(57)【要約】  動物由来成分を含まず、非動物由来増殖培地に由来する成分を本質的に含まないベジタリアンプロテインＡを産生するために、多次元的精製方法を使用して、プロテインＡの産生に使用される非動物性発酵培地に由来するプロテインＡ中の望まれない非動物由来成分の不純物を除去する、ベジタリアン（非動物由来）プロテインＡの精製。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非動物由来のプロテインＡの精製方法であって、
（ａ）ベジタリアンアミノ酸またはペプチドを含有する培地中で黄色ブドウ球菌の分泌型系統を発酵させることにより産生された非動物由来プロテインＡ溶液を提供すること、ここで、当該培地は、動物の生成物を含まないものである；
（ｂ）濾過したプロテインＡ溶液を第１カラムに負荷すること；
（ｃ）バッファー−塩混合物でカラムを洗浄し、カラムから望まれない色および混入しているタンパク質を洗い流すこと；
（ｄ）プロテインＡを第１カラムから溶出し、プロテインＡ溶液貯留物を産生すること；
（ｅ）プロテインＡ溶液貯留物のｐＨおよび伝導率を調節すること；
（ｆ）プロテインＡ溶液貯留物からのプロテインＡを第２カラムに負荷すること；
（ｇ）バッファー−塩混合物で第２カラムを洗浄し、カラムから望まれない色および混入しているタンパク質を洗い流すこと；および、
（ｈ）プロテインＡを第２カラムから溶出し、精製プロテインＡ溶液を産生すること；
を含み、
ここで、第１カラムは、（１）陰イオン交換カラム、ＨＩＣカラムおよびセラミックのヒドロキシアパタイトカラムからなる群、または、（２）陽イオン交換カラムから選択され；そして、第１カラムが、陰イオン交換カラム、ＨＩＣカラムおよびセラミックのヒドロキシアパタイトカラムからなる群から選択されるカラムである場合、第２カラムは陽イオン交換カラムであり、第１カラムが陽イオン交換カラムである場合、第２カラムは、陰イオン交換カラム、ＨＩＣカラムおよびセラミックのヒドロキシアパタイトカラムからなる群から選択されるカラムである、方法。
【請求項２】
第１カラムが、陰イオン交換カラム、ＨＩＣカラムおよびセラミックのヒドロキシアパタイトカラムからなる群から選択され；そして、第２カラムが陽イオン交換カラムである、請求項１に記載の非動物由来プロテインＡの精製方法。
【請求項３】
付加的段階：
（ｉ）集めるのに適する分画を選択するために、第１カラムおよび第２カラムからの精製プロテインＡの各分画の、２７５ｎｍおよび３４０ｎｍの吸光度を監視し、Ａ２７５／Ａ３４０比を得ること、
を含む、請求項１に記載の精製方法。
【請求項４】
第１カラムが陰イオン交換カラムである、請求項２に記載の精製方法。
【請求項５】
第１カラムがＨＩＣカラムである、請求項２に記載の精製方法。
【請求項６】
第１カラムがセラミックのヒドロキシアパタイトカラムである、請求項２に記載の精製方法。
【請求項７】
さらなる段階：
（ｋ）精製プロテインＡ溶液を、乾燥生成物に乾燥させること、
を含む、請求項１に記載の精製方法。
【請求項８】
乾燥が凍結乾燥により起こる、請求項７に記載の精製方法。
【請求項９】
プロテインＡ溶液を第１カラムに負荷する前に、細菌細胞、粒子および低分子量分子（＜１０,０００ダルトン）を除去するために該プロテインＡ溶液を濾過するさらなる段階を含む、請求項１に記載の精製方法。
【請求項１０】
第１カラムが陽イオン交換カラムであり、第２カラムが、陰イオン交換カラム、ＨＩＣカラムおよびセラミックのヒドロキシアパタイトカラムからなる群から選択されるカラムである、請求項１に記載の非動物由来プロテインＡの精製方法。
【請求項１１】
付加的段階：
（ｉ）集めるのに適する分画を選択するために、第１および第２カラムからの精製プロテインＡの各分画の、２７５ｎｍおよび３４０ｎｍの吸光度を監視し、Ａ２７５／Ａ３４０比を得ること、
を含む、請求項１０に記載の精製方法。
【請求項１２】
第２カラムが陰イオン交換カラムである、請求項１０に記載の精製方法。
【請求項１３】
第２カラムがＨＩＣカラムである、請求項１０に記載の精製方法。
【請求項１４】
第２カラムがセラミックのヒドロキシアパタイトカラムである、請求項１０に記載の精製方法。
【請求項１５】
さらなる段階：
（ｊ）精製プロテインＡ溶液を、乾燥生成物に乾燥させること、
を含む、請求項１０に記載の精製方法。
【請求項１６】
乾燥が凍結乾燥により起こる、請求項１５に記載の精製方法。
【請求項１７】
プロテインＡ溶液を陽イオン交換カラムに負荷する前に、細菌細胞、粒子および低分子量分子（＜１０,０００ダルトン）を除去するために該プロテインＡ溶液を濾過するさらなる段階を含む、請求項１０に記載の精製方法。
【請求項１８】
ベジタリアンプロテインＡ−クロマトグラフィー樹脂を形成させるための、請求項１の方法により産生され、クロマトグラフィー樹脂に固定された、精製ベジタリアンプロテインＡ。
【請求項１９】
クロマトグラフィー樹脂が合成ポリマーまたは無定形物質である、請求項１８に記載のベジタリアンプロテインＡクロマトグラフィー樹脂。
【請求項２０】
クロマトグラフィー樹脂が、ポリメタクリレートまたはポリガラクトースからなる群から選択される合成ポリマーである、請求項１９に記載のベジタリアンプロテインＡクロマトグラフィー樹脂。
【請求項２１】
クロマトグラフィー樹脂が、シリカまたは珪藻土からなる群から選択される無定形物質である、請求項１９に記載のベジタリアンプロテインＡクロマトグラフィー樹脂。
【請求項２２】
ベジタリアンプロテインＡのカルボキシルまたはアミノ基を、クロマトグラフィー樹脂の化学的官能基と反応させることにより産生される、請求項１８に記載のベジタリアンプロテインＡクロマトグラフィー樹脂。
【請求項２３】
プロテインＡ−クロマトグラフィー樹脂を形成させるための、請求項２の方法により産生され、クロマトグラフィー樹脂に固定された、精製ベジタリアンプロテインＡ。
【請求項２４】
クロマトグラフィー樹脂が合成ポリマーまたは無定形物質である、請求項２３に記載のベジタリアンプロテインＡクロマトグラフィー樹脂。
【請求項２５】
クロマトグラフィー樹脂が、ポリメタクリレートまたはポリガラクトースからなる群から選択される合成ポリマーである、請求項２４に記載のベジタリアンプロテインＡクロマトグラフィー樹脂。
【請求項２６】
クロマトグラフィー樹脂が、シリカまたは珪藻土からなる群から選択される無定形物質である、請求項２４に記載のベジタリアンプロテインＡクロマトグラフィー樹脂。
【請求項２７】
ベジタリアンプロテインＡのカルボキシルまたはアミノ基を、クロマトグラフィー樹脂の化学的官能基と反応させることにより産生される、請求項２３に記載のベジタリアンプロテインＡクロマトグラフィー樹脂。
【請求項２８】
抗体または抗体断片を請求項２３のベジタリアンプロテインＡクロマトグラフィーカラムと接触させることを含む、クロマトグラフィー樹脂への抗体または抗体断片の結合方法。
【請求項２９】
抗体または抗体断片を請求項２５のベジタリアンプロテインＡクロマトグラフィーカラムと接触させることを含む、クロマトグラフィー樹脂への抗体または抗体断片の結合方法。
【請求項３０】
プロテインＡ−クロマトグラフィー樹脂を形成させるために、請求項１０の方法により産生され、クロマトグラフィー樹脂に固定された、ベジタリアン精製ベジタリアンプロテインＡ。
【請求項３１】
クロマトグラフィー樹脂が合成ポリマーまたは無定形物質である、請求項３０に記載のベジタリアンプロテインＡクロマトグラフィー樹脂。
【請求項３２】
クロマトグラフィー樹脂が、ポリメタクリレートまたはポリガラクトースからなる群から選択される合成ポリマーである、請求項３１に記載のベジタリアンプロテインＡクロマトグラフィー樹脂。
【請求項３３】
クロマトグラフィー樹脂が、シリカまたは珪藻土からなる群から選択される無定形物質である、請求項３１に記載のベジタリアンプロテインＡクロマトグラフィー樹脂。
【請求項３４】
