(57)【要約】  本開示は、一態様では、体重および体脂肪の減少の治療および／または予防、悪液質の予防または治療、食欲の刺激、食物摂取の刺激、体重増加の刺激、または体脂肪量増大、または除脂肪体重増大の１つ以上のための薬剤を調製するためのグレリンスプライス変異体またはその類似体の使用に関する。別の態様は、このような治療を必要とする個体において癌悪液質を予防または治療するための薬剤を調製するためのグレリンスプライス変異体様化合物の使用に関する。別の態様は、前記薬剤の皮下投薬を個体に投与することによって、個体において悪液質を予防または治療するための薬剤を調製するためのグレリンスプライス変異体様化合物の使用に関する。さらなる態様は、前記薬剤の皮下投薬を個体に投与することによって、個体において食欲を刺激するための薬剤を調製するためのグレリンスプライス変異体様化合物または医薬的に許容可能なその塩の使用に関する。さらなる態様は、いくつかの新しいグレリンスプライス変異体様化合物とそれらの使用、ならびに新しいグレリンスプライス変異体様化合物を含んでなる医薬組成物と医療包装に関する。
2009530277.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式、
Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２
（式中、
Ｚ１は場合により存在する保護基であり；各Ｘ１は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され；Ｘ２は天然アミノ酸および合成アミノ酸から選択され、前記アミノ酸はかさ高い疎水性基で修飾され；各Ｘ３は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され、Ｘ１およびＸ３の１つ以上は場合によりかさ高い疎水性基で修飾されてもよく；Ｚ２は場合により存在する保護基であり；ｍは１〜１０の範囲内の整数であり；ｎは４〜９２の範囲内の整数であり；ただし式Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物はアミノ酸１５〜９４個の長さであり、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する）で表されるグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項２】
Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物が、配列番号１と少なくとも８５％の相同性を有する、請求項１に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項３】
Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物が、配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する、請求項２に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項４】
Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物が、配列番号１と少なくとも９５％の相同性を有する、請求項３に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項５】
Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物が、配列番号１と少なくとも９８％の相同性を有する、請求項４に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項６】
前記化合物がアミノ酸２２〜２９個の長さである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項７】
前記かさ高い疎水性基がアシル基または脂肪酸基である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項８】
前記アシル基がＣ１〜Ｃ３５アシル基である、請求項７に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項９】
前記アシル基がＣ７〜Ｃ１２アシル基である、請求項８に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項１０】
前記化合物が、式、Ｚ１−Ｇｌｙ−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２、Ｚ１−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２、またはＺ１−Ｇｌｙ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項１１】
（Ｘ１）ｍが、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ、Ｇｌｙ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ、Ｇｌｙ−Ａｓｎ、Ｇｌｙ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ−Ｔｈｒ、またはＧｌｙ−Ｔｙｒである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項１２】
（Ｘ２）が、修飾Ｓｅｒ、修飾Ｃｙｓ、修飾Ａｓｐ、修飾Ｌｙｓ、修飾Ｔｒｐ、修飾Ｐｈｅ、修飾Ｉｌｅ、または修飾Ｌｅｕである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項１３】
（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）が、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｓｅｒ＊、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｄｐｒ＊、またはＧｌｙ−Ｘａａ−Ｃｙｓ＊（式中、＊はアミノ酸残基がかさ高い疎水性基で修飾されていることを示し、Ｘａａは任意の天然アミノ酸または合成アミノ酸である）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項１４】
ＸａａがＳｅｒである、請求項１３に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項１５】
（Ｘ３）ｎが配列番号６の断片を含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項１６】
前記化合物が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５で記載されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項１７】
前記化合物の第２のまたは第３のアミノ酸がオクタノイル基で修飾される、請求項１６に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項１８】
Ｚ１が、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０置換アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０置換アルケニル、アリール、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアリール、Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）−ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ（Ｏ）−アリール、Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６−アルキル）、およびＣ（Ｏ）−Ｏ−アリールからなる群から選択される、請求項１〜５または１６〜１７のいずれか一項に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項１９】
Ｚ２が、アミド、メチルアミド、およびエチルアミドからなる群から選択される、請求項１〜５または１６〜１７のいずれか一項に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項２０】
前記ＧＨＳ受容体ＧＨＳ−Ｒ  １ａに結合する、請求項１〜５または１６〜１７のいずれか一項に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項２１】
前記化合物がＧＨＳ−Ｒ  １ａに対して５００ｎＭ未満のＥＣ５０力価を有する、請求項２０に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項２２】
前記化合物が５００ｎＭ未満の解離定数を有する、請求項２０に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項２３】
前記化合物がグレリンの機能活性の少なくとも約５０％を有する、請求項１〜５または１６〜１７のいずれか一項に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項２４】
前記機能活性が、Ｇｑ／Ｇ１１の活性化、イノシトールホスフェート蓄積、細胞内貯蔵からのカルシウム動員、ＭＡＰキナーゼの活性化または不活性化、ＮＦκＢ転位、ＣＲＥ駆動遺伝子転写、アレスチンとグレリン受容体との結合、またはその組み合わせである、請求項２３に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項２５】
前記化合物がポリマー分子に抱合する、請求項１〜５または１６〜１７のいずれか一項に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項２６】
前記ポリマー分子が、ポリ酸化アルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリ−ビニルアルコール、ポリ−カルボキシレート、ポリ−（ビニルピロリドン）、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、およびデキストランからなる群から選択される、請求項２５に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項２７】
前記化合物が化学的に反応性の基で修飾される、請求項１〜５または１６〜１７のいずれか一項に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項２８】
前記化学的に反応性の基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミド、マレイミド−ベンゾイル−スクシンイミド、γ−マレイミド−ブチリルオキシスクシンイミドエステル、およびマレイミドプロピオン酸からなる群から選択される、請求項２７に記載のグレリンスプライス変異体様化合物。
【請求項２９】
請求項１〜５または１６〜１７のいずれか一項に記載のグレリンスプライス変異体様化合物を含んでなる医薬組成物。
【請求項３０】
医薬的に許容可能なキャリア、ビヒクル、賦形剤、輸送分子、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはその組み合わせをさらに含んでなる、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
少なくとも２つの異なるグレリンスプライス変異体様化合物の混合物を含んでなる、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
医薬的に許容可能な量の
（ａ）グレリンスプライス変異体、
（ｂ）式、
Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２
（式中、
Ｚ１は場合により存在する保護基であり；各Ｘ１は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され；Ｘ２は天然アミノ酸および合成アミノ酸から選択され、前記アミノ酸はかさ高い疎水性基で修飾され；各Ｘ３は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され、Ｘ１およびＸ３の１つ以上は場合によりかさ高い疎水性基で修飾されていてもよく；Ｚ２は場合により存在する保護基であり；ｍは１〜１０の範囲内の整数であり；ｎは４〜９２の範囲内の整数であり；ただし、式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物はアミノ酸１５〜９４個の長さであり、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する）で表される、グレリンスプライス変異体様化合物、または
（ｃ）その混合物
をそれを必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる、悪液質を治療する方法。
【請求項３３】
前記グレリンスプライス変異体様化合物が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記グレリンスプライス変異体が、配列番号１、配列番号７、配列番号８、またはそのアミノ酸１５個以上のペプチドであり、さらにグレリンスプライス変異体が、場合により少なくとも１つの翻訳後修飾を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物が、皮下、経口、静脈内、鼻腔内、局所、または経皮投与のために調合される、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物が、食事前または食事中に投与される、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物が、体重１ｋｇあたり１０ｎｇ〜１０ｍｇの範囲のグレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物に相当する濃度で投与される、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物が、体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１ｍｇの範囲のグレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物に相当する濃度で投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物が、食事前または食事中にボーラスとして投与され、前記ボーラスが０．３μｇ〜６ｇの範囲に相当する量のグレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物またはその塩を含んでなる、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物が毎日１〜３回投与され、各投与が食事中または最大限でも食事前１８０分である、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記悪液質が異化作用障害または食欲不振障害によって引き起こされる、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記哺乳類が、肺癌、膵臓癌、肝臓癌、内分泌癌、卵巣癌、乳癌、白血病、および消化管癌からなる群から選択される癌を患っている、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記悪液質が固形腫瘍によって引き起こされる、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物が、食欲調節剤と組み合わされて投与される、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記食欲調節剤が、ＧＨ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦＢＰ−３、またはＡＬＰである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物が、化学療法薬剤、放射線療法、または外科治療と組み合わされて投与される、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物の投与が、食欲の刺激、食物摂取の刺激、体重増加または体重維持の刺激、体脂肪量増大、除脂肪体重増大、またはその組み合わせをもたらす、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
食欲の刺激が、食欲、空腹感、または満腹レベルを測定するための視覚的アナログ尺度によって測定される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
食欲の刺激が、刺激前の食欲と比較して少なくとも５％高い食欲を生じる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
食物摂取の刺激が、刺激前の食物摂取と比較して少なくとも１％高い食物摂取を生じる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
食物摂取の刺激が、刺激前のカロリー摂取と比較して少なくとも１％高いカロリー摂取を生じる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
医薬的に許容可能な量のプロゲステロン剤；分枝鎖アミノ酸；オキサンドラリン；抗ＴＮＦ−α剤；テストステロン；免疫栄養剤、抗酸化剤、およびＣＯＸ２阻害剤を含んでなるカクテル；カンナビノイド；エイコサペンタエン酸；メラトニン；サリドマイド；β２アドレナリン作動薬；抗炎症化合物；エリスロポエチン；アンギオテンシンＩＩ低下剤；アンドロゲン受容体調節因子；レプチン；オピオイド受容体作用薬；ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ作用薬；またはその混合物を投与するステップをさらに含んでなる、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
医薬的に許容可能な量の抗うつ薬、制吐薬、抗精神病薬、抗不安剤、またはその混合物を投与するステップをさらに含んでなる、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
投与するステップの後に、化合物（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の投与の効果をモニタリングするさらなるステップを含んでなる、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記モニタリングが、グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物活性の少なくとも１つのマーカーを測定することによって達成される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
少なくとも１つのマーカーが、ＧＨ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦＢＰ−３、ＡＬＰ、甲状腺ホルモン、性ホルモン、インシュリンレベル、グルコースレベル、およびアルブミンからなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記哺乳類がヒトである、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
医薬的に許容可能な量の
（ａ）グレリンスプライス変異体、
（ｂ）式、
Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２
（式中、
Ｚ１は場合により存在する保護基であり；各Ｘ１は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され；Ｘ２は天然アミノ酸および合成アミノ酸から選択され、前記アミノ酸はかさ高い疎水性基で修飾され；各Ｘ３は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され、Ｘ１およびＸ３の１つ以上は場合によりかさ高い疎水性基で修飾されてもよく；Ｚ２は場合により存在する保護基であり；ｍは１〜１０の範囲内の整数であり；ｎは４〜９２の範囲内の整数であり；ただし、式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物はアミノ酸１５〜９４個の長さであり、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する）で表されるグレリンスプライス変異体様化合物、または
（ｃ）その混合物
をそれを必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる、悪液質を予防する方法。
【請求項５９】
医薬的に許容可能な量の
（ａ）グレリンスプライス変異体、
（ｂ）式、
Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２
（式中、
Ｚ１は場合により存在する保護基であり；各Ｘ１は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され；Ｘ２は天然アミノ酸および合成アミノ酸から選択され、前記アミノ酸はかさ高い疎水性基で修飾され；各Ｘ３は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され、Ｘ１およびＸ３の１つ以上は場合によりかさ高い疎水性基で修飾されてもよく；Ｚ２は場合により存在する保護基であり；ｍは１〜１０の範囲内の整数であり；ｎは４〜９２の範囲内の整数であり；ただし、式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物はアミノ酸１５〜９４個の長さであり、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する）で表されるグレリンスプライス変異体様化合物、または
（ｃ）その混合物
をそれを必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる、食欲、食物摂取、および／または体重増加の刺激のための方法。
【請求項６０】
医薬的に許容可能な量の
（ａ）グレリンスプライス変異体、
（ｂ）式、
Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２
（式中、
Ｚ１は場合により存在する保護基であり；各Ｘ１は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され；Ｘ２は天然アミノ酸および合成アミノ酸から選択され、前記アミノ酸はかさ高い疎水性基で修飾され；各Ｘ３は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され、Ｘ１およびＸ３の１つ以上は場合によりかさ高い疎水性基で修飾されてもよく；Ｚ２は場合により存在する保護基であり；ｍは１〜１０の範囲内の整数であり；ｎは４〜９２の範囲内の整数であり；ただし、式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物はアミノ酸１５〜９４個の長さであり、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する）で表されるグレリンスプライス変異体様化合物）、または
（ｃ）その混合物
をそれを必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる、脂肪異栄養症を治療する方法。
【請求項６１】
医薬的に許容可能な量の
（ａ）グレリンスプライス変異体、
（ｂ）式、
Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２
（式中、
Ｚ１は場合により存在する保護基であり；各Ｘ１は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され；Ｘ２は天然アミノ酸および合成アミノ酸から選択され、前記アミノ酸はかさ高い疎水性基で修飾され；各Ｘ３は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され、Ｘ１およびＸ３の１つ以上は場合によりかさ高い疎水性基で修飾されてもよく；Ｚ２は場合により存在する保護基であり；ｍは１〜１０の範囲内の整数であり；ｎは４〜９２の範囲内の整数であり；ただし、式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物はアミノ酸１５〜９４個の長さであり、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する）で表されるグレリンスプライス変異体様化合物、または
（ｃ）その混合物
をそれを必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる、脂肪異栄養症を予防する方法。
【請求項６２】
医薬的に許容可能な量のレプチン、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体作用薬、レニン−アンギオテンシン作用薬、オピオイド受容体作用薬、脱アシルグレリンスプライス変異体、アディポネクチン、ｈＧＨ、またはその混合物を投与するステップをさらに含んでなる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
（ａ）グレリンスプライス変異体、
（ｂ）式、
Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２
（式中、
Ｚ１は場合により存在する保護基であり；各Ｘ１は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され；Ｘ２は天然アミノ酸および合成アミノ酸から選択され、前記アミノ酸はかさ高い疎水性基で修飾され；各Ｘ３は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され、Ｘ１およびＸ３の１つ以上は場合によりかさ高い疎水性基で修飾されてもよく；Ｚ２は場合により存在する保護基であり；ｍは１〜１０の範囲内の整数であり；ｎは４〜９２の範囲内の整数であり；ただし、式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物はアミノ酸１５〜９４個の長さであり、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する）で表されるグレリンスプライス変異体様化合物、または
（ｃ）その混合物
を含んでなる、医薬的に許容可能な量の分泌促進物質を、それを必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる、悪液質および／または食欲不振症および／または食欲不振症−悪液質および／または栄養失調および／または脂肪異栄養症および／または食欲−刺激を治療する方法であって、
治療が悪液質の予防または治療、脂肪異栄養症の予防または治療、食欲の刺激、食物摂取の刺激、体重増加の刺激、体脂肪量増大、除脂肪体重増大、またはその組み合わせからなる群から選択される、方法。
【請求項６４】
医薬的に許容可能な量の
（ａ）グレリンスプライス変異体、
（ｂ）式、
Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２
（式中、
Ｚ１は場合により存在する保護基であり；各Ｘ１は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され；Ｘ２は天然アミノ酸および合成アミノ酸から選択され、前記アミノ酸はかさ高い疎水性基で修飾され；各Ｘ３は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され、Ｘ１およびＸ３の１つ以上は場合によりかさ高い疎水性基で修飾されてもよく；Ｚ２は場合により存在する保護基であり；ｍは１〜１０の範囲内の整数であり；ｎは４〜９２の範囲内の整数であり；ただし、式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物はアミノ酸１５〜９４個の長さであり、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する）で表されるグレリンスプライス変異体様化合物、または
（ｃ）その混合物
をそれを必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる、筋肉消耗を治療する方法。
【請求項６５】
医薬的に許容可能な量の
（ａ）グレリンスプライス変異体、
（ｂ）式、
Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２
（式中、
Ｚ１は場合により存在する保護基であり；各Ｘ１は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され；Ｘ２は天然アミノ酸および合成アミノ酸から選択され、前記アミノ酸はかさ高い疎水性基で修飾され；各Ｘ３は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され、Ｘ１およびＸ３の１つ以上は場合によりかさ高い疎水性基で修飾されてもよく；Ｚ２は場合により存在する保護基であり；ｍは１〜１０の範囲内の整数であり；ｎは４〜９２の範囲内の整数であり；ただし、式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物はアミノ酸１５〜９４個の長さであり、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する）で表されるグレリンスプライス変異体様化合物、または
（ｃ）その混合物
をそれを必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる、筋肉消耗を予防する方法。
【請求項６６】
（ａ）医薬的に許容可能な量の
（１）グレリンスプライス変異体、
（２）式、
Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２
（式中、
Ｚ１は場合により存在する保護基であり；各Ｘ１は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され；Ｘ２は天然アミノ酸および合成アミノ酸から選択され、前記アミノ酸はかさ高い疎水性基で修飾され；各Ｘ３は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され、Ｘ１およびＸ３の１つ以上は場合によりかさ高い疎水性基で修飾されてもよく；Ｚ２は場合により存在する保護基であり；ｍは１〜１０の範囲内の整数であり；ｎは４〜９２の範囲内の整数であり；ただし、式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物はアミノ酸１５〜９４個の長さであり、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する）で表されるグレリンスプライス変異体様化合物、または
（３）その混合物
を含んでなる剤形、および
（ｂ）場合により（ａ）を投与するための説明書
を含んでなる、グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物を投与するためのキット。
【請求項６７】
（ａ）請求項１のグレリンスプライス変異体様化合物をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなるｃＤＮＡを提供するステップと、
（ｂ）ｃＤＮＡがプロモーターと作動的に結合するように、前記ｃＤＮＡを発現ベクターに挿入するステップと、
（ｃ）前記発現ベクターを宿主細胞に導入し、それによって前記宿主細胞が前記グレリンスプライス変異体様化合物を生成するステップと、
（ｄ）場合によりステップ（ｃ）で生成されたグレリンスプライス変異体様化合物を回収するステップ
を含んでなる、グレリンスプライス変異体様化合物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によって全体を本明細書に援用する２００６年３月１３日に出願されたU.S. Provisional Application No. 60/781,860の優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、悪液質および／または脂肪異栄養症および／または筋肉消耗およびそれに関連する病状を治療または予防するための化合物に関する。
【背景技術】
【０００３】
グレリンは齧歯類において食物摂取、体重増加、および脂肪過多症を誘発する生理活性ペプチドである（非特許文献１、非特許文献２）。グレリンの急性投与は、健康な男女（非特許文献３）（非特許文献４）ならびに食欲不振症がある癌患者（非特許文献５）において食物摂取を誘発する。グレリンの反復投与は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）がある悪液質の患者において、除脂肪体重、体重、および食物摂取を増大させ（非特許文献６）、慢性心不全の患者において筋肉消耗を改善した（非特許文献７）。同様の効果はまた、マウスモデルでも示された（非特許文献８）。
【０００４】
腫瘍生育は、食欲不振症−悪液質症候群の発症をもたらす可能性のある、顕著な代謝および神経化学的変化と関連付けられている。食欲不振症は摂食要求の喪失と定義され、一方、悪液質は、骨格筋重量の、およびより少ない程度に脂肪組織の進行性消耗に起因し、体重減少が明らかになる前でさえ起きる。癌食欲不振症−悪液質症候群は癌患者の間で非常に蔓延しており、罹患率および死亡率に対して大きな影響を与えて、患者の生活の質を侵害する。しかしその臨床的関連性は見過ごされることが多く、治療は通常、疾患のかなり進行した段階においてのみ試みられる（非特許文献９）。
【０００５】
グレリンは食事前の状況において分泌され、食事の１〜２時間前に始まって、食事前にグレリンの血漿レベルに鋭い短時間の急上昇をもたらし、食事開始後少しの間持続する。グレリンは既知の唯一の末梢性に生成される食欲促進（食欲を促す）物質であるので、グレリンの血漿レベルの増大は、食事開始のために重要であると考えられる。
【０００６】
食欲の主要開始剤としてのその役割において、胃腸（ＧＩ）管の粘膜中の内分泌細胞から放出されたグレリンは、癌悪液質に関するセクションにおいて後述するように、局所性にパラクリン物質として、また中枢性にホルモンとしてのいずれかで作用してもよい。
【０００７】
ＧＨＲＬ（グレリン）遺伝子は、選択的スプライスによる転写物、プレプロペプチドの様々なタイプの切断、および様々な翻訳後修飾に起因する、多様な生成物をコードする（非特許文献１０、非特許文献１１）。さらに、異なる分解生成物が様々な組織によって生成される（非特許文献１２）。これらのＧＨＲＬ生成物のいくつかについて本明細書に記載する。
【０００８】
グレリンは、アミノ酸１１７個のプレプログレリンからのシグナルおよびプロペプチドの切断、およびアシル化現象によってもたらされる、第３のセリンにｎ−オクタノイル側鎖があるアミノ酸２８個のペプチドである。グレリンのアシル化Ｎ−末端は、内分泌機能のために必須である（非特許文献１３、非特許文献１４）。内分泌機能を欠く脱アシルグレリンは、生体外グルコース放出に対するグレリンの機能に対して、拮抗的効果を与えることが示されている（非特許文献１５）。選択的スプライスによるグレリンｍＲＮＡはアミノ酸１１６個のプレプロペプチドをコードし、それはさらに処理されて脱Ｇｌｎ１４−グレリンとアミノ酸２７個のペプチドになる（非特許文献１６）。別のペプチドであるオベスタチンはプレプログレリンから切断されて、処理済グレリンペプチドと配列重複部分を有さない。このペプチドはアシル化グレリンに対していくらかの拮抗効果を与え、食物摂取および体重増加を阻害することが示された（非特許文献１１）。さらに別のペプチドであるプレプログレリンのアミノ酸６６個のＣ−末端もまた、機能性であるかもしれない（非特許文献１７）。異なるスプライス変異体によってコードされるイソ型をはじめとする多様なイソ型が、例えば血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などのその他のタンパク質について知られており、異なるイソ型が、結合親和力などのいくつかのその他の特徴は異なりながら、血管形成誘導の役割を分かち合う（非特許文献１８）。したがってＧＨＲＬ遺伝子の様々な生成物はまた、グレリンイソ型の内分泌およびパラクリン作用の同様に複雑な制御を反映するのかもしれない。
【０００９】
以前に、２７０分間にわたる５ｐｍｏｌ／ｋｇ／分の用量の持続注入によるグレリンの投与は、健康なヒトにおいて食物摂取を増大させることが示された（非特許文献３）。９０分間にわたるグレリンの注入が、癌悪液質患者において食物摂取を３０％増大できることもまた示された（非特許文献１９）。最近、食事前に３．６ｎｍｏｌ／ｋｇのアシル化グレリンを皮下注射することによって、自然の食事前の状況そっくりに模倣することにより、エネルギー摂取が２７％増大することが示された。グレリンはまた、提供される食物に対して知覚される美味性を増強するようである（非特許文献４）。
【００１０】
これらの研究は、グレリンの非経口投与が、正常な対象および食欲減退患者の双方で、食欲を増進し得ることを実証する。さらに出願人は、対象に投与すると、特に食事前の皮下投与によって自然の食事前の状況そっくりに模倣することを確実にすると、新規なグレリンスプライス変異体によって、顕著な体重増加効果、および顕著な食物摂取の増大を得ることが可能であることを見いだした（参照によって本明細書に援用する、共有される同時係属出願（特許文献１）を参照されたい）。出願人の新規なグレリンスプライス変異体の体重増加効果は、主に除脂肪体重に対するものである一方、グレリンの体重増加効果は、主に体脂肪量に対するものである。
