(57)【要約】  本発明は、哺乳動物細胞のパルボウイルス形質導入を変える薬剤の同定方法を提供する。哺乳動物細胞中での導入遺伝子発現を高める方法、ならびにパルボウイルスで形質導入した哺乳動物細胞中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を高める薬剤の同定方法もまた提供される。
2009535034.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）哺乳動物細胞、１種若しくはそれ以上の薬剤、およびレドックス感受性パルボウイルスを接触させて混合物を生じせしめる工程；ならびに
ｂ）パルボウイルスと接触されるがしかし該１種若しくはそれ以上の薬剤と接触されない対応する哺乳動物細胞に関してエンドソームのＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を変える、該混合物中の薬剤の１種若しくはそれ以上を同定する工程
を含んでなる、哺乳動物細胞のパルボウイルス形質導入を変える薬剤の同定方法。
【請求項２】
パルボウイルス形質導入が阻害される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
パルボウイルス形質導入が高められる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
パルボウイルスが病原性パルボウイルスである、請求項１ないし３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
パルボウイルスがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項１ないし３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
パルボウイルスが組換えＡＡＶである、請求項１ないし３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
ａ）哺乳動物細胞および改変ウイルスキャプシドを有するパルボウイルスを接触させる工程であって、かつ、少なくとも１種の改変がキャプシド中のレドックス感受性残基の数若しくは位置の変化である、工程；
ｂ）該改変パルボウイルスによる哺乳動物細胞の形質導入が、対応する未改変パルボウイルスによる対応する哺乳動物細胞の形質導入に関して変えられているかどうかを同定する工程
を含んでなる、哺乳動物細胞のパルボウイルス形質導入を高めるウイルスキャプシド改変の同定方法。
【請求項８】
改変パルボウイルスによる形質導入が高められる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
改変がレドックス感受性残基の数の増大である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
改変が、システイン、リシン、ヒスチジン若しくはメチオニン、またはそれらのいずれかの組合せの増大された数である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
キャプシドが翻訳後修飾される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
パルボウイルス、およびエンドソームのＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を高める薬剤と哺乳動物細胞を接触させる工程
を含んでなる、哺乳動物細胞のパルボウイルス感染を高める方法。
【請求項１３】
パルボウイルスがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＡＡＶが組換えＡＡＶである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物細胞を、導入遺伝子の発現を高めるように、エンドソームのＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を高めるよう選択されたある量の薬剤、および導入遺伝子を有するある量の組
換えパルボウイルスと接触させる工程を含んでなる、哺乳動物細胞中での導入遺伝子発現を高める方法。
【請求項１６】
導入遺伝子が治療的遺伝子産物をコードする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子産物がポリペプチド若しくはペプチドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が、肺細胞、上皮細胞、肝細胞、筋細胞、造血細胞、心細胞若しくは神経細胞である、請求項１５ないし１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
細胞がヒト細胞である、請求項１５ないし１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
細胞がヒト以外の哺乳動物細胞である、請求項１５ないし１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１】
パルボウイルス、およびＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を阻害する薬剤と哺乳動物細胞を接触させる工程
を含んでなる、哺乳動物細胞のパルボウイルス感染の阻害方法。
【請求項２２】
哺乳動物細胞を、そのキャプシドがレドックス感受性アミノ酸残基の数若しくは位置を変えるように改変されているパルボウイルスと接触させる工程
を含んでなる、哺乳動物細胞のパルボウイルス感染を変える方法。
【請求項２３】
システイン、リシン、ヒスチジン若しくはメチオニン残基、またはそれらのいずれかの組合せの数が変えられている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
哺乳動物細胞を、そのキャプシドがレドックス感受性アミノ酸残基の数若しくは位置を変えるように改変されているパルボウイルスと接触させる工程
を含んでなる、ウイルス産生を変える方法。
【請求項２５】
薬剤およびパルボウイルスと接触させた哺乳動物細胞を提供する工程；ならびに
該薬剤が、パルボウイルスと接触されたがしかし該薬剤と接触されない哺乳動物細胞に関してパルボウイルス含有細胞中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を変えるかどうかを同定する工程
を含んでなる、パルボウイルスで形質導入した哺乳動物細胞中のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を変える薬剤の同定方法。
【請求項２６】
該薬剤がＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を高める、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
該薬剤がＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を低下させる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を阻害する薬剤が、ＤＰＩ、アポシニン若しくはそれらの組合せである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
パルボウイルスがアデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ２）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ウイルスに感染させた哺乳動物細胞からＲａｃ含有エンドソームを単離する工程、および、未感染の哺乳動物細胞中のＲａｃ含有エンドソーム中に存在しない、ウイルスに感染させたＲａｃ含有エンドソーム中の分子を同定する工程
を含んでなる、ウイルス受容体若しくは共受容体の同定方法。
【請求項３１】
ウイルスがパルボウイルスである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
パルボウイルスがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ｒａｃ含有エンドソーム中に組換えＲａｃを含んでなる、請求項３０ないし３２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３４】
組換えＲａｃが融合タンパク質を含んでなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ウイルスが病原性ウイルスである、請求項３０ないし３２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３６】
病原性ウイルスがＢ１９である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ウイルスが、アデノウイルス、ポックスウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、コックサッキーウイルス若しくはインフルエンザウイルスである、請求項３０ないし３２のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本出願は、２００６年４月２８日に出願された米国特許出願第６０／７９６，１０９号および２００６年１１月７日に出願された米国特許出願第６０／８５７，３４９号（それらの開示は本明細書に引用することにより組込まれる）の出願日の利益を主張する。
【０００２】
政府の権利の声明
本発明は、米国政府からの助成金（国立保健研究所からの助成金第ＨＬ５８３４０号）を用いてなされた。該政府は本発明にある種の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
活性酸素種（ＲＯＳ）は、タンパク質ホスファターゼおよびチオールで調節されるタンパク質／タンパク質相互作用を調節することにより、多様な細胞シグナリング過程で不可欠の役割を演じている（非特許文献１；非特許文献２）。貪食細胞中で、貪食細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（Ｎｏｘ２ｇｐ９１ｐｈｏｘ）複合体の病原体誘発性の活性化が、貪食された病原体の破壊で補助する食胞中のＲＯＳの高レベルにつながる。さらに、広範な他の細胞型で、ＲＯＳは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インスリン、インターロイキンβ（ＩＬ−１β）などのような多様なリガンドに応答しての細胞のシグナリングの媒介において重要な役割を演じている（非特許文献１；非特許文献２）。ＲＯＳが細胞のシグナル伝達を促進する機構は、タンパク質の活性部位のチオール基の不可逆的修飾を伴い、それらのなかの十分に研究された一例はタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）である（非特許文献２）。伝達される電子の数に依存して、チオール基のレドックス修飾は、他者に加えてジスルフィド結合、スルフェン酸、スルフィン酸、スルホン酸を包含する多様な産物をもたらし得る（非特許文献３）。
【０００４】
それらの高度に反応性の特性により、細胞は、シグナリングに関与する特定の場所にそれらの作用部位を制限するようにＲＯＳを区画化する。例えば、研究は、ＴＮＦ媒介性アポトーシスで重要なＪＮＫホスファターゼの酸化的不活性化の原因であるＨ２Ｏ２の供給源として、ミトコンドリアのスーパーオキシドが関係あるとされた（非特許文献４）。同様に、ペルオキシレドキシンＩＩ（ＰｒｘＩＩ）が、ＰＤＧＦ受容体不活性化で重要なＰＴＰの活性を制御することにより、ＰＤＧＦシグナル伝達の負の制御因子として作用することが示された（非特許文献５）。より最近、研究は、リガンド結合したＩＬ−１Ｒ１の受容体媒介性のエンドサイトーシスが、Ｎｏｘ２媒介性のエンドソームＲＯＳ産生を刺激し、かつ、受容体複合体のレドックス活性化を空間的に制限することもまた示した（非特許文献６；非特許文献７）。
【０００５】
細胞シグナリングにおけるＲＯＳの十分に確立された重要性に加え、増大する証拠は、ＲＯＳが多くの型のウイルス感染症の発病においてもまた決定的に重要な役割を演じていることを示唆する（非特許文献８：非特許文献９；非特許文献１０）。この情況において、多くのウイルスが感染の間にＲＯＳ生成を誘導すること、および、であるから、細胞のＲＯＳを消失させる原因である遺伝子の誘導にもまたつながることが既知である。アデノウイルスおよび腫瘍原性ポックスウイルスは、これらのウイルスが複製するために依存する細胞のレドックス不均衡を誘導し得る（非特許文献１１；非特許文献１２）。例えば、ＨＩＶ、インフルエンザウイルスおよび肝炎ウイルスは酸化的ストレスを誘導することが既知であり、また、抗酸化薬剤処置はこれらのウイルスにより引き起こされる病的状態を改善することが報告された（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７）。Ａ型インフルエンザ感染のｉｎ  ｖｉｖｏ研究（非特許文
献１８）において、感染した動物の気道の微小環境は、増大されたスーパーオキシド生成およびＨ２Ｏ２形成、ならびに低下されたアスコルビン酸レベルを包含する、酸化的ストレスの徴候を表した。しかしながら、感染した肺の抗酸化能力は、未感染動物と比較して損なわれておらず、ＲＯＳの生成に対するＡ型インフルエンザの主影響を示唆した。複合させたＳＯＤを使用するＡ型インフルエンザに対する抗酸化薬剤治療は有効であることが判明したが、しかし該投与が特定の期間内であった場合のみであった（非特許文献１６）。ＨＩＶの場合、酸化的ストレスがその複製を助長し、そして該機構はウイルス遺伝子発現を高め得るレドックスで活性化されるＮＦ−κＢが関わると一般に考えられている（非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献９）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを使用する研究は、ＨＩＶ感染からの病的状態の改善における数種の抗酸化薬剤の有効性を示した（非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献１７）。
【０００６】
対照的に、伝染性軟疣ウイルス（ＭＣＶ）ゲノムは、細胞がウイルス感染を制限するよう適応させる防御機構である酸化的ストレス誘発性アポトーシスを予防するのを助けるグルタチオンペルオキシダーゼ（Ｇｐｘ）様タンパク質をコードする（非特許文献８；非特許文献１０）。多数のウイルスが感染後に細胞のＲＯＳを誘導することが既知であるという事実にもかかわらず、細胞のレドックス状態の変化がウイルス感染／複製を助長若しくは阻害のいずれかをする機構は、不十分に理解されたままである。
【０００７】
【非特許文献１】Ｌａｍｂｅｔｈ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４：１８１（２００４）
【非特許文献２】Ｒｈｅｅら、Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ、２０００：ＰＥ１（２０００）
【非特許文献３】Ｐａｇｅｔら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、３７：９１（２００３）
【非特許文献４】Ｋａｍａｔａら、Ｃｅｌｌ、１２０：６４９（２００５）
【非特許文献５】Ｃｈｏｉら、Ｎａｔｕｒｅ、４３５：３４７（２００５）
【非特許文献６】Ｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８１：１４９５（２００６ａ）
【非特許文献７】Ｌｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２６：１４０（２００６ｂ）
【非特許文献８】ＭｃＦａｄｄｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７９：４０（１９９８）
【非特許文献９】Ｓｃｈｗａｒｚ、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、２１：６４１（１９９６）
【非特許文献１０】Ｓｈｉｓｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７９：１０２（１９９８）
【非特許文献１１】Ｒａｎｎａｎら、２００４
【非特許文献１２】Ｔｅｏｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７９：５７９９（２００５）
【非特許文献１３】Ｃａｉら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、３４：９２８（２００３）
【非特許文献１４】Ｌｏｇｕｅｒｃｉｏら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、３４：１（２００３）
【非特許文献１５】Ｎａｋａｍｕｒａら、Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ．Ｓｉｇｎａｌ、４：４５５（２００２）
【非特許文献１６】Ｏｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：９７４（１９８９）
【非特許文献１７】Ｎｅｗｍａｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８０：３５９（１９９４）
【非特許文献１８】Ｂｕｆｆｉｎｔｏｎら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１６：９９（１９９２）
【非特許文献１９】Ｂａｒｕｃｈｅｌら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．、５２：１１１（１９９２）
【非特許文献２０】Ｐｏｌｌａｒｄら、１９９４
【非特許文献２１】Ｓｃｈｒｅｃｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６：６２８８（１９９２）
【非特許文献２２】Ｄｒｏｇｅら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ、１３：２１１（１９９２）
