(57)【要約】  本発明は、インビトロまたはエクスビボでヒト骨髄幹細胞から、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞、およびそれらを含む細胞集団を得る方法であって、該骨髄幹細胞を、ヒト血清または血漿および、増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体に接触させるステップを含む方法を提供する。さらに、本発明は、新規な骨芽前駆細胞または骨芽細胞表現型細胞型、およびそれらを含む細胞集団を提供するが、その際、該細胞集団は、好ましくは内皮細胞または前駆体などの細胞型をさらに含みうる。関連する態様では、本発明は、特に治療、好ましくは骨治療の分野における上記方法の使用、その方法を使用して得られる細胞および細胞集団の使用、ならびに具体的に本明細書に記載した細胞型および細胞集団の使用を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロまたはエクスビボでヒト骨髄幹細胞から、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、もしくは骨芽細胞表現型細胞を得る方法、または前記細胞を含む細胞集団を得る方法であって、該骨髄幹細胞を、ヒト血清または血漿、および塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−ｂ、ＦＧＦ−２）またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体に接触させるステップを含む方法。
【請求項２】
該ヒト血漿または血清が、骨髄幹細胞に対して自家性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該骨髄幹細胞が、非ヒト動物から得られた、血清成分などのいかなる物質にも接触しない、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
該骨髄幹細胞が、ヒト対象の生物試料、好ましくは該対象の骨髄試料から得られる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該ヒト対象が、骨関連疾患の危険にさらされているか、または同疾患を有している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）ＢＭＳＣを含むヒト対象の生物試料、好ましくは骨髄試料から細胞を回収する；
（ｂ）例えば好適な密度勾配遠心分離法または他の方法を使用して、（ａ）で回収した該細胞から単核細胞を任意に単離する；
（ｃ）ヒト血漿または血清および、ＦＧＦ−２またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体を含む培地に、（ａ）または好ましくは（ｂ）の細胞を加え、該細胞−培地混合物を培養して、例えば基板表面、例えば培養容器などのガラスまたはプラスチック表面に細胞を接着させる；
（ｄ）非接着物質を除去し、さらに（ｃ）で定義した該培地で接着細胞を培養して、例えば、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、もしくは骨芽細胞様細胞、またはそれらを含む細胞集団が得られるようにする；
ステップを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
（ｅ）培養１２〜１６日目に、好ましくは約１４日目に（ｄ）で得られた細胞または細胞集団を採取するステップを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（ｅ）培養１２〜１６日目に、好ましくは１４日目に（ｄ）の該細胞または細胞集団を継代培養し、さらに該継代培養した細胞または細胞集団を培養し、および培養１８〜２４日目、好ましくは約２１日目に、該細胞または細胞集団を採取するステップを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＦＧＦ−２またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体が、１０ng/mlより低い濃度、好ましくは５ng/mlより低い濃度、さらにいっそう好ましくは１、２、３、４、または５ng/mlの濃度で含まれる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかの方法によって得られる、ヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞もしくは骨芽細胞表現型細胞、またはそれらを含む単離細胞集団。
【請求項１１】
ヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞を少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、そしてより好ましくは少なくとも９５%を含む、請求項１０で定義した単離細胞集団。
【請求項１２】
内皮様細胞を２０%未満、好ましくは１０%未満、より好ましくは５%未満含む、請求項１０または１１のいずれかで定義した単離細胞集団。
【請求項１３】
（１）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、より具体的には骨−肝臓−腎臓型ＡＬＰ、プロコラーゲン１型アミノ末端プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）、および骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）から選択した少なくとも一種の骨芽細胞マーカーを、（２）ＣＤ６３およびＣＤ１６６から選択した少なくとも一種の幹細胞／未成熟骨芽前駆細胞マーカーとともに、同時発現することを特徴とする、ヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞。
【請求項１４】
以下の事象：
−該細胞がオステオカルシン（ＯＣＮ）に陰性である；
−該細胞がＣＤ３４に陽性である；
−該細胞がＣＤ９０、ＣＤ７３、およびＣＤ１０５のいずれか１個、２個、または全３個に陽性である；
−該細胞がＣＤ４５、ＣＤ１９、およびＣＤ１４のいずれか１個、２個、または全３個に陰性である；
−該細胞がＣＤ１３３に陰性である；
のいずれか１つ、複数、または全てに当てはまる、請求項１３に記載の骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞。
【請求項１５】
以下の事象：
−該細胞を骨形成培地に曝露すると、該細胞がその外部環境を石灰化し、またはカルシウム含有細胞外マトリックスを合成することができる；
−該細胞が、脂肪細胞系統の細胞または軟骨細胞系統の細胞のどちらか一つに、好ましくはどちらにも実質的に分化しない；
のいずれか１つまたは両方に当てはまる、請求項１３または１４のいずれかに記載の骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞。
【請求項１６】
（１）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、より具体的には骨−肝臓−腎臓型ＡＬＰ、プロコラーゲン１型アミノ末端プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）、および骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）から選択した少なくとも一種の骨芽細胞マーカーを、（２）造血／内皮前駆体マーカーＣＤ３４とともに、同時発現することを特徴とする、ヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞。
【請求項１７】
以下の事象：
−該細胞がオステオカルシン（ＯＣＮ）に陰性である；
−該細胞がＣＤ６３に陽性である；
−該細胞がＣＤ１６６に陽性である；
−該細胞がＣＤ９０、ＣＤ７３、およびＣＤ１０５のいずれか１個、２個、または全３個に陽性である；
−該細胞がＣＤ４５、ＣＤ１９、およびＣＤ１４のいずれか１個、２個、または全３個に陰性である；
−該細胞がＣＤ１３３に陰性である；
のいずれか１つ、複数、または全てに当てはまる、請求項１６に記載の骨芽前駆細胞または骨芽細胞表現型細胞。
【請求項１８】
以下の事象：
−該細胞を骨形成培地に曝露すると、該細胞がその外部環境を石灰化し、またはカルシウム含有細胞外マトリックスを合成することができる；
−該細胞が、脂肪細胞系統の細胞または軟骨細胞系統の細胞のどちらか一つに、好ましくはどちらにも実質的に分化しない；
のいずれか１つまたは両方に当てはまる、請求項１６または１７のいずれかに記載の骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞。
【請求項１９】
請求項１３〜１５のいずれかに記載の骨芽前駆細胞、骨芽細胞、もしくは骨芽細胞表現型細胞、および／または請求項１６〜１８のいずれかに記載の骨芽前駆細胞、骨芽細胞、もしくは骨芽細胞表現型細胞を好ましくは少なくとも７０%、より好ましくは少なくとも８０%、さらにより好ましくは少なくとも９０%、ならびにさらにいっそう好ましくは少なくとも９５%含む、請求項１３〜１５のいずれかに記載の骨芽前駆細胞、骨芽細胞、もしくは骨芽細胞表現型細胞、および／または請求項１６〜１８のいずれかに記載の骨芽前駆細胞、骨芽細胞、もしくは骨芽細胞表現型細胞を含む細胞集団。
【請求項２０】
さらに、内皮細胞またはその前駆体を含む、請求項１９で定義した細胞集団。
【請求項２１】
該内皮細胞または前駆体が、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）、ＶＥＧＦ、およびＣＤ１３３の少なくとも１個、少なくとも２個、または全３個を発現し、好ましくはＣＤ３４陽性である、請求項２０で定義した細胞集団。
【請求項２２】
該内皮細胞またはその前駆体を１０%未満、好ましくは５%未満、または２%未満含む、請求項の２０または２１のいずれかで定義した細胞集団。
【請求項２３】
治療に使用するための、請求項１０もしくは１３〜１８のいずれかで定義した細胞、または請求項１０、１１、１２もしくは１９〜２２のいずれかで定義した細胞集団。
【請求項２４】
骨関連疾患を治療する薬剤を製造するための、請求項１０もしくは１３〜１８のいずれかで定義した細胞、または請求項１０、１１、１２もしくは１９〜２２のいずれかで定義した細胞集団の使用。
【請求項２５】
骨病変部位に、請求項１０もしくは１３〜１８のいずれかで定義した細胞、または請求項１０、１１、１２もしくは１９〜２２のいずれかで定義した細胞集団を投与する、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
請求項１０もしくは１３〜１８のいずれかで定義した細胞、または請求項１０、１１、１２もしくは１９〜２２のいずれかで定義した細胞集団を含み、骨病変部位に該細胞または単離細胞集団を投与するのに適している、医薬組成物。
【請求項２７】
骨病変部位に組成物を投与するための手術道具を含み、およびさらに請求項２６に記載の医薬組成物を含む装置であって、該骨病変部位に該医薬組成物を投与するのに適している装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ある態様では、本発明は、骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）を骨形成的に、そして好ましくは少なくとも部分的に、内皮的にも分化させるインビトロ法またはエクスビボ法、ならびにそのように分化した細胞の応用に関する。別の態様では、本発明は、既に開示されている骨前駆細胞および骨芽細胞に類似するが、それよりも新規な特性を示す細胞の特定の型および集団に関する。関連する態様では、本発明は、特に治療、好ましくは骨治療の分野における上記方法の使用、その方法を使用して得られる細胞および細胞集団の使用、ならびに具体的に本明細書に記載した細胞型および細胞集団の使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
重篤な骨形成不全症小児において、同種骨髄移植の実現可能性は実証されている（非特許文献１）。その研究では、機能性の髄由来間葉系細胞が移植され、新規な高密度骨の形成に寄与し、移植した細胞が骨生成骨芽細胞に分化したことが示された。また、自家骨髄移植は、上腕頭の骨壊死を患う患者でも報告された（非特許文献２）。従って、特に新規な骨の生成が必要な治療の場合、骨分化することができる幹細胞、または骨分化に関与している細胞の移植は、骨関連疾患の治療の有望な手段であろう。
【０００３】
従って、骨関連疾患の治療法として移植に適切な細胞、特に自家細胞を十分な量で提供する効率的技術に対しては大きなニーズがある。
【０００４】
未分化の骨髄幹細胞も移植しうるが、これらの細胞はまだ骨形成系統に関与しておらず、従って移植した幹細胞の相当な比率が、骨組織の形成に最終的に寄与しない可能性がある。さらに、骨髄幹細胞のインビトロ培養によって、骨髄幹細胞をＦＧＦ−２などの増殖因子で処理したとき、その増殖能および分化を受けうるその能力が低下することが実証されている（非特許文献３）。例えば、その研究では、インビトロ培養した骨髄幹細胞の骨形成効率は、一回継代ですら、新たに単離した骨髄と比較して３６分の１に減少した。従って、骨髄幹細胞をインビトロ増殖すると、移植での骨形成骨芽細胞の供給源としてのその効率が減少する恐れがある。
【０００５】
Martinら（非特許文献４）は、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）成分と組み合せて、線維芽細胞増殖因子２型（ＦＧＦ−２）の存在下で骨髄幹細胞をインビトロ培養すると、たとえ細胞が特異的骨形成培養条件下でインビトロ骨分化を受ける受容能があっても、細胞は未成熟状態（低アルカリホスファターゼおよび線維芽細胞様形態）に保たれることを示している。しかしながら、該未成熟細胞の骨生成骨芽細胞へのインビボにおける分化は、依然として移植と同時に適切なシグナルが供給されるかどうかにかかっている。従って、該細胞は、インビトロで骨分化できるかもしれないが、その相当な割合は、依然としてインビボで骨芽細胞にはならないかもしれない。また、Chaudharyら（非特許文献５）には、ＦＧＦ−２で処理したヒト骨髄幹細胞は、いかなる骨形成表現型も示さず（アルカリホスファターゼは発現せず）、実際、異栄養性形態を有することが示されている。同様に、Kalajzicら（非特許文献６）は、ＦＧＦ−２が骨分化を阻害することを示している。
【０００６】
加えて、ヒト治療で使用する物質の調製に、培地に非ヒト動物成分、例えば血清成分（ＦＣＳなど）を使用することは避けるべきである。しかし、Kuznetsovら（非特許文献７）が示すように、相同または自家ヒト血清を使用すると、ヒト骨髄幹細胞が、コロニーを形成し、インビトロで増殖し、そしてインビボで骨を形成する能力が著しく減少する。従って、Kuznetsovらは、ＦＣＳの使用が、骨髄幹細胞の効率的増殖とその骨形成能力の前提条件であることを示唆している。
【０００７】
Takagiら （非特許文献８）は、特定の条件下、ＦＧＦ−２を補充したドナー血清でヒト骨髄液をインキュベートした。２００３年、Takagiらが、そのようにして得た細胞集団は、潜在的軟骨分化能を示しただけであり、従って細胞集団を著者らは軟骨の再生に使用することを企図した。
【０００８】
Kobayashiら（非特許文献９）は、自家ドナー血清中で、ヒトＢＭＳＣを単離し維持するための特定の条件について記載し、こうした条件によって、ヒトＢＭＳＣは、その多分化能を保存しながら、十分にエクスビボ増殖しうると結論付けた。２００５年、Kobayashiらは、分化させずにさらにＢＭＳＣの増殖を促進するために、二次培養でＦＧＦ−２を使用している。その著者らは、それらの細胞を骨芽前駆細胞もしくは骨芽細胞表現型細胞に向けて成長させる条件については開示していない。
【０００９】
Linら （非特許文献１０）は、自家ドナー血清中での多分化能ヒトＢＭＳＣの増殖時間の延長を報告した。一定の条件下では、細胞にＦＧＦ−２およびＥＧＦを添加しても、細胞増殖は影響を受けず、骨形成の宿命に向けて細胞を成長させることはなかった。
【００１０】
最大の骨形成を与えるためには、既に骨芽細胞の表現型を示している細胞を移植することが望ましいであろう。該細胞は、本質的に、骨形成活性が実証されている唯一の細胞であるからである。しかしながら、インビトロでの骨髄幹細胞の骨芽細胞への分化には、骨形成培地での培養が伴い（非特許文献１１）、インビトロでの該細胞の増殖が低下する恐れがある。さらに、骨形成培地の使用には、細胞にそれ以上の成分を加える必要があり、細胞培養汚染の危険性が増大しかねない。
【非特許文献１】Horwitz et al. 1999. Nat Med 5(3): 309-13
【非特許文献２】Hernigou et al. 1997. J Bone Joint Surg Am 79:1726-1730
【非特許文献３】Banfi et al. 2000. Exp Hematol 28: 707-15
【非特許文献４】Martin et al. Endocrinology 138: 4456-4462, 1997
【非特許文献５】Chaudhary et al. Bone 34: 402-11, 2004
【非特許文献６】Kalajzic et al. J Cell Biochem 88: 1168-76, 2003
【非特許文献７】Kuznetsov et al. Transplantation 70: 1780-1787, 2000
【非特許文献８】Takagi et al. 2003 Cytotechnology 43: 89-96
【非特許文献９】Kobayashi et al. 2005 J Bone Joint Surg Br 87: 1426-3
【非特許文献１０】Lin et al. 2005 Transplant Proc 37: 4504-5
【非特許文献１１】Jaiswal et al. 1997. J Cell Biochem 64: 295-312
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、細胞の高増殖能を維持し、自家性条件を確実にし、細胞培養に関与する成分の数を最小にする一方で、インビトロでヒト成体幹細胞、特にヒト骨髄幹細胞から、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞を生成するための単純で確実な方法に対するニーズが当技術分野にはある。
【００１２】
さらに、特異的で有用な、例えば骨治療という状況で有用な特性を有する骨芽前駆細胞または骨芽細胞様細胞に対する、および該細胞を含む細胞集団に対するニーズが当技術分野にはある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、上記および従来技術の他の問題に対処する。
【００１４】
特に、本発明者らは、本明細書に開示した培養条件を使用し、有利にはヒト起源の成体幹細胞、特に骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）はエクスビボで容易に増殖でき、有用な骨芽前駆細胞または骨芽細胞表現型、ならびにそれらを含む有用な細胞集団および他の表現型、に対して向けられ得ることに気づいた。
【００１５】
従って、一態様では、本発明は、インビトロまたはエクスビボでヒト骨髄幹細胞から、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞を得る方法であって、該骨髄幹細胞に、ヒト血漿または血清、および増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体を接触させるステップを含む方法に関する。
【００１６】
本発明者らは、本発明の方法によって、曝露した幹細胞のかなりの画分、例えば、大半を骨芽前駆細胞または骨芽細胞表現型に分化できるということを観察した。従って、一態様では、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞それ自体を得るために、本発明の方法を使用することができる。
【００１７】
とはいえ、当然のことながら、一般的には、本発明の方法によって、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞を含む細胞集団、通常、該細胞をかなりの割合、例えば大部分を含む集団が生成される。本発明者らはまた、本方法から得られた細胞集団は、それ以上の細胞型を含んでよく、それらの少なくともいくつかは、 該集団中に存在する骨芽前駆細胞または骨芽細胞表現型細胞の有用な特性を、特に骨治療と関連して増大できるということに気づいた。例えば、一実施形態では、本発明の方法から得られた細胞集団は、内皮細胞または内皮前駆体も含んでよい。
