(57)【要約】  本発明は、ペラルゴニウム属の植物体、特に根の成分抽出の方法に関する。上記方法は、水および炭素原子を少なくとも３つ含む少なくとも１つの一価アルコールと、水および少なくとも１つの多価アルコールと、水および少なくとも１つの無機酸、有機酸、一塩基酸または多塩基酸またはそれらの誘導体と、少なくとも１つの植物油と、二酸化炭素とからなる群より選択される、エタノールを含まない溶媒またはエタノールを含まない溶媒の混合物を用いる手段により植物の成分抽出を行うことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペラルゴニウム属植物の植物体、特に根、の成分抽出方法であって、水および炭素原子数が少なくとも３である少なくとも１つの一価アルコールと、水および少なくとも１つの多価アルコールと、水および少なくとも１つの無機酸、有機酸、一塩基酸または多塩基酸またはそれらの誘導体と、少なくとも１つの植物油と、二酸化炭素とからなる群より選択される、エタノールを含まない溶媒またはエタノールを含まない溶媒の混合物を用いて植物から成分抽出を行うことを特徴とする抽出方法。
【請求項２】
上記抽出は、浸出および／または１段階もしくは多段階、好ましくは２段階の浸漬を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記多価アルコールは、ポリエチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、キシリトールおよびこれらの混合物からなる群より選択されるものであることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記ポリエチレングリコールは、分子量が略４０から略４０，０００であり、好ましくは、略２００から略２，０００であり、特に好ましくは、略２００から略８００であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記植物体は、切り刻まれ、すりつぶされ、および／または乾燥され、および／または新鮮な状態で用いられることを特徴とする請求項１から４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
水：多価アルコールの重量比は、９５：５から略５：９５までの範囲内にあることを特徴とする請求項１から５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
水：有機一塩基酸または有機多塩基酸の重量比は、９９．９：０．１から略８０：２０までの範囲内にあることを特徴とする請求項１から５の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの植物油または二酸化炭素を抽出剤として用いることを特徴とする請求項１から５の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
水：無機酸の重量比は、９９．９：０．１から略８０：２０までの範囲内にあることを特徴とする請求項１から５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
水：多価アルコールの重量比は、浸漬においては、８０：２０から略６０：４０までの範囲内にあり、好ましくは略７０：３０であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
水：多価アルコールの重量比は、浸出においては、９０：１０から略７０：３０までの範囲内にあり、好ましくは略８０：２０であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
浸出の前に上記植物体をすりつぶすことを特徴とする請求項２から１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
水および炭素原子数が少なくとも３である少なくとも１つの一価アルコールと、水および少なくとも１つの多価アルコールと、水および少なくとも１つの無機酸、有機酸、一塩基酸または多塩基酸またはそれらの誘導体と、少なくとも１つの植物油と、二酸化炭素とからなる群より選択される、エタノールを含まない溶媒またはエタノールを含まない溶媒の混合物に溶解しており、特に請求項１から１２の何れか１項に記載の方法にしたがって調製したときに上記溶媒または上記混合物に溶解している、ことを特徴とするペラルゴニウム属植物の抽出物。
