(57)【要約】【課題】  本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を診断するのに役立つ遺伝子パネルを提供すること、ＮＡＳＨ関連遺伝子のパネルにおける特定の遺伝子の発現に基づいた非侵入性のアッセイにおいてＮＡＳＨを診断する方法を提供すること、及びＮＡＳＨの治療法及びＮＡＳＨを治療するための成分を提供すること。【解決手段】  患者がＮＡＳＨの病状であると診断する方法であって、患者のサンプルにおいて、ＮＡＳＨの発病又は進行に関連した遺伝子パネルの発現レベルを測定し、該発現レベルと前記遺伝子パネルにおけるＮＡＳＨに関連した遺伝子発現に対する所定値とを比較して、該発現レベルとＮＡＳＨの病状とを関連づける方法。【選択図】  図１０Ｂ
2009535642.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者がＮＡＳＨの病状であると診断する方法であって、
患者のサンプルにおいて、ＮＡＳＨの発病又は進行に関連した遺伝子パネルの発現レベルを測定し、
該発現レベルと前記遺伝子パネルにおけるＮＡＳＨに関連した遺伝子発現に対する所定値とを比較して、該発現レベルとＮＡＳＨの病状とを関連づける方法。
【請求項２】
前記遺伝子パネルは１又は２以上の小誘導性サイトカインを含む請求項１の方法。
【請求項３】
前記小誘導性サイトカインはＳＣＹＡ１９、ＳＣＹＡ２０、ＳＣＹＡ２１及びＳＣＹＢ６から成るグループから選択される少なくとも１つである請求項２の方法。
【請求項４】
前記パネルは、ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ１‐Ａ２  ｌａｍｂｄａ  ｈｙｂｒｉｄ  ＧＡＵ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ（免疫グロブリンＡ１‐Ａ２ラムダハイブリッドＧＡＵ重鎖）；  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ４（ＮＫ４）（ナチュラルキラー細胞トランスクリプト４（ＮＫ４））；  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｋａｐｐａ‐ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｖ‐Ｊ‐ｒｅｇｉｏｎ（免疫グロブリン再構成カッパ鎖遺伝子Ｖ‐Ｊ‐領域）；  ｄｉｕｂｉｑｕｉｔｉｎ（ＵＢＤ）（ジユビキチン（ＵＢＤ））；  ＧＴＰ‐ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ（ＧＥＭ）（骨格筋内過剰発現ＧＴＰ結合タンパク質（ＧＥＭ））；  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８（ＩＬ８）（インターロイキン８（ＩＬ８））；  ｄｅｆｅｎｓｉｎ，ａｌｐｈａ  １，ｍｙｅｌｏｉｄ‐ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＤＥＦＡ１）（デフェンシン、アルファ１、骨髄関連配列（ＤＥＦＡ１））；  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｄ２  ｓｙｎｔｈａｓｅ（２１ｋＤ，ｂｒａｉｎ）（ＰＴＧＤＳ）（プロスタグランジンＤ２合成酵素（２１ｋＤ、脳）（ＰＴＧＤＳ））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  １９（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー１９）；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ２０（ＳＣＹＡ２０）（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー２０（ＳＣＹＡ２０））；  ｎｅｐｈｒｏｐｏｎｔｉｎ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  １，ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ，ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ，ｅａｒｌｙ  Ｔ‐ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  １）（ネフロポンチン（分泌型燐タンパク質１、オステオポンチン、骨シアロプロテインＩ、初期Ｔ‐リンパ球活性１））；  ｆｉｂｕｌｉｎ  ５（ＦＢＬＮ５）（フィブリン５（ＦＢＬＮ５））；  ａｌｄｏ‐ｋｅｔｏ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  １，ｍｅｍｂｅｒ  Ｂ１０（ａｌｄｏｓｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（ＡＫＲ１Ｂ１０）（アルド‐ケト還元酵素ファミリー１、メンバーＢ１０（アルドース還元酵素）（ＡＫＲ１Ｂ１０））；  ｍａｔｒｉｘ  Ｇ１ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＧＰ）（マトリクスＧ１ａタンパク質（ＭＧＰ））；  ＩｇＫ  ｃｈａｉｎ  ｆｒｏｍ  ＧＭ  ６０７，Ｖ‐ｋａｐｐａ‐２  ｒｅｇｉｏｎ（ＩｇＫ鎖フロムＧＭ６０７、Ｖ‐カッパ‐２領域）；  Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｉ，ｍｅｍｂｅｒ  ６（嗅覚受容体、ファミリー２、サブファミリーＩ、メンバー６）；  ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ  Ｉ，ａｌｐｈａ  ２（ＣＯＬ１Ａ２）（コラーゲン、タイプＩ、アルファ２（ＣＯＬ１Ａ２））；  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ＰＡＣ  ８４５Ｏ２４  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １ｐ３６．１‐３６．２（染色体１ｐ３６．１‐３６．２上ＰＡＣ８４５Ｏ２４由来ＤＮＡ塩基配列）；  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋ���ｎ  ７  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（インターロイキン７受容体）；  ｃＤＮＡ，３  ｅｎｄ  ／ｃｌｏｎｅ＝ＩＭＡＧＥ‐３０１７２３（ｃＤＮＡ、３ｅｎｄ／ｃｌｏｎｅ＝ＩＭＡＧＥ‐３０１７２３）；  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８  Ｃ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔ（ＩＬ８）（インターロイキン８Ｃ末端変異体（ＩＬ８））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ２１（ＳＣＹＡ２１）（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー２１（ＳＣＹＡ２１））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｂ（Ｃｙｓ‐Ｘ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ６（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）（ＳＣＹＢ６）（小誘導性サイトカインサブファミリーＢ（Ｃｙｓ‐Ｘ‐Ｃｙｓ）、メンバー６（顆粒球走化性タンパク質２）（ＳＣＹＢ６））；  ｃｌｏｎｅ  ＫＭ３６  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ（クローンＫＭ３６免疫グロブリン軽鎖可変領域）；  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｇａｎｇｌｉａ，ｎｅｕｒａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １０（ＳＣＧＮ１０）（上頚神経節、神経特異１０（ＳＣＧＮ１０））；  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０ｋＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（熱ショックタンパク質７０ｋＤタンパク質２）；  ＥＧＦ‐ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｆｉｂｕｌｉｎ‐ｌｉｋｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＥＦＥＭＰ１）（ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリクスタンパク質１（ＥＦＥＭＰ１））；  Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｇａｎｇｌｉａ，ｎｅｕｒａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １０（上頚神経節、神経特異１０）；  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，ａｌｐｈａ  ２（ヘモグロビン（アルファ２））；  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌａｍｂｄａ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ３‐１０（免疫グロブリンラムダ可変部３‐１０）；  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ，ｍｕｓｃｌｅ（ＰＫＭ２）（ピルビン酸キナーゼ、筋（ＰＫＭ２））；  ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ  １（ＲＴＮ１）（レチクロン１（ＲＴＮ１））；  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ（ＬＣＫ）（リンパ球特異タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ））；  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｍｕ‐ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｖ‐Ｎ‐Ｄ‐Ｎ‐Ｊ‐ｒｅｇｉｏｎ（免疫グロブリン再構成μ鎖遺伝子Ｖ‐Ｎ‐Ｄ‐Ｎ‐Ｊ‐領域）；  ｎｏｒｍａｌ  ｍｕｃｏｓａ  ｏｆ  ｅｓｏｐｈａｇｕｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １（ＮＭＥＳ１）（正常粘膜オブ食道特異１（ＮＭＥＳ１））；  及びｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ  ＸＶ，ａｌｐｈａ  １（ＣＯＬ１５Ａ１）（コラーゲン、タイプＸＶ、アルファ１（ＣＯＬ１５Ａ１））、から成るグループから選択される少なくとも１つの遺伝子を備える請求項１の方法。
【請求項５】
ＮＡＳＨに関連した遺伝子発現の前記所定値は、遺伝子の正常な発現に対し少なくとも４倍の増加である請求項１の方法。
【請求項６】
ＮＡＳＨに関連した遺伝子発現の前記所定値は、遺伝子の正常な発現に対し少なくとも４乃至１２倍の増加である請求項１の方法。
【請求項７】
該遺伝子発現のレベルは、前記遺伝子から発現されたタンパク質のレベルを測定する免疫測定によって測定される請求項１の方法。
【請求項８】
前記患者のサンプルは血液である請求項１の方法。
【請求項９】
哺乳類の対象におけるＮＡＳＨを治療する方法であって、
ＮＡＳＨを有する疑い又は罹患し易い疑いのある哺乳類の対象に対し、少なくとも１つのＮＡＳＨ関連の遺伝子又はタンパク質の阻害剤を、ＮＡＳＨを減衰させ、除去させ又は予防するのに有効な量の形において治療的有効量投与する方法。
【請求項１０】
前記哺乳類の対象はヒトである請求項９の方法。
【請求項１１】
前記阻害剤は少なくとも１つの小誘導性サイトカインを阻害する請求項９の方法。
【請求項１２】
前記小誘導性サイトカインは、ＳＣＹＡ１９、ＳＣＹＡ２０、ＳＣＹＡ２１及びＳＣＹＢ６から成るグループから選択される請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記阻害剤は、ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ１‐Ａ２  ｌａｍｂｄａ  ｈｙｂｒｉｄ  ＧＡＵ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ（免疫グロブリンＡ１‐Ａ２ラムダハイブリッドＧＡＵ重鎖）；  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ４（ＮＫ４）（ナチュラルキラー細胞トランスクリプト４（ＮＫ４））；  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｋａｐｐａ‐ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｖ‐Ｊ‐ｒｅｇｉｏｎ（免疫グロブリン再構成カッパ鎖遺伝子Ｖ‐Ｊ‐領域）；  ｄｉｕｂｉｑｕｉｔｉｎ（ＵＢＤ）（ジユビキチン（ＵＢＤ））；  ＧＴＰ‐ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ（ＧＥＭ）（骨格筋内過剰発現ＧＴＰ結合タンパク質（ＧＥＭ））；  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８（ＩＬ８）（インターロイキン８（ＩＬ８））；  ｄｅｆｅｎｓｉｎ，ａｌｐｈａ  １，ｍｙｅｌｏｉｄ‐ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＤＥＦＡ１）（デフェンシン、アルファ１、骨髄関連配列（ＤＥＦＡ１））；  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｄ２  ｓｙｎｔｈａｓｅ（２１ｋＤ，ｂｒａｉｎ）（ＰＴＧＤＳ）（プロスタグランジンＤ２合成酵素（２１ｋＤ、脳）（ＰＴＧＤＳ））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  １９（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー１９）；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ２０（ＳＣＹＡ２０）（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー２０（ＳＣＹＡ２０））；  ｎｅｐｈｒｏｐｏｎｔｉｎ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  １，ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ，ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ，ｅａｒｌｙ  Ｔ‐ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  １）（ネフロポンチン（分泌型燐タンパク質１、オステオポンチン、骨シアロプロテインＩ、初期Ｔ‐リンパ球活性１））；  ｆｉｂｕｌｉｎ  ５（ＦＢＬＮ５）（フィブリン５（ＦＢＬＮ５））；  ａｌｄｏ‐ｋｅｔｏ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  １，ｍｅｍｂｅｒ  Ｂ１０（ａｌｄｏｓｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（ＡＫＲ１Ｂ１０）（アルド‐ケト還元酵素ファミリー１、メンバーＢ１０（アルドース還元酵素）（ＡＫＲ１Ｂ１０））；  ｍａｔｒｉｘ  Ｇ１ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＧＰ）（マトリクスＧ１ａタンパク質（ＭＧＰ））；  ＩｇＫ  ｃｈａｉｎ  ｆｒｏｍ  ＧＭ  ６０７，Ｖ‐ｋａｐｐａ‐２  ｒｅｇｉｏｎ（ＩｇＫ鎖フロムＧＭ６０７、Ｖ‐カッパ‐２領域）；  Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｉ，ｍｅｍｂｅｒ  ６（嗅覚受容体、ファミリー２、サブファミリーＩ、メンバー６）；  ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ  Ｉ，ａｌｐｈａ  ２（ＣＯＬ１Ａ２）（コラーゲン、タイプＩ、アルファ２（ＣＯＬ１Ａ２））；  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ＰＡＣ  ８４５Ｏ２４  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １ｐ３６．１‐３６．２（染色体１ｐ３６．１‐３６．２上ＰＡＣ８４５Ｏ２４由来ＤＮＡ塩基配列）；  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋ���ｎ  ７  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（インターロイキン７受容体）；  ｃＤＮＡ，３  ｅｎｄ  ／ｃｌｏｎｅ＝ＩＭＡＧＥ‐３０１７２３（ｃＤＮＡ、３ｅｎｄ／ｃｌｏｎｅ＝ＩＭＡＧＥ‐３０１７２３）；  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８  Ｃ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔ（ＩＬ８）（インターロイキン８Ｃ末端変異体（ＩＬ８））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ２１（ＳＣＹＡ２１）（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー２１（ＳＣＹＡ２１））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｂ（Ｃｙｓ‐Ｘ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ６（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）（ＳＣＹＢ６）（小誘導性サイトカインサブファミリーＢ（Ｃｙｓ‐Ｘ‐Ｃｙｓ）、メンバー６（顆粒球走化性タンパク質２）（ＳＣＹＢ６））；  ｃｌｏｎｅ  ＫＭ３６  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ（クローンＫＭ３６免疫グロブリン軽鎖可変領域）；  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｇａｎｇｌｉａ，ｎｅｕｒａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １０（ＳＣＧＮ１０）（上頚神経節、神経特異１０（ＳＣＧＮ１０））；  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０ｋＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（熱ショックタンパク質７０ｋＤタンパク質２）；  ＥＧＦ‐ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｆｉｂｕｌｉｎ‐ｌｉｋｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＥＦＥＭＰ１）（ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリクスタンパク質１（ＥＦＥＭＰ１））；  Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｇａｎｇｌｉａ，ｎｅｕｒａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １０（上頚神経節、神経特異１０）；  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，ａｌｐｈａ  ２（ヘモグロビン（アルファ２））；  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌａｍｂｄａ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ３‐１０（免疫グロブリンラムダ可変部３‐１０）；  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ，ｍｕｓｃｌｅ（ＰＫＭ２）（ピルビン酸キナーゼ、筋（ＰＫＭ２））；  ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ  １（ＲＴＮ１）（レチクロン１（ＲＴＮ１））；  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ（ＬＣＫ）（リンパ球特異タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ））；  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｍｕ‐ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｖ‐Ｎ‐Ｄ‐Ｎ‐Ｊ‐ｒｅｇｉｏｎ（免疫グロブリン再構成μ鎖遺伝子Ｖ‐Ｎ‐Ｄ‐Ｎ‐Ｊ‐領域）；  ｎｏｒｍａｌ  ｍｕｃｏｓａ  ｏｆ  ｅｓｏｐｈａｇｕｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １（ＮＭＥＳ１）（正常粘膜オブ食道特異１（ＮＭＥＳ１））；  及びｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ  ＸＶ，ａｌｐｈａ  １（ＣＯＬ１５Ａ１）（コラーゲン、タイプＸＶ、アルファ１（ＣＯＬ１５Ａ１））、から成るグループから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害する請求項９の方法。
【請求項１４】
前記阻害剤は少なくとも１つの抗体である請求項９の方法。
【請求項１５】
前記抗体はモノクローナル抗体である請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記抗体は、ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ１‐Ａ２  ｌａｍｂｄａ  ｈｙｂｒｉｄ  ＧＡＵ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ（免疫グロブリンＡ１‐Ａ２ラムダハイブリッドＧＡＵ重鎖）；  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ４（ＮＫ４）（ナチュラルキラー細胞トランスクリプト４（ＮＫ４））；  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｋａｐｐａ‐ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｖ‐Ｊ‐ｒｅｇｉｏｎ（免疫グロブリン再構成カッパ鎖遺伝子Ｖ‐Ｊ‐領域）；  ｄｉｕｂｉｑｕｉｔｉｎ（ＵＢＤ）（ジユビキチン（ＵＢＤ））；  ＧＴＰ‐ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ（ＧＥＭ）（骨格筋内過剰発現ＧＴＰ結合タンパク質（ＧＥＭ））；  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８（ＩＬ８）（インターロイキン８（ＩＬ８））；  ｄｅｆｅｎｓｉｎ，ａｌｐｈａ  １，ｍｙｅｌｏｉｄ‐ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＤＥＦＡ１）（デフェンシン、アルファ１、骨髄関連配列（ＤＥＦＡ１））；  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｄ２  ｓｙｎｔｈａｓｅ（２１ｋＤ，ｂｒａｉｎ）（ＰＴＧＤＳ）（プロスタグランジンＤ２合成酵素（２１ｋＤ、脳）（ＰＴＧＤＳ））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  １９（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー１９）；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ２０（ＳＣＹＡ２０）（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー２０（ＳＣＹＡ２０））；  ｎｅｐｈｒｏｐｏｎｔｉｎ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  １，ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ，ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ，ｅａｒｌｙ  Ｔ‐ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  １）（ネフロポンチン（分泌型燐タンパク質１、オステオポンチン、骨シアロプロテインＩ、初期Ｔ‐リンパ球活性１））；  ｆｉｂｕｌｉｎ  ５（ＦＢＬＮ５）（フィブリン５（ＦＢＬＮ５））；  ａｌｄｏ‐ｋｅｔｏ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  １，ｍｅｍｂｅｒ  Ｂ１０（ａｌｄｏｓｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（ＡＫＲ１Ｂ１０）（アルド‐ケト還元酵素ファミリー１、メンバーＢ１０（アルドース還元酵素）（ＡＫＲ１Ｂ１０））；  ｍａｔｒｉｘ  Ｇ１ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＧＰ）（マトリクスＧ１ａタンパク質（ＭＧＰ））；  ＩｇＫ  ｃｈａｉｎ  ｆｒｏｍ  ＧＭ  ６０７，Ｖ‐ｋａｐｐａ‐２  ｒｅｇｉｏｎ（ＩｇＫ鎖フロムＧＭ６０７、Ｖ‐カッパ‐２領域）；  Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｉ，ｍｅｍｂｅｒ  ６（嗅覚受容体、ファミリー２、サブファミリーＩ、メンバー６）；  ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ  Ｉ，ａｌｐｈａ  ２（ＣＯＬ１Ａ２）（コラーゲン、タイプＩ、アルファ２（ＣＯＬ１Ａ２））；  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ＰＡＣ  ８４５Ｏ２４  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １ｐ３６．１‐３６．２（染色体１ｐ３６．１‐３６．２上ＰＡＣ８４５Ｏ２４由来ＤＮＡ塩基配列）；  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉ���  ７  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（インターロイキン７受容体）；  ｃＤＮＡ，３  ｅｎｄ  ／ｃｌｏｎｅ＝ＩＭＡＧＥ‐３０１７２３（ｃＤＮＡ、３ｅｎｄ／ｃｌｏｎｅ＝ＩＭＡＧＥ‐３０１７２３）；  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８  Ｃ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔ（ＩＬ８）（インターロイキン８Ｃ末端変異体（ＩＬ８））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ２１（ＳＣＹＡ２１）（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー２１（ＳＣＹＡ２１））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｂ（Ｃｙｓ‐Ｘ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ６（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）（ＳＣＹＢ６）（小誘導性サイトカインサブファミリーＢ（Ｃｙｓ‐Ｘ‐Ｃｙｓ）、メンバー６（顆粒球走化性タンパク質２）（ＳＣＹＢ６））；  ｃｌｏｎｅ  ＫＭ３６  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ（クローンＫＭ３６免疫グロブリン軽鎖可変領域）；  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｇａｎｇｌｉａ，ｎｅｕｒａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １０（ＳＣＧＮ１０）（上頚神経節、神経特異１０（ＳＣＧＮ１０））；  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０ｋＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（熱ショックタンパク質７０ｋＤタンパク質２）；  ＥＧＦ‐ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｆｉｂｕｌｉｎ‐ｌｉｋｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＥＦＥＭＰ１）（ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリクスタンパク質１（ＥＦＥＭＰ１））；  Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｇａｎｇｌｉａ，ｎｅｕｒａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １０（上頚神経節、神経特異１０）；  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，ａｌｐｈａ  ２（ヘモグロビン（アルファ２））；  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌａｍｂｄａ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ３‐１０（免疫グロブリンラムダ可変部３‐１０）；  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ，ｍｕｓｃｌｅ（ＰＫＭ２）（ピルビン酸キナーゼ、筋（ＰＫＭ２））；  ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ  １（ＲＴＮ１）（レチクロン１（ＲＴＮ１））；  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ（ＬＣＫ）（リンパ球特異タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ））；  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｍｕ‐ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｖ‐Ｎ‐Ｄ‐Ｎ‐Ｊ‐ｒｅｇｉｏｎ（免疫グロブリン再構成μ鎖遺伝子Ｖ‐Ｎ‐Ｄ‐Ｎ‐Ｊ‐領域）；  ｎｏｒｍａｌ  ｍｕｃｏｓａ  ｏｆ  ｅｓｏｐｈａｇｕｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １（ＮＭＥＳ１）（正常粘膜オブ食道特異１（ＮＭＥＳ１））；  及びｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ  ＸＶ，ａｌｐｈａ  １（ＣＯＬ１５Ａ１）（コラーゲン、タイプＸＶ、アルファ１（ＣＯＬ１５Ａ１））、から成るグループから選択される少なくとも１つのタンパク質に特異的に結合する請求項１４の方法。
