(57)【要約】  本発明は、ＨＩＶに対するワクチン及び／又は免疫原性組成物、並びにＨＩＶ感染及びＡＩＤＳを予防及び／又は治療するためのそれらの使用方法を包含する。このワクチン及び／又は免疫原性組成物は、単離されたＨＴＶタンパク質又はそれらの断片、サポニンと組み合わせてＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４リガンドを含むアジュバントを含有してよい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＨＩＶ−１の複数株に対する交差反応性中和抗血清の産生を誘導することができる単離ＨＩＶエンベロープタンパク質であって、前記ＨＩＶエンベロープタンパク質のＶ３領域が配列番号１のアミノ酸３１３から３２５又はその免疫原性断片を含む単離ＨＩＶエンベロープタンパク質；及び
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４リガンドをサポニンと組み合わせて含むアジュバント、
を含む免疫原性組成物。
【請求項２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＨＩＶ−１の複数株に対する交差反応性中和抗血清の産生を誘導することができる単離ＨＩＶエンベロープタンパク質であって、配列番号１と少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＩＶエンベロープタンパク質；及び
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４リガンドをサポニンと組み合わせて含むアジュバント、
を含む免疫原性組成物。
【請求項３】
前記Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４リガンドがリピドＡ誘導体である、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記リピドＡ誘導体がモノホスホリルリピドＡである、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記モノホスホリルリピドＡが３脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）である、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記リピドＡ誘導体がＯＭ１７４、ＯＭ２９４ＤＰ及びＯＭ１９７ＭＰ−ＡｃＤＰからなる群から選択される、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４リガンドがアルキルグルコサミニドホスフェートである、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記サポニンがＱＳ−２１又はＱＳ−７である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記サポニンがリポソーム、ＩＳＣＯＭ又は水中油エマルジョンの形で提供される、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記ＨＩＶエンベロープタンパク質が配列番号１と少なくとも９５パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２〜９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記ＨＩＶエンベロープタンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項２〜１０のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記アジュバントが水中油エマルジョン中にＱＳ２１、ＭＰＬ及びトコフェロールを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記アジュバントがリポソームＱＳ２１及びＭＰＬを含み、前記リポソームの大きさが約１００ｎｍである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を、それを必要とするヒトに投与することによって免疫応答を誘導する方法。
【請求項１６】
ＨＩＶを予防するための医薬品の製造における、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許仮出願第６０／７９８７１８号（２００６年５月９日出願）の利益を主張するものである。
【発明の分野】
【０００２】
本発明は、ＨＩＶ感染及び／又はＡＩＤＳの予防及び治療に関する。
【連邦支援の謝辞】
【０００３】
本発明は、一部がＮＩＨ助成金ＡＩ３７４３８及びＡＩ０６４０７０によって資金援助を受けた研究から生じた。
【発明の背景】
【０００４】
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）は、後天的免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体である。世界的流行の原因であるＨＩＶ−１株は、グループＭ系統（主系統）と呼ばれ、およそ１０種類の遺伝的サブタイプ又はクレイドに分類される。ＨＩＶ−１グループＭサブタイプは、ＨＩＶ−１配列の系統学的に関連した群であり、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ１、Ｆ２、Ｇ、Ｈ、Ｊ及びＫ並びに１６種の組換え型流行株に分類される（Ｋｏｒｂｅｒ他（１９９９）Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ（ｖｏｌ．ＩＩＩ）４９２〜５０５）。いずれか１つのサブタイプ内の配列は、ゲノム全体にわたってその他のサブタイプの配列よりも互いに類似している。これらのサブタイプは、ＨＩＶの様々な系列を表し、いくつか地理的関連を有する。従来のサブタイプＥ及びＩの両方は、現在では組換え型流行株（ＣＲＦ）と定義されている（Ｋｏｒｂｅｒ他（１９９９）Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ（ｖｏｌ．ＩＩＩ）４９２〜５０５）。未治療のＨＩＶ−１感染は一般的に、ＣＤ４＋リンパ球数の漸進的不可逆的減少（Ｐａｎｔａｌｅｏ他（１９９３）Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２８、３２７〜３３５）及びウイルス負荷の増加（Ｐａｎｔａｌｅｏ他（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６２、３５５〜３５８；Ｐｉａｔａｋ他（１９９３）Ｌａｎｃｅｔ  ３４１、１０９９）が特徴である。
【０００５】
ＨＩＶ感染に有効なワクチン又はＨＩＶ疾患の進行を防ぐことができるワクチンの開発は、１５年にわたって公衆衛生学の目標となってきた。ＨＩＶ感染に対する防御免疫応答を惹起するのに必要となり得る免疫応答の１つは、ウイルスを中和する抗体の生成である。
【０００６】
ｇｐ１２０又はｇｐ１６０の単量体型を使用する従来のサブユニットＨＩＶ−１エンベロープワクチンの取り組みは、小動物、霊長類及びヒトにおいて免疫原性があることが示されているが、この抗体応答は、ＴＣＬＡ  ＨＩＶ−１分離株を中和することはできるが、霊長類ＨＩＶ−１分離株に対する中和活性は限られている（Ｂｅｌｓｈｅ他（１９９４）ＪＡＭＡ  ２７２、４７５〜４８０；Ｈａｎｓｏｎ（１９９４）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．１０、６４５〜６４８；Ｋａｈｎ他（１９９４）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７０、１２８８〜１２９１；Ｍａｓｃｏｌａ他（１９９６）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７３、３４０〜３４８；Ｍａｔｔｈｅｗｓ（１９９４）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．１０、６３１〜６３２；Ｓｃｈｗａｒｔｚ他（１９９３）Ｌａｎｃｅｔ  ３４２、６９〜７３；Ｗｒｉｎ他（１９９４）ＡＩＤＳ  ８、１６２２〜１６２３）。さらに、候補単量体ｇｐ１２０サブユニットワクチンの臨床試験に登録された数名は、ワクチン接種計画を十分に受けたにもかかわらず、ＨＩＶ−１に感染し（Ｃｏｎｎｏｒ他（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２、１５５２〜１５７６；Ｋａｈｎ他（１９９５）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７１、１３４３〜１３４７；ＭｃＥｌｒａｔｈ他（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３、３９７２〜３９７７）、これらの感染と感染株との相関はなかった（Ｃｏｎｎｏｒ他（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２、１５５２〜１５７６）。これらの結果は、抗体の大部分が直鎖状エピトープを主に目標としており、ｇｐ１２０／ｇｐ４１を発現した細胞表面に十分接近できないので、これらの単量体ｇｐ１２０ワクチンは、保存された不連続なエピトープに特異的な抗体を惹起することができないことが原因である可能性がある（ＶａｎＣｏｔｔ他（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５、４１００〜４１１０）。これらのデータは、ＴＣＬＡ分離株をベースにした単量体ｇｐ１２０には、広範な反応性を有する中和抗体を誘導する能力に必須の重要な構造的特徴が欠如している可能性があることを示唆している。これらの構造的特性は、ＴＣＬＡ及び主要分離株は補助受容体利用（Ａｌｋｈａｔｉｂ他（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２、１９５５〜１９５８；Ｄｅｎｇ他（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８１、６６１〜６６６；Ｄｒａｊｉｃ他（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８１、６６７〜６７３；Ｆｅｎｇ他（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２、８７２〜８７７）、及び、抗体又は血清媒介中和に対する感受性（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ他（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８、７０５６〜７０６０；Ｂｒｉｇｈｔｙ他（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８、７８０２〜７８０５；Ｄａａｒ他（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７、６５７４〜６５７８；Ｍｏｏｒｅ他（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９、１０１〜１０９；Ｒｏｂｂ他（１９９２）Ｊ．Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．５、１２２４〜１２２９；Ｓａｗｙｅｒ他（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８、１３４２〜１３４９）に関���て顕著に異なる表現型を有することが示されたので、ワクチン株の選択に関与する可能性がある。しかし、ＭＮ株及びＳＦ２株から得られた単量体ｇｐ１２０はまた、類似の初代分離株ＨＩＶ−１ＳＦ２曝露に対してチンパンジーを防御することが示された（Ｂｅｒｍａｎ他（１９９６）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１７３、５２〜５９；Ｇｉｒａｒｄ他（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９、６２３９〜６２４８；ｅｌ−Ａｍａｄ他（１９９５）ＡＩＤＳ  ９、１３１３〜１３２２）。最近、ｇｐ１６０を発現するアデノウイルスで初回刺激を受け、ｒｇｐ１２０ＳＦ２で追加免疫されたチンパンジーが、ＣＸＣＲ４補助受容体及び非ＰＨＡ刺激ＰＢＭＣを使用して、主要分離株に対する中和抗体を生じた（Ｚｏｌｌａ−Ｐａｚｎｅｒ他（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２、１０５２〜１０５９）。後者のことから、初回−追加免疫計画に関して使用すると、機能的抗体特性が高まる可能性が示唆される。
【０００７】
