(57)【要約】  本発明は、抗体−抗原複合体の存在を証明する磁気的な免疫検査方法に関する。そのような一つの方法は、抗体または抗原、好ましくは抗−抗原抗体または血液型の抗原の調査および／または同定を含み、赤血球などの細胞に保有されうる抗原で被覆された磁性粒子懸濁液を備える。本発明はそのような一つの方法を実行するための装置およびキットにも関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中に存在する抗体と磁性粒子に結合された抗原との反応により形成された特定の複合体の存在の証明方法であって、
前記反応は開口された頂部と封じられた底部とを有する反応器内で発生し、
当該反応器の直径は、底部へと下方に伸びる傾斜壁を形成するように、底部に近接した領域で小さくなり、
当該傾斜壁は、前記形成された複合体の抗体に対して結合しうる抗免疫グロブリンまたは他の化合物で少なくとも一部が被覆され、
次のステップからなることを特徴とする方法：
ａ）反応に先立って、
反応器の傾斜壁の少なくとも一部が被覆されるような粘性材料または均一なゲルによる反応器の予備的な充填、
ｂ）前記抗体を含むまたは含む可能性が高い溶液の、前記抗原を有するまたは有する可能性が高い磁性粒子懸濁液への、反応器内の粘性溶液上の位置での接触、
ｃ）反応器の定温保持、好ましくは前記複合体の形成に必要とされる時間および温度での定温保持、
ｄ）磁性粒子が反応器の底部および／または傾斜壁へと引き込まれるような前記反応器への磁場の印加および反応器の攪拌、および
ｅ）目視および／または他の適切な読み取りシステムによる、前記抗体に結合可能な抗免疫グロブリンもしくは他の化合物で被覆された反応器の底部および／または反応器の傾斜壁で得られた画像の読み取りであって、得られた画像は、特定の抗体／抗原複合体の存否を可能とするものである。
【請求項２】
前記抗体を含むまたは含む可能性が高い溶液と前記抗原を有するまたは有する可能性が高い磁性粒子懸濁液とを混合することにより得られる反応混合物は、磁性粒子に保有された抗原に対するものでなく、かつ前記抗体に結合可能な抗免疫グロブリンまたは他の化合物に結合可能である一つまたは二つ以上の抗体を有することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ステップｄ）において、前記反応器への磁場の印加および反応器の攪拌が同時に実行されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｄ）において、前記反応器への磁場の印加および反応器の攪拌が、2.5〜10分間、同時に実行されることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ステップｄ）において、前記反応器への磁場の印加および反応器の攪拌が、５〜６分間、同時に実行されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップｄ）において、磁性粒子が反応器の底部へと引き込まれるように、磁場の印加は反応器の外側の下に配置された磁石によって行われることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ステップｄ）において、前記磁石が10,000〜14,000ガウスの磁力の永久磁石であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップｄ）において、攪拌が回転攪拌器によって行われることを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ステップｄ）において、攪拌が250〜750rpmで行われることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｃ）において、定温保持時間が10〜30分間であることを特徴とする、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ステップｃ）において、定温保持が20〜40℃で行われることを特徴とする、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ステップｂ）において、定温保持が37℃±1℃で行われることを特徴とする、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
磁気粒子の直径が100ｎｍ〜1.5μｍであることを特徴とする、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
磁気粒子が少なくとも40質量％の強磁性体化合物を含むことを特徴とする、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ステップａ）において、粘性材料または均一なゲルによる反応器の予備的な充填が、磁性粒子に結合された抗原であって前記抗体に対してステップｄ）で結合しうる抗免疫グロブリンまたは他の化合物で被覆された反応器の傾斜壁および底部を向く抗原との複合体を形成しない抗体が移動することを抑制するような、密度の粘性材料またはゲルを使用して行われることを特徴とする、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ステップａ）において、前記粘性材料またはゲルの密度が１以上であることを特徴とする、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ステップａ）において、前記ゲルがデキストランまたはアガロースゲルであることを特徴とする、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ステップａ）において、前記ゲルがＳｅｐｈａｄｅｘＴＭゲル、好ましくはスーパーファインＧ−１００ＴＭであることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップｂ）において、前記抗体を含むまたは含む可能性が高い溶液は、前記抗原を有するまたは有する可能性が高い磁性粒子懸濁液を堆積させることに先立って、前記粘性溶液上に堆積されることを特徴とする、請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ステップｂ）に先立って、前記粘性液体またはゲルは、ステップｂ）で堆積される前記反応混合物を希釈すべく、水溶液によって覆われることを特徴とする、請求項１から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ステップｂ）に先立って、前記粘性液体またはゲルは、ステップｂ）における抗体／抗原複合体の形成を促進すべく、水溶液によって覆われることを特徴とする、請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記反応器は丸いまたはＶ字の底部を有するマイクロプレート杯状体であることを特徴とする、請求項１から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
ステップｄ）において、攪拌が直径1.0〜2.5ｍｍの回転軌道を有する回転攪拌によって行われることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
抗体溶液はヒト血漿または血清サンプルであって、磁性粒子に結合された抗原に特異的に対する抗体の存在の証明が調査されており、抗免疫グロブリンはヒト抗免疫グロブリンであることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップｅ）において、反応器の最底部に磁性粒子が集まることは、特定の抗体／抗原複合体の生成がないことによって特徴付けられ、または抗免疫グロブリンによって被覆された傾斜壁における磁性粒子の少なくとも一つの可視部分の存在が前記複合体の生成を特徴付けることを特徴とする、請求項１から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
溶液中に存在する抗体およびそれ自体一つもしくはそれ以上の磁性粒子に結合された細胞に保有される抗原の反応により形成される特定の複合体の存在を証明する請求項１から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞が赤血球であって、溶液中に存在する血液型の坑−抗原抗体と血液型の抗原との反応により形成される特定の複合体の存在を証明する請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
抗原を保有する赤血球懸濁液は、あらかじめアルブミン溶液と接触した磁性粒子に対して吸着により結合されるステップを含む、血清または血漿サンプル中の不規則凝集素調査（Irregular Agglutinin Research, IAR）のための請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ステップｂ）における抗体溶液は公知の血液型の坑−抗原抗体を含むテスト用の血清溶液である、赤血球のフェノタイピングのための請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
磁性粒子の結合に先立って、赤血球はプロテアーゼの作用を受けることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
磁性粒子に結合された赤血球懸濁液中の赤血球濃度は０．１％から０．５％であることを特徴とする請求項２７から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
溶液中に存在する抗体と磁性粒子に結合された抗原との反応により形成された特定の複合体の存在の証明、または溶液中に存在する血液型の坑−抗原抗体と赤血球により保有される血液型の抗原との反応により形成された特定の複合体の存在の証明、またはＩＡＲもしくは血液型のフェノタイピングのための装置であって、
ａ）−開口された頂部と封じられた底部とを有し、底部へと下方に伸びる傾斜壁を形成するようにその底部に近い領域の直径が小さくなっている反応器または一連の反応器であって、前記傾斜壁は、前記形成された複合体の抗体に対して結合しうる抗免疫グロブリンまたは他の化合物で少なくとも一部が被覆され、
−それぞれの反応器は部分的に粘性材料またはゲルによって満たされ、
ｂ）前記反応器の外側の下に配置される少なくとも一つの磁石または一連の磁石および前記反応器の回転攪拌システム、
ｃ）必要であれば、反応器の定温保持温度を一定にすることができる定温保持器、ならびに
ｄ）必要であれば、反応終了時におけるそれぞれの反応器内の磁化された赤血球が存在することおよびその位置を評価しうる読取システム
を含むことを特徴とする装置。
【請求項３３】
溶液中に存在する抗体と磁性粒子に結合された抗原との反応により形成された特定の複合体の存在の証明のためのキットであって、
ａ）少なくとも抗原により被覆されたまたは少なくとも抗原により被覆されるものである磁性粒子の懸濁液を含む試薬、および
ｂ）−開口された頂部と封じられた底部とを有し、底部へと下方に伸びる傾斜壁を形成するようにその底部に近い領域の直径が小さくなっている反応器または一連の反応器であって、前記傾斜壁は前記形成された複合体の抗体に対して結合しうる抗免疫グロブリンまたは他の化合物で少なくとも一部が被覆され、
−粘性材料もしくはゲルを有する容器、または必要に応じて、部分的に粘性材料またはゲルによって満たされた各反応器、および
ｃ）必要であれば、回転攪拌器と組み合わされた、前記反応器の外側の下に配置される少なくとも一つの磁石または一連の磁石
を含むことを特徴とするキット。
【請求項３４】
前記試薬が、前記磁性粒子が吸着されまたは連結される既知のフェノタイプのテスト用赤血球の懸濁液を含み、
