(57)【要約】  特定の天然に存在するタンパク質と相互作用できる分子の合理的な同定のための新規の方法が、新しい薬学的に重要な化合物と治療のための使用方法をもたらすために、提供される。概して、この方法は、関心のある特定のタンパク質の一部を構成するスイッチ制御リガンドを同定するステップ、及び、タンパク質の一部を構成し、該スイッチ制御リガンドと相互作用をする相補的なスイッチ制御ポケットをも同定するステップを含む。リガンドはイン・ビボでポケットと相互作用して、リガンド−ポケット相互作用があるときにはタンパク質が第一のコンホメーション及び最初の生物学的活性を有し、リガンド−ポケット相互作用がないときには第二の異なるコンホメーション及び生物学的活性を有するような、タンパク質のコンホメーション及び生物学的活性を調節する。次には、第一及び第二のコンホメーションにおける該タンパク質のそれぞれのサンプルが提供され、これらが１又は２以上の小分子候補に対して、分子とサンプルを接触することによって、スクリーニングされる。その結果、タンパク質とポケット部分で結合する小分子が同定されるだろう。新規のタンパク質−モジュレータのアダクト体及びタンパク質の活性を変える方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スイッチ制御ポケットとスイッチ制御リガンドを備えた天然タンパク質と、このタンパク質のスイッチ制御ポケットに結合している非天然分子を含むタンパク質・モジュレータ・アダクトであって、この分子が、上記タンパク質のコンホメーションを誘導または制限することによって上記タンパク質の生物学的活性を少なくとも部分的に調節する役目をはたし、上記スイッチ制御ポケットは、対応する修飾可能な残基と結合して上記スイッチ制御リガンドの一部分を形成する、複数のコンホメーション制御アミノ酸残基を有し、上記分子は、スイッチポケットによるコンホメーション制御アミノ酸残基またはスイッチ制御リガンド修飾アミノ酸残基からとられる少なくとも１つのアミノ酸残基に結合するアダクト。
【請求項２】
前記分子が、前記タンパク質のコンホメーションの変化を誘導する役目をはたしている請求項１記載のアダクト。
【請求項３】
前記分子が、前記タンパク質のコンホメーションの変化を制限する役目をはたしている請求項１記載のアダクト。
【請求項４】
前記リガンドが、インビボで前記ポケットと相互作用して、前記タンパク質のコンホメーションおよび生物学的活性を調節しており、調節は、リガンドとポケットが相互に作用すると、上記タンパク質が、第一コンホメーションおよび第一生物学的活性を示し、リガンドとポケットが相互に作用しない場合には、第二の、上記とは異なるコンホメーションおよび生物学的活性を示すよう進行するものである請求項１記載のアダクト。
【請求項５】
前記ポケットが、オンのポケットであり、前記分子が、アゴニストとして、前記タンパク質のこのオンのポケットの領域に結合するものである請求項１記載のアダクト。
【請求項６】
前記ポケットが、オンのポケットであり、前記分子が、アンタゴニストとして、前記タンパク質のこのオンのポケットの領域に結合するものである請求項１記載のアダクト。
【請求項７】
前記ポケットが、オフのポケットであり、前記分子が、アゴニストとして、前記タンパク質のこのオフのポケットの領域に結合するものである請求項１記載のアダクト。
【請求項８】
前記ポケットが、オフのポケットであり、前記分子が、アンタゴニストとして、前記タンパク質のこのオフのポケットの領域に結合するものである請求項１記載のアダクト。
【請求項９】
前記タンパク質が、酵素、受容体、シグナル伝達タンパク質よりなる群から選ばれる請求項１記載のアダクト。
【請求項１０】
前記タンパク質が、キナーゼ、ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ、プロテアーゼ、スルホトランスフェラーゼ、スルファターゼ、転写因子、核ホルモン受容体、Ｇタンパク質結合受容体、Ｇタンパク質、ＧＴＰアーゼ、ホルモン、ポリメラーゼ、およびヌクレオチド調節部位を含む他のタンパク質よりなる群から選ばれる請求項９記載のアダクト。
【請求項１１】
前記タンパク質の分子量が、少なくとも約１５ｋＤａである請求項１記載のアダクト。
【請求項１２】
前記分子量が、約３０ｋＤａを超えるものである請求項１１記載のアダクト。
【請求項１３】
前記タンパク質が、キナーゼタンパク質である請求項１記載のアダクト。
【請求項１４】
タンパク質・モジュレータアダクトであって、タンパク質に結合した非天然分子を含む天然タンパク質を備え、タンパク質のコンホメーションを誘導または制限することにより上記タンパク質を少なくとも部分的に調整する役目を果たし、上記タンパク質は第１、第２、または第３配列のアミノ酸残基を内部に有し、上記第１配列のアミノ酸残基はスイッチ制御リガンドの1部を形成し、２つの各状態の間でインビボで個別に修飾可能であり、上記第１配列のアミノ酸残基は、上記の２つの状態の１方にあるときは上記第２配列のアミノ酸残基と結合し、上記第１配列のアミノ酸残基は、上記の２つの状態の他方にあるときは上記第３配列のアミノ酸残基と結合し、上記分子は第１第２または第３配列のアミノ酸残基の少なくとも１つと結合している、タンパク質・モジュレータアダクト。
【請求項１５】
前記第１配列を構成する前記残基のすべてが実質的に前記２つの各状態の間で修飾可能である請求項１４記載のアダクト。
【請求項１６】
前記第１配列のアミノ酸残基のいくつかは前記第１配列の他のアミノ酸とは別個に修飾可能である請求項１４記載のアダクト。
【請求項１７】
前記第１配列のアミノ酸残基と前記第２配列のアミノ酸残基との結合は前記タンパク質の第１コンホメーションに対応し、上記第１配列のアミノ酸残基と上記第３配列のアミノ酸残基との結合は上記タンパク質の第２の、異なるコンホメーションに対応する請求項１４記載のアダクト。
【請求項１８】
前記第１配列のアミノ酸残基は、リン酸化、硫酸化、脂肪酸アシル化、プレニル化、グリコシル化、カルボキシル化、ニトロシル化、シスチニル化、酸化、または突然変異によって修飾可能である請求項１４記載のアダクト。
【請求項１９】
前記第１配列のアミノ酸残基の各々はリン酸化、硫酸化、脂肪酸アシル化、プレニル化、グリコシル化、カルボキシル化、ニトロシル化、シスチニル化、酸化、または突然変異によって修飾可能であり、その際上記第１配列の残基の各々は同じ方法（modality）によって修飾可能である請求項１８記載のアダクト。
【請求項２０】
前記第１配列のアミノ酸残基の少なくとも１つはリン酸化、硫酸化、脂肪酸アシル化、プレニル化、グリコシル化、カルボキシル化、ニトロシル化、シスチニル化、酸化、または突然変異によって修飾可能であり、上記第１配列のアミノ酸残基の他のものは上記少なくとも１つのアミノ酸残基とは異なる方法によって修飾可能である請求項１８記載のアダクト。
【請求項２１】
前記分子は前記第２、または第３配列の少なくとも１つのアミノ残基と結合する請求項１８記載のアダクト。
【請求項２２】
前記第１配列のアミノ酸残基の少なくとも１つは過渡的に修飾可能である請求項１４記載のアダクト。
【請求項２３】
前記第１配列のアミノ酸残基の少なくとも１つは実質的に永久的に修飾可能である請求項１４記載のアダクト。
【請求項２４】
前記分子は前記第１配列のアミノ酸残基と結合し、該結合の1部として、第１配列の残基を化学的に修飾し、該残基のスイッチ状態を変化させる請求項１４記載のアダクト。
【請求項２５】
前記第１配列のアミノ酸残基はニトロシル化によって修飾可能であり、前記分子はニトロシル基を除去する請求項２４記載のアダクト。
【請求項２６】
前記第１配列の前記アミノ酸残基はその中の酸化によって修飾可能であり、前記分子は酸素ラジカルを除去する請求項２４記載のアダクト。
【請求項２７】
前記分子は前記第１配列のアミノ酸残基と結合し、該結合の1部として、前記残基の状態を変更させるために、修飾モイエティ（部分）の添加により上記残基を化学的に修飾する請求項１４記載のアダクト。
【請求項２８】
前記分子はその中の前記第１配列の前記アミノ酸残基を酸化する請求項２７記載のアダクト。
【請求項２９】
前記第１配列のアミノ酸残基は、突然変異によって不可逆修飾されたアミノ酸残基を含む請求項１４記載のアダクト。
【請求項３０】
前記分子は前記第２または第３配列の少なくとも１つのアミノ酸残基と結合する請求項１４記載のアダクト。
【請求項３１】
前記分子は前記第１、第２または第３配列の複数の残基と結合する請求項１４記載のアダクト。
【請求項３２】
前記分子は前記第２または第３配列の複数の残基と結合する請求項３１記載のアダクト。
【請求項３３】
前記分子は前記第２配列の１つまたはそれ以上の残基と結合する請求項１４記載のアダクト。
【請求項３４】
前記分子は前記第３配列の１つまたはそれ以上の残基と結合する請求項１４記載のアダクト。
【請求項３５】
前記タンパク質はキナーゼタンパク質である請求項１４記載のアダクト。
【請求項３６】
前記第１配列のアミノ酸残基はリン酸化、脂肪酸アシル化、ニトロシル化、シスチニル化、酸化、または突然変異によって修飾可能である請求項３５記載のアダクト。
【請求項３７】
前記第１配列のアミノ酸残基の各々はリン酸化、脂肪酸アシル化、ニトロシル化、シスチニル化、酸化、または突然変異によって修飾可能であり、その際上記第１配列の残基の各々は同じ方法（modality）によって修飾可能である請求項３６記載のアダクト。
【請求項３８】
前記第１配列のアミノ酸残基の少なくとも１つはリン酸化、脂肪酸アシル化、ニトロシル化、シスチニル化、酸化、または突然変異によって修飾可能であり、上記第１配列のアミノ酸残基の他のものは上記少なくとも１つのアミノ酸残基とは異なる方法によって修飾可能である請求項３６記載のアダクト。
【請求項３９】
前記分子は前記第１配列の少なくとも１つのアミノ残基と結合する請求項３６記載のアダクト。
【請求項４０】
前記第１配列のアミノ酸残基の少なくとも１つは過渡的に修飾可能である請求項３６記載のアダクト。
【請求項４１】
前記第１配列のアミノ酸残基の少なくとも１つは実質的に永久的に修飾可能である請求項３６記載のアダクト。
【請求項４２】
前記分子は前記第１配列のアミノ酸残基と結合し、該結合の1部として、第１配列の残基を化学的に修飾し、該残基のスイッチ状態を変化させる請求項３６記載のアダクト。
【請求項４３】
前記第１配列の前記アミノ酸残基はニトロシル化によって修飾可能であり、前記分子はニトロシル基を除去する請求項４２記載のアダクト。
【請求項４４】
前記第１配列の前記アミノ酸残基はその中の酸化によって修飾可能であり、前記分子は酸素ラジカルを除去する請求項４２記載のアダクト。
【請求項４５】
前記分子は前記第１配列のアミノ酸残基と結合し、該結合の1部として、前記残基の状態を変更させるために、修飾モイエティの添加により上記残基を化学的に修飾する請求項３６記載のアダクト。
【請求項４６】
前記分子はその中の前記第１配列の前記アミノ酸残基を酸化する請求項４５記載のアダクト。
【請求項４７】
前記第１配列のアミノ酸残基は、突然変異によって不可逆修飾されたアミノ酸残基を含む請求項３６記載のアダクト。
【請求項４８】
前記分子は前記第２または第３配列の少なくとも１つのアミノ酸残基と結合する請求項３６記載のアダクト。
【請求項４９】
前記分子は前記第１、第２または第３配列の複数の残基と結合する請求項３６記載のアダクト。
【請求項５０】
前記分子は前記第２または第３配列の複数の残基と結合する請求項４９記載のアダクト。
【請求項５１】
前記分子は前記第２配列の１つまたはそれ以上の残基と結合する請求項３６記載のアダクト。
【請求項５２】
前記分子は前記第３配列の１つまたはそれ以上の残基と結合する請求項３６記載のアダクト。
【請求項５３】
前記キナーゼタンパク質はｐ３８−αキナーゼである請求項３５記載のアダクト。
【請求項５４】
前記分子は前記タンパク質のアルギニン７０および／またはアルギニン６７のいずれかに結合する請求項５３記載のアダクト。
【請求項５５】
前記分子はアルギニン７０またはアルギニン６７のグアニジルモイエティと結合する請求項５４記載のアダクト。
【請求項５６】
前記分子は、グルタミン酸７１、ロイシン７４、メチオニン７８、バリン８３、イソロイシン１４１、ヒスチジン１４８、フェニルアラニン１６９、リシン５３、イソロイシン８４、ロイシン１０４、トレオニン１０６からなる群から選択される少なくともある種の残基に更に結合する請求項５３記載のアダクト。
【請求項５７】
前記分子は、グルタミン酸７１、ロイシン７４、メチオニン７８、バリン８３、イソロイシン１４１、ヒスチジン１４８、フェニルアラニン１６９、リシン５３、イソロイシン８４、ロイシン１０４、トレオニン１０６からなる群から選択される少なくともある種の残基に更に結合する請求項５５記載のアダクト。
【請求項５８】
前記分子はチロシン３５と結合する請求項５３記載のアダクト。
【請求項５９】
前記分子は、アルギニン７０および／またはアルギニン６７のいずれか、およびグルタミン酸７１、ロイシン７４、メチオニン７８、バリン８３、イソロイシン１４１、ヒスチジン１４８、フェニルアラニン１６９、リシン５３、イソロイシン８４、ロイシン１０４、トレオニン１０６からなる群から選択される少なくともある種の残基に更に結合する請求項５８記載のアダクト。
【請求項６０】
前記キナーゼは野生型のＢｒａｆキナーゼである請求項３５記載のアダクト。
【請求項６１】
前記分子はアスパラギン４９９、リシン６００、およびアルギニン６０２の１つまたはそれ以上と結合する請求項６０記載のアダクト。
【請求項６２】
前記分子は、アラニン４９６、バリン５９９、グルタミン酸５００、フェニルアラミン５９４、リシン４８２、ロイシン５１３、イソロイシン５２６、トレオニン５２８、バリン５０３、ロイシン５０４、トレオニン５０７、イソロイシン５１２、ロイシン５６６およびヒスチジン５７８からなる群から選択される少なくともある種の残基と更に結合する請求項６１記載のアダクト。
【請求項６３】
前記キナーゼは発癌性Ｖ５９９Ｅ  Ｂｒａｆキナーゼである請求項３５記載のアダクト。
【請求項６４】
前記分子はアスパラギン４９９、リシン６００、およびアルギニン６０２の１つまたはそれ以上と結合する請求項６３記載のアダクト。
【請求項６５】
前記分子は、アラニン４９６、グルタミン酸５９９、グルタミン酸５００、フェニルアラミン５９４、リシン４８２、ロイシン５１３、イソロイシン５２６、トレオニン５２８、バリン５０３、ロイシン５０４、トレオニン５０７、イソロイシン５１２、ロイシン５６６およびヒスチジン５７８からなる群から選択される少なくともある種の残基と更に結合する請求項６４記載のアダクト。
【請求項６６】
前記分子はグルタミン酸５９９と結合する請求項６３記載のアダクト。
【請求項６７】
前記分子は、アスパラギン４９９、リシン６００、およびアルギニン６０２の１つまたはそれ以上、およびアラニン４９６、グルタミン酸５９９、グルタミン酸５００、フェニルアラミン５９４、リシン４８２、ロイシン５１３、イソロイシン５２６、トレオニン５２８、バリン５０３、ロイシン５０４、トレオニン５０７、イソロイシン５１２、ロイシン５６６およびヒスチジン５７８からなる群から選択される少なくともある種の残基と更に結合する請求項６６記載のアダクト。
【請求項６８】
前記タンパク質は野生型のｃ−Ａｂｌキナーゼである請求項３５記載のアダクト。
【請求項６９】
前記分子はアルギニン４０５またはグルタミン酸３０１の１つまたはそれ以上と結合する請求項６８記載のアダクト。
【請求項７０】
前記分子が、グルタミン酸３０５、フェニルアラニン４０１、リシン２９０、バリン３１８、イソロイシン３３２、トレオニン３３４、バリン３０８、イソロイシン３１２、ロイシン３１７、ロイシン３７３、およびヒスチジン３８０の１つまたはそれ以上と更に結合する請求項６９記載のアダクト。
【請求項７１】
前記タンパク質が発癌性Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼである請求項３５記載のアダクト。
【請求項７２】
前記分子がアルギニン４０５またはグルタミン酸３０１の１つまたはそれ以上と結合する請求項７１記載のアダクト。
【請求項７３】
前記分子が、グルタミン酸３０５、フェニルアラニン４０１、リシン２９０、バリン３１８、イソロイシン３３２、トレオニン３３４、バリン３０８、イソロイシン３１２、ロイシン３１７、ロイシン３７３、およびヒスチジン３８０の１つまたはそれ以上と更に結合する請求項７２記載のアダクト。
【請求項７４】
タンパク質・モジュレータアダクトであって、ｐ３８−αキナーゼ、および該キナーゼに結合した非天然分子を含み、該分子は上記タンパク質のアルギニン７０および／またはアルギニン６７のいずれかに結合するタンパク質・モジュレータアダクト。
【請求項７５】
前記分子はアルギニン７０またはアルギニン６７のいずれかのグアニジルモイエティと結合する請求項７４記載のアダクト。
【請求項７６】
前記分子は、グルタミン酸７１、ロイシン７４、メチオニン７８、バリン８３、イソロイシン１４１、ヒスチジン１４８、フェニルアラニン１６９、リシン５３、イソロイシン８４、ロイシン１０４、およびトレオニン１０６からなる群から選択される少なくともある種の残基に更に結合する請求項７４記載のアダクト。
【請求項７７】
前記分子は、グルタミン酸７１、ロイシン７４、メチオニン７８、バリン８３、イソロイシン１４１、ヒスチジン１４８、フェニルアラニン１６９、リシン５３、イソロイシン８４、ロイシン１０４、トレオニン１０６からなる群から選択される少なくともある種の残基に更に結合する請求項７５記載のアダクト。
【請求項７８】
タンパク質・モジュレータアダクトであって、ｐ３８−αキナーゼ、および該キナーゼに結合した非天然分子を含み、該分子はチロシン３５に結合するタンパク質・モジュレータアダクト。
【請求項７９】
前記分子は、アルギニン７０および／またはアルギニン６７のいずれか、およびグルタミン酸７１、ロイシン７４、メチオニン７８、バリン８３、イソロイシン１４１、ヒスチジン１４８、フェニルアラニン１６９、リシン５３、イソロイシン８４、ロイシン１０４、およびトレオニン１０６からなる群から選択される少なくともある種の残基に更に結合する請求項７８記載のアダクト。
【請求項８０】
タンパク質・モジュレータアダクトであって、野生型Ｂｒａｆキナーゼ、および該キナーゼに結合した非天然分子を含み、該分子はアスパラギン４９９、リシン６００、およびアルギニン６０２に結合するタンパク質・モジュレータアダクト。
【請求項８１】
前記分子は、アラニン４９６、バリン５９９、グルタミン酸５００、フェニルアラミン５９４、リシン４８２、ロイシン５１３、イソロイシン５２６、トレオニン５２８、バリン５０３、ロイシン５０４、トレオニン５０７、イソロイシン５１２、ロイシン５６６およびヒスチジン５７８からなる群から選択される少なくとも数ある種の残基と更に結合する請求項８０記載のアダクト。
【請求項８２】
タンパク質・モジュレータアダクトであって、発癌性Ｖ５９９Ｅ  Ｂｒａｆキナーゼ、および該キナーゼに結合した非天然分子を含み、該分子はアスパラギン４９９、リシン６００、およびアルギニン６０２のいずれか１つまたはそれ以上と結合するタンパク質・モジュレータアダクト。
【請求項８３】
前記分子は、アラニン４９６、グルタミン酸５９９、グルタミン酸５００、フェニルアラミン５９４、リシン４８２、ロイシン５１３、イソロイシン５２６、トレオニン５２８、バリン５０３、ロイシン５０４、トレオニン５０７、イソロイシン５１２、ロイシン５６６およびヒスチジン５７８からなる群から選択される少なくともある種の残基と更に結合する請求項８２記載のアダクト。
【請求項８４】
タンパク質・モジュレータアダクトであって、発癌性Ｖ５９９Ｅ  Ｂｒａｆキナーゼ、および該キナーゼに結合した非天然分子を含み、該分子はグルタミン酸５９９に結合するタンパク質・モジュレータアダクト。
【請求項８５】
前記分子は、アラニン４９６、グルタミン酸５９９、グルタミン酸５００、フェニルアラミン５９４、リシン４８２、ロイシン５１３、イソロイシン５２６、トレオニン５２８、バリン５０３、ロイシン５０４、トレオニン５０７、イソロイシン５１２、ロイシン５６６およびヒスチジン５７８からなる群から選択される少なくともある種の残基と更に結合する請求項８４記載のアダクト。
【請求項８６】
タンパク質・モジュレータアダクトであって、野生型Ｂｒａｆキナーゼ、および該キナーゼに結合した非天然分子を含み、該分子はアルギニン４０５またはグルタミン酸３０１に結合するタンパク質・モジュレータアダクト。
【請求項８７】
前記分子が、グルタミン酸３０５、フェニルアラニン４０１、リシン２９０、バリン３１８、イソロイシン３３２、トレオニン３３４、バリン３０８、イソロイシン３１２、ロイシン３１７、ロイシン３７３、およびヒスチジン３８０の１つまたはそれ以上と更に結合する請求項８６記載のアダクト。
【請求項８８】
タンパク質・モジュレータアダクトであって、発癌性Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼ、および該キナーゼに結合した非天然分子を含み、該分子はアルギニン４０５またはグルタミン酸３０１に結合するタンパク質・モジュレータアダクト。
【請求項８９】
前記分子が、グルタミン酸３０５、フェニルアラニン４０１、リシン２９０、バリン３１８、イソロイシン３３２、トレオニン３３４、バリン３０８、イソロイシン３１２、ロイシン３１７、ロイシン３７３、およびヒスチジン３８０の１つまたはそれ以上と更に結合する請求項８８記載のアダクト。
【請求項９０】
タンパク質・モジュレータアダクトであって、Ａ鎖およびＢ鎖を持つカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）−７  二量体プロテアーゼと、上記プロテアーゼに結合した非天然分子を含み、該分子は上記二量体プロテアーゼのＡ鎖由来のシスチン２９０および／または上記二量体プロテアーゼのＢ鎖由来のシスチン２９０−プライムに結合するタンパク質・モジュレータアダクト。
【請求項９１】
タンパク質・モジュレータアダクトであって、Ａ鎖およびＢ鎖を持つカスパーゼ−７  二量体プロテアーゼと、上記プロテアーゼに結合した非天然分子を含み、該分子は上記二量体プロテアーゼのＡ鎖由来のＳ−ニトロシル  シスチン２９０および／または上記二量体プロテアーゼのＢ鎖由来のＳ−ニトロシル  シスチン２９０−プライムに結合するタンパク質・モジュレータアダクト。
【請求項９２】
タンパク質の生物学的活性を変更する方法であって、
スイッチ制御ポケットを備えた天然タンパク質と、
スイッチ制御リガンドとを用意する工程、
上記スイッチ制御ポケットは、対応する修飾可能な残基と結合して上記スイッチ制御リガンドの一部分を形成する、複数のコンホメーション制御アミノ酸残基を有し、
上記タンパク質を、非天然分子のモジュレータと接触させる工程、および
上記モジュレータを上記タンパク質の上記ポケットの領域に結合させて、タンパク質のコンホメーションの誘導または制限により、少なくとも部分的にタンパク質の生物学的活性を調節する工程、
上記分子は、スイッチポケットによるコンホメーション制御アミノ酸残基またはスイッチ制御リガンド修飾アミノ酸残基から取った少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する、を含む方法。
【請求項９３】
タンパク質の生物学的活性を変更する方法であって、
第１、第２、および第３の各配列のアミノ酸残基を内部に有する上記タンパク質を含む天然タンパク質を用意する工程、
上記第１配列のアミノ酸残基はリガンドの1部を形成し、２つの各状態の間でインビボで個別に修飾可能であり、上記第１配列のアミノ酸残基は、上記の２つの状態の１方にあるときは上記第２配列のアミノ酸残基と結合し、上記第１配列のアミノ酸残基は、上記の２つの状態の他方にあるときは上記第３配列のアミノ酸残基と結合する、
上記タンパク質を、非天然分子のモジュレータと接触させる工程、および
上記モジュレータを上記タンパク質に結合させて、タンパク質のコンホメーションの誘導または制限により、少なくとも部分的にタンパク質の生物学的活性を調節する工程、
上記分子は第１第２または第３配列のアミノ酸残基の少なくとも１つと結合している、を含む方法。
【請求項９４】
前記タンパク質を非天然分子のモジュレータと接触させる工程は、上記タンパク質の第２の小型分子モジュレータの結合を誘導、相乗、または促進して、三元アダクトを形成し、このような同時進行（co-incident）結合の結果、どちらかの小型分子のみの作用によるタンパク質の生物学的調節特性と比べて、高いタンパク質の生物学的調節特性を示す、請求項９２記載の方法。
【請求項９５】
前記第２の小型分子は前記タンパク質の基質、コファクタ、または調節部位において相互作用し、前記第２の部位は前記第１の非天然分子のモジュレータと相互作用する前記スイッチ制御ポケットとは異なる、請求項９４記載の方法。
【請求項９６】
前記第２の小型分子は前記タンパク質のアロステリック部位において相互作用し、前記第２の部位は前記第１の非天然分子のモジュレータと相互作用する前記スイッチ制御ポケットとは異なる、請求項９４記載の方法。
【請求項９７】
前記第２の小型分子はＡＴＰコファクタ部位において相互作用する請求項９５記載の方法。
【請求項９８】
前記タンパク質はキナーゼである請求項９７記載の方法。
【請求項９９】
前記キナーゼはｃ−Ａｂｌキナーゼ、またはＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼである請求項９８記載の方法。
【請求項１００】
前記第２の小型分子は、Ｎ−  （４−メチル−３−（４−（ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル）−４−（（４−メチルピペラジン−ｌ−  イル）メチル）ベンズアミド（グレエベクＧｌｅｅｖｅｃ）；  Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−（６−（４−（２−  ヒドロキシエチル）ピペラジン−ｌ−イル）−２−メチルピリミジン−４−イルアミノ）チアゾール−５−カルボキサミド  （ＢＭＳ−３５４８２５）；  ６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（３−（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）−８−  メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン  （ＰＤ  １６６３２６）；  ６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−  メチル−２−（３−（メチルチオ）フェニルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン  （ＰＤ  １７３９５５）；  ６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（４−フルオロ−３−メチルフェニルアミノ）−８−  メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン  （ＰＤ  ｌ８０９７０）；  ６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（４−エトキシフェニルアミノ）−８−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン  （ＰＤ  １７３９５８）；  ６−  （２，６−ジクロロフェニル）−２−（４−フルオロフェニルアミノ）−８−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＤ  １７３９５６）；  ６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（４−（２−  （ジエチルアミノ）エトキシ）フェニルアミノ）−８−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン  （ＰＤ  １６６２８５）；  ２−（４−（２−アミノエトキシ）フェニルアミノ）−６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−  メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン；  Ｎ−（３−（６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチル−７−オキソ−７，８−ジヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル）アセトアミド  （ＳＫＩ  ＤＶ−  ＭＯ１６）；  ２−（４−アミノフェニルアミノ）−６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチルピリド［２，３−  ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン  （ＳＫＩ  ＤＶ  １−１０）；  ６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（３−  ヒドロキシフェニルアミノ）−８−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン  （ＳＫＩ  ＤＶ２−８９）；  ２−  （３−アミノフェニルアミノ）−６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−  ７（８Ｈ）−オン  （ＳＫＩ  ＤＶ  ２−４３）；  Ｎ−（４−（６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチル−７−オキソ−７，８−  ジヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル）アセトアミド  （ＳＫＩ  ＤＶ−ＭＯ  １７）；  ６−（２，６−  ジクロロフェニル）−２−（４−ヒドロキシフェニルアミノ）−８−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−  オン  （ＳＫＩ  ＤＶ−Ｍ０１７）；または  ６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（３−エチルフェニルアミノ）−８−  メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン  （ＳＫＩ  ＤＶ  ２  ８７）からとられる請求項���９記載の方法。
【請求項１０１】
前記タンパク質を非天然分子のモジュレータと接触させる工程は、上記タンパク質の第２の小型分子モジュレータの結合を誘導、相乗、または促進して、三元アダクトを形成し、このような同時進行（co-incident）結合の結果、どちらかの小型分子のみの作用によるタンパク質の生物学的調節特性と比べて、高いタンパク質の生物学的調節特性を示す、請求項９３記載の方法。
【請求項１０２】
前記第２の小型分子は前記タンパク質の基質、コファクタ、または調節部位において相互作用し、前記第２の部位は前記第１の非天然分子のモジュレータと相互作用する前記スイッチ制御ポケットとは異なる、請求項１０１記載の方法。
【請求項１０３】
前記第２の小型分子は前記タンパク質のアロステリック部位において相互作用し、前記第２の部位は前記第１の非天然分子のモジュレータと相互作用する前記スイッチ制御ポケットとは異なる、請求項１０１記載の方法。
【請求項１０４】
前記第２の小型分子はＡＴＰコファクタ部位において相互作用する請求項１０２記載の方法。
【請求項１０５】
前記タンパク質はキナーゼである請求項１０４記載の方法。
【請求項１０６】
前記キナーゼはｃ−Ａｂｌキナーゼ、またはＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼである請求項１０５記載の方法。
【請求項１０７】
請求項１０６記載の方法で、
前記第２の小型分子は、Ｎ−  （４−メチル−３−（４−（ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル）−４−（（４−メチルピペラジン−ｌ−  イル）メチル）ベンズアミド（Ｇｒｅｅｖｅｃ）；  Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−（６−（４−（２−  ヒドロキシエチル）ピペラジン−ｌ−イル）−２−メチルピリミジン−４−イルアミノ）チアゾール−５−カルボキシアミド  （ＢＭＳ−３５４８２５）；  ６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（３−（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）−８−  メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン  （ＰＤ  １６６３２６）；  ６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−  メチル−２−（３−（メチルチオ）フェニルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン  （ＰＤ  １７３９５５）；  ６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（４−フルオロ−３−メチルフェニルアミノ）−８−  メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン  （ＰＤ  ｌ８０９７０）；  ６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（４−  エトキシフェニルアミノ）−８−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン  （ＰＤ  １７３９５８）；  ６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（４−フルオロフェニルアミノ）−８−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＤ  １７３９５６）；  ６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（４−（２−  （ジエチルアミノ）エトキシ）フェニルアミノ）−８−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン  （ＰＤ  １６６２８５）；  ２−（４−（２−アミノエトキシ）フェニルアミノ）−６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−  メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン；  Ｎ−（３−（６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチル−７−オキソ−７，８−ジヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル）アセトアミド  （ＳＫＩ  ＤＶ−  ＭＯ１６）；  ２−（４−アミノフェニルアミノ）−６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチルピリド［２，３−  ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン  （ＳＫＩ  ＤＶ  １−１０）；  ６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（３−  ヒドロキシフェニルアミノ）−８−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン  （ＳＫＩ  ＤＶ２−８９）；  ２−  （３−アミノフェニルアミノ）−６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−  ７（８Ｈ）−オン  （ＳＫＩ  ＤＶ  ２−４３）；  Ｎ−（４−（６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチル−７−オキソ−７，８−  ジヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル）アセトアミド  （ＳＫＩ  ＤＶ−Ｍ０１７）；  ６−（２，６−  ジクロロフェニル）−２−（４−ヒドロキシフェニルアミノ）−８−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−  オン  （ＳＫＩ  ＤＶ−Ｍ０１７）；または  ６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（３−エチルフェニルアミノ）−８−  メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン  （ＳＫＩ  ＤＶ  ２  ８７）からとられる請求項１０６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願についての相互参照）
