）などのセリンプロテアーゼを欠損しているノックアウトマウスがまた、抗コラーゲン抗体による関節炎の誘導に対しても耐性であることが示されたので、関節炎誘導に対する耐性が、好中球由来セリンプロテアーゼの不活性化に相関する。
【００１８】
触媒三つ組の欠損によって産出された酵素的に不活性なＰＲ−３断片［Yang, 2001］は、
（ｉ）正常造血前駆細胞におけるＤＮＡ合成のダウン−モジュレーション、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）によって逆転可能である効果で、ＰＲ−３が、増殖のモジュレーターに対する拮抗勢力として機能できることを示唆する［Skold, 1999］、
（ｉｉ）転写および翻訳レベル両方での、インターロイキン−８の誘導［Berger, 1996］、および
（ｉｉｉ）ヒト臍帯血内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）中のアポトーシスの誘導［Yang, 2001］
を含む、種々の生物学的活性を維持している。
【００１９】
さきに言及したように、ＰＲ−３はセリンプロテアーゼであり、多くのよく特徴づけられた天然および合成セリンプロテアーゼ阻害剤が、可逆的または不可逆的にＰＲ−３を不活性化可能である。種々のセリンプロテアーゼ阻害剤が、特異的にＰＲ−３を阻害することが報告された。合成阻害剤７−アミノ−４−クロロ−３−（２−ブロモエトキシ）イソクマリンおよび３，４−ジクロロイソクマリン（ＤＣＩ）が、それぞれ４７００および２６００Ｍ-1ｓ-1のＫＩ値を示した［Kam, 1992］。抗腫瘍薬物として最近使用されるヘキサスルホン化ナフチルウレアであるスラミンは、ヒト好中球エラスターゼ、カセプシンＧ、およびＰＲ−３の強力な阻害剤である。ＰＲ−３に対するＫｉは、５・１０-7Ｍである［Cadene, 1997］。１，２，５−チアジアゾリジン−３−オン１，１−ジオキシド骨格に基づく新しいクラスのペプチドミメティック薬剤が記述され、それらのスルホン誘導体が、ヒト白血球エラスターゼ、カセプシンＧ、およびＰＲ−３の時間依存の、強力かつ高効果な不可逆的阻害剤であることが発見された［Groutas, 1997］。そのような化合物は、抗炎症薬剤として有用である（Groutas WC.,米国特許第５，５５０，１３９号、１９９６年８月２７日）。
【００２０】
他のプロテアーゼ阻害剤は、種々の供給源のポリペプチドからなる。ヒト白血球エラスターゼを阻害するヒト皮膚由来ペプチドであるエラフィンは、９．５×１０-9ＭのＩＣ50を示す、強力なＰＲ−３の阻害剤である。強度は、抗白血球プロテアーゼおよびエグリンＣと比較して、１００倍以上高いことが発見された［Wiedow, 1991; Zani, 2004］。ＭＮＥＩ（単球／好中球エラスターゼ阻害剤）は、４２ｋＤａセルピンスーパーファミリーメンバーであり、エラスターゼ−およびキモトリプシン−様特異性によりプロテアーゼを効果的に阻害する。ＭＮＥＩは、＞１０7Ｍ-1・ｓ-1の速度にて、ＰＲ−３を急速に阻害する［Cooley, 2001］。生物工学処理セルピン（ＬＥＸ０３２）が、ＰＲ−３の時間依存阻害剤であることが発見され、非常に安定な酵素−阻害剤複合体を形成する（Ｋｉ  １２ｎＭ）［Groutas, 1997］。したがって、多くのセリンプロテアーゼ阻害剤が、ＰＲ−３を阻害することが特異的に示された。
【発明の開示】
【００２１】
本発明は、ＩＬ−３２のＰＲ−３への結合に基づいた、インターロイキン３２（ＩＬ−３２）のモジュレーターのスクリーニング方法に関し、候補モジュレーターの存在下におけるＩＬ−３２のＰＲ−３への結合を測定すること、前記結合のレベルを、前記候補モジュレーターの非存在下におけるＩＬ−３２のＰＲ−３への結合のレベルと比較すること、および前記結合を阻害または増強することが可能なモジュレーターを選択することを含む。
【００２２】
本発明の実施態様において、ＩＬ−３２のＰＲ−３への前記結合は、表面プラズモン共鳴によって測定される。
【００２３】
本発明の１つの実施態様において、前記モジュレーターがＩＬ−３２のＰＲ−３への結合を阻害する。
【００２４】
本発明のさらなる実施態様において、モジュレーターは、ＩＬ−３２の阻害剤、好ましくはＩＬ−３２の炎症活性の阻害剤である。
【００２５】
本発明の他の実施態様において、前記モジュレーターは、ＩＬ−３２のＰＲ−３への結合を増強し、ＩＬ−３２の活性を増強する。
【００２６】
本発明のさらに他の実施態様において、モジュレーターは、ＰＲ−３の断片であり、ＩＬ−３２に結合するが、しかしそれを切断できない。
【００２７】
本発明は、インターロイキン３２（ＩＬ−３２）におけるＰＲ−３のタンパク質分解活性に基づくＩＬ−３２活性の阻害剤のスクリーニング方法を提供し、候補阻害剤の存在下におけるＰＲ−３によるＩＬ−３２のタンパク質分解を決定すること、およびＰＲ−３のタンパク質分解活性によって産出されるＩＬ−３２断片の発生または完全（intact）ＩＬ−３２の消失を阻害することが可能な阻害剤を選択することを含む。
【００２８】
本発明の１つの実施態様において、前記阻害剤は、ＩＬ−３２の炎症活性を阻害する。
【００２９】
本発明の他の実施態様において、前記ＩＬ−３２断片は、約１６ｋＤａまたは約１３ｋＤａである。
【００３０】
さらに、本発明は、ＩＬ−３２応答性細胞中のＰＲ−３によるＩＬ−３２仲介サイトカイン分泌の増強に基づく、インターロイキン３２（ＩＬ−３２）活性の阻害剤のスクリーニング方法を提供し、ＩＬ−３２およびＰＲ−３を、候補阻害剤の存在下で、ＩＬ−３２応答性細胞と接触させること、前記細胞の細胞培養液中のサイトカインの濃度を測定すること、前記候補阻害剤の非存在下における前記細胞の培養培地中の前記サイトカインの濃度と比較すること、および前記サイトカイン分泌を阻害できる阻害剤に関して選択することを含む。
【００３１】
本発明の１つの実施態様において、前記阻害剤はＩＬ−３２の炎症活性を阻害する。
【００３２】
本発明の他の実施態様において、ＩＬ−３２応答性細胞はＴ細胞またはマクロファージ細胞である。
【００３３】
本発明のさらなる実施態様において、サイトカインは、ＴＮＦ、ＩＬ−８およびＭＩＰ−２からなる群より選択される。
【００３４】
本発明はまた、インターロイキン３２（ＩＬ−３２）の活性またはその断片の活性のモジュレーターのスクリーニング方法を提供し、候補モジュレーターの存在下で、ＩＬ−３２−応答性細胞をＩＬ−３２で、またはその断片で刺激すること、前記細胞の培養培地中に分泌されたサイトカインの濃度を測定すること、前記候補モジュレーターの非存在下における前記細胞の培養培地中に分泌された前記サイトカインの濃度と比較すること、および前記細胞からの前記サイトカインの分泌を阻害または増強できるモジュレーターを選択することを含む。
【００３５】
本発明の１つの実施態様において、ＩＬ−３２断片は、ＰＲ−３のタンパク質分解活性によって産出される約１６ｋＤａの断片である。
【００３６】
本発明の他の実施態様において、ＩＬ−３２断片は、ＰＲ−３のタンパク質分解活性によって産出される約１３ｋＤａの断片である。
【００３７】
本発明のさらなる実施態様において、ＩＬ−３２応答性細胞はＴ細胞またはマクロファージ細胞である。
【００３８】
本発明のまたさらなる実施態様において、前記候補モジュレーターは、本発明の方法によって選択された阻害剤および増強剤からなる群より選択される。
【００３９】
本発明のまたさらなる実施態様において、モジュレーターはＩＬ−３２の炎症活性の阻害剤である。
【００４０】
本発明は、本発明のスクリーニング方法によって選択された、ＩＬ−３２炎症活性の阻害剤などの、ＩＬ−３２活性のモジュレーターを提供する。
【００４１】
１つの実施態様において、本発明は、本発明のスクリーニング方法によって選択されたＩＬ−３２活性の増強剤を提供する。
【００４２】
１つの態様において、本発明は、ＩＬ−３２またはその断片の、その発現細胞からの上方調節された産生および／または分泌によって、ヒトを含む哺乳動物内で引き起こされる、または悪化する疾患の治療のための医薬品の製造におけるＰＲ−３の阻害剤の利用を提供する。
【００４３】
本発明の１つの実施態様において、疾患は、ＩＬ−３２の断片の産出および／または分泌によって引き起こされ、または悪化する。
【００４４】
本発明の他の実施態様において、ＩＬ−３２断片は、約１６ｋＤａのものであり、かつＰＲ−３のタンパク質分解活性によって産出される。
【００４５】
本発明のさらなる実施態様において、ＩＬ−３２断片は、約１３ｋＤａのものであり、かつＰＲ−３のタンパク質分解活性によって産出される。
【００４６】
本発明のまたさらなる実施態様において、ＩＬ−３２またはその断片を発現する細胞は上皮細胞である。
【００４７】
本発明のまたさらなる実施態様において、ＰＲ−３の阻害剤は、イソクマリン、ジクロロイソクマリン、スラミン、ヘキサスルホン化ナフチルウレア、１，２，５−チアジゾリジン−３−オン１，１−ジオキシド骨格およびそれらのスルホン誘導体に基づくペプチドミメティック薬剤、プロテアーゼ阻害剤、エラフィン、抗ロイコプロテアーゼエグリンＣ、ＭＮＥＩ（単球／好中球エラスターゼ阻害剤）、生物工学処理セルピンＬＥＸ０３２、および中和抗−ＰＲ−３抗体からなる群より選択される。
【００４８】
他の態様において、本発明は、ＩＬ−３２またはその断片の、その発現細胞からの制御されていない産生および／または分泌によって、ヒトを含む哺乳動物内で引き起こされる、または悪化する疾患の治療のための医薬品の製造における、本発明の方法にしたがって選択されたＩＬ−３２の増強剤または阻害剤の使用を教示する。
【００４９】
本発明の１つの実施態様において、疾患がＩＬ−３２の断片の制御されていない産出および／または分泌によって引き起こされ、または悪化する。