単量体ｇｐ１２０に接近可能な領域に位置する潜在的中和モノクローナル抗体がいくつかあり（Ｔｒｋｏｌａ他（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９、６６０９〜６６１７；Ｔｒｋｏｌａ他（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０、１１００〜１１０８；Ｔｉｌｌｅｙ他（１９９１）Ｒｅｓ．Ｖｉｒｏｌ．１４２、２４７〜２５９；Ｔｈａｌｉ他（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６、５６３５〜５６４１；Ｔｈａｌｉ他（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５、６１８８〜６１９３；Ｇｏｒｎｙ他（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６、７５３８〜７５４２；Ｇｏｒｎｙ他（１９９３）Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１５０、６３５〜６４３；Ｇｏｒｎｙ他（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８、８３１２〜８３２０；Ｃｏｎｌｅｙ他（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１、３３４８〜３３５２；Ｃｏｎｌｅｙ他（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８、６９９４〜７０００；Ｂｕｒｔｏｎ他（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６、１０２４〜１０２７；Ｂａｒｂａｓ他（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１、３８０９〜３８１３；Ｍｏｏｒｅ他（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９、１２２〜１３０；Ｐｏｓｎｅｒ他（１９９３）Ｊ．Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．６、７〜１４；Ｍｕｓｔｅｒ他（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７、６６４２〜６６４７）、単量体ｇｐ１２０に存在するこれらの中和エピトープがなぜワクチンの状態で存在すると免疫原性がなくなるのか依然として解っていない。広範な抗ｇｐ１２０中和モノクローナル抗体の大部分は、単量体ＨＩＶ−１サブユニットワクチンを使用して惹起することが特に困難な立体構造的エピトープに特異的である。抗体結合性と機能的能力とを関連づけるために考案された研究によって、単量体ｇｐ１２０は、中和能力の予測においてオリゴマーのｇｐ１６０のように予測的ではなく（Ｍｏｏｒｅ他（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９、１０１〜１０９；Ｍｏｏｒｅ他（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８、４６９〜４８４；Ｓａｔｔｅｎｔａｕ他（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２、１８５〜１９６；Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ他（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９、６１９１〜６１９８；Ｓｕｌｌｉｖａｎ他（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９、４４１３〜４４２２；Ｆｏｕｔｓ他（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１、２７７９〜２７８５）、膜発現オリゴマーｇｐ１２０／ｇｐ４１の状況では、ｇｐ１２０上の多くのエピトープが隠れてしまうことが原因であるらしいことが示された。
【０００８】
保存された立体構造的エピトープに対して中和抗体を誘導することが困難であることの説明として、単量体型ｇｐ１２０が構造的に不安定であること等が挙げられ、このことはおそらく、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質の適切な４次元構造の状況において安定化されるためであろう。ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１６０は、ウイルス粒子の表面上に多量体（三量体又は四量体）として存在することが知られている（Ｅａｒｌ他（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７、６４８〜６５２；Ｐｉｎｔｅｒ他（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２６７４〜２６７９；Ｓｃｈａｗａｌｌｅｒ他（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７２、３６７〜３６９；Ｔｈｏｍａｓ他（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５、３７９７〜３８０３）。ｇｐ４１に関する最近の構造データは、実質的にアルファヘリックスの内容物を有するｇｐ４１の２領域に対応するペプチドがアルファヘリックスコイルドコイル三量体を形成することを示しており、機能的にはヘマグルチニン融合タンパク質と類似しており（Ｃｈａｎ他（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８９、２６３〜２７３；Ｗｅｉｓｓｅｎｈｏｒｎ他（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８７、４２６〜４３０）、ｇｐ４１は、ｇｐ１２０がないと顕著なアルファヘリックス量を有するオリゴマー（三量体）を形成することを示す以前の生化学的データと一致している（Ｗｅｉｓｓｅｎｈｏｒｎ他（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ１５、１５０７〜１５１４）。別の最近の研究は、哺乳類細胞におけるｇｐ１６０発現から得られたｇｐ４１は四量体を形成することを示しており、アルファヘリックスｇｐ４１配列の外側の領域が、ｇｐ４１の全体的な４次構造に影響を及ぼし得る可能性を示唆している（ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ他（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２、１５２３〜１５３３）。オリゴマーのｇｐ１４０でマウスを免疫すると、ｇｐ４１内のオリゴマー特異的又は感受性のエピトープに特異性を有するいくつかのｍＡｂの誘導が生じることが示された（Ｂｒｏｄｅｒ他（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１、１１６９９〜１１７０３；Ｅａｒｌ他（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８、３０１５〜３０２６）。これらの応答をさらに位置づけすると、６個の抗原決定基が示され、そのうち３個はオリゴマー構造に左右される立体構造的エピトープであった（Ｅａｒｌ他（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７１、２６７４〜２６９４）。これらのｍＡｂは、ＨＩＶ−１血清と競合することが発見され、大きく異なった分離株から得られたＨＩＶ−１ｇｐ４１と交差反応性があるので、これらのエピトープは実質的に保存されていることが示唆された。しかし、これらのｍＡｂのＨＩＶ−１中和活性は測定されておらず、以前の研究では、多くのｇｐ４１特異的ｍＡｂは、おそらくエピトープの大部分がｇｐ１２０との関連することによって遮断されるために、あまり中和活性がないことが示されている（Ｓａｔｔｅｎｔａｕ他（１９９５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０６、７１３〜７１７）。
【０００９】
いくつかの研究によって、受動伝達されたエンベロープ特異的中和抗体は、非ヒト霊長類におけるＳＨＩＶ疾患及び／又は感染を防御できることが実証されおり、（Ｐａｒｒｅｎ他（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５、８３４０〜８３４７；Ｍａｓｃｏｌａ他：（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６、２０７〜２１０；Ｍａｓｃｏｌａ他（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３、４００９〜４０１８；Ｂａｂａ他（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６、２００〜２０６；Ｓｈｉｂａｔａ他（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５、２０４〜２１０）、ワクチン効力におけるＨＩＶ特異的中和抗体の潜在的に重要な役割が強調される。極めて重要な抗体の機能特性は、曝露ウイルスに対する中和能力である。ワクチンが誘発する広範な中和抗体は（受動伝達研究で使用されたＨＩＶ感染に対して惹起された抗体とは異なり）実現が困難であった。最近の開発によって、ＤＮＡ及び組換えウイルスワクチンの戦略にはウイルス特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を引き起こす能力があるという朗報がもたらされた（Ａｍａｒａ他（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２、６９〜７４；Ｂａｒｏｕｃｈ他（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５、５１５１〜５１５８；Ｂａｒｏｕｃｈ他（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０、４８６〜４９２）。これらの応答は、測定可能な中和抗体がなくても、病原体曝露後の疾患からのある程度の防御（無菌化はしない）をもたらした。より強力な中和抗体を誘導し、これらとＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導するワクチン戦略とを併用するという最近の目標によって、レベルの高い防御をもたらすことができる。中和抗体の誘導に向けて新たなサブユニットエンベロープワクチンの研究を続けることは、依然として残されている目標である。
【００１０】
既に、単離されたＨＩＶ−１エンベロープ配列をウサギに投与すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＨＩＶ−１の複数株に対して広範な交差反応応答性を備えた抗体の産生がもたらされることが確認されている（国際公開第００／０７６３１号パンフレット）。本発明は、交差反応性の高い中和応答の改善された予期せぬ知見をもたらすために、これらのエンベロープタンパク質と併用できるアジュバント系を同定することによって、以前のこれらの発見を前進させる。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＨＩＶ−１の複数株に対する交差反応性中和抗血清の産生を誘導することができる単離ＨＩＶエンベロープタンパク質であって、ＨＩＶエンベロープタンパク質のＶ３領域が配列番号１のアミノ酸３１３から３２５を含むＨＩＶエンベロープタンパク質又はその免疫原性断片と、サポニンと組み合わせたＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４リガンドとを含むワクチン及び／又は免疫原性組成物を包含する。
【００１２】
本発明の他の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＨＩＶ−１の複数株に対する交差反応性中和抗血清の産生を誘導することができる単離ＨＩＶエンベロープタンパク質であって、配列番号１と少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＩＶエンベロープタンパク質と、サポニンと組み合わせたＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４リガンドを含むワクチン及び／又は免疫原性組成物を提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４リガンドは、限定はしないが、モノホスホリルリピドＡを含むリピドＡ誘導体である。モノホスホリルリピドＡの例には、限定はしないが、３脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）が含まれる。いくつかの実施形態では、サポニンはＱＳ−２１である。いくつかの実施形態では、サポニンはリポソーム、ＩＳＣＯＭ又は水中油エマルジョンの形で提供される。
【００１４】
ワクチン及び／又は免疫原性組成物のいくつかの実施形態では、ＨＩＶエンベロープタンパク質は、配列番号１と少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、又は少なくとも９９パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＩＶエンベロープタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
本発明は、前述のワクチン及び／又は免疫原性組成物のいずれかをそれを必要とするヒトに投与することによって免疫応答を誘導する方法を包含する。本発明は、ＨＩＶ感染及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の予防及び／又は治療のための医薬品の製造における前述のワクチン及び／又は免疫原性組成物の使用を包含する。
【００１６】
前述の概要並びに以下の本発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むと、よりよく理解されるだろう。本発明を例示する目的で、図には本発明の実施形態を示す。しかし、本発明は、示した正確な配列、実施例及び手段に限定されないことを理解されたい。
【詳細な説明】
【００１７】
引用した特許、特許出願、出版物及びこの出願で引用したその他の書類は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。本発明は、本出願で記載した特定の実施形態に関して限定するものではなく、本発明の個々の態様を単に例示するものである。本明細書で列記したものに加えて、本発明の範囲内で機能的に同等の方法及び装置は、前述の説明及び添付の図面から当業者には明らかであろう。このような変更及び変化は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入るものとする。
【００１８】
ＨＩＶに対する免疫の目標は、様々なウイルス株に対して広く反応する中和抗体（ＮＡ）応答を誘導することである。本発明者等は、ウサギをある種のアジュバントで賦活化したＨＩＶ−１Ｒ２株のオリゴマーｇｐ１４０で免疫すると、強力で、広範な交差反応性のある中和抗体応答の誘導が生じることを発見した。ｇｐ１４０で免疫した動物の血清は、４５種類の異なるＨＩＶ−１株のエンベロープ糖タンパク質のそれぞれでシュードタイプ化したウイルスの感染性を阻害した。この株には、１９種のサブタイプＢ株、１４種類のサブタイプＣ株、及びサブタイプＡ、Ｄ、ＡＥ、Ｆ、ＡＧ、Ｈ及び複合ＣＲＦエンベロープが含まれる。この結果は、実に広範な交差反応性を有し、非ヒト霊長類の免疫及び曝露研究を考案するための新たな原動力となり、ＨＩＶ−１を高い交差反応性で中和するための基礎を吟味するためのモデル系を確立する、免疫に対するＨＩＶ−１中和応答を最初に示したものである。本発明は、ワクチン及び免疫原性組成物、提供した組成物を使用した免疫応答の誘導方法、並びに、ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳを予防、及び／又は、治療するための医薬品の製造における本発明の組成物の使用を包含する。