【００１８】
従って、一態様では、本発明は、インビトロまたはエクスビボでヒト骨髄幹細胞から、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞を含む細胞集団を得る方法であって、該骨髄幹細胞に、ヒト血漿または血清、および増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体を接触させるステップを含む方法に関する。
【００１９】
実験証拠によって示すように、本発明の方法は、３週間、より詳しくは２１日間かけて、骨髄幹細胞を４０，０００〜７１０，０００倍に増殖しうる。ヒト血清の使用は、ヒト骨髄幹細胞の増殖を顕著に減少させると説く従来技術（Kuznetsovら，2000）を考慮すると、該高度増殖は驚くべきことである。従って、本発明は、移植を目的として多数の細胞を生成できるようになる。これは、幹細胞を提供するために被験者から取り出さなければならない骨髄の試料サイズを有利に減少させる。さらに、分化した細胞を患者に移植できるようになると、本発明によって時間短縮が可能になり、従って結果的に治療が迅速化される。
【００２０】
好ましい実施形態では、本方法は、線維芽細胞増殖因子、特にＦＧＦ−ｂ、すなわちＦＧＦ−２を使用する。ＦＧＦ−２が、骨髄幹細胞のより未成熟な表現型の原因であると説く従来技術（Martinら，1997、Kalajzicら，2003）を考慮すると、ヒト血漿または血清成分と組み合せてＦＧＦ−２を使用することによって、骨髄幹細胞の分化が刺激され、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞の表現型特性が得られるということは驚くべきことである。
【００２１】
従って、本方法は、別々に使用した場合、反対効果をもたらすことが従来技術で知られている要素を組み合わせることによって、予想外の有利な効果−高増殖および骨芽細胞表現型−をもたらす。さらにいっそう際立つことには、従来技術は、インビトロで骨芽細胞へ分化させるには、デキサメタゾン（dexamethasone）、アスコルビン酸ホスフェート（ascorbic acid phosphate）、およびβ−グリセロールホスフェート（beta-glycerolphosphate）などの成分を含む骨形成培地が必要であると説いた。驚くべきことに、本発明は、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞を得るのに、該成分を必要としないことを示している。従って、培地中の成分の数は有利に減少し、結果として過誤もしくは汚染、または移植による該成分の持ち越し汚染、の確率も低下するであろう。
【００２２】
さらに好ましい実施形態では、本方法は、骨髄幹細胞に対して自家性であるヒト血漿もしくは血清を使用し、および／または骨髄幹細胞の培養中にいかなる非ヒト動物性物質（血清成分など）も含まない。これは、例えば、得られた細胞が拒絶される危険性を減少し、および／または病原体による汚染の危険性を減少させることによって、本方法をヒト治療で使用するのに特に有利なものにする。
【００２３】
本方法のさらに好ましい実施形態では、他の特徴、例えば、それだけには限定されないが、インキュベーション回数、継代、成分量などが定義されるが、それらは単独でまたは組み合わさって、さらに本方法と従来技術とを明確に分け、そして例えば骨移植における優位性という有利な特徴を細胞および細胞集団にもたらす基礎となる。
【００２４】
本発明者らは、本発明の方法を使用して得られる骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞、および細胞集団が、従来技術に勝る典型的な利点を示すことに気づいた。第一に、少なくともエクスビボで培養中、該細胞は、推定倍加時間が約２日という高増殖速度を示す。従って、比較的短時間内に十分な細胞数を生成することができ、それは患者治療期間を有利に制限する。第二に、該細胞は、基板の石灰化速度が比較的速く、それによって患者に細胞を移植後、骨形成が促進される。第三に、その細胞は、他の間葉系表現型へ、特に脂肪細胞または軟骨細胞へ分化する性向をほとんど、または実質的に全く示さない。これにより、その細胞を移植したとき、骨以外の組織の形成を有利に制限できる。
【００２５】
従って、他の態様では、本発明は、本発明の方法を使用して得られる、または直接得られた骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞、かつ細胞集団、およびそれらを含む培養物を提供し、さらに骨関連疾患におけるそれらの治療的使用、および骨関連疾患に対応するそれらを含む医薬製剤もまた提供する。
【００２６】
本発明のそれ以上の開発では、治療、特に骨移植治療において特定の優位性を提供しうる、新たな骨形成細胞型およびそれらを含む新規な細胞集団を定義するために、本発明者らは、本発明の方法を実施して得られた細胞および細胞集団を詳細に分析した。従って、本発明は、該新規な細胞型、それらを含む集団、および特に骨治療におけるその使用も企図している。
【００２７】
従って、一態様では、本発明は、（１）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、より具体的には骨−肝臓−腎臓型ＡＬＰ、プロコラーゲン１型アミノ末端プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）、および骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）から選択した少なくとも一種の骨芽細胞マーカーを、（２）ＣＤ６３（例えば、抗体ＨＯＰ−２６によって認識される、Zannettinoら，2003. J Cell Biochem. 89: 56-66を参照）およびＣＤ１６６から選択した少なくとも１個の幹細胞／未成熟骨芽前駆細胞マーカーと共に、同時発現することを特徴とする、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞（本明細書では「ＯＯＰ−１細胞」）を提供する。（１）に基づいて、好ましい一実施形態では、該ＯＯＰ−１細胞は、少なくともＡＬＰを発現し、さらに好ましい一実施形態では、該ＯＯＰ−１細胞は、ＡＬＰ、Ｐ１ＮＰ、およびＢＳＰから選択した少なくとも２種のマーカー、例えば少なくともＡＬＰとＰ１ＮＰ、少なくともＡＬＰとＢＳＰ、または少なくともＰ１ＮＰとＢＳＰを発現し、よりさらに好ましい実施形態では、該ＯＯＰ−１細胞は、ＡＬＰ、ＢＳＰ、およびＰ１ＮＰの少なくとも全３個を発現することができる。（２）に基づいて、好ましい一実施形態では、該ＯＯＰ−１細胞は、少なくともＣＤ６３を発現し、別の好ましい実施形態では、該ＯＯＰ−１細胞は、少なくともＣＤ１６６を発現し、さらに好ましい一実施形態では、該ＯＯＰ−１細胞は、少なくともＣＤ６３とＣＤ１６６を発現することができる。
【００２８】
本発明者らが知る限りでは、従来技術は、ＡＬＰ、Ｐ１ＮＰ、およびＢＳＰが陰性であったとき、幹細胞／未成熟骨芽前駆細胞中にＣＤ６３および／またはＣＤ１６６を観察したのみであった。従来技術の該ＣＤ６３および／またはＣＤ１６６陽性細胞は多分化能を示し、軟骨細胞、脂肪細胞、および骨芽細胞に分化することもあり得た。従って、ＡＬＰ、Ｐ１ＮＰ、またはＢＳＰの少なくとも１個が、ＣＤ６３および／またはＣＤ１６６と同時存在にすることは、今までに開示されていない新規な細胞型として、本発明の骨芽前駆細胞または骨芽細胞表現型細胞（ＯＯＰ−１細胞）を特徴付ける。さらに、この新規な細胞型は、高増殖速度、高石灰化速度、ならびに軟骨細胞および脂肪細胞へ分化する性向の実質的欠除という有利な特性の少なくともいくつかを示し、それは例えば骨治療という状況で特に有用である。
【００２９】
好ましい実施形態では、該骨芽前駆細胞または骨芽細胞表現型細胞（ＯＯＰ−１細胞）は、オステオカルシン（ＯＣＮ）に陰性である。ＯＣＮが、成熟骨芽細胞中で優先的に発現するようになることは当技術分野で知られている。従って、ＯＣＮの発現の欠除は、これらの細胞の成熟特性が低いことを意味する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、（１）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、より具体的には骨−肝臓−腎臓型ＡＬＰ、プロコラーゲン１型アミノ末端プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）、および骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）から選択した少なくとも一種の骨芽細胞マーカーと、（２）造血／内皮前駆体マーカーＣＤ３４と共に同時発現し、すなわち、これらに対して陽性であることを特徴とする、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞（本明細書では「ＯＯＰ−２細胞」）を提供する。（１）に基づいて、好ましい実施形態では、該ＯＯＰ−２細胞は、少なくともＡＬＰを発現し、さらに好ましい実施形態では、該ＯＯＰ−２細胞は、ＡＬＰ、Ｐ１ＮＰ、およびＢＳＰから選択した少なくとも２個のマーカー、例えば少なくともＡＬＰとＰ１ＮＰ、少なくともＡＬＰとＢＳＰ、または少なくともＰ１ＮＰとＢＳＰを発現し、よりさらに好ましい実施形態では、該ＯＯＰ−２細胞は、ＡＬＰ、ＢＳＰ、およびＰ１ＮＰの少なくとも全３個を発現することができる。
【００３１】
本発明者らが知る限りでは、ＣＤ３４を発現する骨芽前駆細胞または骨芽細胞表現型細胞は、今まで記載されたことがなく、かつＣＤ３４の欠除は、通常、骨髄間葉系幹細胞の特徴の一つと考えられる。従って、ＡＬＰ、Ｐ１ＮＰ、またはＢＳＰの少なくとも１個とＣＤ３４とが同時に存在することは、今までに開示されていない新規な細胞型として、本発明の骨芽前駆細胞または骨芽細胞表現型細胞（ＯＯＰ−２細胞）を特徴付ける。さらに、この新規な細胞型は、有利な特性、例えば、高増殖速度、高石灰化速度、および軟骨細胞および脂肪細胞へ分化する性向の実質的欠除という特性の少なくともいくつかを示し、それは例えば骨治療という状況で特に有用である。
【００３２】
好ましい実施形態では、該骨芽前駆細胞または骨芽細胞表現型細胞（ＯＯＰ−２細胞）は、オステオカルシン（ＯＣＮ）に陰性である。ＯＣＮは、成熟骨芽細胞で優先的に発現するようになることは当技術分野で知られている。従って、ＯＣＮの発現の欠除は、これらの細胞の成熟特性が低いことを意味する。
【００３３】
本発明者らはまた、上記の本発明の骨芽前駆細胞または骨芽細胞型間の重複を企図している。例えば、いくつかの実施形態では、ＯＯＰ−１細胞は、さらにＣＤ３４を同時発現しうる。他の実施形態では、ＯＯＰ−２細胞は、さらにＣＤ６３およびＣＤ１６６の少なくとも１個、例えば、片方もしくは両方を発現しうる。
【００３４】
記載したように、本発明は、さらに、上記の本発明の骨芽前駆細胞または骨芽細胞表現型細胞を含む細胞集団、例えば、上述したＯＯＰ−１および／またはＯＯＰ−２細胞型を含む細胞集団を包含する。典型的な細胞集団は、ＯＯＰ−１および／またはＯＯＰ−２細胞型を少なくとも１０%、好ましくは少なくとも３０%、より好ましくは少なくとも５０%、例えば少なくとも６０%、さらにより好ましくは少なくとも７０%、例えば少なくとも８０%、そしてなおより好ましくは少なくとも９０%、例えば少なくとも９５%含むであろう。好ましい実施形態では、細胞集団は、上記のＯＯＰ−１および／またはＯＯＰ−２細胞型以外の細胞型を５０%未満、好ましくは４０%未満、さらにいっそう好ましくは３０%未満、さらにより好ましくは２０%未満、よりさらに好ましくは１０%未満、例えば７%未満、５%未満、または２%未満含むであろう。
【００３５】
好ましい実施形態では、該細胞集団は、内皮細胞またはその前駆体を含みうる。好ましくは、該内皮細胞または前駆体は、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）、ＶＥＧＦおよびＣＤ１３３の少なくとも１個、例えば少なくとも２個、または少なくとも全３個を発現しうる。別の実施形態では、該内皮細胞は、ＣＤ３４も同時発現することができる。
【００３６】
有利なことに、本発明の骨芽前駆細胞または骨芽細胞表現型細胞と一緒に、細胞集団中に該内皮細胞またはその前駆体が存在することが、おそらくそれだけには限定されないが、移植した細胞および組織を支持し、酸素添加する血管形成を刺激すること、および／または例えばＶＥＧＦなどの増殖因子を放出することによって、患者において該骨形成系統細胞の移植を改善しうることを本発明者らは気づいた。
【００３７】
関連する態様では、本発明は、先に定義した細胞および細胞集団を含む医薬製剤、ならびにその治療的使用を提供する。
【００３８】
本発明のこれらの特徴および他の特徴を以下本明細書および添付の特許請求の範囲にさらに説明し、かつ非限定的な例によって例示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本明細書で使用する通り、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈上、明瞭に別段の指示がない限り、単数および複数の指示物を含む。例として、「細胞」は、１個または１個を超える細胞をさす。
【００４０】
本明細書で使用する「含む（comprising）」、「含む（comprises）」および「含む（comprised of）」という用語は、「含む（including）」、「含む（includes）」または「含む（containing）」、「含む（contains）」と同義であり、包括的もしくは非制限的であり、付加的な列挙しない構成物、要素、または方法ステップを排除しない。
【００４１】
評価項目による数値範囲の記述は、記載した評価項目ばかりでなく、その範囲内に包含される全数値および分数を含む。
【００４２】
本明細書で使用する「約」という用語は、測定可能な値、例えば、パラメーター、量、時間長などをさす場合、明記した値から＋／−２０%以下、好ましくは＋／−１０%以下、より好ましくは＋／−５%以下、さらにいっそう好ましくは＋／−１%以下、よりさらに好ましくは＋／−０．１%以下の変動を包含することを意味するが、ただし該変動が開示した発明で実施するのに適切である限りにおいてである。
【００４３】
本明細書に引用した全ての文書は、これによりすべて参照によって援用される。特に、具体的に言及した本明細書のすべての文書の教示は参照によって援用される。
【００４４】
別段の定義が無い限り、技術用語および科学用語含め、本発明を開示する際に使用する全ての用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されている意味を有する。
【００４５】
１．発明の方法
発明の開示の節に詳述した通り、一態様では、本発明は、インビトロまたはエクスビボでヒト骨髄幹細胞から、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞を得る方法、および骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞を含む細胞集団を得る方法であって、骨髄幹細胞を、ヒト血漿または血清、および増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体に接触させるステップを含む方法に関する。
【００４６】
骨髄は、長骨の骨髄腔、数本のハバース管、および海綿状骨もしくは海綿質骨間の空間を占有する柔組織である。従来から２つの型の骨髄が識別されている。赤、これは若年期の全ての骨と、成人期の限定された場所（例えば海綿質骨）に見出され、主として血液細胞の生成（造血）に関与する。そして黄色、これには、主として脂肪細胞および結合組織が含まれる。
【００４７】
全体として、骨髄は、造血幹細胞、赤血球、および白血球、およびそれらの前駆体、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、間質細胞、およびそれらの前駆体、ならびに線維芽細胞、網状赤血球、脂肪細胞を含む細胞群、ならびに「間質」と称する結合組織網を形成する細胞を含む複合組織である。
【００４８】
骨髄細胞は、マウスおよびヒトにおいて全身移植後、多くの多様な組織に寄与する。この能力は、骨髄中に存在する複数の幹細胞、例えば、造血幹細胞、間葉系幹細胞、および／または髄多分化能幹細胞などの活性を反映しうる。例えば、Krauseら(Cell 105: 369-377, 2001)は、単一の骨髄由来幹細胞が、造血系統および非造血系統の細胞を生成できることを示した。これは、骨髄移植後、造血細胞および骨芽細胞が、通常の髄前駆体から派生できることを示したDominiciら(PNAS 101(32): 11761-6, 2004)によって確認されている。別の実施例では米国特許第５，４８６，３５９号は、例えば、骨、軟骨、筋肉、腱、結合組織、脂肪、または髄間質の間葉系統細胞を生成できる間葉系幹細胞を骨髄から単離することを開示している。さらに、Horwitzら(Nat Med 5(3): 309-13, 1999)は、重篤な骨形成不全症を有する小児で、同種骨髄移植が有効であることを示した。その研究では、機能的な髄由来間葉系細胞が移植され、新規な高密度骨の形成に寄与した。Horwitzら(PNAS 99(13): 8932-7, 2002)によって示されるように、移植した骨芽細胞の割合は、間葉系幹細胞（プラスチック接着骨髄細胞）のみの移植後、著しくは改善されず、間葉系幹細胞が存在すると考えられる接着集団中の骨髄細胞以外の骨髄細胞が、強力な移植可能骨芽細胞前駆体でありうるという結論に至った。上記に照らして、骨髄は、骨細胞（骨）系統の細胞を生成させる能力を有する数種の幹細胞型を含みうる。
【００４９】
本明細書で使用する「骨髄幹細胞」または「ＢＭＳＣ」という用語は、従って骨髄中に存在し、特に、骨髄試料中に存在し、または（部分的には）骨髄試料から単離した任意の成体幹細胞をさす。骨髄（ＢＭＳＣ）試料は、例えば、対象の腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨、または他の髄腔から得られるであろう。ＢＭＳＣという用語は、さらに、ＢＭＳＣの子孫、例えば、対象試料から得られたＢＭＳＣの、インビトロまたはエクスビボ増殖によって得られた子孫を包含する。
【００５０】
本明細書で使用する「幹細胞」という用語は、好適な条件に曝露した場合、少なくとも１個、好ましくは２個、またはそれ以上の異なる細胞型を発生できる任意の細胞をさす。該幹細胞は、インビボで、そして特定の条件下ではさらにインビトロで、広範に、またはおそらく無限に増殖することが可能であろうし、その際、該幹細胞の子孫は、母細胞の表現型特徴および増殖能を保持し、でなければ好適な条件に曝露した場合、より専門化した細胞、すなわちさらに分化した細胞を発生するであろう。例えば、幹細胞が、予め細胞分裂を受けることなく、他の細胞になるために分化した場合、あるいは幹細胞が一回以上の細胞分裂および／または分化を行って、他の細胞が生成された場合、幹細胞は、別のさらに分化した細胞を「発生させた」と言う。
【００５１】
本明細書で使用する「成体幹細胞」という用語は、胎性期または出生後の生物中に存在し、またはそれから得られた幹細胞をさす。
【００５２】
本発明による好ましい骨髄幹細胞は、少なくとも骨形成（骨）系統、例えば、骨形成細胞および／または骨芽前駆細胞および／または前骨芽細胞および／または骨芽細胞および／または骨細胞などの細胞を生成する能力を有する。
【００５３】
好ましくは、本発明による少なくともいくつかの骨髄幹細胞は、本発明の方法により得られた細胞集団に含まれるそれ以上の細胞、例えば内皮系統細胞など、例えば内皮前駆細胞および／または内皮細胞を生成する能力もまた有しうる。
【００５４】
少なくとも骨形成系統の細胞を生成する能力を有する、限定しないが典型的なＢＭＳＣ型は間葉系幹細胞である。本明細書で使用する「間葉系幹細胞」または「ＭＳＣ」（「髄間質細胞」としても知られる）という用語は、間葉系統細胞、通常は、２種またはそれ以上の間葉系統、例えば、骨細胞（骨）、軟骨細胞（軟骨）、筋細胞（筋肉）、腱細胞（腱）、線維芽細胞（結合組織）、脂肪細胞（脂肪）および間質生成（髄間質）系統を生成することができる成体の中胚葉由来幹細胞をさす。ＭＳＣは、例えば、骨髄、血液、臍帯、胎盤、胎児卵黄嚢、皮膚（真皮）、具体的には胎児および青年の皮膚、骨膜、および脂肪組織から単離することができる。ヒトＭＳＣ、それらの単離、インビトロ増殖および分化については、例えば、米国特許第５，４８６，３５９号、米国特許第５，８１１，０９４号、米国特許第５，７３６，３９６号、米国特許第５，８３７，５３９号、または米国特許第５，８２７，７４０号に記載されている。当技術分野に記載されたＭＳＣであり、そして当技術分野に記載された任意の方法によって単離されたいずれのＭＳＣも、該ＭＳＣが、少なくとも骨細胞性（骨）系統の細胞、例えば、骨形成細胞および／または骨芽前駆細胞および／または前骨芽細胞および／または骨芽細胞および／または骨細胞などの細胞を生成することができるならば、本発明には適切であろう。
