(57)【要約】  ヒトおよび動物対象におけるインフルエンザウイルスを検出するための動力学的ポリメラーゼ連鎖反応（ｋＰＣＲ）アッセイに使用されるプライマーおよびプローブを調製するために使用される核酸配列を提供する。ｋＰＣＲアッセイ用の出発物質はＤＮＡまたはＲＮＡのことがあり、このアッセイは、単一のインフルエンザウイルスを検出するためのシングルプレックスアッセイまたは複数のインフルエンザウイルスを検出するためのマルチプレックスアッセイで行うことができる。このプライマーおよびプローブは、インフルエンザウイルスＡ型およびＢ型（それぞれＩＮＦＡおよびＩＮＦＢ）の検出および定量化に有用性を有し、全ての公知のＩＮＦＡ亜型、すなわちＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８およびＨ９の検出および定量化に有効であることが示された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１１から調製されるプライマーおよびプローブを用いて実行される動力学的ポリメラーゼ連鎖反応アッセイを行うことを含む、試料中のインフルエンザウイルスを検出および定量化する方法。
【請求項２】
インフルエンザウイルスが、トリインフルエンザウイルスＡ型（ＩＮＦＡ）であり、プライマーおよびプローブが、配列番号１〜５から調製される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
プライマーおよびプローブが、トリＩＮＦＡの亜型Ｈ５を検出および定量化する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
インフルエンザウイルスが、ヒトインフルエンザウイルスＡ型（ＩＮＦＡ）であり、プライマーおよびプローブが、配列番号６〜８から調製される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
プライマーおよびプローブが、ヒトＩＮＦＡのマトリックス遺伝子を検出および定量化する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
インフルエンザウイルスが、ヒトインフルエンザウイルスＢ型（ＩＮＦＢ）であり、プライマーおよびプローブが、配列番号９〜１１から調製される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
プライマーおよびプローブが、ヒトＩＮＦＢの非構造遺伝子を検出および定量化する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
プライマーおよびプローブが、インフルエンザウイルスを検出および定量化するための動力学的ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ（ｋＰＣＲ）に使用される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
試料が、ヒトまたは動物対象から得られたＤＮＡ試料である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
試料が、ヒトまたは動物対象から得られたＲＮＡ試料である、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
ｋＰＣＲアッセイが、動力学的逆転写酵素ＰＣＲ（ｋＲＴ−ＰＣＲ）アッセイである、請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づき２００６年４月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／７９５，７８５号の優先権を主張し、この仮特許出願の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は、広くはヒトインフルエンザウイルスおよびトリインフルエンザウイルスを検出するための診断アッセイに有用な核酸配列に関する。さらに具体的には、本発明は、トリインフルエンザＡ型（「ＩＮＦＡ」）ウイルスの亜型ならびにヒトＩＮＦＡウイルスおよびＢ型インフルエンザ（「ＩＮＦＢ」）ウイルスの株の同定に特異的なプライマーおよびプローブに関する。これらの配列は、試料中のインフルエンザウイルスを検出するためのシングルプレックスアッセイに使用することもできるし、試料中のインフルエンザウイルスを他の呼吸器疾患と共に検出するマルチプレックスアッセイに使用することもできる。
【０００３】
発明の背景
インフルエンザウイルスにはＩＮＦＡ、ＩＮＦＢおよびインフルエンザＣ型（「ＩＮＦＣ」）の３種類がある。最も毒性のインフルエンザウイルスはインフルエンザウイルスＡ型であり、このウイルスは、ヒト、トリ、ブタ、ウマ、アザラシ、クジラ他の動物に感染することができる。自然宿主として野鳥を使用するインフルエンザウイルスは、トリインフルエンザウイルスと呼ばれ、自然宿主としてヒトを使用するインフルエンザウイルスはヒトインフルエンザウイルスと呼ばれる。シチメンチョウやニワトリなどの家禽は、トリインフルエンザウイルスから致死的疾病を発生し、他の動物およびヒトも同様に、感染した家禽と接触することによりトリインフルエンザウイルスに感染した。家禽は、感染した野鳥もしくは感染した他の動物との直接接触、ウイルスが住みつく表面との接触、または汚染された食物もしくは水を介してトリインフルエンザウイルスに感染するおそれがある。今までのところ、種を超えヒトに感染したトリインフルエンザウイルスが、最近のヒトインフルエンザの世界的大流行の原因である。通常はヒトにだけ感染するインフルエンザＢ型ウイルスおよびインフルエンザＣ型ウイルスは、インフルエンザＡ型ほど毒性ではない。インフルエンザＢ型は、インフルエンザの地域的流行の原因であったが、広範なインフルエンザの世界的大流行の原因になったことはない。最も低毒性のインフルエンザＣ型ウイルスは、これまでに一度も広範なヒトインフルエンザの流行を導いたことはない。
【０００４】
インフルエンザウイルスは、ゲノムが８個の一本鎖マイナスセンスＲＮＡセグメントを含有するエンベロープウイルスである。ウイルスエンベロープは、ウイルスの付着の原因となるタンパク質である二つの主要な表面ウイルス糖タンパク質：ヘマグルチニン（「ＨＡ」）およびノイラミニダーゼ（「ＮＡ」）を有する宿主由来脂質二重層をもつ。エンベロープ内では、マトリックスタンパク質Ｍ１および核タンパク質（「ＮＰ」）がウイルスＲＮＡを保護している。インフルエンザウイルスのＡ、ＢおよびＣ型という名称は、Ｍ１マトリックスタンパク質およびＮＰの抗原的特徴に基づく。８個のＲＮＡセグメントは、少なくとも１０個のウイルスタンパク質をコードし、すなわちセグメント１、２および３は、３個のウイルスポリメラーゼタンパク質をコードし、セグメント４はＨＡをコードし、セグメント５はＮＰをコードし、セグメント６はＮＡをコードし、セグメント７はＭ１およびＭ２マトリックスタンパク質をコードし（前者はイオンチャネル活性を有し、ウイルスエンベロープに埋まっている）、そしてセグメント８は非構造タンパク質ＮＳ１およびＮＳ２をコードする（前者はホスト抗ウイルス応答をブロックし、後者はウイルス粒子の集合に関与する）。
【０００５】
ＩＮＦＡウイルスは、ウイルス表面のＨＡおよびＮＡタンパク質の亜型により同定される。ＩＮＦＡウイルスは、１６個の異なるＨＡ亜型および９個の異なるＮＡ亜型を有し、その全てが多数の異なる組合せでウイルス表面に存在しうることから、Ｈ５Ｎ１ウイルスは、ＨＡ５タンパク質およびＮＡ１タンパク質をその表面に有する。全ての亜型のＩＮＦＡウイルスは鳥類に見られる。ヒトに通常見られるＩＮＦＡ亜型は、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３亜型であり（Ｈ２亜型は現在循環していない）、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９亜型もまたヒトに感染することが知られてきた。鳥類に見られるＩＮＦＡ亜型ウイルスの中で、Ｈ５およびＨ７亜型が最も毒性が高く、Ｈ５およびＨ７亜型の株は、さらに低病原性トリインフルエンザ（「ＬＰＡＩ」）または強病原性トリインフルエンザ（「ＨＰＡＩ」）のいずれかに分類される。ＨＰＡＩは、細胞区画および器官系に広く分布する無数の細胞性プロテアーゼによる切断に高度に感受性なＨＡを特徴とするが、対照的にＬＰＡＩは、呼吸部位および腸部位の内腔に限定されるトリプシンなどの特異的活性細胞外プロテアーゼを切断に必要とする。ＨＰＡＩ  Ｈ５またはＨ７ウイルスに感染した家禽のうち、９０％から１００％のトリが死亡するものである。ＬＰＡＩ  Ｈ５およびＨ７ウイルスはＨＰＡＩ  Ｈ５およびＨ７ウイルスにそれぞれ進化しうることから、家禽集団におけるＬＰＡＩ  Ｈ５およびＨ７ウイルスの激増はしっかりとモニターしなければならない。動物とヒトとの間を循環しているトリインフルエンザウイルスの亜型には、ウマに疾病を引き起こすＨ７Ｎ７およびＨ３Ｎ８ウイルスならびに一般にヒトに循環しているＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２およびＨ３Ｎ２ウイルスが挙げられる。ＩＮＦＢおよびＩＮＦＣウイルスは、亜型によって分類されない。
