(57)【要約】【課題】ヘアピンＤＮＡ構造と、植物中で転写後の遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を起こさせるためのその使用方法を提供する。【解決手段】配列番号３及び配列番号３のアンチセンス配列などのヌクレオチド配列を有し、細胞中で転写されたときに、遺伝子的に組換えられたＴＧＢ−３ウイルス配列が、二重鎖の自己相補的なＲＮＡ分子を生成できる遺伝子的に組換えられたＴＧＢ−３ウイルス配列。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号３及び配列番号３のアンチセンス配列を含んで成るヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号３のフラグメント及び配列番号３の該フラグメントのアンチセンス配列を含んで成るヌクレオチド配列、
ｃ）組換えられた配列番号３及び該組換えられた配列番号３のアンチセンス配列を含んで成るヌクレオチド配列、及び
ｄ）組換えられた配列番号３のフラグメント及び該組換えられた配列番号３のフラグメントのアンチセンス配列を含んで成るヌクレオチド配列、
から成る群から選択される配列を含んで成る遺伝子的に組換えられたＴＧＢ−３ウイルス配列であって、
細胞中で転写されたときに、前記遺伝子的に組換えられたＴＧＢ−３ウイルス配列が、二重鎖の自己相補的なＲＮＡ分子を生成できることを特徴とする遺伝子的に組換えられたＴＧＢ−３ウイルス配列。
【請求項２】
センス及びアンチセンス配列が、１つの核酸配列に含まれる請求項１記載のＴＧＢ−３ウイルス配列。
【請求項３】
センス及びアンチセンス配列間に配置されたイントロンフラグメントを更に含んで成り、細胞中で転写されたときに、前記ＴＧＢ−３ウイルス配列が、ヘアピンＲＮＡ分子を形成できる請求項１又は２に記載のＴＧＢ−３ウイルス配列。
【請求項４】
イントロンフラグメントが、植物遺伝子から誘導される請求項３に記載のＴＧＢ−３ウイルス配列。
【請求項５】
植物遺伝子が、ビート遺伝子である請求項４記載のＴＧＢ−３ウイルス配列。
【請求項６】
イントロンフラグメントが、高度に転写された遺伝子である請求項３に記載のＴＧＢ−３ウイルス配列。
【請求項７】
高度に転写された遺伝子が、リボゾームＲＮＡ遺伝子である請求項６に記載のＴＧＢ−３ウイルス配列。
【請求項８】
高度に転写された遺伝子が、高度に転写されたサトウダイコン遺伝子である請求項６に記載のＴＧＢ−３ウイルス配列。
【請求項９】
前記組換えられた配列番号３配列中で、配列番号３配列の翻訳開始及び／又は停止コドンが組換えられて、翻訳を阻害するようにした請求項１〜８までのいずれか１項に記載のＴＧＢ−３ウイルス配列。
【請求項１０】
配列番号９又は配列番号１３を含んで成る請求項１〜９までのいずれか１項に記載のＴＧＢ−３ウイルス配列。
【請求項１１】
配列番号９又は配列番号１３から成る請求項１〜１０までのいずれか１項に記載のＴＧＢ−３ウイルス配列。
【請求項１２】
請求項１〜１１までのいずれか１項に記載の遺伝子的に組換えられたＴＧＢ−３ウイルス配列を含んで成ることを特徴とするベクター。
【請求項１３】
植物細胞中で活性な１又は２以上の調節塩基配列に結合した請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１２又は１３のベクターにより発現した二本鎖の自己相補的ＲＮＡ分子。
【請求項１５】
植物又は植物細胞中で活性な１又は２以上の調節塩基配列にリンクされた、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の遺伝子的に修飾したＴＧＢ−３ウイルス配列を含んで成る核酸構成物を生産する工程、及び
該核酸構成体で植物細胞を形質変換し、これにより植物又は植物細胞中のウイルスに対する抵抗力を与えることを含んで成る植物又は植物細胞中のウイルスに抵抗性を付与する工程を含んで成る方法。
【請求項１６】
ウイルスが、リンゴステムピッティングウイルス、ブリーベリースコーチウイルス、ジャガイモＭウイルス、ホワイトクローバーモザイクウイルス、シンビディウムモザイクウイルス、オオムギ班葉モザイクウイルス、ジャガイモモップトップウイルス、ピーナッツクランプウイルス、ビートソイルボーンウイルス及びＢＮＹＷウイルスから成る群から選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
植物又は植物細胞における全ＲＮＡ２、又はＴＧＢ−３移動蛋白質の転写後の遺伝子サイレンシングを起こすための方法であって、
植物又は植物細胞中で活性な１又は２以上の調節塩基配列にリンクされた、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の遺伝子的に修飾したＴＧＢ−３ウイルス配列を含んで成る核酸構成物を生産する工程、及び
該核酸構成物で植物細胞を形質変換し、これにより二重鎖ＲＮＡ分子を形成できるＲＮＡ分子の前記植物細胞中での発現が、転写後の遺伝子サイレンシングの機構を起こさせる工程を含んで成る方法。
【請求項１８】
植物細胞が、気孔細胞である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
植物が、リンゴ、ブルーベリー、ジャガイモ、クローバー、蘭、ピーナッツ及びサトウダイコンから成る群から選択される請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
形質変換された植物細胞から遺伝子導入植物を再生するようにした請求項１７から１９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
調節塩基配列が、植物中で活性なプロモータ配列又は終了配列を含んで成る請求項１７から２０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
プロモータ配列が、構造性配列又は外来配列である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
プロモータ配列が、３５Ｓカリフラワーモザイクウイルスプロモータ、及びポリユビキチン・シロイヌナズナ・プロモータ（polyubiquitin Arabidopsis thaliana promoter）から成る群から選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
プロモータ配列が、植物の根組織中で活性なプロモータである請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
プロモータ配列が、サトウダイコンの根組織中で活性なプロモータである請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
植物の根組織中で活性な前記プロモータが、ペロスポニア・アンデルソニー(Persponia andersonii)からのヘモグロビン遺伝子のパープロモータ(par promoter)である請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
植物又は植物細胞中で活性な１又は２以上の調節塩基配列にリンクされた、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の遺伝子的に修飾したＴＧＢ−３ウイルス配列を有する核酸構成物を含んで成り、更に請求項１２又は１３に記載のベクター、又は請求項１４に記載の二重鎖の自己相補的なＲＮＡ分子を含んで成るウイルス抵抗性の遺伝子組換え植物又は遺伝子組換え植物細胞。
【請求項２８】
ウイルスが、リンゴステムピッティングウイルス、ブリーベリースコーチウイルス、ジャガイモＭウイルス、ホワイトクローバーモザイクウイルス、シンビディウムモザイクウイルス、ジャガイモＸウイルス、オオムギ班葉モザイクウイルス、ジャガイモモップトップウイルス、ピーナッツクランプウイルス、ビートソイルボーンウイルス及びＢＮＹＷウイルスから成る群から選択される請求項２７に記載の遺伝子組換え植物又は遺伝子組換え植物細胞。
【請求項２９】
植物が、リンゴ、ブルーベリー、ジャガイモ、クローバー、蘭、ピーナッツ及びサトウダイコンから成る群から選択される請求項２７又は２８に記載の遺伝子組換え植物又は遺伝子組換え植物細胞。
【請求項３０】
調節塩基配列が、植物中で活性なプロモータ配列又は終了配列を含んで成る請求項２７から２９までのいずれか１項に記載の遺伝子組換え植物又は遺伝子組換え植物細胞。
【請求項３１】
プロモータが、植物の根組織中で活性である請求項３０に記載の遺伝子組換え植物。
【請求項３２】
前記プロモータが、ペロスポニア・アンデルソニー(Persponia andersonii)からのヘモグロビン遺伝子のパープロモータ(par promoter)である請求項３０又は３１に記載の遺伝子組換え植物。
【請求項３３】
前記遺伝子組換え植物がサトウダイコンで、遺伝子組換え植物細胞がサトウダイコン細胞である請求項２７から３２までのいずれか１項に記載の遺伝子組換え植物又は遺伝子組換え植物細胞。
【請求項３４】
調節塩基配列が、構成的配列又は外来配列である請求項２７から３３までのいずれか１項に記載の遺伝子組換え植物又は遺伝子組換え植物細胞。
【請求項３５】
プロモータが、３５Ｓカリフラワーモザイクウイルスプロモータ、及びポリユビキチン・シロイヌナズナ・プロモータから成る群から選択される請求項２７から３４までのいずれか１項に記載の遺伝子組換え植物又は遺伝子組換え植物細胞。
【請求項３６】
前記組織が、果実、茎、根、塊茎及び種から成る群から選択される請求項２７から３５までのいずれか１項に記載の遺伝子組換え植物細胞から誘導される遺伝子組換え植物組織。
【請求項３７】
再生可能な構造が、角質、芽又は胚から選択される請求項２７から３５までのいずれか１項に記載の遺伝子組換え植物細胞から得られる遺伝子組換え再生可能構造。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘアピンＤＮＡ構造と、植物中で転写後の遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を起こさせるためのその使用方法に関し、より詳細にはビート壊疽性葉脈黄化ウイルス（ＢＮＹＶＶ）のようなウイルスに対する抵抗や耐性が増大した植物を得る目的のサトウダイコンに関する。本発明は更に、例えばＢＮＹＶＶやその子孫に対して増大した抵抗を示す遺伝子組換え細胞及び植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
興味深い分野は、植物に、ウイルスに対する抵抗又は耐性を与えることである。穀物の収穫の多くがウイルス感染により失われることがある。
【０００３】
叢根病と呼ばれるサトウダイコンの広く広まったウイルス性疾患は、ビート壊疽性葉脈黄化ウイルス（ＢＮＹＶＶ）であるフロウイルス（非特許文献１及び２）によって起こり、これは土壌病原菌であるポリミクサ・ベーテ（Polymyxa Betae）によりサトウダイコンの根に伝染する（非特許文献３）。
【０００４】
この疾患は、サトウダイコンが農業として生育される欧州、米国及び日本、そして場合によっては東欧の幾つかの国まで広がり、広い農地に影響を与える（非特許文献４及び５）。
【０００５】
１９８６年から、多数の報告や刊行物が、特定の感染性ウイルスに対する高レベル耐性を与え、あるいは多数の関連ウイルスに対し幅広い範囲の型の耐性を与える、植物中で発現する単離されたウイルス性のヌクレオチド配列の使用を記述している（非特許文献６，７及び８）。じゃがいも、スカッシュ、かぼちゃ又はトマトのような多くの栽培種において、文献に見られる遺伝子工学に基づく多くのウイルス耐性戦略の１つは、植物調節要素のコントロール下で、対象ウイルスの外殻蛋白質をエンコードするウイルス性ヌクレオチド配列の使用である（非特許文献９）。
【０００６】
しかし外殻蛋白質が仲介する耐性でも、遺伝子組換え植物の耐性レベルの発現は、ＲＮＡ共抑制又は蛋白質配列の生成で始動する蛋白質仲介耐性のような異なった機構に起因する。
【０００７】
一般に、ウイルス配列は、与えられた種に成功裏に適用できる、組織培養又は細胞培養法の制約に従う、アグロバクテリウムが仲介する形質変換システム又は直接遺伝子導入法を使用して、植物種の好適な細胞又は組織培養で形質変換できる。植物全体が再生し、トランス遺伝子が特性化される。
【０００８】
サトウダイコンは、その種における実際的な遺伝子工学の用途の広がりを限定する、細胞培養では扱いにくい種として知られているが、現在では、植物全体を成功裏に形質変換しかつ再生させたことに関する多くのレポートが知られている（３８）。サトウダイコンゲノム中のＢＮＹＷ外殻蛋白質配列を形質変換し発現させることによりＢＮＹＷへの耐性を生じさせる数例も刊行されているが（非特許文献１１及び特許文献１）、これらは遺伝子組換えのサトウダイコンの全体のデータは殆ど開示していない（非特許文献１２）。特にＢＮＹＷ外殻蛋白質配列をエンコードする遺伝子で形質変換された遺伝子組換えサトウダイコンによる感染条件で観察される実際の抵抗のレベルに関するデータは殆ど提示されていない（非特許文献１３及び非特許文献１４）。
【０００９】
サトウダイコン形質変換法、及び該形質変換法で得られた遺伝子組換えサトウダイコン内に抵抗源としてＢＮＹＷ外殻蛋白質配列を発現させるための使用を含む完全な技術のパッケージが特許文献２に開示されている（特許文献１）。
【００１０】
