(57)【要約】  本発明は、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を投与することによって、頭痛（例えば、片頭痛、群発性頭痛、および緊張性頭痛）および顔面紅潮を含めた血管運動症状などのＣＧＲＰ関連障害を予防または治療する方法を特色とする。ＣＧＲＰに対するアンタゴニスト抗体Ｇ１およびＧ１に由来する抗体も記載する。【図１】 2009515942.tif 000014
2009515942.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３７℃で表面プラズモン共鳴によって測定される、ヒトα−ＣＧＲＰに対する結合親和性（ＫＤ）が５０ｎＭ以下である抗体。
【請求項２】
配列番号１とアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であるＶＨドメインを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列番号１の９９位のアミノ酸残基がＬであり、またはＡ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、ＶもしくはＲによって置換され、配列番号１の１００位のアミノ酸残基がＡであり、またはＬ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｙ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、ＫもしくはＰによって置換されている、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
配列番号２とアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であるＶＬドメインを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
ａ．配列番号３で示されるＣＤＲ  Ｈ１、
ｂ．配列番号４で示されるＣＤＲ  Ｈ２、
ｃ．配列番号５で示されるＣＤＲ  Ｈ３、
ｄ．配列番号６で示されるＣＤＲ  Ｌ１、
ｅ．配列番号７で示されるＣＤＲ  Ｌ２、
ｆ．配列番号８で示されるＣＤＲ  Ｌ３、ならびに
ｇ．表６で示されるＬ１、Ｌ２およびＨ２の変異体
からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
ａ．配列番号５で示されるＶＨＣＤＲ３、または１つもしくは２つの保存的アミノ酸置換により配列番号５と異なる配列と、
ｂ．配列番号８で示されるＶＬＣＤＲ３、または１つもしくは２つの保存的アミノ酸置換により配列番号８と異なる配列と
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
配列番号１とアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であるＶＨドメインと、配列番号２とアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であるＶＬドメインとを含む抗体。
【請求項８】
抗体がＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＤ分子であり、またはそれに由来する、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６８６７の発現ベクターによって産生される重鎖を含む、請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６８６６の発現ベクターによって産生される軽鎖を含む、請求項７に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項１に記載の抗体と、薬学的に許容できる添加剤とを含む医薬組成物。
【請求項１２】
個体中の少なくとも１つの血管運動症状を予防または治療する方法であって、有効量の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を個体に投与するステップを含む方法。
【請求項１３】
前記血管運動症状が、前兆を伴うもしくは伴わない片頭痛、片麻痺性片頭痛、群発性頭痛、片頭痛性神経痛、慢性頭痛、または緊張性頭痛である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記血管運動症状が顔面紅潮である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体が、請求項１から１０に記載の抗体のいずれかである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
抗ＧＣＲＰアンタゴニスト抗体が、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６８６７およびＰＴＡ−６８６６の発現ベクターによって産生される抗体である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００５年１１月１４日出願の米国特許出願第６０／７３６６２３号に対する優先権を主張し、この特許文献は参照により本明細書に組み込まれているものとする。
【０００２】
本発明は、ＣＧＲＰ関連頭痛（例えば、片頭痛）および顔面紅潮などの血管運動症状の予防、寛解、または治療のための抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＧＲＰ（カルシトニン遺伝子関連ペプチド）は３７アミノ酸神経ペプチドであり、カルシトニン、アドレノメデュリン、およびアミリンを含むペプチドファミリーに属する。ヒトでは、２種類のＣＧＲＰ（α−ＣＧＲＰおよびβ−ＣＧＲＰ）が存在し、類似の活性を有する。これらのＣＧＲＰは３アミノ酸異なり示差的分布を示している。少なくとも２種類のＣＧＲＰ受容体サブタイプも示差的活性を説明する可能性がある。ＣＧＲＰは中枢神経系の神経伝達物質であり、ＣＧＲＰ含有ニューロンが血管と密接に結合している末端での強力な血管拡張剤であることが明らかにされている。ＣＧＲＰ媒介血管拡張は、血漿の血管外遊走および微小血管系の血管拡張をもたらし片頭痛に存在する現象のカスケードの一部として、神経原性炎症とも関連している。
【０００４】
ＣＧＲＰは、血管運動症状との考えられる関連で注目されてきた（Ｗｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．３５：９２−９６（２００１）；Ｗｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｎｏｐａｕｓｅ  ７（１）：２５−３０（２０００））。顔面紅潮および寝汗などの血管運動症状（ＶＭＳ）は、閉経期に付随するもっとも一般的な症状であり、自然なまたは外科的に誘発される閉経期に続いてあらゆる女性の６０％から８０％に起こる。顔面紅潮は、減退する性ステロイドに対する中枢神経系（ＣＮＳ）の適応応答である可能性がある（Ｆｒｅｅｄｍａｎ  Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍａｎ  Ｂｉｏｌ．１３：４５３−４６４（２００１））。現在まで、顔面紅潮のもっとも効果的な治療法は、エストロゲンおよび／またはいくつかのプロゲスチンを含むホルモンを主とする治療である。ホルモン治療は顔面紅潮を軽減するに効果的になりうるが、あらゆる女性に適切なわけではない。神経過敏、疲労、易刺激性、不眠症、うつ、記憶喪失、頭痛、不安、神経質または集中力の欠如などの観察される精神的および感情的症状は、顔面紅潮および寝汗に続く睡眠遮断によって引き起こされると考えられている（Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，３．ｓｕｐ．ｒｄ  Ｉｎｔ’ｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ−Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ：ＳＣＩ：３−７（１９９２））。
【０００５】
男性もステロイドホルモン（アンドロゲン）離脱療法に続いて顔面紅潮を体験する。これは加齢に伴ったアンドロゲン減退（Ｋａｔｏｖｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９０，１９３（２）：１２９−３５）の場合の他に、前立腺癌の治療に付随するホルモン欠乏（Ｂｅｒｅｎｄｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２００１，４１９（１）：４７−５４）の極端な場合にも当てはまる。これらの患者のうち３分の１もの人が、重大な不快感および不自由を引き起こすほど重篤で持続する頻繁な症状を体験することになる。
【０００６】
ＣＧＲＰは、（前兆を伴うまたは伴わない）片頭痛および群発性頭痛を含むあらゆる種類の血管性頭痛などの他の血管運動症状の病態と関連付けられてきた強力な血管拡張剤である（Ｄｕｒｈａｍ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：１０７３−１０７５，２００４）。外頚静脈中のＣＧＲＰの血清レベルは、片頭痛中の患者において高まっている（Ｇｏａｄｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２８：１８３−７，１９９０）。ヒトα−ＣＧＲＰの静脈内投与は、前兆なしの片頭痛に罹った患者に頭痛および片頭痛を誘発し、ＣＧＲＰが片頭痛において原因役割を有することが示唆される（Ｌａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ  ２２：５４−６１，２００２）。
【０００７】
考えられるＣＧＲＰの片頭痛関与は、ＣＧＲＰの放出を阻害し（例えば、スマトリプタン）、ＣＧＲＰ受容体で拮抗し（例えば、ジペプチド誘導体ＢＩＢＮ４０９６ＢＳ（Ｂｏｅｒｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）；ＣＧＲＰ（８−３７））、または、両方がＣＧＲＰのその受容体への結合に影響する受容体活性膜タンパク質（ＲＡＭＰ）もしくは受容体成分タンパク質（ＲＣＰ）などの１個または複数個の受容体関連タンパク質と相互作用するいくつかの化合物の開発および試験のための根拠であった（Ｂｒａｉｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２３：５１−５３，２００２）。アルファ−２アドレナリン受容体サブタイプおよびアデノシンＡ１受容体も、ＣＧＲＰ放出および三叉神経活性化を抑制（阻害）する（Ｇｏａｄｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  １２５：１３９２−４０１，２００２）。アデノシンＡ１受容体アゴニストＧＲ７９２３６（メトラファジル）は、ヒトにおける神経原性血管拡張および三叉神経痛覚を阻害することが明らかにされているが、抗片頭痛活性も有する可能性がある（Ａｒｕｌｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ  ２５：１０８２−１０９０，２００５；Ｇｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｔ．，Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ  ２３：２８７−２９２，２００３）。
【０００８】
この説を困惑させるのは、神経原性炎症（例えば、タキキニンＮＫ１受容体アンタゴニスト）または三叉神経活性化（例えば、５ＨＴ１Ｄ受容体アゴニスト）を独占的に阻害する化合物での治療は、片頭痛の急性期治療としては比較的無効であることが明らかにされたという知見であり、一部の研究者は、ＣＧＲＰ放出の阻害が効果的な抗片頭痛治療の主要な作用機序であるかどうか疑問視している（Ａｒｕｌｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５００：３１５−３３０，２００４）。
【０００９】
片頭痛は、重篤で突発性の頭痛発作および、悪心、嘔吐、光、音、または運動に対する敏感性を含むこともある随伴所見により特徴付けられる複雑で一般的な神経学的状態である。一部の患者では、頭痛に前兆が先行し、または前兆を伴う。頭痛の痛みは重篤のこともあり、ある種の患者では一側性のこともある。
【００１０】
片頭痛発作は日常生活にとり破壊的である。米国および西ヨーロッパでは、片頭痛患者の全罹患率は一般人口の１１％（男性６％；女性１５〜１８％）である。さらに、個体の発作の中央頻度は１．５／月である。症状を軽減するまたは減少させるいくつかの治療が利用できるが、月当たり３〜４回以上の片頭痛発作がある患者には予防療法が勧められる（Ｇｏａｄｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６（４）：２５７−２７５，２００２）。
【００１１】
片頭痛を治療するのに使われてきた薬理学的介入の多様性、および患者間の応答のばらつきは、この疾患の多様な性質の証拠である。したがって、セロトニン作動性の他に、アドレナリン作動性、ノンアドレナリン作動性、およびドーパミン作動性活性を示す麦角アルカロイドなどの比較的非選択性の薬剤（例えば、エルゴタミン、ジヒドロエルゴタミン、メチセルジド）が８０年以上の間片頭痛の治療に使われてきた。他の治療には、アヘン剤（例えば、オキシコドン）およびβ−アドレナリン作動薬アンタゴニスト（例えば、プロプラノロール）がある。一部の患者、通常症状が比較的軽度の患者は、アスピリン、アセトアミノフェン、およびカフェインの併用（例えば、Ｅｘｃｅｄｒｉｎ（登録商標）ミグレイン）などの１個または複数個の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）などの非処方箋治療薬で症状を抑制することができる。
【００１２】
もっと最近では、一部の片頭痛患者は、電位依存性ナトリウムチャネルおよびある種のグルタミン酸受容体（ＡＭＰＡ−カイニン酸）を遮断し、ＧＡＢＡ−Ａ受容体活性を増強し、ならびに炭酸脱水酵素を遮断する抗痙攣薬のトピラメートで治療されてきた。一部の患者での、スマトリプタンなどのセロトニン５ＨＴ−１Ｂ／１Ｄおよび／または５ＨＴ−１ａ受容体アゴニストの比較的最近の成功により、研究者たちは、前記疾病のセロトニン作動性病因論を提唱してきた。残念ながら、一部の患者はこの治療によく反応するが、その効果に比較的抵抗性の患者もいる。
【００１３】
アミン作動性脳幹核におけるイオンチャネルの機能障害が前記疾病の根底にあると想定されてきたが、片頭痛の正確な病態生理学はまだ十分に理解されていない。片頭痛の一種、すなわち家族性片麻痺性片頭痛は、電位開口Ｐ／Ｑ型カルシウムチャネルのα１サブユニットにおけるミスセンス変異と関連があることが明らかにされており、おそらく他のイオンチャネル変異も他の患者集団で見つかると考えられている。血管の拡張は、片頭痛の疼痛症状に関連しておりこの症状を悪化させるが、そのような神経血管性の現象は現在では、前記状態の原因ではなく結果であると考えられている。全体的に見れば、感覚入力を調節する脳幹経路の機能障害は、片頭痛の統一的特徴であると考えられている（Ｇｏａｄｓｂｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６（４）：２５７−２７５，２００２）。
【００１４】
本出願全体で、種々の出版物（特許および特許出願を含む）が参照される。これらの出版物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれているものとする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本明細書で開示する発明は、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体、および抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を使用して、前兆を伴うもしくは伴わない片頭痛、片麻痺性片頭痛、群発性頭痛、片頭痛性神経痛、慢性頭痛、緊張性頭痛や、他の医学的状態（感染や、腫瘍による頭蓋内圧の上昇など）から生じる頭痛などの頭痛など、血管運動症状を治療または予防する方法に関する。他の血管運動症状には顔面紅潮が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
一態様では、本発明は、個体中の少なくとも１つの血管運動症状を治療または予防する方法を提供し、その方法は、有効量の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を個体に投与するステップを含む。
【００１７】
一態様では、本発明は、個体中の頭痛（例えば、片頭痛および群発性頭痛）を治療または予防する方法を提供し、その方法は、有効量の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を個体に投与するステップを含む。
【００１８】
他の態様では、本発明は、個体中の頭痛（例えば、片頭痛および群発性頭痛）を改善し、調節し、その発生を減少させ、またはその進展もしくは進行を遅延させる方法を提供し、その方法は、有効量の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を個体に投与するステップを含む。
【００１９】
さらなる実施形態では、本発明は、個体中の頭痛（例えば、片頭痛および群発性頭痛）を改善し、調節し、その発生を減少させ、またはその進展もしくは進行を遅延させる方法を提供し、その方法は、頭痛を治療するのに有用な少なくとも１つのさらなる作用物質と組み合わせて、有効量の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を個体に投与するステップを含む。そのようなさらなる作用物質には、５−ＨＴ１様アゴニスト（および他の５−ＨＴ１部位で作用するアゴニスト）、および非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が含まれる。
【００２０】
抗ＣＧＲＰ抗体と組み合わせて使用することができる５−ＨＴ１アゴニストの例には、スマトリプタン、ゾルミトリプタン、ナラトリプタン、リザトリプタン、エレトリプタン、アルモトリプタンやフロバトリプタンなど、トリプタンとして知られるクラスの化合物が含まれる。麦角アルカロイドおよび関連化合物も５−ＨＴアゴニスト活性を有することが知られ、片頭痛などの頭痛の治療に使用されている。酒石酸エルゴタミン、マレイン酸エルゴノビン、およびメシル酸エルゴロイド（例えば、ジヒドロエルゴコルニン、ジヒドロエルゴクリスチン、ジヒドロエルゴクリプチン、およびメシル酸ジヒドロエルゴタミン（ＤＨＥ４５））が、これらの化合物の中に含まれる。
【００２１】
抗ＣＧＲＰ抗体と組み合わせて使用することができるＮＳＡＩＤの例には、ナプロキセン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、オキサプロジン、エトドラク、インドメタシン、ケトロラク、ナブメトン、メフェナム酸、およびピロキシカン（ｐｉｒｏｘｉｃａｎ）が含まれる。さらなるＮＳＡＩＤには、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤がある。この群の構成要素には、セレコキシブ、ロフェコキシブ、メロキシカム、ＪＴＥ−５２２、Ｌ−７４５，３３７、ＮＳ３９８、および薬学的に許容できるその塩が含まれる。
【００２２】
他の態様では、本発明は、個体中の顔面紅潮を改善し、調節し、その発生を減少させ、またはその進展もしくは進行を遅延させる方法を提供し、その方法は、有効量の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を個体に投与するステップを含む。
【００２３】
他の態様では、本発明は、個体中の顔面紅潮を改善し、調節し、その発生を減少させ、またはその進展もしくは進行を遅延させる方法を提供し、その方法は、顔面紅潮を治療するのに有用な少なくとも１つのさらなる作用物質と組み合わせて、有効量の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を個体に投与するステップを含む。そのようなさらなる作用物質には、それだけに限らないが、エストロゲンおよび／またはプロゲスチンを含めたホルモンを基礎とする治療薬が含まれる。
【００２４】
一実施形態では、上記に記載の方法のいずれかで使用する抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、本明細書に記載の抗体のいずれかである。
【００２５】
いくつかの実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体はヒトＣＧＲＰを認識する。いくつかの実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ヒトのα−ＣＧＲＰともβ−ＣＧＲＰとも結合する。いくつかの実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ヒトおよびラットＣＧＲＰと結合する。いくつかの実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ＣＧＲＰのアミノ酸２５〜３７を有するＣ末端断片と結合する。いくつかの実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ＣＧＲＰのアミノ酸２５〜３７内にあるＣ末端エピトープと結合する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体はヒト化されている。いくつかの実施形態では、その抗体はヒト抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は（本明細書に記載の）抗体Ｇ１である。いくつかの実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、抗体Ｇ１または表６に示すＧ１の変異体の１つまたは複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはいくつかの実施形態では６つすべてのＣＤＲなど）を含む。さらに他の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、図５に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１）と、図５に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２）とを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、抗体は、（一部免疫学的に不活性なものを含めて）免疫学的に不活性な定常領域、例えば、補体媒介性溶解を誘発せず、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激せず、小膠細胞を活性化せず、または１つもしくは複数のこれらの活性が低下した定常領域などの改変定常領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４；ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１；および／または英国特許出願第９８０９９５１．８号に記載のように定常領域を改変する。他の実施形態では、抗体は、Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１への突然変異を含むヒト重鎖ＩｇＧ２定常領域を含む（野生型ＩｇＧ２配列を基準としてアミノ酸を番号付けている）。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４。いくつかの実施形態では、抗体の重鎖定常領域は、１）Ａ３２７Ａ３３０Ｐ３３１からＧ３２７Ｓ３３０Ｓ３３１へ；２）Ｅ２３３Ｌ２３４Ｌ２３５Ｇ２３６からＧ２３６が欠失したＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５へ；３）Ｅ２３３Ｌ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５へ；４）Ｅ２３３Ｌ２３４Ｌ２３５Ｇ２３６Ａ３２７Ａ３３０Ｐ３３１からＧ２３６が欠失したＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５Ｇ３２７Ｓ３３０Ｓ３３１へ；５）Ｅ２３３Ｌ２３４Ｌ２３５Ａ３２７Ａ３３０Ｐ３３１からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５Ｇ３２７Ｓ３３０Ｓ３３１へ；および６）Ｎ２９７からＡ２９７またはＮを除いた任意の他のアミノ酸への突然変異のいずれかを有するヒト重鎖ＩｇＧ１である。いくつかの実施形態では、抗体の重鎖定常領域は、Ｅ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５Ｇ２３６からＧ２３６が欠失したＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５へ；Ｅ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５へ；およびＳ２２８Ｌ２３５からＰ２２８Ｅ２３５への突然変異のいずれかを有するヒト重鎖ＩｇＧ４である。
【００２８】
さらに他の実施形態では、Ｎ−結合グリコシル化について定常領域を非グリコシル化する。いくつかの実施形態では、（Ａｓｎ２９７などの）オリゴ糖結合残基および／または定常領域中のＮ−グリコシル化認識配列の一部である隣接残基に突然変異を起こさせることにより、Ｎ−結合グリコシル化について定常領域を非グリコシル化する。いくつかの実施形態では、Ｎ−結合グリコシル化について定常領域を非グリコシル化する。酵素的に、またはグリコシル化欠損宿主細胞中での発現によって、Ｎ−結合グリコシル化について定常領域を非グリコシル化することができる。
【００２９】
（２５℃や３７℃などの適当な温度で表面プラズモン共鳴によって測定されるヒトα−ＣＧＲＰなどの）ＣＧＲＰに対する抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の結合親和性（ＫＤ）は、約０．０２〜約２００ｎＭでよい。いくつかの実施形態では、結合親和性は、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、または約２ｐＭのいずれかでよい。いくつかの実施形態では、結合親和性は、約２５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、または約５０ｐＭのいずれかより低い。
【００３０】
抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、頭痛の前、頭痛中、および／または頭痛後に投与することができる。いくつかの実施形態では、頭痛（例えば、片頭痛および群発性頭痛）の発作前に抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を投与する。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の投与は、経口、静脈内、皮下、動脈内、筋内、心内、脊髄内、胸郭内、腹腔内、脳室内、舌下、経皮、および／または吸入による投与を含めた当技術分野で知られている任意の手段によるものでよい。投与は、全身、例えば静脈内投与でもよく、または局所投与でもよい。
【００３１】
いくつかの実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、頭痛を治療するための他の作用物質などの他の作用物質と併用して投与することができる。
【００３２】
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法のいずれか、例えば、頭痛を治療または予防する方法で使用する薬剤を製造するための抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の使用を提供する。
【００３３】
他の態様では、本発明は、頭痛（例えば、片頭痛および群発性頭痛）を予防または治療するための医薬組成物を提供し、その組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容できる添加剤と組み合わせた、有効量の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む。
【００３４】
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法のいずれかで使用するキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、容器と、薬学的に許容できる担体と組み合わせた、本明細書に記載の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む組成物と、本明細書に記載の方法のいずれかでその組成物を使用するための説明書とを含む。
【００３５】
本発明はまた、抗ＧＣＲＰアンタゴニスト抗体および抗体Ｇ１または表６で示されるその変異体に由来するポリペプチドをも提供する。したがって、一態様では、本発明は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６８６６およびＰＴＡ−６８６７を有する発現ベクターによって産生される抗体Ｇ１（互換的に「Ｇ１」と称される）である。例えば、一実施形態は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６８６７の発現ベクターによって産生される重鎖を含む抗体である。さらなる実施形態は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６８６６の発現ベクターによって産生される軽鎖を含む抗体である。Ｇ１の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を図５に示す。抗体Ｇ１の相補性決定領域（ＣＤＲ）部分（ＣｈｏｔｈｉａおよびＫａｂａｔのＣＤＲを含む）も図５に示す。Ｇ１の任意の部分または領域全体への言及が、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６８６６およびＰＴＡ−６８６７を有する発現ベクターによって産生される配列、ならびに／または図５で表される配列を包含することが理解される。本発明はまた、表６で表されたアミノ酸配列を有するＧ１の抗体変異体をも提供する。
【００３６】
一態様では、本発明は、配列番号１とアミノ酸配列が少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるＶＨドメインを含む抗体である。
【００３７】
他の態様では、本発明は、配列番号２とアミノ酸配列が少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるＶＬドメインを含む抗体である。
【００３８】
他の態様では、本発明は、抗体Ｇ１または表６で示されるその変異体の断片または領域を含む抗体である。一実施形態では、断片は抗体Ｇ１の軽鎖である。他の実施形態では、断片は抗体Ｇ１の重鎖である。さらに他の実施形態では、断片は、抗体Ｇ１の軽鎖および／または重鎖由来の１つまたは複数の可変領域を含有する。さらに他の実施形態では、断片は、図５で示される軽鎖および／または重鎖由来の１つまたは複数の可変領域を含有する。さらに他の実施形態では、断片は、抗体Ｇ１の軽鎖および／または重鎖由来の１つまたは複数のＣＤＲを含有する。
【００３９】
他の態様では、本発明は、配列番号５で示されるＶＨＣＤＲ３、または１、２、３、４もしくは５つのアミノ酸置換により配列番号５と異なる配列を含むポリペプチド（抗体でもよく、または抗体でなくてもよい）を提供する。特定の実施形態では、そのようなアミノ酸置換は保存的置換である。
【００４０】
他の態様では、本発明は、配列番号８で示されるＶＬＣＤＲ３、または１、２、３、４もしくは５つのアミノ酸置換により配列番号８と異なる配列を含むポリペプチド（抗体でもよく、または抗体でなくてもよい）を提供する。特定の実施形態では、そのようなアミノ酸置換は保存的置換である。
【００４１】
他の態様では、本発明は、ａ）抗体Ｇ１または表６で示されるその変異体の１つまたは複数のＣＤＲ；ｂ）抗体Ｇ１または表６で示されるその変異体の重鎖由来のＣＤＲ  Ｈ３；ｃ）抗体Ｇ１または表６で示されるその変異体の軽鎖由来のＣＤＲ  Ｌ３；ｄ）抗体Ｇ１または表６で示されるその変異体の軽鎖由来の３つのＣＤＲ；ｅ）抗体Ｇ１または表６で示されるその変異体の重鎖由来の３つのＣＤＲ；ｆ）抗体Ｇ１または表６で示されるその変異体の軽鎖由来の３つのＣＤＲおよび重鎖由来の３つのＣＤＲをいずれか１つまたは複数含むポリペプチド（抗体でもよく、または抗体でなくてもよい）を提供する。本発明は、ａ）抗体Ｇ１もしくは表６で示されるその変異体に由来する１つもしくは複数（１、２、３、４、５、もしくは６つ）のＣＤＲ；ｂ）抗体Ｇ１の重鎖由来のＣＤＲ  Ｈ３に由来するＣＤＲ；ならびに／またはｃ）抗体Ｇ１の軽鎖由来のＣＤＲ  Ｌ３に由来するＣＤＲをいずれか１つまたは複数含むポリペプチド（抗体でもよく、または抗体でなくてもよい）をさらに提供する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは図５で示されるＣＤＲである。いくつかの実施形態では、抗体Ｇ１または表６で示されるその変異体に由来する１つまたは複数のＣＤＲは、Ｇ１またはその変異体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つのＣＤＲと少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ＣＤＲはＫａｂａｔのＣＤＲである。他の実施形態では、ＣＤＲはＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲである。他の実施形態では、ＣＤＲはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの組合せ（「組合せＣＤＲ」または「伸長ＣＤＲ」とも称される）である。言い換えれば、複数のＣＤＲを含有する任意の所与の実施形態について、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、および／または組合せのいずれかでよい。
【００４３】
いくつかの実施形態では、（抗体などの）ポリペプチドは、ＫＡＳＫＸａａＶＸａａＴＹＶＳのアミノ酸配列を含み、５位のＸａａはＲ、Ｗ、Ｇ、Ｌ、またはＮであり、７位のＸａａはＴ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｗ、またはＶである。いくつかの実施形態では、ＫＡＳＫＸａａＶＸａａＴＹＶＳのアミノ酸配列は、抗体軽鎖のＣＤＲ１である。
【００４４】
いくつかの実施形態では、（抗体などの）ポリペプチドは、ＸａａＸａａＳＮＲＹＸａａのアミノ酸配列を含み、１位のＸａａはＧまたはＡであり、２位のＸａａはＡまたはＨであり、７位のＸａａはＬ、Ｔ、Ｉ、またはＳである。いくつかの実施形態では、ＸａａＸａａＳＮＲＹＸａａのアミノ酸配列は、抗体軽鎖のＣＤＲ２である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、（抗体などの）ポリペプチドは、ＥＩＲＳＸａａＳＤＸａａＸａａＡＴＸａａＹＡＸａａＡＶＫＧのアミノ酸配列を含み、５位のＸａａはＥ、Ｒ、Ｋ、Ｑ、またはＮであり、８位のＸａａはＡ、Ｇ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、Ｓ、Ｌ、Ｒ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｖ、Ｄ、またはＰであり、９位のＸａａはＳ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｃ、Ｅ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｖ、Ｄ、またはＭであり、１２位のＸａａはＨまたはＦであり、１５位のＸａａはＥまたはＤである。いくつかの実施形態では、ＥＩＲＳＸａａＳＤＸａａＸａａＡＴＸａａＹＡＸａａＡＶＫＧのアミノ酸配列は、抗体重鎖のＣＤＲ２である。
【００４６】
