(57)【要約】  本発明は、新規の改善された抗ＭＡｄＣＡＭ抗体を提供する。医薬におけるこれらの抗体の使用、詳細には炎症性腸疾患などの炎症状態を治療するための使用も含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）６．２２．２−ｍｏｄ＿Ｖ（配列番号２）の重鎖可変領域を含む抗体、
（ｂ）６．３４．２−ｍｏｄ＿ＳＳＱ、６．３４．２−ｍｏｄ＿ＱＴ、または６．３４．２−ｍｏｄ＿ＳＳＱ，ＱＴ（配列番号８、１０、１２）の軽鎖可変領域を含む抗体、
（ｃ）６．６７．１−ｍｏｄ＿Ｙ、６．６７．１−ｍｏｄ＿ＴΔＰ、または６．６７．１−ｍｏｄ＿Ｙ，ＴΔＰ（配列番号１６、１８、２０）の軽鎖可変領域を含む抗体、
（ｄ）６．７７．１−ｍｏｄ＿ΔＳ（配列番号２２）の重鎖可変領域を含む抗体、
（ｅ）７．１６．６＿Ｌ（配列番号２８）の重鎖可変領域を含む抗体、または
（ｆ）７．１６．６＿Ｖ、７．１６．６＿Ｓ、または７．１６．６＿ＶＳ（配列番号３０、３２、３４）の軽鎖可変領域を含む抗体、
（ｇ）７．１６．６＿Ｖ、７．１６．６＿Ｓ、または７．１６．６＿ＶＳの軽鎖可変領域（配列番号３０、３２、３４）、および７．１６．６＿Ｌの重鎖可変領域（配列番号２８）を含む抗体、または
（ｈ）９．８．２＿ΔＲＧＡＹＨ，Ｄ（配列番号３６）の重鎖可変領域を含む抗体、
（ｉ）９．８．２−ｍｏｄ（配列番号３８）の軽鎖可変領域を含む抗体
からなる群から選択された、ＭＡｄＣＡＭまたはその抗原結合部分に特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項２】
（ａ）配列番号１および配列番号３に記載の核酸配列によってコードされている可変領域を含む抗体、
（ｂ）配列番号５および配列番号７、９、または１１に記載の核酸配列によってコードされている可変領域を含む抗体、
（ｃ）配列番号１３および配列番号１５、１７、または１９に記載の核酸配列によってコードされている可変領域を含む抗体、
（ｄ）配列番号２１および配列番号２３に記載の核酸配列によってコードされている可変領域を含む抗体、
（ｅ）配列番号２５または２７および配列番号２９、３１、または３３に記載の核酸配列によってコードされている可変領域を含む抗体、
（ｆ）配列番号３５および配列番号３７に記載の核酸配列によってコードされている可変領域を含む抗体
からなる群から選択された請求項１に記載の抗体または部分。
【請求項３】
（ａ）配列番号２および配列番号４に記載のアミノ酸配列の可変領域を含み、かつシグナル配列を含まない抗体、
（ｂ）配列番号６および配列番号８、１０、または１２に記載のアミノ酸配列の可変領域を含み、かつシグナル配列を含まない抗体、
（ｃ）配列番号１４および配列番号１６、１８、または２０に記載のアミノ酸配列の可変領域を含み、かつシグナル配列を含まない抗体、
（ｄ）配列番号２２および配列番号２４に記載のアミノ酸配列の可変領域を含み、かつシグナル配列を含まない抗体、
（ｅ）配列番号２６または２８、および配列番号３０、３２または３４に記載のアミノ酸配列の可変領域を含み、かつシグナル配列を含まない抗体、または
（ｆ）配列番号３６および配列番号３８に記載のアミノ酸配列の可変領域を含み、かつシグナル配列を含まない抗体
からなる群から選択された、請求項１または請求項２に記載のモノクローナル抗体または部分。
【請求項４】
（ａ）配列番号１および配列番号３に記載の核酸配列によってコードされている抗体、
（ｂ）配列番号５および配列番号７、９、または１１に記載の核酸配列によってコードされている抗体、
（ｃ）配列番号１３および配列番号１５、１７、または１９に記載の核酸配列によってコードされている抗体、
（ｄ）配列番号２１および配列番号２３に記載の核酸配列によってコードされている抗体、
（ｅ）配列番号２５または２７および配列番号２９、３１、または３３に記載の核酸配列によってコードされている抗体、または
（ｆ）配列番号３５および配列番号３７に記載の核酸配列によってコードされている抗体
からなる群から選択された、請求項１から３のいずれかに記載の抗体または部分。
【請求項５】
重鎖Ｃ末端リジンが切除されている、請求項１から４のいずれかに記載のモノクローナル抗体または部分。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分の、薬物としての使用。
【請求項７】
白血球のＭＡｄＣＡＭ介在接着に関与する疾患を治療するための薬物を製造するための、請求項１から５のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項８】
前記疾患が炎症性疾患である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記疾患が、炎症性腸疾患、肝線維形成、移植片宿主相関病、ブドウ膜炎、脳炎、インスリン依存型糖尿病から選択される、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
炎症性腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
請求項１から５のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分と、薬学的に許容できる担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１２】
それを必要とする対象の炎症性疾患を治療する方法であって、請求項１から５のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を前記対象に投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粘膜アドレッシン細胞接着分子（ＭＡｄＣＡＭ）に特異的な改善されたヒト抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
粘膜アドレッシン細胞接着分子（ＭＡｄＣＡＭ）は、細胞接着受容体の免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＭＡｄＣＡＭは、リンパ球表面のインテグリン分子と相互作用することによって、必要な際に、組織へのリンパ球の動員を行う接着分子の１つである。
【０００３】
ＭＡｄＣＡＭがそのインテグリン結合パートナーであるα４β７に結合するのを阻害する抗体、例えば抗ＭＡｄＣＡＭ抗体（例えばＭＥＣＡ−３６７；米国特許第５４０３９１９号、第５５３８７２４号明細書）または抗α４β７抗体（例えばＡｃｔ−１；米国特許第６５５１５９３号明細書、または国際公開第０１／７８７７９号パンフレットに記載の、ＭＬＮ０２とも呼ばれるヒト化Ａｃｔ−１）が、炎症を起こしている腸への白血球血管外遊走を阻害でき、したがって、炎症性腸疾患の治療に有益でありうることが示されている。
【０００４】
しかし、ＭＥＣＡ−３６７などの抗ＭＡｄＣＡＭ抗体は、ヒト患者の治療には有用でない。すなわち、ＭＥＣＡ−３６７は、マウスＭＡｄＣＡＭに結合し、ヒトＭＡｄＣＡＭ分子には弱い親和性しか示さない。加えてラット抗体であるので、それはヒト患者で免疫応答へと導き、それゆえに、治療適用に適さないであろう。ヒトＭＡｄＣＡＭ対して産生されたマウスモノクローナル抗体が記述されているが（国際公開第９６／２４６７３号パンフレット）、これらも、ヒトにおいて免疫原性となる傾向がある。最近、ヒトおよび霊長類ＭＡｄＣＡＭに対して極めて高い特異性および親和性を有する、治療上有用であり、完全にヒト配列の抗ヒトＭＡｄＣＡＭ抗体が開発され、国際公開第２００５／０６７６２０号パンフレットに開示された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
完全にヒト配列の抗体でさえ、一部の患者ではなお免疫応答へと導きうることが知られており、それは、その抗体の可変領域の配列による可能性が高い。本発明の抗体は、国際公開第２００５／０６７６２０号パンフレットで開示されたヒト抗ＭＡｄＣＡＭ抗体の改変物であり、ヒト患者における免疫原性のいかなる問題もさらに起こしにくいものである可能性が高い。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一態様は、６．２２．２−ｍｏｄ＿Ｖ（配列番号２）の重鎖可変領域を含み、ＭＡｄＣＡＭに特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【０００７】
本発明の別の態様は、６．３４．２−ｍｏｄ＿ＳＳＱ、６．３４．２−ｍｏｄ＿ＱＴ、または６．３４．２−ｍｏｄ＿ＳＳＱ，ＱＴ（配列番号８、１０、１２）の軽鎖可変領域を含む、ＭＡｄＣＡＭに特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【０００８】
本発明の別の態様は、６．６７．１−ｍｏｄ＿Ｙ、６．６７．１−ｍｏｄ＿ＴΔＰ、または６．６７．１−ｍｏｄ＿Ｙ，ＴΔＰ（配列番号１６、１８、２０）の軽鎖可変領域を含む、ＭＡｄＣＡＭに特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【０００９】
本発明の別の態様は、６．７７．１−ｍｏｄ＿ΔＳ（配列番号２２）の重鎖可変領域を含む、ＭＡｄＣＡＭに特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【００１０】
本発明の別の態様は、７．１６．６＿Ｖ、７．１６．６＿Ｓ、または７．１６．６＿ＶＳ（配列番号３０、３２、３４）の軽鎖可変領域を含む、ＭＡｄＣＡＭに特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【００１１】
本発明の別の態様は、７．１６．６＿Ｌ（配列番号２８）の重鎖可変領域を含む、ＭＡｄＣＡＭに特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【００１２】
本発明の別の態様は、７．１６．６＿Ｖ、７．１６．６＿Ｓ、または７．１６．６＿ＶＳの軽鎖可変領域（配列番号３０、３２、３４）と、７．１６．６＿Ｌの重鎖可変領域（配列番号２８）とを含む、ＭＡｄＣＡＭに特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【００１３】
本発明の別の態様は、９．８．２＿ΔＲＧＡＹＨ，Ｄ（配列番号３６）の重鎖可変領域を含む、ＭＡｄＣＡＭに特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【００１４】
本発明の別の態様は、９．８．２−ｍｏｄ（配列番号３８）の軽鎖可変領域を含む、ＭＡｄＣＡＭに特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【００１５】
本発明の別の態様は、
（ａ）配列番号１および配列番号３に記載の核酸配列によってコードされている可変領域を含む抗体、
（ｂ）配列番号５および配列番号７、９、または１１に記載の核酸配列によってコードされている可変領域を含む抗体、
（ｃ）配列番号１３および配列番号１５、１７、または１９に記載の核酸配列によってコードされている可変領域を含む抗体、
（ｄ）配列番号２１および配列番号２３に記載の核酸配列によってコードされている可変領域を含む抗体、
（ｅ）配列番号２５または２７および配列番号２９、３１、または３３に記載の核酸配列によってコードされている可変領域を含む抗体、または
（ｆ）配列番号３５および配列番号３７に記載の核酸配列によってコードされている可変領域を含む抗体
からなる群から選択された、ＭＡｄＣＡＭに特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【００１６】
本発明の別の態様は、
（ａ）配列番号２および配列番号４に記載のアミノ酸配列の可変領域を含み、かつシグナル配列を含まない抗体、
（ｂ）配列番号６および配列番号８、１０、または１２に記載のアミノ酸配列の可変領域を含み、かつシグナル配列を含まない抗体、
（ｃ）配列番号１４および配列番号１６、１８、または２０に記載のアミノ酸配列の可変領域を含み、かつシグナル配列を含まない抗体、
（ｄ）配列番号２２および配列番号２４に記載のアミノ酸配列の可変領域を含み、かつシグナル配列を含まない抗体、
（ｅ）配列番号２６または２８、および配列番号３０、３２または３４に記載のアミノ酸配列の可変領域を含み、かつシグナル配列を含まない抗体、または
（ｆ）配列番号３６および配列番号３８に記載のアミノ酸配列の可変領域を含み、かつシグナル配列を含まない抗体
からなる群から選択された、ＭＡｄＣＡＭに特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【００１７】
本発明の別の態様は、
（ａ）シグナル配列を含まない、配列番号２のアミノ酸配列の重鎖および配列番号４の軽鎖アミノ酸配列、
（ｂ）シグナル配列を含まない、配列番号６のアミノ酸配列の重鎖、および配列番号８、１０、または１２の軽鎖アミノ酸配列、
（ｃ）シグナル配列を含まない、配列番号１４のアミノ酸配列の重鎖、および配列番号１６、１８、または２０の軽鎖アミノ酸配列、
（ｄ）シグナル配列を含まない、配列番号２２のアミノ酸配列の重鎖、および配列番号２４の軽鎖アミノ酸配列、
（ｅ）シグナル配列を含まない、配列番号２６または２８のアミノ酸配列の重鎖、および配列番号３０、３２または３４の軽鎖アミノ酸配列、
（ｆ）シグナル配列を含まない、配列番号３６のアミノ酸配列の重鎖、および配列番号３８の軽鎖アミノ酸配列
を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
【００１８】
本発明の別の態様は、重鎖Ｃ末端リジンが切除されている、本発明のヒトモノクローナル抗体である。
【００１９】
本発明の別の態様は、ＩｇＧ２アイソタイプである、本発明のヒトモノクローナル抗体である。本発明のさらに別の態様は、ＩｇＧ４アイソタイプである、本発明のヒトモノクローナル抗体である。本発明のさらに別の態様は、κ軽鎖を含む、本発明のヒトモノクローナル抗体である。本発明のさらに別の態様は、λ軽鎖を含む、本発明のヒトモノクローナル抗体である。本発明の好ましい態様は、ＩｇＧ２アイソタイプであり、かつκ軽鎖を含む本発明のヒトモノクローナル抗体である。
【００２０】
本発明の別の態様は、配列番号１、７、９、１１、１５、１７、１９、２１、２７、２９、３１、３３、３５、または３７の可変領域配列のいずれか、または配列番号２、８、１０、１２、１６、１８、２０、２２、２８、３０、３２、３４、３６、または３８の可変領域をコードする配列のいずれかを含むベクターである。本発明のさらに別の態様は、配列番号１、７、９、１１、１５、１７、１９、２１、２７、２９、３１、３３、３５、または３７の可変領域配列のいずれか、または配列番号２、８、１０、１２、１６、１８、２０、２２、２８、３０、３２、３４、３６、または３８の可変領域をコードする配列のいずれかを含む宿主細胞である。宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌でも、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｓｔｏｒｉｓ）などの酵母でも、植物細胞でも、昆虫細胞でも、哺乳類細胞でもよい。宿主細胞は哺乳類細胞であることがより好ましい。宿主細胞はＣＨＯ細胞またはＮＳ０細胞であることが最も好ましい。
【００２１】
本発明の別の態様は、配列番号１、７、９、１１、１５、１７、１９、２１、２７、２９、３１、３３、３５、または３７の可変領域配列のうちの任意のもの、または配列番号２、８、１０、１２、１６、１８、２０、２２、２８、３０、３２、３４、３６、または３８の可変領域をコードする配列のうちの任意のものを含む宿主細胞を、上記抗体が発現される条件下で培養するステップと、上記抗体を宿主細胞またはその培養上清から回収するステップとを含む、本発明の抗体を産生する方法である。
【００２２】
本発明の別の態様は、配列番号１、７、９、１１、１５、１７、１９、２１、２７、２９、３１、３３、３５、または３７の可変領域配列のうちの任意のもの、または配列番号２、８、１０、１２、１６、１８、２０、２２、２８、３０、３２、３４、３６、または３８の可変領域をコードする配列のうちの任意のものを含むトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物である。
【００２３】
