(57)【要約】【課題】  塩素化スクロース誘導体を、酵素的に脱アシル化する。【解決手段】  トリクロロガラクトスクロースの生成方法が説明される。当該方法では、塩素化後の反応混合物を中和してｐＨ６．５〜７に調整し、遊離型又は固定化型のリパーゼ又はプロテアーゼを用いて脱アシル化することにより、スクロース−６−エステルの脱アシル化が達成される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
保護基を除去可能な酵素の挙動を用いることにより、溶液中の６−Ｏ−保護されたスクロースの塩素化された誘導体を脱保護化する
塩素化スクロース化合物の生成方法。
【請求項２】
請求項１に記載の塩素化スクロース化合物の生成方法であって、
（ａ）前記６−Ｏ−保護されたスクロースは、スクロース−６−アセテート、スクロース−６−ベンゾエート、スクロース−６−プロピオネート、スクロース−６−ラウラート、スクロース−６−グルタラート、スクロース−６−パルミテート等のうちの１つ又は複数を含み、
（ｂ）前記溶液は、（ｉ）純粋な６−Ｏ−保護されたスクロースの溶液、又は（ｉｉ）塩素化スクロース化合物の生成プロセスにおいて得られたプロセスストリームを含む
塩素化スクロース化合物の生成方法。
【請求項３】
請求項２に記載の塩素化スクロース化合物の生成方法であって、
前記プロセスストリームは、スクロースの塩素化プロセス又は６−Ｏ−保護されたスクロースの塩素化プロセスを含む、１つ又は複数の塩素化スクロースの生成プロセスを含み、
前記塩素化スクロース化合物は、トリクロロガラクトスクロース、ジクロロガラクトスクロース、テトラクロロガラクトスクロース等の１つ又は複数の塩素化スクロースを含む
塩素化スクロース化合物の生成方法。
【請求項４】
請求項３に記載の塩素化スクロース化合物の生成方法であって、
前記塩素化プロセスは、スクロース誘導体と、１つ又は複数の塩素化剤とを、以下の：
（ａ）ピリジンに溶解された６−Ｏ−保護されたスクロースと塩化スルフリルとの反応、又は
（ｂ）トリフェニルホスフィン及び１，１，２−トリクロロエタンの存在下での、６−Ｏ−保護されたスクロースと塩化チオニルとの反応、又は
（ｃ）スクロース−６−エステルを含む、６−Ｏ−保護されたスクロースと、一般式［ＨＣＬＣ＝Ｎ＋Ｒ２］Ｃｌ−  ［ＨＰＯＣｌ２ＯＣ＋＝Ｎ＋Ｒ２］Ｃｌ−、若しくは［ＨＰＯＣｌ２ＯＣ＋＝Ｎ＋Ｒ２］Ｃｌ−（ここで、Ｒはアルキル基、好ましくはメチル基若しくはエチル基を表す）のビルスマイヤー試薬との反応
を含む１つ又は複数のプロセスによって反応させることを含む
塩素化スクロース化合物の生成方法。
【請求項５】
請求項４に記載の塩素化スクロース化合物の生成方法であって、
前記保護基を除去可能な酵素の前記挙動は、酵素リパーゼ又はプロテアーゼから導出される
塩素化スクロース化合物の生成方法。
【請求項６】
請求項５に記載の塩素化スクロース化合物の生成方法であって、
前記リパーゼ又はプロテアーゼは、固定化されていない酵素又は固定化された酵素である
塩素化スクロース化合物の生成方法。
【請求項７】
請求項６に記載の塩素化スクロース化合物の生成方法であって、
（ｄ）（ｉ）溶液、又は（ｉｉ）ビルスマイヤー試薬、塩化スルフリル、塩化チオニルから成る群から選択された塩素化剤を用いた、塩素化スクロースの生成プロセスにおいて得られたプロセスストリーム、に含有されたスクロース−６−アセテートを塩素化し、
（ｅ）前記ステップ（ｄ）の前記プロセスストリームのｐＨを約ｐＨ６．５〜７に調整し、
（ｆ）（ｉ）６−Ｏ−保護されたＴＧＳと、固定化されていないリパーゼ若しくは固定化されたリパーゼ又は遊離プロテアーゼ若しくは固定化されたプロテアーゼとを、好ましくは反応容器内で振盪させながら接触させること、又は、カラムに充填された酵素の床に再循環させることによって、好ましくは約２５〜３０℃の常温において、９５％を上回る最大限の脱アシル化を達成するのに十分な期間、ステップ（ｄ）の前記プロセスストリームにおいて形成された６−Ｏ−保護されたＴＧＳを脱アシル化し、
（ｇ）前記ステップ（ｆ）の前記プロセスストリームの望ましくない成分からＴＧＳを分離する
