(57)【要約】  3'末端に隣接する標的配列を有する核酸分子を検出するための方法が提供される。3'末端に隣接する標的配列を有する核酸分子と同一配列が分子中に組み込まれている核酸分子を区別するための方法も提供される。
2009531035.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
3'末端に隣接しておらず核酸分子内に組み込まれている標的配列を含む分子の存在下で、3'末端に隣接している標的配列を有する核酸分子を試料から選択的に増殖するための方法であって、
（i）試料を、
（a）核酸分子の3'末端に隣接する標的配列に実質的に相補的な3'領域；
（b）鋳型オリゴヌクレオチドが、3'末端に隣接して位置するまたは核酸分子内に組み込まれている標的配列にアニーリングすると遊離の5'テイルが形成されるような核酸配列を含む5'テイルであって、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な配列を取り込む標的配列の3'末端の伸長のための鋳型となって、5'テイルに相補的な配列が標的配列に付加される5'テイル；及び
（c）前記鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長を遅延させる3'領域における改変
を有する鋳型オリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（ii）試料を、鋳型オリゴヌクレオチドと反対方向にプライムするための第2のオリゴヌクレオチド、及び任意選択で鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルとヌクレオチド配列を共有する第3のオリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（iii）試料の増幅を実行する段階であって、
（a）3'末端に隣接する標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングは、前記オリゴヌクレオチドの遅延された3'伸長の存在下での標的配列の3'末端からの伸長による鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルの複製によって、3'末端に隣接していない標的配列への前記オリゴヌクレオチドのアニーリングよりも安定化しており；
（b）3'末端に隣接する標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドの結果的に安定化したアニーリングにより、3'末端に隣接していない標的配列にアニーリングされた鋳型オリゴヌクレオチドの伸長と比較して、鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長の効率が高まり、
（c）鋳型オリゴヌクレオチド及び/または第3のオリゴヌクレオチドを第2のオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用して増幅が起こり、分子内に組み込まれている標的配列を含む核酸分子の存在下で3'末端に隣接する標的配列が選択的に増幅される段階と
を含む方法。
【請求項２】
核酸分子内に組み込まれている標的配列を含む非切断分子の存在下で、分子の切断の結果である3'末端に隣接する標的配列を有する核酸分子を試料から選択的に増幅するための方法であって、
（i）試料を、
（a）核酸分子の3'末端に隣接する標的配列に実質的に相補的な3'領域；及び
（b）鋳型オリゴヌクレオチドが、切断されたまたは非切断の核酸分子にアニーリングすると遊離の5'テイルが形成されるような核酸配列を含む5'テイルであって、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な配列を取り込む標的配列の3'末端の伸長のための鋳型となって、5'テイルに相補的な配列を標的配列に付加する5'テイル；及び
（c）鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長を遅延させる3'領域における改変
を有する鋳型オリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（ii）試料を、鋳型オリゴヌクレオチドと反対方向にプライムするための第2のオリゴヌクレオチド、及び任意選択で鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルとヌクレオチド配列を共有する第3のオリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（iii）試料の増幅を実行する段階であって、
（a）核酸分子の切断の結果である3'末端に隣接する標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングは、前記オリゴヌクレオチドの遅延された3'伸長の存在下での標的配列の3'末端からの伸長による鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルの複製によって、非切断核酸分子における3'末端に隣接していない標的配列への前記オリゴヌクレオチドのアニーリングよりも安定化しており；
（b）切断された核酸分子への鋳型オリゴヌクレオチドの結果的に安定化したアニーリングにより、非切断核酸分子にアニーリングされた前記オリゴヌクレオチドの伸長と比較して、鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長の効率が高まり、
（c）鋳型オリゴヌクレオチド及び/または第3のオリゴヌクレオチドを第2のオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用して増幅が起こり、核酸分子内に組み込まれている標的配列よりも3'末端に隣接する標的配列が選択的に増幅され、非切断の核酸分子よりも切断された核酸分子が選択的に増幅される段階と
を含む方法。
【請求項３】
異なる3'末端を有する分子の混合集団の存在下で、3'末端に隣接する標的配列を有する核酸分子を試料から選択的に増幅するための方法であって、
（i）試料を、
（a）前記3'末端に隣接する標的配列に実質的に相補的な3'領域；及び
（b）鋳型オリゴヌクレオチドが、3'末端に隣接する標的配列にアニーリングすると遊離の5'テイルが形成されるような核酸配列を含む5'テイルであって、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な配列を取り込む標的配列の3'末端の伸長のための鋳型となって、5'テイルに相補的な配列が標的配列に付加される5'テイル；及び
（c）前記オリゴヌクレオチドの3'伸長を遅延させる3'領域における改変
を有する鋳型オリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（ii）試料を、鋳型オリゴヌクレオチドと反対方向にプライムするための第2のオリゴヌクレオチド、及び任意選択で鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルとヌクレオチド配列を共有する第3のオリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（iii）試料の増幅を実行する段階であって、
（a）3'末端に隣接する標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドの特異的アニーリングは、鋳型オリゴヌクレオチドの遅延された3'伸長の存在下での標的配列の3'末端からの伸長による鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルの複製によって、3'末端に隣接する非相補的配列への鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングよりも安定化しており；
（b）3'末端に隣接する標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドの結果的に安定化したアニーリングにより、3'末端に隣接する非相補的配列にアニーリングされた前記オリゴヌクレオチドの伸長と比較して、鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長の効率が高まり、
（c）鋳型オリゴヌクレオチド及び/または第3のオリゴヌクレオチドを第2のオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用して増幅が起こり、3'末端の混合集団の存在下で3'末端に隣接する標的配列が選択的に増幅される段階と
を含む方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドの3'伸長を遅延させる鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における改変が、
（i）3'末端ヌクレオチドミスマッチの取込み、
（ii）3'末端に近接する鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における1つまたは複数のヌクレオチドミスマッチの取込み、
（iii）3'末端に近接する鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における欠失の取込み、
（iv）3'末端に近接する鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における挿入の取込み、
（v）（i）〜（iv）の改変の任意の組合せ
からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における改変が3'末端ヌクレオチドミスマッチの取込みである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における改変が3'末端に近接する鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における挿入の取込みである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
3'末端に隣接しておらず核酸分子内に組み込まれている標的配列を含む分子の存在下で、3'末端に隣接する標的配列を有する核酸分子を試料から選択的に増幅するための方法であって、
（i）試料を、
（a）核酸分子の3'末端に隣接する標的配列に実質的に相補的な3'領域；及び
（b）鋳型オリゴヌクレオチドが3'末端に隣接して位置するまたは核酸分子内に組み込まれている標的配列にアニーリングすると、遊離の5'テイルが形成されるような核酸配列を含む5'テイルであって、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な配列を取り込む標的配列の3'末端の伸長のための鋳型となって、5'テイルに相補的な配列が標的配列に付加される5'テイル；及び
（c）前記鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長を遮断する3'領域における改変、または3'伸長を可能にするが、前記オリゴヌクレオチドの3'領域における複製を妨げるまたは遮断する鋳型オリゴヌクレオチドのハイブリダイズ領域における改変
を有する鋳型オリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（ii）試料を、鋳型オリゴヌクレオチドと反対方向にプライムするための第2のオリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（iii）DNA試料を、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルとヌクレオチド配列を共有し、3'伸長が妨げられずに進行する第3のオリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（iv）試料の増幅を実行する段階であって、
（a）鋳型オリゴヌクレオチドの遮断された3'伸長の存在下で、またはそれに続く複製が妨げられるもしくは遮断される鋳型オリゴヌクレオチドの妨げられていない3'伸長の存在下で、鋳型オリゴヌクレオチドが3'末端に隣接する標的配列にアニーリングする場合は、試料中の核酸分子への鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングに続いて鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルが複製されるが、鋳型オリゴヌクレオチドが核酸分子内に組み込まれている標的配列にアニーリングする場合は、試料中の核酸分子への鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングに続いて鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルが複製されず；
（b）増幅が第2及び第3のオリゴヌクレオチドと共に進行し、複製された5'テイルにより3'末端に隣接して位置する標的配列を選択的に増幅し、5'テイルの複製の不在のために、及び鋳型オリゴヌクレオチドの遮断された3'伸長または鋳型オリゴヌクレオチドの遮断された複製のどちらかのために、核酸分子内に組み込まれている標的配列の増殖は進行しない段階と
を含む方法。
【請求項８】
核酸分子内に組み込まれている標的配列を含む非切断の核酸分子の存在下で、分子の切断の結果である3'末端に隣接する標的配列を有する核酸分子を試料から選択的に増幅するための方法であって、
（i）DNA試料を、
（a）核酸分子の3'末端に隣接する標的配列に実質的に相補的な3'領域；及び
（b）鋳型オリゴヌクレオチドが、切断されたまたは非切断の核酸分子にアニーリングすると遊離の5'テイルが形成されるような核酸配列を含む5'テイルであって、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な配列を取り込む標的配列の3'末端の伸長のための鋳型となって、5'テイルに相補的な配列が標的配列に付加される5'テイル；及び
（c）前記鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長を遮断する3'改変、または3'伸長を可能にするが、前記オリゴヌクレオチドの3'領域における複製を妨げるまたは遮断する鋳型オリゴヌクレオチドのハイブリダイズ領域における改変
を有する鋳型オリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（ii）試料を、鋳型オリゴヌクレオチドと反対方向にプライムするための第2のオリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（iii）試料を、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルとヌクレオチド配列を共有し、3'伸長が妨げられずに進行する第3のオリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（iv）試料の増幅を実行する段階であって、
（a）前記オリゴヌクレオチドの遮断された3'伸長の存在下で、またはそれに続く複製が妨げられるもしくは遮断される鋳型オリゴヌクレオチドの妨げられていない3'伸長の存在下で、核酸分子の切断の結果である3'末端に隣接する標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングに続いて鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルが複製されるが、鋳型オリゴヌクレオチドが非切断の核酸分子内に組み込まれている標的配列にアニーリングする場合は、核酸分子の切断の結果である3'末端に隣接する標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングに続いて鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルが複製されず；
（b）増幅が第2及び第3のオリゴヌクレオチドと共に進行し、複製された5'テイル配列によって3'末端に隣接する標的配列を選択的に増幅し、5'テイルの複製の不在のために、及び鋳型オリゴヌクレオチドの遮断された3'伸長、または鋳型オリゴヌクレオチドの遮断された複製のどちらかのために、非切断分子内の組み込まれている標的配列の増幅が進行せず、非切断の核酸分子よりも切断された核酸分子が選択的に増幅される段階と
を含む方法。
【請求項９】
3'末端の混合集団の存在下で、3'末端に隣接する標的配列を有する核酸分子を試料から選択的に増幅するための方法であって、
（i）試料を、
（a）3'末端に隣接する標的配列に実質的に相補的な3'領域；及び
（b）鋳型オリゴヌクレオチドが、3'末端に隣接する標的配列にアニーリングすると遊離の5'テイルが形成されるような核酸配列を含む5'テイルであって、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な配列を取り込む標的配列の3'末端の伸長のための鋳型となって、5'テイルに相補的な配列が標的配列に付加される5'テイル；及び
（c）鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長を遮断する3'領域の改変、または3'伸長を可能にするが、前記オリゴヌクレオチドの3'領域における複製を妨げるまたは遮断する鋳型オリゴヌクレオチドのハイブリダイズ領域における改変
