(57)【要約】本発明は、油滴の容量による母集団の９０％のサイズが２００ｎｍ以下である、少なくとも、スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテルである非イオン界面活性剤、および熱可逆性疎水性非イオン界面活性剤を含む水中油型アジュバントエマルションに関する。本発明はまた、少なくとも１つのワクチン抗原を水中油型エマルションと混合する、免疫原性組成物の製造方法に関する。本発明は、温度変化による転相法によって水中油型エマルションが得られることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、
スクアレン、
水性溶媒、
ポリオキシエチレンアルキルエーテルである非イオン界面活性剤、
疎水性非イオン界面活性剤
を含むことを特徴とする水中油型アジュバントエマルションであって、
それが熱可逆性であること、および油滴の容量による母集団の９０％が２００ｎｍ以下のサイズであることを特徴とする、水中油型アジュバントエマルション。
【請求項２】
油滴の容量による母集団の９０％が１６０ｎｍ以下のサイズであることを特徴とする、請求項１記載のエマルション。
【請求項３】
油滴の容量による母集団の９０％が１５０ｎｍ以下のサイズであることを特徴とする、請求項１または２記載のエマルション。
【請求項４】
油滴の容量による母集団の５０％が１００ｎｍ以下のサイズであることを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項記載のエマルション。
【請求項５】
油滴の容量による母集団の５０％が９０ｎｍ以下のサイズであることを特徴とする、請求項１〜４いずれか１項記載のエマルション。
【請求項６】
さらに少なくとも１種類のアルジトールを含むことを特徴とする、請求項１〜５いずれか１項記載のエマルション。
【請求項７】
疎水性非イオン界面活性剤がソルビタンエステルまたはマンニッドエステルを含むことを特徴とする、請求項１記載のエマルション。
【請求項８】
ポリオキシエチレンアルキルエーテルがポリオキシエチレン(１２)セトステアリルエーテルであることを特徴とする、請求項１〜７いずれか１項記載のエマルション。
【請求項９】
アルジトールがグリセロール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールから選択されることを特徴とする、請求項１〜８いずれか１項記載のエマルション。
【請求項１０】
疎水性非イオン界面活性剤がモノオレイン酸ソルビタンであることを特徴とする、請求項１〜９いずれか１項記載のエマルション。
【請求項１１】
スクアレンの量が５〜４５％であることを特徴とする、請求項１〜１０いずれか１項記載のエマルション。
【請求項１２】
ポリオキシエチレンアルキルエーテルをベースとする界面活性剤の量が０.９〜９％であることを特徴とする、請求項１〜１１いずれか１項記載のエマルション。
【請求項１３】
疎水性非イオン界面活性剤の量が０.７〜７％であることを特徴とする、請求項１〜１２いずれか１項記載のエマルション。
【請求項１４】
スクアレン３２.５％、
ポリオキシエチレン(１２)セトステアリルエーテル６.１８％、
モノオレイン酸ソルビタン４.８２％、
マンニトール６％
を含むことを特徴とする、請求項１〜１３いずれか１項記載のアジュバントエマルション。
【請求項１５】
さらにアルキルポリグリコシドを含むことを特徴とする、請求項１〜１４いずれか１項記載のエマルション。
【請求項１６】
さらに凍結保護剤を含むことを特徴とする、請求項１〜１５いずれか１項記載のエマルション。
【請求項１７】
筋肉内投与を目的とした免疫原性組成物を製造するための、請求項１〜１６いずれか１項記載のエマルションの使用。
【請求項１８】
皮内投与を目的とした免疫原性組成物を製造するための、請求項１〜１６いずれか１項記載のエマルションの使用。
【請求項１９】
皮下投与を目的とした免疫原性組成物を製造するための、請求項１〜１６いずれか１項記載のエマルションの使用。
【請求項２０】
インフルエンザに対する投与を目的とした免疫原性組成物を製造するための、請求項１〜１６いずれか１項記載のエマルションの使用。
【請求項２１】
ＡＩＤＳに対する投与を目的とした免疫原性組成物を製造するための、請求項１〜１６いずれか１項記載のエマルションの使用。
【請求項２２】
ヒトサイトメガロウイルス病理に対する投与を目的とした免疫原性組成物を製造するための、請求項１〜１６いずれか１項記載のエマルションの使用。
【請求項２３】
少なくとも１つのワクチン抗原を水中油型エマルションと混合することを含む免疫原性組成物の製造方法であって、該水中油型エマルションが温度変化による転相法によって得られることを特徴とする、方法。
【請求項２４】
少なくとも、油中水型逆エマルションを冷却することによって水中油型エマルションを調製する工程を含むことを特徴とし、ここで、該油中水型逆エマルションが、少なくとも、
スクアレン、
水性溶媒、
ポリオキシエチレンアルキルエーテルである親水性非イオン界面活性剤、
疎水性非イオン界面活性剤
を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
油中水型逆エマルションが、スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテルである非イオン界面活性剤、および疎水性非イオン界面活性剤を混合して、まず、粗水中油型エマルションを得、次いで、このエマルションを少なくとも転相温度まで加熱して油中水型逆エマルションを得ることによって得られることを特徴とする、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
一方で、水性溶媒およびポリオキシエチレンアルキルエーテルである界面活性剤を含む水性相を、他方で、スクアレンおよび疎水性界面活性剤を含む油性相を、別々に、少なくとも転相温度と等しい温度まで加熱すること、次いで、
この２つの相を混合して油中水型逆エマルションを得る、
請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
一方で、水性溶媒およびポリオキシエチレンアルキルエーテルである界面活性剤を含む水性相を、他方で、スクアレンおよび疎水性界面活性剤を含む油性相を、別々に、エマルションの転相温度よりも低い温度まで加熱し、
次いで、この２つの相を混合して、水中油型エマルションを得、
次いで、得られた水中油型エマルションを少なくとも転相温度と等しい温度まで加熱して、油中水型逆エマルションを得る、
請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
転相温度が４５〜８０℃の間であることを特徴とする、請求項２３〜２７いずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
転相温度が５０〜６５℃の間であることを特徴とする、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
さらに、少なくとも１つの凍結乾燥工程を含むことを特徴とする、請求項２３〜２９いずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
請求項２３〜３０いずれか１項記載の方法によって得ることができることを特徴とする、免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチンの分野に関する；より詳しくは、本発明は、アジュバントエマルションを含むワクチンの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来技術として、１種類またはそれ以上のアジュバントを含有するワクチンが多数存在する。特許文献１には、特に、油滴のサイズが１００〜１０００ｎｍの間である水中油型エマルションを含むアジュバント製剤が記載されている。このエマルションは、油滴のサイズを縮小させるのに十分に大きい剪断力を得るために高い機械的エネルギーを使用する製造の過程で高圧ホモジナイザー（マイクロフルイダイザー）を用いて得られる。この教示によると、得られる油滴のサイズ範囲の最小値は１００ｎｍであり、平均値はそれよりも非常に高く、最高で約１７０ｎｍであり、より一般的には約５００ｎｍである。
【特許文献１】米国特許第６,２９９,８８４号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
低エネルギー法であると同時に再現性があり、かつ完全に信頼性のある、より簡単な（いずれもの特定の剪断技術を必要としない）方法を用いて得ることができる、上記特許にて提案された製剤の代わりになる有用な製剤が望まれている；加えて、該アジュバント製剤は、特に、得られる免疫応答の増大または存在する抗原の量の減少を可能にすることと同時にその完全に安全な投与に有害であろう毒性の徴候を示さないことによって、ワクチンを有効に補助できなければならない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
この目的を達成するために、本発明の主題は、少なくとも、
スクアレン、
水性溶媒、
ポリオキシエチレンアルキルエーテルである親水性非イオン界面活性剤、