【請求項１４】
ペラルゴニウム・シドイデス、ペラルゴニウム・レニフォルメ、ペラルゴニウム・ロバツムおよび／またはペラルゴニウム・トリステの植物体の根から得られるものであることを特徴とする請求項１３に記載の抽出物。
【請求項１５】
さらに増粘剤が含まれており、固体状に硬化した形態であることを特徴とする請求項１３または１４に記載の抽出物。
【請求項１６】
菓子、薬用キャンディー、口腔投与または舌下投与の投薬形態、もしくは棒付きキャンディーの形態であることを特徴とする請求項１５に記載の抽出物。
【請求項１７】
哺乳動物における急性および／または慢性炎症疾患および／または感染症の治療に用いることを特徴とする請求項１３から１６の何れか１項に記載の抽出物の利用方法。
【請求項１８】
人間、ペット、家畜、好ましくは馬、犬、猫、豚、または鶏に対して用いることを特徴とする請求項１７に記載の利用方法。
【請求項１９】
上記抽出物は経口投与されることを特徴とする請求項１７または１８に記載の利用方法。
【請求項２０】
ＨＩＶ感染またはＨＩＶ関連感染の治療のために、または予防薬として用いることを特徴とする請求項１７から１９の何れか１項に記載の利用方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ペラルゴニウム属植物の植物体、好ましくは根からの成分抽出の方法、特にその方法により生成された抽出物、およびその抽出物の利用に関する。
【０００２】
ペラルゴニウム・レニフォルメ／シドイデス（Pelargonium reniforme/sidoides）は、南アフリカにおいて、胃腸の疾患および呼吸器系の疾患を治療するための民間医療に習慣的に用いられている植物である。この植物は、１８９７年に英国に運び込まれ、この植物とその抽出物は、２０世紀にＳｅｃｈｅｈａｙｅによってスイスに持ち込まれた。抽出物は、中でも、結核の治療における類似療法の際の調合に用いられた（Kolodziej, H., Kayser, O., Z. Phytotherap. 19, 141-151, 1998）。
【０００３】
エタノール抽出物は数種のグラム陽性菌およびグラム陰性菌に対して抗菌効果を有しており（Kayser, O., Kolodziej, H., Planta Med. 63, 508-510, 1997）、また免疫調節効果を保持している（Kayser, O., Kolodziej, H., Kiderlen, A. F., Radtke, O., Phytomedicine 2003; 10 Suppl. 4:18-24）ことが、科学的研究により実証されている。
【０００４】
ペラルゴニウム・シドイデスの根の主な含有物は、プロアントシアニジン、加水分解性タンニンオリゴマー、クマリン、フラボノイドおよびコーヒー酸誘導体である（Kayser, O., Dissertation, Free University of Berlin, 1997）。特徴的な点は、場合によって高度に酸化されたクマリンが存在することである。この酸化クマリンは、生物学的作用に部分的に関与するものであると考えられている（Kayser, O., Kolodziej, H., Phytochemistry, 39, 1181-1185, 1995）。
【０００５】
従来、ペラルゴニウム・シドイデスおよびペラルゴニウム・レニフォルメの根の物質の抽出物、ならびにペラルゴニウム属の他の植物の根の物質の抽出物は、浸漬（maceration）および／または浸出（percolation）によって、純水、水とアセトンなどの有機溶媒との混合物（Kayser, O., Kolodziej, H., Phytochmemistry, 39, 1181-1185, 1995）、メタノール（Bladt, S., Wagner, H., Dtsch. Apoth.-Ztg., 128, 292-296, 1988）、またはエタノール（WO 03/028746 A1）を用いて生成していた。