(57)【要約】  本発明は、次式（Ｉ）及びその対応エノール形のＩｇＧ選択的吸着用クロマトグラフィー用吸着剤に関する。【化１】2009500604.tif 000011式中、ＸはＯ、Ｓ又はＮＨを表し、Ｒ１はＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル、Ａｒ、−Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ３、−Ｃ(Ｏ)−Ｒ３又はハロを表し、Ｒ２はＨ、Ｃ１−３アルキル又はハロを表し、Ｒ３はＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル又はＡｒを表し、ｎは０、１、２又は３を表し、Ｙは担体を表す。本発明はまた、前記吸着剤の製造方法並びにアフィニティクロマトグラフィーによって物質を分離するためのその使用にも関する。【選択図】    図１
2009500604.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式及びその対応エノール形のＩｇＧ選択的吸着用クロマトグラフィー用吸着剤。
【化１】
2009500604.tif 000009
（式中、
ＸはＯ、Ｓ又はＮＨを表し、
Ｒ１はＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル、Ａｒ、−Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ３、−Ｃ(Ｏ)−Ｒ３又はハロを表し、
Ｒ２はＨ、Ｃ１−３アルキル又はハロを表し、
Ｒ３はＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル又はＡｒを表し、
ｎは０、１、２又は３を表し、
Ｙは担体を表し、
Ａｒは、−ＯＨ、シアノ、ハロ、ニトロ、Ｃ１−６アルキル及びアルコキシから選択される１以上の置換基で任意に置換されたＣ６−１０アリール基を表す。）
【請求項２】
担体Ｙが、セルロース、デンプン、デキストラン、寒天、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリ（メタ）アクリレート、ポリビニル親水性ポリマー、ポリスチレン、ポリスルホン、シリカ、アルミナ、チタニア酸化物、ジルコニア酸化物、多糖−合成ポリマー、多糖−無機質構造体及び合成ポリマー−無機質構造体から選択される、請求項１記載の吸着剤。
【請求項３】
Ｒ１がＨを表し、ｎが０を表し、ＸがＮＨを表し、Ｙがアガロースを表す、請求項１又は請求項２記載の吸着剤。
【請求項４】
ＸとＹとの間にスペーサー分子を含む、請求項３又は請求項４記載の吸着剤。
【請求項５】
Ｒ１がＨを表し、ｎが０を表し、ＸがＮＨを表し、ＹがＨＰ−セファロースを表し、スペーサー分子としてヘキサメチレンジアミンを含む、請求項３又は請求項４記載の吸着剤。
【請求項６】
担体材料Ｙが、ビーズ、不規則形状粒子、繊維、膜、平形構造体又は多孔質無機材料の形態を有する、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の吸着剤。
【請求項７】
請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載のクロマトグラフィー用吸着剤の製造方法であって、
ａ）クロマトグラフィー用担体材料Ｙを用意する段階、並びに
ｂ）前記担体材料の表面上にリガンドを結合して、次式及びその対応エノール形の吸着剤を製造する段階
を含んでなる方法。
【化２】
2009500604.tif 000010
（式中、
ＸはＯ、Ｓ又はＮＨを表し、
Ｒ１はＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル、Ａｒ、−Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ３、−Ｃ(Ｏ)−Ｒ３又はハロを表し、
Ｒ２はＨ、Ｃ１−３アルキル又はハロを表し、
Ｒ３はＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル又はＡｒを表し、
ｎは０、１、２又は３を表し、
Ｙは担体を表し、
Ａｒは、−ＯＨ、シアノ、ハロ、ニトロ、Ｃ１−６アルキル及びアルコキシから選択される１以上の置換基で任意に置換されたＣ６−１０アリール基を表す。）
【請求項８】
担体Ｙがアミン含有マトリックスである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
担体Ｙが、ヘキサメチレンジアミンで延長したエピクロロヒドリン活性化ＨＰ−セファロースである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
アフィニティクロマトグラフィーによって物質を分離するための、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の吸着剤の使用。
【請求項１１】
