(57)【要約】野生型アレルゲンと比べてアレルゲン活性が低減した、野生型タンパク質アレルゲンＰｈｌ  ｐ  １の誘導体を製造する方法であって、野生型タンパク質アレルゲンＰｈｌ  ｐ  １を準備するステップと、上記野生型タンパク質アレルゲンを少なくとも３つの断片に断片化するステップであって、該少なくとも３つの断片のうちの少なくとも１つの断片は少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含み、該少なくとも３つの断片は、アレルゲン活性が低減しているかまたはアレルゲン活性を失っている断片に断片化するステップと、上記少なくとも３つの断片を、上記野生型アレルゲンの断片の順序とは異なる順序で再結合させるステップとを含むことを特徴とする。
2009535041.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型アレルゲンと比べてアレルゲン活性が低減した、野生型タンパク質アレルゲンＰｈｌ  ｐ  １の誘導体を製造する方法であって、
野生型タンパク質アレルゲンＰｈｌ  ｐ  １を準備するステップと、
上記野生型タンパク質アレルゲンを少なくとも３つの断片に断片化するステップであって、該少なくとも３つの断片のうちの少なくとも１つの断片は少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含み、該少なくとも３つの断片は、アレルゲン活性が低減しているかまたはアレルゲン活性を失っている断片に断片化するステップと、
上記少なくとも３つの断片を、上記野生型アレルゲンの断片の順序とは異なる順序で再結合させるステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
アレルゲン活性の低減を、野生型アレルゲンと比べて少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、特には少なくとも５０％のＩｇＥ結合能力の低減によって判定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アレルゲン活性の低減を、好ましくは、上記誘導体のドットブロットに対する、アレルゲンに過敏な患者の血清におけるＩｇＥ抗体の結合の欠如によって、または好塩基球放出分析によって判定することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記野生型タンパク質アレルゲンを少なくとも３つの断片に断片化する前に、上記アレルゲンのＴ細胞エピトープを決定することを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記少なくとも３つの断片は、Ｐｈｌ  ｐ  １の２５から３９番目までのアミノ酸残基、３４から４５番目までのアミノ酸残基、７３から８４番目までのアミノ酸残基、９１から１０２番目までのアミノ酸残基、１００から１１１番目までのアミノ酸残基、１０９から１３３番目までのアミノ酸残基、１２１から１３５番目までのアミノ酸残基、１２７から１３８番目までのアミノ酸残基、１５７から１６８番目までのアミノ酸残基、１６９から１８３番目までのアミノ酸残基、または２２６から２４０番目までのアミノ酸残基を含んで構成されることを特徴とする請求項１から４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記少なくとも３つの断片は、Ｐｈｌ  ｐ  １の１から６４番目までのアミノ酸残基（Ａ）、６５から１２５番目までのアミノ酸残基（Ｂ）、１２６から２０５番目までのアミノ酸残基（Ｃ）および２０６から２４０番目までのアミノ酸残基（Ｄ）から成る群より選択されることを特徴とする請求項１から５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記アレルゲン誘導体における上記断片の順序は、Ｂ−Ｄ−Ａ−Ｃであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記誘導体を、製薬基準を満たした賦形剤と組み合わせて医薬製剤に仕上げることを特徴とする請求項１から７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
上記誘導体を、好適なワクチンアジュバントと組み合わせて製薬基準を満たしたワクチン製剤に仕上げることを特徴とする請求項１から７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
上記誘導体を少なくとも１つのさらなるアレルゲンと組み合わせて複合ワクチンにすることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
上記さらなるアレルゲンは、野生型アレルゲン、特に野生型アレルゲンの混合物、組み換え野生型アレルゲン、野生型タンパク質アレルゲンの誘導体またはこれらの混合物であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
上記製剤は、アレルゲン抽出物をさらに含むことを特徴とする請求項９から１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
上記さらなるアレルゲンは、主要なカバノキの花粉アレルゲン、特にＢｅｔ  ｖ  １およびＢｅｔ  ｖ  ４、主要なオオアワガエリの花粉アレルゲン、特にＰｈｌ  ｐ  ２、Ｐｈｌ  ｐ  ５、Ｐｈｌ  ｐ  ６およびＰｈｌ  ｐ  ７、主要なイエダニアレルゲン、特にＤｅｒ  ｐ  １およびＤｅｒ  ｐ  ２、主要なネコアレルゲンＦｅｌ  ｄ  １、主要なハナバチアレルゲン、主要なスズメバチアレルゲン、プロフィリン、特にＰｈｌ  ｐ  １２、および貯蔵庫ダニ（storage mite）アレルゲン、特にＬｅｐ  ｄ  ２、から成る群より選択されることを特徴とする請求項１０から１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から７の何れか１項に記載の方法によって得られるアレルゲン誘導体。
【請求項１５】
野生型タンパク質アレルゲンＰｈｌ  ｐ  １のアレルゲン誘導体であって、
上記野生型タンパク質アレルゲンの少なくとも３つの断片をふくみ、該３つの断片は上記野生型アレルゲンにおける順序とは異なる順序で互いに連結しており、
上記少なくとも３つの野生型アレルゲン断片はアレルゲン活性が低減しているか、またはアレルゲン活性を欠いており、上記少なくとも３つの断片のうちの少なくとも１つは１つ以上のＴ細胞エピトープを含んで構成されていることを特徴とするアレルゲン誘導体。
【請求項１６】
上記少なくとも３つのアレルゲン断片は、少なくとも６アミノ酸残基、好ましくは少なくとも１０アミノ酸残基、特に少なくとも１５アミノ酸残基を含んで構成されていることを特徴とする請求項１５に記載のアレルゲン誘導体。
【請求項１７】
