(57)【要約】  本発明の目的は、安全性が高く、造影と温熱療法とＤＤＳを一度に行えることができ、かつ薬剤内包率が高いナノ粒子を提供すること。本発明は、表面に活性物質が固定化されている平均粒子粒径1〜500nmの無機ナノ粒子、及びポリマーから構成されるナノ粒子を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に活性物質が固定化されている平均粒子粒径1〜500nmの無機ナノ粒子、及びポリマーから構成されるナノ粒子。
【請求項２】
無機ナノ粒子が磁性体ナノ粒子である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
無機ナノ粒子が酸化鉄、フェライト、酸化亜鉛、酸化チタン、シリカ、又はアルミナである、請求項１又は２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
表面にアミノ酸が固定化されている無機ナノ粒子の表面に、活性物質が物理吸着により固定化されている、請求項１から３の何れかに記載のナノ粒子。
【請求項５】
一般式：Ｒ１−（ＯＣＨ（Ｒ２）ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｌ−Ｘ
（式中、Ｒ１は、炭素鎖長１以上２０以下のアルキル基あるいはアルケニル基、無置換又は炭素鎖長１０以下のアルキル基若しくはアルコキシル基で置換されたフェニル基を表す；Ｒ２は、水素原子又はメチル基を表す；ｎは１以上２０以下の整数を示し、Ｌは単結合、又は炭素数１〜１０のアルキレン基を示し、Ｘはカルボン酸基、リン酸基、スルホン酸基又はホウ酸基を示す）で表される化合物で表面修飾されている無機ナノ粒子の表面にアミノ酸が固定化されており、さらにその表面に活性物質が物理吸着により固定化されている、請求項１から４の何れかに記載のナノ粒子。
【請求項６】
平均粒子サイズ１０〜１０００nmを有する、請求項１から５の何れかに記載のナノ粒子。
【請求項７】
無機ナノ粒子が平均粒子粒径１〜５０nmを有する、請求項１から６の何れかに記載のナノ粒子。
【請求項８】
ポリマーに対して０．１〜１００重量％の無機ナノ粒子を含む、請求項１から７の何れかに記載のナノ粒子。
【請求項９】
ポリマーに対して０.１〜１００重量％の活性物質を含む、請求項１から８の何れかに記載のナノ粒子。
【請求項１０】
活性物質が、化粧品成分、機能性食品用成分、又は医薬品成分である、請求項１から９の何れかに記載のナノ粒子。
【請求項１１】
化粧品成分が保湿剤、美白剤、又はアンチエイジング剤であり、機能性食品用成分がビタミン又は抗酸化剤であり、医薬品成分が制癌剤、抗アレルギー剤、抗血栓剤、又は抗炎症剤である、請求項１から１０の何れかに記載のナノ粒子。
【請求項１２】
ポリマーが合成高分子、生分解性高分子、又は天然高分子である、請求項１から１１の何れかに記載のナノ粒子。
【請求項１３】
ポリマーがタンパク質である、請求項１から１２の何れかに記載のナノ粒子。
【請求項１４】
タンパク質がナノ粒子の形成中または形成後に架橋処理されている、請求項１から１３の何れかに記載のナノ粒子。
【請求項１５】
タンパク質の重量に対して０.１〜１００重量％の架橋剤を添加することによってタンパク質が架橋処理されている、請求項１４に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
架橋剤が、無機または有機の架橋剤である、請求項１５に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
架橋剤が酵素、好ましくはトランスグルタミナーゼである、請求項１６に記載のナノ粒子。
【請求項１８】
タンパク質が有機溶媒中で架橋処理されている、請求項１４から１７の何れかにに記載のナノ粒子。
【請求項１９】
タンパク質が、リジン残基およびグルタミン残基を有する、請求項１３から１８の何れかに記載のナノ粒子。
【請求項２０】
タンパク質がコラーゲン、ゼラチン、アルブミン、オバルブミン、カゼイン、トランスフェリン、フィブリン、フィブリノーゲン、又はこれらの混合物である、請求項１３から１９の何れかに記載のナノ粒子。
【請求項２１】
タンパク質が酸処理ゼラチン又はアルブミンである、請求項１３から２０の何れかに記載のナノ粒子。
【請求項２２】
タンパク質が酸処理ゼラチンであり、無機ナノ粒子及び酸処理ゼラチンから構成されるナノ粒子の形成中または形成後に、酸処理ゼラチンを酵素で架橋処理することにより得られる、請求項１３から２１の何れかに記載のナノ粒子。
【請求項２３】
下記の工程によって製造される、請求項１３から２２の何れかに記載のナノ粒子。
（ａ）少なくとも１種の活性物質の溶液と無機ナノ粒子を混合することにより、無機ナノ粒子表面に活性物質を吸着させる工程；
（ｂ）タンパク質を水性媒体に溶解させる工程；
（ｃ）少なくとも１種の活性物質を吸着した無機ナノ粒子をタンパク質溶液と混合する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で得た溶液を有機溶媒に注入する工程；及び
（ｅ）架橋剤を添加してタンパク質を架橋する工程；
【請求項２４】
下記の工程によって製造される、請求項１３から２２の何れかに記載のナノ粒子。
（ａ）少なくとも１種の活性物質の溶液と無機ナノ粒子を混合することにより、無機ナノ粒子表面に活性物質を吸着させる工程；
（ｂ）タンパク質を水性媒体に溶解させる工程；
（ｃ）少なくとも１種の活性物質を吸着した無機ナノ粒子をタンパク質溶液と混合する工程；
（ｄ）酵素を添加する工程；及び
（ｅ）工程（ｄ）で得た溶液を有機溶媒に注入して、タンパク質を酵素で架橋する工程；
【請求項２５】
タンパク質を還元剤で処理してタンパク質分子内のジスルフィド結合を切断した後、該タンパク質のナノ粒子を形成し、さらに該タンパク質を酸化剤で処理することにより得られる、請求項１４に記載のナノ粒子。
【請求項２６】
タンパク質を酸化剤で処理する工程を、有機溶媒中に分散したタンパク質ナノ粒子を酸化剤で処理することによって行う、請求項２５に記載のナノ粒子。
【請求項２７】
タンパク質がアルブミン、オバルブミン、トランスフェリン、又はグロブリンである、請求項２５又は２６に記載のナノ粒子。
【請求項２８】
下記の工程によって製造される、請求項２５から２７の何れかに記載のナノ粒子。
（ａ）少なくとも１種の活性物質の溶液と無機ナノ粒子を混合することにより、無機ナノ粒子表面に活性物質を吸着させる工程；
（ｂ）ジスルフィド結合を還元したタンパク質を水に溶解させる工程；
（ｃ）少なくとも１種の活性物質を吸着した無機ナノ粒子をタンパク質溶液と混合する工程；
（ｄ）工程（ｃ）の溶液を有機溶媒に注入する工程；及び
（ｅ）上記で得られたものを酸化剤で処理する工程；
【請求項２９】
タンパク質がカゼインである、請求項１３記載のナノ粒子。
【請求項３０】
下記の工程によって製造される、請求項２９に記載のナノ粒子。
（ａ）少なくとも１種の活性物質の溶液と無機ナノ粒子を混合することにより、無機ナノ粒子表面に活性物質を吸着させる工程；
（ｂ）カゼインをpH８以上の塩基性水性媒体に溶解させる工程；
（ｃ）少なくとも１種の活性物質を吸着した無機ナノ粒子をカゼイン溶液と混合する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）の溶液をpH3.5〜7.5の水性媒体に注入する工程；
【請求項３１】
下記の工程によって製造される、請求項２９に記載のナノ粒子。
（ａ）少なくとも１種の活性物質の溶液と無機ナノ粒子を混合することにより、無機ナノ粒子表面に活性物質を吸着させる工程；
（ｂ）カゼインをpH８以上の塩基性水性媒体に溶解させる工程；
（ｃ）少なくとも１種の活性物質を吸着したナノ粒子をカゼイン溶液と混合する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）の溶液のpH をpH3.5〜7.5まで攪拌しながら下降させる工程；
【請求項３２】
ポリマーの重量に対して０.１〜１００重量％の脂質が添加されている、請求項１から３１の何れかに記載のナノ粒子。
【請求項３３】
ポリマーの重量に対して０．１〜１００重量％のカチオン性またはアニオン性多糖が添加されている、請求項１から３２の何れかに記載のナノ粒子。
【請求項３４】
ポリマーの重量に対して０．１〜１００重量％のカチオン性タンパク質またはアニオン性タンパク質が添加されている、請求項１から３３の何れかに記載のナノ粒子。
【請求項３５】
