(57)【要約】本発明は、サンプル中の標的核酸配列の存在を示すシグナルを発生する方法であって、その方法が、標的核酸配列を含有するサンプルを、核酸ポリメラーゼと共にインキュベートすること、および切断構造をヌクレアーゼで切断して、切断核酸フラグメントを発生することによって、切断構造を形成することを含む方法に関する。本発明は、標的核酸配列を検出または測定する方法であって、その方法は、標的核酸配列を、核酸ポリメラーゼと共にインキュベートすること、ヌクレアーゼで切断構造を切断すること、またはフラグメントの遊離を検出または測定することによって、切断構造を形成することを含む方法にも関する。【選択図】図１３
2009517049.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の存在を検出する方法であって、
その方法が、
ａ）３’から５’への順で、第一のハイブリダイゼーション部位および第二のハイブリダイゼーション部位を含む標的核酸、
第一のハイブリダイゼーション部位に相補的である上流オリゴヌクレオチドであって、上流オリゴヌクレオチドが封鎖３’末端を有する上流オリゴヌクレオチド、および
５’領域および３’領域を含む下流プローブであって、下流プローブを標的にアニールする場合に３’領域が、第二のハイブリダイゼーション部位に相補的であり、および５’が、非相補的５’フラップを形成する下流プローブ
を供すること、
ｂ）上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを標的核酸にアニールして、切断構造を形成すること、
ｃ）ヌクレアーゼで切断構造を切断して、非相補的５’フラップを遊離すること、および
ｄ）遊離された非相補的５’フラップを検出することであって、遊離された非相補的５’フラップが、サンプル中の標的核酸の存在を示すこと、
を含む方法。
【請求項２】
下流プローブの非相補的５’フラップが、ｎ個のヌクレオチド、および第一のハイブリダイゼーション部位から構成され、第二のハイブリダイゼーション部位が、ｍ−ヌクレオチドによって分離され、ｎは、１から２５までの整数であり、ｍは、ｎより大きな整数である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
シグナルを供給する能力のある少なくとも１つの標識部分を含む切断構造を形成する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ヌクレアーゼが、ＦＥＮヌクレアーゼを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＦＥＮヌクレアーゼが、フラップ特異的ヌクレアーゼである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＦＥＮヌクレアーゼが、熱安定性である請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ＦＥＮヌクレアーゼが、アルカエグロブス・フルギドゥス（Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタノコックス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、およびピロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）から由来するＦＥＮヌクレアーゼ酵素から構成される群から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項８】
形成された切断構造が、検出可能なシグナルの発生を消すのに有効に配置された相互作用性シグナル発生標識部分の対を含み、ＦＥＮヌクレアーゼ切断に影響を受けやすい部位によって標識部分を分離し、それによりＦＥＮヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性に、ＦＥＮヌクレアーゼに影響を受けやすい部位で切断し、それにより検出可能なシグナルを発生することによって、第二の相互作用性シグナルを発生する標識部分から第一の相互作用性シグナルを発生する標識部分を分離させる請求項４に記載の方法。
【請求項９】
相互作用性シグナル発生部分の対が、クエンチャー部分および蛍光部分を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、遊離非相補的５’フラップを定量する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
下流プローブの３’末端を封鎖して、下流プローブの３’伸長を防止する請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
下流プローブの３’位置が、標的核酸のさらに第三のハイブリダイゼーションに相補的であり、第三のハイブリダイゼーションが、第二のハイブリダイゼーション部位に対して５’であり、標的核酸の介在領域により、第二のハイブリダイゼーション部位および第三のハイブリダイゼーション部位を分離する請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
下流プローブの３’位置が、第二および第三のハイブリダイゼーション部位にハイブリッド形成し、標的核酸の介在領域が、非相補的領域を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
下流プローブの３’位置が、１−２５ヌクレアーゼであり、介在領域が、１−２０ヌクレアーゼである請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
封鎖３’末端の一方または両方が、核酸合成または伸長を可能にする条件下で、標的核酸に非相補的である塩基、またはヌクレオチド三リン酸の添加を阻害する修飾物を含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
封鎖３’末端の一方または両方が、
ａ）ジデオキシヌクレオチド、
ｂ）３’ヒドロキシルが、リン酸基で置換されたヌクレオチド、または
ｃ）３’炭素に、または３’酸素に付着したレポーター部分を有するヌクレオチドを含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
サンプル中に切断構造を形成し、切断構造を切断し、および標的核酸に相補的な核酸を転写する方法であって、その方法が、
ａ）３’から５’への順で、第一のハイブリダイゼーション部位、第二のハイブリダイゼーション部位および第三のハイブリダイゼーション部位を含む標的核酸、
第一のハイブリダイゼーション部位に相補的である上流伸長プライマー、
第二のハイブリダイゼーション部位に相補的であるクランピング・オリゴヌクレオチドであって、クランピング・オリゴヌクレオチドがクランプで封鎖された３’末端および５’末端を含み、クランプが、核酸ポリメラーゼによってクランピング・オリゴヌクレオチドの置換を阻害するクランピング・オリゴヌクレオチド、および
５’領域および３’領域を含む下流プローブであって、下流プローブを標的にハイブリッド形成する場合に３’領域が、第三のハイブリダイゼーション部位に相補的であり、および５’領域が、非相補的５’フラップを形成する下流プローブ
を供すること、
ｂ）上流伸長プライマー、プランピング・オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを標的核酸にアニールし、クランピング・オリゴヌクレオチドおよび下流プローブが切断構造を形成すること、
ｃ）ヌクレアーゼで切断構造を切断して、非相補的５’フラップを遊離すること、
ｄ）上流伸長プライマーから、クランピング・オリゴヌクレオチドのクランプまで相補的鎖を伸長すること、
ｅ）標的核酸からクランピング・オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを解離して、核酸ポリメラーゼに、先にクランピング・オリゴヌクレオチドおよび下流プローブによって変換された標的核酸を利用させること、
ｆ）さらに、標的核酸に相補的な鎖を伸長すること、および
ｇ）遊離非相補的５’フラップを検出することであった、遊離非相補的５’フラップがサンプル中の標的核酸の存在を示すものであること、
を含む方法。
【請求項１８】
上流プライマーが、クランピング・オリゴヌクレオチドよりいっそう緊縮な条件下核酸にアニールし、クランピング。オリゴヌクレオチドが、下流標識プローブよりいっそう緊縮な条件下で標的核酸にアニールする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ａ）アニーリング段階ｂ）が、上流伸長プライマー、クランピング・オリゴヌクレオチドおよび下流プローブのアニーリング温度より下の温度で起こり、および
ｂ）解離段階ｆ）が、さらに、
ｉ）下流プローブを標的核酸から解離する一方で、上流伸長プライマーおよびクランピング・オリゴヌクレオチドはアニール化されたままであるように温度を増大させること、および
ｉｉ）さらに、クランピング・オリゴヌクレオチドを、標的核酸から解離する一方で、上流伸長プライマーはアニール化されたままであるように温度を増大させること、
を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
サンプル中に切断構造を形成し、切断構造を切断し、および標的核酸に相補的な核酸を転写する方法であって、その方法が、
ａ）３’から５’への順で、第一のハイブリダイゼーション部位、第二のハイブリダイゼーション部位および第三のハイブリダイゼーション部位を含む標的核酸、
第一のハイブリダイゼーション部位に相補的である上流オリゴヌクレオチド伸長プライマー、
第二のハイブリダイゼーション部位に相補的である上流オリゴヌクレオチドであって、上流オリゴヌクレオチドが、封鎖３’末端を含む上流オリゴヌクレオチド、および
５’領域および３’領域を含む下流プローブであって、下流プローブを標的にハイブリッド形成する場合に、３’領域が、第三のハイブリダイゼーション部位に相補的であり、および５’領域が、非相補的５’フラップを形成する下流プローブ
を供すること、
ｂ）上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを標的核酸にアニールして、切断構造を形成すること、
ｃ）ヌクレアーゼで切断構造を切断して、非相補的５’フラップを遊離すること、
ｄ）上流伸長プライマーを標的核酸にアニールすること、
ｅ）上流オリゴヌクレオチド伸長プライマーを伸長して、標的核酸に相補的な鎖を合成すること、および
ｅ）遊離非相補的５’フラップを検出することであって、遊離非相補的５’フラップがサンプル中の標的核酸の存在を示すものであること、
を含む方法。
【請求項２１】
サンプル中に切断構造を形成し、切断構造を切断し、標的核酸に相補的な核酸を転写し、および標的核酸を増幅する方法であって、その方法が、
ａ）領域Ａ’を含む標的核酸、
非相補的５’タグ領域（Ｘ）および３’プライミング領域（Ａ）を含む順方向伸長プライマーであって、５’タグ領域が増幅前に標的に相補的でなく、および３’プライミング領域（Ａ）が標的核酸中の領域（Ａ’）と相補的である順方向伸長プライマー、
領域Ｘの少なくとも一部を含む上流オリゴヌクレオチドであって、上流オリゴヌクレオチドが封鎖３’末端を有する上流オリゴヌクレオチド、
５’領域および３’領域を含む下流プローブであって、下流プローブを標的のＡ’部分にハイブリッド形成する場合に、３’領域が、領域Ａの少なくとも一部を含み、および５’領域が、非相補的５’フラップを形成する下流プローブ、および
標的核酸の少なくとも一部を含む第二の鎖を予備刺激する逆伸長プライマー
を供すること、
ｂ）順方向伸長プライマーの領域Ａを標的核酸にアニールすること、
ｃ）順方向伸長プライマーを伸長して、標的核酸の相補的鎖を生成し、相補的鎖が、領域Ａおよび領域Ｘを含むこと、
ｄ）標的核酸および相補的鎖を変性すること、
ｅ）逆伸長プライマーを、領域Ａの下流で相補的鎖の領域にアニールすること、
ｆ）逆伸長プライマーから鎖を伸長して、標的核酸配列、領域Ａ’および５’タグに相補的な領域（Ｘ’）の少なくとも一部を含む第二鎖を生ずること、
ｇ）第二鎖から相補的鎖を変性させること、
ｈ）上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを第二鎖にアニールして、切断構造を形成すること、
ｉ）ヌレアーゼで切断構造を切断して、下流オリゴヌクレオチドの非相補的５’フラップを遊離すること、および
ｊ）遊離非相補的５’フラップを検出することであって、遊離非相補的５’フラップが、サンプル中の標的核酸の存在を示すものであること、
を含む方法。
【請求項２２】
さらに、標的配列を増幅するために変性、伸長および切断サイクルを反復することを含むことが、ＰＣＲサイクリング段階に許容性がある条件下で、切断形態を形成し、切断構造を切断する請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
核酸ポリメラーゼが、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
下流プローブの非相補的５’フラップが、ｎ個のヌクレオチド、および上流シグナルオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部位から構成され、下流プローブが、ｍ−ヌクレオチドによって分離され、ｎは、１から２５までの整数であり、ｍは、ｎより大きな整数である請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
ヌクレアーゼが、ＦＥＮヌクレアーゼを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
ＦＥＮヌクレアーゼが、アルカエグロブス・フルギドゥス（Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタノコックス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、およびピロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）から由来するＦＥＮヌクレアーゼ酵素から構成される群から選択される請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
切断構造がを形成し、シグナルを供する能力のある少なくとも１つの標識部分を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
形成された切断構造が、検出可能なシグナルの発生を消すのに有効に配置された相互作用性シグナル発生標識部分の対を含み、ＦＥＮヌクレアーゼ切断に影響を受けやすい部位によって標識部分を分離し、それによりＦＥＮヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性に、ＦＥＮヌクレアーゼに影響を受けやすい部位で切断し、それにより検出可能なシグナルを発生することによって、第二の相互作用性シグナルを発生する標識部分から第一の相互作用性シグナルを発生する標識部分を分離させる請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
相互作用性シグナル発生部分の対が、クエンチャー部分および蛍光部分を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
さらに、遊離非相補的５’フラップを定量する段階を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
下流プローブの３’末端を封鎖して、下流プローブの３’伸長を防止する請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
封鎖３’末端の一方または両方が、核酸合成または伸長を可能にする条件下で、標的核酸に非相補的である塩基、またはヌクレオチド三リン酸の添加を阻害する修飾物を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
封鎖３’末端の一方または両方が、
ａ）ジデオキシヌクレオチド、
ｂ）３’ヒドロキシルが、リン酸基で置換されたヌクレオチド、または
ｃ）３’炭素に、または３’酸素に付着したレポーター部分を有するヌクレオチドを含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
サンプル中に切断構造を形成し、切断構造を切断し、標的核酸に相補的な核酸を転写し、および標的核酸を増幅する方法であって、その方法が、
ａ）３’から５’へのＡ’領域およびＴ’領域を含む標的核酸であって、該Ａ’およびＴ’領域が非連続性である標的核酸、
２つの小領域（Ｘ１およびＸ２）を含む５’タグ領域を含む順方向伸長プライマーであって、Ｘ１がＸ２および３’予備刺激領域（Ａ）の上流であり、および５’タグ領域が、増幅前に標的に相補的でなく、および３’予備刺激領域（Ａ）は標的核酸の領域Ａ’に相補的である順方向伸長プライマー、
領域Ｘ１の少なくとも一部を含む上流オリゴヌクレオチドであって、上流オリゴヌクレオチドが封鎖３’末端を有する上流オリゴヌクレオチド、
５’領域および３’領域を含む下流プローブであって、下流プローブを標的のＡ’領域にアニールする場合に、３’領域が、領域Ｘ２、および領域Ｘ２の下流にある領域Ｔの少なくとも一部を含み、および標的核酸のＴ’に相補的であり、および５’領域が、非相補的５’フラップを形成する下流プローブ、および
標的核酸の少なくとも一部を含む第二の鎖を予備刺激する逆伸長プライマー
を供すること、
ｂ）順方向伸長プライマーの相補的領域Ａを標的核酸のＡ’領域およびＴ’領域にアニールすること、
ｃ）順方向伸長プライマーを伸長して、標的核酸の相補的鎖を生成することであって、相補的鎖が、領域Ａおよび領域Ｘ１およびＸ２を含むこと、
ｄ）標的核酸および相補的鎖を変性すること、
ｅ）逆伸長プライマーを、領域Ｔの下流で相補的鎖の領域にアニールすること、
ｆ）逆伸長プライマーから鎖を伸長して、標的核酸配列、領域Ａ’領域Ｔ’および５’タグに相補的な領域（Ｘ１’、Ｘ２’）の少なくとも一部を含む第二鎖を生じること、
ｇ）第二鎖から相補的鎖を変性させること、
ｈ）上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを第二鎖にアニールして、切断構造を形成すること、
ｉ）ヌレアーゼで切断構造を切断して、下流オリゴヌクレオチドの非相補的５’フラップを遊離すること、および
ｊ）遊離非相補的５’フラップを検出することであって、遊離非相補的５’フラップが、サンプル中の標的核酸の存在を示すものであること、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する関連文献
本発明は、１９９９年１０月２９日に出願された米国出願番号第０９／４３０，６９２号の一部継続出願であって、現在米国特許第６，５２８，２５４号である２０００年８月３０日に出願された米国出願番号第０９／６５０，８８８号の一部継続出願であって、現在米国特許第６，５４８，２５０号である２０００年１１月３０日に出願された米国出願番号第０９／７２８，５７４号の一部継続出願である２００５年１０月１１日に出願された米国出願番号第１１／２４９，０５９号の一部継続出願であり、全ての全開示は、全体に参照してここに組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ複製、組換え、および修復の忠実度は、ゲノム安定性を維持するために必須であり、そしてこれらのプロセスの全ては、全ての臓器に存在する５’から３’エキソヌクレアーゼ酵素による。ＤＮＡ修復については、これらの酵素は、損傷を受けたフラグメント切除および組換えミスマッチ補正のために要求される。複製については、これらのヌクレアーゼは、ラギング鎖ＤＮＡ合成の間に岡崎フラグメントの有効なプロセシングに重要である。エッシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（大腸菌）では、この後者の活性は、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＰｏｌＩ）によって提供される。ＰｏｌＩ５’から３’エキソヌクレアーゼ・ドメイン中に不活性化突然変異を有するイー．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、岡崎フラグメントを処理する能力がないため生存可能でない。しかし、真性生物のＤＮＡポリメラーゼは、内在性５’から３’エキソヌクレアーゼ・ドメインを欠き、そしてこの重要な活性は、多官能構造特異的メタロヌクレアーゼＦＥＮ−１（ｆｉｖｅ’エキソヌクレアーゼ−１またはｆｌａｐエンドヌクレアーゼ−１）によって提供され、そしてそれは、５’ＤＮＡフラップに関してエンドヌクレアーゼとしても作用する（Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ａ、Ｃｅｌｌ、９５：１３５で概説される）。
【０００３】
酵素が標識核酸フラグメントを産生する核酸を検出および／または測定する方法は、当業界で知られている。
【０００４】
米国特許第５，８４３，６６９号、第５，７１９，０２８号、第５，８３７，４５０号、第５，８４６，７１７号および第５，８８８，７８０号では、５’標識標的ＤＮＡを、サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑポリメラーゼ）から単離されるＤＮＡポリメラーゼ、および所望の切断点で配列にハイブリッド形成する能力のある部分的に相補性のオリゴヌクレオチドと共にインキュベートすることによって、標的ＤＮＡ分子を切断する方法が開示される。そのオリゴヌクレオチドの非相補的領域が３’アームを供し、そして基質分子の未アニール化５’領域が５’アームを供する、切断の所望の部位に対峙する３’伸長を有する二本鎖を含有する基質構造の形成を通して、部分的に相補性のオリゴヌクレオチドは、Ｔａｑポリメラーゼを標的ＤＮＡに向ける。
部分的に相補的なオリゴヌクレオチドは、短いヘアピンを形成する能力のある３’ヌクレオチド伸長を含む。Ｔａｑポリメラーゼによる切断に続く標識フラグメントの遊離を検出する。
【０００５】
米国特許第５，８４３，６６９号、第５，７１９，０２８号、第５，８３７，４５０号、第５，８４６，７１７号および第５，８８８，７８０号では、突然変異体の発生、検出可能な合成活性をほとんど有しないか、またはない熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および野生型熱安定性ヌクレアーゼ活性が開示されている。突然変異体ポリメラーゼは、５’から３’への合成活性を欠くので有用であり、したがって、合成活性は、検出アッセイでのＤＮＡ切断段階を組合せにおいて望ましくない副作用であるとされる。
【０００６】
米国特許第５，８４３，６６９号、第５，７１９，０２８号、第５，８３７，４５０号、第５，８４６，７１７号および第５，８８８，７８０号では、野生型Ｔａｑポリメラーゼ、またはヘアピン構造の３’アームに結合するプライマーの存在下で熱変性、続いて冷却によって形成される５’末端標識ヘアピン構造を切断することによって、合成活性を欠く突然変異体Ｔａｑポリメラーゼが標識フラグメントを遊離できることが開示されている。さらに、米国特許第５，８４３，６６９号、第５，７１９，０２８号、第５，８３７，４５０号、第５，８４６，７１７号および第５，８８８，７８０号では、合成活性を欠く突然変異体Ｔａｑポリメラーゼが、ヘアピン構造の３’アームに結合するプライマーの不在下でこのヘアピン構造を切断できることも教示されている。
【０００７】
米国特許第５，８４３，６６９号、第５，７１９，０２８号、第５，８３７，４５０号、第５，８４６，７１７号および第５，８８８，７８０号では、合成活性を欠く突然変異体Ｔａｑポリメラーゼによってヘアピン構造の３’アームに結合するプライマーの存在下でこのヘアピン構造の切断が、単一種の標識切断産物を生じる一方で、野生型Ｔａｑ酵素の合成活性のレベルが高いことにより、野生型Ｔａｑポリメラーゼが、複数の切断産物を産生し、かつｄＮＴＰの存在下でヘアピン構造を二重鎖形態に変換することが開示されている。
【０００８】
核酸ポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性は、特定の核酸の増幅に損傷を与える可能性がある。核酸ポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性の不在下で核酸切断反応を使用したシグナルを発生する方法について当業界で必要性もある。
【０００９】
米国特許番号第５，８４３，６６９号、第５，７１９，０２８号、第５，８３７，４５０号、第５，８４６，７１７号および第５，８８８，７８０号では、５’末端標識核酸および相補的オリゴヌクレオチドを含む線状核酸基質を切断することによって、野生型Ｔａｑポリメラーゼではなく、合成活性が減少したことを示す突然変異体Ｔａｑポリメラーゼが、単一標識フラグメントを遊離でき、相補的オリゴヌクレオチドが、標的核酸の５’および３’領域がオリゴヌクレオチドにアニールされず、単鎖のままでいるように標的核酸の一部にハイブリッド形成することも開示されている。
【００１０】
核酸重合体の５’から３’までのエキソヌクレアーゼ活性の不在下で核酸切断反応を使用して、ヌクレアーゼ混入物から生じる可能性があるオリゴヌクレオチド・フラグメントと容易に区別できる別々のサイズのシグナルを発生する方法について当業界で必要性がある。
【００１１】
米国特許番号第５，８４３，６６９号、第５，７１９，０２８号、第５，８３７，４５０号、第５，８４６，７１７号および第５，８８８，７８０号では、二次構造の天然に生じる領域で標識核酸基質を切断する方法も開示されている。この方法にしたがって、ビオチン標識ＤＮＡ基質をＰＣＲにより作製し、野生型のＴａｑポリメラーゼまたはクリバーゼＢＮ（減少した合成活性および野生型５’から３’へのヌクレアーゼ活性を示す突然変異体Ｔａｑポリメラーゼ）と混合し、９５℃で５秒間インキュベートして、基質を変性させ、その後６５℃まで急冷して、相補的塩基の間の鎖内水素結合の形成を可能にすることによって、ＤＮＡに、それの特有の二次構造を想定させる。反応混合物を、６５℃でインキュベートさせて、切断を生じさせ、そしてビオチン化産物を検出する。
【００１２】
核酸ポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性の不在下で核酸切断反応を使用してシグナルを発生する方法で、切断構造が二次構造の領域を含有することを必要としない方法について当業界で必要性がある。
【００１３】
核酸を検出および／または測定する方法で、ＦＥＮ−１酵素を、標識核酸フラグメントを発生するために使用する方法が、当業界で知られている。
【００１４】
米国特許番号第５，８４３，６６９号では、減少した合成活性を示す突然変異体Ｔａｑポリメラーゼの存在または不在下で、熱安定性ＦＥＮ−１ヌクレアーゼを使用して切断フラグメント長多型分析によって多型を検出する方法が開示されている。この方法によって、ＰＣＲ反応での５’末端標識プライマー（ＴＭＲ蛍光染料で標識された）によって、二本鎖Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＤＮＡフラグメントを標識する。９５℃まで加熱し、５５℃まで冷却して、切断構造を発生させることによって、ＴＭＲで標識されたＰＣＲ産物を変性させる。米国特許番号第５，８４３，６６９号では、切断構造が、二次構造を含む単鎖核酸基質の領域を含むことが開示されている。古細菌メタノコックス・ジャナスキ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）から由来するクレバーゼ（Ｃｌｅａｖａｓｅ）ＢＮヌクレアーゼ、ＦＥＮ−１ヌクレアーゼまたは両方の酵素の存在下で切断を行う。ゲル電気泳動続いてフルオロ画像法によって、標識反応産物を可視化する。米国特許番号第５，８４３，６６９号には、クレバーゼＢＮヌクレアーゼおよびメタノコックス・ジャナスキＦＥＮ−１ヌクレアーゼが、互いに容易に区別される切断バターンを生じること、および両方の酵素を含む反応から得られる切断パターンが、各個別の酵素を用いた切断によって生じるパターンの要素を含むが、単に各個別の酵素によって生じる切断パターンの複合体であるわけではないことが開示されている。これは、１つの酵素によって切断されない（そして、その酵素のパターンでバンドとして見える）フラグメントのいくつかが、同じ反応混合物中で二次酵素によって切断できることを示す。
Ｌｙａｍｉｃｈｅｖらは、標的ＤＮＡの領域に部分的に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブの重複対を標的ＤＮＡと混合して５’フラップ領域を形成し、かつ熱安定性ＦＥＮ−１ヌクレアーゼ産物による標識下流プローブの切断が、標識切断産物を生じるものであるＤＮＡを検出する方法を開示する。Ｌｙａｍｉｃｈｅｖらは、切断シグナルを増幅し、そしてサブ−アトモル・レベルで標的ＤＮＡの定量的検出を可能にするために、温度サイクリングの不在下で単一標的配列について下流オリゴヌクレオチドプローブの複数コピーを切断できる反応条件も開示する（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖら、１９９９、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：２９２）。
【００１５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、米国特許番号第４，６８３，２０２号、第４，６８３，１９５号および第４，８００，１５９号で開示されている。その最も簡単な形態では、ＰＣＲは、標的ＤＮＡ中で対峙鎖にハイブリッド形成し、そして目的の領域にぶら下る２つのオリゴヌクレオチド・プライマーを使用した特定のＤＮＡ技術の酵素的合成のインビトロ法である。テンプレート変性に関与する連続反復の反応段階、プライマーアニーリング、およびアニール化プライマーの伸長は、その末端がプライマーの５’末端によって定義される特定のフラグメントの指数関数的蓄積を生じる。ＰＣＲは、１０９のファクターによって特定のＤＮＡ配列の選択的豊富化を生じる能力があると報告されている。ＰＣＲ法は、Ｓａｉｋｉら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０：１３５０でも記述される。
【００１６】
ＰＣＲ技術は、核酸配列を増幅する極端に強力な方法である一方で、増幅材料の検出は、別の操作、および標的ＤＮＡが存在するかどうかを決定するためにＰＣＲ産物の継続的取扱いを必要とする。増幅材料の検出のために最近要求される継続的取扱い段階の数を減少させることが望ましい。標的配列が増幅されるときに、シグナルが発生されるアッセイシステムは、増幅段階の間にシグナルを発生しないＰＣＲ法に比較したときに、増幅材料の検出のために少ない取扱い手段を必要とする。
米国特許第５，２１０，０１５号および第５，４８７，９７２号では、増幅されるべき核酸、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑポリメラーゼ、増幅領域に相補的な領域および別の非相補的５’尾部領域を含む５’、３’または５’および３’末端で標識されたプローブの存在下でＰＣＲ反応の増幅段階の間にシグナルを発生する、標識プローブを遊離するＰＣＲを基本とするアッセイが開示されている。米国特許第５，２１０，０１５号および第５，４８７，９７２号では、さらに、上流プローブによって、Ｔａｑポリメラーゼが、重合依存性手段で、たとえばｄＮＴＰの不在下で、標識プローブ付近に配置される場合に、このＰＣＲベースのアッセイが、ハイブリッド形成されたプローブの５’標識末端を遊離できることが開示される。
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、核酸ポリメラーゼと共に、標的核酸配列を含むサンプルをインキュベートすることによって、切断構造を形成すること、およびＦＥＮヌクレアーゼを用いて切断構造を切断して、シグナルを発生することを含む方法であって、当該シグナルの発生は、サンプル中の標的核酸配列の存在を示す。
【００１８】
１つの態様では、本発明は、標的核酸の存在を検出する方法であって、その方法が、
ａ）３’から５’への順で、第一のハイブリダイゼーション部位および第二のハイブリダイゼーション部位を含む標的核酸、
第一のハイブリダイゼーション部位に相補的である上流オリゴヌクレオチドであって、上流オリゴヌクレオチドが封鎖３’末端を有する上流オリゴヌクレオチド、および
５’領域および３’領域を含む下流プローブであって、下流プローブを標的にアニールする場合に３’領域が、第二のハイブリダイゼーション部位に相補的であり、および５’が、非相補的５’フラップを形成する下流プローブ
を供すること、
ｂ）上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを標的核酸にアニールして、切断構造を形成すること、
ｃ）ヌクレアーゼで切断構造を切断して、非相補的５’フラップを遊離（ｒｅｌｅａｓｅ）すること、および
ｄ）遊離された（ｒｅｌｅａｓｅｄ）非相補的５’フラップを検出することであって、遊離された非相補的５’フラップが、サンプル中の標的核酸の存在を示すこと、
を含む方法を提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、切断構造を形成し、および切断構造を切断する方法であって、その方法が、
ａ）３’から５’への順で、第一のハイブリダイゼーション部位および第二のハイブリダイゼーション部位を含む標的核酸、
第一のハイブリダイゼーション部位に相補的であり、および下流オリゴヌクレオチドが封鎖３’末端を有する上流オリゴヌクレオチド、および
５’領域および３’領域を含み、下流プローブを標的にアニールする場合に３’領域が、第二のハイブリダイゼーション部位に相補的であり、および５’領域が、非相補的５’フラップを形成する下流プローブ
を供すること、
ｂ）上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを標的核酸にアニールして、切断構造を形成すること、および
ｃ）ピロコッカス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）から由来するＦＥＮヌクレアーゼ酵素で切断構造を切断して、非相補的５’フラップを遊離すること、
を含む方法を提供する。
【００２０】
さらに別の態様では、本発明は、サンプル中に切断構造を形成し、切断構造を切断し、および標的核酸に相補的な核酸を転写する方法であって、その方法が、
ａ）３’から５’への順で、第一のハイブリダイゼーション部位、第二のハイブリダイゼーション部位および第三のハイブリダイゼーション部位を含む標的核酸、
第一のハイブリダイゼーション部位に相補的である上流伸長プライマー、
第二のハイブリダイゼーション部位に相補的であるクランピング・オリゴヌクレオチドであって、クランピング・オリゴヌクレオチドがクランプで封鎖された３’末端および５’末端を含み、クランプが、核酸ポリメラーゼによってクランピング・オリゴヌクレオチドの置換を阻害するクランピング・オリゴヌクレオチド、および
５’領域および３’領域を含む下流プローブであって、下流プローブを標的にハイブリッド形成する場合に、３’領域が、第三のハイブリダイゼーション部位に相補的であり、および５’領域が、非相補的５’フラップを形成する下流プローブ
を供すること、
ｂ）上流伸長プライマー、クランピング・オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを標的核酸にアニールし、クランピング・オリゴヌクレオチドおよび下流プローブが切断構造を形成すること、
ｃ）ヌクレアーゼで切断構造を切断して、非相補的５’フラップを遊離すること、
ｄ）上流伸長プライマーから、クランピング・オリゴヌクレオチドのクランプまで相補的鎖を伸長すること、
ｅ）標的核酸からクランピング・オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを解離して、核酸ポリメラーゼに、先にクランピング・オリゴヌクレオチドおよび下流プローブによって変換された標的核酸を利用させること、
ｆ）さらに、標的核酸に相補的な鎖を伸長すること、および
ｇ）遊離された非相補的５’フラップを検出することであって、遊離された非相補的５’フラップがサンプル中の標的核酸の存在を示すものであること、
を含む方法を提供する。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、サンプル中に切断構造を形成し、切断構造を切断し、および標的核酸に相補的な核酸を転写する方法であって、その方法が、
ａ）３’から５’への順で、第一のハイブリダイゼーション部位、第二のハイブリダイゼーション部位および第三のハイブリダイゼーション部位を含む標的核酸、
第一のハイブリダイゼーション部位に相補的である上流伸長プライマー、
第二のハイブリダイゼーション部位に相補的であるクランピング・オリゴヌクレオチドであって、クランピング・オリゴヌクレオチドがクランプで封鎖された３’末端および５’末端を含み、クランプが、核酸ポリメラーゼによってクランピング・オリゴヌクレオチドの置換を阻害するクランピング・オリゴヌクレオチド、および
５’領域および３’領域を含み、下流プローブを標的にハイブリッド形成する場合に３’領域が、第三のハイブリダイゼーション部位に相補的であり、および５’領域が、非相補的５’フラップを形成する下流プローブ
を供すること、
ｂ）上流伸長プライマー、クランピング・オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを標的核酸にアニールし、クランピング・オリゴヌクレオチドおよび下流プローブが切断構造を形成すること、
ｃ）ピロコッカス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）から由来するＦＥＮヌクレアーゼで切断構造を切断して、非相補的５’フラップを遊離すること、
ｄ）上流伸長プライマーから、クランピング・オリゴヌクレオチドのクランプまで相補的鎖を伸長すること、
ｅ）標的核酸からクランピング・オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを解離して、核酸ポリメラーゼに、先にクランピング・オリゴヌクレオチドおよび下流プローブによって変換された標的核酸を利用させること、
ｆ）さらに、標的核酸に相補的な鎖を伸長すること、および
ｇ）遊離された非相補的５’フラップを検出することであって、遊離された非相補的５’フラップがサンプル中の標的核酸の存在を示すものであること、
を含む方法を提供する。
【００２２】
さらに別の態様では、本発明は、サンプル中に切断構造を形成し、切断構造を切断し、および標的核酸に相補的な核酸を転写する方法であって、その方法が、
ａ）３’から５’への順で、第一のハイブリダイゼーション部位、第二のハイブリダイゼーション部位および第三のハイブリダイゼーション部位を含む標的核酸、
第一のハイブリダイゼーション部位に相補的である上流オリゴヌクレオチド伸長プライマー、
第二のハイブリダイゼーション部位に相補的である上流オリゴヌクレオチドであって、上流オリゴヌクレオチドが、封鎖３’末端を含む上流オリゴヌクレオチド、および
５’領域および３’領域を含む下流プローブであって、下流プローブを標的にハイブリッド形成する場合に、３’領域が、第三のハイブリダイゼーション部位に相補的であり、および５’領域が、非相補的５’フラップを形成する下流プローブ
を供すること、
ｂ）上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを標的核酸にアニールして、切断構造を形成すること、
ｃ）ヌクレアーゼで切断構造を切断して、非相補的５’フラップを遊離すること、
ｄ）上流伸長プライマーを標的核酸にアニールすること、
ｅ）上流オリゴヌクレオチド伸長プライマーを伸長して、標的核酸に相補的な鎖を合成すること、および
ｆ）遊離された非相補的５’フラップを検出することであって、遊離された非相補的５’フラップがサンプル中の標的核酸の存在を示すものであること、
を含む方法を提供する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、サンプル中に切断構造を形成し、切断構造を切断し、および標的核酸に相補的な核酸を転写する方法であって、その方法が、
ａ）３’から５’への順で、第一のハイブリダイゼーション部位、第二のハイブリダイゼーション部位および第三のハイブリダイゼーション部位を含む標的核酸、
第一のハイブリダイゼーション部位に相補的である上流オリゴヌクレオチド伸長プライマー、
第二のハイブリダイゼーション部位に相補的である上流オリゴヌクレオチドであって、上流オリゴヌクレオチドが、封鎖（ｂｌｏｃｋｅｄ）末端を含む上流オリゴヌクレオチド、および
５’領域および３’領域を含む下流プローブであって、下流プローブを標的にハイブリッド形成する場合に、３’領域が、第三のハイブリダイゼーション部位に相補的であり、および５’領域が、非相補的５’フラップを形成する下流プローブ
を供すること、
ｂ）上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを標的核酸にアニールして、切断構造を形成すること、
ｃ）ピロコッカス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）から由来するＦＥＮヌクレアーゼ酵素で切断構造を切断して、非相補的５’フラップを遊離すること、および
ｄ）上流伸長プライマーを標的核酸にアニールすること、
ｅ）上流伸長プライマーを伸長して、標的核酸に相補的な鎖を合成すること、および
ｆ）遊離された非相補的５’フラップを検出することであって、遊離された非相補的５’フラップがサンプル中の標的核酸の存在を示すものであること、
を含む方法を提供する。
【００２４】
さらに別の態様では、本発明は、サンプル中に切断構造を形成し、切断構造を切断し、標的核酸に相補的な核酸を転写し、および標的核酸を増幅する方法であって、その方法が、
ａ）領域Ａ’を含む標的核酸、
非相補的５’タグ領域（Ｘ）および３’プライミング領域（Ａ）を含む順方向伸長プライマーであって、５’タグ領域が増幅前に標的に相補的でなく、および３’プライミング領域（Ａ）が標的核酸中の領域（Ａ’）と相補的である順方向伸長プライマー、
領域Ｘの少なくとも一部を含む上流オリゴヌクレオチドであって、上流オリゴヌクレオチドが封鎖３’末端を有する上流オリゴヌクレオチド、
５’領域および３’領域を含む下流プローブであって、下流プローブを標的のＡ’部分にハイブリッド形成する場合に、３’領域が、領域Ａの少なくとも一部を含み、および５’領域が、非相補的５’フラップを形成する下流プローブ、および
標的核酸の少なくとも一部を含む第二の鎖を予備刺激（ｐｒｉｍｅ）する逆伸長プライマー
を供すること、
ｂ）順方向伸長プライマーの領域Ａを標的核酸にアニールすること、
ｃ）順方向伸長プライマーを伸長して、標的核酸の相補的鎖を生成し、相補的鎖が、領域Ａおよび領域Ｘを含むこと、
ｄ）標的核酸および相補的鎖を変性すること、
ｅ）逆伸長プライマーを、領域Ａの下流で相補的鎖の領域にアニールすること、
ｆ）逆伸長プライマーから鎖を伸長して、標的核酸配列、領域Ａ’および５’タグに相補的な領域（Ｘ’）の少なくとも一部を含む第二鎖を生ずること、
ｇ）第二鎖から相補的鎖を変性させること、
ｈ）上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを第二鎖にアニールして、切断構造を形成すること、
ｉ）ヌクレアーゼで切断構造を切断して、下流オリゴヌクレオチドの非相補的５’フラップを遊離すること、および
ｊ）遊離された非相補的５’フラップを検出することであって、遊離された非相補的５’フラップが、サンプル中の標的核酸の存在を示すものであること、
を含む方法を提供する。
【００２５】
さらに別の態様では、本発明は、サンプル中に切断構造を形成し、切断構造を切断し、標的核酸に相補的な核酸を転写し、および標的核酸を増幅する方法であって、その方法が、
ａ）領域Ａ’を含む標的核酸、
非相補的５’タグ領域（Ｘ）および３’プライミング領域（Ａ）を含む順方向伸長プライマーであって、５’タグ領域が増幅前に標的に相補的でなく、および３’プライミング領域（Ａ）が標的核酸中の領域（Ａ）と相補的である順方向伸長プライマー、
領域Ｘの少なくとも一部を含む上流オリゴヌクレオチドであって、上流オリゴヌクレオチドが封鎖３’末端を有する上流オリゴヌクレオチド、
５’領域および３’領域を含む下流プローブであって、下流プローブを標的のＡ’部分にハイブリッド形成する場合に、３’領域が、領域Ａの少なくとも一部を含み、および５’領域が、非相補的５’フラップを形成する下流プローブ、および
標的核酸の少なくとも一部を含む第二の鎖を予備刺激する逆伸長プライマー
を供すること、
ｂ）順方向伸長プライマーの領域Ａを標的核酸にアニールすること、
ｃ）順方向伸長プライマーを伸長して、標的核酸の相補的鎖を生成し、相補的鎖が、領域Ａおよび領域Ｘを含すること、
ｄ）標的核酸および相補的鎖を変性すること、
ｅ）逆伸長プライマーを、領域Ａの下流で相補的鎖にアニールすること、
ｆ）逆伸長プライマーから鎖を伸長して、標的核酸配列、領域Ａ’および５’タグに相補的な領域（Ｘ’）の少なくとも一部を含む第二鎖を生じること、
ｇ）第二鎖から相補的鎖を変性させること、
