(57)【要約】  被験対象における選択された領域に関心ある化合物の薬物デポーを送達する方法。この方法は、前記関心ある領域に組成物を直接的に投与する工程を含み、前記組成物は、前記選択された領域での前記関心ある化合物の徐放が提供されるように、送達すべき関心ある化合物（抗炎症薬または化学療法薬など）と逆温度相転移をするポリマー（エラスチン様ペプチドもしくはＥＬＰなど）とを含む。本発明を実施するために有用な組成物もまた記載される。
2009501703.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験対象における選択された領域に関心ある化合物の薬物デポーを送達する方法であって、前記方法が、
組成物を前記関心ある領域へ直接的に投与する工程を含み、前記組成物は送達すべき前記化合物と逆温度相転移をするポリマーとを含み；
結果として前記関心ある化合物の前記選択された領域での徐放が提供され；
前記ポリマーは前記被験対象の体温より低い転移温度（Ｔt）を有する、方法。
【請求項２】
前記組成物が関心ある領域内で凝集し、その後徐々に解離し、それにより前記選択された領域内での前記関心ある化合物の前記徐放を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記投与する工程が、注射によって実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記投与する工程が、針もしくはカニューレを通しての注射によって実施され、前記針もしくはカニューレが７〜３３ゲージである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記関心ある領域が関節である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記関心ある領域が関節であり、前記関心ある化合物が抗炎症化合物であり、前記患者が変形性関節症に罹患しており、前記組成物が前記変形性関節症を治療するための有効量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記投与する工程が、関節内注射によって実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記患者が、可動関節障害および／または椎間板病変に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記関心ある領域が椎間板腔である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記関心ある領域が充実性腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記関心ある領域が前記被験対象が罹患している充実性腫瘍であり、前記組成物が前記充実性腫瘍を治療するための有効量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記投与する工程が、１カ月に３回を超えない頻度の複数の機会に繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が、逆温度相転移をする前記ポリマーにコンジュゲートされた送達すべき前記化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリマーがバイオエラスティックポリマーであり、前記バイオエラスティックポリマーが、バイオエラスティックのペンタペプチド、テトラペプチド、およびノナペプチドからなる群から選択されるエラストマーユニットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記関心ある化合物がタンパク質またはペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記関心ある化合物が、ＴＮＦブロッキング抗体、ＩＬ−１抗体、可溶性ＴＮＦ受容体、可溶性ＩＬ−１受容体、ＴＮＦ受容体アンタゴニスト、およびＩＬ−１受容体アンタゴニストからなる群から選択される抗炎症化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記関心ある化合物が、組換えヒトＩＬ−１受容体アンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記治療用化合物が、前記ポリマーにコンジュゲートされている、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記治療用化合物が、前記ポリマーと混合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
逆温度相転移をするポリマーと組み合わせた治療用化合物を含む、製薬学的に許容可能な組成物。
【請求項２１】
前記治療用化合物が、抗炎症薬および化学療法薬からなる群から選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記治療用化合物が抗炎症薬である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記治療用化合物が、ＴＮＦ抗体、ＩＬ−１抗体、可溶性ＴＮＦ受容体、可溶性ＩＬ−１受容体、ＴＮＦ受容体アンタゴニスト、およびＩＬ−１受容体アンタゴニストからなる群から選択される抗炎症薬である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記治療用化合物が、組換えヒトＩＬ−１受容体アンタゴニストである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２５】
前記治療用化合物が化学療法薬である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２６】
前記治療用化合物が、前記ポリマーにコンジュゲートされている、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２７】
前記治療用化合物が、前記ポリマーと混合されている、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２８】
滅菌注射剤型の請求項２０に記載の組成物を含有する、注射器具。
【請求項２９】
前記注射器具がシリンジである、請求項２８に記載の注射器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国立衛生研究所からの補助金番号ＡＲ０４７４４２およびＥＢ００２２６３の下、米連邦政府による支援を受けてなされた。米連邦政府は、本発明に所定の権利を有する。