ＩｇＧ、そのフラグメント、及び／又はＩｇＧ若しくはそのフラグメントを含む複合体を分離するための、請求項１０記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子のクロマトグラフィー分離の分野内にある。さらに詳しくは、本発明は、ＩｇＧを選択的に吸着する新規リガンドを含むクロマトグラフィー用吸着剤並びに前記クロマトグラフィー用吸着剤の製造方法及びアフィニティクロマトグラフィー用としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体技術の発展は、科学及び医学を研究、診断及び治療に役立てるための多くの機会を与えた。モノクローナル抗体は、例えば、インビトロ及びインビボ診断並びにヒトの疾患の免疫療法に使用されている。現在、開発中にある生物工学由来の薬物の多くの部分はＧ型のモノクローナル抗体に基づいている。
【０００３】
通常、ＩｇＧは標準的な技法に従って細胞発現系で大量に製造される。最も広く使用されている製造方法はクロマトグラフィーによる精製を含んでいる。クロマトグラフィーは、その融通性及び化合物に対する感度の点から見て、生体分子に関して好ましい精製方法である。
【０００４】
アフィニティクロマトグラフィーの分野では、細菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのＩｇＧ結合性細胞壁タンパク質であるプロテインＡ及びリガンドとしてのその使用に関する様々な特許及び特許出願が存在している。例えば、ＰＣＴ／ＳＥ８３／００２９７号（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）は、親和性リガンドとしての以後の使用のために分離マトリックスへの結合性を向上させるため、プロテインＡ分子にシステイン残基を付加した組換え形のプロテインＡを開示している。さらに、（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．に譲渡された）米国特許第６１９７９２７号は、野生型Ｚドメインと同等のＩｇＧ結合能力を有しながら顕著に減少したサイズを有するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓプロテインＡのＺドメイン変異体を開示している。しかし、プロテインＡはプロテアーゼ感受性であることが証明されている。加えて、プロテインＡに基づく親和性リガンドは酸性及び塩基性条件下で不安定であることも知られている。これは、精製プロセス中にリガンドの望ましくない漏出をもたらし、生成物を汚染すると共に精製装置の品質を損なうことがある。
【０００５】
先行技術の中には、ＩｇＧに対する親和性をもった小分子リガンドを記載するいくつかの特許出願が存在している。
【０００６】
国際公開第２００４／０３９７６５号（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）は、フェニル尿素スカフォールドに基づく小分子を、κ型軽鎖を有するＩｇＧ及びＦａｂフラグメントのためのクロマトグラフィー用親和性リガンドとして使用することを記載している。
【０００７】
（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．に譲渡された）米国特許第６６１０６３０号は、固体担体に結合した２−メルカプトイミダゾール及びその誘導体をＩｇＧの選択的吸着用の擬似バイオアフィニティクロマトグラフィー媒体として使用することを記載している。
【０００８】
（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓに譲渡された）米国特許第６１１７９９６号は、トリアジンに基づく構造の製造及び各種タンパク質系物質の精製におけるその使用を記載している。
【０００９】
米国特許出願公開第２００３／０１６６００２号（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ）は、樹脂への結合に適したリンカーを有するトリアジン構造に基づく活性化合物の合成及び選択を記載している。
【００１０】
欧州特許第１５００４３１号（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＵＫ，Ｌｔｄ、英国）は、固体担体と、２−アミノベンゾイミダゾール及び２−アミノメチルベンゾイミダゾールから選択されかつ固体担体に結合された１種以上のアフィニティクロマトグラフィー用リガンドとを含んでなる媒体に関する。この発明の親和性リガンドはＩｇＧ精製のために使用される。
【００１１】
ＩｇＧ結合用のプロテインＡ代替物が現存しているにもかかわらず、さらに有利な性質の新規ＩｇＧ結合リガンドに対するニーズが今なお存在している。かかる新規リガンドは、上述の欠点を回避すると共に、好ましくはこれまで提唱されたリガンドより好ましい結合特性を有するべきである。
【特許文献１】国際公開第８４／００７７３号パンフレット
【特許文献２】米国特許第６１９７９２７号明細書