【０００６】
１９９７年以来、以前は鳥類への感染に限られたＩＮＦＡウイルスが、致命的転帰を伴ってヒトに感染してきた。トリインフルエンザウイルスの激増の確認が、結果として生じる数例のヒトの死と共に１９９７年（Ｈ５Ｎ１、香港）、１９９９年（Ｈ９Ｎ２、中国および香港）、２００２年（Ｈ７Ｎ２、米国バージニア州）、２００３年（Ｈ５Ｎ１、中国および香港；Ｈ７Ｎ７、オランダ；Ｈ９Ｎ２、香港；Ｈ７Ｎ２、米国ニューヨーク州）；２００４年（Ｈ５Ｎ１、タイおよびベトナム；Ｈ７Ｎ３、カナダ）；および２００５年（Ｈ５Ｎ１、タイおよびベトナム）に報告された。
【０００７】
トリＩＮＦＡウイルスが渡り鳥を介して全世界に運ばれ、このウイルスが抗原ドリフトおよび抗原シフトならびに遺伝的ドリフトの結果として急速に変化することが知られていることから、トリインフルエンザウイルスのサーベイランスに使用される方法は、抗原的および遺伝的に多様なインフルエンザ株の検出を可能にするために十分な特異性を有さねばならない。
【０００８】
トリＩＮＦＡを検出する伝統的な方法には、培養強化酵素結合免疫吸着アッセイ（「ＣＥ−ＥＬＩＳＡ」）などのプラークアッセイおよび孵化鶏卵を用いたウイルス単離が挙げられる。ウイルスのヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼの亜型分けは、血清学的方法による検出後に実施される。伝統的な方法は十分に高感度であることが示されているが、このプロセスには時間がかかり、例えば孵化鶏卵を用いたウイルス単離は、結果を得るために１から２週間かかる。
【０００９】
トリＩＮＦＡを検出する伝統的な方法の時間およびコストの欠点を克服するために、リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（「リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ」）（動力学的（kinetic）ＲＴ−ＰＣＲ（「ｋＲＴ−ＰＣＲ」）とも呼ばれる）として知られる技法を使用した診断法が開発された。このようなアッセイは、ＩＮＦＡおよびＩＮＦＢのマトリックスおよび核タンパク質の遺伝子から得られる配列を使用してＩＮＦＡおよびＩＮＦＢを検出する。Stone et al., J. VIROL. METH. 117:103-112 (2003)；Smith et al., J. CLIN. VIR. 28:51-58 (2003)；Ward et al., J. CLIN. VIR. 29:179-188 (2004)。ＩＮＦＡ  Ｈ５およびＨ７のＨＡ亜型に対するそれらのアッセイについて、アッセイの結果は、ＨＡ亜型についての伝統的な血清型分類に勝るとは見出されていない。Spackman et al., J. CLIN. MICROBIOL.   40(9):3256-3260 (2002); Munch et al., ARCH. VIROL. 146:87-97 (2001); Lee & Suarez, J. VIROL.  METH. 119:151-158 (2004)。
【００１０】
ヒトおよび動物におけるＩＮＦＡおよびＩＮＦＢウイルスを検出および処置できるためには、当技術分野において全てのＩＮＦＡおよびＩＮＦＢの株および亜型を検出できる高感度アッセイが依然として必要である。
【００１１】
発明の概要
本発明は、ＩＮＦＡおよびＩＮＦＢの全ての株ならびにＩＮＦＡの全ての亜型を包含するように設計された増幅プライマーおよび検出プローブのセットを提供することによって、ヒトまたは動物対象から全てのＩＮＦＡおよびＩＮＦＢの株および亜型を検出することができる高感度アッセイの当技術分野における必要性を克服する。トリＩＮＦＡの検出のために、本発明のプライマーおよびプローブのセットは、様々なトリ種の間で保存されているＨＡ遺伝子のＨ５亜型の核酸配列を検出する（表１）。ヒトＩＮＦＡの検出のために、本発明のプライマーおよびプローブのセットは、多数のヒト試料の間で保存されているマトリックス（Ｍ１）遺伝子の核酸配列を検出する（表２）。ヒトＩＮＦＢの検出のために、本発明のプライマーおよびプローブのセットは、複数のヒト試料の間で保存されている非構造（ＮＳ１およびＮＳ２）遺伝子の核酸配列を検出する（表３）。本明細書に記載された方法が、（任意の種についての）インフルエンザウイルスの任意のセグメントに発現される任意の遺伝子についての保存された核酸配列を検出するプライマーおよびプローブを開発するために使用することができることから、本発明の方法は、本明細書に記載されるトリおよびヒトのプライマーおよびプローブのセットに限定されないことが了解される。
【００１２】
本発明の一態様では、試料中のインフルエンザウイルスを検出および定量化する方法が提供され、その方法は、配列番号１〜１１から調製されたプライマーおよびプローブを用いて実行された動力学的ポリメラーゼ連鎖反応アッセイを行うことを含む。
【００１３】
本発明の別の態様では、インフルエンザウイルスはトリインフルエンザウイルスＡ型（ＩＮＦＡ）であり、プライマーおよびプローブは、配列番号１〜５から調製され、トリＩＮＦＡの亜型Ｈ５の両方の系統が検出および定量化される。トリインフルエンザＡ／Ｈ５ウイルスには、ユーラシア系統およびアメリカ系統の２系統がある。これら２系統由来のウイルスは遺伝的に異なる。全ての公知のヒトインフルエンザＨ５感染は、ユーラシア系統由来の高病原性ウイルスにより起こってきた。
【００１４】
本発明のさらなる態様では、インフルエンザウイルスはヒトインフルエンザウイルスＡ型（ＩＮＦＡ）であり、プライマーおよびプローブは、ヒトＩＮＦＡのマトリックス遺伝子を検出および定量化するために配列番号６〜８から調製される。
【００１５】
本発明のなお別の態様では、インフルエンザウイルスはヒトインフルエンザウイルスＢ型（ＩＮＦＢ）であり、プライマーおよびプローブは、ヒトＩＮＦＢの非構造遺伝子を検出および定量化するために配列番号９〜１１から調製される。
【００１６】
本発明のなおさらなる態様では、プライマーおよびプローブは、インフルエンザウイルスを検出および定量化するために動力学的ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ（「ｋＰＣＲ」）で使用される。ｋＰＣＲアッセイのために、試料は、ヒトまたは動物対象から得られたＤＮＡ試料のこともあるし、ヒトまたは動物対象から得られたＲＮＡ試料のこともある。出発試料がＲＮＡである場合には、ｋＰＣＲアッセイは動力学的逆転写酵素ＰＣＲ（ｋＲＴ−ＰＣＲ）アッセイである。
【００１７】
本発明の追加的な局面、長所および特徴は、部分的には以下の説明に示されるであろうし、部分的には以下を検討するときに、または本発明を実施するときに当業者に明らかになるであろう。
【００１８】
発明の詳細な説明
定義：
下に提供される定義は、開示および請求された本発明の理解を助けるためにのみ示されるものであり、これらの定義および命名は限定を意図しない。
【００１９】
状況が明らかに別のことを命じない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に使用する「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形には、複数の参照対象が含まれる。
【００２０】
本明細書に使用する用語「流行」は、急速に広がり、ある地方または集団中の多数の固体を同時に冒すインフルエンザの激増を表す。
【００２１】
本明細書に使用する用語「世界的大流行」は、広い地理的地域に広がり、集団の大部分を冒すインフルエンザの流行を表す。
【００２２】
用語「抗原ドリフト」は、時間的に継続して起こるウイルスにおける小さな変化を表す。インフルエンザウイルスに関連して、抗原ドリフトは、初期のインフルエンザ株に対する抗体によって認識されることのできない新しいトリインフルエンザウイルス株を産生する。抗原ドリフトは、トリインフルエンザウイルスによく発生する。
【００２３】
