(57)【要約】  開示の発明は、特異的な核酸増幅及び検出方法を用いることにより増幅オリゴマーとして使用できる、プライマー、試料調製用捕捉プローブ及び試料中の指標調製２３ＳｒＲＮＡ配列の検出のための検出プローブを含めた核酸オリゴマーを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）核酸を検出するための検出プローブオリゴマーであって、以下の：配列番号４５からなる標的結合領域を含み、ここで、
前記標的結合領域は、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・ムンチイ（Ｅ．ｍｕｎｄｔｉｉ）、エンテロコッカス・デュランス（Ｅ．ｄｕｒａｎｓ）、エンテロコッカス・ハイレ（Ｅ．ｈｉｒａｅ）及びエンテロコッカス・コロンベ（Ｅ．ｃｏｌｕｍｂａｅ）由来の核酸と検出可能なハイブリッドを形成することができ；及び
前記標的結合領域は、エンテロコッカス・アビウム（Ｅ．ａｖｉｕｍ）、エンテロコッカス・マロドラタス（Ｅ．ｍａｌｏｄｏｒａｔｕｓ）、エンテロコッカス・シュードアビウム（Ｅ．ｐｓｅｕｄｏａｖｉｕｍ）、エンテロコッカス・ラフィノーサス（Ｅ．ｒａｆｆｉｎｏｓｕｓ）、エンテロコッカス・サッカロリティカス（Ｅ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）及びエンテロコッカス・ディスパル（Ｅ．ｄｉｓｐａｒ）由来の核酸と検出可能なハイブリッドを形成することができず；並びに
前記検出プローブオリゴマーは、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・カセリフラブス、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・ムンチイ、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・ハイレ及びエンテロコッカス・コロンベ由来の核酸と検出可能なハイブリッドを形成することができる他の標的結合領域を含まない；
前記検出プローブオリゴマー。
【請求項２】
さらに少なくとも１つの非標的結合領域を含む、請求項１記載の検出プローブオリゴマー。
【請求項３】
検出プローブオリゴマーがエンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・カセリフラブス、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・ムンチイ、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・ハイレ及びエンテロコッカス・コロンベ由来の核酸にハイブリダイズしない場合に互いにハイブリダイズする２つの非標的結合領域を含む、請求項２記載の検出プローブオリゴマー。
【請求項４】
さらに、検出可能な標識を含む、請求項１記載の検出プローブオリゴマー。
【請求項５】
エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・カセリフラブス、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・ムンチイ、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・ハイレ及びエンテロコッカス・コロンベ由来の核酸にハイブリダイズする請求項１の検出プローブオリゴマーを含む組成物。
【請求項６】
試料中の腸球菌核酸を検出するための、請求項１の検出プローブオリゴマーを含むキット。
【請求項７】
配列番号３０からなる標的結合領域を含む第１増幅オリゴマー；
配列番号３１からなる標的結合領域を含む第２増幅オリゴマー；及び
請求項１記載の検出プローブオリゴマー；
を含む、試料中の腸球菌核酸を増幅及び検出するためのキット。
【請求項８】
試料中の腸球菌核酸を検出するための方法であって、以下の：
ａ）試料を、配列番号４５からなる標的結合領域を含む検出プローブオリゴマーと接触させる工程であって；
前記標的結合領域は、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・カセリフラブス、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・ムンチイ、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・ハイレ及びエンテロコッカス・コロンベ由来の核酸と検出可能なハイブリッドを形成することができ、
前記標的結合領域は、エンテロコッカス・アビウム、エンテロコッカス・マロドラタス、エンテロコッカス・シュードアビウム、エンテロコッカス・ラフィノーサス、エンテロコッカス・サッカロリティカス及びエンテロコッカス・ディスパル由来の核酸と検出可能なハイブリッドを形成することができず、
前記検出プローブオリゴマーは、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・カセリフラブス、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・ムンチイ、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・ハイレ及びエンテロコッカス・コロンベ由来の核酸と検出可能なハイブリッドを形成することができる他の標的結合領域を含まない；並びに
ｂ）前記核酸が試料中にあるかを判定する工程；
を含む、前記方法。
【請求項９】
試料中の腸球菌核酸を増幅及び検出するための方法であって、以下の：
ａ）試料を、配列番号３０からなる標的結合領域を含む第１増幅オリゴマー、配列番号３１からなる標的結合領域を含む第２増幅オリゴマー及び配列番号４５からなる標的結合領域を含む検出プローブオリゴマーと接触させる工程であって
前記標的結合領域は、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・カセリフラブス、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・ムンチイ、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・ハイレ及びエンテロコッカス・コロンベ由来の核酸と検出可能なハイブリッドを形成することができ、
前記標的結合領域は、エンテロコッカス・アビウム、エンテロコッカス・マロドラタス、エンテロコッカス・シュードアビウム、エンテロコッカス・ラフィノーサス、エンテロコッカス・サッカロリティカス及びエンテロコッカス・ディスパル由来の核酸と検出可能なハイブリッドを形成することができず、
前記検出プローブオリゴマーは、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・カセリフラブス、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・ムンチイ、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・ハイレ及びエンテロコッカス・コロンベ由来の核酸と検出可能なハイブリッドを形成することができる他の標的結合領域を含まない；
ｂ）被験試料を腸球菌核酸の増幅に十分な条件に曝露する工程；並びに
ｃ）前記核酸が試料中に存在するかを判定する工程；
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
［０００１］本出願は２００６年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／８００，１１６号に基づく優先権を主張する。本先願の開示内容全体を本明細書に援用する。
【０００２】
発明の分野
［０００２］本発明は、分子生物学的方法を用いて試料中の細菌の存在を検出すること、具体的には、腸球菌由来の核酸を増幅し、当該増幅核酸配列を検出することにより、試料中の腸球菌を検出することに関する。
【背景技術】
【０００３】
［０００３］腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種はヒト及び動物の消化管の常在細菌叢種であり、院内感染の主因であることが明らかになった。ヒトでの２つの主な病原性菌種はエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ））及びエンテロコッカス・フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）であり、場合によりエンテロコッカス・デュランス（Ｅ．ｄｕｒａｎｓ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、エンテロコッカス・アビウム（Ｅ．ａｖｉｕｍ）、エンテロコッカス・ハイレ（Ｅ．ｈｉｒａｅ）、エンテロコッカス・ムンチイ（Ｅ．ｍｕｎｄｔｉｉ）及びエンテロコッカス・ラフィノーサス（Ｅ．ｒａｆｆｉｎｏｓｕｓ）により感染症が起きる。高度に固有な抗生物質耐性のため、腸球菌感染症は特に問題である。
【０００４】
［０００４］腸球菌はレクリエーション用水の品質を評価するための指標生物として日常的に用いられている。高濃度の腸球菌、特にエンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム及びエンテロコッカス・デュランスは、糞便汚染及び腸管内病原体存在の指標となる。多剤耐性腸球菌の拡散を抑え、かつレクリエーション用水の品質を評価する際に、環境内腸球菌の迅速な検出が重要である。
【０００５】
［０００５］培養に基づく一般的な腸球菌検出方法には、場合により１〜２日を要する。当該方法は、培養適性が劣る損傷及びストレスを受けた生物を培養しやすくする人工培地での細菌増殖及び生存するが培養できない状態の腸球菌によりさらに阻害される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
［０００６］本明細書に記載する、糞便汚染の指標となる腸球菌種（以下、「指標腸球菌（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）」）に特有の特異的なｒＲＮＡ配列の検出に基づく方法及び組成物は、エンテロコッカス・アビウム（Ｅ．ａｖｉｕｍ）、エンテロコッカス・マロドラタス（Ｅ．ｍａｌｏｄｏｒａｔｕｓ）、エンテロコッカス・シュードアビウム（Ｅ．ｐｓｅｕｄｏａｖｉｕｍ）、エンテロコッカス・ラフィノーサス（Ｅ．ｒａｆｆｉｎｏｓｕｓ）、エンテロコッカス・サッカロリティカス（Ｅ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）及びエンテロコッカス・ディスパル（Ｅ．ｄｉｓｐａｒ）を検出せずに、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・カセリフラブス、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・ムンチイ、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・ハイレ及びエンテロコッカス・コロンベを迅速、高感度及び特異的に検出することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
概要