上記少なくとも３つの断片は、Ｐｈｌ  ｐ  １の２５から３９番目までのアミノ酸残基、３４から４５番目までのアミノ酸残基、１から６４番目までのアミノ酸残基、７３から８４番目までのアミノ酸残基、９１から１０２番目までのアミノ酸残基、１００から１１１番目までのアミノ酸残基、１０９から１３３番目までのアミノ酸残基、１２１から１３５番目までのアミノ酸残基、６５から１２５番目までのアミノ酸残基、１２６から２０５番目までのアミノ酸残基、１２７から１３８番目までのアミノ酸残基、１５７から１６８番目までのアミノ酸残基、１６９から１８３番目までのアミノ酸残基、２０６から２４０番目までのアミノ酸残基、または２２６から２４０番目までのアミノ酸残基を含んで構成されていることを特徴とする請求項１５または１６に記載のアレルゲン誘導体。
【請求項１８】
上記少なくとも３つの断片は、Ｐｈｌ  ｐ  １の１から６４番目までのアミノ酸残基（Ａ）、６５から１２５番目までのアミノ酸残基（Ｂ）、１２６から２０５番目までのアミノ酸残基（Ｃ）および２０６から２４０番目までのアミノ酸残基（Ｄ）から成る群より選択されることを特徴とする請求項１５から１７の何れか１項に記載のアレルゲン誘導体。
【請求項１９】
上記アレルゲン誘導体における上記断片の順序は、Ｂ−Ｄ−Ａ−Ｃであることを特徴とする請求項１８に記載のアレルゲン誘導体。
【請求項２０】
請求項１４から１９の何れか１項に記載のアレルゲン誘導体と、さらなるアレルゲン、好ましくは野生型アレルゲン、特には野生型アレルゲン、組み換え野生型アレルゲン、野生型タンパク質アレルゲンの誘導体またはこれらの混合物の混合物とを含んで構成されることを特徴とするアレルゲン組成物。
【請求項２１】
アレルゲン抽出物をさらに含むことを特徴とする請求項２０に記載のアレルゲン組成物。
【請求項２２】
製薬基準を満たした賦形剤を含むことを特徴とする請求項２０または２１に記載のアレルゲン組成物。
【請求項２３】
主要なカバノキの花粉アレルゲン、特にＢｅｔ  ｖ  １およびＢｅｔ  ｖ  ４、主要なオオアワガエリの花粉アレルゲン、特にＰｈｌ  ｐ  １、Ｐｈｌ  ｐ  ２、Ｐｈｌ  ｐ  ５、Ｐｈｌ  ｐ  ６およびＰｈｌ  ｐ  ７、主要なイエダニアレルゲン、特にＤｅｒ  ｐ  １およびＤｅｒ  ｐ  ２、主要なネコアレルゲンＦｅｌ  ｄ  １、主要なハナバチアレルゲン、主要なスズメバチアレルゲン、プロフィリン、特にＰｈｌ  ｐ  １２および貯蔵庫ダニアレルゲン、特にＬｅｐ  ｄ  ２、から成る群より選択される１つ以上のアレルゲンをさらに含んで構成されることを特徴とする請求項２０から２２の何れか１項に記載のアレルゲン組成物。
【請求項２４】
アレルゲン特異的免疫療法薬剤の調剤のための、請求項１４から２３の何れか１項に記載のアレルゲン誘導体またはアレルゲン組成物の使用。
【請求項２５】
能動免疫付与用薬剤の調剤のための、請求項１４から２３の何れか１項に記載のアレルゲン誘導体またはアレルゲン組成物の使用。
【請求項２６】
予防免疫接種用薬剤の調剤のための、請求項１４から２３の何れか１項に記載のアレルゲン誘導体またはアレルゲン組成物の使用。
【請求項２７】
上記薬剤は、アジュバント、希釈剤、防腐剤またはこれらの混合物をさらに含むことを特徴とする請求項２４から２６の何れか１項に記載の使用。
【請求項２８】
１０ｎｇから１ｇ、好ましくは１００ｎｇから１０ｍｇ、特には０．５μｇから２００μｇの上記組み換えアレルゲン誘導体を含むことを特徴とする請求項２４から２７の何れか１項に記載の使用。
【請求項２９】
請求項１５から１８の何れか１項に記載のアレルゲン誘導体を製造する方法であって、
請求項１５から１８の何れか１項に記載のアレルゲン誘導体をコードするＤＮＡ分子を準備するステップと、
上記ＤＮＡ分子を用いて宿主細胞を形質転換するステップと、
上記宿主細胞内で上記誘導体を発現させ、上記誘導体を単離するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
上記宿主細胞は、真核細胞、好ましくは酵母細胞もしくは植物細胞、または原核細胞、好ましくはエシェリキア・コリであることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１５から１８の何れか１項に記載のアレルゲン誘導体を製造する方法であって、
上記アレルゲン誘導体は化学合成によって製造されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、野生型タンパク質アレルゲンＰｈｌ  ｐ  １の誘導体、おとびその製造方法に関するものである。
【０００２】
アレルギーとは、通常は無害である異物（つまり非自己）（「アレルゲン」）に対する反応可能性の遺伝的または後天的な特異的変更である。アレルギーは、病気に冒された臓器系（皮膚、結膜、鼻、咽頭、気管支粘膜、胃腸管）における炎症性反応と、アレルギー性鼻炎、結膜炎、皮膚炎、アナフィラキシーショックおよび喘息といった即時の病徴と、喘息およびアトピー性皮膚炎の後期反応といった慢性疾患の徴候と結びついている。
【０００３】
Ｉ型アレルギーとは、遺伝的に決定される過敏性疾病を指し、これは、産業化した世界人口の約２０％に影響を及ぼしている。Ｉ型アレルギーの病態生理学的特質は、その他の場合には無害の抗原（アレルゲン）に対して、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体が産生されることである。
【０００４】
現在、アレルギー治療の唯一の使役形態（causative form）は、アレルゲン特異的な免疫療法であり、該療法では、患者にアレルゲンの漸増用量を投与して、アレルゲン特異的な無反応を誘起させる。アレルゲン特異的な免疫療法の臨床効果については、いくつかの研究によって報告されているが、根源的な仕組みについては完全には理解されていない。
【０００５】
アレルゲン特異的な免疫療法の主たる欠点は、天然アレルゲン抽出物の使用に依存している点である。この天然アレルゲン抽出物を少なくとも工業生産レベルまで規格化することは、不可能でないにしても難しいことである。このような天然アレルゲン抽出物は、様々な、アレルギー性および非アレルギー性化合物から成り、このため、投与された抽出物の中には特定のアレルゲンが存在しない可能性もあり、または、（もっと悪いことには）治療中の成分に対して、新たなＩｇＥの特異性が患者に発現する可能性もある。抽出物ベースの療法の他の欠点は、生物活性のあるアレルゲン製剤の投与がアナフィラキシー的副作用を誘発するという点に起因している。
【０００６】
アレルゲンの特徴付けの分野で分子生物学的技法を用いることによって、関連する全ての環境アレルゲンをコードするｃＤＮＡコードを単離することが可能となり、組み換えアレルゲンの製造が可能となっている。このような組み換えアレルゲンを用いて、個々の患者の反応特質を生体外診断法（つまり、血清内のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体を検出すること）または生体内検査によって特定することが可能となった。この技術を基に、各患者の感作特質に合わせて調整された、新規成分ベースの、アレルゲン、特にＩ型アレルゲンに対するワクチン接種戦略を開発することが可能であると思われる。しかしながら、組み換えアレルゲンがその天然の同等物と類似しているため、組み換えアレルゲンもまた、著しいアレルギー誘発性活動の兆候を示す。この組み換えアレルゲンは、野生型アレルゲンのアレルギー誘発性活動に極めて類似した反応を呈する。そのため、天然アレルゲンを適用する免疫療法におけるこのアレルギー誘発性活動に関連した全ての欠点が、組み換えアレルゲンの場合にも存在する。免疫療法を改善するには、アナフィラキシー的副作用のリスクを抑えたまま、投与されるアレルゲンの量を増大させることが可能なように、組み換えアレルゲンのアレルギー誘発性活動を低減させる必要がある。