【００５０】
本発明の他の実施態様において、ＩＬ−３２断片は、約１６ｋＤａのものであり、かつＰＲ−３のタンパク質分解活性によって産出される。
【００５１】
本発明のさらなる実施態様において、ＩＬ−３２断片は、約１３ｋＤａのものであり、かつＰＲ−３のタンパク質分解活性によって産出される。
【００５２】
またさらなる実施態様において、モジュレーターは、本発明のスクリーニング方法によって選択された阻害剤である。
【００５３】
またさらなる実施態様において、発現細胞からのＩＬ−３２の、またはその断片の産出または分泌が上方調節される。
【００５４】
またさらなる実施態様において、ＩＬ−３２またはその断片を発現する細胞は、上皮細胞である。
【００５５】
またさらなる実施態様において、疾患は炎症性疾患である。
【００５６】
さらなる態様において、本発明は、ＩＬ−３２またはその断片の、その発現細胞からの上方調節された産生および／または分泌によって、ヒトを含む哺乳動物内で引き起こされる、または悪化する疾患の治療方法に関し、該方法は、そのような必要としている哺乳動物に、効果的な量のＰＲ−３阻害剤を投与することを含む。
【００５７】
本発明の１つの実施態様において、疾患が、ＩＬ−３２の断片の制御されていない産出および／または分泌によって引き起こされ、または悪化する。
【００５８】
本発明の他の実施態様において、ＩＬ−３２の断片は、約１６ｋＤａのものであり、かつＰＲ−３のタンパク質分解活性によって産出される。
【００５９】
本発明のまたさらなる実施態様において、ＩＬ−３２断片は、約１３ｋＤａのものであり、かつＰＲ−３のタンパク質分解活性によって産出される。
【００６０】
本発明のまたさらなる実施態様において、ＩＬ−３２またはその断片を発現する細胞は上皮細胞である。
【００６１】
本発明のまたさらなる実施態様において、ＰＲ−３阻害剤は、イソクマリン、ジクロロイソクマリン、スラミン、ヘキサスルホン化ナフチルウレア、１，２，５−チアジゾリジン−３−オン１，１−ジオキシド骨格およびそれらのスルホン誘導体に基づくペプチドミメティック薬剤、プロテアーゼ阻害剤、エラフィン、抗ロイコプロテアーゼエグリンＣ、ＭＮＥＩ（単球／好中球エラスターゼ阻害剤）、生物工学処理セルピンＬＥＸ０３２、および中和抗−ＰＲ−３抗体からなる群より選択される。
【００６２】
またさらなる態様において、本発明は、ＩＬ−３２またはその断片の、その発現細胞からの制御されていない産生および／または分泌によって、ヒトを含む哺乳動物内で引き起こされる、または悪化する疾患の治療方法に関し、該方法は、そのような必要としている哺乳動物に、効果的な量の本発明のスクリーニング方法のいずれか１つにしたがって選択されるモジュレーターを投与することを含む。
【００６３】
本発明の１つの実施態様において、疾患が、ＩＬ−３２の断片の上方調節された産出および／または分泌によって引き起こされ、または悪化する。
【００６４】
本発明の他の実施態様において、ＩＬ−３２を発現する細胞は上皮細胞である。
【００６５】
本発明のまたさらなる実施態様において、ＩＬ−３２断片は、約１６ｋＤａまたは１３ｋＤａのものであり、かつＰＲ−３のタンパク質分解活性によって産出される。
【００６６】
本発明はまた、約１６ｋＤａまたは約１３ｋＤａからなるＩＬ−３２断片、そのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、または活性画分などの、ＰＲ−３によるＩＬ−３２のタンパク質分解によって得られるＩＬ−３２のポリペプチド断片も提供する。
【００６７】
さらに、本発明は、約１６ｋＤａからなるＩＬ−３２断片または約１３ｋＤａからなるＩＬ−３２断片からなるＩＬ−３２断片などの、ＰＲ−３によるＩＬ−３２のタンパク質分解によって得られるＩＬ−３２のポリペプチド断片、そのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、または活性画分、および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【００６８】
また、一つの実施態様において、本発明は、配列番号：１のＩＬ−３２のポリペプチド断片、そのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、または活性画分を提供する。
【００６９】
他の実施態様において、本発明は、配列番号：２のＩＬ−３２のポリペプチド断片、そのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、または活性画分を提供する。
【００７０】
さらなる実施態様において、たとえば、病原薬物または癌に対する宿主免疫応答を増強するために、本発明は、配列番号：１のＩＬ−３２のポリペプチド断片、配列番号：２のＩＬ−３２のポリペプチド断片、そのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、または活性画分と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７１】
本発明は、ＰＲ−３がインターロイキン３２（ＩＬ−３２）に結合し、ＩＬ−３２タンパク質分解を引き起こし、ＰＲ−３の活性によって産生されたタンパク質分解断片が活性を増強するという本発明者らの発見に基づく、ＩＬ−３２活性のモジュレーターのスクリーニング（または同定または選択）方法に関する。
【００７２】
さらに、本発明は、前記スクリーニング方法によって同定されたＩＬ−３２活性のモジュレーター、およびＩＬ−３２の、またはその断片の制御されていない産生および／または分泌によって引き起こされる、または悪化する疾患における前記モジュレーターの使用に関する。
【００７３】
本発明はまた、ＩＬ−３２に結合するが、切断は不可能であるＰＲ−３の断片である、ＩＬ−３２活性の阻害剤に関する。
【００７４】
サイトカインは通常、防御を増強することに役に立つ。しかしながら、過剰に作用した場合、これらは大きな障害を引き起こし得、それは病原体が引き起こし得るよりも小さくはない。実際、多くの疾患において、サイトカインの不当な効果が主要な病因を構成する。ＩＬ−３２またはその断片の産生および／または分泌の上方調節が、炎症性疾患を引き起こし得、または炎症性疾患を悪化させ得る。ＩＬ−３２活性の阻害剤は、ＩＬ−３２産生および／分泌の上方調節によって引き起こされる、または悪化する炎症性疾患を阻害することが望ましい。ＩＬ−３２またはその断片の産生および／または分泌の下方調節が宿主防御を弱め、それによって、感染および癌の発生率を増加させる。ＩＬ−３２活性の増強剤は、ＩＬ−３２産生および／または分泌の下方調節によって引き起こされる、または悪化する感染および癌を阻害することが望ましい。本発明は、ＰＲ−３が高い親和力でＩＬ−３２に結合し、ＩＬ−３２を１３および１６ｋＤａ断片に分解し、完全ＩＬ−３２の生物学的活性と比較して、増強した生物学的活性を示すという本発明者らの発見に基づいている。
【００７５】
以下の実施例の項にて例示するように、本発明者らは、ＰＲ−３がＩＬ−３２の活性化において重大な役割を果たすことを確立した。
【００７６】
簡単に記すと、本発明者らは、アガロースに結合したヒトＩＬ−３２からなるカラムにて未精製ヒト尿タンパク質を濃縮し、該カラムにのせた。本発明者らは、カラムｐＨを低下させることによって、カラム−結合タンパク質を溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミド）によって溶出したタンパク質を解析した。（以下の実施例１で記述したような）好中球由来セリンプロテアーゼＰＲ−３としてさらに同定された２８〜３２ｋＤａのタンパク質バンドが、溶出画分の１つに特異的に濃縮された（図１溶出画分３）。
【００７７】
本発明者らは、ＰＲ−３が高い親和力でＩＬ−３２に結合することを発見した（尿ＰＲ−３で約２．６５×１０-8ＭのＫｄ、市販ＰＲ−３で約１．２０×１０-8ＭのＫｄ、実施例２を参照のこと）。ＰＲ−３のＩＬ−３２への結合親和力は、ＰＲ−３をフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）でプレインキュベーションした後に非常にわずかにしか減少せず、これは、ＩＬ−３２のＰＲ−３への結合が、後者の酵素的活性に依存しないことを示唆している。
【００７８】
本発明者らは、ＰＲ−３が（約２０ｋＤａの）ＩＬ−３２を、約１３ｋＤａ（配列番号：１）および１６ｋＤａ（配列番号：２）の断片に切断することを見出した。
【００７９】
2009500639.tif 000003
【００８０】
ＰＲ−３はＩＬ−３２をＴｈｒ（５７）とＶａｌ（５８）との間で切断する。ＹＬＥＴ（５７）Ｖ（５８）ＡＡＹ。
【００８１】
１３ｋＤａ配列は、ＩＬ−３２のＮ−末端断片であると予想され：ＭＣＦＰＫＶＬＳＤＤＭＫＫＬＫＡＲＭＨＱＡＩＥＲＦＹＤＫＭＱＮＡＥＳＧＲＧＱＶＭＳＳＬＡＥＬＥＤＤＦＫＥＧＹＬＥＴ（配列番号：１）、１６ｋＤａ配列はＣ−末端断片と予想される：ＶＡＡＹＹＥＥＱＨＰＥＬＴＰＬＬＥＫＥＲＤＧＬＲＣＲＧＮＲＳＰＶＰＤＶＥＤＰＡＴＥＥＰＧＥＳＦＣＤＫＳＹＧＡＰＲＧＤＫＥＥＬＴＰＱＫＣＳＥＰＱＳＳＫ（配列番号：２）。
【００８２】
本発明者らは、（約２０ｋＤａの）ＩＬ−３２タンパク質が、市販ＰＲ−３との１分間のインキュベーション後に消え、同時に１３ｋＤａ（配列番号：１）および１６ｋＤａ（配列番号：２）が産出されたことを示した。ＰＭＳＦでのＰＲ−３の前処理が、ＩＬ−３２の切断を完全にブロックした。
【００８３】