［０００７］本発明には、環境試料又は生物検体を含めた試料中の指標腸球菌を検出する方法が含まれる。本発明には、指標腸球菌の検出のためのプライマー及びプローブとして使用できる核酸オリゴマーも含まれ、これらをキットとして提供することができる。本発明方法は、当該特異的なプライマー及びプローブを用いて指標腸球菌の２３ＳｒＲＮＡ配列中の標的配列を増幅する工程及び増幅生成物を検出する工程を含む。本発明方法のある態様では、増幅工程中に特異的増幅生成物の発現をモニターする。本発明方法のある態様には、既知量の２３ＳｒＲＮＡを用いて標準曲線を作製すること又はアッセイでの内部対照若しくは検量配列（これらは非腸球菌配列であってよい）を検出することも含まれる。
【０００８】
［０００８］本発明の１側面には、試料中に存在する指標腸球菌核酸の２３ＳｒＲＮＡ配列の量を測定する増幅及び検出方法を用いて、試料中の指標腸球菌を定量する方法が含まれる。好ましい態様には、アッセイに際して標準曲線を作成すること又は内部対照若しくは検量配列を検出することが含まれる。
【０００９】
［０００９］本発明の他の側面には、試料中の指標腸球菌を検出及び／又は定量するための組成物が含まれる。好ましい態様には、核酸増幅反応において増幅オリゴヌクレオチドとして機能する核酸オリゴマー及び増幅した核酸生成物に特異的にハイブリダイズするプローブの組合わせが含まれる。ある態様は、指標腸球菌に特異的な当該増幅オリゴヌクレオチド及び／又はプローブを収容したキットであり、場合によりキットは核酸の増幅及び／又は検出に使用する他の試薬を含んでもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
詳細な説明
［００１０］本発明は、環境試料又は生物試料等の試料中の指標腸球菌の存在又は不存在を検出するための方法を提供する。当該方法は、指標腸球菌核酸の高感度かつ特異的な検出法を提供する。本発明方法としては、２３ＳｒＲＮＡ配列の核酸増幅を実施し、例えば試料中の指標腸球菌の存在を指示する信号を発生する核酸プローブと増幅生成物を特異的にハイブリダイズさせることにより、増幅生成物を検出することがあげられる。増幅工程としては、試料を２３ＳｒＲＮＡ中の標的配列に特異的な１以上の増幅オリゴマーと接触させて、試料中に指標腸球菌のｒＲＮＡが存在する場合に増幅生成物を生成させることがあげられる。増幅によって、少なくとも１の核酸ポリメラーゼを用い、鋳型鎖を利用して増幅オリゴマー（プライマー）から配列を延長することにより、標的配列又はその相補配列の追加コピーが合成される。増幅生成物を検出するための好ましい態様には、ハイブリダイゼーション工程を用いる；本工程としては、増幅生成物を、選択した増幅オリゴマーにより増幅された配列（例えば選択した一対のプライマーがフランキングする標的配列に含まれる配列）に特異的な少なくとも１つのプローブと接触させることがあげられる。検出工程は、増幅反応が終了した後に実施することができ、あるいは標的領域の増幅と同時に、すなわちリアルタイムで実施することができる。好ましくは、増幅生成物を検出するためのプローブを使用する検出工程は均一に検出することができ、すなわちハイブリダイズしていないプローブを混合物から分離せずに、ハイブリダイズしたプローブを検出することができる（例えば米国特許第５，６３９，６０４号及び第５，２８３，１７４号、Ａｒｎｏｌｄ  Ｊｒ．ら）。増幅生成物を増幅工程の終了時付近又は終了時に検出する好ましい態様では、線状プローブを用いて、プローブが増幅生成物にハイブリダイズしたことを指示する信号を発生させる。リアルタイム検出を用いる他の好ましい態様では、プローブは好ましくはヘアピンプローブ、例えば分子ビーコン（ｂｅａｃｏｎ）、分子トーチ（ｔｏｒｃｈ）又はハイブリダイゼーションスイッチプローブであり、これはプローブが増幅生成物に結合した際に検出されるリポーター部分で標識されている。例えば、ヘアピンプローブは、プローブの一端に結合した標識、例えば発蛍光団（「Ｆ」）及びヘアピン構造の他端に結合した相互作用化合物、例えば消光体（「Ｑ」）を含むことができ、ヘアピン構造が「閉鎖」構造で増幅生成物にハイブリダイズしていない場合には標識からの信号の発生が阻害され、これに対しプローブが増幅生成物中の相補配列にハイブリダイズしているためプローブが「開放」構造の場合には信号を検出できる。そのような多様な形態のプローブの報告が以前にある（例えば米国特許第５，１１８，８０１号及び第５，３１２，７２８号、Ｌｉｚａｒｄｉら；米国特許第５，９２５，５１７号及び第６，１５０，０９７号、Ｔｙａｇｉら；米国特許第６，８４９，４１２号、第６，８３５，５４２号、第６，５３４，２７４号及び第６，３６１，９４５号、Ｂｅｃｋｅｒら；米国特許公報第２００６−００６８４１７号並びにＡｒｎｏｌｄ  Ｊｒ．、米国出願番号第６０／６５７，５２３号；��れらの詳細を本明細書に援用する）。
【００１１】
［００１１］本明細書の側面の理解の一助のため、本明細書中で用いるいくつかの用語をより詳細に以下に記載する。別途記載しない限り、本明細書中で用いる他の科学用語及び技術用語はすべて、当業者が一般に理解しているもの、例えば、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology、第２版（Singleton et al, 1994, John Wiley & Sons、ニューヨーク州ニューヨーク）、The Harper Collins Dictionary of Biology（Hale & Marham, 1991, Harper Perennial、ニューヨーク州ニューヨーク）及び本明細書で引用する他の参考文献中に示したものと同じ意味で用いられる。別途記載しない限り、本明細書中で使用又は意図する技術は分子生物学の分野の当業者に周知の標準法である。
【００１２】
［００１２］「試料」には、腸球菌又はその成分、例えば核酸又は核酸フラグメントを含有する可能性のある、いかなる検体も含まれる。試料は環境源、例えば水、土壌、汚泥、壊死組織片、水性流体の容器からのバイオフィルム、空中粒子又はエアロゾル等から得ることができ、これには処理済み試料、例えば試料を濾過器具に導通若しくは遠心分離又は媒体、マトリックス若しくは支持体に吸着させることにより得られたものを含めてもよい。試料には「生物試料」も含まれ、これには、生存又は死亡したヒトから得られたいかなる組織又は材料であって、腸球菌又はそれに由来する標的核酸を含有する可能性のある、例えば消化器、糞便、尿又は他の体液若しくは身体材料が含まれる。試料を処理してそれに含まれる凝塊又は細胞を物理的又は機械的に破壊し、これにより核酸を含む細胞内成分を溶液中へ放出させることができ、この溶液は他の成分、例えば酵素、緩衝剤、塩類、界面活性剤等を含有してもよい。
【００１３】
［００１３］「核酸」は、窒素複素環式の塩基又は塩基類似体をもつヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含む多量体化合物をいい、ヌクレオチドがホスホジエステル結合又は他の結合により互いに連結してポリヌクレオチドを形成している。核酸には、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はキメラＤＮＡ−ＲＮＡポリマー若しくはオリゴマー及びその類似体が含まれる。核酸の「主鎖」は、糖−ホスホジエステル結合、ペプチド−核酸結合（「ペプチド核酸」又はＰＮＡ；国際出願公報ＷＯ９５／３２３０５号を参照）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合又はその組合わせのうち１以上を含む多様な結合で構成されてもよい。核酸の糖部分は、リボース若しくはデオキシリボースであるか、あるいは既知の置換、例えば２’メトキシ置換及び２’ハライド置換（例えば２’−Ｆ）をもつ類似化合物であってもよい。窒素塩基は、一般的な塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その類似体（例えばイノシン；The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adamsら編、第１１版、1992）、プリン又はピリミジン塩基の誘導体（例えばＮ４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−若しくはアザ−プリン、デアザ−若しくはアザ−ピリミジン、５又は６位に置換基があるピリミジン塩基、２、６及び／又は８位に変更又は交換された置換基があるプリン塩基、例えば２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン類、４−アミノ−ピリミジン類、４−ジメチルヒドラジンピリミジン類及びＯ４−アルキル−ピリミジン類並びにピラゾロ化合物、例えば非置換又は３−置換ピラゾロ［３，４，−ｄ］ピリミジン；米国特許番号第５，３７８，８２５号、第６，９４９，３６７号及び国際出願公開ＷＯ９３／１３１２１号）であってもよい。核酸は、主鎖が１以上の残基について窒素塩基を含まない「非塩基」残基を含んでもよい（米国特許第５，５８５，４８１号、Ａｒｎｏｌｄら）。核酸は、ＲＮＡ及びＤＮＡにみられる一般的な糖、塩基及び結合のみを含むか、あるいは一般的な構成要素及び置換（例えば、２’メトキシ主鎖により連結した一般的な塩基又は一般的な塩基と１以上の塩基類似体の混合物を含む核酸）を含んでもよい。核酸には「ロックされた核酸」（ＬＮＡ）、すなわちＲＮＡ模倣糖構造にロックされた二環式フラノース単位を含む１以上のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含有する類似体も含まれ、これは一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）又は２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）中の相補配列に対するハイブリダイゼーション親和性を高める（Vester et al., 2004, Biochemistry 43(42); 13233-41）。インビトロで核酸を製造するための合成法は当技術分野で周知である。
【００１４】
［００１４］用語「オリゴマー」及び「オリゴヌクレオチド」は互換性があり、一般に１，０００未満の残基を含む核酸をいい、下限約２〜５ｎｔ残基及び上限約５００〜９００ｎｔ残基である範囲のポリマーを含む。好ましいオリゴマーの大きさは下限約５〜１５ｎｔ及び上限約５０〜６００ｎｔの範囲にあり、特に好ましい態様は下限約１０〜２０ｎｔの及び上限約２２〜１００ｎｔの範囲にある。オリゴマーは天然源から精製できるが、好ましくは多様な周知のいずれかの酵素法又は化学的方法により合成される。
【００１５】
［００１５］「増幅オリゴマー」は、標的核酸又はその相補配列にハイブリダイズして核酸増幅反応に関与するオリゴマーである。増幅オリゴマーの一例は「プライマー」であり、これは鋳型核酸にハイブリダイズし、かつ増幅プロセスでポリメラーゼにより延長される３’ＯＨ末端を含む。増幅オリゴマーの他の例は、ポリメラーゼにより延長されない（例えば３’遮断末端をもつため）が、増幅に関与し、又は増幅を促進するオリゴマーである。増幅オリゴマーの大きさの好ましい範囲の長さとしては、約１０〜約６０ｎｔで、標的核酸配列（又はその相補鎖）の領域に相補的な少なくとも約１０の連続塩基、より好ましくは少なくとも１２の連続塩基のものがあげられる。当該連続塩基は、増幅オリゴマーが結合する標的配列に対して、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは約１００％、相補的である。増幅オリゴマーは場合により、増幅反応に関与するが標的核酸に相補的でなく又はそれに含まれない修飾されたヌクレオチド若しくは類似体又は追加配列を含んでもよい。増幅オリゴマーは標的又は鋳型配列に相補的でない配列を含んでもよい。例えばプライマーの５’領域は、標的核酸に対して相補的ではないプロモーター配列を含んでもよい（「プロモーター−プライマー」という）。当業者であれば、プライマーとして機能する増幅オリゴマーが５’側プロモーター配列を含み、したがってプロモーター−プライマーとして機能するように修飾しうることを理解するはずである。同様に、プロモーター−プライマーをプロモーター配列の除去又はプロモーター配列を含まない合成により修飾し、なおかつプライマーとして機能させることができる。３’遮断された増幅オリゴマーがプロモーター配列を備え、重合の鋳型として作用することができる（「プロモーター−プロバイダー」という）。
