(57)【要約】【課題】老化及び／又は老化に関連する生理学的機序の変化、又はそれに類似した症状よりもたらされる皮膚の衰えの一連の原因に効果を発揮することが可能な多官能性活性物質を提供すること。【解決手段】バニラプラニフォリア抽出物は１種類の脂溶性画分からなる。この画分は、気相クロマトグラフィーによって分離した全成分の合計に対する相対パーセントで、不飽和モノカルボニル化合物０．５〜１０％、不飽和ジカルボニル化合物２０〜８０％、及び不飽和ピラノン１〜４０％を含むことが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種類の脂溶性画分で構成されているバニラプラニフォリア抽出物。
【請求項２】
前記脂溶性画分が、気相クロマトグラフィーで分離した全成分の合計に対する相対パーセントで表した場合に、不飽和モノカルボニル化合物０．５〜１０％、不飽和ジカルボニル化合物２０〜８０％、不飽和ピラノン１〜４０％を含む請求項１に記載の抽出物。
【請求項３】
前記脂溶性画分が、気相クロマトグラフィーで分離した全成分の合計に対する相対パーセントで表した場合に、不飽和モノカルボニル化合物１〜５％、不飽和ジカルボニル化合物３５〜６５％、不飽和ピラノン３〜２５％を含む請求項１又は２に記載の抽出物。
【請求項４】
ペンタコセン−１６−オン−２、ヘプタコセン−１８−オン−２、及びノナコセン−２０−オン−２から選択される不飽和モノカルボニル化合物を含む請求項１乃至３のいずれか記載の抽出物。
【請求項５】
ペンタコセン−１６−ジオン−２，４、ヘプタコセン−１８−ジオン−２，４、ノナコセン−２０−ジオン−２，４、及びヘントリアコンテン−２２−ジオン−２，４から選択される不飽和ジカルボニル化合物を含む請求項１乃至４のいずれか記載の抽出物。
【請求項６】
ノナデセニル−２  ジヒドロ−２，３  メチル−６  ピラノン−４、ヘンイコセニル−２  ジヒドロ−２，３  メチル−６  ピラノン−４、及びトリコセニル−２  ジヒドロ−２，３  メチル−６  ピラノン−４から選択される不飽和ピラノンを含む請求項１乃至５のいずれか記載の抽出物。
【請求項７】
前記画分が、気相クロマトグラフィーで分離した全成分の合計に対する相対パーセントで表した場合に、飽和又は不飽和脂肪酸５〜５０％を更に含む請求項１乃至６のいずれか記載の抽出物。
【請求項８】
コレステロール、カンペステロール、スチグマステロール、及びβ−シトステロールから選択されるステロール化合物を含む請求項１乃至７のいずれか記載の抽出物。
【請求項９】
少なくとも１種類の溶媒を用いてバニラプラニフォリア粉砕物からの抽出を行い、その脂溶性画分を回収する工程により、場合によっては更に前記脂溶性画分を分子蒸留することにより油性蒸留液を得るという手順で得られるバニラプラニフォリア抽出物。
【請求項１０】
老化、老化に関連する生理学的機序、又は該生理学的機序に類似した症状、による皮膚の衰えの予防用及び／又は治療用の化粧用組成物又は皮膚科用組成物における多官能性活性物質としての、請求項１乃至９のいずれか記載のバニラプラニフォリア抽出物の使用。
【請求項１１】
化粧用組成物における、皮膚の衰えの改善剤及び／又は美白剤及び／又は皮膚の微小循環の改善材及び／又は表皮再生剤及び／又はエモリエント剤としての、請求項１乃至９のいずれか記載のバニラプラニフォリア抽出物の使用。
【請求項１２】
請求項１乃至９のいずれか記載のバニラプラニフォリア抽出物の、皮膚脱色用組成物の調製における使用。
【請求項１３】
請求項１乃至９のいずれか記載のバニラプラニフォリア抽出物と、化粧料又は医薬品に使用できる賦形剤と、を含む化粧用又は皮膚科用組成物。
【請求項１４】
局所用である請求項１３に記載の化粧用又は皮膚科用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１種類の脂溶性画分からなる新規なバニラプラニフォリア抽出物及びその抽出工程、それを含有する化粧用組成物若しくは皮膚科用組成物、並びに、特に老化、老化に関連する生理学的機序、又はそれら機序に類似する症状によりもたらされる皮膚の劣化の予防及び／又は治療を目的とした、化粧用組成物若しくは皮膚科用組成物においての多官能性活性物質としてのその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は主に３つの層からなる。すなわち、最も表面に近いものから、表皮、真皮、皮下組織である。表皮は、皮膚の保護と栄養機能の維持に大いに寄与する。
【０００３】
皮膚の老化及び光老化、及びそれに関連する衰えは様々な形で顕在化する。その例として、表皮及び／又は真皮レベルでの組織の損傷による張り及び弾力の低下、表皮レベルでの微小循環の減少及び細胞の再生速度の鈍化によるつやの低下、メラニンの合成異常（又はメラニン生成）に関連する色素斑の出現、角質層のバリア機能の低下及び表皮の再生速度の低下による皮膚の乾燥、などが挙げられる。
【０００４】
したがって、老化及び／又は老化に関連する生理学的機序の変化、又はそれに類似した症状よりもたらされる皮膚の衰えの一連の原因に効果を発揮することが可能な多官能性活性物質を提供する必要性がある。
【０００５】
フランス特許出願ＦＲ２８３７３８４号では、化粧用又は医薬用組成物の調製におけるバニラ（好ましくはバニラタヒテンシス）抽出物の利用が開示されている。該抽出物内に含まれるポリフェノールにより太陽光の照射又はフリーラジカルの生成から皮膚を保護する効果が得られる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、１種類の脂溶性画分からなるバニラプラニフォリア抽出物が、老化、老化に関連する生理学的機序、又は該生理学的機序に関連する表皮及び／又は真皮レベルの異常が原因の症状に対し、生理学的機序の促進又は抑制を通じて効果を示すことを発見した。意外にも、これらの効果は、抽出物中のポリフェノールの存在とは関連しない。