本発明者らは、驚くべきことに、（実施例８にて示されたように）１３ｋＤａ（配列番号：１）および１６ｋＤａ（配列番号：２）の、ＩＬ−３２のタンパク質分解断片が、完全ＩＬ−３２タンパク質と比較して、増強された生物学的活性を有することを見出した。ＩＬ−３２の切断、およびそれに続く生物学的活性の増強がＰＭＳＦの作用によって両方ブロックされた。
【００８４】
本記述の目的として、表現「ＩＬ−３２の生物学的活性（biological activity of IL-32）」は、とりわけ、以下の生物学的特性、（ｉ）ＭＩＰ−２の誘導、（ｉｉ）ＴＮＦの誘導、および（ｉｉｉ）ＩＬ−８の誘導の少なくとも１つを意味する。
【００８５】
したがって、本発明者らの結果に基づいて、ＩＬ−３２のＰＲ−３への結合（またはＩＬ−３２−ＰＲ−３複合体の形成）の調節が、ＩＬ−３２の活性を調節、すなわち増強または阻害する。本明細書で使用するところの、表現「ＩＬ−３２の活性を阻害する（inhibiting the activity of IL-32）」は、ブロッキング、たとえば部分阻害などに加えて、任意のＩＬ−３２活性を阻害する阻害剤の能力を意味する。
【００８６】
本発明は、モジュレーター分子を同定する方法、ＰＲ−３のＩＬ−３２への結合（またはＰＲ−３−ＩＬ−３複合体形成）を増強または阻害可能である分子を同定することを含む方法を提供し、当該分子がモジュレーターである。
【００８７】
１つの実施態様において、本発明は、候補モジュレーターの存在下におけるインターロイキン３２（ＩＬ−３２）のＰＲ−３への結合を測定すること、前記候補モジュレーターの非存在下におけるＩＬ−３２のＰＲ−３への結合と比較すること、および前記結合を阻害または増強可能なモジュレーターを選択（または同定）することを含む、ＩＬ−３２のＰＲ−３への結合に基づいた、ＩＬ−３２活性のモジュレーターのスクリーニング方法に関する。
【００８８】
１つの実施態様において、候補モジュレーターはコンビナトリアルケミストリーによって設計され得る有機分子である。
【００８９】
本発明にしたがった用語「ＩＬ−３２」には、ＩＬ−３２α、ＩＬ−３２β、ＩＬ−３２γおよびＩＬ−３２δなどの、すべてのＩＬ−３２アイソフォームが含まれる。
【００９０】
用語「ＩＬ−３２活性のモジュレーター（modulator of IL-32 activity）」は、ＩＬ−３２活性の阻害剤または増強剤を意味する。
【００９１】
本明細書で使用されるところの、表現「ＩＬ−３２への結合（binding to IL-32）」は、たとえば、実施例１においてアフィニティ精製されたとき、または実施例３においてＢＩＡｃｏｒｅにて試験されたときに、ＩＬ−３２に結合しているＰＲ−３によって証明されるように、ＰＲ−３のＩＬ−３２に結合する能力を意味する。
【００９２】
言及したように、サイトカインは通常防御を増強するために働く。しかしながら、過剰に働いた場合、これらは大きな障害を引き起こし得、それは病原体が引き起こし得るよりも小さくはない。実際、多くの疾患において、サイトカインの不当な効果が、主要な病因を構成する。過剰に働くＩＬ−３２は、ＴＮＦの過敏機能および炎症を引き起こし得る。本発明のさらなる実施態様において、モジュレーターはＩＬ−３２の炎症活性の阻害剤である。
【００９３】
ＩＬ−３２の欠損は、宿主防御を弱め、それによって感染および癌の発生率を増加させる。本発明のさらなる実施態様において、モジュレーターがＩＬ−３２の活性の増強剤である。
【００９４】
本発明者らの結果に基づくと、（ＰＭＳＦにて以下で例示するように）ＰＲ−３によるＩＬ−３２のタンパク質分解を阻害することが、ＩＬ−３２の活性の阻害をもたらす。
【００９５】
本発明は、モジュレーター分子を同定する方法を提供し、該方法は、ＰＲ−３によるＩＬ−３２のタンパク質分解を増強するか、または阻害することが可能な分子を同定することを含み、当該分子はモジュレーターである。
【００９６】
１つの実施態様において、本発明は、ＩＬ−３２上のＰＲ−３のタンパク質分解活性に基づくＩＬ−３２活性の阻害剤のスクリーニング方法に関し、該方法は、候補阻害剤の存在下におけるＰＲ−３によるＩＬ−３２のタンパク質分解を測定すること、およびＰＲ−３のタンパク質分解活性によって産出されるＩＬ−３２断片の発生または完全ＩＬ−３２の消失を阻害することが可能な阻害剤を選択することを含む。
【００９７】
さらなる実施態様において、ＩＬ−３２のタンパク質分解を測定することは、実施例５〜７にて例示したように、約１６および１３ｋＤａの分子量を有する、ＰＲ−３によって産出されるＩＬ−３２断片をモニターすることによって、および／または、約２０ｋＤａの分子量の完全ＩＬ−３２の消失をモニターすることによって実施する。
【００９８】
本発明者らの結果に基づくと、（ＰＭＳＦにて以下で例示したように）ＰＲ−３を阻害することが、ＩＬ−３２の生物学的活性を阻害する。
【００９９】
本発明の他の実施態様にしたがって、任意の公知の方法によってＰＲ−３を切断することで得られる、ＩＬ−３２に結合するがＩＬ−３２を切断することはできないＰＲ−３の断片を利用して、切断されたＩＬ−３２によって明示されるような、ＰＲ−３のＩＬ−３２の生物学的活性における増強機能を無効にし得る。
【０１００】
本発明にしたがって、ＰＲ−３を、ＣＮＢｒまたはトリプシンによって切断し、ＰＲ−３の得られた断片を、ＢＩＡＣＯＲＥによってＩＬ−３２に対する親和性について確認し、完全ＰＲ−３の親和性と比較する。次いで、高い親和性を有する断片をさらに、ＩＬ−３２の生物学的活性の阻害に関して試験した。
【０１０１】
本発明は、モジュレーター分子を同定する方法を提供し、該方法は、ＰＲ−３によって増強されたＩＬ−３２の生物学的活性を増強する、または阻害することが可能な分子を同定することを含み、該方法において生物学的活性は、ＩＬ−３２応答性細胞による、ＩＬ−８、ＴＮＦおよびＭＩＰ−４などのサイトカインの分泌によって現され、該分子がモジュレーターである。
【０１０２】
１つの実施態様において、本発明は、インターロイキン３２（ＩＬ−３２）応答性細胞における、ＰＲ−３によるＩＬ−３２−仲介サイトカイン分泌の増強に基づいた、ＩＬ−３２活性の阻害剤のスクリーニング方法に関し、該方法は候補阻害剤の存在下でＩＬ−３２応答性細胞とＩＬ−３２およびＰＲ−３を接触させること、前記細胞の培養培地中のサイトカインの濃度を測定すること、前記候補阻害剤の非存在下での前記細胞の培養培地中の前記サイトカインの濃度と比較すること、および前記サイトカイン分泌を阻害できる阻害剤を選択することを含む。
【０１０３】
本発明は、モジュレーター分子を同定する方法を提供し、該方法は、ＩＬ−３２の活性を増強または阻害可能な分子、またはＩＬ−３２  １３ｋＤａ（配列番号：１）および１６ｋＤａ（配列番号：２）断片の活性または産出を増強または阻害可能な分子を同定することを含み、当該分子がモジュレーターである。
【０１０４】
１つの実施態様において、本発明は、インターロイキン３２（ＩＬ−３２）の活性のモジュレーター、またはその断片の活性または産出を増強または阻害可能な分子のスクリーニング方法に関し、該方法は、候補モジュレーターの存在下でＩＬ−３２−応答性細胞をＩＬ−３２で、またはその断片で刺激すること、前記細胞の培養培地中に分泌されたサイトカインの濃度を測定すること、前記候補モジュレーターの非存在下で前記細胞の培養培地中に分泌された前記サイトカインの濃度と比較すること、および前記細胞からの前記サイトカインの分泌を阻害または増強できるモジュレーターを選択することを含む。
【０１０５】
本明細書で使用するところの表現「ＰＲ−３によるＩＬ−３２仲介サイトカイン分泌の増強（enhancement of IL-32-mediated cytokine secretion by PR-3）」は、たとえば（実施例８にて例示したような）ＰＲ−３とともにインキュベートしたＩＬ３２によって刺激されるＩＬ−８またはＭＩＰ−２の分泌の増強によって明らかなように、ＩＬ−３２応答性細胞内での、ＩＬ−３２仲介サイトカイン分泌を増強するＰＲ−３の能力を意味する。
【０１０６】
１つの実施態様において、本発明は、本発明の方法によって見出されたＩＬ−３２のモジュレーター、ならびにＩＬ−３２またはその断片の、その発現細胞からの制御されていない産生および／または分泌によって、ヒトを含む哺乳動物内で引き起こされる、もしくは悪化する疾患の治療のための医薬品の製造におけるそれらの使用に関する。
【０１０７】
さらなる実施態様において、本発明は、ＩＬ−３２またはその断片の、その発現細胞からの制御されていない産生および／または分泌によって、ヒトを含む哺乳動物内で引き起こされる、または悪化する疾患の治療のための医薬品の製造におけるＰＲ−３のモジュレーターの使用に関する。
【０１０８】
本発明者らの結果は、本発明のスクリーニング方法によって同定された、ＰＲ−３の阻害剤、ＰＲ−３のＩＬ−３２への結合の阻害剤、（ＰＭＳＦによって以下で例示された）ＰＲ−３によるＩＬ−３２タンパク質分解の阻害剤、およびＩＬ−３２の生物学的活性の阻害剤などの、本発明の阻害剤が、たとえば、ＩＬ−３２の内因性産出または外因性投与が疾患の原因であるか、または患者の状態を悪化させる疾患において、ＩＬ−３２活性の阻害剤として使用し得ることがわかったことを示している。
【０１０９】
本発明の１つの実施態様において、本発明のスクリーニング方法によって同定されたＩＬ−３２活性の阻害剤は、炎症などの、ＩＬ−３２の産生および／または分泌の増加によって引き起こされるか、または悪化する疾患で使用される。
【０１１０】
用語「炎症」、「炎症性疾患（inflammation diseases）」、「炎症状態（inflammation condition）」または「炎症過程（inflammation process）」は、炎症反応に伴う、生理学的または病理学的状態を意味する。そのような状態には、限定はしないが、敗血症、虚血再灌流傷害、クローン病、関節リウマチ、多発性硬化症、心筋症、結腸炎、感染性髄膜炎、脳炎、急性呼吸促迫症候群、ウェーグナー肉芽腫症、アテローム性動脈硬化症、（皮膚、腎臓、心臓、肺、肝臓、骨髄、角膜、膵臓、小腸などの）器官／組織移植拒絶、皮膚炎、脳卒中、外傷性脳傷害、乾癬および狼瘡が含まれる。