一方、ペラルゴニウム・ロバツム（Pelargonium lobatum）およびペラルゴニウム・トリステ（Pelargonium triste）もまた、ペラルゴニウム属の植物種として知られている。グリセロールにより安定化した、ペラルゴニウム・レニフォルメ／シドイデスのエタノール抽出物は、市販されており、治療への応用に用いられている（Rote Liste 2006）。水、メタノールまたはアセトンによる抽出と比較すると、エタノール抽出では、抽出物の収率が向上し、かつ室温での抽出が可能である。しかしながら、子供たちは医療目的で用いられる抽出物を摂取することが好ましい患者グループであるため、専門家の間では、ペラルゴニウム・レニフォルメ／シドイデスのエタノール抽出物の使用には、問題があるとみられている。この問題は、アルコール依存症の患者、てんかんの患者またはパーキンソン病の患者など、医学的な理由により、エタノールを摂取すべきではない、または摂取してはならない患者にも当てはまる。
【０００６】
植物から採取されるエタノールを含まない液体に対する要望が他の製薬分野においてあったため、これまでに、エタノールを用いない調製方法の開発がなされてきた。この方法によれば、新鮮な植物の絞り汁、煎じ薬および水分強壮剤と異なり、脂肪親和性植物含有物もまた含まれている。使用する溶液および抽出溶剤の例としては、ポリエチレングリコール、グリセロール、ソルビトールもしくはプロピレングリコールの単体、または水との組み合わせであった。Vogel, K., Dissertion, Tubingen University 1992による論文では、カモミルの脂肪親和性の含有物、すなわちカマズレン（chamazulene）およびビサボロール（bisabolol）は、プロピレングリコールに容易に溶解するだけでなく、化学的および物理的に安定であることが示されている。カモミルは、ペラルゴニウムとは異なる属の植物である。しかし、カモミル抽出物では、多価アルコールであるプロピレングリコールを用いると、脂肪親和性の成分のみが優先的に抽出され、一方、親水性の成分が全く得られないことが見出されている（Vogel, K., Dissertation, Tubingen University, 1992）。エタノールを含まない抽出物と比較すると、エタノール／水混合物では、一定の技術的利点および微生物殺生における利点があり、とりわけ、収率の多大な増大を見込むことができる。現在、ある完成調合製剤において、プロピレングリコール／グリセロール／水混合物が、エタノール粘性抽出物またはアセトン抽出物（例えば、テボニン  フォルテ（Tebonin forte）溶液）を溶解するために用いられている。ソルビトール／水混合物は、小児科において用いられている薬剤プロスパン（Prospan）を提供するために用いられている（Rote Liste 2006）。
【０００７】
本発明は、現状の不都合を克服するように汎用方法を改良するという課題に基づくものである。とりわけ、本発明の目的は、医学的な理由によりエタノールを摂取すべきではないまたは摂取してはいけない患者（例えば、子供、アルコール依存症の患者、てんかんの患者、またはパーキンソン病の患者）に対しても生成物を投与できるようにするために、ペラルゴニウム属植物の植物体、特に根から、エタノールを用いずに成分抽出できる方法を提供することである。本発明の方法は、さらに、水／エタノール抽出により取得された抽出物と実質的に同じである抽出物を得ることを意図している。抽出剤は、毒物学的に無害でなければならない。特に、本方法は、質的および量的に水性エタノール抽出物に類似した抽出物を提供することを意図している。
【０００８】
さらに本発明は、抽出物、特に本方法に従って調製した抽出物を提供し、その利用を可能にすることを目的とする。
【０００９】
第一の課題は、水および炭素原子数が少なくとも３である少なくとも１つの一価アルコールと、水および少なくとも１つの多価アルコールと、水および少なくとも１つの無機酸、有機酸、一塩基酸または多塩基酸またはそれらの誘導体と、少なくとも１つの植物油と、二酸化炭素とからなる群より選択される、エタノールを含まない溶媒またはエタノールを含まない溶媒の混合物を用いて植物から成分抽出を行うことにより解決される。多価アルコールとして、糖および糖アルコールが好ましいこともまた理解される。
