(57)【要約】  本発明は、回腸炎に対する防御性を高めるための、改善されたワクチン接種法を提供する。この方法は、10〜26日齢の若い動物、好ましくは子豚にワクチン接種を施すために、妊娠第二期または第三期における、身籠った雌豚にワクチン接種を施すために、およびこれらの組み合わせを実施するために提供される。該身籠った雌豚のワクチン接種は、分娩前に、ローソニア抗原を、反復的および/または高い用量で使用することによって行うことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物に、ローソニアイントラセルラリス(Lawsonia intracellularis)感染に対する高い防御性を付与する方法であって、
有効な用量のローソニアイントラセルラリスワクチンを、生後26日以内に、該動物に投与することを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
該ローソニアイントラセルラリスワクチンが、ローソニアイントラセルラリス抗原を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
該有効用量が、単位用量当たり、約103〜約109なる範囲のローソニアイントラセルラリス菌を含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
該有効用量が、単位用量当たり、3.0 TCID50〜約6.0 TCID50なる範囲内のローソニアイントラセルラリス菌を含む、請求項1〜3の何れか1項に記載の方法。
【請求項５】
該動物がブタである、請求項1〜4の何れか1項に記載の方法。
【請求項６】
該ワクチンが、生後16〜26日なる範囲の期間に、該動物に投与される、請求項1〜5の何れか1項に記載の方法。
【請求項７】
該ワクチンが、生後19〜22日なる範囲の期間に、該動物に投与される、請求項1〜6の何れか1項に記載の方法。
【請求項８】
該投与が、該ワクチンの単一用量の投与を含む、請求項1〜7の何れか1項に記載の方法。
【請求項９】
該投与が、経口投与用の水薬によるものである、請求項1〜8の何れか1項に記載の方法。
【請求項１０】
更に、該動物の母親が、該動物を妊娠している際に、該母親に、該ワクチンを予防接種する工程をも含む、請求項1〜9の何れか1項に記載の方法。
【請求項１１】
該予防接種を、該動物の妊娠の第二または第三期中に行う、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
該動物を分娩する前に、ワクチンの反復的用量を用いて、該母親にワクチン接種を施す、請求項10および11の何れか1項に記載の方法。
【請求項１３】
該母親に、3回のワクチン接種を施し、その第一のワクチン接種を、該動物を分娩する前の、50〜60日なる範囲の期間内に行う、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
該第二のワクチン接種が、該動物を分娩する前の、30〜40日なる範囲の期間内に行われる、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
該第三のワクチン接種が、該動物を分娩する前の、10〜20日なる範囲の期間内に行われる、請求項13および14の何れか1項に記載の方法。
【請求項１６】
該ワクチン接種が、高用量のローソニアイントラセルラリス抗原で行われる、請求項10〜15の何れか1項に記載の方法。
【請求項１７】
該高用量が、ワクチンにおいて使用されている、ローソニア抗原の従来の量と比較して、少なくとも3倍高い、ローソニアイントラセルラリス抗原の量を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
該抗原が、変性されたローソニアイントラセルラリスの生菌、ローソニアイントラセルラリスの死菌、ローソニアイントラセルラリス菌の1またはそれ以上のサブユニット、およびこれらの組み合わせから選択される請求項10〜17の何れか1項に記載の方法。
【請求項１９】
該変性されたローソニアイントラセルラリスの生菌が、ATCC承認番号PTA-4926、ATCC承認番号55783、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
子豚に、回腸炎に対する防御性を与える方法であって、該子豚を身ごもっている雌豚を、有効用量の、ローソニアイントラセルラリス感染に対するワクチンの接種を施す工程を含み、該雌豚のワクチン接種が、妊娠の第二または第三期に行われることを特徴とする、上記方法。
【請求項２１】
該ワクチン接種を、該子豚の分娩前の、60日までに行う、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
該雌豚を、該子豚の分娩前に、ワクチンの反復的用量を接種する、請求項20および21の何れか1項に記載の方法。
【請求項２３】
該雌豚に、3回のワクチン接種を施し、該第一のワクチン接種を、該子豚を分娩する前の、50〜60日なる範囲の期間内に行う、請求項20〜22の何れか1項に記載の方法。
【請求項２４】
該第二のワクチン接種を、該子豚を分娩する前の、30〜40日なる範囲の期間内に行う、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
該第三のワクチン接種を、該子豚を分娩する前の、10〜20日なる範囲の期間内に行う、請求項23〜24の何れか1項に記載の方法。
【請求項２６】
該ワクチン接種が、高用量のローソニアイントラセルラリス抗原で行われる、請求項20〜25の何れか1項に記載の方法。
【請求項２７】
該高用量が、ワクチンにおいて使用されている、ローソニア抗原の従来の量と比較して、少なくとも3倍高い、ローソニアイントラセルラリス抗原の量を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
該抗原が、変性されたローソニアイントラセルラリスの生菌、ローソニアイントラセルラリスの死菌、ローソニアイントラセルラリス菌の1またはそれ以上のサブユニット、およびこれらの組み合わせから選択される請求項20〜27の何れか1項に記載の方法。
【請求項２９】
該変性されたローソニアイントラセルラリスの生菌が、ATCC承認番号PTA-4926、ATCC承認番号55783、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
ローソニアイントラセルラリス感染に対する、高い防御性を与えるのに効果的なワクチンの有効投与量で、10〜26日なる範囲の日齢の若い動物に、ワクチン接種を施すための医薬の製造のための、ローソニアイントラセルラリス抗原の、有効量での医薬的使用。
【請求項３１】
該若い動物が、子豚を含む、請求項30記載の医薬的使用。
【請求項３２】
該有効投与量が、投与当たり該細菌を、約103〜約109なる範囲の数で含む、請求項30および31の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項３３】
該有効投与量が、単位投与量当たり、3.0 TCID50〜約6.0 TCID50なる範囲内のローソニアイントラセルラリス菌を含む、請求項30〜32の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項３４】
該若い動物が子豚である、請求項30〜33の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項３５】
該ワクチンが、生後16〜26日なる範囲の期間内に、該若い動物に投与される、請求項30〜34の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項３６】
該ワクチンが、生後19〜22日なる範囲の期間内に、該若い動物に投与される、請求項30〜35の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項３７】
該ワクチン接種段階が、該ワクチンの単一の用量を投与することを含む、請求項30〜36の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項３８】
該ワクチン接種段階が、経口投与用の水薬によって、該ワクチンを投与する段階を含む、請求項30〜37の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項３９】
更に、該若い動物の母親が、該動物を妊娠している際に、該母親に、該医薬を用いて予防接種を施す工程をも含む、請求項30〜38の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項４０】
該予防接種を、該若い動物の妊娠の第二または第三期中に行う、請求項39記載の医薬的使用。
【請求項４１】
該若い動物を分娩する前に、ワクチンの反復的用量を用いて、該母親にワクチン接種を施す、請求項39〜40の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項４２】
該母親に、3回のワクチン接種を施し、その第一のワクチン接種を、該若い動物を分娩する前の、50〜60日なる範囲の期間内に行う、請求項39〜41の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項４３】
該第二のワクチン接種が、該若い動物を分娩する前の、30〜40日なる範囲の期間内に行われる、請求項42記載の医薬的使用。
【請求項４４】
該第三のワクチン接種が、該動物を分娩する前の、10〜20日なる範囲の期間内に行われる、請求項42および43の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項４５】
該ワクチン接種が、高用量のローソニアイントラセルラリス抗原を用いて行われる、請求項39〜44の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項４６】
該高用量が、ワクチンにおいて使用されている、ローソニア抗原の従来の量と比較して、少なくとも3倍高い、ローソニアイントラセルラリス抗原の量を含む、請求項45記載の医薬的使用。
【請求項４７】
該抗原が、ローソニアイントラセルラリスの変性された生菌、ローソニアイントラセルラリスの死菌、ローソニアイントラセルラリス菌の1またはそれ以上のサブユニット、およびこれらの組み合わせから選択される請求項46記載の医薬的使用。
【請求項４８】
該ローソニアイントラセルラリスの変性された生菌が、ATCC承認番号PTA-4926、ATCC承認番号55783、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項47記載の医薬的使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本件特許出願は、2005年7月15日付で出願した、米国仮特許出願第60/699,946号の利益を請求するものであり、本米国仮特許出願の教示および内容を、ここに参考として組入れる。
【０００２】
本発明は、概して、真性の細胞内細菌：ローソニアイントラセルラリス(Lawsonia intracellularis)(ローソニア(Lawsonia)またはL.イントラセルラリス(L. intracellularis)に起因する、回腸炎としても知られる、豚の増殖性(繁殖性)腸炎に対して免疫付与するための、改良されたワクチン接種法に関するものである。具体的には、本発明は、夫々、身ごもった雌豚にワクチン接種を施すことによって；妊娠した雌豚にワクチン接種し、引続き幼い子豚に、その誕生後約3週間以内に、ワクチン接種を施すことによって；および幼い子豚に、その誕生後25〜26日なる範囲の期間内にワクチン接種を施すことによって、L.イントラセルラリスに対する高い防御性を付与する方法を提供するものである。
【０００３】
豚の増殖性腸炎(PPE)は、離乳期から青年期の豚が冒される可能性のある、自然に発病する疾患である。その原因となる物質が、真性の、細胞内、グラム陰性細菌である、ローソニアイントラセルラリスであることが確認されており、この細菌は、公知の細胞を含まない培地上での、通常の細菌学的方法では、培養できず、またその成育のためには細胞が必要であるものと考えられている。S. McOrist等, Infection and Immunity, Vol. 61, No. 19, 4286-4292 (1993)およびG. Lawson等, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 31, No. 5, 1136-1142 (1993)では、従来の組織培養フラスコ内で、IEC-18ラット由来の腸上皮細胞の単層を用いた、L.イントラセルラリスの培養について論じている。米国特許第5,714,375号および同第5,885,823号(これら特許の内容全体を参考としてここに組入れる)においては、懸濁された宿主細胞中での、L.イントラセルラリスの培養が記載されている。
