(57)【要約】  本発明は、認知機能の改善または栄養ストレス状態の望ましくない兆候の治療および生存の延長のために使用することができる医薬の製造のための、レプチンタンパク質、レプチンタンパク質の変異体断片もしくは模倣体またはＡＭＰＫシグナル伝達経路のアクチベーターの使用に関する。【選択図】  図４Ａ
2009508847.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
栄養ストレス状態の望ましくない兆候の治療のための医薬の製造のための、
（ａ）レプチンタンパク質；レプチンタンパク質の生理学的性質を有する、レプチンタンパク質の断片；レプチンタンパク質の生理学的性質を有する、レプチンタンパク質変異体、またはレプチンタンパク質断片の断片の変異体；
（ｂ）レプチン模倣体であるレプチン受容体アゴニスト；
（ｃ）ＡＭＰＫシグナル伝達経路のアクチベーター；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の２以上の組合せ
から選ばれる物質の使用。
【請求項２】
認知機能を改善するための医薬の製造のための、
（ａ）レプチンタンパク質；レプチンタンパク質の生理学的性質を有する、レプチンタンパク質の断片；レプチンタンパク質の生理学的性質を有する、レプチンタンパク質変異体、またはレプチンタンパク質断片の断片の変異体；
（ｂ）レプチン模倣体であるレプチン受容体アゴニスト；
（ｃ）ＡＭＰＫシグナル伝達経路のアクチベーター；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の２以上の組合せ
から選ばれる物質の使用。
【請求項３】
該物質がレプチンタンパク質である、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
レプチン模倣体が、ＣＢＴ１４５２および｛Ｄ−ＬＥＵ−４｝−ＯＢ３よりなる群から選ばれる、請求項１または２記載の使用。
【請求項５】
ＡＭＰＫ伝達経路のアクチベーターが、ＴＳＣ２、ＬＫＢ１、ＡＩＣＡＲおよびメトホルミンよりなる群から選ばれる、請求項１または２記載の使用。
【請求項６】
ＡＭＰＫ伝達経路のアクチベーターが、該経路の低レベルの活性化を引き起こす量のものである、請求項５記載の使用。
【請求項７】
該医薬が、敗血症、長期にわたる術後ストレス、長期にわたる損傷後ストレス、肝性脳症；重度の栄養不良、吸収不良状態、腹腔疾患、大腸炎、炭水化物不耐性、慢性疾患（癌、感染、ＨＩＶ感染など）、および食欲不振に関連した体重減少から選ばれる疾患の治療のためのものである、請求項１記載の使用。
【請求項８】
該医薬が、加齢、感染症、卒中、肝性脳症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、ならびに痴呆および悪液質に関連した他の神経変性過程から選ばれる疾患の治療のためのものである、請求項２記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、栄養状態、健康状態および認知機能、特に栄養不良により引き起こされた認知障害を改善し生存を延長させる化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
エデンの園ならびに知恵の木および命の木の時代以来、食物、認知および生存の間の関連性が認められている。今日では、栄養状態は、神経機能および寿命の、十分に受け入れられている調節因子である。
【０００３】
軽度のエネルギー制限（対照の６０％まで）は認知機能を改善するが、重度の制限（４０％まで）はそれを害することが、いくつかの研究から示されている。そのような認知機能不全は、空間情報処理を含む海馬依存的な学習および記憶の欠損として現れうる。寿命の延長および神経変性疾患の改善における、軽度のエネルギー制限の利点が、繰返し示されている。パーキンソン病およびアルツハイマー病において見出される神経細胞喪失のいくつかがアポトーシスによって生じることが示された際に、神経損傷のメカニズムの理解が進んだ。神経アポトーシス細胞死は、いくつかの鍵分子が関与する多段階過程であり、そのモジュレーションは該過程を抑制しうる。そのような神経保護物質は、これらの疾患の動物モデルにおいて見出される行動能力の低下を克服することも示されている１，２。
【０００４】
哺乳動物の前脳は、分裂しニューロンおよびグリアに分化する細胞の集団を含有する。これらのニューロンは成体脳の特定領域において幹細胞から絶えず生成される。そのような構成的な神経新生は食事の変化によりモジュレーションされうる。マウスにおける栄養状態の低下は、主として、学習および記憶５のための主要中枢である海馬の歯状回において新たに生成される細胞の数を増加させた３，４。神経新生の抑制は学習および記憶の障害を招いた６。
【０００５】
細胞エネルギー状態は５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）系によりモニターされ制御される。ＡＭＰＫおよびそのホモログ（Saccharomyces cerevisiaeにおけるもの）は、ＡＴＰ加水分解後に蓄積する５’−ＡＭＰによりアロステリックに活性化される。また、５’−ＡＭＰは上流キナーゼによるＡＭＰＫのリン酸化および活性化も促進しうる。逆に、高いＡＴＰはＡＭＰＫに対する５’−ＡＭＰの活性化効果に拮抗する。低酸素、熱ショック、代謝毒および運動のようなストレスはすべて、５’−ＡＭＰとＡＴＰとの比に対するそれらの作用によりＡＭＰＫを活性化する。次にＡＭＰＫは複数の標的をリン酸化し、これらは同化経路を断ち、異化経路を刺激する７。最近の研究は、この活性化が、内皮細胞、肝臓、膵ベータ細胞および他の組織における細胞生存およびアポトーシス細胞死に関与する細胞内シグナル伝達経路を調節することを示している８，９，１０。ＡＭＰＫは細胞代謝の「燃料計」として作用すると考えられ、ＡＴＰの内因性エネルギー供給を制御する。したがって、ＡＭＰＫが摂食行動をも調節することが判明した際、それは驚くべきことではなかった１１，１２。
【０００６】
レプチンは、主としてその視床下部受容体を介して、食物摂取、エネルギー収支および体重調節において中心的な役割を果たす脂質動員ホルモンである１３，１４，１５。レプチンの機能に関する研究は、ＡＭＰＫがその作用を媒介するのに必須であることを示している１６。レプチンは、ＡＭＰＫのリン酸化および活性化を刺激することにより末梢においてその異化作用を発揮するが、エネルギー収支に対するその中心的な作用は、視床下部ＡＭＰＫの脱リン酸化および抑制を介して作用する１１，１２。
【０００７】
海馬にもレプチン受容体が存在するが、記憶学習および認知機能におけるその役割は解明されていない。
【発明の開示】
【０００８】
本発明を実施化するにあたり、本発明者らは、認知および生存に対する栄養の効果の根底にある過程を明らかにするために食餌制限（ＤＲ）手段を用いた。それらの結果は、ＡＭＰキナーゼが栄養状態に応答し、神経新生と神経アポトーシスとの間の平衡に影響を及ぼすことにより認知能力をモジュレーションすることを示している。レプチンは過酷なＤＲの有害な影響を好転させる。
【０００９】
「栄養ストレス態様」と称される１つの態様において、本発明は、栄養ストレス状態の望ましくない兆候の治療方法であって、レプチン受容体アゴニストまたはＡＭＰＫシグナル伝達経路のアクチベーターの治療上有効な量を、そのような治療を要する対象に投与することを含む方法に関する。
【００１０】
本発明は更に、栄養ストレス状態の望ましくない兆候の治療のための医薬の製造のための、レプチン受容体アゴニストまたはＡＭＰＫシグナル伝達経路のアクチベーターの使用に関する。
【００１１】
本発明は更に、有効成分としてのレプチン受容体アゴニストまたはＡＭＰＫシグナル伝達経路のアクチベーターと製薬上許容される担体とを含む、栄養ストレス状態の望ましくない兆候の治療のための医薬組成物に関する。
【００１２】
「レプチン受容体アゴニスト」なる語は以下のうちの１つを意味する：
（ａ）レプチンタンパク質、レプチンタンパク質の生理学的性質を有するレプチンタンパク質の断片、レプチンタンパク質の生理学的性質を有する、レプチンタンパク質変異体、またはレプチンタンパク質断片の断片の変異体；
（ｂ）レプチン模倣体であるレプチン受容体アゴニスト；
（ｃ）（ａ）〜（ｂ）の２以上の組合せ。
【００１３】
本発明は更に、栄養ストレス状態の望ましくない兆候の治療方法であって、
（ａ）レプチンタンパク質；レプチンタンパク質の生理学的性質を有するレプチンタンパク質の断片；レプチンタンパク質の生理学的性質を有する、レプチンタンパク質変異体、またはレプチンタンパク質断片の断片の変異体；
（ｂ）レプチン模倣体であるレプチン受容体アゴニスト；
（ｃ）ＡＭＰＫシグナル伝達経路のアクチベーター；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の２以上の組合せ
から選ばれる物質の治療上有効な量を、そのような治療を要する対象に投与することを含む方法に関する。
【００１４】
本発明は更に、栄養ストレス状態の望ましくない兆候の治療のための医薬の製造のための、
（ａ）レプチンタンパク質；レプチンタンパク質の生理学的性質を有するレプチンタンパク質の断片；レプチンタンパク質の生理学的性質を有する、レプチンタンパク質変異体、またはレプチンタンパク質断片の断片の変異体；
（ｂ）レプチン模倣体であるレプチン受容体アゴニスト；
（ｃ）ＡＭＰＫシグナル伝達経路のアクチベーター；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の２以上の組合せ
から選ばれる物質の使用に関する。
【００１５】
本発明は更に、有効成分としての
（ａ）レプチンタンパク質；レプチンタンパク質の生理学的性質を有するレプチンタンパク質の断片；レプチンタンパク質の生理学的性質を有する、レプチンタンパク質変異体、またはレプチンタンパク質断片の断片の変異体；
（ｂ）レプチン模倣体であるレプチン受容体アゴニスト；