【０００７】
第一の態様では、本発明は、１種類の脂溶性画分からなるバニラプラニフォリア抽出物に関する。上記画分には以下が含まれることが好ましい。不飽和モノカルボニル化合物：０．５〜１０％、不飽和ジカルボニル化合物：２０〜８０％、不飽和ピラノン：１〜４０％。上記含有率は、気相クロマトグラフィーによって分離した全成分の合計に対する相対パーセントで表したものである。
【０００８】
「脂溶性画分」とは、溶媒を用いた抽出を行う際に、バニラの粉砕及び／又は浸漬の後で、その後、相を分離するため有機溶媒を用いたデカンテーションを行うか否かに関わらず、油相に溶解し、水相には溶解しない画分を指す。特に、２５℃において１質量％以上水に溶解せず、２５℃において、少なくとも極性指数が３．５未満の非極性溶媒に１質量％以上溶解する画分を指す。ここで使用する該非極性溶媒としては、特にヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、イソオクタン、ジクロロメタンが挙げられる。上記非極性溶媒は、極性指数が１未満であることが好ましく、すなわちシクロヘキサン、ヘプタン、イソオクタンが好ましい。「気相クロマトグラフィーによって分離した全成分合計に対する相対パーセントで表した含有率」とは、クロマトグラフィー系で分離した各成分の、全成分の合計に対する含有率を指す。なお、試料の調製にあたって溶媒によって抽出された、インジェクター内で気化することができる組成物のみを対象とする。
【０００９】
試料の調製は、フランス標準ＮＦ  Ｔ  ６０−２３３（１９７７年５月）「脂肪酸メチルエステルの調整」（５．２節  酸性脂肪体と脂肪酸に適用可能な方法）に準拠して行うことが好ましい。クロマトグラフィーの条件は、フランス標準ＮＦ  ＥＮ  ＩＳＯ  ５５０８（１９９５年６月）に定められている。簡潔にいうと、この方法は、まず酸性のメタノール溶媒中で脂肪酸をエステル化し、該エステル化した脂肪酸をヘプタンで抽出し、その後該ヘプタン溶液を気相クロマトグラフィーに導入する。
【００１０】
好ましくは、本発明のバニラプラニフォリア抽出物は、以下を含む画分によって構成される。不飽和モノカルボニル化合物：１〜５％、不飽和ジカルボニル化合物：３５〜６５％、不飽和ピラノン：３〜２５％。上記含有率は、気相クロマトグラフィーによって分離した全成分の合計に対する相対パーセントで表したものである。
【００１１】
本発明の好ましい態様によれば、上記抽出物には以下が含まれる。ペンタコセン−１６−オン−２、ヘプタコセン−１８−オン−２、ノナコセン−２０−オン−２から選択される不飽和モノカルボニル化合物及び／又はペンタコセン−１６−ジオン−２，４、ヘプタコセン−１８−ジオン−２，４、ノナコセン−２０−ジオン−２，４、ヘントリアコンテン−２２−ジオン−２，４から選択される不飽和ジカルボニル化合物及び／又はノナデセニル−２  ジヒドロ−２，３  メチル−６  ピラノン−４、ヘンイコセニル−２  ジヒドロ−２，３  メチル−６  ピラノン−４、トリコセニル−２  ジヒドロ−２，３  メチル−６  ピラノン−４から選択される不飽和ピラノン。
【００１２】
加えて、上記の脂溶性画分は、特に、５〜５０％、好ましくは１０〜４０％の飽和脂肪酸又は不飽和脂肪酸を含む。上記含有率は、気相クロマトグラフィーによって分離した全成分の合計に対する相対パーセントで表したものである。
【００１３】
更に、好ましい態様によれば、上記抽出物はコレステロール、カンペステロール、スチグマステロール、β−シトステロールから選択されるステロール化合物も含む。
【００１４】
他の態様として、又は上記に追加して、（特にヒドロキシル化又はアルコキシル化）ベンズアルデヒド誘導体、特に４−ヒドロキシ−３−メトキシ−ベンズアルデヒド（バニリン）を好ましくは０．１〜１０質量％含む。
【００１５】
使用する原料の例としては、バニラプラニフォリア種のバニラの種子鞘が挙げられ、該種子鞘は周知の方法により粉砕又は破砕できる。
【００１６】
上記粉砕物は、単独又は複数の溶媒による抽出の対象とすることができる。溶媒の例としては、Ｃ１〜Ｃ４アルコール（メタノール、エタノール、イソプロパノール等）、有機溶媒（プロピレングリコール、ジプロピレングリコール等）、エチルアセテート、ヘキサン、シクロヘキサン又は当該技術において周知のすべての有機溶媒）が挙げられる。又、超臨界流体（好ましくは超臨界二酸化炭素）によっても抽出を行うことができる。溶媒はアルコール性のものが好ましい。
【００１７】
抽出作業は一般的に、促進温度（例えば室温〜１００℃）で３０分〜１２時間、上記溶媒のうち単独又は複数の溶媒中で、粉砕物を浸漬又はゆっくりと撹拌して行う。
【００１８】
バニラに含まれる不溶性物質を除去するため、上記によって得られた溶液を濾過する。エタノール、メタノール、ヘキサン、シクロヘキサン、エチルアセテート等の揮発性溶媒を用いている場合には、必要に応じて、溶媒も除去する。
【００１９】
抽出作業におけるこの処理は、植物抽出物の分野においては公知であり、当業者にあっては、通常の知識を基に反応パラメータを調製することが可能である。抽出作業におけるこの処理によって、バニラオレオレジンが得られる。
【００２０】
本発明の好ましい態様では、該オレオレジンの精製を目的として、分別処理を行う。好ましくは、上記の溶媒のうち単独の溶媒又は複数種類を混合した溶媒、又は、好ましくは含水アルコール溶媒を用いる。超臨界流体（好ましくは超臨界二酸化炭素）による分別を行うこともできる。