同じ試薬に含まれる磁性粒子または磁性流体に吸着または結合するための既知のフェノタイプのテスト用赤血球の懸濁液を含む第二の試薬を含むこと
を特徴とするＩＡＲのための請求項３３記載のキット。
【請求項３５】
前記試薬が、血液型の坑−抗原抗体、好ましくはＩｇＧ型のものを含むテスト用血清を含み、さらに、そのフェノタイプが調査されるものである赤血球懸濁液に対して結合しうる磁性粒子の懸濁液または磁性流体溶液を含むこと
を特徴とする血液型のフェノタイピングのための請求項３３記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体／抗原複合体の存在の証明のための磁気的免疫診断方法に関する。そのような方法の一つは、抗体または抗原、好ましくは血液型の抗−抗原抗体または抗原の調査および／または同定に関連し、赤血球などの細胞により保有されうる抗原により被覆された磁性粒子の懸濁液を備える。本発明はまた、そのような方法の一つを実行するための装置およびキットを含む。
【背景技術】
【０００２】
近年、輸血は、ドナーの血液から得られた濃縮された赤血球の調製品（球状濃縮体）の静脈内投与からなる。
輸血の主たる危険性は、抗体とその被提供者（輸血を受ける人）の体内の赤血球抗原とをともに運ぶ可能性である。赤血球膜抗原、とりわけ血液型（または血液系）抗原、は赤血球（erythrocyte、red cellともred blood corpuscleとも呼ばれる。）の表面で見られ、免疫システムによって認識されて免疫反応を引き起こすことができる。
【０００３】
ドナーの赤血球は、被提供者がドナーの赤血球抗原に対する循環抗体を有していなければ、被提供者の血液と互換性があるといわれている。
血液型を構成する赤血球膜抗原の変異抗原の中で、２０以上のヒトの赤血球抗原系が今まで同定されており、ＡもしくはＢ抗原によるＡＢＯシステム、Ｄ，Ｅもしくはｅ、およびＣもしくはｃ抗原によるＲｈシステム、Ｋもしくはｋ抗原によるＫｅｌｌシステム、Ｄｕｆｆｙ（Ｆｙａ，Ｆｙｂ）、Ｋｉｄｄ（Ｊｋａ，Ｊｋｂ）、またはＭＮＳ、Ｌｅｗｉｓなどのような現実面では調査頻度の低いシステムが挙げられる。赤血球抗原の同じ組み合わせを有する個人は、同じ赤血球血液型に属する。いくつもの抗原システムを使用すれば、血液型はましてやなおさら複雑であり非常に多くの種類となる。
【０００４】
例えば自己免疫疾患の場合のような病的状態を除いて、個人の血清は、赤血球抗原に対する二種類の抗体を有しうる：
（ｉ）ＡＢＯシステムの抗原に対するいわゆる正常な（regular）抗体（例えば、Ｂ型の個人にある抗Ａ抗体）。これらはＩｇＭタイプの免疫グロブリンであり、インビトロで赤血球を凝集させることができる。この現象は、Ｂｅｔｈ−ＶｉｎｃｅｎｔおよびＳｉｍｏｎｉｎテストに用いて個人のＡＢＯ血液型をはっきりさせることに有用である。このＢｅｔｈ−Ｖｉｎｃｅｎｔテストはどの抗原が赤血球によって保有されているか（抗原フェノタイプ）を決定することを可能とし、Ｓｉｍｏｎｉｎテストは補足的研究を実行すること、換言すれば個人の血清の中で循環する抗Ａおよびおよび／または抗Ｂ抗体を検出することを可能とする。
【０００５】
Ｂｅｔｈ−Ｖｉｎｃｅｎｔテストにおいて、個人の赤血球は試験用血清または試験用抗体と接触され、これらのそれぞれはＡＢＯシステムの抗原に対する特定の抗体タイプを有している。それゆえ、これは試験用赤血球を用いる血清の凝集テストである。
【０００６】
Ｓｉｍｏｎｉｎテスト、別名カウンターテストにおいて、これらの循環抗体を含む個人の血清は、試験用赤血球（red cellまたはerythrocyte）と接触され、これらのそれぞれは、ＡＢＯシステムの特定の抗原グループに属する。それゆえ、これは試験用赤血球に対する血清の凝集テストである、
【０００７】
（ｉｉ）血漿の血清中での存在は任意的なものであって非ＡＢＯシステムの抗原に対するものである、いわゆる不規則性（または免疫）抗体。これは最も一般的にはＩｇＧを含み、これは外部の赤血球による抗原刺激に引き続いて、例えば、輸血の過程において、または母親の血液型には属さない胎児の赤血球抗原に対する母体免疫反応の結果として妊娠中でさえも、とりわけ出産時に生じる一つまたは複数の抗原に対する免疫に引き続いて、発生する。
【０００８】
これらの不規則性抗体の調査は、不規則性凝集調査（ＩＡＲ）と呼ばれる。このテストは、さまざまな赤血球抗原に対する個人のＩｇＧの血液中おける存否を検出するために使用される。このテストを実行するためには、その抗原が知られているテスト用赤血球に対するこれらのＩｇＧの結合を調査する。この方法は、同時に多くの種類の赤血球について実行され、結果の比較によって、ＩｇＧの存在が同定される。
【０００９】
ＲｈのＤ因子だけでなく、他のＲｈタイプ（Ｅ＞ｃ＞ｅ＞Ｃ）、Ｋｅｌｌ（Ｋ），Ｄｕｆｆｙ（Ｆｙ  ａ，Ｆｙ  ｂ），Ｋｉｄｄ（Ｊｋａ，Ｊｋｂ）などのような多くの免疫原性抗原の危険性はより大きい。
【００１０】
実際、適切な血液型を適切なときに得ることは不可能であろうから、特にいくつかの抗原の組み合わせはきわめて希であるから、輸血を行う際に全てのこれらの抗原を考慮することは不可能である。標準的な輸血は、ＡＢＯ式とＲｈ式（Ｒｈ＋またはＲｈ−）のみを考慮する。不規則性凝集の危険性がある場合には、いくつかの他のシステム、とりわけＲｈのＣおよびＥならびにＫｅｌｌ、ならびに時には他のシステムが考慮される。したがって、これらの危険性のある場合には、これらの不規則性凝集の存在および発生の危険性を考慮して、ドナーの血液型の被提供者の血液型との互換性を確保することが重要である。
【００１１】
それゆえ、不規則性の抗−赤血球抗原を有する輸血を受ける患者において、または危険性のある状況において、例えば複数の輸血を受けているが抗−赤血球不規則性抗原を有していない患者や、妊娠中の女性において、ドナーの赤血球が被提供者の抗体に対応する抗原を持っていないまたはその可能性が高いように、輸血される赤血球濃縮体ユニットを選択することが重要なことである。ドナーの赤血球を被提供者の血清や血漿に存在させる直接的な互換性テストによる赤血球濃縮体の投与に先だって、この互換性テストはこれらの患者について義務的なものであり、全ての被提供者について予防的に使用される。ＩＡＲに使用された手法において凝集反応および／または溶解反応が見つからないべきである。
【００１２】
臨床の輸血の実務において、赤血球表面における血液型の抗原の調査および同定（対応する正常な抗体の存在もまた調査されるＡＢＯシステムは除く。）に対応する赤血球のフェノタイプは、被提供者とドナーとの双方に関係する。
【００１３】
被提供者およびドナーにとって、危険度の状況に応じて互換性のある赤血球濃縮体を被提供者に提供できるように赤血球フェノタイプには３つの段階がある：
・ＡＢＯ型フェノタイプ（またはＡＢＯ型）の決定および正常なＲｈ（Ｄ抗原の存否）、
・Ｋｅｌｌ  Ｒｈフェノタイプの決定（Ｃ，Ｅ，ｃ，ｅおよびＫ抗原の存否）および
・拡張された（またはより大きな）フェノタイプの決定（Ｄｕｆｆｙシステム、Ｆｙ  ａおよびＦｙ  ｂシステム、Ｋｉｄｄシステム、Ｊｋ  ａおよびＪｋ  ｂシステムの抗原、ならびにＭＮＳシステム（Ｓおよびｓ抗原）の抗原、危険性の種類および／または被提供者の血清に発見された不規則性抗体に依存しておそらく調査される他の抗原の存否）。
【００１４】
被提供者および／もしくはドナーの赤血球の表面における血液型抗原の存否の調査および同定に使用される、または被提供者および／もしくはドナーの血清もしくは血漿についてのＩＡＲの場合における正常なもしくは不規則性の血液型抗−抗原抗体の存否についての調査および同定の目的で一般的に使用される手法は、当業者によく知られているものであり、ここでは記載されない。
【００１５】
フェノタイピングは、一般的に、適当な抗体を含むテスト用血清を用いる、問題になっている抗原の存否の調査からなる。好ましくは、このこれらのテスト用血清に含まれる抗体は、そのフェノタイプが調査対象の赤血球がテスト用血清に存在する抗体に対応する抗原を保有しているとき、その赤血球の全体または部分的な凝集を得ることを可能とする接着剤（ＩｇＭまたはＩｇＡ）である。しかしながら、接着剤でない（ＩｇＧタイプの）テスト用抗原を使用することは可能であって、その抗原において凝集は、抗免疫グロブリンによって引き起こされ、（間接クームス試験として知られている）遠心分離ステップとそれにより得られた残留物の再懸濁を経て視認可能となる。また、これらの赤血球に結合されたテスト用抗原が固相に結合された抗免疫グロブリンによって可視化される場合（免疫接着法）には、非接着性のテスト用抗原を使用することは可能である。結果物は裸眼でまたは適切な機器によって読み取られる。
【００１６】
テストされる患者の血清または血漿のサンプル内における、ＡＢＯのための正常なまたはＩＡＲのための不規則性の、血液型抗−抗原抗体の調査または同定のために、テスト用赤血球（erythrocyte、red blood corpuscleともtest red cell５とも呼ばれる。）は、多くの血液型システムのための公知の抗原性（ＡＢＯ，Ｒｈ，Ｋｅｌｌ，Ｄｕｆｆｙ，Ｋｉｄｄ，ＭＮＳｓなど）を有する患者の血清または血漿に接触される。ＩＡＲの場合には、存在している可能性が高い抗体は非凝集性である可能性がより高く、使用される手法は抗免疫グロブリンを用いて凝集させるまたは抗免疫グロブリンで被覆された固相への免疫接着による間接クームス試験である。
【００１７】
ＩＡＲにとって、第１ステップは、赤血球のパネルを使用することを含み、スクリーニング（最大数の抗原を含むように選択された、異なった血液型からの二つまたは三つの赤血球）と呼ばれ、不規則性抗体の存否を検出すること（しかし同定することではない。）を可能とする。スクリーニングにおいて陽性であるとき、存在する不規則性抗体の特異性の同定が赤血球のパネルによって実行され、これは赤血球同定と呼ばれ、非常に多くの公知の血液型システムにおける１０の異なるフェノタイプの赤血球を含む。
【００１８】
輸血の分野におけるフェノタイピングやＩＡＲに使用される手法には数多くの変形例が存在する。これらの手法は、マイクロプレート上、管内もしくはマイクロプレート杯状体の中でなされる手動のものであったり、または、サンプル分配器、試薬、攪拌器、定温保持器およびその使用される手法に適合されたソフトウエアによる自動読み取りによって完全に自動化されたものであったりする。
【００１９】
使用される手法は、血液型の抗−抗原抗体または血液型の抗原の存在が、透明の小型ろ過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）またはマイクロビーズ）を用いる遠心分離後の赤血球の凝集の証明に基づいている手法を含む。そのカラムでは、上端の開口部が定温保持チャンバーの役割をし、カラムのために選択されたカットオフしきい値が、遠心分離後の凝集した赤血球がカラムを通過すること防止している（特に、特許文献１および２参照。）。
【００２０】
フェノタイピングまたはＩＡＲが、遠心分離および引き続いての免疫接着の後の抗体で感作された赤血球の存在を証明することに基づく手法も引用することができ、その免疫接着は、ゲルまたは５つの赤血球のみが遠心分離中に通過可能なように濃度が選択された液体から構成される分離障壁を使用し、感作赤血球を捕捉して特徴的な画像をもたらすように、下層が抗免疫グロブリンで被覆された反応容器を用いる。これらの手法の中で、特許文献３を引用することができ、その文献には、反応混合物が（牛アルブミンやポリビニルピロリドン型溶液のような）高密度の媒体を通過するように遠心分離される血液のフェノタイピング法が記載されている。この方法は、感作赤血球のための洗浄ステップを除外できるという有利さを有する。特許文献４を引用することもでき、この文献には、赤血球上の血液抗原またはそのような抗原に結合する抗体の存在を決定するための一般的な方法が記載されている。この方法において、赤血球は、感作されていてもいなくても、抗体を含む液体の密度よりも高く赤血球よりも低い分離媒質を用いる遠心分離により結合されていない抗体から分離され、抗免疫グロブリンが固定化された反応容器の下層壁上において、感作赤血球は非感作赤血球から分離され、非感作赤血球は容器の底部に集められる。得られた最終的な画像の解析は、被分析物の存否それぞれに固有である。