ポリマーの重量に対して０.１〜１００重量％のシクロデキストリンが添加されている、請求項１から３４の何れかに記載のナノ粒子。
【請求項３６】
請求項１から３５の何れかに記載のナノ粒子を含む、温熱療法剤。
【請求項３７】
請求項１から３５の何れかに記載のナノ粒子を含む、MRI造影剤。
【請求項３８】
請求項１から３５の何れかに記載のナノ粒子を含む、薬物送達剤。
【請求項３９】
表面に活性物質が固定化されている平均粒子粒径1〜500nmの無機ナノ粒子、及びタンパク質から構成されるナノ粒子の製造方法において、ナノ粒子の形成中および／又は形成後にタンパク質の架橋処理を行うことを特徴とするナノ粒子の製造方法。
【請求項４０】
タンパク質が酵素により架橋処理されている、請求項３９に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項４１】
タンパク質が有機溶媒中において酵素により架橋処理されている、請求項４０に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項４２】
表面に活性物質が固定化されている平均粒子粒径1〜500nmの無機ナノ粒子、及びタンパク質から構成されるナノ粒子の製造方法において、タンパク質を還元剤で処理してタンパク質分子内のジスルフィド結合を切断した後、該タンパク質のナノ粒子を形成し、さらに該タンパク質を酸化剤で処理することを特徴とするナノ粒子の製造方法。
【請求項４３】
表面に活性物質が固定化されている平均粒子粒径1〜500nmの無機ナノ粒子、及びタンパク質から構成されるナノ粒子の製造方法において、タンパク質を還元剤で処理してタンパク質分子内のジスルフィド結合を切断した後、該タンパク質のナノ粒子を形成し、さらに有機溶媒中に分散した該タンパク質を酸化剤で処理することを含むナノ粒子の製造方法。
【請求項４４】
表面に活性物質が固定化されている平均粒子粒径1〜500nmの無機ナノ粒子、及びカゼインから構成される平均粒経１０〜１０００nmのナノ粒子の製造方法において、下記の工程を含む上記方法。
（ａ）少なくとも１種の活性物質の溶液と無機ナノ粒子を混合することにより、無機ナノ粒子表面に活性物質を吸着させる工程；
（ｂ）カゼインをpH８以上の塩基性水性媒体に溶解させる工程；
（ｃ）少なくとも１種の活性物質を吸着した無機ナノ粒子をカゼイン溶液と混合する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）の溶液をpH3.5〜7.5の水性媒体に注入する工程；
【請求項４５】
表面に活性物質が固定化されている平均粒子粒径1〜500nmの無機ナノ粒子、及びカゼインから構成される平均粒経１０〜１０００nmのナノ粒子の製造方法において、下記の工程を含む上記方法。
（ａ）少なくとも１種の活性物質の溶液と無機ナノ粒子を混合することにより、無機ナノ粒子表面に活性物質を吸着させる工程；
（ｂ）カゼインをpH８以上の塩基性水性媒体に溶解させる工程；
（ｃ）少なくとも１種の活性物質を吸着した無機ナノ粒子をカゼイン溶液と混合する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）の溶液のｐＨをpH3.5〜7.5まで攪拌しながら下降させる工程；
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ライフサイエンス又は医療診断の分野において使用するためのナノ粒子に関する。より詳細には、本発明は、表面に活性物質が固定化されている無機ナノ粒子とポリマーとから構成されるナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
微粒子材料は、バイオテクノロジーにおいて幅広い利用が期待されている。特に近年、ナノテクノロジーの進展によって生み出されたナノ微粒子材料をバイオテクノロジーや医療に応用することが活発に検討され、研究成果も数多く報告されるようになってきている。微粒子材料の中でも、磁性微粒子材料は、バイオ領域において幅広く利用されてきている。例えば、抗体などが固定化されている磁性微粒子は免疫診断に利用されてきている。また、磁性微粒子表面にDNAを固定化して、mRNAや一本鎖DNAの分離、DNA結合タンパク質の分離等、遺伝子工学の広範な領域にも活用されている。さらに、磁気応答性粒子は、プロテオーム解析においても、その重要な柱の一つであるタンパク質相互作用解析において極めて有効である。
【０００３】
上記粒子は、医療診断分野においても、MRI診断などの造影剤として、さらには癌の温熱治療法（ハイパーサーミア）などその有効性が示される。癌細胞は42.5℃以上に加温すると殺傷される（例えば、非特許文献１）。現行の温熱療法では、正常組織も腫瘍組織も区別なく加温するので、患者の負担を考慮して正常組織への影響があまりない温度である42.5℃付近までしか加温しない。しかし、加温する温度が高いほど癌細胞は死にやすいことは、自明である。したがって、もし、正常組織が加温されずに、腫瘍組織だけを特異的に加温することができれば、どのような種類の癌細胞であっても死滅させることが理論上可能となる。磁気応答性粒子であるマグネタイト（Fe3O4）を発熱体とする誘導加温型の温熱療法が開発され、現在までに様々な動物種（マウス、ラット、ハムスター、ウサギ）や癌種（脳腫瘍、皮膚癌、舌癌、乳癌、肝細胞癌、骨肉腫）で腫瘍の退縮に成功している（例えば、非特許文献２及び非特許文献３）。
【０００４】
磁気応答性粒子は、その粒径がナノサイズと小さいため、従来使用されているミクロンサイズの磁性粒子やラテッテクスビーズに比べて、水溶液中での分散性および分子認識性が格段に向上する。その結果、従来法で使用されている磁性微粒子やラテックス担体などを置き換えるだけで、大幅な感度アップと測定時間の短縮が期待される。
【０００５】
一方、薬剤送達システム（ＤＤＳ）の分野では早くからナノ粒子への期待が強く、薬剤や遺伝子のキャリアーとしてナノ粒子が極めて有望である。抗癌剤の治療効率を向上させるには薬剤を癌細胞または癌病巣のみに作用させる、ターゲティングが要求されるが、上記ナノ粒子によれば、磁気の性質を利用して、非侵襲的に生体内である物質を誘導し、あるいは局所的に停滞させることが可能である。
【０００６】
加藤らはマイトマイシンCとフェライト磁粉を封入した経約250μｍのエチルセルロースマイクロカプセル（以下、FM-MMC-mc）を開発した。家兎下腿に移植したＶＸ腫瘍に対する治療実験では、通常剤形のMMC投与と比較してFM-MMC-mcの磁気誘導群では著明な抗腫瘍効果がみられた。これは磁気で腫瘍部の微小動脈に集積したカプセルから、長時間にわたってMMCが周囲の腫瘍組織内に放出された結果である。この結果は、従来の方法では得られない強力なターゲティング療法が可能なことを強く示唆している（例えば、非特許文献４）。しかし、上記のFM-MMC-mcは、サイズが250μｍと大きく、毛細血管などの微細な部位には到達できない。
【０００７】
特許文献１には、ゲル体の少なくとも表層部に粒径５〜２００ｎｍの金属酸化物粒子が分散して存在することを特徴とする金属酸化物複合体が記載されている。特許文献２には、貴金属ナノ粒子含有天然高分子粉末が記載されている。特許文献３には、半導性材料または金属性材料を含む水分散性ナノ粒子が記載されている。これらは、活性物質（薬剤）を含んでいないためＤＤＳとしての機能はない。
【０００８】
特許文献４にはポリマー材料から作られるナノ粒子を用いた薬剤標的化システムが記載されている。特許文献５は、コア/シェル構造を有する医薬上または化粧上の活性物質のナノ粒子製剤が記載されている。特許文献６には、球状タンパク質粒子が記載されており、薬物を含有する組成物としての粒子サイズは１μｍ以上である。これらのシステム、製剤及び粒子は、磁気応答性粒子を含んでいないため、磁力によりナノ粒子を疾患部位に誘導することができない。
【０００９】
また、特許文献７には、磁性金属酸化物でコーティングしたナノ粒子を調製するための方法が記載されている。特許文献８には、複数個の糖ナノ粒子リガンドと連結した金属または半導体原子が記載されている。
【００１０】
【非特許文献１】Dewey,W.C.,Radiology.,123,463-474(1977)
【非特許文献２】Kobayashi.,T Jpn.J.Cancer Res.,89,463-469(1998)
【非特許文献３】Kobayashi.,T.,Melanoma Res.,13,129-135(2003)