塩素化スクロース化合物の生成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩素化反応により得られた６−Ｏ−保護された（６位のヒドロキシル基が保護された）ＴＧＳを酵素的に脱アシル化することを含む、１−６−ジクロロ−１−６−ジデオキシ−β−フルクトフラノシル−４−クロロ−４−デオキシ−ガラクトピラノシド（ＴＧＳ）の生成のための新規方法及び新規方針に関する。
【背景技術】
【０００２】
４，１’，６’トリクロロガラクトスクロース（ＴＧＳ）の従来の生成方法の方針は、主に、スクロース−６−エステルを塩素化して６アセチル４，１’，６’トリクロロガラクトスクロースを生成するために、種々の塩素化剤、例えばオキシ塩化リン、塩化オキサリル、五塩化リン等、及び、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の第３級アミド等から成るビルスマイヤー・ハック試薬を用いることにより、スクロース−６−エステルを塩素化することに関するものである。前記塩素化反応の後、反応マスは、カルシウム、ナトリウム等の適切なアルカリ性水酸化物を用いてｐＨ７．０〜ｐＨ７．５に中和される。その後、カルシウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ性水酸化物を用いて、中和された反応マスのｐＨがさらに９．５以上に上げられ、６アセチル４，１’，６’トリクロロガラクトスクロースを脱アシル化／脱アセチル化して、４，１’，６’トリクロロガラクトスクロース（ＴＧＳ）を生成する。このアルカリ性脱エステル化／脱アシル化は、反応物を強いアルカリ性のｐＨに晒すことを含むが、これによりかなりの量のＤＭＦが破壊されることがある。ＤＭＦは高価な投入物であり、ＤＭＦが破壊されることは、反応後のＤＭＦ回収率に悪影響を与える。
【０００３】
従来技術のプロセスでは、反応混合物も、脱アシル化プロセス中に厳しい温度条件に晒され、これにより生成物であるＴＧＳ自体が破壊されることがある。
【特許文献１】英国特許第２２２４５０４号
【特許文献２】欧州特許第０６１００６３号
【非特許文献１】Khan R. "Chemical and enzymatic transformations of sucrose" Int. Sugar Jnl. P6 (1141): 12-17
【非特許文献２】Palmer D.C. and Terradas F. (1994) "Regioselective Enzymatic Deacetylation of Sucrose Octaacetate in Organic Solvents" Tetrahedron Letters 35 (11): 1673-1676
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、ＤＭＦが破壊されない脱アシル化方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ＤＭＦを破壊しないｐＨにおいて、酵素的に脱アシル化を達成する方法が開発された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
［発明の詳細な説明］
酵素的な脱アシル化が、Palmer他（１９９５）によって、米国特許第５４４５９５１号において報告されている。この方法では、前記スクロースエステルの脱アシル化を触媒して、予め選択された位置（複数可）に保護されていないヒドロキシル基（複数可）を有する部分的に脱アシル化されたスクロース誘導体を生成することが可能な酵素又は複数の酵素の組み合わせを用いて、スクロースオクタアシレート、スクロースへプタアシレート、及びスクロースヘキサアシレートから成る群から選択されたスクロースエステルを、無水有機溶媒中で酵素触媒により脱アシル化し、得られた部分的に脱アシル化されたスクロース誘導体を回収することにより、部分的にアシル化されたスクロース誘導体を生成する。
【０００７】