用語「抗原シフト」は、新しいウイルスを産生する、ウイルスにおける急激で主要な変化を表す。インフルエンザウイルスの状況内では、抗原シフトは新しいインフルエンザウイルス亜型を生じる。抗原ドリフトとは異なり、抗原シフトはめったに起こらない。
【００２４】
用語「遺伝的ドリフト」は、小さな孤立した集団における遺伝子の出現頻度における、自然淘汰の結果ではないランダムなゆらぎを表す。
【００２５】
用語「突然変異」は、ゲノムＤＮＡの配列における任意の変化を表す。
【００２６】
用語「相同性」は、以前のある時点における特徴の独特な遺伝可能な改変に起因する遺伝的関係を表す。この用語は、同一の起源を有する共通の祖先に由来するＤＮＡ、遺伝子または他の性質を表すために使用される。
【００２７】
用語「保存された」は、配列、構造または機能における類似性を表すために使用される。
【００２８】
用語「アライメント」は、系統学的分析のために相同な分子配列を並べるための任意に連なった技法を表す。
【００２９】
用語「コンセンサス配列」は、相同配列の共通な特徴を規定する、通常はギャップおよび幾分の縮重を有する直鎖状に連なるヌクレオチドを表す。コンセンサス配列は、各位置が、多数の実際の配列を比べた場合に最も頻繁に見出される塩基（ヌクレオチド）を表す理想化された配列である。
【００３０】
用語「ターゲット」は、インフルエンザＡ型ウイルスの核酸配列を表す。
【００３１】
用語「試料」は、インフルエンザウイルスまたは他の呼吸障害もしくは呼吸疾患などの一つまたは複数の疾患状態の存在について試験することができる、任意の対象からの生物学的試料を表す。このような試料には、皮膚または任意の器官、血液、血漿、粘液、唾液など由来の組織試料が含まれることがある。
【００３２】
用語「対象」は、試料を得ることができる生物学的生物を表す。本発明の状況内では、対象は通常ヒト患者であろうが、対象には、ブタ、ウマもしくは海洋哺乳動物などの任意の哺乳動物、または野鳥もしくは家禽などの非哺乳動物もまた含まれることがある。
【００３３】
用語「増幅プライマー」は、ｃＤＮＡまたはＲＮＡターゲット分子に相補的なオリゴヌクレオチドであって、基質の３’−ＯＨ末端を提供するオリゴヌクレオチドを表し、その３’末端に任意のＤＮＡポリメラーゼがこれから伸長するＤＮＡ鎖のヌクレオシドを５’から３’方向に付加することができる。
【００３４】
用語「プローブ」は、増幅したターゲット核酸に適切な条件で選択的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを表す。プローブ配列は、コード鎖またはセンス鎖に対するセンス（すなわち相補的）配列（＋）またはアンチセンス（すなわち逆相補的）配列（−）のいずれかとして確認される。動力学的ＰＣＲ形式では、検出プローブは、５’−レポーター色素（Ｒ）および３’−クエンチャー色素（Ｑ）を有するオリゴヌクレオチドからなることがある。蛍光レポーター色素（すなわちＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）など）は、典型的には３’−末端に局在する。検出プローブは、増幅および検出プロセスの間にＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブとして作用する。
【００３５】
本明細書に使用する用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および適切な場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを表す。この用語には、等価物としてヌクレオチドアナログから作られたＲＮＡまたはＤＮＡのアナログと、記載中の態様に適用できる一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドとが含まれることもまた了解すべきである。発現配列タグ（「ＥＳＴ」、すなわち発現された遺伝子の一端または両端のいずれかを配列決定することによって発生した、通常は２００から５００ヌクレオチド長の小さなＤＮＡ配列片）、染色体、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡは、核酸と呼ぶことができる分子の代表例である。
【００３６】
本明細書に使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドである他の任意の種類のポリヌクレオチド、および非ヌクレオチド主鎖（例えばタンパク質核酸およびＮＥＵＧＥＮＥ（商標）ポリマーとしてＡｎｔｉ−Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｇｒｏｕｐ（Corvallis, Oregon）から市販されている合成の配列特異的核酸ポリマー）または非標準結合を含有する他のポリマー（但し、このポリマーはＤＮＡおよびＲＮＡに見られるように塩基対形成および塩基のスタッキングを可能にするコンフィギュレーションの核酸塩基を含有する）を包含する。したがって、本明細書における「オリゴヌクレオチド」には、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡ、ならびにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドが含まれ、公知の種類の改変オリゴヌクレオチド、例えば一つまたは複数の天然ヌクレオチドがアナログに置換されたオリゴヌクレオチド；ヌクレオチド間改変を含有するオリゴヌクレオチド、例えば非荷電結合を有するもの（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）、陰性荷電した結合（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、および陽性荷電した結合（例えばアミノアルキルホスホルアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル）、ペンダント部分を含有するもの、例えばタンパク質など（ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなどを含む）、挿入剤（例えばアクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレート剤（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するもの、およびアルキル化剤を含有するものなどもまた含まれる。用語「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」との間に長さの意図された区別はなく、これらの用語は相互交換可能に使用される。これらの用語は、分子の一次構造のみを表す。本明細書に使用する、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドに関する記号は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢ生化学命名合同委員会（http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/jcbnを参照されたい）に準拠する。
【００３７】
オリゴヌクレオチドは、公知の方法により合成することができる。広くオリゴヌクレオチドを合成するための方法に関する、背景となる参考文献には、β−シアノエチルホスフェート保護基の使用に基づく５’−から３’−合成に関するものが挙げられる。例えば、de Napoli et al., GAZZ CHIM ITAL 114:65 (1984)；Rosenthal et al., TETRAHEDRON LETT 24:1691 (1983)；Belagaje and Brush, NUC ACIDS RES 10:6295 (1977)を参照されたく、溶液相の５’−から３’−合成を記載している参考文献には、Hayatsu and Khorana, J AM CHEM SOC 89:3880 (1957)；Gait and Sheppard, NUC ACIDS RES 4: 1135 (1977)；Cramer and Koster, ANGEW CHEM INT ED ENGL 7:473 (1968)；およびBlackburn et al., J CHEM SOC PART C, 2438 (1967)が挙げられる。追加的に、Matteucci and Caruthers, J AM CHEM SOC 103:3185-91 (1981)は、オリゴヌクレオチドの調製へのホスホクロリダイトの使用を記載し;Beaucage and Caruthers, TETRAHEDRON LETT 22:1859-62 (1981)およびCaruthersらの米国特許第４，４１５，７３２号は、オリゴヌクレオチドの調製のためのホスホルアミダイトの使用を記載している。Smith, AM BIOTECH LAB, pp.15-24 （December 1983）は、自動固相オリゴデオキシリボヌクレオチド合成を記載しており、T. Horn and M.S. Urdea, DNA 5:421-25 (1986)は、ビス（シアノエトキシ）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフィンを用いた固体支持ＤＮＡフラグメントのリン酸化を記載している。Smith、上記；Warner et al., DNA 3:401-11 (1984)；およびT. Horn and M.S. Urdea, TETRAHEDRON LETT 27:4705-08 (1986)に引用された参考文献もまた参照されたい。