【非特許文献４】加藤哲郎：マイクロカプセルの磁場誘導による抗癌剤の効果増強、癌と化学療法、8(5)、698-706、1981
【特許文献１】特開２０００−２５６０１５号公報
【特許文献２】特開２００４−２４４４３３号公報
【特許文献３】特表２００４−５１７７１２号公報
【特許文献４】特表２００１−５０２７２１号公報
【特許文献５】特表２００２−５３１４９２号公報
【特許文献６】特表２００５−５００３０４号公報
【特許文献７】特表２００２−５１７０８５号公報
【特許文献８】特表２００４−５１１５１１号公報
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、安全性が高く、造影と温熱療法とＤＤＳを一度に行えることができ、かつ薬剤内包率が高いナノ粒子を提供することを解決すべき課題とした。
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、表面に活性物質が固定化されている無機ナノ粒子と、タンパク質などのポリマーとを混合することによって上記課題を解決したナノ粒子を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本発明によれば、表面に活性物質が固定化されている平均粒子粒径1〜500nmの無機ナノ粒子、及びポリマーから構成されるナノ粒子が提供される。
【００１４】
好ましくは、無機ナノ粒子は磁性体ナノ粒子である。
好ましくは、無機ナノ粒子は酸化鉄、フェライト、酸化亜鉛、酸化チタン、シリカ、又はアルミナである。
好ましくは、表面にアミノ酸が固定化されている無機ナノ粒子の表面に、活性物質が物理吸着により固定化されている。
好ましくは、一般式：Ｒ１−（ＯＣＨ（Ｒ２）ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｌ−Ｘ
（式中、Ｒ１は、炭素鎖長１以上２０以下のアルキル基あるいはアルケニル基、無置換又は炭素鎖長１０以下のアルキル基若しくはアルコキシル基で置換されたフェニル基を表す；Ｒ２は、水素原子又はメチル基を表す；ｎは１以上２０以下の整数を示し、Ｌは単結合、又は炭素数１〜１０のアルキレン基を示し、Ｘはカルボン酸基、リン酸基、スルホン酸基又はホウ酸基を示す）で表される化合物で表面修飾されている無機ナノ粒子の表面にアミノ酸が固定化されており、さらにその表面に活性物質が物理吸着により固定化されている。
【００１５】
好ましくは、本発明のナノ粒子は、平均粒子サイズ１０〜１０００nmを有する。
好ましくは、無機ナノ粒子は、平均粒子粒径１〜５０nmを有する。
好ましくは、ポリマーに対して０.１〜１００重量％の無機ナノ粒子を含む。
好ましくは、ポリマーに対して０.１〜１００重量％の活性物質を含む。
【００１６】
好ましくは、活性物質は、化粧品用成分、機能性食品用成分、又は医薬品成分である。
好ましくは、化粧品用成分が保湿剤、美白剤、又はアンチエイジング剤であり、機能性食品用成分がビタミン又は抗酸化剤であり、医薬品成分が制癌剤、抗アレルギー剤、抗血栓剤、又は抗炎症剤である。
【００１７】
好ましくは、ポリマーは合成高分子、生分解性高分子、又は天然高分子である。
好ましくは、ポリマーはタンパク質である。
好ましくは、タンパク質はナノ粒子の形成中または形成後に架橋処理されている。
【００１８】
好ましくは、タンパク質の重量に対して０.１〜１００重量％の架橋剤を添加することによってタンパク質が架橋処理されている。
好ましくは、架橋剤は無機または有機の架橋剤、あるいは酵素などを用いることができる。無機または有機の架橋剤の具体例としては、クロム塩（クロム明ばん、酢酸クロムなど）；カルシウム塩（塩化カルシウム、水酸化カルシウムなど）；アルミニウム塩（塩化アルミニウム、水酸化アルミニウムなど）；ジアルデヒド類（グルタルアルデヒドなど）；カルボジイミド類（EDC,WSC、N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2，3-ジカルボキシイミド（HONB）、N-ヒドロキシこはく酸イミド（HOSu）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）など）；N−ヒドロキシスクシイミド；オキシ塩化リンなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
酵素としては、タンパク質の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼを用いることができる。
好ましくは、タンパク質は有機溶媒中で架橋処理される。
【００１９】
好ましくは、タンパク質は、リジン残基およびグルタミン残基を有する。
好ましくは、タンパク質はコラーゲン、ゼラチン、アルブミン、オバルブミン、カゼイン、トランスフェリン、フィブリン、フィブリノーゲン、又はこれらの混合物である。
好ましくは、タンパク質は酸処理ゼラチン又はアルブミンである。
【００２０】
好ましくは、タンパク質は酸処理ゼラチンであり、ナノ粒子は、無機ナノ粒子及び酸処理ゼラチンから構成されるナノ粒子の形成中または形成後に、酸処理ゼラチンを酵素で架橋処理することにより調製される。
【００２１】
好ましくは、本発明のナノ粒子は、下記の工程によって製造される。
（ａ）少なくとも１種の活性物質の溶液と無機ナノ粒子を混合することにより、無機ナノ粒子表面に活性物質を吸着させる工程；
（ｂ）タンパク質を水性媒体に溶解させる工程；
（ｃ）少なくとも１種の活性物質を吸着した無機ナノ粒子をタンパク質溶液と混合する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で得た溶液を有機溶媒に注入する工程；及び
（ｅ）架橋剤を添加してタンパク質を架橋する工程；
【００２２】
好ましくは、本発明のナノ粒子は、下記の工程によって製造される。
（ａ）少なくとも１種の活性物質の溶液と無機ナノ粒子を混合することにより、無機ナノ粒子表面に活性物質を吸着させる工程；
（ｂ）タンパク質を水性媒体に溶解させる工程；
（ｃ）少なくとも１種の活性物質を吸着した無機ナノ粒子をタンパク質溶液と混合する工程；
（ｄ）酵素を添加する工程；及び
（ｅ）工程（ｄ）で得た溶液を有機溶媒に注入して、タンパク質を酵素で架橋する工程；
【００２３】
好ましくは、本発明のナノ粒子は、タンパク質を還元剤で処理してタンパク質分子内のジスルフィド結合を切断した後、該タンパク質のナノ粒子を形成し、さらに該タンパク質を酸化剤で処理することにより得られる。
好ましくは、タンパク質を酸化剤で処理する工程を、有機溶媒中に分散したタンパク質ナノ粒子を酸化剤で処理することによって行う。
好ましくは、タンパク質はアルブミン、オバルブミン、トランスフェリン、又はグロブリンである。
【００２４】
好ましくは、本発明のナノ粒子は、下記の工程によって製造される。
（ａ）少なくとも１種の活性物質の溶液と無機ナノ粒子を混合することにより、無機ナノ粒子表面に活性物質を吸着させる工程；
（ｂ）ジスルフィド結合を還元したタンパク質を水に溶解させる工程；
（ｃ）少なくとも１種の活性物質を吸着した無機ナノ粒子をタンパク質溶液と混合する工程；
（ｄ）工程（ｃ）の溶液を有機溶媒に注入する工程；及び
（ｅ）上記で得られたものを酸化剤で処理する工程；
【００２５】
好ましくは、タンパク質はカゼインである。
好ましくは、本発明のナノ粒子は、下記の工程によって製造される。
（ａ）少なくとも１種の活性物質の溶液と無機ナノ粒子を混合することにより、無機ナノ粒子表面に活性物質を吸着させる工程；
（ｂ）カゼインをpH８以上の塩基性水性媒体に溶解させる工程；
（ｃ）少なくとも１種の活性物質を吸着した無機ナノ粒子をカゼイン溶液と混合する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）の溶液をpH3.5〜7.5の水性媒体に注入する工程；
【００２６】
好ましくは、本発明のナノ粒子は、下記の工程によって製造される。
（ａ）少なくとも１種の活性物質の溶液と無機ナノ粒子を混合することにより、無機ナノ粒子表面に活性物質を吸着させる工程；
（ｂ）カゼインをpH８以上の塩基性水性媒体に溶解させる工程；
（ｃ）少なくとも１種の活性物質を吸着したナノ粒子をカゼイン溶液と混合する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）の溶液のpH をpH3.5〜7.5まで攪拌しながら下降させる工程；
【００２７】
好ましくは、ポリマーの重量に対して０.１〜１００重量％の脂質が添加されている。