L.イントラセルラリスの、病原性および非-病原性の、弱毒化細菌の菌株は、当分野の現状において周知である。例えば、WO 96/39629号およびWO 05/011731号は、L.イントラセルラリスの非-病原性、弱毒化菌株を開示している。更に、L.イントラセルラリスの弱毒化細菌の菌株は、WO 02/26250号およびWO 03/00665号からも公知である。これら参考文献の教示および内容を、参考としてここに組入れる。
【０００４】
この疾患は、先ずその著しい微視的な病状によって特徴付けられ、また末期の、感染された細胞内の細胞内細菌存在の立証により特徴付けられる。この疾患に特徴的な、病理的な特徴は、回腸の陰窩(小腸の末端部分)、大腸またはこれら両者における未熟な上皮細胞の増殖である。感染組織の部分は、「ガーデンホース(garden hose)」に類似する赤変した肥厚化粘膜、および腸の病変によって特徴付けられる。この腸の肥厚化は、最終的に正常な腸管の機能、吸収能力、および栄養分の輸送を阻害する。この疾患の臨床的な効果は、慢性的な体重減、発育不全、下痢、および死亡である。この疾患は、罹患した動物の死亡による損失、高い医療上のコスト、低い体重増および低い食物転化率のために、経済的に重要である。回腸炎の臨床例は、最も顕著には、6-20週齢の豚において観測される。しかし、L.イントラセルラリスの存在は、最近離乳期の豚(3-4週齢)において、(PCRによって)確認され、このことは、L.イントラセルラリスに対する暴露が、保育室において起り、また恐らくローソニア-陽性の雌親を起源とするものであると推定される(Mauch ＆ Bilkei, (2004), Vet. Rec., 155: 532; Marsteller等, (2003), Swine Health Prod., 11:127-130; Stege等, (2004), Vet. Micro., 104: 197-206)。これらの観測は、初期段階のワクチン接種等の予防戦略を、生産系に組入れることの重要性を強調するものである。
【０００５】
回腸炎に対する免疫性付与のための、従来のワクチン接種戦略は、ローソニア-感染経験のない豚に、該ワクチンを、3週齢およびそれ以上においてのみ、経口投与することを含んでいる。というのは、この週齢以下の子豚の群は、以前の雌豚の該細菌に対する暴露またはワクチン接種のために、L.イントラセルラリスに対して陽性の母親の抗体を持つ可能性があるからである。本発明の方法に先立って、母親の抗体または他の乳汁起源の因子の存在が、このような子豚における予防接種の効能を、潜在的に妨害するものと考えられていた。というのは、該母親起源の抗体は、該子豚の免疫系が、これを認識し、また子豚自身の抗体を分泌し始める前に、該ワクチンを中和する能力を持つからである。従って、若い子豚の予防接種は、母親起源の抗体に鑑みて、回避された。
【０００６】
本発明は、公知技術の諸欠点を克服し、また回腸炎に対する高い防御性を、豚に与える新規な方法を提供するものである。特に、本発明は、雌豚および/または生後数週間以内の若い子豚に、免疫学的に有効な量のワクチンを投与して、これらに、回腸炎に対する免疫性を付与する方法を提供する。ローソニア-ワクチン接種された、または該細菌に暴露された雌豚由来の母親起源の免疫性の、子豚への移入は、生後少なくとも6週間に渡り、子豚内部に、回腸炎に対する幾分かの防御性を与えることが発見された。しかし、ワクチン接種されない場合には、子豚は、直ぐにこの疾患に罹り易くなる。本発明の方法は、身籠った動物において、反復的な用量での投与後に、該ワクチンの、高い用量での使用は、妊娠の第二または第三期における投与でさえも、驚いたことに安全であり、しかも母子免疫性を付与するためにも有効であることが明らかとなった。
【０００７】
従って、本発明は、一般には身籠った動物(好ましくは豚)に、L.イントラセルラリス感染に対するワクチン接種を施す方法に係り、該方法では、該身籠った動物に、L.イントラセルラリス抗原によるワクチン接種を施す。更なる局面によれば、該ワクチン接種は、高い用量でおよび/または反復的用量で、L.イントラセルラリス抗原を用いて行われる。もう一つの局面によれば、本発明は、身籠った動物(好ましくは豚)に、L.イントラセルラリス感染に対するワクチン接種を施す方法に係り、該方法では、該身籠った動物に、その妊娠の第二または第三期において、ワクチン接種を施し、好ましくはこれらの身籠った動物に、高い用量でおよび/または反復的用量で、L.イントラセルラリス抗原によるワクチン接種を施す。
【０００８】
好ましい一態様においては、豚に、回腸炎に対するワクチン接種を施す方法が提供され、該方法では、ローソニアワクチンを、分娩前に少なくとも1回、好ましくは分娩前に二回、および最も好ましくは分娩前に三回(反復的用量)、身籠った雌豚に投与することを特徴とする。幾つかの形態においては、該身籠った雌豚は、高い用量のL.イントラセルラリス抗原によって、ワクチン接種される。該ワクチンを、該雌豚に3回投与した場合には、その第一の投与は、分娩前の50〜60日なる範囲、好ましくは分娩前の52〜58日なる範囲、および最も好ましくは分娩前の54〜56日なる範囲の期間内に行うべきである。該第二の投与は、分娩前の30〜40日なる範囲、好ましくは分娩前の32〜38日なる範囲、および最も好ましくは分娩前の34〜36日なる範囲の期間内に行われるべきである。該最後の投与は、分娩前の10〜20日なる範囲、好ましくは分娩前の12〜18日なる範囲、および最も好ましくは分娩前の14〜16日なる範囲の期間内に行われるべきである。該雌豚が出産した後には、該ワクチンは、離乳した後、屠殺に至るまで、各子豚に投与されるが、好ましくは子豚が3週齢に至る前に、何れにしても、夫々少なくとも10〜25および26日齢(好ましくは、16〜26日齢)なる範囲、より好ましくは10〜21日齢、より一層好ましくは15〜21日齢、および最も好ましくは19〜21日齢なる範囲の期間内に投与される。この方法のもう一つの態様においては、該ワクチンは、26日齢以前に、好ましくは16〜26日齢、より好ましくは18〜24日齢、更に一層好ましくは19〜22日齢なる範囲の期間内に、および最も好ましくは21日齢の時点にて、各子豚に投与される。
【０００９】
従って、更に別の態様において、本発明は、妊娠している雌豚並びにその分娩された子豚に、ワクチン接種を施す方法を提供する。好ましくは、該妊娠している雌豚およびその分娩された子豚は、上に説明したようにしてワクチン接種される。
母子免疫性は、予想外のことに、誕生後短期間の経過後には、該子豚の連続的なワクチン接種を妨害せず、また実際に、ここで説明するように、誕生後約3週間以内にワクチン接種した子豚が、ワクチン接種していない子豚と比較して、該疾患と関連する激しい病状が軽減されたことを見出した。
【００１０】
このように、本発明は、誕生後約3週間以内の若い動物(好ましくは、若い子豚)に、L.イントラセルラリス感染に対するワクチンの接種を施す方法に関連する。好ましくは、これらの若い動物(好ましくは、若い子豚)は、21±5日齢以内に、ワクチン接種される。より一層好ましくは、これらの若い動物(好ましくは、若い子豚)は、夫々10〜25および26日齢以内に、ワクチン接種される。より一層好ましくは、これらの若い動物(好ましくは、若い子豚)は、10〜21日齢以内に、ワクチン接種される。より一層好ましくは、これらの若い動物(好ましくは、若い子豚)は、夫々12〜21日齢以内に、ワクチン接種される。より一層好ましくは、これらの若い動物(好ましくは、若い子豚)は、15〜21日齢以内に、最も好ましくは19〜21日齢以内にワクチン接種される。この方法のもう一つの態様において、該ワクチンは、該子豚各々に、26日齢以前に、好ましくは16〜26日齢、より好ましくは18〜24日齢、更に一層好ましくは19〜22日齢、および最も好ましくは21日齢の時点にて投与される。本発明によって使用される該ワクチンは、L.イントラセルラリスに対する防御性を与える、任意のワクチンであり得る。好ましくは、該ワクチンは、生ウイルスL.イントラセルラリスワクチンである。より好ましくは、該ワクチンは、エンテリソールイライタス(EnterisolTM Ileitis) B3903(ベーリンガーインゲルハイムベトメディア社(Boehringer Ingelheim Vetmedia, Inc.)製)である。
【００１１】
該ワクチンは、動物、好ましくは哺乳動物、およびより一層好ましくは豚に、あらゆる公知の方法で、最も好ましくは経口投与用の水薬として投与される。
投与すべき用量は、特定の症例に依存するであろうが、何れにしろ、回腸炎に対する防御抗体の分泌を、および/または細胞-媒介免疫応答を誘発するのに十分な量である。適当な投薬量は、過度の実験を行うことなしに、当分野において公知の手段によって決定され、最も一般的には、使用する特定のワクチンに依存するであろう。多くの場合、適当な投薬量は、0.1〜10mL、および好ましくは約1〜5mLなる範囲内にある。エンテリソール(登録商標)イライタスの場合、該当約量は、好ましくは豚一頭当たり少なくとも2mLである。該当約量は、また非水性ワクチン接種に関しては、該豚の体重当たりの乾燥質量基準で、計算することも可能である。
以下の実施例に提示する研究は、ローソニアイントラセルラリスに暴露したおよびローソニア-陽性の雌豚を由来とするワクチンの、豚における効能を評価する目的で行われた。更に、これらの研究は、3週齢の子豚のワクチン接種に起因する、何らかの母親による妨害が存在するか否かをも評価した。
【００１２】
ここで使用する用語「ワクチン接種(vaccinationまたはvaccinating)」とは動物に対するL.イントラセルラリス抗原の投与を含む方法を意味するが、これに限定されず、ここで該L.イントラセルラリス抗原は、該動物に投与された場合に、該動物内に、L.イントラセルラリスに対する免疫応答を誘発し、または誘発することができる。
ここで使用する用語「動物」とは、鳥類、魚類、および哺乳類、例えばウシ、豚、ウマ、および霊長類を意味するが、これ等に限定されない。しかし、本発明の好ましい一態様によれば、該動物は、豚、好ましくは夫々10〜25および26日齢、好ましくは10〜21日齢、より一層好ましくは15〜21日齢、および最も好ましくは19〜21日齢なる範囲の子豚である。もう一つの好ましい態様において、該子豚とは、26日齢未満、好ましくは16〜26日齢、より好ましくは、18〜24日齢、より一層好ましくは19〜22日齢なる範囲、および最も好ましくは21日齢の時点にある子豚である。
ここで用いる用語「有効用量(投与量)(effective dose or efficacious dose)」とは、該有効用量のL.イントラセルラリス抗原を投与した動物において、免疫応答を誘発し、または誘発することができる、該抗原の量を意味するが、これに限定されない。
【００１３】
組成物またはワクチンに関連する「免疫学的または免疫応答(immunological or immune response)」とは、宿主における、対象とする該組成物またはワクチンに対する細胞性および/または抗体-媒介免疫応答の発現である。従って、該用語「免疫応答を誘発または誘発することができる」とは、宿主における免疫学的な過程を意味するが、これに限定されない。ここで、該免疫学的な過程は、該宿主が、対象とする該組成物またはワクチンに対して細胞性および/または抗体-媒介免疫応答を発現することを特徴とする。通常、「免疫応答」とは、以下に列挙する作用の1またはそれ以上を含むが、これらに限定されない：対象とする該組成物またはワクチンに含まれる、1または複数の抗原に対して特異的な、抗体、B細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、および/または細胞傷害性T細胞および/またはyd T細胞の生産または活性化。好ましくは、該宿主は、新たな感染に対する耐性が、増強されおよび/または該疾患の臨床的な重篤度が軽減されるように、治療上のまたは防御上の免疫学的な応答を示すであろう。このような防御性は、上記のような宿主の感染に関連する症状の、重篤度における軽減を含む軽減、または該症状の欠落によって明らかになるであろう。