【００３８】
用語「ヌクレオチド」および「ヌクレオシド」は、四つの天然ＤＮＡヌクレオチド塩基、すなわちプリン塩基であるグアニン（Ｇ）およびアデニン（Ａ）ならびにピリミジン塩基であるシトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）だけでなく、ＲＮＡプリン塩基であるウラシル（Ｕ）、非天然ヌクレオチド塩基であるイソ−Ｇおよびイソ−Ｃ、ユニバーサル塩基、縮重塩基、ならびに他の改変ヌクレオチドおよびヌクレオシドを含有するヌクレオシドおよびヌクレオチドを表す。縮重塩基は、オリゴヌクレオチドに導入するとＧまたはＡのいずれかと塩基対形成する二重縮重ピリミジン誘導体６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−オン（Ｐ）と、オリゴヌクレオチドに導入するとＣまたはＴのいずれかと塩基対形成する二重縮重プリン誘導体Ｎ６−メトキシ−２，６，−ジアミノプリン（Ｋ）とからなる。ユニバーサル塩基は、オリゴヌクレオチド二本鎖の融解挙動またはオリゴヌクレオチドの機能的生化学的有用性のどちらにもあまり影響せずに四つの通常の塩基のうち任意のものに置き換わる能力を示す塩基である。ユニバーサル塩基の例には、３−ニトロピロール、ならびに４−、５−および６−ニトロインドール、ならびに２−デオキシイノシン（ｄＩ）が挙げられ、この後者は、唯一の「天然」ユニバーサル塩基とみなされる。ｄＩは全ての天然塩基に理論的に結合することができるが、ｄＩは主にＧとしてコードされる。
【００３９】
ヌクレオチドおよびヌクレオシドに加える改変には、非限定的にプリンまたはピリミジン部分のメチル化またはアシル化、ピリミジン環から、またはプリン環系における一つもしくは複数の環から異なる複素環構造への置換、および例えばアセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、イソブチリル、ベンゾイルなどの保護基を使用した一つまたは複数の官能基の保護が含まれる。改変ヌクレオシドおよび改変ヌクレオチドには、例えば一つまたは複数のヒドロキシル基がハライドおよび／もしくはヒドロカルビル置換基（後者の場合、典型的には脂肪族基）に置き換わるか、またはエーテル、アミンなどとして官能化された、糖部分への改変もまた含まれる。改変ヌクレオチドおよび改変ヌクレオシドの例には、非限定的に１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、Ｎ6−メチルアデニン、Ｎ6−イソペンチル−アデニン、２−メチルチオ−Ｎ6−イソペンチルアデニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、８−ブロモアデニン、２−チオシトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、５−エチルシトシン、４−アセチルシトシン、１−メチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、８−ブロモ−グアニン、８−クロログアニン、８−アミノグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、５−エチルウラシル、５−プロピルウラシル、５−メトキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−（メチル−アミノメチル）ウラシル、５−（カルボキシメチルアミノメチル）−ウラシル、２−チオウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−（２−ブロモビニル）ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、プソイドウラシル、１−メチルプソイドウラシル、キューオシン（queosine）、イノシン、１−メチルイノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、２−アミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−チオプリン、および２，６−ジアミノプリンが挙げられる。
【００４０】
用語「相補的」および「実質的に相補的」は、ヌクレオチドまたは核酸間の、例えば二本鎖ＤＮＡ分子の二つの鎖間の、またはオリゴヌクレオチドプライマーと、配列決定または増幅される一本鎖核酸上のプライマー結合部位との間の塩基対形成を表す。相補的ヌクレオチドは、一般にＡおよびＴ（またはＡおよびＵ）、ならびにＧおよびＣである。本発明の状況内で、記載した特異的配列長は例示的であって限定するものではないこと、および同一のマップ位置にわたる配列であって、わずかに多少のある塩基数を有する配列は、記載した配列とターゲット上で同じ位置にハイブリダイゼーションするならば配列の同等物とみなされ、本発明の範囲内に属することを了解されたい。核酸がハイブリダイゼーションするために完全な相補性は必要ないことが了解されていることから、本明細書に開示するプローブおよびプライマーの配列は、特異的プライマーおよびプローブとして有用性を失うことなくある程度改変することができる。全般に、８０％以上の相同性を有する配列が本発明の範囲内に属する。当技術分野で公知のように、相補的核酸配列および部分相補的核酸配列のハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件を調整してストリンジェンシーを増加または減少させることにより、すなわちハイブリダイゼーション温度または緩衝液の塩含量を調整することにより得ることができる。開示された配列の特異性を維持するためのこのような小さな改変およびハイブリダイゼーション条件の任意の必要な調整は、日常的な実験のみを必要とし、当技術分野の通常の技術の範囲内である。
【００４１】
用語「ハイブリダイゼーション条件」は、相補的配列の少なくとも一部に相互にアニーリングさせるために十分な時間、温度、およびｐＨ、ならびに反応物および試薬の必要量および濃度の条件を意味することを意図する。当技術分野に周知であるように、ハイブリダイゼーションを達成するために必要な時間、温度およびｐＨ条件は、ハイブリダイゼーションされるオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーのサイズ、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーとターゲットとの間の相補度、およびハイブリダイゼーション反応混合物中の他の物質の存在に依存する。各ハイブリダイゼーション段階に必要な実際の条件は、当技術分野において周知であるか、または過度に実験せずに決定することができる。ハイブリダイゼーション条件には、プライマー、プローブ、および他の構成要素に関して適合性の緩衝液、すなわち化学的に不活性な緩衝液であって、それでもなお相補的塩基対の間のハイブリダイゼーションを可能にする緩衝液もまた含まれ、これを使用することができる。このような緩衝液の選択は、当業者の知識の範囲内である。
【００４２】
試料からのＤＮＡおよびＲＮＡターゲット配列の単離に、異なるハイブリダイゼーション条件が必要なことは、当業者に了解されている。例えば、試料が当初アルカリ緩衝液中で崩壊されるならば、二本鎖ＤＮＡが変性し、ＲＮＡは破壊される。対照的に、試料がＳＤＳおよびプロテイナーゼＫを有する中性緩衝液中で収集されるならば、ＤＮＡは二本鎖のままで、プライマーおよび／またはプローブとハイブリダイゼーションすることができず、ＲＮＡは分解から保護される。