本ＰＣＴ出願は、同一名称の米国特許出願第１１／１７８，８３４号（２００５年７月１１日出願）の優先権を主張するものである。後者の出願はここに言及することをもって、本発明に組み込むものである。
仮出願である以下の各出願はここに言及することをもって、本発明に組み込むものである：米国特許出願第６０／６３８，９８７号のＥｎｚｙｍｅ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ，  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ，  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２００４年１２月２３日出願）、米国特許出願第６０／６３９，０８７号のＥｎｚｙｍｅ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒｓ  Ａｎｄ  Ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２００４年１２月２３日出願）、米国特許出願第６０／６３８，９８６号のＥｎｚｙｍｅ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒｓ，  Ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，  Ｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｔｒｅａｔａｂｌｅ  Ｗｉｔｈ  Ａｎ  Ａｎｔｉ−Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  Ａｇｅｎｔ（２００４年１２月２３日出願）、および米国特許出願第６０／６３８，９６８号のＥｎｚｙｍｅ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒｓ  Ａｎｄ  Ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２００４年１２月２３日出願）。
以下の各出願も、ここに言及することをもって、本発明に組み込むものである：米国特許出願第６０／４３７，４８７号のＰｒｏｃｅｓｓ  Ｆｏｒ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（２００２年１２月３１日出願）、米国特許出願第６０／４３７，４０３号のＡｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ（２００２年１２月３１日出願）、米国特許出願第６０／４３７，４１５号のＡｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ（２００２年１２月３１日出願）、米国特許出願第６０／４３７，３０４号のＡｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ（２００２年１２月３１日出願）、および米国特許出願第６０／４６３，８０４号のＭｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ  Ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ（２００３年４月１８日出願）。
【０００２】
（配列表）
以下の本出願にはコンピュータ読取可能形式（ＣＲＦ）の配列表が含まれる。付属のＣＲＦの内容をここに言及することをもって、本発明に組み込むものである。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、広義には、タンパク質の活性モジュレータの役目を果たす分子の新規で合理化された識別方法、ならびに新規なタンパク質とモジュレータのアダクトに関するものである。より詳細には、本発明は、こうした方法およびアダクトであって、好適な態様では、スイッチ制御リガンドとこれと相補的なスイッチ制御ポケットとの相互作用を含むタンパク質コンホメーションの変化機構を利用するような方法およびアダクトに関するものである。
【０００４】
（先行技術の説明）
近年、基礎研究によって、ヒト遺伝コードやそれによって生成されるタンパク質について、かつてない量の情報が生命科学コミュニティにもたらされている。２００１年には、ヒトゲノムの完全配列も報告された（Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．ら，Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ；Ｎａｔｕｒｅ（２００１）  ４０９：８６０；Ｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｃ．ら，Ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）  ２９１：１３０４）。全世界の研究コミュニティは、現在、こうした遺伝子配列によってコードされる５０，０００以上のタンパク質の分類に着手しており、さらに重要なこととして、主要な疾患でありながら、治療が十分に行われていないヒトの疾患の原因タンパク質の識別に取り組んでいる。ヒトゲノムやそのタンパク質によってもたらされる情報、特に、タンパク質の機能をコンホメーションによって制御する分野について多大な情報が存在するにもかかわらず、製薬産業が小分子治療薬の開発に着手しうるような方法論や戦略は、小分子治療薬を結合させる際に天然のタンパク質結合部位を利用するところから有意には先に進んでいない。こうした天然の部位は、通常、必須の細胞機能を営むうえで、各種のタンパク質によって利用されている部位であり、その際には、タンパク質がこうした部位に結合することによって天然の基質の処理が進行したり、タンパク質によって、天然リガンド由来の信号が伝達されたりする。これらの天然部位は、タンパク質ファミリー内の他の多くのタンパク質によっても広範に利用されているので、こうした部位と相互に作用する薬剤では、選択性の欠如が問題となることも多く、その結果、最大効力を達成するには治療域が不十分となることも多い。こうした小分子では、副作用および有害性は、臨床以前の創薬時、臨床治験の間、またはその後市場で明らかになる。副作用および有害性は、薬剤開発プロセスに見られる高い消耗率の主因であり続けている。キナーゼタンパク質ファミリーのタンパク質については、こうした天然部位での相互作用についてのレビューが最近報告されている（Ｊ．Ｄｕｍａｓ，Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅｓ：  １９９７−２０００，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐａｔｅｎｔｓ（２００１）  １１：  ４０５−４２９；Ｊ．Ｄｕｍａｓ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）  ２：  ｉｓｓｕｅ  ９を参照されたい）。
【０００５】
タンパク質は可撓性であることが知られており、この可撓性を利用して、タンパク質の別々の可撓性の活性部位に結合する小分子を見いだした事例が報告されている。こうした利用についてのレビューについては、Ｔｅａｇｕｅ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｖｏｌ．２，ｐｐ．５２７−５４１（２００３）を参照されたい。また、Ｗｕら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．１１，ｐｐ．３９９−４１０（２００３）も参照されたい。しかし、これらの報告では、タンパク質の天然の活性部位のみに結合する小分子に焦点があてられている。Ｐｅｎｇら，Ｂｉｏ．  Ｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｔｒｓ．，Ｖｏｌ．１３，ｐｐ．３６９３−３６９９（２００３），およびＳｃｈｉｎｄｌｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８９，ｐ．１９３８（２０００）には、Ａｂｌキナーゼの阻害物質が記載されている。こうした阻害物質については、国際公開番号第ＷＯ２００２／０３４７２７号に特定されている。こうした一群の阻害物質は、ＡＴＰ活性部位に結合し、その一方で、キナーゼ触媒ループの動きを誘導するようなかたちでも結合を生じる。Ｐａｒｇｅｌｌｉｓら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９，ｐ．２６８（２００２）には、国際公開番号第ＷＯ００／４３３８４号、およびＲｅｇａｎら，Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４５，ｐｐ．２９９４−３００８（２００２）にも開示されている阻害物質ｐ３８アルファ−キナーゼが報告されている。これらの一群の阻害物質も、キナーゼのＡＴＰ活性部位で結合し、同時に、キナーゼ活性化ループの動きを生じる。
【０００６】
さらに最近、キナーゼは、活性化ループおよびキナーゼドメイン調節ポケットを利用して、触媒活性の状態を制御していることが開示されている。この点については、最近レビューが公開されている。Ｍ．ＨｕｓｅおよびＪ．Ｋｕｒｉｙａｎ，Ｃｅｌｌ（２００２）１０９：２７５を参照されたい。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、特定の天然タンパク質（たとえば哺乳動物、特にヒトのタンパク質）と相互作用して、タンパク質の活性を調節する分子を識別する方法、ならびに新規なタンパク質と小分子モジュレータのアダクトに関するものである。本発明の方法の側面では、天然タンパク質が持つ性質、すなわち、タンパク質は、インビボでコンホメーションが変化し、それに対応してタンパク質の活性も変化するという性質を利用する。たとえば、あるコンホメーションの特定のタンパク質を生物学的にアップ・レギュレートして酵素とすることができ、一方、同じタンパク質が別のコンホメーションの場合には、生物学的にダウン・レギュレートすることができる。また、本発明では、タンパク質内の「スイッチ制御リガンド」および相補的な「スイッチ制御ポケット」と称する領域の相互作用を介して、天然のタンパク質が利用しているコンホメーション変化機構の一つを利用することが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、天然のタンパク質（たとえば哺乳動物、特にヒトのタンパク質）と相互作用して、タンパク質の活性を調節する新規な小分子モジュレータを合理的に開発する方法を提供するものである。また、新規なタンパク質と小分子とのアダクトも提供する。本発明は、好ましくは、インビボでコンホメーションが変化し、それに対応してタンパク質の活性も変化するという天然タンパク質の性質を利用する。たとえば、あるコンホメーションの特定の酵素タンパク質を生物学的にアップ・レギュレートすることができ、一方、同じタンパク質が別のコンホメーションの場合には、生物学的にダウン・レギュレートすることができる。本発明では、タンパク質内の「スイッチ制御リガンド」および相補的な「スイッチ制御ポケット」と称する領域の相互作用を介して、天然タンパク質が利用しているコンホメーション変化機構の一つを利用することが好ましい。
【０００９】
本発明で使用する場合には、「スイッチ制御リガンド」とは、天然タンパク質内の領域またはドメインであって、ゲノム修飾、生化学的修飾、または化学修飾、具体的には、修飾可能なリガンド残基の突然変異、リン酸化、硫酸化、脂肪酸アシル化、グリコシル化、プレニル化、カルボキシル化、ニトロシル化、シスチニル化（２つの近接するシステイン残基がそれらの間でジスルフィド結合を形成する）、または酸化によって、インビボで（一時的、（可逆的）、または実質上永久的のいずれかで）修飾されて個別の状態のいずれかをとる１以上のアミノ酸残基を内部に有するものを意味する。ゲノム修飾、脂肪酸アシル化、グリコシル化、プレニル化、またはカルボキシル化は、スイッチ制御リガンド残基を実質上永久的に修飾し、一方、リン酸化、硫酸化、ニトロシル化、シスチニル化、または酸化はスイッチ制御リガンド残基を可逆的に修飾する。同様に、「スイッチ制御ポケット」は、天然のタンパク質内の複数の隣接または非隣接アミノ酸残基であって、インビボで、上記個別状態のいずれかにあるスイッチ制御リガンドの修飾可能な残基と結合して、そのタンパク質のコンホメーションを誘導または制限することにより、そのタンパク質の生物学的活性を調節しうるコンホメーション制御残基（以下、オンのポケットの場合はＺ残基とし、オフのポケットの場合はＸ残基とする）を含み、またこれらのコンホメーション制御残基の少なくとも１部は非天然のスイッチ制御調節分子と結合して、タンパク質のコンホメーションを誘導または制御することにより、そのタンパク質の生物学的活性を調節しうるようなものを意味する。
【００１０】
本発明のタンパク質・モジュレータ・アダクトは、スイッチ制御ポケットを備えた天然のタンパク質と、タンパク質の上記スイッチ制御ポケット領域に結合した非天然分子を含むものであり、この分子は、スイッチ制御ポケットの１部を構成するコンホメーション制御アミノ酸残基の１部または全部に結合し、そのタンパク質のコンホメーションを誘導または制限することによってそのタンパク質の生物学的活性を少なくとも部分的に調節する役目を果たしている。好ましくは、このタンパク質は、対応するスイッチ制御リガンドをその配列中に埋め込む形で備えており、このリガンドは、インビボで、ポケットと相互作用を生じてタンパク質のコンホメーションおよび生物学的活性を調節し、リガンドとポケットの相互作用が生じると、そのタンパク質が第一コンホメーションおよび第一生物学的活性をとり、リガンドとポケットの相互作用の不在下では、第二の異なったコンホメーションおよび生物学的活性をとるものである。
【００１１】
スイッチ制御リガンド／スイッチ制御ポケットの相互作用の性質については、図１〜４の模式図を考慮すると、理解しやすい。すなわち、図１に、「オン」スイッチ制御ポケット１０２および「オフ」スイッチ制御ポケット１０４、ならびにスイッチ制御リガンド１０６を含むタンパク質１００を模式的に示す。また、この模式的に描いたタンパク質は、ＡＴＰ活性部位１０８も含んでいる。図１のこのタンパク質の例では、リガンド１０６は、側鎖にリン酸化可能なＯＨ基１１０を含む修飾可能なアミノ酸残基３つを備えている（一般には、これらのアミノ酸残基はセリン、トレオニン、またはチロジンを含む）。オフ・ポケット１０４は、対応するＸコンホメーション制御残基１１２を、オン・ポケット１０２は、Ｚコンホメーション制御残基１１４を含んでいる。従って、これらのＸおよびＺ残基は、リガンド１０６の１部を形成する対応する残基に結合しうるコンホメーション制御アミノ酸残基として考えることができる。
この例では、タンパク質１００は、リガンド１０６上のＯＨ基１１０の荷電状態に応じて、コンホメーションが変化し、すなわち、ＯＨ基は、修飾されていない場合には、中性の電荷を示すが、これらの基がリン酸化されると、負の電荷を示すことになる。
【００１２】
ポケット１０２および１０４とリガンド１０６の官能性については、図２〜４を考慮すると理解しやすい。図２では、リガンド１０６がオフ・ポケット１０４と協同的に相互作用して、ＯＨ基１１０が、ポケット１０４の一部を形成するＸコンホメーション制御残基１１２と相互作用している。こうした相互作用は、主に、ＯＨ基１１０と残基１１２の間の水素結合と、それに加えて疎水性のファンデルワース相互作用およびロンドン分散力によるものである。このリガンド／ポケット相互作用が生じると、タンパク質１００が、図１に見られるのとは異なった、タンパク質のオフの、すなわち、生物学的にダウン・レギュレートされたコンホメーションに対応するコンホメーションをとるようになる。
【００１３】
図３は、リガンド１０６が、図２のオフのポケット相互作用コンホメーションからシフトし、ＯＨ基１１０がリン酸化されて、リガンドが負に帯電した状態を示す。この状態では、リガンドは、ポケット１０２と相互に作用することによって、タンパク質のコンホメーションを、オン、すなわち生物学的にアップ・レギュレートされた状態（図４）に変化させようとする傾向が強い。図４ａには、リガンド１０６上のリン酸化された基が、正に帯電したコンホメーション制御Ｚ残基１１４（一般にはアルギニンまたはリジン残基を含む）に引き寄せられて、これらの基１１０とＺ残基との間に安定化されたイオン状の結合を示している状態を示す。図４のコンホメーションでは、タンパク質のコンホメーションが、図２のオフのコンホメーションとは異なる状態となっており、ＡＴＰ活性部位が利用可能な状態となって、タンパク質がキナーゼ酵素として機能しうる状態となっていることに注意されたい。
【００１４】
上記は、主にリン酸化可能な残基を持つスイッチ制御リガンドについて説明したものであるが、本発明はこれに限定されるものではなく、様々な種類のリガンド修飾を包含するものである。例えば、タンパク質キナーゼの多くは、そのスイッチ制御リガンドの領域内にメチオニンおよび／またはシステインアミノ酸残基を含んでおり、これらの残基は一般に、リン酸化ではなく酸化反応によって修飾される。
【００１５】
酸化ストレス条件下で、スイッチ制御リガンドのメチオニン残基は酸化されてメチオニンスルホキシドまたはメチオニンスルホン変性アミノ酸残基を生成しうる。これらの修飾されたメチオニン残基は電気陰性度を提供し、スイッチ制御リガンドがオンまたはオフのスイッチ状態を選択するように誘導する。図４ｂは、１以上のメチオニンアミノ酸残基が修飾されてメチオニンスルホキシドになり、この修飾によってスイッチ制御リガンド１０６が誘導されてオンのスイッチポケット１０２を占有しているスイッチ制御リガンドを図示したものである。図４ｃは、１以上のメチオニンアミノ酸残基が修飾されてメチオニンスルホンになり、この修飾によってスイッチ制御リガンドが誘導されオンのスイッチポケット１０２を占有しているスイッチ制御リガンドを図示したものである。
【００１６】
下記式はスイッチ制御リガンドのメチオニン残基がメチオニンスルホキシドまたはメチオニンスルホンのいずれかに変性する酸化変性を表す。メチオニン残基からメチオニンスルホン残基へ酸化修飾する際に、メチオニン残基からメチオニンスルホキシド残基への中間の酸化を介して進行する傾向がある。
【００１７】
【化１】
2009503440.tif 000002
【００１８】
なお、個々のスイッチ制御リガンドの配列に複数のメチオニン残基が存在する場合は、その内の１以上のメチオニン残基を酸化してスイッチ機構を調整してもよいことはいうまでもない。また、１以上のメチオニン残基を修飾してメチオニンスルホキシドにし、一方、他のメチオニン残基を同時酸化しメチオニンスルホンにしてもよい。
【００１９】
酸化ストレス条件下では、スイッチ制御リガンド内のシステイン残基は酸化されシステインスルフェン酸またはシステインスルフィン酸変性アミノ酸残基を生成しうる。これらの修飾されたシステイン残基は電気陰性度または負の電荷を提供し、スイッチ制御リガンドがオンまたはオフのスイッチ状態を選択するように誘導する。図４ｄは、１以上のシステインアミノ酸残基が修飾されてシステインスルフェン酸になり、この修飾によってスイッチ制御リガンドが誘導されオンのスイッチポケット１０２を占有している状態を図示したものである。図４ｅは、１以上のシステインアミノ酸残基が修飾されてシステインスルフィン酸になり、この修飾によってスイッチ制御リガンドが誘導されオンのスイッチポケット１０２を占有している状態を図示したものである。
【００２０】
下記式はスイッチ制御リガンドのシステイン残基がシステインスルフェン酸またはシステインスルフィン酸のいずれかに変性する酸化変性を表す。システイン残基からシステインスルフィン酸残基へ酸化修飾の際に、システイン残基からシステインスルフェン酸残基への中間の酸化を介して進行する傾向がある。
【００２１】
【化２】
2009503440.tif 000003
【００２２】
なお、個々のスイッチ制御リガンドの配列に複数のシステイン残基が存在する場合は、その内の１以上のシステイン残基を酸化してスイッチ機構を調整してもよいことはいうまでもない。また、１以上のシステイン残基を修飾してシステインスルフェン酸にし、一方、他のシステイン残基を同時酸化してシステインスルフィン酸にしてもよい。
【００２３】
また、スイッチ制御リガンドが１以上のシステインおよびメニオニン残基を含んでいる場合、酸化されたシステイン残基および酸化されたメチオニン残基の組合せが共役してスイッチ制御リガンドを修飾し、オンまたはオフのスイッチ状態を占有させるように誘導することは当業者であればわかるはずである。
【００２４】
この他にスイッチ制御リガンドを一時的に修飾する機構としてはスイッチ制御リガンド配列中に存在するシステイン残基のＳ−ニトロシル化を行い、リガンドがオンまたはオフ状態を選択するように誘導する機構がある。Ｓ−ニトロシル化されたこれらのシステイン残基は電気陰性度を提供し、スイッチ制御リガンドがオンまたはオフのスイッチ状態を選択するように誘導する。その際、たとえば、システイン由来のＮＯ部分がポケット１０２由来のアルギニンＺ基、またはポケット１０４由来のアルギニンＸ基へ移動するような相互作用、または直接結合による相互作用など各種の相互作用を伴う。図４ｆは、１以上のシステインアミノ酸残基が修飾されてＳ−ニトロシル化されたシステイン残基になり、その修飾によりスイッチ制御リガンドが誘導されオンのスイッチポケット１０２を占有している状態を図示したものである。
【００２５】
下記式はスイッチ制御リガンドのシステイン残基がＳ−ニトロシル化されたシステイン残基に変性する酸化変性を表す。
【００２６】
【化３】
2009503440.tif 000004
【００２７】
いくつかの例では、ジスルフィド結合によって互いに酸化的に結合される１対の近接するシステイン残基が修飾されシスチンダイマーを形成する場合がある。これらの例では、１方のシステイン残基が一時的に酸化されシステインスルフェン酸またはＳ−ニトロシル化システインになり、他方のシステインは、続いて、１方のシステインの酸化された部分を置換してシスチンジスルフィドダイマーを形成する。ジスルフィドシスチンダイマーを形成する機構としては、システインスルフェン酸またはＳ−ニトロシル化システイン残基の中間物を介さない他の機構もあり、それらの他の機構は本書に包含されることはいうまでもない。
【００２８】
【化４】
2009503440.tif 000005
【００２９】
上述したように、スイッチ制御リガンドが１以上のシステインおよびメニオニン残基を含んでいる場合、酸化されたシステイン残基およびメチオニン残基の組合せが共役してスイッチ制御リガンドを修飾し、オンまたはオフのスイッチ状態を占有させるように誘導することができ、その際、酸化されたシステイン残基は、システインスルフェン酸残基、システインスルホン酸残基、またはＳ−ニトロシル化システイン残基の組合せでありうることは理解できるはずである。メチオニンをスイッチ制御リガンド配列の１部として持つキナーゼの例（但し、これに限定されない）を表１ａおよび１ｂに示す。システインをスイッチ制御リガンド配列の１部として持つキナーゼの例（但し、これに限定されない）を表２ａおよび２ｂに示す。メチオニンおよびシステインの両方をスイッチ制御リガンド配列の１部として持つキナーゼの例（但し、これに限定されない）を表３ａおよび３ｂに示す。メチオニンまたはシステインのいずれも、スイッチ制御リガンド配列の１部として持たないキナーゼの例（但し、これに限定されない）を表４に示す。
【００３０】
【表１】
2009503440.tif 000006
【００３１】
【表２】
2009503440.tif 000007
【００３２】
【表３】
2009503440.tif 000008
【００３３】
【表４】
2009503440.tif 000009
【００３４】
【表５】
2009503440.tif 000010
【００３５】
【表６】
2009503440.tif 000011
【００３６】
【表７】
2009503440.tif 000012
【００３７】
スイッチ制御リガンド１０６のアミノ酸残基を修飾する更に別の型としては、タンパク質のコンホメーション状態の変化を介在させる機能を持たない野生型アミノ酸残基を、突然変異させて、タンパク質のコンホメーション状態の変化を介在させる機能を持つアミノ酸残基に変えるゲノム突然変異がある。このように突然変異した残基はスイッチリガンド配列の修飾されたアミノ酸と呼ばれ、永久である。例えば、下記式は、リガンド配列の修飾されたアミノ酸残基ではないＶａｌｉｎｅアミノ酸残基５９９が突然変異して、グルタミン酸残基５９９になり、永久的に修飾されたアミノ酸残基（野生型残基Ｖａｌｉｎｅ５９９と比較すると）としてＢｒａｆキナーゼのスイッチ機構を起動する機能を持つようになった野生型Ｂｒａｆキナーゼの例を表す。
【００３８】
【化５】
2009503440.tif 000013
【００３９】
図１〜４はタンパク質が別個のポケット１０２および１０４、およびリガンド１０６を示す単純な状態を図示したものである。しかし、多くの場合はより複雑なスイッチ制御ポケットパターンが見られる。図６は、リガンド１０６と、例としてポケット１０２との両方から得られるアミノ酸残基から、小分子との相互作用に適当なポケットが形成された状態を図示したものである。このポケットを、リガンド１０６およびスイッチ制御ポケットの両方に由来する残基から形成した「複合型スイッチ制御ポケット」と称し、参照番号１２０で示す。ポケット１２０と相互に作用してタンパク質を調節する小分子１２２も図示する。なお、小分子１２２は複合型ポケットのコンホメーション制御残基Ｚの１部、または全部に結合することはいうまでもない。
【００４０】
図６ａは、小分子のスイッチ制御阻害物質と結合関係にある天然の哺乳動物のタンパク質キナーゼを示す模式図であり、図では小分子が、タンパク質キナーゼの複合型スイッチ制御ポケット１２０上のコンホメーション制御Ｚ残基に結合している。このオンの複合型スイッチ制御ポケット１２０はオンのスイッチ制御ポケット１０２由来のアミノ酸残基およびスイッチ制御リガンド１０６のＮ末端領域１０６ａ由来のアミノ酸残基から形成される。小分子はスイッチ制御ポケット１０２のＺ基と結合接触を生じる。また、この阻害物質はスイッチ制御リガンドのＮ末端領域１０６ａ由来のＺ基と選択的に結合接触を生じる。ポケット１０２およびＮ末端領域１０６ａ由来の他のアミノ酸はこの複合型スイッチ制御ポケットに貢献しうる。小分子がこのオンの複合型スイッチ制御ポケットに結合すると、スイッチ制御リガンド１０６のＣ末端領域１０６ｂがオフのスイッチ制御ポケット１０４に移動する。小分子がオンの複合型スイッチ制御ポケットへ結合し、同時に、Ｃ末端領域１０６ｂがオフのスイッチ制御ポケット１０４に移動することにより、タンパク質キナーゼの生物学的活性の機能をダウン・レギュレートする。具体的には、１）ＡＴＰコファクタポケットがＮ末端領域１０６ａの１以上のアミノ酸残基によって閉塞され；２）スイッチ制御リガンド１０６の全体がタンパク質キナーゼのタンパク質基質結合ポケットを閉塞し；３）１０６ａのＤＦＧモチーフ由来のアスパラギン酸と、触媒ループ由来のヒスチジン、アスパラギン酸、およびアスパラギンアミノ酸の組合せと含む触媒アミノ酸残基が誘導され、触媒的にダウン・レギュレートされたコンホメーションをとる。更に、小分子のスイッチ制御阻害物質がタンパク質キナーゼに結合することにより、タンパク質コンホメーションの変化を誘導し、二量化またはオリゴマー化、細胞内輸送、あるいは他のタンパク質との信号伝達複合体へ関与などに関連するドメインの調節を行う。
【００４１】
他の例では、オンおよびオフのポケットのコンホメーション制御ＺまたはＸ残基の各々が、特定のタンパク質コンホメーションで、相互に結合可能であることがわかっている。例えば、ｐ３８アルファ−キナーゼを持つ実施例２９のスイッチ制御阻害物物質のＸ線共結晶構造では、阻害物質はＸコンホメーション制御残基チロジン−３５に接触（結合）する。また、チロジン−３５はオンの制御ポケット由来のＺ基であるアルギニン−６７にも結合する。このｐ３８アルファ−キナーゼのオフのコンホメーション状態では、Ｚコンホメーション制御残基のアルギニン−６７がＸコンホメーション制御残基のチロジン−３５と安定化相互作用を生じる。
【００４２】
さらに複雑なスイッチポケットを図７に示す。このポケットは、オン・ポケット１０２由来の残基と、ＡＴＰ部位１０８とを含み、「組合せ型スイッチ制御ポケット」と称するポケットを構成している。この組合せ型のポケットを、番号１２４で示す。このポケットは、リガンド１０６由来の残基をさらに含むものとすることができる。このポケット１２４と相互に作用してタンパク質を調節する適当な小分子１２６も図示する。
【００４３】
したがって、図１〜４に示すような単純なポケットの状況の場合には、小分子は、単純なポケット１０２または１０４と相互に作用するのに対し、図６および７に示すようなさらに複雑な状況では、相互作用を生じるポケットが、ポケット１２０または１２４の領域に存在することになることが理解されるはずである。このように、広義では、小分子は、各スイッチ制御ポケットの「領域」で相互作用を生じる。
【００４４】
また、本発明で有用なタンパク質は、タンパク質中にアミノ酸残基の第１、第２、および第３の各配列を有するものであるとも考えることができる。残基の第１配列はリガンド１０６の１部を形成し、第１配列の残基は、通常は２つの異なるタンパク質コンホメーションに対応する２つの状態のいずれかにインビボ（一時的、または実質上永久的のいずれか）で個別に修飾可能である。このアミノ酸残基の第１配列は、第１配列が１方の状態にある場合は、残基の第２配列に結合可能であり、一方、第１配列が他方の状態にある場合は、残基の第３配列に結合可能である。このように、残基の第２および第３配列は上述のＺおよびＸ残基と同様であると考えることができる。
【００４５】
スイッチ制御リガンド配列（すなわち、第１配列）の修飾可能な残基は、集合として、または互いに個別に修飾することができる。具体的には、第１配列の残基全体を実質的に同時に２つの状態のどちらかに修飾することができ、あるいは他の例では、第１配列の特定の他の残基を第１配列の他の残基とは別に修飾することができる。第１配列の残基は、例えば、リン酸化、硫酸化、脂肪酸アシル化、グリコシル化、プレニル化、カルボキシル化、ニトロシル化、シスチニル化または酸化などの各種機構を介して修飾可能である。
【００４６】
タンパク質・モジュレータ・アダクトの場合は、モジュレータ分子は、第１、第２、または第３配列のアミノ酸残基の少なくとも１つに結合する。すなわち、モジュレータ分子は、第１（リガンド）配列の残基の１以上に、および／または第２配列および第３配列の残基の１以上に結合することができる。このような結合は、例えば、水素結合、疎水性結合、静電結合、イオン結合、ファンデルワース相互作用、またはロンドン分散力などの非共有可逆結合という性質を持つ結合である。また、特定の例では、これらの結合が、残基部分の除去によるアミノ酸残基の化学修飾を伴うことがあり、その際、一般には例えば、第１配列のアミノ酸残基がニトロシル化により修飾される、配列が結合する間にモジュレータ分子が残基からニトロシル基を除去する、などの状態の変化が起こる。下記式は、リガンド（第１配列）Ｓ−ニトロシルシステインアミノ酸残基からニトロシル基を除去する小分子モジュレータＲ−ＳＨを表す。
【００４７】
【化６】
2009503440.tif 000014
【００４８】
他の例では、第１配列の残基が酸化により修飾可能であり、小分子モジュレータが、結合シーケンス中、酸素ラジカルを付加することがある。下記式はこの現象を表す式であり、酸化状態の小分子モジュレータがリガンド配列（すなわち、第１配列）のメチオニンアミノ酸残基に接触し、そのメチオニンアミノ酸残基を化学修飾し、酸化状態にする現象を示す。この酸化・還元機構では小分子モジュレータはメチオニンアミノ酸残基の酸化プロセス中に還元される。
【００４９】
【化７】
2009503440.tif 000015
【００５０】
多くの場合、モジュレータ分子は第２および第３配列（または、上述のＺまたはＸ残基）の１以上の残基に結合する。この状態を実際のタンパク質・モジュレータ・アダクトにより説明できる。
【００５１】
例えば、タンパク質がｐ３８アルファ−キナーゼである場合、有効なモジュレータ分子は、Ｚ残基（第２配列）であるアルギニン７０および／またはアルギニン６７に結合し、好ましくはこの分子がこれらのアルギニンのいずれか、または両方のグアニジニル部分に結合する。また、この分子は、グルタミン酸７１、ロイシン７４、メチオニン７８、バリン８３、イソロイシン１４１、ヒスチジン１４８、フェニルアラニン１６９、リジン５３、イソロイシン８４、ロイシン１０４、およびトレオニン１０６からなる群から選択される少なくとも特定の残基に更に結合しうる。また別のケースでは、有用なモジュレータは、Ｘ残基（第３配列）のチロジン３５に結合し、その場合、アルギニン７０および／またはアルギニン６７、およびグルタミン酸７１、ロイシン７４、メチオニン７８、バリン８３、イソロイシン１４１、ヒスチジン１４８、フェニルアラニン１６９、リジン５３、イソロイシン８４、ロイシン１０４、およびトレオニン１０６から成る群から選択される少なくとも特定の残基に更に結合しうる。
【００５２】
タンパク質が野生型Ｂｒａｆキナーゼの場合は、有用なモジュレータ分子は、Ｚ残基（第２配列）であるアスパラギン４９９、リジン６００、およびアルギニン６０２の１以上に結合し、さらに、アラニン４９６、バリン５９９、グルタミン酸５００、フェニルアラミン５９４、リジン４８２、ロイシン５１３、イソロイシン５２６、トレオニン５２８、バリン５０３、ロイシン５０４、トレオニン５０７、イソロイシン５１２、ロイシン５６６およびヒスチジン５７３から成る群から選択される少なくとも特定の残基に結合しうる。
【００５３】