【特許文献３】国際公開第２００４／０３９７６５号パンフレット
【特許文献４】米国特許第６６１０６３０号明細書
【特許文献５】米国特許第６１１７９９６号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００３／０１６６００２号明細書
【特許文献７】欧州特許第１５００４３１号明細書
【特許文献８】欧州特許第０２９５０７３号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２００３／０１８７２２７号明細書
【特許文献１０】国際公開第９７／１０８８７号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第２００４／０３５１９９号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第２００４／０５２８７０号パンフレット
【非特許文献１】SU FERN TENG ET AL, "Affinity chromatography on immobilized "biomimetic" ligands Synthesis, immobilization and chromatographic assessment of an immunoglobulin G-binding ligand", Journal of Chromatography B, 2000, vol.740, page 1-page 15
【発明の開示】
【００１２】
本発明者らは、クロマトグラフィー用樹脂に結合した場合にＩｇＧの包括的結合性を有する、プリン関連構造に基づく小さい有機分子を発見した。これは、ＩｇＧ精製プロセスで親和性リガンドとして使用できる。
【００１３】
第１の態様では、本発明は、次式及びその対応エノール形のＩｇＧ選択的吸着用クロマトグラフィー用吸着剤に関する。
【００１４】
【化１】
2009500604.tif 000003
式中、
ＸはＯ、Ｓ又はＮＨを表し、
Ｒ１はＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル、Ａｒ、−Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ３、−Ｃ(Ｏ)−Ｒ３又はハロを表し、
Ｒ２はＨ、Ｃ１−３アルキル又はハロを表し、
Ｒ３はＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル又はＡｒを表し、
ｎは０、１、２又は３を表し、
Ｙは担体を表し、
Ａｒは、−ＯＨ、シアノ、ハロ、ニトロ、Ｃ１−６アルキル及びアルコキシから選択される１以上の置換基で任意に置換されたＣ６−１０アリール基を表す。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、「ハロ」という用語はフルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを包含する。
【００１６】
特記しない限り、本明細書中に記載されるアルキル基並びにアルコキシ及びアルコキシアルキルのアルキル部分は、直鎖状であり得るか、或いは十分な数（即ち、最小３つの）炭素原子が存在する場合には枝分れ鎖状及び／又は環状であり得る。さらに、十分な数（即ち、最小４つの）炭素原子が存在する場合、かかる基は部分環状／非環状であり得る。かかるアルキル基並びにアルコキシ及びアルコキシアルキル基のアルキル部分は、飽和状態であり得るか、或いは十分な数（即ち、最小２つの）炭素原子が存在する場合には不飽和状態であり得る。特記しない限り、かかる基は１以上のハロ原子（特にフルオロ原子）で置換されていてもよい。
【００１７】
疑いを避けるために述べれば、アルコキシ基はその基中の酸素原子を介して分子の残部部に結合している。
【００１８】
ついでながら、本発明の化合物は互変異性を示し得る。すべての互変異性体及びその混合物が本発明の技術的範囲内に含まれる。上記式中、担体Ｙはセルロース、デンプン、デキストラン、寒天、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリ（メタ）アクリレート、ポリビニル親水性ポリマー、ポリスチレン、ポリスルホン、シリカ、アルミナ、チタニア酸化物、ジルコニア酸化物、多糖−合成ポリマー、多糖−無機質構造体及び合成ポリマー−無機質構造体から選択される。
【００１９】
本発明に係る好ましい実施形態では、上記式中、Ｒ１はＨを表し、ｎは０を表し、ＸはＮＨを表し、Ｙはアガロースを表す。
【００２０】
任意には、上記式中、ヘキサメチレンジアミン又はアミノカプロン酸のようなスペーサー分子がＸとＹとの間に位置している。
【００２１】
さらに別の好ましい実施形態では、Ｒ１はＨを表し、ｎは０を表し、ＸはＮＨを表し、ＹはＨＰ−セファロースを表し、スペーサー分子（存在する場合）はヘキサメチレンジアミンである。
【００２２】
担体材料Ｙは任意形状のクロマトグラフィー用担体材料であり、ビーズ、不規則形状粒子、繊維、膜、平形構造体又は多孔質無機材料の形態を有し得る。
