(57)【要約】  グルココルチコイド誘導性胃酸分泌を変化させる方法であって、血清グルココルチコイド誘導性キナーゼ(SGK)を発現する細胞と、前記グルココルチコイド誘導性キナーゼを調節する物質とを接触させることを含む、前記方法。更に、本発明は、診断及び、病理学的胃酸分泌の治療に潜在的に有効であるアゴニスト、アンタゴニストであり得る化合物の同定に関する。【選択図】図１
2009531020.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃酸分泌阻害に適した血清グルココルチコイド誘導性キナーゼ(SGK)の阻害因子をスクリーニングする方法であって:
(i)事前活性化リン酸化S組換えGKタンパク質を提供する工程、
(ii)SGK基質ポリペプチドをATPと共に提供する工程、
(iii)グルココルチコイド誘導性キナーゼの阻害因子を提供する工程、及び
(iv)基質のリン酸化を測定することによりSGK活性を評価する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
SGKタンパク質が、SGK1、SGK2およびSGK3からなる群より選ばれる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
SGK1、SGK2又はSGK3が、選ばれた単一ヌクレオチド多型変種である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
SGK阻害因子が、下記一般式:
2009531020.tif 000005
(式中、R1、R5は、H、OH、OA、OAc又はメチルであり、
R2、R3、R4、R6、R7、R8、R9、R10は、H、OH、OA、OAc、OCF3、Hal、NO2、CF3、A、CN、OSO2CH3、SO2CH3、NH2又はCOOHであり、
R11は、H又はCH3であり、
Aは、C原子1、2、3又は4個を有するアルキルであり、
Xは、CH2、CH2CH2、OCH2又は-CH(OH)-であり、
Halは、F、Cl、Br又はIである。)
を有する化合物又はその医薬的に有効な誘導体、塩、溶液又は立体異性体、又はそれらの混合物である、請求項1-3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
SGK阻害因子が、以下の化合物群:
(3-ヒドロキシフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ヒドロキシフェニル)-酸性酸-[1-(4-ヒドロキシ-2-メトキシフェニル)エチリデン]ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
フェニル酸性酸-(3-フルオル-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(4-ヒドロキシフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3,4-ジクロルフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
m-トリル-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
o-トリル-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(2-クロルフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-クロルフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(4-フルオルフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(2-クロル-4-フルオルフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-フルオルフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2,6-ジメチルベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酸性酸-(3-フルオル-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酸性酸-[1-(4-ヒドロキシ-2-メトキシフェニル)エチリデン]ヒドラジド、
(3-メチルスルホニルオキシフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3,5-ジヒドロキシフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-フルオルフェニル)-酸性酸-(3-フルオル-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酸性酸-(4-アセトキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-トリフルオロメチルフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
3-(3-メトキシフェニル)-プロピオン酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酸性酸-(2,4-ジヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェノキシ)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ニトロフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酸性酸-(5-クロル-2-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酸性酸-(2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジリデン)ヒドラジド、
2-ヒドロキシ-2-フェニル-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酸性酸-(2-エトキシ-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ブロムフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酸性酸-[1-(4-ヒドロキシフェニル)エチリデン]ヒドラジド、
(3,5-ジフルオルフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ヒドロキシフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メチルベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ヒドロキシフェニル)-酸性酸-(2-エトキシ-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ヒドロキシフェニル)-酸性酸(2-メトキシ-4-ヒドロキシ-6-メチルベンジリデン)ヒドラジド、
(2-フルオルフェニル)-酸性酸-(2-メトキシ-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド
より選ばれる、請求項5に記載の方法。
【請求項６】
SGK阻害因子が、下記一般式:
2009531020.tif 000006
(式中、R1、R2、R3、R4、R5は、H、A、OH、OA、アルケニル、アルキニル、NO2、NH2、NHA、NA2、Hal、CN、COOH、COOA、-OHet、-O-アルキレン-Het、-O-アルキレン-NR8R9又はCONR8R9、R1、R2、R3、R4、R5より選ばれる二つの基、又は-O-CH2-CH2-、-O-CH2-O-又は-O-CH2-CH2-O-であり、
R6、R7は、H、A、Hal、OH、OA又はCNであり、
R8、R9は、H又はAであり、
Hetは、一つ以上のHal、A、OA、COOA、CN又はカルボニル酸素(=O)によって置換された、N-、O-及び/又はS-原子1〜4個を有する飽和又は不飽和素環であり、
Aは、C原子1〜10個を有するアルキルであり、H原子1-7個は、F及び/又は塩素によって置換されてもよく、
X、X'は、NHであるか又は存在せず、
Halは、F、Cl、Br又はIである。)
を有する化合物又はその医薬的に有効な誘導体、塩、溶液又は立体異性体、又はそれらの混合物である、請求項1-3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
SGK阻害因子が、以下の化合物群:
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(2-フルオル-5-トリフルオルメチルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(4-クロル-5-トリフルオルメチルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(2,4-ジフルオルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(2,6-ジフルオルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(3-フルオル-5-トリフルオルメチルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(4-フルオル-5-トリフルオルメチルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(4-メチル-5-トリフルオルメチルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(2,3,4,5,6-ペンタフルオルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(2,4-ジブロム-6-フルオルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(2-フルオル-6-トリフルオルメチルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(2-フルオル-5-メチルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(2,3,4-トリフルオルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(4-ブロム-2,6-ジフルオルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(2-フルオル-3-トリフルオルメチル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[2-(1-tert-ブチルオキシカルボニルピペリジン-4-イル)フェニル]尿素、
N-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-2,4-ジクロルベンズアミド、
N-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-4-クロル-5-トリフルオルメチルベンズアミド、
N-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-2-フルオル-5-トリフルオルメチルベンズアミド、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[3-クロル-5-トリフルオルメチル-2-(ピペリジン-4-イルオキシ)フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[(2-フルオル-5-(2-ジメチルアミノエトキシ)フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[5-フルオル-2-(ピペリジン-4-イルオキシ)フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[4-クロル-5-トリフルオルメチル-2-(ピペリジン-4-イルオキシ)フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[2-(ピペリジン-4-イルオキシ)フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[2-フルオル-5-(2-ジエチルアミノエトキシ)フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[2-フルオル-5-[2-(ピペリジン-1-イル)エトキシ]フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[4-フルオル-2-(2-ジメチルアミノエトキシ)フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[4-フルオル-2-(2-ジエチルアミノエトキシ)フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[3-クロル-4-[2-(モルホリン-4-イル)エトキシ]フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[4-フルオル-2-[2-(モルホリン-4-イル)エトキシ]フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[3-クロル-4-(2-ジメチルアミノエトキシ)フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[3-クロル-4-(2-ジエチルアミノエトキシ)フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[4-クロル-2-(2-ジメチルアミノエトキシ)フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[2-クロル-5-(2-ジエチルアミノエトキシ)フェニル]尿素
より選ばれる、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
単離されたヒト組織試料及び検体においてSGK1、SGK2又はSGK3のアップレギュレートされた発現と活性を測定することによって胃酸分泌誘発性疾患疾患の進行、退行又は発症を決定する方法。
【請求項９】
SGK1、SGK2又はSGK3が、選ばれた単一ヌクレオチド多型変種である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
疾患診断のための請求項9に記載の方法であって、前記疾患が消化性潰瘍である、前記方法。
【請求項１１】
SGK1、SGK2又はSGK3が選ばれた単一ヌクレオチド多型変種である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
SGK1、SGK2又はSGK3の阻害用薬剤の製造のための請求項4-7のいずれか1項に記載の化合物の使用。
【請求項１３】
血清グルココルチコイド誘導胃酸分泌によって引き起こされた疾患の治療用薬剤の製造のための請求項12に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
胃酸は、胃における壁細胞によって生成される。壁細胞は、胃酸が胃内腔に分泌される広範囲な分泌のネットワークを有する。これらの細胞は、胃の粘膜における上皮胃底腺の一部である。胃酸のpHは、胃内腔において2-3であり、酸性は、プロトンポンプのH+/K+ ATPアーゼによって維持されている。
通常、胃と小腸の内層は、胃において生成される刺激性の酸に対して保護されている。種々の理由のために、保護のメカニズムが不完全になることがあり、内層の損傷につながる。これにより、炎症(胃炎)又は潰瘍が生じる。潰瘍は、炎症性、感染性、又は悪性の条件によって引き起こされる胃の皮膚又は粘膜又は小腸の上部にクレーター状の病巣を生じる。
消化性潰瘍疾患は、胃遠位部又は十二指腸近位部における酸生成ゾーンの粘膜潰瘍である。正常な胃は、充分な粘液とアルカリ性分泌液を生成して、胃と十二指腸の粘膜をHClから保護する。十二指腸において、膵臓の重炭酸塩が粘膜の管腔膜でpH7.5を生じさせる。
消化性潰瘍疾患を誘発し得る危険因子は、ASA、NSAID、皮質ホルモンのような薬剤、高レベルのCa2+が胃酸分泌を促進する副甲状腺機能亢進症、膵臓のガストリン産生腫瘍及び胃のヘリコバクターピロリ感染である。他の寄与因子は、主細胞からペプシノーゲンの増加、壁細胞量の増加、幽門部のD細胞からソマトスタチン分泌の減少、及び粘膜の損傷である。アセチルサリチル酸やステロイド系又は非ステロイド系抗炎症剤は、プロスタグランジンのための胃粘膜を減少させ、粘膜損傷につながる。
遺伝因子が考慮されなければならない。例えば、唾液や胃液に血液型0抗原を分泌しない人は、十二指腸潰瘍を生じるリスクが増加する。
診断には、異常を調べるために、胃と十二指腸の胃鏡検査法が必要となることがある。H.ピロリ菌の細菌と炎症性係数を検査するために組織試料を得ることができる。
潰瘍の治療は、細菌を死滅させ、酸のレベルを低下させ、且つ胃腸管を保護する薬剤の併用をしばしば含む。薬剤は、以下の一つ以上を含むのがよい: シメチジン、ニザチジン、ラニチジン、又はファモチジンのような酸遮断薬。オメプラゾールのようなプロトンポンプインヒビター又はスクラルフェートのような組織内層を保護する薬剤。ビスマスは、内層を保護し細菌を死滅させ、更に、クラリスロマイシンのような抗生物質は、ピロリ菌を死滅させるために用いられる。
プロスタグランジンE1類似体、例えば、ミソプロストールは、壁細胞や他の所において第二メッセンジャー、cAMPの非特異的阻害によって胃酸分泌を阻害し、それによって、潰瘍治癒が促進される。
【０００２】
胃酸分泌の阻害によって作用する全ての治療手順は、共通の欠点を有する。胃酸分泌が減少する限りにおいて、幽門部のG細胞からのガストリン放出の阻害は起こらない。従って、血液ガストリンが増加し、患者の治療の間、この濃度は絶えず増加する。高ガストリンレベルは、酸生産に対して期待される効果を妨げる。ガストリンは胃粘膜のための栄養性ホルモンであるので、酸抑制による長期間治療により粘膜肥大が生じ、酸生産も細胞修飾も更に増大することになる。このような複雑性は、おそらくほとんどの治療手順のむしろ高い潰瘍再発率に関連しているのであろう。胃酸の平衡異常を妨害する手段としてSGK阻害を用いる本発明において、消化性潰瘍疾患の原因を排除するための新たな合理的な戦略を提供する。
グルココルチコイドは、胃潰瘍の発症[Ahamed et al., 1983; Zamora et al., 1975]、高H+分泌 [Cooke et al., 1966; Raptis et al., 1976]及びプロスタグランジン放出のような防衛機序障害[Bandyopadhyay et al., 1999; Nobuhara et al., 1985] によるとみなされる作用を支持することが周知である。しかしながら、酸分泌にグルココルチコイド受容体の刺激を関連づける機序は不明である。
【０００３】