公知文献からは、外殻蛋白質媒介抵抗機構が、ウイルス複製と拡散機構を完全に抑制することにより、サトウダイコンにＢＮＹＷ感染への全免疫を付与する能力を与えると結論付けられない。感染初期において、ウイルスの広がりを十分に阻止する抵抗機構を特定することは、遺伝子組換え抵抗力を育成することは成功の主要な基準である。更にこのような抵抗力は、利用できる抵抗力の機構を多様化する。
【００１１】
病気は、多数の国又は地域で、多くの局地的環境又は農業関係の因子の組み合わせに依存する速度で広がることが示されているので、産業上の利用が増えているサトウダイコンの現在及び将来の品種に関する長期間安定した抵抗性戦略を単独又は組み合わせで与える遺伝子的抵抗力の多様化及び改良に対する大きな興味が存在する。
【００１２】
ビートえそ性葉脈黄化ウイルス（BNYVV）のゲノムは、５種のプラスセンスＲＮＡから成り、そのうちの２種（ＲＮＡ１及び２）は全ての植物の感染に必須な機能をエンコードし、他の３種（ＲＮＡ３，４及び５）はサトウダイコン（Beta vulgaris）の根の、ベクターが媒介する感染に関連する。ＢＮＹＷの細胞から細胞への動きは、トリプル遺伝子ブロック（ＴＧＢ）として知られ、ウイルス蛋白質P42, P13 and P15をエンコードする３種の連続する、ＲＮＡ２上で僅かにオーバーラップするウイルス遺伝子により支配される（遺伝子生成物は、キロダインで計算された代謝速度で指定される）。
【００１３】
以下の説明では、ＴＧＢ遺伝子及び対応する蛋白質を、TGB-I, TGB-2, TGB-3又はそれらのエンコードされたウイルス蛋白質数P42, P13 and P15で特定する。ＴＧＢの対を成す他方は、フロウイルス、及びポテックスー、カルラー及びホルデリウイルス中に存在する（非特許文献１５，１８，１９，２０、２１及び２２）。表１は、ＴＧＢ−３配列を有するウイルス、それらのウイルスのＴＧＢ−３の分子量及び宿主及び参考文献を示す。
【００１４】
ＢＮＹＷ−ＲＮＡ３から誘導される「レプリコン」として知られるウイルス性ＲＮＡ複製種からＰ１５の独立発現は、細胞から細胞への動きを阻害することによりＢＮＹＷ感染が抑制することは前述した（非特許文献１６）。
【００１５】
ＴＧＢ−３核酸配列を有するウイルスを、植物細胞又は植物に導入するためには、該植物中で活性な１又は２以上の調節塩基配列に結合したＴＧＢ−３核酸配列を有する核酸構成物を組み入れることである（特許文献２）。
【００１６】
遺伝子導入植物中の野生型ＴＧＢ−３ウイルス配列は、該ウイルスの感染を阻止するが、前記野生型配列の存在は、形質変換された植物又は植物細胞の農業的な性質への悪影響を誘発することがある。本発明は、本発明で開示する（遺伝子的に組換えられた）突然変異したＴＧＢ−３ウイルス配列が、ＢＮＹＡＡ／抵抗性（サトウ）ダイコンの遺伝子工学に非常に有用であることの発見にある。
【特許文献１】国際特許公開公報第ＷＯ９１／１３１５９号
【特許文献２】国際特許公開公報第ＷＯ９８／０７８７５号
【非特許文献１】Ｔ．タマダ及びＴ．ババ、Annals of the Phytopathological Society of Japan 39, pp. 325-332  (1973)
【非特許文献２】Ｍ．クスザラ及びＣ．プッツ、 Annals of Phytopathology 9, pp. 435-446 (1977)
【非特許文献３】Ｂ．ケスキン、Archiv fur Mikrobiology 49, pp. 348-374 (1964)。
【非特許文献４】Ｍ．Ｊ．Ｃ．アッシャー、Rhizomania In The sugar beet crop, ed. D. A. Cooke and R. K. Scott, Chapman & Hall, London, pp. 312-338 (1993)。
【非特許文献５】Ｍ．リチャードーモラー、Rhizomanie In Institut francais de Ia betterave industrielle . Compte-rendu des travaux effectues en 1994, ITB, Paris pp. 225-229 (1995)
【非特許文献６】A. P.パウエルら、Science 232, pp. 738-743 (1986)
【非特許文献７】Ｊ．Ｈ．フリッチェン及びＲ．Ｎ．ビーキー、Ann. Rev. Microbiol . 47, pp. 739-763 (1993)
【非特許文献８】Ｔ．Ｍ．Ａ．ウィルソン、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, pp. 3134-3141 (1993)
【非特許文献９】Ｄ．ゴンサルベス及びＪ．Ｌ．スライトムSeminars in Virology 4, pp. 397-405 (1993)
【非特許文献１０】Ｋ．ダルインら、Biotechnology 10, pp. 309-314 (1992)
【非特許文献１１】Ｊ．カレンホフら、Plant Cell Reports 9, pp. 224-228 (1990)
【非特許文献１２】Ｕ．エラーズら、Theoretical and Applied Genetic 81, pp. 777-782 (1991)
【非特許文献１３】Ｊ．クラウスら、Field performance of transgenic sugar beet plants expresing BNYW coat protein plants, Fourth International Congress of Plant Molecular Biology, Int. Soc . for Plant Molecular Biology, Amsterdam (1994)
【非特許文献１４】Ｅ．マイスら、Proceedings of the Third International Symposium on the Biosafety Results of Field Tests of Genetically Modified Plants and Microorganisms,  Monterey, pp. 129-139 (1994)
【非特許文献１５】ギルマーら、Virology 189, pp. 40-47 (1992)
【非特許文献１６】グレイカステン−グロスハウスら、MoI. Plant-Microbe Interact. 10, pp. 240-246 (1997)
【非特許文献１７】ボゾバーら、J. Gen. Virol. 67, pp. 1689-1700  (1986)
【非特許文献１８】リチャーズ及びタラーダ、Annu.  Revendication. Phytopathol . 30, pp. 291-313 (1992)
【非特許文献１９】ボゾバーら、 J. Gen. Virol. 68, pp. 615-626 (1987)
【非特許文献２０】ヘルツォークら、J. Gen. Virol. 18, pp. 3147-3155 (1994)
【非特許文献２１】スコットら、J. Gen. Virol. 75, pp. 3561-3568 (1994)
【非特許文献２２】コーニン及びＡ．ドリ、Crit.Revendication. Biochem. and MoI. Biol. 28, pp. 375-430 (1993)
【非特許文献２３】ツッカー及びスティーグラー、Acids Res. 9, pp. 133-148 (1981)
【非特許文献２４】ヒギンス、Encyclopedia of Life Sciences, pp. 1-10 (2001)
【非特許文献２５】ラスカら、Biology of the Cell 96, pp. 579-594  (2004)
【非特許文献２６】タマダら、Proceeding of the 3rd symposium of the International Working Group on Plant Viruses with Fungal Vectors, American Society of Sugar Beet Technologists, Denver: p. 49 (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、植物細胞を遺伝子的に組換え又は形質変換することにより、植物、より具体的にはサトウダイコンに、例えばＢＮＹＷウイルス抵抗、好ましくは最高のＢＮＹＷウイルス耐性のようなウイルス抵抗を付与する信頼できる方法及び手段を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、このようにして得られ、ＢＮＹＷのような植物ウイルスに対して高い耐性又は抵抗を示す植物中で再生された、遺伝子的に組換え又は形質変換した植物細胞を提供することである。
【００１９】
本発明の更に他の目的は、このような組換え又は形質変換された植物又は植物細胞から得られる、ＢＮＹＷ抵抗性子孫のような抵抗性のある子孫、種及び他の再生できる器官や構造を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
細胞から細胞へ移動するＴＧＢ−3野生配列の機能は、少なくとも部分的に宿主植物の成分（プラスモデスムの要素であることが好ましい）とウイルス由来の成分（細胞から細胞へ移動する他のウイルス蛋白質であることが好ましい）間の相互作用を行うことを含むと考えられる。ＴＧＢ−3野生型配列のドメイン（宿主成分と相互作用を行うと推定される）とＴＧＢ−3野生型配列のドメイン（ウイルス成分と相互作用を行うと推定される）のいずれかが乱れると、細胞から細胞への移動が抑制される。
【００２１】
更に、ＴＧＢ−3野生型配列中のこのような特定の突然変異は、遺伝子組換え植物中での突然変異種の生産を可能にし、これは依然としてウイルス成分とは相互作用を行うが、宿主成分とは行わないと考えられる。これらの突然変異種は、ウイルス感染初期に生産されるＴＧＢ−3野生型配列のウイルス成分のサイトへ結合することを争い、隣接する細胞へのウイルスの移動を禁止することにより感染を中断させるのかもしれない。
【００２２】
前記配列中の少なくとも１個のアミノ酸を他の異なったアミノ酸で置換することは望ましく、その領域に、生来の構成である蛋白質の表面に通常存在する親水性アミノ酸が豊富に存在するようにする。
【００２３】
点突然変異は、１又は２以上のアミノ酸を１又は２以上の異なったアミノ酸中に置換できることが好ましい。
【００２４】
添付した表１には、ＴＧＢ−３野生型ウイルス配列、対応するＴＧＢ−３ペプチドの分子量、それらの宿主及び文献を記載してある。ＢＮＹＷの特定の野生型Ｐ１５ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列も既に述べられている（非特許文献１７、野生型配列が本文献に含まれている）。
【００２５】
前記点突然変異は、当業者に公知である。
【００２６】
点突然変異を含む前記突然変異種の有する、レプリコンからトランスに発現したウイルス突然変異種（正常に機能しないＴＧＢ−３配列を有する突然変異種、好ましくは正常に機能しないＰ１５遺伝子を有するＢＮＹＶＶ突然変異種）を細胞間移動させることの能力をテストした。これらの突然変異種は、このような移動を促進できなかった。そしてＴＧＢ−３配列、好ましくはＰ１５遺伝子の形態の突然変異種がレプリコンから発現したときに、共培養した野生型ＴＧＢ−３ウイルス、好ましくは野生型ＢＮＹＶＶで共培養したウイルスの感染を抑止する能力をテストした。
【００２７】
本発明者らは、本発明による遺伝子組換え方法（好ましくは点突然変異）が組換えＴＧＢ−３ウイルス配列（好ましくは組換えＢＮＹＷ−Ｐ１５配列）を得るために使用できることを予期せずに発見した。この方法は、植物又は植物細胞のゲノムに組み込まれると、悪影響を生じさせることなく、ウイルス感染を阻止できる。本発明の第１の態様は、それに関する。
【００２８】
「植物又は植物細胞へのウイルス感染を阻止できる」ということの意味は、組換えＴＧＢ−３ウイルス配列により形質変換された植物又は植物細胞により、前記ウイルス感染に対する高度の耐性が得られる可能性を得られることで、特に植物中へのウイルスの増殖及び分散機構を迅速かつ完全に阻止することを確実にする可能性で、好ましくは前記ＢＮＹＷ感染を受けやすい飼料ビート、スイス・チャード及びテ−ブル・ビートを含むサトウダイコン植物（ベータ・ブルガリス）にＢＮＹＷウイルスの増殖及び分散機構を阻止する可能性である。
【００２９】
前記耐性又は抵抗性は当業者により種々の方法で測定できる。
【００３０】
ＴＧＢ−３野生型ウイルス配列での遺伝子組換えは、ウイルスの細胞間移動の機構に含まれる前記野生型ウイルス配列の部分での点突然変異であることが好ましい。
【００３１】
本発明は、前記（組換え及び選択）方法により得られた（再生された）組換えＴＧＢ−３ウイルスのヌクレオチド及びアミノ酸配列にも関し、より詳細には前記方法により得られた（再生された）ＢＮＹＷ  Ｐ１５ 組換えヌクレオチド及びアミノ酸配列に関する。
【００３２】
前記ＢＮＹＷ  Ｐ１５ヌクレオチド及びアミノ酸配列は、次のヌクレオチド配列又は対応するアミノ酸配列から成る群から選択されることが好ましい。
【００３３】
【化１】
2009535046.tif 000003
【００３４】
【化２】
2009535046.tif 000004
【００３５】
【化３】
2009535046.tif 000005
【００３６】
以下の説明では、種々の組換えBNYW  ＴＧＢ−３配列を、配列番号１に対応するBNP１５-Ala１、配列番号３に対応するBNP１５-Ala４及び配列番号５に対応するBNP１５-Aｓｐ９で特定される「P15突然変異体」と呼ぶ。
