(57)【要約】  本発明は、乳タンパク質に由来するACE阻害の特性を有する新規のペプチド、ならびにその混合物および降圧剤としてのそれらの使用を提供する。前記ペプチドは2〜14のアミノ酸残基を有し、その少なくとも1つは分枝鎖アミノ酸である。例には、IV、LV、VLGPV、VPYPQ、VPYPQR、AVP、KIHP、KYKVPQL、FFVAPFPEVFG、VAPFPEVF、MKGLDI、KGLDI、LR、MHIRLS、MHI、IIA、IAEKT、LKALP、ALP、およびKKが含まれる。本発明は、乳タンパク質または他のタンパク質の酵素的な加水分解によるペプチドの製造方法も提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ACE阻害活性を有するペプチドであって、少なくとも1つは分枝鎖アミノ酸（Val、Ile、Leu）である2〜14のアミノ酸残基を有し、以下の配列IV、LV、VLG、VLGP、VLGPV、VLPV、VLPVP、VPYPQ、VPYPQR、AVP、FPIIV、GPFPIIV、KIHP、KYKVPQL、VAPFPEVF、FVAPFPEVF、FFVAPFPEVFG、HIQK、IVP、LHSMK、MKGLDI、LR、LRV、RVY、HIRL、MHIRLS、IIA、IAEKT、IIAEKT、IAEKTKIP、ALK、ALP、LKALP、IVTQTM、KGLDIQKVAGTW、KK、および1〜3の付加的なアミノ酸を有する伸長されたペプチドから選択されるペプチド。
【請求項２】
ACE阻害活性を有するペプチドであって、配列Xaa-Xbbを有するジペプチドであり、前記XaaはAla、Val、Ile、およびLeuから選択され、前記XbbはVal、Ile、およびLeuから選択されるペプチド、またはトリペプチドXaa-Xbb-Xccであって、前記XaaおよびXbbは上述した通りであり、XccはGlyおよびAlaおよび(XaaがAlaである場合) Proから選択されるペプチド、または配列Xaa-Xbb(-Xcc)を含んでなるテトラペプチドもしくはペンタペプチドであるペプチド。
【請求項３】
請求項1または2に記載のペプチドであって、IV、LV、VLGPV、VPYPQ、VPYPQR、AVP、KIHP、KYKVPQL、FFVAPFPEVFG、VAPFPEVF、MKGLDI、KGLDI、LR、MHIRLS、MHI、IIA、IAEKT、LKALP、ALP、およびKKから選択されるペプチド。
【請求項４】
請求項3に記載のペプチドであって、KK、VPYPQ、VPYPQR、KIHP、MKGLDI、およびLKALPから選択されるペプチド。
【請求項５】
少なくとも1の請求項1〜4のいずれか1項に記載のペプチドを含有するペプチド混合物。
【請求項６】
2以上のACE阻害ペプチドを含有する乳タンパク質加水分解産物または2以上の加水分解産物の組み合わせである、請求項5に記載のペプチド混合物。
【請求項７】
請求項5または6に記載のペプチド混合物であって、1以上のペプチドKK、VPYPQ、VPYPQR、およびKIHPを、好ましくは、ペプチドに基づいて、少なくともそれぞれ3重量％の量および／または少なくとも全体で5重量％の量で含有するペプチド混合物。
【請求項８】
請求項5または6に記載のペプチド混合物であって、1以上のペプチドMKGLDI、LDIQK、およびLKALPを、好ましくは、ペプチドに基づいて、少なくともそれぞれ3重量％の量および／または少なくとも全体で5重量％の量で含有するペプチド混合物。
【請求項９】
ACE阻害活性を有する1以上のペプチドを製造する方法であって、タンパク質を、40〜200mMのカリウムおよび／またはカルシウムイオンの存在下、および／または1〜20重量％の水混和性の有機溶媒の存在下において、3〜30％の加水分解度が得られるまで、水性媒質において少なくとも1のプロテアーゼと接触させる工程と、前記プロテアーゼを不活化または分離する工程と、任意に、得られたペプチドを濃縮および／または単離する工程とを含んでなる方法。
【請求項１０】
請求項9に記載の方法により得られる、ACE阻害活性を有するペプチドまたは2以上のペプチドの混合物。
【請求項１１】
請求項1〜8および10のいずれか1項に記載の1以上のペプチドを、少なくとも1の栄養成分と共に含有する栄養組成物。
【請求項１２】
請求項1〜8および10のいずれか1項に記載の1以上のペプチドを、少なくとも1の薬学的に許容可能なキャリアと共に含有する医薬組成物。
【請求項１３】
高血圧の治療または予防のための栄養組成物または医薬組成物を調製するための、請求項1〜5および7のいずれか1項に記載の1以上のペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、アンギオテンシン変換酵素(ACE)を阻害することができる新規のペプチドならびに高血圧の調節および予防におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