【００１４】
動物内に、免疫応答を誘発するのに有効な、または免疫応答の誘発を可能とする抗原の量は、該ワクチンの成分およびその投与スケジュールに依存する。典型的には、死菌抗原を該ワクチンにおいて使用する場合、該ワクチンは、単位用量当たり約103〜約109なる範囲の量の細菌、好ましくは単位用量当たり約104〜約108なる範囲の量の細菌、およびより一層好ましくは単位用量当たり約105〜約106なる範囲の量の細菌を含む。
特に、変性したL.イントラセルラリスの生菌、例えば該細菌の単離体である、分離株B3903、ATCC承認番号PTA-4926号と命名されたものおよび分離株N34NP40wk、ATCC承認番号55783号と命名されたもの(両者共に、WO 96/39629およびWO 05/011731に記載されている)を、該ワクチンにおいて使用する場合、感染の恐れのある動物に投与すべき推奨される用量は、好ましくは約3.0 TCID50(50％終点組織培養感染量)/用量〜約6.0 TCID50/用量なる範囲およびより好ましくは、約4.0 TCID50/用量〜約5.0 TCID50/用量なる範囲内にある。好ましい一態様において、該ワクチンの力価は、組織培養感染量50％終点希釈アッセイ(Tissue Culture Infective Dose 50% endpoint dilution assay)により測定した値として、約4.9 TCID50/用量である。
【００１５】
サブ-ユニットワクチンは、通常、単位用量当たり抗原を、少なくとも0.2μg、好ましくは約0.2〜約400μg/用量、更に一層好ましくは約0.3〜約200μg/用量、より一層好ましくは約0.35〜約100μg/用量、更に一層好ましくは約0.4〜約50μg/用量、更に一層好ましくは約0.45〜約30μg/用量、更に一層好ましくは約0.6〜約15μg/用量、より一層好ましくは約0.75〜約8μg/用量、より一層好ましくは約1.0〜約6μg/用量、より一層好ましくは約1.3〜約3.0μg/用量なる範囲の、抗原含有率にて含むものとして、投与される。
一般に、該抗原の量は、5〜5,000μgなる範囲、および精製された細菌を使用した場合には、102.0〜109.0TCID50なる範囲、好ましくは103.0〜106.0TCID50なる範囲、およびより好ましくは104.0〜105.0TCID50なる範囲内にある。
【００１６】
ここで使用する用語「高い用量」とは、成熟した動物のワクチン接種に通常使用される単一用量の、少なくとも3倍の抗原量を意味する。特に、該用語「高い用量」とは、変性されたL.イントラセルラリスの生菌に関しては、少なくとも3×103.0〜3×109.0TCID50なる範囲、好ましくは約3×104.5〜3×106.0TCID50なる範囲の量を意味する。特に、該用語「高い用量」とは、死菌L.イントラセルラリス抗原の場合には、少なくとも3×104.0〜3×109.0個の生物または細菌、好ましくは約3×106.0〜3×108.0個の生物または細菌なる量を意味する。特に、該用語「高い用量」とは、任意のサブ-ユニットL.イントラセルラリス抗原の場合には、少なくとも3×0.2〜約3×400(0.6〜約1,200)μg/用量なる範囲の量を意味する。本件特許出願においては、高い用量のL.イントラセルラリス抗原を、身籠っている雌豚に投与して、該身籠っている雌豚における増強された免疫学的な応答を誘発した。該免疫学的な応答は、その子に伝達され、あるいはその分娩された子豚に、幾分かの免疫性を付与するであろう。
【００１７】
本明細書で使用する用語「反復的用量(repeated doses)」とは、少なくとも2回、好ましくは3回の、L.イントラセルラリス抗原の投与を意味する。身籠った雌の豚に関する、「反復的用量」でのワクチン接種養生の例は、上に与えられている。
ここで使用する用語「高い防御性(increased protection)」とは、ワクチン接種された動物群対ワクチン接種されていないコントロール動物群とを比較した場合における、L.イントラセルラリス感染と関連する、1またはそれ以上の臨床的な症状および/または病変発現の重篤度または頻度(例えば、実施例1において規定される方法並びに基準によって決定される交差病変の頻度等)における、統計的に有意な減少を意味するが、これらに限定されない。該用語「臨床的な症状の統計的に有意な減少」とは、該ワクチン接種された動物群において発現した、少なくとも一つの臨床的な症状および/または病変発現の発症頻度が、感染性のL.イントラセルラリス細菌で攻撃された後に、ワクチン接種されていないコントロール群において見られるよりも、少なくとも20％、好ましくは少なくとも30％、より一層好ましくは少なくとも40％、更に一層好ましくは少なくとも50％、より一層好ましくは少なくとも60％、より一層好ましくは少なくとも70％、より一層好ましくは少なくとも80％、より一層好ましくは少なくとも90％、より一層好ましくは少なくとも95％低いことを意味するが、これに限定されない。
【００１８】
ここで使用する用語「L.イントラセルラリス(L. intracellularis)」または「ローソニア(Lawsonia)」とは、細胞内の、湾曲したグラム-陰性細菌を意味し、これはC. Gebhart等, Int'l. Journal of Systemic Bacteriology, 1993, Vol. 43, No. 3, pp. 533-538および S. McOrist等, Int'l. Journal of Systemic Bacteriology, 1995, Vol. 45, No. 4, pp. 820-825 (1995) (これら文献は、各々その全体を、参考としてここに組入れる)に詳細に記載されており、またWO 96/39629およびWO 05/011731に記載されている分離株を含むが、これらに限定されない。特に、該用語「L.イントラセルラリス」は、またブダペスト条約に基いて、ATCC (American Type Culture Collection), 10801 ユニバーシティーブールバール(University Boulevard), マナサス(Manassas), バージニア(Virginia) 20110-2209に寄託され、かつATCC承認番号PTA 4926またはATCC承認番号55783が付与された分離株をも意味するが、これらに限定されない。これら分離株両者は、夫々WO 96/39629およびWO 05/011731に記載されている。該用語「L.イントラセルラリス」は、またあらゆる他のL.イントラセルラリス菌株、または分離株、好ましくはWO 96/39629およびWO 05/011731記載されているL.イントラセルラリス菌株の少なくとも一つの免疫学的な特性を持つもの、特にブダペスト条約に基いて、ATCC (American Type Culture Collection), 10801 ユニバーシティーブールバール, マナサス, バージニア20110-2209に寄託され、かつATCC承認番号PTA 4926またはATCC承認番号55783が付与された分離株の少なくとも一つの、免疫学的な特性を持つものをも意味するが、これらに限定されない。
【００１９】
菌株または分離株は、これが、WO 06/01294に記載されている、少なくとも抗-L.イントラセルラリス特異的抗体によって、同様にWO 06/01294に記載されている、検出アッセイに従って、検出可能である場合には、WO 96/39629およびWO 05/011731記載されている、該L.イントラセルラリス菌株、特にATCC承認番号PTA 4926またはATCC承認番号55783として寄託された分離株の少なくとも一つの「免疫学的な特性」を持つ。好ましくは、これらの抗体は、参照番号301:39、287:6、268:29、110:9、113:2および268:18を持つ抗体から選択される。好ましくは、該検出アッセイは、WO 06/12949の実施例2および3に記載されているようなサンドイッチELISA法であり、一方で抗体110:9を捕獲抗体(capture antibody)として使用し、かつ抗体268:29を、複合抗体(conjugated antibody)として使用する。WO 06/12949に記載されている、あらゆる抗体は、ハイブリドーマ細胞によって生産され、該細胞は、ブダペスト条約に基いた、特許用の寄託機関としての、センターフォーアプライドマイクロバイオロジー＆リサーチ(Center for Applied Microbiology and Research: CAMR)およびヨーロピアンコレクションオブセルカルチャー(European Collection of Cell Culture; ECACC), サリスバリー(Salisbury), ウイルシア(Wilshire) SP4 0JG, UKに寄託されている。寄託日は、2004年5月11日であった。ハイブリドーマ細胞系(HYBRIDOMA CELL LINE) 110:9は、ECACC Acc. No. 04092204の下で、首尾よく寄託された。ハイブリドーマ細胞系113:2は、ECACC Acc. No.  04092201の下で、首尾よく寄託された。ハイブリドーマ細胞系268:18は、ECACC Acc. No. 04092202の下で、首尾よく寄託された。ハイブリドーマ細胞系268:29は、ECACC Acc. No. 04092206の下で、首尾よく寄託された。ハイブリドーマ細胞系287:6は、ECACC Acc. No.  04092203の下で、首尾よく寄託された。ハイブリドーマ細胞系301:39は、ECACC Acc. No.  04092205の下で、首尾よく寄託された。
【００２０】
本発明において使用する該用語「L.イントラセルラリス抗原」とは、これが動物に投与された場合に、L.イントラセルラリスに起因する感染症に対する免疫応答を誘発し、これを刺激し、またはこれを増強できる少なくとも一つの抗原を含む、任意の組成物を意味するが、これに限定されない。好ましくは、該L.イントラセルラリス抗原は、完全なL.イントラセルラリス細菌、特に不活性化された形状にあるもの(所謂、死菌)、変性されたまたは弱毒化されたL.イントラセルラリス細菌(所謂MLB)、各々がL.イントラセルラリスの少なくとも一つの免疫原性のアミノ酸配列を含む場合には、L.イントラセルラリスのあらゆるサブ-ユニット、ポリペプチドまたは成分、または任意のキメラベクターである。ここで使用する用語「免疫原性タンパク」、「免疫原性ポリペプチド」または「免疫原性アミノ酸配列」とは、任意のアミノ酸配列を意味し、該アミノ酸配列は、宿主において、該免疫原性タンパク、免疫原性ポリペプチドまたは免疫原性アミノ酸配列を含む病原体に対する免疫応答を誘発する。特に、L.イントラセルラリスの「免疫原性タンパク」、「免疫原性ポリペプチド」または「免疫原性アミノ酸配列」とは、該「免疫原性タンパク」、「免疫原性ポリペプチド」または「免疫原性アミノ酸配列」が投与される宿主内で、L.イントラセルラリスに対する免疫応答を誘発する抗原をコードする、任意のアミノ酸配列を意味する。
【００２１】
ここで使用する「免疫原性タンパク」、「免疫原性ポリペプチド」または「免疫原性アミノ酸配列」とは、任意のタンパクの完全な長さを持つ配列、その類似体またはその免疫原性のフラグメントを包含するが、これに限定されない。該用語「免疫原性のフラグメント」とは、1またはそれ以上のエピトープを含み、またその結果として該関連する病原体に対する免疫学的な応答を誘発する、タンパクのフラグメントを意味する。このようなフラグメントは、当分野において周知の、任意数のエピトープマッピング技術を用いて、同定することができる。これについては、例えば分子生物の方法における、エピトープマッピングプロトコール(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology), Vol. 66 (Glenn E. Morris編, 1996),フマナ(Humana)プレス刊, トトワ(Totowa), N.J.を参照のこと(これら文献の教示並びに内容を、参考としてここに組入れる)。例えば、線状のエピトープは、該タンパク分子の部分に相当する多数のペプチドを、固体担体上で同時に合成し、また該ペプチドを該担体に結合したままの状態で、該ペプチドを抗体と反応させる等の方法によって決定することができる。このような技術は、当分野において公知であり、また米国特許第4,708,871号; Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81:3998-4002; およびGeysen等, Molec. Immunol., 1986, 23:709-715に記載されている(これら文献の教示並びに内容を、参考としてここに組入れる)。同様に、配座エピトープは、アミノ酸の空間的な配座を、例えばX-線結晶解析法および2-次元NMR法によって、容易に同定される。これについては、例えば上記のエピトープマッピングプロトコールを参照のこと。合成抗原は、この定義内に含まれ、例えばポリエピトープ、フランキングエピトープ、およびその他の組換えまたは合成により誘導した抗原を包含する。これについては、例えばBergmann等, Eur. J. Immunol., 1993, 23:2777-2781; Bergmann等, J. Immunol., 1996, 157:3242-3249; Suhrbier A., Immunol. ＆ Cell Biol., 1997, 75:402-408; およびGardner等, 1998,第12回世界AIDS会議(12th World AIDS Conference), ジェネバ, スイス国, 1998年6月28日乃至7月3日を参照のこと(これら文献の教示並びに内容を、参考としてここに組入れる)。
