(57)【要約】  炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治療する方法は、患者の炎症を起こしている組織から得た腸生検試料を用意し；試料を機械的に処理して細胞懸濁液を得て；該懸濁液中のＴリンパ球、好中性顆粒球及び好酸性顆粒球から選択される活性化した白血球の細胞表面マーカーを同定し；１つ又はそれ以上の活性化した細胞に対する抗体を惹起し、そしてそれらを支持体上に固定化し；該支持体を充填したカラムを用意し；患者の末梢血の１部分を迂回させて該カラムを通過させ、それを再度患者に注入して活性化した白血球を該支持体上の該抗体と結合させ、それによってそれらを血流から除去する；ことを含む。また、該方法における対応するカラム及び支持体、並びに該方法でのそれらの使用も開示される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治療する方法であって、
（ａ）患者の炎症を起こしている組織から得た腸生検試料を用意し；
（ｂ）試料を機械的に処理して細胞懸濁液を得て；
（ｃ）該懸濁液中のＴリンパ球、好中性顆粒球及び好酸性顆粒球から選択される活性化した白血球の細胞表面マーカーを同定し；
（ｄ）該活性化した白血球に対する抗体を惹起し；
（ｅ）共通の又は別々の支持体上に、該活性化した白血球に対する該抗体を固定化し；
（ｆ）該支持体を充填したカラムを用意し；
（ｇ）患者の末梢血の１部分を迂回させてカラムを通過させ、それを再度患者に注入して該活性化した白血球を該支持体上の該抗体と結合させ、それによってそれらを血流から除去する；
ことを含む方法。
【請求項２】
該白血球に対する抗体を担持する該支持体が、直列に又は並列に接続した別々のカラムで提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該活性化した白血球に対する抗体が固定化された支持体を充填した単一のカラムを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
２０〜１００ｍｌの空容積を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
３０〜５０ｍｌの空容積を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
１回の治療で患者の血液量の３分の１〜３分の２をカラムを通過させる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
１回の治療で患者の血液量の約半分又は半分より若干少ない量を、カラムを通過させる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
治療が１〜３週以内に３〜５回繰り返される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該腸の生検試料が患者から得たいくつかのそのような試料の１つであり、且つ、該試料が機械的処理に先立って混ぜ合わされて細胞懸濁液を与える、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
活性化したＴリンパ球の存在が、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ１５、ＣＤ１９に対する特異的な抗体の１つ又はそれ以上にそれらを暴露することにより確認される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
活性化したＴリンパ球の存在が、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４４に対する特異的な抗体の１つ又はそれ以上にそれらを暴露することにより確認される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
支持体上に固定化された活性化した白血球に対する抗体が、ＣＤ６９及びインテグリンα４β７抗体から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
支持体上に固定化された活性化した好中性顆粒球に対する抗体がＣＤ６６ｂである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
支持体上に固定化された活性化した好酸性顆粒球に対する抗体がＣＤ９である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｔリンパ球、好中性顆粒球及び好酸性顆粒球から選択される活性化した白血球の細胞表面マーカーに対する抗体が固定化されている支持体が充填され、該活性化した白血球が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に罹患した患者の炎症を起こしている腸組織から得られそして細胞懸濁液を得るために機械的に処理された生検試料における活性化した白血球である、白血球アフェレシス・カラム。