アンギオテンシン変換酵素(ACE)は、アンギオテンシンIをアンギオテンシンIIに変換し、血管平滑筋細胞の収縮を引き起こす。加えて、ACEは、血管拡張性のブラジキニンを不活性化する。それ故、ACEは昇圧効果を有する。それ故、ACEを阻害することができる薬剤は、強力な降圧剤である。いくつかのペプチドは、ACE阻害(ACEI)能力を有することが既知であり、そのいくつかは乳タンパク質に由来する。
【０００３】
米国特許第5,449,661号(Nakamura et al.)は、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)株JCM 1004による乳の発酵によるACEIトリペプチドVPPの産生について開示する。WO 01/032836およびWO 01/032905 (Mayra-Makinen et al.)は、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)株LBK-16H (DSM 13137)を用いた発酵によるVPPおよびIPPの産生について記載する。WO 01/034828 (Yamamoto et al.; = EP-A 1 231 279)は、カゼインの2段階の酵素的なタンパク質分解によるVPPおよびIPPの産生について記載する。
【０００４】
米国特許第6,514,941号(Tolton et al.)は、酸性カゼインのトリプシン加水分解により得られる、ACEI効果を有する3つのペプチドについて述べている。これらは、C7 (AVPYPQR) (β-カゼインに由来)、ならびにC12 (FFVAPFPEVFGK)およびC6 (TTMPLW) (共にα-S2カゼインに由来)と命名されている。
【０００５】
EP-A 821 968 (Yamamoto)には、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)株FERM BP-4835による乳の発酵によりACEIジペプチド YPを産生することが記載されている。
【０００６】
WO 02/071854 (Draaisma et al.)は、ラクトバチルス・デルブリュック・ラクティス(Lactobacillus delbrueckii lactis)を用いた乳の発酵により得られるACEIペプチドであって、β-カゼイン配列DKIHPFおよびKVLPVPQまたはそれらの特異的な部分を有するペプチドについて記載されている。
【０００７】
WO 04/002509 (Tauzin et al.)には、α-S2カゼインのトリプシン加水分解により得られるACEIペプチドであって、配列TVY、NMAINP(SK)、FALP(QY(LK))、YL、FPQYLQY、およびALNEINQFY(QK)を有するペプチドについて記載されている。
【０００８】
WO 02/019837 (Schlothauer et al.)には、ペプチドSAP、MKG、ALPMH、LIVTQ、LKPTPEGDLEIL、INYWL、および(LKGYGG)VSLPEWを産生する特異的なプロテアーゼを用いた乳清タンパク質の加水分解について記載されている。
【０００９】
Van Elswijk et al., J. Chromatography A, 1020 (2003) 45-58には、乳タンパク質に由来するACEIペプチドの検出および同定について記載されており、ペプチドWLAHK、ALPMHIR、GLDIQK、FALPQYLK、FFVAPFPEVFGK (C12)、AVPYPQR (C7)等の生理活性について報告されている。WO 04/098310には、β-ラクトグロブリンに由来するACE阻害ペプチドとして、IIAEK、IPAVF、およびIPAVKが記載されている。
【００１０】
WO 04/104182には、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)の特異的な株を用いた乳の発酵により得られる生理活性のあるペプチドについて記載されている。前記ペプチドには、β-カゼイン由来ペプチドLHLPLP、VLGPVRPFP、およびVVVPPFが含まれる。
【発明の説明】
【００１１】
ACE阻害活性を有する新規のペプチドは、本発明により見出された。これら新規のペプチドは、乳画分、乳タンパク質、または他のタンパク質の酵素的なタンパク質分解により得られる。
【００１２】
