(57)【要約】  ＣＢＰまたはｐ３００とβ−カテニンまたはγ−カテニンとの相互作用を調節するための方法と薬物が開示される。β−カテニンへのＣＢＰの結合を増加させる薬物は、胚幹細胞だけでなく、造血幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、および膵島幹細胞を含む成体幹細胞のβ−カテニン関連増殖を強化させることに関連している。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類幹細胞の増殖を維持できる薬物を同定する方法であって、セリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼＰＰ２ＡのサブユニットＰＲ７２／１３０の少なくとも１つと薬物を接触させるステップと前記少なくとも１つのサブユニットへの前記薬物の結合を検出するステップとを含む方法。
【請求項２】
前記結合を免疫ブロッティングによって検出する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記薬物が式１〜５，７〜１２、１５および１７〜２８の化合物からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
哺乳類幹細胞にＣＢＰまたはｐ３００とβ−カテニンの相互作用を選択的に調節する薬物を投与することを含む、哺乳類幹細胞の増殖を増進させる方法。
【請求項５】
前記薬物がＣＢＰへのβ−カテニンの結合を増加させる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記薬物がｐ３００へのβ−カテニンの結合を減少させる請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記幹細胞への前記投与が生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で行われる請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記幹細胞が造血幹細胞である請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記幹細胞が有毛細胞である請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記幹細胞が神経幹細胞である請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記幹細胞が膵島細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記幹細胞が皮膚幹細胞である請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記幹細胞が筋肉幹細胞である請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法によって、前記化合物がセリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼＰＰ２Ａの異なってスプライスされた調節サブユニット（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ）であるＰＲ７２／１３０の１つと相互作用し、β−カテニン／ｐ３００相互作用を犠牲にしてβ−カテニン／ＣＢＰの相互作用を増加させる請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法によって、カノニカルなＷｎｔ刺激と共同して前記化合物がＯｃｔ４およびＳｏｘ２の発現を増加させ、ｃ−ｍｙｃの発現を減少させる請求項４に記載の方法。
【請求項１６】
精製したＷｎｔ３ａと共同して前記化合物がＯｃｔ４およびＳｏｘ２の発現を増加させ、ｃ−ｍｙｃの発現を減少させる請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＧＳＫ−３活性の抑制と共同して前記化合物がＯｃｔ４およびＳｏｘ２の発現を増加させ、ｃ−ｍｙｃの発現を減少させる請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法によって、カノニカルなＷｎｔ刺激と共同して、前記化合物が幹細胞を分化させることなく増殖を引き起こす請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記幹細胞が胚幹細胞である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記幹細胞が成体幹細胞である請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ＩＱ−１の生物学的活性を有する化合物を哺乳類幹細胞に投与することを含む、哺乳類幹細胞の増殖を増進させるための組成物。
【請求項２２】
前記生物学的活性がｐ３００のリン酸化を防止すること、胚幹細胞培養においてＮａｎｇｏの発現を維持すること、ＥＳＣ培養においてＯｃｔ３／４の発現を維持すること、およびＥＳＣ培養においてＲｅｘ−１の発現を維持することからなる群から選択される請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記化合物がＩＱ−１である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記方法によって、Ｗｎｔ３ａまたはＧＳＫ３抑制因子のいずれかを用いて、カノニカルＷｎｔ経路の刺激と共同して、前記化合物がＭＡＲＫキナーゼ経路（ＭＥＫまたはＥＲＫ）およびＰＫＣを抑制する請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−カテニンまたはγ−カテニンとコアクチベータタンパク質ＣＢＰとの間、あるいはβ−カテニンまたはγ−カテニンとコアクチベータタンパク質ｐ３００との間の相互作用を調節し、幹／前駆細胞の増殖／脱分化または分化を増進させる化合物と方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ここ数年間、幹細胞は、適切な細胞の微環境（ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）下において、多様な細胞および組織のタイプに分化し、かつ発達する潜在力によって相当な関心が集められている。成体幹細胞の十分なプール（ｐｏｏｌｓ）を発生させることを可能にすることによって、細胞置換療法、遺伝子療法、および組織工学を含めたいくつかの重要な生物医学的な応用が可能となる。米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によれば、幹細胞の治療上の用途は２０年内に医学の礎になると見込まれている：
“最も破壊的な疾病を克服するための新しい治療法の開発につながる幹細胞の巨大な可能性を考慮すると、直ちに利用できる幹細胞のソース（ｓｏｕｒｃｅ）を同定すれば、この研究が医療業務を変革し、暮らしの質と寿命を向上させるという話があまり非現実的なものではなくなる（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．Ｊｕｎｅ  １７，２００１）。”
【０００３】
しかし、成体幹細胞に対するこのような応用の開発は、培養で機能的な成体幹細胞を増殖させ増やすことができないために著しく妨げられてきた。今日に至るまで、これは幹細胞において非常に難題であることが判明している（Ｓｈｅｒｌｅｙ，Ｊ．（２００２）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２０：５６１−５７２）。ここ１０年間、科学者らは移植のための細胞の数を増加させるために培養で幹細胞を成長させる試みを行ってきた。こういう作業が直面した問題は幹細胞の分化しやすい性質である。この問題は、生後の身体組織において幹細胞固有の非対称的な細胞動態（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｃｅｌｌ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）と関連し得るものである（Ｓｈｅｒｌｅｙ，Ｊ．（２００２）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２０：５６１−５７２）。幹細胞の数を増加させるために用いられる既存の科学的方法は、２Ｄのストローマ層上において細胞を培養すること、および様々なサイトカインの混合物の存在下でそれらを成長させることがある（Ｒｅｂｅｌ，ＶＩ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｌｏｏｄ，８３（１）：１２８−１３６）。しかし、既存の生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）の方法のいずれも、増殖を増進させつつ幹細胞の分化を防止することができなかった（Ｒｅｂｅｌ，ＶＩ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ，５（ｌ）：２５−３７）。よって、本技術分野において、培養で成体幹細胞を増殖させ増やすのに用いる化合物および方法が求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、β−カテニン（またはγ−カテニン）とコアクチベータタンパク質ＣＢＰおよびｐ３００との間の相互作用を調節し、幹／前駆細胞の増殖／脱分化または分化を増進させる化合物と方法に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この方法の一実施態様において、薬物はβ−カテニンのＣＢＰに対する結合を増加させる。前記方法の他の一実施態様において、薬物はβ−カテニンに対するｐ３００の結合を減少させる。
【０００６】
前記方法の実施態様において、薬物はβ−カテニンへのｐ３００の結合を増加させるか、または薬物はβ−カテニンにへのＣＢＰの結合を減少させる。
【０００７】
細胞は本発明の薬物で生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で処理することができ、細胞は幹／前駆細胞であってもよい。
【０００８】
特定の実施態様において、薬物は前記細胞を含む哺乳動物に局所的に投与することができる。
【０００９】
他の特定の実施態様において、薬物は１４−３−３タンパク質とＳｅｒ  ８９がリン酸化されたｐ３００（Ｓｅｒ  ８９  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｐ３００）の相互作用を調節し、薬物はフシコクシンの類似体であってもよく、ここでフシコクシンの類似体は下記の一般式：
【化１】
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を有する。
【００１０】
また、本発明は、細胞においてＣＢＰまたはｐ３００とβ−カテニンの相互作用を調節する方法に関するものであり、該方法において、薬物はβ−カテニン、ＣＢＰまたはｐ３００とプロリルイソメラーゼ（Ｐｉｎ１）の相互作用を調節し；特定の実施態様において、薬物はＣＢＰとＰｉｎ１の結合を増加させる。
【００１１】
これらすべての実施態様において、薬物は幹細胞の成長を支持できる生体材料に組み込むことができ；幹細胞は造血幹細胞であってもよい。
【００１２】
また、本発明は、ＣＢＰまたはｐ３００とβ−カテニンの相互作用の調節を含む哺乳類の幹細胞の増殖を増進させる方法に関するものであり；薬物はＣＢＰに対するβ−カテニンの結合を増加させることができ；また、薬物はｐ３００に対するβ−カテニンの結合を減少させることができる。
【００１３】
幹細胞への投与は生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で行うことができ、幹細胞は造血幹細胞、有毛細胞、神経幹細胞、膵島細胞、または胚幹細胞であってもよい。
【００１４】
また、本発明は、セリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼＰＰ２ＡのＰＲ７２／１３０の異なってスプライスされた調節サブユニット（ａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｕｂｕｎｉｔ）と選択的に相互作用する、ＩＱ−１などの薬物を胚幹細胞に投与することを含む、未分化状態で胚幹細胞を維持する方法に関するものであり、該方法において、β−カテニン／ＣＢＰの相互作用を増加させる。
【００１５】
また、本発明は、セリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼＰＰ２ＡのＰＲ７２／１３０の異なってスプライスされた調節サブユニットと選択的に相互作用する薬物を胚幹細胞に投与することを含む、未分化状態で胚幹細胞を維持する方法に関するものであり、該方法において、β−カテニン／ｐ３００の相互作用を減少させる。
【００１６】
前記方法の特定の実施態様において、化合物は、Ｗｎｔ３ａまたはＧＳＫ３抑制因子を用いるカノニカルな（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）Ｗｎｔ経路の刺激と共同して、ＭＡＰＫキナーゼ経路（ＭＥＫまたはＥＲＫ）およびＰＣＫを抑制する。
【００１７】
また、本発明は、幹細胞の自己再生を維持し、かつ／又は増進させるのに適した化合物を同定するためのアッセイに関するものである。そのようなアッセイの１つは、セリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼＰＰ２ＡのＰＲ７２／１３０サブユニットのうちの１つ以上への化合物または薬物の選択的な結合を測定するものである。特定の実施態様において、薬物はＩＱ−１に類似する活性を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
幹細胞は自己再生（すなわち、新しい幹細胞を作ること）および分化（すなわち、最終的に分化した細胞を発生させること）のプロセスのバランスをとることによって組織の再生および維持を担うものである。このようなバランスは、幹細胞に内在する調節シグナルと微環境からの外部シグナルの統合によって生じる。自己再生と分化間のバランスが攪乱すると、幹細胞枯渇の結果（例えば、再生不良貧血）や自己再生の増加の結果（例えば、癌）として疾病が生じ得る。神経発生において、転写因子Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２およびＳｏｘ３は未分化状態で神経細胞を維持する役割をする。
【００１９】
哺乳動物において、幹細胞調節の分子レベルのメカニズムについての大半の知識は造血系の研究から得られたものである。末端の系統（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｌｉｎｅａｇｅｓ）への分化を調節する分子レベルのメカニズムが広範囲にわたって理解され、その理解が広がっている。しかし、造血幹細胞（ＨＳＣ）の運命決定を調節するメカニズムの機械的な理解はよく知られていない。除去される時に、ＨＳＣ自己再生の攪乱（例えば、ＴＮＦα−Ｐ５５−レセプター、ｐ２１、Ｒａｅ２８、およびＢｍｉ−１）または分化の改変（例えば、ＴＥＬ、ＰＵ．１、Ｆｌｔ−３、およびｐ２７）をもたらすいくつかの遺伝子が同定されている。一方、ＨＳＣｓにおいて、ＨｏｘＢ４、β−カテニン、およびノッチ（Ｎｏｔｃｈ）シグナルがＨＳＣにおいて過剰発現した場合、これらのシグナルはＨＳＣの自己再生を刺激する。
【００２０】
最近の研究ではＨＳＣの自己再生および分化においてＣＢＰおよびｐ３００が重要な役割をすることが明らかになっている。ＣＢＰおよびｐ３００は様々な転写シグナルの分子統合因子として機能する。転写因子によってＣＢＰおよびｐ３００がプロモーターへ補充された際に、それらは、クロマチンのリモデリング、関連タンパク質のアシル化、および基本転写装置の補充を含めた複数のメカニズムによって転写のコアクチベータとして作用する。ＣＢＰおよびｐ３００は、構造的なレベルにおいて、高度な相同性を有し、あるタンパク質−結合ドメイン内では９３％までの同一性を有する（配列番号１および２）。多くの機能について、前記２つのタンパク質は機能上重複しているように見える。しかし、マウスの遺伝子の機能喪失研究によって、ＨＳＣにおいてｐ３００とＣＢＰの機能間の違いが明らかとなり、すなわち、ＣＢＰの喪失によって不完全なＨＳＣの自己再生がもたらされる一方で、ｐ３００の喪失によって造血幹細胞の不完全な分化がもたらされた。
【００２１】
ＣＢＰおよびｐ３００はＨＳＣ調節に重要であることが示されている既知の転写因子（例えば、ＨｏｘＢ４、β−カテニン、ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）、ＡＭＬ−１、ＭＬＬ）の多くと相互作用することが既に示されている。過去の結果は、ＨＳＣ内に、自己再生のために不可欠なＣＢＰによって特異的に共活性化される転写因子、および分化に非常に必要なｐ３００によって選択的に共活性化されるその他のものなどがあり得ることを示唆する。ＣＢＰおよびｐ３００を区別して用いると見られるシグナル伝達経路（シグナル経路）の一例はＷｎｔシグナル伝達経路である。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、血液、腸、および皮膚を含む様々な組織の発達および維持に関連した役割を果たすことが明らかになっている。その効果は、幹細胞および前駆細胞のレベルで達成され、自己再生および分化の両方に影響を与える。さらに、胚幹（ＥＳ）細胞の未分化の特徴の維持におけるＷｎｔシグナルの重要性はよく明らかにされている。重要なことは、Ｗｎｔシグナルが攪乱される際に、これらの同様の組織において癌の発達が引き起こされ得ることである。
【００２２】