本発明の一態様は、薬物として使用するための、本発明の抗体またはその抗原結合部分の使用である。本発明の別の態様は、白血球のＭＡｄＣＡＭ介在接着に関与する状態を治療するための薬物を製造するための、本発明の抗体またはその抗原結合部分の使用である。本発明の別の態様は、限定されるものではないが、クローン病、潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；憩室性疾患、胃炎、肝臓疾患、原発性硬化症、硬化性胆管炎を含めた胃腸管の炎症性疾患など、炎症状態を治療するための、本発明の抗体またはその抗原結合部分の使用である。炎症性疾患には、腹部疾患（腹膜炎、盲腸、胆道疾患が含まれる）、急性横断性脊髄炎、アレルギー性皮膚炎（アレルギー性皮膚、アレルギー性湿疹、皮膚アトピー、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎、皮膚炎症、炎症性湿疹、炎症性皮膚炎、ノミ皮膚、粟粒性皮膚炎、粟粒性湿疹、チリダニ皮膚）、強直性脊椎炎（ライター症候群）、喘息、気道炎症、アテローム性動脈硬化、動脈硬化、胆道閉鎖、膀胱炎症、乳癌、心血管炎症（血管炎、リウマチ疹爪郭梗塞、下腿潰瘍、多発性筋炎、慢性血管炎症、心嚢炎、慢性閉塞性肺疾患が含まれる）、慢性膵炎を含めた膵炎、神経周囲の炎症、腹腔疾患、大腸炎（アメーバ性大腸炎、伝染性大腸炎、細菌性大腸炎、クローン病大腸炎、乏血性大腸炎、潰瘍性大腸炎、特発性直腸大腸炎、炎症性腸疾患、偽膜性大腸炎が含まれる）、緑色腫、コラーゲン脳血管障害（慢性関節リウマチ、ＳＬＥ、進行性全身性硬化症、混合性結合織病、糖尿病）、クローン病（限局性回腸炎、肉芽腫回腸炎、回結腸炎、消化系炎症）、脱髄性疾患（脊髄炎、多発性硬化症、多発硬化、急性播種性脳脊髄炎、静脈周囲髄鞘脱落、ビタミンＢ１２欠乏症、ギラン−バレー症候群、ＭＳ関連レトロウイルスが含まれる）、皮膚筋炎、憩室炎、肺気腫、滲出性下痢症、免疫低下患者の発熱、胃炎、肉芽腫性肝炎、肉芽腫性炎症、胆嚢炎、インスリン依存性糖尿病、肝臓炎症性疾患（限定されるものではないが、Ｃ型肝炎誘発性の肝臓障害、アルコール性肝障害、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）；原発性胆汁性肝硬変、肝炎、硬化性胆管炎を含めた肝線維症）、肺炎症（特発性肺線維症、肺好酸性肉芽腫症、肺組織球症Ｘ、細気管支周囲炎、急性気管支炎）、性病性リンパ肉芽腫、悪性黒色腫、口／歯疾患（歯肉炎、歯周病が含まれる）、転移癌、粘膜炎、筋骨格系炎症（筋炎）、非アルコール性脂肪性肝炎（非アルコール性脂肪肝疾患）、眼および眼窩炎症（ブドウ膜炎、視神経炎、末梢リウマチ様潰瘍形成、末梢角膜炎が含まれる）、変形性関節炎、頭蓋骨骨髄炎、咽頭炎症、多発関節炎、直腸炎、乾せん、放射線障害、類肉腫症、鎌状赤血球壊疽、表在性血栓性静脈炎、全身炎症反応症候群、甲状腺炎、全身性紅斑性狼瘡、熱帯性下痢、移植片対宿主病、急性熱傷、ベーチェット症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症などの子宮障害、月経困難症、または骨盤内炎症性疾患も含まれるが、これらに限定されない。本発明の抗体は、クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、移植片対宿主病、肝線維症、ブドウ膜炎の治療に用いられることが好ましい。本発明の抗体は、炎症性腸疾患の治療に用いられることがさらに好ましい。
【００２４】
本発明の別の態様は、上述の状態を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、本発明の抗体を治療有効量投与するステップを含む。
【００２５】
本発明の別の態様は、本発明の抗体またはその抗原結合部分と、薬学的に許容できる担体または賦形剤とを含む医薬組成物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の抗ＭＡｄＣＡＭ抗体の重鎖全体をコードする核酸分子は、重鎖可変ドメイン全体またはその抗原結合ドメインをコードする核酸分子を、重鎖定常ドメインと融合させることによって構築することができる。同様に、抗ＭＡｄＣＡＭ抗体の軽鎖をコードする核酸分子は、軽鎖可変ドメインまたはその抗原結合ドメインをコードする核酸分子を、軽鎖定常ドメインと融合させることによって構築することができる。ＶＨおよびＶＬ領域をコードする核酸分子は、それらをそれぞれ重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターに、ＶＨセグメントが上記ベクター中で重鎖定常領域（ＣＨ）セグメントに作動可能に連結され、ＶＬセグメントが上記ベクター中で軽鎖定常領域（ＣＬ）セグメントに作動可能に連結されるように挿入することによって完全長抗体遺伝子に変換することができる。別法では、標準的な分子生物学的技法を用いて、ＶＨ鎖をコードする核酸分子をＣＨ鎖をコードする核酸分子に連結すること、例えばライゲーションすることによって、ＶＨまたはＶＬ鎖をコードする核酸分子を完全長抗体遺伝子に変換する。ＶＬおよびＣＬ鎖をコードする核酸分子を用いて同じことが実現できる。ヒト重鎖および軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られている。例えば、Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．９１−３２４２（１９９１年）を参照のこと。その後、完全長の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子をそれらが導入された細胞から発現し、抗ＭＡｄＣＡＭ抗体を単離することができる。
【００２７】
本発明の抗ＭＡｄＣＡＭ抗体の重鎖もしくはその抗原結合部分、または本発明の抗ＭＡｄＣＡＭ抗体の軽鎖もしくはその抗原結合部分のいずれかをコードする核酸分子は、例えば、本明細書に提供する配列情報を用いて適切な核酸を合成し、免疫グロブリン遺伝子の所望の定常領域と共にそれらをスプライシングすることによって調製することができる。当業者ならば、適切な方法を知っているであろう。
【００２８】
上記核酸分子は、下記の通り、多量の抗ＭＡｄＣＡＭ抗体を組換え発現するのに使用できる。上記核酸分子は、さらに下に記述する通り、キメラ抗体、一本鎖抗体、イムノアドヘシン、ディアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）、変異型抗体、および抗体誘導体を産生するのに使用できる。上記核酸分子を非ヒト非トランスジェニック動物から得る場合、これも以下に記述する通り、上記核酸分子を抗体ヒト化に使用できる。
【００２９】
本発明は、上記重鎖またはその抗原結合部分をコードする本発明の核酸分子を含むベクターを提供する。本発明は、上記軽鎖またはその抗原結合部分をコードする本発明の核酸分子を含むベクターも提供する。本発明は、融合タンパク質、改変抗体、抗体断片、およびそれらのプローブをコードする核酸分子を含むベクターも提供する。
【００３０】
本発明で使用される抗体または抗体部分を発現するには、上述の通り得られた部分または完全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを、転写および翻訳調節配列に上記遺伝子が作動可能に連結されるように発現ベクターに挿入する。発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイク病ウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが含まれる。抗体遺伝子は、ベクター中の転写および翻訳調節配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するそれらの意図されている機能を果たすようにベクターに連結する。発現ベクターおよび発現調節配列は、使用される発現宿主細胞に適合するように選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は別々のベクターに挿入することができる。好ましい実施形態では、両遺伝子を同じ発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子は、標準法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクターの相補的制限部位の連結、または制限部位がない場合には平滑末端連結）で発現ベクターに挿入する。
【００３１】
好都合なベクターは、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコードし、上述の通り、いかなるＶＨまたはＶＬ配列も容易に挿入および発現できるように構築された適切な制限部位を有するものである。そのようなベクターでは、通常、挿入されたＪ領域のスプライスドナー部位と、ヒトＣ領域の前にあるスプライスアクセプター部位との間で、ヒトＣＨエキソン中に存在するスプライス領域でもスプライシングが起こる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域下流の天然染色体部位で起こる。上記組換え体発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることもできる。上記抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクター中にクローニングすることもできる。上記シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドでも、異種シグナルペプチド（すなわち非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）でもよい。
【００３２】
上記抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え体発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保持する。調節配列の選択を含めた発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存しうることを当業者ならば理解するであろう。哺乳類宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、レトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーなど、哺乳類細胞中で高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメント、ならびに天然免疫グロブリンおよびアクチンプロモーターなどの強力な哺乳類プロモーターが含まれる。ウイルス性調節エレメントおよびその配列のさらなる記述に関しては、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５１６８０６２号、第４５１０２４５号、および第４９６８６１５号明細書を参照のこと。プロモーターおよびベクター、ならびに植物の形質転換の記述を含めた、植物で抗体を発現する方法は当技術分野で知られている。例えば、米国特許第６５１７５２９号明細書を参照のこと。細菌細胞または真菌細胞、例えば酵母細胞中でポリペプチドを発現する方法も当技術分野で周知である。
【００３３】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明で使用される組換え体発現ベクターは、宿主細胞でベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）および選択マーカー遺伝子などの追加配列を保持してもよい。上記選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４３９９２１６号、第４６３４６６５号、および第５１７９０１７号明細書を参照）。例えば、上記選択マーカー遺伝子は、通常、ベクターがその中に導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を与える。好ましい選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅と共にｄｈｆｒ宿主細胞で使用する）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）、およびグルタミン酸シンテターゼ遺伝子が含まれる。
【００３４】
抗ＭＡｄＣＡＭ抗体の重鎖もしくはその抗原結合部分および／または軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする核酸分子、ならびにこれらの核酸分子を含むベクターは、適した哺乳動物、植物、細菌、または酵母宿主細胞の形質転換に用いることができる。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入するための、既知のいかなる方法によるものでもよい。異種ポリヌクレオチドを哺乳類細胞に導入する方法は当技術分野で周知であり、これらには、デキストラン媒介形質移入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介形質移入、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチドの封入、微粒子銃注入、および核へのＤＮＡの直接微量注入が含まれる。加えて、核酸分子は、ウイルスベクターによって哺乳類細胞中に導入することもできる。細胞を形質転換する方法は当技術分野で周知である。例えば、米国特許第４３９９２１６号、第４９１２０４０号、第４７４０４６１号、および第４９５９４５５号明細書を参照のこと（これらの特許を参照により本明細書に組み込む）。植物細胞を形質転換する方法は、当技術分野で周知であり、これらには、例えば、アグロバクテリウム媒介形質転換、微粒子銃形質転換、直接注入、エレクトロポレーション、およびウイルス形質転換が含まれる。細菌細胞および酵母細胞を形質転換する方法も当技術分野で周知である。
【００３５】
発現用の宿主として利用可能な哺乳類細胞系は当技術分野で周知であり、これらには、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手できる多数の不死化細胞株が含まれる。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、および他の多数の細胞系が含まれる。哺乳類宿主細胞には、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、およびハムスター細胞が含まれる。特に好ましい細胞系は、どの細胞系が高発現レベルを有するか決定することを通して選択される。使用できる他の細胞系は、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞系、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞、および真菌細胞である。重鎖もしくはその抗原結合部分、軽鎖および／もしくはその抗原結合部分をコードする組換え体発現ベクターを、哺乳類宿主細胞に導入した場合、上記抗体は、宿主細胞中での上記抗体の発現、またはより好ましくは、宿主細胞がその中で増殖している培養培地中への上記抗体の分泌を可能にするのに十分な時間、宿主細胞を培養することによって産生する。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培養培地から回収できる。植物宿主細胞には、例えば、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモなどが含まれる。細菌宿主細胞には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属諸種が含まれる。酵母宿主細胞には、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が含まれる。
【００３６】
さらに、本発明で使用する抗体（またはそれ由来の他の部分）の、産生細胞系からの発現は、多くの既知の技法を用いて容易にすることができる。例えば、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、特定の条件下で発現を強化するための一般的なアプローチである。ＧＳ系は、その全部または一部が、欧州特許第０２１６８４６号、第０２５６０５５号、第０３３８８４１号、および第０３２３９９７号明細書に関連して論じられている。
【００３７】
異なった細胞系によって、またはトランスジェニック動物で発現された抗体は、相互に異なったグリコシル化を有するであろう可能性が高い。しかし、本明細書に提示する核酸分子によってコードされているか、または本明細書に提示するアミノ酸配列を含むすべての抗体は、上記抗体のグリコシル化に関係なく本発明の一部である。
【００３８】
本発明で使用する抗体を産生するのに、上述した１つまたは複数の核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト動物およびトランスジェニック植物を用いてもよい。抗体は、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスターまたは他の哺乳動物の組織、または乳、血液、もしくは尿などの体液中に産生させて、それから回収することができる。例えば、米国特許第５８２７６９０号、第５７５６６８７号、第５７５０１７２号、および第５７４１９５７号明細書を参照のこと。上述の通り、ＭＡｄＣＡＭまたはその部分を用いて、ヒト免疫グロブリン座を含む非ヒトトランスジェニック動物を免疫化することができる。植物中で抗体を作る方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６０４６０３７号および第５９５９１７７号明細書に記載されている。
【００３９】
非ヒトトランスジェニック動物およびトランスジェニック植物は、本発明で使用される１つまたは複数の核酸分子を、標準的なトランスジェニック技法で動物または植物に導入することによって産生する。Ｈｏｇａｎ、同上を参照のこと。トランスジェニック動物を作製するのに用いられるトランスジェニック細胞は、胚幹細胞、体細胞または受精卵細胞でよい。トランスジェニック非ヒト生物は、キメラ、非キメラヘテロ接合体、および非キメラホモ接合体でありうる。例えば、Ｈｏｇａｎら、「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ社（１９９９年）；Ｊａｃｋｓｏｎら、「Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ社（２０００年）；およびＰｉｎｋｅｒｔ、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社（１９９９年）を参照のこと。上記トランスジェニック非ヒト生物は、対象とする重鎖および／または軽鎖をコードするものの標的破壊および置換除去を有するものでよい。上記トランスジェニック動物または植物は、ＭＡｄＣＡＭ、好ましくはヒトＭＡｄＣＡＭに特異的に結合するように会合する重鎖および軽鎖をコードする核酸分子を含み、発現するものでよい。上記トランスジェニック動物または植物は、一本鎖抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体などの改変抗体をコードする核酸分子を含むものでよい。抗ＭＡｄＣＡＭ抗体は、いかなるトランスジェニック動物で作製してもよい。上記非ヒト動物には、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、またはウマが含まれる。上記非ヒトトランスジェニック動物は、血液、乳、尿、唾液、涙、粘液、および他の体液中に、前記コードしているポリペプチドを発現する。
