(57)【要約】  ヒトβ-アミロイドペプチドに結合する抗体、増大したβ-アミロイドレベルまたはβ-アミロイド沈着を特徴とする疾患または障害を当該抗体を用いて治療する方法、当該抗体を含む医薬組成物および製造方法【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
β-アミロイドペプチドに結合し、かつ以下のCDR:
VH3遺伝子ファミリーを起源とするヒト重鎖可変領域内の
CDRH1: DNGMA(配列番号1)
CDRH2: FISNLAYSIDYADTVTG(配列番号2)
CDRH3: GTWFAY(配列番号3)
および
GenPept登録番号CAA51135に開示されるアミノ酸配列(配列番号24)を起源とするヒト軽鎖可変領域内の
CDRL1: RVSQSLLHSNGYTYLH(配列番号4)
CDRL2: KVSNRFS(配列番号5)
CDRL3: SQTRHVPYT(配列番号6)
を含む、抗体もしくは抗原結合断片および／またはそれらの誘導体である、治療抗体。
【請求項２】
ヒト重鎖可変領域が、
・以下のVH3ファミリーメンバーのサブセット：VH3-48, VH3-21, VH3-11, VH3-7, VH3-13, VH3-74, VH3-64, VH3-23, VH3-38, VH3-53, VH3-66, VH3-20, VH3-9もしくはVH3-43から選択されるV遺伝子；
・以下のVH3ファミリーメンバーのサブセット：VH3-48, VH3-21もしくはVH3-11から選択されるV遺伝子；
・VH3-48遺伝子；または
それらの対立遺伝子
を起源とする、請求項１記載の治療抗体。
【請求項３】
ヒトアクセプター重鎖フレームワークがフレームワーク 4を伴うM99675(配列番号21)に由来する、請求項２記載の治療抗体。
【請求項４】
フレームワーク 4配列がヒトJH4ミニ遺伝子(Kabat):
YFDYWGQGTLVTVSS  (配列番号23)
［該遺伝子中、CDR3領域に含まれる最初の４残基はドナー抗体より受け入れたCDRによって置換されている］
によってコードされる、請求項３記載の治療抗体。
【請求項５】
配列番号17の配列を有するドナーVHドメインおよび配列番号19の配列を有するVLドメインに見出される対応する残基に基いて、１または複数のアミノ酸残基の置換を有し、ドナー抗体のβ-アミロイドペプチドに対する結合アフィニティを完全にまたは実質的に完全に保持している、請求項４記載の治療抗体。
【請求項６】
M99675およびJH4に由来するヒトアクセプター重鎖フレームワークが24位、48位、93位および94位(Kabat番号)からなる群から選択される１〜４個のアミノ酸残基の置換を含む、請求項５記載の治療抗体。
【請求項７】
ヒトアクセプター重鎖フレームワークが以下の残基(またはそれらの保存的置換)を含む、請求項６記載の治療抗体。
(i)
位置              残基
93                V
94                S
または
(ii)
位置              残基
24                V
93                V
94                S
または
(iii)
位置              残基
48                I
93                V
94                S
【請求項８】
配列番号26で表される配列を有するVH鎖と配列番号32で表される配列を有するVLドメインとを含む治療抗体。
【請求項９】
配列番号28で表される配列を有するVH鎖と配列番号32で表される配列を有するVLドメインとを含む治療抗体。
【請求項１０】
配列番号30で表される配列を有するVH鎖と配列番号32で表される配列を有するVLドメインとを含む治療抗体。
【請求項１１】
100pM未満の平衡定数KDでβ-アミロイドペプチド1-12(配列番号15)と結合し、かつβ-アミロイドペプチド2-13(配列番号44)に対する結合の平衡定数KDが、ペプチド1-12(配列番号15)に対する結合の平衡定数KDよりも1000倍よりも大きい抗体もしくは抗原結合断片および／またはそれらの誘導体である治療抗体であって、両測定がストレプトアビジンチップに捕捉されたペプチドを利用する表面プラズモン共鳴アッセイにおいてなされる、上記治療抗体。
【請求項１２】
10nM未満の平衡定数KDでβ-アミロイドペプチド1-40と結合し、かつβ-アミロイドペプチド2-13(配列番号44)に対する結合の平衡定数KDが、ペプチド1-12(配列番号15)に対する結合の平衡定数KDよりも1000倍よりも大きい抗体もしくは抗原結合断片および／またはそれらの誘導体である治療抗体であって、両測定が本明細書中の実施例における方法Bに記載される表面プラズモン共鳴アッセイにおいてなされる、上記治療抗体。
【請求項１３】
IgG1イソタイプである、請求項１〜１２のいずれか１項記載の治療抗体。
【請求項１４】
a)古典経路による補体の活性化、およびb)抗体依存性細胞傷害の仲介といった機能を実質的に欠いている、請求項１〜１４のいずれか１項記載の治療抗体。
【請求項１５】
残基235および237がアラニンに変異している、請求項１３記載の治療抗体。
【請求項１６】
抗体が配列番号34、36または38で表される配列を有する重鎖と配列番号40で表される配列を有する軽鎖とを含む、請求項１記載の治療抗体。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項記載の治療抗体を含む医薬組成物。
【請求項１８】
β-アミロイドペプチド関連疾患に罹患しているヒト患者の治療方法であって、該患者に治療有効量の請求項１〜１６のいずれか１項記載の治療抗体を投与するステップを含む、上記方法。
【請求項１９】
β-アミロイドペプチド関連疾患を治療するために薬剤の製造における、請求項１〜１６のいずれか１項記載の治療抗体の使用。
【請求項２０】
配列番号17で表される配列を有するVHドメインと配列番号19で表される配列を有するVLドメインとを含む、抗体またはその断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はβ-アミロイドペプチド、特にヒトβ-アミロイドペプチドに結合する抗体に関する。本発明はまた、高レベルのβ-アミロイドまたはβ-アミロイド沈着を特徴とする疾患または障害、特にアルツハイマー疾患を上記抗体を用いて治療する方法、当該抗体を含む医薬組成物およびその製造法に関する。本発明の他の態様は以下の説明より明らかとなろう。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー疾患(AD)は加齢に伴う認識衰退の最も一般的な原因であり、世界で1200万を上回る人が罹患している(非特許文献１)。この疾患の初期段階は認識衰退ならびに言語および行動障害を伴う進行性の記憶障害を特徴とする。当該疾患のその後の段階では、患者は全健忘を発症し、運動機能が非常に低下する。通常、診断から9年後に死亡し、しばしば他の症状（通常肺炎）を伴う(非特許文献２)。現行の治療は対症アプローチであり、認識機能障害の軽減および進行性の疾患病因を伴う行動症状の改善に焦点を置く。実際には、これらの治療は、認識機能障害のレベルに短期間（わずか2年）の認知効果をもたらすにすぎない。疾患の進行を遅らせるおよび、場合によっては食い止める疾患改善療法の可能性は、非常に大きい。このようなアプローチは患者の生活の質および重要なことは彼らのケアに、根本的かつ継続的な改善をもたらし、ならびにこの疾患に対する莫大な総医療費を削減する。
【０００３】
アルツハイマー疾患の臨床診断は、アルツハイマー疾患の可能性または予想を診断する、肉体的および精神的テストの組み合わせに基づく。死後、この疾患は脳内における十分に特徴付けされた神経学的特質によって裏付けられる。この神経学的特質として特定の脳領域における、実質プラーク（parenchymal  plaque）および脳血管におけるAβの沈着、神経細胞内の神経原線維変化の形成、シナプスの消失ならびに神経細胞の亜集団の消失が挙げられる(非特許文献３)。
【０００４】
多量の遺伝的、組織学的および機能的証拠により、β-アミロイドペプチド(Aβ)がアルツハイマー疾患進行の鍵となることが示唆される(非特許文献４)。
【０００５】
Aβはβアミロイド前駆タンパク質(APPとしても知られる)がBACE1として知られるアスパルチルプロテアーゼ酵素(β-セクレターゼ、Asp2またはMemapsin-2としても知られる)によって切断されることによって生成される(非特許文献５)。実質および血管の沈着の他に、Aβの可溶性オリゴマー形態がADの発症の一因となることが仮定されており、この可溶性オリゴマー形態が病初では神経細胞機能に、シナプス機能を損傷することにより影響を与え得る(非特許文献６)。不溶性アミロイドプラークがADの初期においてMCIに見出されるが、可溶性Aβ凝集体(オリゴマーまたはAβ由来の拡散性リガンド(ADDL)と称される)のレベルもこのような個体において増加しており、可溶性Aβレベルはアミロイドプラークよりも神経原線維変性およびシナプスマーカーの消失とより相関している(非特許文献７、非特許文献８)。高アミロイド生成性Aβ42およびアミノ末端が切断された形態のAβx-42は広範性および老人性プラークの両方に見出されるAβの優勢種である(非特許文献９、非特許文献１０)。Aβ42の相対レベルはアミロイドプラークへのAβ凝集の重要な調節因子であると考えられ、実際にAβ42がin vitroにおいて他のAβ形態よりも容易に凝集することが示されている(非特許文献１１)。このようにAβ42はAD発症の開始分子として関与していると考えられている(非特許文献１２)。Aβ42はAPP代謝の微量生成物であるが、その生成におけるわずかな変化がAβ沈着に多大な影響を与えるために、Aβ42を減少させることがADを治療する有効な方法であると仮定されている(非特許文献１２)。このことを支持するものとして、アミロイド前駆タンパク質(APP)およびプレセニリン遺伝子における変異がAβ42の相対レベルを優位に増大させ、アルツハイマー疾患(AD)発症までの期間を短くすることが報告されている(非特許文献１３)。しかし、沈着の速度もまた、異化およびAβクリアランスに依拠している点に留意すべきである。
【０００６】
アミロイド沈着の動物モデルが、変異ヒトトランス遺伝子をマウスにおいて過剰発現させることによって作製されている。ヒトAPPトランス遺伝子のみを過剰発現するマウスは通常、12月齢より脳プラーク様β-アミロイド沈着を発症するが(非特許文献１４、非特許文献１５)、変異ヒトAPPおよびプレセニリン-1(PS-1)トランス遺伝子の両方を有するマウスは通常、脳プラーク様β-アミロイド沈着を早ければ2月齢で発症する(非特許文献１６、非特許文献１７)。
【０００７】
外因性Aβの中枢神経系(CNS)および血漿間の輸送が脳のアミロイドレベルの調節に影響を与えており(非特許文献１８)、CSF AβはCSFから血漿へ迅速に輸送されることが、ますます明らかとなっている。したがって、Aβペプチドを用いた能動ワクチン接種または特異的Aβ抗体の受動的投与によって、血漿、CSFおよび最終的にCNS間の動的平衡を変化させる末梢Aβが迅速に拘束される。実際に現在多くの研究が、上記アプローチによりAβレベルを低下させ、Aβ病変を減少し、アミロイドーシスの様々なトランスジェニックモデルにおいて認知的効果をもたらすことが示されている。高等な種においても限られた研究が実施されている。16〜10年齢のサル（Caribbean vervet monkey)をAβペプチドを用いて10ヶ月にわたって免疫した。血漿中のAβ40レベルは2〜5倍に上昇した（ピークは251日目）が、Aβ40およびAβ42のCSFレベルは100日目までに優位に減少し、その後基準へと戻った。このCSFにおける減少はプラークによる苦しみの優位な減少を伴っていた(非特許文献１９)。血漿Aβレベルの同様の増大が、高齢(15〜20年齢)のアカゲザルを免疫付与した後にも検出された(非特許文献２０)。
【０００８】
脳アミロイドを標的とする第一免疫療法はElan/Wyeth’s AN-1792（能動ワクチン）であった。この治療は髄膜脳炎と一致する臨床的兆候が発症した後に終了した。サブグループ分析により、治療により認知機能の低下が遅くなったことが示唆された(非特許文献２１)。患者の死後分析により、プラーククリアランスの証拠も示された(非特許文献２２)。Bapineuzumab(AAB-001, Elan/Wyeth)（受動Mab療法）により、小規模の第１相安全性試験において認知スコアに優位な改善が示されている。
【０００９】
β-アミロイドレベルまたはβ-アミロイド沈着の増大を特徴とする他の疾患または障害としては、軽度の認識機能障害(非特許文献２３)、Dutchタイプのβ-アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、脳β-アミロイド血管症および様々なタイプの変性認知症（例えば、パーキンソン病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症および広範性 Lewis bodyタイプのアルツハイマー疾患(非特許文献２４、非特許文献２５)およびダウン症(非特許文献２６)を伴うものなど）が挙げられる
【非特許文献１】Citron M(2002)Nat. Neurosci 5, Suppl 1055-1057
【非特許文献２】Davis K.L. and Samules S.C.(1998)in Pharmacological Management of Neurological and Psychiatric Disorders eds Enna S.J. and Coyle J.T.(McGraw-Hill, New York  pp267-316)
【非特許文献３】Terry, RD(1991)J Neural Trans Suppl 53 : 141-145
【非特許文献４】Selkoe, D. J.(2001)Physiological Reviews 81: 741-766
【非特許文献５】De Strooper, B. and Konig, G.(1999)Nature 402: 471-472
【非特許文献６】Lambertら、(1998)Proceedings of the National Academy of Science, U.S.A. 95 : 6448-6453
【非特許文献７】Naslundら、(2000)J Am Med Assoc 283: 1571-1577
【非特許文献８】Younkin, S.(2001)Nat. Med. 1: 8-19
【非特許文献９】Iwatsubo, T(1994)Neuron. 13:45-53
【非特許文献１０】Gravina, SA(1995)J. Biol. Chem. 270:7013-7016
【非特許文献１１】Jarrett, JT(1993)Biochemistry.32:4693-4697
【非特許文献１２】Younkin SG,(1998)J. Physiol.(Paris). 92:289-292
【非特許文献１３】Selkoe D.J., Podlisny M.B.(2002)Annu. Rev. Genomics Hum. Gemet. 3:67-99
【非特許文献１４】Games D.ら、(1995)Nature 373: 523-527
【非特許文献１５】Hsiao K.ら、(1996)Science 274: 99-102)
【非特許文献１６】Kurt M.A.ら、(2001)Exp.Neurol. 171: 59-71
【非特許文献１７】McGowan E.ら、(1999)Neurolbiol. Dis. 6: 231-244
【非特許文献１８】Shibata,ら、(2000)J Clin Invest 106 : 1489-1499
【非特許文献１９】Lemere, CA(2004)Am J病理 165 : 283-297
【非特許文献２０】Gandy, S(2004)Alzheimer Dis Assoc Disord 18 : 44:46
【非特許文献２１】Nature Clin Pract Neurol(2005)1:84-85
【非特許文献２２】Gilman S.ら、(2005)Neurology 64(9)1553-1562
【非特許文献２３】MCI, Blasko I(2006)Neurobiology of aging “Conversion from cognitive health to mild cognitive impairment and Alzheimer’s disease: Prediction by plasma amyloid beta 42, medial temporal lobe atrophy and homocysteine” in press, e-published 19 Oct 2006
【非特許文献２４】Mollenhauer B(2007)J Neural Transm e-published 23 Feb 2007
【非特許文献２５】van Oijen, M  2006 5:655-60
【非特許文献２６】Mehta, PD(2007) 254:22-7
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の実施形態において、平衡定数KDが100pM未満でβ-アミロイドペプチド1-12(配列番号15)と結合するが、β-アミロイドペプチド2-13(配列番号44)とは結合しない抗体もしくは抗原結合断片および／またはそれらの誘導体である治療抗体を提供する（ここで両測定はストレプトアビジンチップ上に捕捉されたペプチドを利用する表面プラズモン共鳴アッセイにおいてなされる）。
【００１１】
本発明の別の実施形態において、平衡定数KDが100pM未満でβ-アミロイドペプチド1-12(配列番号15)と結合し、かつβ-アミロイドペプチド2-13(配列番号44)との結合における平衡定数KDがペプチド1-12(配列番号15)との結合における平衡定数KDより1000倍よりも大きな抗体もしくは抗原結合断片および／またはそれらの誘導体である治療抗体を提供する（ここで両測定はストレプトアビジンチップ上に捕捉されたペプチドを利用する表面プラズモン共鳴アッセイにおいてなされる）。
【００１２】
本発明の別の実施形態において、平衡定数KDが100pM未満でβ-アミロイドペプチド1-12(配列番号15)と結合し、かつβ-アミロイドペプチド2-13(配列番号44)との結合における平衡定数KDがペプチド1-12(配列番号15)との結合における平衡定数KDより10,000倍よりも大きな抗体もしくは抗原結合断片および／またはそれらの誘導体である治療抗体を提供する（ここで両測定はストレプトアビジンチップ上に捕捉されたペプチドを利用する表面プラズモン共鳴アッセイにおいてなされる）。
