(57)【要約】  細胞の再プログラム化および任意選択的な遺伝学的改変のための方法が提供される。多能性ゲノムは、ＮａｎｏｇまたはＭＥＫ阻害剤の存在下において、多能性細胞を分化細胞と融合させることにより分化したゲノムから得られる。細胞は、染色体を個別に含む第１および第２の細胞を提供し、第１の細胞と第２の細胞を融合させ、次いで、第１の細胞由来の少なくとも１つの染色体および第２の細胞由来の少なくとも１つの染色体を有する二倍体細胞を得るために融合細胞を培養することにより遺伝学的に改変される。細胞融合の方法は、ＮａｎｏｇまたはＭＥＫ阻害剤の存在下で第１の細胞と第２の細胞を融合させることを含む。それにより得られる細胞およびそれらの使用について記載される。
2009515515.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分化したゲノムから多能性ゲノムを得る方法であって、
多能性細胞を分化細胞と融合させ、次いで
多能性細胞、分化細胞および／または生じた融合細胞でＮａｎｏｇを過剰発現させることを含む方法。
【請求項２】
多能性細胞および／または分化細胞でＮａｎｏｇを過剰発現させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
融合細胞でＮａｎｏｇを発現させることを含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
分化したゲノムから多能性ゲノムを得る方法であって、
多能性細胞を分化細胞と融合させて融合細胞が形成されることを含み、多能性細胞、分化細胞または融合細胞のうちの少なくとも１つがＭＥＫ阻害剤で処理されることを含む方法。
【請求項５】
多能性細胞が胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性癌腫（ＥＣ）細胞または胚の性腺（ＥＧ）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
分化細胞が体細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
分化細胞が幹細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
分化細胞が神経幹細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
多能性細胞および分化細胞がマウス細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
多能性細胞および分化細胞がヒト細胞である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
二倍体細胞を得るために融合細胞を培養することを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
多能性細胞と分化細胞の融合が四倍体細胞を生じ、ならびに前記方法が四倍体細胞の子孫を得て、次いで二倍体であるかかる子孫を同定することを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
融合細胞の子孫として得られた二倍体の多能性細胞を培養し、次いで二倍体の多能性細胞から分化細胞を誘導することをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞を遺伝学的に改変する方法であって、
染色体を含む第１の細胞を提供し、
染色体を含む第２の細胞を提供し、
前記第１の細胞と前記第２の細胞を融合させて融合細胞が形成され、次いで
前記第１の細胞由来の少なくとも１つの染色体および前記第２の細胞由来の少なくとも１つの染色体を含む二倍体細胞を得るために前記融合細胞を培養することを含む方法。
【請求項１５】
第１の細胞、第２の細胞および融合細胞のうちの少なくとも１つがＭＥＫ阻害剤で処理される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第１の細胞および第２の細胞の両方が二倍体である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
第１の細胞および第２の細胞の両方がマウス細胞である、請求項１４、１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
第１の細胞および第２の細胞の両方がヒト細胞である、請求項１４、１５または１６に記載の方法。
【請求項１９】
第１の細胞および第２の細胞の一方が多能性であり、第１の細胞および第２の細胞の他方が任意で多能性である、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
他方の細胞が体細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
他方の細胞が幹細胞である、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
他方の細胞が神経幹細胞である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の方法であって、
（ｉ）望ましい遺伝子および（ｉｉ）改変されるべき望ましくない遺伝子を有する第１の細胞を同定し、
望ましくない遺伝子の改変形態を有する第２の細胞を同定し、
第１の細胞および第２の細胞を融合させ、
融合細胞を培養し、次いで
望ましい遺伝子と望ましくない遺伝子の改変形態の両方を含む融合細胞の子孫を同定することを含む方法。
【請求項２４】
第１の細胞の遺伝子欠損を修復するためであって、望ましくない遺伝子が欠損を有する遺伝子であり、第２の細胞における前記遺伝子の改変形態が修復される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
第２の細胞に望ましくない遺伝子の改変形態を導入するために、第１の細胞との融合の前に第２の細胞を遺伝学的に改変することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
Ｎａｎｏｇの存在下で細胞を培養することを含む、請求項１４〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
第１の細胞および／または第２の細胞でＮａｎｏｇを発現させることを含む、請求項１４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
Ｎａｎｏｇの存在下で第１の細胞と第２の細胞を融合させることを含む、細胞融合の方法。
【請求項２９】
ＭＥＫ阻害剤の存在下で第１の細胞と第２の細胞を融合させることを含む、細胞融合の方法。
【請求項３０】
第１の細胞が多能性である、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
第１の細胞がＥＳ、ＥＣまたはＥＧ細胞である、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
第２の細胞が体細胞である、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
第２の細胞が幹細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
幹細胞が神経幹細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
第１の細胞でＮａｎｏｇを発現させることを含む、請求項２８〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
第１および第２の細胞の融合が異数性細胞を生じさせる、請求項２８〜３５のいずれか１項に記載の方法であって、該方法が融合細胞を培養してその二倍体の子孫を得ることを含む方法。
【請求項３７】
請求項２８〜３６のいずれか１項に記載の細胞融合の方法を含む、生きた非ヒト動物を得る方法。
【請求項３８】
ＭＥＫ阻害剤がＭＥＫ１阻害剤である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
ＭＥＫ１阻害剤がＰＤ１８４３５２である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞が約０.１μＭおよび約２５μＭのＭＥＫ阻害剤で処理される、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
細胞が約１μＭおよび約５μＭのＭＥＫ阻害剤で処理される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法により得られる細胞。
【請求項４３】
治療における使用のための医薬品の製造における、請求項４２に記載の細胞の使用。
【請求項４４】
細胞の治療における請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
患者に有効な量の請求項４２記載の細胞を投与することを含む、治療方法。
【請求項４６】
患者に有効な量の請求項１４〜２７のいずれか１項により得られた遺伝学的に改変された細胞を投与することを含む、治療方法。
【請求項４７】
遺伝学的に改変された細胞を必要とする患者を同定し、
前記患者の治療に必要とされる遺伝学的改変を同定し、
請求項１４〜２７のいずれか１項の方法により遺伝学的に改変された細胞を調製すること
を含む、請求項４６記載の治療方法。
【請求項４８】
多能性細胞と体細胞の融合によって得られた細胞の再プログラム化におけるＮａｎｏｇの使用。
【請求項４９】
多能性細胞がＥＳ細胞である、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
体細胞が神経幹細胞である、請求項４８または４９に記載の使用。
【請求項５１】
多能性細胞と体細胞の融合によって得られた細胞の再プログラム化におけるＭＥＫ阻害剤の使用。
【請求項５２】
多能性細胞がＥＳ細胞である、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
体細胞が神経幹細胞である、請求項５０または５１に記載の使用。
【請求項５４】
体細胞の核をレシピエント細胞に移植して核移植細胞を形成し、次いで前記核移植細胞においてＮａｎｏｇを過剰発現させることを含む、核移植の方法。