【請求項１７】
哺乳類の対象におけるＮＡＳＨを治療する方法であって、
ＮＡＳＨを有する疑い又は罹患し易い疑いのある哺乳類の対象に対し、ＮＡＳＨ関連のタンパク質に対する少なくとも１つの受容体の阻害剤を、ＮＡＳＨを減衰させ、除去させ又は予防するのに有効な量の形において治療的有効量投与する方法。
【請求項１８】
前記受容体は小誘導性サイトカインに対する受容体である請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記小誘導性サイトカインは、ＣＬＣ１９、ＳＣＹＡ２０、ＳＣＹＡ２１及びＣＸＣＬ６から成るグループから選択される少なくとも１つである請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記受容体は、ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ１‐Ａ２  ｌａｍｂｄａ  ｈｙｂｒｉｄ  ＧＡＵ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ（免疫グロブリンＡ１‐Ａ２ラムダハイブリッドＧＡＵ重鎖）；  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ４（ＮＫ４）（ナチュラルキラー細胞トランスクリプト４（ＮＫ４））；  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｋａｐｐａ‐ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｖ‐Ｊ‐ｒｅｇｉｏｎ（免疫グロブリン再構成カッパ鎖遺伝子Ｖ‐Ｊ‐領域）；  ｄｉｕｂｉｑｕｉｔｉｎ（ＵＢＤ）（ジユビキチン（ＵＢＤ））；  ＧＴＰ‐ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ（ＧＥＭ）（骨格筋内過剰発現ＧＴＰ結合タンパク質（ＧＥＭ））；  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８（ＩＬ８）（インターロイキン８（ＩＬ８））；  ｄｅｆｅｎｓｉｎ，ａｌｐｈａ  １，ｍｙｅｌｏｉｄ‐ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＤＥＦＡ１）（デフェンシン、アルファ１、骨髄関連配列（ＤＥＦＡ１））；  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｄ２  ｓｙｎｔｈａｓｅ（２１ｋＤ，ｂｒａｉｎ）（ＰＴＧＤＳ）（プロスタグランジンＤ２合成酵素（２１ｋＤ、脳）（ＰＴＧＤＳ））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  １９（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー１９）；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ２０（ＳＣＹＡ２０）（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー２０（ＳＣＹＡ２０））；  ｎｅｐｈｒｏｐｏｎｔｉｎ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  １，ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ，ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ，ｅａｒｌｙ  Ｔ‐ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  １）（ネフロポンチン（分泌型燐タンパク質１、オステオポンチン、骨シアロプロテインＩ、初期Ｔ‐リンパ球活性１））；  ｆｉｂｕｌｉｎ  ５（ＦＢＬＮ５）（フィブリン５（ＦＢＬＮ５））；  ａｌｄｏ‐ｋｅｔｏ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  １，ｍｅｍｂｅｒ  Ｂ１０（ａｌｄｏｓｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（ＡＫＲ１Ｂ１０）（アルド‐ケト還元酵素ファミリー１、メンバーＢ１０（アルドース還元酵素）（ＡＫＲ１Ｂ１０））；  ｍａｔｒｉｘ  Ｇ１ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＧＰ）（マトリクスＧ１ａタンパク質（ＭＧＰ））；  ＩｇＫ  ｃｈａｉｎ  ｆｒｏｍ  ＧＭ  ６０７，Ｖ‐ｋａｐｐａ‐２  ｒｅｇｉｏｎ（ＩｇＫ鎖フロムＧＭ６０７、Ｖ‐カッパ‐２領域）；  Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｉ，ｍｅｍｂｅｒ  ６（嗅覚受容体、ファミリー２、サブファミリーＩ、メンバー６）；  ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ  Ｉ，ａｌｐｈａ  ２（ＣＯＬ１Ａ２）（コラーゲン、タイプＩ、アルファ２（ＣＯＬ１Ａ２））；  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ＰＡＣ  ８４５Ｏ２４  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １ｐ３６．１‐３６．２（染色体１ｐ３６．１‐３６．２上ＰＡＣ８４５Ｏ２４由来ＤＮＡ塩基配列）；  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋ���ｎ  ７  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（インターロイキン７受容体）；  ｃＤＮＡ，３  ｅｎｄ  ／ｃｌｏｎｅ＝ＩＭＡＧＥ‐３０１７２３（ｃＤＮＡ、３ｅｎｄ／ｃｌｏｎｅ＝ＩＭＡＧＥ‐３０１７２３）；  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８  Ｃ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔ（ＩＬ８）（インターロイキン８Ｃ末端変異体（ＩＬ８））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ２１（ＳＣＹＡ２１）（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー２１（ＳＣＹＡ２１））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｂ（Ｃｙｓ‐Ｘ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ６（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）（ＳＣＹＢ６）（小誘導性サイトカインサブファミリーＢ（Ｃｙｓ‐Ｘ‐Ｃｙｓ）、メンバー６（顆粒球走化性タンパク質２）（ＳＣＹＢ６））；  ｃｌｏｎｅ  ＫＭ３６  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ（クローンＫＭ３６免疫グロブリン軽鎖可変領域）；  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｇａｎｇｌｉａ，ｎｅｕｒａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １０（ＳＣＧＮ１０）（上頚神経節、神経特異１０（ＳＣＧＮ１０））；  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０ｋＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（熱ショックタンパク質７０ｋＤタンパク質２）；  ＥＧＦ‐ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｆｉｂｕｌｉｎ‐ｌｉｋｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＥＦＥＭＰ１）（ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリクスタンパク質１（ＥＦＥＭＰ１））；  Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｇａｎｇｌｉａ，ｎｅｕｒａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １０（上頚神経節、神経特異１０）；  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，ａｌｐｈａ  ２（ヘモグロビン（アルファ２））；  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌａｍｂｄａ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ３‐１０（免疫グロブリンラムダ可変部３‐１０）；  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ，ｍｕｓｃｌｅ（ＰＫＭ２）（ピルビン酸キナーゼ、筋（ＰＫＭ２））；  ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ  １（ＲＴＮ１）（レチクロン１（ＲＴＮ１））；  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ（ＬＣＫ）（リンパ球特異タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ））；  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｍｕ‐ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｖ‐Ｎ‐Ｄ‐Ｎ‐Ｊ‐ｒｅｇｉｏｎ（免疫グロブリン再構成μ鎖遺伝子Ｖ‐Ｎ‐Ｄ‐Ｎ‐Ｊ‐領域）；  ｎｏｒｍａｌ  ｍｕｃｏｓａ  ｏｆ  ｅｓｏｐｈａｇｕｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １（ＮＭＥＳ１）（正常粘膜オブ食道特異１（ＮＭＥＳ１））；  及びｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ  ＸＶ，ａｌｐｈａ  １（ＣＯＬ１５Ａ１）（コラーゲン、タイプＸＶ、アルファ１（ＣＯＬ１５Ａ１））、から成るグループから選択されるタンパク質に対するものである請求項１７の方法。
【請求項２１】
サブストレート上で不可動とされた非アルコール性脂肪性肝炎に関連する複数の単離されたポリヌクレオチドを備える診断ツールであって、
前記複数のポリヌクレオチドは、ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ１‐Ａ２  ｌａｍｂｄａ  ｈｙｂｒｉｄ  ＧＡＵ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ（免疫グロブリンＡ１‐Ａ２ラムダハイブリッドＧＡＵ重鎖）；  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ４（ＮＫ４）（ナチュラルキラー細胞トランスクリプト４（ＮＫ４））；  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｋａｐｐａ‐ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｖ‐Ｊ‐ｒｅｇｉｏｎ（免疫グロブリン再構成カッパ鎖遺伝子Ｖ‐Ｊ‐領域）；  ｄｉｕｂｉｑｕｉｔｉｎ（ＵＢＤ）（ジユビキチン（ＵＢＤ））；  ＧＴＰ‐ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ（ＧＥＭ）（骨格筋内過剰発現ＧＴＰ結合タンパク質（ＧＥＭ））；  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８（ＩＬ８）（インターロイキン８（ＩＬ８））；  ｄｅｆｅｎｓｉｎ，ａｌｐｈａ  １，ｍｙｅｌｏｉｄ‐ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＤＥＦＡ１）（デフェンシン、アルファ１、骨髄関連配列（ＤＥＦＡ１））；  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｄ２  ｓｙｎｔｈａｓｅ（２１ｋＤ，ｂｒａｉｎ）（ＰＴＧＤＳ）（プロスタグランジンＤ２合成酵素（２１ｋＤ、脳）（ＰＴＧＤＳ））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  １９（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー１９）；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ２０（ＳＣＹＡ２０）（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー２０（ＳＣＹＡ２０））；  ｎｅｐｈｒｏｐｏｎｔｉｎ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  １，ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ，ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ，ｅａｒｌｙ  Ｔ‐ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  １）（ネフロポンチン（分泌型燐タンパク質１、オステオポンチン、骨シアロプロテインＩ、初期Ｔ‐リンパ球活性１））；  ｆｉｂｕｌｉｎ  ５（ＦＢＬＮ５）（フィブリン５（ＦＢＬＮ５））；  ａｌｄｏ‐ｋｅｔｏ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  １，ｍｅｍｂｅｒ  Ｂ１０（ａｌｄｏｓｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（ＡＫＲ１Ｂ１０）（アルド‐ケト還元酵素ファミリー１、メンバーＢ１０（アルドース還元酵素）（ＡＫＲ１Ｂ１０））；  ｍａｔｒｉｘ  Ｇ１ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＧＰ）（マトリクスＧ１ａタンパク質（ＭＧＰ））；  ＩｇＫ  ｃｈａｉｎ  ｆｒｏｍ  ＧＭ  ６０７，Ｖ‐ｋａｐｐａ‐２  ｒｅｇｉｏｎ（ＩｇＫ鎖フロムＧＭ６０７、Ｖ‐カッパ‐２領域）；  Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｉ，ｍｅｍｂｅｒ  ６（嗅覚受容体、ファミリー２、サブファミリーＩ、メンバー６）；  ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ  Ｉ，ａｌｐｈａ  ２（ＣＯＬ１Ａ２）（コラーゲン、タイプＩ、アルファ２（ＣＯＬ１Ａ２））；  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ＰＡＣ  ８４５Ｏ２４  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １ｐ３６．１‐３６．２（染色体１ｐ３６．１‐３６．２上ＰＡＣ８４５Ｏ２４由来ＤＮＡ塩基配列）；  Ｉ���ｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ７  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（インターロイキン７受容体）；  ｃＤＮＡ，３  ｅｎｄ  ／ｃｌｏｎｅ＝ＩＭＡＧＥ‐３０１７２３（ｃＤＮＡ、３ｅｎｄ／ｃｌｏｎｅ＝ＩＭＡＧＥ‐３０１７２３）；  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８  Ｃ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔ（ＩＬ８）（インターロイキン８Ｃ末端変異体（ＩＬ８））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ２１（ＳＣＹＡ２１）（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー２１（ＳＣＹＡ２１））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｂ（Ｃｙｓ‐Ｘ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ６（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）（ＳＣＹＢ６）（小誘導性サイトカインサブファミリーＢ（Ｃｙｓ‐Ｘ‐Ｃｙｓ）、メンバー６（顆粒球走化性タンパク質２）（ＳＣＹＢ６））；  ｃｌｏｎｅ  ＫＭ３６  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ（クローンＫＭ３６免疫グロブリン軽鎖可変領域）；  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｇａｎｇｌｉａ，ｎｅｕｒａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １０（ＳＣＧＮ１０）（上頚神経節、神経特異１０（ＳＣＧＮ１０））；  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０ｋＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（熱ショックタンパク質７０ｋＤタンパク質２）；  ＥＧＦ‐ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｆｉｂｕｌｉｎ‐ｌｉｋｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＥＦＥＭＰ１）（ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリクスタンパク質１（ＥＦＥＭＰ１））；  Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｇａｎｇｌｉａ，ｎｅｕｒａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １０（上頚神経節、神経特異１０）；  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，ａｌｐｈａ  ２（ヘモグロビン（アルファ２））；  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌａｍｂｄａ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ３‐１０（免疫グロブリンラムダ可変部３‐１０）；  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ，ｍｕｓｃｌｅ（ＰＫＭ２）（ピルビン酸キナーゼ、筋（ＰＫＭ２））；  ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ  １（ＲＴＮ１）（レチクロン１（ＲＴＮ１））；  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ（ＬＣＫ）（リンパ球特異タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ））；  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｍｕ‐ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｖ‐Ｎ‐Ｄ‐Ｎ‐Ｊ‐ｒｅｇｉｏｎ（免疫グロブリン再構成μ鎖遺伝子Ｖ‐Ｎ‐Ｄ‐Ｎ‐Ｊ‐領域）；  ｎｏｒｍａｌ  ｍｕｃｏｓａ  ｏｆ  ｅｓｏｐｈａｇｕｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １（ＮＭＥＳ１）（正常粘膜オブ食道特異１（ＮＭＥＳ１））；  及びｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ  ＸＶ，ａｌｐｈａ  １（ＣＯＬ１５Ａ１）（コラーゲン、タイプＸＶ、アルファ１（ＣＯＬ１５Ａ１））、から成るグループから選択されるタンパク質に対して少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質をコードする少なくとも２つのポリヌクレオチドに特異的に結合する少なくとも２つのポリヌクレオチドを備えるツール。
【請求項２２】
サブストレート上で不可動とされた非アルコール性脂肪性肝炎に関連する複数の単離されたポリヌクレオチドを備える診断ツールであって、
前記複数のポリヌクレオチドは、小誘導性サイトカインに対して少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質をコードする少なくとも２つのポリヌクレオチドに特異的に結合する少なくとも２つのポリヌクレオチドを備えるツール。
【請求項２３】
前記小誘導性サイトカインは、ＣＣＬ１９、ＳＣＹＡ２０、ＳＣＹＡ２１及びＣＸＣＬ６から成るグループから選択される請求項２２の診断ツール。
【請求項２４】
ＮＡＳＨを予防し又はＮＡＳＨの進行を阻害する方法であって、
少なくとも２つのＮＡＳＨ関連遺伝子の発現を阻害する成分を治療的に有効量投与することを備える方法。
【請求項２５】
前記ＮＡＳＨ関連遺伝子の少なくとも１つは小誘導性サイトカインである請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記小誘導性サイトカインは、ＣＣＬ１９、ＳＣＹＡ２０、ＳＣＹＡ２１及びＣＸＣＬ６から成るグループから選択される請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記ＮＡＳＨ関連遺伝子は、ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ１‐Ａ２  ｌａｍｂｄａ  ｈｙｂｒｉｄ  ＧＡＵ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ（免疫グロブリンＡ１‐Ａ２ラムダハイブリッドＧＡＵ重鎖）；  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ４（ＮＫ４）（ナチュラルキラー細胞トランスクリプト４（ＮＫ４））；  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｋａｐｐａ‐ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｖ‐Ｊ‐ｒｅｇｉｏｎ（免疫グロブリン再構成カッパ鎖遺伝子Ｖ‐Ｊ‐領域）；  ｄｉｕｂｉｑｕｉｔｉｎ（ＵＢＤ）（ジユビキチン（ＵＢＤ））；  ＧＴＰ‐ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ（ＧＥＭ）（骨格筋内過剰発現ＧＴＰ結合タンパク質（ＧＥＭ））；  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８（ＩＬ８）（インターロイキン８（ＩＬ８））；  ｄｅｆｅｎｓｉｎ，ａｌｐｈａ  １，ｍｙｅｌｏｉｄ‐ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＤＥＦＡ１）（デフェンシン、アルファ１、骨髄関連配列（ＤＥＦＡ１））；  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｄ２  ｓｙｎｔｈａｓｅ（２１ｋＤ，ｂｒａｉｎ）（ＰＴＧＤＳ）（プロスタグランジンＤ２合成酵素（２１ｋＤ、脳）（ＰＴＧＤＳ））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  １９（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー１９）；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ２０（ＳＣＹＡ２０）（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー２０（ＳＣＹＡ２０））；  ｎｅｐｈｒｏｐｏｎｔｉｎ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  １，ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ，ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ，ｅａｒｌｙ  Ｔ‐ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  １）（ネフロポンチン（分泌型燐タンパク質１、オステオポンチン、骨シアロプロテインＩ、初期Ｔ‐リンパ球活性１））；  ｆｉｂｕｌｉｎ  ５（ＦＢＬＮ５）（フィブリン５（ＦＢＬＮ５））；  ａｌｄｏ‐ｋｅｔｏ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  １，ｍｅｍｂｅｒ  Ｂ１０（ａｌｄｏｓｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（ＡＫＲ１Ｂ１０）（アルド‐ケト還元酵素ファミリー１、メンバーＢ１０（アルドース還元酵素）（ＡＫＲ１Ｂ１０））；  ｍａｔｒｉｘ  Ｇ１ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＧＰ）（マトリクスＧ１ａタンパク質（ＭＧＰ））；  ＩｇＫ  ｃｈａｉｎ  ｆｒｏｍ  ＧＭ  ６０７，Ｖ‐ｋａｐｐａ‐２  ｒｅｇｉｏｎ（ＩｇＫ鎖フロムＧＭ６０７、Ｖ‐カッパ‐２領域）；  Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｉ，ｍｅｍｂｅｒ  ６（嗅覚受容体、ファミリー２、サブファミリーＩ、メンバー６）；  ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ  Ｉ，ａｌｐｈａ  ２（ＣＯＬ１Ａ２）（コラーゲン、タイプＩ、アルファ２（ＣＯＬ１Ａ２））；  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ＰＡＣ  ８４５Ｏ２４  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １ｐ３６．１‐３６．２（染色体１ｐ３６．１‐３６．２上ＰＡＣ８４５Ｏ２４由来ＤＮＡ塩基配列）；  Ｉｎｔ���ｒｌｅｕｋｉｎ  ７  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（インターロイキン７受容体）；  ｃＤＮＡ，３  ｅｎｄ  ／ｃｌｏｎｅ＝ＩＭＡＧＥ‐３０１７２３（ｃＤＮＡ、３ｅｎｄ／ｃｌｏｎｅ＝ＩＭＡＧＥ‐３０１７２３）；  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８  Ｃ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔ（ＩＬ８）（インターロイキン８Ｃ末端変異体（ＩＬ８））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ２１（ＳＣＹＡ２１）（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー２１（ＳＣＹＡ２１））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｂ（Ｃｙｓ‐Ｘ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ６（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）（ＳＣＹＢ６）（小誘導性サイトカインサブファミリーＢ（Ｃｙｓ‐Ｘ‐Ｃｙｓ）、メンバー６（顆粒球走化性タンパク質２）（ＳＣＹＢ６））；  ｃｌｏｎｅ  ＫＭ３６  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ（クローンＫＭ３６免疫グロブリン軽鎖可変領域）；  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｇａｎｇｌｉａ，ｎｅｕｒａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １０（ＳＣＧＮ１０）（上頚神経節、神経特異１０（ＳＣＧＮ１０））；  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０ｋＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（熱ショックタンパク質７０ｋＤタンパク質２）；  ＥＧＦ‐ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｆｉｂｕｌｉｎ‐ｌｉｋｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＥＦＥＭＰ１）（ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリクスタンパク質１（ＥＦＥＭＰ１））；  Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｇａｎｇｌｉａ，ｎｅｕｒａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １０（上頚神経節、神経特異１０）；  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，ａｌｐｈａ  ２（ヘモグロビン（アルファ２））；  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌａｍｂｄａ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ３‐１０（免疫グロブリンラムダ可変部３‐１０）；  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ，ｍｕｓｃｌｅ（ＰＫＭ２）（ピルビン酸キナーゼ、筋（ＰＫＭ２））；  ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ  １（ＲＴＮ１）（レチクロン１（ＲＴＮ１））；  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ（ＬＣＫ）（リンパ球特異タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ））；  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｍｕ‐ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｖ‐Ｎ‐Ｄ‐Ｎ‐Ｊ‐ｒｅｇｉｏｎ（免疫グロブリン再構成μ鎖遺伝子Ｖ‐Ｎ‐Ｄ‐Ｎ‐Ｊ‐領域）；  ｎｏｒｍａｌ  ｍｕｃｏｓａ  ｏｆ  ｅｓｏｐｈａｇｕｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １（ＮＭＥＳ１）（正常粘膜オブ食道特異１（ＮＭＥＳ１））；  及びｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ  ＸＶ，ａｌｐｈａ  １（ＣＯＬ１５Ａ１）（コラーゲン、タイプＸＶ、アルファ１（ＣＯＬ１５Ａ１））、から成るグループから選択される請求項２４の方法。