【０１１１】
本発明は、ヒトを含む哺乳動物における、Ｔ細胞および内皮細胞などの、発現細胞中のＩＬ−３２またはその断片の制御されていない産生および／または分泌によって引き起こされる、または悪化する疾患の治療方法を提供し、該方法は効果的な量のＰＲ−３阻害剤を、必要としているそのような哺乳動物に投与することを含む。
【０１１２】
用語「治療（treatment）」または「治療すること（treating）」は、制御されていないＩＬ−３２活性によって引き起こされるか、または悪化するものの予防法（prophylaxis）、改善、予防（prevention）または治癒を含み得る目的のために、対象への、本発明の化合物の投与を含むことが意図される。そのような治療は、炎症反応または特定の疾病に関連する他の反応を必ずしも完全に改善する必要はなない。さらに、そのような治療は、単独治療として、または当業者に公知な疾患、疾病または状態の有害な効果を減少させるための他の常套的な治療との組合せで使用し得る。
【０１１３】
本発明の方法は、疾病の発現から、たとえば移植患者などのその同じ疾病に高リスクの患者を予防するために、たとえば炎症状態の検出前の「予防的（preventive）」治療として提供され得る。
【０１１４】
用語「癌（cancer）」は、転移、腫瘍増殖および血管新生を含む種々の癌関連状態を意味する。
【０１１５】
本発明にしたがって、イソクマリン、ジクロロイソクマリン、スラミン、ヘキサスルホン化ナフチルウレア、１，２，５−チアジゾリジン−３−オン１，１−ジオキシド骨格およびそれらのスルホン誘導体に基づくペプチドミメティック薬剤、プロテアーゼ阻害剤、エラフィン、抗ロイコプロテアーゼエグリンＣ、ＭＮＥＩ（単球／好中球エラスターゼ阻害剤）、生物工学処理セルピンＬＥＸ０３２、および中和抗−ＰＲ−３抗体から選択されるＰＲ−３阻害剤などのＰＲ−３の阻害剤が、ＩＬ−３２活性化および放出の阻害剤として提供される。
【０１１６】
本発明はまた、ＰＲ−３に対する、ならびにそれらのムテイン、融合タンパク質、塩、機能的誘導体および活性画分に対する中和抗体の使用を含む。用語「抗体（antibody）」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）、キメラ抗体、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体から可溶性型または結合型にて標識化可能な抗体、およびヒト化抗体、ならびに限定はしないが酵素的切断、ペプチド合成または組換え技術などの任意の公知の技術によって提供されるそれらの断片が含まれることを意味する。
【０１１７】
言及したように、サイトカインは通常防御を増強するように働く。過剰にＩＬ−３２が作用することがＴＮＦの過剰な機能を引き起こし得るが、許容濃度でのＩＬ−３２またはその活性画分は宿主防御を増強するように働き得る。
【０１１８】
１つの側面において、本発明は、約１６ｋＤａ（配列番号：２）のＩＬ−３２のポリペプチド断片、および約１３ｋＤａ（配列番号：１）のＩＬ−３２のポリペプチド断片に関し、両方とも活性であり、ＰＲ−３のタンパク質分解活性によって得られる。
【０１１９】
本発明はまた、ＩＬ−３２  １６ｋＤａ（配列番号：２）ポリペプチド、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体もしくは活性画分にも関する。
【０１２０】
本発明はまた、ＩＬ−３２  １３ｋＤａ（配列番号：１）ポリペプチド、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体もしくは活性画分にも関する。
【０１２１】
本明細書で使用するところの用語「ムテイン（muteins）」は、元のタンパク質と比較して、得られた産物の活性を相当に変更することなしに、天然に存在するタンパク質の成分の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基によって置換されるか、または欠損するか、または１つまたはそれ以上のアミノ酸残基がタンパク質の本来の配列に加えられる、タンパク質の類似体を意味する。これらのムテインは、したがって公知の合成によって、および／または部位特異的突然変異誘発技術によって、または好適な任意の他の公知の技術によって調製される。
【０１２２】
本発明にしたがったムテインには、ストリンジェントな条件下で、本発明にしたがって、タンパク質をコードしている、ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズする、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸によってコードされるタンパク質が含まれる。用語「ストリンジェントな条件（stringent conditions）」は、当業者が従来、「ストリンジェント」として意味した、ハイブリダイゼーションおよび続く洗浄条件である。Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、上記、Interscience, N.Y.,§§6.3および6.4(1987, 1992)、およびSambrookら（Sambrook, J.C., Fritsch, E.F., and Maniatis, T.(1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）を参照のこと。
【０１２３】
制限されないが、ストリンジェントな条件の例には、たとえば２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳで５分間、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで１５分間中、試験下のハイブリッドの計算されたＴｍより１２〜２０℃低い洗浄条件、０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ、３７℃、３０〜６０分、ついで０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ、６８℃、３０〜６０分間の洗浄条件が含まれる。当業者は、ストリンジェントな条件がまた、ＤＮＡ配列、（１０〜４０残基などの）オリゴヌクレオチドプローブ、または混合オリゴヌクレオチドプローブの長さに依存することを理解する。混合プローブを使用する場合、ＳＳＣの代わりに塩化テトラメチルアンモニア（ＴＭＡＣ）を使用することが好ましい。Ausubelら（上記）を参照のこと。
【０１２４】
任意のこのようなムテインは好ましくは、本発明のポリペプチドに対して実質的に同様の、またはさらにより高い活性を有するように、本発明のポリペプチドのものと十分に重複したアミノ酸の配列を有する。たとえば、ＩＬ−３２の１つの特徴的活性は、応答性細胞中のＴＮＦの分泌を誘導するその能力である。ＴＮＦの結合を測定するためのＥＬＩＳＡ型アッセイが本技術分野で記述されている。ムテインが本発明のポリペプチドの実質的な活性を有する限り、本発明のポリペプチドと本質的に同様の活性を有すると考えられる。したがって、任意の所与のムテインが、少なくとも本質的に本発明のポリペプチドと同一の活性を有するかどうか、そのようなムテインを、たとえばＩＬ−３２応答性細胞中の、ＴＮＦ、ＩＬ−８またはＭＩＰ−２などのサイトカインの分泌を誘導するかしないかを決定するための単純なアッセイにかけることを含む、通常の実験によって決定することができる。
【０１２５】
好ましい実施態様において、任意のそのようなムテインは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも４０％の同一性または相同性を有する。より好ましくは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または最も好ましくは少なくとも９０％の同一性または相同性を有する。
【０１２６】
同一性は、配列を比較することによって決定される、２つまたはそれ以上のポリペプチド配列、または２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を反映する。一般に、同一性は、比較する配列の長さにわたり、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の、実際のヌクレオチド対ヌクレオチド、またはアミノ酸対アミノ酸対応を意味する。
【０１２７】
正確な相関がない配列に関して、「同一性率（percent identity）」が決定され得る。一般に、比較すべき２つの配列を配列間の最大相関が得られるように並べる。これには、アライメントの程度を増強するために、１つまたは両方の配列いずれかに「ギャップ（gaps）」を挿入することが含まれ得る。同一性率は、とりわけ同一の、または非常に同様の長さの配列のために好適である、比較されている配列のそれぞれの全長にわたって（グローバルアライメントと呼ばれる）、またはより短い配列、定義された配列のために好適であり、等しくない長さの配列に対して（ローカルアライメントと呼ばれる）決定され得る。
【０１２８】