ｈ）上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを第二鎖にアニールして、切断構造を形成すること、
ｉ）ピロコッカス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）から由来するＦＥＮヌレアーゼ酵素で切断構造を切断して、下流オリゴヌクレオチドの非相補的５’フラップを遊離すること、および
ｊ）遊離された非相補的５’フラップを検出することであって、遊離された非相補的５’フラップが、サンプル中の標的核酸の存在を示すものであること、
を含む方法を提供する。
【００２６】
さらに別の態様では、本発明は、サンプル中に切断構造を形成し、切断構造を切断し、標的核酸に相補的な核酸を転写し、および標的核酸を増幅する方法であって、その方法が、
ａ）３’から５’へのＡ’領域およびＴ’領域を含む標的核酸であって、上記Ａ’およびＴ’領域が非連続性である標的核酸、
２つの小領域（Ｘ１およびＸ２）を含む５’タグ領域を含む順方向伸長プライマーであって、Ｘ１がＸ２および３’予備刺激領域（Ａ）の上流であり、および５’タグ領域が、増幅前に標的に相補的でなく、および３’予備刺激領域（Ａ）は標的核酸の領域Ａ’に相補的である順方向伸長プライマー、
領域Ｘ１の少なくとも一部を含む上流オリゴヌクレオチドであって、上流オリゴヌクレオチドが封鎖３’末端を有する上流オリゴヌクレオチド、
５’領域および３’領域を含む下流プローブであって、３’領域が、領域Ｘ２、および領域Ｘ２の下流にある領域Ｔの少なくとも一部を含み、および標的核酸のＴ’に相補的であり、および下流プローブを標的のＡ’領域にアニールする場合に、５’領域が、非相補的５’フラップを形成する下流プローブ、および
標的核酸の少なくとも一部を含む第二の鎖を予備刺激する逆伸長プライマー
を供すること、
ｂ）順方向伸長プライマーの相補的領域Ａを標的核酸のＡ’領域およびＴ’領域にアニールすること、
ｃ）順方向伸長プライマーを伸長して、標的核酸の相補的鎖を生成することであって、相補的鎖が、領域Ａおよび領域Ｘ１およびＸ２を含むこと、
ｄ）標的核酸および相補的鎖を変性すること、
ｅ）逆伸長プライマーを、領域Ｔの下流で相補的鎖の領域にアニールすること、
ｆ）逆伸長プライマーから鎖を伸長して、標的核酸配列、領域Ａ’領域Ｔ’および５’タグに相補的な領域（Ｘ１’、Ｘ２’）の少なくとも一部を含む第二鎖を生じること、
ｇ）第二鎖から相補的鎖を変性させること、
ｈ）上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを第二鎖にアニールして、切断構造を形成すること、
ｉ）ヌクレアーゼで切断構造を切断して、下流オリゴヌクレオチドの非相補的５’フラップを遊離すること、および
ｊ）遊離された非相補的５’フラップを検出することであって、遊離された非相補的５’フラップが、サンプル中の標的核酸の存在を示すものであること、
を含む方法を提供する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、サンプル中に切断構造を形成し、切断構造を切断し、標的核酸に相補的な核酸を転写し、および標的核酸を増幅する方法であって、その方法が、
ａ）３’から５’へのＡ’領域およびＴ’領域を含み、上記Ａ’およびＴ’領域が非連続性である標的核酸、
２つの小領域（Ｘ１およびＸ２）を含む５’タグ領域を含む順方向伸長プライマーであって、Ｘ１がＸ２および３’予備刺激領域（Ａ）の上流にあり、および５’タグ領域が、増幅前に標的に相補的でなく、および３’予備刺激領域（Ａ）は標的核酸の領域（Ａ’）に相補的である順方向伸長プライマー、
領域Ｘ１の少なくとも一部を含む上流オリゴヌクレオチドであって、上流オリゴヌクレオチドが封鎖３’末端を有する上流オリゴヌクレオチド、
５’領域および３’領域を含む下流プローブであって、３’領域が、領域Ａ、および領域Ｘ２の下流にある領域Ｔの少なくとも一部を含み、および標的核酸のＴ’に相補的であり、および下流プローブを標的のＡ’領域にアニールする場合に、５’領域が、非相補的５’フラップを形成する下流プローブ、および
標的核酸の少なくとも一部を含む第二の鎖を予備刺激する逆伸長プライマー
を供すること、
ｂ）順方向伸長プライマーの相補的領域Ａを標的核酸のＡ’領域およびＴ’領域にアニールすること、
ｃ）順方向伸長プライマーを伸長して、標的核酸の相補的鎖を生成することであって、相補的鎖が、領域Ａおよび領域Ｘ１およびＸ２を含むこと、
ｄ）標的核酸および相補的鎖を変性すること、
ｅ）逆伸長プライマーを、領域Ｔの下流で相補的鎖の領域にアニールすること、
ｆ）逆伸長プライマーから鎖を伸長して、標的核酸配列、領域Ａ’領域Ｔ’および５’タグに相補的な領域（Ｘ１’、Ｘ２’）の少なくとも一部を含む第二鎖を生じること、
ｇ）第二鎖から相補的鎖を変性させること、
ｈ）上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを第二鎖にアニールして、切断構造を形成すること、
ｉ）ピロコッカス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）から由来するＦＥＮヌレアーゼで切断構造を切断して、下流オリゴヌクレオチドの非相補的５’フラップを遊離すること、および
ｊ）遊離された非相補的５’フラップを検出することであって、遊離された非相補的５’フラップが、サンプル中の標的核酸の存在を示すものであること、
を含む方法を提供する。
【００２８】
ここで使用される「ヌクレアーゼ」または「切断剤（ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｇｅｎｔ）」は、特異的である（すなわち本発明によって切断構造を切断する）酵素、特異的でない（すなわち標的核酸にハイブリット形成されないプローブまたはプライマーのいずれかを実質的に切断しない）酵素のいずれの意味にも用いる。用語「ヌクレアーゼ」は、５’エンドヌクレアーゼ活性を保持する酵素、たとえばＤＮＡポリメラーゼ、たとえばイー．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）から得られるＤＮＡポリメラーゼＩ、およびサームス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）、サームス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）およびサームス・フラブス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）（Ｔｆｌ）から得られるＤＮＡポリメラーゼを含む。本発明によるヌクレアーゼとしては、サッカロミセス・セルビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｓｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＲＡＤ２７、およびシゾサッカロミセス・ポムベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＲＡＤ２、Ｐｏｌ  Ｉ  ＤＮＡポリメラーゼ結合５’から３’へのエキソヌクレアーゼ・ドメイン、（たとえば、イー．コリ、サームス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）、テーモ・フラブス（Ｔｆｌ）、バシルス・カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）（Ｂｃａ）、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））およびそれに限定されないがＴ５  ５’から３’へのエキソヌクレアーゼ、Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼおよびＴ３遺伝子６エキソヌクレアーゼを含めたＦＥＮのファージ機能相同性が挙げられる。好ましくは、Ｔａｑ、ＴｆｌおよびＢｃａＦＥＮヌクレアーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼドメンイを使用する。用語「ヌクレアーゼ」は、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）を含まない。
【００２９】
ここで使用される場合、「ＦＥＮヌクレアーゼ」は、本発明による切断構造を切断する酵素に該当する。用語「ＦＥＮヌクレアーゼ」は、５’エキソヌクレアーゼ活性およびエンドヌクレアーゼ活性のいずれか一方又は両方から基本的に構成される酵素を包含する。ここで使用される場合、「から基本的に構成される」は、５’から３’への合成活性および３’単鎖フラップ切断活性（すなわち、３’エンドヌクレアーゼ活性および３’エキソヌクレアーゼの活性の一方または両方）の一方または両方が実質的に欠いているように、酵素の優勢な活性が、５’エキソヌクレアーゼ活性および５’エンドヌクレアーゼの活性の一方または両方である酵素に該当する。「実質的に欠く」は、ＦＥＮヌクレアーゼが、野生型酵素の活性（たとえば、５’から３’への合成活性および３’エンドヌクレアーゼおよび（または）３’エキソヌクレアーゼの活性については、酵素は、これらの活性を有する野生型ＤＮＡポリメラーゼであってよい）の５％または１０％未満、好ましくは０．１％、０．５％または１％未満を保有することを意味する。たとえばニック翻訳アッセイで、または合成の全体的方向が、５’から３’への方向にあるように、オリゴヌクレオチドプライマーの成長末端にある３’−水酸基と、流入デオキシヌクレオチドの５’−リン酸基との間でリン酸ジエステル架橋の形成に関与する酵素的配列決定反応で５’から３’への合成活性を測定できる。３’フラップ切断は、ＤＮＡ二重鎖の（方式）３’末端が不対であるので、その二重鎖から切断されるＤＮＡ合成反応で測定できる。５’エキソヌクレアーゼおよび（または）エンドヌクレアーゼ活性「から構成される」ＦＥＮヌクレアーゼは、５’から３’への合成活性および（または)３’単鎖フラップ切断活性を「欠く」酵素に該当する。「欠く」は、Ｆｅｎヌクレアーゼが、検出可能な活性を示さないか、または「僅かの」活性しか有しない、すなわち、野生型酵素の活性の１．０％、０．５％または０．０１％であることを意味する。ここで使用される場合、「ＦＥＮヌクレアーゼ」は、５’フラップ特異的ヌクレアーゼを包含する。
【００３０】
用語「ＦＥＮヌクレアーゼ」は、５’フラップ特異的ヌクレアーゼも含む。本発明によるヌクレアーゼまたは切断剤としては、それに限定されないが、アルカエグロブス・フルギドゥス（Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタノコックス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、ピロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、ヒト、マウスまたはキセノプス・ラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）から由来するＦＥＮヌクレアーゼ酵素が挙げられる。
【００３１】
ここで使用される場合、「野生型」は、天然に生じる源から単離されるときに、遺伝子または遺伝子産物の特徴（すなわち、遺伝子については、そのまたはコードする配列を有するか、または酵素については、の配列または活性を保有するかのいずれかで）を示す遺伝子または遺伝子産物に該当する。
【００３２】
本発明による「５’フラップ特異的ヌクレアーゼ」（ここで「フラップ特異的ヌクレアーゼ」とも称される）は、５’単鎖として突出する単鎖フラップを除去できるエンドヌクレアーゼである。本発明によるフラップ特異的ヌクレアーゼは、偽Ｙ構造をも切断できる。本発明によるフラップ特異的ヌクレアーゼの基質は、標的核酸、第二の核酸、標的核酸と特異的にハイブリッド形成するものの一部、および標的核酸配列と特異的にハイブリッド形成する第三の核酸から得られるプライマー伸長産物を含む。
【００３３】
ここで使用される場合、「切断構造」は、フラップ、ループ、単鎖バブル、Ｄ−ループ、ニック、またはギャップを含む単鎖領域を有する少なくとも二重鎖核酸を含むポリヌクレオチド構造（たとえば、図１で示されるとおりの）に該当する。このように得られる本発明による切断構造は、５’単鎖ポリヌクレオチドフラップが、その構造の二重鎖部分との接合部付近の位置から伸長する、分岐ＤＮＡのフラップ鎖を含むポリヌクレオチド構造を含む。いくつかの実施態様では、フラップは、検出可能な標識で標識される。本発明による切断構造のフラップは、好ましくは１−１０，０００ヌクレオチド、さらに好ましくは約５−２５ヌクレオチド、最も好ましくは約１０−２０ヌクレオチドであり、そして好ましくは分岐構造の「肘」に配置されたリン酸で、またはフラップ鎖の肘から近位および（または）遠位に配置された１から１０までのリン酸いずれか一つで配置される位置で切断される。ここで使用される場合、「肘」は、５’フラップの第一の単鎖ヌクレオチドおよび第一の二重鎖（たとえば、標的核酸にハイブリッド形成した）ヌクレオチドの間のリン酸結合に該当する。１つの実施態様では、切断構造のフラップは、標的核酸にハイブリッド形成できない。
【００３４】
本発明による切断構造は、好ましくは、標的核酸配列を含み、さらに標的核酸配列と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド、およびハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドから伸長するフラップも含みうる。
たとえば、本発明による切断構造は、標的核酸配列（たとえば、図３でＢ）、標的核酸配列に相補的である上流オリゴヌクレオチド（たとえば、図３でＡ）、および標的配列に相補的である下流オリゴヌクレオチド（たとえば、図３でＣ）を含むことができる。このような構造では、下流オリゴヌクレオチドを、３’末端で封鎖して、下流オリゴヌクレオチドの３’末端の伸長を防止しうる。このような切断構造では、上流オリゴヌクレオチドを封鎖しうる（たとえば、図１３でＸ）。
【００３５】
本発明による切断構造は、下流オリゴヌクレオチドから伸長するフラップを含むオリゴヌクレオチド構造であって、核酸ポリメラーゼの合成活性による上流オリゴヌクレオチドの伸長、および下流オリゴヌクレオチドの５’末端の連続、部分的置換により、そのフラップを形成しうる構造である。さらに別の実施態様では、本発明による切断構造は、下流オリゴヌクレオチドから伸長する予め形成されたフラップであって、標的に非相補的である下流オリゴヌクレオチドの５’部分によって形成されるフラップを含む。
【００３６】
本発明による切断構造は、標的核酸配列をオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させることによって形成でき、そのオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列にアニールする相補的領域、および標的核酸配列にアニールせず、５’フラップを形成する非相補的領域を含む。
【００３７】
本発明の別の実施態様では、標的核酸を、標的核酸に対するプローブの結合により変動する第二の構造を有する下流オリゴヌクレオチドブローブとインキュベートすること、およびさらに、結合部分および、標的核酸にアニールせず、５’フラップおよび標的核酸にアニールする相補的３’領域を形成する非相補的５’領域、および上流オリゴヌクレオチドを含むことによって、本発明による切断構造を製造できる。１つの実施態様では、上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブは、標的核酸の非重複領域にハイブリッド形成する。別の実施態様では、上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブは、標的核酸の隣接領域にハイブリッド形成する。
【００３８】
切断構造は、偽Ｙ構造でもあり得て、フラップの上流にある鎖（ここで、フラップ隣接鎖、またはプライマー鎖と称される）を除去する場合に、偽Ｙ構造を形成でき、二重鎖ＤＮＡ基質が、ギャップまたはニックを含む。ここで使用される場合、「切断構造」は、３’単鎖フラップのみを有する二重鎖核酸構造を含まない。ここで使用される場合、「切断構造」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含み、したがってＲＮＡまたはＤＮＡでありうる。
【００３９】
本発明による切断構造は、標的核酸配列にハイブリッド形成する能力のある上流オリゴヌクレオチドの３’末端（たとえば、図３でＡ）が、標的核酸配列にアニールされる下流オリゴヌクレオチドの１塩基対（たとえば、図３でＣ）に相補的であり、そして重複が、単鎖フラップの伸長の点の直接下流である、重複フラップでありうる。
１）核酸配列をオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリッド形成させる条件下でａ）上流伸長可能な３’末端、好ましくはオリゴヌクレオチドプライマー、ｂ）上流プライマーの５０００ヌクレオチド未満下流に配置されるオリゴヌクレオチドプライマープローブ、およびｃ）標的配列が上流プライマーと下流プローブの両方に相補的である適切な標的核酸配列、およびｄ）適切な緩衝液を含むこと、および２）上流オリゴヌクレオチドプライマーの新たに合成された３’末端が、下流オリゴヌクレオチドプローブの５’末端の（すなわち、その５−１０ヌクレオチド）少なくとも一部に隣接になるか、および／または下流オリゴヌクレオチドプローブの５’末端の少なくとも一部を置換するように、ポリメラーゼの合成活性により上流オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を伸長する段階によって、本発明による切断構造を形成する。本発明の方法によって、緩衝液および伸長温度は、特定の本発明による核酸ポリメラーゼによる鎖置換に都合がよい。好ましくは、下流オリゴヌクレオチドの３’末端の伸長を防止するために、下流オリゴヌクレオチドを３’末端で封鎖される。本発明の別の実施態様では、標的核酸配列にアニールせず、５’フラップを形成する非相補的５’領域、および標的核酸配列にアニールする相補的３’領域を含むオリゴヌクレオチドプライマーと標的核酸配列をインキュベートすることによって、本発明による切断構造を作製できる。
【００４０】
本発明の好ましい実施態様では、切断構造を標識する。
１）核酸配列にプライマーにハイブリッド形成させる条件下で、ａ）上流伸長可能な３’末端、好ましくはオリゴヌクレオチドプライマー、ｂ）上流プライマーの好ましくは５０００未満、さらに好ましくは５００未満のヌクレオチド下流に配置された標識プローブ、およびｃ）標的配列がプライマーと標識プローブとの両方に相補的である適切な標的核酸配列、およびｄ）適切な緩衝液をインキュベートする段階、および２）上流プライマーの新たに合成された３’末端が、下流プローブの５’末端を部分的に置換するように、ポリメラーゼの合成活性により上流プライマーの３’末端を伸長する段階によって、本発明による標識切断構造を形成する。本発明の方法によって、緩衝液および伸長温度は、本発明による特定の核酸ポリメラーゼによる鎖置換に都合がよい。好ましくは、下流オリゴヌクレオチドの３’末端の伸長を防止するために、下流オリゴヌクレオチドを、３’末端で封鎖する。別の実施態様では、標的核酸配列を、標的核酸配列にアニールせず、５’フラップを形成する非相補的な標識５’領域、および標的核酸配列にアニールする相補的３’領域を含むプローブとインキュベートすることによって、本発明による切断構造を作製できる。
【００４１】
別の実施態様では、図１３で示され、そして実施例７で記述されるとおり切断構造を形成する。切断構造は、「３Ｂ」として示される「封鎖３’末端」を有する上流オリゴヌクレオチド（Ｘ）、標的核酸および５’フラップを有する下流プローブ（Ａ）を含む。いくつかの実施形態では、上流オリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチドは、下流オリゴヌクレオチドの５’末端のハイブリッド形成ヌクレオチドから得られる０−２０塩基の間である。他の実施形態では、上流オリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチドは、下流オリゴヌクレオチドの５’末端のハイブリッド形成ヌクレオチドから得られる０−１０塩基の間である。さらに他の実施形態では、上流オリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチドは、下流オリゴヌクレオチドの５’末端のハイブリッド形成ヌクレオチドから得られる０−５塩基の間である。別の実施形態では、ニックは、上流および下流オリゴヌクレオチドを分離する。
【００４２】
他の実施形態では、上流オリゴヌクレオチドの封鎖３’末端は、下流オリゴヌクレオチドの５’末端のハイブリッド形成ヌクレオチドの上流、そのヌクレオチドに、またはそのヌクレオチドの下流にかのいずれかにあってよい。
【００４３】
ここで使用される場合、「標識」または「シグナルを供給できる標識部分」は、検出可能な（好ましくは定量可能な）シグナルを供給するために使用でき、および核酸に操作的に連結できるいずれかの原子または分子に該当する。標的は、蛍光、放射活性、比色分析、重力法、Ｘ線回折または吸収、磁性、酵素的活性、質量分析、結合親和性、ハイブリダイゼーション高周波などによって検出可能なシグナルを供給できる。
【００４４】
ここで使用される場合、「シグナルを発生する」は、サンプル中の標的核酸配列の存在の指標として遊離核酸フラグメントを検出および、または測定することに該当する。
【００４５】
ここに示される場合、「サンプル」は、目的の核酸（標的核酸配列）または目的の標的核酸配列を含有するか、含有することが推測されるそれ自身核酸であるものを含有するか、または含有することが推測されるいずれかの物質に該当する。このため用語「サンプル」は、核酸（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）、細胞、生物、組織、流動体、または物質のサンプルを含に、そしてそれに限定されないが、たとえば血漿、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、便；皮膚、呼吸器、大腸および尿生殖管の外部分泌物；唾液、血液細胞、腫瘍、臓器、組織、インビトロ細胞培養構成要素のサンプル、天然の分離物（飲料水、海水、固形材料のような）、微生物試験片、および核酸追跡分子で「標識」された目的物または試験片を含む。
【００４６】
ここで使用する場合、「標的核酸配列」または「鋳型核酸配列」は、複製、増幅、および／または検出されるべきである核酸の領域に該当する。１つの実施形態では、「核酸配列」または「鋳型核酸配列」は、増幅のために使用される２つのプライマー配列の間にある。
【００４７】
ここで使用される場合、「核酸ポリメラーゼ」は、三リン酸ヌクレオチドの重合を触媒する酵素に該当する。一般に、酵素は、標的配列にアニールされたプライマーの３’末端で合成を開始し、そして鋳型に沿って５’方向で処理し、５’から３’までのヌクレアーゼ活性を保持する場合に、合成が終結するまで、加水分解は、標識または未標識プローブフラグメントの両方を遊離するアニール化プローブを介在する。既知ＤＮＡポリメラーゼとしては、たとえばイー．コリＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、サームス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、バシルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サームス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、およびピロコッカス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００４８】
ここで使用される場合、「５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性」または「５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性」は、鋳型特異的核酸ポリメラーゼの活性、たとえば５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性が、ある種のＤＮＡポリメラーゼにもともと関連しており、それによりモノヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを、連続手段でポリヌクレオチドの５’末端から除去すること（すなわち、イー．コリＤＮＡポリメラーゼＩは、この活性を有するのに対して、クレノー（Ｋｌｅｎｏｗら、１９７０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、６５：１６８）フラグメントは有しない（Ｋｌｅｎｏｗら、１９７１、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２：３７１））か、または５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性で本質的に存在する可能性のあるエンドヌレアーゼの活性により５’からポリヌクレオチドを除去するという意味を含む。
【００４９】
ここで使用される場合、語句「５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く」または「５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く」は、野生型酵素の活性の１０％、５％、１％、０．５％または０．１％未満を示すことを意味する。語句「５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠く」または「５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠く」は、検出可能でない５’から３’までのエキソヌクレアーゼ活性を有するか、野生型の酵素の５’から３’までのエキソヌクレアーゼの約１％、０．５％または０．１％未満を有することを意味する。３０分間、６０℃で適切な緩衝液（たとえば１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０μｇ／ｍｌ仔牛血清アルブミン）の存在下でニックの入った基質を切断する段階、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルーを含有する９５％ホルムアミドの添加により切断反応を終止する段階、およびニックの入ったまたはニックなしの産物を検出する段階を含むエキソヌクレアーゼ活性により５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を測定できる。
【００５０】
本発明により有用な核酸ポリメラーゼとしては、それに限定されないが、Ｐｆｕ、エキソ−Ｐｆｕ（３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠くＰｆｕの突然変異形態）、Ｔａｑのストフェル・フラグメント、Ｎ−切断Ｂｓｔ、Ｎ−切断Ｂａｃ、ゲンタ（Ｇｅｎｔａ）、ＪｄＦ３エキソ−、ベント（Ｖｅｎｔ）、ベント・エキソ−（３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠くディープ・ベントの突然変異形態）、Ｕ１Ｔｍａおよびシーケナーゼが挙げられる。本発明による有用な別の核酸ポリメラーゼは、「核酸ポリメラーゼ」と題される区分で下で含まれる。
【００５１】
ここで使用される場合、「切断」は、切断構造を特徴的（すなわち、リン酸ジエステル結合によって他のフラグメントまたは核酸に物理的に連結されない）フラグメントまたはヌクレオチドに、および切断構造から遊離されるフラグメントに酵素的に分離する意味を含む。たとえば、標識切断構造を切断することは、本発明により、かつ下で定義される標識切断構造を、標的核酸配列と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドから由来するフラグメントを含めた特徴的なフラグメントに分離することか、または特徴的なフラグメントの内の１つが、標識フラグメント上に存在する標識部分を検出するのに適している当業界で周知であり、およびここに記述される方法によって検出および／または測定できる標的核酸配列から由来する、および（または）標的核酸配列と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドから由来する標識核酸フラグメントであることに該当する。
【００５２】
ここで使用される場合、「エンドヌクレアーゼ」は、核酸分子内の結合、好ましくはリン酸ジエステル結合を切断する酵素に該当する。本発明によるエンドヌクレアーゼは、単鎖または二重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに特異的でありうる。
【００５３】
ここで使用される場合、「エキソヌクレアーゼ」は、ポリヌクレオチドの末端から一度に１つ、ヌクレオチドの間の結合、好ましくはリン酸ジエステル結合を切断する酵素に該当する。本発明によるエキソヌクレアーゼは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の５’または３’末端に特異的でありえて、ここで５’エキソヌクレアーゼまたは３’エキソヌクレアーゼと称される。
【００５４】
ここで使用される場合、「フラップ」は、二重鎖核酸分子から伸長する単鎖ＤＮＡの領域を意味する。本発明によるフラップは、好ましくは約１−５００ヌクレオチド、さらに好ましくは約５−２５ヌクレオチドの間、最も好ましくは約１０−２０ヌクレオチドの間である。
【００５５】
好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く。
【００５６】
好ましい実施形態では、切断構造は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【００５７】
本発明は、標的核酸配列を含むサンプルを、核酸ポリメラーゼとインキュベートすること、ＦＥＮヌクレアーゼで切断構造を切断して、核酸フラグメントを遊離すること、およびサンプル中の標的配列の存在の指標としてフラグメントの遊離を検出および／または測定することによって、切断構造を形成することを含む標的核酸配列を検出または測定する方法も提供する。
【００５８】
ここで使用される場合、「標的核酸配列を検出すること」または「標的核酸配列を測定すること」は、サンプル中の特定の標的核酸配列の存在を測定すること、またはサンプル中の標的核酸配列の存在の指標としてサンプル中の特定の標的核酸配列の量を測定することを含む。測定または検出できる標的核酸配列の量は、好ましくは約１分子から１０２０個の分子、さらに好ましくは約１００分子から１０１７個の分子まで、最も好ましくは約１０００から１０１４個の分子までである。本発明によって、検出核酸は、本発明による切断構造の上流プローブ（たとえば、図３のＡ）の３’伸長により標的核酸配列から置換される本発明による切断構造（たとえば、図３でＣ）の下流プローブの標識５’末端から誘導される。
【００５９】
本発明によって、標識を、本発明による切断構造を含む下流プローブ（たとえば、図３でＣ）の５’末端に付着させる。代わりに、標識を、下流プローブの３’末端に付着させ、クエンチャーを、下流プローブの５’フラップに付着させる。本発明によって、標識を、本発明による切断構造を含む下流プローブ（たとえば、図３でＣ）の３’末端に付着させる。
【００６０】
本発明によって、下流プローブ（たとえば、図３でＣ）を、内部で標識できる。好ましくは実施形態では、標的核酸配列にアニールせず、５’フラップを形成する非相補的な標識５’領域、および標的核酸配列にアニールする相補的３’領域を含むプローブで標的核酸配列をインキュベートすることによって、本発明による切断構造を作製できる。本発明の本実施態様によって、検出核酸は、プローブの標識５’フラップ領域から誘導される。好ましくは、標的核酸配列と切断された検出核酸によって発生されるシグナルとの量の間の直接的相互関係がある。
【００６１】
ここで使用される場合、「標識フラグメントの遊離を検出すること」または「標識フラグメントの遊離を測定すること」は、サンプル中の標識フラグメントの存在を測定することか、またはサンプル中の標識フラグメントの量を測定することに該当する。当業界で周知で、ここに記述される方法を、標識フラグメントの遊離を検出または測定するために使用できる。標識フラグメントの遊離を検出または測定する方法は、標識フラグメントに存在する標識部分を測定または検出するのに適している。測定または検出できる遊離された標識フラグメントの量は、標識プローブの総出発量の好ましくは約２５％、さらに好ましくは約５０％、最も好ましくは約９５％である。
【００６２】
ここで使用される場合、「標識フラグメント」は、切断されたモノヌクレオチドまたは小型オリゴヌクレオチド、または本発明による標識された切断構造から由来するオリゴヌクレオチドであって、切断オリゴヌクレオチドは、好ましくは約２−１０００の間のヌクレオチド、さらに好ましくは約５−５０の間のヌクレオチド、最も好ましくは約１６―１８の間のヌクレオチドであり、ＦＥＮヌクレアーゼにより切断構造から切断され、当業界で周知であり、ここに記述される方法によって検出できるヌクレオチドに該当する。
【００６３】
ここで使用される場合、「遊離された非相補的５’フラップを検出すること」または「標識非相補的５’フラップを測定すること」は、サンプル中の切断５’フラップの存在を測定すること、またはサンプル中の切断５’フラップの量を測定することを意味する。
当業界で周知であり、ここに記述される方法を、核酸フラグメントの遊離を検出または測定するために使用できる。切断５’フラップを直接的に、たとえばＦＲＥＴ対から得られる蛍光シグナル、または間接的に、たとえば二次切断または増幅反応で検出できる。（他の関連特許を参照、その開示は、直接検出について（２００４年１１月５日に出願された米国特許出願第１０／９８１，９４２号；１９９９年１０月２９日に出願された米国特許第６，５２８，２５４号Ｂ１；２０００年８月３０日に出願された米国特許第６，５４８，２５０号）および間接的検出について（２０００年１１月２１日に出願された米国特許第６，８９３，８１９号；２００５年１０月１１日に出願された米国特許出願第６０／７２５，９１６号）参照してここに組み込む。）
【００６４】
ここで使用される場合、「遊離５’フラップ」は、切断された小型オリゴヌクレオチドまたは本発明による切断構造から由来するオリゴヌクレオチドであって、切断オリゴヌクレオチドは、好ましくは約２−１０００の間のヌクレオチド、さらに好ましくは約５−５０の間のヌクレオチド、最も好ましくは約１６−１８の間のヌクレオチドに該当し、そしてそれは、ヌクレアーゼによって切断構造から切断され、当業界で周知で、ここに記述される方法によって検出できる。
【００６５】
好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く。
別の好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼである。
別の好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは、熱安定性である。
【００６６】
ここで使用される場合、「熱安定性」は、たとえば類似の活性を有する酵素の非熱安定性形態の酵素と比較した場合、加熱するために、好ましくは約９０−１００℃の間、さらに好ましくは約７０−９８℃の間と同じ程度に大きい温度で安定で、かつ活性である酵素に該当する。たとえば、ピー．フリオスス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｉｓ）、エム．ジャナスキ（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、エイ．フルギドゥス（Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ）またはピー．フリオスス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）のような好熱性生物から由来する熱安定性核酸ポリメラーゼまたはＦＥＮヌクレアーゼは、イー．コリまたは哺乳類ＦＥＮ酵素から得られる核酸ポリメラーゼと比較した場合に、高温でより安定で活性である。サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）から単離される代表的熱安定性核酸ポリメラーゼは、米国特許番号第４，８８９，８１８号に記述される。従来のＰＣＲでそれを使用するための方法は、Ｓａｉｋｉら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：４８７に記述される。ピー．フリオスス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｉｓ）（Ｐｆｕ）から単離される別の代表的熱安定性核酸ポリメラーゼは、Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、１９９１、Ｇｅｎｅ、１０８：１−６で記述される。
別の代表的温度安定性ポリメラーゼとしては、たとえば好熱性細菌サームス・フラブス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、サームス・ルバー（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、サームス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（列挙された他のものよりある程度低い温度最適を示す）、サームス・ラクテウス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ）、サームス・ルベンス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｎｓ）、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）から、または好熱性古細菌サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、およびメタノセルムス・フェルビヅス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｅｒｖｉｄｕｓ）から抽出されるポリメラーゼが挙げられる。
温度安定性ポリメラーゼおよびＦＥＮヌクレアーゼは、ＰＣＲサイクルの間に高温（約９５℃）にされされることによって二重鎖核酸が変性される熱サイクルプロセスで好ましい。
【００６７】
別の好ましい実施形態では、ＦＥＮヌクレアーゼは、フラップ特異的ヌクレアーゼである。
別の好ましい実施形態では、ＦＥＮヌクレアーゼは、熱安定性である。
別の好ましい実施形態では、シグナルを供給する能力のある少なくとも１つの標識部分を含む切断構造を形成する。
【００６８】
別の好ましい実施形態では、検出可能なシグナルの発生を消すのに有効に配置された相互作用性シグナル発生標識部分の対を含む切断構造を形成し、ＦＥＮヌクレアーゼ切断に影響を受けやすい部位によって、標識部分を分離し、それによりＦＥＮヌクレアーゼに影響を受けやすい部位で切断することによって、ＦＥＮ分子のヌクレアーゼ活性に、第二の相互作用性シグナル発生標識部分から第一の相互作用性シグナル発生標識部分を分離さて、それにより検出可能なシグナルを発生させる。
【００６９】
さらに別の好ましい実施形態では、二次構造を有するヘアピン形成オリゴヌクレオチドプローブを含む切断構造を形成する。
【００７０】
ここで使用される場合、「二次構造」は、同じ分子中に第一の単鎖配列の塩基、続いて第二の相補的配列を含む配列が、それ自身に折畳み戻して、逆平行の二重鎖構造を発生し、単鎖配列および相補的配列が、水素結合の形成によりアニールするものである核酸分子の高次構造（たとえば、ヘアピン、ステプループ構造、内部ループ、バルジループ、分岐構造、または偽結び目構造）に該当する。「二次構造」は、親和性対が分子間に存在する引力の結果として逆に結合する、親和性対を含む核酸分子の高次構造にも該当する。ここで使用される場合、「二次構造」は、プローブが捕捉要素に結合するのを防止する核酸高次構造に該当する。切断反応における二次構造を利用するプローブは、２０００年１１月３０日に出願された関連の米国特許出願番号０９／７２８，５７４号に記述され、そしてその全体に参照してここに組み込まれる。
【００７１】
ここで使用される場合、「ヘアピン構造」または「ステム」は、ＤＮＡのＲＮＡ（ＲＮＡ  ｏｆ  ＤＮＡ）の単鎖中の隣接の逆方向相補的配列の間の塩基対によって形成される二重鎖領域に該当する。
【００７２】
ここで使用される場合、「ステムループ」構造は、ヘアピン構造に該当し、さらに一方の末端で未対塩基のループを含む。
【００７３】
別の好ましい実施形態では、相互作用性シグナル発生部分の対は、クエンチャー部分および蛍光部分を含む。
別の好ましい実施形態では、切断構造は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【００７４】
本発明は、切断構造を供すること、１組のオリゴヌクレオチドプライマーを供することであって、第一のプライマーは、標的核酸配列の一方の鎖で領域に相補的な配列を含み、相補的ＤＮＡ鎖の合成を予備刺激し、第二のプライマーは、標的核酸配列の第二の鎖で領域に相補的な配列を含み、相補的ＤＮＡ鎖の合成を予備刺激し、および
（ｉ）標的配列内に含まれる鋳型核酸配列に対する増幅のために必要とされるプライマーのアニーリング、および標的核酸配列に、切断構造の形成のために必要とされるプライマーをアニールする段階、（ｉｉ）プライマーを伸長する段階であって、核酸ポリメラーゼがプライマー伸長産物を合成し、および（ｉｉｉ）切断構造から標的フラグメントの遊離のための切断剤としてＦＥＮヌクレアーゼを用いて切断構造を切断し、それにより切断可能な標識フラグメントを作製する段階、および（ｄ）サンプル中の標的核酸配列の存在の指標として標識フラグメントの遊離を検出および／または測定する段階のＰＣＲサイクリング段階として許容性のある条件下で、鋳型依存性重合剤として核酸ポリメラーゼを使用して標的核酸配列を増幅することを含む。
【００７５】
本発明は、標的核酸配列の増幅および検出が、同時に起こる（すなわち、リアルタイム検出）ポリメラーゼ連鎖反応プロセスを提供する。本発明は、標的核酸配列の増幅が、標的核酸配列の検出の前に起こる（すなわち、終点検出）ポリメラーゼ連鎖反応プロセスも提供する。
【００７６】
ここで使用される場合、「オリゴヌクレオチドプライマー」または「伸長プライマー」は、核酸鋳型にハイブリッド形成し、第二の核酸鎖の酵素的合成を予備刺激できる単鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子に該当する。本発明によるオリゴヌクレオチドプライマーは、長さ約１０から１００までの間のヌクレオチドであり、好ましくは長さ約１７−５０ヌクレオチド、さらに好ましくは長さ約１７−４５ヌクレオチドである。
【００７７】
ここで使用される場合、「プローブ」は、標的核酸に相補的である１領域または複数領域（標的核酸結合配列）を含む単鎖核酸に該当する。本発明による「プローブ」は、標的核酸を結合して、ヌクレアーゼによって切断できる切断構造を形成し、そして切断温度で切断を行う。本発明によるプローブを切断して、ここで定義されるとおり、標的核酸に対する結合の前に、「ヌクレアーゼ」によるシグナルを発生できない。いくつかの実施形態では、本発明による「プローブ」は、標的核酸に対するプローブの結合により変動し、さらに、結合部分を含む可能性がある二次構造を有する。本発明の１つの実施形態では、プローブは、標的核酸に結合できないか、または相補的でない領域を含む可能性がある。いくつかの実施形態では、プローブは、ポリメラーゼによる伸長を防止する封鎖３’末端を有する。
【００７８】
本発明による切断構造の形成のために有用なオリゴヌクレオチドプローブは、長さ約１７−４０ヌクレオチドの間であり、好ましくは長さ約１７−３０ヌクレオチドであり、さらに好ましくは長さ約１７−２５ヌクレオチドである。
本発明に使用される場合、オリゴヌクレオチドは、二次構造を含むオリゴヌクレオチドを含み、それに限定されないが、分子ビーコン、安全ピン（図１０）、サソリ（図１１）、およびサンライズ／アンプリフラー（ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ）プローブ（図１２）が挙げられ、その詳細および構造は、下で、および対応の図面で示される。
【００７９】
ここで使用される場合、「鋳型依存性重合剤」は、適切な塩、金属陽イオン、適切な安定化剤、およびｐＨ緩衝システムを含む反応培地中で適量の４つの三リン酸デオキシリボヌクレオシド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）またはここに記述される類似物の存在下でオリゴヌクレオチドプライマーを伸長する酵素に該当する。鋳型依存性重合剤は、プライマー−および鋳型−依存性ＤＮＡ合成を触媒することが知られる酵素であり、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を保有する。好ましくは、本発明による鋳型依存性重合剤は、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を欠く。