【００２１】
上述の通り、単独又は複数の揮発性溶媒を用いている場合には、次の処理に先立ち、溶媒も除去する。
【００２２】
適切な抽出溶媒を用いた抽出により、又は、沈殿後、上記の分別作業により得られた脂溶性画分を回収する。
【００２３】
上記脂溶性画分は、本発明のバニラプラニフォリア抽出物として用いることができる。更に、好ましい態様によれば、上記脂溶性画分に分子蒸留の処理を行う。
【００２４】
短行程のワイパー式薄膜分子蒸留装置が好ましく用いられる。上記分子蒸留装置は、ローラーワイパーを備えた蒸留室を含み、蒸発面（熱面）に蒸留する物質を継続的に拡散させることができる。物質の蒸気は、蒸留室中央に配置される冷却器を通じて凝縮される。蒸留液と残滓は、重力流によって捕集される。この方法は、それぞれの成分の沸点の違いを利用して、複合混合物の成分を分離するものである。短行程のワイパー式薄膜分子蒸留は、高真空状態で蒸留を行うため、より低い温度で蒸留が可能であり、また、蒸留装置内で複合混合物がより早く分離するというメリットがある。材料の腐敗速度は、温度と暴露時間が原因で極めて速くなる。例えば、アランビック式の蒸留器では、混合物を高温で数時間にもわたり放置することがあるため、変性の原因となる。
【００２５】
これまで、このような工程は、植物油の場合には不鹸化画分を分離する目的又は不鹸化画分を除去して該植物油を精製する目的、又、水溶性画分又は脂溶性画分の場合には抽出物の脱色又は脱臭の目的にしか用いられなかった。
【００２６】
ところが、本発明者は、分子蒸留の技術を利用することにより、上述のような脂溶性画分から油性蒸留物を分離できることを発見した。好ましい態様によれば、本発明の多官能性活性物質として利用されるバニラプラニフォリア抽出物の抽出工程において、脂溶性画分の分子蒸留を加えて行う。この分子蒸留は、好ましくは以下の手順を含む。すなわち、上述した抽出により得られた脂溶性画分を、温度約１００〜２５０℃、圧力約０．１〜０．００１ｍｂａｒで分子蒸留し、蒸留液を得る。
【００２７】
上記工程を行う際の好ましい条件を、以下に述べる。脂溶性画分の蒸留に先立ち、蒸留を促進するため又は該脂溶性画分のカラム内での流れをスムーズにするため、該脂溶性画分に高粘度溶媒を添加することが好ましい。高粘度溶媒は鉱物油、植物油、ポリオール（好ましくはポリエチレングリコール）から選択される。
【００２８】
脂溶性画分と高粘度溶媒の混合物は、一定流量に制御され、温度２０〜１２０℃、好ましくは５０〜１００℃で、筒型の蒸発缶の熱内壁に送り出される。複数の輪状のローラーワイパーが擦過することにより、混合物の薄膜が、１００〜２５０℃（好ましくは１５０〜２２０℃）に維持された加熱内壁の全面に形成される。
【００２９】
蒸発缶中で極低圧（０．１〜０．００１ｍｂａｒ）が優勢であることにより、内壁との接触時に揮発性成分は徐々に揮発し、揮発性の低い成分が内壁の下方へ伝い流れる。
【００３０】
送り出された蒸気は、熱内壁と同心であり熱内壁と極めて近くに配置されている冷内壁において凝縮される。冷却内壁の温度は４０〜１２０℃、好ましくは６０〜１００℃である。
【００３１】
本工程において分離された各成分は、重力により、それぞれ熱内壁と冷内壁の下方へ伝い流れる。得られた蒸留液には、必要に応じて分離工程（例えば濾過又は遠心分離）を加えて行う。
【００３２】
このようにして、本発明の多官能性活性物質として利用可能な油性蒸留物が得られる。好ましいことに、本発明により得られる抽出物（脂溶性画分又は油性蒸留物）は透明である。さらには、上記抽出物には、抽出工程で添加された溶媒やいかなる化学試料もほとんど、好ましくは一切、含まれない。
【００３３】
同様に、エマルション状の化粧用組成物又は皮膚科用組成物において有効性を得るために、従来は抽出物の凝縮が必要となり、製剤上問題があったが、上記抽出物は凝縮度が高く、更に、従来の方法によって得られた植物抽出物のように、凝縮して濃い色になってしまうことがないため、上述のような問題を発生させることなく利用できる。
【００３４】
このことから、本発明による抽出物は、化粧用組成物又は皮膚科用組成物の調製に直接用いることができる。同様に、本発明は上述の工程により得ることのできるバニラプラニフォリア抽出物、つまり、少なくとも一種類の溶媒を用いて破砕したバニラプラニフォリアから抽出を行い、脂溶性画分を回収し、続いて該脂溶性画分を分子蒸留し油性蒸留物を得るという手順で得られたバニラプラニフォリア抽出物にも関する。
【００３５】
別の態様によれば、本発明は、化粧用組成物における上述のバニラプラニフォリア抽出物の、皮膚の衰えの改善剤及び／又は美白材及び／又は皮膚の微小循環の改善材及び／又は表皮再生剤及び／又はエモリエント剤としての利用に関する。
【００３６】
本発明は同様に、上述のバニラプラニフォリア抽出物の皮膚脱色用組成物の調製における利用に関する。
【００３７】
好ましいことに、本発明によるバニラプラニフォリア抽出物は、特に老化を原因とする皮膚の劣化を予防又は改善する生理学的機序に対する重要な機能を複数有していることが明らかになった。
【００３８】
具体的には本発明は、本発明によるバニラプラニフォリア抽出物の、メラニン生成阻害剤、特にエンドセリン生成阻害剤としての利用化粧料における利用に関する。
【００３９】
同様に、好ましいことに、本発明によるバニラプラニフォリア抽出物は、ケラチノサイトによる複数群の増殖因子の生成を活性化する機能があることが明らかになった。
【００４０】