【請求項２８】
前記成分は、アンチセンスＲＮＡ、モルホリノポリヌクレオチド、及び干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）から選択される遺伝子発現の阻害剤を備える請求項２４の方法。
【請求項２９】
ＮＡＳＨを予防し又はＮＡＳＨの進行を阻害する方法であって、
患者がＮＡＳＨであると又はＮＡＳＨを進展させる危険があると同定し、
少なくとも１つのＮＡＳＨ関連タンパク質の生物活性を阻害する成分を治療的に有効量投与する方法。
【請求項３０】
前記成分は前記ＮＡＳＨ関連タンパク質に特異的に結合する抗体又は小さな分子を備える請求項２９の方法。
【請求項３１】
前記ＮＡＳＨ関連タンパク質は少なくとも１つの小誘導性サイトカインを備える請求項３０の方法。
【請求項３２】
前記小誘導性サイトカインは、ＣＣＬ１９、ＳＣＹＡ２０、ＳＣＹＡ２１及びＣＸＣＬ６から成るグループから選択される請求項３１の方法。
【請求項３３】
前記ＮＡＳＨ関連タンパク質は、ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ１‐Ａ２  ｌａｍｂｄａ  ｈｙｂｒｉｄ  ＧＡＵ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ（免疫グロブリンＡ１‐Ａ２ラムダハイブリッドＧＡＵ重鎖）；  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ４（ＮＫ４）（ナチュラルキラー細胞トランスクリプト４（ＮＫ４））；  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｋａｐｐａ‐ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｖ‐Ｊ‐ｒｅｇｉｏｎ（免疫グロブリン再構成カッパ鎖遺伝子Ｖ‐Ｊ‐領域）；  ｄｉｕｂｉｑｕｉｔｉｎ（ＵＢＤ）（ジユビキチン（ＵＢＤ））；  ＧＴＰ‐ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ（ＧＥＭ）（骨格筋内過剰発現ＧＴＰ結合タンパク質（ＧＥＭ））；  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８（ＩＬ８）（インターロイキン８（ＩＬ８））；  ｄｅｆｅｎｓｉｎ，ａｌｐｈａ  １，ｍｙｅｌｏｉｄ‐ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＤＥＦＡ１）（デフェンシン、アルファ１、骨髄関連配列（ＤＥＦＡ１））；  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｄ２  ｓｙｎｔｈａｓｅ（２１ｋＤ，ｂｒａｉｎ）（ＰＴＧＤＳ）（プロスタグランジンＤ２合成酵素（２１ｋＤ、脳）（ＰＴＧＤＳ））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  １９（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー１９）；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ２０（ＳＣＹＡ２０）（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー２０（ＳＣＹＡ２０））；  ｎｅｐｈｒｏｐｏｎｔｉｎ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  １，ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ，ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ，ｅａｒｌｙ  Ｔ‐ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  １）（ネフロポンチン（分泌型燐タンパク質１、オステオポンチン、骨シアロプロテインＩ、初期Ｔ‐リンパ球活性１））；  ｆｉｂｕｌｉｎ  ５（ＦＢＬＮ５）（フィブリン５（ＦＢＬＮ５））；  ａｌｄｏ‐ｋｅｔｏ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  １，ｍｅｍｂｅｒ  Ｂ１０（ａｌｄｏｓｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（ＡＫＲ１Ｂ１０）（アルド‐ケト還元酵素ファミリー１、メンバーＢ１０（アルドース還元酵素）（ＡＫＲ１Ｂ１０））；  ｍａｔｒｉｘ  Ｇ１ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＧＰ）（マトリクスＧ１ａタンパク質（ＭＧＰ））；  ＩｇＫ  ｃｈａｉｎ  ｆｒｏｍ  ＧＭ  ６０７，Ｖ‐ｋａｐｐａ‐２  ｒｅｇｉｏｎ（ＩｇＫ鎖フロムＧＭ６０７、Ｖ‐カッパ‐２領域）；  Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｉ，ｍｅｍｂｅｒ  ６（嗅覚受容体、ファミリー２、サブファミリーＩ、メンバー６）；  ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ  Ｉ，ａｌｐｈａ  ２（ＣＯＬ１Ａ２）（コラーゲン、タイプＩ、アルファ２（ＣＯＬ１Ａ２））；  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ＰＡＣ  ８４５Ｏ２４  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １ｐ３６．１‐３６．２（染色体１ｐ３６．１‐３６．２上ＰＡＣ８４５Ｏ２４由来ＤＮＡ塩基配列）；  Ｉ���ｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ７  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（インターロイキン７受容体）；  ｃＤＮＡ，３  ｅｎｄ  ／ｃｌｏｎｅ＝ＩＭＡＧＥ‐３０１７２３（ｃＤＮＡ、３ｅｎｄ／ｃｌｏｎｅ＝ＩＭＡＧＥ‐３０１７２３）；  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８  Ｃ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔ（ＩＬ８）（インターロイキン８Ｃ末端変異体（ＩＬ８））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ２１（ＳＣＹＡ２１）（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー２１（ＳＣＹＡ２１））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｂ（Ｃｙｓ‐Ｘ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ６（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）（ＳＣＹＢ６）（小誘導性サイトカインサブファミリーＢ（Ｃｙｓ‐Ｘ‐Ｃｙｓ）、メンバー６（顆粒球走化性タンパク質２）（ＳＣＹＢ６））；  ｃｌｏｎｅ  ＫＭ３６  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ（クローンＫＭ３６免疫グロブリン軽鎖可変領域）；  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｇａｎｇｌｉａ，ｎｅｕｒａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １０（ＳＣＧＮ１０）（上頚神経節、神経特異１０（ＳＣＧＮ１０））；  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０ｋＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（熱ショックタンパク質７０ｋＤタンパク質２）；  ＥＧＦ‐ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｆｉｂｕｌｉｎ‐ｌｉｋｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＥＦＥＭＰ１）（ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリクスタンパク質１（ＥＦＥＭＰ１））；  Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｇａｎｇｌｉａ，ｎｅｕｒａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １０（上頚神経節、神経特異１０）；  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，ａｌｐｈａ  ２（ヘモグロビン（アルファ２））；  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌａｍｂｄａ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ３‐１０（免疫グロブリンラムダ可変部３‐１０）；  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ，ｍｕｓｃｌｅ（ＰＫＭ２）（ピルビン酸キナーゼ、筋（ＰＫＭ２））；  ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ  １（ＲＴＮ１）（レチクロン１（ＲＴＮ１））；  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ（ＬＣＫ）（リンパ球特異タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ））；  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｍｕ‐ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｖ‐Ｎ‐Ｄ‐Ｎ‐Ｊ‐ｒｅｇｉｏｎ（免疫グロブリン再構成μ鎖遺伝子Ｖ‐Ｎ‐Ｄ‐Ｎ‐Ｊ‐領域）；  ｎｏｒｍａｌ  ｍｕｃｏｓａ  ｏｆ  ｅｓｏｐｈａｇｕｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １（ＮＭＥＳ１）（正常粘膜オブ食道特異１（ＮＭＥＳ１））；  及びｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ  ＸＶ，ａｌｐｈａ  １（ＣＯＬ１５Ａ１）（コラーゲン、タイプＸＶ、アルファ１（ＣＯＬ１５Ａ１））、から成るグループから選択される少なくとも１つのタンパク質を備える請求項３１の方法。
【請求項３４】
前記阻害剤はモノクローナル抗体である請求項３０の方法。
【請求項３５】
前記阻害剤はポリクローナル抗体である請求項３０の方法。
【請求項３６】
ＮＡＳＨを阻害する化合物をスクリーニング方法であって、
試験物質とＮＡＳＨに関連した少なくとも１つのタンパク質とを接触させて、前記試験物質が前記タンパク質又はその受容体に結合するかどうか判断することを備え、
結合が前記試験物質がＮＡＳＨを阻害することが可能であることを示す方法。
【請求項３７】
前記タンパク質は小誘導性サイトカイン又はその受容体である請求項３６の方法。
【請求項３８】
前記小誘導性サイトカインは、ＣＣＬ１９、ＳＣＹＡ２０、ＳＣＹＡ２１及びＣＸＣＬ６又はその受容体から成るグループから選択される請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記タンパク質は、ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ１‐Ａ２  ｌａｍｂｄａ  ｈｙｂｒｉｄ  ＧＡＵ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ（免疫グロブリンＡ１‐Ａ２ラムダハイブリッドＧＡＵ重鎖）；  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ４（ＮＫ４）（ナチュラルキラー細胞トランスクリプト４（ＮＫ４））；  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｋａｐｐａ‐ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｖ‐Ｊ‐ｒｅｇｉｏｎ（免疫グロブリン再構成カッパ鎖遺伝子Ｖ‐Ｊ‐領域）；  ｄｉｕｂｉｑｕｉｔｉｎ（ＵＢＤ）（ジユビキチン（ＵＢＤ））；  ＧＴＰ‐ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ（ＧＥＭ）（骨格筋内過剰発現ＧＴＰ結合タンパク質（ＧＥＭ））；  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８（ＩＬ８）（インターロイキン８（ＩＬ８））；  ｄｅｆｅｎｓｉｎ，ａｌｐｈａ  １，ｍｙｅｌｏｉｄ‐ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＤＥＦＡ１）（デフェンシン、アルファ１、骨髄関連配列（ＤＥＦＡ１））；  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｄ２  ｓｙｎｔｈａｓｅ（２１ｋＤ，ｂｒａｉｎ）（ＰＴＧＤＳ）（プロスタグランジンＤ２合成酵素（２１ｋＤ、脳）（ＰＴＧＤＳ））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  １９（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー１９）；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ２０（ＳＣＹＡ２０）（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー２０（ＳＣＹＡ２０））；  ｎｅｐｈｒｏｐｏｎｔｉｎ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  １，ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ，ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ，ｅａｒｌｙ  Ｔ‐ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  １）（ネフロポンチン（分泌型燐タンパク質１、オステオポンチン、骨シアロプロテインＩ、初期Ｔ‐リンパ球活性１））；  ｆｉｂｕｌｉｎ  ５（ＦＢＬＮ５）（フィブリン５（ＦＢＬＮ５））；  ａｌｄｏ‐ｋｅｔｏ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  １，ｍｅｍｂｅｒ  Ｂ１０（ａｌｄｏｓｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（ＡＫＲ１Ｂ１０）（アルド‐ケト還元酵素ファミリー１、メンバーＢ１０（アルドース還元酵素）（ＡＫＲ１Ｂ１０））；  ｍａｔｒｉｘ  Ｇ１ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＧＰ）（マトリクスＧ１ａタンパク質（ＭＧＰ））；  ＩｇＫ  ｃｈａｉｎ  ｆｒｏｍ  ＧＭ  ６０７，Ｖ‐ｋａｐｐａ‐２  ｒｅｇｉｏｎ（ＩｇＫ鎖フロムＧＭ６０７、Ｖ‐カッパ‐２領域）；  Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｉ，ｍｅｍｂｅｒ  ６（嗅覚受容体、ファミリー２、サブファミリーＩ、メンバー６）；  ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ  Ｉ，ａｌｐｈａ  ２（ＣＯＬ１Ａ２）（コラーゲン、タイプＩ、アルファ２（ＣＯＬ１Ａ２））；  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ＰＡＣ  ８４５Ｏ２４  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １ｐ３６．１‐３６．２（染色体１ｐ３６．１‐３６．２上ＰＡＣ８４５Ｏ２４由来ＤＮＡ塩基配列）；  Ｉｎｔｅｒｌｅ���ｋｉｎ  ７  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（インターロイキン７受容体）；  ｃＤＮＡ，３  ｅｎｄ  ／ｃｌｏｎｅ＝ＩＭＡＧＥ‐３０１７２３（ｃＤＮＡ、３ｅｎｄ／ｃｌｏｎｅ＝ＩＭＡＧＥ‐３０１７２３）；  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８  Ｃ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔ（ＩＬ８）（インターロイキン８Ｃ末端変異体（ＩＬ８））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ２１（ＳＣＹＡ２１）（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー２１（ＳＣＹＡ２１））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｂ（Ｃｙｓ‐Ｘ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ６（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）（ＳＣＹＢ６）（小誘導性サイトカインサブファミリーＢ（Ｃｙｓ‐Ｘ‐Ｃｙｓ）、メンバー６（顆粒球走化性タンパク質２）（ＳＣＹＢ６））；  ｃｌｏｎｅ  ＫＭ３６  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ（クローンＫＭ３６免疫グロブリン軽鎖可変領域）；  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｇａｎｇｌｉａ，ｎｅｕｒａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １０（ＳＣＧＮ１０）（上頚神経節、神経特異１０（ＳＣＧＮ１０））；  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０ｋＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（熱ショックタンパク質７０ｋＤタンパク質２）；  ＥＧＦ‐ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｆｉｂｕｌｉｎ‐ｌｉｋｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＥＦＥＭＰ１）（ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリクスタンパク質１（ＥＦＥＭＰ１））；  Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｇａｎｇｌｉａ，ｎｅｕｒａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １０（上頚神経節、神経特異１０）；  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，ａｌｐｈａ  ２（ヘモグロビン（アルファ２））；  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌａｍｂｄａ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ３‐１０（免疫グロブリンラムダ可変部３‐１０）；  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ，ｍｕｓｃｌｅ（ＰＫＭ２）（ピルビン酸キナーゼ、筋（ＰＫＭ２））；  ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ  １（ＲＴＮ１）（レチクロン１（ＲＴＮ１））；  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ（ＬＣＫ）（リンパ球特異タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ））；  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｍｕ‐ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｖ‐Ｎ‐Ｄ‐Ｎ‐Ｊ‐ｒｅｇｉｏｎ（免疫グロブリン再構成μ鎖遺伝子Ｖ‐Ｎ‐Ｄ‐Ｎ‐Ｊ‐領域）；  ｎｏｒｍａｌ  ｍｕｃｏｓａ  ｏｆ  ｅｓｏｐｈａｇｕｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １（ＮＭＥＳ１）（正常粘膜オブ食道特異１（ＮＭＥＳ１））；  及びｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ  ＸＶ，ａｌｐｈａ  １（ＣＯＬ１５Ａ１）（コラーゲン、タイプＸＶ、アルファ１（ＣＯＬ１５Ａ１））、から成るグループから選択される請求項３６の方法。
【請求項４０】
前記試験物質が前記タンパク質又はその受容体の生物活性を阻害するかどうかを判断することを更に備える請求項３６の方法。
【請求項４１】
前記試験物質が前記タンパク質又はその受容体の生物活性を阻害するかどうかを判断する前期ステップは、細胞ベース分析をさらに備える請求項３６の方法。
【請求項４２】
ＮＡＳＨ関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する少なくとも１つのポリヌクレオチド・プローブ、及び使用に対する指示を備える、患者のＮＡＳＨ診断用キット。
【請求項４３】
ＮＡＳＨ関連のポリペプチドに特異的に結合する少なくとも１つの抗体又は抗体の抗原結合性フラグメント、及び使用に対する指示を備える、患者のＮＡＳＨ診断用キット。
【請求項４４】
前記ＮＡＳＨ関連タンパク質は、ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ１‐Ａ２  ｌａｍｂｄａ  ｈｙｂｒｉｄ  ＧＡＵ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ（免疫グロブリンＡ１‐Ａ２ラムダハイブリッドＧＡＵ重鎖）；  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ４（ＮＫ４）（ナチュラルキラー細胞トランスクリプト４（ＮＫ４））；  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｋａｐｐａ‐ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｖ‐Ｊ‐ｒｅｇｉｏｎ（免疫グロブリン再構成カッパ鎖遺伝子Ｖ‐Ｊ‐領域）；  ｄｉｕｂｉｑｕｉｔｉｎ（ＵＢＤ）（ジユビキチン（ＵＢＤ））；  ＧＴＰ‐ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ（ＧＥＭ）（骨格筋内過剰発現ＧＴＰ結合タンパク質（ＧＥＭ））；  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８（ＩＬ８）（インターロイキン８（ＩＬ８））；  ｄｅｆｅｎｓｉｎ，ａｌｐｈａ  １，ｍｙｅｌｏｉｄ‐ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＤＥＦＡ１）（デフェンシン、アルファ１、骨髄関連配列（ＤＥＦＡ１））；  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｄ２  ｓｙｎｔｈａｓｅ（２１ｋＤ，ｂｒａｉｎ）（ＰＴＧＤＳ）（プロスタグランジンＤ２合成酵素（２１ｋＤ、脳）（ＰＴＧＤＳ））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  １９（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー１９）；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ２０（ＳＣＹＡ２０）（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー２０（ＳＣＹＡ２０））；  ｎｅｐｈｒｏｐｏｎｔｉｎ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  １，ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ，ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ，ｅａｒｌｙ  Ｔ‐ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  １）（ネフロポンチン（分泌型燐タンパク質１、オステオポンチン、骨シアロプロテインＩ、初期Ｔ‐リンパ球活性１））；  ｆｉｂｕｌｉｎ  ５（ＦＢＬＮ５）（フィブリン５（ＦＢＬＮ５））；  ａｌｄｏ‐ｋｅｔｏ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  １，ｍｅｍｂｅｒ  Ｂ１０（ａｌｄｏｓｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（ＡＫＲ１Ｂ１０）（アルド‐ケト還元酵素ファミリー１、メンバーＢ１０（アルドース還元酵素）（ＡＫＲ１Ｂ１０））；  ｍａｔｒｉｘ  Ｇ１ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＧＰ）（マトリクスＧ１ａタンパク質（ＭＧＰ））；  ＩｇＫ  ｃｈａｉｎ  ｆｒｏｍ  ＧＭ  ６０７，Ｖ‐ｋａｐｐａ‐２  ｒｅｇｉｏｎ（ＩｇＫ鎖フロムＧＭ６０７、Ｖ‐カッパ‐２領域）；  Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｉ，ｍｅｍｂｅｒ  ６（嗅覚受容体、ファミリー２、サブファミリーＩ、メンバー６）；  ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ  Ｉ，ａｌｐｈａ  ２（ＣＯＬ１Ａ２）（コラーゲン、タイプＩ、アルファ２（ＣＯＬ１Ａ２））；  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ＰＡＣ  ８４５Ｏ２４  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １ｐ３６．１‐３６．２（染色体１ｐ３６．１‐３６．２上ＰＡＣ８４５Ｏ２４由来ＤＮＡ塩基配列）；  Ｉ���ｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ７  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（インターロイキン７受容体）；  ｃＤＮＡ，３  ｅｎｄ  ／ｃｌｏｎｅ＝ＩＭＡＧＥ‐３０１７２３（ｃＤＮＡ、３ｅｎｄ／ｃｌｏｎｅ＝ＩＭＡＧＥ‐３０１７２３）；  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８  Ｃ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔ（ＩＬ８）（インターロイキン８Ｃ末端変異体（ＩＬ８））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ２１（ＳＣＹＡ２１）（小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ）、メンバー２１（ＳＣＹＡ２１））；  ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｂ（Ｃｙｓ‐Ｘ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ６（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）（ＳＣＹＢ６）（小誘導性サイトカインサブファミリーＢ（Ｃｙｓ‐Ｘ‐Ｃｙｓ）、メンバー６（顆粒球走化性タンパク質２）（ＳＣＹＢ６））；  ｃｌｏｎｅ  ＫＭ３６  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ（クローンＫＭ３６免疫グロブリン軽鎖可変領域）；  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｇａｎｇｌｉａ，ｎｅｕｒａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １０（ＳＣＧＮ１０）（上頚神経節、神経特異１０（ＳＣＧＮ１０））；  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０ｋＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（熱ショックタンパク質７０ｋＤタンパク質２）；  ＥＧＦ‐ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｆｉｂｕｌｉｎ‐ｌｉｋｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＥＦＥＭＰ１）（ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリクスタンパク質１（ＥＦＥＭＰ１））；  Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｇａｎｇｌｉａ，ｎｅｕｒａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １０（上頚神経節、神経特異１０）；  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，ａｌｐｈａ  ２（ヘモグロビン（アルファ２））；  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌａｍｂｄａ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ３‐１０（免疫グロブリンラムダ可変部３‐１０）；  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ，ｍｕｓｃｌｅ（ＰＫＭ２）（ピルビン酸キナーゼ、筋（ＰＫＭ２））；  ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ  １（ＲＴＮ１）（レチクロン１（ＲＴＮ１））；  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ（ＬＣＫ）（リンパ球特異タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ））；  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｍｕ‐ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  Ｖ‐Ｎ‐Ｄ‐Ｎ‐Ｊ‐ｒｅｇｉｏｎ（免疫グロブリン再構成μ鎖遺伝子Ｖ‐Ｎ‐Ｄ‐Ｎ‐Ｊ‐領域）；  ｎｏｒｍａｌ  ｍｕｃｏｓａ  ｏｆ  ｅｓｏｐｈａｇｕｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １（ＮＭＥＳ１）（正常粘膜オブ食道特異１（ＮＭＥＳ１））；  及びｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ  ＸＶ，ａｌｐｈａ  １（ＣＯＬ１５Ａ１）（コラーゲン、タイプＸＶ、アルファ１（ＣＯＬ１５Ａ１））、から成るグループから選択される請求項４２又は４３のキット。