【００２１】
フェノタイピングまたはＩＡＲに使用される手法の変形例の中で、おおむね、細胞に結合しうるサンプル内の被分析物を、磁性粒子を用いて調査するために開発された方法を引用することもできる。この方法は、ＩＡＲまたはフェノタイピングのために凝集を基本とする手法（凝集または固相への免疫接着による間接クームス試験）では必要されるプロセスである遠心分離を特に除外するためのものである。ＩＡＲに関しては、これはまた、続いてのステップで使用される抗免疫グロブリンを認識しうる非特異的な抗体を除去するように感作赤血球の洗浄が必要な場合である。
【００２２】
遠心分離ステップは実際、完全に自動化されるべき方法において、とりわけコストと遠心分離機の煩雑な特性、取り扱い性などにより、常に実行することが困難である。
磁性粒子は、配位子−受容体または抗体―抗原の複合体の検出のために長年にわたり使用されてきた。例えば、次の特許文献に記載された方法を引用することができる：
【００２３】
−特許文献５には、磁性を有するラテックス粒子が定温保持されたサンプル内における配位子の存在を決定する方法が記載されている。当該粒子は異なった色を有し、配位子に結合可能な抗体のような基質で被覆されている。この方法では、引き続いて定温保持媒体に磁場が印加され、最後に、凝集の存否が観察される、または
【００２４】
−特許文献６には、ある配位子に結合可能な抗原または抗体に感作されたゼラチン磁性粒子が定温保持されたサンプル内におけるこの配位子の存在を決定する方法が記載されている。引き続いて定温保持媒体に磁場が印加され、最後に、凝集の存否が観察されるこの方法では、反応容器を傾けた後の、とりわけＶ型の底部を有するマイクロプレート杯状体内でのこれらの粒子の、傾き状況が観察されることが特徴となっている。
そのような磁性粒子は免疫血液学ではフェノタイピングおよび／またはＩＡＲのためにすでに使用されてきている。以下は、そのような応用を記載する文献として引用されうる、
【００２５】
−特許文献７には、磁性ラテックスビーズに固定された抗体または抗原のような磁化されたマーカーを用いる免疫アッセイ方法が記載されている。これらのマーカーは、免疫反応ステップにおいて決定されるべきものである基質に結合することができる。ラベル付きの磁性粒子は次に、測定容器の壁表面の予め規定された領域に、この杯状体の下方に配置された磁石を用いて磁場の影響のもとで収集される。この方法は、測定容器の壁表面の予め規定された領域に固定されるものである、決定される基質に特異的に結合しうる基質を含みうる。マイクロプレート杯状体に予め固定された赤血球が被提供者の血清で感作されたのち（洗浄液の吸引および注入によって）洗浄されるという免疫接着によるＩＡＲ手法の記載が存在する。この後、磁場の印加に先立って、抗免疫グロブリンで被覆された磁性ラテックスビーズが添加される。
【００２６】
−特許文献８には、サンプル内に存在する可能性が高い生体基質の免疫接着による検出方法が記載されている。この方法では、フェノタイプされたりスクリーニングおよび／または同定パネルとして使用されたりする赤血球は、マイクロプレートの底部に予備的な固定がなされる。固定された赤血球のテスト用血清（フェノタイプ用）またはテストされる被提供者の血清（ＩＡＲ用）による感作後、杯状体は洗浄され、次いで抗免疫グロブリンで被覆された磁性ラテックスビーズが添加される。この方法において、テスト用基質に非特異的に結合された磁性粒子を移動させるように、連続的に二種類（垂直方向および円状）の磁場が印加される、および
【００２７】
−特許文献９には、磁場の存在下におけるポリカチオン性の化合物またはポリアニオン性の化合物による、サンプル内に含まれる基質に結合しうる磁性粒子の共凝集方法が記載されている。特に、当該文献には赤血球を含む血液全体のサンプルにおける血漿の分離が記載され、文献中、その方法は、磁石上に配置された容器への血液全体のサンプルおよびコハク酸化牛血清アルブミンで被覆された磁性流体（ＦｅＣｌ２／ＦｅＣｌ３）の連続的な添加を含み、こうして得られた赤血球粒子の凝集体は次に磁石に引き寄せられ、こうしてデカンテーションによって精製された血漿の収集が可能となる。当該文献にはさらに、血漿サンプル内の抗−Ｒｈ抗体（抗−Ｄ）定量化方法が記載されている。それは、上記の方法にしたがって準備され、蛍光Ｒｈ＋赤血球の懸濁液の存在下で定温保持され、その混合体にコハク酸化磁性流体およびポリブレンが連続的に添加される。ここで、抗免疫グロブリンの添加に先立って磁場印加およびデカンテーションにより赤血球は何回か洗浄される。血漿サンプル内の抗−Ｒｈ抗体の定量評価は、所定の容積で観察される蛍光量のゆらぎを解析することによる実験対照との比較によってなされる。
【特許文献１】欧州特許公開EP 0 194 212
【特許文献２】欧州特許公開EP 0 755 719
【特許文献３】欧州特許公開EP 0 058 780
【特許文献４】国際公開WO 98/02752
【特許文献５】国際公開WO 92/17781
【特許文献６】欧州特許公開EP 0 426 170
【特許文献７】欧州特許公開EP 0 351 857
【特許文献８】欧州特許公開EP 0 528 708
【特許文献９】欧州特許公開EP 0 230 768
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
それゆえ、他の抗原に対する抗体をも含む複合反応混合物における所定の抗原に対して特異的な抗体の存在を検出するすばやくかつ簡単な方法を利用可能とすることは有効であろう。そのような遠心分離ステップおよび洗浄ステップを有さない方法は、とりわけＩＡＲ目的で、マイクロプレートのような全自動化された実務的で入手可能なサポートにおいて使用できる有利さを提供する。
【００２９】
これがまさしく本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
丸みを帯びた底部と特定の抗原に結合可能な抗免疫グロブリンで被覆された傾斜壁マイクロプレート杯状体タイプの反応器において、本発明者は、遊離抗体、とりわけ他の抗原に対するものを含みうる複合反応混合物内で抗体と抗原との間で形成された特定の複合体を検出する簡単で効率的な方法であって、洗浄や遠心分離ステップが行われていない方法を開発した。本方法は細胞によって保有される抗原で被覆された磁性粒子懸濁液を使用し、大いに自動化されることができ、特に赤血球のＩＡＲ、必要であれば赤血球のフェノタイピングに適用される方法である。
【００３１】
この方法において、抗体／抗原複合体の存在は、免疫接着の結果として、反応器の傾斜壁上に形成された複合体の存在の可視化により反応の最後に決定される。
【００３２】
本発明者は、驚くべきことに、抗体溶液と抗原、とりわけ赤血球により被覆された磁性粒子の懸濁液とからなり、杯状体内で粘性溶液または密度が抗体溶液の密度よりも高いゲル上で形成されている反応混合物の定温保持に引き続いて、磁性粒子の懸濁液をこの粘性溶液またはこの分離ゲルを通過して抗免疫グロブリンで被覆された傾斜壁および／または杯状体の底部へと、杯状体の下方に設置された磁石を用いて得られる磁場によって移動させることが可能であることを見出した。移動後、免疫接着によって形成された特定の複合体の存在は可視化される。また、この方法では、抗免疫グロブリンの移動を飽和させる可能性が高い遊離抗原を生じることがない。
【００３３】
さらに驚くべきことに、本発明者は、粒子、特に被覆された赤血球が粘性溶液またはゲルを通過する移動を大いに促進するだけでなく、磁性粒子に担持される抗原が傾斜壁および杯状体の底部に結合された抗免疫グロブリンに衝突する可能性を高めるという、磁場および杯状体の回転攪拌の複合および同時効果によって、本方法を改善することが可能であることを見出した。
【００３４】
免疫接着手法において洗浄ステップを除外するために、抗体を含有する液体よりも高いが赤血球よりも低い密度の粘性溶液またはゲルを用いて、遠心分離によって（感作されたまたはそうでない）赤血球をこれらの赤血球に結合されていない遊離抗体から分離しうることは示されているものの（これまで引用した特許文献３、４を参照。）、本発明者は、抗原、とりわけ赤血球を担持する磁性粒子とともにこれらの粘性溶液やゲルを用いて、杯状体の外部の下方に配置された永久磁石によって作り出される磁場によって、特に磁場を反応器内の回転攪拌ステップと複合させることによって、遠心分離ステップを除外することが同様に可能であることを見出した。
【００３５】
それゆえ、第一の実施形態として、本発明の対象は、溶液中に存在する抗体と磁性粒子に結合された抗原との反応により形成された特定の複合体の存在の証明方法であって、反応は開口された頂部と封じられた底部とを有する反応器内で発生し、その反応器の直径は、底部へと下方に伸びる傾斜壁を形成するように、底部に近接した領域で小さくなり、この傾斜壁は、前記形成された複合体の抗体に対して結合しうる抗免疫グロブリンまたは他の化合物で少なくとも一部が被覆され、次のステップからなる：
ａ）反応に先立って、
−反応器の傾斜壁の少なくとも一部が被覆されるような粘性材料または均一なゲルによる反応器の予備的な充填、
ｂ）前記抗体を含むまたは含む可能性が高い溶液の、前記抗原を有するまたは有する可能性が高い磁性粒子懸濁液への、反応器内の粘性溶液上の位置での接触、
ｃ）好ましくは前記複合体の形成に適した時間、好ましくは少なくとも５分間および温度での反応器の定温保持、
ｄ）反応器の底部および／または抗体に対して結合しうる抗免疫グロブリンまたは他の化合物で被覆された傾斜壁へと磁性粒子が引き込まれるような、特に、大部分の粒子が反応器の底部に見つかるようなおよび／または抗体に対して結合しうる抗免疫グロブリンもしくは他の化合物によって傾斜壁に特異的に結合されるような前記反応器への磁場の印加および反応器の攪拌、および
ｅ）目視および／または他の適切な読み取りシステムによる、反応器の底部および／または前記抗免疫グロブリンで被覆された反応器の傾斜壁の読み取りであって、得られた画像は、それゆえ、特異的な抗体／抗原複合体の存否の証明を可能とするものである。
【００３６】
「溶液中に存在する抗体と磁性粒子に結合された抗原との反応により形成された特定の複合体」とは、本記載において、ある抗原を特異的に認識可能な抗体とこの抗原との間で形成された複合体であって、抗原に対して結合された磁性粒子上で形成されたものを意味する。
【００３７】
「特定の複合体」とは、細胞、とりわけ赤血球によって保有される抗原を特異的に認識可能な抗体とこの抗原との間で形成された複合体であって、抗原を保有する細胞が結合された磁性粒子上で形成されたものをも意味する。
一般的に、特異的な抗体／抗原複合体の抗体として、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡもしくはＩｇＥ、またはあらゆる他の抗原種類がありうる。
【００３８】
「形成された複合体の抗体に対して結合しうる抗免疫グロブリン」とは、ここでは、抗免疫グロブリンであって、多クローン性または単クローン性の、いかなる抗体、特にヒトの、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡもしくはＩｇＥ（全抗免疫グロブリン）、またはある特定の抗原種類、とりわけ特定の抗−ＩｇＧ抗体のいずれかについて認識し結合可能なものを意味する。そのような抗免疫グロブリン、特にヒトの抗免疫グロブリンは、当業者によく知られており、多くの提供者から入手可能である。それゆえ、ここでは詳細な説明、特にその製造方法に関しては行わない。
【００３９】