【０００７】
Ｔ細胞エピトープだけを含有するペプチドを投与することによって、アレルゲン特異的Ｔ細胞の活性だけを操作することが提案されている。Ｔ細胞エピトープは、低分子ペプチドであり、この低分子ペプチドは、抗原提示細胞による無傷アレルゲンのタンパク分解に起因している。このようなＴ細胞エピトープは合成ペプチドとして製造可能である。今までのところＴ細胞エピトープに関する試験は行われているが、結果は芳しくなく、有効性が低いことしか示されていない。このＴ細胞エピトープベースの免疫療法の有効性が低いことに関しては、いくつかの原因が考えられている。第１に、Ｔ細胞活性化ではなくＴ細胞寛容を実現するための最適量を投与することが困難であるという点、第２に、低分子Ｔ細胞エピトープペプチドは体内での半減期が短いという点。第３に、個々のアトピー患者におけるＩｇＥ産生が記憶免疫反応を示すという、無視できない証拠が存在する点である。この記憶免疫反応は、新たなクラススイッチを必要とせず、Ｔ細胞に由来するサイトカインによっては制御することが出来ない。従って、Ｔ細胞エピトープの投与だけに基づいた治療形態は、アレルゲン特異的Ｔ細胞の活性を調節するが、既にスイッチされた記憶Ｂ細胞によるアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の産生にはほとんど影響を及ぼさない。
【０００８】
組み換えＤＮＡ技術またはペプチド合成によって、低アレルゲン性アレルゲン誘導体または断片を製造することもさらに提案されている。このような誘導体または断片は、Ｔ細胞エピトープを有しており、ＩｇＥ抗体を誘導することが可能である。このＩｇＥ抗体は、天然アレルゲンのＩｇＥ認識と競合する。２０年以上も前に、アレルゲンのタンパク分解により、部分的にはそのＩｇＥ結合能力を保持するが、即時型反応を誘発しない低分子アレルゲンの断片が生じることが実証されている。アレルゲンのタンパク分解を制御して規格化することは困難であるが、分子生物学によって、ＩｇＥ結合ハプテンを製造する新たな手段が開発された。このようなＩｇＥ結合ハプテンは、アナフィラキシー的作用を生じさせるリスクが少ない能動免疫法、および、アレルゲンと接触する前にエフェクター細胞結合ＩｇＥを飽和させて、これによってアレルゲン誘導性のメディエーター放出を阻止する受動的治療法に有効であることが示唆されている。
【０００９】
他にも、低アレルゲン性アレルゲンの変異体（version）を遺伝子工学によって製造することが提案されている。これは、アレルゲンが、いくつかのアミノ酸残基が異なる、および／または、ＩｇＥ結合能力が低い立体構造を有する点において異なるイソ型として自然に発生するという観察に基づいている。例えば、主要なカバノキの花粉アレルゲンＢｅｔ  ｖ  １を遺伝子工学によってオリゴマー化することによって、アレルゲン活性が大幅に低減した組み換え三量体が生じる。あるいは、点突然変異を導入することによって、アレルゲン構造の立体構造を変化させて非連続性ＩｇＥエピトープを分離させること、または、ＩｇＥの結合能力に直接影響を及ぼすことのいずれかが提案されてきている（Valenta et al．，Biol．Chem．380 （１９９９）、８１５−８２４頁）。
【００１０】
アレルゲンをいくつかの断片（例えば２つの断片）に断片化することによって、アレルゲンのＩｇＥ結合能力およびアレルゲン活性がほぼ完璧に失われる。これは、Ｂｅｔ  ｖ  １（Vrtala et al. J. Clin. Invest. 99 （１９９７）、１６７３〜１６８１頁）、Twardosz et al.（BBRC 239 (1997), 197-204頁）のＢｅｔ  ｖ  ４、Hayek et al.（J. Immunol. 161 (1998), 7031-7039頁）のＡｌｎ  ｇ  ４、Zeiler et al.（J. Allergy Clin. Immunol. 100 (1997), 721-727頁）のウシの鱗屑アレルゲン、Elfman（Int. Arch. Allergy Immunol. 117 (1998),167-173頁）のＬｅｐ  ｄ２、Westritschnig（J. Immunol. 172 (2004), 5684-5692頁）のＰｈｌｐ  ７の天然様折りたたみ構造が失われるためである。主として非連続／立体構造的なＩｇＥエピトープを含有するタンパク質の断片化は、アレルゲンのＩｇＥ結合能力を実質的に低減させる。この知見に基づいて、従来技術では、このような低アレルゲン性アレルゲンの断片が生体内で防御免疫反応を誘導し得るかどうかが研究されていた（Westritschnig et al.（Curr. Opinion in Allergy and Clin. Immunol. 3 (2003)、495-500頁））。
【００１１】
Ball et al.（Eur J Immunol 1999, 29: 2026-2036頁）には、免疫療法の過程で、水酸化アルミニウムを通して吸着した花粉抽出物を投与することが記載されている。
【００１２】
米国第２００２／００５２４９０Ａ１には、少なくとも１つのＰｈｌ  Ｐ  １−エピトープを含むポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡ分子が開示されている。
【００１３】
Flicker S et al.（J Allergy Clin Immunol 2006, 117：1336-1343頁）において、Ｐｈｌ  Ｐ  １アレルゲンのＣ末端技術が全Ｐｈｌ  Ｐ  １分子のアレルゲン性潜在能力のほとんどを含むことが見つかっている。
【００１４】
Linhart B et al.（FASEB J 2002, 16:1301-1303頁）には、オオアワガエリのいくつかのアレルゲンを含有するハイブリッド分子の製造について記載されている。
【００１５】
ＤＥ第１０３５１４７１Ａ１はハイブリッドポリペプチドに関するものであり、このハイブリッドポリペプチドは、免疫的に優勢ないくつかの、アレルゲンのＴ細胞エピトープから成り、交差反応を起こさない。
【００１６】
本発明の目的は、上述の知見に基づいた、改善されたアレルギー免疫療法の手段および方法を提供することにある。このような方法および手段は、アナフィラキシーショックのリスクが低い点、容易に適用可能であると共に個々の患者の要求に合わせることができる点、および、容易に工業規模に変えることができる点と関連しているため、有効である。
【００１７】
従って本発明は、野生型アレルゲンと比べてアレルゲン活性が低減した、野生型タンパク質アレルゲンＰｈｌ  ｐ  １（主要なオオアワガエリの花粉アレルゲン）の誘導体を製造する方法であって、
野生型タンパク質アレルゲンＰｈｌ  ｐ  １を準備するステップと、