（ｃ）ＡＭＰＫシグナル伝達経路のアクチベーター；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の２以上の組合せ
から選ばれる物質と製薬上許容される担体とを含む、栄養ストレス状態の望ましくない兆候の治療のための医薬組成物に関する。
【００１６】
「認知改善態様」と称されるもう１つの態様において、本発明は、認知機能を改善するための方法であって、レプチン受容体アゴニストまたはＡＭＰＫシグナル伝達経路のアクチベーターの治療上有効な量を、そのような治療を要する対象に投与することを含む方法に関する。
【００１７】
本発明は更に、認知機能を改善するための医薬の製造のための、レプチン受容体アゴニストまたはＡＭＰＫシグナル伝達経路のアクチベーターの使用に関する。
【００１８】
本発明は更に、有効成分としてのレプチン受容体アゴニストまたはＡＭＰＫシグナル伝達経路のアクチベーターと製薬上許容される担体とを含む、認知機能を改善するための医薬組成物に関する。
【００１９】
「レプチン受容体アゴニスト」なる語は以下のうちの１つを意味する：
（ａ）レプチンタンパク質、レプチンタンパク質の生理学的性質を有するレプチンタンパク質の断片、レプチンタンパク質の生理学的性質を有する、レプチンタンパク質変異体、またはレプチンタンパク質断片の断片の変異体；
（ｂ）レプチン模倣体であるレプチン受容体アゴニスト；
（ｃ）（ａ）〜（ｂ）の２以上の組合せ。
【００２０】
本発明は更に、認知機能を改善するための方法であって、
（ａ）レプチンタンパク質；レプチンタンパク質の生理学的性質を有するレプチンタンパク質の断片；レプチンタンパク質の生理学的性質を有する、レプチンタンパク質変異体、またはレプチンタンパク質断片の断片の変異体；
（ｂ）レプチン模倣体であるレプチン受容体アゴニスト；
（ｃ）ＡＭＰＫシグナル伝達経路のアクチベーター；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の２以上の組合せ
から選ばれる物質の治療上有効な量を、そのような治療を要する対象に投与することを含む方法に関する。
【００２１】
本発明は更に、認知機能を改善するための医薬の製造のための、
（ａ）レプチンタンパク質；レプチンタンパク質の生理学的性質を有するレプチンタンパク質の断片；レプチンタンパク質の生理学的性質を有する、レプチンタンパク質変異体、またはレプチンタンパク質断片の断片の変異体；
（ｂ）レプチン模倣体であるレプチン受容体アゴニスト；
（ｃ）ＡＭＰＫシグナル伝達経路のアクチベーター；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の２以上の組合せ
から選ばれる物質の使用に関する。
【００２２】
本発明は更に、有効成分としての
（ａ）レプチンタンパク質；レプチンタンパク質の生理学的性質を有するレプチンタンパク質の断片；レプチンタンパク質の生理学的性質を有する、レプチンタンパク質変異体、またはレプチンタンパク質断片の断片の変異体；
（ｂ）レプチン模倣体であるレプチン受容体アゴニスト；
（ｃ）ＡＭＰＫシグナル伝達経路のアクチベーター；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の２以上の組合せ
から選ばれる物質と製薬上許容される担体とを含む、認知機能を改善するための医薬組成物に関する。
【００２３】
以下の定義は「栄養ストレス態様」に関する本発明の第１の態様と関連する。
【００２４】
「栄養ストレス状態」なる語は、急性または慢性の負のエネルギー収支により引き起こされる任意の状態を意味する。これらの状態には、敗血症、長期にわたる術後ストレス、長期にわたる損傷後ストレス、肝疾患により引き起こされる脳損傷；ならびに開発途上国で見られる重度の栄養不良、吸収不良状態、例えば腹腔疾患、大腸炎、慢性栄養不良を招きうる炭水化物不耐性、慢性疾患（例えば癌、または感染全般および特にＨＩＶ感染）、食欲不振により引き起こされる栄養不良に関連した体重減少が含まれる。これらの状態のすべては典型的には栄養リハビリテーションを要する。
【００２５】
「望ましくない兆候」なる語は、栄養ストレス状態に関連した任意の臨床的または行動的病状を意味する。これらには、認知機能の低下、特に慢性または急性栄養不良に関連した低下、感情鈍麻および疲労、エネルギーの欠如、組織の治癒の鈍化、（手術からの）回復速度の低減、（小児における）成長速度の低減、死亡率の増大、免疫系機能の低下、感染に対する感受性の増大、繁殖力の低下が含まれる。好ましくは、本発明においては、上記方法は、栄養ストレス状態に関連した認知機能（特に学習および記憶）の障害の治療のための方法である。好ましい実施形態においては、望ましくない兆候は認知機能の低下である。
【００２６】
本発明の第１の「栄養ストレス態様」における「治療」なる語は、未処置対照と比較した場合の、「望ましくない兆候」の少なくとも１つのパラメーターの改善を意味する。この用語は、未処置対照と比較した場合の、確立された病状の改善（既存の望ましくない兆候、例えば、慢性または急性栄養不良により引き起こされた認知機能障害における改善）、および該病状が発生する前の該病状の発生の完全な予防または望ましくない兆候の発生の完全な予防の両方を意味する。例えば、望ましくない兆候が発生する前（またはそれが重度の望ましくない兆候へと進展する前）にそれを予防するまたは少なくとも軽減するために、特に、栄養ストレス状態に関連した認知機能の低下を予防または軽減するために、栄養ストレス状態（手術によるもの、または癌もしくはＨＩＶ疾患における予想される悪化によるもの）に陥ると予想される患者に本発明の治療を行うことが可能である。
【００２７】
以下は、本発明の第２の態様である「認知機能改善態様」に関する定義である。
【００２８】
「認知機能」なる語は、一般に、学習および記憶能力を意味する。
【００２９】
「認知機能における改善」は、未処置対照と比較した場合の、学習または記憶能力における任意の改善、あるいは未処置対照と比較した場合の、認知機能の悪化の減速または予防でありうる。
【００３０】
認知機能の改善の態様における患者は、加齢、感染症、卒中、肝疾患により引き起こされる脳損傷、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、痴呆および悪液質に関連した他の神経変性過程により認知機能が悪化した患者、好ましくは、体重減少を伴う認知障害を有する患者でありうる。
【００３１】
以下の定義は本発明の両方の態様に関連する。
【００３２】
「投与」なる語は任意のタイプの全身投与を意味し、すべての非経口投与、例えば静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻腔投与（脳への透過を増強するためのもの）による腹腔内投与、デポー投与（徐放用）、吸入投与など、経口投与を含みうる。好ましい投与方法は皮下投与、吸入投与、鼻腔投与による腹腔内投与である。
【００３３】
「治療上有効な量」なる語は、前記（ａ）〜（ｄ）に記載の物質のいずれかの、望ましくない兆候の軽減、予防または排除をもたらすのに十分な量を意味する。該活性物質が、ＡＭＰＫシグナル伝達経路を活性化しうる物質である場合には、治療上有効な量は、該経路の低レベルの活性化を引き起こす量であることに注意すべきである。なぜなら、低レベルの活性化のみが神経新生をもたらし、一方、より高いレベルの活性化は逆の効果（すなわち、ニューロンのアポトーシス）を引き起こしうるからである。
【００３４】
「低レベルの活性化」がどの程度のものであるかを決定するために、Ｂｒｄ−Ｕと共に、ヒトにおいて使用されることが意図された最終製剤中の種々の用量のＡＭＰＫ経路アクチベーターを試験動物に投与することが可能である。ついで動物を犠死させ、新たな細胞の生成速度を測定するために歯状回におけるＢｒｄＵ−免疫反応細胞の数を測定する。公知基準に従いヒトにおける生理的に対応する量に変換された、新たに生成された細胞の数を増加させうる量が、「治療上有効な量」とみなされる。
【００３５】
本発明の方法において使用される活性物質は、Zhang Y, Proenca R, Maffei M, Barone M, Leopold L, Friedman JM. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature 1994 1:372 (6505):425-432に示されておりＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ｕ４３６５３に示されている配列を有する全長レプチンタンパク質でありうる。本発明の好ましい実施形態においては、これが好ましい態様である。
【００３６】
全長タンパク質の代わりに、親レプチンタンパク質と（同一濃度範囲において）類似した生理学的性質を有する（該全長タンパク質または該受容体の）断片または変異体を使用することが可能である。
【００３７】
全長タンパク質または断片の代わりに、保存的または非保存的置換により１以上のアミノ酸が（天然に存在するまたは合成の）別のアミノ酸により置換された変異体、１以上の非末端アミノ酸が欠失した変異体、１以上のアミノ酸が化学修飾された変異体、あるいはアミノ酸間の結合が非天然結合により置換された変異体が使用されうる。該変異体は、全長親タンパク質の生理的レプチン受容体活性化特性を尚も維持しているものであるべきである。
【００３８】
上記変異体は、例えばその（ＢＢＢへの）侵入性を増強するために、そのクリアランス速度を低下させるために、その放出速度を改善するために、その溶解性、バイオアベイラビリティ、免疫学的特性、薬物動態学的特性などを改善するために、レプチン、レプチン断片またはレプチン変異体に種々のペプチド性または非ペプチド性部分を付加することによっても得ることができる。
【００３９】
上記変異体の断片が親レプチンの特性を維持しているかどうかを判定するために、例えば以下のようなアッセイでそれらを試験することが可能である：
１）（ＲＴ−ＰＣＲ、受容体結合による）レプチン受容体の活性化、
２）過酷なカロリー制限下での動物の生存期間の延長、