を有する鋳型オリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（ii）試料を、鋳型オリゴヌクレオチドと反対方向にプライムするための第2のオリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（iii）DNA試料を、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルとヌクレオチド配列を共有し、3'伸長が妨げられずに進行する第3のオリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（iv）試料の増幅を実行する段階であって、
（a）鋳型オリゴヌクレオチドの遮断された3'伸長の存在下で、またはそれに続く複製が妨げられるまたは遮断される鋳型オリゴヌクレオチドの妨げられていない3'伸長の存在下で、鋳型オリゴヌクレオチドが3'末端に隣接する標的配列にアニーリングする場合は、標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドの特異的アニーリングに続いて鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルが複製されるが、鋳型オリゴヌクレオチドが3'末端に隣接する非相補的配列にアニーリングする場合は、標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドの特異的アニーリングに続いて鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルが複製されず；
（b）増幅が第2及び第3オリゴヌクレオチドと共に進行し、複製された5'テイル配列によって3'末端に隣接して位置する標的配列を選択的に増幅し、5'テイルの複製の不在のために、及び鋳型オリゴヌクレオチドの遮断された3'伸長、または鋳型オリゴヌクレオチドの遮断された複製のどちらかのために、3'末端に隣接する非相補的配列の増幅が進行せず、3'末端の混合集団の存在下で、3'末端に隣接する標的配列が選択的に増幅される段階と
を含む方法。
【請求項１０】
鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長を遮断する鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における改変が、
（i）1つまたは複数の非伸長性部分もしくはヌクレオチド類似物のその3'末端での取込み、
（ii）3'末端非伸長性部分もしくはヌクレオチド類似物と3'末端に近接する鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における1つまたは複数のヌクレオチドミスマッチの組合せの取込み、
（iii）3'末端に近接する鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における1つまたは複数の脱塩基部位の取込み、及び
（iv）1つまたは複数の脱塩基部位と3'末端に近接する鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における1つまたは複数のヌクレオチドミスマッチの組合せの取込み
からなる群から選択される、請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
1つまたは複数の非伸長性部分もしくはヌクレオチド類似物が、
（i）2',3'ジデオキシヌクレオチド、
（ii）3' C3、C18または他の長さスぺーサー、
（iii）3'リン酸化ヌクレオチド、
（iv）ペプチド核酸塩基、
（v）アミンリンカー、
（vi）ウラシル_DNAグリコシラーゼで処理された1つまたは複数のウラシル、
（vii）RNA、
（viii）1つまたは複数の2' O-メチルRNA残基、及び
（ix）（i）〜（viii）の任意の組合せ
からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
非伸長性塩基がアミンリンカーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
非伸長性塩基がC3スぺーサーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
非伸長性塩基がウラシル_DNAグリコシラーゼで処理された1つまたは複数のウラシルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
非伸長性塩基が1つまたは複数の2' O-メチルRNA残基である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
非伸長性塩基が3'末端に近接する鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における1つまたは複数の脱塩基部位である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
3'伸長を可能にするが、前記オリゴヌクレオチドの3'領域における複製を妨げるまたは遮断する3'領域における改変が、
（i）1つまたは複数の塩基類似物の鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域内の挿入、
（ii）1つまたは複数のRNAヌクレオチドの挿入、
（iii）1つまたは複数の脱塩基部位の挿入、及び
（iv）（i）〜（iii）の任意の組合せ
からなる群から選択される、請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
改変が1つまたは複数の塩基類似物の挿入である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
改変が1つまたは複数の脱塩基部位の挿入である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
標的された核酸分子の3'末端を含む試料中の核酸分子の3'末端が、試料を隣接カッター制限エンドヌクレアーゼで消化した結果である、請求項９に記載の方法。
【請求項２１】
前記鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長を遮断する3'領域における改変が、1つまたは複数の塩基類似物、1つまたは複数の脱塩基部位、またはこれらの任意の組合せのその3'末端での取込みである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
鋳型オリゴヌクレオチドが、標的配列の3'伸長を遮断する3'領域における改変をさらに取り込んでいる、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
改変が、鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における1つまたは複数の塩基類似物の取込みである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
鋳型オリゴヌクレオチドが、3'末端ヌクレオチドミスマッチ、1つまたは複数の脱塩基部位及び1つまたは複数の塩基類似物の取込みを取り込んでいる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
第2のオリゴヌクレオチドが追加の鋳型オリゴヌクレオチドである、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
切断及び非切断DNAを含むDNA試料から切断DNAを選択的に増幅するためのキットであって、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法に従って定義された（i）鋳型オリゴヌクレオチド、（ii）第2のオリゴヌクレオチド、及び（iii）第3のオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項２７】
核酸分子がDNAを含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
核酸分子の切断が、配列特異的制限エンドヌクレアーゼによる切断の結果である、請求項２または８に記載の方法。
【請求項２９】
制限エンドヌクレアーゼが配列特異的メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼがDNAメチル化により阻害される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼが、HpaII、HhaI、BstuI、NotI、SmaI及びSacIIからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼがメチル化DNAを切断する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼが、GlaI及びBisIからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
制限エンドヌクレアーゼが、試料中の核酸分子における制限部位の存在または不在を区別するように選ばれる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
単一ヌクレオチド多型または突然変異の検出のための請求項２または８に記載の方法。
【請求項３６】
単純ヌクレオチド反復における不安定性の検出のための請求項３または９に記載の方法。
【請求項３７】
単純ヌクレオチド反復における不安定性の検出のための請求項２０から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
単純ヌクレオチド反復における不安定性の検出のための請求項２４に記載の方法。
【請求項３９】
核酸分子を含む試料のメチル化状態を判定するための請求項２９から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
欠失または挿入が制限酵素認識部位と認識部位の外側に限定された距離で位置するその切断部位との間で起きる、試料中の核酸分子における欠失または挿入の存在または不在を検出するための方法であって、
（i）試料を、認識部位の外側に限定された距離で切断部位を有する制限酵素で消化する段階と；
（ii）3'末端に隣接するヌクレオチド配列が欠失または挿入の存在または不在に依存し、3'または5'方向のどちらかへの切断部位の移動が、それぞれ欠失または挿入の存在下で起こる、切断によって生成される3'末端に隣接するヌクレオチド配列を決定する段階と
を含む方法。
【請求項４１】
段階（ii）が請求項３または９に記載の方法により実現される、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、3'末端に隣接する特定の配列を有する核酸分子を、同一配列が分子内に組み込まれている、または不在である核酸分子と区別することに関する。本発明は、3'末端に隣接する配列が異なる核酸分子を区別することにも関する。特に、本発明は、同一標的配列を共有する非切断DNAの存在下で、切断されたDNAを選択的に増幅するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、二本鎖DNAの変性、それに続くオリゴヌクレオチドプライマーのDNA鋳型へのアニーリング、及びDNAポリメラーゼによるプライマー伸長の反復サイクルに基づいている（例えば、Mullisら、米国特許第4683195号、米国特許第4683202号、及び米国特許第4800159号を参照されたい）。PCRで使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、DNAの反対鎖にアニーリングするように設計されており、一方のプライマーのDNAポリメラーゼ触媒伸長産物が、他方のプライマーのための鋳型鎖として働けるように位置取りされている。PCR増幅法により、その長さがオリゴヌクレオチドプライマーの5'末端により規定されている別々のDNAが指数関数的に増加する。
【０００３】
その標準的適用では、標的ゲノム内の配列にマッチし、増幅されることになるDNAの領域に隣接するプライマーが選択される。さらに、リンカーがDNAフラグメントの末端上に連結され、次にリンカー内の配列がDNA増幅をプライムするために使われるいくつかのPCRの変法がすでに記載されている。ライゲーション媒介PCRは最初、DNAフットプリント法及びDNA末端がデオキシリボヌクレアーゼI消化または化学的切断により生成され（Mueller及びWold、1989年並びにPfeiferら、1989年）、制限消化により形成される末端まで伸長される（Steigerwaldら、1990年）塩基配列決定反応に適用された。特異的標的領域へのプライマーを、付加されたリンカーに標的されたプライマーと組み合わせることにより、特異性が実現される。この技法の変法は、ゲノム塩基配列決定及びDNAメチル化分析、染色体歩行、染色体組込みまたは組換え部位の同定、突然変異限界点及びmRNA末端の研究に一定範囲の用途を見出してきた。ライゲーション媒介PCRは、連結された末端のある分子の全集団を増幅する全ゲノム増幅のためにも使用することができる（Schumakerら、2006年）。
【特許文献１】米国特許第4683195号
【特許文献２】米国特許第4683202号
【特許文献３】米国特許第4800159号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ライゲーション媒介PCRの広範囲の有用性にもかかわらず、3'末端を有するDNAの選択的増幅を可能にし、単純性、特異性、及び有用性という利点を提供する改良されたPCRベース法に対する必要性が依然として存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、3'末端に隣接する特定の配列を有する核酸分子を、同一標的配列が存在するが分子内に組み込まれている、または不在である核酸分子と区別するための方法を提供する。3'末端は、例えば、制限酵素切断または他の特異的酵素的もしくは化学的切断の結果でもよく、または末端はPCR生成単位複製配列の遊離末端、染色体、ウイルスもしくはファージ由来などの天然のDNAの遊離末端でもよく、または末端はRNA鋳型からの逆転写により生成される、もしくは3'末端を有する核酸を生成する他の任意の手法により生成されてもよい。
【０００６】
本明細書では「末端特異的PCR」またはES-PCRとも呼ばれる、本発明の一実施形態によれば、核酸分子の3'末端に隣接して位置するヌクレオチド配列は、これらの配列が核酸分子内に組み込まれている場合ではなく、これらの配列が3'末端に隣接して存在する場合にのみ進行する増幅反応をプライムするのに利用される。
【０００７】
この区別を実現するために、標的配列に相補的な3'部分及びオリゴヌクレオチドが核酸にアニーリングすると5'テイルを形成する5'部分を有するオリゴヌクレオチド（以下では「鋳型オリゴヌクレオチド」）が利用される。鋳型オリゴヌクレオチドが3'末端に隣接して位置する標的配列にアニーリングすると、適切なポリメラーゼの存在下で、遊離の3'末端の伸長により5'テイルの複製が起こることができる。鋳型オリゴヌクレオチドが核酸分子内に組み込まれている標的配列にアニーリングすると、遊離の3'末端の不在のために、5'テイルの複製は起こることができない。現在記載されているオリゴヌクレオチドは、その5'テイルが3'末端に隣接して位置する標的配列の3'伸長のための鋳型として働くために、本明細書では鋳型オリゴヌクレオチドと呼ばれる。
【０００８】
標的配列が3'末端に隣接して存在する場合の5'テイルの複製により、新しい配列が標的された核酸分子の3'末端に付加され、これは3'末端に隣接する標的配列を有する核酸分子のそれに続く選択的増幅に利用することができる。
【０００９】
例えば、3'末端が制限酵素切断の産物である場合、非切断DNAよりも切断DNAの選択的増幅が起きるであろう。
【００１０】
一実施形態では、鋳型オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの3'伸長を遅延させる改変を取り込んでいるが、標的配列の伸長による5'テイルの複製は妨げられることなく進行する。従って、鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域の核酸配列は、5'テイルの複製の不在の下では、核酸分子内に組み込まれている標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが阻害されるように使用される条件では、標的配列へのハイブリダイゼーションが不安定になるように選んでよい。5'テイルの複製は、5'テイルの複製がまったく起こらない核酸分子内に組み込まれている標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングと比べて、3'末端に隣接する標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングを増強する。
【００１１】
鋳型オリゴヌクレオチドの増強されたアニーリングは、次に鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長が起きる効率を高め、それによって、逆方向にプライムする別の鋳型オリゴヌクレオチドと組み合わせても、標的された核酸分子内の他の場所の配列に相補的な逆プライマーと組み合わせても、標的配列の増幅の進行を可能にし、所望の分子、すなわち、3'末端に隣接する標的配列を有する分子の特異的検出または増幅を可能にする。
【００１２】
標的された核酸分子の3'末端に新たに取り込まれた配列（オリゴヌクレオチドの5'テイルの複製により）を利用して、標的された核酸分子を増幅することもできる。