疎水性非イオン界面活性剤
を含むことを特徴とする水中油型アジュバントエマルションであって、
それが熱可逆性であること、および油滴の容量による母集団の９０％が２００ｎｍ以下のサイズであることを特徴とする、水中油型アジュバントエマルションにある。
【０００５】
本発明によると、かかるエマルションは温度変化による転相法によって得られ、工業的見地から非常に大きな利益をもたらす。かかる方法は、製薬工業に必要な安全性および収益性の保証の全てを提供する。加えて、この方法によって、単分散エマルションを得ることができ、その小滴サイズは非常小さく、このようにして得られたエマルションは特に安定となり、滅菌フィルターによって容易に濾過することができ、そのカットオフ閾値は２００ｎｍである。
【０００６】
特定の特徴によると、油滴の容量による母集団の９０％（またはｄ９０）は、１６０ｎｍ以下のサイズであり、１５０ｎｍ以下でもよい。
【０００７】
本発明の特定の実施態様によると、本発明のエマルションはまた、アルジトールを含む；これにより、アルジトールを含有しない同組成物に必要な温度よりも低い温度で転相を得ることが可能になり、生産コストおよびエマルションの成分の熱変性のリスクをも低減させることが可能になる。
【０００８】
特定の有利な実施態様によると、本発明の疎水性非イオン界面活性剤は、ソルビタンエステルまたはマンニッドエステルである。かかる界面活性剤は、注射液剤中にて全く安全に使用することができるという利点を有する。
【０００９】
本発明の特定の実施態様によると、該エマルションはまた、アルキルポリグリコシドおよび凍結保護剤（例えば、糖、特に、ドデシルマルトシドおよび／またはシュークロース）を含む。
【００１０】
かくして、凍結乾燥および復元後にその特性（特に、粒度特性）を回復する凍結乾燥可能なエマルションを得ることができる。すなわち、凍結乾燥し、次いで、復元したエマルションはなおも単分散であり、容量による母集団の９０％が２００ｎｍ以下のサイズである油滴からなる。このことは、しばしば、安定性（ある種の抗原またはある種のアジュバントのいずれかの安定性）のために凍結乾燥形態で保存されなければならないワクチンの分野にとって特に重要である。
【００１１】
本発明の主題はまた、水中油型エマルションが温度変化による転相法によって得られることを特徴とする、少なくとも１種類のワクチン抗原を水中油型エマルションと混合することによる免疫原性組成物の製造方法である。
【００１２】
一の実施態様によると、本発明の方法は、少なくとも１つの、油中水型逆エマルションを冷却することによって水中油型エマルションを調製する工程を含み、ここで、該油中水型逆エマルションが、少なくとも、
スクアレン、
水性溶媒、
ポリオキシエチレンアルキルエーテルである親水性非イオン界面活性剤、
疎水性非イオン界面活性剤
を含む。
【００１３】
工業的見地から非常に有利なかかる方法によって、非常に低用量の抗原であっても非常に有効である安定な免疫原性組成物が得られる。
【００１４】
加えて、使用される製造方法によって、エマルションの油滴は全て、非常に小さいサイズのものにキャリブレートされる；実際、粒度特性（サイズおよび粒度分布）を測定した場合、エマルションは、非常狭くて低い値（一般に、８０〜９０ｎｍ）を中心とするガウス分布曲線を有する単分散エマルションであることが判明する。
【００１５】
本発明の方法の特定の実施態様によると、油中水型逆エマルションは、スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテルである親水性非イオン界面活性剤、および疎水性非イオン界面活性剤を混合して、まず、粗水中油型エマルションを得、次いで、このエマルションを少なくとも転相温度まで加熱して逆エマルションを得ることによって得られる。このようにして該方法を実施すると、エマルションの様々な成分が高温にさらされる時間を制限するという利点が得られる。
【００１６】
別の実施態様によると、本発明の方法は、以下の工程：
一方で、水性溶媒およびポリオキシエチレンアルキルエーテルを含む水性相を、他方で、スクアレンおよび疎水性界面活性剤を含む油性相を、別々に、少なくとも転相温度と等しい温度まで加熱すること、次いで、
この２つの相を混合して油中水型逆エマルションを得ること
を含む。
【００１７】
本発明の特定の実施態様によると、水性相および油性相の各々を、混合する前に別々に、転相温度よりも低い温度まで加熱する。次いで、この２つの相を混合して油中水型エマルションを得る；次いで、全体を少なくとも転相温度と等しい温度まで加熱して油中水型逆エマルションを得る。
【００１８】
特定の実施態様によると、本発明の製造方法はまた、凍結乾燥工程を含む。かくして、本発明の方法は、安定性のために凍結乾燥形態で保存しなければならない抗原を含有する免疫原性組成物の製造に使用することができる。
【００１９】
本発明の多くの利点は、以下の記載で明らかになるであろう。
【００２０】
本発明の記載の目的のために、本明細書に記載するパラメーターｄ５０およびｄ９０は、容量に関する値である；ｄ５０値は、小滴の容量による母集団の５０％の値を意味する。
【００２１】
本発明の目的のために、「水中油型エマルション」なる用語は、緩衝化されてもよい水または生理食塩水のいずれかからなり得る水性相中における油性相の分散を意味するものである。本発明の特定の実施態様によると、エマルションの水性相は、ダルベッコのリン酸緩衝溶液（Ｄ−ＰＢＳ、カルシウムまたはマグネシウムを含まない）のような緩衝液からなる。
【００２２】
「アジュバントエマルション」なる用語は、免疫アジュバントエマルション、すなわち、抗原の投与の間に誘導される免疫系の応答を、該エマルションの不在下で得られる応答と比べて修飾することができるエマルションを意味するものである；この免疫系応答には、抗体産生、またはある種の細胞（特に、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）、Ｔリンパ球およびＢリンパ球）の活性化が反映され得る。この細胞活性化は、細胞の表面での活性化マーカーの存在またはサイトカインの放出によって立証することができる。該アジュバントエマルションによって誘導される免疫応答の修飾は、本質的に定量的であり得る（すなわち、誘導応答の増大が得られる）か、または、本質的に定性的であり得る（すなわち、本質的に異なるかまたは異なる配向を有する応答が得られるか、またはさらなる応答が得られる）。「アジュバントエマルション」なる用語はまたは、同一の誘導応答のために投与される抗原の量を減少させることを可能にするエマルションを意味するものである。
【００２３】
本発明の目的のために、「免疫原性組成物」なる用語は、免疫系応答を誘導するために、ヒトまたは動物に投与することができる、少なくとも１種類の抗原を含む組成物を意味するものである。この応答は、体液性応答（抗体産生）または細胞応答（免疫細胞の増殖および／または活性化）であり得る。免疫原性組成物は、予防目的もしくは治療目的またはその両方のための組成物であり得る。本発明に従って得られる免疫原性組成物は、ワクチンのために通常使用されるかまたは推奨される経路のいずれか（非経口または経粘膜）によって投与することができ、種々の形態、特に、液体または凍結乾燥形態であり得る。筋肉注射、皮下注射もしくは皮内注射のための注射器もしくは無針注射器、または鼻腔用スプレーによって投与され得る。
【００２４】
本発明の目的のために、「抗原」なる用語は、その性質に関係なく、含まれるのが微生物全体であってもサブユニット抗原であっても、ワクチンにおいて使用され得るいずれもの抗原を意味するものである；抗原は、実際、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖、糖脂質、リポペプチドなどであり得る。
【００２５】
本発明のアジュバントエマルションは、特にウイルス抗原に適している；実際、ヒトサイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルスおよびインフルエンザウイルスの抗原の場合に特に良好な結果が得られた。
【００２６】
インフルエンザウイルス抗原に関して、単一のウイルス株、または種々のウイルス株の混合物に由来する抗原を使用することができる。卵または細胞にて慣用的に培養されたウイルス由来の抗原を使用することができる。本発明によると、単一の株であっても株の混合物であっても、満足のいく免疫系応答を得ることができると同時にワクチン中に存在する抗原の量を非常に実質的に減少させることができることが判明した。このことは、非常に短期間で非常に大量のワクチンを生産することができなければならないインフルエンザ大流行に対するワクチンの調製の場合に特に大きな価値のあるものであり得る。
【００２７】
本発明によると、水中油型エマルションは、当初はサメの肝臓由来であった油であるスクアレンを含む；それは、実験化学式がＣ30Ｈ50である６つの二重結合を含む油である；この油は、代謝可能であり、注射用医薬品に使用することができる質を有する。オリーブオイルから抽出される植物起源のスクアレンも存在する。特に、Fluka社によって提供される動物起源のスクアレンを使用すると良好な結果が得られた。濃縮エマルションの調製に使用されるスクアレンの量は、有利には、５〜４５％である；この濃縮エマルションは、その後、免疫原性組成物の調製の間に希釈されて、スクアレンの量が０.５〜５％の免疫薬を調製することができる。この希釈は、本発明のアジュバントエマルションと抗原を含む懸濁液とを単純に混合することによって行うことができる。
