(57)【要約】本発明は、ピラゾロチアゾールキナーゼモジュレータ、癌などのいくつかの疾患状態を治療する方法、およびその医薬組成物を提供する。
2009515998.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2009515998.tif 000084
［式中、
R1およびR3は独立して水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、
R2およびR4は独立して-C(X1)R5、-SO2R6、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールであり；
X1は独立して=N(R7)、=Sまたは=Oであり、ここに、R7は水素、シアノ、-NR8R9、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールであり；
R5は独立して-NR8R9、-OR10、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールであり；
R6は独立して-NR8R9、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールであり；
R8およびR9は独立して水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールであり；
R10は独立して置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールであり；
ここに、R1とR2、R3とR4およびR8とR9は独立して、適宜それらが結合している窒素と一緒になって、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成してもよい］
で示される化合物。
【請求項２】
R1およびR3が独立して水素、R11-置換もしくは非置換アルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロアルキル、R11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールであり；
R2およびR4が独立して-C(X1)R5、-SO2R6、R11-置換もしくは非置換アルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロアルキル、R11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールであり；
X1が独立して=N(R7)、=Sまたは=Oであり、ここに、R7が水素、シアノ、-NR8R9、R11-置換もしくは非置換アルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールであり；
R5が独立して-NR8R9、-OR10、R11-置換もしくは非置換アルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロアルキル、R11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールであり；
R6が独立して-NR8R9、R11-置換もしくは非置換アルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロアルキル、R11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールまたは-NR8R9であり；
R8およびR9が独立して水素、R11-置換もしくは非置換アルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロアルキル、R11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールであり；
R10が独立してR11-置換もしくは非置換アルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロアルキル、R11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールであり；
ここに、R1とR2、R3とR4およびR8とR9が独立して、適宜それらが結合している窒素と一緒になって、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成してもよく；
R11が独立してハロゲン、-L1-C(X2)R12、-L1-OR13、-L1-NR14R15、-L1-S(O)mR16、-CN、-NO2、-CF3、
(1) 非置換C3-C7シクロアルキル；
(2) 非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル；
(3) 非置換ヘテロアリール；
(4) 非置換アリール；
(5) 置換C3-C7シクロアルキル；
(6) 置換3〜7員ヘテロシクロアルキル；
(7) 置換アリール；
(8) 置換ヘテロアリール；
(9) 非置換C1-C20アルキル；
(10) 非置換2〜20員ヘテロアルキル；
(11) 置換C1-C20アルキル；または
(12) 置換2〜20員ヘテロアルキルであり、
ここに、
(5)、(6)、(11)および(12)が独立してオキソ、-OH、-CF3、-COOH、シアノ、ハロゲン、R17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18-置換もしくは非置換アリール、R18-置換もしくは非置換ヘテロアリール、-L1-C(X2)R12、-L1-OR13、-L1-NR14R15または-L1-S(O)mR16で置換されており、
(7)および(8)が独立して-OH、-CF3、-COOH、シアノ、ハロゲン、R17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18-置換もしくは非置換アリール、R18-置換もしくは非置換ヘテロアリール、-L1-C(X2)R12、-L1-OR13、-L1-NR14R15または-L1-S(O)mR16で置換されており、ここに、
(a) X2が独立して=S、=Oまたは=NR27であり、ここに、R27がH、-CN、-NR8R9、-OR28、R17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18-置換もしくは非置換アリールまたはR18-置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、ここに、R28が水素またはR17-置換もしくは非置換C1-C10アルキルであり、
(b) mが独立して0〜2の整数であり；
(c) R12が独立して水素、R17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18-置換もしくは非置換アリール、R18-置換もしくは非置換ヘテロアリール、-OR19または-NR20R21であり、ここに、
R19、R20およびR21が独立して水素、R17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18-置換もしくは非置換アリールまたはR18-置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、
ここに、R20が適宜-S(O)2R30または-C(O)R30であってもよく、ここに、R30がR17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18-置換もしくは非置換アリールまたはR18-置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、
ここに、R20およびR21が適宜それらが結合している窒素と一緒になって、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキルまたはR18-置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成してもよく；
(d) R13、R14およびR15が独立して水素、-CF3、R17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18-置換もしくは非置換アリール、R18-置換もしくは非置換ヘテロアリール、-C(X3)R22または-S(O)2R22であり、ここに、R14およびR15が適宜それらが結合している窒素と一緒になって、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキルまたはR18-置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成してもよく、ここに、
(i) X3が独立して=S、=Oまたは=NR23であり、ここに、R23がシアノ、-NR8R9、R17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18-置換もしくは非置換アリールまたはR18-置換もしくは非置換ヘテロアリールであり；
(ii) R22が独立してR17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18-置換もしくは非置換アリール、R18-置換もしくは非置換ヘテロアリールまたは-NR24R25であり、
ここに、R11が-L1-NR14R15であり、R14またはR15が-C(X3)R22である場合、R22が適宜水素であってもよく、
ここに、R24およびR25が独立して水素、R17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18-置換もしくは非置換アリールまたはR18-置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、ここに、R24およびR25が適宜それらが結合している窒素と一緒になって、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキルまたはR18-置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成してもよく；
(e) R16が独立してR17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18-置換もしくは非置換アリール、R18-置換もしくは非置換ヘテロアリールまたは-NR26R27であり、ここに、mが0である場合、R16が適宜水素であってもよく、ここに、
(i) R26およびR27が独立して水素、シアノ、-NR8R9、R17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員21-置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、ここに、R26およびR27が適宜それらが結合している窒素と一緒になって、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキルまたはR18-置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成してもよく、
ここに、R26が適宜-C(O)R30であってもよく；
(f) L1が独立して結合、非置換C1-C10アルキレンまたは非置換ヘテロアルキレンであり；
(g) R17が独立してオキソ、-OH、-COOH、-CF3、-OCF3、-CN、アミノ、ハロゲン、R28-置換もしくは非置換2〜10員アルキル、R28-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R28-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R28-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R29-置換もしくは非置換アリールまたはR29-置換もしくは非置換ヘテロアリールであり；
(h) R18が独立して-OH、-COOH、アミノ、ハロゲン、-CF3、-OCF3、-CN、R28-置換もしくは非置換2〜10員アルキル、R28-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R28-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R28-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R29-置換もしくは非置換アリールまたはR29-置換もしくは非置換ヘテロアリールであり；
(i) R28が独立してオキソ、-OH、-COOH、アミノ、ハロゲン、-CF3、-OCF3、-CN、非置換C1-C10アルキル、非置換2〜10員ヘテロアルキル、非置換C3-C7シクロアルキル、非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリールであり；
(j) R29が独立して-OH、-COOH、アミノ、ハロゲン、-CF3、-OCF3、-CN、非置換C1-C10アルキル、非置換2〜10員ヘテロアルキル、非置換C3-C7シクロアルキル、非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリールである、
請求項１記載の化合物。
【請求項３】
R1が水素である、請求項２記載の化合物。
【請求項４】
R3が水素である、請求項２記載の化合物。
【請求項５】
R2が-C(X1)R5、R11-置換もしくは非置換アルキル、R11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、ここに、X1が=Oである、請求項２記載の化合物。
【請求項６】
R2が-C(X1)R5である、請求項２記載の化合物。
【請求項７】
R5がR11-置換もしくは非置換アルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロアルキル、R11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールである、請求項６記載の化合物。
【請求項８】
R5がR11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールである、請求項６記載の化合物。
【請求項９】
R5がR11-置換もしくは非置換シクロアルキルである、請求項６記載の化合物。
【請求項１０】
R4が-C(X1)R5、R11-置換もしくは非置換アルキル、R11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択され、ここに、X1が=Oである、請求項２記載の化合物。
【請求項１１】
R4がR11-置換もしくは非置換アルキルであり、ここに、R11が(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)または(8)である、請求項２記載の化合物。
【請求項１２】
R4が-C(X1)R5、R11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択され、ここに、X1が=Oである、請求項２記載の化合物。
【請求項１３】
R4が-C(X1)R5である、請求項１２記載の化合物。
【請求項１４】
R4のR5がR11-置換もしくは非置換アルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロアルキル、R11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールである、請求項１３記載の化合物。
【請求項１５】
R4のR5がR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールまたはR11-置換もしくは非置換アリールである、請求項１３記載の化合物。
【請求項１６】
R4のR11がハロゲン、-L1-S(O)mR16、-L1-OR13、-L1-C(X2)R12、-L1-NR14R15、(3)、(4)、(7)または(8)である、請求項１５記載の化合物。
【請求項１７】
L1が結合またはメチレンである、請求項１６記載の化合物。
【請求項１８】
mが2である、請求項１６記載の化合物。
【請求項１９】
R4のR11-置換ヘテロアリールおよびR4のR11-置換アリールがオルト位で置換されている、請求項１５記載の化合物。
【請求項２０】
R4およびR3がそれらが結合している窒素と一緒になって、R11-置換もしくは非置換5員ヘテロアリールを形成する、請求項２記載の化合物。
【請求項２１】
R4およびR3がそれらが結合している窒素と一緒になって、R11-置換もしくは非置換ピロリル、R11-置換もしくは非置換イミダゾリル、R11-置換もしくは非置換ピラゾリルおよびR11-置換もしくは非置換トリアゾリルからなる群から選択されるR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成する、請求項２記載の化合物。
【請求項２２】
R4およびR3がそれらが結合している窒素と一緒になって、R11-置換もしくは非置換[1,2,3]トリアゾリル、R11-置換もしくは非置換[1,2,4]トリアゾリルまたはR11-置換もしくは非置換[1,3,4]トリアゾリルを形成する、請求項２１記載の化合物。
【請求項２３】
R3およびR4により形成されるR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールのR11がハロゲン、-L1-S(O)mR16、-L1-OR13、-L1-C(X2)R12、-L1-NR14R15、(3)、(4)、(7)または(8)である、請求項２１記載の化合物。
【請求項２４】
R3およびR4により形成されるR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールのR11が(7)または(8)である、請求項２１記載の化合物。
【請求項２５】
(7)および(8)が独立してハロゲン、-L1-OR13、-L1-NR14R15、-L1-C(X2)R12、-L1-S(O)mR16、R17-置換もしくは非置換C1-C10アルキルまたはR18-置換もしくは非置換ヘテロアリールで置換されている、請求項２４記載の化合物。
【請求項２６】
L1が結合またはメチレンである、請求項２５記載の化合物。
【請求項２７】
R4およびR3により形成されるR11-置換ヘテロアリールがオルト位で置換されている、請求項２１記載の化合物。
【請求項２８】
タンパク質キナーゼを請求項１記載の化合物と接触させることを含む、タンパク質キナーゼの活性を調節する方法。
【請求項２９】
タンパク質チロシンキナーゼを請求項１記載の化合物と接触させることを含む、タンパク質チロシンキナーゼの活性を調節する方法。
【請求項３０】
レセプターチロシンキナーゼを請求項１記載の化合物と接触させることを含む、レセプターチロシンキナーゼの活性を調節する方法。
【請求項３１】
タンパク質キナーゼがエイブルソンチロシンキナーゼ、Ronレセプターチロシンキナーゼ、Metレセプターチロシンキナーゼ、3-ホスホイノシチド依存キナーゼ1、オーロラキナーゼ、サイクリン依存キナーゼ、神経成長因子レセプター（TRKC）、コロニー刺激因子1レセプター（CSF1R）または血管内皮成長因子レセプター2（VEGFR2、KDR）である、タンパク質キナーゼを請求項１記載の化合物と接触させることを含む、タンパク質キナーゼの活性を調節する方法。
【請求項３２】
治療的有効量の請求項１記載の化合物を対象に投与することを含む、そのような治療を必要とする対象において癌、アレルギー、喘息、炎症、閉塞性気道疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、ウイルス性疾患、細菌感染、中枢神経系疾患、肥満、血液疾患、骨疾患、変性神経疾患、心疾患または血管形成、血管新生もしくは脈管形成を伴う疾患を治療する方法。
【請求項３３】
請求項１記載の化合物を医薬的に許容される賦形剤とともに含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2005年11月16日に出願された米国仮出願番号60/737,702「ピラゾロチアゾールタンパク質キナーゼモジュレータ」の優先権の利益を主張する。出願日における優先権は本明細書にて主張され、該出願の開示は本明細書にそのまま引用される。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類タンパク質キナーゼは細胞機能の重要な調節因子である。タンパク質キナーゼ活性における機能障害がいくつかの疾患および障害と関連するため、タンパク質キナーゼは薬物開発のための標的である。
【０００３】
チロシンキナーゼレセプター、FMS様チロシンキナーゼ3（FLT3）は、急性骨髄性白血病（AML）、急性リンパ性白血病（ALL）などの白血病および骨髄異形成を含む癌に関与する。約四分の一〜三分の一のAML患者は、キナーゼの構成的活性化および下流シグナリング経路をもたらすFLT3変異を有する。正常なヒトにてFLT3は正常な骨髄性前駆細胞およびリンパ性前駆細胞により主に発現されるが、FLT3は70〜80%のAMLおよびALLの患者の白血病細胞にて発現する。FLT3を標的する阻害剤は、変異および／または構成的に活性なFLT3を発現する白血病細胞に毒性であると報告されている。従って、白血病などの疾患および障害を治療するために用いることができる強力なFLT3阻害剤を開発する必要性がある。
【０００４】
エイブルソン（Abelson）非レセプターチロシンキナーゼ（c-Abl）は、その基質タンパク質のリン酸化によりシグナル伝達に関与する。細胞にて、c-Ablは細胞質および核間を往復し、その活性は通常、多様な機序を通して正常にしっかりと調整される。Ablは成長因子の制御およびインテグリンシグナル伝達、細胞周期、細胞分化および神経新生、アポトーシス、細胞接着、細胞骨格構造、およびDNA損傷および酸化ストレスへの応答に関与している。
【０００５】
c-Ablタンパク質は、N-末端キャップ領域、SH3およびSH2ドメイン、チロシンキナーゼドメイン、核局在配列、DNA-結合ドメインおよびアクチン結合ドメインに分類される、およそ1150のアミノ酸残基を含む。
【０００６】
慢性骨髄性白血病（CML）は9〜22の染色体のフィラデルフィア染色体転座を伴う。この転座はbcr遺伝子および遺伝子コード化c-Abl間の異常な融合を生成する。得られたBcr-Abl融合タンパク質は、構成的に活性なチロシンキナーゼ活性を有する。上昇したキナーゼ活性は、CMLの主な原因となる因子であることが報告されており、細胞形質転換、成長因子依存の欠乏および細胞増殖に関与する。
【０００７】
2-フェニルアミノピリミジン化合物イマチニブ（STI-571、CGP 57148またはGleevecとしても称される）は、Bcr-Ablの具体的および強力な阻害剤ならびに２の他のチロシンキナーゼ、c-キットおよび血小板由来成長因子レセプターとして認識されている。イマチニブはこれらのタンパク質のチロシンキナーゼ活性を遮断する。イマチニブはCMLのすべての段階の治療のための有効な治療剤であることが報告されている。しかし、薬物への耐性の発展によりイマチニブ治療が続くにもかかわらず、大多数の進行期または急性転化CMLの患者は再発に苦しんでいる。しばしば、この耐性についての分子基盤は、Bcr-Ablのキナーゼドメインのイマチニブ耐性変異形の出現である。通常観察される基本的なアミノ酸置換としては、Glu255Lys、Thr315Ile、Tyr293PheおよびMet351Thrが挙げられる。
【０００８】
METは、N-メチル-N'-ニトロ-ニトロソグアニジンで処理されたヒト骨肉腫細胞系における形質転換DNA転位（TPR-MET）として最初に同定された（Cooper et al. 1984）。METレセプターチロシンキナーゼ（肝細胞成長因子レセプター、HGFR、METまたはc-Metとしても知られている）およびそのリガンド肝細胞成長因子（「HGF」）は、増殖、生存、分化および形態形成、分岐管形成、細胞運動および浸潤性増殖の刺激などの多くの生物学的活性を有する。病理学的に、METは、腎臓癌、肺癌、卵巣癌、肝臓癌および乳癌などの癌の多くの異なる形態の成長、浸潤および転移に関与している。METにおける体細胞活性化変異は、ヒト癌転移および乳頭状腎細胞癌などの散発性癌にて見られた。METが転移への進行を制御する念願の癌遺伝子の一つである証拠が増大し、それゆえ興味の標的である。癌に加えて、MET阻害がリステリア浸潤、多発性骨髄腫を伴う骨溶解、マラリア感染症、糖尿病性網膜症、乾癬および関節炎などの種々の適応の治療に有用性を有することができる証拠がある。
【０００９】
チロシンキナーゼRONは、タンパク質を刺激するマクロファージのためのレセプターであり、レセプターチロシンキナーゼのMETファミリーに属する。METのように、RONは胃癌および膀胱癌などのいくつかの異なる形態の癌の成長、浸潤および転移に関与する。
【００１０】
サイクリン依存キナーゼ（「CDK」）は、細胞周期の制御に関与するセリン／トレオニンキナーゼである。哺乳類細胞周期は、第一成長または間（G1）期で始まり、次いでDNA合成（S）期となる一連のプログラムされた事象からなり、染色体、別の成長または間期（G2）および最終的に有糸分裂（M期）および細胞分割を複製する。これはCDKにより制御される細胞周期相間の遷移である。CDKは、細胞周期と一致した振動形式にて発現する調節タンパク質サイクリンとの相互作用により活性化される。例えば、D型サイクリンはCDK4およびCDK6を活性化し、S期への侵入を制御する（G1-S遷移）。サイクリンAはCDK2と対になってS-G2遷移を調節し、CDK1/サイクリンBはG2-M遷移を促進する。腫瘍成長における細胞周期制御の決定的な重要性は、CDK阻害が癌治療に有用な戦略であることを証明するだろうことを示唆する。この見解は、ヒト腫瘍におけるサイクリン（特にサイクリンD）の上方調節、キナーゼ自体（例えばCDK4）または調節体（例えばINK4についての遺伝子）における変異によるCDKの活性化および動物モデルにおける腫瘍成長へのCDK阻害の効果などの実質的な証拠により支持される。いくつかの他のCDKもまたヒト疾患に重要な役割を果たすにもかかわらず、CDK1、CDK2、CDK4およびCDK6が最も徹底的に研究されたCDKである。
【００１１】
オーロラ（Aurora）キナーゼ、特にオーロラ-A（「AurA」）およびオーロラ-B（「AurB」）は癌治療のための標的としてかなりの興味を引きつけている。これらは有糸分裂の調節に関与し、オーロラキナーゼの阻害剤は動物モデルにおける腫瘍の成長を有効に抑制することを示している。
【００１２】
3-ホスホイノシチド-依存キナーゼ1（「PDK1」）は、Akt/PKB、タンパク質キナーゼC（PKC）、PKC関連キナーゼ（PRK1およびPRK2）、p70リボソームS6-キナーゼ（S6K1）および血清およびグルココルチコイド調整キナーゼ（SGK）などのAGCキナーゼスーパーファミリーにて多くのキナーゼをリン酸化し活性化することができるSer/Thrタンパク質キナーゼである。最初に同定されたPDK1基質はプロトオンコジーンAktである。多くの研究は、黒色腫および乳癌、肺癌、胃癌、前立腺癌、血液癌および卵巣癌などの大きな割合（30〜60%）の一般的腫瘍タイプにて高レベルの活性化Aktを見つけた。従って、PDK1/Aktシグナリング経路は、癌の治療に有用であることができる小分子阻害剤の開発のための魅力的な標的を示す。Feldman et al., JBC Papers in Press. Published on March 16, 2005 as Manuscript M501367200.