【０００２】
[関連出願]
本出願は、２００５年６月２４日に出願された米国特許仮出願第６０／６９３，９６６号の利益を主張し、その開示は全体として参照することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０００３】
本発明は、医薬化合物を放出制御により送達するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
変形性関節症（ＯＡ）は、任意の他の筋骨格疾病より多数の患者が罹患する変形性関節疾患である。この疾患は、毎年４００万例を超える入院の原因となり、その罹患率は今後２０年間に５０％以上増大すると推定されている。ＯＡは、個々の関節を侵襲し、歴史的には関節負荷に起因する「摩損」の結果として発生すると考えられていた。現在では、ＯＡは、相互に作用して関節疾患の進行を促進する生化学的、遺伝的および生体力学的因子を含む複数の原因から発生すると理解されている。進行性関節変性である患者には、関節の再調整（骨切り術）、人工置換術（関節形成術）、または固定（関節固定術）のための外科的選択肢を利用できるが、手術的治療法を必要とするのは極めて小さい割合の患者に過ぎない。従って、患者の症状を緩和することと疾患の進行経過を改善することができる非外科的治療法を提供する大きな必要があり、この必要は増加しつつある。
【０００５】
初期から中期の関節疾患である患者のために最も広く利用可能な治療は、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド抗炎症薬）の常用である。これらの薬物は疼痛緩和における有効性を提供するが、消化管出血および潰瘍形成を含む頻回な悪条件と結び付いている。さらに、ＮＳＡＩＤは細胞生合成を阻害し、関節変性における長期的な内因性修復プロセスを損なう可能性があると報告されている。より最近には、ＯＡの疾患状態を改善する能力をもつタンパク質薬が同定された。これらのタンパク質薬にはＴＮＦ−α阻害剤が含まれ、ＩＬ−１阻害剤は、この疾患の発生を防止し進行を遅らせることに関して、前臨床試験および臨床試験の両方で有意な前途を示している。
【０００６】
ＯＡは同時には少数の関節に局在する疾患であるので、治療薬の局所送達が非常に好ましい。そのような技術の１つは、罹患した関節腔内へ薬物を直接的に投与すること、すなわち関節内注射であり、これは現在、ＯＡを治療する際にコルチコステロイド剤およびヒアルロン酸溶液について推奨されている。ドラッグデリバリーの関節内メカニズムは患者にも臨床医にも魅力的ではあるが、滑液腔からの分子を迅速に除去する高度に効率的なリンパ系の存在によって損なわれる。結果として、治療薬が有効であるためには、頻回に、または高濃度で投与されなければならない。これは、同様に、費用がかさむ可能性があり、副作用および高度な患者の苦痛を生じさせ得る。これらの課題を克服するために、制御型ドラッグデリバリーシステムが追求されてきた。
【０００７】
Ｕｒｒｙへの米国特許第６，３２８，９９６号は、バイオエラストマーのドラッグデリバリーシステムについて記載しているが、関心ある領域内へそれらを直接的に投与することは提案していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ＩＬ−１受容体アンタゴニストなどの薬物を持続的に送達するための熱応答性生体適合性ポリマーを提供することである。本発明におけるデリバリーシステムは、熱応答性バイオポリマーの固有の速やかな凝集特性および緩徐な解離特性を利用して、ＯＡ罹患関節などの病変部位へタンパク質薬を直接的に送達する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、被験対象における選択された領域に関心ある化合物の薬物デポー（ｄｒｕｇ  ｄｅｐｏｔ）を送達する方法を提供する。この方法は、前記関心ある領域に組成物を直接的に投与する工程を含み、前記組成物は送達すべき前記化合物および逆温度相転移（ｉｎｖｅｒｓｅ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｐｈａｓｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）をするポリマーを含み、結果として前記関心ある化合物の前記選択された領域での徐放が提供される。
【００１０】
一部の実施形態では、本発明は、被験対象における選択された領域（例えば、関節もしくは滑膜性関節）に関心ある化合物の薬物デポーを送達するための方法を提供する。この方法は、関心ある領域に組成物を（例えば、関心ある領域内もしくは関心ある領域に向けた注射によるなどして直接的に）投与する工程を含む。この組成物は、送達すべき化合物および逆温度相転移をするポリマーを含む。ポリマーは、被験対象の体温（例えば、３７℃未満）より低い転移温度（Ｔt）を有する。この組成物もしくはコンジュゲートは関心ある領域内で凝集し、その後徐々に解離し、選択された領域での関心ある化合物の徐放もしくは制御された放出を提供する。
【００１１】
一部の実施形態では、本発明は、被験対象における選択された領域に関心ある化合物の薬物デポーを送達する方法であって、前記方法は前記関心ある領域へ組成物を直接的に投与する工程を含み、前記組成物は送達すべき前記化合物と逆温度相転移をするポリマーとを含み；前記ポリマーは前記被験対象の体温より低い転移温度（Ｔt）を有し；その結果として前記組成物（もしくは前記コンジュゲート）は前記関心ある領域の溶液から分離してバルク凝集体を形成し、次にバルク凝集体から徐々に分離して溶液に戻り、前記選択された領域で前記関心ある化合物の徐放を提供する（または言い換えると、結果として前記コンジュゲートは前記関心ある領域内の溶液から分離して徐々に溶液相に戻り、前記選択された領域での前記関心ある化合物の徐放を提供する）方法を提供する。
【００１２】
一部の実施形態では、本組成物は、ポリマーにコンジュゲートした送達すべき化合物を含む。他の実施形態では、この組成物は、ポリマーと混合されてはいるが、コンジュゲートも化学結合もしていない送達すべき化合物を含む。
【００１３】
本発明のまた別の態様は、逆温度相転移するポリマーと組み合わせた（例えば、混合され、もしくはコンジュゲートされた）治療用化合物を含む、製薬学的に許容可能な組成物である。そのような治療用化合物の例には、ＴＮＦ抗体、ＩＬ−１抗体、可溶性ＴＮＦ受容体、可溶性ＩＬ−１受容体、ＴＮＦ受容体アンタゴニスト、およびＩＬ−１受容体アンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。特定の例は組換えヒトＩＬ−１受容体アンタゴニストおよびそのアイソフォームである。
