(57)【要約】  本発明は、臍帯血から分離または、増殖された細胞を含む進行性、慢性肺疾患治療用組成物に関するもので、より具体的には、臍帯血から分離または、増殖された細胞を気道内に投与して、進行性、慢性肺疾患を治療するための組成物に関するものである。本発明の治療用組成物の細胞は、増殖および分化能力が非常に優れていて、由来組織の採取・獲得および、ドナー選択が容易で、気道に直接投入することによって、進行性、慢性肺疾患を治療することにおいて有効に利用できる。
2009526768.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
臍帯血から分離、または、増殖した細胞を含む進行性、慢性肺疾患の治療用組成物。
【請求項２】
請求項１において、
細胞は、臍帯血から分離した自家造血母細胞および、間葉幹細胞を始とする単核球細胞、および、臍帯血から分離した間葉幹細胞から継代培養され増幅した間葉幹細胞からなる群の中から選ばれた一つ以上の細胞であることを特徴とする、進行性、慢性肺疾患の治療用組成物。
【請求項３】
請求項１において、
分離または、増殖された細胞を培養している培地をさらに含む、進行性、慢性肺疾患の治療用組成物。
【請求項４】
請求項３において、
前記培地は、ＤＭＥＭ，ＭＥＭ、alpha-MEM, McCoys 5A培地(Gibco), Eagle's basal培地、CMRL培地、Glasgow最小必需培地、Ham's F-12培地、Iscove's modified Dulbecco's培地、Liebovitz' L-15培地、ＲＰＭＩ１６４０培地からなる群から選ばれることを特徴とする、進行性、慢性肺疾患の治療用組成物。
【請求項５】
請求項１において、
前記組成物は、患者の気道内に投入されることを特徴とする、進行性、慢性肺疾患の治療用組成物。
【請求項６】
請求項１において、
進行性、慢性肺疾患は、嚢胞性繊維症、慢性閉鎖性肺疾患、および、肺異形成症であることを特徴とする、進行性、慢性肺疾患の治療用組成物。
【請求項７】
請求項１において、
前記組成物は、血清、抗生剤および、抗真菌剤でなる群から選ばれる一つ以上の補助成分を含むことを特徴とする、進行性、慢性肺疾患の治療用組成物。
【請求項８】
請求項１において、
前記組成物は、胎児牛血清、馬血清、人血清、ペニシリンＧ(Penicillin G)、ストレプトマイシンスルフェート(streptomycin sulfate)、アムホテリシンＢ(amphotericin B)、ゲンタマイシン(gentamycin)、および、ナイスタチン(nystatin)でなる群から選ばれる一つ以上の補助成分を含むことを特徴とする、進行性、慢性肺疾患の治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臍帯血から分離または、増殖された細胞を含む進行性、慢性肺疾患治療用組成物に関するもので、より具体的には、臍帯血から分離または、増殖された細胞を気道内に投与して、進行性、慢性肺疾患を治療するための組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
進行性、慢性肺疾患には、成人の嚢胞性繊維症(cystic fibrosis)、肺気腫(emphysema)等のような慢性閉鎖性肺疾患(chronic obstructive lung disease, COPD)、および、新生児および未熟児の気管支肺異形成症(bronchopulmonary dysplasia)等がある。これらの疾患は、疾病の深刻さや慢性有病状態に比べて、これを明らかに予防し、治療できる具体的な方法がないことに由々しき問題がある。例えば、気管支肺異形成症は、主に未熟児および新生児の呼吸不全、または、これによる人工呼吸器治療によって生じる慢性肺疾患で、最近未熟児の治療が盛んに進んでいることにより、この疾患の発病頻度は増加しつつある(Avery ME et al., Pediatrics 79: 26-30, 1987)。これは、新生児、特に、未熟児死亡の主原因疾患であるだけでなく、生存児の場合でも入院期間の長期化になり、肺動脈高血圧のような重い後遺症を誘発するか、または、退院後もウィルス性急性毛細気管支炎や肺炎等で、再入院が必要となる場合が５０％以上である。また、長期的に気管支の過敏性が増加し気管支喘息に転ずる場合もしばしばであり(Coalson JJ. Semin Neonatol, 8:73-81, 2003)、さらには、脳性マヒのような重い神経学的後遺症と関連することが分かっている(Bregman J and Farrell EE, Clin Perinatol, 19: 673-94, 1992)。
【０００３】