上記野生型タンパク質アレルゲンを少なくとも３つの断片に断片化するステップであって、該少なくとも３つの断片のうちの少なくとも１つの断片は少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含み、該少なくとも３つの断片は、アレルゲン活性が低減しているかまたはアレルゲン活性を失っている断片に断片化するステップと、
上記少なくとも３つの断片を、上記野生型アレルゲンの断片の順序とは異なる順序で再結合させるステップとを含む方法に関する。
【００１８】
アレルギー性反応は、予め形成されているＩｇＥとクロスリンクしたアレルゲンがマスト細胞上の高親和性受容体ＦｃεＲＩと結合したときに引き起こされる。マスト細胞は、身体の表面に並んでおり、免疫システムに局部感染に対する注意を促すように機能している。一旦活性化されると、これらは、予め形成されている顆粒内に格納された化学的メディエータを分泌することによって、および、活性化が生じた後、ロイコトリエンおよびサイトカインを合成することによって、炎症反応を引き起こす。従って、アレルギーに苦しんでいるかアレルギーに苦しむ危険性のある各患者に対して、予防するため、治療するため、または敏感にさせるために野生型アレルゲンを投与することは、副作用が生じるために有効ではない。免疫療法においてアレルギー性反応を回避する１つの方法は、野生型アレルゲンを変形させて、この変形された「アレルゲン」がわずかな量だけＩｇＥに結合するか、または、全く結合しなくなる程度にまで変形することである。結果的に、このような分子は、強いアレルギー性反応を引き起こすことが不可能である。しかしながら、特定のアレルゲンの断片は、防御抗体応答を生じさせる程十分には免疫原性を有していないことに留意されたい（Westritschnig et al., （2004））。
【００１９】
本発明に係る方法により、ＩｇＥと結合する可能性が低いかまたはこの可能性がないが、Ｔ細胞性免疫応答を引き起こすために必要とされるアレルゲンの特性を一緒に保持するアレルゲン誘導体の製造が可能となる。これは、本発明に係る方法によって達成され得る。なぜなら、Ｔ細胞性免疫応答の誘発の原因となる構造要素、例えば野生型アレルゲンのＴ細胞エピトープは、本発明に係るアレルゲン誘導体内に実質的に保持された状態で残っているからである。しかしながら、アレルゲンの断片をシャッフルすること（断片化して再結合すること）によって、ＩｇＥに対する結合能力の大幅な低減、または、この結合能力の完全な欠損が引き起こされる。もちろん、アレルゲン誘導体の製造過程でいくつかのアミノ酸残基のみを欠失させる（除去する）か、または追加する（挿入する）した場合、または、各部分が直接結合する代わりにリンカーによって結合した場合にも、本発明に係る利点は依然として存在する。このアレルゲン活性の低減または消滅は、アレルゲンを確定した断片に分割する公知および通常の原理によって達成される。
【００２０】
本発明に係るアレルゲン誘導体は、組み換えにより製造されることが好ましい。当然ながら、単一のアレルゲンの断片を化学的に合成して、その後、これら断片を一緒につなげることも可能である。
【００２１】
本発明の好ましい一実施形態によれば、アレルゲン活性の低減を、野生型アレルゲンと比べて少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、特には５０％のＩｇＥ結合能力の低減によって判定する。
【００２２】
アレルゲン活性の低減を、好ましくは、上記誘導体のドットブロットに対する、アレルゲンに過敏な患者の血清におけるＩｇＥ抗体の結合の欠如によって、または好塩基球放出分析によって判定する。
【００２３】
アレルゲン活性を評価する従来の生体外分析は、ＲＡＳＴ（Sampson and Albergo, J. Allergy Clin. Immunol. 74:26, 1984）、ＥＬＩＳＡ（Burks et al. N. Engl. J. Med. 314:560, 1986）、免疫ブロット法（Burks et al., J. Allergy Clin. Immunol. 81:1135, 1988）、好塩基球ヒスタミン放出分析（Nielsen, Dan. Med. Bull. 42:455, 1995 and du Buske, Allergy Proc. 14:243, 1993）、およびその他のもの（Hoffmann et al. Allergy 54:446, 1999）を含む。
【００２４】
本発明の好ましい一実施形態によれば、上記少なくとも３つの断片は、Ｐｈｌ  ｐ  １の２５から３９番目までのアミノ酸残基、３４から４５番目までのアミノ酸残基、７３から８４番目までのアミノ酸残基、９１から１０２番目までのアミノ酸残基、１００から１１１番目までのアミノ酸残基、１０９から１３３番目までのアミノ酸残基、１２１から１３５番目までのアミノ酸残基、１２７から１３８番目までのアミノ酸残基、１５７から１６８番目までのアミノ酸残基、１６９から１８３番目までのアミノ酸残基、および／または、２２６から２４０番目までのアミノ酸残基を含んで構成される。
【００２５】
本発明に係る方法で用いられる少なくとも３つの断片は、上述のＴ細胞エピトープのうちの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで構成されてよい（例えば、Schenk S. et al. J Allergy Clin Immunol. （1995）96:986-996参照）。
【００２６】
本発明の他の好ましい一実施形態によれば、上記少なくとも３つの断片は、Ｐｈｌ  ｐ  １の１から６４番目までのアミノ酸残基（Ａ）、６５から１２５番目までのアミノ酸残基（Ｂ）、１２６から２０５番目までのアミノ酸残基（Ｃ）および２０６から２４０番目までのアミノ酸残基（Ｄ）から成る群より選択される。
【００２７】
本発明の断片は、ＩｇＥ結合／Ｂ細胞エピトープおよび保存されているＴ細胞エピトープを破壊するように選択される。これらのエピトープは、これらのエピトープに対する適切な免疫応答の生成を引き起こす。野生型アレルゲンＰｈｌ  ｐ  １に自然にみられるＢ細胞エピトープの破壊／低減によって、各患者に投与される場合に、上記誘導体は、アレルギー性反応を誘導するよりもむしろ、主としてＴ細胞性応答を生じさせることができる（メディエーター放出細胞に結合しているＩｇＥへの結合を全く欠くか、または、結合が低減する）。
【００２８】
上記アレルゲン誘導体における上記断片の順序は、Ｂ−Ｄ−Ａ−Ｃであることが好ましい。
【００２９】
仮に得られたアレルゲン誘導体のアレルゲン活性が野生型アレルゲンと比べて低い場合には、上記断片を他の順序で並べることも当然可能である（Ｄ−Ｂ−Ａ−Ｃ、Ｂ−Ａ−Ｄ−Ｃ等）。
【００３０】
本発明に従って得られた誘導体を、製薬基準を満たした賦形剤と組み合わせて医薬製剤に仕上げることは容易に可能である。
【００３１】
好ましくは、上記誘導体を、好適なワクチンアジュバントと組み合わせて製薬基準を満たしたワクチン製剤に仕上げる。
【００３２】
好ましい一実施形態では、本発明に係る誘導体をさらなるアレルゲンと組み合わせて、複合ワクチンにする。このようなアレルゲンは、野生型アレルゲン、特に野生型アレルゲンの混合物、組み換え野生型アレルゲン、野生型タンパク質アレルゲンの誘導体またはこれらの混合物であることが好ましい。この混合物は、特定の患者のニーズ（アレルゲンプロファイル）に合わせて特別に製造され得る。
【００３３】