【００１９】
本明細書で記載したものと類似又は同等の任意の方法及び材料は本発明の実施又は試験で使用することができるが、適切な方法及び材料の例を記載する。特記しなければ、本明細書で使用した技術用語及び科学用語は全て、本発明の属する業界の当業者によって通常理解されるのと同一の意味を有する。
【００２０】
ポリペプチドについての「同定する」の意味を以下に挙げる。ポリペプチドの実施形態はさらに、ポリペプチド参照配列と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有するポリペプチドを含む単離ポリペプチドを含み、前記ポリペプチド配列は参照配列と同一であってよく、又は参照配列と比較してある整数の数までのアミノ酸変化を含んでよく、前記変化は、少なくとも１個のアミノ酸欠失、保存的及び非保存的置換を含む置換、又は挿入からなる群から選択され、前記変化は、参照ポリペプチド配列のアミノ末端若しくはカルボキシ末端の位置又はそれらの末端位置の間のどこか、参照配列のアミノ酸の中に個々に分散しているか、又は参照配列内の１個又は複数の連続した群に生じてよく、アミノ酸変化の前記数は、アミノ酸の総数に、パーセント同一性を表す整数を１００で除したものを乗じ、次にアミノ酸の前記総数からその結果を差し引くことによって決定されるか、又は、ｎａ  ｘａ−（ｘａ  ｙ）によって決定され、式中、ｎａはアミノ酸変化の数であり、ｘａは配列中のアミノ酸の総数であり、ｙは９５％の場合０．９５、９７％の場合０．９７、又は１００％の場合１．００であり、  はかけ算操作の印であり、ｘａ及びｙの任意の非整数の結果は、ｘａから差し引く前に最も近い整数に切り捨てられる。
【００２１】
ヌクレオチド又はアミノ酸配列レベルでの相同性又は配列同一性はまた、配列類似性検索用に個別化されたｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５、３３８９〜３４０２及びＫａｒｌｉｎ他（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７、２２６４〜２２６８、いずれも参照として全体が組み込まれている）によって用いられるアルゴリズムを使用してＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）分析によって測定することができる。ＢＬＡＳＴプログラムによって使用される取り組みとは、検索配列とデータベース配列との間の、ギャップを有する（非隣接）、及びギャップを有さない（隣接）類似部分を最初に考察し、次に同定された一致全部の統計学的有意性を評価し、最終的に予め選択した有意性の閾値を満たす一致のみをまとめることである。配列データベースの類似性検索における基本的問題の考察については、参照として全体を組み込んだＡｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６、１１９〜１２９を参照のこと。ヒストグラム、説明、アラインメント、期待値（すなわち、データベース配列に対して報告された一致の統計学的に有意な閾値）、カットオフ、マトリクス及びフィルター（低複雑性）の検索パラメータは、初期設定にする。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘによって使用される初期設定スコアリングマトリクスは、ヌクレオチド長又はアミノ酸長が８５個を上回る検索配列のために推奨されるＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス（参照として全体を組み込んだＨｅｎｉｋｏｆｆ他（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９、１０９１５〜１０９１９）である。
【００２２】
ｂｌａｓｔｎでは、スコアリングマトリクスは、Ｎ（すなわち、不一致残基のペナルティースコア）に対するＭ（すなわち、一致残基対のリワードスコア）の比によって設定され、Ｍ及びＮの初期設定値はそれぞれ、＋５及び−４である。４種類のｂｌａｓｔｎパラメータは、以下のように調節した。Ｑ＝１０（ギャップ生成ペナルティー）、Ｒ＝１０（ギャップ伸長ペナルティー）、ｗｉｎｋ＝１（検索に沿ってｗｉｎｋ番目の位置毎にワードヒットが生じる）及びｇａｐｗ＝１６（ギャップ付きアラインメントが生じる範囲内のウインドウ幅に設定する）。同等のＢｌａｓｔｐパラメータの設定は、Ｑ＝９、Ｒ＝２、ｗｉｎｋ＝１及びｇａｐｗ＝３２であった。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０で利用可能な配列間のＢｅｓｔｆｉｔ比較では、ＤＮＡパラメータＧＡＰ＝５０（ギャップ生成ペナルティー）及びＬＥＮ＝３（ギャップ伸長ペナルティー）を使用し、タンパク質の比較では同様にＧＡＰ＝８及びＬＥＮ＝２に設定した。
【００２３】
「単離された」とは、「人の手によって」天然の状態から変化したことを意味し、すなわち、天然に生じるならば、元の環境から変化させるか、又は取り出すこと、或いはその両方である。例えば、生きている生物に天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは、「単離されて」いないが、その天然の状態で一緒に存在する物質から分離された同ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、限定はしないが、このようなポリヌクレオチド又はポリペプチドが細胞に再度導入されるときを含めて「単離されて」いる。
【００２４】
「ポリヌクレオチド」とは一般的に、未修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又は、修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってよい任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドのことである。「ポリヌクレオチド」には、限定はしないが、１本鎖及び２本鎖ＤＮＡ、１本鎖及び２本鎖領域又は１本鎖、２本鎖及び３本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖及び２本鎖ＲＮＡ、１本鎖及び２本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、１本鎖若しくはより一般的には２本鎖、若しくは３本鎖領域、又は１本鎖及び２本鎖領域の混合物であってよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれる。さらに、本明細書で使用したような「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又は、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む３本鎖領域のことである。このような領域の鎖は、同一分子又は異なる分子から得ることができる。この領域には、１種又は複数の分子の全てが含まれてよいが、より一般的には分子のいくつかの領域のみが関与してよい。３本鎖ヘリカル領域の分子の１つは、オリゴヌクレオチドであることが多い。本明細書で使用したように、「ポリヌクレオチド」という用語にはまた、１個又は複数の修飾塩基を含む前述のようなＤＮＡ又はＲＮＡが含まれる。したがって、安定性若しくはその他の理由のために修飾された主鎖を有するＤＮＡ若しくはＲＮＡは、その用語が本明細書で企図されているとき、「ポリヌクレオチド」である。さらに、ほんの２、３の例を挙げると、イノシン等の普通にはない塩基又はトリチル化塩基等の修飾された塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡは、その用語が本明細書で使用されているとき、ポリヌクレオチドである。当業者に公知の多くの有用な目的に使える非常に様々な変更がＤＮＡ及びＲＮＡに行われていることは理解されよう。本明細書で使用するとき、「ポリヌクレオチド」という用語は、ポリヌクレオチドのこのような化学的、酵素的又は代謝的に変更された形態、並びに、ウイルス及び、例えば、単純及び複雑な細胞を含む細胞に特徴的なＤＮＡ及びＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、オリゴヌクレオチドと呼ばれることが多い短いポリヌクレオチドを包含する。
【００２５】
「ポリペプチド」とは、互いにペプチド結合又は修飾されたペプチド結合によって結合した２個以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質のことである。「ポリペプチド」とは、一般的にペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーと呼ばれる短鎖、並びに、一般的にタンパク質と呼ばれる長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは、２０個の遺伝子がコードするアミノ酸以外のアミノ酸を含むことができる。「ポリペプチド」には、天然のプロセス、例えば、プロセシング及びその他の翻訳的修飾によって修飾されたものだけでなく、化学的修飾技術によって修飾されたものも含まれる。このような修飾は、基本的教科書によく説明されており、学術文献及び詳しい研究文献ではさらに詳細に説明されており、当業者には周知である。同種の修飾は、所与のポリペプチド中のいくつかの部位に同様の、又は、様々な程度で存在することができることは理解されよう。また、所与のポリペプチドは多くの種類の修飾を含んでよい。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミノ末端若しくはカルボキシル末端を含むポリペプチドのどこでも生じることが可能である。修飾には、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド若しくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質若しくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋結合の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質プロセシング、ホスホリル化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化及びＡＤＰ−リボシル化、セレノイル化、硫酸化、転移ＲＮＡ媒介によるアミノ酸のタンパク質への付加、例えば、アルギニル化及びユビキチン化が含まれる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第２版、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（編）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）及びＰｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）のＷｏｌｄ、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ、ｐｐ．１〜１２；Ｓｅｉｆｔｅｒ他（１９９０）Ｍｅｔｈ：Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２、６２６〜６４６及びＲａｔｔａｎ他（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３、４８〜６２を参照のこと。ポリペプチドは、分枝していてもよく、分枝を含む、又は含まない環式であってよい。環式、分枝及び分枝環式ポリペプチドは、翻訳後の天然のプロセスによって生じることができ、同様に、合成法によって完全に作製することもできる。
【００２６】
ワクチン及び／又は免疫原性組成物
本発明のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、その組成物を投与されたヒトにおいて、いくつかの体液性及び／又は細胞性免疫応答の少なくとも１つを誘導するか、又は、少なくとも１種のＨＩＶ株に対して少なくとも１種の免疫応答を高めるのに効果的であり、したがって、投与はワクチン接種の目的及び／又は１種又は複数のＨＩＶ−１株によるＨＩＶ感染の予防に適している。本発明の組成物は、１種又は複数のＨＩＶ−１由来のｇｐ１２０、ｇｐ１４０、及び／又は、ｇｐ１６０及びアジュバントを含む組換えｅｎｖタンパク質をそれを必要とする対象に送達する。いくつかの実施形態では、ｇｐ１２０及びｇｐ１４０は、国際公開第００／０７６３１号パンフレットに記載のようにＨＩＶ−１Ｒ２株から得られる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ワクチン及び／又は免疫原性組成物は、本明細書に記載の１種又は複数のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を含む。本発明のエンベロープタンパク質には、配列番号１を含むアミノ酸配列を有する完全長エンベロープタンパク質、配列番号１のアミノ酸１から５２０に対応するアミノ酸配列を含むｇｐ１２０、配列番号１のアミノ酸５２１から８６６に対応するアミノ酸配列を含むｇｐ４１、並びに、Ｖ３ドメイン及びＶ１／Ｖ２、Ｃ３、Ｖ４、Ｃ４及びＶ５等のその他のドメインに対応するポリペプチド及びペプチドが含まれる。これらのドメインは、配列番号１の以下のアミノ酸残基に対応する。
【００２８】
【表１】
2009536653.tif 000002
【００２９】