現在、気管支肺異形成症には、効果的で明らかな治療法が開発されていない。なるべく、新生児および未熟児の人工換気治療の際、陽圧換気による圧力および容量損傷、また、酸素濃度を減らして治療して見ようとする、物理的な努力が主であるとともに、損傷している肺の炎症を減らすための治療であるステロイド療法が予防と治療法として用いられていたが、未熟児に用いた場合、神経学的に好ましくない予後、特に、脳性マヒの増加と関連しているという報告があって、その使用が制限されているのが現状である(Committee on Fetus and Newborn, Pediatrics, 109: 330-8, 2002)。
【０００４】
最近、全ての臓器に分化可能な幹細胞治療に対する期待が高まっている中、分化能が極めて優れている胚性幹細胞の移植の場合、制御の不可能な奇形種の発生、遺伝体刷込み(imprinting)を介した発達学的問題、なによりも重要な倫理的問題のために制約を受けていて、成体幹細胞に対する関心が高まりつつある。
【０００５】
成体幹細胞としては、造血系幹細胞が注目を集めているが、造血系幹細胞源である骨髄には、現在、大きく２種類の幹細胞が知られている。一つ目が造血幹細胞(hematopoietic stem cell)で、二つ目が間葉幹細胞(mesenchymal stem cell)である。
【０００６】
骨髄の造血幹細胞が形成性(plasticity)を持っていて、造血系細胞だけでなく各種臓器の他の細胞に分化するということが既に知られているが(Gussoni E, Soneoka Y et al. Nature., 401:390-394, 1999; Petersen BE et al., Science. 284:1168-1170, 1999; Mezey E et al., Science. 290:1779-1782, 2000; Krause DS et al., Cell., 105:369-377, 2001)、これは、極めてまれに起こり生体学的に適切な有用性を持つには限界がある上、さらに、一方ではこのような結果が細胞融合(fusion)によるという報告もまたある(Wagers AJ et al., Science., 297:2256-2259, 2002)。
【０００７】
これに対し、骨髄の間葉幹細胞として、成人マウスの骨髄から分離された“万能分化性成人性前駆細胞” (multipotent adult progenitor cell, MAPC)と命名された幹細胞は、３つの全胚葉、つまり、外胚葉、中胚葉、内胚葉への分化が可能で、マウスの胚盤胞(blastocyst)に注入した時、ほとんど全ての臓器細胞に分化する、優れた分化能が報告されていて、これらの細胞は、OCT-4 and Rex-1 and SSEA-1のような胚性幹細胞の標識を示すことと知られている(Jiang Y et al., Nature. 418:41-49, 2002)。
【０００８】
人間の骨髄にても、このような類似性状の幹細胞が分離して(Reyes M et al., Blood. 98:2615-2625, 2001; Woodbury D et al., J Neurosci Res., 61:364-370, 2000)、疾病および、損傷に対する細胞治療領域分野の応用可能性において多大な注目の対象となっている。しかしながら、骨髄は、年を取るにつれ造血幹細胞および、間葉幹細胞の区域が減って行き(Geiger H and Van Zant G. Nat Immunol., 3:329-333, 2002)、骨髄の採取自体が苦痛を引き起こすということから、実際適用の有用性において非常に不利であるため、対案の必要性が持続的に提起されて来た。
【０００９】
臍帯(umbilical cord)は、胎児に対する全ての栄養供給源であり、かつ、老廃物の排泄器官である母体の胎盤と胎児を繋ぐ紐であって、臍帯血というのは、これの中にある血液のことである。臍帯血は、造血系幹細胞を採るにおいて、骨髄の代わりになるのに最も適している対案として提示しているが、その理由は、骨髄よりも臍帯血の幹細胞の方がより原始的で、かつ、細胞採取において容易であることからである。
【００１０】
臍帯血の造血幹細胞の移植は、既に１９８０年代から臨床的になされてきているが、これは、臍帯血の方が骨髄に比べて造血増殖能力に優れている原始造血母細胞が、単位容量当たりより多くて(Szilvassy SJ et al., Blood. 98:2108-2115, 2001)、さらに、ＨＬＡ不適合が骨髄より少ないため移植片対宿主反応が少なく(Rocha V et al., N Engl J Med., 342:1846-1854, 2000)、その採取において容易でかつ侵襲も少なく(Rubinstein P et al., N Engl J Med., 339:1565-1577, 1998)、さらには、各種癌や外の疾病において、自家骨髄移植の場合に生じうる危険性が著しく減ることのできる優れた長点による。特に、最近では、臍帯血保管銀行もでき、臍帯血の保管および、増殖が容易になってきて、臍帯血の造血幹細胞の移植は、臨床的に一層盛んになっている。
【００１１】