【００４３】
用語「支持体」および「基質」は、オリゴヌクレオチドプローブもしくはプライマー、分析物分子、または他の化学的実体をアンカーすることのできる任意の固体表面または半固体表面を表すために相互交換可能に使用される。適切な支持体物質には、非限定的に、典型的には固相化学合成に使用される支持体が含まれ、例えばビーズ、シートおよびマイクロタイターウェルもしくはマイクロタイタープレートに使用するためのポリマー物質およびプラスチック（例には、非限定的にポリスチレン、ポリスチレンラテックス、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸メチル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートおよびジビニルベンゼン−スチレン系ポリマーが含まれる）；ポリマーゲル；ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）などのアガロース；ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）などのデキストラン）；ニトロセルロースなどのセルロース；セルロースポリマー；多糖；シリカおよびシリカ系物質；ガラス（特に制御孔ガラス（controlled pore glass））および機能性ガラス；セラミック、ならびに金属が含まれる。
【００４４】
本明細書に使用する用語「ラベル」は、検出可能な（好ましくは定量化可能な）シグナルを提供するために使用することできる任意の原子または分子であって、共有結合または非共有相互作用により（例えばイオン結合もしくは水素結合を介して、または固定化、吸着などにより）核酸またはタンパク質に結びつくことができる任意の原子または分子を表す。ラベルは、広くは蛍光、化学発光、放射能、比色分析、質量分析、Ｘ線回折または吸収、磁気、酵素活性などにより検出可能なシグナルを提供する。ラベルの例には、発蛍光団、発色団、放射性原子（特に32Ｐおよび125Ｉ）、高電子密度試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンドが含まれる。酵素は、典型的にはその活性により検出される。
【００４５】
本明細書に使用する用語「ターゲット増幅」は、核酸ターゲットの数十億のコピーを産生することができる酵素介在性手順を表す。当技術分野において公知の酵素介在性ターゲット増幅の例には、ＰＣＲ、「ＮＡＳＢＡ」（nucleic acid-sequence based amplification）、「ＴＭＡ」（transcription-mediated amplification）、「ＳＤＡ」（strand displacement amplification）、および「ＬＣＲ」(ligase chain reaction）が挙げられる。
【００４６】
最も広く使用されているターゲット増幅手順はＰＣＲであり、これは、ＤＮＡの増幅についてＭｕｌｌｉｎｓらによって米国特許第４，６８３，１９５号に、そしてＭｕｌｌｉｓによって米国特許第４，６８３，２０２号に最初に記載された。ＰＣＲ手順は、当業者に周知である。ＰＣＲ技法では、ＤＮＡの試料は、ＤＮＡ二本鎖の各鎖の３’末端に相補的なように調製されたモル過剰の二つのオリゴヌクレオチドプライマー（それぞれ１０〜３０塩基対）；モル過剰の未結合ヌクレオチド塩基（すなわちｄＮＴＰ）；およびオリゴヌクレオチドプライマーおよびｄＮＴＰからのＤＮＡ形成を触媒するＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは熱に安定なＴａｑポリメラーゼ）を有する溶液中で混合される。二つのプライマーのうち一方は、変性したＤＮＡ分析物の一方の鎖の３’末端に５’→３’方向に結合するフォラードプライマーであり、もう一方は、変性したＤＮＡ分析物のもう一方の鎖の３’末端に３’→５’方向に結合するリバースプライマーである。二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性させるために、この溶液は９４〜９６℃に加熱される。この溶液を冷却すると、プライマーは分離された鎖に結合し、ＤＮＡポリメラーゼは、ｄＮＴＰをプライマーに繋げることによって分析物の新しい鎖を触媒する。このプロセスを繰り返し、プライマーから合成された伸長産物をその相補体から分離すると、各伸長産物は、もう一方のプライマーから合成された相補的伸長産物のためのテンプレートとして作用する。言い換えると、フォワードプライマーから合成された伸長産物が分離されると、リバースプライマーから合成された相補的伸長産物のためのテンプレートとして作用する。同様に、リバースプライマーから合成された伸長産物が分離されると、フォワードプライマーから合成された相補的伸長産物のためのテンプレートとして作用する。このように、プライマー間のＤＮＡ領域は、プロセスを繰り返す度に選択的に複製される。増幅中の配列がサイクルが終わる度に倍増することから、プロセスを数時間繰り返した後で１０億コピーの理論的増幅を実現することができ、その結果、ＰＣＲを用いてごく少量のＤＮＡを比較的短時間で増幅することができる。
【００４７】
用語「増幅配列」、「増幅産物」および「アンプリコン」は相互交換可能に使用され、ＰＣＲの最終産物である一本鎖配列を表す。
【００４８】
ＰＣＲ用の出発物質がＲＮＡである場合に、相補的ＤＮＡ（「ｃＤＮＡ」）は逆転写によってＲＮＡから作られる。次いで、結果として得られたｃＤＮＡは、上記ＰＣＲプロトコールを用いて増幅される。逆転写酵素は、レトロウイルスに見出される、例えばテンプレートとしてのｍＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ配列などのＲＮＡ配列からＤＮＡの相補的一本鎖を合成することのできる酵素として当業者に知られている。この酵素は、遺伝子工学に使用され、ＲＮＡ（すなわち例えばｍＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ）の精製調製物から特異的ｃＤＮＡ分子が産生される。ＲＮＡ産物を増幅するために使用されるＰＣＲは、逆転写酵素ＰＣＲまたは「ＲＴ−ＰＣＲ」と呼ばれる。
【００４９】
用語「動力学的ＰＣＲ（ｋＰＣＲ）または「動力学的ＲＴ−ＰＣＲ」（ｋＲＴ−ＰＣＲ）は、それぞれ「リアルタイムＰＣＲ」および「リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ」とも呼ばれるが、同一または異なるオリゴヌクレオチド基質への蛍光色素分子およびクエンチャー部分の連結により発生する蛍光シグナルによるＰＣＲ産物の検出を表す。ｋＰＣＲおよびｋＲＴ−ＰＣＲに使用されるなじみ深いプローブの例には、以下のプローブが挙げられる：ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ、分子ビーコンプローブ、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（登録商標）プローブ、およびＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎプローブ。簡潔には、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ、分子ビーコン、およびＳＣＯＲＰＩＯＮ（登録商標）プローブは、それぞれプローブの５’末端に結びついた蛍光レポーター色素（「フルオル（fluor）とも呼ばれる）と、プローブの３’末端に連結したクエンチャー部分とを有する。ハイブリダイゼーションしていない状態では、フルオルおよびクエンチ分子が近接していることから、プローブからの蛍光シグナルの検出が阻害され、プローブが結合しているテンプレートをポリメラーゼが複製するＰＣＲの間には、ポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性がプローブを切断することによって、複製サイクルの度に蛍光が増加する。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎプローブは、二本鎖ＤＮＡに結合し、励起する際に発光することから、ＰＣＲ産物が蓄積するにしたがって蛍光が増加する。
【００５０】
用語「シングルプレックス」は、任意の他のアッセイと同時に実施されない単一アッセイを表す。シングルプレックスアッセイには、連続的に実施される個別のアッセイが含まれる。
【００５１】
