(57)【要約】  唾液の成分が口腔衛生に重要であることは一般的に受け入れられているが、現在までに１つまたはそれ以上の前記成分と齲蝕開始の間に明白な相関関係は見出されていない。本発明は、試験を行った個人の唾液サンプルからの唾液の可溶性ＣＤ１４タンパク質の存在および／または含有量を解析することを含むアッセイの方法に関する。すなわち、唾液サンプルからの前記タンパク質の非存在、あるいは齲蝕のない個人の既定の閾値と比較して減少した量の存在が、齲蝕を発生しやすいマーカーとしておよび／または進行中の齲蝕病変の存在のための診断要素として考慮される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
唾液の可溶性ＣＤ１４タンパク質の存在について個人からの唾液サンプルを試験する段階を含むことを特徴とする、齲蝕の発生に対する個人の素因を決定するまたは齲蝕の進行を診断するアッセイの方法であって、前記サンプルからの前記タンパク質の非存在、または齲蝕のない個人における既定の閾値と比較して減少したその量の存在が、前記素因または進行中の齲蝕の存在の指標である方法。
【請求項２】
前記サンプルの試験がウェスタンブロッティング技術によって実施されることを特徴とする、請求項１に記載のアッセイの方法。
【請求項３】
唾液サンプルの試験がＥＬＩＳＡ技術によって実施されることにより、前記サンプル中の可溶性ｓＣＤ１４の発現が定量され、前記定量が齲蝕のない個人からの唾液サンプルにおけるｓＣＤ１４の発現の既定量の値と比較されることを特徴とする、請求項１に記載のアッセイの方法。
【請求項４】
解析にかけた唾液サンプルのｓＣＤ１４の発現の値が前記既定量より少なくとも２０％低い値である時に、齲蝕の発生に対する個人の素因または進行中の齲蝕病変の存在が陽性として決定されることを特徴とする、請求項３に記載のアッセイの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、齲蝕に対する個人の受容性を決定するのに有用であるインビトロアッセイの方法、特に、齲蝕の発生に対する個人の素因を決定する、あるいは口腔内の１つまたはそれ以上の活性のある齲蝕の存在を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
齲蝕は、脱鉱質化を招く病理学的因子と再鉱質化を招く保護因子間の動的な平衡によって決定される、多因子性の感染疾患である（Featherstone, 2004）。
【０００３】
多くの唾液タンパク質は、酸産生細菌の増殖を抑制し、それらを凝集し、歯の表面に対するそれらの接着を促進し、あるいは鉱質化／脱鉱質化の平衡を修正する能力に依存して、齲蝕原性または抗齲蝕原性因子のどちらかとして役割を果たすと推定されている（Lenander-Lumikari and Loimaranta, 2000; Nieuw Amerongen et al., 2004）。
【０００４】
齲蝕発生における唾液タンパク質の役割を理解することは、これらのタンパク質の多くが多機能性（同一タンパク質が異なる機能を有しうる）、重複性（多くのタンパク質が同一の機能を共有しうる）、両性機能（同一タンパク質が口腔内環境に応じて相反する効果を有しうる）であるという事実によってより複雑となった（Rudney, 2000; Humphrey and Williamson, 2001）。
【０００５】
耳下腺唾液（Dodds et al., 1997）および全唾液（Banderas-Tarabay et al., 2002）のタンパク質の組成物における顕著な相違は、齲蝕活性（ＣＡ）と齲蝕のない（ＣＦ）個人の間において検出されなかった。
【０００６】
実際に、一次元ゲル電気泳動の各バンドは、多くの場合、異なるタンパク質型から構成され、それゆえに特定のタンパク質の量的変化を検出することを困難にする。二次元ゲル電気泳動によるヒト唾液タンパク質のマッピングは、まだ同定されていない多くのスポットの存在を明らかにした（Ghafouri et al., 2003）。これらのタンパク質の１つが主として齲蝕の発生に関与するということが判明できた。
【０００７】
しかしながら、従来技術は、齲蝕の発生に対する個人の素因のためのマーカーとして、または進行する齲蝕の存在の指標として用いられうる特異的な唾液タンパク質の存在の可能性に関するいずれの指針も含まない。
【０００８】
本発明は、唾液タンパク質ｓＣＤ１４（可溶性ＣＤ１４）の発現がＣＦ個人の唾液と比較してＣＡ個人からの唾液で大幅に減少するという事実の認識に基づく；特に、若年のＣＡ患者からの唾液サンプルのウェスタンブロッティング解析により、ｓＣＤ１４タンパク質は、若年のＣＡ患者からの唾液サンプル全てにおいて非存在であることが決定され、一方でコントロールの高齢者ＣＦ個人全てからの唾液中において明確に検出可能であった。