好ましくは、ポリマーの重量に対して０．１〜１００重量％のカチオン性またはアニオン性多糖が添加されている。
【００２８】
好ましくは、ポリマーの重量に対して０．１〜１００重量％のカチオン性タンパク質またはアニオン性タンパク質が添加されている。
好ましくは、ポリマーの重量に対して０.１〜１００重量％のシクロデキストリンが添加されている。
【００２９】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明のナノ粒子を含む、温熱療法剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のナノ粒子を含む、MRI造影剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のナノ粒子を含む、薬物送達剤が提供される。
【００３０】
本発明のさらに別の側面によれば、表面に活性物質が固定化されている平均粒子粒径1〜500nmの無機ナノ粒子、及びタンパク質から構成されるナノ粒子の製造方法において、ナノ粒子の形成中および／又は形成後にタンパク質の架橋処理を行うことを含むナノ粒子の製造方法が提供される。
【００３１】
好ましくは、タンパク質は酵素により架橋処理される。
好ましくは、タンパク質は有機溶媒中において酵素により架橋処理される。
【００３２】
本発明のさらに別の側面によれば、表面に活性物質が固定化されている平均粒子粒径1〜500nmの無機ナノ粒子、及びタンパク質から構成されるナノ粒子の製造方法において、タンパク質を還元剤で処理してタンパク質分子内のジスルフィド結合を切断した後、該タンパク質のナノ粒子を形成し、さらに該タンパク質を酸化剤で処理することを含むナノ粒子の製造方法が提供される。
【００３３】
本発明のさらに別の側面によれば、表面に活性物質が固定化されている平均粒子粒径1〜500nmの無機ナノ粒子、及びタンパク質から構成されるナノ粒子の製造方法において、タンパク質を還元剤で処理してタンパク質分子内のジスルフィド結合を切断した後、該タンパク質のナノ粒子を形成し、さらに有機溶媒中に分散した該タンパク質を酸化剤で処理することを含むナノ粒子の製造方法が提供される。
【００３４】
本発明のさらに別の側面によれば、表面に活性物質が固定化されている平均粒子粒径1〜500nmの無機ナノ粒子、及びカゼインから構成される平均粒経１０〜１０００nmのナノ粒子の製造方法において、下記の工程を含む上記方法が提供される。
（ａ）少なくとも１種の活性物質の溶液と無機ナノ粒子を混合することにより、無機ナノ粒子表面に活性物質を吸着させる工程；
（ｂ）カゼインをpH８以上の塩基性水性媒体に溶解させる工程；
（ｃ）少なくとも１種の活性物質を吸着した無機ナノ粒子をカゼイン溶液と混合する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）の溶液をpH3.5〜7.5の水性媒体に注入する工程；
【００３５】
本発明のさらに別の側面によれば、表面に活性物質が固定化されている平均粒子粒径1〜500nmの無機ナノ粒子、及びカゼインから構成される平均粒経１０〜１０００nmのナノ粒子の製造方法において、下記の工程を含む上記方法が提供される。
（ａ）少なくとも１種の活性物質の溶液と無機ナノ粒子を混合することにより、無機ナノ粒子表面に活性物質を吸着させる工程；
（ｂ）カゼインをpH８以上の塩基性水性媒体に溶解させる工程；
（ｃ）少なくとも１種の活性物質を吸着した無機ナノ粒子をカゼイン溶液と混合する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）の溶液のｐＨをpH3.5〜7.5まで攪拌しながら下降させる工程；
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明のナノ粒子は、表面に活性物質が固定化されている平均粒子粒径1〜500nmの無機ナノ粒子、及びポリマーから構成される。
【００３７】
本発明のナノ粒子の平均粒子サイズは、通常は１〜１０００ｎｍであり、好ましくは１０〜１０００ｎｍであり、より好ましくは３０〜５００ｎｍであり、特に好ましくは５０〜２００ｎｍである。上記したようなナノオーダーのサイズを有することにより、本発明のナノ粒子は、毛細血管などの微細な部位にも到達することが可能になる。
【００３８】
本発明で用いる無機ナノ粒子の平均粒子粒径は１〜５００ｎｍであり、好ましくは１ｎｍ〜５０ｎｍであり、より好ましくは１ｎｍ〜３０ｎｍである。
【００３９】
本発明において活性物質は無機ナノ粒子の表面に固定化されているが、ここで言う固定化とは、物理吸着、又は化学吸着の何れでもよい。吸着の種類としては、イオン相互作用による吸着、疎水性相互作用による吸着、配位結合による吸着などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
本発明で用いる無機ナノ粒子の分散液は、例えば、無機ナノ粒子の凝集物に、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（４，５）ラウリルエーテル酢酸など）の水溶液を加えて分散することにより無機ナノ粒子の分散液を調製することができる。しかし、無機ナノ粒子の分散液の調製方法はこれに限定されるものではなく、例えば、親水性ポリマー[ポリエチレングリコール、ポリリン酸ナトリウムなど]、あるいはリン脂質（ホスファチジルコリンなど）を無機ナノ粒子合成時又は合成後に共存させても良い。
【００４１】
本発明のナノ粒子には、好ましくは、タンパク質などのポリマーの重量に対して０.１〜１００重量％の無機ナノ粒子を含めることができる。
【００４２】
本発明で用いる無機ナノ粒子としては、酸化鉄ナノ粒子、酸化亜鉛ナノ粒子、酸化チタンナノ粒子、シリカナノ粒子、アルミナナノ粒子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、磁気応答性粒子を挙げることができる。
【００４３】
本発明で用いる磁気応答性粒子としては、電磁波を吸収して発熱し、人体に無害なものであれば、任意のものを使用することができるが、特に人体に吸収されにくい周波数の電磁波を吸収して発熱するものを使用することが好ましい。好ましい磁気応答性粒子は、鉄、白金、酸化鉄、又はフェライト（Ｆｅ，Ｍ）３Ｏ４であり、特に好ましくは、酸化鉄粒子である。ここで酸化鉄には、とりわけＦｅ３Ｏ４（マグネタイト）、γ−Ｆｅ２Ｏ３（マグヘマイト）、またはこれらの中間体、混合物が含まれる。また、磁気応答性粒子は、表面と内部の組成が異なるコアシェル型構造であってもよい。前記式中、Ｍは、該鉄イオンと共に用いて磁性金属酸化物を形成することのできる金属イオンであり、典型的には遷移金属の中から選択され、最も好ましくはＺｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｍｇ２＋などであり、Ｍ／Ｆｅのモル比は、選択されるフェライトの化学量論的な組成に従って決定される。
【００４４】
本発明において好ましくは、下記一般式で表わされる化合物で表面修飾されている無機ナノ粒子を用いることができる。
一般式：Ｒ１−（ＯＣＨ（Ｒ２）ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｌ−Ｘ
（式中、Ｒ１は、炭素鎖長１以上２０以下のアルキル基あるいはアルケニル基、無置換又は炭素鎖長１０以下のアルキル基若しくはアルコキシル基で置換されたフェニル基を表す；Ｒ２は、水素原子又はメチル基を表す；ｎは１以上２０以下の整数を示し、Ｌは単結合、又は炭素数１〜１０のアルキレン基を示し、Ｘはカルボン酸基、リン酸基、スルホン酸基又はホウ酸基を示す）
【００４５】
炭素鎖長１以上２０以下のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｔ-ブチル基、オクチル基、セチル基などを挙げることができる。炭素鎖長１以上２０以下のアルケニル基としては、上記のアルキル基において少なくとも１個以上の二重結合を有するものを挙げることができる。
【００４６】
上記一般式で表わされる化合物の具体例としては、以下のものが挙げられるが、本発明においてはこれらに限定されるものではない。
【００４７】
【化１】
2009536151.tif 000002
【００４８】
【化２】
2009536151.tif 000003
【００４９】
【化３】
2009536151.tif 000004
【００５０】
