(57)【要約】  本発明は、サイモシンβ４（Ｔβ４）誘導体、Ｇｌｙ−Ｔβ４及びＡｌａ−Ｔβ４に関する。更に本発明は、前記Ｔβ４誘導体を含む医薬組成物に関する。本発明は前記Ｔβ４誘導体を、皮膚損傷、心臓障害、角膜損傷、及び／又は冠状動脈性心疾患の治療のための薬剤の製造における前記Ｔβ４誘導体の使用方法にも関する。本発明は更に、前記Ｔβ４誘導体を使用することにより、皮膚損傷、心臓障害、角膜損傷、及び／又は冠状動脈性心疾患を治療する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＧｌｙ−Ｔβ４、及び配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するＡｌａ−Ｔβ４から選択されるサイモシンβ４誘導体。
【請求項２】
請求項１記載のサイモシンβ４誘導体をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
請求項１記載のサイモシンβ４誘導体及び必要に応じて薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項４】
皮膚損傷、心臓障害、角膜損傷、及び／又は冠状動脈性心疾患の治療のための医薬の製造における、請求項１記載のサイモシンβ４誘導体の使用。
【請求項５】
請求項１記載のサイモシンβ４誘導体の有効量を被験者に適用することを含む、皮膚損傷、心臓障害、角膜損傷、及び／又は冠状動脈性心疾患の治療方法。
【請求項６】
前記被験者がヒトである、請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明はサイモシンβ４（Ｔβ４）誘導体、Ｇｌｙ−Ｔβ４及びＡｌａ−Ｔβ４に関する。本発明は更に、前記Ｔβ４誘導体を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、皮膚損傷、心臓障害、角膜損傷、及び／又は冠状動脈性心疾患の治療用のための薬剤の製造における、前記Ｔβ４誘導体の使用に関する。本発明は更に、前記Ｔβ４誘導体を使用することにより、皮膚損傷、心臓障害、角膜損傷、及び／又は冠状動脈性心疾患を治療する方法に関する。
【０００２】
背景技術
免疫システムは人体の防御システムである。免疫応答に関与している主たる細胞は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、およびマクロファージである。胸部腺（ｔｈｏｒａｃｉｃ  ｇｌａｎｄ）はＴリンパ球の増殖と分化のための中心的な免疫器官である。胸部腺から分泌される胸腺の因子（又はホルモン）はＴリンパ球の増殖と分化のために必要な一連の必須の物質であり、ここでＴβ４は主たる胸腺因子の一つであって、その構造と機能は比較的に明確であって本技術分野において知られている。Ｔβ４は、ウシの胸部腺から抽出されたサイモシン画分５（ＴＦ５）から、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらにより最初に単離され、配列番号１に示すような４３アミノ酸を有するポリペプチドであり、４，９６３ＫＤの分子量を有し、ジスルフィド結合およびグリコシル化が存在しないことが本技術分野でよく知られている（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．２５７，Ｎｏ．２，ｐｐ１０００−１００６，  １９８２、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｙｍｏｓｉｎ  ｂｅｔａ）。
【０００３】
Ｔβ４は胚の中で心臓疾患が発症する間に発現する蛋白質であり、心臓細胞の移動を促進することができ、これらの細胞の生存に影響する（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ  ｂｅｔａ  ４  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｒｅｐａｉｒ．  Ｎａｔｕｒｅ，  Ｖｏｌ．４３２，  Ｎｏｖ．２５，  ２００４）。上記の文献の中に示されたように、前記蛋白質は細胞を死から防ぐこと、及び実験的に引き起こされた心臓疾患が発症した後の瘢痕組織の形成をある程度抑えることができた。Ｔβ４は皮膚の創傷治癒を促進させるために、臨床的な治験に適用されている。研究者たちは近い将来において、心臓疾患の治療のための臨床試験のフェーズでＴβ４が使用されるであろうと信じている。
【０００４】
Ｔβ４活性に関する上記の研究の一つにおいて示されたように、Ｔβ４は胚の及び出生後の心筋細胞の生存を組織培養中で改善し、ラットにおいて冠状血管を結紮した後に前記蛋白質を腹腔内注射すると、心臓の修復の促進に成功し、Ａｋｔサーバイバルキナーゼを活性化することができた。これらの結果は、Ｔβ４は急性冠状血管閉塞のための可能性がある治療ターゲットであることを示唆している。
【０００５】
上記の文献の中でテキサス州立大学の研究者もまた、心臓の発達の間に生成した蛋白質（すなわち、Ｔβ４）が、心疾患を発症した後の心臓の自己修復を促進することができるであろうことを見出した。ラットにおいて得られたこの発見は、心疾患の治療のための新たな方法の発見をもたらし、本技術分野において心疾患の治療を、最終的には変えるかもしれない。
【０００６】
既知のＴβ４の四次構造を解析することと、前記蛋白質のＮ末端を遺伝子工学的に修飾することにより、皮膚損傷、心臓障害の修復などに関して天然のＴβ４よりも有意に高い活性を有している新たなＴβ４誘導体が、本発明の発明者らにより思いがけなく見出された。
【０００７】
発明の概要
本発明の１つの観点は新たなＴβ４誘導体に関し、それらはそれぞれ、配列番号６に示されたＧｌｙ−Ｔβ４と、配列番号５に示されたＡｌａ−Ｔβ４である。
【０００８】
本技術分野において前記Ｇｌｙ−Ｔβ４とＡｌａ−Ｔβ４は、遺伝子組換えの方法により発現させることができ、あるいは化学合成の方法により調製できることが周知である。本発明において前記Ｇｌｙ−Ｔβ４とＡｌａ−Ｔβ４は、遺伝子工学を介した組換えと発現の方法によって得ることができる。
【０００９】
本発明の一態様において、Ｎ末端が修飾されたサイモシンβ４誘導体、すなわちＧｌｙ−Ｔβ４またはＡｌａ−Ｔβ４は、下記の工程を含む方法によって得ることができる。
【００１０】
(1)発現ベクターの構築
Ｔβ４（配列番号１）の既知のアミノ酸配列に従い、それがコードするアミノ酸配列のＮ末端とＣ末端に対応する制限部位を付加した大腸菌の優先コドンを、そのＮ末端を修飾して用いることにより、Ｔβ４のＤＮＡ配列を新たに合成し、そしてそれによってＴβ４誘導体、Ｇｌｙ−Ｔβ４又はＡｌａ−Ｔβ４をコードする核酸配列が得られる。ＧＳＴの既知のアミノ酸配列に従い、それがコードするアミノ酸配列のＮ末端とＣ末端に対応する制限部位を付加した大腸菌の優先コドンを用いることにより、リーダーペプチドＤＮＡ配列を新たに合成し、そしてそれによってリーダーペプチドの核酸配列が得られる。
【００１１】
上記のようにして調製されたリーダーペプチドとＴβ４誘導体の配列及びスクリーニングプラスミドｐＢＳＫは制限酵素によって処理し、成分の濃度に従って計算された特定のモル比でＴ４ライゲーションシステムの中に付加する。形質転換を介して、望みの組換え体が選別する。