臍帯血に、間葉幹細胞、特に、各種臓器細胞への分化能が非常に優れたＭＡＰＣ−類似細胞が存在するかに対しては、これまで多くの議論がなされて来て焦眉の関心事である。これは、何よりも臍帯血からこのような細胞を多量に得ることさえできれば、細胞治療および細胞と組織再生医学に画期的な転機を迎えられる可能性が高いからである。臍帯血幹細胞群の原始性から見て、成人の骨髄より臍帯血にこのようなＭＡＰＣ−類似細胞が多くあると予想したところへ最近、臍帯血から間葉幹細胞を分離することに成功し(Erices A et al., Br J Haematol., 109:235-242, 2000)、これらが体外で骨芽細胞、脂肪細胞、神経細胞系列に分化するＭＡＰＣ細胞と似ている多重分化能があることもまた証明された(Lee OK et al., Blood., 103:1669-1675, 2004)。また、臍帯血から最初に採取できる間葉細胞の数はとても少なくこれを増幅するのは難しいとされて来たのだが、最近多量の間葉幹細胞源としてこれらの体外増幅が可能になった(Yang SE et al, Cytohterapy., 6:476-486, 2004; Kern SH et al., Stem Cells, 24:1294-1301, 2006)。
【００１２】
これらの細胞は、継代培養(subculture)によって増幅された後にも、多分化性があり体外で骨芽細胞、軟骨芽細胞、脂肪細胞、神経系細胞に分化し、また、生体内にても神経細胞に分化し移住されることが証明され、軟骨および、骨、造血系細胞、肝細胞に分化することが証明されている(Kogler G et al., J Exp Med., 200:123-135, 2004)。
【００１３】
方法論的にも実際の胎盤組織から抽出した臍帯血は、自家および、同種幹細胞のもっとも理想的な供給源となることができ、また、このように収集された幹細胞は、直接使用するか、もしくは増殖過程を経てから、必要な時期に必要な量だけ容易に用いることのできる利点を持つ。
【００１４】
しかしながら、未だ進行性、慢性肺疾患に臍帯血由来の幹細胞移植に関する研究が行われたことはない。ただ、成人の骨髄幹細胞が、放射線による肺炎になったマウスから、移植後気管支細胞と第２型肺細胞等に分化され(Theise ND et al. Exp Hematol., 30:1333-1338, 2002)、また、ブレオマイシン投与後に発生する繊維化を緩和させたという一部の成人動物実験モデルの実験的報告が存在している(Ortiz L et al. Proc Natl Acad Sci USA, 100:8407-8411, 2003, Rojas M et al.,Am J Respir Cell Mol Biol, 33:145-152, 2005)。
【００１５】
臍帯血から分離した細胞を用いた疾病治療に関する特許としては、大韓民国公開特許第２００３−００１５１６０号に、臍帯血から分離、増殖または、分化した細胞成分とその培地からなる関節軟骨損傷治療用組成物に関して記載されていて、大韓民国公開特許第２００５−０１０５４６７号には、臍帯血−由来幹細胞を高投与量で用いて骨髄異形成症および、硬化症を治療する方法に関して記載されている。しかし、前記文献の内いずれも進行性、慢性肺疾患において臍帯血幹細胞移植の治療効果に対しては述べていない。
【００１６】
そこで、本発明者等は、新生ラットにて、高濃度酸素を持続的に投与して気管支肺異形成症モデルを作製した後、本発明の組成物を気道内に投与した結果、肺胞数が増加し肺胞が正常に発達して投与された細胞が肺の実質細胞に分化することを観察することにより、本発明の組成物が進行性、慢性肺疾患の治療に利用できることを確認して本発明を完成した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、現在特別な治療方法のない進行性、慢性肺疾患の治療のために、臍帯血幹細胞を含む組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、臍帯血から分離、または、増殖した細胞を含む進行性、慢性肺疾患の治療用組成物を提供する。
【００１９】
本発明の治療用細胞の起原組織である臍帯血は、胎盤と胎児を繋ぐ臍帯静脈から採れた血液として定義される。臍帯血は、出産の際自然に発生する副産物で、何度の手術を必要とする骨髄などの一般間葉組織よりはるかに採取が容易で、骨髄移植に比べ臍帯血保管産業が活性化して、既にインフラが構築されているのでドナーも求めやすくなっている。それと共に、臍帯血由来細胞は、組織や臓器移植で拒否反応を起こす最も主原因である組織適合抗原のHLA-DR(class II)が発現しない細胞であるため(Le Blanc, KC, Exp Hematol, 31:890-896, 2003; Tse WT et al., Transplantation, 75:389-397, 2003)、既存の移植手術の際問題となる拒否反応等の免疫反応を誘発しないか、最小化ができて、自家由来臍帯血は無論のこと、他家由来臍帯血も用いることができる。