【００１３】
癌に関与する２以上のキナーゼを標的するキナーゼ阻害剤は、個々のキナーゼ標的についての特異的な阻害剤に対していくつかの利点を有する。これは特に、標的キナーゼが腫瘍形成に特徴的な役割を有する場合に当てはまる。例えば、オーロラキナーゼ、KDR（VEGFR2）およびMETなどの小配列の標的の特異的な阻害剤は、これら三つの標的を通して細胞分割、血管形成および転移を同時に中断させることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
キナーゼが癌などの多くの疾患および病態に関与しているため、治療に用いることができる新規かつ強力なタンパク質キナーゼモジュレータを開発する必要がある。本発明は当分野におけるこれらおよび他の必要性を果たす。いくつかのタンパク質キナーゼが具体的に本明細書に命名されているが、本発明はこれらのキナーゼの阻害剤に限定されないで、その範囲内で、関連タンパク質キナーゼの阻害剤および同種タンパク質の阻害剤が挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の概要
ある態様において、本発明は式：
【化１】
2009515998.tif 000003
で示されるピラゾロチアゾールキナーゼモジュレータを提供する。
【００１６】
式(I)において、R1およびR3は独立して水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールである。R2およびR4は独立して-C(X1)R5、-SO2R6、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールである。X1は独立して=N(R7)、=Sまたは=Oであり、ここに、R7は水素、シアノ、-NR8R9、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
【００１７】
R5は独立して-NR8R9、-OR10、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールである。R6は独立して-NR8R9、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールである。R8およびR9は独立して水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールである。R10は独立して置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
【００１８】
R1とR2、R3とR4およびR8とR9は独立して適宜それらが結合している窒素と一緒になって、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成してもよい。
【００１９】
別の態様において、本発明はタンパク質キナーゼの活性を調節する方法を提供する。該方法は、タンパク質キナーゼを本発明のピラゾロチアゾール化合物と接触させることを含む。
【００２０】
別の態様において、本発明は、タンパク質キナーゼ（例えばレセプターチロシンキナーゼ、またはエイブルソンチロシンキナーゼ、Ronレセプターチロシンキナーゼ、Metレセプターチロシンキナーゼ、3-ホスホイノシチド依存キナーゼ1、オーロラキナーゼ、サイクリン依存キナーゼ、神経成長因子レセプター（TRKC）、コロニー刺激因子1レセプター（CSF1R）および血管内皮成長因子レセプター2（VEGFR2、KDR）から選択されるキナーゼ）の活性を調節する方法を提供する。該方法は、タンパク質チロシンキナーゼを本発明のピラゾロチアゾール化合物と接触させることを含む。
【００２１】
別の態様において、本発明は、本発明のピラゾロチアゾール化合物を医薬的に許容される賦形剤とともに含む、医薬組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
発明の詳しい記載
定義
本明細書において略語は、その化学的および生物学的分野の範囲内の従来の意味を有する。
【００２３】
置換基がその慣習的な化学式により左から右に記載することにより具体的に示されている場合、それらは右から左への構造を記載することから生じうる化学的に同一の置換基を均等的に包含し、例えば-CH2O-は-OCH2-と均等である。
【００２４】
用語「アルキル」は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、特に明記されなければ、完全に飽和であるか、モノまたはポリ不飽和であることができる、直鎖（すなわち非分枝鎖）もしくは分枝鎖または環状炭化水素基またはその組合せを意味し、指定された数の炭素原子（すなわちC1-C10は１〜１０の炭素を意味する）を有する二価および多価の基を含むことができる。飽和炭化水素基の例としては、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、シクロヘキシル、(シクロヘキシル)メチル、シクロプロピルメチル、例えばn-ペンチル、n-ヘキシル、n-ヘプチル、n-オクチルなどの同族体および異性体などの基が挙げられるが、これらに限定されない。不飽和アルキル基は１以上の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例としては、ビニル、2-プロペニル、クロチル、2-イソペンテニル、2-(ブタジエニル)、2,4-ペンタジエニル、3-(1,4-ペンタジエニル)、エチニル、1-および3-プロピニル、3-ブチニル、および高級同族体および異性体が挙げられるが、これらに限定されない。炭化水素基に限定されるアルキル基は「ホモアルキル」と称される。
【００２５】
用語「アルキレン」は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、-CH2CH2CH2CH2-により例示されるアルキルに由来する二価の基を意味するが、これに限定されない。典型的に、アルキル（またはアルキレン）基は、1〜24の炭素原子、本発明において好ましくは10以下の炭素原子を有するだろう。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般に8以下の炭素原子を有する短鎖アルキルまたはアルキレン基である。
【００２６】
用語「ヘテロアルキル」は、それ自体でまたは別の用語と組み合わせて、特に明記されなければ、少なくとも一つの炭素原子とO、N、P、SiおよびSからなる群から選択される少なくとも一つのヘテロ原子からなる、安定な直鎖もしくは分枝鎖または環状炭化水素基またはその組合せを意味し、ここに、窒素および硫黄原子は適宜酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は適宜四級化されていてもよい。ヘテロ原子O、N、PおよびSおよびSiは、ヘテロアルキル基内の任意の位置またはアルキル基が残りの分子に結合している位置にあってよい。例としては、-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH=CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3、-CH=CH-N(CH3)-CH3、O-CH3、-O-CH2-CH3および-CNが挙げられるが、これらに限定されない。２までのヘテロ原子が連続していてもよく、例えば-CH2-NH-OCH3および-CH2-O-Si(CH3)3であることができる。同様に、用語「ヘテロアルキレン」は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、ヘテロアルキルに由来する二価の基を意味し、例えば-CH2-CH2-S-CH2-CH2-および-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-が挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアルキレン基について、ヘテロ原子はまた、鎖の末端の一方または両方を占めることもできる（例えばアルキレンオキソ、アルキレンジオキソ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基について、連結基の配向は連結基の式が記載される方向により示されるものではない。例えば、式-C(O)OR'-は-C(O)OR'-および-R'OC(O)-の両方を意味する。上記のように、ヘテロアルキル基としては、本明細書において、ヘテロ原子を通して残りの分子に結合している基が挙げられ、例えば-C(O)R'、-C(O)NR'、-NR'R''、-OR'、-SR'および／または-SO2R'である。「ヘテロアルキル」が列挙され、次いで-NR'R''などの具体的なヘテロアルキル基が列挙されている場合、用語ヘテロアルキルと-NR'R''は重複しないかまたは互いに排他的ではないことは理解されよう。むしろ、具体的なヘテロアルキル基を列挙して明瞭性を加える。従って、用語「ヘテロアルキル」は、本明細書において、-NR'R''などの具体的なヘテロアルキル基を排除するように解釈すべきではない。
【００２７】
本明細書において、「アルキルエステリル」は、式R'-C(O)O-R''（ここに、R'はアルキレン部分であり、R''はアルキル部分である）を有する部分を意味する。
【００２８】
用語「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、それ自体でまたは他の用語と組み合わせて、特に明記されなければ、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状版を意味する。さらに、ヘテロシクロアルキルについて、ヘテロ原子はヘテロ環が残りの分子に結合している位置を占めることができる。シクロアルキルの例としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、1-シクロヘキセニル、3-シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例としては、1-(1,2,5,6-テトラヒドロピリジル)、1-ピペリジニル、2-ピペリジニル、3-ピペリジニル、4-モルホリニル、3-モルホリニル、テトラヒドロフラン-2-イル、テトラヒドロフラン-3-イル、テトラヒドロチエン-2-イル、テトラヒドロチエン-3-イル、1-ピペラジニル、2-ピペラジニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。用語「シクロアルキレン」および「ヘテロシクロアルキレン」は、それぞれシクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルの二価誘導体を意味する。
【００２９】
用語「シクロアルキルアルキル」は、非置換アルキレン基により残りの分子に結合している3〜7員シクロアルキル基を意味する。炭素原子の具体的な数の列挙（例えばC1-C10シクロアルキルアルキル）は、アルキレン基における炭素原子の数を意味する。
【００３０】
用語「ハロ」または「ハロゲン」は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、特に明記されなければ、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むことを意味する。例えば用語「ハロ(C1-C4)アルキル」は、トリフルオロメチル、2,2,2-トリフルオロエチル、4-クロロブチル、3-ブロモプロピルなどを含むが、これらに限定されないことを意味する。
【００３１】
用語「アリール」は、特に明記されなければ、一緒に縮合しているかまたは共有結合している単環または複数環（好ましくは1〜3の環）であることができる、ポリ不飽和芳香族炭化水素置換基を意味する。用語「ヘテロアリール」は、N、OおよびSから選択される１〜４のヘテロ原子を含むアリール基（または環）を意味し、ここに、窒素および硫黄原子は適宜酸化されていてもよく（例えばピリジンN-オキシド）、窒素原子は適宜四級化されていてもよい。ヘテロアリール基は炭素またはヘテロ原子を通して残りの原子に結合することができる。アリールおよびヘテロアリール基の非限定的な例としては、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、4-ビフェニル、1-ピロリル、2-ピロリル、3-ピロリル、3-ピラゾリル、2-イミダゾリル、4-イミダゾリル、ピラジニル、2-オキサゾリル、4-オキサゾリル、2-フェニル-4-オキサゾリル、5-オキサゾリル、3-イソオキサゾリル、4-イソオキサゾリル、5-イソオキサゾリル、2-チアゾリル、4-チアゾリル、5-チアゾリル、2-フリル、3-フリル、2-チエニル、3-チエニル、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、2-ピリミジル、4-ピリミジル、5-ベンゾチアゾリル、プリニル、2-ベンズイミダゾリル、5-インドリル、1-イソキノリル、5-イソキノリル、2-キノキサリニル、5-キノキサリニル、3-キノリルおよび6-キノリルが挙げられる。上記それぞれのアリールおよびヘテロアリール環系についての置換基は、以下に記載の許容される置換基の群から選択される。用語「アリーレン」および「ヘテロアリーレン」は、それぞれアリールおよびヘテロアリールの二価誘導体を意味する。
【００３２】
略して、他の用語と組み合わせて用いられる場合（例えばアリールオキソ、アリールチオキソ、アリールアルキル）、用語「アリール」は、上記に定義されるアリールおよびヘテロアリール環の両方を含む。従って用語「アリールアルキル」は、アリール基がアルキル基（例えばベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）中の炭素原子（例えばメチレン基）が例えば酸素原子で置換されているアルキル基（例えばフェノキシメチル、2-ピリジルオキシメチル、3-(1-ナフチルオキシ)プロピルなど）などのアルキル基と結合している基を含むことを意味する。しかし、本明細書において、用語「ハロアリール」は、１以上のハロゲンで置換されているアリールのみに及ぶことを意味する。
【００３３】
本明細書において、用語「オキソ」は、炭素原子に二重結合している酸素を意味する。
【００３４】
上記それぞれの用語（例えば「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」ならびにその二価誘導基）は、示された基の置換および非置換形態の両方を含むことを意味する。それぞれのタイプの基についての好ましい置換基は以下に与える。
【００３５】
アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル単価および二価誘導基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニルおよびヘテロシクロアルケニルとして称されることが多い基など）についての置換基は、ゼロから(2m'+l)（ここに、m'は基の炭素原子の総数である）までの範囲の数の-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R''、-SR'、-ハロゲン、-SiR'R''R'''、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-C(O)NR'R''、-OC(O)NR'R''、-NR''C(O)R'、-NR'-C(O)NR''R'''、-NR''C(O)OR'、-NR-C(NR'R'')=NR'''、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R''、-NRSO2R'、-CNおよび-NO2から選択される１以上の種々の基であることができるが、これらに限定されない。R'、R''、R'''およびR''''はそれぞれ、好ましくは独立して水素、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール（例えば1〜3のハロゲンで置換されているアリール）、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基またはアリールアルキル基を意味する。本発明化合物が２以上のR基を含む場合、例えばR基はそれぞれ、２以上のR'、R''、R'''およびR''''基が存在している場合にそのそれぞれであるように独立して選択される。R'およびR''が同じ窒素原子に結合している場合、それらは窒素原子と一緒になって、4、5、6または7員環を形成することができる。例えば-NR'R''は、1-ピロリジニルおよび4-モルホリニルを含むことを意味するが、これらに限定されない。置換基の上記記載から、当業者は用語「アルキル」が水素基以外の基と結合している炭素原子を含む基、例えばハロアルキル（例えば-CF3および-CH2CF3）およびアシル（例えば-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3など）を含むことを意味することを理解するだろう。
【００３６】
上記アルキル基について記載された置換基と同様に、アリールおよびヘテロアリール基（ならびにその二価誘導体）についての典型的な置換基は、芳香環系にてゼロから開環（open）価数の総数までの範囲の数にて、例えばハロゲン、-OR'、-NR'R''、-SR'、-ハロゲン、-SiR'R''R'''、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-C(O)NR'R''、-OC(O)NR'R''、-NR''C(O)R'、-NR'-C(O)NR''R'''、-NR''C(O)OR'、-NR-C(NR'R''R''')=NR''''、-NR-C(NR'R'')=NR'''、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R''、-NRSO2R'、-CNおよび-NO2、-R'、-N3、-CH(Ph)2、フルオロ(C1-C4)アルコキソおよびフルオロ(C1-C4)アルキルから変化し選択され；ここに、R'、R''、R'''およびR''''は、好ましくは独立して水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリールおよび置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択される。本発明化合物が２以上のR基を含む場合、例えばR基はそれぞれ、２以上のR'、R''、R'''およびR''''基が存在している場合にそのそれぞれであるように独立して選択される。
【００３７】
アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の２の置換基は、適宜式-T-C(O)-(CRR')q-U-（ここに、TおよびUは独立して-NR-、-O-、-CRR'-または単結合であり、qは0〜3の整数である）の環を形成していてもよい。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の２の置換基は、適宜式-A-(CH2)r-B-（ここに、AおよびBは独立して-CRR'-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR'-または単結合であり、rは1〜4の整数である）の置換基で置換されていてもよい。そのようにして形成される新たな環の単結合の一つは、適宜二重結合で置き換えられていてもよい。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の２の置換基は、適宜式-(CRR')s-X'-(C''R''')d-（ここに、sおよびdは独立してO〜3の整数であり、X'は-O-、-NR'-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-または-S(O)2NR'-である）の置換基で置換されていてもよい。置換基R、R'、R''およびR'''は好ましくは独立して水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリールおよび置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択される。
【００３８】
本明細書において、用語「ヘテロ原子」または「環ヘテロ原子」は、酸素（O）、窒素（N）、硫黄（S）、リン（P）およびケイ素（Si）を含むことを意味する。
【００３９】
本発明化合物は塩として存在することができる。本発明はそのような塩を含む。適切な塩形態の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、硝酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩（例えば(+)-酒石酸塩、(-)-酒石酸塩またはそのラセミ混合物を含む混合物）、コハク酸塩、安息香酸塩、およびグルタミン酸塩などのアミノ酸との塩が挙げられる。これらの塩は当業者に知られている方法により製造することができる。さらに、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノまたはマグネシウム塩または同様の塩などの塩基付加塩も含まれる。本発明化合物が相対的に塩基性の官能基を含む場合、酸付加塩はそのような化合物の中性形態を十分な量の所望な酸と無溶媒または適切な不活性溶媒中にて接触させることにより得ることができる。許容される酸付加塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、炭酸塩、炭酸一水素塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、硫酸塩、硫酸一水素塩、ヨウ化水素酸塩または亜リン酸塩などの無機酸由来のもの、ならびに酢酸塩、プロピオン酸塩、イソ酪酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、マンデル酸塩、フタル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-トリルスルホン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩などの有機酸由来の塩が挙げられる。さらに、アルギン酸塩などのアミノ酸塩およびグルクロン酸塩またはガラクツロン酸塩などの有機酸の塩も含まれる。本発明化合物のいくつかの具体的な化合物は、該化合物を塩基または酸付加塩に変換することが可能な塩基性および酸性官能基の両方を含む。
【００４０】
化合物の中性形態は、好ましくは従来の方法で塩を塩基または酸と接触させ、親化合物を単離することにより再生する。化合物の親形態は、極性溶媒中の可溶性などのいくつかの物理的特性において種々の塩形態と異なる。
【００４１】
本発明のいくつかの化合物は、非溶媒和形態ならびに水和形態などの溶媒和形態にて存在することができる。一般に、溶媒和形態は非溶媒和形態と均等であり、本発明の範囲内に包含される。本発明のいくつかの化合物は、複数の結晶形または非晶質形態にて存在することができる。一般に、すべての物理的形態は、本発明により包含される使用について均等であり、本発明の範囲内にあるものである。
【００４２】
本発明のいくつかの化合物は、不斉炭素原子（光学中心）または二重結合を有し；絶対立体化学の意味において、(R)-もしくは(S)-またはアミノ酸について(D)-もしくは(L)-として定義することができる鏡像異性体、ラセミ体、ジアステレオマー、互変異性体、幾何異性体、立体異性体、および個別の異性体は本発明の範囲内に包含される。本発明化合物は、当分野にて合成および／または単離することができないほど不安定であるものと知られているものは含まない。本発明は、ラセミ体および光学的に純粋な形態にて化合物を含むことを意味する。光学活性な(R)-および(S)-または(D)-および(L)-異性体は、キラルシントンもしくはキラル試薬を用いて製造するか、または従来の技術を用いて分解することができる。本明細書に記載の化合物がオレフィン結合または他の幾何学的不斉中心を含む場合、特に明記されなければ、化合物はEおよびZの両方の幾何異性体を含むものである。
【００４３】
本明細書において、用語「互変異性体」は、平衡に存在し容易に一の異性体から別のものに変換される、２以上の構造異性体のうちの一つを意味する。
【００４４】
本発明のいくつかの化合物が互変異性体にて存在することができ、化合物のそのようなすべての互変異性体が本発明の範囲内であることは、当業者にとって明らかであろう。
【００４５】
特に明記されなければ、本明細書に示される構造はまた、該構造のすべての立体化学形態、すなわち各不斉中心についてのRおよびSコンフィギュレーションを含むことも意味する。それゆえ、本発明化合物の単一立体化学異性体ならびに鏡像異性体およびジアステレオマー混合物は本発明の範囲内である。
【００４６】
特に明記されなければ、本明細書に示される構造はまた、１以上の同位体濃縮原子の存在のみ異なる化合物を含むことも意味する。例えば、水素の重水素もしくは三重水素による置換または炭素の13C-もしくは14C-濃縮炭素による置換を除き、本発明の構造を有する化合物は、本発明の範囲内である。
【００４７】
本発明化合物はまた、そのような化合物を構成する１以上の原子にて非天然的割合の原子同位体も含むことができる。例えば、化合物は、例えば三重水素（3H）、ヨウ素-125（125I）または炭素-14（14C）などの放射性同位体で放射性標識することができる。本発明化合物のすべての同位体的変形は、放射性であろうとなかろうと、本発明の範囲内に包含される。
【００４８】
用語「医薬的に許容される塩」は、本明細書に記載の化合物に見られる特定の置換部分に応じて、相対的無毒性酸または塩基と製造される活性化合物の塩を含むことを意味する。本発明化合物が相対的酸性官能基を含む場合、塩基付加塩は、無溶媒または適切な不活性溶媒中にてそのような化合物の中性形態を十分な量の所望の塩基と接触させることにより得ることができる。医薬的に許容される塩基付加塩の例としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノまたはマグネシウム塩または同様の塩が挙げられる。本発明化合物が相対的塩基性官能基を含む場合、酸付加塩は、無溶媒または適切な不活性溶媒中にてそのような化合物の中性形態を十分な量の所望の酸と接触させることにより得ることができる。医薬的に許容される酸付加塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、炭酸塩、炭酸一水素塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、硫酸塩、硫酸一水素塩、ヨウ化水素酸塩または亜リン酸塩などの無機酸由来の塩ならびに酢酸塩、プロピオン酸塩、イソ酪酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、マンデル酸塩、フタル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-トリルスルホン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩などの相対的に無毒性の有機酸由来の塩が挙げられる。さらに、アルギン酸塩などのアミノ酸の塩およびグルクロン酸またはガラクツロン酸などの有機酸の塩も含まれる（例えば、文献（Berge et al.,「Pharmaceutical Salts」, Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19）を参照のこと）。本発明のいくつかの特定の化合物は、化合物を塩基または酸付加塩に変換することができる塩基性および酸性官能基の両方を含む。
【００４９】
塩形態に加えて、本発明はプロドラッグ形態の化合物を提供する。本明細書に記載の化合物のプロドラッグは、生理学的条件下、化学変化を容易に受けて本発明化合物を提供する化合物である。さらに、プロドラッグは、生体外環境中、化学的または生化学的方法により本発明化合物に変換されうる。例えば、プロドラッグは、適切な酵素または化学的試薬と経皮パッチ容器内に置いた場合、本発明化合物にゆっくりと変換しうる。
【００５０】
用語「a」、「an」または「a(n)」は、本明細書の置換基に関して用いる場合、少なくとも一つを意味する。例えば、化合物が「an」アルキルまたはアリールで置換されている場合、該化合物は適宜少なくとも一つのアルキルおよび／または少なくとも一つのアリールで置換されていてもよい。さらに、部分がR置換基で置換されている場合、基は「R-置換」と称することができる。部分がR-置換である場合、該部分は少なくとも一つのR置換基で置換されており、各R置換基は適宜異なっていてもよい。
【００５１】
本発明化合物の記載は、当業者に知られている化学結合の原理により限定される。従って、基が１以上の数の置換基で置換することができる場合、そのような置換基は、化学結合の原理に適合し、本質的には不安定でなくおよび／または当業者に水性、中性、生理学的条件などの通常条件下にて不安定であるようだと知られているような化合物を得るように選択する。
【００５２】
特定の疾患に関する用語「治療する」または「治療」は、疾患の予防を含む。
【００５３】
ピラゾロチアゾールキナーゼモジュレータ
ある態様において、本発明は、式：
【化２】
2009515998.tif 000004
で示されるピラゾロチアゾールキナーゼモジュレータを提供する。
【００５４】
式(I)において、R1、R2、R3およびR4は上記に定義されているとおりである。
【００５５】
いくつかの具体的態様において、R1およびR3は独立して水素、R11-置換もしくは非置換アルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロアルキル、R11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールである。いくつかの具体的態様において、R2およびR4は独立して-C(X1)R5、-SO2R6、R11-置換もしくは非置換アルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロアルキル、R11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールである。いくつかの具体的態様において、X1は独立して=N(R7)、=Sまたは=Oであり、ここに、R7は水素、シアノ、-NR8R9、R11-置換もしくは非置換アルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールである；
【００５６】
いくつかの具体的態様において、R5は独立して-NR8R9、-OR10、R11-置換もしくは非置換アルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロアルキル、R11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールである。いくつかの具体的態様において、R6は独立して-NR8R9、R11-置換もしくは非置換アルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロアルキル、R11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールである。いくつかの具体的態様において、R8およびR9は独立して水素、R11-置換もしくは非置換アルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロアルキル、R11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
【００５７】
いくつかの具体的態様において、R10は独立してR11-置換もしくは非置換アルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロアルキル、R11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
【００５８】
いくつかの具体的態様において、R1とR2、R3とR4およびR8とR9は独立して適宜それらが結合している窒素と一緒になって、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成してもよい。
【００５９】
R11は独立してハロゲン；-L1-C(X2)R12；-L1-OR13；-L1-NR14R15；-L1-S(O)mR16；-CN；-NO2；-CF3；(1) 非置換C3-C7シクロアルキル；(2) 非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル；(3) 非置換ヘテロアリール；(4) 非置換アリール；(5) 置換C3-C7シクロアルキル；(6) 置換3〜7員ヘテロシクロアルキル；(7) 置換アリール；(8) 置換ヘテロアリール；(9) 非置換C1-C20アルキル；(10) 非置換2〜20員ヘテロアルキル；(11) 置換C1-C20アルキル；または(12) 置換2〜20員ヘテロアルキルである。
【００６０】
置換基(5)、(6)、(11)および(12)は独立してオキソ、-OH、-CF3、-COOH、シアノ、ハロゲン、R17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18-置換もしくは非置換アリール、R18-置換もしくは非置換ヘテロアリール、-L1-C(X2)R12、-L1-OR13、-L1-NR14R15または-L1-S(O)mR16で置換されている。置換基(7)および(8)は独立して-OH、-CF3、-COOH、シアノ、ハロゲン、R17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18-置換もしくは非置換アリール、R18-置換もしくは非置換ヘテロアリール、-L1-C(X2)R12、-L1-OR13、-L1-NR14R15または-L1-S(O)mR16で置換されている。
【００６１】
X2は独立して=S、=Oまたは=NR27である。R27はH、-CN、-NR8R9、-OR28、R17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18-置換もしくは非置換アリールまたはR18-置換もしくは非置換ヘテロアリールである。R28は水素またはR17-置換もしくは非置換C1-C10アルキルである。記号mは独立して0〜2の整数を示す。
【００６２】
R12は独立して水素、R17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18-置換もしくは非置換アリール、R18-置換もしくは非置換ヘテロアリール、-OR19または-NR20R21である。R19、R20およびR21は独立して水素、R17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18-置換もしくは非置換アリールまたはR18-置換もしくは非置換ヘテロアリールである。R20は適宜-S(O)2R30または-C(O)R30であってもよい。R20およびR21は適宜それらが結合している窒素と一緒になって、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキルまたはR18-置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成してもよい。R30はR17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18-置換もしくは非置換アリールまたはR18-置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
【００６３】
R13、R14およびR15は独立して水素、-CF3、R17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18-置換もしくは非置換アリール、R18-置換もしくは非置換ヘテロアリール、-C(X3)R22または-S(O)2R22である。R14およびR15は適宜それらが結合している窒素と一緒になって、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキルまたはR18-置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成してもよい。X3は独立して=S、=Oまたは=NR23である。R23はシアノ、-NR8R9、R17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18-置換もしくは非置換アリールまたはR18-置換もしくは非置換ヘテロアリールである。R22は独立してR17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18-置換もしくは非置換アリール、R18-置換もしくは非置換ヘテロアリールまたは-NR24R25である。いくつかの具体的態様において、R11が-L1-NR14R15であり、R14またはR15が-C(X3)R22である場合、R22は適宜水素であってもよい。R24およびR25は独立して水素、R17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18-置換もしくは非置換アリールまたはR18-置換もしくは非置換ヘテロアリールである。R24およびR25はそれらが結合している窒素と一緒になって、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキルまたはR18-置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成することができる。