グルココルチコイド作用に関与するシグナル伝達分子には、血清グルココルチコイド誘導性キナーゼSGK1が含まれ、これは胃の組織において高度に発現される[Waldegger et al., 1997]。SGK1は、種々の輸送タンパク質を調節することがわかった[Lang et al., 2003]。アフリカツメガエル卵母細胞におけるSGK1の共発現は、上皮Na+チャネルENaC [Alvarez de la Rosa et al., 1999; Boehmer et al., 2000; Chen et al., 1999; Faletti et al., 2002; Lang et al., 2000; Naray-Fejes-Toth et al., 1999; Pearce 2003; Verrey et al., 2003; Wagner et al., 2001; Wang et al., 2001]、腎の髄質外部K+チャネルROMK1 [Palmada et al., 2003b; Palmada et al., 2003a; Yun et al., 2002b]、電位依存性Na+チャネルSCN5A [Boehmer et al., 2003c]、電位依存性K+チャネル複合体KCNE1/KCNQ1 [Embark et al., 2003]、及び電位依存性K+チャネルKv1.2、Kv1.3、Kv1.4及びKv1.5 [Gamper et al., 2002b; Gamper et al., 2002a; Henke et al., 2004; Waerntges et al., 2002]をアップレギュレートする。チャネルに加えて、SGK1は、Na+/H+交換体NHE3 [Yun et al., 2002a; Yun 2003]、グルタミン輸送体SN1 [Boehmer et al., 2003b]、グルタミン酸輸送体EAAT1 [Boehmer et al., 2003a]、腎臓と腸のグルコース輸送体SGLT1 [Dieter et al., 2004]及びNa+/K+-ATPアーゼ[Henke et al., 2002; Setiawan et al., 2002; Verrey et al., 2003; Zecevic et al., 2004]を調節する。
一般的な(〜5%の率)SGK1遺伝子変種は、高血圧と体重増加と関連している(Vallon et al., 2005) Jan;14(1): 59-66。従って、SGK1は、メタボリックシンドロームに寄与するものである。SGK1は、更に、腫瘍成長、神経変性、線維症、及び虚血の後遺症に関与する。SGK3は、充分な育毛及び腸の栄養素輸送の維持に必要であり、自発運動行動に影響する。結論として、SGKは、種々の生理機能に関連し、多くの病態生理学的条件の活性役割を果たすことができる。
本研究は、胃酸分泌の調節がSGK1活性の発現及びアップレギュレーションに依存するという予想外の知見を提供する。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、SGK1が胃酸分泌の調節において関与するという証拠を提供する。SGK1は、K+/H+ ATPアーゼ活性を増大させることによってH+分泌を刺激し、或いは、SGK1は、胃H+分泌に重要で[Vallon et al., 2006]SGK1によってアップレギュレーションされることが知られているKCNQ1チャネルを刺激することによってH+分泌を増強する。KCNE1/KCNQ1の調節には、酵素のその標的タンパク質に対する親和性を低下させるユビキチンリガーゼNedd4-2が関与する[Abriel et al., 2000; Debonneville et al., 2001; Snyder et al., 2002; Verrey et al., 2003]。
これらの結果は、更に、SGK1は、一般に胃のH+分泌には必要でないが、主に疾患に関連した胃のH+分泌の刺激に或いはグルココルチコイド治療には関与する高度に特異的なタンパク質標的であることを証明している。
この予想外の知見は、血清グルココルチコイド誘導性キナーゼ1、SGK-1活性の調節因子、特にSGK-1活性のアンタゴニストを胃のH+分泌誘発性疾患疾患、例えば、消化性潰瘍疾患の治療のために重要にするものである。
【０００５】
本発明において、胃酸分泌の阻害に適した血清グルココルチコイド誘導性キナーゼ(SGK)阻害因子をスクリーニングする方法は、(i)事前活性化リン酸化組換えSGKタンパク質を提供する工程、(ii)SGK基質ポリペプチドをATP又は他のリン酸供給源と共に提供する工程、(iii)グルココルチコイド誘導性キナーゼ阻害因子を提供する工程、及び(iv)基質のリン酸化を測定することによってSGK活性を評価する工程を含む。本発明の好ましい実施態様は、血清グルココルチコイド誘導性キナーゼ阻害因子をスクリーニングするためのSGK1の使用に関する。特許請求されたスクリーニング法によって利用可能なSGK1阻害因子の例は、本発明の実施例4に記載され、化合物及びその医薬的に有効な誘導体、塩、溶液及び立体異性体及び混合物が胃酸分泌誘発性疾患疾患、例えば、消化性潰瘍の治療に有効な薬剤であることを専門家は認識する。
本発明の好ましい実施態様は、SGK1、SGK1に対する阻害因子、およびSGK1機能および診断であることを専門家は更に理解するが、特許請求された方法、使用及び阻害性化合物がSGK2およびSGK3のような疾患に関連した他のタンパク質イソ型およびこれらの３つのイソ型について記載された単一ヌクレオチド多型変種に適用し得ることは専門家にとって明らかである。本発明は、SGKの機能を阻害する化合物を提供し特許請求する。この機能的阻害は、SGK酵素のキナーゼ活性と直接干渉することを特徴とし、それ故、その機序は、他の既知のリン酸化阻害因子に対して独特のものである。
【０００６】
胃酸分泌の過剰を特徴とする疾患の治療のためのSGKの特許請求された治療の使用のほかに、本発明の他の側面は、消化性潰瘍のような疾患の診断のためにSGKの機能をモニターすることである。
胃酸分泌誘発性疾患疾患の進行、退行又は発症の決定は、患者から採取された臓器又は単離されたヒト組織試料及び検体においてSGK1、SGK2又はSGK3のアップレギュレートされた発現及び/又は機能活性をモニタすることによって測定され得ることを専門家は直ちに認識する。
更に、本発明は、多型表現型を胃酸分泌誘発性疾患疾患の存在、重篤度又は体質と相関させるために、単一ヌクレオチド多型変種、例えばSGK1について単一ヌクレオチド多型変種を分析することによって疾患を診断する可能性を開示する。SGKのための診断法は、SGK1に制限されず、SGK2及び又はSGK3の同時分析を必要とすることもある。
【０００７】
発明の詳細な記載
胃のH+輸送に対するグルココルチコイドの作用は、SGK1を欠く(sgk1-/-)遺伝子ターゲッティングマウスとそれらの野生型同腹子(sgk1+/+)において研究されてきた。SGK1転写物レベルをリアルタイムPCRによって決定し、BCECF蛍光をH+分泌(ΔpH)の決定に用いた。
野生型マウスの胃組織において、10μg/g BW/日デキサメタゾン(DEX)による4日間の処理によって胃のSGK1転写物レベルが著しくアップレギュレートすることがわかった。それらのマウスのデキサメタゾン処理後、msgk1/mGAPDH*1000の比率は胃組織において20.7±10.1(n = 3)から46.2±16.0(n = 6)に増大した。msgk1転写物はSGK1ノックアウトマウスにおいて全く検出されなかった(SGK1/GAPDH比率0.0、n=4)。
プロトンポンプ活性を決定するために細胞質ゾルpHの詳細な測定値を用いた。開始時細胞質ゾルpHは、未処理sgk1+/+(7.16±0.01、n = 6)及びsgk1-/-(7.18±0.01、n = 6)において同様であった。デキサメタゾン処理は、sgk1+/+マウス(7.15±0.01、n =8)において又はsgk1-/-マウス(7.17±0.01、n =10)において細胞質ゾルpHを顕著に変化させなかった。
アンモニウムパルスを用いて細胞にH+を装荷した[Roos and Boron 1981]。20mM NH4Clによる表面灌流とNa+の同時除去(NMDGとの置換)に続いてわずかなアルカリ化を行った(図3)。引き続きNa+非存在下におけるNH4ClのNMDG Cl-による置換により、NH3の排出と細胞内のH+の保持のために鋭い酸性化が生じた。酸性化は見かけの緩衝能の計算を可能にしたが、未処理sgk1+/+マウス(47.51±5.79mM/pH、n =6)とsgk1-/-マウス(48.2±3.18mM/pH、n =6)において同様であった(方法を参照)。デキサメタゾンは、sgk1+/+マウス(46.38±3.12mM/pH、n =8)においてもsgk1-/-マウス(46.44±2.42mM/pH、n =10)においても緩衝能を顕著に変化させなかった。
【０００８】
デキサメタゾン処理前は、Na+非存在下におけるpH回復は未処理sgk1+/+マウス(0.028±0.008ΔpH/分、n = 6)とsgk1-/-マウス(0.029±0.010ΔpH/分、n = 6)において同様であった。デキサメタゾンによる処理によって、sgk1+/+マウス(0.133±0.022ΔpH/分、n = 8)においてNa+非依存性再アルカリ化が〜4倍増加し、sgk1-/-マウス(0.071±0.012ΔpH/分、n = 10)において〜2倍増加した。デキサメタゾン処理後、Na+非存在下のpH回復は、sgk1+/+マウスにおけるよりsgk1-/-においてかなり(p<0.05)小さくなった。
50μMオメプラゾールを添加すると、Na+非依存性pH回復がデキサメタゾン処理sgk1+/+マウスにおいて0.009±0.003ΔpH/分、n = 5に、デキサメタゾン処理sgk1-/-において0.007±0.002ΔpH/分、n = 5に低下した。デキサメタゾン処理後、オメプラゾール感受性再アルカリ化は、更にまた、sgk1+/+マウスにおけるよりsgk1-/-においてかなり(p<0.05)小さくなった。
【０００９】