３）後述した８アーム迷路（Eight Arm Maze）またはモリス水迷路（Morris water maze）試験のような認知機能の試験、
４）対照と比較した場合の（ストレス条件下の）培養ニューロンのアポトーシスの防止、
５）ＡＭＰＫ発現およびリン酸化の測定。
【００４０】
全長レプチンの濃度より有意には低くない濃度で前記の５つのアッセイのいずれかにおいて活性を有する断片および変異体が、本発明の範囲内に含まれるものである。
【００４１】
また、本発明における物質は、ＣＢＴ１４５２（Cambridge Biotechnology Ltd）、｛Ｄ−ＬＥＵ−４｝−ＯＢ３  ＧｒａｓｓｏＰ（Regul Pept. 2001 Sep 15;101(l-3):123-9）のようなレプチン模倣体（タンパク質ではない分子）であるレプチン受容体アゴニストでありうる。
【００４２】
本発明の方法において使用されるもう１つの物質は、ＡＭＰＫシグナル伝達経路を活性化する物質であり、該物質には、ＡＭＰＫ自体を活性化する物質、その上流エフェクター、例えばＴＳＣ２、および下流因子、例えばＬＫＢ１が含まれる。ＡＭＰＫアクチベーターの一例として、ＡＩＣＡＲ、メトホルミンが挙げられる。ＡＭＰＫに対する他の可能な標的を図６に示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
全長レプチンは１４６アミノ酸ペプチドの配列を有する。「断片」なる語は、任意の連続的部分、好ましくは少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５アミノ酸を意味する。
【００４４】
「変異体」なる語は、該天然配列のアミノ酸の４０％まで、好ましくは３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％までが、天然に存在するもしくは天然に存在しないアミノ酸またはペプチド模倣有機部分で置換された、全長レプチンタンパク質または前記断片を意味する。これは次のことを意味する。すなわち、本発明における変異体は、そのアミノ酸の少なくとも６０％（好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）を該天然配列と共有する（相同である）アミノ酸配列を意味するが、そのアミノ酸のいくつかは、他の天然に存在するアミノ酸により置換（保存的置換および非保存的置換の両方）されているか、または天然に存在しないアミノ酸により置換（保存的置換および非保存的置換の両方）されているか、あるいは真のペプチド模倣体（すなわち、置換されるアミノ酸と同じ立体的および電気化学的特性を有するもの）として働く有機分子でもしくはこの置換アミノ酸と該アミノ酸との間の空間的関係を維持するようアミノ酸の代わりの単なるスペーサーとして働くに過ぎない有機分子で置換されている。置換および置換えの決定のための指針は以下で説明される。好ましくは、上記アミノ酸のせいぜい３０％、２５％、２０％または１０％が置換される。
【００４５】
「変異体」なる語は、該アミノ酸の４０％まで（好ましくは３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％まで）が、化学修飾された側鎖を有するアミノ酸をも含みうる。これらの修飾体は、同じタイプのアミノ酸残基を有するがその側鎖に官能基が付加された変異体を意味する。例えば、該側鎖はリン酸化、グリコシル化、脂肪アシル化、アシル化、ヨード化またはカルボキシアシル化されうる。化学置換基の他の例は当技術分野で公知である。
【００４６】
「変異体」なる語は、いくつかのアミノ酸（非末端の、そして必ずしも連続的に伸長しているわけではないアミノ酸）が欠失しているタンパク質、好ましくは、アミノ酸のせいぜい２０％（好ましくは１５％、１０％、５％）までが欠失しているタンパク質をも意味する。
【００４７】
典型的には、該変異体は、親レプチンタンパク質内のアミノ酸の少なくとも５０％（好ましくは少なくとも５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％）が該変異体において未改変のままで維持されているものである。これは、４０％までの置換、４０％までの化学修飾および２０％までの欠失が組み合わされることを意味する。すなわち、アミノ酸残基の性質および該配列内のその位置の両方に関して天然アミノ酸の少なくとも５０％がレプチンタンパク質の天然配列のものと同一である限り、同じ変異体が（複数の）置換、化学修飾および欠失を有しうる。また、本発明の第１の態様における栄養不良の望ましくない兆候の改善または本発明のシグナル伝達の第２の態様における認知機能の改善においては、該親配列の生理学的性質は、典型的には同じまたはより高い濃度の該変異体において維持される必要がある。
【００４８】
典型的には、「必須アミノ酸」は維持されるか、または保存的置換により置換され、一方、非必須アミノ酸は維持されるか、欠失されるか、または保存的もしくは非保存的置換により置換されうる。一般に、必須アミノ酸は種々の構造活性相関（ＳＡＲ）技術により決定され（例えば、アミノ酸は、Ａｌａにより置換されると、活性の喪失を引き起こす）、保存的置換により置換され、一方、非必須アミノ酸は欠失されたり、または任意のタイプの置換により置換されうる。欠失、置換および置換えの決定のための指針は以下で説明される。
【００４９】
上記変異体は、少なくとも１つのペプチド骨格が、天然に存在しないペプチド骨格へと改変されたペプチドをも含みうる。この変異体は、１つのアミノ酸残基のＮ側から次のアミノ酸のＣ側への少なくとも１つの結合が、天然に存在しない結合へと、還元（−ＣＨ２−ＮＨ−へと）、窒素原子上のアルキル化（メチル化）により改変されたもの、あるいは該結合がアミド結合、尿素結合もしくはスルホンアミド結合、エーテル結合（−ＣＨ２−Ｏ−）、チオエーテル結合（−ＣＨ２−Ｓ−）または−ＣＳ−ＮＨ−により置換されたものを含む。Ｎ−アルキル化Ｇｌｙ（ペプチドイド）を得るために、該残基の側鎖を骨格上の窒素に転移させることが可能である。
【００５０】
また、上記変異体は、その末端の一方または両方に種々の官能基が付加された、全長レプチンタンパク質、断片または既に記載されている変異体でありうる。そのような官能基の目的は、生理学的性質の改善、特に、バイオアベイラビリティおよび血液脳関門への侵入の改善のためのものでありうる。したがって、ＢＢＢ侵入を促進することが知られている官能基を本発明の活性物質のいずれかに（好ましくは切断可能な結合により）複合体化させることが可能である。また、官能基は、他の目的のもの、例えば、安定性の改善、透過性（細胞膜または関門の侵入性）の改善、組織局在化の改善、効力の改善、クリアランスの低減、毒性の低減、選択性の改善、細胞ポンプによる補充（repletion）に対する抵抗性の改善などのためのものでありうる。
【００５１】
適当な官能基はGreenおよびWuts, “Protecting Groups in Organic Synthesis”, John Wiley and Sons, チャプター5および7, 1991に記載されており、その教示を参照により本明細書に組み入れることとする。好ましい保護基は、それに結合している化合物の、細胞内への輸送を、例えば該化合物の親水性を減少させ親油性を増大させることにより促進するものであり、これらは「細胞膜透過輸送用部分」の一例である。
【００５２】
これらの部分は細胞内で加水分解によりまたは酵素的にｉｎ  ｖｉｖｏで切断されうる（Ditterら, J. Pharm. Sci 57:783 (1968); Ditterら, J. Pharm. Sci. 57:828 (1968); Ditterら, J. Pharm. Sci. 58:557 (1969); Kingら, Biochemistry 26:2294 (1987); Lindbergら, Drug Metabolism and Disposition 17:311 (1989); およびTunekら, Biochem. Pharm. 37:3867 (1988), Andersonら, Arch. Biochem. Biophys. 239:538 (1985) およびSinghalら, FASEB J. 1:220 (1987)）。ヒドロキシル保護基には、エステル、カーボネートおよびカルバメート保護基が含まれる。アミン保護基には、Ｎ末端保護基に関して前記で説明したのと同様のアルコキシおよびアリールオキシカルボニル基が含まれる。カルボン酸保護基には、Ｃ末端保護基に関して前記で説明したのと同様の脂肪族、ベンジルおよびアリールエステルが含まれる。１つの実施形態においては、本発明の化合物における１以上のグルタミン酸またはアスパラギン酸残基の側鎖中のカルボン酸基が、好ましくはメチル、エチル、ベンジルまたは置換ベンジルエステルで、より好ましくはベンジルエステルとして保護されている。
【００５３】
また、修飾されたリシン残基を上記化合物のＣ末端に付加して生物学的活性を増強することが可能である。リシン修飾の具体例には、リシン残基のイプシロンアミノ基における、芳香族置換基、例えばベンゾイル安息香酸、ダンシル−リシン、安息香酸の種々の誘導体（ジフルオロ−、トリフルオロメチル−、アセトアミド−、ジメチル−、ジメチルアミノ−、メトキシ−）またはカルボン酸の種々の誘導体（ピラジン−、チオフェン−、ピリジン−、インドール−、ナフタレン−、ビフェニル）または脂肪族基（例えばアシル、またはミリスチン酸もしくはステアリン酸）の付加が含まれる。
【００５４】