【請求項５５】
レシピエント細胞が卵母細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
レシピエント細胞が除核された卵母細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
ＥＳ細胞において、Ｎａｎｏｇの内在性発現レベルの２〜１５倍のレベルでＮａｎｏｇを発現させることを含む、請求項５４〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
体細胞の核をレシピエント細胞に移植して核移植細胞を形成させ、次いで前記核移植細胞をＭＥＫ阻害剤で処理することを含む、核移植の方法。
【請求項５９】
レシピエント細胞が卵母細胞である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
レシピエント細胞が除核された卵母細胞である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
請求項５４〜６０のいずれか１項に記載の核移植の方法を含む、生きた非ヒト動物を得る方法。
【請求項６２】
請求項５４〜６０のいずれか１項に記載の核移植の方法を含む、多能性幹細胞の培養物を得る方法。
【請求項６３】
Ｎａｎｏｇの発現の上方調節におけるＭＥＫ阻害剤の使用。
【請求項６４】
細胞の再プログラム化におけるＭＥＫ阻害剤の使用。
【請求項６５】
細胞が体細胞である、請求項６４に記載の使用。
【請求項６６】
細胞がインビトロで再プログラム化される、請求項６４または６５に記載の使用。
【請求項６７】
細胞が融合細胞でない。請求項６４〜６６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６８】
細胞をＭＥＫ阻害剤で処理することを含む、体細胞を再プログラム化する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞、特に再プログラム化されうる細胞の再プログラム化および遺伝子改変に関する。本発明は、特に細胞の多能性状態への再プログラム化、ならびに細胞の遺伝学的な改変、例えばかかる再プログラム化の前に遺伝子欠損を修復することに関する。
【背景技術】
【０００２】
胚発生の間、多能性細胞は多くの異なる細胞型に分化する。これらは、活性化または抑制される遺伝子の特異的なサブセット、すなわちエピゲノムにより決定される。有意なことに、分化したエピゲノムは、除核された卵母細胞への核移植およびＥＳまたはＥＧ細胞のいずれかとの細胞融合により多能性が回復されうる。ＥＳおよびＥＧ−Ｔ細胞のハイブリッドでは、Ｔ細胞の不活性化Ｘ、サイレントに刷り込まれた遺伝子およびサイレントなＯｃｔ４−ＧＦＰレポーター導入遺伝子の再活性化が示されている（Tada et al, 1997 and 2001）。さらに、ＥＳおよびＥＧ−Ｔ細胞のハイブリッドが３つの全一次胚葉を付与することがインビボで示され、それは多能性の特性を示す（Tada et al, 1997; 2001）。他の研究では、中枢神経系、骨髄および脾細胞の核がＥＳ細胞との融合後に多能性の可能性を示すことも示されている（Matveeva et al, 1998; Terada et al, 2002; Ying et al, 2002）。さらに、ＥＳ分化細胞のハイブリッドにおける体細胞ゲノムのクロマチン状態の解析では、ＥＳ細胞のゲノム特性が獲得されることが示された（Kimura et al, 2004）。これらの結果は、まとめると、ハイブリッドは単に２つのゲノムの集合体を含むだけでなく、体細胞のドナーゲノムが完全な再プログラム化を経ている可能性が高いことを示した。
【０００３】
除核された卵母細胞への体細胞核移植（ＳＣＮＴ）により生存できる動物が作成されているが、成功率は極めて低く、ほとんどの胚が発生の初期段階で致死となる（Hochedlinger and Jaenisch, 2003でレビュー）。主な起因因子はドナーゲノムの再プログラム化におけるエラーである可能性が高い（Humpherys et al, 2001, 2002; Kang et al, 2001, 2002; Xue et al, 2002; Santos et al, 2003）。さらに、一定の比率において、初期のクローン胚が多能性に関連する遺伝子Ｏｃｔ４の不完全な再活性化を示し、このことは、ほとんどのクローン胚が正確に多能性の胚集団を確立できないことを示唆している（Bortvin et al, 2003）。この考察を支持するように、Ｂ細胞核由来の成体マウスの作成は、クローン胚由来のＥＳ細胞の誘導を含むさらなる工程なしでは不可能である（Hochedlinger and Jaenisch, 2002）。したがって、エピジェネティックな再プログラム化の効率を改善することが望まれる。
【０００４】
ゲノムの再プログラム化はインビボでも生じる。１０．５ｄｐｃ〜１１．５ｄｐｃで生殖隆起に入り込む始原生殖細胞（ＰＧＣ）は、ゲノム全域にわたる脱メチル化、サイレントＸ染色体の再活性化および刷り込みの抹消を経る（Hajkova et al, 2002; Sato et al, 2003; Tam et al, 1994）。近年、再プログラム化が初期胚の特徴であることが報告された（Mak et al, 2004; Okamoto et al, 2004）。これらの研究では、刷り込まれたＸ染色体の不活化が後期桑実胚および胚盤胞の全細胞内で生じることが示された。これらの段階では、不活性Ｘのクロマチンは、他のエピジェネティックな標識とともに、Ｈ３−Ｋ９のジメチル化およびＨ３−Ｋ２７のトリメチル化の増多を示した。これは、不活性Ｘが細胞分化のマーカーであり、その状態が安定で遺伝的に伝達され、多能性細胞でのみ可逆性であることから、驚くべき結果であった（Wutz and Jaenisch, 2000）。重要なことに、不活性Ｘはエピジェネティックな標識を抹消し、約４．５ｄｐｃの胚盤葉上層において再活性化することが示された（Mak et al, 2004; Okamoto et al, 2004）。予想外なことに、マウス卵母細胞に移植されたＸＸ体細胞核におけるＸ染色体のエピジェネティックなダイナミクス解析では、正常胚との顕著な差異が示された（Bao et al, 2005）。不活性Ｘのエピジェネティックな標識であるトリメチルＨ３−Ｋ２７は、卵母細胞により抹消されず、Ｘの再活性化が生じた際に胚盤葉上層が形成するまで存続する。このことは、卵母細胞および胚盤葉上層がゲノムの再プログラム化に関して異なる特性を有することを示唆する。再プログラム化を構成する因子は知られていない。しかしながら、これらは、多能性胚盤葉上層を生じることになる胚盤胞の細胞内、ならびにＥＳ−分化細胞ハイブリッドにおけるＸの再活性化を担うＥＳ細胞内に存在しなければならない。同様に、これらの因子はまた、生殖隆起内に移動するＰＧＣ内およびＥＧ細胞内にも存在しなければならない。
【０００５】
Ｎａｎｏｇは、多能性の哺乳類細胞内に存在し、初期発生に必須である固有のホメオドメインを含有するタンパク質である。胚盤胞内での多能性細胞の形成とともに、雌ＸＸ胚内で予め不活性化された親Ｘ染色体は再活性化状態になる。再活性化は、Ｎａｎｏｇを発現する細胞に限定され、Ｎａｎｏを含まない胚内で生じることがない。
【０００６】
初期胚におけるＮａｎｏｇの発現は、将来の多能性胚盤葉上層細胞を標識し、ＥＳ細胞の分化および胚の発生の間に急速に下方調節される（Chambers et al, 2003; Mitsui et al, 2003）。さらに、Ｎａｎｏｇは、ＥＳ細胞で過剰発現される場合、本来では必須な因子であるＬｉｆおよび血清（ＢＭＰ−４）の非存在下において自己再生を可能にするという独特の特性を示す（Chambers et al, 2003; Ying et al, 2003）。さらに、Ｎａｎｏｇは、再プログラム化が生じている多能性のＥＧ細胞およびＰＧＣで発現される（Chambers et al, 2003; Yamaguchi et al, 2005）。ＮａｎｏｇヌルＥＳ細胞および単離された内部細胞塊（ＩＣＭ）のインビトロにおける特徴付けでは、これらが未分化状態を保持できずに内胚葉様細胞に分化することが示された（Mitsui et al, 2003）。
【０００７】
ＷＴとＮａｎｏｇ−／−４．５ｄｐｃおよび休止雌胚の比較解析では、Ｘ染色体の再活性化のみがＷＴ胚、Ｎａｎｏｇを発現する細胞に生じることが示された。
【０００８】
ＷＯ０３／０６４４６３には、ＮａｎｏｇのＬＩＦとの併用により細胞または核が再プログラム化されることが記載されている。しかしながら、本明細書中に記載の比較例では、Ｎａｎｏｇの発現が再プログラム化を誘導するのに不十分であることが見出された。
【０００９】
細胞治療を目的として、細胞を遺伝学的に改変し、特に多能性細胞を改変し、それらから子孫を誘導することが望まれる。細胞の遺伝学的な改変は、核の再プログラム化と一緒に、例えばベクターを用いることが知られる。ＳＣＮＴにより生成される細胞の遺伝子改変は、例えば免疫不全の治療に用いられている（Rideout et al, 2002）。しかし、これらの方法はゲノム内に人工産物を残しうる。細胞治療の産物は二倍体細胞であるべきだが、二倍体細胞の融合は、四倍体細胞または染色体の分離が不均等な細胞を生じ、種々の異なる異数性の細胞型を生じることが知られる（Matveeva et al, 1998）。これは監督機関にとっては受け入れがたいものであると思われる。
【００１０】
それゆえ、核の再プログラム化の効率を高めることが望まれるだろう。しかし、上記のように、現在の効率は低い。遺伝学的な改変を再プログラム化された細胞に導入し、それから二倍体の子孫を誘導することもまた望まれるだろう。
【００１１】
本発明の目的は、上記の課題に対する代替するものを改善するか、または少なくとも提供することである。本発明の特定の具体例の目的は、改善された再プログラム化の方法およびそれにより得られる細胞を提供することである。本発明の特定の具体例のさらなる目的は、細胞の遺伝学的な改変、必要に応じて、続いて改変された細胞の再プログラム化、次いでその子孫を誘導する方法を提供することである。
【００１２】
（発明の要約）