【００４０】
処置は、本発明の１つまたは複数の阻害抗ＭＡｄＣＡＭモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を単独もしくは薬学的に許容できる担体と共に投与するものでありうる。阻害抗ＭＡｄＣＡＭ抗体およびそれらを含む組成物は、他の１つまたは複数の治療薬、診断薬、または予防薬と組み合わせて投与することができる。そのような追加薬剤は、同一組成物中に含めても、または別々に投与してもよい。追加治療薬には、抗炎症薬または免疫調節薬が含まれる。これらの薬剤には、プレドニソロン、メチルプレドニゾロン、ＮＣＸ−１０１５、またはブデソニドなどの局所および経口コルチコステロイド；メサラジン、オルサラジン、バルサラジド、またはＮＣＸ−４５６などのアミノサリチル酸；アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、サイクロスポリン、ＦＫ５０６、ＩＬ−１０（イロデカキン）、ＩＬ−１１（オプレレフキン（Ｏｐｒｅｌｅｖｋｉｎ））、ＩＬ−１２、ＭＩＦ／ＣＤ７４アンタゴニスト、ＴＮＸ−１００／５−Ｄ１２などのＣＤ４０アンタゴニスト、ＯＸ４０Ｌアンタゴニスト、ＧＭ−ＣＳＦ、ピメクロリムス、またはラパミシンなどのクラスの免疫調節剤；インフリキシマブ、アダリムマブ、ＣＤＰ−８７０、オネルセプト（ｏｎｅｒｃｅｐｔ）、エタネルセプトなどのクラスの抗ＴＮＦα薬；ＰＤＥ−４阻害剤（ロフルミラストなど）、ＴＡＣＥ阻害剤（ＤＰＣ−３３３、ＲＤＰ−５８など）、およびＩＣＥ阻害剤（ＶＸ−７４０など）、ダシリツマブなどのＩＬ−２受容体アンタゴニストのクラスの抗炎症薬、ナタリズマブ、ＭＬＮ−０２、またはアリカフォルセン（ａｌｉｃａｆｏｒｓｅｎ）などのクラスの選択的付着分子アンタゴニスト、限定されるものではないが、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、セレコキシブなどのコックス２阻害薬、ガバペンチンおよびプレガバリンなどのＰ／Ｑ型電位感受性チャネル（α２δ）調節因子、ＮＫ−１受容体アンタゴニスト、カンナビノイド受容体調節薬、およびデルタオピオイド受容体アゴニストなどのクラスの鎮痛薬、ならびに抗悪性腫瘍薬、抗腫瘍薬、抗血管新生化学療法薬、または、限定されるものではないがプロテアーゼ阻害剤、好ましくはカスパーゼ阻害剤を含めた抗線維化剤が含まれるが、これらに限定されない。上記カスパーゼ阻害剤は、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容できる塩であることがより好ましい。
【００４１】
式Ｉの化合物
【００４２】
【化１】
2009500390.tif 000002
式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、およびＲ２は以下に定義する通りであり、
式中、
Ａは、式ＩＩａ〜ｉ： 
【００４３】
【化２】
2009500390.tif 000003
の天然または非天然のアミノ酸であり、
Ｂは、水素原子、重水素原子、アルキル、シクロアルキル、フェニル、置換フェニル、ナフチル、置換ナフチル、２−ベンゾオキサゾリル、置換２−オキサゾリル、（ＣＨ２）ｎ−シクロアルキル、（ＣＨ２）ｎ−フェニル、（ＣＨ２）ｎ（置換フェニル）、（ＣＨ２）ｎ−（１または２−ナフチル）、（ＣＨ２）ｎ−（置換１または２−ナフチル）、（ＣＨ２）ｎ−（ヘテロアリール）、（ＣＨ２）ｎ−（置換ヘテロアリール）、ハロメチル、ＣＯ２Ｒ１２、ＣＯＮＲ１３Ｒ１４、ＣＨ２ＺＲ１５、ＣＨ２ＯＣＯ（アリール）、ＣＨ２ＯＣＯ（ヘテロアリール）、またはＣＨ２ＯＰＯ（Ｒ１６）Ｒ１７であり、Ｚが酸素または硫黄原子であるか、またはＢは、式ＩＩＩａ〜ｃ： 
【００４４】
【化３】
2009500390.tif 000004
の一群であり、
Ｒ１は、アルキル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、フェニル、置換フェニル、フェニルアルキル、置換フェニルアルキル、ナフチル、置換ナフチル、（１または２ナフチル）アルキル、置換（１または２ナフチル）アルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、（ヘテロアリール）アルキル、置換（ヘテロアリール）アルキル、Ｒ１ａ（Ｒ１ｂ）Ｎ、またはＲ１ｃＯであり、
Ｒ２は、水素、低級アルキル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、フェニル、置換フェニル、フェニルアルキル、置換フェニルアルキル、ナフチル、置換ナフチル、（１または２ナフチル）アルキル、または置換（１または２ナフチル）アルキルであり、
式中、
Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、独立に、水素、アルキル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、フェニル、置換フェニル、フェニルアルキル、置換フェニルアルキル、ナフチル、置換ナフチル、（１または２ナフチル）アルキル、置換（１または２ナフチル）アルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、（ヘテロアリール）アルキル、または置換（ヘテロアリール）アルキルであり、ただし、Ｒ１ａとＲ１ｂの両方が水素であることはできず、
Ｒ１ｃは、アルキル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、フェニル、置換フェニル、フェニルアルキル、置換フェニルアルキル、ナフチル、置換ナフチル、（１または２ナフチル）アルキル、置換（１または２ナフチル）アルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、（ヘテロアリール）アルキル、または置換（ヘテロアリール）アルキルであり、
Ｒ３は、Ｃ１−６アルキル、シクロアルキル、フェニル、置換フェニル、（ＣＨ２）ｎＮＨ２、（ＣＨ２）ＮＨＣＯＲ９、（ＣＨ２）ｎＮ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２、（ＣＨ２）ｍＣＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｍＯＲ１０、（ＣＨ２）ｍＳＲ１１、（ＣＨ２）ｎシクロアルキル、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ（置換フェニル）、（ＣＨ２）ｎ（１または２−ナフチル）または（ＣＨ２）ｎ（ヘテロアリール）であり、ヘテロアリールには、ピリジル、チエニル、フリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソキサゾリル、ピラジニル、ピリミジル、トリアジニル、テトラゾリル、およびインドリルが含まれ、
Ｒ３ａは、水素またはメチルであるか、またはＲ３およびＲ３ａは一緒になって−（ＣＨ２）ｄ−であり、ｄは２から６までの整数であり、
Ｒ４は、フェニル、置換フェニル、（ＣＨ２）ｍフェニル、（ＣＨ２）ｍ（置換フェニル）、シクロアルキル、またはベンゾ縮合シクロアルキルであり、
Ｒ５は、水素、低級アルキル、シクロアルキル、フェニル、置換フェニル、（ＣＨ２）ｎシクロアルキル、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ（置換フェニル）、または（ＣＨ２）ｎ（１または２−ナフチル）であり、
Ｒ６は、水素、フッ素、オキソ、低級アルキル、シクロアルキル、フェニル、置換フェニル、ナフチル、（ＣＨ２）ｎシクロアルキル、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ（置換フェニル）、（ＣＨ２）ｎ（１または２−ナフチル）、ＯＲ１０、ＳＲ１１、またはＮＨＣＯＲ９であり、
Ｒ７は、水素、オキソ（すなわち、＝Ｏ）、低級アルキル、シクロアルキル、フェニル、置換フェニル、ナフチル、（ＣＨ２）ｎシクロアルキル、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ（置換フェニル）、または（ＣＨ２）ｎ（１または２−ナフチル）であり、
Ｒ８は、低級アルキル、シクロアルキル、（ＣＨ２）ｎシクロアルキル、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ（置換フェニル）、（ＣＨ２）ｎ（１または２−ナフチル）、またはＣＯＲ９であり、
Ｒ９は、水素、低級アルキル、シクロアルキル、フェニル、置換フェニル、ナフチル、（ＣＨ２）ｎシクロアルキル、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ（置換フェニル）、（ＣＨ２）ｎ（１または２−ナフチル）、ＯＲ１２、またはＮＲ１３Ｒ１４であり、
Ｒ１０は、水素、低級アルキル、シクロアルキル、フェニル、置換フェニル、ナフチル、（ＣＨ２）ｎシクロアルキル、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ（置換フェニル）、または（ＣＨ２）ｎ（１または２−ナフチル）であり、
Ｒ１１は、低級アルキル、シクロアルキル、フェニル、置換フェニル、ナフチル、（ＣＨ２）ｎシクロアルキル、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ（置換フェニル）、または（ＣＨ２）ｎ（１または２−ナフチル）であり、
Ｒ１２は、低級アルキル、シクロアルキル、（ＣＨ２）ｎシクロアルキル、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ（置換フェニル）、または（ＣＨ２）ｎ（１または２−ナフチル）であり、
Ｒ１３は、水素、低級アルキル、シクロアルキル、フェニル、置換フェニル、ナフチル、置換ナフチル、（ＣＨ２）ｎシクロアルキル、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ（置換フェニル）、または（ＣＨ２）ｎ（１または２−ナフチル）であり、
Ｒ１４は、水素または低級アルキルであるか、または
Ｒ１３およびＲ１４は、一緒になって、モルホリンまたはＮ−置換ピペラジンなど、５から７員の炭素環または複素環を形成し、
Ｒ１５は、フェニル、置換フェニル、ナフチル、置換ナフチル、ヘテロアリール、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ（置換フェニル）、（ＣＨ２）ｎ（１または２−ナフチル）、または（ＣＨ２）ｎ（ヘテロアリール）であり、
Ｒ１６またはＲ１７は、独立に、低級アルキル、シクロアルキル、フェニル、置換フェニル、ナフチル、フェニルアルキル、置換フェニルアルキル、または（シクロアルキル）アルキルであり、
Ｒ１８およびＲ１９は、独立に、水素、アルキル、フェニル、置換フェニル、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ（置換フェニル）であるか、またはＲ１８およびＲ１９は一緒になって−（ＣＨ＝ＣＨ）２−であり、
Ｒ２０は、水素、アルキル、フェニル、置換フェニル、（ＣＨ２）ｎフェニル、（ＣＨ２）ｎ（置換フェニル）であり、
Ｒ２１、Ｒ２２、およびＲ２３は、独立に、水素またはアルキルであり、
Ｘは、ＣＨ２、（ＣＨ２）２、（ＣＨ２）３、またはＳであり、
Ｙ１は、ＯまたはＮＲ２３であり、
Ｙ２は、ＣＨ２、Ｏ、またはＮＲ２３であり、
ａは、０または１であり、ｂは、１または２であり、ただし、ａが１である場合、ｂは１であり、
ｃは、１または２であり、ただし、ｃが１である場合、ａは０であり、ｂは１であり、
ｍは、１または２であり、
ｎは、１、２、３、または４である。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、メチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソプロピル、ｎ−オクチルなどの、直鎖または分枝のＣ１からＣ１０炭素鎖を意味する。「低級アルキル」という用語は、メチル、エチル、イソプロピルなどの、直鎖または分岐のＣ１からＣ６炭素鎖を意味する。
【００４６】
溶媒または当業者に知られている他の条件の選択に応じて、これらの化合物は、ケタール型またはアセタール型もとりうる。本発明の組合せにおけるこれらの型の使用も本発明に包含される。
【００４７】
これらの化合物は、参照により本明細書に全体として組み込まれている国際公開第００／０１６６６号パンフレットまたは米国特許第６５４４９５１号明細書に記載の通りに調製することができる。好ましい部分群は、米国特許第６５４４９５１号明細書に記載のものである。
【００４８】
以下のものから選択された化合物が好ましい。
（３Ｓ）−３−［Ｎ−（Ｎ’−（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）オキサミル）バリニル］アミノ−５−（２’，３’，５’，６’−テトラフルオロフェノキシ）−４−オキソペンタン酸；
（３Ｓ）−３−［Ｎ−（Ｎ’−（２−クロロフェニル）オキサミル）バリニル］アミノ−５−（２’，３’，５’，６’−テトラフルオロフェノキシ）−４−オキソペンタン酸；
（３Ｓ）−３−［Ｎ−（Ｎ’−（２−ブロモフェニル）オキサミル）バリニル］アミノ−５−（２’，３’，５’，６’−テトラフルオロフェノキシ）−４−オキソペンタン酸；
（３Ｓ）−３−［Ｎ−（Ｎ’−（２−フルオロフェニル）オキサミル）バリニル］アミノ−５−（２’，３’，５’，６’−テトラフルオロフェノキシ）−４−オキソペンタン酸；
（３Ｓ）−３−［Ｎ−（Ｎ’−（２−トリフルオロメチルフェニル）オキサミル）バリニル］アミノ−５−（２’，３’，５’，６’−テトラフルオロフェノキシ）−４−オキソペンタン酸；
（３Ｓ）−３−［Ｎ−（Ｎ’−（１−アントリル）オキサミル）バリニル］アミノ−５−（２’，３’，５’，６’−テトラフルオロフェノキシ）−４−オキソペンタン酸；
（３Ｓ）−３−［Ｎ−（Ｎ’−（２−Ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）オキサミル）アラニニル］アミノ−５−（２’，３’，５’，６’−テトラフルオロフェノキシ）−４−オキソペンタン酸；
（３Ｓ）−３−［Ｎ−（Ｎ’−（２−トリフルオロメチルフェニル）オキサミル）アラニニル］アミノ−５−（２’，３’，５’，６’−テトラフルオロフェノキシ）−４−オキソペンタン酸；
（３Ｓ）−３−［Ｎ−（Ｎ’−（２，６−ジフルオロフェニル）オキサミル）アラニニル］アミノ−５−（２’，３’，５’，６’−テトラフルオロフェノキシ）−４−オキソペンタン酸；
（３Ｓ）−３−［Ｎ−（Ｎ’−（１−ナフチル）オキサミル）アラニニル］アミノ−５−（２’，３’，５’，６’−テトラフルオロフェノキシ）−４−オキソペンタン酸；
（３Ｓ）−３−［Ｎ−（Ｎ’−（４−メトキシフェニル）オキサミル）アラニニル］アミノ−５−（２’，３’，５’，６’−テトラフルオロフェノキシ）−４−オキソペンタン酸；
（３Ｓ）−３−［Ｎ−（Ｎ’−（２−トリフルオロメチルフェニル）オキサミル）バリニル］アミノ−４−オキソブタン酸；
（３Ｓ）−３−［Ｎ−（Ｎ’−（２−ｔｅｒｔ−ブチルメチルフェニル）オキサミル）バリニル］アミノ−４−オキソブタン酸；
（３Ｓ）−３−［Ｎ−（Ｎ’−（２−ベンジルフェニル）オキサミル）バリニル］アミノ−４−オキソブタン酸；
（３Ｓ）−３−［Ｎ−（Ｎ’−（２−フェニルフェニル）オキサミル）バリニル］アミノ−４−オキソブタン酸。
【００４９】
上記化合物は、（３Ｓ）−３−［Ｎ−（Ｎ’−（２−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）オキサミル）アラニニル］アミノ−５−（２’，３’，５’，６’−テトラフルオロフェノキシ）−４−オキソペンタン酸であることが最も好ましい。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容できる担体」は、生理的に適合したあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤、ならびに吸収促進剤または遅延剤などを意味する。薬学的に許容できる担体の一部の例は、塩化ナトリウム、ブドウ糖、グリセロール、ポリエチレングリコール、エタノールなど、ならびにこれらの組合せを含む、水、食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、酢酸緩衝液である。多くの場合、等張薬剤、例えば、マンニトール、ソルビトールなどの糖、ポリアルコール、または塩化ナトリウムを上記組成物中に含むことが好ましいであろう。薬学的に許容できる物質の追加例は、界面活性物質、湿潤剤、または、湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤、または緩衝剤などの小量の補助剤であり、それらは抗体の貯蔵期限または効力を強化する。
【００５１】