【非特許文献２３】Ｍｉｈｍら、Ａｉｄｓ、５：４９７（１９９１）
【発明の開示】
【０００８】
［発明の要約］
本発明は、レドックス感受性の細胞内経路を有するウイルスによるウイルス形質導入を変えるための方法および化合物、ならびにそれらのレドックス感受性を変えるためのウイルスの改変方法を提供する。一態様において、哺乳動物細胞のウイルス形質導入を高める方法が提供される。一態様において、本発明は、例えばエンドソームのＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を高めることにより有効量でＲＯＳ産生を高める化合物を使用して、組換えパルボウイルス、例えば組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の形質導入を高め、それによりそれらのウイルスによる遺伝子移入を高める方法を提供する。別の態様において、哺乳動物細胞のウイルス形質導入の阻害方法が提供される。一態様において、本発明は、例えばエンドソームのＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を阻害することにより有効量でＲＯＳ産生を阻害する化合物を使用する、パルボウイルス形質導入の阻害方法を提供する。レドックス感受性の細胞内ウイルスプロセシング経路を高める若しくは阻害する薬剤の同定方法がさらに提供される。
【０００９】
後述されるとおり、アデノ随伴ウイルス２型（ＡＡＶ２）は、その感染の間のエンドソームのＲＯＳ産生の刺激、および結果として生じる過酸化水素を利用してのビリオンのエンドソームプロセシングの助長の双方をするよう進化した。ＨｅＬａ細胞、ＩＢ３細胞若しくは初代マウス線維芽細胞のｒＡＡＶ２への感染は、エンドソームのＮＡＤＰＨ依存性のスーパーオキシド産生を３ないし４倍刺激した。カタラーゼ負荷によるエンドソーム区画内からの過酸化水素の除去は、ｒＡＡＶ２による形質導入を約８０倍有意に低下させた。ＲａｃｌがｒＡＡＶ２形質導入に重要でありかつ２種のＮＡＤＰＨオキシダーゼ（Ｎｏｘ１およびＮｏｘ２）の活性化因子であることを考え、Ｎｏｘ１若しくはＮｏｘ２ノックアウト（ＫＯ）および同腹仔の野生型の初代皮膚線維芽細胞をＡＡＶ２に感染させた。これらの実験からの結果は、Ｎｏｘ２−／−線維芽細胞がｒＡＡＶ２感染後にエンドソームＲＯＳを誘導することに失敗し、また、野生型同腹仔の線維芽細胞に比較して１８倍より低いレベルの形質導入を有したことを示した。対照的に、ｒＡＡＶ２誘発性のエンドソームのＲＯＳ若しくは形質導入の差違は、Ｎｏｘ１  ＫＯおよび野生型同腹仔の線維芽細胞で観察されなかった。これらの結果は、ＡＡＶ２感染がエンドソーム区画中でＲＯＳを産生するようにＮｏｘ２を誘導すること、およびＨ２Ｏ２へのウイルスのエンドソーム曝露が該ウイルスの増殖性細胞内プロセシングに重要であることを示唆した。
【００１０】
本明細書にまた記述されるとおり、パルボウイルスの１サブクラス（例えばＡＡＶ２）は、感染の早期段階の間にエンドソームのＮｏｘ２を刺激し、そして結果として生じるＨ２Ｏ２を利用してキャプシドＶＰ中のＣｙｓ２８９のスルホン酸酸化を促進する。このレドックス事象は、ＡＡＶ２ビリオンの部分的アンフォールディング、およびビリオンのエンドソームエスケープに必要とされるキャプシドＶＰ１のホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）活性の活性化につながった。
【００１１】
本発明は、従って、哺乳動物細胞のウイルス形質導入を変える薬剤の同定方法を提供する。該方法は、哺乳動物細胞、１種若しくはそれ以上の薬剤、およびレドックス感受性の細胞内経路を有することが疑われるウイルスを接触させること、ならびにウイルスと接触させたがしかし１種若しくはそれ以上の薬剤と接触されない対応する哺乳動物細胞に関し
てエンドソームのＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を変える薬剤の１種若しくはそれ以上を同定することを包含する。エンドソーム区画でＲＯＳを生成するＮｏｘ複合体を不活性化する薬剤は抗ウイルス薬として有用でありうる一方、ＮｏｘによるＲＯＳ産生を高める薬剤は、感染を増強するのに有用、そして従って遺伝子治療ベクター若しくはウイルスワクチンとともに、すなわちそれらの効能を高めるのに有用でありうる。
【００１２】
従って、哺乳動物細胞を、レドックス感受性ウイルス、およびＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を高めるように選択された薬剤と接触させることを包含する、哺乳動物細胞のウイルス感染を高める方法もまた提供される。哺乳動物細胞を、レドックス感受性ウイルス、およびＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を阻害するよう選択された薬剤、例えばアポシニン（ａｐｏｃｙｎｉｎ）、若しくは多サブユニットＮｏｘ複合体を標的とする他の化合物と接触させることを包含する、哺乳動物細胞のウイルス感染の阻害方法がさらに提供される。一態様において、ウイルスは病原性パルボウイルス例えばＢ１９のような病原性ウイルスである。一態様において、該薬剤はプロテオソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）阻害薬剤若しくは修飾因子である。
【００１３】
ＡＡＶ２はＲａｃ１含有エンドソームに進入するため、レドックス依存性形質導入を示すか若しくは形質導入のためのＮｏｘ複合体を利用する他のウイルスは、Ｒａｃ１依存性の形質導入経路を有しうる（Ｒａｃ１はＮｏｘの活性化補助因子であるため）。これゆえに、Ｒａｃ１がＡＡＶ２と同一エンドソームに共局在化することを示す知見は、単離されたＨＡ−Ｒａｃ１標識エンドソームのプロテオミクスのアプローチを使用してのウイルスの侵入の原因である新受容体の同定を可能にする。
【００１４】
従って、ウイルスに感染した細胞からのＲａｃ含有エンドソーム中の分子が同定される方法がさらに提供される。一態様において、Ｒａｃ含有エンドソームが同定かつ単離されうるようにＲａｃを標識（ｔａｇ）で標識する（ｌａｂｅｌｅｄ）。一端単離されれば、ウイルスを含むＲａｃ含有エンドソームのプロテオームを、対照からのＲａｃ含有エンドソームのプロテオームと比較する。ウイルス含有エンドソーム中に存在する分子が受容体若しくは共受容体の候補である。
【００１５】
本明細書でまた記述されるとおり、ｒＡＡＶ２のＲＯＳ媒介性のエンドソームプロセシングは、キャプシド上のシステイン若しくは他のレドックス感受性残基に対するレドックス媒介性の変化を伴いうる。Ｈ２Ｏ２に曝露される精製ビリオンに対する構造的変化を、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＦ  ＭＳを使用してマッピングした。これらの実験からの結果は、ｎＭ量のＨ２Ｏ２が無傷のキャプシドのトリプシン感受性を高め得ることを示唆する。従って、ＲＯＳは、キャプシドがエンドソーム中にある間にアンフォールディングすることを助けかつ該ウイルスのある種の生物学的機能（１種若しくは複数）の活性化において補助しうる。無傷のｒＡＡＶ２ビリオンのｎＭ量のＨ２Ｏ２での処理は、ウイルスキャプシド中に常在性のホスホリパーゼＡ２活性もまた刺激した。これらの結果は、ＡＡＶ２が、Ｎｏｘ２由来のＲＯＳを増殖性に誘導および利用の双方をして感染の間にそのビリオンをプロセシングするように進化したことを示唆する。
【００１６】
パルボウイルスキャプシドの改変はレドックス感受性であるため、該ウイルスキャプシドはパルボウイルスベクターを改良するための標的となることができ、そしてタンパク質キャプシドを有する他の型のウイルスのキャプシドタンパク質のレドックス調節は、同様にウイルスベクターを改良しうる。ＰＬＡ２活性をもつキャプシドのレドックス調節は、酸化による新たなジスルフィド結合の創製、および／若しくはキャプシドの共有修飾、例えばシステインを包含するキャプシド残基の修飾（スルフィン酸、スルホン酸、スルフェン酸など）を伴いうる。システイン若しくは他のレドックス調節可能なアミノ酸、例えばヒスチジン、メチオニンなどが一旦同定されれば、その後、アミノ酸置換、若しくは他の
共有修飾を、キャプシドのレドックス調節される部分に工作することができ、それは、感染後にＮｏｘを活性化しかつ／若しくはウイルス産生を改良することに失敗する細胞中での感染性を改良しうる。あるいは、病原性パルボウイルスビリオン、例えば病原性パルボウイルスのキャプシド中のレドックスで調節される成分の同定は、ビリオンを不活性化するレドックス化学を用いて抗ウイルス薬を同定するのに有用でありうる。
【００１７】
従って、本発明は、哺乳動物細胞のウイルス形質導入を高めるウイルスキャプシド改変の同定方法を提供する。該方法は、哺乳動物細胞、および改変ウイルスキャプシド（少なくとも１種の改変が、キャプシド中のレドックス感受性残基の数若しくは位置（すなわち場所）の変化、またはキャプシドのレドックス感受性を変える翻訳後変化（例えば、システイン、メチオニン、リシン、ヒスチジンおよび他のレドックス改変可能なアミノ酸ならびにジスルフィド結合の豊富さ若しくは配置）である）を有するウイルスを接触させること、ならびに、該改変ウイルスによる哺乳動物細胞の形質導入が、対応する未改変ウイルスによる対応する哺乳動物細胞の形質導入に関して変えられているかどうかを同定することを包含する。別の態様において、哺乳動物細胞を、キャプシド変化を伴うウイルスおよび変えられたレドックス感受性、例えばレドックスストレスに対する低下された感受性をもつウイルスのライブラリーと接触させ、同定しかつ特徴付けする。従って、本発明は、ウイルス形質導入に対する細胞の障壁を回避するための、遺伝子治療のための改良されたベクター設計戦略を提供する。
【００１８】
［発明の詳細な記述］
定義
本明細書で使用されるところの「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含んでなるか若しくはそれと会合しかつｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏいずれかでの該ポリヌクレオチドの細胞への送達を媒介するのに使用し得る巨大分子若しくは巨大分子の連合を指す。具体的に説明するベクターは、例えばプラスミド、ウイルスベクター、リポソームおよび他の遺伝子送達ベヒクルを包含する。ときに「標的ポリヌクレオチド」若しくは「導入遺伝子」と称される送達されるべきポリヌクレオチドは、遺伝子治療における目的のコーディング配列（治療的すなわち目的のタンパク質をコードする遺伝子のような）、ワクチン開発における目的のコーディング配列（哺乳動物で免疫応答を導き出すのに適するタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドを発現するポリヌクレオチドのような）、および／または選択可能な若しくは検出可能なマーカーを含みうる。
【００１９】
「パルボウイルス」は、パルボウイルス、デペンドウイルスおよびデンソウイルスを包含するウイルスの科である。アデノ随伴ウイルスは例示的一パルボウイルスである。
【００２０】
「ＡＡＶ」はアデノ随伴ウイルスであり、そして天然に存在する野生型ウイルスそれ自身若しくはその誘導体を指すのに使用しうる。該用語は、別の方法で必要とされる場合を除き、全部のサブタイプ、血清型および偽型、ならびに天然に存在するおよび組換え双方の形態を包括する。本明細書で使用されるところの「血清型」という用語は、規定される抗血清とのキャプシドタンパク質の反応性により同定かつそれに基づき他のＡＡＶと識別されるＡＡＶを指し、例えば霊長類ＡＡＶの１０血清型（ＡＡＶ−１ないしＡＡＶ−１０）が存在する。例えば、血清型ＡＡＶ２は、ＡＡＶ２のｃａｐ遺伝子からコードされるキャプシドタンパク質、ならびに同一のＡＡＶ２血清型からの５’および３’ＩＴＲ配列を含有するゲノムを含有するＡＡＶを指すのに使用する。シュードタイピングされた（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）ＡＡＶは、１血清型からのキャプシドタンパク質および第二の血清型の５’−３’ＩＴＲを包含するウイルスゲノムを含有するＡＡＶを指す。シュードタイピングされたｒＡＡＶは、キャプシドの血清型の細胞表面結合特性、およびＩＴＲの血清型と一致する遺伝子特性を有することが期待されるとみられる。シュードタイピングされたｒＡＡＶは当該技術分野で記述された標準的技術を使用して製造する。本明細書で使用
されるところの例えばｒＡＡＶ５は、同一血清型からのキャプシドタンパク質および５’−３’ＩＴＲ双方を有するＡＡＶを指すのに使用しうるか、若しくは、それは、血清型５からのキャプシドタンパク質および異なるＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶ血清型２からの５’−３’ＩＴＲを有するＡＡＶを指すことができる。本明細書で具体的に説明される各例について、ベクターの設計および製造の記述はキャプシドおよび５’−３’ＩＴＲ配列の血清型を記述する。略語「ｒＡＡＶ」は、組換えＡＡＶベクター（若しくは「ｒＡＡＶベクター」）ともまた称される組換えアデノ随伴ウイルスを指す。
【００２１】
本明細書で使用されるところの「形質導入」若しくは「形質導入すること」は、ポリヌクレオチドの発現につながる宿主細胞中へのウイルスベクターによる外因性ポリヌクレオチド（例えばｒＡＡＶベクター中の導入遺伝子）の導入（例えば細胞中の導入遺伝子）の過程を指す用語である。例えば、ＡＡＶについて、該過程は１）それが細胞表面受容体に結合した後のＡＡＶのエンドサイトーシス、２）エンドソーム若しくは細胞のサイトゾル中の他の細胞内区画からのエスケープ、３）ウイルス粒子若しくはウイルスゲノムの核への輸送、４）ウイルス粒子の脱コート、および環状中間体を包含する発現可能な二本鎖ＡＡＶゲノムの形態の生成を包含する。ｒＡＡＶの発現可能な二本鎖の形態は、核エピソームとして持続しうるか、若しくは、場合によっては宿主ゲノムに組込まれうる。本発明の薬剤によるエンドソーム活性化および／若しくはエンドソーム滞留（ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ）時間の変化は、変えられた発現レベル若しくは発現の持続性、核への変えられた輸送、導入されるポリヌクレオチドを発現する宿主細胞若しくは細胞の集団の変えられた型若しくは相対数、および／または変えられたウイルス産生をもたらしうる。ウイルスを介して導入されるポリヌクレオチドの変えられた発現若しくは持続性は、限定されるものでないが、例えばＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーおよびウエスタンブロットによるタンパク質発現、ハイブリダイゼーションアッセイ、例えばノーザンブロット、サザンブロットによるＤＮＡおよびＲＮＡ産生の測定、ならびにゲルシフト移動度アッセイを挙げることができる当該技術分野に公知の方法により測定し得る。一態様において、本発明の薬剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏでの導入されるポリヌクレオチド、例えばｒＡＡＶベクター中の導入遺伝子の発現を変えるように、エンドソームプロセシングを変えうるかまたはエンドソーム若しくは他の細胞内サイトゾル区画からエスケープしうる、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性、例えばＲＯＳ産生を高める若しくは増大させる。外因性ポリヌクレオチドの導入に使用される方法は、トランスフェクション、リポフェクション、ウイルス感染、形質転換および電気穿孔法、ならびにウイルス以外の遺伝子送達技術のような公知の技術を包含する。導入されたポリヌクレオチドは宿主細胞中で安定に若しくは一過性に維持されうる。
【００２２】
「増大された形質導入若しくは形質導入頻度」、「変えられた形質導入若しくは形質導入頻度」、または「高められた形質導入若しくは形質導入頻度」は、未処理細胞に関しての処理された細胞での上述された活性の１種若しくはそれ以上の増大を指す。形質導入効率を増大させる本発明の薬剤は、導入遺伝子の発現を測定すること、導入遺伝子の機能を測定すること、若しくは該薬剤で処理されない宿主細胞に比較して同一の導入遺伝子の影響を生じるのに必要な粒子の数を測定することを包含しうる、１種若しくはそれ以上の形質導入活性に対する影響を測定することにより、決定しうる。
【００２３】
「プロテオソーム修飾因子」は、プロテオソームと相互作用すること、それに結合すること、あるいはその機能および／または輸送若しくは場所を変えることにより、ｒＡＡＶ形質導入若しくはｒＡＡＶ形質導入頻度を変える若しくは高める薬剤若しくは薬剤の分類を指す。プロテオソーム修飾因子は、例えば抗生物質ドキソルビシンのような当該技術分野で記述されるところの他の細胞性機能を有しうる。一態様において、プロテオソーム修飾因子は、例えば、トリペプチジルアルデヒド（Ｚ−ＬＬＬ若しくはＬＬｎＬ）、すなわちカルパイン、カテプシン、システインプロテアーゼ、および／若しくはプロテアソーム
のキモトリプシン様プロテアーゼの活性を阻害する薬剤（Ｗａｇｎｅｒら、２００２；Ｙｏｕｎｇら、２０００；Ｓｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒら、２００１）のようなプロテオソーム阻害薬剤を包含しない。
【００２４】
「二本鎖の発現可能な形態の生成」若しくは「一本鎖の二本鎖ｒＡＡＶゲノムへの転化」は、ｒＡＡＶに感染した宿主細胞の核中でｒＡＡＶ一本鎖ベクターＤＮＡゲノムの相補鎖を複製すること、および二本鎖ＤＮＡのｒＡＡＶゲノムを生じるための相補鎖のベクターゲノムへのアニーリングの過程を指す。ｒＡＡＶ形質導入を増大する、変える若しくは高めるために本明細書に記述される本発明の薬剤は、定常状態の機構を介して遺伝子転化事象を駆動し得る、核輸送の速度、若しくは核中の一本鎖ウイルスＤＮＡゲノムの定常状態を増大させる薬剤を包含する。本明細書に記述される本発明の目的上、一本鎖の二本鎖への転化を高める薬剤は、Ｒｕｓｓｅｌら（１９９５）により記述されるＤＮＡ修復酵素の濃度を増大させる若しくは代替のＤＮＡ修復機構を活性化する薬剤を包含しない。
【００２５】
「遺伝子送達」は、遺伝子移入のための細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入を指し、そして、ターゲッティング、結合、取り込み、輸送、局在化、レプリコン組込みおよび発現を包含しうる。
【００２６】