具体的には、上記の機能は以下の増殖因子に対して働きかける。ＦＧＦ−ｂ（Ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、線維芽細胞増殖因子）は、ＦＧＦＢ、ｂ−ＦＧＦ、ＦＧＦ−２とも呼ばれ、細胞（特に線維芽細胞）の増殖、治癒又は老化に必須のケラチノサイトの移動（Ａｓｈｃｒｏｆｔ  ＧＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ａｎａｔ，１９９７，１９０  （Ｐｔ  ３）：３５１−６５）、及び血管形成（Ｂｉｋｆａｌｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｒｅｖｉｅｗ，  １９９７，  Ｖｏｌ  １８  Ｎｏ．１）、を促す機能を有することにより、又、紫外線照射に反応して（Ｋｒａｍｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，  ２６８（９）：６７３４−４１）、多くの組織の維持と再生において重要な役割を果たす。
【００４１】
分泌されたＦＧＦ−ｂは細胞外マトリックスに貯留され、組織の再生に用いられる。さらに、ＦＧＦ−ｂは、メラノサイトの増殖と分化にも関わっている（Ｔａｄａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ，  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．，  １９９８，  ９  （７）  ：  ５７５−８４）。ＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、血小板由来増殖因子）は、特にマイトジェン活性を、間葉組織由来の大部分の細胞に適用し（Ｌｅｐｉｓｔｏ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，  １９９５，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ，  ２０９  （２）  ：３９３−９）、該細胞によるコラーゲン及びコラゲナーゼの生成を促進することにより、組織の治癒及び修復等の生理学的過程に関わっている（Ｔａｎ  ＥＭ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  １９９５，  ３１０（Ｐｔ  ２）：５８５〜８）。同様に、ＰＤＧＦの誘導レベル及び細胞の複製能力は年齢と結びついていることが明らかになっている。老化した線維芽細胞のＰＤＧＦ率は低下している（Ｋａｒｌｓｓｏｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  １９９４，  １５８（２）：２５６〜６２）。同様に、年齢によって組織の修復機能が異なることが、種々の増殖因子の量と種類によって説明できることが明らかになっている（Ａｓｈｃｒｏｆｔ  ＧＳ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｎａｔ，  １９０，  １９９７，（Ｐｔ  ３）：３５１〜６５）。ＴＧＦβ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  β、トランスフォーミング増殖因子β）は、細胞増殖の調節に介在するサイトカインで、ケラチノサイト増殖の調節（Ｙｉｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  ２００３，  １２０（４）：７０３〜５；  Ｒｉｔｔｉｅ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓ．  Ｒｅｖ．，  ２００２，  １（４）：７０５〜２０）、及び細胞外マトリックスの生成（Ｒｅｅｄ  ＭＪ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，  １９９４，  １５８（１）：１６９〜７９；  Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  Ｍ  ａｎｄ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  Ｓｃｉ，  ２００４，  ３５（２）：８３〜９２）に関わる。ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、血管内皮細胞増殖因子）は、皮膚内で、皮膚血管形成に関わる主要因子である。表皮は重要なＶＥＧＦ源である。ＶＥＧＦは増殖中のケラチノサイトにより多量に分泌される。ＶＥＧＦのＡＲＮｍは、ｉｎ  ｓｉｔｕでも細胞培養でも通常のケラチノサイトによって発現される。ＶＥＧＦは、高齢の被験者にあっても、内皮細胞の恒常性、及び、血管新生刺激に対して応答する該内皮細胞の能力を維持することが明らかになっている（Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４：２０２５〜２０３２）。他方で、紫外線への暴露後に、ＶＥＧＦが減少することが観察されている（Ｍｉｌｄｎｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，  １９９９；  ７０  （４）：６７４〜９）。ＨＢ−ＥＧＦ（Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、膜結合型増殖因子）は、ケラチノサイトの調節と分化（Ｉ���ａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｒｅｗｉｅｗｓ，  ２０００，  １１：３３５〜３４４）、又、該因子に依存して増殖する幼若細胞の老化（ＪＩＤ  Ｓｕｐｐｌ．２４：Ｓ４６〜Ｓ５０；  Ｋａｎｚａｋｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ．  Ｒｅｓ．，  ２００２，  ２７９（２）：３２１〜３２９）において重要な役割を果たす。