【００８０】
ここで使用される場合、「増幅」は、ポリメラーゼ連鎖反応の方法を含めた核酸配列の別のコピーを生じることに該当する。
【００８１】
好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く。
好ましい実施形態では、上に記述されるポリメラーゼ連鎖反応プロセスの段階ｂのオリゴヌクレオチドプライマーは、順方向プライマーを本発明による切断構造の上流に配置し、逆方向プライマーを本発明による切断構造の下流に配置するように向けられる。逆方向プライマーは、切断構造の鎖に相補的である順方向プライマーの対峙する鎖に相補的である。
別の好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼである。
別の好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは、熱安定性である。
別の好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは、ＴａｑポリメラーゼおよびＰｆｕポリメラーゼから構成される群から選択される。
別の好ましい実施形態では、ＦＥＮヌクレアーゼは、熱安定性である。
別の好ましい実施形態では、ＦＥＮヌクレアーゼは、フラップ特異的ヌクレアーゼである。
【００８２】
別の好ましい実施形態では、ＦＥＮヌクレアーゼは、アルカエグロブス・フルギドゥス（Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタノコックス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、ピロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、ヒト、マウスまたはキセノプス・ラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）から由来するＦＥＮヌクレアーゼ酵素から構成される群から選択される。本発明によるヌクレアーゼは、サッカロミセス・セルビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｓｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＲＡＤ２７、およびシゾサッカロミセス・ポムベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＲＡＤ２、Ｐｏｌ  Ｉ  ＤＮＡポリメラーゼ結合５’から３’へのエキソヌクレアーゼ・ドメイン、（たとえば、イー．コリ、サームス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）、サームス・フラブス（Ｔｆｌ）、バシルス・カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）（Ｂｃａ）、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））およびそれに限定されないがＴ４  ＲＮａｓｅＨ、Ｔ５  ５’から３’へのエキソヌクレアーゼ、Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼおよびＴ３遺伝子６エキソヌクレアーゼを含めたＦＥＮのファージ機能相同体が挙げられる。
好ましくは、Ｔａｑ、ＴｆｌおよびＢａｃＦＥＮヌクレアーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼドメインのみを使用する。
【００８３】
別の好ましい実施形態では、シグナルを供給できる少なくとも１つの標識部分によって標識切断構造を形成する。
本発明は、（ａ）標的核酸配列の１つの鎖にある領域に相補的である上流オリゴヌクレオチドプライマー、および標的核酸配列の同じ鎖にある領域に相補的な下流標識プローブを供することであって、上流プライマーは、標的核酸配列の１つの鎖中の領域に相補的な配列を含み、相補的ＤＮＡ鎖の合成を予備刺激し、下流プローブは、標的核酸配列の第二の鎖中の領域に相補的な配列を含み、相補的ＤＮＡ鎖の合成を予備刺激し、および
（ｂ）標的核酸配列の増幅、およびその切断を含む反応で産生される核酸を検出することであって、核酸ポリメラーゼは、（ｉ）標的核酸配列に対するプライマーのアニーリング段階、（ｉｉ）段階（ａ）のプライマーを伸長する段階のＰＣＲサイクリクング段階として許容性のある条件下で鋳型依存性重合剤であり、核酸ポリメラーゼ合成が、伸長産物を合成し、および段階（ａ）のプライマーのプライマー伸長産物は、段階（ａ）の下流プローブを部分的に交換して、切断構造を形成すること、および（ｉｉｉ）切断構造から標的フラグメントの遊離のための切断剤としてＦＥＮヌクレアーゼを使用して切断構造を切断し、それにより検出可能な標識フラグメントを作製することを含む、切断構造を同時に形成し、サンプル中の標的核酸配列を増幅し、切断構造を切断するポリメラーゼ連鎖反応プロセスも提供する。
好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く。
本発明は、（ａ）標的核酸配列を供する段階、（ｂ）上記核酸配列に相補的な上流プライマーを供する段階、（ｃ）上記標的核酸配列に相補的な下流プローブを供する段階、（ｄ）上流プライマーの３’末端を、核酸ポリメラーゼで伸長する段階、および（ｅ）下流プローブの５’末端を置換する段階を含む、切断構造を形成する方法も提供する。
好ましくは、下流プローブは、上流プライマーの５００ヌクレオチド未満下流に配置される。
伸長段階の間に、上流プライマーの新たに合成された３’末端が、下流プローブの５’末端を部分的に置換する。
好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く。
【００８４】
本発明の別の実施形態では、標的核酸配列を、標的核酸配列にアニールせず、５’フラップを形成する非相補的５’領域、および標的核酸配列にアニールする相補的３’領域を含むプローブと共にインキュベートすることによって、本発明による切断構造を作製できる。
【００８５】
本発明は、標識切断構造を形成する方法であって、（ａ）標的核酸配列を供する段階、（ｂ）上記標的核酸配列に相補的な上流プライマーを供する段階、（ｃ）上記標的核酸配列に相補的な下流末端標識プローブを供する段階、（ｄ）核酸ポリメラーゼで上流プライマーの３’末端を伸長する段階、および（ｅ）下流プローブの５’末端を置換する段階を含む方法を提供する。
【００８６】
好ましくは、下流末端標識プローブは、上流プライマーの５００ヌクレオチド未満下流に配置される。好ましくは、下流オリゴヌクレオチドは、３’末端で封鎖して、下流オリゴヌクレオチドの３’末端の伸長を防止する。このような封鎖は、オリゴヌクレオチドの３’末端ヒドロキシルでホスフェート、十分に除去されない他の部分を入れることによって達成される。
【００８７】
伸長段階の間に、上流オリゴヌクレオチドプライマーの新たに合成された３’末端が、下流オリゴヌクレオチドプローブの５’末端を部分的に置換するように、ポリメラーゼの合成活性により上流プライマーの３’末端を伸長する。本発明の方法によって、緩衝液および伸長温度は、本発明による特定の核酸ポリメラーゼによる鎖置換に都合がよい。
本発明の１つの実施形態では、標的核酸配列を、標的核酸配列にアニールせず、５’フラップを形成する非相補的に標識された５’領域、および標的核酸配列にアニールする相補的３’領域を含むプローブと共にインキュベートすることによって、本発明による切断構造を作製できる。
【００８８】
本発明は、核酸ポリメラーゼ、ＦＥＮヌクレアーゼおよび適切な緩衝液を含むサンプル中の標的核酸配列の存在を示すシグナルを発生するキットも提供する。好ましい実施形態では、本発明は、１つまたはそれ以上の核酸ポリメラーゼ、ＦＥＮヌクレアーゼおよび適切な緩衝液を含むサンプル中の標的核酸配列の存在を示すシグナルを発生するキットも提供する。
【００８９】
好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く。
好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは、熱安定性である。
別の好ましい実施形態では、ＦＥＮヌクレアーゼは、熱安定性である。
別の好ましい実施形態では、キットは、さらに、標的核酸配列に相補的な標識核酸を含む。
本発明は、核酸ポリメラーゼおよびＦＥＮヌクレアーゼを含む組成物も提供する。
好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く。
好ましい実施形態では、本発明は、１つまたはそれ以上の核酸ポリメラーゼおよびＦＥＮヌクレアーゼを含む組成物を提供する。
本発明のされなる特徴および利点は、以下のとおりである。請求された発明は、標的核酸を検出および／または測定するシグナルを発生する方法であって、シグナルの発生は、サンプル中の標的核酸の存在の指標である方法を提供する。請求の発明の方法は、多段階を必要としない。請求された発明は、標的核酸を検出および／または測定するＰＣＲ基本の方法であって、標的核酸の存在の指標としてシグナルを発生する方法も提供する。請求の発明は、同時増幅および検出および／または標的核酸配列の測定に対処する。請求の発明は、標的核酸を検出および／または測定するＰＣＲ基本の方法であって、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を示す核酸ポリメラーゼの不在下でシグナルを発生する方法も提供する。
【００９０】
本発明のさらなる特徴および利点は、実施形態およびその図面、および請求項から以下の説明でさらに十分に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ＦＥＮヌクレアーゼ切断構造を示す。
【図２】ＦＥＮヌクレアーゼ活性を検出するために使用できる３つの鋳型（標識１、２、および３）を示す。
【図３】本発明によるシグナルを発生する合成および切断反応を示す図である。
【図４】ＣＢＰタグ付ＰｆｕＦＥＮ−１タンパク質を示すシプロオレンジで染色されたポリアクリルアミドゲルである。
【図５】ＦＥＮ−１ヌクレアーゼアッセイのオートラジオグラフである。
【図６】ＦＥＮ−１の存在下で蛍光で標識したβ−アクチンプローブ、および５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性に欠損のあるＴａｑポリメラーゼを使用したゲノムＤＮＡ中でβ−アクチン配列の検出を表す図である。
【図７】ＦＥＮ−１の存在下で蛍光で標識したβ−アクチンプローブ、および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性に欠損のあるＴａｑポリメラーゼを使用したゲノムＤＮＡ中でβ−アクチン配列の検出を表す図である。
【図８Ａ】サイクル増幅を回転させるための開環ブローブの表示である。
【図８Ｂ】サイクル増幅を回転させるための開環ブローブの表示である。
【図９Ａ】サイクル増幅を回転させるための表示である。
【図９Ｂ】サイクル増幅を回転させるための表示である。
【図１０】安全性ピンプローブの表示である。
【図１１】サソリ・プローブの表示である。
【図１２】サンライズ／アンプリファープローブの表示である。
【図１３】封鎖上流オリゴヌクレオチドおよび封鎖下流プローブを用いた標的核酸の検出のための本発明の実施形態を表す模式図である。
【図１４】クランプを有する３’封鎖上流オリゴヌクレオチドを用いた標的の同時検出および標的核酸に相補的な鎖の発生についての本発明の実施形態を表す模式図である。
【図１５】３’封鎖上流オリゴヌクレオチドを用いた標的の同時検出および標的核酸に相補的な鎖の発生についての本発明の別の実施形態を表す模式図である。
【図１６】３’封鎖上流オリゴヌクレオチドを用いた標的核酸の同時検出およびその増幅についての本発明の別の実施形態を表す模式図である。
【図１６ｂ】３’封鎖上流オリゴヌクレオチドを用いた標的核酸の同時検出およびその増幅についての本発明の別の実施形態を表す模式図である。
【図１７】３’封鎖上流オリゴヌクレオチドおよび標的の非連続領域に相補的な３’封鎖下流プローブを用いた標的核酸の同時検出およびその増幅についての本発明のさらに別の実施形態を表す模式図である。
【図１８】３’封鎖上流オリゴヌクレオチドおよび標的の非連続領域に相補的な３’封鎖下流プローブを用いた標的核酸の同時検出およびその増幅についての本発明の実施形態を表す模式図である。
【図１８ｂ】３’封鎖上流オリゴヌクレオチドおよび標的の非連続領域に相補的な３’封鎖下流プローブを用いた標的核酸の同時検出およびその増幅についての本発明の実施形態を表す模式図である。
【図１９】３’封鎖プローブを利用するフルベロシティー反応での蛍光ｖサイクルを表す図である。
【図２０】３’封鎖プローブを利用するＦＥＮ反応での蛍光ｖサイクルを表す図である。
【図２１】標的の存在を示すシグナルを発生するそれらの能力についての種々の鍵プローブを試験するために使用された典型的標的アンプリコンを示す。
【図２２】対照鍵プローブ（Ａ）および試験鍵プローブ（Ｂ）の例を示す。
【図２３】鍵プローブの例を示す。
【図２４】下流鍵プローブの相補的領域の５’末端との重複の０および３の間の残基を有する上流３’封鎖プローブの例を示す。
【発明の詳細な開示】
【００９２】
本願発明は、試料内に検出対象の構造を持つ核酸が存在することを示すシグナルを発生させる方法を提供するものであり、同発明になる方法にあっては核酸が核酸ポリメラーゼとＦＥＮヌクレアーゼの両方により作用を受ける。同発明は、上記に加えて、試料中に存在する核酸であってその標的シークエンス（配列）部位の増殖、切断ならびに検出の工程を同時進行させ得るものを検出対象の核酸として検出あるいは測定する処方を提供するものともいえる。
【００９３】
本願発明の実施にあっては特にその旨の記載がない限り、分子生物学、マイクロバイオロジーならびに組換えＤＮＡ技術のいずれかに関わる分野に特有の専門的既知手法が利用される。これら既知の手法については既存文献、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （ＭＪ．  Ｇａｉｔ，  ｅｄ．，  １９８４）；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  （Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｒｎｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  ｅｄｓ．，  １９８４）；  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ，  １９８４）；  および一連のシリーズとして出版されたＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）  に記載がある。本文書中において既に前段であるいは今後後段で特定する特許文献、特許出願文献、出版文書は本願開示の一部分をなす参照文献とする。
【００９４】
本願発明は、調査対象試料内に検出対象の構造を持つ核酸の存在を示すシグナルを発生させる方法を提供するものであり、同方法は検出対象の構造を有する核酸を含有する当該試料を何らかのプローブと共に培養し被切断構造部位を生成し、すなわち、検出対象である構造でなる核酸配列を含んでいる当該試料を核酸ポリメラーゼと共に培養し、次にヌクレアーゼで前記被切断構造部位を切断することにより核酸断片として遊離し、その結果、シグナルを発生させるに至る工程でなる。このシグナルの発生は当該試料中に検出対象の構造を持つ核酸が存在することを示すものであり、この分子断片の量を直接的に検出ないし測定することにより、あるいは同分子断片の量を間接的に検出ないし測定することにより同シグナルを検出あるいは測定できる。
【００９５】
本願発明は、調査対象試料内に検出対象の構造を持つ核酸が存在する場合にそれを示すシグナルを発生させる方法を提供するものであり、同方法は、
ａ）  ３’位置から５’位置の方向順に位置する第一ハイブリダイゼーション部位と第二ハイブリダイゼーション部位を有する構造を持つ検出対象である核酸と、
前記第一ハイブリダイゼーション部位と相補的な特性を有すると共に保護された３’端末を有し前方部分に配置するオリゴヌクレオチドと、
自身の３’端末領域が前記第二ハイブリダイゼーション部位と相補的な特性を有する一方、自身の５’端末領域は標的とのアニーリング操作下にあっていずれの部位とも非相補的な５’フラップを形成するような分子構造でなると共に後方部分に配置するプローブの存在を前提とし、
ｂ）  前方部分に配置する前記オリゴヌクレオチドと後方部分に配置する前記プローブをアニーリング操作により検出対象である核酸に再結合させ被切断構造部位を形成し、
ｃ）  ヌクリアーゼを用いることで当該被切断構造部位を切断しいずれの部位とも非相補的な前記５’フラップを遊離させ、次いで
ｄ）  遊離されたものであり、検出対象の構造を有する核酸が当該試料中に存在することを示すものであるいずれの部位とも非相補的な５’フラップを検出することからなる。
一実施例にあっては、後方部分に配置するプローブのものであるいずれの部位とも非相補的な５’フラップがｎ個（ｎは１ないし２５の整数）のヌクレオチド鎖でなり、前記第  
【００９６】
一ハイブリダイゼーション部位と第二ハイブリダイゼーション部位がｍ個（ｍはｎよりも大きい整数）のヌクレオチド鎖で隔てられている。
【００９７】
上記とは異なる実施例にあっては、被切断構造部位の少なくとも一ヶ所がシグナルを発生する機能を有する置換基でラベルされている。
更に別なる実施例にあっては、前記したヌクレアーゼとしてＦＥＮヌクレアーゼが採用される。このＦＥＮヌクレアーゼはフラップを識別できるような構造のヌクレアーゼか耐熱性に優れたヌクレアーゼであること、あるいはこれら双方の特徴を有するヌクレアーゼであることが望ましく、Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ，  Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉおよびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓに由来する種々のＦＥＮヌクレアーゼ酵素のいずれかであることがより望ましい。またＴａｑ，  ＴｆｌおよびＢｃａのいずれかに由来するヌクレアーゼが採用されることもある。
【００９８】
形成される被切断構造部位は同部位にラベルされたものであって相互作用を及ぼし合う一対のシグナル発生型置換基を含んで構成され、該置換基の一対は検知可能なシグナルの発生を同相互作用により抑制するに好適な間隔だけ互いに離れて位置し、かつ当該置換基の間にはＦＥＮヌクレアーゼによる鎖の切断を受ける部位が配置されており、ＦＥＮヌクレアーゼが有するヌクレアーゼ活性により同部位での切断が起こると相互作用を及ぼし合う一対の内の第一のシグナル発生型置換基が同第二のシグナル発生型置換基から切り離され、その結果、検知可能なシグナルの発生が起るように構成されるのが望ましい。ここでいう相互作用を及ぼし合うシグナル発生型の置換基対は抑制置換基と蛍光発生型置換基との一対であることがより望ましい。
【００９９】
更に異なる実施例にあっては相互作用を及ぼし合うシグナル発生型のものでありラベルされる置換基対が蛍光発色団と抑制置換基の一対で構成される。すなわち、この抑制置換基は後方部分に配置するプローブのいずれの部位とも非相補的な５’フラップ上に位置し、もう一方の蛍光発色団が同後方部分に配置するプローブの相補的な３’領域内に位置するものであって良い。あるいは、もっと具体的に例示するならば、ここでいう後方部分に配置するプローブの相補的な３’領域の５’端末から二つ目のヌクレオチド残基に蛍光発色団を結合させても良い。
【０１００】
上記したいずれとも異なる実施例にあっては、本願発明になる方法が既に述べた工程ステップに加えて遊離されるいずれの部位とも非相補的な５’フラップを定量するステップを含んで構成される。
更に別なる実施例にあっては、後方部分に配置されるプローブの３’エクステンションを防止する目的で後方部分に配置する同プローブの３’端末が保護基で封鎖されている。
更に別なる実施例にあっては、後方部分に配置するプローブの３’部分が検出対象の核酸に存在する第三ハイブリダイゼーション部位とも相補的な構造を有し、同第三ハイブリダイゼーション部位の第二ハイブリダイゼーション部位に近い側は５’となっており、これら第二ハイブリダイゼーション部位と第三ハイブリダイゼーション部位とは当該検出対象の核酸の領域分離鎖により隔てられている。後方部分に配置するプローブのこの３’部分は第二と第三のいずれのハイブリダイゼーション部位にもハイブリダイズするほか、検出対象の核酸の前記した領域分離鎖が非相補的な領域であることが望ましい。ここで後方部分に配置するプローブのこの３’部分は１ないし２５個のヌクレオチドを擁するものであり、領域分離鎖は１ないし２０個のヌクレオチドを擁するものであることが好ましい。
【０１０１】
好適な一実施例にあっては、保護基により封鎖された３’端末の一方または双方は、検出対象の核酸とは非相補的な塩基とされているか、あるいは核酸の合成ないし核酸鎖の伸長反応（エクステンション）が進行しかねない環境下にあってもヌクレオチド・トリホスフェートが同位置に付加しないように変成されている。ここで、封鎖された３’端末の一方または双方は、
ａ）  ジデオキシヌクレオチドか
ｂ）  ３’位の水酸基がリン酸基に変更されたヌクレオチドか、あるいは
ｃ）  ３’位の炭素または３’位の酸素にリポーター基が結合された形のヌクレオチド
であるのが好適である。
【０１０２】
本願発明は、
ａ）  ３’位置から５’位置の方向順に位置する第一ハイブリダイゼーション部位と第二ハイブリダイゼーション部位を有する構造を持つ検出対象である核酸と、
前記第一ハイブリダイゼーション部位と相補的な特性を有すると共に保護された３’端末を有し前方部分に配置するオリゴヌクレオチドと、
自身の３’端末領域が前記第二ハイブリダイゼーション部位と相補的な特性を有する一方、自身の５’端末領域は標的とのアニーリング操作下にあっていずれの部位とも非相補的な５’フラップを形成するような分子構造でなり、後方部分に配置するプローブの存在を前提とし、
ｂ）  前方部分に配置する前記オリゴヌクレオチドと後方部分に配置する前記プローブをアニーリング操作により検出対象である核酸に再結合させ被切断構造部位を形成し、
ｃ）  ピロコックス・フリオスス由来のＦＥＮヌクリアーゼ酵素を用いることで当該被切断構造部位を切断しいずれの部位とも非相補的な前記５’フラップを遊離させる
ことでなる、被切断構造部位を形成し、形成された被切断構造部位を切り離すための方法を提供するものでもある。
【０１０３】
一実施例にあっては、後方部分に配置するプローブのものであるいずれの部位とも非相補的な５’フラップがｎ個（ｎは１ないし２５の整数）のヌクレオチド鎖でなり、前記第一ハイブリダイゼーション部位と第二ハイブリダイゼーション部位がｍ個（ｍはｎよりも大きい整数）のヌクレオチド鎖で隔てられている。
【０１０４】
上記とは異なる実施例にあっては、被切断構造部位の少なくとも一ヶ所がシグナルを発生する機能を有する置換基でラベルされている。
【０１０５】
更に別なる実施例にあっては、形成される被切断構造部位は同部位にラベルされたものであって相互作用を及ぼし合う一対のシグナル発生型置換基を含んで構成され、該置換基の一対は検知可能なシグナルの発生を同相互作用により抑制するに好適な間隔だけ互いに離れて位置し、かつ当該置換基の間にはＦＥＮヌクレアーゼによる鎖の切断を受ける部位が配置されており、ＦＥＮヌクレアーゼが有するヌクレアーゼ活性により同部位での切断が起こると相互作用を及ぼし合う一対の内の第一のシグナル発生型置換基が同第二のシグナル発生型置換基から切り離され、その結果、検知可能なシグナルの発生が起こるように構成される。ここでいう相互作用を及ぼし合うシグナル発生型の置換基対は抑制置換基と蛍光発生型置換基との一対であることが望ましい。
【０１０６】
更に別なる実施例にあっては、本願発明になる方法が既に述べた工程ステップに加えて遊離される非相補的５’フラップを定量するステップを含んで構成される。
更に別なる実施例にあっては、後方部分に配置されるプローブの３’エクステンションを防止する目的で後方部分に配置する同プローブの３’端末が保護基で封鎖されている。
【０１０７】
更に別なる実施例にあっては、後方部分に配置するプローブの３’部分が検出対象の核酸の第二ハイブリダイゼーション部位の５’端側に存在する第三ハイブリダイゼーション部位とも相補的な構造を有し、これら第二ハイブリダイゼーション部位と第三ハイブリダイゼーション部位とは当該検出対象の核酸の領域分離鎖により隔てられている。後方部分に配置するプローブのこの３’部分は第二と第三のいずれのハイブリダイゼーション部位にもハイブリダイズするほか、検出対象の核酸の前記した領域分離鎖が非相補的な領域であることが望ましい。ここで後方部分に配置するプローブのこの３’部分は１ないし２５個のヌクレオチドを擁するものであり、領域分離鎖は１ないし２０個のヌクレオチドを擁するものであることが好ましい。
【０１０８】
本願発明の別なる特徴として、保護基により封鎖された３’端末の一方または双方は、検出対象の核酸とは非相補的な塩基とされているか、あるいは核酸の合成ないし核酸鎖の伸長反応（エクステンション）が進行しかねない環境下にあってもヌクレオチド・トリホスフェートが同位置に付加しないように変成されている。ここで、封鎖された３’端末の一方または双方は、
ａ）  ジデオキシヌクレオチドか
ｂ）  ３’位の水酸基がリン酸基に変更されたヌクレオチドか、あるいは
ｃ）  ３’位の炭素または３’位の酸素にリポーター基が結合された形のヌクレオチド
であるのが好適である。
【０１０９】
本願発明は被切断構造部位を試料中に形成し、形成した被切断構造部位を切り離し、検出対象の核酸と相補的な核酸を転写・形成するものであり、以下のごとき工程で構成される方法を提供するものでもある。すなわち、本方法は
ａ）  ３’位置から５’位置の方向順に位置する第一ハイブリダイゼーション部位と第二ハイブリダイゼーション部位と第三ハイブリダイゼーション部位を有する構造を持つ検出対象である核酸と、
前記第一ハイブリダイゼーション部位と相補的な特性を有し前方部分に配置するエクステンション・プライマーと、
前記第二ハイブリダイゼーション部位と相補的な特性を有し、保護基で封止された３’端末と核酸ポリメラーゼによる位置移動作用を妨害するためのクランプが結合している５’端末の双方を有する構造のクランピング・オリゴヌクレオチドと、
検出対象の核酸との再結合操作下にあって、第三ハイブリダイゼーション部位と相補的な３’領域ならびにいずれの部位とも非相補的な５’フラップを形成する５’領域を擁してなる後方部分に配置するプローブの存在を前提とし、
ｂ）  前方部分に配置する前記エクステンション・プライマーならびに、クランピング・オリゴヌクレオチドと後方部分に配置するプローブの両方により被切断構造部位が形成させるものであるが、これらクランピング・オリゴヌクレオチドと後方部分に配置する前記プローブとをアニーリング操作により検出対象である核酸に再結合させ、
ｃ）  ヌクリアーゼを用いることで当該被切断構造部位を切断しいずれの部位とも非相補的な前記５’フラップを遊離させ、
ｄ）  前方部分に配置する前記エクステンション・プライマーから前記クランピング・オリゴヌクレオチドに至るまで相補的なストランドを伸長せしめ、
ｅ）  検出対象の核酸に核酸ポリメラーゼが接近できるようにするために検出対象の核酸から同核酸に結合している前記クランピング・オリゴヌクレオチドと後方部分に配置するプローブの双方を分離・遊離せしめ、
ｆ）  検出対象である核酸に相補的なストランドを更に伸長し、次いで
ｇ）  当該試料中に検出対象である核酸が存在することを示すものでありいずれの部位とも非相補的なものである遊離された５’フラップを検出する
ことからなる複数の工程により構成される。
一実施例にあっては、本願発明の方法は上記に加えて逆方向エクステンション・プライマーの存在をも前提とする。この逆方向エクステンション・プライマーは検出対象の核酸の少なくとも一部分をその構造中に含み、第二ストランドの伸長反応を開始させるものである。
【０１１０】
別の実施例にあっては、ＰＣＲの反応が進行する環境において本願発明の方法が実行される。
【０１１１】
更に別なる実施例にあって本願発明の方法は上記した各工程に加えて、
ｈ）  検出対象の核酸の少なくとも一部分をその構造中に有するオリゴヌクレオチドであって、第二のストランドの伸長反応を開始させる逆方向エクステンション・プライマーの存在をも前提とし、
ｉ）  第一、第二、第三のハイブリダイゼーション部位に対応した、相補的なストランド上の部位から後方の位置に逆方向エクステンション・プライマーを再結合させ、
ｊ）  同逆方向エクステンション・プライマーからストランドを伸長させて、検出対象の核酸の少なくとも一部分、および第一、第二、第三のハイブリダイゼーション部位を含んだ構造を有する第二ストランドを形成し、
ｋ）  形成された第二ストランドから相補的ストランドを変性・分離し、
ｌ）  これら変性工程、伸長反応（エクステンション）工程、切断工程でなる工程サイクルをＰＣＲのサイクル反応工程を進行させ得る環境・条件下で何度も繰り返し実施し標的配列を増殖し、被切断構造部位を形成し、形成された被切断構造部位を切り離す
各工程を含んで構成される。
【０１１２】
更に別の実施例にあっては、後方部分に配置するプローブの５’フラップがｎ（ｎは１ないし２５の整数）個のヌクレオチドで構成されており、第二と第三のハイブリダイゼーション部位の間はｍ（ｍはｎより大きい整数）個のヌクレオチド鎖で隔てられている。
【０１１３】
好適な一実施例にあっては、前方部分に配置するエクステンション・プライマーを標的配列と再結合させるには、クランピング・オリゴヌクレオチドや後方部分に配置するプローブの再結合を進行させる場合よりもより限定された条件が設定される。すなわち、
ａ）  再結合を進行させる工程ｂ）は前方部分のエクステンション・プライマーとクランピング・オリゴヌクレオチド、ならびに後方部分に配置するプローブ各々のアニーリング温度（再結合が進行する最高温度）のいずれよりも低い温度において実施され、
ｂ）  分離を進行させる工程ｆ）は前方部分のエクステンション・プライマーのアニーリング温度よりは低いもののクランピング・オリゴヌクレオチドと後方部分に配置するプローブ各々のアニーリング温度よりは高い温度において実施されることが
より一層好適である。
【０１１４】
前方部分に配置するエクステンション・プライマーの検出対象である核酸への再結合がクランピング・オリゴヌクレオチドの場合よりもより限定的な条件下で進行し、クランピング・オリゴヌクレオチドの検出対象である核酸への再結合が後方部分に配置するプローブの場合よりもより限定的な条件下で進行するように構成するのがより一層好適である。
すなわち、
ａ）  再結合を進行させる工程ｂ）は前方部分のエクステンション・プライマーとクランピング・オリゴヌクレオチド、ならびに後方部分に配置するプローブ各々のアニーリング温度のいずれよりも低い温度において実施され、
ｂ）  分離を進行させる工程ｆ）が前記に加えて
ｉ）  後方部分に配置するプローブの検出対象の核酸からの分離は進行するものの前方部分に配置するエクステンション・プライマーならびにクランピング・オリゴヌクレオチドは結合した状態に留まるような温度に昇温し、
ｉｉ）  次にクランピング・オリゴヌクレオチド検出対象の核酸から分離するものの前方部分に配置するエクステンション・プライマーは結合した状態に留まるような温度にまで昇温することが
より一層好適である。
【０１１５】
更に別なる実施例にあっては、前述のクランプ機構が核酸ポリメラーゼによってもそれが配置する部分から移動させられることにならないよう十分に強い親和性をもってクランピング・プライマーを検出対象の核酸に結合させるような塩基配列ないしは分子修飾により実現されている。すなわち、このクランプ機構がＧＣリッチな塩基配列であったり、小さい溝を有する結合であったり、インターカレート剤であったり、ＬＮＡであったりするのが望ましい。
【０１１６】
更に別なる実施例にあっては、後方部分に配置するオリゴヌクレオチドが保護基で封止された３’端末を有する。３’端末の一方は双方が検出対象の核酸とは非相補的な塩基となっているか核酸の合成や核酸鎖の伸長反応が進行しかねない環境条件下にあってもヌクレオチド・トリホスフェートの付加反応の進行を防止できるような端末基になっていることが望ましい。すなわち、３’端末の一方は双方が
ａ）  ジデオキシヌクレオチドであるか、
ｂ）  ３’位の水酸基がリン酸基に変更されたヌクレオチドであるか、
ｃ）  ３’位の炭素または３’位の酸素にレポーター機能を有する官能基が結合したヌクレオチドである
ことが望ましい。
【０１１７】
更に別なる実施例にあっては、前記した分離が進行する工程ｆ）において、後方部分に配置するプローブは、クランピング・オリゴヌクレオチドを検出対象である核酸から分離するより早い時点で検出対象の当該核酸から分離される。
使用する核酸ポリメラーゼは５’から３’方向のエクソヌクリアーゼ（５’→３’エクソヌクリアーゼ）活性を実質的に保持しないことが望ましい。この核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼであることが望ましい。またこの核酸ポリメラーゼは耐熱性のものであることが望ましい。この核酸ポリメラーゼは５’→３’エクソヌクリアーゼ欠損型ＴａｑポリメラーゼおよびＰｆｕポリメラーゼでなるポリメラーゼ・グループから選ばれることがより一層好ましい。
【０１１８】
一実施例にあっては、シグナルを発生する機能を有する置換基が少なくとも一つラベルされた構成の被切断構造部位が形成される。
【０１１９】
好適な一実施例にあっては、ヌクリアーゼとしてＦＥＮヌクリアーゼが採用される。ここでこのＦＥＮヌクリアーゼはフラップ特異性を有するか、加えて／または耐熱性を有するタイプのヌクリアーゼとされる。このようなＦＥＮヌクリアーゼは、アルカエグロブス・フルギドゥス（Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタノコックス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、およびピロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）のいずれかに由来するＦＥＮヌクリアーゼ酵素でなるグループから選ばれるものとすることがより一層好適である。ここで採用するヌクリアーゼはＴａｑ、ＴｆｌおよびＢｃａから獲得されるものであっても良い。
【０１２０】
好適な一実施例にあっては、形成される被切断構造部位は同部位にラベルされたものであって相互作用を及ぼし合う一対のシグナル発生型置換基を含んで構成され、該置換基の一対は検知可能なシグナルの発生を同相互作用により抑制するに好適な間隔だけ互いに相手から離れて位置し、かつ当該置換基の間にはＦＥＮヌクレアーゼによる鎖の切断を受ける部位が配置されており、ＦＥＮヌクレアーゼが有するヌクレアーゼ活性により同部位での切断が起こると相互作用を及ぼし合う一対の内の第一のシグナル発生型置換基が同第二のシグナル発生型置換基から切り離され、その結果、検知可能なシグナルの発生が起るように構成されるのが望ましい。ここでいう相互作用を及ぼし合うシグナル発生型の置換基対は抑制置換基と蛍光発生型置換基との一対であることがより望ましい。
【０１２１】
一実施例にあっては、本願発明の方法は上記の工程に加えて遊離されたいずれの部位とも非相補的な５’フラップの量を測定する工程を含む。
【０１２２】
本願発明は試料中に被切断構造部位を形成し、形成された被切断構造部位を切断し、検出対象である核酸と相補的な核酸を転写・形成する方法を提供するものでもある。すなわち、本方法は
ａ）  ３’位置から５’位置の方向順に位置する第一ハイブリダイゼーション部位と第二ハイブリダイゼーション部位と第三ハイブリダイゼーション部位を有する構造を持つ検出対象である核酸と、
前記第一ハイブリダイゼーション部位と相補的な特性を有し前方部分に配置するエクステンション・プライマーと、
前記第二ハイブリダイゼーション部位と相補的な特性を有し、保護基で封止された３’端末と核酸ポリメラーゼによる位置移動作用を妨害するためのクランプが結合している５’端末の双方を有する構造のクランピング・オリゴヌクレオチドと、
検出対象の核酸との再結合操作下にあって、第三ハイブリダイゼーション部位と相補的な３’領域ならびにいずれの部位とも非相補的な５’フラップを形成する５’領域を擁してなる後方部分に配置するプローブの存在を前提とし、
ｂ）  前方部分に配置する前記エクステンション・プライマーならびに、クランピング・オリゴヌクレオチドと後方部分に配置するプローブの両方により被切断構造部位が形成させるものであるが、これらクランピング・オリゴヌクレオチドと後方部分に配置する前記プローブとをアニーリング操作により検出対象である核酸に再結合させ、
ｃ）  ピロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のＦＥＮヌクリアーゼ酵素を用いることで当該被切断構造部位を切断しいずれの部位とも非相補的な前記５’フラップを遊離させ、
ｄ）  前方部分に配置する前記エクステンション・プライマーから前記クランピング・オリゴヌクレオチドに至るまで相補的なストランドを伸長せしめ、
ｅ）  検出対象の核酸に核酸ポリメラーゼが接近できるようにするために検出対象の核酸から同核酸に結合している前記クランピング・オリゴヌクレオチドと後方部分に配置するプローブの双方を分離・遊離せしめ、
ｆ）  検出対象である核酸に相補的なストランドを更に伸長し、次いで
ｇ）  当該試料中に検出対象である核酸が存在することを示すものでありいずれの部位にも非相補的なものである遊離された５’フラップを検出する
ことからなる複数の工程により構成される。
【０１２３】
一実施例にあっては、本願発明の方法は上記に加えて逆方向エクステンション・プライマーの存在をも前提とする。この逆方向エクステンション・プライマーは検出対象の核酸の少なくとも一部分をその構造中に含み、第二ストランドの伸長反応を開始させるものである。
【０１２４】
別の実施形態において、本方法は、ＰＣＲにとって許容される条件下で行われる。
さらに別の実施形態において、本方法は、さらに：
ｈ）標的核酸の少なくとも一部を含む、第２の鎖を開始するオリゴヌクレオチド逆方向伸長プライマーを提供する工程；
ｉ）第１、第２および第３のハイブリダイゼーション部位に対応する相補鎖に、上記部位から下流の逆方向伸長プライマーをアニーリングする工程；
ｊ）逆方向伸長プライマーから鎖を伸長して、標的核酸の少なくとも一部ならびに第１、第２および第３のハイブリダイゼーション部位を含む第２の鎖を生成する工程；
ｋ）第２の鎖から相補鎖を変性する工程；および
１）ＰＣＲサイクル工程に許容的な条件下で、変性、伸長および切断のサイクルを繰り返して、標的配列を増幅し、切断構造を形成し、そして切断構造を切断する工程
を含む。
【０１２５】
なおも別の実施形態において、下流プローブの非相補的な５’フラップは、ｎ個のヌクレオチドからなり、第１のハイブリダイゼーション部位および第２のハイブリダイゼーション部位は、ｍ個のヌクレオチドによって分断されており、ここで、ｎは、１〜２５の整数であり、かつ、ｍは、ｎより大きい整数である。
【０１２６】
なおも別の実施形態において、シグナルを提供することができる少なくとも１つの標識部分を含む切断構造が、形成される。好ましくは、形成された切断構造は、検出可能なシグナルの生成をクエンチするために効果的な位置にある、相互作用シグナル生成標識部分の対を含み、ここで、その標識部分は、ＦＥＮヌクレアーゼ切断に感受性である部位によって分断されており、そのＦＥＮヌクレアーゼに感受性である部位で切断することによって、ＦＥＮヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を、第１の相互作用シグナル生成標識部分と第２の相互作用シグナル生成標識部分とで分断することが可能となり、検出可能なシグナルが生成される。より好ましくは、相互作用シグナル生成部分の対は、クエンチャー部分および蛍光部分を含む。
【０１２７】
別の実施形態において、本方法は、遊離された非相補的な５’フラップを定量化する工程をさらに含む。
【０１２８】
なおも別の実施形態において、下流プローブの３’末端は、下流プローブの３’伸長を防ぐために保護されている。好ましくは，保護された３’末端の一方または両方が、標的核酸に非相補的な塩基、または、核酸の合成もしくは伸長を可能にする条件下でのヌクレオチド三リン酸の付加を阻害する修飾を含む。好ましくは、保護された３’末端の一方または両方は：
ａ）ジデオキシヌクレオチド；
ｂ）３’ヒドロキシルがリン酸基で置換されているヌクレオチド；または
ｃ）３’炭素または３’酸素に結合しているレポーター部分を有するヌクレオチド
を含む。
【０１２９】
本発明はまた、サンプル中で切断構造を形成し、切断を切断し、そして標的核酸に相補的な核酸を転写するための方法も提供し、ここで、その方法は：
ａ）
３’から５’の順で、第１のハイブリダイゼーション部位、第２のハイブリダイゼーション部位および第３のハイブリダイゼーション部位を含む標的核酸、
第１のハイブリダイゼーション部位に相補的な上流オリゴヌクレオチド伸長プライマー、
第２のハイブリダイゼーション部位に相補的な上流オリゴヌクレオチド（ここで、上流オリゴヌクレオチドは、保護された３’末端を含む）、および
５’領域および３’領域を含む下流プローブ（ここで、３’領域は、第３のハイブリダイゼーション部位に相補的であり、５’領域は、下流プローブが標的にアニーリングしているとき、非相補的な５’フラップを形成する）
を提供する工程；
ｂ）標的核酸に上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブをアニーリングして、切断構造を形成する工程；
ｃ）ヌクレアーゼを用いて切断構造を切断して、非相補的な５’フラップを遊離する工程；
ｄ）上流伸長プライマーを標的核酸にアニーリングする工程；
ｅ）上流オリゴヌクレオチド伸長プライマーを伸長して、標的核酸に相補的な鎖を合成する工程；および
ｆ）遊離された非相補的な５’フラップを検出し、遊離された非相補的な５’フラップが、サンプル中に標的核酸が存在することを示唆する工程
を含む。
【０１３０】
１つの実施形態において、本方法は、標的核酸の少なくとも一部を含む、第２の鎖を開始するオリゴヌクレオチド逆方向伸長プライマーを提供する工程をさらに含む。
別の実施形態において、前記方法は、ＰＣＲにとって許容される条件下で行われる。
【０１３１】
さらに別の実施形態において、本方法は、さらに：
ｇ）標的核酸の少なくとも一部を含む、第２の鎖を開始するオリゴヌクレオチド逆方向伸長プライマーを提供する工程；
ｈ）第１、第２および第３のハイブリダイゼーション部位に対応する相補鎖に、上記部位から下流の逆方向伸長プライマーをアニーリングする工程；
ｉ）逆方向伸長プライマーから鎖を伸長して、標的核酸の少なくとも一部ならびに第１、第２および第３のハイブリダイゼーション部位を含む第２の鎖を生成する工程；
ｊ）相補鎖を第２の鎖から変性する工程；および
ｋ）ＰＣＲサイクル工程に許容的な条件下で、変性、伸長および切断のサイクルを繰り返して、標的配列を増幅し、切断構造を形成し、そして切断構造を切断する工程
を含む。
【０１３２】
別の実施形態において、下流プローブの５’フラップは、ｎ個のヌクレオチドからなり、第２のハイブリダイゼーション部位および第３のハイブリダイゼーション部位は、ｍ個のヌクレオチドによって分断されており、ここで、ここで、ｎは、１〜２５の整数であり、かつ、ｍは、ｎより大きい整数である。
別の実施形態において、上流シグナルオリゴヌクレオチドおよび下流プローブは、上流伸長プライマーよりストリンジェントな条件下で標的配列にアニーリングする。
【０１３３】
さらに別の実施形態において、ヌクレアーゼは、ＦＥＮヌクレアーゼを含む。より好ましくは、ヌクレアーゼは、アルカエグロブス・フルギドゥス（Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタノコックス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、およびピロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のＦＥＮヌクレアーゼ酵素からなる群から選択される。ヌクレアーゼは、Ｔａｑ、ＴｆｌおよびＢｃａから得られうる。
【０１３４】
本発明はまた、サンプル中で切断構造を形成し、その切断構造を切断し、そして標的核酸に相補的な核酸を転写するための方法も提供し、ここで、その方法は：
ａ）
３’から５’の順で、第１のハイブリダイゼーション部位、第２のハイブリダイゼーション部位および第３のハイブリダイゼーション部位を含む標的核酸、
第１のハイブリダイゼーション部位に相補的な上流オリゴヌクレオチド伸長プライマー、
第２のハイブリダイゼーション部位に相補的な上流オリゴヌクレオチド（ここで、上流オリゴヌクレオチドは、保護された３’末端を含む）、および
５’領域および３’領域を含む下流プローブ（ここで、３’領域は、第３のハイブリダイゼーション部位に相補的であり、５’領域は、下流プローブが標的にアニーリングしているとき、非相補的な５’フラップを形成する）
を提供する工程；
ｂ）標的核酸に上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブをアニーリングして、切断構造を形成する工程；