「遺伝子移入」は、ターゲッティング、結合、取り込み、輸送、局在化およびレプリコン組込みを包含しうる細胞中への外因性ポリヌクレオチドの導入を指すが、しかし該遺伝子のその後の発現と異なりかつそれを意味しない。
【００２７】
「遺伝子発現」若しくは「発現」は、遺伝子の転写、翻訳および翻訳後修飾の過程を指す。
【００２８】
「検出可能なマーカー遺伝子」は、該遺伝子を保有する細胞が特異的に検出される（例えば該マーカー遺伝子を保有しない細胞と識別される）ことを可能にする遺伝子である。多様なこうしたマーカー遺伝子が当該技術分野で既知である。
【００２９】
「選択可能なマーカー遺伝子」は、該遺伝子を保有する細胞が、対応する選択薬剤の存在下で賛成して若しくは反対して（ｆｏｒ  ｏｒ  ａｇａｉｎｓｔ）特異的に選択されることを可能にする遺伝子である。具体的説明として、抗生物質耐性遺伝子を、対応する抗生物質の存在下で宿主細胞が陽性に選択されることを可能にする陽性の選択可能なマーカー遺伝子として使用し得る。多様な陽性および陰性の選択可能なマーカーが当該技術分野で既知であり、それらのいくつかを下述する。
【００３０】
本明細書で使用されるところの「ｒＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ起源のものでないポリヌクレオチド配列（すなわちＡＡＶに対し異種のポリヌクレオチド）、典型的には細胞の遺伝子形質転換のための目的の配列を含んでなるＡＡＶベクターを指す。本発明の好ましいベクター構築物において、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１個、好ましくは２個のＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）により隣接される。ｒＡＡＶベクターという用語は、ｒＡＡＶベクター粒子およびｒＡＡＶベクタープラスミド双方を包含する。
【００３１】
「ＡＡＶウイルス」若しくは「ＡＡＶウイルス粒子」は、（好ましくは野生型ＡＡＶのキャプシドタンパク質の全部による）少なくとも１種のＡＡＶキャプシドタンパク質、およびキャプシド形成されたポリヌクレオチドより構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達されるべき導入遺伝子のような、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含んでなる場合、それは典型的に「ｒＡＡＶ」と称される。
【００３２】
本明細書で使用されるところの「ウイルスワクチン」は、該ベクターと接触された宿主中で免疫応答を導き出すことが可能なペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質をコードする、そのウイルスに対し異種のポリヌクレオチドを含んでなるウイルスベクターを指す。該ポリヌクレオチドの発現は、中和抗体応答および／若しくは細胞媒介性応答、例えば細胞傷害性Ｔ細胞応答の生成をもたらしうる。
【００３３】
ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（例えば野生型ＡＡＶ）が哺乳動物細胞により複製かつパッケージングされることを可能にするウイルスを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびワクシニアのようなポックスウイルスを包含するＡＡＶの多様なこうしたヘルパーウイルスが当該技術分野で既知である。アデノウイルスは多数の異なるサブグループを包含するとは言え、サブグループＣのアデノウイルス５型が最も一般に使用される。ヒト、ヒト以外の哺乳動物およびトリ起源の多数のアデノウイルスが既知であり、そしてＡＴＣＣのような供託所から入手可能である。ヘルペス科のウイルスは、例えば単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）を包含し；それらもまたＡＴＣＣのような供託所から入手可能である。
【００３４】
「感染性」ウイルス若しくはウイルス粒子は、該ウイルス種が栄養性である細胞中にそれが送達することが可能であるポリヌクレオチド成分を含んでなるものである。該用語は、ウイルスのいずれかの複製能力を必ずしも意味しない。
【００３５】
「複製能力のある」ウイルス（例えば、ときに「ＲＣＡ」と略称される、複製能力のあるＡＡＶ）は、感染性であり、かつ、感染させた細胞中で（すなわちヘルパーウイルス若しくはヘルパーウイルス機能の存在下で）複製されることもまた可能である、表現型上野生型のウイルスを指す。ＡＡＶの場合、複製能力は一般に機能的ＡＡＶパッケージング遺伝子の存在を必要とする。本明細書に記述されるところの好ましいｒＡＡＶベクターは、１種若しくはそれ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子の欠如によって哺乳動物細胞中（とりわけヒト細胞中）で複製能力がない。好ましくは、こうしたｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージング遺伝子と入ってくるｒＡＡＶベクターの間の組換えによりＲＣＡが生成される可能性を最小限にするため、いかなるＡＡＶパッケージング遺伝子配列も欠く。本明細書に記述されるところの好ましいｒＡＡＶベクター調製物は、ＲＣＡを（あれば）ほとんど含有しない（好ましくは１０２ｒＡＡＶ粒子あたり約１未満のＲＣＡ、より好ましくは１０４ｒＡＡＶ粒子あたり約１未満のＲＣＡ、なおより好ましくは１０８ｒＡＡＶ粒子あたり約１未満のＲＣＡ、なおより好ましくは１０１２ｒＡＡＶ粒子あたり約１未満のＲＣＡ、最も好ましくはＲＣＡなし）ものである。
【００３６】
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドまたはそれらのアナログを包含する、いずれかの長さのポリマーの形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、メチル化若しくはキャッピングされたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログのような修飾ヌクレオチドを含むことができ、そしてヌクレオチド以外の成分により中断されうる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの集成前若しくは後に与えられうる。本明細書で使用されるところのポリヌクレオチドという用語は、二本鎖および一本鎖分子を互換性に指す。別の方法で明記され若しくは必要とされない限り、ポリヌクレオチドである本明細書に記述される本発明のいかなる態様も、二本鎖の形態、および二本鎖の形態を構成することが既知の若しくは予測される２種の相補的一本鎖の形態のそれぞれの双方を包含する。
【００３７】
「遺伝子」は、転写および翻訳された後に特定の一タンパク質をコードすることが可能である少なくとも１個のオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。
【００３８】
ポリヌクレオチドに適用されるところの「組換え」は、該ポリヌクレオチドが、クローニング、制限および／若しくは連結段階、ならびに天然に見出されるポリヌクレオチドと異なる構築物をもたらす他の手順の多様な組合せの産物であることを意味している。組換えウイルスは組換えポリヌクレオチドを含んでなるウイルス粒子である。該用語は、それぞれ、元のポリヌクレオチド構築物の複製物および元のウイルス構築物の子孫を包含する。
【００３９】
「調節領域」若しくは「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、転写、スプライシング、翻訳若しくは分解を包含するポリヌクレオチドの機能的調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。該調節は、該過程の頻度、速度若しくは特異性に影響を及ぼすことがあり、そして性質が増強若しくは阻害性でありうる。当該技術分野で既知の調節領域は、例えばプロモーターおよびエンハンサーのような転写制御配列である。プロモーターは、ある種の条件下で、ＲＮＡポリメラーゼを結合しかつ通常はプロモーターから下流（３’の方向に）配置されるコーディング領域の転写を開始することが可能なＤＮＡ領域である。プロモーターは、ＡＡＶプロモーター、例えばＰ５、Ｐ１９、Ｐ４０およびＡＡＶ  ＩＴＲプロモーター、ならびに異種プロモーターを包含する。
【００４０】
「発現ベクター」は、目的のポリペプチドをコードする領域を含んでなるベクターであり、かつ、意図している標的細胞中でのタンパク質の発現を遂げるために使用される。発現ベクターは、標的中でのタンパク質の発現を助長するためにコーディング領域に効果的に連結されている調節領域もまた含んでなる。調節領域、および発現のためにそれらが作動可能に連結されている遺伝子（１種若しくは複数）の組合せは、ときに「発現カセット」と称され、多数のそれらが当該技術分野で既知かつ利用可能であるか、若しくは当該技術分野で利用可能である成分から容易に構築され得る。
【００４１】
「遺伝子変化」は、遺伝因子が有糸分裂若しくは減数分裂による以外で細胞に導入される過程を指す。該因子は細胞に対し異種でありうるか、またはそれは該細胞中に既に存在する因子の付加的なコピー若しくは改良されたバージョンでありうる。遺伝子変化は、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、若しくはポリヌクレオチド−リポソーム複合体と接触させることのような、当該技術分野で既知のいずれかの方法により、組換えプラスミド若しくは他のポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることにより遂げることができる。遺伝子変化は、例えばＤＮＡ若しくはＲＮＡウイルス若しくはウイルスベクターでの形質導入若しくは感染によってもまた遂げることができる。好ましくは、遺伝因子は細胞中で染色体若しくはミニ染色体中に導入されるが；しかし、細胞およびその子孫の表現型および／若しくは遺伝子型を変えるいかなる変化も本用語に包含される。
【００４２】
細胞は、遺伝子配列がｉｎ  ｖｉｔｒｏで該細胞の延長された培養の間にその機能を遂行するために利用可能である場合に、該配列で「安定に」変えられ、形質導入され、若しくは形質転換されたと言われる。好ましい例において、こうした細胞は、該変えられた細胞の子孫によってもまた遺伝可能である遺伝子変化が導入されているため、「遺伝可能に」変えられている。
【００４３】
本明細書で使用されるところの「組換えＤＮＡ分子」という用語は、分子生物学的技術によって一緒に結合されたＤＮＡのセグメントから構成されるＤＮＡ分子を指す。
【００４４】
本明細書で使用されるところの「転写制御配列」若しくは「ＴＲＳ」は、それが作動可能に連結されている遺伝子若しくはコーディング配列の転写を制御するゲノム領域を指す。本発明で有用な転写制御配列は、一般に少なくとも１個の転写プロモーターを包含し、
そして１個若しくはそれ以上の転写のエンハンサーおよび／若しくはターミネーターもまた包含しうる。「作動可能に連結されている」は、そのように記述される成分が、それらが協調された様式で機能することを可能にする関係にある、２種若しくはそれ以上の成分の配置を指す。具体的説明として、転写制御配列若しくはプロモーターは、ＴＲＳ若しくはプロモーターがコーディング配列の転写を促進する場合に、該コーディング配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されているＴＲＳは、一般にコーディング配列とシスに結合されているが、しかしそれは必ずしもそれに直接隣接していなくてもよい。
【００４５】
「ターミネーター」は、読み通し転写を減少させる若しくは予防する傾向があるポリヌクレオチド配列を指す（すなわち、それは、ターミネーターの一側で発する転写が該ターミネーターの他側まで継続することを減少させる若しくは予防する）。転写が破壊される程度は、典型的に、ターミネーター配列の塩基配列および／若しくは長さの関数である。とりわけ、多数の分子生物学的系で公知であるとおり、一般に「転写終止配列」と称される特定のＤＮＡ配列は、おそらくＲＮＡポリメラーゼ分子を停止させかつ／若しくは転写されているＤＮＡから解放することにより、ＲＮＡポリメラーゼによる読み通し転写を破壊する傾向がある特殊な配列である。こうした配列特異的ターミネーターの典型的な例は、ポリアデニル化（「ポリＡ」）配列、例えばＳＶ４０ポリＡを包含する。こうした配列特異的ターミネーターに加えて、若しくはその代わりに、プロモーターとコーディング領域の間の比較的長いＤＮＡ配列の挿入もまた、一般には介在配列の長さに比例してコーディング領域の転写を破壊する傾向がある。この効果はおそらく、転写されているＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼ分子が解放されたようになる何らかの傾向が常に存在し、また、コーディング領域に達する前に通り抜けられるべき配列の長さを増大させることが、コーディング領域の転写が完了した若しくはおそらく開始される前にさえ解放が起こるとみられる見込みを一般に増大させるとみられるために生じる。ターミネーターは、従って、一方向のみ（「一方向」ターミネーター）若しくは双方向（「二方向」ターミネーター）からの転写を予防することができ、そして、配列特異的終止配列若しくは配列非特異的ターミネーターまたは双方から構成されうる。多様なこうしたターミネーター配列が当該技術分野で既知であり；そして本発明の情況内のこうした配列の具体的に説明する使用を下に提供する。
【００４６】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、いずれかの長さのアミノ酸のポリマーを指すのに、別の方法で識別されない限り本明細書で互換性に使用される。該用語はまた修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、アセチル化、ホスホニル化（ｐｈｏｓｐｈｏｎｙｌａｔｉｏｎ）、脂質化、若しくは標識成分との複合）。遺伝子治療およびそのための組成物の情況で論考される場合の「ＣＦＴＲ」などのようなポリペプチドは、該無傷のタンパク質の所望の生化学的機能を保持する、それぞれの無傷のポリペプチド、またはそのいずれかのフラグメント若しくは遺伝子的に工作された誘導体を指す。同様に、ＣＦＴＲおよび遺伝子治療での使用のための他のこうした遺伝子（典型的に、レシピエント細胞に送達されるべき「導入遺伝子」と称される）への言及は、所望の生化学的機能を有する無傷のポリペプチドまたはいずれかのフラグメント若しくは遺伝子的に工作された誘導体をコードするポリヌクレオチドを包含する。
【００４７】
本明細書で使用されるところの「組換えタンパク質」若しくは「組換えポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ分子から発現されるタンパク質分子を指す。
【００４８】
核酸、ペプチド、ポリペプチド若しくはウイルスに関して使用される場合の「単離された」という用語は、それがその天然の供給源中で通常連合される少なくとも１種の汚染物質の核酸、ポリペプチド、ウイルス若しくは他の生物学的成分から同定かつ分離されている核酸配列、ペプチド、ポリペプチド若しくはウイルスを指す。例えば、単離された物質
は、供給源混合物からそれを濃縮するための精製技術を使用することにより製造しうる。濃縮は、溶液の容量あたり重量のような絶対的な基準に基づいて（ｏｎ  ａｎ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｂａｓｉｓ）測定し得るか、若しくは、それは、供給源混合物に存在する第二の潜在的に妨害する物質に関して測定し得る。本発明の態様の濃縮を増大することがますますより好ましい。例えば、２倍濃縮が好ましく、１０倍濃縮がより好ましく、１００倍濃縮がより好ましく、１０００倍濃縮がなおより好ましい。従って、単離された核酸、ペプチド、ポリペプチド若しくはウイルスは、それが天然に見出されるものと異なる形態若しくは環境で存在する。例えば、所定のＤＮＡ配列（例えば遺伝子）は隣接する遺伝子に近接して宿主細胞染色体上で見出され；特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列のようなＲＮＡ配列は、多数のタンパク質をコードする多数の他のｍＲＮＡとの混合物として細胞中で見出される。単離された核酸分子は一本鎖若しくは二本鎖の形態で存在しうる。単離された核酸分子がタンパク質を発現するのに利用されることになる場合、該分子は少なくともセンスすなわちコーディング鎖を含有することができる（すなわち該分子は一本鎖でありうる）が、しかしセンスおよびアンチセンス双方の鎖を含有しうる（すなわち該分子は二本鎖でありうる）。
【００４９】
「異種の」は、それが比較される実体の残部のものと遺伝子型上異なる実体に由来することを意味している。例えば、遺伝子工作技術により異なる細胞型に導入されるポリヌクレオチドは異種ポリヌクレオチドである（そして、発現される場合に異種ポリペプチドをコードし得る）。同様に、その天然のコーディング配列から取り出されかつ異なるコーディング配列に作動可能に連結されているＴＲＳ若しくはプロモーターは、異種ＴＲＳ若しくはプロモーターである。
【００５０】
細胞若しくは生物体中のタンパク質、遺伝子、核酸若しくはポリヌクレオチドに関して使用される場合の「外因性」という用語は、人工的若しくは天然の手段により該細胞若しくは生物体に導入されたタンパク質、遺伝子、核酸若しくはポリヌクレオチドを指す。外因性核酸は異なる生物体若しくは細胞からでありうるか、または、それは該生物体若しくは細胞内に天然に存在する核酸の１個若しくはそれ以上の付加的なコピーでありうる。制限しない例として、外因性核酸は天然の細胞のものと異なる染色体位置にあるか、若しくは、そうでなければ天然に見出されるものと異なる核酸配列により隣接されている（例えば、１遺伝子からのプロモーターを異なる遺伝子からの遺伝子産物のオープンリーディングフレームに連結する発現カセット）。
【００５１】
「配列相同性」という用語は、２種の核酸配列間の塩基の一致の比率若しくは２種のアミノ酸配列の間のアミノ酸の一致の比率を意味している。配列相同性をパーセントとして表す（例えば５０％）場合、該パーセントは、いずれかの他の配列と比較される選択された配列の長さにわたる一致の比率を示す。ギャップ（２配列のいずれか中の）が一致を最大にするように許容され；１５塩基若しくは未満のギャップ長さを通常使用し、６塩基若しくは未満が好ましく、２塩基若しくは未満がより好ましい。オリゴヌクレオチドをプローブ若しくは処理として使用する場合、標的核酸とオリゴヌクレオチド配列の間の配列相同性は、一般に、２０の可能なオリゴヌクレオチド塩基対の一致からの少なくとも１７の標的塩基の一致（８５％）；好ましくは１０の可能な塩基対の一致から少なくとも９の一致（９０％）、およびより好ましくは２０の可能な塩基対の一致から少なくとも１９の一致（９５％）である。