【００１２】
制限酵素を用いて融合蛋白質の遺伝子を消化し、そしてその遺伝子を制限酵素で処理したプラスミドｐＧＭと結合し（カナマイシン耐性のマーカーを有するプラスミドｐＧＭは、ＧＳＴ融合蛋白質を大量に発現することができ、それはペキンノースランドバイオテック社により構築される）、そして望みの組換え体がスクリーニングによって得られる。
【００１３】
(2)組換えＴβ４誘導体の発現及びその分離と精製
上記で得られたレコン（ｒｅｃｏｎ）を細菌発現宿主の中へ形質転換し；発現の後、高発現するように遺伝子組換えされた細菌を選び出し；そして望みの蛋白質を高発現している組換え細菌を発酵により得る。細菌を高圧ホモジナイザーによって破壊し、遠心分離して望みの前駆体蛋白質を含んでいる上清を得、上清をＧＳＴアフィニティーカラムにかけ、望みの前駆体蛋白質を溶出してトロンビンを用いて消化し、得られたサンプルを陰イオンカラムにかけて更に精製し、９８％以上の蛋白質純度を有する最終産物を得る。
【００１４】
本発明の他の側面は、本発明のＴβ４誘導体、Ｇｌｙ−Ｔβ４及び／又はＡｌａ−Ｔβ４、および必要に応じて薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関連する。
本発明において「薬学的に許容される」という用語は、動物のため、より特異的にはヒトのために使用するものであると一般的に認識されているものを意味する。「担体」という用語は、希釈剤、アジュバント例えば、（完全な及び不完全な）フロインドアジュバント、添加剤、又はベヒクルを言い、それと共に治療剤が含有されるか、又は投与される。
【００１５】
そのような医薬の担体は、水や油などの滅菌された液体であってもよく、石油、動物、植物又は合成由来のもの、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む。医薬組成物が静脈内投与される時には、水は好適な担体である。生理食塩水溶液及び水性デキストロースとグリセロールの溶液も液体担体として、特に注射可能な溶液として、採用することができる。適切な医薬品添加剤には、澱粉、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリセロール、水、エタノールなどが含まれる。本組成物は、もし望むならば、少量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、ピル、カプセル、粉剤、徐放性製剤などの形態をとることもできる。
【００１６】
本発明の一態様において、前記医薬組成物は凍結乾燥した注射可能な形態であって、サイモシン誘導体Ｇｌｙ−Ｔβ４又はＡｌａ−Ｔβ４を０．０１から０．２％、マンニトールを５％と、薬学的に許容可能な担体を含む。
【００１７】
本発明の医薬組成物は、望みの投与経路に適合した形態の製剤とされる。投与経路の例には非経口投与が含まれるが、それに限定されるものではなく、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与、経鼻投与（吸入投与など）、経皮投与（局所投与など）、経粘膜投与、及び経直腸投与がある。一つの特定の態様において該組成物は、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与、経鼻投与、又は局所投与に適した医薬組成物を形成する製剤とされる。通常、静脈内投与に適している該組成物は、滅菌された等張の水性緩衝液中の溶液である。もし必要ならば該組成物は更に可溶化剤と、注射部位の苦痛を軽減させるためにエルゴタミンなどの局所麻酔剤を含む。
【００１８】
本発明の他の態様において、前記組成物は点眼剤の溶液であり、サイモシン誘導体Ｇｌｙ−Ｔβ４及び／又はＡｌａ−Ｔβ４を５０から５００μｇ／ｍｌ、クロロマイセチン又はオフロキサシンからなる群から選択された抗生剤、及び薬学的に許容可能な担体を含む。本発明の他の態様において、前記組成物は点眼剤の溶液であり、サイモシン誘導体Ｇｌｙ−Ｔβ４及び／又はＡｌａ−Ｔβ４を５０から５００μｇ／ｍｌ、適切な量のヒアルロン酸ナトリウム、及び薬学的に許容可能な担体を含む。本発明の他の態様において、前記組成物は点眼剤の溶液であり、サイモシン誘導体Ｇｌｙ−Ｔβ４及び／又はＡｌａ−Ｔβ４を５０から５００μｇ／ｍｌ、ある量のヒアルロン酸ナトリウム、クロロマイセチン又はオフロキサシン、及び薬学的に許容可能な担体を含む。
【００１９】
もし本発明の組成物が局所的に投与されたならば、該組成物は軟膏、クリーム、経皮バッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー剤、エアロゾル、溶液、乳液、又は当業者に良く知られている他の形態の製剤とすることができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍ，  １９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９９５も参照されたい）。
【００２０】
スプレー剤以外の局所的な剤形に関しては、粘性から半固形又は固形の形が通常では採用され、それは担体又は一つ以上の局所的な適用に適合した添加剤を含み、水よりも大きな動的粘度を有する。適切な製剤には、溶液、懸濁液、乳液、クリーム、粉剤、ワニス、軟膏などがあるが、それらに限定されるものではなく、もし必要ならば、滅菌されているか、あるいは補助剤（保存剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝剤又は塩）と混合し、浸透圧などそれらの性質を変化させる。他の適切な局所投与の剤形にはエアロゾルが含まれ、そこでは固形相又は液体相の担体は活性成分と組み合わされ、好ましくは混合物の中に、又は圧力を有する揮発性物質（フレオンなどの圧縮ガス）を含んでいる圧搾可能なボトルの中にパッケージされる。もし必要であるならば、加湿剤又は湿潤剤を医薬組成物と製剤の中に添加することができる。これらの付加的な成分の例は本技術分野で良く知られている。
【００２１】
本発明の他の態様において、前記医薬組成物は軟膏であり、サイモシン誘導体Ｇｌｙ−Ｔβ４及び／又はＡｌａ−Ｔβ４を０．０１％から０．２％、及びワセリンなどの薬学的に許容可能な添加剤を含む。
【００２２】
もし本発明の方法が組成物の経鼻投与を含むならば、該組成物をエアロゾル、スプレー剤、噴霧剤、又は滴剤に製剤することができる。特に、都合よくは本発明で使用される予防薬又は治療薬を、圧力包装又は適切な噴射剤（ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の適切なガス）を用いて、エアロゾルの形で送達してもよい。圧縮エアロゾルの場合には、測定された量を送るためのバルブを提供することにより、単位用量を決定することができる。吸入器、又は吸入器の中で使用されるカプセル及びカートリッジ（例えば、ゼラチンで構成される）は、化合物、及び、ラクトース又は澱粉などの適切な粉末の基質を含む混合粉末を含むように製剤することができる。
【００２３】
本発明の更なる他の態様において、前記医薬組成物はスプレー剤であり、サイモシン誘導体Ｇｌｙ−Ｔβ４又はＡｌａ−Ｔβ４を５から５００μｇ／ｍｌ、エチルｐ−ヒドロキシベンゾエートを０．００３％、及び薬学的に許容可能な担体を含む。