β−カテニン（配列番号３）はショウジョウバエ遺伝子のアルマジロの脊椎動物ホモログであり、細胞接着、および本明細書において論じられているＷｎｔシグナル経路の両方において機能する。γ−カテニン（配列番号４）もまた、アルマジロの脊椎動物ホモログである。β−カテニンおよびγ−カテニンは類似する構造および機能を有し、ＡＰＣ腫瘍抑制因子によって調節される能力を有する。
【００２３】
Ｗｎｔシグナル経路の活性化は、ＴＣＦ（Ｔ細胞因子）／β−カテニン複合体の核での安定化およびＣＢＰおよびｐ３００などの転写コアクチベータの補充を必要とする。β−カテニンは構成的にに細胞内で生産され、生体内において、異常な転写活性をもたらし、癌などの病的状態をもたらすレベル以下にβ−カテニンのレベルを維持する抑制メカニズムが存在する。異常な調節の一例において、最近、Ｅｍａｍｉと同僚らは（ＰＮＡＳ，１0１，１２６８２−７，２００４）、癌細胞においてβ−カテニンがＣＢＰと優先して結合することを証明した。しかし、β−カテニンがβ−カテニン／ＣＢＰ−特異的抑制因子を用いることによってＣＢＰと結合しないようにした際には、β−カテニンはｐ３００と結合することができた。β−カテニンのｐ３００への“代替的な”結合は、分化の遺伝子プログラムの実行によって達成された（Ｔｅｏ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ）。よって、β−カテニンはＣＢＰに結合し、それを活性化することによって分化することなく増殖を促進させ、ｐ３００に結合し、それを活性化することによって分化を開始し、増殖を制限すると考えられる。従って、ＣＢＰ及び／又はｐ３００とβ−カテニンの相互作用の攪乱は分化または増殖に影響を及ぼすと予想される。
【００２４】
幹細胞治療は、様々な細胞のタイプに分化するヒト胎児または成体多能性幹細胞の能力に基づいている。幹細胞は、癌、パーキンソン病、脊髄損傷、火傷、糖尿病、心臓病、リューマチ関節炎、および骨関節炎を含む多くの種々の疾病に対する治療として損傷した細胞を置換するのに、および遺伝子療法に用いることができる（Ｌａｚｉｃ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ，１２（６）：６３５−６４２，Ｇａｆｈｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１１（４）：４１７−４２６）。長い間、幹細胞治療は我々を興奮させる可能性のある医学的な突破口であった。不具合のある患者組織を置換し得る器官−特異的な細胞を生じさせることができる、正常幹細胞を患者に注入できることは大きな可能性をもたらすものである。
【００２５】
胚幹細胞（ＥＳ細胞）は重要な研究ツール及び再生医薬のための潜在資源である。一般的に、ＥＳ細胞はマウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦｓ）の支持フィーダー細胞層と共に培養される。前記ＭＥＦフィーダー細胞層はＥＳ細胞の自己再生能力を維持し自発的な分化を阻害する因子を供給する。これらの煩わしい条件に加えて、ＭＥＦｓ上で成長したヒトＥＳ細胞の生体異物汚染の危険によって、ＥＳ細胞の増殖のために安全に用いることが可能な化学的に規定された培地の開発が優先される。ハイスループットの細胞ベースのスクリーニングを用いて、ＭＥＦフィーダー層または白血病抑制因子（ＬＩＦ）無しでマウスＥＳ細胞の増殖を可能にし、かつ自発的な分化を阻害する化合物として低分子ＩＱ−１が同定された。また、ＩＱ−１が、β−カテニンがＣＢＰからｐ３００へコアクチベータの使用を切り替えられないようにすることが確認された。β−カテニン／ｐ３００によって媒介される転写を犠牲にしてβ−カテニン／ＣＢＰによって媒介される転写を増加させることは幹細胞の多能性維持のために重要である。
【００２６】
胚の内細胞塊に由来するＥＳ細胞は胚繊維芽細胞層上で共培養することができる。最近、Ｘｕら（（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００１，１９，９７１）は、ヒトＥＳ細胞をＭＥＦ馴化培地を用いるフィーダーがない条件下で成長させることができることを証明した。しかし、ＭＥＦｓおよびＭＥＦ馴化培地における変化、馴化培地においてどのような因子が重要であるかについての知識の欠如および人畜共通の汚染への懸念によって、ＥＳ細胞を増殖させる化学的に規定された条件の必要性が強調される。
【００２７】
インビトロで成人皮膚幹細胞を維持できることによって、火傷患者に培養した皮膚の移植（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）が可能となっている（Ｇｒｅｅｎ，Ｈ．（１９９１）ＳｃｉＡｍ，２６５：９６−１０２）。さらに、現在、造血の再構成に用いられる３つの成体幹細胞に関連した移植手段、すなわち骨髄移植（ＢＭＴ）、末梢血幹細胞移植（ＰＢＳＣＴ）および臍帯血幹細胞移植（ＵＣＢＳＣＴ）がある。最初の２つの造血再構成技術、ＢＭＴおよびＰＢＳＣＴは、同種ドナーとの一致の問題にかなり悩まされている。移植の成功に必要な一致の程度は、ＵＣＢＳＣＴよりはＢＭＴまたはＰＢＳＣＴにおいてより厳格であると見られる。しかし、得られる幹細胞が比較的少量であることおよび移植手段当たり１つのみ採られた臍帯血単位が利用できることにより、ＵＣＢＳＣＴを幅広く利用することができない（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ，Ｐ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ，６（１）：５，２００５）。この問題に対する１つの解決方法は、臍帯血幹細胞の生体外で増殖させることである。しかし、このような直接的な解決方法を提供するためには克服しなければならない大きなハードルがある。
【００２８】
幹細胞および癌“幹細胞”
全ての癌の共通する特徴はそれらの無制限な自己再生能力であり、これは正常幹細胞の明らかな特徴でもある。数十年前に、すべての癌細胞の増殖能力は同等ではなく、ごく一部の腫瘍細胞だけが頻繁に増殖できるということが発見された（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ，ＡＷ．ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７（４３０２）：４６１−４６３）。これは、悪性腫瘍が相当な増殖の潜在力を有する癌幹細胞と制限された増殖能力を有するより分化した癌細胞の別のプールで構成されるという概念を提示した。癌幹細胞の仮設の重要な意味は、正常幹細胞の自己再生と癌幹細胞の増殖との間に機械的な類似性があるということである（Ｐａｒｄａｌ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，３（１２）：８９５−９０２）。最近の研究では、特定の遺伝子産物は癌細胞の増殖だけでなく、正常な体細胞の幹細胞の自己再生も調節するということが証明された（Ｐａｒｋ，ＩＫ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  ４２３：３０２−３０５；Ｌｅｓｓａｒｄ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ，４２３（６９３７）：２５５−２６０）。これは、増殖性で、かつ未分化な状態を維持するために幹細胞および癌細胞の両方において類似するメカニズムが用いられるということを意味する。
【００２９】
幹細胞および癌におけるＷｎｔシグナル
Ｗｎｔ／β−カテニン経路は正常発達および癌の初期および進展の両方において重要なシグナル伝達系を開始させるものである（Ｇｉｌｅｓ，ＲＨ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１６５３（ｌ）：ｌ−２４；Ｗｏｄａｒｚ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｍｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ，１４：５９−８８）。Ｗｎｔシグナル、特にβ−カテニンの核機能は幹細胞の分化だけでなく、維持、増殖においても重要であると証明された（Ｓｏｎｇ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３０（１４）：３２５９−３２６８）。本発明に関連するこのようなシグナル経路の顕著な特徴中のいくつかは図１に要約されている。Ｗｎｔ／β−カテニン経路は、増殖と分化の両方を促進させることに関与する遺伝子範囲の発現を調節する。Ｗｎｔ経路の活性化によって、β−カテニンが核に蓄積され、転写因子のＴＣＦファミリーのメンバーに結合し、かつ転写コアクチベータＣＢＰまたはそれと密接に関連したホモログ、ｐ３００を補充することによって、転写的に活性を有する複合体が形成されるようになる。しかし、結腸癌の８５％以上において、この経路内の突然変異によって、ターゲット遺伝子、例えば、ｃ−ｍｙｃ、サイクリンＤ１およびスルビビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の構成的な活性化および発現が誘導され、その総ての遺伝子は迅速な細胞増殖のために重要なものである（Ｋｏｌｌｉｇｓ，ＦＴ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９（８）：５６９６−５７０６；Ｔｅｔｓｕ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ，３９８（６７２６）：４２２−４２６；Ｋｉｍ，ＰＪ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｌａｎｃｅｔ，３６２：２０５−２０９）。よって、腸上皮における腫瘍形成は、腸陰窩幹細胞のＷｎｔ／β−カテニンによって誘導された過剰増殖およびその後に継ぐ悪性腫瘍と癌進行をもたらす更なる突然変異の蓄積によって引き起こされたものであると思われる。また、Ｗｎｔシグナルは、培養において、マウスおよびヒトの胚幹細胞の両方において多能性の維持のために重要であると証明されている（Ｓａｔｏ，Ｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔ  Ｍｅｄ，１０（１）：５５−６３）。Ｗｎｔ経路の多数の成分の発現は、胚幹細胞だけでなく、Ｐ１９ヒト胚性癌腫細胞株においても明らかである（Ｗａｌｓｈ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＡＰＭＩＳ，１１１（１）：１９７−２１１）。
【００３０】
Ｗｎｔおよび造血幹細胞（ＨＳＣ）
造血幹細胞（ＨＳＣ）の自己再生もＷｎｔシグナルによって増進される。マウス由来の培養された骨髄ＨＳＣにおける安定したβ−カテニンの過剰発現によって、長期間の培養において、放射線照射後のマウスの造血系を再構成する能力によって測定したこれらの細胞数が増加した。さらに、精製したＷｎｔ３ａは培養において自己再生は増進させたが、ＨＳＣの分化は一部のみ抑制した（Ｒｅｙａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ，４２３（６９３８）：４０９−４１４）。
【００３１】
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナルにおける区別したコアクチベータの使用
前述したように、ＣＢＰおよびｐ３００の機能はいくつかの研究で十分に説明されており（ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｇｏｏｄｍａｎ，ＲＨ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，１４（１３）：１５５３−１５７７）、マウスの発生中、それらの発現パターンはほぼ同一である（Ｐａｒｔａｎｅｎ、Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍ  Ｊ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ，４３（６）：４８７−４９４）。しかし、これらの高度に相同であるコアクチベータは生理的条件下で重複しておらず、別個の転写プログラムを担うことが次第に明らかになっている。Ｒｅｖｅｌら（Ｒｅｂｅｌ、Ｖ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９９（２３）：１４７８９−１４７９４）は、ノックアウトマウスから得た細胞を用いて、ｐ３００ではなくＣＢＰの総量がＨＳＣ自己再生にとって重要であり、逆に、ＣＢＰではなくｐ３００が適切な造血分化のために必須であることを証明した。同じく、Ｅｃｋｎｅｒおよび同僚らは（Ｒｏｔｈ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｅｍｂｏ  Ｊ，２２（１９）：５１８６−５１９６）、ＣＢＰのＨＡＴ活性ではなく、ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性（ＨＡＴ）が果たす重要な役割を証明した。これらおよび他の研究では、発達中、ＣＢＰおよびｐ３００が重複しない、別個の役割を果たすということを明らかに証明するものである。
【００３２】
β−カテニン／ＣＢＰ相互作用の低分子の抑制因子および付加的な遺伝子発現プロファイリングを用いる本発明者らの先のケモゲノミクス研究から、Ｗｎｔシグナルにおいて区別してコアクチベータを使用することが増殖対分化をどのように調節するかを表すモデルが開発された。このモデルの重要な特徴は、例えば、癌や幹細胞において経路のＣＢＰアーム（ａｒｍ、図１０、左側）が分化することなく増殖するために必須であり、その反面、ｐ３００アーム（ａｒｍ、図１０、右側）は分化させ、増殖を制限するために重要であるということである。ＩＣＧ−００１は特異的にβ−カテニン／ＣＢＰ依存転写（すなわち、経路の左アーム）を抑制し、よって、癌細胞においてプログラムされた細胞死を選択的に誘導し（Ｅｍａｍｉ，Ｋ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０１，１２６８２−７，２００４）、また、非腫瘍形成前駆細胞、例えば、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞（図１１および１２）および３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞の分化を誘導する。
【００３３】
本発明は、特定のメカニズムにとらわれずに、β−カテニン／ｐ３００相互作用（すなわち、図１０の右側経路）を選択的に抑制するか、又は下方調節することによって、多能性幹細胞が分化することなく増殖するようになるという前提に基づくものである。また、本発明は、実施例１にてより詳細に開示するように、あるメカニズムが、セリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼＰＰ２ＡのＰＲ７２／１３０サブユニットの少なくとも１つへの化合物または薬物の選択的な結合を伴うという発見に基づいている。一実施態様において、薬物はＩＱ−１と類似する活性を有する。
【００３４】
セリン／スレオニンホスファターゼＰＰ２Ａは、細胞内のシグナル伝達、遺伝子発現、および細胞周期の進行の調節に関与する。ＰＰ２Ａの主な機能は、セリン／スレオニンキナーゼの活性を妨害することにより、シグナル伝達系を調節することである（２０）。ＰＰ２Ａはマルチサブユニット複合体からなる。この三量体の複合体の核の成分は３６ｋＤａの触媒のサブユニット、６５ｋＤａの調節サブユニット（ＰＲ６５）および３番目の可変（ｖａｒｉａｂｌｅ）サブユニットであり、これらのうちの１つがＰＲ７２／１３０である。ＰＲ７２／１３０は同一遺伝子の組織選択的な異なってスプライスされた形態を示す（２１）。ＰＰ２ＡはＷｎｔシグナル伝達系を色々なレベルで調節する（２２，２３）。最近、ＰＲ７２／１３０はＷｎｔシグナル経路の負の制御成分であるＮｋｄ（Ｎａｋｅｄ  ｃｕｔｉｃｌｅ）タンパク質と相互作用し（２４）、それによってＷｎｔシグナル伝達を調節するということが証明されている（２５）。Ｃｒｅｙｇｈｔｏｎらは、ゼノプスの胚において、モルフォリノを用いて、ＮｋｄのようにＰＲ７２が“カノニカルな”Ｗｎｔ／β−カテニンシグナルの“負の”制御因子であり、“カノニカルな”Ｗｎｔシグナル伝達から“非カノニカルな”収斂伸長への切り替えに関与することを証明した（２５）。
【００３５】
造血幹細胞の増殖維持のために、本発明の好ましい薬物はＣＢＰ、ｐ３００、またはβ−カテニンのうちのいずれか１つの翻訳後修飾に影響を及ぼし、ＣＢＰとβ−カテニンの相互作用の選択的な増加またはｐ３００とβ−カテニンの相互作用の選択的な減少を誘導することによって幹細胞の増殖を“調節する”。前記で薬物はＣＢＰまたはｐ３００に直接結合しない。“相互作用する”および“相互作用”は２つまたは３つ以上の分子の間、この場合にはβ−カテニンとＣＢＰまたはｐ３００の間の正常な生物学的関係を意味する。一実施態様において、前記薬物はＣＢＰに対するβ−カテニンの結合を増加させる。別の実施態様において、前記薬物はｐ３００に対するβ−カテニンの結合を減少させる。これらの実施態様のうちのいずれかによって、全体の結果はβ−カテニン経路をターゲット細胞の“増殖／非分化プログラム”の方に偏らせ、本発明における該ターゲット細胞は造血幹細胞、神経幹細胞、または皮膚幹細胞などの成体幹細胞である。薬物の非存在下で幹細胞の増殖がより多くなり、かつ／又は肝細胞の分化がより少なくなる場合、その薬物は幹細胞の増殖を“調節”するものだろう。例えば、図５Ｃを参照すれば、ＣＢＰへβ−カテニンが優先的に結合し、ｐ３００への結合が少ないことは、未分化状態で連続して増殖する造血幹細胞の維持と関連しており、造血システム再生治療が必要なヒトなどの哺乳動物の造血システムを再生するのに有用な未分化細胞の数を増殖させる結果をもたらす。このような調節は、例えば、実施例に記述されたアッセイを用いて測定することができる。
【００３６】