【００５２】
２種のアミノ酸配列は、それらの配列間に部分的若しくは完全な同一性が存在する場合に相同である。例えば、８５％相同性は、２配列を最大の一致のため整列する場合に該アミノ酸の８５％が同一であることを意味している。ギャップ（一致されている該２配列のいずれか中の）が一致の最大化において許容され；５若しくは未満のギャップ長さが好ましく、２若しくは未満がより好ましい。あるいは、そして好ましくは、２種のタンパク質
配列（若しくは長さ少なくとも３０アミノ酸のそれら由来のポリペプチド配列）は、突然変異データマトリックスおよび６若しくはそれ以上のギャップペナルティを用いてプログラムＡＬＩＧＮを使用してそれらが５以上（標準偏差単位で）でのアライメントスコアを有する場合に、本用語が本明細書で使用されるところの相同である。Ｄａｙｈｏｆｆ、１９７２を参照されたい。該２配列若しくはそれらの部分は、より好ましくは、それらのアミノ酸がＡＬＩＧＮプログラムを使用して至適に整列される場合に５０％以上若しくはそれに等しく同一である場合に、相同である。
【００５３】
「に対応する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部若しくは一部分に構造的に関係付けられること、あるいはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列の全部若しくは一部分に構造的に関係付けられる、例えばそれらが少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上、例えば９９％若しくは１００％の配列同一性を有することを意味するのに本明細書で使用される。対比して、「に相補的」という用語は、該相補配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部若しくは一部分に相同であることを意味するのに本明細書で使用される。具体的説明のため、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、そして参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
【００５４】
以下の用語、すなわち「参照配列」、「比較ウィンドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセント」および「実質的同一性」は、２種若しくはそれ以上のポリヌクレオチド間の配列の関係を記述するのに使用する。「参照配列」は配列比較の基礎として使用される規定された配列であり；参照配列は、例えば完全長ｃＤＮＡ若しくは配列表に示される遺伝子配列の１セグメントのようなより長い配列の１サブセットでありうるか、または完全なｃＤＮＡ若しくは遺伝子配列を含みうる。一般に、参照配列は長さが少なくとも２０ヌクレオチド、頻繁には長さが少なくとも２５ヌクレオチド、およびしばしば長さが少なくとも５０ヌクレオチドである。２種のポリヌクレオチドはそれぞれ（１）該２ポリヌクレオチド間で類似である配列（すなわち完全なポリヌクレオチド配列の一部分）を含むことができ、かつ（２）該２ポリヌクレオチド間で相違する配列をさらに含むことができるため、２種（若しくはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的に、配列が類似の局所領域を同定かつ比較するための「比較ウィンドウ」にわたり該２ポリヌクレオチドの配列を比較することにより実施する。
【００５５】
本明細書で使用されるところの「比較ウィンドウ」は、少なくとも２０の連続するヌクレオチドの概念的セグメントを指し、そして、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列の部分は、該２配列の至適のアライメントのための参照配列（付加若しくは欠失を含まない）と比較して、２０パーセント若しくは未満の付加若しくは欠失（すなわちギャップ）を含みうる。比較ウィンドウを整列するための配列の至適のアライメントは、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ（１９８８）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ  リリース７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、ウィスコンシン州マディソン中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、若しくは検査により実施することができ、そして、多様な方法により生成される最良のアライメント（すなわち、比較ウィンドウにわたる最高の相同性パーセントをもたらす）を選択する。
【００５６】
「配列同一性」という用語は、２ポリヌクレオチド配列が比較のウィンドウにわたり同一である（すなわちヌクレオチド１つずつ）ことを意味している。「配列同一性のパーセント」という用語は、２ポリヌクレオチド配列が比較のウィンドウにわたり同一である（
すなわちヌクレオチド１つずつ）ことを意味している。「配列同一性のパーセント」という用語は、２種の至適に整列した配列を比較のウィンドウにわたり比較すること、同一核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ若しくはＩ）が双方の配列に存在する位置の数を決定して一致した位置の数を生じること、一致した位置の数を比較のウィンドウ中の位置の総数（すなわちウィンドウサイズ）により除算すること、および該結果を１００により乗算して配列同一性のパーセントを生じることにより、計算する。本明細書で使用されるところの「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、少なくとも２０ヌクレオチド位置の比較ウィンドウにわたり、頻繁には少なくとも２０〜５０ヌクレオチドのウィンドウにわたり、参照配列と比較して少なくとも８５パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０ないし９５パーセントの配列同一性、より通常は少なくとも９９パーセントの配列同一性を有する配列を含んでなり、配列同一性のパーセントが、比較のウィンドウにわたり参照配列の合計２０パーセント若しくは未満になる欠失若しくは付加を包含しうるポリヌクレオチド配列と参照配列を比較することにより計算される、ポリヌクレオチド配列の特徴を示す。
【００５７】
ポリペプチドに適用されるところの「実質的同一性」という用語は、２ペプチド配列をデフォルトのギャップ重み付け（ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ）を使用するプログラムＧＡＰ若しくはＢＥＳＴＦＩＴによるように至適に整列する場合に、少なくとも約８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも約９０パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５パーセントの配列同一性、および最も好ましくは少なくとも約９９パーセントの配列同一性を共有することを意味している。
【００５８】
本明細書で使用されるところの「パッケージング」は、ウイルスベクターの集成およびキャプシド形成をもたらす一連の細胞内事象を指す。従って、適するベクターを適切な条件下でパッケージング細胞株に導入する場合、それはウイルス粒子に集成され得る。
【００５９】
「宿主細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、「パッケージング細胞株」および他のこうした用語は、本発明で有用なより高等な真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞を示す。これらの細胞は、組換えベクター、ウイルス若しくは他の移入ポリヌクレオチドのレシピエントとして使用し得、そして形質導入された元の細胞の子孫を包含し得る。単一細胞の子孫は、元の親細胞に必ずしも完全に同一（形態若しくはゲノム相補物（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）において）でなくともよい。
【００６０】
「トランスフェクトされた」、「形質転換された」若しくは「トランスジェニック」は、少なくとも１種の組換えＤＮＡ配列の存在により変えられた若しくは増強されたいかなる宿主細胞若しくは細胞株も包含するのに本明細書で使用される。
【００６１】
「治療的遺伝子」、「予防的遺伝子」、「標的ポリヌクレオチド」、「導入遺伝子」、「目的の遺伝子」などは、全般的に、ベクターを使用して移入されるべき遺伝子（１種若しくは複数）を指す。典型的には、本発明の情況で、こうした遺伝子はウイルスベクター（複製されかつ粒子中にキャプシド形成され得る）内に配置される。標的ポリヌクレオチドは、多数の異なる応用のためのベクターを生成するのに本発明で使用し得る。こうしたポリヌクレオチドは、限定されるものでないが：（ｉ）欠けている、不足している若しくは至適以下のレベルの構造タンパク質若しくは酵素により引き起こされる欠乏症を解消するための他の形態の遺伝子治療で有用なタンパク質をコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）アンチセンス分子に転写されるポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）転写若しくは翻訳因子を結合するデコイに転写されるポリヌクレオチド；（ｉｖ）サイトカインのような細胞修飾因子をコードするポリヌクレオチド；（ｖ）ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のような特定の薬物に対しレシピエント細胞を感受性にし得るポリヌクレオチド；および（ｖｉ）多様な癌の処置のためのＥ１Ａ癌抑制遺伝子若しくはｐ５３癌抑制遺伝子のよう
な癌治療のためのポリヌクレオチドを挙げることができる。レシピエント宿主細胞中で導入遺伝子の発現を遂げるために、それは、好ましくはプロモーター（それ自身若しくは異種いずれかのプロモーター）に作動可能に連結される。多数の適するプロモーターが当該技術分野で既知であり、それらの選択は、標的ポリヌクレオチドの所望の発現レベル；構成的発現、誘導可能な発現、細胞特異的若しくは組織特異的発現を欲するかどうか、などに依存する。ウイルスベクターは選択可能なマーカーもまた含有しうる。
【００６２】
ＡＡＶの調製物は、感染性ヘルパーウイルス粒子に対する感染性ＡＡＶ粒子の比が少なくとも約１０２：１；好ましくは少なくとも約１０４：１、より好ましくは少なくとも約１０６：１；なおより好ましくは少なくとも約１０８：１である場合に、ヘルパーウイルスを「実質的に含まない」と言われる。調製物はまた、好ましくは同等な量のヘルパーウイルスタンパク質（すなわち、上で示されたヘルパーウイルス粒子の不純物が破壊された形態で存在した場合にヘルパーウイルスのこうしたレベルの結果として存在するとみられるところのタンパク質）も含まない。ウイルスおよび／若しくは細胞タンパク質の汚染は、一般にＳＤＳゲル上のクマシー染色するバンドの存在（例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に対応するもの以外のバンドの出現）として観察され得る。
【００６３】
ウイルスの産生、複製若しくはパッケージングの記述において使用される場合の「効率」は、該方法の有用な特性、すなわち、とりわけ細胞あたりに産生されるウイルス粒子の増殖速度および数を指す。「高効率」産生は、指定される培養期間の経過にわたる細胞あたり少なくとも１００ウイルス粒子；好ましくは細胞あたり少なくとも約１０，０００、およびより好ましくは少なくとも約１００，０００粒子の産生を示す。
【００６４】
本発明により処置される「個体」若しくは「被験体」は、脊椎動物、とりわけ哺乳動物種のメンバーを指し、そして、限定されるものでないが家畜、スポーツ動物（ｓｐｏｒｔｓ  ａｎｉｍａｌ）、およびヒトを包含する霊長類を挙げることができる。個体若しくは細胞の「処置」は、該処置を開始する時点での該個体若しくは細胞の天然の経過を変えるための試みにおけるいずれかの型の介入（例えば個体において予防的、治療的若しくは他の有益な効果を導き出すこと）である。本明細書で使用されるところの「処置すること」若しくは「処置する」は、（ｉ）病理学的状態が発生することを予防すること（例えば予防）；（ｉｉ）病的な状態を阻害若しくはその発生を阻止すること；（ｉｉｉ）病理学的状態を解消すること；および／または病理学的状態と関連する症状を減少させることを包含する。例えば、個体の処置は、（限定されるものでないが）遺伝若しくは誘発された遺伝的欠損、ウイルス、細菌若しくは寄生性生物体による感染、腫瘍性若しくは形成不全の状態、または自己免疫若しくは免疫抑制のような免疫系機能不全を挙げることができるいずれかの病理学的状態により引き起こされる病状を減少若しくは制限するために着手しうる。処置は、（限定されるものでないが）製薬学的組成物のような組成物の投与、および組成物で処理された適合性の細胞の投与を挙げることができる。処置は、予防的に若しくは治療的にのいずれでも実施しうる（すなわち、病理学的事象の開始若しくは病原体との接触の前若しくは後いずれでも）。
【００６５】
本明細書で使用されるところの「実質的に純粋」若しくは「精製された」は、目的の種が存在する優性な種であり（すなわち、モル基準でそれが該組成物中のいずれかの他の個々の種より豊富である）、そして、好ましくは、実質的に精製された画分は、目的の種が存在する全巨大分子種の少なくとも約５０パーセント（モル基準で）を含んでなる組成物であることを意味している。一般に、実質的に純粋な組成物は、該組成物中に存在する全巨大分子種の約８０％以上、より好ましくは約８５％、約９０％、約９５％および約９９％以上を含むことができる。最も好ましくは、目的の種は、該組成物が本質的に単一巨大分子種よりなる本質的な均質性まで精製されている（汚染物質種が慣習的検出方法により
該組成物中で検出され得ない）。
【００６６】
本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる塩」は、親化合物がその酸若しくは塩基塩を作成することにより改変されている、開示される化合物の誘導体を指す。製薬学的に許容できる塩の例は、限定されるものでないが、アミンのような塩基性残基の無機若しくは有機酸塩；カルボン酸のような酸性残基のアルカリ若しくは有機塩を挙げることができる。製薬学的に許容できる塩は、例えば非毒性の無機若しくは有機酸から形成される親化合物の慣習的な非毒性の塩若しくは四級アンモニウム塩を包含する。例えば、こうした慣習的非毒性塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、フマル酸、リン酸、硝酸などのような無機酸由来のもの；および酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸などのような有機酸から製造される塩を包含する。
【００６７】
本発明で有用な化合物の製薬学的に許容できる塩は、慣習的な化学的方法により、塩基若しくは酸性部分を含有する親化合物から合成し得る。一般に、こうした塩は、遊離酸若しくは塩基の形態のこれらの化合物を、水若しくは有機溶媒中または２者の混合物中で、化学量論的量の適切な塩基若しくは酸と反応させることにより製造し得；一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール若しくはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。適する塩の一覧は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８５）（その開示は引用することによりここに組み込まれる）に見出される。
【００６８】
「製薬学的に許容できる」という句は、信頼できる医学的判断の範囲内で、合理的な利益／危険比と釣り合う、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題若しくは合併症を伴わない、ヒトおよび動物の組織と接触しての使用に適する、化合物、物質、組成物および／若しくは投薬形態物を指すのに本明細書で使用する。
【００６９】
本明細書に開示される化合物の一方のジアステレオマーが、他方と比較して優れた活性を表しうる。必要とされる場合、ラセミ物質の分離は、キラルなカラムを使用するＨＰＬＣにより、若しくはカンフォン酸塩化物（ｃａｍｐｈｏｎｉｃ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）のような分割薬剤を使用する分割により達成し得る。式Ｉのキラルな化合物はまた、キラルな触媒若しくはキラルなリガンドを使用して直接に合成もしうる。
【００７０】
「治療上有効な量」は、例えば、宿主における疾患若しくは障害を処置若しくは予防するための、または疾患若しくは障害の症状を処置するための、本発明で有用な化合物の量、若しくは特許請求される化合物の組合せの量を包含することを意図している。化合物の組合せは好ましくは相乗的組合せである。相乗効果は、組合せで投与される場合の化合物の効果が、単一薬剤として単独で投与される場合の該化合物の相加的効果より大きい場合に起こる。一般に、相乗効果は化合物の至適以下の濃度で最も明瞭に示される。相乗効果は、個々の成分と比較しての組合せのより低い細胞傷害性、増大された活性、若しくは何らかの他の有益な効果に関し得る。
【００７１】
「安定な化合物」および「安定な構造」は、反応混合物からの有用な程度の純度までの単離、および有効な治療薬への処方を生き残るのに十分に丈夫である化合物を示すことを意味している。安定な化合物のみを本発明により企図している。
【００７２】
「置換されている」は、「置換されている」を使用する表現で示される原子上の１個若