同様に、タンパク質が発癌性Ｖ５９９Ｅ  Ｂｒａｆキナーゼである場合は、有用なモジュレータ分子は、Ｚ残基（第２配列）のアスパラギン４９９、リジン６００、およびアルギニン６０２の１以上に結合する。また、有用なモジュレータは、さらに、突然変異したアミノ酸残基グルタミン酸５９９（第１配列の修飾されたアミノ酸）に結合しうる。このモジュレータは、さらに、アラニン４９６、グルタミン酸５００、フェニルアラミン５９４、リジン４８２、ロイシン５１３、イソロイシン５２６、トレオニン５２８、バリン５０３、ロイシン５０４、トレオニン５０７、イソロイシン５１２、ロイシン５６６およびヒスチジン５７３から成る群から選択される少なくとも特定の残基と結合しうる。
【００５４】
野生型のｃ−Ａｂｌキナーゼまたは発癌性Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼは、アルギニン４０５（Ｚ残基）および／またはグルタミン酸３０１（Ｘ残基）において本発明に係るモジュレータと結合することができる。さらに、グルタミン酸３０５、フェニルアラニン４０１、リジン２９０、バリン３１８、イソロイシン３３２、トレオニン３３４、バリン３０８、イソロイシン３１２、ロイシン３１７、ロイシン３７３、およびヒスチジン３８０において、タンパク質とこの分子が結合しうる。
図８および９は、インシュリン受容体のキナーゼドメインタンパク質のＸ線結晶構造解析によって得られたリボン図であり、図８は、オンのコンホメーション、すなわち生物学的にアップ・レギュレートされたコンホメーションのタンパク質を青で示す。この写真では、黄色のストランドは、スイッチ制御リガンドの配列、マゼンタの部分は、リガンド配列と相互に作用して、タンパク質を生物学的にアップ・レギュレートされたコンホメーションに保つ相補的なオンのスイッチ制御ポケットを形成する鍵残基を示す。一方、図９は、オフのコンホメーション、すなわち生物学的にダウン・レギュレートされたコンホメーションのタンパク質を、真鍮模擬色で示す。この図では、スイッチ制御配列を図８と同じく黄色で示し、オフのスイッチ制御ポケットの鍵残基は緑で示す。スイッチ制御リガンドとオフのスイッチ制御ポケットとの相互作用によって、タンパク質が、図示した生物学的にダウン・レギュレートされたコンホメーションに保たれる。
【００５５】
模式図についてさらに説明すると、図８の図は、リガンド１０６がポケット１０２と相互に作用する図４に対応する。同様に、図９は、リガンド１０６がポケット１０４と相互に作用する図２に対応する。
当業者は、特定のタンパク質が、リガンド１０６の修飾に基づき、つまり、リガンド１０６の修飾状態の状態変化が、タンパク質をオンのポケットコンホメーションへと導く傾向にあるのか、それともタンパク質をオフのポケットコンホメーションに導く傾向にあるのかにより、アップ・レギュレートされたコンホメーションとダウン・レギュレートされたコンホメーションとの間で経時的に「スイッチ」されることを、理解できるはずである。このように、スイッチ制御リガンドとスイッチ制御ポケットとの相互作用によって生じるコンホメーションの変化は、動的な性格をもつものであり、究極的には細胞内の状態によって支配されている。
【００５６】
また、タンパク質のコンホメーションに異常が生じると、病状が悪化する可能性があることも理解されるはずである。たとえば、所定のタンパク質が、オフのコンホメーション、すなわち生物学的にダウン・レギュレートされたコンホメーションのままとなってしまうと、活性のタンパク質が必要とされるような代謝プロセスが停止、遅滞したり、望ましくない副作用が生じる可能性がある。同様に、タンパク質が、オンのコンホメーション、すなわち生物学的にアップ・レギュレートされたコンホメーションのままとなってしまうと、代謝プロセスが促進されすぎて、その結果、健康上の重篤な問題が生じる場合もある。
【００５７】
しかし、タンパク質活性を調節して、正常なインビボのタンパク質の活性を復元または近似させうる小分子化合物を開発しうることを見出した。図５からわかるように、小分子１１６はオフのポケット１０４と相互に作用して、リガンド１０６のポケット１０４との相互作用を防止することができる。この場合、この簡略仮想図では、タンパク質１００は、オンのコンホメーション、すなわち生物学的にアップ・レギュレートされたコンホメーションのままでいる可能性が高くなる。あるいは、小分子１１８がオンのポケット１０２と相互作用することにより、リガンド１０６のポケット１０２との相互作用を防止することもできる。この場合、この簡略模式図では、リガンド１０６がオフのポケット１０４と相互作用して、タンパク質がオフのコンホメーションに移動する、すなわち生物学的にダウン・レギュレートされたコンホメーションとなる可能性が高くなる。
【００５８】
したがって、タンパク質を分析して、相互作用するスイッチ制御リガンドおよびスイッチ制御ポケットの位置および配列を確認し、同時に、これらがどのように相互作用してタンパク質が、生物学的にアップ・レギュレートされたコンホメーションと、ダウン・レギュレートされたコンホメーションの間でスイッチされるのかを理解することは、タンパク質の活性を調節しうる小分子化合物を設計・開発する際に使用できる強力な手段となる。
【００５９】
一般に、特定の天然タンパク質と相互に作用してタンパク質活性を調節する分子を識別する方法では、まず、タンパク質の一部を形成するスイッチ制御リガンドと、同じくタンパク質の一部を形成し、このリガンドと相互作用するスイッチ制御ポケットとを識別する。リガンドとポケットとは、協同して相互に作用して、タンパク質のコンホメーションおよび生物学的活性を調節し、その際には、タンパク質は、リガンドとポケットが相互作用すると、第一コンホメーションと対応する第一生物学的活性をとり、リガンドとポケットが相互作用しない場合には、第一コンホメーションとは異なる第二のコンホメーションおよび生物学的活性をとる。
【００６０】
次の工程では、第一および第二のコンホメーションのタンパク質の各サンプルを用意し、これらのタンパク質サンプルを使用して、候補小分子のスクリーニング・アッセイを行う。こうしたスクリーニングでは、一般に、候補分子を、サンプルの少なくとも１つと接触させ、どの小分子が、上記で識別したタンパク質のスイッチ制御ポケット領域と結合するかを識別する。
【００６１】
本発明の方法は、多岐にわたる天然の哺乳動物（たとえばヒト）のタンパク質、たとえば野生型のコンセンサスタンパク質、疾病の多形、疾病の融合タンパク質、および／または人工的に操作した改変タンパク質に適用することができる。適用可能なタンパク質の分類群としては、酵素、受容体、シグナル伝達タンパク質を挙げることができ、具体的には、キナーゼ、ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ、プロテアーゼ、スルホトランスフェラーゼ、スルファターゼ、転写因子、核ホルモン受容体、Ｇタンパク質結合受容体、Ｇタンパク質、ＧＴＰアーゼ、ホルモン、ポリメラーゼ、およびヌクレオチド調節部位を含む他のタンパク質を挙げることができる。大抵の場合、対象タンパク質の分子量は少なくとも約１５ｋＤａ、より一般には、約３０ｋＤａを超えるものである。
【００６２】
本発明の方法の過程では、数多くの技法を用いて、１以上のスイッチ制御リガンド配列および１以上のスイッチ制御ポケットを識別し、候補小分子モジュレータの上方およびダウン・レギュレートを判定することができる。一般に、こうした方法としては、生物情報学的分析、Ｘ線結晶構造解析、磁気共鳴スペクトロスコピー（ＮＭＲ）、円偏光二色性（ＣＤ）、およびアフィニティ系のスクリーニングを挙げることができる。また、全くの通常技術、たとえば、部位特異的突然変異誘発および標準的な生化学実験法も役立つはずである。
【００６３】
生物情報学的分析を実施すると、実験を行うことなく、関連したリガンドおよびポケットを識別することが可能である。たとえば、関連タンパク質に関するデータは、場合によっては、利用可能なデータベース、たとえばＰＵＢＭＥＤの使用のみによっても評価することができる。したがって、最初の工程では、配列情報ＰＵＢＭＥＤを、対象タンパク質の公知の構造について調べる。次に、ＢＬＡＳＴ検索を行って、選択した最小ストリンジェンシー（たとえば、６０％以上）を含む他の配列を確認することができる。この検索によって、対象点突然変異または多形、ならびに異常融合タンパク質が明らかとなる可能性がある。これらの検索対象は、いずれも、疾患の原因となりうるものであり、疾患の原因となる機能性または機能障害性のスイッチ制御リガンド配列および／またはポケットの識別についての洞察が得られる可能性がある。こうした生物情報学的分析の具体例については、実施例Ａで後述する。
【００６４】
Ｘ線結晶構造解析法では、まず、精製されたタンパク質が得られるタンパク質発現法が必要である。全遺伝子を合成する技術を使用して、使用する特定の発現系に対して最適化したタンパク質遺伝子を化学的に合成することもできる。通常技術を用いて、合成オリゴヌクレオチドから任意の遺伝子を迅速に合成することができる。ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｂｕｉｌｄｅｒ（登録商標））と付随する分子生物学的方法を用いると、任意の遺伝子を合成することができる。全遺伝子を合成する方が、最適な発現にむけて、コドンを最適化した遺伝子を迅速に合成できるので、伝統的なクローニング法より有利である。また、複雑な突然変異（たとえば、多くの異なった変異の組合せによるもの）を、複数工程でなく１工程で生成することも可能である。制限部位を戦略的に配置すると、必要に応じて、突然変異を迅速に付加することができる。したがって、この技術を用いると、より短時間に、はるかに多くの遺伝子構築物を生成できる。タンパク質配列の選択は、系統分析、分子モデリングおよび構造予測、公知の発現、機能的なデータ・スクリーニング、報告済みの文献データの組合せを用いて判断して、タンパク質製造戦略を開発する。発現構築物を市販のベクターを用いて製造して、タンパク質を、バキュロウイルスに感染させた昆虫細胞で発現させることができる。大腸菌の発現系を使用して、他のタンパク質を製造することもできる。遺伝子は、アフィニティ・タグを付加することによって修飾することもできる。遺伝子は、欠失、点突然変異、タンパク質の融合を生成することによって修飾して、発現を改善したり、精製の便宜をはかったり、結晶化を促進したりすることもできる。
【００６５】
タンパク質の精製：  発現実験で得られた全細胞のペーストを、窒素キャビテーション、フレンチプレス、ミクロ流動化のうち、可溶性のタンパク質を得るうえで最も効果的な方法で破砕する。抽出物のタンパク質精製を、複数のカラム（Ｇｌｕ−ｍＡｂ、ｍｅｔａｌ  ｃｈｅｌａｔｅ、Ｑ−ｓｅｐｈ、Ｓ−Ｓｅｐｈ、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈ、およびＣｉｂａｃｒｏｎ  Ｂｌｕｅを含む複数のカラム）を標準的な手順で並行して走らせるロボット装置を使用してパラレルに実施し、各分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。この情報を、公開されている精製プロトコールと組合わせて、精製プロトコールを迅速に開発する。精製を終了したら、タンパク質を、複数の生物物理学的アッセイ（動的光散乱、紫外線吸収、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、分析用ゲル濾過、等）に供する。
【００６６】
結晶の成長とＸ線による品質分析：  スパース行列および集束結晶化スクリーンを、リガンド有りと無しの場合について２以上の温度で用意する。リガンド無しで得た結晶（アポ結晶）をリガンド含浸実験に用いる。結晶の成長状態を、最初の結果にもとづいて、タンパク質結晶に対して最適化する。適当なタンパク質結晶が得られたら、スクリーニングを行って、各種の凍結保存状態について、Ｒ−ＡＸＩＳ  ＩＶイメージングプレート装置およびＸ−ＳＴＲＥＡＭクリオスタットで、回折能を測定する。回折能のよいタンパク質結晶を、Ｘ線回折データの収集に使用するか、液体窒素中でその後のシンクロトロンＸ線放射源でのデータ収集用に保存する。タンパク質結晶の回折限界を、少なくとも２回回折画像を、９０°の間隔をおいたφスピンドルで撮影することによって決定する。回折画像を収集する間は、φスピンドルを１°揺動する。双方の画像を、Ｘ線データ解析のＨＫＬ−２０００スイートと分解ソフトウェアで処理する。タンパク質結晶の回折解像度は、インデクシングした反射の５０％以上が１シグマ以上の強さを有する解像シェルの高い側の解像限界として受け取る。
【００６７】
Ｘ線回折データの収集：  タンパク質結晶が、Ｒ−ＡＸＩＳ  ＩＶシステムまたはシンクロトロンで３．０Å以上の回折を示すことがわかった場合には、完全なデータセットをシンクロトロンで収集する。ここで、完全なデータセットとは、解像度が最大のシェルでの全ての反射の９０％以上を収集した場合として定義するものである。Ｘ線回折データは、Ｘ線回折データ処理用のソフトウェアのＨＫＬ−２０００スイートを使用して処理する（固有反射と強度に分解する）。
【００６８】
構造の決定：  タンパク質の構造を、１以上のタンパク質検索モデルを利用した分子置換（ＭＲ）で決定する。このＭＲ法では、タンパク質データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ、ＰＤＢ）から入手可能なタンパク質の座標セットを使用する。必要に応じて、構造の決定は、重原子を用いた多重重原子同型置換法（ＭＩＲ）および／または多波長異常分散（ＭＡＤ）法で行う。結晶（重原子を含まない母液または凍結保護物質で洗浄後のもの）のＥＸＡＦＳスキャンで適当な重原子シグナルが得られた場合には、重原子を含浸させた結晶についてのＭＡＤシンクロトロンのデータセットを集める。誘導化のための重原子のデータセットの解析は、計算プログラムのＣＣＰ４結晶構造解析スイートを使用して行うことができる。重原子の部位を、（│ＦＰＨ│−│ＦＰ│）２の差のパターソンおよび（│Ｆ＋│−│Ｆ−│）２の異常差パターソン図で識別する。
【００６９】
スイッチ制御リガンド配列およびポケットの識別に際しては、強磁場核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光分析法を使用することもできる。ＮＭＲを用いた研究で、タンパク質、特にタンパク質キナーゼの構造を解明できることが報告されている。（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，Ｋ；“ＮＭＲ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ”  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：１９８６、Ｅｖａｎｓ，Ｊ．Ｎ．Ｓ．，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｍｒ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９９５、Ｃａｖａｎａｇｈ，Ｊ．ら，Ｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｎｍｒ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：１９９６．、Ｋｒｉｓｈｎａ，Ｎ．Ｒ．；Ｂｅｒｌｉｎｅｒ，Ｌ．Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｎｍｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，２０），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂ  Ｃｏｒｐ：２００３。
【００７０】
この２０年間で、ＮＭＲは、タンパク質の構造を解明し、タンパク質と他の生体分子との相互作用を探り、小分子とタンパク質の相互作用の詳細を明らかにするうえで強力な技法に育ってきた。ＮＭＲ法は、Ｘ線結晶構造解析法と相補的であり、これらの２つの技法を組合わせると、タンパク質と小分子の相互作用がどのようなものなのかを明らかとするうえで強力な戦略を立てることが可能となる。特に有用なＮＭＲ法は、１５Ｎおよび／または１３Ｃ標識タンパク質を調製し、このタンパク質のスイッチ制御リガンド配列のスイッチ制御ポケットとの相互作用、または小分子モジュレータのスイッチ制御ポケット領域との相互作用にともなって生じるタンパク質のコンホメーション変化時の化学シフトの動揺を分析するものである。
【００７１】
ＮＭＲ法による化学シフトの動揺の分析は、スイッチ制御阻害物質がキナーゼのスイッチ制御領域に結合する際のダイナミクスを解明するうえで強力な技法となる。このアプローチについては、主要な文献に詳しく記載されており、また、小分子とタンパク質基質の相互作用を探るうえの有用なツールとして受け入れられている（Ｐｅｌｌｅｃｃｈｉａ  Ｍ，  Ｓｅｍ  ＤＳ５  Ｗｕｔｈｒｉｃｈ  Ｋ．“  ＮＭＲ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ”，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２００２  Ｍａｒ；ｌ（３）：２１１−９  およびその中の引用文献を参照されたい）。原理は、主要文献に既に記載されたものに準じるものであり、リガンドによって誘導され、リガンドと直接相互に作用するタンパク質の骨格および側鎖の１Ｈ、１３Ｃおよび１５Ｎ共鳴の化学シフトに変化を起こすタンパク質の局所的磁気環境の変化に依存するものである。これらの分析には、小型のタンパク質（２０ｋＤ未満）の場合は均一に標識され、または大型のタンパク質（２０ｋＤ超）の場合は個別に標識された、１５Ｎおよび１５Ｎ／１３Ｃ標識タンパク質が必要であることは理解されるはずである。
【００７２】
分子量が２０ｋＤ未満であるタンパク質基質の場合は、当業者であればＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ＴＯＣＳＹ／ＨＯＨＡＨＡ、ＨＳＱＣ、ＨＮＣＡ、ＨＮＣＯＣＡ、およびＮＣＯＣＡＣＢ（但しこれに限定されない）などの最近のＮＭＲパルスシーケンスを用いて、均一に同位体標識された目的のアポタンパク質（キナーゼなど）の１Ｈ、１３Ｃおよび１５Ｎの共鳴全てを帰属させるはずである（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ  Ｋ．  “Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ−  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：  ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ”，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １９８９；１７７：１２５−３１；  Ｗｕｔｈｒｉｃｈ  Ｋ．  “Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｂｙ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ”，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９９０  Ｄｅｃ  ２５；２６５（３６）：２２０５９−６２  およびその中の引用文献を参照されたい）。小分子モジュレータがタンパク質に結合すると、（１）リガンドとの直接接触および／または相互作用、および／または（２）リガンドとの結合時のアポタンパク質のコンホメーションの動き、によってその局所的な異方性が影響を受けるアミノ酸残基に関して１Ｈ、１３Ｃおよび１５Ｎの化学シフトに変化が観察されるはずである。後者は、キナーゼ中のＤＦＧモチーフのＰｈｅがＤＦＧ−「イン」コンホメーションからＤＦＧ−「アウト」コンホメーションへ動くことで示される。タンパク質の１５Ｎおよび１３Ｃに均一に同位体標識を行うには、当業者が標準として用いる最新の分子生物学技法を用いる。Ｚｈａｏ，  Ｑ；  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，  Ｒ；  Ｓｅｄｅｒ，  Ｋ；  Ｔｈａｏ，  Ｓ；  Ｓｒｅｅｎａｔｈ，  Ｈ；  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，  Ｆ；  Ｖｏｌｋｍａｎ，  Ｂ．  Ｆ．；  Ｍａｒｋｌｅｙ，  Ｊ．  Ｌ．；  Ｆｏｘ，  Ｂ．  Ｇ．  “Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｗｏ−ｌｉｔｅｒ  ｂｅｖｅｒａｇｅ  ｂｏｔｔｌｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ＮＭＲ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｉｔｈｅｒ  １５Ｎ−  ｏｒ  １３Ｃ−１５Ｎ．”  Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｆｕｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  ２００４；５（ｌ−２）：８７−９３  およびその中の引用文献を参照されたい。
【００７３】
分子量が２０ｋＤ超であるキナーゼなどのタンパク質の場合は、そのタンパク質内の１Ｈ、１３Ｃおよび１５Ｎ共鳴全部を直接帰属させることは困難である。その場合は、（１）リガンドの結合に直接関連する、および／または（２）リガンドに結合するとアポタンパク質に関連してコンホメーション変化を起こす、と識別された鍵残基について特定の標識を行う。タンパク質中の１以上の残基の特定の標識化は、次の方法のうちの１つを用いる。
ａ．  タンパク質中の特定のアミノ酸の全例を標識する方法。この方法は標識されたアミノ酸をインプットとして用い、バクテリア栄養要求体、または細胞フリーのインビトロ翻訳を介して行う。
ｂ．  インビボでの発現、またはインビトロでの翻訳のいずれかによるノンセンスコドン法を用いた単一アミノ酸の部位特定標識方法。Ｗａｎｇ，  Ｌ；  Ｂｒｏｃｋ，  Ａ；  Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，  Ｂ；  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｐ．  Ｇ．  “Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ”，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００１  Ａｐｒ  ２０；２９２（５５１６）：４９８−５００  およびその中の引用文献を参照されたい。
ｃ．  インビボでの発現と、ペプチドとタンパク質との合成に用いるインテイン技術との組合せによる１以上の残基の半合成または外因的標識。Ｈｏｎｄａｌ，  Ｒ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｒａｉｎｅｓ，  Ｒ．  Ｔ．  “Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  （２００２）  ３４７：７０−８３；  Ｈｏｎｄａｌ，  Ｒ．  １；  Ｎｉｌｓｓｏｎ，  Ｂ．  Ｌ．；ｌ  Ｒａｉｎｅｓ，  Ｒ．  Ｔ．  “Ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｉｎ  ｎａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇａｔｉｏｎ”，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  （２００１）  １２３（２１）：５１４０−ｌ；  Ｎｉｌｓｓｏｎ，  Ｂ．  Ｌ．；  Ｓｏｅｌｌｎｅｒ，  Ｍ．  Ｂ．；  Ｒａｉｎｅｓ，  Ｒ．  Ｔ．  “Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．  ２００４．  Ｋｉｉｃｋ，  Ｋ．  Ｌ．；  Ｓａｘｏｎ，  Ｅ；  Ｔｉｒｒｅｌｌ，  Ｄ．  Ａ．；  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，  Ｃ．  Ｒ．  “Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｚｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ．”，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２００２  Ｊａｎ  ８；９９（１）：  １９−２４を参照されたい。
【００７４】
このアプローチはＢｒａｆキナーゼを用いて説明される。配列番号４５を持つ発癌性Ｖ５９９Ｅ  Ｂｒａｆキナーゼ（ＭＷ＝３１ｋＤ）の合成は、キナーゼのＮおよびＣ末端のインビボでの発現と、それを、半合成法を用いて特定の１３Ｃ／１５Ｎ残基に結合することとを組み合わせることによって達成し、全長のキナーゼの合成を完成する。酵素の能力は生化学アッセイによって検証する。
【００７５】
配列番号４６および配列番号４７を持つ、２種類の個別に同位体標識したキナーゼを半合成アプローチで半合成することより、構成的に活性化された、上述のＳＦ−２１セルで発現したアポ配列と同様の挙動を持つ生化学的に有用な酵素を生成する。
【００７６】
実施例６４の尿素成分と強力な結合接触を生じる鍵残基であるという理由で、第１の標識Ｂｒａｆキナーゼ（１５Ｎ／１３Ｃ標識グルタミン酸５００、配列番号４６）が選択される。実施例６４の結合時に発癌性Ｂｒａｆキナーゼ（配列番号４６）のＥ５００の１Ｈ、１５Ｎおよび１３Ｃの化学シフトに変化が観察される。１５Ｎフィルタリングを用いて、小分子リガンドに結合する際の１Ｈの化学シフトの変化を示す。これによって、実施例６４の存在下で鍵結合残基の化学シフトの変化が観察されることが示される。
【００７７】
阻害物質の結合時のタンパク質のコンホメーションの変化の様子を示すために、第２のＢｒａｆキナーゼ（１５Ｎ／１３Ｃ標識フェニルアラニン５９４、配列番号４７）が選択される。実施例６４の結合時にＢｒａｆキナーゼ（配列番号４７）のＦ５９４の１Ｈ、１５Ｎおよび１３Ｃの化学シフトに変化が観察される。１５Ｎフィルタリングを用いて、小分子リガンドに結合する際の１Ｈの化学シフトの変化を示す。これによって、実施例６４の存在下で鍵結合残基の化学シフトの変化が観察されることが示される。
【００７８】
円偏光二色性（ＣＤ）は、タンパク質のコンホメーションを調べるのに適した技法であり（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｗ．Ｃ．，Ｊｒ．；Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｖａｃｕｕｍ  ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ｒｅｇｉｏｎ；Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．（１９７８）  ２９：９３、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｗ．Ｃ．，Ｊｒ．；Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ：  Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｇｕｉｄｅ”  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒ．Ｆｕｎｃ．Ｇｅｎ．（１９９０）  ７：２０５、Ｗｏｏｄｙ，Ｒ．Ｗ．“Ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ”（Ｃｈａｐｔｅｒ  ２）  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ７，１９８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｅｒｏｖａ，Ｎ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．，Ｗｏｏｄｙ，Ｒ．Ｗ．，Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００、Ｓｃｈｍｉｄ，Ｆ．Ｘ．；Ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  １９８９）、特に、タンパク質キナーゼのコンホメーションの変化を調べるうえでの円偏光二色性の利用も報告されている（Ｂｏｓｃａ，Ｌ．；Ｍｏｒａｎ，Ｆ．；Ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｓｏｌ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ．（１９９３）  ２９０：８２７、Ｏｋｉｓｈｉｏ，Ｎ．；Ｔａｎａｋａ，Ｔ．；Ｆｕｋｕｄａ，Ｒ．；Ｎａｇａｉ，Ｍ．；Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｓｒｃ  ａｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−Ｋｉｎａｓｅ  Ｓｒｃ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ３  Ｄｏｍａｉｎｓ：  Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  ａｎｄ  Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｒａｍａｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００３）  ４２：  ２０８、Ｄｅｎｇ，Ｚ．；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．；Ｗａｎｇ，Ｘ．；Ｋｅｍｐ，Ｒ．Ｇ．；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏ−１−ｋｉｎａｓｅ  ｏｆ  Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．（１９９９）  ３７１：  ３２６；、Ｒｅｅｄ，Ｊ；Ｋｉｎｚｅｌ，Ｖ；Ｋ���ｍｐ，Ｂ．Ｅ．；Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．Ｃ．；Ｗａｌｓｈ，Ｄ．Ａ．；Ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｃ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａｎ  ｏｒｄｅｒｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ／ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８５）  ２４：  ２９６７、Ｏｋｉｓｈｉｏ，Ｎ．；Ｔａｎａｋａ，Ｔ．；Ｎａｇａｉ，Ｍ．；Ｆｕｋｕｄａ，Ｒ．；Ｎａｇａｔｏｍｏ，Ｓ．；Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｔ．；Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−Ｋｉｎａｓｅ  Ｓｒｃ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ３  Ｄｏｍａｉｎ：  Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  ａｎｄ  ＵＶ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｒａｍａｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１）  ４０：  １５７９７、Ｏｋｉｓｈｉｏ，Ｎ．；Ｔａｎａｋａ，Ｔ．；Ｆｕｋｕｄａ，Ｒ．；Ｎａｇａｉ，Ｍ．；Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ａｃｉｄｉｃ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  Ａｓｐ２１  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−Ｋｉｎａｓｅ  Ｓｒｃ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ３  Ｄｏｍａｉｎ：  Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｓｔｕｄｉｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１）  ４０：  １１９、Ｍａｔｔｓｓｏｎ，Ｐ．Ｔ．；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ，Ｉ．；Ｂａｃｋｅｓｊｏ，Ｃ．−Ｍ．；Ｂｒｏｃｋｍａｎｎ，Ｅ．；Ｌａｕｒｅｎ，Ｓ．；Ｖｉｈｉｎｅｎ，Ｍ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｉ．Ｅ．；“Ｓｉｘ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ａｇａｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ−ｃａｕｓｉｎｇ  ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ２  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｂｒｕｔｏｎ’ｓ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ：  ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ．”  Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．（２０００）  １６４：  ４１７０、Ｒａｉｍｂａｕｌｔ，Ｃ．；Ｃｏｕｔｈｏｎ，Ｆ．；Ｖｉａｌ，Ｃ．；Ｂｕｃｈｅｔ，Ｒ．；“Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐＨ  ａｎｄ  ＫＣｌ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｕｓｃｌｅ．  Ｉｎｆｒａｒｅｄ，ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｃ，ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ．”  Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５）  ２３４：  ５７０、Ｓｈａｈ，Ｊ．；Ｓｈｉｐｌｅｙ，Ｇ．Ｇ．；Ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９９２）  １１１９：  １９）。