いくつかの実施形態では、（抗体などの）ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、配列番号１の９９位のアミノ酸残基はＬであり、またはＡ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、もしくはＲによって置換され、配列番号１の１００位のアミノ酸残基はＡであり、またはＬ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｙ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｋ、もしくはＰによって置換されている。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体はヒト抗体である。他の実施形態では、本発明の抗体はヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナルである。いくつかの実施形態では、抗体（またはポリペプチド）は単離されている。いくつかの実施形態では、抗体（またはポリペプチド）は実質的に純粋である。
【００４８】
抗体の重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡやＩｇＥなどの任意の型の定常領域由来のもの、およびＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３やＩｇＧ４などの任意のアイソタイプ由来のものでよい。
【００４９】
いくつかの実施形態では、抗体は本明細書に記載の改変定常領域を含む。
【００５０】
他の態様では、本発明は、抗体Ｇ１または表６で示されるその変異体の断片または領域をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド（単離されていてもよい）を提供する。一実施形態では、断片は抗体Ｇ１の軽鎖である。他の実施形態では、断片は抗体Ｇ１の重鎖である。さらに他の実施形態では、断片は、抗体Ｇ１の軽鎖および／または重鎖由来の１つまたは複数の可変領域を含有する。さらに他の実施形態では、断片は、抗体Ｇ１の軽鎖および／または重鎖由来の１つまたは複数（すなわち１、２、３、４、５、または６つ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。
【００５１】
他の態様では、本発明は、抗体Ｇ１または表６で示されるその変異体をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド（単離されていてもよい）である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは配列番号９および配列番号１０で示されるポリヌクレオチドの一方または両方を含む。
【００５２】
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の（抗体断片を含めた）抗体またはポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００５３】
他の態様では、本発明は、本明細書で開示されているポリヌクレオチドのいずれかを含む（発現およびクローン化ベクターを含めた）ベクターおよび宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−６８６７を有するｐＤｂ．ＣＧＲＰ．ｈＦｃＧＩである。他の実施形態では、ベクターは、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−６８６６を有するｐＥｂ．ＣＧＲＰ．ｈＫＧＩである。
【００５４】
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞である。
【００５５】
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体またはポリペプチドのいずれかと結合したＣＧＲＰの複合体である。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体Ｇ１または表６で示されるその変異体である。
【００５６】
他の態様では、本発明は、本明細書に記載した、有効量の（抗体Ｇ１の１つまたは複数のＣＤＲを含む抗体などの抗体を含めた）ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかと、薬学的に許容できる添加剤とを含む医薬組成物である。
【００５７】
他の態様では、本発明は抗体Ｇ１を生成する方法であり、その方法は、抗体Ｇ１の産生を可能にする条件下で、抗体Ｇ１をコードする発現ベクターを含む宿主細胞またはその子孫を培養するステップと。いくつかの実施形態において抗体Ｇ１を精製するステップとを含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号９および配列番号１０で示されるポリヌクレオチド配列の一方または両方を含む。
【００５８】
他の態様では、本発明は、適切な細胞中で抗体またはポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを発現させ（この抗体は単一の軽鎖もしくは重鎖として別々に発現させることができ、または軽鎖と重鎖の両方を１つのベクターから発現させる）、一般にはその後対象とする抗体またはポリペプチドを回収および／または単離することによって、本明細書に記載の抗体またはポリペプチドのいずれかを生成する方法を提供する。
【００５９】
本発明の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体およびポリペプチド、ならびにその抗体およびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用して、頭痛（例えば、片頭痛、群発性頭痛、慢性頭痛、および緊張性頭痛）や、ＣＧＲＰ活性との拮抗により治療または予防することができる他の状態などのＣＧＲＰの異常な機能と関係する疾患を治療し、予防し、改善し、調節し、またはその発生を低下させることができる。
【００６０】
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の組成物をいずれか１つまたは複数含むキットおよび組成物を提供する。一般に適切な包装に入れられ、適当な説明書と共に提供されるこれらのキットは、本明細書に記載の方法のいずれかに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
本明細書に開示する本発明は、個体に治療有効量の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を投与することによって、個体における頭痛（例えば、片頭痛、群発性頭痛、慢性頭痛、および緊張性頭痛）または顔面紅潮などの血管運動症状を治療および／または予防するための方法を提供する。
【００６２】
本明細書に開示する本発明は、表６中に示すＧ１またはその変異体に由来する抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体およびポリペプチドも提供する。本発明は、これらの抗体およびポリペプチドを産生および使用する方法も提供する。
【００６３】
一般的技法
本発明の実践は、他に示さない限り、当技術分野の範囲内にある（組換え技法を含めた）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技法を利用するものとする。このような技法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３−１９９８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ａｎｄ  Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ��Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）などの文献中で完全に説明されている。
【００６４】
定義
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、例えば炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的と特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書中で使用するこの用語は、完全なポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、それらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖（ＳｃＦｖ）、それらの突然変異体、抗体部分（ドメイン抗体など）を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む任意の他の修飾形状の免疫グロブリン分子も包含する。抗体はＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそれらのサブクラス）などの任意のクラスの抗体を含み、抗体は任意の特定クラスである必要はない。抗体の重鎖の定常ドメインのそのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。５つの主なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらの数個はサブクラス（イソ型）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖の定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元形状はよく知られている。
【００６５】
本明細書中で使用する「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得た抗体、すなわち、その集団を含む個々の抗体は微量で存在する可能性がある考えられる本来存在する突然変異以外同一であることを指す。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、１つの抗原部位を対象とする。さらに、抗原決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体の調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の１つの抗原決定基を対象とする。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生が必要であると解釈すべきではない。例えば、本発明により使用するモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５により最初に記載されたハイブリドーマ法によって産生することができ、または米国特許第４８１６５６７号中に記載された方法などの組換えＤＮＡ法によって産生することができる。モノクローナル抗体は、例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４中に記載された技法を使用して産生したファージライブラリーから単離することもできる。
【００６６】
本明細書中で使用する「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらの断片（例えば抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または他の抗原結合部分列など）である非ヒト（例えば、ネズミ）抗体の形を指す。その大部分に関して、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が望ましい特異性、親和性、および生物活性を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置換される、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基と交換される。さらにヒト化抗体は、レシピエント抗体中または移入ＣＤＲまたはフレームワーク配列中では見られないが、抗体の性能をさらに改良および最適化するために含まれる残基を含むことができる。一般にヒト化抗体は、すべてまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、かつすべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列の領域である、少なくとも１つ、および典型的には２つの可変ドメインのすべてを実質的に含むはずである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンの一部分も含むのが最適であるはずである。抗体はＷＯ９９／５８５７２中に記載されたのと同様に修飾されたＦｃ領域を有することができる。他の形のヒト化抗体は、原型抗体に対して改変されており、原型抗体からの１つまたは複数のＣＤＲに「由来する」１つまたは複数のＣＤＲとも呼ばれる、１つまたは複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ）を有する。
【００６７】
本明細書中で使用する「ヒト抗体」は、ヒトによって産生された抗体、および／または当技術分野で知られているまたは本明細書に開示するヒト抗体を産生するための技法のいずれかを使用して産生された抗体のアミノ酸配列に対応する、アミノ酸配列を有する抗体を意味する。このヒト抗体の定義は、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。１つのこのような例は、ネズミ軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体である。ヒト抗体は当技術分野で知られている様々な技法を使用して産生することができる。一実施形態では、ヒト抗体はファージライブラリーから選択し、この場合そのファージライブラリーはヒト抗体を発現する（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３０９−３１４；Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＰＮＡＳ，（ＵＳＡ）９５：６１５７−６１６２；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１））。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えばその中で内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性状態であるマウスに導入することによって産生することもできる。この手法は、米国特許第５５４５８０７号、米国特許第５５４５８０６号、米国特許第５５６９８２５号、米国特許第５６２５１２６号、米国特許第５６３３４２５号、および米国特許第５６６１０１６号中に記載されている。代替的に、標的抗原を対象とする抗体を産生するヒトＢリンパ球を不死化させることによってヒト抗体を調製することができる（このようなＢリンパ球は個体から回収することができる、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫処置されている可能性がある）。例えば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５；および米国特許第５，７５０，３７３号を参照。
【００６８】
本明細書中で使用する用語「カルトシニン遺伝子関連ペプチド」および「ＣＧＲＰ」は、任意の形のカルトシニン遺伝子関連ペプチドおよびＣＧＲＰの活性の少なくとも一部を保持するその変異体を指す。例えば、ＣＧＲＰはα−ＣＧＲＰまたはβ−ＣＧＲＰであってよい。本明細書中で使用するＣＧＲＰは、全哺乳動物種、例えばヒト、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシの原型配列ＣＧＲＰを含む。
【００６９】
本明細書中で使用する「抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体」（「抗ＣＧＲＰ抗体」と同義で呼ばれる）は、ＣＧＲＰと結合しＣＧＲＰの生物学的活性および／またはＣＧＲＰシグナリングによって介在される下流経路を阻害することができる抗体を指す。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ＣＧＲＰシグナリング、受容体結合および／またはＣＧＲＰに対する細胞応答の誘導などによって介在される下流経路を含めて、ＣＧＲＰの生物学的活性を（有意な状態を含めて）遮断する、アンタゴナイズする、抑制するまたは低下させる抗体を包含する。本発明の目的で、用語「抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体」は、すべての前に確認した用語、タイトル、およびＣＧＲＰ自体、ＣＧＲＰの生物学的活性（任意の態様の頭痛に介在するその能力を含むがこれだけには限られない）、または生物学的活性の結果を、任意の有意な程度で実質的に無効にする、低下させる、または無力化させる機能状態および特徴を包含することは明らかに理解されるはずである。いくつかの実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体はＣＧＲＰと結合し、ＣＧＲＰがＣＧＲＰ受容体と結合するのを妨げる。他の実施形態では、抗ＣＧＲＰ抗体はＣＧＲＰと結合し、ＣＧＲＰ受容体の活性化を妨げる。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の例は本明細書中に与える。
【００７０】
本明細書中で使用する用語「Ｇ１」および「抗体Ｇ１」は同義で使用して、ＡＴＣＣＰＴＡ−６８６７およびＡＴＣＣＰＴＡ−６８６６の寄託番号を有する発現ベクターによって産生される抗体を指す。重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は図５中に示す。抗体Ｇ１のＣＤＲ部分（ＣｈｏｔｈｉａおよびＫａｂａｔＣＤＲ含む）は、図５中に図式的に示す。重鎖および軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドも、配列番号９および配列番号１０で示す。Ｇ１の特徴付けは実施例中に記載する。
【００７１】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は本明細書中では同義で使用して、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは直鎖状または分岐状であってよく、ポリマーは修飾アミノ酸を含むことができ、ポリマーは非アミノ酸によって割り込まれていてよい。これらの用語は、自然に修飾された、または介入、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作または修飾、標識要素との結合などによって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。定義内には、例えば（例えば、非天然アミノ酸などを含めた）アミノ酸の１つまたは複数の類似体を含むポリペプチド、および当技術分野で知られている他の修飾も含まれる。本発明のポリペプチドは抗体に基づくので、これらのポリペプチドは単鎖または結合鎖として存在し得ることは理解される。
【００７２】
本明細書において同義で使用する「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは塩基、および／またはそれらの類似体、またはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによってポリマー中に取り込まれ得る任意の基質であってよい。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾はポリマーの構築前後に与えられる可能性がある。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド要素によって割り込まれていてよい。ポリヌクレオチドは、標識要素との結合などによって、重合後にさらに修飾することができる。他の型の修飾には、例えば「キャプス」、１つまたは複数の本来存在するヌクレオチドと類似体の置換、ヌクレオチド間置換、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）による修飾、および荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）による修飾、ペンダント成分、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リシンなど）などを含有する修飾、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラーレンなど）による修飾、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有する修飾、アルキル化剤を含有する修飾、修飾結合（例えば、αアノマー核酸など）、および非修飾形のポリヌクレオチドによる修飾などがある。さらに、糖中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホネート基、ホスフェート基によって置換することができ、標準的な保護基によって保護することができ、または活性化して他のヌクレオチドに対する他の結合を調製することができ、または固相単体と結合させることが可能である。５’および３’末端のＯＨはリン酸化、または１〜２０個の炭素原子のアミンまたは有機キャッピング基成分で置換することができる。他のヒドロキシル基を標準的な保護基に誘導体化することもできる。ポリヌクレオチドは、例えば２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環糖類似体、□−アノマー糖、アラビノース、キシロースまたはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体および脱塩基ヌクレオシド類似体、メチルリボシドなどを含めた、当技術分野で一般に知られている類似形のリボースまたはデオキシリボース糖も含有することができる。１つまたは複数のホスホジエステル結合は、他の結合基によって置換することができる。これらの他の結合基には、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）によって置換されており、前式中それぞれのＲまたはＲ’が独立にＨ、またはエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラリジルを場合により含有する置換または���置換アルキル（１〜２０個のＣ）である、実施形態があるが、これらだけには限られない。ポリヌクレオチド中のすべての結合が同一である必要はない。前述の記載は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含めた、本明細書で述べるすべてのポリヌクレオチドに当てはまる。
【００７３】
抗体の「可変領域」は、単独または組合せのいずれかの、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域としても知られる３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）によって結び付いた４個のフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。それぞれの鎖中のＣＤＲはＦＲの非常に近くに１つに保持され、他の鎖由来のＣＤＲは抗体の抗原結合部位の形成に貢献する。ＣＤＲを決定するための少なくとも２つの技法：（１）異種間の配列の多様性に基づく手法（すなわちＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ  ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ））、および（２）抗原−抗体複合体の結晶学的試験に基づく手法（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８））が存在する。本明細書中で使用するように、ＣＤＲはいずれかの手法によって定義されるＣＤＲ、または２つの手法の組合せによって定義されるＣＤＲを指すことができる。
【００７４】
抗体の「定常領域」は、単独または組合せのいずれかの、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指す。
【００７５】
（本明細書において同義で使用する）抗体またはポリペプチドと「優先的に結合する」または「特異的に結合する」エピトープは、当技術分野で十分理解されている用語であり、このような特異的または優先的結合を測定するための方法も当技術分野でよく知られている。分子が他の細胞または物質と反応または結合するより頻繁に、より迅速に、より長期間および／またはより高い親和性で特定の細胞または物質と反応または結合する場合、分子は「特異的結合」または「優先的結合」を示すと言える。抗体が他の物質と結合するより高い親和性、アビディティーで、より容易に、および／またはより長期間結合する場合、抗体は標的と「特異的に結合」または「優先的に結合」する。例えば、ＣＧＲＰエピトープと特異的または優先的に結合する抗体は、それが他のＣＧＲＰエピトープまたは非ＣＧＲＰエピトープと結合するより高い親和性、アビディティーで、より容易に、および／またはより長期間このエピトープと結合する抗体である。例えば、第１標的と特異的または優先的に結合する抗体（または成分またはエピトープ）は、第２標的と特異的または優先的に結合することができる、またはできないことも、この定義を読むことによって理解される。このように、「特異的結合」または「優先的結合」は、排他的結合を必ずしも必要としない（ただし含む可能性はある）。一般に、必ずではないが、結合に対する言及は優先的結合を意味する。
【００７６】
本明細書中で使用する「実質的に純粋」は、少なくとも５０％純粋（すなわち、汚染物質を含まない）、より好ましくは少なくとも９０％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、より好ましくは少なくとも９８％純粋、より好ましくは少なくとも９９％純粋である物質を指す。
【００７７】
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチド挿入体の取り込み用のベクターのレシピエントであってよい、またはそのレシピエントとなっている個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は一宿主細胞の子孫を含み、その子孫は天然、偶然、または故意の突然変異により、原型親細胞と（形態またはゲノムＤＮＡ相補配列が）必ずしも完全に同一ではない可能性がある。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドを用いてｉｎ  ｖｉｖｏにおいてトランスフェクトした細胞を含む。
【００７８】
用語「Ｆｃ領域」を使用して、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義する。「Ｆｃ領域」は、原型配列Ｆｃ領域または変異体Ｆｃ領域であってよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変わる可能性があるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、位置Ｃｙｓ２２６におけるアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端に広がると定義される。Ｆｃ領域中の残基の番号は、Ｋａｂａｔ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１中と同様のＥＵインデックスの番号である。免疫グロブリンのＦｃ領域は一般に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。
【００７９】
本明細書中で使用する「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域と結合する受容体を記載する。好ましいＦｃＲは原型配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体と結合するＦｃＲ（γ受容体）であり、対立遺伝子変異体および選択的スプライシング形のこれらの受容体を含めたＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、その細胞質ドメインが主に異なる類似のアミノ酸配列を有する、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「抑制受容体」）を含む。ＦｃＲはＲａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，１９９１，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：４５７−９２；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，４：２５−３４；およびｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１２６：３３０−４１中に総説されている。「ＦｃＲ」は、胎児への母方ＩｇＧの移動を担う新生児受容体、ＦｃＲｎも含む（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１７：５８７；およびＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：２４９）。
【００８０】
「補体依存性細胞障害」および「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的の溶解を指す。補体活性化経路は、補体系の第１要素（Ｃ１ｑ）と同種抗原と複合体形成した分子（例えば抗体）の結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３（１９９６）中に記載されたのと同様のＣＤＣアッセイを実施することができる。
【００８１】
「機能性Ｆｃ領域」は、原型配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を有する。例示的な「エフェクター機能」は、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）、ファゴサイトーシス、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）の下方制御などを含む。このようなエフェクター機能はＦｃ領域を結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わせることを一般に必要とし、このような抗体のエフェクター機能を評価するための当技術分野で知られている様々なアッセイを使用して評価することができる。
【００８２】
「原型配列Ｆｃ領域」は、本来見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって原型配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列と異なるが、原型配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を保持するアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、原型配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば原型配列Ｆｃ領域中または親ポリペプチド中に約１個〜約１０個のアミノ酸置換、および好ましくは約１個〜約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書において変異体Ｆｃ領域は、好ましくは原型配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列同一性、およびもっとも好ましくはそれらと少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくはそれらと少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有するはずである。
【００８３】
本明細書中で使用する「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」および「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞障害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞上の結合抗体を認識し、後に標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性の反応を指す。当該の分子のＡＤＣＣ活性は、米国特許第５５００３６２号または米国特許第５８２１３３７号中に記載されたアッセイなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡＤＣＣアッセイを使用して評価することができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびＮＫ細胞がある。代替的、または追加的に、当該の分子のＡＤＣＣ活性はｉｎ  ｖｉｖｏで、例えばＣｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），９５：６５２−６５６中に開示された動物モデルなどの動物モデルにおいて評価することができる。
【００８４】
本明細書中で使用する「治療」は、有益または望ましい臨床結果を得るための手法である。本発明の目的で、有益または望ましい臨床結果は、以下の：重度の低下を含めた任意の態様の頭痛の改善、疼痛強度、および他の関連症状の緩和、再発の頻度の低下、頭痛に罹患している人の生活の質の向上、および頭痛を治療するために必要とされる他の薬剤の用量の低下の１つまたは複数だけには限られないが、これらを含む。片頭痛に関しては、他の関連症状には悪心、嘔吐、および光、音、および／または動きに対する感受性があるが、これらだけには限られない。群発性頭痛に関しては、他の関連症状には目の下または周辺の膨張、過剰な涙、赤目、鼻漏または鼻づまり、および赤く紅潮した顔があるが、これらだけには限られない。
【００８５】
頭痛の「発生率の低下」は、重度、（例えば片頭痛用のエルゴタミン、ジヒドロエルゴタミン、またはトリプタンを含めた、この状態用に一般に使用される（例えば露出される）他の薬剤および／または療法剤の必要性および／または量の低下を含み得る）、期間、および／または頻度（例えば、個体における次の一時的発作までの時間の遅延または増大を含む）の任意の低下を意味する。当業者によって理解されるように、個体は治療に対するそれらの応答性の点で異なる可能性があり、例えば「個体における頭痛の発生率を低下させる方法」などは、このような投与はその特定の個体においてこのような発生率の低下をおそらく引き起こし得るという妥当な予測に基づく、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の投与を表す。
【００８６】
頭痛または１つまたは複数の頭痛の症状の「改善」は、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の非投与と比較した１つまたは複数の頭痛の症状の低下または改善を意味する。「改善」は症状の期間の短縮または減少も含む。
【００８７】
本明細書中で使用する「頭痛の調節」は、（治療前のレベルと比較した）個体における１つまたは複数の頭痛の症状の重度または期間または頭痛発作の頻度の、維持または低下を指す。例えば、頭痛の期間または重度、または発作の頻度は、治療前のレベルと比較して、個体において少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％のいずれか低下する。
【００８８】
本明細書中で使用する頭痛の発症の「遅延」は、疾患の進行の引き延ばし、妨げ、遅れ、妨害、安定化、および／または延期を意味する。この遅延は、疾患歴および／または治療する個体に応じて、様々な長さの時間であり得る。当業者には明らかであるように、十分または有意な遅延は実際、個体が頭痛（例えば、片頭痛）を発症しない点で予防を包含し得る。症状の発症を「遅延させる」方法は、方法を使用しないときと比較して、所与の時間枠で症状が発症する確率を低下させる、および／または所与の時間枠で症状の程度を低下させる方法である。このような比較は典型的には、統計上有意な数の対象を使用する臨床試験に基づく。
【００８９】
頭痛の「発症」または「進行」は、障害の初期症状および／または後の進行を意味する。頭痛の発症は、当技術分野でよく知られている標準的な臨床技法を使用して検出および評価することができる。しかしながら、発症は検出不能である可能性がある進行も指す。本発明の目的で、発症または進行は症状の生物学的過程を指す。「発症」は発生、再発、および発病を含む。本明細書中で使用する頭痛の「発病」または「発生」は、初期発病および／または再発を含む。
【００９０】