【００１０】
これに関しては、上記抽出は、浸出および／または１段階もしくは多段階、好ましくは２段階の浸漬を含むことが好ましい。
【００１１】
上記多価アルコールは、ポリエチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、キシリトールおよびこれらの混合物からなる群より選択されるものであることが特に好ましい。
【００１２】
上記ポリエチレングリコールは、分子量が略４０から略４０，０００であり、好ましくは、略２００から略２，０００であり、特に好ましくは、略２００から略８００であることが提案される。
【００１３】
一実施形態において、上記植物体は、切り刻まれ、すりつぶされ、および／または乾燥され、および／または新鮮な状態で用いられる。
【００１４】
水：多価アルコールの重量比は、９５：５から略５：９５までの範囲内にあることが特に好ましい。
【００１５】
水：有機一塩基酸または有機多塩基酸の重量比は、９９．９：０．１から略８０：２０までの範囲内にあることもまた提案される。
【００１６】
また、少なくとも１つの植物油または二酸化炭素を抽出剤として用いることが提案される。
【００１７】
また同様に、水：無機酸の重量比は、９９．９：０．１から略８０：２０までの範囲内にあることが提案される。無機酸は、リン酸またはそのアルカリ塩もしくはアルカリ土類塩であることが好ましい。
【００１８】
水：多価アルコールの重量比は、浸漬においては、８０：２０から略６０：４０までの範囲内にあり、好ましくは略７０：３０であり、また、水：多価アルコールの重量比は、浸出においては、９０：１０から略７０：３０までの範囲内にあり、好ましくは略８０：２０であることが好ましい。
【００１９】
また浸出の前に上記植物体をすりつぶすことも可能である。
【００２０】
第二の課題は、水および炭素原子数が少なくとも３である少なくとも１つの一価アルコールと、水および少なくとも１つの多価アルコールと、水および少なくとも１つの無機酸、有機酸、一塩基酸または多塩基酸またはそれらの誘導体と、少なくとも１つの植物油と、二酸化炭素とからなる群より選択される、エタノールを含まない溶媒またはエタノールを含まない溶媒の混合物に溶解している、ペラルゴニウム属植物の抽出物により解決される。
【００２１】
上記抽出物は、ペラルゴニウム・シドイデス、ペラルゴニウム・レニフォルメ、ペラルゴニウム・ロバツムおよび／またはペラルゴニウム・トリステの植物の根から得られるものであることが最も好ましい。
【００２２】
一実施形態において、さらに増粘剤が含まれており、固体状に硬化した形態であることもまた提案される。
【００２３】
この場合には、本抽出物は、菓子（sweet to suck）、薬用キャンディー（lozenge to suck）、口腔投与または舌下投与の投薬形態（buccal or lingual dosage form）、もしくは棒付きキャンディーの形態であることができる。
【００２４】
最終的には、哺乳動物における急性および／または慢性炎症疾患および／または感染症の治療に用いる本発明の抽出物の利用方法が提案される。
【００２５】
人間、ペット、家畜、好ましくは馬、犬、猫、豚、または鶏に対して用いる利用方法が好ましい。
【００２６】
また、根抽出物は経口投与されることが好ましい。
【００２７】
また、本抽出物は、好ましくはＨＩＶ感染またはＨＩＶ関連感染の治療のために、または予防薬として用いることできる。この種のＨＩＶ関連感染は、細菌、他のウイルス、真菌および／または寄生生物による感染であってよい。より具体的な例は、ＤＥ１０２００４０３２４３９Ａ１に記載されている。
【００２８】
驚くべきことに、本発明の方法によれば、ペラルゴニウム属植物の抽出物、好ましくは根の抽出物を、水／エタノールを用いた抽出と同じ量および同じ質で得ることができることが分かった。同時に、本発明の方法により、公知の抗菌効果および免疫刺激効果を獲得できることが分かった。本発明の方法によれば、脂肪親和性および親水性の含有物の大部分を抽出することができる。本発明の方法はエタノールを用いないでとり行われる。そのため、得られた抽出物を、子供、アルコール依存症の患者、てんかん患者およびパーキンソン病患者に対して安全に用いることができる。
【００２９】