ｃ）ピロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のＦＥＮヌクレアーゼ酵素を用いて切断構造を切断して、非相補的な５’フラップを遊離する工程；および
ｄ）上流伸長プライマーを標的核酸にアニーリングする工程；
ｅ）上流伸長プライマーを伸長して、標的核酸に相補的な鎖を合成する工程；および
ｆ）遊離された非相補的な５’フラップを検出し、遊離された非相補的な５’フラップが、サンプル中に標的核酸が存在することを示唆する工程
を含む。
【０１３５】
別の実施形態において、本方法は、標的核酸の少なくとも一部を含む、第２の鎖を開始するオリゴヌクレオチド逆方向伸長プライマーを提供する工程をさらに含む。
さらに別の実施形態において、本方法は、ＰＣＲにとって許容される条件下で行われる。
【０１３６】
なおも別の実施形態において、本方法は、さらに：
ｇ）標的核酸の少なくとも一部を含む、第２の鎖を開始するオリゴヌクレオチド逆方向伸長プライマーを提供する工程；
ｈ）第１、第２および第３のハイブリダイゼーション部位に対応する相補鎖に、上記部位から下流の逆方向伸長プライマーをアニーリングする工程；
ｉ）逆方向伸長プライマーから鎖を伸長して、標的核酸の少なくとも一部ならびに第１、第２および第３のハイブリダイゼーション部位を含む第２の鎖を生成する工程；
ｊ）相補鎖を第２の鎖から変性する工程；および
ｋ）ＰＣＲサイクル工程に許容的な条件下で、変性、伸長および切断のサイクルを繰り返して、標的配列を増幅し、切断構造を形成し、そして切断構造を切断する工程
を含む。
【０１３７】
さらに別の実施形態において、下流プローブの非相補的な５’フラップは、ｎ個のヌクレオチドからなり、第１のハイブリダイゼーション部位および第２のハイブリダイゼーション部位は、ｍ個のヌクレオチドによって分断されており、ここで、ここで、ｎは、１〜２５の整数であり、かつ、ｍは、ｎより大きい整数である。
【０１３８】
なおも別の実施形態において、シグナルを提供することができる少なくとも１つの標識部分を含む切断構造が形成される。好ましくは、形成された切断構造は、検出可能なシグナルの生成をクエンチするために効果的な位置にある、相互作用シグナル生成標識部分の対を含み、ここで、その標識部分は、ＦＥＮヌクレアーゼ切断に感受性である部位によって分断されており、そのＦＥＮヌクレアーゼに感受性である部位で切断することによって、ＦＥＮヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を、第１の相互作用シグナル生成標識部分と第２の相互作用シグナル生成標識部分とで分断することが可能となり、検出可能なシグナルが生成される。より好ましくは、相互作用シグナル生成部分の対は、クエンチャー部分および蛍光部分を含む。
別の実施形態において、本方法は、遊離された非相補的な５’フラップを定量化する工程をさらに含む。
さらに別の実施形態において、下流プローブの３’末端は、下流プローブの３’伸長を防ぐために保護されている。
【０１３９】
なおも別の実施形態において、保護された３’末端の一方または両方が、標的核酸に非相補的な塩基、または、核酸の合成もしくは伸長を可能にする条件下でのヌクレオチド三リン酸の付加を阻害する修飾を含む。好ましくは、保護された３’末端の一方または両方は：
ａ）ジデオキシヌクレオチド；
ｂ）３’ヒドロキシルがリン酸基で置換されているヌクレオチド；または
ｃ）３’炭素または３’酸素に結合しているレポーター部分を有するヌクレオチド
を含む。
【０１４０】
本発明はまた、サンプル中で切断構造を形成し、切断を切断し、標的核酸に相補的な核酸を転写し、そして標的核酸を増幅するための方法も提供し、ここで、その方法は：
ａ）
領域Ａ’を含む標的核酸、
非相補的な５’タグ領域（Ｘ）および３’プライミング領域（Ａ）を含む順方向伸長プライマー（ここで、５’タグ領域は、増幅の前に標的に相補的でなく、３’プライミング領域（Ａ）は、標的核酸内の領域（Ａ’）に相補的である）、
領域Ｘの少なくとも一部を含む上流オリゴヌクレオチド（ここで、上流オリゴヌクレオチドは、保護された３’末端を有する）、
５’領域および３’領域を含む下流プローブ（ここで、３’領域は、領域Ａの少なくとも一部を含み、５’領域は、下流プローブが標的核酸のＡ’部にアニーリングしているとき、非相補的な５’フラップを形成する）、および
標的核酸の少なくとも一部を含む、第２の鎖を開始する逆方向伸長プライマー
を提供する工程；
ｂ）標的核酸に順方向伸長プライマーの領域Ａをアニーリングする工程；
ｃ）順方向伸長プライマーを伸長して、標的核酸の相補鎖（領域Ａおよび領域Ｘを含む）を生成する工程；
ｄ）標的核酸および相補鎖を変性する工程；
ｅ）領域Ａの下流の相補鎖の領域に逆方向伸長プライマーをアニーリングする工程；
ｆ）逆方向伸長プライマーから鎖を伸長して、標的核酸配列の少なくとも一部、領域Ａ’および５’タグに相補的な領域（Ｘ’）を含む第２の鎖を生成する工程；
ｇ）相補鎖を第２の鎖から変性する工程；
ｈ）上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを第２の鎖にアニーリングして、切断構造を形成する工程；
ｉ）ヌクレアーゼを用いて切断構造を切断して、下流オリゴヌクレオチドの非相補的な５’フラップを遊離する工程；および
ｊ）遊離された非相補的な５’フラップを検出し、遊離された非相補的な５’フラップが、サンプル中に標的核酸が存在することを示唆する工程
を含む。
【０１４１】
１つの実施形態において、本方法は、ＰＣＲサイクル工程に許容的な条件下で、変性、伸長および切断のサイクルを繰り返して、標的配列を増幅し、切断構造を形成し、そして切断構造を切断する工程をさらに含む。
１つの実施形態において：
ａ）Ｘは、５〜２５ヌクレオチドであり；
ｂ）Ａは、５〜２５ヌクレオチドであり；そして
ｃ）逆方向プライマーは、５〜２５ヌクレオチドである。
別の実施形態において、核酸ポリメラーゼは、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。
さらに別の実施形態において、下流プローブの５’フラップは、ｎ個のヌクレオチドからなり、上流シグナルオリゴヌクレオチドおよび下流プローブのハイブリダイゼーション部位は、ｍ個のヌクレオチドによって分断されており、ここで、ｎは、１〜２５の整数であり、かつ、ｍは、ｎより大きい整数である。
なおも別の実施形態において、ヌクレアーゼは、ＦＥＮヌクレアーゼを含む。好ましくは、ＦＥＮヌクレアーゼは、アルカエグロブス・フルギドゥス（Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタノコックス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、およびピロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のＦＥＮヌクレアーゼ酵素からなる群から選択される。ヌクレアーゼは、Ｔａｑ、ＴｆｌおよびＢｃａから得られうる。
【０１４２】
さらに別の実施形態において、シグナルを提供することができる少なくとも１つの標識部分を含む切断構造が、形成される。好ましくは、形成された切断構造は、検出可能なシグナルの生成をクエンチするために効果的な位置にある、相互作用シグナル生成標識部分の対を含み、ここで、その標識部分は、ＦＥＮヌクレアーゼ切断に感受性である部位によって分断されており、そのＦＥＮヌクレアーゼに感受性である部位で切断することによって、ＦＥＮヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を、第１の相互作用シグナル生成標識部分と第２の相互作用シグナル生成標識部分とで分断することが可能となり、検出可能なシグナルが生成される。より好ましくは、相互作用シグナル生成部分の対は、クエンチャー部分および蛍光部分を含む。
別の実施形態において、本方法は、遊離された非相補的な５’フラップを定量化する工程をさらに含む。
【０１４３】
さらに別の実施形態において、下流プローブの３’末端は、下流プローブの３’伸長を防ぐために保護されている。好ましくは、保護された３’末端の一方または両方が、標的核酸に非相補的な塩基、または、核酸の合成もしくは伸長を可能にする条件下でのヌクレオチド三リン酸の付加を阻害する修飾を含む。好ましくは、保護された３’末端の一方または両方は：
ａ）ジデオキシヌクレオチド；
ｂ）３’ヒドロキシルがリン酸基で置換されているヌクレオチド；または
ｃ）３’炭素または３’酸素に結合しているレポーター部分を有するヌクレオチド
を含む。
【０１４４】
本発明はまた、サンプル中で切断構造を形成し、その切断構造を切断し、標的核酸に相補的な核酸を転写し、そして標的核酸を増幅するための方法も提供し、ここで、その方法は：
ａ）
領域Ａ’を含む標的核酸、
非相補的な５’タグ領域（Ｘ）および３’プライミング領域（Ａ）を含む順方向伸長プライマー（ここで、５’タグ領域は、増幅の前に標的に相補的でなく、３’プライミング領域（Ａ）は、標的核酸内の領域（Ａ’）に相補的である）、
領域Ｘの少なくとも一部を含む上流オリゴヌクレオチド（ここで、上流オリゴヌクレオチドは、保護された３’末端を有する）、
５’領域および３’領域を含む下流プローブ（ここで、３’領域は、領域Ａの少なくとも一部を含み、５’領域は、下流プローブが標的核酸のＡ’部にアニーリングしているとき、非相補的な５’フラップを形成する）、および
標的核酸の少なくとも一部を含む、第２の鎖を開始する逆方向伸長プライマー
を提供する工程；
ｂ）標的核酸に順方向伸長プライマーの領域Ａをアニーリングする工程；
ｃ）順方向伸長プライマーを伸長して、標的核酸の相補鎖（領域Ａおよび領域Ｘを含む）を生成する工程；
ｄ）標的核酸および相補鎖を変性する工程；
ｅ）領域Ａの下流の相補鎖の領域に逆方向伸長プライマーをアニーリングする工程；
ｆ）逆方向伸長プライマーから鎖を伸長して、標的核酸配列の少なくとも一部、領域Ａ’および５’タグに相補的な領域（Ｘ’）を含む第２の鎖を生成する工程；
ｇ）相補鎖を第２の鎖から変性する工程；
ｈ）上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを第２の鎖にアニーリングして、切断構造を形成する工程；
ｉ）ピロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のＦＥＮヌクレアーゼ酵素を用いて切断構造を切断して、下流のオリゴヌクレオチドの非相補的な５’フラップを遊離する工程；および
ｊ）遊離された非相補的な５’フラップを検出し、遊離された非相補的な５’フラップが、サンプル中に標的核酸が存在することを示唆する工程
を含む。
【０１４５】
１つの実施形態において、本方法は、ＰＣＲサイクル工程に許容的な条件下で、変性、伸長および切断のサイクルを繰り返して、標的配列を増幅し、切断構造を形成し、そして切断構造を切断する工程をさらに含む。
本発明はまた、サンプル中で切断構造を形成し、その切断構造を切断し、標的核酸に相補的な核酸を転写し、そして標的核酸を増幅するための方法も提供し、ここで、その方法は：
ａ）
Ａ’領域およびＴ’領域を３’から５’に含む標的核酸（ここで、Ａ’領域およびＴ’領域は、隣接していない）、
２つの小領域（Ｘ１およびＸ２）を含む５’タグ領域を含む順方向伸長プライマー（ここで、Ｘ１は、Ｘ２および３’プライミング領域（Ａ）の上流であり、５’タグ領域は、増幅の前に標的に相補的でなく、そして３’プライミング領域（Ａ）は、標的核酸の領域Ａ’に相補的である）、
領域Ｘ１の少なくとも一部を含む上流オリゴヌクレオチド（保護された３’末端を有する）、
５’領域および３’領域を含む下流プローブ（ここで、３’領域は、領域Ｘ２の少なくとも一部、および、領域Ｘ２の下流であり、標的核酸のＴ’に相補的である領域Ｔを含み、そして、下流プローブが標的核酸のＡ’領域にアニーリングしているとき、５’領域は、非相補的な５’フラップを形成する）および
標的核酸の少なくとも一部を含む第２の鎖を開始する逆方向伸長プライマー
を提供する工程；
ｂ）標的核酸のＡ’領域およびＴ’領域に順方向伸長プライマーの相補的な領域Ａをアニーリングする工程
ｃ）順方向伸長プライマーを伸長して、標的核酸の相補鎖（領域Ａならびに領域Ｘ１およびＸ２を含む）を生成する工程；
ｄ）標的核酸および相補鎖を変性する工程；
ｅ）逆方向伸長プライマーを領域Ｔの下流の相補鎖の領域にアニーリングする工程；
ｆ）逆方向伸長プライマーから鎖を伸長して、標的核酸配列の少なくとも一部、領域Ａ’、領域Ｔ’および５’タグに相補的な領域（Ｘ１’、Ｘ２’）を含む第２の鎖を生成する工程；
ｇ）相補鎖を第２の鎖から変性する工程；
ｈ）上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを第２の鎖にアニーリングして、切断構造を形成する工程；
ｉ）ヌクレアーゼを用いて切断構造を切断して、下流オリゴヌクレオチドの非相補的な５’フラップを遊離する工程；および
ｊ）遊離された非相補的な５’フラップを検出し、遊離された非相補的な５’フラップが、サンプル中に標的核酸が存在することを示唆する工程
を含む。
【０１４６】
１つの実施形態において、本方法は、ＰＣＲサイクル工程に許容的な条件下で、変性、伸長および切断のサイクルを繰り返して、標的配列を増幅し、切断構造を形成し、そして切断構造を切断する工程をさらに含む。
別の実施形態において：
ａ）Ｘ１は、５〜２５ヌクレオチドであり；
ｂ）Ｘ２およびＴは、各々独立して１〜２５ヌクレオチドであり、Ｘ２およびＴは、あわせて５〜３０ヌクレオチドであり；
ｃ）Ａは、５〜２５ヌクレオチドであり；そして
ｄ）逆方向プライマーは、５〜２５ヌクレオチドである。
さらに別の実施形態において、核酸ポリメラーゼは、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。
【０１４７】
なおも別の実施形態において、
ａ．下流プローブの５’フラップは、ｎ個のヌクレオチドからなり、上流シグナルオリゴヌクレオチドおよび下流プローブのハイブリダイゼーション部位は、ｍ個のヌクレオチドによって分断されており、ここで、ｎは、１〜２５の整数であり、かつ、ｍは、ｎより大きい整数である。
【０１４８】
なおも別の実施形態において、ヌクレアーゼは、ＦＥＮヌクレアーゼを含む。好ましくは、ＦＥＮヌクレアーゼは、アルカエグロブス・フルギドゥス（Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタノコックス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、およびピロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のＦＥＮヌクレアーゼ酵素からなる群から選択される。ヌクレアーゼは、Ｔａｑ、ＴｆｌおよびＢｃａから得られうる。
【０１４９】
別の実施形態において、シグナルを提供することができる少なくとも１つの標識部分を含む切断構造が、形成される。好ましくは、形成された切断構造は、検出可能なシグナルの生成をクエンチするために効果的な位置にある、相互作用シグナル生成標識部分の対を含み、ここで、その標識部分は、ＦＥＮヌクレアーゼ切断に感受性である部位によって分断されており、そのＦＥＮヌクレアーゼに感受性である部位で切断することによって、ＦＥＮヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を、第１の相互作用シグナル生成標識部分と第２の相互作用シグナル生成標識部分とで分断することが可能となり、検出可能なシグナルが生成される。より好ましくは、相互作用シグナル生成部分の対は、クエンチャー部分および蛍光部分を含む。
別の実施形態において、本方法は、遊離された非相補的な５’フラップを定量化する工程をさらに含む。
【０１５０】
さらに別の実施形態において、下流プローブの３’末端は、下流プローブの３’伸長を防ぐために保護されている。好ましくは、保護された３’末端の一方または両方が、標的核酸に非相補的な塩基、または、核酸の合成もしくは伸長を可能にする条件下でのヌクレオチド三リン酸の付加を阻害する修飾を含む。好ましくは，保護された３’末端の一方または両方は：
ａ）ジデオキシヌクレオチド；
ｂ）３’ヒドロキシルがリン酸基で置換されているヌクレオチド；または
ｃ）３’炭素または３’酸素に結合しているレポーター部分を有するヌクレオチド
を含む。
【０１５１】
本発明は、サンプル中で切断構造を形成し、その切断構造を切断し、標的核酸に相補的な核酸を転写し、そして標的核酸を増幅するための方法を提供し、ここで、その方法は：
ａ）
Ａ’領域およびＴ’領域を３’から５’に含む標的核酸（ここで、前記Ａ’領域およびＴ’領域は、隣接していない）、
２つの小領域（Ｘ１およびＸ２）を含む５’タグ領域を含む順方向伸長プライマー（ここで、Ｘ１は、Ｘ２および３’プライミング領域（Ａ）の上流であり、５’タグ領域は、増幅の前に標的に相補的でなく、そして３’プライミング領域（Ａ）は、標的核酸の領域（Ａ’）に相補的である）、
領域Ｘ１の少なくとも一部を含む上流オリゴヌクレオチド（保護された３’末端を有する）、
５’領域および３’領域を含む下流プローブ（ここで、３’領域は、領域Ｘ２の少なくとも一部、および、領域Ｘ２の下流であり、標的核酸のＴ’に相補的である領域Ｔを含み、そして、下流プローブが標的核酸のＡ’領域にアニーリングしているとき、５’領域は、非相補的な５’フラップを形成する）および
標的核酸の少なくとも一部を含む、第２の鎖を開始する逆方向伸長プライマー
を提供する工程；
ｂ）標的核酸のＡ’領域およびＴ’領域に順方向伸長プライマーの相補的な領域Ａをアニーリングする工程
ｃ）順方向伸長プライマーを伸長して、標的核酸の相補鎖（領域Ａならびに領域Ｘ１およびＸ２を含む）を生成する工程；
ｄ）標的核酸および相補鎖を変性する工程；
ｅ）逆方向伸長プライマーを領域Ｔの下流の相補鎖の領域にアニーリングする工程；
ｆ）逆方向伸長プライマーから鎖を伸長して、標的核酸配列の少なくとも一部、領域Ａ’、  領域Ｔ’および５’タグに相補的な領域（Ｘ１’、Ｘ２’）を含む第２の鎖を生成する工程；
ｇ）相補鎖を第２の鎖から変性する工程；
ｈ）上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを第２の鎖にアニーリングして、切断構造を形成する工程
ｉ）ピロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のＦＥＮヌクレアーゼを用いて切断構造を切断して、下流オリゴヌクレオチドの非相補的な５’フラップを遊離する工程；および
ｊ）遊離された非相補的な５’フラップを検出し、遊離された非相補的な５’フラップが、サンプル中に標的核酸が存在することを示唆する工程
を含む。
【０１５２】
１つの実施形態において、本方法は、ＰＣＲサイクル工程に許容的な条件下で、変性、伸長および切断のサイクルを繰り返して、標的配列を増幅し、切断構造を形成し、そして切断構造を切断する工程をさらに含む。
【０１５３】
別の実施形態において、下流プローブの非相補的な５’フラップは、ｎ個のヌクレオチドからなり、第１のハイブリダイゼーション部位および第２のハイブリダイゼーション部位は、ｍ個のヌクレオチドによって分断されており、ここで、ｎは、１〜２５の整数であり、かつ、ｍは、ｎより大きい整数である。
【０１５４】
さらに別の実施形態において、シグナルを提供することができる少なくとも１つの標識部分を含む切断構造が、形成される。好ましくは、形成された切断構造は、検出可能なシグナルの生成をクエンチするために効果的な位置にある、相互作用シグナル生成標識部分の対を含み、ここで、その標識部分は、ＦＥＮヌクレアーゼ切断に感受性である部位によって分断されており、そのＦＥＮヌクレアーゼに感受性である部位で切断することによって、ＦＥＮヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を、第１の相互作用シグナル生成標識部分と第２の相互作用シグナル生成標識部分とで分断することが可能となり、検出可能なシグナルが生成される。より好ましくは、相互作用シグナル生成部分の対は、クエンチャー部分および蛍光部分を含む。
別の実施形態において、本方法は、遊離された非相補的な５’フラップを定量化する工程をさらに含む。
【０１５５】
さらに別の実施形態において、下流プローブの３’末端は、下流プローブの３’伸長を防ぐために保護されている。
好ましくは、保護された３’末端の一方または両方が、標的核酸に非相補的な塩基、または、核酸の合成もしくは伸長を可能にする条件下でのヌクレオチド三リン酸の付加を阻害する修飾を含む。好ましくは、保護された３’末端の一方または両方は：
ａ）ジデオキシヌクレオチド；
ｂ）３’ヒドロキシルがリン酸基で置換されているヌクレオチド；または
ｃ）３’炭素または３’酸素に結合しているレポーター部分を有するヌクレオチド
を含む。
【０１５６】
Ｉ．ヌクレアーゼ
本発明の有用なヌクレアーゼとしては、５’ヌクレオチド内部結合分解（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性を有する任意の酵素、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼＩならびにＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ）およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｌ）が挙げられる。本発明の有用なヌクレアーゼとしては、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ種由来の酵素（Ｔａｑ、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ、Ｔｃａ（ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｔｂｒ（ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種由来の酵素（Ｂｓｔ、Ｂｃａ、Ｍａｇｅｎｔａ（完全長ポリメラーゼ、Ｎ切断型バージョンではない））、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ種由来の酵素（Ｔｍａ（ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｎｅ（ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ））ならびにＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩを含む真正細菌のＤＮＡポリメラーゼＩが挙げられるがこれらに限定されない）も挙げられる。用語ヌクレアーゼはまた、ＦＥＮヌクレアーゼを具体的に表現したものである。本発明の有用なヌクレアーゼは、標的核酸にハイブリダイズしていないプローブもしくはプライマー、または、プローブもしくはプライマーにハイブリダイズしていない標的核酸のいずれかを切断することができない。
【０１５７】
ＦＥＮ−１は、５’一本鎖フラップ鎖の骨格を特異的に認識し、このアームの切断部位を見つけ出す、約４０ｋＤａの二価金属イオン依存性エキソおよびエンドヌクレアーゼであり、その切断部位は、二重鎖ＤＮＡの２本の鎖が一本鎖アームと隣接する接合部に位置する。ヌクレオチド内部結合分解活性とヌクレオチド末端（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）結合分解活性の両方が、フラップまたはニックにおける最５’位の塩基に対してほとんど感受性を示さない。ＦＥＮ−１ヌクレオチド内部結合および末端結合分解基質の結合および切断は、上流オリゴヌクレオチド（フラップ隣接鎖またはプライマー）によって刺激される。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｏｌ  Ｉに対する場合でもある。この酵素のエンドヌクレアーゼ活性は、５’フラップ長とは無関係であり、１ヌクレオチドと同程度に小さい５’フラップを切断する。エンドヌクレアーゼ活性およびエキソヌクレアーゼ活性は、基質の化学的性質に非感受性であり、ＤＮＡとＲＮＡの両方を切断する。
【０１５８】
ヌクレオチド内部結合分解活性とヌクレオチド末端結合分解活性の両方が、生理学的範囲内の塩濃度によって阻害される。０ｍＭ  ＮａＣｌと比較して５０ｍＭ  ＮａＣｌではエキソヌクレアーゼ活性は５０倍阻害される。
エンドヌクレアーゼ活性は、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて７倍だけ阻害される（Ｌｉｅｂｅｒ  １９９７，前出で概説）。
【０１５９】
５’−ＯＨ末端は、５’フラップ基質に付着するＦＥＮ−１に対する良好な基質であるが、別の二本鎖ＤＮＡ構造内にニックの一部が入っているとき、５’−ＯＨ末端は、非常に不良な基質として作用する。末端のリン酸による静電反発は、基質を偽フラップ構造（ＦＥＮ−１に対して活性型の基質をもたらす）にすることを助ける可能性がある。そのような説明から、フラップの５’ｓｓＤＮＡ末端またはニックの偽フラップ構造に、ＦＥＮ−１を付着させる単一の活性部位および単一のメカニズムが示唆されうる。ニックでの至適活性には、塩基対形成を不安定化する非常に低いＭｇ＋２濃度および一価の塩濃度が必要であり、また、その至適活性によって、ニックがフラップになることが助けられうる、という知見は、上記モデルと一致する。Ｍｇ＋２濃度および一価の塩濃度が高いと、ニックからフラップにならないことがあり、そしてフラップに変換するために必要な、ニック構造またはギャップ構造の切断が阻害されうる。安定なフラップ構造の切断は、中程度のＭｇ＋２レベルにおいて最適であり、Ｍｇ＋２濃度が上がってもその切断は低下しない。これは、フラップ基質が、その構造を完成するために塩基対を融解する必要がないためであり；ゆえに、フラップ基質は、完全にＭｇ＋２に非感受性である。ヌクレオチド内部結合分解活性が、一価の塩とともに低下するにもかかわらず、その低下は、ヌクレオチド末端結合分解活性について見られるものほど激しくない。さらに、１ヌクレオチドフラップが、有効な基質であることが以前に示されている。ＦＥＮ−１がエキソヌクレアーゼとして機能すると解釈されるとき、これらの知見のすべてが、分解産物のサイズが１〜数ヌクレオチド長と多様であるという事実と一致する。ニックが様々な長さのフラップになることは、Ｇ／Ｃ含有量に依存して局所的配列によって変動すると予想される。要約すれば、ニックが一過性のフラップを形成することは、ＦＥＮ−１のヌクレオチド末端結合分解活性が、ヌクレオチド内部結合分解活性と同じであることを意味する（Ｌｉｅｂｅｒ，１９９７、前出で概説）。
【０１６０】
ＦＥＮ−１のエンドヌクレアーゼ活性およびエキソヌクレアーゼ活性は、アクセサリータンパク質を必要とすることなく、ＤＮＡとＲＮＡの両方を切断する。しかしながら、複製フォークでは、ＦＥＮ−１は、ＤＮＡヘリカーゼおよび増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）（ＤＮＡポリメラーゼに対する進化性因子）を含む他のタンパク質と相互作用する。ＰＣＮＡは、ＦＥＮ−１のヌクレオチド内部結合分解およびヌクレオチド末端結合分解活性を有意に刺激する。
【０１６１】
ＦＥＮ−１酵素は、いくつかのより小さなバクテリオファージ５’３’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔ５  ５’エキソヌクレアーゼおよびＴ４  ＲＮアーゼＨ）ならびにより大きな真核生物ヌクレオチド除去修復酵素（例えば、ＸＰＧ）（酸化性塩基損傷の転写共役修復においても作用する）に機能的に関連する。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓなどの真正細菌において、岡崎プロセシングは、ＰｏｌＩ５’３’エキソヌクレアーゼドメインによってもたらされる。これらの細菌およびファージの酵素は、ＦＥＮ−１と限られた配列相同性を有する２つの領域を共有し、それらの領域は、Ｎ（Ｎ末端）領域およびＩ（中間）領域と呼ばれ、残基類似性は、約７個の保存的酸性残基に集中している。Ｔ４  ＲＮａｓｅ  ＨおよびＴ５エキソヌクレアーゼの結晶構造ならびに突然変異誘発データに基づいて、これらの残基が、ＤＮＡ加水分解への影響に必要な２つのＭｇ＋２イオンに結合すると提案されている；しかしながら、各金属が触媒サイクルにおいて果たす役割は、各酵素に対してわずかに異なり、十分に解明されていない（Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ｂ，前出で概説）。
【０１６２】
本発明において有用なＦＥＮ−１酵素をコードするＦｅｎ−１遺伝子としては、マウスのｆｅｎ−１、ヒトのｆｅｎ−１、ラットのｆｅｎ−１、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓのｆｅｎ−１ならびに４つの古細菌、Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓおよびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のｆｅｎ−１遺伝子が挙げられる。ＦＥＮ−１酵素をコードするｃＤＮＡクローンは、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ００４１１１およびＬ３７３７４）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｌ２６３２０）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡ８１９７９３）、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ６８１４１およびＵ６４５６３）およびＰ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０１３４９７）から単離されている。Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのフラップエンドヌクレアーゼに対する完全なヌクレオチド配列もまた、決定されている（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ００５２１５）。ＦＥＮ−１ファミリーには、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＲＡＤ２７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｚ２８１１３  Ｙ１３１３７）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅのＲＡＤ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｘ７７０４１）も含まれる。Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｌｕｍの古細菌ゲノムもまた配列決定されている。ＦＥＮ−１と原核生物およびウイルスの５’３’エキソヌクレアーゼとの配列類似性は、低いが、真核生物界のＦＥＮ−１は、アミノ酸レベルで非常に保存されており、ヒトとＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのタンパク質では、６０％同一であり、７８％類似である。３つの古細菌のＦＥＮ−１タンパク質もまた、真核生物のＦＥＮ−１酵素と非常に相同である（Ｍａｔｓｕｉら、１９９９．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１８２９７，Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ｂ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：２７１５４およびＬｉｅｂｅｒ，１９９７，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，１９：２３３に概説）。
ヒトと他のＦＥＮ−１ファミリーメンバーとの、２つの保存されたヌクレアーゼドメイン（Ｎ末端またはＮドメインおよび中間またはＩドメイン）の配列類似性は、９２％（マウス）、７９％（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、７７％（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、７２％（Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、７６％（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）および７４％（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）である。
【０１６３】
ＦＥＮ−１は、５’一本鎖フラップ鎖の骨格を特異的に認識し、このフラップアームを、二重鎖ＤＮＡおよび一本鎖アームの２本の鎖の間の接合部に位置する切断部位に移動させる。フラップの上流の鎖（時折、フラップ隣接鎖またはプライマー鎖と呼ばれる）が、除去される場合、生じる構造は、偽Ｙと呼ばれる（図１を参照のこと）。この構造は、ＦＥＮ−１によって切断されるが、効率は、２０〜１００倍低い。ＦＥＮ−１は、３’一本鎖フラップを切断しない。しかしながら、エキソヌクレアーゼとして作用するＦＥＮ−１は、ギャップまたはニックを含むｄｓＤＮＡ基質を加水分解する（Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ａ，前出、Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９９ｂ，前出およびＬｉｅｂｅｒ  １９９７，前出に概説）。ヌクレオチド末端結合分解的には、ＦＥＮ−１は、ニックにおいて作用し、低効率ではあるが、ｄｓＤＮＡ上のギャップまたは陥凹５’末端において作用する。ギャップ構造において、ＦＥＮ−１の結合および切断の効率は、ギャップサイズが約５ヌクレオチドまで大きくなるにつれて低下し、そしてｄｓＤＮＡ内の陥凹５’末端に対する活性と等価の切断のレベルで安定化する。平滑末端ｄｓＤＮＡ、陥凹３’末端およびｓｓＤＮＡは、切断されない（Ｌｉｅｂｅｒ  １９９７，前出で概説）。
【０１６４】
本発明の有用なＦＥＮヌクレアーゼは、種々の生物から単離されており、その生物としては、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ００４１１１およびＬ３７３７４）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｌ２６３２０）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡ８１９７９３）、酵母（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｚ２８１１３  Ｙ１３１３７およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｘ７７０４１）およびｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ６８１４１およびＵ６４５６３）が挙げられる。当該分野で周知の従来技術を用いて、そのような酵素をクローニングおよび過剰発現することができる。
【０１６５】
本発明のＦＥＮヌクレアーゼは、好ましくは熱安定性である。熱安定性ＦＥＮヌクレアーゼは、４つの古細菌（ａｒｃｈｅａｅｂａｃｔｅｒｉａ）を含む種々の熱安定性生物から単離および特徴付けされている。Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓのフラップエンドヌクレアーゼに対するｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０１３４９７）およびアミノ酸配列（Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ａ，前出およびＨｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ｂ）が決定されている。Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのフラップエンドヌクレアーゼに対する完全ヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ００５２１５）およびアミノ酸配列（Ｍａｔｓｕｉら、前出）もまた決定されている。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのフラップエンドヌクレアーゼに対するアミノ酸配列（Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ｂおよびＭａｔｓｕｉら、１９９９  前出）およびＡ．ｆｕｌｇｉｄｕｓのフラップエンドヌクレアーゼに対するアミノ酸配列（Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ｂ）もまた決定されている。
【０１６６】
当該分野で周知の技術ならびにＨｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ａ，前出、Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ｂ，Ｋａｉｓｅｒら、１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：２１３８７およびＭａｔｕｓｉら、前出ならびに「Ｐｆｕ  ＦＥＮ−１のクローニング」と題されている本明細書中の実施例２に記載されている技術を用いて、熱安定性ＦＥＮ−１酵素をクローニングおよび過剰発現することができる。
ＦＥＮ酵素のエンドヌクレアーゼ活性は、以下の方法を含む種々の方法によって測定されうる。
【０１６７】
Ａ．ＦＥＮエンドヌクレアーゼ活性アッセイ
１．鋳型（例えば、図２に示されている）を用いて、本発明のＦＥＮヌクレアーゼの活性を評価する。
鋳型１は、以下の配列を有する５’３３Ｐ標識オリゴヌクレオチド（Ｈｅｌｔｅｓｔ４）である：５’ＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧ３’（配列番号：１）。Ｈｅｌｔｅｓｔ４の下線部は、Ｍ１３ｍｐ１８＋に相補的な領域を示す。切断産物は、配列ＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴ（配列番号：２）を有する１８ヌクレオチドのフラグメントである。
Ｈｅｌｔｅｓｔ４は、Ｍ１３に結合して、相補的な二本鎖ドメインならびに非相補的な５’オーバーハングを生成する。この二重鎖は、ヘリカーゼアッセイでも使用される鋳型２（図２）を形成する。鋳型３（図２）は、Ｍ１３に結合しており、Ｈｅｌｔｅｓｔ４にすぐ隣接しているさらなるプライマー（ＦＥＮＡＳ）を有する。ＦＥＮＡＳの配列は：５’ＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＡ３’（配列番号：３）である。鋳型３の存在下で、ＦＥＮは、Ｈｅｌｔｅｓｔ４の遊離５’末端と結合し、接合部に移動し、そしてＨｅｌｔｅｓｔ４を切断することにより、１８ヌクレオチドのフラグメントを生成する。鋳型１および２は、コントロールとして作用するが、鋳型２は、鋳型としても作用しうる。
【０１６８】
鋳型は、以下に記載するように調製される：
鋳型１    鋳型２      鋳型３
Ｈｅｌｔｅｓｔ４    １４μｌ    １４μｌ    １４μｌ
Ｍ１３                ＊＊      １４μｌ    １４μｌ
ＦＥＮＡＳ            ＊＊      ＊＊        １４μｌ
Ｈ２Ｏ              ２８μｌ    １４μｌ      ＊＊
１０×Ｐｆｕ緩衝液  ４．６μｌ  ４．６μｌ  ４．６μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カタログ＃２００５３６）から入手可能である。本発明の方法によれば、１０×Ｐｆｕ緩衝液は、反応が１×緩衝液の存在下で行われるように希釈される。
Ｍ１３は、２００ｎｇ／μＬの濃度のＭ１３ｍｐ１８＋鎖であり、３３Ｐ標識Ｈｅｌｔｅｓｔ４は、約０．７ｎｇ／μｌの濃度であり、ＦＥＮＡＳは、４．３ｎｇ／μｌの濃度である。これらの濃度に基づいて、Ｈｅｌｔｅｓｔ４およびＭ１３は、ほぼ等モル量（５×１０−１４）であり、ＦＥＮＡＳは、モル濃度が約１０倍過剰（６×１０−１３）で存在する。
【０１６９】
鋳型混合物を９５℃で５分間加熱し、４５分間室温に冷却し、４℃で一晩保存する。
２μｌのＦＥＮ−１またはコントロールとしてのＨ２Ｏを、以下のとおりに３つの鋳型と混合する：
３            μｌの鋳型
０．７            μｌの１０×クローン化Ｐｆｕ緩衝液
０．５６          μｌの１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２
２．００          μｌの酵素またはＨ２Ｏ
０．７４          μｌのＨ２Ｏ
７．００          μｌの総容積
反応を５０℃で３０分間進め、そして２μｌのホルムアミド「シークエンシング停止」溶液を各サンプルに加えることによって反応を停止する。サンプルを９５℃で５分間加熱し、６％アクリルアミド、７Ｍ尿素ＣａｓｔＡｗａｙ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ゲルにロードする。
あるいは、１時間のインキュベーション時間を利用して、以下の緩衝液中でＦＥＮ活性を解析することができる。
１０×ＦＥＮ緩衝液
５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０
１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２
【０１７０】
以下の反応混合物を、２μｌのＦＥＮまたはコントロールとしての２μｌのＨ２Ｏと混合する。
３            μｌの鋳型
０．７            μｌの１０×ＦＥＮ緩衝液
２．００          μｌの酵素またはＨ２Ｏ
１．３            μｌのＨ２Ｏ
７．００          μｌの総容積
【０１７１】
Ｒｏｂｏｃｙｌｅｒ９６ホットトップサーマルサイクラーにおいて、サンプルを５０℃で１時間インキュベートする。２μｌのシークエンシング停止染色溶液を加えた後、サンプルを９９℃で５分間加熱する。サンプルを１１インチ長の、手で分注した２０％アクリルアミド／ビスアクリルアミド、７Ｍ尿素ゲルにロードする。ブロモフェノールブルーが総距離の約２／３に移動するまで、ゲルを２０ワットで泳動する。ゲルをガラスプレートから取り出し、固定液（１５％メタノール、５％酢酸）中に１０分間浸漬し、次いで、１０分間、水に浸漬する。
ゲルをＷｈａｔｍａｎｎの３ｍｍ紙の上に置き、プラスチックラップで覆い、そして加熱吸引ゲルドライヤーで２時間乾燥させる。ゲルを一晩、Ｘ線フィルムに感光させる。
【０１７２】
２．ＦＥＮエンドヌクレアーゼ活性は、Ｋａｉｓｅｒら、前出）の方法に従っても測定することができる。簡潔には、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．５、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．０５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１０１ｇ／ｍｌのｔＲＮＡおよびＴａｑＰｏｌおよびＴｔｈＰｏｌに対しては２００ｍＭ  ＫＣｌまたは他のすべての酵素に対しては５０ｍＭ  ＫＣｌを含む１０１１容積において反応を行う。解析される切断構造に応じて、反応条件を変更することができる。基質（２１Ｍ）および様々な量の酵素を、記載した（上の）反応緩衝液と混合し、Ｃｈｉｌｌ−ｏｕｔ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）液体ワックスを重層する。基質を９０℃で２０秒間加熱変性し、５０℃に冷却し、次いで、ＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２を加えることによって反応を開始し、５０℃で特定の時間インキュベートする。１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．０２％メチルバイオレット（Ｓｉｇｍａ）を含む９５％ホルムアミドの１０１１を加えることによって、反応を停止する。サンプルを１分間、９０℃に加熱した直後に、７Ｍ尿素を含む２０％変性アクリルアミドゲル（１９：１架橋）および４５ｍＭ  Ｔｒｉｓホウ酸，ｐＨ８．３、１．４ｍＭ  ＥＤＴＡの緩衝液において、電気泳動を行う。別途記載されない限り、各停止反応物の１×１を１レーンごとにロードする。５０５ｎｍフィルターを使用して、ＦＭＢＩＯ−１００蛍光ゲルスキャナー（Ｈｉｔａｃｈｉ）においてゲルをスキャンする。ＦＭＢＩＯ解析ソフトウェア（バージョン６．０，Ｈｉｔａｃｈｉ）を用いて、非切断基質および切断基質に対応するバンドの強度から切断産物の画分を決定する。測定値を最初の切断速度に確実に近づけるために、切断産物の画分は、２０％を超えるべきではない。切断速度は、酵素濃度および反応時間（分）で割った切断産物濃度と定義される。各酵素について、３つのデータポイントを使用して、速度および実験誤差を決定する。