本明細書中で使用する薬剤、化合物、または医薬組成物の「有効用量」または「有効量」は、有益または望ましい結果を得るのに十分な量である。予防的使用に関して、有益または望ましい結果は、リスクの排除または低下、重度の低下、または疾患の生化学的、組織学的および／または行動症状、疾患の発症中に示されるその合併症および中間期の病的表現型を含めた疾患の発症の遅延などの結果を含む。治療的使用に関して、有益または望ましい結果は、疼痛強度、期間、または頭痛発作の頻度の低下、および疾患の発症中に示されるその合併症および中間期の病的表現型、頭痛から生じる１つまたは複数の（生化学的、組織学的および／または行動）症状の減少、頭痛に罹患している人の生活の質の向上、疾患を治療するために必要とされる他の薬剤の用量の低下、他の薬剤の効果の増大、および／または患者の疾患の進行の遅延などの臨床結果を含む。有効用量は、１回または複数回投与で投与することができる。本発明の目的で、薬剤、化合物、または医薬組成物の有効用量は、直接的または間接的のいずれかで、予防的または療法的治療を実施するのに十分な量である。臨床状況において理解されるように、薬剤、化合物、または医薬組成物の有効用量は、他の薬剤、化合物、または医薬組成物を併用して得ることができる、またはできない。したがって、「有効用量」は１つまたは複数の治療物質を投与する状況で考えることができ、および１つまたは複数の他の物質と併用する場合、１つの治療物質は有効量で与えられると考えることができ、望ましい結果が得られる可能性があるか、または得られる。
【００９１】
「個体」または「対象」は哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は、家畜、愛玩用動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットも含むが、これらだけには限られない。
【００９２】
本明細書中で使用する「ベクター」は、１つまたは複数の当該の遺伝子または配列を宿主細胞に送達することができる、および好ましくはそれらを宿主細胞中で発現させることができる構築体を意味する。ベクターの例には、ウイルスベクター、裸ＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤と結合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および産生細胞などのいくつかの真核生物細胞があるが、これらだけには限られない。
【００９３】
本明細書中で使用する「発現制御配列」は、核酸の転写を誘導する核酸配列を意味する。発現制御配列は、構成性または誘導性プロモーターなどのプロモーター、またはエンハンサーであってよい。発現制御配列は、転写される核酸配列と作動可能に連結している。
【００９４】
本明細書中で使用する「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できる賦形剤」は、活性成分と組み合わせると、その成分が生物学的活性を保持するのを可能にし、対象の免疫系と反応性がない任意の物質を含む。例にはリン酸緩衝溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および様々な型の湿潤剤などの標準的な薬剤担体のいずれかがあるが、これらだけには限られない。エアロゾルまたは非経口投与に好ましい希釈剤は、リン酸緩衝溶液または正常（０．９％）生理食塩水である。このような担体を含む組成物は、よく知られている従来の方法によって配合する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００を参照）。
【００９５】
本明細書中で使用する用語「ｋｏｎ」は、抗体と抗原の結合に関する速度定数を指すものとする。
【００９６】
本明細書中で使用する用語「ｋｏｆｆ」は、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に関する速度定数を指すものとする。
【００９７】
本明細書中で使用する用語「ＫＤ」は、抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指すものとする。
【００９８】
本明細書中で使用する用語「血管運動症状」は、血管拡張と関係がある状態を指すものとし、特に体温調節障害によって引き起こされる、頭痛（片頭痛他など）、顔面紅潮（またはのぼせ）、コールドフラッシュ、不眠症、睡眠障害、気分障害、過敏症、過剰な発汗、寝汗、日中の汗、疲労などだけには限られないが、これらを含む。
【００９９】
本明細書中で使用する用語「紅潮」、「顔面紅潮」および「のぼせ」は、典型的には突然の皮膚の紅潮からなり、通常は対象における発汗を伴う、体温の一時的な乱れを指す当技術分野では理解されている用語である。
【０１００】
Ａ．血管運動症状を防止または処置する方法
一態様では、本発明は、個体に有効量の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体または抗体に由来するポリペプチドを投与することを含む、個体における、頭痛（例えば、片頭痛）または顔面紅潮などの、少なくとも１つの血管運動症状を処置または防止するための一方法を提供する。
【０１０１】
別の一態様では、本発明は、個体に有効量の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を投与することを含む、個体における、頭痛（例えば、片頭痛）または顔面紅潮などの、少なくとも１つの血管運動症状の発症または進行を改善し、コントロールし、発生を低減し、または遅延するための一方法を提供する。
【０１０２】
別の一態様では、本発明は、個体に有効量の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を、頭痛を処置するのに有用な少なくとも１つのさらなる物質と併用して投与することを含む、個体における頭痛（例えば、片頭痛）の発症または進行を改善し、コントロールし、発生を低減し、または遅延するための方法を提供する。
【０１０３】
このようなさらなる物質には、それだけには限定されないが、５−ＨＴ作用薬およびＮＳＡＩＤが含まれる。例えば、抗体および少なくとも１つのさらなる物質を同時に投与することができる、すなわち、それらの個々の治療効果を重ね合わせるために、側頭部に十分近接して与えることができる。例えば、抗ＣＧＲＰ抗体と併用して投与する５−ＨＴ作用薬またはＮＳＡＩＤの量は、患者における頭痛の再発の頻度を低減し、または他のものの非存在下でこれらの物質のいずれか１つを投与するのに比べてより長時間継続する効力をもたらすのに十分でなければならない。この手順を用いて、前兆を伴う、または伴わない片頭痛；片麻痺性片頭痛、群発性頭痛、片頭痛性神経痛、慢性頭痛、緊張性頭痛、他の医学的状態（例えば、感染症、もしくは腫瘍による頭蓋における圧力の増大）に起因する頭痛、慢性発作性片側頭痛、構造的病変に非関連の様々な頭痛、非血管の頭蓋内障害に関連する頭痛、物質の投与またはその離脱に関連する頭痛、頭部以外の感染症に関連する頭痛、代謝障害に関連する頭痛；頭蓋骨、頸、目、耳、鼻、副鼻腔、歯、口、または他の顔面もしくは頭蓋の構成組織の障害に関連する頭痛、頭蓋神経痛、および神経幹痛、ならびに求心路遮断性疼痛を含む様々なクラスのいずれかに分類される頭痛を処置することができる。
【０１０４】
当業者であれば抗ＣＧＲＰ抗体と併用して用いる特定の物質の好適な投与量を決定することができる。例えば、スマトリプタンを、約０．０１ｍｇから約３００ｍｇまでの投与量で投与してもよい。経口的に投与する場合、スマトリプタンの典型的な投与量は、約２５ｍｇから約１００ｍｇまでであり、約５０ｍｇが一般的に好ましく、非経口的に投与する場合、好ましい投与量は約６ｍｇである。しかし、これらの投与量は、特定の患者または特定の併用療法に最適化するように、当技術分野では標準の方法に従って変化してよい。さらに、例えば、セレコキシブを、５０ｍｇと５００ｍｇとの間の量で投与してもよい。
【０１０５】
別の一態様では、本発明は、個体に有効量の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を、顔面紅潮を処置するのに有用な少なくとも１つのさらなる物質と併用して投与することを含む、個体における顔面紅潮の発症または進行を改善し、コントロールし、発生を低減し、または遅延する方法を提供する。このようなさらなる物質には、それだけには限定されないが、エストロゲン、および／またはいくつかのプロゲスチンを含む、ホルモンベースの処置が含まれる。
【０１０６】
本明細書に記載するすべての方法に関して、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体に対する言及は、１つまたは複数のこれらの物質を含む組成物も含む。これらの組成物は、バッファを含めた薬学的に許容できる賦形剤など、当技術分野ではよく知られている適切な賦形剤をさらに含むことができる。本発明は、単独で、または他の従来の処置の方法と併用して用いることができる。
【０１０７】
抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を、あらゆる適切な経路により個体に投与することができる。当業者であれば、本明細書に記載する実施例は限定的ではないが、利用可能な技術を例示することが企図されることが明らかであるはずである。したがって、いくつかの実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を、静脈投与など（例えば、ボーラスとして、またはある時間にわたる連続的な注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、舌下、滑液包内、インサフレーション、くも膜下腔内、経口、吸入、または局所の経路によって）、知られている方法に従って個体に投与する。投与は、静脈内投与など全身的でもよく、または局所的でもよい。液体の製剤には、ジェットネブライザーおよび超音波ネブライザーを含む、液体製剤用の市販のネブライザーが投与に有用である。液体製剤を直接霧状にすることができ、凍結乾燥した粉末を再構成後、霧状にすることができる。あるいは、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を、フルオロカーボン製剤および定量式噴霧器を用いてエアロゾル化することができ、または凍結乾燥し、粉砕した粉末として吸入することができる。
【０１０８】
一実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を、部位特異的な、または標的化した局所送達技術によって投与する。部位特異的な、または標的化した局所送達技術の例には、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の様々な植込み型の貯蔵供給源、または局所送達カテーテル、例えば、注入カテーテル、留置カテーテル、もしくはニードルカテーテル、人工血管、外膜ラップ、シャントおよびステント、または他の植込み型装置、部位特異的な担体、直接注射、または直接適用が含まれる。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／５３２１１、および米国特許第５９８１５６８号を参照されたい。
【０１０９】
抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の様々な製剤を、投与のために用いることができる。いくつかの実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体をストレートで投与してもよい。いくつかの実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体および薬学的に許容できる賦形剤は、様々な製剤であってよい。薬学的に許容できる賦形剤は当技術分野では知られており、薬理学的に有効な物質の投与を促進する、比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形態または粘稠性を与え、または希釈剤として働くことができる。適切な賦形剤には、それだけには限定されないが、安定化剤、湿潤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変えるための塩、カプセル化剤、バッファ、および皮膚浸透促進剤が含まれる。賦形剤、ならびに非経口および経口的に薬物を送達するための製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に述べられている。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、これらの物質は注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）による投与のために配合されている。したがって、これらの物質を、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液などの薬学的に許容できるビヒクルと組み合わせることができる。特定の投与量レジメン、すなわち投与量、タイミング、および反復は、特定の個体、および個体の薬歴に依存する。
【０１１１】
抗ＣＧＲＰ抗体は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）を含む、あらゆる適切な方法を用いて投与することができる。抗ＣＧＲＰ抗体を、本明細書に記載するように、吸入によって投与することもできる。一般的に、抗ＣＧＲＰ抗体を投与するためには、はじめの候補の投与量は、約２ｍｇ／ｋｇであってよい。本発明の目的では、典型的な１日投与量は、上記で言及する要因に応じて、約３μｇ／ｋｇから３０μｇ／ｋｇから３００μｇ／ｋｇから３ｍｇ／ｋｇから３０ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、またはそれを超えるあらゆるものの範囲であってよい。例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、および約２５ｍｇ／ｋｇの投与量を用いることができる。数日またはそれより長い日数にわたって反復投与するには、状態に応じて、症状の望ましい抑制が生じ、または、例えば疼痛を低減するのに、十分な治療レベルを達成するまで、処置を持続する。例示の投薬レジメンは、約２ｍｇ／ｋｇの初回投与量を投与し、その後、毎週約１ｍｇ／ｋｇの抗ＣＧＲＰ抗体の維持投与量、または１週間おきに約１ｍｇ／ｋｇの維持投与量を含む。しかし、医師が達成したい薬物動態学的減衰のパターンに応じて、他の投与量レジメンも有用であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、１週間に１〜４回からの投薬が企図される。この治療の進行は、従来の技術およびアッセイによって、容易にモニターされる。投薬レジメン（用いられるＣＧＲＰ拮抗薬を含む）は、経時的に変化する。
【０１１２】
本発明の目的では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の好適な投与量は、使用する抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体（またはその組成物）、処置する頭痛（例えば、片頭痛）のタイプおよび重症度、物質を予防目的で投与するのかまたは治療目的で投与するのか、以前の治療、患者の病歴および物質に対する反応、ならびに担当の医師の判断に依存する。典型的には、臨床医は、望ましい結果を達成する投与量に到達するまで、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を投与する。投与量および／または頻度は、処置の経過にわたって変化してよい。
【０１１３】
半減期などを経験的に考慮することが、一般的に、投与量を決定する一因となる。例えば、ヒト化抗体または完全ヒト抗体など、ヒトの免疫系に適合性である抗体を用いて、抗体の半減期を延長し、抗体が宿主の免疫系によって攻撃されるのを防ぐことができる。治療の経過にわたって、投与の頻度を決定し、調節することができ、必然的ではないが、一般的には、頭痛（例えば、片頭痛）の処置、および／または抑制、および／または軽減、および／または遅延に基づくものである。あるいは、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の持効性製剤が好適であり得る。持続放出を達成するための様々な製剤および装置が、当技術分野では知られている。
【０１１４】
一実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体に対する投与量は、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の１回または複数回投与を受けている個体において、経験的に決定され得る。個体に、増加的な投与量の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を投与する。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の有効性を評価するために、疾患の指標が続いてもよい。
【０１１５】
本発明の方法に従った抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の投与は、例えば、受容者の生理的状態、投与の目的が治療的であるかまたは予防的であるか、および当業者には知られている他の要因に応じて、連続的でも、または断続的でもよい。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の投与は、あらかじめ選択された期間にわたって実質的に連続的であってよく、または一連の間隔のあいた投与量、例えば、頭痛（例えば、片頭痛）を発症する前、間、後のいずれか；前；間；前および後、間および後、前および間；または頭痛を発症する前、間、および後でよい。投与は、頭痛を生じそうなあらゆる事象の前、間、および／または後でよい。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、１つを超える抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体が存在し得る。少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つの異なる、またはそれを超える抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体が存在し得る。一般的には、これらの抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、相互に有害な影響を及ぼさない、補足的な活性を有することがある。拮抗的な抗ＣＧＲＰ抗体を、他のＣＧＲＰ拮抗薬、またはＣＧＲＰ受容体拮抗薬と組み合わせて用いることもできる。例えば、１つまたは複数の、以下のＣＧＲＰ拮抗薬を用いてもよい：ＣＧＲＰに向けられているアンチセンス分子（ＣＧＰＲをコードする核酸に対して向けられているアンチセンスの分子を含む）、ＣＧＲＰ阻害性化合物、ＣＧＲＰの構造的類似体、ＣＧＲＰのドミナントネガティブ変異、ＣＧＲＰに結合する受容体、および抗ＣＧＲＰ受容体抗体。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を、物質の有効性の増強および／または補完をもたらす他の物質と組み合わせて用いることもできる。
【０１１７】
本発明に従って用いられる抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の治療用製剤は、望ましい純度を有する抗体を、任意選択の薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定化剤と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、貯蔵用に調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００））。許容できる担体、賦形剤、または安定化剤は、使用される投与量および濃度で受容者にとって非毒性であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などのバッファ；塩化ナトリウムなどの塩；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量の（約１０残基より少ない）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、および、グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた他の炭化水素；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成性の対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含むことができる。
【０１１８】
抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含むリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０（１９８０）；ならびに米国特許第４４８５０４５号および第４５４４５４５号に記載されているものなど、当技術分野では知られている方法によって調製する。循環時間の向上したリポソームは、米国特許第５０１３５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ由来のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物で、逆層蒸発法によって生成することができる。リポソームは、望ましい直径を有するリポソームをもたらすために規定された孔サイズのフィルターを通して押し出される。
【０１１９】
有効成分を、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、コロイド性薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン、微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）において、またはマイクロエマルジョンにおいて、それぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンのマイクロカプセル、ならびにポリ（メチルメタシレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルに封入することもできる。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に公開されている。
【０１２０】
持続放出の調製物を調製してもよい。持続放出の調製物の適切な例には、そのマトリクスが成形された物品の形態、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルである、抗体を含有する固体の疎水性ポリマーの半透性のマトリクスが含まれる。持続放出マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ−グルタミン酸と７−エチル−Ｌ−グルタメートとの共重合体、非分解性のエチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）などの分解性の乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドからなる、注射可能な微小球）、スクロースアセテートイソブチレート、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【０１２１】
ｉｎ  ｖｉｖｏの投与に用いる製剤は、滅菌でなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することによって、容易に行うことができる。治療用の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体組成物は、一般的に、滅菌のアクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通することができるストッパーを有する静脈内溶液用のバッグまたはバイアル中に配置される。
【０１２２】
本発明による組成物は、経口、非経口、もしくは直腸投与のための、または吸入もしくはインサフレーションによる投与のための、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、溶液剤もしくは懸濁剤、または坐剤などの、単位投与量形態であってよい。
【０１２３】
錠剤などの固体の組成物を調製するためには、主要な有効成分を、製薬上の担体（例えば、コーンスターチ、ラクトース、ショ糖、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、もしくはゴムなどの従来の錠剤化の成分）、および他の製薬上の希釈剤（例えば、水）と混合して、本発明の化合物の均一な混合物、または非毒性の薬学的に許容できるその塩を含む固体の予備処方組成物を形成する。これらの予備処方の組成物を均一と呼ぶ場合は、組成物を、錠剤、丸剤、およびカプセル剤などの等しく有効な単位投与量形態に容易に細分することができるように、有効成分を組成物中に均等に分散させることを意味する。次いで、固体の予備処方の組成物を、本発明の有効成分０．１ｍｇから約５００ｍｇまでを含む上記に記載したタイプの単位投与量形態に細分する。新規な組成物の錠剤または丸剤は、コーティングすることができ、または、作用の延長の利点をもたらす投与量形態を提供するように他の方法で配合することができる。例えば、錠剤または丸剤は、内側の投与量および外側の投与量の成分を含むことができ、後者は、前者の上を覆うものの形態である。２つの成分は、胃における崩壊に抵抗をもたらし、内側の成分が十二指腸中にそのままで通過し、または遅れて放出されるのを可能にする腸溶層によって分離され得る。このような腸溶層またはコーティングには、様々な材料を用いることができ、そのような材料には、シェラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースなどの材料と共に、数々の重合体の酸、および重合体の酸の混合物が含まれる。
【０１２４】
適切な界面活性剤には、特に、非イオン性の物質、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン（例えば、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、４０、６０、８０、または８５）、および他のソルビタン（例えば、Ｓｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０、または８５）が含まれる。界面活性剤を含む組成物は、０．０５％と５％との間の界面活性剤を含むと好都合であり、０．１％と２．５％との間であり得る。必要であれば、他の成分、例えば、マンニトール、または他の薬学的に許容できるビヒクルを加えてもよいことが理解されよう。
【０１２５】
Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（商標）およびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）などの市販の脂肪乳剤を用いて、適切な乳剤を調製してもよい。有効成分を、あらかじめ混合した乳剤組成物に溶解してもよく、またはその代わりに油（例えば、ダイズ油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油、もしくはアーモンド油）に溶解してもよく、リン脂質（例えば、卵のリン脂質、大豆のリン脂質、もしくはダイズレシチン）および水と混合すると乳剤が形成される。グリセロールまたはグルコースなどの他の成分を加えて乳剤の張性を調節してもよいことが理解されよう。適切な乳剤は、典型的には最高２０％の、例えば、５％と２０％との間の油を含む。脂肪乳剤は、０．１と１．０ｌｍとの間の、詳しくは０．１と０．５ｌｍとの間の脂肪の液滴を含むことができ、５．５から８．０の範囲のｐＨを有する。
【０１２６】
乳剤組成物は、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）またはその成分（ダイズ油、卵のリン脂質、グリセロール、および水）と混合することによって調製されるものであってよい。
【０１２７】
吸入またはインサフレーションのための組成物には、薬学的に許容できる、水性もしくは有機の溶媒、またはそれらの組合せ、および粉末における溶液および懸濁液を含む。液体または固体の組成物は、上記で述べた適切な薬学的に許容できる賦形剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物を、局所または全身性の効果に対して、経口または経鼻の呼吸器の経路によって投与する。好ましくは滅菌の薬学的に許容できる溶媒における組成物を、ガスの使用により霧状にしてもよい。霧状にした溶液を、霧状化装置から直接呼吸してもよく、または霧状化装置をフェースマスク、テント、または間欠的陽圧呼吸器に取り付けてもよい。溶液、懸濁液、または粉末の組成物を、好ましくは、経口または経鼻により、製剤を好適なやり方で送達する装置から投与してもよい。
【０１２８】
頭痛の診断または評価は、当技術分野では十分確立されている。評価は、患者による症状の特徴付けなど、主観的な基準に基づいて行われることがある。例えば、片頭痛は、以下の診断基準に基づいて診断することができる：１）４時間から７２時間続く一時的な頭痛の発作、２）以下の症状の２つを伴う；片側性の疼痛、拍動、動作時の悪化、および中程度または重症の強度の疼痛、ならびに３）以下の症状の１つ：悪心または嘔吐、および羞明または音声恐怖。Ｇｏａｄｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：２５７−２７０，２００２。
【０１２９】
処置の有効性を、当技術分野ではよく知られている方法によって評価することができる。例えば、疼痛緩和を評価してもよい。したがって、いくつかの実施形態では、疼痛緩和を、抗ＣＧＲＰ抗体投与後１、２、または数時間後に主観的に観察する。いくつかの実施形態では、頭痛の発作の頻度を、抗ＣＧＲＰ抗体の投与後に、主観的に観察する。
【０１３０】
Ｂ．抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体
本発明の方法は、受容体との結合および／もしくはＣＧＲＰへの細胞応答の誘発などのＣＧＲＰシグナリングによって調節される下流経路を含むＣＧＲＰの生物学的活性を、（有意にを含んで）遮断、抑制または低減させる任意の抗体分子を意味する抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を使用する。
【０１３１】
抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、以下の特性、（ａ）ＣＧＲＰへの結合、（ｂ）ＣＧＲＰのその受容体への結合からの遮断、（ｃ）ＣＧＲＰ受容体の活性化（ｃＡＭＰの活性化を含む）の遮断または減少、（ｄ）ＣＧＲＰの生物学的活性またはＣＧＲＰシグナリング機能によって調節される下流経路の阻害、（ｅ）任意の態様の頭痛（例えば片頭痛）の予防、改善または治療、（ｆ）ＣＧＲＰのクリアランスの増大、および（ｇ）ＣＧＲＰ合成、産生または放出の阻害（低減）、の任意の１つまたは複数を示さなければならない。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、当業者に周知である。例えば、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．（Ｌｏｎｄ）．８９：５６５−７３，１９９５；Ｓｉｇｍａ（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳ），ｐｒｏｄｕｃｔ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｃ７１１３（ｃｌｏｎｅ  ＃４９０１）；Ｐｌｏｕｒｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １４：１２２５−１２２９，１９９３を参照。
【０１３２】
本発明の目的のために抗体は、ＣＧＲＰおよび／またはＣＧＲＰシグナリング機能によって調節される下流経路を阻害する様にＣＧＲＰと反応する。いくつかの実施形態において抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ヒトＣＧＲＰを認識する。いくつかの実施形態において抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ヒトα−ＣＧＲＰおよびβ−ＣＧＲＰの両方と結合する。いくつかの実施形態において抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ヒトおよびラットＣＧＲＰと結合する。いくつかの実施形態において抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ＣＧＲＰのアミノ酸２５〜３７を有するＣ末端断片と結合する。いくつかの実施形態において抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ＣＧＲＰのアミノ酸２５〜３７の中にあるＣ末端エピトープと結合する。
【０１３３】
本発明において有用である抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヘテロ複合抗体、１本鎖（ＳｃＦｖ）、これらの変異体、抗体の一部を含む融合タンパク質（例えばドメイン抗体）、ヒト化抗体、ならびに、抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアントおよび共有結合的に修飾された抗体を含む必要とされる特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された配置を包含する。抗体は、ネズミ、ラット、ヒト、または任意の他種由来であることができる（キメラまたはヒト化抗体を含む）。
【０１３４】
いくつかの実施形態において抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態において抗体は、ヒト抗体である。いくつかの実施形態において抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、Ｇ１抗体である（本明細書に記載の通り）。いくつかの実施形態において抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、Ｇ１抗体または表６に示すＧ１のバリアントの１個または複数のＣＤＲ（１個、２個、３個、４個、５個、またはいくつかの実施形態においては６個すべてのＣＤＲ）を含む。さらに他の実施形態において抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、図５（配列番号１）に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列および図５（配列番号２）に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。
【０１３５】
いくつかの実施形態において抗体は、本明細書に記載の免疫学的に不活性である定常領域などの改変定常領域を含む。いくつかの実施形態において定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１；および／または英国特許出願第９８０９９５１．８号に記載の通り改変される。他の実施形態において抗体は、以下の変異、Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１へ（アミノ酸番号は野生型ＩｇＧ２配列を参照）を含むヒト重鎖ＩｇＧ２定常領域を含む。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４  いくつかの実施形態において抗体は、以下の変異、Ｅ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５へを含むＩｇＧ４の定常領域を含む。さらに他の実施形態において定常領域は、Ｎ−結合型グリコシル化について非グリコシル化される。いくつかの実施形態において定常領域は、オリゴ糖付着部位（Ａｓｎ２９７など）および／または定常領域内のＮ−グリコシル化認識配列の一部である隣接残基を変異させることによって、Ｎ−結合型グリコシル化について非グリコシル化される。いくつかの実施形態において定常領域は、Ｎ−結合型グリコシル化について非グリコシル化される。定常領域は、酵素によってまたはグリコシル化欠損宿主細胞中での発現によってＮ−結合型グリコシル化について非グリコシル化されることができる。
【０１３６】
抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体のＣＧＲＰ（ヒトα−ＣＧＲＰなど）への結合親和性（ＫＤ）は、約０．０２から約２００ｎＭであることができる。いくつかの実施形態において結合親和性は、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭまたは約２ｐＭのいずれでも良い。いくつかの実施形態において結合親和性は、約２５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭまたは約５０ｐＭのいずれか未満である。
【０１３７】
抗体のＣＧＲＰへの結合親和性を決定する１つの方法は、抗体の単機能Ｆａｂ断片の結合親和性を測定することによるものである。単機能Ｆａｂ断片を得るために抗体（例えばＩｇＧ）をパパインで切断するか、または組換えによって発現させることができる。抗体の抗ＣＧＲＰ  Ｆａｂ断片の親和性は、ＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％容量／容量Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）を使用する、あらかじめ固定化したストレプトアビジンセンサーチップ（ＳＡ）を備えた表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（商標）ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＳＲＰ）ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｉａｃｏｒｅ，ＩＮＣ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）によって決定できる。ビオチニル化ヒトＣＧＲＰ（または任意の他のＣＧＲＰ）は、０．５μｇ／ｍｌ未満の濃度にＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中に希釈し、詳細な動力学試験用に５０〜２００レスポンスユニット（ＲＵ）またはスクリーニングアッセイ用に８００〜１０００ＲＵの２つの範囲の抗原密度のいずれかを達成するために、様々な接触時間を使用して個々のチップチャネルへ注入することができる。再生試験は、２５％容量／容量エタノール中の２５ｍＭ  ＮａＯＨが、注入２００回を超えてチップ上のＣＧＲＰの活性を維持したままで、結合しているＦａｂを効果的に除去することを示している。典型的には、精製したＦａｂ試料の系列希釈（推定ＫＤの０．１〜１０×の濃度域）が１００μＬ／分で１分間注入され、２時間までの解離時間が許容される。Ｆａｂタンパク質の濃度は、既知の濃度のＦａｂ（アミノ酸分析によって決定される）を標準として使用するＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって決定される。動力学的会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍを使用して包括的に１：１ラングミュア結合モデル（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．Ｒｏｏｓ，Ｈ．Ｆａｇｅｒｓｔａｍ，Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．（１９９４），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６，９９−１１０）にデータを当てはめることによって同時に得る。平衡解離定数（ＫＤ）値は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出される。このプロトコルは、ヒトＣＧＲＰ、他の哺乳類のＣＧＲＰ（マウスＣＧＲＰ、ラットＣＧＲＰ、霊長類ＣＧＲＰなど）ならびにＣＧＲＰの異なる型（α型およびβ型など）を含む任意のＣＧＲＰへの抗体の結合親和性の決定における使用に適する。抗体の結合親和性は、一般に２５℃で測定されるが、３７℃でも測定できる。
【０１３８】
抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、当業者に既知の任意の方法により作製されることができる。宿主動物の免疫化の経路およびスケジュールは、本明細書にさらに記載の通り一般に抗体刺激および産生のための確立された従来技術と一致している。ヒトおよびマウス抗体の産生のための一般的技術は、当業者に既知であり、本明細書に記載されている。
【０１３９】
ヒトまたはそれから抗体を産生する細胞を含む任意の哺乳類対象は、ヒトを含む哺乳類のハイブリドーマ細胞系の産生のための基礎として役立てるために操作されることができる。典型的には宿主動物は、腹腔内、筋内、経口、皮下、足底皮下、および／または皮内に、本明細書における記載を含む、抗原の量で接種される。
【０１４０】
ハイブリドーマは、リンパ球および不死化骨髄腫細胞から、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７の一般的体細胞ハイブリダイゼーション技術またはＢｕｃｋ，Ｄ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，１８：３７７−３８１（１９８２）によって変更された技術、を使用して調製できる。Ｘ６３−Ａｇ８．６５３およびＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ由来のものを非限定的に含む入手可能な骨髄腫細胞系を、ハイブリダイゼーションに使用できる。一般に技術は、ポリエチレングリコールなどの融合剤を使用して、または当業者に十分に既知である電気的手段によって、骨髄腫細胞およびリンパ系細胞を融合することを含む。融合後細胞は、融合培地から分離され、ハイブリダイズしていない親細胞を排除するためにヒポサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地などの選択増殖培地で増殖させる。血清でまたは血清無しで補った、本明細書に記載の任意の培地を、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するために使用できる。細胞融合技術の他の選択として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を本発明の対象の抗ＣＧＲＰモノクローナル抗体を産生するために使用することができる。ハイブリドーマを播種およびサブクローン化し、所望により上清を通常のイムノアッセイ手順（例えばラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイまたは蛍光イムノアッセイ）によって抗免疫原活性をアッセイする。
【０１４１】
抗体の供給源として使用できるハイブリドーマは、すべての類縁体、ＣＧＲＰまたはその一部分に特異的なモノクローナル抗体を産生する親ハイブリドーマの子孫細胞を包含する。
【０１４２】
このような抗体を産生するハイブリドーマは、既知の手順を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで増殖させることができる。モノクローナル抗体は、所望により、硫酸アンモニウム沈澱、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィーおよび限外濾過などの通常の免疫グロブリン精製手順によって培養培地または体液から単離することができる。望ましくない活性が存在する場合は、例えば固相に付着させた免疫原で作製された吸着剤における調製を実行し、所望の抗体を免疫原から溶出または放出することによって除去できる。ヒトＣＧＲＰ、または免疫化される種において免疫原となるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリンまたは二機能性剤もしくは誘導化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を経て複合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を経て複合）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、もしくはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ、式中ＲとＲ１とは異なるアルキル基、を使用するダイズトリプシンインヒビター、に複合している標的アミノ酸配列を含有する断片による宿主動物の免疫化で、抗体の集団（例えばモノクローナル抗体）が得られる。
【０１４３】
所望により目的の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）は、配列分析されることができ、次いでポリヌクレオチド配列は、発現または増殖のためにベクターにクローン化されることができる。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞中のベクターにおいて維持されることができ、次いで宿主細胞は将来の使用のために播種および凍結されることができる。別法としてポリヌクレオチド配列は、抗体の「ヒト化」または親和性もしくは抗体の他の特徴を改善するための遺伝子操作に使用できる。例えば、抗体を臨床試験およびヒトの治療に使用する場合、免疫応答を回避するためにヒト定常領域にさらに類似させるため、定常領域を工学的に操作することができる。ＣＧＲＰへのさらに強い親和性およびＣＧＲＰの阻害におけるさらに強い有効性を得るために抗体配列を遺伝子操作することが望ましい場合がある。ＣＧＲＰへの結合能力を維持したまま、１つまたは複数のポリヌクレオチドの変更を抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体に作製できることは、当業者に明らかである。
【０１４４】
モノクローナル抗体をヒト化するための一般的な４つのステップがある。それらは、（１）ヌクレオチドならびに出発抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインの予測されるアミノ酸配列を決定するステップ（２）ヒト化抗体を設計する、すなわちヒト化過程において使用する抗体構造領域を決めるステップ（３）実際にヒト化する方法論／技術のステップ、ならびに（４）トランスフェクションおよびヒト化抗体の発現のステップ、である。例えば、米国特許第４８１６５６７号；第５８０７７１５号；第５８６６６９２号；第６３３１４１５号；第５５３０１０１号；第５６９３７６１号；第５６９３７６２号；第５５８５０８９号；および第６１８０３７０号を参照。
【０１４５】
非ヒト免疫グロブリン由来抗原結合部位を含むいくつかの「ヒト化」抗体分子は、げっ歯類または改変げっ歯類Ｖ領域およびその関連相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト定常ドメインに融合させているキメラ抗体を含めて、すでに記載されている。例えば、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９（１９９１）；Ｌｏｂｕｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４２２０−２２４（１９８９）；Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８（１１９８７）；およびＢｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：３５７７−３５８３（１９８７）を参照されたい。他の参考文献は、適切なヒト抗体定常ドメインとの融合の前にヒト支持フレームワーク領域（ＦＲ）にグラフとしたげっ歯類ＣＤＲを記載している。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；およびＪｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）を参照されたい。別の参考文献は、組換えベニアげっ歯類フレームワーク領域により支持されるげっ歯類ＣＤＲを記載している。例えば、欧州特許出願公開第０５１９５９６号を参照されたい。これらの「ヒト化」分子は、ヒト受容者のその部分の治療的応用の持続時間および有効性を限定する、げっ歯類抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫学的応答を最小限に抑えるように設計されている。例えば、前記抗体定常領域は、免疫学的に不活性である（例えば、補体溶解を引き起こさない）ように工学的に改変することができる。例えば、ＰＣＴ公開第ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１号；英国特許出願公開第９８０９９５１．８号を参照されたい。利用する可能性もある抗体のヒト化の他の方法は、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：２４７１−２４７６（１９９１）、ならびに米国特許第６０５４２９７号；第５９９７８６７号；第５８６６６９２号；第６２１０６７１号；および第６３５０８６１号；ならびにＰＣＴ公開国際公開第０１／２７１６０号に開示されている。
【０１４６】
さらに別の代替法では、完全なヒト抗体は、特異的なヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように工学的に改変されている市販のマウスを使って入手してもよい。もっと望ましい（例えば、完全なヒト抗体）またはもっと強い免疫応答を生じるように設計されたトランスジェニック動物も、ヒト化またはヒト抗体の産生のために使ってよい。そのような技術の例は、Ａｂｇｅｎｉｘ社（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）製のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）ならびにＭｅｄａｒｅｘ社（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）製のＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ  Ｍｏｕｓｅ（商標）である。
【０１４７】
一代替法では、抗体は組換え的に作製し、当技術分野で公知のあらゆる方法を使って発現してよい。別の代替法では、ファージディスプレイ法により組換え的に作製してよい。例えば、米国特許第５５６５３３２号；第５５８０７１７号；および第６２６５１５０号；ならびにＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５（１９９４）を参照されたい。代わりに、ファージディスプレイ法（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０））を使って、非免疫供与者由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト抗体および抗体フラグメントを作製することができる。この技術に従って、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３またはｆｄなどの糸状バクテリオファージのメジャーまたはマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームクローン化され、ファージ粒子の表面に機能抗体フラグメントとして提示される。前記糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有しているので、抗体の機能特性に基づく選別により、それらの特性を示している抗体をコードする遺伝子も選別される。したがって、前記ファージは、Ｂ細胞の特性の一部を再現する。ファージディスプレイは種々の型式で実現することができ、概説は、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために使うことができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫化したマウスの脾臓由来のＶ遺伝子の小ランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様なアレーを単離した。非免疫ヒト供与者由来のＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、抗原（自己抗原を含む）の多様なアレーに対する抗体は、基本的に、Ｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）により記載された技術に従って、単離することができる。自然免疫応答では、抗体遺伝子は変異体を高率に蓄積している（体細胞突然変異）。導入された変化の一部はより高い親和性を与えることになり、高親和性表面免疫グロブリンを提示しているＢ細胞は、その後に続く抗原攻撃中に好ましく複製され、分化される。この自然の過程は、「チェインシャフリング」として知られる技術を用いて再現することができる（Ｍａｒｋｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９−７８３（１９９２））。この方法では、ファージディスプレイによって得られる「一次」ヒト抗体の親和性は、経時的に、重および軽鎖Ｖ領域遺伝子を、非免疫供与者から得られたＶドメイン遺伝子の天然に存在する変異体（レパートリー）のレパートリーで置き換えることにより改善することができる。この技術により、ｐＭ〜ｎＭ範囲で親和性のある抗体および抗体フラグメントの作製が可能になる��非常に大きなファージ抗体レパートリー（「全ライブラリーの母」としても知られる）を作製するための戦略は、Ｗａｔｈｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３）により記載されている。遺伝子シャフリングも使って、ヒト抗体が開始げっ歯類抗体に対して類似の親和性および特異性を有するげっ歯類抗体からヒト抗体を引き出すことができる。「エピトープ刷り込み」とも呼ばれるこの方法に従って、ファージディスプレイ法により得られるげっ歯類抗体の重または軽鎖Ｖドメイン遺伝子は、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置き換えられ、げっ歯類ヒトキメラが作製される。抗原に基づく選別により、機能的抗原結合部位を修復することができる、すなわち、前記エピトープが相手の選択を支配している（刷り込んでいる）ヒト可変領域が単離される。前記過程が残存するげっ歯類Ｖドメインを置き換えるために繰り返される場合、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開されたＰＣＴ公開国際公開第９３／０６２１３号を参照されたい）。ＣＤＲグラフティングによるげっ歯類抗体の従来のヒト化と違って、この技術は、げっ歯類起源のフレームワークまたはＣＤＲ残基がない完全なヒト抗体を提供する。
【０１４８】
上記の議論はヒト化抗体に関係するが、議論されている一般原則は、例えば、イヌ、ネコ、霊長類、ウマ、およびウシでの使用のために抗体をカスタマイズするのに適用可能であることは明白である。本明細書に記載の抗体のヒト化の１つまたは複数の態様は組み合わせてよいことはさらに明白である、例えば、ＣＤＲグラフト、フレームワーク突然変異およびＣＤＲ突然変異。
【０１４９】
抗体は、まず、宿主動物から抗体および抗体産生細胞を単離し、遺伝子配列を入手し、前記遺伝子配列を使って宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）において前記抗体を組換え的に発現させることによって、組換え的に作製してよい。用いる可能性のある別の方法は、前記抗体配列を植物（例えば、タバコ）において、またはトランスジェニックミルクにおいて発現することである。植物またはミルクにおいて抗体を組換え的に発現するための方法は、すでに開示されている。例えば、Ｐｅｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：２７５６（２００１）；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ  Ｄ．Ｈｕｓｚａｒ  Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：６５（１９９５）；およびＰｏｌｌｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１４７（１９９９）を参照されたい。抗体の誘導体、例えば、ヒト化、単鎖、等を作製するための方法は、当技術分野では公知である。
【０１５０】
イムノアッセイおよび、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリーソーティング技術も、ＣＧＲＰに特異的である抗体を単離するために用いることができる。
【０１５１】
抗体を、多数の異なる担体に結合させることができる。担体は、活性および／または不活性であることができる。十分に周知の担体の例は、ポリプロプレン、ポリスチレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、ガラス、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースならびに磁鉄鉱を含む。担体の性質は、発明の目的のために可溶性または不溶性のいずれであることもできる。当業者は、抗体を結合させる他の適切な担体を承知しているか、または慣用の実験を使用してそれを確定することができるであろう。いくつかの実施形態において担体は、心筋を標的にする部分を含む。
【０１５２】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、通常の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離および配列分析される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。ＤＮＡは一度単離されると、発現ベクター（ＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０４４６２において開示の発現ベクターなど）内に配置されることができ、次いで組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を行うために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他の免疫ブロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞中にトランスフェクトされる。例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０４４６２を参照。例えばヒト重鎖および軽鎖定常ドメインをコードする配列を相同するネズミ配列の位置に置換することによって、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１（１９８４）、または非免疫グロブリンペプチドをコードする配列のすべてもしくは一部を免疫グロブリンをコードする配列に共有結合的に連結することによって、ＤＮＡを改変することもできる。このように、本明細書の抗ＣＧＲＰモノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体を調製する。
【０１５３】
抗ＣＧＲＰアゴニスト抗体および抗体由来のポリペプチドを、当業者に既知の方法を使用して同定および特性を明らかにすることができ、それによりＣＧＲＰの生物学的活性の低減、改善もしくは中和が検出および／または測定される。例えば抗ＣＧＲＰアゴニスト抗体は、候補物質をＣＧＲＰとインキュベートしかつ、以下の特性、（ａ）ＣＧＲＰへの結合、（ｂ）ＣＧＲＰのその受容体への結合からの遮断、（ｃ）ＣＧＲＰ受容体の活性化（ｃＡＭＰの活性化を含む）の遮断または減少、（ｄ）ＣＧＲＰの生物学的活性またはＣＧＲＰシグナリング機能によって調節される下流経路の阻害、（ｅ）任意の態様の頭痛（例えば片頭痛）の予防、改善または治療、（ｆ）ＣＧＲＰのクリアランスの増大、および（ｇ）ＣＧＲＰ合成、産生または放出の阻害（低減）、の１つまたは複数をモニターすることによって同定できる。いくつかの実施形態において抗ＣＧＲＰアゴニスト抗体またはポリペプチドは、候補物質をＣＧＲＰとインキュベートしかつ、結合および／またはそれに伴うＣＧＲＰの生物学的活性の低減もしくは中和をモニターすることによって同定できる。結合アッセイは、精製されたＣＧＲＰポリペプチド、または細胞が天然に発現しているもしくはトランスフェクトにより発現しているＣＧＲＰポリペプチドで実施することができる。一実施形態において結合アッセイは、競合結合アッセイであり、ＣＧＲＰへの結合について既知の抗ＣＧＲＰアゴニストと競合する候補抗体の能力が評価される。アッセイは、ＥＬＩＳＡ形式を含む様々な形式において実施される。他の実施形態において抗ＣＧＲＰアゴニスト抗体は、候補物質をＣＧＲＰとインキュベートし、かつ結合およびそれに伴う、細胞表面で発現しているＣＧＲＰ受容体の活性化の阻害をモニターすることによって同定される。
【０１５４】
最初の同定の後、標的生物活性を試験するのに知られているバイオアッセイによって候補抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の活性をさらに確認し洗練することができる。あるいは、バイオアッセイを使用して、候補を直接スクリーニングすることができる。例えば、ＣＧＲＰは、反応性細胞においていくつかの測定可能な変化を促進する。これには、それだけに限らないが、細胞（例えば、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞）中でのｃＡＭＰの刺激がある。アンタゴニスト活性はまた、ラット伏在神経の刺激により誘導される皮膚血管拡張の測定など、動物モデルを使用して測定することもできる。Ｅｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１０：７７２−７７６，１９９３。アンタゴニスト抗体またはポリペプチドの有効性の試験に頭痛（片頭痛など）の動物モデルをさらに使用することもできる。Ｒｅｕｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１５）Ｓｕｐｐｌ．３，２０００。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体またはポリペプチドを同定し特徴付けるいくつかの方法が、実施例中に詳細に記載されている。
【０１５５】
当技術分野で周知の方法を使用して、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を特徴付けることができる。例えば、１つの方法は、それが結合するエピトープを同定する方法、または「エピトープマッピング」である。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９の第１１章に記載されている抗体−抗原複合体の結晶構造の解明、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドに基づくアッセイを含めて、タンパク質上のエピトープの位置のマッピングおよび特徴付けについて当技術分野で知られている多数の方法がある。さらなる例では、エピトープマッピングを使用して、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープマッピングは、様々な供給元、例えばＰｅｐｓｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ  １５，８２１９  ＰＨ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から市販されている。エピトープは、直鎖エピトープ、すなわち単一の一続きのアミノ酸中に含有されるエピトープでもよく、または単一の一続きの中に必ずしも含有されていないかもしれないアミノ酸の三次元的相互作用によって形成された高次構造エピトープでもよい。様々な長さ（例えば、少なくとも４〜６アミノ酸の長さ）のペプチドを単離しまたは（例えば組換えにより）合成し、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体との結合アッセイにそれを使用することができる。他の例では、ＣＧＲＰ配列に由来する重複ペプチドを使用し、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体による結合を決定することにより、体系的なスクリーニングで抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体が結合するエピトープを決定することができる。遺伝子断片発現アッセイによれば、ＣＧＲＰをコードするオープンリーディングフレームをランダムにまたは特定の遺伝子構成により断片化し、ＣＧＲＰの発現断片と試験する抗体との反応性を決定する。遺伝子断片は、例えば、ＰＣＲにより作製し、次いでそれを放射性アミノ酸の存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写しタンパク質へと翻訳することができる。次いで、抗体と放射標識ＣＧＲＰ断片の結合を免疫沈降法およびゲル電気泳動によって決定する。ファージ粒子の表面上に提示されるランダムペプチド配列の大型ライブラリー（ファージライブラリー）を使用することによって、特定のエピトープを同定することもできる。あるいは、単純な結合アッセイで、試験抗体との結合について重複ペプチド断片の確定したライブラリーを試験することもできる。さらなる例では、抗原結合ドメインの突然変異生成、ドメイン交換実験およびアラニンスキャニング突然変異生成を行って、エピトープ結合に必須、十分、および／または必要な残基を同定することができる。例えば、ＣＧＲＰポリペプチドの様々な断片が、密接に関係するが抗原としては別個のタンパク質（ニューロトロフィンタンパク質ファミリーの他の構成要素など）由来の配列と置換（交換）されている突然変異ＣＧＲＰを使用して、ドメイン交換実験を行うことができる。抗体と突然変異ＣＧＲＰの結合を評価することによって、抗体結合に対する特定のＣＧＲＰ断片の重要性を評価することができる。
【０１５６】
抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の特徴付けに使用することができるさらなる他の方法は、同じ抗原、すなわちＣＧＲＰ上の様々な断片と結合することが知られている他の抗体との競合アッセイを使用して、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体が他の抗体と同じエピトープと結合するかどうかを決定することである。競合アッセイは当業者に周知である。
【０１５７】
発現ベクターを使用して、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の発現を誘導することができる。当業者は、発現ベクターを投与してｉｎ  ｖｉｖｏで外因性タンパク質の発現を得ることに精通している。例えば、米国特許第６４３６９０８号；第６４１３９４２号；および第６３７６４７１号を参照されたい。発現ベクターの投与には、注射、経口投与、遺伝子銃またはカテーテル投与、および局所的投与を含めた局所または全身投与がある。他の実施形態では、交感神経幹もしくは節に、または冠動脈、心房、心室、もしくは心膜中に発現ベクターを直接投与する。
【０１５８】
発現ベクター、またはサブゲノムポリヌクレオチドを含有する治療用組成物の標的送達を使用することもできる。受容体媒介ＤＮＡ送達技術は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３）１１：２０２；Ｃｈｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ，ｅｄ．）（１９９４）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：６２１；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：５４２；Ｚｅｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：３６５５；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６：３３８に記載されている。ポリヌクレオチドを含有する治療用組成物は、遺伝子治療のプロトコールでは、局所投与でＤＮＡ約１００ｎｇ〜約２００ｍｇを投与する。ＤＮＡ約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００ｍｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇの濃度範囲を遺伝子治療のプロトコールの間で使用することもできる。遺伝子送達媒体を使用して、治療用ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを送達することができる。遺伝子送達媒体は、ウイルス由来でもよく、または非ウイルス由来でもよい（一般には、Ｊｏｌｌｙ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１；Ｋｉｍｕｒａ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：８４５；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９５）１：１８５；およびＫａｐｌｉｔｔ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４）６：１４８を参照されたい）。内因性哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを使用して、そのようなコード配列の発現を誘導することができる。コード配列の発現は、構成的でもよく、または制御されていてもよい。
【０１５９】
所望のポリヌクレオチドを送達し所望の細胞中で発現させるための、ウイルスに基づくベクターは当技術分野で周知である。ウイルスに基づく例示的な媒体には、それだけに限らないが、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；ＷＯ９３／１１２３０；ＷＯ９３／１０２１８；ＷＯ９１／０２８０５；米国特許第５２１９７４０号および第４７７７１２７号；英国特許第２２００６５１号；ならびに欧州特許第０３４５２４２号を参照されたい）、アルファウイルスに基づくベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ  １２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５を参照されたい）がある。Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７に記載されている、死滅アデノウイルスと結合したＤＮＡの投与を使用することもできる。
【０１６０】
それだけに限らないが、単独の死滅アデノウイルスと結合したまたは結合していないポリカチオン性濃縮ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７を参照されたい）；リガンド結合ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：１６９８５を参照されたい）；真核細胞送達媒体細胞（例えば、米国特許第５８１４４８２号；ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０７９９４；ＷＯ９６／１７０７２；ＷＯ９５／３０７６３；およびＷＯ９７／４２３３８を参照されたい）および核電荷中和（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｃｈａｒｇｅ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）または細胞膜との融合を含めた非ウイルス性の送達媒体および方法を使用することもできる。裸のＤＮＡを使用することもできる。裸のＤＮＡの例示的な導入方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５５８０８５９号に記載されている。遺伝子送達媒体として働くことができるリポソームは、米国特許第５４２２１２０号；ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１３７９６；ＷＯ９４／２３６９７；ＷＯ９１／１４４４５；およびＥＰ０５２４９６８に記載されている。さらなる手法は、Ｐｈｉｌｉｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９４）１４：２４１１、およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９４）９１：１５８１に記載されている。
【０１６１】