【００２０】
臍帯血を採取分離する方法は以下のようである。臍帯血の採取段階では、正常腟式分娩の場合、出産後子宮内にまだ胎盤が残っている状態で、外に娩出された臍帯静脈から採るか、または、帝王切開の場合は、出産後、胎盤も子宮外に娩出された状態で臍帯静脈から採る。本発明において、出産後、子宮外に娩出された臍帯静脈から臍帯血を採る時は、新生児が生まれた後、胎盤と胎児を繋いでいた臍帯静脈から無菌操作法により採取する。この際、出産後子宮から胎盤剥離が起こる前に臍帯血を採るか、または、胎盤剥離が起こった後体外で臍帯血を採る方法のいずれも用いることができる。帝王切開の場合は、胎盤剥離が起こった後体外で臍帯血を採る方法を用いる。臍帯静脈の確保した後、採取針を用いて抗凝固剤が含まれている臍帯血採取バック(袋)に臍帯血を採取する。
【００２１】
本発明の組成物は、前記のような臍帯血から分離した自家造血母細胞および、間葉幹細胞を始とする単核球細胞、臍帯血から分離した間葉幹細胞および、前記間葉幹細胞から継代培養され増幅した間葉幹細胞の中から選ばれた一つ以上の細胞である。臍帯血から分離した間葉幹細胞は、典型的な骨髄の間質細胞(stromal cells)とは違い多能性(multipotent)であるため、適切な分化条件下で骨、軟骨、脂肪組織、筋肉、腱などのような間葉組織に分化されうる。また、臍帯血由来の間葉幹細胞は、自家複製(self-renewal)する能力があるため、特定の細胞や組織に分化しなく、かつ、適宜の条件下で増殖が可能な細胞であって、移植時、抗炎症所見を示すことがありうる。さらに、骨髄、筋肉、皮膚等の一般間葉組織から分離された間葉幹細胞から由来する細胞に比べ、より幼い個体から起原する細胞であるので、細胞の増殖および、分化能力、並びに調節物質分泌能力が遥かに優れている。
【００２２】
採取された臍帯血から間葉幹細胞を分離・培養する方法は、大韓民国公開特許第２００３−００６９１１５号の方法や、既存の用いられて来た方法を全て用いることができ(Pittinger MF et al. Science, 284: 143-7, 1999; Lazarus HM et al. Bone Marrow Transplant, 16: 557-64, 1995)、その内の一例を挙げると以下のようである。採取された臍帯血を遠心分離して単核細胞を分離した後、何度も洗浄して異物を除去する。洗浄後、適宜の密度で単核細胞を培養容器で培養すると、単一層を成しながら細胞が増殖するが、この中から、位相差顕微鏡で観察される模様が、同質性であり(homogeneous)、かつ、紡錘形(spindle shape)の長い形態の細胞のコロニー形態として増殖する細胞が間葉幹細胞である。以後、細胞が培養し成長すると継代培養を行い、必要分だけの細胞数になるまで増殖する。
【００２３】
本発明の細胞を冷凍保管する方法は、公知の方法により行われるが(Doyle et al., 1995)、冷凍の際用いられる培地の組成は１０〜２０％のDMSO(dimethylsulfoxide)および、５〜１０％のグリセロールで構成され、前記の培地１mlに約1x106〜5x106個の細胞が存在するように細胞を懸濁する。
【００２４】
前記細胞の懸濁液を、低温冷凍用のガラスまたは、プラスチック材質のアンプルに分配し、これを封じて予め温度条件を合せているプログラム冷凍機に入れる。細胞を冷凍する際には、-１℃/minの温度変化を提供する冷凍プログラムを用いることが以後解凍の際に細胞の損傷を少なくするため好ましい。
【００２５】
一旦、アンプルの温度が-１８０℃に達したら、液体窒素タンクに移動させる。冷凍保管された細胞は、数年間格納できるが、周期的に少なくとも５年毎に生存性を保っているかを点検する。
【００２６】
冷凍保管されている細胞を解凍するときは、アンプルを液体窒素タンクから速やかに３７℃に調節された水槽に移動させる。アンプル内の解凍された内容物は、滅菌状態下で１０％のＦＢＳ、５％のＥＳを含む培地を持っている培養容器に即移す。
【００２７】
本発明の治療に用いられる細胞の濃度は、１ml当たり1.0 x105個乃至1.0 x109個、好ましくは、1.0 x10６個乃至1.0 x10８個、より好ましくは、1.0 x10７個存在するようにするのが望ましい。本発明の組成物は、治療を必要とする気道内に直接投与方式を用いて肺組織近くに投与することによって、既存の血管静注を介した細胞移植方法に比べ接近性を高めて治療効果を高めることができる。
【００２８】
本発明者等は、採れた臍帯血を遠心分離して単核細胞を分離し、適切な密度で培養容器に入れ培養した後、適正の密度に達すると継代培養して細胞を増殖させた。その後、出生直後の新生ラットに高濃度の酸素を持続的に投与して気管支肺異形性症モデルを製作した。前記モデルから気管支肺胞の細胞と肺を摘出して、染色した後観察した結果、気管支肺異形性症のラット達は、呼吸数が非常に増加し、体重が中々増えなく、かつ、単核球の増加が伴う慢性炎症性の反応と、間質繊維芽細胞が伴う繊維化が進んでいた(図１乃至図４を参照)。さらに、正常のラットの肺組織(ＮＣ)に比べ、肺胞の大きさを示すＭＬＩは、著しく増加した(図５および、図６を参照)。