【００１６】
［００１６］「増幅」は、多数コピーの標的核酸配列若しくはその相補配列又はフラグメントを得るためのいずれか既知の操作をいう。「フラグメント」の増幅は、完全な標的核酸又はその相補配列より少ない核酸を含む増幅核酸を製造することをいい、これは例えば標的核酸の内部位置にハイブリダイズしてそこから重合を開始する増幅オリゴヌクレオチドを用いて製造される。既知の増幅法としては、例えばレプリカーゼ介在増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）及び転写介在増幅又は転写関連増幅があげられる。レプリカーゼ介在増幅には、自己複製ＲＮＡ分子及びレプリカーゼ、例えばＱＢ−レプリカーゼを使用する（例えば米国特許第４，７８６，６００号、Ｋｒａｍｅｒら）。ＰＣＲ増幅には、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー対及びサーマルサイクリングを用いて、ｄｓＤＮＡの２つの相補鎖又はｃＤＮＡから多数コピーを合成する（例えば米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号、Ｍｕｌｌｉｓら）。ＬＣＲ増幅には４種類以上の異なるオリゴヌクレオチドを用いて、多数サイクルのハイブリダイゼーション、ライゲーション及び変性を用いて、標的及びその相補鎖を増幅する（例えば米国特許第５，４２７，９３０号、Ｂｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒら；米国特許第５，５１６，６６３号、Ｂａｃｋｍａｎら）。ＳＤＡには、制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位を含むプライマー及び標的配列を含む半修飾ＤＮＡ二重体の一方の鎖を切断するエンドヌクレアーゼを用いて、これにより一連のプライマー延長工程及び鎖置換工程で増幅を行う（例えば米国特許第５，４２２，２５２号、Ｗａｌｋｅｒら；米国特許第５，５４７，８６１号、Ｎａｄｅａｕら；米国第５，６４８，２１１号、Ｆｒａｉｓｅｒら）。
【００１７】
［００１７］「転写関連増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」又は「転写介在増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」（ＴＭＡ）は、ＲＮＡポリメラーゼを用いて核酸鋳型から多数のＲＮＡ転写体を製造するいかなるタイプの核酸増幅をもいう。当該方法は、一般にＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸及びプロモーター配列を含む鋳型相補的オリゴヌクレオチドを用いて、場合により１以上の他のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。転写関連増幅の変法が、以前詳細に開示されているように当技術分野で周知である（米国特許第５，３９９，４９１号及び第５，５５４，５１６号、Ｋａｃｉａｎら；米国特許第５，４３７，９９０号、Ｂｕｒｇら；国際出願公開ＷＯ８８／０１３０２号及びＷＯ８８／１０３１５号、Ｇｉｎｇｅｒａｓら；米国特許第５，１３０，２３８号、Ｍａｌｅｋら；米国特許第４，８６８，１０５号及び第５，１２４，２４６号、Ｕｒｄｅａら；国際出願公開ＷＯ９５／０３４３０号、Ｒｙｄｅｒら；並びに米国出願公開第２００６−００４６２６５号、Ｂｅｃｋｅｒら）。ＫａｃｉａｎらのＴＭＡ法及びＢｅｃｋｅｒらの単一プライマー型の転写関連法は、後記のように指標腸球菌標的配列の検出に用いる増幅法の好ましい態様である。ＴＭＡ法又は転写関連増幅法を用いて好ましい態様を説明するが、当業者であれば、本明細書に開示する増幅オリゴマーをポリメラーゼによるオリゴマー配列延長に基づく他の増幅法の使用に容易に適用できることを認識するはずである。
【００１８】
［００１８］「プローブ」は、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、核酸、好ましくは増幅核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズして、標的配列又は増幅核酸を検出することができる核酸オリゴマーをいう。検出は直接（すなわち、その標的配列に直接ハイブリダイズしたプローブ）又は間接（すなわち、その標的に中間分子構造体を介して結合したプローブ）のいずれでもよい。プローブの「標的配列」とは、一般に、より大きな配列（例えば増幅配列のサブセット）内の小配列であって、プローブオリゴマーの少なくとも一部に標準塩基対合により特異的にハイブリダイズするものをいう。プローブは、標的特異的配列及びプローブの三次元構造に関与する他の配列を含んでもよい（例えば米国特許第５，１１８，８０１号及び第５，３１２，７２８号、Ｌｉｚａｒｄｉら；並びに米国特許第６，８４９，４１２号、第６，８３５，５４２号、第６，５３４，２７４号及び第６，３６１，９４５号、Ｂｅｃｋｅｒら；米国出願公開第２００６−００６８４１７号、Ｂｅｃｋｅｒらに記載）。
【００１９】
［００１９］「十分に相補的」とは、一連の相補的塩基間の水素結合により他の配列にハイブリダイズしうる連続配列を意味し、これは配列中の各位置で標準塩基対合（例えばＧ：Ｃ、Ａ：Ｔ又はＡ：Ｕ対合）により相補的であってもよく、あるいは標準水素結合による相補的塩基ではない１以上の残基（非塩基残基を含む）を含んでもよい。連続塩基は、オリゴマーを特異的にハイブリダイズさせることを目的とする配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは約１００％、相補的である。「十分に相補的」である配列により、当該配列が完全に相補的ではなくても、選択されたハイブリダイゼーション条件下で核酸オリゴマーは、当該標的配列に安定にハイブリダイズすることができる。適当なハイブリダイゼーション条件は当技術分野で周知であり、塩基配列組成に基づいて容易に推定できるか又はルーチン試験を用いて判定できる（例えばSambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第２版(Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー、1989)、§§ 1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51及び11.47-11.57、特に§§ 9.50-9.51, 11.12-11.13, 11.45-11.47及び11.55-11.57）。
【００２０】
［００２０］「試料の調製」は、試料中に存在する腸球菌核酸を後に増幅及び検出するために試料を調製するいかなる工程又は方法をもいう。試料の調製には、例えば、空気試料から空中粒子を、又は環境水試料から微生物を、濾過するような、より多容量の試料又は実質的に水性の混合物から成分を濃縮するいずれか既知の方法を含めることができる。試料の調製には、細胞成分を溶解して例えば濾過又は遠心分離により細胞屑を除去することを含んでもよい。試料の調製は、標的核酸を他の試料成分から選択的に捕捉する核酸オリゴマーを用いてもよい。
【００２１】
［００２１］「捕捉プローブ」又は「捕捉オリゴマー」は、標的配列と固定化オリゴマーを塩基対ハイブリダイゼーションにより結合させる少なくとも１つの核酸オリゴマーをいう。好ましい態様の捕捉オリゴマーは、２つの結合領域、すなわち標的配列結合領域及び固定化プローブ結合領域を、通常は同一オリゴマー上に含むが、これらの２領域は１以上のリンカーにより結合した異なるオリゴマー上にあってもよい。例えば第１オリゴマーは固定化プローブ結合領域を含み、第２オリゴマーは標的配列結合領域を含むことができ、これらの２つの異なるオリゴマーが、これらの第１オリゴマーと第２オリゴマーの２配列を連結するリンカーとの水素結合により結合する。
【００２２】
［００２２］「固定化プローブ」又は「固定化核酸」は、捕捉オリゴマーを固定化支持体に直接又は間接的に結合させる核酸をいう。好ましい固定化プローブは、固体支持体に結合したオリゴマーであって、試料中の結合した標的配列が結合していない物質から分離するが容易になる。固体支持体には、既知の材料、例えばニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シラン、ポリプロピレン、金属からなる材料、例えばマトリックス及び溶液中の自由粒子を含めてよく、好ましい態様は磁気付着性粒子である。好ましい支持体は単分散磁性球体（一貫した結果を得るために、例えば均一サイズ±５％）であり、これに固定化プローブが（共有結合、キレート形成又はイオン性相互作用により）直接結合又は（１以上のリンカーにより）間接結合し、その際、プローブと支持体の結合又は相互作用はハイブリダイゼーション条件で安定である。
【００２３】
［００２３］「分離」又は「精製」は、試料の１以上の成分を１以上の他の試料成分から除去又は分離することを意味する。試料成分には一般に水溶液相中の標的核酸が含まれ、当該相は細胞フラグメント、タンパク質、炭水化物、脂質及び他の核酸をも含有してもよい。分離又は精製により、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは約９５％の標的核酸が他の試料成分から分離される。
【００２４】
［００２４］「標識」は、検出できる又は検出可能な応答をおこすことができる、分子部分又は化合物をいう。標識は核酸プローブに直接又は間接的に結合させることができる。直接標識化は標識をプローブに連結させる結合又は相互作用により行うことができ、これには共有結合又は非共有相互作用、例えば水素結合、疎水性及びイオン性相互作用又はキレート若しくは配位錯体の形成が含まれる。間接標識化は架橋部分又は「リンカー」、例えば抗体又は追加オリゴマーを用いて行うことができ、これは直接又は間接的に標識され、検出可能な信号を増幅することができる。標識には、検出可能ないずれかの部分、例えば放射性核種、リガンド（例えばビオチン、アビジン）、酵素若しくは酵素基質、反応性基又は発色団（例えば検出可能な色を付与する色素、粒子又はビーズ）、発光性化合物（例えば生物発光性、リン光性又は化学発光性の標識）若しくは発蛍光団が含まれる。好ましい標識は均一アッセイで検出でき、この場合、混合物中の結合した標識プローブは結合していない標識プローブと比較した際に異なる検出可能な変化、例えば安定性又は異なる分解性を示す。「均一検出可能な標識」は、結合していない形の標識又は標識プローブからハイブリダイズした結合形のものを物理的に分離せずに検出できる（例えば米国特許第５，２８３，１７４号、Ａｒｎｏｌｄら；米国特許第５，６５６，２０７号、Ｗｏｏｄｈｅａｄら；及び米国特許第５，６５８，７３７号、Ｎｅｌｓｏｎらに記載）。好ましい標識には化学発光性化合物、より好ましくはアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物（標準的ＡＥ及びその誘導体を含む）（米国特許第５，６５６，２０７号、Ｗｏｏｄｈｅａｄら；米国特許第５，６５８，７３７号、Ｎｅｌｓｏｎら；米国特許第５，６３９，６０４号、Ａｒｎｏｌｄらに記載）又は発蛍光団、より好ましくはフルオレセインとＤＡＢＣＹＬ消光体の組合わせ又はＲＯＸとＴＡＭＲＡ消光体の組合わせが含まれる。標識を核酸に結合させる合成法及び標識を検出する方法は周知である（例えばSambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第２版(Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー、1989)１０章；米国特許第５，６５８，７３７号、Ｎｅｌｓｏｎら；米国特許第５，６５６，２０７号、Ｗｏｏｄｈｅａｄら；米国特許第５，５４７，８４２号、Ｈｏｇａｎら；米国特許第５，２８３，１７４号、Ａｒｎｏｌｄら；米国特許第４，５８１，３３３号、Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙら）。