【請求項４５】
前記遺伝子パネルはＣＣＬ１９から本質的に構成される請求項１の方法。
【請求項４６】
前記遺伝子パネルはＳＣＹＡ２０から本質的に構成される請求項１の方法。
【請求項４７】
サブストレート上で不可動とされた非アルコール性脂肪性肝炎に関連する単離されたポリヌクレオチドを備える診断用ツールであって、前記ポリヌクレオチドはＣＣＬ１９をコードするポリヌクレオチド配列に特異的に結合するポリヌクレオチド配列を備えるツール。
【請求項４８】
サブストレート上で不可動とされた非アルコール性脂肪性肝炎に関連する単離されたポリヌクレオチドを備えた診断用ツールであって、前記ポリヌクレオチドはＳＣＹＡ２０をコードするポリヌクレオチド配列に特異的に結合するポリヌクレオチド配列を備えるツール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願へのクロスレファレンス）
本願は２００６年５月３日になされた米国仮出願第６０／７９７，４５７号の利益を主張するものであり、その開示は参照によりここに全体として取り入れられる。
【０００２】
（本発明の技術分野）
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ：ｎｏｎ‐ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）に関する。より詳細には、本発明は患者のＮＡＳＨを評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
肥満の蔓延により、糖尿病、心疾患及び高血圧症を含む様々な疾患がますます増加している。重要だが未だ研究下にある肥満の合併症として、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）がある。ＮＡＳＨは、多くの場合は臨床的に診断不能の肝臓疾患であり、また、合衆国における死因のトップ１０のうちの１つであって肝細胞癌の前癌状態である肝硬変に進行する場合がある（Ｔｈｏｍａｓ，Ｍ．Ｂ．ａｎｄ  Ａ．Ｘ．Ｚｈｕ（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３（１３）：２８９２‐２８９９）。ＮＡＳＨは、既に原因不明肝硬変の主要原因になっており（Ｃｌａｒｋ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ａ．Ｍ．Ｄｉｅｈｌ  （２００３）ＪＡＭＡ  ２８９（２２）：ｐ．３０００‐３００４）、何れは肝硬変の主要原因としてアルコールを抜くかもしれない。生検を基に評価される肝臓組織検査だけが、ＮＡＳＨの診断をするための唯一明確で臨床上受容されている方法である。これは、脂肪肝（脂肪の蓄積）、炎症及び線維形成を含む所見に基づくものである（Ｂｒｕｎｔ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９４（９）：ｐ．２４６７‐２４７４）。合衆国における成人の２０％から３０％が、肝臓に余分な脂肪蓄積を有していると推定されており（Ｎｅｕｓｃｈｗａｎｄｅｒ‐Ｔｅｔｒｉ，Ｂ．Ａ．ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．Ｃａｌｄｗｅｌｌ（２００３）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３７（５）：１２０２‐１２０９）、その約１０％（すなわち全成人の２％〜３％）がＮＡＳＨについての現在の診断基準を満たす。ＮＡＳＨが肝硬変にどのように進展・進行するのかについての分子学的基礎があまり明らかになっておらず、血清診断検査法は有効でなく、また、有効な薬学的治療法も存在しない。これは巨大で未達成の医学的必要性を意味する。
【０００４】
ＮＡＳＨは、有意な程度にアルコール消費がない脂肪性肝炎の患者における肝生検に基づく所見に関係する（Ｎｅｕｓｃｈｗａｎｄｅｒ‐Ｔｅｔｒｉ，Ｂ．Ａ．ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．Ｃａｌｄｗｅｌｌ（２００３）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３７（５）：１２０２‐１２０９）。それは、通常は重さで５％から１０％を超える肝臓における脂肪蓄積として定義される非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ：ｎｏｎ‐ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）という用語により包含されるが、実際には光学顕微鏡によって観察された脂質を含んでいる肝細胞の割合として推定される。ここで用いられるように、ＮＡＳＨという用語は、単純脂肪肝及びその極端な形態であるＮＡＳＨの双方を含むＮＡＦＬＤによって画される、組織学的に異常である範疇を意味する。脂肪（大脂肪及び小脂肪）、小葉状炎症（急性及び／又は慢性）及び線維形成（ゾーン３及びポータル）の量及び型といった具体的な所見の必要性及び性質を含め、どのようにすればＮＡＳＨを最も良く定義できるかに関して若干の議論が存するが、Ｂｒｕｎｔによって提案されて刊行された組織学的基準が一般的に用いられている（Ｂｒｕｎｔ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９４（９）：ｐ．２４６７‐２４７４）。原因不明肝硬変は、殆どの患者において典型的な壊死炎症性で且つ脂肪沈着性の特徴を失ったＮＡＳＨの後期を意味するかと思われる。
【０００５】
ＮＡＳＨは、すべての肝臓疾患に最も共通のものかもしれない（Ｎｅｕｓｃｈｗａｎｄｅｒ‐Ｔｅｔｒｉ，Ｂ．Ａ．ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．Ｃａｌｄｗｅｌｌ（２００３）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３７（５）：１２０２‐１２０９）。脂肪肝は肥満患者の６０〜７０％及び細身患者の３５％に存在し、その肥満患者の２０〜２５％、細身患者の２．７％が脂肪性肝炎及び線維症となる。ＮＡＳＨを有する肥満患者の２〜３％程度が肝硬変を有しているかもしれない。２型糖尿病患者の７０〜７５％以上は、ＮＡＳＨの何らかの形態を有している。多くの報告は、ＮＡＳＨの臨床的な予測因子を取り扱ってきた。これらの中で、４０歳〜５０歳を越える年齢と、肥満、糖尿病、又は高脂血症（特に高トリグリセリド血症）の重度性とが、特異度に欠けるものの、最も確実性が高いものの中にある。女性の役割もいくつかのシリーズにおいて研究されてきた。進展したＮＡＳＨは女性において相対的に多いようであり、進行にとっての危険因子としての女性についての役割を支持する。日常的評価で検出された異常な肝酵素レベルは、患者をＮＡＳＨであると同定するための一般的な方法である。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の上昇、及びＡＳＴ：ＡＬＴ比が１．５超であることは、予測因子として研究されてきた。これらの要因は、初期の生検上で進展した疾患を発見する蓋然性をサポートするが、高感度でも特有のものでもない。また、それらは長期予後的意義を伴うかもしれない。しかしながら、臨床医は、肝酵素が正常範囲の場合にＮＡＳＨがしばしば発見されることをよく知っている。また、肥満患者が長年の診療にもかかわらず診断未確定の肝硬変を潜伏させることは非一般的でない。なぜなら、これらの患者が肝硬変に係る古典的栄養変化を往々にして欠くからである。
【０００６】
肝生検は、ＮＡＳＨにおいて特有の壊死炎症性変化及び線維形成の存在及び程度を評価する唯一の手段であり続ける。しかしながら、日常的な臨床設定において肝生検をいつ実行すべきかについての確固たる提言は未だ展開されていない。臨床研究では必要なアミノ基転移酵素及び線維症マーカーのようなサロゲートマーカーの使用は、疾患をモニタリングするのには十分でない。
【０００７】
ＮＡＳＨは、一般に肥満、糖尿病、及び高脂血症に関係しており、また高血圧症、高尿酸血症、及び多嚢胞卵巣にも関係する。ＮＡＳＨは、リポジストロフィーの患者に見ることができ（Ｇａｒｇ，Ａ．（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１０８（２）：１４３‐１５２）、また、ペルオキシゾーム疾患、ミトコンドリアオーパシーズ、ウェーバークリスチャン病、ウィルソン病、工業溶剤被曝、薬物投与（アミオダロン、タモキシフェン、ヌクレオシド・アナログ、及びメトトレキサート）、セリアック病、及び無β‐リポ蛋白血症のような様々な他の疾患の患者にも見ることができる（Ｎｅｕｓｃｈｗａｎｄｅｒ‐Ｔｅｔｒｉ，Ｂ．Ａ．ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．Ｃａｌｄｗｅｌｌ（２００３）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３７（５）：１２０２‐１２０９）。これらの疾患に共通の特徴は、異常な脂肪代謝及び／又はミトコンドリアの障害若しくは機能障害である。
【０００８】
死は多くの場合複合的な病的状態によって惹起されるが、ＮＡＳＨにおける５年〜及び１０年〜の存命はそれぞれ６７％及び５９％と見積もられている（Ｐｒｏｐｓｔ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．４０（８）：１８０５‐１８１５）。家族関連性もまた記載されており（Ｓｔｒｕｂｅｎ，Ｖ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１０８（１）：９‐１３）、遺伝因子がＮＡＳＨの進展を起こしやすいかもしれないことが示唆されている。
【０００９】
脂肪肝、脂肪性肝炎、進行性の肝線維症、及び肝硬変の進展は、大いに恐らくは多くの代謝性異常の結果である。ＮＡＳＨの主要な所見を包括する詳細で統一的な病態生理学上の定説は未だ出現していないが、病因についてもっともらしいパラダイムは「２段ヒット」仮説である（Ｄａｙ，Ｃ．Ｐ．ａｎｄ  Ｏ．Ｆ．Ｊａｍｅｓ（１９９８）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１４（４）：８４２‐８４５）。第１の「ヒット」は肝細胞での脂肪の蓄積であり、これは高脂血症、糖尿病、及び肥満を含む多くの症状に起因しうる。脂肪酸の酸化の抑制、肝臓への脂肪酸の送達の増加、及び／又は超低比重リポタンパク質の合成若しくは分泌の減少もまた、脂肪蓄積に何らかの役割を果たすのかもしれない。第２の「ヒット」は、特徴的な炎症、肝細胞腫大及び細胞死、さらには後続する線維化に至るトリガーである。
【００１０】
ある主要な理論によれば、インスリン抵抗性の増加による肝臓の酸化ストレスの増加、遊離脂肪酸代謝の増加、ミトコンドリア脱共役タンパク質の活性の増加、シトクロムＰ‐４５０２Ｅ１の活性の増加、鉄貯蔵の増加、及び／又はアンチオキシダント活性の減少により、肝臓星細胞が活性化され、前炎症性サイトカインの生成及び進行性の炎症が続くと考えられている（Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．ａｎｄ  Ｈ．Ｌ．Ｂｏｎｋｏｖｓｋｙ（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３５（３）：２５３‐２６１）。
【００１１】
インスリン抵抗性と高インスリン血症はＮＡＳＨにおける主要な異常である（Ｎｅｕｓｃｈｗａｎｄｅｒ‐Ｔｅｔｒｉ，Ｂ．Ａ．ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．Ｃａｌｄｗｅｌｌ（２００３）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３７（５）：１２０２‐１２０９；Ｓａｎｙａｌ，Ａ．Ｊ．（２００１）Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９６（２）：２７４‐２７６）。インスリン抵抗性の主要な機序は、余分な遊離脂肪酸によって信号する、インスリン受容体サブストレート１（ＩＲＳ‐１）のダウンレギュレーションである場合がある。脂肪酸は、ＩＲＳ‐１のチロシンリン酸化を減少させる。インスリン感受性もペプチドメディエータによって制御される。脂肪組織、特に静脈血が肝臓に直接に流れる腸間膜の脂肪は、代謝活性を下流に制御するサイトカイン及びペプチドホルモンの生産の豊富な源である。
【００１２】
酸化ストレスとミトコンドリアの機能障害はＮＡＳＨにおける肝細胞性障害の中心的機序として取り込まれている（Ｃａｌｄｗｅｌｌ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．８（３）：５９５‐６１７）。酸化ストレスのマーカーとＮＡＳＨの間の関連付けは、脂肪肝疾患の動物モデルにおいてなされた（Ｋｏｔｅｉｓｈ，Ａ．ａｎｄ  Ａ．Ｍａｅ  Ｄｉｅｈｌ（２００２）Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１６（５）：６７９‐６９０）。脂肪肝における酸化ストレスの多数の可能なソースは、シトクロムＰ４５０ペルオキシソームベータ酸化、ミトコンドリアの電子リーク及び動員された炎症細胞を含め、ある役割を果たす場合がある。
【００１３】
遊離脂肪酸のレベルの増加は、インスリン抵抗性をメディエートするだけでなく、肝細胞に直接に有毒となりうる（Ｎｅｕｓｃｈｗａｎｄｅｒ‐Ｔｅｔｒｉ，Ｂ．Ａ．ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．Ｃａｌｄｗｅｌｌ（２００３）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３７（５）：１２０２‐１２０９）。脂質を循環させるレベルを調節する１つの機序は、末梢における貯蔵脂肪の代謝である。リポジストロフィー（Ｇａｒｇ，Ａ．（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１０８（２）：１４３‐１５２）、脂肪組織を形成する能力の部分的又は完全な欠落によって特徴づけられる遺伝障害は、肝臓脂肪症、ＮＡＳＨ、及び肝硬変に関係する（Ｇａｒｇ，Ａ．ａｎｄ  Ａ．Ｍｉｓｒａ（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８７（７）：３０１９‐３０２２）。先天性全身性リポジストロフィーは、喪失された末梢脂肪、重度の肝臓脂肪症、及び肝硬変の著しいリスクによって特徴づけられる。
【００１４】
エネルギー代謝もまた、ＮＡＳＨにおいてある役割を果たす場合がある。アデノシン三リン酸（ＡＴＰ：ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）は細胞の完全性を維持するために必要であり、したがってその喪失は肝細胞性の障害を起こしやすいかもしれない。肝臓のＡＴＰレベルは、ＮＡＳＨでは減ぜられている（Ｃｏｒｔｅｚ‐Ｐｉｎｔｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＪＡＭＡ  ２８２（１７）：１６５９‐１６６４）。ミトコンドリア障害が、恐らくは、ＮＡＳＨにおける肝細胞性ＡＴＰストア減少の１つの原因であろう（Ｃａｌｄｗｅｌｌ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．８（３）：５９５‐６１７）。電子顕微鏡による研究により、不確かな組成の結晶組織がミトコンドリアのマトリクスであると同定された（Ｃａｌｄｗｅｌｌ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３１（３）：４３０‐４３４）。ミトコンドリア障害は、ミトコンドリアＤＮＡの変形及び喪失に至る場合がある。ミトコンドリアＤＮＡの損傷又は喪失は、アルコールによる肝臓損傷（Ｍａｎｓｏｕｒｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２７（ｌ）：９６‐１０２）及び老化（Ｖａｎ  Ｒｅｍｍｅｎ，Ｈ．ａｎｄ  Ａ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（２００１）Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．３６（７）：９５７‐９６８）において生じる。ある限定的データによれば、ミトコンドリアＤＮＡ損傷がＮＡＳＨでも生じることが示唆されている（Ｃａｌｄｗｅｌｌ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３１（３）：４３０‐４３４）。
【００１５】
肝臓線維化は、コラーゲンのような細胞外マトリックスタンパク質の沈着を誘発する慢性の細胞の障害に起因する（Ｂａｔａｌｌｅｒ，Ｒ．ａｎｄ  Ｄ．Ａ．Ｂｒｅｎｎｅｒ（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５（２）：２０９‐２ｌ８）。肝臓線維化の主な要因には、慢性のＨＣＶ感染、アルコール中毒、及びＮＡＳＨが含まれる。細胞外マトリックスタンパク質の蓄積は、線維痕の形成により肝臓の組織学的完全性を分裂させる。この線維状物質の初期分布は、肝臓損傷の原因に左右される。慢性ウイルス性肝炎においては、線維化組織は当初は門脈路の周囲に位置するが、他方アルコール誘導肝炎及びＮＡＳＨにおいては、それは中心周囲領域及び類洞周囲領域に位置する。線維症の肝臓病は、コラーゲンバンドから、架橋線維化、明白な肝硬変へと明らかに進行する。肝細胞を再生成する結節が成長したときに、肝硬変であると認定される
【００１６】
肝硬変は、血流に対する増加した肝臓内抵抗と門脈圧亢進症、腹水、腎不全、肝性脳症及び静脈瘤出血を引き起こす。肝硬変の患者は、病的状態の発現前に長期にわたりかなり無症候性である場合がある（代償性肝硬変）。肝硬変は、肝細胞癌（ＨＣＣ：ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の殆どの場合に関係する。ＨＣＣの約１８，０００の新規の症例が２００５年の米国において発生すると予測されている（Ｔｈｏｍａｓ，Ｍ．Ｂ．ａｎｄ  Ａ．Ｘ．Ｚｈｕ（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３（１３）：２８９２‐２８９９）。ＨＣＣの発生率は過去３０年にわたって２倍になっており、今も上昇し続けている。これは、Ｃ型肝炎の感染者数が多いことと初期感染とＨＣＣの進展の間に数十年間という長いインターバルがあることとによる。ＮＡＳＨに関連する肝硬変は、また、米国において増加しており、急成長するＨＣＣの蔓延に著しく寄与しうる。ＨＣＣは主として肝細胞障害のコンテキストにおいて進展し、これは、炎症、肝細胞再生、肝臓マトリックス・リモデリング、線維化、そして最終的には肝硬変に至る。
【００１７】
肝生検組織の組織学的検査は、肝臓の線維化を評価するための最善の標準である（Ｎｅｕｓｃｈｗａｎｄｅｒ‐Ｔｅｔｒｉ，Ｂ．Ａ．ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．Ｃａｌｄｗｅｌｌ（２００３）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３７（５）：１２０２‐１２０９；Ｚａｆｒａｎｉ，Ｅ．Ｓ．，（２００４）Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ．４４４（１）：３‐１２）。しかしながら、肝生検は侵襲的で費用のかかる手技であり、死を含め患者の約０．５％における重大な合併症に関連する（Ｔｈａｍｐａｎｉｔｃｈａｗｏｎｇ，Ｐ．ａｎｄ  Ｔ．Ｐｉｒａｔｖｉｓｕｔｈ（１９９９）Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．５（４）：ｐ．３０１‐３０４）。特に針生検を得る場合には、サンプリング誤差が生じる場合がある（Ｒｅｇｅｖ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９７（１０）：２６１４‐２６１８）。肝臓の線維化を評価するための、信頼性があり、簡易であり、かつ非侵襲的である方法が、したがって必要となる。ＴＩＭＰ（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）タイプ１、ヒアルロン酸、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドなどの、肝臓の線維形成プロセスと直接に関係するタンパク質の血中濃度が肝臓線維化のサロゲートマーカーとして用いられた（Ｂａｔａｌｌｅｒ，Ｒ．ａｎｄ  Ｄ．Ａ．Ｂｒｅｎｎｅｒ（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５（２）：２０９‐２１８）。これらのマーカーは一定の患者における肝硬変を識別するのに有用である場合があるが、線維化の病期が数段ある中においては十分な識別力に欠ける。それらはまた、線維化が他の器官において存在する場合に明確でない。したがって、臨床治験において潜在的な治療薬を評価することは、肝生検により肝臓の線維化を判断する必要があるので、不確実である。肝臓の線維化を判断する非侵襲性のバイオマーカーは、臨床治験のデザインを促進するに相違ない。
【００１８】
今日までの肝線維症に関する殆どの研究は、限定的な遺伝子レパートリーを備えたマイクロアレイを用いてウイルス性肝炎又はアルコール性肝臓疾患による肝硬変に焦点を当ててきた。また、組織源は肝移植を受けた患者や診断のための針生検からであったので、肝線維症がかなり進行した段階にある患者からとなっていた。
【００１９】
限定的な遺伝子発現プロファイルが、ＮＡＳＨにおいて報告された。ある研究（Ｙｏｕｎｏｓｓｉ，Ｚ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｌｉｖｅｒ  Ｉｎｔ．２５（４）：７６０−７７１）において、２９人のＮＡＳＨ患者（脂肪肝だけの１２人、残りは特になし）、７人の肥満コントロール、及び６人の非肥満コントロールからなるグループが、５２２０の遺伝子を含むカスタマイズされたｃＤＮＡマイクロアレイを用いて解析された。８つの遺伝子のみが、肥満コントロールと比較して、ＮＡＳＨ患者において有意な差別的発現を示した。別の研究において、ＮＡＳＨによる肝硬変の患者からの肝臓における遺伝子発現が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ：ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ）感染に付随して起こる肝硬変、原発性胆汁性肝硬変症（ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｉｌｉａｒｙ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）に付随して起こる肝硬変の患者及び健全コントロールと比較された（Ｓｒｅｅｋｕｍａｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３８（１）：２４４−２５１）。各グループにおける被検者の総数は６で、６，４１２の既知の遺伝子用プローブを含んでいるオリゴヌクレオチドＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕ６８００配列が用いられた。４つのグループの平均年齢は約５０歳で、平均ＢＭＩは約３０で、各グループは４人の女性の及び２人の男性のコーカサス人の被検者を備える。調査された６，４１２の遺伝子のうち、１６個だけが、他のグループのすべてと比較した場合、ＮＡＳＨの被検者において差別的に発現した（ＮＡＳＨ  ｖｓ．健康コントロール，ＮＡＳＨ  ｖｓ．ＨＣＶ，  ＮＡＳＨ  ｖｓ．ＰＢＣ）。１２個の遺伝子は、ＮＡＳＨ被検者では有意な発現には至らなかった。
【００２０】
ＮＡＳＨ、特に肝炎ウイルス以外の原因からの肝線維症／肝硬変について多くの研究が報告されている。たとえば、日本からの研究では、肝細胞癌の８人、及び肝臓を含む転移癌の３人の患者を含め、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）に感染した１９人の患者からの線維症肝生検からのＲＮＡを解析するために、３，８００の遺伝子のオリゴヌクレオチド・マイクロアレイが用いられた（Ｓｈａｏ，Ｒ．Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１１（１３）：１９９５−１９９９）。ＨＣＶに感染した肝臓において、免疫学的応答に含まれる遺伝子が高度に発現した。架橋線維化（ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）及び肝硬変とそれほど重度でない線維化との対比において、血漿たんぱく（アルブミンとアポリポ蛋白質を含む）及び薬物代謝酵素（アルドケト還元酵素及びシトクロムＰ４５０遺伝子）についての遺伝子の発現レベルは減少し、細胞周期に含まれる遺伝子のそれら（たとえば、セリン／トレオニン・キナーゼ）は増加した。少数の患者については、小規模の針生検、及びマイクロアレイ上の限定的な数の遺伝子からの電位変動、重度・軽度の線維化間の差異は達成することができなかった。
【００２１】
より大きな研究では、Ｂ型肝炎（ｎ＝７）及びＨＣＶ（ｎ＝１１）感染、遺伝性ヘモクロマトーシス（ｎ＝３）、ウィルソン病（ｎ＝５）、アルコール性肝臓疾患（ｎ＝１０）、原発性胆汁性肝硬変症（ｎ＝１６）、及び自己免疫性肝炎（ｎ＝７）による肝硬変の５９人の患者からの肝臓組織が、８，４００個の遺伝子のマイクロアレイで研究された（Ｋｉｍ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３９（２）：５１８‐５２７）。患者は肝細胞癌を進展させるリスクによって、肝炎、血色素沈着症及びウィルソン病の者を高リスク・グループに他の原因の者を低リスク・グループとしてグループ化された。５５６個の遺伝子群が、それらのグループ間で差別的であった。メタロチオネイン１Ｂ、メタロチオネイン１Ｅ、メタロチオネイン１Ｌ、セルロプラスミン、ＡＴＰ結合カセットＡ１、カルシウム・チャンネル・ベータ３サブユニット、タンパク質Ｓ、カルボキシペプチダーゼＢ２、抗トロンビンＩＩＩ、組織因子阻害因子、ミッドカイン、補体成分６、補体成分９、及びＣＤ５抗原様は、最も有意な差別的遺伝子の中にあった。肝臓癌腫遺伝子発現データとの対比によって、２７３個の遺伝子の共通セットが明らかになった。
【００２２】
ＨＣＶに感染した硬変した肝臓に関する別の研究が、正常の肝臓と比較して、約１３，６００個の遺伝子のマイクロアレイを用いて実行された（Ａｎｄｅｒｓ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６２（３）：９９１‐１０００）。加えて、遺伝子発現における正常の生理学的なバリエーションを判定するために、正常の複数の肝臓サンプルが相互に比較された。あるグループの遺伝子は、ストレス、急性期免疫反応、及び肝臓の星細胞活性化に関連したものを含め、正常の肝臓において可変の発現を示すことが分かった。肝細胞癌に関連した遺伝子だけでなくこれらの遺伝子も、硬変した肝臓において差別的に発現した遺伝子のセットから除外された。遺伝子セットは、活性化リンパ球及び活性化された肝臓マクロファージにおいて発現したＨＣＶに感染した硬変症の肝臓遺伝子、細胞外マトリックスのリモデリングに含まれる遺伝子、Ｂｃｌ‐２信号の抗アポトーシス経路と関係する遺伝子、並びにインターフェロン反応及びウイルス宿主相互作用に関連した遺伝子に関連する。
【００２３】
進行した末期アルコール誘発肝硬変の７人の男性の患者からのヒト肝臓サンプルが、３６００個の遺伝子マイクロアレイを用いて、７つの正常の肝臓と比較された（Ｓｅｔｈ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６３（６）：２３０３‐２３１７）。平行して、アルコールが与えられたヒヒ肝臓も解析された。線維形成、異物代謝、炎症、酸化ストレス、細胞信号と関係する遺伝子は、アップレギュレートされた。コラーゲン、マトリックス・メタロプロテアーゼ、マトリックス・メタロプロテアーゼの組織阻害因子、及びアネキシン遺伝子は、ヒトにおいてアップレギュレートされた。
【００２４】
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓによって後援され、２００２年９月２０‐２２日に開催されたＳｉｎｇｌｅ  Ｔｏｐｉｃ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅからのレポートは、脂肪肝疾患を対象とした（Ｎｅｕｓｃｈｗａｎｄｅｒ‐Ｔｅｔｒｉ，Ｂ．Ａ．ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．Ｃａｌｄｗｅｌｌ（２００３）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３７（５）：１２０２‐１２０９）。この会議では、ＮＡＳＨの臨床的及び基礎的な側面について議論された。本願に関連する要点は、ＮＡＳＨにおける肝生検のための一般的に認識された見解の欠如、及び肝酵素は感度が鈍く、ＮＡＳＨの診断を確認するためにも線維化の程度を段階分けするためにも信頼して用いることができないということを含む。会議報告書は、次のように結論した：「将来の研究アジェンダには、ＮＡＳＨにおけるインスリン抵抗性及び異常なリポタンパク代謝の役割を解明すること、細胞の障害の病因を決定すること、素因的遺伝的異常を説明すること、疾患に係るよりよい非侵襲性の予測因子を同定すること、及び有効な治療法を示すことが含まれる。」
【００２５】
したがって、ＮＡＳＨのための非侵襲性の診断検査法及びＮＡＳＨの治療法のための標的に対する大きなニーズが、当該技術分野に存在する。
【００２６】
【非特許文献１】Ｔｈｏｍａｓ，Ｍ．Ｂ．ａｎｄ  Ａ．Ｘ．Ｚｈｕ（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３（１３）：２８９２‐２８９９
【非特許文献２】Ｃｌａｒｋ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ａ．Ｍ．Ｄｉｅｈｌ（２００３）ＪＡＭＡ  ２８９（２２）：ｐ．３０００‐３００４
【非特許文献３】Ｂｒｕｎｔ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９４（９）：ｐ．２４６７‐２４７４
【非特許文献４】Ｎｅｕｓｃｈｗａｎｄｅｒ‐Ｔｅｔｒｉ，Ｂ．Ａ．ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．Ｃａｌｄｗｅｌｌ（２００３）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３７（５）：１２０２‐１２０９