【００１３】
一態様において、ストレプトアビジンチップ上に捕捉されたペプチドを利用する表面プラズモン共鳴アッセイは、以下の実施例中に記載される表面プラズモン共鳴アッセイである。別の態様において、ストレプトアビジンチップ上に捕捉されたペプチドを利用する表面プラズモン共鳴アッセイは、以下にSPR BiacoreTM Analysisとして記載される方法A(i)である。
【００１４】
本発明の代替的な実施形態において、平衡定数KDが10nM未満でβ-アミロイドペプチド1-40と結合するが、β-アミロイドペプチド2-13(配列番号44)とは結合しない抗体もしくは抗原結合断片および／またはそれらの誘導体である治療抗体を提供する（ここで測定は以下の実施例における方法Bに記載される表面プラズモン共鳴アッセイにおいてなされる）。
【００１５】
本発明の別の代替的な実施形態において、平衡定数KDが10nM未満でβ-アミロイドペプチド1-40と結合し、かつβ-アミロイドペプチド2-13(配列番号44))との結合における平衡定数KDがペプチド1-12(配列番号15))との結合における平衡定数KDより1000倍よりも大きな抗体もしくは抗原結合断片および／またはそれらの誘導体である治療抗体を提供する（ここで両測定は以下の実施例の方法Bに記載される表面プラズモン共鳴アッセイにおいてなされる）。
【００１６】
本発明の別の代替的な実施形態において、平衡定数KDが10nM未満でβ-アミロイドペプチド1-40と結合し、かつβ-アミロイドペプチド2-13(配列番号44)との結合における平衡定数KDがペプチド1-12(配列番号15)との結合における平衡定数KDより10,000倍よりも大きな抗体もしくは抗原結合断片および／またはそれらの誘導体である治療抗体を提供する（ここで両測定は以下の実施例における方法Bに記載される表面プラズモン共鳴アッセイにおいてなされる）。
【００１７】
本発明の実施形態において、β-アミロイドペプチドと結合し、かつ以下のCDRを含む抗体もしくは抗原結合断片および／またはそれらの誘導体である治療抗体を提供する：
VH3遺伝子ファミリーを起源とするヒト重鎖可変領域内の
CDRH1: DNGMA(配列番号1)
CDRH2: FISNLAYSIDYADTVTG(配列番号2)
CDRH3: GTWFAY(配列番号3)
および
GenPept登録番号CAA51135に開示されるアミノ酸配列(配列番号24)を起源とするヒト軽鎖可変領域内の
CDRL1: RVSQSLLHSNGYTYLH(配列番号4)
CDRL2: KVSNRFS(配列番号5)
CDRL3: SQTRHVPYT(配列番号6)。
【００１８】
本明細書中において、「CDR」、「CDRL1」、「CDRL2」、「CDRL3」、「CDRH1」、「CDRH2」、「CDRH3」なる用語は、Kabatら;Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987に示されるKabat番号付け系に従う。従って、以下に本発明のCDRを規定する：
CDR:    残基
CDRH1:  31-35B
CDRH2:  50-65
CDRH3:  95-102
CDRL1:  24-34
CDRL2:  50-56
CDRL3:  89-97
VH3遺伝子ファミリーおよび関連する免疫グロブリン遺伝子の命名法はMatsudaら、(Journal of Experimental Medicine, 188:2151-2162, 1998)およびLefranc & Lefranc(The Immunoglobulin Factsbook. 2001. Academic Press: London)に記載されている。
【００１９】
特定の実施形態において、ヒト重鎖可変領域は以下のものを起源とする：
・以下のVH3ファミリーメンバーのサブセットから選択されるV遺伝子：VH3-48, VH3-21, VH3-11, VH3-7, VH3-13, VH3-74, VH3-64, VH3-23, VH3-38, VH3-53, VH3-66, VH3-20, VH3-9もしくはVH3-43
・以下のVH3ファミリーメンバーのサブセットから選択されるV遺伝子：VH3-48, VH3-21もしくはVH3-11
・VH3-48遺伝子
またはそれらの対立遺伝子。
【００２０】
Genbank登録番号M99675の配列はVH3-48遺伝子の対立遺伝子である。M99675は、ヒト重鎖遺伝子VH3-48(配列番号22)を構成し、かつ配列番号21で表される可変領域アミノ酸配列をコードする２つのエクソンを含んでなる一片のゲノムDNAからなるGenbankヌクレオチド配列である。特定の態様において、ヒトアクセプター重鎖フレームワークはM99675に由来する。
【００２１】
完全なV領域を構築するために、フレームワーク4は生殖細胞系にコードされたV遺伝子M99675に付加されなければならない。好適なフレームワーク4配列は、ヒトJH4ミニ遺伝子(Kabat):
YFDYWGQGTLVTVSS  (配列番号23)
［最初の４残基は、ドナー抗体より受け入れたCDRによって置換されているCDR3領域内に含まれる］
によってコードされるものを含む。
【００２２】
当業者は、生殖細胞系V遺伝子およびJ遺伝子が重鎖CDR3全体のコード配列を含まないことを理解する。しかし、本発明の抗体において、CDR3配列はドナー免疫グロブリンによって提供される。したがって、VH3-48などのVH遺伝子、JH4などのJHミニ遺伝子ならびに配列番号1、配列番号2および配列番号3などの重鎖CDRのセットの組合わせ(成熟した、完全に再編成された重鎖可変領域を模倣するように構築される)は、配列番号26、28、30で表されるような本発明の重鎖可変領域を規定するのに十分である。
【００２３】
Genpept ID CAA51134によってコードされる可変領域は、配列番号24で表されるアミノ酸配列を有する。
【００２４】
GenPept ID CAA51134で知られる軽鎖可変領域フレームワーク配列は完全に再編成された軽鎖可変領域の推定アミノ酸配列であり、当該データベース内の同じフレームワークを有する別のアミノ酸配列（Genpept受入番号S40356）と同一であり、またKlein, R.ら、Eur. J. Immunol. 23(12), 3248-3262(1993)に記載されている。CAA51134のDNAコード配列（Genbank受入番号X72467として利用可能である）は、配列番号25で表される。
【００２５】
本発明の特定の態様において、ヒトアクセプター重鎖フレームワークはM99675に由来し、JH4ミニ遺伝子およびヒトアクセプター軽鎖フレームワークはCAA51135に由来し、必要に応じて、配列番号17の配列を有するドナーVHドメインおよび配列番号19の配列を有するVLドメイン中に見出される対応する残基に基いて１または複数（例えば、１〜４、より好ましくは１〜３）のアミノ酸残基の置換を含有し、これらはβ-アミロイドペプチドに対するドナー抗体の結合アフィニティを完全にまたは実質的に完全に維持している。
【００２６】
「結合アフィニティを実質的に完全に」とは、治療抗体の結合アフィニティがドナー抗体と比べて最大でも10倍低下していることを意味する。
【００２７】
さらに特定の態様において、M99675およびJH4に由来するヒトアクセプター重鎖フレームワークは、24位、48位、93位および／または94位(Kabat番号付け)から選択される１〜４個のアミノ酸残基の置換を有する。
【００２８】
さらに本発明の特定の態様において、M99675およびJH4に由来するヒトアクセプター重鎖フレームワークは以下の残基(またはその保存的置換)を含む:
(i)
位置          残基
93            V
94            S
または
(ii)
位置          残基
24            V
93            V
94            S
または
(iii)
位置          残基
48            I
93            V
94            S。
【００２９】
本発明の一実施形態において、配列番号26, 28または30に表される配列を有するVH鎖および配列番号32に表される配列を有するVLドメインを含む治療抗体を提供する。
【００３０】
本発明の別の実施形態において、配列番号34, 36または38に表される配列を有する重鎖および配列番号40に表される配列を有する軽鎖を含む治療抗体を提供する。
【００３１】
本発明の別の実施形態において、本発明の治療抗体を含む医薬組成物を提供する。
【００３２】
本発明のさらなる実施形態において、β-アミロイドペプチド関連疾患に罹患するヒト患者を治療する方法を提供し、当該方法は治療有効量の本発明の治療抗体を当該患者に投与するステップを含む。
【００３３】
さらに、β-アミロイドペプチド関連疾患を治療するための薬剤の製造における本発明の治療抗体の使用を提供する。
【００３４】
本発明の別の実施形態において、本発明の治療抗体の製造方法を提供し、当該方法は当該抗体をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞にて発現させることを含む。
【００３５】
本発明の別の実施形態において、配列番号26, 28または30に表される配列を有するVH鎖を含む治療抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００３６】
本発明の別の実施形態において、配列番号32に表される配列を有するVLドメインを含む治療抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００３７】
本発明の別の実施形態において、配列番号34, 36または38に表される配列を有する治療抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００３８】
本発明の別の実施形態において、配列番号40に表される配列を有する治療抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００３９】
本発明のさらに特定の実施形態において、配列番号35, 37, 39または42に表される配列を含む、治療抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００４０】
本発明のさらに別の特定の実施形態において、配列番号41または43に表される配列を含む、治療抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００４１】
特定の実施形態において、抗体または断片および／もしくはそれらの誘導体である治療抗体は、a)古典経路による補体の活性化;およびb)抗体依存性細胞傷害の仲介の機能を実質的に欠いている。
【００４２】
本発明の別の実施形態において、配列番号17に表される配列を有するVHドメインおよび配列番号19に表される配列を有するVLドメインを含む抗体またはその断片を提供する。
【００４３】
本発明の別の実施形態において、配列番号17に表される配列を有するVHドメインを含む抗体重鎖またはその断片をコードするポリヌクレオチド（特に配列番号18のポリヌクレオチド）を提供する。
【００４４】
本発明の別の実施形態において、配列配列番号19に表される配列を有するVLドメインを含む抗体軽鎖またはその断片をコードするポリヌクレオチド（特に配列番号20のポリヌクレオチド）を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
1.抗体の構造
1.1インタクトな抗体
インタクトな抗体は通常、少なくとも2つの重鎖と2つの軽鎖を含んでなるヘテロ多量体糖タンパク質である。IgMの他に、インタクトな抗体はおよそ150Kdaからなるヘテロ4量体糖タンパク質であり、これは2つの同一の軽(L)鎖および2つの同一の重(H)鎖からなる。典型的に、各軽鎖は1つのジスルフィド共有結合によって重鎖に結合しているが、異なる免疫グロブリンイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は様々である。重鎖および軽鎖のそれぞれはまた、鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は一端に１つの可変ドメイン(VH)、続いて複数の定常領域を有する。各軽鎖は１つの可変ドメイン(VL)およびその別の端に１つの定常領域を有する；軽鎖の定常領域を重鎖の第1の定常領域と合わせ、軽鎖可変ドメインを重鎖の可変ドメインと合わせる。多くの脊椎動物種に由来する抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいてκおよびλと称され2つのタイプのいずれかに割り当てることができる。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基いて、ヒト抗体を5つの異なるクラス（IgA, IgD, IgE, IgGおよびIgM）に割り当てることができる。IgGおよびIgAはさらに、サブクラスIgG1, IgG2, IgG3およびIgG4；ならびにIgA1およびIgA2に細分することができる。種による変種が存在し、マウスおよびラットは少なくともIgG2aおよびIgG2bを有する。抗体の可変ドメインによって、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる特定の可変性を示す領域により、抗体に結合特異性を付与する。可変領域のより保存された部分はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。インタクトな重鎖および軽鎖それぞれの可変ドメインは3つのCDRに結合される4つのFRを含む。各鎖のCDRはFR領域によって接近して結合され、他の鎖に由来するCDRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常領域は抗原に対する抗体の結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)、Fcγ受容体への結合を介した食作用、新生児Fc受容体(FcRn)を介した半減期／クリアランス速度および補体カスケードのC1qコンポーネントを介した補体依存性細胞傷害への関与が示される。ヒトIgG2定常領域は、古典経路により補体を活性化する能力または抗体依存性細胞傷害を仲介する能力を欠いている。IgG4定常領域は古典経路により補体を活性化する能力を欠き、抗体依存性細胞傷害をわずかに仲介するのみである。上記のエフェクター機能を実質的に欠いている抗体を、「非溶解性」抗体と称し得る。
【００４６】
1.1.1 ヒト抗体
ヒト抗体は当業者に公知の複数の方法によって作製できる。ヒト抗体はヒトミエローマまたはマウス‐ヒトヘテロミエローマ細胞系を使用したハイブリドーマ法を使用して作製できる（Kozbor J.Immunol 133, 3001,(1984)およびBrodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp51-63(Marcel Dekker Inc, 1987参照)。代替的な方法では、ヒトV領域レパートリーを利用するファージライブラリーまたはトランスジェニックマウスを使用することを含む(Winter G,(1994), Annu.Rev.Immunol 12,433-455, Green LL(1999), J.Immunol.methods 231, 11-23参照)。
【００４７】
いくつかのトランスジェニックマウス系統が今日利用可能であり、それらのマウス免疫グロブリン遺伝子座はヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントと置換されている(Tomizuka K,(2000)PNAS 97,722-727; Fishwild D.M (1996)Nature Biotechnol. 14,845-851, Mendez MJ, 1997, Nature Genetics, 15,146-156、参照)。抗原チャレンジ時に、上記マウスはヒト抗体のレパートリーを作製することができ、これより目的の抗体を選択することができる。
【００４８】
特に注目すべきなのは、TrimeraTMシステム［(Eren Rら、(1998)Immunology 93:154-161)参照、ヒトリンパ球を放射線を照射したマウスに移植する］、Selected Lymphocyte Antibody System［(SLAM, Babcookら、PNAS(1996)93:7843-7848参照)、ヒト(または他の種)のリンパ球を大量プールのin vitro抗体産生法、その後デコンブレート（deconvulated）、限界希釈および選択手順に付す］ならびにXenoマウスIITM(Abgenix Inc)である。代替的アプローチとしては、MorphodomaTM technologyを使用するMorphotek Inc製のものを利用することが可能である。
【００４９】
ファージディスプレイ技術をヒト抗体(およびその断片)を作製するために用いることができる（McCafferty; Nature, 348, 552-553(1990)およびGriffiths ADら、(1994)EMBO 13:3245-3260参照）。当該技術において、抗体Vドメイン遺伝子を線維状バクテリオファージのメジャーまたはマイナーコートのタンパク質遺伝子 （例えば、M13またはfd）のいずれかにインフレームでクローニングし、(通常ヘルパーファージを用いて)ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片としてディスプレイする。抗体の機能的特性に基く選択により、当該特性を示す抗体をコードする遺伝子を選択する。ファージディスプレイ法を用いて、上記疾患または障害に罹患している個体より得たヒトB細胞または非免疫化ヒトドナーより得たヒトB細胞より作製したライブラリーより抗原特異的抗体を選択することができる(Marks; J.Mol.Bio. 222,581-597, 1991参照)。インタクトなヒト抗体がFcドメインを含むことが所望される場合、ファージディスプレイに由来する断片を所望される定常領域を含みかつ安定して発現する細胞系統を確立する哺乳動物発現ベクターに再クローニングすることを必要とする。
【００５０】
アフィニティ成熟法(Marks; Bio/technol 10,779-783(1992))を用いて結合アフィニティを改良することができる。当該方法において、ヒト一次抗体のアフィニティは、H鎖およびL鎖のV領域を天然の変異体と逐次的に置換し、改良された結合アフィニティに基いて選択することによって改良される。「エピトープインプリンティング」などの当該法の改良法も今日利用可能である（WO 93/06213参照）。さらに、Waterhouse; Nucl.Acids Res 21, 2265-2266(1993)参照。