【００２２】
適当なL.イントラセルラリス抗原は、EP 1219711; US 6,605,696; WO 96/39629; WO97/20050; WO 00/69903; WO 00/69904; WO 00/69905; WO 00/69906; WO 02/38594; WO 02/26250; WO 03/006665; WO 04/033631; WO 05/026200; およびWO 05/011731に記載されているものを包含するが、これに限定されない。
このように、本発明で使用するためのワクチンは、L.イントラセルラリスに対する免疫応答を誘発し、またはこれを誘発することのできる上記のような任意のL.イントラセルラリス抗原を含む。好ましくは、該ワクチンは、少なくともL.イントラセルラリスに対する高い防御性を与える。
【００２３】
従って、第一の局面によれば、本発明は、若い動物に、L.イントラセルラリス感染に対するワクチン接種を施す方法に係り、該方法は、約3週齢以内に、該若い動物に、有効用量のL.イントラセルラリス抗原を投与する工程を含み、ここで該L.イントラセルラリス抗原は、変性されたL.イントラセルラリスの生菌、L.イントラセルラリスの死菌、またはL.イントラセルラリス菌の1またはそれ以上のサブユニットから選択される。一態様に関して上記したように、好ましくは、該ワクチン接種は、10〜26日齢、より好ましくは12〜21日齢、より一層好ましくは15〜21日齢、および最も好ましくは19〜21日齢なる範囲の期間内に行われる。もう一つの態様において、好ましくは、該ワクチン接種は、26日齢以前、好ましくは16〜26日齢、より好ましくは、18〜24日齢、より一層好ましくは19〜22日齢なる範囲の期間内、および最も好ましくは21日齢の時点において行われる。
好ましくは、該ワクチンは、変性されたL.イントラセルラリスの生菌を含む。より好ましくは、該ワクチンは、エンテリソールイライタス(EnterisolTM Ileitis) B3903(ベーリンガーインゲルハイムベトメディア社製)である。
【００２４】
更なる局面において、本発明は、若い動物、好ましくは若い子豚に、L.イントラセルラリス感染に対するワクチン接種を施す方法に係り、該方法は、10〜26日齢、より好ましくは12〜21日齢、より一層好ましくは15〜21日齢、および最も好ましくは19〜21日齢なる範囲の期間から、該若い動物に、あるいは26日齢以前、好ましくは16〜26日齢、より好ましくは、18〜24日齢、より一層好ましくは19〜22日齢なる範囲の期間内、および最も好ましくは21日齢の時点における若い動物に、約3.0 TCID50〜約6.0 TCID50なる範囲内の用量で、変性されたL.イントラセルラリスの生菌を投与する工程を含む。好ましくは、該細菌は、エンテリソール(登録商標)イライタスB3903(ベーリンガーインゲルハイムベトメディア社製)である。
更なる局面によれば、本発明は、若い動物、好ましくは若い子豚に、L.イントラセルラリス感染に対するワクチン接種を施す方法に係り、該方法は、10〜26日齢、より好ましくは12〜21日齢、より一層好ましくは15〜21日齢、および最も好ましくは19〜21日齢なる範囲の期間から、該若い動物に、あるいは26日齢以前、好ましくは16〜26日齢、より好ましくは、18〜24日齢、より一層好ましくは19〜22日齢なる範囲の期間内、および最も好ましくは21日齢の時点における若い動物に、有効用量のL.イントラセルラリス抗原を投与する工程を含み、ここで該若い動物は、L.イントラセルラリスおよび抗-L.イントラセルラリスの母性抗体陰性である。
【００２５】
更なる局面によれば、本発明は、医薬、好ましくはワクチン組成物調製のための、有効量のL.イントラセルラリス抗原の新規な医薬的利用にも係り、該医薬は、10〜26日齢、より好ましくは12〜21日齢、より一層好ましくは15〜21日齢、および最も好ましくは19〜21日齢なる範囲の若い動物、好ましくは若い子豚に、あるいは26日齢以前、好ましくは16〜26日齢、より好ましくは、18〜24日齢、より一層好ましくは19〜22日齢なる範囲の期間内、および最も好ましくは21日齢の時点における該若い動物に、ワクチン接種を施すためのものである。
【００２６】
上記医薬的な利用の更なる局面に従えば、該L.イントラセルラリス抗原は、変性されたL.イントラセルラリスの生菌、L.イントラセルラリスの死菌、またはL.イントラセルラリス菌の1またはそれ以上のサブユニットからなる群から選択される。好ましくは、該L.イントラセルラリス抗原は、変性されたL.イントラセルラリスの生菌である。より好ましくは、該若い動物には、約3.0 TCID50〜約6.0 TCID50なる範囲内の用量で、変性されたL.イントラセルラリスの生菌を投与する。L.イントラセルラリス抗原を含有するワクチン組成物の製造は、当分野の現状において独創性のあるものではなく、また当業者には公知である。例えば、当分野における当業者は、該組成物に含めることのできる追加の成分を知ることができる(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990, 第18版, マック出版社刊(Mack Publ.), イーストンを参照のこと)。専門家は、公知の注射可能な生理的に許容される無菌溶液を使用することができる。腸管外注射または注入用の直ぐに使用できる溶液を調製するために、水性の等張液、例えば塩水または対応する血漿タンパク溶液を容易に利用することができる。該ワクチン組成物は、無菌条件下で、使用の直前に公知の注射溶液で再生することのできる、凍結乾燥品または乾燥製剤、例えば構成部品を含むキットとして存在できる。
【００２７】
更に、本発明の免疫原性およびワクチン組成物は、1またはそれ以上の獣医学的に許容される担体を含むことができる。ここで使用する用語「獣医学的に許容される担体」とは、任意のあらゆる溶媒、分散媒、被覆、アジュバント、安定剤、希釈剤、保存剤、抗生物質および抗真菌剤、等張化剤、吸着遅延剤等を包含する。
「希釈剤」は、水、塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等を含むことができる。等張化剤は、特に塩化ナトリウム、デキストロース、マニトール、ソルビトール、およびラクトースを含むことができる。安定剤は、特にアルブミンおよびエチレンジアミンテトラ酢酸のアルカリ塩を包含する。
【００２８】
ここで使用する用語「アジュバント」とは、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、サポニン、例えばキル(Quil) A、QS-21(ケンブリッジバイオテック社(Cambridge Biotech Inc.), ケンブリッジ, MA), GPI-0100(ガレニカファーマシューティカルズ社(Galenica Pharmaceuticals, Inc.), バーミンガム, AL)、油中水型エマルション、水中油型エマルション、または水中油中水型エマルションを含むことができる。該エマルションは、特に軽質液状パラフィン油(欧州薬局方式(European Pharmacopoeia type))；イソプレノイド油、例えばスクアランまたはスクアレン；アルケン、特にイソブテンまたはデセンのオリゴマー化により得られるオイル；直鎖アルキル基を含む酸またはアルコールのエステル、より具体的には植物油、エチルオレエート、プロピレングリコールジ-(カプリレート/カプレート)、グリセリルトリ-(カプリレート/カプレート)、またはプロピレングリコールジ-オレエート；分岐脂肪酸またはアルコールのエステル。特にイソステアリン酸エステルを主成分とするものであり得る。該オイルは、エマルションを生成するために、乳化剤と組合わせて使用される。これらの乳化剤は、好ましくはノニオン性界面活性剤、特にソルビタン、マンニド(例えば、無水マニトールのオレエート)、グリコール、ポリグリセロール、プロピレングリコールと、オレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸またはヒドロキシステアリン酸とのエステル(これらは、場合によりエトキシル化されている)、およびポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特にプルロニック(Pluronic)製品、とりわけL121である。これについては、Hunter等, アジュバントの理論と実際の応用(The Theory and Practical Application of Adjuvants), Stewart-Tull編, D. E. S., John Wiley and Sons社刊, NY, pp51-94 (1995)およびTodd等, Vaccine, 1997, 15:564-570を参照のこと(これら文献の教示並びに内容を、参考としてここに組入れる)。例えば、「ワクチンデザイン、サブユニットおよびアジュバント法(Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach)」, M. Powell ＆ M. Newman編, Plenum Press社刊, 1995の147頁に記載されているSPTエマルションおよびこの書物の183頁に記載されているMF59エマルションを使用することができる(これら文献の教示並びに内容を、参考としてここに組入れる)。
【００２９】
アジュバントの更なる例は、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマー、およびマレイン酸無水物とアルケニル誘導体とのコポリマーから選択される化合物である。有利なアジュバント化合物は、特に糖またはポリアルコールのポリアルケニルエーテルで架橋されている、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物は、カルボマーなる名称の下に公知である(Phameuropa, 1996, Vol. 8(No. 2), 6月)。当業者は、また米国特許第2,909,462号を参照することができる。この特許は、少なくとも3個、好ましくは8個を越えないヒドロキシル基を持つポリヒドロキシル化化合物で架橋されたこのようなアクリル系ポリマーを開示しており、少なくとも3個のヒドロキシル基の水素原子は、少なくとも2個の炭素原子を含む不飽和脂肪族基で置換されている。好ましいこれらの基は、2〜4個の炭素原子を持つもの、例えばビニル基、アリル基、およびその他のエチレン系不飽和基である。該不飽和基は、それ自体他の置換基、例えばメチル基を含むことができる。カルボポール(Carbopol) (BFグッドリッチ(Goodrich), オハイオ州, USA)なる名称の下で市販されている製品が、特に適している。これらは、アリルスクロースまたはアリルペンタエリスリトールで架橋されている。これらとしては、カルボポール(Carbopol) 974P、934Pおよび971Pを例示することができる。カルボポール971Pを使用することが、最も好ましい。マレイン酸無水物とアルケニル誘導体とのコポリマーとしては、コポリマーEMA(モンサント(Monsanto)社)を挙げることができ、これらは、マレイン酸無水物とエチレンとのコポリマーである。これらポリマーの水に対する溶解は、酸性溶液の生成に導くが、これは好ましくは生理学的なpHに中和されて、上記の免疫原性、免疫学的またはワクチン組成物自体が配合されることになる、該アジュバント溶液を与える。更に適当なアジュバントは、数多く存在する中で、特にRIBIアジュバント系(リビ社(Ribi Inc.)), ブロックコポリマー(CytRx、アトランタ、GA)、SAF-M(チロン(Chiron), エマービル、CA)、モノホスホリル脂質A、アブリジン(Avridine)脂質-アミンアジュバント、E.コリ由来の非-耐熱性のエンテロトキシン(組換えその他)、コレラ毒素 IMS 1314またはムラミールジペプチドを含むが、これに限定されない。