【０１７３】
３．ＦＥＮエンドヌクレアーゼ活性は、Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ａ，前出の方法に従っても測定することができる。簡潔には、最終容積１３μｌにおいて、様々な量のＦＥＮおよび１．５４ｐｍｏｌの標識された切断基質を、様々な温度で３０分間インキュベートした後、反応を、等容積の停止溶液（１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、９５％脱イオンホルムアミドならびに０．００８％ブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノール）でクエンチする。サンプルを変性１５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＭａｃＢＡＳ画像解析ソフトウェアを備えたＩＰＬａｂＧｅｌシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、出発物質および産物の相対量を定量化する。ほとんどの反応は、標準的なアッセイ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン）中で行うが；しかしながら、一連の実験において、様々な二価金属レベルおよびｐＨレベルの影響を、標準的な緩衝液を変化させることによって調べる。
二価金属について、ＭｇＣｌ２は除き、様々な金属イオンを最終濃度１０ｍＭで使用する。ｐＨの影響を調べるために、様々な量のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、グリシンおよび酢酸ナトリウムを含む緩衝液を最終濃度１０ｍＭで使用して、２５℃で広範なｐＨレベルを得る。
４．ＦＥＮエンドヌクレアーゼ活性は、Ｍａｔｕｓｉら、１９９９，前出の方法に従っても測定することができる。簡潔には、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１００１ｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンおよび０．６ｐｍｏｌの標識切断構造を含む１５μｌの反応混合物中で酵素をインキュベートする。６００Ｃでの３０分間のインキュベーションの後、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１ｍｇ／ｍｌのブロムフェノールブルーを含む９５％ホルムアミド１５μｌを加えることによって、反応を停止する。サンプルを９５℃で１０分間加熱し、７Ｍ尿素および１０×ＴＢＥ（８９ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を含む１５％ポリアクリルアミドゲル（３５ｃｍ×４２．５ｃｍ）にロードし、次いで、２０００Ｖで２時間電気泳動する。反応産物を可視化し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて定量化する。サイズマーカーであるオリゴヌクレオチドは、［α−３２Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５’末端標識されている。
至適ｐＨを決定するために、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンおよび０．６ｐｍｏｌの５’末端標識切断構造（以下の緩衝液のうちの１つの５０ｍＭにおいて）を含むアッセイ混合物（１５μｌ）において、反応を６００Ｃで３０分間、行う。３つの異なる５０ｍＭ緩衝液を使用して、以下のとおり、広範なｐＨ範囲を得る：酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０〜５．５）、リン酸緩衝液（ｐＨ５．５〜８．０）およびホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０〜９．４）。
【０１７４】
Ｂ．ＦＥＮエキソヌクレアーゼ活性アッセイ
本発明のＦＥＮヌクレアーゼのエキソヌクレアーゼ活性は、Ｍａｔｓｕｉら、１９９９，前出に記載され、そして上で要約された、ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ活性を測定する方法によって測定することができる。
あるいは、ＦＥＮ酵素のエキソヌクレアーゼ活性は、Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ｂ，前出に記載されている方法によって解析することができる。簡潔には、エンドヌクレアーゼアッセイ（上記）について記載された条件と同一の条件下で、ニックの入ったＦＥＮの基質を用いて、エキソヌクレアーゼ活性をアッセイする。
エキソヌクレアーゼ実験とエンドヌクレアーゼ実験の両方におけるＤＮＡ切断の正確な位置は、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を用いて、５’３２Ｐ標識鋳型鎖の部分的な消化によって得ることができる。
【０１７５】
本発明の切断構造は、標的核酸配列にアニーリングしたオリゴヌクレオチドの部分的に置換された５’末端を含む。本発明の別の切断構造は、標的核酸配列（例えば、図３中のＢ）、標的配列に相補的な上流オリゴヌクレオチド（例えば、図３中のＡ）および標的配列に相補的な下流オリゴヌクレオチド（例えば、図３中のＣ）を含む。本発明の切断構造は、上流オリゴヌクレオチドと下流プローブとの重複または核酸ポリメラーゼの合成活性による上流オリゴヌクレオチドの伸長およびその後の下流オリゴヌクレオチドの５’末端の部分的な置換によって形成されうる。このタイプの切断構造は、「切断構造」と題された項に記載されている方法に従って形成される。
あるいは、本発明の切断構造は、標的核酸配列をオリゴヌクレオチドにアニーリングすることによって形成され、ここで、そのオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列にアニーリングする相補的領域および標的核酸配列にアニーリングせず、５’フラップを形成する非相補的領域を含む。この実施形態によれば、切断構造は、オリゴヌクレオチドの非相補的領域によって形成される５’フラップを含む。
本発明の切断構造はまた、重複フラップも含み、ここで、標的核酸配列にアニーリングすることができる上流オリゴヌクレオチド（例えば、図３中のＡ）の３’末端は、標的核酸配列にアニーリングする下流オリゴヌクレオチド（例えば、図３中のＣ）の１つ（またはそれ以上）の塩基対に相補的であり、その１つ（またはそれ以上）の塩基対の重複は、一本鎖フラップの伸長点のすぐ下流であり、「切断構造」と題された項に記載されている方法に従って形成される。
【０１７６】
ＩＩ．核酸ポリメラーゼ
本発明は、核酸ポリメラーゼを提供する。好ましくは、本発明の核酸ポリメラーゼは、熱安定性である。
公知のＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓのＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【０１７７】
本発明の有用な５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている核酸ポリメラーゼとしては、ＫｌｅｎｏｗおよびＫｌｅｎｏｗエキソ−ならびにＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明の有用な５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている熱安定性核酸ポリメラーゼとしては、Ｐｆｕ、エキソ−Ｐｆｕ（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているＰｆｕの変異型）、ＴａｑのＳｔｏｆｆｅｌフラグメント、Ｎ切断型Ｂｓｔ、Ｎ切断型Ｂｃａ、Ｇｅｎｔａ、ＪｄＦ３エキソ−、Ｖｅｎｔ、Ｖｅｎｔエキソ−（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているＶｅｎｔの変異型）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔエキソ−（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔの変異型）、Ｕ１ＴｍａおよびＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７８】
本発明の有用な核酸ポリメラーゼには、天然のポリメラーゼと５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているポリメラーゼ変異体との両方が含まれる。本発明の有用な核酸ポリメラーゼは、様々な程度の熱安定性を有しうる。好ましくは、本発明の核酸ポリメラーゼは、それが核酸プライマーを伸長することができる温度で鎖置換活性を示す。本発明の好ましい実施形態において、核酸ポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性と３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の両方を欠いている。
様々な程度の熱安定性を有し、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている、本発明の有用なさらなる核酸ポリメラーゼを以下に列挙する。
Ａ．バクテリオファージのＤＮＡポリメラーゼ（３７℃アッセイに有用）：
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が、別個のポリペプチドによってコードされているので、バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼは、この５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている。適当なＤＮＡポリメラーゼの例は、Ｔ４、Ｔ７およびφ２９ＤＮＡポリメラーゼである。市販の酵素は：Ｔ４（多くの供給業者、例えば、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅから入手可能）およびＴ７（多くの供給業者、例えば、非修飾のものについてはＥｐｉｃｅｎｔｒｅおよび３’→５’エキソ−Ｔ７「Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ」ＤＮＡポリメラーゼについてはＵＳＢから入手可能）である。
【０１７９】
Ｂ．古細菌のＤＮＡポリメラーゼ：
古細菌では、２つの異なるクラスのＤＮＡポリメラーゼが同定されている：１．ファミリーＢ／ｐｏｌ  αタイプ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＰｆｕのホモログ）および２．ｐｏｌ  ＩＩタイプ（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ＤＰ１／ＤＰ２  ２−サブユニットポリメラーゼのホモログ）。両方のクラスのＤＮＡポリメラーゼが、関連する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を天然には欠いていること、および、３’→５’エキソヌクレアーゼ（校正）活性を有していることが示されている。
適当なＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ  αまたはｐｏｌ  ＩＩ）を、所望のアッセイ温度と類似である至適成長温度を有する古細菌から得ることができる。適当な古細菌の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：
１．熱不安定性菌（３７℃アッセイに有用）−例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｏｌｔａｅ
２．熱安定性菌（非ＰＣＲアッセイに有用）−例えば、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ。適当な古細菌は、８０〜８５℃以下の最高成長温度または７０〜８０℃以下の至適成長温度を示すと推定されている。
３．熱安定性菌（ＰＣＲアッセイに有用）−例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ｆｕｒｉｏｓｕｓ、ＧＢ−Ｄ種、ＫＯＤ１株、ｗｏｅｓｉｉ株、ａｂｙｓｉｉ株、ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ株）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、９０Ｎｏｒｔｈ−７種、ＪＤＦ−Ｓ種、ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ種）、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍおよびＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ。適当な古細菌は、８０〜８５℃以上の最高成長温度または７０〜８０℃以上の至適成長温度を示しうると推定されている。古細菌のｐｏｌ  αＤＮＡポリメラーゼ群の適切なＰＣＲ酵素は、市販されており、それらとしては、ＫＯＤ（Ｔｏｙｏｂｏ）、Ｐｆｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）およびＰｗｏ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）が挙げられる。
【０１８０】
上で列挙されたものに関連するさらなる古細菌は、以下の参考文献に記載されている：Ａｒｃｈａｅａ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｒｏｂｂ，Ｆ．Ｔ．ａｎｄ  Ｐｌａｃｅ，Ａ．Ｒ．，ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９９５およびＴｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（Ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎ，Ｊ．Ｋ．，ｅｄ．）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９９２。
【０１８１】
Ｃ．真正細菌のＤＮＡポリメラーゼ：
真正細菌のＤＮＡポリメラーゼには３つのクラス、ｐｏｌ  Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩが存在する。Ｐｏｌ  Ｉ  ＤＮＡポリメラーゼファミリーの酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、あるメンバーは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性も示す。Ｐｏｌ  ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を天然には欠いているが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は示す。Ｐｏｌ  ＩＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼは、細胞の主要な複製用ＤＮＡポリメラーゼであり、複数のサブユニットから構成される。ｐｏｌ  ＩＩＩ触媒サブユニットは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているが、いくつかの場合おいて、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が同じポリペプチドに存在する。
種々の市販のＰｏｌ  Ｉ  ＤＮＡポリメラーゼが存在し、そのうちのいくつかは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を低下するためまたは消滅するために修飾されている。
ｐｏｌ  Ｉ  ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を排除するために使用される方法としては：
−突然変異誘発（Ｘｕら、１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６８：２８４およびＫｉｍら、１９９７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ；７：４６８に記載されているとおり）
−タンパク分解性消化によるＮ切断（Ｋｌｅｎｏｗら、１９７１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：３７１に記載されているとおり）または
−クローニングおよびＣ末端のフラグメントとして発現することによるＮ切断（Ｌａｗｙｅｒら、１９９３，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，２：２７５に記載されているとおり）
が挙げられる。
【０１８２】
古細菌の起源に関して、アッセイ温度として求められる温度によって、どの真正細菌を、本発明の有用なＤＮＡポリメラーゼの起源（例えば、中温菌、好熱菌、超好熱菌）として使用するべきであるかが決定される。
【０１８３】
１．中温菌／不耐熱性菌（３７℃アッセイに有用）
ｉ．天然には５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いているＤＮＡポリメラーゼ：中温性の真正細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ｌｅｐｒａｅ））由来のｐｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩの触媒サブユニット
ｉｉ．５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いているＤＮＡポリメラーゼ変異体：Ｎ切断または突然変異誘発のためのＰｏｌ  Ｉ  ＤＮＡポリメラーゼを、上に列挙された中温性の真正細菌から単離することができる（Ｃｉ）。市販の真正細菌のＤＮＡポリメラーゼｐｏｌ  Ｉフラグメントは、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（Ｎ切断型Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｏｌ  Ｉ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。
【０１８４】
２．熱安定性菌（非ＰＣＲアッセイに有用）
ｉ．天然には５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いているＤＮＡポリメラーゼ：好熱性の真正細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ））由来のＰｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩの触媒サブユニット
ｉｉ．５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いているＤＮＡポリメラーゼ変異体：Ｎ切断または突然変異誘発に適したｐｏｌ  Ｉ  ＤＮＡポリメラーゼを、上に列挙されたＢａｃｉｌｌｕｓ種などの好熱性の真正細菌から単離することができる。Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼｐｏｌ  Ｉの熱安定性Ｎ切断型フラグメントは、市販されており、商標名Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメント（Ｂｉｏ−ＲａｄおよびＩｓｏｔｈｅｒｍ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ））として販売されている。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ  ｐｏｌ  ＩのＣ末端フラグメントは、Ｐａｎｖｅｒａから入手可能である（商標名Ｌａｄｄｅｒｍａｎとして販売されている）。
【０１８５】
３．熱安定性菌（ＰＣＲアッセイに有用）
ｉ．天然には５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いているＤＮＡポリメラーゼ：Ｔｈｅｒｍｕｓ種（ａｑｕａｔｉｃｕｓ、ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ｆｌａｖｕｓ、ｒｕｂｅｒ、ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ、ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、ｂｒｏｋｉａｎｕｓ）またはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＰｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩの触媒サブユニット。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来の触媒性ｐｏｌ  ＩＩＩサブユニットは、Ｙｉ−Ｐｉｎｇら、１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，４８：７５６およびＭｃＨｅｎｒｙら、１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７２：１７８に記載されている。ｉｉ．５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いているＤＮＡポリメラーゼ変異体：Ｎ切断または突然変異誘発に適したｐｏｌ  Ｉ  ＤＮＡポリメラーゼを、Ｔｈｅｒｍｕｓ種およびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（上を参照のこと）を含む種々の好熱性真正細菌から単離することができる。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓのＤＮＡポリメラーゼｐｏｌ  Ｉ（Ｔａｑ）の熱安定性フラグメントは、市販されており、商標名ＫｌｅｎＴａｑ１（Ａｂ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）およびＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）として販売されている。Ｃ末端フラグメントに加えて、５’→３’エキソヌクレアーゼ−Ｔａｑ変異体もまた市販されている（ＴａｑＦＳ（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）など）。Ｔａｑの５’−３’エキソヌクレアーゼ−バージョンに加えて、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａのＤＮＡポリメラーゼＩのＮ切断型バージョンもまた市販されている（商標名ＵｌＴｍａ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）。
上に列挙したものと関連するさらなる真正細菌は、Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（Ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎ，Ｊ．Ｋ．，ｅｄ．）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９９２に記載されている。
【０１８６】
Ｄ．真核生物の５’→３’エキソヌクレアーゼ−ＤＮＡポリメラーゼ（３７℃アッセイに有用）
いくつかのＤＮＡポリメラーゼが、真核生物において同定されており、それらとしては、ＤＮＡ  ｐｏｌ  α（複製／修復）、δ（複製）、ε（複製）、β（修復）およびγ（ミトコンドリアの複製）が挙げられる。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が、別個のポリペプチド（例えば、哺乳動物のＦＥＮ−１または酵母のＲＡＤ２）によってコードされているので、真核生物のＤＮＡポリメラーゼは、この５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている。適当な熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼは、種々の真核生物（酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａが挙げられるがこれらに限定されない）および真核生物ウイルス（例えば、ＥＢＶ、アデノウイルス）から単離されうる。
【０１８７】
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いていることに加えて３’−５’エキソヌクレアーゼ（校正）活性を欠いているＤＮＡポリメラーゼ変異体が、ＦＥＮベースの検出ストラテジーにおいて改善された性能を示すことがありうる。例えば、固有の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の低下または消滅は、標識プローブの非特異的なヌクレオチド末端結合分解を低減することによってバックグラウンドシグナルを低下させうる。３つの３’→５’エキソヌクレアーゼモチーフが同定されており、これらの領域内の変異は、Ｋｌｅｎｏｗ、φ２９、Ｔ４、Ｔ７およびＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、酵母のＰｏｌ  α、Ｐｏｌ  βおよびＰｏｌ  γならびにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｐｏｌ  ＩＩＩにおいて３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を消滅させることが示されている（Ｄｅｒｂｅｙｓｈｉｒｅら、１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６２：３６３で概説）。
【０１８８】
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が低下しているか、または消滅している、さらなるＤＮＡポリメラーゼ変異体を調製するための方法は、当該分野で周知である。
５’→３’と３’→５’の両方のエキソヌクレアーゼ活性を欠いている市販の酵素としては、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（エキソ−Ｔ７；ＵＳＢ）、Ｐｆｕエキソ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、エキソ−Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、エキソ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、エキソ−Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｂｓｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｉｓｏｔｈｅｒｍ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、Ｌａｄｄｅｒｍａｎ（Ｐａｎｖｅｒａ）、ＫｌｅｎＴａｑ１（Ａｂ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳＢ）およびＴａｑＦＳ（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）が挙げられる。
【０１８９】
Ｐｆｕ以外のポリメラーゼを使用する場合、緩衝液および伸長温度は、本発明の有用な特定のポリメラーゼによって至適活性が得られるように選択される。本発明のポリメラーゼに有用な緩衝液および伸長温度は、当該分野で公知であり、製造供給元の仕様書から決定することもできる。
【０１９０】
ＩＩＩ．核酸
Ａ．本発明に有用な核酸配列
本発明は、標的核酸配列を検出および測定する方法を提供する；同時に本発明による切断構造物を形成するためのオリゴヌクレオチド、プライマー、およびプローブ、ならびに鋳型核酸配列を増幅するためのプライマーも利用する。本明細書で用いる用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、プライマー、プローブ、および検出対象となるオリゴマーフラグメントを指し、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−でオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、およびプリンもしくはピリミジン塩基、または修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基（脱塩基部位を含む）のＮ−グリコシドである他タイプの任意のポリヌクレオチドを包括するものとする。用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」については、長さを区別する意図はなく、これらの用語は互換的に使用されるだろう。これらの用語は、分子の一次構造のみを指す。かくしてこれら用語は、二本鎖および単鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および単鎖ＲＮＡを含む。
【０１９１】
本明細書で用いられる核酸配列の相補体とは、核酸配列を、一方の配列の５’端を他方の配列の３’と対合するようにアラインメント取りした時に、「逆平行会合」するオリゴヌクレオチドを指す。
オリゴヌクレオチドは、必ずしも既存または天然の配列に物理的に由来せず、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、またはそれらの組み合わせを含む任意の方法で生成してよい。用語「オリゴヌクレオチド」または「核酸」は、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ、ｃＤＮＡ、半合成または合成起源のポリヌクレオチドを意味し、その合成起源または操作によっては：（１）自然界においてそれが会合しているポリヌクレオチドの全てもしくは一部と会合せず；および／または（２）自然界においてそれが連結しているもの以外のポリヌクレオチドと連結する。
【０１９２】
本発明によれば、オリゴヌクレオチドはプローブとして機能する核酸配列を追加して含み、かつヘアピンおよびステム−ループのような二次構造を有してよい。このようなオリゴヌクレオチドプローブとしては、本明細書に記載する分子ビーコン、セーフティーピン、スコルピオン、およびサンライズ／アンプリフルオロプローブが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９３】
モノヌクレオチドは、あるモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩が、それに隣接するモノヌクレオチドペントース環の３’酸素にリン酸ジエステル結合により一方向に結合するように反応してオリゴヌクレオチドを作ることから、オリゴヌクレオチドの端部は、その５’リン酸塩がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素と連結していない場合には「５’端」と呼ばれ、その３’酸素が続くモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩に連結していない場合には「３’端」と呼ばれる。本明細書で用いる場合、核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチドの内部の場合でも、５’および３’端を有すると言うことができる。
【０１９４】
２種類の、重複しないオリゴヌクレオチドが、同一の、直線状の相補的核酸配列の異なる領域にアニーリングした時に一方のオリゴヌクレオチドの３’端が、もう一方のオリゴヌクレオチドの５’端方向を指す場合、前者を「上流」オリゴヌクレオチド、後者を「下流」オリゴヌクレオチドと呼ぶことがある。
【０１９５】
天然の核酸には通常存在しないある種の塩基を本発明の核酸に含めることができ、そのような核酸としては、例えばイノシンおよび７−デアザグアニンが挙げられる。相補性の要求は絶対的でない；安定した二重鎖は、ミスマッチ塩基対または非適合塩基を含んでよい。核酸技術分野の当業者は、二重鎖の安定性を、例えばオリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成および配列、イオン強度、ならびにミスマッチ塩基対の頻度を考慮にいれて経験的に決定することができる。
【０１９６】
核酸二重鎖の安定性は、融解温度または「Ｔｍ」によって測定される。固有条件下でのある種核酸二重鎖のＴｍは、塩基対の半分が解離する温度である。
【０１９７】
Ｂ．本発明の有用なプライマーおよびプローブ
本発明は、核酸の検出または測定、鋳型核酸配列の増幅、および本発明による切断構造物の形成に有用なオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを提供する。
【０１９８】
用語「プライマー」は、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が触媒される条件に置かれた時に、相補鎖に沿って合成の開始点となることができる、精製された制限酵素消化物のようにして自然に生ずるか、または合成により作られた、二種類以上のプライマーを指してもよく、一種類のオリゴヌクレオチドを指す。このような条件には、四種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸およびＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のような重合誘導剤が、好適緩衝液（「緩衝液」は、補助因子であるか、またはｐＨ、イオン強度等に影響する置換基を含む）中、および好適温度で存在することを含む。プライマーは、増幅効率が最大の単鎖のものが好ましい。
【０１９９】
本発明の有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型の核酸配列にハイブリダイゼーションでき、第二核酸鎖の酵素合成をプライミングできる単鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。プライマーは核酸分子集合体中に存在する標的分子の一部に相補的である。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、化学的または酵素的どちらの合成的方法によって調製されることが熟考される。あるいは、このような分子またはそのフラグメントは天然に生じ、その天然供給源から単離されるか、または商業的供給元から購入する。オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは５〜１００ヌクレオチド長であり、理想的には１７〜４０ヌクレオチド長であるが、プライマーとプローブは長さの異なるものが用いられる。増幅用プライマーは、約１７〜２５ヌクレオチドが好ましい。本発明の切断構造物の生成用プライマーは、１７〜４５ヌクレオチドが好ましい。本発明の有用なプライマーは、融解温度予測法によって特定の融解温度を持つように設計される。Ｏｌｉｇｏ（商標）、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎを含む商業プログラム、ならびにＰｒｉｍｅｒ３およびＯｌｉｇｏ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを含むインターネット上で利用可能なプログラムを用いて、本発明の有用な核酸配列のＴｍを計算することができる。好ましくは、本発明の有用な増幅プライマーのＴｍは、例えばＯｌｉｇｏ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒによって計算した場合、約４５〜６５度の間であることが好ましく、約５０〜６０度の間であることがより好ましい。
好ましくは、本発明の有用なプローブのＴｍは、対応する増幅プライマーのＴｍより７℃高い。
【０２００】
本明細書の用いる場合、「プローブ」は、本発明の切断構造物の調製に有用であるプライマーとなることができる標識化オリゴヌクレオチドを指す。単鎖ＤＮＡプライマーのペアは、標的核酸配列内の配列にアニーリングできるか、またはこれを用いて標的核酸配列のＤＮＡ合成の増幅をプライミングできる。
【０２０１】
典型的には、２つの核酸配列が実質的に相補的であれば（少なくとも１４〜２５ヌクレオチドのストレッチについて少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％相補的）ハイブリダイゼーションが起こる。参照によってここに組み入れられるＫａｎｅｈｉｓａ，  Ｍ．，  １９８４．  １２：  ２０３を参照。結果として、プライミング部位についてある程度のミスマッチが許容されることが期待される。このようなミスマッチは、モノ−、ジ−、またはトリ−ヌクレオチドのような小さなものであろう。あるいはミスマッチ領域はループを含むこともあり、このループはミスマッチが４またはそれ以上連続するヌクレオチドとして存在する領域として定義される。
【０２０２】
多くの要因が、プライマーの第二核酸分子へのハイブリダイゼーションの効率および選択性に影響する。プライマー長、ヌクレオチドの配列および／または組成、ハイブリダイゼーション温度、緩衝液組成、プライマーがハイブリダイゼーションするのに必要とする領域内の立体障害の潜在性を含むこれらの要因は、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する際に考慮される。プライマー長と、プライマーが標的配列にアニーリングする際の効率及び正確性の両方との間には正の相関性がある。具体的には、長井配列は短い配列より高い融解温度（Ｔｍ）を有し、特定の標的配列内で繰り返しが起こりにくいとされることから、無差別的なハイブリダイゼーションは少なくなる。ＧＣ含有量が高いか、パリンドローム配列を含むプライマー配列は、溶液中においては、一般的に二分子間より単分子間での動的ハイブリダイゼーションが起こりやすいために、目的とする標的部位と同様に自己へのハイブリダイゼーションも起こしやすい。しかしながらＧ−Ｃのペアはそれぞれ、ＡとＴの塩基対が標的配列に結合する際に見られる二重の水素結合ではなく三重水素結合で結合していること、その結果より強固な結合を形成することから、十分な数のＧ−Ｃヌクレオチド対を含むようにプライマーを設計することも重要である。ハイブリダイゼーション温度が高い程プライマーアニーリング効率は下がり、またプライミング反応液またはハイブリダイゼーション混合液中に含めることがある有機溶媒、例えばホルムアミドの濃度も同じように働くが、塩濃度の上昇は結合を促す。
ストリンジェントなアニーリング条件では、長いハイブリダイゼーションプローブまたは合成プライマーは、短いものよりもハイブリダイゼーション効率が高く、より寛大な条件でも十分に機能する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には約１Ｍ未満、より一般的には約５００ｍＭ、好ましくは約２００ｍＭ未満の塩濃度を含む。ハイブリダイゼーション温度は、Ｏ℃程度から２２℃まで、約３０℃以上まで、（多くの場合）約３７℃以上までの範囲である。長いフラグメントほど特異的ハイブリダイゼーションには高いハイブリダイゼーション温度を必要とするだろう。ハイブリダイゼーションの厳密さには複数の要因が影響することから、単独の要因の絶対値よりもパラメータの組み合わせが重要である。
【０２０３】
オリゴヌクレオチドプライマーは、これらについて配慮しながら設計し、以下の方法に従って合成することができる。
【０２０４】
１．オリゴヌクレオチドプライマーの設計戦略
本発明の切断構造物をシーケンシング、ＰＣＲするための、または調製するための具体的オリゴヌクレオチドプライマーの設計には、標的配列は認識できるが予想二次構造は最小である配列を選択することが含まれる。オリゴヌクレオチド配列は、標的核酸配列中の単一部位にだけ結合する。更には、オリゴヌクレオチドのＴｍは、オリゴヌクレオチドの長さおよびＧＣ含有量の分析によって最適化される。さらには、ゲノムＤＮＡの増幅に有用なＰＣＲプライマーを設計する際には、選択されたプライマー配列はＧｅｎＢａｎｋデータベース（またはその他利用可能なデータベース）の配列と有意な一致を示さない。
【０２０５】
プライマーの設計は、上記した複数のパラメータの評価およびプライマー配列の最適化を支援するために開発された、直ちに利用可能なコンピュータプログラムを用いることによって容易になる。このようなプログラムの例は、ＤＮＡＳｔａｒ（商標）ソフトウエアパッケージ（ＤＮＡＳｔａｒ，Ｉｎｃ．；Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）の「ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ」、ＯＬＩＧＯ  ４．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．）、ＰＲＩＭＥＲ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ、ＰＧＥＮ  ａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓに記載されている）がある。一つの態様では、プライマーは、更なる増幅（例えばＰＣＲ産物をシーケンシングするため）の標的として働く、その端部に既知配列を有するＰＣＲ産物を生成するための別のプライマーを標的とする配列を用いて設計される。多くの異なる標的核酸配列を、共通「テイル配列」を共有する特異的プライマーを用いて増幅した場合は、これら異なる遺伝子からのＰＣＲ産物はその後単一セットのプライマーを用いてシーケンシングできる。
あるいはプライマーを、続く増幅した配列のクローニングを容易にするために、それらの５’端に制限酵素部位配列が追加されるように設計する。このようにプライマーの全てのヌクレオチドは、制限酵素部位を形成するのに必要な少数のヌクレオチドを除いて、標的核酸配列または標的核酸配列に隣接する配列に由来する。このような核酸配列のゲノム配列および標的核酸配列のオープンリーディングフレームの配列が既知であれば、具体的なプライマーの設計は当技術分野の技術水準内である。
【０２０６】
オリゴヌクレオチドが特定の化学物質および／または捕獲成分を用いて合成でき、それらは固体支持物に結合できることは当業者に周知である。好適な捕獲成分としては、ビオチン、ハプテン、タンパク質、ヌクレオチド配列、または化学活性成分が挙げられるが、これらに限定されない。このようなオリゴヌクレオチドは、最初溶液で用いてから固体支持物に捕獲させても、または最初固体支持物に付着させてから検出反応液で用いてもよい。後者の例は、下流プローブ分子を、下流プローブの５’端が蛍光クエンチャーを含む様に固体支持物に結合させる方法である。同一の下流プローブ分子は更に、ＦＥＮヌクレアーゼが物理的蛍光団からクエンチャーを分離するような場所に蛍光団を含むだろう。例えば、標的核酸は、固相の下流プローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションでき、かつ液相の上流プライマーも標的分子とハイブリダイゼーションできれば、ＦＥＮ切断反応は固体支持物上で起こり、複合体から５’クエンチャー成分が遊離する。こうなると固体支持物に結合した蛍光団は検出することができ、こうして好適に標識または識別された固体支持物の上で切断が起こったことが明示される。各種下流プローブ分子は、列を成す異なる場所に結合させることができる。列中の場所からプローブ分子は識別され、その場所はプローブ分子がハイブリダイゼーションできる鋳型の存在を示す。
【０２０７】
２．合成
プライマーそれ自体は、同様に当技術分野で周知である技術を用いて合成される。特異配列のオリゴヌクレオチドを調製する方法は、当技術分野で知られており、例えば適当な配列のクローニングおよび制限酵素消化分析、ならびに直接化学合成が挙げられる。オリゴヌクレオチドは、一度設計が終われば好適な化学合成方法、例えばＮａｒａｎｇｅら、１９７９、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ６８：９０が記載したホスホトリエステル法、Ｂｒｏｗｎら、１９７９，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ６８：１０９が開示したホスホジエステル法、Ｂｅａｕｃａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２２：１８９５９に開示されているジエチルホスホアミダート法、および米国特許第４，４５８，０６６号に開示されている固体支持体法を含む好適な化学合成法、あるいは市販の自動化オリゴヌクレオチド合成装置（市販されている）またはＶＬＳＩＰＳ（商標）技術のいずれかを用いた他の化学的方法によって調製される。