好ましい一実施形態では、このような医薬製剤は、アレルゲン抽出物をさらに含む。
【００３４】
本発明の他の好ましい一実施形態では、上記さらなるアレルゲンは、主要なカバノキの花粉アレルゲン（特にＢｅｔ  ｖ  １およびＢｅｔ  ｖ  ４）、主要なオオアワガエリの花粉アレルゲン（特にＰｈｌ  ｐ  ２、Ｐｈｌ  ｐ  ５、Ｐｈｌ  ｐ  ６、および、Ｐｈｌ  ｐ  ７）、主要なイエダニアレルゲン（特にＤｅｒ  ｐ  １およびＤｅｒ  ｐ  ２）、主要なネコアレルゲン（Ｆｅｌ  ｄ  １）、主要なハナバチアレルゲン、主要なスズメバチアレルゲン、プロフィリン（特にＰｈｌ  ｐ  １２）、および、貯蔵庫ダニ（storage mite）アレルゲン（特にＬｅｐ  ｄ  ２）から成る群より選択される。
【００３５】
本発明に係る医薬製剤およびワクチン製剤は、Ｐｈｌ  ｐ  １に近いもの、他のアレルゲンまたは誘導体およびこれらの断片、アレルゲン抽出物などを含んで構成されてもよい。
【００３６】
本発明の別の態様は、本発明に係る方法によって得られるアレルゲン誘導体に関する。
【００３７】
本発明のさらに別の態様は、野生型タンパク質アレルゲンＰｈｌ  ｐ  １のアレルゲン誘導体であって、上記野生型タンパク質アレルゲンの少なくとも３つの断片をふくみ、該３つの断片は上記野生型アレルゲンにおける順序とは異なる順序で互いに連結しており、上記少なくとも３つの野生型アレルゲン断片はアレルゲン活性が低減しているか、またはアレルゲン活性を欠いており、上記少なくとも３つの断片のうちの少なくとも１つは１つ以上のＴ細胞エピトープを含んで構成されているアレルゲン誘導体に関する。
【００３８】
本発明の好ましい一実施形態によれば、上記少なくとも３つのアレルゲン断片は、少なくとも６アミノ酸残基、好ましくは少なくとも１０アミノ酸残基、特に少なくとも１５アミノ酸残基を含んで構成されている。
【００３９】
上記少なくとも３つの断片は、好ましくは、Ｐｈｌ  ｐ  １の２５から３９番目までのアミノ酸残基、３４から４５番目までのアミノ酸残基、７３から８４番目までのアミノ酸残基、９１から１０２番目までのアミノ酸残基、１００から１１１番目までのアミノ酸残基、１０９から１３３番目までのアミノ酸残基、１２１から１３５番目までのアミノ酸残基、１２７から１３８番目までのアミノ酸残基、１５７から１６８番目までのアミノ酸残基、１６９から１８３番目までのアミノ酸残基、および２２６から２４０番目までのアミノ酸残基を含んで構成されている。
【００４０】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記少なくとも３つの断片は、Ｐｈｌ  ｐ  １の１から６４番目までのアミノ酸残基（Ａ）、６５から１２５番目までのアミノ酸残基（Ｂ）、１２６から２０５番目までのアミノ酸残基（Ｃ）および２０６から２４０番目までのアミノ酸残基（Ｄ）から成る群より選択される。
【００４１】
上記アレルゲン誘導体における上記断片の順序は、Ｂ−Ｄ−Ａ−Ｃであることが好ましい。
【００４２】
本発明のアレルゲン誘導体は、Ｐｈｌ  ｐ  １感受性の検出および診断にも用いられ得る。例えば、この検出および診断は、感受性を評価する患者から採取した血液または血液製剤を、Ｐｈｌ  ｐ  １の活性を有するペプチドと生体外で組み合わせることによって実施可能であり、血液中の成分（例えば、抗体、Ｔ細胞、Ｂ細胞）と上記誘導体との結合およびこのような結合が生じる範囲の決定に適した環境下でなされる。本発明の誘導体が用いられ得るアレルギー性疾患の他の診断方法としては、放射性アレルギー吸着試験（RAST）、ペーパー放射性免疫吸着試験（PRIST）、酵素免疫吸着法（ELISA）、放射免疫測定法（RIA）、免疫放射定量測定法（IRMA）、発光免疫測定法（LIA）、ヒスタミン放出測定法およびＩｇＥ免疫ブロット法が挙げられる。
【００４３】
本発明の別の態様は、本発明に係るアレルゲン誘導体（上記参照）と、さらなるアレルゲン、好ましくは野生型アレルゲン、特には野生型アレルゲン、組み換え野生型アレルゲン、野生型タンパク質アレルゲンの誘導体またはこれらの混合物の混合物とを含んで構成されるアレルゲン組成物に関する。
【００４４】
上記組成物は、好ましくはアレルゲン抽出物をさらに含む。
【００４５】
本発明の好ましい一実施形態によれば、アレルゲン組成物は製薬基準を満たした賦形剤を含む。
【００４６】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記組成物は、主要なカバノキの花粉アレルゲン（特にＢｅｔ  ｖ  １およびＢｅｔ  ｖ  ４）、主要なオオアワガエリの花粉アレルゲン（特にＰｈｌ  ｐ  ２、Ｐｈｌ  ｐ  ５、Ｐｈｌ  ｐ  ６およびＰｈｌ  ｐ  ７）、主要なイエダニアレルゲン（特にＤｅｒ  ｐ  １およびＤｅｒ  ｐ  ２）、主要なネコアレルゲン（Ｆｅｌ  ｄ  １）、主要なハナバチアレルゲン、主要なスズメバチアレルゲン、プロフィリン（特にＰｈｌ  ｐ  １２）および貯蔵庫ダニアレルゲン（特にＬｅｐ  ｄ  ２）から成る群より選択される１つ以上のアレルゲンをさらに含んで構成される。
【００４７】
本発明の別の態様は、アレルゲン特異的免疫療法薬剤の調剤のための本発明に係るアレルゲン誘導体またはアレルゲン組成物の使用に関する。
【００４８】
本発明のさらに別の態様は、能動免疫付与用薬剤の調剤のための本発明に係るアレルゲン誘導体またはアレルゲン組成物の使用に関する。
【００４９】
本発明の別の態様は、予防免疫接種用薬剤の調剤のための本発明に係るアレルゲン誘導体またはアレルゲン組成物の使用に関する。
【００５０】
上記薬剤は、好ましくはアジュバント、希釈剤、防腐剤またはこれらの混合物をさらに含む。
【００５１】
本発明の好ましい一実施形態によれば、上記薬剤は、１０ｎｇから１ｇ、好ましくは１００ｎｇから１０ｍｇ、特には０．５μｇから２００μｇの上記組み換えアレルゲン誘導体を含んで構成される。好ましい投与の方法としては、概してワクチン接種用および特にはアレルギー免疫療法用に記述または提案されている全ての標準的な投与法が含まれる（経口、経皮、経静脈、経鼻、経粘膜など）。本発明は、本発明に係る医薬製剤の有効量を投与することによってアレルギーを治療および予防する方法を包含する。
【００５２】
本発明の別の態様は、本発明に係るアレルゲン誘導体を製造する方法であって、
本発明に係るアレルゲン誘導体をコードするＤＮＡ分子を準備するステップと、
上記ＤＮＡ分子を用いて宿主細胞を形質転換するステップと、
上記宿主細胞内で上記誘導体を発現させ、上記誘導体を単離するステップとを含む方法に関する。
【００５３】
本発明の好ましい一実施形態によれば、上記宿主細胞は、真核細胞、好ましくは酵母細胞もしくは植物細胞、または原核細胞、好ましくはエシェリキア・コリ（Escherichia coli）である。
【００５４】