【００２９】
一方、赤い蛍光を帯びるＰＫＨ２６で細胞の標識を施して、本発明の組成物を気道内に移植したラットの肺組織を蛍光顕微鏡で観察したところ、組成物内の細胞が肺に安着していることが確認されて(図８参照)、本発明の組成物を気道内に投与したラットの肺(ＨＴ)においては損傷が緩和され(図１乃至図４を参照)、ＲＡＣが増加しＭＬＩが減少していることが観察された(図５および、図６を参照)。
【００３０】
本発明の組成物は、臍帯血から分離または、増殖された細胞の培地をさらに含む。前記培地は、細胞を懸濁するためのものであって、ＤＭＥＭ，ＭＥＭ培地を始め、alpha-MEM, McCoys 5A培地(Gibco), Eagle's basal培地、CMRL培地、Glasgow最小必需培地、Ham's F-12培地、Iscove's modified Dulbecco's培地、Liebovitz' L-15培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等、一般に用いられる細胞培養用の培地はいずれも可能であり、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を用いることが好ましい。
【００３１】
本発明において、細胞培養用の培地には、必要に応じて一つ以上の補助成分を添加することができて、牛の胎児、馬又は人の血清を始めとして、微生物の汚染を防ぐためのペニシリンＧ、ストレプトマイシンスルフェート(streptomycin sulfate)等の抗生剤およびアムホテリシンＢ(amphotericin B)、ゲンタマイシン(gentamycin)、または、ナイスタチン(nystatin)等の抗真菌剤(antifungal agent)の内選ばれた一つ以上を用いることができる。
【００３２】
本発明の組成物は、１回、または、多数回の投与によって肺胞を発達させることのできる有効投与量を含む。さらに、移植および、その他の用途に用いられる他の幹細胞とともに、または、そのような幹細胞との混合物として用いられうる。本発明の組成物は、凍結されないまま使用されるか、また、以降の使用のために凍結されうる。凍結される場合、標準冷凍保存剤(例えば、ＤＭＳＯ，グリセロール、エピライフ(Epilife、登録商標)細胞凍結培地(Cascade Biologics))が、凍結の前の細胞集団に添加されうる。
【００３３】
凍結していない臍帯血から分離または、増殖された細胞は、注入バッグ(例えば、バクスター(Baxter)、ベクトンーディキンソン(Becton-Dickinson)、メドセップ(Medcep)、ナショナルホスピタルプロダクツ(National Hospital Products)、または、テルモ(Terumo)製品)により運ばれる。
【００３４】
本発明は、臍帯血から分離または、増殖された細胞を含む前記組成物を用いた進行性、慢性肺疾患の治療方法を提供する。
【００３５】
前記方法は、前記組成物を患者に投与する段階を含む。この際、投与方法は、患者の肺疾患部位に直接生着、または、移植するか、気道に移植または、注入することが可能であるが、これに限定しない。また、前記投与は、カテーテルを用いる非外科的投与および、胸部切開後注入または、移植するなど外科的投与方法のいずれも可能であるが、カテーテルを用いる非外科的投与方法がより好ましい。また、造血系幹細胞移植の一般的方法である血管内注入による移植も可能である。
【発明の効果】
【００３６】
本発明の組成物を用いることにより、治療が必要な気道内に直接投与法を用いて、肺組織近くに投与することで接近性を高め治療効果を高めることができる。また、出産の際自然に発生する副産物である臍帯血を用いることによって、何度の手術を必要とする骨髄などの一般間葉組織よりはるかに採取が容易である。さらに、臍帯血は、骨髄移植に比べ保管産業が活性化して、既にインフラが構築されているのでドナーも求めるのも容易である。また、組織や臓器移植で拒否反応を起こす最も主原因である組織適合抗原のHLA-DR(class II)が発現しない細胞であるため、既存の移植手術の際問題となる拒否反応等の免疫反応を誘発しないか、最小化ができて、自家由来臍帯血は無論のこと、他家由来臍帯血も用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、本発明の治療法により、進行性、慢性肺疾患の一つである気管支肺異形性症が誘導された新生ラットの肺組織の病理学的所見が好転していることを示す図である。
【図２】図２は、本発明の治療法により、進行性、慢性肺疾患の一つである気管支肺異形性症が誘導された新生ラットの肺組織の病理学的所見が好転していることを示す図である。
【図３】図３は、本発明の治療法により、進行性、慢性肺疾患の一つである気管支肺異形性症が誘導された新生ラットの肺組織の病理学的所見が好転していることを示す図である。