【００２８】
本発明によると、当該エマルションは、親水性／親油性バランスまたはＨＬＢの値が１０またはそれ以上であり、ポリオキシエチレン化脂肪アルコールエーテルまたはｎ−アルキルポリオキシエチレングリコールエーテルとしても知られているポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＰＡＥ）の化学基に属する親水性非イオン界面活性剤を含む。これらの非イオン界面活性剤は、脂肪アルコールとエチレンオキシドとの化学的縮合によって得られる。それらは、ＣＨ3(ＣＨ2)x−(Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2)n−ＯＨ（ｎは、エチレンオキシド単位の数を示し、通常、１０〜６０であり、ｘ＋１は使用する脂肪アルコールに依存する炭素数である）のタイプの一般的な化学式を有する。一般に、これらの生成物は、類似の長さの炭化水素をベースとする鎖をもつポリマーの混合物である。
【００２９】
本発明のエマルションは、通常、単一の親水性ＰＡＥを含む。全体的なＨＬＢ値が≧１０である限りいくつかのＰＡＥの混合物もまた適している。
【００３０】
本発明の主題に適しているポリオキシエチレン化脂肪アルコールエーテルは、周囲温度で液体形態であっても固体形態であってもよい。固体化合物のうち、水性相に直接溶解するものまたは実質的な加熱を必要としないものが好ましい。
【００３１】
エチレンオキシド単位の数が十分である限り、ラウリル、ミリスチル、セチル、オレイルおよび／またはステアリルアルコールのポリオキシエチレン化エーテルは、本発明の主題に特に適している。それらは、特に、ICI America's Inc.社によって販売されている製品についてＢｒｉｊ（登録商標）、Cognis社によって販売されている製品についてＥｕｍｕｌｇｉｎ（登録商標）、またはSEPPIC社によって販売されている製品についてＳｉｍｕｌｓｏｌ（登録商標）の商品名の下に知られている製品の範囲で見つけることができる。
【００３２】
本発明の特に好ましいエマルションは、親水性非イオン界面活性剤として、ｃｅｔｅａｒｅｔｈ−１２（Ｅｕｍｕｌｇｉｎ（登録商標）Ｂ１の名称の下に販売）、ｃｅｔｅａｒｅｔｈ−２０（Ｅｕｍｕｌｇｉｎ（登録商標）Ｂ２）、ｓｔｅａｒｅｔｈ−２１（Ｅｕｍｕｌｇｉｎ（登録商標）Ｓ２１）、ｃｅｔｅｔｈ−２０（Ｓｉｍｕｌｓｏｌ（登録商標）５８またはＢｒｉｊ（登録商標）５８）、ｃｅｔｅｔｈ−１０（Ｂｒｉｊ（登録商標）５６）、ｓｔｅａｒｅｔｈ−１０（Ｂｒｉｊ（登録商標）７６）、ｓｔｅａｒｅｔｈ−２０（Ｂｒｉｊ（登録商標）７８）、ｏｌｅｔｈ−１０（Ｂｒｉｊ（登録商標）９６またはＢｒｉｊ（登録商標）９７）およびｏｌｅｔｈ−２０（Ｂｒｉｊ（登録商標）９８またはＢｒｉｊ（登録商標）９９）からなる群から選択されるポリオキシエチレンアルキルエーテルを含有する。各化学名に付けられた番号は、化学式中のエチレンオキシド単位の数に対応する。
【００３３】
Ｂｒｉｊ（登録商標）５６なる製品を用いて良好な結果が得られた。半合成起源のために特に適しており好ましい化合物は、ＥｕｍｕｌｇｉｎTMＢ１の名称の下にCognis社によって供給されるポリオキシエチレン(１２)セトステアリルエーテルである。この化合物は、ＣＨ3(ＣＨ2)15−(Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2)12−ＯＨおよびＣＨ3(ＣＨ2)17−(Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2)12−ＯＨの混合物である。
【００３４】
本発明によると、アジュバントエマルションはまた、疎水性非イオン界面活性剤を含む；それは、製薬工業で使用され得る界面活性剤でなければならない；この点において適している界面活性剤のうち、ソルビタンエステルおよびマンニッドエステルを挙げることができる；ソルビタンエステルは、脂肪酸、およびソルビトールの部分エステルとその一および二無水物との混合物の反応によって得られる；これは、モノ−、ジ−もしくはトリエステルまたはそれらの混合物を含むことができる；それらは、全体的な親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）が９以下、好ましくは、６以下の疎水性界面活性剤である。それらは、特に、Ｓｐａｎ（登録商標）の名称の下にICI Americas Inc.社によって販売されている界面活性剤、またはＤｅｈｙｍｕｌｓTMの名称の下にCognis社によって販売されている界面活性剤またはＡｒｌａｃｅｌTMの名称の下にICI社によって販売されている界面活性剤の範囲で見つけることができる；特に適している界面活性剤の例としては、Ｄｅｈｙｍｕｌｓ ＳＭＯTMまたはＳｐａｎ（登録商標）８０の名称の下に販売されているモノオレイン酸ソルビタンが挙げられる。マンニッドエステルからなる界面活性剤のうちでは、Sigma社によって販売されているか、またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ ８０TMの名称の下にSeppic社によって販売されているモノオレイン酸マンニッドが挙げられる。
【００３５】
この度、エマルションを調製することに関して従来技術において提案されている全ての界面活性剤のうちのこれらの特定の界面活性剤の選択により、転相法を用いて水中油型アジュバントエマルションを非常に有利に製造することができることが見出された。
【００３６】
これに関し、スクアレンおよび各界面活性剤の使用量は、有利には、状態図が、界面張力が非常に低いゼロ平均曲率相（マイクロエマルションまたはラメラ相タイプ）を含む混合物を得るように選択される。
【００３７】
スクアレンの使用の場合には、使用される種々の界面活性剤の全体的なＨＬＢ値が８.５〜１０、特に、８.６〜９.６の間である場合に、得られるエマルションは安定かつ単分散であり、油滴のサイズは非常に小さい（ｄ９０が２００ｎｍ以下）ことが判明した。エマルションの組成物中の親水性界面活性剤および疎水性界面活性剤の各濃度を決定するために、下記式を使用することができる：
ＨＬＢm＝(ＨＬＢe×Ｍ)＋ＨＬＢpae(１−Ｍ)
ここで、
ＨＬＢmは、混合物のＨＬＢに相当し、好ましくは、８.５〜１０、特に、８.６〜９.６であり、
ＨＬＢeは、疎水性界面活性剤のＨＬＢに相当し、
Ｍは、疎水性界面活性剤およびポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＰＡＥ）からなる混合物中の疎水性界面活性剤の質量パーセントに相当し、
ＨＬＢpaeは、ＰＡＥのＨＬＢに相当する。
【００３８】
５〜４５％の濃度のスクアレンを使用することによって、転相温度が９５℃以下のエマルションが非常に有利に得られることが判明した。
【００３９】
かかるエマルションについて、０.９〜９％の濃度のポリオキシエチレンアルキルエーテルおよび０.７〜７％の濃度の疎水性非イオン界面活性剤を使用することができる；エマルションの残部は水性溶媒からなる。
【００４０】
本発明の特定の実施態様によると、免疫原性組成物はまた、アルジトール、例えば、特に、グリセロール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトールまたはマンニトールを含む。特に、Roquette Freres社によって販売されているマンニトールを用いると良好な結果が得られた。当該製造方法において使用するアルジトールの量は、１〜１０％、特に、２〜７の範囲であり得る。
【００４１】
本発明の特定の実施態様によると、アジュバントエマルションはまた、得られたエマルションの凍結乾燥を可能にする凍結保護剤を含む；凍結保護剤のうち、糖が特に好ましく、特にシュークロースが好ましい。加えて、本発明のエマルションは、糖ヘッドの界面活性剤であるアルキルポリグリコシドを含むことができる；特に、デシル−Ｄ−ガラクトシドウロン酸ナトリウムであり得るか、または好ましい実施態様によるとRoche社から入手可能なドデシル−β−マルトシドであり得る。
【００４２】
温度を変化させることによって得られる転相による本発明のエマルションの製造方法によって、油滴のサイズが非常に均一である水中油型エマルションが非常に容易にかつ非常に再現性良く得られる：ｄ９０値（容量による）は、２００ｎｍ以下、好ましくは、１５０ｎｍ以下であり、１００ｎｍに近くてもよく、一方、ｄ５０値は、１００ｎｍ以下、または９０ｎｍであってよい。本発明の方法に従って製造されたエマルションのほとんどは、約８０ｎｍのｄ５０値、約１００ｎｍのｄ９０値を得ることができる（測定は、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＬＳ２３０を用いて行われる）。かくして、得られたエマルションが十分に希釈される条件下で該エマルションの滅菌濾過を行うことができる。
【００４３】
小滴のサイズが均一かつ非常に小さいかかるエマルションは、経時的に安定である。かくして、本発明に従って調製され、４℃で貯蔵されたエマルションは、２年後に、エマルションが非常に高度に安定であることを証明する９０ｎｍのｄ５０値および１１６ｎｍのｄ９０値をもつ単分散プロフィールを保存していることが判明した。