【００４２】
同様に、本発明は、少なくとも１つの細胞増殖因子のケラチノサイトによる生成を活性化する活性物質としての、特に、ＦＧＦ−ｂ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、ＶＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦのうち少なくとも１つの細胞増殖因子の活性物質としての、本発明によるバニラプラニフォリア抽出物の利用に関する。
【００４３】
同様に、本発明は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＭＭＰ）活性阻害剤としての、本発明によるバニラプラニフォリア抽出物の利用に関する。マトリックスメタロプロテイナーゼは、皮膚の生理的な再形成に寄与する細胞外マトリックスを分解する酵素であるが、加齢や紫外線への暴露により、ＭＭＰ、特にＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９の活性が促進される。これにより、細胞外マトリックスが高度に分解され、その結果、皮膚の組織が沈下し、しわが形成される（Ｒｉｔｔｉｅ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓ．  Ｒｅｖ．，  ２００２，  １（４）：７０５〜２０、Ｃｈｕｎｇ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，  ２００１，  １１７（５）１２１８〜２４）。同様に、本発明は、さらに別の態様によれば、上述のバニラプラニフォリア抽出物及び化粧料又は医薬品に使用できる賦形剤を含有する化粧用組成物又は皮膚科用組成物に関する。好ましくは、上記抽出物は、化粧用組成物又は皮膚科用組成物中に、組成物の総質量の０．００１〜１０％、特には０．０１〜１０％、好ましくは０．１〜１０％含まれる。上記化粧用組成物又は皮膚科用組成物は、特に、局所用として用いることができる。
【００４４】
好ましいことに、上記化粧用組成物又は皮膚科用組成物は、粉末、エマルション、マイクロエマルション、ナノエマルション、懸濁液、溶液、ローション、クリーム、水性ゲル又は水アルコールゲル、ムース、セラム、エアロゾル用溶液又は分散液、又は、脂質小胞の分散液の形で提供される。
【００４５】
エマルションの場合、油中水滴エマルション又は水中油滴エマルションのいずれでもよい。
【００４６】
本発明の化粧用組成物又は皮膚科用組成物には、様々な原料及び投与形に応じて選択される溶媒も含まれる。
【００４７】
例として、水（好ましくは脱塩水）、エタノール等のアルコール、又は、エトキシジグリコール又はジエチレングリコールモノメチルエーテル等のジエチレングリコールエーテル、が挙げられる。
【００４８】
上記化粧用組成物は、更に、当該技術において周知の添加剤を少なくとも１つ含むことができる。例えば、エモリエント剤又は保湿剤、ゲル化剤及び／又は増粘剤、界面活性物質、油、活性物質、着色剤、防腐剤、酸化防止剤、有機又は無機粉末、紫外線防止剤、香料、のうち少なくとも１つの化合物を含むことができる。
【００４９】
特に、上記組成物は、以下を含むことができる。例えばグリセリン、グリコール、ＫＦ６０１１（信越化学工業社製）等の水溶性シリコーン、Ｒｅｓｐｌａｎｔａ  ｊｏｊｏｂａ（Ｒｅｓ  ｐｈａｒｍａ社製）等の水溶性ホホバ油、から選択される１つ又は複数のエモリエント剤又は保湿剤。
【００５０】
上記エモリエント剤又は保湿剤は、組成物の総質量の０〜３０質量％、好ましくは２〜１０質量％の割合で組成物に含まれることができる。例えばセルロース誘導体、植物由来の増粘剤（グアーガム、キャロブガム、アルギン酸塩、カラギーナン、ペクチン）、細菌由来の増粘剤（キサンタンガム）、粘土（ラポナイト）、アンモニウムアクリロイルジメチルタウレート／ＶＰコポリマー及びアクリロイルジメチルタウリンアンモニウムメタクリル酸ベヘネス−２５クロスポリマー（例えば、Ｃｌａｒｉａｎｔ社製Ａｒｉｓｔｏｆｌｅｘ  ＡＶＣ及びＡｒｉｓｔｏｆｌｅｘ  ＨＭＢ）、から選択される１つ又は複数の水相ゲル化剤又は水相増粘剤。上記ゲル化剤又は増粘剤は、組成物の総質量の０〜１０質量％の割合で組成物に含まれることができる。１つ又は複数の界面活性物質、好ましくは非イオン系界面活性物質：組成物の総質量の０〜８質量％、好ましくは０．５〜３質量％。揮発性又は不揮発性油、炭化水素油又はシリコーン油、直鎖状油、環鎖状又は分岐鎖状油と総称される、室温の、１種類又は複数種類の液体油（例えば、イソドデカン、シクロペンタジメチルシロキサン、ジメチコン、イソノナノ酸イソノニル、テトラステアリン酸ペンタエリスリチル等）：組成物の総質量の０〜約１０質量％、好ましくは０．５〜５質量％。１種類又は複数種類の、自然由来、バイオ技術由来又は合成の、生物活性を有する活性物質（例えば、ビタミン、痕跡元素、アラントイン、植物性タンパク、植物抽出物等）。例えば、ポンソーのジナトリウム塩、アリザリングリーンのジナトリウム塩、キノリンイエロー、アマランスのトリナトリウム塩、タートラジンのジナトリウム塩、ローダミンのモノナトリウム塩、フクシンのジナトリウム塩、又はキサントフィル等の、１種類又は複数種類の水溶性着色剤：好ましくは組成物の総質量の０〜２質量％。
【００５１】