【図４】図４は、本発明の治療法により、進行性、慢性肺疾患の一つである気管支肺異形性症が誘導された新生ラットの肺組織の繊維化の度合いが好転していることを定量した図表で、  ＮＣ：正常対照群  ＨＣ：高濃度酸素投与(気管支肺異形性症)群  ＨＴ：高濃度酸素投与および、臍帯血間葉幹細胞の気道内移植群  *  ：２つの群と類似の(ｐ＜０．０５)差を示す。
【図５】図５は、本発明の治療法により、進行性、慢性肺疾患の一つである気管支肺異形性症が誘導された新生ラットの肺組織において、肺胞の発達の度合いが好転していることを示す図である。
【図６】図６は、本発明の治療法により、進行性、慢性肺疾患の一つである気管支肺異形性症が誘導された新生ラットの肺組織において、肺胞の発達の度合いが好転していることを示す図である。
【図７】図７は、本発明の治療法により、進行性、慢性肺疾患の一つである気管支肺異形性症が誘導された新生ラットの肺組織の炎症細胞である中性白血球の蓄積を示す骨髄細胞型過酸化酵素(myeloperoxidase, MPO)の活性が減少していることを示す図である。
【図８】図８は、本発明の治療法により、進行性、慢性肺疾患の一つである気管支肺異形性症が誘導された新生ラットの肺組織において、移植された治療用細胞成分が肺に安着していることを示す図である。
【００３８】
青色：ＤＡＰＰＩ染色による細胞核標識
赤色：ＰＫＨ２６標識の治療用細胞成分
【図９】図９は、本発明の治療法により、進行性、慢性肺疾患の一つである気管支肺異形性症が誘導された新生ラットの肺組織において、治療用細胞成分が肺に安着して２型肺細胞に分化することを示す図である。
【００３９】
緑色：ヒトＨＬＡ−ＤＲ標識で移植された治療用細胞
赤色：Ｐｒｏ  ＳＰ−Ｃ標識で２型肺細胞
黄色：ヒトＨＬＡ−ＤＲおよび、Ｐｒｏ  ＳＰ−Ｃが共に同時標識(投与された治療用細胞が肺の実質細胞に分化していることを示す)
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。但し、下記の実施例によって本発明が制限されることではない。
＜実施例１＞細胞の分離・培養
本発明の治療用細胞、つまり、間葉幹細胞(Mesenchymal stem cell)を、以下のようにヒト臍帯血から分離・培養した(Yang, Ha et al. 2004)。
＜１−１＞臍帯血(umbilical cord blood, UCB)の取得
具体的に、臍帯血のサンプルは、産婦の同意を得て出産時に臍静脈(umbilical vein)から取得するが、２３ｍｌのＣＰＤＡ−１抗凝固剤(Greencross Co., Korea)を含むＵＣＢ収集バックの１６−ゲージの注射針を臍静脈に挿入しＵＣＢが重力によって収集バックに集まるようにした。全ての臍帯血取得物は、収集後２４時間内に処理して生存率は９０％以上であった。
＜１−２＞間葉幹細胞の分離および増幅
単核球細胞は、Ficoll Hypaque gradient(密度 1.077 g/cm3, Sigma, USA)で遠心分離して取得し、分離した単核球細胞は、洗浄後１０％ＦＢＳ(HyClone, USA)が添加された最小基本培地(a-MEM, Gibco BRL, USA)に懸濁してから５×１０６cells/cm2の濃度で接種した。これを、３７．８℃、５％ＣＯ２を含む湿潤大気で一週間に２回ずつ培地を交換しながら培養した。培養後、繊維芽細胞と類似した付着力のある細胞が観察され、１〜３週後に間葉幹細胞コロニーの単一層が８０％の集密(confluence)を示した際、細胞にトリプシン(0.25% trypsin, HyClone)を処理し、洗浄して、培養培地(１０％のＦＢＳが添加されたa-ＭＥＭ)に懸濁してから５×１０４cells/cm2の濃度で接種した。これを、連続した体外(exvivo)増殖により数を増加させた(Yang SE et al., Cytotherapy, 6(5): 476-86, 2004)。
＜実施例２＞高濃度酸素注入−気管支肺異形性症モデル
全ての動物実験は、三星(サンスン)生命科学研究所の実験動物委員会(Research Animal Laboratory Committee of Samsung Biomedical Research Institute, Korea)により承認を得て、機関のガイドラインに沿った。気管支肺異形性症モデルを作るために、在胎期間が正確に分かる妊娠したスプラグダウレイラット(Daihan Biolink Co., Korea)を購入し実験動物飼育施設で出産前の少なくとも１週間以上飼育した。それから生まれた新生ラットに出生直後(出産後１０時間以内)から高濃度酸素を１４日間投与して、具体的に６９．５×５０．０×３２．０cm大きさのアクリルケージ(密閉されたプレキシグラスケージ)にラットのケージを入れ、１気圧下で十分な湿度(４０〜６０％)と温度(２３〜２６℃)を保ちながら１００％の酸素を最初の１０分間は１０?/minに飽和させ、酸素濃度分析器(model 572, Servomex, USA)によって測定して、９５％以上に酸素飽和度が達すれば、以降１００％の酸素を２．５?/minに還流させながら酸素飽和度を測定し続けて９５％以上を保つようにした。親ラットの酸素毒性による肺浮腫を防ぐため２４時間周期で親ラットを交換しながら１４日間続けた。