【００５５】
潜在的には、それだけには限らないが、少なくともいくつかのＭＳＣも、本発明の方法により得られた細胞集団に含まれるそれ以上の細胞、例えば、内皮系統細胞、例えば、内皮前駆細胞および／または内皮細胞などを生成しうる。
【００５６】
ＭＳＣという用語は、さらに、ＭＳＣの子孫、例えば、動物またはヒト対象の生物試料から得られたＭＳＣのインビトロまたはエクスビボ増殖によって得られた子孫を包含する。
【００５７】
例に示すように、本方法には、ヒト血漿または血清、および増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体を接触させると、基板表面、例えば、培養容器の表面に接着するようなＢＭＳＣ細胞の選択が伴う。基板表面、例えば、プラスチック表面に接着できるような（単核）細胞を選択することによって、骨髄（または他の供給源）からＭＳＣを単離できることは当技術分野で周知ある（実際、ＭＳＣは、プラスチック接着細胞またはコロニー形成単位線維芽細胞と呼ばれる場合もある）。従って、いかなる仮説にも限定されないが、本発明者らは、本方法において、ＭＳＣが、少なくとも部分的にはＢＭＳＣからの骨芽細胞または骨芽細胞表現型細胞の入手に寄与しうると推測する。
【００５８】
従って、一態様では、本発明はまた、インビトロまたはエクスビボでヒト間葉系幹細胞から、骨芽細胞または骨芽細胞表現型細胞を得る方法であって、ＭＳＣを、ヒト血漿または血清、および増殖因子に接触させるステップを含む方法を企図する。
【００５９】
ＭＳＣは、生物試料、例えばＢＭＳＣを含む試料に含まれるであろうし、または当技術分野で周知の通り、少なくとも部分的にはそこから単離しうる。さらに、ＭＳＣは、少なくとも部分的には、骨髄または骨髄以外のＭＳＣを含む供給源、例えば、血液、臍帯、胎盤、胎児卵黄嚢、皮膚（真皮）、具体的には胎児および青年の皮膚、骨膜、ならびに脂肪組織から単離しうる。
【００６０】
好ましい一実施形態では、ＢＭＳＣまたはＭＳＣが、分化することなく細胞増殖し倍加できる条件で、先に増殖させることなく、生物試料中に存在し、または少なくとも部分的にはそれから単離したＢＭＳＣまたはＭＳＣを、ヒト血漿または血清、および増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体と接触させることができる。
【００６１】
骨髄からのＭＳＣの調製物には、細胞亜集団が含まれることはさらに知られているが、この亜集団は小型であり、急速に増殖し、低密度で再播種すると周期的再生を行い、同じ培養中のより成熟したＭＳＣ前駆体である。この細胞亜集団は、「急速自己再生細胞」と称し、ＲＳ−１およびＲＳ−２として同定される少なくとも２成分を含みうる（Colterら，PNAS 97(7): 3213-8, 2000、参照により本明細書に援用される）。従って、いかなる仮説にも限定されないが、本発明者らは、本方法では、２０００年にColterらが記載したＲＳ細胞は、おそらく、より成熟したＭＳＣの中間体を通じて、ＢＭＳＣからの骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞の入手に少なくとも部分的に寄与しうると推測する。可能性として、限定はしないが、本発明者らは、ＲＳ細胞も本発明の方法により得られた細胞集団に含まれるそれ以上の細胞、例えば、内皮系統細胞、例えば、内皮前駆細胞および／または内皮細胞などを生成しうると推測する。
【００６２】
従って、一実施形態では、本発明はまた、インビトロまたはエクスビボでヒト急速自己再生細胞（ＲＳ）から、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、もしくは骨芽細胞表現型細胞を得る方法、またはそれらを含む細胞集団を得る方法であって、該ＲＳに、ヒト血漿または血清と、増殖因子とを接触させるステップを含む方法を企図する。
【００６３】
さらに、骨髄が、「サイドポピュレーション」（ＳＰ）と称する前駆体細胞集団を含むことは知られている。これらの細胞は、ＣＤ３４ｌｏｗ／ｎｅｇ造血系前駆体として同定されるが、非造血系組織と同様に造血系組織を再生するという点で、著しく可塑性に富む（Goodellら，1997. Nat Med 3(12):1337-45、参照により本明細書に援用される）。従って、いかなる仮説にも限定されないが、本発明者らは、１９９７年にGoodellらが記載したＳＰ細胞は、本方法でおそらく、より成熟したＭＳＣの中間体を通じて、ＢＭＳＣからの骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞の入手に少なくとも部分的に寄与しうると推測する。可能性として、限定されないが、本発明者らは、ＳＰ細胞も本発明の方法により得られた細胞集団に含まれるそれ以上の細胞、例えば、内皮系統細胞、例えば、内皮前駆細胞および／または内皮細胞などを生成しうると推測する。
【００６４】
従って、一実施形態では、本発明はまた、インビトロまたはエクスビボでヒトサイドポピュレーション細胞（ＳＰ）から、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、もしくは骨芽細胞表現型細胞を得る方法、またはそれらを含む細胞集団を得る方法であって、該ＳＰに、ヒト血漿または血清と、増殖因子とを接触させるステップを含む方法を企図する。
【００６５】
さらに、骨髄が、骨形成前駆細胞集団を含むことは知られており、この集団は、当初、骨形成マーカーの密度の低さ（例えば密度勾配遠心分離による）、非接着性質、および低発現レベルによって同定されている（Longら，1995. J Clin Invest. 1995 Feb; 95(2):881-7米国特許第５，９７２，７０３号、参照により本明細書に援用される）。しかしながら、該細胞は、骨芽細胞に分化するように誘発されるので、それらもまた基板表面に対して接着性になる。従って、いかなる仮説にも限定されないが、本発明者らは、１９９５年にLongらが記載した骨形成前駆体は、本方法で、ＢＭＳＣからの骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞を得るのに、少なくとも部分的に寄与しうると推測する。
【００６６】
従って、一実施形態では、本発明はまた、インビトロまたはエクスビボでヒト骨形成前駆体（ＯＰ）から、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、もしくは骨芽細胞表現型細胞を得る方法、またはそれらを含む細胞集団を得る方法であって、該ＯＰに、ヒト血漿または血清と、増殖因子とを接触させるステップを含む方法を企図する。
【００６７】
さらに、骨髄が、造血系統および非造血系統の細胞を発生できる原始的前駆細胞集団（Krauseら，2001. Cell 105:369-377、Dominiciら，2004. PNAS 101 (32): 11761-6）を含むことは知られている。従って、いかなる仮説にも限定されないが、本発明者らは、該原始的前駆体は、本方法でおそらく、より成熟したＭＳＣの中間体を通じて、ＢＭＳＣからの骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞の入手に少なくとも部分的に寄与しうると推測する。可能性として、限定されないが、本発明者らは、該原始的前駆体も、本発明の方法により得られた細胞集団に含まれるそれ以上の細胞、例えば、内皮系統細胞、例えば、内皮前駆細胞および／または内皮細胞などを生成しうると推測する。
【００６８】
当然のことながら、骨髄幹細胞集団の複雑さを考慮すると、本発明が、１個以上の具体的なＢＭＳＣ型に限定されると見るべきではない。むしろ、本方法では、例えば上記の１個以上のＢＭＳＣ細胞型は、おそらく異なる程度で骨芽前駆細胞、骨芽細胞、もしくは骨芽細胞表現型細胞を得るのに、またはそれらを含む細胞集団を得るのに寄与しうる。他方で、当然のことながら、本方法が、特定のＢＭＳＣ集団、例えば少なくとも部分的に他のＢＭＳＣ集団から単離したＭＳＣも使用しうる。
【００６９】
本発明の態様によれば、ヒト骨髄幹細胞からの骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞の入手は、インビトロまたはエクスビボによる。本明細書で使用する「インビトロ」という用語は、動物または人体の外側または外部をさすものである。本明細書で使用する「インビトロ」という用語は、「エクスビボ」を含むと理解されるものとする。通常は、「エクスビボ」という用語は、動物または人体から取り出され、身体外側で、例えば培養容器で維持され、または増殖された、組織または細胞をさす。
【００７０】
一実施形態では、ＢＭＳＣはヒト対象の生物試料から得られる。
【００７１】
本明細書で使用する「生物試料」または「試料」という用語は、生物源、例えば動物またはヒト対象などの生物、細胞培養物、組織試料から得られた試料をさす。動物またはヒト対象の生物試料は、動物またはヒト対象から取り出した、それらの細胞を含む試料をさす。動物またはヒト対象の生物試料は、１個以上の組織型を含み、そして１個以上の組織型の細胞を含みうる。動物またはヒト対象の生物試料を得る方法は、組織生検または血液採取など、当技術分野で周知である。
【００７２】
ヒト対象の有用な生物試料には、その骨髄幹細胞が含まれる。通常は、該試料は、骨髄、例えば対象の腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨、または他の髄腔からから得られるであろう。別の有用な生物試料には、間葉系幹細胞が含まれ、例えば対象の血液、臍帯、胎盤、胎児卵黄嚢、皮膚（真皮）、具体的には胎児および青年の皮膚、骨膜、または脂肪組織から得られるであろう。
【００７３】
本明細書で使用する「対象」という用語は、真核生物、特に動物またはヒト生物をさす。動物対象には、動物の胎児形態、例えば胎児などが含まれる。ヒト対象には、胎児は含まれるが、胚は含まれない。
【００７４】
別の実施形態では、ＢＭＳＣは骨関連疾患の危険にさらされ、または同疾患を有しているヒト対象から得られる。本発明者らは、本発明の方法による、該対象のＢＭＳＣから得られた骨芽細胞または骨芽細胞表現型細胞の投与は、例えば新たな骨形成または骨密度の増加によって、該対象で骨関連疾患の治療に有用でありうることに気づいた。
【００７５】
従って、本明細書で使用する「骨関連疾患」という用語は、あらゆる種類の骨疾患をさし、その疾病を有する対象に、骨形成系統細胞、例えば骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞を投与することから、その治療は恩恵を受けるであろう。特に、該疾病は、例えば、骨形成の減少または過剰な骨吸収、骨中に存在する骨芽細胞または骨細胞の数、生存度、または機能の減少、対象の骨量の減少、骨痩せ、損なわれた骨強度または弾性などによって特徴付けられよう。
【００７６】
限定されないが、一例として、本発明の骨芽細胞または骨芽細胞表現型細胞の投与から恩恵を受ける骨関連疾患には、局所性または全身性疾患、例えば、あらゆる種類の骨粗鬆症または骨減少症、例えば、原発性、閉経後、老人、コルチコイド誘発型骨壊死、あらゆる二次性、単一または多部位骨壊死、あらゆる種類の骨折、例えば、非癒合、変形癒合、遅延癒合骨折または圧迫、骨融合する必要がある状態（例えば、脊髄融合および再建）、顎顔面骨折、外傷性損傷または癌手術後などの骨再構築、頭蓋顔面骨再構築、骨形成不全症、溶骨性骨癌、ページェット病、内分泌学的疾病、高リン酸塩血症（hypophsophatemia）、低カルシウム血症、腎性骨異栄養症、骨軟化症、無形成骨症、リューマチ性関節炎、副甲状腺機能亢進、原発性副甲状腺機能亢進症、二次性副甲状腺機能亢進症、歯周病、ゴーハム−ストウト疾患およびマクキューン−オールブライト症候群が含まれるであろう。
【００７７】
上記のように、本発明の方法は、ＢＭＳＣから骨芽前駆細胞、骨芽細胞、もしくは骨芽細胞表現型細胞、またはそれらを含む細胞集団を得ることである。
【００７８】
本発明の方法と関連して本明細書で使用するように、記載の骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞は、一般的に骨物質または骨基質の形成に寄与し、またはその形成に寄与できる細胞に発生できる細胞を包含する。本発明者らによって実験的に実証された通り、当然のことながら、本発明のこの態様が、治療設定で骨形成を修復するのに有用な細胞および細胞集団を結果的にもたらす方法を提供する。従って、記述の骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞は、本発明の方法から得られた骨形成系統の任意の該有用な細胞を包含することが望まれていると解釈すべきである。
【００７９】
本開示は、本発明の方法を実施するための十分な指針、例えば、本明細書に企図し、一般的に先の記述により言及した、細胞および細胞集団に到るための指針を提供する。所望の細胞または細胞集団が得られたどうかの検証には、当業者は、例えば、実施例に開示した表現型評価法、または当技術分野でのそれ以上の試験を利用することができる。とはいえ、それ以上の指針により、そして限定されないが、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞は、以下のリスト：（ａ）ＣＤ９０、ＣＤ７３、およびＣＤ１０５に陽性、（ｂ）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）（より具体的には骨−肝臓−腎臓型ＡＬＰ）陽性、（ｃ）（成熟骨芽細胞に特異的な）オステオカルシンに陽性、（ｄ）密度が１．０５０〜１．０９０g/cm3、（ｅ）オステオネクチンに陽性（骨芽細胞および前駆体で陽性）、（ｆ）細胞径が６〜７０μmであり、実質的に立方形、（ｇ）Ｉ型コラーゲン（プロコラーゲン）および／またはビメンチンおよび／または骨シアロタンパク質に陽性、（ｈ）他の骨芽細胞特異的マーカー、例えば、ＢＭＰ受容体、ＰＴＨ受容体に陽性、（ｉ）骨形成培地に曝露すると、外部環境を石灰化し、またはカルシウム含有細胞外マトリックスを合成する能力の証拠（Jaiswalら，1997. J Cell Biochem 64: 295-312）から、少なくとも１個の特徴を有するであろうし、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、または少なくとも５個の特徴を示すかもしれない任意の骨形成細胞系統細胞を包含しうる。
【００８０】
上記の細胞特異的マーカーの発現は、当技術分野で公知の任意の好適な免疫学的技術、例えば、免疫細胞化学もしくは親和吸着法、ウエスタンブロット分析、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡなどを使用し、または（例えばＡＬＰに対する）任意の好適な生化学的酵素活性アッセイによって、またはマーカーｍＲＮＡ量を測定する任意の好適な技術、例えば、ノーザンブロット、半定量または定量的ＲＴ−ＰＣＲなどによって検出することができる。本開示中に収載されたマーカーの配列データは公知であり、GenBankなどの公的データベースから得ることができる。細胞中のカルシウムの蓄積およびマトリックスタンパク質への沈着は、４５Ｃａ２＋中で培養し、洗浄し、再培養し、次いで細胞内に存在するいかなる放射能も定量することによって、または細胞外マトリックス中に沈着させることによって（米国特許第５，９７２，７０３号）、またはＣａ２＋アッセイキット（Sigmaキット#587）を使用し培養基板の石灰化をアッセイすることによって、または実施例に記載した通りに測定することができる。
【００８１】
細胞が、特定のマーカーに陽性であると言うとき、これは、当業者であれば、測定が適切に行なわれた場合、そのマーカーに対して明瞭なシグナルが存在すると結論付けられるだろう、ということを意味する。本方法によって、マーカーの定量的評価が可能になる場合、陽性細胞は、対照細胞（例えば、本発明の方法を利用前のＢＭＳＣ細胞、または他の任意の非骨形成細胞）によって生じた該シグナルよりも、少なくとも２倍高いシグナル、例えば少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍高いシグナルを生成しうる。
【００８２】
説明したように、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞を得るために、生物試料中に存在するか、または少なくとも部分的にはそれから単離したＢＭＳＣを、ヒト血漿または血清、および増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体に接触させる。
【００８３】
当業者は、ヒト血漿および血清は、一種以上の増殖因子、サイトカイン、またはホルモンを含みうる複合生物学的組成物であることを理解している。従って、「ヒト血漿または血清、および増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体を接触」という用語は、血漿または血清に加えて、すなわち外来的に、またはこれらを補って、該増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体が供給されることを示す。従って、血漿または血清中に含まれうる増殖因子の他に、ＢＭＳＣは、血漿または血清に加えて、すなわち外来的に、またはこれらを補って供給される、増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくはその誘導体と接触する。
【００８４】
該増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体は、血漿または血清中に存在しないものであってよい。その場合、ＢＭＳＣは（すなわち該）増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体と接触するが、ＢＭＳＣが、もし血漿または血清単独と接触する場合は、ＢＭＳＣは増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体と接触しないであろう。該増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体は、血漿または血清中に存在するものであってもよい。該事例では、ＢＭＳＣは、血漿または血清単独と接触する場合よりも、多量または高濃度の（すなわち該）増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体と接触する。
【００８５】
本明細書で使用する「増殖因子」という用語は、生物学的に活性な物質をさし、その物質は、単独で、または他の物質によって調節された場合、様々な細胞型の増殖、成長、分化、生存、および／または遊走に影響し、かつ生物体内で発生的、形態的、および機能的変化に影響を与えうる。通常は、増殖因子は、細胞中に存在し、増殖因子に応答する受容体（例えば、表面または細胞内受容体）に対して、リガンドとして結合することによって作用しうる。本明細書で増殖因子は、１つ以上のポリペプチド鎖を含む特にタンパク質性実体であってよい。
【００８６】
一例として、そして限定しないが、「増殖因子」という用語は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリー、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリー、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ファミリー、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）ファミリー、神経成長因子（ＮＧＦ）ファミリー、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）ファミリー、インスリン関連増殖因子（ＩＧＦ）ファミリー、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）ファミリー、造血成長因子（ＨｅＧＦ）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、アンジオポエチン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリー、グルココルチコイド、およびなどの構成物を包含する。