２つまたはそれ以上の配列の同一性および相同性を比較するための方法が、本技術分野でよく知られている。したがってたとえば、Wisconsin Sequence Analysis Package、バージョン９．１（Devereux Jら、1984, Nucleic Acids Res. 1984 Jan 11; 12(1 Pt 1): 387-95.）にて利用可能なプログラム、たとえばプログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを使用して、２つのポリペプチド間の％同一性および２つのポリペプチド配列間の％同一性および％相同性を決定し得る。ＢＥＳＴＦＩＴは、Smith および Waterman（J Theor Biol.1981 Jul 21; 91(2): 379-80およびJ Mol Biol.1981 Mar 25; 147(1): 195-7. 1981）の「ローカル相同性」アルゴリズムを使用し、２つの配列間の相同性の最適単一領域を見つける。配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムがまた本技術分野で公知であり、たとえばＢＬＡＳＴプログラムファミリー（Altschul S Fら、1990, J Mol Biol.1990 Oct 5; 215(3): 403-10、Proc Natl Acad Sci USA.1990 Jul; 87(14): 5509-13、Altschul S Fら、Nucleic Acids Res.1997 Sep 1; 25(17): 3389-402、www.ncbi.nlm.nih.gov にてＮＣＢＩのホームページを介してアクセス可能）およびＦＡＳＴＡ（Pearson W R,Methods Enzymol.1990; 183: 63-98. Pearson J Mol Biol. 1998 Feb 13; 276(1): 71-84）である。
【０１２９】
本発明にしたがって使用可能な、本発明のポリペプチドのムテイン、またはそれをコードしている核酸には、本明細書で示した教義およびガイダンスに基づいて、不必要な実験なしに、当業者によって日常的に得ることができる置換ペプチドまたはポリヌクレオチドとして、有限の組の本質的に相当する配列が含まれる。
【０１３０】
本発明にしたがったムテインの好ましい変化は、「保守的（conservative）」置換として知られているものである。本発明のポリペプチドの保守的アミノ酸置換には、グループのメンバー間の置換が、分子の生物学的機能を保存する、十分に類似の物理化学的特性を有するグループ内の同義アミノ酸が含まれ得る（Grantham Science.1974 Sep 6; 185(4154): 862-4）。アミノ酸の挿入および欠損がまた、それらの機能を変化させることなく以上で定義した配列内で実施可能であり、とりわけ挿入または欠損が、数個のアミノ酸のみ、たとえば３０以下、好ましくは１０以下のみに関わる場合、たとえばシステイン残基などの、機能的配座に重要なアミノ酸を除去または置換しないことが明らかである。そのような欠損および／または挿入によって産出されるタンパク質およびムテインが、本発明の範囲内に含まれる。
【０１３１】
好ましくは、同義アミノ酸群は、表１で定義したようなものである。より好ましくは、同義アミノ酸群は、表２で定義したようなものであり、もっとも好ましくは、同義アミノ酸群は、表３で定義したようなものである。
【０１３２】
【表１】
2009500639.tif 000004
【０１３３】
【表２】
2009500639.tif 000005
【０１３４】
【表３】
2009500639.tif 000006
【０１３５】
本発明のポリペプチドのムテインを得るため、本発明での使用のために使用可能であるタンパク質内のアミノ酸置換の生産の例には、Markらに付与された米国特許第４，９５９，３１４号、第４，５８８，５８５号および第４，７３７，４６２号、Kothsらに付与された第５，１１６，９４３号、Namenらに付与された第４，９６５，１９５号、Chongらに付与された第４，８７９，１１１号、Leeらに付与された第５，０１７，６９１号、および米国特許第４，９０４，５８４号（Shawら）にて示されたリジン置換タンパク質などの任意の公知の方法の工程が含まれる。
【０１３６】
本明細書で使用するところの「機能的誘導体（functional derivatives）」は、本技術分野で公知の方法によって、残基の側鎖で発生するか、Ｎ−またはＣ−末端基への添加である官能基より調製され得る、本発明のポリペプチドの誘導体およびそれらのムテインをカバーし、薬学的に許容可能である限り、すなわち、本質的に本発明のポリペプチドの活性と同様のタンパク質の活性を破壊せず、またそれを含む組成物上で毒性特性を発生させないかぎり、本発明に含まれる。
【０１３７】
「機能的誘導体」はまた、変化が従来の方法によって本発明のポリペプチドを構成するアミノ酸の配列中に導入される、本発明のポリペプチドを構成するマルチマーも含む。これらの変化には、本発明のポリペプチドの伸長または切断、または本発明のポリペプチドを構成する１つまたはそれ以上のアミノ酸の欠損または置換が含まれ得る。上記変化のいずれもが、本発明のポリペプチドの特性に影響を与ええないことが理解される。
【０１３８】
これらの誘導体には、たとえば、抗原性部位をマスクし、体液中での本発明のポリペプチドの残留を引き延ばし得るポリエチレングリコール側鎖が含まれる。他の誘導体には、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは一級または二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部位とともに形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体（たとえばアルカノイルまたはカルボン酸アロイル基）、またはアシル部位とともに形成される遊離ヒドロキシ基のＯ−アシル誘導体（たとえばセリル基またはスレオニル残基）が含まれる。
【０１３９】
本発明にしたがった「活性画分（active fraction）」は、たとえば１３ｋＤａまたは１６ｋＤａ断片の断片であり得る。用語画分は、任意の分子の一部を意味し、すなわち、たとえばＩＬ−３２応答性細胞によるＴＮＦ分泌を誘導する、というような所望の生物学的活性を残したより短いペプチドを意味する。画分は、本発明のポリペプチドのいずれかの末端からアミノ酸を除去し、その生物学的特性に関して得られた画分を試験することによって簡単に調製し得る。ポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端いずれかから、一度に１つのアミノ酸を除去するためのプロテアーゼが公知であり、そのため所望の生物学的活性を残した断片の決定には、日常の実験のみが関与する。
【０１４０】
本発明のポリペプチドの活性画分、そのムテインおよび融合タンパク質として、本発明はさらに、前記画分が本発明のポリペプチドに対して本質的に同様の活性を有するという条件で、単独またはそれに結合した関連分子または残基、たとえば糖またはリン酸残基と一緒のタンパク質分子のポリペプチド鎖の任意の断片、またはそれらによるタンパク質分子または糖残基の凝集物をカバーする。
【０１４１】
またさらなる実施態様において、本発明にしたがった物質には、免疫グロブリン融合が含まれ、すなわち、本発明にしたがった分子が、免疫グロブリンのすべてまたは一部に融合する。免疫グロブリン融合タンパク質を作製するための方法が、たとえば国際公開第０１／０３７３７号パンフレットにて記述されたもののように、本技術分野でよく知られている。当業者は、本発明の得られた融合タンパク質が、本発明のポリペプチドの生物学的活性を残していることを理解する。得られた融合タンパク質は、理想的には、体液中の残留時間（半減期）の延長、特異的活性の増加、発現レベルの増加、または融合タンパク質の精製の促進などの改善された特性を有する。
【０１４２】
好ましくは、本発明にしたがった物質は、Ｉｇ分子の定常領域に融合する。たとえばヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインのような、重鎖領域に融合し得る。Ｉｇ分子の他のアイソフォームが、たとえば、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４またはＩｇＭまたはＩｇＡのような他のＩｇクラスなどのものがまた、本発明にしたがった融合タンパク質の産出のために好適である。融合タンパク質は、一量体または多量体、ヘテロまたはホモ多量体であり得る。
【０１４３】
本明細書で用語「塩（salts）」は、本発明のポリペプチドまたはその類似体のカルボキシル基の塩、およびアミノ基の酸添加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は、本技術分野で公知の方法によって形成され得、たとえばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄または亜鉛塩などの無機塩、およびたとえばトリエタノールアミン、アルギニンまたはリシン、ピペリジン、プロカインなどのアミンとともに形成されるような有機塩基との塩が含まれる。酸添加塩にはたとえば、塩酸または硫酸などのミネラル酸との塩、およびたとえば酢酸またはオキサロ酸などの有機酸との塩が含まれる。もちろん、任意のそのような塩は、ＩＬ−３２応答性細胞中で、ＴＮＦ、ＩＬ−８またはＭＩＰ−２を誘導する能力などの、本発明のポリペプチドの生物学的活性を維持すべきである。
【０１４４】