【００４４】
小滴のサイズは、様々な手段によって測定することができ、特に、ＬＳ系のＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ装置（特に、ＬＳ２３０）またはＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ系のＭａｌｖｅｒｎ装置（特に、Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００）のようなレーザー回折粒度によって測定することができる。これらの装置の測定の原理は、試料にレーザー光を照射した場合に角度（大、中および小角検出器）の関数として粒子により散乱した光の強度を分析することに基づいている。この分析は、使用される物質のサイズおよび性質に従って選択される数学的モデルによって行われる。サブミクロン粒子のサイズの測定の場合、試料の屈折率（スクアレンについては１.４９５）およびその媒体の屈折率（水については１.３３２）を考慮して特定の光学モデル（Ｍｉｅ理論）を適用することが必要である；非常に微細な粒子が発する弱い強度を検出する能力を有することが必要であり、分析の最適化を要する：
大角偏光強度示差散乱測定のためのさらなる検出セル（４０ｎｍから測定可能な、CoulterからのＰＩＤＳシステム）、
Malvernからの青色光および赤色光の２つの波長を合わせる検出システム。広角散乱および後方散乱検出器を伴う短波長の青色光源は、サブミクロン域における分析の性能レベルを強化する。
【００４５】
使用した装置に従って、測定値は、使用した装置の要素およびデータ処理ソフトウェアに応じてわずかに変化し得る。かくして、同一の本発明のエマルションを２つの装置で分析し、以下の結果を得た：
−  以下のパラメーターをもってＬＳ２３０を使用した場合：ＩＲ（粒子）＝１.４９５；ＩＲ（媒体）＝１.３３２；吸収値＝０；ｄ５０＝８０〜９０ｎｍ、およびｄ９０＝１２０〜１３０ｎｍ；
−  以下のパラメーターをもってＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００を使用した場合：ＩＲ（粒子）＝１.４９５；ＩＲ（媒体）＝１.３３２；吸収値＝０；あいまいさ＝４〜７％；「汎用」光学モデル；ｄ５０＝９０〜１００ｎｍ、およびｄ９０＝１４０〜１５０ｎｍ。
【００４６】
本発明の方法は、以下のように行われ得る：油性相（スクアレンおよび疎水性非イオン界面活性剤）中に水性相（ポリオキシエチレンアルキルエーテルを含む、アルジトールを添加していてもよい緩衝溶液）を配合することにより；または、逆に、該水性相中に該油性相を配合することにより、濃縮粗水中油型エマルションを調製する。次いで、迅速に不安定性さを示す非キャリブレート水中油型エマルションを得る。このエマルションを撹拌し、転相が得られるまで、すなわち、油中水型エマルションが得られるまで、加熱する。転相または相転移は、伝導度測定法によりモニターすることができる。実際、温度上昇の間、転相が起こるまで伝導度は増加する；転相が起こった時、伝導度の相対的に急激な低下が観察される。伝導度に従う曲線の曲率の変化が生じるところの温度は、１つのタイプのエマルションから別のタイプのエマルションへの経過を反映する；それが転相温度である。実際には、この温度は、非常に正確なポイント値というよりむしろ温度範囲である；実際、この温度は、エマルション全体が転相現象を受けるような１または２℃の範囲内で測定される温度であると考えられる。この転相温度に達すると、したがって、油中水型エマルションの存在下になると、加熱を止め、混合物を冷却する。冷却は、単純にエマルションを自然に周囲温度に戻すことによって受動的に、またはエマルションを例えば氷浴中に浸漬することによってより能動的に行うことができる。温度が転相温度を通過すると、油中水型エマルションは再び転相して、もう一度、水中油型エマルションとなる。この時、このエマルション中の油滴のサイズは非常に均一で小さい；得られたエマルションは非常に安定である。ワクチン抗原を含む溶液による希釈を待つ間、そのまま貯蔵することができる。
【００４７】
このエマルションは熱可逆性であり、これは、再び転相温度以上の温度になった場合には、もう一度、油中水型エマルションとなることを意味する。伝導度に従う曲線は、受けた熱転相の回数と関係なく同一エマルションについて重ね合わせることができること、および得られたエマルションは、常に同一の粒度プロフィールを有することが判明する。
【００４８】
本発明によると有利には、エマルションの形成は、９５℃以下の、特に、４５〜８０℃、さらに特に、５０〜６５℃の転相温度を有するように選択される。この温度範囲は、比較的高い温度（約３７℃）で貯蔵する場合にエマルションの状態が変化する危険性がないので有利である。さらにまた、熱可逆性エマルションの製造方法におけると同様に、成分の加熱は激しすぎず、これは、成分の構造的完全性の保持に寄与する。エマルションの転相温度が高い場合、特に、約８０℃またはそれ以上である場合には、エマルションの組成物にアルジトールを加えることによってそれを低下させることが有用であり得る。該アルジトールは、通常、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、キシリトールまたはエリスリトールから選択される。アルジトールを１〜１０％（ｗ／ｗ）の濃度範囲で、特に、２〜７％（ｗ／ｗ）の濃度範囲で使用すると、エマルションの転相温度は、約１０℃低下する。水だけからなる水性相に代えて緩衝生理食塩水水性相を用いることによってエマルションの転相温度を低下させることもできる。通常、トリス緩衝液、またはＰＢＳ、もしくはＣａ2+およびＭｇ2+を含まないダルベッコＰＢＳ緩衝液のようなリン酸緩衝液が使用される。
【００４９】
上記した方法の代替法が存在する。詳しくは、上記したように、水性および油性の２つの相を混合して粗エマルションを得、次いで、加熱し、次いで、冷却することができる。
【００５０】
別法として、調製した２つの相を別々に転相温度よりもわずかに高い温度に加熱した後に混合して油中水型逆エマルションを得、それを水中油型サブミクロンエマルションが得られるまで冷却することができる。
【００５１】
混合を行う前に各相をわずかに加熱して、水中油型エマルションを得、次いで、このエマルションを加熱して相転移させた後、冷却することもできる。
【００５２】
これらの操作は全て、バッチ調製用の別々の容器中で行うことができるが、オンラインプロセスを使用することもできる。
【００５３】
エマルションをオンラインで調製する方法は、特に、高温条件下で、温度調節した静的ミキサーにより、予め別々に調製しておいた水性および油性の２つの相を混合すること、次いで、該静的ミキサーの出口で連絡している冷却熱交換器によりオンライン冷却すること、次いで、適当な容器（フラスコまたは反応器）中での本発明のエマルションの最終回収からなり得る。成分を導入する管の軸に対して傾斜しているクロスブレードで構成される一連の混合要素からなる静的ミキサーが成功裏に使用された。混合に必要なエネルギーは、流体を輸送するポンプによってもたらされ、混合は、いずれもの可動部を用いずに、混合物の成分の分離、置換および連続的配合によって混合要素を介して行われる。
【００５４】
オンライン製造法は、以下のようにして行われる：水性相（ポリオキシエチレンアルキルエーテルを含む緩衝溶液）および油性相（スクアレンおよび疎水性非イオン界面活性剤）を２つのフラスコまたは反応器中にて別々に調製する。２つの相を撹拌しながら転相温度よりも僅かに高い温度まで加熱する。次いで、２つの相を２つのポンプによって温度調節した静的ミキサー中に導入する。その流速は、本発明のエマルションの組成物が得られるように調節される。２つの相が該静的ミキサーを通過する間に油中水型逆エマルションが得られる。その後、静的ミキサーの出口で連絡している冷却熱交換器をオンラインで通過させることによって逆エマルションを冷却する。次いで、冷却熱交換器を介して油中水型エマルションを転相させて、水中油型エマルションを得、それをフラスコまたは反応器中に回収する。その特性は、バッチ法により得られたエマルションのものと同一である。
【００５５】
次に、本発明のアジュバントエマルションは、免疫原性組成物の調製のために使用される。簡単な実施態様は、少なくとも１種類のワクチン抗原を含む溶液と上記実施態様のうちの１つにより得られたエマルションとを混合することにある。スクアレンの量が免疫原性組成物の合計質量の少なくとも５質量％を表す場合、得られた免疫原性組成物は、水中油型エマルションの形態または熱可逆性水中油型エマルションの形態である。別法として、エマルションを調製する前に抗原を水性相または油性相と混合することができる。このようにして該方法を行うことは、もちろん、該抗原が熱転相法に適合する抗原であることを含む。
【００５６】
抗原の溶液はまた、鉱物塩または１種類もしくはそれ以上の緩衝液、および、安定剤、保存剤または任意には他のアジュバントのような通常ワクチンに使用されるいずれもの他の化合物を含有することができる。
【００５７】