【００３７】
配列番号１、配列番号３及び配列番号５のヌクレオチド及び対応数するアミノ酸配列は、既に非特許文献１７に開示されている野生型Ｐ１５ヌクレオチド及びアミノ酸配列の配列である配列番号７と比較できる。
【００３８】
本発明は、植物又は植物細胞中で活性な１又は２以上の調節塩基配列に結合できる前記組換えヌクレオチド配列又はそのフラグメントを含むベクターに関する。当該ベクターは、植物又は植物細胞中で活性な前記調節塩基配列を既に含むプラスミドであることが好ましい。ベクターは、植物のゲノム（この場合、組換えBNYW  ＴＧＢ−３配列又はそのフラグメント）に組み入れられたヌクレオチド配列のみから成る、カセットヌクレオチド配列であることもでき、これは依然として他の原核生物の又はプラスミドのヌクレオチド配列（欧州特許第１１７４５１３号参照）を実質的に含まない配列の効果的な発現を得るために十分な１又は２以上のプロモータ、末端ヌクレオチド配列及び調節塩基配列を付随している。
【００３９】
本発明は、ＴＧＢ−３配列、好ましくは表１に記載された１種のウイルス、より好ましくはＢＮＹＷウイルスを含んで成るウイルスに対する抵抗力を付与する方法にも関連し、当該方法は、次のステップを含んで成る。
−本発明方法で遺伝子組換えされた核酸配列、又はこのような組換え配列のフラグメントを含んで成り、植物又は植物細胞中で活性な１又は２以上の調節塩基配列にリンクされた核酸構成体を作製し、
−該植物細胞を前記核酸構成体で形質変換し、かつ
−必要であれば、形質変換された植物細胞から遺伝子組換え植物を再生する。
【００４０】
該方法は、サトウダイコン植物又はサトウダイコン細胞に、ＢＮＹＷ抵抗性を付与するために使用することが好ましい。該方法は、次のステップを含んで成る。
−本発明方法で得られる組換え核酸配列を含んで成る、又はこのような組換え配列を含んで成るフラグメントを含んで成る核酸構成体を作製し、好ましくは植物に活性な１又は２以上の調節塩基配列にリンクされかつ配列番号１、配列番号３及び配列番号５から成る群から選択される核酸配列を含んで成る核酸構成体を作製し、
―サトウダイコン植物を、前記核酸構成体で形質変換し、かつ
−必要であれば、形質変換されたサトウダイコン植物細胞から形質変換されたサトウダイコン植物を再生する。
【００４１】
本発明は、ＴＧＢ−３配列を含んで成るウイルスによる感染に抵抗性を有する、得られた（再生された）形質変換植物又は形質変換植物細胞にも関連し、好ましくは表１に記載された１種のウイルスであり、より好ましくはＢＮＹＷウイルスである。前記植物又は植物細胞は、該植物又は植物細胞に活性な１又は２以上の調節塩基配列にリンクされたＴＧＢ−３組換え核酸配列を有する核酸構成体を含んで成る。
【００４２】
前記組換え核酸配列は、植物又は植物細胞に活性な１又は２以上の調節塩基配列にリンクされた配列番号１、配列番号３及び配列番号５から成る群から選択されることが好ましい。
【００４３】
細胞は、植物に対して活性なプロモータ配列及び末端配列を含んで成る気孔細胞及び調節塩基配列である。該プロモータ配列は、本来存在するものであっても、外来的なプロモータ配列から得られるものでも良く、３５Ｓカリフラワーモザイクウイルスプロモータ、及びポリユビキチン・シロイヌナズナ・プロモータ成る群から選択されることが好ましい。
【００４４】
前記プロモータ配列は、主として特にサトウダイコンのような植物の根組織中で活性である、ペロスポニア・アンデルソニーからのパープロモータ又はヘモグロビン遺伝子のような根に特異的なプロモータである。
【００４５】
本発明の他の態様は、形質変換植物の果実、茎、根、塊茎及び種のような形質変換植物組織に、あるいは形質変換植物又は植物細胞から得られる再生可能な構造（角質、芽及び胚から成る群から選択されることが好ましい）に関連する。
【００４６】
本発明で使用する植物形質変換、組織培養及び再生の技術は、当業者に周知である。このような技術のうち好ましいものは、国際公開第WO95/101778, WO91/13159（ヨーロッパ特許出願EP-B-0517833に対応）、WO98/07875に開示され、本明細書でこれらを引用する。孔辺細胞のプロトプラストは、サトウダイコンの形質変換に好ましい組織である。
【００４７】
これらの技術は、本発明による形質変換サトウダイコン植物及び植物細胞の作製に好ましく使用される。
【００４８】
本発明の突然変異又は遺伝子組換えＴＧＢ−３（Ｐ１５）配列（配列番号１、３，５）で形質変換されたサトウダイコンの中に、バイオアッセイでＢＮＹＷに強く明らかな抵抗性を示す植物が発見され、これらの発見は現場試験で確認された。強いＢＮＹＷ抵抗性は、特に配列番号３で形質変換された植物で見られた。
【００４９】
突然変異Ｐ１５蛋白質の生産は、発現の誘因になると考えられる。ウエスタンブロット分析により、配列番号３で形質変換された高度に抵抗性を有する植物中での突然変異Ｐ１５蛋白質の発現は、大きく減少したが、依然として存在することが示された。これは得られたサイレンシング機構では各Ｐ１５ｍＲＮＡを分解するには不十分であることを示している。
【００５０】
ＰＴＧＳによるサイレンシングが行われていないＰ１５過剰生産した形質変換植物で生産されたＰ１５の量を、ＰＴＧＳ機構が活性な抵抗性植物で生産したＰ１５の量と比較した。
【００５１】
植物成分のより詳細な特性化によると、ＢＮＹＷ  ＴＧＢ−３（Ｐ１５）ＷＴ配列のセンス及びアンチセンスの両螺旋構造に相補的な小さいＲＮＡ分子の存在が示された。これらのセンス及びアンチセンスの小さいＲＮＡの存在は、転写後の遺伝子のサイレンシング（ＰＴＧＳ）で付与される抵抗性機構に関連していることは否定できないと考えられる。
【００５２】
ＢＮＹＷウイルスに感染した抵抗性植物のノーザンブロット分析により、感染しやすいコントロールと比較して、ＢＮＹＷ  ＲＮＡの不存在が確認された。抵抗性植物中で生じる小さいＰ１５ＲＮＡ分子の高度な相同依存性配列特異性に起因して、これらの転写体は、全ＲＮＡ２の分解プロセスを活性化する。
【００５３】
これらの植物では、遺伝子的構成体自身で開始されることなく、ＰＴＧＳ機構が生じ、恐らくこれらの挿入体の再配置から生じる。
【００５４】
本発明者らは、センス及びアンチセンスオリエンテーション中の本発明の突然変異ＴＧＢ−３（ｐ１５）配列を有するヘアピン構成体又はそのフラグメントは、効果的にＰＴＧＳを誘起し、例えばＢＮＹＷであるＲＮＡ２の分解をターゲットにすることを予期せずに発見した。特に配列番号３のＴＧＢ−３突然変異配列（例えば翻訳を抑止するため更に組換えが行割れていても良い）及びそのフラグメントや一部が、高度の再生条件下でＰＴＧＳを開始するために非常に有効であることが証明された。
【００５５】
本発明の他の態様は、これらの二重鎖自己相補ＲＮＡ分子、核酸構成体、特に植物細胞で発現するためのＤＮＡ構成体又はヌクレオチド配列、ベクター又は発現カセット、及びそれらに基づく方法及び使用に関する。
【００５６】
本発明は、ＴＧＢ−３移動蛋白質の発現を変化させる核酸構成体、特にＤＮＡ構成体を提供する。前記核酸構成体は、細胞中で、例えば（組換え）配列番号１、３又は５、又は（組換え）配列番号１、３又は５のフラグメント又は一部を有する突然変異ＢＮＹＷ  ＴＧＢ−３のセンスフラグメントを「発現」させられる第１のＤＮＡ配列と、前記細胞中で、（組換え）配列番号１、３又は５、又は（前記組換え）配列番号１、３又は５のフラグメント又は一部を有する前記突然変異ＢＮＹＷ  ＴＧＢ−３のアンチセンス配列を「発現」させられる第２のＤＮＡ配列を含んで成る。「発現」とは、基本的に「転写」又は「（ｍ）ＲＮＡフラグメントの生成」を意味する（次段参照）。転写の次には「翻訳」が続く。翻訳が抑止されることが好ましい。「（組換え）」とは、問題となっている配列が更に組換えされて、例えば翻訳が抑止されることを意味する。例えば「配列番号３」という用語は、配列番号自体だけでなく、配列番号１０のような「組換え」配列番号３配列も意味する。
【００５７】
本発明で提供されるのは、（組換え）配列番号３又はそのフラグメントの配列を含んで成り、更に前記（組換え）配列番号３のアンチセンス配列、又は前記（組換え）配列番号３フラグメントのアンチセンス配列を含んで成る遺伝子組換えＴＧＢ−３ウイルス配列であり、細胞中で転写されると、前記ＴＧＢ−３ウイルス配列は、二重鎖自己相補的ＲＮＡ分子を形成できる。例えば、（ａ）配列番号３及び配列番号３のアンチセンス配列を含んで成るヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号３のフラグメント及び該配列番号３のフラグメントのアンチセンス配列を含んで成るヌクレオチド配列、（ｃ）組換え配列番号３及び該組換え配列番号３のアンチセンス配列を含んで成るヌクレオチド配列、及び（ｄ）組換え配列番号３のフラグメント及び該組換え配列番号３フラグメントのアンチセンス配列を含んで成るヌクレオチド配列から成る群から選択される遺伝子組換えＴＧＢ−３ウイルス配列が提供され、細胞中で転写されると、前記遺伝子組換えＴＧＢ−３ウイルス配列は、二重鎖自己相補的ＲＮＡ分子を形成できる。
【００５８】
センス及びアンチセンス配列は、単一核酸配列、単一ＤＮＡ螺旋又は分子中に含まれることが好ましい。しかし２種の異なった核酸配列、ＤＮＡ螺旋又は分子中に含まれていても良く、これらは塩基対、又はこれにより二重鎖自己相補ＲＮＡ分子を形成できる。
【００５９】
転写されると、本発明の遺伝子組換えＴＧＢ−３ウイルス配列は、
１）少なくとも約１０の連続ヌクレオチド（ｎｔ）、好ましくは少なくとも１５又は２０、より好ましくは少なくとも５０，１００，１５０，２００，３００，３５０、あるいは更に好ましくは約４００の連続ヌクレオチド（ｎｔ）で、これらはｐ１５  ＢＮＷＴ  ＷＴ配列（配列番号７）の少なくとも一部と約７５から約１００％の配列同一性を有するセンスヌクレオチド配列（例えば（組替え）配列番号３又はそのフラグメントである）、及び
２）このセンスヌクレオチド配列に対して十分相補的であるアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列又は核酸配列を有するＲＮＡ分子を生成する。
発現した（転写されたが翻訳されていない）ＲＮＡ分子は、十分な量で発現（転写）したときは、センス及びアンチセンスヌクレオチド配列間の塩基対形成による二重鎖ＲＮＡステムを有する人工的なヘアピンＲＮＡ構造のような、二重鎖自己相補的ＲＮＡ分子を形成できる。「十分な量」とは、ＰＴＧＳ，好ましくは完全な遺伝子サイレンシングを起こさせるために十分な量を意味する。
【００６０】
本発明の自己相補的ヘアピン構成体は、突然変異（ＢＮＹＷ）ｐ１５ヘアピン構成体としても参照される。
【００６１】
センス及びアンチセンスヌクレオチド配列は互いに相補的であることが好ましい。相補領域におけるセンス及びアンチセンスＲＮＡフラグメント間のミスマッチは約５０％未満であることが望ましく、約３０％未満のミスマッチであることがより望ましく、約２０％未満のミスマッチであることが好ましく、約１０％未満のミスマッチであることがより好ましく、約５，４，３，２又は１％未満のミスマッチであることが更に好ましい。
【００６２】
センスヌクレオチド配列又はＤＮＡ配列の全長は、少なくとも約１０ｎｔ、１５ｎｔであることが好ましく、少なくとも約２０ｎｔ、２５ｎｔであることがより好ましく、少なくとも約５０ｎｔであることが望ましく、少なくとも約１００ｎｔであることがより好ましく、特に少なくとも約１５０ｎｔであり、より特定すれば少なくとも約２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔであり、更に特定すれば少なくとも約３５０ｎｔ又は４００ｎｔである。
【００６３】
センスヌクレオチド配列の全長が長くなるほど、全センスヌクレオチド配列（この場合、特に配列番号３又はそのフラグメントに対応する配列）と対象遺伝子中の対応配列（この場合例えばＢＮＹＷ  Ｐ１５  ＷＴ配列）間の配列同一性に関する要求の厳格さは少なくなる。好ましくは、センスヌクレオチド配列は、その全長に亘って、ＢＮＹＷ  Ｐ１５  ＷＴ配列に対して少なくとも約７５％、特に少なくとも約８０％、更に少なくとも約８５％、更に少なくとも約９０％、更に少なくとも約９５％、更に少なくとも約９９％あるいはそれ以上（１００％未満が好ましい）の配列同一性を有するべきである。好ましい突然変異ＴＧＢ−３配列、ｐ１５ala４（配列番号３）は、ＷＴｐ１５と比較して３個の突然変異塩基を有し、これは９９．２４％の類似性又は配列同一性に対応する。本発明の他の好ましい配列である配列番号１０は、ＷＴｐ１５と比較して５個の突然変異塩基を有し、これは９８．７４％の類似性又は配列同一性に対応する（図８参照）。
【００６４】
センスヌクレオチド配列は、常に、対象核酸（この場合は、ＢＮＹＷ  ＷＴ  Ｐ１５配列）の対応する部分に対して、１００％の配列同一性を有する、約１０の連続したヌクレオチド、特に約２０のｎｔ、更に約５０のｎｔ、更には約１００のｎｔ、特に約１５０ｎｔを含むことが好ましい。配列同一性の計算及び対応するセンスヌクレオチド配列のデザインのためには、特に短いセンスヌクレオチド配列の場合、ギャップ数を最小にすることが好ましい。
【００６５】