「形成された複合体の抗体に対して結合しうるいかなる化合物」とは、特にプロテインＡタイプの化合物またはプロテインＧタイプを意味し、これらは、抗原への認識と特異的な結合で当業者によく知られている。
【００４０】
「大部分の磁性粒子」とは、ここでは、反応混合物内の磁性粒子の数量の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％，８０％，８５％，９０％および９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％を意味する。
【００４１】
特に、抗原が細胞、とりわけ赤血球によって保有されているとき、「大部分の磁性粒子」なる用語は大部分の磁性粒子または大部分の細胞を意味し、大部分の細胞は、反応混合物内に存在する磁化された細胞の数量の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％，８０％，８５％，９０％および９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％を意味する。
【００４２】
抗原が細胞、とりわけ赤血球に保有されている特別な場合には、反応器に対する磁場の印加および反応器の攪拌に関するステップｄ）は、反応器の底部および／または抗体に対して結合しうる抗免疫グロブリンまたは他の化合物で被覆された傾斜壁へと磁性粒子または磁化された細胞が引き込まれように、特に、大部分の磁性粒子または磁化された細胞が反応器の底部に見出される、および／または抗体に対して結合しうる抗免疫グロブリンもしくは他の化合物によって傾斜壁に特異的に結合されるようになされるべきである。
【００４３】
好ましい態様として、本発明は、上記の発明において、抗体を有しているまたは有している可能性が高い溶液と抗原を保有しているまたは保有している可能性が高い磁性粒子懸濁液との定温保持後に得られる反応混合物が遊離抗体、特に磁性粒子に保有された抗原に対するものでないものを有しており、調査対象である抗体に対して結合しうるものである、使用された抗免疫グロブリンもしくは他の化合物にこの遊離抗体は結合可能である方法を含む。
【００４４】
「遊離抗体」とは、ここでは、磁性粒子に保有された抗原と複合体を形成していない抗体を意味する。
同様に好ましい実施形態として、本発明は、上記の発明において、溶液に含まれるまたは含まれる可能性が高い抗体であって、磁性粒子によって保有される抗原とにより特定の複合体が形成されるものは、ＩｇＧタイプの抗体、またはこの抗体が血液型抗原の抗体である場合には非凝集性抗体であって赤血球が対応する抗体を保有していることを特徴とする方法を含む。
【００４５】
さらに好ましくは、この抗体がＩｇＧタイプであるとき、抗ＩｇＧ、とりわけ（ヒト由来の抗体に対する）ヒト抗ＩｇＧが好ましい抗免疫グロブリンである。
特に好ましい実施形態として、本発明は、上記の発明において、ステップｄ）で反応器は磁場の存在下で攪拌される方法を含む。
【００４６】
ステップｄ）では、磁場印加ステップと反応器攪拌ステップとはいずれか一方を開始することで実行されてもよいが、少なくとも所定の時間、磁場の印加と攪拌とが同時に発生するように実行されてもよい。
【００４７】
明らかに、ステップｄ）において反応器の攪拌に先立って磁場の印加が実行され、このとき、磁場の印加のみ（攪拌なし）の時間は最大でも２分、好ましくは１分３０秒、１分、または３０秒を越えないという上記発明の変形例の方法も本発明に含まれる。磁場の印加に先立って攪拌が実行され、このとき攪拌のみの時間は最大でも２分、好ましくは１分３０秒、１分、または３０秒を越えないという場合もある。
【００４８】
特に好ましい実施形態として、本発明は上記発明において、ステップｄ）で磁場の印加が攪拌と同時に実行される方法を含む。
「同時に」とは、攪拌のみまたな磁場の印加のみが実行される時間が２０秒を超えないことを意味する。
【００４９】
この態様に関して、本発明は上記発明において、ステップｄ）で磁場の印加と攪拌とが同時に２．５分間〜１０分間実行される方法を含む。
好ましい実施形態として、本発明は上記発明において、ステップｄ）で磁場の印加と攪拌とが同時に４分間〜７分間の範囲、さらに好ましくは５分間〜６分間実行される方法を含む。
【００５０】
本発明は上記発明において、ステップｄ）で、磁性粒子が反応器の底部へと、好ましくは反応容器の縦軸に沿って引き込まれるように、磁場の印加は反応器の外側の下に配置された磁石によって実行される方法を含む。
【００５１】
本発明の方法の好ましい実施形態様として、ステップｄ）において、上記の磁石が、8000〜16000ガウスの範囲、好ましくは10000〜14000ガウス、さらに好ましくは11500〜12500ガウス、特に好ましくは12000ガウスの磁力の永久磁石である方法を含む。
【００５２】
好ましい実施形態として、本発明は上記発明において、ステップｄ）で、攪拌が回転攪拌器によって行われる方法を含む。
「回転攪拌器」とは、ここでは、特に、一体化された反応器、または９６杯状体マイクロプレート（図１Ａおよび１Ｂ参照。）の場合には反応器セットを有する回転プラットフォームを意味する。
【００５３】
特定の攪拌の様式として、本発明は上記発明において、ステップｄ）で、攪拌が、反応器の最大直径が７ｍｍのとき直径１．０ｍｍから２．５ｍｍ、好ましくは直径１．２５ｍｍから２．２５ｍｍ、１．５ｍｍから２ｍｍ、２ｍｍとなる比率の軌道を有する回転攪拌からなる方法を含む。
【００５４】
「比率」は、例えば、最大直径が７ｍｍの２倍または半分となったとき、対応する上記の回転軌道の直径は２倍になったり半分になったりすることを意味する。
【００５５】
「回転タイプの攪拌装置の軌道」とは、攪拌プロセス中における反応器の最低部（反応器の縦軸の最低点５）によって示される円の直径を意味する。
【００５６】
好ましい実施形態として、本発明は上記発明において、ステップｄ）で、攪拌が250〜750rpm、好ましくは400〜600rpmで行われる方法を含む。
特別な実施形態として、各反応器の間に配置された磁石が攪拌プラットフォームの一部を形成する（図１Ａおよび１Ｂ参照。）。
【００５７】
この場合に、反応器の下に配置された磁石の縦方向の中心軸は、攪拌中、反応器の縦方向の中心軸によって形成される軌道に従う。
【００５８】
特別な実施形態として、各反応器の間に配置された磁石は攪拌プラットフォームに対して固定されない。この場合には、反応器の下に配置された磁石の縦方向の中心軸は動かず、攪拌中、反応器の縦方向の中心軸によって形成される軌道に従わない。
【００５９】
本発明は上記発明において、ステップｃ）で、定温保持時間が10〜30分間、好ましくは15〜25分間である方法を含む。
【００６０】
好ましい実施形態として、本発明は上記発明において、ステップｃ）で、定温保持が10℃〜40℃、好ましくは25℃〜40℃、30℃〜40℃、好ましくは約37℃（37℃±1℃）で行われる方法を含む。
【００６１】
好ましい実施形態として、本発明は上記発明において、ステップｂ）で、定温保持が30℃〜40℃、好ましくは37℃で行われる方法を含む。
【００６２】
磁性粒子を含む免疫診断における捕捉および三細胞（tri-cellular）手法は、膨大な刊行物の主題となってきており、当業者にとってよく知られている。
【００６３】
これらの手法の中で、磁性粒子の機能化を利用するものを引用することができ、それゆえ、それは、適切な条件で適した試薬を用いて、粒子に対して共有結合的に結合されるべきものである抗原と反応しうる表面上に反応性官能基、とりわけ、最も一般的なものとして引用すれば、酸基、アミノ基、エポキシまたはアルデヒド基を得ることを可能とする。
【００６４】
粒子に対して結合されるべきものである抗原の受動的な吸着を利用する手法をも引用することができ、それは、とりわけ、抗原およびこの受動的吸着が実行されるべき条件に依存して正または負に荷電されたビーズとすることを可能とする適切な処理によりなされる。
【００６５】
本発明の目的の使用に適した磁性マイクロビーズ（または粒子）の提供者として特にＡｄｅｍｔｅｃｈ（３３６００  Ｐｅｓｓａｃ，Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、Ａｄｅｍｔｅｃｈは、酸またはアミンで機能化されうる直径約１００から５００ｎｍの磁性粒子のほかに、これらの官能基との所望の結合の実行を可能とする手順書および試薬を提供している。この企業はまた、直径約３００ｎｍ±３０ｎｍの機能化されていない疎水性粒子も提供する。この粒子は、後記する実施例において主として使用される。これらの磁性粒子は５０％以上の強磁性体による（酸化鉄のような）核からなり、この核は、ポリスチレンによって被覆されている。他の企業としてＢｉｏｃｌｏｎｅ社（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ）が挙げられ、この企業は全範囲の機能化磁性ビーズを提供する。さらに、Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の広範囲のＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭがあり、この企業は特に、ストレプトアビジン、トシルまたはカルボン酸基により活性化された磁性マイクロビーズを提供する。もう一つの企業としてＭｅｒｃｋ  Ｃｈｉｍｉｅ  ＳＡＳ（９４１２６  Ｆｏｎｔｅｎａｙ−ｓｏｕｓ−Ｂｏｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、異なった粒子径（３００ｎｍから２μｍ）の範囲で、最大５０％のフェライトを含むポリスチレンまたはジビニルベンゼンに基づく磁性マイクロビーズのＥｓｔａｐｏｒＴＭを有し、当該粒子は例えば酸またはアミノ基によって機能化されうるしそのままともしうる。これらの粒子は、強磁性化合物の存在下スチレンの高分子化を用いる方法によって調製される。最後に、磁性ポリマーラテックスが記載されている欧州特許EP0 038 730（Ｒｈｏｎｅ  Ｐｏｕｌｅｎｃ）、このほか、欧州特許出願EP0 150 714，EP0 190 006，EP0 238 353，EP0 249 357（Ｓｅｒｏｎｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）またはフランス国特許FR2262805およびFR2454098（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｇｌａｓｓ  Ｗｏｒｋｓ）に記載される磁性粒子を引用することができる。
【００６６】
本発明における「磁性粒子」なる用語は、鉄（ＩＩＩ）ポリ酸化負イオンと鉄（ＩＩ）のような少なくとも酸化度ＩＩのＭ（ＩＩ）の混合体から得られる磁性流体水溶液を意味し、磁性流体は、特に、フランス国特許ＦＲ２４６１５２１の実施例１から８に記載される方法によって得られるようなものである。
【００６７】
好ましくは、本発明の方法において使用されうる磁性流体溶液は、フランス国特許出願FR2461521の実施例１から８に記載される方法によって調製される磁性流体溶液を、赤血球が磁化されるためにその磁性流体溶液に接触したときに赤血球が溶解することを避けるために、水系の溶媒で、好ましくは界面活性剤（または洗浄剤）を存在させることなく希釈することで生じる。これは赤血球によって保有される抗原を使用する本発明の特に好ましい方法である。
【００６８】
好ましい実施形態において、その磁性流体溶液は、Ｆｅ（ＩＩＩ）ポリ酸化負イオンと少なくとも一つの酸化度ＩＩの金属Ｍ（ＩＩ）、好ましくはＦｅ（ＩＩ），Ｃｏ（ＩＩ），Ｍｎ（ＩＩ），Ｃｕ（ＩＩ）またはＮｉ（ＩＩ）のような第一遷移金属から選ばれる金属とからなる混合物によって調製されることによって特徴付けられる。
【００６９】