本明細書で使用するところの用語「円順列（circularly permuted）」は、直鎖分子において、末端を、直接またはリンカーを介して互いに結合して環状分子を形成し、ついでその環状分子を他の局所で切断し、本来の分子中の末端と異なる末端を有する新規の直鎖分子が産出されることを意味する。円順列には、その構造を環状化し、ついで切断した分子と同等である分子が含まれる。したがって、円順列分子は、直鎖分子としてデノボ合成され得、環状化および切断工程を通らない。分子の特定の円順列は、ペプチド結合が排除されたアミノ酸残基を含むブラケットによって設計される。ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を含み得る円順列分子は、その正常の末端が、しばしばリンカーにて融合し、他の位置で新規の末端を有する一本鎖分子である。両方とも本明細書に参考文献によって組み込まれている、Goldenbergら、J.Mol.Biol.,165: 407-413(1983)およびPanら、Gene 125: 111-114(1993)を参照のこと。円順列は、直鎖分子をとり、末端を融合して環状分子を形成し、ついで異なる局所で前記環状分子を切断し、異なる末端を有する新規の直鎖分子を形成することと機能的に同等である。円順列はしたがって、異なる局所で新規の末端を形成する一方で、タンパク質のアミノ酸の配列および同一性を本質的に保存する効果を有する。
【０１４５】
本発明は、約１６ｋＤａの、または約１３ｋＤａのＩＬ−３２のポリペプチド断片および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【０１４６】
本発明はまた、約１６ｋＤａの、または約１３ｋＤａのＩＬ−３２のポリペプチド断片および薬学的に許容され得る担体を含む、病原体によって誘導された疾患の治療のための医薬組成物を提供する。
【０１４７】
「薬学的に許容され得る（pharmaceutically acceptable）」とは、活性成分の生物学的活性の効果を干渉せず、投与される宿主に対して毒性ではない、任意の担体を含むことを意味する。たとえば、非経口投与のために、活性タンパク質（類）を、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンガー溶液などの賦形剤中での注射のために、単位投与形態で処方し得る。
【０１４８】
本発明にしたがった医薬組成物の活性成分は、種々の方法にて個体に投与可能である。投与の経路には、皮内、経皮（たとえば遅延放出処方中）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、頭蓋内、硬膜外、局所および鼻腔内経路が含まれる。任意の他の治療的に効果的な投与経路を、たとえば、上皮または内皮組織を介した吸収、または活性薬剤をコードしているＤＮＡ分子を患者に投与し、活性薬物がインビボで発現および分泌され得る遺伝子治療によって使用可能である。さらに、本発明にしたがったタンパク質（類）を、薬学的に許容され得る界面活性剤、賦形剤、担体、希釈物およびビヒクルなどの生物学的に活性な薬剤の他の成分と一緒に投与可能である。
【０１４９】
非経口（たとえば静脈内、皮下、筋肉内）投与のために、活性タンパク質（類）を、溶液、懸濁液、エマルジョンまたは凍結乾燥粉末として、薬学的に許容され得る非経口ビヒクル（たとえば水、生理食塩水、デキストロース溶液）、および等張性（たとえばマンニトール）または化学安定性（たとえば保存剤および緩衝液）を維持する添加物とともに処方可能である。処方は一般的に使用される技術によって滅菌される。
【０１５０】
本発明にしたがった活性タンパク質（類）のバイオアベイラビリティーをまた、たとえばＰＣＴ特許出願、国際公開第９２／１３０９５号パンフレットにて記述されたような、分子をポリエチレングリコールに結合させることによって、ヒト体内での分子の半減期を増加させる結合手順を用いることによっても改善可能である。
【０１５１】
本発明は、治療的に有効量の、前記ＩＬ−３２の断片の投与を含む、必要としている患者、たとえば感染性疾患および癌を患っている患者における免疫を増強する方法に関する。
【０１５２】
「治療的に有効量（therapeutically effective amount）」とは、投与したときに、前記ＩＬ−３２の断片が、宿主防御の増強となるような量である。単一または複数回投与用量として、個体に投与した用量は、投与経路、患者の状態および特性（性別、年齢、体重、健康、背格好（サイズ））、症状の程度、平行治療、治療の頻度および所望の効果を含む種々の因子に非常に依存し得る。確立された用量の範囲の適合および操作は、よく当業者の技術の範囲内であり、ならびに前記ＩＬ−３２断片の活性を決定するインビトロおよびインビボでの方法の範囲内である。
【０１５３】
本発明は、その特定の実施態様に関連して記述されてきているが、さらなる改変が可能であることが理解されるであろう。本出願は、一般に本発明の原理にしたがった、ならびに本発明が属する技術分野内の公知または習慣的な実施内になるような、および付随する請求項の範囲内で以下のように説明された以上の必須の特徴に適用可能であり得るような本開示物からの離脱を含む、本発明の種々の変更、使用または適合をカバーすることが意図される。
【０１５４】
雑誌記事または要約、発行されたまたは未発行の米国または外国特許出願、付与された米国または外国特許または任意の他の参考文献を含む、本明細書で引用されたすべての参考文献が、引用された参考文献中に表されたすべてのデータ、表、図およびテキストを含んで、すべてが本明細書で参照によって組み込まれている。さらに、本明細書で引用された参考文献内に引用された参考文献の全内容がまた、すべて参照によって組み込まれている。
【０１５５】
いずれにしても、公知の方法の工程、従来の方法の工程、公知の方法または従来の方法に対する参照は、本発明の任意の態様、記述または実施態様を、関連技術分野において開示、指導または示唆することの承認ではない。
【０１５６】
特定の実施態様の以下の記述は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにし得るので、（本明細書で引用された参考文献の内容を含む）本技術分野内の知識を適用することによって、他人が、不必要な実験なしに、本発明の一般的なコンセプトから逸脱することなしに、種々の適用のために、そのような特定の実施態様を簡単に改変および／または適合することができる。したがって、そのような適応および改変は、本明細書にて示された教義およびガイダンスに基づいて、開示された実施態様の等価物の範囲を意味する中であることが意図される。本明細書での語句法または専門用語が、記述の目的であり、制限の目的ではなく、したがって、本明細書の語法または専門用語が、本明細書で示された教義およびガイダンスを考慮に入れて、普通の当業者の知識と組み合わせて、当業者によって翻訳されるべきであることが理解される。
【０１５７】
本発明をここで、以下の非限定実施例および付随する図面にて、より詳細に記載する。
【０１５８】
実施例１
ヒト尿タンパク質からのＩＬ−３２結合タンパク質の単離
ヒト組換えＩＬ−３２（ｈｒＩＬ−３２）のアフィニティカラムを、ヒト尿からＩＬ−３２結合タンパク質を単離するために調製した。
【０１５９】
大腸菌（E.coli）中に産生された組換えヒトＩＬ−３２α（３ｍｇ）を、取扱説明書にしたがって、Ａｆｆｉｇｅｌ−１５（１ｍｌ、バイオラッド（BioRad）、リッチモンド、ＣＡ）に結合させ、カラム内にパックした。１０００倍濃度のヒト粗尿タンパク質（５００ｍｌ）を、０．２５ｍｌ／分の流速でカラム上にのせた。カラムをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中０．５ＭのＮａＣｌを含む２５０ｍｌの溶液で洗浄した。カラムに結合したタンパク質を、２５ｍＭクエン酸、ｐＨ２．２およびベンズアミジン（１ｍＭ）を含む溶液で溶出して、１ｍｌ画分を回収し、１ＭのＮａ2ＣＯ3（０〜７０マイクロリットル、溶出３のために、７０マイクロリットルの中和溶液を使用した）によって直ちに中和した。カラムから溶出した画分（および洗浄画分）のアリコートを、非還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）にて分離し、タンパク質バンドを銀染色によって視覚化した。２８〜３２ｋＤａの特定のＩＬ−３２結合タンパク質に相当する広いバンドが、主に溶出された画分３（図１中矢印）にて検出された。このバンドは、粗尿タンパク質を表す洗浄画分には見られなかった。
【０１６０】
本結果は、２８〜３２ｋＤａのＩＬ−３２結合タンパク質の濃縮した尿タンパク質の画分が、ｈｒＩＬ−３２のカラムでのアフィニティクロマトグラフィーによって得られたことを示している。
【０１６１】
実施例２
プロテアーゼ３としてのＩＬ−３２結合タンパク質の同定
以下の実験は、ｈｒＩＬ−３２カラムでのアフィニティクロマトグラフィーによって濃縮された尿ＩＬ−３２結合タンパク質（実施例１）を同定するために実施した。
【０１６２】
２８〜３２ｋＤａに相当する、実施例１からのＳＤＳ−ＰＡＧＥ由来のバンドをゲルから切り出し、タンパク質を電気溶出し、トリプシンで消化した。得られたトリプシン消化物を液体−クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析器（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）に供した。ＬＦＰＤＦＦＴＲ、ＶＡＬＹＶＤＷＩＲおよびＬＶＮＶＶＬＧＡＨＮＶＲとして、３つのトリプシンペプチドの配列がはっきりと検出された。３つのトリプシンペプチドの配列と、米国国立衛生研究所、ベテスダ、メリーランド州におけるthe National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のタンパク質データベース中のトリプシンペプチド配列とのアライメントによって、アフィニティクロマトグラフィーによって単離されたＩＬ−３２結合タンパク質が、ヒトプロテアーゼ−３（ＰＲ−３、スイスプロット、アクセス番号Ｐ２４１５８）であることが明らかになった。ヒト免疫グロブリン鎖に相当するさらなるタンパク質もまた、同様のタンパク質バンドから同定されたが、非特異的成分であると見られる。