組換えセンスＴＧＢ−３配列は、ＷＴ（野生型）Ｐ１５配列と比較して、次の組換えを含むことが好ましい。ＷＴ  Ｐ１５遺伝子は、核酸位置３で突然変異を受け、ＧがＣで置換され、他の具体的な置換は、核酸位置１５８で突然変異を受け、ＡがＣで置換され、更に他の具体的な置換は、位置１６０及び１６１の突然変異で、ＡＧがＧＣで置換されている。又付加的な突然変異が位置３９７で起こり、ＴがＣで置換される（配列番号１０、図８参照）。このような位置３での組換えは翻訳開始を抑止し、位置３９７での組換えは、翻訳停止信号を発生させない。本発明の他の好ましい組換えセンスＴＧＢ−３配列は、ＷＴｐ１５遺伝子と比較して、次の組換えを含む配列番号３である。核酸位置１５８における突然変異で、ＡがＣで置換されている。更に具体的な置換として、位置１６０及び１６１の突然変異があり、ＡＧがＧＣで置換されている。
【００６６】
アンチセンスヌクレオチド配列の長さは、ほぼセンスヌクレオチド配列の長さで決定され、センスヌクレオチド配列の長さに対応することが好ましい。しかしセンスヌクレオチド配列と、長さが約１０％から約５０％、好ましくは約１０％から約１５％異なったアンチセンス配列を使用することも可能である。
【００６７】
同様に、アンチセンス領域のヌクレオチド配列は、センス領域のヌクレオチド配列によりほぼ決定され、センス領域のヌクレオチド配列の相補体と同一であることが好ましい。しかし特にアンチセンス領域が長くなると、センスヌクレオチド配列の相補体に対して配列同一性が小さいアンチセンス配列、好ましくはセンス領域のヌクレオチド配列の相補体に対して少なくとも約７５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の配列同一性、特に好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、更に好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、更に好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するアンチセンス配列を使用することが可能になる。
【００６８】
それにもかかわらず、アンチセンスヌクレオチド配列は、センスヌクレオチド配列の対応部分の相補体に１００％の配列同一性を有する約１０又は約１５の連続ヌクレオチド（ｎｔ）、好ましくは約２０ｎｔ、より好ましくは約５０ｎｔ、更に好ましくは約１００ｎｔ、より好ましくは１５０ｎｔの配列を常に含むことが好ましい。センスヌクレオチド配列の相補体に対し１００％の配列同一性を有する連続ヌクレオチドの長さは、センスヌクレオチド配列自身より長くなれないことは明らかである。再度いうと、ギャップ数は、特に短いアンチセンス配列について、最小化すべきである。アンチセンス配列は、対象配列の相補体に対して約７５％から１００％の配列同一性を有することも好ましい。
【００６９】
本発明のヌクレオチド配列又はＤＮＡ構成体中のセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列の順序は重要でないと考えられる。
【００７０】
本発明の組換えＴＧＢ−３ウイルス配列中のセンス及びアンチセンス配列は、好ましくはイントロンであるリンカー又はスペーサーヌクレオチドで分離されていることが好ましい。このイントロンは植物イントロンであることが好ましく、サトウダイコンイントロンであることがより好ましい。高度に転写された遺伝子の使用が好ましく、高度に転写されたサトウダイコン遺伝子の使用が更に好ましい。好ましい高度に転写された遺伝子は、リボゾ−ムＲＮＡ遺伝子である（非特許文献２４及び２５）。
【００７１】
本発明の遺伝子組換えＴＧＢ−３配列中のセンスＴＧＢ−３フラグメントは、（組換え）配列番号１、３又は５、又はそれらの部分又はフラグメントを含んで成ることが好ましい。例えば本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列は、（組替え）配列番号１，３又は５の少なくともｎｔ１００からｎｔ３９９、ｎｔ１５０からｎｔ３９９又はｎｔ１６３からｎｔ３９９を含んでいても良い。
【００７２】
本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３配列中のセンスＴＧＢフラグメントは、（組替え）配列番号３又はその部分又はフラグメントであることが最も好ましい。例えば本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列は、（組替え）配列番号３の少なくともｎｔ１００からｎｔ３９９、ｎｔ１５０からｎｔ３９９又はｎｔ１６３からｎｔ３９９を含むことができる。本発明のセンスＴＧＢ−３フラグメントは、（組替え）配列番号３又はその部分（フラグメント）、例えば（組替え）配列番号３の少なくともｎｔ１００からｎｔ３９９、ｎｔ１５０からｎｔ３９９又はｎｔ１６３からｎｔ３９９から成っていることが更に好ましい。
【００７３】
本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３配列中のセンスＴＧＢ−３フラグメントは、更に突然変異を受けて、翻訳抑止の目的で、少なくとも１つの翻訳停止コドンを含むことが好都合である。本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３配列中の前記センスＴＧＢ−３フラグメントの翻訳停止コドンは、壊されることが好都合である。翻訳開始コドンは翻訳開始を抑制するために組替えられても良い。配列番号３のＡＴＧ開始コドンは、例えばＡＴＣに組替えられ、ＴＡＡ停止コドンはＣＡＡに組替えられた（図８参照）。この特別な配列は、「組替え」配列番号３とされる。当業者は、他の多くの可能性を考慮できるであろう。
【００７４】
本発明の好ましい構成体は、本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列中のセンスＴＧＢ−３フラグメントが配列番号１０を含んで成るＤＮＡ構成体又はヌクレオチド配列である。より好ましいのは、本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３配列中のセンスＴＧＢ−３フラグメントが配列番号１０から成るＤＮＡ構成体である。
【００７５】
本発明の好ましい遺伝子組替えＴＧＢ−３配列は、配列番号９又は１３を含んで成る。より好ましいのは、配列番号９又は１３から成る遺伝子組替えＴＧＢ−３配列である。
【００７６】
本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列は、根で活性なプロモータ、好ましくは異種（heterologous）プロモータにリンクしていることが好都合である。植物の根組織で活性な好ましいプロモータ配列はペロスポニア・アンデルソニーからのパープロモータ及びヘモグロビン遺伝子である。最も好ましいのは、サトウダイコン植物の根で活性なサトウダイコン特異性のプロモータである。転写ターミネーション及び／又はポリアデニレーション又は他の調節塩基配列（例えば転写を促進する配列）に含まれるＤＮＡ領域は、本発明のＤＮＡ構成体にリンクしていても良い。 
【００７７】
本発明は、更に１又は２以上の調節塩基配列にリンクされた、本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３配列を含んで成る、ベクター、特に発現ベクター又は発現カセットに関する。
【００７８】
本発明は、本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３配列、又は本発明のベクター又は発現カセットにより発現された二重鎖自己相補的ＲＮＡ分子に関する。
【００７９】
本発明の他の態様は、本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３配列及び／又は本発明のベクター及び／又は本発明のＲＮＡ分子で形質変換された宿主細胞に関する。宿主細胞は、植物細胞であることが好ましく、ビート細胞であることがより好ましく、サトウダイコン細胞であることが最も好ましい。
【００８０】
本発明は更に、そのゲノムに、ＤＮＡ構成体及び／又は本発明のベクターを含んで成り、及び／又はその細胞に、本発明のＲＮＡ分子を含んで成る、形質変換された植物、より好ましくは形質変換されたビート植物、最も好ましくはサトウダイコン植物に関する。
【００８１】
本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列を含んで成るＤＮＡ構成体、及び／又は同じ物を含んで成るベクターを使用して植物細胞及び／又は植物組織のような植物材質を形質変換することが好ましい。本発明の組替えＴＧＢ−３配列を（植物）細胞のゲノムに安定して組み入れることが好ましい。それはエピゾームの形態で存在していても良い。
【００８２】
このように、本発明は、本発明のＤＮＡ構成体及び／又はベクター及び／又はＲＮＡ分子を含んで成る形質変換され又は遺伝子組替えされた植物細胞に関する。ＢＮＹＷ抵抗性又は耐性を付与するために、本発明のＲＮＡ分子自身を使用することも可能である（下記参照）。
【００８３】
本発明の他の態様は、遺伝子導入植物に関し、好ましくは宿主細胞から再生されたサトウダイコン植物、好ましくは本発明のＤＮＡ構成体、ベクター及び／又はＲＮＡ分子で形質変換され更にＴＧＢ−３移動蛋白質の変化した発現を示す植物細胞である。(BNYW) TGB- 3 (pl5)分子の発現は、コントロール（形質変換しない、又は本発明のｐ１５ヘアピン構成体で形質変換しない）と比較して大きく減少することが好ましい。
【００８４】
ＢＮＹＷｐ１５の発現が（強く）減少する例を示す。本発明によるｐ１５ヘアピンＲＮＡ分子の存在下のＢＮＹＷｐ１５の発現は、それが存在しない場合より低くならなければならず、これは、本発明のｐ１５ヘアピンＲＮＡ分子又はそれをエンコードする遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列が存在しない場合の発現の約２５％のみであることが好ましく、約１０％のみであることがより好ましく、約５％のみであることが更に好ましい。
【００８５】
ＢＮＹＷｐ１５の発現が、最早それが検出できないレベルにまで減少することが好都合である。ｐ１５蛋白質の存在は、ｐ１５抗体を使用するウエスタンブロット分析により検出できる。その代わりに、この蛋白質のレベルは、周知のマスースペクトルにより決定できる。ｐ１５蛋白質又はその部分が生成しないことが最も好ましく、これはその全てのｍＲＮＡが分解したか、少なくとも不活性化したことを意味する。ウイルスからのｐ１５ＷＴ遺伝子発現は、本発明の方法や手段により形質変換された植物細胞や植物中で起こらないことが好都合である。
【００８６】
本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列、ＤＮＡ構成体、ベクター又はＲＮＡ分子で形質変換された植物又は植物細胞中で、ウイルス複製が起こらないことが好都合である。
【００８７】
本発明の他の態様は、本発明の形質変換植物の子孫に関し、これは、少なくともその細胞の一部のゲノム中に、本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列及び／又はベクターを含んで成り、及び／又はその細胞の少なくとも一部に本発明のＲＮＡ分子を含んで成る。この材質（組替えウイルス配列、ベクター及び／又はＲＮＡ分子）は実質的に全ての植物細胞中に存在することが好ましい。本発明の形質変換植物の子孫は、（ＢＮＹＷ）ＴＧＢ−３移動蛋白質の変わられた発現を示すことが好都合である。同じ理論が、表１に挙げた各ウイルスに適用できるが、ここで述べたＰ１５配列は、ＢＮＹＷウイルスのみをターゲットにする。子孫の例は、果実、茎、根、塊茎及び種のような組織である。
【００８８】
本発明の他の態様は、好ましくは本発明による形質変換されたサトウダイコン植物である、形質変換された植物の種に関する。
【００８９】
本発明は、本発明の形質変換植物から得られる、角質、芽又は胚のような（植物に関する）再生可能な構造に関する。
【００９０】
この子孫、種、再生可能な構造等は、その細胞の少なくとも一部、好ましくはその細胞の実質的に全てにおけるゲノム中で、遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列及び／又は本発明のベクター及び／又は本発明のＲＮＡ分子を含んで成ることが好都合である。これらの植物材質は、ＢＮＹＷ抵抗性植物又は植物材質中で再生されると好都合である。
【００９１】
本発明の他の態様は、植物から再生できる、このような種や植物的に再生できる構造の使用方法に関し、これは、例えばＢＮＹＷに対する抵抗性があるか、及び／又はＢＮＹＷに対して十分に大きな耐性を示すサトウダイコン植物であることが好ましい。
【００９２】
本発明の他の態様は、ＲＮＡ２全て、特に植物又は植物細胞中の（ＢＮＹＷ）ＴＧＢ−３移動蛋白質の発現を変える方法に関し、該方法は、
−好ましくはサトウダイコン植物である植物の細胞中に、遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列（ＤＮＡ構成体）及び／又は同じ物を含んで成るベクターを導入して形質変換された植物細胞を得ることを含んで成り、
二重鎖ＲＮＡ分子を形成できるＲＮＡ分子の前記植物細胞中での発現が、前記植物又は植物細胞中のＲＮＡ２の全て、及び特に（ＢＮＹＷ）ＴＧＢ−３移動蛋白質の発現を変え、更に前記植物又は植物細胞中の同じＲＮＡ上に位置する他のウイルス蛋白質の発現を変えられれば好都合である。
【００９３】
本発明の他の態様は、植物又は植物細胞における全ＲＮＡ２、又は（ＢＮＹＷ）ＴＧＢ−３移動蛋白質の転写後の遺伝子サイレンシングを起こすための方法に関し、該方法は、