【００１４】
本発明のまた別の態様は、本明細書に記載した組成物を含有する注射器具（シリンジおよび他の注射器具を含む）である。
【００１５】
本発明のまた別の態様は、本明細書に記載した方法を実施するための本明細書に記載した注射器具の使用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本明細書で使用する「バイオエラスティック（生物弾性）ポリマー」は、エラストマーユニットの繰り返しを含む化合物を意味する。エラストマーユニットは、典型的には、ペンタペプチド、テトラペプチド、またはノナペプチドである。例は、エラスチン様ポリペプチド、すなわち「ＥＬＰ」である。
【００１７】
本明細書で使用する「被験対象」には、ヒト被験者（男性および女性の両方の被験者を含み、若年、青年、成人、および高齢患者を含む）、ならびに動物被験対象、詳細には霊長類、イヌ、ネコ、およびウマなどの他の哺乳動物被験対象が、獣医学の目的で含まれる。
【００１８】
本明細書で使用する「関節炎」は任意のタイプの関節炎を意味し、関節リウマチ、変形性関節症、および強直性脊椎炎を含むがこれらに限定されない。
【００１９】
本明細書で使用する「凝集体」は、粒子が形成されるような複数の分子の集合体もしくは凝集塊を意味する。
【００２０】
本明細書で使用する「解離」は、凝集体からの分子の分離、凝集体のサイズの進行性の減少、または粒径の進行性の減少を意味する。
【００２１】
本明細書で使用する「関心ある領域」は、任意の関心ある領域であってよく、関節および充実性腫瘍を含むがこれらに限定されない、（「充実性腫瘍」は、充実性腫瘍の原発性塊の外科的除去後の、充実性腫瘍内にある切除腔を含み、その中に本発明の組成物を直接投与できる）。関節内投与の一部の実施形態では、関心ある領域は、椎間板腔または関連脊椎関節構造である。
【００２２】
本明細書で使用する「体温」には、中核体温および局所体温（例えば、関節などの関心ある領域が四肢に位置する場合は四肢の温度）が含まれる。
【００２３】
本明細書で使用する「関節」は、２つの骨が会合する可動点、しばしば骨膜関節もしくは靭帯結合を意味しており、球関節、楕円関節、平面関節、蝶番関節、車軸関節、および鞍関節を含むが、これらに限定されない。そのような関節は、例えば、肩、頸部、脊椎、肘、臀部、手首、手、膝、足首、または足に位置してもよい。
【００２４】
本明細書で使用する「充実性腫瘍」は、任意の充実性腫瘍もしくは癌であってよく、肺癌、肝臓癌、前立腺癌、卵巣癌、大腸癌、皮膚癌（黒色腫を含む）、脳腫瘍などの原発性および続発性（もしくは転移性）充実性腫瘍を含むがこれらに限定されない。
【００２５】
本明細書で使用する「注射」もしくは「注射する工程」は、針、シリンジ、シャント、カニューレ（例えば、７〜３３ゲージ）、または単回ボーラスもしくは時間をかけた注入として、（全身送達を含まず、これと対照的に）送達すべき本組成物を関心ある領域内へ直接的に送達する任意の他の適切な器具を介した、任意の適切な手段によって実施できる。
【００２６】
本明細書で使用する「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含む、あらゆるタイプの免疫グロブリンを意味する。用語「免疫グロブリン」は、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4などのこれらの免疫グロブリンのサブタイプを含む。これらの免疫グロブリンのうち、ＩｇＭおよびＩｇＧが好ましく、ＩｇＧが特に好ましい。これらの抗体は、（例えば）マウス、ラット、ウサギ、ウマ、もしくはヒトを含む任意の種に由来するものであってよく、またはキメラ抗体であってよい。本明細書で使用する用語「抗体」には、標的抗原に結合する能力を保持している抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦｖフラグメントが含まれ、対応するフラグメントはＩｇＧ以外の抗体から得られる。そのようなフラグメントもまた、公知の技術によって生成される。
【００２７】
本明細書で使用する「化学療法薬」（もしくは「抗癌薬」）には、メトトレキサート、ダウノマイシン、マイトマイシン、シスプラチン、ビンクリスチン、エピルビシン、フルオロウラシル、ベラパミル、シクロホスファミド、シトシンアラビノシド、アミノプテリン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、デモコルシン（ｄｅｍｏｃｏｌｃｉｎｅ）、エトポシド、ミトラマイシン、クロラムブシル、メルファラン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、タモシフェン、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、カンプトテシン、アクチノマイシンＤ、およびシタラビンが含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
本明細書で引用したすべての米合衆国特許文献の開示は、全体として参照することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００２９】
［関心ある化合物］  任意の適切な化合物は、タンパク質およびペプチドを含むがこれらに限定されないものであり、ポリマーに（例えば、化学結合または融合タンパク質としての生成によって）結合されてよい、または上述したようにポリマーと混合されてよい。一般に、関心ある化合物は、検出可能な群または治療用の群であってよい。
【００３０】
例えば、関心ある化合物は、骨形成タンパク質、ペプチド、および成長因子、より詳細にはヒトカルシトニンアナログ、骨形成性成長ペプチド、および骨形成性成長ペプチド−ヒトカルシトニンアナログハイブリッドの群から選択されてよい。例えば、米国特許第６，５９３，３９４号を参照されたい。
【００３１】
関心ある化合物は、抗生物質および抗ウイルス剤などの抗感染薬；化学療法薬（すなわち、抗癌剤）；拒絶反応抑制剤；鎮痛剤および鎮痛複合剤；抗炎症薬；ステロイドなどのホルモン薬；骨形態形成タンパク質（すなわち、ＢＭＰ  １〜７）、骨形態形成様タンパク質（すなわち、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−７およびＧＤＦ−８）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（すなわち、ＦＧＦ  １〜９）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、形質転換成長因子（すなわち、ＴＧＦ−β  Ｉ〜ＩＩＩ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む成長因子；ならびにその他の天然由来もしくは遺伝子組換えタンパク質、多糖、糖タンパク質、もしくはリポタンパク質の群から選択することができる。例えば、Ｄ．Ｏｖｅｒａｋｅｒ、米国特許第６，５７５，９８６号を参照されたい。