Ｃ．抗体Ｇ１ならびに関連抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
本発明は、表６に示された抗体Ｇ１およびその変異体または表６に示された抗体Ｇ１に由来するポリペプチドおよびその変異体；およびＧ１およびその変異体または該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む医薬組成物などの組成物を包含する。本明細書に用いられる組成物は、ＣＧＲＰに結合する１種以上の抗体またはポリペプチド（抗体であってもなくてもよい）、および／またはＣＧＲＰに結合する１種以上の抗体またはポリペプチドをコードする配列を含む１種以上のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、当業界に知られている緩衝剤など、薬学的に許容できる賦形剤などの好適な賦形剤をさらに含むことができる。
【０１６２】
本発明の抗−ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体およびポリペプチドは、任意（１つ以上）の以下の特性：（ａ）ＣＧＲＰに結合する；（ｂ）ＣＧＲＰの受容体へのＣＧＲＰの結合を遮断する；（ｃ）ＣＧＲＰ受容体活性化（ｃＡＭＰ活性化など）を遮断するか、または減少させる；（ｄ）ＣＧＲＰシグナル伝達機能により媒介されるＣＧＲＰ生物活性または下流経路を阻止する；（ｅ）頭痛の何らかの態様（例えば、片頭痛）を予防、寛解または治療する；（ｆ）ＣＧＲＰのクリアランスを増加させる；および（ｇ）ＣＧＲのＰ合成、産生または放出を阻止する（減少させる）ことのいずれか（１つ以上）を特徴とする。
【０１６３】
したがって、本発明は、以下のもののいずれか、または以下のもののいずれかを含む組成物（医薬組成物など）：（ａ）表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体；（ｂ）表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体の断片または領域；（ｃ）表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体の軽鎖；（ｄ）表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体の重鎖；（ｅ）表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体の軽鎖および／または重鎖からの１つ以上の可変領域；（ｆ）表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体の１つ以上のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲ）；（ｇ）抗体Ｇ１の重鎖からのＣＤＲ  Ｈ３；（ｈ）表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体の軽鎖からのＣＤＲ  Ｈ３；（ｉ）表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体の軽鎖からの３つのＣＤＲ；（ｊ）表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体の重鎖からの３つのＣＤＲ；（ｋ）表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体の軽鎖からの３つのＣＤＲならびに重鎖からの３つのＣＤＲ；および（ｌ）（ｂ）から（ｋ）のいずれか１つを含む抗体、を提供する。本発明はまた、上記のいずれか１つ以上を含むポリペプチド類を提供する。
【０１６４】
抗体Ｇ１のＣＤＲ部分（ＣｈｏｔｈｉａおよびＫａｂａｔ  ＣＤＲなど）は、図５にダイヤグラムで描写されている。ＣＤＲ領域の決定は、十分に当業界の技術範囲内にある。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲとの組合せ（「組合せＣＤＲ」または「拡張ＣＤＲ」とも呼ばれる）であり得ることが解される。いくつかの実施形態において、ＣＤＲはＫａｂａｔ  ＣＤＲである。他の実施形態において、ＣＤＲはＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲである。言い換えれば、２つ以上のＣＤＲによる実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ、組合せＣＤＲ、またはそれらの組合せのいずれかであり得る。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、本発明は、表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは６つすべてのＣＤＲと実質的に同一である、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは６つすべてのＣＤＲを含むポリペプチド（抗体であってもなくてもよい）を提供する。他の実施形態としては、Ｇ１またはＧ１に由来する少なくとも２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲと実質的に同一である、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲを有する抗体が挙げられる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲは、表６に示されたＧ１またはその変異体の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲに対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。本発明の目的に関して、結合特異性および／または全体的活性は一般に保持されるが、活性の程度は、表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体と比較して変わり得る（より大きいこともより小さいこともあり得る）ことが解される。
【０１６６】
本発明はまた、以下のもの：少なくとも３つのアミノ酸が表６に示された抗体Ｇ１（図５）またはその変異体の可変領域に由来する、表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体の少なくとも約５つの連続アミノ酸、少なくとも約８つの連続アミノ酸、少なくとも約１０の連続アミノ酸、少なくとも約１５の連続アミノ酸、少なくとも約２０の連続アミノ酸、少なくとも約２５の連続アミノ酸、少なくとも約３０の連続アミノ酸のいずれかを有する、表６に示されたＧ１またはその変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチド（抗体であってもなくてもよい）を提供する。一実施形態において、可変領域はＧ１の軽鎖に由来する。別の実施形態において、可変領域はＧ１の重鎖に由来する。代表的なポリペプチドは、Ｇ１の重鎖および軽鎖双方の可変領域からの連続アミノ酸（上記の長さ）を有する。別の実施形態において、５つ（またはそれ以上）の連続アミノ酸は、図５に示されたＧ１の相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する。いくつかの実施形態において、連続アミノ酸は、Ｇ１の可変領域に由来する。
【０１６７】
ＣＧＲＰ（ヒトα−ＣＧＲＰなど）への抗−ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体およびポリペプチドの結合親和性（ＫＤ）は、約０．０６から約２００ｎＭであり得る。いくつかの実施形態において、該結合親和性は、約２００ｎＭ、１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、または約２ｐＭのいずれかである。いくつかの実施形態において、該結合親和性は、約２５０ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約５００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、または約５０ｐＭ未満のいずれかである。
【０１６８】
本発明はまた、これら抗体またはポリペプチドのいずれかを製造する方法を提供する。本発明の抗体は、当業界に知られている手法により製造できる。ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解または他の分解により、上記の通り組換え法（すなわち、単一または融合ポリペプチド）により、または化学的合成により製造できる。抗体のポリペプチド、特に約５０までのアミノ酸の短いポリペプチドは、化学的合成によって都合よく製造される。化学的合成法は当業界に知られており、市販されている。例えば、抗体は、固相法を使用する自動ポリペプチドシンセサイザーにより製造できるであろう。また、米国特許第５８０７７１５号；米国特許第４８１６５６７号；および米国特許第６３３１４１５号を参照されたい。
【０１６９】
別の代替法において、抗体は、当業界に十分に知られている手法を用いて組換え的に製造できる。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号９および配列番号１０に示された、抗体Ｇ１の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする配列を含む。別の実施形態において、配列番号９および配列番号１０に示されたヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、発現または増殖のために、１種以上のベクターにクローン化される。対象となっている抗体をコードする配列は、宿主細胞においてベクター内に保持することができ、次に宿主細胞を増殖させ、将来の使用のために凍結できる。ベクター（発現ベクターなど）および宿主細胞は、本明細書でさらに記載される。
【０１７０】
本発明はまた、Ｇ１などの本発明の抗体の一本鎖可変領域断片（「ｓｃＦｖ」）を包含する。一本鎖可変領域断片は、短い結合ペプチドを用いることにより、軽鎖および／または重鎖可変領域を結合させることによって作製される。Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６。結合ペプチドの一例は、一可変領域のカルボキシ末端と他の可変領域のアミノ末端との間の凡そ３．５ｎｍを架橋する（ＧＧＧＧＳ）３である。他の配列のリンカーも設計され、使用されている。Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）。次にリンカーを、薬物の結合または固体支持体への結合など、さらなる機能のために修飾できる。一本鎖変異体は、組換え的または合成的に製造できる。ｓｃＦｖの合成的製造に関して、自動化シンセサイザーを使用できる。ｓｃＦｖの組換え的製造に関して、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドを、好適な宿主細胞、酵母、植物、昆虫または哺乳動物などの真核細胞、もしくは大腸菌などの原核細胞に導入できる。対象のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの連結などのルーチン的操作により製造できる。生じたｓｃＦｖを、当業界に知られた標準的なタンパク質精製技法を用いて単離できる。
【０１７１】
ジア体などの一本鎖抗体の他の形態もまた包含される。ジア体は、ＶＨおよびＶＬドメインが一本鎖ポリペプチド上に発現されるが、同一鎖上の２つのドメイン間を対合させるには短すぎるリンカーを用いることによって、それらのドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を作出する二価の二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照）。
【０１７２】
例えば、少なくとも２種の異なる抗原に対して結合特異性を有する二重特異性抗体であるモノクローナル抗体を、本明細書に開示された抗体を用いて調製できる。二重特異性抗体を製造する方法は当業界に知られている（例えば、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０を参照）。伝統的に、二重特異性抗体の組換え的製造は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対と、異なる特異性を有する２つの重鎖との共発現に基づいていた（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５，５３７−５３９）。
【０１７３】
二重特異性抗体を製造するための１つのアプローチによれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。少なくともヒンジ部分であるＣＨ２およびＣＨ３領域を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合が好ましい。少なくとも１つの融合に存在する軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合、ならびに所望ならば、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、別個の発現ベクターに挿入し、好適な宿主生物に同時にトランスフェクトする。これにより、構築物に用いられる３本のポリペプチド鎖の不等な比率が最適収率を提供する場合、実施形態における３つのポリペプチド断片相互の割合の調整に大いに柔軟性が提供される。しかしながら、等しい比率での少なくとも２本のポリペプチド鎖の発現により高収率がもたらされるか、またはその比率に特に意味がない場合、１つの発現ベクターにおいて２本または３本すべてのポリペプチド鎖をコードする配列を挿入することは可能である。
【０１７４】
一アプローチにおいて、二重特異性抗体は、１つのアームに第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他のアームにおいてハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）から構成される。二重特異性分子の半分だけに免疫グロブリン軽鎖を有するこの非対称構造によって、望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せから所望の二重特異性化合物の分離を容易にする。このアプローチは、１９９４年３月３日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ第９４／０４６９０号に記載されている。
【０１７５】
２つの共有結合抗体を含むヘテロ共役抗体もまた本発明の範囲内に入る。このような抗体は、免疫系細胞を望ましくない細胞に標的化するため（米国特許第４６７６９８０号）、ＨＩＶ感染症の治療のために（ＰＣＴ出願公開ＷＯ第９１／００３６０号およびＷＯ第９２／２００３７３号；ＥＰ第０３０８９号）使用されている。ヘテロ共役抗体は、任意の好適な架橋法を用いて製造できる。好適な架橋試薬および技法は、当業界によく知られており、米国特許第４６７６９８０号に記載されている。
【０１７６】
キメラまたはハイブリッド抗体もまた、架橋剤を含むものなど合成タンパク質化学の既知の方法を用いてインビトロで調製できる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いるか、またはチオエーテル結合を形成することによって構築できる。この目的のために好適な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
【０１７７】
表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体の１つ以上のＣＤＲ、または表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体に由来する１つ以上のＣＤＲを含むヒト化抗体を、当業界に知られた任意の方法を用いて製造できる。モノクローナル抗体をヒト化するために、例えば、４つの一般的なステップが使用できる。
【０１７８】
本発明は、増加または減少した活性および／または親和性を有する、抗体の性質に有意に影響を及ぼさない機能的に等しい抗体および変異体など、表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体に対する修飾を包含する。例えば、ＣＧＲＰに対する所望の結合親和性を有する抗体を得るために、表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体のアミノ酸配列を変異させることができる。ポリペプチドの修飾は当業界におけるルーチン的な実践であり、本明細書において詳細に説明する必要はない。ポリペプチドの修飾は実施例に例示されている。修飾ポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換、機能的活性を有意に有害的に変化させないアミノ酸の１つ以上の削除もしくは付加を有するポリペプチド、または化学的類縁体の使用が挙げられる。
【０１７９】
アミノ酸配列の挿入としては、１つの残基から１００以上の残基を含有するポリペプチド長の範囲であるアミノ−および／またはカルボキシル−末端融合、ならびに単一または複数アミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ−末端メチオニル残基を有する抗体、またはエピトープタグに融合された抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変型としては、抗体の血清中半減期を増加させる酵素の抗体またはポリペプチドのＮ−またはＣ−末端への融合が挙げられる。
【０１８０】
置換変異体は、抗体分子における少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されてその位置に挿入された異なる残基を有する。置換変異誘発に関してもっとも大きな関心対象部位としては、高頻度可変領域が挙げられるが、ＦＲ変化もまた考慮されている。保存的置換は、「保存的置換」の見出しで表１に示されている。このような置換によって、生物活性に変化がもたらされる場合、表１の「代表的な置換」と称されるかまたはさらにアミノ酸クラスに関して下記に記載されるような、より実質的な変化を導入でき、生成物をスクリーンできる。
【０１８１】
【表１】
2009515942.tif 000003
【０１８２】
抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、（ａ）例えば、シートまたはらせん状コンフォメーションとしての置換領域のポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位での分子の変化または疎水性、または（ｃ）側鎖の大きさ、の維持に対する効果が有意に異なる置換基を選択することによって達成される。天然残基は、共通の側鎖の性質：
（１）非極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）電荷なしの極性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性（負電荷）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性（正電荷）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向性に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ
に基づいた群に分けられる。
【０１８３】
非保存的置換は、これらのクラスの１メンバーを別のクラスに交換することによって成される。
【０１８４】
抗体の適切なコンフォメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基もまた、一般的にセリンにより置換されて、分子の酸化的安定性を改善でき、異常な架橋を防止することができる。逆に、特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合、システイン結合を抗体に付加してその安定性を改善できる。
【０１８５】
アミノ酸修飾は、１つ以上のアミノ酸の変化、または修飾から、可変領域などの領域の完全な再設計までの範囲であり得る。可変領域の変化により、結合親和性および／または特異性を変更できる。いくつかの実施形態において、１つから５つまでの保存的アミノ酸置換が、ＣＤＲドメイン内で成される。他の実施形態において、１つから３つまでの保存的アミノ酸置換が、ＣＤＲドメイン内で成される。さらに他の実施形態において、ＣＤＲドメインは、ＣＤＲ  Ｈ３および／またはＣＤＲ  Ｌ３である。
【０１８６】
修飾としてはまた、グリコシル化および非グリコシル化ポリペプチド、ならびに、例えば、種々の糖類によるグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化など、他の翻訳後修飾されたポリペプチドが挙げられる。抗体は、それらの定常領域内の保存位置でグリコシル化される（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｕｎｄ，１９９７，Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：１１１−１２８；Ｗｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９７，ＴｉｂＴＥＣＨ  １５：２６−３２）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能に影響を与え（Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１−１３１８；Ｗｉｔｔｗｅ  ａｎｄ  Ｈｏｗａｒｄ，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：４１７５−４１８０）、また糖タンパク質のコンフォメーションおよび提供された三次元表面に影響を及ぼし得る糖タンパク質の部分間での分子内相互作用に影響を与える（Ｈｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｕｎｄ、上記文献；Ｗｙｓｓ  ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ，１９９６，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４０９−４１６）。オリゴ糖類はまた、特異的認識構造に基づく一定の分子に対して所与の糖タンパク質を標的化するために役立ち得る。抗体のグリコシル化は、抗体依存細胞の細胞毒性（ＡＤＣＣ）に影響を与えることも報告されている。特に、二分割性ＧｌｃＮＡｃ形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）のテトラサイクリン制御発現を有するＣＨＯ細胞は、改善されたＡＤＣＣ活性を有することが報告されている（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｍａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０）。
【０１８７】
抗体のグリコシル化は、典型的にはＭ−結合またはＯ−結合である。Ｎ−結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合のことである。Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であるトリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−トレオニン、およびアスパラギン−Ｘ−システインは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合に関する認識配列である。したがって、ポリペプチドにこれらトリペプチド配列のいずれかが存在することにより、グリコシル化の可能な部位が作出される。Ｏ−結合グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、もっとも一般的にはセリンまたはトレオニンへの糖類のＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１つの結合のことであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンもまた使用できる。
【０１８８】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、１つ以上の上記トリペプチド配列（Ｎ−結合グリコシル化部位に関する）を含有するようにアミノ酸配列を変化させることによって都合よく達成される。この変化は、元の抗体の配列（Ｏ−結合グリコシル化部位に関する）に対して１つ以上のセリンまたはトレオニン残基の付加、またはそれらによる置換によっても成すことができる。
【０１８９】
抗体のグリコシル化パターンは、基礎配列を変化させずに変化させることもできる。グリコシル化は、抗体を発現するために使用される宿主細胞に大いに依存する。治療剤として可能性のある組換え糖タンパク質、例えば抗体の発現に使用される細胞型は、自生の細胞であることは稀であるため、抗体のグリコシル化パターンの変異体が期待できる（例えば、Ｈｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：９０６２−９０７０を参照）。
【０１９０】
宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え時のグリコシル化に影響を及ぼす因子としては、増殖様式、培地配合、培養物密度、酸化、ｐＨ、精製スキームなどが挙げられる。オリゴ糖製造に関与する一定の酵素の導入または過剰発現など、特定の宿主生物において達成されるグリコシル化パターンを変化させるために、種々の方法が提案されている（米国特許第５０４７３３５号；米国特許第５５１０２６１号および米国特許第５２７８２９９号）。グリコシル化、または一定のタイプのグリコシル化は、例えば、エンドグリコシダーゼＨ（エンドＨ）、Ｎ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３を用いて糖タンパク質から酵素的に除去できる。さらに、組換え宿主細胞が、一定のタイプの多糖類の処理を欠くように遺伝子的に操作できる。これらおよび同様の技法は、当業界によく知られている。
【０１９１】
他の修飾方法としては、限定はしないが、酵素的手段、酸化的置換およびキレート化など、当業界に知られたカップリング技法の使用が挙げられる。修飾は、例えば、免疫アッセイに関する標識結合のために使用することができる。修飾Ｇ１ポリペプチドは、当業界で確立された手法を用いて作製され、当業界に知られた標準的なアッセイを用いてスクリーンすることができ、それらのいくつかは下記および実施例に記載されている。
【０１９２】
本発明のいくつかの実施形態において、以下の１つ以上：補体媒介溶解を作動させること、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）を刺激すること、またはミクログリアを活性化することにおいて、免疫学的に不活性か、または部分的に不活性である、例えば、補体媒介溶解を作動しないか、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）を刺激しないか、もしくはミクログリアを活性化しないか；または活性低下がある（非修飾抗体と比較して）定常領域などの修飾された定常領域を、抗体は含む。この定常領域における種々の修飾は、エフェクター機能の最適レベルおよび／または組合せを達成するために使用できる。例えば、Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８６：３１９−３２４（１９９５）；Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５７：４９６３−９  １５７：４９６３−４９６９（１９９６）；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６４：４１７８−４１８４（２０００）；Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４３：２５９５−２６０１（１９８９）；およびＪｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６３：５９−７６（１９９８）を参照されたい。いくつかの実施形態において、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１号；および／または英国特許出願第９８０９９５１．８号に記載されている通りに修飾される。他の実施形態において、抗体は、以下の変異：Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（野生型ＩｇＧ２配列を参照とするアミノ酸の番号付け）を含むヒト重鎖ＩｇＧ２定常領域を含む。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４。さらに他の実施形態において、定常領域は、Ｎ−結合グリコシル化に対してグリコシル化されない。いくつかの実施形態において、定常領域においてグリコシル化アミノ酸残基またはＮ−グリコシル化認識配列の一部であるフランキング残基を変異することにより、定常領域は、Ｎ−結合グリコシル化に対してグリコシル化されない。例えば、Ｎ−グリコシル化部位Ｎ２９７は、Ａ、Ｑ、Ｋ、またはＨに変異できる。Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４３：２５９５−２６０１（１９８９）；およびＪｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６３：５９−７６（１９９８）を参照されたい。いくつかの実施形態において、定常領域は、Ｎ−結合グリコシル化に対してグリコシル化されない。定常領域は、酵素的に（酵素ＰＮＧアーゼにより炭水化物を除去するなど）、またはグリコシル化欠損宿主細胞における発現によってＮ−結合グリコシル化に対してグリコシル化できない。
【０１９３】
他の抗体修飾としては、１９９９年１１月１８日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ第９９／５８５７２号に記載されている通りに修飾された抗体が挙げられる。これらの抗体は、標的分子に特異的な結合ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常ドメインのすべてまたは一部に実質的に相同性であるアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、重要な補体依存性溶解、または標的の細胞媒介破壊を作動させることなく標的分子を結合できる。いくつかの実施形態において、エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂを特異的に結合できる。これらは典型的に、ヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインの２つ以上に由来するキメラドメインに基づいている。この様式で修飾された抗体は、炎症反応および従来の抗体療法に対する他の副作用を避けるために、慢性抗体療法の使用に特に好適である。
【０１９４】
本発明は、親和性成熟実施形態を包含する。例えば、親和性成熟抗体は、当業界に知られた手法により製造できる（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３；Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ，１６９：１４７−１５５；Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４；Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４（７）：３３１０−９；Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９−８９６；およびＷＯ２００４／０５８１８４）。
【０１９５】
以下の方法は、抗体の親和性を調整し、ＣＤＲを特性化するために使用できる。抗体のＣＤＲを特性化し、および／または抗体などのポリペプチドの結合親和性を変化させる（改善するなど）一方法は、「ライブラリースキャンニング変異誘発」と呼ばれる。一般に、ライブラリースキャンニング変異誘発は以下の通り操作される。ＣＤＲの１つ以上のアミノ酸位置が、当業界で認められている方法を用いて２つ以上（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０など）のアミノ酸により置換される。これにより、各々が２つ以上のメンバーの複雑性を有する（２つ以上のアミノ酸がどの位置でも置換される場合）クローン（いくつかの実施形態において、分析される各アミノ酸位置に対して１つ）の小さなライブラリーが作出される。一般に、ライブラリーはまた、自生の（非置換）アミノ酸を含むクローンを包含する。各ライブラリーから少数のクローン、例えば、約２０〜８０のクローン（ライブラリーの複雑性に依る）が、標的ポリペプチド（または他の結合標的）に対する結合親和性に関してスクリーンされ、増加した、同一の、減少した結合を有するか、または結合のない候補物が同定される。結合親和性を判定する方法は、当業界によく知られている。結合親和性は、約２倍以上の結合親和性の相違を検出するＢｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴分析を用いて測定できる。Ｂｉａｃｏｒｅは、出発抗体が既に、比較的高い親和性、例えば、約１０ｎＭ以下のＫＤで結合する場合に特に有用である。Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴を用いるスクリーニングは、本明細書の実施例に記載されている。
【０１９６】
結合親和性は、Ｋｉｎｅｘａ  Ｂｉｏｃｅｎｓｏｒ、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ免疫アッセイ（ＩＧＥＮ）、蛍光消光、および／または酵母ディスプレイを用いて測定できる。結合親和性はまた、好適なバイオアッセイを用いてスクリーンできる。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、当業界で認められた変異誘発法（そのいくつかは本明細書に記載されている）を用いてＣＤＲにおいてどのアミノ酸位置でも２０種すべての天然アミノ酸により置換される（いくつかの実施形態においては、一度に１つずつ）。これにより、各々が２０のメンバーの複雑性を有する（２０種のアミノ酸のすべてがどの位置でも置換される場合）クローン（いくつかの実施形態において、分析される各アミノ酸位置に関するもの）の小さなライブラリーが作出される。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、スクリーンされるライブラリーは、同じＣＤＲか、または２つ以上のＣＤＲ内にあり得る２つ以上の位置での置換を含む。このように、このライブラリーは、１つのＣＤＲにおいて２つ以上の位置での置換を含むことができる。このライブラリーは、２つ以上のＣＤＲにおいて２つ以上の位置での置換を含むことができる。このライブラリーは、３つ、４つ、５つ以上の位置での置換を含み、前記位置は、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲに見ることができる。この置換は、低縮退コドンを用いて調製できる。例えば、表２のＢａｌｉｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｇｅｎｅ  １３７（１）：１０９−１８を参照されたい。
【０１９９】
ＣＤＲは、ＣＤＲＨ３および／またはＣＤＲＬ３であり得る。ＣＤＲは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、および／またはＣＤＲＨ３であり得る。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ、または拡張ＣＤＲであり得る。
【０２００】
改善された結合性を有する候補物を配列決定でき、それによって親和性の改善をもたらすＣＤＲ置換変異体（「改善」置換とも呼ばれる）を同定できる。結合する候補物もまた配列決定でき、それによって結合を保持するＣＤＲ置換を同定できる。
【０２０１】
複数回のスクリーニングを実施することができる。例えば、改善された結合性を有する候補物（各々が、１つ以上のＣＤＲの１つ以上の位置にアミノ酸置換を含む）は、改善されたＣＤＲ位置の各々（すなわち、置換変異体が改善された結合性を示したＣＤＲのアミノ酸位置）に少なくとも元の置換アミノ酸を含有する第２ライブラリーの設計にも有用である。このライブラリーの作成、およびスクリーニングまたは選択は、さらに以下に考察されている。