【０００９】
唾液中のｓＣＤ１４の存在と初期齲蝕の開始との間の逆相関関係は、この唾液タンパク質が齲蝕の発生を予防するのに役割を果たしうるか、あるいはその消失（または明確な減少）が活性な齲蝕の存在のマーカーを示しうるという推測を導く。
【００１０】
それゆえ、本発明の主題は、齲蝕の発生に対する個人の素因を決定するため、あるいは口腔内の活性な齲蝕の存在を検出するための予後および診断アッセイの方法であって、唾液中の可溶性ＣＤ１４タンパク質の存在についての個人に由来する唾液サンプルを試験する段階を含むことを特徴とし、サンプルからの前記タンパク質の非存在または齲蝕のない個人における既定の閾値と比較して減少した量の存在が、前記素因または活性な齲蝕の存在の指標である方法を含む。
【００１１】
ＣＤ１４は、主に単球／マクロファージおよび好中球の表面で発現する５５ｋＤａの膜糖タンパク質であり、グラム陰性およびグラム陽性菌それぞれの主要な構成要素である、リポ多糖（ＬＰＳ、エンドトキシン）およびペプチドグリカンのごとき数個の微生物産物の認識に重要な役割を果たし、それゆえに免疫応答の開始に関与する（Lien and Ingalls, 2002）。
【００１２】
ＬＰＳ−およびペプチドグリカン−ＣＤ１４複合体は、他の補助タンパク質と一緒に、Ｔｏｌｌ様受容体として表される細胞表面受容体と相互作用し、複数のシグナリング経路の活性を媒介して、炎症誘発性サイトカインの合成を導く（Guha and Mackman, 2001）。
【００１３】
ＣＤ１４は、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカーを介して細胞表面上で発現されるが、膜中の遊離形態でも見出され、これは可溶性ＣＤ１４（ｓＣＤ１４）と称される。ｓＣＤ１４は、内皮および上皮細胞のごときＣＤ１４陰性細胞のＬＰＳによる活性を媒介する（Frey et al., 1992）。
【００１４】
主なヒト唾液腺は、唾液中にｓＣＤ１４を構成的に発現し、分泌する（Sugawara et al., 2002）：唾液ｓＣＤ１４は、Ｔｏｌｌ−様受容体ＴＬＲ４を介するＬＰＳによるＣＤ１４を欠失する腸上皮細胞の活性を媒介し（Uehara et al., 2003）、アクチノバチルス  アクチノミセタムコミタンスによる口の上皮細胞の浸潤を促進し、それによりインターロイキン−８の産生を増加させうる（Takayama et al., 2003）。このことは、ヒトｓＣＤ１４が口腔内の自然免疫において重要な役割を担いうることを示唆するが、唾液ｓＣＤ１４と齲蝕に対する個人の受容性の間の相関関係について従来技術に証拠はない。
【００１５】
本発明内で得られた結果は、前記タンパク質が多機能性に加えて抗齲蝕原性因子として重要な役割を担うことを示す。
【００１６】
かかる機能を説明するために、多くの仮説が立てられるかもしれないが、本発明は、作用メカニズムの特定の説明のいずれかに結びつくことまたは制限されることを意図していない。
【００１７】
第一に、ｓＣＤ１４は、口の上皮細胞が細菌に結合でき（それにより歯の表面への接着を予防する）、歯肉の接触面において食細胞を補充できるサイトカインを産生可能にする（それにより唾液からの細菌の殺菌力を高める）。
【００１８】
明白なことに、ＣＤ１４を欠失する上皮細胞は、ｓＣＤ１４に依存した形でＬＰＳに応答してインターロイキン−８を産生し、好中球の活性と移動を誘導する（Uehara et al., 2001）。
【００１９】
ｓＣＤ１４はまた、哺乳類の外分泌物中で見出されたヒトラクトフェリン（Baveye et al., 2000）、鉄−およびＬＰＳ−でキレートされた糖タンパク質（Caccavo et al., 2002）に高い親和性で結合して、唾液の抗炎症特性を調節しうる。
【００２０】
さらに、ｓＣＤ１４の細菌への結合は、浮遊から固着状態までの移行を妨害し、プラーク形成を遅延させうる。
【００２１】
唾液サンプル中のｓＣＤ１４の決定のための唾液サンプルの解析は、それ自体周知であるウェスタンブロッティング解析によって行われてもよい；この目的を達成するために、一次抗ヒトＣＤ１４抗体は、市販の、例えば、イタリア、Ｄ．Ｂ．ＡのＵｐｓｔａｔｅ社のヤギポリクローナル抗ヒトＣＤ１４抗体である。
【００２２】
ヒト可溶性ＣＤ１４の定性的および定量的決定に有用であるＥＬＩＳＡキットもまた市販されている。
【００２３】
以下の実施例は、本発明の範囲内で実施された解析を示す。