【００３２】
関心ある化合物は、治癒を実質的に促進もしくは早める化合物もしくは物質であってよく、エフェクターは、感染を防止する化合物もしくは物質（例えば、抗菌剤および抗生物質）、炎症を減少させる化合物もしくは物質（例えば、抗炎症薬）、酸化再生セルロース（例えば、Ｅｔｈｉｃｏｎ社から入手可能なＩＮＴＥＲＣＥＥＤ（商標）およびＳＵＲＧＩＣＥＬ（商標））、ヒアルロン酸などの癒着形成を防止もしくは最小限に抑える化合物、および免疫系を抑制する化合物もしくは物質（例えば、免疫抑制剤）を含んでよい。適切な関心ある化合物には、異種もしくは自己成長因子、タンパク質（基質タンパク質を含む）、ペプチド、抗体、酵素、血小板、糖タンパク質、ホルモン、サイトカイン、グリコサミノグリカン、核酸、鎮痛剤、ウイルス、ウイルス粒子、および細胞型が含まれる。同一もしくは相違する機能をもつ１つ以上のエフェクターは、スカフォールド内に組み込まれてもよいことが理解されている。適切な関心ある化合物には、傷害もしくは損傷組織の治療および／または再生を促進することが知られている多数の異種もしくは自己成長因子が含まれる。適切な関心ある化合物には、走化性物質；治療薬（例えば、抗生物質、ステロイド性および非ステロイド性鎮痛薬および抗炎症薬、免疫抑制剤および抗癌薬などの拒絶反応抑制剤）；様々なタンパク質（例えば、短期ペプチド（ｓｈｏｒｔ  ｔｅｒｍ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、骨形成タンパク質、糖タンパク質およびリポタンパク質）；細胞接着メディエーター；生物活性リガンド；インテグリン結合配列；リガンド；様々な成長および／または分化剤およびそれらのフラグメント（例えば、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＴＧＦ−β  Ｉ〜ＩＩＩ、成長因子および分化因子、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン由来成長因子（ＩＧＦ）および形質転換成長因子、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン関連ペプチド、ｂＦＧＦ；ＴＧＦＢスーパーファミリー因子；ＢＭＰ−２；ＢＭＰ−４；ＢＭＰ−６；ＢＭＰ−１２；ソニック・ヘッジホッグ；ＧＤＦ５；ＧＤＦ６；ＧＤＦ８；ＭＰ５２、ＣＤＭＰ１）；特異的成長因子のアップレギュレーションに影響を及ぼす小分子；テネイシン−Ｃ；ヒアルロン酸；コンドロイチン硫酸；フィブロネクチン；デコリン；トロンボエラスチン；トロンビン由来ペプチド；ヘパリン結合ドメイン；ヘパリン；ヘパラン硫酸；ＤＮＡフラグメントおよびＤＮＡプラスミドが含まれる。適切なエフェクターには、同様に上述した物質のアゴニストおよびアンタゴニストが含まれる。成長因子は、上記に列挙した成長因子の組み合わせもまた含むことができる。さらに、成長因子は、血液中の血小板によって供給される自己成長因子であってよい。この場合には、血小板からの成長因子は様々な成長因子の不確定混合物である。例えば、Ｊ．Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願公開第２００４／０２６７３６２号を参照されたい。
【００３３】
一部の実施形態では、特に関節炎の治療のためには、関心ある化合物は、抗炎症薬であり、その例には、ＴＮＦ抗体、ＩＬ−１抗体、可溶性ＴＮＦ受容体、可溶性ＩＬ−１受容体、ＴＮＦ受容体アンタゴニスト、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、ＣＯＸ−２阻害剤、および非ステロイド抗炎症薬（抗体および受容体などのタンパク質もしくはペプチド化合物については、それらの活性フラグメントを含む）が含まれるが、これらに限定されない。そのような化合物の数多くの例は公知である。例えば、米国特許第６，８４６，８３４号を参照されたい。さらに、米国特許第６，６２４，１８４号、米国特許第６，５９６，７４６号、米国特許第６，４９８，１６５号、および米国特許第６，４２０，３７３号も参照されたい。米国特許第６，５９９，８７３号および米国特許第５，０７５，２２２号に記載されているように、１つの特定の例は、ｒｈＩＬ１Ｒａ（そのアイソフォームを含む）（Ａｍｇｅｎ社からＫＩＮＥＲＥＴ（商標）として市販されている）である。
【００３４】
［バイオエラスティックポリマー］  バイオエラスティックポリマーは既知であり、例えば、Ｕｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，５２０，６７２号に記載されている。一般に、バイオエラスティックポリマーは、バイオエラスティックのペンタペプチド、テトラペプチド、および／またはノナペプチドのエラストマーユニットを含むポリペプチドである。そこで一部の実施形態では、エラストマーユニットはペンタペプチドであり、他の実施形態では、エラストマーユニットはテトラペプチドであり、さらにまた他の実施形態では、エラストマーユニットはノナペプチドである。本発明を実施するために使用できるバイオエラスティックポリマーは、米国特許第４，４７４，８５１号において説明されており、バイオエラスティックポリマーを形成するために使用できる多数のテトラペプチドおよびペンタペプチドの繰り返しユニットについて記載している。本発明を実施するために使用できる特定のバイオエラスティックポリマーは、米国特許第４，１３２，７４６号、米国特許第４，１８７，８５２号、米国特許第４，５００，７００号、米国特許第４，５８９，８８２号、および米国特許第４，８７０，０５５号にも記載されている。バイオエラスティックポリマーのさらに他の例は、Ｕｒｒｙへの米国特許第６，６９９，２９４号、Ｆｅｒｔａｌａ  ａｎｄ  Ｋｏへの米国特許第６，７５３，３１１号、Ｗａｌｌａｃｅへの米国特許第６，０６３，０６１号およびＣｈｉｌｋｏｔｉへの米国特許第６，８５２，８３４号に記載されている。バイオエラスティックポリマーは、当技術分野において公知のリーダーおよび／またはトレーラー配列などの追加の残基もしくはユニットを含有してもよい。
【００３５】