好ましくは、上記宿主細胞は、高い発現能力を有する宿主細胞である。本明細書で用いられる場合、「高い発現能力を有する宿主細胞」は、関心をもっているタンパク質を、培養液に少なくとも１ｍｇ／ｌ、好ましくは少なくとも５ｍｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも１０ｍｇ／ｌ、最も好ましくは少なくとも２０ｍｇ／ｌの量で発現する宿主である。もちろん、発現能力は、選択する宿主および発現システム（例えば、ベクター）によっても左右される。本発明に係る好ましい宿主はＥ．ｃｏｌｉ、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、バチルス・スブティリス（Bacillus subtilis）、植物細胞（例えば、タバコ由来）などである。
【００５５】
もちろん、あらゆる他の好適な方法によっても本発明に係るアレルゲン誘導体を製造することができ、とりわけ、化学合成または半化学合成によっても製造することができる。
【００５６】
本発明は、以下の図面および実施例によってさらに説明されるが、それらに限定されるものではない。
【００５７】
図１Ａは、本発明に係る低アレルゲン性Ｐｈｌ  ｐ１誘導体の構成を示している。
【００５８】
図１Ｂは、本発明に係るＰｈｌ  ｐ１モザイクタンパク質のアミノ酸配列を示している（配列番号１）。
【００５９】
図２Ａは、＞９０％の純度に精製したＰｌｍのクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。
【００６０】
図２Ｂは、Ｐｌｍの質量分光分析を示しており、レーザー脱離質量スペクトルは、ＴＯＦ  Ｃｏｍｐａｃｔ  ＭＡＬＤＩ  ＩＩ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｋｒａｔｏｓ社、英国）（ｐｉＣＨＥＭ社、オーストリア）を用いてリニアモードで得られた。
【００６１】
図２Ｃは、Ｐｌｍの円偏光二色性（ＣＤ）分析を示している。遠紫外ＣＤスペクトルを、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ社、イーストン、メリーランド州）において室温で回収した。このとき、最終的なタンパク質濃度は、Ｐｌｍについては４６μＭであり、組み換えＰｈｌについては１２μＭであり、経路長が０．００１ｃｍおよび０．０５ｃｍの石英キュベットをそれぞれ使用した。３回の独立の測定結果を記録し、各スペクトル点について平均化した。同じ条件により得られた対応するバッファースペクトルを差し引くことによって、最終的なスペクトルをベースライン修正した。結果は、所定の波長における平均残基楕円率[θ]として表されている。
【００６２】
図３は、メンブレンに結合しているアレルゲンｒＰｈｌ  ｐ  １、ＰｌｍおよびＨＳＡに対するＩｇＥ結合を示している。４９人の花粉アレルギー患者からの血清および１人の非アトピードナーからの血清を（ｎ＝５０）、メンブレン結合組み換えアレルゲンｒＰｈｌ  ｐ  １、ＰｌｍおよびＨＳＡとともにインキュベートした。１２５Ｉ標識した抗ヒトＩｇＥ抗体を用いて、結合したＩｇＥを検出した。
【００６３】
図４は、５つのＰｈｌ  ｐ１アレルギー性個体のサンプルをｒＰｈｌ  ｐ１およびＰｌｍにさらしたときのＣＤ２０３ｃの発現の比較を示している。
【００６４】
図５は、ｒＰｈｌ  ｐ１およびＰｌｍにさらされたマウスにおけるＩｇＧ１応答の誘導を示している。
【００６５】
〔実施例：低アレルゲン性Ｐｈｌ  ｐ  １モザイク（Ｐｌｍ）タンパク質の特徴づけ〕
（実施例１：低アレルゲン性Ｐｈｌ  ｐ  １モザイク（Ｐｌｍ）タンパク質の構築）
組み換え低アレルゲン性Ｐｈｌ  ｐ  １モザイクを構築するために、４つのＰｈｌ  ｐ  １断片をコードするｃＤＮＡを増幅した。断片Ａ（アミノ酸１−６４）、Ｂ（アミノ酸６５−１２５）、Ｃ（アミノ酸１２６−２０５）およびＤ（アミノ酸２０６−２４０）は図１Ａに示されている。説明したｃＤＮＡ断片は、「ジーン・ソーイング法（gene soeing）」（Horton et al., 1999）によってＢ−Ｄ−Ａ−Ｃの順序でアセンブルされている。第１のＰＣＲ反応において、断片Ａ（プライマーＡＦ：5'ATC CCC AAG GTT CCC 3'およびＡＲ：5'CAG CTC GCC GGC GCT CTT GAA GAT GGG 3'）、Ｂ（プライマーＢＦ：5'C TCC TCC CAT ATG TCC GGA CGC GGC 3'およびＢＲ：5'GGT GAA GGG GCC CGT GCG CAG CTT CTG 3'）、Ｃ（プライマーＣＦ：5'AGC GCC GGC GAG CTG 3'およびＣＲ：5'C GGG ATC CTA ATG ATG ATG ATG ATG ATG GGC GGC GAG CTT GTC GGG AGT GTC 3'）およびＤ（プライマーＤＦ：5'ACG GGC CCC TTC ACC 3'およびＤＲ：5'GGG AAC CTT GGG GAT CTT GGA CTC GTA 3'）のためのｃＤＮＡを取得した。その後の第１のソーイング（ＳＯＥｉｎｇ）反応では、断片ＢＤ（プライマーＢＦおよびＤＲを使用）および断片ＡＣ（プライマーＡＦおよびＣＲを使用）をコードするｃＤＮＡを取得するために、ゲル精製したＰＣＲ産物をテンプレートとして用いた。その後の第２のソーイング反応では、プライマーＢＦおよびＣＲを用いてＢＤＡＣをコードするＰＣＲ産物を取得するために、ゲル精製した断片ＢＤおよびＡＣをテンプレートとして用いた（図１Ａに概略的に示している）。
【００６６】
結果として得られたＢＤＡＣをコードするｃＤＮＡコンストラクトを、プラスミドｐＥＴ１７ｂ（ノバジェン社、マディソン、ウィスコンシン州）のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素部位に挿入した。Ｎｉ２＋アフィニティクロマトグラフィによってモザイクタンパク質を精製できるように、ＢＤＡＣコンストラクトのＣ末端には、２つのグリシンの後に６ヒスチジンタグが続いている（図１Ｂ）。Ｐｈｌ  ｐ  １モザイク（Ｐｌｍ）をコードしているｃＤＮＡが正しい配列であることを、シーケンシングによって確認した。
【００６７】
結果として得られる分子は、全一次配列（Laffer et. al., 1994）およびＴ細胞エピトープ（Schenk et al., 1995）を保持している。
【００６８】
（実施例２：Ｐｌｍの生化学的特徴づけ）
Ｐｌｍの発現および精製
形質転換によりＰｌｍコンストラクトをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ストラタジーン社、オーストラリア）内に導入し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地中で発現させた。形質転換された細胞を３７℃でＯＤ６００＝０．９になるまで増殖させ、１ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって組み換えＰｌｍの発現を誘導した。同じ条件下で４時間インキュベーションを継続し、その後、遠心分離によって細胞を回収した。変性条件を用いて、組み換えＰｌｍを不溶性ペレット画分から精製した。８Ｍの尿素、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０中で６０分間攪拌することによって、細胞を溶解した。１４，０００×ｇで３０分間遠心分離した後、上清をＮｉ−ＮＴＡカラムにロードした。組み換えＰｌｍを、８Ｍの尿素、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ４．５中に溶出させ、段階的透析によって再生した。１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０で、６Ｍ、４Ｍ、３Ｍ、２Ｍ、１Ｍおよび０．５Ｍの尿素を含む段階的透析の各ステップにおいて、少なくとも４時間透析した。１０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０でタンパク質の最終的な透析を実施し、Ａｍｉｃｏｎ  ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ．−３濃縮器を用いてタンパク質を濃縮した。