本発明で使用される組成物は、様々な形態、例えば、液体溶液（例えば、注射用溶液および浸剤用溶液）などの液体、半固体、および固体剤形、分散液もしくは懸濁液、錠剤、丸剤、凍結乾燥ケーキ、乾燥粉末薬、リポソーム、ならびに坐剤でありうる。好ましい形態は、意図されている投与および治療適用方式に依存する。典型的な好ましい組成物は、ヒトの受動免疫化に使用されるものと同様な組成物など、注射用溶液および浸剤用溶液の形態のものである。好ましい投与方法は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内）投与である。好ましい実施形態では、静脈注入または注射によって、上記抗体を投与する。別の好ましい実施形態では、筋肉内、皮内、または皮下注射によって上記抗体を投与する。望ましい場合には、ポンプ、浣腸剤、坐剤、留置リザーバーなどを用いることによって、上記抗体を投与することもできる。
【００５２】
治療組成物は、通常、製造および貯蔵条件下で無菌かつ安定でなければならない。上記組成物は、溶液、凍結乾燥ケーキ、乾燥粉末薬、マイクロエマルション、分散体、リポソーム、または高薬物濃度に適した他の規則的構造として処方できる。無菌注射用溶液は、滅菌の後、必要に応じて、必要な量の抗ＭＡｄＣＡＭ抗体を、上記の成分の１つまたはそれらの組合せを含む適切な溶媒中に組み入れることによって調製できる。無菌注射用溶液調製用の無菌粉末薬の場合、好ましい調製の方法は、活性成分に、あらかじめ滅菌された溶液に由来する任意の望ましい追加成分を加えた粉末薬を産生する真空乾燥および凍結乾燥である。通常、分散体は、基礎的な分散媒と、上記のものとは異なる他の必要な成分とを含有する無菌媒体中に活性化合物を組み入れることによって調製される。界面活性物質、リン脂質、および重合体の使用による分散体の場合には、溶液の望ましい特性は、例えば、界面活性物質および必要な粒径の使用によって維持することができる。注射用組成物の持続吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩、重合体物質、油、およびゼラチンを含ませることによって引き起こすことができる。
【００５３】
本発明の抗体は、当技術分野で知られている様々な方法で投与することができる。しかし、多くの治療応用のための、投与の好ましい経路／方法は、皮下、筋肉内、または皮内、または静脈内注入である。当業者ならば理解するであろうが、投与の経路および／または方法は、所望の結果に応じて異なるであろう。
【００５４】
特定の実施形態では、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル送達系を含めた徐放性製剤など、急速な放出に対して抗体を保護する担体と共に、上記抗体組成物を調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生分解性、生体適合性の重合体も使用できる。そのような製剤を調製する多数の方法が、特許取得されているか、当業者に公知となっている。「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」（Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編集、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ社、米国ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９７８年））を参照のこと。
【００５５】
特定の実施形態では、本発明の抗ＭＡｄＣＡＭ抗体は、例えば、不活性な希釈剤または同化可能な可食担体と共に経口投与することができる。上記化合物（および、望ましい場合には他の成分）は、硬質または軟質ゼラチンカプセル中に封入することも、錠剤に圧縮することも、対象の食物に直接組み入れることもできる。経口治療投与には、上記抗ＭＡｄＣＡＭ抗体を賦形剤と共に組み込み、経口摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル剤、エリキシール、懸濁液、シロップ、オブラートなどの形態で使用することができる。非経口投与以外の方法で本発明の化合物を投与するには、上記化合物を、その不活性化を防止する物質でコーティングするか、またはそれと共に同時投与する必要がありうる。
【００５６】
本発明の組成物は、「治療有効量」または「予防有効量」の、本発明の抗体または抗原結合部分を含みうる。「治療有効量」は、必要な用量および期間にわたって、望ましい治療成績を実現するのに有効な量を指す。上記抗体または抗体部分の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに上記抗体または抗体部分の、上記個体で望ましい反応を引き出す能力などの因子に応じて異なりうる。治療有効量は、その量における、上記抗体または抗体部分のいかなる毒性も、または有害な影響も、治療上の有益な影響がそれにまさるものでもある。「予防有効量」は、必要な用量および期間にわたって、望ましい予防成績を実現するのに有効な量を指す。通常、予防的投与は、疾患に先だって、もしくは疾患の早期に対象で使用されるので、予防有効量は治療有効量未満でありうる。
【００５７】
投与計画は、最適な望ましい反応（例えば、治療反応または予防反応）を与えるように調整することができる。例えば、単一のボーラスを投与することもできるし、ある期間にわたって、いくつかの分割量を投与することもできるし、または治療状況の要求によって指示されるのと比例して、用量を減少または増大させることもできる。投与の容易さ、および用量の均一性のため、投薬単位形態の非経口組成物を処方するのが特に有利である。本明細書で使用される場合、投薬単位形態は、治療するべき哺乳類対象用の単一用量として適した物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体と共に望ましい治療効果をもたらすように計算された所定の量の活性化合物を含有する。本発明の投薬単位形態のための規格は、（ａ）抗ＭＡｄＣＡＭ抗体またはその部分の特有な特徴、および実現すべき特定の治療または予防効果、および（ｂ）個体の感受性を治療するそのような抗体を配合する技術に固有の制限によって決定され、これらに直接的に依存している。
【００５８】
本発明の抗体または抗体部分の治療または予防有効量の例示的かつ非限定な範囲は、０．０２５から５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１から５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜２５、０．１から１０ｍｇ／ｋｇ、または０．１から３ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、製剤は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．２ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０の緩衝液中に、５ｍｇ／ｍＬの抗体を含有している。他の実施形態では、製剤は、例えば静脈内適用用に、氷酢酸でｐＨ５．５に調整された、２．７３ｍｇ／ｍｌ酢酸ナトリウム三水和物、４５ｍｇ／ｍｌマンニトール、０．０２ｍｇ／ｍｌ二ナトリウムＥＤＴＡ二水和物、０．２ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０中に、１０ｍｇ／ｍｌの抗体を含有している。他の実施形態では、製剤は、例えば、皮下または皮内適用用に、５０ｍｇ／ｍｌの抗体、氷酢酸でｐＨ５．５に調整された、２．７３ｍｇ／ｍｌ酢酸ナトリウム三水和物、４５ｍｇ／ｍｌマンニトール、０．０２ｍｇ／ｍｌ二ナトリウムＥＤＴＡ二水和物、０．４ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０を含有している。用量の値は、緩和するべき状態のタイプおよび重度に応じて変動しうることに留意するべきである。いかなる特定の対象に関しても、特定の投与計画は、時間がたつにつれて、個体の必要性、およびその組成物の投与を管理または監督する人の専門的な判断に従って調整されるべきであること、ならびに本明細書に記載した用量範囲は、専ら例示的なものであり、特許請求の組成物の範囲または実施を限定するものではないことをさらに理解するべきである。
【００５９】
好ましい実施形態では、約５．０から約６．５までの範囲のｐＨを有し、約１ｍｇ／ｍｌから約２００ｍｇ／ｍｌの抗体、約１ｍＭから約１００ｍＭのヒスチジン緩衝剤、約０．０１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、約１００ｍＭから約４００ｍＭのトレハロース、および約０．０１ｍＭから約１．０ｍＭの二ナトリウムＥＤＴＡ二水和物を含む無菌水溶液として、製剤中で、抗体を投与する。
【００６０】
本発明の別の態様は、本発明の抗ＭＡｄＣＡＭ抗体もしくは抗体部分、またはそのような抗体を含む組成物を含むキットを提供する。キットは、上記抗体または組成物に加えて、診断または治療薬を含みうる。キットは、診断または治療方法で使用するための説明書を含みうる。好ましい実施形態では、キットは、抗体またはそれを含む組成物と、以下に記述する方法で使用できる診断薬とを含んでいる。別の好ましい実施形態では、キットは、抗体またはそれを含む組成物と、以下に記述する方法で使用できる１つまたは複数の治療薬とを含んでいる。
【００６１】
本発明の核酸分子は、それを必要とする患者に、遺伝子療法を介して投与することができる。治療は、ｉｎ  ｖｉｖｏのものでも、ｅｘ  ｖｉｖｏのものでもよい。好ましい実施形態では、重鎖および軽鎖の両方をコードする核酸分子を患者に投与する。さらに好ましい実施形態では、Ｂ細胞の染色体中に安定に組み込まれるように、上記核酸分子を投与する。それは、これらの細胞が抗体の産生に特化され細胞だからである。好ましい実施形態では、Ｂ前駆細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで形質移入または感染させ、それを必要とする患者に再移植する。別の実施形態では、対象とする細胞型を感染させることが知られている組換え体ウイルスを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで、前駆Ｂ細胞または他の細胞を感染させる。遺伝子療法に使用される典型的なベクターには、リポソーム、プラスミド、およびウイルスベクターが含まれる。例示的ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスである。ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏのいずれかにおける感染の後、処置された患者から試料採取し、当技術分野で知られているか、もしくは本明細書中で論じられた任意のイムノアッセイを用いることによって、抗体発現のレベルをモニターすることができる。
【００６２】
好ましい実施形態では、上記遺伝子療法は、抗ＭＡｄＣＡＭ抗体の重鎖またはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子を投与するステップと、上記核酸分子を発現させるステップとを含む。別の実施形態では、上記遺伝子療法は、抗ＭＡｄＣＡＭ抗体の軽鎖またはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子を投与するステップと、上記核酸分子を発現させるステップとを含む。より好ましい方法では、上記遺伝子療法は、本発明の抗ＭＡｄＣＡＭ抗体の重鎖またはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子、および軽鎖またはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子を投与するステップと、上記核酸分子を発現させるステップとを含む。上記遺伝子療法は、別の抗炎症剤または免疫調節剤を投与するステップも含みうる。
【００６３】
本発明の別の態様は、患者において、本発明の抗体の異常な結合が起こるかどうか試験することによって、本発明の抗体が薬物として有用であろう状態を診断する方法である。これは、エックス線分析、ガンマシンチグラフィー、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、ポジトロン放射断層撮影、またはコンピューター断層撮影（ＣＴ）など、当業者に周知な様々な画像処理技術を用いて実施できる。
【００６４】
本発明の１つまたは複数の抗ＭＡｄＣＡＭ阻害抗体は、ワクチンとして、またはワクチンに対するアジュバントとして使用でき、これが本発明の別の態様である。詳細には、ＭＡｄＣＡＭはリンパ球様組織で発現されるため、本発明の抗ＭＡｄＣＡＭ抗体の抗原を結合することによって、ワクチン抗原をリンパ球様組織に有利にターゲッティングすることができる。
【００６５】
本明細書中に別段の定義がない限り、本発明に関して使用されている科学用語および技術用語は、当業者によって通常に解釈される意味を有するものとする。さらに、文脈によって別段のことが要求されない限り、単数の用語には複数が含まれるものとし、複数の用語には単数が含まれるものとする。概して、本明細書に記載した細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子学、タンパク質および核酸化学、およびハイブリダイゼーションに関連して使用される用語およびこれらの技法は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されているものである。本発明の方法および技法は、概して、別段の指示がない限り、当技術分野で周知であり、本明細書全体で引用および議論された様々な一般的もしくはより専門的な参考文献に記載されている従来の方法に従って実施される。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社（米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）所在）（１９８９年）と、Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社（１９９２年）と、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社（米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）所在）（１９９０年）とを参照のこと。酵素反応および精製技法は、製造業者の仕様書に従って、当技術分野で一般的に実施されている通り、または本明細書に記載の通りに行う。化学合成、分析化学、製剤、処方、および送達、ならびに患者の治療に、標準的な技法を用いる。
【００６６】
「ポリペプチド」という用語には、あるタンパク質配列の天然または人工的なタンパク質、タンパク質断片、およびポリペプチドアナログが包含される。ポリペプチドは、単量体でも、重合体でもよい。
【００６７】
「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」という用語は、その起源または由来した発生源に基づいて、（１）その天然状態においてそれに伴う天然随伴成分が附随していないか、（２）同じ種に由来する他のタンパク質を含まないか、（３）異なった種に由来する細胞によって発現されたか、（４）天然に存在しないタンパク質またはポリペプチドである。したがって、化学合成されたか、天然でそれが生じる細胞とは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、その天然随伴成分から「単離されている」であろう。タンパク質は、当技術分野で周知のタンパク質精製技法を用いて、単離によって、天然随伴成分を実質的に含まないものとすることもできる。
【００６８】
タンパク質またはポリペプチドは、試料の少なくとも約６０から７５％が単一の種類のポリペプチドを示す場合に、「実質的に純粋である」、「実質的に均一である」、または「実質的に精製されている」。ポリペプチドまたはタンパク質は、単量体でも多量体でもよい。実質的に純粋なポリペプチドまたはタンパク質は、一般的に、タンパク質試料の約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％Ｗ／Ｗ、より一般的には９５％を含むであろうし、好ましくは純度９９％超であろう。タンパク質の純度または均一性は、タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびそれに続く、当技術分野で周知の染色でゲルを染色した際の単一ペプチドバンドの可視化など、当技術分野で周知の多数の方法によって示すことができる。ある種の目的には、ＨＰＬＣまたは当技術分野で周知の他の精製法を用いることによって、より高い分解能を得ることができる。
【００６９】
「ポリペプチド断片」という用語は、本明細書で使用される場合、アミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は、天然に存在する配列における対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。一部の実施形態では、断片は、長さが少なくとも５、６、８または１０アミノ酸である。他の実施形態では、上記断片は、長さ少なくとも１４アミノ酸、より好ましくは長さ少なくとも２０アミノ酸、通常、長さ少なくとも５０アミノ酸、さらにより好ましくは長さ少なくとも７０、８０、９０、１００、１５０または２００アミノ酸である。
【００７０】