スクロースエステル又はその誘導体／前駆体の酵素的な脱アシル化に関する他の報告は知られていない。
【０００８】
本発明の実施形態は、人工甘味料であるＴＧＳの生成中に塩素化反応により得られた６−Ｏ−保護されたＴＧＳの酵素的な脱アシル化に関する。本発明の実施形態において説明される方法を適用することができる塩素化反応混合物の実施形態は、Mufti他（１９８３）の米国特許第４３８０４７６号、Walkup他（１９９０）の米国特許第４９８０４６３号）、Jenner他（１９８２）の米国特許第４３６２８６９号、Tulley他（１９８９）の米国特許第４８０１７００号、Rathbone他（１９８９）の米国特許第４８２６９６２号、Bornemann他（１９９２）の米国特許第５１４１８６０号、Navia他（１９９６）の米国特許第５４９８７０９号、Simpson（１９８９）の米国特許第４８８９９２８号、Navia（１９９０）の米国特許第４９５０７４６号、Neiditch他（１９９１）の米国特許第５０２３３２９号、Walkup他（１９９２）の米国特許第５０８９６０８号、Dordick他（１９９２）の米国特許第５１２８２４８号、Khan他（１９９５）の米国特許第５４４００２６号、Palmer他（１９９５）の米国特許第５４４５９５１号、Sankey他（１９９５）の米国特許第５４４９７７２号、Sankey他（１９９５）の米国特許第５４７０９６９号、Navia他（１９９６）の米国特許第５４９８７０９号、Navia他（１９９６）の米国特許第５５３０１０６号に記載されている、スクロース−６−エステルと塩素化剤とを混合することにより得られたプロセスストリームを含むがこれに限定されない。
【０００９】
酵素的な脱アシル化は、６−Ｏ−保護されたＴＧＳの中間単離後に、又は中間単離を行うことなく、塩素化された反応マスの中和後に、上述の方法で得られたプロセスストリームに対して実行される。中和された反応マス中に存在する溶媒である第３級アミドは、酵素的反応のため、分解されず、したがって当該溶媒の回収率は向上する。
【００１０】
本発明の実施形態では、塩素化反応により塩素化された反応マスが適切な塩基によって中和される。中和の間、ｐＨが６．０未満に調整される場合、形成される化合物ＴＧＳは依然として、６位において損なわれていない保護基を有する。この６位の脱保護化は、前記化合物の単離を伴って又は伴わずに実行される。さらに、様々な文献において、脱保護化は第三級アミド及び他の溶媒並びに水性条件を伴って又は伴わずに実行することができることも指摘されている。
【００１１】
本発明の実施形態は、酵素的プロセスを用いた、６位における脱アシル化を説明する。この酵素的プロセスでは、塩素化反応において用いられたＤＭＦを含む第３級アミドの存在下、又は非存在下で、酵素が保護基を選択的に除去する。
【００１２】
本発明の実施形態の方法は、純粋なＴＧＳ−６−エステルの単純な溶液等、塩素化反応によって得られたものではないプロセスストリームの脱アシル化の実施形態でも良好に動作する。
【００１３】
酵素触媒による脱アシル化は周知であり、リパーゼ及びタンパク質分解酵素が、良性条件下で脱アシル化及びアシル化反応を実行する。また、酵素触媒による脱アシル化は、Soedjak HS, Spradlin JE (1994), Biocatalysis 11:241-248; Therisod M, Klibanov AM (1986), J. Am. Chem. Soc. 108:5638-5640; B Cambou and A. M. Klibanov, J. Am. Chem. SOC. 106, 2687 (1984); Kirpal S Bisht, Pure & Appl. Chem., Vol. 68, No. 3, pp. 749-752, 1996; F. J. Plou1;_, M. A. Cruces1, Biotechnology Letters 21:635-639, 1999.によって広く報告されている。
【００１４】