しくはそれ以上の水素が、示される基（１個若しくは複数）からの選択で置換されているが、但し、示される原子の通常の原子価が超えられず、かつ、該置換が安定な化合物をもたらすことを示すことを意図している。適する示される基は、例えば、アルキル、アルケニル  アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／若しくはＣＯＯＲｘ（ここで各ＲｘおよびＲｙは独立にＨ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシである）を包含する。置換基がケト（すなわち＝Ｏ）若しくはチオキソ（すなわち＝Ｓ）基である場合には、該原子上の２個の水素が置換される。
【００７３】
「中断される」は、「中断される」を使用する表現で示される２個若しくはそれ以上の隣接炭素原子およびそれらが結合されている水素原子（例えばメチル（ＣＨ３）、メチレン（ＣＨ２）若しくはメチン（ＣＨ））の間に、示される基（１個若しくは複数）からの選択物が挿入されているが、但し、示される原子の通常の原子価のそれぞれが超えられず、そして該中断が安定な化合物をもたらすことを示すことを意図している。こうした適する示される基は、例えば、ペルオキシド以外のオキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）−）、イミン（Ｃ＝ＮＨ）、スルホニル（ＳＯ）若しくはスルホキシド（ＳＯ２）を包含する。
【００７４】
基、置換基および範囲について下に列挙される特定のおよび好ましい値は具体的説明のみのためであり；それらは該基および置換基についての他の規定される値若しくは規定される範囲内の他の値を除外しない。
【００７５】
「アルキル」は、正、第二、第三若しくは環状炭素原子を含有するＣ１−Ｃ１８炭化水素を指す。例は、メチル（Ｍｅ、−ＣＨ３）、エチル（Ｅｔ、−ＣＨ２ＣＨ３）、１−プロピル（ｎ−Ｐｒ、ｎ−プロピル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−プロピル（ｉ−Ｐｒ、ｉ−プロピル、−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１−ブチル（ｎ−Ｂｕ、ｎ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−１−プロピル（ｉ−Ｂｕ、ｉ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−ブチル（ｓ−Ｂｕ、ｓ−ブチル、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−２−プロピル（ｔ−Ｂｕ、ｔ−ブチル、−Ｃ（ＣＨ３）３）、１−ペンチル（ｎ−ペンチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２−メチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ３）、３−メチル−２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−１−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−メチル−１−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、１−ヘキシル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３））、２−メチル−２−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、４−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−３−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２−メチル−３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、２，３−ジメチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３，３−ジメチル−２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（ＣＨ３）３である。
【００７６】
アルキルは、場合によっては、１個若しくはそれ以上のアルケニル  アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルア
ミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／若しくはＣＯＯＲｘ（ここで各ＲｘおよびＲｙは独立にＨ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシルである）で置換され得る。アルキルは、場合によっては、１個若しくはそれ以上のペルオキシド以外のオキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、スルホニル（ＳＯ）若しくはスルホキシド（ＳＯ２）で中断され得る。加えて、アルキルは、場合によっては少なくとも部分的に不飽和であり得、それによりアルケニルを提供する。
【００７７】
「アルケニル」は、少なくとも１個の不飽和部位、すなわち炭素−炭素のｓｐ２二重結合をもつ正、第二、第三若しくは環状炭素原子を含有するＣ２−Ｃ１８炭化水素を指す。例は、限定されるものでないが：エチレンすなわちビニル（−ＣＨ＝ＣＨ２）、アリル（−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、シクロペンテニル（−Ｃ５Ｈ７）および５−ヘキセニル（−ＣＨ２  ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）を挙げることができる。
【００７８】
アルケニルは、場合によっては、１個若しくはそれ以上のアルケニル  アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／若しくはＣＯＯＲｘ（ここで各ＲｘおよびＲｙは独立にＨ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシルである）で置換され得る。加えて、アルケニルは、場合によっては、１個若しくはそれ以上のペルオキシド以外のオキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、スルホニル（ＳＯ）若しくはスルホキシド（ＳＯ２）で中断され得る。
【００７９】
「アルキレン」は、１〜１８個の炭素原子の、かつ、親アルカンの同一若しくは異なる炭素原子からの２個の水素原子の除去により派生される２個の一価のラジカルセンターを有する、飽和の分枝状若しくは直鎖または環状炭化水素基を指す。典型的なアルキレン基は、限定されるものでないが：メチレン（−ＣＨ２−）１，２−エチル（−ＣＨ２ＣＨ２−）、１，３−プロピル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、１，４−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）などを挙げることができる。
【００８０】
アルキレンは、場合によっては、１個若しくはそれ以上のアルキル、アルケニル  アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／若しくはＣＯＯＲｘ（ここで各ＲｘおよびＲｙは独立にＨ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシルである）で置換され得る。加えて、アルキレンは、場合によっては、１個若しくはそれ以上のペルオキシド以外のオキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、スルホニル（ＳＯ）若しくはスルホキシド（ＳＯ２）で中断され得る。さらに、アルキレンは、場合によっては少なくとも部分的に不飽和であり得、それによりアルケニレンを提供する。
【００８１】
「アルケニレン」は、２〜１８個の炭素原子の、かつ、親アルケンの同一若しくは２個
の異なる炭素原子からの２個の水素原子の除去により派生される２個の一価のラジカルセンターを有する、不飽和の分枝状若しくは直鎖または環状炭化水素基を指す。典型的なアルケニレン基は、限定されるものでないが：１，２−エチレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）を挙げることができる。
【００８２】
アルケニレンは、場合によっては、１個若しくはそれ以上のアルキル、アルケニル  アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／若しくはＣＯＯＲｘ（ここで各ＲｘおよびＲｙは独立にＨ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシルである）で置換され得る。加えて、アルケニレンは、場合によっては、１個若しくはそれ以上のペルオキシド以外のオキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、スルホニル（ＳＯ）若しくはスルホキシド（ＳＯ２）で中断され得る。
【００８３】
「アルコキシ」という用語は基アルキル−Ｏ−（ここでアルキルは本明細書で定義される）を指す。好ましいアルコキシ基は、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ｎ−ヘキソキシ、１，２−ジメチルブトキシなどを包含する。
【００８４】
アルコキシは，場合によっては、１個若しくはそれ以上のアルキル  ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよびＣＯＯＲｘ（ここで各ＲｘおよびＲｙは独立にＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシルである）で置換され得る。
【００８５】
「アリール」という用語は、単一環（例えばフェニル）、若しくはその中の少なくとも１個の環が芳香族である複数の縮合（ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ）（縮合（ｆｕｓｅｄ））環（例えばナフチル、ジヒドロフェナントレニル、フルオレニル若しくはアントリル）を有する６から２０個までの炭素原子の不飽和芳香族炭素環基を指す。好ましいアリールは、フェニル、ナフチルなどを包含する。
【００８６】
アリールは、場合によっては、１個若しくはそれ以上のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよびＣＯＯＲｘ（ここで各ＲｘおよびＲｙは独立にＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシルである）で置換され得る。
【００８７】
「シクロアルキル」という用語は、単一の環式環（ｃｙｃｌｉｃ  ｒｉｎｇ）若しくは複数の縮合環を有する３から２０個までの炭素原子の環状アルキル基を指す。こうしたシクロアルキル基は、例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチルなどのような単環構造、若しくはアダマンタニルなどのような複数環構造を包含
する。
【００８８】
シクロアルキルは、場合によっては、１個若しくはそれ以上のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよびＣＯＯＲｘ（ここで各ＲｘおよびＲｙは独立にＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシルである）で置換され得る。
【００８９】
シクロアルキルは、場合によっては少なくとも部分的に不飽和であり得、それによりシクロアルケニルを提供する。
【００９０】
「ハロ」という用語はフルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを指す。同様に、「ハロゲン」という用語はフッ素、塩素、臭素およびヨウ素を指す。
【００９１】
「ハロアルキル」は、同一若しくは異なりうる本明細書で定義されるところの１〜４個のハロ基により置換された、本明細書で定義されるところのアルキルを指す。代表的ハロアルキル基は、例として、トリフルオロメチル、３−フルオロドデシル、１２，１２，１２−トリフルオロドデシル、２−ブロモオクチル、３−ブロモ−６−クロロヘプチルなどを包含する。
【００９２】
「ヘテロアリール」という用語は、１、２若しくは３個の芳香環を含有しかつ１個の芳香環中に少なくとも１個の窒素、酸素若しくはイオウ原子を含有し、ならびに未置換であり得るか、または例えば１個若しくはそれ以上の、およびとりわけ１ないし３個のハロ、アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルおよびアルキルスルホニルのような置換基で置換され得る、単環、二環若しくは三環性の環系と本明細書で定義する。ヘテロアリール基の例は、限定されるものでないが、２Ｈ−ピロリル、３Ｈ−インドリル、４Ｈ−キノリジニル、４ｎＨ−カルバゾリル、アクリジニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、ベンゾチアゾリル、β−カルボリニル、カルバゾリル、クロメニル、シンナオリニル（ｃｉｎｎａｏｌｉｎｙｌ）、ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラニル、フラザニル、フリル、イミダゾリル、イミジゾリル（ｉｍｉｄｉｚｏｌｙｌ）、インダゾリル、インドリシニル（ｉｎｄｏｌｉｓｉｎｙｌ）、インドリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ナフチリジニル、ナプト［２，３−ｂ］、オキサゾリル（ｎａｐｔｈｏ［２，３−ｂ］，ｏｘａｚｏｌｙｌ）、ペリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナルサジニル（ｐｈｅｎａｒｓａｚｉｎｙｌ）、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリルおよびキサンテニルを挙げることができる。一態様において、「ヘテロアリール」という用語は、炭素、ならびに群ペルオキシド以外の酸素、イオウおよびＮ（Ｚ）（ここでＺは非存在であるかまたはＨ、Ｏ、アルキル、フェニル若しくはベンジルである）から独立に選択される１、２、３若しくは４個のヘテロ原子を含有する５若しくは６個の環原子を含有する単環性芳香環を示す。別の態様において、ヘテロアリールは、それらに由来する約８ないし１０個の環原子のオルト縮合二環性複素環、とりわけベンズ誘導体、またはプロピレン若しくはテトラメチレンジラジカルをそれに縮合することにより派生されるものを示す。
【００９３】
ヘテロアリールは、場合によっては、１個若しくはそれ以上のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよびＣＯＯＲｘ（ここで各ＲｘおよびＲｙは独立にＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシルである）で置換され得る。
【００９４】
「複素環」という用語は、群酸素、窒素およびイオウから選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有しかつ場合によってはアルキル若しくはＣ（＝Ｏ）ＯＲｂ（ここでＲｂは水素若しくはアルキルである）で置換されている、飽和若しくは部分的に不飽和の環系を指す。典型的に、複素環は、群酸素、窒素およびイオウから選択される１個若しくはそれ以上のヘテロ原子を含有する単環、二環若しくは三環性基である。複素環基は環に結合されたオキソ基（＝Ｏ）もまた含有し得る。複素環基の制限しない例は、１，３−ジヒドロベンゾフラン、１，３−ジオキソラン、１，４−ジオキサン、１，４−ジチアン、２Ｈ−ピラン、２−ピラゾリン、４Ｈ−ピラン、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、インドリニル、イソクロマニル、イソインドリニル、モルホリン、ピペラジニル、ピペリジン、ピペリジル、ピラゾリジン、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピロリジン、ピロリン、キヌクリジンおよびチオモルホリンを包含する。
【００９５】
複素環は、場合によっては、１個若しくはそれ以上のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよびＣＯＯＲｘ（ここで各ＲｘおよびＲｙは独立にＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシルである）で置換され得る。
【００９６】
窒素複素環およびヘテロアリールの例は、限定されるものでないが、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドリン、モルホリノ、ピペリジニル、テトラヒドロフラニルなど、ならびにＮ−アルコキシ窒素含有複素環を挙げることができる。本発明の特定の一態様において、窒素複素環は３−メチル−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピラジノ［３，２，１−ｊｋ］カルバゾル−３−イウムヨウ化物であり得る。
【００９７】
別の分類の複素環は、式［−（ＣＨ２−）ａＡ−］（式中ａは２に等しいか若しくはそれより大きく、かつ、各別個の存在でのＡはＯ、Ｎ、Ｓ若しくはＰであり得る）の１個若しくはそれ以上の反復単位を有する複素環化合物の特定の一分類を指す「クラウン化合物」として知られる。クラウン化合物の例は、例のみとして、［−（ＣＨ２）３−ＮＨ−］３、［−（（ＣＨ２）２−Ｏ）４−（（ＣＨ２）２−ＮＨ）２］などを包含する。典型的には、こうしたクラウン化合物は４から１０個までのヘテロ原子および８ないし４０個の炭素原子を有し得る。
【００９８】
「アルカノイル」という用語はＣ（＝Ｏ）Ｒ（ここでＲは以前に定義されたところのアルキル基である）を指す。
【００９９】
「アシルオキシ」という用語は−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ（ここでＲは以前に定義されたところのアルキル基である）を指す。アシルオキシ基の例は、限定されるものでないがアセトキシ、プロパノイルオキシ、ブタノイルオキシおよびペンタノイルオキシを挙げることができる。上で定義されたところのいかなるアルキル基も、アシルオキシ基を形成するのに使用し得る。
【０１００】