【００２４】
もし本発明の方法が経口投与を含むならば、該組成物を、錠剤、カプセル、キット、軟カプセル、溶液、懸濁液などの形の製剤とすることができる。錠剤又はカプセルを薬学的に許容可能な添加剤を用いて形成することは便利であり、その添加剤は、結合剤（アルファ澱粉、ポリビニルピロリドン、又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（ラクトース、微結晶セルロース、又はリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、又はシリカなど）；崩壊剤（ジャガイモ澱粉又はエキスプロタブなど）；又は保湿剤（ラウリル硫酸ナトリウムなど）などである。錠剤を本技術分野で良く知られた方法で被覆することができる。経口投与のために適した液体調製剤を、それらに限られるものではないが、溶液、シロップ、又は懸濁液の形態としてもよく、あるいは投与前に他の適切な溶剤の水で溶解できるそれらの乾燥形態としてもよい。これらの液体調製物を、薬学的に許容可能な添加剤を用いた通常の方法によって調製してもよく、その添加剤には、懸濁剤（ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、又はハロゲン化食用脂など）；乳化剤（レシチン、又はアラビアガムなど）；非水性溶媒（アーモンド油、油状エステル、エタノール、又は分別（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ）植物油など）；及び保存剤（メチル又はプロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）がある。これらの調製物は、緩衝塩、矯味剤、着色剤、及び甘味剤を更に含んでもよい。経口投与のための調製物を適切に製剤し、持続放出性、制御放出性、又は連続放出性の予防薬又は治療薬を形成することができる。
【００２５】
本発明の方法は更に、注射（押し出し注射又は継続的輸液）による非経口投与のための組成物を含む。注射のための調製物は、更なる保存剤を含む単位投与形態（アンプル内又はマルチユニット容器）でもよい。該組成物は、油状の又は油性の又は水性の溶媒中の懸濁液、溶液又は乳液などの形態でもよく、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤などの補助剤を含んでもよい。また、活性成分は粉状の形態で、適切な溶媒（滅菌した、非発熱性の水）と溶解してもよい。
【００２６】
本発明の非経口投与剤形のために適した溶媒は、本技術分野の当業者に良く知られている。いくつかの態様において、非経口投与形態剤形に適した溶媒には注射用蒸留水ＵＳＰが含まれるが、それに限定されるものではなく；水性溶媒には注射用食塩水、リンゲル注射液、グルコース注射液、グルコースと塩化ナトリウムの注射液、及び乳酸リンゲル注射液が含まれるが、それらに限定されるものではなく；水混和性溶媒にはトウモロコシ油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、及び安息香酸メチルが含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００２７】
本発明の更なる他の観点は、Ｇｌｙ−Ｔβ４とＡｌａ−Ｔβ４からなる群から選択されたＮ末端の修飾を有するＴβ４を、心臓障害、皮膚損傷、角膜損傷及び／又は冠動脈心疾患の治療のための医薬の製造に使用することに関連する。
【００２８】
本発明者は驚くべきことに、モデル動物における実験において、本発明のＧｌｙ−Ｔβ４とＡｌａ−Ｔβ４は、障害を受けた心臓組織の修復、皮膚損傷の修復、及び角膜損傷の修復に関して、天然のＴβ４と比べてより高い活性を示すことを見出した。
【００２９】
本発明者は、心臓組織の修復に対するＧｌｙ−Ｔβ４とＡｌａ−Ｔβ４の効果をアッセイした。６０匹の成熟ラットの冠動脈を結紮して心疾患の発症を模倣し、左冠動脈前下行枝の結紮と再潅流を有するラットモデルを得た。サイモシン誘導体Ｇｌｙ−Ｔβ４又はＡｌａ−Ｔβ４又はサイモシンＴβ４を１ヶ月間継続的に注射することにより、障害を受けたラット心臓の細胞死は限定され、心疾患の発症の後に数週間で心機能は改善され、そしてＧｌｙ−Ｔβ４又はＡｌａ−Ｔβ４の治療効果はＴβ４と比較して有意であった。本発明者らはサイモシン誘導体Ｇｌｙ−Ｔβ４又はＡｌａ−Ｔβ４は、細胞の代謝を変えること、そして心疾患の発症後の低酸素状態に耐性を有するより力強い心筋細胞を作ることの、両者が可能であることを見出した。
【００３０】
本発明者は、障害を受けた表皮組織に対するＧｌｙ−Ｔβ４とＡｌａ−Ｔβ４の効果もアッセイした。３０匹の成熟ラットの表皮を切断し、ラット表皮損傷モデルを得た。サイモシンＧｌｙ−Ｔβ４、Ａｌａ−Ｔβ４又はＴβ４を５日間塗布したラットの創傷の長さはブランクのコントロールよりも５０％小さく、Ｇｌｙ−Ｔβ４とＡｌａ−Ｔβ４の治療効果はＴβ４よりも有意であった。
【００３１】
本発明者は、障害を受けた角膜組織に対するＧｌｙ−Ｔβ４の効果もアッセイした。３０匹の成熟ラットの角膜を１ＮのＮａＯＨで火傷させ、ラット角膜損傷モデルを得た。サイモシンＧｌｙ−Ｔβ４又はＴβ４を眼に４日間滴下したラットでは障害を受けた角膜は完全に回復し、一方生理食塩水のみで治療した群においてはラットの障害を受けた角膜は回復せず、重篤な炎症と充血も患っていた。
【００３２】
上記の結果は、本発明のＴβ４誘導体Ｇｌｙ−Ｔβ４及び／又はＡｌａ−Ｔβ４は、天然のＴβ４よりも、心臓組織障害、表皮組織障害及び角膜組織障害の治療という点において、有意により高い活性を示したことを表す。
【００３３】
本発明の他の観点は、前記Ｔβ４誘導体Ｇｌｙ−Ｔβ４及び／又はＡｌａ−Ｔβ４を、被験者、特にヒトの心臓組織障害、表皮組織障害及び角膜組織障害の治療のために使用する方法に関する。本発明の１態様において心臓組織障害、表皮組織障害、及び角膜組織障害を治療するための方法は、本発明の前記Ｔβ４誘導体Ｇｌｙ−Ｔβ４及び／又はＡｌａ−Ｔβ４の治療有効量を被験者に投与することを含む。
【００３４】
投与の方法、頻度及び用量は、疾患、疾患及び個体の状態によることは、本技術分野で良く知られている。一般的には投与は注射（皮内、筋肉内、静脈内又は皮下注射）、局所投与（表皮投与など）、又は滴下投与（点眼薬など）であってもよい。適切な投与経路と投与スケジュールは、個々の被験者により選択することができる。適切な投与量は前記医薬組成物の用量であって、それを投与した後に、心臓組織障害、表皮組織障害及び角膜組織障害を効果的に治療できるような用量である。
【００３５】
一般的に、前記Ｔβ４誘導体である本発明のＧｌｙ−Ｔβ４及び／又はＡｌａ−Ｔβ４を含む医薬組成物において、各々の用量は約１００μｇから５ｍｇである。適切な用量は患者の疾患及び投与方法によるが、通常は約０．１ｍｌから５ｍｌである。
【００３６】
特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って本発明者は、組換え株であるＰＧＭＴβ４−Ａ／ＢＬ２１及びＰＧＭＴβ４−Ｇ／ＢＬ２１を、中国総合微生物培養物コレクションセンター（ＣＧＭＣＣ、Ｂｅｉｙｉｔｉａｏ、Ｚｈｏｎｇｇｕａｎｃｕｎ、ペキン、中国）に、寄託番号ＣＧＭＣＣ  １７５０とＣＧＭＣＣ１７５１として、別々に寄託した。