Ｎ末端保護基の例には、アシル基（−ＣＯ−Ｒ１）およびアルコキシカルボニルまたはアリールオキシカルボニル基（−ＣＯ−Ｏ−Ｒ１）が含まれ、ここで、Ｒ１は、脂肪族、置換脂肪族、ベンジル、置換ベンジル、芳香族または置換芳香族基である。アシル基の具体例には、アセチル、（エチル）−ＣＯ−ｎ−プロピル−ＣＯ−、イソ−プロピル−ＣＯ−、ｎ−ブチル−ＣＯ−、ｓ−ブチル−ＣＯ−、ｔ−ブチル−ＣＯ−、ヘキシル、ラウロイル、パルミトイル、ミリストイル、ステアリル、オレオイルフェニル−ＣＯ−、置換フェニル−ＣＯ−、ベンジル−ＣＯ−および（置換ベンジル）−ＣＯ−が含まれる。アルコキシカルボニルおよびアリールオキシカルボニル基の具体例には、ＣＨ３−Ｏ−ＣＯ−、（エチル）−Ｏ−ＣＯ−、ｎ−プロピル−Ｏ−ＣＯ−、イソ−プロピル−Ｏ−ＣＯ−、ｎ−ブチル−Ｏ−ＣＯ−、ｓ−ブチル−Ｏ−ＣＯ−、ｔ−ブチル−Ｏ−ＣＯ−、フェニル−Ｏ−ＣＯ−、置換フェニル−Ｏ−ＣＯ−およびベンジル−Ｏ−ＣＯ−、（置換ベンジル）−Ｏ−ＣＯ−、アダマンタン、ナフタレン、ミリストレイル、ツルエン（tuluen）、ビフェニル、シンナモイル、ニトロベンゾイル、トルオイル、フロイル、ベンゾイル、シクロヘキサン、ノルボルナン、Ｚ−カプロン酸が含まれる。Ｎアシル化を容易にするために、分子のＮ末端に１〜４個のグリシン残基を存在させることが可能である。
【００５５】
化合物のＣ末端のカルボキシル基は、例えばアミド（すなわち、Ｃ末端のヒドロキシル基が−ＮＨ２、−ＮＨＲ２および−ＮＲ２Ｒ３で置換される）またはエステル（すなわち、Ｃ末端のヒドロキシル基が−ＯＲ２で置換される）により保護されうる。Ｒ２およびＲ３は、独立して、脂肪族、置換脂肪族、ベンジル、置換ベンジル、アリールまたは置換アリール基である。また、Ｒ２およびＲ３は、窒素原子と一緒になって、約０〜２個の追加的なヘテロ原子（例えば、窒素、酸素または硫黄）を含有するＣ４〜Ｃ８複素環を形成しうる。適当な複素環の具体例には、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリノ、チオモルホリノまたはピペラジニルが含まれる。Ｃ末端保護基の具体例には、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＨ（エチル）、−Ｎ（エチル）２、−Ｎ（メチル）（エチル）、−ＮＨ（ベンジル）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）（ベンジル）、−ＮＨ（フェニル）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）（フェニル）、−ＯＣＨ３、−Ｏ−（エチル）、−Ｏ−（ｎ−プロピル）、−Ｏ−（ｎ−ブチル）、−Ｏ−（イソ−プロピル）、−Ｏ−（ｓ−ブチル）、−Ｏ−（ｔ−ブチル）、−Ｏ−ベンジルおよび−Ｏ−フェニルが含まれる。
【００５６】
好ましくは、上記化合物は、Ｃ４−Ｃ２０、好ましくはＣ６−Ｃ１８、最も好ましくはＣ８−Ｃ１６の長さを有する炭化水素をＮ末端に含む。炭化水素部分の具体例としては、アアイスチル（aaystyl）、ステアリル、ラウロイル、パルミトイルおよびアセチルなどが挙げられる。他の具体例としては、ゲラニル−ゲラニル（gernyl-gernyl）、アセチルが挙げられる。
【００５７】
レプトンタンパク質のアミノ酸をどこで置換、欠失または化学修飾すべきか、あるいはどの断片が選択されうるかを決定するためには、必須アミノ酸および非必須アミノ酸を特定することが重要である。これは以下のものの１つにより行われうる。
【００５８】
Ａｌａスキャン
本発明の変異体または断片を得るためには、必須アミノ酸が維持されること（すなわち、天然レプチンに存在するものと同一であること）、保存的置換（以下の定義を参照）により置換または化学修飾されることが必要である。非必須アミノ酸は維持され、欠失され、スペーサーにより置換され、あるいは保存的または非保存的置換により置換されていてよい。
【００５９】
該ペプチドにおけるアミノ酸が必須アミノ酸であるか非必須アミノ酸であるかの特定は、いくつかのペプチドを調製し、各アミノ酸をアミノ酸Ａｌａにより逐次的に置換し（「Ａｌａスキャン」）、または各アミノ酸を逐次的に欠損（omit）させる（「欠損（omission）スキャン」）ことにより達成されうる。これにより、モジュレーション活性が該置換／欠損により低下したアミノ酸（「必須」）および該置換／欠損により低下しなかったアミノ酸（「非必須」）を特定することが可能となる（Morrisonら, Chemical Biology 5:302-307, 2001）。種々のペプチドの重要性を試験するためのもう１つの方法は部位特異的突然変異誘発の利用によるものである。他の構造活性相関技術も用いられうる。
【００６０】
３Ｄ分析
必須アミノ酸および非必須アミノ酸を見分けるためのもう１つの方法は、全長レプチンの３Ｄにおけるどのアミノ酸領域が露出しており、どのアミノ酸領域が埋め込まれるのかを決定することによるものである。これは、ＳＰＤＢビューアー、Glaxo-Welcomeの「color by accessibility」のような標準的なソフトウェアを使用して行われうる。
【００６１】
典型的には、埋め込まれるアミノ酸は非必須アミノ酸であり、露出または部分露出しているアミノ酸は必須アミノ酸である可能性が高い。しかし、該埋込領域におけるどの「非保存的」置換が許容されうるかを理論的に「推測（guess）」したい場合の良好な指針は、全長レプチンの３Ｄコンピューターモデル上で「点検（check）」することである。コンピューターの３Ｄ構造上で（例えばTriphoseTMソフトウェアを使用して）シミュレーションした場合に該領域の全体的形状の劇的な変化（露出アミノ酸の位置における劇的な変化）を引き起こさない非保存的置換が、非保存的置換である可能性がある。したがって、実験的試験の前に、コンピューターシミュレーションにより試験候補体の数を減少させることが可能である。特定のキナーゼの３Ｄ構造が活性化結晶データにおいて入手可能でない場合には、CompSerTM（Tripose, USA）のようなプログラムを使用して公知の結晶構造に対する相同性に基づいて該キナーゼの「バーチャル」３Ｄ構造を得ることが可能である。
【００６２】
欠失は特に、「非必須アミノ酸」において施されうる。付加は特に、該配列のアミノ酸のいずれかのＮ末端またはＣ末端において施されうる。該アミノ酸のせいぜい２０％、好ましくは１５％、１０％、５％が欠失されるべきである。挿入は、好ましくは、該ペプチド／断片／変異体の配列のＮ末端またはＣ末端に施される。しかし、他の挿入または欠失も可能である。
【００６３】
置換
該変異体は、天然レプチン内に存在するアミノ酸のいずれかの置換により得られうる。他の位置よりも置換を許容できる位置が配列内に存在することが理解されており、それどころか、置換のなかには天然配列の活性を改善しうるものもある。該位置の決定は、前記の「Ａｌａスキャン」、「欠損スキャン」、「部位特異的突然変異誘発」または３Ｄ理論的考察により達成されうる。一般に、「必須」であることが判明したアミノ酸は、天然レプチン中に存在するアミノ酸と同一であるか、または「保存的置換」により置換されるべきである。「非必須」であることが判明したアミノ酸は天然ペプチド中のアミノ酸と同一であることが可能であり、保存的または非保存的置換により置換されることが可能であり、欠失され、または「スペーサー」により置換されることが可能である。
【００６４】
「天然に存在するアミノ酸」なる語は、−ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯ−（ここで、Ｒは、天然に存在するアミノ酸の側鎖である）により表される、ペプチド内に存在する部分を意味する。
【００６５】
「天然に存在しないアミノ酸」（アミノ酸類似体）なる語は、ペプチド模倣体であるか、あるいは式：−ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯ−（ここで、Ｒは脂肪族基、置換脂肪族基、ベンジル基、置換ベンジル基、芳香族基または置換芳香族基であり、Ｒは、天然に存在するアミノ酸の側鎖に対応しない）を有するＤまたはＬ残基である。この用語は、天然に存在するアミノ酸のＤアミノ酸対応物をも意味する。アミノ酸類似体は当技術分野でよく知られており、多数のこれらの類似体が商業的に入手可能である。しばしば、該ペプチドにおける、天然に存在しないアミノ酸の使用は、酵素がそれを認識できなくなるため、そのような酵素による分解に対して該ペプチドがより抵抗性になるという利点を有する。
【００６６】
本発明における「保存的置換」なる語は、レプチンの天然配列内に存在するアミノ酸を、類似した立体特性を有する、天然に存在するもしくは天然に存在しないアミノ酸またはペプチド模倣体で置換することを意味する。
【００６７】
天然に存在するアミノ酸はそれらの特性に従い分類されるため、本発明においては、立体的に類似している非荷電アミノ酸による荷電アミノ酸の置換は保存的置換とみなされることに留意して、天然に存在するアミノ酸による保存的置換を容易に決定することができる。
【００６８】
天然に存在しないアミノ酸による保存的置換を行うためには、当技術分野で周知のアミノ酸類似体（合成アミノ酸）を使用することも可能である。天然に存在するアミノ酸のペプチド模倣体は、当業者に公知の文献に詳細に記載されている。
【００６９】
保存的置換を行う場合には、置換アミノ酸は、元のアミノ酸と同じまたは類似した側鎖内官能基を有するべきである。
【００７０】
以下に、天然に存在するアミノ酸またはアミノ酸類似体のグループのいくつかの非限定的な具体例を記載する。該グループ内の１つのメンバーを該グループの別のメンバーにより置換することは本発明においては保存的置換とみなされる。
【００７１】
グループＩは、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、システイン、トレオニン、および以下の側鎖を有する修飾アミノ酸を含む：エチル、ｎ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ３および−ＣＨ２ＳＣＨ３。好ましくは、グループＩはロイシン、イソロイシン、バリンおよびメチオニンを含む。
【００７２】
グループＩＩは、グリシン、アラニン、バリン、セリン、システイン、トレオニン、およびエチル側鎖を有する修飾アミノ酸を含む。好ましくは、グループＩＩはグリシンおよびアラニンを含む。
【００７３】