また、本発明で用いる無機ナノ粒子においては、好ましくは無機ナノ粒子１個に対して１から２００分子、より好ましくは１から１００分子のアミノ酸が固定化されていてもよい。固定化するアミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ノルバリン、ノルロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、システイン、メチオニン、オルニチン、シトルリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、β-アラニン、γ-アミノ酪酸（GABA）、及びプロリンなどを挙げることができる。固定化するアミノ酸としては、水溶性アミノ酸が好ましく、例えば、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、システイン、プロリン、β-アラニン、GABAなどから選択することができる。
【００５１】
表面にアミノ酸が固定化されている無機ナノ粒子は、例えば、水に分散している平均粒子粒径1〜50nmの無機ナノ粒子を、アミノ酸の存在下において超音波を照射して処理することによって製造することができる。アミノ酸を無機ナノ粒子の表面に固定化するために行う超音波照射は、当業者に公知の常法により行うことができ、例えば、市販の超音波バスなどを用いて行うことができる。超音波照射はｐＨ5.0以上の緩衝液中で行うことが好ましく、例えばリン酸緩衝液中で行うことができる。超音波の照射時間は、磁性ナノ粒子の表面にアミノ酸を固定化できる限り、特に限定されずに適宜設定することができ、一般的には、１分以上２時間以下である。また。超音波としては、高周波出力が0.1〜200Ｗの超音波を照射することが好ましい。
【００５２】
本発明の無機ナノ粒子の表面には、活性物質が固定化されている。本発明に用いられる活性物質は、保湿剤、美白剤、アンチエイジング剤などの化粧品用成分、ビタミン、抗酸化剤などの機能性食品用成分、制癌剤、抗アレルギー剤、抗血栓剤、抗炎症剤などの医薬品成分である。
【００５３】
本発明に用いられる保湿剤の具体例としては、ヒアルロン酸、セラミド、リピジュア、イソフラボン、アミノ酸、コラーゲンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
本発明に用いられる美白剤の具体例としては、ビタミンＣ、アルブチン、ハイドロキノン、コウジ酸、ルシノール、エラグ酸などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５５】
本発明に用いられるアンチエイジング剤の具体例としては、レチノイン酸、レチノール、ビタミンＣ、カイネチン、β-カロテン、アスタキサンチン、トレチノインなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
本発明に用いられる抗酸化剤の具体例としては、ビタミンＣ誘導体、ビタミンＥ、カイネチン、α−リポ酸、コエンザイムＱ１０などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
本発明に用いられる制癌剤の具体例としては、フッ化ピリミジン系代謝拮抗薬（５-フルオロウラシル（5FU）やテガフール、ドキシフルリジン、カペシタビンなど）；抗生物質（マイトマイシン（MMC）やアドリアシン（DXR）など）；プリン代謝拮抗薬（メソトレキサートなどの葉酸代謝拮抗薬、メルカプトプリンなど）；ビタミンAの活性代謝物（ヒドロキシカルバミドなどの代謝拮抗薬、トレチノインやタミバロテンなど）；分子標的薬（ハーセプチンやメシル酸イマチニブなど）；白金製剤（ブリプラチンやランダ（CDDP）、パラプラチン（CBDC）、エルプラット（Oxa）、アクプラなど）；植物アルカロイド薬（トポテシンやカンプト（CPT）、タキソール（PTX）、タキソテール（DTX）、エトポシドなど）；アルキル化剤（ブスルファンやシクロホスファミド、イホマイドなど）；抗男性ホルモン薬（ビカルタミドやフルタミドなど）；女性ホルモン薬（ホスフェストロールや酢酸クロルマジノン、リン酸エストラムスチンなど）；LH-RH薬（リュープリンやゾラデックスなど）；抗エストロゲン薬（クエン酸タモキシフェンやクエン酸トレミフェンなど）；アロマターゼ阻害薬（塩酸ファドロゾールやアナストロゾール、エキセメスタンなど）；黄体ホルモン薬（酢酸メドロキシプロゲステロンなど）；BCGなどが挙げられるが、これに限定されない。
【００５８】
本発明に用いられる抗アレルギー剤の具体例としては、クロモグリク酸ナトリウムやトラニラストなどのメディエーター遊離抑制薬、フマル酸ケトチフェンや塩酸アゼラスチンなどのヒスタミンH1-措抗薬、塩酸オザグレルなどのトロンボキサン阻害薬、プランルカストなどのロイコトリエン拮抗薬、トシル酸スプラタストなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
本発明に用いられる活性物質は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００６０】
本発明において活性物質を無機ナノ粒子の表面に固定化するために行う超音波照射は、当業者に公知の常法により行うことができ、例えば、市販の超音波バスなどを用いて行うことができる。超音波照射は、例えば水中で行うことができる。超音波の照射時間は、ナノ粒子の表面に活性物質を固定化できる限り、特に限定されずに適宜設定することができ、一般的には、１分以上２時間以下である。また。超音波としては、高周波出力が0.1〜200Ｗの超音波を照射することが好ましい。
【００６１】
本発明で用いるポリマーの種類は特に限定されないが、合成高分子であってもよく、天然高分子であってもよい。好ましくは、生分解性高分子が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６２】
本発明で用いる合成高分子としては、ポリエーテル類、ポリアミン、ポリアクリレート類、ポリメタクリレート類、ポリシアノアタリレート類、ポリアリールアミド類、ポリラタタート類、ポリグリコレート類、ポリ無水物、ポリオルトエステル類、ポリスチレン類、ポリビニル類、ポリアクロレイン、ポリグルタルアルデヒド類、およびその誘導体、そのコポリマー、ならびにその混合物などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ乳酸、ポリビニルピロリドン、ポリアルギン酸などが挙げられる。
【００６３】
本発明で用いる生分解性高分子は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、あるいはそのコポリマーなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００６４】
本発明で用いる天然高分子は、タンパク質、又は多糖を挙げることができる。
本発明で用いるポリマーとしては、上記の中でも、タンパク質が特に好ましい。
【００６５】
本発明で用いるタンパク質の種類は特に限定されないが、分子量１万から１００万程度のタンパク質を用いることが好ましい。タンパク質の由来は特に限定されないが、例えば、コラーゲン、ゼラチン又は酸処理ゼラチン、アルブミン、グロブリン、カゼイン、又はトランスフェリン、フィブリン、フィブリノーゲンなどを使用することができる。ヒト由来のタンパク質を用いることが特に好ましい。
【００６６】
本発明においては、遺伝子組み換えゼラチンを用いてもよい。遺伝子組み換えゼラチンは、天然ゼラチンと比較して、生体適合性及び非感染性に優れ、均一であり、また配列も決定されているため、その強度及び分解性は、以下に記載の通り架橋などによって正確に設計することができる。
【００６７】
遺伝子組み換えゼラチンとしては、例えばEU1014176Ａ２、US6992172に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００６８】
また、該生体高分子は部分的に加水分解されていてもよい。該ゼラチンは生体由来のコラーゲンの配列とのアミノ酸同一性が40％であればよく、より好ましくは50％以上である。より好ましくは80％以上、最も好ましくは90％以上である。
【００６９】