【請求項１６】
２０ｃｃｍ〜１００ｃｃｍの空隙容積を有する、請求項１５に記載のカラム。
【請求項１７】
３０ｃｃｍ〜５０ｃｃｍの空隙容積を有する、請求項１５に記載のカラム。
【請求項１８】
該活性化したＴリンパ球に対する抗体がＣＤ６９に対する抗体及びインテグリンα４β７抗体から選択される、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のカラム。
【請求項１９】
該活性化した好中性顆粒球に対する抗体がＣＤ６６ｂに対する抗体から選択される、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のカラム。
【請求項２０】
該活性化した好酸性顆粒球に対する抗体がＣＤ９に対する抗体から選択される、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のカラム。
【請求項２１】
並列及び／又は直列に接続された、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の白血球アフェレシス・カラムの１つ又はそれ以上の組み合わせ。
【請求項２２】
請求項１５〜２１のいずれか１項に記載のカラム、該カラムと直列に接続した血液ポンプ、及び該ポンプ及び該カラムを患者の静脈系に接続する手段を含む、白血球アフェレシスのための装置。
【請求項２３】
該ポンプ及び該カラムを患者の静脈系に接続する該手段が２つのカニューレを含む、請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
該ポンプが該カラムと接続した柔軟なチューブに作用する蠕動ポンプである、請求項２２又は２３に記載の装置。
【請求項２５】
その上に固定化された、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に罹患した患者の炎症を起こしている腸組織から単離した、Ｔリンパ球、好中性顆粒球及び好酸性顆粒球から選択される活性化した白血球に対して惹起された１種又はそれ以上の抗体を含む、Ｔ白血球アフェレシスのための支持体。
【請求項２６】
該活性化した白血球が、炎症を起こしている腸組織から取り出した１つ又はそれ以上の生検試料から単離したものである、請求項２５に記載の支持体。
【請求項２７】
クローン病を治療するための、請求項２５又は２６に記載の支持体の使用。
【請求項２８】
潰瘍性大腸炎を治療するための、請求項２５又は２６に記載の支持体の使用。
【請求項２９】
コラーゲン性大腸炎を治療するための、請求項２５又は２６に記載の支持体の使用。
【請求項３０】
リンパ球性大腸炎を治療するための、請求項２５又は２６に記載の支持体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、特に潰瘍性大腸炎及びクローン病、を治療する方法、及び該治療に使用するための手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
潰瘍性大腸炎及びクローン病は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の症状である。ＩＢＤの他の形態としては、リンパ球性大腸炎及びコラーゲン性大腸炎が挙げられる。劇症性潰瘍性大腸炎に罹患した患者は、現在高用量のステロイド治療を受けている。抗ＴＮＦαによる第三相臨床試験が進行中である。両薬物は、炎症の一般的な阻害物質である。それらは約５０％の事例において有効ではあるが、重篤な副作用を及ぼす。頻繁に、患者は、また劇症性大腸炎の反復性の発作を起こす可能性がある。医療に応答しない劇症性大腸炎の患者では、迅速な外科的処置は必須のものである。潰瘍性大腸炎は、常に大腸(大腸)に限定される。劇症性大腸炎では、大腸は切除され、体外のイレオストーマ（ileostoma）が構築される。回復及び場合により直腸断端(stump)炎症の更なる医療の後、回腸直腸吻合又は腰袋（pelvic pouch）を用いた再建手術のどちらかが、腸の連続性を回復するために大部分の患者で行われる。両者の手術方法は、毎日約６回の軟便及び水及びミネラルバランスの乱れを伴う。
【０００３】
クローン病に罹患した患者は、通常小腸の最遠部位及び大腸の最初の部分(回盲部領域) の炎症を有するが、炎症は消化管のいずれの部分に位置する可能性もある。一時的な緩和は、ステロイド及びアザチオプリンのような抗炎症薬によってもたらされるかも知れないが、医療ではその病気を治すことはできない。狭窄及び瘻孔形成を示す腸管分節の切除を伴う外科手術は、患者の約５０％において指示され；彼らの半分は再発を迎え、更なる手術を必要とするであろう。それ故に、ＩＢＤにおける炎症を特異的に止めることができ、個々の患者における再発疾患を予防する方法は、高度に望まれている。