1つの実施形態において、本発明は、ACE阻害活性を有するペプチドであって、少なくとも1つは分枝鎖アミノ酸(Val、Ile、Leu)である2〜14のアミノ酸残基を有し、以下の配列から選択されるペプチドを提供する：IV、AIV、IIV、LIV、LV、VL、VLV、LVL、LVYP、VLGPV、VLG、LGP、GPV、VLGP、LGPV、VLPV、VLPVP、VLPVPQ、LPVPQ、VPYPQR、VPYPQ、AVPY、AVPYP、VPYP、AVP、GPFPIIV、FPIIV、KIHP、IHP、KYKVPQL、YKVP、KYKVP、FFVAPFPEVFG、FVAPFPEVFG、FFVAPFPEVF、FVAPFPEVF、VAPFPEVF、HIQK、IVP、LHSMK、MKGLDI、KGLDI、GLDI、LR、LRV、RVY、LRVY、MHIRLS、MHI、IRLS、IRL、LPMHI、LPMHIRL、HIRL、IRLS、IIA、IAEKT、IIAEKT、IAEKTKIP、IIAEKTK、IIAEKTKIP、IAEKTKIP、IAEKTKI、LKALP、KALP、ALP、ALK、DKAL、KALPM、ALKALP、IVTQTM、およびKGLDIQKVAGTW。意図されるのは、1〜3、特に1〜2のアミノ酸の伸長を有する上記配列を有するペプチドであり、前記伸長は、N-末端、もしくは好ましくはC末端、または（2以上のアミノ酸が含まれる場合）両方である。
【００１３】
この群に由来する好ましいペプチドは、IV、LV、VLGPV、VPYPQ、VPYPQR、AVP、KIHP、KYKVPQL、FFVAPFPEVFG、VAPFPEVF、MKGLDI、KGLDI、LR、MHIRLS、MHI、IIA、IAEKT、LKALP、およびALPを含んでなる。最も好ましくは、IV、LV、AVP、およびLKALPである。特に好ましくは、β-カゼイン由来ペプチドKK、KIHP、VPYPQ、およびVPYPQR、ならびにβ-ラクトグロブリン由来ペプチドMKGLDI、IAEKT、およびLKALPである。これらは、個々に本発明の部分でもある。もう1つの好ましいペプチドは、本発明によるペプチド混合物の一部であってよく、β-ラクトグロブリン由来ペプチドLDIQKである。
【００１４】
本発明は、1以上の上記ペプチドを含有するペプチド混合物にも関する。特に、そのようなペプチド混合物は、ペプチドに基づいて、少なくとも1重量％、好ましくは少なくとも3重量％、特に少なくとも5重量％の1以上の個々のペプチドKK、IV、LV、VLGPV、VPYPQ、VPYPQR、AVP、KIHP、KYKVPQL、FFVAPFPEVFG、VAPFPEVF、MKGLDI、KGLDI、LDIQK、LR、MHIRLS、MHI、IIA、IAEKT、LKALP、およびALPを含有する。特に、そのような混合物は、少なくとも3重量％、好ましくは少なくとも5重量％、特に少なくとも8重量％の1以上の個々のカゼイン由来ペプチドKK、VPYPQ、VPYPQR、およびKIHPを含有する。あるいは、または加えて、前記混合物は、全体の少なくとも5重量％、特に少なくとも10重量％、もしくは少なくとも15重量％のペプチドKK、VPYPQ、VPYPQRおよび／またはKIHPを含有する。もう1つの付加的な、または代替の形態において、そのような混合物は、少なくとも3重量％、好ましくは少なくとも5重量％、特に少なくとも8重量％の1以上の個々のβ-ラクトグロブリン由来ペプチドMKGLDI、LDIQK、およびLKALPを含有する。特別な実施形態において、前記混合物は、全体の少なくとも5重量％、好ましくは少なくとも10重量％、最も好ましくは少なくとも15重量％の前記個々のペプチドMKGLDI、LDIQK、およびLKALPを含有する。特別な上限はないが、実際には、そのような混合物は50重量％より多い個々のペプチドを含まないであろう。
【００１５】
本発明による好ましいペプチド混合物は、AVP、LV、およびIVを含有する。もう1つの好ましい混合物は、ペプチドKIHP、KK、VPYPQR、およびKYKVPQを含有する。さらに好ましいペプチド混合物は、VLGPV、VLPVPQK、VPYPQ、KK、VNELSK、およびFFVAPFPEVFGを含有する。さらにもう1つの好ましい混合物は、ペプチドIAEKT、LDIQK、およびLKALPを含有する。さらに好ましいペプチド混合物は、ペプチドVLGPV、VLPVPQ、MKGLDI、LR、MHIRLS、およびIIAを含有する。適切な混合物中におけるこれらのペプチドの好ましい量は、上に示した通りであり、すなわち、ペプチドに基づいて、個々のペプチドについて少なくとも1重量％、特定の組み合わせについて少なくとも5重量％である。
【００１６】