本発明の組成物は、任意の単一ドメインを含むタンパク質及び／又はポリペプチドを含有してよく、長さは様々であってよいが、以前に配列決定したエンベロープタンパク質とは異なる配列番号１のアミノ酸残基３１３から３２５を含む。例えば、Ｖ３ドメインの全部又は一部を含む本発明のペプチドは、配列ＰＭＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｑを含むことができ、Ｘ１からＸ１０は任意の天然又は非天然アミノ酸（Ｐはプロリンを意味し、Ｍはメチオニンを意味し、Ｑはグルタミンを意味する）を含むことができる。本発明の一実施形態では、本発明のエンベロープタンパク質は、配列番号１のＨＩＶエンベロープタンパク質のＶ３領域（アミノ酸３０１から３３６）と少なくとも約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％同一である。したがって、本発明のＶ３ペプチドは、約１３個のアミノ酸を含むが、アミノ酸長は少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０又はそれ以上であってよい。一実施形態では、Ｖ３ドメインは、アミノ酸配列ＰＭＧＰＧＲＡＦＹＴＴＧＱ（配列番号１のアミノ酸３１３から３２５）（配列番号２）を含む。
【００３０】
本発明の別の実施形態では、Ｖ１／Ｖ２ドメインの全て又は一部を含むエンベロープタンパク質には、配列番号１のアミノ酸１６７に対応する位置のアラニン残基を有するアミノ酸配列が含まれる。例えば、Ｖ１／Ｖ２ドメインにわたる本発明のペプチドは、アミノ酸配列ＦＮＩＡＴＳＩＧ（配列番号１のアミノ酸１６４から１７１）（配列番号３）を含むことができ、アミノ酸長は約８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個以上であってよい。本明細書で使用したように、「対応する位置の」とは、周囲の残基の状況で、又は特定の配列のアラインメントによって、配列番号１の配列の所与のアミノ酸残基と同等である本発明のＨＩＶエンベロープタンパク質又はペプチドにおけるアミノ酸の位置を意味する。
【００３１】
本発明では、ワクチン及び／又は免疫原性組成物は、アジュバントを含む。本明細書で使用したように、「アジュバント」とは、それ自身にはいかなる特定の抗原作用も有さないが、免疫系を刺激してワクチンに対する応答を高めることができる薬剤のことである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、サポニンと組み合わせてＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４リガンドを含む。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４リガンドは、例えば、リピドＡ誘導体、特にモノホスホリルリピドＡ、又は、より特定の３脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）等のアゴニストであってよい。３Ｄ−ＭＰＬは、Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社から登録商標ＭＰＬ（登録商標）として販売されており、主にＩＦＮ−ｇ（Ｔｈ１）表現型のＣＤ４＋Ｔ細胞応答を促進する。ＧＢ２２２０２１１Ａで開示された方法によって製造することができる。化学的に、３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡと３、４、５又は６本のアシル化鎖との混合物である。一実施形態では、本発明の組成物において、小粒子３Ｄ−ＭＰＬを使用する。小粒子３Ｄ−ＭＰＬは、０．２２μｍフィルターによって滅菌濾過され得るような粒径を有する。このような調製は、国際公開第９４／２１２９２号パンフレットに記載されている。
【００３２】
アジュバントにはまた、限定はしないが、以下に含まれるＴＬＲ４アゴニストとして知られているリピドＡの１種又は複数の合成誘導体を含めることができる。
【００３３】
国際公開第９５／１４０２６号パンフレットに記載のＯＭ１７４（２−デオキシ−６−ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラ−デカノイルアミノ］−４−ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシルジヒドロゲンホスフェート）。
【００３４】
国際公開第９９／６４３０１号パンフレット及び国際公開第００／０４６２号パンフレットに記載のＯＭ２９４ＤＰ（３Ｓ、９Ｒ）−３−［（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９（Ｒ）−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１、１０−ジオール、１、１０−ビス（ジヒドロゲノホスフェート）。
【００３５】
国際公開第０１／４６１２７号パンフレットに記載のＯＭ１９７ＭＰ−ＡｃＤＰ（３Ｓ−，９Ｒ）−３−［（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１、１０−ジオール、１−ジヒドロゲノホスフェート１０−（６−アミノヘキサノエート）。
【００３６】
使用できるその他のＴＬＲ４リガンドには、限定はしないが、国際公開第９８／５０３９９号パンフレット又は米国特許第６３０３３４７号（ＡＧＰ調製方法も開示されている）に開示されているもの等のアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）、又は、米国特許第６７６４８４０号に開示されたようなＡＧＰの薬学的に許容される塩が含まれる。いくつかのＡＧＰは、ＴＬＲ４アゴニストであり、いくつかはＴＬＲ４アンタゴニストである。いずれも、本発明の組成物において１種又は複数のアジュバントとして使用することができる。
【００３７】
本発明で使用するために好ましいサポニンは、ＱｕｉｌＡ及びその誘導体である。ＱｕｉｌＡは、南アメリカの樹木Ｑｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａから単離されたサポニン調製物であり、Ｄａｌｓｇａａｒｄ他（１９７４）Ｓａｐｏｎｉｎ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ、Ａｒｃｈｉｖ．ｆｕｒ  ｄｉｅ  ｇｅｓａｍｔｅ  Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇ、Ｖｏｌ．４４、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、ｐｐ．２４３〜２５４によってアジュバント活性を有することが最初に記載された。ＱｕｉｌＡ、例えば、ＱＳ７及びＱＳ２１（ＱＡ７及びＱＡ２１としても知られている）に関連した毒性を有さずアジュバント活性を保持するＱｕｉｌＡの精製された断片は、ＨＰＬＣによって単離された（欧州特許第０３６２２７８号）。ＱＳ２１は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、Ｔｈ１細胞及び優性なＩｇＧ２ａ抗体応答を誘導するＱｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの樹皮から得られた天然サポニンであり、本発明の場合好ましいサポニンである。
【００３８】
特に好ましいＱＳ２１の特定の調製物が記載されており、これらの調製物はさらにステロールを含む（国際公開第９６／３３７３９号パンフレット）。本発明の一部を形成するサポニンは、ミセル、混合ミセル（好ましいが、胆汁酸塩に限定しない）の形態で分離することもでき、或いはＩＳＣＯＭマトリクス（欧州特許第０１０９９４２Ｂ１号）、リポソーム又はらせん状若しくは環状の多量体複合体等の関連するコロイド状構造の形、又はコレステロール及び脂質と共に調製するときは脂質／層構造及びラメラの形、又は（例えば、国際公開第９５／１７２１０号パンフレットにあるように）水中油エマルジョンの形でもよい。サポニンは、金属塩、例えば、水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムと結合し得る（国際公開第９８／１５２８７号パンフレット）。いくつかの実施形態では、サポニンはリポソーム、ＩＳＣＯＭ又は水中油エマルジョンの形で提供される。
【００３９】
いくつかの実施形態では、アジュバントは３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１（欧州特許第０６７１９４８Ｂ１号）及び３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１を含む水中油エマルジョン（国際公開第９５／１７２１０号パンフレット、国際公開第９８／５６４１４号パンフレット）の組み合わせである。
【００４０】
本発明の一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＨＩＶ−１の複数株に対する交差反応性中和抗血清の産生を誘導することができる、単離ＨＩＶエンベロープタンパク質であって、ＨＩＶエンベロープタンパク質のＶ３領域が配列番号１のアミノ酸３１３から３２５を含む単離ＨＩＶエンベロープタンパク質；及び、ＱＳ２１及びＭＰＬを有する水中油エマルジョンを含むアジュバントであって、トコフェロールも存在しても良く、例えば、このエマルジョンは、スクアレン５％、トコフェロール５％、Ｔｗｅｅｎ８０  ２．０％を含有し、粒径は約１８０ｎｍであってよいアジュバント、を含む免疫原性組成物が提供される。或いは、アジュバントはリポソームＱＳ２１及びＭＰＬを含んでよく、例えば、このリポソームの大きさは約１００ｎｍであり、ＳＵＶ（単層小胞）と称する。
【００４１】
本発明の他の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＨＩＶ−１の複数株に対する交差反応性中和抗血清の産生を誘導することができる、単離ＨＩＶエンベロープタンパク質であって、ＨＩＶエンベロープタンパク質は配列番号１と少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列、例えば、配列番号１と９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ＨＩＶエンベロープタンパク質；及び、ＱＳ２１及びＭＰＬを有する水中油エマルジョンを含むアジュバントであって、トコフェロールも存在しても良く、例えば、このエマルジョンは、スクアレン５％、トコフェロール５％、Ｔｗｅｅｎ８０  ２．０％を含有し、粒径は約１８０ｎｍであってよいアジュバント、を含む免疫原性組成物が提供される。或いは、アジュバントはリポソームＱＳ２１及びＭＰＬを含んでよく、例えば、このリポソームの大きさは約１００ｎｍであり、ＳＵＶ（単層小胞）と称する。
【００４２】
本発明のさらに他の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＨＩＶ−１の複数株に対する交差反応性中和抗血清の産生を誘導することができる、単離ＨＩＶエンベロープタンパク質であって、ＨＩＶエンベロープタンパク質は配列番号１のアミノ酸配列からなる単離ＨＩＶエンベロープタンパク質；及び、ＱＳ２１及びＭＰＬを有する水中油エマルジョンを含むアジュバントであって、トコフェロールも存在しても良く、例えば、このエマルジョンは、スクアレン５％、トコフェロール５％、Ｔｗｅｅｎ８０  ２．０％を含有し、粒径は約１８０ｎｍであってよいアジュバント、を含む免疫原性組成物が提供される。或いは、アジュバントはリポソームＱＳ２１及びＭＰＬを含んでよく、例えば、このリポソームの大きさは約１００ｎｍであり、ＳＵＶ（単層小胞）と称する。
【００４３】
本明細書で記載の免疫原性断片は、抗原の少なくとも１個のエピトープを含有し、ＨＩＶ抗原性を示し、適切な構築物中で提供されるとき、例えば、その他のＨＩＶ抗原と融合しているか又は担体上で提供されるとき、免疫応答を起こすことができ、この免疫応答は天然の抗原に対して誘導される。本発明の一実施形態では、免疫原性断片は、ＨＩＶ抗原の少なくとも２０個の連続したアミノ酸、例えば、ＨＩＶ抗原の少なくとも５０、７５又は１００個の連続したアミノ酸を含有する。
【００４４】
本発明の一実施形態では、ワクチン及び／又は免疫原性組成物は、アジュバントＡＳ０２Ａ（Ｇ１ａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含む。別の実施形態では、ワクチン及び／又は免疫原性組成物は、アジュバントＡＳ０３Ａ（Ｇ１ａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含む。
【００４５】
本発明の別の実施形態では、ワクチン及び／又は免疫原性組成物は、医薬組成物の一部であってよい。本発明の医薬組成物は、賦形剤及び補助剤を含む適切な薬学的に許容される担体を含有してよく、これは、作用部位に送達するために薬学的に使用することができる調製物中への活性化合物の加工を促進するものである。
【００４６】
本発明のワクチン及び／又は免疫原性組成物はさらに、本発明の免疫方法をさらに増強することができる様々な株由来のｇｐ１２０及びｇｐ１４０に対応し得る他のＨＩＶ−１ｅｎｖタンパク質を含んでよい。
【００４７】
使用方法
本発明は、本発明の組成物を投与することを含むＨＩＶ感染及び／又はＡＩＤＳの予防及び／又は治療方法を包含する。ＨＩＶ−１ｅｎｖタンパク質ｇｐ１２０及び／又はｇｐ１４０を本明細書で記載したアジュバントと共にワクチン接種することによって惹起された活性化免疫は、細胞性又は体液性免疫応答を刺激するか、又は追加刺激することができる。有効量のＨＩＶ−１ｅｎｖタンパク質、ｇｐ１２０及び／又はｇｐ１４０又はそれらの抗原断片は、ワクチンを調製するためにアジュバントに混合して調製することができる。
【００４８】
ＨＩＶ−１ｅｎｖタンパク質、ｇｐ１２０及び／又はｇｐ１４０を含むか、又はコードするワクチン及び／又は免疫原性組成物を本明細書で記載した１種又は複数のアジュバントと共に投与することは、「予防」又は「治療」目的のいずれかであることができる。本発明の一態様では、組成物は予防目的で有用である。予防的に用いる場合、このワクチン組成物は、ＨＩＶ感染又はＡＩＤＳの症状の検出に先だって提供される。有効量の化合物の予防的投与は、その後のＨＩＶ感染の防御又は軽減に役立つ。治療的に用いる場合、このワクチンは、実際に感染の症状が検出されたとき有効量で提供される。組成物は、投与がレシピエント患者によって許容され得るならば、「薬理学的に許容される」と言われる。このような薬剤は、投与された量に生理学的な意味があれば、「治療的又は予防的に有効な量」で投与されると言われる。本発明のワクチン又は免疫原性組成物は、例えば、ＨＩＶ−１の１種又は複数の株に対する広範な反応性の体液性若しくは細胞性免疫応答を増強することによって、その存在がレシピエント患者の生理に検出可能な変化をもたらすならば、生理学的な意味がある。対照集団に対して統計学的に有意な改善があるならば、もたらされた「防御」は、完全である必要はない（すなわち、ＨＩＶ感染又はＡＩＤＳは、完全に防御したり根絶したりする必要はない）。防御は、疾患の症状の重症度又は発症の迅速性の緩和に限定することができる。