「ポリペプチドアナログ」という用語は、本明細書で使用される場合、アミノ酸配列の一部に実質的な同一性を有する少なくとも２５アミノ酸のセグメントを含み、かつ以下の特性、すなわち、（１）適した結合条件下におけるＭＡｄＣＡＭとの特異的な結合、（２）ＭＡｄＣＡＭへの、α４β７インテグリンおよび／またはＬセレクチンの結合を阻害する能力、または（３）ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＭＡｄＣＡＭの細胞表面発現を阻害する能力の少なくとも１つを有するポリペプチドを指す。通常、ポリペプチドアナログは、天然に存在する配列を基準にして、保存的アミノ酸置換（または挿入もしくは欠失）を含む。アナログは、通常、長さ少なくとも２０アミノ酸、好ましくは、長さ少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００アミノ酸以上であり、しばしば、天然に存在する完全長ポリペプチドと同じくらい長いことがある。
【００７１】
「免疫グロブリン」は、４量体分子である。天然に存在する免疫グロブリンでは、各４量体が２対の同一なポリペプチド鎖対から構成され、各対が１本の「軽鎖」（約２５ｋＤａ）と１本の「重鎖」（約５０〜７０ｋＤａ）とを有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識の原因となる、約１００アミノ酸から１１０アミノ酸以上の可変領域を含む。各鎖のＣ末端部分は、主としてエフェクター機能の原因となる、定常領域を定める。ヒト軽鎖は、κおよびλ軽鎖に分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεとして分類され、それぞれ、抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと定める。軽鎖内および重鎖内では、可変領域および定常領域が、約１２アミノ酸以上の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖は約１０アミノ酸以上の「Ｄ」領域も含む。全般的には、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ編集、第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ社（米国ニューヨーク州所在）（１９８９年））（すべての目的においてその全体を参照により本明細書に組み込む）を参照のこと。各軽鎖／重鎖対の可変領域が抗体結合部位を形成し、そのため、完全な免疫グロブリンは２箇所の結合部位を有する。
【００７２】
免疫グロブリン鎖は、比較的に良く保存されているフレームワーク領域（ＦＲ）が、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３箇所の超可変領域によって連結されているという同一の一般構造を示す。各対の２本の鎖からのＣＤＲは、フレームワーク領域によって整列され、エピトープ特異的な結合部位を形成する。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖および重鎖の両方は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４というドメインを含む。各ドメインへのアミノ酸の帰属は、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれている、Ｋａｂａｔ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、米国メリーランド州ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）（１９８７年および１９９１年））またはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１−９１７（１９８７年）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７８−８８３（１９８９年）の定義に従っている。
【００７３】
「抗体」という用語は、特異的な結合に関して完全な抗体と競合する完全な免疫グロブリンまたはその抗原結合部分を指す。一部の実施形態では、抗体は、その抗原結合部分である。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技法、または完全な抗体の酵素的もしくは化学的切断によって産生することができる。抗原結合部分には、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ディアボディー、ならびにそのポリペプチドに特異的抗原結合を与えるのに十分な、免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドが含まれる。Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、Ｃｌ、およびＣＨ１ドメインからなる一価の断片であり；Ｆ（ａｂ）２断片は、ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であり；Ｆｄ断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなり；Ｆｖ断片は、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなり；ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４−５４６（１９８９年））はＶＨドメインからなる。この用語には、ペグ化抗体または酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）、放射性同位元素、ビオチン、蛍光標識、および他のものなどの検出可能部分に結合した抗体など、上記抗体の改変バージョンも含まれるものとする。
【００７４】
本明細書で使用される場合、例えば、１．７．２、１．８．２、６．１４．２、６．３４．２、６．６７．１、６．７７．２、７．１６．６、７．２０．５、７．２６．４、９．８．２と呼ばれる抗体は、同じ名前のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体である。例えば、抗体１．７．２は、ハイブリドーマ１．７．２によって産生される。６．２２．２−ｍｏｄ、６．３４．２−ｍｏｄ、６．６７．１−ｍｏｄ、６．７７．１−ｍｏｄ、または７．２６．４−ｍｏｄと呼ばれる抗体は、その配列が対応する親から、部位特異的変異導入によって改変されているモノクローナル抗体である。
【００７５】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬおよびＶＨ領域が単一タンパク質鎖となるのを可能にする合成リンカーを介して、それらが一価分子を形成するように対合されている抗体である（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３−４２６（１９８８年）およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９−５８８３（１９８８年））。ディアボディーは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一ペプチド鎖上に発現されているが、同一鎖上の２つのドメイン間で対合するのを可能にするには短過ぎるリンカーを用いており、それによって、それらのドメインが別の鎖の相補的なドメインと対合するのを強制し、２箇所の抗原結合部位を生成させる二価の二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４８（１９９３年）、およびＰｏｌｊａｋ、Ｒ．Ｊ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２：１１２１−１１２３（１９９４年）を参照）。本発明の抗体に由来する１つまたは複数のＣＤＲを、共有結合または非共有結合によって分子に組み入れて、それを、ＭＡｄＣＡＭに特異的に結合するイムノアドヘシンにすることができる。イムノアドヘシンは、より大きなポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲに組み入れても、共有結合によって別のポリペプチド鎖にＣＤＲを連結させても、または非共有結合によってＣＤＲを組み入れてもよい。上記ＣＤＲは、イムノアドヘシンが、対象とする特定の抗原に特異的に結合するのを可能にする。
【００７６】
抗体は、１つまたは複数の結合部位を有していてもよい。複数の結合部位が存在する場合、それら結合部位は、相互に同一であっても、相違していてもよい。例えば、天然に存在する免疫グロブリンは、２箇所の同一な結合部位を有し、一本鎖抗体またはＦａｂ断片は、１箇所の結合部位を有し、一方、「二重特異性」または「二機能性」抗体（ディアボディー）は、２箇所の異なった結合部位を有する。
【００７７】
「単離された抗体」は、（１）その天然状態でそれに伴っている、他の天然随伴の抗体を含めた天然随伴成分を伴っていない抗体、（２）同一種に由来する他のタンパク質を含まない抗体、（３）異なった種に由来する細胞によって発現される抗体、または（４）天然に存在しない抗体である。単離された抗体の例には、ＭＡｄＣＡＭを用いてアフィニティー精製された抗ＭＡｄＣＡＭ抗体、ハイブリドーマまたは他の細胞系によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生された抗ＭＡｄＣＡＭ抗体、およびトランスジェニック哺乳動物または植物から得られたヒト抗ＭＡｄＣＡＭ抗体が含まれる。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、可変および定常領域配列がヒト配列である抗体を意味する。この用語は、ヒト遺伝子に由来するが、例えば、可能な免疫原性を低減するため、親和性を増強するため、望ましくない折りたたみを起こしうるであろうシステインまたはグリコシル化部位を除去するために改変されている配列を有する抗体を包含する。この用語は、非ヒト細胞で組換え産生された、ヒト細胞の非典型的なグリコシル化を与えうるであろう抗体を包含する。この用語は、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の一部またはすべてを含むトランスジェニックマウスで産生された抗体も包含する。
【００７９】
一態様では、本発明は、ヒト化抗体を提供する。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒトでの免疫応答を回避または抑止するために、重鎖および軽鎖のフレームワークおよび定常ドメイン内の特定のアミノ酸に変異導入されている非ヒト種由来の抗体である。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト抗体由来の定常ドメインを、非ヒト種の可変ドメインに融合させることによって産生できる。ヒト化抗体をどのようにして作製するかに関する例は、米国特許第６０５４２９７号、第５８８６１５２号、および第５８７７２９３号明細書に見出すことができる。一部の実施形態では、本発明のヒト化抗ＭＡｄＣＡＭ抗体は、本発明の１つまたは複数のヒト抗ＭＡｄＣＡＭ抗体の１つまたは複数のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含む。
【００８０】
別の態様では、本発明は、「キメラ抗体」の使用を含む。一部の実施形態では、キメラ抗体は、ある抗体からの１つまたは複数の領域と、１つまたは複数の他の抗体からの１つまたは複数の領域とを含有する抗体を指す。好ましい実施形態では、１つまたは複数のＣＤＲが、本発明のヒト抗ＭＡｄＣＡＭ抗体に由来する。さらに好ましい実施形態では、すべてのＣＤＲが、本発明のヒト抗ＭＡｄＣＡＭ抗体に由来する。別の好ましい実施形態では、本発明の複数のヒト抗ＭＡｄＣＡＭ抗体に由来するＣＤＲを混合し、キメラ抗体中で適合させる。例えば、キメラ抗体は、第１のヒト抗ＭＡｄＣＡＭ抗体の軽鎖に由来するＣＤＲ１を含むものでもよく、それを第２のヒト抗ＭＡｄＣＡＭ抗体の軽鎖に由来するＣＤＲ２およびＣＤＲ３と結合させてもよく、さらに、重鎖由来のＣＤＲは、第３の抗ＭＡｄＣＡＭ抗体に由来するものでもよい。さらに、フレームワーク領域は、同一の抗ＭＡｄＣＡＭ抗体のものに由来するものでも、ヒト抗体など、１つまたは複数の異なった抗体に由来するものでも、ヒト化抗体に由来するものでもよい。
【００８１】
「中和抗体」、「阻害抗体」、またはアンタゴニスト抗体は、ＭＡｄＣＡＭへのα４β７もしくはα４β７発現細胞、または任意の他の認識リガンドもしくは認識リガンド発現細胞の結合を少なくとも約２０％阻害する抗体である。好ましい実施形態では、上記抗体は、ＭＡｄＣＡＭへのα４β７インテグリンまたはα４β７発現細胞の結合を少なくとも４０％、より好ましくは６０％、さらにより好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％低減する。結合の低減は、当業者に知られている任意の手段で測定でき、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ競合結合アッセイで測定される。ＭＡｄＣＡＭへのα４β７発現細胞の結合低減の測定例を実施例１に示す。
【００８２】
抗体の断片またはアナログは、当業者ならば、この明細書の教示に従って容易に調製できる。断片またはアナログの好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能ドメインの境界近傍に存在する。構造的および機能的ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを、公共または占有の配列データベースと比較することによって同定できる。配列モチーフまたは既知の構造および／または機能を有する他のタンパク質に存在する予測されたタンパク質立体配座ドメインを同定するには、コンピューター化された比較法を用いることが好ましい。既知の三次元構造に折りたたまれるタンパク質配列を同定する方法は公知である（Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３：１６４（１９９１年））。
【００８３】
「ｋｏｆｆ」という用語は、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に関する、解離速度定数を指す。
【００８４】
「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体抗原相互作用の解離定数を指す。抗体は、その解離定数が≦１μＭである場合、好ましくは≦１００ｎＭである場合、最も好ましくは≦１０ｎＭである場合に、抗原に結合すると言われる。
【００８５】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合できるか、または他の方法で分子と相互作用できるいかなるタンパク質決定基も包含する。通常、エピトープ決定基は、アミノ酸または糖側鎖など、分子の化学的に活性な表面配置からなり、通常、特定の三次元構造特性および特定の荷電特性を有する。エピトープは、「直鎖状」でも、「コンフォメーションナル」でもよい。直鎖状エピトープでは、タンパク質と相互作用分子（抗体など）との相互作用点のすべてが、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直鎖状に存在する。コンフォメーションナルエピトープでは、相互作用点が、タンパク質上の、相互に離れたアミノ酸残基にまたがって存在する。
【００８６】
本明細書で使用される場合、従来の２０種のアミノ酸、およびそれらの簡略名は慣例的用法に従う。参照により本明細書に組み込まれている、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（第２版、Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編集、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社、米国マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）所在（１９９１年））を参照のこと。従来の２０種のアミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）、α−，α−二置換アミノ酸などの非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の通常にはないアミノ酸も、本発明のポリペプチドに適した成分でありうる。通常にはないアミノ酸の例には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、ｓ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば−４ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書で使用されるポリペプチド表記法では、標準的用法および慣習に従って、左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシ末端方向である。
【００８７】
本明細書で指す「ポリヌクレオチド」という用語は、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチド、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれか、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾型の重合体型を意味する。この用語には、ＤＮＡの一本鎖形態および二本鎖形態が含まれる。