１つの非限定的な例では、本発明を実施するために使用されるバイオエラスティックポリマーは、少なくとも一般的なブロック構造［（ＶＰＧＸiＧ）ni］m、（配列番号４）（式中、ｉ＝ｌ〜Ｊに対して、Ｘiはプロリン以外の任意のアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ）、ｎiはブロックｉ＋１に隣接し、かつ先行するブロックｉの連続する繰り返しの数である）を含有するポリペプチドである。ｎiは、１、２、３、もしくは４〜２０などの任意の数であり、ｎiはｉとは無関係である。Ｊは、１、２、もしくは３〜５、もしくはこれ以上などの任意の数であり、ｍはブロック構造の繰り返しの数であり、ｍは２、３もしくは４〜６０、８０もしくは３００以上などの任意の適切な数である。第４位の様々なアミノ酸の同一性および頻度は変化させることができる。例えば、本発明を実施するために使用されるバイオエラスティックポリマーは、一般式：［（ＶＰＧＡＧ）51（ＶＰＧＶＧ）2（ＶＰＧＧＧ）23］m、（配列番号５）（式中、Ｘ1＝Ａ、Ｘ2＝Ｖ、Ｘ3＝Ｇ、ｎ1は５、ｎ2は１、ｎ3は２、ｍは少なくとも１、２、もしくは３〜１００、１５０もしくは３００以上である）のポリペプチドであってよい。
【００３６】
また別の非限定的な例では、本発明を実施するために使用されるバイオエラスティックポリマーは、バイオエラスティックの非ペプチド、ペンタペプチドおよびテトラペプチドからなる群から選択された繰り返しエラストマーユニットを含んでもよいが、繰り返しユニットは、全てのアミノ酸およびグリシン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基を含む。好ましいアミノ酸残基は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンからなる群から選択される。多くの場合に、繰り返しユニットの第１アミノ酸残基は、バリン、ロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンの残基である；第２アミノ酸残基はプロリンの残基である；第３アミノ酸残基はグリシンの残基である；および第４アミノ酸残基は、グリシン、またはトリプトファン、フェニルアラニンもしくはチロシンなどの極めて疎水性の残基である。特定の例には、テトラペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号６）、テトラペプチドＧＧＶＰ（配列番号７）、テトラペプチドＧＧＦＰ（配列番号８）、テトラペプチドＧＧＡＰ（配列番号９）が含まれ、ペンタペプチドは、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（配列番号１０）、ペンタペプチドＧＶＧＶＰ（配列番号１１）、ペンタペプチドＧＫＧＶＰ（配列番号１２）、ペンタペプチドＧＶＧＦＰ（配列番号１３）、ペンタペプチドＧＦＧＦＰ（配列番号１４）、ペンタペプチドＧＥＧＶＰ（配列番号１５）、ペンタペプチドＧＦＧＶＰ（配列番号１６）、およびペンタペプチドＧＶＧＩＰ（配列番号１７）である。例えば、Ｕｒｒｙへの米国特許第６，６９９，２９４号を参照されたい。
【００３７】
［投与］  上述したように、本発明の方法は一般に、関心ある領域に組成物を（例えば、関心ある領域内もしくは関心ある領域に注射によるなどして直接的に）投与する工程を含む。この組成物は、送達すべき化合物および逆温度相転移をするポリマーを含む。ポリマーは、被験対象の体温（例えば、３７℃未満）より低い転移温度（Ｔt）を有する。コンジュゲートは関心ある領域内で凝集し、その後徐々に解離し、選択された領域で関心ある化合物の徐放を提供する。投与する工程は、注射、および詳細には（例えば、滑膜関節の滑液中に）関節内注射などの任意の適切な手段によって実施できる。
【００３８】
デポー薬剤が所望される任意の疾患もしくは症状に罹患している患者は、この方法によって治療することができるが、特定の例は関節炎に罹患している患者である。
【００３９】
関心ある化合物は、注射部位、被験対象の年齢、体重、および症状、特定の活性物質などに依存して、任意の適切な量で投与できる。一般に、本化合物は、１回の投与もしくは注射当たり０．００１、０．０１、０．１、１、５もしくは１０ｍｇから、１回の投与もしくは注射当たり約１００、２００もしくは３００ｍｇの量で投与される。一般に、化合物は、関心ある領域に依存する注射量で、１ｐｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬの濃度で投与される。一般に、ＥＬＰは１ｐｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬの同等濃度で、または化合物をエラストマーと混合する例ではより高濃度で共投与することができる。一部の実施形態では、関心ある化合物は、好ましくは前記領域内における１時間もしくは２時間以上のインビボ半減期を有する。一部の実施形態では、前記投与方法におけるＥＬＰと組み合わせた関心ある化合物の投与は、少なくとも２もしくは３日間、１週間、または４週間以上から、２カ月もしくは３カ月間以上までの前記領域内での化合物のインビボ半減期と結び付いている。他の場所で述べたように、投与する工程は定期的におよび反復して（例えば、関節炎などの慢性症状を治療するために）実施されるが、投与頻度は、所望の治療有効量を保持しながらも１カ月当たり１、２、３もしくは４回を超えないと企図されている。
【００４０】
以下の非限定的な実施例において、本発明をより詳細に説明する。
【００４１】
［実施例］
エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）は遺伝子組換えバイオポリマーであり、上記に規定したペンタペプチド繰り返しユニットで構成されており、温度の上昇に応答して凝集する。ＥＬＰは、転移温度（Ｔt）未満の温度では可溶性であるが、Ｔtを超える温度では不溶性になり、ミクロンサイズの凝集体を形成する。本発明者らは、本明細書において、この薬物担体に付着したタンパク質薬が注射時点で凝集して注射部位で薬剤「デポー」を形成し、その後持続的に関節腔内へ緩徐に解離することを開示する（例えば、図１を参照されたい）。これらの実施例において、本発明者らはＴtを超える温度でのＥＬＰのインビトロにおける解離、ならびに関節内注射後の凝集性ＥＬＰ（Ｔt＜３０℃）および非凝集性ＥＬＰ（Ｔt＞５０℃）のインビボ生体内分布および関節半減期を評価する。さらに、本発明者らはＥＬＰ融合タンパク質薬物担体システムについて実証するために、ＥＬＰおよびＩＬ１Ｒａの融合タンパク質を設計し、それらのＩＬ−１受容体への結合親和性およびＩＬ−１を阻害する生物活性を評価する。
【実施例１】
【００４２】
[ＥＬＰのインビトロにおける解離およびペプチド放出]