【特許文献１】U.S. Patent Application No. 2005/0059015
【非特許文献１】Tschop M. et al., Nature 407:908-13 (2000)
【非特許文献２】Wren A.M. et al., Diabetes 50:2540-47 (2001)
【非特許文献３】Wren A.M. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 86:5992-95 (2001)
【非特許文献４】Druce M.R. et al., Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 29:1130-36 (2005)
【非特許文献５】Neary N.M. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 89:2832-36 (2004)
【非特許文献６】Nagaya N. et al., Chest 128:1187-93 (2005)
【非特許文献７】Nagaya N. et al., Circulation 110:3674-79 (2004)
【非特許文献８】Hanada T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 301:275-79 (2003)
【非特許文献９】Laviano A. et al., Nat. Clin. Pract. Oncol. 3:158-65 (2005)
【非特許文献１０】Kojima M. & Kangawa M., Physiol. Rev. 85:495-522 (2005)
【非特許文献１１】Zhang J.V. et al., Science 310:996-99 (2005)
【非特許文献１２】De Vriese C. et al., Endocrinology 145:4997-5005 (2004)
【非特許文献１３】Kojima M. et al., Nature 402:656-60 (1999)
【非特許文献１４】Bednarek M.A. et al., J. Med. Chem. 43:4370-76 (2000)
【非特許文献１５】Gauna C. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 89:5035-42 (2004)
【非特許文献１６】Hosoda H. et al., J Biol. Chem. 275:21995-22000 (2000)
【非特許文献１７】Pemberton C. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 310:567-73 (2003)
【非特許文献１８】Neufeld G. et al., FASEB J. 13:9-22 1999
【非特許文献１９】Abstract P09, Digestive Hormones, Appetite and Energy Balance, Baylis and Starling meeting, London, June 2003
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様は、式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２（式中、Ｚ１は場合により存在する保護基であり；各Ｘ１は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され；Ｘ２は天然アミノ酸および合成アミノ酸から選択され、前記アミノ酸はかさ高い疎水性基で修飾され；各Ｘ３は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され、Ｘ１およびＸ３の１つ以上は場合によりかさ高い疎水性基で修飾されてもよく；Ｚ２は場合により存在する保護基であり；ｍは１〜１０の範囲内の整数であり；ｎは４〜９２の範囲内の整数であり；ただし、式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物はアミノ酸１５〜９４個の長さであり、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する）で表されるグレリンスプライス変異体様化合物である。
【００１２】
別の態様は、式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２（式中、Ｚ１は場合により存在する保護基であり；各Ｘ１は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され；Ｘ２は天然アミノ酸および合成アミノ酸から選択され、前記アミノ酸はかさ高い疎水性基で修飾され；各Ｘ３は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され、Ｘ１およびＸ３の１つ以上は場合によりかさ高い疎水性基で修飾されてもよく；Ｚ２は場合により存在する保護基であり；ｍは１〜１０の範囲内の整数であり；ｎは４〜９２の範囲内の整数であり；ただし、式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物はアミノ酸１５〜９４個の長さであり、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する）で表されるグレリンスプライス変異体様化合物を含んでなる医薬組成物である。
【００１３】
さらなる態様は、医薬的に許容可能な量の（ａ）グレリンスプライス変異体、（ｂ）式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２（式中、Ｚ１は場合により存在する保護基であり；各Ｘ１は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され；Ｘ２は天然アミノ酸および合成アミノ酸から選択され、前記アミノ酸はかさ高い疎水性基で修飾され；各Ｘ３は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され、Ｘ１およびＸ３の１つ以上は場合によりかさ高い疎水性基で修飾されてもよく；Ｚ２は場合により存在する保護基であり；ｍは１〜１０の範囲内の整数であり；ｎは４〜９２の範囲内の整数であり；ただし、式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物はアミノ酸１５〜９４個の長さであり、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する）で表されるグレリンスプライス変異体様化合物、または（ｃ）その混合物を、それを必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる、悪液質を治療する方法である。
【００１４】
追加的態様は、医薬的に許容可能な量の（ａ）グレリンスプライス変異体、（ｂ）式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２（式中、Ｚ１は場合により存在する保護基であり；各Ｘ１は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され；Ｘ２は天然アミノ酸および合成アミノ酸から選択され、前記アミノ酸はかさ高い疎水性基で修飾され；各Ｘ３は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され、Ｘ１およびＸ３の１つ以上は場合によりかさ高い疎水性基で修飾されてもよく；Ｚ２は場合により存在する保護基であり；ｍは１〜１０の範囲内の整数であり；ｎは４〜９２の範囲内の整数であり；ただし、式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物はアミノ酸１５〜９４個の長さであり、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する）で表されるグレリンスプライス変異体様化合物、または（ｃ）その混合物を、それを必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる、悪液質を予防する方法である。
【００１５】
さらなる態様は、医薬的に許容可能な量の（ａ）グレリンスプライス変異体、（ｂ）式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２（式中、Ｚ１は場合により存在する保護基であり；各Ｘ１は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され；Ｘ２は天然アミノ酸および合成アミノ酸から選択され、前記アミノ酸はかさ高い疎水性基で修飾され；各Ｘ３は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され、Ｘ１およびＸ３の１つ以上は場合によりかさ高い疎水性基で修飾されてもよく；Ｚ２は場合により存在する保護基であり；ｍは１〜１０の範囲内の整数であり；ｎは４〜９２の範囲内の整数であり；ただし、式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物はアミノ酸１５〜９４個の長さであり、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する）で表されるグレリンスプライス変異体様化合物、または（ｃ）その混合物を、それを必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる、食欲、食物摂取、および／または体重増加を刺激する方法である。
【００１６】
別の態様は、医薬的に許容可能な量の（ａ）グレリンスプライス変異体、（ｂ）式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２（式中、Ｚ１は場合により存在する保護基であり；各Ｘ１は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され；Ｘ２は天然アミノ酸および合成アミノ酸から選択され、前記アミノ酸はかさ高い疎水性基で修飾され；各Ｘ３は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され、Ｘ１およびＸ３の１つ以上は場合によりかさ高い疎水性基で修飾されてもよく；Ｚ２は場合により存在する保護基であり；ｍは１〜１０の範囲内の整数であり；ｎは４〜９２の範囲内の整数であり；ただし、式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物はアミノ酸１５〜９４個の長さであり、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する）で表されるグレリンスプライス変異体様化合物、または（ｃ）その混合物を、それを必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる、脂肪異栄養症を治療するための方法である。
【００１７】
さらなる態様は、医薬的に許容可能な量の（ａ）グレリンスプライス変異体、（ｂ）式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２（式中、Ｚ１は場合により存在する保護基であり；各Ｘ１は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され；Ｘ２は天然アミノ酸および合成アミノ酸から選択され、前記アミノ酸はかさ高い疎水性基で修飾され；各Ｘ３は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され、Ｘ１およびＸ３の１つ以上は場合によりかさ高い疎水性基で修飾されてもよく；Ｚ２は場合により存在する保護基であり；ｍは１〜１０の範囲内の整数であり；ｎは４〜９２の範囲内の整数であり；ただし、式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物はアミノ酸１５〜９４個の長さであり、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する）で表されるグレリンスプライス変異体様化合物、または（ｃ）その混合物を、それを必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる、脂肪異栄養症を予防する方法である。
【００１８】
別の態様は、医薬的に許容可能な量の（ａ）グレリンスプライス変異体、（ｂ）式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２（式中、Ｚ１は場合により存在する保護基であり；各Ｘ１は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され；Ｘ２は天然アミノ酸および合成アミノ酸から選択され、前記アミノ酸はかさ高い疎水性基で修飾され；各Ｘ３は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され、Ｘ１およびＸ３の１つ以上は場合によりかさ高い疎水性基で修飾されてもよく；Ｚ２は場合により存在する保護基であり；ｍは１〜１０の範囲内の整数であり；ｎは４〜９２の範囲内の整数であり；ただし、式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物はアミノ酸１５〜９４個の長さであり、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する）で表されるグレリンスプライス変異体様化合物、または（ｃ）その混合物を、それを必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる、筋肉消耗を治療するための方法である。
【００１９】
さらなる態様は、医薬的に許容可能な量の（ａ）グレリンスプライス変異体、（ｂ）式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２（式中、Ｚ１は場合により存在する保護基であり；各Ｘ１は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され；Ｘ２は天然アミノ酸および合成アミノ酸から選択され、前記アミノ酸はかさ高い疎水性基で修飾され；各Ｘ３は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され、Ｘ１およびＸ３の１つ以上は場合によりかさ高い疎水性基で修飾されてもよく；Ｚ２は場合により存在する保護基であり；ｍは１〜１０の範囲内の整数であり；ｎは４〜９２の範囲内の整数であり；ただし、式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物はアミノ酸１５〜９４個の長さであり、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する）で表されるグレリンスプライス変異体様化合物、または（ｃ）その混合物を、それを必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる、筋肉消耗を予防する方法である。
【００２０】
追加的態様は、（ａ）グレリンスプライス変異体、（ｂ）式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２（式中、Ｚ１は場合により存在する保護基であり；各Ｘ１は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され；Ｘ２は天然アミノ酸および合成アミノ酸から選択され、前記アミノ酸はかさ高い疎水性基で修飾され；各Ｘ３は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され、Ｘ１およびＸ３の１つ以上は場合によりかさ高い疎水性基で修飾されてもよく；Ｚ２は場合により存在する保護基であり；ｍは１〜１０の範囲内の整数であり；ｎは４〜９２の範囲内の整数であり；ただし、式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物はアミノ酸１５〜９４個の長さであり、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する）で表されるグレリンスプライス変異体様化合物、または（ｃ）その混合物を含んでなる医薬的に許容可能な量の分泌促進物質を、それを必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる、悪液質および／または食欲不振症および／または食欲不振症−悪液質および／または栄養失調および／または脂肪異栄養症および／または食欲−刺激を治療する方法であり、治療は悪液質の予防または治療、脂肪異栄養症の予防または治療、食欲の刺激、食物摂取の刺激、体重増加、体脂肪量増大、除脂肪体重増大の刺激、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【００２１】
さらなる態様は、（ａ）医薬的に許容可能な量の（１）グレリンスプライス変異体、（２）式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２（式中、Ｚ１は場合により存在する保護基であり；各Ｘ１は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され；Ｘ２は天然アミノ酸および合成アミノ酸から選択され、前記アミノ酸はかさ高い疎水性基で修飾され；各Ｘ３は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され、Ｘ１およびＸ３の１つ以上は場合によりかさ高い疎水性基で修飾されてもよく；Ｚ２は場合により存在する保護基であり；ｍは１〜１０の範囲内の整数であり；ｎは４〜９２の範囲内の整数であり；ただし、式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物はアミノ酸１５〜９４個の長さであり、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する）で表されるグレリンスプライス変異体様化合物、または（３）その混合物を含んでなる剤形、および（ｂ）場合により（ａ）を投与するための説明書を含んでなる、グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物を投与するためのキットである。
【００２２】
別の態様は、（ａ）上述のようなグレリンスプライス変異体様化合物をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなるｃＤＮＡを提供するステップと、（ｂ）ｃＤＮＡがプロモーターと作動的に結合するように、前記ｃＤＮＡを発現ベクターに挿入するステップと、（ｃ）前記発現ベクターを宿主細胞に導入し、それによって前記宿主細胞が前記グレリンスプライス変異体様化合物を生成するステップと、（ｄ）場合によりステップ（ｃ）で生成されたグレリンスプライス変異体様化合物を回収するステップを含んでなる、グレリンスプライス変異体様化合物を製造する方法である。
【００２３】
以下の詳細な説明を参照すれば、当業者にはその他の目的および利点が明らかになるであろう。
【００２４】
配列の簡単な説明
配列番号１は、シグナル伝達配列の後ろのヒトプレプログレリンスプライス変異体を表す。
配列番号２は、アミノ酸２２個のヒトグレリンスプライス変異体を表す。
配列番号３は、アミノ酸２４個のヒトグレリンスプライス変異体を表す。
配列番号４は、アミノ酸２４個の修飾ヒトグレリンスプライス変異体を表す。
配列番号５は、アミノ酸２９個のヒトグレリンスプライス変異体を表す。
配列番号６は、全長ヒトグレリンスプライス変異体の断片を表す。
配列番号７は、シグナル伝達配列の後ろのマウスプレプログレリンスプライス変異体を表す。
配列番号８は、シグナル伝達配列の後ろのラットプレプログレリンスプライス変異体を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
出願人らは、本開示内で引用される参考文献の内容全体を具体的に援用する。さらに量、濃度、またはその他の値またはパラメーターが、範囲、好ましい範囲、または好ましい上限値と好ましい下限値の一覧のいずれかとして与えられる場合、これは範囲が別々に開示されるかどうかに関わらず、あらゆる範囲上限または好ましい上限値と、あらゆる範囲下限または好ましい下限値とのあらゆる対から形成される全範囲を具体的に開示するものと理解される。本明細書において一連の数値が挙げられる場合、特に断りのない限り、範囲は、その終点と、範囲内の全ての整数および端数とを含むことが意図される。範囲を規定する場合、本発明の範囲を挙げられた特定値に限定することは意図されない。
【００２６】
本開示の文脈で、いくつかの用語が利用される。
【００２７】
「親和力」とは、本明細書での用法では、例えば抗体とその抗原の間などの受容体とそれらのリガンドの間の結合強度を意味する。
【００２８】
「アミノ酸残基」とは、本明細書での用法では、そのペプチド結合におけるポリペプチドの化学消化（加水分解）に際して形成されるアミノ酸を意味する。本明細書に記載のアミノ酸残基は、好ましくは「Ｌ」異性体形態である。しかし所望の機能特質がポリペプチドによって保たれれば、アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、天然アミノ酸、および合成アミノ酸などの任意のアミノ酸を包含する。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。アミノ酸残基の標準ポリペプチドの略語を表１に示す。
【００２９】
【表１】
2009530277.tif 000003
【００３０】
本明細書で式によって表される全てのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向で、左から右への向きを有することに留意すべきである。さらに「アミノ酸残基」という語句は、表１に列挙されるアミノ酸と、修飾および非天然アミノ酸とを含むように広く定義される。さらにアミノ酸残基配列の始めまたは終わりのダッシュは、１つ以上のアミノ酸残基のさらなる配列へのペプチド結合、またはＮＨ２またはアセチルなどのアミノ末端基への、またはＣＯＯＨなどのカルボキシ末端基への共有結合を示すことに留意すべきである。
【００３１】
「抗腫瘍治療」とは、本明細書での用法では、個体において異常な組織生育（新生物など）を停止させまたは低下させることを目指す治療を意味する。このような治療の例としては、放射線療法または化学療法などの癌治療法が挙げられる。
【００３２】
個体との関連で「食欲」は、摂取食物の量を測定すること、および個体の摂食要求を評価することで評価される。本明細書で食欲（すなわち空腹感）は、典型的に毎週数回無作為に個体に与えられる短い質問表で評価される。典型的に対象は、１（全くない）から５（極めて）の範囲のアナログ尺度を使用して質問に答えることで、彼らの空腹感、食物への執着、およびより大量の食物そして異なるタイプの食物を食べることへの欲求を格付けする。
【００３３】
「体格指数」または「ＢＭＩ」とは、個体の身長と重量の比率の尺度である。ＢＭＩは、キログラムで表した体重をメートルで表した身長の二乗で除して計算することで判定される。ＢＭＩの「正常」範囲は１８．５〜２５である。
【００３４】
「体脂肪量」は、例えば脂肪厚法によって測定できる。脂肪厚法では、鉗子タイプのノギスを使用して、身体の代表的部位における脂肪厚を判定することで皮下脂肪を測定する。次にこれらの脂肪厚測定を使用して、様々な測定からのスコアを加算してこの値を個体間の相対肥満度の指標として使用するか、または体脂肪率を予測するために開発された数学方程式の測定を使用するかのいずれかによって体脂肪を計算する（Fogelholm M. & van Marken Lichtenbelt W., Eur. J. Clin. Nutr. 51:495-503 (1997)）。
【００３５】
「濃度当量」とは、本明細書での用法では、グレリンスプライス変異体の用量反応曲線からの評価で、生体外および／または生体内において同一反応を有するグレリンスプライス変異体様化合物の投薬当量を意味する。
【００３６】
「解離定数」または「Ｋｄ」は、例えば抗体とその抗原などの受容体とそれらのリガンドの間の結合強度（または親和力または結合活性）を表す尺度である。Ｋｄが小さいほど結合は強力である。
【００３７】
「融合ポリペプチド」とは、少なくとも２つのポリペプチド、および２つのポリペプチドを１つの連続ポリペプチドに作動可能なように連結するための連結配列を含んでなるポリペプチドである。融合ポリペプチド内で連結された２つのポリペプチドは、典型的に２つの独立した起源に由来し、したがって２つの連結ポリペプチドを含んでなる融合ポリペプチドは、常態では自然界で連結して見られない。
【００３８】
「ヒトグレリン」とは、本明細書での用法では、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）登録番号ＮＰ＿０５７４４６またはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ識別子ＧＨＲＬ＿ＨＵＭＡＮで記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ヒトグレリンプレタンパク質は、１１７個のアミノ酸を有する。このプレタンパク質は、以下の翻訳後プロセシングを被る。シグナルペプチド（アミノ酸１〜２３）は除去されて、残る９４個のアミノ酸はプロテアーゼによって切断され、アミノ酸２８個の成熟グレリン（アミノ酸２４〜５１）またはアミノ酸２７個の成熟グレリン（アミノ酸２４〜５０）、およびアミノ酸２３個の成熟オベスタチン（アミノ酸７６〜９８）が提供される。アミノ酸２７または２８個の成熟グレリンペプチドは、Ｏ−オクタノイル基またはＯ−デカノイル基のいずれかによって、プレタンパク質中の位置２６のセリンでさらに修飾できる。オベスタチン成熟ペプチドは、アミド基によってプレタンパク質の位置９８のリジンでさらに修飾できる。プレタンパク質の位置３７でグルタミンを欠く、追加的なグレリンプレタンパク質が知られている。
【００３９】
「グレリンスプライス変異体」は、配列番号１で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または翻訳後修飾ありまたはなしの配列番号１からのアミノ酸１５個以上の任意のペプチド、または配列番号７または配列番号８で記載される任意の配列番号１の相同体、および／または翻訳後修飾ありまたはなしの配列番号７または配列番号８からのアミノ酸１５個以上の任意のペプチドである。
【００４０】
「グレリンスプライス変異体様化合物」とは、本明細書での用法では、特に食欲の刺激および／または悪液質治療および／または予防などの本明細書に記載の所望の治療効果をもたらすグレリンスプライス変異体機能の観点から、グレリンスプライス変異体、特にヒトグレリンスプライス変異体の機能を模倣する任意の化合物を指し、式Ｉ、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２（式中、Ｚ１は場合により存在する保護基であり；各Ｘ１は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され；Ｘ２は天然アミノ酸および合成アミノ酸から選択され、前記アミノ酸はかさ高い疎水性基で修飾され；各Ｘ３は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され、Ｘ１およびＸ３の１つ以上は場合によりかさ高い疎水性基で修飾されてもよく；Ｚ２は場合により存在する保護基であり；ｍは１〜１０の範囲内の整数であり；ｎは４〜９２の範囲内の整数であり；ただし、式、Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物は、アミノ酸１５〜９４個の長さおよび配列番号１と少なくとも８０％（または代案の実施態様では、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％）の相同性を有する）によって定義される。好ましい実施態様では、グレリンスプライス変異体様化合物はアミノ酸２２〜２９個の長さである。
【００４１】
「免疫学的に異なる」とは、ポリペプチドの１つと特異的に結合し、その他のポリペプチドと特異的に結合しない抗体の能力によって、２つのポリペプチドを識別する能力を指す。
【００４２】
「個体」とは、病状、特に本明細書で定義される悪液質の病状に影響を受けやすい動物またはヒトである。好ましい実施態様では、個体はヒトと、およびイヌ、ネコ、ブタ、雌牛、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウスなどの非ヒト哺乳類とをはじめとする哺乳類である。最も好ましい実施態様では、個体はヒトである。
【００４３】
「単離された」とは、その天然環境の成分から同定されて分離されおよび／または回収された様々なグレリンスプライス変異体様化合物、すなわち本明細書で開示されるポリペプチドおよびヌクレオチドについて記載するために使用される。天然環境の汚染物質成分は、典型的にポリペプチドの診断用または治療上の使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、およびその他のタンパク様または非タンパク様溶質を含むかもしれない。好ましい実施態様では、グレリンスプライス変異体様化合物は精製される。
【００４４】
「修飾アミノ酸」とは、本明細書での用法では、その任意の基が化学修飾されているアミノ酸である。
【００４５】
「非標準アミノ酸」とは、本明細書での用法では２０個の標準アミノ酸に属さないアミノ酸である。非標準アミノ酸は、通常、標準アミノ酸への化学修飾を通じて形成される。それらはまた、代謝経路の中間体成分として、または微生物および／または植物によって自然に形成できる。
【００４６】
「モノクローナル抗体」とは、その様々な文法的形態で、特定の抗原と免疫反応できる部位とを結合させる、１種類の抗体のみを含有する抗体分子の集団を指す。
【００４７】
「非アシル化グレリンスプライス変異体様化合物」とは、そのいずれの構成アミノ酸に付着するアシル基も含有しない、本明細書で定義されるようなグレリンスプライス変異体様化合物である。
【００４８】
「対症療法」とは、治癒効果なしに疾患または障害症状を軽減するまたは和らげる療法である。
【００４９】
「ポリクローナル抗体」は特異的な特定抗原を認識する抗体分子の混合物であり、したがってポリクローナル抗体は前記抗原内の異なるエピトープを認識してもよい。
【００５０】
「ポリペプチド」とは、隣接するアミノ酸残基間のアミド結合以外の結合を含有しないアミノ酸残基を含んでなる分子を指す。
【００５１】
「処理済グレリン」とは、アミノ酸残基が２７または２８個のアシル化グレリン（それぞれアミノ酸残基１１６および１１７個の長さのプレプログレリンの切断およびアシル化の翻訳後生成物（例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ  Ｑ９ＵＢＵ３ＧＨＲＬ＿ヒト））を意味する。
【００５２】
「受容体」とは、別の分子と特異的に（非無作為に）結合できるタンパク質、糖タンパク質などの分子である。
【００５３】
「分泌促進物質」とは、グレリンまたはグレリン様化合物などの成長ホルモン放出を刺激する物質である。本開示に係る分泌促進物質は、例えばＬ−６９２−４２９およびＬ−６９２−５８５（ベンゾラクタム化合物；ニュージャージー州ホワイトハウスステーションのメルク社（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ，Ｉｎｃ．（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ）から入手できる）、ＭＫ６７７（スピロインダン；メルク（Ｍｅｒｃｋ）から入手できる）、Ｇ−７２０３、Ｇ−７０３９、Ｇ−７５０２（イソニペコチン酸ペプチド模倣薬；カリフォルニア州サウス・サンフランシスコのジェンテック社（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）から入手できる）、ＮＮ７０３（ニュージャージー州プリンストンのノボ・ノルディスク社（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ））、またはイパモレリンから選択されてもよい。特に分泌促進物質は、アミノ酸２９個のヒトグレリンスプライス変異体、アミノ酸２４個のヒトグレリンスプライス変異体、またはアミノ酸２２個のヒトグレリンスプライス変異体（例えば配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５）をはじめとする、グレリンスプライス変異体様化合物である。成長ホルモン分泌促進物質は、一実施態様では例えば非アシル化形態のグレリンスプライス変異体または非アシル化グレリンスプライス変異体様化合物などの非アシル化形態であってもよい。
【００５４】
「界面活性剤分子」とは、疎水性部分および親水性部分を含んでなる分子、すなわち親油性相および親水性相の間の中間相に存在できる分子である。
【００５５】
適応症
本開示は、例えばａ）悪液質の予防または治療、および／またはｂ）脂肪異栄養症の予防または治療、および／またはｃ）食欲の刺激、および／またはｄ）食物摂取の刺激、および／またはｅ）体重増加の刺激、および／またはｆ）体脂肪量の増大、および／またはｇ）除脂肪体重の増大をはじめとする、病的体重減少または除脂肪および／または体脂肪量減少に関わる病状の治療または予防における、グレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質の使用に関する。特に本開示は、悪液質の治療または予防および／または食欲の刺激、美味性の刺激、生活の質向上、最も好ましくは悪液質の予防または治療に関する。
【００５６】
悪液質
悪液質は、癌などのいくつかの重篤な疾患の最も悲惨で深刻な症状の１つであり、個体から彼らのエネルギー、幸福感、生活の質を奪い、彼らの他人に対する依存を増大させる。悪液質は膵臓、胃、食道、肺、および腸の悪性腫瘍に伴うことが多い。
【００５７】
悪液質の最も重要な徴候は、脂肪組織だけでなく、筋肉組織および骨でさえも重量が減少することである。この非脂肪組織は「除脂肪体重」としてもまた知られている。さらに食欲の減少（食欲不振症）、衰弱（無力症）、およびヘモグロビンレベル低下（貧血）がある。
【００５８】
悪液質の治療は、単によりたくさん食べるだけの問題ではない。個体が食べたくても、個体が食べようとしてさえも、個体が胃管を経由してまたは静脈内に栄養素を与えられても、病状は通常回復しない。
【００５９】
最近の研究は、病状が今や、基礎疾患の存在に対する身体反応の一部と見なされることを明らかにした（Laviano A. et al., Nat. Clin. Pract. Oncol. 2:158-65 (2005)）。最近の研究はまた、場合によっては、腫瘍それ自体が悪液質を誘発する物質を生成することも示す（Esper D.H. & Harb W.A., Nutr. Clin. Pract. 20:369-76 (2005)）。
【００６０】
消耗とも称されることがある悪液質は、ＡＩＤＳ、癌、股関節骨折後、慢性心不全、ＣＯＬＤ（慢性閉塞性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ））およびＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ））などの慢性肺疾患、肝硬変、腎不全、関節リウマチおよび全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患、敗血症、結核、嚢胞性線維症、クローン病、および重篤感染症などのいくつかの疾患で見られる。さらに消耗はまた、加齢においても見られる。
【００６１】
悪液質はこのような患者で見られる複雑な代謝症候群を代表するが、一般に、宿主の脂肪組織および骨格筋貯蔵の枯渇を伴う、進行性体重減少として認識される。
【００６２】
癌悪液質
癌悪液質症候群の核心は、進行性腫瘍生育の問題および従来の抗腫瘍治療法の異化副作用に関わる。これらの２つの現象は、神経−内分泌系改変、多様な炎症促進性サイトカイン生成、および癌−特異的悪液質因子放出を生じさせる。次にこれらの介在物質は、食物摂取量減少、代謝異常、またはこれら２つの組み合わせを引き起こす。
【００６３】
癌悪液質は全癌患者の約半数で起きると報告されており、２０％を超える癌死亡と関連付けられている（Tisdale M.J., Nat. Rev. Cancer 2:862-71 (2002)）。病状は、進行癌において、特に身体中に転移性腫瘍が存在する場合に起きることが多い。悪液質はまた、小児および高齢患者でより一般的である。上部消化管癌（膵臓、胃、食道、および肝臓をはじめとする）（Bruera E., Br. Med. J. 315:1219-22 (1997)；Palesty J.A. et al., Dig. Dis. 21:198-213 (2003)）；肺癌、特に小細胞肺癌；頭頚部癌；結腸直腸癌；その他の固形腫瘍など、癌悪液質頻度が特に高い特定の癌もまた、一貫して同定される（Bruera E., Br. Med. J. 315:1219-22 (1997)）。ＩＷＬ（不随意体重減少）は、生存の約５０％の低下、および癌療法耐性低下と関連付けられている（Laviano A. et al., Nat. Clin. Pract. Oncol. 2:158-65 (2005)）。体重減少の最大リスクと関連付けられている癌部位は、気道および消化管（肺、頭頚部、および食道）と、特に膵臓、胃、および肝臓などの胃腸系とに影響するものである。さらに診断時に上部消化管癌がある全患者の８０％、および肺癌がある全患者の６０％が、相当の体重減少を既に経験していた（Bruera E., Br. Med. J. 315:1219-22 (1997)）。平均して、死亡前に悪液質の罹患率は５０％から８０％以上に増大し、２０％を超える患者では、悪液質が主死因である（Bruera E., Br. Med. J. 315:1219-22 (1997)）。
【００６４】
癌悪液質の検出
栄養状態は臨床評価、人体計測的試験（体重、皮脂厚、および上腕周囲）、および撮像（ＤＥＸＡスキャン、ＭＲスキャン、ＣＴスキャン、および生体電気インピーダンス測定）の併用によって評価される。６ヶ月以内に発病前体重の５％を超える不随意体重減少が観察される場合、特にそれが筋肉消耗を伴う場合に、悪液質が一般に疑われる。