【００８８】
「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ゲノムｃＤＮＡもしくは合成起源のポリヌクレオチド、またはこれらのなんらかの組合せを意味するであろう。「単離されたポリヌクレオチド」は、その起源に関して、（１）「単離されたポリヌクレオチド」が天然で存在するポリヌクレオチドのすべてまたは一部を伴っていないか、（２）それが天然では連結されていないポリヌクレオチドに作動可能に連結しているか、または、（３）天然では、より大きな配列の一部として存在しない。
【００８９】
本明細書で指す「オリゴヌクレオチド」という用語には、天然存在および非天然存在のオリゴヌクレオチド結合によって相互に連結された、天然存在のヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチドは、概ね、２００塩基以下の長さを含むポリヌクレオチド部分集合である。オリゴヌクレオチドは、長さ１０から６０塩基であることが好ましく、長さ１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０から４０塩基であることが最も好ましい。オリゴヌクレオチドは、例えばプローブ用には、通常、一本鎖であるが、例えば遺伝子変異体の構築での使用には、オリゴヌクレオチドは２本鎖でありうる。本発明のオリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかでありうる。
【００９０】
本明細書で指す「天然存在のヌクレオチド」という用語には、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドが含まれる。本明細書で指す「修飾ヌクレオチド」という用語には、修飾または置換糖基などを有するヌクレオチドが含まれる。本明細書で指す「オリゴヌクレオチド結合」という用語には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホラニラダート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、ホスホロアミデートなどのオリゴヌクレオチド結合が含まれる。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９０８１（１９８６年）；Ｓｔｅｃら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７（１９８４年）；Ｓｔｅｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６：３２０９（１９８８年）；Ｚｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、６：５３９（１９９１年）；Ｚｏｎら、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、８７〜１０８頁（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編集、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ社、英国オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）（１９９１年））；Ｓｔｅｃら、米国特許第５１５１５１０号明細書；ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０：５４３（１９９０年）を参照のこと。これらの開示を参照により本明細書に組み込む。望ましい場合には、オリゴヌクレオチドは検出用の標識を含みうる。
【００９１】
「作動可能に連結している」配列には、対象とする遺伝子と隣接した発現調節配列と、トランスまたは距離を置いて作用して、対象とする遺伝子を制御する発現調節配列との両方が含まれる。「発現調節配列」という用語は、本明細書で使用される場合、それらが連結されているコード配列の発現およびプロセッシングに作用するのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現調節配列には、適切な転写開始配列、終止配列、プロモーター配列、およびエンハンサー配列；スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的ＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定させる配列；翻訳効率を増強する配列（すなわちコーザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに望ましい場合には、タンパク質分泌を増強する配列が含まれる。そのような調節配列の性質は、宿主生物に応じて異なり、原核生物では、そのような調節配列は概ねプロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み、真核生物では、そのような調節配列は概ねプロモーターおよび転写終結配列を含む。「調節配列」という用語は、最小限、その存在が発現およびプロセシングに必須である全構成要素を含むものであることが意図されており、その存在が有利である追加構成要素、例えばリーダー配列および融合パートナー配列も含みうる。
【００９２】
「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すものとする。ベクターの１タイプが「プラスミド」であり、これは、その中に追加ＤＮＡセグメントを連結できる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターがウイルスベクターであり、このベクターでは、追加ＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中に連結できる。ある種のベクターは、それらが導入された宿主細胞内で自律的に複製できる（例えば、細菌複製開始点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞内に導入した際に、宿主細胞のゲノム中に組み込むことができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが作動可能に連結している遺伝子の発現を指示することができる。本明細書では、そのようなベクターを「組換え体発現ベクター」（または単純に「発現ベクター」）と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技法で有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態にある。プラスミドは、最も一般的に使用されているベクター形態であるので、本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」とを同義的に使用できる。しかし、本発明は、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）など、同等な機能を果たす、発現ベクターの他の形態も含むものとする。
【００９３】
「組換え体宿主細胞」（または単純に「宿主細胞」）という用語は、本明細書で使用される場合、その中に組換え体発現ベクターが導入されている細胞を指すものとする。そのような用語は、特定の対象細胞を指すのみではなく、そのような細胞の子孫も指すものとされていることを理解するべきである。変異または環境的影響のいずれかにより、後続の世代ではある種の改変が起こりうるので、そのような子孫は、実際には親細胞とは同一でない可能性があるが、本明細書で使用される場合、それらは依然として「宿主細胞」という用語に包含されている。
【００９４】
「選択的にハイブリッド形成する」という用語は、本明細書では、検出可能かつ特異的に結合することを意味する。本発明によるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびそれらの断片は、測定可能な量の非特異的な核酸に対する検出可能な結合を最小にするハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、核酸鎖に選択的にハイブリッド形成する。当技術分野で知られており、本明細書に論じられているように、選択的なハイブリダイゼーション条件を実現するのに、「高ストリンジェンシー」条件または「高度にストリンジェントな」条件を用いることができる。「高ストリンジェンシー」条件または「高度にストリンジェントな」条件の例は、あるポリヌクレオチドを別のポリヌクレオチドと共に、６×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、５０％ホルムアミド、５×デンハルト試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡのハイブリダイゼーション緩衝液中で、ハイブリダイゼーション温度４２℃で、１２〜１６時間インキュベートし、その後、１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの洗浄緩衝剤を用いて、５５℃で２回洗浄する方法であり、この際、一方のポリヌクレオチドは、膜などの固体表面に固定されていてもよい。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上、９．５０〜９．５５頁を参照のこと。
【００９５】
ヌクレオチド配列に関する文脈において、「パーセント配列同一性」という用語は、最大の一致が得られるようにアラインメントさせた際に、２つの配列で同一である残基を指す。配列同一性比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約１８ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３６、または４８ヌクレオチド以上の範囲におよぶものでありうる。当技術分野には、知られているヌクレオチド配列同一性を測定するのに使用できる多数の異なったアルゴリズムが存在する。例えば、Ａｃｃｅｌｒｙｓ社製（米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）所在）、ウィスコンシンパッケージバージョン１０．３のプログラムであるＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ、またはＢｅｓｔｆｉｔを用いて、ポリヌクレオチド配列を比較することができる。ＦＡＳＴＡは、クエリー配列と検索配列との間における最良オーバーラップ領域のアラインメントおよび配列同一性パーセントを提供し、これには例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３プログラムが含まれる（Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８３：６３−９８（１９９０年）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１３２：１８５−２１９（２０００年）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２６６：２２７−２５８（１９９６年）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７６：７１−８４（１９９８年）；これらの開示を参照により本明細書に組み込む）。別段の指定がない限り、特定のプログラムまたはアルゴリズム用のデフォルトパラメータを使用する。例えば、ヌクレオチド配列間の配列同一性パーセントは、参照により本明細書に組み込まれているウィスコンシンパッケージバージョン１０．３中に提供されている、デフォルトパラメータ（ワード長は６、スコア行列にはＮＯＰＡＭファクター）を用いたＦＡＳＴＡを使用して、またはデフォルトパラメータを用いたＧａｐを使用して測定できる。
【００９６】
ヌクレオチド配列への言及は、別段の指定がない限り、その相補配列を包含する。したがって、特定の配列を有する核酸分子への言及は、その相補配列を有する相補鎖を包含するものと理解するべきである。
【００９７】
分子生物学分野では、研究者が「配列同一性パーセント」、「配列類似性パーセント」、および「配列相同性パーセント」という用語を同義的に使用する。この出願では、これらの用語は、ヌクレオチド配列のみに関して同じ意味を有するものとする。
【００９８】
「実質的な類似性」または「実質的な配列類似性」という用語は、核酸またはその断片について言及する場合、適切なヌクレオチド挿入または欠失を有するように、別の核酸（またはその相補鎖）と最適にアラインメントさせた際に、上記に論じたような、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐなどのよく知られた配列同一性アルゴリズムによる測定で、ヌクレオチド塩基の少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％でヌクレオチド配列同一性があることを示す。
【００９９】
ポリペプチドに適用される場合、「実質的な同一性」という用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトのギャップウェイトを用いたＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムなどによって最適にアラインメントされた際に、少なくとも７５％または８０％配列同一性、好ましくは少なくとも９０％または９５％配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９９％配列同一性を共有することを意味する。同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって相違していることが好ましい。「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が類似した化学特性（例えば電荷量または疎水性度）を有する側鎖（Ｒ群）を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させないであろう。２つ以上アミノ酸配列が保存的置換によって相互に相違している場合、置換の保存的性質に関して修正するために、配列同一性パーセント、すなわち類似性の度合いを上方に調整することができる。この調節を行う手段は、当業者には周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４：３０７−３１（１９９４年）を参照のこと。類似した化学特性をもつ側鎖を有するアミノ酸の群の例には、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；２）脂肪族−ヒドロキシ基側鎖：セリンおよびトレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン；ならびに６）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが含まれる。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【０１００】
別法では、保存的置換は、参照により本明細書に組み込まれている、Ｇｏｎｎｅｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６：１４４３−４５（１９９２年）に開示されている、ＰＡＭ２５０対数尤度行列における正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的」な置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列における非負の値を有する任意の変化である。
【０１０１】
ポリペプチドの配列類似性は、通常、配列分析ソフトウェアを用いて測定する。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含めた、様々な置換、欠失、および他の改変に割り当てられた類似性の尺度を用いて、類似配列を対応させる。例えば、ＧＣＧは、「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムを含んでおり、これらは、異なった種の生物に由来する相同ポリペプチドなど、密接に関連したポリペプチド間、または野生型タンパク質と、その変異タンパク質との間における配列相同性または配列同一性を測定するのに、デフォルトパラメータ用いて使用することができる。例えば、ウィスコンシンパッケージバージョン１０．３を参照のこと。デフォルトまたは推奨パラメータを用いて、ウィスコンシンパッケージバージョン１０．３の中のプログラムであるＦＡＳＴＡを使用することによっても、ポリペプチド配列を比較することができる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列と検索配列との間における最良オーバーラップ領域のアラインメントおよび配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０年）；Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００年））。様々な生物からの多数の配列を含有するデータベースと、本発明の配列を比較する際の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを用いた、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、とりわけｂｌａｓｔｐおよびｔｂｌａｓｔｎである。参照により本明細書に組み込まれている、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０頁（１９９０年）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２（１９９７年）を参照のこと。