【００４９】
本発明のワクチン又は免疫原性組成物は、ＨＩＶ−１の複数株に耐性をもたらす可能性がある。したがって、本発明は、少なくとも２種類のＨＩＶ−１株による感染を防御するか、又は軽減するための手段を提供する。本明細書で使用したように、ワクチンは、個体に投与して、疾患の徴候又は症状の全体的若しくは部分的な軽減（すなわち、抑制）、或いは、疾患に対する個体の全体的若しくは部分的免疫のいずれかを引き起こすならば、疾患を防御又は軽減したと言われる。
【００５０】
本発明の少なくとも１種のワクチンは、例えば、本明細書で説明した医薬組成物を使用して、企図する目的を実現する手段によって投与することができる。例えば、このような組成物の投与は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経皮的又は頬側経路等の様々な非経口経路によることができる。本発明の一実施形態では、この組成物は皮下投与される。非経口投与は、ボーラス注射又は時間をかけた持続潅流によることができる。
【００５１】
積極的特異的細胞免疫治療によって細胞性免疫応答で軽減することができる疾患、又は、症状を予防、抑制若しくは治療するための一般的計画には、単一の治療薬として投与する、又は、１週間から約２４ヶ月までの期間及びそれらを含む期間にわたって、繰り返し増強投与若しくは追加投与する、前述の有効量のワクチン組成物の投与が含まれる。
【００５２】
本発明では、ワクチン組成物の「有効量」とは、この場合、１種又は複数のＨＩＶ−１株に対する少なくとも１種の細胞性免疫応答又は体液性免疫応答の所望する生物学的効果を実現するために十分な量である。有効投与量は、レシピエントの年齢、性別、健康状態及び体重、もし有るならば併用治療の種類、治療頻度、並びに、所望する効果の特徴に左右されると考えられる。以下に挙げた有効用量の範囲は、本発明を制限するものではなく、本発明の組成物を投与するために適切であり得る用量範囲の例を表している。しかし、過度の実験を行うことなく当業者には理解され、決定できるように、用量を個々の対象に対して調整することができる。（例えば、Ｂｅｅｒｓ（１９９９）Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇｅｎｎａｒｏ他（２００５）、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ；Ｋａｔｚｕｎｇ（１９８８）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ；ここに引用されたこれらの参考文献類は、参照により全体を本明細書に組み込む）。
【００５３】
本発明はさらに、本明細書で説明したポリペプチドの調製方法であって、適切な発現系において、特に、Ｅ．ｃｏｌｉ等の原核細胞系において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現すること、及び、発現したポリペプチドを回収することを含む方法を提供する。好ましくは、発現は、ポリペプチドの溶解性を促進するために、３７°未満の低温で誘導する。
【００５４】
本発明はさらに、本明細書で説明したようなポリペプチドの精製方法を提供し、その方法は、
ｉ．未精製ポリペプチドを含む組成物を提供するステップと、
ｉｉ．前記組成物に少なくとも２種類のクロマトグラフィーステップを行うステップと、
ｉｉｉ．ポリペプチドを任意選択でカルボキシアミド化するステップと、
ｉｖ．医薬製剤のために適切な緩衝液中にこのタンパク質を提供するために、緩衝液交換ステップを実施するステップと、を含む。
【００５５】
カルボキシアミド化は、２回のクロマトグラフィーステップの間に実施してよい。カルボキシアミド化ステップは、ヨードアセトイミドを使用して実施してよい。一例では、本発明による方法は、２回以下のクロマトグラフィーステップを使用する。
【００５６】
本発明はさらに、薬学的に許容されるアジュバント又は担体と組み合わせて、本発明によるポリペプチド及びアジュバントの組み合わせを含む医薬組成物及び免疫原性組成物及びワクチンを提供する。
【００５７】
本発明によるワクチンは、ＨＩＶに対する予防的又は治療的免疫のために使用することができる。本発明はさらに、ＨＩＶに対する予防的又は治療的免疫のためのワクチンの製造における、本明細書で記載したポリペプチド組成物の使用を提供する。
【００５８】
本発明のワクチンは、免疫防御又は免疫治療量のポリペプチド及びアジュバントの組み合わせを含有し、従来の技術によって調製することができる。
【００５９】
ワクチン調製物は一般的に、Ｎｅｗ  Ｔｒｅｎｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｖｏｌｌｅｒ他編（１９７８）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒｋ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤに記載されている。リポソーム内への封入は、例えば、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、米国特許第４２３５８７７号に記載されている。タンパク質の高分子への結合は、例えば、Ｌｉｋｈｉｔｅ、米国特許第４３７２９４５号及びＡｒｍｏｒ他、米国特許第４４７４７５７号に開示されている。
【００６０】
ワクチン用量におけるタンパク質の量は、通常のワクチン内で、重大で有害な副作用を起こすことなく免疫防御応答を誘導する量として選択される。このような量は、使用した特定の免疫原／アジュバントの組み合わせ、及び、選択したワクチン接種計画に応じて変化させる。一般的に、各用量は、各タンパク質を１から１０００μｇ、例えば、ポリペプチドを２から２００μｇ、又は４から４０μｇ含むことが予測される。特定のワクチンの最適な量は、抗体力価及び対象におけるその他の免疫応答の観察が関与する標準的研究によって確認することができる。最初のワクチン接種後、対象はその後追加投与を受けることができる。このような追加投与は、最初のワクチンを接種してから約４週間後に行い、その後第２回の追加免疫を行うことができる。
【００６１】
これらの製剤は、製剤を保有するために十分な量の任意の適切な薬学的媒体又は担体中に懸濁することができる。一般的に、担体、アジュバント等を含む最終量は、通常少なくとも０．１ｍｌ、より一般的には少なくとも約０．２ｍｌである。上限は、投与する量の実用性によって決定され、一般的に約０．５ｍｌ以下から約１．０ｍｌである。
【００６２】
本発明のワクチンのレシピエントは、ＨＩＶ−１に対する細胞性又は体液性免疫応答によって特異的免疫を獲得することができる哺乳類であることができ、この細胞性応答はＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩタンパク質によって媒介される。哺乳類の中でも、レシピエントは、霊長目の哺乳類（ヒト、チンパンジー、類人猿及びサルを含む）であってよい。本発明の一実施形態では、ヒトを本発明の免疫原性組成物で治療する方法を提供する。対象は、ＨＩＶに感染していてよく、又は、ＨＩＶ−１感染のモデルであってよい（例えば、Ｈｕ他（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２８、７２１〜７２３を参照のこと、この文献は、参照として全体を本明細書に組み込む）。
【実施例】
【００６３】
本発明をここで以下の実施例を参照にして説明する。これらの実施例は、例示するためにのみ提供されており、本発明は、これらの実施例に決して制限されるものではなく、本明細書で提供した教示の結果として明らかなありとあらゆる変更を包含するものでなければならない。以下の材料及び方法は、その後の実施例に関して提供されているが、本発明に包含される材料及び方法の多様性を制限するものではない。
【００６４】
以下の実施例では、ＨＩＶ−１感染個体から得られたＥｎｖを使用しており、この個体の血清抗体は様々なウイルスサブタイプの多くのＨＩＶ−１初代株に対して広範な中和交差反応性を表す（Ｄｏｎｇ他（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７７、３１１９〜３１３０；Ｚｈａｎｇ他（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６、６４４〜６５５）。Ｒ２と称されるこのＥｎｖは、ＣＤ４非依存性感染を媒介することができる天然に生じるＨＩＶ−１エンベロープとして非常に珍しい（Ｚｈａｎｇ他（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６、６４４〜６５５）。小動物及び非ヒト霊長類で実施された免疫原性の研究では、このＥｎｖは複数のＨＩＶ−１に対して中和抗体を誘導することが示され、非ヒト霊長類ではサル−ヒト免疫不全ウイルス（ＳＨＩＶ）の異種株による静脈内曝露に対して防御を誘導することが示された（Ｄｏｎｇ他（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７、３１１９〜３１３０；Ｑｕｉｎｎａｎ他（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７９、３３５８〜３３６９）。
【００６５】
ｇｐ１４０及びｇｐ１２０の産生
ｇｐ１４０Ｒ２、ｇｐ１４０１４／００／４及びｇｐ１４０ＣＭ２４３をコードする配列は、予測ｇｐ４１膜貫通領域の直前に２個の翻訳終止コドンを挿入し、産生中のオリゴマーエンベロープ糖タンパク質の生成を増加させるため、アルギニンをセリンに置換させてプロテアーゼ切断シグナルを混乱させることによって調製される（Ｄｏｎｇ他（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７、３１１９〜３１３０；Ｑｕｉｎｎａｎ他（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９、３３５８〜３３６９）。ｇｐ１２０Ｒ２コード配列は、翻訳終止コドンの挿入によって調製される。この遺伝子は、ワクチンベクター、ｐＭＣＯ２にサブクローニングされた（Ｄｏｎｇ他（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７、３１１９〜３１３０）。組換えワクチンウイルスは、標準的方法を使用して作製された（Ｄｏｎｇ他（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７、３１１９〜３１３０；Ｑｕｉｎｎａｎ他（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７９、３３５８〜３３６９）。糖タンパク質が産生され、レンチルレクチンセファロース４Ｂアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、血清を含まない培地で調製した培養上清から精製した（Ｄｏｎｇ他（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７、３１１９〜３１３０；Ｑｕｉｎｎａｎ他（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９、３３５８〜３３６９）。オリゴマーｇｐ１４０Ｒ２は詳細に分析されており、サイズ排除クロマトグラフィーに基づいて、約４０％が三量体で、６０％が二量体であることが示されている（Ｄｏｎｇ他（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７、３１１９〜３１３０；Ｑｕｉｎｎａｎ他（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９、３３５８〜３３６９）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色による分析で、糖タンパク質に一般的な電気泳動移動度であり、純度が９８％であることが明らかになった。内毒素濃度は、０．２〜１．１ＥＵ／μｇであった。
【００６６】
ウイルス株
この研究で使用したシュードタイプ化ウイルスの調製のために使用したエンベロープ遺伝子をコードするプラスミドを表１に記載する。現在の流行株の代表と考えられるサブタイプＢ及びＣのエンベロープ糖タンパク質をコードするＳＶＰＢ又はＤＵの文字で開始するプラスミド（Ｌｉ他（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９、１０１０８〜１０１２５）を表１に挙げる。全て初代ウイルスである。Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ博士から入手したサブタイプＢ株及び３種類のサブタイプＣ株は、博士がＮＩＨに提供したパネルに含まれている。これらの株は、流行性であり、同サブタイプの株に感染した個体の血清による中和に耐性であることが示されたことに基づいて選択された。中国新彊の個体から得られたｅｎｖクローンは、今までに記載されていない。新彊のサブタイプＣに感染した個体の血清によるこれらの株の中和の結果を表２に示す。５−４、６−１５、７−１０２、８−１４５及び１０−３５株は、試験した異種血清のほとんど又は全てによる中和に全て耐性であった。１−２７株及び９−２６株は、本発明の研究においてｇｐ１２０誘導性抗体による中和に感受性であるものに入り、新彊のＨＩＶ−１感染個体の血清による中和に対して感受性が比較的強いものに入る。残りの株は、当研究室で様々なときにクローニングされ、記載した出版物に記載されている（Ｚｈａｎｇ他（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６、６４４〜６５５；Ｚｈａｎｇ他（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３、５２２５〜５２３０；Ｄｏｎｇ他（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７、３１１９〜３１３０；Ｑｕｉｎｎａｎ他（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９、３３５８〜３３６９；Ｑｕｉｎｎａｎ他（１９９９）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．１５、５６１〜５７０；Ｑｕｉｎｎａｎ他（１９９８）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．１４、９３９〜９４９；Ｃｈａｍ他（２００５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）。これらの株の特徴は、この研究で使用したものと類似のシュードタイプ化ウイルスアッセイでの試験に基づいている。