凍結乾燥可能なエマルションの調製のために、まず、好ましくは、水性相として緩衝溶液よりもむしろ水を選択すること以外は上記したように濃縮液体エマルションを調製し、次いで、このエマルションをアルジトール、糖およびアルキルポリグリコシドを含む溶液（例えば、マンニトール、シュークロースおよびドデシルマルトシドを含む溶液）で希釈する。
【００５８】
次いで、得られたエマルションを複数の試料（例えば、０.５ｍｌ）に分け、以下のようにして行うことができる凍結乾燥サイクルに付す：
−  ＋４℃での試料の負荷、
−  −４５℃の設定温度で約２時間の冷凍、
−  ０℃の設定温度で１４〜１９時間の一次乾燥、
−  ＋２５℃の設定温度で３時間３０分の二次乾燥。
【００５９】
次いで、得られたエマルションは、免疫原性組成物の調製に使用するまで、すなわち、ワクチン抗原を含む組成物と合わせるまで、保存することができる。免疫原性組成物の調製のためのこの工程は、抗原を含む水溶液に凍結乾燥エマルションを溶解することによって実施することができる。このようにして得られた免疫原性組成物は、その後、液体状態で保存することができるか、または、抗原の性質が許すならば凍結乾燥物の形態で保存するためにさらなる凍結乾燥サイクルに付すことができる。
【００６０】
別法として、濃縮エマルションを、ワクチン抗原とアルジトール、糖およびアルキルポリグリコシドとの両方を含む水溶液で直接希釈することができ、その後、得られた組成物を凍結乾燥に付すことができる。該方法を行うこのような方法は、もちろん、抗原が凍結乾燥法に適合する抗原であることを意味する。
【００６１】
以下の実施例は本発明の様々な実施態様を例示する。
【実施例】
【００６２】
実施例１：  本発明のアジュバントエマルションの調製
ＥｕｍｕｌｇｉｎTM Ｂ１（３.７１ｇ）およびマンニトールのＰＢＳ緩衝液中１０％溶液３３.９ｇをビーカー中にて混合し、該混合物を約３０℃で撹拌しながらホモジナイズした。
別の容器中にて、ＤｅｈｙｍｕｌｓTM ＳＭＯ  ２.８９ｇおよびスクアレン１９.５ｇを電磁撹拌した。
各容器中にて均一相が得られると、水性相を油性相中に混和し、それを撹拌しながら３０℃に維持した。
混和が完了したら、得られた粗エマルションを、撹拌を続けながら、温度が５８〜６０℃に達するまで加熱した。
次いで、加熱を止めたが、温度が周囲温度に達するまで撹拌は続けた。
次いで、水中油型エマルションを得た。その油滴のサイズは約８０ｎｍに集中しており（測定はＬＳ２３０を使用して行った）、その質量による組成は、以下のとおりであった：
スクアレン３２.５％、
ポリオキシエチレン(１２)セトステアリルエーテル６.１８％、
モノオレイン酸ソルビタン４.８２％、
マンニトール６％。
【００６３】
実施例２：  ＡＩＤＳに対するワクチン組成物
抗原として解毒したＴＡＴ ＩＩＩ Ｂタンパク質を含むワクチン組成物を調製した。該ＴＡＴタンパク質は、以下の条件下でヨードアセトアミドを使用するアルカリ媒体中でのアルキル化反応によって解毒した：ヨードアセトアミドのマイクロモル数＝２００×ＴＡＴのマイクロモル数＋ＤＴＴのマイクロモル数。この解毒したタンパク質およびその製造方法はＷＯ ９９／３３３４６に詳細に記載されており、そこでは、それはカルボキシメチル化ＴＡＴなる用語の下に同定されている。この組換えＴＡＴ抗原は、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.５）の存在下、−７０℃にて溶液中で保存される。
【００６４】
以下の定量的組成を有する２００μｌの免疫薬を得るように、濃縮溶液から投与されるべきワクチン組成物を調製した：
抗原のみを有する組成物について：ｐＨ７.５の５０ｍＭトリス緩衝液、１００ｍＭのＮａＣｌ中、ＴＡＴ  ２０μｇ；
本発明の組成物について：
ＴＡＴ  ２０μｇ、
スクアレン  ５ｍｇ、
ＤｅｈｙｍｕｌｓTM ＳＭＯ  ０.７５ｍｇ、
ＥｕｍｕｌｇｉｎTM Ｂ１  ０.９４ｍｇ、
マンニトール  ０.９１ｍｇ。
【００６５】
８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス６匹ずつの２つのグループを準備し、調製した組成物の１つをマウス１匹につき１回投与量２００μｌの割合で皮下注射した；注射は０日目および２１日目に行った。
一次応答を評価するために１４日目に、そして、二次応答を評価するために３４日目に、後眼窩から血液試料を採取した。標準ＥＬＩＳＡアッセイにより特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ力価を判定した。
３７日目にマウスを屠殺した；それらの脾臓を取り出し、脾細胞を単離した。
体液性応答に関して得られた結果を下記表にまとめる。この表では、ＩｇＧ力価を任意のＥＬＩＳＡ単位（ｌｏｇ１０）で表す。
各グループのマウスについて、表に示した値は、各マウスについて得られた値の幾何平均力価である。
【００６６】
【表１】
2009500382.tif 000002
【００６７】
得られた結果は、本発明のエマルションは、ＩｇＧ２ａ応答がＩｇＧ１応答よりも大きく増大するので、全体的な体液性応答の増大を可能にし、１型Ｔヘルパー応答を促進する傾向にあることを示している。
細胞性応答に関しては、取り出された脾細胞の組換えＴＡＴタンパク質による再刺激後のＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、脾細胞が本発明の調製物で免疫化したマウスから採取したものである場合にγインターフェロンを産生する細胞の数の明らかな増加を立証することができた（抗原のみを含有する調製物についての細胞１０6個につき３９スポットに対して細胞１０6個につき４８６スポット）。同様に、培養上清中のサイトカインのアッセイは、γインターフェロン（１９４０ｐｇ／ｍｌに対して５０２８ｐｇ／ｍｌ）およびインターロイキン５（２３９４ｐｇ／ｍｌに対して５３６５ｐｇ／ｍｌ）の両方の分泌が多いことを示した。
【００６８】
実施例３：  ヒトサイトメガロウイルス感染に対するワクチン組成物の調製
ヌクレオチド配列およびタンパク質配列が米国特許第５,８３４,３０７号に記載されているｇＢと称するＣｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）Ｔｏｗｎｅ株のエンベロープ糖タンパク質に由来する組換えタンパク質をワクチン抗原として含むワクチン組成物を調製した。この組換えタンパク質は、修飾したｇＢ遺伝子を含有するｐＰＲｇＢ２７ｃｌｖ４と称するプラスミドをトランスフェクトした組換えＣＨＯ系によって産生される。特に、ＣＨＯ系によるこの組換えタンパク質の産生を容易にするために、バリン６７７〜アルギニン７５２のアミノ酸配列に対応するｇＢタンパク質の膜貫通領域をコードする遺伝子の部分を欠失させること、および、天然ｇＢ中に存在する開裂部位を除去するように３つの点変異を導入することによってｇＢ遺伝子をあらかじめ修飾した。実際、組換えＣＨＯ系によって産生される組換えタンパク質は、ｇＢｄＴＭと称する切断部位および膜貫通領域を欠いているトランケートしたｇＢタンパク質に対応する。
【００６９】
プラスミドｐＰＲｇＢ２７ｃｌｖ４の構築およびトランケートしたｇＢタンパク質（ｇＢｄＴＭ）の組換えＣＨＯ系による産生は、米国特許第６,１００,０６４号に記載されている。トランケートしたｇＢタンパク質の精製は、Rasmussen L. et al.（J. Virol. (1985) 55:274-280）によって記載されているモノクローナル抗体１５Ｄ８を使用してイムノアフィニティークロマトグラフカラムにて行われる。
【００７０】
このようにして得られ、リン酸緩衝液中にて維持されているｇＢ抗原を０.９７５ｍｇ／ｍｌで含む原組成物、実施例１の記載に従って濃縮した本発明のエマルション、およびマイクロフルイダイゼーションにより得られた従来技術のエマルションから、以下の組成を有する免疫組成物５０μｌを調製した：
ｐＨ６のクエン酸緩衝液中のｇＢ  ２μｇ（ｇＢ単独と称するグループ）、
ｐＨ６のクエン酸緩衝液中のｇＢ  ２μｇ；スクアレン１.０７５ｍｇ；ＭｏｎｔａｎｅTM ＶＧ ８５  ０.１３３ｍｇおよびＴｗｅｅｎTM８０  ０.１２５ｍｇ（「従来技術のエマルション含有」と称するグループ）、
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、ｇＢ  ２μｇ；スクアレン１.２５ｍｇ；ＤｅｈｙｍｕｌｓTM ＳＭＯ  ０.１８５ｍｇ；ＥｕｍｕｌｇｉｎTM Ｂ１  ０.２３５ｍｇおよびマンニトール０.２３０ｍｇ（「本発明のエマルション含有」と称するグループ）。
【００７１】
８週齢雌性Ｏｕｔｂｒｅｄ ＯＦ１マウス１０匹ずつの３つのグループを準備し、上記組成物のうちの１つで０日目および２１日目の２回皮下免疫化した（各グループのマウスには、どちらの回も同じ組成物を投与した）。
２０日目および３４日目に、後眼窩から血液試料を採取し、ｇＢ抗原に対して特異的なＩｇＧ１タイプの抗体およびＩｇＧ２ａタイプの抗体の濃度を測定するのに使用した。
【００７２】
ＥＬＩＳＡアッセイによってアッセイを行った；得られた結果を下記表に示し、ＥＬＩＳＡ力価のｌｏｇ10で表した。示した値は、各グループのマウスについて得られた平均値である。
【００７３】
【表２】
2009500382.tif 000003
【００７４】