用語「マルチプレックス」は、同時に実施される複数のアッセイを表し、このアッセイでは検出ステップおよび分析ステップは広くは平行して実行される。本発明の状況内で、マルチプレックスアッセイにはプライマーおよびプローブを単独で、または追加のプライマーおよびプローブと共に使用して、例えばインフルエンザウイルスを一つまたは複数の追加のウイルスと共に同定することが含まれるものである。本発明の状況内では、内部対照および／または追加の呼吸器ウイルスのためのプライマーおよびプローブをＩＮＦＡならびにＩＮＦＡのプライマーおよびプローブと一緒に１回のマルチプレックスアッセイで使用することができることが了解されている。
【００５２】
以下は、請求された本発明のいくつかの好ましい態様および実施例の説明である。追加的な態様、および開示された態様の機能、目的または構造における改変は、本出願の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【００５３】
本発明のトリおよびヒトＩＮＦＡならびにヒトＩＮＦＢの増幅プライマーおよび検出プローブは、ＩＮＦＡおよびＩＮＦＢ配列の間に見出される高い縮重を説明するために複数の配列をアライメントすることによって、そして適切であれば、その配列に縮重プローブおよび／またはユニバーサルプローブを組み込むことによって得られるコンセンサス配列である。
【００５４】
トリインフルエンザＡ型のプライマーおよびプローブセット
本発明の一態様では、トリＩＮＦＡのＨ５亜型を増幅および検出するトリＩＮＦＡの増幅プライマーおよび検出プローブが提供される。Ｈ５プライマーおよびプローブは、５５個のトリおよびヒトＩＮＦＡ  Ｈ５配列のアライメントに基づき設計された（表１）。Ｈ５亜型を選択したのは、これらのトリ亜型がブタなどの中間宿主内で再編成せずに、種を飛び越えヒトに感染する能力が原因である。ＨＡ遺伝子配列の最も高度に保存された領域を選択することによって、そして適切であれば縮重塩基および／またはユニバーサル塩基を含めることによって、ＨＡ領域を通じて見出される高い縮重を適応させるようにトリＨ５のプライマーおよびプローブセットを設計した。本発明のＨ５プライマーおよびプローブの特異性は高い特異性を有し、Ｈ５トリＩＮＦＡ  ＨＡ亜型を残りの１６個のトリＩＮＦＡ  ＨＡ亜型から区別することができる。
【００５５】
ヒトインフルエンザＡ型のプライマーおよびプローブセット：
本発明の別の態様では、ヒトＩＮＦＡのＭ１マトリックス遺伝子配列を増幅および検出するヒトＩＮＦＡ増幅プライマーおよび検出プローブが提供される。ＩＮＦＡマトリックスプライマーおよびプローブは、ヒトＩＮＦＡの１３亜型からの４１４個のヒトマトリックスタンパク質遺伝子配列のアライメントに基づき設計された。マトリックスの最も高度に保存された領域を選択することによって、そして適切であれば縮重塩基および／またはユニバーサル塩基を含めることによって、ヒトＩＮＦＡゲノムを通じて見出される高い縮重を適応させるようにヒトＩＮＦＡプライマーおよびプローブセットを設計した。プライマーおよびプローブをそのようなものとして設計することによって、本発明のヒトＩＮＦＡマトリックスプライマーおよびプローブは、公知のヒトＩＮＦＡ亜型の全てを検出することができる。ヒトＩＮＦＡマトリックス配列をトリＩＮＦＡマトリックス配列とアライメントすることによって、ヒトＩＮＦＡのプライマーおよびプローブを使用して、トリＩＮＦＡも同様に増幅および検出することができる。
【００５６】
実施例４に、ｋＲＴ−ＰＣＲを使用したＩＮＦＡマトリックスアッセイに本発明のヒトＩＮＦＡマトリックスプライマーおよびプローブを使用して、組織培養抽出液をＨ１Ｎ１およびＨ５Ｎ２について試験することを説明する。全ての公知のヒトＩＮＦＡ亜型を検出および増幅するためにＩＮＦＡマトリックスアッセイを使用することができることから、実施例４はＩＮＦＡ亜型を検出するためにＩＮＦＡマトリックスアッセイを使用することを単に例示しているだけであり、Ｈ１Ｎ１およびＨ５Ｎ２亜型のみを検出するためにこのアッセイを使用することに全く限定されないと解されるであろう。図２（ａ）から２（ｈ）（実施例６）にもまた、インフルエンザＨ１、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８およびＨ９亜型を検出するために本発明のヒトＩＮＦＡマトリックスプライマーおよびプローブを使用することを説明する。
【００５７】
ヒトインフルエンザＢ型のプライマーおよびプローブのセット：
本発明のさらなる態様では、ヒトＩＮＦＢの非構造遺伝子（ＮＳ１およびＮＳ２）を増幅および検出するヒトＩＮＦＢ増幅プライマーおよびプローブが提供される。ＩＮＦＢ構造遺伝子のプライマーおよびプローブは、１１７個のヒトセグメント８（ＮＳ１およびＮＳ２）遺伝子配列のアライメントに基づき設計された（表３）。上記のトリおよびヒトＩＮＦＡのプライマーおよびプローブのように、非構造遺伝子配列の最も高度に保存された領域を選択することによって、そして適切であれば縮重塩基および／またはユニバーサル塩基を含めることによって、ＩＮＦＢ  Ｂゲノムを通じて見出される高い縮重を適応させるようにヒトＩＮＦＢのプライマーおよびプローブのセットを設計した。
【００５８】
用途
本発明のプライマーおよびプローブは、トリであれヒトであれ対象がＩＮＦＡまたはＩＮＦＢの特定の株または亜型に感染しているかどうかを判定するための診断アッセイに有用である。このようなアッセイには、臨床試料に使用するための任意の核酸増幅試験（ＮＡＡＴＳ）が含まれ、この試験には、非限定的にＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｋＰＣＲ、ｋＲＴ−ＰＣＲ、サザンブロット分析およびリニア増幅法などのＮＡＡＴが含まれる。本発明の好ましい態様では、このプライマーおよびプローブは、任意のヒトまたは動物対象からＩＮＦＡおよびＩＮＦＢを検出するためのｋＰＣＲアッセイに使用される。
【００５９】
本発明のプライマーおよびプローブは、単一のＩＮＦＡまたは単一のＩＮＦＢを検出するために単一の試料を試験するためのシングルプレックスアッセイに使用することができるし（実施例４は、ＩＮＦＡを検出および定量化するためのシングルプレックスアッセイに本発明のプライマーおよびプローブを使用することを示す）、これらは、一つまたは複数のＩＮＦＡおよびＩＮＦＢについてヒト試料を試験するマルチプレックスアッセイに使用することができる（実施例５、表７はＩＮＦＡおよびＩＮＦＡを検出および定量化するマルチプレックス形式に本発明のプライマーおよびプローブを使用することを示す）。ＩＮＦＡおよび／またはＩＮＦＢのプライマーおよびプローブは、他の増幅プライマーおよび検出プローブと共にマルチプレックスアッセイに使用して、パラインフルエンザ１、２、３および４、ＲＳＶ  ＡおよびＲＳＶ  Ｂ、メタニューモウイルス、アデノウイルス、クラミジアニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）、マイコプラズマニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae）、ならびにレジオネラニューモフィリア（Legionella pneumophilia）などの他の呼吸器生物と一緒にＩＮＦＡおよび／またはＩＮＦＢの同時検出に供することができる（実施例５、表８に、ＩＮＦＡおよびＩＮＦＢを平行して検出および定量化するためのマルチプレックス形式に本発明のプライマーおよびプローブを使用することを示す。ライノウイルス、パラインフルエンザウイルス（paraflu）、および呼吸器合胞体ウイルス（「ＲＳＶ」）などの追加的なウイルスの存在は、本発明のプライマーおよびプローブの特異性に変化をもたらさなかった。
【００６０】
本発明のプライマーおよびプローブには、臨床家によって、インフルエンザの症状に苦しむ患者からヒトおよびトリインフルエンザウイルスを検出するために使用されるキットもまた含まれることがある。このようなキットには、トリＩＮＦＡ、ヒトＩＮＦＡまたはヒトＩＮＦＢを検出するための一つまたは複数のプライマーおよびプローブセットが含まれるものである。
【００６１】
上に言及したように、本明細書に開示されたプライマーおよびプローブは、対象がＩＮＦＡまたはＩＮＦＢに感染しているかどうかを判定するために設計されうるプライマーおよびプローブを例示することから、本発明の別の態様では、インフルエンザの複数の株および亜型から得られるコンセンサス配列を含む、インフルエンザウイルスの検出用のプライマーおよびプローブを調製し、適切ならばその配列に縮重塩基および／またはユニバーサル塩基を組み込むための方法を提供する。
【００６２】