【００３７】
図面及び実施例と共に本発明を更に述べるが、それらによって限定されるものではない。
【００３８】
実施例１．サイモシンβ４誘導体Ｇｌｙ−β４の調製
１．組換えプラスミドｐＧＭＴβ４−Ｇ
Ｔβ４の既知のアミノ酸配列（配列番号１）
【００３９】
【化１】
2009500045.tif 000002
【００４０】
（配列番号１）
に従って、大腸菌の優先コドンを用いることにより、Ｔβ４のＤＮＡ配列を新たに合成した。遺伝子組換えの操作を促進するために、それがコードするペプチドのＮ末端とＣ末端に対応するＢａｍＨＩとＸｈｏＩの制限部位を付加し、配列番号２
【００４１】
【化２】
2009500045.tif 000003
【００４２】
（配列番号２）
に示すようにＮ末端をグリシンで修飾した（ここで制限部位に下線をひいた）。
対応するアミノ酸配列は、下記の通りである：
【００４３】
【化３】
2009500045.tif 000004
【００４４】
（配列番号６）
既知のＧＳＴアミノ酸配列により、大腸菌の優先コドンを用いることによりリーダーペプチドＤＮＡ配列を新たに合成し、配列のＮ末端とＣ末端に対応している部位でＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩの制限部位を付加し、それによって配列番号３
【００４５】
【化４】
2009500045.tif 000005
【００４６】
（配列番号３）
に示すように前記リーダーペプチドの核酸配列を得た。
本技術分野の通常の方法に従い（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ａｍｅｒｉｃａ，  １９９２も参照されたい）、上記で調製されたリーダーペプチド、Ｇｌｙ−Ｔβ４及びスクリーニングプラスミドｐＢＳＫ（ストラタジーン、＃２１２２０５）を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩで消化し、ここでＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩをリーダーペプチドの消化に使用し、ＸｈｏＩとＢａｍＨＩをＧｌｙ−Ｔβ４の消化に使用し、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩをスクリーニングプラスミドｐＢＳＫの消化に使用し、ここで各成分の濃度を計算した後に、１：１のモル比でそれらをＴ４ライゲーションシステムの中に添加した。形質転換とスクリーニングの後に、前記Ｇｌｙ−Ｔβ４核酸配列とリーダーペプチド融合蛋白質の遺伝子を含んでいる組換えプラスミドが得られ、ｐＳＫ−Ｔβ４と名づけた。
【００４７】
前記融合蛋白質遺伝子を対応する制限酵素で別々に消化し、そしてその融合蛋白質遺伝子断片及びＸｈｏＩとＥｃｏＲＩによる二重酵素消化によって得られたプラスミドｐＧＭの回収された大きな断片を（カナマイシン耐性スクリーニングのためのマーカーを有しているプラスミドｐＧＭは、ＧＳＴ融合蛋白質を大量に発現可能であり、ペキンノースランドバイオテック社により構築された）、１８℃でＴ４リガーゼシステムの中で３つの望みの遺伝子断片と連結させた。得られたレコンを消化及び配列決定により同定し、正しい連結を有する組換えプラスミドを得、ｐＧＭ−Ｔβ４−Ｇと名づけた。
【００４８】
２．組換えプラスミドｐＧＭＴβ４−Ｇを有する遺伝子改変した細菌の調製
次いで、塩化カルシウム法により大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含んでいるＬＢプレート上に蒔き、そして前記組換えプラスミドｐＧＭＴβ４−Ｇを含んでいる形質転換体を同定するために陽性クローンを選択した。
【００４９】
前記形質転換体をＬＫ液体培地中でＯＤ６００が０．６から０．８になるまで培養し、細菌を遠心分離で回収する前に３−４時間誘導するために０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、そして８Ｍ尿素と共に破壊し、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動中で１つの約３０ＫＤのバンドが４０％の発現レベルで見られた。Ｔβ４モノクローナル抗体のイムノブロットアッセイは、陽性の反応を示した。サイモシン誘導体Ｇｌｙ−Ｔβ４蛋白質を高発現している、取得された遺伝子改変株は、ＰＧＭ２Ｔβ４／ＢＬ２１と名づけられた。
【００５０】
上記の調製方法に従って、本出願人によって取得されたサイモシン誘導体Ｇｌｙ−Ｔβ４蛋白質を高発現している遺伝子改変株は、ＰＧＭＴ４β−Ｇ／ＢＬ２１と名づけられた（寄託番号：ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１７５１）。
【００５１】
３．Ｇｌｙ−Ｔβ４の発現及び精製
１）振盪フラスコ中での発現：上記のようにして調製した遺伝子改変株ＰＧＭＴβ４−Ｇ／ＢＬ２１を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含んでいるＬＢ培地中で一晩培養し（３７℃、２００ｒｐｍ）、そして５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含んでいるＬＢ培地の中へ１：３０の容量比で植菌し、そして３７℃で３時間培養し、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加することにより４時間誘導した。細胞を回収してＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で解析し、そして、サイモシン誘導体Ｇｌｙ−Ｔβ４（３０ＫＤ）は主として可溶性発現生成物の形であることが見出され、全蛋白質に基づいた発現生成物の量は６０％であった。
【００５２】
２）大規模な発酵及び発現
Ａ．培養培地の組成
ａ）播種液体培地（ＬＫ）
トリプトン：１０ｇ／Ｌ；粉末酵母：５ｇ／Ｌ；塩化ナトリウム：１０ｇ／Ｌ；カナマイシン：５０μｇ／ｍＬ；
ｂ）培養培地（１５リットル）
リン酸１水素２ナトリウム：３１５ｇ；リン酸２水素１カリウム：１００ｇ；塩化ナトリウム：１０．０５ｇ；塩化アンモニウム：５０ｇ；トリプトン  ９０ｇ
上記の成分を共にタンク内で滅菌し；下記の成分を個々に滅菌し、そして発酵タンク中に添加した。
硫酸マグネシウム：１５ｇ；グルコース：４５０ｇ；給餌（５００ｇ／Ｌ）：グルコース
ｃ）発酵及び誘導発現：
ｉ）種培養
同定されたプレートから株を採取し、５０ｍｌのＬＫの中に植菌し（２５０ｍｌフラスコ）、３６℃、２００ｒｐｍで８時間培養し、そしてこの種の液体の５０ｍｌを７００ｍｌのＬＫの中へ移して植菌し、３６℃、２００ｒｐｍで一晩培養した。
【００５３】
ｉｉ）発酵と誘導発現の方法
培養された種の液体（ＯＤ６００＝３−４）をタンクの中へ添加し、パラメーターを：３６℃、１５０ｒｐｍに調整し、酸素１００％を溶解して発酵を行い；５時間後、約８００ｍｌの給餌を２時間につき２．５の速度で与え、誘導のために１ｇのＩＰＴＧを添加した（３時間）。
【００５４】
３）クロマトグラフィー
（ｉ）アフィニティークロマトグラフィー