【００８７】
好ましい一実施形態では、増殖因子は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーの構成物である。別の実施形態では、ＦＧＦファミリーの該メンバーは、酸性のＦＧＦであるＦＧＦ−１および塩基性のＦＧＦであるＦＧＦ−２、ｉｎｔ２（ＦＧＦ−３）、ｈｓｔ（ＦＧＦ−４）、ＦＧＦ−５、ｈｓｔ２（ＦＧＦ−６）、ケラチノサイト増殖因子（ＦＧＦ−７）、アンドロゲン誘発増殖因子（ＦＧＦ−８）、グリア活性化因子（ＦＧＦ−９）、およびＦＧＦ−１０〜２３のいずれか、からなる群から選択される。
【００８８】
好ましい一実施形態では、線維芽細胞増殖因子は、塩基性ＦＧＦであり、またＦＧＦ−ｂ、ＦＧＦ−２、ＢＦＧＦ、ＨＢＧＨ−２、プロスタトロピン（prostatropin）、またはヘパリン結合増殖因子２前駆体（ＨＢＧＦ−２）と呼ばれる。本発明者らは、ＦＧＦ−ｂが本発明の方法で特に有効であることに気づいた。
【００８９】
一実施形態では、ＦＧＦ−２またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体は、ヒト血清または血漿中に潜在的に存在するものに外来的に供給される唯一の増殖因子であり、本発明の方法でＢＭＳＣが接触する唯一の増殖因子である。
【００９０】
別の実施形態では、ＢＭＳＣは、ＦＧＦ−２またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体、およびＦＧＦ−２以外の１個以上の追加の増殖因子と接触する。好ましくは、該１個以上の追加の増殖因子はＥＧＦを含まない。
【００９１】
別の実施形態では、増殖因子は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリーの構成物である。別の実施形態では、ＢＭＰファミリーの該メンバーは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−３ｂ／ＧＤＦ−１０、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、およびＢＭＰ−１５からなる群から選択されるいずれかである。
【００９２】
一実施形態では、増殖因子は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ファミリーの構成物である。別の実施形態では、ＰＤＧＦファミリーの該メンバーは、ニューロピリン−２、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、およびＰＩＧＦからなる群から選択されるいずれかである。
【００９３】
一実施形態では、増殖因子は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）ファミリーの構成物である。別の実施形態では、ＴＧＦβファミリーの該メンバーは、ＴＧＦ−β−１、ＴＧＦ−β−２、ＴＧＦ−β−３、ＴＧＦ−β−４、ＧＤＦ１（増殖／分化因子１）、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１５、ＩＮＨＡ（インヒビンα鎖）、ＩＮＨＢＡ（インヒビンβＡ鎖）、ＩＮＨＢＢ（インヒビンβＢ鎖）、ＩＮＨＢＣ（インヒビンβＣ鎖）、ＩＮＨＢＥ（インヒビンβＥ鎖）、ＭＩＳ（ミュラー管（Muellerian）抑制因子）、そしてさらにＧＤＮＦ（グリア細胞系統由来神経栄養因子）、ＮＲＴＮ（ノイルツリン（neurturin））、ＰＳＰＮ（ペルセフィン（persephin））を含むＧＤＮＦサブファミリーの構成物からなる群から選択されるいずれかである。
【００９４】
一実施形態では、その増殖因子は、神経成長因子（ＮＧＦ）ファミリーの構成物である。別の実施形態では、ＮＧＦファミリーの該構成物は、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）、ＮＧＦ（β−神経成長因子）、ＮＴ３（ニューロトロフィン−３）、およびＮＴ５からなる群から選択されるいずれかである。
【００９５】
一実施形態では、増殖因子は、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）ファミリーの構成物である。別の実施形態では、ＥＧＦファミリーの該構成物は、アンフィレグリン、ベータセルリン、ＥＧＦ、エピレグリン、ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子）、ＮＲＧ１（ニューレグリン−１）アイソフォームＧＧＦ２、ＮＲＧ１アイソフォームＳＭＤＦ、ＮＲＧ１−α、ＮＲＧ１−β、ＴＧＦα、トモレグリン（Tomoregulin）−１およびＴＭＥＦＦ２からなる群から選択されるいずれかである。
【００９６】
一実施形態では、増殖因子は、インスリン関連増殖因子（ＩＧＦ）ファミリーの構成物である。別の実施形態では、ＩＧＦファミリーの該構成物は、インスリン、ＩＧＦ１Ａ（インスリン様成長因子１Ａ）、ＩＧＦ１Ｂ、ＩＧＦ２、ＩＮＳＬ３（インスリン様３）、ＩＮＳＬ５、ＩＮＳＬ６、およびリラキシンからなる群から選択されるいずれかである。
【００９７】
一実施形態では、増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーの構成物である。別の実施形態では、ＶＥＧＦファミリーの該構成物は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄからなる群から選択されるいずれかである。
【００９８】
一実施形態では、増殖因子はグルココルチコイドである。別の実施形態では、該グルココルチコイドは、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン、コルチコステロン、フルオシノロン、コルチゾン、ベタメタゾンからなる群から選択されるいずれかである。
【００９９】
好ましい一実施形態では、本方法で使用される増殖因子はヒト増殖因子である。本明細書で使用する通り、「ヒト増殖因子」という用語は、自然発生のヒト増殖因子と実質的に同じ増殖因子をさす。例えば、その増殖因子がタンパク質性実体である場合、その構成ペプチドまたはポリペプチドは、自然発生のヒト増殖因子と同一の一次アミノ酸配列を有しうる。本方法では、該増殖因子は、細胞機能に対して望ましい効果を引き出すと予想されるのでヒト増殖因子の使用が好ましい。
【０１００】
「自然発生の」という用語は、人が人工的に作った物とは区別される物として、自然に見られる対象または実体について記載するために使用する。例えば、自然の供給源から単離することができ、および研究室で人が意図的に改変していない、生物体内に存在するポリペプチド配列は、自然に発生するものである。特定の実体、例えばポリペプチドまたはタンパク質を指す場合、その用語は、自然に生じる、例えば個体間の通常のばらつきにより生じる全ての形態およびその変異体を包含する。例えば、タンパク質性増殖因子をさす場合、「自然発生の」という用語は、それらの構成ペプチドまたはポリペプチドの一次配列中に、個体間の通常の対立形質のばらつきによる差異を有する増殖因子を包含する。
【０１０１】
本方法は、増殖因子の生物学的に活性な変異体または誘導体を使用しうる。本発明の方法では、増殖因子の「生物学的に活性な」変異体または誘導体は、他の条件が実質的に同じであるとき、それぞれの増殖因子と少なくともほぼ同程度で、ＢＭＳＣから骨芽細胞もしくは骨芽細胞表現型細胞を入手することができる。
【０１０２】
増殖因子が、その同族受容体と結合することによってその効果を発揮する場合、該増殖因子の生物学的に活性な変異体または誘導体は、その同族受容体に結合するために、結合親和性および／または特異性を示すであろうし、その結合親和性および／または特異性はそれに対して結合する増殖因子の親和性および／または特異性と少なくともほぼ同じくらい高い。例えば、該生物学的に活性な変異体または誘導体は、その同族受容体に対して結合親和性および／または特異性を有する可能性があり、それは、それぞれの増殖因子のその受容体に対する結合親和性および／または特異性の少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%、好ましくは少なくとも９０%、例えば少なくとも９０%、またはさらに１００%以上である。上記の結合パラメーターは、自体公知のインビトロアッセイまたは細胞アッセイを使用し、当業者が容易に定量することができる。
【０１０３】
所与の増殖因子の活性が、すでに行われているアッセイ、例えば、インビトロアッセイまたは細胞アッセイ（例えば、細胞培養での分裂促進活性測定など）で、容易に測定できる場合、該増殖因子の生物学的に活性な変異体または誘導体は、該アッセイで活性を示すであろうし、その活性は、その増殖因子の活性と少なくともほぼ同じほど高い。例えば、該生物学的に活性な変異体または誘導体は、それぞれの増殖因子の活性の少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%、好ましくは少なくとも９０%、例えば少なくとも９０%、またはさらに１００%以上の活性を示すであろう。
【０１０４】
ポリペプチドの「変異体」は、そのポリペプチドのアミノ酸配列に実質的に同一であるアミノ酸配列（すなわち、大部分同一であるが、全て同一ではない）を含む。本明細書で、「実質的に同一」は、少なくとも８５%同一、例えば少なくとも９０%同一、好ましくは少なくとも９５%同一、例えば少なくとも９９%同一であることをさす。配列差異は、１個以上（one of more）のアミノ酸の挿入（付加）、欠失および／もしくは置換の結果生じうる。
【０１０５】
２個のポリペプチド間の配列相同性は、そのポリペプチドのアミノ酸配列を配列し、一方でそのポリペプチドが同じアミノ酸残基を含む、配列中の位置数を採点し、他方で２個のポリペプチドがそれらの配列で異なる、配列中の位置数を採点することによって、決定することができる。２個のポリペプチドが、配列中の所与の位置に異なるアミノ酸残基を含む場合（アミノ酸置換）、またはそれらのポリペプチドの１個が、その位置にアミノ酸残基を含むが、他方のものはそうではなく、もしくはその逆である場合（アミノ酸挿入／付加、または欠失）、それらのポリペプチドは所与の位置でそれらの配列が異なる。
【０１０６】
配列相同性は、ポリペプチドが同じアミノ酸残基を含む、配列中の位置／配列中の総位置数の比率（割合）として算出される。
【０１０７】
変異体のアミノ酸配列と、その変異体が実質的に同一であるそれぞれのポリペプチドのアミノ酸配列との間の差異の少なくともいくつかは、アミノ酸置換を含みうる。好ましくは、該差異の少なくとも８５%、例えば少なくとも９０%、より好ましくは少なくとも９５%、例えば１００%がアミノ酸置換であってもよい。好ましくは、該アミノ酸置換は、保存性であってよい。本明細書で使用する「保存的置換」という用語は、一アミノ酸残基が、別の生物学的に類似するアミノ酸残基で置換されていることをさす。非限定的な保存的置換の例には、一疎水性アミノ酸残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニンと別のものとの置換、または一極性残基と別のものとの置換、例えば、アルギニンとリジン間、グルタミン酸とアスパラギン酸間、またはグルタミンとアスパラギン間の置換などが含まれる。
【０１０８】
変異体増殖因子は、１個以上のペプチドまたはポリペプチドを含んでよく、その少なくとも１個は、先に定義した通り、その増殖因子のそれぞれの構成ペプチドまたはポリペプチドの変異体である。
【０１０９】
ポリペプチドの「誘導体」は、例えば、糖鎖形成、リン酸化、アシル化、アセチル化、硫酸化、脂質化、アルキル化などによる、１個以上のアミノ酸残基の化学的改変および／または１個以上のアミノ酸残基における１個以上の部分の添加によって誘導体化しうる。通常は、誘導体ポリペプチド中、アミノ酸の５０%未満、例えば４０%未満、好ましくは３０%未満、例えば２０%未満、より好ましくは１５%未満、例えば１０%未満または５%未満、例えば４%未満、３%、２%、または１%が、そのように誘導体化されていてよい。誘導体タンパク質性増殖因子は、１個以上のペプチドまたはポリペプチドを含んでいてよく、その少なくとも１個は、少なくとも１個のアミノ酸残基で誘導体化されていてよい。
【０１１０】
別の実施形態では、本方法で使用する増殖因子では、非ヒト動物増殖因子、特に非ヒト哺乳動物増殖因子、またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体であってよい。本明細書で使用する通り、「非ヒト動物増殖因子」および「非ヒト哺乳動物増殖因子」という用語は、それぞれ、自然発生の非ヒト動物または非ヒト哺乳動物増殖因子と実質的に同じ増殖因子をさす。例えば、増殖因子がタンパク質性実体である場合、その構成ペプチドまたはポリペプチドは、自然発生の非ヒト動物または非ヒト哺乳動物増殖因子と同一の一次アミノ酸配列を有しうる。非ヒト動物または非ヒト哺乳動物増殖因子が、ヒト動物増殖因子よりも少ない程度ではあるが、本方法に利用しうることは、後者のものがＢＭＳＣ細胞と同じ起源のものであることから当業者であれば理解するであろう。特に、非ヒト動物または非ヒト哺乳動物増殖因子は、それらが、所望の効果、例えば（類似の）ヒト増殖因子と似た効果を引き出す場合に使用してよい。
【０１１１】
好ましい実施形態では、増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体は組換え体であり、すなわち、組換え核酸分子の発現を通じて宿主生物によって産生され、その組換え核酸分子は、宿主生物またはその原種中に導入されており、かつ該ポリペプチドをコードする配列を含む。本明細書で使用する「組換え核酸分子」という用語は、組換えＤＮＡ技術を使用し、連結したセグメントを含む核酸分子（例えばＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子）をさす。
【０１１２】
組換えによって発現した増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体を使用することは、特に有利であろう。例えば、増殖因子がヒト増殖因子である場合、それは、ヒト生物学的物質から単離するよりも、容易に組換え供給源から調製できるであろう。さらに、ヒトまたは動物性物質からの増殖因子の単離は、病原性媒介物を伝達する危険性を伴いかねない。特に、常法に従って、これに、病原性媒介物の存在について調査できる細胞発現系を使用すると、組換え発現中、該危険性をより効果的に制御し、または排出することができる。有利には、細胞発現系がヒトから離れている場合、例えば細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、または昆虫細胞である場合、該危険性をさらに減少させることができる。それは、おそらく該培養物中に存在しうる病原性媒介物が、ヒト細胞またはヒトを害する可能性がおそらく低いからである。
【０１１３】
適切な発現系、例えばプラスミドおよびウイルスベクターなどの発現ベクター、宿主生物、例えば、細菌［例えば、大腸菌（E. coli）、Ｓ．チンフィムリウム（tymphimurium）、セラチアマルセセン（Serratia marcescens）、枯草菌（Bacillus subtilis）］、酵母［例えば、出芽酵母（S. cerevisiae）およびピキアパストリス（Pichia pastoris）］、培養植物細胞［例えば、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）およびタバコ（Nicotiana tobaccum）由来］、および動物細胞（例えば、哺乳動物細胞と昆虫細胞）、および植物または動物などの多細胞生物；ならびに組換え手法により発現し生成したタンパク質、例えば、増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体の単離手順は当技術分野で公知である。例えば参照により本明細書に援用される、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual第２版" (Sambrookら，1989)，Animal Cell Culture (R. I. Freshney編, 1987)、the series Methods in Enzymology (Academic Press), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987)、"Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 第３版" (F. M. Ausubelら編, 1987 & 1995)、Recombinant DNA Methodology II (R. Wu ed., Academic Press 1995)を含む公知の教本を参照されたい。また、組換え増殖因子は、一般に（例えば、Sigma、Biological Industries、R&D SYSTEMS、Peprotechなどから）市販されている。
【０１１４】
「血漿」という用語は従来から定める通りである。通常、血漿は、凝固を防ぐために、血液試料から採取すると同時にまたは直後に、抗凝血剤、例えば、ヘパリン、クエン酸塩［例えば、クエン酸ナトリウムまたはクエン酸デキストロース（acid citrate dextrose）］、シュウ酸塩、またはＥＤＴＡによって得られた、またはこれらと接触させた全血試料から得る。続いて、好適な技術によって、通常は遠心分離によって、液体成分（血漿）からその血液試料の細胞成分を分離する。従って「血漿」という用語は、ヒトまたは動物身体の一部を形成しない組成物をさす。
【０１１５】
「血清」という用語は、従来から定める通りである。通常、血清は、第一に、試料中で凝固が生じるようにするステップ、続いて好適な技術、一般的に遠心分離によって、液体成分（血清）から、そのようにして形成された血液試料の血餅および細胞成分を分離するステップによって、全血試料から通常、得ることができる。凝固は、不活性触媒、例えば、ガラスビーズまたは粉末によって促進することができる。有利に、血清は、当技術分野で公知の血清分離チューブ（ＳＳＴ）を使用して調製でき、このチューブには、凝固を促進するための不活性触媒を入れ、さらに密度が液体成分と血餅間に位置するように設計したゲル、および遠心分離後の細胞成分を入れ、そのようにして分離を簡略化する。また、抗凝血剤およびフィブリンを除去することによって、血漿から血清を得ることができる。従って、「血清」という用語は、ヒトまたは動物身体の一部を形成しない組成物をさす。
【０１１６】
単離した血漿または血清は、直接、本発明の方法に使用することができる。それらは、後に本発明の方法で使用するために適切に貯蔵することもできる。通常は、血漿または血清は、血漿または血清のそれぞれの氷点より高いが、周囲温度より低い温度で、短期間、例えば約１〜２週間まで貯蔵することができる。通常、この温度は、約１５℃以下、好ましくは約１０℃以下、より好ましくは約５℃以下、例えば約５℃、４℃、３℃、２℃、または約１℃、最も好ましくは約５℃または約４℃である。また、血漿または血清は、それぞれのその氷点以下で、すなわち冷凍保存によって貯蔵することができる。当技術分野で通常の通り、血漿または血清の冷凍保存に有利な温度は、約−７０℃以下、例えば約−７５℃未満、または約−８０℃以下であってよい。該温度は、貯蔵した血漿または血清のどんな解凍も有利に防止し、それによってその質を保存することができる。冷凍保存は、血漿または血清を貯蔵しなければならない期間に関わりなく使用できるが、長期保存、例えば数日より長く、または１〜２週間より長く保存する必要がある場合、特に適切であろう。
【０１１７】
保存または使用の前に、単離した血漿または血清を熱失活させることができる。熱失活は、当技術分野では主として補体を除去するために使用される。本方法が、自家性である血漿または血清をそれらの存在下で培養した細胞に利用する場合、血漿または血清を熱失活させる必要はないであろう。血漿または血清が、培養細胞と少なくとも部分的に同種である場合、血漿または血清を熱失活させることは有利でありうる。通常は、熱失活には、血漿または血清を一定で攪拌しながら５６℃で３０〜６０分間、例えば３０分間インキュベートするステップが伴い、その後、血漿または血清を放置して徐々に周囲温度に冷却する。当業者であれば、上記手順の任意の一般的変更および要件を承知しているであろう。
【０１１８】