特に、その磁性流体溶液は、Ｆｅ（ＩＩＩ）ポリ酸化負イオンと、Ｈ＋，ＣＨ３＋，Ｎ（ＣＨ３）４＋，Ｎ（Ｃ２Ｈ５）４＋のような正イオンまたはポリ酸化負イオンにＮａ，Ｋ＋およびＮＨ４＋よりも高い水への溶解度をもたらしうるいかなる他の正イオンに結合された少なくとも一つの酸化度ＩＩの金属Ｍ（ＩＩ）とからなる混合物によって調製されうる。これらの正イオンは塩酸、酢酸のような適切な酸によって、またはテトラメチルもしくはテトラエチルアンモニウムの水酸化物によって保有されうる。
【００７０】
好ましくは、磁性流体を調製するためのＦｅ（ＩＩＩ）およびＭ（ＩＩ）のために選択される開始金属源は次の中から選ばれる塩である：
Ｆｅ（ＩＩＩ）のためには、フランス国特許FR2461521の第４ページ第１および２行に列記されるもの、とりわけ塩化第二鉄、および
Ｍ（ＩＩ）のためには、フランス国特許FR2461521の第４ページ第３から６行に列記されるもの、とりわけ塩化第一鉄。
【００７１】
好ましくは、磁性流体溶液はＦｅ（ＩＩＩ）と金属Ｍ（ＩＩ）との混合物から調製され、酸化度ＩＩの初期のモル濃度比率が２±１、好ましくは２±０．５、２±０．２５または２±０．１であることを特徴とし、Ｆｅ（ＩＩＩ）と酸化度ＩＩの金属（ＩＩ）の最も好ましい初期のモル濃度比率は２である。
【００７２】
さらにもっと好ましくは、水酸化ナトリウム、または水酸化テトラメチルもしくはテトラエチルアンモニウムのような適切な強アルカリが初期のＦｅ（ＩＩＩ）および金属Ｍ（ＩＩ）の塩の混合物に添加される。
【００７３】
さらに好ましくは、磁性流体水溶液は緩衝液または食塩水で予備的な希釈がなされる。
ある用途では、感度または反応速度が向上されるべきものであるとき（しかしながらテストの非特異性は増加させることない）に特に、低イオン強度緩衝液（ＩＳＢ）、ＬＩＳＳ緩衝液とも称される、を使用することができる。
【００７４】
好ましい実施形態において、上記の緩衝液または食塩水によって磁性流体溶液は０．２５から１０％（ｖ／ｖ）、好ましくは０．２５から５％、０．２５から２．５％、０．２５から１％、および０．２５から０．７５％に希釈される。
【００７５】
好ましい実施形態において、本発明は上記発明において、磁性粒子は１００ｎｍから１．５μｍ、好ましくは、１５０ｎｍから１．２μｍ、２００ｎｍから１μｍ、または２００ｎｍから８００ｎｍ、の直径を有する方法を含み、２００ｎｍから８００ｎｍが最も好ましい。
【００７６】
好ましい実施形態において、本発明は上記発明において、磁性粒子は少なくとも３５質量％、好ましくは少なくとも５０質量％の強磁性化合物（例えばフェライトまたは酸化鉄）を有する方法を含み、少なくとも７０質量％であって強磁性化合物が酸化鉄であることが好ましい。
【００７７】
さらに好ましくは、特定の複合体の抗原が細胞、とりわけ赤血球によって保有されているとき、磁性粒子は疎水性であって、界面活性剤、好ましくはノニオン性洗浄剤の存在下で予備的な洗浄を受けている。
【００７８】
好ましい実施形態において、本発明は上記発明において、ステップａ）で、粘性材料または均一なゲルによる反応器の予備的な充填は、ステップｄ）の間に、磁性粒子に結合された抗原との複合体を形成しない抗体が、その抗体を認識しうる抗免疫グロブリンまたは他の化合物で被覆された反応器の傾斜壁および底部に移動することを妨げるような密度の粘性材料またはゲルを使用して実行される方法を含む。
【００７９】
好ましい実施形態において、本発明は上記発明において、ステップａ）で、粘性材料またはゲルの密度が１以上である方法を含む。好ましくは、粘性溶液は血清アルブミン、特にウシ血清アルブミン、またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ−４０またはＰＶＰ−６０）、さらにはゼラチンに基づいている。
【００８０】
均一なスーパーファインＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ  Ｇ−１００ゲル溶液についての実施例として以下に記載された手順書を、（細胞に保有されているまたは保有されていない）抗原の性質ならびにフェライト磁性粒子の大きさおよび組成に応じて、これらの粘性溶液またはゲルを通過して完全な粒子の移動を得るように、とりわけ粘性溶液またゲルの最終濃度、移動時間（攪拌）、攪拌速度、および必要であれば回転攪拌の回転軌道を変化させることにより、他のタイプのゲルまたは粘性溶液に対して適用するために必要な知識を当業者は有しているであろう。
【００８１】
例えば、アルブミンまたはＰＶＰに基づく粘性溶液に関し、３０％±１０％の領域の濃度で用いられうる。
【００８２】
好ましい実施形態様において、本発明は上記発明において、ステップａ）で、ゲルがデキストランまたはアガロース（ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、すなわちＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ  ４Ｂまたは６Ｂ）である方法を含む。
【００８３】
同様に好ましい実施形態として、溶液がゲルタイプであるとき、ゲル溶液の密度を高めるために、ウシ血清アルブミンの存在下でこのゲルは調製され、好ましいゲル溶液における最終濃度は５％から１５％、好ましくは１０％±２．５％（単位はいずれもＷ／Ｖ）である。
【００８４】
好ましい実施形態において、本発明は上記発明において、ステップａ）で、粘性溶液またはゲルがＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ、またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、好ましくはＧ−１０ＴＭ、Ｇ−２５ＴＭ、Ｇ−７５ＴＭ、Ｇ−１００ＴＭ、Ｇ−１５０ＴＭまたはＧ−２００ＴＭであって、これらにおいてデキストランビーズの直径は２０ｎｍから３００ｎｍの範囲にありうる方法を含む。さらに好ましくは、ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭがスーパーファインＧ−１００ＴＭである。
【００８５】
さらにまして好ましくは、ゲルの濃度、特にまたはＳｅｐｈａｄｅｘＴＭまたはＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭの濃度は１．５％から６％、好ましくは２％から５％、２．５％から４％である。濃度が３％±０．５％であることは、とりわけＳｅｐｈａｄｅｘＴＭに、特にスーパーファインＧ−１００ＴＭとって最も好ましい。
【００８６】
好ましい実施形態において、本発明は上記発明において、ステップｂ）で、抗体を含むまたは含む可能性が高い溶液は、抗原を有するまたは有する可能性が高い磁性粒子懸濁液を堆積させることに先立って、粘性溶液上に堆積される方法を含む。  
【００８７】
好ましい実施形態において、本発明は上記発明において、ステップｂ）に先立って、粘性液体またはゲルは、ステップｂ）で堆積される反応混合物を希釈すべく、水溶液によって覆われる方法を含み、抗体溶液が希釈されていないヒト血清または血漿であるときにこのようにすることが好ましい。好ましくは、その抗体溶液またはサンプルを希釈するために使用される水溶液は、抗体溶液の体積の１から１０倍、さらに好ましくは２から７倍、３から６倍、または４から５．５倍の体積に相当する。４から５倍の容積が最も好ましい範囲であり、とりわけ９６凹タイプのマイクロプレート杯状体において好ましい。それゆえ、希釈溶液はＢＳＡをも含みうる（その好適濃度については後記参照。）食塩水になりうる。
【００８８】
好ましい実施形態において、本発明は上記発明において、ステップｂ）に先立って、粘性液体またはゲルは、ＨＡＧによって被覆された杯状体の壁にテスト用の抗体を含むサンプル（血清または血漿）が直接的に接触すること、または粘性溶液またはゲルとこのサンプルが交じり合うことを防ぐためにも、水溶液によって覆われる方法を含む。すなわち、その血清または血漿サンプルに含まれる非特異的な抗体を有する壁面の底部における被覆されたＨＡＧとの反応または飽和は、検出対象である特定の抗体抗原複合体の結合を抑制するであろうから、この反応または飽和を防ぐためである。
【００８９】
好ましい実施形態において、本発明は上記発明において、ステップｂ）に先立って、粘性液体またはゲルは、希釈してステップｂ）における抗体／抗原複合体の形成を促進するように、水溶液によって覆われる方法を含む（図２Ａおよび２Ｂ参照。）。
【００９０】
この場合には、血液型の抗体／抗原によって形成される特定の複合体が、とりわけＩＡＲまたは赤血球フェノタイピングとの関連でその存在を証明されるべきものであって、この希釈された溶液は、血液免疫学の当業者にとってよく知られた低イオン強度緩衝液（ＩＳＢ）を用いて実行される反応を促進する。必要に応じて、このＩＳＢである低イオン強度緩衝液は、最終的な濃度が１．５％から６％、好ましくは２％から５％、好ましくは３％±１％の値（単位はいずれも（Ｗ／Ｖ））であるであるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下得られる。
【００９１】
いくつかの用途では、とりわけ（テスト対象の非特異性を増加させることなく）感度または反応速度を向上させることに関するとき、低イオン強度緩衝液ＩＳＢ、これはまたＬＩＳＳ（Ｌｏｗ  Ｉｏｎｉｃ  Ｓｔｒｅｎｇｔｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）緩衝液とも呼ばれる、は使用されうる。
【００９２】
緩衝液または食塩水は細胞生物学、とりわけ免疫血液学の領域において、赤血球の溶解を防ぐために、とりわけＩＡＲまたはフェノタイピングの用途において、一般的に使用される緩衝液を意味することを当業者は知っているだろう。そのような緩衝液または溶液は例えば、生理学的ｐＨとして６．８から７．５であって、得られる最終的な緩衝液のモル濃度が浸透圧の観点では０．９％の食塩水（約０．１５ＭのＮａＣｌ）のモル濃度と同様であるように、緩衝液の構成成分のモル濃度は調製される。特に、これに限定されることなく引用すれば、当業者にとってよく知られたものとして、ＰＢＳタイプのｐＨ７．０−７．４のリン酸塩緩衝液が挙げられる。
【００９３】
ＩＳＢまたはＬＩＳＳ緩衝液の組成は、それゆえ、凝集反応を促進しうることについて血液免疫学においてよく知られているので、ここでは記載しない。これらの緩衝液は血液学的試薬の提供者から入手可能である（例えば、これに限定されることなく引用すれば、次の組成を有するＬＩＳＳ緩衝液が挙げられる：１６ｇ／Ｌのグリシン、０．０３ＭのＮａＣｌおよび０．０１５Ｍのリン酸塩でｐＨが６．７）。
【００９４】
好ましい実施形態として、本発明は上記発明において、反応器は丸い底部（Ｕ字底部もしくは半球底部とも呼ばれる。）またはＶ字の底部を有するマイクロプレート杯状体である方法を含む。
【００９５】
抗体を認識しうる抗免疫グロブリンまたは他の物質によって杯状体の底部および傾斜壁があらかじめ感作されて（被覆されて）いるマイクロプレート杯状体タイプの反応器は、当業者によく知られた容易に入手できる（特に下記の実施例を参照。）。
【００９６】
好ましい実施形態として、本発明は上記発明において、抗体溶液はヒト血漿または血清のサンプルであって、磁性粒子に結合された抗原に特異的に対する抗体、好ましくは磁性粒子と凝集しない抗体、特にＩｇＧタイプの存在の発見を目的とし、抗免疫グロブリンがヒト抗免疫グロブリン、特にヒト抗ＩｇＧであることを特徴とする方法を含む。
【００９７】
好ましい実施形態として、本発明は上記発明において、ステップｅ）で、反応器の最底部での磁性粒子の収集は特定の抗体／抗原複合体の生成がないことによって特徴付けられる、または、抗免疫グロブリンによって被覆された傾斜壁における磁性粒子の少なくとも一つの可視部分の存在が複合体の生成の特徴となる方法を含む。
【００９８】
好ましくは、磁性粒子はこれらの粒子のよりよい可視化のために着色されていることができる。
【００９９】