これらの結果は、ＩｇＧ１タイプおよびＩｇＧ２ａタイプの両方の抗体のより大きな誘発を可能にした本発明のエマルションの有効性を示しており、加えて、同時に十分なレベルのＴＨ２タイプの応答（その指標はＩｇＧ１力価である）を維持しながら、従来技術のエマルションと比較して、ＴＨ１応答（その指標はＩｇＧ２ａ力価である）に対する免疫応答を方向付けるものであるヒトサイトメガロウイルスに対するワクチンと関連する望ましい結果を得た。
【００７５】
実施例４：  インフルエンザに対するワクチン組成物
インフルエンザウイルス抗原は、使用したウイルス株がＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ Ｈ１Ｎ１株であることを除いてＷＯ ９６／０５２９４の実施例に記載されている方法に従って得られた。
【００７６】
この抗原調製物、実施例１で得られた本発明の濃縮エマルション、およびＡｌＯＯＨ Ｒｅｈｙｄｒａの名称の下にREHEISにより提供されたアルミニウム懸濁液を使用して、免疫薬５０μｌを調製した。この免疫薬は以下に示す組成を有しており、インフルエンザ抗原の量は血球凝集素ＨＡの重量によって表す：
ＰＢＳ緩衝液中ＨＡ  １μｇ、または
ＰＢＳ緩衝液中ＨＡ  ５μｇ、または
ＨＡ  １μｇおよび水酸化アルミニウム６０μｇ、または
ＨＡ  １μｇ；スクアレン１.２５ｍｇ；ＤｅｈｙｍｕｌｓTM ＳＭＯ  ０.１８５ｍｇ；ＥｕｍｕｌｇｉｎTM Ｂ  ０.２３５ｍｇ；マンニトール０.２１ｍｇ；ＰＢＳ緩衝液中の全体の混合物。
【００７７】
８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス５匹ずつの８つのグループを準備し、以下の分類に従って調製した組成物を０日目に投与した：
ＨＡ  １μｇを有する組成物を皮下投与したグループ１つ、
ＨＡ  １μｇを有する同組成物を皮内投与したグループ１つ、
ＨＡ  ５μｇを有する組成物を皮下投与したグループ１つ、
ＨＡ  ５μｇを有する同組成物を皮内投与したグループ１つ、
ＨＡ  １μｇおよびアルミニウム６０μｇを有する組成物を皮下投与したグループ１つ、
ＨＡ  １μｇおよびアルミニウム６０μｇを有する同組成物を皮内投与したグループ１つ、
ＨＡ  １μｇおよび本発明のエマルションを有する組成物を皮下投与したグループ１つ、
ＨＡ  １μｇおよび本発明のエマルションを有する組成物を皮内投与したグループ１つ。
【００７８】
１４日目、２８日目、４１日目、５６日目および１０５日目に各マウスから血液試料を採取した。
免疫化したマウスからの血清を、まず、三価ワクチンのインフルエンザ株Ａ／Ｈ１Ｎ１に対して誘発された全抗体の含有量を評価するためにＥＬＩＳＡ法によりアッセイし（抗体力価は、任意のＥＬＩＳＡ単位のｌｏｇ１０値として表され、検出閾値は１.３ｌｏｇ１０である）、次に、インフルエンザ株Ａ／Ｈ１Ｎ１に対する機能的抗体の含有量を測定するためにＨＡＩ（血球凝集阻害）法によりアッセイした。抗体力価は、算術的値における希釈度の逆数として表し、検出閾値は５である。
【００７９】
得られた結果を以下の表に示す。表に示した値は、各グループのマウスの力価の平均値を表す。
【００８０】
ＥＬＩＳＡ力価：
【表３】
2009500382.tif 000004
【００８１】
ＨＡＩ力価：
【表４】
2009500382.tif 000005
【００８２】
これらの結果は、本発明の有利な点を示す；詳しくは、従来技術において幅広く使用されている周知のアジュバントである水酸化アルミニウムは、本発明の製剤と同様の迅速性および同様の強度をもってインフルエンザ抗原の免疫原性を増大させることはできなかった；本発明の組成物は皮下投与または皮内投与のどちらであっても特に有効であった。
【００８３】
実施例５：  インフルエンザに対するワクチン組成物
関与するワクチンが、抗原として３種類のインフルエンザ株を含有し、皮内投与される、インフルエンザに対するワクチンである場合にワクチン抗原の量を減少させることについて本発明の有利な点をマウスにて評価することが目的であった。
【００８４】
この目的を達成するために、実施例１の濃縮エマルションをＰＢＳ緩衝液で希釈して５％スクアレンエマルションを得、それをさらに、該抗原を含む組成物で半分の濃度に希釈した。
実際、ＷＯ ９６／０５２９４に記載の方法で得られた３種類のウイルス株に由来するインフルエンザウイルスを含む組成物を得た。この場合、この３種類の株は、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ（Ｈ３Ｎ２）株およびＢ／Ｊｉａｎｇｓｕ株であった。このような三価ワクチン組成物は、インフルエンザワクチンにとって通常ものものであり、２００４年のインフルエンザシーズンの間に北半球で販売されたワクチンに相当する。各ウイルス株の抗原の量は、血球凝集素ＨＡの量により評価される。
【００８５】
容量５０μｌの調製した免疫薬は、以下に示す組成を有した：
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ０.３３μｇ；
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  １.３１μｇ；
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ５.２５μｇ；
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  １０.５μｇ；
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ２１μｇ；
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ０.３３μｇ；スクアレン１.２５ｍｇ；ＤｅｈｙｍｕｌｓTM ＳＭＯ  ０.１８５ｍｇ；ＥｕｍｕｌｇｉｎTM Ｂ１  ０.２３５ｍｇおよびマンニトール０.２３０ｍｇ；
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  １.３１μｇ；スクアレン１.２５ｍｇ；ＤｅｈｙｍｕｌｓTM ＳＭＯ  ０.１８５ｍｇ；ＥｕｍｕｌｇｉｎTM Ｂ１  ０.２３５ｍｇおよびマンニトール０.２３０ｍｇ；
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ５.２５μｇ；スクアレン１.２５ｍｇ；ＤｅｈｙｍｕｌｓTM ＳＭＯ  ０.１８５ｍｇ；ＥｕｍｕｌｇｉｎTM Ｂ１  ０.２３５ｍｇおよびマンニトール０.２３０ｍｇ。
【００８６】
６〜８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス１０匹ずつの８つのグループを準備し、１グループにつき１つの組成物の割合で、調製した組成物の１つを皮内（耳の内面）投与した。
投与の３週間後、血液を採取し、各グループについて各ウイルス株に対して誘発されたＩｇＧをＥＬＩＳＡによりアッセイした；各グループについて各ウイルス株に対する血球凝集素阻害アッセイも行った。
得られた結果を、グループごとに平均の形態で以下の表に示す。ＥＬＩＳＡの結果を任意の単位のｌｏｇ10で表し、ＨＡＩの結果は希釈度の逆数の幾何平均力価である。
【００８７】
【表５】
2009500382.tif 000006
【００８８】
これらの結果は、抗原の量を減少させることについて本発明の特に有利な点を示す；詳しくは、本発明のエマルションにより、誘発された同一の免疫応答について、免疫薬中に存在する抗原の量を非常に実質的に減少させることができた。
【００８９】
実施例６：  非ナイーブ集団におけるインフルエンザに対する三価ワクチン組成物
個体が既にインフルエンザウイルスと接触しているために、または、個体が予めインフルエンザワクチンで免疫化されているために既に身体がインフルエンザウイルス抗原と接触した個体に投与されるインフルエンザワクチンの場合の本発明のエマルションの有効性を試験することを目的とする。
【００９０】
Vaccine, 2003, 21:940-5においてC.W. Potterにより公表された情報に従って、この試験を行うための動物モデルとして、三価ワクチンで筋肉内予備免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウスを使用することができる。
【００９１】
ＰＢＳ緩衝液のみを含む免疫薬、または２００４年のシーズンからの三価ワクチン、すなわち、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ（Ｈ３Ｎ２）株およびＢ／Ｊｉａｎｇｓｕ株をｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中各株のＨＡ  ５μｇの割合で含むワクチンの５０μｌを調製した。
【００９２】
ＢＡＬＢ／ｃマウス７匹ずつの６つのグループを準備した；３つのグループは緩衝液のみを含む該免疫薬で皮内免疫化し、他の３つのグループは三価ワクチンで皮内免疫化した。
【００９３】
また、実施例１の濃縮エマルション、および上記の２００４年のシーズンの３種類のウイルス株を含むワクチン組成物から、以下の組成を有する免疫薬３０μｌを調製した：
ＰＢＳ緩衝液のみ、
ＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ０.３μｇ、