【００６５】
最も一般に使用される検査値は、血清アルブミンである。しかしこれは非特異パラメーターである。その他のマーカーは半減期の短いタンパク質であり、トランスフェリンおよびトランスサイレチンもまた使用されている。
【００６６】
悪液質のその他のマーカーは、ＩＧＦ−１、ＩＧＦＢＰ−３、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）、およびテストステロンである。
【００６７】
癌と癌悪液質の関係
癌は、後述するように、食欲不振症の誘発および／または代謝の低下または変化をはじめとする多様な機序を通じて、悪液質を引き起こすかもしれない。
【００６８】
食欲不振症
体重減少中の癌患者では、エネルギー摂取が実質的に低下することが示されている。癌患者は、消化管の物理的閉塞、疼痛、うつ病、便秘症、吸収不良、衰弱、または治療（例えばアヘン剤、放射線療法または化学療法による治療など）の副作用を患うことが多い可能性があり、それらは全て食物摂取を低下させるかもしれない（Barber M.D. et al., Surg. Oncol. 8:133-41 (1999)）。癌−関連高カルシウム血症もまた、悪心、嘔吐、および食欲喪失を誘発するかもしれない。
【００６９】
しかし食物摂取低下に明らかな臨床的原因がない、多数の癌患者が残る。
【００７０】
癌−誘発性食欲不振症および悪液質の中心機序は複雑であり、多くの異なるサイトカイン、ホルモン、および癌細胞によって生成されるその他の因子を含む。
【００７１】
レプチン
正常な生理学的状況では、体重減少が体脂肪減少に比例してレプチンレベルを低下させるので、レプチンは飢餓に対する適応反応の始動において重要な役割を果たす。しかし癌患者では、癌細胞によって生成されるサイトカイン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γ）のレベル増大が、レプチンの発現および／または放出を刺激するかもしれない。サイトカインの別の可能な機序は、それらがレプチンからの過剰な負のフィードバックシグナル伝達の視床下部性効果を模倣することであり、食物摂取および体重に関する正常な代償性機序の阻害をもたらす。
【００７２】
ＮＰＹ（神経ペプチドＹ）
視床下部ＮＰＹ系は、ＩＬ−１またはその他のサイトカインによって誘発される食欲不振症および癌において中断される主要神経経路の１つである。サイトカインはＮＰＹに対する感受性を低下させる。ＮＰＹは神経内分泌腫瘍の生育−調節因子であり、腫瘍細胞増殖またはアポトーシスの自己分泌活性化と、血管新生の双方によって働くことが示されている（Kitlinska J et al., Cancer Res. 65:1719-28 (2005)）。さらにＹ１およびＹ２受容体は、腫瘍細胞および腫瘍不随血管の双方において、乳癌、副腎および関連腫瘍、腎細胞癌、および卵巣癌中で発現されることが分かっている。それらの癌細胞における幅広い発現は、それらが腫瘍細胞増殖および腫瘍血液供給に対するＮＰＹ効果を媒介できるようにする（概説についてはKoerner M & Reubi JC, Peptides 28:419-25 (2007)を参照されたい）。
【００７３】
メラノコルチン
異常なメラノコルチンシグナル伝達が、食欲不振症および悪液質の双方における寄与因子であるかもしれない。常態では、エネルギー貯蔵を節約する手段として、食欲促進メラノコルチンシグナル伝達系を下方制御することが予期される著しい体重減少にもかかわらず、癌−誘発性悪液質においてメラノコルチン系は活性のままである。ＡｇＲＰ（アグーチ−関連ペプチド）またはその他の拮抗薬による中枢メラノコルチン遮断は、動物モデルにおいて食欲不振症および悪液質を回復させ、この系の病原性役割が示唆された（Wisse B.E. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 994:275-81 (2003)）。さらに最近の実験は、メラノコルチンＭＣ（４）受容体に対する拮抗薬を使用したメラノコルチンシグナル伝達の遮断が、癌および腎不全の齧歯類モデルにおいて疾患−随伴食欲不振症および消耗を減弱することを示す（DeBoer MD & Marks DL, Nat. Clin. Pract. Endocrinol. Metab. 2:459-66 (2006)）。
【００７４】
代謝
代謝亢進は安静時エネルギー消費量（ＲＥＥ）の上昇と定義され、悪液質の基本的特徴である。総エネルギー消費は、ＲＥＥ（およそ７０％）および随意エネルギー消費（およそ２５％）および消化におけるエネルギー消費（５％）を含む。随意エネルギー消費は悪液質において減少する場合があり、それは感情鈍麻、疲労、およびうつ病として臨床的に現れるかもしれない。
【００７５】
食欲促進および食欲不振誘発性のシグナルは、ミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ）の誘導を通じて、齧歯類の褐色脂肪組織内の、そしておそらくはヒト筋肉内の熱産生を活性化することでＲＥＥを制御する、交感神経活性をそれぞれ増大および減少させることが知られている（Alvarez R et al., J. Biol. Chem. 270:5666-73 (1995)）。サイトカインによる筋肉内および白色脂肪組織内のＵＣＰの活性化が、熱産生および筋肉消耗の増大の根底にある分子機序の１つかもしれないことが示されている（Inui A., CA Cancer J. Clin. 52:72-91 (2002)；Fearon K.C. & Moses A.G., Int. J. Cardiol. 85:73-81 (2002)）。
【００７６】
癌患者における改変された栄養代謝についてもまた、記載されている。固形腫瘍は大量の乳酸を生成し、それは大量のＡＴＰを使用する非常にエネルギー非効率的な過程を通じて転換されてグルコースに戻るので、エネルギー消費がさらに増大する。さらに腫瘍由来の脂質動員因子（ＬＭＦ）は、脂肪細胞に直接に作用して脂肪分解増大を引き起こし、遊離脂肪酸およびグリセロールの放出をもたらして（Islam-Ali B. et al., Br. J. Cancer 85:758-63 (2001)）、腫瘍細胞内の遊離ラジカル毒性を減衰させる（Sanders PM & Tisdale MJ, Br. J. Cancer 90:1274-78 (2004)）ことが示されている。
【００７７】
サイトカインレベルの増大が、筋肉修復過程に影響することで、筋肉タンパク質異化作用を間接的に誘発するかもしれないこともまた、示されている（Islam-Ali B. et al., Br. J. Cancer 85:758-63 (2001)）。
【００７８】
癌悪液質の治療における分泌促進物質使用の理論的根拠
理論による拘束は意図しないが、分泌促進物質、特にグレリンスプライス変異体様化合物での治療の理論的根拠は、以下に基づいている。消化管の粘膜中の内分泌細胞から放出されるグレリンスプライス変異体は、局所性にパラクリン物質として、中枢性にホルモンとしての双方で作用するかもしれない。局所性にはグレリンスプライス変異体は、例えば求心性迷走神経ニューロンの求心性活動の開始剤として作用するかもしれない。このようなニューロンは、グレリンスプライス変異体刺激を孤束核（ＮＴＳ）などのＣＮＳ内の中枢に中継し、それはさらに、視床下部の傍室核および弓状核などの食欲およびエネルギー恒常性調節中枢と情報交換する。ホルモンとしては、グレリンスプライス変異体は、グレリンスプライス変異体受容体を発現する、中央食欲調節ＰＯＭＣ（プロオピオメラノコルチン）およびＮＰＹ／ＡｇＲＰニューロンに作用すると考えられる。
【００７９】
最近、グレリンが血液脳関門を越えて輸送されると記載されている（Banks W.A. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 302:822-27 (2002)）。例えばＮＰＹ／ＡｇＲＰニューロン（すなわち食欲制御の刺激分枝における第１レベルのニューロン）などの中央食欲調節中枢では、刺激性グレリン受容体を通じて作用するグレリンが、末梢からの唯一の知られている刺激入力であることに留意することが重要である。例えばレプチン、インシュリン、ＰＹＹ３−３６、ａ−ＭＳＨなどの全てのその他の既知のホルモンおよび神経伝達物質は、この重要な「食欲ゲートキーピング」センターにおいて、ＮＰＹ／ＡｇＲＰニューロンに対する阻害剤として作用する。癌−誘発性悪液質においてＮＰＹ系は下方制御されるので、この系に対するグレリンの刺激は病状を正常化できるかもしれない。同様に癌−誘発性悪液質において活性であるメラノコルチンは、ＡｇＲＰの刺激を通じてグレリンおよびグレリンスプライス変異体により阻害されるかもしれない。
【００８０】
グレリン濃度の増大は、結果として生じるコルチゾールレベルの増大と共に、ＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン）を増大させることが示されている。コルチゾールはサイトカイン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−ａ、ＩＦＮ−ａ）のレベルを低下させるので、この作用は悪液質の治療に重要で有益な意味合いがあるかもしれない。グルココルチコイドの投与は、癌と関連付けられている症状のための対症的状況で、既に広く使用されている（Inui A., CA Cancer J. Clin. 52:72-91 (2002)）。さらに齧歯類においてグレリンのＩＣＶ注射は中核体温を低下させることが示されており、それはＲＥＥの低下を示唆する（Lawrence C.B. et al., Endocrinology 143:155-62 (2002)）。ここでも理論による拘束は意図しないが、野生型グレリンに類似したグレリンスプライス変異体は、上述のように悪液質の重要な特徴であるＲＥＥの増大を逆転させることが予期される。
【００８１】
分泌促進物質、特にグレリンスプライス変異体様化合物は、予期される癌進行の知識ならびに抗腫瘍治療投与計画を考慮して、任意の適切な投与計画を使用して投与してもよい。
【００８２】
一実施態様では、本開示に従って、病因にかかわらず、あらゆる癌タイプを患っているあらゆる個体に分泌促進物質を投与して、癌悪液質を成功裏に治療し、低下させ、または予防できることが想定される。
【００８３】
したがって好ましい一実施態様では、グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質での個体の治療は、例えば以下の癌タイプの１つ以上によって引き起こされる癌悪液質の治療または予防のためのものである。急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ−関連癌、ＡＩＤＳ−関連リンパ腫、肛門癌、小児期小脳星細胞腫、小児期脳星細胞腫、基底細胞腫（Ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ，  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｃｅｒｅｂｅｌｌａ  Ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ，  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｂａｓａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝外胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、男性気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、未知の原発部位癌（Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  Ｕｎｋｎｏｗｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ）、中枢神経系リンパ腫、原発性脳星細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、小児期上衣細胞腫、食道癌（Ｅｐｅｎｄｙｍｏｍａ，  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  Ｃａｎｃｅｒ）、ユーイング腫瘍ファミリー、小児期頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍（Ｅｘｔｒａｃｒａｎｉａｌ  Ｇｅｒｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒ，  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｅｘｔｒａｇｏｎａｄａｌ  Ｇｅｒｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒ）、眼癌、眼内メラノーマ眼癌、網膜芽細胞腫胆嚢癌、胃癌、胃腸カルチノイド腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頚部癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視覚路神経膠腫、眼内メラノーマ、島細胞癌（内分泌膵）、カポジ肉腫腎臓（腎細胞）癌、喉頭癌、口唇および口腔癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ−関連リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症（Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ，  Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｅｍ’ｓ）、骨癌、骨肉腫および骨の悪性線維性組織球症（Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｆｉｂｒｏｕｓ  Ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｏｍａ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ／Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）小児期髄芽細胞腫、メラノーマ、メルケル細胞癌（Ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ，  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｍｅｒｋｅｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、成人悪性中皮腫、小児期中皮腫（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ，  Ａｄｕｌｔ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ，  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ）、潜在・原発性の転移性扁平上皮頚癌、小児期多発性内分泌腺腫症症候群、多発性骨髄腫／プラスマ細胞腫瘍（Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｎｅｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｏｃｃｕｌｔ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｙｅｌｏｍａ／Ｐｌａｓｍａ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｍ）、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患（Ｍｙｅｌｏｍａ，  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、小児期鼻咽頭癌、神経芽細胞腫（Ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  Ｃａｎｃｅｒ，  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）、中咽頭癌、骨肉腫および骨の悪性線維性組織球症（Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ／Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｆｉｂｒｏｕｓ  Ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｏｍａ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ）、小児期卵巣癌、卵巣上皮癌（Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ，  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃａｎｃｅｒ）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性潜在的腫瘍、膵臓癌、鼻腔および副鼻腔癌、副甲状腺癌、老人性癌、褐色細胞腫、小児期松果体芽細胞腫およびテント上方未分化神経外胚葉性腫瘍、脳下垂体腫瘍（Ｐｉｎｅｏｂｌａｓｔｏｍａ  ａｎｄ  Ｓｕｐｒａｔｅｎｔｏｒｉａｌ  Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ  Ｔｕｍｏｒｓ，  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｔｕｍｏｒ）、胸膜肺芽球腫、前立腺癌、腎盤と尿管の移行細胞癌、網膜芽細胞腫（Ｒｅｎａｌ  Ｐｅｌｖｉｓ  ａｎｄ  Ｕｒｅｔｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ，  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）、小児期横紋筋肉腫、唾液腺癌（Ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ，  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｓａｌｉｖａｒｙ  Ｇｌａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ）、成人発症型軟部組織肉腫、小児期肉腫、子宮肉腫（Ｓａｒｃｏｍａ，  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｕｔｅｒｉｎｅ  Ｓａｒｃｏｍａ）、セザリー症候群、皮膚癌（非メラノーマ）、メルケル細胞皮膚癌、小腸癌（Ｓｋｉｎ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ，  Ｍｅｒｋｅｌ  Ｃｅｌｌ  Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ｃａｎｃｅｒ）、小児期テント上方未分化神経外胚葉性腫瘍、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（Ｓｕｐｒａｔｅｎｔｏｒｉａｌ  Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ  Ｔｕｍｏｒｓ，  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ）、精巣癌、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、腎盤と尿管の移行細胞癌、妊娠性絨毛性腫瘍、腎盤と尿管の移行細胞癌（Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  Ｔｕｍｏｒ，  Ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ  Ｕｒｅｔｅｒ  ａｎｄ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｅｌｖｉｓ  Ｃａｎｃｅｒ，  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｎｃｅｒ）、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、膣癌、小児期視覚路および視床下部神経膠腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症（Ｖｉｓｕａｌ  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  Ｇｌｉｏｍａ，  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｅｍ’ｓ  Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）、ウィルムス腫瘍。
【００８４】
上で考察したように、癌悪液質は、例えば進行性腫瘍生育または抗癌治療法の異化副作用のいずれかに起因する、上述した代謝亢進状態のような異化作用障害のためであるかもしれない。しかし癌悪液質はまた、癌を患っている個体に食欲がないか、または腫瘍の位置が食物摂取を減少させまたは妨げる場合など、食欲不振障害のためであるかもしれない。
【００８５】
したがって一実施態様は、グレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質による、異化作用障害によって引き起こされる癌悪液質の治療または予防のためのものである。これは癌が消化管癌、特に上部消化管癌（本明細書で「上部消化管癌」という用語は、膵臓癌もまた包含するものと理解される）、肺癌（特に小細胞肺癌）、および／または肝臓癌（本明細書で「肝臓癌」という用語は、肝臓内の転移癌プロセスもまた包含するものと理解される）である場合に特に適する。
【００８６】
別の実施態様は、グレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質による、食欲不振障害によって引き起こされる癌悪液質の治療または予防のためのものである。
【００８７】
さらに別の実施態様は、グレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質による、癌が悪液質をどのように誘発したのかとは無関係である癌悪液質、ならびに異化作用障害および食欲不振障害の組み合わせによって引き起こされる悪液質の治療または予防のためのものである。
【００８８】
好ましい実施態様では、固形腫瘍によって引き起こされる癌悪液質の治療または予防において、グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質が使用される。
【００８９】
癌の別の下位集団は、視床下部内の中枢欲調節中枢の調節不全によって引き起こされる食欲不振症があるものであり、ここで小食のその他の可能な理由は除外される。
【００９０】
特にさらなる癌治療が不可能な末期癌の個体では、食物摂取を増大させ、消化を改善し、代謝を改善する、対症療法としてのグレリンスプライス変異体処置が有益と判明するかもしれない。したがって別の態様は、前記個体が特に末期癌などの進行癌を患っている場合のよううに、それを必要とする個体において、食物摂取を増大させ、消化を改善し、代謝を改善する、対症療法に関する。
【００９１】
上に従って、本明細書で開示される化合物は、以下の気道および消化管形態を患っている個体において、特に悪液質を治療または予防するのに適する。膵臓癌；胃癌および／または食道癌などの上部消化管の癌；特に甲状腺癌または唾液腺癌などの頭頚部癌；および特に小細胞肺癌などの肺癌。
【００９２】
別の好ましい実施態様では、結腸直腸癌などの下部消化管癌、特に結腸癌によって引き起こされる癌悪液質の治療または予防において、グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質が使用される。
【００９３】
別の好ましい実施態様では、内分泌癌、すなわち個体の身体の内分泌器官の癌によって引き起こされる癌悪液質の治療または予防において、グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質が使用される。
【００９４】
本明細書で開示される化合物はまた、卵巣癌または乳癌を患っている個体を治療するために有用である。
【００９５】
さらなる好ましい実施態様では、化学療法または放射線療法またはそれらの組み合わせなどの抗癌療法によって、全体的にまたは部分的に引き起こされる、癌悪液質の治療または予防において、グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質が使用される。
【００９６】
好ましい一実施態様では、癌悪液質に関して治療される個体は、７０〜１２０歳など、８０〜１２０歳など、９０〜１２０歳などのような６０〜１２０歳などの高齢者である。同様に好ましいのは、前記個体が、０〜１５歳など、０〜１０歳など、０〜５歳など、０〜１歳など、２ヶ月齢未満の新生児などのような０〜２０歳などの幼児である実施態様である。
【００９７】
一実施態様では、悪液質状態を予防するために、グレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質を予防的に投与することが好ましい。この実施態様では、いかなる抗腫瘍療法を開始する前に治療を始めてもよい。分泌促進物質は、抗腫瘍療法中に連続的に投与してもよく、またはそれは例えば抗腫瘍療法期間の合間に投与してもよい。抗腫瘍療法期間中および特にその合間に投与することで、個体のより良い健康状態のために、処置された個体が感染症および／またはその他の合併症を得るリスクが低下されるかもしれない。
【００９８】
グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質を使用した癌悪液質の治療は、当該技術分野で知られている任意の投与法を使用して達成されてもよい。好ましくは治療は、本明細書に記載の任意の投与法を使用して、より好ましくは静脈内または皮下投与を使用して、最も好ましくは皮下投与法を使用して達成されてもよい。
【００９９】
脂肪異栄養症
別の態様では、本開示は、脂肪異栄養症症候群の治療のための、または脂肪異栄養症症候群の治療のための薬剤の製造のための、上で定義したようなグレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質の使用に関する。脂肪異栄養症症候群は、部分的または全身性の脂肪組織沈着の減少によって特徴づけられる稀な障害の異質のグループを包含する（Garg A., Am. J. Med. 108:143-52 (2000)）。いくつかの異なるタイプの脂肪異栄養症があり、脂肪損失の程度は非常に小さな陥凹部からほぼ完全な脂肪組織不在の間で変動してもよい。美容上の問題のみを有するかもしれない患者がいる一方、異脂肪血症、肝臓の脂肪症、および重篤なインシュリン抵抗性などの重篤な代謝合併症を有するかもしれない患者もいる（Reitman M.L. et al., Trends Endocrinol. Metab. 11:410-16 (2000)）。これらの障害は、遺伝性（家族性または遺伝的脂肪異栄養症）であるか、または様々なタイプの病気または薬に二次的に生じる（後天性脂肪異栄養症）かのいずれかであることができる。遺伝性脂肪異栄養症は、遺伝子の突然変異によって引き起こされる。
【０１００】
異なるタイプの遺伝性脂肪異栄養症の原因である、いくつかの遺伝子が同定されている。これらとしては、先天性全身性脂肪異栄養症（ＣＧＬ）におけるＡＧＰＡＴ２（１−アシルグリセロール−３−ホスフェート−Ｏ−アシル基転移酵素２）およびＢＳＣＬ２（ベラルディネリ−セイプ先天性脂肪異栄養症２）、家族性部分的脂肪異栄養症ダニガン亜種（家族性部分的脂肪異栄養症）におけるラミンＡ／Ｃ（ＬＭＮＡ）遺伝子、および家族性部分的脂肪異栄養症におけるＰＰＡＲＧ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ）遺伝子が挙げられる。遺伝性脂肪異栄養症のその他の亜種について、いくつかのその他の候補遺伝子が現在研究されている。
【０１０１】
後天性脂肪異栄養症は、例えばＨＩＶ−感染患者（ＬＤ−ＨＩＶ）、後天性全身性脂肪異栄養症（ＡＧＬ）、後天性部分的脂肪異栄養症（ＡＰＬ）、および局在化脂肪異栄養症における、ＨＡＡＲＴ（高度活性抗レトロウイルス剤療法）／ＨＩＶ−誘発性脂肪異栄養症である。後天性脂肪異栄養症は直接的遺伝的根拠を有さない。むしろ多くの機序が関与してもよい。このような１つの機序は、正常な脂肪細胞を破壊する自己免疫反応であってもよい（Misra A. et al., Medicine (Baltimore) 83:18-34 (2004)）。
【０１０２】
ＨＡＡＲＴ／ＨＩＶ−誘発性脂肪異栄養症は、全身性脂肪異栄養症の最も一般的な後天性形態になった。これらの身体異常の全発生率は、プロテアーゼ阻害剤による治療の１２〜１８ヶ月後に約５０％である。１８％〜８３％にわたる現在の報告間の差違は、レトロウイルス治療法のタイプおよび継続期間などの交絡因子に起因する。プロテアーゼ阻害剤と関連付けられている脂肪異栄養症症候群は、脂質および脂肪細胞調節タンパク質と、それにプロテアーゼ阻害剤が結合するＨＩＶ−１プロテアーゼの触媒部位との部分的類似に起因するかもしれないことが示されている（Carr A. et al., Lancet 351:1881-83 (1998)）。
【０１０３】
局在化脂肪異栄養症は、小さな領域からのまたは四肢部分からの局在化した皮下脂肪の減少として定義される。皮下脂肪減少に対応する陥凹部によって特徴づけられる単一または多発性病変があってもよい。場合によっては、それは皮膚の敏感な有痛性小結節に付随してもよい。通常、それは糖尿病の患者において、インシュリン注射部位で起きる。患者によっては、脂肪損失は、圧力がかかることが多い領域から起きる（例えば化粧台への腿の押しつけ）。
【０１０４】
脂肪異栄養症の発病機序は、大部分は未知である。しかし累積する証拠は、脂肪細胞におけるアポトーシス誘導増大のための因子の１つとして、ミトコンドリアの欠陥を指摘する（Misra A. et al., Medicine (Baltimore) 83:18-34 (2004)）。ＨＩＶ−１によってコードされるいくつかのタンパク質は、ミトコンドリア膜の透過性上昇を誘導することで、アポトーシスをトリガーする。ＨＩＶ−１の治療において臨床的に使用されるいくつかのヌクレオシドアナログは、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の複製を阻害し、および／またはｍｔＤＮＡ突然変異の頻度を増大させる。これらの要素の双方が重篤なミトコンドリア病を引き起こして、脂肪異栄養症に寄与するかもしれない。脂肪細胞のアポトーシスを阻害できる治療法は、特にＨＩＶ／ＨＡＡＲＴ誘発性形態において、脂肪異栄養症発症のための非常に有用な治療法、特に予防法であるかもしれない。
【０１０５】
脂肪異栄養症の代謝結果は、総体的健康および生存にとって非常に重要である。インシュリン抵抗性および結果として生じる糖尿病の進行が、肥満症または脂肪異栄養症のいずれかに起因できるという事実は、炭水化物および脂質代謝における脂肪組織の重要な役割を反映する。適切な脂肪細胞容量の不在下では、過剰なカロリーはそれらの正常な貯蔵所に分配されることができず、代わりにそれらは、肝臓内、骨格および心筋、および膵臓β細胞内において、増大するトリグリセリド貯蔵として蓄積する。過剰な脂肪蓄積は、未だに不明瞭な手段を通じて、損なわれたインシュリン作用、そして頻繁に糖尿病と関連付けられている。
【０１０６】
貯蔵所としてのそれらの受動的役割に加えて、正常な脂肪細胞は、インシュリン感受性および／またはエネルギー収支に影響するかもしれないいくつかのペプチド（「アディポカイン」）を分泌する（Kahn B.B. & Flier J.S., J. Clin. Invest. 106:473-81 (2000)；Berg A.H. et al., Trends Endocrinol. Metab. 13:84-89 (2002)）。これらとしては、レプチンおよびＡｃｒｐ３０（アディポネクチンとしてもまた知られている）などの可能なインシュリン増感剤と、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、および恐らくはレジスチンをはじめとするインシュリン拮抗薬とが挙げられる。したがって脂肪異栄養症のインシュリン抵抗性は、乱された脂質流動および／またはアディポカイン分泌異常の結果かもしれない。
【０１０７】
ｒｈＧＨによる治療法は、少数の患者において、「野牛肩」および体幹脂肪のサイズ減少を引き起こすことが報告されている。しかし脂肪損失および脂質異常は改善せず、血液グルコース制御は悪化した（Lo J.C. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 86:3480-87 (2001)）。
【０１０８】
グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質を使用した脂肪異栄養症の治療は、当該技術分野で知られている任意の投与法を使用して、達成されてもよい。好ましくは治療は、本明細書に記載の任意の投与法を使用して、より好ましくは静脈内または皮下投与を使用して、最も好ましくは皮下投与法を使用して達成されてもよい。
【０１０９】
生活の質
全ての実施態様で、本開示の治療方法および／または医薬組成物および／または化合物が、このようにして治療された個体に、例えば改善された食欲および／または体重および／または栄養状態および／または身体機能によって証明されるような、改善された生活の質（ＱＯＬ）をもたらすことが好ましい。したがって一態様は、上で定義したようなグレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質を使用した、生活の質の改善に関する。
【０１１０】
別の実施態様では、個体のＱＯＬにおける前記改善は、当業者に知られているような「生活の質」質問票を使用して評価される。
【０１１１】
本明細書で開示される化合物の投与によって引き起こされる改善されたＱＯＬの評価に使用するのに好ましい、２種の検証された生活の質調査は次のとおりである。（ｉ）医学的転帰研究短文式健康調査（Medical Outcomes Study Short-Form Health Survey）（ＳＦ−３６）、および（ｉｉ）ＥＯＲＴＣ  ＱＬＱ−Ｃ３０（＋３）質問票。ＳＦ−３６は、以下の８つの患者のＱＯＬの側面を評価する３６の質問を含む。身体機能（ＰＦ）、役割−身体機能（ＲＰ）、肉体的苦痛（ＢＰ）、総体的健康（ＧＨ）、活力（ＶＴ）、社会的機能（ＳＦ）、役割情動性機能（ＲＥ）、および精神的健康（ＭＨ）。マニュアルおよび解説ガイドに従って、尺度内の質問への応答を合計して、０（不健康状態を表す）から１００（最適健康状態を表す）の範囲の尺度スコアに線形変換する。スウェーデンのバージョンが検証されており、スウェーデンの一般人口に関する規範的データが提示されている（Ｓｕｌｌｉｖａｎ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｈａｌｓｏｅｎｋａｔ：  Ｓｖｅｎｓｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｃｈ  Ｔｏｌｋｎｉｎｇｓｇｕｉｄｅ”  （ＳＦ−３６  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｕｒｖｅｙ，  Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｍａｎｕａｌ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ），  Ｇｏｅｔｅｂｏｒｇ，  Ｓａｈｉｇｒｅｎｓｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，  １９９４）。
【０１１２】
ＥＯＲＴＣ  ＱＬＱ−Ｃ３０（バージョン３．０）は、患者におけるＱＯＬの評価に向けた、３０項目の基礎的質問（ＥＯＲＴＣ生活の質研究グループ（ＥＯＲＴＣ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｇｒｏｕｐ）による開発）であり、国立衛生研究所ウェブサイトを参照して、例えばＥＯＲＴＣ  ＱＬＱ−Ｃ３０の見本（バージョン３．０、ＥＯＲＴＣウェブサイトで入手でき、参照によって本明細書に援用する）を参照されたい。最初のバージョンは癌患者で検証されており、一般人口からの参照データが公開されている。質問票は、身体機能（５つの質問）、役割機能（２つの質問）、情動性機能（４つの質問）、認知性機能（２つの質問）、および社会的機能（２つの質問）の５つの機能性尺度を含んでなる。疲労（３つの質問）、悪心および嘔吐（２つの質問）、および疼痛（２つの質問）の３つの症状尺度がある。呼吸困難、不眠症、食欲喪失、便秘症、下痢、および経済的困窮に関する６つの単一項目がある。２つの包括的質問は、患者の健康状態および全体的ＱＯＬについて尋ねる。全ての尺度および単一項目測定は、スコアが０〜１００の範囲にある。機能尺度および全体的健康状態およびＱＯＬに関する高いスコアは、高レベルの機能／健康状態およびＱＯＬを表す。症状／項目尺度の高いスコアは高レベルの症状／問題を表す。ＱＯＬスコアは、ＥＯＲＴＣ  ＱＬＱ−Ｃ３０採点マニュアルに従って計算できる。
【０１１３】
１つ以上の分泌促進物質化合物による治療後の患者の改善された生活の質を評価するための好ましい質問票は、下記の実施例９にある。
【０１１４】
好ましい実施態様では、本明細書に記載の病状がある患者の治療が、患者のＱＯＬの顕著な改善をもたらす。好ましくは治療は、例えばＱＯＬスコア、または個体測定ツールとしてふさわしい複合ＱＯＬスコアの増大、または症状および／または問題に関する各スコアの低下など、前述の質問票をはじめとするがこれに限定されるものではない、ＱＯＬを試験する任意の方法を使用して測定される、ＱＯＬの顕著な増大をもたらす。