【００２５】
［００２５］本発明は、指標腸球菌、詳細には指標腸球菌２３ＳｒＲＮＡ又は２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の配列を増幅及び検出する方法を含む。本発明は、指標腸球菌２３ＳｒＲＮＡ若しくは当該相補配列又は２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子若しくは当該相補配列の標的配列を特異的に認識するオリゴヌクレオチド配列を含む。当該オリゴヌクレオチド配列を増幅オリゴマーとして使用でき、これにはプライマー、プロモーター−プライマー、遮断オリゴマー及びプロモーター−プロバイダーオリゴマーを含めることができ、当該機能は以前に全般的な報告がある（例えば米国特許第５，３９９，４９１号、第５，５５４，５１６号及び第５，８２４，５１８号、Ｋａｃｉａｎら；並びに米国出願公開第２００６−００４６２６５号、Ｂｅｃｋｅｒら；並びに米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号；Ｍｕｌｌｉｓら）。オリゴヌクレオチド配列の他の態様は、増幅した指標腸球菌配列を検出するためのプローブとして使用できる。
【００２６】
［００２６］ＴＭＡ増幅を用いる増幅法は、下記の工程を含む（先に米国特許第５，３９９，４９１号、第５，５５４，５１６号及び第５，８２４，５１８号、Ｋａｃｉａｎらに記載；それらの詳細を本明細書に援用する）。要約すると、増幅すべき配列を含む標的核酸は、一本鎖核酸（例えばｓｓＲＮＡ又はｓｓＤＮＡ）として提示される。当業者であれば、一般的な二本鎖核酸（例えばｄｓＤＮＡ）の融解法を用いて一本鎖標的核酸を得ることができることを認識するはずである。プロモーター−プライマーがその標的配列で標的核酸に特異的に結合し、逆転写酵素（ＲＴ）が標的鎖を鋳型として用いてプロモーター−プライマーの３’末端を延長し、標的配列鎖のｃＤＮＡコピーが作製され、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重体となる。ＲＮアーゼ（例えばＲＴのＲＮアーゼＨ）によりこのＲＮＡ：ＤＮＡ二重体のＲＮＡ鎖が消化され、ｃＤＮＡ鎖上のプロモーター−プライマー末端から下流にある第２プライマーの標的配列に第２プライマーが特異的に結合する。ＲＴが第１ｃＤＮＡ鋳型を用いて第２プライマーの３’末端を延長することにより新たなｄｓＤＮＡが合成され、機能性プロモーター配列を含むｄｓＤＮＡが作製される。次いでプロモーター配列に特異的なＲＮＡポリメラーゼが転写を開始してＲＮＡ転写体が製造され、その反応中で最初の標的鎖の約１００〜１０００増幅コピー（「アンプリコン」）となる。各アンプリコン中の第２プライマーの標的配列に第２プライマーが特異的に結合すると、増幅が継続し、ＲＴがアンプリコンＲＮＡ鋳型からＤＮＡコピーを作製して、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重体が製造される。反応混合物中のＲＮアーゼがＲＮＡ：ＤＮＡ二重体からアンプリコンＲＮＡを消化し、新たに合成されたＤＮＡ中のプロモーター−プライマーの相補配列にプロモーター−プライマーが特異的に結合する。ＲＴがプロモーター−プライマーの３’末端を延長して機能性プロモーターを含むｄｓＤＮＡを作製し、これにＲＮＡポリメラーゼが結合して、標的鎖に相補的な追加アンプリコンを転写する。さらに多数のアンプリコンを作製する当該自触媒サイクルが反応経過中に反復され、その結果、試料中に存在する標的核酸が約１０億倍増幅される。増幅中に、すなわちリアルタイム又は増幅反応が終了した時点で、増幅生成物に含まれる標的配列に特異的に結合するプローブを用いて増幅生成物を検出することができる。結合したプローブから発生する信号が検出されることは、その試料中に標的核酸が存在することの指標となる。
【００２７】
［００２７］他の形の転写関連増幅法は、１のプライマー及び１以上の他の増幅オリゴマーを用いてインビトロで核酸を増幅し、試料中に標的配列が存在することの指標となる転写体（アンプリコン）を作製する（先に米国出願公開第２００６−００４６２６５号、Ｂｅｃｋｅｒらに詳述；その詳細を本明細書に援用する）。要約すると、この単一プライマー型ＴＭＡ法には、プライマー（又は「プライミングオリゴマー」）、自身の３’末端からのＤＮＡ合成開始を阻止するように修飾された（例えば、３’−遮断部分を含有させることによる）修飾プロモーターオリゴマー（又は「プロモーター−プロバイダー」）及び場合により、標的鎖からのｃＤＮＡの延長を終止させる結合分子（例えば３’−遮断されたエキステンダーオリゴマー）を用いる。この方法は標的配列の多数のコピーを合成するものであり、標的配列を含む標的ＲＮＡをプライミングオリゴマー及び結合分子で処理する工程を含み、その際、プライマーが標的鎖の３’末端にハイブリダイズする。ＲＴによりプライマーの３’末端からのプライマー延長が開始してｃＤＮＡが製造され、これが標的鎖との二重体（例えばＲＮＡ：ｃＤＮＡ）になる。３’−遮断されたエキステンダーオリゴマー等の結合分子を反応に用いた場合、それは標的配列の５’末端付近に隣接した標的核酸に結合する。すなわち、結合分子は増幅すべき標的配列の５’末端の隣で標的鎖に結合する。プライマーがＲＴのＤＮＡポリメラーゼ活性により延長されてｃＤＮＡ鎖が製造される際、結合分子の位置によりｃＤＮＡの３’末端が決定される；標的鎖に結合した結合分子にプライマー延長生成物が到達した時点で、重合が停止するからである。こうして、ｃＤＮＡの３’末端は標的配列の５’末端に相補的となる。このＲＮＡ：ｃＤＮＡ二重体は、ＲＮアーゼ（例えば、ＲＴのＲＮアーゼＨ）がＲＮＡ鎖を分解した際に分離する；ただし、当業者であれば、いかなる形態の鎖分離法も使用できることを認識するはずである。次いで、プロモーター−プロバイダーオリゴマーがｃＤＮＡ鎖の３’末端付近でｃＤＮＡにハイブリダイズする。プロモーター−プロバイダーオリゴマーは、ＲＮＡポリメラーゼに対する５’側プロモーター配列及びｃＤＮＡの３’側領域の配列に相補的な３’側領域を含む。プロモーター−プロバイダーオリゴマーは、プロモーター−プロバイダーオリゴマーの３’末端からのＤＮＡ合成開始を阻止する遮断部分を含む修飾された３’末端をも含む。プロモーター−プロバイダー：ｃＤＮＡ鎖二重体で、プロモーターオリゴマーを鋳型として用いてｃＤＮＡの３’末端がＲＴのＤＮＡポリメラーゼ活性により延長してプロモーター配列がｃＤＮＡに付加され、機能性二本鎖プロモーターが作製される。次いで、プロモーター配列に特異的なＲＮＡポリメラーゼがこの機能性プロモーターに結合し、ｃＤＮＡに相補的でありかつ最初の標的鎖から増幅された標的領域配列と実質的に同一である多数のＲＮＡ転写体を転写する。得られた増幅ＲＮＡは、次いでプライマーを結合し、さらにｃＤＮＡを製造するための鋳型として用いられることにより、再びこのプロセスを循環し、試料中に存在する最初の標的核酸から最終的に多数のアンプリコンを製造することができる。ある態様の単一プライマー型の転写関連増幅法は結合分子を含まず、したがってプライマーから作製されたｃＤＮＡ生成物がもつ３’末端は不定であるが、増幅工程は他のすべての工程について実質的に上記同様進行する。
【００２８】
［００２８］増幅生成物の検出は多様な方法で達成できる。検出可能な物理的変化、例えば電気的変化を生じる表面と核酸を会合させることができる。増幅核酸をマトリックス内又はマトリックス上に濃縮し、核酸又はそれと会合した色素（例えば挿入剤、例えば臭化エチジウム又はサイバーグリーン）からの信号を検出することにより、あるいは溶液相中で核酸と会合した色素の増加を検出することにより、増幅核酸を検出できる。他の検出法では、増幅生成物中の配列に対して相補的な核酸プローブを用いてプローブ：増幅生成物複合体の存在を検出するか、あるいは増幅生成物と会合した検出可能な信号を増幅しうるプローブの複合体を用いて検出することができる（例えば米国特許第５，４２４，４１３号及び第５，４５１，５０３号、Ｈｏｇａｎら；米国特許第５，８４９，４８１号、Ｕｒｄｅａら）。増幅生成物と特異的に会合する直接又は間接標識プローブは、試料中に標的核酸が存在することを指示する検出可能な信号を発する。例えば、標的核酸が指標腸球菌２３ＳｒＲＮＡである場合、増幅生成物は指標腸球菌２３ＳｒＲＮＡ中の標的配列又はそれに相補的な配列を含み、プローブは増幅生成物に含まれる配列に直接又は間接的に結合して、被験試料中に指標腸球菌が存在することの指標となる。
【００２９】
［００２９］相補的な増幅配列にハイブリダイズするプローブの好ましい態様は、ＤＮＡオリゴマー若しくはＲＮＡオリゴマー又はＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドの組合わせを含むオリゴマー又は主鎖が修飾されて合成されたオリゴマー、例えば１以上の２’−メトキシ置換リボヌクレオチドを含むオリゴマーであってもよい。増幅した指標腸球菌ｒＲＮＡ配列の検出に用いるプローブは、標識されておらず間接的に（例えば、検出される他の結合パートナーがプローブ上のある部分に結合することにより）検出されてもよく、あるいは検出可能な多様な標識で標識されていてもよい。好ましい態様の標識には、検出可能な光信号を発する化合物、例えば均一混合物中で検出しうる発蛍光団又は発光性化合物が含まれる。１より多い標識及び１より多いタイプの標識が特定のプローブ上に存在してもよく、あるいは検出は各プローブが検出可能な信号を発する化合物で標識されたプローブ混合物の使用によってもよい（例えば米国特許第６，１８０，３４０号及び第６，３５０，５７９号、Ｎｅｌｓｏｎ）。共有結合、キレート形成及びイオン性相互作用を含む多様な手段で標識をプローブに結合させることができるが、好ましくは標識を共有結合させる。プローブは、分子内結合により保持された構造を実質的に形成していない線状オリゴマー又は分子内ハイブリダイゼーションにより一般にヘアピンという構造を形成したオリゴマーであってもよい。好ましい態様の線状オリゴマーは、標識として一般に化学発光性化合物、好ましくはＡＥ化合物を含む。
【００３０】