本発明における使用に適した薬物は、Ｅｍａｍｉ  ｅｔ．ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０１，１２６８２−７，２００４に記載された共免疫沈降方法を用いてスクリーニングすることができる。簡単に言えば、ターゲット細胞を、ＨＳＣの場合において、全長のβ−カテニンまたは全長のｐ３００によってトランスフェクトする。核溶解物を放射標識した検査薬単独または非放射性の検査薬で処理する。結合していない放射標識した検査薬を除去し、放射標識した検査薬の結合を測定する。結果は検査薬が特異的にｐ３００と相互作用するかどうかを示す。
【００３７】
別の一連の実験では、ｐ３００とβ−カテニンの相互作用の抑制を証明することができる。ＣＢＰ（アミノ酸１−１１１）、ｐ３００（アミノ酸１−１１１）、およびβ−カテニンのＣ末端領域（配列番号３）（アミノ酸６４７−７８１）の最小結合ドメインを、適切な薬物で処理した哺乳類細胞において発現させて、相互作用を改変し、精製する。β−カテニンを、β−カテニン特異的抗体で被覆したプロテインＡ−アガロースビーズ（ｂｅａｄｓ）に結合させ、ＣＢＰ又はｐ３００とインキュベートする。非結合タンパク質を洗浄によって除去し、次いでＣＢＰまたはＳｅｒ８９がリン酸化されたｐ３００に直接結合する化合物をテストするために、、β−カテニンとｐ３００との間、およびβ−カテニンとＣＢＰとの間の特異的相互作用を検査薬を使ってテストする。ＣＢＰへのβ−カテニンの結合を増加させるか、又はｐ３００へのβ−カテニンの結合を減少させる薬物を、造血幹細胞増殖／分化の適切なモデルを用いて、インビトロでさらにテストする。このようなモデルの１つはＲｅｂｅｌ，Ｖ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９９：１４７８９−１４７９４、２００２に記載されている。
【００３８】
本発明に係る薬物はいくつかのメカニズムのうちの１つを通じて望ましい生物学的作用を達成することができる。いずれの場合において、“増加”または“減少”への言及は、薬物の非存在下での値と関連したアッセイの結果または生物学的作用を指す。例えば、薬物はＣＢＰのアミノ末端の１１０個のアミノ酸へのβ−カテニンの結合を増加させることができるか、または薬物はｐ３００のアミノ末端の１１０個のアミノ酸へのβ−カテニンの結合を減少させることができる。ｐ３００へのβ−カテニンの結合の減少はｐ３００のＳｅｒ８９のリン酸化を抑制することによって達成することができ、ここで、前記リン酸化はタンパク質キナーゼＣ−イプシロン（ＰＫＣ）、カルシウム／カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼ（ＣａＭＫ）、プロテアーゼ活性化受容体−４（ＰＡＲ−４）、プロテアーゼ−活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）、または他のセリン／スレオニンタンパク質キナーゼによって、キナーゼカスケードを通じて直接または間接的に触媒される。
【００３９】
ｐ３００のＳｅｒ８９のリン酸化の減少は、例えば、マイトジェン−活性化タンパク質キナーゼ４（ＭＡＰＫ）、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）、または他のセリン／スレオニンタンパク質キナーゼを用いて、Ｓｅｒ９０のリン酸化を増加させることによって、達成することができる。
【００４０】
本発明の好ましい薬物は１４−３−３タンパク質とＳｅｒ８９がリン酸化されたｐ３００の相互作用を調節することができる。このような薬物はフシコクシンの類似体であってもよい。フシコクシンはＨ＋−ＡＴＰアーゼの活性化を研究するために用いられる真菌毒素である。メカニズムはＨ＋−ＡＴＰアーゼのＣ−末端部分と１４−３−３タンパク質との間の不可逆的な結合を誘導することを伴うものである（Ｓｖｅｎｎｉｌｉｄ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １１：２３７９−２３９２，１９９９）。その結果として、Ｃ末端の自己阻害ドメインが置換される。同様に、フシコクシンの類似体は１４−３−３タンパク質とＳｅｒ８９がリン酸化されたｐ３００の相互作用を調節することができ、β−カテニンとｐ３００の相互作用の減少をもたらす。
【００４１】
他の実施態様において、薬物はβ−カテニンとまたはＣＢＰもしくはｐ３００とのＰｉｎ１の相互作用を調節する。本発明の一実施態様において、薬物はβ−カテニン／ＣＢＰとＰｉｎ１との結合を増加させる。Ｐｉｎ１（プロリルイソメラーゼ）は腫瘍抑制因子ＡＰＣとβ−カテニンの相互作用を抑制することによって癌のメカニズムに関わっている。Ｐｉｎ１の過剰発現はヒト乳癌で起こると報告されている（Ｒｙｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：７９３−８０１（２００１））。また、Ｐｉｎ１は正常な精子形成にも関わっている。Ａｔｃｈｉｓｏｎ，Ｆ．Ｗ．ら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６９：１９８９−１９９７，２００３）は、成体のＰｉｎ１欠乏マウスが幹細胞の潜在力の加速した枯渇の証拠を示し、Ｐｉｎ１の非存在下において分化の経路に偏る可能性を報告した。
【００４２】
リン酸化はタンパク質の立体構造に影響を及ぼし、リン酸化された残基を認識することができる特定の適切なドメインへシグナルトランスデューサーを結合させるための条件を構築する。Ｐｉｎ１は、リン酸化されたＳ／Ｔ−Ｐ結合（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフ）を特異的に認識する。例えば、Ｐｉｎ１はリン酸化されたＳｅｒ−Ｐｒｏモチーフ（Ｓｅｒ  ２４６−Ｐｒｏ）をβ−カテニン内においてＡＰＣ−結合部位の次に直接結合させ、大腸腺腫症タンパク質（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ  ｐｒｏｔｅｉｎ、（ＡＰＣ））とβ−カテニンの相互作用を抑制し、それにより、細胞核へのその移行（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を増加させる（Ｒｙｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：７９３−８０１，２００１）。
【００４３】
また、Ｐｉｎ１は、転写因子とのコアクチベータの相互作用に影響を及ぼし得る。ｐ７３は腫瘍抑制因子ｐ５３に関連する転写因子である。Ｐｉｎ１により改変されたｐ７３は改変されていないｐ７３よりｐ３００に対してより高い親和性を示した（Ｍｏｎｔｏｖａｎｉ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ  １４：６２５−６３６，２００４）。同様に、リン酸化されたβ−カテニンへのＰｉｎ１の結合はβ−カテニン／ＣＢＰ相互作用を増加させることができ、それによってβ−カテニン／ＣＢＰ依存性の遺伝子転写は分化を犠牲にして増殖を増進させる。
【００４４】
本発明の薬物は、造血幹細胞が成長する生体適合材料に入れることができる。その例はＨｏｒａｋら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２５，５２４９−６０，２００４およびＨａｒｒｉｓｏｎら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２５，４９７７−８６，２００４に開示されている。
【００４５】
造血幹細胞が本発明の方法のターゲットの実施態様として本明細書に記載されているが、該方法は組織再生に用いることができるいずれの成体哺乳類幹細胞（またはＥＳ細胞）にも適用することができる。成体幹細胞は出生後一生の間に増殖する能力、および病んだり、死んだり、喪失したりした細胞を代替するために特定細胞に分化する能力を有する未分化の細胞集団を構成する（Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２３：７８−８３，２００５）。ＨＳＣに加え、本発明に従う用途に適した幹細胞としては、神経幹細胞、皮膚幹細胞、筋肉幹細胞、および膵島細胞が挙げられる。
【００４６】
糖尿病治療の目的はインスリン生産β細胞の正常な数および機能を回復することである。Ｔｒｕｃｃｏ，Ｍ．（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：５−１２，２００５）は、β細胞を生産することができ、膵島由来多能性前駆体と称される成体膵島前駆細胞の存在について論じている。他の幹細胞をβ細胞へ分化を方向付けるように誘導することができる。β細胞のこれらの供給源のいずれかとして、本発明の方法および薬物は、治療的用途のため適切な数の細胞を得るために、増殖を誘導しおよび分化を制限するのに適している。
【００４７】
成体神経幹細胞は、成体神経システムの３つの主要系統であるニューロン、星状細胞、およびオリゴデンドロサイトに分化することができる。本発明のこのような適用のためには、生体内原位置において成体神経幹細胞を操作することが生体内において神経発生を達成するために適切であり得る。活性幹細胞は海馬の歯状回の領域内、前脳の脳室下帯（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）の成熟した脳に存在し、これらの幹細胞はニューロン、星状細胞、およびオリゴデンドロサイトに分化することができる。また、無活動の幹細胞のプールは脊髄、黒質、視覚神経、および視床下部に存在する（Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，２００５）。よって、神経幹細胞の限定されたプールは本発明における調節のために用いることができる。
【００４８】
皮膚幹細胞は毛髪の成長を増進させるか又は回復するために生体内で増殖するように誘導することができる。最近の証拠は、Ｗｎｔ経路が多能性幹細胞の特性を得るか、かつ／又は維持する皮膚表皮細胞の能力に関与することを示唆している（Ａｌｏｎｓｏ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．；ＰＮＡＳ  １００：１１８３０−１１８３５，２００３）。皮膚における多能性幹細胞は、それらが毛嚢を形成する前にＷｎｔシグナルを受ける。β−カテニンが構成的に安定化した遺伝子導入マウスの皮膚において、成体毛嚢間の表皮（ｉｎｔｅｒｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）は胚皮膚の特徴を有し、毛嚢に発達する能力を有し得る（Ｇａｔ，Ｖ．，Ｃｅｌｌ  ９５：６０５−６１４、１９９８）。よって、本発明の薬物および方法は、皮膚において多能性幹細胞の増殖を増進させて、局所的に使用することによって、生体内適用を含めた失われた毛髪の成長を増加させるか、又は置換するために毛嚢を形成することが可能な細胞のリザーバを提供するのに適している。米国特許第６，４１９，９１３号には、毛髪喪失を治療するための薬物を含む治療剤の局所送達に適した組成物が開示されている。また、米国特許第６，６８０，３４４号には毛髪喪失を治療するために薬物を局所送達することが開示されている。
【００４９】
本発明の薬物および方法によって誘導された増殖後、幹細胞を用いることに加え、用いる前に前記幹細胞を遺伝子治療法によって変化させることもまた可能である。したがって、本発明は、治療用途のための細胞の投与前に、外因性遺伝子を発現する哺乳類幹細胞の増殖を増進させる方法を提供する。また、遺伝子治療を生体内で行って、例えば、神経幹細胞の分化潜在力を変化させることができる（Ｇｏｍｅｓ，Ｗ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５５：１６４−１７７，２００３；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｗ．Ｍ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．６：６８３−６９１，２００３）。
【００５０】
哺乳類幹細胞が未分化状態で維持されるかどうかを決定するのに適したアッセイは、ＯＣＴ４プロモーターの調節下でのレポーター遺伝子の使用を伴う。ＯＣＴ４は未分化の幹／前駆細胞状態の既知のマーカーであり、そのプロモーター領域は、Ｇｅｒｒａｒｄ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２３：１２４−１３３（２００５）に記載されているような、ＥＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ））またはルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子に機能的に連結することができる。いずれかのレポーター遺伝子を用いて、細胞を、Ｇｅｒｒａｒｄら（２００５）に記載された方法を用いてＯＣＴ４−レポーター遺伝子コンストラクトでトランスフェクトし、細胞の未分化状態対分化状態に対する本発明に係る薬物の効果を試験する。
【００５１】
インビトロで幹細胞に対する低分子の効果をテストするための方法としては、Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９９：１４７０１−１４０７６（２００２）およびＦｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ  １：１０（２００２）によって記載されたものなどが挙げられる。
【００５２】
胚幹細胞は研究のための重要なツールであり、基本的には再生医学のための潜在的なリソースである（Ｈｏｒｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００２，９９，１６１０５，Ｋｉｍ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１８，５０，Ｌａｎｚａ  ＲＰ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｍｅｄ，１９９９，５，９７５）。多能性の内細胞塊に由来するマウスＥＳ（ｍＥＳ）細胞は血清とＬＩＦで補充された培地においてフィーダー細胞の非存在下で成長することができる。ｍＥＳ細胞の多能性を維持するためのＬＩＦの能力にはＳＴＡＴ３シグナル経路の活性が必要である。しかし、ＬＩＦが前記ＳＴＡＴ３シグナル経路を活性化させるという事実にもかかわらず、ＬＩＦはｈＥＳ細胞の未分化状態を維持しない（Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ＲおよびＢｅａｔｔｉｅ  Ｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００４，Ｄａｈｅｒｏｎ  ＬおよびＯｐｉｔｚ  Ｓ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００４）。
【００５３】
実施例で詳細に示すように、ＩＱ−１は投与量依存的にＥＳ細胞増殖および多能性を維持した。培地にＷｎｔ３ａを補充した場合、ＩＱ−１は血清の非存在下でＥＳ細胞増殖を維持できた。重要なことは、Ｗｎｔ３ａプラスＩＱ−１は、培養において長期間（少なくとも４８日間）ＥＳ細胞の増殖および多能性を維持するのに充分なものであったことである。Ｗｎｔ３ａおよびＩＱ−１の組み合わせはＰ１９胚性癌腫細胞においてＯｃｔ４およびＳｏｘ２の発現を増加させ、ｃ−ｍｙｃの発現を減少させた。最近、Ｂｏｙｅｒら（Ｃｅｌｌ  １２２，９４７，２００５）は、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２がヒトＥＳ細胞の維持のために必要な遺伝子の実質的な部分のプロモーター／エンハンサーを共に占有するということを証明した。さらに、ｃ−ｍｙｃが幹細胞の自己再生および分化間のバランスにおいて重要な役割を有し、分化の際に増加すると見られている（Ｗｉｌｓｏｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １８，２７４７，２００４）。
【００５４】
カノニカルなまたはＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達はヒトおよびマウスの幹細胞集団の両方の増殖の調節において重要な役割を果たす（Ｋｌｅｂｅｒ  ＭおよびＳｏｍｍｅｒ  Ｌ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ  ２００４，Ｗｉｌｌｅｒｔ  ＫおよびＢｒｏｗｎ  Ｊ  Ｎａｔｕｒｅ  ２００３，およびＳａｔｏ  ＮおよびＭｅｉｊｅｒ  Ｌ  Ｎａｔ．Ｍｅｄ  ２００４）。しかし、数多くの研究では、Ｗｎｔが多能性を維持する成長因子としての機能を果たすことができるか、またはその代わりに分化を誘導することができ、細胞系統の決定に影響を及ぼし得るということを証明した（ＫｌｅｂｅｒおよびＳｏｍｍｅｒ  ２００４，ＩＨｅ  ＦおよびＳｏｍｍｅｒ  Ｌ  Ｃｅｌｌ  ＭｏＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ２００５，Ｍｕｒａｓｈｏｖ  Ａ，Ｐａｋ  Ｅ  Ｆａｓｅｂ  Ｊ  ２００４，Ｆｅｎｇ  ＺおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ  Ａ  ＢＢＲＣ  ２００４）。
【００５５】