【００６９】
タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。精製したサンプルのタンパク質濃度を２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度によって評価した。タンパク質のモル吸光係数をチロシンおよびトリプトファン含有量から計算した（Gill et al., 1989）。
【００７０】
Ｐｌｍは組み換えＰｈｌ  ｐ  １に類似した泳動パターンを示している（図２Ａ参照）。これは、タンパク質の推定アミノ酸配列に従って算出された分子量と一致する。
【００７１】
質量分析によってＰｌｍの分子質量は２７０８２ダルトンと決定され、これは、タンパク質の予測分子量と一致する（図２Ｂ参照）。
【００７２】
精製したＰｌｍを円偏光二色性分析によって分析し、組み換えＰｈｌ  ｐ  １と比較して、その二次構造含量を決定した（図２Ｃ参照）。意外にも、Ｐｌｍは、２０７ｎｍおよび２１５ｎｍに最小点、１９５ｎｍに最大点を有する折りたたみ構造分子である。これは、かなりの量のβ−二次構造であることを示唆している。人工アレルゲンタンパク質であるＰｌｍは、バキュロ・ウイルス感染昆虫細胞で発現している組み換えＰｈｌ  ｐ  １の折りたたみ型とは異なるＣＤスペクトルを呈している（Ball et al.）。相対的に、Ｅ．ｃｏｌｉ発現組み換えＰｈｌ  ｐ  １は非折りたたみ構造タンパク質のスペクトルを呈し、この事実は最近報告されている（Ball et al., 2005）。
【００７３】
（実施例３：ＰｌｍにおけるＩｇＥ結合能力の低減）
抗原過剰の条件下におけるドットブロット実験によって、ＰｌｍのＩｇＥ反応性を測定し、ｒＰｈｌ  ｐ  １と比較した（Niederberger et al., 1998）。３μｇの精製組み換えタンパク質をニトロセルロースストリップ上に点状にのせ（ドットし）、４９人のＰｈｌ  ｐ  １アレルギー性患者の血清とともにインキュベートした。結合したＩｇＥ抗体を、１２５Ｉ標識した抗ヒトＩｇＥ抗体を用いて検出し、γ−計測（Ｗａｌｌａｃ社、フィンランド）によって定量した（Ball et al., 1999）。
【００７４】
非変性条件下で決定したＰｌｍのＩｇＥ反応性は、ｒＰｈｌｐ１のＩｇＥ結合能力と比較して著しく低減していた（図３）。Ｐｌｍが結合したＩｇＥ抗体の定量化から、ｒＰｈｌ  ｐ  １と比較してＰｌｍのＩｇＥ結合能力が平均して８６．５％低減していることが示されている（表１）。
【００７５】
図３は、メンブレンに結合している組み換えアレルゲンｒＰｈｌ  ｐ  １、ＰｌｍおよびＨＳＡに対するＩｇＥ結合を示している。４９人の花粉アレルギー患者からの血清および１人の非アトピードナーからの血清を（ｎ＝５０）、メンブレン結合組み換えアレルゲンｒＰｈｌ  ｐ  １、ＰｌｍおよびＨＳＡとともにインキュベートした。１２５Ｉ標識した抗ヒトＩｇＥ抗体を用いて、結合したＩｇＥを検出した。
【００７６】
表１．ｒＰｈｌ  ｐ  １およびＰｌｍの血清ＩｇＥ反応性。ドットしたタンパク質を、２９人の花粉アレルギー患者の血清にさらした。結合したＩｇＥ抗体を、１２５Ｉ標識した抗ヒトＩｇＥ抗体を用いて検出し、γ−計測によって定量化した。
【００７７】
【表１】
2009535041.tif 000003
【００７８】
（実施例４：Ｐｌｍはアレルゲン活性が低減している）
ＣＤ２０３ｃ発現によって測定された好塩基球の活性化
インフォームド・コンセントが得られた後、５人のアレルギードナーから末梢血を採取した。血液をヘパリン添加チューブに回収した。等分した血液（１００μｌ）を、ＰｌｍおよびｒＰｈｌ  ｐ  １の連続希釈（１０−３から１０μｇ／ｍｌ）、抗ＩｇＥ抗体（１μｇ／ｍｌ）（イムノテック社、マルセイユ、フランス）またはバッファー（リン酸緩衝生理食塩水＝ＰＢＳ）とともに、１５分間３７℃でインキュベートした。インキュベーションの後、細胞を２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中で洗浄した。次いで、ＣＤ２０３ｃ  ｍＡｂ  ９７Ａ６（イムノテック社、マルセイユ、フランス）を含む１０μｌのＰＥとともに、細胞を１５分間室温（ＲＴ）でインキュベートした。その後、サンプルを、２ｍｌのＦＡＣＳＴＭライシング・ソリューション（ベクトン・ディッキンソン社、サンノゼ、カリフォルニア州）による赤血球溶解に供した。細胞を洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁し、Ｐａｉｎｔ−ａ−Ｇａｔｅソフトウェアを用いてＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・ディッキンソン社）で二色フローサイトメトリーにより解析した。ＣＤ２０３ｃのアレルゲン誘導亢進制御を、刺激細胞（ＭＦＩｓｔｉｍ）および非刺激細胞（ＭＦＩｃｏｎｔｒｏｌ）を用いて得られた平均蛍光強度（ＭＦＩｓ）から算出し、刺激指数（ＭＦＩｓｔｉｍ：ＭＦＩｃｏｎｔｒｏｌ）として表した。
【００７９】
５人のＰｈｌ  ｐ  １アレルギー患者の血中好塩基球におけるＣＤ２０３ｃの発現を測定することによって、Ｐｌｍのアレルゲン活性を解析した。図４に表されているように、タンパク質濃度を１μｇ／ｍｌにしてｒＰｈｌ  ｐ  １とともにインキュベートすると、ＣＤ２０３ｃの発現は著しく（ｐ＜０．０５）亢進制御される。一方、Ｐｌｍとの場合には、ＣＤ２０３ｃの発現は誘導されない。Ｐｌｍの濃度が１０μｇ／ｍｌに上昇した場合のみ、ＣＤ２０３ｃの発現は亢進制御される。そのため、Ｐｌｍと比較すると、Ｐｈｌ  ｐ  １は１０倍のアレルゲン活性を呈する。
【００８０】
（実施例５：Ｐｌｍを用いた免疫付与により誘導されたＩｇＧ抗体は、患者のＩｇＥのｒＰｈｌ  ｐ  １に対する結合を阻害する）
ウサギへの免疫付与
まず、ＣＦＡを用いて、２００μｇのＰｌｍおよびｒＰｈｌ  ｐ  １によりウサギを免疫した。また、その後のＩＦＡ（チャールズ・リバー・ブリーディング・ラボラトリー、キスレッグ、ドイツ）を用いた追加免疫注射のために、１００μｇの免疫原により免疫付与した（第１の追加免疫注射を４週間後に付与し、不完全アジュバントを含む第２の追加免疫注射を７週間後に付与した）。最初の免疫から８週間後、ウサギは出血させられた（bled）。
【００８１】
Ｐｌｍ誘導ＩｇＧによる、ｒＰｈｌ  ｐ  １に対するアレルギー患者のＩｇＥ結合の阻害