【００２４】
（実施例１−唾液の解析）
年齢６から１２歳までの無関係で健康なイタリア人の子供４０人を、経験豊富な歯医者によって臨床的に試験した；包含した判断基準は、全身性疾患、薬物治療および抜歯のないことであった。彼らのうちの２０人（男８人、女１２人；年齢＝８．４５＋０．３５８歳）は齲蝕がなく（ＣＦ）、２０人（男９人、女１１人；年齢＝７．９＋０．３４１歳）は齲蝕活性であった（ＣＡ：手術を必要とする２から８個の齲蝕病変を有すると定義した）。
【００２５】
研究は地域倫理委員会（ｌｏｃａｌ  ｅｔｈｉｃａｌ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により認可された；全ての参加者から書面と口頭に基づいた承諾を得た。
【００２６】
患者に、唾液を採取する最低２時間前には、飲食または口内清涼剤の使用を控えるように指示した。起こり得る日周変動を減少させるために、無刺激のヒトの唾液全体（約５ｍｌ）を、臨床試験前に同一の試験者によって午前８時と１０時の間に採取した。
【００２７】
被験者に、歯ブラシで歯を磨き、水で口を濯いでもらった。１０分の待機時間後、被験者に滅菌したプラスチック製チューブ内に唾液を吐くように頼み、タンパク質の分解を最小限にするために、そのすぐ直後に処理した（Banderas-Tarabay et al., 2002）。
【００２８】
サンプルにプロテアーゼ阻害剤ｃｏｃｋｔａｉｌ  ｓｅｔ  ＩＩＩ（１００ｍＭ  ＡＥＢＳＦ、８０μＭ  アプロチニン、５ｍＭ  ベスタチン、１．５ｍＭ  Ｅ−６４、２ｍＭ  ロイペプチン、および１ｍＭ  ペプスタチン；カリフォルニア州のＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社）を添加し、処理過程を通して氷上に置いた。唾液を４℃において１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して不溶性物質、細胞および細片を除去した（Ghafouri et al., 2003）。２ｍｌのサンプルを１２ｍＭ  重炭酸アンモニウム、ｐＨ７．１中でゲルろ過（ＰＤ−１０カラム、ニュージャージー州、ピスカタウェイのアマシャムインターナショナル（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））により脱塩した。溶離液を凍結乾燥し、電気泳動解析まで７０℃で保存した。
【００２９】
（実施例２−ウェスタンブロット解析）
電気泳動試薬をバイオラッドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（カリフォルニア州、リッチモンド）から入手した。唾液全体のタンパク質内容物をＰｉｅｒｃｅ（イリノイ州、ロックフォード）のＢＣＡキットで測定した。
【００３０】
特記がない限り、他の試薬をシグマケミカル社（ミズーリ州、セントルイス）とアルドリッヒ（Ａｌｄｒｉｃｈ）社（イタリア、ミラン）から購入した。
【００３１】
サンプルを溶解緩衝液（１２５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、４％  ドデシル硫酸ナトリウム、２０％  グリセロール、ｐＨ６．８、１０％  β−メルカプトエタノール、および０．００２％  ブロモフェノールブルー）中に直接可溶化させ、ゲルに泳動する前に５分間沸騰させた。３０μｇのタンパク質を含む一定分量をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２％  ポリアクリルアミド）にかけた。タンパク質をＰＶＤＦろ過膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ、マサチューセッツ州、ベッドフォードのミリポア）に移行させ、ＰＢＳ−ＢＳＡ１％で１：５００に希釈した抗ヒトＣＤ１４ポリクローナル抗体（ヤギ由来；イタリア、Ｄ．Ｂ．Ａ．のＵｐｓｔａｔｅ）とインキュベートした。
【００３２】
一晩インキュベートした後、膜をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％で洗浄し、ブロッカーの脱脂粉乳５％（カリフォルニア州のバイオラッド）を含有するＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１：１０００に希釈したペルオキシダーゼ抱合抗ヤギＩｇＧ抗体（マウス由来；アマシャムインターナショナル）に１時間かけた。ＰＶＤＦ膜をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで再度洗浄し、タンパク質を高感度化学発光（アマシャムインターナショナル）により検出した。