【００１３】
従って、本発明の一実施形態では、試料は、その3'部分が標的された核酸配列の3'末端に隣接する標的配列に実質的に相補的な配列を含有し、5'部分が5'テイルを形成する鋳型オリゴヌクレオチドと一緒にインキュベートされる。鋳型オリゴヌクレオチドは、その3'末端からの伸長を遅延させる改変を取り込んでいる。適切なポリメラーゼの存在下で、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルは、その3'末端からの標的配列の伸長により複製される。標的配列の3'伸長の結果として、核酸分子内に組み込まれている標的配列へのアニーリングと比べて、鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングは増強され、従って、鋳型オリゴヌクレオチドが3'末端に隣接する標的配列にアニーリングされると、鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長は促進される。次に、鋳型オリゴヌクレオチドそれ自体または新たに取り込まれた配列（本明細書では「第3のオリゴヌクレオチド」と呼ぶ）を単独で、または標的された分子内の配列と組み合わせて使用して、所望の標的配列、すなわち、3'末端に隣接する配列の特異的検出または増幅を可能にすることができる。
【００１４】
本発明の方法は、ライゲーション段階が必要ではなく、核酸3'末端に標的されている鋳型オリゴヌクレオチドに配列特異性が直接取り込まれる点で、ライゲーション媒介PCRとは異なっている。
【００１５】
従って、本発明の一態様は、3'末端に隣接しておらず核酸分子内に組み込まれている標的配列を含む分子の存在下で、3'末端に隣接している標的配列を有する核酸分子を試料から選択的に増殖するための方法であって、
（i）試料を、
（a）核酸分子の3'末端に隣接する標的配列に実質的に相補的な3'領域；
（b）鋳型オリゴヌクレオチドが、3'末端に隣接して位置するまたは核酸分子内に組み込まれている標的配列にアニーリングすると遊離の5'テイルが形成されるような核酸配列を含む5'テイルであって、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な配列を取り込む標的配列の3'末端の伸長のための鋳型となって、5'テイルに相補的な配列が標的配列に付加される5'テイル；及び
（c）前記鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長を遅延させる3'領域における改変
を有する鋳型オリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（ii）試料を、鋳型オリゴヌクレオチドと反対方向にプライムするための第2のオリゴヌクレオチド、及び任意選択で鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルとヌクレオチド配列を共有する第3のオリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（iii）試料の増幅を実行する段階であって、
（a）3'末端に隣接する標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングは、前記オリゴヌクレオチドの遅延された3'伸長の存在下での標的配列の3'末端からの伸長による鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルの複製によって、3'末端に隣接していない標的配列への前記オリゴヌクレオチドのアニーリングよりも安定化しており；
（b）3'末端に隣接する標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドの結果的に安定化したアニーリングにより、3'末端に隣接していない標的配列にアニーリングされた鋳型オリゴヌクレオチドの伸長と比較して、鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長の効率が高まり、
（c）鋳型オリゴヌクレオチド及び/または第3のオリゴヌクレオチドを第2のオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用して増幅が起こり、分子内に組み込まれている標的配列を含む核酸分子の存在下で3'末端に隣接する標的配列が選択的に増幅される段階と
を含む方法を提供する。
【００１６】
核酸分子は、DNA（cDNAを含む）もしくはRNAでもよく、またはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び/もしくは天然のヌクレオチドの類似物の組合せを含む分子でもよい。
【００１７】
本発明の方法に従えば、同一標的配列を共有する非切断DNA核酸分子の存在下で、切断の結果として、標的配列が3'末端に隣接している切断核酸分子の選択的増幅を実現することができる。
【００１８】
従って、本発明の追加の態様は、核酸分子内に組み込まれている標的配列を含む非切断分子の存在下で、分子の切断の結果である3'末端に隣接する標的配列を有する核酸分子を試料から選択的に増幅するための方法であって、
（i）試料を、
（a）核酸分子の3'末端に隣接する標的配列に実質的に相補的な3'領域；
（b）鋳型オリゴヌクレオチドが、切断されたまたは非切断の核酸分子にアニーリングすると遊離の5'テイルが形成されるような核酸配列を含む5'テイルであって、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な配列を取り込む標的配列の3'末端の伸長のための鋳型となって、5'テイルに相補的な配列が標的配列に付加される5'テイル；及び
（c）鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長を遅延させる3'領域における改変
を有する鋳型オリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（ii）試料を、鋳型オリゴヌクレオチドと反対方向にプライムするための第2のオリゴヌクレオチド、及び任意選択で鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルとヌクレオチド配列を共有する第3のオリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（iii）試料の増幅を実行する段階であって、
（a）核酸分子の切断の結果である3'末端に隣接する標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングは、前記オリゴヌクレオチドの遅延された3'伸長の存在下での標的配列の3'末端からの伸長による鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルの複製によって、非切断核酸分子における3'末端に隣接していない標的配列への前記オリゴヌクレオチドのアニーリングよりも安定化しており；
（b）切断された核酸分子への鋳型オリゴヌクレオチドの結果的に安定化したアニーリングにより、非切断核酸分子にアニーリングされた前記オリゴヌクレオチドの伸長と比較して、鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長の効率が高まり、
（c）鋳型オリゴヌクレオチド及び/または第3のオリゴヌクレオチドを第2のオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用して増幅が起こり、核酸分子内に組み込まれている標的配列よりも3'末端に隣接する標的配列が選択的に増幅され、非切断の核酸分子よりも切断された核酸分子が選択的に増幅される段階と
を含む方法を提供する。
【００１９】
一実施形態では、切断された及び非切断核酸分子はDNA分子である。
【００２０】
3'末端に隣接する標的配列を有する核酸分子の、分子内に組み込まれている標的配列を有する核酸分子との区別に加えて、鋳型オリゴヌクレオチドは、3'末端に隣接する配列が異なる核酸分子間の区別、すなわち、3'末端間の区別を可能にする。これは、配列特異的オリゴヌクレオチドプライマーに通常あるように、標的配列に特異的なヌクレオチド配列を3'領域に含む鋳型オリゴヌクレオチドのおかげである。従って、試料中の種々の3'末端からの3'末端に隣接する標的配列の選択が実現される。とりわけ、鋳型オリゴヌクレオチドが核酸分子にアニーリングすると、5'テイルの形成のために、鋳型オリゴヌクレオチドと3'末端に隣接する核酸配列間のミスマッチが、標的DNA配列の3'末端の伸長が妨げられるために、5'テイルの複製を妨げるであろう。この配置を利用して、3'末端に隣接する標的配列を組み込まれている標的配列から区別するだけではなく（5'テイルを介して）、3'末端に隣接する配列に差異が存在する3'末端も区別する鋳型オリゴヌクレオチドを設計することができる。
【００２１】
従って、本発明の追加の態様は、3'末端の混合集団の存在下で、3'末端に隣接する標的配列を有する核酸分子を試料から選択的に増幅するための方法であって、
（i）試料を、
（a）前記3'末端に隣接する標的配列に実質的に相補的な3'領域；
（b）鋳型オリゴヌクレオチドが、3'末端に隣接する標的細胞にアニーリングすると遊離の5'テイルが形成されるような核酸配列を含む5'テイルであって、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な配列を取り込む標的配列の3'末端の伸長のための鋳型となって、5'テイルに相補的な配列が標的配列に付加される5'テイル；及び
（c）前記オリゴヌクレオチドの3'伸長を遅延させる3'領域における改変
を有する鋳型オリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（ii）試料を、鋳型オリゴヌクレオチドと反対方向にプライムするための第2のオリゴヌクレオチド、及び任意選択で鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルとヌクレオチド配列を共有する第3のオリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（iii）試料の増幅を実行する段階であって、
（a）3'末端に隣接する標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドの特異的アニーリングは、鋳型オリゴヌクレオチドの遅延された3'伸長の存在下での標的配列の3'末端からの伸長による鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルの複製によって、3'末端に隣接する非相補的配列への鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングよりも安定化しており；
（b）3'末端に隣接する標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドの結果的に安定化したアニーリングにより、3'末端に隣接する非相補的配列にアニーリングされた前記オリゴヌクレオチドの伸長と比較して、鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長の効率が高まり、
（c）鋳型オリゴヌクレオチド及び/または第3のオリゴヌクレオチドを第2のオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用して増幅が起こり、3'末端の混合集団の存在下で3'末端に隣接する標的配列が選択的に増幅される段階と
を含む方法を提供する。
【００２２】
一実施形態では、核酸分子はDNA分子である。
【００２３】
鋳型オリゴヌクレオチドは、核酸分子の3'末端でハイブリダイズすると、その分子の3'伸長を遮断する改変された塩基を3'領域内に含んでいてよい。
【００２４】
好ましくは、鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長を遅延させる3'改変には、3'末端ヌクレオチドミスマッチ、3'末端に近接する鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における欠失もしくは挿入、これらの組合せ、または鋳型オリゴヌクレオチドの遅延された3'伸長を生じる他の任意の改変がある。
【００２５】
標的配列の3'末端の伸長による5'テイルの複製により、3'末端に隣接して位置する標的配列を有する核酸分子が選択的に増幅される。5'テイルの複製の不在の下では、3'伸長を遅延するもしくは妨げる鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における改変のために、アニーリングした鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長は起こらないか、またはごくわずかな速度で起こるかのどちらかであり、鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングを不安定化する。従って、5'テイルの複製はアニーリングを増強し、それによって、鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長の効率を高める。
【００２６】
3'末端に隣接して位置する標的配列の選択的増幅は、鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長を遮断することによっても実現することができる。鋳型オリゴヌクレオチドが3'伸長を遮断される場合、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルと配列を共有する追加の第3のオリゴヌクレオチドを、サーモサイクリック増幅を進行させるように増幅反応で利用する。従って、伸長が遮断されるために、しかし、さらに重要なのは、5'テイルの複製が起こることができないために、核酸分子内に組み込まれている標的配列にアニーリングされる鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長は起こることができず、従って、第3のオリゴヌクレオチドを使用した核酸の増幅は、核酸分子内に位置する標的配列を増幅することはないであろう。
【００２７】
鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長は起こることができるが、本発明に従った選択的増幅はそれでも実現される方法の変法は、標的配列内の改変された鋳型オリゴヌクレオチドを使用して、増幅されるとオリゴヌクレオチドを通じて逆に複製するのを防ぐことである。複製を防ぐ改変には、アッセイにおいて用いられる特定のポリメラーゼによるオリゴヌクレオチドの複製を妨げるまたは遮断する、鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域内への1つもしくは複数の塩基類似物の挿入または1つもしくは複数の脱塩基部位、あるいはこれらの任意の組合せがある。その結果、鋳型オリゴヌクレオチドの伸長産物は、それに続くPCRサイクルで複製することができない。例えば、Taq DNAポリメラーゼをDNAの増幅において使用する場合、DNAヌクレオチドを2-O-メチルRNAヌクレオチドなどのRNAヌクレオチドで置換しても、それでも鋳型オリゴヌクレオチドの標的配列へのハイブリダイズは可能であろう。しかし、鋳型オリゴヌクレオチドを通じての逆の複製は、改変されたヌクレオチドの存在のために遮断されるかまたは非効率的になるであろう。不完全な複製物は、それ以上の増幅サイクルには関与しないであろう。サーモサイクリングを進行させるためには、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルと配列を共有する第3のオリゴヌクレオチドを利用し、従って、5'テイルに相補的な伸長した3'である、3'末端に隣接する標的配列を有する核酸分子のみが増幅されるであろう。
【００２８】
従って、本発明の追加の態様は、3'末端に隣接しておらず核酸分子内に組み込まれている標的配列を含む分子の存在下で、3'末端に隣接する標的配列を有する核酸分子を試料から選択的に増幅するための方法であって、
（i）試料を、
（a）核酸分子の3'末端に隣接する標的配列に実質的に相補的な3'領域；
（b）鋳型オリゴヌクレオチドが3'末端に隣接して位置するまたは核酸分子内に組み込まれている標的配列にアニーリングすると、遊離の5'テイルが形成されるような核酸配列を含む5'テイルであって、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な配列を取り込む標的配列の3'末端の伸長のための鋳型となって、5'テイルに相補的な配列が標的配列に付加される5'テイル；及び
（c）前記鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長を遮断する3'領域における改変、または3'伸長を可能にするが、前記オリゴヌクレオチドの3'領域における前記オリゴヌクレオチドの複製を妨げるまたは遮断する鋳型オリゴヌクレオチドのハイブリダイズ領域における改変
を有する鋳型オリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（ii）試料を、鋳型オリゴヌクレオチドと反対方向にプライムするための第2のオリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（iii）DNA試料を、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルとヌクレオチド配列を共有し、3'伸長が妨げられずに進行する第3のオリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（iv）試料の増幅を実行する段階であって、