【０１１５】
この増大または減少は、それぞれ好ましくは治療開始前に得られたスコアを１％超え、より好ましくは２％超え、さらにより好ましくは５％を超え、例えば１０％、さらにより好ましくは治療前スコアを２０％、５０％または７５％超える。別の実施態様では、治療は、治療後スコアが比較できる健康な対象プールに見られる平均スコアと等しくなるように、またはこのような正常なスコアに近くなるように、すなわちスコアの５０％を超える、さらにより好ましくはスコアの６０％、またはより好ましくはスコアの７５％などのＱＯＬスコアの測定可能な増大をもたらす。さらに別の実施態様では、治療は、治療開始前スコアの少なくとも１％、より好ましくは３％、さらにより好ましくは５％、またはより好ましくは１０％、２０％、３０％または５０％の症状および／または問題に関するスコアの低下をもたらす。これらの増大または減少は、それぞれ個体ＱＯＬ測定ツールの態様の１つ、いくつか、または全て、または適切ならば複合スコアを指してもよい。
【０１１６】
食欲刺激、食物摂取、体重増加、除脂肪体重増加、体脂肪量増加
上で考察したように、特に病的体重減少を患っている個体において、体重増加を促進しまたは体重維持を促進することは、食欲および／または食物摂取を刺激する問題だけでなく、むしろエネルギー摂取とエネルギー消費間の不均衡、すなわち全身代謝の補正でもある。しかしいくらかの個体、特に病的過程が食欲低下をもたらし、それが自然に不健康な体重減少を引き起こしている個体は、なおも食欲の刺激から恩恵を受ける。したがって一態様は、グレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質を投与することによる食欲の刺激に関する。食欲の刺激は、例えば食欲、空腹感または満腹レベルを測定する視覚的アナログ尺度を使用して測定されてもよい。好ましい実施態様では、刺激は、例えば治療前と比較して１０％、より好ましくは２０％高く、またはさらにより好ましくは３０％、４０％または５０％高いなど、少なくとも５％高い。
【０１１７】
食欲の刺激は必ずしも食物摂取の増大をもたらさず、したがって本開示は、グレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質を投与することによる食物摂取の刺激という、別の態様にさらに関する。
【０１１８】
食物摂取は、例えば日記または質問票を使用した自己申告、摂取前の食物計量を使用したセルフサービス食からのカロリー摂取測定、または対を成す食物量の計量および分析をはじめとする多数の技術を使用して測定できる。食物摂取は毎食ベース、日間ベース、週間ベースまたは月間ベースで測定してもよい。好ましい実施態様では、治療は、例えば治療開始前の平均食物摂取の２％、より好ましくは３％、または５％または７％、およびさらにより好ましくは１０％を超えるなど、食物摂取の１％の増大をもたらす。脂肪、炭水化物、およびタンパク質などの様々な食品は、食物量あたり異なるカロリー量を含有するため、食物摂取量はカロリー摂取と直接関連しなくてもよいので、別の実施態様では、治療は食物摂取の変化に関わりなくカロリー摂取の増大をもたらす。好ましい実施態様では、治療は例えばカロリー摂取の２％の増大、より好ましくは３％、または５％または７％、およびさらにより好ましくは１０％の増大など、カロリー摂取の１％の増大をもたらす。
【０１１９】
別の態様は、グレリンスプライス変異体様化合物を投与することによる、体重増加の刺激または安定した体重の維持に関する。
【０１２０】
好ましくは、グレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質は、食物摂取および体重増加を刺激するのに有用である。より好ましくはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質は、体重増加を刺激するのに、または安定した体重を維持するのに有用である。
【０１２１】
下で考察するように、食事前１８０分以内など、食事前１５０分以内など、食事前１２０分以内など、食事前１００分以内など、食事前８０分以内など、食事前６０分以内など、食事前４５分以内など、食事前３０分以内など、食事前１５分以内などの食事前に、グレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質を投与することが好ましい。さらにグレリンスプライス変異体様化合物が、皮下投与されることが好ましい。
【０１２２】
さらに例えば人工股関節挿入、切断術、骨折、および心臓切開手術などの重大な外科手術から回復中の個体などにおいて、グレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質を投与して、身体機能の維持を促進し、および／または身体機能回復を促進してもよい。
【０１２３】
特にグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質は、低体重対象の治療、または低体重段階への体重減少の防止のために有用である。低体重対象とは、「正常な」体重範囲またはＢＭＩの下端の約３％、５％以下、１０％以下、２０％以下、または３０％以下の体重を有するものを含む。「正常な」体重量範囲は、当該技術分野でよく知られており、患者年齢、身長、および体格などの要素を考慮している。さらに本明細書で開示される化合物は、治療開始前に、１ヶ月あたり１％、１ヶ月あたり２％以下、または６ヶ月あたり５％以下の体重減少などの不随意体重減少を経験した患者を治療するのに適する。
【０１２４】
体重または食欲の増大は、疾患を有する患者、または体重または食欲に影響する治療を受ける患者にとって有用であることができる。さらに例えばブタ、雌牛、およびニワトリなどの家畜動物を処置して、体重を増加させることができる。
【０１２５】
個体の体脂肪量の増大は、いくつかの既知の技術を使用して、当業者によって容易に評価できる。一実施態様は、個体の総体重の増加なしの体脂肪量増大に関する。好ましい実施態様は、治療開始前と比較して２％の増大、より好ましくは治療前値の５％、および８％および１０％、さらにより好ましくは２０％または４０％を超えるなどの４％の体脂肪増大をもたらす。
【０１２６】
本開示に従って治療できるさらなる個体の病状は、神経性過食症、食欲不振症、男性勃起不全、女性性的機能不全、虚血性神経または筋肉損傷の回復、ならびに全身性エリテマトーデスである。
【０１２７】
皮下投与
グレリンおよびグレリンスプライス変異体は、ＧＨＳ受容体と、さらに別の未だ同定されていない受容体とを活性化することに留意することが重要である。これらの受容体は、食欲制御のための視床下部中枢内のＧＨ産生細胞上、および生物中のいくつかの追加的な位置に見られる。ＣＮＳ内において、これらの受容体は、局在性グレリンスプライス変異体含有ニューロンからのシグナルを受信するように調節される。末梢性に分泌されたまたは人工的に投与されたグレリンスプライス変異体は、このような部位に到達して血液脳関門を通過し、適切な受容体を特異的に活性化して特異的な経路を作動させる。しかし一般にＧＨＳ受容体との結合を目的とする、ＭＫ−０６７７（メルク（Ｍｅｒｃｋ））などの小さな有機化合物である、現在入手できる「いわゆる」ＧＨ分泌促進物質は、血液脳関門を通過してこれらの部位にも到達し、様々なＧＨＳ受容体関連経路を活性化して、結果的に目眩、悪心、転倒、空腹時血清グルコースおよびインシュリンの上昇、およびかすみ目などの望ましくない副作用を引き起こす危険性を有する。したがって例えば経口的に活性である利点を有さない化合物は、非特異的に体内の全ＧＨＳ受容体関連経路を活性化するので、自然の食事前のグレリンスプライス変異体の食欲誘発性の急上昇を模倣するのには最適でない。対照的に、好ましい実施態様におけるように、天然ペプチドであるグレリンスプライス変異体それ自体、またはその相同体を使用して、それを末梢性に投与することで、妥当な食欲調節グレリンスプライス変異体受容体および経路のみに到達して、刺激することを確実にする。
【０１２８】
常態では食事前の状況における末梢性に生成されたグレリンスプライス変異体の標的である、グレリンスプライス変異体受容体が、十分なレベルの生理活性形態のグレリンスプライス変異体に曝露することを確実にし、系の脱感作を引き起こすことなく、堅牢で適切な食欲刺激を確実にする、任意の非経口投与形態が、本開示の実施態様の一部であってもよい。しかし治療を受ける個体は、おそらく数週間または数ヶ月などのより長期間にわたり、治療を受けなくてはならないことを勘案すると、投与形態はそれに良く適していることが好ましい。したがってグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質は、グレリンスプライス変異体の生理活性形態、すなわちアシル化形態の十分なレベルが、来る食事前に受容体に到達できるようにする量で、皮下投与されることが好ましい。
【０１２９】
本開示は、好ましくは、生理学的な食事前の状況をできるだけ密接に模倣するが、なおも例えば脆弱な高齢者、手術後の患者、および／または例えば癌や心臓疾患などによって誘発された悪液質の一端として食欲を喪失した患者など、食物摂取増大を必要とする患者に、常態では食事前の状況においてグレリンスプライス変異体によって到達される、彼らの食欲制御グレリンスプライス変異体受容体に、十分な追加的刺激入力を提供する様式で、グレリンスプライス変異体などの分泌促進物質を投与する方法を扱う。
【０１３０】
ボーラス投与
さらに分子薬理学的の観点から、グレリン受容体、ひいてはグレリンスプライス変異体受容体が、常態ではグレリン濃度の短時間の急上昇に曝露することが分かっていることに留意することが重要である。ＧＨＳ−Ｒ  １ａ受容体（成長ホルモン分泌促進物質受容体１ａ）は、作用薬への持続性曝露に際し、脱感作され、内部移行されて、下方制御される、Ｇタンパク質結合受容体または７ＴＭ受容体のクラスに属する。総合情報伝達系に固有であるこれらの機序は、（それ自体が作用薬に対する受容体の親和力を低下させる）受容体リン酸化、および（Ｇタンパク質などの情報伝達分子の結合を立体的にブロックする）アレスチンなどの阻害性タンパク質の結合などの過程を伴う。作用薬媒介性脱感作過程の別の部分は、受容体内部移行（すなわち作用薬に結合できる受容体の細胞表面からの物理的除去）、ならびに受容体下方制御（すなわち受容体の生成／発現の低下）である。受容体の作用薬への短時間の曝露後に、受容体の内部移行には、受容体が脱リン酸化されて再利用のために細胞表面に再循環される、再感作過程が続くことができる。理論による拘束は意図しないが、例えば作用薬の持続性の連続注入の間に起きるであろう長期の刺激に際して、受容体下方制御過程は、標的細胞がこの状況に対してその情報伝達系を調節することを確実にすると考えられる。
【０１３１】
最適投与
本開示はまた最大の反応を得て、例えば脱感作機序を避けるために、患者にグレリンスプライス変異体を最適投与する手順も提供する。
【０１３２】
したがって、一態様は、ボーラス、好ましくは主要な各食事前のボーラスでのグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質の投与に関する。先行技術における長期の投与過程とは対照的に、ボーラス投与は食欲の刺激だけでなく、食餌摂取の刺激と、より重要な体重増加の刺激もまたもたらすことが分かっている。理論による拘束は意図しないが、適切な用量のグレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質の食事前皮下注射、静脈内注射、または短期注入は、例えば患者の可動性などに対する最少の制約で、食欲を誘発するグレリンスプライス変異体受容体の堅牢な刺激が得られることを確実にすると考えられる。したがって例えば手術後の状況において股関節骨折がある患者は、食事前、そして必要に応じて食事中にこのように処置され、自由に動き回って、重要な手術後の理学療法に参加できる。好ましい一実施態様では、グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質が、体重１ｋｇあたり１０μｇに相当する量でボーラスとして投与される。
【０１３３】
グレリンスプライス変異体様化合物
ここで開示される方法においては、グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの任意の分泌促進物質を使用してもよい。本明細書に記載の好ましい一タイプのグレリンスプライス変異体様化合物は、式Ｉ、
Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２（式中、Ｚ１は場合により存在する保護基であり；各Ｘ１は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され；Ｘ２は天然アミノ酸および合成アミノ酸から選択され、前記アミノ酸はかさ高い疎水性基で修飾され；各Ｘ３は天然アミノ酸および合成アミノ酸から独立して選択され、Ｘ１およびＸ３の１つ以上は場合によりかさ高い疎水性基で修飾されてもよく；Ｚ２は場合により存在する保護基であり；ｍは１〜１０の範囲内の整数であり；ｎは４〜９２の範囲内の整数であり；ただし式Ｚ１−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２で表される化合物はアミノ酸１５〜９４個の長さであり、配列番号１と少なくとも８０％（または代案の実施態様では８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％）の相同性を有する）によって定義される構造を含んでなる化合物である。好ましい実施態様では、グレリンスプライス変異体様化合物は、アミノ酸２２〜２９個の長さである。
【０１３４】
したがって「分泌促進物質」という用語は、そのアミノ酸配列が配列番号５で示される天然のアミノ酸２９個のヒトグレリンスプライス変異体、ならびにそのアミノ酸配列が配列番号２で示される、天然のアミノ酸２２個のヒトグレリンスプライス変異体、およびそのアミノ酸配列が配列番号３で示される、天然のアミノ酸２４個のヒトグレリンスプライス変異体を含む。
【０１３５】
本開示は、ジアステレオマーならびにそれらのラセミおよび分離鏡像異性的純粋形態を含む。分泌促進物質はＤ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、天然アミノ酸および／または合成アミノ酸など、またはその組み合わせを含有できる。好ましくはグレリンスプライス変異体様化合物中に存在するアミノ酸は、Ｌ−鏡像異性体である。
【０１３６】
グレリンスプライス変異体様化合物は、好ましくはかさ高い疎水性基で修飾されたアミノ酸を含んでなる。修飾アミノ酸のＮ−末端のアミノ酸の数は、好ましくは１〜９の範囲内である。したがってｍは好ましくは、１〜８など、１〜７など、１〜６など、１〜５など、１〜４など、１〜３など、１〜２など、２などの１〜９の範囲内の整数である。
【０１３７】
修飾アミノ酸のＮ−末端のアミノ酸の数は、１〜３など、１〜２などのように小さいことがより好ましい。最も好ましくは２個のアミノ酸が、修飾アミノ酸のＮ−末端に位置する。
【０１３８】
好ましい実施態様では、（Ｘ１）ｍは配列のＮ−末端部分にＧｌｙ残基を有する。したがって好ましい実施態様では、（Ｘ１）ｍは以下の配列から選択される。Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ、Ｇｌｙ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ、Ｇｌｙ−Ａｓｎ、Ｇｌｙ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ−Ｔｈｒ、およびＧｌｙ−Ｔｙｒ。より好ましくは（Ｘ１）ｍは、Ｇｌｙ−ＳｅｒおよびＧｌｙ−Ｃｙｓから選択され、最も好ましくは（Ｘ１）ｍはＧｌｙ−Ｓｅｒである。
【０１３９】
換言すれば、好ましい実施態様では、グレリンスプライス変異体様化合物は、Ｚ１−Ｇｌｙ−（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２（式ＩＩ）、Ｚ１−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２（式ＩＩＩ）、およびＺ１−Ｇｌｙ−（Ｘ２）−（Ｘ３）ｎ−Ｚ２（式ＩＶ）から選択される。より好ましくはグレリンスプライス変異体様化合物は、式ＩＩＩで表される。
【０１４０】
上述のように、Ｘ２は、かさ高い疎水性基で修飾された任意のアミノ酸であってもよい。特にＸ２は、修飾Ｓｅｒ、修飾Ｃｙｓ、修飾Ａｓｐ、修飾Ｌｙｓ、修飾Ｔｒｐ、修飾Ｐｈｅ、修飾Ｉｌｅ、および修飾Ｌｅｕからなる群から選択される。より好ましくは、Ｘ２は修飾Ｓｅｒ、修飾Ｃｙｓ、および修飾Ｌｙｓからなる群から選択され、最も好ましくはＸ２は修飾Ｓｅｒである。
【０１４１】
さらに（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）は、好ましくはＧｌｙ−Ｘａａ−Ｓｅｒ＊またはＧｌｙ−Ｘａａ−Ｃｙｓ＊であり、式中、Ｘａａは任意のアミノ酸であり、より好ましくは（Ｘ１）ｍ−（Ｘ２）は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ＊またはＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ＊であり、式中、＊はアミノ酸残基がかさ高い疎水性基で修飾されていることを示す。
【０１４２】
（Ｘ３）ｎは、好ましくは、ヒトグレリンスプライス変異体などのグレリンスプライス変異体断片である配列を含んでなる。したがって（Ｘ３）ｎは、好ましくは、以下の配列（配列番号６）の断片を含んでなる。Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ。
【０１４３】
好ましい実施態様では、グレリンスプライス変異体様化合物の長さは、処理済みヒトグレリンの長さ、すなわちアミノ酸２９個と実質的に似ている。したがってｎは、好ましくは４〜２４など、４〜２２など、４〜１５など、４〜１０など、１０〜２５など、１０〜２４など、１５〜２５など、１５〜２４などの４〜２５の範囲内の整数である。最も好ましくは、グレリンスプライス変異体様化合物は、そのアミノ酸配列が配列番号５で示されるアミノ酸２９個のヒトグレリンスプライス変異体、そのアミノ酸配列が配列番号２で示されるアミノ酸２２個のヒトグレリンスプライス変異体、そのアミノ酸配列が配列番号３で示されるアミノ酸２４個のヒトグレリンスプライス変異体、またはそのアミノ酸配列が配列番号４で示される第３の位置に２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）残基を有するアミノ酸２４個のヒトグレリンスプライス変異体である。
【０１４４】
機能性
本明細書に記載の分泌促進物質は、上述のようなＧＨＳ受容体、すなわち受容体ＧＨＳ−Ｒ  １ａにおいて活性である。化合物はＧＨＳ−Ｒ  １ａに結合でき、好ましくは受容体活性を刺激する。いくつかの実施態様では、化合物はその他の受容体に結合でき、場合によりそれらの活性を刺激する。
【０１４５】
受容体活性は、受容体中の細胞内立体配座、Ｇ−タンパク質共役活性、および／または細胞内メッセンジャーの変化を検出するなどの異なる技術を使用して測定できる。グレリンスプライス変異体様化合物がグレリンスプライス変異体受容体を活性化する能力の簡単な一つの測定は、そのＥＣ５０、すなわち化合物が化合物の最大効果の半分にまで、受容体のシグナル伝達を活性化できる用量を測定することである。例えばＥＣ５０を測定する際、受容体は、例えば下垂体細胞などの初代細胞培養上で内因的に発現でき、あるいはグレリン受容体で形質移入された細胞上で異種的に発現できる。アッセイタイプ次第で、ホールセルアッセイ、またはこれらの細胞タイプのいずれかから調製された膜を使用するアッセイが使用できる。
【０１４６】
受容体は、一般に主としてＧｑシグナル伝達経路と共役すると考えられているので、例えば以下のようなＧｑ／Ｇ１１シグナル伝達経路の活性をモニターする任意の適切なアッセイが使用できる。
１）例えば信号対雑音比を増大させるために、例えば抗Ｇ−α−ｑまたは−１１抗体沈降と組み合わさったＧＴＰｇＳ結合の測定によって行われる、Ｇｑ／Ｇ１１の活性化を測定するアッセイ。このアッセイはまた、Ｇｑ／１１以外のＧ−タンパク質へのカップリングを検出してもよい。
２）例えばＰＬＣ生成物の１つであるイノシトールホスフェートの蓄積を測定することで、経路内の最初の下流エフェクター分子の１つである、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）の活性を測定するアッセイ。
３）シグナル伝達カスケード内のより下流では、細胞内貯蔵からのカルシウムの動員が当業者に知られている任意の方法で測定できる。
４）さらにより下流では、異なる種類のＭＡＰキナーゼ（ｐ３８、ｊｕｎなど）、ＮＦκＢ転位およびＣＲＥ駆動遺伝子転写活性などのシグナル伝達分子もまた測定してよい。
５）蛍光標識したアレスチンの活性化グレリン受容体への結合。
【０１４７】
分泌促進物質の機能性の判定において使用される適切なプロトコルの例は、下記の実施例４にある。
【０１４８】
一実施態様では、化合物の受容体ＧＨＳ−Ｒ  １ａへの結合が、上述のアッセイの使用によって測定できる。
【０１４９】
グレリンスプライス変異体様化合物は、上述のアッセイを使用した判定で、アミノ酸２８個のヒト野生型グレリンと比較して、好ましくは少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の機能活性を有し、および／または約１，０００を超え、約１００を超え、または約５０を超え、または約１０を超えるＥＣ５０を有する。超えるとは力価を指し、したがって結合阻害を達成するのにより少ない量を要することを示す。
【０１５０】
一実施態様では化合物は、ＧＨＳ−Ｒ  １ａに対して５００ｎＭ未満の力価（ＥＣ５０）を有する。別の実施態様では化合物は、ＧＨＳ−Ｒ  １ａに対して、８０ｎＭ未満など、６０ｎＭ未満など、４０ｎＭ未満など、２０ｎＭ未満など、１０ｎＭ未満など、５ｎＭ未満など、１ｎＭ未満など、０．５ｎＭ未満など、０．１ｎＭ未満など、０．０５ｎＭ未満など、０．０１ｎＭ未満などの１００ｎＭ未満の力価（ＥＣ５０）を有する。
【０１５１】
さらなる実施態様では、化合物の解離定数（Ｋｄ）は５００ｎＭ未満である。なおもさらなる実施態様では、リガンドの解離定数（Ｋｄ）は、８０ｎＭ未満など、６０ｎＭ未満など、４０ｎＭ未満など、２０ｎＭ未満など、１０ｎＭ未満など、５ｎＭ未満など、１ｎＭ未満など、０．５ｎＭ未満など、０．１ｎＭ未満など、０．０５ｎＭ未満など、０．０１ｎＭ未満などの１００ｎＭ未満である。
【０１５２】
結合アッセイは、異なる環境内に存在する組み換え的に生成された受容体ポリペプチドを使用して実施できる。このような環境としては、例えば組み換え核酸または天然核酸から発現された受容体ポリペプチドを含有する、細胞抽出物および精製細胞抽出物が挙げられ、および例えば組み換え手段によって生成された、または異なる環境に導入された天然核酸から生成された、精製ＧＨＳ受容体ポリペプチドの使用もまた挙げられる。
【０１５３】
組み換え的に発現されたＧＨＳ受容体を使用することは、受容体における化合物に対する反応をその他の受容体における反応とさらに容易に区別できるように、規定の細胞系内で受容体を発現する能力などのいくつかの利点を提供できる。例えば受容体は、常態では発現ベクターによって受容体を発現しないＨＥＫ  ２９３、ＣＯＳ  ７、およびＣＨＯなどの細胞系内で発現でき、発現ベクターのない同一細胞系は対照として機能できる。
【０１５４】
同一性および相同性
「同一性」または「相同性」という用語は、配列を位置合わせして必要に応じてギャップを導入して、全配列との最大％の同一性を達成した後に、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せずに、それが比較される対応する配列の残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の百分率を意味するものと解釈される。Ｎ−またはＣ−末端の延長あるいは挿入は、いずれも同一性または相同性を低下させると解釈される。配列比較の方法およびコンピュータープログラムについては、当該技術分野でよく知られている。配列同一性は、配列分析ソフトウェア（例えばのウィスコンシン州マディソンのウィスコンシン大学生物工学センターのジェネティック・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ））からの配列分析ソフトウェアパッケージを使用して測定してもよい。このソフトウェアは、様々な置換、欠失、およびその他の修飾に相同性の程度を割り当てることによって、同様の配列を整合させる。
【０１５５】
ここで規定される配列の１つ以上のグレリンスプライス変異体相同体は、規定の配列と比較して１つ以上のアミノ酸が変動してもよいが、同一機能を遂行でき、すなわち相同体は所定の配列の機能的同等物であると認識してもよい。
【０１５６】
グレリンスプライス変異体相同体は、好ましくは上で定義したようなグレリンスプライス変異体様化合物である。
【０１５７】
上述のように、あらゆる所定の配列の相同体は、以下のように定義されてもよい。
ｉ）抗体によって認識されることができるアミノ酸配列を含んでなる相同体であり、前記抗体はまた、アミノ酸２２個および／またはアミノ酸２４個のヒトグレリンスプライス変異体および／またはアミノ酸２９個のヒトグレリンスプライス変異体、好ましくはアシル化アミノ酸２２個および／またはアミノ酸２４個のヒトグレリンスプライス変異体および／またはアミノ酸２９個のヒトグレリンスプライス変異体を認識し、および／または
ｉｉ）ＧＨＳ−Ｒ  １ａと選択的に結合できるアミノ酸配列を含んでなる相同体、および／または
ｉｉｉ）アミノ酸２２個および／またはアミノ酸２４個のヒトグレリンスプライス変異体および／またはアミノ酸２９個のヒトグレリンスプライス変異体、好ましくはアシル化アミノ酸２２個および／またはアミノ酸２４個のヒトグレリンスプライス変異体および／またはアミノ酸２９個のヒトグレリンスプライス変異体と実質的に同様の、またはそれより高い親和力をＧＨＳ−Ｒ  １ａに対して有する相同体（アミノ酸２２個および／またはアミノ酸２４個および／またはアミノ酸２９個のヒトグレリンスプライス変異体は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５で示される配列を有することができ、アシル化すると位置３でアシル化される）。
【０１５８】
ここで使用される抗体は、グレリンスプライス変異体のＮ−末端領域、またはグレリンスプライス変異体のＣ−末端領域、好ましくはＮ−末端領域に結合する抗体であってもよい。抗体は、Ariyasu H. et al., Endocrinology 143:3341-50 (2002)に記載のような抗体であってもよい。
【０１５９】
例示的な相同体は、所定のアミノ酸の同一群内の１つ以上の保存的アミノ酸置換をはじめとする１つ以上の保存的アミノ酸置換、または各保存的置換が異なる所定のアミノ酸群内の置換によって発生する、複数の保存的アミノ酸置換を含んでなる。したがって前記相同体の少なくとも１つのグリシン（Ｇｌｙ）が、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびｌｌｅからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換された相同体、およびそれと独立して前記その相同体の前記アラニン（Ａｌａ）の少なくとも１つが、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換された相同体、およびそれと独立して前記その相同体のバリン（Ｖａｌ）の少なくとも１つが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換された相同体、およびそれと独立して前記その相同体の前記ロイシン（Ｌｅｕ）の少なくとも１つが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、およびｌｌｅからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換された相同体、およびそれと独立して前記その相同体のイソロイシン（Ｉｌｅ）の少なくとも１つが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＶａｌおよびＬｅｕからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換された相同体、およびそれと独立して前記その相同体の前記アスパラギン酸（Ａｓｐ）の少なくとも１つが、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、およびＧｌｎからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換された相同体、およびそれと独立して前記その相同体の前記フェニルアラニン（Ｐｈｅ）の少なくとも１つが、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、およびＰｒｏからなるアミノ酸群から選択される、および好ましくはＴｙｒおよびＴｒｐからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換された相同体、およびそれと独立して前記その相同体の前記チロシン（Ｔｙｒ）の少なくとも１つがＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、およびＰｒｏからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸、好ましくはＰｈｅおよびＴｒｐからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換された相同体、およびそれと独立して前記断片の前記アルギニン（Ａｒｇ）の少なくとも１つが、ＬｙｓおよびＨｉｓからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換された相同体、およびそれと独立して前記その相同体のリジン（Ｌｙｓ）の少なくとも１つが、ＡｒｇおよびＨｉｓからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換された相同体、およびそれと独立して前記その相同体の前記アスパラギン（Ａｓｎ）の少なくとも１つが、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、およびＧｌｎからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換された相同体、およびそれと独立して前記その相同体のグルタミン（Ｇｌｎ）の少なくとも１つが、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、およびＡｓｎからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換された相同体、およびそれと独立して前記その相同体のプロリン（Ｐｒｏ）の少なくとも１つが、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、およびＨｉｓからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換された相同体、およびそれと独立して前記その相同体の前記システイン（Ｃｙｓ）の少なくとも１つが、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＴｙｒからなるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換された相同体は、互いに独立した保存的置換を含んでなってもよい。
【０１６０】
保存的置換は、好ましい所定の配列の任意の位置に導入してもよい。しかし非保存的置換、特に、しかしこれに限定されるものではない、任意の１つ以上の位置における非保存的置換を導入することもまた望ましいかもしれない。
【０１６１】
ここで配列の機能的に同等の相同体形成をもたらす非保存的置換は、例えばｉ）例えばＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、またはＧｌｎなどの極性側鎖がある残基、またはＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、またはＬｙｓなどの荷電アミノ酸を置換する、非極性側鎖がある残基（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、ｌｌｅ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＭｅｔ）、または荷電または極性残基で非極性のものを置換するなど極性が実質的に異なり、および／またはｉｉ）別の残基によるＰｒｏまたはＧｌｙの置換などのポリペプチド主鎖の配向に対するその効果が実質的に異なり、および／またはｉｉｉ）例えばＧｌｕまたはＡｓｐなどの負に帯電した残基と、Ｌｙｓ、ＨｉｓまたはＡｒｇなどの正に帯電した残基との置換（逆もまた然り）のように電荷が実質的に異なり、および／またはｉｖ）例えばＨｉｓ、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＴｙｒなどのかさ高い残基と、例えばＡｌａ、ＧｌｙまたはＳｅｒなどのより小さい側鎖を有するものとの置換（逆もまた然り）のように立体バルクが実質的に異なる。
【０１６２】
アミノ酸の置換は、一実施態様ではそれらの疎水性および親水性値と、電荷やサイズをはじめとするアミノ酸側鎖置換基の相対類似性などに基づいて行ってもよい。様々な前述の特徴を考慮した例示的なアミノ酸置換は当業者によく知られており、例えばアルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；およびバリン、ロイシン、およびイソロイシンなどが挙げられる。
【０１６３】
好ましい実施態様では、結合領域は、配列番号１と少なくとも６０％相同的なアミノ酸配列を有する相同体を含んでなる。より好ましくは相同性は、配列番号１と少なくとも７０％相同的など、少なくとも７５％相同的など、少なくとも８０％相同的など、少なくとも８５％相同的など、少なくとも９０％相同的など、少なくとも９５％相同的など、少なくとも９８％相同的など、少なくとも６５％である。より好ましい実施態様では、上述の百分率は、配列番号１と比較した相同体配列の同一性と関連がある。配列番号１の相同体は、アミノ酸２２個のヒトグレリンスプライス変異体（配列番号２）、アミノ酸２４個のヒトグレリンスプライス変異体（配列番号３）、またはアミノ酸２９個のヒトグレリンスプライス変異体（配列番号５）であってもよい。その他の相同体は、参照によって本明細書に援用するEP 1 197 496 (Kangawa)に記載の変異体である。
【０１６４】
かさ高い疎水性基
本明細書で開示される分泌促進物質のかさ高い疎水性基は、ＧＨＳ−Ｒ  １ａおよび／またはＧＳ−Ｒ−１ｂに対する結合親和力がある、脱アシル化されたアミノ酸２８個のヒト野生型グレリン、またはその類似体を提供できる任意のかさ高い疎水性基である。任意の適切なアミノ酸が、任意の適切なかさ高い疎水性基によって修飾されてもよい。好ましい実施態様では、Ｓｅｒ残基（好ましくはグレリンスプライス変異体アミノ酸鎖中のアミノ酸番号３）は、かさ高い疎水性基で修飾される。修飾されるアミノ酸が、例えばその側鎖中の置換基として−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨまたは−ＮＨ２を含有する場合、このような置換基のアシル化によって形成される基が好ましい。したがって結合様式は、エステル、エーテル、チオエステル、チオエーテル、アミド、およびカルバミドからなる群から選択されてもよい。例えば修飾アミノ酸がセリン、スレオニン、チロシンまたはオキシプロリンであれば、アミノ酸は側鎖中に水酸基を有する。修飾アミノ酸がシステインであれば、アミノ酸は側鎖中にメルカプト基を有する。修飾アミノ酸がリジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、プロリンまたはオキシプロリンであれば、それは側鎖中にアミノ基またはイミノ基を有する。
【０１６５】
したがって上述の水酸基、メルカプト基、アミノ基、およびイミノ基は、化学修飾されてもよい。すなわち水酸基またはメルカプト基は、例えばエーテル化、エステル化、チオエーテル化またはチオエステル化されてもよい。イミノ基は、例えばイミノエーテル化、イミノチオエーテル化またはアルキル化されてもよい。アミノ基は、例えばアミド化、チオアミド化またはカルバミド化されてもよい。さらにメルカプト基は、例えばジスルフィド化されてもよく、イミノ基は例えばアミド化またはチオアミド化されてもよく、アミノ基は例えばアルキル化またはチオカルバミド化されてもよい。
【０１６６】
好ましい実施態様では、修飾アミノ酸は疎水性基にエステル結合を通じて結合するＳｅｒであり、または別の好ましい実施態様では、修飾アミノ酸は疎水性基にアミド結合を通じて結合するＤｐｒである。
【０１６７】
疎水性基は、１つ以上の炭素原子を含有する、飽和または不飽和アルキルまたはアシル基がある、任意の基であってもよい。一実施態様では、かさ高い疎水性基は、有機カルボン酸、有機スルホン酸または有機リン酸から水酸基を除去して形成される基をはじめとするアシル基である。有機カルボン酸としては例えば脂肪酸が挙げられ、その炭素原子数は好ましくは１〜３５である。有機スルホン酸または有機リン酸中では、その炭素原子数は好ましくは１〜３５である。
【０１６８】
したがってアシル基は好ましくは、Ｃ１〜Ｃ２０アシル基など、Ｃ１〜Ｃ１５アシル基など、Ｃ６〜Ｃ１５アシル基など、Ｃ６〜Ｃ１２アシル基など、Ｃ８〜Ｃ１２アシル基などのＣ１〜Ｃ３５アシル基から選択される。より好ましくはアシル基は、Ｃ７アシル基、Ｃ８アシル基、Ｃ９アシル基、Ｃ１０アシル基、Ｃ１１アシル基、およびＣ１２アシル基からなる群から選択される。このようなアシル基は、オクタン酸（好ましくはカプリル酸）、デカン酸（好ましくはカプリン酸）、またはドデカン酸（好ましくはラウリン酸）、ならびにそのモノエンまたはポリエン脂肪酸から形成されてもよい。
【０１６９】
さらに修飾アミノ酸は、参照によって本明細書に援用する EP 1 197 496 (Kangawa)に記載されているように、基が修飾されている任意のアミノ酸であってもよい。
【０１７０】
保護基