【００３３】
分子量標準を全てのゲルに用い、タンパク質のバンド密度をゲルドック濃度計（Ｇｅｌ−Ｄｏｃ  ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）（バイオラッド）で定量化した。
【００３４】
図１は、上記に記載された実験的な試験から決定されるように、ヒトの唾液全体における可溶性ＣＤ１４の発現を示す：Ａは、２０人のＣＦ被験者（サンプル１から２０）および２０人のＣＡ被験者（サンプル２１から４０）から得られた唾液サンプルのウェスタンブロット解析である；Ｂは、被験者１−２０から得られたバンドの濃度測定の定量化を表す。
【００３５】
免疫ブロット解析は、全ＣＦ被験者におけるＣＤ１４の５５ｋＤａの可溶性形態の存在と全ＣＡ被験者からの非存在を示すと観察されうる。
【００３６】
本発明によると、ウェスタンブロット解析におけるｓＣＤ１４の非存在は、齲蝕の発生についての試験にかけた個人の素因のマーカーとして、または進行中の齲蝕の診断マーカーとして考えられてもよく；さらに、齲蝕のない被験者における既定の閾値と比較した唾液サンプルにおける減少したｓＣＤ１４発現の測定が、齲蝕の発生の指標として、または進行中の齲蝕の診断マーカーとして考慮されうる。
【００３７】
このために、ｓＣＤ１４の定量的解析を、好ましくはＥＬＩＳＡアッセイにより実施する。閾値の決定を、健康なＣＦ被験者、好ましくは解析に向いている高齢者の好ましくは統計的解析によって行う。とりわけ、テストの予測では、唾液ｓＣＤ１４の発現の値が既定の閾値の２０％よりも低い時に特に高いと考えられる。
【００３８】
幼児および若年者における齲蝕の開始は、より急速に齲蝕に罹りやすい遺伝学的因子の関与が強く示唆される。ＣＤ１４遺伝子の５’隣接領域における数個の遺伝子多型がより高いレベルの血清型ｓＣＤ１４に関連することから（Baldini et al., 1999; Vercelli et al., 2001）、複数の齲蝕にかかっている若年の患者におけるｓＣＤ１４の唾液発現の減少が特定の遺伝子多型に関連することが予想される。
【００３９】
この事に関して、ｓＣＤ１４の遺伝子多型はＲＦＬＰ−ＰＣＲ技術によって研究されうる。この技術は、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡの特異的な制限酵素による切断から生じた断片より得られた異なる電気泳動パターンの解析に基づいて、単一の変異が入ったヌクレオチド全てを検出することを可能にする。
【００４０】
それゆえ、齲蝕の発生に遺伝子学的に感受性のあるマーカーとしてのＣＤ１４をコードする特定の遺伝子多型に関する研究は、本発明の範囲内である。
【００４１】
（参考文献）
Baldini M, Lohman IC, Halonen M, Erickson RP, Holt PG, Martinez FD (1999). A polymorphism in the 5' flanking region of the CD14 gene is associated with circulating soluble CD14 levels and with total serum immunoglobulin E. Am J Resp Cell Mol Biol 20:976-983.
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Vercelli D, Baldini M, Stern D, Lohman IC, Halonen M, Martinez F (2001). CD14: a bridge between innate immunity and adaptive IgE responses. J Endotoxin Res 7:45-48.
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、上記に記載された実験的な試験から決定されるように、ヒトの唾液全体における可溶性ＣＤ１４の発現を示す：Ａは、２０人のＣＦ被験者（サンプル１から２０）および２０人のＣＡ被験者（サンプル２１から４０）から得られた唾液サンプルのウェスタンブロット解析である；Ｂは、被験者１−２０から得られたバンドの濃度測定の定量化を表す。
【図１】
2009501335.tif 000002
【国際調査報告】
2009501335.tif 000003
2009501335.tif 000004