−植物、好ましくはサトウダイコン植物の細胞中に、遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列（ＤＮＡ構成体）及び／又は本発明の同じ成分を含んで成るベクターを導入して形質変換された植物細胞を得ることを含んで成り、二重鎖ＲＮＡ分子を形成できるＲＮＡ分子の前記植物細胞中での発現が、転写後の遺伝子サイレンシングの機構を開始する。
【００９４】
前述の本発明方法では、ＲＮＡ２全てが分解することが好ましい。
【００９５】
本発明の更に他の態様は、植物又は植物細胞を、表１に列挙された植物ウイルス、例えばＢＮＹＷに対して抵抗性又はより以上の耐性を有するようにするための方法に関し、該方法は、好ましくはサトウダイコンである植物の細胞中に、遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列（ＤＮＡ構成体）及び／又は本発明の同じ成分を含んで成るベクターを導入して形質変換された植物細胞を得ることを含んで成り、二重鎖ＲＮＡ分子を形成できるＲＮＡ分子の前記植物細胞中での発現が、例えばＢＮＹＷである植物ウイルスに対する前記植物の抵抗性及び／又は耐性増加の要因となる。
【００９６】
本発明の更に他の態様は、植物又は植物細胞中で非常に大きな抵抗性（高レベルの免疫）を付与する方法に関し、該方法は、好ましくはサトウダイコンである植物の細胞中に、遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列（ＤＮＡ構成体）及び／又は本発明の同じ成分を含んで成るベクターを導入して形質変換された植物細胞を得ることを含んで成り、二重鎖ＲＮＡ分子を形成できるＲＮＡ分子の前記植物細胞中での発現が、少なくとも一部の、好ましくは実質的に全ての細胞中で、本発明のＤＮＡ構成体及び／又はベクターを含んで成る植物中で、非常に大きな抵抗性（高レベルの免疫）を付与できる。
【００９７】
本発明の更に他の態様は、植物中で、ウイルス（好ましくはＢＮＹＷのような表１記載のもの）の拡散を（非常に強く）減少させるか阻止する方法に関し、該方法は、好ましくはサトウダイコンである植物の細胞中に、遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列（ＤＮＡ構成体）及び／又は本発明の同じ成分を含んで成るベクターを導入して形質変換された植物細胞を得ることを含んで成り、二重鎖ＲＮＡ分子を形成できるＲＮＡ分子の前記植物細胞中での発現が、このように形質変換した植物又は植物細胞内のウイルスの拡散を減少又は阻止できる。ウイルスの拡散は、ウイルス繁殖（全ての又はある種の細胞のタイプ）、植物全体に亘るウイルスの移送（例えば長距離移送や細胞間移動を阻止する）を減少／阻止し、又はウイルスのある種の細胞 (血管の柔組織（parenchyma）)で、師管細胞でない) への拡散のみを制限することにより、減少／阻止できる。ウイルスの拡散は、本発明によるｐ１５ヘアピン構成体で形質変換された植物の根の中で、ＯＤ405値で０．２以下となるように減少／阻止すると好都合である。この値は最大０．１であるとより好都合である。このＯＤ405値は、最大０．０５、最大０．０１、あるいはゼロに近づく（検出限界未満）ことが最も好都合である。
【００９８】
その代わりに、ＢＮＹＷ  ＴＧＢ−３移動蛋白質の発現を変え、ＴＧＢ−３移動蛋白質の転写後遺伝子サイレンシングを起こし、植物又は植物細胞をＢＮＹＷに抵抗性又はより大きな耐性を有するようにする目的で、又は植物又は植物細胞中で十分に大きな抵抗性を与える目的で、又は植物中でウイルスが拡散するのを阻止し又は減少させる目的で、本発明のＲＮＡ分子を、植物細胞に導入しても良い。
【００９９】
本発明方法は、更に形質変換植物細胞から遺伝子導入植物を再生するステップを含んでいても良い。
【０１００】
本発明方法は、好適な構成体を作製し、それを使用して植物（細胞）を形質変換し、上記効果の１つに達するステップを含んでいても良い（段落３９参照）。
【０１０１】
本発明で形質変換された植物は、天然産のもの（周知の）のウイルスに対する耐性／抵抗性（周知のリザー（Rizor）、ホリー（Holly）又はベータ、マリチナ（maritima）亜種、 マリチ・アクセション（accession） WB42抵抗性源）と比較して、より高レベルのＢＮＹＷへの抵抗性を与えることが発見された。
【０１０２】
本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３配列による植物の形質変換、好ましくはヘアピン構造を形成できる形質変換は、根システムを通してウイルスの拡散を阻止し及び／又は大きく減少させられると考えられる。これによりウイルスが、長距離トランスロケーションシステムに到達することが防止されることが好都合である。本発明の植物形質変換が、表層におけるウイルス繁殖を防止し及び／又は大きく減少できると好都合である。本発明方法は、好都合なことにウイルスが土壌中で感染力を維持する能力を減少させることができる。
【０１０３】
本発明の病原菌由来抵抗性は、天然産に存在するものと異なると考えられる。病原菌由来抵抗性は、天然の抵抗性機構と組み合わせると好都合である。
【０１０４】
異なった抵抗性源（天然及び病原体由来）の組み合わせは、地下茎抵抗性種に大きな安定性を与え、かつ１又は２以上の病原型（少なくとも１つの病原型）に長期間抵抗性の確保を補助できることが好都合である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０５】
図１は、９１ｂｐのイントロン配列（太線及び下線、配列番号１１）が介在する、センス突然変異ｐ１５ヌクレオチド配列（配列番号１０、太線及び下線のＷＴと比較して組替えられている）及びアンチセンスｐ１５ヌクレオチド配列（太線でイタリック体、配列番号１２）を有する本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列を示す（図１ａ及びｂ、配列番号９）。図１ｂのいくつかのヌクレオチドはイタリックで示してある（二重下線）。これらはｐ１５にもイントロンにも属さないが、制限サイトを囲むクローニングのための残部として存在する。配列番号９を含んで成る構成体は、ｈｐ１５構成体２としても参照される。
【０１０６】
図２は、５５０ｂｐのイントロン配列（太線及び下線、配列番号１４）が介在する、センス突然変異ｐ１５ヌクレオチド配列及びアンチセンスｐ１５ヌクレオチド配列（太線でイタリック体）を有する本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列を示す（図２ａ及びｂ、配列番号１３）。図２ｂのいくつかのヌクレオチドはイタリックで示してある（二重下線）。これらはｐ１５にもイントロンにも属さないが、制限サイトを囲むクローニングのための残部として存在する。センス及びアンチセンスｐ１５ヌクレオチド配列は、図１Ｂのものと同一である。配列番号１３を含んで成る構成体は、ｈｐ１５構成体３としても参照される。
【０１０７】
図３は、ＷＴｐ１５配列（配列番号７及び８）を示す。
【０１０８】
図４は、ペチュニア（petunia）のチャルコン・シンサーゼ（Chalcone Synthase） A遺伝子の遺伝子配列が介在し、ＢＮｐ１５−ａｌａ遺伝子がセンス及びアンチセンス方向に導入されたｐＦＧＣ５９４１ベクターの概略図である。ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ：ＣａＭＶのプロモータ３５Ｓ。ＯＣＳ３：オクトピン・シンターゼ（mannopine synthase）遺伝子のポリアデニレーション信号。ＭＡＳ３：マンノピン・シンターゼ（octopine synthase）遺伝子のポリアデニレーション信号。ＢＡＲ：バスタ・ヘルビシド・レジスタンス（Basta herbicide resistance）遺伝子。Ｋｍ：カナマイシン・レジスタンス（Ｋａｎａｍｙｃｉｎｅ resistance）遺伝子。ＲＢ，ＬＢ：左右のｔ−ＤＮＡボーダー。
【０１０９】
図５は、５５０ｎｔ（図５Ａ、ｐＳ１４０、構成体３）及び９１ｎｔ（図５Ｂ、ｐＳ１４０、構成体３）が介在し、ＢＮｐ１５−ａｌａ遺伝子がセンス及びアンチセンス方向に導入されたｐＳ１４０及びｐＳ１４２ベクターのそれぞれの概略図である。ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ：ＣａＭＶのプロモータ３５Ｓ。ＮＯＳ３’：ノパリン・シンターゼ・シンターゼ・ターミネーター（nopaline synthase  terminator）。ＫＡＮ：カンマイシン・レジスタンス遺伝子。ＲＢ，ＬＢ：左右のｔ−ＤＮＡボーダー。 
【０１１０】
図６は、構成体１（ペチュ・リイア（petu.riia）・イントロン）で得られたＰＴＧＳデータの統計分析である。各ヒストグラムは、感染した葉の組織障害の数（Ｙ）とサイズ（−Ｙ）を表している。「／」は損傷がなかった。「ｖ」はウイルスＳｔｌ２３４。「ｔｐ」はバッファ。「ｈｐ」はヘアピン。Ｙ軸は、１．１０、２０、３０、１００。Ｙ軸は４。Ｘ軸は左から右に、ｖ、ｖ＋ＭＡバッファ、ｖ＋ｈｐＧＦ，ｖ＋ｈｐ１５。
【０１１１】
図７は、構成体１、２及び３で得られたＰＴＧＳデータの統計分析である。各ヒストグラムは、感染した葉の損傷の数（Ｙ）とサイズ（−Ｙ）を表している。「／」は損傷がなかった。「ｖ」はｖ±：ｒｕ.ｓＳＴ１２３４。「ｔｐ」はバッファ。「ｈｐ」はヘアピン。「−ｈｐ１５」は構成体１。「ｐＳ１４０」は構成体３。「ｐＳ１４２」は構成体２。Ｙ軸は、１．１０、２０、３０、４０。Ｙ軸は４。Ｘ軸は左から右に、ｖ、ｖ＋ＭＡバッファ、―ｖ＋ｈｐＧＦ，ｖ＋ｈｐ１５（構成体１）、．v + ｐＳ１４０ (構成体 3 ) ;ｖ+ ｐＳ１４２ (構成体２)。
【０１１２】
図８は、配列番号７で表されるＷＴｐ１５ＢＮＹＷ配列と同等の配列番号１０における差異を強調した図である。
【０１１３】
図９は、ＢＮＹＷ感染した土壌で成長した植物の根のウイルスの存在確認手段としてのＥＬＩＳＡテストの結果を示す。バイオテストＲｚ２００７−００１Ａ。ＴＨＰＲ：ＰＥＧ情報。
【０１１４】
図１０は、ＢＮＹＷ感染した土壌で成長した植物の根のウイルスの存在確認手段としてのＥＬＩＳＡテストの結果を示す。バイオテストＲｚ２００７−００１Ａ。ＴＨＰＲ：ＰＥＧ情報。ＡｇＨＰ：アグロバクテリウム（Agrohacterlum）情報。
【０１１５】
図１１は、ＰＥＧ直接遺伝子形質変換実験で使用するｐＳ１３８ベクターを表す。
【０１１６】
図１２は、アグロバクテリウムが仲介する形質変換のために使用するｐＳ１４３ベクターを表す。
【０１１７】
本発明の態様では、センス及びアンチセンス組替えＴＧＢ−３ヌクレオチド配列は１つの分子に含まれることが好ましく、つまりセンス突然変異ＴＧＢ−３ＲＮＡフラグメント及びアンチセンス突然変異ＴＧＢ−３ＲＮＡフラグメントが単一のＲＮＡ分子に含まれることが好ましいことを意味する。本発明のＲＮＡ分子は折りたたまれて、二重鎖ヘアピンＲＮＡ分子を構成すると好都合である。
【０１１８】
本明細書で使用する「ヘアピンＲＮＡ」は、任意の自己強化二重鎖ＲＮＡ分子を意味する。最も簡単な例では、ヘアピンＲＮＡは、単一鎖ＲＮＡループで接続された強化ＲＮＡ鎖で形成された二重鎖から成り、「パン−ハンドルＲＮＡ」とも呼ばれる。しかし「ヘアピンＲＮＡ」という用語は、自己強化二重鎖ＲＮＡ配列だけでなく、内部突起やロープを含むより複雑な二次ＲＮＡ構造にも及ぶ。具体的な二次構造は、ＲＮＡ分子の自由エネルギーにより決定され、ＦＯＬＤＲＮＡのような適切なソフトウエアを使用して異なった状況に関して予測できる（非特許文献２３）。
【０１１９】
その代わりに、センス及びアンチセンス組替えＴＧＢ−３ヌクレオチド配列は、同時及び／又は連続的に、そして好ましくは第１及び第２のヌクレオチド配列の提供の間に長い時間が経過しないようにして植物細胞に供給される、２個の別個の分子又はヌクレオチド配列に存在していても良く、これにより、転写されたときに、塩基対形成により二重鎖ＲＮＡ分子が生成できる。
【０１２０】
本発明のＤＮＡ配列は、本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列及び／又はおなじ構成のベクターとともに、転写されている植物細胞のゲノム中に安定して取り入れられることが好ましい。
【０１２１】
その代わりに、本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列を含んで成る導入遺伝子は、エピソームや自己複製ベクターに存在しても良い。自己複製ベクターの例は、ウイルス、特にジェミニウイルスである。
【０１２２】
本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列は、直接プラスミドゲノム中に形質変換されても良い。プラスミド形質変換技術は、米国特許明細書第5,451,513、5,545,817及び 5,545,818号、国際特許公開公報第WO 95/16783号、及びマクブライドらの(1994) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305頁に開示されている。葉緑体形質変換の基本技術は、例えばバイオリスティック又は原形質形質変換（例えば塩化カルシウム又はＰＥＧで行われる形質変換）を使用して、適切な対象組織中へ、対象とするヌクレオチド配列とともに、選択できるマーカーを配置したクローン化プラスミドＤＮＡの領域を導入することを含む。１から１．５ｋｂの配置領域は、プラスミドゲノムとの均一系再結合を容易にし、従ってプラストーム（葉緑体ゲノム）の特定の領域の置換又は組替えを可能にする。