本開示に係るグレリンスプライス変異体様化合物は、Ｎ−末端またはＣ−末端または双方に保護基を含んでなってもよい。保護基は生体内条件下で、Ｎ−末端アミノ基と共有結合してアミノ末端の反応性を低下させる。アミノ保護基としては、例えばＣ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０置換アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０置換アルケニル、アリール、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアリール、Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）−ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ（Ｏ）−アリール、Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６−アルキル）、またはＣ（Ｏ）−Ｏ−アリールが挙げられる。好ましくはアミノ末端保護基は、アセチル、プロピル、スクシニル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニルまたはｔ−ブチルオキシカルボニルである。
【０１７１】
保護基は、生体内条件下でＣ−末端カルボキシ基に共有結合して、カルボキシ末端の反応性を低下させる。カルボキシ末端保護基は、好ましくは最後のアミノ酸のａ−カルボニル基に付着する。カルボキシ末端保護基としては、例えばアミド、メチルアミド、およびエチルアミドが挙げられる。
【０１７２】
抱合体
グレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質は、分泌促進物質抱合体、すなわち別の実体に抱合する分泌促進物質を含んでなる分子の形態で提供されてもよい。その他の実体は、分泌促進物質に、例えば改善された安定性や半減期などの観点から、改善された特性を与えることができる任意の物質であってもよい。適切な実体の例については後述する。例えば分泌促進物質は、ノシセプチン受容体ＯＲＬ１に対する効果を有するペプチドなどのペプチドに抱合してもよい。一実施態様では、抱合体は、グレリンスプライス変異体またはその誘導体または相同体と、例えばペプチドＡｃ−ＲＹＹ（ＲＫ）（ＷＩ）ＲＫ）−ＮＨ２などのＯＲＬ１に対して効果を有するペプチドとの抱合体であり、ここで、括弧はアミノ酸残基の可能な変形を示す。その他の適切なペプチドの例は、それぞれを参照によって本明細書に援用する、Published U.S. Patent Application Nos. 2003/040472および2002/004483、およびU.S. Patent No. 5,869,046にある。
【０１７３】
別の実施態様では、グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質は、ポリマー分子と抱合する。ポリマー分子は、典型的に分子量が、約３〜２０ｋＤａなど、５〜１０ｋＤａなどの約１〜１００ｋＤａの範囲内である、天然または合成ポリマーなどの任意の適切なポリマー分子であってもよい。ポリマーは、分泌促進物質上に存在する、例えばアミン基またはチオール基などの反応性基に結合する。適切なポリマー分子の例としては、直鎖または分枝鎖ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）などのポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）をはじめとする、ポリ酸化アルキレン（ＰＡＯ）；ポリ−ビニルアルコール（ＰＶＡ）；ポリ−カルボキシレート；ポリ−（ビニルピロリドン）；ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物；ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物；およびカルボキシメチル−デキストランをはじめとするデキストランからなる群から選択されるポリマー分子が挙げられる。好ましくは、ポリマー分子はＰＥＧ分子、特にメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）などの単官能性ＰＥＧである。適切な活性化ＰＥＧ分子は、例えばアラバマ州ハンツビルのネクター・セラピューティクス社（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａ．））、またはカリフォルニア州バーリンガムのバレンティス社（Ｖａｌｅｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌ．））から入手できる。あるいは、ポリマー分子は、例えば参照によって本明細書に援用するWO 90/13540で開示されるように、当該技術分野で知られている従来の方法により活性化できる。活性化ＰＥＧポリマーの具体例としては、ＮＨＳ−ＰＥＧ（例えばＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＢＡ−ＰＥＧ、ＳＳ−ＰＥＧ、ＳＳＡ−ＰＥＧ、ＳＣ−ＰＥＧ、ＳＧ−ＰＥＧ、およびＳＣＭ−ＰＥＧ）、ＮＯＲ−ＰＥＧ、ＢＴＣ−ＰＥＧ、ＥＰＯＸ−ＰＥＧ、ＮＣＯ−ＰＥＧ、ＮＰＣ−ＰＥＧ、ＣＤＩ−ＰＥＧ、ＡＬＤ−ＰＥＧ、ＴＲＥＳ−ＰＥＧ、ＶＳ−ＰＥＧ、ヨード−ＰＥＧ、およびＭＡＬ−ＰＥＧの直鎖ＰＥＧ、およびＰＥＧ２−ＮＨＳおよびどちらも参照によって本明細書に援用するU.S. Patent Nos. 5,932,462および5,643,575で開示されるものなどの分枝ＰＥＧが挙げられる。
【０１７４】
ＰＥＧ化（すなわち分泌促進ポリペプチドおよび活性化ポリマー分子の抱合）は、例えば（ポリマー分子活性化の適切な方法についてもまた記載されている）以下の参考文献に記載されているように、確立された手順に従って行う。Ｒ．Ｆ．  Ｔａｙｌｏｒ，  （１９９１），  “Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎ．  Ｙ．；Ｓ．Ｓ．  Ｗｏｎｇ，  （１９９２），  “Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ”，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ；  Ｇ．Ｔ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３），  “Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．  Ｙ．。
【０１７５】
本開示に従って、リンカーを通じてポリマー分子を分泌促進物質に結合させることもまた考察された。適切なリンカーは当業者によく知られている。好ましい例は塩化シアヌルである（Abuchowski A. et al., J. Biol. Chem. 252:3578-81 (1977)；U.S. Patent No. 4,179,337； Shafer et al., J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. 24:375-78 (1986)）。
【０１７６】
さらに別の実施態様では、分泌促進物質は、デキストラン、グリカン、トランスフェリンなどのオリゴ糖類分子に抱合する。このような抱合は、例えばペンシルベニア州ホーシャムのネオセ・テクノロジーズ社（Ｎｅｏｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ））から入手できるものなどの確立された技術に従って達成されていてもよい。
【０１７７】
さらに別の実施態様では、分泌促進物質は、典型的に融合タンパク質の形態で、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に抱合される。例えばＩｇＧのＦｃ領域（すなわちアイソタイプＩｇＧの免疫グロブリンのＦｃ部分）のサルベージ受容体結合エピトープを、その循環半減期を増大させるが、その生物学的活性を失わせないようにして、分泌促進物質中に組み込む。これは分泌促進物質中の適切な領域を変異させてＦｃ領域を模倣するか、またはペプチドにエピトープを組み込んで、次にいずれかの端または中央で分泌促進物質に融合するか、またはＤＮＡまたはペプチドを合成するなどの任意の手段によって行われる。
【０１７８】
サルベージ受容体結合エピトープは、当業者に知られている任意の適切なエピトープであり、その性質は例えば修飾される分泌促進物質タイプに左右される。エピトープは、分泌促進物質の生物学的活性が維持されるように、すなわちエピトープが分泌促進物質の立体配座に悪影響を及ぼさないように、またはその生物学的活性を与えるリガンドへのその結合に影響しないように、分泌促進物質に導入される。
【０１７９】
抱合体の形態の分泌促進物質を提供する代案としては、分泌促進物質を修飾して適切な反応性基を含めてもよく、それによってこのように修飾された分泌促進物質が、（個体に投与された後に）血液成分上の利用できる反応性官能基との共有結合を通じて、生体内で抱合体を形成できるようになる。本開示はまた、このような修飾分泌促進物質、およびそれらの使用方法にも関する。また本開示は、上述のような修飾分泌促進物質と血液成分との間で、生体外で形成される抱合体に関する。この実施態様に従って形成された抱合体は、対応する非修飾分泌促進物質と比較して、増大した生体内半減期を有すると考察される。
【０１８０】
この実施態様に従って、分泌促進物質は、化学的に反応性の基（反応性実体）によって修飾される。反応性実体は、例えば、ヒドロキシル部分が生理学的に許容可能である、多様な活性カルボキシル基、特にエステルから選択されてもよい。このような基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）、マレイミド−ベンゾイル−スクシンイミド（ＭＢＳ）、γ−マレイミド−ブチリルオキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、およびマレイミドプロピオン酸（ＭＰＡ）からなる群から選択されてもよい。この実体群の主要な標的は、血液成分上の第一級アミンである。活性実体の別の基は、ＭＰＡおよびγ−マレイミド−ブチルアミド（ＧＭＢＡ）などのマレイミド含有基によって構成される。このような基は、血液成分上に存在するチオール基と反応する（Ｌｅｅ  Ｖ．Ｈ．Ｌ．  ｉｎ  “Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．  Ｙ．，  Ｍ．  Ｄｅｋｋｅｒ，  １９９０）。
【０１８１】
修飾分泌促進物質がそれと反応するようにデザインされた血液成分は、例えばアミンまたはチオール基などの利用できる標的基を有する任意の血液成分であってもよく、それは生体内で修飾分泌促進物質と結合するキャリアとして適切であり、したがってその循環半減期を延長させる。このような血液成分の例は、血清アルブミンおよびＩｇＧである。
【０１８２】
上述のように、修飾分泌促進物質の血液成分への共有結合は、患者への直接の修飾分泌促進物質投与によって、生体内で達成されてもよい。投与は、ボーラス形態、または定量フロー法などを使用して注入によって長時間かけて緩慢に導入するなどの任意の適切な形態で行ってもよい。あるいは、分泌促進物質／血液成分抱合体はまた、血液と修飾分泌促進物質とを合わせ、修飾分泌促進物質を血液成分上の反応性官能基に共有結合させて、次に抱合型血液を個体に戻しまたは投与して、生体外で調製してもよい。
【０１８３】
さらに上記は、最初に個々の血液成分、または赤血球、免疫グロブリン、血清アルブミンなどの限られた数の成分を精製して、生体外で成分と化学的に反応性の分泌促進物質とを合わせて達成してもよい。
【０１８４】
グレリンスプライス変異体様化合物の生成
グレリンスプライス変異体様化合物は、当該技術分野でよく知られている技術を使用して生成できる。例えばグレリンスプライス変異体様化合物のポリペプチド領域は、化学的または生化学的に合成して修飾できる。ポリペプチドの化学合成技術については、当該技術分野でよく知られている（例えばＬｅｅ  Ｖ．Ｈ．Ｌ．  ｉｎ  “Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．  Ｙ．，  Ｍ．  Ｄｅｋｋｅｒ，  １９９０を参照されたい）。細胞内への核酸導入および核酸の発現を伴う生化学的合成技術の例は、それぞれ参照によって本明細書に援用する、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，  １９８７−１９９８、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  ２ｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９で提供される。参照によって本明細書に援用するU.S. Patent No. 5,304,489に記載の別の例示的な技術は、遺伝子導入哺乳類のミルク中への合成グレリンスプライス変異体様化合物の生成および分泌をもたらす、乳腺−標的突然変異を有する遺伝子導入哺乳類の使用である。
【０１８５】
グレリンスプライス変異体様化合物はまた、当該技術分野で知られている日常的発現方法を使用して組み換え的に生成できる。所望のグレリンスプライス変異体様化合物をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターと作動的に結合して任意の都合よい宿主に適した発現ベクターになる。真核生物および原核生物宿主系の双方が、組み換えグレリンスプライス変異体様化合物を形成するのに使用される。次にグレリンスプライス変異体様化合物は、溶解細胞から、または培養液から単離されて、その意図される用途に必要な程度に精製される。
【０１８６】
したがってさらなる実施態様は、グレリンスプライス変異体様化合物を製造する方法であり、前記方法は、（ａ）グレリンスプライス変異体様化合物をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなるｃＤＮＡを提供するステップと、（ｂ）ｃＤＮＡがプロモーターと作動的に結合するように、前記ｃＤＮＡを発現ベクターに挿入するステップと、（ｃ）前記発現ベクターを宿主細胞に導入し、それによって前記宿主細胞が前記グレリンスプライス変異体様化合物を生成するステップを含んでなる。
【０１８７】
この実施態様の一態様では、本方法は、ステップ（ｃ）で生成されたグレリンスプライス変異体様化合物を回収するステップをさらに含んでなる。別の実施態様は、先行する段落に記載の方法によって得られるグレリンスプライス変異体様化合物である。発現ベクターは、当該技術分野で知られている哺乳類、酵母、昆虫、または細菌発現系のいずれかである。市販されるベクターおよび発現系は、マサチューセッツ州ケンブリッジのジェネティクス・インスティチュート（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．））、カリフォルニア州ラホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．））、ウィスコンシン州マディソンのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．））、およびカリフォルニア州サンディエゴのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．））をはじめとする多様な供給元から入手できる。必要に応じて、その開示の全体を参照によって本明細書に援用するU.S. Patent. No. 5,082,767で説明されるように、発現を増強して適切なタンパク質折りたたみを促進するため、その中に発現ベクターが導入される特定の発現生物のために、配列のコドン文脈およびコドン対形成が最適化される。
【０１８８】
別の実施態様では、組み換えポリヌクレオチドに、分泌またはリーダー配列、プロ配列、複数ヒスチジン残基などの精製を助ける配列をコードする追加的なヌクレオチド配列、または組み換え生成中の安定性のための追加的配列を添加することが有利であることが多い。
【０１８９】
グレリンスプライス変異体様化合物をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞中への導入は、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介形質移入、カチオン脂質−仲介形質移入、電気穿孔、形質導入、感染、またはその他の方法によって達成できる。このような方法については、その開示の全体を参照によって本明細書に援用する、Davis et al., (1986) Basic Methods in Molecular Biology, ed., Elsevier Press, NYなどの多数の標準実験室マニュアルに記載されている。本明細書で開示されるグレリンスプライス変異体様化合物が、事実上、組み換えベクターを欠く宿主細胞によって発現されるか、または細胞によって自然に生成されることが具体的に考察される。
【０１９０】
グレリンスプライス変異体様化合物は、微分抽出、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーをはじめとするよく知られている方法によって、組み換え細胞培養から回収して精製できる（例えばタンパク質を精製する多様な方法については、参照によって本明細書に援用する“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｔｗｏ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ”，  Ｗａｌｔｅｒ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９３）を参照されたい）。一実施態様では、高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製のために用いる。グレリンスプライス変異体様化合物の組み換え生成バージョンは、実質的に、本明細書に記載されるか、またはさもなければ例えばその開示の全体を参照によって本明細書に援用する、Smith & Johnson, Gene 67:31 40 (1988)に記載の一段階法などの当該技術分野で知られている技術を使用して、精製できる。グレリンスプライス変異体様化合物はまた、タンパク質精製技術分野でよく知られている方法において、本明細書に記載のようなグレリンスプライス変異体様化合物に対して誘導された抗体を使用して、組み換え源からも精製できる。
【０１９１】
一実施態様では、組み換え的に発現されたグレリンスプライス変異体様化合物は、標準イムノクロマトグラフィ技術を使用して精製される。このような手順では、培養液または細胞抽出物などの対象とするグレリンスプライス変異体様化合物を含有する溶液を、クロマトグラフィーマトリックスに結合したグレリンスプライス変異体様化合物に対する抗体を有するカラムに入れる。組み換えグレリンスプライス変異体様化合物をイムノクロマトグラフィカラムに結合させる。その後、カラムを洗浄して非特異的に結合したタンパク質を除去する。次に特異的に結合した分泌されたグレリンスプライス変異体様化合物をカラムから放出して、標準技術を使用して回収する。
【０１９２】
組み換え精製手順に用いる宿主次第で、グレリンスプライス変異体様化合物は、グリコシル化されていてもまたはグリコシル化されていなくてもよい。さらに本発明のポリペプチドはまた、場合によっては宿主仲介過程の結果として、初期修飾メチオニン残基を含んでいてもよい。したがって一般に翻訳開始コドンによってコードされるＮ−末端メチオニンが、全ての真核生物細胞中における翻訳後に、あらゆるタンパク質から高効率で除去されることは、当該技術分野でよく知られている。ほとんどのタンパク質上のＮ−末端メチオニンはまた、ほとんどの原核生物中で効率的に除去される一方、いくつかのタンパク質ではこの原核生物除去過程は、それに対してＮ−末端メチオニンが共有結合するアミノ酸の性質次第で非効率的である。
【０１９３】
医薬組成物
本開示の化合物または塩は、未加工化学薬品として投与することが可能である一方、それらを医薬組成物の形態で提示することが好ましい。したがって一態様は、式Ｉで定義されるグレリンスプライス変異体様化合物を含んでなる医薬組成物に関する。
【０１９４】
別の実施態様は、Ｃ８アシルでアシル化されたグレリンスプライス変異体様化合物と、Ｃ１０アシルでアシル化されたグレリンスプライス変異体様化合物との混合物などの少なくとも２つの異なるグレリンスプライス変異体様化合物の混合物を含んでなる医薬組成物に関する。理論による拘束は意図しないが、このような混合物は血漿中でより長い半減期を有すると考えられる。
【０１９５】
さらに別の実施態様では、医薬組成物は、場合により脱アシル化グレリンスプライス変異体様化合物と組み合わさった、場合により好ましくはＣ７アシル基、Ｃ９アシル基、およびＣ１１アシル基からなる群から選択される、異なるアシル鎖長を有する化合物である、アシル化グレリンスプライス変異体様化合物を含んでなる。
【０１９６】
別の態様は、上で定義したような任意のグレリンスプライス変異体様化合物などの任意の分泌促進物質、または医薬的に許容可能なその塩、および医薬的に許容可能なキャリア、ビヒクルおよび／または賦形剤を含んでなる医薬組成物に関し、前記組成物は輸送分子をさらに含んでなる。脱アシル化グレリンスプライス変異体は、ＧＨＳ−Ｒ  １ａに対して活性でないかもしれないので、輸送分子が、主としてアシル化化合物の半減期を増大させて、早発性脱アシル化を予防するために添加される。
【０１９７】
輸送分子は、本明細書で開示される化合物内に組み込まれるか、またはそれに固定されることによって機能する。当業者に知られている任意の適切な輸送分子を使用してもよい。輸送分子の例は、前出の抱合体セクションに記載のものである。その他の好ましい例は、リポソーム、ミセル、および／または微小球である。
【０１９８】
従来のリポソームは、典型的にリン脂質（中性または負に帯電した）および／またはコレステロールから構成される。リポソームは、水性区画周囲の脂質二重層に基づく小胞構造物である。それらは、サイズ、脂質組成、表面電荷および数、およびリン脂質二重層の流動性などのそれらの物理−化学的特性が異なることができる。リポソーム形成のために最も頻繁に使用される脂質は、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（モノナトリウム塩）（ＤＭＰＡ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（モノナトリウム塩）（ＤＰＰＡ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（モノナトリウム塩）（ＤＯＰＡ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ナトリウム塩）（ＤＭＰＧ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール））（ナトリウム塩）（ＤＰＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ナトリウム塩）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）（ＤＭＰＳ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）（ＤＰＰＳ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）（ＤＯＰＳ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（グルタリル）（ナトリウム塩）および１，１’，２，２’−テトラミリストイルカルジオリピン（アンモニウム塩）である。例えばコレステロールおよび／またはホスファチジルコリンと組み合わさったような、その他の脂質またはリポソーム調節剤と組み合わさった、ＤＰＰＣから構成される調合物が好ましい。
【０１９９】
長期循環リポソームは、血管壁の透過度が増大している身体部位で、血管外遊出するそれらの能力によって特徴づけられる。長期循環リポソームを生成する好ましい方法は、親水性ポリマーポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をリポソーム外面に共有結合させることである。いくつかの好ましい脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５０００］（アンモニウム塩）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（塩化塩）（ＤＯＴＡＰ）である。
【０２００】
リポソームに適用できる可能な脂質は、アラバマ州アラバスターのアバンティ・ポラー・リピズ社（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ））により供給される。さらにリポソーム懸濁液は、貯蔵中のフリーラジカルおよび脂質−過酸化的損傷から脂質を保護する脂質保護剤を含んでもよい。α−トコフェロールなどの親油性フリーラジカル失活剤、およびフェリオキサミンなどの水溶性鉄特異性キレート剤が好ましい。
【０２０１】
例えば全て参照によって本明細書に援用する、Szoka F. & Papahadjopolous D., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467-508 (1980)；U.S. Patent Nos. 4,235,871、4,501,728、および4,837,028に記載されているように、リポソームを調製する多様な方法が利用できる。別の方法は不均一なサイズの多重膜小胞を生じる。この方法では、小胞形成脂質を適切な有機溶剤または溶剤系に溶解して真空または不活性ガス下で乾燥させ、薄い脂質フィルムを形成する。必要に応じて、フィルムを第三級ブタノールなどの適切な溶剤に再溶解し、次に凍結乾燥して、より容易に水和する粉末様形態である、より均質な脂質混合物を形成してもよい。このフィルムを標的とされる薬剤および標的とされる成分の水溶液で覆い、典型的に１５〜６０分間にわたり撹拌して水和させる。得られた多重膜小胞の粒度分布は、より激しい撹拌条件下で脂質を水和することによって、またはデオキシコレートなどの可溶化洗剤を添加することによって、より小さなサイズに向けて移行できる。
【０２０２】
ミセルは、水溶液中の界面活性剤（疎水性部分と１つ以上のイオン性またはさもなければ強力な親水性基とを含有する分子）によって形成される。固体界面活性剤の濃度が増大すると、空気／水またはガラス／水境界面で吸着されるその単層は非常に密に充填されるようになるので、さらなる占有は、既に２つの単層にある界面活性剤分子の過剰な圧縮を要する。この濃度を超える溶解した界面活性剤量のさらなる増大は、新しい分子に相当する量のミセルへの凝集を引き起こす。この過程は「臨界ミセル濃度」と称される特徴的な濃度で開始する。
【０２０３】
希釈界面活性剤溶液内で形成するミセルの形状は、ほぼ球状である。界面活性剤分子の極性頭部基が外側球状シェル内に配列されるのに対し、それらの炭化水素鎖は中心の方を向いてミセルの球状コアを形成する。炭化水素鎖は無作為に巻いて交絡し、ミセル内部は非極性の液体様性状を有する。ポリオキシエチル化非イオン性洗剤のミセル内では、ポリオキシエチレン部分は外側を向いて、水によって透過される。親水性頭部基が水と接して、炭化水素部分が水性媒体から除去され、極性頭部基によって水との接触から部分的に遮蔽されるので、この配置はエネルギー的に好ましい。ミセル内部に位置する界面活性剤分子の炭化水素尾部は、弱いファンデルワールス力によって相互作用する。
【０２０４】
ミセルのサイズまたはその凝集数は、幾何学的因子によって大きく左右される。炭化水素コアの半径は、界面活性剤分子の伸展した炭化水素鎖の長さを超えることができない。したがって鎖長を長くするかまたは同族列を上げることにより、球状ミセルの凝集数を増大させる。界面活性剤濃度が数％を超えて増大する場合、および電解質が添加される場合（イオン性界面活性剤の場合）、または温度が上昇する場合（非イオン性界面活性剤の場合）、ミセルはサイズが増大する。これらの条件下では、ミセルは球状を保つには大きくなりすぎて、形状が楕円体、円柱状または最後に層板状になる。
【０２０５】
本開示のミセルにおいて、当業者によく知られている一般的な界面活性剤が使用できる。適切な界面活性剤としては、ラウリン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オクタオキシエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクトキシノール９、およびニュージャージー州フォーハムパークのＢＡＳＦ社（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ．（Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ，ＮＪ））からのプルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣ）（登録商標）Ｆ−１２７が挙げられる。好ましい界面活性剤は、トウィーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）−８０、プルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣ）（登録商標）Ｆ−６８、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、などの静脈内注射と適合性の非イオン性ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレン洗剤である。さらにリポソームの生成における使用に記載のものなどのリン脂質もまた、ミセル形成のために使用してよい。
【０２０６】
別の好ましい実施態様では、本明細書で開示される化合物は、バッカル送達、舌下送達、経皮送達、吸入、およびパウダージェット（Ｐｏｗｄｅｒｊｅｔ）により開発された方法を使用するような無針注射から選択される投与経路に関する文献に記載されているようにして調合される。
【０２０７】
吸入のためには、本明細書で開示される化合物は、例えば好ましくはこのような送達向きの装置（カリフォルニア州ヘイワードのアラジグム社（Ａｒａｄｉｇｍ  Ｃｏｒｐ．（Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃａｌ．））、マサチューセッツ州ケンブリッジのアルケーム社（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．））またはカリフォルニア州サンカルロスのネクター・セラピューティクス（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，Ｃａｌ．））から市販されるものなど）内での煙霧剤、乾燥粉末または微小滴中などへの可溶化などの当業者に知られている方法を使用して調合できる。
【０２０８】
投与
本開示の様々な化合物の適切な投与計画および方法は、好ましくは、例えば投薬対象のタイプ；対象の年齢、体重、性別、および疾患；投与経路；対象の腎臓および肝臓機能；所望の効果；および用いられる特定化合物をはじめとする、当該技術分野でよく知られている要因を考慮して判定される。好ましくは組成物は、約０．５％〜７５重量％の本明細書で開示される分泌促進物質を含んでなり、残部は適切な医薬品賦形剤からなる。
【０２０９】
毒性なしに有効性を生じる範囲内の薬剤濃度の達成における最適精度は、標的部位の薬剤可用性動態に基づく投薬計画を必要とする。これは薬剤の分布、平衡状態、および排除の考慮を伴う。
【０２１０】
上述のように、一態様では、グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質が皮下投与される。
【０２１１】
別の態様では、グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質は、食事前のボーラスとして投与され、投与形態は任意の適切な非経口形態であってもよい。好ましい実施態様では、グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質は、食事前のボーラス中で皮下投与される。
【０２１２】
グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質はまた、食事中にボーラスとして投与できる。食事中投与の様式としては、皮下ボーラスなどの皮下投与が挙げられる。
【０２１３】
非経口投与のための医薬組成物としては、無菌の水性および非水性注射用溶液、分散体、懸濁液またはエマルジョン、ならびに使用前に無菌の注射用溶液または分散体で戻される無菌粉末が挙げられる。その他の適切な投与形態としては、坐薬、スプレー、軟膏、クリーム、ゲル、吸入剤、皮膚パッチ、植込錠、丸薬、錠剤、ロゼンジ、およびカプセルが挙げられる。
【０２１４】
典型的な投薬量は、体重１ｋｇあたり１０ｎｇ〜１０ｍｇのグレリンスプライス変異体に相当する濃度である。ここで濃度および量はグレリンスプライス変異体当量で示され、グレリンスプライス変異体は、アミノ酸２２個のヒトグレリンスプライス変異体（配列番号２）、および／またはアミノ酸２９個のヒトグレリンスプライス変異体（配列番号５）、および／またはアミノ酸２４個のヒトグレリンスプライス変異体（配列番号３）、および／または第３の位置にＤｐｒ残基を有するアミノ酸２４個のヒトグレリンスプライス変異体（配列番号４）である。当量は、上の「機能性」と題されたセクションに記載されているようにして試験してもよい。
【０２１５】
好ましい実施態様では、薬剤は、体重１ｋｇあたり０．５μｇ〜０．５ｍｇのグレリンスプライス変異体など、体重１ｋｇあたり１．０μｇ〜０．１ｍｇのグレリンスプライス変異体など、体重１ｋｇあたり１．０μｇ〜５０μｇのグレリンスプライス変異体など、体重１ｋｇあたり１．０μｇ〜１０μｇのグレリンスプライス変異体などの体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１ｍｇのグレリンスプライス変異体に相当する濃度で投与される。
【０２１６】
上述のように、グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質は、好ましくはボーラスで投与される。したがって一実施態様では薬剤は食事前にボーラスで投与され、前記ボーラスは、０．３μｇ〜６００ｍｇのグレリンスプライス変異体に相当する量の分泌促進物質またはその塩を含んでなる。より好ましくは薬剤は食事前にボーラスで投与され、前記ボーラスは、５．０μｇ〜１００ｍｇのグレリンスプライス変異体など、１０μｇ〜５０ｍｇのグレリンスプライス変異体など、１０μｇ〜５ｍｇのグレリンスプライス変異体など、１０μｇ〜１．０ｍｇのグレリンスプライス変異体などの２．０μｇ〜２００ｍｇのグレリンスプライス変異体に相当する量の分泌促進物質またはその塩を含んでなる。
【０２１７】
食事前に起きる正常なグレリンスプライス変異体様反応はグレリンスプライス変異体の血漿濃度における短時間の急上昇であり、ペプチドの比較的短い半減期のために、グレリンスプライス変異体の静脈内注射は、グレリンスプライス変異体濃度に、同様の短時間のピークが得られることを確実にすることに留意すべきである。投与経路は、ペプチドの非劣化生理活性形態が、グレリンスプライス変異体受容体に到達して刺激する循環中において、優勢な形態であることを確実にしなくてはならない。
【０２１８】
したがって薬剤の最大効果を得るために、それは好ましくは毎日１〜３回投与され、各投与は食事の３０分以内など、食事の２５分以内など、食事の２０分以内など、食事の１５分以内など、食事の１０分以内など、食事の５分以内などのように食事の４５分以内である。より好ましくは、薬剤は毎日３回投与されるなど主要な各食事前に投与される。
【０２１９】
本明細書で開示される化合物はまた、経鼻投与のために調合してもよい。溶液または懸濁液は、例えばスポイト、ピペットまたはスプレーなどの従来の手段によって、鼻孔に直接適用される。組成物は、単回または多回用量形態で提供されてもよい。後者のスポイトまたはピペットの場合、これは患者が適切な所定の体積の溶液または懸濁液を投与することで、達成されてもよい。スプレーの場合、これは例えば定量噴霧スプレーポンプによって達成されてもよい。
【０２２０】
本明細書で開示される化合物は、鼻腔内投与を含む、特に気道への煙霧剤投与のために調合されてもよい。化合物は一般に、例えばほぼ５μｍ以下程度の小さな粒度を有する。このような粒度は、例えば微粒子化などの当該技術分野で知られている手段によって得られてもよい。活性成分は、例えばヒドロフルオロアルカン−１３４ａおよびヒドロフルオロアルカン−２２７などのヒドロフルオロアルカン（ＨＦＡ）、二酸化炭素またはその他の適切なガスなどの適切な噴霧剤と共に、加圧パック内で提供される。煙霧剤は、好都合には、レシチンなどの界面活性剤もまた含有する。薬剤用量は、定量バルブによって制御されてもよい。あるいは、活性成分は、例えば乳糖、デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのデンプン誘導体、およびポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）などの適切な粉末基剤中の化合物の粉末ミックスなどの乾燥粉末の形態で提供されてもよい。粉末キャリアは鼻孔内でゲルを形成する。粉末組成物は、例えばゼラチンのカプセルまたはカートリッジ、またはそれから吸入器によって粉末が投与されてもよい、ブリスター包装などの単位用量形態で提供されてもよい。
【０２２１】
煙霧剤によって投与される組成物は、例えばベンジルアルコールまたはその他の適切な保存料、生物学的利用能を増強する吸収促進剤を用いて、フルオロカーボンを用いて、および／またはその他の可溶化または分散剤を用いて、食塩水中の溶液として調製されてもよい。
【０２２２】