ここで言うコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれであっても構わないが、好ましくはI型、II型、III型、IV型、およびV型のコラーゲンである。より好ましくは、I型、II型、III型のコラーゲンである。別の形態によると、該コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ラットである。より好ましくはヒトである。
【００７０】
遺伝子組み換えゼラチンの等電点は、好ましくは5〜10であり、より好ましくは6〜10であり、さらに好ましくは7〜9である。
【００７１】
遺伝子組み換えゼラチンは、コラーゲンに特徴的なGXY部分を有し、分子量が好ましくは2 KDa以上100 KDa以下であり、より好ましくは2.5 KDa以上95KDa以下であり、より好ましくは5 KDa以上90 KDa以下であり、最も好ましくは、10 KDa以上90KDa以下である。
【００７２】
好ましくは、該遺伝子組み換えゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、該遺伝子組み換えゼラチンはプロコラーゲンおよびプロコラーゲンを有さない。
好ましくは、該遺伝子組み換えゼラチンは天然コラーゲンをコードする核酸により調製された実質的に純粋なコラーゲン材料である。
【００７３】
本発明のタンパク質ナノ粒子は、特開平６−７９１６８号公報、又はC.Coester著、ジャーナル・ミクロカプスレーション、２０００年、１７巻、p.１８７−１９３に記載の方法に準じて作製することができる。好ましくは、グルタルアルデヒドの変わりに本明細書に記載の架橋剤を用いる。
【００７４】
本発明のナノ粒子におけるタンパク質は、架橋処理されていてもよいし、架橋処理されていなくてもよいが、架橋処理されていることが好ましい。さらに好ましくは、タンパク質は、ナノ粒子の形成中または形成後に架橋処理されている。タンパク質の架橋処理は、架橋剤を用いて行ってもよいし、あるいはタンパク質分子内のジスルフィド結合を還元し、粒子形成後に再結合により架橋することもできる。  本発明において、タンパク質は１種類の架橋方法で架橋してもよいし、または２種以上の架橋方法を組み合わせて架橋してもよい。
【００７５】
本発明においては、タンパク質は好ましくは有機溶媒中で架橋処理される。ここで用いる有機溶媒としては、エタノール、イソプロパノール、アセトン、THFなどの水溶性有機溶媒が好ましい。
【００７６】
架橋剤を使用する場合、タンパク質の重量に対して、好ましくは０.１〜１００重量％の架橋剤を添加して、タンパク質は架橋処理される。
【００７７】
架橋剤としては、無機または有機の架橋剤、あるいは酵素などを用いることができる。無機または有機の架橋剤の具体例としては、クロム塩（クロム明ばん、酢酸クロムなど）；カルシウム塩（塩化カルシウム、水酸化カルシウムなど）；アルミニウム塩（塩化アルミニウム、水酸化アルミニウムなど）；カルボジイミド類（EDC,WSC、N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2，3-ジカルボキシイミド（HONB）、N-ヒドロキシこはく酸イミド（HOSu）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）など）；N−ヒドロキシスクシイミド；オキシ塩化リンなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。酵素としては、タンパク質の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼを用いることができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。その中でも、酸処理ゼラチン、コラーゲン、又はアルブミンが好ましい。
【００７８】
トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなどが挙げられる。
【００７９】
本発明に用いられる架橋剤の量は、タンパク質の種類に応じて適宜設定することが出来る。標準的には、タンパク質の重量に対して、０.１〜１００重量％程度を添加することができ、好ましくは、１〜５０重量％程度の架橋剤を添加することができる。
【００８０】
架橋反応の時間は、タンパク質の種類、ナノ粒子サイズに応じて適宜設定することができるが、標準的には、１時間から７２時間反応することができ、好ましくは、２時間から２４時間反応することができる。
架橋反応の温度は、タンパク質の種類、ナノ粒子サイズに応じて適宜設定することができるが、標準的には、温度は０℃から８０℃であり、好ましくは、２５℃から６０℃である。
本発明に用いられる架橋剤を単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００８１】
タンパク質を還元剤で処理してタンパク質分子内のジスルフィド結合を切断した後、該タンパク質のナノ粒子を形成し、さらに該タンパク質を酸化剤で処理する場合、タンパク質を酸化剤で処理することによって、タンパク質分子間のジスルフィド結合、および部分的に分子内のジスルフィド結合が再形成されることにより、タンパク質ナノ粒子が架橋され、水に不溶化するものと考えられる。この場合、本発明で用いるタンパク質の種類はジスルフィド結合を有するタンパクであれば特に制限されないが、分子量１万から１００万程度のタンパク質を用いることが好ましい。タンパク質の由来は特に限定されないが、ヒト由来のタンパク質を用いることが好ましい。その中で好ましいものは、アルブミン、グロブリン、トランスフェリンである。
【００８２】
本発明で用いる還元剤の具体例としては、ジチオトレイトール、チオグリコール酸またはチオグリコール酸アンモニウムなどのチオグリコール酸塩、システイン、システイン塩酸塩などのシステイン酸塩、Ｎ−アセチルシステイン、グルタチオンなどのシステイン誘導体、チオグリコール酸モノグリセリン、システアミン、チオ乳酸、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、メルカプトエタノールなどを挙げることができる。しかし、本発明における還元剤は、これらの化合物に限定されるものではない。
本発明で用いる還元剤は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００８３】
本発明で用いる還元剤の量は、タンパク質の種類に応じて適宜設定することができるが、標準的には、タンパク質の重量に対して、０.１〜１００重量％程度の還元剤を添加することができ、好ましくは、１〜５０重量％程度の還元剤を添加することができる。
タンパク質を還元剤で処理する還元反応の時間は、タンパク質の種類、ナノ粒子サイズに応じて適宜設定することができるが、標準的には、５分から７２時間反応することができ、好ましくは、１０分から１２時間反応することができる。
還元反応の温度は、タンパク質の種類、ナノ粒子サイズに応じて適宜設定することができるが、標準的には、温度は０℃から８０℃であり、好ましくは、２５℃から４０℃である。
【００８４】
本発明で用いる酸化剤の具体例としては、酸素、過酸化水素、臭素酸ナトリウム、臭素酸カリウムなどの臭素酸塩、過ほう酸塩、過炭酸ナトリウムなどを挙げることができる。しかし、本発明における酸化剤はこれらの化合物に限定されるものではない。酸素としては、空気中の酸素を使用することができる。即ち、酸化剤として酸素を使用する場合には、ナノ粒子を含む分散液を空気中で攪拌することによって、タンパク質を酸素で処理することができる。本発明に用いられる酸化剤は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００８５】
本発明で用いる酸化剤の量は、タンパク質の種類に応じて適宜設定することが出来る。標準的には、タンパク質の重量に対して、０.１〜１００重量％程度の酸化剤を添加することができ、好ましくは、１〜５０重量％程度の酸化剤を添加することができる。
タンパク質を酸化剤で処理する酸化反応の時間は、タンパク質の種類、ナノ粒子サイズに応じて適宜設定することができるが、標準的には、５分から７２時間反応することができ、好ましくは、１０分から１２時間反応することができる。
酸化反応の温度は、タンパク質の種類、ナノ粒子サイズに応じて適宜設定することができるが、標準的には、温度は０℃から８０℃であり、好ましくは、２５℃から６０℃である。
【００８６】