【０００４】
特許文献１は、体液試料から選択された物質を除去するフィルター及び方法を開示している。このフィルターは、外側ハウジング、入口及び出口を含む。複数のフィルター表面は、外部ハウジング内に備えられ、少なくとも1つの被膜がフィルター表面に適用される。少なくとも1つの被覆は、少なくとも２つの結合モジュールを含み、それらは順々に選択的に互いに結合する。１つの結合モジュールは選択的にフィルター表面に結合し、別の結合モジュールは、液体試料から除去すべき選択された物質に選択的に結合するように構成される。流体試料は入口、外側ハウジング及び出口を通過することができるので、選択された物質は、被膜を通して選択的にフィルター表面に結合する。液体試料は、血液試料である。１つの選択された液体成分は、白血球、顆粒球及びリンパ球から選択される血液成分である。血液から白血球を分離するための濾材及び装置は、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９に開示されている。
【特許文献１】ＷＯ第２００５１１３０３７号
【特許文献２】特開２００３−２６５５９６
【特許文献３】米国特許第５８８５４５７号
【特許文献４】特開平０４−１８７２０６
【特許文献５】米国特許第４９３６９９３号
【特許文献６】特開平０３−００００７４
【特許文献７】特開平０２−１６７０７１
【特許文献８】特開平０２−００９８２３
【特許文献９】特開平１０−０５７４７７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的はＩＢＤ、特に潰瘍性大腸炎及びクローン病、を治療するための方法を提供することである。
本発明の別の目的は、該方法において使用する手段を提供することである。本発明の更なる目的は、図面に示されたその好ましい実施態様に関する以下の本発明の概要、及び添付の特許請求の範囲から明白になるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ＩＢＤの炎症過程で、Ｔリンパ球は白血球と相互作用する。特定の補助因子による刺激によって、有害物質が白血球から放出される。これらの有害物質は、腸細胞を損傷する。活動性ＩＢＤに罹患した患者からの腸生検から得られた物質のフローサイトメトリーによって、本発明者らは、活性化したＴリンパ球の、並びに活性化した好中性及び好酸性顆粒球の白血球細胞表面マーカー、即ち、炎症部位に濃縮されているが、循環する末梢血中にも存在する細胞、を同定した。
【０００７】
本発明は、これらの活性化した細胞がＩＢＤにおける炎症の開始及び持続に関与しており、そして循環からのそれらの除去はそのような炎症を軽減し、そして更に排除さえもする可能性があるという仮説に基づいている。この考えは、各患者の炎症状態が、白血球の活性化の程度及び侵入するＴ細胞の種類及び相対的割合、患者間で及び病気の重症度で変動し、患者に投与される薬剤によって影響されるパラメータに関して特有のものであるという洞察を含む。本発明は、綿及び他のポリマー繊維のような、当該技術分野において公知である非特異的な白血球吸着材の使用には頼らない。本発明の文中において、ＩＢＤは、主としてクローン病及び潰瘍性大腸炎を含むが、また水性下痢、内視鏡検査では正常であるが腸の粘膜下組織中の病理学的コラーゲンの蓄積によって特徴づけられるコラーゲン蓄積大腸炎、及び下痢を伴う腸粘膜中の大量のリンパ細胞の存在によって特徴付けられるリンパ球性大腸炎を含む。
【０００８】
本発明によれば、ＩＢＤ患者は大腸内視鏡検査を受ける。罹患した腸組織の1つ又はいくつかの生検が採取される。単一の又は混ぜ合わせた生検材料から、単一細胞懸濁液が調製される。ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ１５、ＣＤ１９に対する抗体を用いたフローサイトメトリーによって、単一細胞懸濁液中のＴリンパ球、Ｂリンパ球、好中性顆粒球及び好酸性顆粒球の存在が測定される。更に、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４４及びＣＤ６６ｂのような活性化マーカーに対する抗体を用いることによって、粘膜侵入免疫細胞の活性化状態を調べる。原理的には、個々の患者の炎症状態は、活性化の程度及び細胞侵入のタイプ、並びに病気の重篤さ及び投与される薬剤により変動するパラメータに関して固有である。この研究の結果に基づいて、目的とする主要な炎症を引き起こす細胞集団の除去に、白血球アフェレシス（leukapheresis）・カラムが使用される。活性化したＴ及びＢリンパ細胞の除去のために、固体支持体に結合した活性化マーカーＣＤ６９を認識する抗体が使用される。活性化した好中性顆粒球の除去のために、腸管回帰分子（gut homing molecule）又はＣＤ６６ｂに対する抗体が使用される。インテグリンα４β７抗体が固定化された支持体を充填したカラムが、この種の白血球を除去するであろう。このように、リンパ節の中で活性化され、腸の炎症部位を腸粘膜へ排出して別の局所炎症をもたらす末梢循環中の血球は、末梢血の白血球アフェレシスに基づくそのような抗体によって除去されるであろう。このことは、腸の自己反応性Ｔ細胞の更なる補充を弱らせ、又は阻害さえするであろう。