（a）鋳型オリゴヌクレオチドの遮断された3'伸長の存在下で、またはそれに続く複製が妨げられるもしくは遮断される鋳型オリゴヌクレオチドの妨げられていない3'伸長の存在下で、鋳型オリゴヌクレオチドが3'末端に隣接する標的配列にアニーリングする場合は、試料中の核酸分子への鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングに続いて鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルが複製されるが、鋳型オリゴヌクレオチドが核酸分子内に組み込まれている標的配列にアニーリングする場合は、試料中の核酸分子への鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングに続いて鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルが複製されず；
（b）増幅が第2及び第3のオリゴヌクレオチドと共に進行し、複製された5'テイルにより3'末端に隣接して位置する標的配列を選択的に増幅し、5'テイルの複製の不在のために、及び鋳型オリゴヌクレオチドの遮断された3'伸長または鋳型オリゴヌクレオチドの遮断された複製のどちらかのために、核酸分子内に組み込まれている標的配列の増殖は進行しない段階と
を含む方法を提供する。
【００２９】
追加の態様に従って、本発明は、核酸分子内に組み込まれている標的配列を含む非切断の核酸分子の存在下で、分子の切断の結果である3'末端に隣接する標的配列を有する核酸分子を試料から選択的に増幅するための方法であって、
（i）DNA試料を、
（a）核酸分子の3'末端に隣接する標的配列に実質的に相補的な3'領域；
（b）鋳型オリゴヌクレオチドが、切断されたまたは非切断の核酸分子にアニーリングすると遊離の5'テイルが形成されるような核酸配列を含む5'テイルであって、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な配列を取り込む標的配列の3'末端の伸長のための鋳型となって、5'テイルに相補的な配列が標的配列に付加される5'テイル；及び
（c）前記鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長を遮断する3'改変；または3'伸長を可能にするが、前記オリゴヌクレオチドの3'領域における前記オリゴヌクレオチドの複製を妨げるまたは遮断する鋳型オリゴヌクレオチドのハイブリダイズ領域における改変
を有する鋳型オリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（ii）試料を、鋳型オリゴヌクレオチドと反対方向にプライムするための第2のオリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（iii）試料を、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルとヌクレオチド配列を共有し、3'伸長が妨げられずに進行する第3のオリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（iv）試料の増幅を実行する段階であって、
（a）前記オリゴヌクレオチドの遮断された3'伸長の存在下で、またはそれに続く複製が妨げられるもしくは遮断される鋳型オリゴヌクレオチドの妨げられていない3'伸長の存在下で、核酸分子の切断の結果である3'末端に隣接する標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングに続いて鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルが複製されるが、鋳型オリゴヌクレオチドが非切断の核酸分子内に組み込まれている標的配列にアニーリングする場合は、核酸分子の切断の結果である3'末端に隣接する標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングに続いて鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルが複製されず；
（b）増幅が第2及び第3のオリゴヌクレオチドと共に進行し、複製された5'テイル配列によって3'末端に隣接する標的配列を選択的に増幅し、5'テイルの複製の不在のために、及び鋳型オリゴヌクレオチドの遮断された3'伸長、または鋳型オリゴヌクレオチドの遮断された複製のどちらかのために、非切断分子内に組み込まれている標的配列の増幅が進行せず、非切断の核酸分子よりも切断された核酸分子が選択的に増幅される段階と
を含む方法を提供する。
【００３０】
追加の態様に従って、本発明は、異なる3'末端を有する分子の混合集団の存在下で、3'末端に隣接する標的配列を有する核酸分子を試料から選択的に増幅するための方法であって、
（i）試料を、
（a）3'末端に隣接する標的配列に実質的に相補的な3'領域；
（b）鋳型オリゴヌクレオチドが、3'末端に隣接する標的配列にアニーリングすると遊離の5'テイルが形成されるような核酸配列を含む5'テイルであって、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な配列を取り込む標的配列の3'末端の伸長のための鋳型となって、5'テイルに相補的な配列が標的配列に付加される5'テイル；及び
（c）鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長を遮断する3'領域の改変、または3'伸長を可能にするが、前記オリゴヌクレオチドの3'領域における前記オリゴヌクレオチドの複製を妨げるまたは遮断する鋳型オリゴヌクレオチドのハイブリダイズ領域における改変
を有する鋳型オリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（ii）試料を、鋳型オリゴヌクレオチドと反対方向にプライムするための第2のオリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（iii）DNA試料を、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルとヌクレオチド配列を共有し、3'伸長が妨げられずに進行する第3のオリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（iv）前記試料の増幅を実行する段階であって、
（a）鋳型オリゴヌクレオチドの遮断された3'伸長の存在下で、またはそれに続く複製が妨げられるまたは遮断される鋳型オリゴヌクレオチドの妨げられない3'伸長の存在下で、鋳型オリゴヌクレオチドが3'末端に隣接する標的配列にアニーリングする場合は、標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドの特異的アニーリングに続いて鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルが複製されるが、鋳型オリゴヌクレオチドが3'末端に隣接する非相補的配列にアニーリングする場合は、標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドの特異的アニーリングに続いて鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルが複製されず；
（b）増幅が第2及び第3オリゴヌクレオチドと共に進行し、複製された5'テイル配列によって3'末端に隣接して位置する標的配列を選択的に増幅し、5'テイルの複製の不在のために、または鋳型オリゴヌクレオチドの遮断された3'伸長、または鋳型オリゴヌクレオチドの遮断された複製のどちらかのために、3'末端に隣接する非相補的配列の増幅が進行せず、3'末端の混合集団の存在下で、3'末端に隣接する標的配列が選択的に増幅される段階と
を含む方法を提供する。
【００３１】
一実施形態では、核酸分子はDNA分子である。
【００３２】
鋳型オリゴヌクレオチドは、核酸分子の3'末端でハイブリダイズされると、その分子の3'伸長を遮断する改変された塩基をその3'領域内に含んでいてよい。
【００３３】
好ましくは、鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長を遮断する3'改変には、3'末端での1つもしくは複数の非伸長性の部分またはヌクレオチド類似物、例えば、単一3'末端非伸長性塩基または塩基類似物の取込み、3'末端に近接する鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における3'末端非伸長性塩基及びヌクレオチドミスマッチの組合せ、あるいは、3'末端に近接する鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における脱塩基部位の取込みがある。さらに好ましくは、非伸長性塩基は、2',3'ジデオキシヌクレオチド、3' C3、C18もしくは他の長さスぺーサー、3'リン酸化ヌクレオチド、「ペプチド核酸」塩基、「固定核酸」（LNA）塩基、ヌクレオチドアミン誘導体、ウラシルDNAグリコシラーゼで処理したウラシル、RNAもしくは2' O-メチルRNA残基、またはこれらの組合せから選択される。
【００３４】
伸長を遮断する他の方法は、使用するポリメラーゼの種類によって適切になる可能性があることを当業者であれば認識するであろう。例えば、プルーフリーディングポリメラーゼを使用したい場合は、ヌクレオチドミスマッチと組み合わせたホスホロチオエートを使用して、伸長を遮断することができると考えられる。
【００３５】
好ましくは、第2のオリゴヌクレオチドは、追加の鋳型オリゴヌクレオチド、すなわち、鋳型オリゴヌクレオチドの特徴を有する、または非鋳型オリゴヌクレオチドであるのどちらかであり、例えば、鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長が遮断されるのではなく、遅延されるだけである場合において、鋳型オリゴヌクレオチドの伸長産物に相補的なヌクレオチド配列の単一領域からなる、または鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長が遮断される場合において、第3のオリゴヌクレオチドの伸長産物に相補的なヌクレオチド配列の単一領域からなる。
【００３６】
好ましい実施形態では、ES-PCRにより増幅されたDNA分子の3'末端は、配列特異的制限エンドヌクレアーゼによる切断の結果である。さらに好ましくは、制限エンドヌクレアーゼは配列特異的メチル化感受性制限酵素であり、本発明の方法に従って、DNAメチル化により阻害される、HpaII、HhaI、BstuI、NotI、SmaI及びSacIIなどの制限酵素、またはメチル化DNAを選択的に切断する、GlaI及びBisIなどの制限酵素の使用によって、メチル化DNAよりも非メチル化DNAを選択的に増幅することができる、または逆にすることも可能である。このようにして、本発明の方法は、2つのDNA試料間のメチル化状態の差の検出を可能にし、メチル化の変化が病的状態に関連している病変組織の検出のためのアプローチを提供する。例えば、DNAの脱メチル化も、他の特定のDNA配列の過剰メチル化も含むメチル化状態の変化は、細胞の癌状態への変換と関連がある。従って、追加の態様では、本発明は、切断及び非切断DNAを含むDNA試料から切断DNAを選択的に増幅するためのキットであって、本発明に従って、（i）鋳型オリゴヌクレオチド、（ii）第2のオリゴヌクレオチド、及び（iii）第3のオリゴヌクレオチドを含むキットを提供する。
【００３７】
追加の好ましい実施形態では、DNAの切断部位は、制限部位の存在または不在を区別するように選択され、それによって、単一ヌクレオチド多型または突然変異の検出など、DNA試料間の配列差の検出を可能にする。従って、本発明の方法は、遺伝子指紋法、またはゲノム配列における改変が付随する遺伝病の診断、または癌細胞を示している可能性のある特定の突然変異の検出を目的とする遺伝子型の同定を可能にする。
【００３８】
モノヌクレオチド反復を含む単純ヌクレオチド反復における、1つまたは複数の塩基対の欠失などの不安定性の検出は、本発明の追加の実施形態に従って実現してよい。その認識配列の外側の限定された距離に切断部位を有する、本明細書で「隣接カッター」と呼ばれる制限酵素に対するモノヌクレオチド反復近くに制限酵素認識配列が存在することを利用して、欠失変異形の存在を区別することができる。そのような制限部位がモノヌクレオチド反復近くに都合よく位置していなければ、例えば、第1巡目のPCRによりそのような制限部位を導入することができる。塩基対の欠失が切断部位と認識配列の間で起きているところでは、非欠失反復DNAの消化産物は、欠失反復DNAの消化産物とは、その3'末端に隣接するヌクレオチド配列が異なっているであろう。これは、1つまたは複数の塩基対の欠失により、切断部位が3'方向に移動し、必然的に、切断部位の配列が変化するからである。従って、欠失変異形に特異的にアニーリングする鋳型オリゴヌクレオチドの設計を使用して、そのような変異形を検出することができる。
【００３９】
例えば、鋳型オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの塩基対が反復配列から欠失している欠失変異形の消化により生じるDNAフラグメントの長さに合った長さの相補的モノヌクレオチド反復を取り込んでよい。鋳型オリゴヌクレオチドの反復配列は、消化フラグメントの3'末端に隣接する相補的反復配列へのアニーリングを可能にするであろうが、欠失変異形の消化フラグメントの3'伸長を可能にするのみであろう。これは、非欠失反復DNAから生じるフラグメントは、欠失変異形のヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を必ず有しており、鋳型オリゴヌクレオチドと消化フラグメントの3'末端との間に1つまたは複数のミスマッチを生じ、それによって、非欠失反復DNAの消化フラグメントの3'伸長を妨げるからである。鋳型オリゴヌクレオチドのこのような設計は、DNA分子内に組み込まれている同一の標的配列よりも3'末端に隣接して位置する標的DNAを選択的に増幅するその能力を変えることはないであろうが、ある種の3'末端を有するDNAを区別する追加の能力を実証する。
【００４０】
制限部位が反復配列中に位置していようと、反復配列の下流に位置していようと、反復配列の長さが変化すれば、制限酵素切断の部位が変化し、欠失を受けなかった反復DNAから生成されたフラグメントとは異なる配列を有するフラグメントを生じるであろう。
【００４１】
モノヌクレオチド反復における、1つまたは複数の反復の欠失などの不安定性の検出は、腫瘍細胞のマイクロサテライトにおいて存在することが注目されているように、マイクロサテライト不安定性を測定するためのアプローチを提供する。本発明のこの特定の実施形態は、ジヌクレオチドまたは制限酵素認識部位が記載の通りに適切に位置している（または導入される）トリヌクレオチド及びテトラヌクレオチド反復などの他の反復における不安定性の検出に等しく適用されることは当業者には明らかであると考えられる。
【００４２】
隣接カッターを利用する本発明の実施形態は、核酸分子における塩基対の挿入の検出にも適用してよい。
【００４３】
核酸変異形が塩基対の挿入から生じる場合は、5'方向への切断部位の移動が起こり、それによって、切断から生じる3'末端に隣接し、挿入が存在しない場合とは異なる配列を生じるであろう。隣接カッターの使用を、いかなる核酸分子の欠失または挿入の検出にも適用することができると考えられること、及び隣接カッターの適用はモノヌクレオチド反復配列の検出に限定されるものではなく、1つまたは複数の塩基対の欠失または挿入から生じるいかなる核酸分子変異形にも等しく適用されることは、当業者には明らかであると考えられる。
【００４４】
従って、本発明の追加の態様は、欠失または挿入が制限酵素認識部位と認識部位の外側の限定された距離に位置するその切断部位との間で起こる、試料中の核酸分子における欠失または挿入の存在または不在を検出するための方法であって、
（i）試料を、認識部位の外側の限定された距離で切断部位を有する制限酵素で消化する段階と、及び
（ii）3'末端に隣接するヌクレオチド配列が欠失または挿入の存在または不在に依存し、3'または5'方向のどちらかへの切断部位の移動が、それぞれ欠失または挿入の存在下で起きる、切断によって生成される3'末端に隣接するヌクレオチド配列を決定する段階と
を含む方法を提供する。
【００４５】
隣接カッターによる切断から生じる3'末端に隣接するヌクレオチド配列の決定は、ES-PCRにより、または他の選択的増幅アプローチにより実現することができる。
【００４６】
追加の実施形態では、本発明の方法を、RNA転写物変異形の検出及び定量化のために利用してよい。mRNA複製cDNAは、その対応する5'mRNA配列に従って、一定範囲の3'末端を有するcDNAの集団を含むであろう。エキソン配列がわかっている場合は、最初のエキソンの配列固有性に従って、代わりにスプライスされるmRNAを区別する鋳型オリゴヌクレオチドを調製することができる。
【００４７】