本実験の結果は、SGK1を欠損することは未処理動物におけるH+分泌に影響しないが、胃のH+分泌に対するグルココルチコイドの刺激作用を選択的に無効にすることを示すので、予想外のことである。未処理sgk1-/-マウスにおける明らかに正常なH+分泌は、グルココルチコイド刺激が存在しないときにSGK1を置き換える機序を必要とする。相同性スクリーニングからクローン化されたSGK1イソ型SGK2とSGK3は、当該技術において既知であり[Kobayashi et al., 1999]、いくつかのチャネルと輸送体のタンパク質存在量及び/又は活性を増強するSGK1の能力を共有する[Lang et al., 2003]。実際、アフリカツメガエル卵母細胞における実験は、KCNE1/KCNQ1をアップレギュレートするSGK3の能力を開示した[Embark et al., 2003]。
グルココルチコイドが存在しない場合、胃のH+分泌についてsgk1-/-マウスとsgk1+/+マウスとの間にほとんど差は認められない。従って、基礎H+分泌はSGK1に依存しない。しかしながら、H+分泌のグルココルチコイド刺激はSGK1に高度に依存する。
SGK1は、グルココルチコイドの作用に関連するだけではなく、更に、SGK1は、同様にミネラルコルチコイドによってもアップレギュレートされ[Chen et al., 1999; Naray-Fejes-Toth et al., 1999; Shigaev et al., 2000]、腎臓のNa+とK+排出のミネラルコルチコイド調節に関与する。
【００１０】
本発明の血清グルココルチコイド誘導性キナーゼは、関連する遺伝子における突然変異(SNP)を検出することによって、診断用薬として用いることができる。cDNA又はゲノム配列において、本出願の実施例5に開示され且つ機能不全と関連しているポリヌクレオチド多型によって確認される遺伝子の変異形の検出は、遺伝子の過小発現、過剰発現又は空間的又は時間的発現の変化から生じる疾患又は疾患に対する感受性を診断することのできる、または診断に付加することができる診断ツールを提供する。遺伝子の突然変異をもつ個体は、当該技術において周知の種々の技術によってDNAレベルで検出することができる。
しかしながら、好ましくは、分子診断は、潰瘍を直接試験することを可能にする上部腸管の内視鏡検査法によっても常に確認しなければならない。内視鏡検査法によって、生検材料を試験のために身体から取り出すことができる。組織は免疫染色を用いて顕微鏡下で調べられて、診断を援助するため血清グルココルチコイド誘導性キナーゼ発現の分子診断が用いられるであろう。それ故、極めて小さい試料しか必要としない。或いは又は更に、被検者の細胞から、例えば、血液、尿、唾液、組織生検又は剖検材料から診断のための核酸を得ることもできる。
【００１１】
検出のためにゲノムDNAを直接用いることができ、又は分析の前にPCR、好ましくはRT-PCRによって酵素的に、又は他の増幅技術を用いることによりゲノムDNAを増幅することができる。RNA又はcDNAも同様にして用いることができる。正常な遺伝子型と比較して増幅された産物のサイズの変化によって欠失及び挿入を検出することができる。点突然変異は、標識SGK1、SGK2、又はSGK3ヌクレオチド配列に対して増幅されたDNAをハイブリダイズさせることによって同定することができる。完全にマッチする配列は、RNase消化によって又は融解温度の差によってミスマッチ二重らせんから区別され得る。DNA配列差は、変性剤を含む又は含まないゲルにおけるDNA断片の電気泳動移動度の変化によって、又は直接のDNAシークエンシングによって検出することができる(例えば、Myers et al., Science (1985) 230:1242を参照)。特定位置の配列変化は、ヌクレアーゼ保護分析、例えば、RNase及びS1保護又は化学開裂法によって示すことができる(Cotton et al., Proc Natl Acad Sci USA (1985) 85: 4397-4401を参照)。
SGK1、SGK2又はSGK3ポリヌクレオチド配列又はそれらの断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイは、例えば、遺伝子突然変異の効率的なスクリーニングを行うように構築することができる。このようなアレイは好ましくは高密度アレイ又はグリッドである。アレイ技術法は周知であり、一般的適用性を有し、遺伝子発現、遺伝子の連鎖、及び遺伝的変異性が含まれる分子遺伝学における種々の問題に取り組むために使用し得る（例えば、M. Chee et al., Science, 274, 610-613 (1996)及びその中に引用される他の文献を参照）。
異常に低下又は上昇したレベルのポリペプチド又はmRNA発現の検出を用いて、本発明の疾患に対する被検者の感受性を診断するか又は決定することができる。発現の低下又は上昇は、ポリヌクレオチドの定量化、例えば、核酸増幅、例えば、PCR、RT-PCR、RNase保護、ノーザンブロット法及び他のハイブリダイゼーション法のために当該技術における周知の方法のいずれを用いてもRNAレベルで測定され得る。
【００１２】
例えば、本発明のポリヌクレオチド配列は、また、組織発現研究に有益なツールである。このような研究は、本発明のポリヌクレオチドの発現パターンの決定をそれらをコードしているmRNAを検出することによって可能にし、組織におけるコードされたポリペプチドの発現パターンに関する指標を示すことができる。用いられる技術は、当該技術において周知であり、グリッド上に配列されたクローンに対するin situハイブリダイゼーション技術、例えば、cDNAマイクロアレイハイブリダイゼーション(Schena et al, Science, 270, 467-470, 1995 and Shalon et al, Genome Res, 6, 639-645, 1996)及びヌクレオチド増幅技術、例えば、PCRが含まれる。好ましい方法は、Perkin Elmerから入手しえるTAQMAN(商標)技術を用いる。これらの研究からの結果は、生物体におけるポリペプチドの正常機能を示すことができる。更に、mRNAの正常な発現パターンと同一遺伝子の代替形によってコードされるmRNA(例えば、ポリペプチドコーディング能の改変又は調節変異を有する)の発現パターンとの比較研究は、本発明のポリペプチドの役割、又は疾患におけるその不適切な発現の役割に有益な洞察を与えることができる。このような不適切な発現は、一時的、空間的又は単に定量的な性質を有し得る。
【００１３】
抗体ベースの分析技術は、本発明のSGK1、SGK2又はSGK3のレベルを決定するために使用し得る他の可能性である。市販の供給業者、例えば、Sigma又はCell Signalling TechnologiesからいくつかのSGK抗体が利用可能であり、又は他者によって発表されてきた。本発明の選択したポリペプチドに対する追加の抗体も、通常のプロトコールを用いてポリペプチド又はエピトープ保持断片、又は細胞を動物、好ましくは非ヒト動物に投与することによって得ることができる。モノクローナル抗体の調製のために、連続細胞系培養によって産生される抗体を与えるいかなる技術も使用し得る。例としては、ハイブリドーマ技法(Kohler, G. and Milstein, C., Nature (1975) 256:495-497)、トリオーマ技法、ヒトB-細胞ハイブリドーマ技法(Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4:72)及びEBV-ハイブリドーマ技法(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985)が含まれる。
抗体は、ラジオイムノアッセイ、競合結合分析、ウェスタンブロット分析及びELISA分析を含む分析において有効である。
【００１４】
従って、他の態様においては、本発明は、以下を含む診断キットに関する: 
(a)本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列番号: 1のヌクレオチド配列、又はその断片又はRNA転写物; 
(b)(a)に相補的なヌクレオチド配列;
(c)本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号: 2のポリペプチド又はその断片; 又は
(d)本発明のポリペプチドに対する、好ましくは配列番号: 2のポリペプチドに対する抗体。
このようないずれのキットにおいても、(a)、(b)、(c)又は(d)は実質的な成分を含むことができることが理解される。このようなキットは、疾患又は疾患に対する感受性、特に、数ある中でも本発明の疾患を診断するのに有用である。
上記の抗体は、単離物を診断するために又はポリペプチドを発現するクローンを同定するために又はアフィニティークロマトグラフィによってポリペプチドを精製するために使うことができる。本発明のポリペプチドに対する抗体は、また、とりわけ、本発明の疾患を治療するために使うことができる。
【００１５】
実施例
実施例1: マウスのデキサメタゾン処理
以前に記載されたように[Wulff et al., 2002]、SGK1を欠くマウス(sgk1-/-)を作製した。12のエキソン上に全転写領域を包含する7kbの断片からコンディショナルターゲッティングベクターを作成した。ネオマイシン耐性カセットは二つのloxP部位に挟まれており、これをイントロン11に挿入した。第三のloxP部位をイントロン3に挿入することによってSgk1キナーゼドメインをコードするエキソン4-11を“loxP部位で挟み込ん(floxed)”だ。標的R1  ES細胞にCreリコンビナーゼを一過性にトランスフェクトした。第一loxP部位と第三loxP部位との間に組換えを生じた(I型組換え)クローンをC57BL/6未分化胚芽細胞に注入した。雄キメラを129/SvJ雌に交配した。ヘテロ接合体sgk1欠損マウスを、129/SvJ野生型マウスに二世代にわたって戻し交配し、その後、異系交配して同型接合体sgk1-/-とSgk1+/+同腹子を作製した。動物を、標準法を用いてPCRによって遺伝子タイピングした。