変形性関節症などの局所性疾患を治療するために提案されたデリバリーシステムの機能検証として、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）もしくはバイオエラスティックポリマーを、凝集体形態から「遊離」ポリマーの徐放を提供する能力について評価した。ドラッグデリバリーシステムは、速やかに熱による誘導で凝集して大きな粒子を形成し、その後にバルク凝集した大きな粒子から「遊離」形態と呼ばれるＥＬＰの徐放が行われるという固有のＥＬＰ特性を利用している。これを評価するために、遺伝子組換え技術を利用して２つのＥＬＰ分子：（１）ＥＬＰ４〜９０＝［（ＶＰＧＶＧ）10］9（配列番号１）、Ｔt＝３０．６℃、ＭＷ＝３７ｋＤａ；および（２）ＥＬＰ４〜１２０＝［（ＶＰＧＶＧ）10］12（配列番号２）、Ｔt＝２８．６℃、ＭＷ＝４９ｋＤａを、既知の技術（Ｕｒｒｙへの米国特許第６，６９９，２９４号およびＣｈｉｌｋｏｔｉへの米国特許第６，８５２，８３４号を参照されたい）にしたがって合成し、熱的に精製した。インビトロ試験のために、１．５ｍＬの濃度３０ｍｇ／ｍＬのいずれかのＥＬＰを円錐管内に入れて、３７℃で２４時間インキュベートした。この時間の終了時に、上清を３７℃のＰＢＳと完全に交換し、上清中のＥＬＰの量を２８０ｎｍでの吸光度によって出発ＥＬＰ（図２、ｔ＝０時間）の関数として定量した。サンプルを３７℃へ戻し、遊離ＥＬＰの量を経時的に７μＬアリコートの上清で定量した。平衡の時間定数は、遊離ＥＬＰ濃度についてのデータを一次指数関数へ数値的にフィッティングすることによって決定した。
【００４３】
両方のＥＬＰタイプについて、ポリペプチドは３７℃に置かれた直後に逆温度相転移をし、緩徐に平衡状態に到達し、出発ＥＬＰの１５〜２０％が遊離形態となった（図２）。平衡の時間定数は、上清が完全に交換されてから約１〜２日後であった。凝集体ＥＬＰに対する遊離ＥＬＰの濃度についての定常値を表す平衡定数は０．１５〜０．２０であった。これらの結果は、凝集ＥＬＰ形態が遊離ＥＬＰを経時的に緩徐に放出することを説明している。遊離形態が滑液膜組織を通して常に排出される可動関節では、ＥＬＰ凝集体の継続的な「解離」が促進される。
【実施例２】
【００４４】
[関節内注射後のＥＬＰの生体内分布]
凝集性ＥＬＰ４−１２０（［（ＶＰＧＶＧ）10］12、配列番号２、Ｔt＜３２℃、ＭＷ  ４７ｋＤａ）および非凝集性ＥＬＰ２（［（ＶＰＧＶＧ）1（ＶＰＧＡＧ）8（ＶＰＧＧＧ）7］10、配列番号１８、ＭＷ  ６１ｋＤａ、Ｔt＞５０℃）の生体内分布および関節半減期。関節内注射後のＥＬＰをラット動物モデルにおいて評価した。ＥＬＰは、３２〜３７ｍＣｉ／ｍｍｏｌｅの比放射能を生じさせるように［14Ｃ］を用いて標識した。標識したＥＬＰを透析し、無菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、約６５０μＭのいずれかのペプチドを容量３０μＬでＷｉｓｔａｒ系ラットの右膝の関節腔内へ注射した。注射後、動物をケージ内で４週間まで飼育した。各時点において５匹のラットを致死させ、それらの右および左膝（滑液、半月、軟骨、滑膜）、血液、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、および膀胱を採取し、消化した。各組織の放射能は、液体βシンチレーション計数を用いて決定した。組織重量当たりの総計数を各動物および各組織もしくは体液（１群当たりおよび１時点当たりｎ＝５の動物）について測定し、各組織について時間の関数としてプロットした。関節組織および関節液についての数値を総計「関節」値（滑液、半月、関節軟骨、滑膜）に合計した。
【００４５】
注射１０分後に関節腔内の全組織および液体から回収された総計の放射能を、非特異的に分布する注射された［14Ｃ］−ＥＬＰについて調整すると、出発用量は投与された用量の７０〜７５％であることが見いだされた。次に組織重量当たりの放射能を、全回収組織および液体について送達された量に対する組織１ｇ当たりの注射用量の百分率（％ＩＤ／ｇｍ）を得るために、この初期注射膝関節腔値（注射１０分後）によって標準化した。
【００４６】
全時点で、抹消器官でのいずれかのペプチドの優先蓄積は観察されなかった（図３Ｃまたは４Ｃ）。注射された膝関節中および血液中を除いて、各ペプチドの総量は他の全ての器官において１％ＩＤ／ｇｍ未満であった（図３Ｂもしくは４Ｂ）。注射された膝関節内の非凝集性ＥＬＰのプロファイルは図３に示されており（時間（時間）に対してプロットされている）、注射された膝関節内の凝集性ＥＬＰのプロファイルは図４にプロットされている（時間（日数）に対してプロットされている）。非凝集性ＥＬＰは関節腔内で初めの２４時間以内に１０％ＩＤ／ｇｍ未満であったが、凝集性ＥＬＰは同一レベルに到達するのにほぼ２週間を要した。
【００４７】
放射能半減期（ｔ1/2）は、上述したように関節についての総放射能計数を合計することによって注射された膝関節区画について決定した（図５）。図５Ａは非凝集性ＥＬＰ（Ｔt＞５０℃）についての注射された膝関節区画の値を示し、図５Ｂは凝集性ＥＬＰ（Ｔt＜３５℃）についての注射された膝関節区画の値を示している。データは平均値±ＳＥ（ｎ＝５）として表示し、一次指数関数的崩壊関数（実線）にフィッティングし、半対数軸上にプロットした。信頼区間（９５％、破線）もまた示されている。各フィッティングに対して時間定数（τ）を使用して、２つのＥＬＰタイプの関節半減期を計算した［ｔ1/2＝τｌｎ（２））。関節における非凝集性ＥＬＰおよび凝集性ＥＬＰの半減期は、各々３．４±０．２時間および３．７±０．２日間であることが見いだされた。このことは、ＥＬＰの凝集特性が関節内のペプチドの半減期を２４倍以上有意に延長させる（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）ことを示唆しており、提案された徐放性メカニズムを確証している。これらの所見は、タンパク質薬を関節炎罹患関節へ送達するためにＥＬＰの熱応答性特性が利用できることを実証しているため重要である。
【実施例３】
【００４８】
[捕捉の実証]