グループＩＩＩは、フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシン、トリプトファン、シクロヘキシルメチル、および置換ベンジルまたはフェニル側鎖を有する修飾アミノ残基を含む。好ましい置換基は以下の１以上を含む：ハロゲン、メチル、エチル、ニトロ、メトキシ、エトキシおよび−ＣＮ。好ましくは、グループＩＩＩはフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンを含む。
【００７４】
グループＩＶは、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸またはアスパラギン酸の置換または非置換の脂肪族、芳香族またはベンジルエステル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、シクロヘキシル、ベンジルまたは置換ベンジル）、グルタミン、アスパラギン、ＣＯ−ＮＨ−アルキル化グルタミンまたはアスパラギン（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピルおよびイソ−プロピル）、ならびに側鎖−（ＣＨ２）３−ＣＯＯＨを有する修飾アミノ酸、そのエステル（置換または非置換の脂肪族、芳香族またはベンジルエステル）、そのアミドおよびその置換または非置換Ｎ−アルキル化アミドを含む。好ましくは、グループＩＶは、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸メチル、アスパラギン酸エチル、アスパラギン酸ベンジル、ならびにグルタミン酸メチル、グルタミン酸エチルおよびグルタミン酸ベンジルを含む。
【００７５】
グループＶは、ヒスチジン、リシン、アルギニン、Ｎ−ニトロアルギニン、β−シクロアルギニン、μ−ヒドロキシアルギニン、Ｎ−アミジノシトルリンおよび２−アミノ−４−グアニジノブタン酸、リシンのホモログ、アルギニンのホモログおよびオルニチンを含む。好ましくは、グループＶは、ヒスチジン、リシン、アルギニンおよびオルニチンを含む。アミノ酸のホモログは１〜約３個の追加的なメチレン単位を側鎖内に含む。
【００７６】
グループＶＩは、セリン、トレオニン、システイン、および−ＯＨまたは−ＳＨで置換された直鎖状または分枝状Ｃ１−Ｃ５アルキル側鎖を有する修飾アミノ酸を含む。好ましくは、グループＶＩはセリン、システインまたはトレオニンを含む。
【００７７】
本発明においては、元の配列または部分配列内のいずれかのシステインが、ホモシステインまたは他のスルフヒドリル含有アミノ酸残基もしくは類似体により置換されうる。そのような類似体には、それぞれリシン−εアミノシステインまたはアラニン−βアミノシステインを形成するようシステイン残基が第２級アミンを介して結合しているリシンまたはβアミノアラニンが含まれる。
【００７８】
「非保存的置換」なる語は、天然Ｌｙｎに存在するアミノ酸を、異なる電気化学的および／または立体的特性を有する別の天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸により置換することを意味し、このような置換は、例えば、置換するアミノ酸が、該天然キナーゼ配列の置換されるアミノ酸と同じグループのものではないことにより確認される。本発明の範囲内に含まれる非保存的置換は、キナーゼ関連シグナル伝達モジュレーション活性を有する化合物を尚も構成するものである。Ｄ−アミノ酸は、グリシン水素側鎖と同じ位置に水素を有するため、Ｄ−アミノ酸またはそれらの類似体は、しばしば、グリシン残基の代わりに使用されることが可能であり、これは好ましい非保存的置換である。
【００７９】
「非保存的置換」は、置換するアミノ酸（天然に存在するアミノ酸または修飾アミノ酸）が、置換されるアミノ酸とは有意に異なるサイズ、立体配置および／または電気的特性を有する置換である。したがって、置換するアミノ酸の側鎖は、置換される天然アミノ酸の側鎖より有意に大きい（もしくは小さい）ことが可能であり、および／または置換されるアミノ酸とは有意に異なる電気的特性を有する官能基を有することが可能である。このタイプの非保存的置換の具体例には、アラニンからフェニルアラニンまたはシクロヘキシルメチルグリシンへの置換、グリシンからイソロイシンへの置換または−が含まれる。
【００８０】
本発明の化合物におけるアミノ酸残基は、保存的置換および非保存的置換の両方により「ペプチド模倣有機部分」で置換されうる。これらのペプチド模倣有機部分は、必須および非必須アミノ酸のアミノ酸残基の代わりに使用され、あるいは（非必須アミノ酸の）欠失アミノ酸の代わりの該ペプチド内のスペーサー基として働く。ペプチド模倣有機部分は、しばしば、置換されるアミノ酸に類似した立体的、電気的または立体配置的特性を有し、そのようなペプチド模倣体は必須位置におけるアミノ酸の代わりに使用され、これは保存的置換とみなされる。しかし、そのような類似性が必ずしも要求されるわけではない。ペプチド模倣体の使用に関する唯一の制限は、該化合物が、天然レプチンタンパク質内に見出されるものと同じ配列領域を構成する化合物と比較してそのレプチン様生理学的性質を保有していることである。
【００８１】
ペプチド模倣体は、しばしば、酵素的または他の分解過程によるペプチドの分解を抑制するために使用される。ペプチド模倣体は有機合成技術により製造されうる。適当なペプチド模倣体の具体例には、対応Ｌアミノ酸のＤアミノ酸、テトラゾール（Zabrockiら, J. Am. Chem. Soc. 110:5875-5880 (1988)）；アミド結合の等電子体（isostere）（Jonesら, Tetrahedron Lett. 29: 3853-3856 (1988)）；ＬＬ−３−アミノ−２−プロペニドン−６−カルボン酸（ＬＬ−Ａｃｐ）（Kempら, J. Org. Chem. 50:5834-5838 (1985)）が含まれる。同様の類似体がKempら, Tetrahedron Lett. 29:5081-5082 (1988) およびKempら, Tetrahedron Lett. 29:5057-5060 (1988)、Kempら, Tetrahedron Lett. 29:4935-4938 (1988) およびKempら, J. Org. Chem. 54:109-115 (1987)に示されている。他の適当なペプチド模倣体がNagaiおよびSato, Tetrahedron Lett. 26:647-650 (1985); Di Maioら, J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1687 (1985); Kahnら, Tetrahedron Lett. 30:2317 (1989); Olsonら, J. Am. Chem. Soc. 112:323-333 (1990); Garveyら, J. Org. Chem. 56:436 (1990)に示されている。他の適当なペプチド模倣体には、ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート（Miyakeら, J. Takeda Res. Labs 43:53-76 (1989)）；１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボキシレート（Kazmierskiら, J. Am. Chem. Soc. 133:2275-2283 (1991)）；ヒスチジンイソキノロンカルボン酸（ＨＩＣ）（Zechelら, Int. J. Pep. Protein Res. 43 (1991)）；（２Ｓ，３Ｓ）−メチル−フェニルアラニン、（２Ｓ，３Ｒ）−メチル−フェニルアラニン、（２Ｒ，３Ｓ）−メチル−フェニルアラニンおよび（２Ｒ，３Ｒ）−メチル−フェニルアラニン（KazmierskiおよびHruby, Tetrahedron Lett. (1991)）が含まれる。
【００８２】
本発明においては、天然配列内に存在するアミノ酸残基の側鎖が化学修飾されうる（すなわち、官能基の付加により改変されうる）。該修飾は該分子の合成過程（すなわち、アミノ酸鎖伸長中）において行われることが可能であり、アミノ酸（すなわち、化学修飾アミノ酸）が付加される。しかし、分子または配列内に存在するアミノ酸の化学修飾（「ｉｎ  ｓｉｔｕ」修飾）も可能である。
【００８３】
該分子の配列領域のいずれかのアミノ酸は、カルボキシメチル化、アシル化、リン酸化、グリコシル化または脂肪アシル化により修飾（ペプチドにおいては概念的には「化学修飾」とみなされる）されうる。セリンまたはトレオニンヒドロキシルを糖のヒドロキシルに結合させるためには、エーテル結合が用いられうる。グルタミン酸またはアスパラギン酸カルボキシル基を糖上のアミノ基に結合させるためには、アミド結合が用いられうる（GargおよびJeanloz, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Vol. 43, Academic Press (1985); Kunz, Ang. Chem. Int. Ed. English 26:294-308 (1987)）。アミノ酸と炭水化物との間ではアセタールおよびケタール結合も形成されうる。脂肪酸アシル誘導体が、例えば遊離アミノ基（例えば、リシン）のアシル化により製造されうる（Tothら, Peptides: Chemistry, Structure and Biology, RivierおよびMarshal編, ESCOM Publ, Leiden, 1078-1079 (1990)）。
【００８４】
本発明の活性タンパク質、断片および変異体は、固相合成により、または適当な発現ベクターを使用する組換え系における発現により、または天然源からの単離により合成されうる。組換え技術による製造が好ましい。
【００８５】