【００５１】
1.2 キメラ抗体およびヒト化抗体
ヒト疾患または障害の治療におけるインタクトな非ヒト抗体の使用は、潜在的な免疫原性に関する、今日十分に確立された問題を伴う（特に、当該抗体の繰り返し投与時）。すなわち、患者の免疫系は非自己としてインタクトな非ヒト抗体を認識し、中和反応を開始し得る。完全なヒト抗体の開発に加えて(上記、参照)様々な手法が何年にも渡って開発されており、上記問題を克服し、通常インタクトな治療抗体中の非ヒトアミノ酸配列からなる組成物を減少させる一方で、免疫化動物（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）より非ヒト抗体を比較的容易に得ることは維持されている。概して、2つのアプローチを使用して、上記を達成することができる。第１はキメラ抗体であり、これは通常ヒト定常領域に融合されている非ヒト(例えば、マウスなどのげっ歯類)可変ドメインを含む。抗体の抗原結合部位は可変領域内に位置するために、キメラ抗体は抗原に対するその結合アフィニティは保持しているが、ヒト定常領域のエフェクター機能を獲得しており、上記のようなエフェクター機能を果たすことができる。キメラ抗体は通常、組換えDNA法を使用して作製する。抗体をコードするDNA(例えば、cDNA)を従来法を使用して単離し、配列決定する(例えば、本発明の抗体のH鎖およびL鎖の可変領域をコードする遺伝子（例えば、上記配列番号18および20のDNA)に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用する）。ハイブリドーマ細胞はこのようなDNAの典型的な供給源としての機能を果たす。単離した後、当該DNAを発現ベクターに組み入れ、そしてこのベクターをE.Coli, COS細胞、CHO細胞、PerC6細胞またはミエローマ細胞など（これらは本来、抗体合成のために免疫グロブリンタンパク質を産生しない）の宿主細胞にトランスフェクトする。当該DNAをヒトL鎖およびH鎖のコード配列を対応する非ヒト(例えば、マウス)HおよびL定常領域に置換することによって改変することができる（例えば、Morrison; PNAS 81, 6851 (1984)参照）。したがって、本発明の別の実施形態において、ヒト定常領域(IgGイソタイプ、例えば、IgG1であり得る)に融合されている配列番号17の配列を有するVHドメインと配列番号19の配列を有するVLドメインとを含むキメラ抗体を提供する。
【００５２】
第2のアプローチは、ヒト化抗体の作製を含む。当該方法において抗体の非ヒト含有量は可変領域をヒト化することによって減少させる。ヒト化のための2つの方法が注目されている。第1の方法はCDR移植によるヒト化である。CDRは抗体のN末端付近にループを構築する。ここにCDRはフレームワーク領域によってもたらされたスキャホールドにマウントされた表面を形成する。抗体の抗原結合特異性は主に、トポグラフィーによっておよびそのCDR表面の化学的特性によって規定される。これらの特徴は次に、個々のCDRの構造、CDRの相対的配置、CDRを含む残基の側鎖の性質および配置によって決定される。免疫原性の大きな減少は、非ヒト(例えば、マウス)抗体(「ドナー」抗体)のCDRのみを好適なヒトフレームワーク(「アクセプターフレームワーク」)および定常領域に移植することによって得ることができる(Jonesら、(1986)Nature 321,522-525およびVerhoeyen Mら、(1988)Science 239, 1534-1536参照)。しかし、CDR移植自体は抗原結合特性を完全に保持できず、有効な抗原結合アフィニティを回復する場合、ドナー抗体のいくつかのフレームワーク残基は、ヒト化分子中に保存する必要がある(しばしば“復帰突然変異”と称される)(Queen Cら、(1989)PNAS 86, 10,029-10,033, Co, Mら、(1991)Nature 351, 501-502参照)。この場合、非ヒトドナー抗体に対して最高の配列相同性(通常、60%またはそれ以上)を示すヒトV領域をデータベースより選択し、ヒトフレームワーク(FR)を提供し得る。ヒトFRの選択は、ヒトコンセンサスまたは個々のヒト抗体のいずれかより行ない得る。必要に応じて、ドナー抗体由来の主要な残基をヒトアクセプターフレームワークに置換しCDR構造を保存しても良い。抗体のコンピュータモデリングを使用し、構造的に重要な残基などを同定するのに役立てても良い（WO99/48523参照）。
【００５３】
あるいは、ヒト化は「ベニア化」法によって行い得る。ヒトおよびマウスの固有免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域の統計分析によって、露出した残基の正確なパターンがヒトおよびマウスの抗体で異なること、ならびに個々の表面位置の大部分が少数の異なる残基に対して優先性が高いことが示された(Padlan E.A.ら;(1991)Mol.Immunol.28, 489-498およびPedersen J.T.ら、(1994)J.Mol.Biol. 235; 959-973参照)。したがって、非ヒトFvの免疫原性をヒト抗体中に通常見出されるものとは異なるそのフレームワーク領域中の露出した残基を置換することによって減少させることができる。タンパク質の免疫原性が表面への接近可能性と相関し得るために、表面残基の置換はマウス可変領域をヒト免疫系より「隠す」のに十分であり得る(Mark G.E.ら、(1994)in Handbook of Experimental Pharmacology vol.113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, pp105-134参照)。このヒト化の方法は、抗体の表面のみを改変し、支持残基は影響を受けないために「ベニア化」と称される。さらなる代替的アプローチとしては、WO04/006955に記載されるもの、およびHumaneeringTM法(Kalobios)（当該方法は細菌発現系を使用し、配列中のヒト生殖細胞系列に近接する抗体を産生する）(Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics January 2007, San Diego,California)。
【００５４】
当業者には明らかであるように、「由来する」との用語は材料の物理的起源という意味の供給源のみでなく、材料と構造的に同一であるが、関連する供給源を起源としない材料を規定することを意図する。したがって、「ドナー抗体に見出される残基」とは必ずしも、ドナー抗体より精製されていることを必要としない。
【００５５】
当該分野において、特定のアミノ酸置換が「保存的」なものであるとみなされるということは十分に理解されている。アミノ酸は一般的な側鎖の特性に基いてグループ分けされ、本発明の治療抗体の結合アフィニティを完全にまたは実質的に完全に保持しているグループ内の置換は保存的置換とみなされる。以下の表1参照：
【表１】
2009531380.tif 000002
【００５６】
1.3 二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体誘導体であり、また本発明の一部を形成する。このような抗体の製造法は当該分野において公知である。従来的に、二重特異性抗体の組換え製造は2つの免疫グロブリン H鎖-L鎖対の共発現に基いており、ここで2つのH鎖は異なる結合特異性を有する（Millsteinら、Nature 305 537-539(1983), WO93/08829およびTrauneckerら、EMBO, 10, 1991, 3655-3659参照）。H鎖およびL鎖の任意の組み合わせにより、10種の異なる抗体構造からなる潜在的な混合物が作製され、この中の1つだけが所望の結合特異性を有する。代替的アプローチは、所望される結合特異性を有する可変ドメインをヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域の少なくとも一部を含む重鎖定常領域に融合することを含む。少なくとも1つの融合体に存在する軽鎖結合に必要な部位を含有するCH1領域を有することが好ましい。これらの融合体をコードするDNAおよび必要な場合にはL鎖を別々の発現ベクターに挿入し、その後好適な宿主生物に同時トランスフェクションする。2または3つ全ての鎖のコード配列を1つの発現ベクターに挿入することも可能である。1つの好ましいアプローチにおいて、二重特異性抗体は1のアームに第1の結合特異性を有するH鎖と別のアームに第2の結合特異性を付与するH-L鎖対とからなる（WO94/04690参照）。さらに、Sureshら、Methods in Enzymology 121, 210, 1986参照。
【００５７】
脳への治療用タンパク質の送達は、血液脳関門(BBB)によって妨げられている。本発明の抗体または本発明の抗体断片をBBBを越えて送達することが所望される場合、様々なストラテジーがこのような送達を必要な場合に増強するために提案されている。
【００５８】
血液から、必要とされる栄養素および因子を得るために、BBBはいくつかの特定の受容体を保有し、これにより循環血液より脳へ化合物を輸送する。研究によるといくつかの化合物、例えば、インスリン(Duffy KRら、(1989)Brain Res. 420:32-38参照)、トランスフェリン(Fishman JBら、(1987)J.Neurosci 18:299-304参照)ならびにインスリン様増殖因子1および2(Pardridge WM(1986)Endocrine Rev.7:314-330およびDuffy KRら、(1986)Metabolism 37:136-140参照)は、受容体仲介トランスサイトーシスを介してBBBを越える。したがって、これらの分子の受容体は、本発明の治療抗体がいわゆる「誘導（vectored）」抗体を使用して脳に入るための潜在的な手段を提供する(Pardridge WM(1999)Advanced Drug Delivery Review 36:299-321参照)。例えば、トランスフェリン受容体に対する抗体は、脳実質に動的に輸送されることが示されている(Friden PMら、(1991)PNAS 88:4771-4775およびFriden PMら、(1993)Science 259:373-377参照)。したがって、1つの潜在的なアプローチは、前述の二重特異性抗体または二重特異性断片を作製することであり、ここで第1の特異性および第2の特異性は、BBBにある輸送受容体に対する（例えば、第2の特異性はトランスフェリン輸送受容体に対する）。
【００５９】
1.4抗体断片
本発明の特定の実施形態において、抗原結合断片である治療抗体を提供する。このような断片は、インタクトな抗体および／またはヒト化抗体および／またはキメラの抗体の機能的抗原結合断片であり得る（例えば、Fab, Fd, Fab', F(ab')2, Fv,前述の抗体のScFv断片）。定常領域を欠いている断片は、古典経路により補体を活性化する能力または抗体依存性細胞傷害を仲介する能力を欠失している。従来的に、このような断片はインタクトな抗体のタンパク質消化、例えば、パパイン消化により作製されるが(例えば、WO 94/29348参照)、組換え技術により形質転換した宿主細胞より直接産生することもできる。ScFvの作製については、Birdら、(1988)Science, 242, 423-426参照。さらに、抗体断片は下記の様々なエンジニアリング技術を使用して作製することができる。
【００６０】
Fv断片は、Fab断片よりもその2つの鎖の相互作用エネルギーが低いと考えられる。VHドメインおよびVLドメインの結合を安定化するために、これらをペプチド(Birdら、(1988)Science 242, 423-426, Hustonら、PNAS, 85, 5879-5883)、ジスルフィド架橋(Glockshuberら、(1990)Biochemistry, 29, 1362-1367)および「ノブインホール（knob in hole）」変異(Zhuら、(1997), Protein Sci., 6, 781-788)により結合する。ScFv断片は当業者に周知の方法で作製することができる（Whitlowら、(1991)Methods companion Methods Enzymol, 2, 97-105およびHustonら、(1993)Int.Rev.Immunol 10, 195-217参照）。ScFvは細菌細胞（例えば、E.Coliなど）にて産生し得るが、より一般的には、真核細胞にて産生される。ScFvは、その産物が一原子価である点（これにより多価結合による増強された親和性が排除される）およびその半減期が短い点において不都合である。これらの問題点を克服するための試みとしては、化学的結合によりさらなるC末端システインを含有するScFVより作製される二価(ScFv')2(Adamsら、(1993)Can.Res 53, 4026-4034およびMcCartneyら、(1995)Protein Eng. 8, 301-314)または不対C末端システイン残基を含有するScFvの自発的な部位特異的二量化によって作製される二価(ScFv')2(Kipriyanovら、(1995)Cell. Biophys 26, 187-204参照)が挙げられる。あるいは、ScFvはペプチドリンカーを3〜12残基に短くして、「二重特異性抗体」を形成することによって多量体を形成せざるを得ない（Holligerら、PNAS(1993), 90, 6444-6448)。リンカーをさらに減らすことによって、ScFV三量体(「三重特異性抗体」, Korttら、(1997)Protein Eng, 10, 423-433参照)および四量体(「四重特異性抗体」, Le Gallら、(1999)FEBS Lett, 453, 164-168参照)を生じ得る。二価ScFV分子の構築はまた、タンパク質二量化モチーフを用いて遺伝子融合し、「ミニ抗体」(Packら、(1992)Biochemistry 31, 1579-1584参照)および「ミニボディー」(Huら、(1996), Cancer Res. 56, 3055-3061参照)を形成することによって行うことができる。ScFv-Sc-Fvタンデム((ScFV)2)はまた、2つのScFvユニットを第3のペプチドリンカーによって連結することによって作製することができる(Kuruczら、(1995)J.Immol.154, 4576-4582)。二重特異性抗体は、短いリンカーによって別の抗体のVLドメインに結合された1抗体由来のVHドメインからなる一本鎖融合産物を２つ、非共有結合性会合させることにより作製できる(Kipriyanovら、(1998), Int.J.Can 77,763-772参照)。このような二重特異性抗体の安定性は、前述のジスルフィド架橋または「ノブインホール」変異を導入することによって、または一本鎖二重特異性抗体(ScDb)を形成することによって増強することができる。この場合2つのハイブリッドScFv断片は、ペプチドリンカーにより結合されている(Kontermannら、(1999)J.Immunol.Methods 226 179-188参照)。四価の二重特異性分子を、例えば、ScFv断片をIgG分子のCH3ドメインにまたは Fab断片にヒンジ領域により融合することによって得ることができる（Colomaら、(1997)Nature Biotechnol. 15, 159-163参照)。あるいは、四価の二重特異性分子が二重特異性一本鎖二重特異性抗体を融合することによって作製されている(Altら(1999)FEBS Lett 454, 90-94参照)。小さな四価の二重特異性分子がまた、ヘリックス‐ループ‐ヘリックスモチーフを含有するリンカーによりScFv-ScFvタンデムを二量化するか(DiBi ミニ抗体, Mullerら、(1998)FEBS Lett 432, 45-49参照)、または4つの抗体可変ドメイン(VHおよびVL)を分子内のペアリングを回避する向きで含む一本��分子を二量化する(タンデム二重特異性抗体, Kipriyanovら、(1999)J.Mol.Biol. 293, 41-56参照)ことによって形成できる。二重特異性F(ab')2断片は、Fab'断片の化学的結合またはロイシンジッパーによるヘテロ二量化によって作製できる(Shalabyら、(1992)J.Exp.Med. 175, 217-225およびKostelnyら、(1992), J.Immunol. 148, 1547-1553参照)。さらに、単離されたVHおよびVLドメインも利用可能である(US 6, 248,516; US 6,291,158; US 6, 172,197参照)。
【００６１】
1.5ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体は、本発明の実施形態を形成する誘導体である。ヘテロコンジュゲート抗体は任意の簡便な架橋法を使用して形成される2つの共有結合で結合した抗体からなる。US 4,676,980参照。
【００６２】
1.6 その他の改変
抗体のFc領域と様々なFc受容体(FcγR)との間の相互作用は、抗体のエフェクター機能（抗体依存性細胞傷害(ADCC)、補体の固定、食作用および抗体の半減期/クリアランス）を仲介すると考えられる。本発明の抗体のFc領域に対する様々な改変を、所望されるエフェクター特性に応じて行うことができる。特に、a)古典経路による補体の活性化；およびb)抗体依存性細胞傷害の仲介といった機能を実質的に欠いているヒト定常領域は、特定の変異、例えば、234位、235位、236位、237位、297位、318位、320位および／または322位における変異を含有するIgG4定常領域、IgG2定常領域およびIgG1定常領域を含む（EP0307434(WO8807089)、EP 0629 240(WO9317105)およびWO 2004/014953に開示される）。重鎖定常領域のCH2ドメイン内の残基235または237(Kabat番号付け; EU Index system)における変異は別々に記載されており、FcγRI, FcγRIIおよびFcγRIII結合に対する結合を減少し、したがって、抗体依存性細胞傷害(ADCC)を減少させる(Duncanら、Nature 1988, 332; 563-564; Lundら、J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662; Chappelら、PNAS 1991, 88; 9036-9040; Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992, 51;1-84; Morganら、Immunology 1995, 86; 319-324; Hezarehら、J. Virol. 2001, 75(24); 12161-12168)。さらに、いくつかの報告によると、これら残基のいくつかが補体依存性細胞傷害(CDC)の補充または仲介に関与していることが記されている(Morganら、1995; Xuら、Cell. Immunol. 2000; 200:16-26; Hezarehら、J. Virol. 2001, 75(24); 12161-12168)。したがって、残基235および237は共に、アラニン残基に変異し(Brettら、Immunology 1997, 91; 346-353; Bartholomewら、Immunology 1995, 85; 41-48;およびWO9958679)補体仲介による効果およびFcγR仲介による効果を共に減少させる。これらの定常領域を含む抗体を「非溶解性」抗体と称し得る。