本発明の実施形態では、反応マスの中和後、ｐＨは適切な塩基を用いて６．５に調整される。その後、室温で、攪拌しながらリパーゼ酵素が反応マスに添加される。反応マスに添加される酵素の量は、酵素活性及び反応条件に応じて１０％〜４０％（重量パーセント：ｗ／ｖ）で変化する。中和された反応マス中の第３級アミド含有量は、約１０％〜４０％である。反応混合物は、１０〜６０時間、より好ましくは１６〜２０時間、攪拌を続けられる。６−Ｏ−保護されたＴＧＳからＴＧＳへの転換は、ＴＬＣによって観察される。完全な脱アシル化の後、反応混合物は、親和性クロマトグラフィによるＴＧＳの単離のために用いられる。単離されたＴＧＳはその後、適切な方法で結晶化される。
【００１５】
６−Ｏ−保護されたＴＧＳからＴＧＳへの脱アシル化のために用いられるリパーゼ又はタンパク質分解酵素は、固定化されていない型であっても固定化型であってもよい。固定化された酵素を用いる場合、酵素は脱アシル化の完了後に濾過されて除去される。回収された酵素はさらに再利用することができる。また、固定化された酵素をカラムに充填してもよく、反応マスをそのカラムに通過させて、６−Ｏ−保護されたＴＧＳのｉｎ  ｓｉｔｕの脱アシル化を実行してもよい。これらの酵素は、限定はしないが、ポリアクリル若しくはポリスチレン若しくはポリアクリルアミドのナイロンを原料とする担体等の合成ポリマー担体、又は、限定はしないが、セルロース、デンプン、デキストラン、アガロース、キトサン、キチン等の多糖類を原料とする半合成又は天然有機担体、又は炭素、シリカ、ジルコニア、アルミナ、リン酸ジルコニウム等を原料とする無機担体の中又は表面に固定化されてもよい。
【００１６】
酵素リパーゼの発生源は、動物由来、植物由来、又は微生物由来であってよく、より好ましくは、バシラス・テルモカテヌラテュシス、シュードモナス緑膿菌等の微生物又は細菌由来、ペニシリウム・ロックフォルティ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼー、リゾープス・ニベウス、カンジダ・ルゴサ、リゾムコール・ミエヘイ、カンジダ・アンタークチカ等の真菌由来である。
【００１７】
本発明の実施形態の方法において、ＴＧＳ生成物は、酸、アルカリを用いた従来の脱アシル化プロセスのように厳しいｐＨ条件又は温度条件に晒されることはない。生成物の損失は、いかなる他の形の脱アシル化プロセスと比較しても最小である。
【００１８】
本発明の実施形態の方法において、第３級アミドは、酸、アルカリを用いた従来の脱アシル化プロセスのように厳しいｐＨ条件又は温度条件に晒されることはない。よって、第３級アミドの分解はまったく起こらない。したがって、第３級アミドの回収効率は非常に大きく向上する。
【００１９】
以下に記述するのは、本発明の範囲を決して限定することなく、本発明の実施形態の動作を例示する実施例である。記載される反応物、用いられる反応物の比率、反応条件の範囲、用いられる酵素等は例示に過ぎず、それらの類似の反応物、反応条件、及び類似の包括的性質の反応にまで範囲が拡大される。概して、塩素化スクロースの生成分野の当業者にとって明らかな任意の均等な代替物は、本明細書の範囲内に包含される。したがって、「アセテート」への言及は、本発明の実施形態の文脈において同じ機能を実行することができる任意の均等なエステル群を包含し、用いられる酵素は、類似の反応条件下で、本明細書において記述される酵素の挙動又は類似の挙動を提供可能な任意の代替物を包含するものとする。当業者には実施形態のいくつかの他の適応例が容易に予期されるであろう。これらの適応例も本明細書の範囲内に包含される。単数形での言及は、その文脈において特に指定されない限り、その複数形も包含するように解釈される。すなわち、抽出に「有機溶媒（an organic solvent）」を用いることは、１つ又は複数の有機溶媒を順次、又は混合物として組み合わせて用いることを包含する。
【実施例１】
【００２０】
［スクロース−６−アセテートの塩素化］