本発明の方法では、抽出は、浸出および／または２段階の浸漬の形態で行われることが好ましい。
【００３０】
浸出は、水と多価アルコールとの異なる混合物を用いて行われることが好ましい。多価アルコールとしてはソルビトールが好ましく、例えば、水／グリセロール／ソルビトールが７０：１５：１５（重量％）の混合物である。またはポリエチレングリコールが好ましく、例えば、水／ポリエチレングリコール／グリセロールが７０：２０：１０（重量％）の混合物である。しかしながら、すりつぶすことによっても浸出は可能である。すりつぶすときに用いる水／アルコール混合物と、その後の浸出のときに用いる水／アルコール混合物とは、同じ濃度または異なる濃度であることができる。比率が７０：３０（重量比）である水／アルコールを用いてすりつぶし、比率が８０：２０（重量比）である水／アルコールを用いて浸出を行うと、最良の生成物が得られることが、利点として本明細書に示されている。根をすりつぶしたものと、抽出剤との比率を２０：８０（重量比）にすると、多価アルコールの最終濃度がおよそ２２％になる。本発明の抽出物は、ある割合のクマリンを含んでおり、スコポレチンを基準にすると、エタノール抽出物の場合と同程度の量である。
【００３１】
水および多価アルコールの混合物を用いて、すりつぶして乾燥させたペラルゴニウムの根から抽出を行う実験では、驚くべきことに、抽出溶剤の組成に依存して、一方では例えばクマリンのような脂肪親和性物質が、もう一方では水溶性フェノールが、同じ抽出段階において抽出されることが分かった。ペラルゴニウム・シドイデスおよびペラルゴニウム・レニフォルメに関する現認識の背景では、これは予想できなかったことである。浸出および２段階の浸漬によって、エタノール抽出物に匹敵する量および質の多量の抽出物を得ることができる。この浸出および２段階の浸漬は、後述する例において詳細に説明される。
【００３２】
本発明に従い得られた根の抽出物の特に好ましい一実施形態は、例えばグルコースシロップといった、抽出物が凝固または硬化するような質の増粘剤を抽出物に添加することにある。その結果、例えば、菓子、薬用キャンディー、口腔投与もしくは舌下投与の投与形態、または棒付きキャンディーなどの形態の、硬化した抽出物を投与することができ、それにより、特に子供の治療が容易になる。さらに、本発明の抽出物は、ドロップ、リンクタス剤、シロップなどの従来の液体製剤として、処方および投与することもまた可能である。
【００３３】
本発明の抽出物について抗菌効果および免疫刺激効果を決定するために試験を行ったところ、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、および肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）などのグラム陽性菌、ならびに、大腸菌（E.coli）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、およびインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）などのグラム陰性菌に対して顕著な効果があることが分かった。免疫刺激について試験を行ったところ、ドノバンリーシュマニアを感染させたマウスマクロファージにおいてγ−ＩＦＮおよびＴＮＦアルファの誘導がみられた。
【００３４】
用いることができる抽出剤としては、例えば脂肪族および芳香族一価または多価アルコールといった特定の一価または多価アルコールおよびその誘導体、無機酸または有機酸および一塩基酸または多塩基酸ならびにその誘導体、植物油、ならびに二酸化炭素が挙げられる。好ましい混合比は、上述したとおりである。
【００３５】
特定の、とりわけ好ましい抽出剤の例としては：