【０１２３】
植物の形質変換及び再生方法は周知である。例えばＴｉプラスミドベクターは、直接ＤＮＡ取り入れ、リポソーム、エレクトロポレーション、
微小注入及び微小発射に利用されている。更にアグロバクテリウム族のバクテリアを植物細胞の形質変換に利用できる。
【０１２４】
植物の形質変換に利用される多くの形質変換ベクターが当業者に周知であり、本発明のＤＮＡ又はヌクレオチド構成体（遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列を含んで成る）をそのようなベクターに関連させて使用できる。ベクター選択は、好ましい形質変換技術に応じて行う。
【０１２５】
形質変換で汎用される選択マーカーは、カナマイシン及び関連する抗体に抵抗性を与えるnptil遺伝子(メッシング及びビーラ、 Gene 19: 259-268 (1982)及びベバンら、Nature '304: 184-187 (1983))、ヘルビシド・ホスフィノスリシン（herbicide phosphinothricin）に抵抗性を与えるバー遺伝子(ホワイトら、Nucl. Acids Res. 18: 1062 (1990)及びスペンサーら、Theor. Appl. Genet 79: 625-631 (1990) )、抗体ハイグロマイシン（hygromycin）に抵抗性を与えるｈｐｈ遺伝子(ブロチンガー及びディッゲルマン、 MoI Cell Biol 4: 2929-2931)、メタトレキセート（methatrexate）に抵抗性を与えるｄｈｆｒ遺伝子(ブレーら、EMBO J. 2 (7) : 1099-1104 (1983))、グリホセート（glyphosate）に抵抗性を与えるＥＰＳＰＳ遺伝子（米国特許明細書第4,940,935 及び5,188,642号）、ジェンタマイシン（gentamycin）への抵抗性をエンコードするaac(秉och')遺伝子（国際特許公開公報第WO94/01560号）、又は周知のpat及び imi遺伝子を含む。
【０１２６】
アグロバクテリウム・チューメファシアン（tumefaciens）を使用する植物細胞の形質変換又は遺伝子組替えに多くのベクターを利用できる。これらのベクターは多くの場合少なくとも１個のＴ−ＤＮＡボーダー配列を有し、pBIN19のようなベクターを含む (ベバン、Nucl. Acids Res. (1984))。アグロバクテリウム形質変換に適したベクターは、バイナリベクターpCIB200及びpCIB2001と、バイナリベクターpCIBlO及びそれらのハイグロマイシン選択誘導体を含む（例えば米国特許明細書第5,639,949号参照）。植物の形質変換にアグロバクテリウム・チューメファシアンを使用する利点は、他の技術と比較して、コピー数が少なく、最小の再配置ですむことである。
【０１２７】
アグロバクテリウム・チューメファシアンを使用しない形質変換は、選ばれた形質変換ベクター中のＴ−ＤＮＡ配列のための要件を使用せず、従って、これらの配列を欠くベクターを、前述のＴ−ＤＮＡ配列を含むベクターに加えて利用する。アグロバクテリウムに依存しない形質変換技術は、直接遺伝子トランスファーによる形質変換、粒子衝突、 原形質取り入れ (例えばPEG及びエレクトロポレーション) , 花粉を利用する形質変換、植物ＲＮＡウイルスを利用する形質変換、微小注入、傷ついた及び／又は酵素分解された胚芽状組織の形質変換、及び／又は熟していない胚、リポソームを利用する形質変換等を含む。ベクターの選択は、形質変換している種や使用する選択マーカーに大きく依存する。アグロバクテリウムを使用しない形質変換に適したベクターは、pCIB3064, pSOG19, and pSOG35を含む（米国特許明細書第5,639,949号参照）。
【０１２８】
発現システムの成分は、例えばセンス及びアンチセンスＲＮＡフラグメントの発現可能性を高めるために組替えても良い。
【０１２９】
本明細書で使用する「発現カセット」は、ターミネーション信号にリンクした対象ヌクレオチド配列にリンクしたプロモータを含んで成る、好適な宿主細胞中で特別のヌクレオチド配列の直接発現が可能なＤＮＡ配列を意味する。
【０１３０】
この場合は本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列である、対象ヌクレオチド配列を含んで成る発現カセットは、キメラでも良く、これは少なくともその成分の１つが、他の少なくとも１つの成分に対して異種であることを意味する。発現カセットは天然産でも良いが、異種発現に有用な組替え形態で得られている。しかし通常は、発現カセットは、宿主に対して異種で、つまり発現カセットの特定のＤＮＡ配列は宿主細胞中に天然に存在せず、形質変換により、宿主細胞中に又は宿主細胞の祖先に導入されなければならない。
【０１３１】
発現カセットは、トランス遺伝子の発現（及び可能であれば翻訳）に必要とする又は選択された任意の他の配列を含んでいても良い。このような配列は、限定されるものではないが、例えば転写ターミネータ、イントロンのような発現を促進する非本質的な配列、ウイルス配列、及び特定の細胞小器官及び細胞のコンパートメントへの遺伝子生成物のターゲット化を意図する配列を含む。これらの発現カセットは、前述の植物形質変換ベクターに容易に移すことができる。次に具体的な発現カセットの種々の成分を記載する。
【０１３２】
「調節要素」は、ヌクレオチド配列の発現を起こす際に存在する配列を意味する。調節要素は、通常対象とするヌクレオチド配列にリンクされたプロモータとターミネーション信号を含んで成る。これは、好適な又は対象とするヌクレオチド配列の翻訳に必要な配列まで含むことがある。この場合、存在し得る翻訳開始及び／又は停止コドンを組替えることにより、遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列のセンスヌクレオチド配列の翻訳を禁止することが好ましい（後述）。
【０１３３】
ヌクレオチド配列の発現は、宿主細胞が特定の外部刺激に曝されたときにのみ、転写を開始する構造性プロモータ又は誘発性プロモータるコントロール下に置くことができる。植物のような多細胞有機体の場合、プロモータは特定の組織又は器官又は成長の段階に特異的であっても良い。
【０１３４】
本発明のセンス及び／又はアンチセンスヌクレオチド配列にリンクされたプロモータは、形質変換する細胞の特有なプロモータであっても良い。その代わりに、プロモータは、例えば組織特異的なプロモータ、発達する調節プロモータ、構造性プロモータ又は誘発プロモータのような異種プロモータであっても良い。適切なプロモータは当業者に周知である。本発明では、根組織で活性な又は主にそこで活性な（他の組織での発現が望ましくない場合）強い異種プロモータが好ましい。
【０１３５】
種々の転写ターミネータは、発現カセットで使用できる。これらは、トランス遺伝子を超える転写の終止及びその正確なポリアデニレーションに有効である。好適な転写ターミネータは植物中で機能することが知られている、CaMV 35Sターミネータ、 tm／ターミネータ、オパリン・シンターゼ（opaline synthase）ターミネータ及びpea rbcS E9 ターミネータ等を含む。
【０１３６】
多数の配列が、転写ユニット内の遺伝子発現を促進することが発見され、これらの配列は本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３配列と関連して使用され、トランス遺伝子の植物での発現可能性を増加させる。例えばマイザ・アデル（maize Adhl）遺伝子のイントロンのような種々のイントロン配列が発現を促進することが示されている。更にウイルスから誘導される非翻訳リーダー配列も発現を促進することが知られている。
【０１３７】
少なくとも１つの「植物発現」プロモータが、センスヌクレオチド配列及び／又はアンチセンスヌクレオチド配列にリンクされていることが好ましい（上記参照）。本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３配列中のセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列は、同じプロモータのコントロール下にあることが好ましい。
【０１３８】
本明細書で使用する「植物発現プロモータ」は、植物細胞中で転写をコントロール（開始）できるＤＮＡ配列を意味する。これは植物由来の任意のプロモータを含むが、例えばCaMV35S、 地下にあるクローバウイルスプロモータNo 4又はNo 7、又はT- DNA遺伝子プロモータのような植物細胞又は組織で転写を行うことのできる植物非由来のプロモータも含む。
【０１３９】
本発明の遺伝子組替えセンス及びアンチセンスＴＧＢ−３ヌクレオチド配列が単一のヌクレオチド配列又はＤＮＡ鎖に含まれるか否かに応じて、プロモータの選択と配置に関するオプションを記載する。
【０１４０】
本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列中のセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列は、特に両者が単一のヌクレオチド配列に含まれる場合は、単一のプロモータのコントロール下にあることが好ましい。しかしこれらは異なったプロモータ（例えば２つの配列に与えられる場合）のコントロール下にあっても良い。即ち、センスＤＮＡ配列が第１のプロモータにリンクされ、アンチセンスＤＮＡ配列が第２のプロモータにリンクされている場合である。当該第１及び第２のプロモータは、同じプロモータでも異なるプロモータでも良い。前記プロモータは、プロモータの各サイドでＤＮＡ配列の転写を開始できる、分枝又は双方向性プロモータであっても良い。
【０１４１】
センスＲＮＡフラグメント及びアンチセンスＲＮＡフラグメントが、２つのＲＮＡ分子として場合する場合は、センスＤＮＡ配列及びアンチセンスＤＮＡ配列は、例えば双方向性プロモータにリンクしても良い。その代わりに、センスＤＮＡ配列が第１のプロモータにリンクし、アンチセンスＤＮＡ配列が第２のプロモータにリンクしていても良い。第１のプロモータ及び第２のプロモータは、同じプロモータでも、異なったプロモータでも良い。
【０１４２】
アンチセンス配列は、ＤＮＡ分子（この場合２本の鎖を有するＤＮＡ分子）中のセンス組替えＴＧＢ−３配列の相補ＤＮＡ鎖であっても良いこの場合、前記センス又は前記アンチセンスＤＮＡ配列にリンクしたプロモータがあっても良く、前記プロモータと前記アンチセンスＤＮＡ配列間に第１のサイト特異的な再結合サイト、及び前記センス又は前記アンチセンスＤＮＡ配列の３´末端に第２のサイト特異的な再結合サイトがあり、前記第１及び第２のサイト特異的な再結合サイトは、サイト特異的なリコンビナーゼの存在下で、前記第１及び第２のサイト特異的な再結合サイト間の前記第１又は第２のＤＮＡ配列を逆にできる。この逆転の結果、前記第１のプロモータは、前記アンチセンス（又はセンス、当初どちらのＤＮＡ配列がプロモータにリンクしていたかによる）ＤＮＡ配列を発現できるようになる。植物細胞は、更に前記サイト特異的な再結合サイトを認識できるサイト特異的なリコンビナーゼを有することが好ましい。
【０１４３】
本発明のＤＮＡ構成体又は配列は、センス及びアンチセンス組替えＴＧＢ−３ウイルス配列は別にして、センス及びアンチセンスＲＮＡフラグメントをエンコードするＤＮＡ配列間に、リンカー又はスペーサヌクレオチド配列を更に有することが好都合である。
【０１４４】
特にセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列が１０ヌクレオチドより大きくかつセンス及び／又はアンチセンスヌクレオチド配列の一部をループを形成するために使用して、センス及びアンチセンスヌクレオチド配列間の塩基対形成及び二重鎖ＲＮＡ形成を可能にする場合に、スペーサ配列が存在しなくても、ＲＮＡ分子は依然として二重鎖ＲＮＡを形成できる。これらのパラメータが、センス及びアンチセンスヌクレオチド配列を有するＲＮＡ領域の二重鎖ＲＮＡを形成する能力を邪魔しない限りは、スペーサ領域と連携する長さ限界も配列の要件もないと期待できる。好ましい態様では、スペーサ領域は、５から約１０００ｂｐ間で変化する。
【０１４５】
好ましい態様では、センス及びアンチセンス領域により形成されるヘアピンＲＮＡ及びもし好適ならばスペーサ領域は、人工的なヘアピンＲＮＡである。「人工的なヘアピンＲＮＡ」又は「人工的なステムーループＲＮＡ構造」は、このようなヘアピンＲＮＡが天然に産出しないことを意味する。
【０１４６】
好ましいスペーサ又はリンカーヌクレオチド配列は、好ましくはセンス方向にあるイントロン配列で、対象核酸、BNYW pl5又はBNYVY RNA2の発現を減少させる効率を向上させる。効率向上は、植物の頻度の増加として表すことができ、ここではサイレンシングが起こるか、BNYW pl5又はRNA2発現の減少レベルが増加する。
【０１４７】
好ましいイントロンヌクレオチド配列は、推定リボゾームＲＮＡ遺伝子又は高度に転写された植物遺伝子のような植物遺伝子から誘導される。これらのイントロンは、任意の植物遺伝子から誘導され、好ましくは例えばペチュニア遺伝子であるジコチルドナス（dicotyledonous）植物遺伝子、最も好ましくはサトウダイコン遺伝子から誘導される。これらの（植物）イントロンの一部のみ、例えばスプライシング信号を含む少なくともボーダーのみを使用することが可能である（下記参照）。これらのイントロンの全部又は一部は、本発明の文脈から「イントロンフラグメント」又は「イントロン配列」として参照される。