【非特許文献５】Ｇａｒｇ，Ａ．（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１０８（２）：１４３‐１５２
【非特許文献６】Ｐｒｏｐｓｔ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．４０（８）：１８０５‐１８１５
【非特許文献７】Ｓｔｒｕｂｅｎ，Ｖ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１０８（１）：９‐１３
【非特許文献８】Ｄａｙ，Ｃ．Ｐ．ａｎｄ  Ｏ．Ｆ．Ｊａｍｅｓ（１９９８）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１４（４）：８４２‐８４５
【非特許文献９】Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．ａｎｄ  Ｈ．Ｌ．Ｂｏｎｋｏｖｓｋｙ（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３５（３）：２５３‐２６１
【非特許文献１０】Ｓａｎｙａｌ，Ａ．Ｊ．（２００１）Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９６（２）：２７４‐２７６
【非特許文献１１】Ｃａｌｄｗｅｌｌ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．８（３）：５９５‐６１７
【非特許文献１２】Ｋｏｔｅｉｓｈ，Ａ．ａｎｄ  Ａ．Ｍａｅ  Ｄｉｅｈｌ（２００２）Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１６（５）：６７９‐６９０
【非特許文献１３】Ｇａｒｇ，Ａ．ａｎｄ  Ａ．Ｍｉｓｒａ（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８７（７）：３０１９‐３０２２
【非特許文献１４】Ｃｏｒｔｅｚ‐Ｐｉｎｔｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＪＡＭＡ  ２８２（１７）：１６５９‐１６６４
【非特許文献１５】Ｃａｌｄｗｅｌｌ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３１（３）：４３０‐４３４
【非特許文献１６】Ｍａｎｓｏｕｒｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２７（ｌ）：９６‐１０２
【非特許文献１７】Ｖａｎ  Ｒｅｍｍｅｎ，Ｈ．ａｎｄ  Ａ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（２００１）Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．３６（７）：９５７‐９６８
【非特許文献１８】Ｂａｔａｌｌｅｒ，Ｒ．ａｎｄ  Ｄ．Ａ．Ｂｒｅｎｎｅｒ（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５（２）：２０９‐２ｌ８
【非特許文献１９】Ｔｈｏｍａｓ，Ｍ．Ｂ．ａｎｄ  Ａ．Ｘ．Ｚｈｕ（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３（１３）：２８９２‐２８９９
【非特許文献２０】Ｚａｆｒａｎｉ，Ｅ．Ｓ．，（２００４）Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ．４４４（１）：３‐１２
【非特許文献２１】Ｔｈａｍｐａｎｉｔｃｈａｗｏｎｇ，Ｐ．ａｎｄ  Ｔ．Ｐｉｒａｔｖｉｓｕｔｈ（１９９９）Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．５（４）：ｐ．３０１‐３０４
【非特許文献２２】Ｒｅｇｅｖ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９７（１０）：２６１４‐２６１８
【非特許文献２３】Ｙｏｕｎｏｓｓｉ，Ｚ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｌｉｖｅｒ  Ｉｎｔ．２５（４）：７６０‐７７１
【非特許文献２４】Ｓｒｅｅｋｕｍａｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３８（１）：２４４‐２５１
【非特許文献２５】Ｓｈａｏ，Ｒ．Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１１（１３）：１９９５‐１９９９
【非特許文献２６】Ｋｉｍ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３９（２）：５１８‐５２７
【非特許文献２７】Ａｎｄｅｒｓ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６２（３）：９９１‐１０００
【非特許文献２８】Ｓｅｔｈ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６３（６）：２３０３‐２３１７
【発明の開示】
【００２７】
本発明は、ＮＡＳＨの発現及び進行と高い相関を有する、ＮＡＳＨに関連した遺伝子のパネルを提供する。そのため、本発明はＮＡＳＨに関連する遺伝子のパネルを備える診断ツールを提供し、そのパネルは表１に示される遺伝子から選択された少なくとも２つの遺伝子を備える。いくつかの実施形態において、該パネルは少なくとも１つのｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅを備える。いくつかの実施形態において、該ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅは、ＣＣＬ１９、ＳＣＹＡ２０、ＳＣＹＡ２１及びＣＸＣＬ６から成るグループから選択される。いくつかの実施形態において、該パネルは少なくともＳＣＹＡ２０を又は少なくともＣＣＬ１９を備える。一実施形態において、該パネルはＣＣＬ１９のみである。別の一実施形態において、該パネルはＳＣＹＡ２０のみである。
【００２８】
本発明は、正常の患者と比較して、ＮＡＳＨに関連する遺伝子のパネルの少なくとも１つの発現レベルを判定することにより、ＮＡＳＨを診断する方法を提供する。その発現レベルは、核酸レベル又はアミノ酸レベルで判定することができる。いくつかの実施形態において、表１から選択された多数の遺伝子の発現レベルが用いられる。いくつかの実施形態において、該パネルは、ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ（ＣＣＬ１９、ＳＣＹＡ２０、ＳＣＹＡ２１及びＣＸＣＬ６）の少なくとも１つを含む。いくつかの好適な実施形態において、該パネルにおける遺伝子の発現は血液ベースのアッセイにおいて判定され、遺伝子の発現レベルは患者から受け取られた血液のサンプルにおいて判定される。ＮＡＳＨに関連した遺伝子の発現レベルは、正常なレベルの遺伝子の発現と比較される。ここで示されるように、いくつかの遺伝子の高い発現が、ＮＡＳＨの発生率と相関する。一実施形態において、ＣＣＬ１９の発現レベルは正常なＣＣＬ１９発現と比較され、発現の増加はＮＡＳＨと相関する。他の実施形態において、ＳＣＹＡ２０の発現レベルは正常なＳＣＹＡ２０発現と比較され、発現の増加はＮＡＳＨと相関する。
【００２９】
本発明は、また、ＮＡＳＨに関連した遺伝子の発現又は活性を調節することにより、ＮＡＳＨを治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、遺伝子発現は増加される。他のいくつかの実施形態において、遺伝子発現は減少される。他のいくつかの実施形態において、発現のレベルは修飾されないが、タンパク質プロダクトの活性が、そのタンパク質のためのレセプタの調節により又は細胞間のシグナリングを乱すことにより変更される。いくつかの実施形態において、発現レベルは治療によって減少される。いくつかの実施形態において、表１における少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現レベルが、治療によって減少される。いくつかの実施形態において、表１から選択された複数の遺伝子の発現レベルが、治療によって減少される。いくつかの実施形態において、ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ（ＣＣＬ１９、ＳＣＹＡ２０、ＳＣＹＡ２１及びＣＸＣＬ６）の少なくとも１つの発現レベルが、治療によって減少される。いくつかの実施形態において、ＣＣＬ１９の発現レベルが減少される。いくつかの実施形態において、ＳＣＹＡ２０の発現レベルが減少される。
【００３０】
本発明に係る該治療法において、タンパク質又はそのレセプタの発現又は生物的活性を抑制するために治療で用いられる化合物は、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、モルホリノ・オリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、抗体、抗体フラグメント又は小さな分子を含む（これらに限定されない。）阻害因子である。
【００３１】
本発明は、また、ＮＡＳＨを治療するか又はＮＡＳＨの進行を遅くするのに有用である化合物を発見する方法を提供する。該方法は、表１からの少なくとも１つのタンパク質を試験物質とコンタクトさせることを含み、該試験物質が表１のタンパク質又はそのレセプタに結合するかを判断する。そのようなアッセイはインビトロでなされても良いし、細胞ベースのアッセイであっても良い。さらに、本発明の当該方法において、試験物質はタンパク質又はそのレセプタの生物的活性を抑制すると細胞ベースのアッセイにおいて判定することができ、これによりＮＡＳＨの治療に有用である化合物であると同定される。
【００３２】
本発明は、また、核酸ベースの試験又はタンパク質ベースの試験でありうる、患者のサンプル（好ましくは血液）からＮＡＳＨを診断するためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、該キットは、ＮＡＳＨ関連のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに結合する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、該キットは、少なくとも１つのＮＡＳＨ関連のタンパク質に特異的に結合する、少なくとも１つの抗体又は抗体の抗原結合部を含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＳＨ関連のタンパク質は、あるｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅである。他のいくつかの実施形態において、ＮＡＳＨに関連するタンパク質は表１からの少なくとも１つのタンパク質である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本明細書で参照されるＧｅｎＢａｎｋデータベース配列への受入番号を含め、参照される業績、特許、特許出願、及び科学文献は、当業者の知識を確認するものであり、各々が引用によって組み入れられるべく具体的かつ個別的に示されるのと同程度に、引用により全体としてここに組み入れられる。ここで引用される文献と本明細書の特定の教示との間に矛盾がある場合には、後者の利益になるように解決されることとする。
【００３４】
種々の定義が本文書を通してなされる。殆どの語は、当業者によってそれらの語に帰せられる意味を有する。以下において又は本書類の他の箇所において具体的に定義される語は、全体として本発明の文脈において与えられ、当業者によって典型的に理解されるような意味を有する。ある語又は熟語の技術的に理解される定義と、その語又は熟語について本明細書において具体的に教示される定義との間に矛盾が生じた場合には、後者の利益になるように解決されることとする。本明細書に使用される見出しは便宜上のものであり、限定するものとして解されるべきでない。
【００３５】
当業者には既知である組み換えＤＮＡ技術の一般原理を記述している標準的な参考業績には、Ａｕｓｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２Ｄ  ＥＤ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９５；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｅｄ．，ＤＩＲＥＣＴＥＤ  ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１が含まれる。
【００３６】
ここで用いられるように「ＮＡＳＨ」は非アルコール性脂肪性肝炎を意味し、実施可能性に関する如何なる特定の理論と結合することを望むことなく、ＮＡＳＨに関連するとしてここで議論される遺伝子は、炎症、線維化、脂肪肝及び肝硬変のようなＮＡＳＨの１又は２以上の構成要素と関連すると考えられる。
【００３７】
ここで用いられるように、「単離される」とは、物質がその最初の環境（たとえば、それが自然に存するのであれば、自然環境）から除去されることを意味する。たとえば、生きている動物中に現れる自然に存在しているポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていないが、自然システム中に共存する物質の全部又は一部から単離された同一のポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であってもよく、及び／又はそのようなポリヌクレオチド若しくはポリペプチドは組成物の一部であってもよく、そしてそのようなベクター若しくは組成物がその自然環境の一部でない場合にはなお単離されてもよい。
【００３８】
「精製された」又は「十分に精製された」ポリヌクレオチド又はポリペプチドとは、生来の（又は野生型の）核酸又はポリペプチドが自然に随伴する他の細胞成分から、及び／又は他の不純物（たとえば、アガロースゲル）から十分に分離されることをいう。精製されたポリペプチド又はタンパク質は、サンプルの約６０％〜９９％ｗ／ｗ以上を備え、約９０％、約９５％、又は約９８％の純度であってもよい。
【００３９】
ここで用いられる「約」とは、基準値の＋／−１０％を指す。
【００４０】
ここで用いられるように、「バリアント」核酸又はアミノ酸配列とは、たとえば、関心のある配列のイソ型、種変異体、対立遺伝子変異体、及びフラグメントを含む、相同体を指す。「相同性ヌクレオチド配列」若しくは「相同性アミノ酸配列」、又はその変異体とは、基準配列、又は機能的ドメインをコードしているか若しくは有するその部分若しくはフラグメントに関して、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％、より好ましくは１００％のパーセンテージ同一性（ポリヌクレオチドに関する場合）又は相同性（ポリペプチドに関する場合）によって特徴付けられる配列を指す。相同性とは、基準アミノ酸配列の、同類若しくは非同類のアミノ酸置換又は同類及び非同類のアミノ酸置換の双方との許容性の、割合的同一性を意味する。
【００４１】
ＮＡＳＨに関連した核酸又はタンパク質の、すなわちＮＡＳＨの調節ないし改善のための標的に対する抗体の「治療学的有効量」という用語は、肝臓において、すなわち血漿において（全身的に投与される場合）治療学的に有効なレベルを達成かつ維持して、ＮＡＳＨを抑制するように計算された量を意味する。もちろん、治療学的用量は、各アゴニスト又はアンタゴニストの効力、また、身体による及び／又は血漿におけるアゴニスト又はアンタゴニストの排除又は代謝の速度により変化するであろう。また、治療学的用量は、治療の任意の組合せ療法を増進するであろうアゴニスト又はアンタゴニストの量に適合する。
【００４２】
ここで用いられるように、「分析物」とは検出すべき物質である。それは、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡそれらの断片）、タンパク質、タンパク質断片、ペプチド、代謝物質などである。
【００４３】
実施例に記載されているように、いくつかの遺伝子は、遺伝子プロファイリングによってＮＡＳＨに関連することが明らかになった。本発明の方法に有用である遺伝子には、限定するものでないが、ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、コラーゲン、マトリックスＧ１ａタンパク質、ＩＬ‐８、ＥＧＦ含有ｆｉｂｕｌｉｎ様細胞外マトリックスタンパク質１（例えば、表１に示される遺伝子）が含まれる。
【００４４】
身体においてＮＡＳＨ状態の存在を検出するために、複数の遺伝子の複数のパネルを選択してもよい。パネルにおける遺伝子の配置構成は表１における遺伝子の少なくとも１つかもしれない。たとえば、ＩＬ‐８がパネルにある場合、そのパネルは表１の少なくとも１つの他の遺伝子を備えるというように、表１の遺伝子とそれらの遺伝子の任意のサブセットの総数を含め、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つの遺伝子等々、表１から選択された任意の合計数の遺伝子であってもよい。
【００４５】
いくつかの実施形態において、パネルは、ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓである遺伝子を備える。たとえば、限定するものでないが、パネルは、ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ，ｍｅｍｂｅｒｓ  １９（ＣＣＬ１９），２０（ＳＣＹＡ２０又はＣＣＬ２０），２１（ＳＣＹＡ２１）と、ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｂ，ｍｅｍｂｅｒ  ６（ＣＸＣＬ６）とから選択された少なくとも１つのｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅを備える。
【００４６】
いくつかの実施形態において、パネルは、例えば、ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、コラーゲン、インターロイキン、マトリクスタンパク質など、遺伝子の同一のファミリーにおける遺伝子を備える。他の実施形態において、パネルは、遺伝子の１つを超えるファミリーからの代表的な遺伝子を備える。さらに別の実施形態において、パネルは、遺伝子のすべてのファミリーからの代表を備える。
【００４７】
いくつかの実施形態において、パネルは、表１から、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の遺伝子を備える。
【００４８】
本発明の遺伝子のパネルは、患者からサンプルを取得し、パネルにおける遺伝子の発現のレベルを判定し、スクリーンの結果と、結果の患者におけるＮＡＳＨの蓋然性との相関性のための１セットの予め定められた値とを比較することによって、ＮＡＳＨのための診断スクリーンにおいて用いることができる。
【００４９】
本発明の方法の一実施形態において、患者のサンプルを試薬と接触させ、ＮＡＳＨに関連した遺伝子又は遺伝子産物に対応する、当該サンプル中の分析物の存在が検出される。いくつかの実施形態において、分析物はＮＡＳＨに関連した遺伝子に対応する核酸であり、制限するものでないが、マイクロアレイ解析（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎを使用）、ＰＣＲ、ＲＴ‐ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼイション、核酸保護アッセイ、制限消化プロファイリングなどを含む、核酸の検出及び解析のために知られている任意の方法によって検出することができる。
【００５０】
本発明の他の実施形態において、患者のサンプルを試薬と接触させ、ＮＡＳＨに関連した遺伝子産物に対応する当該サンプル中の分析物の存在が検知される。いくつかの実施形態において、分析物は、ＮＡＳＨに関連した遺伝子に対応するタンパク質、ペプチド又はタンパク質断片であり、制限するものでないが、免疫測定（ＥＬＩＳＡ、ウェスタン法、放射免疫検定、蛍光ベースの免疫測定などを含むが、これらに限定されない。）、ＦＰＬＣ解析などを含め、タンパク質の検出及び解析のために知られている任意の方法によって検出することができる。
【００５１】
ＮＡＳＨタンパク質の抗体は生成可能であり、抗体は、対応するタンパク質の検出、特性解析又は単離に有用であるとともに、タンパク質の活性を修飾するのに有用でもある。抗体は、免疫原としてヒト又は動物の純化又は組み換えられた受容蛋白又はその断片を用い、標準的な技術によって生成可能である。
【００５２】
ＮＡＳＨタンパク質に対するモノクローナル抗体は、たとえば、Ｅｓｍｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２２２：３５９‐３８５によって他のタンパク質のために記述されるようにして得ることができる。抗体には、放射ラベリング、酵素ラベリング、フルオレスセイン、金粒子状物質、着色料などの蛍光ラベル等の標準的技術、及び他の抗体検出のための手段を用いてラベルを付けることができる。たとえば、抗体は、標準的な手順を用いて、ビオチンアミドカプロエートＮ‐ヒドロキシスクシンイミドエステルでビオチン化することができる。抗体は、免疫測定での使用のために、又は溶液フェーズ免疫測定での使用のために、たとえばＡｆｆｉＧｅｌ‐１０（登録商標）、ニトロセルロース、マイクロタイタ・ウェルなどの固いサポートに固定することができる。一実施形態において、タンパク質は、実施例４に記載されているようにｍＡｂでコートされた微量定量プレートにおいてＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定される。
【００５３】
多くの場合において、当該技術分野において公知の表１における遺伝子又は遺伝子の遺伝子産物の存在を検出するための、当該技術分野における公知の試薬が存在する。遺伝子の配列は公知であり、また、当業者は、遺伝子の存在を検出するプローブないしプライマーとして有用となるオリゴヌクレオチド配列を導き出すために、利用可能なオリゴヌクレオチド予測プログラムの任意のものを用いることができる。加えて、タンパク質及びタンパク質の断片に対する抗体は、遺伝子配列を知っている標準的技術を用いて容易に作製することができる。さらに、該パネルのタンパク質に結合して検出する、当該技術分野において利用可能な抗体のうちの任意のものを、本発明の方法において用いてもよい。
【００５４】
本発明の方法は、末梢血のスクリーニング（血清又はＰＢＭＣの何れかにおける対象遺伝子の発現の存在の検出）に適している。前者の場合において、タンパク質の検出はＥＬＩＳＡ又は他の具体的で、定量可能な、蛋白質検出方法を用いて行うことができ、肝臓起源であって今は末梢を循環しているであろうタンパク質の検出という利点を有する。如何なる特定の動作原理によって束縛されることを望まずに、ＳＣＹＡ２０（ＣＣＬ２０）は肝臓において発現され放出されたタンパク質であると考えられている。そして、その循環レベルは検出してＮＡＳＨと関連付けることができる（実施例７を参照）。
【００５５】
他の実施形態において、核酸レベルの遺伝子発現は、ＰＢＭＣから抽出されたＲＮＡ上のリアルタイムＰＣＲのような具体的で、定量可能な方法によって、ＰＢＭＣにおいて検出される。Ｔａｑｍａｎアッセイは、ＲＮＡサブストレートで始まる解析のための遺伝子発現を定量する手段として、当該技術分野において周知である。（対象遺伝子によって）増加したか又は減少した発現をＮＡＳＨの診断を関連付けるべく遺伝子発現を検出して発現レベルを正常のレベルと比較するために、当該技術分野において公知の任意のタイプの正確で、定量可能な解析法を用いてもよい。
【００５６】
本発明は、また、患者のサンプル（好ましくは血液）からＮＡＳＨを同定するためのキットを提供する。核酸ベースの試験であっても、タンパク質ベースの試験であってもよい。いくつかの実施形態において、該キットは、ＮＡＳＨ関連のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに結合する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、該キットは、別個のコンテナにおいて、１又は２以上のＮＡＳＨ関連のタンパク質をコードする１又は２以上のポリヌクレオチドを検出するために、複数のプローブを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質はＣＣＬ１９、ＳＣＹＡ２０、ＳＣＹＡ２１及びＣＸＣＬ６を含め（これらに限定するものでない。）、ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓである。他の実施形態において、タンパク質は、表１に示されるタンパク質の１又は２以上である。他の実施形態において、該キットは、少なくとも１つのＮＡＳＨ関連のタンパク質に特異的に結合する少なくとも１つの抗体又は抗体の抗原結合部を含む。いくつかの実施形態において、該キットは、別個のコンテナにおいて、１又は２以上のＮＡＳＨ関連のタンパク質を検出するために、複数の抗体又は抗体の抗原結合部（又はそれらの混合物）を含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＳＨ関連のタンパク質は、ＣＣＬ１９、ＳＣＹＡ２０、ＳＣＹＡ２１及びＣＸＣＬ６を含め（これらに限定するものでない。）、ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓである。他の実施形態において、ＮＡＳＨに関連するタンパク質は、表１からの少なくとも１つのタンパク質を含む。該キットは、また、使用のための説明書を含んでいてもよい。
【００５７】
本発明は、また、ＮＡＳＨに関連した遺伝子の発現の調節により、あるいはＮＡＳＨのシグナル経路を変化することにより、患者のＮＡＳＨを治療しかつ／または予防する方法を提供する。
【００５８】
本発明の方法において、本発明の方法によって予測されるようなＮＡＳＨを有しているか又はＮＡＳＨを進展させるリスクがある患者を同定し、そして、ＮＡＳＨに関連した少なくとも１つの遺伝子の発現を調節し又はＮＡＳＨに関連した少なくとも１つの発現されたタンパク質の生物的活性を変化するために、その患者をレジメンにより治療することができる。ある場合には、そのタンパク質の生物活動の調整は、ＮＡＳＨに関連したタンパク質のための受容体の発現又は機能を変えることにより、達成することができる。一定の実施形態において、調節される遺伝子又はタンパク質は、表１に示されるタンパク質又はその受容体である。いくつかの実施形態において、調節された遺伝子又はタンパク質は、ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ又はその受容体である。他の実施形態において、調節される遺伝子又はタンパク質は、ＣＣＬ１９、ＳＣＹＡ２０、ＳＣＹＡ２１、ＣＸＣＬ６及びその受容体から選択される。
【００５９】
ＮＡＳＨに関連した遺伝子の発現を変化する方法は、当該技術分野において知られている任意の手段であってよい。発現を強化するために、インビボ又はエスクビボで患者の細胞へ発現ベクターを導入し、ＮＡＳＨと相関する特定のタンパク質の発現を増加することができる。これは、それの発現のレベルが低すぎる場合に行われる。このように、タンパク質の発現の増加によって、ＮＡＳＨの進行又は発症が改善される。２つ以上のポリペプチドをコードする核酸は、同一の発現ベクターに組み入れられてもよいし、別個の発現ベクター上に存在してもよい。細胞の中へのベクターのトランスフェクションは、同時であっても連続であってもよい。１つ又は両方のポリペプチドの制御された発現を可能にするために、複数のポリペプチドの発現は、同一の調節エレメント又は異なる調節エレメントの下で制御されてもよい。あるいは、ポリペプチドの発現は構成的となるようになされてもよい。
【００６０】
逆に、ＮＡＳＨと相関する遺伝子が、正常者と比較して高すぎるレベルで発現する場合、そのような患者における遺伝子の発現又は活性を減少するために当該技術分野において既知の種々の方法を用いることができる。たとえば、限定するものでないが、阻害因子を用いて遺伝子の発現を変化することができる。阻害因子は、たとえば、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、モルホリノオリゴヌクレオチド、抑制性（ＲＮＡｉ）、免疫療法（モノクローナル抗体又はアポリクローナル抗体又は抗体フラグメントのいずれか）などである。
【００６１】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、動物及びヒトにおける疾病状態の処置において治療上の成分として使用することができる。リボザイムを含むアンチセンス・オリゴヌクレオチド薬物は、ヒトに安全かつ有効に投与されており、多くの臨床試験が現在進行中である。かくして、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織及び動物、特にヒト、の処置のための処置法において有用となるように構成可能な有用な治療手段になり得ることが確立される。
【００６２】
本発明の文脈上、「オリゴヌクレオチド」との用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）若しくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はそれらの擬似物のオリゴマー若しくはポリマーを指す。この用語は、自然に存在する核酸塩基、糖及びヌクレオシド間（骨格）共有結合からなるオリゴヌクレオチド並びに同様に機能する自然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような改変され又は置換されたオリゴヌクレオチドは、所望の特性、たとえば細胞の取込み増進、核酸標的に対する親和力増進及びヌクレアーゼの存在下での安定性増大のために、しばしば本来の形態物以上に好適である。
【００６３】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドが本発明によって熟考されるが、限定されるものではないが下記のようなオリゴヌクレオチド擬似物を含む、他のオリゴマーのアンチセンス化合物もまた含まれる。本発明によるアンチセンス化合物は、好ましくは、約８〜約５０個の核酸塩基（すなわち、約８〜約５０個の連結ヌクレオシド）を含む。いくつかの実施態様では、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは約８〜約１５個の核酸塩基を含む。他の実施態様では、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは約１６〜約２５個の核酸塩基を含む。他の実施態様では、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは約２０〜約３０個の核酸塩基を含む。他の実施態様では、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは約２５〜約３５個の核酸塩基を含む。他の実施態様では、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは約３０〜約４５個の核酸塩基を含む。他の実施態様では、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは約４０〜約５０個の核酸塩基を含む。アンチセンス化合物には、標的核酸にハイブリダイズし、そしてその発現を調節する、リボザイム、エクスターナルガイド（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｇｕｉｄｅ）配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド（オリゴザイム）、及び他の短い触媒ＲＮＡ又は触媒オリゴヌクレオチドを含む。
【００６４】