任意に、血漿または血清はまた、保存または使用する前に滅菌してもよい。通常の滅菌手段は、例えば、細孔径が１μmより小さい、好ましくは０．５μmより小さい、例えば０．４５μmより小さい、０．４０μm、０．３５μm、０．３０μm、または０．２５μm、より好ましくは０．２μm以下、例えば０．１５μm以下、０．１０μm以下の１つ以上のフィルターによるろ過を含みうる。
【０１１９】
一実施形態では、本方法は、接触させるヒトＢＭＳＣに対して自家性であるヒト血漿または血清を使用する。血漿または血清に関して「自家性」という用語は、血漿または血清が、該血漿または血清と接触するＢＭＳＣを得た対象と、同じ対象から得ることを示す。本発明者らは、自家性血漿または血清の使用が、ＢＭＳＣから骨芽細胞および骨芽細胞表現型細胞を得るのに有利な条件を提供することに気づいた。さらに、ＢＭＳＣを得た対象と同じヒト対象に、得られた骨芽細胞または骨芽細胞表現型細胞を投与する場合、自家性血漿または血清を使用することによって、対象が細胞を確実に最適に受けいれられるようになり、および／または例えば他の血清からの感染病原体の偶発的の伝達を回避しうる。
【０１２０】
別の実施形態では、本方法は、接触させるヒトＢＭＳＣに「相同」である、すなわち、ＢＭＳＣを得た対象以外の、一人以上の（プールした）ヒト対象から得たヒト血漿または血清を使用しうる。
【０１２１】
別の実施形態では、本方法は、先に定義した通り、自家性および相同な血漿または血清の混合物を使用しうる。
【０１２２】
本明細書で使用する「接触すること」という用語は、直接的または間接的に、１個以上の分子、成分、または物質を、別のものと一緒にし、それによってその間の相互作用を促進することを意味する。通常は、増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体、およびヒト血漿または血清は、ＢＭＳＣを培養する培地中にそれらを入れることによって、ＢＭＳＣと接触させてよい。
【０１２３】
実施形態では、ヒト血漿または血清は、０．５%〜３０%、好ましくは１%〜２０%、より好ましくは２%〜１０%、例えば、５%〜１０%、例えば約５%、６%、７%、８%、９%、または１０%の比率（血清の容量／培地の容量）で培地に入れてよい。驚くべきことに、本発明者らは、ＢＭＳＣから骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞を得るのに、比較的低量、例えば約５容量%以下、例えば１%〜５%、２%〜５%、３%〜５%、または４%〜５%のヒト血漿または血清で十分であることに気づいた。これにより、ＢＭＳＣを培養するためにドナー（例えば、自家性血漿または血清の場合には患者）から入手する必要がある血漿または血清容量を有利に低減できるようになる。
【０１２４】
増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体は、上記の比率の一比率で、同じ培地に入れたヒト血漿または血清と組み合せて、ＢＭＳＣが骨芽細胞または骨芽細胞表現型細胞へ分化するのを誘発し、それによって後者を得るのに十分な濃度で培地に入れてよい。通常は、増殖因子、例えばＦＧＦ−２、またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体は、培地に０．０１〜１００ng/ml、好ましくは０．１〜５０ng/ml、例えば０．５〜３０ng/ml、より好ましくは１〜２０ng/ml、例えば１〜１０ng/ml、例えば好ましくは５ng/ml未満、例えば１、２、３、４、または５ng/mlの濃度で入れることができる。増殖因子が、デキサメタゾンなどのグルココルチコイドである場合、該濃度は、好ましくは１０−９〜１０−５mMolになるであろう。当然のことながら、上記の濃度は、血漿または血清に加えて、すなわち外来的に、またはこれらを補って供給される、増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体について言及している（本明細書の他の部分を参照されたい）。
【０１２５】
好ましい一実施形態では、ＦＧＦ−２またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体は、２０ng/mlより低い、好ましくは１０ng/mlより低い、さらにより好ましくは５ng/mlより低い、例えば１、２、３、４、または５ng/mlの濃度で含まれる。本発明者らは、分化を達成するには、該低いＦＧＦ−２濃度が特に好ましいものとなり得ると推測する。
【０１２６】
一実施形態では、上記濃度は、培地中の該増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体の総濃度、すなわち、血漿または血清が寄与し、それらに加えてもたらされた、増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体の合計濃度を指すこともあり得る。
【０１２７】
別の実施形態では、上記濃度は、既に血漿または血清が寄与しているものに加えて、もたらされた該増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体の濃度を指すこともあり得る。当然、添加すべき増殖因子が、通常血漿または血清には存在しない（検出不能）場合、増殖因子の全濃度および追加濃度は、（実質的に）同じである。
【０１２８】
一実施形態では、ＢＭＳＣの骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞への分化を誘発し、それによって後者を得るのに十分な時間の間、ＢＭＳＣを、ヒト血漿または血清、および増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体に継続的に接触させてよい。「継続的に接触した」という用語は、該成分が全ての培地に含まれることを意味してよく、その際、ＢＭＳＣ、その子孫、および／またはそれらに由来する細胞を該時間培養する。通常は、ヒト血漿または血清、ならびに増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくは誘導体は、該時間ＢＭＳＣを培養するのに使用する全（新鮮）培地に実質的に同一なそれぞれの濃度で供給されるであろう。
【０１２９】
従って、通常は、ｔ＝０日間は、成長ホルモンおよびヒト血清または血漿の存在下で、単離したＢＭＳＣを最初に播種した（初代培養）時点に対応する。
【０１３０】
実施形態では、上記曝露時間は、少なくとも５日間、好ましくは少なくとも１０日間、より好ましくは少なくとも１５日間、そしてなおより好ましくは少なくとも１８日間、例えば少なくとも２０日間であろう。例えば、その時間は、５〜３０日間、好ましくは１０〜３０日間、より好ましくは１５〜２５日間、さらにいっそう好ましくは約２０日間、例えば２０、２１、２２またはそれくらいの日にちであろう。例えば、好ましい実施形態では、その時間は、１２〜１６日間、例えば１２、１３、１４、１５、または１６日間、特に好ましくは約１４日間であろう。別の好ましい実施形態では、その時間は、１８〜２４日間、例えば１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４日間、特に好ましくは約２１日間であろう。
【０１３１】
別の実施形態では、上記時間には、一回以上の細胞継代、例えば１、２、３、４回、またはそれ以上の継代が含まれてよく、好ましくは上記時間には１、２、または３回継代、さらにいっそう好ましくは１または２回継代、例えば１回継代が含まれるであろう。継代数は、培養容器から細胞集団を取り出し、継代培養すなわち継代を経た回数をさす。当業者が理解するように、培地で増殖した細胞は、通常は、所与の集密度に到達するまで継代培養する。例えば、細胞が単層として存在する場合、細胞は、その集密度が６０%以上、例えば７０%以上、８０%以上、または９０%以上、またはさらに１００%であるまで継代培養されるであろう。通常は、それらの細胞は、１／８〜２／３の割合で、例えば１／４〜１／２の割合で継代培養しうる。この割合は、継代培養後に同量の培地に導入される細胞比率を表す。細胞がコロニーで存在する場合は、細胞は、例えば培地で所与の日数、例えば４〜２０日、例えば８〜１５日、より好ましくは１０〜１５日、例えば１０、１１、１２、１３、または１４日後、継代培養されるであろう。例えば、細胞は、コロニー当たりの平均細胞数が２０以上、または５０以上、または１００以上、５００以上になるまで継代培養されるであろう。
【０１３２】
特定の好ましい一実施形態では、細胞と、増殖因子、特にＦＧＦ−２および、ヒト血清または血漿との全接触時間が、好ましくは１２〜１６日間である場合、一次播種したＢＭＳＣは継代培養する必要はないかもしれず、直接採取してもよい。別の好ましい実施形態では、ＢＭＳＣと、増殖因子、特にＦＧＦ−２および、ヒト血清または血漿との全接触時間が、好ましくは約１８日間〜約２４日間である場合、初代培養の一継代は、好ましくは８〜１７日、さらにより好ましくは１２〜１６日、例えば最も好ましくは１４日目に実施してよい。
【０１３３】
本発明者らは、ＢＭＳＣを、増殖因子、特にＦＧＦ−２および、ヒト血清または血漿に約１２〜１６日間接触させることが好ましい可能性があることを観察した。この期間の最後に、細胞は、骨芽細胞に最も近似した表現型を示すからである。その後、形態の変化、低ＡＬＰ、および高レベルの分化因子によって実証されるように、細胞は、少なくとも部分的脱分化を経ると思われる。とはいえ、上記期間は、現れた、より多くの骨形成系統細胞を得るために、さらに細胞を実質的に脱分化させることなく、約１８〜２４日間に、有利に伸長することができる。それ以上の継代を潜在的に含む、これらの期間のそれ以上の延長も可能ではあろうが、本発明者らは、増殖因子、特にＦＧＦ−２がそのように長時間存在することにより、望ましくないそれ以上の細胞脱分化が引き起こされる可能性があると推測する。従って、上記に引用した短い期間が好ましい。
【０１３４】
一実施形態では、本方法では、細胞培養で線維芽細胞の増殖を支持することができる、任意の培地を使用してよい。線維芽細胞の増殖を支持する培地製剤には、それだけには限定されないが、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α改変最小必須培地（α−ＭＥＭ）、基本必須培地（ＢＭＥ）、ＢＧＪｂ、Ｆ−１２栄養混合液（Ｈａｍ）などが含まれ、それらは市販されている（例えば、Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド）。本方法で使用するのに特に適切な培地は、InvitrogenまたはCambrex（ニュージャージー）から購入できるα−ＭＥＭ、ＩＭＤＭ、Ｘ−Ｖｉｖｏ−１０、Ｘ−Ｖｉｖｏ２０無血清培地（臨床等級）であろう。該液体培地には、自体公知の哺乳動物細胞の発生に必要な成分が含まれている。例えば、これらの成分には、無機塩（特にＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ、そしておそらくＣｕ、Ｆｅ、およびＺｎ）、アミノ酸、ビタミン、および炭素源（例えばグルコース）などが含まれる。通常は、線維芽細胞の増殖を支持するために、上記の培地に５−２０%の血清成分、例えばウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を加える必要があろう。しかしながら、線維芽細胞の増殖に必要なＦＣＳ中の因子が、増殖培地中に同定され、提供されているならば、所定の無血清培地を使用することもできる。有利には、本方法では、ＢＭＳＣと接触させるヒト血漿または血清によって、この血清成分を表すことができ、その結果、それ以上の血清成分を培地に加えない。培地は、さらに、それだけには限定されないが、重炭酸ナトリウム、抗菌性および／または抗真菌性成分、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、および／またはアンフォテリシンなどを含む一種以上の当該化合物を含んでよい。
【０１３５】
好ましい実施形態では、ＢＭＳＣは、非ヒト動物、特に非ヒト哺乳動物から得たいかなる成分にも接触しない。ヒト対象に、ＢＭＳＣから得た骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞を投与する場合、ＢＭＳＣと非ヒト動物から得た成分との接触が起きないということは、対象が細胞を確実に最適で受けいれ、細胞への感染病原体の偶発的伝達が回避される。後者の関心は、プリオン疾患の出現、例えば動物からヒト伝達し得るＢＳＥの出現によりますます重要になっている。
【０１３６】
特定の実施形態では、ＢＭＳＣは、非ヒト動物に由来するいかなる血清成分とも接触しない。例えば、本方法でＢＭＳＣを培養し、分化させるために使用する培地は、非ヒト動物のいかなる血清成分も含まないであろう。上記のように、細胞培養物の増殖を維持するために、細胞培地に例えばＦＣＳを添加することは、当技術分野では普通のことである。従って、本方法でＢＭＳＣを培養し、分化するために使用する培地には、いかなるＦＣＳまたは他の非ヒト動物血清成分も含めないであろう。本発明者らは、ＢＭＳＣが、非ヒト動物のいかなる血清成分とも接触しないとき、これにより、ＢＭＳＣから骨芽細胞および骨芽細胞表現型細胞を得るのに有利な状態が引き起こされることに気づいた。
【０１３７】
別の実施形態では、ＢＭＳＣを培養する培地は、任意の抗生物質成分または抗真菌剤成分を含まない。これらの成分が存在しないことによって、潜在的な培養物の汚染を容易に見極められるようになる。ＢＭＳＣから得た骨芽細胞または骨芽細胞表現型細胞をヒト対象に投与する場合、これにより対象への病原性微生物の導入が回避される。
【０１３８】
一実施形態では、培地は、骨分化を誘発するために、当技術分野で通常使用される成分、例えば、グルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）、アスコルビン酸−２−ホスフェートおよび／またはβ−グリセロールホスフェートを含まない。
【０１３９】
従って、上記の好ましい特徴を考慮すると、典型的な実施形態では、インビトロまたはエクスビボで、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、もしくは骨芽細胞表現型細胞、またはそれらを含む細胞集団を得る方法（および任意により、さらに他の細胞型、例えば内皮細胞または前駆体を含む）は、
（ａ）ＢＭＳＣを含むヒト対象の生物試料、好ましくは骨髄試料から細胞を回収する、
（ｂ）例えば好適な密度勾配遠心分離法または他の方法を使用して、（ａ）で回収した細胞から単核細胞を任意に単離する、
（ｃ）ヒト血漿または血清および、増殖因子またはその生物学的に活性な変異体もしくはその誘導体を含む培地に、（ａ）または好ましくは（ｂ）の細胞を加え、細胞−培地混合物を培養して、例えば基板表面、例えば培養容器などのガラスまたはプラスチック表面に細胞を接着させる、
（ｄ）非接着物質を除去し、さらに（ｃ）で定義した培地で接着細胞を培養して、例えば、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、もしくは骨芽細胞様細胞、またはそれらを含む細胞集団を得られるようにする、
ステップを含む。
【０１４０】
好ましい一実施形態では、本方法は、好ましくは１２〜１６日目、例えば１４日目に（ｄ）で得られた細胞または細胞集団を採取するステップをさらに含んでよい。
【０１４１】
別の好ましい実施形態では、本方法は、約１２〜１６日目に（ｄ）の細胞または細胞集団を継代培養し、約１８〜２４日目に、該培養細胞または細胞集団を採取するステップを含んでよい。
【０１４２】
好ましい一実施形態では、培養容器は、細胞接着が可能なプラスチック表面を準備しうる。別の実施形態では、その表面はガラス表面であってよい。さらに別の実施形態では、細胞増殖に役立つ好適な物質、例えばMatrigel（登録商標）、ラミニン、またはコラーゲンでその表面をコーティングしてよい。
【０１４３】
特定の成分に関して「単離すること」という用語は、その成分を、その成分を単離する組成物の少なくとも一種の他の成分から分離することを指す。従って、ＢＭＳＣの単離は、ＢＭＳＣを、ＢＭＳＣを含む組成物の少なくとも一種の他の成分から分離することを含む。ＢＭＳＣの単離は、ＢＭＳＣを単離する組成物と比較して、他の成分、特に他の細胞成分に対する組成物中のＢＭＳＣの比率の上昇もまた伴う。例えば、生物試料からのＢＭＳＣの単離は、ＢＭＳＣと、他の成分、特に試料の細胞成分からの分離をさす。
【０１４４】
任意の細胞集団に関連して、本明細書で使用する「単離した」という用語は、該細胞集団が、動物または人体の一部を形成しないこともまた意味する。
【０１４５】
一実施形態では、（ａ）または（ｂ）の細胞は、１〜１×１０６細胞／ｍｍ２、例えば１〜５×１０５細胞／ｍｍ２、１〜１．５×１０５細胞／ｍｍ２、例えば１×１０３〜５×１０５細胞／ｍｍ２、好ましくは１×１０４〜５×１０５細胞／ｍｍ２、例えば１×１０４〜１×１０５細胞／ｍｍ２、または５×１０４〜５×１０５細胞／ｍｍ２、または５×１０４〜１×１０５細胞／ｍｍ２、例えば約１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、９×１０４、または１×１０５細胞／ｍｍ２で培養するために播種してよい。
【０１４６】
好ましい実施形態では、（ｄ）の非接着物質の該除去は、１〜８日後、例えば２〜６日後、好ましくは１〜４日後に、より好ましくは約４日目、例えば４日目、さらにいっそう好ましくは１、２または３日目、さらにより好ましくは１または２日目に実施する。
【０１４７】
さらに、好ましい実施形態では、（ｄ）の、該それ以上の接着細胞の培養は、５〜３０日間、例えば約１０〜２５日間、より好ましくは約１８〜２２日間、さらにより好ましくは１８〜２４日間、例えば１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４日間実施しうる。
【０１４８】
さらに好ましい実施形態では、（ｄ）の、該それ以上の接着細胞の培養は、１回または１回以上、例えば２または３回細胞継代、好ましくは１または２回、より好ましくは１回継代を含みうる。好ましくは、それは、ステップ（ｃ）後、約１０〜１８日目、例えば約１２〜１６日目、例えば１４日目の継代を含みうる。
【０１４９】
好ましい一実施形態では、該継代は、培養手順を標準化するために一定期間、例えば約１４日目、例えば培養１４日目であってよい。
【０１５０】
好ましくは、細胞は、継代培養後、（ｄ）でさらに培養するために１〜１×１０６細胞／ｍｍ２、例えば１×１０２〜１×１０５細胞／ｍｍ２、１×１０３〜１×１０５細胞／ｍｍ２、好ましくは５×１０３〜５×１０４細胞／ｍｍ２、例えば、約５×１０３、６×１０３、７×１０３、８×１０３、９×１０３、１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、または５×１０４細胞／ｍｍ２、より好ましくは８×１０３〜２×１０４細胞／ｍｍ２、例えば約１×１０４細胞／ｍｍ２で再播種してよい。
【０１５１】
一実施形態では、細胞は、少なくとも５%、または少なくとも１０%、例えば少なくとも３０%、せいぜい９０%、またはせいぜい８０%、またはせいぜい５０%、好ましくは３０〜８０%の集密で再播種してよい。
【０１５２】
一実施形態では、継代培養ステップは、二価イオンキレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ）による細胞の処理および／またはトリプシンによる処理を含む。好ましい実施形態では、継代培養ステップは、二価イオンキレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ）による細胞の処理を含み、トリプシンによる処理を含まない。トリプシンは、動物源に由来するかもしれず、従って病原性媒介物が導入される危険性を伴いうるので、有利である。
【０１５３】
工程ステップ（ａ）〜（ｄ）のさらに好ましい実施形態は上記の通りである。
【０１５４】
先に説明したように、本発明の方法、およびその好ましい実施形態によって、優れた特性、例えば高速増殖、迅速な石灰化、および脂肪細胞または軟骨細胞へ分化する能力の実質的欠如という特性を示す、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞、かつそれらを含む細胞集団が生じる。本発明者らはまた、これらの細胞および細胞集団を患者骨組織に移植した場合、優れた性能が発揮されることに気づいた。本発明の方法によって得られる細胞および細胞集団の該驚くべき特性を考慮すると、これらの細胞および集団は、自体、当技術分野に有益に寄与する。その上、以下の節でさらに説明し、その実験データで実証するように、本発明の方法は、これらの細胞でのマーカーの新規で予想外の組合せ、かつ骨治療に特に適している新規な細胞集団によって実証された骨形成細胞の新しい型を提供する。
【０１５５】