最近、本発明者らはこれらの多岐にわたるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性を説明するためのモデルを開発した（図５）。このモデルは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル経路におけるコアクチベータＣＢＰおよびｐ３００の別々の役割を明確にするものである（Ｅｍａｍｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００４，Ｍａ  ｅｔ  ａｌ  ２００５，Ｔｅｏ  ｅｔ  ａｌ  ２００５，ＭｃＭｉｌｌａｎおよびＫａｈｎ  ２００５）。前記モデルの重要な特徴は、ＴＣＦ／β−カテニン／ＣＢＰによって媒介される転写が幹／前駆細胞増殖のために重要である一方、ＴＣＦ／β−カテニン／ｐ３００によって媒介される転写への切り替えが、ＩＣＧ−００１を用いてケモゲノミクスにより（ｃｈｅｍｏｇｅｎｏｍｉｃａｌｌｙ）誘導されても、内生的に誘導されても、増殖能力をより制限することにより分化のプログラムを開始するために重要であることである。このモデルに基づき、実験を行って、ＩＱ−１がＷｎｔ／β−カテニンシグナル経路において選択的なＣＢＰコアクチベータの使用に影響を及ぼすかどうかを決定した。
【００５６】
ＩＱ−１は対応するｐ３００／β−カテニンの相互作用を犠牲にして、選択的にβ−カテニン／ＣＢＰ相互作用を増進させた。親和性クロマトグラフィーのアプローチを使用して、ＩＱ−１の分子ターゲットがタンパク質ホスファターゼＰＰ２ＡのＰＲ７２／１３０の異なってスプライスされた調節サブユニットであることが本明細書において示された（Ｂｅｒｎａｒｄｓ  Ｒ  ２００４およびｉｎ  ｐｒｅｓｓ）。Ｂｅｒｎａｒｄｓは、以前に、ＰＲ７２がＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達のＷｎｔ−誘導性拮抗剤であるタンパク質Ｎｋｄと相互作用し、ＰＲ７２またはＮｋｄの損失がＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化をもたらすことを証明した。ＩＱ−１はゼブラフィッシュの胚発生および収斂伸長に対し劇的な効果を有していた。ＩＱ−１の分子ターゲットとしてＰＲ７２／１３０を同定することによって、本発明は幹細胞増殖の促進及び／又は維持に有用な他の薬物を同定するためのアッセイを提供する。
【００５７】
所定の成長条件下において、“幹／前駆”集団を増殖する能力は再生医学の領域において派生的な効果を有する（Ｈｏｒｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００２，９９，１６１０５，Ｋｉｍ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１８，５０，Ｌａｎｚａ  ＲＰ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｍｅｄ，１９９９，５，９７５）。Ｗｎｔシグナル経路は、“幹／前駆”集団の増殖において明らかに重要な役割を果たす（Ｒｅｙａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２００５．；４３４，８４３）。しかし、Ｗｎｔシグナル伝達は、また、細胞、組織および器官の分化プロセスおよび発生において重要な役割を果たす。Ｗｎｔシグナル伝達のこれら多岐にわたる行動はコアクチベータタンパク質であるＣＢＰまたはｐ３００の選択的な使用によって明らかに調節されている（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｏ  ｅｔ  ａｌ．およびＭｃＭｉｌｌａｎおよびＫａｈｎ  ２００５）。コアクチベータ使用の内生的な選択は、複雑な一連の区別された翻訳後修飾によって調節されるように思われる。
【００５８】
薬理学的に、本発明者らは、以前にＩＣＧ−００１でＣＢＰ／β−カテニン相互作用を遮断し、それによって多岐にわたるプロモーター特異的な効果を有するｐ３００／β−カテニン相互作用への切り替えを促進させることによって直接的にコアクチベータを選択することを示した（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ）。本結果は、翻訳後修飾の調節およびＷｎｔ／β−カテニン抑制フィードバックの成分との相互作用により、ＩＱ−１は、また、Ｗｎｔ／β−カテニンのコアクチベータの選択を操作できるということを示す。ＩＱ−１によってＷｎｔ／β−カテニン／ＣＢＰシグナルを増進させ、かつＷｎｔ／β−カテニン／ｐ３００の使用への切り替えを妨害することは、ＭＥＦｓまたは血清のない所定の培地において多能性を維持しつつ、ＥＳ細胞の長期間の増殖を可能にするものである。再生医学のために必要な原料を生産するために“幹／前駆”細胞を調節して増殖させることは本発明の重要な成果である。
【００５９】
本明細書に記載され、特許請求の範囲に記載された方法を実施するために有用な更なる化合物は、２００４年１２月２７日に出願された特願２００６−１８０７６３号公報に開示され、教示されている化合物があり、参照によって本明細書に組み込むものとする。前記特許公報の化合物としては特願２００６−１８０７６３にに記載されているような構造を有する化合物として示されたものなどがあり、その例を下記に示す。
【００６０】
化合物としては化学式（化合物）番号として下記に示す次のようなものがある。
【００６１】
式１
【化２】
2009517085.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ同一または異なっていてもよく；電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。Ａ環は、少なくとも１つのヘテロ原子を環内に含む５〜８員環を表す。Ｘは、主鎖の原子数が０〜１０のアルキレン基を表す。原子数０のアルキレン基とは単結合を表す。該アルキレン基を構成する１つ以上のエチレンが、−Ｃ＝Ｃ−基及び／又は−Ｎ＝Ｎ−基及び／又は−ＣＯＮＨ−基で置き換わっていてもよい。また、環Ａと結合するボンドが二重結合となる基であってもよい。さらに、該アルキレン基は、置換基として、電子吸引基、電子供与基または水素原子を１つ以上有してもよい。Ｇは、電子吸引基、電子供与基または水素原子を有してもよい芳香族基である。該Ａ環は、−ＸＧ基以外の置換基として電子吸引基及び／又は電子供与基を１つ以上有してもよい。
【００６２】
式２
【化３】
2009517085.tif 000005
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ及びＧは、前記化学式（１）中の定義と同義である。Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。）
【００６３】
式３
【化４】
2009517085.tif 000006
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ及びＧは、前記化学式（１）中の定義と同義である。Ｒ５及びＲ６は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。）
【００６４】
式４
【化５】
2009517085.tif 000007
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は、前記と同義である。Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。二重片側破線は単結合または二重結合を表す。二重片側破線が二重結合を表す場合、波線部に関して幾何異性体が存在する。これらの幾何異性体の配置は特に限定されず、それぞれ独立に、Ｅ体又はＺ体のいずれであってもよい。）
【００６５】
式５
【化６】
2009517085.tif 000008
（ただし、Ａは水素原子もしくは式６：
【化７】
2009517085.tif 000009
を表す。
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は、前記と同義である。Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。）
【００６６】
式７
【化８】
2009517085.tif 000010
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は前記と同義である。Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。）
【００６７】
式８  
【化９】
2009517085.tif 000011
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。電子供与基とは、ベンゼン環へ電子を供与し得る置換基をいい；電子吸引基とはベンゼン環上のπ電子を吸引する性質を有する置換基をいう。また、Ｈａｍｍｅｔｔの置換基定数σを用いてσ＜０を電子供与基、σ＞０を電子吸引基と定義することもできる（基礎有機反応論、橋本静信ら著、三共出版、１９９７年）。）
【００６８】
式９
【化１０】
2009517085.tif 000012
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ及びＧは、前記と同義である。Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。）
【００６９】
式１０
【化１１】
2009517085.tif 000013
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ及びＧは、前記と同義である。Ｒ５及びＲ６は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。）
【００７０】
式１１
【化１２】
2009517085.tif 000014
式１２  
【化１３】
2009517085.tif 000015
（ただし、Ａは水素原子もしくは
【化１４】
2009517085.tif 000016
を表す。）
【００７１】
式（１１）及び（１２）中、Ｒ１〜Ｒ１３は、それぞれ同一または異なっていてもよく、電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。
【００７２】
具体的な例としては次のようなものが挙げられる。
２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
２−（３−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
２−（４−ブロモ−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
２−（３−ブロモ−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
２−（４−クロロ−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
２−（３−クロロ−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−ｍ−トリルアゾ−アセトアミド
２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−ｐ−トリルアゾ−アセトアミド
２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（４−メトキシ−フェニルアゾ）−アセトアミド
２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（３−メトキシ−フェニルアゾ）−アセトアミド
２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（４−ニトロ−フェニルアゾ）−アセトアミド
２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（３−ニトロ−フェニルアゾ）−アセトアミド
２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（４−スルファモイル−フェニルアゾ）−アセトアミド
２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（３−スルファモイル−フェニルアゾ）−アセトアミド
２−（４−アセチルアミノ−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
２−（３−アセチルアミノ−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
２−（２−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−フェニルアゾ−アセトアミド
（４−アセチル−フェニルアゾ）−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−酢酸エチルエステル
２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−１−イル）−アセトアミド
２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−メチル−アセトアミド
２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−フェニル−アセトアミド
２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（２，３，３−トリメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
（４−アセチル−フェニルアゾ）−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトニトリル
２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アセトアミド
（４−アセチル−フェニルアゾ）−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−酢酸
２−（２−アセチル−３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−アセトアミド
２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−ｐ−トリル−アセトアミド
２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−ｍ−トリル−アセトアミド
２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−ｏ−トリル−アセトアミド
２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−（４−メトキシ−フェニル）−アセトアミド
２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−（３−メトキシ−フェニル）−アセトアミド
２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−（４−ニトロ−フェニル）−アセトアミド
２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−（３−ニトロ−フェニル）−アセトアミド
４−［２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセチルアミノ］−安息香酸エチルエステル
３−［２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセチルアミノ］−安息香酸エチルエステル
２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−フェニル−アセトアミド
２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−（２，４−ジメチル−フェニル）−アセトアミド
２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
【００７３】
式１５
【化１５】
2009517085.tif 000017
（式中、Ｒ１〜Ｒ９は同一または異なってもよい電子吸引基、電子供与基または水素原子を表す。このうち、好ましくは、Ｒ１〜Ｒ９はアルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、ニトリル基、アセトキシ基、アセトキシアルキル基、酸素原子を含んでも良い環状アルキルアミノアルキル基、ジアルキルアミノアルキル基、ジアルキルアミノビニル基、ヒドロキシアルキルアミノアルキル基、アリールアミノビニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子及び水素原子よりなる群から選ばれる基または原子があげられる。さらには、Ｒ１およびＲ２が水素原子であり；Ｒ３がヒドロキシル基またはアセトキシ基であり；Ｒ４がアセトキシアルキル基、酸素原子を含んでも良い環状アルキルアミノアルキル基、ジ低級アルキルアミノ低級アルキル基、ヒドロキシ低級アルキルアミノ低級アルキル基、又は水素原子であり；Ｒ５が低級アルキル基、ジ低級アルキルアミノビニル基またはアリールアミノビニル基であり；Ｒ６がニトロ基であり；Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９が同一であっても異なってもよい低級アルキル基、低級アルコキシ基、または水素原子であることが望ましい。）
【００７４】
化合物の具体的な例としては次のようなもの挙げられる。
２−メチル−３−ニトロ−１−フェニル−１Ｈ−インドール−６−オール
１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
２−メチル−３−ニトロ−１−ｐ−トリル−１Ｈ−インドール−６−オール
２−［２−（４−メトキシ−フェニルアミノ）−ビニル］−３−ニトロ−１−ｐ−トリル−１Ｈ−インドール−６−オール
１−（２−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
７−ジメチルアミノメチル−２−（２−ジメチルアミノ−ビニル）−３−ニトロ−１−ｐ−トリル−１Ｈ−インドール−６−オール