本発明によると、Ｎａｎｏｇの発現および／またはＭＥＫの阻害が細胞の再プログラム化のために用いられる。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明によると、多能性細胞を分化した細胞と融合させ、次いで融合細胞においてＮａｎｏｇを過剰発現させることを含む分化したゲノムから多能性ゲノムを得る方法が提供される。
【００１４】
Ｎａｎｏｇは、融合工程前に多能性細胞でＮａｎｏｇを過剰発現させ、融合の工程前に分化細胞でＮａｎｏｇを過剰発現させ、あるいは、すなわち融合工程後に融合細胞でＮａｎｏｇの過剰発現させることにより、過剰発現されうる。Ｎａｎｏｇは、Ｎａｎｏｇを発現する遺伝学的な構築物を細胞に導入することにより適切に過剰発現される。Ｎａｎｏｇはまた、細胞でＮａｎｏｇの発現を高める培地成分の存在下で、細胞を導入すること、または細胞を培養することにより過剰発現されうる。
【００１５】
本発明の特定の具体例では、本方法は、多能性細胞を分化細胞と融合させて融合細胞が形成され、ここで、多能性細胞、分化細胞および融合細胞のうちの少なくとも１つがＭＥＫ阻害剤で処理される。
【００１６】
多能性細胞と分化細胞の両方がＭＥＫ阻害剤で処理されうる。
【００１７】
この方法において、直接の過剰発現または例えばＭＥＫ阻害剤を用いる過剰発現を介してのＮａｎｏｇの使用が、多能性特性を示す細胞を得る効率を高めることは、有利に見出されている。ＭＥＫ阻害剤による処理がＮａｎｏｇの発現の上方調節をもたらされると考えられる。発明者はまた、さらなる培養後、分化細胞由来の遺伝子情報を有する多能性の二倍体細胞の取得が可能であることを有利に見出している。本発明の方法では、融合細胞は、培地中で維持され、その染色体相補対（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）が二倍体に減少し、回復するまでは自然に染色体を失う。一般に、分化細胞由来の少なくとも１つまたはそれ以上の染色体が、生じた多能性細胞の二倍体状態に寄与する。それゆえ、多能性細胞は、望ましい遺伝子または望ましい染色体あるいは他の望ましい遺伝物質を含む分化細胞をはじめとする細胞および組織を含むその分化した子孫を誘導するために得られ、用いられ得る。
【００１８】
多能性細胞は、適切には、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性癌腫（ＥＣ）細胞または胚の性腺（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｏｎａｄａｌ）（ＥＧ）細胞であり、下記により詳細に記載される本発明の特定の具体例では、細胞融合は、ＥＳ細胞を分化細胞と融合させることにより多能性ゲノムを生じさせることに成功している。
【００１９】
分化細胞は体細胞であり得、一般には、実質的にすべての体細胞が本明細書に記載される本発明の適用時の使用に適すると考えられる。分化細胞はまた、幹細胞でもあり得、さらに本発明の適用はいずれの特定の幹細胞に限定されないが、一般に幹細胞、特に神経幹細胞、造血幹細胞などまで広げると考えられる。本発明の特定の実施例の使用では、再プログラム化は、分化細胞が神経幹細胞である場合に成功している。
【００２０】
Ｎａｎｏｇは、様々な異なる手段を介して提供されうる。一の具体例では、Ｎａｎｏｇは多能性細胞でＮａｎｏｇを過剰発現させることにより提供され、別の具体例では、Ｎａｎｏｇは分化細胞でＮａｎｏｇを発現させることにより提供される。
【００２１】
Ｎａｎｏｇが、多能性細胞および分化細胞の両者またはいずれかにおいて、１つまたはそれ以上の細胞に、適切なプロモーターと一緒にＮａｎｏｇをコードするヌクレオチド型配列を含むベクターをトランスフェクトすることにより利便的に直接発現されることも任意選択である。
【００２２】
本発明の方法が多能性細胞で過剰発現されるＮａｎｏｇを生じることが好ましく、実際には、内在性ＥＳ細胞レベルの２倍から１５倍までの発現レベルが適すると考えられ、好ましくは１つまたはそれ以上の実施例で用いられる正常レベルの約５倍である３〜１０倍である。
【００２３】
本発明は、一般に、マウス、ヒト、ブタ、ヒツジ、ウシおよびヤギを含む哺乳動物の細胞に適用されると考えられ、あらゆる場合において、多能性細胞および分化細胞が同種のものであることが好ましい。多能性細胞および分化細胞が、両方ともマウス細胞または両方ともヒト細胞であることがさらに好ましい。
【００２４】
これまでに、ＥＳ細胞の融合後、染色体の不均等な分離が存在することが記載されている（Matveva et al 2005）。しかしながら、本発明によると、再プログラム化の方法は、二倍体細胞を得るために融合細胞を培養することを含む。したがって、有利なことまたは驚くべきことに、本発明の教示に従うと、染色体分離が実際には不均等ではなく、二倍体の染色体相補対を含む細胞を得るために行うことができることが見出されている。これらの細胞の解析は、典型的には、それらが多能性細胞由来の染色体およびさらに分化細胞由来の染色体との混合物、すなわち染色体の混合物を有することを示す。
【００２５】
したがって、本発明の特に好ましい具体例では、多能性細胞と分化細胞の融合が四倍体細胞を生じ、本方法は、四倍体細胞の子孫を得て、次いで、例えば自然な染色体の喪失により二倍体であるか、二倍体になった、かかる子孫を同定することを含む。実際に、得られた細胞の有意な割合が二倍体である。いずれの理論にも縛られたくはないが、これらの細胞の大部分が二倍体状態に自然に戻る場合、および細胞の培養中、好ましくはＮａｎｏｇの存在下で継続される細胞の培養中である場合の両者では、実際に二倍体細胞にとって生存に有利な点が存在しているように思われる。それゆえ、二倍体細胞集団が２つの出発原料細胞の各々に由来する染色体とともに得られうる。
【００２６】
それゆえ、本発明は、記載されるごとき再プログラム化の工程を行い、その後、融合細胞の子孫として得られた二倍体の多能性細胞を培養し、次いで二倍体の多能性細胞から分化細胞を誘導することにより、分化細胞から体細胞または幹細胞あるいは他の細胞を誘導する機会を提供する。
【００２７】
本発明は、
染色体を含む第１の細胞を提供し、
染色体を含む第２の細胞を提供し、
第１の細胞および第２の細胞を融合させて融合細胞が形成され、次いで
第１の細胞由来の少なくとも１つの染色体および第２の細胞由来の少なくとも１つの染色体を含む二倍体細胞を得るために融合細胞を培養すること
を含む、遺伝学的に細胞を改変する方法をさらに提供する。
【００２８】
任意選択的に、Ｎａｎｏｇは、第１の細胞、第２の細胞および／または融合細胞において過剰発現される。例えば、第１の細胞、第２の細胞および融合細胞のうちの少なくとも１つがＭＥＫ阻害剤で処理されうる。第１の細胞および第２の細胞は、好ましくは両方とも二倍体であり、両方ともマウス細胞または両方ともヒト細胞でありうる。
【００２９】
このようにして得られた細胞が第１の細胞および第２の細胞の各々に由来する染色体を含むことから、本方法は、２つの異なる供給源由来の遺伝的材料を組み合わせて用いることができる。生じた二倍体細胞の得た後、これを試験することにより、染色体のどの特定の組み合わせが二倍体細胞となったかが同定され、必要に応じ、選択が行われて染色体の特に望ましい組み合わせを有する細胞が同定されうる。
【００３０】
本方法の実施では、第１の細胞および第２の細胞の一方が多能性であることが好ましい。第１の細胞および第２の細胞の他方は、必要に応じて多能性であり、体細胞、必要に応じて幹細胞でありうる。下記の実施例では、他方の細胞は神経幹細胞である。
【００３１】
染色体の特定の組み合わせを有する細胞の選択は、本発明によって達成されうる。したがって、本発明の具体例は、遺伝子の望ましいコピーおよび改変されるべき同じ遺伝子の望ましくないコピーを有する第１の細胞を同定すること、望ましくない遺伝子の改変形態を有する第２の細胞を同定すること、第１の細胞と第２の細胞を融合させること、融合細胞を培養すること、次いで、遺伝子の望ましいコピーと望ましくない遺伝子の改変形態の両方を含む融合細胞の子孫を同定することを含む。この方法では、第１および第２の細胞に由来する遺伝子の組み合わせは、遺伝的欠損を含まず、望ましくない遺伝子を含まない細胞を生じる。染色体／遺伝子の望ましい組み合わせを含むかまたは含まない細胞の同定および分離を可能にする技術は容易に利用可能であり、それにより欠損を含まない改変された細胞の単離細胞または純粋な集団が得られる。
【００３２】
本発明は、第１の細胞における遺伝的欠損を修復するために有効に利用され、ここで、望ましくない遺伝子が欠損を有する遺伝子を構成し、第２の細胞における遺伝子の改変形態が修復される。
【００３３】
本発明の別の具体例は、正常な内在性遺伝子の発現を変化させるように改変された第１の細胞と内在性遺伝子の正常なコピーを含む第２の細胞との融合、融合細胞を培養すること、次いで、遺伝子の正常なコピーと遺伝子の改変形態の両方を含む融合細胞の子孫を同定することを含む。本発明は、遺伝子発現において代償の変化を起こさせることによって病気を治療するために有効に利用される。
【００３４】
修復または改変された遺伝子が第２の細胞で作り出されることも任意であり、このことは、第１の細胞との融合用の遺伝子の適切な組み合わせを有する利用可能な第２の細胞が存在しない場合に適切でありうる。それゆえ、適切な第２の細胞が作られる場合の本発明の方法は、第２の細胞に望ましくない遺伝子の改変形態を導入するために、第１の細胞との融合前に、第２の細胞を遺伝学的に改変することを含みうる。本発明の他の態様に関して記載されるように、初めにまたは潜在的に異数体、一般には四倍体の生じた細胞は、染色体の分離を経ることにより許容される比率で二倍体細胞となり、例えば、進行中の培養、子孫の誘導および細胞治療に有用な細胞を生じ得ることが見出されている。
【００３５】
さらなる態様では、本発明は、ＭＥＫ阻害剤の存在下で第１の細胞と第２の細胞を融合させることを含む、細胞融合の方法を提供する。
【００３６】
第１の細胞は、好ましくは多能性であり、ＥＳ、ＥＣまたはＥＧ細胞であってもよい。第２の細胞はまた、多能性でありうるが、好ましくは体細胞であり、より好ましくは幹細胞である。Ｎａｎｏｇは、本明細書中の他の箇所で記載されるように、第１の細胞および／または第２の細胞でＮａｎｏｇを発現されることにより提供されうる。第１の細胞、第２の細胞および／または融合細胞は、さらに本明細書中の他の箇所で記載されるのように、ＭＥＫ阻害剤の存在下で培養されうる。
【００３７】