【００７９】
キナーゼの活性化（アップ・レギュレート）に際して生じる、ダウン・レギュレート状態の場合よりはっきりとしたヘリックスの組織化およびコンホメーションの変化については、ＣＤによって観察することができる。スイッチ制御ポケットに基づく小分子による調節が生じる結果、優勢なコンホメーション状態が安定化する可能性がある。小分子モジュレータの存在下で得られたＣＤスペクトルと、モジュレータの不在下で得られたＣＤスペクトルの相関を調べると、小分子の結合の性質を判定し、そうした結合を通常のＡＴＰ拮抗阻害物質の結合と区別することができる。
【００８０】
各種の生物分析法によって、小分子のタンパク質に対する結合アフィニティを測定することができる。候補の小分子モジュレータをスクリーニングする早期の段階では、キャピラリー電気泳動（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｚｏｎｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、ＣＺＥ）を利用するアフィニティ系のスクリーニング法を用いることができる。小分子モジュレータとタンパク質の相互作用についてのＫｄｓ（解離定数）を直接測定することもできる。（Ｈｅｅｇａａｒｄ，Ｎ．Ｈ．Ｈ．；Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｓ．；Ｇｕｚｍａｎ，Ｎ．Ａ．；Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｒｅａｓ  ａｎｄ  ｓｏｍｅ  ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ；Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ（１９９８）７１５：  ２９−５４、  Ｙｅｎ−Ｈｏ  Ｃｈｕ，Ｙ．  −Ｈ．；Ｌｅｅｓ，Ｗ．Ｊ．；Ｓｔａｓｓｉｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．；Ｗａｌｓｈ，Ｃ．Ｔ．；Ｕｓｉｎｇ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｔｏ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９４）  ３３：  １０６１６−１０６２１、Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｇ．；Ａｎｄｅｒｅｇｇ  Ｒ．Ｊ．；Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｓ．Ｇ．，Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｔｏ  ｅｎｒｉｃｈ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｉｇｈｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９９）  ５５：  １１６５３−１１６６、Ｓｈｅｎ  Ｈｕ，Ｓ．；Ｄｏｖｉｃｈｉ，Ｎ．Ｊ．；Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ；Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．（２００２）  ７４：  ２８３３−２８５０、Ｈｏｎｄａ，Ｓ．；Ｔａｇａ，Ａ．；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓ．；Ｋａｋｈｉ，Ｋ．，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｏｆ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ｍｏｄｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｕｇａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｚｏｎｅ  ｅｌｅｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ（１９９２）  ５９７：  ３７７−３８２、Ｃｏｌｔｏｎ，Ｉ．Ｊ．；Ｃａｒｂｅｃｋ，Ｊ．Ｄ．；Ｒａｏ，Ｊ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．，Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：  Ａ  ｐｈｙｓｉｃａｌ−ｏｒｇａｎｉｃ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（１９９８）  １９：  ３６７−３８２。
【００８１】
別のアフィニティ系のスクリーニング法では、候補タンパク質と結合する蛍光プローブ・レポータを利用する。候補である小分子モジュレータを、この蛍光プローブアッセイでスクリーニングする。タンパク質と結合する化合物を、蛍光プローブ・レポータの蛍光の調節によって測定する。この方法については、以下の実施例Ｃで報告する。
【００８２】
本発明は、小分子モジュレータとタンパク質のアダクトも提供する。タンパク質は、上述したタイプのものとする。モジュレータに関しては、モジュレータは、モジュレータとタンパク質の結合を最大限促進するために、スイッチ制御ポケット領域内の活性残基と相補的な官能基を有する必要がある。たとえば、各種キナーゼの場合には、１〜３のジカルボニル結合を有するモジュレータが有用であることが多いことがわかった。陽イオン性のスイッチ制御ポケットが見いだされた場合には、小分子モジュレータは、酸性の官能基または部分、たとえばスルホン基、ホスホン基、カルボキシル基を有するものとすることが多い。分子量に関しては、好適なモジュレータは、通常、分子量が約１２０−６５０Ｄａ、より好ましくは約３００〜５５０Ｄａである。これらの小分子モジュレータを全細胞環境で調べる場合には、小分子モジュレータの特性が、小分子モジュレータの細胞浸透性を最適化する周知の原理に適合する必要がある（Ｌｉｐｉｎｓｋｉ’ｓ  Ｒｕｌｅ  ｏｆ  ５，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．２３，Ｉｓｓｕｅｓ  １−３，ｐｐ３−２５（１９９７））。
【００８３】
本発明は、タンパク質の生物学的活性を変更する方法も提供するものであり、この方法では、一般に、まず、スイッチ制御ポケットを備えた天然タンパク質を用意する。次に、このタンパク質を、非天然分子のモジュレータと、このモジュレータがタンパク質のポケット領域に結合するような条件で接触させて、タンパク質のコンホメーションの誘導または制限により、少なくとも部分的にタンパク質の生物学的活性を調節する。
【００８４】
以下の実施例は、本発明の代表的な方法について説明するものである。しかし、これらの実施例は、例示を目的としてここに記載するものであって、実施例中の何らかの記載をもって、本発明全体の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００８５】
（実施例Ａ）
以下の工程１−３では、天然タンパク質の生体内での生物学的活性を調節するために、該タンパク質の一部を形成するスイッチ制御ポケットの領域と相互作用する小分子を同定および／または開発する技術を説明する。具体的には、本発明の方法を用いて、８つの公知のキナーゼタンパク質ファミリーすなわち、Ａｂｌ、ｐ３８−α、野生型Ｂｒａｆ、発癌性Ｖ５９９Ｅ  Ｂｒａｆ、Ｇｓｋ−３β、インスリン受容体−１、タンパク質キナーゼＢ／Ａｋｔ、およびトランスフォーミング成長因子Ｂ−Ｉ受容体キナーゼが分析される。これら実施例は上記技術を説明するものであって、本願をそれらに限定することを意図するものではない。
【００８６】
工程１：８つのキナーゼタンパク質内のスイッチ制御リガンドの同定と分類
一般に、上記キナーゼのスイッチ制御リガンドは、その種類について十分詳細な情報があれば、各キナーゼ由来の配列および構造データの利用により同定することができる。したがって、本法のこの工程は実験なしでも成し遂げることができる。上記キナーゼに関する公知のデータにより、そのタンパク質をリン酸化、アシル化、メチオニンもしくはシステインの酸化、システインのＳ−ニトロシル化、またはシスチン化により修飾する際の修飾可能なアミノ酸残基は直ちに同定可能である。次いで、スイッチ制御リガンドの全配列の推定範囲を推測することができる。上記キナーゼの場合に有用な補足的要素は、多くのリガンドがしばしばＤＦＧ配列の残基で始まり、ＡＰＥ配列の残基で終わることである（本明細書では、一文字アミノ酸コードを使用する）。
【００８７】
ｃ−ＡｂｌキナーゼまたはＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼ
全長ヒトｃ−Ａｂｌアイソフォーム１−Ｂ配列を、本明細書での配列番号２９として示す。全長Ｂｃｒ−Ａｂｌ配列を、本明細書での配列番号３３として示す。Ａｂｌキナーゼおよびｂｃｒ−ａｂｌ融合タンパク質キナーゼのスイッチ制御リガンド配列の１つは、次の配列で構成される：Ｄ４００，Ｆ４０１，Ｇ４０２、Ｌ４０３，Ｓ４０４，Ｒ４０５，Ｌ４０６，Ｍ４０７，Ｔ４０８，Ｇ４０９，Ｄ４１０，Ｔ４１１，Ｙ４１２，Ｔ４１３，Ａ４１４，Ｈ４１５（リガンド１，ｃ−Ａｂｌアイソフォーム１−Ｂ配列の付与番号）（配列番号１）。Ｙ４１２は、上流の調節キナーゼによる（ｂｃｒ）Ａｂｌ活性化にしたがい、または自己リン酸化により、リン酸化を生じる、つまり過渡的に修飾される残基である（タニス（Tanis）ら、Molecular and Cellular Biology（２００３）２３：３８８４；ブラッシャー（Brasher）およびファンエッテン（Van Etten），The Journal of Biological Chemistry（２０００）２７５：３５６３１）。そのスイッチ制御リガンド配列は、ＤＦＧで始まりＥ４２８で終わる。
【００８８】
別のスイッチ制御リガンドは、配列Ｍｙｒ−Ｇ２，Ｑ３，Ｑ４，Ｐ５，Ｇ６，Ｋ７，Ｖ８，Ｌ９，Ｇ１０，Ｄ１１，Ｑ１２，Ｒ１３，Ｒ１４，Ｐ１５，Ｓ１６，Ｌ１７（リガンド２，ヒトｃ−Ａｂｌアイソフォーム１−Ｂ配列の付与番号）（配列番号２）を有する。リガンド２は、ａｂｌキナーゼアイソフォーム１Ｂに特異的で、Ａｂｌタンパク質配列のＮ末端封鎖であり、具体的には、Ｇ２（グリシン２）上についているＮ末端ミリストリル基は修飾アミノ酸残基である（ジャクソン（Jackson）およびバルチモア（Baltimore），（１９８９）ＥＭＢＯ Journal ８：４４９； レッシュ（Resh），Biochem Biophys. Acta（１９９９）１４５１：１）。
【００８９】
ｐ３８−αキナーゼ
ｐ３８−αキナーゼ（配列番号３）のスイッチ制御リガンド配列は、次の配列で構成される：Ｄ１６８，Ｆ１６９，Ｇ１７０，Ｌ１７１，Ａ１７２，Ｒ１７３，Ｈ１７４，Ｔ１７５，Ｄ１７６，Ｄ１７７，Ｅ１７８，Ｍ１７９，Ｔ１８０，Ｇ１８１，Ｙ１８２，Ｖ１８３，Ａ１８４，Ｔ１８５，Ｒ１８６，Ｗ１８７，Ｙ１８８，Ｒ１８９（配列番号４）。Ｔ１８０およびＹ１８２は、上流の調節キナーゼによるｐ３８−α活性化にしたがいリン酸化を生じる（ウィルソン（Wilson）ら，Chemistry & Biology（１９９７）４：４２３ならびにそこでの参考文献参照）、つまり過渡的に修飾可能な残基である。
【００９０】
Ｂｒａｆキナーゼ
全長Ｂｒａｆキナーゼ（配列番号４０）のスイッチ制御リガンド配列は、次の配列で構成される：Ｄ５９３，Ｆ５９４，Ｇ５９５，Ｌ５９６，Ａ５９７，Ｔ５９８，Ｖ５９９，Ｋ６００，Ｓ６０１，Ｒ６０２，Ｗ６０３，Ｓ６０４，Ｇ６０５，Ｓ６０６，Ｈ６０７，Ｑ６０８，Ｆ６０９，Ｅ６１０，Ｑ６１１，Ｌ６１２，Ｓ６１３，Ｇ６１４，Ｓ６１５，Ｉ６１６，Ｌ６１７，Ｗ６１８，Ｍ６１９，Ａ６２０，Ｐ６２１，Ｅ６２２（配列番号４１）Ｔ５９８およびＳ６０１は、上流の調節キナーゼによるＢｒａｆ活性化にしたがいリン酸化を生じる、つまり過渡的に修飾可能な残基である。
【００９１】
発癌性Ｖ５９９Ｅ  Ｂｒａｆキナーゼ
全長発癌性Ｖ５９９Ｅ  Ｂｒａｆキナーゼ（配列番号４２）のスイッチ制御リガンド配列は、次の配列で構成される：Ｄ５９３，Ｆ５９４，Ｇ５９５，Ｌ５９６，Ａ５９７，Ｔ５９８，Ｅ５９９，Ｋ６００，Ｓ６０１，Ｒ６０２，Ｗ６０３，Ｓ６０４，Ｇ６０５，Ｓ６０６，Ｈ６０７，Ｑ６０８，Ｆ６０９，Ｅ６１０，Ｑ６１１，Ｌ６１２，Ｓ６１３，Ｇ６１４，Ｓ６１５，Ｉ６１６，Ｌ６１７，Ｗ６１８，Ｍ６１９，Ａ６２０，Ｐ６２１，Ｅ６２２（配列番号４３）Ｖ５９９は、Ｅ５９９残基に突然変異し,この変異したＥ５９９は、Ｔ５９８およびＳ６０１のリン酸化とは無関係に、スイッチ制御リガンドを活性化させる修飾可能な残基として機能する。つまり、Ｖ５９９Ｅは構成的に活性化されるキナーゼであり、ここではＥ５９９がＴ５９８および／またはＳ６０１のリン酸化を擬似する代理の酸として機能し、Ｂｒａｆキナーゼのスイッチ制御機構を活性化させる。
【００９２】
Ｇｓｋ−３βキナーゼ
全長Ｇｓｋ−３βキナーゼ配列を、本明細書での配列番号３１として示す。
１ＧＮＧ結晶構造に対応するＧｓｋ−３βキナーゼ配列を、本明細書での配列番号１５として示す。Ｇｓｋ−３βキナーゼタンパク質のスイッチ制御リガンド配列は、次の配列で構成される：Ｄ２００，Ｆ２０１，Ｇ２０２，Ｓ２０３，Ａ２０４，Ｋ２０５，Ｑ２０６，Ｌ２０７，Ｖ２０８，Ｋ２０９，Ｇ２１０，Ｅ２１１，Ｐ２１２，Ｎ２１３，Ｖ２１４，Ｓ２１５，Ｙ２１６，Ｉ２１７，Ｃ２１８，Ｓ２１９，Ｒ２２０（Ｇｓｋリガンド１）（配列番号５）；Ｙ２１６は、上流の調節キナーゼによる活性化にしたがいリン酸化を生じる（ヒュー（Hughes）ら，ＥＭＢＯ Journal（１９９３）１２：８０３；リゾート（Lesort）ら，Journal of Neurochemistry（１９９９）７２：５７６；ハー（ter Haar）ら，Nature Structural Biology（２００１）８：５９３およびそこでの参考文献を参照。
【００９３】
別のスイッチ制御リガンド配列は：Ｇ３，Ｒ４，Ｐ５，Ｒ６，Ｔ７，Ｔ８，Ｓ９，Ｆ１０，Ａ１１，Ｅ１２（Ｇｓｋリガンド２）（配列番号６）であり；Ｓ９は、上流のキナーゼＰＫＢ／Ａｋｔの作用によりリン酸化を生じる（ダヤニ（Dajani）ら，Cell（２００１）１０５：７２１）クロス（Cross）ら，Nature（１９９５）３７８：７８５）。Ｓ９は過渡的に修飾可能な残基である。
【００９４】
インスリン受容体キナーゼ−１
全長ＩＲＫ−１遺伝子を、本明細書での配列番号３４として示す。１ＧＡＧ結晶構造に対応する配列を、本明細書での配列番号１９として示す。インスリン受容体キナーゼ−１のスイッチ制御リガンド配列は、次の配列で構成される：Ｄ１１５０，Ｆ１１５１，Ｇ１１５２，Ｍ１１５３，Ｔ１１５４，Ｒ１１５５，Ｄ１１５６，Ｉ１１５７，Ｙ１１５８，Ｅ１１５９，Ｔ１１６０，Ｄ１１６１，Ｙ１１６２，Ｙ１１６３，Ｒ１１６４，Ｋ１１６５，Ｇ１１６６，Ｇ１１６７，Ｋ１１６８，Ｇ１１６９，Ｌ１１７０（配列番号７）。Ｙ１１５８，Ｙ１１６２およびＹ１１６３ は、過渡的に修飾可能な残基であり、インスリンによるインスリン受容体の活性化にしたがいリン酸化を生じる（ハバード（Hubbard）ら，ＥＭＢＯ Journal（１９９７）１６：５５７２ ならびにそこでの参照文献参照）。
【００９５】
タンパク質キナーゼＢ／Ａｔｋ
全長のＡｔｋ１配列を、本明細書での配列番号３６として示す。タンパク質キナーゼＢ／Ａｋｔキナーゼのみのドメインを、本明細書での、配列番号３７として示す。なお、これら配列は、Ｎ末端およびＣ末端で相違する。また、上記キナーゼのみのドメインは、全長配列の残基１４３で始まる。タンパク質キナーゼＢ／Ａｔｋのスイッチ制御リガンド配列は、Ｐ４６８，Ｈ４６９，Ｆ４７０，Ｐ４７１，Ｑ４７２，Ｆ４７３，Ｓ４７４，Ｙ４７５，Ｓ４７６，Ａ４７７，Ｓ４７８（配列番号８）で構成される。Ｓ４７４は、過渡的に修飾可能な残基であり、上流のキナーゼ調節タンパク質による活性化にしたがいリン酸化され、それによりＰＫＢ／Ｐｔｋ活性を、リン酸化されていないＰＫＢ／Ａｔｋに対し１，０００倍超で高める（ヤン（Yang）ら，Molecular Cell（２００２）９：１２２７ならびにそこでの参照文献）。
【００９６】
トランスフォーミング成長因子Ｂ−Ｉ受容体キナーゼ
ＴＧＦ−Ｂ−Ｉ受容体キナーゼの全長配列を本明細書での配列番号３９として示す。このトランスフォーミング成長因子Ｂ−Ｉ受容体キナーゼのスイッチ制御リガンドは、Ｔ１８５，Ｔ１８６，Ｓ１８７，Ｇ１８８，Ｓ１８９，Ｇ１９０，Ｓ１９１，Ｇ１９２，Ｌ１９３，Ｐ１９４，Ｌ１９５，Ｌ１９６（配列番号９）である。Ｔ１８５，Ｔ１８６，Ｓ１８７，Ｓ１８９およびＳ１９１は、過渡的に修飾可能な残基であり、トランスフォーミング成長因子Ｂ−ＩＩ受容体のキナーゼ活性による活性化にしたがい一部または全部がリン酸化される（ウラナ（Wrana）ら，Nature（１９９４）３７０：３４１；チェン（Chen）およびワインバーグ（Weinberg），Proc. Natl. Acad. Sci. USA（１９９５）９２：１５６５）。
【００９７】
工程２：スイッチ制御ポケットの同定と分類
スイッチ制御リガンドの同定の場合と同様に、その相補的なスイッチ制御ポケットは、公開されているキナーゼのデータ、特にＸ線結晶構造解析から推定することができる。
この分析の第１工程は、対応するスイッチ制御リガンド内の前もって同定された修飾可能な残基に結合するであろう残基の同定である。
工程２および３では、スイッチポケット、複合スイッチポケットおよび組合せ型スイッチポケットが同定される。
先ず、その中にスイッチ制御リガンドが結合するポケットを形成するアミノ酸残基からスイッチポケットが同定される。
次に、多くのキナーゼについて複合スイッチポケットが同定される。ここでは、スイッチ制御リガンド配列由来のアミノ酸残基もスイッチポケットの定義範囲内に含まれることになる。
最後に、多くのキナーゼについて組合せ型スイッチポケットを同定する。ここでは、ＡＴＰポケット、特にＡＴＰポケットのヒンジ領域由来のアミノ酸残基もスイッチポケットの定義範囲内に含まれる。
【００９８】
機能性ＡＴＰポケットをもたないキナーゼのいくつかの立体配座状態では、β−ストランド領域および／またはグリシンリッチループ由来のアミノ酸残基がスイッチ制御ポケットの形状付与に寄与する。
機能性ＡＴＰポケットが存在する他の立体配座状態では、上記β−ストランド領域および／またはグリシンリッチループ由来のアミノ酸残基のいくつかは、ＡＴＰポケットに代替、それ故に組合せ型スイッチ制御ポケットの形状付与に寄与することができる。一例を挙げれば、ｐ３８−αキナーゼの不活性な立体配座状態では、チロシン３５（グリシンリッチループ由来）は、スイッチ制御ポケットおよび複合スイッチ制御ポケットの形状付与に寄与する。この不活性な立体配座状態では、上記ＡＴＰポケットは歪んでおり、グリシンリッチループは置換排除されている。
しかしながら、ｃ−ＡｂｌまたはＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼでは、グリシンリッチループ由来の対応チロシン２７２は、時として、該キナーゼに、組合せ型スイッチ制御ポケットの形状付与（ＡＴＰポケットの一部として）に寄与する立体配座状態にある。
【００９９】
ｃ−ＡｂｌキナーゼまたはＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼ
ヒトＡｂｌキナーゼＩＦＰＵ（配列番号１０）（シュリンツラー（Schlindler）ら、 Science（２０００）２８９：１９３８）およびｌＩＥＰ（配列番号１１）（ネイガー（Nagar）ら、Cancer Research（２００２）６２：４２３６）のＸ線結晶構造解析。このスイッチ制御ポケット配列は、このキナーゼについて先に同定したスイッチ制御リガンド１配列と相補的であり、Ｃ−αヘリックス（残基３００−３１１）および触媒ループ（残基３７８−３８７）の組み合わせから供出される２つの塩基性アミノ酸からなるクラスターをもつ。特に、Ｃ−αヘリックス由来のリシン３０４および触媒ループ由来のアルギニン３８１は、これら残基が、スイッチ制御リガンド由来の過渡的な修飾（リン酸化）残基Ｙ４１２の結合を安定化させることができるため、スイッチ制御ポケットのＺ残基を構成する。スイッチ制御ポケットへの寄与が予想される他のアミノ酸残基としては、グリシンリッチループ（チロシン２７２），β−３ストランド（Ａ２８８，Ｋ２９０，Ｄ２９５，Ｍ２９７，Ｅ２９８），β−４ストランド（Ｉ３１２，Ｌ３１７），β−５ストランド（Ｖ３１８），β−６ストランド（Ｉ３３２，Ｔ３３４，Ｅ３３５，Ｆ３３６）由来の残基，Ｃ−αヘリックス（Ｅ３０１，Ｋ３０４，Ｅ３０５，Ｖ３０８，Ｍ３０９）から供出される他のアミノ酸および触媒ループ（Ｆ３７８，Ｉ３７９，Ｈ３８０，Ｒ３８１，Ｄ３８２，Ｎ３８７）から供出される他のアミノ酸が挙げられる。また、Ε−αヘリックス残基Ｌ３７３およびＦ−αヘリックス残基Ｆ４３５は、このポケットの底を形成しているものと予想される。
【０１００】
表５は、ｃ−Ａｂｌキナーゼまたは（ｂｃｒ）Ａｂｌキナーゼのリガンド１に対しスイッチ制御ポケットを形成するタンパク質配列由来のアミノ酸を示す。このアミノ酸残基のすべての参照番号は、全長ヒトｃ−ＡｂｌキナーゼアイソフォームＩＢ（配列番号２９）に関連するものである。
【０１０１】
【表８】
2009503440.tif 000016
【０１０２】
ＡｂｌキナーゼのＸ線結晶構造解析により、構造１ＯＰＬ（配列番号１２）に基づいて、リガンド２と相補的であるスイッチ制御ポケットの推定配列を解明した。表６は、（ｂｃｒ）Ａｂｌキナーゼのリガンド２と相補的なスイッチ制御ポケットを形成するタンパク質配列由来のアミノ酸を示す。このアミノ酸番号は、ヒトｃ−ＡｂｌキナーゼアイソフォームＩＢのアミノ酸配列からのものである。
【０１０３】
【表９】
2009503440.tif 000017
【０１０４】
ｐ３８−αキナーゼ
構造１ＫＶ２（配列番号１４）に基づくｐ３８−αキナーゼのＸ線結晶構造解析（パージェリス（Pargellis）ら；Nat. Struct.. Biol 第９巻２６８−２７２頁（２００２）により、推定スイッチ制御ポケットを解明した。先に同定されたスイッチ制御リガンド配列に対するこのスイッチ制御ポケットは、Ｃ−αヘリックス（残基６１−７８）および触媒ループ（残基１４６−１５５）の組み合わせから供出される２つの塩基性アミノ酸からなるクラスターをもつ。具体的には、アルギニン６７および／またはアルギニン７０はＣ−αヘリックスから供出され、アルギニン１４９は触媒ループから供出され、かつこれら残基は、このスイッチ制御ポケットのＺ基を構成する。スイッチ制御ポケットへの寄与が予想される他のアミノ酸としては、グリシンリッチループ（残基３４−３６，Ｘ残基チロシン３５を含む）由来の残基、Ｃ−αヘリックス（残基６１−７８）由来のアミノ酸、および触媒ループ（残基１４６−１５５）由来のアミノ酸が挙げられる。また、Ｆ−αヘリックス（残基１９７−２００）から供出されるアミノ酸は、このポケットの底を形成する。
【０１０５】
表７は、上記スイッチ制御ポケットを形成するタンパク質配列由来のアミノ酸を示す。
【表１０】
2009503440.tif 000018
【０１０６】
Ｂｒａｆキナーゼおよび発癌性Ｖ５９９Ｅ  Ｂｒａｆキナーゼ
Ｂｒａｆキナーゼ１ＵＷＨ（配列番号４４）および発癌性Ｖ５９９Ｅ  Ｂｒａｆキナーゼ １ＵＷＪ（配列番号４５）構造のＸ線結晶構造解析（P.T.C.ヴァン（Wan）ら，Cell（２００４）１１６：８５５）により、推定スイッチ制御ポケットを解明した。先に同定されスイッチ制御リガンド配列に対するこのスイッチ制御ポケットは、触媒ループから供出される塩基性アミノ酸をもつ。具体的に、アルギニン５７４は、触媒ループに由来し、このスイッチ制御ポケットのＺ基を構成する。スイッチ制御ポケットへの寄与が予想される他のアミノ酸としては、グリシンリッチループ（残基４６６−４７０）由来の残基、βストランド（ストランド３，５および６）、Ｃ−αヘリックス（残基４９３−５０７）から供出されるアミノ酸、および触媒ループ（残基５７１−５８０）から供出されるアミノ酸が挙げられる。また、Ε−αヘリックス（Ｌ５６６）およびＣ−ローブ（Ｙ６３２）由来の残基は、このポケットの底を形成する。
表８は、上記スイッチ制御ポケットを形成するタンパク質配列由来のアミノ酸を示す。発癌性Ｖ５９９Ｅ  Ｂｒａｆキナーゼの上記スイッチ制御ポケットは、野生型Ｂｒａｆキナーゼと一致する。
【０１０７】
【表１１】
2009503440.tif 000019
【０１０８】
Ｇｓｋ−３βキナーゼ
Ｇｓｋ−３βキナーゼのＸ線結晶構造解析により、構造１ＧＮＧ（配列番号１５），１Ｈ８Ｆ（配列番号１６），１Ｉ０９（配列番号１８）および１Ｏ９Ｕ（配列番号２８のアクシン（axin）ペプチドを伴う配列番号２７構造）に基づいて、スイッチ制御ポケットを解明する（フレーム（Frame）ら，Molecular Cell, 第７巻，１３２１−１３２７頁（２００１）；Dajaniら，Cell，第１０５巻，７２１−７３２頁（２００１）；Dajaniら、ＥＭＢＯ Journal，第２２巻，４９４−５０１頁（２００３）；およびter Haarら、Nature Structural Biology，第８巻，５９３−５９６頁（２００１）。前記同定されたスイッチ制御リガンド配列１および２に対応するスイッチ制御ポケットは、Ｃ−αヘリックス（残基９６−１０４）および触媒ループ（残基１１７−１８６）の組み合わせから供出される２つの塩基性アミノ酸からなるクラスターをもつ。具体的には、アルギニン９６はＣ−αヘリックスに由来し、アルギニン１８０は触媒ループに由来する。これら残基は、このスイッチ制御ポケットのＺ基を構成する。スイッチ制御ポケットに寄与する他のアミノ酸としては、グリシンリッチループ（残基６６−６８）由来の残基、βストランド５（Ｋ８５）、Ｎ−ローブ（Ｈ１０６，Ｉ１０９，Ｖｌ１０）由来の他の残基、Ｃ−αヘリックス（残基９０−１０４）から供出されるアミノ酸、および触媒ループ（残基１７７−１８６）から供出されるアミノ酸が挙げられる。また、Ｃ−ローブ（残基２３３−２３５）由来のアミノ酸は、このポケットの底を形成する。
【０１０９】
表９は、上記スイッチ制御ポケットを形成するタンパク質配列由来のアミノ酸を示す。
【表１２】
2009503440.tif 000020
【０１１０】
インスリン受容体キナーゼ−１
インスリン受容体キナーゼ−１のＸ線結晶構造解析により、構造１ＧＡＧ（配列番号１９）および１ＩＲＫ（配列番号２１）に基づいて、スイッチ制御ポケットを解明する（パラング（Parang）ら，Nat. Structural Biology，８，３７頁（２００１）；Hubbardら，Nature，３７２，４７６頁（１９９４）。上記スイッチ制御リガンド配列に対するスイッチ制御ポケットは、Ｃ−αヘリックス（残基１０３７−１０５４）および触媒ループ（残基１１２７−１１３７）の組み合わせから供出される２つの塩基性アミノ酸からなるクラスターをもつ。具体的には、アルギニン１０３９はＣ−αヘリックスから供与され、アルギニン１１３１は触媒ループから供与される。これら残基は、このスイッチ制御ポケットのＺ基を構成する。スイッチ制御ポケットに寄与する他のアミノ酸としては、グリシンリッチループ（残基１００５−１００７）由来の残基、Ｃ−αヘリックス（残基１０３７−１０５４）から供出されるアミノ酸、および触媒ループ（残基１１２７−１１３７）から供出されるアミノ酸が挙げられる。また、Ｃ−ローブ（残基１１８５−１１８７）由来のアミノ酸は、このポケットの底を形成する。
【０１１１】
表１０は、上記スイッチ制御ポケットを形成するタンパク質配列由来のアミノ酸を示す。
【表１３】
2009503440.tif 000021
【０１１２】
タンパク質キナーゼＢ／Ａｋｔ
タンパク質キナーゼＢ／ＡｋｔのＸ線結晶構造解析により、構造１ＧＺＫ（配列番号２２）、１ＧＺＯ（配列番号２３）および１ＧＺＮ（配列番号２４）に基づいて、スイッチ制御ポケットを解明する（Yangら，Molecular Cell（２００２）９：１２２７）。上記スイッチ制御リガンド配列に対するこのスイッチ制御ポケットは、Ｂ−αヘリックス（残基１８５−１９０）、Ｃ−αヘリックス（残基１９４−２０４）およびβ−５ストランド（残基２２５−２３１）から供出されるアミノ酸残基で構成される。具体的には、アルギニン２０２は、Ｃ−αヘリックスに由来し、このスイッチ制御ポケットのためのＺ基を構成する。
【０１１３】
表１１は、タンパク質キナーゼＢ／Ａｋｔのスイッチ制御ポケットを形成するタンパク質配列由来のアミノ酸を示す。
【表１４】
2009503440.tif 000022
【０１１４】
トランスフォーミング成長因子Ｂ−Ｉ受容体キナーゼ
トランスフォーミング成長因子Ｂ−Ｉ受容体キナーゼのＸ線結晶構造解析により、構造１Ｂ６Ｃ（配列番号２５）に基づいて、スイッチ制御ポケットを解明する（Huseら，Cell（１９９９）９６：４２５）。このスイッチ制御ポケットは、ＧＳ−１ヘリックス、ＧＳ−２ヘリックス、Ｎローブ残基２５３〜２６６およびＣ−αヘリックス残基２４２〜２５２から供出されるアミノ酸残基によって構成されている。
【０１１５】
表１２は、ＴＧＦ  Ｂ−Ｉ受容体キナーゼのスイッチ制御ポケットを形成するタンパク質配列由来のアミノ酸を示す。
【表１５】
2009503440.tif 000023
【０１１６】
第二のスイッチ制御ポケットは、ＴＧＦ Ｂ−１受容体キナーゼ中に存在する。このスイッチ制御ポケットは、Ａｂｌキナーゼ（表５）、ｐ３８−αキナーゼ（表７）およびＧｓｋ−３βキナーゼ（表９）について上述したポケットと同様である。ＴＧＦ  Ｂ−１は、このポケットに適合する明らかな相補的スイッチ制御リガンドを持たないにも拘らず、このポケットは、進化的に保存されており、小分子スイッチ制御モジュレータの結合のために利用することができる。このポケットは、グリシンリッチループ、Ｃ−αヘリックス、触媒ループ、スイッチ制御リガンド配列およびＣローブに由来する残基から構成されている。
【０１１７】
表１３は、この“スイッチ制御ポケット”を形成するタンパク質配列由来のアミノ酸を示す。
【表１６】
2009503440.tif 000024
【０１１８】
第三のスイッチ制御ポケットは、空間的には、ＡＴＰ結合ポケットとＣ−αヘリックスの間に位置し、表１４で特定される残基から供出される残基からなる。このポケットは、阻害タンパク質ＦＫＢＰ１２（配列番号２６）を捕獲している“閉鎖状態”でのＣ−αヘリックスの歪みの結果としてもたらされる（ヒューズ（Huse）ら，Molecular Cell（２００１）８：６７１参照）。
【０１１９】
表１４は、上記第三スイッチ制御ポケットの配列を示す。
【表１７】
2009503440.tif 000025
【０１２０】
工程３：スイッチ制御リガンドとスイッチ制御ポケットとの相互作用性の確認、および小分子設計のための適切な遺伝子座の同定
１．一般的な計算法
スイッチ制御ポケットおよびスイッチ制御ポケット／リガンド相互作用のコンピュータ支援描写には、改変型ＳｕｒｆＮｅｔ（ラスコウシ（Laskowsi）, R. A，J. Mol. GraｐＨ.，１９９５，１３，３２３；ＰＡＳＳ；G. パトリックブレイディ（Patrick Brady），G. P. Jr.；シュタウテン（Stouten）, P. F. W., J. Computer-Aided Mol. Des. ２０００，１４，３８３，ＶＯＩＤＯＯ，GJ. KleywegtおよびT. A. Jones（１９９４）Acta Cryst D50，１７８−１８５；http://www.iucr.ac.uk/iournals/acta/tocs/actad/1994/actad5002.html；および立方体；ジャン（Jiang）, F.；キム（Kim）, S.-H.；"'Soft-docking'"：Matching of Molecular Surface Cubes", J. MoL Biol. １９９１，２１９，７９）を、ポケット可視化用ＧＲＡＳＰ（http://trantor.bioc.colｕＭbia.edu/grasp/）と併せて利用した。
これら想定部位への小分子化学種（chemotypes）のパニングおよびドッキングは、ＳｏｆｔＤｏｃｋ（http://www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock/：Morris, G. M.；Goodsell, D. S.；Halliday, R.S.；Huey, R.；Hart, W. E.；Belew, R. K.；Olson, A. J, J. Computational Chemistry，１９９８，１９，１６３９］およびＤｏｃｋ［http://www.cmｐＨarm.ucsf.edu/kuntz/dock.html；Ewing, T. D. A.；Kuntz, I. D., J. Comp. Chem.１９９７，１８，１１７５］を、ＡＭＢＥＲベース［http://www.amber.ucsf.edu/amber/amber.html］の束縛分子ダイナミクスと適宜組合わせて用いる。
【０１２１】
ポケット解析プログラムに使用される一般的アプローチは、空隙領域の形を定め、それを用いて、タンパク質の表面上でどの溶剤接触可能なホールが利用可能かを決定することである。空隙領域は、球または立方体に基づいて、まず、２以上の原子間の領域を球または立方体（完全または摺切）で満たし、次いでこれらを用いて、等高線が結ばれる場合、空隙領域の表面輪郭を画することで三次元（３Ｄ）密度マップをコンピュータ計算する。球についての一般的なアプローチは、Ｓｕｒｆｎｅｔのユーザーマニュアルからの抜粋では、下記のとおりである。
【０１２２】
ａ．２つの原子ＡおよびＢは、それらのファン・デル・ヴァールス面の間に、まさに各面に接触するように配置された試行の空隙球をもつ。
【０１２３】
ｂ．次に、隣接原子を順次検討する。空隙球への貫入があれば、試行の空隙球の半径を、貫入している原子にちょうど接触するまで低減する。この手順を繰り返し、全ての隣接原子を検討する。上記球の半径がある所定の下限値（通常１．０Ａ）を下回る場合には、選外とする。そうでない場合には、最終の空隙球を保存する。
【０１２４】
ｃ．上記手順を続けて全ての原子ペアを検討し、空隙領域を球で満たす。
【０１２５】
ｄ．次に、上記球を用いてガウス関数を用いる三次元配列の格子点の点を更新する。
【０１２６】
ｅ．この更新は、格子を等高線ピッチ１００.０で等高線を結んで、各空隙球に対応する三次元表面を得るものである。
【０１２７】
ｆ．すべての球で格子を更新したときの最終的な三次元等高線は、相互貫入している空隙球の表面を表し、つまり表面ポケットを形成する原子からなるポケット基の形を定める。
【０１２８】
ポケット分析に影響を及ぼす因子としては、格子点の間隔、用いた等高線ピッチ、空隙充填に用いた球半径の下限値および上限値が挙げられる。一般に、スイッチ制御ポケットのサイズおよび形状は、各個々のプログラムで決定されたコンピュータ計算スイッチ制御ポケットとの重ね合わせにより一致のみられるポケットとして描写される。
【０１２９】
上述したとおり、スイッチ制御リガンドと１または複数のスイッチ制御ポケットとの相互作用は、“複合スイッチポケット”と称されるものを形成することが見出された。この複合スイッチポケットは、スイッチ制御リガンドと１または複数のスイッチ制御ポケットの両方から供出されるアミノ酸残基を含む配列をもつ。
【０１３０】