【００６４】
R16は独立してR17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18-置換もしくは非置換アリール、R18-置換もしくは非置換ヘテロアリールまたは-NR26R27である。いくつかの具体的態様において、mが0である場合、R16は適宜水素であってもよい。R26およびR27は独立して水素、シアノ、-NR8R9、R17-置換もしくは非置換C1-C10アルキル、R17-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R17-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R17-置換もしくは非置換3〜7員21-置換もしくは非置換ヘテロアリールである。R26およびR27はそれらが結合している窒素と一緒になって、R17-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキルまたはR18-置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成することができる。R26はさらに-C(O)R30であることができる。
【００６５】
L1は独立して結合、非置換C1-C10アルキレンまたは非置換ヘテロアルキレンである。R17は独立してオキソ、-OH、-COOH、-CF3、-OCF3、-CN、アミノ、ハロゲン、R28-置換もしくは非置換2〜10員アルキル、R28-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R28-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R28-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R29-置換もしくは非置換アリールまたはR29-置換もしくは非置換ヘテロアリールである。R18は独立して-OH、-COOH、アミノ、ハロゲン、-CF3、-OCF3、-CN、R28-置換もしくは非置換2〜10員アルキル、R28-置換もしくは非置換2〜10員ヘテロアルキル、R28-置換もしくは非置換C3-C7シクロアルキル、R28-置換もしくは非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、R29-置換もしくは非置換アリールまたはR29-置換もしくは非置換ヘテロアリールである。R28は独立してオキソ、-OH、-COOH、アミノ、ハロゲン、-CF3、-OCF3、-CN、非置換C1-C10アルキル、非置換2〜10員ヘテロアルキル、非置換C3-C7シクロアルキル、非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリールである。R29は独立して-OH、-COOH、アミノ、ハロゲン、-CF3、-OCF3、-CN、非置換C1-C10アルキル、非置換2〜10員ヘテロアルキル、非置換C3-C7シクロアルキル、非置換3〜7員ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリールである。
【００６６】
いくつかの具体的態様において、R1は水素である。いくつかの具体的態様において、R3は水素である。いくつかの具体的態様において、R2は-C(X1)R5、R11-置換もしくは非置換アルキル、R11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、ここに、X1は=Oである。
【００６７】
いくつかの具体的態様において、R2は-C(X1)R5である。いくつかの具体的態様において、R5はR11-置換もしくは非置換アルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロアルキル、R11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールである。いくつかの具体的態様において、R5はR11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールである。いくつかの具体的態様において、R5はR11-置換もしくは非置換シクロアルキルである。
【００６８】
いくつかの具体的態様において、R4は-C(X1)R5、R11-置換もしくは非置換アルキル、R11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択され、ここに、X1は=Oである。いくつかの具体的態様において、R4はR11-置換もしくは非置換アルキルであり、ここに、R11は(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)または(8)である。いくつかの具体的態様において、R4は-C(X1)R5、R11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択され、ここに、X1は=Oである。いくつかの具体的態様において、R4は-C(X1)R5である。いくつかの具体的態様において、R4の一部を形成するR5はR11-置換もしくは非置換アルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロアルキル、R11-置換もしくは非置換シクロアルキル、R11-置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、R11-置換もしくは非置換アリールまたはR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールである。いくつかの具体的態様において、R4内のR5はR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールまたはR11-置換もしくは非置換アリールである。いくつかの具体的態様において、R4内のR5の一部を形成するR11はハロゲン、-L1-S(O)mR16、-L1-OR13、-L1-C(X2)R12、-L1-NR14R15、(3)、(4)、(7)または(8)である。いくつかの具体的態様において、R4内のR11のL1は結合またはメチレンである。いくつかの具体的態様において、mは2である。いくつかの具体的態様において、R4のR11-置換ヘテロアリールおよびR4のR11-置換アリールはオルト位で置換されている。
【００６９】
いくつかの具体的態様において、R4およびR3はそれらが結合している窒素と一緒になって、R11-置換もしくは非置換5員ヘテロアリールを形成する。いくつかの具体的態様において、R4およびR3はそれらが結合している窒素と一緒になって、R11-置換もしくは非置換ピロリル、R11-置換もしくは非置換イミダゾリル、R11-置換もしくは非置換ピラゾリルおよびR11-置換もしくは非置換トリアゾリルからなる群から選択されるR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成する。いくつかの具体的態様において、R4およびR3はそれらが結合している窒素と一緒になって、R11-置換もしくは非置換[1,2,3]トリアゾリル、R11-置換もしくは非置換[1,2,4]トリアゾリルまたはR11-置換もしくは非置換[1,3,4]トリアゾリルを形成する。いくつかの具体的態様において、R3およびR4により形成されるR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールのR11はハロゲン、-L1-S(O)mR16、-L1-OR13、-L1-C(X2)R12、-L1-NR14R15、(3)、(4)、(7)または(8)である。いくつかの具体的態様において、R3およびR4により形成されるR11-置換もしくは非置換ヘテロアリールのR11は(7)または(8)である。いくつかの具体的態様において、(7)および(8)は独立してハロゲン、-L1-OR13、-L1-NR14R15、-L1-C(X2)R12、-L1-S(O)mR16、R17-置換もしくは非置換C1-C10アルキルまたはR18-置換もしくは非置換ヘテロアリールで置換されている。いくつかの具体的態様において、L1は結合またはメチレンである。いくつかの具体的態様において、R4およびR3により形成されるR11-置換ヘテロアリールはオルト位で置換されている。
【００７０】
典型的な合成
本発明化合物は、一般によく知られている合成法の適当な組合せにより合成される。本発明化合物の合成に有用な技術は、関連分野の当業者に容易に明らかかつ利用可能なもの（例えば、文献（Elnagdi, et al., J. Heterocyclic Chem., 16: 61-64 (1979), Pawar, et al., Indian J. Chem., 28B: 866-867 (1989), Chande, et al., Indian J. Chem., 35B: 373-376 (1996)）および以下の特許（DE2429195 (1974), US6566363 (2003), WO05068473A1 (2005), WO05095420A1 (2005)）に開示される技術など（これらはすべての目的のためにそのまま引用される））である。以下の議論は、本発明化合物を組み立てる際の使用に利用できるいくつかの種々の方法を説明するために提示する。しかし、議論は、本発明化合物の製造に有用な反応または一連の反応の範囲を定義するものではない。本発明化合物は、以下の実施例に開示される手順および技術ならびに既知の有機合成技術により製造することができる。
【００７１】
以下の典型的な合成において、記号R1、R2、R3およびR4は、特に明記されなければ、上記「ピラゾロチアゾールキナーゼモジュレータ」項に定義されているとおりである。
【００７２】
一般式I
【化３】
2009515998.tif 000005
一般式Iの工程Aにて、チオウレア(b)の合成は、適切に保護されたピラゾール(a)をチオホスゲンまたはチオカルボニルジイミダゾールなど（これらに限定されない）のチオカルボニル試薬と反応させた後、アンモニア、水酸化アンモニウム、アニリン、ヘテロアリールアミン、第一級または第二級アミンなど（これらに限定されない）のアミンで処理することにより行うか、あるいはピラゾール(a)をハロゲン化炭化水素、エーテル溶媒、THF、DMFおよびその水混合物などの適切な溶媒中-30℃〜100℃の範囲の温度にてイソチオシアネート試薬と反応させる。
【００７３】
工程Bにおいて、二環式中間体(c)または(d)の合成は、酢酸、DMF、エーテル溶媒またはハロゲン化炭化水素などの適切な溶媒中-10℃〜100℃の範囲の温度にて、誘導体(b)を塩素、臭素、ヨウ素、ICl、N-クロロスクシンイミド、N-ブロモスクシンイミド、N-ヨードスクシンイミドまたはベンジルトリメチルアンモニウムトリブロミドなど（これらに限定されない）の適切なハロゲン化剤と反応させることにより達成する。
【００７４】
工程Cにおいて、ハロゲン化二環式中間体(e)または(h)の合成は、誘導体(c)または(g)をそれぞれ酸性媒体中の亜硝酸ナトリウムまたは亜硝酸イソアミルなど（これらに限定されない）の適切な「亜硝酸」試薬と所望のハロゲンの銅塩の存在下、アルコール、エーテル溶媒、DMFもしくは水またはその混合物などの適切な溶媒中-78℃〜100℃の範囲の温度にて反応させることにより達成する。
【００７５】
工程Dにおいて、中間体(d)の合成は、ハロゲン化中間体(e)をLewis酸の存在下または非存在下、アルコール、エーテル溶媒、DMFまたはDMSOなどの適切な溶媒中-0℃〜250℃の範囲の温度にて通常の加熱またはマイクロウェーブ加熱下にて第一級もしくは第二級アミン、アニリンまたはヘテロアリールアミンと反応させることにより達成する。あるいは、中間体(d)は、文献（Hartwig et al. J. Org. Chem. 2003, 68, 2861-73）に例示されるように、パラジウム、銅またはニッケルおよび電子豊富なホスフィン、N-ヘテロ環カルベンまたはアミノホスフィンなどのその適当なリガンドなどの金属触媒の存在下、リン酸カリウム、ナトリウムtert-ブトキシドまたは炭酸セシウムなどの塩基の存在下、トルエン、ハロゲン化炭化水素、エーテル溶媒、DMFもしくは水またはその混合物などの適切な溶媒中0℃〜180℃の範囲の温度にて、ハロゲン化中間体(e)を第一級もしくは第二級アミン、アニリンまたはヘテロアリールアミンと反応させることにより得る。
【００７６】
工程Eは中間体(d)の別の合成を例示する。適宜NH部位にて保護されていてもよい中間体(f)をトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、重炭酸ナトリウムまたは炭酸ナトリウムなど（これらに限定されない）の塩基の存在下または非存在下エーテル溶媒、DMF、DMSOなどの適切な溶媒中20℃〜200℃の範囲の温度にてカルボン酸（DCC、EDC、HATU、HBTU、PyBOPなど（これらに限定されない）のアミドカップリング剤と組み合わせて）、酸塩化物、イソシアネート、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、イミドイルクロリド、イミドエート（imidoate）エステルまたはイソチオウレアなどの適切な求電子剤で処理し、次いでアルコール、エーテル溶媒、DMFおよびその水混合物などの適切な溶媒中0℃〜100℃の範囲の温度にて水酸化ナトリウムまたは第一級アルキルアミンなど（これらに限定されない）の塩基で塩基加水分解し、中間体(d)をうまく生成する。あるいは、適宜NH部位にて保護されていてもよい中間体(f)を水素化ホウ素ナトリウムまたはシアノ水素化ホウ素ナトリウムなど（これらに限定されない）の還元剤の存在下アルデヒドで処理し、中間体(d)を得ることができる。
【００７７】
工程Fにおいて、二環式中間体(d)は標準的脱保護条件を受けて中間体(g)を得る。そのような条件は当業者によく知られており、文献（Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd ed. John Wiley＆Sons (1999)）に例示されている。
【００７８】
工程Gは、一般式(I)の最終生成物の典型的な合成を示す。適宜NH部位で保護されていてもよい中間体(g)をエーテル溶媒、DMF、DMSOなどの適切な溶媒中20℃〜200℃の範囲の温度にてカルボン酸（DCC、EDC、HATU、HBTU、PyBOPなど（これらに限定されない）のアミドカップリング剤と組み合わせて）、酸塩化物、イソシアネート、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、イミドイルクロリド、イミドエートエステルまたはイソチオウレアなどの適切な求電子剤で処理し、次いでアルコール、エーテル溶媒、DMFおよびその水混合物などの適切な溶媒中0℃〜100℃の範囲の温度にて水酸化ナトリウムまたは第一級アルキルアミンなど（これらに限定されない）の塩基で塩基性加水分解し、所望の生成物(I)を得る。あるいは、中間体(g)を水素化ホウ素ナトリウムまたはシアノ水素化ホウ素ナトリウムなど（これらに限定されない）の還元剤の存在下アルコール、エーテル溶媒、ハロゲン化炭化水素またはDMFなどの適切な溶媒中0℃〜100℃の範囲の温度にてアルデヒドと反応させ、所望の生成物(I)を得る。別の例において、中間体(g)を脱水剤の存在下または非存在下アルコール、エーテル溶媒またはトルエンなどの適切な溶媒中0℃〜100℃の範囲の温度にてアルデヒドと反応させることによりイミン中間体が形成され、これをさらに炭酸カリウムなど（これに限定されない）の塩基の存在下エーテル溶媒またはDMFなどの適切な溶媒中0℃〜100℃の範囲の温度にてイソシアニドで処理し、所望の生成物(I)（ここに、R3およびR4は結合して環を形成する）を得る。別の例において、中間体(g)は、塩基の存在下または非存在下、無溶媒またはアセトニトリル、トルエン、エーテル溶媒もしくはピリジンなどの適切な溶媒中0℃〜180℃の範囲の温度にて1,4-ジカルボニル試薬、置換オキサジアゾールまたは置換ピラノンなど（これらに限定されない）の環化試薬と反応し、所望の生成物(I)を形成することができる。
【００７９】
工程Hは最終生成物(I)の合成のさらに別の例を示す。適宜NH部位で保護されていてもよい中間体(h)は、アルコール、エーテル溶媒、DMFまたはDMSOなどの適切な溶媒中0℃〜250℃の範囲の温度にて通常の加熱またはマイクロウェーブ加熱下ピロール、イミダゾール、トリアゾールまたはテトラゾールなどの「アニオン性」窒素を有する第一級もしくは第二級アミン、アニリン、ヘテロアリールアミンまたはヘテロアリールで処理し、所望の生成物(I)を得る。あるいは、文献（Hartwig et al. J. Org. Chem. 2003, 68, 2861-73）に例示されるように、第一級もしくは第二級アミン、アニリンまたはヘテロアリールアミンなどの種々のアミンでのハロゲンの置換は、パラジウム、銅またはニッケルおよび電子豊富なホスフィン、N-ヘテロ環カルベンまたはアミノホスフィンなどのその適当なリガンドなどの金属触媒の存在下リン酸カリウム、ナトリウムtert-ブトキシドまたは炭酸セシウムなど（これらに限定されない）の塩基の存在下トルエン、ハロゲン化炭化水素、エーテル溶媒、DMFもしくは水またはその混合物などの適切な溶媒中0℃〜180℃の範囲の温度にて達成することができる。
【００８０】
一般式II
【化４】
2009515998.tif 000006
一般式IIの工程Aは最終生成物(b)の典型的な合成を示す。適宜NH部位で保護されていてもよい中間体(a)をエーテル溶媒、DMF、DMSOなどの適切な溶媒中20℃〜200℃の範囲の温度にてカルボン酸（DCC、EDC、HATU、HBTU、PyBOPなど（これらに限定されない）のアミドカップリング剤と組み合わせて）または酸などの適切なアシル化種で処理し、次いでアルコール、エーテル溶媒、DMFおよびその水混合物などの適切な溶媒中0℃〜100℃の範囲の温度にて水酸化ナトリウムまたは第一級アルキルアミンなど（これらに限定されない）の塩基で塩基性加水分解し、所望の生成物(b)を得る。
【００８１】
工程Bはピラゾロチアゾール(b)のアシルまたはカーバメート基を加水分解する方法を記載する。(a)を水性媒体中、加熱またはマイクロウェーブ条件下50〜200℃の範囲の温度にて塩酸、硫酸または過塩素酸など（これらに限定されない）の強酸で処理し、ピラゾロチアゾール(b)を得る。
【００８２】
工程Cはピラゾロチアゾールウレア(c)をピラゾロチアゾールカーバメート(b)から製造する方法を記載する。(b)をアルコール、エーテル溶媒、DMFまたはDMSOなどの適切な溶媒中、加熱またはマイクロウェーブ条件下50〜200℃の範囲の温度にてアミンで処理し、最終生成物(c)を得る。
【００８３】
工程Dは最終生成物(I)の典型的な合成を示す。ピラゾロチアゾール(a)を塩基の存在下DMSO、NMPまたはDMFなどの適切な溶媒中0〜150℃の範囲の温度にて活性化ハロゲン化アリールまたはヘテロアリールと反応させ、最終生成物(I)を得る。あるいは、文献（Hartwig et al. J. Org. Chem. 2003, 68, 2861-73）に例示されるように、アミン基におけるハロゲン化アリールまたはヘテロアリールでの置換は、パラジウム、銅またはニッケルおよび電子豊富なホスフィン、N-ヘテロ環カルベンまたはアミノホスフィンなどのその適当なリガンドなどの金属触媒の存在下リン酸カリウム、ナトリウムtert-ブトキシドまたは炭酸セシウムなど（これらに限定されない）の塩基の存在下トルエン、ハロゲン化炭化水素、エーテル溶媒、DMFもしくは水またはその混合物などの適切な溶媒中0℃〜180℃の範囲の温度にて達成することができる。
【００８４】
工程Eにおいて、ハロゲン化中間体(d)の合成は、誘導体(a)を所望のハロゲンの銅塩の存在下アルコール、エーテル溶媒、DMFもしくは水またはその混合物などの適切な溶媒中-78℃〜100℃の範囲の温度にて酸性媒体中の亜硝酸ナトリウムまたは亜硝酸イソアミルなど（これらに限定されない）の適切な「亜硝酸」試薬と反応させることにより達成する。
【００８５】
工程Fにおいて、最終生成物(I)の合成は、ハロゲン化中間体(d)をLewis酸の存在下または非存在下アルコール、エーテル溶媒、DMFまたはDMSOなどの適切な溶媒中0℃〜250℃の範囲の温度にて通常の加熱またはマイクロウェーブ加熱下、第一級もしくは第二級アミン、アニリンまたはヘテロアリールアミンと反応させることにより達成する。あるいは、文献（Hartwig et al. J. Org. Chem. 2003, 68, 2861-73）に例示されるように、最終生成物(I)は、ハロゲン化中間体(d)をパラジウム、銅またはニッケルおよび電子豊富なホスフィン、N-ヘテロ環カルベンまたはアミノホスフィンなどのその適当なリガンドなどの金属触媒の存在下リン酸カリウム、ナトリウムtert-ブトキシドまたは炭酸セシウムなどの塩基の存在下トルエン、ハロゲン化炭化水素、エーテル溶媒、DMFもしくは水またはその混合物などの適切な溶媒中0℃〜180℃の範囲の温度にて第一級もしくは第二級アミン、アニリンまたはヘテロアリールアミンと反応させることにより得る。
【００８６】
上記の一般的な方法は、反応式1〜6に示される変換によりさらに例示される。
反応式1
【化５】
2009515998.tif 000007
【００８７】
反応式1において、5-ニトロ-2H-ピラゾール-3-カルボン酸(a)は、tert-ブタノール中ジフェニルホスホリルアジドで処理し、クルチウス転位によりピラゾール(b)を得る。化合物(b)はさらに水素雰囲気下パラジウム触媒の存在下にてアミノピラゾール(c)に還元する。
反応式2
【化６】
2009515998.tif 000008
【００８８】
反応式2において、アミノピラゾール(a)はイソチオシアネートで処理し、チオウレア(b)を生成する。R2＝ベンゾイル(Bz)の場合、ベンゾイル基を水酸化ナトリウムなどの塩基条件下除去し、チオウレア(c)を得る。チオウレア(b)および(c)はともに、酢酸中の臭素またはN-ブロモスクシンイミドなどのブロモカチオン源の存在下、それぞれピラゾロチアゾール(d)および(e)に環化される。
反応式3
【化７】
2009515998.tif 000009
【００８９】
反応式3において、ピラゾロチアゾール(a)はまず、過剰のアシルクロリドまたは「活性化」カルボン酸で加熱条件下、処理し、次いで第一級アミンで捕捉し、ピラゾロチアゾール(b)を得る。化合物(b)のBOC保護基は、ポリマー支持体上のチオフェノールなどのカチオン捕捉剤の存在下、酸性処理することにより除去し、アミノピラゾロチアゾール(c)を得る。あるいは、ピラゾロチアゾール(a)を臭化銅(I)の存在下、亜硝酸イソアミルまたは亜硝酸tert-ブチルなどの亜硝酸アルキルで処理し、ブロモピラゾロチアゾール(d)を得る。次いで、化合物(d)を種々のアミンの存在下、ピラゾロチアゾール(e)に変換する。あるいは、ピラゾロチアゾール(a)をトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元条件下アルデヒドで処理し、ピラゾロチアゾール(e)を得る。
【００９０】
反応式4
【化８】
2009515998.tif 000010
反応式4において、ピラゾロチアゾール(a)は臭化銅(II)の存在下、ジアゾ化し、ブロモピラゾロチアゾール(b)を得る。次いで、化合物(b)を金属またはルイス酸触媒の存在下または非存在下、加熱またはマイクロウェーブ条件下、種々のアミンで処理し、ピラゾロチアゾール(c)を得る。
【００９１】
反応式5
【化９】
2009515998.tif 000011
反応式5にて、ピラゾロチアゾール(a)をまず、加熱条件下、過剰のアシルクロリドまたは「活性化」カルボン酸で処理し、次いで第一級アミンで捕捉し、ピラゾロチアゾール(b)を得る。別の実施例にて、ピラゾロチアゾール(a)をシアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤の存在下、アルデヒドで処理し、置換アミノピラゾロチアゾール(c)を得る。あるいは、ピラゾロチアゾール(a)をアルコール溶媒中、加熱条件下、アルデヒドと反応させ、イミン(e)を形成させ、これをすぐに加熱条件下、塩基の存在下、適宜置換されていてもよいトシルメチルイソシアニドと反応させ、イミダゾール(f)を得る。別の実施例において、ピラゾロチアゾール(a)を加熱またはマイクロウェーブ条件下、1,4-ジカルボニル試薬で処理し、ピロール(d)を得る。
【００９２】
反応式6
【化１０】
2009515998.tif 000012
反応式6において、ピラゾロチアゾール(a)を加熱条件下、過剰の適切に置換されたオキサジアゾールで処理し、ピラゾール(b)を得る。あるいは、ピラゾロチアゾール(a)を塩基存在下、適切に置換されたピラン-2-オンで処理し、ピラゾロチアゾール(c)を得る。別の実施例において、ピラゾロチアゾール(a)を加熱条件下イミデート種で処理し、イミデート(d)を得、これをさらに加熱条件下、塩基存在下にてブロモアセチルケトンまたはブロモピルビン酸種と反応させて環化させ、ピラゾロチアゾール(e)とする。
【００９３】
本発明化合物は化学合成の分野にて一般に知られている１以上の保護基を用いて合成することができる。用語「保護基」は、保護基が除去されるまで、化合物のいくつかのまたはすべての反応性部分を遮断し、そのような部分の化学反応への関与を防止する、化学的部分を意味し、例えば文献（Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd ed. John Wiley＆Sons (1999)）に記載の基が挙げられる。異なる保護基が用いられる場合、そのそれぞれの（異なる）保護基が異なる手段により除去可能であることは有利であることができる。完全に異なる反応条件下にて開裂される保護基は、そのような保護基の特異的な除去を可能とする。例えば保護基は酸、塩基および水素化分解により除去することができる。トリチル、ジメトキシトリチル、アセタールおよびt-ブチルジメチルシリルなどの基は酸不安定であり、水素化分解により除去可能なCbz基または塩基不安定なFmoc基で保護されたアミノ基の存在下カルボキシおよびヒドロキシ反応性部分を保護するために用いることができる。カルボン酸およびヒドロキシ反応性部分は、t-ブチルカーバメートなどの酸不安定基、または安定であるが加水分解で除去可能な酸および塩基の両方であるカーバメートで保護されたアミンの存在下、メチル、エチルおよびアセチルなど（これらに限定されない）の塩基不安定基で保護することができる。
【００９４】
カルボン酸およびヒドロキシ反応性部分はまた、ベンジル基などの加水分解で除去可能な保護基で保護することもできるが、酸と水素結合することができるアミン基はFmocなどの塩基不安定基で保護することができる。カルボン酸反応性部分は、2,4-ジメトキシベンジルなどの酸化的に除去可能な保護基で保護することができるが、共存するアミノ基はフッ化物不安定シリルカーバメートで保護することができる。
【００９５】
アリル保護基は、酸保護基が安定であり、次いで金属またはパイ酸触媒により除去することができるため、酸および塩基保護基の存在下にて有用である。例えば、アリル保護カルボン酸は、酸不安定t-ブチルカーバメートまたは塩基不安定酢酸アミン保護基の存在下にてパラジウム(0)触媒反応で脱保護することができる。保護基のさらに別の形態は、化合物または中間体が付着することができる樹脂である。残基が樹脂に付着する限り、その官能基は保護され、反応することができない。樹脂から放出されるとすぐに、官能基は反応することが可能となる。
【００９６】
典型的な遮断基または保護基としては、例えば以下の基が挙げられる：
【化１１】
2009515998.tif 000013
【００９７】
キナーゼの阻害方法
別の態様にて、本発明は、本発明のピラゾロチアゾールキナーゼモジュレータを用いてタンパク質キナーゼ活性を調節する方法を提供する。本明細書において、用語「キナーゼ活性を調節する」は、本発明のピラゾロチアゾールキナーゼモジュレータと接触させた場合、ピラゾロチアゾールキナーゼモジュレータの非存在下の活性と比較してタンパク質キナーゼの活性が増大または減少することを意味する。それゆえ、本発明は、タンパク質キナーゼを本発明のピラゾロチアゾールキナーゼモジュレータと接触させることによりタンパク質キナーゼ活性を調節する方法を提供する。
【００９８】
いくつかの典型的な具体的態様において、ピラゾロチアゾールキナーゼモジュレータはキナーゼ活性を阻害する。本明細書において、キナーゼ活性に関して用語「阻害」は、ピラゾロチアゾールキナーゼモジュレータと接触させた場合、ピラゾロチアゾールキナーゼモジュレータの非存在下の活性と比較してキナーゼ活性が減少することを意味する。それゆえ、本発明はさらに、タンパク質キナーゼを本発明のピラゾロチアゾールキナーゼモジュレータと接触させることによりタンパク質キナーゼ活性を阻害する方法を提供する。
【００９９】
いくつかの具体的態様において、タンパク質キナーゼはタンパク質チロシンキナーゼである。本明細書において、タンパク質チロシンキナーゼは、タンパク質におけるチロシン残基のホスホリル化をリン酸供与体（例えばATPなどのヌクレオチドリン酸供与体）で触媒する酵素を意味する。タンパク質チロシンキナーゼとしては、例えばエイブルソンチロシンキナーゼ（「Abl」）（例えばc-Ablおよびv-Abl）、Ronレセプターチロシンキナーゼ（「RON」）、Metレセプターチロシンキナーゼ（「MET」）、Fms様チロシンキナーゼ（「FLT」）（例えばFLT3）、src-ファミリーチロシンキナーゼ（例えばlyn、CSK）、FLT3、オーロラ-Aキナーゼ、B-リンパ球チロシンキナーゼ（「Blk」）、src-ファミリー関連タンパク質チロシンキナーゼ（例えばFynキナーゼ）、リンパ球タンパク質チロシンキナーゼ（「Lck」）、神経成長因子レセプター（TRKC）、spermチロシンキナーゼ（例えばYes）、コロニー刺激因子1レセプター（CSF1R）、血管内皮成長因子レセプター2（VEGFR2、KDR）および多くの他の重要な標的（例えば文献（Blume-Jensen P, Hunter T.「Oncogenic kinase signaling」Nature 2001, 411, 355-65）を参照のこと）およびチロシンキナーゼ活性を示すそのサブタイプおよび同族体が挙げられる。いくつかの具体的態様において、タンパク質チロシンキナーゼはAbl、RON、METまたはAurAである。他の具体的態様において、タンパク質チロシンキナーゼはMETまたはAurAファミリーメンバーである。
【０１００】
いくつかの具体的態様において、タンパク質キナーゼはタンパク質セリン／トレオニンキナーゼである。本明細書においてタンパク質セリン／トレオニンキナーゼは、タンパク質中のセリンおよび／またはトレオニン残基のリン酸供与体（例えばATPなどのヌクレオチドリン酸供与体）によるリン酸化を触媒する酵素を意味する。タンパク質セリン／トレオニンキナーゼとしては、例えばp21-活性化キナーゼ-4（「PAK」）、サイクリン依存キナーゼ（「CDK」、例えばCDK1およびCDK5）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ（「GSK」、例えばGSK3αおよびGSK3β、リボソームS6キナーゼ（例えばRsk1、Rsk2およびRsk3）、Rafキナーゼ（例えばBRAF、c-Raf）、Akt（タンパク質キナーゼB、PKB）キナーゼ、ROCKキナーゼ、CHKキナーゼ（CHK1、CHK2）、ポロキナーゼ（例えばPLK1）、p38キナーゼ、他のマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（例えばERK1、ERK2、JNK）、MAPK/ERKキナーゼ（例えばMEK）、およびセリン／トレオニンキナーゼ活性を示すそのサブタイプおよび同族体が挙げられる。
【０１０１】
別の具体的態様において、キナーゼは変異MET、AblキナーゼまたはFLT3キナーゼなどの変異キナーゼである。有用なMET変異キナーゼとしては、Arg988Cys、Thr1010Ile、Tyr1253Asp、Asp1246Asn、Tyr1248Cys/His/Leu、Met1268Thrが挙げられる。有用な変異Ablキナーゼとしては、例えば１以上の以下の変異体：Glu255Lys、Thr315Ile、Tyr293PheまたはMet351Thrを有するBcr-AblおよびAblキナーゼが挙げられる。いくつかの具体的態様において、変異AblキナーゼはY393F変異またはT315I変異を有する。別の典型的な具体的態様において、変異AblキナーゼはThr315Ile変異を有する。
【０１０２】
いくつかの具体的態様において、キナーゼは既知のキナーゼと同族である（本明細書にて「同種キナーゼ」とも称される）。同種キナーゼの生物学的活性を阻害するのに有用な化合物および組成物は、例えば結合アッセイにて初めにスクリーニングすることができる。同種酵素は、既知の全長キナーゼのアミノ酸配列と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%もしくは少なくとも90%同一であるか、または既知のキナーゼ活性ドメインと70%、80%もしくは90%相同である、同一の長さのアミノ酸配列を含む。相同は、例えば文献（Altschul, et al., Nuc. Acids Rec. 25:3389-3402 (1997)）記載のものなど（これに限定されない）のPSI BLASTサーチを用いて決定することができる。いくつかの具体的態様において、配列の少なくとも50%または少なくとも70%はこの分析にて調整される。調整を行うための他のツールとしては、例えばDbClustalおよびESPriptが挙げられ、これらは調整のPostScript版を生成するために用いることができる。文献（Thompson et al., Nucleic Acids Research, 28:2919-26, 2000; Gouet, et al., Bioinformatics, 15:305-08 (1999)）を参照のこと。同族体は例えば、FLT3、Ablもしくは別の既知のキナーゼ、またはFLT3、Ablもしくは別の既知のキナーゼの任意の機能ドメインを有する少なくとも100のアミノ酸にわたり、1×10-6のBLAST E値を有することができる（Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-402 (1997)）。
【０１０３】
相同性はまた、酵素の活性部位結合ポケットを既知のキナーゼの活性部位結合ポケットと比較することにより決定することもできる。例えば、相同酵素において、分子または同族体の少なくとも50%、60%、70%、80%または90%のアミノ酸は、約1.5Å、約1.25Å、約1Å、約0.75Å、約0.5Åおよび／または約0.25Åまでのアルファ炭素原子の標準偏差を有するキナーゼドメインの大きさに匹敵するドメインのアミノ酸構造配位を有する。
【０１０４】
本発明の化合物および組成物は、キナーゼ活性を阻害し、さらにATPを結合する他の酵素を阻害するのに有用である。従って、それらはそのようなATP-結合酵素活性を阻害することにより緩和することができる疾患および障害の治療に有用である。そのようなATP結合酵素を決定する方法は、当業者に知られているもの、相同酵素の選択に関する本明細書に記載のものおよびデータベースPROSITEの使用によるものを含み、ここに、シグネチャー、配列パターン、モチーフまたはタンパク質ファミリーもしくはドメインのプロファイルを含む酵素は同定することができる。
【０１０５】
本発明化合物およびその誘導体はまた、キナーゼ結合剤としても用いることができる。結合剤として、そのような化合物および誘導体は、親和性クロマトグラフィー適用のための連結基質として安定な樹脂に結合することができる。本発明化合物およびその誘導体はまた、酵素もしくはポリペプチド特徴付け、構造および／または機能の調査にてそれらを利用するために改変する（例えば放射性標識または親和性標識など）こともできる。