好ましい実施形態として、本発明は上記発明において、溶液内に存在する抗体と、細胞またはウイルスの大きさと粒子の大きさとに依存してそれ自体は一つまたは複数の磁性粒子（上記の磁性流体タイプの溶液も含む。）によって結合される細胞またはウイルスによって保有される抗原との反応によって形成された特定の結合体の存在を証明する方法を含む。
【０１００】
好ましくは、細胞は、真核細胞、哺乳動物細胞もしくは酵母細胞、またはバクテリアから選ばれる。
【０１０１】
さらにより好ましくは、細胞は哺乳動物細胞、とりわけヒトの細胞であって、好ましくはリンパ球もしくはマクロファージタイプの白血球、または血小板もしくは赤血球である。
【０１０２】
特定の態様において、細胞に保有される抗原は細胞の外表面に自然に存在する抗原でなく、この場合は細胞の表面に共有結合もしくはイオン結合によってあらかじめ固定されたまたは吸着された抗原である。
【０１０３】
好ましい実施形態として、本発明は上記発明において、溶液中に存在する血液型の坑−抗原抗体と血液型の抗原との反応により形成される特定の複合体の存在を証明する方法を含み、細胞が赤血球であって、好ましくは抗原がその赤血球により保有される、自然界に存在する抗原である。
【０１０４】
この記載における「赤血球（erythrocyte, red cell, and red blood corpuscle）」は同一の“blood cell”と互換性のあるように使用される。
【０１０５】
好ましい実施形態として、本発明は、不規則性凝集素調査（ＩＡＲ）または血清もしくは血漿サンプル中の赤血球抗体、好ましくは非凝集性抗体の調査、あるいは赤血球フェノタイピングの方法に係る上記の発明において、抗原を保有する赤血球が、イオン結合性もしくは吸着によって磁性粒子に対し予備的結合を受けるか、または磁性流体溶液において懸濁状態にされるステップを有し、好ましくは、磁性粒子は機能化されておらず、かつ界面活性剤、好ましくはノニオン性界面活性剤の存在下で洗浄されている。これらの磁性粒子は、洗浄剤中の洗浄後、赤血球の吸着を促進するように、（０．０５から５％、好ましくは０．１から１％の）アルブミン溶液に接触していてもよい。
【０１０６】
この場合には、この粒子の処理またはその機能化、とりわけその結果としての表面電荷、がそのようなイオン結合もしくは吸着、または磁性粒子上の官能基に対するルブミンの共有結合を可能としているならば、とりわけこれらの粒子に結合されたカルボキシ基もしくはアルデヒド基がアルブミン（ＢＳＡ）のアミノ気、とりわけレジン残基と共有結合を形成することを可能とするならば、アルブミンはそれ自身磁性粒子の表面にイオン結合により結合されまたは吸着されている。
【０１０７】
好ましい実施形態として、本発明は上記発明において、ステップｂ）の抗体溶液は公知の血液型の坑−抗原抗体、好ましくはＩｇＧタイプを含むテスト用の血清溶液である赤血球のフェノタイピング方法を含み、ＩｇＧタイプの場合には、反応器は、使用される（動物もしくはヒトの）血液型の坑−抗原抗体を与える化学種に対する抗免疫グロブリン、またはこのテスト用血清に含まれる特定の抗体（とりわけＡもしくはＧタンパク質）を認識しうる他の化合物で被覆されている。
【０１０８】
好ましい実施形態として、本発明は上記発明において、磁性粒子への結合もしくは磁性流体溶液への懸濁の前または後、好ましくは前に、赤血球はプロテアーゼ、好ましくはブロメラインまたはパパインの作用を受けうる方法を含み、これは特定の複合体の生成を促進するものであり、このような血液フェノタイピング手法は当業者にとって公知である。
【０１０９】
好ましい実施形態として、本発明は上記発明において、反応器内の抗体溶液に添加される前の赤血球濃度、または磁性流体溶液中の最終的な赤血球濃度は、０．１％から０．５％、好ましくは５％から２．５％および０．７５％から２％、最も好ましくは１％±０．２５％である方法を含む。
【０１１０】
本発明に係るマイクロプレート杯状体内で実行されるＩＡＲおよび／またはフェノタイピングの特に好ましい方法において、その方法は次のステップを含む：
ａ）反応に先立って：
−反応器の傾斜壁の少なくとも一部が被覆されるような、１０％±２．５％のＢＳＡが存在するＬＩＳＳタイプ緩衝液にスーパーファインＳｅｐｈａｄｅｘＴＭＧ−１００ゲルを約３％±０．５％有する均一な５０μＬ±１０μＬの溶液による丸い底部を有する杯状体の予備的な充填、および必要に応じて、
−３％±１％のＢＳＡを有するＬＩＳＳ緩衝液であって好ましくはｐＨが６．５から７．５５の６０μＬ±１５μＬの添加、
−磁性流体溶液または磁性粒子によって磁化された赤血球の使用であって、大きさが１００ｎｍから１０００ｎｍまたは２００ｎｍから８００ｎｍである磁性粒子である場合には、機能化されていないことが好ましく、少なくとも４０％のフェライト（鉄の酸化物）を有していることが好ましく、さらに好ましくは、抗体と特定のものを形成しうる抗体を保有している赤血球に対してこれらの粒子がイオン結合的結合しにまたは吸着しうるようにＢＳＡで被覆されおよび／またはあらかじめ処理されてしまっている、
ｂ）杯状体内に含まれる均一なゲル溶液上での、必要であれば３％±１％のＢＳＡを有するＬＩＳＳ緩衝液上での、
−抗体を含むまたは含む可能性が高い２５μＬ±７．５μＬの溶液、および抗原を有するまたは有する可能性が高い磁性粒子で被覆された赤血球濃度が０．７５％から１．２５％（ｖ／ｖ）の赤血球懸濁液の
−抗体を含む１２μＬ±８μＬのサンプル（ＩＡＲの場合には血清もしくは血漿、またはフェノタイピングの場合にはテスト用血清）への接触、
ｃ）２０分±５分の時間の３７℃±１℃での反応器の定温保持、
ｄ）同時になされる、５分３０秒±１分間の反応器への磁場の印加および反応器の攪拌、および
ｅ）目視および／または他の適切な読み取りシステムによる、反応器の底部および／または抗免疫グロブリンで被覆された反応器の傾斜壁で得られた画像の読み取りであって、得られた画像は、特定の抗体／抗原複合体の形成の存否についての証明を可能とするものである。解釈はそれぞれ（特定の複合体が形成されない）陰性の画像および（複合体が存在する）陽性の画像の特徴を示している図３および図４の助けを受けて実行されてもよい。
【０１１１】
他の態様において、本発明の対象は、溶液中に存在する抗体と磁性粒子に結合された抗原との反応により形成された特定の複合体の存在の証明、好ましくは溶液中に存在する血液型の坑−抗原抗体と、それ自身がいくつかの磁性粒子に結合された赤血球により保有される血液型の抗原との反応により形成された特定の複合体の存在の証明、とりわけＩＡＲ、赤血球抗体の調査、または血液型フェノタイピングのための装置であって、次のものを含む：
ａ）−開口された頂部と封じられた底部とを有し、その少なくとも底部に近い領域の直径が、底部へと下方に伸びる傾斜壁を形成するように小さくなっている反応器または一連の反応器であって、傾斜壁は形成された複合体の抗体に対して結合しうる抗免疫グロブリンまたは他の化合物で少なくとも一部が被覆され、
−それぞれの反応器は部分的に粘性材料またはゲルによって満たされ、
ｂ）反応器の外側の下に配置される少なくとも一つの磁石または一連の磁石および反応器の回転攪拌システムであって、好ましくは、攪拌状態においても反応器と同じように磁石を配置するように、その攪拌システムは磁石または磁石を支持するプラットフォームとともに一つのユニットを形成し、
ｃ）必要であれば、反応器の定温保持温度を一定化することができる定温保持器、ならびに
ｄ）必要であれば、反応終了時においてそれぞれの反応器内の磁化された赤血球が存在することおよびその位置、とりわけ形成されたかもしれない特定の複合体の抗体に対して結合しうる抗免疫グロブリンまたは他の化合物で被覆された反応器の傾斜壁および底部について評価しうる読取システム。
【０１１２】
好ましい態様として、本発明は上記発明において、粘性材料またはゲルが、本発明に係る方法において定義された特性および同じ好適態様を有することを特徴とする装置を含む。このことは磁性粒子または磁化された細胞の懸濁液、磁石および回転攪拌器の特性についてもまた当てはまる。
【０１１３】
さらに好ましくは、本発明に係る装置は、反応器がマイクロプレート杯状体であって、好ましくは丸い底部（半球状）またはＶ字状の底部を有し、さらに好ましくは９６杯状体マイクロプレートであることで特徴付けられる。
【０１１４】
好ましくは、磁石は図１Ａおよび１Ｂに示される積層形状をなし、好ましくは積層形状をなす９６の磁石からなるプラットフォームであって、それぞれの磁石は杯状体の下に配置される。
【０１１５】
さらにまた別の態様において、本発明は、溶液中に存在する抗体と磁性粒子に結合された抗原との反応により形成された特定の複合体の存在の証明のためのキットに関連し、次のものを含む：
ａ）少なくとも抗原により被覆されたまたは少なくとも抗原により被覆されるものである磁性粒子の懸濁液を含む試薬、および
ｂ）−開口された頂部と封じられた底部とを有し、その少なくとも底部に近い領域の直径は、底部へと下方に伸びる傾斜壁を形成するように、小さくなっている反応器または一連の反応器であって、傾斜壁は形成された複合体の抗体に対して結合しうる抗免疫グロブリンまたは他の化合物で少なくとも一部が被覆され、
−粘性材料もしくはゲルを有する容器、または必要に応じて、部分的に粘性材料またはゲルによって満たされた各反応器、および
ｃ）必要であれば、反応器の外側の下に配置される少なくとも一つの磁石または一連の磁石であって、好ましくは、その磁石は回転機構の集積化された部分を形成し、好ましくは、最大直径が７ｍｍの反応器における攪拌の軌道は２ｍｍ±１ｍｍ（またはこの等価の比率）である。
【０１１６】
好ましくは、本発明はＩＡＲの発明において、試薬が既知のフェノタイプのテスト用赤血球を有し、その赤血球上に磁性粒子が吸着されているまたは結合されていることに特徴付けられる、または、フェノタイプが既知であるテスト用赤血球であって同じ試薬に含まれる磁性粒子または磁性流体に対して吸着または結合するためのものの懸濁液を有する第二の試薬を含むことに特徴付けられるキットに関する。
【０１１７】
好ましくは、本発明は血液型のフェノタイピングの発明において、試薬が血液型の抗−抗原抗体、好ましくはＩｇＧタイプを有するテスト用血清を含み、加えて、そのフェノタイプが調査対象である赤血球懸濁液に結合することができる磁性粒子の懸濁液または磁性流体溶液を試薬が含むことに特徴付けられるキットに関する。
【０１１８】
さらに好ましくは、本発明は、粘性材料またはゲルおよび必要に応じ磁性粒子または磁化された細胞の懸濁液、さらに必要に応じ磁石および回転攪拌器が、本発明に係る方法のために定義された特性を粘性溶液もしくはゲルまたは他の化合物および要素のために特定された特性をそれらの好適態様とともに有することに特徴付けられる本発明に係るキットに関する。
【０１１９】
さらに好ましくは、本発明は、反応器がマイクロプレート杯状体であって、好ましくは丸い底部（半球状）またはＶ字状底部を有し、最も好ましくはこのマイクロプレートが９６の杯状体からなることに特徴付けられる本発明に係るキットに関連する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１２０】
下記の図および見出しは実施例とともに、本発明の範囲をいかなる意味にでも限定することなく、本発明を説明するためのものである。
【実施例】
【０１２１】
実施例１：抗免疫グロブリンによる傾斜壁および杯状体底部の被覆
杯状体に使用されたプラスチックの化学的および物理化学的性質は、一層の（単クローン性または多クローン性ＨＡＧタイプの）ヒト抗免疫グロブリンであって、いかなる特定の複合体の抗体に対してもその複合体の抗体がヒト由来であるとき特異的に結合しうるもので、杯状体を覆うことを可能とする。
【０１２２】
さらに、このＨＡＧ組成物が相補型血清中タンパク質決定基に対する抗体を含みうることは記載されることができる。