５リットルの反応フラスコに、１２８０ｍｌのジメチルホルムアミドを添加して０〜５℃に冷却した。その後、反応マスの温度を３０℃未満に維持しつつ、６３５ｇの５塩化リン（５．４モル）を攪拌しながらゆっくりと添加した。マスを０℃未満までさらに冷却し、ＤＭＦ中にスクロース−６−アセテートを０〜−５℃においてゆっくりと添加した。その後、反応マスを８０℃まで加熱して一時間保ち、１００℃までさらに加熱して６時間保ち、最後に１１０〜１１５℃で２〜３時間保った。反応の進行をＨＰＬＣ分析によって観察した。
【００２１】
その後、反応混合物を−５〜−８℃に冷却して、水酸化ナトリウムの２０％溶液をゆっくりと添加し、マスのｐＨを５．５〜６．５にした。この方法により得られた収率は、投入したスクロースの５５．４％であった。
【実施例２】
【００２２】
［リパーゼ酵素による、６−Ｏ−アセチルＴＧＳの酵素的な脱アシル化］
１５ｇの６−Ｏ−アセチル化ＴＧＳを含有する、実施例１で説明したように生成された反応マス１．５リットルを、水酸化カルシウムスラリーを用いてｐＨを７．５になるまで中和した。中和された反応マスを、６リットルの水に希釈した。中和されたマス中のＤＭＦ含有量は３３％であった。アスペルギルス・オリゼーＡＴＣＣ２６８５０；ＮＣＩＭ１２１２から単離された８４ｇのリパーゼ酵素を、常温において攪拌しながら反応混合物に添加した。反応を数時間継続させ、ＴＧＳの形成及び６−Ｏ−アセチル化ＴＧＳの消失をＴＬＣによって観察した。４２時間の終了時、最大９８．４％の脱アシル化が達成された。
【００２３】
脱アシル化後、適切な方法によってマスからＴＧＳを単離した。
【実施例３】
【００２４】
［Ｅｕｄｒａｇｉｒｔ  ＲＬ１００に固定化されたリパーゼ酵素による６−Ｏ−アセチルＴＧＳの酵素的な脱アシル化］
実験において、８０ｇの６−Ｏ−アセチル化ＴＧＳを含有する２．５リットルの反応マスを、５０％水酸化カルシウムスラリーを用いてｐＨ５．５まで中和した。中和された反応マスを、６リットルの水に希釈した。中和されたマス中のＤＭＦ含有量は３３％であった。Ｅｕｄｒａｇｉｒｔ  ＲＬ１００に固定化されたリパーゼ１２０ｇを、攪拌を続けながら、常温である２５℃〜３０℃において反応混合物に添加した。反応を数時間継続させ、ＴＧＳの形成及び６−Ｏ−アセチル化ＴＧＳの消失をＴＬＣによって観察した。２４時間の終了時、最大９８．３％の脱アシル化が達成された。
【００２５】
その後、マスを濾過してＴＧＳを単離した。濾過ケーキにおいて得られた酵素を水で洗浄し、再利用のために保存した。
【実施例４】
【００２６】
［Ｅｕｄｒａｇｉｒｔ  ＲＬ１００に固定化され、カラムに充填されたリパーゼ酵素による６−Ｏ−アセチルＴＧＳの酵素的な脱アシル化］
実験において、１２ｇの固定化された酵素を、直径２ｃｍ、高さ８ｃｍのガラスカラムに充填した。カラムの入口は、蠕動ポンプの送出部に接続され、出口は、５ｇの６−Ｏ−アセチル化ＴＧＳを含有する中和されたマス５００ｍｌが入ったフラスコに接続された。蠕動ポンプの注入口も、中和されたマスに接続された。中和されたマスを、５ｍｌ／分の流量で、固定化されたリパーゼの床に６時間循環させた。
【００２７】
フラスコ中で起こった脱アシル化の程度を見るために、ＴＬＣを１時間毎に実行した。６時間後、９８％の脱アシル化が観察された。
【００２８】
６−Ｏ−アセチル−ＴＧＳからＴＧＳへの脱アシル化の完了後、固定化された酵素の床を脱イオン水で洗浄し、さらなる利用のために１０％のアセトン水溶液中に保存した。
【実施例５】
【００２９】
［タンパク質分解酵素であるＡｌｃａｌａｓｅによる、６−Ｏ−アセチルＴＧＳの酵素的な脱アシル化］
１０ｇの６−Ｏ−アセチル化ＴＧＳを含有する塩素化後に中和されたマス１．０リットルを、酵素反応のために用いた。中和された反応マスを、３．０リットルの水で希釈した。Novozymes社により市販されている、Ｂ．リケニホルミス由来のＡｌｃａｌａｓｅ２．４Ｌ酵素２００ｍｌを、２５〜３０℃において、攪拌しながら反応混合物に添加した。反応を数時間継続させ、ＴＧＳの形成及び６−Ｏ−アセチル化ＴＧＳの消失をＴＬＣにより観察した。３６時間の終了後、最大９６．４％の脱アシル化が達成された。脱アシル化後、適切な方法によりマスからＴＧＳを単離した。
【国際調査報告】
2009508519.tif 000002
2009508519.tif 000003