【００３０】
好ましくは、該アジュバントは、単位用量当たり約100μg〜約10mgなる範囲の量で添加される。より一層好ましくは、該アジュバントは、単位用量当たり約100μg〜約10mgなる範囲の量で添加される。より一層好ましくは、該アジュバントは、単位用量当たり約500μg〜約5mgなる範囲の量で添加される。より一層好ましくは、該アジュバントは、単位用量当たり約750μg〜約2.5mgなる範囲の量で添加される。最も好ましくは、該アジュバントは、単位用量当たり約1mgなる量で添加される。
本発明のワクチン組成物は、更に1またはそれ以上の他の免疫調節薬、例えばインターロイキン、インターフェロン、または他のサイトカインを含むことができる。該ワクチン組成物は、またゲンタマイシンおよびメルチオレートをも含むことができる。本発明に関連して有用なアジュバントおよび添加剤の量および濃度は、当業者によって容易に決定することができるが、本発明は、該ワクチン組成物の単位用量当たり、約50μg〜約2,000μgなる範囲、および好ましくは約250μg/mLなるアジュバントを含む組成物を意図している。もう一つの好ましい態様において、本発明は、約1μg/mL〜約60μg/mLなる範囲の量の抗生物質、およびより好ましくは約30μg/mLなる量の抗生物質を含有するワクチン組成物を意図する。
【００３１】
該ワクチンは、動物、好ましくは哺乳動物、および更に一層好ましくは豚に、任意の公知の方法により、最も好ましくは経口投与用の水薬として投与される。投与すべき用量は、特定の症例に依存するが、何れにしても、防御抗体の分泌を誘発するか、あるいは回腸炎に対する細胞-媒介免疫応答を誘発するのに十分な量である。
本発明の更なる局面によれば、若い動物(好ましくは、若い子豚)にワクチン接種を施すのに使用する、該L.イントラセルラリスワクチンは、単一または反復的用量で投与される。生菌または死菌ワクチンは、1または2回に渡り、最初のワクチン接種後2〜4週間隔で投与することができる。弱毒化、生菌ワクチンに関しては、一回の投薬が好ましい。好ましくは、該第一または単一の投与は、上記の如く、16〜26日齢、より好ましくは、18〜24日齢、より一層好ましくは19〜22日齢なる範囲の期間内に、および最も好ましくは21日齢の時点にいて行われ、あるいは10〜26日齢、より好ましくは12〜21日齢、より一層好ましくは15〜21日齢、および最も好ましくは19〜21日齢なる範囲の期間から開始される。
第二回目の投与が望ましく、または必要な場合には、該第二回目の投与は、該ワクチンの第一回目の投与後の、約1〜約4週間なる範囲の期間内に行われる。更なる局面によれば、ワクチンの再接種は、任意の先行するワクチン接種後、3〜12ヶ月なる間隔で行われる。ワクチン用量の後の投与は、好ましくは6ヶ月〜1年なる間隔を基本として行う。
【実施例】
【００３２】
以下の実施例は、本発明の好ましい態様の代表的なものである。ここに記載する如何なるものも、本発明の範囲を何ら限定するものと考えるべきではない。
実施例1
本実施例は、ローソニア-ワクチン接種したまたはワクチン接種されていない雌豚から誕生した、3-週齢の子豚において、ローソニア-ワクチンの効能を評価し、また雌豚のワクチン接種が、子豚のワクチン接種に対する応答を阻害する、母子免疫妨害を引起すか否かを決定した。これは、例えばワクチン接種したまたはワクチン接種されていない子豚両者の、毒性の純培養物攻撃に伴う、該疾患の誘発における減少によって決定できる。効能を測定するために使用した、基本的な研究(検討)パラメータは、巨視的および微視的な回腸および結腸の病変であった。更に、本実施例では、単一のおよび反復的な用量でのワクチン接種に引続き、妊娠の第二期および第三期における、身籠った雌豚に投与するに際して、安全なローソニア-ワクチンの接種量(safety issues)をも評価した。
【００３３】
物質および方法
盲検的研究において、16頭の身籠った、かつローソニア血清-陰性の雌豚を得、各々8頭の雌豚を含む、2群、即ちA群およびB群に、ランダムに分割した。A群は、分娩前に高レベルの母子免疫性を誘発するために、-55、-35、および-14日に、経口投与用の水薬によって、3用量のエンテリソールイライタス(EnterisolTM Ileitis) B3903の投与を受けた。B群は、分娩前にプラシーボを投与して、陰性のコントロールとした。雌豚には、薬物を添加してない授乳期の飼料に切り替える前に、先ず薬物を添加してない、市販の妊娠期の飼料を与えた。これら全ての雌豚が、均一に受胎し、また分娩するように努力したが、分娩時期における幾分かの変動(10日間)があった。多重ワクチン接種および攻撃誘発日に係る変動性の問題を回避するために、分娩日の中央値をこの試みの0日として設定した。この研究のワクチン接種および攻撃部分として用いた全ての子豚は、ワクチン接種時点(21日齢)において21±5日なる日齢を有していた。子豚には、先ず薬物を添加してない、人工乳飼料を与え、次いで薬物を添加してない、離乳飼料を、更に薬物を添加してない、最終育成飼料を与えた。豚から集めた、血清学的なサンプルは、実際の誕生日、7日齢、および14日齢時点において採取し、母性抗体の存在に関する正確な測定を担保した。血清学的なサンプルは、分娩前に、雌豚からも採取した。更に、雌豚を、22日目に剖検して、その回腸および結腸組織を、全体的な病理に関して評価し、その回腸、結腸、腸間膜のリンパ節、および扁桃を、PCRによって評価し、死産の豚をPCRによって評価し、また該雌豚の再現性ある出産性能を、分娩日における、生存状態で誕生した、死産の、またはミイラ化したものを記録することによって、評価した。
【００３４】
分娩(本研究の21日目)の後、同産子で分け、次いで6群の処置群のひとつに、ランダムに振り分け、該処置群の各々は、本研究中ずっと、別々に収容した。ワクチン接種した雌豚(A群)から生まれた子豚は、処置群1〜3にランダムに分けた。ワクチン接種してない雌豚(B群)から生まれた子豚は、処置群4〜6にランダムに分けた。21日目に、1群当たり20匹の子豚を含む、処置群1および4は、直接経口投与用の水薬によって、用量21mL(1×105.0log10 TCID50/用量)のエンテリソールイライタスB3903の投与を受けた。1群当たり20匹の子豚を含む、処置群2および5は、一回の用量2mLのプラシーボの、経口投与用の水薬による、直接投与を受けた。1群当たり10匹の子豚を含む、処置群3および6は、何ら処置を受けず、L.イントラセルラリス感染に対する感染し易さの、該豚の起源を確認するための、厳密なコントロールとして機能した。
ワクチン接種の3週間後(本研究の42日目)に、処置群1、2、4および5におけるテスト用子豚は、一回の10mL(1×107.3log10 TCID50/用量)なる用量の、強制飼養によって、有毒の低継代(low-passage)純培養ローソニア異種単離株：N101494の投与により、攻撃誘発された。しかし、任意の他の感染性の、野生型または低-継代のL.イントラセルラリス分離株を、攻撃誘発菌として使用することができる。本研究の63日目(免疫誘発後3週間)に、あらゆる処置群(1〜6)を、安楽死させ、かつ剖検して、PPEに関する全体的並びに微視的な病変分析を行った。
【００３５】
異種毒性の純培養物攻撃誘発に対して、子豚における、エンテリソールイライタスB3903ワクチンの効能を測定するのに使用した基本的な基準は、該回腸および結腸における病変を評価するための、巨視的および微視的技術両者を用いた、病変発現の観測であった。全体的な病変は、回腸部分、回腸/盲腸接合部において、および本研究の終了時点での回腸について評価した。腸の病変は、その重篤度のレベルに基いて等級付けを行い、また追加のサンプルを、PCR、IHC、およびH&E分析のために、該組織の任意の感染部分から採取した。病変の重篤度は、該回腸の粘膜内層中に見出される粘膜肥厚化の程度によって決定した。病変スコア0とは、粘膜肥厚化、浮腫、粘膜隆起/皺襞、または漿膜の網状化による隆起がないことを示す。病変スコア1とは、粘膜における小さな隆起/皺襞の存在を包含する僅かな肥厚化、粘膜壁上の僅かな浮腫、および幾つかの症例における充血の存在を示す。病変スコア2とは、中程度の肥厚化および/または炎症の存在に等しいものとみなされた。これは、粘膜における隆起した深い隆起/皺襞、粘膜壁における中程度の浮腫、漿膜表面の網状化、および幾つかの症例における充血の存在によって明らかとなった。病変スコア3とは、粘膜における重度のおよび深い隆起/皺襞、粘膜壁における中程度の浮腫、漿膜表面の網状化、およびこの場合にも、幾つかの症例における充血の存在によって明らかとなる、重度の肥厚化および/または炎症の存在を示す。病変スコア4とは、重度の肥厚化および/または炎症および/または血液の存在を示す。この病変スコアは、粘膜における重度のおよび深い隆起/皺襞、粘膜壁における中程度の浮腫、漿膜表面の網状化、およびこの場合にも、幾つかの症例における充血、および血の混じった内容物および/または血餅の存在によって明らかとされた。最後に、病変スコア5とは、粘膜表面の重度の病変によって立証される壊死の存在を示し、結果として壊死部分が存在し、あるいは幾つかの場合には、全粘膜表面が、重度の病変のために、脱落または剥離する。
【００３６】
ローソニアによって引起される微視的な病変は、PPEに対して診断学的である。この疾患の組織病理学的病変は、上皮過形成、特に明らかな杯細胞の存在しない粘膜陰窩における該過形成を含む。ローソニアは、通常粘膜陰窩の増殖中の上皮細胞内に見出される。ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)およびIHC染色法を利用する、組織学的検査のために、回腸の長さ約2-4cmに及ぶ切片を、緩衝ホルマリン液中に入れた。H&E染色は、ローソニア感染に起因する陰窩の過形成の存在を検出し、一方IHC染色は、感染された組織における、該生物の存在および微視的な病変の発現の存在を確認する際に、抗-ローソニアモノクローナル抗体の特異性を利用するものである。該抗-ローソニアモノクローナル抗体は、全てのローソニア分離株に存在する外部膜タンパク質をターゲットとして、全ローソニア細胞を特異的に検出する。このモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞系VPM53由来のものであり、スコットランドのエジンバラ大学(University of Edinburgh, Scotland)の研究者等によって開発されたものであった。回腸切片のIHC染色により決定されたような、ローソニア菌および微視的な病変の存在を、増殖性の腸細胞(病変)が存在しないことを示すスコア0、僅かな病巣状の病変の存在を示すスコア1、中程度の拡散性病変の存在を示すスコア2、および重度の拡散性病変の存在を示すスコア3によって記録した。細菌の存在に関連して、該IHC評価系は、細菌が存在しない場合を0、僅かな病巣状の細菌が存在する場合を1、中程度の拡散性細菌が存在する場合を2、および重度の拡散性細菌が存在する場合を3として記録した。
【００３７】
測定の二次的な基準は、臨床的な症状の観察、糞便スワブおよび組織におけるPCRによるローソニアの検出、ローソニアに暴露された子豚によるADWGおよびセロコンバージョン(IFAT)であった。
毎日の健康の観察を、本研究の開始日から、各テスト動物の攻撃誘発(チャレンジ)日まで行った。下痢、挙動および身体状況を包含する、臨床的な健康指標パラメータは、チャレンジ日(第42日目)から、本研究の終了日前日(第62日目)まで毎日記録した。該スコアは、疾患の重篤度を反映していた。下痢に関しては、スコア1は、正常な糞便を示し、スコア2は、血液を含まない、半-固形状の糞便を示し、スコア3は、水状の糞便であるが、如何なる血液も含まず、あるいは暗色の糞便でもない場合を示し、またスコア4は、糞便が軟質であれ、完全(formed)であれ、血液が混じっている糞便であることを示す。挙動に関するスコア1は、正常な挙動を示し、スコア2は、僅かに〜中程度に減衰された挙動(孤立傾向)を示し、スコア3は、重度に減退した挙動または横臥状態をとることを示した。身体状況に関するスコア1は、正常な身体状況であることを示し、スコア2は、僅かに〜中程度にやつれた身体状況であることを示し、またスコア3は、酷くやつれた身体状況であることを示していた。