ＨＡＧで被覆されていない容器の内壁の表面は、従来の固相飽和試薬またはＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immnosorbent Assay）式手法を用いて飽和されていてもよい。
【０１２３】
例えば、１から１０μｇ／ｍＬの濃度のＨＡＧ溶液は０．２ＭのｐＨ９．６炭酸塩緩衝液内で調整されうる。
【０１２４】
丸底Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ＮＵＮＣ  Ｕ８タイプのマイクロプレートの各杯状体内に７５μＬの容量でこの溶液は配分される。そして、これらのプレートは一晩４℃で定温保持される。
【０１２５】
次に、杯状体は、プラスチック上に直接吸着されていない全てのたんぱく質を除去するように、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ  １０  ２．５ｍＭ、ｐＨ７．４）を用いて洗浄される。
【０１２６】
続いて、杯状体１は、ＰＢＳ緩衝液中に３０ｇ／Ｌのアルブミン溶液を杯状体当たり１００μＬずつ用いて処理される。
室温で２時間定温保持された後、杯状体は再びリン酸緩衝液で洗浄される。
【０１２７】
実施例２：磁性粒子または磁性流体溶液によって磁化された赤血球の懸濁液の調製
Ａ）磁性粒子の使用
本実施例では、高い形状均一性（直径約３００ｎｍ）、強磁性材料の高い使用割合（５０質量％以上で、約７５質量％）、および（機能化されていない）高い疎水性の表面状態を有する常磁性の粒子を用いる。これらの粒子は、好ましくはノニオン性洗浄剤内での予備的な洗浄の後に、赤血球の磁化に直接的に使用されうる。
【０１２８】
これらの粒子はまた、複数の弱い結合が赤血球表面と粒子との間に生成されるようにして、赤血球を結合するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で処理されるステップの後に使用されうる。
【０１２９】
結合は二段階で発生する。第一段階は粒子をＢＳＡで活性化することからなり、一方、第二段階はＢＳＡで被覆されたこれらの磁性粒子がタンパク分解酵素により処理されていてもよいしまたはされていなくてもよい赤血球の懸濁液に接触することを含む。
【０１３０】
こうして得られた赤血球は磁場に引き寄せられ、それゆえ本発明に使用されうる。
ａ）第一のステップ、強磁性粒子のＢＳＡによる活性化
Ａｄｅｍｔｅｃｈタイプの疎水性で機能化されていない約３００ｎｍの粒子は予備的な洗浄およびノニオン性洗浄剤内の保存がなされる。
【０１３１】
必要であれば、これらの粒子をｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液に０．１％（質量／体積）のウシアルブミンを有する溶液に接触させる。磁場印加しない攪拌条件での室温で３０分間の定温保持の後、懸濁液中の粒子は磁石によって引き寄せられ、粒子に結合していない浮遊物は除去される。ＢＳＡで被覆された粒子残留物は、次に、赤血球磁化ステップに直接的に使用されうる。
【０１３２】
ｂ）第一のステップ、赤血球の磁化
適切な濃度のＬＩＳＳ緩衝液内に配置された球状体の懸濁液（０．６から１０％ｖ／ｖの細胞の懸濁液を用いて、必要であれば予め例えば食塩水により三度洗浄されて、赤血球の磁化は実行されうる。）は、前のステップで得られた強磁性粒子の残留物に添加される。十分な均一化が行われた後、懸濁液は３０分間室温で穏やかに一様に攪拌されて定温保持される。その後、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液内で赤血球は洗浄（遠心分離ごとに５００ｇを用いて３分間の洗浄を２回）される。続いて、磁化された赤血球残留物は、分析において使用される濃度にＬＩＳＳタイプ（またはＢＦＩタイプ）の緩衝液によって調製される。
【０１３３】
特別な実施例において、粒子の使用量と赤血球量との比率は、赤血球表面に存在する血液型抗原の劣化の危険を冒すことなく効果的な磁化が得られるように、１０から３０である。
【０１３４】
こうして得られた赤血球は（例えばＩＡＲ目的で）直接的に試薬として、または（フェノタイピング目的で）検体として使用されうる。このステージでは、必要であれば、目的の分析を行うように、ブロメラインまたはパパインのようなタンパク質分解酵素での処理をも受けうる。
【０１３５】
Ｂ）磁性流体溶液の使用
１）精製前の磁性流体の製造
材料および方法
特別な材料および生成物
−１つのフィルター、Ｓｔｅｒｉｃｕｐ  ＧＳ  ２００ｍｌ  ０．２２μｍ  （１０７９４３参照）
−１つの磁石
−２８〜３０％のＮＨ４ＯＨ溶液（ＡＣＲＯＳ、２０５８４００２５参照）
−６０％の硝酸溶液（ＮＯＲＭＡＰＵＲ、ＵＮ２０３１参照）
−ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（ＳＩＧＭＡ、２２０２９−９参照）
−ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（ＳＩＧＭＡ、Ｆ−２８７７参照）
【０１３６】
磁性流体の製造：
準備：
１／  ＦｅＣｌ３を１３．５１ｇ計量し濾過脱塩水２０ｍＬに磁場攪拌によって溶解させる。５０ｍＬの試験管にその溶液を移し、濾過脱塩水ですすいで５０ｍＬの容積に調整する（１Ｍ溶液）。
【０１３７】
２／  ＦｅＣｌ２を１９．８８ｇ計量し濾過脱塩水２０ｍＬに磁場攪拌によって溶解させる。５０ｍＬの試験管にその溶液を移し、濾過された脱塩水ですすいで５０ｍＬの容積に調整する（２Ｍ溶液）。
【０１３８】
３／  各溶液を０．２２μｍのシリンジフィルターで濾過する。
４／  ２５０ｍＬの試験管に２８％のアンモニア溶液（ＮＨ４ＯＨ）３０ｍＬを入れ、総量１２０ｍＬになるように濾過脱塩水を添加する（２Ｍ溶液）。
【０１３９】
５／  空のＲｏｔａｖａｐｏｒ（ロータリーエバポレータ）用の１Ｌのガラスフラスコの重さを計量する。
【０１４０】
定温保持：
６／  ＲｏｔａｖａｐｏｒフラスコにＦｅＣｌ２溶液（２Ｍ）１０ｍＬとＦｅＣｌ３溶液（１Ｍ）４０ｍＬとを入れ、手動でフラスコ２５を攪拌して溶液を均一化させる。
【０１４１】
７／  ２００ｍＬの濾過脱塩水を加え、手動でフラスコを攪拌して溶液を均一化させる。
８／  Ｒｏｔａｖａｐｏｒタイプの装置に所定の角度でフラスコを設置する。
【０１４２】
９／  溶液をよく均一化させるようにフラスコを最大スピードで回転させる。
１０／  ２Ｍのアンモニア溶液１２０ｍＬを添加する。
１１／  フラスコを１５分間回転させる。
【０１４３】
１２／  １Ｌフラスコ内に６０％硝酸（ＨＮＯ３）溶液１０５ｍＬを加え、総量１Ｌになるように濾過脱塩水を添加する（１Ｍ溶液）。
１３／  １５分間の回転の後、フラスコを磁石の上に４分間置く
１４／  浮遊物の全体を吸引する。
【０１４４】
１５／  残留物を再度懸濁させる。
【０１４５】
第一の洗浄：
１６／  Ｒｏｔａｖａｐｏｒにフラスコを設置し、最大速度で回転させる。
【０１４６】
１７／  １ＭのＨＮＯ３溶液２００ｍＬを添加する。
１８／  フラスコを１０分間回転させる。
１９／  残留物を再懸濁する。
【０１４７】
２０／  このプロセスを残留物が完全に溶解するまで繰り返す。
２１／  鉄懸濁液の上澄みを移動させるように、フラスコを設置する。
２２／  浮遊物を吸引する。
【０１４８】
２３／  残留物を再懸濁する。
ステップ１６から２３を必要であれば繰り返してもよい。
【０１４９】
最終希釈：
２６／  フラスコ質量を計測する。
【０１５０】
２７／  得られた残留物質量を推定し、反応収率を計算する：
（得られた残留物質量／初期の鉄質量）×１００
初期の鉄質量＝１４．７７ｇ
収率＞５５％
２８／  濾過水２００ｍＬをフラスコに添加する。
【０１５１】
２９／  Ｒｏｔａｖａｐｏｒにフラスコを設置する。
３０／  残部を再懸濁する。
３１／  ０．２２μｍのＳｔｅｒｉｃｕｐフィルターで溶液を濾過する。
【０１５２】
磁性流体の保存溶液の調製
上記の得られた磁性流体を、ＬＩＳＳ緩衝液または食塩水によって、ボトル内で所定の濃度になるように希釈する。磁性流体および／または希釈溶液は４℃で保存する。
【０１５３】
２）赤血球の磁化
ａ）可能性１：
−最終的な懸濁液において所望の赤血球濃度、好ましくは赤血球が０．５％から３％、が得られるように、ＬＩＳＳまたは食塩水で０．３から０．５％（ｖ／ｖ）に希釈された磁性流体溶液に赤血球を接触させる。
【０１５４】
ｂ）可能性２：
−開放滴下（ＯＤ）バルブに対して、０．９相当の４５０ｎｍでＬＩＳＳ内で磁性流体を調整し、
−磁性流体溶液２４０μＬあたりヘマトクリット値８０％の球状の残留物１０μＬを添加する。
【０１５５】
実施例３：ＩＡＲの手順書、材料および方法の例
Ａ）手順書
１．ＨＡＧ（ヒト抗グロブリン）で被覆された９６ウェル型マイクロプレートを使用する。
【０１５６】
２．緩衝液１（ゲル溶液）５０μＬをＩＡＲテストのために必要とされる杯状体すべての中に配置する。
３．杯状体ごとに３％のＢＳＡを含むＬＩＳＳ溶液６０μＬを配置する。
【０１５７】
４．分析されるサンプル（血清または血漿）１２μＬを配置する。
５．ＩＡＲパネルの磁化された赤血球（ウェル１内の赤血球１、ウェル２内の赤血球２、ウェル３内の赤血球３）２５μＬを配置する。
【０１５８】
６．２０分間３７℃でマイクロプレートを定温保持する。
７．マイクロプレートをインキュベーターから取り外す。
８．本手順書の要請に適合した（図１Ａおよび１Ｂ参照）ＴｅｌｅｓｈａｋｅＴＭ（Ｈ＋Ｐ  Ｌａｂ．、ドイツ）により提供されるマイクロプレート攪拌器にプレートを設置する。
【０１５９】
９．５分３０秒間５００ｒｐｍで攪拌する。
１０．（ＨＡＧで）被覆されたプレートを配置前後で読み取る（図２Ａおよび２Ｂ参照）。
【０１６０】
Ｂ）読み取り（上方からの観察による）（図３および４参照）
１．整然としてなだらかな中央の残留物は陰性であると読み取られる（図３参照）。
２．中央の残留物がいかなる状態でも開いていれば、陽性であると理解される。
【０１６１】
３．ウェルの表面上の細胞の層は強度に陽性であると解釈される。
【０１６２】
Ｃ）反応に必要な要素の組成
１．  緩衝液１
１．１．  ３０％のＢＳＡを調整して、ＬＩＳＳ緩衝液内の１０％の濃度とする。
【０１６３】
１．２．  スーパーファインＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ  Ｇ−１００（緩衝液１の２０ｍＬあたり６００ｍｇ）を計量する（１７．００６１．０１参照−Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。
【０１６４】
１．３．  そのＳｅｐｈａｄｅｘＴＭをあらかじめＬＩＳＳ内で１０％に調製されたＢＳＡに溶解させる。
１．４．  緩衝液１を使用前に一晩４℃で放置する。
【０１６５】
２．  ３％のＢＳＡを有するＬＩＳＳ溶液（本記載のＬＩＳＳタイプ溶液の組成を参照。）または一般に市場で入手可能なＬＩＳＳ溶液。
３．  ＬＩＳＳ緩衝液（本記載の組成を参照。）。
【０１６６】
４．  ＩＡＲパネルの磁化された赤血球（実施例２参照）。
５．  抗免疫グロブリンで被覆されたマイクロプレート。
１から５μｇ／ｍＬのヒト単クーロン性抗ＩｇＧ抗グロブリンで被覆された９６のウェルを有するＭａｘｉｓｏｒｐ  ＮＵＮＣ  マイクロプレート（被覆条件についてのこれまでの実施例を参照）。
【０１６７】
実施例４：結果
Ａ）被提供者の調査
手順書は３０８の被提供者のサンプルについて試験された。
【０１６８】
試験の開始に先立って、赤血球パネルは１５日間磁化された。
【０１６９】
【表１】
2009515179.tif 000002
【０１７０】
３０８サンプルのうち５つだけが不一致であり、すなわち９８．４％の相関であった。
全ての陽性サンプルは本発明方法により読み取られた。
【０１７１】
感度１００％（ｎ＝４）
３０４の陰性の結果のうち、５つは不一致であり、すなわち９８．３％の相関であった。