【００６３】
サルベージ受容体結合エピトープを抗体に組み入れ、血清半減期を増大させることができる（US 5,739,277参照）。
【００６４】
現在、5つのヒトFcγ受容体が分かっている： FcγR(I), FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIaおよび新生児FcRn。Shieldsら、(2001)J.Biol.Chem 276, 6591-6604において、IgG1残基の共通セットがFcγRの全てを結合するのに関与しているが、FcγRIIおよびFcγRIIIは当該共通セットの外側にある別個の部位を用いることが示された。IgG1残基の1グループは、アラニンに変えた場合（Pro-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297およびPro-239）、全てのFcγRに対する結合が減少した。全てIgG CH2ドメイン内にあり、ヒンジ結合CH1およびCH2付近にクラスター化している。FcγRIは結合のためにIgG1残基の共通セットのみを利用するが、FcγRIIおよびFcγRIIIは当該共通セットの他に別個の残基と相互作用する。いくつかの残基の改変により、FcγRII(例えば、Arg-292)またはFcγRIII(例えば、Glu-293)に対する結合のみが減少した。いくつかの変異体はFcγRIIまたはFcγRIIIに対する改良された結合を示したが、他の受容体に対する結合は影響を受けなかった(例えば、Ser-267AlaはFcγRIIに対する結合は改良されたが、FcγRIIIに対する結合は影響を受けなかった)。他の変異体はFcγRIIまたはFcγRIIIに対する改良された結合を示すと同時に、他の受容体に対する結合は減少した(例えば、Ser-298AlaはFcγRIIIに対する結合は改良されたが、FcγRIIに対する結合は減少した)。FcγRIIIaについて、最高の結合IgG1変異体はSer-298, Glu-333およびLys-334に複合アラニン置換を有していた。新生児FcRn受容体は、IgG分子を分解から保護し、それにより血清半減期および組織を越えるトランスサイトーシスを増強すると考えられる(Junghans R.P(1997)Immunol.Res 16. 29-57およびGhetieら、(2000)Annu.Rev.Immunol. 18, 739-766参照)。ヒトFcRnと直接相互作用させるヒトIgG1残基は、Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434およびHis435を含む。
【００６５】
本発明の治療抗体は、上記定常領域のいずれかの改変を組込むことができる。
【００６６】
特定の実施形態において、治療抗体は、a)古典経路による補体の活性化、およびb)抗体依存性細胞傷害の仲介といった機能を実質的に欠いている。さらに特定の実施形態において、本発明は、半減期/クリアランスおよび／またはエフェクター機能（例えば、ADCCおよび／または補体依存性細胞傷害および／または補体溶解）を改良するために上に詳述される残基変化を1つ（または複数）有する本発明の治療抗体を提供する。
【００６７】
本発明のさらなる態様において、治療抗体は235位(例えば、L235A)および237位(例えば、G237A)(Kabatに述べられているEUスキームによる番号付け)にアラニン(または別の破壊)置換を有するイソタイプヒトIgG1の定常領域を有する。
【００６８】
本発明の他の誘導体としては、本発明の抗体のグリコシル化変異体が挙げられる。それらの定常領域の保存された位置における抗体のグリコシル化は、抗体機能（特に、上記されるようなエフェクター機能）に大きく影響を与えることが知られている（例えば、Boydら、(1996), Mol.Immunol. 32, 1311-1318参照）。本発明の治療抗体のグリコシル化変異体としては、1または複数の糖鎖が付加、置換、欠失または改変されているものが企図される。アスパラギン-X-セリンまたはアスパラギン-X-スレオニンモチーフを導入することによって、糖鎖を酵素により付着させることが可能な部位を作製し、その結果、抗体のグリコシル化を操作するために用いることができる。Rajuら、(2001)Biochemistry 40, 8868-8876において、TNFR-IgGイムノアドヘシンの末端シアル化（sialyation）が、β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／またはα,2,3 シアリルトランスフェラーゼを使用した、再ガラクトシル化および／または再シアリル化の方法により増大した。末端シアリル化の増大により、免疫グロブリンの半減期が増大すると考えられる。多くの糖タンパク質と同じように抗体は通常、糖形態の混合物として本来作製される。この混合物は、抗体が真核細胞、特に哺乳動物細胞において産生される場合に、特に明らかである。様々な方法が規定される糖形態を製造するために開発されている（Zhangら、Science(2004), 303, 371, Searsら、Science,(2001)291, 2344, Wackerら、(2002)Science, 298 1790, Davisら、(2002)Chem.Rev. 102, 579, Hangら、(2001)Acc.Chem.Res 34, 727参照）。このように本発明は、本明細書中に記載されるような複数の治療抗体(IgGイソタイプ、例えば、IgG1であり得る)に関し、当該抗体は規定された数(例えば、7以下、例えば、5以下、例えば、２または1)の当該抗体の糖形態を含む。
【００６９】
本発明による誘導体はまた、非タンパク質様（non-proteinaeous）ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン）に結合されている本発明の治療抗体を含む。PEGへのタンパク質のコンジュゲートはタンパク質の半減期を増大させるため、ならびにタンパク質の抗原性および免疫原性を減少させるための確立された技法である。異なる分子量および形状(線状または分枝状)におけるPEG化の使用が、インタクトな抗体およびFab'断片を用いて調べられている（Koumenis I.L.ら、(2000)Int.J.Pharmaceut. 198:83-95参照）。特定の実施形態においては、a)古典経路による補体の活性化およびb)抗体依存性細胞傷害の仲介といったエフェクター機能を保持していない、PEGに結合されている本発明の抗原結合断片(例えば、Fab断片またはscFv)を含む。
【００７０】
2. 製造方法 
本発明の抗体は、ヤギ(Pollockら、(1999), J.Immunol.Methods 231:147-157参照)、ニワトリ(Morrow KJJ(2000)Genet.Eng.News 20:1-55参照)、マウス(Pollockら、ibid)または植物(Doran PM,(2000)Curr.Opinion Biotechnol. 11, 199-204, Ma JK-C(1998), Nat.Med. 4; 601-606, Baez Jら、BioPharm(2000)13: 50-54, Stoger Eら;(2000)Plant Mol.Biol. 42:583-590参照)などのトランスジェニック生物において製造し得る。抗体はまた、化学合成によっても製造し得る。しかし、本発明の抗体は通常、当業者にとって周知である組換え細胞培養技術を使用して製造する。抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、宿主細胞におけるさらなる増殖または発現のための複製可能なベクター（例えば、プラスミド）に挿入する。有用な発現系の1つはグルタミン酸シンテターゼシステム(例えば、Lonza Biologicsより販売)である（特に宿主細胞がCHOまたはNS0である場合(下記)）。抗体をコードするポリヌクレオチドは、従来法(例えば、オリゴヌクレオチドプローブ)を使用して容易に単離および配列決定できる。使用し得るベクターとしては、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ミニ染色体が挙げられ、これらのプラスミドは典型的な実施形態である。通常、このようなベクターはさらに、軽鎖および／または重鎖ポリヌクレオチドに機能的に連結されているシグナル配列、複製起点、1または複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列を含み、それによって発現を促進する。軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチドは別々のベクターに挿入して、同一の宿主細胞に同時にまたは逐次的に導入(例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションまたは形質導入による)しても良いし、必要な場合には重鎖および軽鎖の両方を同一のベクターに挿入し、その後上記のように導入しても良い。
【００７１】
遺伝子コードの冗長性により、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドの代替的なポリヌクレオチドが、本発明のポリペプチドをコードするために利用可能であることは、当業者にはすぐに明らかであろう。
【００７２】
2.1シグナル配列
本発明の抗体は、成熟タンパク質のN末端に特定の切断部位を有する異種シグナル配列を伴う融合タンパク質として産生され得る。シグナル配列は宿主細胞によって認識され、処理されなければならない。原核生物の宿主細胞について、シグナル配列はアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定性エンテロトキシン IIリーダーであり得る。酵母の分泌のための、シグナル配列は酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダーまたは酸性ホスファターゼリーダーであり得る（例えば、WO90/13646参照）。哺乳動物細胞系において、ウイルス分泌リーダー（単純ヘルペスgDシグナル）および天然の免疫グロブリンシグナル配列(例えば、ヒトIg重鎖)が利用可能である。通常、シグナル配列を、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドの読み枠内にライゲートする。
【００７３】
2.2 複製起点
複製起点は多くのグラム陰性菌に好適なpBR322、多くの酵母用の2μプラスミドおよび多くの哺乳動物細胞用の様々なウイルス系（例えば、SV40,ポリオーマ, アデノウイルス, VSVまたはBPV）と共に、当該分野において周知である。通常、SV40複製起点コンポーネントは、組み入れられた哺乳動物発現ベクターを必要としない。しかし、SV40 oriは、初期プロモーターを含むために含まれ得る。
【００７４】
2.3 選択マーカー
典型的な選択遺伝子はタンパク質をコードし、(a)抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか、(b)補体栄養要求性欠損を補足するか、もしくは複合培地で得ることができない栄養素を供給するか、または(c)これらの組合わせである。選択スキームは、ベクターを含むかまたは含まない宿主細胞の増殖を停止させることを含み得る。本発明の治療抗体をコードする遺伝子を用いて良好に形質転換した細胞は、例えば、同時送達された選択マーカーによって付与された薬剤耐性のために生き残る。一例はDHFR選択系であり、当該系において形質転換体はDHFR陰性宿主系統で作製される(例えば、Page and Sydenham 1991 Biotechnology 9: 64-68)。当該系において、DHFR遺伝子を本発明の抗体のポリヌクレオチド配列と同時送達し、その後DHFR陽性細胞を、ヌクレオシドを取り除くことによって選択した。必要な場合には、DHFRインヒビターメトトレキサートを用いて、DHFR遺伝子増幅を伴う形質転換体を選択する。DHFR遺伝子を本発明の抗体コード配列またはその機能的誘導体に機能的に連結することによって、DHFR遺伝子増幅により、所望される目的の抗体配列の同時増幅を生じる。CHO細胞は当該DHFR/メトトレキサート選択に特に有用な細胞系であり、DHFR系を使用した宿主細胞の増殖および選択法は当該分野において十分に確立されている(Kaufman R.J.ら、J.Mol.Biol.(1982)159, 601-621,  概説についてはWerner RG, Noe W, Kopp K,Schluter M,” Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals”, Arzneimittel-Forschung. 48(8):870-80, 1998 Aug参照)。別の例はグルタミン酸シンテターゼ発現系である(Bebbingtonら、Biotechnology 1992 Vol 10 p169)。酵母において使用するための好適な選択遺伝子は、trp1遺伝子である（Stinchcombら、Nature 282, 38, 1979参照）。
【００７５】
2.4プロモーター
本発明の抗体を発現するための好適なプロモーターを抗体をコードするDNA/ポリヌクレオチドに機能的に連結する。原核細胞の宿主に対するプロモーターとしては、phoAプロモーター、β-ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファンおよびハイブリッドプロモーター（例えば、Tac）が挙げられる。酵母細胞での発現に好適なプロモーターとしては、3-ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド3ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース6ホスフェートイソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼおよびグルコキナーゼが挙げられる。誘導可能な酵母プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロムC、酸ホスファターゼ、メタロチオネインおよび窒素代謝またはマルトース/ガラクトース利用に関与する酵素が挙げられる。哺乳動物細胞系における発現のためのプロモーターとしては、ウイルスプロモーターを含むRNA ポリメラーゼIIプロモーター（例えば、ポリオーマ、鶏痘ウイルスおよびアデノウイルス(例えば、アデノウイルス2)、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス(特に、前初期遺伝子プロモーター)、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、アクチン、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター）および初期または後期シミアンウイルス40）ならびに非ウイルスプロモーター、例えば、EF-1α(Mizushima and Nagata Nucleic Acids Res 1990 18(17):5322)が挙げられる。プロモーターの選択は、発現に用いられる宿主細胞との好適な適合性に基づき得る。
【００７６】
2.5 エンハンサーエレメント
必要に応じて、例えば、高等な真核生物における発現のために、さらなるエンハンサーエレメントを上記プロモーターにあることが見出されているエンハンサーエレメントに代えて、またはそれらと共に含めても良い。好適な哺乳動物エンハンサー配列としては、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン、メタロチオニンおよびインスリンに由来するエンハンサーエレメントが挙げられる。あるいは、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーエレメント、例えばSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、バキュロウイルスエンハンサーまたはマウスIgG2a遺伝子座(WO04/009823参照)を使用し得る。このようなエンハンサーは通常、ベクターにおいてプロモーターの上流部位に配置されるが、他の部位、例えば、非翻訳領域内またはポリアデニル化シグナルの下流にも配置することができる。エンハンサーの選択および配置は、発現に用いられる宿主細胞との好適な適合性に基づき得る。
【００７７】
2.6 ポリアデニル化／停止
真核生物の系において、ポリアデニル化シグナルは本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されている。このようなシグナルは通常、オープンリーディングフレームの3’に配置される。哺乳動物の系において、シグナルの非限定的な例としては、成長ホルモン、伸長因子-1αおよびウイルス(例えば、SV40)遺伝子またはレトロウイルスロングターミナルリピートに由来するものが挙げられる。酵母の系において、ポリアデニル化／停止シグナルの非限定的な例としては、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)およびアルコールデヒドロゲナーゼ 1(ADH)遺伝子に由来するものが挙げられる。原核生物の系において、ポリアデニル化シグナルは通常必要ではなく、その代わりに通常、短くまたより規定されたターミネーター配列を用いる。ポリアデニル化／停止配列の選択は、発現に用いられる宿主細胞との好適な適合性に基づき得る。
【００７８】
2.7 産生量を増大させるための他の方法／エレメント
上記の他に、産生量を増大させるために用いられ得る他の特性としては、クロマチンリモデリングエレメント、イントロンおよび宿主細胞特異的コドン改変が挙げられる。本発明の抗体のコドン使用頻度を改変し、宿主細胞のコドン偏位を適合して転写および／または産生量が増大するようにし得る(例えば、Hoekema Aら、Mol細胞Biol 1987 7(8):2914-24)。コドンの選択は、発現に用いられる宿主細胞との好適な適合性に基づき得る。