【０２０８】
Ｃ．プローブ
本発明は、本明細書に規定される標識化切断構造物の形成に有用なプローブを提供する。本発明の標識化切断構造物を調製する方法は、下記「切断構造物」の項に記載されている。
【０２０９】
本明細書で使用する場合、用語「プローブ」は、プローブ中の少なくとも一つの配列と標的領域内の配列の相補性によって、標的核酸内の配列と二重鎖を形成する標識化されたオリゴヌクレオチドを指す。本発明で有用なプローブの長さは、好ましくは１０〜５０ヌクレオチドであり、より好ましくは１６〜２５ヌクレオチドである。プローブは、プライマーエクステンション中に用いられている配列と相補的な配列を含まないことが好ましい。一般的には、プローブの３’端は、プライマー伸長産物へプライマーの組み込みを阻止するために「ブロッキング」される。「ブロッキング」は、非相補的な塩基を用いるか、またはビオチンもしくはリン酸基のような化学成分を最後のヌクレオチドの３’ヒドロキシルに付加することによって達成できるが、それらは選択した成分によっては、標識物は、標識物が付いた核酸のその後の検出または捕獲するためのものとしても機能して、二重の役割を果たすこともある。ブロッキングは、３’−ＯＨを除去すること、またはジデオキシヌクレオチドのような３’−ＯＨを欠くヌクレオチドを用いることによっても達成できる。
【０２１０】
これに加えて、本発明によれば、プローブはヘアピンまたはステムループのような二次構造を持つオリゴヌクレオチドでもよく、分子ビーコン、セーフティーピン、スコルピオン、およびサンライズ／アンプリフルオロプローブを含むが、これらに限定されない。
【０２１１】
分子ビーコンプローブは、検出可能なシグナルの生成を抑制するように効果的に配置された、インタラクティブシグナルを生成する標識化成分のペア（例えば蛍光団とクエンチャー）を有するヘアピンまたはステムループ構造を含む。ループは、標的核酸に相補的である領域を含む。ループには、核酸標的配列に相補的なプローブの領域が標的核酸と結合していない時には、相補的な核酸配列によって互いが可逆的に相互作用する５’および３’領域がフランキングされている。
あるいは、ループには、核酸標的配列に相補的であるプローブの領域が標的核酸に結合していない時には、導入された親和性を持つ一組の部材によって互いが可逆的に相互作用して二次構造を形成する５’および３’領域（「アーム」）がフランキングされる。本明細書で使用する場合、「アーム」は、核酸標的配列に相補的であるプローブの領域が標的核酸に結合していない時、相補的な核酸配列によって互いに可逆的に相互作用するプローブの領域、あるいは核酸標的配列に相補的であるプローブの領域が標的核酸に結合していない時に導入された親和性を持つ一組の部材によって互いが可逆的に相互作用して二次構造を形成するプローブの領域を指す。分子ビーコンプローブが標的とハイブリダイゼーションしていない時は、アームは互いにハイブリダイゼーションしてステムハイブリッドを形成するが、これは「ステムデュープレックス（ｓｔｅｍ  ｄｕｐｌｅｘ）」と呼ばれることがある。これは閉じられた立体構造である。分子ビーコンプローブがその標的にハイブリダイゼーションすると、プローブの「アーム」は離れる。これは開放された立体構造である。開放立体構造では、アームもまた標的にハイブリダイゼーションする。このようなプローブは溶液内で遊離した状態でも、固体表面に係留されていてもよい。アームがハイブリダイゼーションすると（例えばステムを形成すると）、クエンチャーは蛍光団に非常に接近して、その蛍光を効率的に消去または抑制し、プローブを暗くする。このようなプローブは、米国特許第５，９２５，５１７号および第６，０３７，１３０号に記載されている。
【０２１２】
本明細書で使用する場合、「対立遺伝子識別」プローブである分子ビーコンプローブは、標的核酸相補配列と比較した時、内部に位置する１またはそれ以上のヌクレオチドミスマッチを含む標的類似核酸配列と十分にはハイブリダイゼーションせず、かくして標的類似核酸配列が存在する場合、対立遺伝子識別プローブが標的核酸配列へハイブリダイゼーションできる条件であっても開放立体構造に立体構造変換しない。別の態様では、分子ビーコンプローブは、標的核酸相補配列と比較した時、内部に位置する１またはそれ以上のヌクレオチドミスマッチを含む標的類似核酸配列と十分にハイブリダイゼーションし、標的類似核酸配列が存在する場合、対立遺伝子識別プローブが標的核酸配列へハイブリダイゼーションできる条件では開放立体構造に立体構造変換する。分子ビーコンプローブは、一方のアームに蛍光団を付けており、もう一方のアームにクエンチャーを付けている。蛍光団とクエンチャー、例えばテトラヒドロローダミンとＤＡＢＣＹＬは、ＦＲＥＴのペアである必要はない。
【０２１３】
本発明で有用なステムループプローブでは、標的と相補的であるプローブ配列の長さ、核酸標的配列と相補的な領域が標的核酸に結合していない時に相補的核酸配列によって互いに可逆的に相互作用するプローブの領域（例えばステムハイブリッド）の長さ、および両者の関係は、プローブが用いられるアッセイ条件に従って設計される。特定のアッセイ条件に関する標的相補配列およびステムハイブリッド配列の長さは、当技術分野で知られている事柄に従って推定できる。核酸標的配列に相補的であるプローブの領域が標的核酸に結合していない時に相補的核酸配列によって互いに可逆的に相互作用するプローブの領域は、それぞれ６〜１００、好ましくは８〜５０ヌクレオチド、最も好ましくは８〜２５ヌクレオチドの範囲である。標的に相補的なプローブ配列の長さは、好ましくは１７〜４０ヌクレオチド、より好ましくは１７〜３０ヌクレオチド、最も好ましくは１７〜２５ヌクレオチド長である。相補的核酸配列によって互いに可逆的に相互作用するプローブの領域間の相互作用安定性は、通常の実験によって決定され、適切に機能させることができる。
【０２１４】
本発明に従って修飾された分子ビーコンプローブのオリゴヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはそれらの組み合わせでよい。修飾ヌクレオチド、例えばニトロピロールを基本とするヌクレオチド、または２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含めることもできる。本発明の波長シフトプライマーには修飾連結基も組み入れることもできる。
【０２１５】
セーフティーピンプローブは、本発明で利用する場合には、ヘアピン構造を有し、そのヘアピンの５’アームには蛍光団（ＦＡＭ）を、また３’アームにはクエンチャー（Ｄａｂｃｙｌ）がある「ユニバーサル」ヘアピンプローブ１（図１０、ｂ１７１）、および２つのドメインを含むステムループを備えたプローブ（図１０、ＳＰ１７０ａ）を必要とする：プローブ２の５’側の２／３は、ヘアピンプローブ１に相補的な（ユニバーサル）配列、およびＤＮＡポリメラーゼを停止させるヌクレオチドを有しており、且つプローブ２の３’側の１／３は標的特異的プライマーとして働く。リバースプライマー（即ちプローブ２の３’側の１／３）からプライミングしたポリメラーゼがトップ鎖を合成すると、プローブ２の５’端は置き換わられ、「停止ヌクレオチド」に到達するまで５’エクソヌクレアーゼ活性によって分解される。この時点で、プローブ２の残りの部分は開放または巻き戻されてヘアピンプローブ１の標的として機能するようになり、それによってクエンチャーから蛍光団を分離する（図１０）。
スコルピオンプローブは、本発明で使用する場合は蛍光団／クエンチャーのペアを持つヘアピン構造を含む、５’側に伸長プローブテールを持つ３’プライマーを含む。プローブテールは、ポリメラーゼによるプローブの複製を阻止するヘキセチレングリコール（ＨＥＧ）を含むことによって、５’から３’方向への複製から「保護」されている。最初の増幅ラウンド中、３’標的特異的プライマーは標的にアニーリングし、新たに合成された鎖の中にスコルピオンが組み入れられるようにして伸長し、これは５’プローブ向けに新たに合成された標的領域を有している。次の変性およびアニーリングのラウンドの最中、スコルピオンヘアピンループのプローブ領域は標的とハイブリダイゼーションし、それにより蛍光団とクエンチャーは分離され、測定可能なシグナルが創られる。このようなプローブは、Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８０４〜８０７（１９９９）および図１１に記載されている。
【０２１６】
本発明において有用な更なるオリゴヌクレオチドプローブは、サンライズ／アンプリフルオロプローブである。サンライズ／アンプリフルオロプローブは、ヘアピンプローブ領域の５’から３’への複製を阻止するためのＨＥＧモノマーを欠くこと以外はスコルピオンプローブに類似の構造体である。即ち、増幅の第一ラウンドでは、サンライズ／アンプリフルオロプローブの３’標的特異的プライマーは標的にアニーリングして伸長し、そうすることでアピンプローブを新規合成された鎖（サンライズ鎖）内に組み入れる。増幅の第二ラウンドでは、第二未標識プライマーがサンライズ鎖の３’端にアニーリングする（図１２のサイクル２）。しかしながら、ポリメラーゼがヘアピンの５’端に到達すると、ＨＥＧ停止配列を欠くためポリメラーゼはヘアピンを置き換えて複製し、そうして蛍光団とクエンチャーは分離し、直線化されたヘアピンプローブは新規鎖内に組み入れられる。このタイプのプローブは、Ｎａｚａｒｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２５：２５１６〜２５２１（１９９７）および図１２に更に記載されている。
【０２１７】
本発明で有用なプローブでは、標的と相補的であるプローブ配列の長さ、核酸標的配列に相補的な領域が標的核酸と結合していない時に、相補的核酸配列によって互いに可逆的相互作用するプローブの長さ、および両者の関係は、プローブを使用するアッセイ条件に従って設計される。特定のアッセイ条件に関する標的相補性配列およびステムハイブリッド配列の長さは、当技術分野で知られている事柄に従って推定できる。
核酸標的配列に相補的であるプローブの領域が標的核酸に結合していない時に相補的核酸配列によって互いに可逆的に相互作用するプローブの領域は、それぞれ６〜１００、好ましくは８〜５０ヌクレオチド、最も好ましくは８〜２５ヌクレオチドの範囲である。標的に相補的なプローブ配列の長さは、好ましくは１７〜４０ヌクレオチド、より好ましくは１７〜３０ヌクレオチド、最も好ましくは１７〜２５ヌクレオチド長である。相補的核酸配列によって互いに可逆的に相互作用するプローブの領域間の相互作用安定性は、通常の実験によって決定され、適切に機能させることができる。長さ、相互作用の安定に加えて、相補的核酸配列によって互いに可逆的に相互作用するプローブ領域は、Ｇ−Ｃ含有量を変更すること、および脱安定化ミスマッチを挿入することによって調節できる。相補的核酸配列によって互いに可逆的に相互作用するプローブ領域の一つは、標的と部分的または完全に相補的になるように設計できる。３’アームが標的と相補的であるならば、プローブはＤＮＡポリメラーゼのプライマーとして働くことができる。また波長シフト分子ビーコンプローブは、係留等によって固体表面に固定化しても、自由に浮遊させることもできる。
【０２１８】
本発明のプローブおよびプライマーには、広範囲の蛍光団を用いることができる。利用可能な蛍光団としては、クマリン、テトラクロロフルオロセイン、ヘキサクロロフルオロセイン、ルシファーイエロー、ローダミン、ＢＤＩＰＹ、テトラメチルローダミ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、エオシン、テキサスレッド、およびＲＯＸが挙げられる。例えばＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５：２８１８に記載されているフルオロセイン−ローダミンダイマーのような蛍光団の組み合わせも好適である。蛍光団は可視スペクトル、または紫外域または赤外域のような可視スペクトル外で吸収および放射するように選ぶことができる。
【０２１９】
クエンチャーは、励起された蛍光団に非常に近接して置かれた時、蛍光が殆ど存在しないか、または全くなくなるようにする成分である。当技術分野で記載されている好適クエンチャーとしては、特にはＤＡＢＣＹＬおよびＤＡＢＳＹＬのようなその変種、ＤＡＢＭＩ、ならびにメチルレッドが挙げられる。蛍光団は、クエンチャーとしても用いることができるが、それは、それらが特定の他蛍光団と接触した時に蛍光を消去する蛍光にあるからである。好ましいクエンチャーは、ＤＡＢＣＹＬまたはマラカイトグリーンのような蛍光団か、プローブが開放立体構造を取る時に検出域の蛍光を発しない蛍光団である。
【０２２０】
本発明のプローブを標識する方法および好適な標識体は、下記「切断構造物」と題する項に記載されている。
【０２２１】
Ｄ．核酸の製造
本発明は、標的核酸配列の増幅および切断構造物形成のために、検出または測定される核酸を提供する。
本発明は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成形状、および混合重合体を含む核酸を利用する。本発明は、核酸のセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含む。本発明によれば、核酸は化学的または生化学的に修飾でき、あるいは非天然または誘導化ヌクレオチド塩基を含んでよい。このような修飾としては、例えば標識体、メチル化、一つまたは複数の天然ヌクレオチドの類似体による置換、非荷電連結基（例えばメチルホスホナート、ホスホロジチオエート等）のようなヌクレオチド間修飾、ペンダント成分（例えばポリペプチド）、インタカレーター（例えばアクリジン、ソラレン等）、キレーター、アルキレーター、および修飾連結基（例えばアルファアノマー核酸等）。水素結合および他化学的相互作用を介して、指定配列へのその結合能力についてポリヌクレオチドを模擬する合成分子も含まれる。このような分子は、当技術分野で知られており、例えば分子主鎖中のリン酸連結基に関するペプチド連結置換基が挙げられる。
【０２２２】
１．ＤＮＡを含む核酸
ａ．クローニング
ＤＮＡを含む核酸は、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーから、当業者に周知のクローニング法によって単離できる。簡単に説明すると、特定の核酸配列を含むＤＮＡクローンの単離では、組換え体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすること、および所望配列を含むクローンを特定することを含む。クローニングは次の段階を含むだろう。特定ライブラリーのクローンをプレート上に広げられて、スクリーニングに相応しい基質に移され、変性されて、特定核酸の存在について探索される。ハイブリダイゼーション条件の既述、および標識化プローブの製造方法は以下に記載されている。
所望クローンは、核酸プローブへのハイブリダイゼーションによって、または抗体で検出できるタンパク質を発現させることによって同定するのが好ましい。あるいは、所望クローンは、以下に記載の方法従って、特定のプライマーセットによって規定される配列のポリメラーゼチェイン増幅により同定される。
適切なライブラリーの選択には、所望配列が豊富な供給源である組織または細胞株を同定することも含まれる。更には、関心対象の核酸が制御配列またはイントロン配列を含む場合には、ゲノムライブラリーをスクリーニングする（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、上記）。
【０２２３】
ｂ．ゲノムＤＮＡ
発明の核酸配列は、ゲノムＤＮＡから増幅される。ゲノムＤＮＡは、以下の方法に従って組織または細胞から単離される。
特定組織から変異形態の遺伝子を検出し易くするために、組織は周囲の正常組織を含まないように単離される。哺乳動物組織からゲノムＤＮＡを単離するためには、組織は細断され、液体窒素中で凍結される。凍結組織は、冷やしておいたモーターと乳棒を用いて微粉末に挽かれ、消化緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）中に、組織１００ｍｇ当たり１．２ｍｌの消化酵素の割合になるよう懸濁される。哺乳動物の組織培養細胞からゲノムＤＮＡを単離するには、細胞を５分間、５００ｘｇで遠心分離して沈殿させ、１〜１０ｍｌの氷冷ＰＢＳ中に懸濁し、更に５分間、５００ｘｇで沈殿させてから、１容積量の消化緩衝液中に懸濁する。
消化緩衝液中のサンプルは５０℃で１２〜１８時間インキュベーション（震盪しながら）してから、次に等容積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出した。遠心分離段階（１７００ｘｇで１０分間）後に相分離が起こらない場合は、更に等容積の消化緩衝液（プロテイナーゼＫを含まない）を加えて、遠心分離段階を繰り返す。二つの相の界面に粘調の白色の物質が出現した時は、有機抽出段階を繰り返す。抽出後、上側の水相を新しいチューブに移し、これに１／２容積の７．５Ｍ酢酸アンモニウムと２容積量の１００％エタノールを加える。１７００ｘｇで２分間遠心分離して核酸を沈殿させ、これを７０％エタノールで洗浄し、風乾させてからＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中に１ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。残存するＲＮＡは、０．１％ＳＤＳおよび１μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅフリーＲＮａｓｅ存在下で１時間、サンプルを３７０Ｃでインキュベーションし、前記の抽出およびエタノール沈殿段階を繰り返すことで除去した。この方法によるゲノムＤＮＡの収量は、約２ｍｇ  ＤＮＡ／１ｇ細胞または組織と予想されている（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  上記）。この方法に従って単離されたゲノムＤＮＡは、本発明に従って、ＰＣＲ分析に用いることができる。
【０２２４】
ｃ．制限酵素消化（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの）
特定の標的核酸配列を含む所望のｃＤＮＡまたはゲノムクローンが同定できたら、本発明の核酸は、制限酵素を用いた消化によってこれらクローンから単離できる。
制限酵素消化の技術は当業者に周知である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、上記）。制限酵素消化に有用な試薬は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅを含む商業的供給元だけでなく他の供給元からも容易に入手できる。
【０２２５】
ｄ．ＰＣＲ
本発明の核酸は、ゲノムＤＮＡまたはその他天然供給源から、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）により増幅できる。ＰＣＲ法は当業者に周知である。
ＰＣＲは、熱安定なＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが触媒する複数サイクルのＤＮＡ複製を用いて特定のＤＮＡ配列を容易に増幅し、関心対象の標的配列を増幅するための方法を提供する。ＰＣＲは、増幅対象となる標的核酸配列の存在、増幅対象配列をフランキングする二つ単鎖オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、緩衝液、および塩を必要とする。
ＰＣＲは、参照によりここに組み入れられるＭｕｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｆａｌｏｏｎａ，  １９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １５５：３３５に記載されている通りに実施される。
ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）技術は、米国特許第４，６８３，２０２号、第４，６８３，１９５号、および第４，８００，１５９号に開示されている。その最も単純な形態では、ＰＣＲは、反対側の鎖にハイブリダイゼーションし、且つ標的ＤＮＡ中の関心対象領域をフランキングする二つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる、特異的ＤＮＡ配列を酵素的に合成するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法である。鋳型の変性、プライマーのアニーリング、およびアニーリングしたプライマーのＤＮＡポリメラーゼによる伸長を含む反応段階シリーズを反復すると、その末端がプライマーの５’端によって規定されている特異的フラグメントが対数的に蓄積する。ＰＣＲは、特異的ＤＮＡ配列を１０９倍にできると報告されている。ＰＣＲ法は、Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３５０にも記載されている。
ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ（少なくとも１ｆｇ；  １〜１００ｎｇが有効）および少なくとも２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて実施される。
典型的な反応液は次のものを含む：ＤＮＡ、２μｌ、オリゴヌクレオチドプライマー２５ｐｍｏｌ、好適な緩衝液２．５μｌ、１．２５μＭ  ｄＮＴＰ、０．４μｌ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）２．５単位、および合計容積２５μｌとなる量の脱イオン水。ミネラルオイルを重層し、ＰＣＲはプログラム可能なサーマルサイクラーを用いて実施される。
【０２２６】
ＰＣＲサイクルの各段階の長さと温度、ならびにサイクル数は、実際の厳密性条件に従って調節される。アニーリングの温度とタイミングは、プライマーと鋳型の予想アニーリング効率および許容されるミスマッチの程度の両方によって決まる。プライマーアニーリング条件の厳密性を最適化する能力は、十分当業者の通常知識の範囲内である。３０℃〜７２℃の間のアニーリング温度が用いられる。鋳型分子の最初の変性は、通常は９２〜９９℃で４分間行われ、続いて変性（９４〜９９℃、１５秒〜１分）、アニーリング（上記に従い決定された温度；１〜２分）、および伸長（７２℃、１分）から成るサイクルが２０〜４０回続く。最後の伸長段階は、一般的には７２℃で４分間実施され、それに４℃、無期限（０〜２４時間）の段階を続けても良い。  
【０２２７】
標準的なＰＣＲ技術で一般的に用いられる検出方法は、ハイブリダイゼーションアッセイでは、増幅したＤＮＡと一緒に標識プローブを用いる。好ましくは、プローブはハイブリダイゼーションを検出できるようにする、例えば３２Ｐ、ビオチン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等で標識されている。
【０２２８】
他の検出手段としては、断片長多形の利用（ＰＣＲ  ＦＬＰ）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブへのハイブリダイゼーション（Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３）、またはジデオキシ法によるダイレクトシーケンシング（クローン化ＤＮＡではなく増幅ＤＮＡを使用する）が挙げられる。標準のＰＣＲ技術は、二つのプライマーの間に位置するＤＮＡ配列を複製することによって（原則的に）機能し、反応の主要産物として、それぞれの鎖の５’端がプライマーで終止する、個別長のＤＮＡ配列を提供する。従って、プライマー間の挿入および欠失は、長さが異なる配列を産生することとなり、これはＰＣＲ−ＦＬＰでは産物のサイズを決定することによって検出できる。ＡＳＯハイブリダイゼーションの例では、増幅されたＤＮＡはナイロンフィルター（例えばＵＶ照射によって）に「ドットブロット」の列として固定され、ＨＲＰで標識されたオリゴヌクレオチドプローブと厳密条件の下でハイブリダイゼーションできるようになる。洗浄後、テラメチルベンジジン（ｔｅｒｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）（ＴＭＢ）および過酸化水素を加えた：ＨＲＰは過酸化水素を酸化し、次にこれがＴＭＢを青色の沈殿物に酸化してハイブリダイゼーションしたプローブを表す。
本発明による核酸アッセイを検出または測定するためのＰＣＲアッセイは、「使用方法」と題した項に記載されている。
【０２２９】
２．ＲＮＡを含む核酸
本発明は、ＲＮＡを含む核酸も提供する。
ＲＮＡを含む核酸は、当技術分野で周知である方法（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、上記）に従って精製できる。全ＲＮＡは、当技術分野で周知である方法（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、上記）および以下に記載する方法に従って細胞および組織から単離できる。
【０２３０】
ＲＮＡは、以下の方法に従って哺乳動物組織から精製される。関心対象の組織を取り出した後、組織を≦２ｇの組織片に細断し、液体窒素中で急速凍結してＲＮＡの分解を防ぐ。項適量のグアニジン溶液を添加し（例えば組織２ｇ当たりグアニジン溶液２０ｍｌ）、組織サンプルを組織処理装置（ｔｉｓｓｕｅｍｉｚｅｒ）内で、２または３回、１０秒破裂させて粉にする。組織グアニジン溶液（１Ｌ）を調製するには、グアニジンイソチアオシアナート５９０．８ｇを約４００ｍｌｎＤＥＰＣ−処理Ｈ２Ｏに溶解する。２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５（最終濃度０．０５Ｍ）２５ｍｌおよびＮａ２ＥＤＴＡ（最終濃度０．０１Ｍ）２０ｍｌを加え、溶液を一晩攪拌し、容積を９５０ｍｌに調整し、２−ＭＥを５０ｍｌ加えた。
【０２３１】
ホモジェナイゼーションした組織サンプルを１２℃、１２，０００ｘｇ、１０分間の遠心分離かかける。生じた上清は、０．１容積の２０％Ｓａｒｋｏｓｙｌ存在下で２分間、６５℃でインキュベーションし、５．７ＭのＣｓＣｌ溶液９ｍｌの上に重層し、２２℃、１１３，０００ｘｇの遠心分離に一晩かけて分離した。上清を注意しながら取り除いた後、チューブを逆さまにして水気を切る。チューブの底（ＲＮＡ沈殿物を含んでいる）を５０ｍｌのプラスチック製チューブの中に入れて、組織再懸濁緩衝液（５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０，５％（ｖ／ｖ）Ｓａｒｋｏｓｙｌ、５％（ｖ／ｖ）２−ＭＥ）３ｍｌ存在下に４℃で一晩（またはそれ以上）インキュベーションし、ＲＮＡ沈殿物を完全に再懸濁させる。生じたＲＮＡ溶液を、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール２５：２４：１、クロロホルム／イソアミルアルコール２４：１で連続して抽出し、３Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２および２．５倍容積の１００％エタノールを加えて沈殿させ、ＤＥＰＣ水に再懸濁する（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７９，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １８：５２９４）。
【０２３２】
あるいは、ＲＮＡは哺乳動物組織から、以下の一段階プロトコールに従って単離される。関心対象組織を、ガラステフロン製ホモジェナイザー中、組織１００ｍｇ当たり１ｍｌの変性溶液（４Ｍグアニジンチオスルファート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．１Ｍ  ２−ＭＥ、０．５％（ｖ／ｖ）Ｎ−ラウリルサルコシン）とホモジェナイゼーションして調製する。ホモジェネートを５ｍｌのポリプロピレン製チューブに移した後、０．１ｍｌ  の２Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４、１ｍｌの水飽和フェノール、０．２ｍｌのクロロホルム／イソアミルアルコール４９：１を連続して加える。
各成分を加える毎にサンプルを混合し、全ての成分を添加し終わった後０〜４℃で１５分間インキュベーションする。サンプルを１０，０００ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離して分離し、１００％イソプロパノールを１ｍｌ加えて沈殿させ、−２０℃で３０分間インキュベーションし、１０，０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離して沈査を得た。得られたＲＮＡ沈査を０．３ｍｌの変性溶液に溶解し、マイクロフュージチューブに移し、１００％イソプロパノールを０．３ｍｌ加え−２０℃で３０分間置き、１０，０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離し沈殿させる。ＲＮＡ沈査を７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、１００〜２００μｌのＤＥＰＣ処理水またはＤＥＰＣ処理０．５％ＳＤＳ中に再懸濁する（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ，  １９８７，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １６２：１５６）。
【０２３３】
ＲＮＡを含む核酸は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写法にしたがって産生できる。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写法は当業者に周知である。簡単に説明すると、関心対象遺伝子はＳＰ６、Ｔ３、またはＴ７プロモータを含むベクターに挿入される。ベクターは、ベクターをコーディング配列の下流に位置する単一部位で消化する適切な制限酵素を用いて直線化される。フェノール／クロロホルム抽出後、ＤＮＡはエタノール沈殿、７０％エタノール洗浄、乾燥されて、無菌水に再懸濁される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応は、直線化されたＤＮＡを転写緩衝液（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭスペルミジン、２５０  ＮａＣｌ［Ｔ７もしくはＴ３］、または２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭスペルミジン［ＳＰ６］）、ジチオスレイトール、ＲＮａｓｅ阻害剤、四種類のリボヌクレオシド三リン酸それぞれ、およびＳＰ６、Ｔ７、またはＴ３  ＲＮＡポリメラーゼと共に３０分間、３７℃でインキュベーションして行う。ＲＮＡを含む放射性標識ポリヌクレオチドを調製するには、未標識のＵＴＰを抜きとり、３５Ｓ−ＵＴＰを反応混合液中に加える。次にＤＮａｓｅＩとインキュベーションしてＤＮＡ鋳型を除去する。エタノール沈殿後、放射性標識ＲＮＡの一部をシンチレーショカウンターで測定してｃｐｍ／μｌを決定する（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、上記）。
あるいは、ＲＮＡを含む核酸は、固相ホスホルアミダイトのような化学合成技術によって調製される（上記）。
【０２３４】
３．オリゴヌクレオチドを含む核酸
オリゴヌクレオチドを含む核酸は、市販されているオリゴヌクレオチド合成装置を用いて作ることができる（上記）。
【０２３５】
ＩＶ．切断構造物
発明は、ＦＥＮヌクレアーゼにより切断できる切断構造物を提供し、それ故に切断構造物を調製する方法を教示する。発明はまた、標識化切断構造物および標識か切断構造物を調製する方法も提供する。
【０２３６】
Ａ．切断構造物の調製
一つの態様では、発明の切断構造物は：ａ）上流側、好ましくは伸長可能な３’端の、好ましくはオリゴヌクレオチドプライマー、ｂ）前記上流プライマーより下流側に５，０００ヌクレオチドを越えないで位置するオリゴヌクレオチドプローブ、およびｃ）その中にある標的配列が前記両プライマーに相補的である適切な標的核酸配列、ならびにｄ）好適な緩衝液（例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅより入手できるＳｅｎｔｉｎｅｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ  ＰＣＲコア緩衝液（カタログ番号６００５００）または１０Ｘ  Ｐｆｕ緩衝液（カタログ番号＃２００５３６）を、核酸配列がオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイゼーションできる条件（例えば９５℃、２〜５分間に続いて約５０〜６０℃に冷却する）の下でインキュベーションすることによって形成される。
最適温度は、具体的なプローブ、プライマー、およびポリメラーゼに強く依存するだろう。発明の好ましい態様では切断構造物は重複するフラップを含むが、この場合標的核酸配列にハイブリダイゼーションできる上流オリゴヌクレオチドの３’端（例えば図３）は標的核酸配列とアニーリングする下流オリゴヌクレオチドの一つまたは複数の塩基対と相補的であり、且つ重複する一塩基対は単鎖フラップの伸長点の直ぐ下流にある。
上流オリゴヌクレオチドプライマーの３’端は、本発明によれば、ポリメラーゼの合成活性によって、上流オリゴヌクレオチドプライマーの新たに合成された３’端が下流オリゴヌクレオチドプローブの５’を置き換えるように伸長される。伸長は、１Ｘ  Ｓｅｎｔｉｎｅｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒビーコンコア緩衝液または１Ｘ  Ｐｆｕ緩衝液存在下で、７２℃で１５秒間実施されるのが好ましい。本発明の一つの態様では、本発明の切断構造物は、標的核酸配列を部分的相補性オリゴヌクレオチドプライマーとインキュベーションし、３’相補領域を標的核酸配列にアニーリングし、標的核酸配列とアニーリングしない非相補的な５’領域は５’フラップを形成させることで調製できる。アニーリングは、好適緩衝液存在下（例えば１Ｘ  Ｓｅｎｔｉｎｅｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒビーコンコア緩衝液または１Ｘ  Ｐｆｕ緩衝液）で、核酸配列をオリゴヌクレオチドプライマーへハイブリダイゼーションできるようにする条件（例えば９５℃、２〜５分、続いて約５０〜６０℃に冷却する））にて実施するのが好ましい。
【０２３７】
別の態様では、本発明の切断構造物は、標的核酸、３’側をブロックした上流オリゴヌクレオチド、および５’フラップを有する下流プローブをインキュベーションすることによって形成される。この態様は、本明細書全体を通して、特に実施例７〜１３およびそれらに対応する図面に記載されている。
【０２３８】
さらなる態様では、３’ブロック端部を有する上流プライマーは標的に対し、ブロックされたプライマーの３’端とプローブの５’端間の距離が０ヌクレオチドか、または「切れ目（ｎｉｃｋ）」が入る形で相補的である。
別の態様では、ブロックされたプライマーの３’端とプローブ５’端間の距離は１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、５、１０、または１５ヌクレオチド以上である。
本発明のこの局面によれば、ポリメラーゼにより伸長が不可能な（３’リン酸塩ブロックオリゴヌクレオチドのような３’側がブロックされたオリゴヌクレオチド）、重複のない上流オリゴヌクレオチドは、例えばＦＥＮのようなヌクレアーゼによって、５’フラップを容易に切断できる。
【０２３９】
Ｂ．標識切断構造物を調製する方法
本発明では、標識物は切断構造物を含むオリゴヌクレオチドプライマーに取り付けられ、それによってプローブを形成する。このようにしてフラップ特異的ヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼ活性によって切断された切断モノヌクレオチドまたは小ヌクレオチドを検出することができる。
【０２４０】
本発明の標識化切断構造物は、ａ）上流に伸長可能な３’端、好ましくはオリゴヌクレオチドプライマー、ｂ）上流プライマーより下流側に５００ヌクレオチドを越えないで配置された標識化プローブ、およびｃ）その中の標的配列が前記両オリゴヌクレオチドに相補的である適切な標的核酸配列、ならびにｄ）好適な緩衝液（例えばＳｅｎｔｉｎｅｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒビーコンコアコア緩衝液または１０Ｘ  Ｐｆｕ緩衝液）を、核酸配列がオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイゼーションできる条件（例えば９５℃、２〜５分間に続いて約５０〜６０℃に冷却する）の下でインキュベーションすることによって形成される。本発明の切断構造物は重複するフラップも含むが、この場合標的核酸配列にハイブリダイゼーションできる上流オリゴヌクレオチドの３’端（例えば図３のＡ）は、標的核酸配列とアニーリングする下流オリゴヌクレオチド（例えば図３のＣ）の一塩基対に相補的であり、且つ重複する一塩基対は単鎖フラップの伸長点の直ぐ下流にある。上流プライマーの３’端は、ポリメラーゼの合成活性によって、上流オリゴヌクレオチドプライマーの新たに合成された３’端が下流プローブの標識化５’端を部分的に置換するように伸長する。伸長は、１Ｘ  Ｓｅｎｔｉｎｅｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒビーコンコア緩衝液または１Ｘ  Ｐｆｕ緩衝液存在下で、７２℃で１５秒間実施されるのが好ましい。本発明の切断構造物は、標的核酸配列を、標的核酸配列とアニーリングせずに５’フラップを形成する非相補的な標識化５’領域および標的核酸配列にアニーリングする相補的な３’領域とを含むプローブとインキュベーションすることによって調製できる。
アニーリングは、好適緩衝液存在下（例えば１Ｘ  Ｓｅｎｔｉｎｅｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒビーコンコア緩衝液または１Ｘ  Ｐｆｕ緩衝液）で、核酸配列をオリゴヌクレオチドプライマーへハイブリダイゼーションできるようにする条件（例えば９５℃、２〜５分、続いて約５０〜６０℃に冷却する））にて実施するのが好ましい。
引き続き複数あるストラテジーから任意のものを用いて、切断されていない標識化核酸をその切断フラグメントと識別する。このようにして本発明は、標的核酸配列を含むサンプルを識別する。
【０２４１】
オリゴヌクレオチドプローブは、以下記載する様に、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、酵素学的、または化学的手段によって標識化される。標識物をオリゴヌクレオチドプローブに連結または共役させる方法は、当然使用する標識物のタイプおよびプローブ上の標識物の位置に依存する。好ましくは、プローブは５’端が標識化されるが、本発明の特定の態様では、３’端が標識化されたか、またはプローブの全長にわたって標識化されたプローブも有用である。
【０２４２】
本発明での使用に適する各種標識物、ならびにそれらをプローブ内に組み込む方法は当技術分野で知られており、互いに相互作用してシグナルを高める、変化させる、または減衰させる酵素（例えばアルカリホスファターゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼ）と酵素基質、放射活性原子、蛍光色素、発色団、化学発光標識物、Ｏｒｉｇｅｎ（商標）（Ｉｇｅｎ）のような電気化学発光標識物が挙げられるが、これらに限定されない。もちろん標識化分子をサーマルサイクラー装置を用いて実施するＰＣＲベースのアッセイに用いるのであれば、標識物はこの自動化工程に必要な温度サイクルに耐えられるものでなければならない。
【０２４３】
放射活性原子の中では３３Ｐまたは３２Ｐが好ましい。３３Ｐまたは３２Ｐを核酸内に導入するための方法は当技術分野で知られており、例えばキナーゼによる５’標識化、またはニックトランスレーションによる無秩序な挿入が挙げられる。「特異的結合パートナー」は、例えば抗原とそれに対し特異的なモノクローナル抗体の例のような、高い特異性でリガンド分子を結合できるタンパク質を指す。他の特異的結合パートナーとしては、ビオチンとアビジンもしくはストレプトアビジン、ＩｇＧとプロテインＡ、および当技術分野で知られている数多くの受容体−リガンドの組み合わせが挙げられる。上記は、各種標識物を明瞭な分類にカテゴリー化することを意味しておらず、同一の標識物は様々な様態で利用できる。例えば、１２５Ｉは、放射活性標識物としても、または高電子密度作用物質として役立てることができる。ＨＲＰは、酵素として、またはモノクローナル抗体の抗原として役立てることができる。更には、様々な標識物を所望する効果に合わせて組み合わせることもできる。
例えば、プローブをビオチンで標識し、プローブの存在を１２５Ｉで標識したアビジン、またはＨＲＰで標識した抗−ビオチンモノクローナル抗体で検出することができるだろう。他の組み合わせおよび可能性は、当業者には容易に明らかになるものであり、本発明の範囲内の均等物と考えられる。
【０２４４】
本発明の標識化プローブの構築において標識物として用いられる蛍光団としては、ローダミンとその誘導体（テキサスレッドのような）、フルオロセインとその誘導体（５−ブロモメチルフルオロセイン）、ルシファーイエロー、ＩＡＥＤＡＮＳ、７−Ｍｅ２Ｎ−クマリン−４−アセタート、７−ＯＨ−４−ＣＨ３−クマリン−３−アセタート、７−ＮＨ２−４−ＣＨ３−クマリン−３−アセタート（ＡＭＣＡ）、モノブロモビマン、カスケードブルーのようなピレントリスルフォナート、およびモノブロモリメチル−アンモニオビマンが挙げられる。一般的には、モノクロモメーターよりはフィルターの付いた蛍光測定器を使用可能にして、検出の効率を上げるために、広いストロークシフトを持つ蛍光団が好ましい。
【０２４５】
蛍光団で標識されたプローブは、本発明の標識化プローブを含む切断構造物のＦＥＮを介した切断に容易に使用できる。標識物がプローブの５’単に在る場合は、ＦＥＮが生成する標識化フラグメントは、当技術分野で周知な手順によって無傷のハイブリダイゼーションしたプローブと分離される。次に遊離された標識物の蛍光を標的に結合したままの標識物の蛍光と比較する。プローブが、通常５’端に蛍光団を付け、通常色素より約２０ヌクレオチド下流にクエンチャーを付けて合成されている場合には、ＦＥＮ存在下で切断した後にＦＥＮ生成フラグメントと標的に結合したままのプローブを分離する必要はない。このような二重標識プローブは、無傷時には、クエンチャーによって色素からの放射光が消去されているため蛍光を発しない。かくして無傷のプローブから放射された蛍光は、バックグランド蛍光と見なされる。標識化プローブがＦＥＮヌクレアーゼで切断されると、色素とクエンチャーは分離して、遊離されたフラグメントは蛍光を発する様になる。蛍光の量は、サンプル中に存在する核酸標的配列の量に比例する。
【０２４６】
いくつかの状況では、オリゴヌクレオチド上の標識物間の間隔が適切に維持されるよう配慮しながら、二つの相互作用する標識物を単一のオリゴヌクレオチド上に用いて、オリゴヌクレオチドが加水分解される間に標識物が分離するようにできる。発明の有用な好ましい相互作用標識物としては、ローダミンとその誘導体、フルオロセイン（ＦＡＭ）とその誘導体、テキサスレッド、クマリンとその誘導体、クリスタルバイオレットが挙げられるが、これらに限定されず、ならびにＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭＲＡ、およびＮＴＢ（ニトロチアゾールブルー）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４７】
本発明の別の態様では、加水分化された標識化プローブは、例えば分子振動に基づいて巨大分子と小分子を区別する技術である蛍光偏向を用いて検出できる。巨大分子（即ち無傷の標識化プローブ）は、溶液中では小分子よりもはるかにゆっくり振動している。関心対象分子へ蛍光成分を連結させると（例えば標識化プローブの５’端）、この蛍光成分を分子振動に基づいて測定（および区別）でき、それによって無傷のプローブと消化されたプローブを区別できる。
【０２４８】
更に別の態様では、二重鎖の標的配列の各鎖の別々の領域に対してそれぞれが相補的であり、且つお互いは相補的でない二つの標識化核酸を用いて、標識化された核酸を各プライマーの下流にアニーリングさせる。例えば、二つのプローブの存在は、単一の標識物が生成するシグナルの強度を倍加できる可能性があり、さらにはＰＣＲ増幅時にしばしば起こる、産生された鎖が再アニーリングするのを減らすこともできる。プローブは、プライマーが結合する位置の近く（下流）の位置にプローブが結合するように選択する。
【０２４９】
本発明では複数のプローブを用いて他の便益を達成することもできる。例えば、所望数のプローブを反応混合液にただ加えることによって、サンプル中の任意数の病原体につい試験することができる；プローブは、それぞれが検出を容易にする、異なる標識物を含んでいる。
【０２５０】