【００２３】
第２の態様では、本発明は、上述のクロマトグラフィー用吸着剤の製造方法であって、
ａ）クロマトグラフィー用担体材料Ｙを用意する段階、並びに
ｂ）前記担体材料の表面上にリガンドを結合して、次式及びその対応エノール形の吸着剤を製造する段階
を含んでなる方法に関する。
【００２４】
【化２】
2009500604.tif 000004
式中、
ＸはＯ、Ｓ又はＮＨを表し、
Ｒ１はＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル、Ａｒ、−Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ３、−Ｃ(Ｏ)−Ｒ３又はハロを表し、
Ｒ２はＨ、Ｃ１−３アルキル又はハロを表し、
Ｒ３はＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル又はＡｒを表し、
ｎは０、１、２又は３を表し、
Ｙは担体を表し、
Ａｒは、−ＯＨ、シアノ、ハロ、ニトロ、Ｃ１−６アルキル及びアルコキシから選択される１以上の置換基で任意に置換されたＣ６−１０アリール基を表す。
【００２５】
担体Ｙは、Ｘ＝ＮＨ２又はＳＨ或いはＯＨで置換されている。好ましくは、担体Ｙはアミン含有マトリックスである。担体はまた、チオール含有マトリックス又はヒドロキシル含有マトリックスであり得る。
【００２６】
さらに好ましくは、担体Ｙはヘキサメチレンジアミンで延長したエピクロロヒドリン活性化ＨＰ−セファロースである。
【００２７】
第３の態様では、本発明は、アフィニティクロマトグラフィーによって物質を分離するための上述の吸着剤の使用に関する。好ましい使用は、ＩｇＧ、そのフラグメント、及び／又はＩｇＧ若しくはそのフラグメントを含む複合体を分離するためのものである。ＩｇＧは、モノクローナルＩｇＧ、ポリクローナルＩｇＧ、或いは組換えＩｇＧ又はそのフラグメントであり得る。複合体は、免疫複合体或いはＩｇＧを含む融合タンパク質であり得る。吸着剤は、すべてのＩｇＧサブクラス及びそのフラグメントに対して使用できる。分離されたＩｇＧは治療、診断、研究及び開発目的のために使用でき、或いは例えばクロマトグラフィーにおける親和性ハンドルとして使用できる。
【００２８】
イン・シリコ技法を使用して、ＩｇＧのＦｃ部分上における適当な保存された包括的結合クレフトを同定した。その後、このクレフトに対する可能な結合剤を同定するため、商業的に入手可能な物質のバーチャルスクリーニングを行った。可能な結合構造を序列化し、ＳＴＤ−ＮＭＲ及び表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）分析に基づくインビトロ方法によって結合性及び選択性を試験した。この方法により、興味深いクロマトグラフィー特性を示す１つの構造が同定された。同定された結合構造をクロマトグラフィー用樹脂に結合し、ＩｇＧに対する結合性を評価した。かかるリガンドはＩｇＧに対する包括的結合を示すことが判明した。
【００２９】
ＩｇＧの包括的結合とは、すべてのＩｇＧサブクラス（即ち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）の結合を意味する。
【００３０】
図面の簡単な説明
図１は、本発明に係る吸着剤上における注入ポリクローナル抗体の溶出タンパク質プロフィルを示している。点線は溶出液のｐＨを表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、イン・シリコ及び湿式実験に関連して本発明をさらに詳しく説明する。
【００３２】
適当なＩｇＧ結合部位の同定
コード１ｄｎ２（Ｄｅｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．２０００）を有するプロテイン・データ・バンク（ｐｄｂ）構造を用いる分子モデル化技術でタンパク質表面のスクリーニングを行うことにより、ヒトＩｇＧのＦｃフラグメント上のクレフトを小さい有機分子に対する推定標的ドッキング部位として同定した。
【００３３】
対称的関係の分子間の界面にある深いクレフトから生じる２つの対称的関係のチャンネルを同定した。これらのクレフトはどちらかと言えば親水性であって、その表面上に極性基を含んでいる。２つの対称的関係のクレフトの各々をバーチャルスクリーニング用の（同等な）部位として使用できる。同定された部位は、ヒト由来のＩｇＧファミリーの構成員の間で実質的に保存されていた。
【００３４】
ドッキングシミュレーション
バーチャルスクリーニング用のデータベースからの化合物を同定されたクレフトにドッキングし、推定結合剤として同定される全部で１１９種の化合物を得た。ドッキングシミュレーション用として使用したタンパク質構造は、優れた分解能のため、Ｚ３４Ｃ（ｐｄｂコード１１６ｘ、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．２０００）と複合したＦｃの１．６５Å構造であった。結晶学的対称性から、プログラムＯ（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９１）を用いて二量体を生成した。各分子に関し、最良ランクのコンフォメーション及びそのＦｌｅｘＸ（Ｒａｒｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）スコアを保存した。