デキサメタゾン効果の分析のため、sgk1+/+マウスおよびsgk1-/-マウスにリン酸デキサメタゾン二ナトリウム塩(Sigma、Taufkirchen、ドイツ; 0.9%食塩水に溶解した)を10μg/g BWの用量で4日間連続で午後8時に注射した。0.9%食塩水だけを注射したsgk1-/-マウスとsgk1+/+マウスを対照とした。マウスは標準マウス食餌(Altromin  diet 1310、Heidenau、ドイツ)と水道水を自由に摂取させた。デキサメタゾン処理の4日目に、動物を、水道水を自由に摂取させながら実験の前にワイアグリッド上で16時間絶食させた。
【００１６】
実施例2: 定量的リアルタイムPCRを用いて、SGK1転写物レベルに対するグルココルチコイドの効果を決定した。胃組織を迅速に取り出し、液体窒素中で凍結した。MagNa Lyser InstrumentTM(Roche Diagnostics、マンハイム、ドイツ)を用いて凍結した組織の自動化破壊とホモゲナイズを行った。各試料について一方通行の特別なチューブにセラミックビーズ、20-30mgの凍結した組織及び600μlのRLT-緩衝液(Qiagen、ヒルデン、ドイツ)を充填した。清澄化した細胞溶解物を更にRNA精製プロセス(RNAeasy Mini Kit、Qiagen、ヒルデン、ドイツ)に移した。続いて1μgの全RNAを、製造業者のプロトコールに従ってオリゴ(dT)プライマーと逆転写システム(Bioscience、米国)を用いてcDNAに逆転写した。mSGK1 mRNAレベルを決定するために、LightCycler SystemTM(Roche Diagnostics、マンハイム、ドイツ)において定量的リアルタイムPCRを設定した。2μlのcDNA、2.4μlのMgCl2(3μM)、1μlのプライマーミックス(どちらのプライマーも0.5μM)、2μlのcDNA Master SybrGreen Iミックス(Roche Molecular Biochemicals、マンハイム、ドイツ)及び12.6μlのDEPC処理水を含有する20μlの最終体積中でmSGK1についてPCR反応を行った。市販のプライマーキット(Search LC、ハイデルベルク、ドイツ)を用いて各試料においてハウスキーピング遺伝子mGAPDHの転写物レベルを決定した。GAPDHについてのPCR反応は、2μlのcDNA、2μlのプライマーミックス(Search LC、ハイデルベルク、ドイツ)、2μlのcDNA Master Sybr Green Iミックス(Roche Molecular Biochemicals、マンハイム、ドイツ)及び14μlのDEPC処理水を含有する20μlの最終体積中で行った。
【００１７】
標的DNAの増幅は、95℃10秒間、68℃10秒間及び72℃16秒間の35サイクルで行い、それぞれ20℃/sの温度遷移速度及び0.5℃のステップ幅による58℃の二次ターゲット温度を含む。融解曲線分析を95℃0秒、58℃10秒、95℃0秒で行い、プライマー二量体及び特異的PCR産物の融解温度を決定した。融解曲線分析により増幅産物が確認され、その後、増幅産物を1.5%アガロースゲルにより分離して予想されたサイズ(406bp)を確認した。最後に、標的とハウスキーピング遺伝子転写物との比として結果を算出した。
mSGK1(Genebank No.: NM_011361)について以下のプライマーを用いた:
mSGK1センス: 5' TGT CTT GGG GCT GTC CTG TAT G 3'
mSGK1アンチセンス: 5' GCT TCT GCT GCT TCC TTC ACA C 3'
【００１８】
実施例3: 胃のH+分泌
胃腺の単離のため、動物を水道水を自由に摂取させながらワイアグリッド上で実験の前16時間絶食させた。犠牲にした後、胃を取り出し、縦に切断した。標準Hepes溶液で洗浄した後、胃の基底部を0.3 cm2切片にスライスした。組織を解剖顕微鏡の冷却された試料台に移し、個々の腺を鋭くした顕微手術ピンセットを用いて組織を摘みとることによって胃壁から外した。腺の先端部に触れないように注意した。腺をCell-Tak接着剤(BD Biosciences)で予めコーティングしたガラスのカバースリップに取り付けた。細胞質ゾルpHiのデジタル画像処理のために、単離された個々の腺を10μM BCECF-AM (Molecular Probes、ライデン、オランダ)を含有するHEPES緩衝リンゲル液中で37℃で15分間インキューベートした。装填後、チャンバをリンゲル液で5分間洗い流して、腺の外側にくっついているいかなる脱エステル化色素も除去した。灌流チャンバを倒立顕微鏡(Zeiss Axiovert 135)の試料台に取り付け、その倒立顕微鏡を40×油浸対物レンズ(Zeiss Neoplan、ドイツ)を用いて落射蛍光方式で使用した。BCECFを490/10nmと440/10nmで連続して励起し、得られた蛍光シグナルを増感電荷結合素子カメラ(Proxitronic、ドイツ)と専用のコンピュータソフトウェア(Metafluor、米国)を用いて535/10nmでモニタした。壁細胞を輪郭化し、測定の間モニターした。強度比データ(490/440)を、高K+/ナイジェリシン較正技術を用いてpH値に変換した[Ganz et al., 1989]。
【００１９】
示してある場合、50μMオメプラゾール(Astra-Zeneca スウェーデン)をBCECFインキュベーション培地および標準Hepes溶液に添加した。
溶液、フローライン及び灌流チャンバを、サーモスタット制御の加熱システムによって37℃に維持した。灌流チャンバの容積は600μlであり、流量は全溶液について4ml/分とした。酸負荷のために、細胞を20mMのNH4Clを含有する溶液に一時的にさらし、NH3が流入しH+が結合してNH4+を形成するために細胞質ゾルpH(pHi)の最初の著しいアルカリ化を生じさせた[Roos and Boron 1981]。アンモニアの除去による細胞質ゾルpHの酸性化により、NH4+とNH3が細胞質ゾルと細胞外液において平衡にあり且つアンモニアがNH3として細胞から遊離すると仮定して、細胞の平均固有緩衝能を算出することが可能となる[Roos and Boron 1981]、:
β= Δ[NH4+]i/ΔpHi、
ここで、ΔpHiは、アンモニア除去後の細胞質ゾルpH(pHi)の低下であり、Δ[NH4+]iは細胞質ゾルNH4+濃度の低下である（細胞質ゾルNH4+濃度はアンモニアの除去直前のNH4+の濃度と同一である）。NH4+/NH3のpKが8.9[Boyarsky et al., 1988]とすると、細胞外pH(pH0)7.4で細胞外液のNH4+濃度([NH4+]0)19.37 [20/(1+10pHo-pK)]: [NH4]i = 19.37・10pHo-pHiである。
溶液は、以下から構成される(mM濃度): 標準Hepes 115 NaCl、5 KCl、1 CaCl2、1.2 MgSO4、2 NaH2PO4 10 グルコース、32.2 Hepes; ナトリウムを含まないHepes 132.8 NMDG、3 KCl、1 CaCl2、1.2 MgSO4、2 KH2PO4、32 Hepes、10 マンニトール、10 グルコース; ナトリウムを含まない塩化アンモニウム 10 mM NMDGおよびマンニトールを20mM NH4Clで置き換えた; 検定用高K+  105 KCl、1 CaCl2、1.2 MgSO4、32.2 Hepes、10 マンニトール  5μMナイジェリシン。溶液のpHを、37℃にてHCl/NaOH、HCl/NMDG及びHCl/KOHでそれぞれ7.4又は7.0に滴定した。
【００２０】
実施例4: SGK1を調節する化合物
4.1.一般式Iの化合物及びその医薬的に有効な誘導体、塩、溶液及び立体異性体、及びそれらの混合物。
【００２１】
2009531020.tif 000003
【００２２】
(式中、R1、R5は、H、OH、OA、OAc又はメチルであり、
R2、R3、R4、R6、R7、R8、R9、R10は、H、OH、OA、OAc、OCF3、Hal、NO2、CF3、A、CN、OSO2CH3、SO2CH3、NH2又はCOOHであり、
R11は、H又はCH3であり、
Aは、C原子1、2、3又は4個を有するアルキルであり、
Xは、CH2、CH2CH2、OCH2又は-CH(OH)-であり、
Halは、F、Cl、Br又はIである。)
【００２３】
以下の化合物群より選ばれる式Iの化合物:
(3-ヒドロキシフェニル)-酸性酸(acidic acid)-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ヒドロキシフェニル)-酸性酸-[1-(4-ヒドロキシ-2-メトキシフェニル)エチリデン]ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
フェニル酸性酸-(3-フルオル-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(4-ヒドロキシフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3,4-ジクロルフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
m-トリル-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
o-トリル-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(2-クロルフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-クロルフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(4-フルオルフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(2-クロル-4-フルオルフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-フルオルフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2,6-ジメチルベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酸性酸-(3-フルオル-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酸性酸-[1-(4-ヒドロキシ-2-メトキシフェニル)エチリデン]ヒドラジド、