１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−７−ピペリジン−１−イルメチル−１Ｈ−インドール−６−オール塩酸塩
２−（２−ジメチルアミノ−ビニル）−１−（４−メトキシ−フェニル）−７−モルフォリン４−イルメチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
７−［（３−ヒドロキシ−プロピルアミノ）−メチル］−１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール塩酸塩
７−ジメチルアミノメチル−２−（２−ジメチルアミノ−ビニル）−１−（４−メトキシ−フェニル）−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
７−ジエチルアミノメチル−１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
７−ジメチルアミノメチル−２−メチル−３−ニトロ−１−ｐ−トリル−１Ｈ−インドール−６−オール
１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−７−ピペリジン−１−イルメチル−１Ｈ−インドール−６−オール酢酸
７−アセトキシメチル−２−メチル−３−ニトロ−１−ｐ−トリル−１Ｈ−インドール−６−イルエステル
２−（２−ジメチルアミノ−ビニル）−１−（４−メトキシ−フェニル）−３−ニトロ−７−ピペリジン−１−イルメチル−１Ｈ−インドール−６−オール
７−ジメチルアミノメチル−２−メチル−３−ニトロ−１−フェニル−１Ｈ−インドール−６−オール
７−ジメチルアミノメチル−１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール酢酸
６−アセトキシ−１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−７−イルメチルエステル
２−（２−ジメチルアミノ−ビニル）−３−ニトロ−１−ｐ−トリル−１Ｈ−インドール−６−オール
２−（２−ジメチルアミノ−ビニル）−３−ニトロ−１−フェニル−１Ｈ−インドール−６−オール
酢酸６−アセトキシ−２−（２−ジメチルアミノ−ビニル）−１−（４−メトキシ−フェニル）−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−７−イルメチルエステル
１−（４−クロロ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
酢酸２−（２−ジメチルアミノ−ビニル）−６−ヒドロキシ−１−（４−メトキシ−フェニル）−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−７−イルメチルエステル
５−ヒドロキシ−２−メチル−４，６−ジニトロ−１−フェニル−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸エチルエステル
７−［［ビス−（２−ヒドロキシ−エチル）−アミノ］−メチル］−１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
７−［［ビス−（２−ヒドロキシ−エチル）−アミノ］−メチル］−２−メチル−３−ニトロ−１−ｐ−トリル−１Ｈ−インドール−６−オール
７−ジメチルアミノメチル−２−（２−ジメチルアミノ−ビニル）−３−ニトロ−１−フェニル−１Ｈ−インドール−６−オール
２−（６−ヒドロキシ−３−ニトロ−１−フェニル−１Ｈ−インドール−２−イルメチル）−イソチオウレア
酢酸２−（Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−カーバムイミドイルスルファニルメチル）−１−（４−メトキシ−フェニル）−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−イルエステル
酢酸６−アセトキシ−１−（４−アセトキシ−フェニル）−２−（ジメチルアミノ−ビニル）−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−７−イルメチルエステル
２−（２−ジメチルアミノ−５−ヒドロキシ−ベンゾフラン−３−イル）−１−（４−メトキシ−フェニル）−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
２−（２−ジメチルアミノ−ビニル）−１−（４−メトキシ−フェニル）−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
５−ブロモ−１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
酢酸１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
７−ジメチルアミノメチル−６−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニル−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル
７−ジエチルアミノメチル−６−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニル−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル
２−（２−ジメチルアミノ−５−ヒドロキシ−ベンゾフラン−３−イル）−６−メトキシ−１−フェニル−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル
６−メトキシ−２−メチル−１−フェニル−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル
２−（２−ジメチルアミノ−ビニル）−６−メトキシ−１−フェニル−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル
５−ブロモ−６−ヒドロキシ−１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル
５，７−ジブロモ−６−ヒドロキシ−１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル
６−ヒドロキシ−１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル
６−ヒドロキシ−２−メチル−１−ｐ−トリル−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル
６−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニル−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル
１Ｈ−フロ［２，３−ｇ］インドール−３−酢酸，５−ヒドロキシ−１−（４−メトキシフェニル）−２，８−ジメチル，エチルエステル
５−ブロモ−７−ジメチルアミノメチル−６−ヒドロキシ−１−フェニル−２−フェニルスルファニルメチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
６−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニル−１Ｈ−インドール−３−酢酸
５−ブロモ−６−ヒドロキシ−１−フェニル−２−フェニルスルファニルメチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
６−アセトキシ−５−ブロモ−２−メチル−１−フェニル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
５−ブロモ−７−ジメチルアミノメチル−６−ヒドロキシ−１−フェニル−２−フェニルスルファニルメチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
６−アセトキシ−５−ブロモ−２−ブロモメチル−１−フェニル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
６−アセトキシ−２−ブロモメチル−１−フェニル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
６−アセトキシ−２−メチル−１−フェニル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
ピロロ［２，３−ｆ］［１，３］ベンゾキサジン−３−酢酸，８−エチル−１，７，８，９−テトラヒドロ−２−メチル−１−（４−ニトロフェニル）−，エチルエステル
６−アセトキシ−２−メチル−１−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
１−（２，４−ジメトキシ−フェニル）−６−ヒドロキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
６−ヒドロキシ−１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
１−（４−エトキシカルボニル−フェニル）−６−ヒドロキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
１−（４−シアノ−フェニル）−６−ヒドロキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
６−ヒドロキシ−２−メチル−１−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
６−ヒドロキシ−２−メチル−１−（４−トリフルオロメチル−フェニル）−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
６−ヒドロキシ−２−メチル−１−（４−ニトロ−フェニル）−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
１−（４−ブロモ−フェニル）−６−ヒドロキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
１−（４−フルオロ−フェニル）−６−ヒドロキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
６−ヒドロキシ−２−メチル−１−（４−ニトロ−フェニル）−５，７−ビス−ピペリジン−１−イルメチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
５，７−ビス−ジメチルアミノメチル−６−ヒドロキシ−２−メチル−１−（４−ニトロ−フェニル）−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
６−ヒドロキシ−２−メチル−１−（４−ニトロ−フェニル）−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
６−アセトキシ−１−（４−クロロ−フェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
７−ジメチルアミノメチル−６−ヒドロキシ−２−メチル−１−（４−ニトロ−フェニル）−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
７−ジメチルアミノメチル−６−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
６−ヒドロキシ−２−メチル−１−ｐ−トリル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
６−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
１−（４−クロロ−フェニル）−７−ジメチルアミノメチル−６−ヒドロキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
１−（４−ジメチルアミノ−フェニル）−６−ヒドロキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
１−（２−クロロ−フェニル）−６−メトキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
１−（２−クロロ−フェニル）−６−ヒドロキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
６−アセトキシ−１−（４−クロロ−フェニル）−２−メチル−５，７−ジニトロ−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
１−（４−クロロ−フェニル）−６−ヒドロキシ−２−メトキシ−２−メチル−５，７−ジニトロ−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
６−アセトキシ−５，７−ジブロモ−１−（４−クロロ−フェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
５，７−ジブロモ−１−（４−クロロ−フェニル）−６−ヒドロキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
６−アセトキシ−５−ブロモ−１−（４−クロロ−フェニル）−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
５−ブロモ−１−（４−クロロ−フェニル）−６−メトキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
１−（４−クロロ−フェニル）−６−メトキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸
１−（４−クロロ−フェニル）−６−メトキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
１−（４−クロロ−フェニル）−６−ヒドロキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸エチルエステル
【００７５】
Ｒで表される低級アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−メチルプロピル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルプロピル、２−エチルプロピルなどが挙げられる。好ましくはメチルである。Ｒで表される低級アルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、ヘキシロキシ、へプチロキシ、オクチロキシなどが挙げられる。好ましくはメトキシである。
【００７６】
Ｒで表されるハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素などが挙げられるが、好ましくは塩素または臭素である。Ｒで表される低級アシル基として、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリルなどが挙げられるが、好ましくはアセチルである。Ｒで表される環状構造を形成してもよい低級アルキル基としてシクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなどが挙げられるが、好ましくはシクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルである。
【００７７】
Ｒで表される低級アルコキシカルボニルとして、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニルなどが挙げられるが、好ましくはメトキシカルボニルもしくはエトキシカルボニルである。Ｒで表されるアミノカルボニルとしては、例えば、−ＣＯＮＲ２（Ｒは同一でも異なってもよい水素原子、先に例示した低級アルキル基、及び置換基を有してもよいフェニル基を表す）などが挙げられる。
【００７８】
Ｒで表される二級アミノカルボニル基としては、例えば、−ＣＯＮＨＲ（先に例示した低級アルキル基、及び置換基を有してもよいフェニル基を表す）などが挙げられる。また、三級アミノカルボニル基としては、例えば、−ＣＯＮＲ２（Ｒは同一でも異なってもよい先に例示した低級アルキル基、及び置換基を有してもよいフェニル基を表す）などが挙げられる。Ｒで表されるアミノアルキル基としては、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ２（ｎは１〜８の整数を示すが、好ましくは１である。またＲは同一でも異なっても良い水素原子、低級アルキル基、又は環状構造を形成しても良い低級アルキル基（環状構造中には窒素や酸素などのヘテロ原子を１〜３個含んでも良い）、及び置換基を有しても良いフェニル基を表す）などが挙げられる。
【００７９】
Ｒで表されるアセトキシアルキルとしては、−（ＣＨ２）ｎ−ＯＡｃ（ｎは１〜８の整数を表す）が挙げられる、好ましくはｎは１である。
【００８０】
他の具体例としては下記の式１７〜２８の化合物が挙げられる。
【００８１】
３，３−ジメチル−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリニデン−１−アセトアミド（式１７）
【化１６】
2009517085.tif 000018
【００８２】
２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド（式１８）
【化１７】
2009517085.tif 000019
【００８３】
２−（３−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド（式１９）