【０１０６】
典型的な具体的態様にて、本発明のピラゾロチアゾールキナーゼモジュレータはキナーゼ阻害剤である。いくつかの具体的態様において、キナーゼ阻害剤は、1マイクロモル未満の阻害定数（Ki）のIC50を有する。別の具体的態様において、キナーゼ阻害剤は、500マイクロモル未満のIC50または阻害定数（Ki）を有する。別の具体的態様において、キナーゼ阻害剤は、10マイクロモル未満のIC50またはKiを有する。別の具体的態様において、キナーゼ阻害剤は、1マイクロモル未満のIC50またはKiを有する。別の具体的態様において、キナーゼ阻害剤は、500ナノモル未満のIC50またはKiを有する。別の具体的態様において、キナーゼ阻害剤は、10ナノモル未満のIC50またはKiを有する。別の具体的態様において、キナーゼ阻害剤は、1ナノモル未満のIC50またはKiを有する。
【０１０７】
治療方法
別の具体的態様において、本発明は、有機体（例えばヒトなどの哺乳動物）におけるキナーゼ活性（キナーゼ媒介疾患または障害）により媒介される疾患を治療する方法を提供する。「キナーゼ媒介」または「キナーゼ関連」疾患は、疾患または症状がキナーゼ活性を阻害することにより（例えばキナーゼがシグナリング、媒介、調節または疾患過程の調整に関与する場合）緩和することができる疾患を意味する。「疾患」は、疾患または疾患症状を意味する。
【０１０８】
キナーゼ媒介疾患の例としては、癌（例えば白血病、腫瘍および転移）、アレルギー、喘息、肥満、炎症（例えば炎症性気道疾患）、閉塞性気道疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、感染症（例えば細菌性、ウイルス性、酵母性、真菌性）、中枢神経系疾患、肥満、血液学的障害、骨疾患、脳腫瘍、変性神経疾患、心疾患、および血管形成、血管新生および脈管形成と関連する疾患が挙げられる。典型的な具体的態様において、化合物は白血病などの癌、および異常細胞増殖、骨髄増殖症候群、血液疾患、喘息、炎症性疾患または肥満などの他の疾患または障害を治療するために有用である。
【０１０９】
本発明化合物で治療される癌のより具体的な例としては、乳癌、肺癌、黒色腫、結腸直腸癌、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、扁平上皮細胞癌、膠芽細胞腫、膵臓癌、カポジ肉腫、多発性骨髄腫および白血病（例えば骨髄性、慢性骨髄性、急性リンパ性、慢性リンパ性、ホジキンズおよび他の白血病および血液癌）が挙げられる。
【０１１０】
本発明の化合物または組成物による治療が治療または予防に有用な疾患または障害の他の具体的な例としては、移植拒絶反応（例えば腎臓、肝臓、心臓、肺、島細胞、膵臓、骨髄、角膜、小腸、皮膚同種移植片または異種移植片および他の移植組織）、移植片対宿主病、変形性関節症、関節リウマチ、多発性硬化症、糖尿病、糖尿病性網膜症、炎症性大腸炎（例えばクローン病、潰瘍性大腸炎および他の腸疾患）、腎疾患、悪液質、敗血性ショック、狼瘡、重症筋無力症、乾癬、皮膚炎、湿疹、脂漏症、アルツハイマー病、パーキンソン病、化学療法中の幹細胞保護、自家骨髄移植または同種骨髄移植のための生体外選択または生体外パージ、眼疾患、網膜症（例えば黄斑変性症、糖尿病性網膜症および他の網膜症）、角膜疾患、緑内障、感染症（例えば細菌性、ウイルス性または真菌性）、再狭窄など（これに限定されない）の心臓病が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
アッセイ
本発明化合物は、タンパク質キナーゼ、結合タンパク質キナーゼを調節しおよび／または細胞成長もしくは増殖を予防する能力を決定するために容易にアッセイすることができる。有用なアッセイのいくつかの例は以下に提示する。
【０１１２】
キナーゼ阻害および結合アッセイ
種々のキナーゼの阻害は、本明細書に記載の種々の方法および文献（Upstate KinaseProfiler Assay Protocols June 2003 publication）に記載の方法などの当業者に知られている方法により測定する。
【０１１３】
例えば、インビトロアッセイが行われる場合、キナーゼは典型的に適当な濃度に希釈されて、キナーゼ溶液を形成する。キナーゼ基質およびATPなどのリン酸供与体をキナーゼ溶液に加える。キナーゼはリン酸塩をキナーゼ基質に移して、ホスホリル化基質を形成することができる。ホスホリル化基質の形成は、放射能（例えば[γ-32P-ATP]）または検出可能な二次抗体（例えばELISA）の使用などの任意の適当な手段により直接検出することができる。あるいは、ホスホリル化基質の形成は、ATP濃度の検出などの任意の適当な技術（例えばキナーゼ-Glo（登録商標）アッセイ系（Promega））を用いて検出することができる。キナーゼ阻害剤は試験化合物の存在下および非存在下にてホスホリル化基質の形成を検出することにより同定する（以下の実施例項を参照のこと）。
【０１１４】
細胞におけるキナーゼを阻害する化合物の能力はまた、当業者によく知られている方法を用いてアッセイすることもできる。例えば、キナーゼを含む細胞は、キナーゼを活性化する活性化剤（成長因子など）と接触することができる。試験化合物の非存在下および存在下にて形成される細胞内ホスホリル化基質の量は、細胞を溶解し、任意の適当な方法（例えばELISA）によりホスホリル化基質の存在を検出することにより測定することができる。試験化合物の存在下にて生成するホスホリル化基質の量が試験化合物の非存在下にて生成する量に対して減少する場合、キナーゼ阻害を示唆している。より詳細な細胞キナーゼアッセイは以下の実施例項にて議論される。
【０１１５】
キナーゼへの化合物の結合を測定するために、当業者に知られている任意の方法を用いることができる。例えば、Discoverx (Fremont, CA), ED-スタウロスポリンNSIP（商標）酵素結合アッセイキットにより製造される試験キット（米国特許番号5,643,734を参照のこと）を用いることができる。キナーゼ活性はまた、2003年7月8日発行の米国特許6,589,950のようにアッセイすることもできる。
【０１１６】
適切なキナーゼ阻害剤は、例えばAntonysamyらのPCT公開番号WO03087816A1（これは、すべての目的のために本明細書にそのまま引用される）に開示されるタンパク質結晶学的スクリーニングを通して本発明化合物から選択することができる。
【０１１７】
本発明化合物はコンピュータでスクリーニングして、種々のキナーゼに結合しおよび／または阻害する能力をアッセイし視覚化することができる。複数の本発明化合物により構造をコンピュータでスクリーニングして、種々の部位にてキナーゼに結合する能力を測定することができる。そのような化合物は、医薬品化学努力における標的または先導として用いて、例えば有効な治療的重要性の阻害剤を同定することができる（Travis, Science, 262:1374, 1993）。そのような化合物の三次元構造を、キナーゼまたは活性部位またはその結合ポケットの三次元表示に重ね合わせて、化合物、従ってタンパク質がその表示に空間的に適合するか否かを分析することができる。このスクリーニングにて、そのような構成要素または化合物の結合ポケットへの適合の質は、形の相補性または推定の相互作用エネルギーにより判断することができる（Meng, et al., J. Comp. Chem. 13:505 24, 1992）。
【０１１８】
本発明によりキナーゼに結合しおよび／または調節する（例えばキナーゼを阻害するかまたは活性化する）本発明化合物のスクリーニングは一般に、二つの因子の考慮を含む。まず、化合物はキナーゼと共有的または非共有的に、物理的にかつ構造的に結合することができなければならない。例えば、共有的相互作用は、タンパク質の不可逆阻害剤または自殺型阻害剤を設計するのに重要であることができる。化合物とキナーゼの結合に重要な非共有的分子相互作用としては、水素結合、イオン性相互作用、ファンデルワールスおよび疎水性相互作用が挙げられる。第二に、化合物は、キナーゼと結合することができる結合ポケットに関するコンフォメーションおよび配向を推定することができなければならない。化合物の一部はこのキナーゼとの結合に直接関与しないが、分子の全体的なコンフォメーションにさらに影響し、有効性に有意な効果を有することができる。コンフォメーションの要件としては、すべてのもしくは一部の結合ポケットに関する化学基または化合物の三次元構造および配向、またはキナーゼと直接相互作用するいくつかの化学基を含む化合物の官能基間の空間が挙げられる。
【０１１９】
例えばDOCKまたはGOLDなどの本明細書に記載のドッキングプログラムを用いて、活性部位および／または結合ポケットに結合する化合物を同定する。化合物は、タンパク質の異なる分子動態コンフォメーションを考慮に入れて、タンパク質構造の２以上の結合ポケットまたは同じタンパク質についての２以上の配位に対してスクリーニングすることができる。次いで、一致したスコアリングを用いて、タンパク質についてのベストフィットである化合物を同定することができる（Charifson, P.S. et al., J. Med. Chem. 42: 5100-9 (1999)）。２以上のタンパク質分子構造から得られるデータはまた、2002年5月3日出願のKlinglerらの米国実用新案登録出願（タイトル「Computer Systems and Methods for Virtual Screening of Compounds」）に記載の方法によりスコアリングすることもできる。次いでベストフィットを有する化合物は、化学ライブラリーの生産者から得られるか、または合成し、結合アッセイおよびバイオアッセイに用いる。
【０１２０】
コンピュータモデリング法を用いて、化合物のキナーゼへの有効な調節効果または結合効果を評価することができる。コンピュータモデリングが強い相互作用を示す場合、分子を合成し、そのキナーゼに結合して活性に影響（阻害または活性化）する能力について試験することができる。
【０１２１】
キナーゼの調節または他の結合化合物は、化学基またはフラグメントをキナーゼの個別の結合ポケットまたは他の領域と結合する能力についてスクリーニングし選択する一連の工程を用いてコンピュータで評価することができる。この過程は、例えばキナーゼ配位に基づくコンピュータスクリーンの活性部位の視覚的検査により開始することができる。次いで、選択されたフラグメントまたは化学基は、種々の配向に位置するか、またはキナーゼの個別の結合ポケット内にて結合することができる（Blaney, J.M. and Dixon, J.S., Perspectives in Drug Discovery and Design, 1:301, 1993）。手動ドッキングは、Insight II（Accelrys, San Diego, CA）MOE（Chemical Computing Group, Inc., Montreal, Quebec, Canada）；およびSYBYL（Tripos, Inc., St. Louis, MO, 1992）などのソフトウエア、次いでエネルギー最小化および／またはCHARMM（Brooks, et al., J. Comp. Chem. 4:187-217, 1983）、AMBER（Weiner, et al., J. Am. Chem. Soc. 106: 765-84, 1984）およびC2 MMFF（Merck Molecular Force Field; Accelrys, San Diego, CA）などの標準的な分子構造力場を有する分子動態を用いて達成することができる。より自動化されたドッキングは、DOCK（Kuntz et al., J. Mol. Biol., 161:269 88, 1982；DOCKはカリフォルニア大, San Francisco, CAから入手可能である）；AUTODOCK（Goodsell＆Olsen, Proteins: Structure, Function, and Genetics 8:195 202, 1990；AUTODOCKはScripps Research Institute, La Jolla, CAから入手可能である）；GOLD（Cambridge Crystallographic Data Centre (CCDC)；Jones et al., J. Mol. Biol. 245:43-53, 1995)；およびFLEXX（Tripos, St. Louis, MO; Rarey, M., et al., J. Mol. Biol. 261:470-89, 1996）などのプログラムを用いることにより達成することができる。他の適当なプログラムは、例えばHalperinらの文献に記載されている。
【０１２２】
上記方法による化合物の選択中、その化合物がキナーゼに結合することができる効率は、コンピュータ評価により試験され最適化することができる。例えば、キナーゼ阻害剤として機能するために設計されるかまたは選択される化合物は、天然基質が結合する場合の活性部位残基により占められる容積と重複しない容積を占めることができるが、当業者は主鎖および側鎖の再配列を可能とするある程度の柔軟性があると認識するだろう。さらに、当業者は、例えば誘導適合をもたらす結合上にタンパク質再配列を活用することができる化合物を設計することができる。有効なキナーゼ阻害剤は、その結合および遊離状態の間のエネルギーにおける比較的小さい差を示すことができる（すなわち、それは結合の小変形エネルギーおよび／または結合上の低コンフォメーションひずみを有しなければならない）。従って、最も効率的なキナーゼ阻害剤は、例えば10 kcal/mol以下、7 kcal/mol以下、5 kcal/mol以下または2 kcal/mol以下の結合変形エネルギーで設計すべきである。キナーゼ阻害剤は、全体的な結合エネルギーが同様である２以上のコンフォメーションにてタンパク質と相互作用することができる。そのような場合、結合変形エネルギーは、阻害剤が酵素に結合する場合に観察される遊離化合物のエネルギーとコンフォメーションの平均的なエネルギーとの差とみなされる。
【０１２３】
具体的なコンピュータソフトウエアは、化合物変形エネルギーおよび静電相互作用を評価するために当分野にて入手可能である。そのような使用のために設計されるプログラムの例としては、Gaussian 94, revision C (Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, PA. 1995)；AMBER, version 7. (Kollman, University of California at San Francisco, 2002)；QUANTA/CHARMM (Accelrys, Inc., San Diego, CA, 1995)；Insight II/Discover (Accelrys, Inc., San Diego, CA, 1995)；DelPhi (Accelrys, Inc., San Diego, CA, 1995)；およびAMSOL (University of Minnesota) (Quantum Chemistry Program Exchange, Indiana University)が挙げられる。これらのプログラムは、例えば当業者によく知られているコンピュータ・ワークステーション、例えばLINUX、SGIまたはSunワークステーションを用いて実行することができる。他のハードウエアシステムおよびソフトウエアパッケージは当業者に知られているだろう。
【０１２４】
当業者は、当分野に知られている方法および本明細書に開示される方法を用いてキナーゼタンパク質を発現することができる。本明細書記載の天然および変異キナーゼポリペプチドは、当分野にてよく知られている技術を用いて全部または一部にて化学的に合成することができる（例えばCreighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman＆Co., NY, 1983を参照のこと）。
【０１２５】
遺伝子発現系は、天然および変異ポリペプチドの合成のために用いることができる。当業者に知られている天然または変異ポリペプチドコード配列および適当な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、インビトロ組換えDNA技術、合成技術およびインビボ組換え／遺伝子組み換えを含む。例えば文献（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 2001, and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, 1989）記載の技術を参照のこと。
【０１２６】
ホスト発現ベクター系はキナーゼを用いて発現することができる。このようなものとしては、コード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワー・モザイク・ウイルス、CaMV；タバコモザイク・ウイルス、TMV）で感染させるか、またはコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えばTiプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または動物細胞系が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質はまた、例えば個体中のタンパク質の量を増加するかまたは改変治療タンパク質を発現するためのタンパク質を発現することを含む、ヒト遺伝子療法系にて発現することもできる。これらの系の発現要素は、その強度および特異性を変える。
【０１２７】
具体的に設計されたベクターは、細菌-酵母または細菌-動物細胞などのホスト間のDNAの往復を可能にする。適当に構築された発現ベクターは、ホスト細胞における自己複製のための複製の起源、１以上の選択可能なマーカー、限定数の有用な制限酵素部位、高コピー数についての可能性、および活性なプロモータを含むことができる。プロモータは、RNAポリメラーゼに向けたDNA配列として定義されて、DNAに結合し、RNA合成を開始する。強いプロモータは、高頻度にて開始されたmRNAをもたらす。
【０１２８】
発現ベクターはまた、例えば構成的および誘導プロモータなどの転写および翻訳に影響する種々の要素も含むことができる。これらの要素は、ホストおよび／またはベクター依存であることが多い。例えば細菌系にてクローニングされる場合、T7プロモータ、バクテリオファージλのpL、plac、ptrp、ptac（ptrp-lac複合プロモータ）などの誘導プロモータを用いることができ；昆虫細胞系にてクローニングされる場合、バキュロウイルスポリヘドリンプロモータなどのプロモータを用いることができ；植物細胞系にてクローニングされる場合、植物細胞のゲノム（例えば熱ショックプロモータ；RUBISCOの小サブユニットについてのプロモータ；クロロフィルa/b結合タンパク質についてのプロモータ）または植物ウイルス（例えばCaMVの35S RNAプロモータ；TMVの外皮タンパク質プロモータ）に由来するプロモータを用いることができ；哺乳類細胞系にてクローニングされる場合、哺乳類プロモータ（例えばメタロチオネインプロモータ）または哺乳類ウイルス性プロモータ（例えばアデノウイルス後期プロモータ；牛痘ウイルス7.5Kプロモータ；SV40プロモータ；ウシパピローマ・ウイルスプロモータ；およびエプスタイン・バー・ウイルスプロモータ）を用いることができる。
【０１２９】
種々の方法、例えば形質転換、トランスフェクション、感染、原形質融合およびエレクトロポレーションを用いて、ホスト細胞にベクターを導入することができる。発現ベクター含有細胞は、クローン増殖し、適当なポリペプチドを生産するか否かを決定するために個別に分析する。種々の選択方法、例えば抗生物質耐性を用いて、形質転換されたホスト細胞を同定することができる。ホスト細胞クローンを発現するポリペプチドの同定は、抗キナーゼ抗体との免疫学的反応およびホスト細胞関連活性の存在など（これらに限定されない）のいくつかの手段によりなすことができる。
【０１３０】
cDNAの発現はまた、インビトロで生成された合成mRNAを用いて行うこともできる。合成mRNAは、小麦胚芽抽出物および網状赤血球抽出液など（これらに限定されない）の種々の無細胞系にて効率的に翻訳することができ、ならびにカエル卵母細胞へのマイクロインジェクションなど（これに限定されない）の細胞ベース系にて効率的に翻訳することができる。
【０１３１】
最適なレベルの活性および／またはタンパク質を与えるcDNA配列を決定するために、改変cDNA分子を構築する。改変cDNAの非限定的な例は、cDNAが発現するようなホスト細胞についてcDNAにおけるコドン利用が最適化される場合である。ホスト細胞をcDNA分子で形質転換し、キナーゼRNAおよび／またはタンパク質のレベルを測定する。
【０１３２】
ホスト細胞におけるキナーゼタンパク質のレベルは、免疫親和性および／またはリガンド親和性技術などの種々の方法により定量化され、キナーゼ特異的親和性樹脂または特異的抗体を用いて35S-メチオニン標識または非標識タンパク質を単離する。標識または非標識タンパク質はSDS-PAGEにより分析する。非標識タンパク質は特異的抗体を用いたウエスタン・ブロッティング、ELISAまたはRIAにより検出する。
【０１３３】
組換えホスト細胞におけるキナーゼの発現の後、ポリペプチドを回収し、活性形態のタンパク質を提供することができる。いくつかの精製手順は使用のために利用可能であり、適切である。組換えキナーゼは、当分野にて知られている分画またはクロマトグラフィー工程の種々の組合せまたは個別適用により、細胞溶解物または条件付けされた培養培地から精製することができる。
【０１３４】
さらに、組換えキナーゼは、全長新生タンパク質またはそのポリペプチドフラグメントについて特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体によりなされる免疫親和性カラムの使用により他の細胞タンパク質から分離することができる。当分野にて知られている他の親和性ベース精製法もまた用いることができる。
【０１３５】
あるいは、ポリペプチドは、変性不活性形態のホスト細胞、例えば細菌の封入体から回収することができる。この形態にて回収されるタンパク質は、変性剤、例えば塩酸グアニジニウムを用いて可溶化し、次いで透析などの当業者に知られている方法を用いて活性形態にリフォールディングすることができる。
【０１３６】
細胞成長アッセイ
種々の細胞成長アッセイは当分野にて知られており、細胞成長および／または増殖を阻害（例えば軽減）することができるピラゾロチアゾール化合物（すなわち「試験化合物」）を同定するのに有用である。
【０１３７】
例えば種々の細胞は、成長および／または増殖のための特異的なキナーゼを必要とすることが知られている。試験化合物の存在下そのような細胞の成長する能力を評価し、試験化合物の非存在下の成長と比較し、それにより試験化合物の抗増殖特性を同定することができる。このタイプの一つの一般的な方法は、分裂細胞のDNAへのトリチウム化チミジンなどの標識の取り込みの程度を測定することである。あるいは、細胞増殖の阻害は、細胞数と相互に関連する代理マーカーで細胞の全代謝活性を決定することにより評価することができる。細胞は、試験化合物の存在下および非存在下にて代謝指標で処理することができる。生存細胞は、代謝指標を代謝し、それにより検出可能な代謝生成物を形成する。検出可能な代謝生成物レベルが試験化合物の非存在下と比較して試験化合物の存在下にて減少する場合、細胞成長および／または増殖の阻害が示唆される。典型的な代謝指標としては、例えばテトラゾリウム塩およびAlamorBlue（登録商標）が挙げられる（以下の実施例項を参照のこと）。
【０１３８】
医薬組成物および投与
別の態様にて、本発明は、医薬的に許容される賦形剤とともにピラゾロチアゾールキナーゼモジュレータを含む医薬組成物を提供する。当業者は、医薬組成物が上記ピラゾロチアゾールキナーゼモジュレータの医薬的に許容される塩を含むことを認識するだろう。
【０１３９】
治療的および／または診断的適用にて、本発明化合物は全身および局所または限局性投与などの種々の投与形態のために製剤化することができる。技術および製剤化は一般に、文献（Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.) Lippincott, Williams＆Wilkins (2000)）にて見ることができる。
【０１４０】
本発明化合物は広範な投与量範囲にわたり有効である。例えば成人ヒトの治療において、0.01〜1000 mg、0.5〜100 mg、1〜50 mg／日および5〜40 mg／日の投与量は用いることができる投与量の例である。最も好ましい投与量は10〜30 mg／日である。正確な投与量は、投与経路、化合物が投与される形態、治療される対象、治療される対象の体重、および主治医の好みおよび経験に依存するだろう。
【０１４１】
医薬的に許容される塩は一般に、当業者によく知られており、一例として酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベシル酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重酒石酸塩、臭化物塩、エデト酸カルシウム、カルンシレート（carnsylate）、炭酸塩、クエン酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストル酸塩、エシル酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物塩、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、ムケート、ナプシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩（エンボネート）、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩またはテオクル酸塩を挙げることができるが、これらに限定されない。他の医薬的に許容される塩は、例えば文献（Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.) Lippincott, Williams＆Wilkins (2000)）に見ることができる。好ましい医薬的に許容される塩としては、例えば酢酸塩、安息香酸塩、臭化物塩、炭酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、マレイン酸塩、メシル酸塩、ナプシル酸塩、パモ酸塩（エンボネート）、リン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩または酒石酸塩が挙げられる。
【０１４２】
治療される具体的な条件に応じて、そのような薬剤を液体または固体剤形に製剤化し、全身または局所投与することができる。薬剤は当業者に知られているように、例えば徐放性または持続性低放出形態にて送達することができる。製剤化および投与についての技術は、文献（Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.) Lippincott, Williams＆Wilkins (2000)）に見ることができる。適切な経路としては、経口、口腔、吸入スプレー、舌下、直腸、経皮、膣内、経粘膜、経鼻または腸内投与；筋肉内、皮下、髄内注射ならびに髄腔内、直接心室内、静脈内、関節内、胸骨内、滑膜内、肝内、病巣内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内または眼球内注射などの非経口送達、または他の送達形態を挙げることができる。
【０１４３】
注射のために、本発明の薬剤は、ハンク溶液、リンゲル溶液または緩衝生理食塩水などの生理学的に混合可能な緩衝液などの水溶液にて製剤化および希釈することができる。そのような経粘膜投与について、透過すべき障壁に適当な透過剤を製剤化に用いる。そのような透過剤は一般に当分野に知られている。
【０１４４】
本発明の実践について開示される本明細書記載の化合物を全身投与に適切な投与量に製剤化するための医薬的に許容される不活性な担体の使用は、本発明の範囲内である。担体の適切な選択および適切な製造実践により、本発明の組成物、特に溶液として製剤化されるものは、静脈注射などにより非経口的に投与することができる。化合物は、当分野にてよく知られている医薬的に許容される担体を用いて、容易に経口投与に適切な投与量に製剤化することができる。そのような担体により、治療される患者による経口摂取のための錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして本発明化合物を製剤化することができる。
【０１４５】
経鼻または吸入送達について、本発明の薬剤はまた、当業者に知られている方法により製剤化することもでき、例えば食塩水、ベンジルアルコールなどの保存剤、吸収促進剤およびフルオロカーボンなどの物質の可溶化、希釈または分散を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１４６】
本発明における使用に適切な医薬組成物は、有効成分を有効量にて含みその所望の目的を達成する組成物を含む。有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示の観点から、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１４７】
有効成分に加えて、これらの医薬組成物は、活性化合物の加工を促進する賦形剤および助剤を含む適切な医薬的に許容される担体を医薬的に用いることができる製剤に含むことができる。経口投与のために製剤化される製剤は、錠剤、糖衣錠、カプセル剤または溶液剤の形態であることができる。
【０１４８】
経口使用のための医薬製剤は、活性化合物を固体賦形剤と混合し、適宜得られた混合物をすりつぶしてもよく、適切な助剤を加えた後、顆粒混合物を処理して、所望ならば錠剤または糖衣錠コアを得ることにより得ることができる。適切な賦形剤は、特にラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールなどの糖；セルロース製剤、例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、カルボキシメチル-セルロースナトリウム（CMC）および／またはポリビニルピロリドン（PVP：ポビドン）などの充填剤である。所望ならば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天もしくはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を加えることができる。
【０１４９】
糖衣錠コアは適切なコーティングを提供する。この目的のために、濃縮糖溶液を用いることができ、これは適宜アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール（PEG）および／または二酸化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含んでもよい。同定または異なる組合せの活性化合物の用量を特徴付けるために、染料または色素を錠剤または糖衣錠コーティングに加えることができる。
【０１５０】
経口的に用いることができる医薬製剤は、ゼラチンで作られた押し込み型カプセルならびにゼラチンで作られた軟密閉カプセルおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤を含む。押し込み型カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、適宜安定剤とともに有効成分を含むことができる。軟カプセルにて、活性化合物は油脂、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール（PEG）などの適切な液体中に溶解するか、または懸濁することができる。さらに、安定剤を加えることができる。
【０１５１】
治療または予防される特定の病態または疾患状態に応じて、その病態を治療または予防するために通常投与されるさらなる治療剤を本発明の阻害剤と一緒に投与することができる。例えば化学療法剤または他の抗増殖剤は、本発明の阻害剤と混合して増殖性疾患および癌を治療することができる。既知の化学療法剤の例としては、アドリアマイシン、デキサメタゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、フルオロウラシル、トポテカン、タキソール、インターフェロンおよび白金誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
本発明の阻害剤と混合することができる他の薬剤の例としてはまた、コルチコステロイド、TNF遮断剤、IL-1 RA、アザチオプリン、シクロホスファミドおよびスルファサラジンなどの抗炎症剤；シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、インターフェロン、コルチコステロイド、シクロホスファミド、アザチオプリンおよびスルファサラジンなどの免疫調節剤および免疫抑制剤；アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、MAO阻害剤、インターフェロン、抗痙攣薬、イオンチャネル遮断薬、リルゾールおよび抗パーキンソン病薬などの神経栄養因子；ベータ遮断薬、ACE阻害剤、利尿薬、硝酸塩、カルシウムチャネル遮断薬およびスタチンなどの心疾患の治療剤；コルチコステロイド、コレスチラミン、インターフェロンおよび抗ウイルス剤などの肝疾患の治療剤；コルチコステロイド、抗白血病薬および成長因子などの血液疾患の治療剤；インスリン、インスリン類似体、アルファグルコシダーゼ阻害剤、ビグアニドおよびインスリン抵抗性改善薬などの糖尿病の治療剤；およびガンマグロブリンなどの免疫不全障害の治療剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５３】
これらの添加剤は、複数回用量の一部として、阻害剤含有組成物と別に投与することができる。あるいは、これらの薬剤は単一剤形の一部であり、単一組成物中にて阻害剤と一緒に混合することができる。
【０１５４】
本発明は、例示の具体的態様による範囲に限定されるものではなく、これは本発明の一態様の説明として意図される。実際に、本明細書記載のものに加えて本発明の種々の改変は、上記記載から当業者に明らかとなるだろう。そのような改変は、本発明の範囲内に含まれるものである。さらに、本発明のいずれの具体的態様のいずれの１以上の特徴も、本発明の範囲から逸脱しないで、本発明のいずれの他の具体的態様のいずれの１以上の他の特徴とも組み合わせることができる。例えば、ピラゾロチアゾールキナーゼモジュレータ項に記載のピラゾロチアゾールキナーゼモジュレータは、本明細書に記載の治療方法およびキナーゼを阻害する方法に同様に適用可能である。この出願を通して引用される参考文献は、当業者のレベルの例であり、先に具体的に組み込まれているか否かにかかわらず、すべての目的のために本明細書にそのまま引用される。
【実施例】
【０１５５】
以下の実施例は、特許請求された本発明を説明するために提示されるが、これらに限定されるものではない。本発明の具体的態様の製造は、以下の実施例に記載されている。当業者は、提供された化学反応および合成方法を改変し、多くの他の本発明化合物を製造することができることを理解するだろう。本発明化合物が例示されている場合、当業者はこれらの化合物が本明細書に提示された合成方法を改変することによりおよび当分野にて知られている合成方法により製造することができることを認識するだろう。
【０１５６】
実施例1：化合物の合成
方法A
【化１２】
2009515998.tif 000014
工程1：(5-ニトロ-2H-ピラゾール-3-イル)カルバミン酸tert-ブチルエステルの合成
5-ニトロ-2H-ピラゾール-3-カルボン酸10.35g（68.96 mmol）のtert-BuOH 40 mL中の懸濁液をトリエチルアミン19.25 ml（137.92 mmol）、次いでジフェニルホスホリルアジド30 ml（137.92 mmol）で処理した。混合物を16時間加熱還流した。溶液をEtOAcで希釈し、水で２回洗浄した。水層をEtOAcで抽出し、集めた有機層を食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。粗製の残渣をジクロロメタンでトリチュレーションし、(5-ニトロ-2H-ピラゾール-3-イル)カルバミン酸tert-ブチルエステル10.43 gを固体（66%収率）として得た。
1H NMR (d6-DMSO) δ13.5 (1H, s), 10.4 (1H, broad s), 6.44 (1H, s), 1.48 (9H, s).