化粧料に一般的に用いられるその他の添加剤、特に、当該技術において周知の、防腐剤、酸化防止剤、香料も、同様に本発明の組成物に含まれてよい。当業者は、上記組成物の性質を保持する限りにおいて、これら使用可能な一連の添加物から、上記組成物にいずれを添加し、その量を選択しうる。以下の実施例は、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００５２】
実施例１：本発明の抽出物の調製方法
（１）アルコール抽出法バニラプラニフォリアの種子鞘０．５ｋｇをナイフミル（ＲＥＴＳＣＨ社製）で粉砕し、還流装置を備える５Ｌのガラス製反応容器に入れる。上記反応容器に９６．３％エタノール２．５Ｌを加え、１時間加熱する。その後、一晩冷浸する。翌朝、内容物を濾過し、反応容器を空にする。抽出物を含む溶媒は保管しておく。上記粉砕したバニラ種子鞘を再び９６．３％エタノール２．５Ｌと共にガラス製反応容器に入れ、約８０℃で４時間加熱還流する。内容物を濾過し、反応容器を空にする。得られた２つの濾液を混ぜ合わせる。その後、真空下で、溶媒を回転蒸発器によって蒸発させる。このようにして、０．１５５ｋｇのバニラプラニフォリアのオレオレジンが得られる。収率：３１％
【００５３】
（２）含水アルコールによる分別９６．３％エタノールと水を低温で混合（７０／３０  ｗ／ｗ）し、水性エタノールを調製する。上述の手順で得られたバニラオレオレジンを、溶解を促進するため、６０℃で融解する。続いて、８ｋｇの上記オレオレジンと２ｋｇの水性エタノールを、完全に均一になるまでホモジナイザーで混合する。上記混合物を７２時間デカンテーションした後、上相に脂溶性の浮遊物が形成される。下相を取り除いて上相を回収し、該上相中の溶媒を、真空下で回転蒸発器によって蒸発させる。このようにして、２．３８ｋｇのバニラプラニフォリアの脂溶性画分が得られる。収率：２９．８％
【００５４】
（３）分子蒸留上述の手順で得られたバニラプラニフォリアの脂溶性画分１５０ｇを、ポリエチレングリコール６００（ＩＮＣＩ名ＰＥＧ１２）５０ｇと混合する。ＫＤＬ４蒸留装置（ＵＩＣ社）で、以下の条件において２回の蒸留を行った。
【００５５】
【表１】
2009508914.tif 000002
上記蒸留の収率は、１回目蒸留液：１８．５３％、２回目蒸留液：８．６７％である。
【００５６】
（４）遠心分離１回目蒸留液をデカンテーションした後、浮遊物を回収して、該回収した浮遊物を４０００回転／分で１０分間遠心分離にかけ、油分を含む上相を回収する。デカンテーションにより除去された残留物も遠心分離にかけ、油分を含む上相を回収する。得られた２つの油を混合して、１回目蒸留の最終蒸留液である油２４．２２ｇを得る。２回目蒸留液にはゴムが含まれないため、遠心分離の工程は行わない。全ての油性画分を合わせると、１回目蒸留の最終蒸留液２４．２２ｇ＋２回目蒸留液１３ｇ＝３７．２２ｇとなる。上記分子蒸留及び遠心分離の収率は２４．８１％である。
【００５７】
実施例２：本発明のバニラプラニフォリア抽出物の成分分析
（１）実施例１の要領で得られたバニラプラニフォリア抽出物１００ｍｇを、１Ｎ塩酸メタノール溶液２ｍｌ中で可溶化する。上記溶液を撹拌後、８０℃で１０分間湯煎する。ヘプタン２ｍｌで液液抽出した後、クロマトグラフィーに導入することにより、エステル化した試料を得る。クロマトグラフィーの条件は以下の通りである。気相クロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ  ６８９０）２５０℃のインジェクター（スプリット又はスプリットレス）調製した試料０．５μＬをスプリット比１：１００で導入長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍの、１００％ポリジメチルシロキサンをコーティングしたキャピラリーカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＢ−１）で分離キャリアガス：ヘリウム１ｍｌ／分カラムオーブンの初期温度：７００℃温度勾配７０℃〜２５０℃（２℃／分）、等温線２５０℃６０分間合計時間：１５０分検出：炎イオン化検出器（補助ガス：窒素）
【００５８】
以下の表２に示す割合は、クロマトグラフィー系で分離されたすべての成分の合計に対する相対パーセントで示される。この結果に含まれるのは、試料の調製の際ヘキサンにより抽出された成分と、インジェクター内で蒸発可能な成分のみである。成分の同定は、質量分析計で行った。結果を、以下の表２に示す。
【００５９】
【表２】
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2009508914.tif 000004
【００６０】
実施例３：増殖因子ＨＢ−ＥＧＦに対する本発明のバニラプラニフォリア抽出物の活性の研究検査の対象としたのは、実施例１の手順２の最後で得られたバニラプラニフォリア抽出物（以後「脂溶性画分」と呼ぶ）と、手順４の最後で得られたバニラプラニフォリア抽出物（以後「油性蒸留液」と呼ぶ）
（１）ケラチノサイト培養物の調製本手順は、生物活性に関するすべての検査において共通である。新生児包皮由来のケラチノサイト（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）を６ウェルプレートに播種し、ケラチノサイト増殖用培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製ＫＢＭ）、特に、組換えヒトＥＧＦ、インスリン、ヒドロコルチゾン、ウシ下垂体抽出物、ゲンタマイシン、アンフォテリシンＢを添加した改変培地で培養した。３７℃の空気炉で２４時間培養した後、凝集した細胞をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）で洗浄し、５００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌの各濃度で検査対象を含む専用の基本培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製ＫＢＭ）で２４時間インキュベートした。抽出物の細胞毒性を検査後、活性を評価した。すべての検査において、すべての濃度について必ずしも検査していない。