【００７９】
2.8 宿主細胞
本発明の抗体をコードするクローニングベクターまたは発現ベクターに好適な宿主細胞は、原核細胞、酵母または高等な真核細胞である。好適な原核細胞としては、真正細菌、例えば、腸内細菌科、Escherichia属、例えば、E.Coli(例えば、ATCC 31,446; 31,537; 27,325)、Enterobacter属、Erwinia属、Klebsiella属、Proteus属、Salmonella属 例えば、Salmonella typhimurium、Serratia属、例えば、Serratia marcescansおよびShigella属ならびにBacilli属例えば、B.subtilisおよびB.licheniformis(DD 266 710参照)、Pseudomonas属、例えば、P.aeruginosaならびにStreptomyces属が挙げられる。酵母宿主細胞のなかでも、Saccharomyces cerevisiae、schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces(例えば、ATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500)、yarrowia(EP402, 226)、Pichia Pastoris(EP183, 070, Pengら、J.Biotechnol. 108(2004)185-192参照)、Candida、Trichoderma reesia(EP244, 234)、Penicillin, TolypocladiumおよびAspergillus hosts、例えば、A.nidulansおよびA.nigerが企図される。
【００８０】
本発明において原核細胞および酵母宿主細胞が特に企図されれるが、通常、本発明の宿主細胞は脊椎動物細胞である。好適な脊椎動物宿主細胞としては、哺乳動物細胞、例えばCOS-1(ATCC No.CRL 1650)COS-7(ATCC CRL 1651)、ヒト胎児腎臓細胞系統293, PerC6(Crucell)、ベビーハムスター細胞(BHK)(ATCC CRL.1632)、BHK570(ATCC NO: CRL 10314)、293(ATCC NO.CRL 1573)、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO(例えば、CHO-K1, ATCC NO: CCL 61, DHFRマイナスCHO細胞系、例えばDG44(Urlaubら、Somat Cell Mol Genet(1986)Vol 12 pp555-566)、特に、懸濁培養に適合されているCHO細胞系統、マウスセルトリ細胞、サル腎臓細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞(ATCC CRL-1587)、HELA細胞、イヌ腎臓細胞(ATCC CCL 34)、ヒト肺細胞(ATCC CCL 75)、Hep G2およびミエローマ細胞またはリンパ腫細胞、例えば、NS0(US 5,807,715参照)、Sp2/0, Y0が挙げられる。
【００８１】
したがって、本発明の一実施形態において、本明細書中に記載されるように治療抗体の重鎖および／または軽鎖をコードするベクターを含む、安定して形質転換した宿主細胞を提供する。通常、このような宿主細胞は、軽鎖をコードする第１ベクターおよび重鎖をコードする第2のベクターを含む。
【００８２】
このような宿主細胞はまたさらに、本発明の抗体の質、機能および／または産生量を改変するために操作または適合させることができる。非限定的な例としては特定の改変(例えば、グリコシル化)酵素およびタンパク質ホールディングシャペロンの発現が挙げられる。
【００８３】
2.9細胞培養法
本発明の治療抗体をコードするベクターを用いて形質転換した宿主細胞を当業者に公知の任意の方法で培養し得る。宿主細胞はスピナーフラスコ、振盪フラスコ、ローラーボトル、ウェーブリアクター(例えば、wavebiotech.com製のシステム 1000)または中空糸システム中にて培養し得るが、大規模生産が好ましく、攪拌型タンクリアクターまたはバッグリアクター(例えば、Wave Biotech, Somerset, New Jersey USA)を懸濁培養に特に用いる。通常、撹拌型タンカーは例えば、スパージャー、バッフルまたは低せん断インペラを使用して、エアレーションに適合されている。気泡塔およびエアリフトリアクターには、空気または酸素のバブルを用いて直接エアレーションし得る。宿主細胞を無血清培地中で培養する場合、細胞保護剤（例えば、プルロニックF-68）を添加してエアレーション法による細胞の損傷を防ぐことができる。宿主細胞の特性に応じて、マイクロキャリアを足場依存性細胞株の増殖基質として用いても良いし、細胞を一般的な懸濁培養に適合させても良い。宿主細胞、特に脊椎動物宿主細胞の培養には、様々な方式(例えば、バッチ式、フェドバッチ式、反復バッチ式(Drapeauら、(1994)cytotechnology 15: 103-109)、長時間バッチ式、またはかん流培養を用いることができる。組換え技術により形質転換した哺乳動物の宿主細胞は血清含有培地（例えば、ウシ胎仔血清(FCS)含有培地）中で培養できるが、このような宿主細胞は必要に応じてエネルギー源（例えば、グルコース）および合成増殖因子（例えば、組換えインスリン）を添加した、Keenら、(1995)cytotechnology17:153-163に開示されているように無血清培地中で、または市販の培地（例えば、ProCHO-CDMもしくはUltraCHOTM(Cambrex NJ, USA)）中で培養するのが好ましい。宿主細胞の無血清培養においては、これらの細胞が無血清条件での増殖に適合されていることを必要とし得る。適合法の一つは、血清含有培地中にて宿主細胞を培養し、その後80％の培地を無血清培地に繰り返し交換し、そうして宿主細胞は無血清条件に適合するようになる(例えば、Scharfenberg Kら、(1995)in Animal
Cell Technology: Developments towards the 21st century(Beuvery E.C.ら、eds), pp619-623, Kluwer Academic publishers参照)。
【００８４】
培地中に分泌された本発明の抗体は、企図される用途に適した精製度をもたらす種々の方法を用いて、培地より回収および精製することができる。例えば、治療抗体を含む培地に使用する場合と比べて、ヒト患者を治療するために本発明の治療抗体を用いる場合、通常、還元SDS-PAGEにより測定した場合に、少なくとも95%の純度、より一般的には、98%または99%の純度を必要とする。第１の例において、培地の細胞残屑は通常、遠心分離し、その後例えば、精密ろ過、限外ろ過および／または深層ろ過によって上清を清澄化することによって除去する。あるいは、抗体を事前に遠心分離を行うことなく精密ろ過、限外ろ過または深層ろ過を行うことによって回収し得る。種々の他の方法（例えば、透析およびゲル電気泳動）ならびにクロマトグラフ法（例えば、ヒドロキシアパタイト(HA)、アフィニティクロマトグラフィー(必要に応じて、ポリヒスチジンなどのアフィニティタグシステムを含む)および／または疎水性相互作用クロマトグラフィ(HIC, US 5,429,746参照)）を利用し得る。一実施形態において、本発明の抗体は種々の清澄化工程の後に、プロテインAまたはプロテインGアフィニティクロマトグラフィー、その後さらに、さらなるクロマトグラフィ工程(例えば、イオン交換および／またはHAクロマトグラフィ、アニオンもしくはカチオン交換、サイズ排除クロマトグラフィおよび硫安分画)を使用して得ることができる。通常、様々なウイルス除去工程も用いる(例えば、DV-20フィルターなどを使用するナノろ過)。このような様々な工程を経た後、少なくとも10mg/ml以上、例えば、100mg/ml以上の本発明の抗体を含む精製(通常、モノクローナル)製剤が提供され、その結果、本発明の実施形態が形成される。100mg/ml以上の濃度は超遠心分離によって生じ得る。好ましくは、このような製剤は、凝集した形状の本発明の抗体を実質的に含まない。
【００８５】
細菌系は抗体断片の発現に特に好適である。このような断片は細胞内にまたはペリプラズマ内に限局する。当業者に公知の方法により、不溶性ペリプラズマタンパク質を抽出し、リホールディングさせ活性タンパク質を形成することができる（Sanchezら、(1999)J.Biotechnol. 72, 13-20およびCupit PMら、(1999)Lett Appl Microbiol, 29, 273-277参照）。
【００８６】
3.  医薬組成物
上記本発明の抗体の精製製剤(特に、モノクローナル製剤)は、上記のようなヒト疾患および障害の治療に使用するための医薬組成物に含めることができる。通常、このような組成物はさらに、受容可能な薬務に知られており、また求められるような医薬的に受容可能な(すなわち、不活性な)担体を含む（例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th ed,(1980), Mack Publishing Co参照）。このような担体の例としては、滅菌した担体、例えば、食塩水、Ringer溶液またはデキストロース溶液が挙げられ、これは好適な緩衝剤（例えば、酢酸ナトリウム三水和物）で緩衝して医薬的に受容可能なpH（例えば、5〜8の範囲内のpH）にする。注射(例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内または門脈内による)用または持続注入用の医薬組成物は、目に見える粒状物質を含まないことが好ましく、1mg〜10gの治療抗体、通常、5mg〜1g、より好ましくは5mg〜25mgまたは50mgの抗体を含み得る。このような医薬組成物の調製法は当業者に周知である。一実施形態において、医薬組成物は1mg〜10gの本発明の治療抗体を単位用量形態で、必要に応じて使用説明書と共に含んでなる。本発明の医薬組成物は凍結乾燥し(lyophilisedまたはfreeze dried)、当業者に周知の方法または明らかな方法により、投与の前に再構成し得る。本発明の実施形態は、IgG1イソタイプである本発明の抗体、銅を含む金属イオンのキレーター（クエン酸塩(例えば、クエン酸ナトリウム)もしくはEDTA）またはヒスチジンを含み、医薬組成物に添加して当該イソタイプの抗体の金属を介した分解の程度を低下し得る（EP0612251参照）。医薬組成物はまた、可溶化剤（例えば、アルギニン塩基）、界面活性剤／抗凝集剤（例えば、ポリソルベート80）およびバイアル上部の酸素を置換するための不活性ガス（例えば窒素）を含む。
【００８７】
本発明の抗体の投与に関する効果的な用量および治療レジメは通常、実験に基づいて決定され、患者の年齢、体重および健康状態ならびに治療される疾患または障害などの要因によって決定される。このような要因は主治医によって判断される。適切な用量を選択するためのガイダンスは、例えば、Smithら、(1977)Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New York にみいだすことができるが、通常、1mg〜10gである。一実施形態において、ヒト患者を治療するための投与レジメは、1mg〜1gの本発明の治療抗体を1週間にまたは2週間に1度、皮下に投与するか、静脈内注入を1または2ヶ月毎に投与する。このような用量は、0.014〜140mg/kg、例えば、0.014-14mg/kgに相当する。本発明の組成物はまた、予防的に用いることができる。
【００８８】
4.  臨床用途
増大したβ-アミロイドレベルまたはβ-アミロイド沈着を特徴とする疾患としては、アルツハイマー疾患、軽度の認識機能障害、ダウン症、Dutchタイプのβ-アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、脳のβ-アミロイド血管症および様々なタイプの変性認知症（例えば、Parkinson病に関連するもの）、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症および広範性Lewis体型のアルツハイマー疾患が挙げられると考えられる。
【００８９】
最も好ましくは、増大したβ-アミロイドレベルまたはβ-アミロイド沈着を特徴とする疾患はアルツハイマー疾患である。
【００９０】
本発明はヒト疾患または障害の治療に関して主に記載されるが、本発明はまた非ヒト哺乳動物における同様の疾患または障害を治療するのにも用い得る。
【実施例】
【００９１】
2009531380.tif 000003
2009531380.tif 000004
マウスモノクローナル抗体2E7の作製
マウスモノクローナル抗体2E7を、マウスを従来の方法で免疫化して作製した。マウスを、Freundアジュバント中に調製した可溶性または凝集したβ-アミロイド1-40および1-42を用いて免疫化した。アジュバントを用いることなく最後の追加免疫を行った後、脾細胞をミエローマ細胞と融合した。融合細胞を96ウェルプレートにて増殖し、これよりハイブリドーマ上清を潜在的なリードについてスクリーニングした。可溶性β-アミロイド1-40を用いた免疫化により得られた選択した抗体2E7は、マウスIgG2aイソタイプであり、下記エフラックスアッセイにおいてβ-アミロイド結合活性を有し、BiacoreTM,方法A(i)によって測定した場合に、β-アミロイド1-40 に対して36.1 pMのアフィニティを有していた(表10A)。
【００９２】
2E7のエピトープマッピング
β-アミロイドペプチドに対する抗体2E7の結合を精細にマッピングするために、ペプチドセット(A)を用いた。ペプチドセット(A)は、β-アミロイド1-42ペプチドの完全配列をカバーする12-merの重複ペプチド31本からなるセットから構成されていた。連続的なペプチドのそれぞれは、β-アミロイドペプチド内の連続的なアミノ酸から開始するため、カバーされる配列は連続的なペプチド間でアミノ酸が１個ずつシフトしていた。セット(A)の全てのペプチドは、3つのアミノ酸のC-末端リンカー(グリシン-セリン-グリシン)および末端ビオチン化リシン残基を含んでいた。さらに、全てのペプチド（ただし、ペプチドAβ1 DAEFRHDSGYEVGSGK-ビオチン(配列番号15)は除く）はN-末端がアセチル化されていた。ペプチドの第2セット(セット(B))は、β-アミロイド配列のアミノ酸1〜10を含むペプチドより、C-末端のアミノ酸が１つずつ順次欠失したペプチドから構成されていた。セット(B)の全てのペプチドは、3つのアミノ酸のC-末端リンカー(グリシン-セリン-グリシン)および末端ビオチン化リシン残基を含んでいたが、欠失したβ-アミロイドのアミノ酸の代わりにさらなるグリシンおよびセリン残基を含んでいた(表2)。したがって、セット(B)のペプチドは全て同じ長さである。
【表２】
2009531380.tif 000005
【００９３】
光学的バイオセンサーを使用するβ-アミロイド由来のペプチドに対する2E7の結合のモニタリング
96ウェルSRU BindTM ストレプトアビジンコートプレート(SRU Biosystems)を1% DMSOを含有するPBSで洗浄して、グリセロールおよび保存剤を除去した。１ウェルにつき50μl量を室温まで平衡化して、一定のベースラインを得た。ビオチン化ペプチドを1% DMSO含有PBS中におよそ0.3μg/mlに希釈し、そしてそれぞれ50μlをウェルに加え、およそ1時間インキュベートした。プレートの異なる領域を使用して再現用のウェルを設け、少なくとも１つペプチドを含まないコントロールウェルを各領域に用いて、参照のためにデータを差し引いた。ペプチドキャプチャーの後、プレートを1% DMSO含有PBSで洗浄し、１ウェルにつき50μlの新たな緩衝液を加え、リーダーにあらたなベースラインを得た。表面よりペプチドの崩壊は見られなかった。次に、緩衝液を、試験抗体を20〜64nMで含有する緩衝液（40μl/ウェル）と2時間置換した。抗体2E7のみが、ペプチドセット(A)におけるβ-アミロイドペプチドのアミノ酸1〜12を含むペプチドに結合することを見出した(ペプチドAβ1,配列番号15)。この結果は、残基1のアスパラギン酸が当該ペプチドに結合するのに重要であることを示唆している。
【００９４】
抗体2E7の結合部位をさらに特徴付けするために、ペプチドセット(B)を用いた。SRU BINDTMバイオセンサー法を使用して、抗体2E7がβ-アミロイドペプチドのアミノ酸1〜3を含むペプチドおよびβ-アミロイドペプチドのアミノ酸1〜4を含むペプチド(配列番号14および13)にわずかに結合することが示された。β-アミロイドペプチドのアミノ酸1〜7を含むペプチド(配列番号10)に対する結合は、β-アミロイドペプチドのアミノ酸1〜12を含むペプチド(ペプチドセット(A)由来)に匹敵した。β-アミロイドペプチドのアミノ酸1〜5を含むペプチドまたはβ-アミロイドペプチドのアミノ酸1〜6を含むペプチド(配列番号12または11)に対する結合が観察されたが、β-アミロイドペプチドのアミノ酸1〜7を含むペプチド(配列番号10)に対する結合よりも弱かった(さらなる洗浄工程の後に、安定性によって測定した場合)。
【００９５】
したがって、本方法によって測定した場合、β-アミロイドペプチドの残基1〜7のみが完全な結合に必要であることが示された。
【００９６】
表面プラズモン共鳴アッセイ
上記実験の他に、BiacoreTM 3000光学的バイオセンサーを用いて、選択したβ-アミロイド配列由来のペプチドに対する2E7抗体の結合をモニタした。結合は試験抗体を64nMまでにて5分間、別々のストレプトアビジンチップ表面上に捕捉されたペプチドに注入することによって測定した(130〜230 RU(共鳴単位))。25℃にて0.01M HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTAおよび0.005% Surfactant P20TMを含有するランニング緩衝液 (HBS-EP)を流速20μl／分で用いた。全てのランは、ストレプトアビジン表面なしおよび注入なしに対して二重参照した。BiacoreTM分析ソフトウェアBIAevaluationTM version 4.1を用いて分析した。セット(A)の選択したペプチドの結果よりさらに、2E7がβ-アミロイドペプチドのアミノ酸1〜12を含むペプチド(配列番号15)のみにおよそ50pMの見かけの平衡定数KDで結合することを示すSRU BINDTMから得たデータを確認した。同じ条件下で、2E7は、β-アミロイドペプチドのアミノ酸2〜13を含むペプチドに結合しなかった。