【０１５７】
工程2：(5-アミノ-2H-ピラゾール-3-イル)カルバミン酸tert-ブチルエステルの合成
(5-ニトロ-2H-ピラゾール-3-イル)カルバミン酸tert-ブチルエステル10.4 g（45.61 mmol）を水素化容器内に置き、メタノール150 mlに溶解した。溶液に窒素ガスでパージし、不活性環境を維持しながら10%パラジウム・カーボン1.02 g（0.958 mmol）を反応容器に加えた。容器をParrハイドロジェネータで終夜置いた。反応混合物をセライトでろ過し、減圧濃縮し、(5-アミノ-2H-ピラゾール-3-イル)カルバミン酸tert-ブチルエステル9.0 gを泡状物として得た（定量的収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ10.9 (1H, s), 9.25 (1H, broad s), 5.57 (1H, s), 5.10 (2H, s) 1.64 (9H, s); HPLC/MS m/z: 199 [MH]+.
【０１５８】
工程3：(5-チオウレイド-2H-ピラゾール-3-イル)カルバミン酸tert-ブチルエステルの合成
(5-アミノ-2H-ピラゾール-3-イル)カルバミン酸tert-ブチルエステル14.48 g（73.13 mmol）のTHF 110 mL溶液に、ベンゾイルイソチオシアネート10.8 ml（80.44 mmol）を滴加した。反応混合物を完了まで室温にて撹拌した後、4 N水性NaOH 110 mLを加えた。反応混合物を40℃にて6時間撹拌した後、EtOAcで希釈した。有機物を1 N水性HClおよび食塩水で洗浄した後、Na2SO4で乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。粗製の残渣をジエチルエーテルでトリチュレーションし、沈殿物をろ過し、減圧乾燥し、(5-チオウレイド-2H-ピラゾール-3-イル)カルバミン酸tert-ブチルエステル15.1 g（80%収率）を得た。
1H NMR (d6-DMSO) δ11.8 (1H, s), 10.2 (1H, s), 10.0 (1H, s) 9.11 (1H, s) 8.46 (1H, s) 5.53 (1H, s), 1.46 (9H, s); HPLC/MS m/z: 258 [MH]+.
【０１５９】
工程4：(5-アミノ-1H-ピラゾール-[3,4-d]-チアゾール-3-イル)カルバミン酸tert-ブチルエステルの合成
臭素の1.5 M酢酸溶液（0.46 mL, 89.78 mmol）を激しく撹拌しながら、(5-チオウレイド-2H-ピラゾール-3-イル)カルバミン酸tert-ブチルエステル22.0 g（85.50 mmol）の酢酸1.71 L溶液に滴加した。添加完了後、反応混合物をすぐに減圧濃縮し、固体を得、これに炭酸水素ナトリウムの飽和溶液をpH 8までゆっくり加えた。得られた沈殿物をろ過し、減圧乾燥し、(5-アミノ-1H-ピラゾール-[3,4-d]-チアゾール-3-イル)カルバミン酸tert-ブチルエステル16.08 gを白色固体（73%収率）として得た：
1H NMR (d6-DMSO) δ11.9 (broad s, 1H), 9.74 (broad s, 1H), 7.27 (broad s, 2H), 1.42 (s, 9H); HPLC/MS m/z: 256 [MH]+.
【０１６０】
方法B
【化１３】
2009515998.tif 000015
シクロプロパンカルボン酸(3-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル)アミド、トリフルオロ酢酸塩の合成
(5-アミノ-1H-ピラゾール-[3,4-d]-チアゾール-3-イル)カルバミン酸tert-ブチルエステル16.0 g（62.7 mmol）のTHF 313 mL溶液にピリジン30.4 ml（376 mmol）を加え、次いでシクロプロパンカルボニルクロリド29.0 ml（313.3 mmol）を滴下した。反応混合物を70℃にて3時間撹拌した後、N,N-ジメチルエチレンジアミン44.6 ml（627 mmol）を加え、反応混合物を70℃にて1時間さらに撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、酢酸エチルに再溶解した。有機層を大量の10%クエン酸水溶液で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、ろ過し、終夜放置した。得られた沈殿物をろ過し、減圧乾燥し、[5-(シクロプロパンカルボニル-アミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-3-イル]カルバミン酸tert-ブチルエステル18.3 g（90%収率）を得た。
1H NMR (d6-DMSO) δ12.4 (1H, s), 10.0 (1H, s), 1.44 (9H, s), 1.98 (1H, m), 0.95 (4H, m). 
【０１６１】
[5-(シクロプロパンカルボニル-アミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-3-イル]カルバミン酸tert-ブチルエステル17.0 g（52.61 mmol）のジクロロメタン500 mL中の懸濁液に、トリフルオロ酢酸180 mLを滴加した。反応混合物を室温にて3時間撹拌した後、減圧濃縮した。粗製物をEt2Oでトリチュレーションし、ろ過し、Et2Oで洗浄した。減圧乾燥し、シクロプロパンカルボン酸(3-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル)アミド、トリフルオロ酢酸塩12.47 gを明ベージュ色固体として得た（70%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ12.8 (s, 1H), 1.97 (m, 1H), 0.94 (m, 4H); HPLC/MS m/z: 224 [MH]+.
【０１６２】
方法Bにより製造される他の化合物：
【化１４】
2009515998.tif 000016
【０１６３】
方法C
【化１５】
2009515998.tif 000017
シクロプロパンカルボン酸(3-ブロモ-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル)アミド、HBr塩の合成
シクロプロパンカルボン酸(3-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル)アミド, トリフルオロ酢酸塩622 mg（1.84 mmol）の水性HBr 15 mL中の懸濁液にNaNO2 153 mg（2.21 mmol）をゆっくり加えた。1時間撹拌した後、CuBr 742 mg（5.17 mmol）を加え、反応物を40℃にて17時間加熱した。混合物を水で希釈し、EtOAc (3x)で抽出した。集めた有機物を食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧濃縮した。高真空乾燥後、シクロプロパンカルボン酸(3-ブロモ-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル)アミドHBr塩381 mgを灰白色固体として得た（56%収率）。
HPLC/MS m/z: 287 [MH]+.
【０１６４】
方法D
【化１６】
2009515998.tif 000018
シクロプロパンカルボン酸[3-(2-フェノキシ-アセチルアミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル]アミドの合成
シクロプロパンカルボン酸(3-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル)アミド, トリフルオロ酢酸塩20 mg（0.059 mmol）のTHF 0.5 mL中の懸濁液にピリジン0.032 mL（0.393 mmol）、次いでフェノキシアセチルクロリド0.041 mL（0.295 mmol）を加えた。反応混合物を70℃にて16時間撹拌した後、室温まで冷却した。N,N-ジメチルエチレンジアミン0.1 mLを加え、反応混合物を70℃にて2.5時間撹拌した。室温にて冷却した後、透明溶液をシリカゲルに吸着させた。0〜8%勾配のMeOH/CH2Cl2を溶離液としてシリカゲルで精製し、シクロプロパンカルボン酸[3-(2-フェノキシ-アセチルアミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル]アミド10 mgを白色固体（57%収率）として得た。
1H NMR (d6-DMSO) δ12.7 (broad s, 1H), 12.4 (broad s, 1H), 10.9 (broad s, 1H), 7.30 (t, 2H), 6.95 (m, 3H), 4.71 (s, 2H), 1.94 (m, 1H), 0.90 (m, 4H); HPLC/MS m/z: 358 [MH]+.
【０１６５】
方法Dにより製造される他の化合物：
第1表
【表１−１】
2009515998.tif 000019
【０１６６】
【表１−２】
2009515998.tif 000020
【０１６７】
【表１−３】
2009515998.tif 000021
【０１６８】
方法E
【化１７】
2009515998.tif 000022
シクロプロパンカルボン酸{3-[(3-ブロモ-フラン-2-イルメチル)アミノ]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}アミドの合成
シクロプロパンカルボン酸(3-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル)アミド, トリフルオロ酢酸塩20 mg（0.059 mmol）のDMF/AcOH（3:1, 0.4 mL）溶液に、3-ブロモ-フラン-2-カルバルデヒド12.4 mg（0.071 mmol）、次いでシアノ水素化ホウ素ナトリウム11 mg（0.177 mmol）を加えた。反応混合物を40℃にて4時間撹拌した後、減圧濃縮した。粗製固体をNaHCO3の飽和水溶液でトリチュレーションした後、EtOAcで抽出し、抽出物をシリカゲルで吸着させた。溶離液として0〜8%勾配のMeOH/CH2Cl2を用いてシリカゲルで精製し、シクロプロパンカルボン酸{3-[(3-ブロモ-フラン-2-イルメチル)アミノ]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}アミド7.3 mgを灰白色固体（32%収率）として得た。
1H NMR (d6-DMSO) δ12.4 (broad s, 1H), 11.8 (broad s, 1H), 6.45 (d, 1H), 6.30 (d, 1H), 6.21 (broad s, 1H), 4.26 (d, 2H), 1.93 (m, 1H), 0.90 (m, 4H); HPLC/MS m/z: 382 [MH]+.
【０１６９】
方法Eにより製造される他の化合物：
第2表
【表２】
2009515998.tif 000023
【０１７０】
方法F
【化１８】
2009515998.tif 000024
シクロプロパンカルボン酸{3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}アミドの合成
シクロプロパンカルボン酸(3-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル)アミド, トリフルオロ酢酸塩100 mg（0.297 mmol）の無水EtOH 2.5 mL懸濁液に2-クロロベンズアルデヒド0.04 mL（0.356 mmol）を加えた。反応混合物を16時間還流した後、減圧乾燥した。粗製固体を窒素雰囲気下DMF 2.5 mLに溶解した。炭酸カリウム123 mg（0.891 mmol）、次いでトシルメチルイソシアニド58 mg（0.297 mmol）を加えた。反応混合物を80℃にて3時間撹拌した後、減圧濃縮した。粗製固体を10% MeOH/CH2Cl2に再溶解し、シリカゲルで吸着させた。0〜8%勾配のMeOH/CH2Cl2を溶離液としてシリカゲルで精製し、シクロプロパンカルボン酸{3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}アミド52 mgをクリーム色固体として得た（45%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ13.5 (broad s, 1H), 12.6 (broad s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.48 (d, 1H), 7.37-7.43 (m, 3H), 7.18 (s, 1H), 1.89 (m, 1H), 0.90 (m, 2H), 0.87 (m. 2H); HPLC/MS m/z: 385 [MH]+.
【０１７１】
方法Fにより製造される他の化合物：
第3表
【表３−１】
2009515998.tif 000025
【０１７２】
【表３−２】
2009515998.tif 000026
【０１７３】
【表３−３】
2009515998.tif 000027
【０１７４】
【表３−４】
2009515998.tif 000028
【０１７５】
【表３−５】
2009515998.tif 000029
【０１７６】
【表３−６】
2009515998.tif 000030
【０１７７】
【表３−７】
2009515998.tif 000031
【０１７８】
【表３−８】
2009515998.tif 000032
【０１７９】
【表３−９】
2009515998.tif 000033
【０１８０】
【表３−１０】
2009515998.tif 000034
【０１８１】
方法G
【化１９】
2009515998.tif 000035
工程1：{5-[3-(3-アセチル-フェニル)チオウレイド]-1H-ピラゾール-3-イル}カルバミン酸tert-ブチルエステルの合成
(5-アミノ-2H-ピラゾール-3-イル)カルバミン酸tert-ブチルエステル500 mg（2.52 mmol）のTHF 10 mL溶液に、3-アセチルフェニルイソチオシアネート448 mg（2.52 mmol）を一度に加えた。反応混合物を室温にて2時間撹拌した後、シリカゲルで直接吸着させた。0〜80%勾配のEtOAc/ヘキサンを溶離液としてシリカゲルで精製し、{5-[3-(3-アセチル-フェニル)チオウレイド]-1H-ピラゾール-3-イル}カルバミン酸tert-ブチルエステル279 mgを明黄色固体として得た（30%収率）：
HPLC/MS m/z: 398 [MNa]+.
【０１８２】
工程2：[5-(3-アセチル-フェニルアミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-3-イル]カルバミン酸tert-ブチルエステルの合成
{5-[3-(3-アセチル-フェニル)チオウレイド]-1H-ピラゾール-3-イル}カルバミン酸tert-ブチルエステル275 mg（0.733 mmol）のAcOH 15 mL溶液に、1.5 M臭素のAcOH溶液0.49 mL（0.733 mmol）を滴加した。反応混合物を室温にて6時間撹拌した後、減圧濃縮した。粗製物を飽和水性NaHCO3およびEtOAcで分液した。水層をEtOAc (3x)で抽出し、集めた有機層をシリカゲルで吸着させた。0〜10%勾配のMeOH/CH2Cl2を溶離液としてシリカゲルで精製し、[5-(3-アセチル-フェニルアミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-3-イル]カルバミン酸tert-ブチルエステル74 mgを灰白色固体として得た（27%収率）：
1H NMR (d6-DMSO) δ12.4 (broad s, 1H), 10.5 (broad s, 1H), 9.94 (broad s, 1H), 8.24 (s, 1H), 7.91 (d, 1H), 7.61 (d, 1H), 7.49 (t, 1H), 2.58 (s, 3H), 1.45 (s, 9H); HPLC/MS m/z: 374 [MH]+.
【０１８３】
方法H：
【化２０】
2009515998.tif 000036
シクロプロパンカルボン酸(3-{5-[4-(2-アミノ-アセチルアミノ)-2-クロロ-フェニル]イミダゾール-1-イル}-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル)アミド, 二塩酸塩の合成
[(3-クロロ-4-{3-[5-(シクロプロパンカルボニル-アミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-3-イル]-3H-イミダゾール-4-イル}フェニルカルバモイル)メチル]カルバミン酸tert-ブチルエステル4.0 mg（0.0072 mmol、方法Fにより製造）をHClの4 Nジオキサン溶液で処理した。反応混合物を1時間撹拌し、得られた沈殿物をろ過し、EtOAcで洗浄し、減圧乾燥し、シクロプロパンカルボン酸(3-{5-[4-(2-アミノ-アセチルアミノ)-2-クロロ-フェニル]イミダゾール-1-イル}-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル)アミド二塩酸塩2.5 mgを黄色固体として得た（66%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ12.6 (s, 1H), 10.9 (s, 1H), 9.05 (broad s, 1H), 8.02 (m, 4H), 7.68 (d, 1H), 7.58 (broad s, 1H), 7.40 (dd, 1H), 7.30 (d, 1H), 3.63 (q, 2H), 1.76 (m, 1H), 0.75 (m, 2H), 0.70 (m, 2H); HPLC/MS m/z: 457 [MH]+.
【０１８４】
方法Hにより製造される他の化合物：
第4表
【表４】
2009515998.tif 000037
【０１８５】
方法I：
【化２１】
2009515998.tif 000038
シクロプロパンカルボン酸(3-{5-[4-(2-アセチルアミノ-エトキシ)-2-クロロ-フェニル]イミダゾール-1-イル}-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル)アミドの合成
シクロプロパンカルボン酸(3-{5-[4-(2-アミノ-エトキシ)-2-クロロ-フェニル]イミダゾール-1-イル}-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル)アミド塩酸塩10 mg（0.021 mmol）およびトリエチルアミン0.015 mL（0.105 mmol）のDMF 0.4 mL溶液に、塩化アセチル0.0016 mL（0.022 mmol）を加えた。反応混合物を室温にて2時間撹拌した後、シリカゲルに吸着させた。0〜10%勾配のMeOH/CH2Cl2を溶離液としてシリカゲルで精製し、シクロプロパンカルボン酸(3-{5-[4-(2-アセチルアミノ-エトキシ)-2-クロロ-フェニル]イミダゾール-1-イル}-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル)アミド5.0 mgを白色固体として得た（49%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ13.4 (broad s, 1H), 12.6 (broad s, 1H), 8.15 (s, 1H), 8.08 (t, 1H), 7.32 (d, 1H), 7.10 (m, 2H), 6.98 (d, 1H), 4.00 (t, 2H), 3.36 (q, 2H), 1.89 (m, 1H), 1.81 (s, 3H), 0.90 (m, 2H), 0.86 (m, 2H); HPLC/MS m/z: 486 [MH]+.
【０１８６】
方法Iにより製造される他の化合物：
第5表
【表５】
2009515998.tif 000039
【０１８７】
方法J：
【化２２】
2009515998.tif 000040
工程1：(3-クロロ-4-{3-[5-(シクロプロパンカルボニル-アミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-3-イル]-3H-イミダゾール-4-イル}フェノキシ)酢酸, トリフルオロ酢酸塩の合成
(3-クロロ-4-{3-[5-(シクロプロパンカルボニル-アミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-3-イル]-3H-イミダゾール-4-イル}フェノキシ)酢酸tert-ブチルエステル18 mg（0.035 mmol）およびPS-チオフェノール48 mg（0.07 mmol, argonaut樹脂）のジクロロメタン0.5 mL中の懸濁液に、トリフルオロ酢酸0.5 mLを加えた。反応混合物を室温にて1時間撹拌した。次いで樹脂をろ過し、ジクロロメタンで洗浄した。ろ液を減圧濃縮した。残渣をジエチルエーテルでトリチュレーションし、ろ過し、ジエチルエーテルで洗浄し、減圧乾燥し、(3-クロロ-4-{3-[5-(シクロプロパンカルボニル-アミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-3-イル]-3H-イミダゾール-4-イル}フェノキシ)酢酸, トリフルオロ酢酸塩15 mgを白色固体として得た（75%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ13.7 (broad s, 1H), 12.7 (s, 1H), 8.89 (broad s, 1H), 7.55 (broad s, 1H), 7.40 (d, 1H), 7.11 (d, 1H), 7.01 (dd, 1H), 4.73 (s, 2H), 1.91 (m, 1H), 0.92 (m, 2H), 0.89 (m, 2H); HPLC/MS m/z: 459 [MH]+.
【０１８８】
工程2：シクロプロパンカルボン酸[3-(5-{2-クロロ-4-[(2-メトキシ-エチルカルバモイル)メトキシ]フェニル}イミダゾール-1-イル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル]アミド, ギ酸塩の合成
窒素雰囲気下、バイアルに(3-クロロ-4-{3-[5-(シクロプロパンカルボニル-アミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-3-イル]-3H-イミダゾール-4-イル}フェノキシ)酢酸, トリフルオロ酢酸塩20 mg（0.035 mmol）、炭酸水素ナトリウム8.8 mg（0.105 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール7 mg（0.0525 mmol）およびN-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩10 mg（0.0525 mmol）を充填した。DMF 0.3 mL、次いで2-メトキシエチルアミン0.0037 mL（0.042 mmol）を加えた。反応混合物を室温にて16時間撹拌した。粗製混合物をDMSOで0.8 mL容積に希釈し、0.45ミクロンフィルターに通してろ過した。ろ液を質量誘導（mass-triggered）逆相分取用HPLC（C18カラム）により直接精製し、シクロプロパンカルボン酸[3-(5-{2-クロロ-4-[(2-メトキシ-エチルカルバモイル)メトキシ]フェニル}イミダゾール-1-イル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル]アミド, ギ酸塩11.9 mgを白色固体として得た（61%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ8.12 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 8.07 (t, 1H), 7.30 (d, 1H), 7.06 (m, 2H), 6.95 (dd, 1H), 4.45 (s, 2H), 3.29 (t, 2H), 3.23 (q, 2H), 3.16 (s, 3H), 1.84 (m, 1H), 0.85 (m, 2H), 0.81 (m, 2H); HPLC/MS m/z: 516 [MH]+.
【０１８９】
方法Jにより製造される他の化合物：
第6表
【表６】
2009515998.tif 000041
【０１９０】
方法K：
【化２３】
2009515998.tif 000042
シクロプロパンカルボン酸{3-[5-(4-アミノ-2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}アミド, トリフルオロ酢酸塩の合成
(3-クロロ-4-{3-[5-(シクロプロパンカルボニル-アミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-3-イル]-3H-イミダゾール-4-イル}フェニル)カルバミン酸tert-ブチルエステル13.4 mg（0.027 mmol）およびPS-チオフェノール50 mg（0.075 mmol, argonaut樹脂）を充填したバイアルに、トリフルオロ酢酸1.5 mLを加えた。反応混合物を室温にて2時間撹拌した後、樹脂をろ過し、MeOHで洗浄した。ろ液の溶媒を留去し、減圧乾燥し、シクロプロパンカルボン酸{3-[5-(4-アミノ-2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}アミド, トリフルオロ酢酸塩13.8 mgを得た。
1H NMR (d6-DMSO) δ13.9 (broad s, 1H), 12.6 (broad s, 1H), 9.45 (s, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.1 (d, 1 H),  6.62 (d, 1H), 6.54 (dd, 1H), 3.9 (s, 2H), 1.9 (m, 1H), 0.9 (m, 4H); HPLC/MS m/z: 385 [MH]+.
【０１９１】
方法Kにより製造される他の化合物：
第7表
【表７】
2009515998.tif 000043
【０１９２】
方法L：
【化２４】
2009515998.tif 000044
3-[5-(2-クロロ-5-フルオロ-ピリジン-3-イル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イルアミン, ギ酸塩の合成
マイクロウェーブ容器にてシクロプロパンカルボン酸{3-[5-(2-クロロ-5-フルオロ-ピリジン-3-イル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}アミド7.5 mg（0.0186 mmol）の水0.5 mL中の懸濁液に過塩素酸の70%水溶液0.05 mLを加えた。反応はPersonal Chemistryマイクロウェーブ反応容器で150℃にて30分間行った。粗製物質を質量誘導逆相分取用HPLC（C18カラム）により直接精製し、3-[5-(2-クロロ-5-フルオロ-ピリジン-3-イル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イルアミン, ギ酸塩2.3 mgを白色固体として得た（32%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ12.9 (s, 1H), 8.49 (d, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.96 (dd, 1H), 7.61 (broad s, 2H), 7.23 (s, 1H), 6.47 (s, 1H); HPLC/MS m/z: 336 [MH]+.
【０１９３】
方法Lにより製造される他の化合物：
【化２５】
2009515998.tif 000045
【０１９４】
方法M：
【化２６】
2009515998.tif 000046
シクロプロパンカルボン酸{3-[5-(2-クロロ-フェニル)-4-メチル-イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}アミドの合成
シクロプロパンカルボン酸(3-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル)アミド, トリフルオロ酢酸塩200 mg（0.594 mmol）の無水EtOH 5.0 mL懸濁液に、2-クロロベンズアルデヒド0.08 mL（0.712 mmol）を加えた。反応混合物を16時間還流した後、減圧乾燥した。粗製固体を窒素雰囲気下、DMF 5.0 mLに溶解させた。炭酸カリウム246 mg（1.782 mmol）、次いで1-メチル-1-トシルメチルイソシアニド124 mg（0.594 mmol）を加えた。反応混合物を80℃にて3時間撹拌した後、減圧濃縮した。粗製固体を10% MeOH/CH2Cl2に再溶解し、シリカゲルに吸着させた。0〜8%勾配のMeOH/CH2Cl2を溶離液としてシリカゲルで精製し、シクロプロパンカルボン酸{3-[5-(2-クロロ-フェニル)-4-メチル-イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}アミド54 mgをクリーム色固体として得た（23%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ13.4 (broad s, 1H), 12.6 (broad s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.5 (d, 1H), 7.36-7.44 (m, 3 H), 2.05 (s, 3H), 1.9 (m, 1H), 0.9 (m, 4H); HPLC/MS m/z: 399 [MH]+.
【０１９５】
方法N：
【化２７】
2009515998.tif 000047
シクロプロパンカルボン酸{3-[3-(2-クロロ-フェニル)-[1,2,4]トリアゾール-4-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}アミドの合成
シクロプロパンカルボン酸(3-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル)アミド, トリフルオロ酢酸塩100 mg（0.297 mmol）に、2-(2-クロロ-フェニル)-[1,3,4]オキサジアゾール350 mg（1.93 mmol）を無溶媒で加えた（オキサジアゾール製造：Bulletin de la Societe Chimique de France (1962), 1580-91）。混合物を120℃にて2時間撹拌した。粗製混合物を10% MeOH/CH2Cl2に溶解させ、シリカゲルに吸着させた。0〜9%勾配のMeOH/CH2Cl2を溶離液としてシリカゲルで精製し、シクロプロパンカルボン酸{3-[3-(2-クロロ-フェニル)-[1,2,4]トリアゾール-4-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}アミド16 mg（14%収率）を得た。
1H NMR (d6-DMSO) δ13.7 (broad s, 1H), 12.6 (broad s, 1H), 8.80 (s, 1H), 7.66 (dd, 1H), 7.52-7.62 (m, 3H), 1.91 (m, 1H), 0.88-0.93 (m, 4H); HPLC/MS m/z: 386 [MH]+.
【０１９６】
方法O：
【化２８】
2009515998.tif 000048
工程1：シクロプロパンカルボン酸[3-(ベンズイミドイル-アミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル]アミドの合成
シクロプロパンカルボン酸(3-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル)アミド, トリフルオロ酢酸塩500 mg（1.48 mmol）に、アセトニトリル2.0 mL、次いでトリエチルアミン0.227 mL（1.63 mmol）を加えた。反応物を5分間撹拌した後、メチルベンズイミデート0.508 g（2.96 mmol）を加えた。混合物を55℃にて終夜加熱した。次いで沈殿物をろ過し、アセトニトリルで洗浄し、シクロプロパンカルボン酸[3-(ベンズイミドイル-アミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル]アミド0.37 gを得（77%収率）、これを次の工程に直接用いた。
【０１９７】
工程2：1-[5-(シクロプロパンカルボニル-アミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-3-イル]-2-フェニル-1H-イミダゾール-4-カルボン酸エチルエステルの合成
シクロプロパンカルボン酸[3-(ベンズイミドイル-アミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル]アミド100 mg（0.31 mmol）およびNaHCO3 50 mg（0.6 mmol）に、2-プロパノール7.5 mLを加えた。混合物を40℃まで加熱した後、ブロモピルビン酸エチル53 uL（0.42 mmol）を滴加した。混合物を80℃にて2日間加熱した。0〜9%勾配のMeOH/CH2Cl2を溶離液としてシリカゲルで精製し、1-[5-(シクロプロパンカルボニル-アミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-3-イル]-2-フェニル-1H-イミダゾール-4-カルボン酸エチルエステル15 mgを得た（12%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ13.7 (broad s, 1H), 12.7 (broad s, 1H), 8.2 (s, 1H), 7.2 (m, 5H), 4.3 (q, 2H), 1.91 (m, 1H), 1.3 (t, 3H), 0.9 (m, 4H); HPLC/MS m/z: 423 [MH]+.
【０１９８】
方法P：
【化２９】
2009515998.tif 000049
工程1：シクロプロパンカルボン酸{3-[(2-クロロ-ベンジリデン)アミノ]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}アミドの合成
シクロプロパンカルボン酸(3-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル)アミド, トリフルオロ酢酸塩2.10 g（6.23 mmol）の無水EtOH 40 mL溶液に、2-クロロベンズアルデヒド841 uL（7.45 mmol）を加えた。反応混合物を油浴中80℃にて18時間、還流コンデンサーおよびN2注入下、加熱した。エタノールをロータリーエバポレーションにより除去した。新たにエタノールを加え、ロータリーエバポレーションにより除去した（3回）。精製は不要であり、純粋なシクロプロパンカルボン酸{3-[(2-クロロ-ベンジリデン)アミノ]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}アミド2.53 gを黄色固体として得た（定量的収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ12.8 (s, 1H), 8.92 (broad s, 1H), 8.21 (d, 1H), 7.64 (d, 1H), 7.57 (m, 4H), 2.00 (m, 1H), 0.96 (m, 4H); HPLC/MS m/z: 364 [MH]+.