「アルコキシカルボニル」という用語はＣ（＝Ｏ）ＯＲ（ここでＲは以前に定義されたところのアルキル基である）を指す。
【０１０１】
「アミノ」という用語は−ＮＨ２を指し、また、「アルキルアミノ」という用語は−ＮＲ２（ここで少なくとも１個のＲがアルキルでありかつ第二のＲはアルキル若しくは水素である）を指す。「アシルアミノ」という用語はＲＣ（＝Ｏ）Ｎ（ここでＲはアルキル若しくはアリールである）を指す。
【０１０２】
「イミノ」という用語は−Ｃ＝ＮＨを指す。
【０１０３】
「ニトロ」という用語は−ＮＯ２を指す。
【０１０４】
「トリフルオロメチル」という用語は−ＣＦ３を指す。
【０１０５】
「トリフルオロメトキシ」という用語は−ＯＣＦ３を指す。
【０１０６】
「シアノ」という用語は−ＣＮを指す。
【０１０７】
「ヒドロキシ」若しくは「ヒドロキシル」という用語は−ＯＨを指す。
【０１０８】
「オキシ」という用語は−Ｏ−を指す。
【０１０９】
「チオ」という用語は−Ｓ−を指す。
【０１１０】
「チオキソ」という用語は（＝Ｓ）を指す。
【０１１１】
「ケト」という用語は（＝Ｏ）を指す。
【０１１２】
「炭水化物」という用語は、生存細胞の不可欠の構造成分かつ動物のエネルギー源を指し；小分子を伴う単純な糖ならびに巨大分子物質を包含し；それらが含有する単糖基の数に従って分類される。該用語は、変動可能な数の水素および酸素原子と結合された６（若しくは６の何らかの倍数）個の炭素原子（しかし該２種の前者は常に水を形成するような比率にある）を含有する糖、デンプンおよびガムを包含する化合物の一群の１種を指す（デキストロース、｛Ｃ６Ｈ１２Ｏ６｝のような）。該用語は、２Ｈ：１Ｃ：１Ｏの比の炭素、酸素および水素から構成される化合物若しくは分子を指す。炭水化物は、ショ糖および果糖のような単純な糖、またはキチンおよびデンプンのような複合多糖ポリマーであり得る。
【０１１３】
炭水化物は、場合によっては、１個若しくはそれ以上のアルキル、アルケニル  アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、
アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙおよび／若しくはＣＯＯＲｘ（ここで各ＲｘおよびＲｙは独立にＨ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシである）で置換され得る。
【０１１４】
糖は単糖、二糖、オリゴ糖若しくは多糖であり得る。糖はβ若しくはαの立体化学を有し得、（Ｒ）若しくは（Ｓ）相対配置を有し得、（＋）若しくは（−）異性体として存在し得、そしてＤ若しくはＬ配置で存在し得る。例えば糖はβ−Ｄ−グルコースであり得る。
【０１１５】
「糖（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」という用語はいかなる糖（ｓｕｇａｒ）若しくは他の炭水化物、とりわけ単糖若しくは炭水化物も指す。糖は生存細胞の不可欠の構造成分かつ動物のエネルギー源である。該用語は小分子を伴う単純な糖ならびに巨大分子物質を包含する。糖はそれらが含有する単糖基の数に従って分類される。
【０１１６】
「多糖」という用語は、化学的にすなわちグリコシド結合により一緒に連結されている糖分子を含有する１つの型の炭水化物を指す。該用語は、複数の単糖の鎖から構成される炭水化物である炭水化物の一分類のいずれも指す。多糖は単糖（ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）（単糖（ｓｉｍｐｌｅ  ｓｕｇａｒ））の複数の単位から構成されるポリマーである。
【０１１７】
「オリゴ糖」という用語は２ないし１０個の単糖単位を含有する化合物を指す。
【０１１８】
適する例示的な糖は、例えば、リボース、ブドウ糖、果糖、マンノース、イドース、グロース、ガラクトース、アルトロース、アロース、キシロース、アラビノース、トレオース、グリセルアルデヒドおよびエリトロースを包含する。
【０１１９】
本明細書で使用されるところの「デンプン」は、α−（１，４）−Ｄ−グルコース反復サブユニットおよびα−（１，６）−グルコシド結合よりなる、植物に存在する複合多糖を指す。
【０１２０】
本明細書で使用されるところの「デキストリン」は、熱、酸、酵素若しくはそれらの組合せによるデンプンの部分的分解により生じられる中間の鎖長をもつブドウ糖のポリマーを指す。
【０１２１】
本明細書で使用されるところの「マルトデキストリン」若しくは「ブドウ糖ポリマー」は、主としてα，−１，４結合により連結されたＤ−グルコース単位よりなりかつ２０未満のＤＥ（デキストロース等量）を有する、甘くない栄養素の糖ポリマーを指す。例えば、米国食品医薬品局（２１  Ｃ．Ｆ．Ｒ．第１８４．１４４４項）を参照されたい。マルトデキストリンは部分的に加水分解されたデンプン生成物である。デンプン加水分解生成物は、一般に、デキストロース等量（ＤＥ）（乾燥重量に基づくデキストロースとして計算される還元糖のパーセントである）として表されるそれらの加水分解の程度を特徴とする。
【０１２２】
１個若しくはそれ以上の置換基を含有する上の基のいずれに関しても、もちろん、こうした基は、立体的に実際的でなくかつ／若しくは合成で実現不可能であるいかなる置換若しくは置換パターンも含有しないことが理解される。加えて、本発明の化合物は、これらの化合物の置換から生じる全部の立体化学異性体を包含する。
【０１２３】
本明細書に記述される化合物内の選択された置換基は、繰り返す（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ）程度まで存在する。この文脈で、「繰り返し置換基（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）」は、ある置換基がそれ自身の別の場合を再び引用しうることを意味している。こうした置換基の繰り返す性質により、理論上、いずれの所定の請求項においても多数が存在しうる。医薬品化学の当業者は、意図している化合物の所望の特性によりこうした置換基の総数が合理的に制限されることを理解する。こうした特性は、例としてかつ制限としてでなく、分子量、溶解性若しくはｌｏｇ  Ｐのような物性、意図している標的に対する活性のような応用特性、および合成の容易さのような実務特性を包含する。
【０１２４】
繰り返し置換基は本発明の意図している一局面である。医薬品および有機化学の当業者はこうした置換基の融通性を理解する。繰り返し置換基が本発明の１請求項に存在する程度まで、該総数は上で示されたとおり決定することができる。
【０１２５】
本明細書に記述される化合物は、親化合物、親化合物のプロドラッグ、若しくは親化合物の活性代謝物として投与し得る。
【０１２６】
「プロドラッグ」は、こうしたプロドラッグを哺乳動物被験体に投与する場合にｉｎ  ｖｉｖｏで本発明の活性の親薬物または他の処方（ｆｏｒｍｕｌａｓ）若しくは化合物を遊離する、いかなる共有結合した物質も包含することを意図している。本発明の化合物のプロドラッグは、修飾がなおかつｉｎ  ｖｉｖｏで慣例の操作で親化合物に切断されるような方法で、化合物中に存在する官能基を修飾することにより製造する。プロドラッグは、該プロドラッグを哺乳動物被験体に投与する場合に切断して遊離のカルボニル、カルボン酸、ヒドロキシ若しくはアミノ基を形成するいずれかの基に該カルボニル、カルボン酸、ヒドロキシ若しくはアミノ基が結合されている、本発明の化合物を包含する。プロドラッグの例は、限定されるものでないが、本発明の化合物中のアルコールおよびアミン官能基の酢酸エステル、ギ酸エステルおよび安息香酸エステル誘導体などを挙げることができる。
【０１２７】
「代謝物」は、現在のこうした活性親薬物または他の処方若しくは化合物を哺乳動物被験体に投与する場合に、ｉｎ  ｖｉｖｏで本発明の活性親薬物または他の処方若しくは化合物と生存細胞が相互作用する生化学的過程から生じる、いかなる物質も指す。代謝物はいずれの代謝経路からの生成物若しくは中間体も包含する。
【０１２８】
「代謝経路」は、１化合物を別のものに変換しかつ中間体および細胞機能のためのエネルギーを提供する、一連の酵素に媒介される反応を指す。代謝経路は直線的若しくは循環的であり得る。明らかに、本発明の多数の改変および変形物が上の教示に照らして可能である。従って、付随する請求の範囲の範囲内で、本発明は本明細書にとりわけ記述されるところと別の方法で実施しうることが理解されるべきである。
【０１２９】
本発明の実務は、別の方法で示されない限り、当該技術分野の熟練内にある分子生物学、ウイルス学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の慣習的技術を使用することができる。
【０１３０】
活性酸素種およびＮＡＤＰＨオキシダーゼ
一般に、脊椎動物は感染に応答するための２種の基礎的な機構、すなわち自然免疫系および獲得免疫系を有する（Ｆｅａｒｏｎら、１９９６）。自然（ｉｎｎａｔｅ）すなわち自然（ｎａｔｕｒａｌ）免疫は、侵入する病原体への宿主の以前の曝露に関係なく感染攻撃に直ちに応答する能力である。自然系の要素は、貪食細胞、すなわち多核白血球（ＰＭＮ）および単核貪食細胞（例えばマクロファージ）、ならびに循環する可溶性のプレ酵素タンパク質の補体カスケードを包含する。これらの要素は、植物（Ｅｎｙｅｄｉら、１９
９２）および昆虫（Ｈｏｆｆｍａｎｎら、１９９９）を包含する多様な多細胞生物体の免疫系に機能的類似物を有する比較的非特異的な「パターン認識」系を構成する。であるから、これらの進化上古代の要素は、宿主の免疫系により以前に「見られていない」侵入する微生物で生物体が攻撃される場合に宿主防御の迅速かつ感受性の監視機構を表す。自然系と対照的に、適応免疫は脊椎動物に限定され、そして侵入する病原体若しくは腫瘍細胞の性質を宿主細胞が特異的に規定する正確に調整される系を表す（Ｊａｎｅｗａｙら、１９９４）。こうした精度は、しかしながら、抗原がプロセシングされかつ特異的リンパ球および抗体が生成されるための時間を必要とする。従って、適応系は、特異性を欠く自然系がそうであるより新たな攻撃に対し応答することがよりゆっくりである（Ｆｅａｒｏｎら、１９９６）。
【０１３１】
顆粒球は骨髄に位置する多能性幹細胞から生じ、そして好酸球、好塩基球および好中球を包含する。ＰＭＮはヒト末梢循環中で最多の白血球であり、そしてそれらの名称はそれらの典型的に多葉（ｍｕｌｔｉｌｏｂｅｄ）核に由来する。健康成体での成熟ＰＭＮの１日産生量はほぼ１０１１細胞程度である。急性感染症若しくは他の炎症性ストレスの間、ＰＭＮは通常の１日の好中球の要求の１０倍まで含有する骨髄貯蔵所から動態化される（Ｎａｕｓｅｅｆら、２０００）。ＰＭＮは運動性であり、そしてそれらが感染性微生物に対する第一列の防御としてはたらく炎症の部位にそれらを移動させる非常に可塑性の細胞である。この目的上、ＰＭＮはタンパク質分解性および他の細胞傷害性酵素で満たされた顆粒を含有する（Ｓｃｈｅｔｔｌｅｒら、１９９１；Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄら、１９９７）。酵素を放出することのほかに、ＰＭＮはまた、貪食しかつ酸素を高度活性酸素種（ＲＯＳ）に転化することも可能である。食作用後に、摂取された微生物は、酵素活性およびＲＯＳ産生の組合せ作用によりファゴソームの内側で死滅されうる。
【０１３２】
活性化に際して、ＰＭＮは、ＲＯＳに転化される極めて多量の酸素を消費することを開始する（呼吸若しくは酸化バーストとして知られる過程）（Ｂａｂｉｏｒら、１９７６；Ｂａｂｉｏｒら、１９７８）。この過程は酵素ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性に依存する。このオキシダーゼは、受容体媒介性および受容体非依存性の双方の過程により活性化され得る。典型的な受容体依存性の刺激は、補体成分Ｃ５ａ、Ｃ３ｂおよびｉＣ３ｂ（Ｏｇｌｅら、１９８８）、細菌由来走化性トリペプチドＮ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９７７）、レクチン、コンカナバリンＡ（Ｗｅｉｎｂａｕｍら、１９８０）ならびにオプソニン化されたザイモザン（ＯＰＺ）（Ｗｈｉｔｉｎら、１９８５）である。受容体非依存性の刺激は、長鎖不飽和脂肪酸およびホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｒら、１９９７）を包含する。活性化に際して、オキシダーゼは膜のサイトゾル側のＮＡＤＰＨから電子を受容し、そしてこれらを膜の他側（細胞の外側若しくは摂取された微生物を含有するファゴソーム中のいずれか）の分子酸素に供与する。こうして、酸素のスーパーオキシドアニオン（・Ｏ２−）への１電子還元が、以下の等式：
【０１３３】
【数１】
2009535034.tif 000003
【０１３４】
に描かれるとおり、ＮＡＤＰＨを犠牲にして触媒される。こうして消費される酸素の大部分は・Ｏ２−として存在することができないが、しかし、スーパーオキシドラジカルの不均化から形成される過酸化水素として説明し得る（Ｈａｍｐｔｏｎ、１９９８；Ｒｏｏｓら、１９８４）：
【０１３５】
【数２】
2009535034.tif 000004
【０１３６】
しかしながら、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）は高濃度でのみ殺菌性である（Ｈｙｓｌｏｐら、１９９５）一方、外因性に生成されるスーパーオキシドは、その制限された膜透過性のため、細菌を直接死滅させない（Ｂａｂｉｏｒら、１９７５；Ｒｏｓｅｎら、１９７９）。従って、ＰＭＮの破壊能を説明するために多様な二次酸化体が提案されている。
【０１３７】
鉄で触媒されるフェントン反応により形成されるヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）は、大部分の生物学的分子と極めて反応性であるとは言え、それらは制限された作用範囲を有する（Ｓａｍｕｎｉら、１９８８）。
【０１３８】
【数３】
2009535034.tif 000005
【０１３９】
一重項酸素（１Ｏ２）は酸素の電子的励起状態としてしばしば見られ、そして膜脂質と反応して過酸化を開始しうる（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ、１９７８）。ＰＭＮにより生成されるＨ２Ｏ２の大部分は、刺激されたＰＭＮにより放出される酵素、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）により消費される（Ｋｅｔｔｌｅら、１９９７；Ｎａｕｓｅｅｆ、１９８８；Ｚｉｐｆｅｌら、１９９７；Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ、１９９９）。このヘム含有ペルオキシダーゼはアズール親和性顆粒の主構成要素であり、そして塩化物イオンを強い非ラジカル酸化体、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）に酸化するためのＨ２Ｏ２の使用において独特である（Ｈａｒｒｉｓｏｎら、１９７６）。ＭＰＯの他の基質は、ヨウ化物、臭化物、チオシアナイト（ｔｈｉｏｃｙａｎｉｔｅ）および亜硝酸塩を包含する（Ｖａｎ  Ｄａｌｅｎら、１９９７；Ｖｌｉｅｔら、１９９７）。
【０１４０】
【数４】
2009535034.tif 000006
【０１４１】
ＨＯＣｌはＰＭＮにより産生されることが既知の最も殺菌性の酸化体であり（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ、１９６８）、そして多くの細菌種がＭＰＯ／Ｈ２Ｏ２／塩化物系により容易に死滅される（Ａｌｂｒｉｃｈら、１９８２）。
【０１４２】
実験的環境で、活性化された貪食細胞によるＲＯＳ産生は、ルミノール若しくはルシゲニンのような増強薬剤を使用して検出し得る（Ｆａｕｌｋｎｅｒら、１９９３）。ＲＯＳ検出のため、ルシゲニンは最初に還元を受けなければならない一方、ルミノールは不安定なエンドペルオキシド（その分解は光子放出により光を生成する）（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌら、１９９８）を生成するための一電子酸化を受けなければならない。ルミノールは主としてＨＯＣｌを検出し、これはルミノール検出が主にＭＰＯ／Ｈ２Ｏ２系に依存することを意味している（ＭｃＮａｌｌｙら、１９９６）一方、ルシゲニンを使用する検出はＭＰＯ非依存性であり、そして・Ｏ２−に対しより特異的である（Ａｎｎｉａｎｓｓｏｎら、１９８４）。ルミノールは細胞に進入することが可能であり、そしてそれにより細胞内ならびに細胞外で産生されたＲＯＳを検出する（Ｄａｈｌｇｒｅｎら、１９８９）一方、ルシゲニンは実際上細胞膜を通過することが不可能であり、そしてそれにより細胞外事象のみを検出する（Ｄａｈｌｇｒｅｎら、１９８５）。しかしながら、真の特異性はこれらの光放射増強化合物のいずれでも決して想定し得ないため（Ｌｉｏｃｈｅｖら、１９９７）、結果は慎重に解釈されなければならない。
【０１４３】
・Ｏ２−の産生はＯ２濃度に依存した程度まで全部の好気性細胞内で起こるようである。ミトコンドリア中では、電子の１〜３％が・Ｏ２−を形成すると考えられる。ＲＯＳが好気性代謝の量的に有意の産物でもまたあるという事実は、以下の計算により具体的に説明される。すなわち、安静時の正常成体（７０ｋｇ体重と想定する）が３．５ｍＬのＯ２／ｋｇ／分を利用し、それは３５２．８ｌ／日若しくは１４．７ｍｏｌ／日に同一である。１％が・Ｏ２−を作成する場合、これは０．１４７ｍｏｌ／日若しくは５３．６６ｍｏｌ／年若しくは年あたり約１．７ｋｇの・Ｏ２−を与える。呼吸バーストの間に、Ｏ２取り込みの増加は好中球の静止期Ｏ２消費のものの１０ないし２０倍になり得る（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌら、１９９８）。
【０１４４】
ＲＯＳ産生の原因であるＮＡＤＰＨオキシダーゼは、静止期ＰＭＮ中で集成されていない（そしてそれにより不活性である）多成分酵素系である。しかしながら、例えばオプソニン化された微生物の細胞表面受容体への結合による貪食細胞の活性化は、原形質膜上の活性酵素複合体の集成に至る（Ｃｌａｒｋ、１９９０；Ｓｅｇａｌら、１９９３）。正常の宿主防御における機能するＮＡＤＰＨオキシダーゼの決定的重要性は、構成するタンパク質成分の１種の欠乏により該オキシダーゼが非機能的である障害、慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）を伴う個体で観察される再発性の細菌および真菌感染症により、最も劇的に具体的に説明される（Ｓｍｉｔｈら、１９９１；Ｄｉｎａｕｅｒら、１９９３；Ｄｉｎａｕｅｒら、１９８７；Ｖｏｌｐｐら、１９８８）。機能上適格なオキシダーゼを欠くこうした患者からのＰＭＮは、刺激に際して・Ｏ２−を生成することに失敗する。刺激されたＰＭＮによるＲＯＳの形成は宿主に有利である生理学的応答でありうるとは言え、それは、これらのラジカルが過剰の組織損傷を生じさせうる多くの炎症状態でもまた有害であり得る（Ｗｅｉｓｓ、１９８９；Ｆａｎｔｏｎｅら、１９８５；Ｊａｃｋｓｏｎら、１９８８）。