【化１８】
2009517085.tif 000020
【００８４】
２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（２，３，３−トリメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド（式２０）
【化１９】
2009517085.tif 000021
【００８５】
２−（２−アセチル−３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−アセトアミド（式２１）
【化２０】
2009517085.tif 000022
【００８６】
（４−アセチル−フェニルアゾ）−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトニトリル（式２２）
【化２１】
2009517085.tif 000023
【００８７】
（４−アセチル−フェニルアゾ）−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−酢酸（式２３）
【化２２】
2009517085.tif 000024
【００８８】
（４−アセチル−フェニルアゾ）−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−酢酸エチルエステル（式２４）
【化２３】
2009517085.tif 000025
【００８９】
２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−メチル−アセトアミド（式２５）
【化２４】
2009517085.tif 000026
【００９０】
２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アセトアミド（式２６）
【化２５】
2009517085.tif 000027
【００９１】
２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−フェニル−アセトアミド（式２７）
【化２６】
2009517085.tif 000028
【００９２】
２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−１−イル）−アセトアミド（式２８）
【化２７】
2009517085.tif 000029
【００９３】
化合物の他の例としては次のものなどが挙げられる：
２−シアノ−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−Ｎ−ｐ−トリル−アセトアミド
２−（４−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
２−（３−クロロ−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（３−メトキシ−フェニルアゾ）−アセトアミド
２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（３−ニトロ−フェニルアゾ）−アセトアミド
２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−（４−トリルアゾ−フェニルアゾ）−アセトアミド
２−（３−アセチル−フェニルアゾ）−２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−アセトアミド
２−（３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−１−イリデン）−２−ｍ−トリルアゾ−アセトアミド
２−メチル−３−ニトロ−１−フェニル−１Ｈ−インドール−６−オール
１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
２−メチル−３−ニトロ−１−ｐ−トリル−１Ｈ−インドール−６−オール
２−［２−（４−メトキシ−フェニルアミノ）−ビニル］−３−ニトロ−１−ｐ−トリル−１Ｈ−インドール−６−オール
１−（２−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
７−ジメチルアミノメチル−２−（２−ジメチルアミノ−ビニル）−３−ニトロ−１−ｐ−トリル−１Ｈ−インドール−６−オール
１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−７−ピペリジン−１−イルメチル−１Ｈ−インドール−６−オール
２−（２−ジメチルアミノ−ビニル）−１−（４−メトキシ−フェニル）−７−モルフォリン−４−イルメチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
７−［（３−ヒドロキシ−プロピルアミノ）−メチル］−１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
７−ジメチルアミノメチル−２−（２−ジメチルアミノ−ビニル）−１−（４−メトキシ−フェニル）−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
７−ジメチルアミノメチル−１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
７−ジメチルアミノメチル−２−メチル−３−ニトロ−１−ｐ−トリル−１Ｈ−インドール−６−オール
１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−７−ピペリジン−１−イルメチル−１Ｈ−インドール−６−オール
酢酸７−アセトキシメチル−２−メチル−３−ニトロ−１−ｐ−トリル−１Ｈ−インドール−６−イルエステル
２−（２−ジメチルアミノ−ビニル）−１−（４−メトキシ−フェニル）−３−ニトロ−７−ピペリジン−１−イルメチル−１Ｈ−インドール−６−オール
７−ジメチルアミノメチル−２−メチル−３−ニトロ−１−フェニル−１Ｈ−インドール−６−オール
７−ジメチルアミノメチル−１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
酢酸６−アセトキシ−１−（４−メトキシ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−７−イルメチルエステル
２−（２−ジメチルアミノ−ビニル）−３−ニトロ−１−ｐ−トリル−１Ｈ−インドール−６−オール
２−（２−ジメチルアミノ−ビニル）−３−ニトロ−１−フェニル−１Ｈ−インドール−６−オール
酢酸６−アセトキシ２−（２−ジメチルアミノ−ビニル）−１−（４−メトキシ−フェニル）−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−７−イルメチルエステル
１−（４−クロロ−フェニル）−２−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−６−オール
酢酸２−（２−ジメチルアミノ−ビニル）−６−ヒドロキシ−１−（４−メトキシ−フェニル）−３−ニトロ−１Ｈ−インドール−７−イルメチルエステル
５−ヒドロキシ−２−メチル−４，６−ジニトロ−１−フェニル−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸エチルエステル
【００９４】
このような化合物は、特許請求の範囲に記載され、本明細書に開示された方法を実行するのにそれらが適切であるかについて実施例に記載されたようにテストすることができる。
【００９５】
本明細書に記載された実施例と実施態様は単に説明するためのものであり、これらの観点から様々な変形および変更を当業者であれば想到することができ、そのような変形および変更は本願の精神および範囲内に含まれると理解しなければならない。
【実施例】
【００９６】
実施例１〜７に用いられた実験手順
細胞培養：ＥＳＣｓ、Ｄ３ＥＳ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９３４）を１５％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および１，０００Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）が補充されたＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するマウスＥＳＣ培地中で、マイトマイシンＣ（で処理したＭＥＦｓ上で維持した。ＭＥＦｓを除去するためにトリプシン処理によって細胞を収集し、ゼラチンコーティングを施した培養皿上に２０分間プレーティングした。主にＥＳＣｓからなる非接着性細胞（ｎｏｎ−ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ）をゼラチンコーティング培養皿上に再びプレーティングした。非接着性細胞は追加実験のために用いられた。Ｐ１９細胞をＡＴＣＣによって推奨された条件に従って培養した。細胞を５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃でインキュベートした。精製されたＷｎｔ３ａは購入した（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。
【００９７】
化合物の選別：低分子の選別のために、ＥＳＣｓのアルカリホスファターゼ活性を測定した。ＥＳＣｓをＬＩＦのないＥＳＣ培地においてウェル当たり３１６−１，０００個の細胞の密度で９６ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ）にプレーティングした。化合物を４μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。細胞を化合物で７日間処理し、試験細胞集団をＰＢＳで洗浄し、ｐ−ニトロフェニルリン酸溶液（ＭＯＳＳ  Ｉｎｃ．）ｌ００μｌを添加した。４０５ｎｍでの吸光度を吸光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。
【００９８】
フローサイトメトリー：ＥＳＣｓのＳＳＥＡ−１発現の分析をＺａｎｄｓｔｒａら（３５）に従ってフローサイトメトリーで行った。試験細胞集団を２％ＦＣＳ（ＨＦ）を含有する氷冷したＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄し、非特異的結合を遮断するために抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２単一クローン抗体をｌμｇ／ｌ００μｌ（Ｐｈａｍｉｎｇｅｎ）含有するＨＦで１０分間再懸濁した。次に、遮断された細胞を抗ＳＳＥＡ−ｌ（Ｋｙｏｗａ  Ｍｅｄｅｘ）と共に氷上で４０分間、１ｘ１０７細胞／ｍｌでインキュベートし、続いてＦＩＴＣ−Ｇｏａｔ抗マウスＩｇＭ抗体（ＺＹＭＥＤ）とともにインキュベートした。次に、ＳＳＥＡ−１発現について分析した細胞を、ＨＦで２回洗浄し、最終洗浄液には２μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を添加した。その後、細胞をＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）での分析のためにＨＦに再懸濁した。
【００９９】
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（ｗｔ）、ＮＩＨ−３Ｔ３  ＣＢＰ（＋／−）細胞およびＮＩＨ−３Ｔ３  ｐ３００（＋／−）細胞を（２６）に記載された通りにトランスフェクトした。簡単に述べると、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて、細胞にＴＯＰＦＬＡＳＨまたはＦＯＰＦＬＡＳＨをトランスフェクトした。トランスフェクション効率はｐＲＬ−ｎｕｌｌルシフェラーゼプラスミドを用いて規準化した。ＤＵＡＬ−ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。
【０１００】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ：全ＲＮＡを分離し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写した。遺伝子特異的なプライマーを用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ；Ｂｉｏｒａｄ）を行った。：
Ｎａｎｏｇ−Ｆ  ａｇｇｇｔｃｔｇｃｔａｃｔｇａｇａｔｇｃｔｃｔｇ（配列番号５）
Ｎａｎｏｇ−Ｒ  ｃａａｃｃａｃｔｇｇｔｔｔｔｔｃｔｇｃｃａｃｃｇ（配列番号６）
ＧＡＰＤＨ−Ｆ  ｇｇｔｇａａｇｇｔｃｇｇｔｇｔｇａａｃｇｇａ（配列番号７）
ＧＡＰＤＨ−Ｒ  ｔｇｔｔａｇｔｇｇｇｇｔｃｔｃｇｃｔｃｃｔｇ（配列番号８）
【０１０１】
一部の実験において、製造者のプロトコルに従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、抽出した全ＲＮＡ  ２μｇを逆転写した。１μｌのｃＤＮＡを直線範囲において増幅された反応物を得るために、最適化したＰＣＲサイクルを用いて、配列番号５−１８の遺伝子特異的なプライマーの１つ又は複数を用いたＰＣＲによって増幅させた。
【０１０２】
Ｏｃｔ−３／４−Ｆ  ｇｇｃｇｔｔｃｔｃｔｔｔｇｇａａａｇｇｔｇｔｔｃ（配列番号９）
Ｏｃｔ−３／４−Ｒ  ｃｔｃｇａａｃｃａｃａｔｃｃｔｔｃｔｃｔ（配列番号１０）
Ｒｅｘ−ｌ−Ｆ  ｇｔｃｔｔａｔｃｇａｔｇｃｔｇｇａｇｔｇ（配列番号１１）
Ｒｅｘ−  １  −Ｒ  ａａａｇｃｔｃｔｔｃｔｃｇｃａｇｃｃａｔ（配列番号１２）
Ｓｏｘ−２−Ｆ  ｇｃａｔｇｔｃｃｔａｃｔｃｇｃａｇｃａｇ（配列番号１３）
Ｓｏｘ−２−Ｒ  ｇｃｔｇａｔｃａｔｇｔｃｃｃｇｇａｇｇｔ（配列番号１４）
Ｃ−Ｍｙｃ−Ｆ  ａｃｃａａｃａｇｃａａｃｔａｔｇａｃｃｔｃ（配列番号１５）
Ｃ−Ｍｙｃ−Ｒ  ａａｇｇａｃｇｔａｇｃｇａｃｃｇｃａａｃ（配列番号１６）
ＭＤＲ−１−Ｆ  ｔｇｃｔｔａｔｇｇａｔｃｃｃａｇａｇｔｇａ（配列番号１７）
ＭＤＲ−１−Ｒ  ｔｔｇｇｔｇａｇｇａｔｃｔｃｔｃｃｇｃｇｔ（配列番号１８）
【０１０３】
トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ：ＥＳＣｓを０．１％水性ゼラチン溶液でコーティングされた９６ウェル細胞培養皿で培養し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、０．２μｇ／ウェルのｐＳＴＡＴ３−ＴＡ−Ｌｕｃ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）をトランスフェクトした。６時間後、細胞を洗浄し、指示された投与量のＩＱ−１またはＬＩＦに２４時間さらした。トランスフェクション効率をｐＲＬ−ｎｕｌｌルシフェラーゼプラスミドを用いて基準化した。ＤＵＡＬ−ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。
【０１０４】
一部の実験において、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（ｗｔ）、ＮＩＨ−３Ｔ３  ＣＢＰ（＋／−）細胞およびＮＩＨ−３Ｔ３  ｐ３００（＋／−）細胞を（２６）に記載された通りにトランスフェクトした。簡単に述べると、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて、細胞にＴＯＰＦＬＡＳＨまたはＦＯＰＦＬＡＳＨをトランスフェクトした。トランスフェクション効率はｐＲＬ−ｎｕｌｌルシフェラーゼプラスミドを用いて基準化した。ＤＵＡＬ−ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。
【０１０５】
Ｐ１９細胞におけるＣＢＰ、ｐ３００、およびホスホ−セリン８９−ｐ３００の検出：Ｐ１９細胞をＷｎｔ３ａまたはビヒクル対照群にさらし、その後、ｌ０μＭの最終濃度となるようにＩＱ−１を添加した。対照群のＤＭＳＯは０．０２５％であった。細胞を２４時間インキュベートした。このインキュベート期間が終わってから細胞を洗浄、溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥした。ウサギポリクローナル抗体（Ａ−２２）（ｌ：５０００）；および（Ｃ−２０）（ｌ：５０００）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いて、ＣＢＰおよびｐ３００をそれぞれ検出した。１：１００の割合で薄めたカスタムの抗血清を用いてホスホ−セリン８９−ｐ３００を検出した。
【０１０６】
Ｐ１９細胞におけるＣＢＰまたはｐ３００とβ−カテニンの共免疫沈降：（２７）に記載された通りに共免疫沈降を行った。簡単に述べると、Ｐ１９細胞を１０μＭのＩＣＧ−００１または１０μＭのＩＱ−１（対照群のＤＭＳＯは０．０２５％であった）で２４時間処理し、その後、それらを洗浄して溶解した。核の画分を分離し、ＣＢＰ（Ａ−２２）またはｐ３００（Ｎ−１５）に対する抗体で予め清浄した（ｐｒｅｃｌｅａｒ）。１：５０００の割合で薄めたマウス単一クローン抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてβ−カテニンを検出した。
【０１０７】
インビトロでリン酸化されたｐ３００のβ−カテニンに対する親和性：キナーゼバッファー（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオトレイトール、１００μＭ  ＡＴＰ）中でＰＫＣαとともにＨＡ−ｔａｇと融合させた組み換え型ｐ３００（１−１１０  ａａ）をインキュベートした。ＨＡ−ｔａｇ抗体を用いてインビトロでリン酸化したｐ３００と混合したＰｌ９溶解物において共免疫沈降を行った。ウサギポリクローナル抗体（Ｃ２０）、１：５０００を用いてｐ３００を検出した。１：５０００の割合で薄めたマウス単一クローン抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてβ−カテニンを検出した。