当該技術分野において既知であるように、ヌクレオシドは塩基‐糖の組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は通常は複素環式塩基である。そのような複素環式塩基の２種の最も典型的なクラスは、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むそれらのヌクレオシドでは、リン酸基は糖の２’，３’又は５’ヒドロキシル部分のいずれかに結合することができる。オリゴヌクレオチドの形成では、リン酸基は隣接するヌクレオシドを他のヌクレオシドに共有結合して、直線状ポリマー化合物を形成する。順に、この直線状ポリマー構造物のそれぞれ末端がさらに連結されて、環状構造物が形成されてもよいが、開放された直線状構造物が一般に好適である。オリゴヌクレオチド構造物において、リン酸基は通常、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格の形成に向けられる。ＲＮＡ及びＤＮＡの通常の結合又は骨格は、３’〜５’ホスホジエステル結合である。
【００６５】
本発明において有用である好適なアンチセンス化合物の具体的な例には、修飾骨格又は非天然のヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書で定義されるように、修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格中にリン原子を保持するもの、及び骨格中にリン原子を有しないものが含まれる。本明細書の目的のためには、また、当該技術分野において時々引用されるように、それらのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有しない修飾オリゴヌクレオチドもまたオリゴヌクレオチドであると考えることができる。
【００６６】
いくつかの実施態様では、修飾オリゴヌクレオチド骨格は、たとえば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’‐アルキレンホスホネート、５’‐アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’‐アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、正常な３’‐５’結合を有するセレノホスフェート及びボラノホスフェート、これらの２’‐５’結合類似体、及び１個以上のヌクレオチド間結合が３’〜３’，５’〜５’又は２’〜２’結合である反転極性を有するそれらのものを含む。反転極性を有する好適なオリゴヌクレオチドは、３’‐大多数ヌクレオチド間結合における単一の３’〜３’結合、すなわち、塩基性であってもよい単一の反転ヌクレオシド残基（核酸塩基が失われているか、又はその代わりにヒドロキシル基を有する）を含む。
【００６７】
他の好適なオリゴヌクレオチド擬似物では、両糖及びヌクレオシド間の結合、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が、新規の基により置換される。塩基単位は、適当な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのそのようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されたオリゴヌクレオチド擬似物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）として言及される。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、骨格、特にアミノエチルグリシン骨格を含有するアミドにより置換される。核酸塩基は保有され、そして骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許は、限定されるものではないが米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；及び同第５，７１９，２６２号を含み、これらの各々は引用によって本明細書に組み入れられる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７‐１５００において見出される。
【００６８】
改変されたオリゴヌクレオチドはまた、１又は２個以上の置換糖部分を含有していてもよい。
【００６９】
さらなる改変は、２’‐ヒドロキシル基が糖環の３’又は４’炭素原子に結合されて、二環式糖部分を形成するＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（ＬＮＡ）を含む。結合は、好ましくは、２’酸素原子と４’炭素原子を架橋しているメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基［式中、ｎは１又は２である］であり、そしてそれの調製はＷＯ９８／３９３５２およびＷＯ９９／１４２２６に記述されている。
【００７０】
他の改変は、２’‐メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’‐アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’‐アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）及び２’‐フルオロ（２’−Ｆ）を含む。２’−改変は、アラビノ（ｕｐ）位置又はリボ（ｄｏｗｎ）位置に存在してもよい。好適な２’‐アラビノ改変は２’‐Ｆである。類似の改変もまた、オリゴヌクレオチドにおける他の位置、具体的には３’末端ヌクレオチドにおける糖の３’位又は２’‐５’結合オリゴヌクレオチド及び５’末端ヌクレオチドの５’位において作成されてもよい。またオリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖擬似物を有してもよい。
【００７１】
また、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基（しばしば、当該技術分野では単に「塩基」と呼ばれる。）改変物又は置換物を含んでもよい。ここで使用されるように、「未改変」ないし「自然の」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。改変核酸塩基は、他の合成及び自然の核酸塩基、たとえば５‐メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５‐ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２‐アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６‐メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２‐プロピル及び他のアルキル誘導体、２‐チオウラシル、２‐チオチミン及び２‐チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５‐プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシン及びピリミジン塩基の他のアルキル誘導体、６−アゾ  ウラシル、シトシン及びチミン、５‐ウラシル（プソイドウラシル）、４‐チオウラシル、８‐ハロ、８‐アミノ、８‐チオール、８‐ヒドロキシル及び８‐置換アデニン及びグアニン、５‐ハロ、特に５‐ブロモ、５‐トリフルオロメチル及び他の５‐置換ウラシル及びシトシン、７‐メチルグアニン及び７‐メチルアデニン、２‐Ｆ‐アデニン、２‐アミノアデニン、８‐アザグアニン及び８‐アザアデニン、７‐デアザグアニン及び７‐デアザアデニン及び３‐デアザグアニン及び３‐デアザアデニンを含む。さらなる改変核酸塩基は、三環式ピリミジン、たとえばフェノキサジンシチジン（１Ｈ‐ピリミド［５，４‐ｂ］［１，４］ベンゾキサジン‐２（３Ｈ）‐オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ‐ピリミド［５，４‐ｂ］［１，４］ベンゾチアジン‐２（３Ｈ）‐オン）、Ｇ‐ｃｌａｍｐｓ、たとえば置換フェノキサジンシチジン（たとえば、９‐（２‐アミノエトキシ）‐Ｈ‐ピリミド［５，４‐ｂ］［１，４］ベンゾキサジン‐２（３Ｈ）‐オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ‐ピリミド［５，４‐ｂ］インドール‐２‐オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ‐ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３‐ｄ］ピリミジン‐２‐オン）を含む。また改変核酸塩基は、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環式化合物、たとえば７‐デアザアデニン、７‐デアザグアノシン、２‐アミノピリミジン及び２‐ピリドンにより置換されるものを含んでもよい。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、ＴＨＥ  ＣＯＮＣＩＳＥ  ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ  ＯＦ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ，ｐａｇｅｓ８５８‐８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｊ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ１５，ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ｐａｇｅｓ  ２８９‐３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されるものを含む。これ���の核酸塩基のあるものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和力を増大するために特に有用である。これらは、２‐アミノプロピルアデニン、５‐プロピニルウラシル及び５‐プロピニルシトシンを含む、５‐置換ピリミジン、６‐アザピリミジン及びＮ‐２，Ｎ‐６及びＯ‐６置換プリンを含む。５‐メチルシトシン置換物は、０．６〜１．２℃だけ核酸二重らせんの安定性を増強することが示され（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｄｓ．，ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６‐２７８）、そしてより特別には、２’  ‐Ｏ‐メトキシエチル糖改変と組み合わされた場合、現在、好適な塩基置換物である。
【００７２】
本発明のオリゴヌクレオチドの他の改変は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分配又は細胞取込みを増進する１又は２個以上の部分又は結合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）をオリゴヌクレオチドに化学的に結合することを伴う。本発明の化合物は、官能基、たとえば第１又は第２ヒドロキシル基に共有結合された結合基を含んでもよい。本発明の結合基は、インターカレータ、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的性質を増進する基、及びオリゴマーの薬動学的性質を増進する基を含む。典型的な結合基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フォラシン、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、ローダミン、クマリン及び染料を含む。本発明の文脈上、薬力学的性質を増進する基は、オリゴマーの取込みを改良し、分解に対するオリゴマーの抵抗性を増進し、及び／又はＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。本発明の文脈上、薬動学的性質を増進する基は、オリゴマーの取込み、分配、代謝又は排泄を改良する基を含む。結合部分は、限定されるものではないが、脂質部分、たとえばコレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６５５３‐６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．  ４：１０５３‐１０６０）、チオエーテル、たとえばヘキシル‐Ｓ‐トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：３０６‐３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．  ３：２７６５‐２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０：５３３‐５３８）、脂肪族鎖、たとえばドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ‐Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：１１１１‐１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２５９：３２７‐３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ７５：４９‐５４）、リン脂質、たとえばジーヘキサデシル‐ｒａｃ‐グリセロール又はトリエチルーアンモニウム１，２‐ジ‐Ｏ‐ヘキサデシル‐ｒａｃ‐グリセロ‐３‐Ｈ‐ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３６：３６５１‐３６５４；Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８：３７７７‐３７８３）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １４：９６９‐９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３６：３６５１‐３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２６４：２２９‐２３７）、又はオ���タデシルアミン又はヘキシルアミノ‐カルボニル‐オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｏ．Ｔｈｅｒ．  ２７７：９２３‐９３７）を含む。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、活性薬物物質、たとえば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）‐（＋）‐プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５‐トリヨード安息香酸、フルフェナミン酸（ｆｌｕｆｅｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、ベンゾチアジアジド、クロロチアジアジド、ジアゼピン、インドメチシン、バルビタール酸塩、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤又は抗生物質に結合されてもよい。
【００７３】
所与の化合物の全ての位置について均一に改変されることは必ずしも必要でなく、事実、１を超える前記改変を、オリゴヌクレオチド内の単一の化合物又は単一のヌクレオチドにおいてさえ組み入れてもよい。また本発明はキメラ化合物であるアンチセンス化合物を含む。本発明の文脈上、「キメラの」アンチセンス化合物ないし「キメラ」は、各々が少なくとも１個のモノマー単位、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドから作成された、２個以上の化学的に異なる領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性の増大、細胞取り込みの増大及び／又は標的核酸への結合親和力の増大をオリゴヌクレオチドに与えるようにオリゴヌクレオチドが改変される、少なくとも１つの領域を含有する。オリゴヌクレオチドのさらなる領域が、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂できる酵素のための基質として働いてもよい。例を挙げれば、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重らせんのＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のオリゴヌクレオチド抑制の効力を大きく増進する。結果的に、同じ標的領域へハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドに比較して、キメラオリゴヌクレオチドが使用される場合、匹敵する結果が、しばしば、より短いオリゴヌクレオチドを用いて得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、日常的にはゲル電気泳動によって検出でき、必要であれば当該技術分野において既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって検出できる。
【００７４】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、前記のような２個以上のオリゴヌクレオチド、改変オリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチド擬似物の複合体構造物として形成されてもよい。そのような化合物もまたハイブリッド又はギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）として当該技術分野において呼ばれている。
【００７５】
本発明に従って使用されるアンチセンス化合物は、便利かつ日常的には、周知の固相法という技術により作成されてもよい。そのような合成の機器は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（フォスターシティー，カリフォルニア州）を含むいくつかの販売元によって販売されている。当該技術分野において既知のそのような合成のための任意の他の手段が、追加的又は代替的に使用されてもよい。ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチドを調製するために類似技術を使用することは周知である。
【００７６】
本発明のアンチセンス化合物はインビトロで合成され、そして生物学的起源のアンチセンス組成物、又はアンチセンス分子のインビボ合成を指導するように設計された遺伝ベクター構築物を含まない。また本発明の化合物は、取込み、分配及び／又は吸収を助けるために、たとえば、リポソーム、受容体標的分子、経口、肛門、局所又は他の調合物として、他の分子、分子構造物又は化合物の混合物とともに、混合、カプセル化、結合又は他に会合されてもよい。
【００７７】
アンチセンス技術の具体的形態はモルホリノ・オリゴヌクレオチドである（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．ａｎｄ  Ｄ．Ｗｅｌｌｅｒ（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｃｕｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  ７：１８７‐１９５；Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ，Ａ．ａｎｄ  Ｓ．Ｃ．Ｅｋｋｅｒ（２０００）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．  ２６：２１６‐２２０；Ｙａｎ，Ｙ‐Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９：５０６５‐５０７９）。モルホリノ・オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡと比較して変更された骨格結合をもつ非イオン性のＤＮＡ類似体であるが、相補的配列をもつＷａｔｓｏｎ‐Ｃｒｉｃｋ塩基対に従う。典型的には、モルホリノは少なくとも長さ約１８〜２５の核酸塩基であり、ある実施態様では、モルホリノは少なくとも長さ約２５〜３０の核酸塩基であり、さらに別の実施態様では、モルホリノは少なくとも長さ約３０〜３５かそれ以上の核酸塩基である。脊椎動物の発生を研究するための道具としてのモルホリノの長さは、Ｅｋｋｅｒ  Ｓ．Ｃ．（２０００）Ｙｅａｓｔ  １７：３０２‐３０６による最近の説に十分記述されており、この開示は引用によって本明細書に組み入れられる。
【００７８】
モルホリノは、ＲＮアーゼＨの基質でなく、分解されないＲＮＡ‐モルホリノハイブリッドを形成する。モルホリノオリゴマーは、配列に特異的な様式で遺伝子発現を明瞭にブロックする。
【００７９】
本発明は、ＮＡＳＨに関連した遺伝子のパネルのメンバーの５’非翻訳領域、すなわちＮＡＳＨに関連したポリヌクレオチド又は遺伝子のスプライス部位を標的とするモルホリノ改変オリゴヌクレオチドを提供する。そのようなモルホリノ改変オリゴヌクレオチドは、１又は２以上のこれらの遺伝子の発現を抑制するのに有効であり、これらの改変オリゴヌクレオチドにより処置された動物におけるＮＡＳＨの開始又は進行を妨害する。
【００８０】
モルホリノは高度に無極性である。したがって、改変された又は未改変のモルホリノオリゴは、細胞／組織中にモルホリノオリゴの送達を促進する任意の既知の送達担体／ベクターと組み合わせて投与することができる。
【００８１】
本発明の核酸構築物は、当該技術分野において既知の任意の手段によって送達してよい。ある実施態様では、核酸はエクスビボ手段を用いて細胞中に送達される。他の実施態様では、核酸はインビボ手段を用いて細胞中に送達される。
【００８２】
エクスビボ遺伝子療法では、細胞は、実験操作前に宿主生物、たとえばヒトから除去される。これらの細胞は、次に、当該技術分野において周知の方法を用いてインビトロで核酸がトランスフェクトされる。次いで、これらの遺伝的に操作された細胞が宿主生物中に再導入される。一方、インビボの遺伝子治療アプローチでは、宿主生物からの標的細胞の除去は必要でない。それとは異なり、核酸は、試薬、たとえばリポソーム又はレトロウイルスと複合され、続いて既知の方法を用いて生物内の標的細胞に投与することができる。たとえば、Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３７：１４７６、１９８７；Ｇｅｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．  ３：１８０を参照。
【００８３】
エクスビボ又はインビボいずれかの遺伝子治療アプローチのために、細胞をトランスフェクトするための数種の異なる方法を使用することができる。これらの既知のトランスフェクション法は、標的細胞中に選ばれた核酸を送達するために使用されるエージェントに従って分類することができる。トランスフェクション作用物には、ウイルス依存性、脂質依存性、ペプチド依存性、及び直接トランスフェクション（「裸ＤＮＡ」）アプローチが含まれる。トランスフェクションのために使用される他のアプローチには、カルシウム共沈法及び電気穿孔法が含まれる。
【００８４】
ウイルスアプローチは、宿主細胞を感染させるために遺伝的に工作されたウイルスを使用し、それによって、外因性核酸により細胞を「トランスフェクトする」。既知のウイルスベクターには組換えウイルスがあり、その例は既に開示されている。たとえば、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス及びレトロウイルスがある。そのような組換え体は、プロモータやエンハンサエレメントの制御下で異種の遺伝子を担持でき、ベクターで感染された宿主細胞においてそれらの発現を惹起することができる。ワクシニア及び他の種類の組換えウイルスは、Ｍａｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ４９：３によって概説されている。また、Ｋｏｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ５：１９も参照されたい。
【００８５】
リポソームなどの非ウイルスベクターもまた、遺伝子治療における核酸送達のための媒介物として使用されてもよい。ウイルスベクターに比較して、リポソームは安全であり、比較的高い能力を有し、比較的低い毒性であり、種々の核酸に基づく分子を送達でき、そしてかなり非免疫原性である。参照、Ｆｅｌｇｅｒ，Ｐ．Ｌ．ａｎｄ  Ｒｉｎｇｏｌｄ，Ｇ．Ｍ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：３８７‐３８８。これらのベクターの中では、カチオン性リポソームが、インビトロの哺乳動物細胞トランスフェクションの媒介におけるそれらの有効性により最も研究されている。リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）として既知の１つの技術は、核酸及び細胞へのトランスフェクションを促進するカチオン性脂質から作成されるリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）を使用する。脂質／核酸複合体は、原形質又はエンドソーム膜を融合するか、さもなくば破壊し、そして細胞中に核酸を移送する。リポフェクションは、典型的には、リン酸カルシウムトランスフェクション法よりも細胞へのＤＮＡの導入において一層効率的である。Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｆｏｃｕｓ  １０：６６。
【００８６】
１つの既知タンパク質依存のアプローチは、核酸と混合されたポリリジンの使用を伴う。ポリリジン／核酸複合体は、次いで侵入のために標的細胞に曝露される。参照、たとえば、Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｓｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：２３９；Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５。
【００８７】
「裸のＤＮＡ」トランスフェクションアプローチは、核酸がインビボで直接投与される方法を伴う。参照、Ｇｅｒｍａｎらへの米国特許第５，８３７，６９３号。核酸の投与は、筋肉又は皮膚のような、器官における組織の間質空間中への注入、血流中、所望の体腔中への直接導入によって、あるいはまた吸入によって実施できる。これらの所謂「裸のＤＮＡ」アプローチでは、核酸は注入されるか、さもなくばいかなる補助剤もなしに動物と接触される。体組織、たとえば骨格筋又は皮膚中へ直接、遊離の（「裸の」）プラスミドＤＮＡの注入がタンパク質の発現をもたらすことが報告されている。参照、Ｕｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５‐１７４９；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：４１５７‐４１６０；Ｒａｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９５１９‐９５２３。
【００８８】
電気穿孔法は別のトランスフェクション法である。参照、Ｓｚｏｋａ，Ｊｒ．らへの米国特許第４，３９４，４４８号及びＨａｕｓｅｒへの米国特許第４，６１９，７９４号。種々の動物及び植物細胞への短い高電圧電気パルスの印加により、原形質膜にナノメーターサイズの孔が形成される。ＤＮＡは、これらの小孔を通して又は孔の閉鎖を伴う膜構成成分の再分配の結果として細胞原形質中に直接侵入することができる。
【００８９】
本発明のＮＡＳＨに関連した核酸分子、ポリペプチド（タンパク質の細胞透過性改変バージョンを含む）、及びＮＡＳＨに関連した抗体（ここでは「有効成分」としても参照される）、並びにその誘導体、フラグメント、類似体及び同族体は、投与のために適当な治療学的に有効な量において薬剤組成物中に組み入れることができる。そのような組成物は、典型的には、核酸分子、タンパク質又は抗体及び製薬学的に許容され得る担体を含む。ここで使用されるように、「薬剤学的に許容され得る担体」は、製薬学的投与に適合する、いずれか及び全ての溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤などを含むことを意図している。適当な担体は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、当該分野における標準的参考テキストの最新版に記述されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。そのような担体又は賦形剤の好適な例は、限定されるものではないが、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液及び５％ヒト血清アルブミンを含む。リポソーム及び非水性媒質、たとえば不揮発油がまた使用されてもよい。製薬学的活性物質のためのそのような媒質及び作用物の使用は当該技術分野においては周知である。いずれか慣用の媒質又は作用物が活性化合物と適合しない限りそれを除いて、組成物におけるその使用が考えられる。補足的な活性化合物がまた組成物中に組み入れられてもよい。
【００９０】
本発明の薬剤組成物は、その意図される投与経路に適合するように調合される。投与経路の例は、非経口的、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（たとえば、吸入）、経皮（局所的）、経粘膜及び肛門投与を含む。非経口、皮内又は皮下適用のために使用される液剤又は懸濁剤は次の成分を含む：無菌希釈剤、たとえば注射用の水、無菌食塩水、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗菌剤、たとえばベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、たとえばアスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、たとえばエチレンジアミン四酢酸；バッファー、たとえば酢酸、クエン酸又はリン酸塩、及び等張性調節用作用物、たとえば塩化ナトリウム又はデキストロース。ｐＨは、酸又は塩基、たとえば塩酸又は水酸化ナトリウムにより調節することができる。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器又はガラス又はプラスチック製の多用量バイアル中に封入することができる。
【００９１】
注射用途のために適当な製薬学的組成物は、無菌の水性液剤（ここでは水溶性）または分散剤、及び無菌の注射用液剤又は分散剤の即席調製のための無菌散剤を含む。静脈内投与では、適当な担体は、生理学的食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，パーシッパニー，ニュージャージー州）又はリン酸バッファー食塩水（ＰＢＳ）を含む。すべての場合において、組成物は無菌であらねばならず、そして容易に注射可能である程度に流体でなければならない。それは、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、そして細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に対して防御されなければならない。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適当な混合液を含有する溶媒又は分散媒質であってもよい。適当な流動性は、たとえば、レシチンのようなコーティングの使用、分散剤の場合に要求される粒径の維持及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用防御は、種々の抗菌及び抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、たとえば、糖、マンニトールのようなポリアルコール、ソルビトール及び塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の遅延吸収は、吸収を遅らせる作用物、たとえばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含むことによってもたらされる。