【０１６３】
ＩＬ−３２結合タンパク質がＰＲ−３であることは、Ｎ−末端タンパク質マイクロ配列解析によってさらに確認された。溶出画分３のＳＤＳ−ＰＡＧＥの２８〜３２ｋＤａタンパク質バンド（実施例１および図１）をゲルから切り出し、取扱説明書にしたがって、ＰＶＤＦ膜上に電気溶出し、Ｍｏｄｅｌ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ機器上で、タンパク質マイクロシークエンシングにかけた。得られた電気溶出した２８〜３２ｋＤａタンパク質のＮ−末端配列は、市販ＰＲ−３（アセンズ・リサーチ・アンド・テクノロジー（Athens Research and Technology））のもの、ＩＶＧＧと同一であった。本配列は、プロＰＲ−３の２８〜３１位に存在する。
【０１６４】
結果は、アフィニティ精製によって単離された、２８〜３２ｋＤａの尿ＩＬ−３２−結合−タンパク質が、ＰＲ−３であることを示している。
【０１６５】
実施例３
ＰＲ−３のＩＬ−３２への結合の親和力
（尿由来、または市販の）ＰＲ−３の、ＩＬ−３２への結合親和力を、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）によって測定した。
【０１６６】
酢酸緩衝液ｐＨ４．６中のＩＬ−３２（２０μｇ／ｍｌ）を、製造業者（アマシャム・ファルマシア（Amersham Pharmacia）、ウプサラ（Uppsala）、スウェーデン）により推奨されるように、ＢＩＡｃｏｒｅチップの単一チャネルに固定化した。尿ＰＲ３を含むＩＬ−３２アフィニティカラムからの溶出画分３のアリコートを、１０、２０、３０、４０および８０ｎＭの濃度にし、ＢＩＡｃｏｒｅシステムによって解析した。結合データによって、２．６５×１０-8ＭのｋＤが得られた（図２Ａ）。同様の解析を、ＰＭＳＦ（１ｍＭ）によって不活性化したＰＲ−３で実施した。（図２Ｂ）。得られたｋＤは７．９×１０-8Ｍであった。同様の解析を、市販ヒト好中球由来ＰＲ−３（アセンズ・リサーチ・アンド・テクノロジー、アセンズ、ジョージア州、２０μｌゼラチン溶液中０．５μｇ）で実施した（図３Ａ）。得られたｋＤは、１．２×１０-8Ｍであった。結合をＰＭＳＦによって不活性化した市販ＰＲ−３にて繰り返した（図３Ｂ）。得られたｋＤは、３．５×１０-8Ｍであった。
【０１６７】
チップは再利用不可能であり、これは、ＩＬ−３２が、ＰＲ３によってチップから切断されることを示唆している。
【０１６８】
得られた結果は、ＰＭＳＦによってプレインキュベートしたＰＲ−３が依然として高親和力でＩＬ−３２に結合しているので、ＩＬ−３２のＰＲ−３への結合は、後者の酵素活性に依存しないことを示している。
【０１６９】
実施例４
ＩＬ−３２の放射活性標識化
先行する実施例は、ＩＬ−３２がＰＲ−３に対する基質であることを示している。ＩＬ−３２分解におけるＰＲ−３の触媒活性を調査するために、放射活性標識化ＩＬ−３２を以下のように調製した。
【０１７０】
ＩＬ−３２（６０μｌリン酸緩衝液ｐＨ７．４中１５μｇ）を、クロラミンＴ法の改変法を用いてヨウ素化した。簡単に記すと、クロラミンＴ（５０μｌ、Ｈ2Ｏ中１ｍｇ／ｍｌ）および１ｍＣｉ［125Ｉ］−ＮａＩ（１０μｌ）の混合液を、４℃にて２０秒間インキュベートし、ＩＬ−３２調製物に添加し、４℃にてさらに２０秒間。反応を、メタ亜硫酸水素ナトリウム（５ｍｇ／ｍｌのストックの５０μｌ）とヨウ化カリウム（５ｍｇ／ｍｌのストックの５０μｌ）の添加によって停止した。放射活性標識化ＩＬ−３２を、まず０．０２５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中の０．２５％ゼラチン（すなわちゼラチン溶液）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラム（ファルマシア）で、遊離ヨウ素から分離した。６つの１ｍｌ画分を、ゼラチン溶液を用いて回収した。画分３および４が、125Ｉ−ＩＬ−３２の標識のピークを含有した（特異的活性〜２×１０5ｃｐｍ／ｎｇ）。
【０１７１】
実施例５
尿ＰＲ−３による125Ｉ−ＩＬ−３２の分解の速度論
以下の実験を、ＰＲ−３によるＩＬ−３２分解の速度論を探索するために実施した。
【０１７２】
アフィニティ精製尿ＰＲ−３（実施例１由来の溶出画分３（図１）、５０μｌ）を、125Ｉ−ＩＬ−３２（１０μｌのゼラチン溶液中２５０，０００ｃｐｍ）に加え、０、１、５、１５、３０および６０分間、３７℃にてインキュベートした（図４）。分解を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液の添加によって、そして１０分間の煮沸によって停止させた。種々の期間（０〜６０分間）にてインキュベートした、125Ｉ−ＩＬ−３２およびＰＲ−３を含む試料を、還元条件下、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。ゲルを乾燥させ、オートラジオグラフィーした。図４に要約した結果は、完全ＩＬ−３２を表している２０ｋＤａのバンドの減少（図４、レーン１）と、ＰＲ−３との１分間のインキュベーション後の１６および１３ｋＤａＩＬ−３２切断産物のレベルの増加（図４、レーン２）とを示す。ＰＲ−３とのインキュベーション５分後に、２０ｋＤａバンドが完全に消失し、１６および１３ｋＤａＩＬ−３２切断産物のレベルが増加したこと（レーン３）、および高いレベルの１６および１３ｋＤａＩＬ−３２断片が、最大で６０分間安定して残っていること（図４、レーン３、４、６および７）がわかった。
【０１７３】
本発明者らは、４℃にて一晩の、ＰＲ−３とのＩＬ−３２のインキュベーションが、結果として完全な消化となり、１０ｋＤａマーカー（ゲルの限界）より大きな産物は観察されなかった（データは示していない）ことを見出した。
【０１７４】
実施例６
尿および市販ＰＲ−３による125Ｉ−ＩＬ−３２の切断の速度論
図５で示した実験は、尿または市販ＰＲ−３いずれかと、ＩＬ−３２の最大で５分間のインキュベーションに制限したことを除いて、本質的に実施例５で記載したように実施した。
【０１７５】
尿ＰＲ−３または市販ＰＲ−３（アセンズ・リサーチ・アンド・テクノロジー）を、０、１および５分間、125Ｉ−ＩＬ−３２とともにインキュベートした。消化を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液を加えること、および１０分間煮沸することによって停止した。試料を、還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。ゲルを乾燥させ、オートラジオグラフィーした。図５に要約した結果は、市販ＰＲ−３が、尿ＰＲ−３よりも強力であり、１分間以内に２０ｋＤａＩＬ−３２バンドの完全な消失を引き起こした（レーン６をレーン２と比較）ことを示している。この差違はおそらく、尿対市販ＰＲ３の異なる特異的活性による。
【０１７６】
実施例７
フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）によるＰＲ−３のタンパク質分解活性の阻害−一般的なセリンプロテアーゼ阻害剤
以下の実験は、ＰＲ−３とのインキュベーションの後の分解が、ＰＲ−３のタンパク質分解活性によるものであることを証明するために実施した。
【０１７７】
図６で示した実験は、ＰＲ−３を、125Ｉ−ＩＬ−３２とのインキュベーション前に、ＰＭＳＦでプレインキュベート（１ｍＭの最終濃度、１０分間、３７℃）したことを除いて、実施例５および６にて記載したように実施した。ＰＭＳＦは、尿および市販ＰＲ−３のＩＬ−３２を処理する能力を完全に廃止した。活性ＰＲ−３（それぞれ、尿および市販ＰＲ−３に関して、レーン１、２および９、１０）に対して、ＩＬ−３２とインキュベートしたＰＭＳＦで前処理したＰＲ−３では、切断産物は観察されなかった（図６、レーン３、４、７、８）。
【０１７８】
実施例８
ＩＬ−３２の活性におけるＰＲ−３の効果
先行する実施例にて得られた結果は、ＰＲ−３が、高い親和力でＩＬ−３２に結合し、数分以内にＩＬ−３２を切断することを示す。以下の実験は、ＩＬ−３２の生物学的活性におけるＰＲ−３の効果を調査するために実施した。
【０１７９】
マウスマクロファージＲａｗ２６４．７細胞株（American Type Culture Collectioin、ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で維持した。バイオアッセイは９６ウェルプレート中で実施した。簡単に記すと、Ｒａｗ細胞（５×１０5／ｍｌ、０．１ｍｌ／ウェル）を播き、細胞がプレートに接着するまで培養した。培養液を取り除き、ついで細胞を異なる濃度のＩＬ−３２、またはＰＲ−３で前処理したＩＬ−３２を含む新鮮な培地（ＦＣＳなし）で、５μｇ／ｍｌのＬＰＳブロッカーポリミキシンＢ（ベッドフォード・ラボラトリーズ（Bedford Laboratories）、ベッドフォード、オハイオ州）の存在下、室温にて５分間刺激した。プレートを、５％ＣＯ2にて３７℃で１６〜２０時間インキュベートし、ついで培養上清を回収して、細胞培養によって放出されたＭＩＰ−２を測定した。結果を図７に要約しており、ＰＲ−３−前処理ＩＬ−３２が、非前処理ＩＬ−３２と比較して、Ｒａｗ２６４．７細胞におけるＭＩＰ−２の産生を増強することが示されている。