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ０.３μｇ；スクアレン０.７５ｍｇ；ＤｅｈｙｍｕｌｓTM ＳＭＯ  ０.１１ｍｇ；ＥｕｍｕｌｇｉｎTM Ｂ１  ０.１４３ｍｇおよびマンニトール０.１３８ｍｇ。
【００９４】
このようにして調製した各組成物を使用して、予めＰＢＳ緩衝液のみを投与したマウスのグループおよび三価ワクチンを１回投与したマウスのグループの両方を３４日目に皮内（耳の内面）免疫化した。
５６日目に、各マウスから血液試料を採取し、血球凝集素阻害アッセイによって、Ｈ１Ｎ１株（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ）に対して産生された抗体の力価を測定した。
【００９５】
得られた結果を以下の表にまとめて示し、同一の免疫化プロトコールに従った各グループのマウスについて得られた平均値で表す。
【００９６】
【表６】
2009500382.tif 000007
【００９７】
これらの結果は、投与される抗原に関して非ナイーブである個体においてさえ本願発明がいかに有利であるかを示す。実際に、インフルエンザ抗原で予備感染または予備免疫化されたマウスを免疫化するためにＩＳＣＯＭを使用した場合にＩＳＣＯＭの弱いアジュバント効果を示すことができただけというこのモデルを使用した場合のC.W. Potterによる知見とは反対に、ナイーブマウスの場合であっても既にインフルエンザワクチンで免疫化されたマウスの場合であっても、本発明のエマルションは、誘発された応答を有意に増大させることができたことを示している。
【００９８】
実施例７：  低用量の抗原を含む、インフルエンザに対する三価ワクチン組成物
実施例１の濃縮エマルション、および２００４年のシーズンの３種類のウイルス株（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ（Ｈ３Ｎ２）株およびＢ／Ｊｉａｎｇｓｕ株）を含むワクチン組成物から、以下の組成を有する免疫薬３０μｌを調製した：
ＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ０.１μｇ、
ＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ０.４μｇ、
ＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  １.６μｇ、
ＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ６.３μｇ、
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、ＨＡ  ０.１μｇ；スクアレン０.７５ｍｇ；ＤｅｈｙｍｕｌｓTM ＳＭＯ  ０.１１ｍｇ；ＥｕｍｕｌｇｉｎTM Ｂ１  ０.１４３ｍｇおよびマンニトール０.１３８ｍｇ、
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、ＨＡ  ０.４μｇ；スクアレン０.７５ｍｇ；ＤｅｈｙｍｕｌｓTM ＳＭＯ  ０.１１ｍｇ；ＥｕｍｕｌｇｉｎTM Ｂ１  ０.１４３ｍｇおよびマンニトール０.１３８ｍｇ。
【００９９】
８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス８匹ずつの６つのグループを準備し、０日目に上記組成物の１つ（１グループにつき１つの組成物）の３０μｌを皮内（耳の内面）投与した。
２９日目に、各グループにおいて半分のマウスに、１回目に投与したものと同じ性質を有するものを２回目に皮内投与した。
２２日目および４３日目に血液試料を採取して、誘発された抗体の量を測定した。
投与した株（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２およびＢ）の全てに関して、２２日目および４３日目に誘発された抗体についてＥＬＩＳＡによって抗体力価をアッセイし、Ｈ１Ｎ１株に関してのみ２２日目および４３日目の両日にＨＡＩによっても抗体力価をアッセイした。得られた結果を以下の表にまとめて示す。この表では、示された力価は、各グループのマウスについて得られた平均値である。４３日目の結果に関して、平均値は、２回ワクチン投与したマウスおよび１回のみ投与したマウスについて、同一グループ内で別々に測定した。
【０１００】
【表７−１】
2009500382.tif 000008
【０１０１】
【表７−２】
2009500382.tif 000009
【０１０２】
これらの結果は、本発明のエマルションにより、低用量の抗原の場合でさえ、非常に実質的な体液性応答が得られたことを示している。かくして、最も優れた結果は各ウイルス株のＨＡ  ０.４μｇおよび本発明のエマルションの薬で得られた結果であることがわかる；これらの結果は、非常に意外なことに、ＨＡ  ６.３μｇのみの薬を使用することによって得られた結果よりも非常に優れている。加えて、追加免疫薬を投与しなかった個体においてさえ免疫系は抗体を誘発し続けるが、非アジュバント処理ワクチンの抗原を投与した個体についてはそうではないことがわかる。
【０１０３】
実施例８：  インフルエンザに対する三価ワクチン組成物
実施例１の濃縮エマルション、および２００４年のシーズンの３種類のウイルス株（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ（Ｈ３Ｎ２）株およびＢ／Ｊｉａｎｇｓｕ株）を含むワクチン組成物から、以下の組成を有する免疫薬３０μｌを調製した：
ＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ０.１μｇ、
ＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ０.４μｇ、
ＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  １.６μｇ、
ＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ６.３μｇ、
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ０.１μｇ；スクアレン０.７５ｍｇ；ＤｅｈｙｍｕｌｓTM ＳＭＯ  ０.１１ｍｇ；ＥｕｍｕｌｇｉｎTM Ｂ１  ０.１４３ｍｇおよびマンニトール０.１３８ｍｇ、
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、ＨＡ  ０.４μｇ；スクアレン０.７５ｍｇ；ＤｅｈｙｍｕｌｓTM ＳＭＯ  ０.１１ｍｇ；ＥｕｍｕｌｇｉｎTM Ｂ１  ０.１４３ｍｇおよびマンニトール０.１３８ｍｇ。
【０１０４】
８週齢雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス８匹ずつの６つのグループを準備し、０日目に、上記組成物の１つ（１グループにつき１つの組成物）の３０μｌを皮内（耳の内面）投与した。
２３日目に血液試料を採取して、誘発された抗体の量を測定した。
投与した株の全て（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２およびＢ）に関して誘発された抗体について抗体力価をＥＬＩＳＡおよびＨＡＩによりアッセイした。
【０１０５】
得られた結果を下記表にまとめて示した。この表において示した力価は、各グループのマウスについて得られた平均値である。
【０１０６】
【表８】
2009500382.tif 000010
【０１０７】
得られた結果はまた、存在する抗原の量を非常に実質的に減少させることができるという本発明のエマルションの非常に有利な点を示している。特に、本発明のエマルションでアジュバント処理したわずか０.１μｇのＨＡの場合、ＨＡ  ６.３μｇの場合と同様に優れた結果が得られると考えられる。
【０１０８】
実施例９：  本発明のエマルションまたは従来技術のエマルションを含む、インフルエンザに対する三価ワクチン組成物
実施例１の濃縮エマルション、および２００４年のシーズンの３種類のウイルス株（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ（Ｈ３Ｎ２）株およびＢ／Ｊｉａｎｇｓｕ株）を含むワクチン組成物から、以下の組成を有する免疫薬３０μｌを調製した：
ＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ０.３μｇ、
ＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ６.３μｇ、
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、ＨＡ  ０.３μｇ；スクアレン０.２１ｍｇ；ＤｅｈｙｍｕｌｓTM ＳＭＯ  ０.０３１ｍｇ；ＥｕｍｕｌｇｉｎTM Ｂ１  ０.０４０ｍｇおよびマンニトール０.０３９ｍｇ（エマルション０.７％）、
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、ＨＡ  ０.３μｇ；スクアレン０.７５ｍｇ；ＤｅｈｙｍｕｌｓTM ＳＭＯ  ０.１１ｍｇ；ＥｕｍｕｌｇｉｎTM Ｂ１  ０.１４３ｍｇおよびマンニトール０.１３８ｍｇ（エマルション２.５％）、