本発明に従った鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルは、鋳型オリゴヌクレオチドが3'末端に隣接する標的配列を有する核酸分子にアニーリングする場合にのみ、標的配列の3'末端の伸長のための鋳型となる。鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な標的配列の3'末端の伸長により、5'テイルに相補的な配列が標的配列に付加される。従って、鋳型オリゴヌクレオチドの標的配列へのアニーリング及び鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な標的配列の3'伸長を可能にする反応条件に従って、3'末端に隣接する標的配列を最初に有する試料中の核酸分子もこの時点で、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的である標的配列の追加配列5'を含む。5'テイルに相補的なこの配列を利用して、3'末端に隣接する標的配列を有し試料中で始まる分子を検出することができる。
【００４８】
従って、本発明の追加の態様は、3'末端に隣接する標的配列を有する核酸分子を試料中で検出するための方法であって、
（i）試料を、
（a）核酸分子の3'末端に隣接する標的配列に実質的に相補的な3'領域；
（b）鋳型オリゴヌクレオチドが、3'末端に隣接して位置する標的配列にアニーリングすると遊離の5'テイルが形成されるような核酸配列を含む5'テイルであって、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な配列を取り込む標的配列の3'末端の伸長のための鋳型となって、5'テイルに相補的な配列が標的配列に付加される5'テイル；及び
（c）前記鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長を遅延させる3'領域における改変
を有する鋳型オリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（ii）鋳型オリゴヌクレオチドを試料にアニーリングさせ、3'末端に隣接する標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングが、それに続く5'テイルに相補的な標的配列の3'伸長を可能にする反応条件を提供する段階と、
（iii）前記オリゴヌクレオチドの遅延されたまたは遮断された3'伸長の存在下で、5'テイルに相補的な標的配列の3'伸長を可能にする反応条件を提供する段階と、
（iv）（1）3'末端に隣接する標的配列の3'伸長から生じる鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な核酸配列を検出し、または
（2）3'末端に隣接する標的配列の3'伸長から生じる鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な核酸配列を利用して、3'末端に隣接する標的配列を有する核酸分子を複製すること
により3'末端に隣接する標的配列を有する核酸分子を検出する段階と
を含む方法を提供する。
【００４９】
鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な核酸配列の検出は、既知の配列の核酸分子を検出する任意の既知の手段を通じて、例えば、5'テイルに相補的な標的配列の3'伸長反応を、α32P-dCTPもしくはCy5-dCTPなどの放射標識したもしくは蛍光標識したヌクレオシド三リン酸またはビオチン標識したヌクレオシド三リン酸で直接標識化することにより、あるいは取り込まれた相補的配列を配列特異的プローブを使用してハイブリダイゼーションを通じて捕獲することにより、あるいは鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な核酸配列の直接捕獲により、実現してよい。
【００５０】
鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な核酸配列は、3'末端に隣接する標的配列を有する核酸分子を種々の手段により複製するのに利用してよい。例えば、取り込まれた配列に相補的なプライマーを使用して、標的配列を通じて逆に伸長する合成をプライムすることができる。代わりに、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルは、5'テイルに相補的な配列の付加がポリメラーゼによる標的配列を通じた複製のための鋳型となるように、T7 RNAポリメラーゼなどのポリメラーゼのためのプロモーター及び開始部位を提供してよい。3'末端に隣接する標的配列を有する複製された核酸分子は、ハイブリダイゼーション及びPCRを含む前掲のアプローチなどの、既知の配列の核酸分子を検出する任意の既知の手段により検出することができる。
【００５１】
RNAから複製されたcDNAは本発明の目的に適切な核酸であることは、当業者には十分に明白であると考えられる。
【００５２】
本明細書全体を通じて、状況が他の方法で要求しない限り、単語「含む（comprise、comprises、comprising）」は記載された段階もしくは要素または段階もしくは要素のグループを包含することを意味するが、他のいかなる段階もしくは要素または段階もしくは要素のグループも排除することを意味するものではないことは理解されるであろう。
【００５３】
不定冠詞（a、an）は、1つまたは複数（すなわち、少なくとも1つ）の冠詞の文法的対象物に言及するために本明細書では使われている。例証として、「1要素（an element）」は1つの要素または複数の要素を意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
定義
本発明の状況において使用される場合、用語「試料」とは、核酸分子を含む、典型的にはDNA及び/またはRNAを含む任意の生体試料のことである。試料は、組織、細胞、またはその抽出物でもよく、核酸分子の精製された試料でもよい。用語「試料」の使用は、核酸分子の3'末端に隣接するか、または核酸分子内に組み込まれているかのどちらかの標的配列の存在を意味するものではない。核酸分子内に組み込まれている標的配列の試料中における存在は、3'末端に隣接する標的配列の選択的増幅に必要ではない。従って、鋳型オリゴヌクレオチドは、標的配列が試料中に存在し、核酸分子内に組み込まれて位置しているかどうかとは無関係に、3'末端に隣接する標的配列を有する核酸分子を増幅する働きをするであろう。
【００５５】
本発明の状況において使用される場合、用語「標的配列」とは、鋳型オリゴヌクレオチドがその3'領域に標的配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を有するおかげで、本発明の鋳型オリゴヌクレオチドが特異的にアニーリングする核酸配列のことである。3'末端に隣接して位置する場合、標的配列は、ES-PCRにより選択的に増幅される核酸分子の代表である。
【００５６】
本発明の状況において使用されるように、用語「3'末端に隣接している」とは、典型的には末端ヌクレオチドを含む、核酸分子の3'末端からすぐ5'側のヌクレオチド及び3'末端から伸長している5'側のヌクレオチドの領域のことである。3'末端を有する核酸分子の末端ヌクレオチドから始まる「3'末端に隣接する」領域は、長さが、標的配列に相補的な鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域に一致する。
【００５７】
本発明の状況において使用されるように、語句「核酸分子内に組み込まれている」とは、上記の3'末端に隣接していないが、3'末端から5'側に少なくとも1ヌクレオチド3'末端から移動した位置のことである。従って、核酸分子内に組み込まれている標的配列は、3'末端から1つまたは複数のヌクレオチドの距離の核酸分子内に位置していてよい。
【００５８】
本発明の状況において使用される場合、用語「標的された分子」または「標的された核酸分子」とは、3'末端に隣接して位置する標的配列を有し、本発明の方法によりそれが選択的に増幅される核酸分子のことである。
【００５９】
本発明の状況において使用される場合、用語「切断された核酸分子」とは、3'末端のある核酸を生成する制限エンドヌクレアーゼまたは他の任意の酵素により消化されている分子を指すことを目的にしており、3'末端を生成する制限エンドヌクレアーゼまたは他の酵素により消化されたDNAを包含する。
【００６０】
本発明の状況において使用される場合、用語「鋳型オリゴヌクレオチド」または「鋳型にするオリゴヌクレオチド」とは、その3'領域が核酸にアニーリングすると5'テイルを形成する5'領域を含み、核酸分子の3'末端に隣接して位置すると、それがアニーリングする標的配列の3'伸長を可能にする核酸オリゴヌクレオチドのことである。本発明のある種の実施形態では、鋳型オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドの3'伸長が起こるために、PCR単位複製配列に取り込まれる。そのような場合、鋳型オリゴヌクレオチドは順方向プライマーとして働く。
【００６１】
他の実施形態では、鋳型オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドの3'伸長が遮断されるために、またはそのオリゴヌクレオチドの3'領域の複製が遮断されるために、PCR単位複製配列に取り込まれることはない。これらの背景では、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルと配列を共有する追加の「第3の」オリゴヌクレオチドは順方向プライマーとして使われる。
【００６２】
本発明の鋳型オリゴヌクレオチドは、3'伸長を遅延するもしくは遮断する、またはオリゴヌクレオチドからの複製を遮断するために、オリゴヌクレオチドに取り込むことができるRNAヌクレオチド、ヌクレオチド類似物、または他の非核酸分子などの非DNAヌクレオチドを含んでいてよい。当業者であれば、オリゴヌクレオチドの3'伸長を遅延する、またはオリゴヌクレオチドの3'伸長もしくは複製を遮断するいかなる方法も、選ばれた方法が標的配列の3'伸長を妨げないという条件で、本発明に従って鋳型オリゴヌクレオチドに適用することができることを認識するであろう。
【００６３】
本発明の状況において使用される場合、用語「実質的に相補的な」とは、本発明に従って、適切なハイブリダイゼーションが起こり、核酸分子内に組み込まれている標的配列よりも3'末端に隣接する標的配列を有する核酸分子の選択的増幅を実現するような、核酸間の相補性のことである。従って、オリゴヌクレオチド中のすべての塩基が、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすることになる分子内の領域に相補的である必要はなく、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがその「標的」分子を認識してハイブリダイズすることができるほどの相補的塩基を含有しているだけでよい。従って、用語「実質的に相補的な」は、1つまたは複数のミスマッチ、欠失、挿入、欠失と挿入の組合せ、または核酸の特異的アニーリングを無効にしない他の任意の配列改変を取り込んでいる核酸を包含する。
【００６４】
本発明の状況において使用されるように、用語「遅延された3'伸長」とは、オリゴヌクレオチドの3'伸長が、3'伸長を遅延することになる改変が存在しない場合よりも非効率的に起こるように、進行することを妨げられるが遮断はされない鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長のことである。従って、この背景では、鋳型オリゴヌクレオチドは、増幅反応において順方向プライマーとして機能することになる。
【００６５】
本発明の状況において使用されるように、用語「遮断された3'伸長」とは、追加の「第3の」オリゴヌクレオチド（このオリゴヌクレオチドは鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルと配列を共有しており、3'伸長が起こることになる）が反応に添加されなければ、増幅反応が進行しない、または役に立たない速度で進行するような、鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長の実際面での不在のことである。
【００６６】
本発明の状況において使用されるように、用語「増幅」とは、標的された分子の1つまたは複数の複製を作ることであり、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による核酸分子の増幅を含むが、これに限定されるものではない。PCRとは、DNAの指数関数的増幅に加えて、DNAの直線的、非指数関数的増幅のことでもよく、当業者であれば、どちらの形式の増幅でも本発明の目的に適していることを認識するであろう。
【００６７】
本発明の状況において使用されるように、用語「隣接カッター」とは、核酸をその認識部位から限定された距離で切断する制限エンドヌクレアーゼのことである。
【００６８】
本発明により例示されている末端特異的PCRまたはES-PCRの原理は図１に示されている。ES-PCRは、何らかの形で部分的にまたは完全に伸長を遮断されている、本明細書では鋳型オリゴヌクレオチドと呼ばれる少なくとも1つのオリゴヌクレオチドの使用に依拠している。鋳型オリゴヌクレオチドは、例えば、制限消化により生成される核酸分子の3'末端に重複するように設計されている。鋳型オリゴヌクレオチドの3'部分は、核酸分子の切断された末端に隣接する特定の配列に実質的にマッチしており、その5'部分は、鋳型オリゴヌクレオチドが核酸分子にアニーリングするとテイルを形成する核酸配列を含有する。
【００６９】
鋳型オリゴヌクレオチドが、切断された核酸分子にアニーリングすると、鋳型オリゴヌクレオチドの伸長は遅延されるかまたは遮断されるが、標的された分子の3'末端は伸長されることができ、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルの複製を可能にする。
【００７０】
例えば、制限酵素により所望の制限部位で切断されていないために核酸分子内に組み込まれている標的配列は、鋳型オリゴヌクレオチドとアニーリングすることができるが、アニーリング部位に3'末端が不在であるために、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルの複製を可能にする標的配列の3'伸長は起こることができない。重要なのは、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な遊離の3'末端の伸長により標的配列に付加されたヌクレオチド配列は、引き続いて標的された核酸分子の増幅で使用される。付加された配列は、ES-PCRの改変、例えば、伸長された3'配列を含有する分子を選択的に捕獲するのに使用することができると考えられるビオチン標識されたヌクレオチドなどのタグの取込みも可能にする。2種類の異なる鋳型オリゴヌクレオチド型の使用は実証されるが、鋳型オリゴヌクレオチドの3'末端に取り込まれ、伸長を遅延するまたは遮断するいかなる設計特性でも、本発明の方法を実現するのに使用することができることは当業者には明らかであると考えられる。
【００７１】
典型的に、本発明に従って分析されることになる核酸分子は、DNAを含んでいる。しかし、当業者であれば、本発明の方法は、適切な試薬、例えば、RNAの増幅または複製に適したRNAポリメラーゼまたは逆転写酵素の供給と共に、RNAなどの他の核酸分子にも適用可能であることを容易に認識するであろう。鋳型オリゴヌクレオチドの5'領域を複製することにより形成される取り込まれたテイルは、直接検出してもよいし、サーモサイクリング以外の手段により標的核酸配列を複製するのに使用してもよいことも容易に認識されるであろう。
【００７２】
一実施形態では、鋳型オリゴヌクレオチドは標的配列に弱くアニーリングすることができるが、鋳型オリゴヌクレオチドからの3'伸長が、その3'末端での標的配列との意図的なミスマッチのために、不十分であるように設計される。しかし、鋳型オリゴヌクレオチドが3'末端に隣接する標的配列にアニーリングするならば、核酸、例えば、ゲノムDNAは、鋳型オリゴヌクレオチドを鋳型として使用して3'伸長することができる。鋳型オリゴヌクレオチドと標的された核酸分子間のハイブリダイズ領域の長さがその後に増加すると、鋳型オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを安定化し、鋳型オリゴヌクレオチドが、標的核酸分子上でこの時点でプライムし、伸長する効率を大幅に高める。ミスマッチした鋳型オリゴヌクレオチドが単位反復配列に取り込まれると、初めにミスマッチしていた鋳型オリゴヌクレオチドがこの時点でその標的配列と完全にマッチするので、PCRは効率的に続く。一例では、非切断DNA上でのプライミングは、鋳型オリゴヌクレオチドの短い3'領域と鋳型オリゴヌクレオチド上の末端ミスマッチの組合せを通じて制限される。末端ミスマッチ同様に、他の手段を使用して鋳型オリゴヌクレオチドからのプライミングを制限することができる。
【００７３】
末端ミスマッチを利用する本発明の実施形態では、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルの複製が起きていなければ、伸長は非効率的である。鋳型オリゴヌクレオチドの伸長を減少させるまたは遅延させる他のいかなる改変も、例えば、鋳型オリゴヌクレオチドにおける意図的な短い欠失または挿入の取込みを使えば、ES-PCRを実現することができると考えられる。
【００７４】