従って、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞を得るために、本発明に従ってＢＭＳＣを処理した場合、細胞集団は、主として骨芽細胞または骨芽細胞表現型細胞で構成されて得られることは当業者なら理解するであろう。しかしながら、例えば細胞応答での変動のために、細胞集団は、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞ではない細胞を低い比率で含みうる。
【０１５６】
従って、関連する一態様では、本発明によって、上記のように、本発明の方法を使用して得られる、または直接得られたヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞が提供される。
【０１５７】
一実施形態では、本発明によって、上記のように、本発明の方法を使用して得られる、または直接得られた骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞を含む単離した細胞集団が提供される。例えば、該細胞集団は、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞を少なくとも６０%、例えば少なくとも６５%、好ましくは少なくとも７０%、例えば少なくとも７５%、より好ましくは少なくとも８０%、例えば８５%、さらにより好ましくは少なくとも９０%、例えば９５%またはさらに少なくとも９６%、少なくとも９７%、少なくとも９８%または少なくとも９９%含みうる。
【０１５８】
好ましい実施形態では、細胞集団は、該骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞以外の１個以上の細胞型を含みうる。例えば、その集団は、該骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞以外の細胞型を５０%未満、例えば４０%未満、好ましくは３０%未満、例えば２０%未満、より好ましくは１５%未満または１０%未満、例えば７%未満、５%未満または２%未満含みうる。
【０１５９】
細胞混合物中、残りの細胞の実際の表現型は重要であろう。混合物中の残りの細胞による、骨芽細胞をもたらす物質、例えば増殖因子および／または分化因子の内在的な生成に、骨芽細胞の迅速な増殖および分化が、少なくとも部分的におそらく依存するからである。この点で、骨生成およびリモデリングは、骨形成骨芽細胞と、骨微小環境内に、特に内皮細胞内に存在する他の細胞との間の複合的相互作用に、少なくとも部分的に依存することが知られているのは興味深く、この内皮細胞は、骨中の複合相互作用的通信網の重要な構成物でありうる。ヒト骨芽前駆細胞と内皮細胞間の細胞協力は、既に実証されている（Guillotinら，2004. Cell Physiol Biochem 14(4-6): 325-32）。さらに、内皮細胞の存在は、新たに形成された骨組織を活性化する、血管または毛細血管のin situ形成を引き起こしうる。本発明者らは、本発明の細胞混合物中の該残りの細胞が、内皮様であり、そして特異的マーカーの点から、マーカーＣＤ１３３および／またはＣＤ３４に陽性であり、マーカーＣＤ４５に潜在的に陰性であり、特に好ましくは、ｖＷＦ、ＶＥＧＦ、およびＣＤ１３３の少なくともいずれか１個、２個、または全てに陽性であり、そして任意にＣＤ３４にも陽性であってよいことを見出した。
【０１６０】
従って、さらに好ましい一実施形態では、細胞集団は、内皮細胞または前駆体を含んでよい。別の実施形態では、細胞集団は、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞、および内皮細胞または前駆体を含んでよい。
【０１６１】
別の態様では、本発明は、骨関連疾患の治療に使用し、および／または骨関連疾患を治療する医薬品の製造のための、上記のように本発明の方法を使用して得られる、または直接得られたヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞に関する。
【０１６２】
一実施形態では、本発明は、骨関連疾患の治療に、および／または骨関連疾患を治療する医薬品の製造に使用するための骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞を含む単離した細胞集団に関し、該集団は、上記の本発明の方法を使用して得られる、または直接得られたものである。
【０１６３】
一態様では、本発明の方法によって得られる、または直接得られた骨芽前駆細胞、骨芽細胞、もしくは骨芽細胞表現型細胞、または骨芽前駆細胞、骨芽細胞、もしくは骨芽細胞表現型細胞を含み、上記の本発明の方法を使用して得られる、または直接得られた単離した細胞集団は、骨病変部位に、例えば手術または骨折に投与してもよい。
【０１６４】
別の態様では、本発明は、該治療を必要とする対象への、本発明の方法によって得られる、または直接得られた骨芽前駆細胞、骨芽細胞、もしくは骨芽細胞表現型細胞の投与、または上記の本発明の方法を使用して得られる、または直接得られた、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、もしくは骨芽細胞表現型細胞を含む単離した細胞集団の投与を含む、骨疾患を予防し、および／または治療する方法を提供する。
【０１６５】
ある態様では、本発明は、骨疾患を予防し、および／または治療する方法であって、
（ａ）該治療を必要とする対象から、ＢＭＳＣを含む生物試料を得る、
（ｂ）本発明の方法に従って、インビトロまたはエクスビボで、ＢＭＳＣから骨芽前駆細胞、骨芽細胞、もしくは骨芽細胞表現型細胞を得、または骨芽細胞、もしくは骨芽細胞表現型細胞を含む単離細胞集団を得る、および
（ｃ）対象に、得られた該骨芽前駆細胞、骨芽細胞、もしくは骨芽細胞表現型細胞、またはそれらを含む該細胞集団を投与する
ステップを含む方法に関する。
【０１６６】
好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）には、自家性ヒト血漿または血清を、より好ましくは非ヒト動物成分、例えば血清成分、が欠除している自家性ヒト血漿または血清を使用する本発明の方法が含まれてよい。該条件を本明細書では、本発明の骨芽細胞または骨芽細胞表現型細胞を入手する「純粋自家性」条件と呼んでよい。
【０１６７】
別の態様では、本発明は、本発明の方法によって得られる、または直接得られた骨芽前駆細胞、骨芽細胞、もしくは骨芽細胞表現型細胞を含む、または上記の本発明の方法を使用して得られる、または直接得られた骨芽前駆細胞、骨芽細胞、もしくは骨芽細胞表現型細胞を含む単離した細胞集団、および骨病変部位での投与に適した細胞集団を含む、医薬組成物に関する。
【０１６８】
２．本発明の細胞および集団
発明の開示の節で説明したように、本発明の方法から得られた細胞および細胞集団のそれ以上の研究によって、本発明者らは、骨治療での使用によって観察された有利な特性の根底にある、新規な骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞型、かつそれらを含む特異的細胞集団を定義できるようになった。
【０１６９】
特に、一態様では、本発明は、（１）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、より具体的には骨−肝臓−腎臓型ＡＬＰ、プロコラーゲン１型アミノ末端プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）、および骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）から選択した少なくとも一種の骨芽細胞マーカーを、（２）ＣＤ６３およびＣＤ１６６から選択した少なくとも一種の幹細胞／未成熟骨芽前駆細胞マーカーと共に、同時発現することを特徴とする骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞（本明細書では「ＯＯＰ−１細胞」）、好ましくはヒト起源のそれらの細胞を提供する。
【０１７０】
従って、典型的な実施形態（ａ）〜（ｕ）では、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型（ＯＯＰ−１）細胞は、（ａ）少なくともＡＬＰおよびＣＤ６３、（ｂ）少なくともＰ１ＮＰおよびＣＤ６３、（ｃ）少なくともＢＳＰおよびＣＤ６３、（ｄ）少なくともＡＬＰ、Ｐ１ＮＰ、およびＣＤ６３、（ｅ）少なくともＡＬＰ、ＢＳＰ、およびＣＤ６３、（ｆ）少なくともＰ１ＮＰ、ＢＳＰ、およびＣＤ６３、（ｇ）少なくともＡＬＰ、Ｐ１ＮＰ、ＢＳＰ、およびＣＤ６３、（ｈ）少なくともＡＬＰおよびＣＤ１６６、（ｉ）少なくともＰ１ＮＰおよびＣＤ１６６、（ｊ）少なくともＢＳＰおよびＣＤ１６６、（ｋ）少なくともＡＬＰ、Ｐ１ＮＰ、およびＣＤ１６６、（ｌ）少なくともＡＬＰ、ＢＳＰ、およびＣＤ１６６、（ｍ）少なくともＰ１ＮＰ、ＢＳＰ、およびＣＤ１６６、（ｎ）少なくともＡＬＰ、Ｐ１ＮＰ、ＢＳＰ、およびＣＤ１６６、（ｏ）少なくともＡＬＰ、ＣＤ６３、およびＣＤ１６６、（ｐ）少なくともＰ１ＮＰ、ＣＤ６３、およびＣＤ１６６、（ｑ）少なくともＢＳＰ、ＣＤ６３、およびＣＤ１６６、（ｒ）少なくともＡＬＰ、Ｐ１ＮＰ、ＣＤ６３、およびＣＤ１６６、（ｓ）少なくともＡＬＰ、ＢＳＰ、ＣＤ６３、およびＣＤ１６６、（ｔ）少なくともＰ１ＮＰ、ＢＳＰ、ＣＤ６３、およびＣＤ１６６、または（ｕ）少なくともＡＬＰ、Ｐ１ＮＰ、ＢＳＰ、ＣＤ６３、およびＣＤ１６６と共に同時発現する。
【０１７１】
好ましい一実施形態（ｖ）では、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型（ＯＯＰ−１）細胞、特に上記の実施形態（ａ）〜（ｕ）のいずれかに記載のそれらの細胞は、オステオカルシン（ＯＣＮ）に陰性である。
【０１７２】
さらに好ましい実施形態（ｗ）では、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型（ＯＯＰ−１）細胞、特に上記の実施形態（ａ）〜（ｖ）のいずれかに記載のそれらの細胞は、ＣＤ３４に陽性である。
【０１７３】
さらに好ましい実施形態（ｘ）では、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型（ＯＯＰ−１）細胞、特に上記の実施形態（ａ）〜（ｖ）のいずれかに記載のそれらの細胞は、ＣＤ３４に陰性である。
【０１７４】
さらに好ましい実施形態（ｙ）では、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型（ＯＯＰ−１）細胞、特に上記の実施形態（ａ）〜（ｘ）のいずれかに記載のそれらの細胞は、ＣＤ９０、ＣＤ７３、およびＣＤ１０５のいずれか１個、２個、または全３個にも陽性である。
【０１７５】
さらに好ましい実施形態（ｚ）では、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型（ＯＯＰ−１）細胞、特に上記の実施形態（ａ）〜（ｙ）のいずれかに記載のそれらの細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ１９、およびＣＤ１４のいずれか１個、２個、または全３個に陰性である。
【０１７６】
さらに好ましい実施形態（ａｂ）では、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型（ＯＯＰ−１）細胞、特に上記の実施形態（ａ）〜（ｚ）のいずれかに記載のそれらの細胞は、ＣＤ１３３に陰性である。
【０１７７】
さらに好ましい実施形態（ａｃ）では、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型（ＯＯＰ−１）細胞、特に上記の実施形態（ａ）〜（ａｂ）のいずれかに記載のそれらの細胞は、骨形成培地に曝露すると、外部環境を石灰化し、またはカルシウム含有細胞外マトリックスを合成する能力の証拠を示す（Jaiswalら，1997. J Cell Biochem 64: 295-312）。（当技術分野で公知のように、石灰化培地中Red Alizarinで染色した表面の全比率によって測定する）１週間後の石灰化の量は、少なくとも４０%、好ましくは少なくとも４５%、より好ましくは少なくとも５０%、さらにより好ましくは少なくとも５５%、最も好ましくは少なくとも６０%、例えば少なくとも６５%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、または少なくとも９５%、またはさらに１００%であろう。有利には、上記レベルが、骨形成培地でわずか３〜４週間後に達成される場合、これらの細胞による石灰化は、従来のＢＭＳＣよりも極めて速い。
【０１７８】
興味深いことに、石灰化培地での、上記の本発明の骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞の倍加時間は、１〜３日、例えば約２日であろう。これは、こうした条件での従来の骨芽細胞の倍加時間である約６〜７日よりも相当に速い。
【０１７９】
よりさらに好ましい実施形態（ａｄ）では、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型（ＯＯＰ−１）細胞、特に上記の実施形態（ａ）〜（ａｃ）のいずれかに記載のそれらの細胞は、脂肪細胞系統細胞（例えば脂肪細胞）または軟骨細胞系統細胞（例えば軟骨細胞）のどちらか一つに、好ましくはどちらにも実質的に分化しない。これらの細胞系への分化が存在しないことは、当技術分野で確立されている標準的分化誘発条件（例えばPittengerら，1999. Science 284: 143-7を参照）、およびアッセイ方法（例えば、誘発されると、脂肪細胞は、通常は脂質の蓄積を示すオイルレッドＯによる染色、軟骨細胞は、通常はアルシアンブルーまたはサフラニンＯによる染色）を使用し試験することができる。
【０１８０】
脂肪生成または軟骨分化する性向の実質的欠除は、それぞれの試験に使用した場合、試験した細胞、例えば試験したＯＯＰ−１細胞の５０%未満、好ましくは４０%未満、例えば３０%未満、より好ましくは２０%未満、さらにいっそう好ましくは１０%未満、よりさらに好ましくは５%未満、例えば４%未満、３%未満、２%未満、または１%未満、またはさらに０．１%未満が、脂肪生成または軟骨生成の分化の徴候を示すことを通常は意味する。
【０１８１】
別の態様では本発明は、（１）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、より具体的には骨−肝臓−腎臓型ＡＬＰ、プロコラーゲン１型アミノ末端プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）、および骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）から選択した少なくとも一種の骨芽細胞マーカーを、（２）造血／内皮前駆体マーカーＣＤ３４とともに、同時発現することを特徴とする、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞（本明細書では「ＯＯＰ−２細胞」）、好ましくはヒト起源のそれらの細胞を提供する。
【０１８２】
従って、典型的な実施形態（ａ'）〜（ｇ'）では、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型（ＯＯＰ−２）細胞は、（ａ'）少なくともＡＬＰおよびＣＤ３４、（ｂ'）少なくともＰ１ＮＰおよびＣＤ３４、（ｃ'）少なくともＢＳＰおよびＣＤ３４、（ｄ'）少なくともＡＬＰ、Ｐ１ＮＰおよびＣＤ３４、（ｅ'）少なくともＡＬＰ、ＢＳＰ、およびＣＤ３４、（ｆ'）少なくともＰ１ＮＰ、ＢＳＰ、およびＣＤ３４、または（ｇ'）少なくともＡＬＰ、Ｐ１ＮＰ、ＢＳＰ、およびＣＤ３４と同時発現される。
【０１８３】
好ましい一実施形態（ｈ'）では、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型（ＯＯＰ−２）細胞、特に上記の実施形態（ａ'）〜（ｇ'）のいずれかに記載のそれらの細胞は、オステオカルシン（ＯＣＮ）に陰性である。
【０１８４】
さらに好ましい実施形態（ｉ'）では、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型（ＯＯＰ−２）細胞、特に、上記の実施形態（ａ'）〜（ｇ'）のいずれかに記載のそれらの細胞は、ＣＤ６３に陽性である。
【０１８５】
さらに好ましい実施形態（ｊ'）では、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型（ＯＯＰ−２）細胞、特に上記の実施形態（ａ'）〜（ｉ'）のいずれかに記載のそれらの細胞は、ＣＤ１６６に陽性である。
【０１８６】
さらに好ましい実施形態（ｋ'）では、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型（ＯＯＰ−２）細胞、特に上記の実施形態（ａ'）〜（ｊ'）のいずれかに記載のそれらの細胞は、ＣＤ９０、ＣＤ７３、およびＣＤ１０５のいずれか１個、２個、または全３個にも陽性である。
【０１８７】
さらに好ましい実施形態（ｌ'）では、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型（ＯＯＰ−２）細胞、特に上記の実施形態（ａ'）〜（ｋ'）のいずれかに記載のそれらの細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ１９、およびＣＤ１４のいずれか１個、２個、または全３個に陰性である。
【０１８８】
さらに好ましい実施形態（ｍ'）では、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型（ＯＯＰ−２）細胞、特に上記の実施形態（ａ'）〜（ｌ'）のいずれかに記載のそれらの細胞は、ＣＤ１３３に陰性である。
【０１８９】
さらに好ましい実施形態（ｎ'）では、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型（ＯＯＰ−２）細胞、特に上記の実施形態（ａ'）〜（ｍ'）のいずれかに記載のそれらの細胞は、骨形成培地に曝露すると、外部環境を石灰化し、またはカルシウム含有細胞外マトリックスを合成する能力の証拠を示す（Jaiswalら，1997）。（当技術分野で周知のように、石灰化培地中、Red Alizarinで染色された表面の全比率によって測定する）１週間後の石灰化の量は、少なくとも４０%、好ましくは少なくとも４５%、より好ましくは少なくとも５０%、さらにより好ましくは少なくとも５５%、最も好ましくは少なくとも６０%、例えば少なくとも６５%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%または少なくとも９５%、またはさらに１００%であろう。有利には、上記レベルが、骨形成培地でわずか３〜４週間後に達成される場合、これらの細胞による石灰化は、従来のＢＭＳＣよりも極めて速い。
【０１９０】
興味深いことに、石灰化培地での、上記の本発明の骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞の倍加時間は、１〜３日、例えば約２日であろう。これは、こうした条件での従来の骨芽細胞の倍加時間である約６〜７日よりも相当に速い。
【０１９１】
よりさらに好ましい一実施形態（ｏ'）では、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型（ＯＯＰ−２）細胞、特に上記の実施形態（ａ'）〜（ｎ'）のいずれかに記載のそれらの細胞は、脂肪細胞系統細胞（例えば脂肪細胞）または軟骨細胞系統細胞（例えば軟骨細胞）のどちらか一つに、好ましくはどちらにも実質的に分化しない。
【０１９２】
細胞が、特定のマーカーに対して陽性であると言う場合、これは、当業者であれば、適切な測定を実施した場合、好適な対照と比較して、例えばそのマーカーを抗体検出することが可能な、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって検出することが可能な別個のシグナルの存在または形跡を結論づけることを意味する。本方法によって、マーカーの定量的評価が可能になる場合、陽性細胞は、平均して、対照とは著しく異なるシグナル、例えばそれだけには限らないが、対照細胞が発する該シグナルよりも少なくとも１．５倍高い、例えば少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍高い、またはよりさらに高いシグナルを発生しうる。
【０１９３】