ＨＡ  ０.３μｇ；スクアレン０.６４５ｍｇ；ＴｗｅｅｎTM ８０  ０.０７５ｍｇ；ＳｐａｎTM ８５  ０.０７５ｍｇ（マイクロフルイダイゼーションにより得られた従来技術のエマルション）。
【０１０９】
８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス８匹ずつの５つのグループを準備し、０日目に、上記組成物の１つ（１グループにつき１つの組成物）の３０μｌで皮内（耳の内面）投与した。
誘発された抗体の量を評価するために、２１日目に血液試料を採取し、該血液試料についてＨＡＩ（血球凝集阻害）によりＡ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株およびＢ株に対する活性を測定した。
【０１１０】
各グループのマウスについて得られた結果を以下の表に示す。
【０１１１】
【表９】
2009500382.tif 000011
【０１１２】
これらの結果は、温度変化による転相からなる非常に簡単な調製方法により本発明に従って得られたエマルションに関して、非常に高速の剪断速度を使用して得られた従来技術のエマルションと同様に優れており、かつ、それよりもわずかに良好なアジュバントが得られたことを示している。
【０１１３】
実施例１０：  様々な濃度の本発明のエマルションを含む、インフルエンザに対する三価ワクチン組成物
実施例１の濃縮エマルション、および２００４年のシーズンの３種類のウイルス株（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ（Ｈ３Ｎ２）株およびＢ／Ｊｉａｎｇｓｕ株）を含むワクチン組成物から、以下の組成を有する免疫薬３０μを調製した：
ＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ０.３μｇ、
ＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ６.３μｇ、
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ０.３μｇ；スクアレン０.１２ｍｇ；ＤｅｈｙｍｕｌｓTM ＳＭＯ  ０.０１８ｍｇ；ＥｕｍｕｌｇｉｎTM Ｂ１  ０.０２３ｍｇおよびマンニトール０.０２２ｍｇ（エマルション０.４％）、
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ０.３μｇ；スクアレン０.２９９ｍｇ；ＤｅｈｙｍｕｌｓTM ＳＭＯ  ０.０４４ｍｇ；ＥｕｍｕｌｇｉｎTM Ｂ１  ０.０５７ｍｇおよびマンニトール０.０５５ｍｇ（エマルション１％）、
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ０.３μｇ；スクアレン０.７５ｍｇ；ＤｅｈｙｍｕｌｓTM ＳＭＯ  ０.１１ｍｇ；ＥｕｍｕｌｇｉｎTM Ｂ１  ０.１４３ｍｇおよびマンニトール０.１３８ｍｇ（エマルション２.５％）。
【０１１４】
８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス８匹ずつの５つのグループを準備し、０日目に、上記組成物の１つ（１グループにつき１つの組成物）の３０μｌを皮内（耳の内面）投与した。
誘発された抗体の量を評価するために、２１日目に血液試料を採取し、これらの血液試料について抗Ｈ１Ｎ１抗体、抗Ｈ３Ｎ２抗体および抗Ｂ抗体をＥＬＩＳＡにより測定し、Ａ／Ｈ１Ｎ１株、Ａ／Ｈ３Ｎ２株およびＢ株に対する活性をＨＡI（血球凝集阻害）により測定した。
得られた結果は、各グループについての平均の形態で以下の表に示される；ＥＬＩＳＡの結果は、任意のＥＬＩＳＡ単位のｌｏｇ10で表し、ＨＡＩの結果は、希釈度の逆数の相加平均力価である。
【０１１５】
【表１０】
2009500382.tif 000012
【０１１６】
これらの結果により、評価した株がどれであっても、本発明のエマルションは、非常に低用量の抗原を用いて非常に実質的な免疫系応答を得ることができたことを確認する。
【０１１７】
実施例１１：  凍結乾燥可能な組成物の調製
緩衝液の代わりに水を使用する以外は実施例１におけると同様の方法を行った；その後、得られたエマルションを、マンニトール、シュークロースおよびドデシルマルトシドを含む水溶液で希釈して、最終組成が以下のとおりであるエマルションを得た：
スクアレン５％、
ポリオキシエチレンセトステアリルエーテル０.９５％、
モノオレイン酸ソルビタン０.７５％、
マンニトール３％、
ドデシルマルトシド２％、
シュークロース６％。
【０１１８】
このエマルションを凍結乾燥させ、４℃で３ヶ月間保存した；次いで、復元した後、その特性、特に、その単分散エマルション品質が保存されており、ｄ５０およびｄ９０値が凍結乾燥前に測定した値に近いことがわかった。
このエマルションを、ワクチン抗原を含む溶液で５０／５０に希釈してワクチン組成物を得ることができた。
【０１１９】
実施例１２：  本発明のエマルションおよび該エマルション中に存在する界面活性剤のアジュバント効果の比較
本発明のエマルションのアジュバント活性を、該エマルション中に存在する界面活性剤ＥｕｍｕｌｇｉｎTM Ｂ１のものと比べて評価することを目的とした。
このために、インフルエンザ抗原を使用してマウスについて試験を行った。
この目的を達成するために、使用したウイルス株がＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ Ｈ１Ｎ１株である以外はＷＯ ９６／０５２９４の実施例に記載された方法に従ってインフルエンザウイルス抗原を得た。２００４年のシーズンの３種類のウイルス株（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ（Ｈ３Ｎ２）株およびＢ／Ｊｉａｎｇｓｕ株）を含むワクチン組成物もまた入手した。
【０１２０】
本発明に従って得られた実施例１に記載の濃縮エマルション、ＥｕｍｕｌｇｉｎTM Ｂ１およびインフルエンザウイルス抗原組成物から、以下の組成を有する免疫薬１００μｌを調製した：
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、Ｈ１Ｎ１株のＨＡ  １μｇ；
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、Ｈ１Ｎ１株のＨＡ  ５μｇ；
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、Ｈ１Ｎ１株のＨＡ  １μｇ；スクアレン２.５ｍｇ；ＤｅｈｙｍｕｌｓTM ＳＭＯ  ０.３７ｍｇ；ＥｕｍｕｌｇｉｎTM Ｂ１  ０.４８ｍｇおよびマンニトール０.４６ｍｇ；
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、Ｈ１Ｎ１株のＨＡ  １μｇおよびＥｕｍｕｌｇｉｎTM Ｂ１  ０.４８ｍｇ；
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ０.３３μｇ；
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  １.６６μｇ；
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ０.３３μｇ；スクアレン２.５ｍｇ；ＤｅｈｙｍｕｌｓTM ＳＭＯ  ０.３７ｍｇ；ＥｕｍｕｌｇｉｎTM Ｂ１  ０.４８ｍｇおよびマンニトール０.４６ｍｇ；
ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、各ウイルス株のＨＡ  ０.３３μｇおよびＥｕｍｕｌｇｉｎTM Ｂ１  ０.４８ｍｇ。
【０１２１】
雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス８匹ずつの８つのグループを準備し、０日目に、１回の筋肉注射により免疫化した。２１日目および３５日目に血液試料を採取して、Ａ／Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株または三価ワクチンの各株に対して誘発された全抗体の含有量をＥＬＩＳＡアッセイにより評価した。下記表に示した抗体力価は、任意のＥＬＩＳＡ単位のｌｏｇ10値として表し、検出閾値は１.３  ｌｏｇ１０である。
【０１２２】
【表１１】
2009500382.tif 000013
【０１２３】
この試験で得られた結果により、先の試験で既に得られた結果、すなわち、本発明のエマルションは同一の免疫系応答について抗原の用量を大きく減少させることができることが確認される；実際、本発明のエマルションおよびわずか１μｇのＨＡを使用すると、アジュバントなしでＨＡ  ５μｇの薬を使用するよりも良好な応答が得られた。
使用した界面活性剤は、単独で使用した場合にはアジュバント効果をあまり示さないが、本発明のエマルションはそれ自身が全ての試験株に関して高いアジュバント効果を生じることも観察される。
【国際調査報告】
2009500382.tif 000014
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2009500382.tif 000016
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