【００６７】
ＧＸＥ１４、２４／００／４、１４／００／４、ＣＡ１、ＶＩ４２３、ＮＹＵ１０２６、ＮＹＵ１４２３、ＧＸＥ１４及びＶＩ１７９３株は、Ｃｈａｍ他（Ｃｈａｍ他（２００５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）に記載された。２４／００／４、１４／００／４、ＶＩ４２３及びＣＡ１株は、試験したヒト血清による中和に感受性であったが、ＮＹＵ１０２６、ＮＹＵ１４２３、ＧＸＥ１４及びＶＩ１７９３株は耐性であった。ＭＡＣＳ４及びＭＡＣＳ９株は、Ｚｈａｎｇ他（Ｚｈａｎｇ他（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３、５２２５〜５２３０）に記載された。ＭＡＣＳ４株は、試験した多施設ＡＩＤＳコホート研究の参加者の血清の大部分の血清による中和に対して感受性であったが、ＭＡＣＳ９の株は感受性でなかった。ＣＭ２４３株は一般的に、非サブタイプＥ感染個体の血清による中和に対して耐性である。ＶＩ５２５株は、広い交差反応性を有する血清を除いて、ほとんどのヒト血清に対して耐性である（Ｂｅｉｍａｅｒｔ他（２００１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８１、３０５〜３１４）。ＵＧ２７３及びＮＹＵ１５４５株のヒト血清に対する感受性に関する情報はほとんど入手できない。
【００６８】
【表２】
2009536653.tif 000003
【００６９】
【表３】
2009536653.tif 000004
【００７０】
中和アッセイ
中和アッセイは、２９３Ｔ細胞をプラスミドｐＮＬ４−３．ｌｕｃ．Ｅ−Ｒ−及びｅｎｖ遺伝子発現プラスミドで同時形質移入によって調製されたシュードタイプ化ウイルスを使用して実施した。アッセイは、既に記載したように、終点としてルミネセンスを使用してＨＯＳ細胞で実施した（Ｃｈａｍ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ｏｎ  ｌｉｎｅ  ２００６；Ｄｏｎｇ他（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７、３１１９〜３１３０；Ｚｈａｎｇ他（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３、５２２５〜５２３０；Ｑｕｉｎｎａｎ他（１９９９）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．１５、５６１〜５７０）。本発明者等は、Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉによって記載されたアッセイとこのアッセイを比較する多施設検証研究に最近参加した（Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ（２００４）「Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＩＶ、ＳＩＶ  ａｎｄ  ＳＨＩＶ  ｉｎ  ａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ」（Ｌｉ他（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７９、１０１０８））。これらの研究は、このアッセイが本質的に同一の結果をもたらすことを示した。
【００７１】
中和を測定するために、３種類の１：５に希釈した対照血清の存在下で得られたルミネセンスを平均し、各個体の血清の平均と比較した。≧５０％〜７５％阻害する試験血清の力価を１：５と定めた。≧７５％阻害する試験血清の系列希釈を同時対照血清の系列希釈と比較して試験した。この対照血清は、同じサンプリング日にそれぞれの対照ウサギから収集した血清によって調製した。
【００７２】
免疫計画
成体ニュージーランド産白ウサギに、Ｒ２エンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１２０−Ｒ２  ３０μｇ又はｇｐ１４０−Ｒ２  ３０μｇ）を含むか、又は含まない大量のアジュバントＡ（実施例５にしたがって調製した）を０、３、６及び２８週目に３連で接種した。免疫及び採血計画を表３に示す。
【００７３】
【表４】
2009536653.tif 000005
【００７４】
免疫
用量５００μｌを２つに分けて２５０μｌずつ筋肉注射として各後肢に投与する。最初の３回の免疫ではそれぞれ、免疫混合物５００μｌ（使用したウサギ当たり５００μｌ）であり、濃縮アジュバントＡ（第１ロット）３００μｌをＰＢＳに溶かした抗原（３０μｇ）２００μｌと混合した。４回目の免疫混合物は、アジュバントＡ２５０μｌ及び抗原３０μｇを含有するＰＢＳ２５０μｌを使用して調製した。対象は、０、２１、４２及び１９７日目に免疫した。血清は、１０、３１、５２及び２０７日目に収集した。血清は、第１回ワクチン接種前及び各ワクチン接種の１０日後に、耳静脈から採血することによって収集した。さらに、採血前の血清１０ｍｌを全動物から得た。アジュバント濃度は以下の通りである。アジュバント第１ロットは約１．６×濃縮、アジュバント第２ロットは、２×濃縮であった。ｇｐ１４０免疫群及び対照群のウサギに、４回目の投与の３ヶ月後及び７ヶ月後の２回、さらに免疫原を投与した。これらの投与のそれぞれは、最後の投与で油エマルジョンアジュバント、ＡＳ０３Ａ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用すること以外は、従来の投与と同じ材料から構成された。６回投与した後の血清をＩｇＧ精製用に使用した。
【００７５】
酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
抗原捕捉ＥＬＩＳＡは、既に記載されたように、血清Ｉｇ応答を測定するために使用した（Ｄｏｎｇ他（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７、３１１９〜３１３０；Ｑｕｉｎｎａｎ他（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９、３３５８〜３３６９）。
【００７６】
エンベロープ遺伝子のクローニング
中国新彊省の患者から単離されたウイルスをＨＩＶ−１陰性提供者のＰＢＭＣで１回継代した。ゲノムＤＮＡを細胞から抽出し、ｅｎｖ遺伝子クローニングを既に記載されたように、ＰＣＲを使用して実行した（Ｚｈａｎｇ他（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６、６４４〜６５５；Ｃｈａｍ他（２００５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ参照）。ＨＩＶ−２の７３１２Ａ株のｇｐ１６０をコードする配列は、ＨＩＶ−１で前述した方法を使用して、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｇａｏ他（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８、７４３３〜４７）によって供給された細胞を含まないウイルス保存物からＰＣＲを使用してクローニングした。
【００７７】
ウサギ血清の２９３Ｔ細胞による吸収及びＦＡＣＳ分析
２９３Ｔ細胞がコンフルエントになった７５ｃｍ２フラスコから、トリプシン処理によって得られた細胞を血清４００μｌに再懸濁し、最終血清希釈度を１：２．５にした。懸濁液を遮光して４℃で３時間インキュベートし、細胞を遠心によって沈降させ、新たな細胞で２回及び３回吸収を繰り返した。３回目の吸収は一晩継続した。各吸収の後、各血清５μｌを取り出し、ヤギ血清３％を含むＰＢＳで１：２００及び１：１０００に希釈し、それぞれ１００μｌを使用してＦＡＣＳ分析のために２９３Ｔ細胞１．２×１０５個を懸濁した。３０分後、氷上で、細胞をヤギ血清３％を含むＰＢＳで２回洗浄し、ビオチン−ＳＰ−結合抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、次いでストレプトアビジン−ＰＥ（Ｓｉｇｍａ）と反応させた。細胞を洗浄し、ＰＢＳ中２％のパラホルムアルデヒドに再懸濁した。細胞をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ  ＸＬ−ＭＣＬフローサイトメトリーで分析した。
【００７８】
血清ＩｇＧの精製
血清を１００００ｒｐｍで１５分間遠心することによって清澄にし、次に、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で１：１０に希釈した。ＩｇＧは、ＨｉＴｒａｐタンパク質ＧＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）を使用して、製造元の指示に従って希釈した血清から精製した。精製後、ＩｇＧは、Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ＹＭ−３０メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を備えたｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ遠心フィルターを使用して１５００×ｇで２５分間遠心することによって濃縮した。精製したＩｇＧの濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計を使用して測定した。
【００７９】
実施例１
免疫ウサギから得られた血清によるＨＩＶ−１の中和
免疫原の３回及び４回投与後に収集した血清で実施した中和抗体アッセイの結果を図１及び２に示す。図１に示した結果は、血清なしで実施したウイルス感染と比較した、１：５に希釈した血清の存在下でのルミネセンスのパーセント（％）阻害を示す。４６種類の異なるＨＩＶ−１株を使用して得られた中和の結果を図１に例示する。対照血清によって計算された％阻害は、１７６個の可能な組み合わせのうち４種のみが５０％を上回った。
【００８０】
３種の血清のうち１つのみが＞５０％阻害したＶＩ７９３ウイルス株以外、図１に示したＨＩＶ−１の株は全て、ｇｐ１４０を４回投与した後のウサギの２若しくは３匹から得られた血清によって＞５０％中和された。ｇｐ１２０で免疫したウサギの血清で達成された感染の阻害は、より少なかった。４回投与後、３種類の血清の２種又は３種による＞５０％阻害は、サブタイプＢのＲ２、ＳＦ１６２、ＳＶＰＢ９、ＭＡＣＳ４及びＭＡＣＳ９株、サブタイプＣのＧＸＣ４４及び１０−３５株、サブタイプＦの１４／００／４株及びＣＲＦ１１のＣＡ１株に対してのみ達成された。これらの株の中和は、ｇｐ１２０又はｇｐ１４０のいずれかを２回又は３回投与した後に観察され、一方、その他の株の中和は、免疫原を４回投与した後にのみ主に明らかであることは注目すべきことである。
【００８１】
図２に示した結果は、ｇｐ１２０又はｇｐ１４０を３回及び４回投与した後に得られた中和終点力価を示す。結果は、以下のように計算した。３種類の１：５に希釈した対照血清の収集物と比較して、５０％を上回ってルミネセンスを阻害した血清は、力価が≧１：５であると見なした。血清が１：５で８０％を下回って中和する場合は、力価が１：５であると見なした。１：５で８０％を上回って中和した血清は、収集した対照血清と平行して１：１０で開始した系列希釈で再試験した。各血清のそれぞれの希釈について、平均ルミネセンスの結果を測定した。各試験血清から得られた結果を同希釈の収集した対照血清で得られた平均結果と比較した。同程度に希釈した収集対照血清の平均と比較してルミネセンスを≧５０％（上図）又は≧８０％（下図）阻害する試験血清は、その希釈で中和すると見なした。中和していると見なされた最終希釈を終点と定めた。１：５に希釈した対照血清の結果の間の変動は十分に少なく、個々の対照血清による対照平均のルミネセンス≧５０％阻害が２７６例の可能性のある現象のうち４例においてのみ認められた。対照的に、４回免疫した後、ｇｐ１２０免疫ウサギの２匹又は３匹全ての血清が９株（Ｒ２、ＳＦ１６２、ＳＶＰＢ５、ＳＶＰＢ９、ＭＡＣＳ４、ＧＸＣ４４、１０−３５、１４／００／４及びＣＡ１株）の場合で≧５０％阻害した。中和の頻度は、カイ２乗検定によると、ｇｐ１２０によって免疫された血清では３回（ｐ＝１．９×１０−６）及び４回（ｐ＝１．７×１０−８）投与した後で、対照ウサギよりもはるかに大きかった。ｇｐ１４０による免疫は、ｇｐ１２０で免疫したよりも広い交差反応性の中和をもたらした。３回投与した後では、ｇｐ１４０で免疫したウサギの血清の２種又は３種はＨＩＶ−１の２３株を中和し、４回投与した後では、１つを除いて全ての株が少なくとも２種類の血清によって中和された。３回投与後（ｐ＝２．９８×１０−６）及び４回投与後（ｐ＝４．１×１０−２４）の差は、統計学的に有意であった。
【００８２】
中和終点力価を様々な株で比較したとき認められるパターンは、１：５の希釈での％阻害の比較で認められたものと類似していた。図２で示した結果は、ｇｐ１４０を投与された動物の１種又は複数の血清が各ウイルスを中和することを示している。力価は、３回投与後と比較して４回投与後で増加する傾向があった。特に、ＨＩＶ−１株の４３種がｇｐ１４０で免疫したウサギ（特に、ウサギ４）の少なくとも１種の血清によって、力価≧１：１０で中和され、３９種が力価≧１：２０で中和された。力価は、３回投与後と比較して、４回投与後で増加する傾向があり、ｇｐ１２０よりもｇｐ１４０で免疫すると大きい傾向があった。ｇｐ１２０で免疫したウサギの血清２種又は３種によって中和された株は、ｇｐ１２０及びｇｐ１４０で免疫されたウサギの血清によって類似の力価で中和された。ｇｐ１２０で免疫されたウサギの血清によって中和されたウイルス株は、２回又は３回免疫した後により頻繁に、かつこれらの血清によって中和されない株よりも高い力価で中和される傾向があった。
【００８３】
実施例２
Ｒ２及び１４／００／４の野生型及び変異株の中和