［００３０］ヘアピンプローブは、好ましくは多様な異なるタイプのいずれかの相互作用性標識で標識され、一方の相互作用メンバーは通常はヘアピンプローブの５’末端に結合し、他方の相互作用メンバーは通常はヘアピンプローブの３’末端に結合している。一般にレポーター色素及び消光体ということができる相互作用メンバーとしては、発光体／消光体対、発光体／付加物対、フェルスター（Ｆｏｅｒｓｔｅｒ）若しくは接触エネルギー伝達対又は色素二量体があげられる。発光体／消光体対は、１以上の発光性標識、例えば化学発光性又は蛍光性の標識と、１以上の消光体から構成することができる。好ましい態様では、特定の波長又は範囲の光を吸収し、他の発光波長又は範囲の光を発する蛍光標識（「Ｆ」）でヘアピンプローブの一端を標識し、他端を消光体（「Ｑ」）で標識する；Ｑは、発蛍光団と近接している際には、励起されたＦから発せられる信号を部分的又は完全に減衰させる。そのようなヘアピンプローブを蛍光体／消光体（Ｆ／Ｑ）対で標識されたということができる。発蛍光団は周知の化合物であり、例えばアクリジン、フルオレセイン、スルホローダミン１０１、ローダミン、５−（２’−アミノエチル）アミノアフタリン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、テキサスレッド、エオシン、ボディピイ（Ｂｏｄｉｐｙ）及びルシファーイエローがあげられる（Tyagi et al., Nature Biotechnology 16: 49-53, 1998）。消光体も周知であり、例えば４−（４’−ジメチル−アミノ−フェニルアキソ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、タリウム、セシウム及びｐ−キシレン−ビス−ピリジニウムブロミドがあげられる。種々のＦ／Ｑ組合わせが周知であり、多くの組合わせを互いに機能させることができる；例えばＤＡＢＣＹＬとフルオレセイン、ローダミン又はＥＤＡＮＳである。ヘアピンプローブ用標識の他の組合わせとしては、レポーター色素、例えばＦＡＭ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＪＯＥ（商標）、ＶＩＣ（商標）を、消光体、例えばＴＡＭＲＡ（商標）又は非蛍光性消光体との組み合わせがあげられる。
【００３１】
［００３１］好ましい態様のヘアピンプローブは「分子トーチ」であり、これは試料中に標的指標腸球菌配列が存在するかの指標となる増幅生成物を増幅工程後に検出する。分子トーチは以下の：（１）標的配列が存在する場合にそれにハイブリダイズして「開放」構造を生じる標的検出手段；（２）標的配列が存在しない場合に標的検出手段にハイブリダイズして「閉鎖」構造を生じるトーチ閉鎖手段；及び（３）標的検出手段とトーチ閉鎖手段を連結する連結手段（例えば米国特許第６，８４９，４１２号、第６，８３５，５４２号、第６，５３４，２７４号及び第６，３６１，９４５号、Ｂｅｃｋｅｒら；それらの詳細を本明細書に援用する）があげられる。開放構造のトーチは増幅した標的配列が存在することを指示する検出可能な信号を発し、一方、閉鎖構造のトーチは開放構造のものと識別できる量の信号を発する。他の好ましいヘアピンプローブ態様は「分子ビーコン」であり、これはヘアピン配列の一方のアーム上に標識、他方のアーム上に消光体及び当該２のアームを連結するループ領域を含む（米国特許第５，１１８，８０１号及び第５，３１２，７２８号、Ｌｉｚａｒｄｉら；それらの詳細を本明細書に援用する）。当該ヘアピンプローブを使用する方法は当技術分野で周知である。
【００３２】
［００３２］核酸ポリメラーゼにより延長されるためのものではないオリゴマーとしては、好ましくは増幅反応中におけるオリゴマーの酵素介在延長を阻止するために３’ＯＨを置換する遮断基があげられる。例えば、増幅に際して存在する遮断された増幅オリゴマー及び／又は検出プローブは、好ましくは機能性３’ＯＨをもたず、代わりに３’末端又はその付近に位置する１以上の遮断基を含む。３’末端付近にある遮断基は、好ましくは３’末端の５残基以内にあり、その大きさはポリメラーゼがオリゴマーに結合するのを制限するのに十分である；他の好ましい態様としては、３’末端に共有結合した遮断基があげられる。３’末端を遮断するために、多種多様な化学基、例えばアルキル基、非ヌクレオチドリンカー、アルカン−ジオールジデオキシヌクレオチド残基及びコルジセピン（ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ）を使用できる。
【００３３】
［００３３］指標腸球菌配列を検出するための好ましい方法には、ヘアピンプローブ、例えば分子トーチ又は分子ビーコンを用いる転写関連増幅を使用する；プローブを増幅前に添加しておき、他の試薬を添加せずに検出を実施できるからである。増幅した標的配列にプローブが早期に結合するのを阻止するために、例えばヘアピンプローブのハイブリダイズしたアーム（例えば、分子トーチの標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメイン複合体）の融解温度（Ｔｍ）が増幅反応温度より高くなるようにプローブを設計することができる。増幅期間後に混合物を加熱し、トーチプローブのアームを開放して標的結合ドメインが増幅生成物中のその標的配列にハイブリダイズできるようにする。次いで溶液を冷却して増幅生成物に結合していないプローブを閉鎖することにより標識／消光体（例えば、Ｆ／Ｑ）対が閉鎖して、増幅した標的配列にハイブリダイズしているプローブからの信号を均一様式で検出することができる。例えば、Ｆ／Ｑ標識ヘアピンプローブについては、混合物を適当な励起光で照射し、発生する信号を測定する。
【００３４】
［００３４］他の態様では、増幅中に増幅生成物がプローブの標的結合ドメインに優先的にハイブリダイズするようにヘアピン検出プローブを設計すると、増幅の進行に伴ってヘアピンがその「開放」構造に変化し、増幅反応混合物を増幅反応中に間隔をおいて照射して、開放プローブから発生する信号を増幅中にリアルタイムで検出する。
【００３５】
［００３５］指標腸球菌配列の増幅及び検出のための試料の調製には、試料に含有する有機体を他の試料成分から分離及び／又は濃縮する方法、例えば空気、水その他のタイプの試料から粒状物質を濾過することが含まれる場合がある。試料の調製には、細胞を破壊し、又は細菌を溶解して、指標腸球菌２３ＳｒＲＮＡ又は２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子を含む細胞内容物を放出させるルーチンの方法が含まれる場合もある。増幅前の試料の調製は、場合によりさらに標的核酸を他の試料成分から特異的又は非特異的に分離するための標的捕捉工程を含んでもよい。非特異的な標的調製法は、実質的に水性の混合物から核酸を選択的に沈殿させること、核酸を支持体に付着させ、支持体を洗浄して他の試料成分を除去すること、又は指標腸球菌核酸及び他の試料成分を含有する混合物から核酸を物理的に分離する他の手段を伴う場合がある。
【００３６】
［００３６］好ましい態様では、指標腸球菌標的配列に特異的な捕捉オリゴマーに指標腸球菌核酸を特異的にハイブリダイズさせて標的配列：捕捉プローブ複合体を形成し、これを試料成分から分離することにより、指標腸球菌ｒＲＮＡ又はｒＲＮＡをコードする遺伝子を他の試料成分から選択的に分離する。特異的な標的捕捉の好ましい方法では、上記のように、指標腸球菌標的：捕捉プローブ複合体を固定化プローブに結合させて、標的：捕捉プローブ：固定化プローブ複合体を形成し、これを試料から分離し、場合により洗浄して非標的試料成分を除去する（（米国特許第６，１１０，６７８号、第６，２８０，９５２号及び第６，５３４，２７３号、Ｗｅｉｓｂｕｒｇら；それらの詳細を本明細書に援用する）。要約すると、捕捉プローブオリゴマーは、２３ＳｒＲＮＡ中又は２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子中の指標腸球菌標的配列に特異的に結合する配列を含み、かつ捕捉プローブをその標的配列が結合した状態で固体支持体に付着させる特異的結合パートナーをも含み、その結果、標的配列を試料成分から分離するのが容易になる。好ましい態様では、捕捉プローブの特異的結合パートナーは、指標腸球菌標的配列に対しては相補的でなく、固体支持体に結合している固定化プローブ上の相補配列にハイブリダイズする、３’「テール」配列である。テール領域にはいかなる配列も使用でき、長さは一般に約５〜５０ｎｔであり、好ましい態様には、固体支持体、例えばマトリックス又は粒子に結合した相補的な固定化配列（例えばポリ−Ｔ）に結合する約１０〜４０ｎｔの実質的にホモポリマー状のテール（例えばＡ１０〜Ａ４０）、より好ましくは約１４〜３３ｎｔのもの（例えばＡ１４〜Ａ３０又はＴ３Ａ１４〜Ｔ３Ａ３０）が含まれる。標的捕捉は、通常はテール配列：固定化プローブ配列二重体のＴｍより高い温度のハイブリダイゼーション条件下で指標腸球菌ｒＲＮＡ又は遺伝子の標的配列に特異的にハイブリダイズする１以上の捕捉オリゴマーを含有する溶液相混合物中で行なうことが好ましい。次いで捕捉プローブテールが固定化プローブにハイブリダイズするようにハイブリダイゼーション条件を調整して、指標腸球菌標的：捕捉プローブ複合体を捕捉し、次いで固体支持体上の複合体全体を他の試料成分から分離する。固定化プローブ：捕捉プローブ：指標腸球菌標的配列が付着した支持体を１回以上洗浄して、他の試料成分をさらに除去することができる。好ましい態様には粒状固体支持体、例えば常磁性ビーズを使用し、したがって指標腸球菌標的：捕捉プローブ：固定化プローブの複合体が付着した粒子を洗浄溶液に懸濁し、洗浄溶液から好ましくは磁気引力により回収することができる。腸球菌標的核酸は、複合体を水、低イオン強度の緩衝液、カオトロピック種を含有する緩衝液中で解離させて及び／又は熱をかけて、溶離する。あるいは、操作工程の数を制限するために、支持体上の複合体中の指標腸球菌標的配列を増幅オリゴマーと単に混合して増幅工程を進めることにより、指標腸球菌標的核酸を増幅させてもよい。
【００３７】
［００３７］指標腸球菌核酸を検出するためのアッセイ法は、場合により指標腸球菌ではない内部対照（ＩＣ）核酸を含んでもよく、ＩＣ配列に特異的な増幅オリゴマー及び検出オリゴマーを用いて、同一のアッセイ反応混合物中で増幅及び検出される。増幅され、そしてこの増幅されたＩＣ配列からの信号が検出されると、目的標的である指標腸球菌核酸について信号が得られない場合に（例えば指標腸球について陰性を示す試料）、当該アッセイにおいてアッセイ試薬、条件及びアッセイ工程の操作が適正に使用されたことが証明される。定量的な結果を獲得したい場合、ＩＣをアッセイの内部検量物質として使用できる；すなわち、ＩＣの増幅及び検出から得られる信号を利用して、増幅した指標腸球菌標的配列について得た信号に基づいて試料中の指標腸球菌核酸量を定量するためのアルゴリズムに使用するパラメーターを設定する。好ましいＩＣの態様は、天然源に由来するランダム化配列である（例えばランダムに再配列したＨＩＶ配列）。好ましいＩＣは、天然源から単離したＲＮＡ転写体又は例えばクローニングしたランダム化配列から転写体を作製してインビトロ合成してもよく、これによりアッセイに含まれるＩＣのコピー数を正確に測定できる。ＩＣ標的配列に対するプライマー及びプローブは、いずれか周知の方法を用いて設計及び合成される；ただし、当該プライマー及びプローブは、ＩＣ標的配列の増幅及び増幅したＩＣ配列の検出について、指標腸球菌標的配列の増幅及び検出に用いるものと実質的に同じアッセイ条件で機能する。標的捕捉に基づく精製工程を含む好ましい態様では、アッセイでＩＣ標的に特異的な標的捕捉プローブを標的捕捉工程に含有させることが好ましく、したがってＩＣはアッセイに際してすべてのアッセイ工程で、目的とする指標腸球菌被分析体と同様に処理される。
【００３８】