【００９７】
ペプチドAβ2-13      AEFRHDSGYEVHGSGK-ビオチン  (配列番号44)
用いた実験方法および条件により、高アフィニティ分子の検出だけでなく、比較的低アフィニティ分子の検出も可能とした-同じ実験設定において、2E7と対照的に、β-アミロイドペプチドのN-末端エピトープを認識する別の抗体は、見かけのKDが7nMで、2-13ペプチド(配列番号44)に結合することが示された。2E7はβ-アミロイドペプチドの中間領域に由来するセット(A)中のペプチドに結合しなかった。別の実験において、β-アミロイド1-40ペプチドは、ビオチン化されているN-末端アスパラギン酸残基を介して捕捉された。このペプチドは、前記BiacoreTM ストレプトアビジンコートチップ上に捕捉した。66nMで1分間注入した抗体2E7はこのペプチドを結合できなかった。したがって、結論として、これまでに記載したN-末端結合部位は、リンカーおよびキャプチャー法によりマスクされるため、コア結合部位を含むような極端なN末端を確認することが助長された。
【００９８】
細胞が発現するアミロイド前駆タンパク質(APP)への結合
β-アミロイドは、アミロイド前駆タンパク質(APP)と命名されるI型膜貫通前駆タンパク質のタンパク質分解による切断によって形成されるペプチドからなる。APPは細胞外ドメインが大きいために、当該タンパク質への結合は抗体依存性細胞傷害反応(ADCC)を潜在的に生じ得る。
【００９９】
細胞表面の完全長APPへの抗体の結合を特徴付けするために、FMATTM ABI8200をベースとする分析を用いた。
【０１００】
野生型APP DNAを用いたHEK293T細胞のトランスフェクション
HEK293T細胞を、10 %(v/v)FCSおよび1x Glutamaxを含有するDMEM F12培地中に維持する。細胞を75cm2組織培養フラスコに播種し、60〜80 %コンフルエントなるまで(18〜24時間)増殖させ、その後トランスフェクションを行う。トランスフェクションについては、9μgのDNA(野生型APP DNA(PCDNA3.1ベクター(Invitrogen)中)またはベクターのみ(コントロール)のいずれか)を0.3 mlのOpti-MEMTM培地と混合する。30μlのLipofectamineTMトランスフェクション試薬を0.3mlのOpti-MEMTM培地と混合し、そして2つの混合液をプールする。プールした混合液を室温で30分間インキュベートし、その後さらに4.8 mlのOpti-MEMTM培地を加える。この最終混合液を細胞(Opti-MEMTM培地を用いて洗浄したもの)に5時間加え、その後DMEM中10%(v/v)新生児ウシ血清6 mlを加える。トランスフェクションから48時間後、上清を除去し、単層をヴェルセン中で洗浄し、その後3mlのVerseneTMキレート剤を各フラスコに加え、37℃にて5分間インキュベートし、そして遊離した細胞を200gにて5分間、ペレット化した。得られた細胞ペレットを1mlのアッセイ用緩衝液 (2%加熱処理血清、0.5% BSA、PBS pH7.4中0.1% NaN3, 0.2μmフィルターによりろ過したもの)に穏やかに再懸濁し、単細胞懸濁液を作製する。
【０１０１】
FMATTM ABI8200をベースとするアッセイ
試験抗体(2E7（APPの細胞外ドメインに対するLN27(Zymed)マウスIgG：ポジティブコントロール）および抗体G210（β-アミロイドペプチドのx-40形態を認識する：ネガティブコントロール)をポリプロピレンプレート中ろ過滅菌したアッセイ用緩衝液(2%加熱処理血清, 0.5% BSA, PBS pH7.2中0.1% NaN3)中に10μg/mlに希釈し、その後さらに6回の連続1:1希釈を当該プレートで行った。アッセイ用緩衝液だけをブランクとして用いた。野生型APP DNAを用いてトランスフェクトしたHEK293T細胞の懸濁液50μl(実験1: 10,000細胞; 実験2: 20,000細胞)を96ウェルプレートの各ウェルに加え、これに5μlの各抗体溶液を二揃いのウェルに加えた。50μl/ウェルのF-MATTMブルー抗マウスIgGストック溶液(抗体はF-MATTMブルー単官能基反応色素キット（ABI製, 4328408）を使用して標識されている)をアッセイ用緩衝液中に1:500(実験1)および1:1000(実験2)希釈して、各ウェルに加え、そしてプレートを軽く振とうした後、1時間静置した。次にプレートをABI 8200 蛍光マクロコンホーカル細胞検出システム(Applied Biosystems)を使用して読み取った。
【０１０２】
得られた計数データを次に、ExcelTM 表計算ソフトウェアを用いて読み取った。簡潔に言うと、モックトランスフェクトしたものの計数値を完全長APPをトランスフェクトした細胞の計数値より差し引き、各抗体に特異的なシグナルを得た。曲線の線形部分にある2つの抗体濃度を選択し(1.25および0.63μg/ml)、そしてこれらの濃度における、バックグラウンドを補正した得られた計数データを、LN27抗体結合％として表し、2つの抗体濃度を平均化した。得られたデータを表3に記載する(LN27結合% ±SE)
このように、本アッセイ系において、細胞表面APPに対する2E7の結合は、細胞表面APPに対するネガティブコントロール抗体G210の結合とは区別することが可能である。
【表３】
2009531380.tif 000006
【０１０３】
アミロイド前駆タンパク質に由来するペプチドへの結合 
上記エピトープマッピング研究より、抗体2E7がβ-アミロイドペプチドのN末端へ結合するためには、1位のアスパラギン酸残基が重要であることが示された。これは、この抗体がβ-セクレターゼ部位におけるAPPの切断により形成された「新たな」エピトープを認識することを示唆している。この観察は、抗体2E7が隣接APPペプチド配列を認識しないことを示唆している。この仮説を調べるために、APPペプチド(ペプチドAPP1,配列番号16)を合成し、これはβ-アミロイドペプチドの残基1〜7および5つの隣接APP由来のアミノ酸を含んでいた。したがって、ペプチドAPP1は、BACE-1切断部位よりN-末端5位〜BACE-1切断部位よりC-末端7位の連続アミノ酸を含み、かつN-末端がアセチル化されていた。APP由来ペプチドAPP1およびβ-アミロイド1-12ペプチド(ペプチドAβ1)に対する抗体2E7の結合能をBiacoreTM法(エピトープマッピングについて上記される)を用いて比較した。抗体2E7はβ-アミロイドペプチドAβ-1（基本エピトープ1-7を含む）に対して高いアフィニティ結合を示した。しかし、APP1ペプチド（基本β-アミロイド由来配列1-7を含む）に対する結合は観察されなかった。
【０１０４】
ペプチドAβ1      DAEFRHDSGYEVGSGK-ビオチン  配列番号15
APP1           AcNH-SEVKMDAEFRHDGSGK-ビオチン  配列番号16
FMATTMをベースとする細胞結合およびBiacoreTMをベースとするペプチドマッピングの組み合わせを用いて、これらのフォーマットにおいて、2E7が完全長APPタンパク質に対して結合アフィニティを有さないことを示した。β-アミロイドペプチドの1位におけるアスパラギン酸残基が結合に必要である場合、2E7のみはβ-アミロイドの「新しい」N末端を認識するために、細胞表面に発現されたAPPに結合しないと結論付けられる。
【０１０５】
In vivoにおける生物学的活性
I125β-アミロイド流出モデル
公開された多くの研究により、β-アミロイド抗体が血流においてβ-アミロイドペプチドと複合体を形成し得ることが示されている。末梢β-アミロイドを隔離することによって、血流へのCNSアミロイドのさらなる流出が可能であることが議論されている(DeMattos RB, PNAS(2001), 98(15); 8850-8855)。急性薬力学モデルを開発し、血流における脳由来のβ-アミロイドペプチドとの複合体形成能について抗体をスクリーニングした。
【０１０６】
麻酔(4%イソフルレン)をオスC57/BL6Jマウスに促し、100%酸素中に維持した(1.5%イソフルレン)。次に動物を定位固定フレームに置いた。矢状縫合に沿って正中切開した後、頭蓋骨を貫通して穴を開け、ガイドカニューレを側脳室に挿入した(前後(AP)-0.5mm, 横(L)+0.7mm, 腹側(V)-2.5mmを調整する)。さらに2つの穴を頭蓋骨を貫通して開け、そこに皮質スクリューを配置した。カニューレをシアノアクリレートゲルによって固定し、切開部をシアノアクリレートゲルヘッドキャップの周辺に縫合する。手術後、マウスは0.3mlの食塩水を皮下に受け、暖かい環境に置き、麻酔より回復させた。正向反射が回復したら、マウスを個々に収容し、一般的な術後のケアを5日間施した。さらに5日間または手術前の体重が回復するまで、いかなる処置も認められなかった。回復した後、カニューレの配置をアンジオテンシンII吸飲反応によって確認した。各マウスには、100ngアンジオテンシンII(AII)(0.9% 食塩水中に作製)を脳室内(ICV)投与(5μl)した。AIIの投与後、吸水を15分間観察した。AIIに対して口渇の陽性反応(持続した吸水)を有するマウスを本試験に含めた。当該試験はAIIの注射後5日してすぐに開始した。
【０１０７】
試験日に、マウスを5〜10分間、暖かい環境に置いて血管拡張を誘導した。これは尾静脈への注射を容易にするために必要とされる。試験抗体(600μg)またはPBSビヒクル(投与量は体重1kgあたり10mlを越えないものとする)を尾静脈より注射し、注射後、マウスを個々のケージに戻した。尾静脈注射のちょうど1時間後、マウスに2ng(1μCi)のI125β-アミロイド1-40(Amersham Biosciences, UK)を5μlの投与量で、ゆっくりと(1分間に2μl)ICV注射した。ICV投与からちょうど4時間後に、50μlの体幹血液を採取し、放射能レベルをシンチレーションカウンターで測定した。
【０１０８】
尾静脈に2E7を注射したマウス(1処置群につきn=6)は、50μlの体幹血液における放射能シグナル(1分間あたりのカウント - CPM)が、ビヒクルを注射したマウスにおいて検出されたCPMシグナルと比べて、統計的に有意に増大していることが示された -(CPM -ビヒクル: 1339.7 ± 496.2 vs. 2E7 4387.9 ± 980.3; ANOVA:F(2,13)= 4.97, p<0.05. Post-hoc LSD: p=0.01 2E7 vs.ビヒクル [post-hoc Duncans: p=0.02 2E7 vs,ビヒクル])。
【０１０９】
同一のプロトコルにより実施された2E7を用いた2つのさらなる研究において、ビヒクルを注射したコントロールと比べて、血液へのアミロイド流出について同様の増大が観察された(CPM 血液:ビヒクル 352 +/- 113 vs.  2E7 2397 +/- 353およびビヒクル 1281 +/- 312 vs.  2E7 5291 +/- 885; ANOVA with post-hoc LSD test p<0.001 vs.ビヒクル)。
【０１１０】
トランスジェニックCNSβ-アミロイド低減モデル
1.  2月齢TASTPMマウスに4週間投薬した後のβ-アミロイド取り込み
オスおよびメスTASTPMトランスジェニックマウス(二重変異体APPswe x PS1.M146V, Howlett DR(2004)Brain Research 1017(1-2)130-136)は、本研究開始時に61〜65日齢であり、個々に収容していた。同数のマウスを各処置群に割り振り(1群につきN=12)、性別および年齢にしたがってランダム化した。処置群は以下より構成されていた: A: MOPC21(未知の特異性を有する抗体, Holtonら、(1987)J.Immunol 139(9)3041-3049, ネガティブコントロール), B: 2E7(試験抗体)。全ての抗体をPBS中に溶解し、腹腔内経路で投与した。動物の体重に関係なく、300μgの抗体を投与した。動物には、週に2回、4週間投与した。最後の投与から1日後、動物を過量のペントバルビタールナトリウムで安楽死させた。脳を切開し、二等分した。二等分した脳サンプルを予め計量しておいた2ml エッペンドルフTMチューブに採取し、即座に凍結した。続いて、サンプルを解凍し、再度重さを計り、そして完全プロテアーゼインヒビターTM錠剤(Boehringer Mannheim)を含有する5M グアニジン HClを1ml加え、その後サンプルをホモジナイズし、一定に撹拌しながら、4℃にて90分間以上インキュベートした。
【０１１１】
次にサンプルをアッセイ用緩衝液(50mM Tris HCl, pH7.4, 150mM NaCl, 0.05% Tween-20+ 1% BSA)中に10分の1希釈してボルテックスし、4℃にて20分間、20,000Gにて遠心分離した。上清を除去し、アッセイ用プレートに3つぞろいのサンプルとして加えた。
【０１１２】
Aβ40およびAβ42のレベルを、ビオチン化N-末端特異的Aβ抗体と同様に、Aβ40またはAβ42のいずれかを捕捉するために用いられる、検出を容易にするためにOritagTM特異的標識で標識されている(Aβ40またはAβ42に対する)C-末端特異的β-アミロイド抗体(BioVerisTM)を用いる高感度プレートベース電気化学発光免疫測定法(BioVerisTM)を使用して測定した。抗体-Aβ複合体を激しく混合しながら室温にて一晩インキュベートしたビオチン化抗体(DynabeadsTM , Dynal)に結合するストレプトアビジンコートビーズで捕捉し、BioVerisTM M8 光検出器でアッセイした。必要とされる濃度でグアニジンHClを含有するアッセイ用緩衝液中のヒトAβ40およびAβ42ペプチドを使用して、検量線を作成した。データはExcel RobosageTM 統計分析ソフトウェアを用いて分析し、Aβレベルを組織1ｇあたりのpmoleとして表した。
【０１１３】
本実例において、2E7抗体を用いた処置はCNS Aβ42の取り込みを37%(p<0.001)およびCNS Aβ40の取り込みを23%(p<0.001)減少させた。
【０１１４】
同様の実験条件下におけるその後の研究において、2E7抗体はPBSで処理した動物と比較して、CNS Aβ42の取り込みを38%(研究1, オスのみ)、22%(研究2, 有意ではない)、39%(研究3, オス, p=0.001)および13%(研究3, メス, 有意ではない)低減させた。これらの研究において、2E7はまたPBSで処理した動物と比較して、CNS Aβ40の取り込みを18%(研究3, オス, p=0.017)低減させ、CNS Aβ40の取り込みにおいて25%(研究1, オスのみ), <1%(研究2)の有意でない低減および3%(研究3, メス)の有意でない増大を示した。
【０１１５】
2. 4月齢TASTPMマウスに4ヶ月投薬した後のβ-アミロイド取り込み
簡潔に言うと、4月齢TASTPMトランスジェニックマウスに300μgの抗体を1週間に1度または2度、腹腔内(i.p.)経路で投与した。投薬から4ヶ月後、CNSβ-アミロイドレベルをELISAによって測定し、プラークの取り込みを免疫組織化学により測定した。4〜8月齢において、CNSβ-アミロイドの取り込みは指数関数的に増大し、その結果、プラーク病理が急速に発達する(Howlett DR(2004)Brain Research 1017(1-2)130-136)。
【０１１６】
研究開始時に120〜128日齢のマウスを個々に収容した。同じぐらいの頭数のマウスを各処置群に割り振り(1群につきN=20または21)、性別および年齢にしたがって、ランダム化した。処置群は以下より構成されていた: A: PBS(ビヒクル)；1週間に2回投薬される, B: 2E7；1週間に1回投薬される, C: 2E7；1週間に2回投薬される, D: PBS；1週間に1回投薬される。300μg用量(79 ml量)の2E7を腹腔内経路より投与した。ビヒクルで処理した動物には同量のPBSを与えた。動物には18週間投薬した。TASTPMマウスは自発性発作に罹患しやすく、結果として複数の動物が研究過程にて死亡した。最終的な頭数は以下の通りであった： A: メス4匹,オス9匹; B: メス5匹,オス8匹; C: メス4匹,オス9匹; D: メス2匹,オス9匹。最終投薬から2日または4日後、(1群につき同数の)動物を過量のペントバルビタールナトリウムにより安楽死させた。各マウス由来の尾端サンプルについて、遺伝子型を確認した。脳を切開して、二等分した。右脳を4% パラホルムアルデヒドに浸漬して固定し、組織学的に処理した。左脳を予め計量した2ml エッペンドルフTM チューブに採取し、ドライアイス上で凍結し、アミロイド含有量に関するその後の分析のために-80℃にて保存した。分析前に、サンプルを解凍し、再度重さを計り、そして完全プロテアーゼインヒビターTM錠剤(Boehringer Mannheim)を含有する5M グアニジン HClを1ml加えた。その後、当該サンプルをホモジナイズし、一定に撹拌しながら、4℃にて90分間以上インキュベートした。
【０１１７】
次にサンプルを、アッセイ用緩衝液(50mM Tris HCl, pH7.4, 150mM NaCl, 0.05% Tween-20+ 1% BSA)に10分の1に希釈し、ボルテックスし、4℃にて20分間、20,000Gにて遠心分離した。上清をさらに1:1000に希釈し、アッセイ用プレートに三つ揃いのサンプルとして加えた。
【０１１８】
Aβ40およびAβ42のレベルを、4週間の投薬研究として測定した。
【０１１９】
分散分析を固定効果モデルに含まれる処置、性別および投薬スケジュールと共に用いた。また、これら3要因間のすべての相互作用も含めた。2つの投薬スケジュール(1週間に1度または2度)間に有意な差はなかった。この実験計画において、まずは投薬スケジュール間に有意な差が存在するかを調べ、次に、そのような有意な差が存在しない場合には、2つの投薬スケジュールに由来するデータを組み合わせて、分析におけるマウスの頭数を2倍にして実験の検出力を増大させた。
【０１２０】
この実例において、2E7抗体を用いた処置により、CNS Aβ42の取り込みが22.5%(p=0.0152)低減した。CNS Aβ40のレベルもまた12.1%低減したが、この数字は統計学に有意ではなかった(p=0.118)。
【０１２１】
これらサンプルの複合的な免疫組織化学分析を実施し、プラーク病理を示す脳組織領域を規定した。切片を、尾側のレベルで皮質より、および海馬のレベルで皮質より採取した。隣接切片をAβ40またはAβ42特異的抗体またはアミロイド染色Congo Redを用いて染色した。画像解析ソフトウェアを用いて、プラークが染色された切片の領域を、全切片領域の％として表した。
【０１２２】