【０００９】
本発明によれば、大きな表面積／体積比を有し、表面に末梢血中で循環している活性化した白血球を結合する能力を有する抗体を保有し、該活性化した白血球はＴリンパ球、好中性顆粒球及び好酸性顆粒球から選択される適切な固体支持体を充填した白血球アフェレシス・カラムが開示される。ＩＢＤ炎症に罹患した患者の末梢血を、カラムを通過させることによって活性化した白血球を抗体と結合させ、そのようにして循環からそれらを除去するであろう。ホメオスタシス機構によって、循環する末梢血中の活性化した白血球の減少は、腸を行き来する活性化した白血球の数の減少をもたらし、このようにして腸における活性化した白血球の数の減少をもたらす。本出願において、「抗体」という用語は、抗体、特にモノクローナル抗体、及び対応する抗体の抗原／抗体結合能力を保持している断片又はその改変体、並びにその組換え変性抗体及び抗原結合断片を含む。
【００１０】
このタイプの「オーダーメードの」白血球アフェレシスは、腸粘膜細胞に対して特異的に活性化した白血球を選別する能力があり、このようにして炎症過程における重要な因子を除去し、劇症性大腸炎を回復に向かわせる。クローン病に罹患した患者では、白血球を除いて同じ原理が当てはまる；この場合は、白血球は腸壁内のより深い位置に存在する抗原に対して活性化される。炎症を引き起こしている抗原を同定することにより、抗原を選択して固体支持体に固定化した状態のそれらを、カラムを通過する白血球に対して提示することは可能であり、この方法で活性化した白血球を結合する。
【００１１】
腸のタイプ及び炎症活性化の程度に基づいて、白血球アフェレシス・カラムは、目標とする支配的な炎症を引き起こす細胞集団の除去に使用される。末梢血中の活性化したＴリンパ球の減少は、特に好ましい。
【００１２】
活性化Ｔリンパ球をＣＤ６９又はインテグリンα４β７抗体に対する抗体と接触することによる、ＩＢＤ患者の末梢血からの活性化したＴリンパ球の除去が好ましい；これらの抗体は、単独で使用しても又は組み合わせて使用してもよい。活性化した好中性顆粒球及び好酸性顆粒球は、対応するやり方でそれらをそれぞれＣＤ６６ｂ及びＣＤ９に対する抗体と接触することにより、除去することができる。
【００１３】
本発明に従えば、そのような活性化した好中性顆粒球及び好酸性顆粒球も、またＩＢＤ患者の末梢血中で同定することができる。
【００１４】
本発明の第１の好ましい態様によれば、活性化したＴ白血球及び／又は活性化した好中性顆粒球及び／又は活性化した好酸性顆粒球の除去は、固体支持体上に２種類以上の抗体を含むカラムの使用により達成される。それぞれの抗体毎に別個の支持体を用いることが好ましい。
【００１５】
本発明の第２の好ましい態様によれば、それぞれ異なる抗体又は異なる抗体群を有する別々の支持体は、対応する数の別々のカラム中に配置される。カラムは直列に接続されることが好ましい。
【００１６】
本発明の第３の好ましい態様によれば、ＩＢＤに罹患した患者から大腸内視鏡によって得たいくつかの生検は組み合わされ、機械的に処理されて、単細胞懸濁液を形成し、フローサイトメトリーによって分析されて、Ｔリンパ球、好中性顆粒球及び好酸性顆粒球、場合により活性化したＢリンパ球から選択された活性化した白血球の存在を、それらを特定の抗体、特にＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ１５及びＣＤｌ９に対する抗体に暴露することにより識別する。
【００１７】
本発明の第四の好ましい態様によれば、大腸内視鏡検査によってＩＢＤに罹患した患者から得た粘膜侵入免疫細胞の活性化状態は、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４４及びＣＤ６６ｂのような活性化マーカーに対する抗体に侵入免疫細胞を暴露することにより測定される。
【００１８】
腸壁の粘膜内へ移動しがちなＴリンパ球は、内皮に発現しているＭＡｄＣＡＭ−１（Mucosal Addressin Cell Adhesion Molecule-1）に結合するα４β７インテグリン受容体を発現する。本発明によれば、そのような侵入Ｔ細胞は、α４β７インテグリン受容体に対する抗体を固定化した支持体を含むカラムを使用した白血球アフェレシスによって、末梢循環から取り除くことができる。
【００１９】