(3-メチルスルホニルオキシフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3,5-ジヒドロキシフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-フルオルフェニル)-酸性酸-(3-フルオル-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酸性酸-(4-アセトキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-トリフルオロメチルフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
3-(3-メトキシフェニル)-プロピオン酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酸性酸-(2,4-ジヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェノキシ)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ニトロフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酸性酸-(5-クロル-2-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酸性酸-(2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジリデン)ヒドラジド、
2-ヒドロキシ-2-フェニル-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酸性酸(2-エトキシ-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ブロムフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酸性酸-[1-(4-ヒドロキシフェニル)エチリデン]ヒドラジド、
(3,5-ジフルオルフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ヒドロキシフェニル)-酸性酸-(4-ヒドロキシ-2-メチルベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ヒドロキシフェニル)-酸性酸-(2-エトキシ-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ヒドロキシフェニル)-酸性酸(2-メトキシ-4-ヒドロキシ-6-メチルベンジリデン)ヒドラジド、
(2-フルオルフェニル)-酸性酸-(2-メトキシ-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド。
【００２４】
4.2.一般式IIの化合物及びその医薬的に有効な誘導体、塩、溶液及び立体異性体、及びそれらの混合物。
【００２５】
2009531020.tif 000004
【００２６】
(式中、R1、R2、R3、R4、R5は、H、A、OH、OA、アルケニル、アルキニル、NO2、NH2、NHA、NA2、Hal、CN、COOH、COOA、-OHet、-O-アルキレン-Het、-O-アルキレン-NR8R9又はCONR8R9、R1、R2、R3、R4、R5より選ばれる二つの基、又は-O-CH2-CH2-、-O-CH2-O-又は-O-CH2-CH2-O-であり、
R6、R7は、H、A、Hal、OH、OA又はCNであり、
R8、R9は、H又はAであり、
Hetは、一つ以上のHal、A、OA、COOA、CN又はカルボニル酸素(=O)によって置換された、N-、O-及び/又はS-原子1〜4個を有する飽和又は不飽和素環であり、
Aは、C原子1〜10個を有するアルキルであり、ここで、H原子1-7個は、F及び/又は塩素によって置換されてもよく、
X、X'は、NHであるか又は存在せず、
Halは、F、Cl、Br又はIである。)
【００２７】
以下の化合物の群より選ばれる式IIの化合物:
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(2-フルオル-5-トリフルオルメチルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(4-クロル-5-トリフルオルメチルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(2,4-ジフルオルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(2,6-ジフルオルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(3-フルオル-5-トリフルオルメチルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(4-フルオル-5-トリフルオルメチルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(4-メチル-5-トリフルオルメチルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(2,3,4,5,6-ペンタフルオルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(2,4-ジブロム-6-フルオルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(2-フルオル-6-トリフルオルメチルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(2-フルオル-5-メチルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(2,3,4-トリフルオルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(4-ブロム-2,6-ジフルオルフェニル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-(2-フルオル-3-トリフルオルメチル)尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[2-(1-tert-ブチルオキシカルボニルピペリジン-4-イル)フェニル]尿素、
N-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-2,4-ジクロルベンズアミド、
N-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-4-クロル-5-トリフルオルメチルベンズアミド、
N-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-2-フルオル-5-トリフルオルメチルベンズアミド、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[3-クロル-5-トリフルオルメチル-2-(ピペリジン-4-イルオキシ)フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[(2-フルオル-5-(2-ジメチルアミノエトキシ)フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[5-フルオル-2-(ピペリジン-4-イルオキシ)フェニル]尿素、
【００２８】
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[4-クロル-5-トリフルオルメチル-2-(ピペリジン-4-イルオキシ)フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[2-(ピペリジン-4-イルオキシ)フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[2-フルオル-5-(2-ジエチルアミノエトキシ)フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[2-フルオル-5-[2-(ピペリジン-1-イル)エトキシ]フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[4-フルオル-2-(2-ジメチルアミノエトキシ)フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[4-フルオル-2-(2-ジエチルアミノエトキシ)フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[3-クロル-4-[2-(モルホリン-4-イル)エトキシ]フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[4-フルオル-2-[2-(モルホリン-4-イル)エトキシ]フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[3-クロル-4-(2-ジメチルアミノエトキシ)フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[3-クロル-4-(2-ジエチルアミノエトキシ)フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[4-クロル-2-(2-ジメチルアミノエトキシ)フェニル]尿素、