本発明によるACE-阻害ペプチドの特定の群は、2つの隣接する脂肪族アミノ酸を含有するジペプチドおよびトリペプチドであり、N末端はAla、Val、Ile、およびLeuから選択され、C末端はVal、Ile、およびLeuから選択される。N末端アミノ酸が大きなアミノ酸Val、Ile、またはLeuである場合、任意の第3（C末端）のアミノ酸は、好ましくは、中性の小さなアミノ酸Gly、Ala、およびProのうちの1つであり、より好ましくは、最も小さなアミノ酸GlyおよびAlaのうちの1つである。その例には、IV、LV、II、IIA、ALP、AVP、VLG、およびAIVが含まれる。前記トリペプチドは、11〜15の炭素原子を含有することが好ましい(G＝2、A＝3、P, V＝5、L, I＝6)。この配列を含んでなり、特に、C末端のみが非塩基性のアミノ酸で伸長されたテトラペプチドおよびペンタペプチドも本発明により検討される。例には、VLGP、VLGPV、IIAE、AVPY、IVLN等が含まれる。
【００１７】
本発明によるもう1つの群の活性ペプチドは、β-カゼインペプチドVLGPVに関する。これらには、より短い同族体(VLG、LGP、GPV、VLGP、LGPV)、ならびにβ-カゼイン配列PVLGPVRGPFPIIVに由来するテトラデカペプチド以下のより長い同族体が含まれ、例えばVLGPVRGPFPである。
【００１８】
本発明に包含されるα-S1-カゼインペプチドKYKVPQLの同族体には、配列LKKYKVPQLEIVPに由来するトリペプチドからトリデカペプチドが含まれ、例えば、YKVP、VPQL、VPQLEI、PQLEIV、ならびにKKであるが、YKVPQL等は含まれない。
【００１９】
本発明に包含されるβ-ラクトグロブリンペプチドIIAEKTの同族体には、KIIA、IIA、IIAE、IAEKT、IAEKTKIP等のように、配列KIIAEKTKIPAVFに由来するトリペプチドからトリデカペプチドが含まれる。
【００２０】
ウシのペプチドとは異なる他の哺乳動物の（乳）タンパク質のペプチド類似体も包含され、例えば、(MH)IRLS (ウシ)の代わりの(MH)IRLA (ヤギβ-ラクトグロブリン)、IPPの代わりのILP (ヤギ、ヒツジβ-カゼイン)、およびVPYPQR (ウシ)の代わりのVPQR (ヤギ、ヒツジβ-カゼイン)である。
【００２１】
本発明のペプチドは、乳タンパク質または他のタンパク質原料の特異的な加水分解により調製され得る。これは、タンパク質分解酵素を用いて行うことができ、またはそのような酵素の活性型を含有する微生物を用いた発酵により行うことができる。酵素および／または微生物の組み合わせは、逐次的に、または混合物として使用されてよい。適切な酵素には、トリプシン、キモトリプシン、アルカラーゼ(ノボザイム)、ニュートラーゼ(ノボザイム)プロテアーゼN、プロテアーゼP6、プロテアーゼA (アマノ)、フレーバーザイム(ノボザイム)、プロモド 25P (バイオカタリスツ, UK)、マルチフェクトニュートラル(ゲネンコア)、真菌プロテアーゼ(Bio-Cat Inc, USA)、オリエンターゼ90N (ハンキュウ, 日本)、エンゼコ真菌プロテアーゼ(Enzeco Fungal Protease) 100A (EDC, USA)、プロテイナーゼK、ペプシン、パパイン、サーモリシン、エラスターゼ、Arg-Cプロテイナーゼ、Asp-Nプロテイナーゼのような、商業的に入手可能なプロテアーゼが含まれる。さらに、プロテアーゼ以外に、例えば、得られる加水分解産物の苦味を減少させるため、または特定のCまたはN末端アミノ酸を除去して望ましいペプチドを得るために、(エキソ)ペプチダーゼが使用されてよい。ペプチダーゼの例は、例えば、ロイシンアミノペプチダーゼまたはカルボキシペプチダーゼA、B、Cおよび／またはYである。
【００２２】
本発明の酵素的な過程は、いずれかの哺乳動物の乳タンパク質、特に有蹄動物、特に反芻動物、特にウシ科に属する動物の乳タンパク質において行われてよい。ウシ科には、ウシおよびその近縁種（ウシ亜科：Bovinae）ならびにヤギおよびその近縁種（ヤギ亜科：Caprinae）が含まれる。好ましいウシ亜科の種には、ウシ、ヤク、バッファロー、およびスイギュウが含まれ；好ましいヤギ亜科の種には、ヒツジおよびヤギが含まれる。最も好ましい乳タンパク質は、牛乳タンパク質である。
【００２３】
好ましい実施形態において、前記酵素反応は、以下の工程を具備する：
1）タンパク質原料を、第1のプロテアーゼ、すなわち中性プロテアーゼを含んでなるプロテアーゼと接触させる工程と；
2）任意に、前記タンパク質原料を第2のプロテアーゼもしくはペプチダーゼと接触させる工程、または前記タンパク質原料を前記第1のプロテアーゼと前記第2のプロテアーゼもしくはペプチダーゼとの混合物と接触させる工程と；
3）プロテアーゼを不活化および／または分離し、任意に、得られた加水分解産物をさらに分画および／または精製する工程。
【００２４】
前記第1のプロテアーゼは、細菌（例えばバチルス属由来）または真菌の中性プロテアーゼであってよい。好ましくは、このプロテアーゼは、ニュートラーゼ、プロテアーゼP6、プロテアーゼA、プロモド 25P、マルチフェクトニュートラル(Multifect Neutral)、および真菌プロテアーゼからなる群より選択されてよい。