別の態様では、スイッチ制御ポケットまたは複合スイッチ制御ポケットが、活性部位ポケット（たとえば、キナーゼのＡＴＰポケット）と重なり合って“組合せ型スイッチ制御ポケット”を生じることがある。このような組合せ型スイッチ制御ポケットもまた、スイッチ制御阻害物質の役目をはたす小分子との結合遺伝子座として有用であろう。
【０１３１】
勿論、複合スイッチポケットおよび組合せ型スイッチポケットの分析は、スイッチ制御ポケットに係る上述の手法と同じ手法を用いて行なうことができる。
【０１３２】
ｃ−ＡｂｌキナーゼおよびＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼ
ポケット分析のＳＵＲＦＮＥＴ図を図１０に示す。スイッチ制御ポケットは、水色で彩色されている。このスイッチ制御ポケットのＧＲＡＳＰ図を図１１に示し、該図中、タンパク質の複合ポケット領域を円で囲んである。図１２は、ｃ−Ａｂｌキナーゼまたは（ｂｃｒ）Ａｂｌキナーゼの複合スイッチ制御ポケットを形成するキーとなるアミノ酸残基を示す。複合ポケットを形成するアミノ酸残基は、先に同定されたスイッチ制御リガンドおよびスイッチ制御ポケットによってもたらされる。複合スイッチ制御ポケットの模式図を図６に示す。
【０１３３】
複合ポケットを形成する具体的なアミノ酸残基を表１５に示す。
【表１８】
2009503440.tif 000026
【０１３４】
スイッチ制御リガンド配列由来のアルギニン４０５は、複合スイッチ制御ポケットにＺ基をもたらす。この複合スイッチ制御ポケットに対する小分子の初期設計は、β−ストランド３，４，５および６（表１５参照）、Ｃ−αヘリックス（Ｅ３０１，Ｋ３０４，Ｅ３０５，Ｖ４０８，Ｍ３０９）、Ｅ−αヘリックス（Ｌ３７３）、触媒ループ（Ｆ３７８，Ｉ３７９，Ｈ３８０，Ｒ３８１，Ｄ３８２，Ｎ３８７）およびスイッチ制御リガンド配列（Ｄ４００，Ｆ４０１，Ｇ４０２，Ｒ４０５）から供出されるアミノ酸に結合するであろう化学プローブに焦点をあてた。この複合スイッチ制御ポケットの利用は、ｃ−ＡｂｌキナーゼまたはＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼの該複合スイッチ制御ポケット内に碇着する阻害物質の設計を可能にした。
【０１３５】
スクリーニング用に選択された代表的な化合物としては、ｌ−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−ｌ−（ｌ，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−７−イル）−ｌＨ−ピラゾール−５−イル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）ウレア（実施例６４）；（３Ｓ）−６−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（３−（２，３−ジクロロフェニル）ウレイド）−ｌＨ−ピラゾール−ｌ−イル）−ｌ，２，３，４−  テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（実施例６５）；ｌ−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−ｌ−（ｌ，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−６−イル）−ｌＨ−ピラゾール−５−イル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）ウレア（実施例６６）；およびＮ−（４−メチル−３−（４−フェニルピリミジン−２−イルアミノ）フェニル）−Ｌ−４−（２−オキソ−４−フェニル−オキサゾリジニル−３−カルボニル）ベンズアミド（実施例９７）が挙げられる。
【０１３６】
図１３は、ｃ−Ａｂｌキナーゼまたは（ｂｃｒ）Ａｂｌキナーゼの組合せ型スイッチ制御ポケットを形成するキーとなるアミノ酸残基を示す。組合せ型ポケットを形成するアミノ酸残基は、先に同定されたスイッチ制御リガンド、スイッチ制御ポケットおよびＡＴＰ活性部位によってもたらされる。組合せ型スイッチ制御ポケットの模式図を図７に示す。
【０１３７】
表１６に、組合せ型ポケットを形成している具体的なアミノ酸残基を示す。星印を付した配列は、アミノ酸残基が、ｃ−ＡｂｌまたはＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼのある立体配座状態における複合スイッチ制御ポケットの一部をなす領域を示すが、一方、これらキナーゼの他の立体配座状態では、これら領域は、ＡＴＰポケットの一部として組合せ型スイッチ制御ポケットに寄与することができる。
【０１３８】
【表１９】
2009503440.tif 000027
【０１３９】
この組合せ型スイッチ制御ポケットの利用は、（ｂｃｒ）Ａｂｌキナーゼの該組合せ型スイッチ制御ポケット内に碇着する阻害物質の設計を可能にした。
【０１４０】
スクリーニング用に選択された代表的な化合物としては、ｌ−（ｌ−（３−（２−アミノ−２−オキソエチル）フェニル）−３−ｔｅｒｔ−ブチル−ｌＨ−ピラゾール−５−イル）−３−（３−（ピリジン−３−イルオキシ）フェニル）ウレア（実施例９３）およびｌ−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−ｌ−（ｌ，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−６−イル）−ｌＨ−ピラゾール−  ５−イル）−３−（４−メチル−３−（ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル）ウレア（実施例９４）が挙げられる。
【０１４１】
ｐ３８−αキナーゼ
ポケット分析のＳＵＲＦＮＥＴ図を図１４に示す。複合スイッチ制御ポケットは、水色で彩色されている。この複合スイッチ制御ポケットのＧＲＡＳＰ図を図１５に示す。
【０１４２】
図１６は、ｐ３８−αキナーゼの複合スイッチ制御ポケットを形成するキーとなるアミノ酸残基を示す。これらアミノ酸は、グリシンリッチループ（Ｙ３５）、Ｃ−αヘリックス（Ｉ６２，Ｉ６３，Ｒ６７，Ｒ７０，Ｌ７４，Ｌ７５，Ｍ７８）、β−ストランド５−７（Ｋ５３，Ｖ８３，Ｉ８４，Ｌ１０４，Ｔ１０６）、Ｅ−αヘリックス（Ｉ１４１，Ｉ１４６）、触媒ループ（Ｉ１４７，Ｈ１４８，Ｒ１４９，Ｄ１５０，Ｎ１５５）、Ｎ−ローブストランド（Ｌ１６７）、スイッチ制御リガンド配列（Ｄ１６８，Ｆ１６９，Ｈ１７４）およびＦ−αヘリックス（Ｙ２００）から供出される。複合ポケットを構成しているアミノ酸残基を表１７に具体的に示す。
【０１４３】
【表２０】
2009503440.tif 000028
【０１４４】
この複合スイッチ制御ポケットの利用は、ｐ３８−αキナーゼの該スイッチ制御ポケット内に碇着する阻害物質の設計を可能にする。
【０１４５】
代表的な化合物としては、
１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−ｌ−（３−（２−モルホリノ−２−オキソエチル）フェニル）−ｌＨ−ピラゾール−５−イル）−３−（ナフタレン−ｌ−イル）ウレア（実施例２１）；
ｌ−（ｌ−（３−（２−アミノ−２−オキソエチル）フェニル）−３−ｔｅｒｔ−ブチル−ｌＨ−ピラゾール−５−イル）−３−（４−クロロフェニル）尿素（実施例２６）；
３−（３−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（３−（ナフタレン−ｌ−イル）ウレイド）−ｌＨ−ピラゾール−ｌ−イル）フェニル）プロパン酸（実施例２９）；
３−（３−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（３−（４−クロロフェニル）ウレイド）−ｌＨ−ピラゾール−ｌ−イル）フェニル）プロパン酸（実施例３０）；
３−（４−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（３−（ナフタレン−ｌ−イル）ウレイド）−ｌＨ−ピラゾール−ｌ−イル）フェニル）プロパン酸（実施例３１）；および
３−（４−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（３−（４−クロロフェニル）ウレイド）−ｌＨ−ピラゾール−ｌ−イル）フェニル）プロパン酸（実施例３２）が挙げられる。
【０１４６】
ｐ３８−αキナーゼに組合せ型ポケットを形成するアミノ酸残基は、スイッチ制御リガンド、スイッチ制御ポケットおよびＡＴＰポケットによってもたらされる。組合せ型スイッチ制御ポケットの模式図を図７に示す。
【０１４７】
上記組合せ型ポケットを形成するアミノ酸残基を表１８に具体的に示す。星印を付した配列は、アミノ酸残基が、ｐ３８−αキナーゼのある立体配座状態における複合スイッチ制御ポケット部分をもたらす領域を示すが、一方、ｐ３８−αキナーゼの他の立体配座状態では、これら領域は、ＡＴＰポケットの一部として組合せ型スイッチ制御ポケットに寄与することができる。
【０１４８】
【表２１】
2009503440.tif 000029
【０１４９】
Ｂｒａｆキナーゼ
図５０は、Ｂｒａｆキナーゼの複合スイッチ制御ポケットを形成するキーとなるアミノ酸残基を示す。スイッチ制御リガンド配列（Ｄ５９３，Ｆ５９４，Ｇ５９５，Ｌ５９６，Ａ５９７，Ｔ５９８，Ｖ５９９，Ｋ６００，Ｓ６０１，Ｒ６０２）は、グリシンリッチループから供出される残基（残基４６６−４７０）、βストランド（ストランド３，５および６）、Ｃα−ヘリックス（残基４９３−５０７）および触媒ループ（残基５７１−５８０）から供出されるアミノ酸とともに、Ｂｒａｆキナーゼに複合スイッチ制御ポケットをもたらす。また、Ｅα−ヘリックス（Ｌ５６６）およびＣ−ローブ（Ｙ６３２）由来の残基は、このポケットの底を形成する。Ｒ５７４およびＲ６０２は、過渡的にリン酸化されたスイッチリガンド残基ホスホＴ５９８またはホスホＳ６０１の結合を安定させるＺ基（図４ａ中に定義）である。複合ポケットを形成するアミノ酸残基を表１９に具体的に示す。
【０１５０】
【表２２】
2009503440.tif 000030
【０１５１】
発癌性Ｖ５９９Ｅ  Ｂｒａｆキナーゼ
図４２は、発癌性Ｖ５９９Ｅ  Ｂｒａｆキナーゼの複合スイッチ制御ポケットを形成するキーとなるアミノ酸残基を示す。これらアミノ酸は、グリシンリッチループ（Ｓ４６６，Ｆ４６７，Ｖ４７０）、β−ストランド３（Ｋ４８２）、β−ストランド５（Ｉ５１２，Ｌ５１３）、β−ストランド６（Ｉ５２６，Ｔ５２８）、Ｃ−αヘリックス（Ｑ４９３，Ａ４９６，Ｎ４９９，Ｅ５００，Ｖ５０３，Ｌ５０４，Ｔ５０７）、触媒ループ（Ｉ５７１，Ｈ５７３，Ｒ５７４，Ｄ５７５，Ｎ５８０）、スイッチ制御リガンド配列（Ｄ５９３，Ｆ５９４，Ｇ５９５，Ｌ５９６，Ａ５９７，Ｔ５９８，Ｅ５９９，Ｋ６００，Ｓ６０１，Ｒ６０２）、Ｅα−ヘリックス（Ｌ５６６）およびＣ−ローブ残基（Ｙ６３２）から供出される。Ｒ５７４およびＲ６０２は、突然変異スイッチリガンド残基Ｅ５９９の結合を安定化させるＺ基（図４ａ中に規定）である。複合ポケットを形成するアミノ酸残基を表２０に具体的に示す。
【０１５２】
【表２３】
2009503440.tif 000031
【０１５３】
Ｂｒａｆキナーゼまたは発癌性Ｖ５９９Ｅ  Ｂｒａｆキナーゼ阻害物質の代表例としては、１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−ｌ  −（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−７−ｙｌ）−ｌＨ−ピラゾール−５−ｙｌ）−３−（２，３−ジクロロフェニル）ウレア（実施例６４）および（３Ｓ）−６−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（３−（２，３−ジクロロフェニル）ウレイド）−ｌＨ−ピラゾール−ｌ−ｙｌ）−ｌ，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（実施例６５）が挙げられる。
【０１５４】
Ｇｓｋ−３βキナーゼ
ポケット分析のＳＵＲＦＮＥＴ図を図１７に示す。複合スイッチ制御ポケットは、水色で彩色されている。この複合スイッチ制御ポケットのＧＲＡＳＰ図を図１８に示す。
【０１５５】
図１９は、配列番号１６をもつｇｓｋ−３βキナーゼの複合スイッチ制御ポケットを形成するキーとなるアミノ酸残基を示す。該残基は、グリシンリッチループ（Ｆ６７）、β−ストランド５（Ｋ８５）、他のＮ−ローブ残基（Ｈ１０６，Ｉ１０９，Ｖｌ１０）、Ｃ−αヘリックス（Ｒ９６，Ｅ９７，Ｉ１００，Ｍｌ０ｌ，Ｋ１０３，Ｌ１０４）、Ｅ−αヘリックス（Ｌ１６９，Ｉ１７２）、触媒ループ（Ｉ１７７，Ｃ１７８，Ｈ１７９，Ｒｌ８０，Ｄ１８１，Ｎｌ８６）、スイッチ制御リガンド配列（Ｄ２００，Ｆ２０１，Ｓ２０３，Ｋ２０５，Ｌ２０７，Ｖ２０８，Ｐ２１２，Ｎ２１３，Ｖ２１４，Ｙ２１６）およびＣ−ローブ残基（Ｙ２３４）に由来する。このポケットの利用は、ｇｓｋ−３βキナーゼの該複合スイッチ制御ポケット内に碇着する小分子調節化合物の設計を可能にする。
【０１５６】
表２１に示す複合ポケットは、二重機能性スイッチ制御ポケットである。相補的リガンド配列１（Ｇｓｋリガンド１）との結合時には、該ポケットは、タンパク質の活性を上方調節するオン−ポケットとして機能する。一方、相補的リガンド配列２（Ｇｓｋリガンド２）との結合時には、タンパク質の活性を下方調節するオフ−ポケットとして機能する。
【０１５７】
表２１は、上記複合スイッチ制御ポケットを形成するタンパク質配列由来のアミノ酸を示す。
【表２４】
2009503440.tif 000032
【０１５８】
（実施例Ｂ）
工程４：別々のスイッチ制御状態に静的拘束されたタンパク質の発現および精製
遺伝子合成。
エメラルド（Emerald）／デコード・ジェネティック（deCODE genetics）社の供するソフトウェア（Gene BuilderTM）を用いる最適化コドン利用法を用いて、合成オリゴヌクレオチドから遺伝子を完全に調製した。全遺伝子の合成は、コドン最適化バージョンの遺伝子の迅速な合成が可能であった。制限部位の戦略的な配置は、必要に応じた任意の突然変異の迅速な付加を容易にした。
【０１５９】
タンパク質を、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞または大腸菌の発現系で発現させた。遺伝子は、タグを付したタンパク質の一工程での抗体アフィニティ精製をしばしば可能にする親和性タグを導入して任意に修飾した。構築物は、結晶化性、リガンド相互作用、精製およびコドン利用のために最適化した。月あたり１００リットル超の昆虫細胞培養能力用１１リットルのウェーブ・バイオリアクター（Wave Bioreactor）を２基使用した。
【０１６０】
タンパク質の精製。
タンパク質の精製には、ＡＫＴＡ精製装置、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ、パル（Parr）窒素キャビテーションボンベ、エマルシフレックス（EmulsiFlex）−Ｃ５ホモジナイザーおよびプロテイン・メーカー（Protein Maker）TMタンパク質製造装置（Emerald社の自動並行精製装置）を使用した。精製タンパク質分析用機器は、蛍光分光装置、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析装置および動的光散乱装置などであった。
【０１６１】
全細胞のペーストを、窒素キャビテーション、フレンチプレス、またはミクロ流動化により破砕した。抽出物は、プロテイン・メーカーTM装置を用いて並行タンパク質精製した。このプロテイン・メーカーは、Emerald社によって開発されたロボット装置で、複数ラン（Ｇｌｕ−ｍＡｂ、金属キレート、Ｑ−ｓｅｐＨ、Ｓ−ＳｅｐＨ、フェニル−ＳｅｐＨおよびシバクロンブルーなど）の並行ランで同時精製カラムを実施することができる。その分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。精製タンパク質を、いくつかの生物物理学的試験（動的光散乱、紫外線吸収、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ゲル濾過分析など）に供して、精製度を定量分析した。
【０１６２】
Ａｂｌキナーゼ
全遺伝子合成ならびに配列番号５６（キナーゼドメイン，６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ，残基２４８−５３４）のＡｂｌキナーゼ、配列番号５３（キナーゼドメイン，Ｇｌｕ−６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ，残基２４８−５１８）のＡｂｌキナーゼ、配列番号５１（Ｙ４１２Ｆを有するアイソフォーム１−Ｂ  １−５３１）のＡｂｌキナーゼのサブクローニングを完遂させ、昆虫細胞でのトランスフェクションを遂行した。配列番号５９（Ｇｌｕ−６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ，残基１−２０２９）のＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼおよび配列番号６０（Ｇｌｕ−６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ，残基１−２０２９；Ｙ４１２Ｆ変異体）のＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼも同様に調製し、昆虫細胞にトランスフェクトした。産生された（ｂｃｒ）Ａｂｌタンパク質が、Ｙ２４５またはＹ４１２でリン酸化されていないことを確認するため、ＡＴＰ競合阻害物質ＰＤ１８０９７０またはグリーベック（Gleevec）の存在下でフェルンバッハ（Fernbach）トランスフェクション培養を任意に実施した（Tanisら，Molecular Cell Biology，第２３巻，３８８４頁（２００３）； Van Etten ら，Journal of Biological Chemistry，第２７５巻，３５６３１頁（２０００）参照）。タンパク質発現レベルを、免疫沈降法およびＳＤＳ−Ｐａｇｅで測定した。Ａｂｌキナーゼについてのタンパク質発現レベルは、１０ｍｇ／Ｌを超えた。これら阻害物質の存在下、精製した発現タンパク質に対するＰｙ２０（抗ホスホチロシン抗体）ウェスタン・ブロッティングを行って、Ｙ２４５またはＹ４１２がリン酸化されていないことを確認した。
【０１６３】
図２０および２１は、ＰＤ−１８０９７０存在下で発現されたＡｂｌ構築物２のニッケル・アフィニティクロマトグラフィー後の純度（図２０）、続くＰＯＲＯＳ  ＨＱ陰イオン交換クロマトグラフィー（図２１）後の純度を示す。図２２は、Ａｂｌ構築物２のニッケル・アフィニティクロマトグラフィーの溶出プロファイルを示し、図２３は、Ａｂｌ構築物２のＰＯＲＯＳ ＨＱ陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出プロファイルを示す。このパターンのＡｂｌは、そのリン酸化されていない物理的状態にある。
【０１６４】
図２４は、ｔｅｖプロテアーゼ処理によりＧｌｕ−６ｘＨｉｓ−ＴＥＶ親和性タグを取除いた後の配列番号５３のＡｂｌキナーゼの溶出プロファイルを示す。分画１７〜１９は、Ｇｌｕ−６ｘ／Ｈｉｓ−ＴＥＶタグがついたままのＡｂｌタンパク質を含み、分画２０〜２３は、Ｇｌｕ−６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグが除去されたＡｂｌタンパク質を含む。プール分画２０〜２３の紫外線分析（図２５）は、ＡＴＰ競合阻害物質ＰＤ１８０９７０がＡｂｌ  ＡＴＰポケットに結合したまま存在することを示唆する３６０ｎｍに最大吸収を示し、これによりＡｂｌタンパク質が、発現および精製の間、非リン酸化状態に保たれていたことが確認された。
【０１６５】
図２６は、ニッケル・アフィニティクロマトグラフィーおよびＱ−セファロース・クロマトグラフィーを介した精製における配列番号５１のＡｂｌキナーゼの溶出プロファイルを示す。図２７は、精製したプール分画のＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析を示す。
【０１６６】
ｐ３８−αキナーゼ
配列番号４８（６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ，全長）のｐ３８−αキナーゼの全遺伝子合成を完遂し、アラビノース誘導性ベクターおよびＴ７プロモータベクターの両方を使用して、タンパク質を大腸菌で発現させた。０．５ＭのＩＰＴＧ（ｐＥＴ１５ｂ）または０．２％のアラビノース（ｐＢＡＤ）惹起後の２つの発現ベクター（ｐＥＴ１５ｂおよびｐＢＡＤ）におけるｐ３８−αキナーゼの発現を調べた。タンパク質発現を、免疫沈降法およびＳＤＳ−Ｐａｇｅで測定した。惹起後のｐＢＡＤ構築物におけるｐ３８−αの発現は、抗ＧＬＵモノクローナル抗体を用いた免疫沈降で明確に示すことができた。
【０１６７】
図２８は、Ｑ−セファロース・クロマトグラフィーにおけるｐ３８−αタンパク質の溶出プロファイルを示す。プールした精製分画のＳＤＳ−Ｐａｇｅを図２９に示す。
【０１６８】
Ｂｒａｆキナーゼ
配列番号６１（Ｂｒａｆキナーゼ４，６ｘＨｉｓ−タグ，残基４３２−７２３の全長配列および配列番号５８（６ｘＨｉｓ−タグ，残基，Ｖ５９９Ｅ，４３２−７２３の全長配列をもつ発癌性Ｖ５９９Ｅ Ｂｒａｆキナーゼについて全遺伝子合成を完遂した。バキュロウィルストランスフェクション培地（４０ｍＬ の感染Ｓｆ９，２０ｍｌの感染Ｓｆ９-プロおよびコントロ−ル感染Ｓｆ９）を２日目に採取し、２ｍＬのＮＰ−４０溶解緩衝液中に溶解した。Ｎｉ-キレート沈降およびＫＴ３免疫沈降法をそれぞれ１．５ｍＬおよび０．２ｍＬのライセート（８ｕＬのビーズ床容積）を用いて行なった。ビーズに結合したタンパク質は、ＳＤＳ−検体緩衝液で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけた。以下の５段階の手順を用いて６０ｇの細胞ペーストを精製し、高精製発癌性Ｖ５９９Ｅ  Ｂｒａｆキナーゼ４．５ｍｇを得た。
【０１６９】
１．ＮｉクロマトグラフィＩ：Ｂｒａｆ 精製における第１工程は、人工Ｈｉｓタグと、Ｎｉカラム上の三元複合体の単離（Ｂｒａｆ／ｐ５０ｃｄｃ３７／Ｈｓｐ９０）を利用した。
【０１７０】
２．ＰＯＲＯＳ ＨＳクロマトグラフィ：次いで、プールしたＮｉ分画をＰＯＲＯＳ ＨＳ陽イオン交換カラムにかけた。上記三元複合体の＞９０％ がそこを通過する。
【０１７１】
３．ＮｉクロマトグラフィII：Ｎｉカラムの２回目通過により上記三元複合体を解離した。解離はほんの一部であったため、メインの三元複合体ピークと、１つの低分子量（ＭＷ）側の不純物を含有する第２のＢｒａｆピークが得られた。
【０１７２】
４．ＮｉクロマトグラフィIII：２回目のＮｉカラム後に上記三元複合体がほとんど解離していないため、該三元複合体を再びＮｉカラムで分離した。この３回目のＮｉクロマトグラフィ工程は、該複合体の解離を進行させ、多くのＢｒａｆを取得するに至った。
【０１７３】
５．ヘパリンクロマトグラフィ：Ｂｒａｆ精製における最終工程は、ヘパリンクロマトグラフィを利用し、低分子量（ＭＷ）側の不純物からＢｒａｆを分離し、プールしたＮｉ分画を効果的に濃縮した。精製したＢｒａｆのＳＤＳ−ＰＡＧＥを図５１に示す。
【０１７４】
Ｇｓｋ−３βキナーゼ
配列番号５４（６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ，全長）のキナーゼ、配列番号４９（１０ｘＨｉｓ−残基２７−３９３）のキナーゼおよび配列番号５０（Ｇｌｕ−６ｘＨｉｓ−ＴＥＶタグ，残基３５−３８５）のキナーゼについて全遺伝子の合成を完遂した。昆虫細胞でトランスフェクションを行った。タンパク質発現を、免疫沈降法およびＳＤＳ−Ｐａｇｅで分析した。構築物３の発現レベルは、５ｍｇ／Ｌを超えていた。ｇｓｋ−３βタンパク質の精製は、同じ発現物（run）から、スイッチ制御リガンドの非リン酸化キナーゼ（ＧＳＫ−Ｐ）とスイッチ制御リガンドのリン酸化キナーゼ（ＧＳＫ＋Ｐ）の両形態の単離を可能にする手順を含んでいた。ニッケル・アフィニティクロマトグラフィーは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液中、ｐＨ７．５で実施した。この工程に引き続いて、ＰＯＲＯＳ  ＨＳ（陽イオン交換）クロマトグラフィーを行った。図３０は、４２８６２Ｄａの目的分子イオンを示すＧＳＫ＋Ｐタンパク質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルである。図３１は、４２７８１の目的分子イオンを示すＧＳＫ−Ｐタンパク質のＭＡＤＬＩ−ＴＯＦスペクトルである。
【０１７５】
図３２および３３は、抗ホスホチロシン抗体ＰＹ−２０染色結合でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によるＰＯＲＯＳ  ＨＳクロマトグラフィー分画の分析を示す。分画１０〜１５は、ＰＹ−２０抗体によって顕像化され、スイッチ制御リガンドチロシン残基におけるリン酸塩の存在が示された。分画１７〜２９は、ＰＹ−２０抗体によって顕像化されず、チロシンのスイッチ制御リガンドリン酸化の不在が示された。
【０１７６】
＜実施例Ｃ＞
工程５：小分子スイッチ制御モジュレータ候補を用いた精製タンパク質のスクリーニング
キナーゼタンパク質スイッチ制御ポケット中へのスイッチ制御阻害物質の結合性検査のための蛍光親和性試験
蛍光親和性試験を実施するための一般的方法では、キナーゼのＡＴＰポケットに結合しない限り蛍光を発しない蛍光ローブが用いられる。この蛍光親和性試験は、タンパク質キナーゼのスイッチ制御ポケット中に結合する小分子を同定するための親和性系スクリーンで利用される。小分子スイッチ阻害物質の結合は、ＤＦＧモチーフのスイッチ制御リガンドのフェニルアラニンを、ＡＴＰポケットを立体的に封鎖する幾何学的配置内に偏位させる。このような阻害物質が起こすＡＴＰポケットの封鎖は、蛍光ローブがＡＴＰポケット内に結合することからなる阻害として検出される。
【０１７７】
ＳＫＦ８６００２は、ｐ３８キナーゼ蛍光親和性試験で用いられる蛍光ローブである。この蛍光ローブは既知である（C. Pargellisら，Nature Structural Biology（２００２）９，２６８−２７２；J. リーガン（Regan）ら，J. Med. Chem.（２００２）４５，２９９４− ３００８）。ＰＤ１６６３２６は、ＡｂｌキナーゼおよびＢｒａｆキナーゼのための蛍光親和性試験における蛍光ローブとして利用される。ＳＫＦ８６００２およびＰＤ１６６３２６の構造を以下に示す。ＰＤ１６６３２６は、ＡＴＰ競合タンパク質キナーゼ阻害物質として既報されている（D.R. ヒューロン（Huron）ら，Clinical Cancer Res.（２００３）第９巻：１２６７）。
【０１７８】
実験上、これらおよび他のキナーゼのための他の蛍光ローブは次項により同定することができる。ｉ）１．０−１０，０００ｎＭ，好ましくは１０−１，０００ｎＭの範囲の効力のＡＴＰ競合阻害物質を同定すること；ii）候補の蛍光ローブが候補のキナーゼなしで異常に蛍光発光しないことを確定すること；iii）候補のキナーゼが候補の蛍光ローブなしで異常に蛍光発光しないことを確定すること；iv）同じ実験で、候補の蛍光ローブおよび候補キナーゼの両方の結合では測定しうる蛍光が観察されることを確定すること；ｖ）候補の小分子スイッチ制御阻害物質が、共培養での蛍光ローブの蛍光を調節することを確定すること。ｃ−ＡｂｌまたはＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼのためのこのような候補の蛍光ローブの実験は、例として、ＡＴＰ−競合阻害物質の開示を引用することができる：J. ウィッシング（Wissing）ら，Molecular and Cellular Proteomics（２００４）３：１１８１；N. P. シャー（Shah）ら，Science（２００４）３０５：３９９）参照。
【０１７９】
【化８】
2009503440.tif 000033
【０１８０】
図４３は、ｐ３８−αキナーゼのＡＴＰポケット内に結合したときのＳＫＦ８６００２の励起吸収スペクトルおよび蛍光発光スペクトルを示す。蛍光ローブＳＫＦ８６００２またはｐ３８−αキナーゼのいずれかを単独で評価した場合には、有意な励起または発光スペクトルは観察されなかった。ＳＫＦ８６００２およびｐ３８−αキナーゼを組み合わせて評価した場合のみ、ＳＫＦ８６００２の励起または発光スペクトルを測定することができた。
【０１８１】
図４４は、ＡｂｌキナーゼのＡＴＰポケット内に結合したときのＰＤ１６６３２６の励起吸収スペクトルおよび蛍光発光スペクトルを示す。蛍光ローブＰＤ１６６３２６またはＡｂｌキナーゼのいずれかを単独で評価した場合には、有意な励起または発光スペクトルは観察されなかった。ＰＤ１６６３２６およびＡｂｌキナーゼを組み合わせて評価した場合のみ、ＰＤ１６６３２６の励起または発光スペクトルを測定することができた。
【０１８２】
ＰＤ１６６３２６は、Ａｂｌキナーゼへの結合速度の遅い結合性蛍光ローブである。図４５は、励起−発光スペクトルの経時変化を示す。４０ｎＭのＡｂｌキナーゼに対して１００ｎＭのＰＤ１６６３２６の比率で用いたとき、３０℃において、最大励起−発光スペクトルを得るまでに９０分要した。したがって、ＰＤ１６６３２６は、ＡｂｌキナーゼのＡＴＰポケット内への結合を最大限に達成するためにはＡｂｌキナーゼの可撓性を必要とするような、結合速度の遅い結合蛍光ローブである。
【０１８３】
非リン酸化ｐ３８−αまたはリン酸化ｐ３８−αキナーゼの蛍光親和性試験プロトコル
Ａ．材料
１．ｐ３８−αキナーゼ
ａ．ロッシュ・アプライド・ダイアグノスティック（Roche Applied Diagnostics）より入手したリン酸化ｐ３８−αキナーゼ（０．８ｍｇ／ｍｌ（１２．５ｕＭ））
ｂ．デコード・ジェネティック社（Decode Genetics, Inc.）より入手した非リン酸化ｐ３８−αキナーゼ（０．５２ｍｇ／ｍｌ，１２ｕＭ）
２．ＳＫＦ８６００２蛍光ローブ（ＥＭＤバイオサイエンス（Biosciences））
３．０．１５％ｎ−オクチル−グルコシドを含むビス−トリス（Bis-Tris）プロパン緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ７）
４．３８４マイクロプレート（グライナー（Greiner）７８１０９１，Nuclear）
５．ポーラスター・オプティマ（Polarstar Optima）プレートリーダー（ＢＭＧ）
【０１８４】
Ｂ．手順：
１．ビス−トリス緩衝液中に４８ｎＭのｐ３８および２ｕＭのＳＫＦ８６００２を含有する溶液Ａの調製
２．下記表２２の工程１および２にしたがい、試験化合物をＤＭＳＯ中および反応緩衝液中に連続的に希釈。この希釈は、Tecan（ティーカン）社（もしくは同様の）ロボットワークステーションで自動的に行なうことも、または手作業で実施することもできる。
３．表２２の工程３にしたがい、溶液Ａを希釈化合物溶液と混合。この工程は、Tecan社（もしくは同様の）ロボットワークステーションで自動的に行なうことも、または手作業で実施することもできる。
４．タンパク質の安定性に応じて３０℃または室温で２時間培養。
５．３４０ｎｍでの励起に基づく発光波長４２０ｎｍでの読み取り。
【０１８５】
【表２５】
2009503440.tif 000034
＊工程１における使用量は、所望する最終化合物濃度の最大値によって決定される。この手順におけるスクリーニング化合物の最高値は１ｕＭ（工程３参照，“最終的阻害物質，ｕＭ”）。スクリーニングの最高濃度が１００ｎＭとなるときは、２ｕｌの１ｍＭストック溶液が工程１で用いられることになる。
【０１８６】
Ｃ．プロトコルおよび結果。
ポーラスター・オプティマ社プレートリーダー（ＢＭＧ）上、３８４プレート（グライナー社Nuclear３８４プレート）中で試験を行なった。典型的には、反応混合液は、最終容積６５ｕＬ中に、１ｕＭのＳＫＦ８６００２、８０ｎＭの３８−αキナーゼおよびｐＨ７，０．１５％（ｗ／ｖ）ｎ−オクチルグルコシドおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭビス−トリスプロパン緩衝液中の各種濃度の阻害物質を含有した。反応は、酵素を添加して開始した。プレートを３４０ｎｍでの励起に基づく４２０ｎｍにおける発光を読み取る前に、室温（〜２５℃）で２時間培養した。ＲＦＵ（相対蛍光単位）値を対照（小分子モジュレータの不存在）のそれと比較することにより、小分子の各濃度における阻害百分率を算出した。分光器（グラフパッド（GraphPad）社より入手可能）を用いて、小分子モジュレータの濃度範囲において得られる％阻害率から、小分子モジュレータについてＩＣ50値を算出した。時間依存性阻害の評価では、プレートを０．５、１、２、３、４および６時間などのいくつかの反応時間で読取った。各時点でのＩＣ50値を算出した。もし、ＩＣ50値が反応時間とともに減少するなら（４時間で２倍超）、阻害が時間依存性であると評価した。代表的な小分子のＩＣ50値を表２３に示す。
【０１８７】
【表２６】
2009503440.tif 000035
反応時間２時間の時点で得られるＩＣ50値
【０１８８】
ｐ３８−αキナーゼについての蛍光親和性試験における小分子スイッチ制御阻害物質のさらなる評価を表２４に示す。これらの例では、ｐ３８−αキナーゼ濃度は２４ｎＭに希釈した。小分子スイッチ阻害物質は、非リン酸化ｐ３８−αキナーゼ（第２欄）または二重にリン酸化されたｐ３８−αキナーゼ（ホスホトレオニン１８０＋ホスホチロシン１８２，第３欄）のいずれにおいても、スイッチ制御ポケットに結合することができる。スイッチ制御阻害物質は、ｐ３８−αキナーゼのリン酸化状態に関係なく、蛍光ローブＳＫＦ８６００２の置換について同じ能力を示した。具体的には、オフスイッチ状態が優勢であるような傾向が予めスイッチに備わっている非リン酸化ｐ３８−αキナーゼ、またはオンスイッチ状態が優勢であるような傾向が予めスイッチに備わっている二重にリン酸化されたｐ３８−αキナーゼのいずれでも、スイッチ阻害物質は、スイッチ制御リガンドにオフスイッチ状態をとらせるように誘導することが可能であった。第４欄は、非リン酸化ｐ３８−αキナーゼまたは二重にリン酸化されたｐ３８−αキナーゼを用いて評価した時の小分子スイッチ阻害物質の相対的能力を示す。比１．０は、阻害物質がｐ３８−αキナーゼの両方の形態で同じ能力であることを示す。１．０超の比は、非リン酸化形態のｐ３８−αキナーゼの阻害が、二重にリン酸化された形態よりも優位であることを意味する。１．０未満の比は、二重にリン酸化された形態のｐ３８−αキナーゼの阻害が、非リン酸化形態よりも優先であることを意味する。
【０１８９】
【表２７】
2009503440.tif 000036
【０１９０】
Ａｂｌキナーゼについての蛍光親和性試験
Ａ．材料
１．ｃ−Ａｂｌキナーゼ（配列番号５１），０．２４ｍｇ／ｍｌ，７．５ｕＭ
２．ＰＤ１６６３２６
３．トリス緩衝液：９０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液, ｐＨ７．５，０．２％オクチルグルコシド含有
４．３８４マイクロプレート（グライナー７８１０９１,Nuclear）
5. ポーラスター・オプティマ・プレートリーダー（ＢＭＧ）または同等物
【０１９１】
Ｂ．手順：
１．トリス緩衝液中に８０ｎＭのＡｂｌを含有する溶液Ａの調製
２．試験化合物を溶液Ａ中に連続的に希釈（ウェルあたり５０ｕＬ）
３．プレートを室温で０．５時間培養