ベジタリアンプロテインＡのカルボキシルまたはアミノ基を、クロマトグラフィー樹脂の化学的官能基と反応させることにより産生される、請求項３０に記載のベジタリアンプロテインＡクロマトグラフィー樹脂。
【請求項３５】
抗体または抗体断片を請求項１８のベジタリアンプロテインＡクロマトグラフィー樹脂と接触させることを含む、クロマトグラフィー樹脂への抗体または抗体断片の結合方法。
【請求項３６】
請求項３５の方法によりベジタリアンプロテインＡに結合した、抗体または抗体断片。
【請求項３７】
抗体または抗体断片を請求項２３のベジタリアンプロテインＡクロマトグラフィーカラムと接触させることを含む、クロマトグラフィー樹脂への抗体または抗体断片の結合方法。
【請求項３８】
請求項３７の方法によりベジタリアンプロテインＡに結合した、抗体または抗体断片。
【請求項３９】
抗体または抗体断片を請求項３０のベジタリアンプロテインＡクロマトグラフィーカラムに接触させることを含む、クロマトグラフィー樹脂への抗体または抗体断片の結合方法。
【請求項４０】
請求項３９の方法によりベジタリアンプロテインＡに結合した、抗体または抗体断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、動物起源成分を含まず、非動物由来増殖培地に由来する成分を本質的に含まないベジタリアンプロテインＡを産生するために、多次元的精製方法を使用して、プロテインＡの産生に使用される非動物性発酵培地に由来するプロテインＡ中の望まれない非動物由来成分の不純物を除去する、ベジタリアン（非動物由来）プロテインＡの精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
プロテインＡは、黄色ブドウ球菌によって作られる細胞壁タンパク質である。グラム陽性黄色ブドウ球菌の免疫グロブリン結合タンパク質であるプロテインＡは、ヒト、モルモット、ブタおよびウサギ由来の免疫グロブリンのＦｃ領域に強く結合する。Langone, (1982) Adv. Immunol. 32:157 and Lindmark (1983) J. Immunol. Methods 62:1 参照。プロテインＡは、免疫グロブリンの抗原に対する親和性に影響を与えずに、ＶＨ３領域を有する免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）に、より少ない程度で結合する。プロテインＡは、モノクローナル抗体を精製するために商業的に使用され、それは次いで炎症性疾患および癌などのヒトの疾患の治療剤としてしばしば使用される。また、プロテインＡは、それ自体が治療剤として使用され得る。プロテインＡは、リウマチ性関節炎などの自己免疫疾患において循環している免疫複合体に結合させるために、または、感染のある者において特異的サイトカイン産生を刺激するために、患者に投与され得る。加えて、クロマトグラフィー樹脂と組み合わされると、プロテインＡは、自己免疫疾患および移植臓器拒絶などの障害において、ＩｇＧ複合体を除去することにより血漿または全血を処理する治療的吸収体として作用できる。
【０００３】
黄色ブドウ球菌のいくつかの系統では、プロテインＡは細胞壁に結合したままであるが、いくつかの他の系統（分泌型）では、プロテインＡは、分子量４０−５５,０００の可溶性タンパク質生成物として増殖培地に放出される。Lindmark, (1977) Eur. J. Biochem. 74:623 参照。プロテインＡは、モノクローナル抗体の商業的産生において専ら使用されている。可溶性および機能性プロテインＡおよびプロテインＡの５個のＩｇＧ結合ドメインのいくつかに相当するプロテインＡの機能性断片が分子クローニングにより産生され、それらの全てがＩｇＧへの親和性を示した。典型的には、それらのクローンは、ウシ乳カゼイン、哺乳動物貯蔵肉またはブロスなどの動物の供給源に部分的または全体的に由来する培地中で増殖させられた細菌中で発現される。
【０００４】
元来、プロテインＡは黄色ブドウ球菌の細胞壁に由来するものであったが、このタンパク質を分泌する細菌の系統が単離され、これもプロテインＡを得るために使用されている。しかしながら、従来法によるプロテインＡの製造は、ヒトの治療剤におけるその使用について問題を提起する。黄色ブドウ球菌は、細菌へのアミノ酸供給源として動物性生成物を含有する培地中で増殖させられる。特に、ウシの加水分解産物および抽出物は、細菌の増殖培地の添加物として一般的に使用される。故に、動物由来生成物を含有する培養培地からプロテインＡを得ることは、狂牛病、スクレイピーおよび消耗性疾患の原因物質であるプリオンなどの動物性生成物が培地中に存在し得、ヒトの患者に伝染する可能性を導く。プロテインＡの製造は、また、下流の精製工程中で動物性生成物に曝され、汚染され得る。例えば、現在使用されている方法では、プロテインＡは、ＩｇＧ Sepharose クロマトグラフィーカラムを使用して生成され、Sepharose クロマトグラフィーカラムに結合しているＩｇＧは、典型的には動物起源のものである。しかしながら、単離および精製工程中にプロテインＡ調製物と組み合わされた動物性生成物は、現在知られている方法によって、調製物から容易には精製されない。
【０００５】
伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）と分類される数種の疾患の１つであるウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）およびプリオン関連疾患である変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）などの様々な消耗性疾患の伝染に関する最近の健康上の関心は、培地中で増殖する細菌から得られる生成物がヒトと接触するようになり得る場合に、細菌培養培地から動物由来物質を除去することを促した。従って、植物由来培地が、ビタミン、アミノ酸または抗体などの治療用タンパク質などの最終的に医薬物質になる生成物を産生するように設計された微生物を増殖させるために、動物由来培地に取って代わり始めた。故に、高い純度、一般的に使用されるプロテインＡと少なくとも同等の結合特性、並びに、動物不含増殖条件および精製過程の保証を有さなければならない治療用抗体において使用するための、非動物由来プロテインＡを製造および精製する商業的に実施可能な手段への要望がある。
【０００６】
動物由来の微生物発酵から生成物を単離するために大昔に開発された精製方法は、発酵過程で微生物により産生されたか、または、増殖培地の一部として偶発的に添加され、微生物により変化したか、または、変化しないままである不要な成分を除去するように設計された。精製の分野における長年の実務は、そのような精製を達成する多数の方法を導いた。しかしながら、微生物により培地中に分泌された可溶性タンパク質の単離などの場合、精製方法の大部分が、急速な増殖および関心のある生成物の効率的な産生を促進するために高レベルで添加された培地成分の除去のために費やされた。培地成分を変える場合には、新しい範囲の汚染が起こる見込みがあり、従って、それらを関心のある生成物から除去する必要がある。しかしながら、それらは、過去の培地からの単離のために開発されたプロトコールにより精製しきれないことがある。故に、動物由来増殖培地から非動物由来培地成分への変更は、精製方法に、培地成分の溶解度、炭水化物内容、脂質内容、タンパク質内容、粒状物、粘度などの違いなどの様々な挑戦をもたらす。これらの各々は、本来は動物由来増殖培地の発酵および増殖のために開発された方法の速度、効率および有効性と関係がある。
【０００７】
動物起源に由来するプロテインＡは、通常、イオン交換カラムおよび／またはサイズ排除カラムの組合せを使用する「古典的」方法、またはアガロースもしくはシリカなどの不溶性マトリックスに共有結合した精製免疫グロブリン（動物由来）を用いる親和性カラムによる、２つの方法のいずれかにより精製される。動物由来混入物を含まないプロテインＡ生成物を産生するために、その直近の経歴から、そして発酵過程から、また、精製方法から、いかなる動物由来生成物をも除去する必要がある。従って、独特の非動物由来培養培地中の増殖生物の保存培養物を単離すること、微生物を非動物由来培地中で増殖させること、および、混入する細菌性タンパク質および培地由来成分を含まない程度まで、非動物由来培地を使用してプロテインＡ生成物を精製することが必要となる。