ＧＳＨ−Ａアガロースクロマトグラフィーのメディウム（ファルマシア社）を用い、平衡溶液は２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８であり、搭載して平衡化した後、溶解した細胞の遠心分離した上清をグルタチオンセファロースカラム（ファルマシア社）に搭載した。平衡化した後、融合蛋白質を１０ｍＭの還元グルタチオン（ＧＳＨ）を含む溶離液によって溶出した。
【００５５】
（ｉｉ）酵素分解
上記工程の溶離液をトロンビンを添加すること（５ＮＩＨＵ／ｍＬ）により、３７℃で２時間酵素的に消化した。
【００５６】
（ｉｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー
ソース３０Ｑクロマトグラフィーメディウム（ファルマシア社）を用い、平衡溶液は２０ｍＭのＰＢ（リン酸１水素２ナトリウム−リン酸２水素１ナトリウム）、ｐＨ７であり、工程（２）の酵素分解により得られたサンプルを等量の水で希釈して搭載し、平衡化した後に望みの蛋白質溶出ピークを、２０ｍＭのＰＢ、ｐＨ７、０から１ＭのＮａＣｌのグラジエント溶出で回収した。
【００５７】
４）検出
上記の精製工程によって得られたＧｌｙ−Ｔβ４の純度は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ純度アッセイと逆相ＨＰＬＣアッセイにより、９８％以上であると決定された。
【００５８】
実施例２  サイモシンβ４誘導体Ａｌａ−Ｔβ４の調製
１．組換えプラスミドｐＧＭＴβ４−Ａの調製
Ｔβ４の既知のアミノ酸配列（配列番号１）に従い、大腸菌の優先コドンをＴβ４のＤＮＡ配列の遺伝的な新規合成のために使用してＡｌａ−Ｔβ４核酸配列を得；一方、遺伝子組換え操作を促進するために、該ポリペプチドのＮ末端とＣ末端に対応する部位へＢａｍＨＩとＸｈｏＩの制限部位を添加し、配列番号４；
【００５９】
【化５】
2009500045.tif 000006
【００６０】
（配列番号４）
で示されるようにＮ末端をアラニンで修飾した（ここで制限部位に下線をひいた。）
対応するアミノ酸配列は下記のとおりである；
【００６１】
【化６】
2009500045.tif 000007
【００６２】
（配列番号５）；
既知のＧＳＴアミノ酸配列により、大腸菌優先コドンを用いることによりリーダーペプチドのＤＮＡ配列を遺伝的に新たに合成し、制限部位ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩを該ポリペプチドのＮ末端とＣ末端に対応する部位へ付加し、それによって配列番号３に示されるようなリーダーペプチド核酸配列を得た。
【００６３】
本技術分野の通常の方法に従い（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ａｍｅｒｉｃａ，  １９９２も参照されたい）、上記の調製されたリーダーペプチド、Ａｌａ−Ｔβ４及びスクリーニングプラスミドｐＢＳＫを、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩで消化したここにおいて、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩはリーダーペプチドを消化するのに使用され、ここでＸｈｏＩとＢａｍＨＩはＧｌｙ−Ｔβ４を消化するのに使用され、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩはスクリーニングプラスミドｐＢＳＫを消化するのに使用され、ここで各成分の濃度を計算した後に、それらを１：１のモル比でＴ４ライゲーションシステムの中に添加した。形質転換とスクリーニングの後に、前記Ａｌａ−Ｔβ４の核酸配列とリーダーペプチド融合蛋白質の遺伝子を含む組換えプラスミドが得られ、ｐＳＫ−Ｔβ４２と名づけた。
【００６４】
前記融合蛋白質遺伝子を対応する制限酵素で別々に消化し、そして融合蛋白質遺伝子断片及びＸｈｏＩとＥｃｏＲＩによる二重酵素消化によって得られたプラスミドｐＧＭの回収された大きな断片を（カナマイシン耐性スクリーニングのためのマーカーを有しているプラスミドｐＧＭはＧＳＴ融合蛋白質を大量に発現可能であり、ペキンノースランドバイオテック社により構築された）、１８℃でＴ４リガーゼシステムの中で３つの望みの遺伝子断片と連結させた。得られたレコンを消化及び配列決定により同定し、正しい連結を有する組換えプラスミドを得、ｐＧＭＴβ４−Ａと名づけた。
【００６５】
２．組換えプラスミドを有する遺伝子改変した細菌の調製
次いで、塩化カルシウム法により大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含んでいるＬＢプレート上に蒔き、前記組換えプラスミドｐＧＭＴβ４−Ａを含んでいる形質転換体を同定するために陽性クローンを選択した。
【００６６】
ＬＫ液体培地中で前記形質転換体をＯＤ６００が０．６から０．８になるまで培養し、細菌を遠心分離で回収する前に３−４時間誘導するために０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、そして８Ｍ尿素と共に破壊した。１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動中で約３０ＫＤの１つの蛋白質バンドが、４０％の発現レベルで見られた。Ｔβ４モノクローナル抗体のイムノブロットアッセイは、陽性の反応を示した。取得された遺伝子改変株はサイモシン誘導体Ａｌａ−Ｔβ４蛋白質を高発現し、ＰＧＭＴβ４／ＢＬ２１と名づけられた。
【００６７】
上記の調製方法に従って、本出願人により取得されたサイモシン誘導体Ａｌａ−Ｔβ４を高発現している遺伝子改変株は、ＰＧＭＴ４β−Ａ／ＢＬ２１と名づけられた（寄託番号：ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１７５０）。
【００６８】
３．Ｇｌｙ−Ｔβ４の発現及び精製
１）振盪フラスコ中での発現：上記のように調製され、Ａｌａ−Ｔβ４蛋白質遺伝子を含んでいる遺伝子改変株ＰＧＭＴ  β４−Ａ／ＢＬ２１を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含んでいるＬＢ培地中で一晩培養し（３７℃、２００ｒｐｍ）、そして５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含んでいるＬＢ培地の中へ１：３０の比で植菌し、そして３７℃で３時間培養し、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加することにより４時間誘導した。細胞を回収してＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で解析し、サイモシン誘導体Ａｌａ−Ｔβ４（３０ＫＤ）は主として可溶性発現生成物の形であることが見出され、そして全蛋白質に基づいた発現生成物の量は６０％であった。
【００６９】
２）大規模な発酵及び発現
Ａ．培養培地の組成
ａ）播種液体培地（ＬＫ）
トリプトン：１０ｇ／Ｌ；粉末酵母：５ｇ／Ｌ；塩化ナトリウム：１０ｇ／Ｌ；カナマイシン：５０μｇ／ｍＬ；
ｂ）培養培地（１５リットル）