【００６１】
（２）ＨＢ−ＥＧＦのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現定量検査原理：リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応増幅（Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を利用して、処理前の試料中と処理後の試料中のＨＢ−ＥＧＦのメッセンジャーＲＮＡの発現を定量する。結果は、該試料中のハウスキーピング遺伝子の発現に対照させて標準化し、又、ＰＣＲの効率の差異を考慮して修正してある。
【００６２】
結果は、処理後の試料中の対象となる遺伝子（ＨＢ−ＥＧＦ）の発現の増加又は減少の回数で表され、転写の絶対数で表されるものではない。
【００６３】
検査対象の遺伝子のｃＤＮＡ／ｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋより入手した。対象遺伝子：ＨＢ−ＥＧＦハウスキーピング遺伝子：ＰＢＤＧ
【００６４】
ＰＣＲの全てのプライマーは、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ＲｅｓａｒｃｈのソフトウェアＰＲＩＭＥＲ３を使用して得た。
【００６５】
検査方法
ｍＲＮＡは、試薬Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を製造者の推奨に従って用い、分離した。逆転写は、遺伝子キットＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を製造者の推奨に従って用い、行った。
【００６６】
ＰＣＲのリアルタイム定量は、機材ｉＣＹＣＬＥＲ  ＩＱ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉによる検出で行った。すべての検査において、ｃＤＮＡは正規化されたプログラムを用いて増幅してある。各試料は、ＩＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ、水、プライマー（ストック）を加えて処理した。反応によるｃＤＮＡの最終的な量は、逆転写に使われたＲＮＡの総量２５ｎｇに対応したものであった。
【００６７】
ＰＣＲの特異性は、アガロースゲル電気泳動によってテストし、ＰＣＲプログラムに含まれる融点解析を用いて各試料について評価した。
【００６８】
対象遺伝子の発現の相対的定量は、Ｐｆａｆｆｌ（Ｐｆａｆｆｌ、ＭＷ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（９）、ｐ．Ｅ４５、２００１）の数学モデルを用いて行った。結果を以下の表３に示す。
【００６９】
【表３】
2009508914.tif 000005
【００７０】
これらの結果から、本発明のバニラプラニフォリア抽出物は増殖因子ＨＢ−ＥＧＦの合成促進活性を有することが明らかになった。
【００７１】
実施例４：増殖因子ＴＧＦ−β１に対する本発明のバニラプラニフォリア抽出物の活性の研究
細胞培養に際しての活性化された増殖因子ＴＧＦ−β１の濃度について、イムノアッセイキットＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）（Ｎｏ．ＤＢ１００、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＥＬＩＳＡ法で定量的評価を行った。ケラチノサイトの培養条件及び検査対象の試料は、実施例３と同一である。結果を以下の表４に示す。
【００７２】
【表４】
2009508914.tif 000006
【００７３】
これらの結果から、本発明のバニラプラニフォリア抽出物は増殖因子ＴＧＦ−β１の合成促進活性を有することが明らかになった。
【００７４】
実施例５：増殖因子ＶＥＧＦに対する本発明のバニラプラニフォリア抽出物の活性の研究細胞培養に際しての増殖因子ＶＥＧＦの濃度について、イムノアッセイキットＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）（Ｎｏ．ＤＶＥ００、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＥＬＩＳＡ法で定量的評価を行った。ケラチノサイトの培養条件及び検査対象の試料は、実施例３と同一である。結果を以下の表５に示す。
【００７５】
【表５】
2009508914.tif 000007
【００７６】
これらの結果から、本発明のバニラプラニフォリア抽出物は増殖因子ＶＥＧＦの合成促進活性を有することが明らかになった。
【００７７】
実施例６：増殖因子ＰＤＧＦ−ＡＡに対する本発明のバニラプラニフォリア抽出物の活性の研究細胞培養に際しての増殖因子ヒトＰＤＧＦ−ＡＡの濃度について、イムノアッセイキットＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）（Ｎｏ．ＤＡＡ００、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＥＬＩＳＡ法で定量的評価を行った。ケラチノサイトの培養条件及び検査対象の試料は、実施例３と同一である。結果を以下の表６に示す。