【０００８】
従来の動物由来培地で増殖した黄色ブドウ球菌から古典的方法によりプロテインＡを精製する試みは、ＳＤＳゲル電気泳動および典型的なプロテインＡのＵＶスペクトルを用いる分析用クロマトグラフィーにより測定される通り、高純度の典型的なタンパク質生成物を与えた（Sjoquist, (1972) Eur. J. Biochem. 29:572 参照）。１−１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、溶液はほぼ無色であった。しかしながら、非動物由来培地で増殖し、同じ方法により精製された黄色ブドウ球菌を使用する我々の初期試行では、プロテインＡ生成物は黄色を帯び、高ＵＶおよび可視領域（３００−４５０ｎｍ）において実質的な吸光を与えたが、ＳＤＳゲル電気泳動では同じパターンを与え、このことは高純度を示した。これは、非タンパク質性の混入物の存在があることを示唆した。実際に、そのようなプロテインＡの１−５ｍｇ／ｍＬ溶液は、増殖培地の希釈版に似た色である明確な黄茶色であった。従って、実存する精製方法は、非動物由来増殖培地の成分を全て除去するわけではないと考えられる。従って、ベジタリアンプロテインＡを精製するための、新しい、改良された精製方法を提供する必要性が高まっている。
【発明の開示】
【０００９】
発明の要旨
本発明は、非動物由来のプロテインＡ精製方法を提供し、それは、
（ａ）ベジタリアンアミノ酸またはペプチドを含有する培地中で黄色ブドウ球菌の分泌型系統を発酵させることにより産生された非動物由来プロテインＡ溶液を提供すること、ここで、当該培地は、動物の生成物を含まないものである；
（ｂ）濾過したプロテインＡ溶液を第１カラムに負荷すること；
（ｃ）バッファー−塩混合物でカラムを洗浄し、カラムから望まれない色および混入しているタンパク質を洗い流すこと；
（ｄ）プロテインＡを第１カラムから溶出し、プロテインＡ溶液貯留物を産生すること；
（ｅ）プロテインＡ溶液貯留物のｐＨおよび伝導率を調節すること；
（ｆ）プロテインＡ溶液貯留物からのプロテインＡを第２カラムに負荷すること；
（ｇ）バッファー−塩混合物で第２カラムを洗浄し、カラムから望まれない色および混入しているタンパク質を洗い流すこと；および、
（ｈ）プロテインＡを第２カラムから溶出し、精製プロテインＡ溶液を産生すること；
を含み、
ここで、第１カラムは、（１）陰イオン交換カラム、ＨＩＣカラムおよびセラミックのヒドロキシアパタイトカラムからなる群、または、（２）陽イオン交換カラムから選択され；そして、第１カラムが、陰イオン交換カラム、ＨＩＣカラムおよびセラミックのヒドロキシアパタイトカラムからなる群から選択されるカラムである場合、第２カラムは陽イオン交換カラムであり、第１カラムが陽イオン交換カラムである場合、第２カラムは、陰イオン交換カラム、ＨＩＣカラムおよびセラミックのヒドロキシアパタイトカラムからなる群から選択されるカラムである。
【００１０】
本発明はまた、精製ベジタリアンプロテインＡクロマトグラフィー樹脂を形成させるための、クロマトグラフィー樹脂に固定された精製ベジタリアンプロテインＡを含む。本発明はさらに、抗体または抗体断片を精製ベジタリアンプロテインＡクロマトグラフィー樹脂と接触させることにより、抗体または抗体断片をクロマトグラフィー樹脂に結合させる方法を含む。本発明はさらに、精製プロテインＡクロマトグラフィー樹脂に結合した抗体または抗体断片を含む。
【００１１】
本発明は、浸出物中に高濃度のプロテインＡを与える非動物由来増殖培地における細菌発酵を提供し、それは、ダイアフィルトレーションおよびカラムを使用して精製され、ＳＤＳゲル電気泳動および化学および物理的試験で＞９５％純度であり、動物由来起源の使用済み培養培地から精製されたプロテインＡと実質的に同一である生成物をもたらす。さらに、非動物性増殖培地から残された混入物は、実質的に排除された。本発明の実施態様では、プロテインＡを分泌すると知られている黄色ブドウ球菌変種（var.）ＩＭＲＥの種培養を、種培養中の動物由来培地の持ち越し汚染を排除するために、２回の培養により連続的に増殖させた。種培養保存物を約４００の滅菌培養バイアルに移し、−７０℃で必要になるまで維持した。種培養を使用して、水中の１.８％ Soy Peptone (Sigma）、５％酵母抽出物（Sigma）、０.５％塩化ナトリウム（Mallinckrodt Baker）、０.２５％デキストロース、０.２５％二塩基リン酸カリウム（Fisher）およびｐＨ７.５をもたらすＮａＯＨで構成される２ｌの非動物由来培地に播種した。１６時間にわたる通気および１Ｍリン酸または水酸化ナトリウムの添加によるｐＨの維持により、３７℃での増殖を助長し、次いで、この種菌を同じ培地組成を含有する１６ｌの増殖チャンバーに移し、３７℃で、１６ｌ／分で通気し、少なくとも１０時間、または、５６０ｎｍの吸光度が５２に達するまで増殖を継続した。次いで、この１６ｌの培養物を、事前に滅菌した同じ培地を含む、３７５ｌほどのより大きい発酵槽のための種菌として使用することにより、より大きく実施し、空気１Ｌ／分／培地１ｌで、５６０ｎｍで約５０の吸光度に達するに十分な時間にわたり、再度増殖させ得る。細胞を遠心分離または０.１ミクロンフィルターを通す濾過により除去し、次いで、ブロス／培養培地を、Millipore PROCON 10,000 MWCO TFF メンブレンを通して濾過し、プロテインＡを保持し、塩濃度および低分子量成分の濃度を低下させ、バッファーを交換する。次いで、得られる濃縮タンパク質／ブロス溶液を適切なカラムにアプライし、次いでそれを緩衝溶液で洗浄し、次いで、高塩濃度を用いるグラジエントまたは段階溶出中にプロテインＡを溶出した。貯留物は適切な純度の活性画分からなり、単純に水で適切な塩濃度に希釈するか、または、濃縮およびバッファーの交換のためにダイアフロー（diaflow）処理した。次いで、このタンパク質溶液を、第２カラムにアプライし、それを洗浄し、次いでプロテインＡを緩衝化高塩濃度で溶出し、画分を集め、プロテインＡを、８０−１００％の回収率、ＨＩＣによる純度＞９５％、ＳＤＳゲル電気泳動による純度＞９５％で得、貯留物の２７５ｎｍ：３４０ｎｍの吸光度の比が７.０より大きいようにした。適切なカラムは、陰イオン交換マトリックス、セラミックのヒドロキシアパタイトマトリックス、疎水性マトリックスまたは陽イオン交換マトリックスであり得る。陰イオン交換マトリックスは、有用な陰イオン交換樹脂のいずれであってもよいが、本発明の好ましい実施態様は、予め２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７.８で平衡化した XWP 500 PolyQuat-35 (Mallinckrodt Baker # 7603) であった。好ましいセラミックのヒドロキシアパタイトマトリックス（Bio-Rad）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、���Ｈ７.８で予め平衡化した。陽イオン交換マトリックスは、有用な陽イオン交換樹脂のいずれであってもよいが、本発明の好ましい実施態様は、１３７ｍＭ酢酸−トリエタノールアミン−３０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４.５−６.０で予め平衡化したＷＰカルボキシ−スルホン（弱−強陽イオン交換剤）（Mallinckrodt Baker # 7587）である。典型的には、第２のイオン交換カラムの後、プロテインＡ溶液を透析またはダイアフィルトレーションしてバルクの塩およびバッファー成分を除去し、次いで冷凍および凍結乾燥し得る。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、非動物由来プロテインＡの精製方法を提供し、それは、