【０１４８】
このようなイントロンヌクレオチド配列の好ましい長さは、約５から約１０００ｂｐで、好ましくは約５０から約６００ｂｐ、より好ましくは約９０から約５５０ｂｐである。好ましいイントロン配列は、配列番号１１又は１４を含んで成り、より好ましくは配列番号１１又は１４から成る。
【０１４９】
イントロン処理は、適切な５’及び３’スプライス接合配列に応じて行われ、少なくともこれらはイントロン配列が維持されるべきである。これらの接合のためのコンセンサス配列は、動物及び植物の両ｍＲＮＡから誘導されるが、数種のヌクレオチドのみが不変としてして知られている。
【０１５０】
以下に述べる両ビートイントロン（配列番号１１及び１４）は、高度に適していることが、更に短い配列は、長い配列より僅かに良好な性能が見い出された。
【０１５１】
例えばヘアピン構造を生成できかつキメラ遺伝子の転写で生成するセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るＲＮＡ分子は、直接植物細胞中に導入できる。このようなＲＮＡ分子は例えば次のようにして生成できる。
−対象とする拡散のヌクレオチド配列の少なくとも一部と７５％から１００％の配列同一性を有する少なくとも１０個の連続ヌクレオチド配列のセンスヌクレオチド配列と、少なくとも１０個の連続ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１５ｎｔ、２０ｎｔ、より好ましくは少なくとも５０ｎｔ、更に好ましくは少なくとも約１００ｎｔ、特に好ましくは少なくとも約１５０ｎｔ、より一層好ましくは少なくとも約２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔ、更に好ましくは少なくとも３５０ｎｔ又は４００ｎｔを含み、更に前記センスヌクレオチド配列の前記少なくとも約１０個の連続ヌクレオチドの相補体と約７５から約１００％の配列同一性を有するアンチセンスヌクレオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子中に転写できるＤＮＡ領域をクローニングして、これにより、ＲＮＡが、Ｔ７−ポリメラーゼ特異的プロモータに限定されない、インビトロの転写反応中でＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼによる認識のために適したプロモータのコントロール下で、例えばヘアピンＲＮＡ構造を形成させる、センス及びアンチセンスヌクレオチド配列の領域間の塩基対形成により二重鎖ＲＮＡを生成できる前記クローニングを行い、
−特に好適なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、及びＲＮＡ分子を生成するために必要な試薬を加えることによりインビトロの転写反応を行わせ、
−ＲＮＡ分子を単離する。
【０１５２】
インビトロの転写反応及びインビトロＲＮＡ生成のための他の方法は周知で、そのためのキットが販売されている。植物細胞に直接ＲＮＡを導入する方法も当業者に容易が利用でき、エレクトロポレーションや 微小注入を含むがこれに限定されない。
【０１５３】
本発明は、その細胞の少なくとも一部、好ましくはその細胞の実質的に全てのゲノム中に、本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列及び／又は同じ構成のベクターを含んで成るＢＮＹＷ抵抗性又は耐性植物を提供する。前記植物は、転写されると、ＰＴＧＳを開始し、それによりＢＮＹＷ  ＲＮＡ２を破壊するＲＮＡ分子を生成する。 その細胞の少なくとも一部、好ましくはその細胞の実質的全てに、上記効果を達成する本発明のＲＮＡ分子を含んで成るＢＮＹＷ抵抗性又は耐性の植物も提供される。
【０１５４】
「植物」は、成長の任意の段階における任意の植物又は植物の一部を意味し、これには切り株、細胞又は組織培養菌及び種も含まれる。本発明に関連して使用される用語「植物組織」は、植物全体、植物細胞、植物器官、植物の種、原形質、カルス、細胞培養及び構造的及び／又は機能的ユニット中に組織される植物細胞の任意の群を含む。後者は（植物的）再生可能な構造としても参照され、植物全体として再生されることを意味する。
【０１５５】
得られた形質変換植物、植物組織及び植物材質は、従来の栽培及び植物繁殖又は再生法で使用でき、これにより同じ特性（ウイルス抵抗性又は耐性）を有するより形質変換された植物を生成させあるいは本発明のＤＮＡ構成体を、同じ又は関連する植物種の他の種類のものに導入できる。
【０１５６】
本明細書では、「ウイルス抵抗性又は耐性」とは、抵抗性又は耐性のある細胞又は植物が、１又は２以上のウイルスの感染を受けないか、感受性細胞又は植物と比較して感染性が低いかのいずれかであることを意味する。本件の場合は、ＢＮＹＷ感染に対する抵抗性、好ましくは極度の抵抗性が期待される。例えば抵抗性又は耐性は、例えばＢＮＹＷ感染であるウイルス感染の通常の症状がないか減少していること、あるいは細胞中のウイルスの蓄積又は複製が防止され又は減少すること、又は例えばウイルスの細胞間の移動を防止又は減少できることを意味する。
【０１５７】
本発明は、細胞中、好ましくは植物細胞又は植物中で、ウイルス（ＢＮＹＷ）ｐ１５ＲＮＡ２遺伝子の発現を、制御、つまり変化させ、好ましくは十分に減少させ、又は完全に抑止する方法に関する。ＰＴＧＳは、ＲＮＡ２上に位置する各遺伝子の発現を抑止する。
【０１５８】
共通の利用できる方法は予見性に欠けることが見い出された。本発明方法は、これらの問題点を軽減し、植物中のウイルス抵抗性の再現可能でより有効な制御法を提供する。
【０１５９】
本発明を、以下の実施例により、更に詳細に説明する。
【０１６０】
これらの実施例は例示のために提示するもので、特に指定がない限り、限定することを意図しない。
【０１６１】
ＢＮＹＷ及びＢＮＹＷ  Ｐ１５用に提示した原理は、表１に挙げたウイルスにも同様に適用できる。
【０１６２】
[実施例]
[実施例１]
[ＢＮＹＷ抵抗性トランス遺伝子の植物の特性化]
蛋白質BNP15-Ala4（配列番号３でエンコードする）を発現させる３種のトランス遺伝子の植物のベータ・ブルガリス（Beta vulgaris）の系列を作製した。３系列のうち２系列がＢＮＹＷに対する抵抗性を有していた。
【０１６３】
Ｐ１５蛋白質発現は、抵抗性系列中より感受性系列中の方がかなり高いことが見い出された。ｓｉＲＮＡは検出されたが、ＢＮＹＷ抵抗性系列の植物中のみであった（表２）。
【０１６４】
従ってＢＮＹＷ抵抗性はＰＧＴＳにより与えられる。この仮説を更にテストするために、各系列の１枚の葉をウイルス接種で感染させた（Stras1234はRNA１、 RNA2 、RNA3及びRNA4を与える)。 このように感染させた抵抗性植物の葉には、組織障害が生じないか僅かに生じたのみであった。これに対し感受性植物の葉では、多数の組織障害が生じた。Ｐ１５特異性のｓｉＲＮＡ分子は、ＢＮＹＷ抵抗性系列中で検出されたが、依然として感受性植物では検出されなかった。
【０１６５】
Ｐ１５遺伝子配列中又は転写ターミネータの配列中では変化は検出されなかった。
【０１６６】
[実施例２]
[Ｐ１５ヘアピン構成体]
（組替え）Ｐ１５配列を生じさせるＰＴＧＳの機能性を調べるために、ペチュニアイントロン又はサトウダイコンイントロンが介在する、センス及びアンチセンス方向の遺伝子組替えＰ１５遺伝子（例えば（組替え）配列番号３）を含むバイナリアグロバクテリウムを構築した。
【０１６７】
次に３種のｈｐ１５構成体（図４及び５参照）で得られた結果を示す。構成体１中のイントロン配列はペチュニアから誘導し（図４参照）、構成体２及び３中のイントロン配列はサトウダイコンから誘導する。構成体２及び３は、イントロンの長さのみが異なる。ｐＳ１４０ベクターの場合は５５０ｎｔで、ｐＳ１４２ベクターの場合は９１ｎｔのみ（それぞれ図５Ａ及び５Ｂ）．
【０１６８】
本発明のＤＮＡ構成体の作製、及びこれらの構成体のアグロバクテリウム・チューメファシアン（例えば（無害化）ＧＶ３１０１株）を周知方法及び技術に従って行った。ｐ１５センス及びアンチセンスフラグメント及びイントロンを、末端に特異的制限サイトを含むＰＣＲで作製した。ベクターのバックボーンと混合すると、フラグメントの末端のこれらの特異的サイトの適合性に基づいて、フラグメントの１つの再結合／挿入が可能であった。フラグメント１の右の制限サイトは、フラグメント２の左の制限サイトと同じであった。
【０１６９】
前記構成体のそれぞれについて、（第１の４００ｎｔの）ＧＦＰ配列（遺伝子組替えｐ１５配列の代わり）を含むヘアピン相同器官を作製し、コントロール（ｈｐＧＦとして参照されるヘアピンコントロール）として使用した。更にＭＡバッファ（１０ｍＭ塩化マグネシウム、２００μＭｍアセトシリンゴン（acetosyringon）を処理用コントロールとした。
【０１７０】
[実施例３]
[実験プロトコル]
テトラゴニア・エクスペンサ（Tetragonia expensa）、ベータ・マクロカルパ（Beta macrocarpa）及びベータ・ブルガリス（Beta vulgaris）の葉状物質（ＢＮＹＷ人工葉接種を保持する植物）をＢＮＹＷ（ＲＮＡ１及びＲＮＡ２を提供するStras 1234又はStras 12）に浸透（infiltration）させ感染させた。プロトコルについては後述を参照。構成体については前述を参照。
【０１７１】
ヘアピン構成体を具有するアグロバクテリウム・チューメファシアンを２８℃で一晩培養する。遠心分離（５０００ｇで１５レイン）及びアセトシリンゴン（２００μＭ）及び１に調整されたＯＤ６００ｎｍを含む１０ｍＭのＭｇＣｌ２バッファ中に再懸濁させることにより、細胞をペレット化する。細胞懸濁物を浸透前に３時間、室温で保持する。
【０１７２】
アグロバクテリウム溶液を、苗の葉（例えばベータ・マクロカルパ、ベータ・ブルガリス、テトラゴニア・エクスペンサ、ニコチナ・ベンサミナ（Nicotiana benthamina）、チェノポディウム・キノア（Chenopodium quinoa））に注入することにより、農的浸透を、４段階で行う。２ｍｌの針のないシリンジを、針で傷ついた葉の上面に押し付ける。コチロドン（cotyledons）を除く各葉は浸透される。
【０１７３】
農的浸透の４日後に、前もってカーボランダム粉で処理した葉を、１０〜２５μＬの接種溶液（1μｇのウイルスＲＮＡ（Stras1234又はStras12), マカロイド（macaloid）0.04%、リン酸カルシウム）バッファ50 mM、pH 7.5)で擦ることによる機械的接種で感染させた。
ベータ・マクロカルパ          １０μＬ接種溶液／葉
ベータ・ブルガリス            ２５μＬ接種溶液／葉
テトラゴニア・エクスペンサ    ２５μＬ接種溶液／葉
ニコチナ・ベンサミナ          ２０μＬ接種溶液／葉
【０１７４】
ベータ・マクロカルパ、ベータ・ブルガリス、テトラゴニア・エクスペンサ及びニコチナ・ベンサミナの葉を、上記のように処理し、その中に１０から１３ｄｐｉのリゾマニア・シンプトン（Rhizomania symptoms）の存在が確認された（接種後の日）。
【０１７５】
[実施例４]
[ＢＮＹＷの繁殖に対するｈｐ１５ｍＲＮＡ発現の効果]
Ａ．ペチュニアイントロンを有する構成体
次の実施例は、本発明のｈｐ１５構成体を使用してサトウダイコン中で得られた結果を記載するものである。
【０１７６】
構成体１（図４）で得られた結果を図６に纏める。ｈｐＧＦ構成体を発現する懸濁液で農的浸透されたベータ・ブルガリスの葉、及びＭＡバッファで浸透された葉に黄色クロロティック（chlorotic） 病変が観察された。これらの病変は、浸透及び接種されていない葉で観察されたものに類似していた。
【０１７７】
ｈｐ１５構成体（構成体１）を発現する懸濁液で農的浸透された植物の葉では、このような病変は存在しなかった。損傷が観察されたとしても、それらは非常に小さく、葉の浸透が最適でなかったゾーンに対応すると考えられる。
【０１７８】
これらの予備的な結果は、ｈｐ１５構成体が、ベータ・ブルガリスでＰＴＧＳを起こすことに適し、ＢＮＹＷ抵抗性を与えられることを示している。
【０１７９】
Ｂ．サトウダイコンイントロンを有する構成体
上記実験を、イントロンの長さのみが異なる構成体２及び３を使用して、更に多数のサトウダイコンを使用して行った。
【０１８０】
ＭＡバッファで又はｈｐＧＦ相同器官を発現するアグロバクテリウム・チューメファシアン懸濁液で感染させた全ての葉は、直径約３〜４ｍｍの多数の損傷を示すことが見い出された。ｈｐ１５（構成体２又は３）で農的浸透された植物の葉は、損傷が全然なく、あるいは最大直径約１ｍｍの非常に少数の損傷が生じた。図７に示した結果から、構成体２（９１ｎｔのサトウダイコンイントロンを有する）がＢＮＹＷに対するより良好な保護を与えると考えられる。
【０１８１】
Ｃ．Ｐ−タイプ単離体による感染に対する保護
フランスのピチビエ周辺で見い出されるＰタイプのＢＮＹＷは、５個のプラスーセンスＲＮＡから成っている。この損傷は、サトウダイコンを高度に発病させる。ｐ２６蛋白質の発現は、リゾマニア・シンプトンを悪化させると信じられている（非特許文献２６）。  
【０１８２】
上記結果（項目Ｂで述べた）は、ウイルス接種としてＰタイプＢＮＹＷを使用した場合にも繰り返された。
【０１８３】
ｈｐ１５構成体を発現させるアグロバクテリウム・チューメファシアン懸濁液で農的浸透された植物の葉では損傷が観察されなかった。