このように、フローサイトメトリーによって研究される生検が活動性炎症を示すＩＢＤに罹患した患者に、局部的な腸の炎症に関与する特定の細胞集団を除去するように設計された、抗体に基づく白血球アフェレシスを行うことができる。静脈内注入が、例えば、１分間に約３０ｍｌの血液を送液する蠕動ポンプに接続したヘパリン処理したチューブに結合した前肘静脈に導入される。血液は設計された抗体白血球アフェレシス・カラムを通過し、チューブは、例えば対側前肘静脈中へ再導入される。例を挙げると、患者は、６０分間の白血球アフェレシスを受け、それにより血液量（６０×２０ｍｌ＝１,８００ｍｌ）の約半分又は若干それより少ない量から活性化した細胞を除去するであろう。１回の白血球アフェレシスで除去される血液量とは関係なく、新しく出現する血液で生まれ、腸で活性化した免疫細胞を除去するために、その治療は１〜３週に３〜５回繰り返される。次いで、その結果の後に、上記で概説したフローサイトメトリーによる、腸生検からの単一細胞の更なる検討を行うことができる。
【００２０】
本発明の特に好ましい態様によれば、
（ａ）患者の炎症を起こしている組織から得た腸生検試料を用意し；
（ｂ）その試料を機械的に処理して細胞懸濁液を得て；
（ｃ）該懸濁液中のＴリンパ球、好中性顆粒球及び好酸性顆粒球から選択される活性化した白血球の細胞表面マーカーを同定し；
（ｄ）該活性化した白血球に対する抗体を惹起し；
（ｅ）共通の又は別々の支持体上に、該活性化した白血球に対する該抗体を固定化し；
（ｆ）該支持体を充填したカラムを用意し；
（ｇ）患者の末梢血の１部分を迂回させてカラムを通過させ、それを再度患者に注入して該活性化した白血球を該支持体上の該抗体と結合させ、それによってそれらを血流から除去する；
ことを含む、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治療する方法が開示される。活性化したＴ白血球並びに活性化した好中性顆粒球及び／又は活性化した好酸性顆粒球に対する抗体を担持する支持体は、別々のカラムに供給されることが好ましく、これらのカラムは直列に接続されてもよく並列であっても良い。活性化したＴ白血球、活性化した好中性顆粒球、及び活性化した好酸性顆粒球、場合により活性化したＢリンパ球の２つ又はそれ以上に対する抗体がそれぞれ固定化された、別々の支持体を充填した単一のカラムに頼る方法もまた好ましい。本発明のカラムは、好ましくは２０〜１００ｍｌ、特に好ましくは３０〜５０ｍｌの空容積を有するが、５００ｍｌまでのようなより大きな容積もまた可能である。大容積のカラムを使用する場合は、失血を最小限に維持するために、治療終了時にカラムから血液を空にすることが重要である。このことは、洗浄媒体がカラム中の大部分の又は本質的に全ての血液を置き換えるまで、例えば食塩水でカラムを洗浄することによって行うことができる。血液と接触するカラム及びチューブの表面は、凝固を防ぐような種類のものであるべきであり；従って、ヘパリン処理された表面を有するカラム及びチューブを使用することが好ましい。凝固系を活性化しない表面を提供し又は変性する方法は、当該技術分野において公知である。標準的には、患者の血液量の３分の１〜３分の２、好ましくはその血液量の半分又は若干それより少ない量を、１回の治療中にカラムを通過させる。通常、症状の寛解、長期的な解放又は実質的な抑制を得るためには、１回の処理では十分ではないであろう。従って、治療は、最初の治療から１〜３週以内に、２回又は３回から５回以上まで繰り返すことが好ましい。腸の生検試料は、患者から得たいくつかのそのような試料のうちの1つであり、ここで、試料を混ぜ合わせた後、機械的な処理を施して細胞懸濁液を提供する。本発明の方法において特に有用なものは、末梢循環中の活性化したＴリンパ球に関しては、ＣＤ６９又はインテグリンα４β７抗体に対する抗体であり、これらの抗体は、また本発明の支持体への固定用としても好ましい。腸粘膜における活性化したＴリンパ球の存在は、細胞懸濁液又は懸濁液から分離した細胞を、活性化マーカーのＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４４、ＣＤ６６ｂの１つ又はそれ以上に対する特異的な抗体に曝露することによって有利に検出される。
【００２１】
「調達(Raising)抗体」は、商業的又はその他の供給源からのそのような抗体の調達を含む。
【００２２】
次に、本発明を、図面に例示されたその好ましい実施態様を参照することにより、より詳細に説明する。
【００２３】
図１〜４は、末梢血及び腸粘膜からのＣＤ４＋Ｔ細胞及び好中性顆粒球上の活性化マーカーの発現を示す。
図５〜９は、ＭＡＣＳ(Magnetically Activated Cell Sorting)カラム上の活性化した末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞及び好中性顆粒球の分離の効果を示す。
図１０は、患者の循環系と接続した本発明のカラムを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
材料及び方法
試料の採取及び調製