【０２０２】
ライブラリースキャンニング変異誘発はまた、改善された結合性、同じ結合性、減少した結合性または結合のないクローン頻度が、抗体−抗原複合体の安定性に関する各アミノ酸位置の重要性に関連する情報を提供する限り、ＣＤＲを特性化する手段を提供する。例えば、ＣＤＲの位置が、２０種すべてのアミノ酸に変化した際に結合性を保持するならば、その位置は、抗原結合に必要とされそうもない位置として同定される。逆に、ＣＤＲの位置が、低パーセンテージの置換のみで結合性を保持する場合、その位置は、ＣＤＲ機能に重要な位置として同定される。このように、ライブラリースキャンニング変異誘発法は、多数の異なるアミノ酸（２０種すべてのアミノ酸など）に変えることができるＣＤＲの位置、および変えることができないか、または２，３のアミノ酸のみを変えることができるＣＤＲの位置に関連する情報を生み出す。
【０２０３】
改善された親和性を有する候補物は、望ましいスクリーニングまたは選択法を用いて改善されたアミノ酸、その位置の元のアミノ酸を包含し、所望の、または許容されるライブラリーの複雑性に依って、その位置でのさらなる置換をさらに包含することができる第２のライブラリーに組み合わせることができる。さらに、所望ならば、隣接アミノ酸位置は、少なくとも２つ以上のアミノ酸に無作為化できる。隣接アミノ酸の無作為化は、変異体ＣＤＲにおける、さらなるコンフォメーションの柔軟性を許容でき、次いで多数の変異改善の導入を許容し得るか、または容易にし得る。このライブラリーはまた、第１回のスクリーニングにおいて親和性改善を示さなかった位置での置換を含むことができる。
【０２０４】
第２のライブラリーは、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴分析を用いるスクリーニングなど、当業界に知られた任意の方法、およびファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、およびリボソームディスプレイなど、選択に関して当業界に知られた任意の方法を用いる選択を用いて、改善および／または変化させた結合親和性を有する、ライブラリーメンバーに関してスクリーンされるか、または選択される。
【０２０５】
本発明はまた、本発明の抗体（Ｇ１など）またはポリペプチドからの１つ以上の断片または領域を含む融合タンパク質を包含する。一実施形態において、配列番号２に示された可変軽鎖領域の少なくとも１０の連続アミノ酸（図５）および／または配列番号１に示された可変重鎖領域の少なくとも１０のアミノ酸（図５）を含む融合ポリペプチドが提供される。他の実施形態において、配列番号２に示された可変軽鎖領域の少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、または少なくとも約３０の連続アミノ酸（図５）および／または配列番号２に示された可変重鎖領域の少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、または少なくとも約３０の連続アミノ酸（図５）を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態において、融合ポリペプチドは、図５の配列番号２および配列番号１に示されたＧ１の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む。別の実施形態において、融合ポリペプチドは、Ｇ１の１つ以上のＣＤＲを含む。さらに他の実施形態において、融合ポリペプチドは、抗体Ｇ１のＣＤＲ  Ｈ３および／またはＣＤＲ  Ｌ３を含む。本発明の目的のために、Ｇ１融合タンパク質は、１つ以上のＧ１抗体および自生分子では結合されない別のアミノ酸配列、例えば、別の領域からの非相同的配列または相同的配列を含有する。代表的な非相同的配列としては、限定はしないが、ＦＬＡＧタグまたは６Ｈｉｓタグなどの「タグ」が挙げられる。タグは当業界によく知られている。
【０２０６】
Ｇ１融合ポリペプチドは、当業界に知られた方法、例えば、合成的または組換え的によって作出できる。典型的には、本発明のＧ１融合タンパク質は、本明細書に記載された組換え方法を用い、それらをコードするポリヌクレオチドの発現を調製することによって製造されるが、それらは、当業界に知られた他の手段、例えば、化学合成によっても調製できる。
【０２０７】
本発明はまた、固体支持体（ビオチンまたはアビジンなど）へのカップリングを容易にする試剤に接合された（例えば、結合された）Ｇ１に由来する抗体またはポリペプチド類を含む組成物を提供する。これらの方法が、本明細書に記載された任意のＣＧＲＰ結合実施形態に適用されることを理解した上で、簡単にするため、一般にＧ１または抗体について記述する。接合とは一般に、本明細書に記載されたこれらの成分の結合のことである。結合（少なくとも投与のために、これらの成分を近位のつながりに固定化する）は、任意の多数の方法で達成できる。例えば、試剤と抗体との間の直接反応は、各々が、他方と反応できる置換基を有する場合に可能である。例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基などの求核性基は、一方では、無水物または酸ハロゲン化物などのカルボニル含有基と、また他方では、良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含有するアルキル基と反応できる。
【０２０８】
本発明の抗体またはポリペプチドは、蛍光分子、放射性分子または当業界に知られた他の標識などの標識化試薬（「標識」とも呼ばれる）に結合できる。一般に（直接的または間接的に）シグナルを提供する標識は当業界に知られている。
【０２０９】
本発明はまた、抗体Ｇ１および、本開示により明らかにされた本明細書に記載された任意またはすべての抗体および／またはポリペプチドを含む組成物（医薬組成物）およびキットを提供する。
【０２１０】
本発明はまた、本発明の抗体およびポリペプチド（図５に示された軽鎖および重鎖可変領域のポリペプチド配列を含む抗体など）をコードする単離ポリヌクレオチド、ベクターおよびポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
【０２１１】
したがって、本発明は、以下のいずれか：（ａ）表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体；（ｂ）表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体の断片または領域；（ｃ）表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体の軽鎖；（ｄ）表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体の重鎖；（ｅ）表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体の軽鎖および／または重鎖からの１つ以上の可変領域；（ｆ）表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体の１つ以上のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲ）；（ｇ）抗体Ｇ１の重鎖からのＣＤＲ  Ｈ３；（ｈ）表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体の軽鎖からのＣＤＲ  Ｈ３；（ｉ）表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体の軽鎖からの３つのＣＤＲ；（ｊ）表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体の重鎖からの３つのＣＤＲ；（ｋ）表６に示された抗体Ｇ１またはその変異体の軽鎖からの３つのＣＤＲならびに重鎖からの３つのＣＤＲ；および（ｌ）（ｂ）から（ｋ）のいずれか１つを含む抗体、をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド（または医薬組成物などの組成物）を提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号９および配列番号１０に示されたポリヌクレオチドのいずれかまたは双方を含む。
【０２１２】
別の態様において、本発明は、エフェクター機能の損傷した抗体およびポリペプチドなど、本明細書に記載された抗体（抗体断片を含めて）およびポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、当業界に知られた手法により製造できる。
【０２１３】
別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物（医薬組成物など）を提供する。いくつかの実施形態において、該組成物には、本明細書に記載されたＧ１抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。他の実施形態において、該組成物には、本明細書に記載された抗体またはポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。さらに他の実施形態において、該組成物は、配列番号９および配列番号１０に示されたポリヌクレオチドのいずれかまたは双方を含む。発現ベクター、およびポリヌクレオチド組成物の投与については、さらに本明細書に記載される。
【０２１４】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されたポリヌクレオチドのいずれかを製造する方法を提供する。
【０２１５】
このような配列のいずれかに相補的なポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コード化またはアンチセンス）または二本鎖であり得、ＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成的）またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子としては、イントロンを含有し、１対１の様式でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子が挙げられる。さらなるコード化または非コード化配列が、本発明のポリヌクレオチド内に存在していてもよいが、存在する必要はない。ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持体材料に結合していてもよいが、必要ではない。
【０２１６】
ポリヌクレオチドは、自生の配列（すなわち、抗体またはその一部をコードする内因性配列）を含んでもよいし、このような配列の変異体を含んでもよい。ポリヌクレオチド変異体は、コード化されたポリペプチドの免疫反応性が、自生の免疫反応性分子に比して減少しないように、１つ以上の置換、付加、削除および／または挿入を含有する。コード化されたポリペプチドの免疫反応性に及ぼす効果は、一般に本明細書に記載された通りに評価できる。変異体は、自生抗体またはその一部をコードするポリヌクレオチド配列に対し、好ましくは、少なくとも約７０％の相同性、より好ましくは、少なくとも約８０％の相同性、もっとも好ましくは、少なくとも約９０％の相同性を示す。
【０２１７】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、前記２つの配列のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載する最大一致するように配列させた場合に同じであれば「同一」であると言われる。２個の配列の比較は、典型的には、前記配列を比較窓にわたって比較して、配列が類似している局所領域を同定し比較することにより実現される。本明細書で使用する「比較窓」とは、前記２つの配列を最適に整列させた後に、配列が同数の近接位の対照配列と比較される、少なくとも約２０、通常は３０から約７５、４０から約５０の近接位のセグメントのことである。
【０２１８】
比較のための配列の最適整列化は、デフォルトパラメーターを使うバイオインフォマティクスソフトウェアのレーザージーンスイートでメグアラインプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ社、マディソン、ウィスコンシン州）を使って行ってよい。このプログラムは、以下の参考文献に記載のいくつかの整列化スキームを具体化する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｉｎ  Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（ｅｄ．）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐｌ．３，ｐｐ．３４５−３５８；Ｈｅｉｎ  Ｊ．，１９９０，Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ｐｐ．６２５−６４５  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．ａｎｄ  Ｍｕｌｌｅｒ  Ｗ．，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．，１９７１，Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．１１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．，Ｎｅｓ，Ｍ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｓｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．，１９７３，Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０．
【０２１９】
好ましくは、「配列同一性の割合」は、比較窓内の前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分が、前記２つの配列の最適整列化に対する対照配列（付加または欠失を含まない）と比べて、２０パーセント以下の、通常は５から１５パーセント、または１０から１２パーセントの付加または欠失（すなわち、隙間）を含む、少なくとも２０位の比較窓にわたり２つの最適に整列化した配列を比較することにより決定される。前記割合は、同一核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在し適合位の数を生じる位置の数を決定し、適合位の数を対照配列の全位数（すなわち、窓の大きさ）で割り、その結果を１００倍して配列同一性の割合を出すことにより計算される。
【０２２０】
変異体も、または代わりに、自然の遺伝子、またはその部分もしくは相補体に実質的に相同であってよい。そのようなポリヌクレオチド変異体は、中程度に厳しい条件の下で、自然の抗体をコードする天然に存在するＤＮＡ配列（または相補的配列）にハイブリダイズすることができる。
【０２２１】
適切な「中程度に厳しい条件」は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡの溶液（ｐＨ８．０）での予洗する；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣで一晩ハイブリダイズする；続いて、０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣそれぞれで６５℃２０分間２度洗浄することを含む。
【０２２２】
本明細書で使用するように、「高度に厳しい条件」または「高度な厳密条件」とは、（１）洗浄のために低イオン強度および高温、例えば、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で用いる；（２）ハイブリダイゼーション中は、ホルムアミドなどの変性剤、例えば、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液の５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムのｐＨ６．５、４２℃で用いる；または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０７５Ｍ  クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理したサーモン精液ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸を４２℃で用い、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）４２℃で洗浄および５０％ホルムアミド５５℃で洗浄、続いて、ＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高厳密洗浄を５５℃で用いる条件である。熟練した技術者であれば、プローブ長、等などの要因を調整するに必要な温度、イオン強度、等の調節方法はわかるであろう。
【０２２３】
遺伝コードの縮重の結果として、本明細書に記載のポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することを当業者は認識するであろう。これらのポリヌクレオチドの一部は、あらゆる自然の遺伝子のヌクレオチド配列に最小限の相同性を有する。にもかかわらず、コドン使用頻度の違いのせいで異なるポリヌクレオチドが、本発明で具体的に企図されている。さらに、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換などの１個または複数個の変異体の結果として、改変される内因性遺伝子である。こうして得られるｍＲＮＡおよびタンパク質は、改変された構造または機能を有することがあるが、それはなくてもよい。対立遺伝子は、（ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較などの）標準技術を使って同定してよい。
【０２２４】
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え法、またはＰＣＲを使って得ることができる。化学的ポリヌクレオチド合成の方法は当技術分野では公知であり、本明細書に詳細に記載するまでもない。当業者は、本明細書に提供される配列と市販のＤＮＡ合成装置を使えば所望のＤＮＡ配列を作製することができる。
【０２２５】
組換え法を使ってポリヌクレオチドを調製するために、所望の配列を含むポリヌクレオチドを適切なベクターに挿入することができ、次に、前記ベクターを、本明細書でさらに議論する複製および増幅のために適切な宿主細胞に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知のいかなる手段によって宿主細胞に挿入してもよい。細胞は、直接取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ接合、またはエレクトロポレーションにより外因性ポリヌクレオチドを導入することにより形質転換される。導入されたら、前記外因性ポリヌクレオチドは細胞内で（プラスミドなどの）非組込みベクターとして維持することができる、または宿主細胞ゲノムに組み込むことができる。このようにして増幅される前記ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の方法により宿主細胞から単離することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）を参照されたい。
【０２２６】
代わりに、ＰＣＲによりＤＮＡ配列の複製が可能である。ＰＣＲ技術は当技術分野で公知であり、米国特許第４６８３１９５号、第４８００１５９号、第４７５４０６５号、および第４６８３２０２号の他にも、ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ（１９９４）にも記載されている。
【０２２７】
ＲＮＡは、適切なベクター中の単離したＤＮＡを使い、それを適切な宿主細胞に挿入することにより得ることができる。前記細胞が複製し前記ＤＮＡがＲＮＡに転写されると、次に前記ＲＮＡを、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）に記載されているように、当業者に公知の方法を使って単離することができる。
【０２２８】
適切なクローニングベクターを標準技術に従って構築してもよいし、当技術分野で入手可能な多数のクローニングベクターから選択してもよい。選択されるクローニングベクターは、利用するつもりの宿主細胞により異なってもよいが、有用なクローニングベクターであれば、一般に自己複製能力を有しており、特定の制限酵素に対する単一の標的を有していてよく、かつ／または前記ベクターを含有するクローンを選別するのに使うことができるマーカーの遺伝子を担っていてよい。適切な例としては、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ブルースクリプト（例えば、ｐＢＳ  ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などのシャトルベクターがある。これらのおよび多くの他のクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ，Ｓｔｒａｔｅｇｅｎ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの製造供給元から入手可能である。
【０２２９】
発現ベクターは一般に、本発明に従ったポリヌクレオチドを含有する複製可能ポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターは宿主細胞内でエピソームとしても染色体ＤＮＡの不可欠な部分としても複製可能でなければならないことが示唆される。適切な発現ベクターには、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミド、およびＰＣＴ出願国際公開第８７／０４４６２号に開示されている発現ベクターがあるが、これらに限定されるものではない。ベクター成分には、一般に、以下の；シグナル配列、複製起点、１個または複数個のマーカー遺伝子、適切な（プロモーター、エンハンサー、およびターミネーターなどの）転写制御エレメントがあってよいが、これらに限定されるものではない。発現（すなわち、翻訳）のためには、通常、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および終止コドンなどの、１個または複数個の翻訳制御エレメントも必要である。
【０２３０】
対象のポリヌクレオチドを含有するベクターは、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を用いたトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、この場合、ベクターはワクシニアウイルスなどの感染病原体である）を含むいくつかの適切な手段のうちいずれによっても宿主細胞に導入することができる。導入ベクターまたはポリヌクレオチドの選択は、多くの場合、宿主細胞の特徴に依存することになる。
【０２３１】
本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれでも含む宿主細胞も提供する。異種ＤＮＡを過剰発現することができるいかなる宿主細胞も、対象の抗体、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする遺伝子を単離するために使うことができる。哺乳動物宿主細胞の非限定的例には、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞があるが、これらに限定されるものではない。ＰＣＴ出願国際公開第８７／０４４６２号も参照されたい。適切な非哺乳動物宿主細胞には、（大腸菌または枯草菌などの）原核生物および（出芽酵母、分裂酵母、またはクルイベロミセスラクチスなどの）酵母がある。好ましくは、前記宿主細胞は、対応する対象の内在性抗体またはタンパク質が宿主細胞に存在したとすれば、その発現レベルの約５倍、さらに好ましくは１０倍、さらに好ましくは２０倍のレベルで前記ｃＤＮＡを発現する。Ａ□１−４０への特異的結合を求めての前記宿主細胞のスクリーニングは、免疫アッセイまたはＦＡＣＳにより達成される。対象の抗体またはタンパク質を過剰発現している細胞は同定することができる。
【０２３２】
Ｄ．組成物
本発明の方法で使用される組成物は、有効量の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体または本明細書に記載の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体由来ポリペプチドを含む。そのような組成物の例、ならびに処方の方法は、前のセクションおよび以下にも記載されている。一実施形態では、前記組成物は、ＣＧＲＰアンタゴニストをさらに含む。別の実施形態では、前記組成物は、１個または複数個の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む。他の実施形態では、前記抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体はヒトＣＧＲＰを認識する。さらに他の実施形態では、前記抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体はヒト化される。さらに他の実施形態では、前記抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、抗体媒介溶解またはＡＤＣＣなどの、必要ではないまたは望ましくない免疫応答を始動させない定常領域を含む。他の実施形態では、前記抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、（１個、２個、３個、４個、５個、または、いくつかの実施形態では、Ｇ１由来の６個すべてのＣＤＲなどの）抗体Ｇ１の１個または複数個のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、前記抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体はヒトである。
【０２３３】
前記組成物は、２個以上の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体（例えば、ＣＧＲＰの異なるエピトープを認識する抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の混合物）を含むことができると理解されている。他の例となる組成物は、同一のエピトープを認識する２個以上の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体、またはＣＧＲＰの異なるエピトープに結合する他の種類の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む。
【０２３４】
本発明で使用する組成物は、薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  Ｅｄ．（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ．）を、凍結乾燥した製剤または水溶液の形でさらに含むことができる。許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、その投与量および濃度で受容者に無毒であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなどの）保存剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性高分子化合物；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストランを含む単糖類、二糖類および他の炭化水素；ＥＤＴＡなどのキレート薬；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、亜鉛タンパク質錯体）；ならびに／または、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含んでいてよい。薬学的に許容可能な賦形剤は本明細書でさらに記載する。
【０２３５】
前記抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体およびその組成物は、前記薬剤の有効性を増強するかつ／または補完するのに役立つ他の薬剤と組み合わせて使用することもできる。
【０２３６】
Ｅ．キット
本発明は、即時法で使用するためのキットも提供する。本発明のキットには、本明細書に記載する（ヒト化抗体などの）抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体またはポリペプチドを含む１個または複数個の容器、および本明細書に記載する本発明の方法のいずれかに従って使用するための説明書が含まれる。一般的に、これらの説明書には、本明細書に記載する方法のいずれかに従って（片頭痛などの）頭痛を治療し、寛解し、または予防するための前記抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の投与についての説明文が含まれる。前記キットは、個体が頭痛がするのかどうか、または個体が頭痛に見舞われる危険性があるかどうかを確認することに基づいて治療に適した個体を選択する説明文をさらに含んでいてよい。さらに他の実施形態では、前記説明書は、（片頭痛などの）頭痛に見舞われる危険性がある個体に抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を投与する説明文を含む。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、前記抗体はヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、前記抗体はヒトである。他の実施形態では、前記抗体はモノクロナール抗体である。さらに他の実施形態では、前記抗体は、（１個、２個、３個、４個、５個、または、いくつかの実施形態では、Ｇ１由来の６個すべてのＣＤＲなどの）抗体Ｇ１の１個または複数個のＣＤＲを含む。
【０２３８】
抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の使用に関する説明書には、一般に、目的の治療のための投与量、服薬スケジュール、および投与経路に関する情報が含まれる。前記容器は、単位用量、大量包装（例えば、多数回投与包装）、またはサブユニット用量でもよい。本発明のキットに提供される説明書は、典型的には、ラベルまたは添付文書（例えば、キットに含まれる紙シート）上の書面での指示であるが、機械可読説明書（例えば、磁気または光学式デスクに載せた説明書）も許容可能である。
【０２３９】
前記ラベルまたは添付文書は、前記組成物が（片頭痛などの）頭痛を治療し、寛解し、かつ／または予防するために使用されることを示している。本明細書に記載の方法のいずれでも実行するための説明書を提供してよい。
【０２４０】
本発明のキットは、適切に包装されている。適切な包装には、バイアル、ビン、ジャー、柔軟包装（例えば、密封マイラーまたはプラスチック袋）、等があるが、これらに限定されるものではない。インヘラー、経鼻投与器具（例えば、アトマイザ）、またはミニポンプなどの輸血用器具などの特定の器具と組み合わせて使用するための包装も企図されている。キットは、無菌アクセスポート（例えば、前記容器は、皮下注射針により貫通できるストッパー付きの静脈輸血バッグでもよいし、バイアルでもよい）が付いていてもよい。前記容器も、無菌アクセスポート（例えば、前記容器は、皮下注射針により貫通できるストッパー付きの静脈輸血バッグでもよいし、バイアルでもよい）が付いていてもよい。前記組成物中の少なくとも１個の活性薬剤は、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体である。前記容器は、第２の薬学的な活性薬剤をさらに含んでいてもよい。
【０２４１】
キットは、緩衝液などの追加の成分および解釈情報を選択により提供してよい。通常、前記キットは、容器および、前記容器上にまたは前記容器に付随してラベルまたは添付文書を含む。
【０２４２】
以下の実施例は本発明を例証するために提供されるものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０２４３】
（実施例１）
抗ＣＧＲＰモノクローナル抗体の生成および性状解析
抗ＣＧＲＰ抗体の生成。ラットおよびヒトＣＧＲＰに対し種間活性を有する抗ＣＧＲＰ抗体を生成するため、マウスは，アジュバントを添加した（１足蹠当たり５０μｌ、１匹当たり計１００μｌ）２５〜１００μｇのＫＬＨと結合したヒトα−ＣＧＲＰまたはβ−ＣＧＲＰを用いて様々な間隔でを感作された。感作は概して、Ｇｅｅｒｌｉｇｓ  ＨＪ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２４：９５−１０２；Ｋｅｎｎｅｙ  ＪＳ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２１：１５７−１６６；ａｎｄ  Ｗｉｃｈｅｒ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８９：１２８−１３５に記述されている方法で行われた。最初にマウスはＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）を添加した５０μｇのＫＬＨと結合したヒトα−ＣＧＲＰまたはβ−ＣＧＲＰでマウスで感作された。２１日後、マウスは、ＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント）を添加した２５μｇのＫＬＨと結合したヒトβ−ＣＧＲＰ（最初にヒトα−ＣＧＲＰで感作されたマウスに対して）またはα−ＣＧＲＰ（最初にヒトβ−ＣＧＲＰで感作されたマウスに対して）で２回目の感作を受けた。２回目の感作２３日後、ＩＦＡを添加した２５μｇのＫＬＨと結合したラットα−ＣＧＲＰで３回目の感作が行われた。その１０日後、抗体価ｇａ，ＥＬＩＳＡを用いて測定された。３回目の感作３４日後、ＩＦＡを添加した２５μｇのペプチド（ラットα−ＣＧＲＰ−ＫＬＨ）で４回目の感作が行われた。４回目の感作３２日後、最終追加抗原刺激が，１００μｇの可溶性ペプチド（ラットα−ＣＧＲＰ）で行われた。
【０２４４】
感作されたマウスから脾細胞が採取され、ポリエチレングリコール１５００を用いてＮＳＯ骨髄腫細胞と１０：１の割合で融合された。２０％ウマ血清および２−オキザロ酢酸／ピルビン酸／インスリン（ＳＩＧＭＡ）を含むＤＭＥＭを用いて、このハイブリッド細胞は９６ウェルプレートにプレートアウトされ，ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン選択が開始された。８日目に、２０％ウマ血清を含む１００μｌのＤＭＥＭがすべてのウェルに添加された。ハイブリッドの上清は、抗体捕捉イムノアッセイを用いてスクリーニングされた。抗体クラスの決定は、抗体クラス特異的二次抗体を用いて行われた。
【０２４５】
モノクローナル抗体生成細胞株群は、さらなる性状解析のため、それらのヒトおよびラットＣＧＲＰへの結合に基づいて選択された。これらの抗体および性状解析は下記の表２および３に示されている。
【０２４６】
精製およびＦａｂフラグメント調整。さらなる性状解析のために選択されたモノクローナル抗体は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを用いてハイブリドーマ培養の上清から精製された。上清はＰＨ８に平衡化された。次に、上清は，ＰＢＳでｐＨ８に平衡化されたプロテインＡカラムＭａｂＳｅｌｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃  １７−５１９９−０２）にロードされた。カラムは、５カラム容量のＰＨ８のＰＢＳで洗浄された。抗体は、ｐＨ３の５０ｍＭのリン酸クエン酸バッファで溶出された。溶出された抗体は、ｐＨ８の１Ｍリン酸バッファで中和された。精製された抗体は、ｐＨ７．４のＰＢＳで透析された。抗体濃度は、マウスモノクローナル抗体標準曲線を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定された。
【０２４７】