（ｂ）ベジタリアンアミノ酸またはペプチドを含有する培地中で黄色ブドウ球菌の分泌型系統を発酵させることにより産生された非動物由来プロテインＡ溶液を提供すること、ここで、当該培地は、動物の生成物を含まないものである；
（ｂ）濾過したプロテインＡ溶液を第１カラムに負荷すること；
（ｃ）バッファー−塩混合物でカラムを洗浄し、カラムから望まれない色および混入しているタンパク質を洗い流すこと；
（ｉ）プロテインＡを第１カラムから溶出し、プロテインＡ溶液貯留物を産生すること；
（ｊ）プロテインＡ溶液貯留物のｐＨおよび伝導率を調節すること；
（ｋ）プロテインＡ溶液貯留物からのプロテインＡを第２カラムに負荷すること；
（ｌ）バッファー−塩混合物で第２カラムを洗浄し、カラムから望まれない色および混入しているタンパク質を洗い流すこと；および、
（ｍ）プロテインＡを第２カラムから溶出し、精製プロテインＡ溶液を産生すること；
を含み、
ここで、第１カラムは、（１）陰イオン交換カラム、ＨＩＣカラムおよびセラミックのヒドロキシアパタイトカラムからなる群、または、（２）陽イオン交換カラムから選択され；そして、第１カラムが、陰イオン交換カラム、ＨＩＣカラムおよびセラミックのヒドロキシアパタイトカラムからなる群から選択されるカラムである場合、第２カラムは陽イオン交換カラムであり、第１カラムが陽イオン交換カラムである場合、第２カラムは、陰イオン交換カラム、ＨＩＣカラムおよびセラミックのヒドロキシアパタイトカラムからなる群から選択されるカラムである。
【００１３】
ある態様では、本発明は、
１．非動物由来培養培地中での黄色ブドウ球菌種培養の発生
２．非動物由来増殖培地中での種培養からの黄色ブドウ球菌の増殖
３．細胞全体および不溶性粒子を除去する濾過
４．ダイアフィルトレーション
５．２つの連続的な精製カラム
６．最も純粋な画分の貯留
７．透析またはダイアフィルトレーション
８．凍結乾燥
を含む。
【００１４】
天然産生、単離または遺伝子改変された系統を含む黄色ブドウ球菌の任意のプロテインＡ産生系統から、プロテインＡを得ることができる。黄色ブドウ球菌のプロテインＡ産生系統には、また、プロテインＡが細胞壁に埋め込まれたままである系統およびプロテインＡを増殖培地中に分泌する系統、好ましくは例えば黄色ブドウ球菌変種Ｉｍｒｅが含まれ得る。プロテインＡを黄色ブドウ球菌の細胞壁から回収する方法（例えば酵素消化）は、当業者に周知である。かくして回収されたプロテインＡは、消化された細胞成分を排除するために精製できる。しかしながら、プロテインＡを培地から回収するだけでよいように、プロテインＡを培地に分泌するブドウ球菌系統からプロテインＡを得るのが好ましい。
【００１５】
黄色ブドウ球菌の保存物から、微生物由来および植物由来の成分および栄養分の培地に連続的に播くことにより、動物性供給源の栄養分および成分を含まないように設計された種培養を得た。いくつかの培地組成は、特に培地の酵母抽出物内容に依存して、浸出物中の様々な量のプロテインＡを有する良好な増殖をもたらした。非動物由来培地の欠点は、最初のプロテインＡ溶液で呈される色の強度がより強いことである。過去に採用された手段を使用してプロテインＡを精製する当初の努力は、色の少ない動物由来培地から同じ方法で精製されたプロテインＡと比較して、実質的な量の色のある生成物を与えた。本発明の多次元交換カラムの方法を用いることは、この不純物による呈色を有意に低減するか、または実質的に排除した。本発明の方法に従い第２のクロマトグラフィーカラムから溶出されたプロテインＡは、色内容を実質的に低減させ、動物由来培地供給源から単離されたプロテインＡと物理および化学的に本質的に同一である高純度（ＳＤＳゲルにより＞９８％）のプロテインＡを与えた。
【００１６】
本明細書で言及するとき、「動物の生成物」は、非ヒト動物から伝達されるか、またはそれに由来する任意の物質と定義され、それらの物質には、ペプチド、タンパク質、アミノ酸、タンパク質様物質、核酸、ウイルスなどが含まれる。本明細書で言及するとき、用語「ベジタリアンプロテインＡ」は、発酵培地または精製媒体に由来する動物性生成物または任意の動物由来ペプチドにより汚染されていないプロテインＡ組成物と定義される。同様に、用語「ベジタリアン培地」は、動物性生成物または任意の動物由来ペプチドにより汚染されていない発酵培地を表す。本明細書で使用するとき、用語「ベジタリアンアミノ酸またはペプチド」は、非ヒト動物に由来しない任意のペプチド、タンパク質、アミノ酸またはタンパク質様物質を表す。
【００１７】
以下は、本発明で用いられる材料および方法の簡単な説明である。これらの材料および方法は、本発明の目的上用い得る材料と方法の例示説明であり、これらを限定するものではない。
【００１８】
黄色ブドウ球菌変種ＩＭＲＥに由来する種培養の保存。分泌型細菌を、細菌の増殖および所望の量のプロテインＡの産生に十分な任意の量のベジタリアン培地中で発酵させることができる。最も好ましくは、黄色ブドウ球菌を大規模な製造バッチで、発酵タンク中で増殖させる。発酵条件（即ち、空気流、温度、撹拌、ｐＨおよび圧力）は、例えばマイクロプロセッサーにより、または、他の電子工学的手段により、電子工学的に制御および／または監視できる。いくつかの特に好ましい条件には、約３７°、培地１ｌにつき約１ｌ／分の無菌空気の空気流での黄色ブドウ球菌の発酵が含まれる。培地は、当分野で知られている黄色ブドウ球菌の増殖用の条件培地の成分、典型的には、酵母抽出物、グルコースおよび必須塩からなることができ、そして、本発明の場合、ベジタリアンアミノ酸およびペプチド（例えば、ダイズ、エンドウマメ加水分解物または綿実加水分解物物のペプチド）をアミノ酸供給源として含む。ベジタリアンアミノ酸またはペプチドは、例えば、任意の非動物性（例えば、植物または植物様）または合成（例えば、化学的に合成された）供給源に由来し得、そして、本発明のある実施態様では、ベジタリアンアミノ酸またはペプチドは、ダイズに由来する。これらの成分は、精製脱イオン水に溶解された約５０ｇ／ｌの酵母抽出物、１５ｇ／Ｌのダイズペプチドおよび５ないし１０ｇ／Ｌのグルコースの濃度であり得、希リン酸および希水酸化ナトリウムを必要に応じて発酵中に添加して、ｐＨを約７ないし８に制御する。この培地は、発酵混合物の泡沫化を防止するために、少なくとも０.６７ｍＬ／Ｌのポリエチレングリコールをさらに含有できる。好ましくは、黄色ブドウ球菌変種ＩＭＲＥの少量の培養物を、非動物由来成分：水中、１.８％ Soy Peptone (Sigma）、５％酵母抽出物（Sigma）、０.５％塩化ナトリウム（Mallinckrodt Baker）、０.２５％デキストロース、０.２５％二塩基リン酸カリウム（Fisher）、３％寒天（Difco）、およびｐＨ７.５をもたらすＮａＯＨ、で構成される滅菌寒天培地に画線した。このプレートを３７℃で終夜インキュベートした。このプレートから単一のコロニーを使用し、同じ組成の他のプレートに画線により移動させ、同じ条件下で終夜増殖させた。この第２の画線からの単一のコロニーを、１２１℃２５分間のオートクレーブにより滅菌した１００ｍＬの滅菌非動物由来液体培地：水中、１.８％Soy Peptone (Sigma）、５％酵母抽出物（Sigma）、０.５％塩化ナトリウム（Mallinckrodt Baker）、０.２５％デキストロースおよび０.２５％二塩基リン酸カリウム（Fisher）およびｐＨ７.５をもたらすＮａＯＨ、に移した。この液体培養物を３００ＲＰＭで終夜３７℃で撹拌した。次いで、この液体培養物１０ｍＬを使用して、オートクレーブにより滅菌した１２ｌの非動物由来培地：３％ Select APSTM TSB (Becton-Dickinson and Co.）および０.０８％ポリエチレングリコール、を含有する１６ｌの発酵槽に播種した。培養物を、３７℃、約１２Ｌ／分の通気で、４００ＲＰＭで撹拌しながら、少なくとも１０時間、または、５６０ｎｍの吸光度５２の細胞密度まで、増殖させた。