４．トリス緩衝液を用いて２００ｎＭのＰＤ１６６３２６を調製
５．５０ｕＬのＰＤ１６６３２６溶液を溶液Ａを含む各ウェルに添加
６．３５５ｎｍでの励起に基づき直ちに発光波長４６０ｎｍでの読み取り。
７．各ランは、陽性対照（阻害物質なしのウェル）およびバックグラウンド対照（ＰＤ１６６３２６のみを含むウェル）を含む
【０１９２】
Ｃ．プロトコルおよび結果
ポーラスター・オプティマ社プレートリーダー（ＢＭＧ）上、３８４プレート（グライナー社Nuclear３８４プレート）中で試験を行なった。典型的には、反応混合液は、最終容積６５ｕＬ中に、１００ｎＭのＰＤ１６６３２６、４０ｎＭのＡｂｌキナーゼおよびｐＨ７，０．１５％（ｗ／ｖ）ｎ−オクチルグルコシドおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭビス−トリスプロパン緩衝液中の各種濃度の阻害物質を含有した。Ａｂｌキナーゼは、試験化合物とともに３０℃で２時間蛍光ローブなしで予備培養した。反応は、ＰＤ１６６３２６を添加して開始した。プレートを３５５ｎｍでの励起に基づく４６０ｎｍにおける発光を読み取る前に、室温（〜３０℃）で２時間培養した。ＲＦＵ（相対蛍光単位）値を対照（小分子モジュレータの不存在）のそれとの比較により、小分子の各濃度における調節百分率を算出した。
【０１９３】
Ａｂｌキナーゼについての蛍光親和性試験における小分子スイッチ制御阻害物質の評価の実施例を図４６に示す。予想外に、Ａｂｌキナーゼの小分子スイッチ制御阻害物質は、ＡＴＰ競合蛍光ローブＰＤ１６６３２６の結合を置換排除しなかった；むしろ、小分子阻害物質は、ＰＤ１６６３２６の結合を促進し、安定化させた。例として、実施例６６のスイッチ阻害物質は、蛍光ローブＰＤ１６６３２６の結合を濃度依存的に促進させた。結合したＰＤ１６６３２６の最終相対蛍光単位（ＲＦＵ）は、〜６０００ＲＦＵに匹敵したが、このＲＦＵ値はＡｂｌキナーゼのＡＴＰポケットが蛍光ローブＰＤ１６６３２６で飽和していることを意味する。
【０１９４】
図４７は、実施例６６のスイッチ阻害物質との共培養により生じるＡｂｌキナーゼのＡＴＰポケットへの蛍光ローブＰＤ１６６３２６の結合の濃度依存的促進をより明確に示す拡大図である。
【０１９５】
Ａｂｌキナーゼに結合した実施例６５の共結晶構造を解析した（下記参照）。実施例６５はＡｂｌキナーゼのオン複合スイッチ制御ポケットを占拠し、そこではＤＦＧモチーフ由来のフェニルアラニン４０１が‘はずれ’立体配座にある。Ａｂｌキナーゼに結合したＰＤ１６６３２６の共結晶構造も解析されている（B. Nagarら，Cell（２００３）第１１２巻：８５９）。ＰＤ１６６３２６はＡｂｌキナーゼのＡＴＰポケット内に結合する。ＰＤ１６６３２６の結合様式も、ＤＦＧモチーフのフェニルアラニン４０１を‘はずれ’立体配座に置換排除する。スイッチ制御阻害物質実施例６５もしくは関連類似物による蛍光ローブＰＤ１６６３２６のＡｂｌキナーゼへの結合の促進は、たとえばフェニルアラニン４０１を‘はずれ’立体配座に誘導など、スイッチ制御阻害物質がＡｂｌキナーゼのスイッチ制御ポケットに結合することにより説明される。実施例６５により引き起こされるこの誘導された立体配座的変化は、Ａｂｌキナーゼを、上記ＡＴＰ競合阻害物質ＰＤ１６６３２６の結合をより一層促進する立体配座に置く。キナーゼのスイッチ阻害物質は、ＡＴＰ競合阻害物質と共存し、かつ該ＡＴＰ競合阻害物質が‘はずれ’立体配座にあるＤＦＧモチーフのフェニルアラニンと結合する時のＡＴＰ競合阻害物質の該結合に相乗作用を及ぼす。両タイプの阻害物質のキナーゼに対するこのような相乗および／または相互の結合は、２以上のメカニズムによりタンパク質キナーゼを阻害する必要性のある哺乳類の疾患の治療に有用性があり、たとえば、単一薬剤に耐性となるＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼなどの発癌性キナーゼの選択圧を保持するために混合薬治療利用の必要性などである。
【０１９６】
スイッチ制御阻害物質のＡＴＰ競合蛍光ローブＰＤ１６６３２６結合促進作用が飽和してから、スイッチ阻害物質の能力を定量するため、結合促進効果についてのＥＣ50値を測定した。図４８は、初期の時点でのｃ−Ａｂｌキナーゼに対する蛍光ローブＰＤ１６６３２６の結合促進について実施例６４の飽和曲線を示す。０．０４３ｕＭのＥＣ50値は、蛍光ローブＰＤ１６６３２６の結合促進効果において、実施例６４について実験的に導かれた。図４８Ａは、初期の時点でのｃ−Ａｂｌキナーゼに対する蛍光ローブＰＤ１６６３２６の結合促進について実施例６５の飽和曲線を示す。０．０８１ｕＭのＥＣ50値は、蛍光ローブＰＤ１６６３２６の結合促進効果において、実施例６５について実験的に導かれた。図４８Ｂは、ｃ−Ａｂｌキナーゼに対する蛍光ローブＰＤ１６６３２６の結合促進について実施例６６の飽和曲線を示す。０．０３０ｕＭのＥＣ50値は、蛍光ローブＰＤ１６６３２６の結合促進効果において、実施例６６について実験的に導かれた。
【０１９７】
非リン酸化及びリン酸化ｐ３８−アルファ・キナーゼの熱変性
非リン酸化及びリン酸化ｐ３８−アルファ・キナーゼへの小分子の結合が、小分子モジュレータが存在する溶液中のタンパク質が変性する（融解する）温度を、小分子モジュレータが存在しない溶液中のタンパク質（アポタンパク質）の融解温度と比較する熱変性（熱融解、ＴＭ）によって示された。変性は溶液の絶対吸光度を適当な波長（典型的には２３０ｎｍ及び２４０ｎｍ）で温度の関数として測定することによって観察された。タンパク質が変性されるにつれて、ＵＶを吸収する官能基が融解温度での吸収を増大しながら、露出するようになった。化合物の親和性が増加することは融解温度がより高い値にシフトすることによって特徴付けられる。温度データは、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）分光光度計及びケムステーション（ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ）ＵＶ／Ｖｉｓ熱変性ソフトウェアを使用して集められた。
【０１９８】
小分子及び非リン酸化ｐ３８−アルファ・キナーゼの両方を含む試験溶液が次のように調製された：１．５μＬの１０ｍＭ阻害化合物ＤＭＳＯ溶液が９９７μＬの緩衝液（Ｂｉｓ−Ｔｉｓプロパン  １９ｍＭ  ｐＨ７，ＮａＣｌ  ８６．５ｍＭ，ＥＤＴＡ  １．７３ｍＭ，０．１５％（ｗ／ｖ）オクチルβ‐Ｄ‐グルコピラノシド（ＯＧ），３．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ）と混合され、そして、１．５μＬの１８４μＭ  ｐ３８−アルファ・キナーゼが溶液に加えられた。終濃度は、ｐ３８−アルファ・キナーゼ  ０．２８μＭ及び小分子  １５μＭであった。最終的なタンパク質と緩衝液の溶液は、過度に激しく混合することによる変性を最小限にするためにピペッターを使用して穏やかに混和された。
【０１９９】
非リン酸化ｐ３８−アルファ・キナーゼのみを含む試験溶液は、次のように調製された：１．５μＬの１８４μＭ  ｐ３８−アルファ・キナーゼが９９８μＬの緩衝液と混合されて緩衝液中に０．２８μＭの濃度のｐ３８を与えた。最終的な溶液は、分析のために５０μＬキュベットに移された。
【０２００】
小分子と二重リン酸化ｐ３８−アルファ・キナーゼの両方を含む試験溶液が次のように調製された：２μＬの１０ｍＭ小分子ＤＭＳＯ溶液が９９８μＬの緩衝液（Ｂｉｓ−Ｔｉｓプロパン  １９ｍＭ  ｐＨ７，ＮａＣｌ  ８６．５ｍＭ，ＥＤＴＡ  １．７３ｍＭ，０．１５％（ｗ／ｖ）オクチルβ‐Ｄ‐グルコピラノシド（ＯＧ），３．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ）と混合されて、緩衝液中に小分子の２０μＭの濃度を与えた。２μＬの２５μＭ  ｐ３８−アルファ・キナーゼが９８μＬの小分子／緩衝液の溶液と混合された。最終的なタンパク質と緩衝液の溶液は、過度に激しく混合することによる変性を最小限にするためにピペッターを使用して穏やかに混和された。最終的な溶液は、分析のために５０μＬキュベットに移された。
【０２０１】
二重リン酸化ｐ３８−アルファ・キナーゼのみを含む溶液が次のように調製された：２μＬの２５μＭ  ｐ３８−アルファ・キナーゼが９８μＬの緩衝液と混合されて、緩衝液中にｐＰ−３８の０．５μＭの濃度を与えた。タンパク質及び緩衝液の溶液は、過度に激しく混合することによる変性を最小限にするためにピペッターを使用して穏やかに混和された。最終的な溶液は、分析のために５０μＬキュベットに移された。
【０２０２】
ＵＶ分析が、ペルチェ式温度コントローラーを装備したアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）８４５３又は８４５２Ａ  ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計で行われた。温度プロファイルは、２４０ｎｍでＵＶ測定しながら、８時間にわたって、０．２℃ずつ、２５℃から７０℃まで増加した。変曲点を融解温度として報告するために、最初の導関数の計算が、データの平滑化とともに、結果のデータに適用された。
【０２０３】
表２５に示されるように、スイッチ制御インヒビターの、非リン酸化又は二重リン酸化ｐ３８−アルファ・キナーゼへの結合は、ｐ３８−アルファ・キナーゼを、アポキナーゼのコントロールに比較して、熱的に安定化する結果となる。一般に、非リン酸化ｐ３８−アルファ・キナーゼの熱的安定性はリン酸化ｐ３８−アルファ・キナーゼよりも高い。
【０２０４】
【表２８】
2009503440.tif 000037
【０２０５】
発ガン遺伝子Ｖ５９９Ｅ  Ｂｒａｆキナーゼの熱変性
スイッチ制御インヒビターがＶ５９９Ｅ  Ｂｒａｆキナーゼに結合することが、小分子を含む溶液中のタンパク質が変性される（融解する）温度を、単独の溶液中のタンパク質（アポタンパク質）の融解温度と比較することによる熱変性を用いて証明された。変性は、適切な波長（通常、２３０ｎｍ及び２４０ｎｍ）で溶液の絶対吸光度を温度の関数として測定することによって監視された。タンパク質が変性するに従い、より多くのＵＶ吸収性官能基が露出するようになり、融解温度での吸収の増大を引き起こした。増大した化合物の親和性は、融解温度がより高い値にシフトすることによって特徴付けられれた。温度データは、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）分光光度計及びケムステーション（ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ）ＵＶ／Ｖｉｓ熱変性ソフトウェアを使用して集められた。
【０２０６】
小分子とＶ５９９Ｅ  Ｂｒａｆキナーゼの両方を含む試験溶液が次の通り調製された：２μＬの１０ｍＭ小分子ＤＭＳＯ溶液が４９８μＬの緩衝液（Ｂｉｓ−Ｔｉｓプロパン  １９ｍＭ  ｐＨ７，ＮａＣｌ  ８６．５ｍＭ，ＥＤＴＡ  １．７３ｍＭ，０．１５％（ｗ／ｖ）オクチルβ‐Ｄ‐グルコピラノシド（ＯＧ），３．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ）と混合されて、緩衝液中に小分子の４０μＭの濃度を与えた。５０μＬの２．８μＭ  Ｖ５９９Ｅ  Ｂｒａｆキナーゼが５０μＬの小分子／緩衝液溶液と混合されボルテックスされて混合された。終濃度は、Ｖ５９９Ｅ  Ｂｒａｆキナーゼ１．４μＭ及び小分子２０μＭであった。最終的な溶液は、分析のために５０μＬキュベットに移された。
【０２０７】
Ｖ５９９Ｅ  Ｂｒａｆキナーゼのみを含む試験溶液は、次の通り調製された：５０μＬの２．８μＭ  Ｂ−Ｒａｆタンパク質が５０μＬの緩衝液に加えられ、ボルテックスされて混合されて、緩衝液中にＢ−Ｒａｆの１．４μＭの濃度を与えた。最終的な溶液は、分析のために５０μＬキュベットに移された。
【０２０８】
ＵＶ分析が、ペルチェ式温度コントローラーを装備したアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）８４５３又は８４５２Ａ  ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計で行われた。温度プロファイルは、２４０ｎｍでＵＶ測定しながら、８時間にわたって、０．２℃ずつ、２５℃から７０℃まで増加した。変曲点を融解温度として報告するために、最初の導関数の計算が、データの平滑化とともに、結果のデータに適用された。これらのデータは、表２６に例示される。
【０２０９】
【表２９】
2009503440.tif 000038
【０２１０】
Ａｂｌキナーゼの熱変性
スイッチ制御インヒビターのＡｂｌキナーゼへの結合が、熱変性を使用して、小分子を含む溶液中のタンパク質が変性（融解）される温度と単独で含まれる溶液中のタンパク質（アポタンパク質）の融解温度とを比較することによって証明された。変性は溶液の絶対吸光度を適切な波長（通常、２３０ｎｍ及び２４０ｎｍ）で、温度の関数として測定することによって観察された。タンパク質が熱変性されるに従って、より多くのＵＶ吸収性官能基が露出されるようになり、融解温度における吸光度の増加を引き起こす。化合物の親和性が増大したことは、融解温度がより高い温度にシフトすることによって特徴付けられる。温度データは、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）分光光度計及びケムステーション（ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ）ＵＶ／Ｖｉｓ熱変性ソフトウェアを使用して集められた。
【０２１１】
小分子とＡｂｌキナーゼの両方を含む試験溶液が次のように調製される：ＤＭＳＯ溶液中１０ｍＭの小分子のうち２μＬが９９８μＬの緩衝液（Ｂｉｓ−Ｔｉｓプロパン  １９ｍＭ  ｐＨ７、ＮａＣｌ  ８６．５ｍＭ、ＥＤＴＡ  １．７３ｍＭ、０．１５％（ｗ／ｖ）オクチルβ‐Ｄ‐グルコピラノシド（ＯＧ）、３．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ）と混合され、緩衝液中で２０μＭの小分子の濃度を与えた。５μＬの４０μＭ  Ａｂｌキナーゼが１９５μＬの小分子／緩衝液の溶液と混合された。最終濃度は、Ａｂｌキナーゼ１μＭ及びの小分子２０μＭであった。最終的なタンパク質と緩衝液の溶液は、過度に激しく混合することによる変性を最小限にするためにピペッターを使用して穏やかに混和された。最終的な溶液は分析のために５０μＬキュベットに移された。
【０２１２】
Ａｂｌキナーゼのみを含む試験溶液が次のように調製された：４０μＭ  Ａｂｌキナーゼの５μＬが１９５μＬの緩衝液と混合され、緩衝液中で１μＭのＡｂｌキナーゼの濃度を与えた。タンパク質及び緩衝液の溶液は、過度に激しく混合することによる変性を最小限とするためにピペッターを使用して穏やかに混和された。最終的な溶液は分析のために５０μＬキュベットに移された。
【０２１３】
ＵＶ分析が、ペルチェ式温度コントローラーを装備したアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）８４５３又は８４５２Ａ  ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計で行われた。温度プロファイルは、２４０ｎｍでＵＶ測定しながら、８時間にわたって、０．２℃ずつ、２５℃から７０℃まで増加した。変曲点を融解温度として報告するために、最初の導関数の計算が、データの平滑化とともに、結果のデータに適用された。これらのデータは表２７に例示される。
【０２１４】
【表３０】
2009503440.tif 000039
【０２１５】
（実施例Ｄ）
ステップ６．タンパク質のモジュレーションのスイッチ制御機構を立証する
タンパク質に対する親和性を持つこと又はタンパク質の活性の機能的なモジュレーションを示すことが判っている小分子は、結合又は機能的モジュレーションが天然のリガンド部位（例えば、キナーゼ・タンパク質のＡＴＰ部位）と非拮抗的又は不拮抗的であることを判断するために生化学的研究によって試験される。これは、標準的な生化学的分析法を使用して達成される。
【０２１６】
実施例の方法によって、小分子スイッチ・インヒビター候補が、ｐ３８−アルファ・キナーゼの生化学的アッセイにおいて評価され、ＡＴＰ−非競争的な振舞いを示すことが説明された。
【０２１７】
ホスホ−ｐ３８−アルファ・キナーゼのスペクトル分析
Ａ．材料
１．ホスホ−ｐ３８−アルファ  ロシュ・アプライド・ダイアグノスティックス製
（０．８ｍｇ／ｍＬ（１２．５ｕＭ））
２．ｐ３８基質：ＩＰＴＳＰＩＴＴＴＹＦＦＦＫＫＫ−ＯＨ（純度＞９５％）
バイオペプチド製
３．リン酸キナーゼ（ＰＫ）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）  シグマ製：
１ｍＬにつき、８０６ユニットのＰＫ及び１１００ユニットのＬＤＨ
４．ＮＡＤＨ（シグマ）：  ５．６ｍＭ
５．ホスホエノールピルビン酸（シグマ）：  ２０ｍＭ
６．トリス緩衝液：  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ／２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，
ｐＨ７．５，１５０ｕＭ  ｎ‐ドデシル‐ｂ‐Ｄ‐マルトピラノシド，
及び５％  ＤＭＳＯ
７．ＡＴＰ（２０ｍＭ）
８．３８４穴マイクロプレート（コーニング  ３６７５）
９．ポーラスター・オプティマ・プレートリーダー（ＢＭＧ）
【０２１８】
Ｂ．ＩＣ５０決定の方法
ＩＣ５０の決定は、インヒビターをＤＭＳＯで希釈し、次いでさらに反応緩衝液で希釈し、最後に全ての酵素を含む混合液１（表２９）と混合する系列希釈スキームを用いて行われた。希釈方法は、様々な濃度の試験化合物が適切に緩衝液及び酵素反応混合液に希釈されることを確実にした。
【０２１９】
Ｃ．方法
１．試験化合物を、表２８のステップ１及び２に従って、１００％ＤＭＳＯ及び反応緩衝液にシリアル希釈する。
２．ミクスチャ１を表２９に記載されるように調製する（３０分以内に使用する）
３．表２８のステップ３に従って、希釈された化合物をミクスチャ１と混合する
４．３８４ウェルプレートを３０℃で２時間インキュベートする
５．１μＬの３０ｍＭ  ＡＴＰを各ウェルに加え、よく混合する
６．１点につき、１分毎に、少なくとも２．５時間にわたって、３０℃で、マイクロプレートリーダーで読む
【０２２０】
【表３１】
2009503440.tif 000040
【０２２１】
＊ステップ１で使用される量は、最も高い最終的な化合物の濃度によって決定される。この方法では、最も高いスクリーニング化合物は１ｕＭである（ステップ３を見よ、“最終インヒビター，ｕＭ”）。最も高いスクリーニング濃度が１００ｎＭならば、それから、２ｕｌの１ｍＭストックがステップ１で使用される。
＊＊ＤＭＳＯ（終濃度５％）をトリス緩衝液に加えることによって作られる。
【０２２２】
【表３２】
2009503440.tif 000041
【０２２３】
Ｄ．連続分光光度測定のためのデータ分析
それぞれのデータセットに対する反応速度を得るために、ｔ＝１．５ｈｒから２．５ｈｒまでに収集されたデータに対して線形回帰が適用された。データは、このタイムフレームの間、だいたいリニアであった。阻害のパーセンテージが、化合物が存在するとき速度とコントロールの速度との比較によって計算された。ＩＣ５０値は、インヒビターの濃度範囲で決定された１連の％阻害値から、グラフパッド・プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）（バージョン４）を使用して計算された。測定条件下（コーニング３６７５マイクロプレート・ウェルで１００μＬの高さ）での３４０ｎｍのＮＡＤＨに対する消散係数が、５×１０３Ｍ−１と決定された。
【０２２４】
図５２は、実施例７２の小分子がＡＴＰと非競合的であることを表す。
【０２２５】
Ｘ線クリスタログラフィーのスイッチ制御インヒビター結合機構を決定するための使用
スイッチ制御モジュレータの様々なタンパク質への結合様式が、Ｘ線クリスタログラフィー又はＮＭＲ法によって決定される。次のセクションは、結合の分子様式を決定するために使われるＸ線クリスタログラフィー法を概説する。
【０２２６】
１．結晶化ラボラトリ：全ての結晶化トライアルデータは、結晶化トライアルを成り立たせ、結果を記録する、種々の自動装置を駆動するために使用されるカスタム・ビルドのデータベースソフトウェアを使用して、取り込まれた。使用されたコンピュータ・ハードウェアは、複数のリナックス・ワークステーション、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ２０００  Ｓｅｒｖｅｒ及びシリコングラフィックスのＯ２ワークステーションを含んだ。Ｘ線クリスタログラフィソフトウェアは、ＨＫＬ２０００、ＤＥＮＺＯ及びＳＣＡＬＥＰＡＣＫ（Ｘ線解析データ処理）；ＭＯＳＦＩＬＭ；ＡＭＯＲＥ、ＭＯＬＲＥＰ及びＲＥＦＭＡＣ（分子置換法による位相決定法、ＭＥＲ及びＭＡＤを含む、種々のクリスタログラフィックなコンピュータ計算法）を含む、ＣＣＰ４スィート；ＳｎＢ（重原子の位置決定のため）；ＳＨＡＲＰ（重原子の位相決定プログラム）；ＣＮＸ（モデル改良を含む、種々のクリスタログラフィックなコンピュータ演算）；ＥＰＭＲ（分子置換）；ＸｔａｌＶｉｅｗ（モデルの可視化及び構築）を含む。
【０２２７】
２．結晶の成長及びＸ線回折品質分析：少しのマトリックスと焦点の合わせられた結晶化スクリーンが、２又は３以上の温度で、リガンドあり及びなしで、組み立てられた。リガンドなしで得られた結晶（アポ結晶）は、リガンド・ソーキング実験のために使用された。一旦、適するタンパク質結晶が得られると、様々な凍結保存条件の下でのタンパク質結晶の回折品質を決定するために、Ｒ−ＡＸＩＳ  ＩＶイメージング・プレート・システム及びＸ−ストリーム・クリオスタット上で、スクリーニングが行なわれた。十分な回折品質をもつタンパク質結晶が、イン・ハウスのＸ線回折データ収集のために使用されたか、又は、液体窒素中に保管され、アルゴン国立研究所のアドバンスト・フォトン・ソースのＣＯＭ−ＣＡＴビームライン、又は、他のシンクロトロン・ビーム・ラインでのシンクロトロンＸ線放射ソースでの次のデータ収集のために取っておかれた。タンパク質の結晶の回折の限界が、９０°ずれたファイ・スピンドル設定がされた少なくとも２つの回折イメージをとることによって決定された。ファイ・スピンドルは回折データ収集中に１°ずつ回転させられる。両イメージは、Ｘ線データ解析及び編集ソフトウェアのＨＫＬ−２０００スイートによって処理された。５０％以上のインデックスされた反射が１シグマ以上の強度をもつタンパク質結晶の回折解像度が、解像シェルのより高い解像度の限界として受容された。
【０２２８】
３．Ｘ線回折データ収集：完全なデータセットは、最も高解像度において、シェルが収集した全反射のうち少なくとも９０％をもつとして定義される。Ｘ線回折データは、Ｘ線回折データ処理ソフトウェアのＨＫＬ−２０００スイートを使用して処理された（ユニークな反射及び強度に減縮された）。
【０２２９】
４．構造決定：タンパク質−小分子複合体の構造が、ＰＤＢで利用可能な１又は２以上のタンパク質検索モデルを使用して、分子置換法（ＭＲ）によって決定された。必要であれば、重原子についての多重重原子同型置換法（ＭＩＲ）及び／又は多波長異常分散法（ＭＡＤ）によって、構造決定が助けられた。もし、結晶のＥＸＡＦＳスキャンが、適当な重原子シグナルを見せるならば、ＭＡＤのシンクロトロンデータセットが、重原子ソーキングされた結晶について集められた。誘導体化のための重原子データセットの分析が、コンピュータ計算プログラムのＣＣＰ４クリスタログラフィック・スイートを使用して完了された。重原子部位が（｜ＦＰＨ｜−｜ＦＰ｜）分散差パターソン及び（｜Ｆ＋｜−｜Ｆ−｜）異常分散差パターソンマップによって同定された。
【０２３０】
複合制御ポケットに結合したスイッチ制御インヒビターのＸ線クリスタログラフィー構造分析
実施例８のスイッチ制御インヒビターの非リン酸化ｐ３８−アルファ・キナーゼへの結合
実施例８の構造が下式に示される。
【０２３１】
【化９】
2009503440.tif 000042
【０２３２】
図３４は、ｐ３８−アルファ・キナーゼに結合した実施例８のスイッチ制御インヒビターの共結晶構造を示す。実施例８のスルホニル尿素のカルボニル部分はＺ基のアルギニン７０と直接的な水素結合をする。アルギニン７０は、ｐ３８−アルファ・キナーゼがオンの状態にあるときに、リン酸化トレオニン１８０を安定化するための不可欠なアンカー基である。アルギニン７０のグアニジン側鎖の反対側は、グルタミン酸３２８と直接的な水素結合及び静電的な相互作用をして、二量化ドメイン（Ｋ−アルファ・へリックスのアミノ酸残基のイソロイシン３３４からセリン３４７）は、ｐ３８−アルファ・キナーゼのダイマー化又はオリゴマー化に適さない状態で、Ｃ−アルファ・ヘリックスと反対方向に押し込まれる。実施例８のスルホニル尿素のスルホニル部分は、スイッチ制御リガンドのＮ−末端領域の残基である、ヒスチジン１７４と静電的な相互作用をする。
【０２３３】
実施例８の尿素部分は、グルタミン酸７１の側鎖と直接的な水素結合によるコンタクトをする。グルタミン酸７１は、プロテイン・キナーゼにおいて保存されており、ベータ鎖５の保存されたリジン５３とエンゲージすることによって、構造上及び反応上の役割を提供する。
【０２３４】
実施例８のナフチル部分は、（スイッチ制御リガンドの）フェニルアラニン１６９とエッジ・フェイスのπ−スタッキング相互作用をして、フェニルアラニン１６９をアウト・コンホメーションの状態で安定化し、それによって、ＡＴＰコファクターポケットの空間をふさぐ。ナフチル部分は、また、ベータ・ストランド５の保存されたリジン５３と直接的なコンタクトをする。ナフチル部分は、また、ベータ・ストランド５の保存されたリジン５３のアルキレン側鎖、ベータ・ストランド６のイソロイシン８４、並びに、ベータ・ストランド７のロイシン１０４及びトレオニン１０６と、直接的なコンタクトをする。
【０２３５】
実施例８の第３ブチル部分は、ｐ３８−アルファ・キナーゼのスイッチ制御機構がオンの状態ならばフェニルアラニン１６９によって代わりにふさがれるであろう、‘イン・コンホメーション’のポケットをふさぐ。第３ブチル部分は、Ｃ−アルファ・ヘリックスのロイシン７４及びメチオニン７８；ベータ・ストランド６のバリン８３；Ｅ−アルファ・ヘリックスのイソロイシン１４１；反応ループのイソロイシン１４６及びヒスチジン１４８と、疎水的なコンタクトをする。
【０２３６】
小分子インヒビターである実施例８とｐ３８−アルファ・キナーゼの複合型オン・スイッチ・ポケットとの間のこれらの直接的なコンタクトに加えて、スイッチ機構における他の変化が実施例８によって誘導されて、このプロテイン・キナーゼの生物学的活性をバイオミメティカルにダウン・レギュレートする。
【０２３７】
具体的には、アミノ酸残基ロイシン１７１からグルタミン酸１９２までのスイッチ制御リガンドの大部分が、ペプチド又はタンパク質基質の結合ポケットに入り込み、それによって、該基質がｐ３８−アルファ・キナーゼに結合することを妨げる。
【０２３８】
チロジン３５は、スイッチ制御ポケットのアルギニン６７と、π−カチオン静電相互作用をする。
【０２３９】
非リン酸化トレオニン１８０と結合し、それを安定化するために、アスパラギン酸１７６、アスパラギン酸１７７及びグルタミン酸１７８は、オフ・スイッチ制御ポケットを形成する。トリプトファン１８７は、非リン酸化チロジン１８２と、エッジ・フェイスのπ−スタッキング相互作用をする。
【０２４０】
最後に、グルタミン酸１７８もまた、スイッチ制御リガンドの残基であるトレオニン１８５と水素結合を形成して、トレオニン１８５を、反応に関与するアミノ酸であるアスパラギン酸１５０、アスパラギン１５５及びアスパラギン酸１６８と、直接的及び水を介した水素結合のネットワークによって相互作用するようにする。トレオニン１８５によって誘導される水素結合のネットワークは、これらの残基を非反応性のオリエンテーションにする。
【０２４１】
実施例２９のスイッチ制御インヒビターの非リン酸化ｐ３８−アルファ・キナーゼへの結合
実施例２９の構造は下式に示される。
【０２４２】
【化１０】
2009503440.tif 000043
【０２４３】
図３５は、ｐ３８−アルファ・キナーゼに結合した実施例２９のスイッチ制御インヒビターの共結晶構造を示す。実施例２９のカルボン酸部分は、アミノ酸残基アルギニン６７及びチロジン３５と静電的相互作用をする。アルギニン６７及びチロジン３５は、ｐ３８−アルファ・キナーゼのスイッチ機構がオフの状態にあるとき、お互いに、バイオミメティカルに相互作用をする。実施例２９カルボン酸側鎖は、この相互作用を増強する。
【０２４４】
実施例２９の尿素部分は、グルタミン酸７１の側鎖と直接的な水素結合によるコンタクトをする。グルタミン酸７１は、プロテイン・キナーゼで保存されていて、ベータ・ストランド５の保存されたリジン５３とエンゲージすることによって、構造上及び反応上の役割を提供する。
【０２４５】
実施例２９のナフチル部分は、（スイッチ制御リガンドの）フェニルアラニン１６９とエッジ・フェイスのπ−スタッキング相互作用をして、フェニルアラニン１６９をアウト・コンホメーションの状態で安定化し、それによってＡＴＰコファクター・ポケットの空間をふさぐ。ナフチル部分また、ベータ・ストランド５の保存されたリジン５３、ベータ・ストランド６のイソロイシン８４、並びに、ベータ・ストランド７のロイシン１０４及びトレオニン１０６のアルキレン側鎖と、直接的なコンタクトをする。
【０２４６】
実施例２９の第３ブチル部分は、ｐ３８−アルファ・キナーゼのスイッチ機構がオンの状態ならばフェニルアラニン１６９によってかわりにふさがれるであろう‘イン・コンホメーション’なポケットをふさぐ。第３ブチル部分は、Ｃ−アルファ・ヘリックスのロイシン７４及びメチオニン７８；ベータ・ストランド６のバリン８３；Ｅ−アルファ・ヘリックスのイソロイシン１４１；及び、反応ループのヒスチジン１４８、と疎水的なコンタクトをする。
【０２４７】
小分子インヒビターである実施例２９とｐ３８−アルファ・キナーゼの複合型オン・スイッチ・ポケットとの間の直接的なコンタクトに加え、実施例２９によって、スイッチ機構における他の変化が誘導されて、このプロテイン・キナーゼの生物学的な活性をバイオミメティカルにダウン・レギュレートする。
【０２４８】
具体的には、アミノ酸残基ロイシン１７１からグルタミン酸１９２までのスイッチ制御リガンドの大部分がペプチド又はタンパク質基質の結合ポケットに入り込み、それによって該基質がｐ３８−アルファ・キナーゼに結合するのを妨げる。
【０２４９】
アルギニン７０のグアニジン側鎖は、グルタミン酸３２８と、直接的な水素結合及び静電的な相互作用をして、二量化ドメイン（Ｋ−アルファ・ヘリックスのアミノ酸残基、イソロイシン３３４からセリン３４７）は、ｐ３８−アルファ・キナーゼのダイマー化又はオリゴマー化に適さない状態で、Ｃ−アルファ・ヘリックスの反対側に押し込まれされる。
【０２５０】
トリプトファン１８７は、非リン酸化チロジン１８２と、エッジ・フェイスのπ−スタッキング相互作用をする。
【０２５１】
スイッチ制御リガンドの残基であるグリジン１７０からグルタミン酸１７８には、電子密度がない。それにもかかわらず、反応に関与するアミノ酸残基であるアスパラギン酸１５０、アスパラギン１５５及びアスパラギン酸１６８は、非反応性のオリエンテーションの状態に置かれている。
【０２５２】
実施例６１のスイッチ制御インヒビターの非リン酸化ｐ３８−アルファ・キナーゼへの結合
実施例６１の構造は下式に示される。
【化１１】
2009503440.tif 000044
【０２５３】
図３６は、ｐ３８−アルファ・キナーゼに結合した実施例６１のスイッチ制御インヒビターの共結晶構造を示す。実施例６１のカルビノール部分は、Ｚ基のアルギニン７０と直接的な水素結合をする。アルギニン７０は、ｐ３８アルファ・キナーゼのスイッチ機構がオンの状態のときに、リン酸化トレオニン１８０を安定化するために不可欠なアンカー基である。アルギニン７０のグアニジン側鎖の反対面は、グルタミン酸３２８と直接的な水素結合及び静電的相互作用をして、二量化ドメイン（Ｋ−アルファ・ヘリックスのアミノ酸残基であるイソロイシン３３４からセリン３４７）は、ｐ３８−アルファ・キナーゼのダイマー化又はオリゴマー化に適さない状態で、Ｃ−アルファ・ヘリックスと反対方向に、押し込まされる。
【０２５４】
実施例６１の尿素部分は、グルタミン酸７１の側鎖と直接的な水素結合によるコンタクトをする。グルタミン酸７１は、プロテイン・キナーゼで保存されており、ベータ・ストランド５の保存されたリジン５３とエンゲージすることによって、構造上及び反応上の役割を提供する。
【０２５５】
実施例６１のパラ−クロロフェニル部分は、（スイッチ制御リガンドの）フェニルアラニン１６９とエッジ・フェイスのπ−スタッキング相互作用をして、フェニルアラニン１６９をアウト・コンホメーションの状態に安定化し、それによってＡＴＰコファクター・ポケットの空間をふさぐ。パラ−クロロフェニル部分はまた、ベータ・ストランド５の保存されたリジン５３、ベータ・ストランド６のイソロイシン８４、並びに、ベータ・ストランド７のロイシン１０４及びトレオニン１０６の、アルキレン側鎖と直接的なコンタクトをする。
【０２５６】
実施例６１の第３ブチル部分は、ｐ３８−アルファ・キナーゼのスイッチ機構がオンの状態ならばトレオニン１６９によってかわりにふさがれるであろう、‘イン・コンホメーション’のポケットをふさぐ。第３ブチル部分はまた、Ｃ−アルファ・ヘリックスのロイシン７４及びメチオニン７８；ベータ・ストランド６のバリン８３；Ｂ−アルファ・ヘリックスのイソロイシン１４１；及び、反応ループのヒスチジン１４８と、疎水的なコンタクトをする。
【０２５７】
小分子インヒビターである実施例６１とｐ３８−アルファ・キナーゼの複合型オン・スイッチ・ポケットとの間の直接的なコンタクトに加えて、実施例６１によって、スイッチ機構における他の変化が誘導されて、このプロテイン・キナーゼの生物学的な活性をバイオミメティカルにダウン・レギュレートする。
【０２５８】
具体的には、アミノ酸残基ロイシン１７１からグルタミン酸１９２までのスイッチ制御リガンドの大部分がペプチド又はタンパク質の結合ポケットに入り込み、それによって、該基質がｐ３８−アルファ・キナーゼに結合することを防ぐ。
【０２５９】
チロジン３５は、スイッチ制御ポケットのアルギニン６７と、πカチオン静電相互作用をする。
【０２６０】
アスパラギン酸１７６、アスパラギン酸１７７、及びグルタミン酸１７８は、非リン酸化トレオニン１８０を結合し安定化するためのオフ・スイッチ制御ポケットを形成する。トリプトファン１８７は、非リン酸化チロジン１８２と、エッジ・フェイスのπ−スタッキング相互作用をする。
【０２６１】
最後に、グルタミン酸１７８もまた、スイッチ・コントロールリガンドの残基であるトレオニン１８５と水素結合を形成して、トレオニン１８５を、反応に関与するアミノ酸残基であるアスパラギン酸１５０、アスパラギン１５５及びアスパラギン酸１６８と直接的及び水を介する水素結合によって相互作用するようにする。
【０２６２】
実施例６２のスイッチ制御インヒビターの非リン酸化ｐ３８−アルファ・キナーゼへの結合
実施例６２の構造は下記式に示される。
【０２６３】
【化１２】
2009503440.tif 000045
【０２６４】