【０１９９】
工程2：シクロプロパンカルボン酸{3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}アミドの合成
シクロプロパンカルボン酸{3-[(2-クロロ-ベンジリデン)アミノ]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}アミド2.15 g（6.21 mmol）、炭酸カリウム2.58 g（18.7 mmol）およびトシルメチルイソシアニド1.33 g（6.83 mmol）のDMF 60 mL溶液を常温にて1.5時間撹拌した。次いで反応混合物を油浴中80℃にて18時間、還流コンデンサーおよびN2注入下、加熱した。反応物を室温まで冷却した後、1M水性クエン酸をpH = 5〜6まで加えた。化合物をEtOAcに抽出し、H2O（3x）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。物質をEtOAcに再溶解し、シリカゲルに吸着させた。0〜100%勾配の1:10 MeOH:EtOAcおよびヘキサンで精製し、シクロプロパンカルボン酸{3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}アミド1.66 gを桃色粉末として得た（69%収率）。
1H NMR (d4-MeOH) δ8.22 (d, 1H), 7.43 (m, 4H), 7.20 (d, 1H), 1.82 (m, 1H), 0.98 (m, 4H); HPLC/MS m/z: 385 [MH]+.
【０２００】
工程3：3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イルアミンの合成
シクロプロパンカルボン酸{3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}アミド4.17 g（10.8 mmol）のH2O 40 mLおよびEtOH 160 mLの混合物中の溶液に、過塩素酸の70%水溶液40 mLを加えた。反応混合物を油浴中105℃にて22時間、還流コンデンサーおよびN2注入下、加熱した。EtOHをロータリーエバポレーションにより除去した後、炭酸水素ナトリウムをpH = 6〜7まで加えた。生成物をEtOAcに抽出し、H2Oおよび食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮して橙色固体とした。固体を塩化メチレンでトリチュレーションし、沈殿物をフリットフィルターに通してろ過した。集めた沈殿物をエーテルで洗浄し、3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イルアミンを黄褐色粉末として得た（92%収率）。
1H NMR (d4-MeOH) δ8.17 (s, 1H), 7.43 (m, 4H), 7.18 (s, 1H); HPLC/MS m/z: 317 [MH]+.
【０２０１】
方法Q：
【化３０】
2009515998.tif 000050
N-{3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}アセトアミドの合成
3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イルアミン25 mg（0.079 mmol）およびピリジン38 uL（0.474 mmol）のTHF 1 mL溶液に、塩化アセチル28 uL（0.395 mmol）を加えた。反応混合物を80℃にて15時間加熱した。反応物にN,N-ジメチルエチレンジアミン60 uL（0.553 mmol）を加え、反応物を常温にて16時間撹拌した。生成物をEtOAcに抽出し、1 M水性クエン酸で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、シリカゲルに吸着させた。0〜100%勾配のEtOAc/ヘキサンを溶離液として精製し、N-{3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}アセトアミド2.9 mgを白色粉末として得た（10%収率）。
1H NMR (d4-MeOH) δ8.23 (s, 1H), 7.45 (m, 4H), 7.21 (s, 1H), 2.16 (s, 3H); HPLC/MS m/z: 359 [MH]+.
【０２０２】
方法Qにより製造される他の化合物：
第8表
【表８】
2009515998.tif 000051
【０２０３】
方法R：
【化３１】
2009515998.tif 000052
N-{3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}-2-ピペリジン-4-イル-アセトアミド, トリフルオロ酢酸塩の合成
マイクロウェーブバイアル中、3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イルアミン27 mg（0.085 mmol）、1-boc-4-ピペリジル酢酸62 mg（0.256 mmol）、HATU 97 mg（0.256 mmol）およびジイソプロピルエチルアミン30 uL（0.170 mmol）をDMF 1 mL中にて混合した。マイクロウェーブバイアルに封をし、Personal Chemistryマイクロウェーブ反応容器中90℃にて900秒間加熱した。加熱が完了した後、N,N-ジメチルエチレンジアミン37 uL（0.340 mmol）を加え、反応物を常温にて16時間撹拌した。Boc保護中間体をEtOAcに抽出し、炭酸水素ナトリウムおよび1 M水性クエン酸の飽和水溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、シリカゲルに吸着させた。0〜100%勾配の1:10 MeOH:EtOAcおよびヘキサンでの精製により、4-({3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イルカルバモイル}メチル)ピペリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル73 mgを白色フィルム状物として得た（定量的収率）。ジクロロメタン5 mLに溶解させた中間体の溶液に、PS-チオフェノール樹脂277 mg（0.406 mmol, 1.46 mmol/g充填容量, argonaut樹脂）およびトリフルオロ酢酸5 mLを加えた。反応混合物を穏やかに常温にて2.5時間振盪した。樹脂をろ別し、ジクロロメタン, MeOHおよびジエチルエーテルですすいだ。ろ液を濃縮し、得られた固体をジエチルエーテルでトリチュレーションした。エーテルをデカンテーションし、N-{3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}-2-ピペリジン-4-イル-アセトアミド, トリフルオロ酢酸塩20.3 mgを明桃色粉末として得た（43%収率）。
1H NMR (d4-MeOH) δ9.18 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.59 (d, 1H), 7.51 (m, 3H), 3.39 (m, 2H), 3.05 (m, 2H), 2.48 (d, 2H), 2.17 (m, 1H), 2.00 (m, 2H), 1.50 (q, 2H); HPLC/MS m/z: 442 [MH]+.
【０２０４】
方法S：
【化３２】
2009515998.tif 000053
{3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}-(5-ニトロ-フラン-2-イル)アミンの合成
3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イルアミン30 mg（0.095 mmol）および2-ブロモ-5-ニトロフラン27 mg（0.142 mmol）の無水DMSO 1 mL溶液に、NaH 4.5 mg（0.190 mmol）を加えた。反応混合物を常温にて16時間撹拌した。反応混合物をDMSO 1 mLで希釈し、0.45 umシリンジフィルターに通してろ過し、H2Oおよびアセトニトリルの移動相の質量誘導逆相クロマトグラフィー（修飾剤として0.1%ギ酸を用いる）により精製した。きれいなフラクションを集め、凍結乾燥し、{3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}-(5-ニトロ-フラン-2-イル)アミン2.3 mgを綿状明黄色粉末として得た（6%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ12.4 (broad s, 1H), 8.65 (broad s, 1H), 8.13 (s, 1H), 7.60 (broad s, 1H), 7.59 (d, 1H), 7.43 (d, 1H), 7.33 (t, 1H), 7.28 (t, 1H), 7.24 (d, 1H), 6.28 (broad s, 1H); HPLC/MS m/z: 428 [MH]+.
【０２０５】
方法T：
【化３３】
2009515998.tif 000054
工程1：3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イルアミンの合成
Personal Chemistryの5mLマイクロウェーブバイアルに、{3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}カルバミン酸エチルエステル106 mg（0.27 mmol）、EtOH 1 mL、水1 mLおよび過塩素酸の水溶液600 uL（40% w/w）を加えた。溶液をマイクロウェーブ中150℃にて1時間加熱した後、減圧濃縮した。質量誘導逆相HPLC（C-18；5〜95%勾配ACN（0.1%ギ酸）：水中0.1%ギ酸）での精製により、3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イルアミン11.9 mgを黄褐色粉末として得た（14%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ12.86 (broad s, 1H), 8.12 (s,1H), 7.37 (m, 4H), 7.12 (s, 1H); HPLC/MS m/z: 317 [MH]+.
【０２０６】
工程2：5-ブロモ-3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾールの合成
CuBr2 533 mg（2.38 mmol）のアセトニトリル8 mL氷冷溶液に、亜硝酸イソアミル320 uL（2.39 mmol）を滴加した。溶液を5分間0℃にて撹拌した後、3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イルアミン518 mg（1.63 mmol）の氷冷DMF 8 mL溶液を5分にわたり滴加した。溶液を室温まで昇温した後、60℃まで2時間加熱した。粗製の反応混合物を濃縮した後、EtOAcおよび水で分液した。有機相を食塩水で処理し、乾燥（NaSO4）し、ろ過し、濃縮して緑色粉末147 mgを得た。ヘキサン：EtOAcの勾配で溶出したシリカゲルフラッシュカラムで精製し、5-ブロモ-3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール6.2 mgを黄色粉末として得た（0.9%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ12.02 (broad s, 1H), 8.27 (d 1H), 7.50 (m, 4H), 7.20 (s, 1H); HPLC/MS m/z: 379.9/381.9 [MH]+.
【０２０７】
工程3：{3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}メチル-アミンの合成
5-ブロモ-3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール18 mg（0.047 mmol）のTHF 1 mL溶液に、40 wt%メチルアミンの水溶液200 uLを加えた。反応混合物を油浴中50℃にて3時間加熱した。出発物質がLC/MSにより未だ観察されたので、さらに40 wt%メチルアミン水溶液200 uLを加え、反応物をさらに16時間50℃にて加熱した。反応物を減圧濃縮した後、DMSO 1 mLに再溶解し、0.45 umシリンジフィルターに通してろ過し、H2Oおよびアセトニトリルの移動相（修飾剤として0.1%ギ酸を含む）中、質量誘導逆相クロマトグラフィーにより精製した。きれいなフラクションを集め、凍結乾燥し、{3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}メチル-アミン1.8 mgを綿状白色粉末として得た（12%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ12.9 (broad s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.93 (q, 1H), 7.46 (d, 1H), 7.37 (m, 1H), 7.33 (d, 2H), 7.08 (s, 1H), 2.72 (d, 3H); HPLC/MS m/z: 331 [MH]+.
【０２０８】
方法U：
【化３４】
2009515998.tif 000055
{3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}-(4-モルホリン-4-イル-フェニル)アミンの合成
マイクロウェーブバイアルに、5-ブロモ-3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール19 mg（0.051 mmol）、4-モルホリノアニリン36 mg（0.203 mmol）および無水DMSO 1.25 mLを加えた。マイクロウェーブバイアルに封をし、Personal Chemistryマイクロウェーブ反応容器中150℃にて1800秒間加熱した。粗製の反応混合物を0.45 umシリンジフィルターに通してろ過し、H2Oおよびアセトニトリルの移動相（修飾剤として0.1%ギ酸を含む）中、質量誘導逆相クロマトグラフィーにより精製した。きれいなフラクションを集め、凍結乾燥し、{3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}-(4-モルホリン-4-イル-フェニル)アミン6.4 mgを綿状紫色粉末として得た（27%収率）：
1H NMR (d6-DMSO) δ13.1 (broad s, 1H), 10.2 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.48 (d, 1H), 7.36 (m, 5H), 7.11 (s, 1H), 6.87 (d, 2H), 3.66 (t, 4H), 2.98 (t, 4H); HPLC/MS m/z: 478 [MH]+.
【０２０９】
方法Uにより製造される他の化合物：
第9表
【表９】
2009515998.tif 000056
【０２１０】
方法V：
【化３５】
2009515998.tif 000057
1-[5-(シクロプロパンカルボニル-アミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-3-イル]-6-オキソ-1,6-ジヒドロ-ピリジン-3-カルボン酸の合成
シクロプロパンカルボン酸(3-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル)アミド、トリフルオロ酢酸塩2.65 g（7.86 mmol）のピリジン50 mL溶液に、クマリン酸を加えた。反応混合物を室温にて8時間撹拌した後、減圧濃縮した。粗製の残渣を1 M水性HClで処理し、得られた沈殿物を集め、水、次いでEt2Oで洗浄し、1-[5-(シクロプロパンカルボニル-アミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-3-イル]-6-オキソ-1,6-ジヒドロ-ピリジン-3-カルボン酸2.23 gを黄褐色粉末として得た（82%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ13.6 (broad s, 1H), 12.6 (s, 1H), 9.02 (d, 1H), 7.87 (dd, 1H), 6.62 (d, 1H), 1.97 (m, 1H), 1.93 (m, 1H), 0.89 (m, 4H); HPLC/MS m/z: 346 [MH]+.
【０２１１】
方法Vにより製造される他の化合物：
【化３６】
2009515998.tif 000058
【０２１２】
方法W：
【化３７】
2009515998.tif 000059
1-[5-(シクロプロパンカルボニル-アミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-3-イル]-6-オキソ-1,6-ジヒドロ-ピリジン-3-カルボン酸エチルアミドの合成
1-[5-(シクロプロパンカルボニル-アミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-3-イル]-6-オキソ-1,6-ジヒドロ-ピリジン-3-カルボン酸50 mg（0.145 mmol）のDMF 1 mL溶液に、HATU 80.9 mg（0.213 mmol）、ジイソプロピルエチルアミン40 uL（0.229 mmol）およびエチルアミン500 uL（THF中2 M）を加えた。反応混合物をPersonal Chemistryマイクロウェーブ反応容器中90℃にて15分間加熱した。粗製の反応混合物をEtOAcで希釈し、水、次いで食塩水で洗浄した。有機相を乾燥し（NaSO4）、ろ過し、濃縮した。ヘキサンおよび10% MeOH/EtOAcの勾配で溶出したシリカゲルフラッシュカラムで精製し、1-[5-(シクロプロパンカルボニル-アミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-3-イル]-6-オキソ-1,6-ジヒドロ-ピリジン-3-カルボン酸エチルアミド1.8 mgを黄褐色粉末として得た（2%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ13.5 (broad s, 1H), 12.5 (broad s, 1H), 8.88 (d, 1H), 8.45 (t, 1H), 7.89 (dd, 1H), 6.53 (d, 1H), 3.19(m, 2H), 1.92 (m, 1H), 1.93 (m, 1H), 1.04 (t, 3H), 0.87 (m, 4H); HPLC/MS m/z: 373 [MH]+.
【０２１３】
方法Wにより製造される他の化合物：
第10表
【表１０】
2009515998.tif 000060
【０２１４】
方法X：
【化３８】
2009515998.tif 000061
シクロプロパンカルボン酸{3-[2-(2-クロロ-4-ニトロ-フェニル)ピロール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}アミドの合成
3-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル)アミド, トリフルオロ酢酸塩100 mg（0.29 mmol）および1-(2-クロロ-4-ニトロ-フェニル)-3-[1,3]ジオキサン-2-イル-プロパン-1-オン90 mg（0.30 mmol）のHOAc 2 mL溶液を80℃にて2日間加熱した。粗製の反応混合物を濃縮した後、EtOAcおよび水で分液した。有機相を食塩水で処理し、乾燥し（NaSO4）、ろ過し、濃縮した。ヘキサン：EtOAcの勾配で溶出したシリカゲルフラッシュカラムで精製し、シクロプロパンカルボン酸{3-[2-(2-クロロ-4-ニトロ-フェニル)ピロール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}アミド43 mgを黄色粉末として得た（35%収率）：
1H NMR (d6-DMSO) δ13.3 (broad s, 1H), 12.7 (broad s, 1H), 8.30 (d, 1H), 8.17 (dd, 1H), 7.59 (d, 1H), 7.40 (m, 1H), 6.55 (m, 1H), 6.45 (t, 1H), 1.91 (m, 1H), 0.91 (m, 2H), 0.87 (m, 2H); HPLC/MS m/z: 429 [MH]+.
【０２１５】
方法Xにより製造される他の化合物：
第11表
【表１１】
2009515998.tif 000062
【０２１６】
方法Y：
【化３９】
2009515998.tif 000063
工程1：[5-(シクロプロピルメチル-アミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-3-イル]カルバミン酸tert-ブチルエステルの合成
(5-アミノ-2H-ピラゾール-3-イル)カルバミン酸tert-ブチルエステル1 g（3.92 mmol）の1,2-ジクロロエタン溶液に、シクロプロピルアルデヒド0.55 g（7.84 mmol）を加えた。次いで酢酸0.235 g（3.92 mmol）を加え、混合物を室温にて30分間撹拌させた。次いで混合物を0℃まで冷却し、Na(OAc)3BH 2.49 g（11.76 mmol）を少しずつ加えた。混合物を室温まで昇温させ、48時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルに吸着させた。0〜8%勾配のMeOH/CH2Cl2を溶離液としてシリカゲルで精製し、[5-(シクロプロピルメチル-アミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-3-イル]カルバミン酸tert-ブチルエステル200 mgを得た（24%収率）。
HPLC/MS m/z: 210 [MH]+.
【０２１７】
工程2：{3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}シクロプロピルメチル-アミンの合成
[5-(シクロプロピルメチル-アミノ)-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-3-イル]カルバミン酸tert-ブチルエステル114 mg（0.368 mmol）に、PS-チオフェノール500 mg（0.75 mmol, argonaut樹脂）およびトリフルオロ酢酸2.0 mLを加えた。反応混合物を室温にて2時間撹拌し、樹脂をろ過し、MeOHで洗浄した。ろ液を減圧留去し、乾燥し、TFA塩を得た。TFA塩（0.368 mmol）に、無水EtOH 1.0 mL、次いで2-クロロベンズアルデヒド0.05 mL（0.44 mmol）を加えた。反応混合物を80℃にて16時間撹拌した後、減圧乾燥した。粗製固体をDMF 1.0 mLに溶解し、炭酸カリウム153 mg（1.11 mmol）、次いでトシルメチルイソシアニド94 mg（0.48 mmol）を加えた。反応混合物を80℃にて3時間撹拌した後、減圧濃縮した。粗製固体を10% MeOH/CH2Cl2に再溶解し、シリカゲルに吸着させた。0〜8%勾配のMeOH/CH2Cl2を溶離液としてシリカゲルで精製し、{3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}シクロプロピルメチル-アミン18 mgを得た（13%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ12.8 (broad s, 1H), 8.03 (broad s, 1H), 7.98 (d, 1H), 7.38 (d, 1H), 7.28 (m, 2H), 7.23 (d, 1H), 6.98 (s, 1H), 2.90 (t, 2H), 0.85 (m, 1H), 0.27 (m, 2H), 0.02 (m, 2H); HPLC/MS m/z: 371 [MH]+.
【０２１８】
方法Z：
【化４０】
2009515998.tif 000064
工程1：SEM保護(5-ニトロ-2H-ピラゾール-3-イル)カルバミン酸tert-ブチルエステルの合成
500 mL丸底フラスコに(5-ニトロ-1H-ピラゾール-3-イル)カルバミン酸tert-ブチルエステル10.0 g（44 mmol）およびジクロロメタン250 mLを充填した。KOHの4 N溶液55 mL（220 mmol）を激しく撹拌しながら加えた。溶液を氷浴中0℃にて冷却し、2-(トリメチルシリル)エトキシメチルクロリド11.64 mL（66 mmol）のジクロロメタン100mL溶液を滴加した。添加後、氷浴を除去し、反応混合物を17時間撹拌しながら室温まで昇温させた。反応混合物を1 N HCl水溶液でpH 1〜2に調節し、EtOAc（3x）で抽出した。有機相を食塩水で洗浄し、乾燥し（MgSO4）、ろ過し、減圧濃縮した。モノ-およびビス-保護(5-ニトロ-1H-ピラゾール-3-イル)カルバミン酸tert-ブチルエステルの粗製混合物19.8 gを次の工程に精製せずに用いた。
HPLC/MS: m/z 359 [MH]+およびm/z 489 [MH]+.
【０２１９】
工程2：SEM保護(5-アミノ-2H-ピラゾール-3-イル)カルバミン酸tert-ブチルエステルの合成
250 mL丸底フラスコに、モノ-およびビス-保護(5-ニトロ-1H-ピラゾール-3-イル)カルバミン酸tert-ブチルエステルの混合物19.8 g（44 mmol）、10%/wt Pd/C 4.4 g（4.4 mmol）およびメタノール180 mLを充填した。フラスコを水素ガスでパージした。水素雰囲気下にて22時間後、反応混合物をセライトろ過し、減圧濃縮した。モノ-およびビス-保護(5-アミノ-2H-ピラゾール-3-イル)カルバミン酸tert-ブチルエステルの混合物18.2 gを次の工程に精製せずに用いた。
HPLC/MS: m/z 329 [MH]+およびm/z 459 [MH]+.
【０２２０】
工程3：SEM保護(5-エトキシカルボニルアミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-3-イル)カルバミン酸tert-ブチルエステルの合成
モノ-およびビス-保護(5-アミノ-2H-ピラゾール-3-イル)カルバミン酸tert-ブチルエステルの混合物18.2 g（40 mmol）のTHF 400mL溶液に、エトキシカルボニルイソチオシアネート4.52 mL（40mmol）を滴加した。完了まで反応物を室温にて2時間撹拌した。NBS 7.83 mmol（44 mmol）のTHF 100 mL溶液を室温にて滴加した。15分後、反応混合物を氷浴中0℃にて冷却し、NaHCO3の飽和水溶液で反応停止処理し、EtOAcで3回抽出した。有機相を食塩水で洗浄し、乾燥し（Na2SO4）、ろ過し、減圧濃縮した。得られた固体をEtOAc/ヘキサンで再結晶し、モノ保護標記化合物3.01 gを黄褐色固体として得た。ろ液をEtOAc/ヘキサンを用いた順相シリカで精製し、さらに3.0 gを得た。
HPLC/MS: m/z 458 [MH]+.
【０２２１】
工程4：(3-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル)カルバミン酸エチルエステル, トリフルオロ酢酸塩の合成
250 mL丸底フラスコに、SEM保護(5-エトキシカルボニルアミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-3-イル)カルバミン酸tert-ブチルエステル4.33 g（9.47 mmol）、PS-チオフェノール樹脂19.0g（28.4 mmol, argonaut樹脂）およびジクロロメタン80 mlを充填した。懸濁液をトリフルオロ酢酸15 mlで処理し、反応混合物を室温にて21時間撹拌した。次いで樹脂をろ過し、メタノールで洗浄した。ろ液を減圧濃縮し、高真空下にて乾燥し、(3-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル)カルバミン酸エチルエステル, トリフルオロ酢酸塩の黄褐色粉末1.43 gを白色固体として得た（44%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ12.4 (br s, 1H), 4.25 (q, 2H), 1.25 (t, 3H); HPLC/MS m/z: 228 [MH]+.
【０２２２】
方法AA：
【化４１】
2009515998.tif 000065
1-{3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}-3-メチル-ウレアの合成
マイクロウェーブ容器に{3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}カルバミン酸エチルエステル15 mg（0.0385 mmol）およびエタノール0.4 mLを充填した。メチルアミン18 uL（0.523 mmol）を加え、容器に封をし、Personal Chemistryマイクロウェーブ反応容器中160℃にて65分間加熱した。粗製の反応混合物をDMSOで1 mLに希釈し、0.45 umシリンジフィルターに通してろ過し、H2Oおよびアセトニトリルの移動相（修飾剤として炭酸水素アンモニウムを含む）中、質量誘導逆相分取用HPLCにより精製した。きれいなフラクションを集め、凍結乾燥し、1-{3-[5-(2-クロロ-フェニル)イミダゾール-1-イル]-1H-ピラゾロ[3,4-d]-チアゾール-5-イル}-3-メチル-ウレア4.0 mgを灰白色固体として得た（28%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ8.14 (d, 1H), 7.48 (d, 1H), 7.36-7.44 (m, 3H), 7.16 (d, 1H), 6.44 (q, 1H), 2.65 (d, 3H); HPLC/MS m/z: 374 [MH]+.
方法AAにより製造される他の化合物：
第12表
【表１２】
2009515998.tif 000066
【０２２３】
方法AB：
【化４２】
2009515998.tif 000067
2-(3-クロロ-4-ホルミル-フェノキシ)アセトアミドの合成
バイアルに、2-クロロ-4-ヒドロキシベンズアルデヒド60 mg（0.383 mmol）、2-ブロモアセトアミド58 mg（0.421 mmol）、炭酸セシウム374 mg（1.149 mmol）および少量のヨウ化カリウム結晶（炭酸カリウムおよびヨウ化ナトリウムはそれぞれ塩基および触媒に良い代替である）を充填した。DMF 1 mLを加え、反応混合物を室温にて終夜撹拌した（適宜加熱した）。混合物を減圧濃縮し、MeOHに希釈し、直接シリカゲルに吸着させた。0〜10%勾配のMeOH/CH2Cl2を溶離液としてシリカゲルで精製し、2-(3-クロロ-4-ホルミル-フェノキシ)アセトアミド32 mgを白色固体として得た（39%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ10.2 (s, 1H), 7.84 (d, 1H), 7.63 (broad s, 1H), 7.45 (broad s, 1H), 7.17 (d, 1H), 7.10 (dd, 1H), 4.61 (s, 2H).
【０２２４】
方法ABにより製造される他のアルデヒド：
第13表
【表１３】
2009515998.tif 000068
【０２２５】
方法AC：
【化４３】
2009515998.tif 000069
2-(3-クロロ-4-ホルミル-フェノキシ)-N,N-ジメチル-アセトアミドの合成
マイクロウェーブバイアルに、2-クロロ-4-ヒドロキシベンズアルデヒド50 mg（0.319 mmol）、N,N-ジメチル-2-クロロアセトアミド36 uL（0.35 mmol）、炭酸セシウム312 mg（0.957 mmol）および少量のヨウ化ナトリウム結晶（炭酸カリウムおよびヨウ化カリウムはそれぞれ塩基および触媒に良い代替である）を充填した。DMF 1.5 mLを加え、反応混合物をPersonal Chemistryマイクロウェーブ反応容器中150℃にて900秒間反応させた。炭酸セシウムをろ過し、ろ液を直接シリカゲルに吸着させた。20〜100%勾配のEtOAc/ヘキサンを溶離液としてシリカゲルで精製し、2-(3-クロロ-4-ホルミル-フェノキシ)-N,N-ジメチル-アセトアミド53 mgを透明油状物として得た（69%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ10.2 (s, 1H), 7.80 (d, 1H), 7.16 (d, 1H), 7.03 (dd, 1H), 5.03 (s, 2H), 2.97 (s, 3H), 2.84 (s, 3H).
【０２２６】
方法ACにより製造される他のアルデヒド：
第14表
【表１４】
2009515998.tif 000070
【０２２７】
方法AD：
【化４４】
2009515998.tif 000071
工程1：(4-アミノ-2-クロロ-フェニル)メタノールの合成
水素化アルミニウムリチウムの1M THF 58 mL溶液に、窒素雰囲気下にて4-アミノ-2-クロロ-安息香酸5 g（29.14 mmol）のTHF 40 mL溶液を0℃にて滴加した。氷浴を除去し、反応混合物を室温にて終夜撹拌した後、2時間還流した。水2.35 mL、次いで5%水性水酸化ナトリウム7.2 mLを滴加することにより0℃にて反応停止処理した。温度を1時間かけて室温まで昇温させた。得られた沈殿物をろ過し、EtOAcで洗浄し、ろ液を直接シリカゲルに吸着させた。0〜80%勾配のEtOAc/ヘキサンを溶離液としてシリカゲルで精製し、(4-アミノ-2-クロロ-フェニル)メタノール2.57 gを灰白色固体として得た（56%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ7.10 (d, 1H), 6.56 (d, 1H), 6.47 (dd, 1H), 5.24 (broad s, 2H), 4.92 (t, 1H), 4.36 (d, 2H).