ｐＨを希ＮａＯＨおよび希リン酸で７.０＋／−０.５に維持した。培養ブロスを数回に分けて２０００ｘｇで３０分間遠心分離し、細胞を濃縮する。濃縮した細胞の塊を、オートクレーブにより滅菌した約４倍の体積の培地：３％ Select APSTM TSB (Becton-Dickinson and Co.）および０.０８％ポリエチレングリコール、に懸濁した。約４−５ｍＬずつの細胞懸濁液を各々約４００−５００の滅菌バイアルに移し、必要になるまで−７０℃で保存した。約５％のバイアルを試験し、細菌の純度を確認した。さらに、発酵ブロスを顕微鏡下で視覚的に評価し、ブロスが他の微生物で汚染されていないことを確認できる。同様に、培養物中の黄色ブドウ球菌を、顕微鏡を使用して、グラム陽性球菌の形状、多形性（即ち、単一のコロニー、連鎖状またはロゼット状）および約０.６ミクロンのサイズを有することを含む、適正な形態について検査できる。培養した黄色ブドウ球菌を、それらが血液寒天プレート上で円形の、盛り上がった、灰色がかった形態を示し、４８時間後にヒツジ血液のβ−溶血を引き起こす能力を有し、凝固酵素およびカタラーゼの酵素について陽性と試験されるか否かを決定することにより、品質および健康についても評価できる。
【００１９】
カラムから溶出されたプロテインＡ溶液の脱塩。一旦この連続方法における第２カラムから貯留物を得たら、本質的に塩不含（２ｍＳ／ｃｍより低い伝導率）となるまで脱イオンまたは蒸留水で透析またはダイアフィルトレーションする。透析膜は、製造業者の推奨に従い処理したＭＷＣＯ＜１０,０００のセルロース膜でできた壁を含む管状の膜またはカセットを含み得る。透析またはダイアフィルトレーションしたタンパク質溶液を、溶液が瓶の壁上で殻状に凍結することを促進する回転装置内の瓶中で凍結させ得るか、または、凍結温度より低い温度でプレートまたは棚板上の浅いガラス皿に置き得る。この実施態様では、−５５℃に設定した棚板上の大型ガラスペトリ皿中で、凍結溶液の温度が−１５℃またはそれ以下に達するまで凍結を行い、その時点で、予め２００−２５０ｍＴｏｒｒに設定した吸引により排出を開始し、棚板を−１５℃に設定する。凍結乾燥を２−２４時間継続し、その時点で、生成物が視覚的に乾燥するまで棚板温度を０℃に上昇させ、その時点で、棚板温度を２３℃に上昇させ、最終的な乾燥のために少なくとも２時間保持し、その時点で、乾燥白色ないし明黄褐色綿毛状生成物を取り出し、冷蔵または冷凍庫内で維持し得る。
【００２０】
分析用Ｃ４（ＨＩＣ）カラム。WP Butyl (C4) Reverse Phase 4.6 X 250 mm カラム (Mallinckrodt Baker # 7116-00) を、Waters 515 HPLC Pump を使用して、１.０ｍＬ／分で水：アセトニトリル：トリフルオロ酢酸（８０：２０：０.１）（体積）で徹底的に予め平衡化した。サンプルまたは標準を水で０.１−１.５ｍｇ／ｍＬに溶解または希釈し、０.０２５ｍＬを注入し、流出物を２１４、２７５および３４０ｎｍで監視した（Waters 996 Photodiode Array Detector）。注入後すぐに、平衡化バッファーで始まり３０分で平衡化バッファーと溶出バッファー（溶出バッファーは、２５：７５：０.１の水：アセトニトリル：トリフルオロ酢酸で構成される）の５０：５０混合物で終了する線形グラジエントを開始した。次のサンプルを注入する前に、カラムを溶出バッファー（１００％）で１分間すすぎ、次いで、平衡化バッファーで３５分間再平衡化した。２１４ｎｍの吸光ピーク下の面積をその装置により測定した。５ないし２５ｍｇの乾燥精製プロテインＡを１.５ｍｇプロテインＡ／ｍＬの濃度まで水に溶解し、０.３５−０.８５ｍＬを微量遠心管に−１０ないし−１５℃で必要になるまで保存することにより、プロテインＡの標準サンプルを作成した。１.５ｍｇプロテインＡ／ｍＬ凍結溶液の保存チューブを融解し、水で１：１、１：３、１：７および１：１５に希釈し、ひと組の濃度標準を生成させた。プロテインＡは、典型的には、１５−１７分で溶出される。標準の２１４ｎｍのプロテインＡピーク下の面積を、アプライした標準のプロテインＡ濃度に対してプロットし、標準曲線を生成させた。試験サンプルから得られた面積を、標準曲線と比較し、サンプルの濃度を得た。サンプルの面積が１.５ｍｇ／ｍＬの標準について得られた面積を超える場合、サンプルを水で適当に希釈し、再度実行した。
【００２１】
分析用サイズ排除カラム。標準的なサイズ排除カラム（7.8 x 300 mm TSK-Gel G3000 SW (Tosoh)）を、０.５Ｍ ＮａＣｌを含有する０.１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７.０で平衡化した。典型的には、０.１０ｍＬのサンプルをアプライし、０.５ｍＬ／分（Waters 515 HPLC Pump）で実行し、その間、流出物を２１４、２８０および３４０ｎｍ（Waters 996 Photodiode Array Detector）で監視した。２１４ｎｍの吸光ピーク下の面積をその装置により測定した。濃度の定量のために、５ないし２５ｍｇの乾燥精製プロテインＡを１.５ｍｇプロテインＡ／ｍＬの濃度まで水に溶解し、微量遠心管中で０.３５−０.８５ｍＬの分注物を−１０ないし−１５℃で必要になるまで保存することにより、プロテインＡの標準サンプルを作成した。１.５ｍｇプロテインＡ／ｍＬ凍結溶液の保存チューブを融解し、水で１：１、１：３および１：７に希釈し、ひと組の濃度標準を生成させた。プロテインＡは、１５−１６分で溶出した。標準の２１４ｎｍのプロテインＡピーク下の面積を、適用した標準のプロテインＡ濃度に対してプロットし、標準曲線を生成させた。試験サンプルから得られた面積を、標準曲線と比較し、サンプルの濃度を得た。サンプルの面積が１.５ｍｇ／ｍＬの標準について得られた面積を超える場合、サンプルを水で適当に希釈し、再度実行した。分子量の見積もりのために、標準試験タンパク質を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８に溶解し、１.０ｍｇ／ｍＬとし、０.１ｍＬを注入し、濃度標準について上記した通りに実行した。分子量の推定のために、既知分子量の標準のｌｏｇ１０を標準の保持時間に対してプロットすることにより標準曲線を得た。２１４ｎｍまたは２８０ｎｍで監視したサンプル中のタンパク質ピークの保持時間を、標準曲線と比較し、サンプルのタンパク質の分子量の推定を得た。プロテインＡは、既知構造およびＳＤＳゲル電気泳動により得られたデータからの予想値４０−５０,０００よりかなり高く、推定分子量８５,０００をもたらす位置で溶出した。これは、天然タンパク質の非球状的性質に関連するらしい（Bjork, (1972) Eur. J. Biochem. 29:579）。
【００２２】
変性ゲル電気泳動。タンパク質を含有する溶液を、１％ドデシル硫酸ナトリウム−０.１Ｍジチオスレイトール−６Ｍ尿素−０.１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６.８で、最終タンパク質濃度０.１−１.０ｍｇ／ｍＬに希釈または溶解し、次いで、６５℃に５−１０分間加熱し、室温に冷却した。タンパク質標準をキット形態で Sigma Chemical Co.または Bio-Rad から入手する。１ないし２５マイクロリットルのタンパク質溶液を、4-20% Ready Gels (Bio-Rad)、4-20% iGels (Gradigels)、4-20% Novex Pre-cast Gels (Invitrogen）などのタンパク質サブユニット（単量体）サイズ測定の目的で商業的に作成されたポリアクリルアミドゲルにアプライし得るか、または、１２％またはそれ以上のアクリルアミド／ビス−アクリルアミド（３７.５／１比）として Laemmli (Laemmli, (1970) Nature 227:680）に従いゲルを作成し得る。必要な感度に応じて、４０％メタノール−７％酢酸−水および０.１％クーマシーブルーＲ２５０または銀染技法を用いるいくつかの一般的に使用される方法のいずれかにより、製造業者または Laemmli の方法の指示に従い、電気泳動の終了時に、ゲルを固定し、染色し、脱染色する。銀染用のキットは購入できる（Sigma または Bio-Rad）。