また、本発明に複数のプローブを使用することによって、例えば異なるＴｍを有するプローブを用い、ある一種類のプローブ／対立遺伝子二重鎖に特異的な温度でアニーリング／切断反応を実施することによって、対立遺伝子特異的または種特異的に識別することもできる。また、単一プローブのみを用い、生成された切断生成物のタイプを検査することによって、対立遺伝子特異的な識別を行うこともできる。発明のこの態様では、プローブは、少なくとも５’末端領域については、一つの対立遺伝子に完全に相補的になり、もう一方の対立遺伝子には相補的でないように設計される。目的以外の対立遺伝子については、プローブはその５’末端領域にミスマッチを有することとなり、プローブが完全に相補的な対立遺伝子にハイブリダイゼーションした時に生成される切断産物とは異なる切断産物が生成される。
【０２５１】
プローブ配列は、重要な便益を達成できるように選択できるが、プローブ標識物の選択によっても重要な便益を実現できる。標識物は、様々な技術によってオリゴヌクレオチドに直接または間接的に取り付けることができる。使用する標識物の正確なタイプに依存して、標識物はプローブの５’または３’端に配置すること、プローブの内部に配置すること、または各種サイズおよび組成のスペーサーアームに取付けてシグナル相互作用を促進することができる。
市販されているホスホルアミダイト試薬を用いて、適切に保護されたホスホルアミダイト試薬を介して５−または３−末端のいずれかに保護官能基（例えばチオールまたは一次アミン）を含むオリゴマーを産生することができ、またそれらを、例えばＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｄ．，  １９９０に記載されているプロトコールを用いて標識できる。
【０２５２】
オリゴヌクレオチド官能化試薬を導入して、オリゴヌクレオチドプローブ配列内、典型的には５’末端に、一つまたは複数のスルフヒドリル、アミノ、またはヒドロキシ成分を導入するための方法は、米国特許第４，９１４，２１０号に記載されている。５’リン酸基は、ポリヌクレオチドキナーゼおよびガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰまたはガンマ−３３Ｐ−ＡＴＰを用いて放射性同位元素として導入し、レポーター基を提供することができる。ビオチンは、合成時に導入したアミノチミジン残基、または６−アミノヘキシル残基をビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させることによって５’端に付加することができる。３’末端の標識物は、ポリヌクレオチドターミナルトランスフェラーゼを用いて、例えばコルジセピン３５Ｓ−ｄＡＴＰ、およびビオチン化ｄＵＴＰのような所望成分を付加できる。オリゴヌクレオチド誘導体も利用可能な標識物である。例えば、エテノ−ｄＡおよびエテノ−Ａは、核酸プローブに組み入れることができる既知の蛍光アデニンヌクレオチドである。同様に、エテノ−ｄＣまたは２−アミノプリンデオキシリボシドは、プローブ合成に用いることができる他の類似体である。このようなヌクレオチド誘導体を含んだプローブは、加水分解されると、フラップ特異的ヌクレアーゼ活性によって遙かに強力な蛍光モノヌクレオチドを遊離する。
【０２５３】
蛍光団／クエンチャーのペアの配置
上記した様に、本発明の一つの態様では、蛍光団／クエンチャーのペアで二重標識されている下流プローブの使用を熟考する。標識化プローブがＦＥＮヌクレアーゼ（または本書記載の他のヌクレアーゼ）によって切断されると、蛍光団とクエンチャーは分離し、残ったフラグメントが蛍光を発する様になる。下流プローブ上の蛍光団とクエンチャーの位置は、５’フラップの侵襲的および非侵襲的な切断を識別するように特に選択できることが熟考される。当業者は、レポーター分子の配置に関する以下の開示が、蛍光団／クエンチャーのペアに関して記載されているものの、これがこの特定のレポーターシステムに限定されないことを認識するだろう。以下に記載するレポーター分子の配置は、他のレポーターシステム、例えばインターカレート色素にも応用でき、この場合は、特定位置でのプローブの切断によって色素シグナルの消去が起こるだろう。
以下に記載する配置の概略は、相互作用するレポーター分子を含む任意のレポーターシステムにも使用でき、この時分子の相互作用は下流プローブの非相補的部分の切断によって中断される。
【０２５４】
Ｐｆｕ  ＦＥＮは上流オリゴヌクレオチドの３’端に対し、下流（「プローブ」）オリゴヌクレオチドを単一位置で優先的に切断する。例えば、標的にハイブリダイゼーションしている下流プローブのヌクレオチドが、ヌクレオチド＋１〜＋Ｘで定義されたとすると、＋１がプローブのハイブリダイゼーション領域の５’部分の端部であり、＋Ｘがプローブのハイブリダイゼーション領域の３’端となる（Ｘは下流プローブのハイブリダイゼーションしている残基の数に等しい）。上流オリゴヌクレオチドが下流オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション領域と当重複しないが、下流オリゴヌクレオチドと境を接しており、この二つのオリゴヌクレオチドの間には一つの切れ目だけが存在している場合、ＦＥＮは下流オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション領域の位置＋１と＋２の間を切断する。もし上流オリゴヌクレオチドが、プローブのハイブリダイゼーション領域の５’端と重複する３’塩基を一つ有しており、この３’塩基位置で標的とハイブリダイゼーションするとすれば、プローブの切断は下流オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション領域の位置＋２と＋３の間で起こる。かくして、もし上流オリゴヌクレオチドの３’端がプローブのハイブリダイゼーション領域とヌクレオチドＮ個分重複しており、上流オリゴヌクレオチドの３’端の重複領域が標的とこの領域でハイブリダイゼーションするのであれば、切断はプローブのハイブリダイゼーション領域の位置＋（Ｎ＋１）と＊（Ｎ＋２）の間で起こる。
【０２５５】
かくして、下流プローブが予備形成された、ハイブリダイゼーションしていない５’端（「５’フラップ」）を有している場合、切断はプローブのハイブリダイゼーション領域の位置＋（Ｎ＋１）と＋（Ｎ＋２）の間で起こり、プローブのハイブリダイゼーション領域からは５’フラップが遊離されるが、上流オリゴヌクレオチドが下流オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション領域と境を接している場合には、二つのオリゴヌクレオチド間には切れ目だけが残り、切断は下流オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション領域の位置＋１と＋２の間で起こり、プローブの５’フラップが遊離されるだろう；５’フラップは、その３’端にプローブのハイブリダイゼーション領域の５’端に由来するヌクレオチドを一つ持つだろう。上流オリゴヌクレオチドがその３’端に一つの塩基を含み、それが下流オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション領域と重複している場合は、切断はプローブの＋２と＋３の間で起こり、５’フラップが遊離されて、その３’端にある二つの塩基は、プローブの先頭二つのハイブリダイゼーション塩基に由来するだろう。
【０２５６】
従って、蛍光団のようなレポーター基をプローブのハイブリダイゼーション領域の塩基＋２に取り付け、クエンチャーを５’フラップ内の塩基に取り付けると、位置＋２の下流の切断によってクエンチャーが遊離されるが、レポーター基は同じ核酸分子に結合したままである。しかしながら、切断がプローブの位置＋２の上流でおこったとすると（即ち＋１と＋２の間）、＋２の塩基に在ったレポーターはフラップ上に配置されたクエンチャーから分離する。位置＋２の上流で切断が起こった場合にも同じことが起こるが、上流プローブには下流プローブのハイブリダイゼーション領域と重複する部分がなくなる。かくして、上流オリゴヌクレオチドが標的と相補的であり且つ下流オリゴヌクレオチドの粗補的部分と重複する３’部分を持つ侵襲的切断構造物では、位置＋２の下流で切断が起こり、位置＋２に配置されたレポーター基と５’フラップ中に配置されたクエンチャーが物理的に分離することはない。侵襲的切断構造物から生ずる切断事象については検出されないが、非侵襲的接眼構造体から生じた切断事象は検出可能である。かくして、下流プローブのハイブリダイゼーション／相補的部分の位置＋２でのレポーター分子の置換によって、侵襲的切断と非侵襲的切断とを区別することができる。このように本発明の一つの態様では、下流プライマーの相補的部分の位置＋２に於けるレポーター分子（例えば蛍光団）の置換を熟考する。蛍光団／クエンチャーのペアの配置を逆転させ、蛍光団を５’フラップに、クエンチャーを下流プローブの相補的部分の位置＋２に配置することも熟考される。
【０２５７】
本発明はまた、一部は、プローブの位置＋３または＋９でのレポーター分子（例えばＦＡＭ（フルオロセイン）のような蛍光団であるが、これに限定されない）の置換が、それぞれプローブの位置＋３と＋４、または位置＋９と＋１０の間での切断を起こさなくするという発見にも基づいている。従って、位置＋２に蛍光団（例えばＦＡＭ）を有するプローブは、位置＋２と＋３の間で切断できず、その結果３’重複塩基を一つだけ持つ上流オリゴヌクレオチドは位置＋２と＋３の間でプローブの切断を起こすことが出来なくなり、一方重複領域を持たず、切れ目だけを持つ上流オリゴヌクレオチドは＋１と＋２の間で切断でき、これによって５’フラップ上に在るクエンチャーからレポーター基が分離する。
かくしてプローブのハイブリダイゼーション領域の塩基＋２に取り付けられたＦＡＭによるプローブの切断によって生み出されるシグナルは、非侵襲性切断構造物からのみ生じ、侵襲性切断構造物からは生じない。更には、相補領域の＋２位置に蛍光団（例えばＦＡＭ）が取り付けられているプローブからの５’フラップの切断は、フラップの３’端に取り付けられた相補領域の５’端からの３’塩基を一つ、または三つの３’塩基を持つ切断フラップを生じる。このようなフラップは、５’フラップに付いたままの二つの３’塩基を生ずる切断構造物は、プローブの＋２塩基上に在る蛍光団によってＦＥＮが封鎖されるために切断されないことから、その３’端に取り付けられた塩基をきっかり二つ持つことはできない。
【０２５８】
従って、発明は塩基＋２に蛍光団を有し、位置＋１の上流にクエンチャーを有し、非侵襲性切断構造物からのみシグナルを発生させ、侵襲性切断構造物からは発生させない下流プローブの使用を熟慮する。
【０２５９】
Ｃ．切断構造物の切断およびシグナルの発生
本発明の切断構造物は、「ＦＥＮヌクレアーゼ」と題した上記の項に記載した方法によって切断できる。
【０２６０】
Ｄ．遊離（ｒｅｌｅａｓｅ）された標識化フラグメントの検出
標識化フラグメントの検出または検証は、当技術分野で周知の様々な方法によって達成でき、それは標識化切断構造物を含む一つまたは複数の標識化成分の特徴に依存するだろう。
本発明の一つの態様では、反応産物は、遊離された標識化フラグメントを含め、サイズ分析に供される。標識化フラグメントのサイズを決定する方法は、当技術分野で知られており、例えばゲル電気泳動、勾配沈殿、ゲル排除クロマトグラフィー、質量分析分析装置、およびホモクロマトグラフィーが挙げられる。
増幅中または増幅後、遊離（ｒｅｌｅａｓｅ）された標識化フラグメントを、例えばＰＣＲ混合物から分離することは、例えばＰＣＲを固相抽出物（ＳＰＥ）と接触させることによって達成できる。例えば、サイズ、電荷、または核酸塩基との相互作用に基づく核酸結合能力を持つ物質はＰＣＲ混合液に、標識化された、未設団の核酸は結合するが、短い、標識化フラグメントは結合しない条件の下で加えることができる。このようなＳＰＥ材料としては、市販の結合微粒子Ｎｅｎｓｏｒｂ（ＤｕＰｏｎｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、Ｎｕｃｌｅｏｇｅｎ（Ｔｈｅ  Ｎｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ）、ＰＥＩ、ＢａｋｅｒＢｏｎｄ（商標）ＰＥＩ、Ａｍｉｃｏｎ  ＰＡＥ  １，０００、Ｓｅｌｅｃｔａｃｅｌ（商標）ＰＥＩ、３’リボースプローブ付きＢｏｒｏｎａｔｅ  ＳＰＥ、プローブの３’端に相補的な配列を含有するＳＰＥ、およびヒドロキシアパタイトのようなイオン交換樹脂またはビーズが挙げられる。特定の態様では、ヌクレアーゼ感受性切断部位によって５’標識物から分離した３’ビオチン標識物を含む二重標識化オリゴヌクレオチドをシグナル手段に用いる場合は、反応混合液、例えばＰＣＲ増幅混合液をアビジンもしくはストレプトアビジン、またはビオチンに対する抗体もしくはモノクローナル抗体と接触させることができる。このような物質としては、特異的結合パートナーでコーティングされたビーズまたは微粒子が挙げられ、また磁性微粒子も挙げることができる。
反応混合液、例えばＰＣＲ混合液をＳＰＥと接触させる段階の後、ＳＰＥ物質は濾過、沈殿、または磁気引力によって取り除いて、切断されていない標識化オリゴヌクレオチドを含まない標識化フラグメントを得て、検出に利用することができる。
【０２６１】
ＩＶ．使用方法
本発明は、標的核酸配列を核酸ポリメラーゼとインキュベーションすることによって標識化切断構造物を形成する段階、および切断構造物をヌクレアーセで切断する段階を含む、サンプル中の標的核酸配列の存在を指示するシグナルを生成する方法を提供する。本発明の方法は、以下記載のＰＣＲを基本とするアッセイに用いることができる。
上流オリゴヌクレオチドプライマー（例えばＡ、図３）、５’端標識化下流オリゴヌクレオチドプローブ（例えば図３のＣ）、および標的核酸配列（例えば図３のＢ）を含む標識化切断構造物は、「切断構造物」と題する上項に記載したように形成される。
簡単に説明すれば、切断構造物は、ＰＣＲ反応液中に標的核酸配列、上流プライマー（例えばＡ、図３）、標識化下流プローブ（例えばＣ、図３）、標的核酸配列に特異的な増幅プライマー、５’から３’方向のエクソヌクレアーゼ活性を欠失した核酸ポリメラーゼ、ＦＥＮヌクレアーゼ、および適切な緩衝液（例えば１０Ｘ  Ｐｆｕ緩衝液、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００５３６）存在させ、以下のサーモサイクルパラメータによって形成および切断される：９５℃２分間、ならびに９５℃１５秒間（変性段階）、６０℃６０秒間（アニーリング段階）および７２℃１５秒間（伸長段階）のサイクル４０回。この反応の間、上流オリゴヌクレオチド（例えばＡ、図３）は、各オリゴヌクレオチドＡは、標的核酸配列にアニーリングする下流オリゴヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチドＣ、図３）の５’標識化端を一部置換するようにして伸長し、生じた標識化構造物は本発明に従ってＦＥＮヌクレアーゼで切断される。
【０２６２】
本発明の方法は、標的核酸配列を検出するＰＣＲを基本としない応用にも用いることができる。幾つかの態様では、固体支持物上に固定できる。核酸配列を固体支持物に固定化する方法は当技術分野で知られており、Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．ならびにメーカーが提供するプロトコール、例えば膜については：Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ、例えば磁性ビーズについては：Ｄｙｎａｌ、例えば培養プレートについては：Ｃｏｓｔａｒ、Ｎａｌｇｅｎｕｎｃ、および本発明に有用な他の支持物については、ＣＰＧ，  Ｉｎｃ．が提供するプロトコールに記載されている。本発明に有用な固体支持物としては、シリカを基礎とするマトリックス、膜を基礎とするマトリックス、およびスチレン、ラテックス、もしくはシリカを基本とする材料、および他のポリマーを含むが、これに限定されない表面を具備するビーズが挙げられるが、これらに限定されない。磁性ビーズも本発明に有用である。固体支持物は上記製造元、および他の既知製造元から得ることができる。
【０２６３】
本発明はまた、溶液中の標的核酸配列を検出するための、ＰＣＲを基本としないアッセイも提供する。本発明の方法は、細胞、組織、単細胞生物、細菌、またはウイルスから単離および精製されたＲＮＡおよびＤＮＡを含むが、これらに限定されない溶液中に在る天然由来の標的核酸配列を検出するのに用いることができる。本発明の方法は、ＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチド、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むがこれに限定されない、溶液中の合成標的を検出するのにも用いることができる。非ＰＣＲアッセイとしては、３’−５’合成活性によって合成される核酸の量が直線的または対数的に増加する、等温での直線的または対数的増幅が関係し、ＦＥＮヌクレアーゼを用いて合成中に置換鎖が切断される検出アッセイが挙げられるが、これに限定されない。
このような例の一つは、ローリングサイクル増幅を利用する。
【０２６４】
固定化されているか、または溶液中に存在している核酸標的配列は、固定化された核酸標的配列または溶液中に在る標的核酸配列を、標的核酸配列に相補的な上流オリゴヌクレオチドプライマー（例えばＡ、図３）および標的核酸配列に相補的な下流オリゴヌクレオチドプローブ（例えばＣ、図３）、ＦＥＮヌクレアーゼ、ならびに５’から３’方向のエクソヌクレアーゼ活性を欠失した核酸ポリメラーゼとインキュベーションすることに検出できる。下流プローブは、５’端または３’端のいずれかを標識するか、またはその内部を標識化する。遊離された標識化フラグメントの検出には、プローブ内に組み入れられている特異的標識物に在った放射性同位元素、酵素、または発色による方法を用いる。本発明に有用な標識物および本発明に有用な標識物を検出する方法は、「切断構造物」と題した項に記載されている。あるいは、下流プローブは、プローブが無傷の時には検出可能なシグナルの発生が消去されるように配置された、相互作用してシグナルを発生させる標識化成分のペア（例えば色素とクエンチャー）を含み、この場合相互作用してシグナルを発生させる成分のペアはＦＥＮヌクレアーゼ切断部位で分離する。ＦＥＮヌクレアーゼによって切断されると、二つのシグナル発生成分はそれぞれ分離し、検出可能なシグナルが作られる。本発明の方法による、固定化された核酸標的配列または溶液中の核酸標的配列の検出に有用な核酸ポリメラーゼとしては、５’から３’へのエクソヌクレアーゼ活性を欠失した中温性、好熱性、または超高熱性ＤＮＡポリメラーゼ（「核酸ポリメラーゼ」と題した項に記載されている）があげられる。
【０２６５】
このＰＣＲを基本としない方法では、検出可能な標的核酸配列の量は、好ましくは約１ｐｇ〜１μｇ、より好ましくは約１ｐｇから１０ｎｇ、最も好ましくは約１ｐｇから１０ｐｇである。あるいは、このＰＣＲを基本としない方法は、好ましくは約１分子〜１０２０分子、より好ましくは約１００分子から１０１７分子、および最も好ましくは約１００分子から１０１４分子を測定または検出できる。
発明はまた、３’がブロッキングされた上流オリゴヌクレオチドを用いて標的核酸を検出する方法も提供する。このような態様は、本明細書の全体を通して、特に実施例７〜１３に記載されている。
【０２６６】
更なる態様では、本発明は、５’フラップ付きプローブ（例えば、同時係属中の特許出願ＵＳＳＮ６０／６８８，７９８に記載されているような重要プローブ）が標的配列に相補的である領域と重複しない、３’がブロッキングされた上流オリゴヌクレオチド存在下での、Ｆｅｎヌクレアーゼによる５’非相補的フラップの切断を熟慮する。
図２０のデータは、プローブの３’端がブロッキングされている場合、５’フラップの効率的切断がこのような重複が無い状態で起こることを証明している。
３’ブロッキング端を有する上流プライマーが標的に対し、ブロッキングプライマーの３’端とプローブの５’端間の距離が０ヌクレオチドであるか、「切れ目」が入る形で相補的であることが好ましい。別の態様では、ブロッキングされたプライマーの３’端とプローブの５’端間の距離は、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、５、１０、または１５ヌクレオチド以上である。
本発明のこの局面によれば、ポリメラーゼによる伸長が不可能である（３’リン酸塩ブロックオリゴヌクレオチドのような３’側がブロックされたオリゴヌクレオチド）重複のない上流オリゴヌクレオチドは、例えばＦＥＮのようなヌクレアーゼによって、５’フラップを容易に切断できる。
【０２６７】
一つの態様では、切断反応は、ＰＣＲプライマーをアニーリングする前のＰＣＲ反応冷却期中に５’−フラップ付きプローブの切断が起こるような、ＰＣＲプライマーの融解温度より高い温度で実施されるのが好ましい。即ち、ＰＣＲ反応液を摂氏９５度から冷却する時、５’フラップ付きプローブおよびブロッキングオリゴヌクレオチドの標的へのアニーリングは、ＰＣＲプライマーが標的にアニーリングする温度より高い温度で起こるのが好ましい。これにより切断酵素（ＦＥＮ）は、ポリメラーゼによるＰＣＲプライマーの伸長が起こる前にプローブを切断できる。切断後、反応液を更に冷却することができ、そうしてＰＣＲプライマーをアニーリングさせ、ポリメラーゼによって伸長させることができる。
【０２６８】
本発明は、切断構造物を「切断構造物」と題する項の記載に従い形成し、標的核酸配列を、例えばローリングサイクル、Ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（３ＳＲ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＴＡＳ）、およびＳｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ）のような等温法、ならびに例えばＬｉｇａｔｉｏｎ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）を含むが、これらに限定されないＰＣＲを基本としない方法で増幅する、サンプル中の標的核酸配列を検出する方法も提供する。非ＰＣＲ増幅法に有用なＦＥＮヌクレアーゼは、用いる具体的な増幅方法にとって適切な温度範囲内で活性であろう。
以下に記載する増幅プロトコールでは、標的を定量化するために必要なサンプルとしては：サンプル、鋳型以外のコントロール、および標準曲線調製用の反応物（一定量の標的を含む溶液の、６桁の範囲の希釈液を含む）が挙げられる。
【０２６９】
Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉａｔｉｏｎ（ＳＤＡ）は、未修飾鎖にヘミホスホロチオエート型のその認識部位に切れ目を入れる制限酵素の能力に基づく。適切なＤＮＡポリメラーゼは、この切れ目で複製を開始し、下流の鋳型以外の鎖をちかんする（Ｗａｌｋｅｒ，  １９９２，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：３９２およびＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ３：１−６，  １９９３）。ＳＤＡ法に従い用いられるポリメラーゼ（ＢｃａおよびＢｓｔ）は、本発明によるＦＥＮ利用の切断にも用いることができる。本発明の方法によれば、分子ビーコンは、４２０ＣでＦＥＮヌクレアーゼ活性によって、本発明の切断構造物を含む切断可能なプローブによって置き換えられる。  分子ビーコン（Ｍｂ）は、溶液中でステムループ構造を形成する蛍光性プローブである。典型例：５’−蛍光色素（例えばＦＡＭ）、５’ステム領域に取付け、ループ領域（標的に相補的、２０〜３０ｎｔ）、３’−ステム領域（５’ステム領域に相補的）、およびクエンチャー（例えばＤＡＢＣＹＬ）。標的が存在しない場合には、ＭＢは色素とクエンチャーを近接させたステムを形成し、その結果蛍光は発せられない。ＭＢがその標的に結合すると、ステムは開き、色素はクエンチャーから空間的に分離し、その結果プローブは蛍光を発する（Ｔｙａｇｉ  Ｓ  ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ  ＦＲ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０３−３０８  （１９９６）および米国特許第５，９２５，５１７号）。Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉａｔｉｏｎ（ＳＤＡ）は基本的には、Ｓｐａｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  １０：２４７−２５６（１９９６）が記載するようにして実施される。使用する酵素としては、エンドヌクレアーゼＢｓｏＢＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＤＮＡポリメラーゼ５’エクソ−Ｂｃａ（Ｐａｎ  Ｖｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。標的はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｂ）ゲノムに見出された挿入類似エレメント（ＩＳ６１１０）である。使用するプライマーはＢ１：ｃｇａｔｃｇａｇｃａａｇｃｃａ（配列番号４）、Ｂ２：ｃｇａｇｃｃｇｃｔｃｇｃｔｇ（配列番号５）、Ｓ１：ａｃｃｇｃａｔｃｇａａｔｇｃａｔｇｔｃｔｃｇｇｇｔａａｇｇｃｇｔａｃｔｃｇａｃｃ（配列番号７）である。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｃｕｌｏｓｉｓのゲノムＤＮＡをヒト胎盤ＤＮＡ中に連続希釈する。ＳＤＡは０〜１０００Ｍｔｂゲノム当量、５００ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡ、１６０単位のＢｓｏＢ１、８単位の５’エクソ−Ｂｃａ、ｄＣＴＰアルファＳ、ＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰを各１．４ｍＭ、３５ｍＭ  Ｋ２ＰＯ４  ｐＨ７．６、０．１ｍｇ／ｍｌのアセチル化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１１ｍＭ  ＮａＣｌ、０．３ｍＭ  ＤＩＴ、４ｍＭ  ＫＣｌ、４％グリセロール、０．００８ｍＭ  ＥＤＴＡ、５００ｎＭプライマーＳ１およびＳ２、ならびに５０ｎＭ  プライマーＢ１およびＢ２（ＫＣｌ、グリセロール、��よびＥＤＴＡはＢｓｏＢ１保存溶液から得られる）を含有するサンプル５０ｕｌで実施する。
サンプル（３５μｌ）は沸騰水槽中で３分間加熱してから、ＢｓｏＢ１および５’エクソＢｃａ（１５μｌのＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ緩衝液２（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．９、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ）中に存在する１０．７単位／μｌ  ＢｓｏＢ１および０．５３単位／μｌ５’エクソＢｃａ）を加えた。インキュベーションは、６０℃で１５分間、続いて沸騰水槽中で５分間行う。
【０２７０】
各サンプル５μｌを検出用として二回に取り出す。各反応液は、１Ｘ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｐｆｕ緩衝液、３．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各ｄＮＴＰを２００ｕＭ、５単位のエクソＰｆｕ、Ｐｆｕ  ＦＥＮ−１を２３ｎｇ、ＰＥＦを１ｎｇ、上流プライマー：ａａｇｇｃｇｔａｃｔｃｇａｃｃｔｇａａａ（配列番号８）と蛍光プローブ（例えばＦＡＭ−ＤＡＢＣＹＬ）：ａｃｃａｔａｃｇｇａｔａｇｇｇｇａｔｃｔｃ（配列番号９）をそれぞれ３００ｎＭ含有している。反応液は、サーマルサイクラーで：９５℃２分間、５５℃１分間、７２℃１分間のサイクルに１回かけられる。次にＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製ＦｌｕｏｒＴｒａｃｋｅｒまたはプレート読み取りモードにしたＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍのような蛍光プレート読み取り機を用いて蛍光を測定する。
【０２７１】
核酸配列ベースの増幅法（ＮＡＳＢＡ）によれば、分子ビーコンはＮＡＳＢＡ  ＲＮＡアンプリコンを定量化するリアルタイム分析に用いられる（Ｌｅｏｎｅ，  ｅｔ  ａｌ／．  １９９８，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２６：２１５０）。本発明の方法によると、ＮＡＳＢＡは分子ビーコンプローブを本発明の切断構造物を含むＦＥＮヌクレアーゼ切断可能なプローブで置換えて実施でき、ＦＥＮヌクレアーゼは４１℃で活性である。
【０２７２】
ＮＡＳＢＡ増幅は、本質的にはＬｅｏｎｅ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２６：２１５０−２１５５（１９９８）が記載したように実施される。ジャガイモ葉巻病ウイルス（ＰＬＲＶ）由来のゲノムＲＮＡは、ＰＤ４１５またはＰＤ４１６（アンチセンス）プライマーとＰＤ４１７（センス）プライマーを用いて増幅されるが、これらはＬｅｏｎｅ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６６：１９−２７  （１９９７）に詳細が記載されている。各ＮＡＳＢＡ反応溶液は、無菌水６μｌ、５Ｘ  ＮＡＳＢＡ緩衝液（５Ｘ  ＮＡＳＢＡ緩衝液は、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、６０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３５０ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＤＴＴ、各ｄＮＴＰを５ｍＭ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、およびＣｐｔを各１０ｍＭとＧＴＰを７．５ｍＭ、ならびにＩＴＰを２．５ｍＭを含む）４μｌ、５Ｘプライマーミックス（７５％ＤＭＳＯおよびアンチセンスプライマーとセンスプライマーを各１μＭ）のプレミックスを含有する。前記プレミックスを１４μｌずつ小分けし、これにＰＬＰＢを１μｌ加える。５分間、６５℃でインキュベーションし４１℃まで５分間かけて冷却した後、酵素混合液５μｌを加える（一反応当たり３７５ｍＭのソルビトール、ＢＳＡ２．１μｇ、ＲＮａｓｅＨ０．０８単位（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、３２単位のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および６．４単位のＡＭＶ−ＲＴ（Ｓｅｉｇａｋａｋｕ））。
増幅は４１℃で９０分間である。
【０２７３】
各サンプルを５μｌずつ２回検出用に取り出す。各反応液は、１ＸのＣｌｏｎｅｄ  Ｐｆｕ緩衝液、３．０ｍＭのＭｇＣｌ２、３５０ｍＭ  ＫＣｌ、各ｄＮＴＰを２００ｕＭ、エクソ−Ｐｆｕを５単位、Ｐｆｕ  ＦＥＮ−１を２３ｎｇ、ＰＥＦを１ｎｇ、上流プライマーＰＤ４１５またはＰＤ４１６を各３００ｎＭ、および蛍光プローブ（例えばＦＡＭ−ＤＡＢＣＹＬ）：ｇｃａａａｇｔａｔｃａｔｃｃｃｔｃｃａｇ（配列番号１０）を含有する。反応液はサーマルサイクラーで：９５℃２分間、５５℃１分間、７２℃１分間のサイクルに１回かけられる。次にＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製ＦｌｕｏｒＴｒａｃｋｅｒまたはプレート読み取りモードにしたＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍのような蛍光プレート読み取り機を用いて蛍光を測定する。
【０２７４】
一般的には、増幅がＰＣＲを基本としない方法で行われるこれらの方法によれば、増幅はＦＥＮヌクレアーゼ存在下に実施され、増幅およびＦＥＮヌクレアーゼによる切断は同時に起こる。遊離された標識フラグメントの検出は、「切断構造物」と題した項に記載されているように行われ、増幅および切断の工程が完了すると同時（リアルタイム）または完了後（エンドポイント）に行うことができる。
エンドポイントアッセイは、増幅段階がＦＥＮヌクレアーゼ存在下に実施される（上記）ＰＣＲを基本としない方法により産生された増幅された標的の定量化に用いることができる。
【０２７５】
エンドポイントアッセイとしては、次のものが挙げられるが、これらに限定されない。
Ａ．  Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４１：１０７７およびＢａｒａｎｙ、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：５−１６  （１９９１）に記載されているＬｉｇａｔｉｏｎ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）。本発明に有用なＬＣＲ産物は、上流プライマーと標識化された下流プローブが８ヌクレオチドより長いギャップで隔てられており、ＦＥＮヌクレアーゼによって効率的に切断できる十分な長さを有する。
【０２７６】
Ｂ．Ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（３ＳＲ）  Ｆａｈｙ，  ｅｔ  ａｌ．  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：２５−３３（１９９１）。Ｓｅｌｆ−Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（３ＳＲ）は、ＮＡＳＢＡに似た技術である。Ｅｈｒｉｃｈｔ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：４６９７−４６９９（１９９７）は、３ＳＲ法をｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎシステム（ＣＡＴＣＨ）に発展させた。これによりＣＡＴＣＨでは、分子ビーコンプローブはＲＮＡアンプリコンのリアルタイム分析に用いられる。増幅された合成標的は、次の配列を有する：ｃｃｔｃｔｇｃａｇａｃｔａｃｔａｔｔａｃａｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｔｃＴｇｃａｃｇｔａｔｔａｇｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔａｔｔａａｔａｇｇａａａｃａｃｃａａａｇａｔｇａｔａｔｔｔｃｇｔｃａｃａｇｃａａｇａａｔｔｃａｇｇ（配列番号１１）。
３ＳＲ反応液は、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＫＣｌ、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各ｄＮＴＰを１ｍＭ、二本鎖標的１ｎＭ、Ｐ１：ｃｃｔｃｔｇｃａｇａｃｔａｃｔａｔｔａｃ（配列番号１２）およびＰ２：ｃｃｔｇａａｔｔｃｔｔｇｃｔｇｔｇａｃｇ（配列番号１３）を２μＭ、３単位／ｕｌのＴ７−ＲＮＡポリメラーゼ、ならびに０．１６単位／ｕｌのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＲＮａｓｅＨを含有する。反応液１００μｌを３０分間、４２℃でインキュベーションする。
【０２７７】
各サンプルは５μｌずつ２回検出用に取り出される。各反応液は、１ＸのＣｌｏｎｅｄ  Ｐｆｕ緩衝液、３．０ｍＭのＭｇＣｌ２、各ｄＮＴＰを２００ｕＭ、エクソ−Ｐｆｕを５単位、Ｐｆｕ  ＦＥＮ−１を２３ｎｇ、ＰＥＦを１ｎｇ、上流プライマーＰ１３００ｎＭおよび蛍光プローブ（例えばＦＡＭ−ＤＡＢＣＹＬ）：ｔａｇｇａａａｃａｃｃａａａｇａｔｇａｔａｔｔｔ（配列番号１４）を含有する。反応液はサーマルサイクラーで：９５℃２分間、５５℃１分間、７２℃１分間のサイクルに１回かけられる。次にＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製ＦｌｕｏｒＴｒａｃｋｅｒまたはプレート読み取りモードにしたＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍのような蛍光プレート読み取り機を用いて蛍光を測定する。
【０２７８】
Ｃ．ローリングサイクル増幅は米国特許第５，８５４，０３３号に記載されており、かつＲａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ（ＲＡＭ）（米国特許第５，９４２，３９１号）に関係する。本発明に適合するローリングサイクル増幅は、下記実施例３に記載されている。
【０２７９】
リアルタイムアッセイも、増幅段階をＦＥＮヌクレアーゼ存在下に実施する（上記）ＰＣＲを基本としない方法で産生した増幅された標的の定量化に用いることができる。ローリングサイクル増幅法（米国特許第５，８５４，０３３号）は、ＦＥＮヌクレアーゼおよび本発明の切断構造物を含む切断可能プローブを共に、増幅および検出用の二次プライマーを含むのに適しており、５０〜６０℃の温度で実施される。
ＦＥＮヌクレアーゼの切断パターンは、プライマーの５’端から１〜１５ヌクレオチド間の任意の場所に配置された単一ミスマッチ塩基の存在によって変えることができ、それが存在しない場合前記ＤＮＡプライマーは完全にアニーリングする。典型的には、完全アニーリングした基質上で、ＦＥＮヌクレアーゼは最も５’側にあるヌクレオチドをエクソヌクレアーゼ活性的に切断する。これは、ミスマッチが、そのミスマッチの除去をもたらすヌクレアーゼの作用を促進する５’プルーフリーディング工程を構成する。かくして、ＦＥＮヌクレアーゼ切断のメカニズムは、単一ミスマッチ塩基対が存在することだけによって主要エクソヌクレアーゼ活性切断から主要エンドヌクレアーゼ活性切断にシフトする。
これはミスマッチが短いフラップの形成を可能にすることにより生ずると予想されている（Ｒｕｍｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７４：１４６０２）。
【０２８０】
本発明の方法は、標的核酸配列内の配列変異の存在を指示するシグナルの発生に用いることができ、この場合完全アニーリングＤＮＡプライマーを含む標識化切断構造物は、標的核酸配列を核酸ポリメラーゼと一緒にインキュベーションし（「切断構造物」と題した項に記載されているように）、ＦＥＮヌクレアーゼで標識化切断構造物を切断することによって形成され、エンドヌクレアーゼ活性切断産物を含む標識化フラグメントの遊離が配列変異の存在を示す。遊離された標識化フラグメントは、「切断構造物」と題した項に記載されているようにして検出される。
【０２８１】
Ｖ．サンプル
本発明は、本明細書に画定されるような、サンプル中の標的核酸配列を検出または測定する方法を提供する。本明細書に使用する「サンプル」とは、関心対象の核酸（標的核酸配列）を含有するか、含有すると推測される任意の物質、またはそれ自体が標的核酸配列であって、関心対象の標的核酸配列を含有するか、または含有すると推測されるものを指す。それ故に用語「サンプル」としては、核酸トレーサー分子で「マーク」された、例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、便、皮膚の外分泌物、呼吸器、腸、および生殖器、唾液腺、血球、腫瘍、器官、組織、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養構成物のサンプル、天然物（飲料水、海水、土壌物質のような）から単離された微生物、ならびに対象物または検体を含むがこれらに限定されない標的核酸配列（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ）、細胞、生物、組織、体液、または物質が挙げられる。
【実施例】
【０２８２】
本発明は、以下の材料および方法を使用する以下の制限なしの実施例によって示される。以降に引用される文献の各々の全開示は、ここに参照して組み込まれる。
【０２８３】
実施例１
以下の方法によって、標的核酸配列を検出および／または測定できる。（ａ）標的核酸配列（図３でＢ）を含有するサンプルを（ｂ）標的核酸配列に特異的にハイブリッド形成する上流オリゴヌクレオチド（図３でＡ）、および（ｃ）オリゴヌクレオチドＡのハイブリッド形成領域の下流にある標的核酸配列の領域に特異的にハイブリッド形成する下流の５’末端標識オリゴヌクレオチド（図３でＣ）と共に９５℃で５分間加熱し、その後およそ５０−６０℃まで冷却することによって、ＦＥＮヌクレアーゼの添加の前に、標的された切断構造を形成する。
ａ）Ｙａｑエキソ−（Ｔａｑポリメラーゼ（ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：１０７４）を修飾するストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のクイックチェンジ部位特異的突然変異誘発キット（カタログ番号２００５１８））を使用した突然変異誘発によって作製される）、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼの突然変異形態、ｂ）Ｐｆｕ、または（ｃ）３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠くＰｆｕポリメラーゼの突然変異形態（エキソＰｆｕ）のような５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠くが、３’から５’へのＤＮＡ合成活性を保有するポリメラーゼを添加し、オリゴヌクレオチドの５’末端を部分的に置換するようなポリメラーゼにオリゴヌクレオチドＡを伸長させる条件下で、たとえば５分から１時間までの間１×Ｐｆｕ緩衝液（ストラタジーン）中で７２℃でインキュベートする。オリゴヌクレオチドＣの置換領域は、ＦＥＮヌクレアーゼの添加により切断される５’フラップを形成する。
５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠くが、３’から５’へのＤＮＡ合成活性を保有するＴａｑポリメラーゼの突然変異形態は、以下の突然変異を含む：Ｄ１４４Ｓが、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を排除し、Ｆ６６７Ｙは、ｄｄＮＴＰ組込みを改善するＤ１４４／Ｆ６６７Ｙ  Ｔａｑ。
【０２８４】
ＰｏｌＩポリメラーゼのエキソ−突然変異体を、Ｘｕら、１９９７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６８：２８４の方法によって作製できる。
本発明による標識切断構造を、ＰｆｕＦＥＮ−１の標品（すなわち、実施例２で下に記述されるとおり作製されるクローン化ピロコックス・フリオススＦＥＮ−１）で切断する。以下のものを含有する７μｌ反応混合物に２μｌのＰｆｕＦＥＮ−１を添加することによって、切断を行う：
３μｌ                切断構造（１０ｎｇ−１０μｇ）
０．７                μｌ  １０×ＦＥＮヌクレアーゼ緩衝液（１０×ＦＥＮヌクレアーゼ緩衝液は、５００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する）
２．００          μｌ  ＰｆｕＦＥＮ−１酵素またはＨ２Ｏ
１．３            μｌ  Ｈ２Ｏ
７．００          μｌ  総量
【０２８５】
サンプルを、１時間、５０℃で、ロボサイラー９６ホットトップ熱サイクラー中でインキュベートする。２μｌのシーケンシング停止染料溶液（ストラタジーンのサイクリストＤＮＡシーケンシングキット、カタログ番号２００３２６に含まれ、実施例３で記述される）の添加に続いて、サンプルを、９９℃で５分間加熱する。サンプルを、１１インチ長の手引きの２０％アクリルアミド／ビスアクリルアミド、７Ｍウレアゲルに入れる。フロモフェノールブルーが、総距離のおよそ２／３移動するまで、ゲルを、２０ワットで稼動させる。ゲルを、ガラスプレートから取り出し、１０分間、固定溶液（１５％メタノール、５％酢酸）で振とうさせ、その後水で１０分間浸透させつ。ゲルをワットマン３ｍｍ紙に乗せ、プラスチック製覆いで覆い、加熱真空ゲル乾燥装置（〜８００℃）で２時間乾燥させる。ゲルを、Ｘ線フィルムに一夜さらして、標的核酸配列の存在を示すシグナルの存在を検出する。
【０２８６】
実施例２
ＰｆｕＦＥＮ−１のクローニング
以下の方法により、本発明による有用な熱安定性ＦＥＮヌクレアーゼ酵素を作製できる。
熱安定性ＦＥＮヌクレアーゼ遺伝子を、当業界で周知のＰＣＲクローニングの方法によってピー．フリオスス（ＡＴＣＣ番号４３５８７）から由来するゲノムＤＮＡから単離できる。クローン化ＰｆｕＦＥＮ−１を、当業界で周知で、下に記述される方法により、細菌細胞中で過剰発現できる。
以下のｐＣＡＬクローニング・オリゴヌクレオチドを合成および精製した：
ａ）
５’ＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＧＴＧＴＣＣＣＡＡＴＴＧＧＴＧＡＧＡＴＴＡＴＡＣＣＡＡＧＡＡＡＡＧ  ３’（配列番号：１５）および
ｂ）
５’ＧＧＡＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＴＴＴＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＣＣＡＡＣＴＴＴＣＡＡＧＧＧＴＴＧＡＴＴＧＴＴＴＴＣＣＡＣＴ３’（配列番号：１６）。