二倍体細胞を得る方法を用いることが望ましく、前記方法の実施の際、両方の細胞由来の染色体の最初の組み合わせを有する初めの細胞が高頻度で二倍体状態に戻ることが見出されている。本発明の方法は、第１および第２の細胞を融合させて異数体細胞を生じさせ、次いで融合細胞を培養してその二倍体の子孫を得ることを含む。
【００３８】
細胞もまた、本発明によって提供され、細胞は本発明のいずれの態様における方法に従っても得られる。本発明は、細胞を用いる細胞治療の方法、ならびに、治療、好ましくは細胞治療における使用のための医薬品の製造における本発明による細胞の使用をさらに提供する。本発明の治療方法は、患者に本発明の細胞の有効な量を投与することを含む。
【００３９】
治療のさらなる方法は、患者に本発明の遺伝学的に改変された細胞の有効な量を投与することを含む。
【００４０】
治療は、適切には、
遺伝学的に改変された細胞を必要とする患者を同定し、
前記患者の治療に必要である遺伝学的な改変を同定し、次いで
本発明のいずれの具体例の方法に従って遺伝学的に改変された細胞を調製すること
を含みうる。
【００４１】
さらに、本発明は、多能性細胞および体細胞の融合により得られた細胞の再プログラム化におけるＮａｎｏｇの使用を提供する。多能性細胞は典型的にはＥＳ細胞であり、体細胞は、典型的には幹細胞であり、特定の具体例では神経幹細胞である。
【００４２】
本発明はまた、多能性細胞および体細胞の融合により得られた細胞の再プログラム化におけるＭＥＫ阻害剤の使用を提供する。多能性細胞は、典型的にはＥＳ細胞であり、体細胞は、典型的には幹細胞であり、特定の具体例では神経幹細胞である。
【００４３】
本発明はまた、多能性細胞を得るための体細胞核移植の改善された方法におけるＮａｎｏｇの使用を提供する。それゆえ、本発明の核移植の方法は、体細胞核をレシピエント細胞に移植して核移植細胞を形成させ、次いで核移植細胞でＮａｎｏｇを過剰発現させることを含む。それにより、ドナーの体細胞核の再プログラム化が改善された効率で成し遂げられる。
【００４４】
一の具体例では、本発明はまた、多能性細胞を得るための体細胞核移植の改善された方法におけるＭＥＫ阻害剤の使用についても提供する。それゆえ、本発明の核移植の方法は、体細胞核をレシピエント細胞に移植して核移植細胞が形成され、次いで核移植細胞をＭＥＫ阻害剤で処理することを含む。ドナーの体細胞核の再プログラム化が改善された効率で成し遂げられる。
【００４５】
レシピエント細胞は、一般に卵母細胞であり、好ましくは除核され、さらに好ましくはドナーと同種である。
【００４６】
本発明の好ましい具体例では、ＭＥＫ阻害剤はＭＥＫ１阻害剤である。既に当該技術分野で既知の適切なＭＥＫ阻害剤の例として、ＭＥＫ１阻害剤ＰＤ１８４３５２およびDavies et al（2000）で開示されたものが挙げられる。
【００４７】
本発明のこれらと他の態様における最終段階の子孫は、クローン化された非ヒト動物（ヒトクローニングの形態であり、本発明の一部でない）および多能性細胞培養物を含みうる。それ故、本発明のさらなる具体例では、本発明の細胞融合または核移植の方法を含む、生きた非ヒト動物を得る方法、ならびに本発明の細胞融合または核移植の方法を含む、多能性幹細胞の培養物を得る方法が提供される。
【００４８】
ドナー体細胞は、より好ましくは幹細胞であり、特に神経幹細胞である。Ｎａｎｏｇは、本明細書中に記載されるように、ドナー体細胞で発現させることにより提供される。ＭＥＫ阻害剤は、本明細書中の他の箇所で記載されるようにも用いられうる。ＭＥＫ阻害剤は、本明細書中に記載されるようにＮａｎｏｇの発現を上方調節する。Ｎａｎｏｇは、ＥＳ細胞におけるＮａｎｏｇの発現の正常な内在性レベルを超えたレベル、例えば、ＥＳ細胞におけるＮａｎｏｇの内在性発現のレベルの２〜１５倍のレベルで発現されることによりドナー体細胞で過剰発現されることが好ましい。
【００４９】
本発明の具体例は、核移植のための遺伝子欠損を有するドナー体細胞を用い、次いで病気の治療における使用のための当該技術分野で既知の方法により、得られた多能性細胞における遺伝子欠損を修復することである。この具体例は、一般に、マウス、ヒト、ブタ、ヒツジ、ウシおよびヤギを含む哺乳動物の細胞に適用されると考えられ、あらゆる場合にレシピエント卵母細胞およびドナー体細胞が同種であることが好ましい。
【００５０】
本発明の好ましい具体例では、細胞はＭＥＫ阻害剤で前処理される。
【００５１】
本明細書中でのＮａｎｏｇに対する参照については、WO03/064463で記載されるポリペプチド（記載される好ましいポリペプチドを含む）のファミリーを指し、それゆえ、例えば２００〜４００個のアミノ酸を有する多能性決定因子であるポリペプチドを示す。詳細には、マウス多能性決定因子は上記文献中の配列番号２により表され、ヒト多能性決定因子は上記文献中の配列番号４により表され、ラット多能性決定因子は上記文献中の配列番号６により表され、ならびにマカク多能性決定因子は上記文献中の配列番号８により表され、WO03/064463の内容は十分に参照され、参照により本明細書中に援用される。
【００５２】
Ｎａｎｏｇはまた、多能性状態に細胞を維持する因子を指し、細胞内で作用し、ホメオドメイン、特に、上記文献中の配列番号２、４、６または８に由来するホメオドメインと少なくとも５０％の配列同一性を有するホメオドメイン、あるいは、所定の種の細胞における因子に関し、同一種の多能性決定因子のホメオドメインと少なくとも５０％の配列同一性を有するものを含む。一般に、ホメオドメインは約６０個のアミノ酸の長さであり、この因子は、任意の２０個のアミノ酸断片が配列番号２、４、６または８のホメオドメインと少なくとも３５％の配列同一性を有するホメオドメインを含む。
【００５３】
Ｎａｎｏｇは、（ａ）配列番号２、４、６または８で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド分子；（ｂ）（ａ）の自然発生型変異型；（ｃ）（ａ）または（ｂ）のオーソログ、ならびに（ｄ）それらの生物学的に活性であり、診断的または治療的に有用である断片、類似体および誘導体を含む単離ポリペプチドをさらに指す。
【００５４】
Ｎａｎｏｇは、配列番号２、４、６および８のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）、ならびに、配列番号２、４、６または８のポリペプチドに対して少なくとも５０％の類似性（好ましくは少なくとも５０％の同一性）を有するポリペプチド、より好ましくは配列番号２、４、６または８のポリペプチドに対して少なくとも９０％の類似性（より好ましくは少なくとも９０％の同一性）、およびさらにより好ましくは配列番号２、４、６または８のポリペプチドに対して少なくとも９５％の類似性（さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性）をさらに含み、一般に少なくとも３０個のアミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含有するポリペプチドのかかる部分を有するかかるポリペプチドの一部も含む。２つのポリペプチド間の「類似性」は、第１のポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換基を、第２のポリペプチドの配列と比較することにより調べられる。様々な異なるアプローチが配列の類似性および同一性の計算について知られている。一般に、これらの計算を行うための適する方法は、スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどのプログラムを用いてデータベース検索を行い、１つまたは好ましくは２つもしくはさらに３つの類似性の表を用いることである。ＢｌｏｓｕｍおよびＰＡＭ（受容点突然変異（Ｐｏｉｎｔ  Ａｃｃｅｐｔｅｄ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ）マトリックスは、データベース検索および配列アラインメントに適するアミノ酸の類似性マトリックスである。スミス−ウォーターマンまたはＦＡＳＴＡが用いられる場合、オープンギャップペナルティが十分に大きいことを保証することが適切であり、初期の実行が全く相同配列を明らかにしない場合、異なるアルゴリズムを試みることが適切でありうる（これはヒューリスティックアルゴリズム、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡの一つから始める場合に特に該当する）。
【００５５】
下記により詳細が示される本発明の実施例では、神経幹細胞は、体細胞、すなわち分化したエピゲノムの供給源として用いられる。神経幹（ＮＳ）細胞は拡張可能であり、遺伝学的に操作しやすい（Conti et al, 2005）。これらは胎児および成人の脳ならびにＥＳ細胞に由来することができる。ＮＳ細胞は、再生可能な様式で、放射状グリア細胞の形態および分子的特徴を表す均一な集団を形成する。さらに、移植アッセイでは、これらの細胞はさらなる増殖後であっても形質転換されないことが示された（Conti et al, 2005）。ＥＳ細胞におけるＮａｎｏｇの過剰発現は、ＥＳ×ＮＳ細胞融合後にＮＳ細胞ゲノムの再プログラム化を促進することが示された。さらに、Ｎａｎｏｇの発現は、Ｎａｎｏｇ−／−ＥＳ細胞がＥＳ−ＮＳ細胞のハイブリッドを作成できないことにより示されているように、ＮＳ細胞の再プログラム化に必要である。しかしながら、我々の試験では、この特性は、Ｎａｎｏｇ−／−ＥＳ細胞および少し限定されたＮＳ細胞の両方において、Ｎａｎｏｇのトランスジェニックな発現の導入により回復された。ＥＳ−ＥＳおよびＥＳ−ＮＳのＦＡＣＳにより選別されたハイブリッドにおけるＥＳ様コロニーを生成する能力の比較では、ＥＳ細胞由来のＮａｎｏｇの過剰発現がＮＳ細胞ゲノムの再プログラム化に必要となる唯一の因子であることが示唆された。本試験では、再プログラム化との関連における結果を分析し、分化したゲノムから多能性ゲノムの構築のためのＮａｎｏｇに基づく系を提供する。
【００５６】