【００９２】
無菌の注射用液剤は、要求される先に列挙された成分の１種又は組合せ物を含む適当な溶媒中に要求される量において有効成分を組み入れ、続いて無菌ろ過によって調製できる。一般に、分散剤は、基剤の分散媒質及び先に列挙されたものからの要求される他の成分を含有する無菌媒質中に活性化合物を組み入れることによって調製される。無菌注射用液剤の調製のための無菌散剤の場合には、調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、これらは、予め無菌濾過された溶液から、有効成分に加えて任意のさらに所望の成分の粉末を生成する。
【００９３】
経口組成物は、一般に、不活性な賦形剤及び食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセル中に封入されるか又は錠剤に圧縮することができる。経口的治療投与の目的では、活性化合物は添加物とともに組み入れられ、そして錠剤、トローチ剤又はカプセル剤の形態で使用することができる。また経口組成物は、口内洗浄液としての使用のために流体担体を用いて調製されてもよく、この場合、流体担体中の化合物は、経口的に適用され、ウガイをして吐き出されるか又は飲み下される。製薬学的に適合する結合剤及び／又は補助材料は組成物の一部として含まれてもよい。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは任意の次の成分又は類似の性質をもつ化合物を含有してもよい：結合剤、たとえば微結晶セルロース、トラガカントガム又はゼラチン；添加物、たとえば澱粉又はラクトース、崩壊剤、たとえばアルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ又はコーンスターチ；滑沢剤、たとえばステアリン酸マグネシウム又はＳｔｅｒｏｔｅｓ；滑り剤、たとえばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、たとえばスクロース又はサッカリン；又は香味剤、たとえばペパーミント、サリチル酸メチル又はオレンジフレーバ。
【００９４】
吸入による投与では、化合物は、適当な噴射剤、たとえば二酸化炭素のような気体を含有する加圧容器又はディスペンサ、又はネブライザーからのエアゾル噴霧の形態で送達される。
【００９５】
また、全身投与は、経粘膜又は経皮手段によるものであってもよい。経粘膜又は経皮投与のためには、透過されるべきバリヤーに適する浸透剤が調合物において使用される。そのような浸透剤は、一般に当該技術分野において既知であり、たとえば、経粘膜投与では、洗剤、胆汁塩及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻内噴霧剤又は坐剤の使用によって達成できる。経皮投与では、活性化合物は、当該技術分野において一般に既知の軟膏剤、膏薬、ゲル剤又はクリーム剤に調合される。
【００９６】
また化合物は、坐剤（たとえば、ココアバター及び他のグリセリドのような慣用の坐剤基剤を用いて）又は直腸送達のための保持浣腸剤の形態で調製されてもよい。
【００９７】
一実施態様では、活性化合物は、たとえばインプラント及び微小内包送達システムを含む徐放性調合物などの、身体からの急速な排除に対して化合物を保護するであろう担体とともに調製される。生体分解性、生体適合性ポリマー、たとえばエチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸が使用されてもよい。そのような調合物の製造方法は、当業者には明らかである。また材料はＡｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販品を得ることができる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を含有する感染細胞に対して標的化されたリポソームを含む）もまた、製薬学的に許容され得る担体として使用できる。これらは、たとえば、米国特許第４，５２２，８１１号に記述されるような当業者に既知の方法に従って製造することができる。
【００９８】
投与の容易さ及び用量の均一性のために用量単位形態物において経口又は非経口組成物を調合することは特に得策である。ここで使用されるような用量単位形態物は、処置される被験者のために単位用量として適合された物理的に区別された単位物を指し；各単位物は、要求される製薬学的担体と合わせて所望される治療効果を生じるように計算された活性化合物の予定量を含有する。本発明の用量単位形態物に関する詳細は、活性化合物の独特な特性及び達成されるべき特定の治療効果、並びに個人の処置のためにそのような活性化合物を調合することの技術上固有の制約によって指示され、そしてそれらに直接依存する。
【００９９】
本発明の核酸分子はベクター中に挿入され、そして遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、たとえば、静脈内注射、局所投与（参照、米国特許第５，３２８，４７０号）又は定位注射（参照、たとえば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４‐３０５７）によって被験者に送達できる。遺伝子治療ベクターの薬剤調製物は、許容できる賦形剤中に遺伝子治療ベクターを含むか、又は遺伝子送達担体が包埋されている徐放性マトリックスを含むことができる。あるいはまた、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞からインタクトに生産できる、たとえばレトロウイルスベクターの場合は、薬剤調製物は、遺伝子送達システムを生産する１種以上の細胞を含むことができる。
【０１００】
薬剤組成物は、投与についての指示書とともに、容器、包装物又はディスペンサ中に包含されてもよい。
【０１０１】
本発明の別の側面は、ＮＡＳＨの開始及び／又は進行に関連したタンパク質に結合する化合物又はタンパク質をコードする核酸分子を同定する方法に関する。一実施形態において、該方法は、ＮＡＳＨに関連したタンパク質又はＮＡＳＨに関連したタンパク質をコードするポリヌクレオチドと試験化合物とを接触させ、その試験化合物がＮＡＳＨに関連したタンパク質又はポリヌクレオチドに結合するかどうか判断することを備える。
いくつかの実施形態において、ＮＡＳＨに関連した当該タンパク質は、表１のグループから選択された少なくとも１つのタンパク質である。
【０１０２】
結合は、限定されるものではないがゲル‐シフトアッセイ、ウエスタン・ブロット、放射能標識競合アッセイ、ファージに基づく発現クローニング、クロマトグラフィーによる同時分画、共沈、架橋、相互作用トラップ（ｔｒａｐ）／２‐ハイブリッド解析、サウスウエスタン解析、ＥＬＩＳＡなどを含む、当該技術分野において既知のいかなる結合アッセイによっても決定することができ、これらは、たとえば、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，１９９９，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．に記述されている。そのような試験において使用されるポリペプチド又はポリヌクレオチドは、溶液中で遊離であっても、固体支持体に接着されていても、細胞内に局在していても、細胞画分と会合されていてもよい。本発明の一実施態様では、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡに対して適当な結合親和力を有する化合物の高処理能スクリーニング（「ＨＴＳ」）が用いられる。多数の試験化合物がＮＡＳＨに関連した１又は２以上の固定化されたタンパク質に曝露されてもよい。結合されたタンパク質が、次に当該技術分野において周知の方法によって検出される。
【０１０３】
標的タンパク質のリガンドを同定するその他の方法は、Ｗｉｅｂｏｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６９：１６８３‐１６９１（１９９７）において記述されている。この技術は、標的タンパク質への結合について溶液相において同時に２０〜３０の作用物の組み合わせライブラリをスクリーニングする。フィルタ上に保持されている標的タンパク質に特異的に結合する作用物は、続いて標的タンパク質から遊離され、ＨＰＬＣ及び空気圧によるエレクトロスプレー（イオンスプレー）イオン化質量分光法によって分析される。この手法は、標的タンパク質に対する最大親和力をもつライブラリ構成成分を選択し、かつ低分子ライブラリのために特に有用である。
【０１０４】
本発明の他の実施態様は、抗体に基づく競合スクリーニングアッセイの使用を含む。一実施態様では、ＮＡＳＨに関連したタンパク質を結合する特異的な中和抗体が、ＮＡＳＨに関連したタンパク質への結合について試験化合物と特異的に競合する。この方式では、抗体は、ＮＡＳＨに関連したタンパク質とともに１種以上の抗原決定基を共有するいずれかのペプチドの存在を決定するために使用することができる。そのような結合の研究は、標識された抗体及び／又は標識された試験化合物を使用してもよい。そのような手法の例は、たとえば、Ｌｉｎ，Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ４１（１０）：２１２７‐２１３１において見出すことができる。
【０１０５】
本発明の別の側面は、ＮＡＳＨに関連したタンパク質の生物学的活性を調節する（すなわち、増大させ又は減少させる）化合物を同定する方法に関する。そのような方法は、試験化合物とＮＡＳＨに関連した少なくとも１つのタンパク質を接触させ、化合物が、試験化合物の不在下でのＮＡＳＨに関連したタンパク質の活性に比較して、ポジティブ（アゴニスト）又はネガティブ（アンタゴニスト）な方式でＮＡＳＨに関連した１又は２以上のタンパク質の生物学的活性に影響を与えるか否かを決定することを含む。表１の遺伝子については、目的は、これらの遺伝子の増加した発現がＮＡＳＨの表現型に関連するように、これらの遺伝子の発現を減少させることである。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ＮＡＳＨに関連したタンパク質の発現又は生物学的活性を調節する化合物は、試験化合物が、ＮＡＳＨに関連したタンパク質を発現するか又はＮＡＳＨに関連したタンパク質をコードするポリヌクレオチドを有する細胞とともにインキュベートされ、そして試験化合物がＮＡＳＨに関連したタンパク質の発現又は生物学的活性に及ぼす効果を決定する、インビトロの細胞アッセイにおいて同定されてもよい。そのようなポリヌクレオチド、タンパク質又は活性のモジュレータは、ＮＡＳＨ治療において治療学的に有用であろう。インビトロで発現又は生物学的活性を調節すると同定された化合物は、関連する有効な活性を確認するためにインビボにおいてさらに試験してもよい。
【０１０７】
本発明によって考慮される試験化合物は、天然生産物及び／又は組合せ化学合成からの合成生成物を含む、化学ライブラリからの化合物を含む。そのような化合物は、ランダムペプチド、オリゴヌクレオチド又は有機分子を含んでもよい。
【０１０８】
以下に示す実施例は、本発明を具体的に説明するためにのみあり、いかなる点においても本発明を限定するものと考えてはならない。
実施例
実施例１
Ａ．ＮＡＳＨに関連する遺伝子の同定
【０１０９】
ゲイシンガークリニックでの包括的体重管理クリニック（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｃｌｉｎｉｃ）における現在進行中の肥満に関する臨床調査プログラムからの患者サンプル及び対応する臨床データを、本研究において用いた。
１．肥満に関する臨床調査プログラム
【０１１０】
基本的には、ゲイシンガーでの包括的体重管理クリニックの肥満手術プログラム（Ｂａｒｉａｔｒｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  Ｐｒｏｇｒａｍ）に登録されているすべての患者を、肥満とＮＡＳＨに関するＩＲＢにより承認された研究計画へ募集した。次の組入基準と除外基準を用いた。
Ａ．組入基準：
【０１１１】
ＮＩＨ基準に基づいた胃バイパス外科手術に相応しい適当な患者；睡眠時無呼吸と高血圧症を含む２つの合併症を備えた肥満指数すなわちＢＭＩ＞４０の者；合併症のないＢＭＩ＞４５の者。
Ｂ．除外基準：
【０１１２】
重度の心理的禁忌の患者；前後外科手術推奨基準に適合しない患者；すなわち、年齢＜２１又は＞６０；妊婦；５年以内に致命的となるであろうと予想される関連する腫瘍の存在がある者；明白な炎症性の疾患（例えば肝炎、感染、結合組織病）のある者；リポジストロフィー、ペルオキシゾーム疾患、ミトコンドリアオーパシーズ、ウェーバークリスチャン病、ウィルソン病、工業溶剤被曝、薬物投与（アミオダロン、タモキシフェン、ヌクレオシド・アナログ、及びメトトレキサート）、セリアック病、及び無β‐リポ蛋白血症を含む、ＮＡＳＨを誘発する症状の履歴がある者。ウイルス性肝炎又はアルコール中毒の履歴がる者（線維化のウイルス性又は代謝性の原因を除外する試験を、肝生検で線維化の患者に後で行なう。）。
【０１１３】
その肥満手術プログラムに登録されている患者は、６‐８か月の前手術評価と準備期間を経る。医師スタッフとの初期診察には、包括的な病歴及び健康の診断、個別化された食事指示、行動修正モジュールのレビュー、ＭｅｄＧｅｍによる代謝速度判定、並びに身体活動処方が含まれる。疾患詳細、及びケア検体検査の基準を得る。たとえば、トリグリセリドおよび総コレステロール、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ヘモグロビンＡ１Ｃ、インスリン、グルコース、アルブミン、総ビリルビン、直接型ビリルビン、アルカリ性ホスファターゼ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、全蛋白量、ＴＳＨ、ビタミンＤ、亜鉛、鉄、ＴＩＢＣ、フェリチン、ＰＴＨ、フォラシン、コルチゾール、ＴＳＨが含まれる。また、テストステロン／エストロゲン／プロゲステロンのレベルや種々の挙動的・食事的調査も得る。Ｒｏｕｘ‐ｅｎ‐Ｙ胃バイパスでは、標準的なケアとして肝生検が慣例的に行われる。この既に摘出された生検から、約３分の１（０．５ｍｍ  ｘ  ０．５ｍｍ  ｘ  １０  ｍｍ）は直ちに分離され、追って研究使用のためにＲＮＡにストアされる。６か月後、手技により；肝機能、任意の疾患具体的な検体検査（すなわち血糖、脂質プロファイル、鉄調査、甲状腺機能調査）や、十分なカルシウム摂取のための副甲状腺ホルモンレベルを得る。
【０１１４】
昨秋にＩＲＢの承認を得て以来、採用率は平均約９０％となった。現在、週当たりで約１０人の患者が肥満手術を受けている。研究の初年に４５０人超の患者から同意が得られ、２２５以上の肝臓サンプルが貯蓄されている（差異は、６‐８か月前外科手術プログラムの患者が手術に先立って完了しなければならないことによる。）。その肥満手術プログラムに登録する患者の将来的採用に加え、既に肥満手術を受けていて肝臓組織構造が知られている８００人を超える患者も、ＤＮＡと血清のサンプルを得るために募集されている。
２．肝生検
【０１１５】
肝生検は、同一の解剖学的な位置で、すなわち鎌状間膜の左横約１０ｃｍの位置で、外科医によって得られる。そして、手術中生検の３分以内に、組織は分割され、３分の１から４分の１があらかじめラベルが付けられたプラスチック遠心分離管内でＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社，テキサス州オースチン）に直接に浸漬される。肝生検サンプルは、手術室から、通りを挟んで病院の真向いのＷｅｉｓ  Ｃｅｎｔｅｒ内にあるＧｅｉｓｉｎｇｅｒ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ研究室へ搬送される。保存されていた肝生検の一部はＲＮＡ単離のために除去され、残りは容器取り扱いソフトウェアで追跡されるバーコード・ラベルが付された管内に−８０°Ｃで保管される。
【０１１６】
肝生検のいくつかの部分は、肝臓組織構造を評価するために用いられる。ある病理医は、肥満手術プログラム患者からの肝生検スライドを、Ｂｒｕｎｔ，Ｅ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９４（９）：２４６７‐２４７４によって提案された基準を用いてすべて読む。慣例的なＨＥ染色着色では識別可能でないかもしれない傍類洞の線維化の初期ステージを検出するために、マッソン・トリクロームを用いる。最初の２００人の患者からのデータに基づくと、ＮＡＳＨに関する組織学的所見の範囲は次のとおりである（図３の代表例においてＤとＦで青く染まっている線維化）：
正常組織構造：２２％
脂肪肝のみ（ミクロ又はマクロ、任意の重症度）：３１％
脂肪性肝炎（任意の重症度）
線維化なし：２２％
線維化（門脈又は中心静脈周囲）：２０％
架橋線維化：５％
３．臨床的なデータベース
【０１１７】
患者統計、身体所見、併発症、病歴、研究室方策、挙動的及び社会的調査、並びに薬歴などの広汎な臨床データはすべて、ＳＡＳにおける研究データベースに入力される。大多数の患者は、中央年齢が４６歳で平均ＢＭＩが約５５の女性である。収集された検体には、ＤＮＡ単離のための追加的な血液サンプル、血清サンプル、及び手術時の生検から得られた肝臓組織が含まれる。頭の中にある研究グレード品質要求事項を備えた臨床データを得るために、最高品質のケアの維持に多大の注意を払いつつ、臨床プログラムを最適化した。このデータの多くは、Ｇｅｉｓｉｎｇｅｒ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの従業者によって構築されたツールを用いて電子的な健康記録から抽出される。データ収集はまた、継続的研究を可能にする将来的なものである。すなわち、将来のバイオマーカー有効性確認研究にとって重要である。たとえば、血液において測定されたＮＡＳＨバイオマーカーを手術後の減量中に追跡してもよい。この豊富なデータベースは、また種々様々の２次的変数に照らして、遺伝子発現データを解析する機会を提供する。
【０１１８】
病理所見は、統計的分析を可能にする脂肪肝、小葉状の炎症、線維化のレベルについての簡便なスコアリングシステムを用いて、データベースアクセス可能なフォーマットに変換した。電子医療記録（ｎ＝１６４）の最初の抽出に対する初期解析では、正常の肝臓組織構造の患者（ｎ＝４４）、傍類洞の線維化のないＮＡＳＨ患者（ｎ＝８５）、及び傍類洞の線維化の患者（ｎ＝３５）における様々な臨床検査室パラメータに注目した。予想どおり、肝機能検査ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）及びＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）は、傍類洞の線維化で著しく高く、予測されるより重度の肝臓損傷と調和しており、一方でアルカリ性ホスファターゼはグループ間で異なっていなかった（図１）。ＨＤＬ、インスリン、ヘモグロビンＡ１Ｃ、グルコース及びトリグリセリドがそうであったように、ＢＭＩも傍類洞の線維化と関連していた（データは不図示）。年齢、総コレステロール、ＬＤＬ、フェリチン、カルシウム、副甲状腺ホルモン、アルブミン、葉酸、鉄結合能力、カリウム、ナトリウム、亜鉛、ＴＳＨ、パン、クレアチニン、鉄、及び転移飽和度は、傍類洞の線維化と関連しなかった。ＨＤＬコレステロールの傍類洞線維化に対する関係について、スタチン薬剤使用による効果を検討した（図２）。スタチン治療には、アトルバスタチン、クレストール、フルバスタチン、レスコール、リピトール、ロバスタチン、メバコール、プラバコール、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、又はゾコールが含まれる。興味深いことに、スタチンを使用しなかった患者において、ＨＤＬレベルは傍類洞の線維化とともに減少し、スタチン使用との間に差異が存しなかったことである。血清コレステロール（合計）とＬＤＬレベルは、３つのグループ間で変わらなかった（データ不図示）。合併症や挙動調査データなどの他の臨床的なパラメータの解析は進行中である。
４．ＮＡＳＨ遺伝子発現プロファイリング
【０１１９】
遺伝子発現プロファイルを、ＮＡＳＨの異なるサブタイプを備えた患者からのいくつかの個々のＲＮＡサンプルを基にして（データ不図示）、また、正常、脂肪性肝炎及び架橋線維化からのサンプルのプールを基にして（図３）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイを用いて得た。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、以下のａｉｍ  １に記載されているように、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙｓに対して調製し、ラベルを付し、ハイブリッドした。サンプルは採用された第１の１９０人の患者から選択した。洗浄とスキャンニングの後、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ遺伝子発現解析ソフトウェアを用いてデータを解析した。個々のサンプルもプールされたサンプルも、架橋線維化が正常の肝臓組織構造に関連のある別個の遺伝子発現プロファイルによって特徴づけられることを示す（図４）。
【０１２０】
架橋線維化からのプール（ｎ＝９、同様の組織構造のために選択された）の解析によれば、約１００の遺伝子が正常組織構造（ｎ＝９）に対して少なくとも４倍（少なくとも２の信号対数比で）アップレギュレートされることが示された。これらの遺伝子の発現レベルの等級序列（１００の任意の蛍光性ユニットをカット）により、遺伝子は約４０となった（表１）。このグループに含まれるのは、線維化でアップレギュレートされると予想される遺伝子であり、Ｉ型コラーゲンα２及びＸＶ型α１、マトリクスＧ１ａタンパク質、並びにＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリクスタンパク質１が含まれる。加えて、インターロイキン８は、ＮＡＳＨ患者の血液において増加されると先に報告されていたとおりアップレギュレートされた（Ｂａｈｃｅｃｉｏｇｌｕ，ＬＨ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ５２（６５）：１５４９‐１５５３）。いくつかのｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓの発現レベルも増加した。これらは、発現レベル、血液における潜在的な検出可能性、及び測定のための利用可能な試薬の存在により優先度の高い候補バイオマーカーである。
５．候補遺伝子
【０１２１】
ゼブラフィッシュにおけるフォアグラ遺伝子のヌル突然変異により、未成熟魚の肝臓に脂肪が蓄積した（Ｓａｄｌｅｒ，Ｋ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３２（１５）：３５６１‐３５７２）。我々はマイクロアレイ遺伝子発現データを調べたところ、フォアグラ遺伝子（すなわちｆｌｊ１２７１６ｌ）のための４つのプローブがＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ上に存在することを発見した。４つのプローブのうち最も発現したものが、架橋線維化の患者において約２倍ダウンレギュレートされることが判明した。我々は、このアイソフォームを検出するためにＰＣＲプライマーを設計し、正常組織構造、脂肪肝、無架橋線維化、及び架橋線維化の患者からの肝臓のＲＮＡを解析した（図５）。架橋線維化の患者はマイクロアレイの結果と一致するレベルまで減少した。一方、限定的な標本数のみであるが、半定量的条件下でＲＴＰＣＲを実行することで、我々はフォアグラ遺伝子発現がＮＡＳＨの他の組織学的サブタイプにおいて有意に変化されるようには思われないと結論する。
【０１２２】
【表１】
2009535642.tif 000003
2009535642.tif 000004
2009535642.tif 000005
【０１２３】
６．研究の設計と方法
概観と根拠
【０１２４】
本研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＥａｒｌｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＥＤＲＮ）におけるバイオマーカーの進展のために用いられたプロセスに基づいてモデリングされている（Ｓｕｌｌｉｖａｎ  Ｐｅｐｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９３（１４）：１０５４‐１０６１、また、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｂ．Ｓ  Ｋｒａｍｅｒ（２０００）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．８０（８）：１１４７‐１１４８）。殆どの癌及びＮＡＳＨは組織学的に定義される。したがって、組織形態は研究の設計において中心的な役割を果たす。癌生態学における遺伝子発現解析の同様の適用により、診断・予後の再分類がなされ、新規の治療上の標的が同定された（Ｗａｄｌｏｗ，Ｒ．ａｎｄ  Ｓ．Ｒａｍａｓｗａｍｙ，（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．５（１）：１１１‐１２０）。組織の大きさが非常に小さいかもしれない初期段階で癌を検出するという潜在的に困難な目的とは対照的に、肝臓は、ＮＡＳＨによって、一様でないにしても多大に影響される大きな器官である。
【０１２５】
プールされたマイクロアレイ分析によって同定された遺伝子の複製は、ＲＴ‐ＰＣＲによって個々のＲＮＡサンプルにおいて有効化され、血清においてテストするためのタンパク質バイオマーカーとして開発される。
【０１２６】
本研究は、ＮＡＳＨに関連する線維化について独特の分子的シグネチャを定義する遺伝子発現プロファイルに焦点を当てる。線維化を反映するＮＡＳＨの組織学的構成要素を評価するための公表されている基準（Ｂｒｕｎｔ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９４（９）：２４６７‐２４７４）を表２に示す。ＮＡＳＨの個々の特徴の評価において病理医の一致が困難であると証明するが、本研究は、２人の病理医により目隠しされた読取りのために、マウス研究において先に用いられたシステムと類似のものを実行した（Ｓｉｎｃｌａｉｒ，Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３７（２）：３５１‐３５８）。今、１人の病理医が肥満手術患者たちからの肝生検の全部を、日常的な治療標準の一環として読む。その後、主任医師が、その１次的な診断の読取りに続いて目隠しされた方法でスライドを再検討し、所見と各患者に関する病理レポートとを比較する。有意な差異があれば、これをその１次病理医と協議することにより、また必要に応じて他のスタッフ病理医から見解を得ることにより解決する。
Ａ．  患者群
【０１２７】
遺伝子発現解析は、重度の線維化（傍類洞及び／又は門脈）だけでなく架橋線維化の患者からプールされたＲＮＡサンプルに対して実行した。重要なことには、肥満の患者からの正常組織構造を備えた多くのサンプルが利用可能であるということである。患者は、年齢、性別、また合併症状などの主要な臨床徴候について、可及的に分類される。我々は、架橋線維化については少なくとも１０人の患者、重度の線維化については＞２５の患者からプールが構成されるであろうと予測する。
Ｂ．  マイクロアレイ法
【０１２８】
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、肝生検組織から単離する。ＲＮＡサンプルのラベリングの後、遺伝子発現を、ヒトゲノムからの＞４７，０００の転写産物及び変異体をカバーするＧｅｎｅＣｈｉｐ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  ｐｌｕｓ  ２．０  ａｒｒａｙ（カリフォルニア州サンタクララのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いることにより検査する。アレイ設計に内蔵されている冗長性により、複数の異なるプローブセットが、ときどき同一の遺伝子又は転写産物とマッピングし、最終合計ではＨＧ‐Ｕ１３３アレイ上の３９，０００の最も特徴づけられたヒト遺伝子に寄与する。最終のハイブリダイゼーションカクテルを作るために用いたすべての試薬は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ３’Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｎｅ‐Ｃｙｃｌｅ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州サンタクララのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）から得た。ＲＮＡターゲット（ビオチンでラベリングされたＲＮＡ断片）は、二重らせん構造のｃＤＮＡ合成により１‐１０μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡから生成され、その後インビトロの転写反応及び断片化反応が続く。断片化されたｃＲＮＡ、アレイコントロール（カリフォルニア州サンタクララのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、ＢＳＡ及びニシン精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーションカクテルを調製し、４５°Ｃで１６時間アレイにハイブリッドする。ハイブリッドされた配列を洗浄し、結合されたビオチンラベルされたｃＲＮＡをストレプトアビジン‐フィコエリトリン結合体によって検出する。洗浄と染色の手順はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ（ｍｏｄｅｌ  ４５０）を用いることで自動化される。各配列は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅ  Ａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００を用いることによりスキャンを１回する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒ  １．２により、アーチファクト、ノイズ、及びバックグラウンドが調節される。スケーリング／ノーマライゼーションに係る全体的な方法を各チップに対して使用することとなろう。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘのプラットフォームからの蛍光信号値は、解析のためのＳｐｏｔｆｉｒｅソフトウェアアプリケーション（ＵＲＬアドレスが「ｓｐｏｔｆｉｒｅ．ｃｏｍ」のワールドワイドウェブ上にある。）に送られる。チップ間偏差、すなわちプローブ間の可変性を正規化するために、Ｚ‐ｓｃｏｒｅとＡＮＯＶＡを実行し、有意に変化した発現を有する遺伝子を同定する。
【０１２９】
【表２】
2009535642.tif 000006
【０１３０】
Ｃ．プール
【０１３１】