本明細書で開示される化合物はまた、カートリッジ入り成長ホルモン（ＧＨ）またはインシュリンに類似した注射ペンによる投与のために調合されてもよい。カートリッジは、本明細書で開示される化合物を溶剤中に含有する。基本的には針、シリンジ、およびバイアルが一体化したペンは、回転運動によって操作されて異なる用量が投与できる。この装置は化合物送達に、簡易さ、便利さ、および向上された安全性の特徴を提供する。これは簡単な装置設計、少ない投与ステップ、および一段ダイヤルバック用量ノブを提供する。このような注射ペンは、当該技術分野で既知の手段によって得ることができる。例えばいくつかの製造業者が、薬剤開発者の化合物と共に使用するための注射ペンを薬剤開発者に提供している（ＢＤメディカル・ファーマスーティカル・システムズ社（ＢＤ  Ｍｅｄｉｃａｌ−Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、オーウェン・マムフォールド社（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ  Ｉｎｃ．）など）。
【０２２３】
経口投与のための組成物
経口投与後に個体において生物学的活性を維持できる（例えば小型分子および短ペプチドなどの）これらの分泌促進物質タイプは、広範な経口投与剤形で調合できる。医薬組成物および剤形は、活性成分として、本明細書で開示される化合物、またはそれらの医薬的に許容可能な塩または結晶形態を含んでなってもよい。
【０２２４】
医薬的に許容可能なキャリアは、固体または液体のいずれかであることができる。固形製剤としては、粉末、錠剤、丸薬、カプセル、カシェ剤、坐薬、および分散顆粒が挙げられる。固体キャリアは、希釈剤、着香剤、溶解剤、潤滑剤、懸濁剤、バインダー、保存料、湿潤剤、錠剤崩壊剤、または封入材料としても機能する、１つ以上の物質であることができる。
【０２２５】
経口投与では、このような賦形剤としては、例えば製薬等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、滑石、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。
【０２２６】
粉末中では、キャリアは、微粉化された活性成分との混合物である微粉化された固体である。錠剤中で活性成分は、必要な結合能力を有するキャリアと適切な比率で混合され、所望の形状およびサイズに圧縮される。粉末および錠剤は、好ましくは１〜７０％の活性化合物を含有する。適切なキャリアは、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、滑石、糖、乳糖、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオ脂などである。「製剤」という用語は、その中でキャリアありまたはなしの活性成分が、それと結合するキャリアによって取り囲まれる、カプセルを提供するキャリアとしての封入材料と共に、本明細書で開示される活性化合物を含んでなる組成物を含むことが意図される。同様に、カシェ剤およびロゼンジも含まれる。
【０２２７】
錠剤、粉末、カプセル、丸薬、カシェ剤、およびロゼンジは、経口投与に適した固形であることができる。
【０２２８】
滴剤は、無菌のまたは非無菌の水性または油性溶液または懸濁液を含んでなってもよく、活性成分を、場合により殺菌および／または殺真菌剤および／または任意のその他の適切な保存料を含み、場合により表面活性剤を含む適切な水溶液に溶解して、調製されてもよい。次に得られた溶液を濾過して清澄化し、適切な容器に移して、次にそれを密封して高圧蒸気滅菌により、または９８〜１００℃に３０分間保って滅菌してもよい。あるいは、溶液を濾過により滅菌し、無菌的に容器に移してもよい。滴剤への包含に適した殺菌性および殺真菌性剤の例は、硝酸または酢酸フェニル水銀（０．００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）、および酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）である。油性溶液調製のための適切な溶剤としては、グリセロール、希釈アルコール、およびプロピレングリコールが挙げられる。
【０２２９】
使用直前に、経口投与のための液体形態製剤に転換されることが意図される固形製剤もまた、含まれる。このような液体形態としては、溶液、懸濁液、およびエマルジョンが挙げられる。これらの製剤は、活性成分に加えて着色剤、香料、安定剤、緩衝液、人工および天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含有してもよい。
【０２３０】
経口投与に適したその他の形態としては、エマルジョン、シロップ、エリキシル剤、水溶液、水性懸濁液、練り歯磨き、ゲル歯磨き剤、チューインガムをはじめとする、液体形態製剤、または使用直前に液体形態製剤に転換することが意図される固形製剤が挙げられる。エマルジョンは、水性プロピレングリコール溶液中で調製されてもよく、レシチン、ソルビタンモノオレエート、またはアカシアなどの乳化剤を含有してもよい。水溶液は、活性成分を水に溶解して、適切な着色剤、香料、安定化剤、および増粘剤を添加することで調製できる。水性懸濁液は、天然または合成ガム、樹脂、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、およびその他のよく知られている懸濁剤などの粘稠な材料と共に、微粉化された活性成分を水中に分散させて調製できる。固形製剤としては、溶液、懸濁液、およびエマルジョンが挙げられ、活性成分に加えて、着色剤、香料、安定剤、緩衝液、人工および天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含有してもよい。
【０２３１】
非経口投与のための組成物
本明細書で開示される化合物は、非経口投与（例えば注射、例えばボーラス注射または持続注入による）のために調合されてもよく、アンプル、充填済みシリンジ、少容量注入中の単位用量形態で、または保存料を添加した多回用量容器中で提供されてもよい。組成物は、例えば水性ポリエチレングリコール中の溶液など、懸濁液、溶液、または油性または水性ビヒクル中エマルジョンの形態を取ってもよい。油性または非水性キャリア、希釈剤、溶剤またはビヒクルの例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、および注射用有機エステル（例えばオレイン酸エチル）が挙げられ、保存料、湿潤剤、乳化剤または懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの配合剤を含有してもよい。あるいは、活性成分は、無菌固体の無菌単離によって、または溶液から凍結乾燥によって得られた、例えば無菌の、発熱物質を含まない水などの適切なビヒクルで使用前に戻すための粉末形態であってもよい。水溶液は、必要に応じて適切に緩衝されるべきであり、液体希釈剤は最初に十分な食塩水またはグルコースで等張にされる。水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適する。用いる無菌水性媒体は、全て当業者に知られている標準技術によって容易に入手できる。
【０２３２】
グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物または医薬的に許容可能なその塩（および例えば抗原エピトープおよびプロテアーゼ阻害剤）の溶液は、水または食塩水中で調製して、場合により無毒の界面活性剤と混合できる。静脈内または脈内投与のための組成物は、緩衝液、リポソーム、希釈剤、およびその他の適切な添加剤もまた含有してもよい、無菌水溶液を含んでもよい。
【０２３３】
非経口組成物中で有用な油としては、石油、動物油、植物油、または合成油が挙げられる。このような組成物中で有用な油の特定例としては、落花生油、ダイズ油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ワセリン油、および鉱物油が挙げられる。非経口組成物で使用する適切な脂肪酸としては、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルが、適切な脂肪酸エステルの例である。
【０２３４】
非経口組成物で使用される適切な石鹸としては、脂肪アルカリ金属、アンモニウム、およびトリエタノールアミン塩が挙げられ、適切な洗剤としては、（ａ）例えばジメチルジアルキルアンモニウムハロゲン化物、およびアルキルピリジニウムハロゲン化物などのカチオン性洗剤、（ｂ）例えばアルキル、アリール、およびオレフィンスルホネート、アルキル、オレフィン、エーテル、およびモノグリセリドスルフェート、およびスルホコハク酸塩などのアニオン性洗剤、（ｃ）例えば脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、およびポリオキシエチレンポリプロピレン共重合体などの非イオン性洗剤、（ｄ）例えばアルキル−β−アミノプロピオネート、および２−アルキル−イミダゾリン第四級アンモニウム塩などの両性洗剤、および（ｅ）それらの混合物が挙げられる。
【０２３５】
非経口組成物は、典型的に溶液中に約０．５〜約２５重量％の活性成分を含有する。保存料および緩衝液を使用してもよい。注射部位における刺激を最小限に抑えるかまたはなくすために、このようなの組成物は、約１２〜約１７の親水性・親油性バランス（ＨＬＢ）を有する１つ以上の非イオン性界面活性剤を含有してもよい。このような組成物中の界面活性剤の量は、典型的に約５〜約１５重量％の範囲である。適切な界面活性剤としては、ソルビタンモノオレエートなどのポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル、および酸化プロピレンとプロピレングリコールの縮合によって形成される酸化エチレンと疎水性塩基の高分子量付加物が挙げられる。非経口組成物は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または多回用量密封容器で提供され、使用直前に例えば注射用水などの無菌液体賦形剤の添加のみを要する、凍結乾燥状態で保存できる。即席注射溶液および懸濁液は、前述した類の無菌粉末、顆粒、および錠剤から調製できる。
【０２３６】
注射または注入に適した医薬品剤形としては、リポソーム内カプセル封入による投与に適応させた活性成分を含んでなる、無菌水溶液または分散体が挙げられる。いかなる場合でも、最終的剤形は、製造および保存条件下において、無菌で流体であり安定でなくてはならない。
【０２３７】
無菌の注射用溶液は、必要に応じて上に列挙した様々なその他の成分と共に、必要な量のグレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物または医薬的に許容可能なその塩を適切な溶剤と合わせて、例えばそれに続いて濾過滅菌して調製される。
【０２３８】
局所投与のための組成物
本明細書で開示される化合物はまた、局所性に送達できる。局所投与領域としては、皮膚表面、また直腸、鼻、口、および喉の粘膜組織も挙げられる。皮膚および粘膜を経由する局所投与のための組成物は、腫脹または発赤などの刺激徴候を生じてはならない。
【０２３９】
局所組成物は、局所投与に適応させた医薬的に許容可能なキャリアを含んでもよい。したがって組成物は、例えば懸濁液、溶液、軟膏、ローション、クリーム、フォーム、煙霧剤、スプレー、坐薬、植込錠、吸入剤、錠剤、カプセル、乾燥粉末、シロップ、香膏またはロゼンジの形態をとってもよい。このような組成物調製する方法については、製薬産業でよく知られている。
【０２４０】
本明細書で開示される化合物は、軟膏、クリームまたはローションとして、または経皮パッチとして、表皮への局所投与のために調合されてもよい。軟膏およびクリームは、例えば適切な増粘剤および／またはゲル化剤を添加して、水性または油性ベースで調合されてもよい。ローションは水性または油性ベースで調合されてもよく、一般に１つ以上の乳化剤、安定剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、または着色剤も含有する。口内への局所投与に適した組成物としては、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガカントである着香基剤中に活性剤を含んでなるロゼンジと、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤中に活性成分を含んでなる香錠と、適切な液体キャリア中の活性成分を含んでなるうがい薬とが挙げられる。
【０２４１】
本開示に係るクリーム、軟膏またはペーストは、活性成分を含んでなる外用の半固体組成物である。それらは活性成分を、油脂性または非油脂性基剤と共に、適切な機械を用いて、単独でまたは水性または非水性流体内の溶液または懸濁液中で、微粉化または粉末形態に混合して作製されてもよい。基剤は、プロピレングリコールなどのアルコールまたはマクロゲルと共に、硬、軟または液体パラフィン、グリセロール、蜜ろう、金属石鹸などの炭化水素；粘液；アーモンド、コーン、落花生、ひまし油またはオリーブ油などの天然起源の油；羊毛脂またはその誘導体；またはステアリン酸またはオレイン酸などの脂肪酸を含んでなってもよい。組成物には、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、またはソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体などの非イオン性界面活性剤などの任意の適切な表面活性剤を組み込んでもよい。天然ガムなどの懸濁剤、セルロース誘導体、またはケイ素質シリカなどの無機材料、およびラノリンなどのその他の成分もまた含まれてもよい。
【０２４２】
本開示に係るローションとしては、皮膚または目への塗布に適したものが挙げられる。目薬は、場合により殺菌剤を含有する無菌の水溶液を含んでなってもよく、滴剤の調製方法と類似した方法によって調製されてもよい。皮膚に塗布するためのローションまたはリニメント剤はまた、アルコールまたはアセトンなどの乾燥を早めて皮膚を冷やす薬剤、および／またはグリセロールなどの保湿剤またはヒマシ油または落花生油などの油を含んでもよい。
【０２４３】
本明細書に記載の化合物は、経皮的に投与できる。経皮投与は、典型的に患者の体循環内への薬剤の経皮的通過のための医薬品の送達を伴う。皮膚部位としては、薬剤を経皮的に投与するための解剖学的領域が挙げられ、前腕、腹部、胸部、背中、臀部、乳様突起領域などが含まれる。
【０２４４】
経皮送達は、活性化合物源を長期間にわたり患者の皮膚に接触させることで達成される。経皮パッチは、身体への化合物複合体の制御された送達を提供する追加的利点を有する（Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft and Guy (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1989)； Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications, Robinson and Lee (eds.), Marcel Dekker Inc., (1987)；およびTransdermal Delivery of Drugs, Vols. 1-3, Kydonieus and Berner (eds.), CRC Press, (1987)を参照されたい）。このような剤形は、本明細書で開示される化合物をエラストマーマトリックス材などの適切な媒体に溶解し、分散し、または別の方法で組み込んで作製できる。吸収促進剤もまた使用して、皮膚にわたる化合物の流動を増大できる。このような流動の速度は、速度制御膜を提供するか、または化合物をポリマーマトリックスまたはゲル中に分散するかのいずれかによって制御できる。
【０２４５】
多様なタイプの経皮パッチが、本明細書に記載の方法において用途がある。例えば単純な粘着パッチは、裏当て材およびアクリレート接着剤から調製できる。活性化合物および任意の促進剤を接着剤キャスティング溶液に調合して、完全に混ぜ合わせる。溶液を裏当て材上に直接キャストすると、キャスティング溶剤はオーブン内で蒸発し、接着フィルムが残る。剥離ライナーを付着してシステムを完成できる。
【０２４６】
あるいは、ポリウレタンマトリックスパッチを用いて、本明細書で開示される化合物を送達することができる。このパッチの層は、裏材料、ポリウレタン薬剤／促進剤マトリックス、膜、接着剤、および剥離ライナーを含んでなる。ポリウレタンマトリックスは、室温硬化ポリウレタンプレポリマーを使用して調製される。水、アルコール、および複合体のプレポリマーへの添加は、裏当て材上に直接キャストできる粘着性で堅固なエラストマーの形成をもたらす。
【０２４７】
さらなる実施態様は、ヒドロゲルマトリックスパッチを利用する。典型的にヒドロゲルマトリックスは、アルコール、水、薬剤、およびいくつかの親水性ポリマーを含んでなる。このヒドロゲルマトリックスは、裏材料と接着剤層の間で経皮パッチに組み込むことができる。
【０２４８】
液体レザバーパッチもまた、本明細書に記載の方法で用途がある。このパッチは、不透過性または半透性のヒートシール可能裏当て材、ヒートシール可能膜、アクリレートベースの感圧皮膚接着剤、およびシリコン処理剥離ライナーを含んでなる。裏材料は膜にヒートシールされて、次に複合体、促進剤、ゲル化剤、およびその他の賦形剤の溶液を充填できるレザバーが形成される。
【０２４９】
フォームマトリックスパッチは、ゲル化した医薬品−化学調節剤溶液が典型的にポリウレタンである薄いフォーム層に拘束されていること以外は、デザインおよび成分が液体レザバー系と類似している。このフォーム層は、裏材料とパッチ周辺でヒートシールされた膜の間に位置する。
【０２５０】
受動的送達系では、放出速度は典型的に、レザバーと皮膚の間に配置された膜によって、一体化した装置からの拡散によって、または皮膚それ自体が送達系における速度制御バリアの役割を果たして制御される（全て参照によって本明細書に援用するU.S. Patent Nos. 4,816,258；4,927,408；4,904,475；4,588,580；4,788,062などを参照されたい）。薬剤送達の速度はある程度、膜の性質に依存する。例えば身体中の膜を越える薬剤送達速度は、一般に経皮バリアを越える速度よりも高い。活性化合物が装置から膜に送達される速度は、最も有利には、レザバーと皮膚の間に配置された律速膜の使用によって制御される。皮膚が活性化合物に対して十分に透過性である（すなわち皮膚を通じた吸収が膜を越える通過速度を超える）と仮定して、膜は患者が経験する投薬速度を制御する役割を果たす。
【０２５１】
適切な透過性膜材料は、所望の透過度、活性化合物の性質、および装置の構築に関わる機械的考慮に基づいて選択されてもよい。例示的な透過性膜材料としては、ポリジメチルシロキサン（シリコーンゴム）、エチレン酢酸ビニル共重合体（ＥＶＡ）、ポリウレタン、ポリウレタン−ポリエーテル共重合体、ポリエチレン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、例えば三酢酸セルロースおよび硝酸／酢酸セルロースなどのセルロース材料、および例えばメタクリル酸２−ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）などのヒドロゲルなどの多種多様な天然および合成ポリマーが挙げられる。
【０２５２】
所望の装置の特徴次第で、治療薬のその他の従来の成分などのその他の品目が装置中に含有されてもよい。例えば本明細書で開示される組成物はまた、例えばヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、クロロクレゾール、塩化ベンザルコニウムなどの１つ以上の保存料または静菌剤も含んでもよい。これらの医薬組成物はまた、抗菌剤、特に抗生物質、麻酔剤、鎮痛剤、および止痒剤などのその他の活性成分も含んでもよい。
【０２５３】
坐薬としての投与のための組成物
本明細書で開示される化合物は、坐薬としての投与のために調合されてもよい。典型的な坐薬は、脂肪酸グリセリドまたはカカオ脂の混合物などの低融点ワックスを提供し、それを最初に融解し、例えば撹拌によってその中に活性成分を均質に分散して生成される。次に溶融した均質混合物を都合よいサイズの型に注ぎ、冷却して凝固させる。
【０２５４】
活性化合物は、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）キャリア（例えばＰＥＧ１０００［９６％］およびＰＥＧ４０００［４％］）中に配置された、本明細書で開示される約０．５％〜約５０％の化合物を含んでなる坐薬に調合されてもよい。
【０２５５】
製剤
好ましい態様は、本明細書に記載の治療法を実行するのに有用な医薬組成物について考察する。医薬組成物は、キャリア中に活性成分として溶解または分散された、本明細書に記載のようなグレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの少なくとも１種の分泌促進物質と共に、生理学的に許容できるキャリアを含有できる。好ましい実施態様では、目的が免疫反応を誘発することでない限り、医薬組成物は、治療目的でヒト個体に投与された際に免疫原性でない。
【０２５６】
一態様は、式Ｉにおいて上で定義したような、グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの少なくとも１種の分泌促進物質を含んでなる医薬組成物に関する。好ましい実施態様では、治療効果を増大させるために、医薬組成物は、式Ｉにおいて上で定義したような、少なくとも２つの異なるグレリンスプライス変異体様化合物を含んでなる。例えば相違は、上で考察したような異なるアシル化を有する化合物であってもよい。
【０２５７】
ここでの用法では、組成物、キャリア、希釈剤、および試薬に言及する「医薬的に許容可能」、「生理学的に許容性」という用語、およびその文法的活用形は、同義的に使用され、悪心、目眩、胃の不調などの望ましくない生理学的効果の発生なしに、物質をヒトに投与できることを表す。
【０２５８】
その中に溶解または分散される活性成分を含有する薬理学的組成物の調製については、当該技術分野でよく理解されている。典型的にこのような組成物は、液体溶液または懸濁液、水性または非水性のいずれかの無菌注射剤として調製される。しかし使用前に液体中にある、溶液または懸濁液に適した固体形態もまた調製できる。製剤はまた、乳化もできる。
【０２５９】
活性成分は、本明細書に記載の治療法における使用に適した量で、医薬的に許容可能であり、活性成分と適合性である賦形剤と混合できる。適切な賦形剤は、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組み合わせである。さらに必要に応じて、組成物は、活性成分の有効性を増強する湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの少量の補助物質を含有できる。製剤は、好ましくは４．５〜７．５の範囲など、５．５〜７の範囲など、６〜７．５の範囲などの３．５〜８の範囲内であり、最も好ましくは７．３前後であるｐＨを有する。しかし当業者によって理解されるように、ｐＨ範囲は治療される個体および投与手順に応じて調節されてもよい。例えばグレリンスプライス変異体およびグレリンスプライス変異体相同体などの特定の分泌促進物質は、より低いｐＨで容易に安定化してもよいので、別の好ましい実施態様では、製剤は４〜６など、５〜６など、５．３〜５．７など、５．５などのような３．５〜７の範囲のｐＨを有する。
【０２６０】
本明細書で開示される医薬組成物は、その中に化合物の医薬的に許容可能な塩を含有できる。これらの塩は、それらの製薬的用途への適用において許容可能なものであり、すなわち塩は親化合物の生物学的活性を保ち、塩は疾患治療でのその適用および使用において、不都合または有害な効果を与えない。
【０２６１】
医薬的に許容可能な塩は、標準様式で調製される。親化合物が塩基である場合、それは適切な溶剤中の過剰な有機または無機酸で処理される。親化合物が酸である場合、それは適切な溶剤中の過剰な有機または無機塩基で処理される。
【０２６２】
本明細書で開示される化合物は、有効量で、例えば経口、直腸、または非経口（皮下をはじめとする）経路に関わらず、特におよび好ましくはその医薬組成物の形態で、医薬的に許容可能なキャリアまたは希釈剤と併行して、同時に、または一緒に、そのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩の形態で投与されてもよい。
【０２６３】
本発明の医薬組成物で使用する医薬的に許容可能な酸付加塩の例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸、および硫酸などの鉱酸と、例えば酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、ｐ−トルエンスルホン酸、アリールスルホン酸などの有機酸に由来するものが挙げられる。
【０２６４】
その他の適切な医薬的に許容可能な塩としては、酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基により形成される）が挙げられる。塩のその他の例としては、医薬的に許容可能な酸付加塩、医薬的に許容可能な金属塩、アンモニウム塩およびアルキル化アンモニウム塩が挙げられる。酸付加塩としては、無機酸ならびに有機酸の塩が挙げられる。適切な無機酸の代表的な例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸、および硝酸などが挙げられる。適切な有機酸の代表的な例としては、ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、ケイ皮酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、シュウ酸、ピクリン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、酒石酸、アスコルビン酸、パモ酸、ビスメチレンサリチル酸、エタンジスルホン酸、グルコン酸、シトラコン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐ−アミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、およびｐ−トルエンスルホン酸などが挙げられる。医薬的に許容可能な無機または有機酸付加塩のさらなる例としては、参照によって本明細書に援用するBerge S.M. et al., J. Pharm. Sci. 66:1-19 (1977)に列挙される医薬的に許容可能な塩が挙げられる。金属塩の例としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、およびマグネシウム塩などが挙げられる。
【０２６５】
アンモニウムおよびアルキル化アンモニウム塩の例としては、アンモニウム、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、エチルアンモニウム、ヒドロキシエチルアンモニウム、ジエチルアンモニウム、ブチルアンモニウム、およびテトラメチルアンモニウム塩などが挙げられる。
【０２６６】
遊離カルボキシル基によって形成された塩はまた、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来することができる。
【０２６７】
本開示の文脈において、化合物またはその医薬的に許容可能な酸付加塩の範囲内には、その任意の水和物（水和形態）も含まれる。
【０２６８】
非経口投与では、無菌水溶液、水性プロピレングリコールまたはゴマ油または落花生油中の本化合物の溶液を用いてもよい。このような水溶液は必要に応じて適切に緩衝されるべきであり、液体希釈剤は、最初に十分な食塩水またはグルコースで等張にされる。水溶液は、特に静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与に適する。用いられる無菌水性媒体は、全て当業者に知られている標準技術によって容易に入手できる。
【０２６９】
液体組成物はまた、水に加えておよび水を除外して、液相も含むことができる。例示的なこのような追加的液相は、グリセリン、綿実油などの植物油、オレイン酸エチルなどの有機エステル、および水−油エマルジョンである。
【０２７０】
適切な製薬キャリアとしては、不活性固体希釈剤または充填材、無菌の水溶液および様々な有機溶剤が挙げられる。固体キャリアの例は、乳糖、白土、スクロース、シクロデキストリン、滑石、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、セルロースのステアリン酸または低級アルキルエーテルである。液体キャリアの例は、シロップ、落花生油、オリーブ油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレンまたは水である。経鼻煙霧剤または吸入製剤は、ベンジルアルコールまたはその他の適切な保存料、生物学的利用能を増強する吸収促進剤を用いて、フルオロカーボンを用いて、および／またはその他の可溶化または分散剤を用いて、例えば食塩水中の溶液として調製されてもよい。
【０２７１】
次に本明細書で開示される化合物および医薬的に許容可能なキャリアを合わせて形成された医薬組成物は、開示される投与経路に適した多様な剤形で容易に投与される。製剤は、医薬技術分野で知られている方法によって、好都合に単位剤形で提供されてもよい。
【０２７２】
好ましい実施態様では、製剤は分泌促進物質またはその塩を凍結乾燥物として含んでなり、製剤は溶剤をさらに含んでなり、前記凍結乾燥物および前記溶剤は投与まで別々の区画にある。別の実施態様では、製剤は分泌促進物質またはその塩の溶液である。どちらの実施態様でも、溶剤は本明細書に記載のものなどの任意の適切な溶剤であってもよく、好ましくは溶剤は食塩水である。
【０２７３】
別の態様は、本明細書で開示される化合物を含んでなる薬剤または医薬組成物を調製する方法に関し、本方法は、上の式Ｉで定義されるような少なくとも１つのグレリンスプライス変異体様化合物と、生理学的に許容可能なキャリアとを混合するステップを含んでなる。さらなる態様は、医薬的に許容可能なキャリアと共に、上の式Ｉで定義されるような化合物または医薬的に許容可能なその塩を活性成分として含んでなる、医薬組成物に関する。したがって製剤は、上述のような輸送分子をさらに含んでもよい。
【０２７４】
併用療法
さらなる態様では、本化合物は、追加的な薬理学的活性物質またはその他の薬理学的活性材料と組み合わされて投与されてもよく、および／または別の治療法と組み合わされて投与されてもよい。「別の物質および／または治療法と組み合わせて」という語句は、本明細書では、分泌促進物質による個体の処置の前、最中（同時を含む）および／または後に、前記別の物質および／または治療法が、このように処置された個体に投与されることを意味する。本明細書に記載の併用療法のいかなる場合でも、併用は、キット−イン−パート（ｋｉｔ−ｉｎ−ｐａｒｔ）システムの形態であってもよく、併用される活性物質は同時、逐次または別々の投与のために使用されていてもよい。いかなる場合でも、ここで言及される薬剤のいずれもが医薬的有効量で投与されることが好ましく、すなわち投与は、意味ある患者への利点を示すのに十分である、薬剤または医薬組成物の各活性成分の総量、または方法を伴う。
【０２７５】
続くセクションでは、好ましい実施態様で使用される併用療法を以下のように分類する。
【０２７６】
１）全ての活性成分が食欲調節剤であり、または別の様式で悪液質および／または脂肪異栄養症を治療するのに有用である併用。
本開示に係る分泌促進物質は、本明細書に記載の式Ｉによって定義される構造を含んでなるグレリンスプライス変異体様化合物などの別のグレリンスプライス変異体様化合物などの、２種以上の成長ホルモン分泌促進物質をはじめとする、その他の食欲調節剤と組み合わせて投与できる。別の分泌促進物質化合物との併用投与に適したその他の分泌促進物質は、本明細書に記載の分泌促進物質化合物のいずれかである。好ましい一実施態様では、グレリンスプライス変異体（最も好ましくはヒトグレリンスプライス変異体）は、異なるグレリンスプライス変異体様化合物と組み合わされて投与され、この併用は、グレリン受容体に対する分泌促進物質の効果を増強および／または延長すると想定される。同様に、３など、４など、５など、６など、７など、８を超えるなどの異なる分泌促進物質タイプなどのような２を超える異なる分泌促進物質タイプなどのいくつかの異なる分泌促進物質を個体に投与して、グレリン受容体に対する有効性を増大させてもよい。グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの本開示に係る分泌促進物質はまた、ｈＧＨをはじめとする医薬的に有効量の成長ホルモンと組み合わせて投与することができる。
【０２７７】
好ましい一実施態様では、グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質は、ＩＧＦ−１、ＩＧＦＢＰ−３、またはＡＬＰ、好ましくはＩＧＦ−１と組み合わせて投与してもよい。この併用療法の背景の理論的根拠は、悪液質の個体において低いことが分かったＩＧＦ−１、ＩＧＦＢＰ−３、および／またはＡＬＰのレベルを増大させることである。
【０２７８】
さらなる実施態様では、グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質は、グレリンと、メラノコルチン受容体拮抗薬と、神経ペプチドＹ受容体の個々のサブタイプに対して選択的な作用薬をはじめとする神経ペプチドＹ受容体作用薬と、レプチンまたはレプチン受容体作用薬と、マリファナおよびマリファナ誘導体をはじめとするカンナビノイドと、抗精神病薬、特にセルチンドール、スフピリド、クロザピン、リスペリドン、クエチアピン、アミスルプリド、ジプラシドン、およびオランザピンなどの非定型抗精神病薬などの食欲を刺激することが知られている化合物と組み合わせて投与してもよい。
【０２７９】
２）グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質と、グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質で治療される疾患または病状を引き起こす、またはそれと関連付けられている、疾患に対し活性である成分または治療法との併用。
特に癌悪液質との関連で、グレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質の投与は、抗新生物化学療法、放射線療法および外科治療をはじめとする、任意の抗癌治療法と組み合わせて実施されてもよい。特にそれは、化学療法および放射線療法と組み合わせて使用される。したがって一実施態様は、本開示に従って有効量の放射線療法および有効量のグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質を投与するステップを含んでなる、癌を治療する方法に関する。グレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質での治療は、放射線療法開始前に開始してもよい。それは放射線療法中に連続的に投与してもよく、またはそれは例えば放射線療法期間の合間など、間隔を置いて投与してもよい。
【０２８０】
別の実施態様は、本開示に従って、有効量の抗新生物化学療法および有効量のグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質を投与するステップを含んでなる、癌を治療する方法に関する。グレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質による治療は、化学療法開始前に開始してもよい。それは化学療法中に連続的に投与してもよく、またはそれは例えば化学療法期間の合間など、間隔を置いて投与してもよい。
【０２８１】
さらに併用療法は、グレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質と、抗新生物化学療法との共製剤であってもよい。
【０２８２】
本開示に係るグレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質はまた、医薬的に有効量のグルココルチコイドステロイドおよび運動促進性処置ならびに癌治療法で使用されるその他の処置と組み合わされて投与されてもよい。したがって別の好ましい実施態様では、本開示に係るグレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質は、最も好ましくは癌悪液質などの悪液質の治療のために、以下の１つ以上の医薬的有効量と組み合わされて投与される。メガストロールおよび／またはシプロヘプタジン（および／またはその他の５−ＨＴ受容体拮抗薬）などのプロゲステロン剤；および／または分枝鎖アミノ酸；および／またはオキサンドラリン；および／またはインフリキシマブ、エタネルセプト、またはアダリムマブなどの抗ＴＮＦ−α剤；および／またはテストステロン；および／または免疫栄養剤、抗酸化剤およびＣＯＸ２阻害剤を含んでなる「カクテル」；および／またはカンナビノイド；および／またはエイコサペンタエン酸；および／またはメラトニン；および／またはサリドマイド；および／またはβ２アドレナリン作動薬。
【０２８３】
さらに別の実施態様では、グレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質は、好ましくはインドメタシンおよびＣＯＸ１阻害剤またはＣＯＸ２阻害剤などのＮＳＡＩＤ；および／またはインフリキシマブ、エタネルセプト、またはアダリムマブなどの抗ＴＮＦ−α化合物である抗炎症化合物と組み合わされて投与される。別の組み合わせは、エリスロポエチン／ＥＰＯであってもよい。別の組み合わせは、ビクター（Ｖｉｔｏｒ）などのアンギオテンシンＩＩ低下剤であることができる。別の組み合わせは、選択的アンドロゲン受容体調節因子であることができる。別の組み合わせは、レプチン、レニン−アンギオテンシン系作用薬、オピオイド受容体作用薬またはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ作用薬の１つ以上であってもよい。
【０２８４】
脂肪異栄養症の治療に関連して、別の実施態様は、グレリンスプライス変異体、より好ましくはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質が、脂肪異栄養症候群の治療に適した、本明細書に記載の治療または化合物の１つ以上などの脂肪異栄養症治療と組み合わされて投与される治療に関する。
【０２８５】
したがって本開示の方法において、前記グレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質と組み合わせて投与してもよいその他の薬理学的に活性物質は、次を含んでなる。