リン酸１水素２ナトリウム：３１５ｇ；リン酸２水素１カリウム：１００ｇ；塩化ナトリウム：１０．０５ｇ；塩化アンモニウム：５０ｇ；トリプトン  ９０ｇ
上記の成分を共にタンク内で滅菌し；下記の成分を個々に滅菌し、そして発酵タンク中に添加した。
硫酸マグネシウム：１５ｇ；グルコース：４５０ｇ；給餌（５００ｇ／Ｌ）：グルコース
ｃ）発酵及び誘導発現：
ｉ）種培養
同定されたプレートから株を採取し、５０ｍｌのＬＫの中に植菌し（２５０ｍｌフラスコ）、３６℃、２００ｒｐｍで８時間培養し、そしてこの種の液体５０ｍｌを７００ｍｌのＬＫの中へ移して植菌し、３６℃、２００ｒｐｍで一晩培養した。
【００７０】
ｉｉ）発酵と誘導発現の方法
培養された種の液体（ＯＤ６００＝３−４）をタンクの中へ添加し、パラメーターを：３６℃、１５０ｒｐｍに調整し、酸素１００％を溶解して発酵を行い；５時間後、約８００ｍｌの給餌を２時間につき２．５の速度で与え、誘導のために１ｇのＩＰＴＧを添加した（３時間）。
【００７１】
３）クロマトグラフィー
（ｉ）アフィニティークロマトグラフィー
ＧＳＨ−Ａアガロースクロマトグラフィーメディウム（ファルマシア社）を用い、平衡溶液は２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８であり、搭載して平衡化した後、溶解した細胞の遠心分離した上清をグルタチオンセファロースカラム（ファルマシア社）に搭載した。平衡化した後、融合蛋白質を１０ｍＭの還元グルタチオン（ＧＳＨ）を含む溶離液によって溶出した。
【００７２】
（ｉｉ）酵素分解
上記工程の溶離液をトロンビンを添加すること（５ＮＩＨＵ／ｍＬ）により、３７℃で２時間酵素的に消化した。
【００７３】
（ｉｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー
ソース３０Ｑクロマトグラフィーメディウム（ファルマシア社）を用い、平衡溶液は２０ｍＭのＰＢ、ｐＨ７であり、工程（２）の酵素分解により得られたサンプルを等量の水で希釈して搭載し、平衡化した後、蛋白質溶出ピークを、２０ｍＭのＰＢ、ｐＨ７、０から１ＭのＮａＣｌのグラジエント溶出で回収した。
【００７４】
４）検出
上記の精製工程によって得られたＡｌａ−Ｔβ４の純度は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ純度アッセイと逆相ＨＰＬＣアッセイにより、９８％以上であると決定された。
【００７５】
実施例３：サイモシンβ４誘導体Ｇｌｙ−Ｔβ４とＡｌａ−Ｔβ４と天然のサイモシンβ４の、ラットモデルにおける心臓虚血の治療における治療効果の評価
１．疾患動物モデルの調製と試験方法
心臓障害の軽減と心臓線維症の軽減におけるＧｌｙ−Ｔβ４とＴβ４の生物活性の評価と比較をするために、急性心筋梗塞−ラット左冠動脈前下行枝の再潅流モデルを確立した。
【００７６】
筋肉内注射によりキシラジン５ｍｇ／ｋｇをラットに投与し；ケタミン５０ｍｇ／ｋｇにより麻酔し、ヨードチンキとアルコールによりラットの前胸壁を消毒し；完全に乾燥させた後、滅菌した手術用タオルを上に置き、手術部位を露出し、完全に無菌の状態の下で手術を行った。ラットの前胸壁の皮膚を切開し、第三から第六の肋骨を切断して胸腔を露出し、肺を脇へ押しやり、心胞（ｈｅａｒｔ  ｖｅｓｉｃｌｅ）を開き、心臓を露出させた。左冠動脈前下行枝の根元から３ｍｍまでの血管を６−０ポリプロピレン結紮ワイアーとＮＥＬＡＴＩＯＮで結紮し、１時間後に再潅流を行った。出血がないことを確認した後、切除した肋骨を胸骨と接合し、そして皮膚を縫合した。手術の後、感染を防ぐために、ラットに３ｍｇ／ｋｇ／日のゲンタマイシンを３日間、筋肉内注射により投与した。
【００７７】
２．超音波心電図を用いた左心室前壁の厚さの比較
１）Ｇｌｙ−Ｔβ４とＴβ４の間の比較
工程１に従ってラット心虚血モデルを確立した後に、ネガティブコントロール群（ラット２０匹、生理食塩水を注射、２００μｌ／ラット／日）、ポシティブコントロール群（ラット２０匹、天然サイモシンＴβ４を腹腔内注射、１０μｇ／ラット／日）、及び試験群（ラット２０匹、サイモシンＧｌｙ−Ｔβ４を腹腔内注射、１０μｇ／ラット／日）に、それぞれ投与をした。
【００７８】
これらの群における動物の左心室前壁の厚さを、投与後の１４日目、２８日目及び５６日目に、超音波心電図（Ｌｉｖｅ  ３Ｄエコー  ７５００）とプローブ（１５−１６Ｌ）を用いて測定した。結果は以下のようである：
基底値については（投与前の０日目）、ネガティブコントロール群の値は０．２６８２±０．０１であり、ポシティブコントロール群の値は０．２５１３±０．０３２であり、Ｇｌｙ−Ｔβ４群の値は０．２４９９±０．０２２５であって、群の間に有意差は存在しなかった。投与後１４日目には、ネガティブコントロール群の値は０．１３６５±０．０１２５であり、ポシティブコントロール群の値は０．１９１９±０．０１２であって、ネガティブコントロール群とポシティブコントロール群の間に有意差が存在した（ｐ＝０．０４８＜０．０５）。Ｇｌｙ−Ｔβ４群の値は０．２１６２±０．００７８であり、群の間に有意差が存在した（ｐ＝０．０８６＜０．１）。
【００７９】
これらの結果は、Ｇｌｙ−Ｔβ４とＴβ４は両者とも、心筋梗塞により引き起こされた左心室前壁の厚さの減少を回復させることができたことを示しており（図１を参照されたい）、前記Ｇｌｙ−Ｔβ４が左心室前壁の厚さを増加させる効果は、Ｔβ４の効果と比較して驚くほど良かった。
【００８０】
２）Ａｌａ−Ｔβ４とＴβ４の間の比較
工程１に従ってラット心虚血モデルを確立した後、ネガティブコントロール群（ラット２０匹、生理食塩水を注射、２００μｌ／ラット／日）、ポシティブコントロール群（ラット２０匹、天然サイモシンＴβ４を腹腔内注射、１０μｇ／ラット／日）、及び試験群（ラット２０匹、サイモシンＡｌａ−Ｔβ４を腹腔内注射、１０μｇ／ラット／日）に、それぞれ投与をした。
【００８１】
これらの群における動物の左心室前壁の厚さを、投与後の１４日目、２８日目及び５６日目に、超音波心電図（Ｌｉｖｅ  ３Ｄエコー  ７５００）とプローブ（１５−１６Ｌ）を用いて測定した。結果は以下のようである：
基底値については（投与前の０日目）、ネガティブコントロール群の値は０．２５９４±０．０２２５であり、ポシティブコントロール群の値は０．２３７８±０．０１８であり、Ａｌａ−Ｔβ４群の値は０．２４３２±０．０１であって、群の間に有意差は存在しなかった。
【００８２】
投与後１４日目には、ネガティブコントロール群の値は０．１３０６±０．０１２８であり、ポシティブコントロール群の値は０．１２１５±０．０１３であり、Ａｌａ−Ｔβ４群の値は０．１２９９±０．０１１であって、群の間に有意差は存在しなかった。
【００８３】
投与後２８日目には、ネガティブコントロール群の値は０．１２０７±０．０１５１であり、ポシティブコントロール群の値は０．１２３３±０．００７１であり、Ａｌａ−Ｔβ４群の値は０．１２８８±０．０１２であって、群の間に有意差は存在しなかった。
【００８４】
投与後５６日目には、ネガティブコントロール群の値は０．１２８８±０．０１２であり、ポシティブコントロール群の値は０．１２３２±０．００５７であり、Ａｌａ−Ｔβ４群の値は０．１６７２±０．０７８であり、そこで、Ａｌａ−Ｔβ４群での左心室前壁の厚さの増加は有意であった（ｐ＜０．０５）。