糖および糖アルコールを含む多価アルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１００−４０００、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール１００−４０００、ブタンジオールのとり得る置換体およびその誘導体、ブチルアルコール、１，３−ブチレングリコール、例えばカルボキシメチルセルロースといったカルボキシメチルセルロースおよびその誘導体、カルボキシエチルセルロース、デキストラン、デキストリン、デキストロース、エチルセルロース、例えばエチレングリコールジステアリン酸といったエチレングリコール誘導体、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、グルコース、グリセリンおよびそのエーテル化合物およびエーテル化誘導体、特に長鎖脂肪酸または長鎖脂肪アルコールによりエーテル化したグリセリン、乳糖、モノグリセリドおよびジグリセリドおよびそのエステルおよびアルカリ塩およびアルカリ土類塩、オクタノール、ポリソルベート２０−８０、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、プロピレングリコールアルギン酸、ソルビタンおよびそのモノエステル化およびポリエステル化誘導体、ソルビトール、キシロース、キシリトール、有機一塩基酸および多塩基酸およびそれらのアルカリ塩およびアルカリ土類塩、例えばアスコルビン酸、酒石酸、リンゴ酸、ヘテロ多糖類、単糖類、二糖類、三糖類、四糖類、二酸化炭素、植物油、レシチンおよびその誘導体、リン酸およびそのアルカリ塩およびアルカリ土類塩およびポリオキシエチレン、好ましくはポリソルベート２０−８０のような飽和または不飽和脂肪酸によりエステル化されたものが好ましい。
【００３６】
同様に、脂肪族フェニルアルコール、例えばイソブチル、プロピルまたはエチルフェニルアルコール、酢酸メチルベンジル、ブチル酸メチルベンジルおよびその他の酸の誘導体、鎖長がＣ６からＣ１６までの液状の飽和および不飽和脂肪酸および脂肪アルコール、ベンジルアルコールおよびその誘導体、イソアミルアルコールおよびその誘導体、イソブチルアルコールおよびその誘導体、が好ましい。
【００３７】
以下、本発明について例を参照して説明するが、この例に限定されるものではない。比較し得る分析データおよび薬理学的データを得るために、全ての抽出物においてスコポレチンを測定した。
【００３８】
実施例１
乾燥してすりつぶしたペラルゴニウム・シドイデスの根１００ｇを、２００ｇの水／ソルビトール混合物（水１００ｍｌにソルビトール７０ｇ）に予め２４時間浸した後、８００ｍｌの同じ水／ソルビトール混合物に８時間浸出した。粗抽出物をサイツ・スプラ（Ｓｅｉｔｚ  Ｓｕｐｒａ）１５００を用いてろ過し、調合した。
【００３９】
【表１】
2009501736.tif 000002
【００４０】
実施例２
乾燥してすりつぶしたペラルゴニウム・シドイデスの根１００ｇを、２００ｇの水／ＰＥＧ４００混合物（水：ＰＥＧ４００＝１０：９０（重量％））に予め２４時間浸した後、８００ｍｌの同じ水／ＰＥＧ４００混合物に８時間浸出した。粗抽出物をサイツ・スプラ１５００を用いてろ過し、調合した。
【００４１】
【表２】
2009501736.tif 000003
【００４２】
実施例３
乾燥してすりつぶしたペラルゴニウム・シドイデスの根の薬物２０ｇずつを、様々な溶剤の製剤（Ａ１−Ａ１５）（表３参照）に予め１６時間浸した後、異なる２種類の抽出溶剤（Ｅ１、Ｅ２）１６０ｇのそれぞれに浸出した。抽出溶剤Ｅ１は、水／グリセロール／ソルビトールが８０：１０：１０（重量％）からなり、抽出溶剤Ｅ２は、水／グリセロール／ＰＥＧ４００が８５：１２．５：２．５（重量％）からなる。浸出を８時間続けた後、粗抽出物をサイズＧ４のフリットガラスフィルタ（fritted glass filter）を用いてろ過した。エタノールを用いない抽出に加えて、エタノールが含まれる抽出物（Ａ１６）も比較目的のために調製した。調製は、ＷＯ０３／０２８７４６Ａ１の実施例１に開示されている詳細な記述に準拠した。
【００４３】
【表３】
2009501736.tif 000004
【００４４】
【表４】
2009501736.tif 000005
【００４５】
実施例４
浸出と比較して、ＤＡＢ１０（Ｇｅｒｍａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）の規定に準拠して一部変更した浸漬を行った。すりつぶして乾燥したペラルゴニウム・シドイデスの根２０ｇを、１４０ｍｌの水／ソルビトール混合物（蒸留水１００ｍｌにソルビトール７０ｇ）に懸濁し、時折振とうさせながら５日間静置した。その後、混合物をろ過し、粗抽出物を捕捉した。次いで、湿潤薬物材料について同じように二度目の浸漬を行った。抽出溶液を同様に捕捉し、最初の粗抽出物と足し合わせた。