本発明を、その好ましい特定の態様と共に説明したが、前述の説明および以下の実施例は、例示を意図し、本発明の範囲を限定するものではないことを了解されたい。他の局面、利点および本発明の範囲内の改変は、本発明が属する技術分野の技術者に明らかなものである。
【００６３】
本明細書に言及される全ての特許および刊行物は、その全体が参照により組み入れられる。
【００６４】
以下の例は、本発明の組成物をどのように作製および使用するかの完全な開示および説明を当業者に提供するために出されたものである。この実施例は、本発明の非限定的な例として意図される。
【００６５】
実験の部
本発明の実施は、別に示さない限り当技術分野の技術の範囲内の分子生物学、生化学、微生物学などの通常の技法を使用するものである。このような技法は、文献に十分に解説されている。例えば、Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed. (1989)；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait, ed., 1984)；THE PRACTICE OF PEPTIDE SYNTHESIS (M. Bodanszky and A. Bodanszky, 2nd ed., Springer-Verlag, New York, NY, 1994)；NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B. D. Haines & S. J. Higgins, eds., 1984)；およびMETHODS IN ENZYMOLOGY (Elsevier, Inc., Burlington, MA)を参照されたい。
【００６６】
以下の実施例において、数（例えば量、温度など）に関する正確さを確実にするために努力されてきたが、説明された実験を行うときは実験誤差および偏差を考慮すべきである。別に示さない限り、部は重量部であり、温度はセ氏であり、圧力は大気圧または大気圧付近であり、全ての実験成分は市販の入手源から得られる。
【００６７】
本発明のプライマーおよびプローブのコンセンサス配列を決定するために使用される配列は、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅから得られた。インターネットのwww.flu.lanl.govから入手できるMacken et al., OPTIONS FOR THE CONTROL OF INFLUENZA IV, pp. 103-106 (A.D.M.E. Osterhaus, N. Cox & A.W. Hampson (eds.) Amsterdam: Elsevier Science, 2001)である。Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ＡｌｉｇｎＸソフトウェア（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）を相同配列のアライメントに使用した。
【００６８】
以下の表記法を実施例に使用する：「ＡＶ」はトリを表し；「ＩＮＦＡ」はインフルエンザＡ型を表し；「ＩＮＦＢ」はインフルエンザＢ型を表し；「Ｈ５」はトリＩＮＦＡのＨ５亜型を表し；「Ｍ」はマトリックスタンパク質遺伝子（Ｍ１およびＭ２）を表し；「Ｓｅｇ８」は非構造タンパク質遺伝子（ＮＳ１およびＮＳ２）を表し；「Ｆｗ」はフォワードプライマーを表し；「Ｒｖ」はリバースプライマーを表し；「Ｐ」はプローブを表し；「Ｓ」はセンス鎖を表し；かつ「ＡＳ」はアンチセンス鎖を表し；かつ「Ｃｔ」はサイクル閾値（バックグラウンドを超えて有意に増大した蛍光が最初に検出されるサイクル数）を表す。
【００６９】
以下の実施例に使用されるｋＲＴ−ＰＣＲアッセイは、ＭＸ３０００Ｐ（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Stratagene, La Jolla, CA）で最大９０試料について約２．４時間かかる運転時間で行われた。各ｋＲＴ−ＰＣＲの運転物は、陽性および陰性対照ならびに定量化されたＩＮＦＡ  ＲＮＡウイルス培養抽出物を系列希釈したものからなる定量用標準を含有した。被験領域（例えば、どのアッセイが行われるかに応じて、トリＨ５領域、トリもしくはヒトマトリックス遺伝子領域、またはヒトセグメント８領域）からクローニングされたフラグメントから発生した定量化されたＲＮＡ転写物を用いて、標準に値を割り付けた。値を割り付けられたウイルス抽出物標準を使用して、各アッセイについて実現されたサイクル閾値（Ｃｔ）を比較した。各アッセイ物は内部対照（ＩＣ）を含有し、内部対照を抽出中に試料に添加し、阻害剤の効率および存在についてアッセイ手順を評定した。アッセイの特異性は、ＩＮＦＡ亜型のパネル、一般的なヒト呼吸器病原体のパネル、ならびに正常なヒト呼吸器組織および呼吸液を試験することによって確認した。
【００７０】
実施例１
トリインフルエンザＨ５亜型
増幅プライマーおよび検出プローブの配列
表１は、トリＩＮＦＡのＨ５亜型のＨＡ遺伝子配列を増幅および検出するように設計された増幅プライマーおよび検出プローブセットを確認するものである。マップ上の位置は、アクセッションナンバーＡＪ８６７０７４を参照し、配列の設計は、５５個のトリおよびヒトＩＮＦＡ  Ｈ５配列のアライメントに基づく。
【００７１】
【表１】
2009535068.tif 000002
【００７２】
実施例２
ヒトインフルエンザＡ型Ｍ１マトリックス遺伝子の増幅プライマーおよび検出プローブの配列
表２に、ヒトおよびトリＩＮＦＡのＭ１遺伝子配列を増幅および検出するために設計された増幅プライマーおよび検出プローブを確認する。マップ上の位置はアクセッションナンバーＡＹ３４００９０を参照し、配列の設計は４１４個のトリおよびヒトＩＮＦＡマトリックス配列のアライメントに基づく。
【００７３】
【表２】
2009535068.tif 000003
【００７４】
実施例３
ヒトインフルエンザＢ型セグメント８の増幅プライマーおよび検出プローブの配列
表３に、ヒトＩＮＦＢのセグメント８（ＮＳ１およびＮＳ２）遺伝子配列を増幅および検出するために設計された増幅プライマーおよび検出プローブを確認する。マップはアクセッションナンバーＡＢ１２０４３９を参照し、配列の設計はヒトＩＮＦＢ  ＮＳ１およびＮＳ２配列１１７個のアライメントに基づく。
【００７５】
【表３】
2009535068.tif 000004
【００７６】
実施例４
ＩＮＦＡのシングルプレックスマトリックスアッセイ
シングルプレックスアッセイでウイルスＲＮＡ抽出物の試料からＨ１Ｎ１およびＨ５Ｎ２を検出および増幅するために、実施例２のＩＮＦＡマトリックス遺伝子のプライマーおよびプローブをｋＲＴ−ＰＣＲアッセイに使用した。Ｈ１Ｎ１についてのＩＮＦＡマトリックスアッセイの結果を表４に示し、Ｈ５Ｎ２についてのＩＮＦＡマトリックスアッセイの結果を表５に示す。表４および５に示すＩＮＦＡマトリックスアッセイの結果は、このプライマーおよびプローブが非常に小さなコピー数の試料からＨ１Ｎ１およびＨ５Ｎ２をうまく検出および増幅したことを実証している。
【００７７】
表６に、異なるコピー数を有する試料に関するＩＮＦＡマトリックスアッセイについての精度および直線性の計算を概要する。表６に示すように、特定のＩＮＦＡ亜型のコピーを１００個以上有する試料についての検出率は１００％である。ＩＮＦＡマトリックスアッセイについての検出プロファイルは、図１にグラフで示す。
【００７８】
【表４】
2009535068.tif 000005
【００７９】
【表５】
2009535068.tif 000006
【００８０】
【表６】
2009535068.tif 000007
【００８１】
実施例５
マルチプレックスアッセイ
表７に、ＩＮＦＡおよびＩＮＦＢについてスクリーニングするマルチプレックスアッセイの結果を示し、表８に、ＩＮＦＡおよびＩＮＦＢについてスクリーニングするマルチプレックスアッセイの結果を示し、特に表８に、ライノウイルス、パラインフルエンザウイルスおよびＲＳＶなどの追加のウイルスの存在が本発明のインフルエンザのプライマーおよびプローブの特異性に変化をもたらさないことを示す。以前に注記したように、全てのアッセイは陰性対照および陽性対照と同時に実行される。
【００８２】
【表７】
2009535068.tif 000008
【００８３】
【表８】
2009535068.tif 000009
2009535068.tif 000010
【００８４】
実施例６
ウイルス原液に関するトリＩＮＦＡアッセイの比較分析