本発明の追加の実施形態では、鋳型オリゴヌクレオチドは、非伸長性塩基のあるその3'末端で停止することができる、または3'伸長を妨げることになる改変を含むことができる。完全に末端遮断されたES-PCRオリゴヌクレオチドの場合は、追加の第3のオリゴヌクレオチドが、標的された核酸分子の最終的伸長を可能にする反応において必要とされる。追加の第3のオリゴヌクレオチドは、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルの核酸配列からなっていてもよく、標的配列と重複して一部の標的特異的配列を含んでいてもよい。増幅のために使用される第3のオリゴヌクレオチドプライマーが鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルの配列のみからなるのであれば、遺伝子特異的またはフラグメント特異的であるが、共通の伸長を含有する一組の鋳型オリゴヌクレオチドを使用して、異なる核酸分子の増幅を多重化することが可能である。この実施形態では、C3スぺーサー、ジデオキシヌクレオチドでの停止、リン酸化、アミン、脱塩基部位、ウラシル（ウラシルDNAグリコシラーゼとのインキュベーションと組み合わせた）及び/または2' O-メチルRNA残基の使用を含むが、これらに限定されることはない伸長を遮断するいかなる手段でも使用することができる。DNAポリメラーゼにより複製することができないDNA類似物を使用する場合は、鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長にかかわらず、ES-PCRを実現することができる。遮断された鋳型オリゴヌクレオチドとミスマッチ鋳型オリゴヌクレオチドの組合せも、本発明に従って使用することができる可能な変法である。
【００７５】
鋳型オリゴヌクレオチドは、核酸分子の3'末端でハイブリダイズされると、その分子の3'伸長を遮断することになる改変された塩基をその3'領域内に含んでいてよい。これにより、鋳型オリゴヌクレオチドの改変された塩基と3'末端でハイブリダイズせず、それによって、3'伸長を遮断されない3'末端に隣接する標的配列を有する標的DNAの選択的増幅が可能になる。
【００７６】
鋳型オリゴヌクレオチドは、核酸分子の3'末端のハイブリダイゼーションが起こる可能性がある複数の考えられる位置にまたがる標的配列に相補的な核酸配列を含んでいてよい。従って、鋳型オリゴヌクレオチド上での3'末端のハイブリダイゼーションの位置次第では、こうして得られる鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルは、標的された核酸分子に相補的な配列を含んでいても含まなくてもよい。核酸分子の3'伸長が、標的された核酸分子の3'末端に特有のハイブリダイゼーションの位置からのみ起こるように、ハイブリダイズした核酸分子の3'末端からの3'伸長を遮断する改変された塩基は、鋳型オリゴヌクレオチド中の、標的されていない核酸分子の3'末端のハイブリダイゼーションを代表する3'末端ハイブリダイゼーションのための1つまたは複数の考えられる位置に置かれていてよい。
【００７７】
他の増幅法の場合と同じように、アニーリング時間、伸長時間、及び温度などの条件は特定の配列に依拠しており、個々の最適化を必要とする。発明者は、2段階またはそれより多い段階が、ES-PCRの設計により大きな柔軟性を与えるPCR反応において有用であることを見出した。一般に、比較的低いハイブリダイゼーション温度及び比較的長いインキュベーション時間が典型的に第1段階では使われる。なぜならば、鋳型オリゴヌクレオチドの通常短い（低Tm）部分上での標的のプライミングは比較的非効率的であると予想されるからである。ミスマッチした及び挿入/欠失鋳型オリゴヌクレオチドの場合は、結合が標的配列の3'伸長により安定化された後に最終伸長をさせるために、長期のインキュベーション時間が典型的に第1段階では使われる。最初の5サイクル後、PCRは大部分がその全長に沿って標的にマッチするオリゴヌクレオチドにより推進されていると予測されるので、第2段階では比較的高い温度（及び通常は、比較的短いインキュベーション時間）を用いることができる。第2段階では比較的短い変性時間（及び、いくつかの場合は、比較的低い温度、これらの例では示されていない）を用いることができる。なぜならば、この時点で反応を支配しているPCR産物は、第1段階中は重要であると予想される種々のDNA分子よりもはるかに容易に変性されるからである。比較的短い変性時間は、Taq DNAポリメラーゼの不活化が少なくなる点で有利である。
【００７８】
しかし、2段階の使用はES-PCRにとり必要条件ではない。特に完全に遮断された鋳型プライマーでは、鋳型オリゴヌクレオチドにおける比較的長い相補的領域の使用によって、1段階PCRを開発することができる。
【００７９】
試料の制限酵素消化はES-PCRに先立って別々の反応において実行してもよく、PCR直前に単一消化増幅反応混合において実行してもよい。
【００８０】
共通配列が増幅されることになるDNAの末端に付加される他の方法の場合と同じように（Elnifro,EMら、2000年；Wittwer,CTら、2001年）、ES-PCRはマルチプレックスPCRのために容易に適応することができる。
【００８１】
ES-PCR産物は、ゲル電気泳動法、SYBRグリーンなどの非特異的DNA結合色素を使用したリアルタイムモニタリング、配列特異的蛍光プローブまたはアレイへのハイブリダイゼーションを含むが、これらに限定されるものではない、当業者に公知の標準方法により検出してよい。
【００８２】
本発明が容易に理解され実際的に実施されるように、以下の非限定的実施例により特定の好ましい実施形態をここで説明する。
【実施例１】
【００８３】
切断DNAを求めて選択するための単一ミスマッチ鋳型オリゴヌクレオチドの使用
標的される領域は、ヒト染色体21上のバンド21q22.3に存在するタンデム反復（コンセンサスサイズ74塩基対、GCGTGGCTGTCTCCACTGAGTCCCGGGCACGGGTCAGGCTAACCGCGGGAGGAATTTAATCTAGAGTTTAACTT）である。ヒトゲノム（2004年5月会議）では、反復領域のゲノムサイズは2218塩基対、chr21：46536826〜46539043である。制限酵素BstuIを使用して、下線を引いたCGCG部位でゲノムDNAを切断した。BstUIによる切断はシトシンメチル化により遮断されるので、制限末端は非メチル化DNAからのみ形成されることになる。
【００８４】
この実施例では、鋳型オリゴヌクレオチドは「順方向」プライマーとしても働き、標的ゲノムDNAとの3'末端ミスマッチを有する。使われる配列及びプライマーは図２に示している。順方向ミスマッチプライマー及び鋳型オリゴヌクレオチドは21qTFMLHC/T、5' CACTCCACTCGGGAGGAATTTAATCTAGC 3'であり、逆方向完全マッチドプライマーは21qTRC、5' ACCCGTGCCCGGGACTCA 3'である。下線を引いた塩基は最初の標的配列とマッチしない塩基である。
【００８５】
PCRは、25マイクロリットルの20mMトリス-HCl（pH8.4）、50mM KCl、2.7mM MgCl2、0.2mM dCTP、0.2mM dGTP、0.2mM dATP、0.4mM dUTP、200nMプライマー、1/125,000希釈SYBR（登録商標）グリーンI（Molecular Probes社製、カタログ番号S7563）、20nMフルオレセインキャリブレーション色素（BioRad社製）、1ユニットのBstUI（New England Biolabs社製）及び0.5ユニットのプラチナTaqポリメラーゼ（Invitrogen社製）で実行した。コルベットロータージーン（Corbett RotorGene）3000は、60℃で5分間、95℃で2分間、次に95℃で15秒間、65℃で3分間を5サイクル、次に95℃で5秒間、65℃で30秒間を40サイクルで作動するように設定した。BstUI消化は60℃での最初の5分間インキュベーション中に起きる。最初の5サイクルにおける比較的長い伸長時間は、標的/プライマーアニーリングが不安定である条件の下での標的DNAの伸長を可能にするためである。
【００８６】
フルオレセインが存在するのは、反応を時にはBioRad Icyclerで行ったからであり、この機械はキャリブレーション目的のために微量のフルオレセイン（または何か他の色素）を必要とする。この低レベルは、結果に対して何ら重大な効果を及ぼすとは予想されていない。
【００８７】
増幅のために使用するDNAは、全CpG部位で酵素的にメチル化されているCpGenome DNA（Chemicon社製）、及びヒト慢性骨髄性白血病細胞株K562由来のDNA、並びに2対のマッチド結腸直腸腫瘍と隣接する正常結腸DNA由来のDNAであった。図３の最初のパネルは、完全メチル化DNAに対する、及び多くの反復配列で実質的に低メチル化されているK562 DNAに対する増幅曲線を示している。増幅は、完全メチル化CpGenome DNAに約13サイクル先立ってK562が増幅している非メチル化DNAに対して高度に選択的である。結腸直腸癌DNA及び隣接する正常組織から単離されたDNAの2つの例がパネルB及びCに示されている。どちらの場合でも、癌DNAの比較的初期の増幅（2.5〜3サイクルによる）は、正常組織と比べて低メチル化を示している。
【実施例２】
【００８８】
順方向と逆方向オリゴヌクレオチドの両方が3'末端ミスマッチを有する鋳型オリゴヌクレオチドである
染色体21q由来の同一反復配列を、プライマーとして順方向と逆方向ミスマッチ鋳型オリゴヌクレオチドの両方を使用して増幅した。プローブ21qTRHEX 5' HEX-CCGTGCCCGGGACTCAGTGG BH1（Sigma社製）が100nMで含まれ、逆方向プライマーは21qTRM13、5' CCCTCACACTCGGTTAGCCTGACT 3'である点を除いてPCR条件は実施例１用と同一であった。下線を引いた塩基は最初の標的配列とマッチしていない塩基である。
【００８９】
リアルタイムPCRは、プログラム：60℃で5分間、95℃で2分間、次に95℃で15秒間、65℃で3分間を3サイクル、次に95℃で5秒間、65℃で15秒間を60サイクルのコルベットロータージーン3000を使用して実行した。異なった割合のK562 DNA（CpGメチル化のレベルが減少していることがわかっている）及びCpGenome DNA（人工的にメチル化されたDNA）を含有する3ng/μLヒトゲノムDNAを、TEX（10mMトリスHCl pH8、0.1mM EDTA、0.01%トリトン（Triton）X100）で希釈させることにより作製した。1μLのDNA混合液を25μL反応液それぞれに添加した。
【００９０】
SYBRグリーン結果は図４に示している。この実験では、特異的なプローブを使用することにより提供される追加の特異性は何ら利点とはならず、結果はSYBRグリーンの結果と類似しており、従って示していない。
【００９１】
K562 DNAからの増幅は、完全メチル化DNAに20サイクル以上先立って検出され、0.1% K562 DNA試料のレベル（3pg、単一ゲノム当量）は、完全メチル化DNAのみを含有する試料の7サイクル前に明確に検出される。
【実施例３】
【００９２】
c-myc中のHpaII部位の標的化-単一複製遺伝子
この実施例では、ヒトゲノムHG17ビルドにおけるc-myc遺伝子配列中のHpaII部位（下線を引いている）GAGCGCCAGAGGAGGAACGAGCTAAAACGGAGCTTTTTTGCCCTGCGTGACCAGATCCCGGAGTTGGAAAA、chr8：128,822,153〜128,822,223を標的する。HpaII部位は、Sharrardら（1992年）により結腸直腸癌で低メチル化されていることが見出された。その領域及び鋳型オリゴヌクレオチド（MycRM1）及びプライマーMycFC1の配列は図５Ａに示している。
【００９３】
DNA試料は個別の反応においてHpaIIで切断した。消化は、ニューイングランドバイオラボズ緩衝液1（New England Biolabs Buffer 1）（10mMビストリスプロパン-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT（25℃でpH7.0））プラス100μg/ml BSA中37℃で2時間実行した。30ナノグラムのDNAは、容積30μL中5ユニットのHpaIIで切断した。70℃で20分間の加熱処理後、24μLのTEX（10mMトリス pH7.4、0.1mM EDTA、0.01%トリトンX100）及び6μL 50mM EDTAを添加し、等しい最終濃度のマグネシウムイオン及びEDTA、並びに0.5ng/μL最終DNA濃度を与えた。これらの試料の2μLをそれぞれのPCRで使用した。
【００９４】
25マイクロリットルの20mMトリス-HCl（pH8.4）、50mM KCl、2.7mM MgCl2、0.2%グリセロール、0.2mM dCTP、0.2mM dGTP、0.2mM dATP、0.4mM dUTP、200nMプライマー、1/125,000希釈のSYBR（登録商標）グリーンI（Molecular Probes社製、カタログ番号S7563）、20nMフルオレセインキャリブレーション色素（BioRad社製）、及び0.5ユニットのプラチナTaqポリメラーゼ（Invitrogen社製）中で、PCRは実行した。コルベットロータージーン3000は、95℃で2分間、次に95℃で15秒間、65℃で3分間を5サイクル、次に95℃で5秒間、65℃で30秒間を45サイクルで作動するように設定した。
【００９５】
ミスマッチプライマーMycRM1は、CpGenomeの完全メチル化DNAと比較して、K562 DNAにおける低メチル化myc DNAの検出を可能にする。ミスマッチプライマーMycRM1は、マッチド正常試料34/03と比較して、結腸直腸癌腫瘍試料35/03におけるHpaII部位での減少したメチル化の検出も可能にする。（図５Ｂを参照されたい）。
【実施例４】
【００９６】
挿入鋳型オリゴヌクレオチド
この実施例は、プライマー中の末端3'ミスマッチを使わずに、むしろその3'末端から数ヌクレオチドに置かれた挿入を使用して選択が実現できることを示している。そのような「挿入」鋳型オリゴヌクレオチドは、標的された制限部位が、伸長点で配列が異なる可能性のある反復配列中に存在する場合に特に適している可能性がある。
【００９７】
反復配列クラスが大きな配列不均一性を有する場合は、共通配列に合わせて設計されたミスマッチプライマーは、実際にかなりの数の変異配列に完全にマッチする可能性がある。これにより、突然変異体が選択的に富化され、ES-PCRの選択能力は減少すると考えられる。そのような場合では、反復クラス共通配列と比較して短い挿入または欠失を有するプライマーを設計する方法の改変を含む開発をした。同一配列を有し同一位置で同一長の欠失または挿入を有すると考えられる突然変異配列はごくわずかであるかまたはまったくないと推論された。3'塩基の一部が標的にマッチする（示されている場合では6）が、欠失（またはここに示されている場合では挿入）が3'末端の正しい位置決めを妨げ、従って伸長を遅延するであろう。
【００９８】
この実施例では、LINEレトロ転位因子の5'（プロモーター）領域中の2つのHpaII部位が標的される。両HpaII部位で切断されている配列を求める選択は、図６Ａに示されている2つの挿入鋳型オリゴヌクレオチド/プライマーを使用することにより実現される。
【００９９】
DraI（認識部位TTTAAA、メチル化感受性ではない）及びHpaII（CCGG、メチル化感受性）で処理した5ngのDNAを試験した。PCRは、25マイクロリットルの20mMトリス-HCl（pH8.4）、50mM KCl、2.7mM MgCl2、400mMベタイン、0.2mM dCTP、0.2mM dGTP、0.2mM dATP、0.4mM dUTP、10nM MLHJ65選択プライマー、200nM挿入プライマー、50nM HEX-標識LPAHexプローブ、1/125,000希釈のSYBR（登録商標）グリーンI（Molecular Probes社製、カタログ番号S7563）、20nMフルオレセインキャリブレーション色素（BioRad社製）、及び0.5ユニットのプラチナTaqポリメラーゼ（Invitrogen社製）中で実行した。コルベットロータージーン3000は、95℃で2分間、次に（95℃で15秒間、60℃で20秒間、65℃で3分間）を5サイクル、次に（95℃で15秒間、65℃で30秒間）を50サイクルで作動するように設定した。
【０１００】
図６Ｂに見られるように、実質的に低メチル化K562 DNAからの増幅は、完全メチル化DNAからの増幅のほぼ14サイクル先立って見られた。
【実施例５】
【０１０１】
3'遮断鋳型オリゴヌクレオチド
Aluエレメントの共通配列中の第1のBstUI部位を、図７Ａに示す鋳型オリゴヌクレオチド及びプライマーを使用して標的した。鋳型オリゴヌクレオチドBAFMLJ15は、その3'末端においてリン酸基で遮断されているために伸長させることができない。オリゴヌクレオチドの四角で取り囲まれている部分は、JOELUX「第3」オリゴヌクレオチドと同一の配列を有しており、最終的なJOELUXのPCR産物への取込みを可能にする。JOELUXは、二本鎖DNAに存在するとその蛍光が増す3'末端近くに結合されたJOE蛍光部分を坦持している。
【０１０２】
PCRは、25マイクロリットルの20mMトリス-HCl（pH8.4）、50mM KCl、2.7mM MgCl2、0.2mM dCTP、0.2mM dGTP、0.2mM dATP、0.4mM dUTP、40nM AluRev21、10nM BAFMLJ15、60nM JOELUXプライマー、1/125,000希釈のSYBR（登録商標）グリーンI（Molecular Probes社製、カタログ番号S7563）、20nMフルオレセインキャリブレーション色素（BioRad社製）、1ユニットのBstUI（New England Biolabs社製）及び1ユニットのプラチナTaqポリメラーゼ（Invitrogen社製）中で実行した。コルベットロータージーン3000は、37℃で5分間、95℃で2分間、次に95℃で1分間-60℃で40秒間を5サイクル、次に95℃で15秒間-68℃で20秒間を45サイクルで作動するように設定した。
【０１０３】
単一リン酸遮断鋳型プライマーを使用した実質的に低メチル化K562 DNAからの増幅は、メチル化CpGenome DNAからの増幅と比べて、6PCRサイクルより多く遅延される。
【実施例６】
【０１０４】