【０１７２】
明らかに間違いの陽性のレベル：１％
疑陽性の結果のレベル：０．６％
特異度（ｎ＝３０４）：９８．３％
【０１７３】
Ｂ）陽性のパネルの研究
１）第一の試験されたパネル、２２の陽性血清、
−７つの希釈された血清、抗Ｄ抗体を有する２つの血清サンプル、抗Ｆｙａ抗体を有する２つのサンプル、抗Ｋｅｌｌ抗体を有する１つのサンプル、抗Ｅ抗体を有する１つのサンプル、抗Ｓを有する一つのサンプル。
結果：誤ったサンプルなし
【０１７４】
２）第二のパネル（生体治療）
−３２の血清
【０１７５】
【表２】
2009515179.tif 000003
【０１７６】
本発明の（実施例に示された）手順で試験されたパネル
結果：誤った陽性血清なし
スクリーニングで試験された３つの赤血球のうち２つのサンプルだけが完全な一致を示さなかった。
二つの赤血球が誤った陽性であった。
【０１７７】
３）  Ｌｉｌｌｅ地域教育病院（ＣＨＲ＆Ｕ  ｄｅ  Ｌｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）における被提供者テスト
Ｌｉｌｌｅ  ＣＨＲ＆Ｕの４つの被提供者のサンプルが、本方法によって陽性と検出され、ＤＩＡＭＥＤの参照用方法により確認された。
【０１７８】
４）検出しきい値
本発明の手順
記載された方法の検出しきい値を試験するために、ＣＮＲＧＳ（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｎａｔｈｉｎａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｒｏｕｐ）からの２０ｎｇ／ｍＬの抗Ｄおよび対照用品質の抗Ｆｙａ抗体であって、いずれもポリコントロールで希釈されたものを使用した。
【０１７９】
−ＣＮＲＧＳ抗Ｄ
ポリコントロールによる希釈：２．５ｎｇ／ｍＬでのホモ接合性の赤血球における１クロスで擬陽性。
図５参照。
【０１８０】
−ＡＢ血漿での希釈：２．５ｎｇ／ｍＬでのホモ接合性の赤血球における１クロス。
図６参照。
【０１８１】
−ＡＢ血清中の品質管理された抗Ｄおよび抗Ｆｙａの滴定
図７参照。
【０１８２】
５）再現性および再産生能
本発明の手順
手順を試験するため、８つの陰性サンプルと４つの陽性サンプル（抗Ｄ）が２つの異なったプレートおよび同じプレートを３回通過した。
【０１８３】
−同じプレート上を３回（プレート内テスト）（図８参照）。
−他のプレート（プレート間テストであって、図８と比較されるべきものである）（図９参照）。
得られた結果は、本発明の優れた再現性および再産生能を証明する。
【０１８４】
実施例５：ＤｉａＭｅｄＴＭ技術および標準的な抗グロブリンＬＩＳチューブ法（《ＬＩＳ  チューブ》）との比較による本発明に係るＩＡＲ方法（ＱｗａｌｙｓＴＭと称される。）の感度の評価
Ａ）赤血球の磁化
赤血球の磁性粒子に対する受動的な吸着による結合
方法：
５００ｎｍから１μｍの直径で平均的には約３０から７０％のフェライトを有することができる機能化されていない磁性ポリスチレン粒子がここでは使用された（形式、ＥｓｔａｐｏｒＴＭ、Ｍｅｒｃｋ−Ｃｈｉｍｉｅ  Ｓ．Ａ．Ｓ／Ｓｅｔａｐｏｒ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，Ｆｏｎｔｅｎａｙ−Ｓｏｕｓ−Ｂｏｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ、またはＡｄｅｍｔｅｃｈ，Ｐａｒｃ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ  Ｕｎｉｔｅｃ  １，  ４  Ａｌｌｅｅ  ｄｕ  Ｄｏｙｅｎ  Ｇｅｏｒｇｅｓ  Ｂｒｕｓ  ３３６００  Ｐｅｓｓａｃ，Ｆｒａｎｃｅ）。
【０１８５】
これらのポリスチレン粒子は、提案されたモデルに依存して、例えばＥｓｔａｐｏｒＴＭまたはＡｄｅｍｔｅｃｈの範囲において、１０から７０％のフェライトまたは酸化鉄を有し、選択されたモデルに依存して３００ｎｍから１３００ｎｍにわたる直径を有する。
【０１８６】
一般的には１０％（ｗ／ｖ）で提供される磁性粒子は、赤血球用希釈緩衝液、好ましくはＬＩＳ（低イオン強度）タイプの緩衝液のような吸着緩衝液によって１％（１０ｍｇ／ｍＬ）に調整される。
【０１８７】
粒子は、必要に応じ、赤血球との接触前に洗浄剤の痕跡を完全に取り除くように、希釈に先立ってこの緩衝液またはＰＢＳ緩衝液で予備的な洗浄がなされていてもよい。
ＬＩＳ中の１％のテスト用赤血球懸濁液は１％の磁性粒子懸濁液と接触され、その混合物は穏やかに攪拌される（このようにして得られた、使用準備ができた磁化された赤血球の電子顕微鏡画像についての図１０参照）。
【０１８８】
受動的な吸着は本質的に数分間で発生するが、接触は３０分まで延長されてもよく、４℃から３７℃の範囲の温度で１から２時間としてもよく、必要であれば使用に先立って、４℃で一晩またはそれ以上としてもよい。
【０１８９】
Ｂ）使用準備のできた磁化された赤血球を有するヒト抗グロブリンで被覆された杯状体マイクロプレート内で洗浄または遠心分離をしないＩＡＲ手順
１−  ＬＩＳに１０％のアルブミンを含む溶液内にスーパーファインＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ  Ｇ−１００を３％有するゲル溶液（《緩衝液１》であってＮａｎｏｌｙｓＴＭとも称される。）５０μＬを、ヒト抗グロブリンで被覆された各Ｕ字マイクロプレート杯状体に加える。抗グロブリンで被覆されたマイクロプレートはＳｃｒｅｅｎＬｙｓＴＭと称される。
【０１９０】
２−  ＢＳＡを３％有するＬＩＳＳ溶液（ＳｃｒｅｅｎＤｉｌｕｅｎｔＴＭと称される。）６０μＬを加える。
３−  分析されるサンプル（血清または血漿）１２μＬおよび赤血球２５μＬを加える。
【０１９１】
４−  ＩＡＲパネル（ＨｅｍａｓｃｒｅｅｎＴＭと称される。）上でのＳｃｒｅｅｎＤｉｌｕｅｎｔＴＭを超えて磁化される。こうして得られたＳｃｒｅｅｎＬｙｓＴＭマイクロプレートを２０分間３７℃での定温保持する。
【０１９２】
５−  定温保持の後、マイクロプレートを磁気攪拌器の上に５分間配置する。
６−  裸眼または自動化された読取装置を用いて結果を読み取る（３つの赤血球１，２，および３のＨｅｍａｓｃｒｅｅｎＴＭパネル上で得られた典型的な結果および読み取りについて図１１および１２参照）。
【０１９３】
Ｃ）結果
【０１９４】
【表３】
2009515179.tif 000004
【０１９５】
【表４】
2009515179.tif 000005
【０１９６】
【表５】
2009515179.tif 000006
【０１９７】
実施例６：国際標準テストサンプルについてのＤｉａＭｅｄＴＭ技術との比較による本発明の方法に係るＩＡＲ手法（ＱｗａｌｙｓＴＭ）の感度の評価
ＩＡＲ手法の感度の評価のために国際標準がここでは使用される。
【０１９８】
これは、（英国の１５の国立生物学的製剤研究所からの）抗Ｒｈ１抗体サンプルである。
見出された検出しきい値は、磁化された赤血球を用いた本発明に係るＱｗａｌｙｓTM技術では０．０１４ＩＵ／ｍＬに近く、感度はＤｉａＭｅｄＴＭ手法で見出されたものと同一である（図１３参照）。
【０１９９】
まとめ
磁化された赤血球および磁場の存在下での攪拌ステップ（磁気的攪拌）を用いる本発明に係るＩＡＲのための洗浄不要かつ遠心分離不要な技術であるＱｗａｌｙｓTMの比較調査は、この新しい技術が、標準的なＩＡＲ手法の一つである《遠心分離を用いたゲル》技術（ＤｉａＭｅｄTM）のものと同等の特異度および感度を示すこと確認する。
【０２００】
本発明に係る新しいＱｗａｌｙｓTM技術の、とりわけ遠心分離ステップを必要とするＤｉａＭｅｄTM技術と比較しての、大きな強みの一つは、洗浄ステップ（それゆえサンプル移動）または（完全な自動化の可能性を制限するステップである）遠心分離ステップを含まないため、他の手法に比べて容易に自動化できることである。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】マイクロプレートの下の軟鉄板からなる攪拌プラットフォームｔｅｌｅｓｈａｋｅＴＭを上方から見た（図１Ａ）および側方から見た（図１Ｂ）略図であり、各マイクロプレート杯状体の下方において各磁石は積層形状で磁気的に固定されている。（１）磁石間の良好な間隙を得ることを可能とするプラスチックスペーサー；（２）Ｔｅｌｅｓｈａｋｅ上のマイクロプレートを楔止めすることを可能とする要素；（３）マイクロプレートを楔止めしうるＴｅｌｅｓｈａｋｅの楔；（４）積層磁石；（５）マイクロプレート；（６）プラスチックスペーサー；（７）磁石がその上に磁気的に固定される軟鉄板；（８）Ｔｅｌｅｓｈａｋｅを磁石積層体の磁場から隔離するボール紙の板；（９）Ｔｅｌｅｓｈａｋｅ回転トレイ。
【図２】丸い底部の（またはＵ字型の）反応器の杯状体であって、ゲル溶液（緩衝液１）ならびに様々な溶液および試薬の添加に先立って、杯状体の傾斜壁（が部分的に）および底部が抗免疫グロブリンで被覆された後の略図である。
【図３】赤血球によって保有される抗原との免疫接着反応が陰性の（特定の複合体が形成されていない）像を示す写真である。
【図４】赤血球によって保有される抗原との免疫接着反応が陽性の（抗免疫グロブリンで被覆された傾斜壁に対して接着する特定の複合体が形成されている）像を示す写真である。
【図５】ＣＮＲＧＳ抗Ｄの滴定、多制御希釈、２．５ｎｇ／ｍＬのホモ結合性赤血球における１クロスでの擬陽性。
【図６】ＣＮＲＧＳ（フランス国立  血液型リファレンスセンター）、抗Ｄの滴定、ＡＢ血漿内での希釈、２．５ｎｇ／ｍＬのホモ結合性赤血球における１クロス。
【図７】ＡＢ血清＊内の品質制御された抗Ｄおよび抗ＦＹＡの滴定。
【図８】再現性および再産生能  ５８の陰性のサンプルと４つの陽性のサンプル（抗Ｄ）が同じプレート上を３度通過した。
【図９】再現性および再産生能。８の陰性のサンプルと４つの陽性のサンプル（抗Ｄ）が他のプレート上を通過した。
【図１０】平均直径５００から７５０ｎｍの磁性粒子を用いているＨａｍａｓｃｒｅｅｎＴＭの磁化赤血球であって使用可能なものの電子顕微鏡写真である。
【図１１】マイクロプレート杯状体内で、テスト用の抗Ｒｈ１サンプル（国際基準品）についてＱｗａｌｙｓＴＭＩＡＲ法の感度を評価して得られた結果である。
【図１２】本発明のＱｗａｌｙｓＴＭ手法に従って３つの赤血球によるパネルを用いた患者の血漿または血清サンプルのＩＡＲのためのマイクロプレート杯状体で得られた典型的な結果である。
【図１３】マイクロプレート杯状体内で、テスト用の抗Ｒｈ１サンプル（国際基準品）についてＱｗａｌｙｓＴＭＩＡＲ法の感度を評価して得られた結果である。
【図１Ａ】
2009515179.tif 000007
【図１Ｂ】
2009515179.tif 000008
【図２Ａ】
2009515179.tif 000009
【図２Ｂ】
2009515179.tif 000010
【図３】
2009515179.tif 000011
【図４】
2009515179.tif 000012
【図５】
2009515179.tif 000013
【図６】
2009515179.tif 000014
【図７】
2009515179.tif 000015
【図８】
2009515179.tif 000016
【図９】
2009515179.tif 000017
【図１０】
2009515179.tif 000018
【図１１】
2009515179.tif 000019
【図１２】
2009515179.tif 000020
【図１３】
2009515179.tif 000021
【国際調査報告】
2009515179.tif 000022
2009515179.tif 000023
2009515179.tif 000024
2009515179.tif 000025
2009515179.tif 000026
2009515179.tif 000027