Ｆａｂは、Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ  Ｆａｂ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ＃  ４４８８５）を用いて、完全抗体のパパインタンパク質分解によって調整され、メーカーの指示書に沿ってプロテインＡクロマトグラフィーによって精製された。濃度は、既知の濃度（アミノ酸分析で決定された）の標準Ｆａｂを用いたＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、および１ＯＤ＝０．６ｍｇ／ｍｌを用いたＡ２８０で（またはアミノ酸配列に基づく理論的に同等な方法で）決定された。
【０２４８】
ＦＡＢの親和性決定。抗ＣＧＲＰモノクローナル抗体の親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（商標）の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム（Ｂｉａｃｏｒｅ，ＩＮＣ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）を使用して、メーカー所有のランニングバッファであるＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣＬ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  Ｖ／ＶポリソルベートＰ２０）を用いて、２５℃または３７℃のいずれかで決定された。親和性は、ＳＡチップ上に事前に固定されたストレプトアビジン経由で、Ｎ末端ビオチン化ＣＧＲＰペプチド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  ｏｒ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｃｏｌｏｒａｄｏからの特別注文品）を捕捉し、ＣＧＲＰ表面上で測定された抗体Ｆａｂの結合反応速度を測定することによって決定された。ビオチン化ＣＧＲＰはＨＢＳ−ＥＰによって希釈され、０．００１ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でチップ上に注入された。各々のチップチャネルで様々なフロー時間を試験し、２種類の抗原濃度の範囲が得られた。つまり詳細な動力学系研究用の＜５０反応単位（ＲＵ）、ならびに濃度研究およびスクリーニング用の約８００ＲＵである。精製済Ｆａｂフラグメントが１ｍＭから０．１ｎＭにわたる濃度に通常なる２〜３倍の階段希釈液（０．１〜１０×推定されたＫＤになることを意図して）が、１００ｍＬ／分の速度で１分間注入され、解離時間は１０分であった。各結合サイクルの後、表面は、２５％  Ｖ／Ｖエタノールの２５ｍＭのＮａＯＨで再生された。このようにして表面は数百以上のサイクルに耐容性を示した。動力学系会合速度（ＫＯＮ）および解離速度（ＫＯＦＦ）は、ＢＩＡ評価  プログラムを用いて、１：１ラングミュア結合モデル（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．Ｒｏｏｓ，Ｈ．Ｆａｇｅｒｓｔａｍ，Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．（１９９４）．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６．９９−１１０）にデータを合わせることによって、同時に得られた。全体の平衡解離定数（ＫＤ）または「結合親和性」は、ＫＤ比率＝ＫＯＦＦ／ＫＯＮから算出された。マウスのＦａｂフラグメントの結合親和性は、表２および３に示されている。
【０２４９】
マウス抗ＣＧＲＰ抗体のエピトープマッピング。抗ＣＧＲＰ抗体がヒトα−ＣＧＲＰに結合するエピトープを決定するのために、様々なＣＧＲＰフラグメントに対するＦａｂフラグメントの結合親和性が、前述のようなＳＡセンサーチップ上のＮ末端ビオチン化ＣＧＲＰフラグメントの１９〜３７アミノ酸および２５〜３７アミノ酸を捕捉することによって測定された。図１は、２５℃で測定されたそれらの結合親和性を表す。図１で示すように、抗体４９０１以外のすべての抗体は、ヒトα−ＣＧＲＰフラグメント１９〜３７および２５〜３７に、全長のα−ＣＧＲＰ（１〜３７）に対するそれらの結合親和性と同程度の親和性で結合する。抗体４９０１は、ヒトα−ＣＧＲＰフラグメント２５〜３７に、全長のヒトα−ＣＧＲＰフラグメントに結合するのと比べて６倍低い親和性で結合する。これは主にオフレートの低下によるものである。データは、これらの抗ＣＧＲＰ抗体が一般にＣＧＲＰのＣ末端に結合することを示している。
【０２５０】
アラニンのスキャニングが、抗ＣＧＲＰ抗体の結合に関わるヒトα−ＣＧＲＰのアミノ酸をさらに性状解析するために行われた。１個のアラニン置導体を有するヒトα−ＣＧＲＰの異なる変異体は、ペプチドの合成によって生成された。それらのアミノ酸配列は、表４にＢｉａｃｏｒｅ分析で使用した他のペプチドと共に示されている。これらの変異体に対する抗ＣＧＲＰ抗体のＦａｂフラグメントの結合親和性は、上記のようにＢｉａｃｏｒｅを用いて決定された。図１で示すように、全１２種の抗体は、もっとも必須の残基であるＦ３７アミノ酸と共に、Ｃ末端のエピトープを標的とする。Ｆ３７のアラニンへの突然変異は、著しく親和性を低下させた、もしくはペプチドに対する抗ＣＧＲＰ抗体の結合を完全にノックアウトさえした。次に重要なアミノ酸残基はＧ３３であるが、高親和性抗体（７Ｅ９、８Ｂ６、１０Ａ８、７Ｄ１１）のみがこの位置でのアラニン置換の影響を受けた。アミノ酸残基Ｓ３４も、これらの４種の高親和性抗体の結合の際に重要な（しかしより影響が小さい）役割を果たす。
【０２５１】
【表２】
2009515942.tif 000004
【０２５２】
【表３】
2009515942.tif 000005
【０２５３】
【表４】
2009515942.tif 000006
【０２５４】
（実施例２）
ＩＮ  ＶＩＴＲＯ試験で使用される抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体のスクリーニング。
マウス抗ＣＧＲＰ抗体は、細胞ベースのｃＡＭＰ活性試験および結合試験を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアンタゴニスト活性の有無に関してさらにスクリーニングされた。
【０２５５】
アンタゴニスト活性は、ｃＡＭＰ試験により測定された。抗ＣＧＲＰ抗体（終濃度１〜３０００ｎＭ）の存在下もしくは非存在下での５μｌのヒトもしくはラットα−ＣＧＲＰ（終濃度５０ｎＭ）、またはラットα−ＣＧＲＰもしくはヒトα−ＣＧＲＰ（終濃度０．１ｎＭ〜１０ｍＭ、ｃＡＭＰ活性の陽性対照として）は、３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、製品番号  ２６４５６７）に分注された。刺激バッファ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１４６ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および５００ｕＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ））中の細胞（ヒトα−ＣＧＲＰが使用された場合はヒトＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ラットα−ＣＧＲＰが使用された場合はＡＴＣＣからのラットＬ６）１０μｌがプレートのウェルに添加された。プレートは室温で３０分間インキュベーションされた。
【０２５６】
インキュベーション後、メーカーの説明書に沿ってＨｉｔＨｕｎｔｅｒ（商標）Ｅｎｚｙｍｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｃｃｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ｃＡＭＰの活性化が行われた。試験は、２種類のフラグメント（酵素受容体（ＥＡ）および酵素供与体（ＥＤ））から構成されている遺伝子改変β−ガラクトシダーゼ酵素に基づいている。２つのフラグメントが切り離される時、酵素は不活性になる。フラグメントが合わさると、それらは相補性と呼ばれるプロセスにより活性酵素を形成するために自然に再結合可能である。ＥＦＣ測定プラットフォームは、ＥＤ−ｃＡＭＰペプチドコンジュゲートを利用する。ＣＡＭＰは抗ＣＡＭＰによって認識される。このＥＤフラグメントは、活性酵素を形成するために、ＥＡと再会合可能である。測定では、抗ＣＡＭＰ抗体は、ＥＤ−ｃＡＭＰコンジュゲートと結合し酵素を形成を阻害するのに、最適に滴定されている。細胞可溶化物サンプル中のＣＡＭＰの量は、抗ＣＡＭＰ抗体との結合においてＥＤ−ＣＡＭＰコンジュゲートと競合する。測定における遊離ＥＤコンジュゲートの量は、ＣＡＭＰの濃度に比例する。したがって、ｃＡＭＰは、β−ガラクトシダーゼの蛍光基質のターンオーバーによって定量化される活性酵素の形成によって測定される。ＣＡＭＰ活性測定は、１０ｍＬの細胞溶解バッファおよび抗ＣＡＭＰ抗体（比率１：１）を添加し、６０分間室温にインキュベートすることにより行われた。次に、１０ｍＬのＥＤ−ｃＡＭＰ薬が各ウェルに添加され、６０分間室温でインキュベートされた。インキュベーション後、２０ＭＬのＥＡ試薬およびＣＬの混合液（基質を含む）（比率１：１）が各ウェルに添加され、室温で１〜３時間またはオーバーナイトでインキュベートした。プレートは、ＰＭＴ機器で１秒／ウェルの速度で、またはイメージャーで３０秒／部分の速度で読み込まれた。α−ＣＧＲＰによってＣＡＭＰの活性を抑制する抗体は、上記の表２および３で確認される（「ＹＥＳ」と記されている）。表２および３のデータは、測定でアンタゴニスト活性を示した抗体が一般に高親和性を有することを示している。例えば、ヒトα−ＣＧＲＰに対し約８０ｎＭ以下のＫＤ（２５℃で決定された）、またはラットα−ＣＧＲＰに対し約４７ｎＭ以下のＫＤ（３７℃で決定された）を有する抗体は、本測定でアンタゴニスト活性を示した。
【０２５７】
放射リガンド結合試験。結合試験は、前述したようなＣＧＲＰをレセプターへの結合から阻止することによって、抗ＣＧＲＰ抗体のＩＣ５０を測定するために行われた。Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １６：４２１−４，１９９５；Ｍａｌｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１４２９４−８，２００２。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞からのメンブレン（２５ｍＧ）は、１０ｐＭの１２５Ｉ−ヒトα−ＣＧＲＰを含んだインキュベーションバッファ（５０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣＬ、ｐＨ７．４、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％ＢＳＡ）中で（総容量１ｍＬ）、９０分間室温でインキュベートされた。抑制濃度（ＩＣ５０）を決定するために、約１００倍高濃度のストック溶液からの抗体または非標識化ＣＧＲＰ（対照として）は、インキュベーションバッファで様々な濃度に溶解され、同時にメンブレンおよび１０ｐＭ１２５Ｉ−ヒトα−ＣＧＲＰと共にインキュベートされた。インキュベーションは、０．５％のＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｍｉｎｉｎｅによって阻止されていたガラスマイクロファイバーフィルター（ＧＦ／Ｂ、１ｍＭ）による濾過によって終了された。用量応答曲線はプロットされ、ＫＩ値は式を用いて決定された：ＫＩ＝ＩＣ５０／（１＋（［リガンド］／ＫＤ）、ヒトα−ＣＧＲＰのＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞に存在するようなＣＧＲＰ１レセプターに対する平衡解離定数ＫＤ＝８ｐＭ、ＢＭＡＸ＝０．０２５ｐｍｏｌ／タンパク質１ｍｇ。報告されたＩＣ５０値（ＩｇＧ分子に関して）は結合部位に換算された（２倍することによって）。それによりＢｉａｃｏｒｅによって決定された親和性（ＫＤ）と比較することができる。
【０２５８】
表２はマウス抗体７Ｅ９、８Ｂ６，６Ｈ２および４９０１のＩＣ５０を表している。データは、抗体親和性が通常ＩＣ５０と相関していることを示している。つまり、高い親和性（低いＫＤ値）の抗体は、放射リガンド結合試験で低いＩＣ５０を示す。
【０２５９】
（実験例３）
ラットの伏在神経刺激により誘発された皮膚血管拡張に対する抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の効果
抗ＣＧＲＰ抗体のアンタゴニスト活性を試験するために、ラットの伏在神経刺激による皮膚血管拡張に対する抗体の効果が、既述のラットモデルを用いて試験された。Ｅｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１０：７７２−７７６，１９９３。このラットモデルでは、伏在神経の電気刺激が神経終末からのＣＧＲＰの放出を誘導し、皮膚血流の増加が起きる。雄のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄｗａｌｅｙラット（１７０〜３００ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒより）の足の皮膚の血流が、伏在神経刺激後測定された。ラットは２％のイソフルランにより、麻酔下で維持された。ブレチリウムトシラート（３０ｍＧ／ｋｇ、静脈投与）が、伏在神経の交感神経線維の付随する刺激による血管収縮を最小限にするため、実験の開始時に投与された。体温は、温度調整ヒーティングパッドにサーモスタットで接続した直腸プローブの使用により、３７℃に維持された。抗体、陽性対照（ＣＧＲＰ８〜３７）および媒体（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ）などの物質が、右大腿静脈から静脈内に投与された。図３に示された実験では被検物質および対照は尾静脈から投与された。図２Ａおよび２Ｂに示された実験では抗体４９０１および７Ｄ１１は腹腔内に（ＩＰ）投与された。陽性対照物質ＣＧＲＰ８〜３７（血管拡張アンタゴニスト）は、半減期が短いので、神経刺激３〜５分前に４００ｎｍｏｌ／ｋｇ（２００ｍｌ）投与された。Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．８９：６５６−７３，１９９５。抗体は、異なる用量（１  ＭＧ／ＫＧ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇ）で投与された。
【０２６０】
図２Ａおよび２Ｂで示される実験では、抗体４９０１（２５ｍｇ／ｋｇ）、抗体７Ｄ１１（２５ｍｇ／ｋｇ）または媒体対照（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ）は、電気パルス刺激７２時間前に腹腔内に（ＩＰ）投与された。図３に示される実験では、抗体４９０１（１ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇまたは２５ｍｇ／ｋｇＧ）、または媒体対照（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ）は、電気パルス刺激２４時間前に静脈内に投与された。抗体または媒体対照投与後、右後肢の伏在神経は、外科的に露出され、近位側が切断され、乾燥を防ぐためにラップで覆われた。レーザードップラープローブは、伏在神経によって神経の分布を受ける領域である後足の背側正中の皮膚に設置された。血液細胞の流束として測定される皮膚血流は、レーザードップラーフローメーターでモニターされた。安定したベースライン流束（５％未満の変動）が少なくとも５分間確立されたとき、神経はプラチナ双極電極上に置かれ、６０パルス（２Ｈｚ、１０Ｖ、１ｍＳ、３０秒間）で電気的に刺激され、２０分後に再度刺激された。皮膚血流の累積的な変化は、電気パルス刺激に対する各流束の反応において、血中濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ、流束の変化×時間の変化と等しい）によって推定された。２つの刺激に対する血流反応の平均がとられた。動物は、１〜３時間麻酔下に維持された。
【０２６１】
図２Ａおよび２Ｂで示されているように、電気パルスを伏在神経に与えることにより刺激される血流の増加は、対照と比較して、ＣＧＲＰ８〜３７（４００ｎＭＯＬ／ｋｇ、静脈内投与）、抗体４９０１（２５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）、または抗体７Ｄ１１（２５ｍＧ／ｋｇ、腹腔内投与）の存在によって抑制された。ＣＧＲＰ８〜３７は、伏在神経刺激の３〜５分前に投与され、抗体は伏在神経刺激の７２時間前に投与された。図３で示されているように、電気パルスを伏在神経に与えることにより刺激される血流の増加は、伏在神経刺激２４時間前に静脈内に投与された各用量の抗体４９０１（１ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび２５１ｍｇ／ｋｇ）の存在によって抑制された。
【０２６２】
図４Ａおよび４Ｂで示される実験では、伏在神経は抗体投与前に外科的に露出された。右後肢の伏在神経は、外科的に露出され、近位側が切断され、乾燥を防ぐためにラップで覆われた。レーザードップラープローブは、伏在神経によって神経の分布を受ける領域である後足の背側正中の皮膚に設置された。血液細胞の流束として測定される皮膚血流は、レーザードップラーフローメーターでモニターされた。ブレチリウムトシラート投与３０〜４５分後、安定したベースライン流束（５％未満の変動）が少なくとも５分間確立されたとき、神経はプラチナ双極電極上に置かれ、電気的に刺激され（２Ｈｚ、１０Ｖ、１ｍＳ、３０秒間）、２０分後に再度刺激された。これらの２つの刺激に対する血流流束反応の平均は、電気刺激に対するベースラインの反応（時間０）を確立するのに用いられた。次に、抗体４９０１（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）、抗体７Ｅ９（１０ｍｇ／ｋｇ）、抗体８Ｂ６（１０ｍｇ／ｋｇ）または媒体（０．０１％のＴｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ）が、静脈内に投与された（ｉ．ｖ．）。続いて、神経が、抗体または媒体投与３０分、６０分、９０分および１２０分後に刺激された（２Ｈｚ、１０Ｖ、１ｍＳで３０秒間）。動物は、約３時間麻酔下に維持された。皮膚血流の累積的な変化は、電気パルス刺激に対する各流束の反応において、血中濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ、流束の変化×時間の変化と等しい）によって推定された。
【０２６３】
図４Ａで示されているように、電気パルス刺激が抗体投与６０分、９０分および１２０分後に印加されたとき、伏在神経上に電気パルスを印加することによって刺激される血流増加は、静脈内に１ｍｇ／ｋｇ投与された抗体４９０１の存在によって著しく抑制された。また、電気パルス刺激が抗体投与３０分、６０分、９０分および１２０分後に印加されたとき、伏在神経上に電気パルスを印加することによって刺激される血流増加は、静脈内に１０ｍｇ／ｋｇ投与された抗体４９０１の存在によって著しく抑制された。図４Ｂでは、電気パルス刺激が抗体投与３０分、６０分、９０分および１２０分後に印加されたとき、伏在神経上に電気パルスを印加することによって刺激される血流増加が、抗体７Ｅ９（１０ＭＧ／ＫＧ、静脈内に投与）の存在によって著しく抑制され、また、電気パルス刺激が抗体投与３０分後に印加されたとき、抗体８Ｂ６（１０ｍｇ／ｋｇ、静脈内に投与）の存在によって著しく抑制されたことを示している。
【０２６４】
これらのデータは、ラットの伏在神経の刺激によって誘発される皮膚血管拡張によって測定されたように、抗体４９０１、７Ｅ９、７Ｄ１１および８Ｂ６がＣＧＲＰ活性を阻害するのに効果的であることを示している。
【０２６５】
（実験例４）
抗ＣＧＲＰ抗体Ｇ１およびその変異体の性状解析
抗ＣＧＲＰ抗体Ｇ１のＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変部のためのアミノ酸配列と（ギャップ１）のは、図５に示される。以下の方法が、抗体Ｇ１およびその変異体の発現と性状解析に使用された。
【０２６６】
使用された発現ベクトル。抗体のＦＡＢフラグメントの発現は、Ｂａｒｂａｓ（２００１）Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｇ  ２．１０で記述されているものと類似の、ＬＡＣＺプロモーター誘導可能なＩＰＴＧの制御下であった。しかし、ベクターｐＣｏｍｂ３×）変異は以下の別のドメインの追加と発現を含んでいた：ヒトκ型軽鎖不変領域およびＩｇＧ２ヒト免疫グロブリンのＣＨ１不変領域、免疫グロブリンγ−２鎖Ｃ領域、タンパク質登録番号Ｐ０１８５９。免疫グロブリンκ型軽鎖（ホモサピエンス）、タンパク質登録番号ＣＡＡ０９１８１。
【０２６７】
小スケールのＦａｂ調製。Ｆａｂライブラリーと共に形質転換されたＥ．Ｃｏｌｉ（エレクトロポレーションコンピテントＴＧ１細胞またはケミカリーコンピテントＴＯＰ  １０細胞のいずれかを用いて）から、マスタープレート（Ａｇａｒ  ＬＢ＋カルベニシリン（５０ｕｇ／ｍｌ）＋２％グルコース）および各ウェルに１．５ｍｌ  ＬＢ＋カルベニシリン（５０ｕｇ／ｍｌ）＋２％グルコースを含んだ作業用プレート（２ｍｌ／ウェル、９６ウェル／プレート）に接種するために単一コロニーが使われた。ガス透過性接着シール（ＡＢｇｅｎｅ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ）が、プレートに貼り付けられた。いずれのプレートも、１２−１６時間の間、３０℃でインキュベートされた。作業用プレートは激しく振盪された。マスタープレートは、必要となるまで４℃で保管された。一方、作業用プレートからの細胞はペレット化されて（４０００ＲＰＭ、４℃、２０分）、３０℃で５時間の激しい振盪によってＦａｂの発現を誘発するために１．０ｍｌのＬＢ＋カルベニシリン（５０ｕｇ／ｍｌ）＋０．５ｍＭのＩＰＴＧで再懸濁された。誘導された細胞は４℃で２０分間、４０００ＲＰＭで遠心分離され、０．６ｍｌ  Ｂｉａｃｏｒｅ  ＨＢ−ＳＥＰバッファ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  Ｖ／Ｖ  Ｐ２０）で再懸濁された。ＨＢ−ＳＥＰの再懸濁された細胞の溶解は、凍結（−８０℃）そして３７℃の融解によって完了された。細胞可溶化物は、Ｆａｂ含有上清から砕片を分離するために、４℃で１時間、４０００ＲＰＭで遠心分離され、次にミリポアマルチスクリーン試験システムの９６ウェル濾過プレートおよび真空マニホールドを使用して濾過（０．２ｕｍ）された。Ｂｉａｃｏｒｅが濾過された上清を分析するために用いられ、センサーチップ上のＣＧＲＰに上清を注入した。親和性によって選択されたＦａｂを発現しているクローンが、ＰＣＲ、シークエンシングおよびプラスミド調整用の鋳型ＤＮＡを供給するマスタープレートから取り出された。
【０２６８】
ラージスケールのＦａｂ調整。動力学的パラメーターを得るために、Ｆａｂは下記のようなラージスケールで発現された。１５０ｍｌのＬＢ＋カルベニシリン（５０ｕｇ／ｍｌ）＋２％グルコースが入っているエーレンマイヤーフラスコに、親和性により選択されたＦａｂを発現したＥ．Ｃｏｌｉのクローンからの、１ｍｌの「スターター」一夜培養を接種した。種培養（〜３ｍｌ）の残余は、シークエンシングおよびさらなる操作のためにプラスミドＤＮＡを調整するのに用いられた。大規模培養物は、１．０のＯＤ６００ＮＭが達成されるまで（一般的に１２〜１６時間）、３０℃で激しく振盪されながらインキュベートされた。細胞は、４℃で２０分間、４０００ＲＰＭで遠心分離することによってペレット化され、１５０ｍｌのＬＢ＋カルベニシリン（５０ｕｇ／ｍｌ）＋０．５ｍＭのＩＰＴＧで再懸濁された。３０℃で５時間の発現後、細胞は、４℃で２０分間、４０００ＲＰＭの遠心分離でペレット化され、１０ｍｌのＢｉａｃｏｒｅ  ＨＢＳ−ＥＰバッファで再懸濁され、１回の凍結（−８０℃）融解（３７℃）サイクルで溶解された。細胞可溶化物は、４℃で１時間、４０００ＲＰＭの遠心分離でペレット化され、上清は集められ濾過された（０．２ｕｍ）。濾過された上清は、ＰＢＳ（ｐＨ８）で平衡化されたＮｉ−ＮＴＡ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ．ＣＡ）カラムにロードされ、次に５カラム容量のＰＢＳ（ｐＨ８）で洗い出した。個々のＦａｂは、異なる分画で、ＰＢＳ（ｐＨ８）＋３００ｍＭのイミダゾールで溶出された。Ｆａｂを含んでいる分画は、プールされ、ＰＢＳで透析された。その後、親和性の性状解析の前に、ＥＬＩＳＡで定量化された。
【０２６９】
完全な抗体調製。完全な抗体の発現のために、重鎖およびＬ鎖可変領域は、哺乳動物発現ベクターでクローン化され、リポフェクトアミンを用いてＨＥＫ２９３細胞に一時的発現のためにトランスフェクトされた。抗体は標準分析法を用いてプロテインＡを使用して精製された。
【０２７０】
ベクターｐＤｂ．ＣＧＲＰ．ｈＦｃＧＩは、Ｇ１抗体のＨ鎖からなる発現ベクターで、Ｈ鎖の一過性または安定な発現に適している。ベクターｐＤｂ．ＣＧＲＰ．ｈＦｃＧＩは、次のような領域に対応するヌクレオチド配列を有する：マウスのサイトメガロウイルスプロモーター領域（ヌクレオチド７〜６１２）、合成イントロン（ヌクレオチド６１３〜１６７９）、ＤＨＦＲコード領域（ヌクレオチド６８８〜１２５３）、ヒト成長ホルモンシグナルペプチド（ヌクレオチド１８９９〜１９７６）、Ｇ１のＨ鎖可変領域（ヌクレオチド１９７７〜２６２１）、以下の突然変異体を含むヒトＨ鎖ＩｇＧ２不変領域：Ａ３３０Ｐ３３１〜Ｓ３３０Ｓ３３１（野生型ＩｇＧ２シークエンスを参照するアミノ酸番号、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４）．Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＤｂ．ＣＧＲＰ．ｈＦｃＧＩ  ｗａｓ  ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  ＡＴＣＣ  ｏｎ  Ｊｕｌｙ  １５，２００５参照）。ベクターｐＤｂ．ＣＧＲＰ．ｈＦｃＧＩは、２００５年７月１５日にＡＴＣＣに預けられ、ＡＴＣＣ登録番号であるＰＴＡ−６８６７を割り当てられた。
【０２７１】
ベクターｐＥｂ．ＣＧＲＰ．ｈＫＧＩはＧ１抗体のＬ鎖からなる発現ベクトルで、Ｌ鎖の一過性の発現に適している。ベクターｐＥｂ．ＣＧＲＰ．ｈＫＧＩは、次のような領域に対応するヌクレオチドシークエンスを有する：マウスのサイトメガロウイルスプロモーター領域（ヌクレオチド２〜６１２）、ヒトＥＦ−１イントロン（ヌクレオチド６１４〜１１４９）、ヒト成長ホルモンシグナルペプチド（ヌクレオチド１１６０〜１２３７）、抗体Ｇ１  Ｌ鎖可変領域（ヌクレオチド１２３８〜１５５８）、ヒトκ鎖不変領域（ヌクレオチド１５５９〜１８８２）。ベクターｐＥｂ．ＣＧＲＰ．ｈＫＧＩは、２００５年７月１５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ登録番号であるＰＴＡ−６８６６を割り当てられた。
【０２７２】
親和性決定のためのＢｉａｃｏｒｅ試験。Ｇ１モノクローナル抗体の親和性およびその変異体は、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（商標）の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム（Ｂｉａｃｏｒｅ，ＩＮＣ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）を使用して、２５℃または３７℃のいずれかで決定された。結合親和性は、事前に不動化したストレプトアビジン（ＳＡセンサーチップ）を介して、Ｎ末端ビオチン化ＣＧＲＰまたはフラグメントを捕捉すること、およびチップ上のＣＧＲＰまたはフラグメントで滴定された抗体Ｇ１Ｆａｂフラグメントまたは変異体を測定することによって決定された。すべての試験は、ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  Ｖ／Ｖ  Ｐ２０）で行われた。ＣＧＲＰ表面は、Ｎ−ビオチン化ＣＧＲＰを、ＨＢＳ−ＥＰバッファで０．００１ｍｇ／ｍｌ未満に希釈し、様々な接触時間を用いて、ＳＡセンサーチップ上に注入することによって調整された。＜５０反応単位（ＲＵ）の捕捉レベルに相当する低能力の表面は、高解像度動力学的研究のために用いられ、一方、高能力の表面は（約８００ＲＵの捕捉ＣＧＲＰ）、濃縮研究、スクリーニング、溶液の結合親和性の決定に用いられた。動態学的データは、抗体Ｇ１ＦＡＢを段階的に希釈し、１ｕＭ〜０．１ｎＭに渡る濃度になるように２〜３倍に増加させることによって得られた。サンプルは概して１００ｍｌ／ｍｉｎで注入され、少なくとも１０分間の解離時間が与えられた。各結合サイクルの後、表面は、２５％  Ｖ／Ｖエタノールの２５ｍＭ  ＮａＯＨで再生された。このようにして表面は数百以上のサイクルに耐容性を示した。すべての漸増段階（通常はデュプリケートで生成された）は、ＢＩＡ評価プログラムを用いて、全体的に１：１ラングミュア結合モデルに適合した。これは、各結合反応の異なる１対の会合および解離反応速度定数（それぞれ、ＫＯＮおよびＫＯＦＦと記す）を返し、これらの比は、平衡解離定数（ＫＤ＝ＫＯＦＦ／ＫＯＮ）を与えた。このように決定される結合親和性（ＫＤ値）は、表６および７に記載されている。
【０２７３】
極めて遅いオフレートを伴う結合反応の高解像度分析  極めて遅いオフレート伴う反応のため（特に、２５℃でチップ上でヒトα−ＣＧＲＰに結合する抗体Ｇ１Ｆａｂ）、結合親和性は２種の実験で得られた。上記のプロトコルが、以下の改変で用いられた。会合速度定数（ＫＯＮ）は、３０秒間、１００ｕｌ／ｍｉｎの速度で、５５０ｎＭ〜１ｎＭに渡る２倍の漸増段階（デュプリケートで）を注入し、３０秒のみ解離相を与えることによって決定された。解離速度定数（ＫＯＦＦ）は、３０秒間、デュプリケートで、同じ漸増段階の３濃度（高、中および低）を注入し、２時間の解離相を与えることによって決定された。表５に示されているように、各相互反応の結合親和性（ＫＤ）は、両方のタイプの実験から得られたＫＯＮおよびＫＯＦＦ値を組み合わせることによって得られた。
【０２７４】
Ｂｉａｃｏｒｅによる溶液の結合親和性の決定。ラット□−ＣＧＲＰおよびＦ３７Ａ（１９〜３７）ヒト□−ＣＧＲＰに対する抗体Ｇ１の溶液の結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅで３７℃で測定された。高性能ＣＧＲＰチップの表面が用いられ（高結合親和性ヒト□−ＣＧＲＰが検出目的で選ばれた）、ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファが５ｕｌ／ｍｉｎで送流された。５ｎＭの一定濃度での抗体Ｇ１Ｆａｂフラグメント（溶液ベースの反応の予想ＫＤになるように、または未満になるように）は、競合ペプチドであるラット□−ＣＧＲＰまたはＦ３７Ａ（１９〜３７）ヒト□−ＣＧＲＰのいずれかと、３倍段階希釈での１ｎＭ〜１ｕＭに渡る最終濃度で、事前にインキュベートされた。溶液ベースの競合ペプチドの存在または非存在下での抗体Ｇ１ＦＡＢ溶液は、チップ上のＣＧＲＰ上に注入され、溶液競合の結果チップ表面上で認められた結合反応の減損がモニターされた。これらの結合反応は、チップ上のＣＧＲＰ上の抗体Ｇ１Ｆａｂのみ（５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３２５および０ｎＭ）を滴定することによって作られた検量線を用いて、「遊離Ｆａｂ濃度」に転化された「遊離Ｆａｂ濃度」は、各データポイントを生みだしＢＩＡ評価ソフトウェアを用いて溶液結合親和性モデルに適合する、競合する溶液ベースのペプチドの濃度に対しプロットされた。このように決定された（間接的に）溶液結合親和性は、表５および７に示されており、ＦａｂがＳＡチップ上のＮ−ビオチン化ＣＧＲＰに直接注入されるときに得られた結合親和性をバリデートするのに用いられた。これらの２つの方法により決定されたそれぞれの結合親和性の緊密な一致が、Ｎ−ビオチン化型のＣＧＲＰをチップに結合させておくことが、固有の溶液結合活性を変化させないということが確認できる。
【０２７５】
表５では、ＢｉａｃｏｒｅでＦａｂフラグメントをＳＡチップ上のＮ−ビオチン化ＣＧＲＰ上に送流することによって決定された、ヒトα−ＣＧＲＰ、ヒトβ−ＣＧＲＰ、ラットα−ＣＧＲＰおよびラットβ−ＣＧＲＰに対する抗体Ｇ１の結合親和性を示している。極端に遅いオフレートを伴う結合親和性の反応をより良く解決するために、この試験の位置付けを補完する２種類の実験によっても決定された。ラットα−ＣＧＲＰ反応の溶液結合親和性も決定された（上記のように）。両方の試験の位置付けで測定された結合親和性の緊密な一致により、固有のラットα−ＣＧＲＰの溶液中の結合親和性は、それがビオチレート化されＳＡチップに結合していれば、変化されないということが確認できる。
【０２７６】
【表５】
2009515942.tif 000007
【０２７７】
下記の表６は、抗体Ｇ１と比較したアミノ酸配列の変位を有する抗体、ならびにラットＣＧＲＰおよびヒトα−ＣＧＲＰの両方に対するそれらの結合親和性を示している。表６で示されている、変異体のすべてのアミノ酸置導体が、Ｇ１の配列と比較して記述されている。Ｆａｂフラグメントの結合親和性は、ＢｉａｃｏｒｅでＳＡチップ上のＣＧＲＰ上にそれらを送流することによって決定された。
【０２７８】
【表６−１】
2009515942.tif 000008
【０２７９】
【表６−２】
2009515942.tif 000009
【０２８０】
【表６−３】
2009515942.tif 000010
【０２８１】
【表６−４】
2009515942.tif 000011
【０２８２】
【表６−５】
2009515942.tif 000012
【０２８３】
抗体Ｇ１によって認識されるヒトα−ＣＧＲＰ上のエピトープを決定するために、上記のＢｉａｃｏｒｅ試験が用いられた。ヒトα−ＣＧＲＰは、チップ上のＳＡセンサーでの高結合親和性を可能にするビオチン化型として購入された。チップ上のヒトα−ＣＧＲＰに対するＧ１Ｆａｂフラグメントの結合が、ＣＧＲＰペプチドの存在下または非存在下で測定された。概して、２０００：１ｍｏｌのペプチド／Ｆａｂ溶液（例えば、５０ｎＭのＧ１  Ｆａｂの１０ｕＭのペプチド）は、チップ上のヒトα−ＣＧＲＰ上に注入された。図６は、競合ペプチドによる結合阻止率を示している。図６のデータは、Ｇ１  Ｆａｂのヒトα−ＣＧＲＰに対する結合を１００％阻止するペプチドは、ヒトα−ＣＧＲＰの１〜３７（ＷＴ）、８〜３７、２６〜３７、Ｐ２９Ａ（１９〜３７）、Ｋ３５Ａ（１９〜３７）、Ｋ３５Ｅ（１９〜３７）、およびＫ３５Ｍ（１９〜３７）；β−ＣＧＲＰ（ＷＴ）１〜３７；ラットα−ＣＧＲＰ（ＷＴ）１〜３７；ならびにラットβ−ＣＧＲＰ（ＷＴ）１〜３７であることを表している。すべてのこれらのペプチドは、Ｃ末端でアミド化されている。ヒトα−ＣＧＲＰのペプチドＦ３７Ａ（１９〜３７）および１９〜３７（後者はＣ末端でアミド化されない）も、Ｇ１  Ｆａｂのヒトα−ＣＧＲＰへの結合を約８０〜９０％阻止した。ヒトα−ＣＧＲＰのペプチド１〜３６（Ｃ末端でアミド化されていない）は、Ｇ１  Ｆａｂのヒトα−ＣＧＲＰへの結合を約４０％阻止した。ヒトα−ＣＧＲＰのペプチドフラグメント１９〜３６（Ｃ末端でアミド化されていない）、ヒトα−ＣＧＲＰのペプチドフラグメント１〜１３および１〜１９（どちらもＣ末端でアミド化されていない）、ヒトアミリン、カルシトニンおよびアドレノメデュリン（すべてＣ末端でアミド化されている）は、チップ上のヒトα−ＣＧＲＰに対するＧ１  Ｆａｂの結合と競合しなかった。これらのデータは、Ｇ１がＣＧＲＰのＣ末端エピトープを標的とすること、ならびにもっとも端に位置する残基（Ｆ３７）およびそのアミド化が結合に重要なことを証明している。
【０２８４】
ヒトα−ＣＧＲＰ変異体へのＧ１  Ｆａｂの結合親和性（３７℃で）も決定された。下記の表７は、チップ上のＮ−ビオチン化ヒトα−ＣＧＲＰおよび変異体を滴定することにより、直接測定されるような結合親和性を示している。表７のデータは、抗体Ｇ１がもっとも重要な残基であるＦ３７およびＧ３３で、Ｃ末端のエピトープと結合することを表している。Ｇ１は、Ｃ末端に余分なアミノ酸残基（アラニン）が追加されても、ＣＧＲＰと結合しない。
【０２８５】
【表７】
2009515942.tif 000013
【０２８６】
上記のデータは、抗体Ｇ１が結合するエピトープが、ヒトα−ＣＧＲＰのＣ末端上にあるということ、およびヒトα−ＣＧＲＰ上のアミノ酸３３〜３７が抗体Ｇ１の結合にとって重要であるということを表している。また、残渣Ｆ３７のアミド化も、結合に重要である。
【０２８７】
（実験例５）
ラットの伏在神経刺激により誘発された皮膚血管拡張に対する抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の効果