劇症性潰瘍性大腸炎に罹患したＩＢＤ患者の大腸内視鏡検査中に生検試料を採取し、直ちに生理食塩水を満たした試験管へ移し、更に1時間以内で処理した。緩く取り付けたガラスのホモジナイザーを使用して生検細胞の単一細胞懸濁液を得た。次いで、ＰＢＳにＮａＮ３（０．０５％）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（０．１％）及びクエン酸三ナトリウム・２水和物（０．４％）を含有する、蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）のためのバッファーで細胞を２回洗浄した。
【００２５】
同一人物からの へパリン処理末梢血を塩化アンモニウム水溶液（０．８３質量％）で溶血し、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄して、白血球の懸濁液を得た。
【００２６】
細胞懸濁液は、蛍光色素を結合したモノクローナル抗体と、暗所、室温で３０分間別々にインキュベートした。最終洗浄の後、細胞を５００μｌのＦＡＣＳバッファーに懸濁し、分析した。
【００２７】
抗体
全ての抗原（ＣＤ４、ＣＤ６９、ＣＤ６６ｂ）に対して、フルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、又はペリジニンクロロフィルタンパク（ＰｅｒＣＰ）に結合したマウス抗ヒトｍＡｂｓを使用した。非特異的染色に対する対照として、蛍光色素を結合したマウス抗ヒトＩｇＭκ及びＩｇＧ２ｂκを用いて、イソタイプ適合(isotype-matched)対照ラベリングも行った。フローサイトメトリーに用いた全ての抗体は、Becton Dickinson（BD）
Biosciences / Pharmingen, San Diego, USAから購入した。抗ＦＩＴＣを結合したMicroBeads（特定の抗体と結合したナノサイズの 超磁性粒子（supramagnetic
particles)）は、Miltenyi Biotech, GmbH, Germany から購入した。
【００２８】
フローサイトメトリー・アッセイ
フローサイトメトリー・アッセイは、２つのレーザーＦＡＣＳ
Caliburサイトメーター(BD Immunocytometry systems, San Jose,
CA, USA）を用いて行なった。各試料において1万個の細胞を計数し、分析した。データ解析については、Becton DickinsonからのCell Quest Proソフトウェアを使用した。
【００２９】
白血球アフェレシス・カラム
第１のカニューレ１の形態の静脈内注入(access)を前肘静脈８に導入する。第１のカニューレ１は、第１のへパリン処理したチューブ２に結合し、それには蠕動ポンプ３が作動していて１分間に約３０ｍｌの血液を送液している。その別の端では、第１のヘパリン処理したチューブ２が白血球アフェレシス・カラム４の１つの端に接続しており、このカラム４は５０ｍｌの容積を有し、Sepharose（登録商標）のような粒状の固体支持体５が充填され、この個体支持体上に患者から採取した活性化したＴ白血球に対して惹起した抗体が固定化されている。固定化した抗体を有する固体支持体５は、第１及び第２のフィルター本体１０、１１によって、所定位置に保持される。白血球アフェレシス・カラム４の別の端は、第２のへパリン処理したチューブ６に接続し、このチューブ６はその別の端で第２のカニューレ７に接続している。第２のカニューレ７は、対側前肘静脈９に導入される。前肘静脈８から対側前肘静脈９へ静脈血が流れるようにし、従ってカラム４を通過するようにし、そこで活性化したＴリンパ球は支持体５上の抗体に結合して該カラム内に保持される。白血球アフェレシスの時間は、通常は６０分であり、それによって、血液量(その人の体重に依存する；６０×２０ｍｌ＝１,８００ｍｌ)の約半分又は半分より少しから活性化した細胞を除去するであろう。その治療は、新しく出現する血液で生まれ腸で活性化した免疫細胞を除去するために、例えば、１〜３週に３〜５回繰り返される。次いでその結果は、上記したようなフローサイトメトリーによる、腸の生検からの単一細胞の更なる研究で確認できる。対応する方法により、活性化した好中球及び／又は活性化した好酸球のアフェレシスが達成される。本発明において有用なアフィニティー・クロマトグラフィーにおける固体支持体への抗体結合の更なる方法は、Nisevitch M. and Firer MA., J. Biochem. Biophys. Methods 49 (2001),
467-480 に記載されており、この文献は、参照用に本明細書に取り込まれている。
［実施例１］
【００３０】
ＭＡＣＳ分離