本発明の化合物は、Applied Biosystemsの430A Peptide Synthesizerを使用して、Ｆ−Ｍｏｃ技術を該製造業者のプロトコールに従って用いて合成されうる。ペプチドを製造するための他の適当な方法は当業者に公知である。例えば、Merrifield, R.B., Science, 232: 341 (1986); Carpino, L.A,, Han, G. Y., J. Org. Chem., 37: 3404 (1972); Gauspohl, H.ら, Synthesis, 5: 315 (1992)（それらの教示を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。本発明の物質は、有効治療用物質と種々の他の製薬上許容される成分とを含む医薬組成物として投与されることが多い。Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1980)を参照されたい。
【００８６】
好ましい形態は、意図される投与方法および治療用途に左右される。組成物は、所望の製剤に応じて、製薬上許容される無毒性担体または希釈剤をも含みうる。それらは、動物またはヒトへの投与のための医薬組成物を製剤化するために一般に使用されるビヒクルと定義される。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響を及ぼさないよう選択される。そのような希釈剤の具体例としては、蒸留水、生理学的リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液およびハンクス液が挙げられる。また、該医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または無毒性で非治療用の非免疫原性の安定剤などをも含みうる。好ましくは、本発明の物質、特に、全長レプチンタンパク質は水に溶解され、食塩水中の形態で投与される。
【００８７】
医薬組成物は、ゆっくりと代謝される大きな巨大分子、例えばタンパク質、多糖、例えばキトサン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、および共重合体（例えば、ラテックス官能化セファロース（latex functionalized sepharose）TM、アガロース、セルロースなど）、多量体アミノ酸、アミノ酸共重合体、および脂質凝集物（例えば、油滴またはリポソーム）をも含みうる。
【００８８】
非経口投与の場合、本発明の物質は、無菌液体（例えば、水、油、食塩水、グリセロールまたはエタノール）でありうる医薬担体と共に生理的に許容される希釈剤中の該物質の溶液または懸濁液の注射可能な剤形として投与されうる。また、補助物質、例えば湿潤または乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝化物質などが組成物中に存在してもよい。医薬組成物の他の成分は、石油、動物油、植物油または合成由来の油、例えばラッカセイ油、ダイズ油および鉱油である。一般に、グリコール、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが、特に注射可能な溶液のための、好ましい液体担体である。該化合物は、有効成分の徐放を可能にするよう製剤化されうるデポー注射剤またはインプラント製剤の形態で投与されうる。典型的な組成物は、ＨＣｌでｐＨ６．０に調節された５０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌよりなる水性バッファー中に製剤化された５ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を含む。
【００８９】
典型的には、組成物は、液体溶液または懸濁液としての注射剤として調製されてもよいし、注射前の液体ビヒクルへの溶解または懸濁に適した固体形態としても調製されうる。また、該調製物は、前記のとおり、アジュバント効果の増強のために、リポソームまたは微粒子（例えば、ポリラクチド、ポリグリコリドもしくは共重合体）中に乳化またはカプセル化されてもよい（Langer, Science 249, 1527 (1990) およびHanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997)を参照されたい）。本発明の物質は、有効成分の徐放または脈動的（pulsatile）放出を可能にするよう製剤化されうるデポー注射剤またはインプラント製剤の形態で投与されうる。
【００９０】
他の投与方法に適した他の製剤には、経口用、鼻腔用および肺用製剤、坐剤、ならびに経皮製剤が含まれる。
【００９１】
該化合物は血液脳関門に侵入することになるため、該製剤は、好ましくは、ＢＢＢを通過することが可能な製剤であろう。これは、ＢＢＢに輸送されることが公知であるリポソームまたは粒子を使用することにより鼻または眼投与により達成されうる。
【００９２】
ＢＢＢ投与は、ＢＢＢを通過させるための他の方法によっても達成可能であり、内因性輸送系の利用、例えば担体媒介輸送体、例としてグルコースおよびアミノ酸担体の利用；インスリンまたはトランスフェリンに関する受容体媒介トランスサイトーシスの利用；ならびに能動流出輸送体、例えばｐ−糖タンパク質の遮断を含みうる。
【００９３】
本発明の活性物質の量は、投与方法、患者の年齢、体重、性別ならびに治療すべき疾患の種類および重症度に応じて決定されるべきである。
【００９４】
一般に、全長レプチンタンパク質が使用される場合のその量は、０．０２ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．０２８ｍｇ／ｋｇ／日〜２ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは０．０２ｍｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００９５】
実験方法
細胞および試薬
ＰＣ−１２細胞は、O. Meyuhas（Dept. of Biochem., Faculty of Medicine, Jerusalem）から快く贈呈されたものである。これらの細胞を、該細胞を分化させる神経成長因子（ＮＧＦ）（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下において１％ウマ血清、または８％ウマ血清、８％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、グルタミンおよびゲンタマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）内で増殖させた。マウスレプチンはA. Gertlerから提供された。ＡＩＣＡＲはToronto Research Chemicals（TRC）から入手した。
【００９６】
マウス
この実験プロトコールは動物の使用に関する組織委員会により承認された（Ｎｏ．ＭＤ−８９．５２−４）。８〜１０週齢の雌Ｓａｂｒａマウス（２９〜３２ｇ）を、１０匹のマウスの異なる群に無作為に割り付けした。供給された食餌はピューリナ飼料（Purina chow）であった。
【００９７】
食餌制限
対照マウスには任意量の食餌を与えた。食餌制限（ＤＲ）マウスには、必要量の６０％としての５７ｋＣａｌ／週／マウス（２．１６ｇ／日／マウス）の食餌、または４０％ＤＲとしての３８ｋＣａｌ／週／マウス（１．４４ｇ／日／マウス）の食餌を与えた。ＤＲは１０日間行った。実験の第２週に、８アーム空間迷路（eight-arm spatial maze）を使用して行動試験を行った。該行動試験中に、各群の動物の半分にＡＩＣＡＲ（２５８〜５１６ｍｇ／ｋｇに等しい１〜２ｍＭ）またはレプチン（１ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ｉ．ｐ）注射し、残りの半分に食塩水を投与した。該行動試験後、マウスを断頭により犠死させ、海馬を−７０℃で凍結した。
【００９８】
ＲＴ−ＰＣＲ分析
総海馬ＲＮＡを、ＴｒｉＦａｓｔ試薬を製造業者の指示に従って使用して抽出し、逆転写した。ＯＢＲｌｏｎｇに特異的なプライマーはGATGTTCCAAACCCCAAGAAおよびCATAGCTGCTGGGACCATCTであった。ＯＢＲｓｈｏｒｔに特異的なプライマーはATCTGCCGGTGTGAGTTTTCおよびCCAGTCTCTTGCTCCTCACCであった。ＢＡＸに特異的なプライマーはCTGAGCTGACCTTGGAGCおよびGACTCCAGCCACAAAGATGであった。Ｂｃｌ−２に特異的なプライマーはGACAGAAGATCATGCCGTCCおよびGGTACCAATGGCACTTCAAGであった。アクチンに特異的なプライマーはCAGCTTCTTTGCAGCTCCTTおよびTCACCCACATAGGAGTCCTであった。すべてのプライマーはDanyel Biotechにより合成された。
【００９９】
免疫ブロット分析
ＴｒｉＦａｓｔ試薬を使用して総海馬タンパク質を抽出した。３０ｍｇのタンパク質を含有する清澄化溶解物のアリコートをＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（６％ＳＤＳ，３０％グリセロール，０．０２％ブロモフェノールブルー，２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）および２５０ｍＭメルカプトエタノール）中、９５℃にて５分間かけて変性させた。該サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミド）により分離し、ニトロセルロース膜上にブロットした。該膜をブロッキングバッファー（Ｔｒｉｓバッファー食塩水−Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ−Ｔ）中の５％脱脂乾燥乳）に室温で２時間浸漬することにより、ウエスタンブロット分析における非特異的結合を防いだ。ついで該膜を、１：１０００希釈された表示の抗体に室温で１時間さらした。ＡＭＰＫ、ホスホ−ＡＭＰＫおよびＰＡＲＰはCell Signalingから入手した。Ｂａｘ、ｂｃｌ−２およびアクチンはSanta Cruz Biotechnology Inc.（Santa Cruz, CA）から入手した。このブロットをＴＢＳ−Ｔ中ですすぎ、ついでホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体（１：１０，０００）と共に室温で１時間インキュベートした。Ｘ線フィルムで増強化学発光を検出することにより、抗体−抗原複合体を可視化した。