【００８５】
これらの結果は、Ａｌａ−Ｔβ４群は、心筋梗塞により引き起こされた左心室前壁の厚さの減少を効果的に回復できたこと（図５を参照されたい）を示しており、ここで前記Ａｌａ−Ｔβ４が左心室前壁の厚さを増加させる効果は、Ｔβ４の効果と比較して驚くほど良かった。
【００８６】
３．組織像を用いることによる心室線維化の程度の比較
工程１に従ってラット心虚血モデルを確立した後、ネガティブコントロール群（ラット２０匹、生理食塩水を注射、２００μｌ／ラット／日）、ポシティブコントロール群（ラット２０匹、天然サイモシンＴβ４を腹腔内注射、１０μｇ／ラット／日）、及び試験群（ラット２０匹、サイモシンＧｌｙ−Ｔβ４を腹腔内注射、１０μｇ／ラット／日）に、それぞれ注射した。結果は以下のようである：
投与後５６日目にラットの心臓を取り出して微細筋肉に基づいて横断面に切断し、切片を作製した。切片を１％ホルムアルデヒドの中に漬け、そしてパラフィン組織切片とガラススライドを作る処理を行い、マッソンのトリクロムで染色をした。群の間の比較は、イメージプロ（登録商標）プラスバージョン４．１（メディアサイバネティクス）を用いて行った。
【００８７】
１）Ｇｌｙ−Ｔβ４とＴβ４の間の比較
左心室の全心筋に基づいた心筋の繊維化部位の割合は以下の通りであった：ネガティブコントロール群は３０．０２±５．１％、ポシティブコントロール群は２３．１５±２．９％（Ｐ＜０．０５）、そしてＧｌｙ−Ｔβ４群は１５．３６±２．７％（Ｐ＜０．０００５）。
【００８８】
上記の結果は、ポシティブコントロール群とＧｌｙ−Ｔβ４群は、ネガティブコントロール群と比較して有意差を示すことを示し、特にＧｌｙ−Ｔβ４群は非常に有意な差を示した。これらの結果は、Ｇｌｙ−Ｔβ４とＴβ４は両者とも、心筋梗塞によってもたらされる心筋線維化を効果的に低下できることを表しており（図２を参照されたい）、ここで心筋線維化を低下させるＧｌｙ−Ｔβ４の効果は、Ｔβ４よりも驚くほど良かった。
【００８９】
２）Ａｌａ−Ｔβ４とＴβ４の間の比較
左心室の全心筋に基づいた心筋の繊維化部位の割合は以下の通りであった：ネガティブコントロール群は２８．１３±２．１％、ポシティブコントロール群は２２．９１±２．３％（Ｐ＜０．０５）、そしてＡｌａ−Ｔβ４群は１６．８６±１．８％（Ｐ＜０．０００５）。上記の結果は、ポシティブコントロール群とＡｌａ−Ｔβ４群は、ネガティブコントロール群と比較して有意差を示すことを表し、特にＡｌａ−Ｔβ４群は非常に有意な差を示した。これらの結果は、Ａｌａ−Ｔβ４とＴβ４は両者とも、心筋梗塞によってもたらされる心筋線維化を効果的に低下できることを表しており（図６を参照されたい）、ここで心筋線維化を低下させるＡｌａ−Ｔβ４の効果は、Ｔβ４よりも驚くほど良かった。
【００９０】
実施例４．ラットモデルでの表皮損傷の治療におけるＧｌｙ−Ｔβ４、Ａｌａ−Ｔβ４とＴβ４の治療効果の評価
１．疾患動物モデルの調製と試験方法
表皮組織障害、表皮損傷疾患動物モデルの修復における、Ｇｌｙ−Ｔβ４とＴβ４の活性を評価及び比較するために、ラット表皮損傷モデルを確立した。
【００９１】
筋肉内投与によりラットにキシラジンを５ｍｇ／ｋｇ投与し；ケタミン５０ｍｇ／ｋｇにより麻酔し、ヨードチンキとアルコールによりラットの臀部の皮膚を消毒し；完全に乾燥させた後、滅菌した手術用タオルを上に置き、手術部位を露出し、完全に無菌の状態の下で手術を行った。ラットの臀部の皮膚を切開し、３ｃｍの切開を作った。
【００９２】
２．コンピューター画像解析システムを用いることによる創傷の長さの測定
１）Ｇｌｙ−Ｔβ４とＴβ４の間の比較
工程１に従ってラット表皮損傷モデルを確立した後、ネガティブコントロール群（ラット１０匹、生理食塩水を５０μｌ／ラット／日）、ポシティブコントロール群（ラット１０匹、天然サイモシンＴβ４を５μｇ／５０μｌ／日）、及び試験群（ラット２０匹、サイモシン誘導体Ｇｌｙ−Ｔβ４を５μｇ／５μｌ／日）にそれらを表皮上に塗布することにより、１日４回投与した。
【００９３】
５日目に、コンピューター画像解析システムを用いて創傷の長さを測定した。結果は以下のようである：
基底値（投与前の０日目）については、ネガティブコントロール群の値は３．１３±０．２１であり、ポシティブコントロール群の値は３．０７±０．１８であり、Ｇｌｙ−Ｔβ４群の値は３．１３±０．１１であって、群の間に有意差は存在しなかった。
【００９４】
５日目には、ネガティブコントロール群の値は２．３７±０．１８であり、ポシティブコントロール群の値は１．６２±０．１３であり、Ｇｌｙ−Ｔβ４群の値は１．１４±０．１２であって、群の間に有意差が存在した。
【００９５】
これらの結果は、Ｇｌｙ−Ｔβ４は表皮の創傷の治癒を効果的に促進できることを示しており（図３を参照されたい）、ここで表皮の創傷の治癒を促進するＧｌｙ−Ｔβ４の活性は、Ｔβ４と比較して驚くほど強かった。
【００９６】
２）Ａｌａ−Ｔβ４とＴβ４の間の比較
工程１に従ってラット表皮損傷モデルを確立した後、ネガティブコントロール物質（ＰＢＳ）、ポシティブコントロール物質（ＧＴβ４）、及び試験物質（Ａｌａ−Ｔβ４）を、噴霧器により１日４回、局所的に投与した。Ｔβ４とＡｌａ−Ｔβ４の薬物濃度は１００μｇ／ｍｌであった。投与後毎日、創傷の治癒を観察した。
【００９７】
試験結果：
（１）創傷炎症反応：ＰＢＳ群の創傷は、赤い腫れ、浸出などの明らかの炎症反応を有し、それは約２−３日間持続し；Ｔβ４群とＡｌａ−Ｔβ４群は、比較的に軽い炎症反応を有し、それは約１−２日間持続した。
【００９８】
（２）創傷治癒時間：ＰＢＳ群の治癒時間は７．３±１．０２日であり、Ｔβ４群の治癒時間は５．８１±０．９１日であり、Ａｌａ−Ｔβ４群の治癒時間は４．７±０．８３日であった。これらの群を比較すると、Ｔβ４群とＡｌａ−Ｔβ４群は、ＰＢＳ群より比較的に短い治癒時間（Ｐ＜０．０５）を有していた。結果を図７に示す。
【００９９】
これらの結果は、Ｔβ４とＡｌａ−Ｔβ４は創傷の治癒を有意に促進できたことを示しており、ここでＡｌａ−Ｔβ４の投与での創傷治癒時間は、Ｔβ４の投与と比較して明らかに短かった。
【０１００】
（３）瘢痕の大きさ：投与２週間後、瘢痕の大きさにつき、これらの群の間で相互に比較し、結果は以下のようであった：ネガティブコントロール群の瘢痕の大きさは２．３±０．３１ｃｍであり、Ｔβ４群の瘢痕の大きさは１．９±０．２３ｃｍであり、Ａｌａ−Ｔβ４群の瘢痕の大きさは１．７±０．３０ｃｍであり；そしてＴβ４群とＡｌａ−Ｔβ４群の瘢痕は比較的に細かい線状の瘢痕であって表面は比較的に平滑であり、一方ネガティブコントロール群の瘢痕は比較的に厚い瘢痕であって表面は平滑でなかった。
【０１０１】
これらの群を比較することにより、Ｔβ４群とＡｌａ−Ｔβ４群の創傷の瘢痕は、ＰＢＳ群よりも明らかに小さかった（Ｐ＜０．０５）。結果を図８に示す。
結果は、Ｔβ４とＡｌａ−Ｔβ４の両者は、瘢痕化に対抗する顕著な機能を有していることを示しており、ここでＡｌａ−Ｔβ４が投与された時の創傷瘢痕の大きさは、Ｔβ４が投与された時と比較して有意に小さかった。
【０１０２】
実施例５．ラットモデルにおける角膜損傷の治療における、Ｇｌｙ−Ｔβ４、Ａｌａ−Ｔβ４とＴβ４の治療効果の評価
１．Ｇｌｙ−Ｔβ４とＴβ４の間の比較