本発明のＩＮＦＡトリＨ５アッセイおよびマトリックスアッセイ（実施例１、２および４）を、ＵＳＤＡ−ＡＲＳにより標準化されたトリＨ５アッセイおよびマトリックスアッセイと比較した。ＩＮＦＡアッセイは、同じトリウイルス原液セットに関して二つのアッセイ形式で行った：（１）ＩＮＦＡ亜型パネルから単離された核酸の一連の１０倍希釈物（ヘマグルチニンＨ１、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８およびＨ９亜型からの十分に特徴付けされたウイルス単離物を含有した）を用いた汎ＩＮＦＡアッセイ形式；ならびに（２）定量化された標準（Ｈ５Ｎ２単離物由来ウイルス抽出物の希釈物から作製した）を用いたＨ５特異的アッセイ形式。
【００８５】
本発明のＩＮＦＡマトリックスアッセイおよびＨ５特異的アッセイは、実施例１の前の考察に上記したように行った。汎ＩＮＦＡマトリックスアッセイは、マトリックス遺伝子の約２０２ｂｐ（塩基対）領域をターゲティングし、Ｈ５特異的アッセイは、ヘマグルチニン遺伝子由来の約１８０ｂｐのフラグメントをターゲティングした。以前に言及したように、本発明のＩＮＦＡマトリックスのプライマーおよびプローブは、現在公知の全てのＩＮＦＡ亜型配列を検出するように設計されている。
【００８６】
ＵＳＤＡ−ＡＲＳのＩＮＦＡマトリックスアッセイおよびＨ５特異的アッセイは、以下のサーモサイクラーでワンステップｋＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して行った：ＩＮＦＡマトリックスアッセイにはＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｈｒｏｍｏ４（商標）（Hercules, CA）およびＨ５特異的アッセイにはＣｅｐｈｅｉｄ  ＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Sunnyvale, CA）（Spackman et al., J. CLIN. MICROBIOL. 40(9):3256-3260を参照されたい）。
【００８７】
本発明の汎ＩＮＦＡマトリックスアッセイおよびＵＳＤＡ−ＡＲＳにより検出された最低レベルのウイルスＲＮＡ（ＬｏＤ）を、以下のメンバー、すなわちＨ１、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８およびＨ９を含めたＩＮＦＡ亜型パネルから高力価のウイルス原液の系列希釈物を試験することによって決定した。Ｈ５トリＩＮＦＡアッセイの相対感度は、Ｈ５Ｎ２インフルエンザ単離物の高力価ウイルス原液を１．６×１０6から３０コピーまで系列希釈したものを定量化することによって決定した。Ｈ５Ｎ２標準には、クローニングしたマトリックスフラグメントからのＲＮＡ転写物に対比して値を割り付けた。
【００８８】
汎ＩＮＦＡマトリックスアッセイの結果を図２（ａ）〜２（ｈ）にグラフで示し、各回のアッセイの終点感度の結果を表９に示す（本発明のアッセイは、「Ｂａｙｅｒ」アッセイとして図から確認され、Ｂａｙｅｒは、本発明の譲受け人である）。図２（ａ）〜２（ｈ）に、表９のデータが獲得された系列希釈物を示す（図２（ｅ）はＨ６Ｎ２亜型についての実行の１回だけを示す）。実行された１０回のアッセイのうち８回で、具体的にはＨ１Ｎ１、Ｈ３、Ｈ５Ｎ２、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９Ｎ２のアッセイ、および３回のＨ６Ｎ２アッセイのうち２回で、本発明のＩＮＦＡマトリックスアッセイが、ＵＳＤＡ−ＡＲＳ  ＩＮＦＡマトリックスアッセイよりも高い感度（すなわち低いＬｏＤ）を示したことを、表９は明らかに示している。全般的に、本発明の汎ＩＮＦＡマトリックスアッセイは、亜型パネルの希釈系列を通じて最低のＬｏＤを有した（１から３０倍の改善）。加えて、本発明の汎ＩＮＦＡマトリックスアッセイがＵＳＤＡ−ＡＲＳ汎ＩＮＦＡマトリックスアッセイよりも約５０から１００倍高い希釈でウイルスのレベルを定量化したＨ１亜型を例外として、大部分の亜型の定量化は類似していた。
【００８９】
【表９】
2009535068.tif 000011
【００９０】
Ｈ５特異的アッセイの結果を図３および図４に示す。本発明のＨ５トリＩＮＦＡアッセイが反応１回あたり３０コピーまで検出および定量化したのに対して、ＵＳＤＡ−ＡＲＳのＨ５−トリＩＮＦＡアッセイは反応１回あたり８０コピーまで定量化したことを図３に示すが、これは、本発明のＨ５−トリＩＮＦＡアッセイが、ＵＳＤＡ−ＡＲＳのＨ５−トリＩＮＦＡアッセイよりも低いＣｔ値でＨ５Ｎ２（アメリカ系統）を検出できることを示す。図４に、アーマード（armored）ＲＮＡユーラシア系統配列に関してＨ５−トリＩＮＦＡアッセイおよびＵＳＤＡ−ＡＲＳ  Ｈ５−トリＩＮＦＡアッセイを比較したときに、本発明のＨ５−トリＩＮＦＡアッセイが１０4および１０3コピー数の希釈物を検出したが、ＵＳＤＡ−ＡＲＳのＨ５トリＩＮＦＡアッセイはこれらの希釈を検出しなかったことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】本発明のＩＮＦＡマトリックスアッセイについての検出プロファイルを示す図である。
【図２（ａ）】本発明の汎ＩＮＦＡマトリックスアッセイおよびＵＳＤＡ−ＡＲＳにより使用された汎ＩＮＦＡマトリックスアッセイを用いてＩＮＦＡ亜型のパネルについてスクリーニングされた同じトリウイルス原液の比較分析の結果を示す図である。
【図２（ｂ）】本発明の汎ＩＮＦＡマトリックスアッセイおよびＵＳＤＡ−ＡＲＳにより使用された汎ＩＮＦＡマトリックスアッセイを用いてＩＮＦＡ亜型のパネルについてスクリーニングされた同じトリウイルス原液の比較分析の結果を示す図である。
【図２（ｃ）】本発明の汎ＩＮＦＡマトリックスアッセイおよびＵＳＤＡ−ＡＲＳにより使用された汎ＩＮＦＡマトリックスアッセイを用いてＩＮＦＡ亜型のパネルについてスクリーニングされた同じトリウイルス原液の比較分析の結果を示す図である。
【図２（ｄ）】本発明の汎ＩＮＦＡマトリックスアッセイおよびＵＳＤＡ−ＡＲＳにより使用された汎ＩＮＦＡマトリックスアッセイを用いてＩＮＦＡ亜型のパネルについてスクリーニングされた同じトリウイルス原液の比較分析の結果を示す図である。
【図２（ｅ）】本発明の汎ＩＮＦＡマトリックスアッセイおよびＵＳＤＡ−ＡＲＳにより使用された汎ＩＮＦＡマトリックスアッセイを用いてＩＮＦＡ亜型のパネルについてスクリーニングされた同じトリウイルス原液の比較分析の結果を示す図である。
【図２（ｆ）】本発明の汎ＩＮＦＡマトリックスアッセイおよびＵＳＤＡ−ＡＲＳにより使用された汎ＩＮＦＡマトリックスアッセイを用いてＩＮＦＡ亜型のパネルについてスクリーニングされた同じトリウイルス原液の比較分析の結果を示す図である。
【図２（ｇ）】本発明の汎ＩＮＦＡマトリックスアッセイおよびＵＳＤＡ−ＡＲＳにより使用された汎ＩＮＦＡマトリックスアッセイを用いてＩＮＦＡ亜型のパネルについてスクリーニングされた同じトリウイルス原液の比較分析の結果を示す図である。
【図２（ｈ）】本発明の汎ＩＮＦＡマトリックスアッセイおよびＵＳＤＡ−ＡＲＳにより使用された汎ＩＮＦＡマトリックスアッセイを用いてＩＮＦＡ亜型のパネルについてスクリーニングされた同じトリウイルス原液の比較分析の結果を示す図である。
【図３】本発明のトリＨ５特異的アッセイおよびＵＳＤＡ−ＡＲＳにより使用されたトリＨ５特異的アッセイを用いた、Ｈ５Ｎ２亜型（アメリカ系統）についてスクリーニングされた同じトリウイルス原液の比較分析を示す図である。
【図４】本発明のトリＨ５特異的アッセイおよびＵＳＤＡ−ＡＲＳによるトリＨ５特異的アッセイを用いた、同じアーマードＲＮＡ（ユーラシア系統）の比較分析の結果を示す図である。
【図１】
2009535068.tif 000012
【図２（ａ）】
2009535068.tif 000013
【図２（ｂ）】
2009535068.tif 000014
【図２（ｃ）】
2009535068.tif 000015
【図２（ｄ）】
2009535068.tif 000016
【図２（ｅ）】
2009535068.tif 000017
【図２（ｆ）】
2009535068.tif 000018
【図２（ｇ）】
2009535068.tif 000019
【図２（ｈ）】
2009535068.tif 000020
【図３】
2009535068.tif 000021
【図４】
2009535068.tif 000022
【配列表】
2009535068000001.app
【国際調査報告】
2009535068.tif 000023
2009535068.tif 000024
2009535068.tif 000025
2009535068.tif 000026