【００３５】
ドッキングされた分子（リガンド分子）の選択
−２０ＫＪ／ｍｏｌより陰性の推定結合自由エネルギーをもったドッキングコンフォメーションを生じるすべての化合物を、疎水性、水素結合パターン、電荷及びコンフォメーションの点から、クレフトの表面に対する相補性に関して目視検査した。加えて、剛性は利点と見なす一方、短い接点及びひずみのある形状は欠点と見なした。
【００３６】
ＮＭＲ及びＳＰＲによる可能なリガンドのスクリーニング
バーチャルスクリーニングから、同定されたクレフトに対する可能な結合剤として１１６の化合物が提案された。（仮定された安定性、反応性及び入手可能性に基づいて）さらに手作業で選択した後、化合物を試験のために序列化した。結局、６９の化合物が得られ、スクリーニング手順に入る前に個別の内部識別番号が割り当てられた。
【００３７】
スクリーニング手順は、飽和差移動ＮＭＲ（ＳＴＤ  ＮＭＲ）法及び表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）法に頼る２つの独立した溶液分析技法を用いるインビトロスクリーニングに基づいていた。
【００３８】
ＮＭＲスクリーニングでは、２種のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）及び商業的に入手し得るＦｃフラグメントに対する親和性に関して６９の物質を試験した。α−アミラーゼに対する親和性を試験することで非特異的なタンパク質結合を検討した。３種のＩｇＧ関連タンパク質のすべてに対して親和性を有するがα−アミラーゼに対しては親和性を有しないことが判明した化合物を、ＩｇＧのＦｃ部に対する親和性リガンド用の可能な候補品と見なした。
【００３９】
ＳＰＲスクリーニングでは、モノクローナル抗体及び商業的に入手し得るＦｃフラグメントに対する親和性に関して５３の化合物を試験した（不溶性の物質は除外した）。分析データを分子量の差について補正し、理論最大応答に対する百分率として示した。
【００４０】
さらなる検討のための可能な候補品を選択するため、Ｆｃフラグメント及びＩｇＧの両方について１０％を超える応答を示すすべての物質が可能な候補品として選択されるようにＳＰＲデータを整理した。これらの化合物を、ＮＭＲスクリーニングで表されたものと比較した。ＳＰＲで導かれたヒット品の大部分は、ＮＭＲスクリーニングではα−アミラーゼに対する非特異結合のために排除されたことがわかった。両方法により、１つの化合物（即ち、下記の化合物Ｉ）が可能な親和性リガンド候補品として選択された。
【００４１】
【化３】
2009500604.tif 000005
親和性リガンド候補品を最適化するため、化合物Ｉを取り巻く追加の構造（商業的に入手可能な化合物）を溶液状態で検討した。これらの化合物を、上述したような対応するＳＰＲ及びＮＭＲ分析に付した。しかし今回は、ＮＭＲスクリーニングではＦｃフラグメントのみを使用したのに対し、ＳＰＲ分析は最初の選択と同じ試験タンパク質を用いて行った。
【００４２】
選択される構造は、ＮＭＲで陽性であると共に、ＳＰＲで表されるようにＩｇＧに対する親和性に関して高いランキングを有し、かつＦｃフラグメントに対する親和性に関して少なくとも中位のランキングを有するべきである。ＨＳＡに対して非特異結合を示す化合物は除外した。このような選択は、最終候補品（即ち、化合物II）で実現した。この化合物は、（エステル保護された）カルボン酸官能基を介して直接の化学的結合を許す可能性も有していた。
【００４３】
【化４】
2009500604.tif 000006
ライブラリからのヒット化合物（リガンドII）はケト形である。溶液状態でスクリーニングされかつゲルに結合されたリガンドは、ケト形とエノール形との間の平衡状態で存在する。
【００４４】
ケト形とエノール形との関係は、溶媒、濃度及び温度のような幾つかのパラメーターで左右される。すべての互変異性体及びその混合物が本発明の技術的範囲内に含まれる。
【００４５】
【化５】
2009500604.tif 000007
クロマトグラフィー用吸着剤の製造
次に本発明の吸着剤の製造を説明するが、この記載は例示的であって限定的でない。結合試薬及び担体の選択は広範囲にわたって変化し得るが、当業者には公知である。
【００４６】
クロマトグラフィーマトリックス（担体）に対する選択されたリガンド（化合物II）の結合