下記でより詳細に示されるさらなる実施例では、胚性幹細胞（ＥＳ）におけるＮａｎｏｇの過剰発現は、神経幹（ＮＳ）細胞との融合後に得られる多能性ハイブリッドの２００倍の頻度まで増大する。このことは、細胞生存度またはクローン原性（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）に関するＮａｎｏｇの効果によって説明できない。ＮＳ細胞におけるＮａｎｏｇの強制発現はそれらをＥＳ細胞に変換しないが、再プログラム化にはＮａｎｏｇにさらなる因子が必要であることを示す。しかしながら、Ｎａｎｏｇを過剰発現させるＥＳ細胞は、ＥＳ×ＥＳ融合体と同じ効率で、ＮＳ細胞と多能性ハイブリッドを形成するが、そこには再プログラム化はなされなかった。このことは、Ｎａｎｏｇのレベルが、ＮＳ細胞エピゲノムをハイブリッド内で多能性に再プログラム化させる唯一の制限因子であることを意味した。
【００５７】
他の点では比較的正常であるが、ＮａｎｏｇヌルＥＳ細胞は、ＮＳ細胞との融合によるいずれの多能性ハイブリッドを生じることができなかった。それらの能力はＮａｎｏｇ導入遺伝子の導入により完全に回復された。これらの知見は、Ｎａｎｏｇが多能性の維持にとって重要でないが、未使用の初期胚細胞と分化した細胞核の再プログラム化の両者において、多能性エピゲノムの形成を編成するのに極めて重要な役割を果たすことを示した。
【００５８】
また、多能性特性を有する細胞を得る効率を高め、細胞におけるＮａｎｏｇの発現を上方調節するためのＭＥＫ阻害剤の使用について下記に記載される。細胞がＭＥＫ阻害剤で処理される場合、Ｎａｎｏｇ導入遺伝子を用いる処理と同様の効果を有する細胞融合により再プログラム化が促進されることが示されている。
【００５９】
本発明のさらなる具体例では、細胞の再プログラム化におけるＭＥＫ阻害剤の使用について提供される。好ましくは、細胞は体細胞である。好ましい具体例では、細胞はインビトロで再プログラム化される。好ましくは、細胞は融合細胞ではない。
【００６０】
細胞をＭＥＫ阻害剤で処理することを含む体細胞を再プログラム化する方法がさらに提供される。
【００６１】
このことに関して、本発明は、体細胞に多能性を戻す再プログラム化を許容し、細胞融合または核移植を伴わない多能性細胞の誘導を可能にする。
【００６２】
本明細書中のＭＥＫ阻害剤に関する参照については、一般にＭＥＫ阻害剤を示す。ＭＥＫ１阻害剤、例えばＰ１８４３５２についても参照がなされる（Davies et al, 2000）。Ｐ１８４３５２は、他の既知のＭＥＫ阻害剤と比較して高い特異性および効力を有することが見出されている。
【００６３】
本発明は、ここでは以下の実施例にて示され、下記の図により添付される特定の具体例において例示される。
【００６４】
図１は、Ｎａｎｏｇの発現がインビボにおけるＸの再活性化に必要であることを示す。
【００６５】
図２は、ＮａｎｏｇがＥＳ細胞におけるＥＳ−分化細胞ハイブリッドコロニーを形成するＥＳ細胞の能力を高めることを示す。
【００６６】
図３は、細胞の生存および分化におけるＰＥＧの効果を示す。
【００６７】
図４は、ＥＳ−ＮＳ細胞ハイブリッドにおけるＮＳエピゲノムの解析を示す。
【００６８】
図５は、融合混合物のＦＡＣＳ解析を示す。
【００６９】
図６は、ＮａｎｏｇがＥＳ様ＥＳ−ＮＳハイブリッドコロニーの作成に必要であることを示す。
【００７０】
図７（補図１）は、ハイブリッドクローンの染色体の計数値を示す。
【００７１】
図８（補図２）は、ＥＳ−ＮＳハイブリッドがトランスジェニックＮａｎｏｇの欠失後に多能性を示すことを示す。
【００７２】
図９は、多能性ＥＳ−ＮＳハイブリッドコロニーの形成におけるＰＤ１８４３５２の効果を示す。
【００７３】
より詳細には、図１は、Ｎａｎｏｇの発現がインビボにおけるＸの再活性化に必要であることを示す。（Ａ〜Ｄ）Ｎａｎｏｇのヘテロ接合型マウス間の交配により得られた、雌（ＸＸ）４．５ｄｐｃおよび休眠胚におけるＥｅｄおよびＮａｎｏｇに対する免疫蛍光。図（Ａ、Ｂ）は、解析した胚の完全な共焦点像を示す。矢印はＮａｎｏｇ陽性細胞を示す。（Ｃ、Ｄ）より高い倍率のＡおよびＢのｎａｎｏｇ陽性胚。Ｎａｎｏｇ陽性細胞由来ではＥｅｄの大きな焦点が存在しないことに留意のこと（白色矢じり）。図は、解析した胚の部分的な共焦点像を示す。赤色矢じりは、Ｅｅｄの大きな焦点（不活性Ｘ）を示す細胞核の例を示す。胚の核をＤａｐｉで対比染色した。（Ｅ、Ｆ）４．５（Ｅ）および休眠（Ｆ）胚のＮａｎｏｇ陽性細胞におけるＥｅｄの大きな焦点の存在（Ｘｉを伴う）または非存在（Ｘｉを伴わない）のスコアをまとめた表。
【００７４】
図２は、ＮａｎｏｇがＥＳ−分化細胞ハイブリッドコロニーを形成するＥＳ細胞の能力を高めることを示す。（Ａ〜Ｆ）リーシュマンで染色されたハイブリッドコロニーを含むプレートを示す。ＥＳ  Ｏ４ＧｉＰ（Ａ）、ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ（胚）（Ｂ）、ＮＳ  ＴＧＦＰ（Ｄ）、ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ（成体）（Ｅ）およびＭＥＦ  ＴＧＦＰ（Ｆ）を有するＲＨおよびＲＨＮ  ＥＳ細胞に関する融合体のスコア化されたコロニーは、赤色および緑色蛍光を示した（右欄の例を参照）。スコア化されたＥＦ４×ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰＧＦＰＩＨ（Ｃ）コロニーは緑色蛍光のみを示した。全スコア化されたコロニーはＥＳの形態を示し、細胞の培養中にスコア化が行われた。（Ｇ）ＲＨ、ＲＨＮ、ＥＦ４、ＥＦ４ｃｒｅ３、ＥＳ  Ｏ４ＧｉＰ、ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ（胚）およびＮＳ  ＴＧＦＰ細胞におけるＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２レベルの解析。α−チューブリンをローディングコントロールとして用いた。ＥＳ  Ｏ４ＧｉＰ細胞がピューロマイシンの選択下で培養され、それはＯｃｔ４調節配列により駆動されることから、比較的純粋なＥＳ細胞集団を示すことに留意のこと。
【００７５】
図３は、細胞の生存および分化におけるＰＥＧの効果を示す。（Ａ）ＲＨおよびＲＨＮ細胞のＰＥＧ処理２４時間後における１００ｍｍプレートに接着したＥＳ細胞の数を示す棒グラフ。１０６個の細胞を蒔いた。（Ｂ）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）で染色されたＲＨおよびＲＨＮコロニーを含む９６ウェルプレートを示す。ＰＥＧにより処理された細胞および未処理の細胞は、トリプシン化（ｔｒｙｐｓｉｎｉｚｅｄ）する前に培養プレート中で４時間静置状態にし、単一の細胞を９６ウェルプレートにＦＡＣＳで選別した。次いで、細胞を１２日間培養した。（Ｃ）９６ウェルプレートのデータをまとめた表。
【００７６】
図４は、ＥＳ−ＮＳ細胞ハイブリッドにおけるＮＳエピゲノムの解析を示す。（Ａ〜Ｄ）ＸＸ  ＮＳ  ＴＧＦＰ、ＸＹ  ＲＨ、ＸＹ  ＲＨＮ、ＸＸＸＹ  ＲＨ−ＮＳ  ＴＧＦＰおよびＸＸＸＹ  ＲＨＮ−ＮＳ  ＴＧＦＰ細胞における、トリメチルＨ３−Ｋ２７（ｍｅ３Ｈ３−Ｋ２７）（Ａ）およびユビキチル（Ｕｂｉｑｕｉｔｙｌ）Ｈ２Ａ（ｕｂＨ２Ａ）（Ｂ）に対する免疫蛍光、ならびにＸｉｓｔ（Ｃ）およびＯｃｔ４（Ｄ）に対するＲＮＡ  ＦＩＳＨ。黄色矢じりは、ＸＸ  ＮＳ  ＴＧＦＰ細胞におけるｍｅ３Ｈ３−Ｋ２７、ｕｂＨ２ＡまたはＸｉｓｔ  ＲＮＡ核小体の存在を示す。これらのマーカーを示す細胞の百分率は黄色で示される。白色矢じりは、Ｏｃｔ４またはＸｉｓｔ  ＲＮＡの発生期（ｎａｓｅｃｅｎｔ）の転写産物の存在を示す。期待される対立遺伝子の発現を示す細胞の百分率を白色で示す。全ての核をＤａｐｉで対比染色した。（Ｅ）ＮＳ  ＴＧＦＰ、ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ、ＲＨ、ＲＨＮ、ＲＨ−ＮＳ  ＴＧＦＰ（クローン１および２）ならびにＲＨＮ−ＮＳ  ＴＧＦＰ（クローン１および２）におけるＢｌｂｐ、Ｏｌｉｇ２およびＯｃｔ４のＲＴ−ＰＣＲ解析。Ｇａｐｄｈを遍在的（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙ）に発現される対照として用いた。ｃｌ−クローン。
【００７７】
図５は融合混合物のＦＡＣＳ分析を示す。（Ａ〜Ｃ）ＲＨ×ＮＳ  ＴＧＦＰ、ＲＨＮ×ＮＳ  ＴＧＦＰ、ＲＨＮ×ＥＳ  Ｏ４ＧｉＰ、ＲＨＮ×ＭＥＦ  ＴＧＦＰおよびＲＨＮ×Ｔ  ＴＧＦＰの赤色および緑色蛍光の両方を検出するＦＡＣＳプロットを示す。（Ａ）ハイブリッド集団の解析およびＦＡＣＳ選別におけるゲート制御をもたらすモック（ｍｏｃｋ）融合体；（Ｂ）ＰＥＧ処理２４時間後における融合混合物；（Ｃ）Ｂでゲート制御され、ＦＡＣＳにより選別されたハイブリッドの精製度確認；（Ｄ）Ｂで選別されたハイブリッドが蒔かれ、形成されたコロニーは、蒔かれたハイブリッド当たりのコロニーの百分率としてスコア化された。これらのスコアでは、ＦＡＣＳにより選別された細胞の精製度を考慮する。繰り返し実験から得られたスコアを（Ｅ）で示す。
【００７８】
図６は、ＮａｎｏｇがＥＳ様ＥＳ−ＮＳハイブリッドコロニーの作成に必要であることを示す。（Ａ、Ｂ）ＲＣ×ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ、ＲＣＡ−／−×ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ、ＲＣＡ−／−ＮＺ×ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ、ＲＣＡ−／−×ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ  ＮＰ、ＲＣＢ−／−×ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ、ＲＣＢ−／−ＮＺ×ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ、ＲＣＢ−／−×ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ  ＮＰ細胞間の融合において、アルカリホスファターゼで染色されたハイブリッドコロニーを含むプレートを示す。スコアを各プレートの下に示す。（Ｄ）ＥＳ  Ｏ４ＧｉＰ、ＲＣ、ＲＣＡ−／−、ＲＣＢ−／−、ＲＣＡ−／−ＮＺ、ＲＣＢ−／−ＮＺ、ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰおよびＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ  ＮＰ細胞におけるＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２レベルの解析。α−チューブリンをローディングコントロールとして用いた。（Ｅ）ＥＳ  Ｏ４ＧｉＰ、ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ  ＮＰおよびＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ細胞におけるＢｌｂｐ、Ｏｌｉｇ２、ＧＦＰおよびＯｃｔ４のＲＴ−ＰＣＲ分析。Ｇａｐｄｈを偏在的に発現される対照として用いた。（Ｆ）ＲＣ、ＲＣＢ−／−およびＲＣＢ−／−ＮＺ細胞の生存におけるＰＥＧの効果。棒グラフは、ＰＥＧ処理２４時間後における１００ｍｍのプレートに接着したＥＳ細胞の数を示す。２×１０６個の細胞を蒔いた。