【０１４５】
ＮＡＤＰＨオキシダーゼの不可欠の成分は原形質膜およびサイトゾルタンパク質を包含する。重要な原形質膜成分は、９１ｋＤａの糖タンパク質（ｇｐ９１ｐｈｏｘ）および２２ｋＤａのタンパク質（ｐ２２ｐｈｏｘ）から構成されるヘテロ二量体のフラボチトクロムｂである（Ｒｏｔｒｏｓｅｎら、１９９２；Ｓｅｇｅｌら、１９９２）。フラボチトクロムｂは、電子をＮＡＤＰＨから分子酸素に輸送するようはたらき、・Ｏ２−の生成をもたらす。ＰＭＮ膜中で、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質Ｒａｐ１Ａがフラボチトクロムｂと会合し、そしてｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＡＤＰＨオキシダーゼ調節で重要な役割を演じている（Ｑｕｉｎｎら、１９８９；Ｇａｂｉｇら、１９９５）。さらに、サイトゾルタンパク質ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘおよび第二の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質Ｒａｃ２がＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性に必要とされ（Ｖｏｌｐｐら、１９８８；Ｌｏｍａｘら、１９８９ａ；Ｌｏｍａｘら、１９８９ｂ）、そしてこれら３種のタンパク質がフラボチトクロムｂと会合して機能的ＮＡＤＰＨオキシダーゼを形成する（Ｃｌａｒｋら、１９９０；Ｈｅｙｗｏｒｔｈら、１９９１；Ｑｕｉｎｎら、１９９３；ＤｅＬｅｏら、１９９６）。加えて、サイトゾルタンパク質ｐ４０ｐｈｏｘが同定されているが、しかしオキシダーゼ機能におけるその役割は完全には定義されていない（Ｗｉｅｎｔｊｅｓら、１９９３）。ＮＡＤＰＨオキシダーゼの集成の現在のモデルによれば、ｐ４７ｐｈｏｘおよびｐ６７ｐｈｏｘは、ＰＭＮ活性化の間に全体で転位してフラボチトクロムｂと会合する（ＤｅＬｅｏら、１９９６；Ｐａｒｋら、１９９２；Ｉｙｅｒら、１９９４）。Ｒａｃ２は同時にしかし他２種のサイトゾル成分と独立に転位して、膜結合したフラボチトクロムｂと会合する（Ｈｅｙｗｏｒｔｈら、１９９４；Ｄｏｒｓｅｕｉｌら、１９９５）。多様な形態のＣＧＤを伴う患者のＰＭＮでのオキシダーゼ集成の研究は、ｐ４７ｐｈｏｘがフラボチトクロムｂに直接結合することを示唆し（Ｈｅｙｗｏｒｔｈら、１９９１）、かつ、ｇｐ９１ｐｈｏｘ上の４部位およびｐ２２ｐｈｏｘ上の２部位を包含するフラボチトクロムｂの少なくとも６領域が、ｐ４７ｐｈｏｘとの相互作用の推定の部位と同定された（Ｋｌｅ
ｉｎｂｅｒｇら、１９９０；Ｌｅｕｓｅｎら、１９９４；Ｌｅｔｏら、１９９４；Ｌｅｕｓｅｎら、１９９４；Ｎａｋａｎｉｓｈら、１９９２；ＤｅＬｅｏら、１９９５；Ｓｕｍｉｍｏｔｏら、１９９４；Ｆｉｎａｎら、１９９４）。
【０１４６】
本発明の方法
本発明の方法は、レドックス感受性の細胞内経路を用いるウイルスのウイルス形質導入を変える薬剤の同定方法、およびウイルス形質導入を高める若しくは阻害するためのそれらの薬剤の使用、細胞内のウイルスのレドックス感受性を変えるためのウイルスキャプシドの改変方法および該方法により製造される改変ウイルス、ならびにＲａｃ含有エンドソームにより輸送するウイルスの受容体および共受容体の同定方法を包含する。本発明の方法で有用なウイルスは、レドックス感受性であるかまたはより多く若しくはより少なくレドックス感受性であるように改変されうるもの、例えば、Ｒａｃ１含有エンドソームとの会合を包含する若しくはＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を変える経路を有するウイルス、例えばアデノウイルス、ポックスウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、コックサッキーウイルスおよび／若しくはインフルエンザウイルスである。例えば、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を増大若しくは低下させることによりウイルス形質導入を増大若しくは低下させる薬剤を検出するために、レドックス感受性であるウイルスを１種若しくはそれ以上の薬剤でスクリーニングしうる。ウイルスは改変することができ、例えば、レドックス感受性若しくは非感受性ウイルスのウイルスキャプシドを改変することができ、そしてそれらのウイルスを、ウイルス形質導入を増大若しくは低下させる薬剤を検出するために１種若しくはそれ以上の薬剤でスクリーニングしうる。
【０１４７】
遺伝子移入のためのウイルスの使用
ウイルスベクターは、遺伝子治療若しくはワクチン接種の目的上の個体への投与に使用し得る。治療のための適する疾患は、限定されるものでないが、ウイルス、細菌若しくは寄生性感染症により誘発されるもの、多様な悪性病変、および過剰増殖状態、自己免疫状態ならびに先天性欠損を挙げることができる。
【０１４８】
遺伝子治療は、細胞内か若しくは細胞により分泌されるかのいずれかの特定の一タンパク質の発現のレベルを高めるために実施し得る。本発明のベクターを、遺伝子マーキング、欠けている若しくは欠陥のある遺伝子の置換、または治療的遺伝子の挿入のいずれかのために細胞を遺伝子的に変えるのに使用しうる。あるいは、発現のレベルを低下させるポリヌクレオチドを細胞に提供しうる。これは、悪性病変の経過の間に増幅若しくは過剰発現される遺伝子、または微生物感染の経過の間に導入若しくは過剰増殖される遺伝子の産物のような望ましくない表現型の抑制に使用しうる。発現レベルは、例えば、標的遺伝子若しくはＲＮＡ転写物（アンチセンス治療）いずれかと安定なハイブリッドを形成することが可能、関連するｍＲＮＡを切断するためのリボザイムとして作用することが可能、または標的遺伝子の産物のデコイとして作用することが可能な配列を含んでなる治療的若しくは予防的ポリヌクレオチドを供給することにより低下させうる。
【０１４９】
本発明の方法によるウイルスベクターの導入は、当該技術分野で利用可能かつ公知であるいずれかの数の送達技術（外科的および非外科的双方）の使用を必要としうる。こうした送達技術は、例えば、血管カテーテル挿入、カニューレ挿入、注入、吸入、気管内、皮下、塗擦、局所、経口、経皮、動脈内、静脈内、および／若しくは腹腔内投与を包含する。ベクターはまた、具体的説明として血管移植片（ＰＴＦＥおよびダクロン）、心臓弁、血管内ステント、血管内壁修復（ｐａｖｉｎｇ）、ならびに他の血管以外のプロテーゼを包含するバイオプロテーゼによっても導入し得る。ベクター溶液の送達、頻度、組成および投薬量範囲に関する全般的技術は当該技術分野の熟練内にある。
【０１５０】
とりわけ、本発明のベクターの組織への送達のため、ベクターを宿主動物に導入するこ
とができるいかなる物理的若しくは生物学的方法も使用し得る。ベクターは、パルボウイルス投与について公知であるとおり、裸の組換えベクター、およびウイルスコートタンパク質中にパッケージングされたベクターＤＮＡ双方を意味している。リン酸緩衝生理的食塩水にウイルスベクターを単純に溶解することは、筋組織発現に有用なベヒクルを提供するのに十分であることが示されており、また、ベクターと共投与し得る担体若しくは他成分に関する既知の制限は存在しない（とは言え、ＤＮＡを分解する組成物はベクターを伴う通常の様式で回避すべきである）。製薬学的組成物は、経皮輸送により筋に送達されるべき注入可能な製薬剤若しくは局所製薬剤として製造し得る。筋肉内注入および経皮輸送双方のための多数の製薬剤が以前に開発されており、そして本発明の実務で使用し得る。該ベクターは、投与および取り扱いの容易さのため、いずれの製薬学的に許容できる担体とも使用し得る。
【０１５１】
筋肉内注入の目的上、ゴマ若しくはラッカセイ油のような補助物質中または水性プロピレングリコール中の溶液、ならびに無菌の水性溶液を使用し得る。こうした水性溶液は、所望の場合は緩衝し得、そして、液体の希釈薬剤を最初に生理的食塩水若しくはブドウ糖で等張にし得る。遊離酸（ＤＮＡは酸性のリン酸基を含有する）若しくは薬理学的に許容できる塩としてのウイルスベクターの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性薬剤と適して混合した水中で製造し得る。ウイルス粒子の分散系は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物ならびに油中でもまた製造し得る。通常の貯蔵および使用条件下で、これらの製薬剤は微生物の増殖を予防するための保存薬剤を含有する。これに関連して、使用される無菌の水性媒体は全部、当業者に公知の標準的技術により容易に得ることができる。
【０１５２】
注入可能な使用に適する製薬学的形態物は、無菌の水性溶液若しくは分散系、および無菌の注入可能な溶液若しくは分散系の即座の製造のための無菌粉末を包含する。全部の場合で、該形態物は無菌でなければならず、そして容易な注入可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動性でなければならない。それは製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対し保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、多価アルコール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、適するそれらの混合物、および植物油を含有する溶媒若しくは分散媒であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散系の場合は必要とされる粒子径の維持、および界面活性薬剤の使用により維持し得る。微生物の作用の予防は、多様な抗菌および抗真菌薬剤、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらし得る。多くの場合、等張薬剤、例えば糖若しくは塩化ナトリウムを包含することが好ましいであろう。注入可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらし得る。
【０１５３】
無菌の注入可能な溶液は、必要とされるところの上で列挙された多様な他成分を含む適切な溶媒中に必要とされる量のＡＡＶベクターを組み込むこと、次いで濾過滅菌により製造する。一般に、分散系は、基本的分散媒および上で列挙されたものからの必要とされる他成分を含有する無菌ベヒクルに、滅菌した有効成分を組み込むことにより製造する。無菌の注入可能な溶液の製造のための無菌粉末の場合には、好ましい製造方法は、その以前に滅菌濾過した溶液から有効成分およびいずれかの付加的な所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１５４】
局所投与の目的上、それ以外は上の非経口溶液に類似の希薄な無菌の水性溶液（通常約０．１％ないし５％濃度の）を、経皮貼付薬剤への組み込みに適する容器中で製造し、そして製薬学的等級のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような既知の担体を包含し得る
。
【０１５５】
本発明の組成物はｉｎ  ｖｉｖｏならびにｅｘ  ｖｉｖｏで使用しうる。ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子治療は、本発明のベクターを直接被験体に投与することを含んでなる。製薬学的組成物は、液体の溶液若しくは懸濁薬剤として、乳薬剤として、または使用前の液体への溶解若しくは懸濁に適する固体の形態物として供給し得る。気道への投与のため、好ましい投与様式は、適切な空気可溶化装置（ａｅｒｏｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｒ）装置で使用される場合に固体若しくは液体いずれかのエアゾルを提供する組成物を使用するエアゾルによる。気道への別の好ましい投与様式は、ベクターを滴下注入するための可撓性光ファイバー気管支鏡を使用することである。典型的には、ウイルスベクターは、リンゲル平衡塩溶液（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ｐＨ７．４）のような製薬学的に適する発熱物質を含まない緩衝液中にある。必要とされないとは言え、製薬学的組成物は、場合によっては、正確な量の投与に適する単位投薬形態物で供給しうる。
【０１５６】
処置の目的に依存するウイルスの有効量を投与する。有効量は単一若しくは分割用量で与えうる。低パーセントの形質導入が遺伝子欠損を治療し得る場合には、処置の目的は、一般に、このレベルの形質導入に一致するか若しくはこれを超えることである。いくつかの場合には、この形質導入レベルは、標的細胞の約１ないし５％のみの形質導入により達成し得るが、しかし、より典型的には所望の組織型の細胞の２０％、通常は少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９５％、およびなおより好ましくは所望の細胞型の細胞の少なくとも約９９％である。一指針として、気管支鏡検査により与える単一用量中に存在するベクター粒子の数は一般に少なくとも約１×１０８であることができ、そしてより典型的には５×１０８、１×１０１０、およびいくつかの場合には１×１０１１の、ＤＮア―ゼ抵抗性およびＤＮアーゼ感受性双方の粒子を包含する粒子である。ＤＮアーゼ抵抗性粒子に関して、該用量は、１×１０６と１×１０１４粒子の間、より一般的には約１×１０８と１×１０１２粒子の間であることができる。該処置は、必要とされるとおり約２若しくは３週ごとに反復し得るとは言え、１８０日に１回の処置が十分でありうる。
【０１５７】
宿主細胞中での所望のＤＮＡ配列の存在を確認するために多様なアッセイを実施しうる。こうしたアッセイは、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲのような当業者に公知の「分子生物学的」アッセイ；例えば、免疫学的手段（免疫沈降、免疫親和性カラム、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）、あるいは本発明の範囲内にある特定の一核酸分子の存在および／若しくは発現を同定するのに有用ないずれかの他のアッセイにより、ベクター中に存在する遺伝子から発現されるポリペプチドの存在を検出することのような「生化学的」アッセイを包含する。
【０１５８】
導入されたＤＮＡセグメントから産生されるＲＮＡを検出かつ定量するためにＲＴ−ＰＣＲを使用しうる。ＰＣＲのこの応用において、逆転写酵素のような酵素を使用してＲＮＡをＤＮＡに逆転写することが最初に必要であり、そしてその後、慣習的ＰＣＲ技術の使用により該ＤＮＡを増幅する。大部分の例において、ＰＣＲ技術は有用な一方でＲＮＡ産物の完全性を示さないことができる。ＲＮＡ産物の性質についてのさらなる情報はノーザンブロッティングにより得ることができる。この技術は、ＲＮＡ種の存在を示しかつそのＲＮＡの完全性についての情報を与える。１ＲＮＡ種の存在若しくは非存在は、ドット若しくはスロットブロットノーザンハイブリダイゼーションを使用してもまた決定し得る。これらの技術はノーザンブロッティングの変法であり、そしてＲＮＡ種の存在若しくは非存在のみを示す。
【０１５９】
サザンブロッティングおよびＰＣＲを問題のＤＮＡセグメントを検出するのに使用しう
る一方、それらは該ＤＮＡセグメントが発現されているかどうかに関する情報を提供しない。発現は、導入されたＤＮＡ配列のポリペプチド産物を特異的に同定すること、若しくは宿主細胞中での該導入されたＤＮＡセグメントの発現によりもたらされる表現型変化を評価することにより、評価しうる。
【０１６０】
従って、遺伝子変化の有効性は、生理学的液体サンプル、例えば尿、血漿、血清、血液、脳脊髄液または鼻若しくは肺洗浄液の分析を包含する数種の基準によりモニターし得る。生検若しくは外科的切除により取り出されたサンプルを、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ベクター特異的プローブを使用するＰＣＲ増幅、ＲＮアーゼ保護、免疫組織学、若しくは免疫蛍光細胞計数により分析しうる。ベクターを気管支鏡検査により投与する場合、肺機能試験を実施することができ、そして気管支洗浄液を炎症性サイトカインの存在について評価しうる。処置した被験体は、臨床的特徴について、および治療的若しくは予防的ポリヌクレオチドにより伝達されることを意図している機能を該細胞が発現するかどうかを決定するためにもまた、モニターしうる。
【０１６１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｅｘ  ｖｉｖｏ治療を使用すべきかどうかの決定、ならびに特定の組成物、用量および投与経路の選択は、限定されるものでないが、処置されている状態および被験体の特徴を挙げることができる多数の異なる因子に依存することができる。こうした特徴の評価および適切な治療若しくは予防療法の設計は、究極的に、処方する医師の責任である。
【０１６２】
本発明の方法で有用な例示的化合物