1-[4-(4-アミノ-5-オキソ-5H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-8-イル)フェニル]-3-[2-クロル-5-(2-ジエチルアミノエトキシ)フェニル]尿素。
【００２９】
実施例5: SGK1ヌクレオチド多型
SGK1ヌクレオチド多型は、配列...aattacattgCgcaacccag..によって示されるが、他の集団を示すヌクレオチド配列は....aattacattgTgcaacccag...である。いずれの配列も受託番号GI 2463200 Position 2071によって利用可能である。条件的胃酸過剰生産患者のエキソン8配列は、ホモ接合体..tactgaCttcggact..又は....tactgaTttcggact....か又はヘテロ接合体.tactgaCttcggact...と...tactgaTttcggact ..である。配列は、受託番号NM _005627.2, Position 777によって利用可能である。
【００３０】
更なる実施例
化学的化合物をスクリーニングするためのSGK1分析
SGK1分析を、活性化/リン酸化SGK1において行った。短縮したSGK1ペプチド(Δ(1-60)hSGK1 S422D)をPDK1-誘導体とATPと共にインキューベートすることにより活性化SGK1を作成した。
この事前活性化/リン酸化SGK1を、試験すべき化合物の存在下又は非存在下でビオチン化Crosstideペプチド(ビオチン-KGSGSGRPRTSSFAEG)および5μM[33P-ATP](50-1000cpm/ピコモル)と共に室温で60分間インキューベートした。
分析緩衝液は、20mM MOPS pH 7.2、5mM EGTA、0.5μM基質ペプチド、15mM MgCl2、25mM グリセロリン酸、1mM Na3VO4、1mM DTT、0.01％Brij-35とした。
ATPを含まない200μlの分析緩衝液を添加することによって反応を停止し、反応混合物のアリコートを96ウェルストレプトアビジン被覆FLASH-プレートに移し、20分間インキューベートした。その後、溶液を除去し、プレートをPBS緩衝液で三回洗浄した。結合した放射能を測定するために、FLASH-プレートをTOPCOUNTマイクロタイタープレートシンチレーションカウンタに入れた。
SGK-1、SGK2-及びSGK3-イソ型の検査のための分析フォーマットは同一とした。ヒトSGK2はStressgen(No # PPK-455)から購入し、hSGK3はΔ(1-60)hSGK3 S422D-誘導体を用いた。
【００３１】
選ばれたSGK1阻害因子をスクリーニングするためのELISA分析
SGK阻害因子を生理的ATP-濃度で試験するために、現行のELISAプロトコールを選択化合物に使った。
96-ウェルマイクロタイタープレートを、0.2M炭酸緩衝液中の0.5μM GSK-3融合タンパク質溶液(Cell Signalling; No. 9278) 50μlを添加することによってコーティングした。MTPを、37℃で60分間インキューベートした。その後、MTP-ウェルを100μl/ウェルの140mM NaCl、10mM NaH2PO4(洗浄緩衝液)で3回洗浄した。
100μlのブロッキング緩衝液(洗浄緩衝液+ 3％(w/v)ウシ血清アルブミン)を各ウェルに添加し、37℃で60分間インキュベートして遊離面のブロッキングを行った。洗浄後、キナーゼ反応を、ADBI-緩衝液(ADBI-緩衝液: 20mM MOPS pH 7.2、5mM EGTA、15mM MgCl2、25mM グリセロリン酸、1mM Na3VO4、1mM DTT、0.01％Brij-35)中30-300μM ATP中、漸次増加させた濃度の試験化合物の存在下に10ngのhSGK(Δ(1-60)hSGK1 S422D-誘導体)をインキュベートすることによって総容量50μlにおいて行った。インキュベーションは室温にて120分間行った。
反応を停止した後、ウェルを三回洗浄し、続いて50μlの蛍光体(phosophor）-GSK3-抗体溶液(Ser21/9抗体の1:1000希釈液、Cell Signaling #9331L)を各ウェルに添加した。MTPを37℃で30分間インキューベートし、その後三回洗浄した。
次に、50μlのヤギ-抗ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ(POD)複合抗体溶液(阻止緩衝液中1:15,000希釈液; Sigma #A-0545)を各ウェルに添加した。更にインキュベートし、洗浄した後、分析物をABTS(2,2'-アジノビス-3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸)(Calbiochem # 194434)とH2O2で発色させた。読み出しは、405nmでSpectraFluor-MTP-リーダー(TECAN)によって行った。対照インキュベーションと比較したODの低下によって本出願で特許請求するSGK1の阻害因子を同定した。
【００３２】
選ばれたSGK1阻害因子のHeLa細胞におけるスクリーニング
NDRG1-タンパク質は、HeLa細胞において発現されたSGK1の特異的基質として記載されている(Murray JT, et al. Biochem. J. 2004, 384:477-88を参照)。本出願において、HeLa細胞は、SGK1-阻害因子の特徴解析のための細胞試験システムとして用いられている。
HeLa細胞を、10%ウシ胎児血清(FCS)、2mMグルタミン及び1mMピルビン酸ナトリウムを添加したDMEM培地中10-20×103細胞/cm2の密度で６ウェルMTP(Costar Corning、# 3506)にプレーティングし、37℃にて24時間、５%CO2中でインキューベートした。その後、化合物の連続希釈物を添加し、１%DMSO濃度で予想されたSGK1-阻害因子濃度が得られた。細胞を更に24時間インキューベートした。
その後、上清を除去し、細胞をBPSで洗浄した。各ウェルに、250μlの氷冷溶解緩衝液(50mMトリス/HCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.5mM活性化Na3VO4、10mMグリセロリン酸、50mM NaF、5mM Na-ピロリン酸、1%トリトンX100、1mM DTT、0.1mM PMSF、及び1μM マイクロクリスチン及びそれぞれ1μg/mlのアプロチニン、ペプスタチン及びロイペプチン)を添加した。細胞をこすり取り、ピペットで懸濁した後、細胞をホモジェナイズし、溶解した。細胞溶解物を-24℃で保存した。
細胞溶解物の16μlアリコートを1μlβ-メルカプトエタノールを添加した6μlの4×NuPage(登録商標)LDS-試料緩衝液に移し、加熱する。試料を、NDRG1-及びP-NDRG1-抗血清を用いてSDS-PAGEとウエスタンブロットの分析によって更に調べた。P-NDRG1-抗体を用いてウエスタンブロットのバンドの強度の低下を決定し、それを用いて本出願において特許請求したSGK1-阻害因子の細胞内阻害能を評価した。
【００３３】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】胃の組織におけるSGK1転写物レベル  胃の組織におけるGAPDHに対するmsgk1写物レベル(対照、白い棒)とデキサメタゾン処理後(dexa、黒い棒)における転写物レベルの比率。算術平均±SEM(n = 3-7)。
【図２】アンモニウムパルス後の壁細胞におけるpH回復  アンモニウムパルス後の回腸における細胞質ゾルpH(ΔpH)の変化。細胞にH+を装荷するために、第一段階で20mM NH4Clを添加し、Na+を除去し(NMDGによって置き換える)(それぞれの原記録グラフの下のバーを参照)、第二段階でNH4Clを除去し、第三段階でNa+を添加し、第四段階でナイジェリシン(Nig.)を適用して、個々の各実験の測定を行った。A: 未処理マウスにおけるsgk1+/+(左のパネル)とsgk1-/-(右のパネル)の典型的な実験においてpHの変化を示す原記録グラフ。B: デキサメタゾン処理マウスにおけるsgk1+/+(左のパネル)とsgk1-/-(右のパネル)の典型的な実験においてpHの変化を示す原記録グラフ。C: 50μMオメプラゾールの存在下のデキサメタゾン処理マウスにおけるsgk1+/+(左のパネル)とsgk1-/-(右のパネル)の典型的な実験においてpHの変化を示す原記録グラフ。D: デキサメサゾン(+Dex)処理又は左の未処理(-Dex)のsgk1+/+(白い棒)及びsgk1-/-(黒い棒)マウスの壁細胞におけるNa+非依存性ΔpHの算術平均±SEM。デキサメタゾン処理sgk1+/+及びsgk1-/-マウスからの壁細胞におけるNa+非依存性ΔpHのオメプラゾール阻害。
【図１】
2009531020.tif 000007
【図２】
2009531020.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月12日(2008.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
SGK阻害因子が、以下の化合物群:
(3-ヒドロキシフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ヒドロキシフェニル)-酢酸-[1-(4-ヒドロキシ-2-メトキシフェニル)エチリデン]ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
フェニル酢酸-(3-フルオル-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(4-ヒドロキシフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3,4-ジクロルフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