【００２５】
前記第2のプロテアーゼまたはペプチダーゼは、エキソプロテアーゼもしくはエンドプロテアーゼ、または2つの混合物であってよい。これらの酵素の好ましい例には、フレーバーザイム、オリエンターゼ90N、およびエンゼコ真菌プロテアーゼ100Aが含まれる。
【００２６】
前記第1のプロテアーゼおよび第2のプロテアーゼまたはペプチダーゼは、同時に、または一方の投与後に他方を、第1のプロテアーゼの中間不活化を伴うかまたは伴わずに適用されてよい。例えば、前記加水分解は、例えば3〜10％の加水分解度まで前記第1のプロテアーゼを使用して行われてよく、続いて任意の不活化、前記第2のプロテアーゼまたはペプチダーゼの添加、および望ましい全加水分解度までのさらなる加水分解が行われてよい。
【００２７】
前記酵素反応は、特定の酵素または酵素の組み合わせに適した条件を用いて行われる。前記反応条件は、酵素の至適温度に依存して20〜60℃の温度、酵素の至適pHに依存して例えば3〜10のpH値、約30分〜24時間の間で変化してよい反応時間を含んでよい。前記反応時間は、反応温度、ならびに酵素の濃度、活性、および特異性に依存して選択される。一般的に、相対的に高いレベルの短いペプチド（12アミノ酸未満）が形成されるような反応条件である。加水分解度は、例えば3〜30％、特に約5〜20％、または7.5％以上もしくはより好ましくは少なくとも10％で変化してよい。望ましい加水分解度に達した場合、加水分解反応は、タンパク分解酵素の分離（例えば、固定化された酵素の場合）、または個々のプロテアーゼに従属する方法による酵素の不活化、例えば、pH3〜4.5への酸化、もしくは70〜120℃、1秒〜30分間の加熱、特に80〜100℃、5秒〜5分間の加熱により終結してよい。
【００２８】
タンパク質分解培地がタンパク質分解の結果および加水分解産物の組成に影響を与えることが見出された。第一に、陽イオン、特にアルカリ金属およびアルカリ土類金属のレベルは、第3期に由来する陽イオンのレベル、特にナトリウムおよびマグネシウムが相対的に低く、且つ第4期に由来する陽イオンのレベル、特にカリウムおよびカルシウムが相対的に高くなるような方法で好都合に調節されてよい。
【００２９】
それ故、タンパク質分解の間、KおよびCaを合わせた濃度は、好ましくはNaおよびMgを合わせた濃度よりも大きく、好ましくは、(K+Ca)/(Na+Mg)は少なくとも2：1であり、より好ましくは3：1〜9：1の間である。好ましくは、K＋Caレベルは10〜500 mM (400 mg〜20 g/l)であり、より好ましくは15〜400 mMであり、さらに好ましくは20〜300 mMであり、最も好ましくは40〜200であり、特に50〜100 mMである。個々の濃度は、Kについては、好ましくは5〜400、より好ましくは10〜200、最も好ましくは25〜100 mMであり、Caについては、好ましくは5〜300、より好ましくは10〜150、最も好ましくは20〜75 mMである。NaおよびMgの濃度は、好ましくは、それぞれ30 mM (700 mg/l)以下および20 mM (480 mg/l)以下である。
【００３０】
アルカリ金属およびアルカリ土類金属カチオンの存在は、適切な出発物質を選択することおよび／または加水分解の前もしくは加水分解の間に金属を添加することにより調節され得る。例えば、カゼイン由来ペプチドを調製する場合、カゼイン酸ナトリウムよりもカゼイン酸カルシウムを出発物質として使用することが有益である。また、加水分解の前または加水分解の間にpHを調節する場合、好ましくは、水酸化ナトリウムまたはナトリウム塩よりも、水酸化カリウムまたはその他のカリウムもしくはカルシウム含有塩（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、炭酸水素塩、グルコン酸塩）を添加することにより行われる。
【００３１】
ナトリウムの代わりにカリウムおよびカルシウムを使用する付加的な利点は、最終的なペプチドまたはペプチド製剤が相対的に低い量のナトリウムを含有することにより、一般的に、高血圧の治療に関して都合がよいと考えられることである。
【００３２】
また、加水分解反応の間に、水混和性の共溶媒が水に添加して使用されてよい。共溶媒の量は、好ましくは加水分解媒質の0.5〜30重量％、より好ましくは1〜20重量％、最も好ましくは2〜10重量％である。適切な共溶媒には、アセトン、メタノール、エタノール、n-プロパノール、もしくはi-プロパノールのようなアルカノール；ジメチルスルホキシド(DMSO)；ジメチルホルムアミド(DMF)；またはジオキサンのようなエーテルが含まれる。前記共溶媒は、単独または相互に組み合わせて使用されてよい。
【００３３】