【０１００】
ＦＡＣＳ分析
細胞を６０ｍｍプレート内で増殖させ、ＡＩＣＡＲで４８時間処理した。アネキシン（Annexin）V FITC Detection Kit（Oncogene Research Products, Cambridge MA）を使用してアポトーシスを評価した。簡潔に説明すると、結合細胞および浮遊細胞の両方を集め、冷ＰＢＳで洗浄し、０．５ｍｌ  ＤＭＥＭに５×ｌ０５／ｍｌの密度で再懸濁させ、アネキシンＶに関して染色し、フローサイトメトリーにより分析した。
【０１０１】
免疫組織化学
マウスの心臓内にＰＢＳに溶解した４％パラホルムアルデヒドで潅流を行った。それらの脳を摘出し、更に同じ溶液中で固定した。同じ日に切断された５ｍＭ切片を脱ロウし、勾配エタノールを用いて水和させ、圧力釜において２５ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）中、１１５０Ｃで３分間で加熱し（デクローキング・チャンバー（decloaking chamber）, Biocare Medical）、沸騰脱イオン水中に移し、２０分間にわたり冷却放置した。３％Ｈ２Ｏ２中で５分間の処理の後、スライドを、ＣＡＳ−Ｂｌｏｃｋ（Zymed）中で１：１００希釈されたウサギポリクローナル活性化カスパーゼ３抗体と共に室温で３時間インキュベートし、Ｏｐｔｉｍａｘ（Biogenex）で３回洗浄し、抗ウサギＥｎｖｉｓｉｏｎ（DAKO）と共に３０分間インキュベートし、ＤＡＢで１５分かけて発色させた。
【０１０２】
カテコールアミンの測定
既に記載されているとおりに（Avrahamら (1996) , Brain Res. 732,133-144）、カテコールアミンを測定した。ドーパミンおよびＮＥに関するアッセイをＨＰＬＣ分離およびＨＰＬＣ−ＥＣＤを用いる検出により行った。値は濃度（ｎｇ／ｍｇ組織）で示されている。
【０１０３】
８アーム迷路
上記の動物を、ラット用に開発されたものの縮小形態である８アーム迷路（eight-arm maze）（Randtら,(1971) Science 172,489-499; Zivら (1994) Neuroscience Lett, 170,136-140）内に配置した。水の摂取を一晩制限することにより絶水を課し、各アームの末端で褒美として５０μｌの水が得られるようにした。マウスが全８アームに進入するかまたは２４回の進入を完了するかのいずれかが達成されるまで、該マウスを試験した。したがって、スコアが低ければひくいほど、行動能力は優れている。連続５日間にわたり毎日、迷路行動能力を測定した。式：（第２日＋第３日＋第４日＋第５日）−４＊（第１日）を用いて、結果を曲線下面積（ＡＵＣ）として表した。
【０１０４】
統計分析
データを平均および標準偏差（ＳＤ）または標準誤差（ＳＥＭ）として表した。結果を一元配置分散分析および両側ｔ−検定により評価した。Tukey-Kramer多重比較法を用いて、事後試験を行った。
【実施例１】
【０１０５】
栄養欠乏は用量依存的海馬ＡＭＰＫ活性化を誘導する
栄養がどのようにして認知機能をモジュレーションしうるのかを研究するために、ＤＲに応答した海馬ＡＭＰＫ活性を測定した。マウスを異なるレベルの５日間のＤＲに無作為に割り付けし（１グループにつきマウス１０匹）、ついで犠死させた。６０％までのＤＲはＡＭＰＫリン酸化の約４倍の上昇を招き、一方、４０％ＤＲの場合にはそれは６倍であった。このことは、栄養欠乏に応答した、海馬におけるＡＭＰＫの用量依存的活性化を示している（図１Ａ）。
【実施例２】
【０１０６】
低レベルのＡＭＰＫ活性化は神経新生および認知を増進する
海馬におけるＡＭＰＫ活性化の機能を評価した。結果は、栄養欠乏が広い範囲にわたってＡＭＰＫを活性化しうることを示したため、このキナーゼの特異的薬理学的アクチベーターであるＡＩＣＡＲ（５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオシド）を使用して、これらの栄養効果を模擬した。マウスをブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）と食塩水または２５ｎＭ  ＡＩＣＡＲ（低レベル刺激）のいずれかとで１０日間にわたり１日１回処置した。歯状回におけるＢｒｄＵ−免疫反応性細胞の数は新たな細胞の生成速度の尺度となり、該処置後に有意に増加した（図１Ｂ）。つぎに、認知における付随的改善が生じるかどうかを判定するために、８アーム迷路を用いて行動試験を行った。２５ｎＭ  ＡＩＣＡＲで処置されたマウスは、対照より有意に良好な成果をもたらした。このことは、この化合物が認知機能に対して有益な効果を及ぼすことを示している（図１Ｃ）。
【実施例３】
【０１０７】
高活性化はカテコールアミン、認知障害および神経アポトーシスをモジュレーションする
海馬ＡＭＰＫ活性化の更なる増強の効果を研究するために、より高い用量のＡＩＣＡＲ（１〜２ｍＭ）をマウスに１０日間にわたり毎日注射した。そのような処置によって、ノルエピネフリン（ＮＥ）濃度が進行的に低下し（２回の投与に関してそれぞれｐ＜０．０５，０．０１）、ドーパミン濃度が上昇した（ｐ＜０．０５）（図１Ｄ）。これらの知見が海馬依存的空間記憶における変化に関連しているかどうかを更に調べた。高用量のＡＩＣＡＲが投与されたマウスは、任意量摂取群と比べて迷路行動能力における有意な悪化を示し、４０％までのＤＲを課したマウスと比べた場合にも同様であった（図１Ｅ）。これらのＡＭＰＫ効果に関与する細胞メカニズムを解明するために、アポトーシスに関連したタンパク質をＲＴ−ＰＣＲおよび免疫ブロット法により測定した。ＡＩＣＡＲ処置はＢａｘのアップレギュレーションを誘導し、ｂｃｌ−２を減少させ、それによりアポトーシスを促進した（図１Ｆ）。
【実施例４】
【０１０８】
高ＡＭＰＫ活性化はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける強力なアポトーシス細胞死を誘導する
海馬におけるＡＭＰＫの細胞効果を確認するために、ＰＣ−１２細胞上でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究も行った。同じ用量のＡＩＣＡＲ（０．１２５〜１．０ｍＭ）での分化細胞の処理は生存細胞数の用量依存的減少を誘導し、９６時間後にほぼ全体に達した（図２Ａ）。
【０１０９】
４８時間の時点におけるアポトーシス比もＦＡＣＳ分析により評価した。アネキシンＶ染色は、ＡＩＣＡＲ処理がアポトーシス細胞死を用量依存的に誘導することを示した（図２Ｂ）。
【実施例５】
【０１１０】
栄養状態はレプチンおよびその受容体の発現を示差的にモジュレーションする
レプチンはエネルギー収支の調節における重要なホルモンであり、他の系におけるＡＭＰＫ活性をモジュレーションすることが公知である１５，１６。脳機能をモジュレーションする際にレプチンがＡＭＰＫと相互作用しうる様態を更に調べた。異なる度合の食餌制限下、レプチンを機能的に分析した。マウスを無作為に３群に割り付けし、それらに１０日間にわたり食餌供給（ＡＬ）、６０％までのＤＲまたは４０％までのＤＲを行った。血清レプチン濃度（ＥＬＩＳＡ）は両方のＤＲ管理の実施直後に減少し、４日後にはほぼ検出不可能となった（図３Ａ）。ＲＴ−ＰＣＲによるレプチン受容体発現の分析は、食餌制限の度合の上昇に伴う短形態の漸増的上昇を示した。しかし、６０％までのＤＲはＯＢ受容体の長形態（機能性形態）の有意なアップレギュレーションを誘導したが、これは４０％ＤＲに対する応答では観察されなかった（図３Ｂ）。これらの結果に従い、海馬ＡＭＰＫリン酸化に対するレプチン投与の効果を調べた。１ｍｇ／ｋｇレプチンでの４０％食餌制限マウスの７２時間の処置はＡＭＰＫリン酸化を有意に低下させた（図３Ｃ）。
【実施例６】
【０１１１】
レプチンは認知、カテコールアミンおよび神経アポトーシスに対する過酷なＤＲの効果を好転させた
食餌制限マウスにおける神経機能に対するレプチン投与の効果（回復）を調べた。マウスを無作為に４群に割り付けした。それらの群に１０日間にわたり任意量の食餌を供給しまたは４０％までのＤＲを課し、第２週において１ｍｇ／ｋｇレプチンまたは食塩水を５日間にわたり毎日注射した。レプチンでの処置は４０％までのＤＲに関連した８アーム迷路行動能力の低下を好転させた。対照群はレプチン投与の影響を受けなかった（図４Ａ）。認知能の改善はモリス水迷路（Morris Water Maze）においても観察された（データ非表示）。ついで海馬におけるＮＥおよびドーパミンの濃度に対する効果を評価した。レプチンでの処置はＤＲ後のＮＥの減少を好転させた。レプチンはＡＬ群においてはドーパミン濃度をダウンレギュレーションしたが、ドーパミン濃度が既に減少していたＤＲ群においては有意な減少を誘導しなかった（図４Ｂ）。レプチン効果に関与する細胞メカニズムを解明するために、アポトーシスに関連するタンパク質を免疫ブロット法により決定した。レプチンはｂｃｌ−２のアップレギュレーションを誘導したが、Ｂａｘレベルを低下させた。ＰＡＲＰ切断の分析はレプチン処置後の切断サブユニットの減少を示し、このことは生存の方向への増加を示唆している（図４Ｃ）。レプチンの抗アポトーシス効果は、アポトーシス細胞死の活性化カスパーゼ３発現の検出により更に確認された。対照動物の海馬においては活性化カスパーゼ３は検出できなかった。レプチンは、４０％ＤＲ後に見られる活性化カスパーゼ３の免疫反応性を有意に低下させた（図４Ｄ）。
【実施例７】
【０１１２】
レプチンは過酷なエネルギー制限下の生存を増進する