同定された候補化合物IIは商業的に入手可能であり、結合用として使用した。Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、酸塩化物形成試薬又はこれらの組合せのような任意の常用アミド形成試薬を使用しながら、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン又は炭酸カリウムのような適当な塩基の存在下で化合物IIをそのカルボン酸官能基を介してアミン含有マトリックス又は担体に結合した。使用した担体は、ヘキサメチレンジアミンで延長したエピクロロヒドリン活性化ＨＰ−セファロースビーズであった。かかる結合は化合物IIのエステル官能基をアミド官能基に変換したが、これは溶液状態で試験されたエステル官能基に比べて最小限の立体的及び電子的変化しか生じないはずである。
【００４７】
【化６】
2009500604.tif 000008
吸着剤Ａは、吸着剤Ａの上記平衡式に記載されるように、ケト形又はエノール形或いはケト形とエノール形との混合物からなる。
【００４８】
結合の成果は、標準的なＭＡＳ  ＮＭＲ法を用いて７μｍｏｌ／ｍＬと測定された。
【００４９】
吸着剤Ａを用いたクロマトグラフィー
０．５ｍＬの吸着剤ＡをＴｒｉｃｏｒｎ５／２０カラムに充填し、０．１Ｍ酢酸塩，０．１３７Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ５．０で平衡させた。
【００５０】
０．１Ｍ酢酸塩，０．１３７Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ５．０を結合緩衝液として使用しながら、ポリクローナルＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ）（緩衝液１ｍｌ中に１ｍｇ）を吸着剤Ａカラムに注入した。
【００５１】
図１中で１ｍｌの位置にあるピークは、カラムをバイパスした注入タンパク質を表している。ポリクローナルＩｇＧの包括的結合が認められた。ＰＢＳ，ｐＨ７．４により、１８ｍＬの位置で５６〜６５％のポリクローナルＩｇＧを溶出した。回収率は、捕集した画分中のタンパク質濃度を計算し、溶出ピーク面積及びバイパスピーク面積を積分してその比を計算することで求めた。結合タンパク質の残りは、ＣＩＰ中に、２３ｍｌの位置で鋭いピークとして放出された。点線は溶出液のｐＨを示している。
【００５２】
別の緩衝液系（０．１Ｍ  ＨＡｃ，５０ｍＭリン酸塩，ｐＨ５．０）では、動的結合体積は２４ｍｇ／ｍＬと測定された。
【００５３】
図１の結果は、本発明の吸着剤がＩｇＧの包括的結合のために使用できることを示している。
【００５４】
参考文献
DeLano, W. L., Ultsch, M. H., De Vos, A. M., Wells, J. A.: Convergent Solutions to Binding at a Protein-Protein Interface Science 287 pp. 1279 (2000)
Idusogie, E. E., Presta, L. G., Santoro-Gazzano, H., Totpal, K., Wong, P. Y., Ultsch, M., Meng, Y. G., Mullkerrin, M. G.: Mapping of the C1Q Binding Site on Rituxan, a Chimeric Antibody with a Human Igg1 Fc J.Immunol. 164 pp. 4178 (2000)
Jones TA, Zou JY, and Cowan SW. 1991. Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these methods. Acta Crystallogr. A 47: 110-119.
Rarey M, Kramer B. Lengauer T and Kleve G. 1996. a fst flexible docking method using an incremental construction algotithm. J. Mol. Biol. 261: 470-489
Carredano E, Baumann H, Gronberg A, Norrman N, Glad G, Zou J-Y, Ersoy O, Steensma E, Axen A. 2004. A novel and conserved pocket of human -Fab fragments: Design, synthesis, and verification of directed affinity ligands. Protein. Sci. 13 (6):1476-1488.
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明に係る吸着剤上における注入ポリクローナル抗体の溶出タンパク質プロフィルを示している。点線は溶出液のｐＨを表す。
【図１】
2009500604.tif 000012
【国際調査報告】
2009500604.tif 000013
2009500604.tif 000014
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