図３７は、ｐ３８アルファ・キナーゼに結合した実施例６２のスイッチ制御インヒビターの共結晶構造を示す。実施例６２のアミド部分は、Ｚ基のアルギニン７０と直接的な水素結合をする。アルギニン７０は、ｐ３８−アルファ・キナーゼのスイッチ機構がオン状態のときに、リン酸化トレオニン１８０を安定化するために不可欠なアンカー基である。アミドのβ‐ヒドロキシエチルＯＨ部分は、スイッチ・ポケットにアミドカルボニル部分ともにｃｉｓ位で結合して、アミドカルボニルとアルギニン７０のグアニジン側鎖の水素結合を強化するように作用する。アルギニン７０のグアニジン側鎖の反対側は、グルタミン酸３２８と直接的な水素結合及び静電的な相互作用をして、二量体形成ドメイン（イソロイシン３３４からセリン３４７までのＫ−アルファへリックスのアミノ酸残基）に、ｐ３８アルファ・キナーゼのダイマー化又はオリゴマー化に適さない状態で、Ｃ−アルファへリックスと反対方向に押し込まされる。
【０２６５】
実施例６２の尿素部分は、グルタミン酸７１の側鎖と直接的な水素結合によるコンタクトをする。グルタミン酸７１はプロテイン・キナーゼでは保存され、ベータ・ストランド５の保存されたリジン５３とエンゲージすることことによって、構造上及び反応上の役割を提供する。
【０２６６】
実施例６２の２，３−ジクロロフェニル部分は、（スイッチコントロールリガンドの）フェニルアラニン１６９と、エッジ・フェイスのπ−スタッキング相互作用をして、フェニルアラニン１６９をアウト・コンホメーションの状態で安定化し、それによってＡＴＰコファクターポケットの空間をふさぐ。２，３−ジクロロフェニル部分はまた、ベータ・ストランド５の保存されたリジン５３、ベータ・ストランド６のイソロイシン８４、並びに、ベータ・ストランド７のロイシン１０４及びトレオニン１０６の、アルキレン側鎖と直接的なコンタクトをする。２，３−ジクロロフェニル部分のメタ−クロロ置換基は、保存されたアミノ酸残基であるリジン５３の主鎖のＮＨ基の水素結合の距離内にある。
【０２６７】
実施例６２の第３ブチル部分は、ｐ３８−アルファ・キナーゼがオンの状態だとしたらフェニルアラニン１６９によってかわりにふさがれるであろう、‘イン・コンホメーション’なポケットをふさぐ。第３ブチル部分は、Ｃ−アルファ・ヘリックスのロイシン７４及びメチオニン７８；ベータ・ストランド６のバリン８３；Ｅ−アルファ・ヘリックスのイソロイシン１４１；及び、反応ループのヒスチジン１４８と、疎水的なコンタクトをする。
【０２６８】
小分子インヒビターである実施例６２とｐ３８−アルファ・キナーゼの複合型オン・スイッチとの間のこれらの直接的なコンタクトに加えて、実施例６２によってスイッチ機構における他の変化が誘導されて、このプロテイン・キナーゼの生物学的な活性をバイオミメティカルにダウン・レギュレートする。
【０２６９】
具体的には、アミノ酸残基１７１からグルタミン酸１９２までのスイッチ制御リガンドの大部分が、ペプチド又はタンパク質基質の結合ポケットに入り込んで、それによって該基質がｐ３８−アルファ・キナーゼに結合するのを妨げる。
【０２７０】
チロジン３５は、スイッチ制御ポケットのアルギニン６７と、π−カチオン静電相互作用をする。
【０２７１】
アスパラギン酸１７６、アスパラギン酸１７７及びグルタミン酸１７８は、非リン酸化トレオニン１８０を結合し、安定化するするためのオフ・スイッチ制御ポケットを形成する。トリプトファン１８７は、非リン酸化チロジン１８２と、エッジ・フェイスのπ−スタッキング相互作用をする。
【０２７２】
最後に、グルタミン１７８はまた、スイッチ制御リガンドの残基であるトレオニン１８５と水素結合を形成し、トレオニン１８５を、反応に関与するアミノ酸残基であるアスパラギン酸１５０、アスパラギン１５５及びアスパラギン酸１６８と直接的及び水を介した水素結合によって相互作用するようにする。トレオニン１８５によって誘導されるこの水素結合ネットワークは、これらの残基を非反応性のオリエンテーションにする。
【０２７３】
実施例６３のスイッチ制御インヒビターの非リン酸化ｐ３８−アルファ・キナーゼへの結合
実施例６３の構造は下式に示される。
【０２７４】
【化１３】
2009503440.tif 000046
【０２７５】
図３８は、ｐ３８−アルファ・キナーゼに結合した実施例６３のスイッチ制御インヒビターの共結晶構造を示す。実施例６３のカルビノール部分は、Ｚ基のアルギニン７０と、直接的な水素結合をする。アルギニン７０は、ｐ３８−アルファ・キナーゼのスイッチ機構がオンの状態にあるときに、リン酸化トレオニン１８０を安定化するために不可欠なアンカー基である。アルギニン７０のグアニジン側鎖の反対側は、グルタミン酸３２８と直接的な水素結合及び静電的な相互作用をして、二量化ドメイン（Ｋ−アルファ・ヘリックスのアミノ酸残基であるイソロイシン３３４からセリン３４７）に、ｐ３８−アルファ・キナーゼのダイマー化又はオリゴマー化に適さない状態で、Ｃ−アルファ・ヘリックスと反対方向に押し込まされる。
【０２７６】
実施例６３の尿素部分は、グルタミン酸７１の側鎖と直接的な水素結合によるコンタクトをする。グルタミン酸７１は、プロテイン・キナーゼで保存されていて、ベータ・ストランド５の保存されたリジン５３とエンゲージすることによって、構造上及び反応上の役割を提供する。
【０２７７】
実施例６３の２，３−ジクロロフェニル部分は、（スイッチ制御リガンドの）フェニルアラニン１６９と、エッジ・フェイスのπ−スタッキング相互作用をして、フェニルアラニン１６９をアウト・コンホメーションの状態に安定化し、それによってＡＴＰコファクター・ポケットの空間をふさぐ。２，３−ジクロロフェニル部分はまた、ベータ・ストランド５の保存されたリジン５３、ベータ・ストランド６のイソロイシン８４、並びに、ベータ・ストランド７のロイシン１０４及びトレオニン１０７の、アルキレン側鎖と直接的なコンタクトをする。２，３−ジクロロフェニル部分のメタ−クロロ置換基は、保存されたアミノ酸であるリジン５３の主鎖のＮＨ基の水素結合の距離内にある。
【０２７８】
実施例６３の（ピラゾール環の３位に結合した）フェニル部分は、ｐ３８−アルファ・キナーゼのスイッチ機構がオンの状態であるとすればフェニルアラニン１６９によって代わりにふさがれるであろう‘イン・コンホメーション’なポケットをふさぐ。ピラゾール環上のこのポジションのフェニル部分はまた、このポジションにフェニル又はヘテロアリールを許容しない他のキナーゼに対してｐ３８−アルファ・キナーゼに関する高度の選択性を与える。フェニル部分は、Ｃ−アルファ・フェリックスのロイシン７４及びメチオニン７８；ベータ・ストランド６のバリン８３；Ｅ−アルファ・ヘリックスのイソロイシン１４１；及び、反応ループのイソロイシン１４６及びヒスチジン１４８と、疎水的なコンタクトをする。
【０２７９】
小分子インヒビターである実施例６３とｐ３８−アルファ・キナーゼの複合型オン・スイッチ・ポケットとの間のこれらの直接的なコンタクトに加えて、スイッチ機構における他の変化が実施例６３によって誘導されて、このプロテイン・キナーゼの生物学的活性をバイオミメティカルにダウンレギュレートする。
【０２８０】
具体的には、アミノ酸残基のロイシン１７１からグルタミン酸１９２までのスイッチ制御リガンドの大部分が、ペプチド又はタンパク質基質の結合ポケットに入り込み、それによって該基質がｐ３８−アルファ・キナーゼに結合することを妨げる。
【０２８１】
チロジン３５は、スイッチ制御ポケットのアルギニン６７と、π−カチオン静電相互作用をする。
【０２８２】
アスパラギン酸１７６、アスパラギン酸１７７及びグルタミン酸１７８は、非リン酸化トレオニン１８０を結合及び安定化するための、オフ・スイッチ制御ポケットを形成する。トリプトファン１８７は、非リン酸化チロジン１８２と、エッジ・フェイスのπ−スタッキング相互作用をする。
【０２８３】
最後に、グルタミン酸１７８はまた、スイッチ制御リガンドの残基であるトレオニン１８５と水素結合を形成して、トレオニン１８５を反応に関与するアミノ酸残基であるアスパラギン酸１５０、アスパラギン１５５及びアスパラギン酸１６８と直接的及び水を介する水素結合ネットワークによって相互作用するようにする。トレオニン１８５によって誘導されるこの水素結合ネットワークは、これらの残基を非反応性のオリエンテーションにする。
【０２８４】
実施例２９のスイッチ制御インヒビターの二重リン酸化ｐ３８アルファ・キナーゼへの結合
実施例２９の構造は下式に示される。
【０２８５】
【化１４】
2009503440.tif 000047
【０２８６】
図３９は、二重リン酸化ｐ３８−アルファ・キナーゼに結合した実施例２９のスイッチ制御インヒビターの共結晶構造を表す。実施例２９のカルボン酸部分は、アミノ酸残基アルギニン６７及びチロジン３５と静電的な相互作用をする。アルギニン６７及びチロジン３５は、ｐ３８−アルファ・キナーゼのスイッチ機構がオフの状態にあるときに、お互いにバイオミメティカルに相互作用する。実施例２９のカルボン酸側鎖によってこの相互作用が増強される。
【０２８７】
実施例２９の尿素部分は、グルタミン酸７１の側鎖と、直接的な水素結合によるコンタクトをする。グルタミン酸７１は、プロテイン・キナーゼにおいて保存され、そして、ベータ鎖５の保存されたリジン５３とエンゲージすることによって構造上及び触媒作用上の役割を提供する。
【０２８８】
実施例２９のナフチル部分は、（スイッチ制御リガンドの）フェニルアラニン１６９と、エッジ−フェイスなπ−スタッキング相互作用をして、フェニルアラニン１６９をアウト・コンホメーションの状態に安定化し、それによってＡＴＰコファクター・ポケットの空間をふさぐ。ナフチル部分はまた、保存されたベータ鎖５のリジン５３、ベータ鎖６のイソロイシン８４、並びに、ベータ鎖７のロイシン１０４及びトレオニン１０６のアルキレン側鎖と、直接的なコンタクトをする。
【０２８９】
実施例２９の第３ブチル部分は、ｐ３８−アルファ・キナーゼのスイッチ機構がオンの状態であるとすればフェニルアラニン１６９によって代わりにふさがれるであろう、‘イン・コンホメーション’のポケットをふさぐ。第３ブチル部分は、Ｃ−アルファへリックスのロイシン７４及びメチオニン７８；ベータ鎖６のバリン８３；Ｅ−アルファへリックスのイソロイシン１４１；及び、反応ループのヒスチジン１４８と、疎水的なコンタクトをする。
【０２９０】
小分子インヒビターの実施例２９とｐ３８−アルファ・キナーゼの複合型オン・スイッチ・ポケットとの間のこれらの直接的なコンタクトに加え、スイッチ機構における他の変化が、実施例２９によって誘導されて、このプロテイン・キナーゼの生物学的活性をバイオミメティカルにダウンレギュレートする。ｐ３８−アルファ・キナーゼのスイッチ制御リガンドが、ホスホトレオニン１８０及びホスホチロジン１８２で二重リン酸化され、それによってスイッチがオンの状態になりがちであるにもかかわらず、小分子スイッチ制御インヒビターである実施例２９は、二重リン酸化スイッチ制御リガンドをオフ・スイッチの状態にする。
【０２９１】
具体的には、アミノ酸残基ロイシン１７１からグルタミン酸１９２までのスイッチ制御リガンドの大部分が、ペプチド又はタンパク質基質の結合ポケットに入り込み、それによって該基質がｐ３８−アルファ・キナーゼに結合するのを妨げる。
【０２９２】
アルギニン７０のグアニジン側鎖は、グルタミン酸３２８と直接的な水素結合及び静電的な相互作用をして、二量化ドメイン（Ｋ−アルファへリックスのアミノ酸残基イソロイシン３３４からセリン３４７）に、ｐ３８−アルファ・キナーゼのダイマー化又はオリゴマー化に適さない状態で、Ｃ−アルファへリックスと反対方向に押し込まさせる。
【０２９３】
トリプトファン１８７は、非リン酸化チロジン１８２とエッジ・フェイスのπ−スタッキング相互作用を受けるため、そのバイオミメティックな位置に配置される。しかし、チロジン１８２はリン酸化されてトリプトファン１８７に認識されないように変化するので、ホスホチロジン１８２は安定が損なわれ、溶媒空間に追い出される。ホスホトレオニン１８０には、電子密度もまた、観測されない。オフスイッチ制御ポケット部分であるアスパラギン酸１７６、アスパラギン酸１７７及びグルタミン酸１７８に結合する非リン酸化トレオニン１８０とは異なり、リン酸化トレオニンは、このオフ・スイッチ・ポケットに結合しない。実際、リン酸化トレオニン、アスパラギン酸１７６、アスパラギン酸１７７及びグルタミン酸１７８の間の負に荷電した静電的な反発によって、アスパラギン酸１７６、アスパラギン酸１７７及びグルタミン酸１７８が溶媒空間に追い出されることとなる。
【０２９４】
トレオニン１８５は、そのバイオミメティックなオフ・スイッチのポジションにあり、ヒスチジン１４８及びアスパラギン酸１５０と水を介する水素結合ネットワークを形成して、これらの反応に関与するアミノ酸残基を、反応できないオフの状態にする。
【０２９５】
実施例６４のスイッチ制御インヒビターＡｂｌキナーゼの結合
実施例６４の構造は下式に示される。
【０２９６】
【化１５】
2009503440.tif 000048
【０２９７】
図４０は、Ａｂｌキナーゼに結合した例６４のスイッチ制御インヒビターの共結晶構造を説明する。実施例６４のテトラヒドロイソキノリン環の環状アミン官能基が、Ｃ−アルファヘリックスのグルタミン酸３０１と静電的な相互作用をする。グルタミン酸３０１は、Ａｂｌキナーゼのスイッチ機構の一部として振舞い、Ｚ基のアルギニン４０５をオフ・スイッチ状態で安定化する。実施例６４のテトラヒドロイソキノリン環の環状アミン官能基は、グルタミン酸３０１とのこのタイプの静電的相互作用を増強する。
【０２９８】
実施例６４の尿素部分は、グルタミン酸３０５の側鎖と直接的な水素結合をする。グルタミン酸３０５は、プロテイン・キナーゼで保存されていて、ベータ・ストランド３の保存されたリジン２９０とエンゲージすることによって、構造的及び触媒的役割を提供する。
【０２９９】
実施例６４の２，３−ジクロロフェニル部分は、（スイッチ制御リガンドの）フェニルアラニン４０１と、エッジ・フェイスのπ−スタッキング相互作用をして、フェニルアラニン４０１をアウト・コンホメーションで安定化し、それによって、ＡＴＰコファクターポケットにおいて空間を占める。２，３−ジクロロフェニル部分もまた、ベータ・ストランド３の保存されたリジン２９０、ベータ・ストランド５のバリン３１８、並びに、ベータ・ストランド６のイソロイシン３３４及びトレオニン３３４のアルキレン側鎖と直接的なコンタクトをする。２，３−ジクロロフェニル部分のメタクロロ置換基は、保存されたアミノ酸残基のリジン２９０の主鎖のＮＨ基の水素結合距離内にある。
【０３００】
実施例６４の第３ブチル部分は、Ａｂｌキナーゼのスイッチ機構がオンの状態ならばフェニルアラニンの４０１によって代わりにふさがれるだろう‘イン・コンホメーション’なポケットをふさぐ。第３ブチル部分は、Ｃ−アルファ・ヘリックスのバリン３０８、ベータ・ストランド４のイソロイシン３１２、ベータ・ストランド５のロイシン３１７、Ｅ−アルファ・ヘリックスのロイシン３７３、及び、反応ループのヒスチジン３８０と疎水的なコンタクトをする。
【０３０１】
小分子インヒビターの実施例６４とＡｂｌキナーゼの複合型オン・スイッチ・ポケットとの間のこれらの直接的なコンタクトに加え、スイッチ機構における他の変化がこのプロテイン・キナーゼの生物学的活性をバイオミメティカルにダウンレギュレートするために、実施例６４によって、誘導される。
【０３０２】
具体的には、ロイシン４０３からイソロイシン４２２までのアミノ酸残基からのスイッチ制御リガンドの大部分が、ペプチド又はタンパク質の結合ポケットの中に入り込まされ、それによって前記基質がＡｂｌキナーゼに結合することを妨げる。
【０３０３】
（グリジン・リッチなループの）チロジン２７２は、２，３−ジクロロフェニル部分のフェニルアラニン４０１との相互作用の側とは反対側で、フェニルアラニン４０１とπ−スタッキング相互作用を形成するように誘導される。
【０３０４】
スイッチ制御リガンドのアミノ酸残基、チロジン４１２は、そのバイオミメティックなポジションに結合するように誘導され、反応に関わるアミノ酸残基のアスパラギン酸３８２及びアスパラギン３８７に、水素結合のネットワークによって、結合する偽基質のチロジンとして振舞う。チロジン４１２によって誘導されるこの水素結合のネットワークは、これらの残基を非反応性のオリエンテーションにする。
【０３０５】
実施例６５のスイッチ制御インヒビターのＡｂｌキナーゼへの結合
実施例６５の構造は下記式に示される。
【０３０６】
【化１６】
2009503440.tif 000049
【０３０７】
図４１は、Ａｂｌキナーゼに結合した実施例６５のスイッチ制御インヒビターの共結晶構造を示す。実施例６５のテトラヒドロイソキノリン環のアミン及びカルボン酸官能基は、それぞれ、Ｃ−アルファ・ヘリックスのグルタミン３０１及びスイッチ制御リガンドのアルギニン４０５と静電的な相互作用をする。グルタミン酸３０１は、Ｚ基のアルギニン４０５をオフ・スイッチ状態で安定化することによって、Ａｂｌキナーゼのスイッチ機構の一部として振舞う。実施例６５のテトラヒドロイソキノリン環の環式アミン官能基はまた、カルボン酸官能基がアルギニン４０５と静電的な相互作用をするのに対して、グルタミン酸３０１と、このタイプの静電的相互作用を増強する。
【０３０８】
実施例６５の尿素部分は、グルタミン酸３０５の側鎖と直接的な水素結合によるコンタクトをする。グルタミン酸３０５はプロテイン・キナーゼで保存されており、ベータ・ストランド３の保存されたリジン２９０とエンゲージすることによって、構造上及び反応上の役割を提供する。実施例６５の２，３−ジクロロフェニル部分は、（スイッチ制御リガンドの）フェニルアラニン４０１と、歪んだエッジ・フェイスのπ−スタッキング相互作用をして、フェニルアラニン４０１をアウト・コンホメーションの状態で安定化し、それによってＡＴＰコファクター・ポケット内の空間をふさぐ。
【０３０９】
２，３‐ジクロロフェニル部分はまた、ベータ・ストランド３の保存されたリジン２９０、ベータ・ストランド５のバリン３１８、並びにベータ・ストランド６のイソロイシン３３２及びトレオニン３３４のアルキレン側鎖と、直接的なコンタクトをする。２，３‐ジクロロフェニル部分のメタクロロ置換基は、保存されたアミノ酸残基リジン２９０の主鎖のＮＨ基の水素結合の距離内にある。
【０３１０】
実施例６５の第３ブチル部分は、Ａｂｌキナーゼのスイッチ機構がオンの状態であったならば、フェニルアラニン４０１によってふさがれただろう‘イン・コンホメーション’なポケットをふさぐ。第３ブチル部分は、Ｃ−アルファ・ヘリックスのバリン３０８、ベータ・ストランド４のイソロイシン３１２、ベータ・ストランド５のロイシン３１７、Ｅ−アルファ・ヘリックスのロイシン３７３、及び、反応ループのヒスチジン３８０と、疎水的なコンタクトをする。
【０３１１】
小分子インヒビターの実施例６５とＡｂｌキナーゼの複合型オン・スイッチ・ポケットとの間の、これらの直接的なコンタクトに加えて、スイッチ機構における他の変化が、このプロテイン・キナーゼの生物学的活性をバイオミメティカルにダウン・レギュレートするように、実施例６４によって、誘導される。
【０３１２】
具体的には、ロイシン４０３からイソロイシン４２２までのアミノ酸残基のスイッチ制御リガンドの大部分が、ペプチド又はタンパク基質の結合ポケットに入り込まされ、それによって、該基質がＡｂｌキナーゼに結合することを妨げる。
【０３１３】
（グリジン・リッチなループの）チロジン２７２は、２，３−ジクロロフェニル部分のフェニルアラニン４０１との相互作用の側とは反対の側で、フェニルアラニン４０１とπ−スタッキング相互作用を形成するように誘導される。
【０３１４】
スイッチ制御リガンドのアミノ酸残基チロジン４１２は、そのバイオミメティックなポジションに結合するように誘導され、反応に関与するアミノ酸残基であるアスパラギン酸３８２及びアスパラギン３８７と水素結合のネットワークによって結合する偽基質チロジンとして振舞う。チロジン４１２によって誘導される水素結合のこのネットワークは、これらの残基を非反応性のオリエンテーションにする。
【０３１５】
実施例６５のスイッチ制御インヒビターのＶ５９９Ｅ発ガン遺伝子Ｂｒａｆキナーゼへの結合
実施例６５の構造は下記式に示される。
【０３１６】
【化１７】
2009503440.tif 000050
【０３１７】
図４２は、発ガン遺伝子Ｖ５９９Ｅ  Ｂｒａｆキナーゼに結合した実施例６５のスイッチ制御インヒビターの共結晶構造を示す。実施例６５のテトラヒドロイソキノリン環のカルボン酸官能基は、Ｃ−アルファ・ヘリックスのアラニン４９６の主鎖のカルボニル基の酸素部分と水素結合による相互作用をする。テトラヒドロイソキノリン環のカルボン酸官能基はまた、アスパラギン４９９と水素結合によるコンタクトをする。アスパラギン４９９は、オン・スイッチ・ポケットのＺ基として振舞い、ホスホセリン５９８を安定化するか、又は、代わりに、オフ・スイッチ・ポケットのX基として振舞い、アルギニン６０２を安定化する。実施例６５のテトラヒドロキノリン環の環式アミン環の官能性は、変異した発癌性の残基グルタミン酸５９９と強く相互作用できるように設計された。しかし、グルタミン酸５９９には電子密度が観察されなかった。
【０３１８】
実施例６５の尿素部分は、グルタミン酸５００の側鎖と、直接的な水素結合をする。グルタミン酸５００は、プロテイン・キナーゼで保存されており、ベータ・ストランド３の保存されたリジン４８２とエンゲージすることによって、構造上及び反応上の役割を提供する。
【０３１９】
実施例６５の２，３−ジクロロフェニル部分は、（スイッチ制御リガンドの）フェニルアラニン５９４と、エッジ・フェイスのπ−スタッキング相互作用をして、フェニルアラニン５９４をアウト・コンホメーションの状態で安定化し、それによってＡＴＰコファクター・ポケット内の空間をふさぐ。２，３−ジクロロフェニル部分はまた、ベータ・ストランド３の保存されたリジン、ベータ・ストランド５のロイシン５１３、並びに、ベータ・ストランド６のイソロイシン５２６及びトレオニン５２８のアルキレン側鎖と直接的なコンタクトをする。２，３−ジクロロフェニル部分のメタクロロ置換基は、保存されたアミノ酸残基リジン４８２の主鎖のＮＨ基の水素結合距離内にある。
【０３２０】
実施例６５の第３ブチル部分は、Ｂｒａｆキナーゼがオンの状態にあるならば、代わりにフェにあるアラニン５９４によってふさがれるだろうスイッチ機構‘イン・コンホメーション’のポケットをふさぐ。第３ブチル部分は、Ｃ−アルファ・ヘリックスのバリン５０３、ロイシン５０４及びトレオニン５０７；ベータ・ストランド５のイソロイシン５１２；Ｅ−アルファ・ヘリックスのロイシン５６６；並びに、反応ループのヒスチジン５７３と、疎水的なコンタクトをする。
【０３２１】
小分子インヒビターの実施例６５とＢｒａｆキナーゼの複合型オン・スイッチ・ポケットとの間のこれらの直接的なコンタクトに加えて、スイッチ機構において他の変化が実施例６５によって誘導されて、このプロテイン・キナーゼの生物学的活性をバイオミメティカルにダウン・レギュレートする。具体的には、ロイシン５９６からロイシン６１７までのアミノ酸残基スイッチ制御リガンドの大部分が、ペプチド又はタンパク質基質の結合ポケットに入り込まされ、それによって、該基質がＢｒａｆキナーゼに結合するのを妨げる。
【０３２２】
スイッチ制御リガンドのアミノ酸残基トレオニン５９８は、バイオミメティックなオフ・スイッチ・ポジションに結合するように誘導され、水を介する水素結合のネットワークによって、反応に関与するアミノ酸残基であるアスパラギン酸５７５、アスパラギン５８０及びアスパラギン酸５９３に結合する。トレオニン５９８によって媒介される水素結合ネットワークは、これらの残基を非反応性のオリエンテーションにする。
【０３２３】
実施例６５をＢｒａｆキナーゼのオンの複合スイッチ・ポケットに結合することは、Ｎ−末端のスイッチ制御リガンドの疎水性アミノ酸残基であるフェニルアラニン５９４、ロイシン５９６及びアラニン５９７を、グリジン・リッチなループ（ベータ・ストランド１及び２）の疎水性アミノ酸残基であるセリン４６６、フェニアルアラニン４６７及びバリン４７０と、より近接してコンタクトするようにする。これらの疎水的な相互作用は、スイッチ制御リガンドがそのオフ状態に変化することを容易にする。実施例６５は、疎水性アミノ酸であるバリン５９９の、反応を促進するグルタミン酸５９９への変異にもかかわらず、このバイオミメティックなスイッチ制御リガンドのそのオフ状態への変化を誘導する。
【０３２４】
（実施例Ｅ）
ステップ７．小分子スイッチ制御モジュレータを改良するために上記のステップを繰り返す
タンパク質の活性をモジュレートすることがわかった個々の小分子は、プロテイン・スーパーファミリー内（例えば、候補となるタンパク質であれば、他のキナーゼ）、又は、プロテイン・ファミリー間（例えば、候補となるタンパク質がキナーゼであれば、ホスファターゼ及び転写因子のような他のタンパク質のクラス）での他のタンパク質のアフィニティと機能的なモジュレーションが評価された。小分子のスクリーニング・ライブラリもまた、このパラダイムで評価された。構造活性相関（ＳＡＲｓ）が検討評価され、続いて、小分子が候補となるタンパク質にとってより有効、及び／又は、選択的であるように設計され、それによって、目的に合わないタンパク質との相互作用を最小化する。
【０３２５】
説明の方法によって、スクリーニング及び実験の最初のラウンドが、実施例２９の小分子をｐ３８−アルファ・キナーゼのスイッチ制御インヒビターと同定した。様々なスクリーニング検査におけるその特性が下記にまとめられる：
実施例２９
蛍光アフィニティアッセイ  ＩＣ５０＝１６ｎＭ（非リン酸化ｐ３８−アルファ・キナーゼ）
蛍光アフィニティアッセイ  ＩＣ５０＝５６ｎＭ（リン酸化ｐ３８−アルファ・キナーゼ）
熱変性アッセイ            ΔＴｍ＝１０．１°（非リン酸化ｐ３８−アルファ・キナーゼ）
熱変性アッセイ            ΔＴｍ＝７．３°（リン酸化ｐ３８−アルファ・キナーゼ）
生化学的アッセイ          ＩＣ５０＝１２ｎＭ
【０３２６】
Ｘ線共結晶構造からの結合様式の解釈は、ｐ３８−アルファ・キナーゼのスイッチ制御インヒビターとしての改良された特性を示す小分子の相互に影響しあう設計と合成につながった。１つのそのような改良されたアナログが実施例６９であり、様々なスクリーニング試験におけるその改良された特性は下記にまとめられる。
実施例６９
蛍光アフィニティ・アッセイ  ＩＣ５０＝９ｎＭ（非リン酸化ｐ３８−アルファ・キナーゼ）
蛍光アフィニティ・アッセイ  ＩＣ５０＝１１ｎＭ（リン酸化ｐ３８−アルファ・キナーゼ）
熱変性アッセイΔＴｍ＝１３．１°（非リン酸化ｐ３８−アルファ・キナーゼ）
熱変性アッセイΔＴｍ＝９．１°（リン酸化ｐ３８アルファ・キナーゼ）
生化学的アッセイ  ＩＣ５０＝７．０ｎＭ
【０３２７】
キナーゼ・タンパク質の分析は、相補的なスイッチ制御リガンドの結合の様式によって分けられる４つのタイプのスイッチ制御ポケットを明らかにした。具体的には：（１）典型的には、相補的なスイッチ制御リガンド（荷電したリガンド）のセリン、トレオニン又はチロジンであるアミノ酸残基によって、又は、メチオニン若しくはシステインであるアミノ酸残基のイオウ原子の酸化によって、形成される、改変リガンドを安定及びそれに結合するポケット；（２）水素結合又は疎水的相互作用（Ｈ−結合／疎水的リガンド）によってリガンドに結合するポケット；（３）アシル化された残基を有するリガンド（アシル化リガンド）を結合するポケット；及び（４）リガンドと内部は結合しないが、天然ではなく生じるスイッチ制御モジュレータ化合物（同定されないリガンド）と結合できるポケット、である。さらに、これらの４つのタイプのポケットは、図１〜４に図示される単純なタイプ、図６及び６Ａに示される複雑なタイプ、又は、図７の組み合わせられたタイプでありうる。
【０３２８】
最終的には、ポケットはそれらのスイッチ制御機能によって定義されうる、つまり、ポケットは、スイッチ制御リガンドの相互作用について、生物学的にアップレギュレートされたタンパク質のコンホメーションを誘導するオンの種類、スイッチ制御リガンドの相互作用について、生物学的にダウンレギュレートされたコンホメーションを誘導するオフの種類、又は、異なる相補的なスイッチ制御リガンドについて、同じポケットがオン・ポケットとオフ・ポケットとして機能する“二機能性”ポケットといわれるもの（例えば、Ｇｓｋ−３  ベータ・キナーゼで例示されるような）。ポケットのこの同じスペクトルは、関心ある全てのタンパク質、つまり、スイッチ制御リガンド配列及び相補的なスイッチ制御ポケットの相互作用によるコンホメーション変化を経験するタンパク質に、見つけることができる。
【０３２９】
次の表３０は、ステップ２及び３に記載されるポケットをポケットの分類とタイプの観点からさらに区別したものである。
【０３３０】
【表３３】
2009503440.tif 000051
【０３３１】
本発明の主要な目的は、選ばれたタンパク質と１又は２以上のスイッチ制御ポケットとタンパク質の活性をモジュレートするために結合する、天然のものではない小分子モジュレータ化合物の設計及び開発を容易にすることである。この実用的なゴールは、スイッチ制御ポケットのタイプ（−オン、−オフ、又は、−二機能性）、選択されたモジュレータ化合物の性質、及び、モジュレータ化合物とタンパク質との間の相互作用による結合のタイプに依存して、いくつかの困難な方法によって達成することができる。
【０３３２】
例えば、選ばれたモジュレータ化合物は、スイッチ制御リガンドのアゴニストとして、選ばれたスイッチ制御ポケットの領域に結合しうる。つまり、モジュレータ化合物が、天然に生じる、相補的なスイッチ制御リガンドによって誘導されるような同じ種類のコンホメーション変化を生み出す。従って、スイッチ制御リガンドのアゴニストがオン・ポケットと結合するならば、結果はタンパク質活性のアップ・レギュレーションであり、それがオフ・ポケットと結合するならば、ダウン・レギュレーションが起こる。反対に、与えられたモジュレータがスイッチ制御リガンドのアンタゴニストとして結合しうる。つまり、モジュレータ化合物が、天然に生じる、相補的なスイッチ制御リガンドによって誘導されるような反対のタイプのコンホメーション変化を生み出す。従って、スイッチ制御リガンドのアンタゴニストがオン・ポケットと結合すれば、結果はタンパク質活性のダウン・レギュレーションであり、そして、それがオフ・ポケットと結合すれば、アップ・レギュレーションが起こる。
【０３３３】
二重機能及び未同定のリガンドポケットにおいては、モジュレータ化合物は、得られる反応の種類に依存して、機能的なアゴニスト又は機能的なアンタゴニストとして役立つ。
【０３３４】
本発明の別の態様は、もちろん、先に定義したようないくつかのＺ又はＸ残基を含むが、オン複合スイッチ制御ポケットから選ばれるいくつかのアミノ酸残基及びオフ複合スイッチ制御ポケットから選ばれる他のアミノ酸残基と同時に結合する小分子スイッチ制御インヒビターを含む。そのようなインヒビターは、二重オン・スイッチ制御ポケットのアンタゴニスト／オフ・スイッチ制御ポケットのアゴニストとして分類される。例えば、図３５では、実施例２９の小分子のカルボン酸を含む側鎖は、オフ・ポケット内でアルギニン６７（オン・ポケットのコンホメーション制御のＺ残基）とチロジン３５（オフ・ポケットの今ホーション制御のＸ残基）の相互作用を安定化する。追加の小分子／複合スイッチ制御ポケット相互作用は、実施例２９の二重オン・スイッチ制御ポケットのアンタゴニスト／オフ・スイッチ制御ポケットのアゴニストを例示する：インヒビターのナフチル環がフェニルアラニン１６９をそのオフ・ポケットのコンホメーション状態に安定化する（つまり、オフ・スイッチ制御ポケット・アゴニズム）。反対に、インヒビターの第３ブチル部分は、フェニルアラニン１６９の結合サイトをふさぎ、それによってフェニルアラニン１６９がそのオン・ポケットのコンホメーション状態をとるのを妨げる（つまり、オン・スイッチ制御ポケット・アンタゴニズム）。
【０３３５】
本発明の別の態様は、スイッチ制御リガンド配列の修飾可能なアミノ酸と直接結合する小分子スイッチ制御インヒビターを含む。本発明のこの態様では、小分子スイッチ制御インヒビターは、セリン、トレオニン、チロジン、システイン、若しくはメチオニン残基に、それらが非修飾の若しくは修飾された状態で、直接結合するか、又は、小分子スイッチ制御インヒビターは、脂肪酸モディファイア（例えば、ミリスチル化された残基）で機能化されるスイッチ制御リガンド配列のアミノ酸と直接結合する。
【０３３６】
本発明のさらに別の態様は、スイッチ機構を構造的に活性化するために機能するスイッチ制御リガンド配列の変異アミノ酸に直接結合する小分子スイッチ制御インヒビターを含む。そのような変異アミノ酸はアスパラギン酸又はグルタミン酸を含む。そのような変異スイッチ制御リガンド配列の一例は、発ガン遺伝子Ｖ５９９Ｅ  Ｂｒａｆキナーゼに見つけられるが、野生型のＢｒａｆはスイッチ制御配列の５９９位にバリン残基を含むのに対し、発ガン遺伝子Ｂｒａｆはキナーゼスイッチ機構を構造的に活性化する５９９位にグルタミン酸残基を含む。
【０３３７】
プロテアーゼのスイッチ制御ポケット及びこれらのポケットのモジュレーション
カスパーゼ−３は、システイン・プロテアーゼであり、全細胞内で、システイン残基がＳ−ニトロシル化されていることが知られている（Ｊ．Ｂ．Ｍａｎｎｉｃｋら，Ｆａｓに誘導されるカスパーゼの脱ニトロシル化，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８４：６５１；  Ｊ．Ｂ．Ｍａｎｎｉｃｋら，一酸化窒素はＦａｓ誘導性アポトーシスを阻害する，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２：２４１２５）。プロカスパーゼ−３（Ｊ．Ｂ．Ｍａｎｎｉｃｋら，Ｆａｓに誘導されるカスパーゼの脱ニトロシル化，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８４：６５１；  Ｊ．Ｂ．Ｍａｎｎｉｃｋら，一酸化窒素はＦａｓ誘導性アポトーシスを阻害する，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２：２４１２５）及びプロカスパーゼ−９（Ｊ．Ｅ．Ｋｉｍ及びＳ．Ｒ．Ｔａｎｎｅｎｂａｕｍ，ＨＴ−２９ヒト癌細胞では、Ｓ-ニトロシル化が内在性プロカスパーゼ９の活性化を調節する，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００４）２７９：９７５８）が、ｉｎ  ｖｉｖｏで、それぞれの反応性システイン残基において、ニトロシル化される。
【０３３８】
さらに、活性化されたカスパーゼ（ここで、酵素前駆体プロカスパーゼは既に活性化カスパーゼに変換されている）もまた、それぞれの反応性システイン残基が、一酸化窒素で処理することによってＳ−ニトロシル化され、そして、これらのカスパーゼの反応活性はＳ−ニトロシル化によって阻害される（B. Zechら，一酸化窒素によって修飾されたカスパーゼ−３のマス・スペクトル分析，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４：２０９３１；Ｓ．Ｍｏｈｒら，一酸化窒素によって引き起こされるＳ−ニトロシル化及び酸化によるカスパーゼ−３の阻害，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９７）２３８：３８７；Ｊ．Ｌｉら，一酸化窒素はＳ−ニトロシル化によってカスパーゼ・ファミリーの７種類を可逆的に阻害する，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９７）２４０：４１９）。
【０３３９】
異なるアロステリックなシステイン残基が、修飾された場合にカスパーゼの反応活性阻害につながるカスパーゼ−３及びカスパーゼ−７において研究された（Ｊ．Ａ．  Ｈａｒｄｙら，カスパーゼにおけるアロステリック・サイトの発見，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  ＵＳＡ  （２００４）１０１：１２４６１）。本発明におけるスイッチ制御リガンドの定義に適合するのは、この２番目のタイプのシステイン残基、アロステリックなシステインである。これらのスイッチ制御リガンドのシステイン残基の一時的な酸化（Ｓ−ニトロシル化）は、カスパーゼの形及び、従って、生物学的な活性を制御する。本発明は、Ｓ−ニトロシル化システインを含む一時的に酸化されたスイッチ制御リガンドに反応するスイッチ制御ポケットに結合する、カスパーゼを含むシステイン・プロテアーゼの、スイッチ制御インヒビターに関する。