＜実施例３＞臍帯血間葉幹細胞の投与
前記実施例１で取得した臍帯血間葉幹細胞の気道内投与は、前記実施例２で高濃度酸素に晒された出生５日目のラットに２６ゲージ針を用いて首の中央部位にて空気の逆流を確認した後、５．８３×１０５cells/０．０５ｍｌを気道内に投与した。
＜実施例４＞動物犠牲後組織準備
実験１４日目、新生ラットにペントバルビタールを腹腔内注射して麻酔を施した後、四肢を固定してから胸郭を切開し心臓と肺組織を露出させ、２３ゲージ針を左心室に固定して、右心房を穿刺し生理食塩水を還流した。左側主気管支をしっかり結紮した後、左側の肺を摘出し液体窒素に凍結して気管支に管を入れて残りの右側の肺に４％のフォルムアルデヒド固定液を入れて２０cmＨ２Ｏ圧力で一定に膨らませた後一晩中同一の固定液で固定した。
＜実施例５＞繊維化程度、RACおよびMLI測定
４％のフォルムアルデヒドに２４時間固定された肺組織切片をパラフィンに埋めて４umの厚さで切りヘマトキシリン・エオシン染色して光学顕微鏡で観察し、中性白血球の数、繊維化の程度と肺胞中隔および肺間質の細胞数、厚さ増加の程度、肺浮腫の有無を確認して、新たに形成される嚢と肺胞を反映する放射状の肺胞数(radial alveolar count, RAC; Husain AN and Hassel RG Pediatr Pathol.,?13:475-484, 1993)と肺胞の大きさを測定する平均線状区分(mean linear intercept, MLI; Dunnill MS., Thorax 17:320-328, 1962)を測定した。繊維化程度の定量はStocker JT(Stocker, J.T, Hum?Pathol., 17:943-961, 1986)の方法を若干変えて、少なくとも１匹当たり３０肺フィールドを１０倍の倍率にて観察し、繊維化程度がなければ０点、若干肺胞中隔繊維化の所見が観察されれば１点、中等度で観察されれば２点、非常に重度の場合を３点として点数をつけ平均した。RACは、末端細気管支から最も近い維管束中隔(fibrovascular septum)まで垂直の線を引き、その間の全ての嚢胞(saccule)の数を測定して、光学顕微鏡の４０倍の倍率にて組織を観察した。MLIは、１ｍｍのルーラを用いてその間に跨る隔膜(septum)の個数を測定し計算した。それぞれの場合、顕微鏡でランダムな部位を各々１０回検査して、これらの平均値から統計的分析を行った。
【００４１】
各切片のイメージは、オリンパスBX８１顕微鏡を介してデジタルカメラで撮影した。データは、平均±SDで示して、なお、統計的分析は、ANOVAに続きSAS enterprise guide version of three(SAS Institute, Cary, NC)を用いてMann-Whitney testまたは、Kruska-Wallisを行った(０．０５以下の全てのｐ値は有意のものとみなす)。
【００４２】
その結果、気管支肺異形成症が誘導されたラットの肺(HC)は、大食細胞とリンパ球等の単核球の増加が伴う慢性炎症性反応と間質繊維芽細胞の過多増殖が伴う繊維化所見が進んでおり、間葉幹細胞を気道内に投与したラットの肺(HT)においては、病理学的所見上損傷が有意に緩和された(図１乃至図３)。繊維化程度の定量からこのような所見は明らかであった(図４)。また、気管支肺異形成症が誘導されたラットの肺組織においては、正常ラットの肺組織に比べRACが著しく減少してMLIは著しく増加した。しかし、間葉幹細胞を気管内に投与したラットの肺組織はRCA値が増加し、MLI値が減少した(図５および図６)。
＜実施例６＞MPO活性
好中球蓄積の指標である骨髄細胞型過酸化酵素(myeloperoxidase, MPO)は、Gray et al.(Gray K.D. et al., Am J Surg., 186(5):526-530, 2003)の方法を変えて測定した。肺組織は、リン酸塩緩衝溶液(ｐH７．４)で均質化した後３０，０００×ｇで３０分間遠心分離して、ペレットは、０．５％のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイドが添加された他のリン酸塩緩衝溶液(５０ｍM、ｐH６．０)で再懸濁した。再懸濁したペレットで、MPO活性は０．１６７mg/ml、O-ジアニシジンヒドロクロライドと０．０００５％過酸化水素を用いて４６０ｎｍで吸光度の変化を測定し確認して、MPO活性１unitは１μmolの過酸化物を１分で分解する酵素の量と定義した。データは、平均±SDで示して、なお、統計的分析は、ANOVAに続きSAS enterprise guide version of three(SAS Institute, Cary, NC)を用いてMann-Whitney testまたは、Kruska-Wallisを行った(０．０５以下の全てのｐ値は有意のものとみなす)。