細胞特異的マーカーの発現は、当技術分野で周知の任意の好適な免疫学的技術、例えば、フローサイトメトリー、免疫細胞化学または親和吸着法、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡなどを使用し、またはマーカーのｍＲＮＡ量を測定する任意の好適な技術、例えばノーザンブロット、半定量または定量的ＲＴ−ＰＣＲなどにより検出することができる。
【０１９４】
実施形態では、上記骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞は、ＡＬＰ陽性である言う場合、ＦＡＣＳによって定量してＡＬＰ陽性である。実施形態では、ＡＬＰ陽性細胞は、全細胞性タンパク質１mgにつき少なくとも３００mUのＡＬＰ、全細胞性タンパク質１mgにつき好ましくは少なくとも４００mUのＡＬＰ、全細胞性タンパク質１mgにつきより好ましくは少なくとも４５０mUのＡＬＰ、全細胞性タンパク質１mgにつき、ＡＬＰを例えば少なくとも５００mU、少なくとも６００mU、少なくとも７００mU、少なくとも８００mU、少なくとも９００mUまたは少なくとも１Uを含む。例えば、ＡＬＰ活性は、全細胞性タンパク質１mgにつき４００〜１５００mU、全細胞性タンパク質１mgにつき、例えば４５０〜１５００mU、５００〜１５００mU、５５０〜１５００mU、または６００〜１５００mUであってよく、そして通常は全細胞性タンパク質１mgにつき４００〜８００mUであり、例えば細胞性タンパク質１mgにつき、約５００mU、約５５０mU、約６００mU、約６５０mU、約７００mU、約７５０mU、または約８００mUであってよい。上記のＡＬＰ活性は、先に定義した一つ以上の他の特性（ａ）〜（ｈ）と組み合せて存在してよい。
【０１９５】
実施形態では、本発明の骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞がＰ１ＮＰを陽性と言う場合、培地に以下の量でプロコラーゲン１型アミノ末端プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）が生成される（培地１ml当たり１０６細胞につき、Ｐ１ＮＰをngで表す）：少なくとも０，４ng、好ましくは少なくとも０．５、より好ましくは少なくとも１．０、さらにより好ましくは少なくとも１．２、最も好ましくは少なくとも１．５、例えば少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８または少なくとも２ng。例えば、Ｐ１ＮＰは、０．４〜３．５、例えば、０．５〜３．５、０．８〜３．５、１．０〜３．５、１．２〜３．５、１．５〜３．５、１．８〜３．５、２．０〜３．５、２．２〜３．５、２．５〜３．５、２．８〜３．５または３．０〜３．５、例えば約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９または約２．０であってよい。上記のＰ１ＮＰの生成は、先に定義した１個または複数の他の特性（ａ）〜（ｈ）と組み合せて存在しうる。
【０１９６】
他の実施形態では、本発明の骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞は、ＢＳＰ陽性という場合、中程度から多量の骨シアロタンパク質を含みうる。定量法（例えば定量的ＲＴ−ＰＣＲ）によって測定する場合、本発明の骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞で生じたシグナルは、対照細胞（例えば、他の任意の非骨形成細胞）によって生じたシグナルよりも少なくとも２倍高いであろうし、好ましくは、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、そしてより好ましくは少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍高いであろう。上記の骨シアロタンパク質の産生は、先に定義した１つ以上の他の特性（ａ）〜（ｈ）と組み合せて存在しうる。
【０１９７】
一般的に、上記ＣＤおよび他のマーカーは、当技術分野で周知であり、細胞でそれらを検出するための方式および試薬は、当業者には得ることができる。
【０１９８】
別の態様では、本発明は、上記の骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞を含む細胞集団、例えば上記のＯＯＰ−１および／またはＯＯＰ−２細胞型を含む細胞集団を包含する。好ましくは、該細胞集団は、ＯＯＰ−１および／またはＯＯＰ−２細胞型を少なくとも１０%、好ましくは少なくとも３０%、より好ましくは少なくとも５０%、例えば少なくとも６０%、さらにより好ましくは少なくとも７０%、例えば少なくとも８０%、そしてなおより好ましくは少なくとも９０%、例えば少なくとも９５%、またはさらに少なくとも９６%、少なくとも９７%、少なくとも９８%または少なくとも９９%含みうる。
【０１９９】
例えば、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞の全画分のうち、ＯＯＰ−１細胞は、少なくとも５%、または少なくとも１０%、または少なくとも２０%、または少なくとも３０%、または少なくとも４０%、または少なくとも５０%、または少なくとも６０%、または少なくとも７０%、または少なくとも８０%または少なくとも９０%または少なくとも９５%、またはさらに１００%を構成しうる一方で、ＯＯＰ−２は、該画分の残りの細胞を実質的に構成しうる。
【０２００】
好ましい実施形態では、細胞集団は、上記の骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞、特にＯＯＰ−１および／またはＯＯＰ−２細胞型以外の細胞型を５０%未満、好ましくは４０%未満、さらにいっそう好ましくは３０%未満、さらにより好ましくは２０%未満、よりさらに好ましくは１０%未満、例えば７%未満、５%未満または２%未満含みうる。
【０２０１】
好ましい実施形態では、該細胞集団は、内皮細胞またはその前駆体を含んでよい。
【０２０２】
好ましくは、該内皮細胞または前駆体は、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）、ＶＥＧＦ、およびＣＤ１３３の少なくとも１個、例えば少なくとも２個の、または少なくとも全３個を発現しうる。
【０２０３】
従って、実施形態（ａ"）〜（ｇ"）では、該内皮細胞は、（ａ"）少なくともｖＷＦ、（ｂ"）少なくともＶＥＧＦ、（ｃ"）少なくともＣＤ１３３、（ｄ"）少なくともｖＷＦおよびＶＥＧＦ、（ｅ"）少なくともｖＷＦおよびＣＤ１３３、（ｆ"）少なくともＶＥＧＦおよびＣＤ１３３、または（ｇ"）少なくともｖＷＦ、ＶＥＧＦ、およびＣＤ１３３を発現する。
【０２０４】
別の実施形態（ｈ"）では、該内皮細胞、特に上記の実施形態（ａ"）〜（ｇ"）の内皮細胞は、さらにＣＤ３４を発現する。
【０２０５】
従って、一実施形態では、細胞集団は、先に定義した（Ａ）骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞、特にＯＯＰ−１および／またはＯＯＰ−２細胞を含み、さらに、先に定義した（Ｂ）内皮細胞または前駆体を含む。
【０２０６】
一実施形態では、（Ａ）下の骨形成細胞および（Ｂ）下の内皮細胞は一緒になって、該細胞集団形成する細胞の少なくとも５０%、例えば少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、例えば少なくとも８０%、より好ましくは少なくとも９０%、さらにより好ましくは少なくとも９５%、最も好ましくは少なくとも９６%、例えば少なくとも９７%、少なくとも９８%、または少なくとも９９%、またはさらに１００%を構成する。
【０２０７】
この（Ａ＋Ｂ）画分のうち、（Ａ）下の骨形成細胞は、好ましくは少なくとも５０%、例えば少なくとも６０%、より好ましくは少なくとも７０%、例えば少なくとも８０%、そしてなおより好ましくは少なくとも９０%、例えば少なくとも９５%、少なくとも９６%、少なくとも９７%、少なくとも９８%、またはさらに少なくとも９９%を構成し、好ましい例では９０%〜９９%、９０%〜９５%、または９５%〜９９%を構成する。
【０２０８】
従って、この（Ａ＋Ｂ）画分のうち、（Ｂ）下の内皮細胞は、好ましくは５０%未満、例えば４０%未満、より好ましくは３０%未満、例えば２０%未満、さらにいっそう好ましくは１０%未満、例えば５%未満、４%未満、３%未満、２%未満、またはさらに１%未満を構成する、好ましい例では、１%〜１０%、５%〜１０%、または１%〜５%を構成する。
【０２０９】
当然のことながら、本明細書に開示した細胞型および細胞集団は、本発明の分化方法を使用し、有利に到達できる。該方法は、（例えば、マーカープロフィールに基づくＦＡＣＳを使用し）特定の細胞型をさらに分離し、または単離し、そして任意に該細胞型を組み合せて、所望の集団を形成することによって、任意に補足してよい。
【０２１０】
とはいえ、当然のことながら、本発明は、それらの構造特性および機能特性によって、細胞型および集団、すなわちそれ自体を定義するものであり、いかなるその調製方法にも限定されない。例によって、そして限定しないが、先に定義した骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞は、細胞を骨形成系統へ分化させる他の条件を使用し、かつ例えばＦＡＣＳにより、本明細書で定義した特定のマーカープロフィールを有する細胞を選択して得られるであろう。同様に、内皮細胞は、例えば血管新生因子を使用して、または造血細胞から生成させ、続いて所望のマーカープロフィールにより細胞を選択しうるであろう。
【０２１１】
別の態様では、本発明はまた、特定のマーカープロフィールを有する特定の集団にも関する。
【０２１２】
例えば、本発明は、７０%〜１００%、好ましくは８０%〜１００%、より好ましくは９０%〜１００%、さらにいっそう好ましくは９５%〜１００%、例えば９０%〜１００%、または９０%〜９８%または９５%〜９８%までＣＤ１０５陽性であり、好ましくは、ＣＤ４５陰性、ＣＤ１９陰性、ＣＤ１４陰性、ＣＤ９０陽性、およびＣＤ７３陽性でもある細胞集団（「ＰＯＰ１」）に関する。
【０２１３】
本発明は、さらに、ＰＯＰ１としての特徴を有し、さらにＣＤ１０５陽性細胞の７０%〜１００%、好ましくは８０%〜１００%、より好ましくは９０%〜１００%、さらにいっそう好ましくは９５%〜１００%が、ＡＬＰ陽性、および／またはＰ１ＮＰ陽性、および／またはＢＳＰ陽性でもある集団２（「ＰＯＰ２」）に関する。
【０２１４】
本発明は、さらに、ＰＯＰ１としての特徴を有し、さらにＣＤ１０５陽性細胞の５０%〜１００%、例えば６０%〜１００%、好ましくは７０%〜１００%、例えば８０%〜１００%、より好ましくは９０%〜１００%、さらにいっそう好ましくは９５%〜１００%が、ＣＤ６３陽性および／またはＣＤ１６６陽性でもある集団３（「ＰＯＰ３」）に関する。
【０２１５】
本発明は、さらに、ＰＯＰ２としての特徴を有し、さらにＡＬＰ陽性および／またはＰ１ＮＰ陽性および／またはＢＳＰ陽性細胞の５０%〜１００%、例えば６０%〜１００%、好ましくは７０%〜１００%、例えば８０%〜１００%、より好ましくは９０%〜１００%、さらにいっそう好ましくは９５%〜１００%が、ＣＤ６３陽性および／またはＣＤ１６６陽性でもある集団４（「ＰＯＰ４」）に関する。
【０２１６】
本発明は、さらに、ＰＯＰ１またはＰＯＰ３のいずれかとしての特徴を有し、細胞の１%〜２０%、好ましくは１%〜１０%、より好ましくは１%〜５%が、ｖＷＦ陽性および／またはＶＥＧＦ陽性および／またはＣＤ１３３陽性である集団５（「ＰＯＰ５」）に関する。
【０２１７】
本発明はまた、細胞の約５０%〜約９８%、好ましくは約７０%〜約９８%、さらにいっそう好ましくは約８０%〜約９８%、例えば約９０%〜約９８%がＡＬＰ陽性であり、細胞の約３０%〜約９８%、好ましくは約４０%〜約９８%、さらにいっそう好ましくは約５０%〜約９８%、例えば約６０%〜約９８%、約７０%〜９８%、約８０%〜９８%、またはさらに約９０%〜９８%がＣＤ１６６陽性であり、細胞の約３０%〜約９８%、好ましくは約４０%〜約９８%、さらにいっそう好ましくは約５０%〜約９８%、例えば約６０%〜約９８%、約７０%〜９８%、約８０%〜９８%、またはさらに約９０%〜９８%がＣＤ６３陽性であり、細胞の約０．５%〜約１０%、好ましくは約１%〜１０%、さらにいっそう好ましくは約１%〜４%がＣＤ１３３陽性であり、細胞の約０．５%〜約１０%、好ましくは約１%〜１０%、さらにいっそう好ましくは約１%〜４%がＶＥＧＦ陽性であり、そして細胞の約０．５%〜約１０%、好ましくは約２%〜１０%、さらにいっそう好ましくは約５%〜１０%、例えば約８%〜１０%がｖＷＦ陽性である、集団６（「ＰＯＰ６」）にも関する。
【０２１８】
関連する態様では、本発明は、骨関連疾患の治療に、および／または骨関連疾患を治療する医薬品の製造に使用するための、先に定義した細胞または細胞集団に関する。
【０２１９】
ある態様では、上に定義した細胞または細胞集団は、骨病変部位に、例えば手術または骨折に投与してもよい。
【０２２０】
別の態様では、本発明は、該治療を必要とする対象に、先に定義した細胞または細胞集団を投与するステップを含む、骨疾患を予防し、および／または治療する方法を提供する。
【０２２１】
ある態様では、本発明は、骨疾患を予防し、および／または治療する方法であって、
（ａ）先に定義した細胞または細胞集団を得る、および
（ｂ）対象に、得られた該細胞または細胞集団を投与する
ステップを含む方法に関する。
【０２２２】
好ましい実施形態では、ステップ（ａ）は、自家性ヒト血漿または血清を使用し、より好ましくは非ヒト動物成分、例えば血清成分が欠除している本発明の方法を含みうる。本明細書では、該条件は、本発明の骨芽細胞または骨芽細胞表現型細胞を得る「純粋な自家性」条件と呼んでよい。
【０２２３】
別の態様では、本発明は、先に定義した細胞および細胞集団を含み、骨病変部位での投与に適した医薬組成物に関する。
【０２２４】
３．本発明の細胞および集団に関連する別の態様
本発明の態様は、上記第１節に記載されている方法によって得られた、またはそれによって得られる骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞、およびそれらを含む集団、かつ上記第２節に記載されている骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞、およびそれらを含む細胞集団それ自体に関する。
【０２２５】
別の態様では、本発明は、骨病変部位に組成物を投与するための手術道具を含み、およびさらに先に定義した本発明の細胞または細胞集団を含む該医薬組成物を含む装置であって、該装置が、該骨病変部位に該医薬組成物を投与するのに適している装置に関する。例えば、適切な手術道具は、骨病変部位に本発明の細胞を含む液体組成物を注射することができる。
【０２２６】
上記の態様によれば、本発明の細胞または細胞集団は、ヒト対象の骨の手術部位または骨折部位に導入してよい。骨芽細胞の骨への導入は、骨折および骨関連疾患の治療に有用である。
【０２２７】
記載したように、骨芽細胞は分化した骨芽細胞を導入しうる対象のＢＭＳＣから得るのが好ましい。しかしながら、ＢＭＳＣは、対象と同一種または異なる種の生物から単離しうる。対象は、骨組織を有する任意の生物であってよい。好ましくは、対象は哺乳動物であり、最も好ましくは、対象はヒトである。
【０２２８】
ＢＭＳＣ細胞または本発明の細胞または細胞集団は、骨病変、例えば対象の手術部位または骨折部位に導入する前に、当該核酸により安定して、または一時的に形質転換しうる。当該核酸配列は、それだけには限定されないが、骨芽細胞の増殖、分化、および／または石灰化を高める遺伝子産物をコードする配列を含む。例えば、ＢＭＰ−４発現系は、非治癒性骨折または骨粗鬆症の治療を目的とした、安定したやり方または一時的やり方でＢＭＳＣに導入することができる。ＢＭＳＣおよび骨芽細胞の形質転換方法は、骨病変部位、例えば骨の手術または骨折に骨芽細胞を導入する方法として当業者には周知である。
【０２２９】
本発明の細胞または細胞集団は、単独で、または骨創傷および欠損の修復に有用なそれ以上の成分と混合して導入しうる。該組成物には、それだけに限定されないが、骨形成タンパク質、ヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウム粒子（ＨＡ／ＴＣＰ）、ゼラチン、ポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール酸、ヒアルロン酸、キトサン、ポリ−Ｌ−リジン、およびコラーゲンが含まれる。例えば、その複合体を骨形成性（それ自体で骨を形成する）および骨誘導性にするために、脂肪間質細胞から分化した骨芽細胞と、脱塩骨マトリックス（ＤＢＭ）または他のマトリックスとを混合してよい。自家性骨髄細胞と同種ＤＢＭを使用する類似の方法から、良好な結果が得られている（Connollyら，1995. Clin Orthop 313: 8-18）。
【０２３０】
本発明の細胞または細胞集団を単独で、または別の成分と混合して導入した場合、その組成物（例えば医薬組成物）は、その中に該細胞、例えば骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞の生存を確実にする別の成分を含むであろう。特に、細胞または細胞集団は、十分に無菌状態下で調製した、ヒト投与用等張賦形剤を含む医薬組成物の形で提供することができる。医薬製剤における一般原理については、読者はCell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy,G. Morstyn & W. Sheridan編，Cambridge University Press, 1996、およびHematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000を参照されたい。細胞賦形剤および組成物に任意に付随する成分の選択は、投与に使用する器具に一致して適合する。例えば、組成物は、適切なｐＨ、例えばほぼ中性ｐＨの適切な緩衝系（例えば、リン酸または炭酸緩衝系）を含み、かつ細胞または細胞集団に等張な条件を確実にするために、すなわち、浸透圧ショックを予防するために十分な塩を含みうる。例えば、これらを目的とする適切な溶液は、当技術分野で周知のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）であってよい。さらに、組成物は、細胞生存度を高めうる輸送タンパク質、例えばアルブミンを含みうる。好ましくは、非ヒト動物性物質を確実に排除するために、アルブミンは、ヒト起源の（例えば、ヒト物質から単離し、または組換え産生した）ものであろう。アルブミンの適切な濃度は一般的に知られている。
【０２３１】
細胞または細胞集団は、それらが意図する組織部位へ移植または遊走でき、かつ機能的に不完全な領域を再構築または再生できるような方式で投与することができる。組成物の投与は、修復する筋骨格部位に依存する。例えば、骨形成は、外科手順に一致して促進でき、組織を再構築し、または開裂、もしくは人工股関節などの補綴用器具を挿入することができる。他の状況では、侵襲性手術は必要ではなく、注射によって、または（脊柱の修復に）誘導性内視鏡を使用し組成物を投与することができる。
【０２３２】
必要に応じて、細胞調製物は、さらに相補的生理活性因子、例えば骨形成タンパク質、例えばＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−４、または他の任意の増殖因子を含み、またはこれと同時投与することができる。他の潜在的な付随成分には、骨再生を補助するのに適切なカルシウムまたはリン酸の無機供給源が含まれる（国際公開公報第００／０７６３９号）。必要に応じて、組織の再生を改善するために、細胞調製物は、担体マトリックスまたは物質に乗せて投与することができる。例えば、その物質は、顆粒状セラミック、またはバイオポイリマー、例えば、ゼラチン、コラーゲン、オステオネクチン、フィブリノーゲン、もしくはオステオカルシンであってよい。多孔質マトリックスは、標準的技術に従って合成することができる（例えばMikosら，Biomaterials 14:323, 1993、Mikosら，Polymer 35:1068, 1994、Cookら，J. Biomed. Mater. Res. 35:513, 1997）。
【０２３３】
一実施形態では、上に定義した細胞調製物は、液体組成物の形態で投与してもよい。
【０２３４】
別の実施形態では、インプラントを提供するために、本発明の細胞または細胞集団を適切な基板上に移送し、および／またはその上で培養してもよい。細胞を付着させ、培養することができる基板は、金属、例えば、チタン、コバルト／クロム合金またはステンレススチール、生理活性表面、例えばリン酸カルシウム、ポリマー表面、例えば、ポリエチレンなどであってよい。あまり好ましくはないが、基板として、ケイ酸物質、例えば、結晶質ガラスを使用することもできる。たとえリン酸カルシウムが基板の不可欠な成分ではなかったとしても、最も好ましいものは、チタンなどの金属およびリン酸カルシウムである。基板は、多孔質または非多孔質であってよい。