（ａ）レプチン：レプチンは、脂肪異栄養症と関連付けられている代謝異常に対して好ましい効果を与えることが示されている（Oral E.A. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 91:621-28 (2006)）。この治療は、レプチンの低い血漿レベルを患う患者、および正常な濃度レベルを有する患者の双方で有益であることが判明している。
（ｂ）ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ−γ）作用薬：ＰＰＡＲ−γは、いくつかの研究で脂肪細胞代謝および代謝症候群に重要であることが実証されており、ＰＰＡＲ−γ作用薬は脂肪異栄養症の症状を減少させることが示されている（Semple R.K. et al., J. Clin. Invest. 116:581-89 (2006)）。
（ｃ）レニン−アンギオテンシン系作用薬：ＨＡＡＲＴでの治療はＴ細胞中のＡＣＥ活性を増大させることが示されており、これはレニン−アンギオテンシン系作用薬が、ＨＡＡＲＴ誘発性脂肪異栄養症を改善するかもしれないことを意味する（Hegele R.A. & Leff T., J. Clin. Invest. 114:163-65 (2004)）。
（ｄ）オピオイド受容体拮抗薬：ナロキソンおよびナルトレキソンなどのオピオイド受容体拮抗薬は、プロテアーゼ阻害剤処置から脂肪異栄養症の最初の症状発生までの期間を延長することが示されている（AIDS Patient Care STDS 14:283 (2000)）。
（ｅ）脱アシルグレリンスプライス変異体：脱アシルグレリンスプライス変異体と組み合わせたグレリンスプライス変異体は、脂肪異栄養症症候群の重要な特徴であるインシュリン抵抗性を低下させることが分かっている（Koutkia P. et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 286:E296-303 (2004)）。
（ｆ）インシュリン抵抗性が病態生理学的機序である、インシュリン抵抗性および疾患の治療および／または予防のためのその他の化合物を含むアディポネクチンおよび抗糖尿病処置。
（ｇ）ｒｈＧＨによる治療法は、少数の患者において「野牛肩」、体幹脂肪のサイズ減少を引き起こし、除脂肪体重を増大させることが報告されている（Lo J.C. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 86:3480-87 (2001)）。しかし脂肪損失および脂質異常は改善せず、血液グルコース制御は悪化した。ｈＧＨで治療された症候群の例としてはＨＩＶ、ＡＩＤＳ、および癌が挙げられる。理論による拘束は意図しないが、グレリンスプライス変異体またはその類似体による治療は、ｈＧＨで治療される患者において体脂肪を維持し、および／または増大させ、したがってｈＧＨによって引き起こされる脂肪異栄養症に効果的に対抗し、または少なくともそれを減少させると考えられる。したがって好ましい一実施態様は、好ましくはＨＩＶまたはＡＩＤＳおよび／または癌悪液質を患っている個体における、成長ホルモンと組み合わせた、グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物の使用に関する。前記グレリンスプライス変異体またはその類似体での治療は、個体に成長ホルモン治療を施す前、および／または最中および／または後であってもよい。前記成長ホルモンは好ましくはｈＧＨである。
（ｈ）前出の上述のようなグループ１）の下の異なる分泌促進物質の併用による治療。
【０２８６】
３）グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質と、グレリンスプライス変異体またはグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質で治療される疾患または病状と関連付けられている症状に対して活性の成分または治療法との併用。
一態様は、組み合わせ中の成分の１つが、悪液質を患っている個体に起こり得る症状または病状を治療するために使用される、併用療法に関する。したがって本開示に係るグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質の投与を伴う使用および併用療法はまた、以下の１つ以上と組み合わせた治療を伴うことができる。
ａ）臨床的うつ病の予防および／または改善および／または治療。併用療法は、抗うつ薬、そのプロドラッグ、または前記抗うつ薬または前記プロドラッグの医薬的に許容可能な塩を投与するステップをさらに含んでなる。上の併用療法において、抗うつ薬は好ましくは、ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＮＥＲＩ）、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、モノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯ）、ＮＥＲＩ／ＳＳＲＩの併用、または非定型抗うつ薬、前記抗うつ薬のプロドラッグ、または前記抗うつ薬または前記プロドラッグの医薬的に許容可能な塩である。好ましい抗うつ薬は、ＳＳＲＩ、そのプロドラッグ、または前記ＳＳＲＩまたは前記プロドラッグの医薬的に許容可能な塩である。ＳＳＲＩは、好ましくは、シタロプラム、エシタロプラム、フェモキセチン、フルオキセチン、フルボキサミン、インダルピン、インデロキサジン、ミルナシプラン、パロキセチン、セルトラリン、シブトラミンまたはジメルジン、前記ＳＳＲＩのプロドラッグ、または前記ＳＳＲＩまたは前記プロドラッグの医薬的に許容可能な塩である。上記の内、シタロプラムおよびエスシタロプラム、そのプロドラッグまたは医薬的に許容可能な塩が、併用療法の特定の実施態様では好ましい。
ｂ）悪心および嘔吐をはじめとする催吐性病状の予防および／または改善および／または治療。併用療法は、制吐薬、そのプロドラッグ、または前記制吐薬または前記プロドラッグの医薬的に許容可能な塩を投与するステップをさらに含んでなる。本開示に係る併用療法で使用される好ましい制吐薬としては、塩酸メクリジン、プロクロルペラジン、プロメタジン、塩酸トリメトベンズアミド、および塩酸オンダンセトロンが挙げられる。特に嘔吐は、抗癌治療法のため、またはこのような癌疾患のためのいずれかで、癌によって引き起こされる場合がある。
ｃ）精神病状態の予防および／または改善および／または治療。併用療法は、抗精神病薬、そのプロドラッグ、または前記抗精神病薬または前記プロドラッグの医薬的に許容可能な塩を投与するステップをさらに含んでなる。本開示に係る併用療法で使用するのに好ましい抗精神病薬としては、クロルプロマジン、ハロペリドール、クロザピン、ロキサピン、塩酸モリンドン、チオチキセン、オランザピン、ジプラシドン、塩酸ジプラシドン、プロクロルペラジン、ペルフェナジン、塩酸トリフルオペラジン、およびリスペリドンが挙げられる。
ｄ）不安の予防および／または改善および／または治療。併用療法は、抗不安剤、そのプロドラッグ、または前記抗不安剤または前記プロドラッグの医薬的に許容可能な塩を投与するステップをさらに含んでなる。本開示に係る併用療法で使用するのに好ましい抗不安剤としては、アルプラゾラム、クロナゼパム、ロラゼパム、オキサゼパム、塩酸クロルジアゼポキシド、ジアゼパム、塩酸ブスピロン、塩酸ドキセピン、パモ酸ヒドロキシジン、およびクロナゼパムが挙げられる。
【０２８７】
当然ながら、上のグループ（１〜３）の併用もまたこの開示の範囲内である。
【０２８８】
医療包装
本明細書で開示される化合物は、単独でまたは医薬的に許容可能なキャリアまたは賦形剤と組み合わせて、単回または多回用量のいずれかで投与してもよい。
【０２８９】
製剤は、好都合には当業者に知られている方法によって単位剤形で提供される。
【０２９０】
本開示に係る化合物は、キット中で提供されることが好ましい。このようなキットは、典型的に投与のための剤形中に活性化合物を含有する。剤形は十分な量の活性化合物を含有するので、１日以上の治療期間中に、好ましくは少なくとも１日１回の食事前に、より好ましくは１日３回などの主要な各食事前に、対象に投与すると望ましい効果を得ることができる。したがって医療包装は、妥当な投与計画に対応する投薬単位量を含んでなることが好ましい。したがって一実施態様では、医療包装は、上で定義したような化合物または医薬的に許容可能なその塩、および医薬的に許容可能なキャリア、ビヒクルおよび／または賦形剤を含んでなる医薬組成物を含んでなり、前記包装は、７〜２１の投薬単位、またはその倍数を有し、それによって１週間の投与または数週間の投与のための投薬単位を有する。
【０２９１】
一実施態様では、医療包装は１週間の毎日１回の投与用で７投薬単位を含んでなり、別の実施態様では医療包装は毎日２回の投与用で１４投薬単位を含んでなる。さらに別のより好ましい実施態様では、医療包装は毎日３回の投与用で２１投薬単位を含んでなる。
【０２９２】
投薬単位は上で定義したとおりであり、すなわち投薬単位は、好ましくは２．０μｇ〜２００ｍｇグレリンスプライス変異体など、５．０μｇ〜１００ｍｇグレリンスプライス変異体など、１０μｇ〜５０ｍｇグレリンスプライス変異体など、１０μｇ〜５ｍｇグレリンスプライス変異体など、１０μｇ〜１．０ｍｇグレリンスプライス変異体などのような０．３μｇ〜６００ｍｇのグレリンスプライス変異体に相当する量のグレリンスプライス変異体様化合物またはその塩を含んでなる。
【０２９３】
医療包装は、非経口投与、特に皮下投与のための任意の適切な形態であってもよい。好ましい実施態様では、包装は注射ペン用カートリッジなどのカートリッジの形態であり、注射ペンはインシュリン治療からまたはｈＧＨ治療から知られている注射ペンのようなものである。
【０２９４】
医療包装が２以上の投薬単位を含んでなる場合、医療包装に各投与を１投薬単位のみに調節する機序が備わっていることが好ましい。
【０２９５】
好ましくは、キットは、望ましい影響を達成するための剤形の使用を指示する説明書、および規定の期間にわたり使用する量の剤形を含有する。したがって一実施態様では、医療包装は、医薬組成物を投与するための説明書を含んでなる。特に前記説明書は、食事中の、または好ましくは最大限でも食事前３０分など、最大限でも食事前２５分など、最大限でも食事前２０分など、最大限でも食事前１５分など、最大限でも食事前１０分など、最大限でも食事前５分などのように最大限でも食事前４５分のいずれかの前記医薬組成物の投与に言及する説明書を含んでもよい。
【０２９６】
グレリンスプライス変異体および／またはグレリンスプライス変異体様化合物による治療の効果をモニタリングする方法
別の態様は、１つ以上のマーカー、特にＧＨ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦＢＰ−３、ＡＬＰ（酸性標識された）、甲状腺ホルモン、性ホルモン、およびアルブミンから選択され；より好ましくはＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦＢＰ−３、ＡＬＰ（酸性標識された）から選択され；なおもより好ましくはＩＧＦ−１であるマーカーを測定するステップを含んでなる本開示の方法において、本明細書で開示されるグレリンスプライス変異体様化合物などの分泌促進物質投与の効果をモニタリングする方法に関する。これらのマーカーは全て、悪液質患者で低く、グレリンスプライス変異体での治療後に増大することが予期される。グレリンスプライス変異体での治療後に増大することが予期されるその他のマーカーは、血液ＧＨレベルおよび体重である。さらに身体組成が変化することが予期され、除脂肪体重は増大することが予期される。身体組成変化は、ＭＲＩまたはＮＭＲを使用して評価できる。
【０２９７】
したがって一実施態様は、本明細書に記載の分泌促進物質による個体のいずれかの治療の効果をモニタリングする方法に関し、前記方法は、（ｉ）ＩＧＦ−１および／または（ｉｉ）ＩＧＦＢＰ−３および／または（ｉｉｉ）ＡＬＰおよび／または（ｉｖ）１つ以上の甲状腺ホルモンおよび／または（ｖ）１つ以上の性ホルモンおよび／または（ｖｉ）アルブミンの１つ以上の、またはより好ましくは（ｉ）ＩＧＦ−１および／または（ｉｉ）ＩＧＦＢＰ−３および／または（ｉｉｉ）ＡＬＰおよび／または（ｉｖ）ＧＨおよび／または（ｖ）体重および／または（ｖｉ）身体組成の１つ以上の前記個体の血液レベルを測定するステップを含んでなる。
【０２９８】
個体の血液レベルの物質を測定する方法は、当該技術分野でよく知られている。例えばウエスタンブロットまたは酵素−連結アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの方法によって、単離された血液サンプルを試験してもよい。
【実施例】
【０２９９】
以下の実施例において本開示をさらに定義する。これらの実施例は好ましい実施態様を示しながら、あくまで例示のために提供されるものと理解される。上の考察およびこれらの実施例から当業者は本開示の好ましい特徴を見極めることができ、その趣旨と範囲を逸脱することなく様々な変更と修正を施して、それを様々な用途と条件に適合できる。
【０３００】
実施例２、５、６、７、８、および９は、データの裏づけのある実施例である。実施例１、３、４、１０、および１１はデータの裏づけのない実施例である。
【０３０１】
実施例１
競合結合アッセイ
形質移入の１日後に、形質移入されたＣＯＳ−７細胞をウェルあたり１×１０５個の細胞の密度で培養プレートに移し、５〜８％の放射性リガンド結合を目指す。形質移入の２日後、米国ニュージャージー州ピスカタウェイのＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ））からの２５ｐＭの［１２５Ｉ］グレリンを使用して、４℃で３時間にわたり競合結合実験を実施する。１ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＭｇＣｌ２、および０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、４０μｇ／ｍｌバシトラシンを添加した０．５ｍｌの５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）中で結合アッセイを実施する。非特異的結合は、１マイクロモルの未標識グレリンスプライス変異体存在下での結合として判定される。細胞を０．５ｍｌの氷冷緩衝液で２回洗浄し、０．５〜１ｍｌの溶解緩衝液（３Ｍ酢酸中の８Ｍ尿素、２％ＮＰ４０）を添加して、結合放射能を計測する。判定は二回行う。
【０３０２】
実施例２
グレリンスプライス変異体様化合物の合成的生成
アミノ酸誘導体および合成試薬は、商業的供給元から得ることができる。ペプチド鎖延長は、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によって製造されたアプライド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）４３３Ａ合成機を使用して実施でき、保護されたペプチド誘導−樹脂は、ＢｏｃまたはＦｍｏｃ法によって構築できる。Ｂｏｃ法によって得られる保護されたペプチド樹脂をｐ−クレゾール存在下で無水フッ化水素（ＨＦ）により脱保護し、それによってペプチドを遊離して、次にそれを精製する。Ｆｍｏｃ法によって得られた保護されたペプチド樹脂をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）により、または様々なスカベンジャーを含有する希釈ＴＦＡにより脱保護し、遊離したペプチドを精製する。精製は、Ｃ４またはＣ１８カラム上の逆相ＨＰＬＣ中で実施する。精製産物の純度は逆相ＨＰＬＣによって確認でき、その構造はアミノ酸組成分析および質量分析法によって確認できる。
【０３０３】
本明細書で開示されるペプチドは、従来のペプチド合成法によって生成できる。具体的には、アシル化またはアルキル化ペプチドの合成を以下に例示する。
【０３０４】
略語：「ＨＭＰ樹脂」は４−ヒドロキシメチル−フェノキシメチル樹脂を意味し；「Ｆｍｏｃアミド樹脂」は４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシアセトアミド−エチル樹脂を意味し；「ＰＡＭ樹脂」はフェニルアセトアミドメチル樹脂を意味し；「ＨＢＴＵ」は２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸を意味し；「ＴＢＴＵ」は２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸を意味し；「ＨＯＢｔ」は１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを意味し；「ＤＣＣ」はジシクロヘキシルカルボジイミドを意味し；「ＤＩＰＣＩ」はジイソプロピルカルボジイミドを意味し；「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸を意味し；「ＤＩＰＥＡ」はジイソプロピルエチルアミンを意味し；「ＴＩＰＳ」はトリイソプロピルシランを意味し；「Ｆｍｏｃ」はフルオレニルメトキシカルボニルを意味し；「Ｂｏｃ」はｔ−ブチルオキシカルボニルを意味し；「Ｔｒｔ」はトリチルを意味し；「Ｂｕ」はｔ−ブチルを意味し；「Ｐｍｃ」は２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニルを意味し；「Ｐｒｌ」はプロピオニルを意味し；「ＰｈＰｒｌ」はフェニルプロピオニルを意味し；「Ｂｚｌ」はベンジルを意味し；「Ｂｏｍ」はベンジルオキシメチルを意味し；「Ｔｏｓ」はトルエンスルホニルを意味し；「Ｃｌ−Ｚ」は２−クロロ−ベンジルオキシカルボニルを意味し；「Ｐｉｓ」は２−フェニルイソプロピルを意味し；「Ｍｔｔ」は４−メチルトリチルを意味し；「ＤＭＦ」はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを意味し；「ＮＭＰ」はＮ−メチルピロリドンを意味し；「ＤＭＡＰ」は４−ジメチルアミノピリジンを意味し；「ＨＯＳｕ」はＮ−ヒドロキシスクシンイミドを意味し；「Ａｄｏｄ」は２−アミノドデカン酸を意味し；「Ａｉｂ」は２−アミノイソ酪酸を意味し；「Ａｐｅ」は５−アミノペンタン酸を意味し；「Ｃｈａ」はシクロヘキシルアラニンを意味し；「Ｄａｐ」は２，３−ジアミノプロピオン酸を意味し；「Ｎａｌ」はナフチルアラニンを意味し；「Ｎｉｅ」はノルロイシンを意味する。
【０３０５】
合成Ｆｍｏｃ法で使用できる保護アミノ酸は以下のとおりである。Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｎ−Ｃ８Ｈ１７）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｎ−Ｃ８Ｈ１７）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｎ−Ｃ８Ｈ１７）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＰｉｓ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（オクタノイル）、Ｆｍｏｃ−２−Ｎａｌ、Ｆｍｏｃ−２−Ｎａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）、Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｃ７Ｈ１５）。Ｂｏｃ法：Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｐｒｌ）、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、Ｂｏｃ−Ａｌａ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ｎ−Ｃ８Ｈ１７）、Ｂｏｃ−Ａｐｅ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ｎ−Ｃ８Ｈ１７）。
【０３０６】
使用ユニット：
（ａ）分析ＨＰＬＣシステムユニット：島津ＬＣ−１０Ａシステム；カラム：ＹＭＣ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）；カラム温度：４０℃；溶出剤：０．１％トリフルオロ酢酸中０〜５０％アセトニトリルで２０分の直線濃度勾配；流速：１ｍＬ／分；検出：ＵＶ（２１０ｎｍ）；注入量：１０〜１００ｍｕＩ
（ｂ）分取ＨＰＬＣシステムユニット：ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）６００マルチソルベント・デリバリ・システム（Ｍｕｌｔｉｓｏｌｖｅｎｔ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）；カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ−ＯＤＳ−Ａ（５ｍｕｍ、２０ｍｍ×２５０ｍｍ）ＹＭＣ−Ｐａｃｋ−ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（５ｍｕｍ、Ｃ４、１０ｍｍ×２５０ｍｍ）ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（５ｍｕｍ、Ｃ４、２０ｍｍ×２５０ｍｍ）ＹＭＣ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）；溶出剤：０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル濃度の適切な直線濃度勾配；流速：１０ｍＬ／分（内径２０ｍｍのカラム）、３ｍＬ／分（内径１０ｍｍのカラム）、１ｍＬ／分（内径４．６ｍｍのカラム）；検出：２１０ｎｍ、２６０ｎｍ；注入：１０〜２０００ｍｕＩ（２０００ｍｕＩ以上はポンプ経由で注入した）
（ｃ）質量分光計ユニット：フィニガン（Ｆｉｎｎｉｇａｎ）ＭＡＴＴＳＱ７００；イオン源：ＥＳＩ；検出イオンモード：ポジティブ・スプレー；電圧：４．５ｋＶ；キャピラリー温度：２５０℃；移動相：０．２％酢酸およびメタノール混合物（１：１）；流速：０．２ｍＬ／分；スキャン範囲：ｍ／ｚ３００〜１，５００
（ｄ）アミノ酸配列分析ユニット：パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によって製造されたアプライド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）４７７Ａ、４９２モデル配列決定装置
（ｅ）アミノ酸組成分析ユニット：日立製作所によって製造されたＬ−８５００モデルアミノ酸分析器；サンプル：特に断りのない限りサンプルは密封管内において６ＭのＨＣｌによって１１０℃で２４時間加水分解される。
【０３０７】
アシルセリン（Ｆｍｏｃ法、カルボキシル−末端アミド誘導体）グレリンスプライス変異体を有する誘導体合成の実施例
ＡＢＩカンパニー（ＡＢＩ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）からのＧＳＳ（ＣＯ−Ｃ７Ｈ１５）ＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＶＲＰＰＨＫＡＰＨ  Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｐｍｃ）−ＨＭＰ−樹脂（４０３ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を２０％ピペラジンで２０分間処理し、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔによるＦｍｏｃ−アミノ酸導入を繰り返し、ピペラジンによるＦｍｏｃ除去を連続して施して、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｕ）−Ｓｅｒ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ）−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ（Ｐｍｃ）−樹脂を構築する。ＤＣＣ／ＨＯＢｔによってＢｏｃ−Ｇｌｙを最後に導入した後、得られた保護されたペプチド樹脂（１．３ｇ）を１％ＴＦＡ−５％ＴＩＰＳ−塩化メチレン溶液（１５ｍＬ）で３０分間処理する。
【０３０８】
ペプチド樹脂を濾過し、塩化メチレン（３０ｍＬ）で数回洗浄し、５％ＤＩ  ＥＡ（１０ｍＬ）および次に塩化メチレン（３０ｍＬ）で洗浄する。得られた脱Ｔｒｔペプチド樹脂（約１．３ｇ）をＮＭＰ（１０ｍＬ）で膨潤させて、ＤＭＡＰ（６１．１ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）存在下でオクタン酸（１４４．２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＣＩ（１２６．２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をそれに添加し、８時間反応させる。樹脂を濾過により回収して、ＮＭＰおよび次に塩化メチレンで洗浄し、引き続いて真空下で乾燥させて、第３のセリンの側鎖がオクタノイル化されている約１．２ｇの保護されたペプチド樹脂を得る。この生成物に、８８％ＴＦＡ−５％フェノール−２％ＴＩＰＳ−５％Ｈ２Ｏからなる脱保護試薬（１０ｍＬ）を添加し、混合物を室温で２時間撹拌する。樹脂を濾過により除去して濾液を濃縮し、引き続いて得られた残留物にエーテルを添加して沈殿を形成させる。沈殿物を濾過により回収し、乾燥させて約５５０ｍｇの粗製ペプチドを得る。この生成物の２００ｍｇを１０ｍＬの水に溶解してＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（Ｃ４、２０ｍｍ×２５０ｍｍ）に溶解し、０．１％トリフルオロ酢酸中０〜５４％のアセトニトリルの直線濃度勾配（流速：１０ｍＬ／分）で６０分間溶出する。所望の画分を収集し、凍結乾燥して約１２０ｍｇの所望の生成物を得る。
【０３０９】
アシルセリン（Ｆｍｏｃ法、カルボキシル−末端アミド化合物）グレリンスプライス変異体（１−２２）−ＮＨ２を有する誘導体の合成実施例
ＡＢＩカンパニー（ＡＢＩ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）からのＧＳＳ（ＣＯ−Ｃ７Ｈ１５）ＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＶＲＰＰＨＫＡＰＨ−ＮＨ２Ｆｍｏｃ−アミド−樹脂（４０３ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を２０％ピペラジンで２０分間処理し、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔによるＦｍｏｃ−アミノ酸導入を繰り返し、ピペラジンによるＦｍｏｃ除去を連続して施して、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｕ）−Ｓｅｒ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（Ｂｕ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ）−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−樹脂を構築する。ＤＣＣ／ＨＯＢｔによってＢｏｃ−Ｇｌｙを最後に導入した後、得られた保護されたペプチド樹脂（約５５０ｍｇ）を１％ＴＦＡ−５％ＴＩＰＳ−塩化メチレン溶液（１０ｍＬ）で３０分間処理する。ペプチド樹脂を濾過して回収し、塩化メチレン（３０ｍＬ）で数回洗浄し、５％ＤＩＥＡ（１０ｍＬ）および次に塩化メチレン（３０ｍＬ）で洗浄する。得られた脱−Ｔｒｔペプチド樹脂（約７５０ｍｇ）をＮＭＰ（１０ｍＬ）で膨潤させて、ＤＭＡＰ（６１．１ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）存在下でオクタン酸（１４４．２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＣＩ（１２６．２ｍｇ、１ｍｍｏｌ）をそれに添加し、４時間反応させる。樹脂を濾過により回収して、ＮＭＰおよび次に塩化メチレンで洗浄し、引き続いて真空下で乾燥させて、第３のセリンの側鎖がオクタノイル化されている約８００ｍｇの保護されたペプチド樹脂を得る。この生成物に、ＴＦＡ（１０ｍＬ）を添加して室温で３０分間拌する。樹脂を濾過により除去して次に濾液を濃縮し、引き続いて得られた残留物にエーテルを添加して沈殿を形成させる。沈殿物を濾過により回収し、乾燥させて約２５０ｍｇの粗製ペプチドを得る。この生成物の約２００ｍｇを１０ｍＬの３０％水性酢酸に溶解して、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（Ｃ４、２０ｍｍ×２５０ｍｍ）に入れ、０．１％トリフルオロ酢酸中０〜５４％アセトニトリルの直線濃度勾配（流速：１０ｍＬ／分）で６０分間溶出する。所望の画分を収集し、次に凍結乾燥して約１５０ｍｇの所望の生成物を得る。
【０３１０】
アシルセリン（Ｂｏｃ法）［Ｓｅｒ３（プロピオニル）］−グレリンスプライス変異体（１−２２）を有する誘導体の合成実施例
ＧＳＳ（ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ３）ＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＶＲＰＰＨＫＡＰＨ保護されたグレリンスプライス変異体樹脂（４−２２）をＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）−Ｐａｍ樹脂（０．７５ｇ、０．５ｍｍｏｌ）からＢｏｃ化学反応によって構築し、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ３）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ、およびＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを樹脂の半量（１．４ｇ）と共に濃縮する。次に得られた１．５ｇの樹脂をＨＦとｐ−クレゾール（８．５ｍＬ：１．５ｍＬ）の混合物によって０℃で１時間処理し、ＨＦを蒸発させる。エーテルを残留物に添加し、それによって６７１ｍｇの粗製ペプチドを得る。次にこのサンプルを５０％酢酸（ＡｃＯＨ）に溶解し、分取カラムＹＭＣ−Ｐａｃｋ−ＯＤＳ−Ａ（５ｍｕｍ、２０ｍｍ×２５０ｍｍ）に入れ、０．１％ＴＦＡ溶液中０〜９５％アセトニトリル濃度の勾配で１０ｍＬ／分の速度で７５分間溶出する。所望の生成物を含有するこれらの画分を凍結乾燥して、およそ１３５．８ｍｇの粗製ペプチドを得る。この生成物の一部（０．５ｍｇ）をＹＭＣ−Ａ−３０２カラム（Ｃ１８、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）に入れて１５〜１９％アセトニトリル濃度の勾配で１ｍＬ／分の流速で溶出する。次に精製手順を繰り返し、所望の画分を合わせておよそ０．４１ｍｇの所望の生成物を得る。
【０３１１】
本開示に係るその他の化合物も同様に生成できる。
【０３１２】
上の方法を使用して、アシル化および非アシル化配列番号２、配列番号４、および配列番号５を合成した。
【０３１３】
実施例３
健康な対象において３種の異なる単回用量で静脈内投与されたグレリンスプライス変異体および皮下投与されたグレリンスプライス変異体の絶対生物学的利用能を調査するための無作為化、単一施設、四期交差試験
目的：
一次目的：単回静脈内および皮下投薬として投与された３種の異なる用量のグレリンスプライス変異体の絶対生物学的利用能を調査する。
二次目的：
１）上昇する用量の用量直線性（用量比例関係）を調査する。
２）治療の薬力学プロフィールを調査し、治療間で比較する。
３）安全性および局所耐性を評価する。
【０３１４】
試験デザイン：健康な対象において、３種の異なる単一用量で静脈内投与されたグレリンスプライス変異体、および皮下投与されたグレリンスプライス変異体の間の絶対生物学的利用能を調査するための無作為化、単一施設、不均衡ブロックデザイン、四期交差試験。低、中、高の３つの用量を各投与様式で使用する。各個体への投薬回数を低下させ、ひいては試験の長さを短縮するために、各対象には全部で６回の用量の内、４回の投与のみが与えられ、すなわち２つの用量レベルがそれぞれ静脈内および皮下投与される。全ての対象が全ての用量レベルを受け入れる訳ではないが、不均衡ブロックデザインは、３つの用量レベルが全て、このようにしてカバーされることを確実にする。個々の投薬期間の間には、十分な休薬期間を置いた。
【０３１５】
終点：
グレリンスプライス変異体の薬剤動態：ＡＵＣ０−ｔ、ＡＵＣ、Ｃｍａｘ、ｔｍａｘ、ｔ、Ｃｌ／ｆ、Ｖｚ／ｆ、Ｃｌ、Ｖｚ、ｔ１／ｚ
ＭＲＴ薬剤動態：ＧＨ：ＡＵＣ、Ｃｍａｘおよびｔｍａｘ心拍出量、空腹感評価、食物／エネルギー摂取、食物摂取に関わる快感の程度、体重、エネルギー消費、ＤＥＸＡ
【０３１６】
安全性：臨床評価により研究全体を通じて安全性および局所耐性を評価する（身体検査および生命兆候）、心電図、および臨床検査（血液学および臨床化学）。
【０３１７】
試験集団および出力計算：健康な男性対象、体格指数（ＢＭＩ）１９〜２６ｋｇ／ｍ２の１８〜４５歳（両端を含む）。
【０３１８】
この研究の主要目的は、静脈内および皮下投与を通じて投与されるグレリンスプライス変異体の絶対生物学的利用能を調査することである。不均衡ブロックデザインを適用して試験期間を短縮し、対象あたりの投薬回数を低下させる。用量レベルあたりの絶対生物学的利用能の統計学的分析、ならびに用量間の用量直線性の分析を実施するのに必要な対象の数は、既存の文献データに基づいて計算される。
【０３１９】
試験製品：静脈内および皮下投与のためのグレリンスプライス変異体
【０３２０】
実施例４
グレリン受容体の機能性試験
形質移入および組織培養−ＣＯＳ−７細胞は、１０％ウシ胎仔血清と２ｍＭグルタミンと０．０１ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したダルベッコの変性イーグル培地１８８５中で生育させる。上述されたように、クロロキン添加によるリン酸カルシウム沈殿法を使用して細胞を形質移入する（Holst B. et al., Mol. Pharmacol. 53:166-175 (1998)）。遺伝子量実験では可変量のＤＮＡを使用する。最大のシグナル伝達をもたらすｃＤＮＡの量（２０μｇ／７５ｃｍ２）を用量反応曲線のために使用する。ＨＥＫ−２９３細胞は、１０％ウシ胎仔血清と２ｍＭグルタミンと０．０１ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加した高グルコースのダルベッコの変性イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）３１９６６中で生育させる。カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌ．））からのリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）２０００で細胞を形質移入する。
【０３２１】
ホスファチジルイノシトール代謝回転：形質移入の１日後、１０％ウシ胎仔血清と２ｍＭグルタミンと０．０１ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したウェルあたり１ｍｌの培地中で、ＣＯＳ−７細胞をニュージャージー州ピスカタウェイのＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））からの５μＣｉの［３Ｈ］−ミオ−イノシトールと共に２４時間インキュベートする。細胞を緩衝液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭグルコース、０．０５％（ｗ／ｖ）ウシ血清を添加した２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、１０ｍＭ  ＬｉＣｌを添加した０．５ｍｌの緩衝液中において３７℃で３０分間インキュベートする。３７℃で４５分の様々な濃度のペプチドによる刺激の後、細胞を１０％氷冷過塩素酸で抽出し、それに続いて氷上で３０分間インキュベートする。得られた上清をＨＥＰＥＳ緩衝液中のＫＯＨで中和し、発生した［３Ｈ］−イノシトールホスフェートをカリフォルニア州ハーキュリーズのバイオラド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌ．））からのバイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＡＧ  １−Ｘ８陰イオン交換樹脂上で、製造業者の使用説明書に従って精製する。判定は二回行う。
【０３２２】
ＣＲＥ、ＳＲＥ、およびＮＦ−κ−Ｂレポーターアッセイ：９６−ウェルプレート内に播種したＨＥＫ２９３細胞（３０，０００細胞／ウェル）を一過性に形質移入する。ＣＲＥレポーターアッセイの場合、細胞は、カリフォルニア州ラホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌ．））からのｐＦＡ２−ＣＲＥＢおよびｐＦＲ−Ｌｕｃレポータープラスミド（パス・ディテクトＣＲＥＢトランス・レポーティング・システム（ＰａｔｈＤｅｔｅｃｔ  ＣＲＥＢ  ｔｒａｎｓ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）またはカリフォルニア州ラホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌ．））からのＳＲＥ−Ｌｕｃ（パス・ディテクトＳＲＥシス・レポーティング・システム（ＰａｔｈＤｅｔｅｃｔ  ＳＲＥ  Ｃｉｓ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）、および指定量の受容体ＤＮＡの混合物で形質移入される。形質移入に続き、実験全体を通じて細胞を低血清（２．５％）に保ち、細胞内シグナル伝達経路のそれぞれの阻害剤で処理する。形質移入の１日後、細胞を培地１００μｌのアッセイ容積中においてそれぞれのリガンドで５時間処理する。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、マサチューセッツ州ウェルズリーのパーキン・エルマー社（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，  Ｍａｓｓ．））からの １００μｌのルシフェラーゼ（登録商標）アッセイ試薬（ラクライト（ＬｕｃＬｉｔｅ）（登録商標））を添加して、アッセイを終結する。コネチカット州メリデンのパッカード・インストゥルメント・カンパニー（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，（Ｍｅｒｉｄｅｎ，Ｃｏｎｎ．））からのトップカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔｅｒ）（トップ・カウント（Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ）ＮＥＴＴ）中でルミネセンスを５秒間測定する。ルミネセンス値は相対光単位（ＲＬＵ）として与えられる。