【００７８】
【表６】
2009508914.tif 000008
【００７９】
これらの結果から、本発明のバニラプラニフォリア抽出物は増殖因子ＰＤＧＦ−ＡＡの合成促進活性を有することが明らかになった。
【００８０】
実施例７：増殖因子ＦＧＦ−ｂに対する本発明のバニラプラニフォリア抽出物の活性の研究細胞培養に際しての増殖因子ヒトＦＧＦ−ｂの濃度について、イムノアッセイキットＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）（Ｎｏ．ＤＦＢ５０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＥＬＩＳＡ法で定量的評価を行った。ケラチノサイトの培養条件及び検査対象の試料は、実施例３と同一である。結果を以下の表７に示す。
【００８１】
【表７】
2009508914.tif 000009
【００８２】
これらの結果から、本発明のバニラプラニフォリア抽出物は増殖因子ＦＧＦ−ｂの合成促進活性を有することが明らかになった。
【００８３】
実施例８：エンドセリン−１に対する本発明のバニラプラニフォリア抽出物の活性の研究細胞培養に際してのヒトエンドセリン−１の濃度について、イムノアッセイキットＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）（Ｎｏ．ＢＢＥ５、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＥＬＩＳＡ法で定量的評価を行った。ケラチノサイトの培養条件及び検査対象の試料は、実施例３と同一である。結果を以下の表８に示す。
【００８４】
【表８】
2009508914.tif 000010
【００８５】
これらの結果から、本発明のバニラプラニフォリア抽出物はエンドセリン−１の合成阻害活性を有することが明らかになった。
【００８６】
実施例９：マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）に対する本発明のバニラプラニフォリア抽出物の活性の研究
検査原理検査する物質を、活性化されたＭＭＰと共にインキュベートする。各ＭＭＰに特異の蛍光性酵素基質を添加することにより、酵素活性を制御する。
【００８７】
検査方法プロＭＭＰ−１、プロＭＭＰ−２、又はプロＭＭＰ−９を、室温のＡＰＭＡ（ｐ−アミノフェニル酢酸第二水銀）溶液と共にプレート内に入れ、１時間軽く撹拌しインキュベートする。
【００８８】
阻害作用を持ち得る様々な物質を、様々な濃度で加える。続いて、該混合物を室温で軽く撹拌しインキュベートする。ジメチルスルホキシド中に可溶化された蛍光性基質を加え、酵素反応を誘発する。
【００８９】
蛍光分光光度計を用いて該酵素反応を１時間追跡する。ＭＭＰ１の場合は励起波長３６０ｎｍ、放射波長４６０ｎｍで蛍光発光を測定する。ＭＭＰ２及びＭＭＰ９の場合は励起波長３２０ｎｍ、放射波長４０５ｎｍで蛍光発光を測定する。結果は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）で示す。ＲＦＵは加水分解された基質の量（毎分）を表す。
【００９０】
蛍光分光光度計Ｍｉｃｒｏｗｉｎ  ２０００で吸光量の変化Δを算出する。これは、酵素反応の初期速度（Ｖｉ）を表す。各検査において、阻害作用を持ち得る物質の各濃度について得られた３つのＶｉ値の平均を算出する。１０回の検査の結果を±ＳＤで表し、更に残効性をパーセンテージで表す。結果を以下の表９〜１１に示す。
【００９１】
【表９】
2009508914.tif 000011
【００９２】
これらの結果から、本発明のバニラプラニフォリア抽出物はＭＭＰ１の阻害活性を有することが明らかになった。
【００９３】
【表１０】
2009508914.tif 000012
【００９４】
これらの結果から、本発明のバニラプラニフォリア抽出物はＭＭＰ２の阻害活性を有することが明らかになった。
【００９５】
【表１１】
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【００９６】
これらの結果から、本発明のバニラプラニフォリア抽出物はＭＭＰ９の阻害活性を有することが明らかになった。
【００９７】
実施例１０：水中油滴（Ｏ／Ｗ）エマルション以下の組成物は当業者において周知の方法で調製することができる。以下に示す分量は質量％で表示している。
エマルションＡセテアリルアルコール＋セテアリルグルコシド：４．００％ベヘネス−２５：２．００％バニラプラニフォリアの脂溶性画分＊：１．００％カンゾウ抽出物：０．１０％皮膚軟化剤：３５．００％酢酸トコフェロール：０．５０％ジメチコン：２．００％ＥＤＴＡ：０．０５％グリセリン：５．００％ゲル化剤：２．００％ｐＨ調整剤：十分量保存料：十分量水：合計が１００．００％となる十分量＊実施例１の方法で調製
【００９８】
エマルションＢベヘネス−２５：２．００％バニラプラニフォリアの油性蒸留液：０．１０％＊ツボクサ抽出物：０．２０％張り向上剤：５．００％エモリエント剤：１５．００％紫外線防止剤：０．５０％酢酸トコフェロール：０．５０％シクロメチコン：５．００％ＥＤＴＡ：０．０５％グリセリン：５．００％ゲル化剤：２．００％ｐＨ調整剤：十分量水：合計が１００．００％となる十分量＊実施例１の方法で調製
【国際調査報告】
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