【００２３】
動物由来および非動物由来培地から単離されたプロテインＡの紫外スペクトル特性。バックグラウンドの吸光度を、Perkin-Elmer λ800 上の１ｃｍ路長の石英キュベット中の水で、２００ないし４００ｎｍでとった。同様に、タンパク質サンプルで、２００−４００ｎｍで、バックグランドを差し引いて吸光度をとった。４００ないし２５０ｎｍ領域のいずれかの波長の吸光が吸光度２.０を超えるならば、２倍量の水でサンプルを希釈し、再度試験した。
【００２４】
２７５および３４０ｎｍの吸光度比。分光光度計を、１ｃｍ路長の石英キュベット中の水またはプロテインＡを溶解するバッファーでブランクとし、装置を２７５ｎｍでゼロに合わせた。問題の任意のタンパク質溶液の吸光を読み、同じ石英キュベット中、同じ波長で記録する。タンパク質を溶解するバッファーが２７５ｎｍまたは３４０ｎｍで吸光すると認識されるならば、装置をブランクにするために、水ではなく問題のバッファーを使用するべきである。この過程を３４０ｎｍで繰り返す。２７５ｎｍの吸光度の３４０ｎｍの吸光度に対する比を、Ａ２７５／Ａ３４０として記録し、第２カラムから溶出されたいずれのプロテインＡについても、７.０を超えないべきである。
【００２５】
精製プロテインＡの凍結乾燥。第２の精製カラムから溶出されたプロテインＡを水でダイアフィルトレーションするか、または、水で透析し、バルクの塩および低分子量成分を除去する。次いで、この溶液を、凍結液の殻を形成させるように回転している瓶の側面上に凍結させるか、または、急速に大型冷却ガラス皿内に凍結させる。冷凍溶液を−５５℃に設定した棚板上で凍結溶液の温度が−１５℃またはそれ以下に達するまで冷却し、その時点で、予め２００−２５０ｍＴｏｒｒに設定した吸引により排出を開始し、棚板を−１５℃に設定する。凍結乾燥を２ないし２４時間継続し、その時点で、生成物が視覚的に乾燥するまで棚板温度を０℃に上昇させ、その時点で、棚板温度を２３℃に上昇させ、最終的な乾燥のために少なくとも２時間保持し、その時点で、乾燥白色ないし明黄褐色綿毛状生成物を取り出し、冷蔵または冷凍庫内で維持し得る。
【実施例】
【００２６】
実施例
（１）黄色ブドウ球菌の大規模増殖。１つのバイアルの種培養を、５０ｇ／Ｌ酵母抽出物（Difco）、１５−２０ｇ／Ｌダイズペプトン（Sigma）、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ（Integra）、２.５−２５ｇ／Ｌグルコース（Fluka）、２.５ｇ／Ｌ二塩基リン酸カリウム（Mallinckrodt Baker）、１ｍＬ Anti-Foam (Dow)／培地１ｌおよび水で構成され、ｐＨを７.５−７.８に調節した滅菌培地を含む１６ｌの発酵槽中、非動物由来増殖培地中で増殖させた。１Ｌ／培地１ｌでの通気により３７℃での増殖を助長し、７.５−７.８でのｐＨの維持を１Ｍリン酸または希水酸化ナトリウムの添加により約１６−２２時間実行し、次いで、この種菌を同じ組成の滅菌培地を含む４００ｌの増殖チャンバーに移し、３７℃で、１Ｌ／分／培地１Ｌで通気し、８００ＲＰＭで撹拌しながら、少なくとも１０時間、少なくとも５６０ｎｍの吸光度５０の細胞密度まで、増殖を継続させた。この時点で、培地中の遊離の分泌形のプロテインＡの生成は、約０.２−１.０ｍｇプロテインＡ／ｍＬである。遠心分離により、または、０.１または０.２ミクロンフィルターを通す濾過により細胞を除去し、次いで、Millipore PROCON 10,000 MWCO TFF 膜を通してブロス／培養培地の濾液をダイアフィルトレーションし、プロテインＡを保持し、塩濃度および低分子量成分の濃度を低下させ、溶液の体積を低減させ、そして、バッファーをそれが適用されるカラムに対して適切なものに交換した。適切なカラムは、陰イオン交換マトリックス、セラミックのヒドロキシアパタイトマトリックス、疎水性マトリックスまたは陽イオン交換マトリックスのいずれかであり得る。陰イオン交換マトリックスは、WP DEAM (弱い) または WP PEI (Mallinckrodt Baker）などのいくつかの陰イオン交換樹脂のいずれかであり得るが、本発明の好ましい実施態様は、Waters 515 HPLC Pump を使用して ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７.８で予め平衡化した XWP 500 PolyQuat-35 である。セラミックのヒドロキシアパタイトマトリックス (Bio-Rad) を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７.８で予め平衡化した。疎水性マトリックスは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.８で平衡化した、０.５Ｍ硫酸アンモニウムを含有する、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソ−ブチルまたはペンチル−シリカなどのシリカに共有結合した短鎖脂肪族物質のいずれかであり得る。陽イオン交換マトリックスは、いくつかの陽イオン交換樹脂のいずれかであり得るが、本発明の好ましい実施態様は、ＷＰカルボキシ−スルホン（弱−強陽イオン交換剤）（Mallinckrodt Baker # 7587）であり、１３７ｍＭ酢酸−トリエタノールアミン−３０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４.５−６.０で平衡化する。
【００２７】
（２）タンパク質溶液を先に陰イオン交換カラムにアプライする。
プロテインＡ溶液を陰イオン交換カラムにアプライするために、３７５ｌの発酵ブロスからの溶液を、Millipore PROCON 10,000 MWCO TFF 膜を通してダイアフィルトレーションし、プロテインＡを保持し、塩濃度を低下させ、低分子量成分の濃度を低下させ、バッファーを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７.８に交換し、溶液の体積を低減させる。このタンパク質溶液を 10 X 75 cm XWP 500 PolyQuat-35 (Mallinckrodt Baker # 7603) に、Waters 515 HPLC Pump を用いて、流速５.５−８.０ｃｍ／分でアプライした。非結合成分を、カラム体積の３−１０倍量の新鮮な平衡バッファーでカラムから洗い流し、次いで、プロテインＡを、ＮａＣｌで１８ｍＳ／ｃｍの伝導率に調節した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７.８でカラムから溶出した。分析用Ｃ４（ＨＩＣ）逆相カラムを使用して、そして、Waters Photodiode Array Detector で２１４、２７５および３４０ｎｍの吸光度を監視することにより、プロテインＡの濃度および純度を各分画で測定した。プロテインＡの分画を、回収率が８５−１００％であり、貯留物のＡ２７５／Ａ３４０比が７またはそれ以上であるように集める。次いで、この時点で、タンパク質溶液を陽イオン交換カラムにアプライする。陽イオン交換のために、プロテインＡ貯留物を希ＨＣｌでｐＨ４.５−６.０に滴定し、次いで水で伝導率４.０−７.３ｍＳ／ｃｍに希釈し、１３７ｍＭ酢酸−トリエタノールアミン−３０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４.５−６.０（好ましい実施態様ではｐＨ４.７）で予め平衡化した１６ｘ７２ｃｍＷＰカルボキシ−スルホンカラム（弱−強陽イオン交換剤）に、流速１００−３００ｃｍ／時間でアプライした。次いで、同じ流速でカラム体積の２−１０倍量の平衡化バッファーでカラムを洗浄し、続いて平衡化バッファー中の１３７ｍＭ酢酸−トリエタノールアミン−２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４.５−６.０の段階または０−１.０Ｍ ＮａＣｌのグラジエントで、カラム体積の１０倍量の範囲にわたり、プロテインＡを溶出した。分析用Ｃ４（ＨＩＣ）逆相カラムを使用して、そして、Waters Photodiode Array Detector で２１４、２７５および３４０ｎｍの吸光度を監視することにより、プロテインＡの濃度および純度を各分画で測定した。プロテインＡ含有分画でＡ２７５およびＡ３４０を調べ、次いで、７.０を超えるＡ２７５／Ａ３４０比を有する分画としてそれらを集めた。