【０２２８】
工程2：4-アミノ-2-クロロ-ベンズアルデヒドの合成
(4-アミノ-2-クロロ-フェニル)メタノール2.5 g（15.86 mmol）のジクロロメタン150 mL溶液に、MnO2 13.8 g（158.6 mmol）を一度に加えた。反応混合物を室温にて23時間撹拌した後、セライトろ過した。ろ液を直接シリカゲルに吸着させた。0〜60%勾配のEtOAc/ヘキサンを溶離液としてシリカゲルで精製し、4-アミノ-2-クロロ-ベンズアルデヒド726 mgを橙黄色固体として得た（29%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ9.95 (s, 1H), 7.56 (d, 1H), 6.62 (broad s, 1H), 6.60 (d, 1H), 6.56 (dd, 1H).
【０２２９】
方法AE：
【化４５】
2009515998.tif 000072
工程1：(2-クロロ-4-メチルアミノ-フェニル)メタノールの合成
水素化アルミニウムリチウムの1M THF 7.48 mL溶液に、窒素雰囲気下、4-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-クロロ-安息香酸1 g（3.68 mmol）のTHF 5 mL溶液を0℃にて滴加した。氷浴を除去し、反応混合物を室温にて2時間、次いで5℃にて2時間撹拌した。水0.3 mL、次いで5%水性水酸化ナトリウム0.92 mLを滴加することにより0℃にて反応停止処理した。EtOAcを加え、沈殿物をろ過し、EtOAcで洗浄した。ろ液をさらに炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液（2x）および食塩水で洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、ろ過し、直接シリカゲルに吸着させた。0〜100%勾配のEtOAc/ヘキサンを溶離液としてシリカゲルで精製し、(2-クロロ-4-メチルアミノ-フェニル)メタノール390 mgを白色蝋状固体として得た（62%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ7.16 (d, 1H), 6.48 (d, 1H), 6.46 (dd, 1H), 5.82 (q, 1H), 4.93 (t, 1H), 4.38 (d, 2H), 2.63 (d, 3H).
【０２３０】
工程2：2-クロロ-4-メチルアミノ-ベンズアルデヒドの合成
(2-クロロ-4-メチルアミノ-フェニル)メタノール380 mg（2.21 mmol）のクロロホルム20 mL溶液に、MnO2 1.9 g（22.1 mmol）を一度に加えた。完了まで反応混合物を室温にて撹拌した後、セライトろ過した。ろ液を直接シリカゲルに吸着させた。0〜70%勾配のEtOAc/ヘキサンを溶離液としてシリカゲルで精製し、2-クロロ-4-メチルアミノ-ベンズアルデヒド296 mgを黄色固体として得た（79%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ9.81 (s, 1H), 7.60 (d, 1H), 7.19 (q, 1H), 6.58 (m, 2H), 2.76 (d, 3H).
【０２３１】
工程3：(3-クロロ-4-ホルミル-フェニル)メチル-カルバミン酸tert-ブチルエステルの合成
2-クロロ-4-メチルアミノ-ベンズアルデヒド290 mg（1.71 mmol）のDMF 10 mL溶液に、4-ジメチルアミノピリジン209 mg（1.71 mmol）、次いでジ-tert-ブチルオキシカルボニル無水物410 mg（1.88 mmol）を加えた。反応混合物を80℃にて2.5時間撹拌した後、減圧濃縮し、EtOAcで希釈した。有機物を1 N水性HCl（2x）および食塩水で洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、ろ過し、濃縮し、減圧乾燥し、(3-クロロ-4-ホルミル-フェニル)メチル-カルバミン酸tert-ブチルエステル444 mgを黄色油状物として得た（96%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ10.2 (s, 1H), 7.82 (d, 1H), 7.61 (d, 1H), 7.48 (dd, 1H), 3.26 (s, 3H), 1.44 (s, 9H).
【０２３２】
方法AF：
【化４６】
2009515998.tif 000073
N-(3-クロロ-4-ホルミル-フェニル)アセトアミドの合成
4-アミノ-2-クロロ-ベンズアルデヒド30 mg（0.193 mmol）のピリジン0.5 mL溶液に、塩化アセチル30 uL（0.414 mmol）を滴加した。反応混合物を60℃にて8時間撹拌した後、減圧濃縮した。粗製物をEtOAcおよび飽和硫酸銅(II)水溶液で分液した。有機層を水で洗浄し、直接シリカゲルに吸着させた。0〜70%勾配のEtOAc/ヘキサンを溶離液としてシリカゲルで精製し、N-(3-クロロ-4-ホルミル-フェニル)アセトアミド26 mgをベージュ色固体として得た（68%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ10.5 (s, 1H), 10.2 (s, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.83 (d, 1H), 7.57 (d, 1H), 2.10 (s, 3H).
【０２３３】
方法AFにより製造される他のアルデヒド：
【化４７】
2009515998.tif 000074
【０２３４】
方法AG：
【化４８】
2009515998.tif 000075
1-(3-クロロ-4-ホルミル-フェニル)-3-(3-フルオロ-フェニル)ウレアの合成
4-アミノ-2-クロロ-ベンズアルデヒド30 mg（0.193 mmol）のトルエン0.5 mL懸濁液に、3-フルオロフェニルイソシアネート24 uL（0.212 mL）を加えた。反応混合物を60℃にて3日間撹拌した後、MeOHで希釈し、シリカゲルに吸着させた。0〜10%勾配のMeOH/CH2Cl2を溶離液としてシリカゲルで精製し、1-(3-クロロ-4-ホルミル-フェニル)-3-(3-フルオロ-フェニル)ウレア38 mgを暗黄色固体として得た（67%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ10.2 (s, 1H), 9.46 (s, 1H), 9.18 (s, 1H), 7.85 (d, 1H), 7.81 (d, 1H), 7.47 (dt, 1H), 7.43 (dd, 1H), 7.33 (dd, 1H), 7.16 (d, 1H), 6.83 (td, 1H).
【０２３５】
方法AGにより製造される他のアルデヒド：
【化４９】
2009515998.tif 000076
【０２３６】
方法AH：
【化５０】
2009515998.tif 000077
工程1：[(3-クロロ-4-ヒドロキシメチル-フェニルカルバモイル)メチル]カルバミン酸tert-ブチルエステルの合成
バイアルに、(4-アミノ-2-クロロ-フェニル)メタノール50 mg（0.317 mmol）およびBoc-グリシン56 mg（0.317 mmol）を充填した。ジクロロメタン1 mL、次いでジイソプロピルエチルアミン61 uL（0.349 mmol）および塩酸N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド67 mg（0.349 mmol）を加えた。反応混合物を室温にて終夜撹拌した後、1 N水酸化ナトリウム水溶液1 mLを加え、混合物をさらに１時間撹拌した。有機層を分離し、1 N水酸化ナトリウム水溶液、1 N HCl水溶液および食塩水で洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、ろ過し、濃縮し、減圧乾燥し、[(3-クロロ-4-ヒドロキシメチル-フェニルカルバモイル)メチル]カルバミン酸tert-ブチルエステル43 mgをわずかに桃色の泡状物として得た（44%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ10.1 (s, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.44 (s, 2H), 7.06 (t, 1H), 5.29 (t, 1H), 4.48 (d, 2H), 3.70 (d, 2H), 1.38 (s, 9H).
【０２３７】
工程2：[(3-クロロ-4-ホルミル-フェニルカルバモイル)メチル]カルバミン酸tert-ブチルエステルの合成
[(3-クロロ-4-ヒドロキシメチル-フェニルカルバモイル)メチル]カルバミン酸tert-ブチルエステル40 mg（0.127 mmol）のクロロホルム1 mL溶液に、MnO2 110 mg（1.27 mmol）を一度に加えた。完了まで反応混合物を室温にて撹拌した後、セライトろ過した。ろ液を直接シリカゲルに吸着させた。0〜80%勾配のEtOAc/ヘキサンを溶離液としてシリカゲルで精製し、[(3-クロロ-4-ホルミル-フェニルカルバモイル)メチル]カルバミン酸tert-ブチルエステル22 mgを泡状物として得た（55%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ10.5 (s, 1H), 10.2 (s, 1H), 7.95 (d, 1H), 7.84 (d, 1H), 7.59 (d, 1H), 7.14 (t, 1H), 3.75 (d, 2H), 1.38 (s, 9H).
【０２３８】
方法AHにより製造される他のアルデヒド：
【化５１】
2009515998.tif 000078
【０２３９】
方法AI：
【化５２】
2009515998.tif 000079
(3-クロロ-4-ホルミル-フェノキシ)メタンスルホンアミドの合成
N-tert-ブチル-C-(3-クロロ-4-ホルミル-フェノキシ)メタンスルホンアミド156 mg（0.511 mmol）の1,4-ジオキサン2.7 mL溶液に、6 N水性HCl 2.7 mLを滴加した。反応混合物を90℃にて1.5時間撹拌した後、水で希釈し、EtOAc（3x）で抽出した。集めた抽出物をシリカゲルに吸着させた。0〜70%勾配のEtOAc/ヘキサンを溶離液としてシリカゲルで精製し、(3-クロロ-4-ホルミル-フェノキシ)メタンスルホンアミド73 mgを白色固体として得た（57%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ10.2 (s, 1H), 7.85 (d, 1H), 7.41 (d, 1H), 7.28 (broad s, 2H), 7.25 (dd, 1H), 5.27 (s, 2H).
【０２４０】
方法AJ：
【化５３】
2009515998.tif 000080
工程1：2-クロロ-3-ジブロモメチル-6-フルオロ-ベンゾニトリルの合成
2-クロロ-6-フルオロ-3-メチル-ベンゾニトリル2 g（11.79 mmol）の四塩化炭素60 mL溶液に、窒素雰囲気下、N-ブロモスクシンイミド6.3 g（35.4 mmol）および過酸化ベンゾイル286 mg（1.18 mmol）を加えた。反応混合物を22時間還流温度にて撹拌した後、減圧濃縮した。残渣をEtOAcおよび飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で分液した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（2x）および食塩水でさらに洗浄した後、Na2SO4で乾燥し、ろ過し、シリカゲルに吸着させた。0〜25%勾配のEtOAc/ヘキサンを溶離液としてシリカゲルで精製し、2-クロロ-3-ジブロモメチル-6-フルオロ-ベンゾニトリル3.05 gを透明油状物として得た（79%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ8.32 (dd, 1H), 7.69 (t, 1H), 7.52 (s, 1H).
【０２４１】
工程2：2-クロロ-6-フルオロ-3-ホルミル-ベンゾニトリルの合成
2-クロロ-3-ジブロモメチル-6-フルオロ-ベンゾニトリル1 g（3.06 mmol）を濃硫酸10 mLで処理した。反応混合物を45℃にて21時間撹拌した後、氷上に注いだ。4 N水酸化ナトリウム水溶液をpH 4まで加えた。水溶液をEtOAc（3x）で抽出し、集めた有機層をシリカゲルに吸着させた。0〜80%勾配のEtOAc/ヘキサンを溶離液としてシリカゲルで精製し、2-クロロ-6-フルオロ-3-ホルミル-ベンゾニトリル360 mgを白色固体として得た（64%収率）。
1H NMR (d6-DMSO) δ10.3 (s, 1H), 8.24 (broad s, 1H), 8.01 (broad s, 1H), 7.95 (dd, 1H), 7.50 (t, 1H).
【０２４２】
実施例２：バイオアッセイ
当業者に知られているキナーゼアッセイを用いて、本発明の化合物および組成物の阻害活性を評価することができる。キナーゼアッセイとしては以下の例が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４３】
均一発光ベース阻害剤スクリーニングアッセイをc-Abl、MET、AurAおよびPDK1キナーゼ（他のうち）について発展させた。これらの各アッセイは、ATP枯渇アッセイ（キナーゼ-Glo（商標）, Promega Corporation, Madison, WI）を用いてキナーゼ活性を定量した。キナーゼ-Glo（商標）フォーマットは熱安定性ルシフェラーゼを使用し、溶液に残存するATPからの発光シグナルを生成させ、次いでキナーゼ反応させる。発光シグナルはキナーゼ活性の量と逆の相関がある。
【０２４４】
スクリーニングデータは次式：
Z'=1-[3＊(σ++σ-)/|μ+-μ-|]
（式中、μは平均を示し、σは標準偏差を示す）
を用いて評価した（Zhang, et al., 1999 J Biomol Screening 4(2) 67-73）。下付記号は陽性または陰性対照を示す。着実なスクリーニングアッセイのためのZ'値は≧0.50であるべきである。典型的な基準点＝μ+-3＊σ+である。基準点以下の任意の値は「ヒット」と指定した。
【０２４５】
用量応答は、式：
y=min+{(max-min)/(1+10[化合物]-logIC50)}
［式中、yは観測初期勾配であり、maxは阻害剤非存在下における勾配であり、minは無限の阻害剤における勾配であり、IC50は総観測振幅の二分の一に対応する[化合物]である（振幅=max-min）］
を用いて分析した。
【０２４６】
同時発現プラスミドの調製
ラムダホスファターゼ同時発現プラスミドは以下のように構築した。
【０２４７】
オーロラキナーゼについてのオープン・リーディング・フレームは、以下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によりホモ・サピエンス（ヒト）HepG2 cDNAライブラリー（ATCC HB-8065）から増幅させた：
順方向プライマー：TCAAAAAAGAGGCAGTGGGCTTTG
逆方向プライマー：CTGAATTTGCTGTGATCCAGG。
【０２４８】
PCR産物（795塩基対が予測された）を以下のようにゲル精製した。PCR産物は、TAE緩衝液中の1%アガロースゲル上の電気泳動によって精製し、適当な大きさのバンドをゲルから切り出し、標準のゲル抽出キットを用いて溶出した。溶出されたDNAを5分間室温にてトポイソメラーゼを用いてpSB2-TOPO内にライゲーションさせた。ベクターpSB2-TOPOは、トポイソメラーゼによって活性化される、pET26b（Novagen、ウィスコンシン州Madison）の変形であり、以下の配列がNdeI部位内に挿入されており：CATAATGGGCCATCATCATCATCATCACGGT GGTCATATGTCCCTT、
以下の配列がBamHI部位内に挿入されている：AAGGGGGATCCTAAACTGCAGAGATCC。
【０２４９】
シャイン-ダルガノ配列から「オリジナル」NdeI部位、停止部位および「オリジナル」BamHI部位にわたる、得られたプラスミドの配列は以下のとおりである：
AAGGAGGAGATATACATAATGGGCCATCATCATCATCATCACGGTGGTCATATGTCCCTT[ORF]AAGGGGGATCCTAAACTGCAGAGATCC。このベクターを用いて発現されるオーロラキナーゼは、N末端に14個のアミノ酸が付加されており（MetGlyHisHisHisHisHisHisGlyGlyHisMetSerLeu）、C末端に4個のアミノ酸が付加されている（GluGlyGlySer）。
【０２５０】
次いで、ラムダバクテリオファージ由来のホスファターゼ遺伝子を上記プラスミド内に挿入することによってホスファターゼ同時発現プラスミドを作製した（Matsui T, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2001, 284:798-807）。ホスファターゼ遺伝子は、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、テンプレートラムダバクテリオファージDNA（HinDIII消化, New England Biolabs）からPCRを用いて増幅させた：
順方向プライマー（PPfor）：GCAGAGATCCGAATTCGAGCTC CGTCGACGGATGGAGTGAAAGAGATGCGC
逆方向プライマー（PPrev）：GGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAA GCTTTCATCATGCGCCTTCTCCCTGTAC
【０２５１】
PCR産物（744塩基対が予測された）をゲル精製した。次いで、精製したDNAならびに非同時発現プラスミドDNAをSacIおよびXhoI制限酵素で消化した。次いで、消化したプラスミドおよびPCR産物をどちらもゲル精製し、8時間16℃にてT4 DNAリガーゼを用いて一緒にライゲーションさせ、標準の手順を用いてTop10細胞内に形質転換させた。同時発現プラスミド内にホスファターゼ遺伝子が存在することは配列決定によって確認した。ここで従った標準の分子生物学プロトコールについて、例えば、文献（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 2001、およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, 1989）に記載の技術も参照されたい。
【０２５２】
この同時発現プラスミドは、lacプロモータの制御下にオーロラキナーゼおよびラムダホスファターゼ遺伝子をどちらも含み、そのそれぞれが独自のリボソーム結合部位を有する。ホスファターゼを、標的遺伝子の下流の複数のクローニング部位の真ん中にクローニングすることによって、ホスファターゼを他のプラスミド内にサブクローニングするために便利な制限部位が利用可能となる。これらの部位としては、キナーゼとホスファターゼとの間のSacI、SalIおよびEcoRIならびにホスファターゼの下流のHinDIII、NotIおよびXhoIが挙げられる。
【０２５３】
タンパク質キナーゼ発現
c-Ablについてのオープン・リーディング・フレームを、市販のキット（Invitrogen）を用いて新しく採取したマウス肝臓から調製したハツカネズミ（マウス）cDNAライブラリーから、以下のプライマーを用いたPCRによって増幅した：
【０２５４】
順方向プライマー：GACAAGTGGGAAATGGAGC
【０２５５】
逆方向プライマー：CGCCTCGTTTCCCCAGCTC。
【０２５６】
PCR産物（846塩基対が予測された）を、PCRクリーンアップキット（Qiagen）を用いてPCR反応混合物から精製した。精製したDNAを5分間室温にてトポイソメラーゼを用いてpSGX3-TOPO内にライゲーションさせた。ベクターpSGX3-TOPOは、トポイソメラーゼによって活性化される、pET26b（Novagen、ウィスコンシン州Madison）の変形であり、以下の配列がNdeI部位内に挿入されており：CATATGTCCCTT、
以下の配列がBamHI部位内に挿入されている：AAGGGCATCATCACCATCACCACTGATCC。
【０２５７】
シャイン-ダルガノ配列から停止部位およびBamHI部位にわたる、得られたプラスミドの配列は以下のとおりである：
AAGGAGGA GATATACATATGTC CCTT[ORF]AAGGGCATCAT CACCATCACCACTGATCC。
このベクターを用いて発現されるc-Ablは、そのN末端に3個のアミノ酸が付加されており（MetSerLeu）、そのC末端に8個のアミノ酸が付加されている（GluGlyHisHisHisHisHisHis）。
【０２５８】
次いで、オーロラ同時発現プラスミドからのホスファターゼを上記プラスミド内にサブクローニングすることによって、c-Abl／ホスファターゼ同時発現プラスミドを作製した。オーロラ同時発現プラスミドおよびAbl非同時発現プラスミドを、どちらも制限酵素EcoRIおよびNotIで3時間消化した。DNA断片をゲル精製し、オーロラプラスミド由来のホスファターゼ遺伝子を消化したc-Ablプラスミドと共に8時間16℃にてライゲーションさせ、Top10細胞内に形質転換させた。得られた構築体内にホスファターゼ遺伝子が存在することは制限消化分析によって確認した。
【０２５９】
このプラスミドは、c-Ablおよびラムダホスファターゼ同時発現をコードしている。これは、標的遺伝子の上流に、このホスファターゼ同時発現プラスミド内に他の標的タンパク質をサブクローニングするために用いることができる２つの特有の制限部位、XbaIおよびNdeIのさらなる利点を有する。
【０２６０】
Abl T315Iについてのプラスミドは、製造者の推奨手順および以下のオリゴヌクレオチドにより、Quick Change突然変異誘発キット（Stratagene）を用いて、Ablプラスミドを変更することによって調製した：
Mm05582dS4 5'-CCACCATTCTACATAATCATTGAGTTCATGACCTATGGG-3'
Mm05582dA4 5'-CCCATAGGTCATGAACTCAATGATTATGTAGAATGGTGG-3'。
ホスファターゼ同時発現プラスミドからのタンパク質は、以下のように精製した。非同時発現プラスミドを化学的に有能なBL21(DE3)コドン＋RIL（Stratagene）細胞内に形質転換させ、同時発現プラスミドをBL21(DE3)pSA0145（ラムダファージの溶解性遺伝子を発現し、凍結と解凍により溶解する株（Crabtree S, Cronan JE Jr. J Bacteriol 1984 Apr;158(1):354-6)）内に形質転換させ、カナマイシンを含むLB寒天を含むペトリ皿に蒔いた。単離した単一コロニーを対数期中間まで増殖させ、15%のグリセロールを含むLB中-80℃にて保存した。このグリセロールストックを、カナマイシンを含むLB寒天プレートに画線し、単一コロニーを用いてカナマイシンおよびクロラムフェニコールを含むLBの10 ml培養物を接種し、これを、30℃にて終夜、振盪しながらインキュベーションを行った。この培養物を用いてカナマイシンおよびクロラムフェニコールを含む500 mlのLBを含む2 Lのフラスコを接種し、これを37℃にて対数期中間まで増殖させ、IPTGを0.5 mMの最終濃度で加えることによって誘発させた。誘発後、フラスコを21℃にて18時間、振盪しながらインキュベーションを行った。
【０２６１】
c-Abl T315I KD（キナーゼドメイン）を以下のように精製した。遠心分離によって細胞を収集し、超音波処理により希釈したクラッキング緩衝液に溶解し（50mMトリスHCl、pH7.5、500mM KCl、0.1% Tween 20、20mMイミダゾール）、遠心分離して細胞細片を除去した。ニッケル（Pharmacia, スウェーデン, Uppsala）を充填したIMACカラムで可溶性画分を精製し、50mMトリス、pH7.8中20mM〜500mM勾配のイミダゾール、500mM NaCl、10mMメチオニン、10%グリセロールを用いてネイティブ条件下で溶出させた。次いで、GF5緩衝液（10mM HEPES、pH7.5、10mMメチオニン、500mM NaCl、5mM DTTおよび10%グリセロール）で平衡化したSuperdex 75調製グレードカラムを用いたゲル濾過によってタンパク質をさらに精製した。精製したc-Abl T315I KDキナーゼドメインを含む画分をプールした。得られたタンパク質は、SDSポリアクリルアミドゲル上の電気泳動によって判断して98%純粋であった。精製したタンパク質の質量分析により、これが優先的に一リン酸化されていたことが示された。次いで、Shrimpアルカリホスファターゼ（MBI Fermentas, Burlington, Canada）を用いて以下の条件下でタンパク質を脱リン酸化した：100 UのShrimpアルカリホスファターゼ／mgのc-Abl T315I KD、100mM MgCl2および250mM追加NaCl。反応を終夜23℃にて行った。質量分析によってタンパク質はリン酸化されていないと決定された。すべての沈殿物を遠心して除去し、GF4緩衝液（10mM HEPES、pH7.5、10mMメチオニン、150mM NaCl、5mM DTTおよび10%グリセロール）で平衡化したSuperdex 75調製グレードカラムを用いたゲル濾過によって、可溶性画分を反応物から分離した。
【０２６２】
Metの精製：
ヒトMetのキナーゼドメインを発現する12 L Sf9昆虫細胞培養物の半分から調製した細胞ペレットを、50mM Tris-HCl pH 7.7および250mM NaClを含む緩衝液中にて、初代培養物1 Lあたり約40 mlの容積に再懸濁した。１錠のRoche Complete、EDTA不含プロテアーゼ阻害剤カクテル（カタログ番号1873580）を初代培養物1 Lあたりに加えた。懸濁液を4℃にて1時間撹拌した。残屑は39,800 x g、4℃にて30分間遠心分離により除去した。上清を500 mlビーカーにデカンテーションし、50mM Tris-HCl pH 7.8にて予め平衡にしたQiagen Ni-NTAアガロースの50%スラリー10 ml（カタログ番号30250）、50mM NaCl、10%グリセロール、10mMイミダゾールおよび10mMメチオニンを加え、4℃にて30分間撹拌した。次いでサンプルを4℃にてドリップカラムに注ぎ、10カラム容積の50mM Tris-HCl pH 7.8、500mM NaCl、10%グリセロール、10mMイミダゾールおよび10mMメチオニンで洗浄した。タンパク質は、50mM、200mMおよび500mMイミダゾールを含む2カラム容積の同緩衝液の段階的勾配を用いて続けて溶出した。6xヒスチジンタグは40ユニットのTEVプロテアーゼ（Invitrogenカタログ番号10127017）／タンパク質1 mgを用いて終夜開裂したが、50mM Tris-HCl pH 7.8、500mM NaCl、10%グリセロール、10mMイミダゾールおよび10mMメチオニン中4℃にて透析した。6xヒスチジンタグは、ニッケルを充填し、50mM Tris-HCl pH 7.8、500mM NaCl、10% グリセロール、10mM イミダゾールおよび10mM メチオニンにて平衡にしたPharmacia 5 ml IMACカラム（カタログ番号17-0409-01）にサンプルを通すことにより除去した。開裂したタンパク質は低親和力にてニッケルカラムに結合し、段階的勾配で溶出した。段階的勾配は、15%、次いで80%のB面（A面 = 50mM Tris-HCl pH 7.8、500mM NaCl、10%グリセロール、10mM イミダゾールおよび10mM メチオニン；B面 = 50mM Tris-HCl pH 7.8、500mM NaCl、10% グリセロール、500mM イミダゾールおよび10mM メチオニン）でそれぞれ4カラム容積で行った。Metタンパク質は第一段階で溶出したが（15%）、非開裂Metおよび開裂ヒスチジンタグは80%フラクションにて溶出した。15%フラクションは開裂Metの存在を確認するSDS-PAGEゲル分析後にプールされ；さらなる精製は、50mM Tris-HCl pH 8.5, 150mM NaCl, 10% グリセロールおよび5 mM DTTにて平衡化したAmersham Biosciences HiLoad 16/60 Superdex 200分取グレード（カタログ番号17-1069-01）でのゲルろ過クロマトグラフィーにより行った。最もきれいなフラクションを集め、Amicon Ultra-15 10,000 Da MWCO遠心分離フィルターユニットにおける遠心分離により〜10.4mg/mlに濃縮した（カタログ番号UFC901024）。
【０２６３】
AurAの精製：
ヒトオーロラ-2を発現する6 Lの培養細胞から産生したSf9昆虫細胞ペレット（〜18 g）を50mMリン酸Na pH 8.0、500mM NaCl、10%グリセロール、0.2%n-オクチル-β-D-グルコピラノシド（BOG）および3mM β-メルカプトエタノール（BME）に再懸濁した。１錠のRoche Complete、EDTA不含プロテアーゼ阻害剤カクテル（カタログ番号1873580）およびベンゾネーゼ（Benzonase）85ユニット（Novagenカタログ番号70746-3）を初代培養物1 Lあたりに加えた。ペレットを初代培養物1 Lあたり約50 mlに再懸濁した後、２の30〜45秒バースト（100%デューティサイクル）で氷上にて超音波を当てた。残屑を遠心分離により除去し、上清を0.8μmシリンジフィルターに通した後、5 ml Ni2+ HiTrap カラム（Pharmacia）に充填した。カラムを6カラム容積の50mMリン酸Na pH 8.0、500mM NaCl、10%グリセロール、3mM BMEで洗浄した。タンパク質は、500mM イミダゾールを含む同緩衝液の直線勾配を用いて溶出した。溶出物24 mlは、50mMリン酸Na pH 8.0、500mM NaCl、10%グリセロール、3mM BMEおよび10,000ユニットのTEV（Invitrogenカタログ番号10127-017）を含む緩衝液中4℃にて終夜開裂した。タンパク質は上記のように二次ニッケル親和性カラムに通し；流出物を集めた。開裂したタンパク質フラクションを集め、スピンコンセントレータを用いて濃縮した。さらなる精製は、50mMリン酸Na（pH 8.0）、250mM NaCl、1mM EDTA、0.1mM AMP-PNPまたはATP緩衝液および5mM DTTにおけるS75サイズカラム上でゲルろ過クロマトグラフィーにより行った。最もきれいなフラクションを集め、約8〜11mg/mlに濃縮し、120μlアリコートにて液体窒素でフラッシュ凍結し、-80℃または4℃にて保存した。