他の有用な加水分解方法は、米国特許第6,514,941号に記載されており、例えば、平均分子量が5000Da以下に達するまでタンパク質分解酵素としてトリプシンを使用し、その後超ろ過およびダイアフィルトレーションを行うものである。この方法は、例えば、セファロースクロマトグラフィーが続いて行われてよい。
【００３４】
得られる加水分解産物は、ろ過（超、ナノ）、クロマトグラフィー（親和性、イオン交換、その他）、電気泳動、抽出、沈殿、および当該分野で既知の他の技術、ならびにそのような技術の組み合わせを用いたさらなる分離の対象とされてよい。最終的な加水分解産物は、不溶性の物質を除去するために、例えば珪藻土のようなろ過助剤を用いたろ過により「磨かれて」よい。
【００３５】
個々のペプチドは、化学的な合成により調製されてよい。
【００３６】
活性ペプチドの混合物が望ましい場合、例えば、スキムミルクが出発物質として使用されてよい。前記ミルクは、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、バッファロー、ヤク、ヒトのものであってよく、好ましくはウシの乳である。実用的な理由により、塩濃度が減少するように、乳画分または超ろ過乳のような加工乳を用いて開始することが好ましい。単一のペプチドが望ましい場合、例えば、単離もしくは混合されたカゼイン塩、乳清タンパク質単離物、乳清タンパク質濃縮物、またはα-ラクトアルブミンもしくはβ-ラクトアルブミン等の単離された乳清タンパク質のような単離された乳タンパク質、またはウシ血清アルブミン、あるいはそれらの画分もしくは部分的な加水分解産物から開始することが有益である。出発物質としてカゼインが使用される場合、セリン残基はリン酸化されてもよい。
【００３７】
他のタンパク質原料は、例えば、大豆（例えば活性ペプチドLRを産生する）、コムギ（グルテンを含む）、綿実、ルピナス、エンドウマメ、ジャガイモ、および他の適切な植物タンパク質；例えば、卵、血液、肉、魚（カツオ、マグロ）のような他の動物タンパク質である。
【００３８】
ペプチド混合物のさらなる多様化もしくは活性化のため、または前記混合物の苦味除去のために、加水分解産物の後処理を行うことが有益である。そのような後処理は、例えば、乳酸菌、ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)、ラクトバチルス・デルブリュック、ラクトバチルス・デルブリュック 亜種 ブルガリカス(Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus)、ラクトバチルス・アシドフィラス(Lb. acidophilus)、Lb. カゼイ、Lb. ヘルベティカス、およびビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、またはそれらの混合物のような適切な微生物を用いた発酵であってよい。適切な処理の例は、ヨーグルト媒質を用いた発酵を含んでなる(S. サーモフィラスおよびLb. d. ブルガリカス)。そのような発酵は、加水分解産物自体において、または乳もしくは乳生成物との組み合わせにおいて行われてよい。ペプトン、トリプトン等の他の栄養分も存在してよい。より短い発酵時間が適用されてもよいが、処理の始めは、そのような発酵に対する通常の条件を用いて行われる。生成物のACE阻害活性は増加または減少してよいが、出発の加水分解産物に対して50％より多く、好ましくは20％より多く減少すべきではない。
【００３９】
本発明は、そのように得られる、すなわち上述した少なくとも1のACEIペプチドを1以上の乳酸菌、特に上述した細菌と共に含有する食品にも関する。
【００４０】
ペプチドおよびその混合物の特性および活性は、例えばVan Elswijk et al. J. Chromatography A, 1020 (2003) 45-58に記載されているように、質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー、およびオンラインバイオアッセイに関する既知の方法により測定されてよい。本発明の活性ペプチドは、1500μM以下、好ましくは750μM以下、より好ましくは250μM以下、またはさらに100μM以下のACE阻害濃度(IC50)を示すことにより特徴付けられる。IC50は、V. Vermeirsen, J. van Camp & J. Verstraete, "Optimisation and validation of an angiotensin-converting enzyme inhibition assay for the screening of bioactive peptides”. J. Biochem. Biophys. Methods 51, 75-87 (2002)に記載されているように、インビトロで測定されてよい。中程度のインビトロ活性のみを有するペプチドは(相対的に高いIC50)、例えば1以上のアミノ酸の開裂のようなさらなる修飾の結果として、体内で相対的に高い活性になり得ることを述べる。