図６は、本発明の方法および組成物による捕捉を実証している。図６は、インビトロでＥＬＰと混合した後に溶液へ放出された放射標識化合物の定量の結果を示している。２．５μｇ／ｍＬでの［3Ｈ］ｒｈＩＬ１Ｒａを、３７℃で濃度の相違する様々なＥＬＰ調製物（ＥＬＰ４−１２０［（ＶＰＧＶＧ）10］12、配列番号２、およびＥＬＰ５［（ＶＰＧＶＧ）6（ＶＰＧＫＧ）］16、配列番号１９）と混合した。ＥＬＰ溶液は、２００μＬの全反応液量で０ｍｇ／ｍＬ（コントロール）、２０ｍｇ／ｍＬ、および５０ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。ＥＬＰ−ＩＬ１Ｒａ混合物は、凝集体に複合体化することが観察された。上清のアリコート（５μＬ）を上清中のｒｈＩＬ１Ｒａ濃度の尺度として、経時的にシンチレーション計数によって［3Ｈ］についてアッセイした。測定結果は、溶液中のｒｈＩＬ１Ｒａ遊離率％＝（サンプルのＣＰＭ／コントロールのＣＰＭ）×１００を決定するためにコントロール（０ｍｇ／ｍＬ）に対して標準化した。データは、捕捉後２４時間以内は安定性である。ここで示されるデータは平衡化の９６時間後のものである。結果は、ＥＬＰが混合後にこの化合物の２５〜５５％まで取り込まれ得ることを示している。
【実施例４】
【００４９】
[ＥＬＰ−ＩＬ１Ｒａ融合タンパク質の設計、合成および特性分析]
このドラッグデリバリーシステムの機能検証試験では、ＥＬＰおよびＩＬ１Ｒａの２つの凝集性融合タンパク質を以下のように遺伝子組換えにより合成した。ヒトＩＬ１Ｒａの遺伝子は、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６３３−８によって以前に記載されたように、ＬＰＳ活性化Ｕ９３７細胞からＰＣＲクローニングした。２つのＥＬＰ調製物は、Ｃｈｉｌｋｏｔｉへの米国特許第６，８５２，８３４号によって記載されたように合成した：ＥＬＰ１［（ＶＰＧＶＧ）5（ＶＰＧＧＧ）3（ＶＰＧＡＧ）2］9、（配列番号２０）、ＭＷ  ３６ｋＤａ、およびＥＬＰ４［（ＶＰＧＶＧ）10］3、（配列番号２１）、ＭＷ  １４．５ｋＤａ。各ＥＬＰ遺伝子は、次に３０．２ｋＤａおよび５３ｋＤａの分子量をもつ２つのＥＬＰ−ＩＬ１Ｒａ融合タンパク質（表１〜２を参照）を生成するために、伝統的な分子生物学技術を用いてＩＬ１Ｒａを含むベクター（ｐＥＴ−２５ｂ＋）にサブクローニングした。融合タンパク質は次に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現させ、公知の技術であるＵｒｒｙへの米国特許第６，６９９，２９４号およびＣｈｉｌｋｏｔｉへの米国特許第６，８５２，８３４号に従って熱的に精製した。融合タンパク質のサイズおよび純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試験して、図７Ａに示した。ここで使用した熱的な精製法は、９５％を超える純度の、細菌増殖１リットル当たり５０ｍｇより多い融合タンパク質を産生した。
【００５０】
各融合タンパク質の温度に駆動される凝集は動的光散乱によって評価した、すなわち、融合タンパク質の希釈液（２５μＭ）を２０〜６０℃の範囲にわたって１℃間隔で加熱しながら、融合タンパク質によるレーザー光の散乱を監視した。散乱データから、流体力学的半径（Ｒh）は球状粒子についてのＳｔｏｋｅｓ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎの関係によって決定した。凝集温度は、その温度より高いと大きな（＞１００ｎｍ）粒子が形成し始めて融合タンパク質が凝集する温度であると規定された。図７Ｂは、設計された融合タンパク質が温度に駆動される相転移を行い、大きな凝集体を形成することを示している。凝集体は、３７℃未満の温度で形成し始める。この熱応答性挙動はドラッグデリバリーシステムの重要な部分である。このことは、ＥＬＰおよびＩＬ１Ｒａの設計された融合タンパク質が注射の時点および部位で凝集することを意味しており、これはタンパク質薬であるＩＬ１Ｒａの半減期の増加をもたらす。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
【表２】
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【００５３】
【表３】
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【実施例５】
【００５４】
[ＥＬＰ−ＩＬ１Ｒａ融合タンパク質の生物活性]
代表的な融合タンパク質（ＥＬＰ４−ＩＬ１Ｒａ）の生物活性を、以前に記載されたように、Ｃｏｎ  Ａ−刺激マウスＣ５７初代胸腺細胞のＩＬ−１β増強の増大を阻害する能力について試験した。簡単には、初代胸腺細胞は新たに致死させた５〜７週齢のＣ５７マウスから機械的に単離して、５％  ＦＣＳ、１μｇ／ｍＬ  ＣｏｎＡ（Ｓｉｇｍａ社）および１ｎｇ／ｍＬのｒｍＩＬ−１β（Ｐｉｅｒｃｅ）が添加されたＲＰＭＩ  １６４０中に約２×１０6ｃｅｌｌｓ／２００μＬの密度で懸濁させた。これらの細胞を４８時間にわたり市販のｒｈＩＬ１Ｒａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）もしくはＥＬＰ４−ＩＬ１Ｒａ融合タンパク質（上述したように）いずれかの連続希釈液の存在下でインキュベートした。胸腺細胞の増殖を［3Ｈ］−チミジン（０．５μＣｉ／ウエル）の取込みによって評価した。データは、６個の同型培養の［3Ｈ］−チミジン取込みの平均ＣＰＭ±ＳＤとして表示した。５０％阻害（ＩＣ５０）を引き起こす最高濃度は、データをシグモイド関数にフィッティングすることによって決定した。ＥＬＰ４−ＩＬ１Ｒａ融合タンパク質は、５２ｐＭのｒｍＩＬ−１βを阻害する６１．４±１９．８ｎＭのＩＣ５０を備える有意な生物活性を示した。図８を参照されたい。
【実施例６】
【００５５】
[腫瘍への投与]
本発明の組成物を投与する実施例は、図９に提供されている。凝集性ＥＬＰ（黒棒）および非凝集性ＥＬＰ（斜線棒）の腫瘍内における注射用量の百分率（％ＩＤ）が示されている。両方のタイプのＥＬＰをヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ）の脚のヒト扁平上皮癌（ＦａＤｕ）腫瘍内へ注入した（４μＬ／分）。データは平均値±ＳＥＭであり、ｎ＝１〜９である。非凝集性ＥＬＰと比較して、凝集性ＥＬＰの用量の方がはるかに多いことに留意されたい。
【００５６】
上記は、本発明の例示であり、それらを限定するものと見なされてはならない。本発明は、上述の特許請求の範囲によって規定されており、特許請求の範囲の同等物はその中に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】提案されたドラッグデリバリーシステムの１つの実施形態を例示する略図である。（ａ）感熱性バイオエラスティックポリマー（ＥＬＰ）に付着させた化合物（薬物）は、組織領域（例えば、関節腔）内に注射することができ、凝集体からの化合物の放出は経時的に起こる。遊離形態では、この化合物は図示したように受容体へ結合するために利用できる。化合物−バイオエラスティックポリマーの「遊離」画分は、経時的に組織領域（例えば、関節腔）から除去される。（ｂ）化合物の捕捉を促進する、組織領域への送達中もしくは送達前に熱感受性バイオエラスティックポリマーと最初に混合された化合物を示している、また別の例である。化合物の放出は経時的に発生し、「遊離」化合物は経時的に組織領域から除去される。