【００３８】
ローソニアの糞便による排出を、本研究における第-55、-35、-14、21、28、35、42、49、56および63日目に糞便スワブテストによって、イレイティス(Ileitis) PCR(f-PCR)により評価した。糞便スワブは、PCRを利用して、糞便中におけるローソニアDNAの存在につきテストした。新たな組織の切片を、本研究の終了日である63日目において、各テスト動物から回収した。組織中の細菌含有率の定性的な分析を、本研究の63日目において、回腸、結腸、扁桃および腸間膜リンパ節におけるローソニアに関する組織学的な評価と共に、イレイティスPCR(t-PCR)により評価した。このPCRアッセイは、Jones等によって開発されたものであり、このアッセイは、2種のオリゴヌクレオチドプライマ(各々20塩基対)の特異性を利用して、ローソニアのゲノムDNAから319bpを持つフラグメントを製造するものである。これらのプライマは、ローソニアに対して特異的なゲノムDNAの、予め決定された配列をターゲットとする。PCR工程中に生成されるDNAフラグメントを、イレイティス-陽性およびイレイティス-陰性DNA抽出液および「正」または「正でない」結果を確認するためのPCR反応コントロールと比較する。該陽性DNA抽出液コントロールは、1Xリン酸緩衝生理塩水(PBS)(200μL/チューブ)内の、感染McCoy細胞を含む全細胞ローソニアである。該陰性DNA抽出液コントロールは、1X PBS(200μL/チューブ)内の、感染されていないMcCoy細胞である。イレイティス-PCR反応コントロールは、細胞培養収穫物(ローソニア+McCoy細胞)から精製した、ローソニアゲノムDNAからなっており、一方該陰性のコントロールは、RNアーゼを含まない水(アムレスコ(Amresco)社、オハイオ州、ソロン)である。ローソニアDNAに対して陽性のテストサンプルは、イレイティス-PCR-陽性コントロール(抽出および反応)両者と等価なサイズのDNAフラグメントを生成するが、陰性のサンプルは、このサイズのフラグメントは生成しないであろう。各テストサンプル由来の抽出DNAを含む調製物は、ISO-QUICK DNA抽出キット(ORCAリサーチ社(Research Inc.)、ワシントン、ボテル)を用いて得た。PCRの結果を、エンテリソールイライタスB3903でワクチン接種し、および/またはローソニア異種分離株N101494によりチャレンジした子豚における、ローソニアの排出を測定するために使用した。体重を、ワクチン接種した日(第21日目)、チャレンジに掛けた日(第42日目)、および本研究を終了した日(第63日目)に測定して、各処置群の、毎日の平均体重獲得割合(ADWG)を算出した。各群に対する該ADWGを、ワクチン接種後およびチャレンジ後のADWGに関して、相互に比較した。体重は、電子式体重バースケール装置(ウエイ-トロニクス(Weigh-Tronix)、ウエイ-トロニクス社製、ミネソタ州、フェアモント)を用いて測定し、該装置は、その使用前後において、公認のテストを用いて較正した。
【００３９】
血清を、インダイレクトフルオレッセントアンチボディーテスト(Indirect Fluorescent Antibody Test; IFAT)を利用してテストして、テスト動物中の抗-ローソニア抗体を検出した。第-55、-35、および-14日目の雌豚由来の、および0、7および14日齢における全てのテスト動物の、および本研究の試験実施日21、28、35、42、49、56、および63日目における、バクテーナチューブ内の静脈全血を、採取した。該血液は、遠心分離前に、凝固させ、またその血清を集め、凍結させた。次いで、このIFATを用いて、該豚の血清を、抗-ローソニアIgG分子の存在につきスクリーニングした。抗-ローソニア抗体は、全細胞ローソニアの外膜抗原に結合し、96-ウエルマイクロタイタプレートの各ウエルの底部分に固定されている、該生物を完全に覆っていた。また抗-IgG FITC-タッグ付けされた二次抗体の接合体が導入され、各ウエル内の任意のIgG-抗原複合体と結合した。これらのFITC-結合複合体は、紫外光の照射下で、緑の蛍光色で輝く。陽性のテストサンプルは、ローソニアあるいは感染したMcCoy細胞を含む多数のローソニアに類似する、多数の明るい緑色の、小さな、湾曲-形状のロッドの存在を明らかにする。陰性のIFATテストサンプルは、McCoy細胞の鈍い(微かな)緑色のバックグラウンドを示す。テスト動物におけるローソニア暴露の指標となる、ワクチン接種および/または毒性のチャレンジを受けた試験動物群における、セロコンバージョンパターンを観察するのに、IFATにより確認されたこれらの結果を使用した。
【００４０】
TCID50終点アッセイを、代表的なサンプル、即ち本研究の21日目において、各ワクチン用量を投与した被検子豚について行った。代表的なテストサンプルの5つの複製体を、ワクチン接種およびチャレンジの前後において、Ham's F12(DMEM F12)および5％の加熱不活性化した、新生児ウシ血清(NBS)(JRHバイオサイエンスズ社(Biosciences)、カンザス州、レネクサ)を強化した、ドゥルベコ(Dulbecco's)改良必須培地で、10倍に希釈(10-1〜10-6)した。希釈したサンプルをテストし、各テストサンプル中のローソニアの生菌数を決定した。平均の力価を、ワクチン接種の前後およびチャレンジ投与前後において、5回の実験から算出し、各子豚に与えられたテスト物質の体積を乗じて、単位用量当たりの全log10(ローソニア)を決定した。ワクチン接種またはチャレンジに関する、平均の全力価(log10 TCID50/用量)は、該平均の前後の力価測定の結果から決定した。
ワクチン接種後およびチャレンジ後両者のADWG、臨床的なスコア、セロコンバージョン率(IFAT)、コロニー形成性(t-PCR)、糞便排出(f-PCR)、全体の病変、および免疫組織化学的(IHC)に発現された微視的な病変に係るデータを解析することによって、処理群の比較を行った。
【００４１】
3匹の子豚(群1から1匹、および群5から2匹)が、ワクチン接種後で、かつ本研究を終了する前に死亡した。該群1由来の子豚を、ローソニアによる感染について分析したが、その死因は、高レベルのE.コリによる、ショック/敗血症であるものと決定された。死亡した該群5由来の2匹の子豚は、ローソニア感染に特徴的な、重度の全体的および微視的な病変を有しており、またその予想された死因は、ローソニアにあるとされた。
結果：
本研究において採取された上記の糞便および血清サンプルの評価は、群AまたはBの何れかにおける雌豚の何れも、その糞便中に、またはその回腸または結腸内に、検出し得るローソニアの存在を見なかった。該群Aの雌豚は、本研究の少なくとも一時点において、8匹の動物中の5匹において、検出可能なIFAT力価を有していた。群Bの雌豚は何れも、同一の期間中において、検出可能なIFAT力価を有していた。これらのデータを、以下の表1にまとめる。
【００４２】
【表１】
2009501730.tif 000002
【００４３】
全ての雌豚を剖検し、ローソニア感染に対して典型的な、全体的な病変について評価した。しかし、全体的な病変またはt-PCR検出に関して陽性の雌豚は皆無であった。
妊娠の第二および第三トリメスター両者において、ワクチンを投与したという事実にも拘らず、如何なる異常な一般的健康上の観測も、この臨床実験中に、全ての雌豚に対して記録されなかった。群AおよびBの雌豚間の分娩の結果も、同様に極めて類似しており、夫々各群において平均して9.4および7.6なる生誕子豚数であった。該群Aの雌豚は、一腹子当たり1.8匹の豚なる、平均の死産率を有し、またミイラ化または分娩致死率は零であった。該群Bの雌豚は、一腹子当たり、0.9匹なる平均の死産率、0.1匹なるミイラ化率、および0.1匹のブタなる分娩時の死亡率を示した。これら死産した豚の診断的な評価は、これらがローソニア-陰性であり、また繁殖に関連する通常の損失の範囲内であることを示していた。該血清学的な結果によれば、予想されるように、ワクチン接種なしの雌豚は、血清反応-陰性のままであり、また幾分かの血清反応-陽性の動物が、該群Aにおいて認められた。該群Aの雌豚は、ワクチン接種なしのコントロール群と比較して、より高い一腹子当たりの生誕豚頭数を示した。この結果は、このワクチン接種法およびその内容に、何ら負の効果がないことを示している。これらのデータは、上記の表1にまとめた。
【００４４】
巨視的な子豚の病変発現は、各テスト動物の回腸および結腸を、本研究の終了時点において、PPEに関連する全体的な病変について評価し、これを評点付けすることによって決定した。群1および4由来の子豚は、夫々0.16および0.15という、最低の回腸病変スコアを有していた。有意な差異は見られず、またワクチン接種したおよびワクチン接種なしの雌豚由来の豚におけるワクチンの効能を明らかにした。群2および5は、夫々0.85および2.35なる値の回腸病変スコアを示した。これらの間には有意な差異(P<0.05)があり、またこのことは、雌豚のワクチン接種が、幾分かのレベルの母性防御をもたらし(群2)またワクチン接種を受けていない動物が、毒性のチャレンジに対して敏感であった(群5)ことを示す。群4および5も、また有意に異なる(P<0.05)回腸病変スコアを有し、これは、ナイーブなワクチン接種を受けた子豚における該ワクチンの効能を確証するものである。群1および2の該回腸病変スコアも、また有意に異なっており(P<0.05)、これは、ローソニア-陽性の雌豚内の豚のワクチン接種が、母子免疫を超える有意な利益(P<0.05)をもたらすことを確証している。同様な傾向および有意性が、割合として陽性の動物(全体として陽性の群)に関して、該回腸サンプルにつき見られた。回腸の病変は、群5の豚の80％において見られた。これに対して、群1および4両者の動物の16％未満が、回腸の病変を示した。
【００４５】
該結腸の全体的な病変スコアおよび陽性の動物の百分率に関連して、群4および5には、有意な差異(P<0.05)がある。処置群間には、その他の有意な差異は観測されなかった。厳密なコントロール(群3および6)は、回腸および結腸における全体的な病変に関して、陰性であり、結果として本研究の妥当性を確証している。このテストの結果を、以下の表2に与える：
【００４６】
【表２】
2009501730.tif 000003
b：群1および2を比較すると、有意な差異(P<0.05)がある。
c：群1および4を比較すると、有意な差異(P<0.05)がある。
d：群2および5を比較すると、有意な差異(P<0.05)がある。
e：群4および5を比較すると、有意な差異(P<0.05)がある。
f：上記プロトコールに示したように、統計的分析に含まれない群。
【００４７】
IHCおよびH&E法を使用して、微視的な子豚における病変の発現を評価した。扁桃、腸間膜リンパ節、回腸末端、および結腸の、長さ2-4cmの切片を、本研究の終了時点(63日目)において採取し、IHC分析のために、10％の緩衝したホルマリン中に入れた。ローソニアは、本研究の終了時点において、全ての処置群の扁桃切片の、IHC染色によっては検出されなかった。ローソニアは、群5の腸間膜リンパ節の20サンプル当たり2サンプルについて検出された。他のすべての群のあらゆる他の腸間膜リンパ節サンプルは陰性であり、また腸間膜リンパ節のテストに関しては、処置群間に如何なる有意な違いも見られなかった。
【００４８】
群1および4は、夫々0.35および0.15なる値の、微視的回腸病変スコアを有しており、また有意な差を示さなかった。群5は、2.42なる値の、最大の微視的回腸病変スコアを有しており、これは群2および4の処置群両者とは、有意な差(P<0.05)を示した。このことは、群2にはあるレベルの母子免疫が存在し、また該ワクチンは、ナイーブなワクチン接種された豚において効能をもたらすことを立証している。微視的な病変を持つ、回腸サンプルの割合に関する評価は、群5における豚の95％が、病変を持ち、またこの群が、この場合にも群2および4とは、有意に異なっている(P<0.05)ことを示している。群5は、1.35なる平均の微視的結腸病変スコアを有し、またこの処置群の動物の60％が、ローソニア病変検出に関して陽性であった。これは、群2および4の処置群両者とは、極めて有意に異なっていた(P<0.05)。微視的なデータを以下の表3にまとめた：