活性化したＴ細胞及び好中性顆粒球を得るために、健常ドナーからのへパリン処理末梢血（２ｍｌ）を、ＳＥＢ（４μｇ／ｍＬ）及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍＬ）を用いて３７℃で２時間刺激した。活性化した細胞及び休止した細胞の混合集団を得るために、引き続いて非刺激血液（２ｍL）を加えた。白血球を固定し、赤血球は低張溶解によって除去した。白血球を洗浄し、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ６９又はＣＤ６６ｂとインキュベートした。暗所で４℃、１０分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄し、抗ＦＩＴＣマイクロビーズと更に１５分間インキュベートした。細胞をＭＡＣＳカラムで分離し、陰性と陽性の両方の画分を異なる試験管に採取した。最後に、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳによって分析した。
［実施例２］
【００３１】
ＩＢＤ患者は末梢血及び腸に活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞を有する
本発明者らは、Ｍｂクローンに罹患した１０人の患者及び潰瘍性大腸炎に罹患した１２人の患者からの血液及び大腸の生検からの単一細胞懸濁液を調べた。ＩＢＤに罹患した患者は、ごく初期の活性化マーカーを発現するＴヘルパー細胞が認められた（図１）ので、末梢血に活性化した表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を表示する。ＩＢＤ患者からの大腸生検では、大部分のＣＤ４＋Ｔ細胞は、大腸の自己免疫破壊に関与する大腸の腸壁に蓄積された炎症性のＴ細胞反応のサインとして、ＣＤ６９活性化マーカーを発現する（図２）。末梢血に見られる活性化したＴ細胞は、炎症性の大腸部分を排出する腸リンパ節で活性化されたＴ細胞のようであり、これらの細胞は炎症への途中にあり、除去されるべき細胞集団である。
［実施例３］
【００３２】
ＩＢＤ患者は末梢血及び腸に活性化した好中性顆粒球を有する
好中性顆粒球は先天性免疫反応の１部であり、局所炎症の活性化及び持続に関与する。ＩＢＤに罹患した患者からの末梢血では、大部分の好中性顆粒球は低レベルのＣＤ６６ｂを発現する。しかしながら、ある画分の好中性顆粒球は高レベルのＣＤ６６ｂを発現し、活性化した表現型を示す（図３）。活動性ＩＢＤに罹患した患者から得た大腸生検からの好中性顆粒球の大部分はＣＤ６６ｂＨｉであり（図４）、先天性免疫反応の活性化が腸炎の発症に関与している可能性を実証している。
［実施例４］
【００３３】
活性化したＣＤ４＋Ｔリンパ球は末梢血から除去することができる
ＣＤ６９活性化マーカーを発現している活性化したＴリンパ球、即ち、大腸粘膜の炎症への途中にある細胞、の末梢血からの除去は（図５）、特異的な抗体及びカラムを使用することによって達成することができる。活性化マーカーＣＤ６９で標識されたＴリンパ球の水性懸濁液を、抗ＦＩＴＣ磁性ビーズを結合した２次抗体を充填したカラムを通過させた。うまく分離されてカラム溶出液中に濃縮された非活性化Ｔリンパ球は溶出し、大部分のＣＤ６９＋細胞は末梢血から除去することができることを示す（図６）。
［実施例５］
【００３４】
末梢血からの活性化した好中性顆粒球の除去
高レベルの細胞表面マーカーＣＤ６６ｂの発現によって同定した活性化した好中性顆粒球（図７）を、抗ＦＩＴＣ磁性ビーズを結合した二次抗体とインキュベートし、カラム精製に供した。中〜高レベルのＣＤ６６ｂ活性化マーカーを発現する大部分の活性化した好中球をカラム中に捕捉し、このようにして末梢血中から除去した（図８）。
［実施例６］
【００３５】
ＩＢＤに罹患した患者の治療例
ＩＢＤに罹患した患者に、大腸内視鏡検査を行う。いくつかの生検を採取する。混ぜ合わせた生検から単一細胞懸濁液を調製する。単一細胞懸濁液中の活性化した白血球、即ち、Ｔリンパ球、Ｂリンパ細胞、好中性顆粒球及び好酸性顆粒球を、例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ１５（ＣＤ１９）に対する抗体を使用するフローサイトメトリーによって同定する。更に、粘膜に侵入する免疫細胞の活性化状態を、例えば、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４４及びＣＤ６６ｂのような活性化マーカーに対する抗体を使用することにより測定する。
【００３６】
活性化されていることが分かった粘膜侵入免疫細胞及び白血球に対する抗体を含む白血球アフェレシス・カラムを調製する。カラムの容積は広い範囲で変えることができるが、経済的理由及び失血量を最小限に維持するという理由で、約３０〜５０ｍｌの容積が好ましい。抗体を共有結合で固体支持体へ結合させるいずれかの技術によって、抗体をSepharose（登録商標）のような適切な支持体上に固定化する。例えば、活性化したＴ細胞を除去するための活性化マーカーＣＤ６９に対する抗体、活性化した好中性顆粒球を除去するための腸管回帰（gut homing）又はＣＤ６６ｂに対する抗体、又は活性化した好酸性顆粒球を除去するためのＣＤ９に対する抗体が、特定の患者に使用される。カラムは、１種又は数種の抗体が固定化された支持体を予め充填して供給することができ、又は、例えば、それぞれ抗体のＦｃドメイン又はビオチン化した抗体を結合するであろう、タンパク質Ａ又はストレプトアビジンを含有する支持体を用いる非共有結合による固定化戦略等によって、個別に調製する。既製品の又は個別に調製した白血球アフェレシス・カラムを、人工腎臓のやり方と同様に、数倍の血液量、好ましくは約３倍〜約５倍の血液量をカラムを通過させるのに十分な時間、患者の末梢循環に接続する。