【００２８】
（３）タンパク質溶液を先に陽イオン交換カラムにアプライする。プロテインＡ溶液を陽イオン交換カラムにアプライするために、３７５ｌの発酵ブロスからの溶液を、Millipore PROCON 10,000 MWCO TFF 膜を通してダイアフィルトレーションし、プロテインＡを保持し、塩濃度を低下させ、低分子量成分の濃度を低下させ、溶液の体積を低減させ、バッファーを１３７ｍＭ酢酸−トリエタノールアミン−３０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４.５−６.０（好ましいｐＨは４.７である）に交換した。あるいは、０.２ミクロンフィルターを通してタンパク質溶液を単純に濾過し、ｐＨを１Ｎ ＨＣｌまたは１Ｎ ＮａＯＨで４.７−６.０に調節し、水で伝導率４.０−７.０ｍＳ／ｃｍに希釈し得る。このタンパク質溶液を、１６ｘ７２ｃｍＷＰカルボキシ−スルホンカラムに流速１００−３００ｃｍ／分でアプライした。非結合成分を、カラム体積の３−１０倍量の平衡化バッファーでカラムから洗い流し、続いて、平衡化バッファー中の１３７ｍＭ酢酸−トリエタノールアミン−２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４.５−６.０の段階または０−１.０Ｍ ＮａＣｌのグラジエントで、カラム体積の１０倍の範囲にわたり、プロテインＡを溶出した。分析用Ｃ４（ＨＩＣ）逆相カラムを使用して、そして、Waters Photodiode Array Detector で２１４、２７５および３４０ｎｍの吸光度を監視することにより、プロテインＡの濃度および純度を各分画で測定した。プロテインＡ含有分画でＡ２７５およびＡ３４０を調べ、７.０を超えるＡ２７５／Ａ３４０比を有するものを集めた。この時点で、タンパク質溶液を、陰イオン交換、疎水性相互作用、または、セラミックのヒドロキシアパタイトカラムにアプライすることを選択でき、好ましい実施態様は陰イオン交換カラムであり、その際、プロテインＡ貯留物を Millipore PROCON 10,000 MWCO TFF 膜を通してダイアフィルトレーションし、プロテインＡを保持し、塩濃度を低下させ、残っている低分子量成分の濃度を低下させ、バッファーを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７.８に交換し、溶液の体積を低減させた。次いで、このタンパク質溶液を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７.８で予め平衡化した XWP 500 PolyQuat-35 陰イオン交換樹脂の１０.５Ｘ７２ｃｍカラム（Mallinckrodt Baker #7603）に、Waters 515 HPLC Pump を用いて、流速１００−２５０ｃｍ／時間でアプライした。非結合成分を、カラム体積の３−１０倍量の新鮮な平衡バッファーでカラムから洗い流し、次いで、プロテインＡを、ＮａＣｌで１８ｍＳ／ｃｍの伝導率に調節した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７.８でカラムから溶出した。分析用Ｃ４（ＨＩＣ）逆相カラムを使用して、そして、Waters Photodiode Array Detector で２１４、２７５および３４０ｎｍの吸光度を監視することにより、プロテインＡの濃度および純度を各分画で測定した。プロテインＡの分画を、回収率が８５−１００％であり、Ａ２７５／Ａ３４０比が７.０またはそれ以上であるように集めた。あるいは、ＨＩＣカラムが第２カラム選択であるならば、貯留物を十分な顆粒状または粉末状硫酸アンモニウムと混合し、最終濃度０.５Ｍ硫酸アンモニウムとし、希水酸化アンモニウムでｐＨを７.５−８.２に調節する。この溶液を、０.５Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム中、ｐＨ８.０で予め平衡化した��Ｐ ＨＩ−プロピル（Ｃ３）ポリマー樹脂の１６ｘ７２ｃｍカラムにアプライする。カラムをカラム体積の２−５倍量の０.５Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム中、ｐＨ８.０で洗浄し、次いで、５倍体積の０.５Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム中、ｐＨ８.０から５倍体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８.０へのグラジエントを開始する。分析用Ｃ４（ＨＩＣ）逆相カラムを使用して、そして、Waters Photodiode Array Detector で２１４、２７５および３４０ｎｍの吸光度を監視することにより、プロテインＡの濃度および純度を分画で測定する。プロテインＡ含有分画でＡ２７５およびＡ３４０を調べ、次いで、７.０を超える２７５／３４０比を有するものとして集めた。第２カラムの選択がセラミックのヒドロキシアパタイトであるならば、タンパク質溶液をダイアフィルトレーションし、バッファーを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５に交換する。セラミックのヒドロキシアパタイトの１６ｘ７２ｃｍカラム（Bio-Rad）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５で平衡化し、タンパク質溶液を１００−１５０ｃｍ／時間でカラムに負荷する。同じバッファーの洗浄液でカラム体積の３−５倍量にわたり流れを継続させ、次いで、０.２Ｍ硫酸アンモニウムを含有するカラム体積の３倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５でプロテインＡを溶出した。分析用Ｃ４（ＨＩＣ）逆相カラムを使用して、そして、Waters Photodiode Array Detector で２１４、２７５および３４０ｎｍの吸光度を監視することにより、プロテインＡの濃度および純度を分画で測定する。分画でＡ２７５およびＡ３４０を調べ、７.０より大きいＡ２７５／Ａ３４０比を有するプロテインＡ含有画分を集める。
【００２９】