【００４６】
【表５】
2009501736.tif 000006
【００４７】
実施例５
浸出と比較して、ＤＡＢ１０の規定に準拠して一部変更した浸漬を行った。すりつぶして乾燥したペラルゴニウム・シドイデスの根２０ｇを、１４０ｍｌの水／ＰＥＧ４００混合物（水：ＰＥＧ４００＝１０：９０（重量％））に懸濁し、時折振とうさせながら５日間静置した。その後、混合物をろ過し、粗抽出物を捕捉した。次いで、湿潤薬物材料について同じように二度目の浸漬を行った。抽出溶液を同様に捕捉し、最初の粗抽出物と足し合わせた。
【００４８】
【表６】
2009501736.tif 000007
【００４９】
分析方法および薬理学方法
Ａ．全フェノールの決定
タンニンのＧｅｒｍａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（ＤＡＢ２００２）に特定されている方法に準拠して、全フェノールの割合を決定した。モリブデン酸塩／タングステン酸塩試薬と反応させた後に、測光法によりフェノール量を決定した。そのために、粗抽出物を直接回収し、炭酸ナトリウム溶液によりアルカリ化した後、モリブデン酸塩／タングステン酸塩試薬と混合した。遠心分離の後、上清溶液の７２０ｎｍにおける吸光を、水を基準に測定した。抽出溶剤Ｅ１またはＥ２を用いた場合に、水と比較して違いを示さないことがわかった。結果はエピカテキンを基準に計算している。
【００５０】
Ｂ．全クマリンの決定
全クマリンは、ＲＰ−１８カラムを用いたＨＰＬＣによって決定した。移動相には、アセトニトリル／水／リン酸勾配（１０：９９０：４から２０５：７９５：４）を使用した。検出は３３０ｎｍにおいて行った。個々のピークをスコポレチンとして計算した。
【００５１】
Ｃ．抗菌効果の決定
１５０ｍｌのミュラーヒントン培地に、本発明の各抽出物５０μｌを２００μｌに希釈して、ＤＩＮ５８９４０，１９９５、およびVan den Berghe D. A., Vlietnick, A. J., Methods in Plant Biochemistry, Assay for Bioactivity, vol.6, Dey, P. M., Harborne, J. B. （eds）, アカデミックプレス、ロンドン、サンディエゴ、ニューヨーク、ボストン、シドニー、東京、トロント、４７−９９（１９９１）、に記載されている方法に準拠して、抗菌効果を決定した。寒天プレート上の阻害小孔（inhibiting areola）を測定することにより効果を決定した。寒天培地には、植菌の前にウェルがあけられる。参照株は、ブラウンシュバイクにあるドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ）から取得した：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ＡＴＣＣ３３３７９。その他の株は全て、大学医療センターＵＭＣＧ、フローニンゲン、オランダ、の患者試料からの組織内株として取得した。
【００５２】
Ｄ．免疫調節効果の決定
ＴＮＦ合成ならびにマウスＬ−９２９（ＴＮＦ）およびヒトＷＥＨＩ線維芽細胞からの放出
マウス線維芽細胞Ｌ−９２９（ＴＮＦ）Ｎｏ．５７０７系統およびＷＥＨＩ１６４／Ｅクローン１３Ｎｏ．５６７６の細胞を、Ｒ５培地中で、３７℃、６％ＣＯ２の条件下で前培養した。栄養フラスコ（nutrient flask）中の培養培地を捨て、フラスコ内に接着した細胞を１０ｍＬのＨＢＳＳ（ヘンク平衡塩類溶液）（ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）は含まない）によってリンスした。ＨＢＳＳ溶液を同様に捨て、５ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ溶液をフラスコに添加し、３７℃、６％ＣＯ２の条件下で１５分間インキュベートした。５ｍＬのＲ５培地を添加して酵素による細胞の剥離を停止させ、細胞懸濁液をファルコンチューブに集めた。細胞を回収するために、１，１００ｒｐｍ、１２分間、室温の条件下で２回、細胞懸濁液を遠心分離し、１０ｍＬのＨＢＳＳ溶液で３回洗浄した。