【００４１】
本発明は、上述したACEIペプチドに富んだ乳タンパク質加水分解産物にも関する。これらの加水分解産物は、少なくとも1重量％（乾燥重量を基準に）の1以上の活性ペプチドを例えば50重量％まで含有する。好ましくは、前記加水分解産物は、2〜40重量％、より好ましくは5〜25重量％のここで定義したペプチドを含有する。残りは、活性のないペプチドおよびタンパク質および／または他の活性ペプチド、ならびに微量（例えば、25重量％以下、好ましくは0.1〜10重量％）のタンパク質でない物質であってよい。
【００４２】
本発明のペプチド、ならびにその混合物または他のペプチドとの混合物は、食品、具体的には高血圧の治療もしくは予防のための機能的な食品またはサプリメントにおける適用に適している。機能的な食品は、ミルクまたはヨーグルト、飲料、栄養バー等の発酵乳製品を含んでなる。任意に、安定化剤（ペクチン、カラゲナン）、乳化剤（モノ-およびジグリセリド）、増粘剤（アルギン酸、キトサン、またはそれらの塩）は、食品中に含まれてよい。食品中のペプチドの濃度は、乾燥食品100gまたは液体食品1リットル当り5〜500mg存在するような濃度であってよい。適切なサプリメントは、例えば、錠剤および即席飲料のための粉末である。
【００４３】
前記ペプチドまたは特異的なペプチド混合物は、高血圧を治療または予防するための医薬用途にも適している。前記ペプチドは、1日に個体当り、1〜500mg活性ペプチド／ペプチド混合物のレベルで投与されてよい。好ましい用量レベルは、10〜150mg/日である。1〜50重量％の活性ペプチドを含有する本発明の加水分解産物に関して、これらは活性ペプチドの濃度に依存して、2mg〜10gのレベルで投与されてよい。前記加水分解産物の好ましい用量レベルは、10mg〜5g、より好ましくは50mg〜1gである。
【００４４】
医薬組成物は、単一の投与単位または複数（例えば2〜6）の1日当りの投与単位で、1日の用量レベルを含んでよい。前記医薬組成物は、さらに、通常の賦形剤、安定化剤、フレーバー剤、着色剤等を含んでよい。特に、前記組成物は、賦形剤として陰イオン性または他の多糖類を含んでよく、例えば、カルボキシメチルセルロース、ペクチン、キトサン、寒天、または特にアルギン酸である。前記陰イオン性多糖類は、塩の形態であってもよい。アルギン酸または他の多糖類と活性ペプチドとの重量比は、例えば、4：1〜50：1、特に9：1〜24：1であってよい。前記医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、コーティングされた錠剤、ロゼンジ、シロップ、散剤、サッシェ、溶液、懸濁液等の形態であってよい。前記医薬組成物の全重量は、乾燥形態で100〜1000mg、例えば錠剤の場合400〜800mgの範囲であってよい。
【実施例】
【００４５】
例I：ACE阻害ペプチドを含有するタンパク質加水分解産物の調製
カゼイン酸カルシウム(DMVインターナショナル, NL) (2.7 kg)を、約50℃の温度で水（16リットル）に溶解した。一定量のエタノールを加え(0.6リットル 50重量％)、KOH(45重量％)を用いてpHを7.2に調節した。CaおよびKの全量は、約90 mMであった。アスペルギルス・オリゼに由来する中性真菌プロテアーゼ(Bio-Cat, Inc.)を0.2％（タンパク質についてw/w）の量で加え、続いてフレーバーザイム(Flavourzyme) (0.1 % w/w)を加え、加水分解を50℃で10時間行った。酵素反応を停止するために、加熱ステップを行った(10分間90℃)。その後、珪藻土を用いて溶液をろ過し、不溶性の粒子を除去し、乾燥して加水分解産物の粉末を得た。
【００４６】
生成物の加水分解度は、AN/TN比(アミノ窒素/全窒素)＊100として表される。AN/TN比は、12.4であった。アミノ窒素は、ホルモール(Formol)滴定法により測定される。全窒素は、ケルダール法を用いて測定される。
【００４７】
例II：ACE阻害ペプチドを含有するタンパク質加水分解産物の調製
水中におけるWPC 80 (アルラフーズ, デンマーク)の12％(w/w)溶液を作り、45重量％のKOH溶液を用いてpHを7.0に調節した。一定量の0.35％ マルチフェクトニュートラル(Multifect Neutral)(細菌性の中性プロテアーゼ, ゲネンコア)を加え、加水分解を50℃で6時間継続した。その後、KOHを用いてpHを6.7に再調節した。Ca＋Kの量は、約45 mMであった。
【００４８】