本発明の好ましい態様によれば、タンパク質としてカゼインを用いることができる。本発明に用いるカゼインの由来は特に限定されない。カゼインは乳由来であっても、豆由来であってもよく、α-カゼイン、β-カゼイン、γ-カゼイン、κ-カゼインおよびそれらの混合物を使用することが出来る。カゼインは、単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００８７】
本発明のカゼインナノ粒子の作製方法は、カゼインをpH８以上の塩基性水性媒体液に溶解し、pH3.5〜7.5の水性媒体中に注入する方法と、カゼインをpH８以上の塩基性水性媒体液に溶解し、攪拌しながら、得られた溶液のpHをpH3.5〜7.5に下降させる方法が挙げられる。
【００８８】
カゼインをpH８以上の塩基性水性媒体液に溶解し、3.5〜7.5の水性媒体中に注入する方法としては、シリンジによるのが、操作が簡便であるため好ましい。しかし、注入速度、溶解性、温度、撹拌状態を満足する方法であれば特に限定しない。一般的には、注入速度は、1mL/minから100mL/minで注入することが出来る。塩基性水性媒体の温度は、適宜設定することができるが、標準的には、０℃から８０℃にすることができ、好ましくは、２５℃から７０℃にすることができる。水性媒体の温度は、適宜設定することができるが、標準的には、０℃から８０℃にすることができ、好ましくは、２５℃から６０℃ですることができる。攪拌速度は、適宜設定することができるが、標準的には、100rpmから3000rpmにすることができ、好ましくは、200rpmから2000rpmである。
【００８９】
カゼインをpH８以上の塩基性水性媒体液に溶解し、攪拌しながら、得られた溶液のpHをpH3.5〜7.5に下降させる方法としては、酸を滴下するのが、操作が簡便であるため好ましい。しかし、溶解性、温度、撹拌状態を満足する方法であれば特に限定しない。塩基性水性媒体の温度は、適宜設定することができるが、標準的には、０℃から８０℃にすることができ、好ましくは、２５℃から７０℃にすることができる。攪拌速度は、適宜設定することができるが、標準的には、100rpmから3000rpmにすることができ、好ましくは、200rpmから2000rpmである。
【００９０】
本発明に用いる水性媒体は、水、生理食塩水、有機酸または塩基、無機酸または無機塩基の水溶液又は緩衝液を用いることができる。
具体的には、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、カルボン酸、酒石酸、コハク酸、酢酸またはフタル酸、トリフルオロ酢酸、モルホリノエタンスルホン酸、2-〔4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル〕エタンスルホン酸のような有機酸；トリス（ヒドロキシメチル）、アミノメタン、アンモニアのような有機塩基；塩酸、過塩素酸、炭酸のような無機酸；燐酸ナトリウム、燐酸カリウム、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウムのような無機塩基を用いた水溶液が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９１】
本発明に用いる水性媒体の濃度は、約10mMから約１Mが好ましい。より好ましくは、約20mMから約200mMである。
【００９２】
本発明に用いる塩基性水性媒体のpHは好ましくは８以上であり、より好ましくはpH８〜１１であり、さらに好ましくはpH10〜11である。８より低いpHではカゼインが溶解しない。
【００９３】
本発明に用いる水性媒体のpHは、好ましいpHは3.5〜7.5である。より好ましくはpHは４〜6である。前述の範囲外では、7.5より高いpHでは粒子が溶解してしまい、３以下のpHでは粒子サイズが大きくなる傾向が見られる。
【００９４】
本発明に用いられる脂質として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、スフィンゴシン類、セラミド、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、大豆油、オリーブ油、スクワラン、などが挙げられる。
【００９５】
本発明に用いられるアニオン性多糖とはカルボキシル基、硫酸基又はリン酸基等の酸性極性基を有する多糖類である。具体例としては、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、カルボキシメチルデキストラン、アルギン酸、ペクチン、カラギーナン、フコイダン、アガロペクチン、ポルフィラン、カラヤガム、ジェランガム、キサンタンガム、ヒアルロン酸類等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９６】
本発明に用いられるカチオン性多糖とは、アミノ基等の塩基性極性基を有する多糖類である。具体例としては、キチン、キトサンなどのグルコサミンやガラクトサミンを構成単糖として含むものなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９７】
本発明に用いられるアニオン性タンパク質とは等電点が生理的ｐＨよりも塩基性側にあるタンパク質およびリポタンパク質である。具体例としては、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、リゾチーム、チトクロムＣ、リボヌクレアーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、α−キモトリプシンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９８】
本発明に用いられるカチオンタンパク質とは等電点が生理的ｐＨよりも酸性側にあるタンパク質およびリポタンパク質である。具体例としては、ポリリジン、ポリアルギニン、ヒストン、プロタミン、オバルブミンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９９】
本発明に用いられるシクロデキストリンとして具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。α-シクロデキストリン、β-シクロデキストリン、γ-シクロデキストリン、2,6-ジ-O-メチル-α-シクロデキストリン、2,6-ジ-O-メチル-β-シクロデキストリン 、グルクロニルグルコシル-β-シクロデキストリン 、ヘプタキス(2,6-ジ-O-メチル)-β-シクロデキストリン、2-ヒドロキシエチル-β-シクロデキストリン 、 ヒドロキシプロピルβ-シクロデキストリン、6-O-α-マルトシル-α-シクロデキストリン、メチル-β-シクロデキストリン、2,3,6-トリ-O-メチル-β-シクロデキストリン 、6-O-α-D-グルコシル-α-シクロデキストリンモノ などが挙げられる。
【０１００】
本発明における無機ナノ粒子が磁気応答性ナノ粒子である場合には、磁力により所定の部位に誘導することができる。即ち、本発明のナノ粒子は体内に投与し、磁力により疾患部位に誘導することができる、また上記のようにして疾患部位に誘導されたナノ粒子は、ＭＲＩ造影により確認することができる。即ち、本発明のナノ粒子は、ＭＲＩ用造影剤として有用である。
さらに本発明のナノ粒子は、上記の方法に従って疾患部位に誘導した後、高周波をあてて加熱し、ナノ粒子に内包した薬学的活性物質を放出させることができる。即ち、本発明のナノ粒子は、薬物送達剤として有用である。
【０１０１】
さらに本発明の磁性ナノ粒子は、分析診断用プローブとして使用することもできる。具体的には、各種アミノ酸受容体（グルタミン酸受容体、アスパラギン酸受容体、セリン受容体など）の検出、分析、濃縮，精製に用いることができる。
【０１０２】
本発明のナノ粒子の投与方法は特に限定されないが、経皮・経粘膜吸収、血管、体腔内又はリンパへ注射により投与することが好ましく、静脈注射が特に好ましい。
本発明のナノ粒子の投与量は、患者の体重、疾患の状態などに応じて適宜設定することができるが、ナノ粒子は、一般的には、１回の投与につき、１０μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ程度を投与することができ、好ましくは、２０μｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ程度を投与することができる。
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【０１０３】
製造例１：磁気応答性粒子分散液の調製