【０１０８】
ターゲットタンパク質の親和性精製：Ｐ１９細胞を９０−１００％のコンフルエンシーになるように培養した。タンパク質−結合バッファー［ＰＢＢ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．９／１００ｍＭ  ＮａＣｌ／０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０／６ｍＭ  ＭｇＣ１２／５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール／Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のタブレット１個］に細胞を溶解した。室温で一晩、５０％ＤＭＳＯおよび５０％ＰＢＢを含有するバッファー中で、ビオチン化ＩＱ−１をストレプトアビジン−アガロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の５０％スラリーに結合させた。ビーズを洗浄して結合していないＩＱ−１を除去し、次いで全細胞溶解物と共にインキュベートした。ＳＤＳ中で煮沸することによって溶出したタンパク質をクマシーで染色してターゲットタンパク質を検出するか、又はか免疫ブロッティングした。
【０１０９】
ゼブラフィッシュ実験：細胞周期の１ステージにおける野生型（ＡＢ）ゼブラフィッシュ系統を胚培地において２４時間最終濃度１μＭのＩＱ−１で処理した。対照群のゼブラフィッシュ胚を同一濃度のＤＭＳＯにおいてインキュベートした。この２４時間の処理が終わった後、手作業で胚の絨毛膜を除去してイメージ化した。ゼブラフィッシュ胚を２８℃で維持した。２つの独立した実験から、各グループの少なくとも１０個の胚から得た代表的な結果を示す。
【０１１０】
免疫細胞化学および抗体：細胞をＰＢＳ中の４％のパラホルムアルデヒドで２０分間固定した。標準プロトコルを用いて免疫染色を行った。次の希釈剤において１次抗体を用いた：ａｎｔｉ  α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ｌ０ｕｇ／ｍｌ）、ａｎｔｉ−Ａｃｔｉｎ、Ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  Ａｂ−Ｉ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（ＬＡＢ  ＶＩＳＩＯＮ、１：１）、ａｎｔｉ−ＧＡＴＡ４  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ、１：１００）、ａｎｔｉ−ＭＡＰ（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）２  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、１：２００）、βＩＩＩ−ｔｕｂｕｌｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、１：２００）、ａｎｔｉ−Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、１：１，０００）。２次抗体はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８または５９４  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：２００）であった。細胞をｘ４０〜２００の倍率でＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ  ７０顕微鏡を用いてイメージ化した。
【０１１１】
実施例１
ＰＲ７２／１３０およびＥＳ細胞増殖
低分子ＩＱ−１（Ａｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ  Ｐｈａｒｍａ、図１）は、β−カテニンがｐ３００の使用を犠牲にしてコアクチベータとしてＣＢＰを使用することを選択的に増加させ、それによって未分化状態に胚（ＥＳ）細胞を維持した。Ｗｎｔ３ａとＩＱ−１の組み合わせによって、Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＲｅｘｌの発現によって判断される増殖及び多能性の維持が可能となったが、ＩＱ−１単独では、ＥＳ細胞の増殖および多能性の維持をもたらすのに充分ではなかった。
【０１１２】
本実施例は、ＩＱ−１の分子ターゲットの同定に関するものである。ＩＱ−１の分子ターゲットを同定するために、Ｐ１９胚性癌腫細胞由来の全細胞溶解物をビオチン化ＩＱ−１で処理した。対照群のビオチン化化合物（図３Ａ、レーン２）と比較して、ビオチン化ＩＱ−１は３つのタンパク質に選択的に結合した（図３Ａ、レーン３）。セリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼＰＰ２Ａの異なってスプライスされた調節サブユニットＰＲ７２／１３０として７２および１３０  ｋＤａの２つのバンドがマススペクトルによる配列決定（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって確認された。その後、このことを、免疫ブロッティングによって確認した（図３Ｂ）。
【０１１３】
ＰＲ７２／１３０がＷｎｔシグナル経路の成分であるネイキッドキューティクル（Ｎａｋｅｄ ｃｕｔｉｃｌｅ、Ｎｋｄ）タンパク質と相互作用し、それによってＷｎｔシグナル伝達を調節することが既に示されていることから（Ｃｒｅｙｇｈｔｏｎ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，ＧｅｎｅｓおよびＤｅｖ  １９：３７６−３８６  ２００５）、ＩＱ−１がこれらのタンパク質に選択的に結合するという事実は、Ｗｎｔシグナル伝達の調節で見られる効果とよく相関している。ゼノプスの胚においてモルフォリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｓ）を用いて、ＰＲ７２が、ネイキッドキューティクル（Ｎｋｄ）のように、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の負の調節因子であり、また、非カノニカルな（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）収斂伸長への切り替えに関与する（Ｃｒｅｙｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）ことも証明された。
【０１１４】
実施例２
ＩＱ−１のＥＳＣｓの未分化状態の維持
未分化のＥＳＣｓのマーカーであるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）の生産を増進させる化合物を同定するために、マウスＥＳＣｓ（Ｄ３  ＥＳ）を化学的ライブラリー（Ａｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ）を用いてスクリーニングした（１２）。このスクリーニングから、ＩＱ−１（ＭＷ＝３６２．４２、図１Ａ）を同定し、該ＩＱ−１は、外因性の白血病抑制因子（ＬＩＦ）を追加することなく、１５％ＦＣＳを含有する培地において投与量依存的にＡＰ活性を増加させた（図１Ｂ）。ＩＱ−１を用いた処理は未分化ＥＳＣマーカーである、段階特異的胚性抗原１（Ｓｔａｇｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ 1、ＳＳＥＡ−１）の発現を投与量依存的に増大させた（図１Ｃ）。
【０１１５】
ＩＱ−１は培養において、ＭＥＦｓおよび外因性ＬＩＦを添加することなくＥＳＣｓの長期間増殖を可能にした。マウスＤ３  ＥＳＣｓを、１５％ＦＣＳおよび４μｇ／ｍｌ  ＩＱ−１を含有する培地で６５日間培養した。ＥＳＣｓは１０日ごとに対数で約２増加するという安定した速度で増殖し続けた（図１Ｄ）。
【０１１６】
実施例３
ＬＩＦと関係ないＩＱ−１のマウスＥＳＣ自己再生の維持
Ｓｔａｔ３シグナル伝達経路を活性化させることにより、サイトカインＬＩＦはマウスＥＳＣの対称的な自己再生を維持し、分化を遮断する（１３、１４、１５）。ＬＩＦはヒトＥＳＣの自己再生を維持しなかった（１６、１７）。ＮａｎｏｇはＥＳＣｓに対する多岐にわたるホメオタンパク質の多能性を維持する因子である（１８、１９）。ＮａｎｏｇはＥＳＣの自己再生を誘導するためのＳｔａｔ３のＬＩＦ−誘発刺激と並行して作用することが示されている。さらに、Ｎａｎｏｇの発現の向上は、Ｓｔａｔ３活性の非存在下において、ＥＳＣｓのクローン性増殖および主要幹細胞転写因子Ｏｃｔ４の発現の維持のために充分なものである（１９）。
【０１１７】
ＩＱ−１の作用メカニズムをさらに調べるために、Ｎａｎｏｇ発現に対するＩＱ−１の効果を測定した。フィーダー細胞なしで、ＬＩＦのみで処理したＥＳＣｓはＮａｎｏｇレベルをわずかに増加させた反面、ＩＱ−１は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって判断した培養におおけるＮａｎｏｇ発現を著しく増加させ、維持した（図２Ａ）。培養物からＩＱ−１を除去すると、Ｎａｎｏｇレベルの急激な低下がもたらされた（図２Ｂ）。Ｎａｎｏｇ発現の損失は既にＥＳＣの分化にと相関していることが示されている（１８、１９）。ＩＱ−１の作用がＳｔａｔ３シグナル伝達によって媒介されないということを確認するために、Ｓｔａｔ３／ルシフェラーゼレポーター遺伝子コンストラクトを用いた。ＩＱ−１がＮａｎｏｇ発現を著しく向上させる反面、ＬＩＦとは異なり、Ｓｔａｔ３／ルシフェラーゼの発現に影響を及ぼさず、予想したとおり、有意な反応を導き出した（図２Ｃ）。この実施例から、マウスＥＳＣの多能性の維持に対するＩＱ−１の影響はＬＩＦ／Ｓｔａｔ３経路と無関係であると結論付けることができる。
【０１１８】
実施例４
ＰＲ７２／１３０との相互作用を通じてのＩＱ−１のＷｎｔシグナル伝達の調節
本実施例は、ゼブラフィッシュ（ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）の発生中、収斂伸長を観察することによって“非カノニカル”Ｗｎｔシグナル伝達に対するＩＱ−１の効果を評価するために行った。１μＭ  ＩＱ−１で処理したゼブラフィッシュ胚は著しい発生上の欠陥を示した（図３Ｃ）。特に、収斂伸長の抑制と一致し、ＰＲ７２のモルフォリノの効果と類似する短い尾が観察された（２５）。本実施例と実施例１から、ＩＱ−１の分子ターゲットはＰＲ７２／１３０であると結論付けることができる。ＰＲ７２／１３０とＩＱ−１の相互作用はＰＲ７２／１３０／Ｎｋｄ複合体の分裂をもたらし、カノニカルＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達および同時に起こる“非カノニカル”収斂伸長への切り替えの“負”の調節を抑制する。
【０１１９】
実施例５
ＩＱ−１によるＥＳＣｓの維持のＷｎｔ／Ｂ−カテニン／ＣＢＰ依存性。
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、神経分化を抑制し、幹細胞において多能性を維持すること（１−３）が証明されており、前駆細胞の増殖のために重要である（４）。しかし、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナルは、また、ＥＳＣｓおよび神経幹細胞の神経分化のためにも必要である（５−６）。最近特徴付けられたβ−カテニン／ＣＢＰ相互作用の特異的な拮抗剤であるＩＣＧ−００１を用いて、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナルの多岐にわたる活性を説明するためのモデルを開発した（７、８、２６、２７）。このモデルの核心となる特徴は、β−カテニン／ＣＢＰによって媒介される転写が“幹／前駆”細胞増殖のために重要である反面、β−カテニン／ｐ３００によって媒介される転写への切り替えは、増殖能力がより制限されることによって分化プログラムを開始するために重要であるということである。
【０１２０】
野生型ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（ｗｔ）、ＮＩＨ−３Ｔ３  ＣＢＰ（＋／−）細胞、およびＮＩＨ−３Ｔ３  ｐ３００（＋／−）細胞において、Ｗｎｔ／β−カテニンレポーターコンストラクトＴＯＰＦＬＡＳＨおよびＦＯＰＦＬＡＳＨを用いて、ＩＱ−１が、ＰＰ２ＡのＰＲ７２／１３０サブユニットをターゲッティングすることにより、β−カテニンがｐ３００の使用を犠牲にして、コアクチベータとしてＣＢＰを用いることを選択的に増加させ、それにより、未分化状態にＥＳＣｓを維持するかどうかを決定した（図４Ａ）。β−カテニンを構成的に転位置させた点突然変異体（ｐｔ−ｍｕｔ  β−ｃａｔ）を用いて、レポーター活性を刺激した（２８）。ＩＱ−１は、ｗｔまたはＣＢＰ（＋／−）細胞においてはＴＯＰＦＬＡＳＨおよびＦＯＰＦＬＡＳＨの活性に影響を及ぼさなかったが、ｐ３００（＋／−）細胞においてはＴＯＰＦＬＡＳＨ活性の２−３倍の増加が観察された（図６）。これは、ＩＱ−１の効果がコアクチベータに特異的であり、ｐ３００の発現レベルに依存することを示唆する。
【０１２１】
β−カテニンコアクチベータの使用に対するＩＱ−１の効果を直接評価するために、ＣＢＰまたはｐ３００に対する抗体を用いる共免疫沈降を行い、ＩＱ−１の存在下または非存在下において、Ｗｎｔ３ａで処理したＰ１９胚性癌腫細胞を用いるコアクチベータ結合β−カテニンに対する免疫ブロッティングを行った。ＩＱ−１は、Ｗｎｔ３ａ、およびＤＭＳＯ又はＣＢＰ／β−カテニン拮抗剤ＩＣＧ−００１のいずれかで処理した細胞に比べ、ＣＢＰと結合されたβ−カテニンの相対的な量の劇的な増加をもたらした。細胞分化を誘導する（７）ＩＣＧ−００１は、ＣＢＰ／β−カテニン相互作用を犠牲にして、ｐ３００／β−カテニン相互作用を著しく増大させた（図４Ｂ）。
【０１２２】
実施例６
ＩＱ−１によるｐ３００  Ｓｅｒ８９のリン酸化およびそれによるβ−カテニン／ｐ３００相互作用の間接的な減少
“非カノニカル”Ｗｎｔ経路を通じたシグナル伝達がＰＫＣ活性（２９）を増加させることができ、 ｐ３００のＳｅｒ８９をＰＫＣ依存的にリン酸化することができること（３０）がよく知られている。本実施例は、ｐ３００のＳｅｒ８９のＰＫＣαによるリン酸化がβ−カテニンに対するｐ３００の結合に及ぼす効果を評価するために行った。組み換え型ｐ３００（１−１１０ａａ）を精製されたＰＫＣαでリン酸化した。次に、インビトロでリン酸化されたｐ３００をＰ１９細胞からの細胞溶解物に添加し、β−カテニン／ｐ３００複合体を共免疫沈降させた。ＰＫＣαによって予めリン酸化すると、ｐ３００／β−カテニン相互作用が増大した（図４Ｃ、レーン２をレーン１と比較）。増大した相互作用がＰＫＣαによるｐ３００のＳｅｒ８９のリン酸化に依存するものであるかどうかを決定するために、組み換え型ｐ３００断片において、セリン残基をアラニンに突然変異させた。Ｓｅｒ８９のＡｌａ８９への突然変異誘発によって、β−カテニンに対する結合のＰＫＣαに依存した増加を阻害した（図４Ｃ、レーン１および２とのレーン３および４の差異比較）。これは、ｐ３００のＳｅｒ８９のリン酸化によってβ−カテニン／ｐ３００相互作用の親和性が増大することを示す。
【０１２３】
細胞においてβ−カテニン／ｐ３００相互作用を増加させるためのこのようなリン酸化依存メカニズムの生理学的な関連性を決定するために、Ｐ１９細胞を精製したＷｎｔ３ａにさらし、ＩＱ−１またはＤＭＳＯ対照群のいずれかで処理した。免疫ブロッティングによって判定したように、Ｗｎｔ３ａで刺激されたＰｌ９細胞をＩＱ−１で処理すると、ｐ３００のＳｅｒ８９のリン酸化レベルの劇的な減少を示し（図４Ｄの一番上、レーン２および３の比較）、その反面、ｐ３００の総量はＩＱ−１によって影響を受けなかった（図４Ｄの中間、レーン２および３の比較）。これらのような結果に基づき、ＩＱ−１は、ｐ３００のＳｅｒ８９のリン酸化を負に調節することによってβ−カテニン／ｐ３００相互作用の親和性を減少させ、β−カテニン／ＣＢＰの使用を増加させると結論付けることができる。
【０１２４】
実施例７
ＩＱ−１およびＷｎｔ３ａを含有する無血清培地におけるＥＳＣｓの長期間維持
Ｗｎｔ３ａおよびＩＱ−１で処理したＰ１９細胞のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２（３１）およびＭＤＲ−１（３２）を含めた“幹／前駆”マーカーの発現の増加を示し、Ｗｎｔ３ａと共にＤＭＳＯで処理した細胞（表１）に比べてｃ−ｍｙｃ（３３）発現の減少を示した。４μｇ／ｍｌのＩＱ−１と併せての１５％ＫＳＲ（血清代替培地）への精製したＷｎｔ３ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）の添加は、アルカリホスファターゼのレベルの増加および長期間（４８ｄａｙｓ）のＥＳＣの多能性維持のために充分であり、ＩＱ−１および１５％ＦＣＳで得られた結果と類似するものであった（図７）。Ｗｎｔ３ａ単独またはＩＱ−１単独は、いずれもＫＳＲ培地においてＥＳＣｓの未分化状態を維持するのに充分ではなかった（図８）。Ｗｎｔ３ａ単独は増殖を誘導したものの、幹細胞マーカーＯｃｔ４、ＮａｎｏｇまたはＲｅｘ１の発現を維持するのに充分ではなかった。しかし、Ｗｎｔ３ａおよびＩＱ−１の組み合わせは、Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＲｅｘ１の発現によって判断される増殖および多能性の維持を可能にした（図９Ａ、Ｂ、およびＣ）。ＩＱ−１およびＷｎｔ３ａによるＥＳＣｓの処理は、４８日後に胚様体を形成する能力（図５Ａ、左側パネル）と、３個すべての胚葉由来組織に分化（図５Ｂ）させる能力によって判断されるＥＳＣｓの多能性を維持した。ＩＱ−１の除去によって、急速な（３日以内）多能性喪失および胚様体を形成する能力喪失がもたらされた（図５Ａ、右側パネル）。このような実施例に基づき、ＩＱ−１は、Ｗｎｔ／β−カテニン／ＣＢＰ依存シグナル伝達を増加させ、Ｗｎｔ／β−カテニン／ｐ３００によって媒介される転写への切り替えを阻害することにより、長期間マウスＥＳＣの多能性を維持するのに充分であったと結論付けることができる。