【０３４０】
スイッチ制御リガンドのアミノ酸配列及び、配列番号５７をもつシステインプロテアーゼであるカスパーゼ‐７のスイッチ制御ポケットを含むアミノ酸が、表３１に示される。
【０３４１】
【表３４】
2009503440.tif 000052
【０３４２】
Ａ鎖のシステイン残基２９０は、一時的に酸化されてＳ−ニトロシル化された状態になる修飾可能な残基である。Ｂ鎖のアルギニン２１０−プライムは、修飾されたスイッチ制御リガンドをオフの状態で安定化するスイッチ制御ポケットの主要なＸ基である。
【０３４３】
潜在的なスイッチ制御小分子の合成
ここに記載される小分子スイッチ制御インヒビターは、２００３年１２月２４日提出の出願番号１０／７４６，５４５；抗炎症薬、２００３年１２月２４日提出の出願番号１０／７４６，４６０；抗癌剤、２００３年１２月２４日提出の１０／７４６，６０７；２００２年１２月３１日に提出の、タンパク質の機能をモジュレートする方法と題された予備出願番号６０／４３７，４８７；抗癌剤、２００２年１２月３１日提出の予備出願番号６０／４３７，４０３；抗炎症薬、２００２年１２月３１日に提出の予備出願番号６０／４３７，４１５；抗炎症薬、２００２年１２月３１日に提出の予備出願番号６０／４３７，３０４；２００４年１２月２３日に提出のＵＳ特許出願番号６０／６３８，９８７；炎症性、自己免疫性、心臓血管性及び免疫学的疾患を治療するための酵素モジュレータ；２００４年１２月２３日に提出のＵＳ特許出願番号６０／６３９，０８７、癌及び超増殖性疾患；２００４年１２月２３日に提出のＵＳ特許出願番号６０／６３８，９８６、癌、超増殖性疾患、又は血管新生阻害薬で治療可能な病気を治療するための酵素モジュレータ；及び、２００４年１２月２３日に提出のＵＳ特許出願番号６０／６３８９６８、癌及び超増殖性疾患を治療するための酵素モジュレータに記載される方法によって調製された。これらの出願のそれぞれは、参照によって本明細書に取り込まれる。
【０３４４】
実施例６１
【化１８】
2009503440.tif 000053
１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）−1Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（４−クロロフェニル）尿素
【０３４５】
実施例６２
【化１９】
2009503440.tif 000054
１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（３−（２−（２−ヒドロキシエチルアミノ）−２−オキソエチル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）尿素
【０３４６】
実施例６３
【化２０】
2009503440.tif 000055
１−（２，３−ジクロロフェニル）−３−（１−（３−（ヒドロキシメチル）フェニル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）尿素
【０３４７】
実施例６４
【化２１】
2009503440.tif 000056
１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−７−イル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）尿素
【０３４８】
実施例６５
【化２２】
2009503440.tif 000057
（３Ｓ）−６−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（３−（２，３−ジクロロフェニル）ウレイド）−１Ｈ−ピラゾ−ル−１−イル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸
【０３４９】
実施例６６
【化２３】
2009503440.tif 000058
１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−６−イル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）尿素
【０３５０】
実施例６７
【化２４】
2009503440.tif 000059
３−（３−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（３−（２，３−ジクロロフェニル）ウレイド）−１Ｈ−ピラゾ−ル−１−イル）フェニル）−２−メチルプロパン酸
【０３５１】
実施例６８
【化２５】
2009503440.tif 000060
２−（４−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（３−（２，３−ジフルオロフェニル）ウレイド）−１Ｈ−ピラゾ−ル−１−イル）フェニル）酢酸
【０３５２】
実施例６９
【化２６】
2009503440.tif 000061
１−（１−（３−（２−アミノ−２−オキソエチル）フェニル）−３−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）尿素
【０３５３】
実施例７０
【化２７】
2009503440.tif 000062
１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（４−（２−（４−ヒドロキシ−４−メチルピペリジン−１−イル）−２−オキソエチル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）尿素
【０３５４】
実施例７１
【化２８】
2009503440.tif 000063
１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（３−（ヒドロキシメチル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）尿素
【０３５５】
実施例７２
【化２９】
2009503440.tif 000064
１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）尿素
【０３５６】
実施例７３
【化３０】
2009503440.tif 000065
１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（４−（２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシエチル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）尿素
【０３５７】
実施例７４
【化３１】
2009503440.tif 000066
３−（３−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（３−（ナフタレン−１−イル）ウレイド）−１Ｈ−ピラゾ−ル−１−イル）フェニル）−２−メチルプロパン酸
【０３５８】
実施例７５
【化３２】
2009503440.tif 000067
１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（３−（２−ヒドロキシプロパン−２−イル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）尿素
【０３５９】
実施例７６
【化３３】
2009503440.tif 000068
１−（１−（４−（２−アミノ−２−オキソエチル）フェニル）−３−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）尿素
【０３６０】
実施例７７
【化３４】
2009503440.tif 000069
１−（１−（３−（２−アミノ−２−オキソエチル）フェニル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）尿素
【０３６１】
実施例７８
【化３５】
2009503440.tif 000070
１−（１−（３−（２−アミノ−２−オキソエチル）フェニル）−３−（チアゾ−ル−４−イル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）尿素
【０３６２】
実施例７９
【化３６】
2009503440.tif 000071
１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（３−（２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）尿素
【０３６３】
実施例８０
【化３７】
2009503440.tif 000072
１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（２−（メチルスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−７−イル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）尿素
【０３６４】
実施例８１
【化３８】
2009503440.tif 000073
１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−６−イル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）尿素
【０３６５】
実施例８２
【化３９】
2009503440.tif 000074
１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（１−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−６−イル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）尿素
【０３６６】
実施例８３
【化４０】
2009503440.tif 000075
１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（３−（２−ヒドロキシプロパン−２−イル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（ナフタレン−１−イル）尿素
【０３６７】
実施例８４
【化４１】
2009503440.tif 000076
１−（１−（４−（２−アミノ−２−オキソエチル）フェニル）−３−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）尿素
【０３６８】
実施例８５
【化４２】
2009503440.tif 000077
１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（３−（ヒドロキシメチル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（４−クロロフェニル）尿素
【０３６９】
実施例８６
【化４３】
2009503440.tif 000078
Ｎ−｛７−［３−ｔ−ブチル−５−（２，３−ジクロロフェン）−１−イル−ウレイド）−ピラゾ−ル−１−イル］−３−ベンジルアミン−２−カルボニル｝−メタンスルホンアミド
【０３７０】
実施例８７
【化４４】
2009503440.tif 000079
１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（４−ヒドロキシメチル）ナフタレン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）尿素
【０３７１】
実施例８８
【化４５】
2009503440.tif 000080
１−（１−（２−アセチル−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−７−イル）−３−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）尿素
【０３７２】
実施例８９
【化４６】
2009503440.tif 000081
１−１−（１−アミノ−３，４−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−３−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）尿素
【０３７３】
実施例９０
【化４７】
2009503440.tif 000082
１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（３−カルバムイミドイルフェニル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）尿素
【０３７４】
実施例９１
【化４８】
2009503440.tif 000083
１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）尿素
【０３７５】
実施例９２
【化４９】
2009503440.tif 000084
２−（４−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（３−（ナフタレン−１−イル）ウレイド）−１Ｈ−ピラゾ−ル−１−イル）フェノキシ）酢酸
【０３７６】
実施例９３
【化５０】
2009503440.tif 000085
エチル  ３−（３−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（３−（２，３−ジクロロフェニル）ウレイド）−１Ｈ−ピラゾ−ル−１−イル）フェニル）プロパン酸
【０３７７】
実施例９４
【化５１】
2009503440.tif 000086
１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（３−シアノフェニル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）尿素）
【０３７８】
実施例９５
【化５２】
2009503440.tif 000087
１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（３−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）尿素
【０３７９】
実施例９６
【化５３】
2009503440.tif 000088
１−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（４−（２−オキソ−２−（４，４−ジオキソ−４−チオモルホリノ）エチル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）尿素
【０３８０】
実施例９７
【化５４】
2009503440.tif 000089
１−（１−（３−（２−アミノ−１−オキソエチル）フェニル）−３−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−ピラゾ−ル−５−イル）−３−（ピリジン−３−イルオキシ）フェニル）尿素
【０３８１】
上記で特定されたリファレンスのすべては、参照によって本明細書に組み込まれる。さらに、次の同時出願、すなわち、２００２年１２月３１日に提出された抗癌剤（Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ）、Ｓ／Ｎ  ６０／４３７，４０３、２００２年１２月３１日に提出された抗炎症薬（Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ）、Ｓ／Ｎ  ６０／４３７，４１５、２００２年１２月３１日に提出された抗炎症薬（Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ）、Ｓ／Ｎ  ６０／４３７，３０４もまた参照によって組み込まれる。
【０３８２】
この特許又は出願のファイルは、１以上のカラー図面を含むものである。カラー図面を含む本特許又は特許出願の公報の複写物は、特許庁に請求し、必要な費用を支払うことによって入手可能である。
【図面の簡単な説明】
【０３８３】
【図１】図１は、「オン」及び「オフ」のスイッチ制御ポケット、一時的に修飾可能なスイッチ制御リガンド、及び活性ＡＴＰ部位を含む、本発明の天然哺乳動物タンパク質の模式図である。
【図２】図２は、図１のタンパク質の模式図であり、この図では、スイッチ制御リガンドがオフのスイッチ制御ポケットと結合状態をとることで、タンパク質が、生物学的にダウン・レギュレートされた第一のコンホメーションをとっている。
【図３】図３は、図１と同様の図であるが、スイッチ制御リガンドの特定のアミノ酸残基のＯＨ基がリン酸化され、スイッチ制御リガンドが、荷電して修飾された状態を示す。
【図４】図４は、図２と同様の図であるが、この図では、スイッチ制御リガンドがオンのスイッチ制御ポケットと結合状態をとることで、タンパク質が、図２の第一のコンホメーションとは異なる、生物学的に活性な第二のコンホメーションをとっている。
【図４ａ】図４ａは、スイッチ制御リガンドのリン酸化された残基と、オンのスイッチ制御ポケット由来の相補的な残基との典型的な結合を図示する拡大模式図である。
【図４ｂ】図４ｂは、タンパク質のスイッチ制御リガンドとオンのポケットとの典型的な結合を示す拡大模式図であり、この図では、タンパク質のスイッチ制御リガンドは酸化により修飾されスルホキシド化学種となったメチオニンアミノ酸残基を含む。
【図４ｃ】図４ｃは、タンパク質のスイッチ制御リガンドとオンのポケットとの典型的な結合を示す拡大模式図であり、この図では、タンパク質のスイッチ制御リガンドは酸化により修飾されスルホン化学種となったメチオニンアミノ酸残基を含む。
【図４ｄ】図４ｄは、タンパク質のスイッチ制御リガンドとオンのポケットとの典型的な結合を示す拡大模式図であり、この図では、タンパク質のスイッチ制御リガンドは酸化により修飾されスルフェン酸化学種となったシステインアミノ酸残基を含む。
【図４ｅ】図４ｅは、タンパク質のスイッチ制御リガンドとオンのポケットとの典型的な結合を示す拡大模式図であり、この図では、タンパク質のスイッチ制御リガンドは酸化により修飾されスルホン酸化学種になったシステインアミノ酸残基を含む。
【図４ｆ】図４ｆは、タンパク質のスイッチ制御リガンドとオンのポケットとの典型的な結合を示す拡大模式図であり、この図では、タンパク質のスイッチ制御リガンドはニトロシル化により修飾されＳ−ニトロシル化学種となったシステインアミノ酸残基を含む。
【図５】図５は、図１と同様の図であるが、オン及びオフのスイッチ制御ポケットと結合関係にある小分子化合物を模式的に示す。
【図６】図６は、スイッチ制御リガンド及びオンのスイッチ制御ポケットのそれぞれの一部から複合型スイッチ制御ポケットが形成され、小分子が、この複合型スイッチ制御ポケットと結合関係にあるようなタンパク質の模式図である。
【図６ａ】図６ａは、スイッチ制御リガンド１０６ａの第１の部分及びオンのスイッチ制御ポケットから複合型オンスイッチ制御ポケットが形成され、小分子が、この複合型オンスイッチ制御ポケットと結合関係にあり、また、スイッチ制御リガンド１０６ｂの第２の部分はオフのスイッチ制御ポケットと結合関係にあるようなタンパク質の模式図である。
【図７】図７は、オンのスイッチ制御ポケット、スイッチ制御リガンド配列、活性ＡＴＰ部位のそれぞれの一部から組合せ型スイッチ制御ポケットが形成され、小分子が、この組合せ型スイッチ制御ポケットと結合関係にあるようなタンパク質の模式図である。
【図８】図８は、Ｘ線結晶構造解析で得られたリボン図であり、生物学的にアップ・レギュレートされた状態にある、配列番号１９を持つインスリン受容体キナーゼのオンのコンホメーションを示すものである。
【図９】図９は、図８と同様の図であるが、生物学的にダウン・レギュレートされた状態の、オフのコンホメーションにある配列番号２１を持つインスリン受容体を示すものである。
【図１０】図１０は、配列番号１０を持つＡｂｌキナーゼを、サーフネット（ＳＵＲＦＮＥＴ）で可視化したものであり、オンのスイッチ制御ポケットを青で示す。
【図１１】図１１は、配列番号１０を持つＡｂｌキナーゼを、ＧＲＡＳＰで可視化したものであり、オンのスイッチ制御ポケットを黄色で囲んである。
【図１２】図１２は、配列番号１０を持つＡｂｌキナーゼタンパク質のリボン図であり、オンのスイッチ制御ポケットの重要なアミノ酸残基を識別してある。
【図１３】図１３は、配列番号１０を持つＡｂｌキナーゼのリボン図であり、組合せ型のスイッチ制御ポケット（オンのスイッチ制御ポケット／スイッチ制御リガンド配列／ＡＴＰ活性部位）を示す。
【図１４】図１４は、配列番号１４を持つｐ３８キナーゼを、サーフネット（ＳＵＲＦＮＥＴ）で可視化したものであり、オンのスイッチ制御ポケットを青で示す。
【図１５】図１５は、配列番号１４のｐ３８キナーゼを、グラスプ（ＧＲＡＳＰ）で可視化したものであり、オンのスイッチ制御ポケットを黄色で囲んである。
【図１６】図１６は、配列番号５２のｐ３８キナーゼのリボン図であり、オンのスイッチ制御ポケットの重要なアミノ酸残基を識別してある。
【図１７】図１７は、配列番号１６のＧｓｋ−３ベータ・キナーゼタンパク質をサーフネット（ＳＵＲＦＮＥＴ）で可視化したものであり、二機能性のオン・オフ・スイッチ制御ポケットを青で示す。
【図１８】図１８は、配列番号１６のＧｓｋ−３ベータ・キナーゼをグラスプ（ＧＲＡＳＰ）で可視化したものであり、二機能性のオン・オフ・スイッチ制御ポケットを黄色で囲んである。
【図１９】図１９は、配列番号１６のＧｓｋ−３ベータ・キナーゼのリボン図であり、組合せ型のオン・オフ・スイッチ制御ポケットの重要なアミノ酸残基を識別してある。
【図２０】図２０は、非リン酸化状態の準精製された、配列番号５３のＡｂｌキナーゼを識別するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２１】図２１は、非リン酸化状態の精製された、配列番号５３のＡｂｌキナーゼを識別するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２２】図２２は、準精製された、配列番号５３のＡｂｌキナーゼのクロマトグラフィーでの溶出特性を示す。
【図２３】図２３は、精製された、配列番号５３のＡｂｌキナーゼのクロマトグラフィーでの溶出特性を示す。
【図２４】図２４は、ＴＥＶタグの切断前（レーン２〜４）及び後（レーン５〜８）の配列番号５３のＡｂｌ  キナーゼを識別したＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルである。
【図２５】図２５は、精製された、配列番号５３を持つＡｂｌキナーゼの、紫外線スペクトルであり、このタンパク質のＡＴＰ部位には、小分子阻害物質であるＰＤ１８０７９０が結合している。
【図２６】図２６は、ニッケル・アフィニティ・クロマトグラフィー及びＱ−セファロースを用いたクロマトグラフィーで精製を行った際の、配列番号５１を持つＡｂｌキナーゼ（Ａｂｌ  １−５３１，Ｙ４１２Ｆ  変異型）のクロマトグラフィーでの溶出特性を示す。
【図２７】図２７は、精製された、配列番号５１を持つＡｂｌキナーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルである。
【図２８】図２８は、非リン酸化状態にある精製された、配列番号４８を持つｐ３８アルファ・キナーゼのクロマトグラフィーでの溶出特性を示す。
【図２９】図２９は、非リン酸化状態にある精製された、配列番号４８を持つｐ３８アルファ・キナーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルである。
【図３０】図３０は、リン酸化状態にある活性化された配列番号５４を持つＧｓｋ３−ベータ・キナーゼの質量スペクトルである。
【図３１】図３１は、非リン酸化状態にある活性化されていない配列番号５４を持つＧｓｋ３−ベータ・キナーゼの質量スペクトルである。
【図３２】図３２は、ウェスタンブロットで、リン酸化された配列番号５４を持つＧｓｋ３−ベータ・キナーゼをホスホチロジン抗体によって染色したところである。
【図３３】図３３は、ウェスタンブロットで、リン酸化されていない配列番号５４を持つＧｓｋ３−ベータ・キナーゼをホスホチロジン抗体によって染色したところである。
【図３４】図３４は、配列番号４８を持つｐ３８アルファ・キナーゼの複合型オンスイッチ制御ポケットに結合した実施例８のｐ３８アルファ小分子スイッチ制御阻害物質のＸ線共結晶構造である。
【図３５】図３５は、配列番号４８を持つｐ３８アルファ・キナーゼの複合型オン・スイッチ制御ポケットに結合した実施例２９のｐ３８アルファ小分子スイッチ制御阻害物質のＸ線共結晶構造である。
【図３６】図３６は、配列番号４８を持つｐ３８アルファ・キナーゼの複合型オン・スイッチ制御ポケットに結合した実施例６１のｐ３８アルファ小分子スイッチ制御阻害物質のＸ線共結晶構造である。
【図３７】図３７は、配列番号４８を持つｐ３８アルファ・キナーゼの複合型オン・スイッチ制御ポケットに結合した実施例６２のｐ３８アルファ小分子スイッチ制御阻害物質のＸ線共結晶構造である。
【図３８】図３８は、配列番号４８を持つｐ３８アルファ・キナーゼの複合型オン・スイッチ制御ポケットに結合した実施例６３のｐ３８アルファ小分子スイッチ制御阻害物質のＸ線共結晶構造である。
【図３９】図３９は、二重リン酸化された配列番号５５を持つｐ３８アルファ・キナーゼの複合型オン・スイッチ制御ポケットに結合した実施例２９のｐ３８アルファ小分子スイッチ制御阻害物質のＸ線共結晶構造である。
【図４０】図４０は、配列番号５３を持つＡｂｌキナーゼの複合型オン・スイッチ制御ポケットに結合した実施例６４のＡｂｌ小分子スイッチ制御阻害物質のＸ線共結晶構造である。
【図４１】図４１は、配列番号５３を持つＡｂｌキナーゼの複合型オン・スイッチ制御ポケットに結合した実施例６５のＡｂｌ小分子スイッチ制御阻害物質のＸ線共結晶構造である。
【図４２】図４２は、配列番号４５を持つ発癌性Ｖ５９９Ｅ  Ｂｒａｆキナーゼの複合型オン・スイッチ制御ポケットに結合した実施例６５のＢｒａｆ小分子スイッチ制御阻害物質のＸ線共結晶構造である。
【図４３】図４３は、ｐ３８アルファ・キナーゼの蛍光アフィニティアッセイの図である。
【図４４】図４４は、Ａｂｌキナーゼの蛍光アフィニティアッセイの図である。
【図４５】図４５は、配列番号５６を持つＡｂｌキナーゼに結合するＡＴＰ拮抗結合蛍光プローブの経時的結合状態を示すグラフである。
【図４６】図４６は、実施例６６のスイッチ制御阻害物質の存在下で、配列番号５６を持つＡｂｌキナーゼに結合する公知のＡＴＰ拮抗結合蛍光ブローブの結合強度の増加を１００分間に亘って示すグラフである。
【図４７】図４７は、図４６と同様のグラフであるが、初期の０〜２０分間の結合強度の増加を示すグラフである。
【図４８】図４８は、公知のＡＴＰ拮抗結合蛍光プローブの結合を加速するための実施例６４のＡｂｌキナーゼスイッチ阻害物質のＥＣ５０値を示すグラフである。
【図４８Ａ】図４８Ａは、公知のＡＴＰ拮抗結合蛍光プローブの結合を加速するための実施例６５のＡｂｌキナーゼスイッチ阻害物質のＥＣ５０値を示すグラフである。
【図４８Ｂ】図４８Ｂは、公知のＡＴＰ拮抗結合蛍光プローブの結合を加速するための実施例６６のＡｂｌキナーゼスイッチ阻害物質のＥＣ５０値を示すグラフである。
【図４９】図４９は、配列番号５７を持つプロカスパーゼ−７のＸ線結晶構造であり、スイッチ制御ポケットのダイマーインタフェースを示す。
【図５０】図５０は、配列番号４４を持つ野生型Ｂｒａｆキナーゼの複合型スイッチ制御ポケットのＸ線結晶構造である。
【図５１】図５１は、精製された、配列番号５８を持つ発癌性Ｖ５９９Ｅ  ＢｒａｆキナーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの図である。
【図５２】図５２は、実施例７２の小分子スイッチ阻害物質によって示される配列番号４８を持つｐ３８アルファ・キナーゼのＡＴＰ非拮抗型阻害を示すグラフである。
【図１】
2009503440.tif 000090
【図２】
2009503440.tif 000091
【図３】
2009503440.tif 000092
【図４】
2009503440.tif 000093
【図４ａ】
2009503440.tif 000094
【図４ｂ】
2009503440.tif 000095
【図４ｃ】
2009503440.tif 000096
【図４ｄ】
2009503440.tif 000097
【図４ｅ】
2009503440.tif 000098
【図４ｆ】
2009503440.tif 000099
【図５】
2009503440.tif 000100
【図６】
2009503440.tif 000101
【図６ａ】
2009503440.tif 000102
【図７】
2009503440.tif 000103
【図８】
2009503440.tif 000104
【図９】
2009503440.tif 000105
【図１０】
2009503440.tif 000106
【図１１】
2009503440.tif 000107
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
2009503440.tif 000141
【図４６】
2009503440.tif 000142
【図４７】
2009503440.tif 000143
【図４８】
2009503440.tif 000144
【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年7月1日(2008.7.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然キナーゼタンパク質を、キナーゼタンパク質にキナーゼのコンホメーション及び活性状態を制御する結合領域で結合した非天然分子とともに含む、キナーゼタンパク質モジュレーター・アダクトであって、該結合領域が第一、第二、及び第三の各系統のアミノ酸残基をその内部に持ち、該第一系統のアミノ酸残基が修飾された又は修飾されやすい残基であり、かつ、スイッチ制御リガンド配列の一部を構成し、該第一系統が少なくとも１の実質上永久的にゲノム的に変異した残基を含み、該第一系統の残基の少なくとも１員が該第二系統のアミノ酸残基の１又は２以上のコンホメーション制御残基と結合しているときに、該キナーゼが第一の生物学的に上方制御されたコンホメーションを呈し、該第一系統の残基のうち少なくとも１残基が該第三系統のアミノ酸残基の１又は２以上のコンホメーション制御残基と結合しているときに、該キナーゼが第二の生物学的に下方制御されたコンホメーションを呈し、該非天然分子が、（ａ）該第二系統のコンホメーション制御残基；（ｂ）該第三系統のコンホメーション制御残基；又は（ｃ）第一系統の１若しくは２以上の残基、の少なくとも１と結合していることを特徴とする、キナーゼタンパク質モジュレーター・アダクト。
【請求項２】
前記第一系統のアミノ酸残基が修飾されやすい残基も含む、請求項１に記載のアダクト。
【請求項３】
前記修飾されやすい残基が、リン酸化、硫酸化、脂肪酸アシル化、ニトロシル化、シスチニル化、又は酸化によって修飾可能である、請求項１又は２に記載のアダクト。
【請求項４】
前記ゲノム的に変異した残基が一塩基多型である、請求項１に記載のアダクト。
【請求項５】
前記キナーゼが一塩基多型変異Ｖ５９９Ｅ  Ｂ−Ｒａｆキナーゼである、請求項１に記載のアダクト。
【請求項６】
天然キナーゼタンパク質を、キナーゼタンパク質にキナーゼのコンホメーション及び活性状態を制御する結合領域で結合した非天然分子とともに含む、キナーゼタンパク質モジュレーター・アダクトであって、該結合領域が第一、第二、及び第三の各系統のアミノ酸残基をその内部に持ち、該第一系列のアミノ酸残基が、システイン、Ｓ−ヒドロキシルシステイン、Ｓ−ニトロシルシステイン、メチオニン及びシステイン残基からなる群から選ばれる少なくとも１の修飾可能なアミノ酸残基若しくはジペプチド残基からなるスイッチ制御リガンド配列の一部を構成し、該第一系統の残基の少なくとも１員が該第二系統のアミノ酸残基の１又は２以上のコンホメーション制御残基と結合しているときに、該キナーゼが第一の生物学的に上方制御されたコンホメーションを呈し、該第一系統の残基の少なくとも１残基が該第三系統のアミノ酸残基の１又は２以上のコンホメーション制御残基と結合しているときに、該キナーゼが第二の生物学的に下方制御されたコンホメーションを呈し、該非天然分子が、（ａ）該第二系統のコンホメーション制御残基；（ｂ）該第三系統のコンホメーション制御残基；又は（ｃ）第一系統の１若しくは２以上の残基、の少なくとも１に結合していることを特徴とする、キナーゼタンパク質モジュレーター・アダクト。
【請求項７】
下記のステップを含む、キナーゼタンパク質の生物学的活性を変える方法：
キナーゼのコンホメーション及び活性状態を制御する結合領域を含む天然キナーゼタンパク質を提供するステップであって、該結合領域が第一、第二、及び第三の各系統のアミノ酸残基をその内部に持ち、該第一系統のアミノ酸残基が修飾された又は修飾されやすい残基であり、かつ、スイッチ制御リガンド配列の一部を構成し、該第一系統が少なくとも１の実質上永久的にゲノム的に変異した残基を含み、該第一系統の１員が該第二系統のアミノ酸残基の１又は２以上のコンホメーション制御残基と結合しているときに、該キナーゼが第一の生物学的に上方制御されたコンホメーションを呈し、該第一系統の残基の少なくとも１残基が該第三系統のアミノ酸残基の１又は２以上のコンホメーション制御残基と結合しているときに、該キナーゼが第二の生物学的に下方制御されたコンホメーションを呈する、天然キナーゼタンパク質を提供するステップ；
該キナーゼタンパク質を非天然分子と接触させるステップ；及び
該分子を該キナーゼタンパク質と結合させるステップであって、該分子が（ａ）該第二系統のコンホメーション制御残基；（ｂ）該第三系統のコンホメーション制御残基；又は（ｃ）第一系統の１若しくは２以上の残基の少なくとも１に結合することを特徴とする、該分子を該キナーゼタンパク質と結合させるステップ。
【請求項８】
前記第一系統のアミノ酸残基が修飾されやすい残基も含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記修飾されやすい残基が、リン酸化、硫酸化、脂肪酸アシル化、ニトロシル化、シスチニル化、又は酸化によって修飾可能である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ゲノム的に変異した残基が一塩基多型である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記キナーゼが一塩基多型変異Ｖ５９９Ｅ  Ｂ−Ｒａｆキナーゼである、請求項７に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２４】
2009503440.tif 000278
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２５】
2009503440.tif 000279