【００７９】
図７（補図１）は、ハイブリッドクローンの染色体の計数値を示す。実施例は、ＲＨ−ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ（Ａ）、ＲＨＮ−ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ（Ｂ）、ＲＨ−ＮＳ  ＴＧＦＰ（Ｃ）およびＲＨＮ−ＮＳ  ＴＧＦＰ（Ｃ）の分裂中期の拡張を示す。分裂中期染色体を各ハイブリッド細胞株の３クローンにつき８から１１個の細胞で計数し、各図の下に示す。ｃｌ−クローン。
【００８０】
図８（補図２）は、ＥＳ−ＮＳハイブリッドがトランスジェニックＮａｎｏｇの欠失後に多能性を示すことを示す。（Ａ）ＥＦ４および神経幹（ＮＳ）Ｏ４ＧｉＰ  ＲＢ細胞の模式図。ＥＦ４細胞はｌｏｘＰ部位に隣接した構成的に発現するＮａｎｏｇ導入遺伝子を含み、それによりｃｒｅ組換え酵素を用いてＮａｎｏｇの欠失が可能となり、ＧＦＰの構成的発現をもたらすことになる。ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ  ＲＢは、Ｏｃｔ４プロモーター配列により促進されるＧＦＰ導入遺伝子および構成的に発現するＲＥＤ蛍光導入遺伝子を含む。灰色の四角はＩＲＥＳ配列を示す。（Ｂ）緑色（ＧＦＰ）および赤色（ｄｓＲＥＤ）蛍光を示すＥＦ４−ＮＳ  ＲＢ  Ｏ４ＧｉＰハイブリッド。これらのマーカーはドナーＮＳ細胞ゲノムから発現される。（Ｃ）ＮａｎｏｇのＣｒｅ欠失後におけるＥＦ４−ＮＳ  ＲＢ  Ｏ４ＧｉＰ細胞。ＧＦＰ発現の増大に留意のこと。（Ｄ）図面は、ＥＦ４−ＮＳ  ＲＢ  Ｏ４ＧｉＰ  ｃｒｅハイブリッドの胚様体（ＥＢ）の分化を示す。（Ｅ）分化（ｄｉｆｆ．）後３、５、７および８日目（ｄ）のＥＦ４−ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ  ＲＢ  ｃｒｅ  ＥＢにおけるＴ−ｂｒａｃｈｙｕｒｙ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。未分化のハイブリッドおよび親／ドナー細胞系についても解析した。Ｇａｐｄｈを偏在的に発現される対照として用いた。（Ｆ）蒔かれたＥＢにおけるα−アクチニン（青色）に対する免疫蛍光。
【００８１】
図９は、多能性ＥＳ−ＮＳハイブリッドコロニーの形成におけるＰＤ１８４３５２の効果の分析を示す。（Ａ〜Ｃ）ＲＨ×ＮＳ  ＴＧＦＰ融合体の赤色および緑色蛍光におけるＦＡＣＳ分析。（Ａ）ＰＥＧ処理２４時間後における融合混合物；（Ｂ）Ａでゲート制御され、ＦＡＣＳにより選別されたハイブリッドの精製度度確認。（Ｃ）Ａで選別されたハイブリッドが蒔かれ、次いで形成されたコロニーが蒔かれたハイブリッド当たりのコロニーの百分率としてスコア化された。これらのスコアは、ＦＡＣＳにより選別された細胞の精製度を考慮に入れている。（Ｄ）データのまとめ。（Ｅ）ハイブリッドのコロニー形態の例。
【００８２】
実施例１
初期胚におけるＮａｎｏｇの発現は必要であり、進行性のＸの再活性化と相関する
Ｘ染色体の再活性化は、約４．５ｄｐｃの雌胚の胚盤葉上層においてインビボで生じることが知られる（Mak et al, 2004; Okamoto et al, 2004）。インビボにおけるＮａｎｏｇの再プログラム化への推定される関与を調べるため、４．５ｄｐｃのＮａｎｏｇ−／−雌胚をＥｅｄとＮａｎｏｇ両方に対する免疫蛍光により試験した。Ｅｅｄは着床前の胚における不活性なＸ染色体のマーカーである（Silva et al, 2003; Mak et al, 2004; Okamoto et al, 2004）。Ｎａｎｏｇ＋／−マウス間の交配から得られた２５個の胚のうち、６つがＮａｎｏｇ染色を欠失し、それらのうちの４つが雌であった。Ｎａｎｏｇ陰性胚は、胚の全ての核において、アポトーシス性で希少なＥｅｄで染色されない細胞を除き、単一の大きいＥｅｄの焦点が存在することを示した（図１Ａ）。Ｎａｎｏｇ陽性胚は、多数のＮａｎｏｇ陽性ＩＣＭ細胞を示した（図１Ｅ）。残りの胚とは対照に、これらの細胞の一部は、Ｘの再活性化に一致するＥｅｄの焦点を全く示さなかった（図１Ｃ、Ｅ）。一般に、Ｎａｎｏｇ−／−胚はより小さい。これが発生の遅延によるものであるかを調べるため、休眠中の６．５ｄｐｃ胚を分析した（図１Ｂ）。試験した３１個の胚のうち、８個がＮａｎｏｇ染色を欠失し、それらのうちの３個が雌であった。４．５ｄｐｃの胚と同様、これらもまた全細胞でＥｅｄ焦点の存在を示した。対照的に、雌のＮａｎｏｇ陽性胚はＮａｎｏｇ陽性のほぼ全ての細胞に対してＥｅｄの焦点を示さなかった（図１Ｄ〜Ｆ）。
【００８３】
結論として、このデータがＮａｎｏｇ−／−雌胚がサイレントなＸ染色体を再活性化できないことを示したことから、エピジェネティックな再プログラム化におけるＮａｎｏｇの役割が示唆される。
【００８４】
実施例２
Ｎａｎｏｇを過剰発現するＥＳ細胞は、ＥＳ様ＥＳ−分化細胞のハイブリッドコロニーを形成する高い能力を有する
Ｎａｎｏｇが再プログラム化に関与するか否かを検討するために、ＥＳ細胞と他のＥＳ、ＮＳ、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）および胸腺細胞（Ｔ）との細胞融合を用い、ＷＴおよびＮａｎｏｇにより操作された細胞のＥＳ様ＥＳ−分化細胞のハイブリッドコロニーを産生する能力を調べた。多能性ハイブリッドは、これまで、３つの異なる細胞融合の方法、すなわち電気融合、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）介在の細胞融合および共培養による自然な細胞融合を用いて生成されている（Matveeva et al, 1998; Terada et al, 2002; Ying et al, 2002）。ここでは、ＰＥＧにより誘導される融合を用いて細胞ハイブリッドを形成させた。初めに、赤色蛍光およびハイグロマイシン耐性遺伝子を構成的に発現するＲＨ  ＥＳ細胞、ならびにＮａｎｏｇを過剰発現するＲＨ  ＥＳ細胞誘導体、ＲＨＮを用いた。これらを、ＧＦＰおよびピューロマイシン耐性（Ｏ４ＧｉＰ）（Ying et al, 2002）を駆動するマウスＯｃｔ４遺伝子（Yeom et al, 1996）の調節配列を有する導入遺伝子を運ぶＥＳおよびＮＳ細胞の両方と融合させた。この導入遺伝子は多能性細胞で排他的に発現され、それによりＮＳ細胞ゲノムがＥＳ−ＮＳ細胞融合後に再プログラム化する場合に限り再活性化される。ＮＳ細胞を１４．５ｄｐｃの胎児前脳から得た。異なる融合ペア間で比較できる結果を生じさせるため、融合手順は同じパラメータを用いて同時に行うこととした。ＥＳ細胞と他のＥＳまたはＮＳ細胞との融合の結果として、薬剤耐性の赤色および緑色の蛍光コロニーが培養プレート上に見られた。これらは、核の拡大以外にはほとんどＥＳの形態を示した。Ｎａｎｏｇの過剰発現とは無関係に、ＥＳ細胞間の融合では、多数のハイブリッドコロニーを含むプレートを生じた（図２Ａ）。対照的に、ＥＳ×ＮＳの細胞融合は異なる結果を示した。ＲＨＮ×ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ融合体は、ＲＨ×ＮＳのＯ４ＧｉＰ融合体と比べて約２００倍異なる、有意により多数のコロニーを示した（図２Ｂ）。
【００８５】
Ｎａｎｏｇを過剰発現するＥＳ細胞におけるＥＳ−ＮＳ細胞のハイブリッドコロニーを形成する能力の向上を確認するために、ｌｏｘＰに隣接された（ｆｌｏｘｅｄ）Ｎａｎｏｇ  ＥＳ細胞（ＥＦ４）およびｃｒｅ欠失の誘導物であるＥＦ４  ｃｒｅ３を用いて実験を行った（Chambers et al, 2003）。これらを、構成性のハイグロマイシン薬剤耐性を与える第２の導入遺伝子ＣＡＧ−ｅｇｆｐ−Ｉｒｅｓ−Ｈｙｇｒｏ（ＧＦＰＩＨ）を運ぶＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ誘導細胞と融合させた。ＥＦ４細胞系統は、以前に、ＬｉＦの非存在下で自己再生することが示されたものであり、ＥＦ４  ｃｒｅ３細胞系統は胚盤胞注入後にキメラを生成することができる（Chambers et al, 2003）。上記の結果と一致し、ＥＦ４×ＮＳ細胞融合が多数の薬剤耐性コロニーを生成する一方、ＥＦ４  ｃｒｅ３×ＮＳ細胞融合は薬剤耐性コロニーを生成しなかった（図２Ｃ）。
【００８６】
この現象をさらに特徴付けるため、融合タンパク質ＴＡＵＧＦＰおよびピューロマイシン耐性遺伝子を構成的に発現する樹立されたＮＳ細胞系統ＴＧＦＰを用いた（Pratt et al, 2000）。これらの細胞をＲＨおよびＲＨＮ  ＥＳ細胞の両方に融合させた。さらに再度、ＲＨＮ×ＮＳ  ＴＧＦＰ融合が多数のハイブリッドコロニーを生じる一方、ＲＨ×ＮＳ  ＴＧＦＰ融合が１つのハイブリッドのみを生成するという対照的な結果を得た（図２Ｄ）。この現象は、ＥＳ×ＮＳ（ＥＳおよび誘導された成体）融合、および程度がより少ないがＥＳ×ＴおよびＥＳ×ＭＥＦ融合においても観察された（図２Ｅ、Ｆ）。
【００８７】
この相関をより詳細に試験するため、細胞系統間におけるＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２のレベルを比較した（図２Ｇ）。高レベルのＮａｎｏｇがＲＨＮおよびＥＦ４  ＥＳ細胞の両方で検出される一方、残りのＥＳ細胞系統において類似のより低いレベルのＮａｎｏｇを見出した。ＥＦ４およびＥＦ４  ｃｒｅ３細胞系統では、Ｎａｎｏｇレベルの差異が５倍であると判定されている（Yates and Chambers, 2005）。多能性マーカーＯｃｔ４およびＳｏｘ２のレベルは、用いられた全ＥＳ細胞系統中で相違しなかった。予想通り、ＮＳ細胞はＳｏｘ２の発現を示した。