メチル化DNAの選択におけるES-PCRの使用
標的された領域は、hMLH1遺伝子のCpGアイランド（hg17フリーズでchr3：37009233〜37010360）中のGlaI部位である（図８Ａ）。Sibenzyme社の発表に従えば（http：//science.sibenzyme.com/article8_article_11_1.phtml）、GlaIは内部のCがメチル化されている場合にのみ配列GCGCを切断する。GlaIの完全活性はその認識部位の4つのCすべてがメチル化されている場合にのみ見られる。従って、GlaIは、完全メチル化DNA上、部位CGCGCGのみで完全活性を示す。この部位はhMLH1遺伝子のCpGアイランド中の位置chr3：37,009,348〜37,009,353に存在する。
【０１０５】
完全メチル化DNA「CpGenome」は、Chemicon社から入手した。このDNAは、全CpG部位で酵素的にメチル化されており、GlaIで処理した。対照として、非メチル化DNAを血液から単離し、制限酵素HhaIで処理した。この酵素は、同一部位を認識するが、その部位がメチル化されていない場合にのみ切断する。（この位置には互いに隣り合って2つのHhaI部位が存在することに注目されたい。）切断末端を求めて選択するのに使用する鋳型オリゴヌクレオチドはMLHJ65であった。このオリゴヌクレオチドは、JOE標識LUXプライマー、すなわちJOELUXの取込みを可能にする5'伸長を有する。このオリゴヌクレオチドは、その3'末端に3つのミスマッチも有しており、そのうちの2つは、ウラシルDNAグリコシラーゼにより消化されると脱塩基部位に変換される。非改変プライマーMLHRev3は逆方向プライマーとして働いた（図８Ａを参照されたい）。
【０１０６】
1μgの完全メチル化DNA（Chemicon社製）を、50μLの1×SEBuffer Y（33mMトリスアセテート、66mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、1mMジチオスレイトール、25℃でpH7.9）プラス100μg/mlウシ血清アルブミン中、37℃で2時間16ユニットのGlaIで処理した。20ユニットの第2の制限酵素DraIも反応に含まれていた。この酵素は、配列TTTAAAを認識し、従ってメチル化状態とは無関係にDNAを切断する。熱失活（70℃で15分間）後、140μL TEX（10mMトリスHCl、0.1mM EDTA、0.01%トリトンX-100）及び10μLの50mM EDTAを添加し、5ng/μL濃度のDNAを与えた。非切断対照は、制限酵素の代わりに50%グリセロールを添加することを除いて、同一の形で処理した。HhaIにより切断した血液DNAを、ニューイングランドバイオラボズ緩衝液3（50mMトリスHCl、10mM MgCl2、100mM NaCl、1mM DTT（25℃でpH7.9）及び20ユニットのHhaIを使用することを除いて、同一の形で調製した。
【０１０７】
5ngの切断または非切断DNAを試験した。PCRは、25マイクロリットルの20mMトリス-HCl（pH8.4）、50mM KCl、4mM MgCl2、800mMベタイン、0.2mM dNTP、10nM MLHJ65選択プライマー、200nM MLHRev3逆方向プライマー、40nM JOELUX蛍光LUXプライマー、SYBR（登録商標）グリーンI（Molecular Probes社製、カタログ番号S7563）、20nMフルオレセインキャリブレーション色素（BioRad社製）、0.02ユニットのウラシルDNAグリコシラーゼ（New England Biolabs社製）及び0.5ユニットのプラチナTaqポリメラーゼ（Invitrogen社製）中で実行した。コルベットロータージーン3000は、95℃で90秒間、次に（95℃で30秒間、60℃で10秒間、72℃で30秒間）を5サイクル、次に（95℃で1秒間-60℃で10秒間、72℃で30秒間）を55サイクルで作動するように設定した。試験は3通り行った。
【０１０８】
GalIで切断しているメチル化DNAは、非切断メチル化DNAに平均6サイクル先立って増幅した。HhaIで切断した対照非メチル化DNAは、非切断DNAに平均8.4サイクル先立って増幅した。データは、DNAを特定の末端を作製するために切断した両方の場合に、増幅は非切断DNAと比較して著しく有利であったことを示している。HhaI切断DNAの比較的早い増幅がHhaIとGlaI酵素の異なった切断効率と関係がある可能性がある。
【実施例７】
【０１０９】
BRAF遺伝子における点突然変異の検出
BRAF遺伝子中の突然変異は結腸直腸癌ではよく起こり、ほとんどTからAへの塩基変換により引き起こされるV600E突然変異を伴う（Chanら、2003年）。ES-PCRを2段階法で使用して、血液及び結腸直腸癌細胞株WiDr由来のDNA中の突然変異及び正常配列をそれぞれ区別した。第1巡目のPCRでは、2つのミスマッチ（図９Ａ（i）；ミスマッチは下線を引いている）5' CCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTCTAG 3'を含有するプライマーBRFMXを使用して、突然変異部位でのA塩基の存在に依拠するXbaI制限部位を導入した（図９Ａ（ii）；突然変異部位は下線を引いている）。
【０１１０】
プライマーBRFMXをPCRにおいて逆方向プライマーBRFR1と一緒に使用して、標的領域を増幅した。こうして得られた増幅されたDNAの配列は、XbaI部位には下線を引いて、図９Ａ（iii）に示している。
【０１１１】
第2巡目では、ES-PCRプライマーBRFUを、外側重複JOELUXプライマー及び逆方向プライマーBRFR2と組み合わせて使用した（図９Ｂ）。XbaIは、複製されると選択性オリゴヌクレオチドBRFUとの複数のミスマッチを与えることになり、従って反応に関与しないほうがよい4塩基オーバーハングを与えるために、複製された上鎖は図９Ｂに示していない。その下鎖は、XbaIで切断し変性後、BRAF-Aとして3'から5'方向に書かれている。BRFU foligoの伸長は3'末端塩基ミスマッチにより阻害される（下線を引いている）。この実験ではウラシルDNAグリコシラーゼは使わなかったので、BRFUの伸長は3'末端ミスマッチのみで妨げられる（図９Ｂ）。
【０１１２】
第1巡目産物それぞれの1/100希釈の2μLを、NEB2緩衝液プラスBSA中37℃で2時間、5ユニットのXbaIで消化した。消化産物それぞれの1μLをES-PCRで使用した。PCRは、25マイクロリットルの20mMトリス-HCl（pH8.4）、50mM KCl、4mM MgCl2、0.2mM dNTP、10nM BRFU選択オリゴヌクレオチド、100nM BRFR2逆方向プライマー、40nM JOELUX蛍光LUXプライマー、SYBR（登録商標）グリーンI（Molecular Probes社製、カタログ番号S7563）、20nMフルオレセインキャリブレーション色素（BioRad社製）及び0.5ユニットのプラチナTaqポリメラーゼ（Invitrogen社製）中で実行した。コルベットロータージーン3000は、95℃で90秒間、次に（95℃で30秒間、50℃で40秒間、65℃で10秒間）を5サイクル、次に（95℃で5秒間、65℃で15秒間）を40サイクルで作動するように設定した。試験は2通り行った。
【０１１３】
JOE蛍光により測定した増幅は図９Ｃに示す。WiDr由来の試料の場合に見られる比較的早い増幅は、ES-PCRを使用して突然変異を検出することができることを示している。
【実施例８】
【０１１４】
その3'末端に隣接する配列が異なる核酸分子の作製においてその認識配列の外側を切断する制限酵素の使用
本明細書で「隣接カッター」と呼ばれる、いくつかの制限酵素（II型、III型及びIV型）は、その認識部位の外側の限定された距離でDNAを切断する。従って、隣接カッターにより生成される3'末端は部位間で異なり、酵素認識部位に隣接する配列に依拠する。所与の切断部位では、そのような酵素は、認識部位と切断部位間の塩基に挿入または欠失があったら、異なる末端も生成するであろう。切断部位に隣接して生成される異なる配列は、ES-PCRまたは他の選択的増幅アプローチを使用した欠失または挿入形の選択的増幅のための基盤を提供する。以前、欠失または挿入の検出のための方法は、制限酵素消化に続くDNAフラグメント長の変化に頼ってきた。現在記載しているアプローチは、その認識配列から限定された距離で切断する制限酵素の切断部位の移動を引き起こす制限酵素認識配列とその切断部位間の欠失または挿入の存在から生じる制限酵素フラグメントの核酸配列の違いを利用する。
【０１１５】
8.1  短いホモポリマーランにおける欠失または挿入の決定
8.1.1.Bbr7I制限部位（GAAGAC（7/11）（図１０Ａ（i））に隣接するAの短いホモポリマーランにおける欠失または挿入は、ES-PCR（図１０Ａ（iv））（以下のセクション8.1.1.1を参照されたい）を使用して、または末端トランスフェラーゼを使用した3'末端の伸長（図１０Ａ（ii）及び10A（iii））に続いて特異的なプライマーを使用することにより、検出される。図１０Ａ（iii）に示されるプライマーは、比較的短い最初のDNA分子の産物にマッチし効果的にプライムするが、このプライマーは比較的長い分子の産物と3塩基ミスマッチを形成しプライムしないであろう。次に、比較的短い分子の産物は、配列中からの適切な逆方向プライマーを使用して増幅することができる。
【０１１６】
8.1.1.1  ES-PCRによる増幅。短い分子由来の切断された下位鎖（「短い配列」図１０Ａ（i））は、その3'領域及びアミン遮断3'末端に相補的核酸配列を有する鋳型オリゴヌクレオチド上では効果的にプライムするであろう。標的された分子の3'伸長から生じる新たに取り込まれた末端配列は、ES-PCR中の増幅のために内部第2オリゴヌクレオチドと組み合わせて使用することができる。これとは対照的に、長い鎖由来の切断された末端（「長い配列」図１０Ａ（i））は3塩基ミスマッチを有しており、従って、鋳型オリゴヌクレオチド上ではプライムしないので、増幅には抵抗性であろう。
【０１１７】
8.2.第2の例が図１０Ｂに示されている。その認識配列の外側に切断部位のある大半の酵素は、切断して、リンカーライゲーション及びそれに続くPCRのための基質として働くことができる互い違い末端を与える。本実施例では、MmeI部位（TCCGAC（20/18））は短いモノヌクレオチドランに隣接している（図１０Ｂ（i））。切断部位は、上鎖上では認識部位から20塩基であり、下鎖上では18塩基である。10または9Tのある配列の変異形を示している。MmeIで切断した場合に生成される末端は図１０Ｂ（ii）に示している。「9」分子を選択的に増幅するためには、図１０Ｂ（iii）に示すように、示されているCA 3'伸長のあるリンカーを連結することができる。この分子は、順方向プライマーが、増幅される領域内からの逆方向プライマーと組み合わせた図１０Ｂ（iii）に示す配列を有すると考えられるPCRによって検出することができるであろう。代わりの「10」分子は連結が不十分になるミスマッチ末端を与え、その増幅はプライマーとのミスマッチによってさらに損なわれるであろう。
【０１１８】
8.2.1  ES-PCRによる増幅。代わりに、生成される3'末端は、図１０Ｃに示される鋳型オリゴヌクレオチドでES-PCRを使用して区別することができる。「9」分子は鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域と完全にマッチし、従って鋳型オリゴヌクレオチド上でプライムすることになるが、「10」分子はその3'末端にミスマッチを作り出し、それによって、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な3'伸長を妨げ、それによって、反応において増幅されない。
【０１１９】
多くの実例で、内在性部位は、その認識配列の外側で切断する制限酵素に対して適切に位置していないことになる。そのような場合、対象の領域に隣接する部位を作り出す突然変異を導入するプライマーを使用してどちらかに適切な部位を導入し、こうして得られたPCR産物を2段階法として分析することが可能である。代わりに、もう1つの密接して位置する制限部位があれば、最初の酵素で切断し、所望の酵素部位を含有するアダプターを連結することにより新たな部位を導入することができる。図１０Ｂの例で、示されている配列は、10のAのストレッチの配列中における単一塩基欠失が結腸直腸癌によく見られるTGFRB2遺伝子中の部位に由来する。MmeI部位は、隣接EcoRII部位で切断しMmeI部位を含有するアダプターを連結することにより理論上導入される。
【０１２０】
マイクロサテライト配列は、通常、比較的短い欠失型の存在を検出することにより短い単純反復の不安定性を検出するのが望ましい臨床的関連性のある例を提供する（実施例8.3.）。
【０１２１】
挿入の存在も実施例8.4で示すように検出することができる。
【０１２２】
8.3：マイクロサテライトNR22における欠失の検出
マイクロサテライトNR-22はSuraweeraら（2002年）により記載された。MboII制限部位はマイクロサテライトのモノヌクレオチド反復の隣に位置している（図１１Ａ（i））。MboIIは、その認識部位、すなわちGAAGAから距離を置いた、上鎖上ではその認識配列の末端から8ヌクレオチド、及び下鎖上では7ヌクレオチド離れて切断する。こうして得られた新しい末端に隣接する配列は、モノヌクレオチド反復の長さに依拠することになる。図１１Ａ（ii）及び１１Ａ（iii）では、便宜上、下鎖のみを示している。実際には、上鎖はPCR中に複製され、新たな伸長性の3'末端を与えるために、上鎖も考慮に入れている。22（正常）、20、18及び16塩基対の長さの例を示している。（結腸直腸癌細胞株HCT116由来のこの領域のクローン化及び塩基配列決定により、NR-22モノヌクレオチド反復に対し16bp及び18bpの長さが得られた）。
【０１２３】
2つの鋳型オリゴヌクレオチドを、16〜22塩基の異なった長さのモノヌクレオチド反復由来のMboII切断DNA（下鎖）と並べて、それぞれ、図１１Ａ（ii）及び１１Ａ（iii）に示している。ゲノムDNA上の鋳型オリゴヌクレオチドの伸長は、3'末端におけるミスマッチ、並びに、U-含有オリゴヌクレオチドのウラシルDNAグリコシラーゼによる切断後の脱塩基部位の存在により妨げられるまたは減少される。図１１Ａ（ii）は、対照鋳型オリゴヌクレオチド04FNR22-0を示している。長さが異なる反復の切断の産物はすべてF1NR22-0上でプライムすることができ、伸長産物はそれに続いてLUXプライマーのFAMLUX1により増幅されることになる。比較的短い反復からの増幅は、ハイブリダイズ領域の比較的短い長さのために、効率が低くなる可能性がある。第2の鋳型オリゴヌクレオチドJ5NR22-4は、比較的短い反復配列からのみ選択的に増幅するように設計されている。20または22塩基の反復由来MboII切断DNAの3'末端で下線を引いた塩基は、鋳型オリゴヌクレオチドとミスマッチを形成し、その伸長を妨げることになる。これとは対照的に、16または18塩基の比較的短い反復由来の末端は効率的にプライムし、それに続いてJOELUX5プライマーにより増幅され、JOE蛍光により検出されることになる。
【０１２４】
要約すると、正常な長さのNR-22マイクロサテライトはPCRにおいてFAM蛍光のみを発すると予測されるが、4bpまたは6bpなどのNR-22の欠失はFAM蛍光もJOE蛍光も発するであろう。
【０１２５】
PCRは、25マイクロリットルの20mMトリス-HCl（pH8.4）、50mM KCl、4mM MgCl2、0.2mM dNTP、2nM FINR22-0、10nM J5NR22-4、80nM NR22R1、80nM JOELUX5蛍光LUXプライマー、20nM FAMLUX1蛍光LUXプライマー、0.04ユニットのウラシルDNAグリコシラーゼ（New England Biolabs社製）、0.5ユニットMboII制限エンドヌクレアーゼ（New England Biolabs社製）、0.5ユニットのプラチナTaqポリメラーゼ（Invitrogen社製）中で実行した。コルベットロータージーン3000は、37℃で5分間、95℃で90秒間、次に（95℃で10秒間、60℃で40秒間、70℃で10秒間）を5サイクル、次に（95℃で5秒間、70℃で15秒間）を60サイクルで作動するように設定した。JOE蛍光及びFAM蛍光をモニタリングした。試験は2通り行った。細胞株HCT116からまたは正常被検体の血液のどちらかから単離したDNAを5ナノグラム反応に添加した。
【０１２６】
図１１Ｂに見られるように、FAM蛍光の場合（図１１Ｂ（i））、血液DNAは、NR-22マイクロサテライト中に欠失を坦持しているHCT116細胞由来のDNAに先立って増幅される。その上、血液DNAの場合のFAM蛍光は反応の終了時のほうが高くなる。これは、このアッセイはエンドポイントアッセイ、すなわち、リアルタイムPCR装置を利用する必要がないアッセイに発展させることができることを示唆している。HCT116の場合では、この細胞株中の欠失は反応において両方の鋳型オリゴヌクレオチドを複製させるために、FAM反応もJOE反応も起こることになる。しかし、欠失坦持DNAに特異的な鋳型オリゴヌクレオチドは比較的高濃度で使われるので、JOE反応に偏っている。逆方向プライマーNR22R1はわずか80nMで使われるために、この2つの反応は互いに競合し、2つの入力DNA間の最終FAMシグナルの差を説明すると予測される。JOEシグナルの場合は（図１１Ｂ（ii））、HCT116由来の欠失DNAのみが、JOELUX5取込みを可能にするテイルを坦持しているJ5NR22-4鋳型オリゴヌクレオチド上でプライムすることができるMboII切断鎖を与える。
【０１２７】
8.4：挿入の検出