１プール当たり最低１０のサンプルで、１プール当たり２つの配列を備えたプール・デザイン（各グループにつき少なくとも２０のサンプル）を、本研究で用いる。プーリングに関する１つの懸念は、自由度が喪失するので、非プール・デザインのパワーに匹敵するだけのパワーを達成するためには、サンプルの数を大きくする必要があるということである（Ｓｈｉｈ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０（１８）：３３１８‐３３２５）。プール・デザインは、また、適切にデータを変換し、外れ値を除去し、集団偏差を評価することができないので批判された。これらの懸念は、サンプル規模が限定的であるか、あるいはサンプルを得ることが高価である場合に妥当する。かくして、マイクロアレイ上のいかなる保留物も無効化される。大きなサンプル数を得ることができれば、不適当な代表についての蓋然性は回避される（Ｇｌａｓｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６９（６）：１０９８‐１１０３）。プーリングは、殆どの遺伝子にとって、全体的な変異性を減少し、かつ正確な生物学的加算平均に帰着することが示された（Ｋｅｎｄｚｉｏｒｓｋｉ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００５．１０２（１２）：４２５２‐４２５７）。したがって、あるプールにおける平均ＲＮＡ発現量と同一物の個々に解析されたＲＮＡサンプルの平均との間に差異を生じさせるかもしれない、マイクロアレイ・データの生成及び処理に導入される潜在的な非線形性は、重要な要因でないように思われる。ほんの少数の配列が各生物学的状態において用いられる小さな設計については、プーリングは正確性を劇的に改善し、それは生物学的複製でさらに改善可能である。これは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォームを用いる我々の経験と一致する；すなわち、ハイブリダイゼーション、洗浄、染色、及びスキャニングは、大きな技術的変化を生じさせない。また、我々は、また、Ｑｉａｇｅｎキットを用いて単離したＲＮＡサンプル中の変異性が最小であること、すなわちＲＮＡは通常高品質であるということを見出した。生物学的な複製は、同一の組織構造の独立したプールを含んでいる。生物学的な複製は、また、重度の線維化及び架橋線維化の解析で生じる場合があり、これは遺伝子発現において同様の変化を共有する場合がある。
Ｄ．マイクロアレイ・データ解析
【０１３２】
Ｓｐｏｔｆｉｒｅによる解析に加えて、遺伝子をｑ値によって階層化し、誤り発見率を１０％で制御して、Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓの手法に従って「ｏｎｅ‐ｇｅｎｅ‐ａｔ‐ｔｉｍｅ」差分解析を行う（Ｔｕｓｈｅｒ，Ｖ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８（９）：５１１６‐５１２１、及びＢｅｎｊａｍｉｎｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｂｅｈａｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１２５（１‐２）：２７９‐２８４）。このソフトウェアは、統計プログラムＲのためのアドオン・パッケージである。
Ｅ．潜在的な問題と代替的手法
【０１３３】
組織採集、ＲＮＡ保存、及びマイクロアレイ・パフォーマンスに関するロジスティックスの問題は、従来の研究において解消された。術中的に得られた生検サイズは外来患者を設定して一般に実行される針生検より遥かに大きいので、豊富なＲＮＡと組織を解析に利用することができる。重要な点は、組織が完全であることを保証するために対応する組織構造を再検討するということである。初期試料におけるかなりの焼灼アーチファクトのため、外科医は今では肝生検のために切断法のみを用いる。
【０１３４】
プールされたマイクロアレイ解析によって検出された遺伝子発現における変化を確認するために、選択された遺伝子の遺伝子発現変化をリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ‐ＰＣＲ）を用いて測定する。蛍光がｄｓＤＮＡへの結合によって大幅に強化されるＤＮＡ二本鎖特有の染料であるＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用いる、簡便な定量逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ‐Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ））を使用する。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉは各サイクル中に増幅されたＰＣＲプロダクトに結合し、その蛍光によって容易に検出することができる。プライマーとプローブのための配列は、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓというプログラム（ＡＢＩ社）を用いて選択する。標的遺伝子及び内因性コントロール・アンプリコンのためのＰＣＲ反応を、先に記述されたように実行する（Ｍａｌｅｋ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １３８（３）：３６３‐３７３）。複数の試験にわたって一貫した基準を提供するために、すべてのＰＣＲ試験について、プールされたヒト肝臓ｃＤＮＡのアリコットを用いる。ＰＣＲ発現データを、ｐ＜０．０５で有意として、標準の非対合ｔ検定を用いて解析する。２次解析には、年齢、性別、ＢＭＩ、及び他の研究室・臨床上のパラメータの個々の遺伝子の発現に対する寄与度を判定するために、回帰分析が含まれる（これで次元の数が大幅に減少される）。
【０１３５】
統計変数、臨床上の変数及び生物学的変数を、対応するタンパク質が血清において高スループット法を用いて高い検出蓋然性を有する遺伝子を選択するために用いる。
【０１３６】
候補バイオマーカーは、異常調節されていると分かった遺伝子から評価され、選択され、優先順位を付けられる。肝臓は血液に存在するタンパク質の主要な源であり、したがって、ＮＡＳＨにより異常調節された遺伝子に由来するタンパク質プロダクトもまた、血清又は血漿における通常の要素として検知することができる。加えて、肝細胞の風船様変性はＮＡＳＨの目印であり、また血液の中へのタンパク質の放出を備えた細胞死は、肝臓遺伝子に由来したタンパク質バイオマーカーが循環において見つかるかもしれない別の機序かもしれない。我々の１次データによって示唆されるように、ＮＡＳＨの炎症性の構成要素も多くの可溶メディエータに関連する場合がある。過剰発現又は過少発現の程度、遺伝子に関する既知情報、及びマーカー・アッセイ開発用試薬（例えば抗体）の有効性は、リード・バイオマーカー候補の選択と優先度を導く主要な要因である。我々のデータに基づくと、架橋線維化においてアップレギュレートされたｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓのグループは、強固なリード候補である。
Ｂ．高スループットタンパク質ベースアッセイ
【０１３７】
リード・バイオマーカー候補を評価するために、かなりの高スループットフォーマットにおいて実行することが可能なアッセイが実行され及び／又は開発されている。事前評価は、免疫ブロット法又は酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ‐ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）のいずれかの免疫アッセイを用いて実行される。何れの技術にとってもキーとなる試薬は、バイオマーカーに対応する抗体である。そのような試薬が利用可能でない遺伝子については、抗原性であって抗原‐抗体相互作用に利用可能な領域から合成されたペプチドに対して免疫血清が生成されよう。あるいは、抗体は、当該技術分野において公知の標準的手法を用いて、ペプチド又はタンパク質全体を備えた動物の免疫化によって生成されてもよい。抗体開発のための配列を同定するのを助けるために、バイオインフォマティックな手法が用いられる。利用可能な抗体を用い、開発の第１フェーズでは、血清、肝臓、及び末梢血免疫細胞で免疫ブロット法を実行する。これにより、免疫血清の特異度に関する基本的な情報が提供され、種々の組織画分におけるバイオマーカー・タンパク質に関する情報も提供される。定量化のための鍵となる側面は、各ブロット上で実行され、再現可能となるように多量から準備されて等分されている内的制御である（例えば正常血清又は血漿）。
【０１３８】
第２フェーズは、ＥＬＩＳＡベースのアッセイの開発である。これは、最初の免疫ブロット解析をパスするリード・バイオマーカーに対して、すなわちＥＬＩＳＡが既に利用可能なリードに対して実行される。この高度に感度のよいフォーマットは、また、低レベルで存在したり限界に近かったりするか、又は免疫ブロット法では検知不能なバイオマーカー候補にとって理想的であろう。ＥＬＩＳＡについては、直接的方法及び間接的方法を含め、アッセイを開発するためのいくつかの手法が存在する。選択される手法は、利用可能な抗体及び抗原試薬の有効性及びパフォーマンスに左右される。
Ｃ．バイオマーカー・アッセイの評価
【０１３９】
リード・バイオマーカー候補のために上記で開発されたタンパク質ベースのアッセイのパフォーマンスは、肝臓組織構造が既知である小規模の患者上で評価する。検出の感度が十分であることが分かれば、すなわち、タンパク質は、ＮＡＳＨ／線維化の患者で検出可能であることが分かれば、第２相試験において、マーカーの有効性確認をより大規模の患者集団において縦断的研究として行うことに焦点が当てられる。バイオマーカーの発見は、続く事前評価と同一の集団から引き出されたケースから実行されるので、人工的なケース／コントロール間の差分によるサンプリング・バイアスは回避されるであろう。サンプルの採集、処理、及び保管に係るラボでの手続は、したがって将来の有効性確認研究及び最初のアッセイ評価と同一である。血液サンプルは標準化された条件下で収集される（例えば、患者断食し、朝に仰臥位において）。
【０１４０】
タンパク質ベースのマーカーについて、多数のアイソフォームに遭遇する場合がある。したがって、免疫ブロット法による定性評価は、潜在的な試薬としての抗体の有効性を判定するためだけでなく、バイオマーカー・タンパク質についての一定の初期の生物学的情報を得るために実行される。バイオマーカー可変性の潜在的な根源は、分泌の日中変動、固有なアッセイ可変性、及び性又は年齢差に因るものかもしれない。重要なのは、バイオマーカーは、異なる併発症又は薬物投与に応じて変化する場合があるということである。したがって、バイオマーカーの評価研究からの結果は、臨床的なデータベースにおける臨床的な変数のコンテキストにおいて解析される必要がある。
【０１４１】
この研究において同定されたバイオマーカーは、我々の研究集団における病的な患者を代表する。種々のレベルの肥満度を有する他の集団に対するバイオマーカーの拡張的評価が、継続的な有効性確認にとって重要となろう。分子マーカーの感度及び特異度は、丁寧な試験が多くの検体において行なわれてコントロールと比較されるまでは、完全には実現することができない。高いリスクでＮＡＳＨ線維化に進展する患者を含め、大規模の患者集団において有効性を研究することは、臨床的な使用に向けた重要なステップである。これらの有効性研究の重要な要素は、結果の評価、すなわち、これらの新規の分子マーカーを用いる試験が、肝硬変及び肝細胞癌を含め、重大な後遺症を予防するのに十分早い病期においてＮＡＳＨ線維化を検出するかどうかの評価である。
実施例２
【０１４２】
１次マイクロアレイ発現データからの２つのリード候補バイオマーカーの発現における変化が、ＲＴ‐ＰＣＲによって確認された。この文献（Ａｓｓｅｌａｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２９（６）：２０６４‐２０７５；Ｂｏｎａｃｃｈｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２５（４）：１０６０‐１０７６）からの関連するデータに基づくと、これらの分子は、ＮＡＳＨ関連の線維化のための診断バイオマーカーとして、続く開発のための２つのリード候補である。
【０１４３】
ＮＡＳＨ関連の肝線維症において発現が増加したいくつかの遺伝子を、表１に示されるマイクロアレイ遺伝子発現データに基づいて更なる研究のために選択した。４つのｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓの存在は、それらの誘導性及び診断テストとしての高い特異性のための対応可能性、並びにそれらの可溶性及び末梢血での検出のための対応可能性のため、興味深かった。これらのうちの２つを、ＮＡＳＨだが線維化していない患者からのマイクロアレイ結果の解析に基づいて（データ不図示）、更なる研究のために選択した。最初のマイクロアレイ結果はプールされたサンプル上で実行されたものであるので、ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  １９（ＣＣＬ１９）、及びｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｂ（Ｃｙｓ‐Ｘ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ６（ＣＸＣＬ６）を増幅するために、逆転写酵素ＰＣＲをそのプールにおける個々の患者の各々からのＲＮＡ上で実行した。図６において下記で示されているように、各遺伝子は容易に検知された。ある者たち（Ｂｏｎａｃｃｈｉ，Ａ．，Ｉ．ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２５（４）：１０６０‐１０７６）によってＣ型肝炎患者からの繊維症の肝臓サンプルにおける遺伝子発現の解析に用いられていたＧＡＰＤＨをコントロール遺伝子として用いたところ、その発現は我々のマイクロアレイ結果における線維化によっては不変であることが分かった（データ不図示）。これらのデータにより、蛍光定量リアルタイムＰＣＲを実行する基礎が提供され、相対的な発現レベルのより正確な定量化が提供される。
【０１４４】
このリアルタイムＰＣＲデータの代わりに、発現レベルの推計をＰＣＲバンドのディジタル画像及び定量化によって得た。平均ＣＣＬ１９／ＧＡＰＤＨ比は、正常の肝臓組織構造患者で１．４５、架橋線維化患者で２．１７であった。正常と架橋線維化での平均ＣＸＣＬ６／ＧＡＰＤＨ比は、それぞれ０．５４２と１．３５であった。これらの値は、実際の比を、特にＣＣＬ１９について、恐らくは低く評価するであろう。そこでは、バンドのいくつかは強くてＰＣＲの線形の範囲を超えている。
【０１４５】
その後、各患者についてのＣＣＬ１９／ＧＡＰＤＨ及びＣＸＣＬ６／ＧＡＰＤＨ比を、いくつかの病理学的・血清学的なパラメータと関連付けた（表３）。この２つの遺伝子は互いに０．５３の相関（ｒ）を有していた。興味深いことに、どちらも、肝臓に存する炎症の程度と際立った相関を示さず、脂肪肝及び門脈域の線維化の程度と広く不一致でなかった。最も強固な相関は、ＣＣＬ１９とＬＤＬ（−０．８８）、ＣＣＬ１９とフェリチン（−０．６９）、及びＣＸＣＬ６とインスリン（＋０．６１）の間にあった。これらのデータは、２つのサイトカインがＮＡＳＨに関連する線維化の病態生理学において、非常に異なる役割を有しているかもしれないことを示す。この分析は、また、将来の研究にとって追尾すべき潜在的方法を提供する。
【０１４６】
【表３】
2009535642.tif 000007
【０１４７】
興味深いことに、ＣＣＬ１９とＣＸＣＬ６の何れも、Ｃ型肝炎感染により、以前から肝線維症の原因であるとされていた。ＣＸＣＬ６の発現は、慢性Ｃ型肝炎感染の患者からの繊維症の肝臓サンプルでＲＮＡにおいて軽度から重度にアップレギュレートされることが分かった（Ａｓｓｅｌａｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２９（６）：２０６４‐２０７５）。ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＣＣＬ２１だけでなくＣＣＬ１９、ＣＣＲ７のための受容体の発現も、Ｃ型肝炎感染における活性化された肝臓の星細胞から線維形成の促進に関係すると示唆されてきた（Ｂｏｎａｃｃｈｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２５（４）：１０６０‐１０７６）。ＮＡＳＨ線維化及びＣ型肝炎線維化の両方におけるこれらのサイトカインの調節異常の発見は、線維化の過程におけるそれらの潜在的な関与及び線維化のバイオマーカーとしてのそれらの潜在的有用性に対する支持を追加する。
実施例３
末梢血ＲＮＡにおけるＮＡＳＨマーカーの検出
【０１４８】
ＮＡＳＨに関連した架橋線維化を備えた肝臓サンプルにおいて過剰発現していると分かった３つの遺伝子の発現を、病的に肥満のＮＡＳＨ患者から得られた末梢血単核細胞からのＲＮＡにおいて逆転写酵素ＰＣＲによって解析した。ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  １９（ＣＣＬ１９）と、ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ２０（ＣＣＬ２０）と、ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｂ（Ｃｙｓ‐Ｘ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ６（ＣＸＣＬ６）とを増幅し、これを図７に示す。各遺伝子は容易に検出検知可能であった。ＧＡＰＤＨを、コントロール遺伝子として用いた。バンドは、これらのサイトカインのうちの２つについては容易に検出されたが、ＣＣＬ２０については違った。これらの結果は、肝臓ＲＮＡにおいて発現が変化されると分かった遺伝子を、循環する末梢血の単核細胞から得られたＲＮＡにおいても測定することができることを示す。
血漿及び血清の採集。
【０１４９】
全血は、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｔｕｂｅｓ（ＣＰＴ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）又は抗凝血剤の無い管（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ｔｕｂｅｓ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社，フランクリンレークス，ニュージャージー州）の中への静脈穿刺によって病的肥満患者から収集した。ドナーのスクリーニングは、年齢、食事又は他の変数に関しては試みなかった。全ボランティアに研究のことが知らされ、彼等は書面による同意を与えた。血液は、１１６０ｘｇで１０分間遠心分離した。血漿と血清は、等分し、アッセイまで−８０°Ｃで冷凍保管した。
実施例４
血清におけるＮＡＳＨマーカーの検出
【０１５０】
正常の肝臓組織構造を有する（ｎ＝３）、中程度の脂肪性肝炎を有する（ｎ＝４）及び架橋線維化を有する（ｎ＝８）病的肥満患者の血清におけるＣＣＬ２０タンパク質レベルを測定するために、ＣＣＬ２０  ＥＬＩＳＡキット（ＲａｎｄＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、ミネソタ州）を用いた。このアッセイについて、マイクロプレートストリップの各ウェルに１００μｌのＡｓｓａｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  ＲＤ  １‐５７を加えた。１００μｌのＳｔａｎｄａｒｄ、サンプル、すなわちコントロールを各ウェルに加えた。ウェルを提供された接着性のストリップで覆い、室温で２時間培養した。その後各ウェルを吸引して洗浄し、このプロセスを３回繰り返して合計４回洗浄した。洗浄は、噴出ボトルを用いて各ウェルをＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（４００μｌ）で満たし、最後の洗浄後、吸引により残留しているＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒをきれいに除去することにより行った。その後、２００μｌのＭＩＰ‐３コンジュゲートを各ウェルに加え、新たな接着性のストリップで覆い、室温で２時間培養した。そして、吸引／洗浄を繰り返して行った。２００μｌのＳｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを各ウェルに加え、室温で３０分間培養し、光から防御した。その後、５０μｌのＳｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを各ウェルに加えた。各ウェルの光学濃度を、マイクロプレートリーダーにおいて４５０ｎｍにセットして３０分以内で測定した。波長補正を５４０ｎｍで用いた。
【０１５１】
ＣＣＬ２０  ＥＬＩＳＡアッセイについての検量線を図８に示す。線形性と感度は、アッセイが非常にロバストであることを示す。
【０１５２】
その後、病的肥満患者からの血清サンプルを、正常組織構造の患者、中程度の炎症の患者、及び架橋線維化の患者から解析した。図９に示されるように、正常の肝臓組織構造の患者、又は中程度の炎症の患者は、架橋線維化の患者よりも血清におけるＣＣＬ２０タンパク質のレベルが低かった。ＣＣＬ２０は末梢血単核細胞ＲＮＡでは検出されなかったので、恐らくは肝臓に、少なくとも一部は、又は顕著に由来するのであろう。
実施例５
リード候補ＣＣＬ２０の発現確認
【０１５３】
あるｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ遺伝子（ｓｍａｌｌ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ（Ｃｙｓ‐Ｃｙｓ），ｍｅｍｂｅｒ  ２０（ＣＣＬ２０））を、最初の追尾すべきリード候補として選択した。なぜなら、それはその最初の選択基準に適合したリストに存する最もアップレギュレートされた遺伝子だったからであり、また、その発現が半定量的ＰＣＲを用いて確認されたからである。ＧＡＰＤＨが当該技術分野ではＣ型肝炎の患者からの繊維症の肝臓サンプルにおける遺伝子発現の解析に用いられているので（Ｂｏｎａｃｃｈｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２５（４）：１０６０‐１０７６）、それをコントロール遺伝子として用い、その発現は我々のマイクロアレイ結果における線維形成によって不変であると分かった（データ不図示）。リアルタイムＰＣＲを、正常組織構造を備えた肝臓組織からの約１２のＲＮＡサンプルに対し、また架橋線維化を備えた約１２のＲＮＡサンプルに対し、ＡＢＩ  ７３００リアルタイムＰＣＲ機上でＴａｑｍａｎアッセイを用いて実行した。ＧＡＰＤＨを、再びコントロールとして用いた。図１０Ａにおいて示されているように、ＣＣＬ２０（黒線）は、正常の組織構造の患者及び重度の（架橋）線維化の患者にわたって、さまざまの発現レベルを示した。蛍光プロットのタイトなグルーピングにおいて明らかなように、ＧＡＰＤＨレベル（灰色線）はそのような種々のサンプルにわたって非常に一貫しており、ＮＡＳＨにおける遺伝子発現の研究のためのコントロールとしてその使用が有効であるといえる。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのレベルを基準ハウスキーピング・コントロール遺伝子として用いたところ、ＣＣＬ２０の発現は、正常組織構造サンプルのうちの１つを除くすべてにおいて、架橋線維化サンプルにおけるよりも遥かに少なかった（図１０Ｂ）。このデータはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップ・データを確認する。
実施例６
血清におけるＣＣＬ２０の検出
【０１５４】
ＣＣＬ２０のためのＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネソタ州）を、ＮＡＳＨ患者の血清におけるレベルを解析するために購入した。ＣＣＬ２０タンパク質レベルを、正常の肝臓組織構造の患者からの３０の血清サンプルにおいて、また肝硬変の４人の患者を含め、中程度から重度の線維化の患者の３５サンプルにおいて測定した。１４ｐｇ／ｍｌの閾値を用い、ＮＡＳＨ線維化を検出する予測力は８３％であったのに対し、通常の上限の２倍の肝生検のための臨床的なガイドラインを用いたＬＦＴｓ（ＡＳＴ及び／又はＡＬＴの高さ）はたったの９％であった。もし、代わりに、遥かに保守的な閾値（＞８０ｕ／ｍｌ）を用いると、予測力は丁度１５％に改善する。ＡＬＴかＡＳＴのいずれかのための基準レンジの上限を用いたとしても、陽性的中率は尚も＜２５％なので、それは肝生検に着手するためには用いられないであろう。重要なのは、この集団における肝硬変の４人の患者はみな、正常のＬＦＴであったが高いＣＣＬ２０レベルを有していたということである。
【０１５５】
６５人の患者集団における軽度から重度のＮＡＳＨ線維化についてのＬＦＴｓに対するＣＣＬ２０の臨床的有用性
陽性的中率          陰性的中率
ＣＣＬ２０            ８１％              ７９％
ＬＦＴＳ（＞２Ｘ）      ９％              ４７％  
ＬＦＴｓ（＞８０）    １５％              ４９％
ＬＦＴｓ（＞ＮＬ）    ２４％              ５２％  
実施例７
末梢血単核細胞ｍＲＮＡの解析
【０１５６】
血清に加えて、末梢血の細胞成分もまた、バイオマーカー解析にとって有用である。末梢において循環する白血球の大多数は非常に短い寿命を有する好中球であり、多くの刺激に対して非常に反応的であり、通常は肝臓におけるＮＡＳＨの重要な構成要素でないので、我々はｍＲＮＡを末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離することにした。これらの細胞はリンパ細胞と単核細胞を含んでおり、これらは、ＮＡＳＨにおける炎症性の成分の多くを構成する。我々はＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、及びＣＸＣＬ６について半定量的な従来のＰＣＲを用い、これらの遺伝子からのｍＲＮＡをＮＡＳＨ患者からの循環するＰＢＭＣにおいて検出することができるかどうか判定した。バンドはＣＣＬ１９とＣＸＣＬ６について検知できたが、ＣＣＬ２０についてはできなかった（データ不図示）。ＣＣＬ２０タンパク質は血清において検知できたので、ＰＢＭＣからの欠如は、ＣＣＬ２０の主たる肝臓性の起源と一致する。
実施例８
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＲＮＡにおけるバイオマーカー候補ＣＣＬ１９の測定
【０１５７】
最初の１００人の患者のＰＢＭＣを収集するためにＣＰＴ管を用いた。ＣＣＬ１９  ＲＮＡレベルをＰＢＭＣ  ＲＮＡサンプルにおいて測定した。正常の肝臓組織構造の１３人の患者（ＮＬ）、脂肪性肝炎だが無線維化の６人の患者（ＳＨ）、傍類洞の線維化の１０人の患者（ＰＦ）、架橋線維化の２人の患者（ＢＦ）、及び肝硬変の１人の患者（ＣＲ）からのサンプルにおいて、ＡＢＩ  ７３００リアルタイムＰＣＲ機上でＴａｑｍａｎアッセイを用いて測定した（図１１の黒線）。コントロール遺伝子ＧＡＰＤＨのレベルは一般的に一貫しており（図１１の灰色線）、サンプルの採集・調製の高品質性及び完全性を反映する。ＣＣＬ１９／ＧＡＰＤＨ比を患者群にわたって評価した。正常の肝臓組織構造の患者からの２番目に高い値を閾値カットオフとして用いる場合、このレベル以上の値は、ＮＡＳＨ（ＳＨ、ＰＦ、ＢＦ又はＣＲを包含する）について８８．９％の陽性的中率と、５２％の陰性的中率と、を有するであろう。これに対し、肝臓機能検査ＡＳＴ又はＡＬＴは、これらの患者の１２％のみにおいて高くなった。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図１は、正常の肝臓組織構造の患者（白色）、傍類洞の線維化の無いＮＡＳＨの患者（軽い灰色）、及び傍類洞の線維化の患者（濃い灰色）における、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＫ  ＰＨＯＳ）、ＡＬＴ、ＡＳＴ及びＢＭＩを示す。＊ｐ＜０．０１．
【図２】図２は、スタチン療法を受けていないか（白色）又はスタチン療法を受けている（灰色）、正常の肝臓組織構造の患者（ｎ＝３０／１５）、傍類洞の線維化の無いＮＡＳＨの患者（ｎ＝６６／２０）、及び傍類洞の線維化の患者（ｎ＝２６／９）における血清ＨＤＬコレステロールレベルを示す。＊ｐ＜０．０５．
【図３】図３は、患者からの代表的な肝臓組織構造（１００Ｘ）を示す。パネルＡ：正常の表出Ｈ＆Ｅ染色部；パネルＢ：中程度の脂肪肝及び軽度の脂肪性肝炎だがＨ＆Ｅ上に線維化なし；パネルＣ：中程度の脂肪肝及び軽度の脂肪性肝炎でＨ＆Ｅ上に軽度の傍類洞の線維化；パネルＤ：Ｃと同様だが線維化のためにトリクロム染色を使用；パネルＥ：Ｈ＆Ｅ上の架橋線維化；パネルＦ：Ｅと同様だが線維化のためにトリクロム染色を使用。
【図４】図４は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓを用いた、プールされた肝臓ＲＮＡ（ｎ＝９／プール）の遺伝子発現プロファイルの階層的クラスタリング図表を示す。「正常」は正常の肝臓を、「中程度の炎症」は中程度の脂肪性肝炎だが無線維化の肝臓を、「架橋線維化」は中程度から重度の脂肪性肝炎及び架橋線維化の肝臓を、それぞれ示す。
【図５】図５は、ヒトＦｏｉｅ  Ｇｒａｓ（ｆｌｊ１２７１６ｌ）ｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ）‐ＰＣＲを示す。左：ＭＷは分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）マーカー；ＮＬは正常（ｎｏｒｍａｌ）組織構造；ＳＴは軽度の脂肪肝（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）；ＦＬは非架橋線維化（ｆｉｂｒｏｓｉｓ）；ＢＦは架橋線維化（ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）である。右：（インプットＲＮＡのためのコントロールとしての）１８ＳｒＲＮＡ。
【図６】図６は、正常の肝臓組織構造又は架橋線維化を備えた個々の患者からのＧＡＰＤＨ、ＣＣＬ１９及びＣＸＣＬ６のＲＴ‐ＰＣＲを示す。
【図７】図７は、５人の病的に肥満な患者の末梢血単核細胞からのＲＮＡのＲＴ‐ＰＣＲを示す。マーカーレーンはゲルをフランクし、ＧＡＰＤＨをコントロールとして用いた。サイトカインのうちの２つ（ＣＣＬ１９及びＣＸＣＬ６）に対応するバンドが検出された。ＣＣＬ２０の発現の証拠は見つからなかった。
【図８】図８は、ＣＣＹＡ２０（ＣＣＬ２０）ＥＬＩＳＡアッセイについての検量線を示す。
【図９】図９は、ＮＡＳＨの患者からの血清においてＥＬＩＳＡによって測定されたＣＣＹＡ２０（ＣＣＬ２０）タンパク質レベルを示す。
【図１０】図１０は、ＧＡＰＤＨ及びＣＣＹＡ２０（ＣＣＬ２０）のリアルタイムＰＣＲを示す。パネルＡは、正常組織構造及び架橋線維化の患者からの個々の肝臓ＲＮＡサンプルのＧＡＰＤＨ（黒線）及びＣＣＬ２０（灰色線）の増幅のリアルタイムＰＣＲ蛍光プロットを示す。ＧＡＰＤＨ蛍光のタイトなグルーピングは、その発現レベルが種々のサンプルにわたって類似しており、ＲＮＡ調製が高品質であることを示す。パネルＢは、Ａにおける試験から得られたリアルタイムＰＣＲ値を示す（ＮＬ＝正常組織構造；ＢＦ＝架橋線維化）。正常組織構造については１つのサンプルだけが架橋線維化サンプルよりも大きかった。
【図１１】図１１は、個々のＰＢＭＣ  ＲＮＡサンプルのＧＡＰＤＨ（後のサイクルで上昇する黒線）及びＣＣＬ１９（前のサイクルで上昇する灰色線）の増幅のリアルタイムＰＣＲ蛍光プロットを示す。ＧＡＰＤＨ蛍光カーブの多くのかなりタイトなグルーピングは、その発現レベルが種々のサンプルにわたって類似しており、ＲＮＡが非常に高品質であることを示す。ＣＣＬ１９増幅プロットは、レベルがＧＡＰＤＨについてのものよりも低く、レベルが広く分散することを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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