ｒＰｈｌ  ｐ  １へのアレルギー患者のＩｇＥ結合を阻害する、ＰｌｍおよびｒＰｈｌ  ｐ  １により誘導したウサギＩｇＧの阻害能力を、ＥＬＩＳＡ競合アッセイ（Focke et al., 2001）により試験した。ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク・マキシソープ社、デンマーク）を、１μｇ／ｍｌのｒＰｈｌ  ｐ  １でコートし、ｒＰｈｌ  ｐ  １およびＰｌｍ抗血清の１／１００希釈液を用いて、また、コントロール目的のために対応する免疫前血清を用いて、プレインキュベートした。洗浄後、４３人のＰｈｌ  ｐ  １感作花粉アレルギー患者からの血清１／１０希釈とともに、プレートをインキュベートした。ＨＲＰに連結したヤギ抗ヒトＩｇＥ  Ａｂｓ（１／２５００に希釈）（ＫＰＬ、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）を用いて、結合したＩｇＥ  Ａｂｓを検出した。抗Ｐｈｌ  ｐ  １および抗Ｐｌｍ抗血清を用いたプレインキュベーションにより実現したＩｇＥ結合の阻害の割合を、以下のように算出した。ＩｇＥ結合の阻害の割合＝１００−ＯＤＩ／ＯＤＰ×１００
。ＯＤＩおよびＯＤＰは、それぞれ、ウサギの免疫血清および対応する免疫前血清を用いてプレインキュベーションした後の吸光度を表している。
【００８２】
患者のＩｇＥのｒＰｈｌ  ｐ  １への結合を阻害する、Ｐｌｍの能力を、割合の減少として表２に示している。抗Ｐｌｍ  Ａｂｓを用いた場合には、患者のＩｇＥにおけるｒＰｈｌ  ｐ  １への結合の最も強い阻害が、０から８９％（減少の平均は５２％）の範囲となり、一方、抗Ｐｈｌ  ｐ  １  Ａｂｓを用いた阻害では、４から７５％（平均は４３％）の範囲となった。
【００８３】
表２．ｒＰｈｌ  ｐ  １およびＰｌｍに対して高められたウサギ抗血清は、ｒＰｈｌ  ｐ  １に対する花粉アレルギー患者のＩｇＥの結合を阻害する。ＥＬＩＳＡプレートに結合したｒＰｈｌ  ｐ  １およびＰｌｍを、ウサギ抗ｒＰｈｌ  ｐ１および抗Ｐｌｍ抗血清とともにプレインキュベートした。４３人の花粉アレルギー患者について得られたＩｇＥ結合の割合の減少を示している。
【００８４】
【表２】
2009535041.tif 000004
【００８５】
（実施例６：Ｐｌｍの免疫原性）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｐｈｌ  ｐ  １モザイクタンパク質がアレルゲン特異的ＩｇＧ応答を誘導するかを調べるために、６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールズ・リバー・ブリーディング・ラボラトリー）を皮下免疫した。５匹のマウスからなる複数のグループについて、５μｇのＰｌｍ、ｒＰｈｌ  ｐ  １、およびコントロール目的のためにＡｌ（ＯＨ）３に吸着したＰＢＳのみ（Ａｌｕ−Ｇｅｌ−Ｓ、セルバ、ドイツ）を用いて免疫した（Vrtala et al., 1998）。マウスを３回免疫し（１日目、２８日目、５６日目）、４週間おきに尾の静脈から採血し、分析まで血清を−２０℃で保存した。
【００８６】
ｒＰｈｌ  ｐ  １に対するＩｇＧ１応答をＥＬＩＳＡにより測定した（Vrtala et al., 1998）。ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク・マキシソープ社、デンマーク）を５μｇのＰｌｍでコートし、１：１０００希釈したマウス血清とともにインキュベートした。結合したＩｇＧ１抗体を、１：１０００希釈したモノクローナルラット抗マウスＩｇＧ１（ファルミンゲン社、カリフォルニア州）および１：２００希釈したＨＲＰ標識ヒツジ抗ラット抗血清（アマシャム、英国）を用いて検出した。
【００８７】
図５に図示するように、ｒＰｈｌ  ｐ  １に対するＰｌｍ誘導ＩｇＧ１応答は、ｒＰｈｌ  ｐ  １を用いた免疫化による誘導の場合と、ほぼ同程度である。
【００８８】
図５．Ｐｌｍの免疫原性。ＰＢＳ、ｒＰｈｌ  ｐ１またはＰｌｍまたは（ｘ軸）により免疫した５匹のマウスの平均ＩｇＧ１応答を、免疫後４、８週間または１２週間におけるＯＤ値と（ｙ軸）して図示している。
【００８９】
〔文献〕
Ball, T., et al. (2005) FEBS J. 272:217-227.
Ball, T., et al. (1999) FASEB J. 13:1277.
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Vrtala, S., et al. (1998) J. Immunol. 160: 6137.
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１Ａ】本発明に係る低アレルゲン性Ｐｈｌ  ｐ１誘導体の構成を示す図である。
【図１Ｂ】本発明に係るＰｈｌ  ｐ１モザイクタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。
【図２Ａ】＞９０％の純度に精製したＰｌｍのクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図２Ｂ】Ｐｌｍの質量分光分析を示す図であり、レーザー脱離質量スペクトルは、ＴＯＦ  Ｃｏｍｐａｃｔ  ＭＡＬＤＩ  ＩＩ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｋｒａｔｏｓ社、英国）（ｐｉＣＨＥＭ社、オーストリア）を用いてリニアモードで得られている。
【図２Ｃ】Ｐｌｍの円偏光二色性（ＣＤ）分析を示す図である。遠紫外ＣＤスペクトルを、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ社、イーストン、メリーランド州）において室温で回収した。このとき、最終的なタンパク質濃度は、Ｐｌｍについては４６μＭであり、組み換えＰｈｌについては１２μＭであり、経路長が０．００１ｃｍおよび０．０５ｃｍの石英キュベットをそれぞれ使用した。３回の独立の測定結果を記録し、各スペクトル点について平均化した。同じ条件により得られた対応するバッファースペクトルを差し引くことによって、最終的なスペクトルをベースライン修正した。結果は、所定の波長における平均残基楕円率[θ]として表されている。
【図３】メンブレンに結合しているアレルゲンｒＰｈｌ  ｐ  １、ＰｌｍおよびＨＳＡに対するＩｇＥ結合を示す図である。４９人の花粉アレルギー患者からの血清および１人の非アトピードナーからの血清を（ｎ＝５０）、メンブレン結合組み換えアレルゲンｒＰｈｌ  ｐ  １、ＰｌｍおよびＨＳＡとともにインキュベートした。１２５Ｉ標識した抗ヒトＩｇＥ抗体を用いて、結合したＩｇＥを検出した。
【図４】５つのＰｈｌ  ｐ１アレルギー性個体のサンプルをｒＰｈｌ  ｐ１およびＰｌｍにさらしたときのＣＤ２０３ｃの発現の比較を示す図である。
【図５】ｒＰｈｌ  ｐ１およびＰｌｍにさらされたマウスにおけるＩｇＧ１応答の誘導を示す図である。
【図１Ａ】
2009535041.tif 000005
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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