【０２６４】
PDK1の精製：
ヒトPDK1を発現している6 LのSf9昆虫細胞から産生した細胞ペレットを、オリジナル培養物1 Lあたり約40 mLの容量にて、50mMトリス-HCl、pH7.7および250mM NaClを含む緩衝液に再懸濁させた。オリジナル培養物1 Lあたり１錠のRoche Complete、EDTA不含プロテアーゼ阻害剤カクテル（カタログ番号1873580）および85単位のBenzonase（Novagenカタログ番号70746-3））を加えた。懸濁液を1時間4℃にて撹拌した。細片を、30分間39,800×g、4℃における遠心分離によって除去した。上清を500 mLビーカーにデカンテーションし、50mMトリス-HCl、pH7.8、500mM NaCl、10%グリセロール、10mMイミダゾールおよび10mMメチオニンで予め平衡化した10 mlのQiagen Ni-NTAアガロースの50%スラリー（カタログ番号30250）を加え、30分間4℃にて撹拌した。次いで、サンプルを4℃のドリップカラムに注ぎ、10倍カラム容量の50mMトリス-HCl、pH7.8、500mM NaCl、10%グリセロール、10mMイミダゾールおよび10mMメチオニンで洗浄した。タンパク質を、それぞれ2倍カラム容量の、50mMおよび500mMイミダゾールを逐次的に含む同じ緩衝液の段階勾配を用いて溶出させた。1 mgのタンパク質あたり40単位のTEVプロテアーゼ（Invitrogenカタログ番号10127017）を用いて、50mMトリス-HCl、pH7.8、500mM NaCl、10%グリセロール、10mMイミダゾールおよび10mMメチオニン中、4℃にて透析しながら、6×ヒスチジンタグを終夜開裂させた。サンプルを、ニッケルで充填し、50mMトリス-HCl、pH7.8、500mM NaCl、10%グリセロール、10mMイミダゾールおよび10mMメチオニンで平衡化したPharmaciaの5 ml IMACカラム（カタログ番号17-0409-01）に通すことによって、6×ヒスチジンタグを除去した。開裂されたタンパク質は流した液中に溶出されたが、開裂されていないタンパク質およびHisタグはNi-カラムに結合したままであった。開裂されたタンパク質画分を集め、遠心濃縮機を用いて濃縮した。さらなる精製は、25mMトリス-HCl、pH7.5、150mM NaClおよび5mM DTTで平衡化したAmersham Biosciences HiLoad 16/60 Superdex 200調製グレード（カタログ番号17-1069-01）上のゲル濾過クロマトグラフィーによって行った。最も清浄な画分を集め、Amicon Ultra-15 10,000 Da MWCO遠心分離フィルターユニット（カタログ番号UFC901024）における遠心分離によって〜15 mg/mlまで濃縮した。
【０２６５】
cAbl発光ベース酵素アッセイ
物質：Abl基質ペプチド＝EAIYAAPFAKKK-OH（Biopeptide, San Diego, CA）、ATP（Sigmaカタログ番号A-3377, FW=551）、HEPES緩衝液、pH 7.5、ウシ血清アルブミン（BSA）（Roche 92423420）、MgCl2、スタウロスポリン（ストレプトミセス種 Sigmaカタログ番号85660-1MG）、ホワイト・コスター384ウェル平底プレート（VWRカタログ番号29444-088）、Ablキナーゼ（以下参照のこと）、キナーゼ-Glo（商標）（Promegaカタログ番号V6712）。
【０２６６】
ストック溶液：-20℃にて保存された10mM Abl基質ペプチド（miliQH2O中13.4 mg/ml）；100mM HEPES緩衝液、pH 7.5（5 ml 1Mストック＋45ml miliQH2O）；-20℃にて保存された10mM ATP（dH2O中5.51 mg/ml）（50μlを毎日全10 ml miliQH2Oに希釈＝50μM ATP通常ストック）；1% BSA（100 ml 0.1M HEPES中1 g BSA、pH 7.5、-20℃にて保存）、100mM MgCl2；200μMスタウロスポリン、2Xキナーゼ-Glo（商標）試薬（新たに生成または-20℃にて保存）。
【０２６７】
384ウェルフォーマットのための標準アッセイ設定（20μlキナーゼ反応、40μl検出反応）：10mM MgCl2；100μM Abl基質ペプチド；0.1% BSA；1μl試験化合物（DMSO中）；0.4μg/ml Ablキナーゼドメイン；10μM ATP；100mM HEPES緩衝液。陽性対照は試験化合物なしでDMSOを含む。陰性対照は10μMスタウロスポリンを含む。
【０２６８】
キナーゼ反応はATPの添加によりt=0の時間に開始した。キナーゼ反応は21℃にて30分間インキュベーションした後、キナーゼ-Glo（商標）試薬20μlを各ウェルに加え、キナーゼ反応を停止処理し、発光反応を開始した。21℃における20分インキュベーション後、発光をプレート・リーディング照度計にて検出した。
【０２６９】
MET発光ベース酵素アッセイ
物質：ポリGlu-Tyr（4:1）基質（Sigmaカタログ番号P-0275）、ATP（Sigmaカタログ番号A-3377, FW=551）、HEPES緩衝液、pH 7.5、ウシ血清アルブミン（BSA）（Roche 92423420）、MgCl2、スタウロスポリン（ストレプトミセス種 Sigmaカタログ番号85660-1MG）、ホワイト・コスター384ウェル平底プレート（VWRカタログ番号29444-088）。METキナーゼ（以下参照のこと）、キナーゼ-Glo（商標）（Promegaカタログ番号V6712）。
【０２７０】
ストック溶液：-20℃にて保存された水中10 mg/ml ポリGlu-Tyr；100mM HEPES緩衝液、pH 7.5（5 ml 1Mストック＋45 ml miliQH2O）；-20℃にて保存された10mM ATP（dH2O中5.51 mg/ml）（50μlを毎日全10 ml miliQH2Oに希釈＝50μM ATP通常ストック）；1% BSA（100 ml 0.1M HEPES中1 g BSA、pH 7.5、-20℃にて保存）、100mM MgCl2；200μMスタウロスポリン、2Xキナーゼ-Glo（商標）試薬（新たに生成または-20℃にて保存）。
【０２７１】
384ウェルフォーマットのための標準アッセイ設定（20μlキナーゼ反応、40μl検出反応）：10mM MgCl2；0.3 mg/ml ポリGlu-Tyr；0.1% BSA；1μl試験化合物（DMSO中）；0.4μg/ml METキナーゼ；10μM ATP；100mM HEPES緩衝液。陽性対照は試験化合物なしでDMSOを含む。陰性対照は10μMスタウロスポリンを含む。キナーゼ反応はATPの添加によりt=0の時間に開始した。キナーゼ反応は21℃にて60分間インキュベーションした後、キナーゼ-Glo（商標）試薬20μlを各ウェルに加え、キナーゼ反応を停止処理し、発光反応を開始した。21℃における20分インキュベーション後、発光をプレート・リーディング照度計にて検出した。
【０２７２】
AurA発光ベース酵素アッセイ
物質：Kemptideペプチド基質＝LRRASLG（Biopeptide, San Diego, CA）、ATP（Sigmaカタログ番号A-3377, FW=551）、HEPES緩衝液、pH 7.5、10% Brij 35（Calbiochemカタログ番号203728）、MgCl2、スタウロスポリン（ストレプトミセス種 Sigmaカタログ番号85660-1MG）、ホワイト・コスター384ウェル平底プレート（VWRカタログ番号29444-088）、自動リン酸化AurAキナーゼ（以下参照のこと）、キナーゼ-Glo（商標）（Promegaカタログ番号V6712）。
【０２７３】
ストック溶液：-20℃にて保存された10 mM Kemptideペプチド（水中7.72 mg/ml）；100mM HEPES緩衝液＋0.015% Brij 35、pH 7.5（5 ml 1M HEPESストック＋75μL 10% Brij 35＋45 ml miliQH2O）；-20℃にて保存された10mM ATP（dH2O中5.51 mg/ml）（50μlを毎日全10 ml miliQH2Oに希釈＝50μM ATP通常ストック）；1% BSA（100 ml 0.1M HEPES中1 g BSA、pH 7.5、-20℃にて保存）；100mM MgCl2；200μMスタウロスポリン、2Xキナーゼ-Glo（商標）試薬（新たに生成または-20℃にて保存）。
【０２７４】
AurA自動リン酸化反応：ATPおよびMgCl2をそれぞれ10mMおよび100mMの最終濃度にて1〜5 mg/ml AurAに加えた。自動リン酸化反応は21℃にて2〜3時間インキュベーションした。EDTAを50mMの最終濃度まで添加することにより反応を停止させ、サンプルを液体N2で急速冷凍し、-80℃にて保存した。
【０２７５】
384ウェルフォーマットのための標準アッセイ設定（20μlキナーゼ反応、40μl検出反応）：10mM MgCl2；0.2 mM Kemptideペプチド；1μl試験化合物（DMSO中）；0.3μg/ml自動リン酸化AurAキナーゼ；10μM ATP；100mM HEPES＋0.015% Brij緩衝液。陽性対照は試験化合物なしでDMSOを含む。陰性対照は5μMスタウロスポリンを含む。キナーゼ反応はATPの添加によりt=0の時間に開始した。キナーゼ反応は21℃にて45分間インキュベーションした後、キナーゼ-Glo（商標）試薬20μlを各ウェルに加え、キナーゼ反応を停止処理し、発光反応を開始した。21℃における20分インキュベーション後、発光をプレート・リーディング照度計にて検出した。
【０２７６】
PDK1発光ベース酵素アッセイ
物質：PDKtideペプチド基質＝KTFCGTPEYLAPEVRREPRILSEEEQEMFRDFDYIADWC（Upstateカタログ番号12-401）、ATP（Sigmaカタログ番号A-3377, FW=551）、HEPES緩衝液、pH 7.5、10% Brij 35（Calbiochemカタログ番号203728）、MgCl2、スタウロスポリン（ストレプトミセス種 Sigmaカタログ番号85660-1MG）、ホワイト・コスター384ウェル平底プレート（VWRカタログ番号29444-088）、PDK1キナーゼ（以下参照のこと）、キナーゼ-Glo（商標）（Promegaカタログ番号V6712）。
【０２７７】
ストック溶液：-20℃にて保存された1mM PDKtide基質（200μl中1 mg、Upstateにより供給）；100mM HEPES緩衝液、pH 7.5（5 ml 1M HEPESストック＋45 ml miliQH2O）；-20℃にて保存された10mM ATP（dH2O中5.51 mg/ml）（25μlを毎日全10 ml miliQH2Oに希釈＝25μM ATP通常ストック）；100mM MgCl2；2〜8℃にて保存された10% Brij 35；200μMスタウロスポリン、2Xキナーゼ-Glo（商標）試薬（新たに生成または-20℃にて保存）。
【０２７８】
384ウェルフォーマットのための標準アッセイ設定（20μlキナーゼ反応、40μl検出反応）：10mM MgCl2；0.01mM PDKtide；1μl試験化合物（DMSO中）；0.1μg/ml PDK1キナーゼ；5μM ATP；10mM MgCl2；100mM HEPES＋0.01% Brij緩衝液。陽性対照は試験化合物なしでDMSOを含む。陰性対照は10μMスタウロスポリンを含む。キナーゼ反応はATPの添加によりt=0の時間に開始した。キナーゼ反応は21℃にて40分間インキュベーションした後、キナーゼ-Glo（商標）試薬20μlを各ウェルに加え、キナーゼ反応を停止処理し、発光反応を開始した。21℃における20分インキュベーション後、発光をプレート・リーディング照度計にて検出した。
【０２７９】
いくつかの本発明化合物は5 uM以下のIC50値でPDK1キナーゼを阻害する。
【０２８０】
33PanQuinase活性アッセイ（ProQuinase GmbH）およびSelectScreen（商標）キナーゼプロファイリング（Invitrogen Corp.）
33PanQuinase活性アッセイは、ProQuinase GmbH, Freiburg, Germanyにより開発された専用の放射性同位体タンパク質キナーゼアッセイである。アッセイ条件の詳細は同社のウェブサイトにて見ることができる。
【０２８１】
SelectScreen（商標）は、Invitrogen Corporation, Madison, WIにより開発されたキナーゼについての商標スクリーニングアッセイプロトコールである。アッセイ条件の詳細は同社のウェブサイトにて見ることができる。
【０２８２】
いくつかの本発明化合物は5 uM以下のIC50値でBRAF、FLT3、FLT4、CDKs、CSF1R、FGFR2、KDR、RET、TRKC、VEGFR2およびAurBなどのキナーゼを阻害する。
キナーゼ活性表
【表１５−１】
2009515998.tif 000081
【０２８３】
【表１５−２】
2009515998.tif 000082
A: IC50＜100 nM
B: 100 nM＜IC50＜1 uM
C: 1 uM＜IC50＜10 uM
D: IC50＞10 uM
*ProQuinaseアッセイ
【０２８４】
実施例3：細胞アッセイ
GTL16細胞は、10%ウシ胎仔血清（FBS）2mM L-グルタミンおよび100単位ペニシリン／100μgストレプトマイシンを補充したDMEM培地中37℃にて5%CO2中にて維持した。
【０２８５】
HCT116細胞は、10%ウシ胎仔血清（FBS）2mM L-グルタミンおよび100ユニットのペニシリン／100μgストレプトマイシンを補充したMcCoyの5a培地中、37℃にて5%CO2中で維持した。
【０２８６】
Ba/F3細胞を10% FBSを補充したRPMI 1640、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび5ng/ml組換えマウスIL-3にて維持した。
化合物は次のアッセイにて２回試験した。
【０２８７】
細胞生存アッセイ
96ウェルXTTアッセイ（GLT16細胞）：アッセイの１日前に成長培地を吸引し、アッセイ培地を細胞に加えた。アッセイの日に、細胞は、96ウェル平底プレート上の種々の濃度の化合物（二重）を含むアッセイ培地中72時間37℃にて5%CO2中で成長させた。出発細胞数は5000細胞／ウェルであり、容積は120μlであった。72時間インキュベーションの最後に、XTT標識混合物40μl（3'-[1-(フェニルアミノカルボニル)-3,4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホン酸ナトリウム水和物および電子カップリング試薬：PMS（N-メチルジベンゾピラジン硫酸メチル）の50:1溶液）をプレートの各ウェルに加えた。37℃におけるインキュベーションのさらに5時間後に、650nmのバックグラウンド補正で450 nmにおける吸光値を分光光度計で測定した。
【０２８８】
96ウェルXTTアッセイ（HCT116細胞）：細胞は、96ウェル平底プレート上の種々の濃度の化合物（二重）を含む成長培地中72時間37℃にて5%CO2中で成長させた。出発細胞数は5000細胞／ウェルであり、容積は120μlであった。72時間インキュベーションの最後に、XTT標識混合物40μl（3'-[1-(フェニルアミノカルボニル)-3,4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホン酸ナトリウム水和物および電子カップリング試薬：PMS（N-メチルジベンゾピラジン硫酸メチル）の50:1溶液）をプレートの各ウェルに加えた。37℃におけるインキュベーションのさらに2〜6時間後、650nmにおける吸光値を分光光度計で測定した。
【０２８９】
96ウェルXTTアッセイ（Ba/F3細胞）：細胞は、96ウェル平底プレート上の種々の濃度の化合物（二重）を含む成長培地中72時間37℃にて成長させた。出発細胞数は5000〜8000細胞／ウェルであり、容積は120μlであった。72時間インキュベーションの最後に、XTT標識混合物40μl（3'-[1-(フェニルアミノカルボニル)-3,4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホン酸ナトリウム水和物および電子カップリング試薬：PMS（N-メチルジベンゾピラジン硫酸メチル）の50:1溶液）をプレートの各ウェルに加えた。37℃におけるインキュベーションのさらに2〜6時間後、650nmにおけるバックグラウンド補正で405 nmにおける吸光値を分光光度計で測定した。
【０２９０】
リン酸化アッセイ
Metリン酸化アッセイ：GTL16細胞は、アッセイ培地3 mL中60 x 15 mm皿（Falcon）あたり1x106細胞にてプレートした。翌日、種々の濃度の化合物をアッセイ培地に加え、37℃、5%CO2にて1時間インキュベーションした。1時間後、培地を吸引し、細胞を1X PBSで１回洗浄した。PBSを吸引し、細胞を改変RIPA溶解緩衝液100μL（Tris.Cl pH 7.4, 1% NP-40, 5mM EDTA, 5mM NaPP, 5mM NaF, 150mM NaCl, プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma）, 1mM PMSF, 2mM NaVO4）中に集菌し、1.7 mLエッペンドルフチューブに移し、15分間氷上にインキュベーションした。溶解後、チューブを遠心分離した（10分, 14,000 g, 4℃）。次いで、溶解物を新たなエッペンドルフチューブに移した。サンプルを2X SDS PAGE充填緩衝液で1:2（250,000細胞／チューブ）に希釈し、5分間98℃にて加熱した。溶解物をNuPage 4〜12% Bis-Tris Gel 1.0mm x 12ウェル（Invitrogen）で、200V、400mAにて約40分間分離した。次いでサンプルを0.45ミクロン ニトロセルロース膜Filter Paper Sandwich（Invitrogen）に1時間75V、400mAにて移した。移した後、膜をブロッキング緩衝液中、穏やかに揺らしながら1時間室温にて置いた。ブロッキング緩衝液を除去し、抗ホスホ-Met（Tyr1234/1235）抗体（Cell Signaling Technologiesカタログ番号3126L）の1X PBS中5% BSA、0.05% Tween 20の1:500希釈物を加え、ブロットを室温にて終夜インキュベーションした。翌日、ブロットを1X PBS、0.1% Tween20で３回洗浄した。HRP結合ヤギ抗ウサギ抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratoriesカタログ番号111-035-003）のブロッキング緩衝液中の1:3000希釈物を加え、穏やかに揺らしながら室温にて1時間インキュベーションした。ブロットをPBS, 0.1% Tween20にて３回洗浄し、SuperSignal West Pico化学発光基質（Pierce番号34078）で化学発光により視覚化した。
【０２９１】
ヒストン-H3リン酸化アッセイ：HCT116細胞は、成長培地3mL（McCoyの5A Media, 10%FBS, 1% pen-strep）中1x106細胞／60 x 15 mm皿（Falcon）にてプレートし、終夜（37℃5% CO2）インキュベーションした。次の日、化合物を加え、1時間（37℃5% CO2）インキュベーションした。1時間後、細胞を1X PBSで一度洗浄し、次いで溶解緩衝液100μL（125mM Tris HCl pH 6.8および2x SDS充填緩衝液）でプレート上にて直接溶解させ、1.7 mL エッペンドルフチューブに移し、氷上に置いた。サンプルに約5秒間超音波を当て、95℃熱ブロックに3分間置いた。加熱後、サンプルをNuPage 4〜12%ビス-トリスゲル（Invitrogen）に充填し、次いで0.45μmニトロセルロース膜（Invitrogen）に電気泳動輸送した。輸送後、膜を、穏やかに揺らしながら室温にて1時間0.1%Tweenを含むQiagen遮断緩衝液中に置いた。抗ホスホ-ヒストンH3（Ser10）抗体（Upstate番号06-570）は、遮断緩衝液中にて1:250に希釈し、ブロットに加え、室温にて1時間インキュベーションした。次いで、ブロットを1X PBS + 0.1% Tween20で３回洗浄した。ヤギ抗ウサギHRP二次抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.番号111-035-003）を遮断緩衝液中1:3000に希釈し、次いで室温にて1時間加えた。ブロットを1X PBS + 0.1% Tween20で３回洗浄し、SuperSignal West Pico化学発光基質（Pierce番号34078）による化学発光により視覚化した。
細胞内活性表
【表１６】
2009515998.tif 000083
A: IC50＜100 nM
B: 100 nM＜IC50＜1 uM
C: 1 uM＜IC50＜10 uM
D: IC50＞10 uM
【図面の簡単な説明】
【０２９２】
【図１】Figure 1はABLエクソンIaによる野生型ABLナンバリングを示す。
【０２９３】
【図２】Figure 2はホモ・サピエンスMET完全配列を示す。
【図１】
2009515998.tif 000085
【図２−１】
2009515998.tif 000086
【図２−２】
2009515998.tif 000087
【図２−３】
2009515998.tif 000088
【図２−４】
2009515998.tif 000089
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月27日(2007.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
式：
【化１】
2009515998.tif 000090
［式中、
R1およびR3は独立して水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、
R2およびR4は独立して-C(X1)R5、-SO2R6、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールであり；
X1は独立して=N(R7)、=Sまたは=Oであり、ここに、R7は水素、シアノ、-NR8R9、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールであり；
R5は独立して-NR8R9、-OR10、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールであり；
R6は独立して-NR8R9、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールであり；
R8およびR9は独立して水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールであり；
R10は独立して置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールであり；
ここに、R1とR2、R3とR4およびR8とR9は独立して、適宜それらが結合している窒素と一緒になって、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成してもよい］
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
サイクリン依存キナーゼ（「CDK」）は、細胞周期の制御に関与するセリン／トレオニンキナーゼである。哺乳類細胞周期は、第一成長または間（G1）期で始まり、次いでDNA合成（S）期となる一連のプログラムされた事象からなり、染色体、別の成長または間期（G2）および最終的に有糸分裂（M期）および細胞分割を複製する。これはCDKにより制御される細胞周期相間の遷移である。CDKは、細胞周期と一致した振動形式にて発現する調節タンパク質サイクリンとの相互作用により活性化される。例えば、D型サイクリンはCDK4およびCDK6を活性化し、S期への侵入を制御する（G1-S遷移）。サイクリンAはCDK2と対になってS-G2遷移を調節し、CDK1/サイクリンBはG2-M遷移を促進する。腫瘍成長における細胞周期制御の決定的な重要性は、CDK阻害が癌治療に有用な戦略であることを証明するだろうことを示唆する。この見解は、ヒト腫瘍におけるサイクリン（特にサイクリンD）の上方調節、キナーゼ自体（例えばCDK4）または調節体（例えばINK4についての遺伝子）における変異によるCDKの活性化および動物モデルにおける腫瘍成長へのCDK阻害の効果などの実質的な証拠により支持される。いくつかの他のCDKもまたヒト疾患に重要な役割を果たすにもかかわらず、CDK1、CDK2、CDK4およびCDK6が最も徹底的に研究されたCDKである。サイクリン依存キナーゼ阻害剤の例は、国際公開WO2002/12250に記載される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
癌に関与する２以上のキナーゼを標的するキナーゼ阻害剤は、個々のキナーゼ標的についての特異的な阻害剤に対していくつかの利点を有する。これは特に、標的キナーゼが腫瘍形成に特徴的な役割を有する場合に当てはまる。例えば、オーロラキナーゼ、KDR（VEGFR2）およびMETなどの小配列の標的の特異的な阻害剤は、これら三つの標的を通して細胞分割、血管形成および転移を同時に中断させることができる。これらのキナーゼ阻害剤の例は、国際公開WO2005/028475およびWO2005/068473に記載される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
用語「アルキル」は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、特に明記されなければ、直鎖（すなわち非分枝鎖）もしくは分枝鎖炭化水素基またはその組合せを意味し、指定された数の炭素原子（すなわちC1-C10は１〜１０の炭素を意味する）を有する二価および多価の基を含むことができる。飽和炭化水素基の例としては、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、例えばn-ペンチル、n-ヘキシル、n-ヘプチル、n-オクチルなどの同族体および異性体などの基が挙げられるが、これらに限定されない。不飽和アルキル基は１以上の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例としては、ビニル、2-プロペニル、クロチル、2-イソペンテニル、2-(ブタジエニル)、2,4-ペンタジエニル、3-(1,4-ペンタジエニル)、エチニル、1-および3-プロピニル、3-ブチニル、および高級同族体および異性体が挙げられるが、これらに限定されない。炭化水素基に限定されるアルキル基は「ホモアルキル」と称される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
用語「ヘテロアルキル」は、それ自体でまたは別の用語と組み合わせて、特に明記されなければ、少なくとも一つの炭素原子とO、N、P、SiおよびSからなる群から選択される少なくとも一つのヘテロ原子からなる、安定な直鎖もしくは分枝鎖炭化水素基またはその組合せを意味し、ここに、窒素および硫黄原子は適宜酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は適宜四級化されていてもよい。ヘテロ原子O、N、PおよびSおよびSiは、ヘテロアルキル基内の任意の位置またはアルキル基が残りの分子に結合している位置にあってよい。例としては、-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-Si(CH3)3、O-CH3および-O-CH2-CH3が挙げられるが、これらに限定されない。２までのヘテロ原子が連続していてもよく、例えば-CH2-NH-OCH3および-CH2-O-Si(CH3)3であることができる。同様に、用語「ヘテロアルキレン」は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、ヘテロアルキルに由来する二価の基を意味し、例えば-CH2-CH2-S-CH2-CH2-および-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-が挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアルキレン基について、ヘテロ原子はまた、鎖の末端の一方または両方を占めることもできる（例えばアルキレンオキソ、アルキレンジオキソ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基について、連結基の配向は連結基の式が記載される方向により示されるものではない。例えば、式-C(O)OR'-は-C(O)OR'-および-R'OC(O)-の両方を意味する。上記のように、ヘテロアルキル基としては、本明細書において、ヘテロ原子を通して残りの分子に結合している基が挙げられ、例えば-C(O)R'、-C(O)NR'、-NR'R''、-OR'、-SR'および／または-SO2R'である。「ヘテロアルキル」が列挙され、次いで-NR'R''などの具体的なヘテロアルキル基が列挙されている場合、用語ヘテロアルキルと-NR'R''は重複しないかまたは互いに排他的ではないことは理解されよう。むしろ、具体的なヘテロアルキル基を列挙して明瞭性を加える。従って、用語「ヘテロアルキル」は、本明細書において、-NR'R''などの具体的なヘテロアルキル基を排除するように解釈すべきではない。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
用語「アリールアルキル」は、アリール基がアルキル基に結合している基を含むことを意味する（例えばベンジルなど）。用語「ヘテロアリールアルキル」は、ヘテロアリール基がアルキル基に結合している基を含むことを意味し（例えばフェネチル、ピリジルメチルなど）、ここに、該アルキル基中の炭素原子（例えばメチレン基）が例えば酸素原子で置換されているものを含む（例えばフェノキシメチル、2-ピリジルオキシメチル、3-(1-ナフチルオキシ)プロピルなど）。しかし、本明細書において、用語「ハロアリール」は、１以上のハロゲンで置換されているアリールのみに及ぶことを意味する。
【手続補正書】
【提出日】平成20年7月15日(2008.7.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009515998000001.app
【国際調査報告】
2009515998.tif 000091
2009515998.tif 000092