（４）タンパク質溶液を陰イオン交換カラムに、続いて陽イオン交換カラムにアプライする。好ましい実施態様では、プロテインＡ溶液を最初に陰イオン交換カラムにアプライする。３７５ｌの発酵ブロスからの溶液を、Millipore PROCON 10,000 MWCO TFF 膜を通してダイアフィルトレーションし、プロテインＡを保持し、塩濃度を低下させ、低分子量成分の濃度を低下させ、バッファーを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７.８に交換し、溶液の体積を低減させる。このタンパク質溶液を XWP 500 PolyQuat-35 の10.5 X 72 cm カラムに、Waters 515 HPLC Pump を用いて、流速５.５−８.０ｃｍ／分でアプライした。非結合成分を、カラム体積の３−１０倍量の新鮮な平衡バッファーでカラムから洗い流し、次いで、プロテインＡを、ＮａＣｌで１８ｍＳ／ｃｍの伝導率に調節した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７.８でカラムから溶出した。分析用Ｃ４（ＨＩＣ）逆相カラムを使用して、そして、Waters Photodiode Array Detector で２１４、２７５および３４０ｎｍの吸光度を監視することにより、プロテインＡの濃度および純度を各分画で測定した。プロテインＡの分画を、回収率が８５−１００％であり、貯留物が７.０またはそれ以上のＡ２７５／Ａ３４０比を示すように集めた。プロテインＡ貯留物を希ＨＣｌでｐＨ４.５−６.０に滴定し、次いで水で伝導率４.０−７.３ｍＳ／ｃｍに希釈し、１３７ｍＭ酢酸−トリエタノールアミン−３０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４.５−６.０（ｐＨ４.７が好ましい実施態様である）で予め平衡化した１６ｘ７２ｃｍＷＰカルボキシ−スルホンカラム（弱−強陽イオン交換剤）に、流速１００−３００ｃｍ／時間でアプライした。次いで、同じ流速でカラム体積の２−１０倍量の平衡化バッファーでカラムを洗浄し、続いて平衡化バッファー中の１３７ｍＭ酢酸−トリエタノールアミン−２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４.５−６.０の段階または０−１.０Ｍ ＮａＣｌのグラジエントで、カラム体積の１０倍量の範囲にわたり、プロテインＡを溶出した。分析用Ｃ４（ＨＩＣ）逆相カラムを使用して、そして、Waters Photodiode Array Detector で２１４、２７５および３４０ｎｍの吸光度を監視することにより、プロテインＡの濃度および純度を各分画で測定した。全てのプロテインＡ含有分画で分画のＡ２７５およびＡ３４０を調べ、次いで、７.０を超えるＡ２７５／Ａ３４０比を有するものを集めた。
【００３０】
（５）タンパク質溶液を陽イオン交換カラムに、続いて陰イオン交換カラムにアプライすること。他の好ましい実施態様では、プロテインＡ溶液を陽イオン交換カラムＷＰカルボキシ−スルホン（弱−強陽イオン交換剤）（Mallinckrodt Baker # 7587）にアプライした。３７５ｌの発酵ブロスからの溶液を、Millipore PROCON 10,000 MWCO TFF 膜を通してダイアフィルトレーションし、プロテインＡを保持し、塩濃度および低分子量成分の濃度を低下させ、溶液の体積を低減させ、バッファーを１３７ｍＭ酢酸−トリエタノールアミン−３０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４.５−６.０（好ましいｐＨは４.７である）に交換した。あるいは、０.２ミクロンフィルターを通してタンパク質溶液を単純に濾過し、ｐＨを１Ｎ ＨＣｌまたは１Ｎ ＮａＯＨで４.７−６.０に調節し、水で伝導率４.０−７.０ｍＳ／ｃｍに希釈し得る。このタンパク質溶液を、０.２ミクロンフィルターを通す濾過により澄ませ（必要であれば）、次いで、１３７ｍＭ酢酸−トリエタノールアミン−３０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４.５−６.０（好ましいｐＨは４.７である）で平衡化した１６ｘ７２ｃｍＷＰカルボキシ−スルホンカラム（弱−強陽イオン交換剤）（Mallinckrodt Baker # 7587）に流速１００−３００ｃｍ／分でアプライした。非結合成分を、カラム体積の３−１０倍量の平衡化バッファーでカラムから洗い流し、続いて、平衡化バッファー中の１３７ｍＭ酢酸−トリエタノールアミン−２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４.５−６.０の段階または０−１.０Ｍ ＮａＣｌのグラジエントで、カラム体積の１０倍の範囲にわたり、プロテインＡを溶出した。分析用Ｃ４（ＨＩＣ）逆相カラムを使用して、そして、Waters Photodiode Array Detector で２１４、２７５および３４０ｎｍの吸光度を監視することにより、プロテインＡの濃度および純度を各分画で測定した。プロテインＡの分画を、回収率が８５−１００％であり、貯留物が７.０またはそれ以上のＡ２７５／Ａ３４０比を示すように集めた。ダイアフローまたは透析を使用して、タンパク質溶液貯留物を交換して２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７.８をもたらし、溶液の体積を低減させた。このタンパク質溶液をXWP 500 PolyQuat-35 の１０.５Ｘ７２ｃｍカラムに、Waters 515 HPLC ポンプを使用して、流速５.５−８.０ｃｍ／分でアプライした。非結合成分を、カラム体積の３−１０倍量の新鮮な平衡バッファーでカラムから洗い流し、次いで、プロテインＡを、ＮａＣｌで１８ｍＳ／ｃｍの伝導率に調節した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７.８でカラムから溶出した。分析用Ｃ４（ＨＩＣ）逆相カラムを使用して、そして、Waters Photodiode Array Detector で２１４、２７５および３４０ｎｍの吸光度を監視することにより、プロテインＡの濃度および純度を各分画で測定した。プロテインＡの分画を、回収率が８５−１００％であり、貯留物が７.０またはそれ以上のＡ２７５／Ａ３４０比を示すように集めた。
【００３１】
（６）動物由来培地および非動物由来培地から単離されたプロテインＡの同一性。ある場合では陰イオン交換、次いで陽イオン交換の順序で、そして、他の場合では陽イオン交換、続いて陰イオン交換の順序で、動物由来培地または非動物由来培地中で増殖した黄色ブドウ球菌細胞から、別々にプロテインＡを精製した。次いで、各精製タンパク質を、ＳＤＳゲルおよび非変性ゲル（サンプルにもゲル自体にもＳＤＳを含まない Laemmli のゲル）で、共移動について試験した。２つの別個のタンパク質は、両システムでそれぞれ同じ速度で移動した。これらの別個のプロテインＡを、６Ｎ ＨＣｌを使用するアミノ酸分析、Ｎ末端配列分析およびペプチドマッピングのために、実験業者に提出した。両タンパク質について、アミノ酸分析を比較した。最初の６アミノ酸のＮ末端分析は一致したが、少量のバリンが非動物由来プロテインＡ中に表れ、これは、動物由来プロテインＡで取り出された最初のアミノ酸にはなかった。トリプシンで消化し、得られたペプチドをＨＰＬＣで分離することにより、これらの２種のタンパク質にペプチドマッピングを実施した。非動物由来プロテインＡの断片から溶出された６１.５および８７分の２つのピークが動物由来プロテインＡ断片では存在せず、動物由来において９２分で溶出されるピークが非動物由来よりはるかに大きいこと以外、２つの溶出プロフィールは実質的に同一であった。この現象の組合せは、非動物プロテインＡ断片における大きいペプチドの不完全な分解に起因し得る。それ以外は、２つのパターン間にはほぼ完全な類似性があった。２つのプロテインＡの各々を、等電点分離法のゲルで流し、ここでも同様のパターンを得、支配的なタンパク質のバンドは、ウマ心臓ミオグロビン、炭酸脱水酵素およびβ−ラクトグロブリンの標準タンパク質と比較したとき、ｐＨ５.１、４.９および４.７の等電点を有した。
【００３２】
本明細書において、特定の実施態様を参照して本発明を説明したが、本明細書で開示した本発明の概念の精神および範囲から逸脱せずに、変更、改変および変形を成し得ることが理解されよう。従って、添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれる全てのそのような変更、改変および変形が包含されると意図している。
【国際調査報告】
2009508950.tif 000002
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