【０３２３】
ＭＡＰキナーゼアッセイ：ＣＯＳ７細胞（播種密度１５０，０００細胞／ウェル）をアッセイプレート内で形質移入する。形質移入の２日後に、いかなる血清もなしに指定濃度のリガンドをアッセイ培地に添加して、３７℃で１０分間インキュベートする。培地を除去し、氷冷ＰＢＳでの２回の洗浄ステップによって反応を停止させる。Laemmli U.K., Nature 227:680-85 (1970)に従って、細胞をサンプル緩衝液中で溶解して１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離する。タンパク質をニトロセルロース上に転写して、カリフォルニア州サンタクルーズのサンタクルーズ・バイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｃａｌ．））からの１：５０００希釈のマウスモノクローナル抗ホスホ−ＥＲＫ１／２抗体を使用してウエスタンブロット分析を実施する。カリフォルニア州サンタクルーズのサンタクルーズ・バイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｃａｌ．））からの抗ＥＲＫ抗体の１：１００００希釈を使用して、全ＥＲＫタンパク質を判定する。抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合二次抗体でブロットをプローブし、ニュージャージー州ピスカタウェイのＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））からの高感度化学発光試薬を使用して視覚化して、濃度測定分析によって定量化する。データを総ＥＲＫ１／２に対するホスホＥＲＫ１／２比率で表して、ＥＲＫ１／２リン酸化をタンパク質の装填に応じて正規化する。結果を刺激されていない模擬形質移入細胞において得られる値の百分率として表す。
【０３２４】
実施例５
アシル化グレリンスプライス変異体の皮下投与の体重増加および食物摂取に対する有効性
ｎ＝１０（図１Ａおよび１Ｂ）またはｎ＝８（図２Ａおよび２Ｂ）の１２９Ｓｖオスマウスを含んでなる群に、アシル化グレリンスプライス変異体（２０μｇ（図１Ａおよび１Ｂ）または１８０μｇ（図２Ａおよび２Ｂ））またはビヒクル（１．６％マンニトール）を１４日間連日（図１Ａおよび１Ｂ）または７日間連日（図２Ａおよび２Ｂ）、皮下（ＳＣ）経路を通じて毎日１回投与した。研究期間全体を通じて、動物のいずれにも死亡は起きなかった。研究期間全体を通じて、動物のいずれにも臨床徴候は観察されなかった。全ての動物は安楽死直前にＣＯ２麻酔下で終末出血させた。終末血液採取は、群毎でなく動物番号に従って連続的に実施した。
【０３２５】
生化学：未被覆の標識済み試験管内に生化学分析のための血液を採取した。試験管は標識済みで以下の情報を含んだ。試験番号、群番号、動物番号、および日付。凝固に続いて各動物からの血液を遠心分離し、血清を２本の標識済み試験管内に採取して、以下のように分析を施した。２５０μｌの血清を分析まで２〜８℃に保った。日立９１７システムを使用して、以下に列挙する試験をサンプルに施した。クレアチニン、総ビリルビン、グルコース、トリグリセリド、コレステロール、ＨＤＬ、ＬＤＬ、総タンパク量、グロブリン、アルブミン、尿素、カリウム、リン、カルシウム、ナトリウム、塩素イオン、ｓＧＯＴ、ｓＧＰＴ、ＡＬＰ。
【０３２６】
尿検査：（上記のような）標識済み試験管内に、安楽死の前および／または後に（可能であれば）全ての動物からの尿を採取した。全ての生存動物では、群毎でなく動物番号に従って連続的に尿採取を実施した。可能な限り最大量を得ることを試みて、下に列挙する試験を実施した。尿検査は尿サンプルに適用されるバイエル（Ｂａｙｅｒ）からの市販の試験スティック（Ｍｕｌｔｉｓｔｉｘ（登録商標）１０ＳＧ）を使用して実施し、以下のパラメーターを評価する。グルコース、ケトン、ｐＨ値、白血球、血液、濃度、亜硝酸塩、ビリルビン、ウロビリノーゲン、およびタンパク質。
【０３２７】
剖検手順および巨視的検査：全ての動物に完全で詳細な剖検を施した。全ての生存動物では、予定された終末出血直後に、群毎でなく動物番号に従って連続的に剖検を実施した。剖検では完全な検査を行い、あらゆる組織および／または臓器中の異常、または肉眼的病理変化を観察して記録する。
【０３２８】
臓器／組織採取：以下の臓器および組織：脳，肝臓、腎臓、胃、膵臓、肺、脾臓、心臓、精巣上体ＷＡＴ、腹膜後ＷＡＴ、肩甲骨間ＢＡＴを切除して、切除および付着脂肪およびその他の結合組織の除去後にできるだけ早く湿潤秤量した。１匹の動物からの全ての臓器は、以下の情報で標識済みの１個の容器内に採取した。試験番号、群番号、動物番号、および日付。
【０３２９】
身体組成評価：脂肪または除脂肪体重いずれかの変化を分析するために、処置の初日および最終日にＮＭＲを使用した（図４）。
【０３３０】
結果：アシル化グレリンスプライス変異体処置１２９Ｓｖマウスの累積体重増加は、ビヒクル処置対照よりも顕著に高かった（ｐ＝６Ｅ−０５）（それぞれ２．２ｇおよび０．７ｇ）。図１Ａを参照されたい。アシル化グレリンスプライス変異体処置１２９Ｓｖマウスの累積食物摂取は、ビヒクル処置対照よりも顕著に高かった（ｐ＝０．０４）（それぞれ５３．２ｇおよび４７．２１ｇ）。図１Ｂを参照されたい。研究期間全体を通じて、死亡発生および処置に対する明らかな臨床徴候に関わる証拠は、いずれの実験動物でも見られなかった。上の研究結果に基づいて、ヒトアシル化グレリンスプライス変異体は、体重増加および食物摂取を顕著に促進する。
【０３３１】
実施例６
アシル化グレリンスプライス変異体の皮下投与のＧＨ放出に対する効果
それぞれ５匹のマウスに、皮下ボーラス注射（０．３μｍｏｌ／ｋｇに相当する）によってアシル化グレリンスプライス変異体（２０μｇ）またはビヒクル（１．６％マンニトール）を投与した。注射の１０および２０分後に血液を試料採取した。血清サンプルを−７０℃に保存して、テキサス州ウェブスターのダイアグノスティック・システムズ・ラボラトリーズ社（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｔｅｘａｓ））からのＤＳＬ−１０−７２１００  ＡＣＴＩＶＥ（登録商標）マウス／ラット成長ホルモンＥＬＩＳＡキットによって分析した。
【０３３２】
結果：アシル化グレリンスプライス変異体またはビヒクルの皮下投与の１０分後の血清成長ホルモン濃度は、ビヒクル群と比較してグレリンスプライス変異体群で２〜１４倍高かった（図３を参照されたい）。
【０３３３】
実施例７
ラットにおけるアシル化グレリンスプライス変異体範囲測定の薬剤動態
それぞれ０．１、０．５および２ｍｇ／ｍｌの濃度に相当する、０．５、２．５および１０ｍｇ／ｋｇの３つの用量レベル、および５ｍｌ／ｋｇの一定容積の投薬量でグレリンスプライス変異体の皮下投与を実施した。０．１ｍｇ／ｍｌの濃度に相当する０．５ｍｇ／ｋｇの１つの用量レベル、および５ｍｌ／ｋｇの一定容積の投薬量で静脈内注射を実施した。研究は、用量レベルおよび投与経路あたり、９匹のオスおよび９匹のメスのスプラーグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）（商標）（ＳＤ（商標））ラットからなった。
【０３３４】
出血試料採取デザインは、各用量レベルあたり以下の９回の出血時点に限定した。投薬前、投薬後５、１５、３０、６０および９０分、３、５および２４時間。３つの個々のサンプル／時点／群を得るために、各群を３つの下位集団に分割して、それぞれを３つの特定出血時点に割り当てた（全部で２７の個体のサンプル／群）。研究開始時における平均群体重値は全ての群で同様であり、性別平均体重の±２０％を超えなかった。全血サンプルは、血液採取時から遠心分離時まで氷上に保った。得られた血漿サンプルを液体窒素中で急速冷凍して、−７０℃への移動までドライアイス上に保った。
【０３３５】
血漿中の試験項目の濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析法／質量分析法）によって判定した。グレリンスプライス変異体の薬剤動態分析は、米国コロラド州のサミット・リサーチ・サービス（Ｓｕｍｍｉｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＣＯ，ＵＳＡ））からのコンピューターソフトウェア「ＰＫソリューションズ（Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）２．０」の使用によって発生させたノンコンパートメント薬剤動態分析によって得られた、各用量群の平均血漿濃度時間プロフィールに基づいた。
【０３３６】
ＳＣ経路のための薬剤動態学的分析は、低用量（それぞれ６．１および５．２ｍｃｇ・分／ｍｌ）および中用量（それぞれ１８．８および２０．８ｍｃｇ・分／ｍｌ）を投与されたオスおよびメスで、ＡＵＣ０−∞値が同様であったことを示した。高用量では、メスのＡＵＣ値（４９．１ｍｃｇ・分／ｍｌ）はオスのＡＵＣ値（７９．２ｍｃｇ・分／ｍｌ）よりも実質的に低かった。Ｔｍａｘは全ての用量群で投薬の５分後に起きた。Ｔ１／２値は、オスラットで１７．４〜２６．４分、メスラットで１０．７〜２８．９分の範囲であった。
【０３３７】
実施例８
アシル化グレリンスプライス変異体の単回急性皮下投与のラットにおける毒性に対する効果
皮下（ＳＣ）経路を通じて、ｎ＝６スプラーグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）（商標）（ＳＤ（商標））ラットを含んでなる群に、アシル化グレリンスプライス変異体（２．５、１５、および７５μｇ）またはビヒクル（食塩水）を１回投与した。研究期間全体を通じて、動物のいずれにも死亡は起きなかった。研究期間全体を通じて、動物のいずれにも臨床徴候は観察されなかった。全ての動物は安楽死直前にＣＯ２麻酔下で終末出血させた。
【０３３８】
臨床徴候：
動物は、投薬後に最初の３０分間に少なくとも１回、最初の２４時間は定期的に、最初の４時間に特別な注意を払って、個別に観察し臨床徴候を記録した。その後は全部で１４日間にわたり、毎日１回動物を検査して臨床徴候を記録した。観察には、皮膚と毛皮と眼球と粘膜の変化、分泌および排泄の発生（例えば下痢）、および自律神経活動（例えば流涙、流涎、立毛、瞳孔サイズ、普通でない呼吸パターン）が含まれた。歩調、姿勢、および取り扱いへの反応の変化、ならびに奇異な動態、振戦、痙攣、睡眠、および昏睡の存在もまた含まれた。
【０３３９】
体重：
動物の個別体重の測定は、グレリンスプライス変異体投与直前（０日目）、投薬の２、７、および１４日後に行った。絶食体重測定を剖検直前に行った。
【０３４０】
臨床病理学：
予定された安楽死前に全ての生存動物から、下に列挙する血液学、生化学、および凝固パラメーターを判定した。
【０３４１】
血液学：一晩の絶食に続いて、血液サンプルを得た。以下の情報を含む標識済みＥＤＴＡ被覆試験管内に、血液サンプル（少なくとも５００μｌの全血）を採取した。研究番号、群番号、動物番号、および日付。サンプルを分析まで２〜８℃に保った。バイエル（Ｂｅｙｅｒ）からのＡＤＶＩＡ１２０ヘマトロジー・システム（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して試験される血液学パラメーターは、ＷＢＣ、ＲＢＣ、ＨＧＢ、ＨＣＴ、ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ、血小板、血液像である。網状赤血球は手動で計測した。
【０３４２】
生化学：未被覆標識済み試験管内に生化学分析のための血液を採取した。試験管は標識済みで以下の情報を含んだ。試験番号、群番号、動物番号、および日付。凝固に続いて各動物からの血液を遠心分離し、３００μｌの血清を２本の標識済み試験管内に採取して分析まで２〜８℃に保って分析を施した。日立モジュラー（ＭＯＤＵＬＡＲ）Ｐ−８００システムを使用して、以下に列挙する試験をサンプルに施した。クレアチニン、カルシウム、グルコース、コレステロール、総タンパク量、グロブリン、ＬＤＨ、カリウム、アスパラギン酸、アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）、ＣＰＫ、リン、尿素、アルブミン、総ビリルビン、アラニン、アミノ基転移酵素（ＡＬＴ）、ナトリウム、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、塩素イオン、トリグリセリド、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）。
【０３４３】
凝固パラメーター：ＣＯ２麻酔下の眼窩後方洞出血によって、クエン酸三ナトリウムで被覆された試験管内に、凝固分析のための血液を採取した。血液採取の完了に続いて、さらなる分析まで、全ての血液および血清サンプルを２〜８℃に保った。シスメックス（Ｓｙｓｍｅｘ）ＣＡ−１５００システムＰＴ、ＡＰＴＴを使用して、以下に列挙する試験をサンプルに施した。
【０３４４】
尿検査：
予定された研究の終了前、または動物福利の理由による研究からの除去の場合は屠殺前に、（該当する場合）全ての動物から、膀胱上での腹部圧迫、または排尿の採取のいずれかによって、さもなければ直接に膀胱から膀胱穿刺によって、排出尿の個々のサンプルを採取した。バイエル（Ｂａｙｅｒ）からの市販の試験キット（マルチスティック（Ｍｕｌｔｉｓｔｉｘ）（登録商標）１０ＳＧ）を使用して、排尿サンプルに適用し、以下のパラメーターを評価して分析を実施した。グルコース、ケトン、ｐＨ、白血球、血液、濃度、亜硝酸塩、ビリルビン、ウロビリノーゲン、およびタンパク質。
【０３４５】
剖検手順および巨視的検査：予定された安楽死に続いて、全ての動物に肉眼剖検を施した。剖検では、全ての動物に、身体外表面と、全ての開口部と、頭蓋内腔、胸腔、および腹腔と、それらの内容物をはじめとする、完全な検査を施した。組織および／または臓器のあらゆる異常または肉眼的病理変化を観察して記録した。身体外表面に肉眼的病理学的異常が起きた場合、それは注射部位またはその近くに位置することが注目される。巨視的異常があるものを含む以下の組織および／または臓器を４％ホルムアルデヒド溶液中で保存する。副腎、胸大動脈、脳、盲腸、結腸、十二指腸、精巣上体、眼球、ハーダー腺、心臓、大腿および膝関節、回腸、空腸、腎臓、涙腺、肝臓、肺、リンパ節（浅頸、リンパ節）腸間膜、乳腺＋皮膚、食道、視神経、卵巣、膵臓、脳下垂体、前立腺、直腸、唾液腺、坐骨神経、精嚢、骨格筋（腿）、皮膚−注射部位、脾臓、脊髄（頸部、胸部、腰部）、胸骨（骨髄）、胃、精巣、胸腺、甲状腺（該当する場合副甲状腺）、舌、気管、膀胱、頸部を含む子宮、膣。
【０３４６】
臓器／組織秤量および臓器／組織固定：
全ての動物で臓器／組織の秤量と固定を実施した。上に列挙した臓器を切除および付着脂肪およびその他の結合組織の除去後にできるだけ早く湿潤秤量した（対の臓器の場合、個々の重量を判定したが平均臓器重量として示した）。次に組織送達の前に少なくとも４８時間の固定期間にわたり、全ての臓器／組織を固定して、４％ホルムアルデヒド溶液中に保存した（デビッドソンの溶液中で固定する眼球、視神経、およびハーダー腺を除く）。さらに肉眼巨視的変化があるあらゆるその他の臓器／組織もまた、４％ホルムアルデヒド溶液中に保存した。動物毎の臓器／組織をプラスチック容器に入れ、各容器は、研究番号、群番号、動物番号、および剖検日付によって識別する。骨髄は、ウシ胎児血清で湿らせて適切な塗抹を可能にし、第２のガラススライドの使用によって清潔な標識ガラススライド上に塗抹される単一の大腿から得られる。その後、適切な固定のためにスライドを開放空気に放置して乾燥させ、メタノールに約５分間浸漬する。動物毎に少なくとも２枚のスライドを調製する。
【０３４７】
結果：研究期間全体を通じて、死亡発生および処置に対する明らかな臨床徴候に関わる証拠は、いずれの実験動物でも見られなかった。
【０３４８】
実施例９
ミニブタにおけるアシル化グレリンスプライス変異体の単回用量急性皮下投与の毒性および毒物動態に対する効果
許容できない毒性を引き起こさない最大用量を表す最大耐容量（ＭＴＤ）または最大実行可能用量（ＭＦＰ）の確立を目指して、先行試験群の２匹のミニブタＳｉｗｉｎｅ／ＨｓｄＳｃｒ：Ｓｉｎｃｌａｉｒに、最大７５ｍｇ／ｋｇまでのアシル化グレリンスプライス変異体の徐々に増える用量を投与する。先行試験で観察された効果に基づいて、適切に選択された最高単回用量を選択し、皮下（ＳＣ）経路を通じて主要な研究動物に投与し、群はｎ＝２のミニブタを含んでなる。１日目（投薬日）に、生物分析アッセイのための血液サンプルを試験前ベースラインの０、投薬後５、１５、３０、６０、９０分間、３、５、および２４時間の全部で９つの時点で採取する。標準ＰＫパラメーターのデータ評価（Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、Ｔ１／２、ＡＵＣ）が得られる。ミニブタは、追加的な１４日間の観察期間中にさらに観察される。
【０３４９】
全ての薬剤動態学的パラメーターが得られ、研究期間全体を通じていずれの実験動物でも死亡は起きなかった。研究期間全体を通じて、いずれの実験動物でも臨床徴候は観察されなかった。全ての動物は安楽死直前にＣＯ２麻酔下で終末出血させた。
【０３５０】
臨床徴候：
動物は、投薬後に最初の３０分間に少なくとも１回、最初の２４時間は定期的に、最初の４時間に特別な注意を払って、個別に観察し臨床徴候を記録する。その後は全部で１４日間にわたり、毎日１回動物を検査して臨床徴候を記録する。観察には、皮膚と毛皮と眼球と粘膜の変化、分泌および排泄の発生（例えば下痢）、および自律神経活動（例えば流涙、流涎、立毛、瞳孔サイズ、普通でない呼吸パターン）が含まれる。歩調、姿勢、および取り扱いへの反応の変化、ならびに奇異な動態、振戦、痙攣、睡眠、および昏睡の存在もまた含まれる。
【０３５１】
体重：
動物の個別体重の測定は、試験品目投与直前（０日目）、投薬の２、７、および１４日後に行う。絶食体重測定は、剖検直前に行う。死亡例では、死亡のできるだけ近くで体重を判定する。
【０３５２】
臨床病理学：
予定された安楽死前に全ての生存動物から、下に列挙する血液学、生化学、および凝固パラメーターを判定する。
【０３５３】
血液学：一晩の食物欠乏に続いて、血液サンプルを得る。以下の情報を含む標識済みＥＤＴＡ被覆試験管内に、血液サンプル（少なくとも５００μｌの全血）を採取する。研究番号、群番号、動物番号、および日付。サンプルを送達および分析まで２〜８℃に保つ。バイエル（Ｂｅｙｅｒ）からのＡＤＶＩＡ１２０ヘマトロジー・システム（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して試験される血液学パラメーターは、ＷＢＣ、ＲＢＣ、ＨＧＢ、ＨＣＴ、ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ、血小板、血液像である。網状赤血球は手動で計測する。
【０３５４】
生化学：未被覆標識済み試験管内に生化学分析のための血液を採取する。試験管は標識済みで以下の情報を含む。試験番号、群番号、動物番号、および日付。凝固に続いて各動物からの血液を遠心分離し、少なくとも３００μｌの血清を２本の標識済み試験管内に採取して分析まで２〜８℃に保って分析を施す。日立モジュラー（ＭＯＤＵＬＡＲ）Ｐ−８００システムを使用して、以下に列挙する試験をサンプルに施す。クレアチニン、カルシウム、グルコース、コレステロール、総タンパク量、グロブリン、ＬＤＨ、カリウム、アスパラギン酸、アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）、ＣＰＫ、リン、尿素、アルブミン、総ビリルビン、アラニン、アミノ基転移酵素（ＡＬＴ）、ナトリウム、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、塩素イオン、トリグリセリド、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）。
【０３５５】
凝固パラメーター：ＣＯ２麻酔下の眼窩後方洞出血によって、クエン酸三ナトリウムで被覆された試験管内に、凝固分析のための血液を採取する。血液採取の完了に続いて、さらなる分析まで、全ての血液および血清サンプルを２〜８℃に保つ。シスメックス（Ｓｙｓｍｅｘ）ＣＡ−１５００システムＰＴ、ＡＰＴＴを使用して、以下に列挙する試験をサンプルに施す。
【０３５６】
尿検査：
予定された研究の終了前、または動物福利の理由による研究からの除去の場合は屠殺前に、（該当する場合）全ての動物から、膀胱上での腹部圧迫、または排尿の採取のいずれかによって、さもなければ直接に膀胱から膀胱穿刺によって、排出尿の個々のサンプルを採取する。バイエル（Ｂａｙｅｒ）からの市販の試験キット（マルチスティック（Ｍｕｌｔｉｓｔｉｘ）（登録商標）１０ＳＧ）を使用して、排尿サンプルに適用し、以下のパラメーターを評価して分析を実施する。グルコース、ケトン、ｐＨ、白血球、血液、濃度、亜硝酸塩、ビリルビン、ウロビリノーゲン、およびタンパク質。
【０３５７】
剖検手順および巨視的検査：予定された安楽死に続いて、全ての動物に肉眼剖検を施す。剖検では、全ての動物に、身体外表面と、全ての開口部と、頭蓋内腔、胸腔、および腹腔と、それらの内容物をはじめとする、完全な検査を施す。組織および／または臓器のあらゆる異常または肉眼的病理変化を観察して記録した。身体外表面に肉眼的病理学的異常が起きた場合、それは注射部位またはその近くに位置することが注目される。巨視的異常があるものを含む以下の組織および／または臓器を４％ホルムアルデヒド溶液中で保存する。副腎、胸大動脈、脳、盲腸、結腸、十二指腸、精巣上体、眼球、ハーダー腺、心臓、大腿および膝関節、回腸、空腸、腎臓、涙腺、肝臓、肺、リンパ節（浅頸、リンパ節）腸間膜、乳腺＋皮膚、食道、視神経、卵巣、膵臓、脳下垂体、前立腺、直腸、唾液腺、坐骨神経、精嚢、骨格筋（腿）、皮膚−注射部位、脾臓、脊髄（頸部、胸部、腰部）、胸骨（骨髄）、胃、精巣、胸腺、甲状腺（該当する場合副甲状腺）、舌、気管、膀胱、頸部を含む子宮、膣。
【０３５８】
臓器／組織秤量および臓器／組織固定：
全ての動物で臓器／組織の秤量と固定を実施する。上に列挙した臓器を切除および付着脂肪およびその他の結合組織の除去後にできるだけ早く湿潤秤量する（対の臓器の場合、個々の重量を判定するが平均臓器重量として示す）。次に組織送達の前に少なくとも４８時間の固定期間にわたり、全ての臓器／組織を固定して、４％ホルムアルデヒド溶液中に保存する（デビッドソンの溶液中で固定する眼球、視神経、およびハーダー腺を除く）。さらに肉眼巨視的変化があるあらゆるその他の臓器／組織もまた、４％ホルムアルデヒド溶液中に保存する。動物毎の臓器／組織をプラスチック容器に入れ、各容器は、研究番号、群番号、動物番号、および剖検日付によって識別する。骨髄は、ウシ胎児血清で湿らせて適切な塗抹を可能にし、第２のガラススライドの使用によって清潔な標識ガラススライド上に塗抹される単一の大腿から得られる。その後、適切な固定のためにスライドを開放空気に放置して乾燥させ、メタノールに約５分間浸漬する。動物毎に少なくとも２枚のスライドを調製する。
【０３５９】
結果：研究期間全体を通じて、死亡発生および処置に対する明らかな臨床徴候に関わる証拠は、いずれの実験動物でも見られなかった。
【０３６０】
実施例１０
ラット／イヌ／ミニブタにおけるアシル化グレリンスプライス変異体の７、１０、２８日または３、６、９ヶ月の反復皮下投与の実施例
ｎ＝１０のラットまたはビーグル犬または悪液質があるヒト対象を含んでなる群に、皮下（ＳＣ）経路を通じて、様々な用量のアシル化グレリンスプライス変異体（０．２、１．０、および５μｍｏｌ／ｋｇ、全て１００μｌのビヒクル中）またはビヒクル（食塩水中）を連日様々な期間（７、１０、２８日間または３、６、９ヶ月）にわたり毎日１回投与する。食物摂取、体重増加、および自発的歩行活動を注射後２０時間にわたり測定する。
【０３６１】
実施例１１
患者の生活の質を評価する日記／質問票の例
Ａ）ＥＯＲＴＣ  ＱＬＱ−Ｃ３０（Aaronson et al., J. Natl. Cancer Inst. 85: 365-76 (1993)）は、国立衛生研究所のウェブサイトを参照されたく、例えばＥＯＲＴＣのウェブサイトで入手でき、参照によって本明細書に援用される、ＥＯＲＴＣ  ＱＬＱ−Ｃ３０（バージョン３．０）の見本を参照されたい。
【０３６２】
私たちはあなたとあなたの健康に関する情報に関心があります。あなたに最もよく当てはまる番号に印を付けて、以下の質問に答えてください。「正答」や「誤答」はありません。この情報は機密性を持って取り扱われます。
【０３６３】
質問：ＥＯＲＴＣウェブサイトで入手でき、参照によって本明細書に援用される、ＥＯＲＴＣＱ  ＬＱ−Ｃ３０（バージョン３．０）の見本を参照されたい。
【０３６４】
実施例１２
本開示で使用する医薬品組成物を調製するための適切な調合物の例
Ｄ−マンニトールを注射用水に溶解し、最終濃度４０ｍｇ／ｍｌを得て４％マンニトール溶液を調製する。ＴＦＡ塩中または酢酸塩（５ｍｇ）中のグレリンスプライス変異体を１０ｍｌの４％マンニトール溶液に溶解してグレリンスプライス変異体原液を調製し、アリコートに分割して使用時まで凍結保存（−７０℃）する。
【０３６５】
グレリンスプライス変異体投薬溶液：各投薬日に、各試験品目の必要量を解凍して、生理食塩水で０．２ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈する。
【０３６６】
対照品目投薬溶液：４％マンニトール溶液をグレリンスプライス変異体投薬溶液と同一比に生理食塩水で希釈して、各投薬日に調製する。
【０３６７】
患者：記録された癌悪液質、および先行する期間中の顕著な体重減少を伴う記録された癌悪液質、および食欲低下がある患者。悪液質は例えば、食道、肺、乳、胃、膵臓、神経および尿道、骨、血液、生殖器官、外分泌腺、内分泌腺、多発性内分泌新生物、精巣、前立腺、腎臓学的、皮膚、甲状腺、肝臓、および結腸をはじめとするあらゆるタイプの癌によって引き起こされることがある。
【０３６８】
グレリンスプライス変異体作用の有効性は、臨床評価に従って評価される。
（１）急性食物摂取：栄養士が評価する注入中の食物摂取。
（２）慢性食物摂取：１日の間に消費された食物量の日報、および食物摂取に関わる快感の評価。これは４日間食餌日記に基づいて、尿窒素排出によって確認される。
（３）体重：標準および較正尺度がクリニックで使用される。
（４）安静時エネルギー消費（ＲＥＥ）は、疾患状態と身体サイズの双方によって影響されるので、それは非常に重要な測定である。
（５）運動試験：アクティグラフ（Ａｃｔｉｇｒａｐｈ）ウェブサイトに記載の標準プロトコルに従ってアクティグラフ（Ａｃｔｉｇｒａｐｈ）を使用する。
（６）前述されるような標準形式を使用した健康−関連ＱＯＬ。
（７）副次臨床（Ｐａｒａ−ｃｌｉｎｉｃａｌ）評価：
（ｉ）尿中窒素排出：報告された食物摂取の検証として２４時間の尿収集を使用すべきである。
（ｉｉ）血漿グルコース、血漿ＦＦＡ、血漿トリグリセリド、血漿グリセロール、および血漿アミノ酸：血漿基質を測定して、報告された食物摂取が吸収された食物摂取量と一致することを確実にする。
（ｉｉｉ）除脂肪体重および体脂肪量は、身体組成の測定としてＴＳＦ厚および上腕周囲によって評価される。
（ｉｖ）全体脂肪（および無脂肪体重）は、スウェーデン国ヘルシングボリのスキャンエクスポート・メディカル（Ｓｃａｎｅｘｐｏｒｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｈｅｌｓｉｎｇｂｏｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ））からのルナー（ｌｕｎａｒ）ＤＰＸ−Ｌ用ソフトウェア１．３１を使用して、ＤＥＸＡスキャンで評価される。
（ｖ）血漿レプチン：レプチンは脂肪細胞によって生成され分泌される。レプチンの血漿レベルは、全脂肪細胞負荷の推定を与える。
（ｖｉ）血漿グレリン：基礎グレリンレベルは悪液質の患者において増大する傾向がある。
（ｖｉｉ）血漿−ＧＨ：以前の研究では、ＧＨが、グレリン投与効果の対照として測定されている（Enomoto M. et al., Clin. Sci. (Lond). 105:431-35 (2003)）。
（ｖｉｉｉ）ＩＧＦ−Ｉ：ＩＧＦ−Ｉの単回判定は２４時間のＧＨ分泌を要約する。これは循環するＩＧＦ−Ｉのレベルが、自発的ＧＨ分泌と相関することが示されている健康なボランティアで実証されている（Rose S.R. et al., N. Engl. J. Med. 319:201-07 (1988)）。ＩＧＦ−Ｉはまた改善された栄養状態によって、ＧＨとは独立に増大するかもしれない。
（ｉｘ）ＩＧＦＢＰ−３：ＩＧＦ−Ｉのキャリアタンパク質の１つ。これはＩＧＦ−Ｉと並行して増大するが、反応速度はより遅い。
（ｘ）アルブミン：栄養状態の指標である。
（ｘｉ）プレアルブミン：栄養状態の指標であり、変化に対する反応がアルブミンよりも迅速である。
（ｘｉｉ）コルチゾール：グレリン投与は、血清コルチゾールレベルを増大させることが示されている（Broglio F. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 88:1537-42 (2003)）。コルチコステロイドは、顕著な抗悪心効果を有し、無力症と疼痛管理を改善することが示されており、それは悪液質の癌患者にとって有益かもしれない。しかしコルチゾールが悪液質の癌患者において体重を増加させることは示されていない。
（ｘｉｉｉ）ＣＲＰおよびＥＳＲ：急性期タンパク質およびＥＳＲは、癌過程に関連した全身性炎症の良好な指標であることが多い（Inui A., CA Cancer J. Clin. 52:72-91 (2002)）。
【０３６９】
実施例１３
癌−関連食欲不振症／悪液質がある患者の治療
あらゆるタイプの進行した不治の癌がある患者など、食欲不振症／悪液質症候群（ＡＣＳ）を患っている進行癌がある患者は、改善された生活の質、食欲増大、食物摂取増大、体重維持または増加、食物の楽しさ、および／または脂肪沈着の観点から、本開示によって恩恵を被ると考えられる。
【０３７０】
患者は、１０μｇ／ｋｇ用量のグレリンスプライス変異体およびプラセボの皮下投与を受ける。一晩の絶食後、プロトコルを０８．００時に開始する。血液試料採取のために２２−ゲージカテーテルを前肘静脈に挿入する。３０分の均衡化期間後、グレリンスプライス変異体（１０μｇ／ｋｇ）またはプラセボ（０．９％食塩水）を皮下投与する。
【０３７１】
治験的治療：グレリンスプライス変異体は、スイス国のバケム・アーゲー（ＢＡＣＨＥＭ  ＡＧ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））または米国のネオＭＰＳ社（ＮｅｏＭＰＳ  Ｉｎｃ．（ＵＳＡ．））から１０μｇ／ｋｇの調製バイアル内のＧＭＰ等級で入手できる。プラセボは病院薬局が提供する生理食塩水（または試験物質を溶解するのに使用されるビヒクル）からなる。グレリンスプライス変異体を食塩水に溶解して、１０μｇ／ｋｇ用量のグレリンスプライス変異体を患者に投与する。
【０３７２】
有効性の評価：
（１）摂食関連症状：「食欲および悪液質治療法の機能性評価（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｐｐｅｔｉｔｅ  ａｎｄ  Ｃａｃｈｅｘｉａ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」（ＦＡＡＣＴ）質問票；ＥＯＲＴＣ−ＱＬＱ−３０食欲不振症／悪液質質問票（例えばＥＯＲＴＣのウェブサイトで入手でき、参照によって本明細書に援用される、ＥＯＲＴＣ  ＱＬＱ−Ｃ３０（バージョン３．０）の見本を参照されたい）；ＮＣＣＴＧ−食欲不振症／悪液質質問票（国立衛生研究所のウェブサイトを参照されたい）および／またはエドモントン（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ）症状評価尺度（Bruera E et al., J. Palliat. Care 7:6-9 (1991)を参照されたい）の応用バージョンを使用して評価する。
（２）生活の質：ＥＯＲＴＣ−ＱＬＱ−Ｃ３０質問票（実施例９を参照されたい）を使用して評価する。
（３）栄養摂取および食物嗜好：患者によって各食事で消費された食品の百分率計算により食物摂取を測定し、食物嗜好は臨床栄養士によって日常的評価の一端として評価される。
（４）食物の楽しみ：確立されたアンカーに従って視覚的アナログ尺度を使用して、昼食後に評価する。
（５）知覚された食欲、空腹感、悪心および満腹：確立されたアンカーに従って、視覚的アナログ尺度を使用して、朝、注入前、および昼食前後に評価する。出願人はまた、短縮臨時味覚質問票を適用する。
（６）成長ホルモン（ＧＨ）：ＧＨは、グレリン注射後の迅速なＧＨ増大と共に、グレリンの生物学的機能を直接反映するので、出願人はＧＨレベルもまた、グレリンと同時点にモニターする。標準グレリンアッセイが使用される。
（７）身体組成：ＢＭＩ、生体インピーダンス分析、および二重光子吸光光度法／二重エネルギーｘ線吸光光度法（ＤＥＸＡ）によって身体組成を評価する。
（８）アルブミンおよびトランスフェリンレベルを栄養状態パラメーターとして判定する。
（９）心臓血管自律神経機能：自律神経障害のスクリーニングのために、２０分間ホルター（Ｈｏｌｔｅｒ）ＥＫＧを実施してＳＤＮＮ値を判定する。
（１０）原発性食欲不振症／悪液質症候群の介在物質：炎症促進反応（ＣＲＰ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α）、代謝活性化（遊離脂肪酸、トリグリセリド、インシュリン、グルコース、レプチン）、腸−脳軸（グレリン）、および成長ホルモン軸（ＩＧＦ−１、遊離テストステロン）の介在物質を第１週中にベースラインとして判定する。腫瘍随伴の食欲不振症／悪液質症候群の介在物質であるタンパク質分解誘発因子（ＰＩＦ）の評価のために、尿サンプルを貯蔵する。
【図面の簡単な説明】
【０３７３】
【図１Ａ】ビヒクル処置対照と比較したアシル化グレリンスプライス変異体処置（配列番号２および５）１２９Ｓｖマウスの累積体重増加を示す折れ線グラフである。アシル化グレリンスプライス変異体は、オス野生型マウスにおける体重増加を誘発する（群あたりｎ＝１０、Ｐ＝０．０００１）。２週間にわたり毎日１回アシル化グレリンスプライス変異体（０．８ｍｇ／ｋｇ、皮下）で処置されたマウスでは、配列番号２群の累積体重増加は、ビヒクル注射された対照動物の３．４倍であった。アシル化配列番号５群の累積体重増加は、ビヒクル注射された対照動物の２倍であった。
【図１Ｂ】ビヒクル処置対照と比較した、アシル化グレリンスプライス変異体処置（配列番号２および５）１２９Ｓｖマウスの累積食物摂取を示す折れ線グラフである。アシル化グレリンスプライス変異体処置は、野生型マウスにおける食物摂取を増大させた。毎日１回２週間にわたりアシル化グレリンスプライス変異体（０．８ｍｇ／ｋｇ、皮下）で処置されたマウスは、ビヒクル注射された対照動物よりも１３％多く食べた（群あたりｎ＝１０、Ｐ＝０．００４）。
【図２Ａ】ビヒクル処置対照と比較した、アシル化グレリンスプライス変異体処置（配列番号２および４）１２９Ｓｖマウス、および未アシル化配列番号５の累積体重増加を示す折れ線グラフである。アシル化グレリンスプライス変異体は、オス野生型マウスにおける体重増加を誘発する（群あたりｎ＝８、Ｐ＝０．０００１）。７日間にわたり毎日１回アシル化または未アシル化グレリンスプライス変異体（７．２ｍｇ／ｋｇ、皮下）で処置されたマウスでは、配列番号２および配列番号４群の累積体重増加は、ビヒクル注射された対照動物の２．２倍であった。未アシル化配列番号５群の累積体重増加は、ビヒクル注射された対照動物よりも２５％少なかった。
【図２Ｂ】ビヒクル処置対照と比較した、アシル化グレリンスプライス変異体処置（配列番号２および４）１２９Ｓｖマウスおよび未アシル化配列番号５の累積食物摂取を示す折れ線グラフである。アシル化グレリンスプライス変異体処置は、野生型マウスにおける食物摂取を増大させた。７日間にわたり毎日１回アシル化グレリンスプライス変異体（７．２ｍｇ／ｋｇ、皮下）で処置されたマウスは、ビヒクル注射された対照動物よりも１８％多く食べた（群あたりｎ＝８）。７日間にわたり毎日１回配列番号５（７．２ｍｇ／ｋｇ、皮下）で処置されたマウスは、ビヒクル注射された対照動物よりも２％少なく食べた（ｎ＝８群あたり）。
【図３】ビヒクル投与対照と比較した、アシル化グレリンスプライス変異体（配列番号２、４、５）および未アシル化配列番号５の皮下投与後の血清成長ホルモン濃度を示す棒グラフである。野性型マウス（群あたりｎ＝５）における注射後１０分および２０分の血漿成長ホルモンに対する食塩水またはアシル化グレリンスプライス変異体（０．８ｍｇ／ｋｇ、皮下）の効果を示す。
【図４】ビヒクルおよびグレリン処置対照と比較した、アシル化グレリンスプライス変異体処置（配列番号２および４）１２９Ｓｖマウスおよび未アシル化配列番号５処置マウスの身体組成の変化を示す棒グラフである。ＮＭＲによって測定された、７日間にわたる毎日の食塩水、グレリンまたはアシル化グレリンスプライス変異体（７．２ｍｇ／ｋｇ、皮下）による皮下処置の脂肪および除脂肪体重に対する効果を示す。
【図１】
2009530277.tif 000004
【図２】
2009530277.tif 000005
【図３】
2009530277.tif 000006
【図４】
2009530277.tif 000007
【配列表】
2009530277000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年11月17日(2008.11.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009530277000001.app
【国際調査報告】
2009530277.tif 000013
2009530277.tif 000014
2009530277.tif 000015
2009530277.tif 000016
2009530277.tif 000017
2009530277.tif 000018