m-トリル-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
o-トリル-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(2-クロルフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-クロルフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(4-フルオルフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(2-クロル-4-フルオルフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-フルオルフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2,6-ジメチルベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酢酸-(3-フルオル-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酢酸-[1-(4-ヒドロキシ-2-メトキシフェニル)エチリデン]ヒドラジド、
(3-メチルスルホニルオキシフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3,5-ジヒドロキシフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-フルオルフェニル)-酢酸-(3-フルオル-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酢酸-(4-アセトキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-トリフルオロメチルフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
3-(3-メトキシフェニル)-プロピオン酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酢酸-(2,4-ジヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェノキシ)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ニトロフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酢酸-(5-クロル-2-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酢酸-(2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジリデン)ヒドラジド、
2-ヒドロキシ-2-フェニル-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酢酸-(2-エトキシ-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ブロムフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酢酸-[1-(4-ヒドロキシフェニル)エチリデン]ヒドラジド、
(3,5-ジフルオルフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ヒドロキシフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メチルベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ヒドロキシフェニル)-酢酸-(2-エトキシ-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ヒドロキシフェニル)-酢酸-(2-メトキシ-4-ヒドロキシ-6-メチルベンジリデン)ヒドラジド、
(2-フルオルフェニル)-酢酸-(2-メトキシ-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド
より選ばれる、請求項１〜３のいずれか1項記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
以下の化合物群より選ばれる式Iの化合物:
(3-ヒドロキシフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ヒドロキシフェニル)-酢酸-[1-(4-ヒドロキシ-2-メトキシフェニル)エチリデン]ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
フェニル酢酸-(3-フルオル-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(4-ヒドロキシフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3,4-ジクロルフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
m-トリル-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
o-トリル-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(2-クロルフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-クロルフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(4-フルオルフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(2-クロル-4-フルオルフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-フルオルフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2,6-ジメチルベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酢酸-(3-フルオル-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酢酸-[1-(4-ヒドロキシ-2-メトキシフェニル)エチリデン]ヒドラジド、
(3-メチルスルホニルオキシフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3,5-ジヒドロキシフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-フルオルフェニル)-酢酸-(3-フルオル-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酢酸-(4-アセトキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-トリフルオロメチルフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
3-(3-メトキシフェニル)-プロピオン酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酢酸-(2,4-ジヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェノキシ)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ニトロフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酢酸-(5-クロル-2-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酢酸-(2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジリデン)ヒドラジド、
2-ヒドロキシ-2-フェニル-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酢酸-(2-エトキシ-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ブロムフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-メトキシフェニル)-酢酸-[1-(4-ヒドロキシフェニル)エチリデン]ヒドラジド、
(3,5-ジフルオルフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メトキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ヒドロキシフェニル)-酢酸-(4-ヒドロキシ-2-メチルベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ヒドロキシフェニル)-酢酸-(2-エトキシ-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド、
(3-ヒドロキシフェニル)-酢酸-(2-メトキシ-4-ヒドロキシ-6-メチルベンジリデン)ヒドラジド、
(2-フルオルフェニル)-酢酸-(2-メトキシ-4-ヒドロキシベンジリデン)ヒドラジド。
【国際調査報告】
2009531020.tif 000009
2009531020.tif 000010
2009531020.tif 000011