塩化鉄（III）６水和物１０．８ｇおよび塩化鉄（II）４水和物６．４ｇをそれぞれ１Ｎ−塩酸水溶液８０ｍｌに溶解した。この溶液を攪拌しながらこの中にアンモニア水（２８重量％）９６ｍｌを２ｍｌ／分の速度で添加した。その後、混合物を８０℃で３０分加熱した後、室温に冷却した。得られた凝集物をデカンテーションにより水で精製した。結晶子サイズ約１２ｎｍのマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）の生成をＸ線回折法により確認した。
【０１０４】
この凝集物に、ポリオキシエチレン（４，５）ラウリルエーテル酢酸（日光ケミカルズ）２．３ｇを溶解した水溶液（ＮａＯＨでｐＨを６．８に調製したもの）１００ｍｌを加えて分散し、磁気応答性粒子分散液を調製した。
【０１０５】
製造例２：アスパラギン酸による磁気応答性粒子の表面修飾
製造例１で製造した界面活性剤（ポリオキシエチレン（４，５）ラウリルエーテル酢酸）で水に分散している磁気応答性粒子の分散液（酸化鉄含量18.2ｇ/L）1.0 mlに、0.1Mリン酸緩衝液（ｐH7.6）1.0mlと1Mアスパラギン酸溶液100μl  を加えた。混合物を超音波バスSharp UT-105で100Ｗで20分間超音波を照射した。磁石で凝集した磁性体を集め、上清を除去した。2.0mlのエタノールを加え、ボルテックスミキサーで凝集体を洗浄し、再び凝集体を磁石で集め、洗浄液は捨てた。次に、2.0mlの水を加え、ボルテックスミキサーで凝集体を洗浄し、再び凝集体を磁石で集め、洗浄液は捨てた。最後に2.0mlの水を加え、100Ｗで20分間超音波照射を行った。その結果、磁気応答性粒子は均一に再分散され、透明な分散液となった。磁気応答性粒子のゼータ電位を測定したところ、処理前の-31mVから-24mVに変化していた。この結果は、表面がアスパラギン酸に置換されていることを示す。
【０１０６】
実施例１：アドリアマイシン吸着酸化鉄粒子を内包したゼラチンナノ粒子
製造例２で作製したアスパラギン酸修飾磁気応答性粒子分散液（Fe3O4  含量1.0mg/ml ）１.0  ｍｌとアドリアマイシン水溶液（1.0mg/ml）を混合し、超音波バスSharp UT-105を用い100Ｗで20分間超音波を照射した。磁石で凝集した磁性体を集め、上清を分離した。上清の吸収スペクトルからアドリアマイシンの残存量（Abs.480nm）を測定し、磁性体表面に固定化されたアドリアマイシン量を算出した。また、磁石で分離した磁気応答性粒子凝集体は1.0mlの水を加えボルテックスミキサーで再分散させた。アドリアマイシンの固定化量は、200μg/1.0ｍｇFe３O４であった。また、Zeta電位は-24mVから＋17.7 mVに変化しており、磁性体表面にアドリアマイシンのアミノ基が存在していることを示している。
【０１０７】
上記の磁気応答性粒子水分散液を0.2ｍL、石灰処理ゼラチンを20ｍｇ、ダイキトサン1mg、イオン交換水を1.8ｍL混合する。前記溶液1mLを、外設40℃、800rpmの攪拌条件で、マイクロシリンジを用いて、エタノール10ｍL中に注入した。2.5μLグルタルアルデヒド（20％）を分散媒に滴下し、混合物を30分間攪拌することで、架橋されたゼラチンナノ粒子が得られた。上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計、大塚電子（株）製ＤＬＳ−７０００を用い測定したところ、１３５nmであった。
【０１０８】
実施例２：５-フルオロウラシル吸着酸化鉄粒子を内包したアルブミンナノ粒子
製造例２で作製したアスパラギン酸修飾磁気応答性粒子分散液（Fe3O4  含量1.0mg/ml ）１.0  ｍｌと５-フルオロウラシル水溶液（1.0mg/ml）を混合し、超音波バスSharp UT-105を用い100Ｗで20分間超音波を照射した。磁石で凝集した磁性体を集め、上清を分離した。上清の吸収スペクトルから５-フルオロウラシルの残存量（Abs.254nm）を測定し、磁性体表面に固定化された５-フルオロウラシル量を算出した。また、磁石で分離した磁気応答性粒子凝集体は1.0mlの水を加えボルテックスミキサーで再分散させた。５-フルオロウラシルの固定化量は、200μg/1.0ｍｇFe3O4であった。
【０１０９】
上記の酸化鉄ナノ粒子分散液を0.2ｍL、アルブミンを20ｍｇ、カルボキシメチルセルロース1mg、イオン交換水を1.8ｍL混合する。前記溶液1mLを、外設40℃、800rpmの攪拌条件で、マイクロシリンジを用いて、エタノール10ｍL中に注入した。2.5μLグルタルアルデヒド（20％）を分散媒に滴下し、混合物を30分間攪拌することで、架橋されたアルブミンナノ粒子が得られた。上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計、大塚電子（株）製ＤＬＳ−７０００を用い測定したところ、１３０nmであった。
【０１１０】
実施例３：アスタキサンチン吸着酸化鉄粒子を内包したカゼインナノ粒子
製造例２で作製したアスパラギン酸修飾磁気応答性粒子分散液（Fe3O4  含量1.0mg/ml ）１.0ｍｌとアスタキサンチンのエタノール-水混合溶液（1.0mg/ml）を混合し、超音波バスSharp UT-105を用い100Ｗで20分間超音波を照射した。磁石で凝集した磁性体を集め、上清を分離した。上清の吸収スペクトルからアスタキサンチンの残存量（Abs.480nm）を測定し、磁性体表面に固定化されたアスタキサンチン量を算出した。また、磁石で分離した磁気応答性粒子凝集体は1.0mlの水を加えボルテックスミキサーで再分散させた。アスタキサンチンの固定化量は、200μg/1.0ｍｇFe３O４であった。
【０１１１】
カゼイン20ｍｇをpH１０のリン酸バッファー1.8ｍLに溶かし、上記、酸化鉄ナノ粒子分散液0.2ｍLを添加する。前記溶液1mLを、外設40℃、800rpmの攪拌条件で、マイクロシリンジを用いて、pH５のリン酸バッファー10ｍL中に注入することで、カゼインナノ粒子が得られた。上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計、大塚電子（株）製ＤＬＳ−７０００を用い測定したところ、１３５nmであった。
【０１１２】
実施例４：アドリアマイシン吸着酸化鉄粒子を内包したゼラチンナノ粒子
酸化鉄粒子の合成方法は実施例１と同様に行った。上記、酸化鉄分散液を0.2ｍL、酸処理ゼラチンを20ｍｇ、コンドロイチン硫酸-C２mg、トランスグルタミナーゼを10ｍｇ、イオン交換水を1.8ｍL混合する。前記溶液1mLを、外設40℃、800rpmの攪拌条件で、マイクロシリンジを用いて、エタノール10ｍL中に注入した。得られた分散液を外設55℃で5時間静置することで、架橋されたゼラチンナノ粒子が得られた。上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計、大塚電子（株）製ＤＬＳ−７０００を用い測定したところ、８５nmであった。
【０１１３】
実施例５：アドリアマイシン吸着酸化鉄粒子を内包したアルブミンナノ粒子
酸化鉄粒子の合成方法は実施例１と同様に行った。アルブミンを３ｍLの７Mグアニジン塩酸塩および10mM EDTAを含む０．５Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.5）に溶解した。ジチオトレイトール１０ｍｇを加えて混合、室温で2時間還元した。ゲルろ過精製し、得られたアルブミン溶液に、上記、酸化鉄分散液0.2ｍLを添加した。前記溶液1mLを、外設40℃、800rpmの攪拌条件で、マイクロシリンジを用いて、エタノール10ｍL中に注入した。得られた分散液を空気中で４０℃、３時間攪拌することで、架橋されたアルブミンナノ粒子が得られた。上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計、大塚電子（株）製ＤＬＳ−７０００を用い測定したところ、１８０nmであった。
【０１１４】
（発明の効果）
本発明のナノ粒子は、生体適合性に問題のないタンパク等のポリマーを用いるため安全性が高い。また、本発明のナノ粒子は、磁気応答性粒子と薬剤を一緒に含有するため、造影と温熱療法とＤＤＳを一度に行うことができる。さらに、本発明のナノ粒子においては、活性物質が無機粒子に吸着されているため、本ナノ粒子は安全性が高く、薬剤内包率が高い。
【国際調査報告】
2009536151.tif 000005
2009536151.tif 000006
2009536151.tif 000007
2009536151.tif 000008