図１２Ａでは、便宜上、DNAフラグメントの下鎖のみが示されている（が、制限酵素は通常二本鎖DNAを切断することを覚えておくほうがよい）。制限酵素認識部位の位置（正確な縮尺ではない）が示されている。その認識部位の外側で切断する制限酵素の例はAcuIであり、この制限酵素は、「下」鎖であることを考慮すると、その認識部位の末端から14の距離で切断する。
【０１２８】
鋳型オリゴヌクレオチドは、切断末端へのハイブリダイゼーション後、鋳型オリゴヌクレオチド上での伸長が、1つまたは複数の2' O-メチルヌクレオチドの存在により減少されるまたは遮断されるように設計されている。鋳型オリゴヌクレオチドにおける脱塩基部位の使用または（本明細書に記載する）ミスマッチの使用などの、伸長を遮断する他の手段は当業者には公知である。切断DNAの3'末端はDNAヌクレオチドにではなく2' O-メチルヌクレオチドにハイブリダイズしたために、この場合は伸長が妨げられる。
【０１２９】
挿入突然変異の例は図１２Ａの下の部分に示している。AcuIなどの外側カッターの認識部位とその切断部位間への4塩基対の挿入により、切断位置が左方向に4塩基対移動する。こうして得られた切断DNAが2' O-メチル含有鋳型オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすると、こうして得られた複合体は4DNA-DNAマッチドヌクレオチドのストレッチを有し、従って、切断3'末端の伸長が可能になる。
【０１３０】
このアプローチの効率を示すためのデータは、「正常な」DNAまたは1bpもしくは4bp挿入のどちらかを含有するDNAのどちらかを切断することから生成されると考えられる異なる切断された下鎖を再現する合成オリゴヌクレオチドを用いることにより得られた（図１２Ｂ）。
【０１３１】
PCRは2つの外側プライマー、すなわち、JOELUX及びCommR5により、最終的に推進される。JOELUXはJOEで標識されたLUXプライマーである。JOELUXは鋳型オリゴヌクレオチドの15ヌクレオチドにマッチしており、従って、鋳型オリゴヌクレオチドが複製された後に取り込まれる。CommR5は、試験オリゴヌクレオチドと11ヌクレオチド共有しており、JOELUXが試験オリゴヌクレオチドを複製した後に取り込まれることができる。
【０１３２】
PCRは、25マイクロリットルの20mMトリス-HCl（pH8.4）、50mM KCl、4mM MgCl2、0.2mM dNTP、10nM鋳型オリゴヌクレオチド、40nM JOELUX蛍光LUXプライマー、200nM CommR5、108試験オリゴヌクレオチド、0.04ユニットのウラシルDNAグリコシラーゼ（New England Biolabs社製）、0.5ユニットのプラチナTaqポリメラーゼ（Invitrogen社製）中で実行した。コルベットロータージーン3000は、37℃で5分間、95℃で90秒間、次に（95℃で30秒間、55℃で40秒間、65℃で15秒間）を5サイクル、次に（95℃で5秒間、65℃で15秒間）を55サイクルで作動するように設定した。JOE蛍光を検出した。試験は3通り行った。37℃での5分間インキュベーションは、ウラシルDNAグリコシラーゼでの消化のための時間を与えるためであった。
【０１３３】
外側カッターで切断後「正常な」DNAの下鎖に相当する108試験オリゴヌクレオチドの増幅（実線）はサイクル30後になってはじめて明らかになることが図１２Ｃで見ることができる。1塩基対（点線）または4塩基対（断続線）の挿入に相当する試験オリゴヌクレオチドは、約10サイクル早く増幅され、この実験装置を使用して挿入突然変異からDNAを選択的に増幅することができることを示している。
【実施例９】
【０１３４】
鋳型オリゴヌクレオチド設計
モデルシステムを使用して、鋳型オリゴヌクレオチドの改変の本発明の方法における有用性を評価した。2つの試験DNAを調製し、標的として使用した。「切断（Cut）」と名付けられた標的DNAは、制限酵素BstUIにより切断されているAluエレメントの下鎖に相当している。BstUI部位でのAluエレメントの切断は、この部位がメチル化されていない場合にのみ成功する。この実験では、標的オリゴヌクレオチド「模倣体」が用いられているために、制限酵素は使用していない。第2の標的DNAは「非切断（Uncut）」と呼ばれ、BstUIが切断する場所とは異なる位置で切断されたまたは中断されたフラグメントの模倣体であり、5Tの伸長を有している。両方の標的オリゴヌクレオチドは図１３Ａにおいて3'から5'方向に示されている。AluRevは逆方向プライマーである。AluRevはその標的配列と完全にマッチしており、やはり3'から5'方向に示されている。
【０１３５】
AluPhB及び一連の関連するオリゴヌクレオチドを鋳型オリゴヌクレオチドとして使用した（図１３Ａ）。これらは5'から3'方向に示している。AluPhBの伸長は、正常なOH基に代わる3'末端でのリン酸基の存在により妨げられる。AluPhBは、3'末端に隣接する標的配列の伸長により複製されると、JOELUXと呼ばれるJOE標識外側プライマーの取込みを可能にする5'テイルを有している（下線を引いている、図１３Ａ）。PCR増幅は、プライマーがPCR産物に取り込まれるので、JOE蛍光によりモニターした。
【０１３６】
PCRは、25マイクロリットルの20mMトリス-HCl（pH8.4）、50mM KCl、4mM MgCl2、0.2mM dNTP、10nM鋳型オリゴヌクレオチド（AluPhBまたはその他）、40nM AluRev、40nM JOELUX蛍光LUXプライマー、0.04ユニットのウラシルDNAグリコシラーゼ（New England Biolabs社製）、0.5ユニットのプラチナTaqポリメラーゼ（Invitrogen社製）中で実行した。コルベットロータージーン3000は、37℃で5分間、95℃で2分間、次に（95℃で10秒間、60℃で40秒間、70℃で5秒間）を5サイクル、次に（95℃で1秒間、65℃で15秒間）を40サイクルで作動するように設定した。JOE蛍光を検出した。試験は2通り行った。37℃で5分間のインキュベーションは、サイクリング条件が、PCRに先立って制限酵素消化が必要にされる他の実験と同一になるように含めただけである。これにより、異なる実験からの結果の比較がさらに容易になった。ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）を反応に添加して、Uヌクレオチドを含有する鋳型オリゴヌクレオチドを消化した。各反応液には、107切断または1010非切断標的DNAのどちらかを添加した。
【０１３７】
標準鋳型オリゴヌクレオチドAluPhBは、「切断」標的配列との23塩基ハイブリダイズ領域を有しており、3'末端のリン酸基により伸長を遮断される。図１３Ｃ（i）は、107「切断」分子及び1000倍量の「非切断」分子からの増幅を示している。選択性がなければ、「切断」分子からの増幅においては約10サイクルの遅延が予想されるであろう。等価サイクル数での増幅は約1000倍の選択性を示している。選択性の程度は、鋳型オリゴヌクレオチドの伸長により（例えば、3'リン酸基が除去されている場合、もしくは鋳型オリゴヌクレオチドが切れ目を入れられている場合）または鋳型オリゴヌクレオチド上の「非切断」分子のミスプライムにより、この場合はAluPhB上でのミスプライムにより、制限される可能性がある。ある種の取り込まれた特徴のために改良された選択性を示す代わりの鋳型オリゴヌクレオチドが開発された。
【０１３８】
一連の代わりの鋳型オリゴヌクレオチドは、鋳型オリゴヌクレオチドの伸長を妨げるように設計された3'改変が異なる。示されている改変には、C7アミンもしくはC3スぺーサーもしくは3塩基末端ミスマッチ（AluUUG、2つのUがUDG処理後脱塩基部位を形成することになる）及び/または正しいプライミング部位の上流からの異常なプライミングがある場合は、伸長を遮断する内部改変がある。これらは、AluMeAm及びAluMeMultにおける2' O-メチル改変塩基（肉太小文字）を含み、脱塩基部位（AluAbSpにおけるX）またはUDGでの処理により脱塩基部位に変換することができるウラシル塩基を含む（図１３Ｂ）。
【０１３９】
鋳型オリゴヌクレオチドにおける伸長遮断改変の取込みは、「非切断」分子からの増幅を実質的に阻害し、1000倍またはそれ以上の選択性を生じる。AluMeAmとAluMeMultの比較により、比較的多数の改変塩基についての選択性が示されるが、その存在はおそらく正しいプライミングの効率も低下させている。
【０１４０】
AluHLの配列は、その5'と3'末端がヘアピン構造を形成することができるものであり、3'末端は、その配列がプライミングするのを妨げることになる標的「切断」分子と複数のミスマッチを有している。ヘアピン構造は、鋳型オリゴヌクレオチドによるミスプライミングと「非切断」核酸分子による鋳型オリゴヌクレオチド上でのミスプライミングの両方をもしかすると妨げる。
【０１４１】
これらの実験は、鋳型オリゴヌクレオチドの伸長を異なる形で妨げることができ、鋳型オリゴヌクレオチドのハイブリダイズ部分の複製を減少させるまたは妨げる改変はES-PCRの特異性を増加させることができることを示している。
【０１４２】
（参考文献）
2009531035.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】非切断DNAよりも切断DNAを選択的に増幅する末端特異的PCRの原理の図式的概略である。
【図２】本発明の実施形態に従った、BstIU切断DNA及び非切断DNA（ヒト染色体21バンド21q22.3のタンデム反復配列）上の21qTFMLHC/T及び21qTRCのプライマー部位、3'末端ヌクレオチドミスマッチを有している対応する末端特異的オリゴヌクレオチドプライマー、並びに逆方向にプライムするための第2のオリゴヌクレオチドプライマーを示す図である。
【図３Ａ】完全にメチル化されたDNA（CpGenome（商標）、Chemicon International社製）、及びK562低メチル化DNAに対する増幅曲線並びにCt値を示す表である。
【図３Ｂ】それぞれマッチド正常及び結腸直腸腫瘍組織試料29/99及び30/99由来のDNAに対する増幅曲線並びにCt値を示す表である。
【図３Ｃ】それぞれマッチド正常及び結腸直腸腫瘍組織試料34/03及び35/03に対する増幅曲線並びにCt値を示す表である。
【図４Ａ】順方向プライマー21qTFMLHC/T及び逆方向プライマー21qTRM13に対するプライマー部位を示す図であり、両方がヒト染色体21のバンド21q22.3のタンデム反復配列中の末端特異的鋳型オリゴヌクレオチドである。
【図４Ｂ】Ct値を示す表、及び完全にメチル化されたDNAに十分先立って低メチル化K562DNAの検出を示すSYBR Green増幅曲線である。0.1% K562 DNAの試料、単一ゲノム当量のレベルは、完全にメチル化されたDNAのみを含有する試料よりも7サイクル前にはっきりと検出される。
【図５Ａ】結腸直腸癌において低メチル化されていることがわかっているHpaII部位で標的されたMyc遺伝子中の、3'末端ヌクレオチドミスマッチを有する末端特異的鋳型オリゴヌクレオチドのMycRM1及び逆方向プライマーMycFC1に対するプライマー部位（Sharrardら、1992年）を示す図である。
【図５Ｂ】Ct値の表並びに、CpGenome（商標）の完全メチル化DNAと比較したK562 DNA中の低メチル化myc DNAの検出、及びマッチド正常試料34/03と比較した結腸直腸腫瘍組織中のHpaIIでの減少したメチル化の検出を示す増幅曲線である。
【図６Ａ】LINEレトロ転位性因子の5'（プロモーター）領域を標的するためのプライマー部位、順方向及び逆方向増幅プライマーとして働く対応する挿入鋳型オリゴヌクレオチド、並びにHEX標識化LPAHexプローブのヌクレオチド配列を示す図である。
【図６Ｂ】SYBRグリーンまたはHEX標識化プローブのどちらかで検出される、実質的に低メチル化K562 DNAからの、または完全メチル化DNAからの増幅に対する増幅曲線及びCt値を示す表である。
【図７Ａ】本発明の実施形態に従った、Aluエレメントと、リン酸基により3'伸長から遮断された鋳型オリゴヌクレオチドとの共通配列における第1のBstUI部位を標的するためのプライマー部位、及び逆方向にプライムするための対応する第2のオリゴヌクレオチドプライマー、及び順方向にプライムするためのJOELUXプライマーを示す図である。
【図７Ｂ】実質的に低メチル化されたK562 DNAからのまたはメチル化されたCpGenome DNAからの増幅に対する増幅曲線及びCt値を示す表である。
【図８Ａ】hHLH1遺伝子のCpGアイランド中のGlaI部位を通じたメチル化DNAを標的するためのプライマー部位を示す図である。本発明の実施形態に従った、鋳型オリゴヌクレオチドはその3'末端で3ミスマッチを取り込み、そのうちの2つは、ウラシルDNAグリコシラーゼにより消化されると脱塩基部位に変換される。対応するMLHRRev3逆方向プライマー、及び順方向LUXプライマー。
【図８Ｂ】メチル化CpGenome DNAまたは非メチル化DNAの増幅に対する増幅曲線及びCt値を示す表である。
【図９Ａ】BRAF遺伝子における点突然変異の検出を示す図である。突然変異部位（標的配列中で下線を施している）でのTからAへの塩基転換の存在に依存しているXbaI制限部位を導入するために使われる第1巡目PCRプライマーBRFMX。
【図９Ｂ】BRAF遺伝子における点突然変異の検出を示す図である。外側重複JOELUXプライマー及び逆方向プライマーBRF2と組み合わせて使用するES-PCRプライマーBRFU。
【図９Ｃ】結腸直腸癌細胞株WiDr中の突然変異BRAF遺伝子の選択的増幅を示す増幅曲線である。
【図１０Ａ】（i）Bbr7I制限部位に隣接するモノヌクレオチド反復における制限酵素切断の産物を示す図である。（ii）末端トランスフェラーゼを使用した切断分子の下鎖の伸長産物及び伸長された産物にアニーリングするプライマーを示す図である。（iii）末端トランスフェラーゼを使用した切断分子の下鎖の伸長産物及び伸長された産物にアニーリングするプライマーを示す図である。（iv）図１０Ａ（i）に示される短い及び長い分子由来の切断下鎖にアニーリングするES-PCRのための鋳型オリゴヌクレオチドを示す図である。
【図１０Ｂ】（i）MmeI制限部位に隣接する9〜10Aの反復のある分子を示す図である。（ii）図１０Ｂ（i）の分子のMmeIでの切断産物を示す図である。（iii）9Aの分子（図１０Ｂ（i））から生じる図１０Ｂ（ii）の分子の切断末端への特異的ライゲーションを示すリンカーライゲーションを示す図である。（iv）「9」及び「10」分子由来の切断鎖にアニーリングするES-PCRのための鋳型オリゴヌクレオチドを示す図である。
【図１１Ａ】（i）MboII部位の位置を示すNR22マイクロサテライト領域及び逆方向プライマー配列を示す図である。（ii）MboIIでの消化に続くNR22マイクロサテライトの異なる長さのモノヌクレオチド配列の増幅のための2つの鋳型オリゴヌクレオチド、FINR22-0及びJ5NR22-4の配列を示す図である。（iii）MboIIでの消化に続くNR22マイクロサテライトの異なる長さのモノヌクレオチド配列の増幅のための2つの鋳型オリゴヌクレオチド、FINR22-0及びJ5NR22-4の配列を示す図である。
【図１１Ｂ】（i）血液DNA及びNR-22マイクロサテライト中に欠失を坦持するHCT116細胞由来のDNAの増幅の結果を示す増幅曲線である。（ii）血液DNA及びNR-22マイクロサテライト中に欠失を坦持するHCT116細胞由来のDNAの増幅の結果を示す増幅曲線である。
【図１２Ａ】その認識配列の外側の限定された距離に切断部位を有する制限酵素での消化、及び認識配列と切断部位間の4bp挿入のための切断部位の移動を示す模式図である。2' Oメチルヌクレオチドが消化されたDNAの3'末端でハイブリダイズすると、消化されたDNAの3'伸長を遮断する鋳型オリゴヌクレオチドにおける2' O-メチルヌクレオチド（下線を施している）の存在のために、認識配列と切断部位の間に挿入が存在する場合にのみ消化されたDNAの3'伸長は起きる。DNAが挿入を有する場合、切断部位は、鋳型オリゴヌクレオチドの2' O-メチルヌクレオチドがもはや3'末端でハイブリダイズしないように移動される。
【図１２Ｂ】1bpまたは4bpの挿入突然変異のES-PCR選択的増幅において使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。鋳型オリゴヌクレオチドは、2' O-メチルヌクレオチドを用いて、切断された標的DNAの3'末端からの3'伸長を遮断する。
【図１２Ｃ】挿入のないDNA、すなわち「正常」DNAよりも1bpまたは4bp挿入を含むDNAの選択的増幅を示す増幅曲線である。
【図１３Ａ】「非切断」及び「切断」DNAを代表する試験DNA、鋳型オリゴヌクレオチドにおける改変のES-PCRに対する効果を評価するための一連のES-PCR実験で使用される、その3'末端におけるリン酸基により伸長を遮断された標準鋳型オリゴヌクレオチドAluPhB、並びに第2及び第3オリゴヌクレオチドの配列（図１３Ｂ）を示す図である。
【図１３Ｂ】「非切断」及び「切断」DNAを代表する試験DNA、鋳型オリゴヌクレオチドにおける改変のES-PCRに対する効果を評価するための一連のES-PCR実験で使用される、その3'末端におけるリン酸基により伸長を遮断された標準鋳型オリゴヌクレオチドAluPhB、並びに第2及び第3オリゴヌクレオチドの配列（図１３Ｂ）を示す図である。
【図１３Ｃ】図１３Ｂに示される種々の鋳型オリゴヌクレオチドを使用する場合のES-PCRの結果を示す増幅曲線である。
【図１】
2009531035.tif 000004
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2009531035.tif 000032
2009531035.tif 000033
2009531035.tif 000034
2009531035.tif 000035