ノイバウエル法にしたがって細胞数計測を行った（Ｌ−９２９（ＴＮＦ）は３．９７×１０７、およびＷＥＨＩ１６４／Ｅは１．３×１０７）。いずれの場合においても、Ｒ５溶液を用いて、１００μＬ中で３×１０４細胞／ウェル（３×１０５細胞／ｍＬに相当）に調整した。標準化した細胞懸濁液をマイクロタイタープレート（９６ウェル）にプレーティングした。コントロール目的のために、培地コントロール（細胞を含まない）を２つのウェルにピペットで加え、ネガティブコントロール（Ｒ５培地を伴う細胞）をさらに２つのウェルにピペットで加え、ポジティブコントロール（１０Ｕ／ｍＬに調整したＴＮＦ溶液を含むＲ５溶液中の細胞）を１つのウェルにピペットで加えた。プレーティングされたマイクロタイタープレートを、３７℃、６％ＣＯ２の条件下で一晩インキュベートした。
【００５３】
細胞懸濁液を一晩インキュベートしたら、底面に接着している細胞から上清を取り除き、異なる濃度に希釈したアクチノマイシンＤ溶液および試験溶液を用いて調整した。
【００５４】
活性化したマイクロタイタープレートを、３７℃、６％ＣＯ２の条件下で１８時間インキュベートした。インキュベーションの後、十分に細胞が溶解しているか、ポジティブコントロールを顕微鏡下で調べた。マイクロタイタープレートから培地を捨て去り、マット上でタップして乾かした。１００μＬのクリスタルバイオレット溶液をそれぞれのウェルに加え、３分間染色した。その後、染色液を捨て、各マイクロタイタープレートを蒸留水で４回洗浄し、マット上でタップして乾かし、５０℃で３０分間乾燥させた。１００μＬの３３％酢酸を各ウェルに添加し、マイクロタイタープレートを１０回振とうさせた。そして、５９２ｎｍにおける吸収を、ＥＬＩＳＡ装置を用いて測定した。
【００５５】
ＥＭＣウイルス／Ｌ９２９（ＩＦＮ）試験モデルにおけるＩＦＮ値の取得による細胞保護効果の決定
Ｌ９２９（ＩＦＮ）細胞（バッチＮｏ．５５７７）を培養し、トリプシン処理し、洗浄し、１００−ｍＬ培養ディッシュ中で細胞数を計測した。懸濁液を２×１０５細胞／ｍＬに調整し、２×１０４細胞／ウェルになるようにマイクロタイタープレートにまき、そしてこれを３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩インキュベートした。その後、上清を１００μＬずつの、培地コントロール、細胞コントロール、ｒＭｕＩＦＮ−γコントロールを含むウイルスコントロール、ｒＭｕＩＦＮ−γスタンダード（１００Ｕ／ｍＬ）および試験溶液に置換した。これらは全て、直線的に希釈した。
【００５６】
サンプルを厳密に８時間、３７℃、５％ＣＯ２の条件下でインキュベートした。インキュベーションの終了時に、使用したウイルス懸濁液を、ウイルスおよびインターフェロンコントロール、ならびに試験溶液に、ピペットを用いて１００μｌずつ添加した。さらに３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。
【００５７】
２２時間後、完全に発現したウイルス活性が明らかになり（ウイルスコントロールにおいて、細胞溶解がはっきりと顕著になる）、溶解が中断になった。洗浄ベースン（wash basin）を介して上清を捨てた。１００μＬの０．５％クリスタルバイオレット溶液を、ピペットを用いて各ウェルに添加した。３分間染色した後、余剰の溶液を取り除き、マイクロタイタープレートを蒸留水によりリンスし、５０℃で１０分間乾燥させた。完全に乾燥したウェルに、１００μＬの酢酸（３３％）をピペットにより添加し、１０回振とうさせた。クリスタルバイオレット染色の５５０ｎｍにおける吸収を、ＥＬＩＳＡ読取装置を用いて決定した。ｒＭｕＩＦＮ−γコントロールの平均吸収を、１００％細胞保護としてセットし、ウイルスコントロールの平均吸収を、０％としてセットした。ｒＭｕＩＦＮ−γスタンダードのＥＤ５０値は１，０７６Ｕ／ｍＬであった（８つの検量線から決定）。
【００５８】
上述の記載および請求の範囲に開示されている本発明の形態は、個別のおよび適宜組み合わせた様々な実施形態における本発明の実施に不可欠であることができる。
【国際調査報告】
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