反応混合物を30秒間85℃に加熱し、酵素を不活化した。溶液を20％の固体まで蒸発により濃縮し、噴霧乾燥した。生成物のAN/TN比は、10であった。
【００４９】
例III：ACE阻害ペプチドの同定
例Iにより得られたペプチドを、Van Elswijk et al. J. Chromatography A 1020 (2003) 45-58に記載されているようにHPLCを用いて分析した。HPLC溶出液を、ペプチド構造を決定するための質量分析およびACE-阻害活性を評価するためのバイオアッセイユニットを用いて分けた。以下のペプチドを同定した：AVP、LV、およびIV。同じカゼイン塩の他のバッチは、ペプチドKIHP、KK、VPYPQR、およびKYKVPQを含有した。他のカゼイン原料で開始した場合、ペプチドVLGPV、VLPVPQK、VPYPQ、KK、VNELSK、およびFFVAPFPEVFGが見られた。
【００５０】
同様に、例IIによる生成物を分析し、IAEKT、LDIQK、およびLKALPが含まれていた。他の乳清タンパク質原料WPC 60または乳清タンパク質単離体から開始した場合、VLGPV、VLPVPQ、MKGLDI、LR、MHIRLS、IIAが同定された。
【００５１】
例IV：抗高血圧組成物（錠剤）
成分 重量％
例Iの加水分解産物                                    98.8
ステアリン酸マグネシウムNF FG D                      0.5
（クロンプトンコーポレーション）
ステアリン酸ヒストレン(Hystrene) 5016 NF FG V        0.5
（クロンプトンコーポレーション）
二酸化ケイ素 Cab-O-Sil-M-5                            0.2
（DMV インターナショナル GmbH）
調製：
加水分解産物を二酸化ケイ素と徹底的に混合する。ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸を加え、1分間混合する。錠剤は、直接圧縮により調製される。前記錠剤は、ChromaTone P DDB8876-BL, Chr. Hansenでコーティングされる。
【００５２】
錠剤化パラメータ：
重量：                840 mg
長さ（楕円形）：       19 mm
厚さ：                6 mm
圧縮力：              18.7 kN
硬度：                180N
崩壊時間：            11.5分
例V：抗高血圧食品
成分 重量％
スキムミルク                                                78.0
水                                                          11.0
糖                                                          7.0
マルチトール(C*マルチデックス 16385, セレスター)            3.0
加水分解産物  例II                                          0.7
ペクチン(ゲヌペクチン YM115-L CP ケルコ)                    0.3
パイナップルフレーバー(B80583, タカサゴ, 日本)              0.03
ピーチフレーバー(B 80361, タカサゴ, 日本)                   0.04
色(リボフラビン 503065, センシエント・フード・カラーズ)     0.001
シトロサ(Citrosa)(フレーバー, NHDC, Exquim S.A., スペイン)  0.0003
乳酸                                                        q.s.
媒質ABT-2(Chr. ハンセン)                                    q.s.
調製：
水（の一部）におけるペクチンの保存溶液(4％)を70℃で調製する。ミルクおよび残りの水を混合し、加水分解産物、糖、マルチトール、およびシトロサ(citrosa)をミルクに溶解し、乳酸を用いてpHを6.7に調節する。
【００５３】
90℃で5分間の低温殺菌の後、混合物を発酵温度(37℃)に冷却し、媒質を加える。pHが4.2になるまで発酵を続ける。その後、乳酸を用いてpHを4.0に調節する。強く混合しながらペクチン溶液を加える。120/20バール、40℃でホモジナイズした後、フレーバーおよび色を加え、生成物を瓶に充填し、冷却保存する。
【国際調査報告】
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