【００８８】
同時に、これらの結果は、ＥＳ細胞におけるＮａｎｏｇの過剰発現がＥＳ−ＥＳハイブリッドコロニーではなくＥＳ−ＮＳを形成する能力を有意に高めることを示し、これは再プログラム化におけるＮａｎｏｇの役割を示唆する。
【００８９】
実施例３
ＰＥＧは、ＲＨｎａｎｏｇ  ＥＳ細胞と比較してＲＨにおける細胞死または分化の促進を誘導しない
ＲＨ対ＲＨＮ  ＥＳ細胞におけるＰＥＧ処理に対する異なる効果の可能性を評価するため、細胞の生存および分化についての解析を進めた。細胞の生存を、ＰＥＧ処理２４時間後に、１００ｍｍプレートに接着したＥＳ細胞の数としてスコア化した。翌日、蒔かれた１０６個のＰＥＧ処理済みＲＨおよびＲＨＮ  ＥＳ細胞から各々、６．６×１０５個および５．３×１０５個の細胞をカウントした（図３Ａ）。ＰＥＧ処理済みのＥＳ細胞における分化誘導能の可能性およびＥＳ細胞コロニーを増殖させ、形成する能力の変化を検証するため、ＰＥＧで処理されたＲＨとＲＨＮ  ＥＳ細胞および未処理のＲＨおよびＲＨＮ  ＥＳ細胞の単一細胞のＦＡＣＳ選別を行った。ＦＡＣＳ選別から約１２日後に、未分化ＥＳ細胞状態の同定のため、ウェルをアルカリホスファターゼで染色した。蒔かれた未処理のＲＨおよびＲＨＮ  ＥＳ細胞の大部分が未分化のコロニーを形成する一方（図３Ｂ、Ｃ）、ＰＥＧで処理された細胞はコロニー総数の減少を示した。ＲＨコロニーはほぼ５０％まで減少したが、ＲＨＮコロニー形成への影響は非常に少なかった。分化の促進は観察されず、ＲＨコロニーの３９個のうちの４個のみおよびＲＨＮコロニーの７３個のうちの１個のみがＡＰ陰性であった。
【００９０】
このデータ全体から、ＰＥＧは、ＲＨおよびＲＨＮ  ＥＳ細胞の両方で細胞死をある程度誘導するが、細胞の分化は誘導しないことが示唆される。ＲＨＮ細胞は、ＦＡＣＳおよびＰＥＧ処理後にさらに２倍のクローン形成能を有するが、このことはハイブリッドで測定された２００倍の増加を説明するには十分ではないことが示された。
【００９１】
実施例４
ハイブリッド細胞は染色体を分離し、有意な頻度で染色体を二倍体に戻す
ＥＳ−ＮＳ細胞ハイブリッドを特徴付けるために、染色体含有量およびＮＳ細胞エピゲノムの同一性に着目した。前者を解析するため、ＲＨ×ＮＳ  Ｏｃｔ４ＧｉＰ、ＲＨｎａｎｏｇ×ＮＳ  Ｏｃｔ４ＧｉＰ、ＲＨ×ＮＳ  ＴＧＦＰおよびＲＨｎａｎｏｇ×ＮＳ  ＴＧＦＰの間の融合から生じた１２個の独立したＥＳ−ＮＳ細胞ハイブリッドクローンに着目した。５回継代した後、クローンはスコア化された分裂中期の大部分で８０個の染色体を示した（補図１）。
【００９２】
ＮＳ細胞ゲノムに対して排他的に選択された６個のＥＳ−ＮＳクローンの解析では、継代数とともに増加する二倍体集団の存在が示された。これはおそらく、四倍体細胞に対する二倍体細胞の増殖の利点によるものである。これらのクローンのうちの２つを継代１２回目で解析し、各々３０％および５０％の二倍体（４０個の染色体）含有量を示した。さらに、細胞集団は２つの別々の集団、すなわち、約４０個の染色体を有する集団とそれとは別に８０個の染色体を有する集団からなり、それらは染色体の分離が単一の事象で生じたことを示唆する。これらの新たに再プログラム化された二倍体ハイブリッドにおけるＮＳ細胞ゲノムの割合を評価するには、さらなる解析が必要とされる。しかしながら、データは、二倍体の未分化ＥＳ細胞が、細胞融合により分化細胞から取得できることを意味する。
【００９３】
実施例５
ＮＳゲノムはＥＳ−ＮＳ細胞ハイブリッドにおけるＥＳ細胞の同一性を獲得する
ＥＳ−ＮＳ細胞ハイブリッドにおけるＮＳ細胞エピゲノムの同一性を評価するため、不活性Ｘ染色体の状態、ならびにＯｃｔ４および神経幹細胞遺伝子ＢｌｂｐとＯｌｉｇ２の対立遺伝子の発現を観察した。ＸＸ多能性細胞とは対照的に、ＸＸ分化細胞は１つの不活性Ｘ染色体を有する。様々な細胞学的なマーカーの中で、不活性Ｘ染色体はＸｉｓｔ  ＲＮＡに関連して見出され、トリメチルＨ３−Ｋ２７およびユビキチルＨ２Ａを豊富に含む（Brown et al, 1992; Napoles et al, 2004; Silva et al, 2003）。共焦点解析は、ＮＳ細胞の分化状態とともに、ＸｉｓｔＲＮＡ、トリメチルＨ３−Ｋ２７およびモノ−ユビキチルＨ２Ａのうちの１つの単一の核小体を明らかにした（図４Ａ〜Ｃ）。さらに、不活性Ｘは、Ｈ３−Ｋ９に対して低アセチル化され、Ｈ３−Ｋ４に対して低メチル化され、ヒストン変異体ｍａｃｒｏＨ２Ａが豊富に含まれることが見出された（データは示さず）。したがって、再プログラム化がＸＸＸＹ  ＥＳ−ＮＳ細胞ハイブリッドで生じる場合、不活性Ｘはサイレンシングマーカーを喪失する。このことは、Ｘｉｓｔ  ＲＮＡの核小体が喪失し、代わりに、ＥＳ細胞の特徴を有し、Ｘｉｓｔの初期転写産物に対応する、３つの明確なＸｉｓｔシグナルが検出されたこととともに観察された（図４Ｃ）。さらに、ＥＳ−ＮＳ細胞ハイブリッドのクロマチン状態の免疫蛍光分析は、トリメチルＨ３−Ｋ２７およびモノ−ユビキチン化Ｈ２Ａ核小体の喪失を示した（図４Ａ、Ｂ）。ＸＸＸＹ  ＥＳ−ＮＳハイブリッドにおけるＯｃｔ４発現に対するＲＮＡ  ＦＩＳＨ解析は、１つの細胞核当たり３もしくは４つの明確なシグナルの存在を明らかにし、ＮＳ細胞由来のＯｃｔ４対立遺伝子の再活性化を示した（図４Ｄ）。ＸＸＸＹ  ＥＳ−ＮＳハイブリッドのさらなる特徴付けは、ＮＳ細胞で発現され、ＥＳ細胞でサイレンシングされる遺伝子、Ｏｌｉｇ２およびＢｌｂｐの発現解析を包含した（Conti et al, 2005）。ＲＴ−ＰＣＲ解析によると、上記の結果に一致し、ＥＳ−ＮＳハイブリッド細胞でＢｌｂｐおよびＯｌｉｇ２の両方のスイッチがオフにされることが示された（図４Ｅ）。
【００９４】
多能性能を調べるために、Ｎａｎｏｇを過剰発現するＥＳおよびＮＳ細胞間の融合によるハイブリッドが胚様体の形成によって分化可能となり、中胚葉マーカーＴ−ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現について分析した（補図２）。Ｎａｎｏｇの過剰発現が分化を阻害することを考慮に入れて（Chambers et al, 2003）、ＥＦ４−ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ  ＲＢハイブリッドを用いた。上記のように、ＥＦ４細胞がｃｒｅ組換え酵素の作用によりその欠失を可能にするｌｏｘＰに隣接されたＮａｎｏｇの導入遺伝子を有する一方、ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ  ＲＢは赤色蛍光タンパク質およびブラスチシジン耐性遺伝子を構成的に発現する（補図２Ａ）。それゆえ、ＥＦ４−ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ  ＲＢハイブリッドはＮＳ由来の赤色および緑色蛍光を示した（補図２Ｂ）。ｃｒｅ組換え酵素による処理後、ハイブリッドが緑色蛍光の増大を示すと同時に、Ｎａｎｏｇの過剰発現の喪失が観察された（補図２Ｃ）。次いで、これらのＥＦ４−ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ  ＲＢ  ｃｒｅハイブリッドは、Ｌｉｆの除去および胚体（ＥＢ）の形成により分化が可能となり、Ｔ−ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現について解析された（補図２Ｄ、Ｅ）。予想通り、Ｔ−ｂｒａｃｈｙｕｒｙはドナー細胞または未分化ハイブリッドで検出されなかった。しかし、多能性能を有することから、分化したハイブリッドで発現された。ＥＢの場合にも１ウェル当たり１〜３個蒔き、接着する細胞の存在について解析した。ウェルの約７０％（２４／３５）は拍動する（ｂｅａｔｉｎｇ）細胞を示し、それらを骨格および心筋細胞の特異的なマーカーであるα−アクチニンに対して陽性に染色された（補図２Ｆ）。
【００９５】
まとめると、データは、全ての解析されたマーカーにおいてＮＳゲノムがＥＳ−ＮＳ細胞ハイブリッドでＥＳ細胞の同一性を獲得することを示す。さらに、ハイブリッドは多能性能を維持した。
【００９６】
実施例６
ＥＳ細胞におけるＮａｎｏｇの過剰発現は、細胞融合後のＮＳ細胞の再プログラム化に必要とされる唯一の因子である
Ｎａｎｏｇを過剰発現するＥＳ細胞は、ＷＴ  ＥＳ細胞よりより高い融合性を有しうる可能性がある。この点を対処するため、融合２４時間後のＲＨ×ＮＳ  ＴＧＦＰおよびＲＨＮ×ＮＳ  ＴＧＦＰの細胞集団を、一次ハイブリッドである赤色および緑色蛍光両方を示す細胞の存在について、ＦＡＣＳにより解析した。予想通り、二重の陽性細胞の数は比較的少なかった。ＲＨ×ＮＳ  ＴＧＦＰおよびＲＨＮ×ＮＳ  ＴＧＦＰでは、二重の陽性細胞が各々、０．１７％および０．１％であることが示された（図５Ｂ）。加えて、ＦＡＣＳにより選別された一次ハイブリッドのコロニーを形成する能力を試験した。融合２４時間後、ハイブリッドを赤色および緑色蛍光の両方について選別した。この段階において、再プログラム化が進行中でありうるが、Ｏｃｔ４調節配列により駆動されるＧＦＰ発現が細胞融合約４８時間後に最初に検出されることが以前に示されたことから、完全ではない（Ｔａｄａ  ｅｔ  ａｌ，  ２００１；  Ｄｏ  ａｎｄ  Ｓｃｈｏｌｅｒ，  ２００４）。そして、この段階での一次ハイブリッドは、細胞周期の調整などの検討事項に加え、エピゲノムの差異を克服してＥＳ様コロニーを生成しなければならない。ＦＡＣＳ選別の３日後、蒔かれた一次ハイブリッドをハイグロマイシンおよびピューロマイシンの両方で選別した。２つの独立した実験から得られた結果は、ＲＨ×ＮＳ  ＴＧＦＰ融合体から選別された一次ハイブリッドがハイブリッドコロニーを生成しないことを示した（図５Ｄ、Ｅ）。対照的に、ＦＡＣＳで選別された２０００個および７００個の細胞のうちの各々３４個および１１個のハイブリッドコロニーをＲＨＮ×ＮＳ  ＴＧＦＰ融合から得た（図５Ｄ、Ｅ）。
【００９７】
これらの結果は、再プログラム化におけるＮａｎｏｇ過剰発現に関する課題を提起した。これに取り組むため、形成されたＲＨＮ−ＮＳ  ＴＧＦＰコロニーの数をＲＨＮ−ＥＳ  Ｏ４ＧｉＰの数と比較し、後者は、蒔かれたハイブリッド当たりのコロニー形成に対する所定の単位であるとした。ＦＡＣＳで選別された真の二重陽性細胞の総数当たりのハイブリッドコロニーの割合を考慮すると、ＲＨＮ−ＮＳ  ＴＧＦＰおよびＲＨＮ−ＥＳ  Ｏ４ＧｉＰの一次ハイブリッドは、ＥＳ様コロニーを生成する同一の能力を有するようである（図５Ｄ、Ｅ）。