（１）疾患動物モデルの調製と試験方法
Ｇｌｙ−Ｔβ４とＴβ４が角膜組織障害を修復する活性を評価するために、急性角膜損傷の疾患動物モデル−ラット角膜アルカリ火傷モデルを確立した。
【０１０３】
直径２ｍｍの濾紙切片を１Ｎの苛性ソーダの中に浸し、浸された濾紙切片をラット角膜の中心に正確に置き、３０秒後にラットの角膜をＰＢＳで十分に洗浄し、Ｇｌｙ−Ｔβ４とＴβ４で直ちに処理した。４日後に眼球を除去し、１０％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、瞳孔視神経面に沿って連続的な切片とし、得られた切片を、画像解析システムによる角膜上皮の回復の収集と解析のために用いた。
【０１０４】
（２）コンピューター画像解析システムを用いることによる角膜上皮の回復の測定
工程１によってラット角膜障損傷モデルを確立した後、ネガティブコントロール群（ラット１０匹、点眼薬により局所投与、生理食塩水を３０μｌ／ラット、１日４回）、ポシティブコントロール群（ラット１０匹、天然サイモシンを３０μｌ／ラット、１日４回）、及び試験群（ラット１０匹、サイモシンＧｌｙ−Ｔβ４を３０μｌ／ラット、１日４回）の眼に投与した。
【０１０５】
投与して４日後に眼球を除去し、１０％ホルムアルデヒドにより固定化してパラフィン包埋し、瞳孔視神経面に沿って連続的な切片とし、得られた切片を、画像解析システムによる角膜上皮の回復の収集と解析のために用いた。結果は以下のようである。
【０１０６】
基底値（投与前の０日目）については、ネガティブコントロール群は４．８２±０．１２であり、Ｔβ４群は４．７６±０．１８であり、Ｇｌｙ−Ｔβ４群は４．８５±０．１６であって、群の間に有意差は存在しなかった。
【０１０７】
投与後４日目には、ネガティブコントロール群は４．８９±０．１２であり、Ｔβ４群は７．０３±０．１３であり、Ｇｌｙ−Ｔβ４群は７．６２±０．１１であって、そこで、Ｔβ４群とＧｌｙ−Ｔβ４群はネガティブコントロール群から有意に異なっており、特に、Ｇｌｙ−Ｔβ４群はネガティブコントロール群から非常に有意に異なっていた。
【０１０８】
これらの結果は、Ｔβ４とＧｌｙ−Ｔβ４の両者は、アルカリで火傷した角膜の回復を促進することを示し（図４を参照されたい）、Ｇｌｙ−Ｔβ４が角膜損傷の修復を促進する効果は、Ｔβ４よりも驚くほど良かった。
【０１０９】
２．Ａｌａ−Ｔβ４と−Ｔβ４の間の比較
（１）疾患動物の調製と試験方法
Ａｌａ−Ｔβ４と−Ｔβ４の有効性を評価するために、急性角膜障害の疾患動物モデル−ウサギ角膜火傷モデルを確立した。
【０１１０】
直径８ｍｍの濾紙切片を１Ｎの苛性ソーダに浸し、浸された濾紙切片をウサギ角膜の中心に正確に置き、３０秒後にウサギ角膜をＰＢＳで十分に洗浄し、Ａｌａ−Ｔβ４とＴβ４により直ちに処理した。１日から５日後に独立して眼球を除去し、１０％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、瞳孔視神経面に沿って連続的な切片とし、得られた切片を染色し、画像解析システムによる角膜上皮の回復の収集と解析のために用いた。
【０１１１】
（２）投与プロトコール
ウサギ角膜アルカリ火傷モデルを確立した後、ネガティブコントロール物質（ＰＢＳ）、ポシティブコントロール物質（Ｔβ４）、及び試験物質（Ａｌａ−Ｔβ４）を、１日４回、点眼薬を用いて局所的に投与した。Ｔβ４とＡｌａ−Ｔβ４の薬剤濃度は５００μｇ／ｍｌであり、角膜の回復を投与後毎日観察した。
【０１１２】
（３）試験結果
角膜表皮の回復状態：１日目、アルカリ火傷した角膜上皮を、Ｔβ４群、Ａｌａ−Ｔβ４とＰＢＳ群の全てにおいて観察した（図９ＡからＣを参照されたい）。しかし、試験が完了した５日目に、ＰＢＳ群において、何らかの角膜上皮細胞の成長は無かったことが見出され（図１０Ａを参照されたい）；試験が完了した５日目に、Ｔβ４群において、全ての障害を受けた角膜上皮細胞は回復して正常となっており、そして１から２層の上皮細胞が出現していることが見出された（図１０Ｂを参照されたい）；試験が完了した５日目に、Ａｌａ−Ｔβ４群において、全ての障害を受けた角膜上皮細胞は回復して正常となっており、そして３から４層の上皮細胞が出現していることが見出された（図１０Ｃを参照されたい）。これらの群を比較することにより、Ｔβ４群とＡｌａ−Ｔβ４群における角膜上皮の回復はＰＢＳ群よりも明らかに良く、そしてＡｌａ−Ｔβ４群における角膜上皮の回復はＴβ４群よりも明らかに良かった。これらの結果は、Ｔβ４とＡｌａ−Ｔβ４の両者は、アルカリ火傷した角膜上皮の回復を促進するのに有意な機能を有していることを示唆しており、ここでＡｌａ−Ｔβ４はＴβ４よりも良い機能を有していた。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１は、ラットモデルにおけるラット心室壁の厚さに対するＴβ４とＧｌｙ−Ｔβ４の注射の効果を説明する。
【図２】図２は、ラットモデルにおけるラット心室壁の線維化に対するＴβ４とＧｌｙ−Ｔβ４の注射の効果を説明する。
【図３】図３は、ラットモデルにおけるラットの障害を受けた表皮の治癒に対するＴβ４とＧｌｙ−Ｔβ４の投与の効果を説明する。
【図４】図４は、ラットモデルにおけるラットの障害を受けた角膜の表皮形成に対するＴβ４とＧｌｙ−Ｔβ４の投与の効果を説明する。
【図５】図５は、ラットモデルにおけるラットの心室壁の厚さに対するＴβ４とＡｌａ−Ｔβ４の注射の効果を説明する。
【図６】図６は、ラットモデルにおけるラット心室壁の線維化に対するＴβ４とＡｌａ−Ｔβ４の注射の効果を説明する。
【図７】図７は、ラットモデルにおけるラットの表皮創傷の治癒時間に対するＴβ４とＡｌａ−Ｔβ４の投与の効果を説明する。
【図８】図８は、ラットモデルにおけるラットの表皮創傷の瘢痕の程度に対するＴβ４とＡｌａ−Ｔβ４の投与の効果を説明する。
【図９Ａ】図９は、ウサギ角膜火傷モデルにおいて、Ｔβ４群（Ｃ）、Ａｌａ−Ｔβ４群（Ｂ）およびＰＢＳ群（Ａ）の投与１日後に、角膜表皮のアルカリ火傷を観察した結果を説明する。
【図９Ｂ】図９は、ウサギ角膜火傷モデルにおいて、Ｔβ４群（Ｃ）、Ａｌａ−Ｔβ４群（Ｂ）およびＰＢＳ群（Ａ）の投与１日後に、角膜表皮のアルカリ火傷を観察した結果を説明する。
【図９Ｃ】図９は、ウサギ角膜火傷モデルにおいて、Ｔβ４群（Ｃ）、Ａｌａ−Ｔβ４群（Ｂ）およびＰＢＳ群（Ａ）の投与１日後に、角膜表皮のアルカリ火傷を観察した結果を説明する。
【図１０Ａ】図１０は、ウサギ角膜火傷モデルにおいて、Ｔβ４群（Ｃ）、Ａｌａ−Ｔβ４群（Ｂ）およびＰＢＳ群（Ａ）の投与５日後に、角膜表皮のアルカリ火傷の回復を観察した結果を説明する。
【図１０Ｂ】図１０は、ウサギ角膜火傷モデルにおいて、Ｔβ４群（Ｃ）、Ａｌａ−Ｔβ４群（Ｂ）およびＰＢＳ群（Ａ）の投与５日後に、角膜表皮のアルカリ火傷の回復を観察した結果を説明する。
【図１０Ｃ】図１０は、ウサギ角膜火傷モデルにおいて、Ｔβ４群（Ｃ）、Ａｌａ−Ｔβ４群（Ｂ）およびＰＢＳ群（Ａ）の投与５日後に、角膜表皮のアルカリ火傷の回復を観察した結果を説明する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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