抗ＣＧＲＰ抗体Ｇ１のアンタゴニスト活性を試験するために、ラットの伏在神経刺激による皮膚血管拡張に対する抗体の効果が、実施例３で記述されたラットモデルを用いて試験された。短時間、ラットは２％のイソフルランにより、麻酔下で維持された。ブレチリウムトシラート（３０ｍｇ／ｋｇ、静脈に投与された）が、伏在神経の交感神経線維の付随する刺激による血管収縮を最小限にするため、実験の開始時に投与された。体温は、温度調整ヒーティングパッドにサーモスタットで接続した直腸プローブの使用により、３７℃に維持された。抗体または媒体対照投与後、右後肢の伏在神経は、外科的に露出され、近位側が切断され、乾燥を防ぐためにラップで覆われた。レーザードップラープローブは、伏在神経によって神経の分布を受ける領域である後足の背側正中の皮膚に設置された。血液細胞の流束として測定される皮膚血流は、レーザードップラーフローメーターでモニターされた。チリウムトシラート投与３０〜４５分後に、投与後２時間以内の抗体の効果を決定するための実験では、ブレ安定したベースライン流束（５％未満の変動）が少なくとも５分間確立されたとき、神経はプラチナ双極電極上に置かれ、電気的に刺激され（２Ｈｚ、１０Ｖ、１ｍＳ、３０秒間）、２０分後に再度刺激された。これらの２つの刺激に対する血流流束反応の平均は、電気刺激に対するベースラインの反応（時間０）を確立するのに用いられた。次に、Ｇ１（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）もしくは媒体（０．０１％のＴｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ）が、静脈内に投与された（ｉ．ｖ．）。続いて、神経が、抗体投与３０分、６０分、９０分および１２０分後に刺激された（２Ｈｚ、１０Ｖ、１ｍＳで３０秒間）。動物は、約３時間麻酔下に維持された。皮膚血流の累積的な変化は、電気パルス刺激に対する各流束の反応において、血中濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ、流束の変化×時間の変化と等しい）によって推定された。
【０２８８】
図７では、伏在神経上に電気パルスを印加することによって刺激される血流増加が、１０ｍｇ／ｋｇの抗体Ｇ１（静脈内に投与）の存在によって、伏在神経が抗体投与９０分後に電気的に刺激されたときの媒体と比較すると、著しく抑制されたことを示している。伏在神経上に電気パルスを印加することによって刺激される血流増加が、１０ｍｇ／ｋｇの抗体Ｇ１（静脈内に投与）の存在によって、伏在神経が抗体投与９０分および１２０分後に電気的に刺激されたときの媒体と比較すると、著しく抑制された。
【０２８９】
伏在神経の試験におけるより長い時点でのアンタゴニストの効果を決定するための実験では、ラットは、上記のような伏在神経刺激の準備を動物にする２４時間または７日前に静脈内に指示された用量の抗体を投与された。これらの実験では、個々のラットで投与前に電気パルス刺激に対するベースライン反応を確立することは不可能だったので、処置群は２４時間または７日目に媒体（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ）を投与された動物と比較された。
【０２９０】
図８Ａおよび８Ｂで示されているように、伏在神経の刺激により惹起された後脚背内側の皮膚における血流増加は、刺激の２４時間または７日前のいずれかに１０ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇのいずれかを投与された動物群で、有意に抑制された。
【０２９１】
図８Ｃは、５０％有効濃度（ＥＣ５０）を決定するのに必要な用量を決定するために図８Ａまたは８Ｂで示されている用量反応データに適用された曲線適合分析を示している。２４時間目のＥＣ５０は１．３ｍｇ／ｋｇであり、７日目のＥＣ５０はわずかに低い（０．８ｍｇ／ｋｇ）。
【０２９２】
（実験例６）
硬膜動脈（閉塞頭窓）試験閉塞頭窓モデルにおける、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体Ｇ１の急性効果
この実験の目的は、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の急性効果を決定し、それをＣＧＲＰレセプターアンタゴニストＢＩＢＮ４０９６ＢＳの急性効果と比較することであった。実験は、前述の通りに（（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ  １７（４）：５１８−２４（１９９７））、次のような改変を伴って行われた。Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（３００〜４００ｇ）は、７０ｍｇ／ｋｇの腹腔内ペントバルビタールで麻酔された。麻酔は、２０ｍｇ／ｋｇ／時の静脈投与のペントバルビタールで維持された。ラットは、すべての薬の送達のために、頸静脈を通してカニューレを挿入された。血圧は、腹腔動脈に大腿動脈を通して装着されたプローブ（マイクロチップカテーテル、Ｍｉｌｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）でモニターされた。ラットは気管切開術を施され、呼吸速度は、容量３．５ｍｌで、１分当たり７５回の呼吸数に維持された。定位装置で頭部を固定させて、頭皮を取り除いた後に、歯科用ドリルで骨を薄くすることによって、矢状縫合外側の左頭頂部に、２×６ｍＭの窓を作成した。マイクロマニピュレーターを使用して、プラチナ双極電極が表面に降ろされ、重い鉱油で覆われた。電極窓の外側には、５×６ｍｍの別の窓が作られ、重い鉱油で満たされた。その窓を通して、中硬膜動脈（ＭＭＡ）の枝分かれ血管の直径が、ＣＣＤカメラおよびビデオ直径分析機（Ｌｉｖｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で継続的にモニターされた。ラットは、準備後４５分間以上休息した。電気刺激に対するベースライン反応は確立され（１５Ｖ、１０Ｈｚ、０．５ｍＳのパルス、３０秒）、その後、ラットは静脈内に実験物質（１０ｍｇ／ｋｇ  ｍｕ７Ｅ９、３００ｇ／ｋｇ  ＢＩＢＮ４０９６ＢＳ、またはＴｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ  ０．０１％）を投与された。追加の電気刺激は、投与５（ＢＩＢＮ４０９６ＢＳ）、３０、６０、９０と１２０分後に行われた。すべてのデータは、チャートソフトウェア（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して記録された。
【０２９３】
図９で示されているように、１０ｍｇ／ｋｇのｍｕ７Ｅ９は、電気電場刺激によって惹起されるＭＭＡ拡張を、投与後６０分以内に有意に阻止し、効果を試験の間中（１２０分）持続させた。比較として、ＢＩＢＮ４０９６ＢＳはＭＭＡ拡張を投与後５分以内に阻止するが、効果は９０分までに完全に消失した。阻止の程度は、ＢＩＢＮ４０９６ＢＳとｍｕ７Ｅ９で同等である。
【０２９４】
（実験例７）
硬膜動脈（閉塞頭窓）試験における抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体Ｇ１の慢性効果
この実験の目的は、抗ＣＧＲＰ抗体が、電気的に刺激されたＭＭＡ拡張を投与７日後に依然として阻止できるかどうかを決定することである。ラットの準備は、次のような例外を除いて、上記の急性実験（図６）と同じである。ラットは、閉塞頭窓作成の準備および刺激の７日前に静脈内に投与された（１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇの  Ｇ１）。投与前に電気パルス刺激に対するベースラインの拡張反応を確立することは、急性実験のように不可能だったので、抗体群は媒体（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ）投与対象群におけるＭＭＡの拡張と比較された。ラットが４５分以上の休息が許された後、硬膜は３０分間隔で電気的に刺激された。刺激は、２．５Ｖ、５Ｖ、１０Ｖ、１５Ｖおよび２０Ｖで、全例１０Ｈｚ、０．５ｍＳのパルスで３０秒間行った。
【０２９５】
図１０で示されているように、１０ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇのＧ１は、電気刺激によって惹起されたＭＭＡ拡張を、１０〜２０Ｖの範囲で、有意に阻止した。このデータは、Ｇ１が電気的に刺激されたＭＭＡ拡張を最大で投薬後７日間、阻止できることを証明する。
【０２９６】
（実験例８）
モルヒネ離脱によるほてりのモデル
モルヒネ離脱のラットモデルは、閉経期のほてりのメカニズムの確立された齧歯類モデルである（Ｓｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１０２８（２）：１９１−２０２（２００４）；Ｍｅｒｃｈｅｎｔｈａｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｔｕｒｉｔａｓ  ３０：３０７−３１６（１９９８）；Ｋａｔｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．４９４：８５−９４（１９８９）；Ｓｉｍｐｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３２：１９５７−１９６６（１９８３））。基本的に、ラットは皮下にモルヒネペレットを挿入することによって、モルヒネの中毒になる。中毒時には、動物は直ちに離脱させるナロキソンが注射される。この離脱は、皮膚温上昇、中核体温の低下、心拍数の増加および血清黄体ホルモンの増加を伴う。これらすべて、程度および時期という点で、ヒトでほてりが発生するときと同じである（Ｓｉｍｐｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３２：１９５７−１９６６（１９８３））。さらに、もしラットが離脱を誘導する前にエストラジオールで治療されていたら、ほてりの症状は軽減される（Ｍｅｒｃｈｅｎｔｈａｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｔｕｒｉｔａｓ  ３０：３０７−３１６（１９９８））。これが、モルヒネの離脱モデルが、偽の臨床的ほてりであると信じられているかの理由である。
【０２９７】
卵巣切除されたラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに注文された。卵巣除去後７日以降に皮下にモルヒネペレット（モルヒネベースで７５ｍｇ）を挿入することによって、モルヒネ依存性が作られる。２日後に、さらに２つのペレットが挿入された。次の日、ラットは、静脈内に１０ｍｇ／ｋｇの４９０１［＊＊］または媒体（０．０１％Ｔｗｅｅｎ加ＰＢＳ）を注射された。２回目のペレット挿入後２日目に、ラットはケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔され、軽度に拘束された。表面温度熱電対は尾根部にテープで貼り付けられ、直腸熱電対は中核体温を測定するのに用いられた。データは、ＣＨＡＲＴソフトウェア（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して記録された。１５分間の安定ベースライン体温を記録した後に、ナロキソン（１ｍｇ／ｋｇ）は皮下に注射された。体温は、継続的に次の６０分間記録された。図１１Ａおよび１１Ｂにその結果が示されている。
【０２９８】
ここで記述した例および実施例は、単に例示することを意図しており、様々な改変または変更が本技術に係る技術者に対して提起されるであろうことや、それらがこの申請の主旨および範囲内に含まれることが理解されている。本出願で引用したすべての参考文献、特許および特許申請は、個々の参考文献、特許および特許申請が特異的におよび個々に参照に組み込まれると示されているかのように、その全体がすべての目的のために同じ範囲で参照に組み込まれる。
【０２９９】
生物物質の寄託
以下の材料は、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９，ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託された：
材料              抗体番号  ＡＴＣＣ登録番号      寄託の日付
ｐＤｂ．ＣＧＲＰ．ｈＦｃＧＩ  Ｇ１Ｈ鎖  ＰＴＡ−６８６７  ２００５年７月１５日
ｐＥｂ．ＣＧＲＰ．ｈＫＧＩ    Ｇ１Ｌ鎖  ＰＴＡ−６８６６  ２００５年７月１５日
【０３００】
ベクターＰＥＢ．ＣＧＲＰ．ＨＫＧＩは、Ｇ１  Ｌ鎖可変領域およびＬ鎖κ不変部領域をコード化しているポリヌクレオチドである。ベクターＰＤＢ．ＣＧＲＰ．ＨＦＣＧＩは、Ｇ１Ｈ鎖可変領域および下記の突然変異を含むＨ鎖ＩｇＧ２不変領域をコード化しているポリヌクレオチドである：Ａ３３０Ｐ３３１〜Ｓ３３０Ｓ３３１（野生型ＩｇＧ２配列を参照するアミノ酸番号、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４参照）。
【０３０１】
これらの寄託はＢｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  ｔｈｅｒｅｕｎｄｅｒ（ブダペスト条約）の規定の下になされた。これは寄託の生存可能な培養物を寄託日から３０年間維持することを保証する。寄託物はブダペスト条約の条項の下で、Ｒｉｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＣｏｒｐおよびＡＴＣＣ間の合意を条件として、ＡＴＣＣによって入手可能となり、これは、適切な米国特許が発行された時点、またはあらゆる米国または外国特許出願が公開された時点のどちらが先にきても、寄託物の培養物の子孫を、公衆が永続的に無制限に入手できることを保証する。そして、３５ＵＳＣ§１２２およびそれに準ずるＣＯＭＭＩＳＳＩＯＮＥＲ’Ｓ  ＲＵＬＥＳ（８８６ＯＧ６８３に特に言及している３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．１４を含む）によって、米国特許庁長官によってその権利があると決定されたものが子孫を入手できることを保証する。
【０３０２】
本発明の受託人は、寄託した材料の培養物が適切な条件下で培養されている時に死滅または失われたまたは破壊された場合、通知に基づいて直ちにもう１つの同じものと交換することに同意した。寄託した材料の入手可能性は、あらゆる政府の権威のもとでその特許法に従って授与された権利に違反して本発明を実施するライセンスとは解釈されるべきではない。
【０３０３】
抗体配列
Ｇ１重鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号１）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＷＩＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＥＩＲＳＥＳＤＡＳＡＴＨＹＡＥＡＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＬＡＹＦＤＹＧＬＡＩＱＮＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
Ｇ１軽鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号２）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＫＡＳＫＲＶＴＴＹＶＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＮＲＹＬＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＳＱＳＹＮＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
Ｇ１  ＣＤＲ  Ｈ１（伸長ＣＤＲ）（配列番号３）
ＧＦＴＦＳＮＹＷＩＳ
Ｇ１  ＣＤＲ  Ｈ２（伸長ＣＤＲ）（配列番号４）
ＥＩＲＳＥＳＤＡＳＡＴＨＹＡＥＡＶＫＧ
Ｇ１  ＣＤＲ  Ｈ３（配列番号５）
ＹＦＤＹＧＬＡＩＱＮＹ
Ｇ１  ＣＤＲ  Ｌ１（配列番号６）
ＫＡＳＫＲＶＴＴＹＶＳ
Ｇ１  ＣＤＲ  Ｌ２（配列番号７）
ＧＡＳＮＲＹＬ
Ｇ１  ＣＤＲ  Ｌ３（配列番号８）
ＳＱＳＹＮＹＰＹＴ
Ｇ１重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号９）
ＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＡＡＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＴＧＧＴＴＣＡＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＣＴＧＣＧＣＴＧＣＴＴＣＣＧＧＴＴＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡＴＣＴＣＣＴＧＧＧＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＴＣＣＧＴＴＣＣＧＡＡＴＣＣＧＡＣＧＣＧＴＣＣＧＣＴＡＣＣＣＡＴＴＡＣＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＴＧＡＣＡＡＣＧＣＴＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＧＣＴＴＡＣＴＴＴＧＡＣＴＡＣＧＧＴＣＴＧＧＣＴＡＴＣＣＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＣＣＣＴＧＧＴＴＡＣＣＧＴＴＴＣＣＴＣＣ
Ｇ１軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１０）
ＧＡＡＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＧＧＣＴＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＣＴＡＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＣＣＡＡＡＣＧＧＧＴＴＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＣＴＴＣＣＡＡＣＣＧＴＴＡＣＣＴＣＧＧＴＡＴＣＣＣＡＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＧＧＴＴＣＣＧＧＴＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＡＡＣＣＣＧＡＡＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＧＴＣＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＣＣＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ
Ｇ１重鎖完全抗体アミノ酸配列（本明細書に記載の改変ＩｇＧ２を含む）（配列番号１１）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＷＩＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＥＩＲＳＥＳＤＡＳＡＴＨＹＡＥＡＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＬＡＹＦＤＹＧＬＡＩＱＮＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
Ｇ１軽鎖完全抗体アミノ酸配列（配列番号１２）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＫＡＳＫＲＶＴＴＹＶＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＮＲＹＬＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＳＱＳＹＮＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
Ｇ１重鎖完全抗体ヌクレオチド配列（本明細書に記載の改変ＩｇＧ２を含む）（配列番号１３）
ＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＡＡＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＴＧＧＴＴＣＡＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＣＴＧＣＧＣＴＧＣＴＴＣＣＧＧＴＴＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡＴＣＴＣＣＴＧＧＧＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＴＣＣＧＴＴＣＣＧＡＡＴＣＣＧＡＣＧＣＧＴＣＣＧＣＴＡＣＣＣＡＴＴＡＣＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＴＧＡＣＡＡＣＧＣＴＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＧＣＴＴＡＣＴＴＴＧＡＣＴＡＣＧＧＴＣＴＧＧＣＴＡＴＣＣＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＣＣＣＴＧＧＴＴＡＣＣＧＴＴＴＣＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＣＣＡＣＴＧＧＣＣＣＣＡＴＧＣＴＣＣＣＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＴＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＡＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＡＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＴＧＧＡＧＡＧＡＡＡＧＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＧＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＣＣＧＧＡＣＣＡＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＡＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡＧＡＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＡＡＡＧＧＡＧＴＡＴＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＧＣＣＡＴＣＣＡＧＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＧＣＣＡＡＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＴＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＣＴＡＴＣＣＡＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＴＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＡＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＴＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＴＴＧＴＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＴＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡＧＴＡＡ
Ｇ１軽鎖完全抗体ヌクレオチド配列（配列番号１４）
ＧＡＡＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＧＧＣＴＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＣＴＡＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＣＣＡＡＡＣＧＧＧＴＴＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＣＴＴＣＣＡＡＣＣＧＴＴＡＣＣＴＣＧＧＴＡＴＣＣＣＡＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＧＧＴＴＣＣＧＧＴＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＡＡＣＣＣＧＡＡＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＧＴＣＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＣＣＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＣＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＧＣＧＣＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＴＴＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＣＧＣＧＧＴＧＡＧＴＧＣＴＡＡ
ヒトおよびラットＣＧＲＰ（ヒトα−ＣＧＲＰ（配列番号１５）；ヒトβ−ＣＧＲＰ（配列番号４３）；ラットα−ＣＧＲＰ（配列番号４１）；およびラットβ−ＣＧＲＰ（配列番号４４））のアミノ酸配列比較：
ＮＨ２−ＡＣＤＴＡＴＣＶＴＨＲＬＡＧＬＬＳＲＳＧＧＶＶＫＮＮＦＶＰＴＮＶＧＳＫＡＦ−ＣＯＮＨ２（ヒトα−ＣＧＲＰ）
ＮＨ２−ＡＣＮＴＡＴＣＶＴＨＲＬＡＧＬＬＳＲＳＧＧＭＶＫＳＮＦＶＰＴＮＶＧＳＫＡＦ−ＣＯＮＨ２（ヒトβ−ＣＧＲＰ）
ＮＨ２−ＳＣＮＴＡＴＣＶＴＨＲＬＡＧＬＬＳＲＳＧＧＶＶＫＤＮＦＶＰＴＮＶＧＳＥＡＦ−ＣＯＮＨ２（ラットα−ＣＧＲＰ）
ＮＨ２−ＳＣＮＴＡＴＣＶＴＨＲＬＡＧＬＬＳＲＳＧＧＶＶＫＤＮＦＶＰＴＮＶＧＳＫＡＦ−ＣＯＮＨ２（ラットβ−ＣＧＲＰ）
【図面の簡単な説明】
【０３０４】
【図１】１２種のマウス抗体のアラニン置換ヒトα−ＣＧＲＰフラグメントに対する結合親和性を示した図である。結合親和性は、チップ上のＣＧＲＰ上にＦａｂを送流させることにより、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて２５℃で測定された。四角で囲まれた部分の値は、親フラグメント（２５〜３７（イタリック体））と比較したアラニン変異体の親和性の減失を表示している。例外として、Ｋ３５Ａは１９〜３７の親フラグメントに由来している。「ａ」は、１９〜３７および２５〜３７フラグメントへの親和性の値が、異なるセンサーチップ上の２種類の独立した測定による平均値±標準偏差の平均値であることを表している。「Ｂ」は、これらの反応が二相性のオフレートのために単純な二分子反応モデルから逸脱していたことを表しており、そのためそれらの親和性は立体構造変化モデルを用いて決定された。グレイスケール階調：白色（１．０）は親ペプチドの親和性、明灰色（０．５未満）は親ペプチドより高い結合親和性を、暗灰色（２を超える）は親ペプチドより低い親和性を、黒色は結合がまったく認められなかったことを表している。
【図２Ａ−２Ｂ】ＣＧＲＰ８〜３７（４００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、抗体４９０１（２５ｍｇ／ｋｇ）および抗体７Ｄ１１（２５ｍｇ／ｋｇ）投与による皮膚血流への影響を、３０秒間の電気パルス刺激後の血液細胞の流束として測定した図である。ＣＧＲＰ８〜３７は電気パルス刺激３〜５分前に静脈内（ｉｖ）に投与された。抗体は電気パルス刺激７２時間前に腹腔内（ＩＰ）に投与された。グラフ中の各点はそれぞれ図に表したような条件下で処置された１匹のラットのＡＵＣを表示している。グラフ中の各線はそれぞれ図に示したような条件下で処置されたラットのＡＵＣの平均値を表示している。ＡＵＣ（血中濃度時間曲線下面積）は、Δ流束×Δ時間に等しい。「Δ流束」は電気パルス刺激後の流束単位の変化を表示しており、「Δ時間」は血液細胞流束レベルが電気パルス刺激前のレベルに戻るのに要した時間を表示している。
【図３】抗体４９０１の異なる用量（２５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の投与による皮膚血流への影響を、３０秒間の電気パルス刺激後の血液細胞の流束として測定した図である。抗体は電気パルス刺激２４時間前に静脈内（ＩＶ）に投与された。グラフ中の各点はそれぞれ図に表したような条件下で処置された１匹のラットのＡＵＣを表示している。グラフ中の各線はそれぞれ図に示したような条件下で処置されたラットのＡＵＣの平均値を表示している。
【図４Ａ−４Ｂ】抗体４９０１（１ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）、抗体７Ｅ９（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）および抗体８Ｂ６（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）投与による皮膚血流への影響を、３０秒間の電気パルス刺激後の血液細胞の流束として測定した図である。抗体は静脈内（ｉ．ｖ）に投与され、抗体投与３０、６０、９０および１２０分後に電気パルス刺激が行われた。Ｙ軸は抗体をまったく投与しなかった場合（時間０分）のＡＵＣレベルと比較したＡＵＣの割合を表示している。Ｘ軸は抗体投与から電気パルス刺激までの時間（分）を表示している。「＊」は時間０分時の値と比較した場合のＰ＜０．０５を、「＊＊」はＰ＜０．０１を表示している。データはダネット多重比較検定を用いて一元配置分散分析で解析が行われた。
【図５】抗体Ｇ１の重鎖可変領域（配列番号１）および軽鎖可変領域（配列番号２）のアミノ酸配列の図である。ＫａｂａｔのＣＤＲは太字で書かれ、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲには下腺が付されている。重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸残基には順次番号が付されている。
【図６】Ｂｉａｃｏｒｅを使用したペプチド競合による抗体Ｇ１のエピトープマッピングの図である。Ｎ−ビオチン化ヒトα−ＣＧＲＰはＳＡセンサーチップ上で捕捉された。Ｇ１Ｆａｂ（５０ｎＭ）は、競合ペプチド非存在下で、または１０ｕＭの競合ペプチドと１時間事前にインキュベートされた後、チップ上に送流された。チップ上でのＧ１Ｆａｂのヒトα−ＣＧＲＰへの結合を測定した。Ｙ軸は、競合ペプチド非存在下での結合と比較した、競合ペプチドの存在下で阻止された結合の割合を表示している。
【図７】抗体Ｇ１投与（１ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）または媒体（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ）の皮膚血流への影響を、３０秒間の電気パルス刺激後の血液細胞の流束として測定した図である。抗体Ｇ１および媒体が静脈内（ｉ．ｖ．）に投与され、抗体投与３０、６０、９０および１２０分後に神経電気パルス刺激が行われた。Ｙ軸は、抗体がまったく投与されていないまたは媒体（１００％と定義されている）が投与された時点（時間０分）のＡＵＣレベルと比較したＡＵＣの割合を表示している。Ｘ軸は、抗体投与から電気パルス刺激までの時間（分）を表示している。「＊」は媒体と比較した場合のＰ＜０．０５を、「＊＊」はＰ＜０．０１を表示している。データは二元配置分散分析およびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後分析を用いて解析された。
【図８Ａ】Ｇ１抗体（１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）または媒体（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ）投与の皮膚血流への影響を、投薬後２４時間で行われた３０秒間の電気パルス刺激後、血液細胞の流束として測定した図である。抗体Ｇ１または媒体は、神経の電気パルス刺激の２４時間前に静脈内（ｉ．ｖ．）に投与された。Ｙ軸は、血中濃度時間曲線下面積を表示している（血液細胞流束の変化×電気パルス刺激から血液細胞の流束がベースラインに戻るまでの時間の変化、ＡＵＣ）。Ｘ軸は、抗体Ｇ１の異なる投与量を表示している。「＊」は媒体と比較した場合のＰ＜０．０５を、「＊＊」はＰ＜０．０１を表示している。データは、一元配置分散分析およびダネット多重比較検定を用いて分析された。
【図８Ｂ】抗体Ｇ１（０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ）または媒体（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ）投与の皮膚血流への影響を、投薬７日後での３０秒間の電気パルス刺激後に、血液細胞の流束として測定した図である。抗体Ｇ１または媒体は、神経の電気パルス刺激の７日前に静脈内（ｉ．ｖ．）に投与された。Ｙ軸は、ｔｏｔａｌＡＵＣを表示している。Ｘ軸は抗体Ｇ１の異なる投薬量を表示している。「＊＊」は媒体と比較した場合のＰ＜０．０１を、「＊＊＊」はＰ＜０．００１を表示している。データは、一元配置分散分析およびダネット多重比較検定を用いて解析された。
【図８Ｃ】図８Ａおよび８Ｂからのデータの曲線適合解析の図である。抗体Ｇ１または媒体は、神経の電気パルス刺激の２４時間前または７日前のいずれかに静脈内（ｉ．ｖ．）に投与された。Ｙ軸は、ｔｏｔａｌＡＵＣを表示し、Ｘ軸は、ＥＣ５０を決定するために、抗体Ｇ１の変動容量をｍｇ／ｋｇ単位で対数目盛で表示している。
【図９】抗体ｍｕ７Ｅ９（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＢＩＢＮ４０９６ＢＳまたは媒体（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ）の、電場刺激後の中硬膜動脈の直径の変化に対する影響を示した図である。抗体ｍｕ７Ｅ９、ＢＩＢＮ４０９６ＢＳまたは媒体は、電場刺激後に対するベースラインの反応が確立された後、０分時点に静脈内（ｉ．ｖ．）に投与を行った。Ｙ軸は、電場刺激後の中硬膜動脈の直径の変化を表示している。安静時の直径は０％に相当する。Ｘ軸は電気パルス刺激の時間（分）を表示している。「＊」は媒体と比較した場合のＰ＜０．０５を、「＊＊」はＰ＜０．０１を表示している。データは、一元配置分散分析およびダネット多重比較検定を用いて解析された。
【図１０】抗体Ｇ１（１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）または媒体（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ）の、電場刺激後の中硬膜動脈の直径の変化に対する影響を示した図である。抗体Ｇ１または媒体は、電場刺激の７日前に静脈内（ｉ．ｖ．）に投与された。Ｙ軸は、中硬膜動脈の直径の変化を表示している。安静時の直径が０％に相当する。Ｘ軸は刺激電圧を表示している。「＊」は媒体と比較した場合のＰ＜０．０５を、「＊＊」はＰ＜０．０１を、「＊＊＊」はＰ＜０．００１を表示している。データは、二元配置分散分析およびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後分析を用いて分析された。
【図１１Ａ】２４時間前に静脈内（ｉ．ｖ．）に投与された抗体ｍｕ４９０１（１０  ＭＧ／ＫＧ）または媒体（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ）の、モルヒネ中毒のラットにおけるナロキソン（１ｍｇ／ｋｇ）の皮下投与に誘導された中核体温の低下に対する影響を示した図である。Ｙ軸は、ベースラインからの体温の違いを表示している。Ｘ軸は、ナロキソンの投与時点から測った時間を表示している。
【図１１Ｂ】２４時間前に静脈内（ｉ．ｖ．）に投与された抗体ｍｕ４９０１（１０ｍｇ／ｋｇ）または媒体（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ）の、モルヒネ中毒のラットにおけるナロキソン（１ｍｇ／ｋｇ）の皮下投与に誘導された尾表面体温の上昇に対する影響を示した図である。Ｙ軸は、ベースラインからの体温の違いを表示している。Ｘ軸は、ナロキソンの投与時点から測った時間を表示している。
【０３０５】
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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