【０１０２】
相同性に関して比較されるポリペプチド配列の長さは、概ね少なくとも約１６アミノ酸残基、通常は少なくとも約２０残基、より通常には少なくとも約２４残基、典型的には少なくとも約２８残基、好ましくは約３５残基超であろう。多数の異なった生物に由来する配列を含有するデータベースを探索する場合、アミノ酸配列を比較することが好ましい。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「標識」または「標識された」という用語は、その抗体の中に別の分子が組み込まれていることを指す。一実施形態では、標識が検出可能なマーカー、例えば、放射性同位元素標識されているアミノ酸の組み込み、または標識されているアビジン（例えば、蛍光標識または光学的方法もしくは比色法によって検出できる酵素活性を含有するストレプトアビジン）で検出できるビオチニル部分のポリペプチドへの結合である。別の実施形態では、標識またはマーカーが治療薬、例えば薬物複合体または毒素でありうる。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野で知られており、使用できる。ポリペプチド用の標識の例には、放射性同位元素または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、２次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、２次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ標識）、ガドリニウム錯体などの磁気物質、百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイシンなどの毒素ならびにこれらのアナログまたはホモログが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、潜在的な立体障害を軽減するために、様々な長さのスペーサアームによって標識を結合させる。
【０１０４】
以下の実施例は、例示のみを目的とするものであり、いかなる方法でも、本発明の範囲を限定するものではないと理解するべきである。
【実施例】
【０１０５】
（実施例１）
潜在的免疫原性エピトープの同定
ＣＤ４＋Ｔ（ヘルパー）細胞エピトープは、タンパク質抗原に対するＴ細胞依存性免疫応答を引き起こすのに極めて重要である。Ｔ細胞依存性免疫応答の開始中、ＭＨＣクラスＩＩの溝に結合した線状ペプチドの形態にあるタンパク質抗原を、樹状細胞が捕捉、プロセンシング、および提示する。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞による、ＭＨＣペプチド／ＩＩ複合体へのＴ細胞性受容体の結合は、同時刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−６）を産生することによって、Ｂ細胞への直接的細胞間接触（例えばＣＤ４０）によって、その中でＴ細胞が増殖、分化、および補助を行うカスケードの引き金となりうる。Ｂ細胞がそれらの免疫グロブリン鎖を再編成して、Ｔ細胞によって認識されたのと同じ抗原に対する高親和性のアイソタイプ転換免疫グロブリンを産生する２次Ｂ細胞リンパ球新生中では、Ｔ細胞からの継続的な補助が必要である。タンパク質ベースの治療効果を中和できるのは、Ｂ細胞産生の免疫グロブリンの結合である。治療用抗体中に含有されているＴ細胞エピトープの同定は、ヒトでの免疫原性を予測するのに重要である。それらが同定された場合、部位特異的変異導入によって、ＭＨＣ−ＩＩアンカーの除去操作を行って、親の治療活性を保持している非免疫原性付加体を生成することが望ましい場合がある。
【０１０６】
潜在的Ｔ細胞エピトープを同定するために、完全にヒト抗体である６種類の抗ＭＡｄＣＡＭ  ｍＡｂ、すなわち６．２２．２−ｍｏｄ、６．３４．２−ｍｏｄ、６．６７．１−ｍｏｄ、６．７７．１−ｍｏｄ、７．１６．６、および９．８．２（以前に、国際公開第２００５／０６７６２０号パンフレットに記載されている；７．１６．６および９．８．２を分泌するハイブリドーマは、２００３年９月９日に、ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、Ｈ．Ｐ．Ａ．（ＣＡＭＲ，Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ＳＰ４  ０ＪＧ（英国）所在）に、以下の寄託番号、すなわち７．１６．６：寄託番号０３０９０９０９；９．８．２：寄託番号０３０９０９１２で寄託された）のｅｘ  ｖｉｖｏ評価を行い、それらの免疫原性を決定した。６．２２．２、６．３４．２、６．６７．１、６．７７．１、７．１６．６、および９．８．２の、重鎖およびκ軽鎖対応物のフレームワーク領域（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含する、配列オーバーラップを有するペプチド（純度＞９０％の１５量体）を、標準法を用いて合成した。生理的な比率のＣＤ４＋細胞および抗原提示細胞の供給源を与える、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇ＰＭＳＣの複数の培養物中で、４０人のヒトドナーのパネルに対して、これらのペプチドをスクリーニングした。これらの４０人の健常ドナーは、ＨＬＡ−ＤＲタイピングベースのスクリーニングに関して選択され、全世界の人口で発現されているＤＲ対立遺伝子の＞８０％を代表する。個々のペプチド（１および５μＭ）は、２つの陽性対照ペプチドと併せて、６つ組でスクリーニングした。細胞をペプチドで７日間処置し、その後、３Ｈ−チミジン（０．５μＣｉ／ウェル；１８時間）の取込みによって増殖を測定した。放射標識の取込みは、シンチレーション計測で測定し、以下の通りの刺激指数（ＳＩ）で表した。
ＳＩ＝試験ペプチドのｃｐｍ／未処置対照のＣｐｍ
【０１０７】
Ｔ細胞性エピトープは、２人以上の独立したドナーで、ＳＩ＞２を与えるペプチドと定義する。
【０１０８】
ペプチドは、ペプチド誘発増殖応答に加えて、ＰＢＭＣドナーに関するＥＬＩＳＰＯＴアッセイでも試験した。この方法は、放出されたサイトカインを捕捉し、全集団中における活性化された細胞の定量化を可能にする。上記ペプチドエピトープによって刺激されたＴ細胞を同定するために、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞によって分泌される主要サイトカインであるＩＬ−２の放出を選択した。増殖アッセイと同様に、評価の前に、ドナー試料をペプチドと共に７日間インキュベートした。分析では、刺激されたＴ細胞それぞれがＩＬ−２放出のスポットとして表された。ドナーとペプチド（１および５μＭ）との組合せのそれぞれで、スポット／ウェルの数を決定し、刺激指数を以下の比率として計算した。
ＳＩ＝（試験ペプチドのスポット／ウェル）／（未処置対照のスポット／ウェル）
【０１０９】
一般に、増殖で観測される反応とＥＬＩＳＰＯＴアッセイで観測される反応との間には、良いオーバーラップがあるはずである。しかし、２つのアッセイ間における反応の速度論および大きさの相違によって、ある程度の相関関係の欠落がもたらされることがある。
【０１１０】
表１は、Ｔ細胞増殖およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイで得られたデータを記載する。これらの分析に基づいて、Ｔ細胞エピトープは、６．２２．２−ｍｏｄ重鎖のＦＲ２／ＣＤＲ２領域；６．３４．２−ｍｏｄ軽鎖のκ軽鎖のＣＤＲ２、ＦＲ３／ＣＤＲ３、およびＣＤＲ３；６．６７．１−ｍｏｄκ軽鎖のＦＲ３／ＣＤＲ３；６．７７．１−ｍｏｄ重鎖のＣＤＲ３；７．１６．６重鎖のＣＤＲ２および７．１６．６κ軽鎖のＦＲ３／ＣＤＲ３；ならびに９．８．２重鎖のＦＲ３／ＣＤＲ３で同定された。
【０１１１】
表１．抗ＭＡｄＣＡＭ  ｍＡｂである６．２２．２−ｍｏｄ、６．３４．２−ｍｏｄ、６．６７．１−ｍｏｄ、６．７７．１−ｍｏｄ、７．１６．６、および９．８．２に由来する様々なペプチドと共にインキュベートされた、４０人の健常ボランティアからのＰＢＭＣにおけるＴ細胞増殖およびＩＬ−２産生の誘導。各ペプチドの配列が示されており、生殖系列配列と異なっている残基は太字になっている。
【０１１２】
【表１】
2009500390.tif 000005
【０１１３】
（実施例２）
７．１６．６の改変変種の性質決定
Ｔ細胞増殖およびＥＬＩＳＰＯＴ分析によって、ＭＡｄＣＡＭ  ｍＡｂである６．２２．２−ｍｏｄ、６．３４．２−ｍｏｄ、６．６７．１−ｍｏｄ、６．７７．１−ｍｏｄ、７．１６．６、および９．８．２の中にある多くの潜在的Ｔ細胞性エピトープを同定した。７．１６．６のκ軽鎖中の主要Ｔ細胞エピトープを、製造業者の指示に従った部位特異的変異導入（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）によって生殖系列に復帰させた。改変型を生成するのに用いたオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。プライマー対７．１６．６＿Ｖ５および７．１６．６＿Ｖ３は、７．１６．６＿Ｖ付加体（ＶＨ＝野生型；ＶＬ＝Ｉ９０Ｖ）を生成するのに用いた。７．１６．６  ＿Ｓ５および７．１６．６＿Ｓ３は、７．１６．６＿Ｓ付加体（ＶＨ＝野生型；ＶＬ＝Ｎ９６Ｓ）を生成するのに用いた。７．１６．６  ＿ＶＳ５および７．１６．６＿ＶＳ３は、７．１６．６＿ＶＳ付加体（ＶＨ＝野生型；ＶＬ＝Ｉ９０Ｖ、Ｎ９６Ｓ）を生成するのに用いた。７．１６．６重鎖ｃＤＮＡを含有するｐＥＥ１２．１ベクター（国際公開第２００５／０６７６２０号パンフレットに記載）。簡潔には、それぞれの重鎖および軽鎖配列を含有する機能的な真核細胞発現ベクターを、以下の通りに構築した。すなわち、所定のｐＥＥ６．１からＮｏｔＩ／ＳａｌＩで重鎖ｃＤＮＡインサートを切り出し、精製された断片を、所定のバージョンのκ軽鎖配列を含有する対応するｐＥＥ１２．１ベクター中の同一部位にクローニングした。これをＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＰＣＲの鋳型として用いた。
７．１６．６＿Ｖ５  ＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣ
７．１６．６＿Ｖ３  ＧＣＡＴＧＣＡＧＴＡＡＴＡＡＡＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＣＴＣＡＧＣＣ
７．１６．６＿Ｓ５  ＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＡＧＴＡＴＡＣＡＧＣＴＴＣＣＧＴＧＧＡＣ
７．１６．６＿Ｓ３  ＧＴＣＣＡＣＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＴＡＣＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＧ
７．１６．６＿ＶＳ５  ＧＧＡＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＡＧＴＡＴＡＣＡＧＣＴＴＣＣＧ
７．１６．６＿ＶＳ３  ＣＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＴＡＣＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＧＴＡＡＴＡＡＡＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＣ
【０１１４】
親７．１６．６重鎖と共に、７．１６．６＿Ｖ、７．１６．６＿Ｓ、および７．１６．６＿ＶＳの改変κ軽鎖を含有するｐＥＥ１２．１コンストラクトをＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＰＣＲ産物から生成し、完全に配列確認した。７．１６．６＿Ｌ変種（ＶＨ＝Ｖ６４Ｌ、ＶＬ＝野生型）を生成するのに、以下オリゴヌクレオチドおよびＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＰＣＲを使用して、同様なＰＣＲアプローチを用いた。
７．１６．６＿Ｌ５  ＣＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＴＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣ
７．１６．６＿Ｌ３  ＧＴＧＡＣＴＣＴＧＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＴＧＣＡＴＡＧ
【０１１５】
７．１６．６＿Ｌおよび７．１６．６＿ＬＶＳ（ＶＨ＝Ｖ６４Ｌ；ＶＬ＝Ｉ９０Ｖ、Ｎ９６Ｓ）変種を生成するのに、国際公開第２００５／０６７６２０号パンフレットに記載の通りに、親κ軽鎖および７．１６．６＿ＶＳ変種を用いた。適切なコンストラクトで一過的に形質移入されたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＨＥＫ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から、組換え体物質をアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
【０１１６】
精製された抗体は、ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質を用いた結合アッセイで活性を評価した。
【０１１７】
ＭＡｄＣＡＭの成熟型細胞外免疫グロブリン様ドメインをコードするＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ  ｃＤＮＡ断片を、ｐＩＮＣＹ  Ｉｎｃｙｔｅクローン（３２７９２７６）から切り出し、ｐＩＧ１ベクター（Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｄ．Ｌ．（１９９３年）、「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｄ．Ａ．編集（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ社、英国オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）所在、９３〜１２７頁））のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングして、インフレームのＩｇＧ１  Ｆｃ融合体を生成させた。この結果得られたインサートをＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩで切り出し、ｐＣＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。ベクター中のＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ１  Ｆｃ  ｃＤＮＡの配列確認を行った。ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を以下に示す。
【０１１８】
【表２】
2009500390.tif 000006
下線部：シグナルペプチド
太字：ＭＡｄＣＡＭ細胞外ドメイン
【０１１９】
ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質ｃＤＮＡを含有するｐＣＤＮＡ３．１＋ベクターでＣＨＯ−ＤＨＦＲ細胞に形質移入し、ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質を発現する安定なクローンを、６００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８および１００ｎｇ／ｍＬメトトレキセートを含有するイスコブ（Ｉｓｃｏｖｅ）培地中で選択した。タンパク質発現のために、１０％低ＩｇＧウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社）、非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社）、２ｍＭグルタミン（Ｇｉｂｃｏ社）、ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ社）、１００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８および１００ｎｇ／ｍＬメトトレキサートを含有するイスコブ培地中で安定発現しているＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ１  Ｆｃ  ＣＨＯ細胞を、中空繊維バイオリアクターに播種し、濃縮培地上清を生成させるのに用いた。ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質は、採取された上清からアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。簡潔には、上清をＨｉＴｒａｐタンパク質Ｇセファロース（５ｍＬ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）カラムに添加し（２ｍＬ／ｍｉｎ）、２５ｍＭトリスｐＨ８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（５倍カラム容量）で洗浄し、１００ｍＭグリシンｐＨ２．５（１ｍＬ／ｍｉｎ）で溶出し、直ちに１ＭトリスｐＨ８で画分をｐＨ７．５に中和した。ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質を含有する画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定し、一緒にプールして、３５ｍＭ  ＢｉｓＴｒｉｓ  ｐＨ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌであらかじめ平衡化したセファクリルＳ１００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に添加した。ゲル濾過を０．３５ｍＬ／ｍｉｎで行い、約３×５ｍＬの画分にＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質のピークを収集した。これらの試料をプールし、３５ｍＭ  ＢｉｓＴｒｉｓ  ｐＨ６．５であらかじめ平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ（６ｍＬ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）カラムに添加した。このカラムを５倍カラム容量の３５ｍＭ  ＢｉｓＴｒｉｓ  ｐＨ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄し（６ｍＬ／ｍｉｎ）、ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質を３５ｍＭ  ＢｉｓＴｒｉｓ  ｐＨ６．５、４００ｍＭ  ＮａＣｌで４〜６ｍＬの画分中に溶出させた。この段階で、タンパク質は９０％純粋であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって約６８ｋＤの単一バンドとして移動した。免疫原として使用するため、その後のすべてのアッセイで使用するために、上記物質を、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０％グリセロール中に緩衝液交換し、アリコートとして−８０℃で保存した。
【０１２０】
精製されたＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質をダルベッコＰＢＳ中に含む４．５μｇ／ｍＬ溶液１００μＬを、９６ウェルのＢｌａｃｋ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ“Ｂ”丸底プレート（Ｄｙｎｅｘ社＃７８０５）に、４℃で終夜、吸着させた。その後、ＭＡｄＣＡＭのコーティングされたプレートを反転させ、過剰な液体を除去し、その後、１０％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、３７℃で少なくとも１時間ブロッキングした。この間に、トリパンブルー排斥アッセイを用いて、培養したＪＹ細胞を計数し（約８×１０５細胞／ｍＬであるべきである）、２０×１０６細胞／アッセイプレートを５０ｍＬ遠心分離管の中にピペットで移した。ＪＹ細胞は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社＃１０１０８−１６５）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社）で培養し、培養物が分化するのを防止するために、２〜３日毎に１〜２×１０５／ｍＬで播種した。遠心法（２４０ｇ）によって、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ社）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社）で細胞を２回洗浄し、最終細胞ペレットを、カルセインＡＭ添加用に、ＲＰＭＩ  １６４０中に２×１０６細胞／ｍＬに再懸濁した。ＤＭＳＯ中の１：２００希釈液（最終濃度約５μＭ）としてカルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社＃Ｃ３０９９）を細胞に添加し、インキュベーション（３７℃、３０分間）中は、細胞を光から保護した。この細胞インキュベーションステップ中に、試験するべき抗体を以下の通りに希釈した。単回用量試験には、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社＃Ａ３０５９）を含むＰＢＳ中に、抗体を最大３μｇ／ｍＬ（最終１μｇ／ｍＬ）に調製し；完全ＩＣ５０曲線用には、３μｇ／ｍＬ（最終１μｇ／ｍＬ）を最高濃度として、抗体を０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ／ＰＢＳ中に希釈し、次にプレート全体にわたって２倍希釈（１：２比）した。列の最終ウェルは総結合を測定するのに使用し、したがって０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含むＰＢＳを用いた。
【０１２１】
ブロッキングの後に、軽くたたいてプレートの内容物を除き、５０μＬの抗体／対照を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で２０分間インキュベートした。この間に、カルセイン添加したＪＹ細胞を、遠心法によって、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地で１回、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ／ＰＢＳで１回洗浄し、最終細胞ペレットを１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ／ＰＢＳ中に１×１０６／ｍＬに再懸濁した。１００μＬの細胞を丸底プレートの各ウェルに添加し、プレートを密封し、短時間遠心分離（１０００ｒｐｍ、２分間）し、その後、プレートを３７℃で４５分間インキュベートした。この時間の終わりに、Ｓｋａｔｒｏｎプレート洗浄器でプレートを洗浄し、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２  １４２０マルチラベルリーダーを用いて蛍光を測定した（励起λ４８５ｎｍ、発光λ５３５ｎｍ、上部から、プレートの底部から８ｍｍ、正常な発光開口で０．１秒間計測）。各抗体濃度に関して、結合パーセントを、いかなる抗体も存在しないときの最大蛍光反応から非特異的結合に関連した蛍光を引いたもののパーセンテージとして表した。ＩＣ５０値は、結合反応が、抗ＭＡｄＣＡＭ抗体の非存在下での反応の５０％まで低減する抗ＭＡｄＣＡＭ抗体濃度と定義する。＜０．１μｇ／ｍＬのＩＣ５０値で、ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ１  Ｆｃ融合体への、ＪＹ細胞の結合を阻害できた抗体は、有効なアンタゴニスト活性を有するものとし、ＭＡｄＣＡＭ−ＣＨＯ結合アッセイへと進行させた。
【０１２２】
ＩＣ５０値を表２に要約する（すべてのデータポイントがμｇ／ｍＬで与えられている）。
表２．抗ＭＡｄＣＡＭ抗体７．１６．６およびそれに由来する５クローンとの、ＭＡｄＣＡＭの相互作用のＫｄ、ｋａ、およびｋｄ値
＊は、これらの解離速度値がＢＩＡｃｏｒｅの下限（５×１０−６ｓ−１）のすぐ下にあることを示す。したがって、親和性（ＫＤ）値は、より正確には、
・  ７．１６．６では＜１５ｐＭ（＝５×１０−６／３．３×１０５）、
・  ７．１６．６＿Ｖでは＜２７．３ｐＭ（＝５×１０−６／１．８３×１０５）
と引用されるべきである。
他の４種の抗体の解離速度は測定器の限界内である。
【０１２３】
【表３】
2009500390.tif 000007
【０１２４】
これらの結果は、上記変種が依然として高親和性でＭＡｄＣＡＭに結合し、それが治療適用に十分に高いものであることを示している。
【０１２５】
７．１６．６、７．１６．６＿Ｖ、７．１６．６＿Ｓ、７．１６．６＿ＶＳ、７．１６．６＿Ｌ、および７．１６．６＿ＬＶＳは、フローサイトメトリーによって検出した際、ＭＡｄＣＡＭを発現するＣＨＯ細胞にも結合した。
【０１２６】
表２で示したＫｄ値は、以下の変更のもとに、本質的には国際公開第２００５／０６７６２０号の実施例ＩＩに記載の通りにＢＩＡｃｏｒｅによって測定した。
【０１２７】
試料注入
使用したフローセル：１を参照とした２または３を参照とした４
流速：１００μＬ／ｍｉｎ
注入時間：２分間
注入後の待ち時間：６０分間（＝解離時間）
注入サイクル：すべての濃度の３つ組、および緩衝液ブランクの注入６回
【０１２８】
再生方法
溶液／流速／注入時間：
【０１２９】
【表４】
2009500390.tif 000008
再生後の安定化時間：５分間
【０１３０】
（実施例３）
７．１６．６の変種を用いたカニクイザル組織の免疫組織化学染色
免疫組織化学は、本質的に、国際公開第２００５／０６７６２０号の実施例ＩＩＩに記載の通りに行った。結果を下記表３に要約する。
【０１３１】
【表５】
2009500390.tif 000009
【０１３２】
（実施例４）
６．２２．２、６．３４．２、６．６７．１、６．７７．１、および９．８．２の改変変種の性質決定
本明細書の実施例２に記載のもの、および国際公開第２００５／０６７６２０号パンフレットで言及されているものと同様な方法を用いて、表１に記載した、６．２２．２、６．３４．２、６．６７．１、６．７７．１および９．８．２の重要な潜在的Ｔ細胞エピトープの一部を、置換または欠失によって生殖系列に改変して、精製された組換え体６．２２．２−ｍｏｄ＿Ｖ（配列番号２）、６．３４．２＿ｍｏｄ＿ＳＳＱ（配列番号８）、６．６７．１−ｍｏｄ＿Ｙ（配列番号１４）、６．７７．１−ｍｏｄ＿ΔＡＳ（配列番号２２）、および９．８．２−ｍｏｄ＿ΔＲＧＡＹＨ，Ｄ（配列番号３６）鎖変種を生成させた。ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ１  Ｆｃ融合体：ＪＹ細胞結合アッセイにおける、６．２２．２−ｍｏｄ＿Ｖ（配列番号２および４）、６．３４．２＿ｍｏｄ＿ＳＳＱ（配列番号６および８）、６．６７．１−ｍｏｄ＿Ｙ（配列番号１４および２０）、６．７７．１−ｍｏｄ＿ΔＡＳ（配列番号２２および２４）、および９．８．２−ｍｏｄ＿ΔＲＧＡＹＨ，Ｄ（配列番号３６および３８）と呼ばれるｍＡｂのＩＣ５０効力を、それらの親対応物である６．２２．２、６．３４．２、６．６７．１、６．７７．１、および９．８．２ｍＡｂと比較して表４に示す。すべての改変変種が、それらの親ｍＡｂと同様なアンタゴニスト効力を維持していた
【０１３３】
【表６】
2009500390.tif 000010
【０１３４】
配列：
シグナルペプチド配列（またはそれをコードする塩基）の配列は、小文字で示し、下線を引いてある。可変領域は大文字である。定常領域は、大文字であり、タンパク質配列中に下線を引いてある。太字は、開示されている元の配列（国際公開第２００５／０６７６２０号パンフレット）から改変されている残基である。
【０１３５】
配列番号１
６．２２．２−ｍｏｄ＿Ｖ重鎖ヌクレオチド配列
【０１３６】
【表７】
2009500390.tif 000011
【０１３７】
配列番号２
６．２２．２−ｍｏｄ＿Ｖ重鎖予測タンパク質配列
【０１３８】
【表８】
2009500390.tif 000012
【０１３９】
配列番号３
６．２２．２−ｍｏｄ  κ軽鎖ヌクレオチド配列
【０１４０】
【表９】
2009500390.tif 000013
【０１４１】
配列番号４
６．２２．２−ｍｏｄ  κ軽鎖予測アミノ酸配列
【０１４２】
【表１０】
2009500390.tif 000014
【０１４３】
配列番号５
６．３４．２−ｍｏｄ重鎖ヌクレオチド配列
【０１４４】
【表１１】
2009500390.tif 000015
【０１４５】
配列番号６
６．３４．２−ｍｏｄ重鎖予測アミノ酸配列
【０１４６】
【表１２】
2009500390.tif 000016
【０１４７】
配列番号７
６．３４．２−ｍｏｄ＿ＳＳＱ  κ軽鎖ヌクレオチド配列
【０１４８】
【表１３】
2009500390.tif 000017
【０１４９】
配列番号８
６．３４．２−ｍｏｄ＿ＳＳＱ  κ軽鎖予測タンパク質配列
【０１５０】
【表１４】
2009500390.tif 000018
【０１５１】
配列番号９
６．３４．２−ｍｏｄ＿ＱＴ  κ軽鎖ヌクレオチド配列
【０１５２】
【表１５】
2009500390.tif 000019
【０１５３】
配列番号１０
６．３４．２−ｍｏｄ＿ＱＴ  κ軽鎖予測タンパク質配列
【０１５４】
【表１６】
2009500390.tif 000020
【０１５５】
配列番号１１
６．３４．２−ｍｏｄ＿ＳＳＱ，ＱＴ  κ軽鎖ヌクレオチド配列
【０１５６】
【表１７】
2009500390.tif 000021
【０１５７】
配列番号１２
６．３４．２−ｍｏｄ＿ＳＳＱ，ＱＴ  κ軽鎖予測タンパク質配列
【０１５８】
【表１８】
2009500390.tif 000022
【０１５９】
配列番号１３
６．６７．１−ｍｏｄ重鎖ヌクレオチド配列
【０１６０】
【表１９】
2009500390.tif 000023
【０１６１】
配列番号１４
６．６７．１−ｍｏｄ重鎖予測アミノ酸配列
【０１６２】
【表２０】
2009500390.tif 000024
【０１６３】
配列番号１５
６．６７．１−ｍｏｄ＿Ｙ  κ軽鎖ヌクレオチド配列
【０１６４】
【表２１】
2009500390.tif 000025
【０１６５】
配列番号１６
６．６７．１−ｍｏｄ＿Ｙ  κ軽鎖予測アミノ酸配列
【０１６６】
【表２２】
2009500390.tif 000026
【０１６７】
配列番号１７
６．６７．１−ｍｏｄ＿ＴΔＰ  κ軽鎖ヌクレオチド配列
【０１６８】
【表２３】
2009500390.tif 000027
【０１６９】
配列番号１８
６．６７．１−ｍｏｄ＿ＴΔＰ  κ軽鎖予測アミノ酸配列
【０１７０】
【表２４】
2009500390.tif 000028
【０１７１】
配列番号１９
６．６７．１−ｍｏｄ＿Ｙ，ＴΔＰ  κ軽鎖ヌクレオチド配列
【０１７２】
【表２５】
2009500390.tif 000029
【０１７３】
配列番号２０
６．６７．１−ｍｏｄ＿Ｙ，ＴΔＰ  κ軽鎖予測アミノ酸配列
【０１７４】
【表２６】
2009500390.tif 000030
【０１７５】
配列番号２１
６．７７．１−ｍｏｄ＿ΔＳ重鎖ヌクレオチド配列
【０１７６】
【表２７】
2009500390.tif 000031
【０１７７】
配列番号２２
６．７７．１−ｍｏｄ＿ΔＳ重鎖予測タンパク質配列
【０１７８】
【表２８】
2009500390.tif 000032
【０１７９】
配列番号２３
６．７７．１−ｍｏｄ  κ軽鎖ヌクレオチド配列
【０１８０】
【表２９】
2009500390.tif 000033
【０１８１】
配列番号２４
６．７７．１−ｍｏｄ  κ軽鎖予測アミノ酸配列
【０１８２】
【表３０】
2009500390.tif 000034
【０１８３】
配列番号２５
７．１６．６  重鎖ヌクレオチド配列
【０１８４】
【表３１】
2009500390.tif 000035
【０１８５】
配列番号２６
７．１６．６  重鎖予測タンパク質配列
【０１８６】
【表３２】
2009500390.tif 000036
【０１８７】
配列番号２７
７．１６．６＿Ｌ重鎖ヌクレオチド配列
【０１８８】
【表３３】
2009500390.tif 000037
【０１８９】
配列番号２８
７．１６．６＿Ｌ重鎖予測タンパク質配列
【０１９０】
【表３４】
2009500390.tif 000038
【０１９１】
配列番号２９
７．１６．６＿Ｖ  κ軽鎖ヌクレオチド配列
【０１９２】
【表３５】
2009500390.tif 000039
【０１９３】
配列番号３０
７．１６．６＿Ｖ  κ軽鎖予測タンパク質配列
【０１９４】
【表３６】
2009500390.tif 000040
【０１９５】
配列番号３１
７．１６．６＿Ｓ  κ軽鎖ヌクレオチド配列
【０１９６】
【表３７】
2009500390.tif 000041
【０１９７】
配列番号３２
７．１６．６＿Ｓ  κ軽鎖予測タンパク質配列
【０１９８】
【表３８】
2009500390.tif 000042
【０１９９】
配列番号３３
７．１６．６＿ＶＳ  κ軽鎖ヌクレオチド配列
【０２００】
【表３９】
2009500390.tif 000043
【０２０１】
配列番号３４
７．１６．６＿ＶＳ  κ軽鎖予測タンパク質配列
【０２０２】
【表４０】
2009500390.tif 000044
【０２０３】
配列番号３５
９．８．２＿ΔＲＧＡＹＨ，Ｄ重鎖ヌクレオチド配列
【０２０４】
【表４１】
2009500390.tif 000045
【０２０５】
配列番号３６
９．８．２＿ΔＲＧＡＹＨ，Ｄ重鎖予測タンパク質配列
【０２０６】
【表４２】
2009500390.tif 000046
【０２０７】
配列番号３７
９．８．２−ｍｏｄ  κ軽鎖ヌクレオチド配列
【０２０８】
【表４３】
2009500390.tif 000047
【０２０９】
配列番号３８
９．８．２−ｍｏｄ  κ軽鎖予測タンパク質配列
【０２１０】
【表４４】
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【国際調査報告】
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