【０１８４】
従って、ヘアピン構成体の中間体によるＰＴＧＳの誘起は、ウイルス感染に対する、特にＢＮＹＷに対する良好な抵抗性源であると考えられる。最も働きの強い単離体に対しても、植物抵抗性が得られた。
【０１８５】
ｈｐ１５構成体が発現（植物中）すると、酵素ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）により認識されかつ約２１〜２３ｎｔのピース（ｓｉＲＮＡ）に切断されるｄｓＲＮＡを形成する。Ｐ１５特異的なｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ（ＲＮＡで誘起されるサイレンシングコンプレックス）コンプレックスを生成し、これは次いでＲＮＡ相同器官、ＲＮＡ２及びある種のＢＮＹＷサブゲノムＲＮＡ種をターゲットにし、これらの分解を引き起こす。そのため、ウイルスは１つの細胞から他の細胞に最早移動することができない。
【０１８６】
[実施例５]
[本発明のｈｐ１５構成体は、皮質細胞中のウイルス繁殖を阻止する]
ＢＮＹＷ（Ａ，Ｂ，Ｐタイプ）の存在及び拡散を、天然の抵抗性源での感受性２倍体サトウダイコン育成ライン４Ｄ６８３４（「４Ｄ」）(ホーリー１−４アクセッション(「Ho」)及びベータ・ブルガリｓｓｐ.マリチナＷＢ４２（「Ｂｍ」）)、及び本発明で形質変換したサトウダイコンで調べた。
【０１８７】
血管組織では、ウイルス被覆蛋白質が、師管シーブ要素及び血管の柔組織内で観察された。これらの観察は、師管を通る長距離移動を支持している。例えばウイルス感染及び免疫検出に関する詳細なプロトコルついては、ドウセ（Doucet）の博士論文を参照。
【０１８８】
「Ｈｏ」のような天然の抵抗性源は、部分的に抵抗性があることのみが証明された。「Ｈｏ」の抵抗性は、例えば  ウイルスの高濃度存在下では消えてしまった。
【０１８９】
本発明の抵抗性植物及び「Ｂｍ」遺伝子型は、ウイルス拡散に同じ限界を示した。しかし両者間の重要な相違は、「Ｂｍ」は依然として皮質細胞中でウイルスを繁殖させられることである。従ってウイルスは、依然としてP. betae（菌ベクター）に接近でき、表皮組織を優先的に感染させると思われる。ウイルス繁殖そして結果的に感染ポテンシャルの維持が可能になり、感染し易い種より程度が低いとはいえ、感染数が維持される。本発明の抵抗性遺伝子型の利点は、表皮組織でのウイルス繁殖を阻止する能力にある。「Ｂｍ」と比較して、土壌中の感染力を維持するウイルスの能力を減少させる。
【０１９０】
[実施例６]
[総括的な結論]
前記実施例から、本発明の病原菌誘導のｈｐ１５抵抗性は、非常に強力なＢＮＹＷ単離体に対しても高度に効果的であると結論付けることができる。
【０１９１】
本発明のｈｐ１５構成体は、病原菌誘導の植物抵抗性を成功裏に生じさせた。テストしたｈｐ１５構成体は全てが、ＰＴＧＳを通してＲＮＡ２の分解を生じさせた。
【０１９２】
ｈｐＧＦ相同器官はＰＴＧＳ機構（目視観察）を生じさせなかった。この場合、ＢＮＹＷ  ＲＮＡ２の分解は起こらなかった（ノーザンブロット分析）。
【０１９３】
前記結果は、完全な長さのｐ１５配列を含むｈｐ１５構成体の関する。  しかし正の結果は、ｐ１５コード配列のフラグメント（一部又は部分）を、センス及びアンチセンス方向で好適なベクター中にクローンした際にも得られた。例えばＰ１５  ＢＮＹＷ遺伝子を３分の２含む構成体も、ｓｉＲＮＡ（小さいインターフェアＲＮＡ）によりターゲットとした。
【０１９４】
このことは、本発明の遺伝子組替えＢＮＹＷ  ＴＧＢ−３配列又はその一部又はフラグメントが、ＰＴＧＳを起こすために非常に適していて、その結果、ＢＮＹＷ抵抗性植物を生成することを示している。
【０１９５】
最大の成功を得るために、次の基準で、形質変換植物を選択することが好ましい。単一の構成体を与える形質変換体を選択し、植物のＢＮＹＷ感染に対する抵抗性を分析する。高レベルの小さいＲＮＡを生成する植物は、非常に高くかつ強いレベルの抵抗性を示す。欧州特許第１１７４５１３号に記載された原理に基づくアグロバクテリウム形質変換及び／又は植物形質変換は形質変換技術として好ましく、これはこれらあの技術が再配列を最小にするからである。
【０１９６】
[実施例７]
[感染土壌中で生育した形質変換植物のＥＬＳＡスクリーニング]
構成体：ベクターｐＳ１３８（図１１）をＰＥＧ直接遺伝子形質変換用に使用し、ベクターｐＳ１４３(図１２)をアグロバクテリウムで生じる形質変換用に使用した。両プラスミドは、図１Ａ及び１Ｂに示すように、短いイントロン配列（９１ｂｐ）を有するＰ１５−４（ＢＮＰ１５−Ａｌａ４）ヘアピン構成体を含む。該構成体では、Ｐ１５−４センス配列は配列番号３に対応し、Ｐ１４−４アンチセンス配列は配列番号１２に対応し、イントロンは配列番号１１に対応する。
【０１９７】
ＰＥＧ形質変換：ＰＥＧ形質変換を、欧州特許公開第ＷＯ９５／１０１７８号公報に記載された方法に従ってサトウダイコンガード細胞原形質体に対して行った。原形質体及びカルス選択を、０．２ｎＭイマザモックス（imazamox）に行った。新芽及び植物は０．２ｎＭイマザモックスについて選択した。PEG形質変換植物は、THPRxxx とラベルした。
【０１９８】
アグロバクテリウムによる形質変換：アグロバクテリウムによる形質変換用の出発物質は、土壌ＰＧＩＢ媒体で培養したアルギン酸塩ディスクから得られるサトウダイコンガード細胞原形質体誘導カルスから成っていた（欧州特許公開第ＷＯ９５／１０１７８号公報に記載）。
【０１９９】
アグロバクテリウム株（ＨＡＴ８０００）を、２５ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンと２ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンで補完されたＬＢ媒体中で一晩成長させた。形質変換の前に、バクテリアの培地を、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ペレットを、１００μＭのアセトシリンゴンで補完されたＰＧｏ媒体中に再懸濁させ、OD550 1.0の接種密度を得た。
【０２００】
接種のために、バクテリアの懸濁液を、得られるガード細胞誘導カルスを含むアルギン酸塩を有するペトリ皿中に注ぐ。１０分後、共培養媒体（１００μＭアセトシリンゴン及び０．９％シープラク・アラゴス（Seaplaque agarose）で補完されたＰＧＩＢ媒体、ｐＨ５．８）上に位置させる前に、アルギン酸塩を除去し、濾紙上で乾燥させる。媒体を、２７℃の暗所で１から２日培養し、その後、個々のカルスを、１２５ｍｇ／Ｌのセフォタクシン（cefotaxime）、０．２ｎＭのイマザモックス及び０．８％のアラゴース（ｐＨ５．８）で補完した選択媒体に移す。２週間後、成長しているカルスを、０．２ｎＭのイマザモックスで補完し、２５℃の明所で培養したＰＢＮ媒体へ移す。得られる新芽及び植物を、２０ｎＭのイマザモックスに関して選択した。アグロバクテリウム形質変換植物を「AgHPxxx」とラベルした。
【０２０１】
ＥＬＩＳＡスクリーニング：ＥＬＩＳＡスクリーニングのために、１又は２のヘアピン構成体を含む形質変換体のみを使用した。次いで、インビトロで、植物を根組織に移した。６から８週間後に、良好に成長した根システムを有するインビトロ根形質変換体を土壌／砂の混合物に移した。この混合物は、フランスのピチビエ地方で集めたＢＮＹＷパトタイプＰを含むポリミキサ・ベータ（Polymyxa betae）が寄生していた。
【０２０２】
１８〜１９℃及び７０％の相対湿度で、４週間培養した後、根から砂及び土壌を洗い流し、根の株をＥＬＩＳＡテストのために使用した。根のかけらを濾紙上で乾燥させ、秤量し、マイクロ管に移し、それをー６０℃で一晩凍結させ、次いで２〜３日間凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、サンプルを粉砕した（３０ｒｐｍ／分で、２ｘ１分）。抽出バッファの対応する量を、各管に加えた。粉末が再懸濁するまで管を振り、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。この上澄み１５０μＬをアッセイのために使用した。
【０２０３】
各植物の根のウイルス含有量を、ネオゲン社(www.neogen.com) .のウイルスの外皮蛋白質に対して育成された抗体を使用する三重抗体サンドイッチ酵素結合免疫吸着法（ＴＡＳ−ＥＬＩＳＡ）により分析した。抵抗性植物のカットオフ値は、OD405 値で0.2であった。
【０２０４】
結果：ＥＬＩＳＡ値が小さいほど、分析した植物の根システムに存在するウイルスの量が小さくなった。異なった２種類のバイオテスト (Rz2007-001A及びRz2007-002A) の結果を図９及び１０に纏めた。次のサトウダイコンを正及び負のコントロールとした。4D6834、感受性コントロール。DKI８、市販の育種素材から誘導した抵抗性コントロール。TMOC1867及び MOX63MSF1、pl5-ALA4構成体（センス構成体でヘアピン構成体でない）で形質変換した植物。
【０２０５】
ＭOX63MSF1植物では、小さいRNAフラグメントが検出された。これらの植物では、このようにして、遺伝子構成体自身による開始を経ずに、より可能性があるのは、挿入体の再配置によりＰＴＧＳ機構が生じる。これは、多分これらの植物で観察される高い抵抗性レベルで説明できる。
【０２０６】
本発明によるｐ１５ヘアピン構成体で形質変換された２９のうち全部で２０系列がリゾマニア抵抗性を示すことが証明された。次の形質変換いる通常のみが感受性があると見出された。THPR82, THPR90, AgHP150, AgHP155, THPR12, THPR15, THPR53 , THPR239 and THPR270.
【０２０７】
上記データは、本発明の病原菌誘導のｈｐ１５抵抗性が非常に強いＢＮＹＷ単離体にさえも非常に有効であることを再度確認している。高レベルの免疫は、例えばバイオテストRZ2007-002Aの次の形質変換植物系列で観察された。THPR26、THPR118、THPR222及びTHPR289。高レベル免疫を有する植物は、０．０５未満のOD405 値を有することが好ましく、０．０１未満あるいはほぼゼロであることがより好ましい。
【０２０８】
【表１】
2009535046.tif 000006
【０２０９】
（表２）
遺伝子組換え植物のＲ１５特異性ｓｉＲＮＡのＰ１５蛋白質発現の検出。Ｒ：ＢＮＹＶＶに抵抗性のある植物系列。Ｓ：ＢＮＹＶＶにかなった植物系列。＋：弱い検出。＋＋：強い検出。−：検出なし。
【表２】
2009535046.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１】図１は、９１  ｂｐのイントロン配列が介在する、センス突然変異ｐ１５ヌクレオチド配列及びアンチセンスｐ１５ヌクレオチド配列を有する本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列を示す。
【図２】図２は、５５０ｂｐのイントロン配列が介在する、センス突然変異ｐ１５ヌクレオチド配列及びアンチセンスｐ１５ヌクレオチド配列を有する本発明の遺伝子組替えＴＧＢ−３ウイルス配列を示す。
【図３】図３は、ＷＴｐ１５配列を示す。
【図４】図４は、ペチュニアのチャルコン・シンサーゼ A遺伝子の遺伝子配列が介在し、ＢＮｐ１５−ａｌａ遺伝子がセンス及びアンチセンス方向に導入されたｐＦＧＣ５９４１ベクターの概略図である。
【図５】図５は、５５０ｎｔ及び９１ｎｔが介在し、ＢＮｐ１５−ａｌａ遺伝子がセンス及びアンチセンス方向に導入されたｐＳ１４０及びｐＳ１４２ベクターのそれぞれの概略図である。
【図６】図６は、構成体１で得られたＰＴＧＳデータの統計分析である。
【図７】図７は、構成体１、２及び３で得られたＰＴＧＳデータの統計分析である。
【図８】図８は、配列番号７で表されるＷＴｐ１５ＢＮＹＷ配列と同等の配列番号１０における差異を強調した図である。
【図９】図９は、ＢＮＹＷ感染した土壌で成長した植物の根のウイルスの存在確認手段としてのＥＬＩＳＡテストの結果を示す。
【図１０】図１０は、ＢＮＹＷ感染した土壌で成長した植物の根のウイルスの存在確認手段としてのＥＬＩＳＡテストの結果を示す。
【図１１】図１１は、ＰＥＧ直接遺伝子形質変換実験で使用するｐＳ１３８ベクターを表す。
【図１２】図１２は、アグロバクテリウムが仲介する形質変換のために使用するｐＳ１４３ベクターを表す。
【図１Ａ】
2009535046.tif 000008
【図１Ｂ】
2009535046.tif 000009
【図２Ａ】
2009535046.tif 000010
【図２Ｂ】
2009535046.tif 000011
【図３】
2009535046.tif 000012
【図４】
2009535046.tif 000013
【図５Ａ】
2009535046.tif 000014
【図５Ｂ】
2009535046.tif 000015
【図６】
2009535046.tif 000016
【図７】
2009535046.tif 000017
【図８】
2009535046.tif 000018
【図９】
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【図１０】
2009535046.tif 000020
【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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