固定後、PFAに浸漬した半分の脳を脳マトリックスにて冠状に切断し、6 x 2mmの厚さの切片にした。これら2mm切片を切片A〜Fと称し、Aは最も吻側であり、Fは最も尾側である。切片A, B & CおよびD, E & Fを各動物の番号が付された別々の包埋カセットに置いた。カセットは、処理および包埋の準備ができるまでPFA中に保持した。
【０１２３】
包埋はCitadelTM 1000(Shandon)組織プロセッサーで行った。全ての組織を以下の処理レジメに供した:
70% IMS - 1時間
100% IMS - 3 x 1時間
100% エタノール - 2時間
100%イソブチルアルコール; 1 x 2時間; 1 x 1.5時間
HistoclearTM - 2 x 1.5時間
Paraffin wax - 2 x 2時間 
処理サイクルの完了時に、ワックスに含浸した組織切片を溶融パラフィンワックスを充填した基枠に移し、HistocentreTM(Shandon)パラフィン包埋システムを用いて包埋した。切片A, B & Cを一の型枠に、D, E & Fを別の型枠に、それぞれ組織を包埋した。これを全ての切片セットについて行った。すなわち、それぞれ二等分した脳から、各3つの切片からなる2つのワックスブロックを得た。切片は、各切片の尾側表面が将来的に切断面となるように型枠に置いた。各切片を型枠中良好に押し下げ、それぞれが平行にミクロトームできるように注意した。次に、孔の開いた処理カセットを慎重に各型枠に置き、次に溶融したワックスを継ぎ足した。次に包埋ブロックを、それらが型枠から取り出せるようになるまで低温プレート上で冷却した。ブロックはミクロトームする際に必要となるまで室温で保存した。ブロックを無作為に切断し、そして5ミクロンの切片を予め標識したゼラチンコートスライド(SuperfrostTM, Erie Scientific Company)上に浮かべた。2枚の切片を各スライドに浮かべた。可能な限り、連続した切片をマウントし、スライドには1〜25の連続的な番号を付けた。50枚の切片(スライド25枚分)が各ブロックより得られた。スライドをホットプレート上で乾燥し、必要となるまで室温で保存した。
【０１２４】
30枚のスライドセットを免疫組織化学に供した。各スライドにおいて、上の切片はAβ40抗体(G30, x-40β-アミロイドを認識するウサギポリクローナル抗体)で標識し、下の切片はAβ42抗体（20G10, x-42β-アミロイドを認識するモノクローナル抗体）で標識した。各ブロックにつき、1抗体あたり最低でも5枚の切片を標識した。
【０１２５】
標識は以下のように行った。Histoclearおよび段階的なアルコールを用いてワックスを落とした後、切片を85%ギ酸に8分間浸漬し、次いで0.3% 過酸化水素中で30分間ブロッキングして、内在性ペルオキシダーゼをブロックした。抗体のG30および20G10を1:1000希釈で一晩用いて、切片を4℃で放置した。切片の現像にはそれぞれビオチン化抗ウサギ二次抗体および抗マウス二次抗体を用いた。発色はジアミノベンジジンテトラ四塩酸塩染色キット(DABTM, Vector Labs)を用いて行った。切片をMayerヘマトキシリンで軽く対染色した後、脱水および洗浄してカバーガラスをかけた。
【０１２６】
切片を放置して、顕微鏡観察の前に少なくとも48時間乾燥した。画像をデジタルカメラを備えたLeica DMRBTM 顕微鏡で得た。画像はQwinTM ソフトウェア(Leica)を用いて分析し、Aβ抗体で標識された、切片の％として表した。
【０１２７】
分散分析を、固定効果モデルに含まれる処置、性別および投薬スケジュールと共に用いた。また、これら3要因間のすべての相互作用も含めた。2つの投薬スケジュール(1週間に1度または2度)間に有意な差はなかった。この実験計画において、まずは投薬スケジュール間に有意な差が存在するかを調べ、次に、そのような有意な差が存在しない場合には、2つの投薬スケジュールに由来するデータを組み合わせて、分析におけるマウスの頭数を2倍にして実験の検出力を増大させた。
【０１２８】
この実例において、2E7抗体を用いた処置により、Aβ42を認識する抗体を用いて測定した場合と同じように、プラーク病理を低減した。プラーク病理は、海馬レベルの皮質において27.1%(p=0.0026)、尾側レベルの皮質において43%(p<0.0001)低減した。また、Aβ40を認識する抗体を用いて測定した場合、プラーク病理は低減した。プラーク病理は、海馬レベルの皮質で16.6%(p=0.0421)および尾側レベルの皮質において17.3%(p=0.0342)低減した。
【０１２９】
本研究に由来する、ビヒクルまたは2E7で処理したマウスのいずれにもマイクロ出血の証拠(Perls’ Prussian Blueによって測定される)は観察されなかった。本方法は、鉄イオン(鉄は赤血球で見られる酸素運搬ヘモグロビンの必須要素である)を不溶性の青色化合物を生成することによって可視化する。全ての動物に由来する脳の全レベルは明瞭であった。
【０１３０】
認知モデル
上記のように4月齢TASTPMマウスに4ヶ月投薬した後、これらマウスを認知に関する2つのモデル（物体認識アッセイおよび恐怖条件付けアッセイ）にて試験した。
【０１３１】
物体認識アッセイ
物体認識アッセイは動物が天然に有する、新規の物体の探索性向を利用し、これまでに探索した物体(馴染みのある物体)を想起する動物の能力に依拠する。8月齢TASTPMマウスは、新規の物体と馴染みのある物体とを区別する能力に欠損を示すことが報告されている(Howlettら、2004)。このことはこれらの動物において認識能力が正常に機能していないことを示している。しかし、本研究において、ビヒクルで処理した8月齢TASTPMマウスは認識機能障害を示していなかった。すなわち、これらのマウスは新規の物体と馴染みのある物体とを区別することができた。したがって、2E7を用いた処置による、潜在的な治療効果を調べる機会はなかった。
【０１３２】
恐怖条件付けアッセイ 
恐怖条件付けモデルは、以前の痛刺激と文脈シグナルまたは手がかりシグナルとを関連付け、X時間後に同一の文脈または音を提示した場合に、当該関連性を想起する動物の能力を試験するために設計された。本研究において、ビヒクル処理(1週間に1度または2度)した8月齢TASTPMマウスは、これらの動物において認識機能障害を示す文脈上の区別に欠点を示した。この欠点は、2週間に1度、2E7で処理しても影響がなかった。
【０１３３】
6月齢TASTPMマウスへの4ヶ月の投薬
本研究は、研究開始時に3月齢のTASTPMマウスに4ヶ月間、2E7(300μg i.p. 1週間に2度)を投与することを含む。コントロールの動物にはPBS中のIgG2Aを投与した。上記のように、脳を切開し、二等分した。右脳を4%パラホルムアルデヒド中に浸漬して固定し、組織学的に処理した。左脳を予め重さを計った2ml エッペンドルフTMチューブに採取し、ドライアイス上で凍結し、アミロイド含有量に関するその後の分析のために-80℃で保存した。
【０１３４】
無作為に選択した脳サンプル(n=6ビヒクル, n=7 2E7処理群)それぞれに由来する一切片を、上記と同一の一般的プロトコルを使用して、IHCによる予備的な分析に供した。統計分析(ステューデントt検定)により、2E7を投与したマウスにおいてAβ42プラークの取り込みが視床にて(71.9%, p=0.007)および視床 + 皮質 + 海馬にて(54.1%, p=0.022)有意に減少していたが、Aβ40については有意な変化はなかったことを示す。
【０１３５】
脳のAβ40およびAβ42の生化学的測定のために、サンプルを上記のように処理し、測定した(希釈係数 1:10,000)。Aβ42は2E7を投与したマウスにおいて(n=12 コントロール, n=16 処理群)、29.9%有意に減少した(p=0.01)。Aβ40の濃度もまた減少した(22.6%)が、この減少は統計学的に有意ではなかった(p=0.052)。
【０１３６】
ハイブリドーマ可変領域のクローニング
可変領域の配列
全RNAを2E7ハイブリドーマ細胞より抽出し、次に重鎖および軽鎖可変ドメインcDNA配列を、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって作製した。RT-PCR用の順向プライマーは、マウス免疫グロブリン遺伝子リーダー配列に特異的な縮重プライマーの混合物であり、逆向プライマーは抗体の定常領域に特異的であった（この場合、重鎖についてはマウスイソタイプIgG2aおよび軽鎖についてはマウスκ）。プライマーはJonesおよびBendig(Bio/Technology 9:88, 1991)に記載されているストラテジーに従って設計された。RT-PCRは両V領域配列について二揃いで実施し、その後の正確なV領域配列の検証を可能とした。RT-PCRにより生成したV領域産物をクローニングし(Invitrogen TA クローニングキット)、そして配列データを得た。
【０１３７】
2009531380.tif 000007
【０１３８】
上記アミノ酸配列中、相補性決定領域(CDR)を下線で示す。
【０１３９】
2E7キメラのクローニングおよび発現
親マウスV領域を重鎖のヒトIgG1(Fc突然変異型(L235A, G237A))または軽鎖のヒトCκ領域にグラフトしてなるキメラ2E7抗体(2E7c)を、組換え抗体材料を発現させるために作製した。当該組換え抗体材料は機能的マウスV領域の正確なクローニングを確認するために用いることができる。2E7マウス重鎖および軽鎖V領域ならびに内在性マウスシグナル配列をコードするDNAを、哺乳動物発現ベクターRLD-bshe(重鎖用)およびRLN-bshe(軽鎖用)（これらは予めヒト定常領域(それぞれ、IgG1 Fc突然変異型(L235A, G237A))またはヒトCκ)を含んでいる）にインフレームでクローニングした。
【０１４０】
2009531380.tif 000008
【０１４１】
正確にクローニングされたVH配列およびVL配列を伴うクローンを同定し、プラスミドを懸濁培養におけるCHO細胞にて発現させるために作製した。発現された2E7c抗体を、細胞培養上清よりFPLC系にてプロテインA クロマトグラフィにより精製し、ELISAおよびBiacoreTM 技術を用いたSPRによって、Aβに対する結合について試験した。これらの結果より、正確な2E7マウスV領域がクローニングおよび発現され、その結果、親マウス抗体2E7と同様の特性を有する機能的抗体が生じたことが示された。
【０１４２】
軽鎖ヒト化
ヒトアクセプター配列（Genpept ID CAA51135(配列番号24)およびGenbank 受託番号 X72467）はアミノ酸レベル(CDRを含む)で77%の同一性を有し、アクセプターフレームワークとして選択した。構築物L1は2E7 VLドメイン由来のマウスCDRをこのアクセプターフレームワークへグラフトしたものである。
【０１４３】
重鎖ヒト化
ヒト配列Genbank受託番号 M99675(配列番号21)は、2E7マウス可変重鎖領域とアミノ酸レベル(CDR1および2を含む)で74%の同一性を有するVH3-48遺伝子の対立遺伝子であり、これをヒトJH4ミニ遺伝子とともにヒト重鎖アクセプターフレームワークとして選択した。3つのヒト化可変重鎖変異体をM99675配列およびJH4を基に設計した。H1はKabatの定義を使用して、93位および94位に2つのさらなるフレームワーク復帰突然変異を有する、マウスCDRを移植したものである。H2およびH3は供にH1に由来するが、1つのさらなるフレームワーク突然変異を組み込んでおり、この突然変異は各構築物で異なっていた(それぞれ、24位および48位;表4参照)。
【表４】
2009531380.tif 000009
【０１４４】
ヒト化重鎖および軽鎖DNAの構築
ヒト化V領域を重複オリゴの構築およびPCR増幅によってde novo合成した。哺乳動物発現ベクターRLD-bsheおよびRLN-bsheにクローニングするための制限酵素部位ならびに選択したヒトアクセプターフレームワークに由来するヒト免疫グロブリンシグナル配列を含めた。次に、シグナル配列および制限酵素部位と供にヒト化V領域(H1(配列番号27), H2(配列番号29), H3(配列番号31), L1(配列番号33))をコードするDNAを哺乳動物発現ベクターにインフレームでクローニングした: H1, H2およびH3をRLD-bsheにクローニングして、3つの完全長ヒトIgG1 Fc突然変異重鎖をコードするDNAを作製する（それぞれ突然変異L235AおよびG237Aを含む）（完全長H1(配列番号35)、完全長H2(配列番号37)および完全長H3(配列番号39)）; L1をヒトκ定常領域をコードするDNAを含むRLN-bsheにインフレームでクローニングし、完全長ヒトκ軽鎖(配列番号41)をコードするDNAを生じた。
【０１４５】
ヒト化重鎖および軽鎖抗体の組み合わせの発現の代表例 
6ウェルプレートにて小規模に、CHOK1細胞をヒト化軽鎖および重鎖DNA構築物の全組み合わせ: L1+H1, L1+H2, L1+H3(配列番号35 + 41, 37 + 41, 39 + 41)を用いて、一過的に形質転換した。5% 超低 IgG 胎児ウシ血清および2mM グルタミンを含有するDMEM F12中に継代したCHOK1細胞を6ウェルプレート中コンフルエントになるまで増殖した。コンフルエント細胞を7.5μg DNA: Optimem Glutamax培地(Invitrogen)中30μg Transfast lipid(Promega)を用いて形質転換した。形質転換細胞を37℃にて5% CO2にてインキュベートした。72時間後、上清を回収し、抗体濃度についてアッセイし、そしてELISAによってヒトAβに対する結合について試験した。3つのヒト化重鎖と組み合わせたヒト化L1は全て、ヒトAβに結合する完全抗体を発現した。
【０１４６】
また、DNAのリポソーム送達(例えば、TransFast(Promega))を使用して大規模に一過的なCHOK1細胞トランスフェクションを行い、その後培養ボトルにて発現させることによって、ヒト化抗体を発現した。一過的なトランスフェクションにおける発現レベルを最適化するために、重鎖発現ベクターDNA：軽鎖発現ベクターDNAの比率を1:6とした。一過的なトランスフェクションに由来する材料は、ProSepAカラムまたはProSepA HiTrapカラムを用いたFPLCによって精製した。
【０１４７】
2E7ヒト化変異体H1L1、H2L1およびH3 L1のβ-アミロイド結合ELISAにおける評価
2E7 H1L1, H2L1およびH3L1ヒト化変異体を、C末端におけるヒトAβペプチド(1-40)ビオチン化に対する結合について調べた。キメラ2E7を参照として用いた。表5〜7は、大規模な一過的なトランスフェクションに由来する精製材料の様々なバッチを用いた結果を示す。
【表５】
2009531380.tif 000010
【表６】
2009531380.tif 000011
【表７】
2009531380.tif 000012
【０１４８】
これらの結果は2E7由来ヒト化変異体それぞれについての、非常によく似たAβ結合プロファイルを示していた。Aβ結合活性のわずかな損失を示す2E7cに対するEC50値の比較は、ヒト化法により行った。
【０１４９】
競合ELISAによる2E7ヒト化変異体の比較
2E7cキメラならびにヒト化抗体H1L1, H2L1およびH3L1を、ヒトAβペプチドと親マウス2E7 Mabとの結合を阻害する能力について、競合ELISAによって調べた。
【０１５０】
2つのタイプの競合ELISAを確立し、3つのヒト化変異体のAβ結合活性を2E7キメラ抗体と比較した。
【０１５１】
1)固定化β-アミロイド;ビオチン化ヒトAβペプチド(1-40)を、ELISAプレート上にストレプトアビジンにより固定した。マウス2E7抗体を定濃度で2E7由来のヒト化変異体抗体の希釈系列に従って加えた。次に結合したマウス2E7 Mabを抗マウスIgG コンジュゲートを用いて検出した。表8は2つの分析の結果を示す。
【表８】
2009531380.tif 000013
【０１５２】
2)溶液中のβ-アミロイド; 定濃度のβ-アミロイドをヒト化2E7抗体変異体の希釈系列と供に予めインキュベートした-複合体化したアミロイドおよび遊離アミロイドを含む混合物を、固定化マウス2E7 Mabを含有するウェルに短時間加えた。固定化親2E7 Mabを結合するのに依然として利用可能な遊離β-アミロイドの量を次に検出した。表9は2つの分析の結果を示す。
【表９】
2009531380.tif 000014
【０１５３】
全てのヒト化抗体変異体は、マウス2E7 Mabのβ-アミロイドに対する結合を非常に近似したプロファイルで阻害した。H2L1およびH3L1変異体について生じたIC50値は、2E7cキメラ(用いる場合)（両アッセイにおいて最高の阻害活性を有していた）のIC50値と常に近似していた。しかし、変異体H1L1は両アッセイにおいていくらか低減した阻害活性を示した。これはβ-アミロイドに対するアフィニティがわずかに低減する可能性を示している。
【０１５４】
2E7, 2E7c, H1L1, H2L1, H3L1のSPR BiacoreTM分析
ヒトβ-アミロイドペプチド(1-40)ならびに(1-42)に結合する、組換えマウス2E7 MAb,キメラ2E7cならびにヒト化変異体H1L1, H2L1およびH3L1の動力学パラメーターを、BiacoreTM 3000にてBiacoreTM分析により調べた。2つの異なるアッセイフォーマットを用いた。
【０１５５】
方法A
(i)簡潔にいうと、β-アミロイド1-40ペプチド(C末端にてビオチン化)の <20 共鳴単位を、ストレプトアビジンバイオセンサーチップ上で捕捉した(表10Aに用いられるように)。抗体をHBS-EP緩衝液中に希釈し、0.001nM〜8nMの濃度範囲でストレプトアビジン/β-アミロイド表面を通過させた(表10A)。2つを別々にランした; 各ランは新たなストレプトアビジン/β-アミロイド表面上で実施した。ラン1および2は実質的に同一であるが、用いたパラメーターにいくらか違いが存在した; ラン1をチップ表面を使用して実施し、この表面上にてβ-アミロイドの16 RUを捕捉し、抗体濃度は0.001nM〜8nMを使用し、4分間の結合時間および20分間の解離時間を50μl／分の流速で用いた。ラン2については、10 RU未満のβ-アミロイドを捕捉し、0.003125nM〜8nMの抗体濃度を用いた。流速および結合時間はラン1と同一であったが、解離時間を15分間に減らした。
【０１５６】
(ii)βアミロイド(1-40)および(1-42)は、CM5バイオセンサーチップの異なる表面上にて、<20 共鳴単位のレベルにアミン結合した(表10Bに用いられるように)。抗体をHBS-EP緩衝液中に希釈し、バイオセンサー/β-アミロイド表面を1nM〜64nMの濃度にて通過させた(表10Bに用いられるように)。
【０１５７】
方法B