MPO活性の測定結果、高濃度の酸素に晒されたラットの肺組織において、MPO活性は、室内空気に晒された動物に比べ相当増加した。間葉幹細胞を気道内に投与した場合には、高濃度酸素に晒されたラットに比べMPO活性は相当減少した(図７)。
＜実施例７＞二重標識免疫蛍光組織化学染色
本発明者等は、肺に移植された間葉幹細胞が装着してどのように分化するかを調べるために顕微鏡検査を行った。
【００４３】
まず、肺に間葉幹細胞が無事移植されたかを見るために、赤い蛍光を帯びるPKH２６で細胞標識をして、治療用の細胞剤を気道内に移植した気管支肺異形成症ラットの凍結肺組織を蛍光顕微鏡で観察した。その結果、治療用の細胞剤が肺に安着した所見を観察できた(図８)。
【００４４】
次に、装着した細胞の分化性状を調べるために、細胞の特異マーカーに対して、免疫蛍光組織化学染色で凍結組織切片を検査した。つまり、ラットに移植された細胞のマーカーとして、ヒトHLA(human leukocyte antigen)−DRと、肺実質細胞の一種である２型肺細胞の特異マーカーであるpro SP-C(pro Surfactant Protien C)が一緒に染まったかを調べた。
【００４５】
具体的に、凍結された肺の切片は、パラホルムアルデヒドで３０分間固定して１％の牛血清アルブミンと０．１％のトリトンを３０分間追加処理した後、０．１％トリトンX-100と３％の正常ヤギ血清が混合したPBSで１時間常温にてブロッキングした。その後、１次抗体であるヒトHLA-DR(マウス単一クロンDAKO、Germany)を１：５０に希釈して、pro SP-C(ラビットポリクロンSterologicals Co. USA)は、１：１０００に希釈して、切片と一緒に４℃で一晩中定温配置した。これを、PBSで洗浄しブロッキング液で１時間Alexa Fluor 488ヤギ抗−マウスIgGと、Alexa Fluor568ヤギ抗−ラビットIgG(1:500, Molecular Probes, USA)2次抗体と定温配置した。それから、DAPI(Molecular probes, Eugene, OR)でカウンタ染色して、Vector shield(Vector Laboratories, USA)を用いて取り付けた後、蛍光は、confocal imaging microscopy(Bio Rad, USA)を用いて確認した。蛍光写真は、オリンパスEX４１蛍光顕微鏡(Olympus America, USA)で撮影した(Olympus MaganFire camera?X100とX400レンズ使用)。
【００４６】
その結果、間葉幹細胞が投与されていない対照群ラットは、最小の基本染色だけを示し、間葉幹細胞が気管内に投与されたラットの肺からは、数多くのヒトHLA−DR標識である緑色の注入細胞が観察された。また、肺実質細胞である2型肺細胞のマーカーのpro SP-Cを赤い蛍光に標識して同時染色した結果、安着した細胞の一部から同時標識である黄色の蛍光標識が観察されたことによって、移植されラットの肺組織に安着した間葉幹細胞の一部が肺実質細胞に分化したことが分かった(図9)。
【００４７】
これによって、本発明の治療用細胞成分の気道内移植は、慢性、進行性肺疾患を効果的に治療できることが分かる。
【００４８】
本発明は、前記の実施形態に述べているが、添付の請求範囲から外れることなく、様々な変形および修正が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の臍帯血から分離、または、増殖した細胞を含む進行性、慢性肺疾患の治療用組成物は、特別な治療法のない進行性、慢性肺疾患において新たな治療方法を提示する。本発明の組成物を用いることにより、治療が必要な気道内に直接投与法を用いて、肺組織近くに投与することで接近性を高め治療効果を高めることができる。また、出産の際自然に発生する副産物である臍帯血を用いることによって、何度の手術を必要とする骨髄などの一般間葉組織よりはるかに採取が容易である。さらに、臍帯血は、骨髄移植に比べ保管産業が活性化して、既にインフラが構築されているのでドナーも求めるのも容易である。また、組織や臓器移植で拒否反応を起こす最も主原因である組織適合抗原のHLA-DR(class II)が発現しない細胞であるため、既存の移植手術の際問題となる拒否反応等の免疫反応を誘発しないか、最小化ができて、自家由来臍帯血は無論のこと、他家由来臍帯血も用いることができる。上記のような利点により、本発明の組成物は、進行性、慢性肺疾患の治療に広く用いられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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