【図２】上清中で経時的に検出されたＥＬＰの画分であり、３７℃におけるＥＬＰ凝集体の平衡へ進む。結果は、ＥＬＰ４−９０（［（ＶＰＧＶＧ）10］9、配列番号１）およびＥＬＰ４−１２０（［（ＶＰＧＶＧ）10］12、配列番号２）について示されている（平均値±ＳＤ、ｎ＝４）。転移温度を超えるＥＬＰは３７℃で平衡化され、逆温度相転移を促進した。上清は３７℃で新鮮なＰＢＳと交換し、上清のアリコート中のＥＬＰ濃度を２８０ｎｍの吸光度によって経時的に定量した。データを［ＥＬＰ］＝［ＥＬＰ］SS−Ａ  ｅｘｐ（−ｔ／τ）の形の一次の指数関数（実線）へフィッティングして、平衡の時間定数（τ）および平衡時に凝集形態に含有されていないＥＬＰの画分（［ＥＬＰ］SS）を入手した。ＥＬＰ４−９０については、定数は、［ＥＬＰ］SS＝０．２１およびτ＝３１ｈであることが見いだされた。ＥＬＰ４−１２０については、定数は、［ＥＬＰ］SS＝０．１８およびτ＝４３ｈであることが見いだされた。
【図３】ラットモデルにおける右膝関節内への関節内注射後の、非凝集性［14Ｃ］ＥＬＰ（Ｔt＞５０℃）の生体内分布。注射された用量（ＩＤ／ｇｍ）は、注射後１０分に注射された膝区画から回収された（回収された組織および液体１ｇ当たりの）14Ｃの量である。個々の区画について、各組織もしくは液体についての％ＩＤ／ｇｍを決定するために、14Ｃ（回収された組織もしくは液体１ｇ当たり）をこの数値によって標準化した。全データは、平均値±ＳＥ（ｎ＝５）として表示されている。（Ａ）＊ｐ＜０．０５、０時点とは統計的に差がある；＋ｐ＜０．０５、未注射（左）膝区画とは統計的に差がある。（Ｂ）＊ｐ＜０．０５、０時点とは統計的に差がある；＋ｐ＜０．０５、血液とは統計的に差がある。（Ｃ）［14Ｃ］ＥＬＰの濃度は全ての器官について１％ＩＤ／ｇｍを下回ることが見いだされ、これらの組織は全時点において未注射（左）膝とは統計的に差がないことが見いだされた。
【図４】ラットモデルの右膝関節内への関節内注射をした後の凝集性［14Ｃ］ＥＬＰ（Ｔt＜３５℃）の生体内分布。注射された用量（ＩＤ）は、０時点（注射後１０分）に注射された膝区画から回収された（回収された組織および液体１ｇ当たりの）14Ｃの量である。個々の区画について、各組織もしくは液体についての％ＩＤ／ｇｍを決定するために、（回収された組織もしくは液体１ｇ当たりの）14Ｃをこの数値によって標準化した。全データは、平均値±ＳＥ（ｎ＝５）として表示されている。（Ａ）＊ｐ＜０．０５、０時点とは統計的に差がある；＋ｐ＜０．０５、未注射（左）膝区画とは統計的に差がある。（Ｂ）＊ｐ＜０．０５、０時点とは統計的に差がある；＋ｐ＜０．０５、血液とは統計的に差がある。（Ｃ）［14Ｃ］ＥＬＰの濃度は全ての器官について１％ＩＤ／ｇｍを下回ることが見いだされ、これらの組織は全時点において未注射（左）膝とは統計的に差がないことが見いだされた。
【図５】注射された関節区画における［14Ｃ］ＥＬＰの経時的な生体内分布。注射された用量（ＩＤ／ｇｍ）は、０時点（注射後１０分）に注射された膝区画から回収された（回収された組織および液体１ｇ当たりの）14Ｃの量である。その後の時点でのＩＤ／ｇｍは、時間の関数として膝関節区画についての％ＩＤ／ｇｍを決定するためにこの数値によって標準化した。（Ａ）非凝集性ＥＬＰ（Ｔt＞５０℃）および（Ｂ）凝集性ＥＬＰ（Ｔt＜３５℃）。データは平均値±ＳＥ（ｎ＝５）として表示し、一次指数関数的崩壊関数（実線）へフィッティングし、片対数軸上にプロットした。信頼区間（９５％、破線）もまた示されている。各フィッティングに対して時間定数（τ）を使用して、２つのＥＬＰタイプの関節半減期を計算した［ｔ1/2＝τ  ｌｎ（２）］。
【図６】インビトロでＥＬＰと混合した後に溶液へ放出された放射標識化合物の定量結果。２．５μｇ／ｍＬの［3Ｈ］ｒｈＩＬ１Ｒａを、３７℃で様々な濃度の相違するＥＬＰ調製物（ＥＬＰ４−１２０（［（ＶＰＧＶＧ）10］12、配列番号２）およびＥＬＰ５（［（ＶＰＧＶＧ）6（ＶＰＧＫＧ）］16、配列番号３））と混合した。ＥＬＰ溶液は、２００μＬの全反応液量中で０ｍｇ／ｍＬ（コントロール）、２０ｍｇ／ｍＬ、および５０ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。ＥＬＰ−ＩＬ１Ｒａ混合物は、凝集体に複合体化することが観察された。上清のアリコート（５μＬ）は、上清中のｒｈＩＬ１Ｒａ濃度の指標としてシンチレーション計数によって経時的に［3Ｈ］についてアッセイした。測定値は、溶液中のｒｈＩＬ１Ｒａ放出率＝（サンプルのＣＰＭ／コントロールのＣＰＭ）×１００を決定するために、コントロール（０ｍｇ／ｍＬ、白棒）に対して標準化した。データは、捕捉後２４時間以内は安定性である。データは、ここでは平衡化の９６時間後を示している（ｎ＝５、平均値＋ＳＤ）。結果は、ＥＬＰが混合後にこの化合物の２５〜５５％を取り込めることを示している。
【図７】（Ａ）２回の熱的な精製後の２種の融合タンパク質についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（Ｂ）２つの融合タンパク質の温度に伴う凝集および粒径は類似しており、３７℃未満の温度で始まる大きな（＞１００ｎｍ）粒子の形成を示した。
【図８】ｒｈＩＬ１ＲａもしくはＥＬＰ４−ＩＬ１Ｒａ融合タンパク質によるＣｏｎ  Ａ誘導性ＩＬ−１依存性初代マウス胸腺細胞の増殖の阻害。細胞は、１ｎｇ／ｍＬのマウスＩＬ−１β、および融合タンパク質もしくはｒｈＩＬ  １Ｒａの濃度を増加させながら、４８時間にわたり培養した。データは、コントロール増殖率（％）と、存在するＩＬ−１βの量に対してモル過剰で加えられたＩＬ−１阻害剤の量、の半対数プロットとして表示した。平均値±ＳＤ（ｎ＝６）、データは各タンパク質についてのＩＣ５０を決定するためにシグモイド関数にフィッティングした。
【図９】凝集性ＥＬＰ（黒棒）および非凝集性ＥＬＰ（斜線棒）の腫瘍における注射された用量の百分率（％ＩＤ）。両方のタイプのＥＬＰをヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ）の脚のヒト扁平上皮癌（ＦａＤｕ）腫瘍内へ注入した（４μＬ／分）。データは平均値±ＳＥＭであり、ｎ＝１〜９である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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