第2の例において、アッセイを反対にし、抗体をまず、CM5バイオセンサーチップの抗マウスIgG ポリクローナル抗体表面(組換えマウス2E7 Mabについて)またはプロテインA表面(ヒト化H2L1について)にて1000〜2500共鳴単位のレベルに捕捉した。新たに調製したβ-アミロイド(1-40)または(1-42)をHBS-EP緩衝液中に希釈し、4〜500nMの濃度にて捕捉抗体表面を通過させた(表10Cおよび10D)。
【０１５８】
両方法において、再生は100mM H3PO4のパルス、表10Aデータについては、その後50mM NaOHのパルスによるものであった。表面は再生に対して、安定でありかつ影響を受けないことが示された。全てのランは、緩衝液ブランク注入に対して二重参照した。BiacoreTM分析ソフトウェア BIAevaluation version 4.1.を使用して分析した。
【０１５９】
結果
方法A(i)を用いて、β-アミロイド結合動的データにより抗体を順序付けた。得られたデータを表10Aに示す。これは親 2E7 Mabが、ストレプトアビジンで捕捉したβ-アミロイドに対して36.1 pMのKDを有することを示す。キメラマウス-ヒト抗体は45.8 pMとわずかに減少したKDを示し、ヒト化構築物は54(H2L1)〜93.6 pM(H1L1)の範囲であった。結論として、これはヒト化法が非常に良好であり、非常にわずかなアフィニティを喪失したことを示す。H2およびH3に導入したさらなる復帰突然変異はわずかであるが有効な効果を有する。しかし、H2およびH3構築物間の違いは3つの実験についての標準偏差内である。
【表１０Ａ】
2009531380.tif 000015
方法A(ii)を用いて、β-アミロイド(1-40)と比較してβ-アミロイド(1-42)のC末端におけるさらなる2つのアミノ酸残基が2E7およびH2L1の結合特性を優位に変化させないことを確認した。得られたデータを表10Bに示し、このことを確認した。
【表１０Ｂ】
2009531380.tif 000016
方法Bを用いて、第1アッセイフォーマットにて見られた親和性効果を否定した。親和性効果（バイオセンサー表面上(またはβ-アミロイドの多量体形態中)の2つの隣接するβ-アミロイド分子に同時に結合する単一抗体分子の両Fabドメインによって生じる）は結合の見かけのアフィニティを増大する。方法Bを使用して得られたアフィニティ測定値を表10Cに示す。
【表１０Ｃ】
2009531380.tif 000017
パパイン消化により得られたH2L1のFab断片が、ストレプトアビジン捕捉β-アミロイド(1-40)に方法A(i)と同様の方法により2.4nMの推定KDで結合する場合、本アッセイが真の1:1 結合アフィニティをもたらしたという証拠を得た。
【０１６０】
また、方法Bを用いて、β-アミロイド(1-40)と比較してβ-アミロイド(1-42)のC末端上のさらなる2つのアミノ酸残基は、同一の配列クローンのマウス2E7 Mab、すなわち2F11に対する結合特性を有意に変化させなかったことを確認した。得られたデータを表10Dに示す。
【表１０Ｄ】
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上記表面プラズモン共鳴アッセイを使用する 2E7のエピトープマッピング研究に類似する研究において、H2L1はβ-アミロイドペプチドのアミノ酸1-12(Aβ1,配列番号15)を含むペプチドに対する結合において2E7と同様の挙動を示したが、β-アミロイドペプチドのアミノ酸2-13を含むペプチド(Aβ2-13,配列番号44)にたいしてはそうではなかった。
【０１６１】
I125β-アミロイド流出モデルにおけるH2L1の活性
ヒト化H2L1と親マウスモノクローナル2E7とを機能的に比較するために、上記I125β-アミロイド流出モデルにおいて同日に供に試験した。
【０１６２】
H2L1および2E7の両者はビヒクルコントロールと比較して、血液中1分間あたりのカウント(CPM)が有意に増大した。血液中の放射能のCPMは以下のとおりであった(ビヒクル: 1940 ± 166; 2E7: 10065 ± 1386; H2L1: 10913 ± 1535)。用いた統計値はpost-hoc LSD検定を伴うANOVAであった。n=7ビヒクル, n=6 2E7, n=6 H2L1,(各試験化合物vsビヒクルについてp<0.001)。
【０１６３】
このデータは、ヒト化H2L1抗体がマウス2E7分子を用いて示される機能的特性を保持していることのさらなる証拠を提供する。
【０１６４】
H2L1および2E7の薬物動態の調査 
マウスにおける試験抗体の最終的な半減期を調べた。試験抗体を1時間、静脈点滴により4匹のマウスに投与し、マウス1匹あたり400μg投薬した。連続的な血液サンプルを、投薬後5日間、各マウスより採取した(2E7群に由来するマウス1匹は研究を完遂せず、またH2L1群に由来する1匹は、投薬量がi.v.投与されていないことが明らかとなったので、その後の分析から取り除いた)。抗体レベルをβ-アミロイド捕捉ELISAによって測定した。
【０１６５】
データの分析より、ヒト化抗体H2L1は、マウスにおいておよそ82時間の最終的な半減期を有し(表11)、これは親マウスモノクローナル抗体2E7(およそ 75 時間)に匹敵することが示される。
【表１１】
2009531380.tif 000019
【０１６６】
高齢の非ヒト霊長類における末梢アミロイド取り込みへのH2L1の影響
研究を高齢のカニクイザル(およそ15年齢)にて実施し、アミロイド/H2L1複合体形成とクリアランスに関係する曝露反応ならびにその後のCSFおよびCNSアミロイドレベルへの効果を調べた。週に1度、腰部CSF(ケタミンによる鎮静状態下で採取)および血液サンプルを第1回目のH2L1投与前の3週間採取した。3週目のサンプリングの直後、動物にプラシーボ(n=10), 0.1mg/kg(n=5), 1mg/kg(n=5)または10mg/kg (n=10)H2L1を投与し、その後2週間ごとに12週間投与した。H2L1および全Aβ42の血漿分析用の血液サンプルを週に1度採取した。Aβ40/42定量用のCSFサンプルを2週間ごとに採取した。投薬期間完了の後、動物を安楽死させ、上記生化学分析によりβ-アミロイドについて脳定量を行い、またマイクロ出血を調べた。最も少ない投薬群(0.1 mg/kg)において、動物を時間差を置いて安楽死させ、投薬終了の結果として脳レベルでの潜在的な経時的影響およびそれによる血漿アミロイドプールの飽和について調べた。
【０１６７】
この研究は実験段階開始前に、MACCINE Pte Ltdまたは「Maccine」の動物管理使用委員会(Institutional  Animal Care and Use Committee(IACUC))の承認を受けた。IACUC プロトコル番号は#08-2006であった。GSKはMaccineの査察を行い、その倫理審査法を検討し、容認可能であることがわかった。
【０１６８】
血漿サンプルを1:10〜1:50000に連続希釈し、Aβ40コートELISAプレートに加えた。検量線を希釈剤中0〜10μg/ml H2L1の範囲で作成した。4℃にて一晩インキュベートした後、H2L1を抗ヒト IgG ホースラディッシュペルオキシダーゼ(Amersham ‐希釈剤中1:2000に希釈)およびテトラメチルベンジデン検出システムを使用して可視化した。単回および繰り返し iv ボーラス投与した後、H2L1の血漿レベルが用量依存的に増加したことが示された。薬物動態がかなり非直線性である証拠は存在せず、これはほとんどの投与間隔において、遊離アミロイドレベルと比べて血漿中H2L1が過剰モル濃度で得られたことを示す。
【０１６９】
全Aβ42を純血漿中にて市販のAβ1-42 ELISAキット(Innogenetics)を製造者の指示に従って使用し、キットの希釈にて作製した500-7pg/mlの検量線を用いて測定した。サンプルおよび標準品をキットの指示書にしたがって、二揃いにてアッセイ前に4℃で一晩インキュベートする。Aβ42アッセイにより添加された検出抗体による干渉により、このキットを用いて遊離Aβ42レベルを測定することはできず、見かけの「全」Aβ42を測定するという点に留意すべきである。Aβ42は用量および濃度依存的に増大した(10, 1または0.1mg/kg H2L1投与後に検出されたプラトーレベルはそれぞれおよそ300, 125および25 pg/ml)。
【０１７０】
本分析より、「全Aβ42」の増大は血漿プールの外側からのアミロイドの有意な流出のよるものである可能性があり、H2L1 濃度 >1 μg/mLに依存していると考えられ、複合体クリアランスの喪失によるものとは考えられなかった。このことは全Aβ42の除去速度および投薬間隔にわたる総レベルの変動より明らかであった。
【０１７１】
今まで、血漿分析のみが行われ、完全に分析されていた。しかし、予備的な分析より、10mg/kg H2L1での処理後、「全」Aβ42がCSF において減少し、海馬レベルで増大する(通常上記したように測定した)傾向があることを示す。
【０１７２】
いくつかの脳切片において、わずかな領域でのマイクロ出血をPerls’ Prussian Blue染色法によって検出した。この方法は不溶性青色化合物を生成することによって、鉄イオン(鉄は赤血球に見出される酸素運搬ヘモグロビンの必須要素である)を可視化する。しかし、ビヒクルで処理した動物と薬物処理した動物とで出現率に違いはなかった。
【０１７３】
脳におけるβアミロイドプラークおよび血漿中の全βアミロイドについての高齢カニクイザル（Cynomologus macaque monkey）の分析
ヒトADの脳脊髄液(CSF)および組織パラメーターをカニクイザルにおいて示した。高齢のカニクイザルはアミロイド沈着の証拠を示した。(Covance, The cynomolgus monkey as a model for Alzheimer’s disease. In: Buse E, Habermann G, Friderichs-Gromoll S, Kaspereit J, Nowak P and Niggemann K, editors. Poster Presentation at the 44th Annual Meeting of the Society of Toxicology, New Orleans, Louisiana, 6 to 10 March 2005)。H2L1が高齢の脳において不適切な応答（例えば、脳炎）を誘発する可能性を高齢の（約20年齢）の 妊娠経験にあるメスザルにおいて調べた。さらに、安全性、処理に関連するマイクロ出血、試験材料の中和／クリアランス、過敏性および免疫複合疾患をまた、1週間に2回の間隔で8週間静脈内投与した後に調べた。さらに、CNSおよび血液サンプルをAβ40/42のレベルについて分析した。
【０１７４】
研究計画
5頭(第1群)、9頭(第2群)または10頭(第3群)からなる群の高齢のメスカニクイザルに、ビヒクル(4 ml/kg)中0(ビヒクル)、50または100 mg/kg/投与日のH2L1を隔週で8週間、ゆっくりとボーラス静脈投与により与えた。ビヒクルは酢酸ナトリウム三水和物6.81 mg/mL, 無水エデト酸2ナトリウム0.0186 mg/mL, ポリソルベート 80 0.2 mg/mLおよびL-アルギニン塩基10 mg/mLからなり、pHは5.5であった。用量レベルを、意図される臨床用量レベルの5倍および10倍の用量レベルを検討するために選択した。
【０１７５】
以下について、投薬前、毎日(臨床的兆候、体重、飼料消費)、4週目および剖検の前の週に評価した:生存中の動物の観察、体重、体温、血液学、臨床化学(脳脊髄液 [CSF]分析を含む)、尿検査およびCSF中のサイトカイン測定。脳の剖検、器官の計量、巨視的観察および顕微鏡観察の後、頸髄および肉眼的病変を全ての動物において処置した。トキシコキネティクスの評価を各投薬後に実施した。
【０１７６】
結果
予定外の死亡が生じたり、また所定の投与量において、当該動物の全身状態になんら影響を及ぼさない試験項目も存在したりした。臨床病理(血液学および血清化学)における顕著な観察のみ、年齢関連であり、かつ被験物質関連ではないことを結論付けた。
【０１７７】
H2L1への全身暴露は(AUC0-τおよびCmaxにより測定した場合)用量に比例して増大した。両用量群について、第1用量および第4用量のサンプリング期の間で、全身暴露に顕著な変化(≧2倍)はなかった。
【０１７８】
CSF分析によって検出された脳において炎症反応の兆候は見られず、また剖検において肉眼で見える、または顕微鏡による所見はなかった。このことは試験物質がマイクロ出血または脳炎に特に影響を及ぼさないことを示す。
【０１７９】
本研究はGerman Chemical Law, annex 1 and 2 to §19a Chemikalien Gesetz, June 2002, the OECD Principles of Good Laboratory Practice(revised 1997, issued January 1998)ENV/MC/CHEM(98)17, the Consensus Document "The Application of the OECD Principles of GLP to the Organisation and Management of Multi-Site Studies" ENV/JM/MONO(2002)9に沿って、Good Laboratory Practice Regulationsに従って実施した。研究は上記規定に沿って実施し、基準はUS FDA規制当局に容認されると考えられた。
【０１８０】
CNSにおけるプラーク取り込みの分析
上記研究に由来するビヒクルで処理したカニクイザル（cynomologus macaque monkey）の左脳を、免疫組織化学によって分析した。歯状回および海馬の部分を含む中側頭溝のレベルの冠状切片を、上記のようにワックス中へと処理した。免疫組織化学については、切片をpan-Aβ抗体(1E8, Aβ13-27に対するモノクローナル抗体)またはAβ42抗体(20G10, Aβx-42を認識するモノクローナル抗体)で標識し、そして標識を上記のように発色した。目で見えるプラーク数を各切片についてカウントした。ビヒクルで処理したカニクイザルの5頭全ての組織において実質Aβプラークの兆候が見られた。また、脳血管の標識Aβおよび神経細胞内のAβの兆候も存在した。
【０１８１】
血漿中のβアミロイド／抗体複合体の分析
50mg/kg(n=9)もしくは100mg/kg(n=10)H2L1を投薬した動物またはビヒクルを投薬したコントロール(n=5)に由来する、2時点（投薬開始から4週間および8週間後）の血漿サンプルについて生化学的分析を行った。100μlの二揃いサンプルを市販の Innogenetics Aβ1-42 ELISAキットを使用して分析し、4℃にて一晩インキュベートした。コントロールサンプルを、そのままおよび1:10希釈(希釈剤を添加して)で分析し、一方投薬した動物に由来するサンプルは、そのままおよび1:25希釈で試験した。その後吸光度値を、検量線を使用してpg/ml値に逆算された未知の吸光度値を用いて分析し、そしてアッセイ希釈について補正した。これらのサンプルに由来するAβ42の全血漿レベルを下記表12に示す(pg/ml ± SE); H2L1で処理した動物に由来する全てのサンプルは、コントロール群よりも顕著に高いAβ42のレベルを含んでいた(p < 0.001 ステゥーデントt検定による)。
【表１２】
2009531380.tif 000020
【０１８２】
報告されるデータは希釈サンプルより得られた。そのままのサンプルに由来する結果は、多くのデータ点として用いなかった。そのままのサンプルに由来する結果は、上記基準よりも大きく、サンプル量に制限があるためである。従って、単一点でのみアッセイを行った。
【０１８３】
製造方法
H2L1をコードし、かつ増幅可能な選択マーカー（例えば、DHFRまたはグルタミンシンテターゼ）に機能的に連結されている発現ベクターを用いて、親CHO細胞株(例えば、CHODG44またはCHOK 1)をトランスフェクトまたは形質導入して、大規模にモノクローナル抗体を産生するのに好適な遺伝子組換え細胞株を作製できる(概説については、Bebbington and Hentschel DNA Clonong Volume III; A practical approach(Glover Dm編)(Oxford IRL press, 1987)参照)。発現レベルを増大させるために、コード配列をシス作用配列モチーフおよび極端なGC含有量(多いまたは少ない)を回避するためにコドン最適化し得る。配列番号42および43はH2重鎖およびL1軽鎖のコード配列を例示する。大規模生産は撹拌型タンクバイオリアクター中にて動物由来成分を含まない培地を使用して、その後精製して行い得る。本方法は、得られたものの清澄化、プロテインAアフィニティクロマトグラフィー、さらにイオン(例えば、カチオン)交換および混合型(例えば、セラミックヒドロキシアパタイト)クロマトグラフィ単位の操作を用いた精製を含み得る。ウイルス除去を行うナノろ過の後、意図する投与経路に好適に製剤化することが可能な最終的な限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程を含む。
【０１８４】
製剤処方の例
含有物 量(1mLあたり)
H2L1                            50mg 
酢酸ナトリウム三水和物          6.81mg 
ポリソルベート 80               0.20mg
アルギニン塩基                  10.00mg
塩化ナトリウム                  3.00mg
エデト酸2ナトリウム二水和物     0.0186mg
塩酸                            pH 5.5にするのに十分量
注射用の水                      1.0mLにするために
窒素                            ヘッドスペースを満たす
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【０１８５】
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【０１８６】
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【０１８７】
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【０１８８】
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【国際調査報告】
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