［００３８］あるいは、精製又は合成した既知量の腸球菌核酸を試料と同様に増幅及び検出することにより、定量的結果を得ることができる。好ましくは、既知試料と未知試料を同時に処理する。この方法で、既知試料の測定応答を既知量のものと比較して定量的結果を得ることができる。他の側面では、既知量の腸球菌に対する当該方法の応答を測定することにより当該方法を「検量」することにより、定量的結果を得ることができる。
【実施例】
【００３９】
［００３９］指標腸球菌の２３ＳｒＲＮＡ配列（２３ＳｒＲＮＡ及び２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子を含む）中にある配列を増幅及び検出するために、既知の２３ＳｒＲＮＡ配列又は２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子配列を比較し、指標腸球菌単離株に共通するが、好ましくは指標ではない腸球菌又は他の細菌の２３ＳｒＲＮＡ配列と完全には共通でない配列を選択して、増幅オリゴマー及び検出プローブとして作用するオリゴマーを設計した。腸球菌種（エンテロコッカス・アビウム、エンテロコッカス・マロドラタス、エンテロコッカス・シュードアビウム、エンテロコッカス・ラフィノーサス、エンテロコッカス・サッカロリティカス、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・カセリフラブス、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・ムンチイ、エンテロコッカス・ディスパル、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・ハイレ、エンテロコッカス・アシニ（Ｅ ａｓｉｎｉ）、エンテロコッカス・セコルム（Ｅ ｃｅｃｏｒｕｍ）、エンテロコッカス・スルフレウス（Ｅ ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ）及びエンテロコッカス・コロンベ）及び他の細菌種（乳酸杆菌（Ｌａｃｆｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）及びストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ））の既知の２３ＳｒＲＮＡ配列（ｒＲＮＡ又は遺伝子）を用いて、配列比較を実施した。特異的配列を選択し、インビトロで合成し、標準実験法を用いて当該オリゴヌクレオチドのＴｍ及び指標腸球菌オリゴマーと相補的標的配列（合成した又は細菌から精製したｒＲＮＡ配列）のハイブリダイゼーション特性を測定して、そのオリゴマーを特性分析した。次いで、合成２３ＳＲＮＡ標的配列又は培養増殖させた多様な指標腸球菌から精製した２３６ＳｒＲＮＡを用いる増幅反応について種々の組み合わせの増幅オリゴマー（表１）を作製して増幅反応を実施し、選択したオリゴマー配列をさらに試験して、２３ＳｒＲＮＡ標的配列の増幅効率を判定した。一般に、標識プローブ（表２）を増幅生成物に結合させて増幅生成物の生成量を指示する信号の相対量を検出して増幅反応の増幅生成物を検出することにより、種々の組み合わせのオリゴマーの相対効率をモニターした。
【００４０】
［００４０］指標腸球菌２３ＳｒＲＮＡ配列に対する増幅オリゴマーの態様としては、表１に示すものがあげられる。増幅オリゴマーとしては、プライマー、プロモーター−プライマー及びプロモーター−プロバイダーオリゴマーとして機能しうるものがあげられ、プロモーター配列を表１に小文字で示す。ある態様は、表１に示すプロモーター−プライマー又はプロモーター−プロバイダーオリゴマーの標的特異的配列であり、これらを場合により既知のいずれかのプロモーター配列の３’末端に結合させることができる。バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼに対して特異的なプロモーター配列の例は、配列番号４９である（ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ）。増幅オリゴマーの態様は、ＤＮＡ塩基とＲＮＡ塩基の混合物又は主鎖連結ＲＮＡ塩基に対する２’メトキシ結合を含んでもよい。増幅オリゴマーの態様は、オリゴマーを単一プライマー型の転写関連増幅反応に使用するのに最適なものにするため、すなわち遮断分子又はプロモーター−プロバイダーオリゴマーとして機能させるために、３’遮断オリゴマーの合成により修飾されてもよい。３’遮断オリゴマーの好ましい態様としては、３’末端付近又は３’末端に遮断されたＣを含む、配列番号３２、３４、３６、３８及び４０のオリゴマーがあげられる。
【００４１】
【表１】
2009536833.tif 000002
【００４２】
［００４１］２３ＳｒＲＮＡ配列又は２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の増幅生成物に対する検出プローブオリゴマーの態様を表２に示す。好ましい態様の検出プローブは、プローブ配列の分子内ハイブリダイゼーションによりヘアピン構造を形成しうるオリゴマーであり、表２の配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３及び２５のオリゴマーが含まれ、分子内ハイブリダイゼーション配列を小文字で示す。ヘアピンプローブオリゴマーの態様は、蛍光標識を配列の一端に結合させ、消光体化合物を配列の他端に結合させた状態で合成された。ヘアピンプローブの態様は、５’側発蛍光団と３’側消光体、例えば５’側フルオレセイン標識と３’側ＤＡＢＣＹＬ消光体で標識することができる。ある態様のヘアピンオリゴマーは、配列内の選択した位置に非ヌクレオチドリンカー部分をも含む。そのような態様の例としては、配列番号４２の残基１７と１８の間、配列番号４４の残基１６と１７の間、配列番号４６の残基１７と１８の間及び配列番号４８の残基１４と１５の間に非塩基９−炭素（「Ｃ９」）リンカーを含むものがあげられる。
【００４３】
【表２】
2009536833.tif 000003
【００４４】
［００４２］指標腸球菌２３ＳｒＲＮＡ標的核酸を他の試料成分から分離するための試料調製に用いる捕捉プローブオリゴマーの態様としては、
【００４５】
【化１】
2009536833.tif 000004
【００４６】
の標的特異的配列を含むものがあげられる。捕捉プローブの好ましい態様としては、標的特異的配列に共有結合した結合パートナーとして作用する３’テール領域があげられ、結合パートナーは、標的核酸と捕捉プローブからなるハイブリダイゼーション複合体を、支持体上の固定化プローブに結合させる。配列番号５０、５１及び５２の標的特異的配列を含む捕捉プローブの好ましい態様は、実質的にホモポリマー配列、例えばｄＴ３Ａ３０ポリマーからなる３’テール領域をさらに含む。
【００４７】
［００４３］本明細書中の実施例に記載する標的捕捉、増幅及び検出の工程に用いる試薬には、一般に下記のうち１以上が含まれる：試料輸送溶液：１５ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウム、１５ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ及び３％（ｗ／ｖ）のラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）を含有、ｐＨ６．７。細胞溶解試薬１：２．６１ｍＭのコハク酸、０．１０４％（ｖ／ｖ）のＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、２．５％（ｗ／ｖ）のソルビトール、２ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、１２５Ｕ／ｍＬのムタノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）を含有、ｐＨ５．０。細胞溶解試薬２：０．２ＭのＴｒｉｚｍａ塩基、１．０ＭのＬｉＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、２％（ｗ／ｖ）のＬＬＳを含有、ｐＨ７．５。標的捕捉試薬：３．９ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．２５％（ｗ／ｖ）のマンニトール、０．３％（ｗ／ｖ）のトレハロース、０．０６％（ｖ／ｖ）のＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１０ ０、１ｍｇ／ｍＬの常磁性粒子（０．７〜１．０５μの粒子、ＳＥＲＡ−ＭＡＧ（商標）MG-CM、Seradyn, Inc.、インディアナ州インディアナポリス）に（ｄＴ）１４オリゴマーが共有結合したもの及び０．０１μＭの配列番号５１を含有、ｐＨ７．７。洗浄用緩衝液：（標的捕捉に使用）１０ｍＭのＴｒｉｚｍａ塩基、０．１５ＭのＬｉＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ及び３．６７ｍＭのＬＬＳを含有、ｐＨ７．５。増幅試薬は、他の反応成分（例えば試料又は検体希釈用成分）と混合して混合物を調製するための、下記を含有する濃厚混合物であった：４７．６ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳ、１２．５ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン、２．５％のＴＲＩＴＯＮＸ−１００、５４．８ｍＭのＫＣｌ、２３ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍＭのＮａＯＨ、０．３５ｍＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、７．０６ｍＭのｒＡＴＰ、１．３５ｍＭのｒＣＴＰ、１．３５ｍＭのＵＴＰ、８．８５ｍＭのｒＧＴＰ、０．２６ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、５％（ｖ／ｖ）のグリセロール、２．９％のトレハロース、０．２２５％のエタノール、０．０７５％のメチルパラベン、０．０１５％のプロピルパラベン及び０．００２％のフェノールレッド、ｐＨ７．５−７．６。増幅オリゴマー（プライマー、プロモーター−プライマー、遮断オリゴマー又はプロモーター−プロバイダーオリゴマー）及び場合によりプローブは、増幅試薬中又は別個に、反応混合物に添加することができる。酵素は、ＴＭＡ反応混合物に、反応当たり約９０Ｕ／μＬのＭＭＬＶ逆転写酵素（ＲＴ）及び約２０Ｕ／μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼで添加された（１ＵのＲＴが３７℃で２００〜４００μＭのオリゴｄＴ−プライムドポリＡ鋳型を用いて１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを１０分で取り込み、１ＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが３７℃でＤＮＡ鋳型中のＴ７プロモーターを用いて１ｎｍｏｌのＡＴＰをＲＮＡ中に１時間で取り込む）。試薬の添加及び混合の工程はすべて手動で又は手動工程と自動化工程の組合わせ又は完全自動化システムにより実施できる。転写介在増幅（ＴＭＡ）を使用する増幅法は、実質的に米国特許第５，３９９，４９１号及び第５，５５４，５１６号（Ｋａｃｉａｎら）に既に詳細に開示された方法を用い、これを本明細書に援用す���。単一プライマー型の転写関連増幅を使用する増幅法は、実質的に米国出願公開第２００６−００４６２６５号に既に詳細に開示された方法を用いる；その詳細を本明細書に援用する。ヘアピンプローブの使用方法は周知であり、米国特許第６，８４９，４１２号、第６，８３５，５４２号、第６，５３４，２７４号及び第６，３６１，９４５号に既に詳細に開示されたものが含まれる；それらの詳細を本明細書に援用する。