【０２３５】
例えば、増殖した細胞、または培養皿で分化させる細胞は、必要に応じて本発明の液体栄養培地でその固相担体をインキュベートすることによって、それらの細胞を増幅し、および／または分化過程を継続させるために、三次元固相担体に移送することができる。例えば、該担体に、該細胞を含む液体懸濁液を含浸することによって、三次元固相担体に細胞を移送することができる。このようにして得られた含浸担体は、ヒト対象に移植することができる。該含浸した担体は、最終的に移植する前に、液体培地にそれらを液浸することによって再培養することもできる。
【０２３６】
三次元固相担体は、それをヒトに移植できるようにするために、生体適合性でなければならない。それは、任意の好適な形のもの、例えば、シリンダー、球、プレート、または任意の形の一部であってよい。生体適合性三次元固相担体に適切な物質のうち、炭酸カルシウム、特にアラゴナイト、具体的にはサンゴ骨格の形のアラゴナイト；アルミナ、ジルコニア、リン酸三カルシウム、および／またはヒドロキシアパタイトをベースとする多孔質セラミック；炭酸カルシウムをヒドロキシアパタイトに形質転換できるようにする水熱交換によって得られた擬似サンゴ骨格；他にはアパタイト−ケイ灰石結晶質ガラス、生理活性結晶質ガラス、例えばBioglass（ＴＭ）ガラスを特に挙げることができる。
【実施例】
【０２３７】
（実施例１）ＢＭＳＣを骨芽細胞に分化させる方法
ヒト対象の腸骨稜から３０mlの骨髄を取り出し、同じ対象から１００mlの血液を採取する。
【０２３８】
血漿は、当技術分野で普通に行われるように血液から調製する。より具体的には、抗血液凝固剤ヘパリンを補給した血液を２０℃で２０００rpmで１５分間遠心分離して、細胞成分を除去し、血漿を回収し、５６℃で５０分間熱失活し、３０００rpmで１５分間遠心分離によって清澄にし、０．２２μmの滅菌フィルターでろ過し、アリコートに分割し、−８０℃で貯蔵する。
【０２３９】
Ficoll勾配遠心法を使用し、特にFicoll Paque plus（Amersham Pharmacia）を使用して、骨髄試料から単核細胞を回収し、２０℃で１４００rpm（４５０g）、３０分間遠心分離する。
【０２４０】
細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、培養フラスコに、ＩＭＤＭ（臨床等級）無血清培地（Cambrex）、先に単離した２０%自家性血漿、および１ng/ml ＦＧＦ−ｂ（Peprotech）を含む培地に、１７５cm2の培養フラスコ（Corning）１個につき１０×１０６細胞で沈着させる。培養４日目に、培地全体を交換し、それによって非接着物質を除去する。７および１１日目に、培地の半分を交換する。１２、１３、または１４日目に、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＥＤＴＡを使用して剥がし、同じ培地で、１７５cm2の培養フラスコ１個につき１×１０６細胞でさらに培養するために継代培養する。上記のように、培養２１〜２４日目に細胞を回収する。移植目的に、５%ヒトアルブミンを含む無菌ＰＢＳに細胞を再懸濁する。表現型の特徴づけに細胞の一部を使用する（実施例２）。
【０２４１】
（実施例２）実施例１の方法によって得られた骨芽細胞および骨芽細胞様細胞の表現型の特徴づけ
Cell Therap Unitで培養し２１日後、患者へ注射し、特徴付けするために細胞を回収する。注射用に２０×１０６細胞を調製する。残りの細胞は、表現型の特徴付けに使用する。
【０２４２】
１．ＲＴ−ＰＣＲによる骨シアロタンパク質の半定量測定
ＲＮＡ抽出緩衝液（ＲＬＴ緩衝液、RNeasyキット，Qiagen）で、１〜２×１０６細胞を溶解し、加工するまで−８０℃で貯蔵する。Qiagen社製RNeasyキットを使用し、溶解物から全ＲＮＡを抽出する。ランダムヘキサマーおよび逆転写酵素を使用し、全ＲＮＡの１μgを逆転写した。骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）およびハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチン用に、オリゴヌクレオチドプライマー対を使用して、第一鎖ｃＤＮＡ生成物を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）にかける。ＲＴ−ＰＣＲ生成物は、２%アガロースゲルでの電気泳動によって分析し、可視化して、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）の半定量測定を行う（０＝発現なし、＋＝低発現、＋＋＝中程度発現、＋＋＋＝高発現）。
結果：骨シアロタンパク質の発現（ｎ＝６）。ＢＳＰの発現は平均＋＋である（＋〜＋＋の範囲）
【０２４３】
培養培地中の全プロコラーゲン１型アミノ末端プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）の投与量
２１日目に、Ｐ１ＮＰの投与量用に２mlの培養培地を−２０℃で貯蔵する。Ｐ１ＮＰレベルは、電気化学発光イムノアッセイ（Roche、Elecsys、１０１０／２０１０モジュラー分析）によって測定する。
結果：Ｐ１ＮＰ＝培養培地（ｎ＝６）の２１〜９０（範囲）ng/ml
【０２４４】
アルカリホスファターゼ活性（ＡＰＡ）測定
アルカリホスファターゼ活性の測定に５×１０５〜１０６細胞を使用する。
【０２４５】
細胞を２mlのＰＢＳで洗浄し、蒸留水で超音波処理する。遠心分離後、アルカリホスファターゼ活性およびタンパク質含有量の定量に上清を使用する。
【０２４６】
以下のように試薬を調製した。ジエタノールアミン緩衝液の調製：１Ｍ、ｐＨ９．８。原液（Ｄ８８８５−Sigma−Aldrich）を水で１０倍に希釈し、ＨＣｌでｐＨ９，８に調整する。反応液の調製：１Ｍジエタノールアミン（ｐＨ９，８）および０，５mM ＭｇＣｌ２（Ｍ８２６６Sigma−Aldrich）溶液。ｐＮＰＰ基板の調製：４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物（Ｎ４６４５、Sigma−Aldrich）溶液を含む反応液１０mM。
【０２４７】
ＡＰＡは、以下の反応を触媒する。
ｐ−ニトロフェニルリン酸＋Ｈ２Ｏ→ｐ−ニトロフェノール＋リン酸
基質溶液（上清２０μl＋基質１０００μl）を３７℃でインキュベートする。３７℃で分光光度計用チューブに移し、４０５nmで２分読取り後、さらに２分間インキュベートし、再度読み取り、さらに２分後最終読取りを行う。吸光度のδ（差分）の平均を計算し、吸光度／minであるδを表す。
【０２４８】
計算：１U＝１分間に１μMのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量。ｐ−ニトロフェノールのモル吸収係数＝１８４５０、mM＝１８，４５μM＝０，０１８４５。２０μlの試料では：ＡＰＡ（Ｕ/L、またはmU/ml）＝δＡ×１０２０／０，０１８４５×２０。
【０２４９】
タンパク質量
クーマシー溶液を以下のように調製する：１００mgクーマシーブルー（Merck 1.15444）＋５０mlエタノール９５%＋１００ml Ｈ３ＰＯ４（８５%）＋Ｈ２Ｏを合わせて１Ｌにし、ホモジナイズしフィルターにかける。１mg/mlウシアルブミン含有溶液を以下のように調製する：ＢＳＡ（１mg/ml）１０〜５０μl＋Ｈ２Ｏを合わせて１ml。
【０２５０】
試料を以下のように調製する：上清２００μl＋Ｈ２Ｏ ８００μlまたは上清５００μl＋Ｈ２Ｏ ５００μl。クーマシー溶液２mlを加え、ボルテックスにかける。５分後、５９５nmでＯＤを測定する。タンパク質をmg/mlで表す。
【０２５１】
試料ごとに、総タンパク質濃度（mU/mgタンパク質）に対してＡＰＡレベルをレポートする。
結果：アルカリホスファターゼ（ｎ＝１０）．ＡＰＡ：６９３±１２６mU/mgタンパク質（平均±ＳＥＭ）、範囲：２７４〜１４７２mU/mgタンパク質
【０２５２】
石灰化能
石灰化能の研究するために、培養１４日目に、１個の６ウェルプレートに播種する。
【０２５３】
２１日目に、このプレートの培地をＭＥＭ＋１５%ＦＣＳ＋５０μg／mlアスコルビン酸＋１０−８Ｍデキサメサゾン＋１０mMβ−グリセロリン酸（ＥＭＥＭ、BioWhittaker BE12-136F、ＦＣＳ In Vitrogen、スコルビン酸Sigma A-4403、デキサメサゾン、Sigma D-4902、β−グリセロリン酸、Sigma G-9891）に交換する。
【０２５４】
２８日目にアリザリン染色をすることによって石灰化を可視化：ホルムアルデヒド４%を含むＰＢＳで細胞を固定し、ＰＢＳで洗浄し、染色するためにアリザリンレッド２%（ｐＨ４．１）によりインキュベートする。
【０２５５】
全培養皿表面（ｎ＝１０）の割合として石灰化を評価する。
【０２５６】
患者での上記の測定の具体例
【０２５７】
【表１】
2009526534.tif 000002
それ以上の実験では、１週間目に７５%以上ほどの高い石灰化能でさえ観察された（図２参照）。
【０２５８】
マーカーのプロファイリング
上記のようにマーカーの発現を追跡し、および／または続いて抗体染色および細胞のフローサイトメトリーを行った。これらの実験により、回収した細胞で以下のマーカー発現像が得られた。
【０２５９】
全集団は、＞９５%（またはさらに＞９９%）ＣＤ４５−、ＣＤ１９−、ＣＤ１４−、ＣＤ９０＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋であった。全細胞の９０〜９５%を骨芽前駆細胞または骨芽細胞表現型として特徴付けることができた。これらのうち、１００%はＡＬＰ＋であり、５０〜１００%はＣＤ１６６＋であり、６５〜１００%はＣＤ６３＋であった。これらの細胞はまた、Ｐ１ＮＰおよびＢＳＰ陽性であった。これらの細胞の３５%〜６５%はＣＤ３４＋であった。（全集団の中で、これは、８０〜９８%のＡＬＰ＋細胞、４０〜９８%のＣＤ１６６＋細胞、および６０〜９８%のＣＤ６３＋細胞に相当した。）
【０２６０】
さらに、全集団に含まれる内皮細胞またはその前駆体の推定量は、全細胞の５〜１０%であった。これらの細胞のうち、５０〜７５%はｖＷＦ（フォンウィルブランド因子）に陽性であり、２５〜５０%はＶＥＧＦ＋であり、２５〜５０%はＣＤ１３３＋であった。約５０%細胞は、ＣＤ１３３およびＶＥＧＦと同時発現した。これらの全ての細胞はＣＤ３４＋であった。（全集団の中で、これは、１〜４%のＣＤ１３３陽性細胞、１〜４%ＶＥＧＦ陽性細胞、および約５〜８%のｖＷＦ陽性細胞を表した。）
【０２６１】
それ以上のマーカープロファイリングによって、本発明者らは、本開示の他の部分でも詳述した本発明の細胞型を定義できるようになった。
【０２６２】
（実施例３）実施例２の細胞の患者への移植
一例では、Gangjiら，2005 (Expert Opin Biol Ther 5(4): 437-42; J Bone Joint Surg Am 87 Suppl 1 :106-12によって先に記載した方法に従って、股関節（hip）壊死区域に骨芽細胞を移植することにより、大腿骨頭第２期骨壊死患者を治療した。
【０２６３】
ベースラインでは、患者の疼痛スコア（視覚的アナログスコア−ＶＡＳ）は３８mm（全スコア１００のうち）であり、ＷＯＭＡＣ股関節機能性スコアは４３（全スコア９６のうち）であり、Lesquesneは１１（全スコア２４のうち）であった。
【０２６４】
３および６ヵ月後、骨芽細胞移植によって治療した患者に、関節症状で顕著な改善が見られた。３および６ヵ月でＶＡＳスコアは０に下がり（図１Ａ）、３および６ヵ月でＷＯＭＡＣは０に下がり（図１Ｂ）、３および６ヵ月でLequesne指数はベースラインの１１から０に下がった。
【０２６５】
別の実施例では、骨芽細胞を股関節壊死区域に移植することによる、同じ方法によって、大腿骨頭第２期骨壊死患者を治療した。ベースラインでは、患者の視覚的アナログ疼痛スコアは６mmであり、Lesquesne機能性スコアは３であった。
【０２６６】
３および６ヵ月後、骨芽細胞移植によって治療した患者に、関節症状で顕著な改善が見られた。３および６ヵ月にＶＡＳスコアは０に下がり、３および６ヵ月にLequesne指数は０に下がった。さらに、骨芽細胞を移植しなかった他方の股関節は、人工股関節全置換術が必要な最終骨壊死期に進行した。
【図面の簡単な説明】
【０２６７】
【図１】大腿骨頭の骨壊死患者において、本発明に従って調製した細胞集団の注射の結果（菱形による実線）を示すグラフである。Ａ：ＶＡＳスコア、Ｂ：ＷＯＭＡＣスコア。「Ｂ」−ベースライン、「３ｍ」−３ヵ月、「６ｍ」−６ヵ月、破線−経時的対照（対照組織診）。
【図２】本発明の細胞／集団による石灰化を示す図である。
【図１】
2009526534.tif 000003
【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年3月26日(2008.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離細胞集団が以下を含む：
（a）（１）骨−肝臓−腎臓型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、プロコラーゲン１型アミノ末端プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）、および骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）から選択した少なくとも一種の骨芽細胞マーカーを、（２）ＣＤ６３およびＣＤ１６６から選択した少なくとも一種の幹細胞／未成熟骨芽前駆細胞マーカーとともに、同時発現することを特徴とする、ヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞；および
（b）ＣＤ３４陽性であり、さらにフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）、ＶＥＧＦ、およびＣＤ１３３の少なくとも１個、少なくとも２個、または全３個を発現する、内皮細胞またはその前駆体；
前記単離細胞集団が、（a）で定義した、ヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞を少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、そしてより好ましくは少なくとも９５%を含み、および（b）で定義した、内皮細胞またはその前駆体が、（a）および（b）で定義したすべての細胞の少なくとも２０%未満である、単離細胞集団。
【請求項２】
（a）の該ヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞が、骨−肝臓−腎臓型ＡＬＰ、Ｐ１ＮＰ、およびＢＳＰを、ＣＤ６３およびＣＤ１６６の少なくとも１種とともに、同時発現する、請求項１に記載の単離細胞集団。
【請求項３】
（a）の該ヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞に対する以下の事象：
−該細胞がオステオカルシン（ＯＣＮ）に陰性である；
−該細胞がＣＤ３４に陽性である；
−該細胞がＣＤ９０、ＣＤ７３、およびＣＤ１０５のいずれか１個、２個、または全３個に陽性である；
−該細胞がＣＤ４５、ＣＤ１９、およびＣＤ１４のいずれか１個、２個、または全３個に陰性である；
−該細胞がＣＤ１３３に陰性である；
のいずれか１つ、複数、または全てに当てはまる、請求項１または２のいずれかに記載の単離細胞集団。
【請求項４】
（a）の該ヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞に対する以下の事象：
−該細胞を骨形成培地に曝露すると、該細胞がその外部環境を石灰化し、またはカルシウム含有細胞外マトリックスを合成することができる；
−該細胞が、脂肪細胞系統の細胞または軟骨細胞系統の細胞のどちらにも実質的に分化しない；
に当てはまる、請求項１〜３のいずれかに記載の単離細胞集団。
【請求項５】
単離細胞集団が以下を含む：
（a）（１）骨−肝臓−腎臓型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、プロコラーゲン１型アミノ末端プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）、および骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）から選択した少なくとも一種の骨芽細胞マーカーを、（２）ＣＤ３４の幹細胞／未成熟骨芽前駆細胞マーカーとともに、同時発現することを特徴とする、ヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞；および
（b）ＣＤ３４陽性であり、さらにフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）、ＶＥＧＦ、およびＣＤ１３３の少なくとも１個、少なくとも２個、または全３個を発現する、内皮細胞またはその前駆体；
前記単離細胞集団が、（a）で定義した、ヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞を少なくとも５０%、好ましくは少なくとも８０%、より好ましくは少なくとも９０%、並びにさらにいっそう好ましくは９５%を含み、および（b）で定義した、内皮細胞またはその前駆体が、（a）および（b）で定義したすべての細胞の少なくとも２０%未満である、単離細胞集団。
【請求項６】
（a）の該ヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞が、骨−肝臓−腎臓型ＡＬＰ、Ｐ１ＮＰ、およびＢＳＰを、ＣＤ３４とともに、同時発現する、請求項５に記載の単離細胞集団。
【請求項７】
（a）の該ヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞に対する以下の事象：
−該細胞がオステオカルシン（ＯＣＮ）に陰性である；
−該細胞がＣＤ６３に陽性である；
−該細胞がＣＤ１６６に陽性である；
−該細胞がＣＤ９０、ＣＤ７３、およびＣＤ１０５のいずれか１個、２個、または全３個に陽性である；
−該細胞がＣＤ４５、ＣＤ１９、およびＣＤ１４のいずれか１個、２個、または全３個に陰性である；
−該細胞がＣＤ１３３に陰性である；
のいずれか１つ、複数、または全てに当てはまる、請求項５または６のいずれかに記載の単離細胞集団。
【請求項８】
（a）の該ヒト骨芽前駆細胞、骨芽細胞、または骨芽細胞表現型細胞に対する以下の事象：
−該細胞を骨形成培地に曝露すると、該細胞がその外部環境を石灰化し、またはカルシウム含有細胞外マトリックスを合成することができる；
−該細胞が、脂肪細胞系統の細胞または軟骨細胞系統の細胞のどちらにも実質的に分化しない；
に当てはまる、請求項５〜７のいずれかに記載の単離細胞集団。
【請求項９】
治療に使用するための、請求項１〜８のいずれかで定義した細胞集団。
【請求項１０】
骨関連疾患を治療する薬剤を製造するための、１〜８のいずれかで定義した細胞集団の使用。
【請求項１１】
骨病変部位に、請求項１〜８のいずれかで定義した細胞集団を投与する、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記細胞集団を投与される対象から得られた、請求項１〜８のいずれかに記載の（a）で定義した、該細胞の、請求項１０または１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
前記細胞集団を投与される対象と同一種だが、異なる対象から得られた、請求項１〜８のいずれかに記載の（a）で定義した、該細胞の、請求項１０または１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれかで定義した細胞集団を含み、骨病変部位に前記細胞または単離細胞集団を投与するのに適している、医薬組成物。
【請求項１５】
さらに担体マトリックスまたは基板を含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
骨病変部位に組成物を投与するための手術道具を含み、およびさらに請求項１４または１５のいずれかで定義した医薬組成物を含む装置であって、該骨病変部位に該医薬組成物を投与するのに適している装置。
【国際調査報告】
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