［実施例７］
【００３７】
特定の細胞集団又は特定の細胞集団群の組み合わせを捕捉するための白血球アフェレシス・カラム
インテグリンα４β７抗体を担持した支持体を含むカラムは、腸管回帰分子を発現するＴ細胞を除去し（図９）、このようにして、更なる局所炎症を引き起こす、腸粘膜に移動中の(en-route)腸の炎症部位を排出するリンパ節の中で活性化された末梢血細胞は、抗体に基づく白血球アフェレシス過程中に除去されるであろう。ＣＤ６９に対する抗体を担持する支持体を充填したカラムは、活性化したＴ及びＢリンパ球を血流から除去し、このようにして、腸の自己反応性Ｔ細胞の更なる補充を阻害するであろう。同様の方法で、ＣＤ６６ｂに対する抗体を担持する支持体を充填したカラムは、活性化した好中性顆粒球を除去するであろう。活性化した好酸性顆粒球の対応する除去に対しては、抗体ＣＤ９が好ましい。これらの支持体は、１つずつ又は組み合わせて、例えば、並列に、又はそれぞれ１種類の支持体を含有するカラムを連続的に接続して、又は例えば１つの支持体がＣＤ６９を担持し別の支持体がＣＤ６６ｂを担持するというように、数種類の支持体を含有する単一カラムとして、使用することができる。所定のサイズ及び固体支持体のカラムにおけるＴ細胞の除去を最適化するために、支持体表面上の抗体密度、抗体の親和性、カラムを通過する血液の流速等を変えることは可能である。
【００３８】
このように、フローサイトメトリーによって調べた生検が活動性炎症を示唆するＩＢＤに罹患した患者に、局所的な腸の炎症に関与する特異的な細胞集団を除去するように設計された、抗体に基づく白血球アフェレシスを行う。静脈内注入(access)が、例えば、１分間に約３０ｍｌの血液を送液する蠕動ポンプが作動するヘパリン処理したチューブに結合した前肘静脈に導入される。血液は本発明の白血球アフェレシス・カラムを通過し、チューブは、例えば、対側前肘静脈中へ再導入される。患者は、６０分間の白血球アフェレシスを受け、それにより血液量（６０×２０ｍｌ＝１,８００ｍｌ）の約半分から活性化した細胞を除去するであろう。新しく出現する血液で生まれ腸で活性化した免疫細胞を除去するために、その治療は１〜３週内に３〜５回繰り返される。次いで、その結果は、上記で概説したフローサイトメトリーによる、腸生検からの単一細胞の更なる調査により確認できる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】活性化マーカーＣＤ６９の発現は、末梢血ＣＤ４＋Ｔリンパ球については比較的低い（ＣＤ４＋Ｔ細胞の３．８％によって発現し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）は２０．０である）。
【図２】大腸粘膜からのＣＤ４＋Ｔリンパ球は、増大したＣＤ６９の発現を示す（７２．８％、ＭＦＩ：３３．５）。
【図３】大部分の末梢血好中性顆粒球は、低レベルのＣＤ６６ｂを発現するが、１１．５％は、細胞活性化を示す増大した発現を示す。ゲートＭ１における細胞のＭＦＩは１０４．３である。
【図４】大腸粘膜からの好中性顆粒球は、より高いＣＤ６６ｂのＭＦＩを有し（ゲートＭ１において６２９．７）、増加した割合の活性化した好中性顆粒球を示す。
【図５】ＣＤ６９−陽性細胞の分離前のＣＤ４＋Ｔリンパ球：細胞の５．９％がＣＤ６９を発現する。
【図６】ＣＤ６９−陽性細胞の分離後のＣＤ４＋Ｔリンパ球。陽性の画分は、６１．６％のＣＤ６９−陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞からなる。
【図７】ＣＤ６６ｂ−陽性細胞の分離前の好中性顆粒球：細胞の４２．７％が中〜高レベルのＣＤ６６ｂの発現を示す。
【図８】ＣＤ６６ｂ−陽性細胞の分離後の好中性顆粒球：陽性画分中の好中球の８６．６％が、中〜高レベルのＣＤ６６ｂの発現を示す。
【図９】α４β７インテグリン陽性細胞の分離前及び後のＣＤ４＋Ｔリンパ球：ＭＡＣＳ前は、細胞の３７．４％が中〜高レベルのα４β７インテグリンの発現を示し、ＭＡＣＳ後は、９２．９％が中〜高レベルのα４β７インテグリンの発現を示す。
【図１０】患者の循環系と接続した本発明のカラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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