【００９８】
要するに、ＥＳ−ＮＳハイブリッドのＦＡＣＳ選別および分析は、Ｎａｎｏｇの過剰発現が細胞融合を増進させないことを示すが、ＥＳ様ＥＳ−ＮＳハイブリッドコロニーの作成を促進させることを確認した。そのことはまた、ＮａｎｏｇがＥＳ−ＮＳハイブリッドコロニーの作成におけるエピジェネティックな差異の克服に必要とされる唯一の制限因子でありうることを示す。
【００９９】
実施例７
再プログラム化におけるドナー細胞としての神経細胞
体細胞核移植（ＳＣＮＴ）では、用いられたドナー細胞のタイプがＥＳ細胞の胚盤胞からの誘導効率に影響することが示された（Hoechedlinger and Jaenisch 2002; Blelloch et al, 2004; Eggan et al, 2004; Inoue et al, 2005）。これらの研究において、ＥＳ細胞が最良の結果をもたらすことが示されており、ドナー細胞の分化状態が重要な因子であることが示唆される。ＮＳ細胞は多能性の体性幹細胞であり（Conti et al, 2005）、それゆえに多少可塑性のエピゲノムを含む。本発明者らの実験では、ＲＨＮ−ＮＳの一次ハイブリッドは、ＲＨＮ−ＥＳの一次ハイブリッドと同じ効率でＥＳ様ハイブリッドコロニーを生成することが示された。これがＮＳエピゲノムの特性によるものか、またはＮａｎｏｇの過剰発現のみによるものかという点に対処するため、ＥＳ様コロニーを生成するＭＥＦおよび胸腺細胞（Ｔ）の一次ハイブリッドの能力を解析した。ＭＥＦおよびＴ細胞をＲＨおよびＲＨＮ  ＥＳ細胞に融合させた。一次ハイブリッドは、ＲＨ−ＮＳ、ＲＨ−ＭＥＦおよびＲＨ−Ｔの場合と同様、ＥＳ様コロニーを生成できなかった（データは示さず）。ＲＨＮ−ＭＥＦおよびＲＨＮ−Ｔの一次ハイブリッドは、ＥＳ様コロニーを生成できたが、ＲＨＮ−ＥＳおよびＲＨＮ−ＮＳの一次ハイブリッドの場合よりも極めて低い効率（各々、０．０８％および０．３３％）であった（図５Ａ〜Ｅ）。
【０１００】
これらのデータは、ＮＳ細胞エピゲノムがＮａｎｏｇを過剰発現するＥＳ細胞への融合によってその分化した対応物よりも再プログラム化に対してより感受性が高いであろうことを示す。
【０１０１】
実施例８（比較）
ＮＳ細胞におけるＮａｎｏｇの発現は再プログラム化には十分でない
Ｎａｎｏｇの発現がＮＳゲノムをＥＳ細胞のゲノムに再プログラム化するのに十分であるか否かを検討するため、ＮＳ細胞にＮａｎｏｇをトランスフェクトした（ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ  ＮＰ）。これらの細胞はＮａｎｏｇを安定的に発現し、タンパク質レベルはＥＳ細胞で見出されるレベルと同様である（図６Ｄ）。さらに、細胞は正常に増殖し、ＮＳ細胞マーカーＢｌｂｐおよびＯｌｉｇ２の発現を示した（図６Ｅ）。しかしながら、内在性のＯｃｔ４またはＯｃｔ４調節配列から駆動されるＧＦＰの発現は存在しなかった。標準的なＧＭＥＭまたはＮ２Ｂ２７  ＥＳ培地中に蒔かれる場合、先行文献にあるようにアストロサイト型細胞に分化した（Conti et al, 2005）。２つの強力なエピジェネティックな脱安定剤（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）であるトリコスタチンＡおよび５−アザシチジンを用いる追加の実験においても、Ｎａｎｏｇを発現するＮＳ細胞を再プログラム化することができなかった（データは示さず）。
【０１０２】
これらの結果は、まとめると、ＥＳ細胞内容物の外側では、Ｎａｎｏｇ発現は再プログラム化を誘導するのに十分でないことを示唆している。
【０１０３】
実施例９
ＮａｎｏｇはＥＳ様ＥＳ−ＮＳ細胞のハイブリッドコロニーの作成に必要である
Ｎａｎｏｇヌルの単離ＩＣＭおよびＥＳ細胞の両培養物は、未分化状態を維持できなかった（Mitsui et al, 2003）。これらの結果は、多能性状態の維持におけるＮａｎｏｇの役割を示すものとして解釈された。しかし、条件付き欠失方法を用いることにより、多能性マーカーを発現するＮａｎｏｇ−／−−ＥＳ様細胞（ＲＣ−／−）を誘導し、それは連続的に継代され、多能性能を維持することができる。この方法は、ｌｏｘＰに挟まれたＮａｎｏｇ導入遺伝子のＥＳ細胞への導入と、その後、両Ｎａｎｏｇ内在性遺伝子を標的とした欠失および最終的なトランスジェニックなＮａｎｏｇのｃｒｅ除去を含む。ＲＣ−／−細胞が真のＥＳ細胞であるというさらなる証拠は、標的化（ｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ）ベクターにより導入される、Ｇ４１８およびハイグロマイシン耐性遺伝子を駆動する内在性Ｎａｎｏｇプロモーターの活性によって選択が行われうるという事実から得られる。このことが純粋なＥＳ様集団の選択を可能にし、そこではＯｃｔ４とＳｏｘ２両方のレベルが他のＮａｎｏｇ発現ＥＳ細胞集団と同様であった（図６Ｄ）。Ｎａｎｏｇが再プログラム化に必要であるか否かを検討するため、ＲＣ−／−またはその親細胞系統ＲＣのいずれか一方とＮＳＯ４ＧｉＰ細胞とを同時に融合を行った。また、ＲＣ−／−を、トランスジェニックＮａｎｏｇを発現するＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ、ＮＳ  Ｏ４ＧｉＰ  ＮＰと融合させた。最終的に、Ｎａｎｏｇを発現する導入遺伝子（ＲＣ−／−ＮＺ）で回復されたＲＣ−／−細胞をＮＳ  Ｏ４ＧｉＰと融合させた。これらの実験は、２つの別々に標的化されたクローン、ＲＣ−／−ＡおよびＢを用いて行われた。ハイブリッドコロニー数の有意な値を得るために、２×１０６個：２×１０６個の融合混合物を蒔いた。予想通り、親細胞系統ＲＣとＮＳＯ４ＧｉＰとの融合はハイブリッドコロニーを生じた（図６Ａ、Ｂ）。対照的に、ＲＣ−／−細胞はこの能力を完全に喪失していた。Ｎａｎｏｇで回復されたＲＣ−／−細胞であるＲＣ−／−ＮＺは、ハイブリッドコロニーの生成能力を獲得するだけでなく、ＲＣ細胞に関してそれをさらに高めていた。この結果は、ＲＣ−／−ＮＺ細胞におけるより高いレベルのＮａｎｏｇの存在と相関する（図６Ｄ）。興味深いことに、ＲＣ−／−細胞はまた、Ｎａｎｏｇを発現するＮＳＯ４ＧｉＰ  ＮＰに融合される場合、ハイブリッドコロニーを形成することもできた。
【０１０４】
これらの結果は、まとめると、Ｎａｎｏｇの発現の存在がＥＳ×ＮＳ細胞融合後のＮＳゲノムの再プログラム化に必須であることを示唆している。
【０１０５】
実施例１０
Ｎａｎｏｇの発現はＭＥＫ阻害剤により高められる
ＭＥＫの阻害剤ＰＤ１８４３５２がＥＳ細胞におけるＮａｎｏｇのレベルを高めることが示された。
【０１０６】
再プログラム化におけるＰＤ１８４３５２の効果についても、細胞融合との関連において、ＮＳ細胞の多能性への転換を調べることにより検討した。
【０１０７】
ｄｓＲｅｄ蛍光タンパク質およびハイグロマイシン耐性を構成的に発現するＲＨ  ＥＳ細胞を、ＩＲＥＳを介してピューロマイシン耐性に連結させた融合タンパク質ＴａｕＧＦＰを発現する胎児由来の神経幹細胞（ＮＳ  ＴＧＦＰ）に融合させた。この融合体のうちの１つにおいて、ＲＨ細胞を３μＭ  ＰＤ１８４３５２との融合の前後３日間に処理した。対照において、ＰＤ１８４３５２を添加しなかった。処理および未処理の一次ハイブリッドを融合２４時間後に選別し、次いで蒔いた（図９Ａ〜Ｃ）。３日後、ハイグロマイシンおよびピューロマイシンをＥＳ培地に添加して選別した。ｄｓＲｅｄ２およびＧＦＰ蛍光を発現し、かつＥＳ細胞の形態を示すコロニーをスコア化した（図９ＤおよびＥ）。結果は、ＰＤ１８４３５２がＥＳ−ＮＳハイブリッドのコロニー形成を４５倍まで高めることを示した。興味深いことに、ＰＤ１８４３５２で処理されたＲＨ細胞では、蒔かれたハイブリッド当たりに形成されたハイブリッドコロニーの百分率は、Ｎａｎｏｇを過剰発現するＥＳ細胞と比べて単に２倍低かった（２．２５％対４％）。この結果は、ＰＤ１８４３５２が細胞融合の過程における再プログラム化を促進することを示す。この効果は、処理されたＲＨ細胞におけるＮａｎｏｇレベルの増加により介在される可能性が高い。したがって、Ｎａｎｏｇが内在的に発現される場合、ＭＥＫ阻害剤を用いることにより、Ｎａｎｏｇを上方調節し、再プログラム化の促進などの関連した効果を得ることが可能である。
【０１０８】
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【０１０９】
したがって、本発明は、細胞の融合および組み合わせを介する細胞の再プログラム化、遺伝的改変の方法、子孫ならびにそれらの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】Ｎａｎｏｇの発現がインビボにおけるＸの再活性化に必要であることを示す。
【図２】ＮａｎｏｇがＥＳ細胞におけるＥＳ−分化細胞ハイブリッドコロニーを形成するＥＳ細胞の能力を高めることを示す。
【図３】細胞の生存および分化におけるＰＥＧの効果を示す。
【図４】ＥＳ−ＮＳ細胞ハイブリッドにおけるＮＳエピゲノムの解析を示す。
【図５】融合混合物のＦＡＣＳ解析を示す。
【図６】ＮａｎｏｇがＥＳ様ＥＳ−ＮＳハイブリッドコロニーの作成に必要であることを示す。
【図７】ハイブリッドクローンの染色体数を示す。
【図８】ＥＳ−ＮＳハイブリッドがトランスジェニックＮａｎｏｇの欠失後に多能性を示すことを示す。
【図９】多能性ＥＳ−ＮＳハイブリッドコロニーの形成におけるＰＤ１８４３５２の効果を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７（Ａ）】
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【図７（Ｂ）】
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【図７（Ｃ）】
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【図７（Ｄ）】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【国際調査報告】
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