中和を試験した株の２種類は広範に交差反応する中和抗体を有する提供者から得られたもので、それらが生じた提供者において中和抗体の交差反応の幅に関連し得る非常に珍しいアミノ酸配列を有している。これらの株の１つはＲ２で、免疫用に使用した株である。Ｒ２エンベロープ糖タンパク質はＣＤ４非依存性感染、Ｖ３ループの３１３〜４残基のプロリン−メチオニン配列に依存する特性を媒介する。１４／００／４エンベロープ糖タンパク質は、多くのｇｐ１２０エピトープに特異的なモノクローナル抗体による中和に耐性であるが、膜近接エピトープである２Ｆ５及び４Ｅ１０に特異的なモノクローナル抗体による中和には非常に感受性である。これらの感受性は、６６２位の非常に希少なチロシン残基に左右される。これらの糖タンパク質それぞれによってシュードタイプ化されたウイルスは、ｇｐ１２０及びｇｐ１４０で免疫したウサギ両方の血清による中和に非常に感受性であった（図１）。これらの原型株及び対応する変異株のそれぞれを、図３で示したようにウサギの血清による中和について比較した。Ｒ２エンベロープ糖タンパク質の３１３〜４残基の変異は、ｇｐ１２０で免疫したウサギの血清による中和に対して非常に耐性になり、ｇｐ１４０で免疫したウサギの血清に著しくはないがいくらかより耐性になる原因となった。野生型及びＲ２（３１３−４／ＰＭ）変種のｇｐ１２０で免疫したウサギの血清による中和に対する感受性の違いは、３回投与後では約６倍、４回投与後では約２５倍であった。ｇｐ１４０免疫血清によるこれら２種類の株の中和の違いは、３回投与後では約２倍、４回投与後では約３．２倍であった。１４／００／４（６６２Ｔ／Ａ）変異株は、野生型１４／００／４株よりもｇｐ１２０及びｇｐ１４０両方の免疫血清による中和に著しく耐性であった。ｇｐ１２０免疫血清は、変異株よりも野生型１４／００／４を、３回投与後で約６．４倍、４回投与後で約２５倍中和し、一方、ｇｐ１４０免疫血清は野生型を約８倍及び６．４倍中和した。いずれの変異種もｇｐ１４０免疫血清４回投与後には中和された。
【００８４】
実施例３
ｇｐ１４０又はｇｐ１２０免疫ウサギの血清は、病原性ＳＨＩＶ及びＨＩＶ株のエンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化したウイルスを中和する
病原性ＳＨＩＶ及びＨＩＶのＤＨ１２、ＳＦ１６２及び８９．６株由来のエンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化したウイルスの中和比較を図４に示す。示された結果は、それぞれ３連で実施した２種類の独立した実験から得られた結果の平均である。２つの実験は類似の結果をもたらした。ＳＨＩＶ及びＨＩＶの３種類の株は全て、ｇｐ１４０免疫ウサギの血清３種全てによって中和された。３種類の株のうちの１株、ＳＦ１６２Ｐ３は、対応するＨＩＶ−１株よりもこれらの血清による中和に対して約４倍耐性であった。その他の２種類のＳＨＩＶは、ｇｐ１４０免疫ウサギの血清によって、対応するＨＩＶ−１株と同等に中和された。ＨＩＶ−１／ＳＨＩＶ対はそれぞれ、ｇｐ１２０免疫血清による比較中和において異なっていた。それらの血清は、ＨＩＶ−１及びＳＨＩＶの両方の変種株８９．６、ＨＩＶ−１のみの変種株ＳＦ１６２及びＳＨＩＶのみの変種株ＤＨ１２を中和した。
【００８５】
実施例４
ｇｐ１４０免疫ウサギの血清は、ＨＩＶ−１のＲ２、１４／００／４及びＣＭＳ２４３株に結合する
ＥＬＩＳＡによる抗体試験の結果を図５に示す。免疫原を３回及び４回投与した後に得られた血清を、Ｒ２、１４／００／４及びＣＭ２４３株のｇｐ１４０に対する抗体について試験した。使用した方法は、他に記載されている（Ｑｕｉｎｎａｎ他（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９、３３５８〜３３６９）。ｇｐ１２０で免疫したウサギは、ｇｐ１４０で免疫したウサギよりも高いＲ２ｇｐ１４０結合力価を生じた。ｇｐ１２０を４回投与した後のＲ２ｇｐ１４０結合抗体の増加はあまり著しくないが、ｇｐ１４０を４回投与した後は有意に増加した（ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。様々なエンベロープに対する結合抗体力価の等級順位は、Ｒ２＞１４／００／４＞ＣＭ２４３であった。ｇｐ１２０免疫後に結合抗体力価が大きくなる傾向は、１４／００／４糖タンパク質では明らかであったが、ＣＭ２４３では明らかではなかった。１４／００／４結合抗体の小さいが有意な増加は、ｇｐ１２０を４回投与した後に認められ（ｐ＝０．０３）、ＣＭ２４３結合抗体ではｇｐ１４０を４回投与した後に認められた（ｐ＝０．００３）。
【００８６】
実施例５
水中油エマルジョンの調製
水中油エマルジョンの調製は、国際公開第９５／１７２１０号パンフレットで示されたプロトコルに従った。このエマルジョンは、スクアレン４２．７２ｍｇ／ｍｌ、トコフェロール４７．４４ｍｇ／ｍｌ及びＴｗｅｅｎ８０  １９．４ｍｇ／ｍｌを含有する。得られた油滴の大きさは約１８０ｎｍであった。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の２％溶液を得るために、Ｔｗｅｅｎ８０をＰＢＳに溶解した。２倍濃度の濃縮エマルジョン１００ｍｌを生成するために、ＤＬアルファトコフェロール５ｇ及びスクアレン５ｍｌを、完全に混合するまでまずボルテックスした。次に、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液９０ｍｌを添加し、完全に混合した。次いで、得られたエマルジョンをシリンジに通し、最後に、Ｍ１１０Ｓ顕微溶液機器を使用することによって顕微溶液化した。得られた油滴の大きさは約１８０ｎｍであった。
【００８７】
ＱＳ２１及びＭＰＬによる水中油エマルジョンの調製（アジュバントＡ）
滅菌した大量のエマルジョンをＰＢＳに添加し、最終濃度を１ｍｌ当たりエマルジョン５００μｌ（ｖ／ｖ）にした。次に、最終濃度を１ｍｌ当たり１００μｇになるように３Ｄ−ＭＰＬを添加した。次に、最終濃度を１ｍｌ当たり１００μｇになるようにＱＳ２１を添加した。成分添加それぞれの間に、中間生成物を５分間撹拌した。１５分後、ｐＨを調べ、必要ならばＮａＯＨ又はＨＣｌで６．８＋／−０．１に調節した。この混合物をアジュバントＡと称する。
【００８８】
実施例６
リポソームＭＰＬの調製
有機溶媒に溶かした脂質（卵黄のホスファチジルコリン又は合成ホスファチジルコリン等）及びコレステロール及び３Ｄ−ＭＰＬの混合物を真空下で（或いは、不活性ガス流下で）乾燥させた。次に、水溶液（リン酸緩衝生理食塩水等）を添加し、全脂質が懸濁するまで容器を撹拌した。次いで、この懸濁液を、リポソームの大きさが約１００ｎｍまで減少するまで、顕微溶液化し、その後０．２μｍのフィルターで滅菌濾過した。このステップの代わりに押し出し又は超音波処理することができる。
【００８９】
通常、コレステロール：ホスファチジルコリン比は、１：４（ｗ／ｗ）で、最終コレステロール濃度を１０ｍｇ／ｍｌになるように水溶液を添加した。ＭＰＬの最終濃度は２ｍｇ／ｍｌである。
【００９０】
このリポソームの大きさは約１００ｎｍで、ＳＵＶ（単層小胞）と称する。このリポソームはそれ自体長時間安定で、膜融合能を有さない。
【００９１】
アジュバントＢの調製
３Ｄ−ＭＰＬの最終濃度を１００μｇ／ｍｌになるように大量の滅菌したＳＵＶをＰＢＳに添加した。ＰＢＳの組成は、Ｎａ２ＨＰＯ４：９ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４：４８ｍＭ、ＮａＣｌ：１００ｍＭ及びｐＨ６．１であった。ＱＳ２１の最終濃度を１００μｇ／ｍｌになるようにＱＳ２１の水溶液をＳＵＶに添加した。この混合物をアジュバントＢと称する。成分の添加それぞれの間に、中間生成物を５分間撹拌した。ｐＨを調べ、必要ならばＮａＯＨ又はＨＣｌで６．１＋／−０．１に調節した。
【００９２】
実施例７
ｇｐ１４０及びｇｐ１２０並びにアジュバントＢで免疫したウサギの血清は、ＨＩＶ−１初代分離株を中和できる抗体を生じる
ウサギは、表３に示したように免疫した。アジュバントＡは、実施例６に記載したように調製した。
【００９３】
【表５】
2009536653.tif 000006
【００９４】
免疫は、０、２１及び４２日目に実施し、血清試料は５６日目に採取した（１４ｄｐＩＩＩ）。これらの血清は、一連のクレイドＢ及びＣのＨＩＶ−１初代分離株に対する中和抗体活性の存在及び力価を試験するために、Ｍｏｎｏｇｒａｍ  Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＵＳＡ）に送った。
【００９５】
表５に示したように、ＣＨＯ産生Ｒ２ｇｐ１２０特異的血清は、１１種のクレイドＢウイルスのうち３種を中和することができたが、クレイドＣウイルスは中和できなかった。このことは同様に、ＣＨＯ産生Ｒ２ｇｐ１４０特異的血清でも認められる。ワクシニア産生Ｒ２ｇｐ１４０特異的血清は、１１種のクレイドＢウイルスのうち３種を中和することができ、６種のクレイドＣウイルスのうち１種も中和できた。
【００９６】
表５のデータは、特定のウイルスについて５０％中和が認められる力価として表した。陽性（下線付き太字で示す）は、特定のウイルスについてのＰｒｅ＋３ｓｄカットオフを上回る場合と定義した。
【００９７】
【表６】
2009536653.tif 000007
【００９８】
実施例８
ＨＩＶ−１  Ｒ２株のｇｐ１４０及びｇｐ１２０、並びに、アジュバントＢで免疫したモルモットの血清は、ＨＩＶ−１初代分離株を中和できる抗体を産生する。
モルモットは、表６に示したように免疫した。免疫は、０、２１及び４２日目に実施し、血清試料は５６日目に採取した（１４ｄｐＩＩＩ）。これらの血清は、一連のクレイドＢ及びＣのＨＩＶ−１初代分離株に対する中和抗体活性の存在及び力価を試験するために、Ｍｏｎｏｇｒａｍ  Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＵＳＡ）に送った。
【００９９】
【表７】
2009536653.tif 000008
【０１００】
表７に示したように、ＣＨＯ産生Ｒ２ｇｐ１２０特異的血清は、１１種のクレイドＢのうち２及び４種を中和することができたが、クレイドＣは中和できなかった。ＣＨＯ産生Ｒ２ｇｐ１４０特異的血清は、１１種のクレイドＢウイルスのうち６種と８種の間を中和することができたが、クレイドＣウイルスは中和できなかった。
【０１０１】
ワクシニア産生Ｒ２ｇｐ１４０特異的血清は、１１種のクレイドＢウイルスのうち３種を中和することができ、６種のクレイドＣウイルスは中和できなかった。ワクシニア産生Ｒ２ｇｐ１２０特異的血清は、１１種のクレイドＢウイルスのうち７種を中和することができ、２匹のモルモットのうち１匹はクレイドＣウイルス６種のうち２種を中和した。
【０１０２】
表７のデータは、特定のウイルスについて５０％中和が認められる力価として表した。陽性（下線付き太字で示す）は、特定のウイルスについてのＰｒｅ＋３ｓｄカットオフを上回る場合と定義した。
【０１０３】
【表８】
2009536653.tif 000009
【０１０４】
実施例７及び実施例８のデータは、アジュバントＢで製剤化したＲ２タンパク質がＨＩＶ−１初代分離株を中和することができる抗体の産生を誘導することができることを示している。
【０１０５】
実施例９
ｇｐ１２０誘導抗体に感受性及び耐性のウイルスを中和する抗体の差次的な出現
以下でさらに説明し、図６に示したように、ｇｐ１２０誘導抗体に感受性の９株を中和した抗体は、ｇｐ１４０誘導抗体にのみ感受性の株を中和した抗体よりも迅速に発生した。ウイルスがｇｐ１２０免疫ウサギの血清によって中和される頻度は、３回若しくは４回免疫した後でも同様であるが、ｇｐ１４０を３回投与したときと比較して、４回投与の後は頻度が実質的に増加した（Ｘ２、ｐ＝４．３×１０−９）。ｇｐ１２０によって誘導される中和応答は、免疫原を２回投与した後、免疫計画プロトコルを開始してちょうど４．５週間後に、実際に最大レベルに接近した。
【０１０６】
実施例１０
抗体応答を中和するＨＩＶ−１特異性
図７Ａで示したように、いずれも２９３Ｔ細胞の形質移入によって生じるＨＩＶ−２Ｅｎｖ及びＶＳＶＧタンパク質でシュードタイプ化したウイルスの中和について、血清を試験した。対照血清と比較して、免疫したウサギの４回投与後の血清は、ＨＩＶ−２もＶＳＶも中和しなかった。類似の結果が繰り返し実験で認められた。示さなかった実験において、ＮｉｐａｈウイルスＦ及びＧタンパク質でシュードタイプ化したウイルスを調製し、同一血清による中和を試験した。有意差は認められなかった。
【０１０７】
ウサギ血清におけるウイルス阻害活性が細胞抗原に特異的な抗体によるものである可能性を調べた。蛍光表示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を使用した予備実験では、ＢＳＣ−１及び２９３Ｔ細胞の両方に対する著しい結合活性が、ｇｐ１２０及びｇｐ１４０免疫ウサギの血清で見出されたが、そのレベルはｇｐ１４０免疫血清でより大きかった。より少ない交差反応性中和活性を誘導する計画で免疫したウサギの血清中における細胞結合ＩｇＧのレベルを調べた。ｇｐ１４０Ｒ２免疫血清のレベルは、ＲｉＢｉアジュバントに溶かしたＨＩＶ−１ｇｐ１４０ＣＭ２４３で免疫したウサギの血清と同様で、中和抗体は誘導しなかった（データは示さず）。それらはまた、ｇｐ１６０Ｒ２を発現するベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子で初回刺激し、その後ＲｉＢｉアジュバントに溶かしたｇｐ１４０Ｒ２で追加免疫することを含む計画で免疫したウサギの血清と同様であった（Ｄｏｎｇ他（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７、３１１９〜３１３０）。これら後者のウサギの血清は、ＨＩＶ−１のいくつかの株を中和する抗体を有するが、図６に示した中和耐性株のいくつかを中和しない抗体を有する（Ｄｏｎｇ他（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７、３１１９〜３１３０）。これらの結果は、血清中の２９３Ｔ細胞結合イムノグロブリンの存在が、ｇｐ１４０に対する中和応答の交差反応性と相関しなかったことを示している。
【０１０８】