【０１２５】
【表１】
2009517085.tif 000030
上記表１に、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した、幹細胞維持に関連する遺伝子に対するＩＱ−１処理の効果を示す。前記値は対照群遺伝子のβ−アクチンからのΔΔＣＴで示す。
【０１２６】
これらの実施例は、精製したＷｎｔ３ａと共同してＩＱ−１が、血清の非存在下で長期の培養期間中（少なくとも４８日）、マウスＥＳＣの増殖および多能性を維持するのに充分であることを示す。ＩＱ−１とＷｎｔ３ａの処理は、ＥＳＣの維持に重要な転写因子Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２の発現を上方制御した。最近、Ｂｏｙｅｒらは、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２がヒトＥＳＣｓの維持に必要な遺伝子の実質的な部分のプロモーター／エンハンサーを共に占有することを証明した（３１）。前記実施例で証明したように、ＩＱ−１はｃ−ｍｙｃの発現を下方制御する。ｃ−ｍｙｃは幹細胞の自己再生および分化の間のバランスに重要な役割を果たすと見られ、分化時に増加する（３３）。
【０１２７】
親和性クロマトグラフィーによるアプローチを用いて、ＩＱ−１の分子ターゲットがセリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼＰＰ２Ａの異なってスプライスされた調節サブユニットＰＲ７２／１３０であることが決定された。これは、ＰＲ７２が“カノニカル”Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達のＷｎｔ誘導性拮抗剤（２４）であるタンパク質Ｎｋｄ（２５）と相互作用するという点で非常に興味深いものである。ＰＲ７２モルフォリノを用いて観察された結果（２５）と同様に、ＩＱ−１はゼブラフィッシュ胚の発生中、“非カノニカル”収斂伸長に対して劇的な効果を示した。“カノニカル”から“非カノニカル”Ｗｎｔシグナルへの切り替えにおいて、２つのスプライスバリアントＰＲ７２およびＰＲ１３０の役割に対する議論は非常に複雑なものになると見られる。最近、Ｂｅｒｎａｒｄｓらは、ＰＲ７２とは異なり、ＰＲ１３０が様々なアッセイにおいてＮｋｄの効果のうちのいくつかを拮抗することができることを証明した。しかし、ＰＲ１３０モルフォリノはゼノプス胚における体節（発生および尾形成に影響を及ぼす（３４）。よって、ゼブラフィッシュ胚の発生に対するＩＱ−１の効果は、スプライスバリアントのすべてを潜在的に抑制することと一致する。特定のメカニズムにとらわれずに、前記結果はＰＲ７２／１３０とＩＱ−１の相互作用がＰＲ７２／１３０とＮｋｄの複合体の分裂をもたらし、それによってＷｎｔシグナル伝達を調節するモデルと一致する。前記ゼブラフィッシュ発生に対する形態学上の効果は、ＩＱ−１がカノニカルＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達および“非カノニカル”収斂伸長への同時切り替えの“負の”調節を抑制するモデルと一致する（図５Ｃ）。
【０１２８】
ＰＫＣによる組み換え型ｐ３００のインビトロでのリン酸化において、“非カノニカル”Ｗｎｔシグナル伝達によって活性化した酵素はｐ３００に対するβ−カテニンの親和性を増加させた。さらに、細胞において、ＩＱ−１はｐ３００の全体の細胞レベルに影響を及ぼすことなく、ｐ３００のＳｅｒ８９においてＷｎｔによって刺激されたリン酸化を著しく減少させた。ＩＱ−１がｐ３００のＳｅｒ８９におけるリン酸化状態を減少させることができるメカニズムは不明であって、現行の研究課題である。
【０１２９】
ＩＱ−１は、対応するβ−カテニン／ｐ３００相互作用を犠牲にして、β−カテニン／ＣＢＰ相互作用を選択的に増進させた。ＩＱ−１は、Ｗｎｔ／β−カテニン／ＣＢＰによって媒介される転写を増大させ、Ｗｎｔ／β−カテニン／ｐ３００によって媒介される転写への切り替えを防止することにより、ＭＥＦｓまたは血清なしで多能性を維持すると同時にマウスＥＳＣｓの長期間の増殖を可能にする。
【０１３０】
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達において、区別されたコアクチベータの使用は、“幹／前駆”状態の維持、増殖能力がより制限されることによる分化の開始および“カノニカル”から“非カノニカル”なＷｎｔシグナル伝達への切り替えにおいて重要な調節因子であると見られる。Ｗｎｔによって媒介される多能性に対するＩＱ−１の効果は、Ｎｋｄ／ＰＲ７２／ＰＰ２Ａ複合体によるカノニカルＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の“負の”調節の抑制に関連し、それにより、β−カテニン／ｐ３００によって誘導される転写を犠牲にしてβ−カテニン／ＣＢＰによって誘導される転写を増加させる。
【０１３１】
所定の成長条件下において、“幹／前駆”集団を増殖する能力は再生医学の分野で重要な結果であり、実施例はそのような用途を裏付けるものである。
【０１３２】
2009517085.tif 000031
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【０１３３】
特定の実施態様および実施例を含む前述の詳細な説明は本発明を説明するためのものであって、本発明を限定するものではない。数多くの他の変形および変更は本発明の真の精神を逸脱することなく達成することができ、本明細書で言及または引用した刊行物はすべての図面および表を含めたそれらの内容全体を、それらが本明細書の明白な教示と不一致ではない範囲で参照によって組み込むものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１Ａ】図１Ａは、ＩＱ−１がＥＳＣｓの未分化状態を維持することを示し、ＩＱ−１の構造を示す。すべてのエラーバーは平均±ＳＤを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＩＱ−１がＥＳＣｓの未分化状態を維持することを示す。ＩＱ−１は投与量依存的にアルカリホスファターゼ活性を維持する。すべてのエラーバーは平均±ＳＤを示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＩＱ−１がＥＳＣｓの未分化状態を維持することを示す。ＩＱ−１は投与量依存的にＳＳＥＡ−１発現を維持する。ＳＳＥＡ−１発現はＩＱ−１を添加してから７日目に分析した。すべてのエラーバーは平均±ＳＤを示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ＩＱ−１がＥＳＣｓの未分化状態を維持することを示す。ＩＱ−１はＥＳＣｓがＭＥＦフィーダー細胞またはＬＩＦがなくても少なくとも６５日間未分化状態で増殖することを可能にした。４μｇ／ｍｌ  ＩＱ−１で補充された培地において、ＥＳＣｓを６ｃｍの皿当たり１Ｘ１０５〜１Ｘ１０６細胞の比率で毎週２〜３回継代し、カウントした。すべてのエラーバーは平均±ＳＤを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ＩＱ−１がＬＩＦに関係なくＥＳＣｓの自己再生を維持することを示す。ＩＱ−１はＬＩＦに比べてＮａｎｏｇ遺伝子発現を著しく増加させる。フィーダー細胞がないシステム下において、ＩＱ−１（４μｇ／ｍｌ）またはＬＩＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）の存在下で２１時間培養したＥＳＣｓからｍＲＮＡを分離した。Ｎａｎｏｇに対するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。０日のＮａｎｏｇの対照群の発現レベルを１とした。すべてのエラーバーは平均±ＳＤを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＩＱ−１がＬＩＦに関係なくＥＳＣｓの自己再生を維持することを示す。ＩＱ−１の除去によってＥＳＣｓにおけるＮａｎｏｇ遺伝子の発現が減少した。フィーダー細胞がないシステム下において、ＩＱ−１（４μｇ／ｍｌ）の存在下で３日間培養されたＥＳＣｓからＩＱ−１を除去した。この期間の終了時に、Ｎａｎｏｇ遺伝子発現を分析するためにｍＲＮＡを分離し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。すべてのエラーバーは平均±ＳＤを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＩＱ−１がＬＩＦに関係なくＥＳＣｓの自己再生を維持することを示す。ＩＱ−Ｉの効果はルシフェラーゼレポーターアッセイによって判断したものであり、Ｓｔａｔ３シグナル経路を通じて媒介されなかった。ｐＳＴＡＴ３−ＴＡ−Ｌｕｃレポーターでトランスフェクトした、フィーダー細胞のないＥＳＣｓを所定投与量のＩＱ−ＩまたはＬＩＦにさらした。すべてのエラーバーは平均±ＳＤを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＩＱ−１がＰＲ７２／１３０との相互作用によってＷｎｔシグナルを調節することを示す。ＩＱ−ｌの分子ターゲットの親和性クロマトグラフィー分離は実験手順に記載された通りに行った。７２  ｋＤａおよび１３０  ｋＤａ（標識された）において２つのバンドは、マススペクトルによる配列決定によってセリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼＰＰ２Ａの異なってスプライスされた調節サブユニットＰＲ７２／１３０として同定した。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＩＱ−１がＰＲ７２／１３０との相互作用によってＷｎｔシグナルを調節することを示す。前記２つのバンドを同定するために、ＰＲ７２／１３０抗血清を用いて免疫ブロッティングを行った。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＩＱ−１がＰＲ７２／１３０との相互作用によってＷｎｔシグナルを調節することを示す。図３Ｃ：ＩＱ−１はゼブラフィッシュにおいて発生上の欠陥を起こす。１−細胞ステージのゼブラフィッシュ胚はｌμＭ  ＩＱ−１（下側）またはＤＭＳＯ対照群（上側）で２４時間処理された。その結果は３つの独立した実験から少なくとも１０個の胚の代表的なものである。
【図４Ａ】図４Ａは、ＩＱ−１のＥＳＣｓの維持がＷｎｔ／β−カテニン／ＣＢＰに依存することを示し、Ｗｎｔ／β−カテニンコアクチベータの切り替えのモデルを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＩＱ−１のＥＳＣｓの維持がＷｎｔ／β−カテニン／ＣＢＰに依存することを示す。ＩＱ−１はｐ３００／β−カテニン複合体を犠牲にしてＣＢＰ／β−カテニン複合体を増加させた。Ｐ１９細胞をＩＱ−１、ＣＢＰ／β−カテニンＩＣＧ−００１またはＤＭＳＯ対照群で補充されたＷｎｔ３ａで処理した。核溶解物は抗−ＣＢＰまたは抗−ｐ３００抗体によって共免疫沈降し、β−カテニンに対して免疫ブロッティングを行った。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＩＱ−１のＥＳＣｓの維持がＷｎｔ／β−カテニン／ＣＢＰに依存することを示す。ＰＫＣ依存的にｐ３００  Ｓｅｒ８９のリン酸化はｐ３００／β−カテニン相互作用を増加させた。ＰＫＣαを用いたインビトロでのリン酸化後、野生型ｐ３００（１−１１０  ａａ）および変異ｐ３００（ｐ３００  Ｓ８９Ａ）をＰ１９溶解物と混合し、ＨＡ−ｔａｇを用いて共免疫沈降した。ｐ３００（上側）またはβ−カテニンローディング対照群（下側）についてのウエスタンブロット分析を行った。レーン１：ｐ３００／β−カテニン結合、レーン２：ＰＫＣαリン酸化ｐ３００／β−カテニン結合、レーン３：Ｓ８９Ａ  ｐ３００／β−カテニン結合、レーン４：ＰＫＣαリン酸化Ｓ８９Ａ  ｐ３００／β−カテニン結合。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＩＱ−１のＥＳＣｓの維持がＷｎｔ／β−カテニン／ＣＢＰに依存することを示す。ＩＱ−１はｐ３００のリン酸化を減少させた。Ｐ１９細胞をＩＱ−１またはＤＭＳＯ（対照群）で処理し、精製したＷｎｔ３ａにさらした。ｐ３００またはＳｅｒ８９の位置にてリン酸化されたｐ３００に特異的な抗体を用いて細胞溶解物を免疫ブロッティングした。レーン１：負の対照群、レーン２：Ｗｎｔ３ａプラスＤＭＳＯ対照群、一番上のパネル：ホスホＳｅｒ８９  ｐ３００免疫ブロット、中央のパネル：ｐ３００免疫ブロット、レーン３：Ｗｎｔ３ａプラスＩＱ−１、一番上のパネル：ホスホＳｅｒ８９  ｐ３００免疫ブロット、中央のパネル：ｐ３００免疫ブロット。
【図５Ａ】図５Ａは、長期間培養したＥＳＣｓの多能性を示す。長期間培養したＥＳＣｓは、３日間の懸濁培養において胚様体を形成するように誘導された。Ｗｎｔ３ＡおよびＩＱ−１（４μｇ／ｍｌ）が存在する培地で４８日間培養したＥＳＣｓは胚様体を形成することができた（左側）。ＥＳＣｓはＩＱ−１非存在下で３日間培養した後、胚様体を形成する能力を失う（右側）。
【図５Ｂ】図５Ｂは、長期間培養したＥＳＣｓの多能性を示す。ＩＱ−１処理したＥＳＣｓ由来の胚様体を７〜１４日間培養して（付着培養）、更なる分化を誘導した。α−フェトプロテイン、平滑筋アクチン、ＧＡＴＡ４、ＭＡＰ２、β−ＩＩＩチューブリンおよび乏突起膠細胞に対する免疫蛍光染色は、ＩＱ−１の存在下において長期間培養したＥＳＣｓが多能性を維持することを証明した。
【図５Ｃ】図５Ｃは、長期間培養したＥＳＣｓの多能性を示し、ＩＱ−１作用の提案されたメカニズムを示すモデルを示す。
【図６】図６は、ＴＣＦ／β−カテニンレポーター遺伝子分析を示す。ＴＣＦ／β−カテニンレポーターコンストラクトＴｏｐＦｌａｓｈを、ＩＱ−１の存在下または非存在下において構成的に活性を有するβ−カテニンとともに、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞−ｗｔ、ＣＢＰ（＋／−）およびｐ３００（＋／−）にコトランスフェクトした。Ｆｏｐｆｌａｓｈレポーターに対するＩＱ−１の効果はなかった。
【図７】図７は、ＩＱ−１および精製したＷｎｔ３ａで補充された無血清培地を用いるフィーダー細胞のないシステムにおけるＥＳＣｓの長期間培養を示す。ＥＳＣｓは１５％ＫＳＲ、４μｇ／ｍｌ  ＩＱ−１および１００ｎｇ／ｍｌ  Ｗｎｔ３ａで培養された。ＥＳＣｓを６ｃｍの皿当たり１Ｘ１０５〜１Ｘ１０６細胞の比率で毎週２〜３回継代させ、細胞をカウントした。
【図８】図８は、ＩＱ−１によるＥＳＣ増殖および多能性の維持が１５％ＫＳＲ培地においてＷｎｔシグナルに依存することを示す。１５％ＦＣＳまたは１５％ＫＳＲで補充された、ＩＱ−１を含有する培地において７日間培養したＥＳＣｓのＡＰ活性。Ｗｎｔ３ａの添加は、１５％ＦＣＳを含有する培地と同じレベルに１５％ＫＳＲを含有する培地において７日間培養したＥＳＣｓのＡＰ活性を増加させた（エラーバーは±Ｓ．Ｄ．を示す）。
【図９Ａ】図９Ａは、ＭＥＦフィーダー細胞なしで４２日間ＩＱ−１およびＷｎｔ３ａで補充された１５％ＫＳＲで培養したＥＳＣｓに対して行われたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ示す。４２日の培養期間にわたって、ＩＱ−１およびＷｎｔ３ａが存在する培地で培養したＥＳＣｓは多能性マーカー、Ｎａｎｏｇの発現を維持する。０日における発現レベルを１とした。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＭＥＦフィーダー細胞なしで４２日間ＩＱ−１およびＷｎｔ３ａで補充された１５％ＫＳＲで培養したＥＳＣｓに対して行われたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ示す。４２日の培養期間にわたって、ＩＱ−１およびＷｎｔ３ａが存在する培地で培養したＥＳＣｓは多能性マーカー、Ｏｃｔ３／４の発現を維持する。０日における発現レベルを１とした。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＭＥＦフィーダー細胞なしで４２日間ＩＱ−１およびＷｎｔ３ａで補充された１５％ＫＳＲで培養したＥＳＣｓに対して行われたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ示す。４２日の培養期間にわたって、ＩＱ−１およびＷｎｔ３ａが存在する培地で培養したＥＳＣｓは多能性マーカー、Ｒｅｘ−１の発現を維持する。０日における発現レベルを１とした。
【図１０】図１０は、核においてＣＢＰまたはｐ３００との選択的な相互作用から生じるβ−カテニン作用の２つの考えられるメカニズムの概略図である。
【図１１】図１１は、成長培地単独と比較して、10μＭ濃度のＩＣＧ−００１が、成長培地において、分化培地と同様に、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞の分化を誘導したことを図示する。
【図１２】図１２は、分化培地と同様に、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞の分化が成長培地において10μＭ  ＩＣＧ−００１によって誘導されたことを図示する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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