【００４８】
［００４４］試料が約１００コピーの２３ＳｒＲＮＡ標的配列を含有する場合、当該増幅オリゴマー及び検出プローブの多様な組合わせを用いて、指標腸球菌２３ＳｒＲＮＡ配列が特異的に検出された。以下の実施例は指標腸球菌２３ＳｒＲＮＡ標的配列を検出するための本発明の若干の態様を示す。
【００４９】
実施例１：検出プローブオリゴマーの特性分析
［００４５］本実施例は、検出プローブオリゴマーのＴｍ及び相補的標的配列とのハイブリダイゼーション特性の測定による、検出プローブオリゴマーの特性分析を示す。標準実験方法に従い、２’−ＯＭｅヌクレオチド類似体を用いて分子ビーコンを合成した。分子ビーコン（反応当たり１０ｐｍｏｌ）のハイブリダイゼーション反応物（０．１００ｍＬの全容量、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２ＴＲＩＳ−緩衝液中）を、合成ＲＮＡ標的（反応当たり３０ｐｍｏｌの配列番号５３（ＣＡＵＣＡＵＵＣＵＣＡＡＵＵＣＣＧＡＧＧＣ））の不存在下又は存在下に、６Ｏ℃で１０分間、次いで４２℃で６０分間インキュベートし、３０秒毎に４２℃で９９サイクルの間、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ２０００計測器により蛍光を相対蛍光単位（ＲＦＵ）で測定した。終了後、反応温度を４２℃から９９℃まで、各段階で１５秒間保持しながら１℃ずつ高め、生じたＲＦＵを測定し、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ２０００計測器が備えるデータ分析ソフトウェアを用いて分子ビーコンのＴｍを判定した。合成ＲＮＡ標的の存在下で測定したエンドポイントＲＦＵを合成ＲＮＡ標的の不存在下で測定したエンドポイントＲＦＵで割ったものから、平均シグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比を計算した；
【００５０】
【表３】
2009536833.tif 000005
【００５１】
当該結果により、合成ＲＮＡ標的の不存在下では安定な分子ビーコン幹構造が形成され、このためこれより低い温度で分子ビーコンの非特異的開放が防止され、合成ＲＮＡ標的の存在下では実験条件下で分子ビーコンの安定なハイブリッドが形成されることが証明された。
【００５２】
実施例２：転写介在増幅及び検出
［００４６］本実施例は、増幅生成物をリアルタイムで検出する、指標腸球菌標的核酸の増幅及び検出アッセイを示す。増幅反応は、前記の若干の増幅オリゴマー態様を用いる、以前に詳述された方法による転写介在増幅であった（米国特許第５，３９９，４９１号及び第５，５５４，５１６号、Ｋａｃｉａｎら；それらの詳細を本明細書に援用する）。各アッセイを、標的ＲＮＡ及び実質的に上記の増幅試薬を含有する増幅反応で（全容量０．０１５ｍＬ）、プロモーター−プロバイダーオリゴマー（反応当たり３ｐｍｏｌ）、プライマーオリゴマー（反応当たり３ｐｍｏｌ）及び分子ビーコン（反応当たり３ｐｍｏｌ）を用いて実施した。増幅オリゴマー、標的及び増幅試薬を含有するが酵素を含有しない反応混合物を蒸発防止のために覆い、６Ｏ℃で１０分間、次いで４２℃で２分間インキュベートした。次いで酵素（５μＬの容量）を添加し、反応物を混合し、４２℃でインキュベートし、酵素添加後、増幅反応期間中３０秒毎に６０サイクルで、蛍光を測定した；
【００５３】
【表４】
2009536833.tif 000006
【００５４】
【表５】
2009536833.tif 000007
【００５５】
【表６】
2009536833.tif 000008
【００５６】
ＮＤ＝検出されなかった；
上記の実験結果により、多様な増幅及び検出プローブオリゴマー組合わせを用いた１００コピーの感度が証明された。
【００５７】
実施例３：単一プライマー型の転写介在増幅及び検出
［００４７］本実施例は、増幅生成物をリアルタイムで検出する、指標腸球菌標的核酸の増幅及び検出アッセイを示す。増幅反応は、前記の若干の増幅オリゴマー態様を用いる、先に詳述された方法による単一プライマー型の転写介在増幅であった（米国出願公開第２００６−００４６２６５；その詳細を本明細書に援用する）。各アッセイは、標的ＲＮＡ及び実質的に上記の増幅試薬を含有する増幅反応で（全容量０．０４０ｍＬ）、プロモーター−プロバイダーオリゴマー（反応当たり１２ｐｍｏｌ）、プライマーオリゴマー（反応当たり１２ｐｍｏｌ）、遮断オリゴマー（反応当たり０．８ｐｍｏｌ）及び分子トーチ（反応当たり６ｐｍｏｌ）を用いて実施された。プロモーター−プロバイダー配列番号３２及び３４は下記の遮断オリゴマーに相当する：
【００５８】
【化２】
2009536833.tif 000009
【００５９】
プロモーター−プロバイダー配列番号３８は下記の遮断オリゴマーに相当する：
【００６０】
【化３】
2009536833.tif 000010
【００６１】
プロモーター−プロバイダー配列番号４０は下記の遮断オリゴマーに相当する：
【００６２】
【化４】
2009536833.tif 000011
【００６３】
増幅オリゴマー、標的及び増幅試薬を含有するが酵素を含有しない反応混合物を蒸発防止のために覆い、６Ｏ℃で１０分間、次いで４２℃で５分間、インキュベートした。次いで酵素（１０μＬの容量）を添加し、反応物を混合し、４２℃で５分間インキュベートし、酵素添加後、増幅反応期間中３０秒毎に蛍光を測定した；
【００６４】
【表７】
2009536833.tif 000012
【００６５】
ＮＤ＝検出されなかった；
本アッセイの結果により、プライマーオリゴマーとしての配列番号２８よりはるかに良好な性能の配列番号２６について１０，０００コピーでの感度が証明された；
【００６６】
【表８】
2009536833.tif 000013
【００６７】
ＮＤ＝検出されなかった；
本アッセイの結果により、分子トーチとしての配列番号４８より極めて性能に優れる配列番号４４について１０００コピーでの感度が証明された。配列番号４８は開放できなかった；
【００６８】
【表９】
2009536833.tif 000014
【００６９】
ＮＤ＝検出されなかった；
本アッセイの結果により、プライマー−プロバイダーオリゴマーとしての配列番号３６又は配列番号４０より極めて性能に優れる配列番号３２について１０００コピーでの感度が証明された；
【００７０】
【表１０】
2009536833.tif 000015
【００７１】
ＮＤ＝検出されなかった；
＊＝低レベルの汚染の結果；
本アッセイの結果により、分子トーチとしての配列番号４２又は配列番号４４より極めて性能に優れる配列番号４６について１０００コピーでの感度が証明された；
【００７２】
【表１１】
2009536833.tif 000016
【００７３】
本アッセイの結果により、プライマーオリゴマーとしての配列番号２９より極めて性能に優れる配列番号２６及び３０について１０００コピーの感度が証明された；
［００４８］まとめると、これらのアッセイの結果により、指標腸球菌２３ＳｒＲＮＡ標的のリアルタイム検出について配列番号３０、３２及び４６の好ましい組合わせが証明された。
【００７４】
実施例４：特異性及び交差反応性
［００４９］本実施例は、指標腸球菌標的核酸に対する本明細書に記載した増幅及び検出アッセイ法の特異性を証明する。増幅反応は以前詳述された方法を用いるリアルタイム単一プライマー型の転写介在増幅であり（米国出願公開第２００６−００４６２６５号；その詳細を本明細書に援用する）、下記のオリゴマー組合わせを用いた：配列番号３０（反応当たり６ｐｍｏｌ）；配列番号３２（反応当たり１２ｐｍｏｌ）；配列番号４６（反応当たり６ｐｍｏｌ）；及び配列番号５４（反応当たり０．５ｐｍｏｌ）。選択した腸球菌及び非腸球菌生物の少なくとも１０８ＣＦＵの試料溶液を、１００ｍＬの無菌塩類溶液中に調製した。試料をメンブレン（０．４５μｍ）により濾過し、ポリビニルピロリドン（５０ｍＬ、３％ｗ／ｖ）で洗浄した。保持された細菌を、実質的に上記の溶解試薬（各１ｍＬ）により、試薬添加間に３７℃で１０分間インキュベートしながら溶解した。得られた溶解物（１ｍＬ）から、実質的に上記の標的捕捉試薬（５０μＬ）の添加、６０℃で５分間のインキュベーション、室温で１０分間の冷却、実質的に上記の洗浄溶液（１ｍＬ、０．５ｍＬ、０．１ｍＬ）による連続洗浄、続いてヌクレアーゼ非含有水（６０μＬ）による磁性粒子からの溶離により、放出された指標腸球菌２３ＳｒＲＮＡを単離した。次いで、指標腸球菌２３ＳｒＲＮＡ（１０μＬ）を、実質的に上記の増幅試薬を用いる増幅反応で（全容量０．０４ｍＬ）、ただしグリセロール、ＥＤＴＡ及びＮ−アセチル−Ｌ−システインを除外し；塩化マグネシウム濃度を２３ｍＭから３０ｍＭに高めるように変更してアッセイした。増幅オリゴマー、標的及び増幅試薬を含有するが酵素を含有しない反応混合物を蒸発防止のために覆い、６Ｏ℃で１０分間、次いで４２℃で５分間、インキュベートした。次いで酵素（１０μＬ）を添加し、反応物を混合し、４２℃でインキュベートし、酵素添加後、増幅反応期間中３０秒毎に３５分間、蛍光を測定した；
【００７５】
【表１２】
2009536833.tif 000017
【００７６】
【表１３】
2009536833.tif 000018
【００７７】
Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｉｓｃｉｃｏｌａ；カルノバクテリウム・ピシコーラ
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ：ラクトバシラス・カゼイ
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｕｍｉｎｉｓ；ラクトバシラス・ルミニス
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ；乳酸杆菌
Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ；リステリア・モノサイトゲネス
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ；唾液連鎖球菌
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ；ストレプトコッカス・ウベリス
同様に、１０６ＣＦＵのストレプトコッカス・ボビスを１０６及び１０ＣＦＵのエンテロコッカス・フェカーリスと比較した。エンテロコッカス・フェカーリスの平均出現時間は各々２３．１２分及び５７．３０分を示したのに対し、ストレプトコッカス・ボビスは検出されなかった。栄養寒天上で増殖させた同様なサイズのエンテロコッカス・フェカーリス、エロコッカス−ビリダンス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ）、ラルストニア・ピッケッチイ（Ｒａｌｓｆｏｎｉａ ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ）及びスタフィロコッカス・エピデルミディスのコロニーを同様に比較した。エンテロコッカス・フェカーリスの平均出現時間は１９．１５分を示したのに対し、他の生物は検出されなかった。
【００７８】