これらの予備的ＦＡＣＳデータを考慮して、図７Ｂ及び７Ｃで示した実験を実施した。ｇｐ１４０Ｒ２４回投与後の血清及び同ウサギの免疫前に収集した収集血清を２９３Ｔ細胞で吸収し、ＦＡＣＳにおける細胞結合活性及び中和活性について試験した。血清を、その後中和アッセイで使用することができるように、高濃度の血清で吸収を実施した。このような高濃度の血清では、細胞結合活性の徹底的な除去は実現不可能であった。しかし、ＦＡＣＳアッセイで試験するために血清を１：１０００に希釈するとき、残存する活性はほとんどなく、ウサギ血清の１：２００希釈を使用して実施したアッセイにおいて著しい減少が反映される（図７Ｂ）ので、細胞結合活性の実質的な減少を、３回連続して吸収することによって実現した。興味深いことに、免疫前の血清もまた、著しい細胞結合活性を有し、１：２００に希釈した血清でも検出され、吸収によって除去された。中和アッセイは、図７Ｃで示したように、ウサギ４の３回吸収血清を使用して実施した。この吸収方法は、試験したサブタイプＢ又はサブタイプＣのウイルスのどちらに対しても、すなわち、いずれもｇｐ１２０Ｒ２によって誘導された抗体による中和に耐性であるＳＶＰＢ１１株及びＤＵ１２３株のどちらに対しても、中和活性にはあまり減少をもたらなかった。
【０１０９】
実施例１１
初代ウイルスの中和はイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）によって媒介される
４回投与後の採血では、ＩｇＧ画分の精製及び中和試験を可能にするために十分な量の血清は得られなかった。したがって、既に記載したように、２回以上免疫した後に収集した血清を、この目的のために使用した。血清及びＩｇＧ画分は、図７Ｄで示したウイルスの中和と並行して試験した。ＩｇＧ濃度は、ウサギ血清中のＩｇＧ濃度とほぼ同等になるように調節した（すなわち、未希釈の血清１ｍｌ当たり１０μｇ）。血清及びＩｇＧの中和活性は、Ｒ２株に対して同一で、ＩｇＧは、さらに５種類のサブタイプＢ株、２種類のサブタイプＣ株及びサブタイプＣ、Ｄ及びＥ株の１種に対して血清と同等であるか、優れていた。Ｒ２を除いて図１０Ａに示した株は全て、ｇｐ１２０誘導抗体による中和に対して耐性であった。中和活性は、対照ウサギのＩｇＧには存在しなかった。
【０１１０】
６回投与後の血清中における中和活性のＨＩＶ−１特異性は、以下に説明し、図８及び９に示したように評価した。ウサギ４の血清及びＩｇＧの両方は、２９３Ｔ細胞結合活性及びＶＳＶ中和活性を含有した。２９３Ｔ細胞で連続的に吸収すると、ＩｇＧでは細胞結合活性のほとんど及びＶＳＶ中和活性の全部が除去され、血清では両方が著しく減少した。吸収は、試験したＨＩＶ−１株の中和には影響を及ぼさなかった。したがって、この事実は、ＩｇＧが一般的に中和耐性株であるＨＩＶ−１株を特異的に中和する抗体を含有することを示唆している。
【０１１１】
６回投与した後のウサギ血清中におけるＨＩＶ−１特異的ＩｇＧ中和活性
ウサギ血清に６回投与した後のＩｇＧの細胞、ＶＳＶ及びＨＩＶ−１との反応性を、ＩｇＧが媒介するＨＩＶ−１の中和の特異性を評価するために試験した。図８に示したように、ウサギ４の血清及びＩｇＧは著しい細胞結合活性を有していたが、対照血清ではほとんど検出されなかった。２９３Ｔ細胞で連続吸収すると、両方の結合活性の漸進的な著しい減少がもたらされ、ＩｇＧ画分の結合活性がほとんど完全に除去された。図９に示したように、吸収した及び吸収していない血清及びＩｇＧのＶＳＶ、ＳＶＰＢ１９（サブタイプＢ）及びＤＵ４２２（サブタイプＣ）の中和を試験した。未吸収の血清及びＩｇＧの両方はＶＳＶの感染性を阻害したが、その阻害効果は、２９３Ｔ細胞に対する吸収によってＩｇＧから完全に除去され、血清では減少した。対照的に、吸収は、血清でもＩｇＧでもＨＩＶ−１中和活性には何ら影響を及ぼさなかった。この結果は、６回投与する免疫計画は、２９３Ｔ細胞表面上の抗原に対してＩｇＧ応答を誘導し、２９３Ｔ細胞に吸収させることによってそれらの抗体を除去すると、２９３Ｔ細胞に対する結合並びにＶＳＶの中和が排除されることを示している。しかし、細胞結合性及びＶＳＶ中和活性を除去してもＨＩＶ−１のＩｇＧ中和に影響を及ぼさないので、このデータは、免疫計画が広範な交差中和活性を備えたＨＩＶ−１特異的ＩｇＧを誘導するという考え方を支持している。
【０１１２】
実施例から明らかなように、ｇｐ１４０Ｒ２免疫原は、試験した様々なＨＩＶ−１サブタイプの４８／４８初代株において５０％中和、４３／４６初代株において８０パーセント中和を実現する抗体を誘導した。試験した株には、サブタイプＢ及びＣ株の標準的パネルの構成要素及び中和耐性があることが知られているその他の様々な株が含まれる。ｇｐ１２０Ｒ２は、同株の９／４８を中和する抗体を誘導した。中和はＩｇＧに媒介され、ＨＩＶ−１特異的であった。
【０１１３】
本発明は、様々な特定の材料、方法及び実施例を参照することによって本明細書で説明し、例示したが、本発明は、それらの目的のために選択された材料及び方法の特定の組み合わせに制限されないことを理解されたい。このような細かい数多くの変更が含まれ得ることは、当業者には理解されよう。明細書及び実施例は単なる例として見なされるものであり、本発明の本当の範囲及び趣旨は以下の特許請求の範囲によって示される。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】様々な株のエンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化したＨＩＶ−１ウイルスの阻害を示した図である。３種類のウサギにそれぞれ、アジュバントＡに入れたＨＩＶ−１Ｒ２株ｅｎｖタンパク質であるｇｐ１２０若しくはｇｐ１４０、又は、アジュバントＡ単独を投与した。３回又は４回投与した後で血清を収集し、ＨＩＶ−１シュードタイプの中和のために１：５に希釈して３連で試験した。各ウイルスに対する３種類の対照血清の平均ルミネセンスを計算した。それぞれの免疫及び対照血清について対照血清の平均と比較することによって、パーセント阻害を計算した。図１では、黒丸は、個々の血清の結果を示し、水平線は収集した血清の平均及び標準偏差を示す。
【図２】ウサギの血清の中和力価を示した図である。血清は、アジュバントＡに入れたＲ２ｇｐ１２０又はｇｐ１４０を３回又は４回投与した後のウサギから収集し、上記に説明したように中和アッセイで使用した。終点は、同時対照ウサギの血清収集物の同一希釈度の存在下で培養したウイルスの平均に対して観察されたレベルの５０％未満までルミネセンスを阻害する最終希釈度として決定した。結果は、相乗平均及び標準偏差による３連の測定値をベースにして試験したＨＩＶ−１の様々な株に対して、個々の免疫血清について示した。
【図３】Ｒ２及び１４／００／４の野生型及び変異株の中和を示した図である。ウイルスは、野生型Ｒ２株、野生型１４／００／４株、Ｒ２変異株（３１３−４ＰＭ／ＨＩ）又は１４／００／４変異株（１６２Ｔ／Ａ）の糖タンパク質でシュードタイプ化した。アジュバントＡに入れたＲ２ｇｐ１２０又はｇｐ１４０を３回投与した後のウサギから収集した血清を、上記に説明したように、前述の株の中和アッセイに使用した。力価は、図２に説明したように測定した。野生型Ｒ２及び１４／００／４株は、黒丸で表し、対応する変異株Ｒ２（３１３−４ＰＭ／ＨＩ）及び１４／００／４（１６２Ｔ／Ａ）は白丸で表す。結果は、個々の血清（円）、相乗平均（横線）及び標準偏差で示す。一連のデータ点の上に示された数字は、野生型及び変異株の中和を比較したスチューデントｔ検定による確率を示す。
【図４】病原性ＳＨＩＶ及びＨＩＶ株の中和を比較した図である。ウイルスは、病原性ＳＨＩＶ及びＨＩＶ株ＤＨ１２、ＳＦ１６２及び８９．６のエンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化した。アジュバントＡに入れたＲ２ｇｐ１２０又はｇｐ１４０を３回投与した後のウサギから収集した血清を、上記で説明したように、前述の株による中和アッセイに使用した。力価は、図２に説明したように計算した。ＨＩＶ株は黒丸で表し、一致する病原性ＳＨＩＶ株は白丸で表す。
【図５】免疫したウサギ血清から得られた抗体は、病原性ＨＩＶ株のｇｐ１４０に結合する。ｇｐ１２０又はｇｐ１４０で免疫したウサギから収集した血清は、Ｒ２、１４／００／４及びＣＭ２４３株のｇｐ１４０に結合する抗体について試験した。３回及び４回免疫した後に得られた血清は、酵素結合免疫測定法を使用してアッセイした。背景の２倍を上回って得られた光学密度を、抗体結合について陽性であると見なした。終点は、回帰分析によって計算した。
【図６】ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現のレベルによって表したように、ｇｐ１２０Ｒ２及びｇｐ１４０Ｒ２で免疫したウサギの血清によるＨＯＳ−ＣＤ４＋ＣＣＲ５＋細胞培養物のＨＩＶ−１感染阻害の比較を示した図である。ウイルスは、ＨＩＶ株及び指示したサブタイプのエンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化した。ウイルスは、細胞培養物に接種する前に、１：５に希釈した試験血清又は対照血清の存在下でインキュベートした。対照血清の存在下で感染させた後の平均ルミネセンスを計算した。個々の試験血清及び対照血清の存在下で得られたルミネセンスを計算し、対照平均と比較したパーセント阻害を決定するために使用した。個々の対照血清によるパーセント阻害は、観察された変動を例示するために示す。
【図７】ｇｐ１２０誘導性抗体に対して感受性の株の潜在的中和が短期免疫計画後に生じることを示した図である。アジュバントのみを投与されたウサギ（白四角）と比較した、ＡＳ０２Ａアジュバントに入れたｇｐ１２０（黒ひし形）又はｇｐ１４０（黒丸）でウサギを免疫した後の中和抗体応答の発生率を示す。ｇｐ１２０又はｇｐ１４０のいずれかで免疫したウサギの血清は、ｇｐ１４０のみで免疫したウサギの血清がＤＵ１５１−２、ＳＶＰＢ４及びＳＶＰＢ１２株を中和した一方、Ｒ２、ＳＦ１６２、ＭＡＣＳ４、ＳＶＰＢ９及び１４／００／４株を中和した。パーセント阻害は、図６に説明したように計算した。血清は、０、３、６及び２８週目にそれぞれ免疫原を投与して、１０日後に試験用に収集した。
【図８】ｇｐ１４０によって誘導された抗体が、病原性ＳＨＩＶ及びそれらが得られたＨＩＶ−１の親株を中和することを示した図である。免疫原を３回又は４回投与した後に採取したウサギ血清の系列希釈を、アジュバントのみを投与したウサギの収集血清の系列希釈と比較した。中和終点は、同様の希釈の対照血清と比較してルミネセンスの≧５０％阻害を生じた試験血清の最高希釈度と定めた。
【図９】ｇｐ１２０Ｒ２及びｇｐ１４０Ｒ２で免疫したウサギの血清の様々なＨＩＶ−１株に対する中和終点力価を示した図である。結果は、免疫原を３回又は４回投与して得られた血清について示している。＜５０％阻害する血清の力価を＜１：５と定めた。≧５０〜７４％阻害する血清の力価を１：５と定めた。≧７５％阻害する血清の中和終点を試験した。試験血清の系列希釈を収集した、同時対照血清の系列希釈と比較した。終点は、同様の希釈の対照血清収集物と比較してルミネセンスの≧５０％又は≧７５％阻害を生じる最高希釈度と見なした。
【図１０】中和抗体応答のＨＩＶ−１特異性を示した図である。図１０Ａは、ｇｐ１２０Ｒ２−及びｇｐ１４０Ｒ２−免疫ウサギから得られた血清がＨＩＶ−２Ｅｎｖ及びＶＳＶＧシュードタイプ化ウイルスを中和しないことを示している。ｇｐ１２０Ｒ２又はｇｐ１４０Ｒ２を４回投与して得られたウサギ血清（白丸及び波線の両方）及び収集した同時対照血清（黒丸）は、系列希釈を１：５から開始し３連で試験した。図１０Ｂ及び図１０Ｃは、２９３Ｔ細胞でｇｐ１４０免疫ウサギ血清を十分に吸収しても初代ＨＩＶ−１中和活性はなくならないことを示している。図１０Ｂは、ｇｐ１４０を４回投与したウサギ血清４（黒三角）、５（黒四角）及び６（黒丸）並びに同ウサギの前採血収集血清（黒ひし形）を、２９３Ｔ細胞で吸収する前、１、２若しくは３回連続して吸収した後のＦＡＣＳ分析の結果を示す。ＰＢＳ及びウサギ血清を含まないヤギ血清を使用して得られた陰性対照結果と比較したパーセント陽性細胞を示す。図１０Ｃは、ウサギ４から得られた４回投与後血清（白い印）のＨＩＶ−１の中和耐性サブタイプＢ株（ＳＶＰＢ１１）及びＣ株（ＤＵ１２３）の阻害を、同時点で対照ウサギの収集血清（黒い印）と比較して、２９３Ｔ細胞で３回連続吸収する前（黒四角、白四角）及び後（黒丸、白丸）で示した図である。標準偏差は、各データ点に関して示す。図１０Ｄは、血清中の中和活性がＩｇＧ媒介性であることを示す。ＩｇＧは、ウサギ４の６回投与後血清及び対照ウサギから精製し、中和のための同血清と比較して試験した。ＩｇＧを使用して得られた結果は、黒い印で示し、血清を使用して得られた結果は、白い印で示す。免疫血清及びＩｇＧを使用して得られた結果は実線で示し、一方、対照ＩｇＧを使用して得られた結果は破線で示す。ＩｇＧ（黒三角）及び血清（白三角）によるＲ２ウイルスの中和は、本質的に同一であった。試験した５種類の別のサブタイプＢ株（上図）は、ＳＶＰＢ５、ＳＢＰＢ１１、ＳＶＰＢ１４、ＳＶＰＢ１６及びＳＶＰＢ１９であった。残りの株（サブタイプ）は、ＤＵ４２２（Ｃ）、ＤＵ１６５．１２（Ｃ）、ＵＧ２７３（Ａ）、ＮＹＵ１５４５（Ｄ）及びＣＭ２４３（Ｅ）（下図）であった。
【図１１】ｇｐ１４０免疫ウサギから得られた血清及びＩｇＧと２９３Ｔ細胞との反応性は、２９３Ｔ細胞で吸収することによって除去されることを示した図である。血清は、ｇｐ１４０又は対照で６回免疫した後に収集し、ＩｇＧを精製し、ＩｇＧは２９３Ｔ細胞で３回連続的に吸収した。１：２００又は１：１０００に希釈した免疫血清（黒四角）及び対照血清（白四角）並びに５０又は１０ｎｇ／ｍｌの免疫ＩｇＧ（黒丸）及び対照ＩｇＧ（白丸）は、図１０で説明したように、２９３Ｔ細胞に対する結合についてＦＡＣＳ分析によって試験した。
【図１２】ｇｐ１４０を６回投与した後のウサギから得られたＩｇＧが、ＨＩＶ−１特異的中和を媒介することを示した図である。図１１で示したように、免疫したウサギ（黒四角、黒丸）及び対照のウサギ（白四角、白丸）の血清（四角）及びＩｇＧ（丸）を２９３Ｔ細胞で吸収した。吸収した及び吸収していない血清及びＩｇＧを、ＶＳＶ及びＨＩＶ−１株ＳＶＰＢ１９及びＤＵ４２２の中和について比較した。未吸収免疫血清及びＩｇＧはそれぞれ、１：１０及び１：２０の希釈でＶＳＶの中和≧５０％を実現したが、吸収した血清は１：５希釈でのみ中和を実現し、吸収したＩｇＧはＶＳＶを中和しなかった。個々のデータ点の周りに標準偏差を示す。
【図１３】株特異性の高い抗体は、ｇｐ１４０よりもｇｐ１２０によって誘導されることを示した図である。ＨＩＶ−１のＲ２株、１４／００／４株（サブタイプＦ）及びＣＭ２４３株（サブタイプＥ）のｇｐ１４０を使用してＥＬＩＳＡを実施した。血清は、１：２００から開始して２倍の系列希釈で試験し、その希釈で陰性である血清は、相乗平均力価の計算及び表示のために、１：１００の力価を割り当てた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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