【００４９】
【表３】
2009501730.tif 000004
d：群2および5を比較すると、有意な差異(P<0.05)がある。
e：群4および5を比較すると、有意な差異(P<0.05)がある。
f：上記プロトコールに示したように、統計的分析に含まれない群。
*1 サンプルは、重度の壊死および脱落を示し、またIHCでは読取れなかった。
【００５０】
f-PCRによる、ローソニアに起因する、子豚の糞便排出を評価するために、糞便スワブを、各処置群の全テスト動物から毎週採集し、本研究の第21、28、35、42、49、56、および63日目に、イレイティス-PCRによって、L.イントラセルラリスの存在につきテストした。第21、28、35日目において、全処置群の子豚は、L.イントラセルラリスにつき、f-PCR陰性であった。群1の子豚は、第42日目にf-PCRに関して陽性として検出され、この期間中に陽性であるとされた子豚の11-16％が、第63日目まで陽性を維持していた。群2の子豚は、第49日目にf-PCRに関して陽性として検出され、この期間中に陽性であるとされた子豚の5-25％が、第63日目まで陽性を維持していた。群4の子豚は、第42日目にf-PCRに関して陽性として検出され、この期間中に陽性であるとされた子豚の5-25％が、夫々第63日目まで陽性を維持していた。群5の子豚は、第49日目にf-PCRに関して陽性として検出され、またこの期間中に陽性であるとされた子豚の15-72％が、第63日目まで陽性を維持していた。群3および6の子豚は、この試験期間中ずっと、f-PCRに関して陰性を維持していた。これらのデータのカイ2乗分析結果は、第42日目に群4と5との間、第63日目に群2と5との間、また第63日目に群4と5との間には、有意な違い(P<0.05)があることを示している。これらの糞便排出データを、以下の表4にまとめた。
【００５１】
【表４】
2009501730.tif 000005
a：カイ2乗テストにおいて、全体としての比較は、有意な差の存在を示さない。
d：カイ2乗分析によれば、群2および5を比較すると、有意な差異(P<0.05)がある。
e：カイ2乗分析によれば、群4および5を比較すると、有意な差異(P<0.05)がある。
f：上記プロトコールに示したように、統計的分析に含まれない群。
【００５２】
豚におけるローソニアの組織コロニー形成(t-PCR)を、回腸末端、結腸、扁桃、および腸間膜リンパ節の組織片の、PCRテストによって、本研究の終了時点(63日目)において評価した。該厳密なコントロール(群3および6)は、ローソニア検出に関してt-PCR陰性であり、またこれは結果的に豚の起源および研究の妥当性を確証している。全ての扁桃サンプルは、t-PCR陰性であった。該群5の結腸および腸間膜リンパ節サンプルのみが、t-PCR陽性であり、テストした子豚の5-10％が陽性であった。群1および2の子豚由来の回腸サンプルは、夫々20％および25％という、t-PCR陽性のテスト結果を与えた。比較すると、群4および5由来の子豚は、夫々5％および45％という、t-PCR陽性のテスト結果を与えた。群3および6由来の全ての回腸サンプルは、t-PCR陰性であった。カイ2乗分析は、扁桃、腸間膜リンパ節、または結腸サンプルにおいて、処置群間の有意な差異を示さなかった。回腸サンプルに関するt-PCRの結果において、群4および5間に有意な差異(P<0.05)がみられ、群5は、この実験において最も高い陽性の割合を示した。以下の表5に、このテストの結果をまとめた：
【００５３】
【表５】
2009501730.tif 000006
a：カイ2乗テストにおいて、全体としての比較は、有意な差の存在を示さない。
e：カイ2乗テストによれば、群4および5を比較すると、有意な差異(P<0.05)がある。
f：上記プロトコールに示したように、統計的分析に含まれない群。
【００５４】
ADWGは、ワクチン接種時点(第21日目)から、チャレンジ投与日(第42日目)まで、本研究の終了時点(第63日目)までの期間に渡り計算した。ワクチン接種時点(第21日目)において、処置群間に何ら有意な差は見られなかった。同様に、ワクチン接種以降、第21日目から第42日目まで、何ら有意な差は見られなかった。このような結果は、該ワクチンが、安全であり、また体重増によって測定されるように、豚の能力に強い影響を及ぼさない。毒性のチャレンジの後には、群1と4との間、群2と5との間、および群4と5との間には、ADWGにおける有意な差(P<0.05)が見られた。群5は、約0.40kg/日(0.88lb/日)という、本研究において最低のADWGを示した。ワクチン接種から、チャレンジを経て、本研究の終了時点までの期間に及ぶ、カイ2乗評価は、また群1と4との間、および群4と5との間における有意な差(P<0.05)を示した。以下の表6に、これらのデータをまとめた：
【００５５】
【表６】
2009501730.tif 000007
a：カイ2乗テストにおいて、全体としての比較は、有意な差の存在を示さない。
c：カイ2乗テストによれば、群1および4を比較すると、有意な差異(P<0.05)がある。
d：カイ2乗テストによれば、群2および5を比較すると、有意な差異(P<0.05)がある。
e：カイ2乗テストによれば、群4および5を比較すると、有意な差異(P<0.05)がある。
f：上記プロトコールに示したように、統計的分析に含まれない群。
【００５６】
該子豚の臨床的な観察は、チャレンジの日(第42日目)から、本研究の終了時点(第63日目)までの期間に渡り、各動物に対して、毎日記録した。臨床上のスコアを算出し、毒性のローソニア分離株によるチャレンジに起因する、処置群における疾患の重篤度および持続期間を反映している、毎日の平均臨床スコアを得た。スコア3は、正常で、健康な動物であることを示す。毒性のチャレンジ後に、該群の何れにおいても、「3」以外の臨床スコアは希であり、また処置群の何れかの群間には、何ら有意な差は見られなかった。各処置群に関する平均臨床スコアを、以下の表7にまとめた：
【００５７】
【表７】
2009501730.tif 000008
a：全体としての比較は、有意な差の存在を示さない。
f：上記プロトコールに示したように、統計的分析に含まれない群。
【００５８】
抗-ローソニアIgG抗体の存在につき、IFATテストによる、子豚の血清学的評価を、全ての被検動物から毎週採取した、血清サンプルについて行った。これらの血清サンプルは第0、7、14、21、28、35、42、49、56、および63日目において採取した。チャレンジに付す前に、群1-3における何頭かの子豚は、ローソニアに関して血清反応陽性であり、結果として雌豚にワクチン接種した際に、幾分かの母子免疫が誘発されたことを立証した。対照的に、群4-6の全ての子豚は、ローソニアに関して血清反応陰性であった。群1の子豚は、分娩日および第7および14日目において、群4と比較して、有意に高い(P<0.05)血清反応陽性の動物数を示した。群1の子豚は、またこの実験の第63日目において、群2に対して、有意に異なっていた(P<0.05)。群2は、群5と比較して、第7、14、28日目において、有意に高い(P<0.05)血清反応陽性の動物数を示した。母親由来の抗体の検出を、群1-3において、第28日目まで継続した。群1-3における全ての動物は、第35日目まで血清反応陰性であった。毒性のチャレンジ後に、群1、2、4および5において、幾分かのセロコンバージョンが見られた。この実験の第56日目において、群1と4との間には、有意な差(P<0.05)が認められた。各群に対する、セロコンバージョン率を、以下の表8にまとめた：
【００５９】
【表８】
2009501730.tif 000009
a：カイ2乗テストにおいて、全体としての比較は、有意な差の存在を示さない。
b：カイ2乗テストによれば、群1および2を比較すると、有意な差異(P<0.05)がある。
c：カイ2乗テストによれば、群1および4を比較すると、有意な差異(P<0.05)がある。
d：カイ2乗テストによれば、群2および5を比較すると、有意な差異(P<0.05)がある。
f：上記プロトコールに示したように、統計的分析に含まれない群。
*：この処置群においては、動物の死亡が見られた。
【００６０】
論考：
本研究は、妊娠の第二期および第三期における、高いレベルでの母親由来の抗体応答を誘発するための、本発明のワクチンの高-力価での、反復的用量での投与後の、雌豚におけるローソニアワクチンの安全性を評価した。IHC、t-PCR、または該ワクチン接種した雌豚の何れかにおける、全体的な病理によって測定したようなローソニア感染の指標によっては、ローソニアは、組織内に検出されなかった。該ワクチン接種した雌豚の何れにおいても、ローソニアによる糞便排泄は観測されなかった。最後に、ワクチン接種した雌豚は、生きた-健康な子豚の数値的に高い出産数を示した。従って、全ての指標が、本発明のワクチンが身籠った動物において安全であることを示している。
この複合的研究は、ローソニア-陽性雌豚(群A)およびローソニア-陰性雌豚(群B)両者を含み、これらから分娩された子豚は、引続きワクチン接種され(群1および4)、あるいはワクチン接種されなかった(群2および5)。群3および6の子豚は、厳密なコントロールとして機能し、また何の処置も受けず、あるいはチャレンジ暴露(攻撃誘発)をも受けなかった。これらのデータおよび後の結論の分析は、単一の変数(子豚のワクチン接種または雌豚のワクチン接種)のみを変更した処置群を比較することにより行った。
【００６１】
ナイーブな子豚におけるワクチンの効能は、該豚の源が、高い感受性を持ち、またその子豚のワクチン接種が、毒性の異種チャレンジに対して、効能をもたらすことを立証している。このことは、群4(ワクチン接種)と群5(ワクチン未接種)との比較を必要とし、これら両群は、ローソニア-陰性雌豚を由来としていた。これらのデータは、群4が、全体的な平均回腸病変スコア、全体的な平均結腸病変スコア、糞便排出(f-PCR)、回腸の組織コロニー形成性(t-PCR)およびADWGにおいて、群5とは有意に異なっていた(P<0.05)ことを示す。傍注として、この研究は、またエンテリソールイライタスB3903が、一回の投与後に、効果的な防御をもたらすことを明らかにした。更に、本実験において使用した豚の起源が、異種の毒性のチャレンジ暴露に対して、高い感受性を持つことを、確証し、また妥当なものとしている。
【００６２】
群2(群Aからの子豚)と群5(群Bからの子豚)との比較は、雌豚のワクチン接種に由来する、潜在的な母子防御の評価を可能にした。これらのデータは、群2と5との間に、全体的な平均回腸病変スコア、全体的な平均結腸病変スコア、平均微視的回腸および結腸病変スコア、糞便排出(f-PCR)、ADWG、および血清学的特長において、有意な差がある(P<0.05)ことを示した。これらのデータは、また誕生後少なくとも6週間の、毒性のチャレンジ暴露に対する防御をもたらす、母子免疫性を幾分か生成することを示した。この研究は、更に血清学的特長(IFA)をも測定し、また血清反応陽性の子豚が、分娩日から第28日目までの間に、群1-3において検出できることを明らかにした。興味深い記録に関連して、チャレンジ日においては、全ての群における全ての豚が、該IFAアッセイを用いた場合、血清反応陰性であったが、このことは恐らく、この実験において使用したアッセイが、毒性のローソニアへの暴露に対する免疫性の、正確な指標を与えないことを示している。粘膜病原体としての該病因的薬剤の特性を与え、また弱毒化された生ワクチンを使用することによって、細胞免疫性のある態様が、一つの因子となる可能性がある。
【００６３】
この研究のもうひとつの目的は、従来推奨されまたは実施されてきたものよりも早期の、子豚のワクチン接種によって、母子免疫性の存在にも拘らず、効果的なワクチン接種が、達成可能であるか否かを決定することであった。このテストに関連して、16-26日齢の子豚のワクチン接種の有効性が、確認された。この決定は、群1(雌豚群A由来のワクチン接種された子豚)と群2(雌豚群A由来のワクチン接種なしの子豚)との比較により行った。この比較のために使用した基本的なパラメータは、回腸および結腸に関連する、巨視的(全体的)並びに微視的な病変であった。平均の全体的な回腸病変スコアは、夫々群1および2に対して、0.16および0.85であり、これらは有意に異なっていた(P<0.05)。全体的な病変を持つ回腸サンプルの割合は、夫々群1および2に対して、16％および45％であり、これらも有意に異なっていた(P<0.05)。群1の子豚は、また統計的な差ではないが、数値的により低い全体的な結腸病変スコア、より低い回腸および結腸の微視的な病変、およびより低い組織コロニー形成性(t-PCR)を示した。これらのデータは、全体として、ワクチン接種が、母子免疫単独の場合以上の、およびこれを凌駕する効果的な防御性をもたらすことを確証している。