［００５０］まとめると、これらの結果は、エンテロコッカス・アビウム、エンテロコッカス・マロドラタス、エンテロコッカス・シュードアビウム、エンテロコッカス・ラフィノーサス、エンテロコッカス・サッカロリティカス及びエンテロコッカス・ディスパルを検出することなく、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・カセリフラブス、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・ムンチイ、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・ハイレ及びエンテロコッカス・コロンベに対する特異性を証明する。ラクトバシラス・ルミニス、乳酸杆菌、唾液連鎖球菌及びストレプトコッカス・ウベリスについては若干の交差反応性がみられたが、当該微生物は、異常に高い濃度で存在しない限り、リクリエーション用水試料における指標腸球菌の増幅及び検出を妨害しないはずである。
【００７９】
実施例５：標的及び内部対照の単一プライマー型転写介在増幅及び検出
［００５１］本実施例は、指標腸球菌標的核酸及び非腸球菌内部対照（ＩＣ）の増幅及び検出アッセイを示す。本実施例は、非特異的増幅という欠陥を検出するのに非腸球菌ＩＣ核酸が有効であることをも証明する。増幅反応は、以前に詳述された方法を用いるリアルタイム単一プライマー型転写介在増幅であり（米国出願公開第２００６−００４６２６５号；その詳細を本明細書に援用する）、下記のオリゴマー組合わせを用いた：配列番号３０（反応当たり６ｐｍｏｌ）；配列番号３２（反応当たり１２ｐｍｏｌ）；配列番号４６（反応当たり６ｐｍｏｌ）；及び配列番号５４（反応当たり０．５ｐｍｏｌ）。指標腸球菌標的核酸及び非腸球菌ＩＣ核酸（各５００ｐｇ、最終容量１０μＬ中）を、実質的に実施例４に記載した増幅試薬を用いる増幅反応で（全容量０．０４ｍＬ）、ただし増幅を阻害することが知られている種々の割合の過剰の洗浄溶液を添加してアッセイした。増幅オリゴマー、標的、ＩＣ及び増幅試薬を含有するが酵素を含有しない反応混合物を蒸発防止のために覆い、６Ｏ℃で１０分間インキュベートし、２℃に冷却した。次いで酵素（１０μＬ）を添加し、反応物を混合し、４２℃でインキュベートし、酵素添加後、増幅反応期間中３０秒毎に３５分間、蛍光を測定した。
【００８０】
【表１４】
2009536833.tif 000019
【００８１】
実施例６：自動標的捕捉
［００５２］本実施例は、市販の自動プラットフォームＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ９６（Thermo Scientificから）を、後続の増幅及び検出のために指標腸球菌標的核酸及び非腸球菌内部対照（ＩＣ）核酸の捕捉に使用することを示す。既知数の指標腸球菌を含有する試料溶液を、１００ｍＬの無菌塩類溶液中に調製した。試料をメンブレン（０．４５μｍ）により濾過し、ポリビニルピロリドン（５０ｍＬ、３％ｗ／ｖ）で洗浄した。保持された細菌を、実質的に上記の溶解試薬（各１ｍＬ）で試薬添加間に３７℃で１０分間インキュベートしながら溶解した。放出された指標腸球菌２３ＳｒＲＮＡの処理試料（１ｍＬ）を、次いで深型９６穴マイクロタイタープレートに移し、これに実質的に上記の標的捕捉試薬（５０μＬ）を６２．５ｐｇの非腸球菌ＩＣ核酸と共に添加した。プレートを６０℃に５分間加熱し、室温で１０分間冷却し、粒子を捕捉し、実質的に上記の洗浄溶液で２回の連続洗浄を行ない、続いてヌクレアーゼを含有しない水（６０μＬ）で核酸を磁性粒子から溶離するようにプログラミングしたＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ９６に、得られた混合物を装填した。次いで各溶出液の一部（１０μＬ）を、実質的に上記の増幅及び検出アッセイに使用した。
【００８２】
【表１５】
2009536833.tif 000020
【配列表】
2009536833000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年1月14日(2009.1.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）核酸を増幅及び検出するための方法であって、以下の：
ａ）試料を、配列番号３０からなる標的結合領域を含む第１増幅オリゴマー、配列番号３１からなる標的結合領域を含む第２増幅オリゴマー及び配列番号４５からなる標的結合領域を含む検出プローブオリゴマーと接触させる工程であって
前記標的結合領域は、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・カセリフラブス、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・ムンチイ、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・ハイレ及びエンテロコッカス・コロンベ由来の核酸と検出可能なハイブリッドを形成することができ、
前記標的結合領域は、エンテロコッカス・アビウム、エンテロコッカス・マロドラタス、エンテロコッカス・シュードアビウム、エンテロコッカス・ラフィノーサス、エンテロコッカス・サッカロリティカス及びエンテロコッカス・ディスパル由来の核酸と検出可能なハイブリッドを形成することができず、
前記検出プローブオリゴマーは、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・カセリフラブス、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・ムンチイ、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・ハイレ及びエンテロコッカス・コロンベ由来の核酸と検出可能なハイブリッドを形成することができる他の標的結合領域を含まない；
ｂ）被験試料を腸球菌核酸の増幅に十分な条件に曝露する工程；並びに
ｃ）前記核酸が試料中に存在するかを判定する工程；
を含む、前記方法。
【請求項２】
検出プローブオリゴマーが、さらに少なくとも１つの非標的結合領域を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
検出プローブオリゴマーが、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・カセリフラブス、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・ムンチイ、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・ハイレ及びエンテロコッカス・コロンベ由来の核酸にハイブリダイズしない場合に互いにハイブリダイズする２つの非標的結合領域を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
検出プローブオリゴマーが、さらに検出可能な標識を含む、請求項１〜３いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
検出プローブオリゴマーが、発蛍光団及び消光体を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
第１増幅オリゴマーが、さらにプロモーター配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
プロモーター配列が配列番号４９からなる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）核酸を増幅及び検出する前に試料から腸球菌核酸を分離する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
捕捉オリゴマーを用いて試料から腸球菌核酸を分離する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
捕捉オリゴマーが配列番号５０、５１又は５２を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
試料中の腸球菌核酸を増幅及び検出するためのキットであって、以下の：
配列番号３０からなる標的結合領域を含む第１増幅オリゴマー；
配列番号３１からなる標的結合領域を含む第２増幅オリゴマー；及び
配列番号４５からなる標的結合領域を含む検出プローブオリゴマー；
を含み、ここで、
前記標的結合領域は、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・ムンチイ（Ｅ．ｍｕｎｄｔｉｉ）、エンテロコッカス・デュランス（Ｅ．ｄｕｒａｎｓ）、エンテロコッカス・ハイレ（Ｅ．ｈｉｒａｅ）及びエンテロコッカス・コロンベ（Ｅ．ｃｏｌｕｍｂａｅ）由来の核酸と検出可能なハイブリッドを形成することができ；及び
前記標的結合領域は、エンテロコッカス・アビウム（Ｅ．ａｖｉｕｍ）、エンテロコッカス・マロドラタス（Ｅ．ｍａｌｏｄｏｒａｔｕｓ）、エンテロコッカス・シュードアビウム（Ｅ．ｐｓｅｕｄｏａｖｉｕｍ）、エンテロコッカス・ラフィノーサス（Ｅ．ｒａｆｆｉｎｏｓｕｓ）、エンテロコッカス・サッカロリティカス（Ｅ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）及びエンテロコッカス・ディスパル（Ｅ．ｄｉｓｐａｒ）由来の核酸と検出可能なハイブリッドを形成することができず；並びに
前記検出プローブオリゴマーは、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・カセリフラブス、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・ムンチイ、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・ハイレ及びエンテロコッカス・コロンベ由来の核酸と検出可能なハイブリッドを形成することができる他の標的結合領域を含まない；
前記キット。
【請求項１２】
検出プローブオリゴマーが、さらに少なくとも１つの非標的結合領域を含む、請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
検出プローブオリゴマーが、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・カセリフラブス、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・ムンチイ、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・ハイレ及びエンテロコッカス・コロンベ由来の核酸にハイブリダイズしない場合に互いにハイブリダイズする２つの非標的結合領域を含む、請求項１２記載のキット。
【請求項１４】
検出プローブオリゴマーが、さらに検出可能な標識を含む、請求項１１〜１３いずれか１項記載のキット。
【請求項１５】
検出プローブオリゴマーが、発蛍光団及び消光体を含む、請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
第１増幅オリゴマーが、さらにプロモーター配列を含む、請求項１１記載のキット。
【請求項１７】
プロモーター配列が配列番号４９からなる、請求項１６記載のキット。
【請求項１８】
さらに捕捉プローブを含む、請求項１１記載のキット。
【請求項１９】
捕捉オリゴマーが配列番号５０、５１又は５２を含む、請求項１８記載のキット。
【国際調査報告】
2009536833.tif 000021
2009536833.tif 000022
2009536833.tif 000023