スタラタジーンからアフィニティー（登録商標）タンパク質発現および精製システムを得、製造業者のプロトコールにしたがって使用した。
【０２８７】
増幅
ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫベクター単鎖尾部に相補的である５’末端で１２および１３ヌクレオチド配列を含み、したがって方向性クローニングに対処する遺伝子特異的プライマー（オリゴヌクレオチドａおよびｂ、上に記述される）を用いたＰＣＲ増幅によって、挿入ＤＮＡを精製した。
５０μｌ            １０×Ｐｆｕ緩衝液（ストラタジーン）
７．５μｌ          ＰｆｕゲノムＤＮＡ（およそ１００ｎｇ／μｌ）
７．５μｌ          Ｐｆｕターボ（２．５ｕ／μｌ）（ストラタジーン、カタログ番号６００２５０）
１５μｌ            混合プライマー対（１００ｎｇ／μｌ各）（オリゴヌクレオチドａおよびｂ、上に記述される）
４μｌ              １００ｍＭ  ｄＮＴＰ
４１６              １Ｈ２Ｏ
５００μｌ総量
を含有する増幅反応液（５つの独立の１００μｌ反応液）を作製し、
ストラタジーンのロボサイクラー９６ホットトップ熱サイクラー：
ウインドウ１  ９５℃１分、１サイクル
ウインドウ２  ９５℃１分
５０℃１分、３０サイクル
７２℃３分
を用いた以下の条件下で増幅を行うことによって、ＦＥＮ−１配列を、ピー．フリオススから由来したゲノムＤＮＡから増幅した。
【０２８８】
５回の反応の各々から得られるＰＣＲ産物を、１つの管に合せ、ストラタプレプＰＣＲを使用して精製し、５０μｌの１ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）中で溶出した。ＦＥＮ−１ＰＣＲ産物をゲル上で分析し、およそ１０００ｂｐであると決定した。
ライゲーション独立性クローニング末端（ＬＩＣ）を作製し、ｆｅｎ−１遺伝子を含むＰＣＲ産物を、ｐＣＡＬｎＥＫ  ＬＩＣベクター（ストラタジーン）にアニールし、細胞を、以下の方法によるアニール混合液で形質転換させることによって、ｆｅｎ−１遺伝子を含むＰＣＲ産物を、ｐＣＡＬｎＥＫ  ＬＩＣベクター（スタラタジーン）にクローン化した。簡潔には、ＰＣＲ増幅に続いて、ＰＣＲ産物を精製し、ｄＡＴＰ（アフィニティー（登録商標）タンパク質発現および精製システム（ストラタジーン、カタログ番号２００３２６）で含まれる取扱い説明書によって）の存在下でＰｆｕＤＮＡポリメラーゼで処理する。ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰの不在下で、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性は、ＰＣＲ産物の個別の３’末端で少なくとも１２および１３ヌクレオチドを除去する。第一のアデニンが遭遇するまでこの活性は持続して、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫベクターの単鎖尾部に相補的である５’伸長された単鎖尾部を有するＤＮＡフラグメントを生じる。
【０２８９】
ＬＩＣ末端を作製
以下の混合物を製造することによって、ＬＩＣ末端を作製した。
４５μｌ精製ＰＣＲ産物（〜０．５μｇ／μｌ）
２．５μｌ  １０ｍＭ  ｄＡＴＰ
５μｌ  １０×ｃＰｆｕ緩衝液
１μｌ  ｃＰｆｕ（２．５ｕ／μｌ）
０．５μｌ  Ｈ２Ｏ
ｃＰｆｕおよびｃＰｆｕ緩衝液を、ストラタジーン（ｃＰｆｕ、ストラタジーンカタログ番号６００１５３、およびｃＰｆｕ緩衝液、ストラタジーンカタログ番号２００５３２）から得ることができる。
７２℃で２０分間、サンプルをインキュベートし、産物を室温に冷却した。各サンプルに４０ｎｇの作製したｐＣＡＬｎＥＫ  ＬＩＣベクター（作製ベクターは、アフィニティーＬＩＣクローニングおよびタンパク質精製キット（２１４４０５）でストラタジーンから市販で入手可能である）を添加した。ベクターおよび挿入ＤＮＡを合せ、室温でアニールさせ、非常にコンピテントな細菌宿主細胞（Ｗｙｂｏｒｓｋｉら、１９９７、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、１０：１）に形質転換する。
【０２９０】
ＦＥＮの産生のための細胞を作製する
２リットルのＬＢ−ＡＭＰを、２０ｍｌのＦＥＮ−１クローン（クローン３）の一夜培養物とインキュベートした。成長させて、およそ１１時間進行させ、その時点で、細胞は、ＯＤ６００＝０．９７４に達した。細胞を、１ｍＭ  ＩＰＴＧで一夜（約１２時間）誘発させた。遠心により細胞を収集し、得られた細胞ペーストを−２０℃で保存した。
【０２９１】
タグ付ＦＥＮ−１の精製
細胞を２０ｍｌのカルシウム結合緩衝液に再懸濁させた。
ＣａＣｌ２結合緩衝液
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１５０ｍＭ  ＮａＣｌ
１．０ｍＭ  ＭｇＯＡｃ
２ｍＭ  ＣａＣｌ２
マイクロチップを使用して、ブランソンのソニケーターでサンプルを超音波処理した。出力設定は５であり、負荷サイクルは９０％であった。サンプルを、三回超音波処理し、間隔をおいて氷上に静止させた。２６，８９０×ｇで音波処理物を遠心分離した。除去された上清を、５０ｍｌ円錐管中で１ｍｌの洗浄（ＣａＣｌ２結合緩衝液中で）カルモジリンアガロース（ＣＡＭアガロース）と混合し、５分間冷却室（４℃）でゆっくりと回転する車輪上でインキュベートした。軽い遠心分離（机上遠心機で５０００ｒｐｍ）によって、ＣＡＭアガロースを収集した。
【０２９２】
上清の除去に続いて、ＣＡＭアガロースを、５０ｍｌＣａＣｌ２結合緩衝液で洗浄し、使い捨て用点滴カラムに移した。最初の容器およびピペットを、十分に洗浄して、残留アガロースを除去した。カラムを、およそ２００ｍｌのＣａＣｌ２結合緩衝液で洗浄した。
１０ｍｌの５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．２ｍＭ  ＥＧＴＡ）で溶出を行った。０．５ｍＬ分画を収集した。０．５ｍｌ分画を収集して、１Ｍ  ＮａＣｌ溶出緩衝液で第二の溶出段階を行った。
【０２９３】
精製タグ付ＦＥＮ−１の評価
１Ｍ  ＮａＣｌ中で溶出されたＣＢＰタグ付ＰｆｕＦＥＮ−１を含有する分画を、ＳＤＳで煮沸し、シプロオレンジで染色した４−２０％ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図４）。
未切断ＦＥＮ−１のタンパク質濃度を、およそ１５０ｎｇ／マイクロリットル（下）と測定した。
【０２９４】
精製ＦＥＮ−１のエンテロキナーゼプロテアーゼ（ＥＫ）切断
分画３−９を、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および２ｍＭ  ＣａＣｌ２中で４℃で一夜透析した。
不透明な非常に微細な沈殿物が、透析ＦＥＮ−１に現れた。サンプルを、１／２０に希釈したときに、沈殿物を除去した。サンプルを、１／３に希釈したときに、不溶性材料はなお検出可能であった。１／３希釈材料を、３７℃で２時間加熱し、ツイーン２０と混合して、０．１％の最終濃度になった。ツイーン２０の添加により、溶液中に「線」のほとんど即時の形成、およびより粗い固形物があったが、これは、溶液を１Ｍ  ＮａＣｌに調節した後でさえ逆行できなかった。
基質として１／２０に希釈されたサンプルを使用して、並びに、１×ＥＫ緩衝液で透析バッグを洗浄することによって作製された希釈サンプルを用いて、ＥＫ切断を行った。室温で一夜（約１６時間）、１μｌＥＫ（１ｕ／μｌ）の添加により、ＥＫ切断を行った。
１００μｌのＣＡＭアガロースと合わせた１００μｌのＳＴＩアガロースを、１０ｍｌの１×ＳＴＩ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ツイーン２０）で二回洗浄した。ＮａＣｌを２つのＥＫサンプルに添加して、最終濃度が２００ｍＭ  ＮａＣｌになった。２つのサンプルを合せ、洗浄アガロースに添加した。サンプルを、４℃で３時間、車輪でゆっくりと回転させ、机上遠心分離機（記述されるとおり）で軽く遠心分離した。上清を取り出し、洗浄物を、５００μｌ  １×ＳＴＩで２回洗浄した。２回の洗浄物を合わせ、当初の上清から別個に保存した。４−２０％ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによってサンプルを、分析した。
およそ５０ｎｇ／ｍｌの濃度でＰｆｕ鎖に比較することによって、消化産物の濃度は、およそ２３ｎｇ／μｌであった。
【０２９５】
実施例３
ＦＥＮヌクレアーゼ活性
実施例２で示されるとおりに作製したＦＥＮヌクレアーゼのエンドヌレアーゼ活性およびＦＥＮヌクレアーゼの切断構造要件は、「ＦＥＮ分子」と題される区分で、または以下のいずれかで示される方法によって決定された。
簡潔には、３つの鋳型（図２）を、本発明によるＦＥＮヌクレアーゼの活性を評価するために使用する。鋳型１は、以下の配列を有する５’３２Ｐ標識オリゴヌクレオチド（Ｈｅｌｔｅｓｔ４）である：
５’ＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧ３’（配列番号：１）。
Ｈｅｌｔｅｓｔ４の下線付区部は、Ｍ１３ｍｐ１８＋に相補的な領域を表す。切断産物は、配列ＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴ  （配列番号：２）を有する１８ヌクレオチドフラグメントである。Ｈｅｌｔｅｓｔ４は、Ｍ１３に結合して、相補的二重鎖ドメイン、並びに非相補的５’オーバハングを生じる。この二重鎖は、鋳型２（図２）を形成する。鋳型３（図２）は、Ｈｅｌｔｅｓｔ４に直接隣接するＭ１３に結合した別のプライマー（ＦＥＮＡＳ）を有する。ＦＥＮＡＳの配列は、
５’ＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＡ  ３’（配列番号：３）である。鋳型３の存在下で、ＦＥＮヌクレアーゼは、Ｈｅｌｔｅｓｔ４の遊離５’末端を結合し、結合に移動し、Ｈｅｌｔｅｓｔ４を切断して、１８ヌクレオチドフラグメントを生じる。生じた切断産物を、６％アクリルアミド、７Ｍウレア配列決定ゲルで分離する。
【０２９６】
以下に示されるとおりに、鋳型を作製する。
鋳型１              鋳型２    鋳型３
Ｈｅｌｔｅｓｔ４      １４μｌ            １４μｌ    １４μｌ
Ｍ１３                ＊＊１４μｌ            １４μｌ
ＦＥＮＡＳ            ＊＊＊＊            １４μｌ
Ｈ２Ｏ                ２８μｌ            １４μｌ    ＊＊
１０×Ｐｆｕ緩衝液    ４．６μｌ            ４．６μｌ４．６μｌ
Ｐｆｕ緩衝液は、ストラタジーン（カタログ番号２００５３６）から得ることができる。
鋳型混合物を、９５℃に５分間加熱し、４５分間室温に冷却し、４℃で一夜保存する。
酵素サンプルは、以下のとおりである。
Ａ.Ｈ２Ｏ（対照）
Ｂ.２μｌ未希釈未切断ＦＥＮ−１（〜４４５ｎｇ／μｌ）
Ｃ.２μｌの１／１０希釈の未切断ＦＥＮ−１（〜４４５ｎｇ／μｌ）
Ｄ.２μｌのエンテロキナーゼプロレアーゼ（ＥＫ）切断ＦＥＮ−１（〜２３ｎｇ／μｌ）
４つの反応混合液を以下のとおり３つの鋳型と混合する。
３            μｌ  鋳型１、鋳型２または鋳型３
０．７            μｌ  １０×クローン化Ｐｆｕ緩衝液
０．６            μｌ  １００ｍＭ  ＭｇＣｌ２
２．００          μｌ  ＦＥＮ−１またはＨ２Ｏ
０．７            μｌ  Ｈ２Ｏ
７．００          μｌ総量
反応を、３０分間、５０℃で進行させ、各サンプルに２μｌホルムアミド「配列決定停止」溶液を添加して停止させる。サンプルを、９５℃で５分間加熱し、６％アクリルアミド７Ｍウレアにかけた。
キャストアウェイゲル（ストラタジーン）
代わりに、１時間インキュベート時間を利用した以下の緩衝液中でＦＥＮヌクレアーゼ活性を分析できる。
【０２９７】
１０×ＦＥＮヌクレアーゼ緩衝液
５００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２
反応混合液は、以下のとおりである。
３            μｌ鋳型１、鋳型２または鋳型３
０．７            μｌ  １０×ＦＥＮヌクレアーゼ緩衝液
２．００          μｌ  ＦＥＮ−１またはＨ２Ｏ
１．３            μｌ  Ｈ２Ｏ
７．００          μｌ総量
【０２９８】
サンプルを、ロボサイクラー９６ホットプレート熱サイクラー中で１時間５０℃でインキュベートする。２μｌの配列決定停止（９５％ホルムアルデヒド、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノール、ストラタジーンから入手可能）染料溶液の添加に続いて、サンプルを、９９℃で５分間加熱する。サンプルを、１１インチ長の手引きの２０％アクリルアミド／ビスアクリルアミド、７Ｍウレアゲルにかける。ブロモフェノールブルーがほぼ２／３総距離移動するまで、ゲルを、２０ワットで稼動させる。ゲルをガラス板から取り出し、固定溶液（１５％メタノール、５％酢酸）中で１０分間浸漬し、その後水中で１０分間浸漬する。ゲルを、ワットマン３ｍｍ紙に乗せ、プラスチック製覆いで覆い、加熱真空ゲル乾燥装置（〜８００℃）で２時間乾燥させる。ゲルをＸ線フィルムに一夜さらす。
Ａ．            Ｈ２Ｏ
Ｂ．            ２μｌのＣＢＰタグ付ＰｆｕＦＥＮ−１
Ｃ．            ２μｌのＣＢＰタグ付ＰｆｕＦＥＮ−１（希釈された１：１０）
Ｄ．            ２μｌのＥＫ切断ＰｆｕＦＥＮ−１
の添加によって、鋳型１、２および３（上に示されるとおりに作製した）を切断したＦＥＮ−１ヌクレアーゼアッセイのオートラジオグラフは、図５に示される。
【０２９９】
レーンは以下のとおりである。レーン１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄは、それぞれ、Ｈ２Ｏ、未希釈ＣＢＰ−タグ付ＰｆｕＦＥＮ−１、１：１０希釈のＣＢＰタグ付ＰｆｕＦＥＮ−１およびＥＫ切断ＰｆｕＦＥＮ−１で切断された鋳型１を表す。レーン２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄは、それぞれ、Ｈ２Ｏ、未希釈ＣＢＰ−タグ付ＰｆｕＦＥＮ−１、１：１０希釈のＣＢＰタグ付ＰｆｕＦＥＮ−１およびＥＫ切断ＰｆｕＦＥＮ−１で切断された鋳型２を表す。レーン３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄは、それぞれ、Ｈ２Ｏ、未希釈ＣＢＰ−タグ付ＰｆｕＦＥＮ−１、１：１０希釈のＣＢＰタグ付ＰｆｕＦＥＮ−１およびＥＫ切断ＰｆｕＦＥＮ−１で切断された鋳型３を表す。
【０３００】
タグ付ＰｆｕＦＥＮ−１は、Ｎ末端ＣＢＰ親和性精製タグを含む。タグ付対タグなしＦＥＮ−１の量は等価でないので、ＦＥＮ−１のタグ付およびタグなし版の間の活性におけるいすれかの差は、タンパク質濃度における差（酵素サンプルの濃度は上で提供される）による。タグ付およびタグなしＰｆｕＦＥＮ−１の両方が、切断活性を示す。
図５は、ＦＥＮ−１（レーン１Ａ、２Ａおよび３Ａ）の不在下での切断のバックグランドレベルを示す。さらに、この図は、タグ付ＰｆｕＦＥＮ−１が、鋳型１と比較した場合、より多くの鋳型２を切断する。特に、多量の鋳型２を、未希釈タグ付ＰｆｕＦＥＮ−１（レーン２Ｂ）の存在下で切断する。鋳型３の分析は、未希釈タグ付ＰｆｕＦＥＮ−１によって最高量の鋳型３を切断すること、および希釈タグ付ＦＥＮ−１によって最小量の鋳型３を切断することを示す。標識プローブは、４０−４３ヌクレオチドバンドとして移動する。ＦＥＮ−１は、鋳型２と比較した場合、鋳型３（上流プライマーを含む）を優先的に切断する。切断産物バンドは、１６−２０ヌクレオチドで移動する主要バンドである。標識切断産物での異質性は、標識基質での異質性の結果であり、使用前にゲル精製されなかった。
【０３０１】
実施例４
ＦＥＮ−１ヌクレアーゼおよび５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性が欠損しているＴａｑポリメラーゼの存在下でのβ−アクチンのＰＣＲ増幅および検出
標的核酸配列を検出するためにＰＣＲアッセイを使用する。このアッセイの方法によって、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性の欠損しているＴａｑポリメラーゼ（たとえばＹａｑエキソ−）、および熱安定性ＦＥＮ−１ヌクレアーゼ（たとえば、ＰｆｕＦＥＮ−１、実施例２で示されるとおりに作製される）の存在下でＰＣＲ反応を行う。蛍光で標識されたフラグメントの遊離の検出は、標的核酸配列の存在を示す。
【０３０２】
１Ｘセンチメル分子ビーコンコア緩衝液、３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５’から３’までのエキソヌクレアーゼ活性（〜１．４５Ｕ）を欠損しているＴａｑポリメラーゼ、ＰｆｕＦＥＮ−１（〜２３ｎｇ）、ＰＥバイオシステムズβ−アクチンプライマー（３００ｎＭ各々）（カタログ番号６００５００）およびβ−アクチン特異的蛍光発生プローブ（２００ｎＭ；５’ＦＡＭ−３’ＴＡＭＲＡ＋ＰＥバイオシステムズ・カタログ番号Ｐ／Ｎ４０１８４６）を含有する複製ＰＣＲ反応物を作製する。１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を、各反応での標的核酸配列として使用した。この反応を、５０μｌ体積で行った。ＰｆｕＦＥＮ−１のみ、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠損しているＴａｑポリメラーゼのみのいずれかを含む負の対照反応物、またはヒトゲノムＤＮＡ鋳型を除き全成分を含有する反応混合物を作製した。２．５単位のＴａｑ２０００を含む正の対照反応物も作製した。分光蛍光分析サーモサイクラー（ＡＢＩ７７００）で反応物をアッセイした。熱サイクリングのパラメーターは、９５℃で２分間、１５秒間９５℃、６０秒間６０℃、および１５秒間７２℃の４０サイクルであった。サンプルをアニーリング段階の間に調べた。
図６で示されるとおり、ＰｆｕＦＥＮ−１のみまたは５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠損しているＴａｑポリメラーゼのみのいずれかの存在下では、シグナルは発生しなかった。５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠損しているＴａｑポリメラーゼと、ＰｆｕＦＥＮ−１の両方の存在下で、２６の閾値サイクル（Ｃｔ）、および１２，０００の最終蛍光強度（ＦＩ）を示すシグナルを発生した。Ｔａｑ２０００（５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ）（タックマン（Ｔａｑｍａｎ））の存在下で、２３のＣｔおよび１７，０００単位のＦＩを示すシグナルを発生した。
【０３０３】
これらの結果は、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠損しているＴａｑポリメラーゼおよび熱安定性ＦＥＮ−１ヌクレアーゼの存在下で、シグナルが発生されるＰＣＲアッセイによって、β−アクチンＤＮＡ配列を検出できることを示す。さらに、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠損しているＴａｑポリメラーゼで不在である５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を、ＰｆｕＦＥＮ−１の添加によって、トランスで保存できる。
【０３０４】
実施例５
ＦＥＮ−１ヌクレアーゼおよび５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠損しているＰｆｕポリメラーゼの存在下でβ−アクチンのＰＣＲ増幅および検出
ＰＣＲアッセイを使用して、標的核酸配列を検出する。このアッセイの方法によって、Ｐｆｕポリメラーゼ（天然に５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠損している）または、さらに同様に、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠損しているＰｆｕポリメラーゼ（たとえば、エキソ−Ｐｆｕ）、および熱安定性ＦＥＮ−１ヌクレアーゼ（ＰｆｕＦＥＮ−１）の存在下で、ＰＣＲ反応を行う。蛍光で標識されたフラグメントの遊離の検出は、標的核酸配列の存在を示す。
【０３０５】
１×クローン化Ｐｆｕ緩衝液（ストラタジーンから入手可能、カタログ番号２００５３２）、３．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５単位の５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠損しているＰｆｕポリメラーゼ、タグ付またはタグなしＰｆｕＦＥＮ−１（〜２３ｎｇ）、ＰＥＦ（１ｎｇ）（国際公開公報ＷＯ９８／４２８６０号で示される）、ＰＥバイオシステムズβ−アクチンプライマー（各３００ｎＭ）（カタログ番号６００５００）、および蛍光発生プローブ（２００ｎＭ；５’ＦＡＭ−３’ＴＡＭＲＡ＋ＰＥバイオシステムズ、カタログ番号Ｐ／Ｎ４０１８４６）を含む複製ＰＣＲ反応物を作製した。１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（プロメガ）を、各反応で標的核酸配列として使用した。５０μｌ体積で反応を行った。５’から３’へ、および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を両方欠損しているＰｆｕポリメラーゼのみを含有するか、またはヒトゲノムＤＮＡ鋳型を除いた全ての成分を含む負の対照反応液も作製した。２．５単位のＴａｑ２０００を含有する反応混合物を作製し、正の対照として使用した。分光蛍光分析サーモサイクラー（ＡＢＩ７７００）で反応物を分析した。熱サイクリングのパラメーターは、９５℃で２分間、および１５秒間９５℃、６０秒間６０℃、および１５秒間７２℃の４０サイクルであった。
【０３０６】
図７で示されるとおり、天然に５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠損しているＰｆｕポリメラーゼのみの存在下で、シグナルを発生しないかった。５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠損しているＰｆｕポリメラーゼ、およびタグ付ＰｆｕＦＥＮ−１の両方の存在下で、２３の閾値サイクル（Ｃｔ）および２０，０００単位の最終蛍光強度（ＦＩ）を示すシグナルを発生した。５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠損しているＰｆｕポリメラーゼおよびタグなしＰｆｕＦＥＮ−１の存在下で、２１のＣｔおよび２０，０００単位の最終ＦＩを示すシグナルを発生した。Ｔａｑ２０００の存在下で、２１のＣｔおよび１９，０００単位の最終ＦＩを示すシグナルを発生した（タックマン）。
【０３０７】
この結果は、β−アクチン標的の存在が、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠損しているＰｆｕポリメラーゼおよび熱安定性ＦＥＮ−１ヌクレアーゼの存在下で、シグナルを発生するＰＣＲアッセイによって検出できることを示す。このシグナルは、ＦＥＮ−１の不在下でＴａｑ２０００の存在下で発生されるシグナルに適合性がある。さらに、Ｐｆｕポリメラーゼの不在下で５’から３’までのエキソヌクレアーゼ活性は、ＰｆｕＦＥＮ−１の添加によってトランスで保存できる。
【０３０８】
実施例６
標的としてヒト・オルニチントランスカルバミレラーゼ遺伝子を使用して、回転環増幅に関与する本発明によるアッセイを行い、そして鎖手段によりバフィーコートから抽出されるヒトＤＮＡで検出される。標的（４００ｎｇ）を、４分間９７℃で加熱変性させ、２つの５’−リン酸化オリゴヌクレオチド、開環プローブおよび１つのギャップオリゴヌクレオチドの存在下でライゲーション条件下でインキュベートする。開環プローブは、配列：
ｇａｇｇａｇａａｔａａａａｇｔｔｔｃｔｃａ
Ｔａａｇａｃｔｃｇｔｃａｔｇｔｃｔｃａｇｃａｇｃｔｔｃｔａａｃｇｇｔｃａｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｔｔｃｔｇｃｃｔｃｔｇｇｇａａｃａｃ（配列番号：１７）を有し、野生型配列についてのプヌクレオチドは、ｔａｇｔｇａｔｃである。図８および９は、回転環プローブおよび回転環増幅を示す。反応緩衝液（４０μｌ）は、５単位／＊ｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ＡＴＰ、８０ｎＭ開環プローブおよび１００ｎＭギャップオリゴヌクレオチドを含有する。２５分間、３７℃でのインキュベートの後、２５ｕｌを取り出し、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、４００μＭｄＴＴＰ，ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの各々、０．２＊Ｍ回転環複製プライマー：ｇｃｔｇａｇａｃａｔｇａｃｇａｇｔｃ（配列番号：１８）、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（１６０ｎｇ／５０ｕｌ）を含有する２５ｕｌの溶液に添加する。サンプルを、３０℃で３０分間インキュベートする。
【０３０９】
試薬の以下の濃度を達成するために希釈される補償緩衝液（保存溶液または濃厚液）の添加によって、開環プローブ中に存在するＴ７プロモーターから、ＲＮＡを産生した：３５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、２ｍＭスペルミジン、１８ｍｍＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＧＭＰ、１ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、３３３ｕＭ  ＵＴＰ，６６７ｕＭビオチン−１６−ＵＴＰ、０．０３％ツイーン２０、ｕｌ当たり２単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ。米国特許第５，８５８，０３３号で示されるとおり、ＲＮＡ生成を行う。インキュベーションは、３７℃で９０分間進行させる。
【０３１０】
５μｌの各サンプル（実際の試験サンプル、（−）リガーゼ対照サンプル、（−）ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ対照、および（−）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ対照）を二重に、検出のために取り出す。逆転写プロセスは、本発明によって、Ａ）開環をライゲートすること、Ｂ）回転環単鎖ＤＮＡを合成すること、Ｃ）ＲＮＡを作製すること（開環プローブ中に存在するＴ７プロモーターから）、Ｄ）ＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを作製すること、およびＥ）ＦＥＮ切断構造の検出の発生のためにプライマーおよびプローブを使用してｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を行うことを含む段階を含む。逆転写については、当量のＹａｑＤＮＡポリメラーゼを製造業者により推奨されるＴａｑ２０００ＤＮＡポリメラーゼに置換することを除いて、ストラタジーン・センチネル・シングルで供給される試薬およびプロトコール、チューブＴＲ−ＰＣＲコア試薬キット（カタログ番号６００５０５）を使用する。各反応液が、１×センチネル分子ビーコンＲＴ−ＰＣＲコア緩衝液、３．５ｍＭＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５単位エキソ−Ｐｆｕ、２３ｎｇ  ＰｆｕＦＥＮ−１、１ｎｇＰＥＦ、５００ｎＭ上流プライマーの各々：ａａｇｔｔｔｃｔｃａｔａａｇａｃｔｃｇｔｃａｔ（配列番号：１９）、逆プライマー：ａｇｇｃａｇａａｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔ（配列番号：２０）、および蛍光発生プローブ（たとえば、ＦＡＭ−ＤＡＢＣＹＬ）：ａｇｃｔｔｃｔａａｃｇｇｔｃａｃｔａａｔａｃｇ（配列番号：２１）を含有する。反応液を、４５℃で３０分間、９５℃で３分間、続いて熱サイクラーで１サイクル：９５℃で２分、５０℃で１分、７２℃で１分のインキュベーションにかける。その後、ストラタジーンのフルオロトラッカー、またはプレート−読取モードでのＰＥバイオシステムズの７７０配列決定システムのような蛍光プレート読取装置で蛍光を測定した。
【０３１１】
回転環増幅ＲＮＡ産物でのビオチン−１６−ＵＴＰの組込みのため、検出の効率についての交差確認が可能である。固定捕捉プローブを使用して、アリコート量の反応液を、ガラススライド（または代わりにマイクロウエルプレート）で捕捉する。捕捉ＲＮＡアンプリコンの検出は、米国特許第５，８５４，０３３号で詳細に記述され、ここに参照して組み込まれる。
【０３１２】
実施例７
図１３は、「下流」オリゴヌクレオチド（Ａと記される）、および上流オリゴヌクレオチド（Ｘと記される）から伸長する５’単鎖フラップがある構造を示し、両方を、標的核酸にハイブリッド形成する。５’単鎖フラップは、１ヌクレオチドまたはそれより大きい可能性がある。いくつかの実施形態では、５’フラップは、存在しない。
【０３１３】
図１３で示される実施形態は、それを使用してもよいが、ポリメラーゼの使用を必要としない。図１３は、「３’Ｂ」として示される「封鎖３’末端」を有する上流オリゴヌクレオチドを示す。封鎖３’末端は、正常な酵素的条件下に酵素が三リン酸ヌクレオチドを添加する能力のない３’末端である。水素のみを含む３’水酸基の修飾（ジデオキシヌクレオチド）、３’水酸基の水素をリン酸基に置換すること、３’炭素への、または３’水素へのビオチンまたは蛍光基のようなレポーター部分の付着、および３’末端に三リン酸ヌクレオチドの添加を防止する３’末端に対する他の変動を含めた多くの方法で３’末端を封鎖することによって、伸長を阻害できる。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、上流オリゴヌクレオチドの３’末端での塩基または複数塩基は、標的と正常なワトソン−クリック塩基対を形成できないかもしれない。たとえば、上流オリゴヌクレオチドの３’末端でミスマッチな塩基がある可能性がある。ミスマッチな塩基または複数塩基は、３’末端が正常な３’水酸を有する場合でさえ、ポリメラーゼのような酵素による３’末端の伸長を阻害するのに十分でありうる。３’末端でのミスマッチは、上流オリゴヌクレオチドが適切な温度で標的にハイブリッド形成する限り、１つまたはそれより多くのミスマッチを含む。
【０３１５】
上流オリゴヌクレオチドの封鎖３’末端は、下流オリゴヌクレオチドの５’末端でハイブリッド形成されたヌクレオチドから０から１０塩基まで、好ましくは０−５塩基でありうる。いくつかの実施形態では、ニックは、上流と下流のおよびを分離する。
【０３１６】
５’フラップヌクレオチドは、図１３で示されるもののような構造の５’伸長を切断できる。上流オリゴヌクレオチドの封鎖３’末端は、下流オリゴヌクレオチドの５’末端でハイブリッド形成されたヌクレオチドの上流、その点、または下流のいずれかでありうる。
【０３１７】
切断フラップを直接的に、たとえばＦＲＥＴ対からの蛍光シグナルで、または間接的に、たとえば二次切断または増幅反応で検出できる。他の関連特許を参照、それらの開示は、直接検出（２００４年１１月５日に出願された米国特許出願第１０／９８１，８４２号；１９９９年１０月２９日に出願された米国特許第６，５２８，２５４号Ｂ１；２０００年８月３０日に出願された米国特許第６，５４８，２５０号）、および間接検出（２０００年１１月２１日に出願された米国特許第６，８９３，８１９号；２００５年１０月１１日に出願された米国特許出願第６０／７２５，９１６号）について参照してここに組み込まれる。
【０３１８】
実施例８
プローブの説明：
図１４は、核酸増幅を用いた切断反応での図１３の上流および下流プローブを示す。実施例７の要件に加えて、その方法は、上流オリゴヌクレオチドに５’でハイブリッド形成する少なくとも１つの伸長プライマーも使用する。伸長プライマーは、約１０−２５ヌクレオチド（ｎｔ）長でありうる。プライマー伸長産物が、上流オリゴヌクレオチドまたは下流オリゴヌクレオチドプローブのいずれとも切断構造を形成しないことが重要である。これは、ポリメラーゼによる置換を阻止する上流オリゴヌクレオチドの５’末端でクランプによって制御される。クランプは、伸長ポリメラーゼによるそれの置換を防止するために、上流クランピングオリゴヌクレオチドに、このような高親和性を有する標的と結合させるあらゆる修飾でありうる。このような修飾は、当業界で知られており、そして小溝結合剤、挿入剤、ＧＣ豊富領域、ＬＮＡが挙げられる。
【０３１９】
上流プランピングオリゴヌクレオチドおよび下流プローブを、所定の温度（切断構造で、伸長産物で形成されたものがない限り）で溶融できるが、しかし上流クランピングオリゴヌクレオチドは、高温で溶融するのが好ましい。
方法の説明：
【０３２０】
アニール／伸長：１つの実施形態では、３つのオリゴヌクレオチド全てを、約５５−６５℃で標的にアニールする。いったんアニールされると、ポリメラーゼは、クランプまでプライマーを伸長する。ポリメラーゼは、クランプ付の上流プランピングオリゴヌクレオチドを置換できず、その後停止する。上流および下流オリゴヌクレオチドプローブによって形成される切断構造を切断する（図１３に関しての実施例７での説明を参照）。
反応の温度を、その後、好ましくは６５−７５℃まで増大させて、下流オリゴヌクレオチドプローブ（切断温度より５−１０℃多く）およびその後上流クランピングオリゴヌクレオチド（切断温度よりさらに５℃大きい）を解離させる。クランプ付上流オリゴヌクレオチドを解離させて、ポリメラーゼは、標的を通して伸長産物をさらに伸長できる。
【０３２１】
実施例９
プローブの説明：
図１５は、核酸増幅に関与する切断反応での図１３の上流および下流プローブを示す。図１３の要件に加えて、その方法は、上流オリゴヌクレオチドに５’をハイブリッド形成する少なくとも１つのプライマーも使用する。プライマーは、約５５−６５℃で標的にハイブリッド形成する。上流および下流オリゴヌクレオチドは、プライマーより約１０℃上で（または高緊縮条件（ＤＭＳＯ、ｐＨ、塩濃度下で）標的にアニールするように設計されている。
【０３２２】
方法の説明：
アニール／切断：１つの実施形態では、上流および下流のオリゴヌクレオチドが、標的にアニールする（６５−７５℃）。上流および下流のオリゴヌクレオチドが、標的にアニールされると、ＦＥＮ（図１３に関して実施例７で説明されるとおり）により下流オリゴヌクレオチドプローブを切断する。
アニール／伸長：反応温度を減少させて、プライマーを標的にアニールさせる。その後、上流および下流のオリゴヌクレオチドの置換で引起されるプライマーを伸長する。
【０３２３】
実施例１０
プローブの説明：
図１６は、核酸増幅を伴う切断反応での図１３の上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを示す。増幅反応は、プライマー核酸を組み込み、そしてそれは、上流オリゴヌクレオチドと共有される。増幅前には、この核酸配列は標的中に存在しない。
伸長プライマー（ＸＡ）は、３’Ａ領域を介して標的にアニールする。Ｘ領域がアンプリコンに組み込まれるまで、プライマーの５’Ｘ領域は、標的中に存在しない。上流オリゴヌクレオチドと伸長プライマーとの両方のＸ領域は、長さ約２０ｎｔである。同様に、下流オリゴヌクレオチドと伸長プライマーとのＡ領域は、長さ約２０ｎｔである。下流プローブは、さらに、標的に相補的であるＡの下流に領域を含むことができる。この領域は、標的についての下流プローブの特異性を増強する。たとえば、この領域は、長さ５−１５ヌクレオチドでありうる。下流プローブのＡ配列は、Ａの対応のヌクレオチドが付加された下流の数に基づいて短縮できる。方法は、逆プライマーも使用してよい。
【０３２４】
方法の説明
アニール／伸長：１つの実施形態では、伸長プライマーは、プライマーのＡ領域を介して標的にアニールする。ポリメラーゼによって、プライマーを伸長して、アンプリコンにＸ領域を組み込む。プライマーアニーリングおよび伸長は、正常なアニーリング／伸長条件下で起こる。その後、核酸を変性する。
【０３２５】
アニール／伸長：連続回の増幅の間に、逆プライマーは、合成鎖にアニールし、そして相補的鎖の合成を予備刺激する。逆プライマー伸長反応は、プライマーのＸ領域（および上流オリゴヌクレオチドのＸ領域）に相補的な領域を合成する。したがって、相補的核酸鎖は、上流および下流のオリゴヌクレオチドの両方についての結合領域（Ｘ’、Ａ’）を有する。反応液を加熱して、オリゴヌクレオチドを変性させる。
アニール／伸長／切断：次のアニーリング／伸長反応では、上流および下流のオリゴヌクレオチドが、標的にアニールして、図１３に関して実施例７で示される切断構造を作製する。切断反応は、実施例７で示されるとおりに進行する。
【０３２６】
実施例１１
プローブの説明：
図１７は、下流プローブが、標的の２つの非近接領域（Ｘ２’Ｔ’）にハイブリッド形成するものである切断反応における図１３の上流および下流プローブの変種を示す。したがって、標的に非相補的である標的の一部（Ａ’）は、下流プローブにハイブリッド形成形成しない。いくつかの実施形態では、領域Ｔは、長さ１−２５ｎｔの間である。いくつかの実施形態では、Ａ’は、約２０ｎｔまたはそれ未満である。一般に、Ａ’は、プライマーが標的に結合するのを防止するように十分に長い領域である。このような方法は、標的結合についての下流オリゴヌクレオチドプローブとＰＣＲプライマーとの間の競合を減じる（図１８も参照）。
【０３２７】
実施例１２
プローブの説明：
図１８は、核酸増幅を含む切断反応における図１３、図１６および図１７の上流および下流プローブの変種を示す。その方法は、上流シグナルオリゴヌクレオチド（Ｘ１）、下流オリゴヌクレオチドプローブ（Ｘ２、Ｔ）、伸長プライマー（Ｘ１、Ｘ２、Ａ）および逆プライマーを使用する。プライマーの３’Ａ領域は、標的のＡ’領域と相補的であり、アニールする。プライマーがアンプリコンに組み込まれるまで、Ｘ１およびＸ２配列は、標的中に存在しない。オリゴヌクレオチドのＴ領域は、Ａ’の下流にある標的の一部に相補的である。Ｘ１領域は、長さ約２０ｎｔでありうる。いくつかの実施形態では、Ｘ２およびＴ領域は、長さ１−２５ｎｔ、好ましくは１０−１５でありうるが、一緒になって、約２０ｎｔまたは適切な温度で標的にアニールするのに十分な長さであるべきである。
【０３２８】
方法の説明
アニール／伸長：プライマーのＡ領域は、標的のＡ’領域にアニールし、ポリメラーゼは、Ｘ２Ｘ２Ａの３’を伸長して、それによりＸ１およびＸ２領域をアンプリコンに取り込む。反応液は、正常な変性条件下で変性される。
アニール／伸長：別の回のアニーリングおよび伸長を行う。このアニーリング／慎重反応では、逆プライマーは、標的にアニールし、伸長し、したがって組込まれたプライマーのＸ１およびＸ２部分に相補的であるＸ１’Ｘ２’で相補的核酸を合成する。反応液を加熱し、オリゴヌクレオチドを変性する。
アニール／伸長：次の回のアニーリングおよび伸長の間に、上流および下流のオリゴヌクレオチドのＸ１Ｘ２Ｔ部分は、増幅産物にアニールする。Ｘ１およびＸ２およびＴ部分のアニーリングは、標的の介在するＡ部分（プライマー結合部分）をループから外す。アニールされた上流および下流オリゴヌクレオチドは、図１３に関して実施例７で示されるもののような切断構造を形成する。
【０３２９】
実施例１３
以下の方法によって、標的核酸を検出および／または測定できる。
１５０ｎＭの３’ＰＯ３封鎖上流オリゴヌクレオチド
１５０ｎＭの５’フラップを有する下流オリゴヌクレオチドプローブ
１５０ｎＭのＰＣＲ鋳型、および
１×フルベロシティー（商標）ＱＰＣＲマスターミックス（ストラタジーンのカタロ番号６００５６１；２００ｎｇのＦｅｎおよび２．５ＵのＰｆｕＶ９３Ｒ、エキソ−、ＤＮＡポリメラーゼ）または
２００ｎｇ１×酵素なしのフルベロシティー（商標）ＱＰＣＲマスター中のＦｅｎのいずれか
を有する反応混合物を作製する。
以下のサイクリングパラメーター９５℃で２分間、９５℃で１０秒間、急速冷却曲線を伴う４０サイクルについて３０秒間６℃を用いたＭ×３０００ｐリアルタイムＰＣＲ装置（ストラタジーン）で実験を行った。
上流オリゴヌクレオチドが、下流オリゴヌクレオチドプローブの直ぐ下流のＰＣＲ鋳型にハイブリッド形成した。したがって、５’フラップ付プローブの上流オリゴヌクレオチドおよび相補的部分は、重複しなかった。対照研究は、上流オリゴヌクレオチドが、完全に封鎖され、プライマー伸長をさせないことを確認した。
結果は、図１９および２０で示され、そしてそれは、ＦＥＮが、５’フラップ付プローブが標的に相補的である領域で重複しない３’封鎖された上流オリゴヌクレオチドの存在下で５’非相補的フラップを切断できないことを示す。
ＦＥＮおよびポリメラーゼを含む反応、およびＦＥＮのみを含む反応についての解離曲線実験も行った。上で記述されるとおりに解離曲線実験を行ったが、しかし急速冷却で９５℃から２５℃までで蛍光を測定した。結果は、蛍光が、鋳型なし、およびプローブ対照なしと比較したときに３’封鎖プライマーについての温度範囲を考慮して上昇したことを示す。
【０３３０】
実施例１４
この実施例は、フルオロファー／クエンチャー対の最適な配置を決定して、特異的浸潤性切断を伴って最高のシグナルを達成するために使用できる下流プローブの変種を示す。図２１−２４は、下流プローブの相補的領域の５’末端の＋２位置で、特定の型の下流プローブ（「鍵プローブ」）を、フルオロファー（たとえばＭＡＦ）の特定の配置と合わせる本発明の方法の例を示す。鍵プローブは、ヘアピンプローブの一種であり、プローブは、標的配列に少なくとも部分的に相補的である第一の配列、および第一の配列と少なくとも部分的に相補的である第二の配列を含む。そのプローブは、さらに、第一の配列（たとえば、フルオロファー）に操作可能に結合した第一の部分、および第二の配列（たとえば、クエンチャー）に操作可能に結合した第二の部分を含む。第一の配列および第二の配列は、プローブが標的配列にハイブリッド形成しない場合に互いにハイブリッド形成でき、標的配列に対するプローブのハイブリッド形成が、第一または第二の部分のいずれかに、検出可能なシグナルを発生させる。鍵プローブは、２００５年６月９日に出願された米国仮出願番号第６０／６８８，７９８号で詳細に示され、その内容は、全体にここで組み込まれる。
【０３３１】
図２１は、標的アンプリコン配列の例を示す。下流プローブに相補的な標的配列の部分は、太字で示され、そして上流３’封鎖プローブに相補的である標的配列の部分は、イタリック体で示される。図２２および２３は、本発明によって使用できる鍵プローブの種々の実施形態を示す。図２２Ａは、対照プローブ、すなわち、フルオロファーおよびクエンチャー部分を、それぞれ３’および５’末端に配置されること、および切断されるべき非相補的部分の能力は、フルオロファー（上で示される実施形態と違い、フルオロファーは、位置＋２で特異的に配置される）の配置に依存すべきでないことを示す。図２２は、ＦＡＭ分子が、下流プローブの相補的領域の５’末端の位置＋２に配置される鍵プローブの例を示す。このプローブは、−８位置（すなわち、８は、相補的領域の５’末端の５’を残す）にクエンチャーＢＨＯ２の配置も示す。
この実施例では、クエンチャーは、−７位置をチミジン（Ｔ）に変えることなく、−７に配置できず、標準鍵プローブ構造は、このような変換によって有害に影響される可能性があることが予想される。図２３ＡおよびＢは、それぞれ、位置＋２にＦＡＭ部分を、位置−３および−１に配置されるＢＨＱ２クエンチャーを有する鍵プローブを示す。位置＋２でフルオロファーに類似するクエンチャー部分の特定の配置は、プローブの非相補的領域の切断を伴う消光および／または蛍光の効率および性能における影響を示しうることが予測される。
【０３３２】
図２４は、鍵プローブの相補的領域の５’末端と３’末端で重複する０−３ヌクレオチドを有する上流３’封鎖オリゴヌクレオチドプローブの例を示す。＋２位置でＦＡＭを有する鍵プローブが、切断して、封鎖オリゴヌクレオチドプローブと下流鍵プローブの５’末端に重複がない蛍光シグナルを発生するのみであることが予測される。
【０３３３】
他の実施形態
他の実施形態は、当業者に明らかであろう。前述の詳細な説明は、明確さのみのために提供され、ただ典型例であるのみであると理解すべきである。本発明の概念および範囲は、上記実施例に限定されるのでなく、請求項によって包含されるべきである。
【図１】
2009517049.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１６ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１８ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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