過酷なエネルギー制限は神経機能の悪化を招き、最終的には死を招く。レプチンは４０％までのＤＲの後の認知機能を改善することが可能であり、神経アポトーシスを防止するため、それがこれらの同じ過酷な条件下でのマウスの生存をも促進しうるかどうかを調べた。第１の実験において、マウスに１２日間にわたり任意量の食餌を与えるかまたは４０％までのＤＲを課し、第２週において（５日間）、１ｍｇ／ｋｇレプチンまたは食塩水を毎日注射した。レプチン処置の場合にはマウスの９５％が生存し、一方、対照群では６５％であった（ｐ＜０．０５）。第２の実験においては、０．０５ｍｇ／ｋｇ／時レプチンまたは食塩水を連続的に１６日間にわたり送達する小型浸透圧ポンプを４０％ＤＲ実施中のマウス（各群１２匹）に移植した。類似した体重減少にもかかわらず、レプチン処置マウスは有意に長く生存した（カプラン・マイヤーログランク，ｐ＜０．０５，片側）。処置群における５０％生存は９日間から１４日間へ増加した（図５）。
【実施例８】
【０１１３】
レプチンは、グルコース欠乏により引き起こされる細胞死を防止する
培養心筋細胞を１、３、６時間にわたりグルコース欠乏に付し、前記のとおりにレプチンで処理した。細胞生存性をＷＳＴにより分析した。結果を図７に示す。レプチンは、グルコース欠乏後の心筋細胞の生存性を有意に増加させた。
【０１１４】
グルコース枯渇に１、３、６時間付された培養心筋細胞をレプチンで処理した。Ｓｔａｔ−３リン酸化（Ａ）およびＡＫＴリン酸化（細胞生存性および心臓保護に関する尺度）をタンパク質分析により測定した。結果を図８に示す。この図から示されるとおり、レプチンの投与は、ＡＫＴリン酸化により測定される細胞生存性を改善した。
【０１１５】
レプチンは条件ストレス後のアポトーシスを低減した。１、２、６時間にわたりグルコース欠乏条件に付された培養心筋細胞を１μｇ／ｍｌレプチンで処理した。アポトーシス細胞死をＦＡＣＳ分析により分析した。
【０１１６】
もう１つの実験においては、１、２、６時間にわたりグルコース欠乏条件に付された培養心筋細胞を１μｇ／ｍｌレプチンで処理した。アポトーシス細胞死をＦＡＣＳ分析により検出した。結果を図９に示す。示されるとおり、レプチンは、グルコース欠乏により引き起こされたアポトーシス死を低減した。
【実施例９】
【０１１７】
肝性脳症の実験モデルにおいてレプチンは神経学的スコア、活性および認知機能を改善し、生存を延長する
肝不全により引き起こされ肝機能が悪化した人においてよく見られる脳損傷である肝性脳症を実験的に誘発するために、マウスをＴＡＡで処置した。この動物の活動指数を評価した。図１０において示されるとおり、レプチンは疾患動物の活動を健常対照のレベルまで好転させることが可能であった。このことは、肝性脳症により引き起こされる認知機能の悪化をレプチンが予防する可能性があることを示している。図１１．レプチンは肝性脳症の実験モデルにおいて認知機能障害を好転させた。図１２．レプチンは肝性脳症の実験モデルにおいて死亡率を減少させた。図１３．レプチンは、肝性脳症の実験モデルにおいて、低下した神経学的スコアを好転させた。
【実施例１０】
【０１１８】
レプチンは、ＬＰＳにより引き起こされた認知機能障害を改善した
ＬＰＳ投与マウスを１ｍｇ／ｋｇレプチンで毎日処置し、ついで８アーム迷路に付した。図１４において示されるとおり、レプチンは疾患動物における認知機能を健常対照のレベルまで好転させることが可能であった。このことは、肝性脳症により引き起こされる認知機能の悪化をレプチンが予防する可能性があることを示している。
【０１１９】
参照文献
2009508847.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１Ａ】図１は、食餌制限がｉｎ  ｖｉｖｏで神経ＡＭＰＫ活性化を誘導することを示す。（Ａ）マウスに８０％、６０％および４０％までの食餌制限を課した。ＡＭＰＫの発現およびリン酸化を免疫ブロット法により分析した。
【図１Ｂ】（Ｂ）顆粒細胞層におけるおよび歯状回の亜顆粒領域におけるＢｒｄＵ＋細胞を、蛍光顕微鏡を使用して写真撮影した。
【図１Ｃ】（Ｃ）マウスを２５ｎＭ  ＡＩＣＡＲで処置しまたは未処置のままとし、ついで８アーム迷路（eight-arm maze）において試験した。実線は対照群を表し、破線は処置群を表す。
【図１Ｄ】（Ｄ）カテコールアミン濃度に対するＡＩＣＡＲの効果。
【図１Ｅ】（Ｅ）マウスを１〜２ｍＭ  ＡＩＣＡＲで処置し、８アーム迷路における行動能力を対照および４０％ＤＲの場合と比較した。
【図１Ｆ】（Ｆ）Ｂｃｌ−２およびＢａｘレベルをＲＴ−ＰＣＲおよび免疫ブロット法により分析した。黒塗の棒グラフはＢｃｌ−２タンパク質を表し、線影付きの棒グラフはＢａｘを表す。
【図２Ａ】図２は、栄養欠乏がＰＣ−１２細胞において用量依存的ＡＭＰＫ活性化を誘導することを示す。（Ａ）分化ＰＣ−１２細胞を前記と同様にＡＩＣＡＲで処理し、９６時間後に染色した。
【図２Ｂ】（Ｂ）該細胞をアネキシンＶ抗体およびヨウ化プロピジウムで同時染色し、ついでフローサイトメトリーにより分析した。アポトーシス細胞は各パネルにおける右側の２つの長方形により表される。
【図３Ａ】図３は、栄養状態がレプチンレベルおよび受容体をモジュレーションすることを示す。（Ａ）マウスを食餌制限下に１０日間維持し、血清レプチンをＥＬＩＳＡにより評価した。一番上側の破線は対照群を表し、一番下の破線は６０％ＤＲを表し、実線は４０％ＤＲを表す。
【図３Ｂ】（Ｂ）ＯＢ受容体の長形態および短形態のＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図３Ｃ】（Ｃ）マウスに食餌制限を課し、１ｍｇ／ｋｇレプチンの注射を行った。ＡＭＰＫの発現およびリン酸化を免疫ブロット法により分析した。
【図４Ａ】図４は、レプチンの投与が４０％ＤＲの細胞性、神経化学的および行動的効果を回復させたことを示す。（Ａ）マウスを、ＡＬまたは４０％までのＤＲにおいて、１ｍｇ／ｋｇレプチンの毎日注射で処置するかまたは処置しなかった。８アーム迷路試験を行った。
【図４Ｂ】（Ｂ）４０％までのＤＲにおけるカテコールアミン濃度に対する投与レプチンの効果。
【図４Ｃ】（Ｃ）Ｂｃｌ−２およびＢａｘレベルをＲＴ−ＰＣＲおよび免疫ブロット法により分析した。黒塗の棒グラフはＢｃｌ−２タンパク質を表し、線影付きの棒グラフはＢａｘを表す。ＰＡＲＰ切断を免疫ブロットにより分析した。
【図４Ｄ】（Ｄ）海馬切片における活性化カスパーゼ３を免疫組織化学法により分析した。
【図５Ａ】図５は、レプチンが過酷なエネルギー制限下の生存を延長させることを示す。皮下２００μｌ小型浸透圧ポンプから持続注入された食塩水または０．０５ｍｇ／ｋｇ／時レプチンでの処置中の４０％ＤＲマウスの体重および生存の評価。生存マウスの数および体重を１６日間にわたって毎日記録した。
【図５Ｂ】皮下２００μｌ小型浸透圧ポンプから持続注入された食塩水または０．０５ｍｇ／ｋｇ／時レプチンでの処置中の４０％ＤＲマウスの体重および生存の評価。
【図６】ＡＭＰＫに関する下流標的を示す。
【図７】レプチンは栄養ストレス後の生存を誘導する。１、３、６時間のグルコース欠乏に付された培養心筋細胞をレプチンで処理した。細胞生存度をＷＳＴにより分析した。
【図８】レプチン投与後の細胞生存および神経保護。１、３、６時間のグルコース欠乏に付された培養心筋細胞をレプチンで処理した。Ｓｔａｔ−３のリン酸化（Ａ）およびＡＫＴのリン酸化（細胞生存および心臓保護の尺度）をタンパク質分析により測定した。
【図９】レプチンは栄養ストレス後にアポトーシスを低減した。培養心筋細胞をグルコース欠乏に付し、１μｇ／ｍｌレプチンで処理した。アポトーシスをＦＡＣＳにより分析した。
【図１０】レプチンは肝性脳症の実験モデルにおいて活動を対照レベルまで好転させた。マウスをＴＡＡで処置し、ついで１ｍｇ／ｋｇレプチンを５日間にわたり毎日投与し、活動指数を評価した。
【図１１】レプチンは肝性脳症の実験モデルにおいて認知機能障害を好転させた。マウスをＴＡＡで処置し、ついで１ｍｇ／ｋｇレプチンを５日間にわたり毎日投与した。８アーム迷路において認知機能を評価した。
【図１２】レプチンは肝性脳症の実験モデルにおいて死亡率を減少させる。マウスを任意量の食餌摂取または４０％までのＤＲ条件で維持した。ＴＡＡをレプチンの存在下または非存在下で投与した。処置死亡率を毎日記録した。
【図１３】レプチンは、肝性脳症の実験モデルにおいて、低下した神経学的スコアを好転させた。マウスをＴＡＡで処置し、ついで１ｍｇ／ｋｇレプチンを５日間にわたり毎日投与し、神経学的スコアを評価した。
【図１４】レプチンは、ＬＰＳにより引き起こされた認知機能障害を改善した。ＬＰＳ投与マウスを１ｍｇ／ｋｇレプチンで毎日処置し、ついで８アーム迷路に付した。示されるとおり、レプチンは疾患動物における認知機能を健常対照のレベルまで好転させることが可能であった。このことは、肝性脳症により引き起こされる認知機能の悪化をレプチンが予防する可能性があることを示している。
【図１Ａ】
2009508847.tif 000004
【図１Ｂ】
2009508847.tif 000005
【図１Ｃ】
2009508847.tif 000006
【図１Ｄ】
2009508847.tif 000007
【図１Ｅ】
2009508847.tif 000008
【図１Ｆ】
2009508847.tif 000009
【図２Ａ】
2009508847.tif 000010
【図２Ｂ】
2009508847.tif 000011
【図３Ａ】
2009508847.tif 000012
【図３Ｂ】
2009508847.tif 000013
【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
2009508847.tif 000019
【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2009508847.tif 000023
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
2009508847.tif 000030
2009508847.tif 000031
2009508847.tif 000032
2009508847.tif 000033
2009508847.tif 000034
2009508847.tif 000035