【００６４】
上で論じた、他の群間の比較の全てが、一つの例を除き、単一の検討変数、即ち雌豚のワクチン接種または子豚のワクチン接種であって、これら両者ではない例に基くものであった。群1と5との間の比較は、2つの検討変量(雌豚のワクチン接種および子豚のワクチン接種)を考慮して、該データを評価する必要があった。群2および5が、幾つかのパラメータにおいて統計的に異なっており(P<0.05)、また幾つかの他のパラメータにおいて数値的に低いことに注意すべきである。群1と5とは、検討したパラメータの多くにおいて、群2および5と同様に、統計的に異なっているであろうことを、合理的に推定することができる。まとめると、群1と5とは、基本的な検討パラメータ、即ち全体的な回腸病変スコア、微視的回腸病変スコア、および微視的結腸病変スコアを含む、多数のパラメータにおいて有意に差がある(P<0.05)ものと決定された。
最後に、群3および6(厳密なコントロール群)は、ローソニアに対する豚の状態を確認しており、また該豚の起源を妥当なものとした。これらの群は、統計的な分析には含めなかった。測定しかつ評価した全てのデータは、これらの動物が、群6の一頭の豚の、微視的な病変スコアを除いて、ローソニア-陰性であることを確証しており、該例外は、ローソニア-陽性であるものと記録された。他の全てのパラメータからの蓄積されたデータによれば、これは誤りであると考えられる。
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月14日(2008.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物（ヒトを除く）に、ローソニアイントラセルラリス(Lawsonia intracellularis)感染に対する高い防御性を付与する方法であって、
有効な用量のローソニアイントラセルラリスワクチンを、該動物が生後３週齢に達する前に、該動物に投与することを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
該ローソニアイントラセルラリスワクチンが、ローソニアイントラセルラリス抗原を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
該有効用量が、単位用量当たり、約103〜約109なる範囲のローソニアイントラセルラリス菌を含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
該有効用量が、単位用量当たり、3.0 TCID50〜約6.0 TCID50なる範囲内のローソニアイントラセルラリス菌を含む、請求項1〜3の何れか1項に記載の方法。
【請求項５】
該動物がブタである、請求項1〜4の何れか1項に記載の方法。
【請求項６】
該ワクチンが、生後少なくとも10日後に、該動物に投与される、請求項1〜5の何れか1項に記載の方法。
【請求項７】
該ワクチンが、生後少なくとも16日後に、該動物に投与される、請求項1〜6の何れか1項に記載の方法。
【請求項８】
該投与が、該ワクチンの単一用量の投与を含む、請求項1〜7の何れか1項に記載の方法。
【請求項９】
該投与が、経口投与用の水薬によるものである、請求項1〜8の何れか1項に記載の方法。
【請求項１０】
更に、該動物の母親が、該動物を妊娠している際に、該母親に、該ワクチンを予防接種する工程をも含む、請求項1〜9の何れか1項に記載の方法。
【請求項１１】
該予防接種を、該動物の妊娠の第二または第三期中に行う、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
該動物を分娩する前に、ワクチンの反復的用量を用いて、該母親にワクチン接種を施す、請求項10および11の何れか1項に記載の方法。
【請求項１３】
該母親に、3回のワクチン接種を施し、その第一のワクチン接種を、該動物を分娩する前の、50〜60日なる範囲の期間内に行う、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
該第二のワクチン接種が、該動物を分娩する前の、30〜40日なる範囲の期間内に行われる、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
該第三のワクチン接種が、該動物を分娩する前の、10〜20日なる範囲の期間内に行われる、請求項13および14の何れか1項に記載の方法。
【請求項１６】
該ワクチン接種が、高用量のローソニアイントラセルラリス抗原で行われる、請求項10〜15の何れか1項に記載の方法。
【請求項１７】
該高用量が、ワクチンにおいて使用されている、ローソニア抗原の従来の量と比較して、少なくとも3倍高い、ローソニアイントラセルラリス抗原の量を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
該抗原が、変性されたローソニアイントラセルラリスの生菌、ローソニアイントラセルラリスの死菌、ローソニアイントラセルラリス菌の1またはそれ以上のサブユニット、およびこれらの組み合わせから選択される請求項10〜17の何れか1項に記載の方法。
【請求項１９】
該変性されたローソニアイントラセルラリスの生菌が、ATCC承認番号PTA-4926、ATCC承認番号55783、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
子豚に、回腸炎に対する防御性を与える方法であって、該子豚を身ごもっている雌豚に、有効用量の、ローソニアイントラセルラリス感染に対するワクチンの接種を施す工程を含み、該雌豚のワクチン接種が、妊娠の第二または第三期に行われること：及び有効用量の、ローソニアイントラセルラリス感染に対するワクチンを、該子豚が３週齢に達する前に接種する工程を含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項２１】
該ワクチン接種を、該子豚の分娩前の、60日までに行う、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
該雌豚を、該子豚の分娩前に、ワクチンの反復的用量を接種する、請求項20および21の何れか1項に記載の方法。
【請求項２３】
該雌豚に、3回のワクチン接種を施し、該第一のワクチン接種を、該子豚を分娩する前の、50〜60日なる範囲の期間内に行う、請求項20〜22の何れか1項に記載の方法。
【請求項２４】
該第二のワクチン接種を、該子豚を分娩する前の、30〜40日なる範囲の期間内に行う、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
該第三のワクチン接種を、該子豚を分娩する前の、10〜20日なる範囲の期間内に行う、請求項23〜24の何れか1項に記載の方法。
【請求項２６】
該ワクチン接種が、高用量のローソニアイントラセルラリス抗原で行われる、請求項20〜25の何れか1項に記載の方法。
【請求項２７】
該高用量が、ワクチンにおいて使用されている、ローソニア抗原の従来の量と比較して、少なくとも3倍高い、ローソニアイントラセルラリス抗原の量を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
該抗原が、変性されたローソニアイントラセルラリスの生菌、ローソニアイントラセルラリスの死菌、ローソニアイントラセルラリス菌の1またはそれ以上のサブユニット、およびこれらの組み合わせから選択される請求項20〜27の何れか1項に記載の方法。
【請求項２９】
該変性されたローソニアイントラセルラリスの生菌が、ATCC承認番号PTA-4926、ATCC承認番号55783、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
ローソニアイントラセルラリス感染に対する、高い防御性を与えるのに効果的なワクチンの有効投与量で、10日齢以上３週齢未満の若い動物に、ワクチン接種を施すための医薬の製造のための、ローソニアイントラセルラリス抗原の、有効量での医薬的使用。
【請求項３１】
該若い動物が、子豚を含む、請求項30記載の医薬的使用。
【請求項３２】
該有効投与量が、投与当たり該細菌を、約103〜約109なる範囲の数で含む、請求項30および31の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項３３】
該有効投与量が、単位投与量当たり、3.0 TCID50〜約6.0 TCID50なる範囲内のローソニアイントラセルラリス菌を含む、請求項30〜32の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項３４】
該若い動物が子豚である、請求項30〜33の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項３５】
該ワクチンが、生後少なくとも16日後に、該若い動物に投与される、請求項30〜34の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項３６】
該ワクチンが、生後少なくとも19日後に、該若い動物に投与される、請求項30〜35の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項３７】
該ワクチン接種段階が、該ワクチンの単一の用量を投与することを含む、請求項30〜36の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項３８】
該ワクチン接種段階が、経口投与用の水薬によって、該ワクチンを投与する段階を含む、請求項30〜37の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項３９】
更に、該若い動物の母親が、該動物を妊娠している際に、該母親に、該医薬を用いて予防接種を施す工程をも含む、請求項30〜38の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項４０】
該予防接種を、該若い動物の妊娠の第二または第三期中に行う、請求項39記載の医薬的使用。
【請求項４１】
該若い動物を分娩する前に、ワクチンの反復的用量を用いて、該母親にワクチン接種を施す、請求項39〜40の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項４２】
該母親に、3回のワクチン接種を施し、その第一のワクチン接種を、該若い動物を分娩する前の、50〜60日なる範囲の期間内に行う、請求項39〜41の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項４３】
該第二のワクチン接種が、該若い動物を分娩する前の、30〜40日なる範囲の期間内に行われる、請求項42記載の医薬的使用。
【請求項４４】
該第三のワクチン接種が、該動物を分娩する前の、10〜20日なる範囲の期間内に行われる、請求項42および43の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項４５】
該ワクチン接種が、高用量のローソニアイントラセルラリス抗原を用いて行われる、請求項39〜44の何れか1項に記載の医薬的使用。
【請求項４６】
該高用量が、ワクチンにおいて使用されている、ローソニア抗原の従来の量と比較して、少なくとも3倍高い、ローソニアイントラセルラリス抗原の量を含む、請求項45記載の医薬的使用。
【請求項４７】
該抗原が、ローソニアイントラセルラリスの変性された生菌、ローソニアイントラセルラリスの死菌、ローソニアイントラセルラリス菌の1またはそれ以上のサブユニット、およびこれらの組み合わせから選択される請求項46記載の医薬的使用。
【請求項４８】
該ローソニアイントラセルラリスの変性された生菌が、ATCC承認番号PTA-4926、ATCC承認番号55783、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項47記載の医薬的使用。
【国際調査報告】
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