【０１８０】
ＰＲ−３での前処理によるＩＬ−３２活性の同様の増強が、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）にて実施した実験で見られた。ＰＢＭＣは、先に記載されたように調製し［Kim,2005 #36］、９６ウェルプレート中に、５×１０5細胞／ウェルの濃度にて播いた。ＩＬ−３２およびＰＲ−３で前処理したＩＬ−３２での刺激の実験設定は、マウスＲａｗ細胞に関して上述したのと同一であった。ＩＬ−３２またはＰＲ−３にて前処理したＩＬ−３２のいずれかでのヒトＰＢＭＣ細胞の刺激後、培養上清を回収して、細胞によって放出されたヒトＩＬ−８を測定した。結果を図８に要約しており、ＰＲ−３−前処理ＩＬ−３２が、非前処理ＩＬ−３２と比較して、ヒトＰＢＭＣ細胞中のＩＬ−８の産生を増強することを示している。
【０１８１】
実施例９
ＰＲ−３断片調製および活性
ＰＲ３（シグマ（Sigma））を、ＣＮＢｒによる切断の前に還元し、アルキル化した。還元およびアルキル化：ＤＴＴ（１８μｌ、５０ｍＭ）をＰＲ３試料（９０μｇ、１ｍｇ／ｍｌ）に加え、５６℃にて１時間インキュベートした。ヨードアセトアミド（６０μｌ、１００ｍＭ）を加え、混合物を暗中室温にて４５分間インキュベートした。反応をＤＴＴ（３３．６μｌ、５０ｍＭ）によって停止した。試料を乾燥させ、７０μｌギ酸中で再構築した。固体臭化シアン（ＣＮＢｒ）を室温、暗中で４８時間加えた。ＣＮＢｒ脱塩を、取扱説明書にしたがって、Ｃ１８Ｚｉｐ−チップで実施した。ペプチド混合物を質量分析（Ｍａｌｄｉ）にかけ、２つのペプチドの形成が示された。
【０１８２】
ＰＲ３の他の試料を還元、アルキル化およびＣＮＢｒにて切断した。得られたペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣ（シグマ・ディスカバリー（Sigma Discovery）ＢＩＯ  Ｗｉｄｅ  Ｐｏｒｅ  Ｃ８  ＨＰＬＣカラム、５μｍ粒子サイズ、５ｃｍ×４ｍｍ）によって分離した。成熟ＰＲ−３が３つのメチオニンを有するので、最大で４つのペプチドが、ＣＮＢｒ切断によって形成されることが予想される。Ｎ−末端１６７８Ｋｄａペプチド、５４９および１１７１２Ｋｄａペプチド、およびＣ−末端１１１８７Ｋｄａペプチド。
【０１８３】
各ペプチドのＩＬ−３２に対する親和力を、完全な酵素学的に活性なＰＲ３のＩＬ３２に対する親和力、および完全な酵素学的に不活性なＰＲ３のＩＬ３２に対する親和力と比較して、ＢＩＡＣＯＲＥによって決定した。
【０１８４】
ついでペプチドを、ＩＬ−３２の生物学的活性の阻害に関して試験した。
【０１８５】
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【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したＩＬ−３２固定アフィニティクロマトグラフィーカラムから溶出された尿タンパク質の画分を示す。ＩＬ−３２は、Ａｆｆｉｇｅｌ１５樹脂に固定化し、５００Ｌの尿からの濃縮尿タンパク質を樹脂に通過させ、樹脂を洗浄し、樹脂結合タンパク質を、１ｍｌ画分で、ｐＨ２．２緩衝液によって溶出した。種々の画分由来のアリコート（６０μｌ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％アクリルアミド；非還元条件）で分離し、ゲルを銀染色した。レーン１は洗浄画分であり、レーン２〜６はそれぞれ溶出画分１〜５であり、レーン７は、分子量マーカーを示しており、右側に（ｋＤａで）示している。図中の矢印は、主に画分３中に溶出され、ＰＲ−３として同定された、３０±２ｋＤａのＩＬ−３２結合タンパク質を示している。
【図２】Ａ〜Ｂは、表面プラズモン共鳴によって測定された、ヒトＩＬ−３２に結合するヒト尿ＰＲ−３の速度論を示す。Ａ：酢酸緩衝液ｐＨ４．６中のＩＬ−３２（２０μｇ／ｍｌ）を、製造業者（アマシャム・ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）によって推奨されたように、ＢＩＡｃｏｒｅチップの単一チャネルに固定化した。ＩＬ−３２アフィニティカラムからの溶出画分３のアリコートを、１０、２０、３０、４０および８０ｎＭ（それぞれ一番下から一番上までの結合曲線）の濃度とし、ＢＩＡｃｏｒｅシステムによって解析した。結合データによって、２．６５×１０-8ＭのｋＤが得られた。Ｂ：同様の解析を、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）によって不活性化したＰＲ−３で実施した。得られたｋＤは、７．９×１０-8Ｍであった。
【図３】Ａ〜Ｂは、表面プラズモン共鳴によって測定された、ヒトＩＬ−３２へ結合する市販ヒトＰＲ−３の速度論を示す。詳細は図２を参照のこと。結合データによって、固定化ＩＬ−３２を大量に分解した活性ＰＲ−３にて、１．２×１０-8ＭのｋＤが得られた（Ａ）。ＰＭＳＦによって不活性化した市販ＰＲ−３のｋＤは、３．５×１０-8Ｍであった（Ｂ）。
【図４】尿ＰＲ−３による、125Ｉ−ＩＬ−３２の消化の速度論を示している。レーン１は、分離した未消化125Ｉ−ＩＬ−３２を示しており、レーン５は分子量マーカー（ｋＤａで、図の右側を参照のこと）であり、レーン２〜４および６〜７はそれぞれ、３７℃にて１、５、１５、３０および６０分間の、ＰＲ−３とのインキュベーション後の125Ｉ−ＩＬ−３２を示している。ＰＲ−３との１分間のインキュベーション後、２０ｋＤａ  ＩＬ−３２（レーン１）が、１６および１３ｋＤａの２つの切断産物に切断された（レーン２）。５分後、完全ＩＬ−３２に相当するバンドが消え（レーン３）、切断産物が、少なくとも６０分間安定して残った（レーン３、４、６および７）。見かけの分子量２０ｋＤａ、１６ｋＤａおよび１３ｋＤａの得られた125Ｉ−ＩＬ−３２断片を、図の左側に示している。
【図５】尿および市販ＰＲ−３によるＩＬ−３２の切断の比較を示す。実験は、ＰＲ−３およびＩＬ−３２のインキュベーションを５分までに制限し、尿および市販両方のＰＲ−３を使用したことを除いて、本質的に図４（実施例５）で示したように実施した。尿（レーン１〜３）または市販ＰＲ−３（レーン５〜７）を、０、１および５分間、125Ｉ−ＩＬ−３２とともにインキュベートした。結果は、２０ｋＤａ  ＩＬ−３２が１分後にその１６および１３ｋＤａ断片に完全に切断されたので、市販ＰＲ−３が尿由来ＰＲ−３よりも効率的であることを示している（レーン６と２とを比較する）。
【図６】セリンプロテアーゼ阻害剤であるフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）が、尿および市販ＰＲ３両方の酵素的活性をブロックし、ＩＬ−３２の切断をブロックする。レーン１〜４は、ＰＭＳＦで処理しないか（レーン１および２）、または前処理したか（レーン３および４）いずれかの、１および５分間、尿ＰＲ−３とともにインキュベーションした後の125Ｉ−ＩＬ−３２を示す。レーン７〜１０は、ＰＭＳＦで処理しないか（レーン９および１０）、または前処理したか（レーン７および８）いずれかの、１および５分間、市販ＰＲ−３とともにインキュベーションした後の125Ｉ−ＩＬ−３２を示す。分子量マーカー（ｋＤａにて、レーン５）を右側に示す。レーン６は、未消化125Ｉ−ＩＬ−３２を示す。図は、インキュベーション１および５分後の、尿および市販ＰＲ−３によるＩＬ−３２の切断の程度を示しており（レーン１および５は尿に関して、９および１０は市販に関して）、ＰＭＳＦが、市販および尿ＰＲ−３両方によるＩＬ−３２切断を完全にブロックしたことを示している。
【図７】マウスＲａｗ２６４．７細胞における、ＰＲ−３で前処理したＩＬ−３２の増強された生物学的活性を示す。マウスマクロファージＲａｗ２６４．７細胞株を、９６ウェルプレート中に播き、ＩＬ−３２（２０または２００ｎｇ／ｍｌ）とともに、ＰＲ−３（１００ｎｇ／ｍｌ）で５分間前処理したＩＬ−３２とともに、または対照としてＰＲ−３のみでインキュベートし、細胞培養培地中に分泌されたＭＩＰ−２を測定した。図に要約された結果は、ＩＬ−３２が、Ｒａｗ２６４．７細胞によるＭＩＰ−２の分泌を誘導したこと、および細胞の処理前に５分間、ＰＲ−３とＩＬ−３２をプレインキュベーションすること（２０ｋＤａ  ＩＬ−３２を１６および１３ｋＤａ断片に切断することが図４〜６にて示された）が、ＭＩＰ−２分泌を増強することを示している。ＰＲ−３のみは細胞において何の効果も示さなかった。
【図８】ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における、ＰＲ−３で前処理したＩＬ−３２の増強された生物学的活性を示している。ヒトＰＢＭＣ細胞を９６ウェルプレート中に播き、ＩＬ−３２（２０または２００ｎｇ／ｍｌ）とともに、５分間ＰＲ−３（１００ｎｇ／ｍｌ）と前処理したＩＬ−３２とともに、または対照としてＰＲ−３のみにてインキュベートした。細胞培養培地中へのＩＬ−８の含量を測定した。結果は、ＩＬ−３２が、ヒトＰＢＭＣ細胞中のＩＬ−８の分泌を誘導すること、および細胞処理の前のＰＲ−３との５分間のインキュベーション（図４〜６にて、完全なＩＬ−３２分解を誘導することが示された）が、ＩＬ−８分泌を増強したことを示している。ＰＲ−３のみでの細胞のインキュベーションはマウス細胞におけるＩＬ−８を誘導しなかった。
【図２】
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【図３】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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