本発明の方法で有用でありうる薬剤は、限定されるものでないが、インターロイキン、アナフィラトキシン、アンジオテンシンＩＩ、ＮＳＡＩＤ、例えばジクロフェナク、カテリシジン、プロリン豊富な抗菌ペプチド、Ｃ反応性タンパク質、ヘモゾイン、ヨードラクトン若しくはヨードアルデヒド、例えばヨードヘキサデカナール、カロテノイド、ＡＣＥ阻害薬剤、降圧薬、ステロイド、メトトレキセート、テトラサイクリンのような抗生物質、ニトロアレン、キニン、芳香族Ｎ−オキシド、アスピリン、フラボノイド、アリシン、αトコフェロール、ケルセチン、カテキン、イソチオシアネート、ＮＡＣ、β−カロテン、ゲニステイン、ダイゼイン、没食子酸プロピル、クルクミン、ピリドキシン−ピロリドンカルボン酸塩、ＰＤＥ阻害薬剤、クラスＩＶ麻酔薬、揮発性麻酔薬、血中コレステロール低下薬、シクロスポリンＡ、ポリフェノール、長鎖ω６アラキドン酸、メタドキシン（ｍｅｔａｄｏｘｉｎｅ）、チラパザミン、ＡＱ４Ｎ、ＲＳＲ１３、モレキサフィン（ｍｏｌｅｘａｆｉｎ）Ｇｄ、ＨＩＦ１阻害薬剤、一酸化窒素供与体、ニトロアスピリン、エイコサノイド、コルチコステロイド、オーラノフィン、酪酸塩、プロピオン酸塩、オキシレスベラトロール、レセルベロール（ｒｅｓｅｒｖｅｒｏｌ）、チオペンタールスクシニルコリン、ジクメロール（ｄｉｃｏｕｍｅｒｏｌ）、トリプトライド（ｔｒｉｐｔｏｌｉｄｅ）、米国特許第６，９２７，２３８号、同第６，８６４，２８８号、同第６，７１３，６０５号、同第６，１８４，２０３号、同第６，０９０，８５１号、同第５，９０２，８３１号、同第５，７６３，４９６号、同第５，７２６，１５５号、同第５．２４４，９１６号、同第５，１１８，６０１号および同第６，１７２１１６号、米国特許出願公開第２００４０１２０９２６号ならびに同第２００４０００１８１８号明細書に開示される薬剤、ＰＲ−３９のような陽イオン性ペプチド、プロリン豊富な抗菌ペプチド、ＤＰＩ、クロモリン、ＮＯＳオキシダーゼ阻害薬剤、フェニルヒ素酸化物（ｐｈｅｎｙｌ  ａｒｓｉｎｅ  ｏｘｉｄｅ）、ヒスタミン、ＰＬＤ活性の阻害薬剤、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１、インターフェロン、ＰＤＧＦ、ならびにＥＧＦ、Ｒａｃ、ホルミルペプチド、ＰＭＡ、カルシウムイオノフォア、例えばイオノマイシン若しくはアグマチンを挙げることができる。
【０１６３】
例示的Ｎｏｘ活性化因子
Ｎｏｘ活性を高めるのに有用でありうる薬剤は、限定されるものでないが、インターロイキン、リン脂質、アナフィラトキシン、アンジオテンシンＩＩ、アンジオポエチン、ＶＥＧＦ、ストレプトゾトシン、ＢＭＰ４、ｇｐ  ９ｌｄｓ−ｔａｔ（Ｗａｌｃｈら、Ａｔｈｅｒｏ．、１６７：２８５（２００６）を参照されたい、Ｗｙ−１４６４３（Ｒｅｉｓｙｎら、Ｃａｎ．Ｒｅｓ．、６０：４７９８（２０００））、ｆ−ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅのようなホルミルペプチド、ＢＤＮＦ（米国特許出願公開第２００６０１３５６００号明細書）、ＮＳＡＩＤ例えばジクロフェナク、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１、インターフェロン、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、Ｒａｃ、ＰＭＡ、カルシウムイオノフォア、例えばイオノマイシン、アグマチン、および米国特許第６，１７２，１１６号明細書に開示されるものを挙げることができる。
【０１６４】
例示的Ｎｏｘ阻害薬剤
Ｎｏｘ活性を阻害するのに有用でありうる薬剤は、限定されるものでないが、米国特許第７，２０２，０５３号、同第７，２０２，０３０号、同第７，０６７，１５８号、同第６，９２７，２３８号、同第６，８６４，２８８号、同第６，７１３，６０５号、同第６，１８４，２０３号、同第６，０９０，８５１号、同第５，９０２，８３１号、同第５，７６３，４９６号、同第５，７２６，１５５号、同第５．２４４，９１６号および同第５，１１８，６０１号、米国特許出願公開第２００４０１２０９２６号、同第２００６０１６００９５号、同第２００６００８９３６２号および同第２００４０００１８１８号明細書に開示されるもの、ＰＲ−３９のような陽イオン性ペプチド、プロリン豊富な抗菌ペプチド、ＤＰＩ、ピロキシカム、ＭｎＴＭＰｘｐ（Ｆｒａｎｃｏら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．、８０：７０９（２００７））、１ＮＡＭＥ（Ｃｏｙｌｅら、ＡＳＡＩＯ  Ｊ．、２００７）、アゼルニジピン、アトルバスタチン、パラブトポリン（ｐａｒａｂｕｔｏｐｏｒｉｎ）、ＮＡＣ、スタウロスポリン、フルオロホスホン酸ジイソプロピル、カテコール、例えばメチル置換カテコール、フッ化４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニル、スチルベン型フィトアレキシンレセルバトロール（ｒｅｓｅｒｖａｔｒｏｌ）、アミノグアニジン、ＯＮ０１７４、Ｓ１７８３４（ベンゾ（ｂ）ピラン−４−オン）、スラミン、スルホン酸化（ｓｕｌｐｈｏｎａｔｅｄ）アリール若しくはベンズアミド誘導体（米国特許出願公開第２００７００３７８８３号明細書）、ロバスタチンおよびコンパクチンのようなイソプレニル化阻害薬剤、ベンゾフラニルおよびベンゾチエニルチオアルカン、クロモリン、ＮＯＳオキシダーゼ阻害薬剤、フェニルヒ素酸化物、ヒスタミン、ＰＬＤ活性の阻害薬剤、ならびに式（Ｉ）の化合物を挙げることができる。
【０１６５】
式（Ｉ）の化合物：
【０１６６】
【化１】
2009535034.tif 000007
【０１６７】
式中、
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、ト
リフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙ若しくはＣＯＯＲｘ（ここで各ＲｘおよびＲｙは独立にＨ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシであり）であり；
Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙ若しくはＣＯＯＲｘ（ここで各ＲｘおよびＲｙは独立にＨ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシであり）であり；
Ｒ３は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、Ｏ−ＲＺ、ＮＲｘＲｙ若しくはＣＯＯＲｘ（ここで各ＲｘおよびＲｙは独立にＨ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシであり；また、式中Ｒｚは炭水化物の一価の基であり）であり；
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙ若しくはＣＯＯＲｘ（ここで各ＲｘおよびＲｙは独立にＨ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシであり）であり；
Ｒ５は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲｘＲｙ若しくはＣＯＯＲｘ（ここで各ＲｘおよびＲｙは独立にＨ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシであり）であり；ならびに、
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ若しくはＮＲｘＲｙ（ここでＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立にＨ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシであり）であり；
またはその製薬学的に許容できる塩
は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの適する強力かつ選択的阻害薬剤である。
【０１６８】
式（Ｉａ）の化合物：
【０１６９】
【化２】
2009535034.tif 000008
【０１７０】
式中、
Ｒ１はＨであり；
Ｒ２はアルコキシであり；
Ｒ３はヒドロキシル、アルコキシ若しくはＯ−Ｒｚ（ここでＲｚは炭水化物の一価の基であり）であり；
Ｒ４はＨ、アルコキシ若しくはアルキルであり；
Ｒ５はＨ若しくはヒドロキシルであり；および
Ｒ６は、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アミノ、アルキルアミノ若しくはＮＲｘＲｙ（ここでＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立にＨ、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシである；
またはその製薬学的に許容できる塩
は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの適する強力かつ選択的阻害薬剤である。
【０１７１】
式（Ｉｂ）の化合物：
【０１７２】
【化３】
2009535034.tif 000009
【０１７３】
式中、
Ｒ１はＨであり；
Ｒ２はアルコキシであり；
Ｒ３はヒドロキシル、アルコキシ、Ｏ−Ｒｚ（ここでＲｚは炭水化物の一価の基であり）であり；
Ｒ４はＨ、アルキル若しくはアルコキシであり；
Ｒ５はＨ若しくはヒドロキシルであり；および
Ｒ６はアルキルである；
またはその製薬学的に許容できる塩
は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの適する強力かつ選択的阻害薬剤である。
【０１７４】
特定の範囲および値：
式（Ｉ）の化合物に関して：Ｒ１の特定の値はＨであり；Ｒ２の特定の値はアルコキシであり；Ｒ２の別の特定の値はメトキシであり；Ｒ３の特定の値はヒドロキシルであり；Ｒ３の別の特定の値はヒドロキシルで置換されているアルコキシであり；Ｒ３の別の特定の値は２−ヒドロキシ−エトキシであり；Ｒ３の別の特定の値はヒドロキシルであり、Ｒ４の特定の値はＨであり；Ｒ４の別の特定の値はアルコキシであり；Ｒ４の別の特定の値はメトキシであり；Ｒ４の別の特定の値はアルキルであり；Ｒ４の別の特定の値はメチルであり；Ｒ５の特定の値はＨであり；Ｒ５の別の特定の値はヒドロキシルであり；Ｒ６の特定の値はアルキルであり；そしてＲ６の別の特定の値はメチルである。
【０１７５】
式（Ｉａ）の化合物に関して、Ｒ２の特定の値はアルコキシである。Ｒ２の別の特定の値はメトキシである。Ｒ６の特定の値はアルキルである。Ｒ６の別の特定の値はメチルである。
【０１７６】
式（Ｉｂ）の化合物に関して、Ｒ２の特定の値はアルコキシである。Ｒ２の別の特定の値はメトキシである。Ｒ６の特定の値はメチルである。
【０１７７】
式（Ｉ）、（Ｉａ）および（Ｉｂ）の特定の化合物はアポシニンである。細胞透過性フェノール、アポシニン（４−ヒドロキシ−３−メトキシアセトフェノン；アセトバニロン；式ＩＩの化合物）は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの強力かつ選択的阻害薬剤である。
【０１７８】
【化４】
2009535034.tif 000010
【０１７９】
アポシニンは、ピクロリザ属（Ｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ）スピーシーズ、例えばコオウレン（Ｐ．ｋｕｒｒｏｏａ）およびベットコオウレン（Ｐ．ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉｉｆｌｏｒａ）の乾燥根茎および根で見出され；後者はネオピクロリザ  スクロフラリイフロラ（Ｎｅｏｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ  ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉｉｆｌｏｒａ）としてもまた知られる。アポシニンは他の供給源から、例えばカナダアサ（Ｃａｎａｄｉａｎ  ｈｅｍｐ）（アポシマム  カンナビナム（Ａｐｏｃｙｍｕｍ  ｃａｎｎａｂｉｎｕｍ））若しくは他のアポシナム属（Ａｐｏｃｙｎｕｍ）スピーシーズ（例えばＡ．アンドロセミフォリウム（Ａ．ａｎｄｒｏｓａｅｍｉｆｏｌｉｕｍ））から、またはイリス属（Ｉｒｉｓ）スピーシーズの根茎からもまた得ることができるが、但し、該抽出液は実質的な量の心配糖体を含有しない。コオウレン（Ｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ  ｋｕｒｒｏａ  Ｒｏｙｌｅ  ｅｘ  Ｂｅｎｔｈ）は多年生の木質薬草であり、そして粗抽出液はそこにアポシニンを包含する。
【０１８０】
ピクロリザ属（Ｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ）の抽出液は、ピクロリザ属（Ｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ）スピーシーズの根茎を抽出すること、および該抽出液をカラムクロマトグラフィーにかけることにより得ることができる。あるいは、多量のフェノール性化合物を含む抽出液を、植物材料を無機酸で前処理してグリコシドをそれらのそれぞれのアグリコンに転化することにより得ることができる。所望の場合は、該材料をその後脱脂して蝋および他の高度に親油性の物質を除去しうる。該材料は例えば酢酸エチルおよび／若しくはエタノールで抽出する。有機溶媒を除去しそして水性溶液を得る。抽出液のｐＨを例えば水酸化ナトリウムを用いて１０に増大させて、フェノール性化合物を脱プロトン化しかつそれらを
水層に保持する。水性溶液をその後例えばジエチルエーテルで洗浄してククルビタシンを除去する。水層をその後再酸性化してフェノール性化合物を中和し、そして再度例えばジエチルエーテルで抽出する。有機層を収集しかつ溶媒を除去する。
【０１８１】
式（Ｉ）の付加的な適する化合物は、例えば、式：
【０１８２】
【化５】
2009535034.tif 000011
【０１８３】
の化合物を包含する。
【０１８４】
ＲＯＳの治療的若しくは予防的阻害若しくは予防方法で有用な他の化合物は、限定されるものでないが、一般に抗酸化薬剤、アゼルニジピン若しくは他のカルシウム拮抗薬、オルメサルタン若しくは他のＡＴ１受容体遮断薬、グルココルチコイド、例えばデキサメサゾン若しくはヒドロコルチゾン、β−アドレナリン作動薬、例えばイソプロテレノール、リポコルチン、ピリジン、ポリフェノール、例えばバニリン、４−ニトログアヤコール、葉酸およびその代謝的アンタゴニスト、ならびにイミダゾール、ならびにＲＮＡｉまたはそれらの組合せを挙げることができる。
【０１８５】
本発明の薬剤の投薬量、製薬剤および投与経路
本発明の薬剤は製薬学的組成物として処方し得、そして選ばれた投与経路、すなわち経口で、または非経口で（すなわち静脈内、筋肉内、局所若しくは皮下経路により）に適合
された多様な形態で、ヒト患者のような哺乳動物宿主に投与し得る。
【０１８６】
本発明により同定される薬剤の投与は、例えばレシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的であるか若しくは予防的であるか、および当業者に既知の他の因子に依存して、連続的若しくは間歇的でありうる。本発明の薬剤の投与は、予め選択された期間にわたり本質的に連続的でありうるか、若しくは一連の間隔を空けられた用量であることができる。局所および全身双方の投与を企図している。本発明の薬剤を予防目的上使用する場合、本発明の薬剤は、好ましくは全身投与による慢性の使用に従う。
【０１８７】
下で論考されるとおり場合によっては徐放のため処方しうる、本発明の薬剤を含んでなる１種若しくはそれ以上の適する単位投薬形態物は、経口、または直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸郭内、肺内および鼻内経路によるを包含する非経口を包含する多様な経路により投与し得る。例えば肝への投与には静脈内投与が好ましい。肺への投与には気道投与が好ましい。製薬剤は、適切な場合、便宜的に別個の単位投薬形態物で提供することができ、そして薬学に公知の方法のいずれかにより製造しうる。こうした方法は、液体担体、固体マトリックス、半固形担体、微粉固体担体若しくはそれらの組合せと該薬剤を連合にもたらす段階、およびその後、必要な場合は生成物を所望の送達系に導入若しくは造形する段階を包含しうる。
【０１８８】
有効成分は、注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）若しくは注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）により静脈内若しくは腹腔内で投与しうる。有効成分若しくはその塩の溶液は、場合によっては非毒性の界面活性薬剤と混合した水中で製造し得る。分散系もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチンおよびそれらの混合物ならびに油中で製造し得る。貯蔵および使用の通常の条件下で、これらの製薬剤は微生物の増殖を予防するための保存薬剤を含有する。
【０１８９】
注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）若しくは注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）に適する製薬学的投薬形態物は、無菌の水性溶液若しくは分散系、または場合によってはリポソーム中に被包化された無菌の注入可能な（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ）若しくは注入可能な（ｉｎｆｕｓｉｂｌｅ）溶液若しくは分散系の即座の製造に適合されている有効成分を含んでなる無菌粉末を包含し得る。全部の場合で、究極の投薬形態物は、製造および貯蔵の条件下で無菌、流動性かつ安定であるべきである。液体担体若しくはベヒクルは、例えば、水、エタノール、多価アルコール（例えばグリセロール、ポリエチレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性のグリセリルエステルおよびそれらの適する混合物を含んでなる溶媒若しくは液体の分散媒であり得る。適正な流動性は、例えば、リポソームの形成、分散系の場合は必要とされる粒子径の維持、若しくは界面活性薬剤の使用により維持し得る。微生物の作用の予防は、多様な抗菌および抗真菌薬剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらし得る。多くの場合に、等張薬剤、例えば糖、緩衝薬剤若しくは塩化ナトリウムを包含することが好ましいことができる。注入可能な組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中での使用によりもたらし得る。
【０１９０】
無菌の注入可能な溶液は、必要とされるところの上で列挙された他成分の多種多様なものとともに有効成分を必要とされる量で適切な溶媒中に組み込むこと、次いで濾過滅菌により製造する。無菌の注入可能な溶液の製造のための無菌粉末の場合、好ましい製造方法は、前もって滅菌濾過した溶液中に存在する有効成分およびいずれかの付加的な所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１９１】
本発明の薬剤を経口投与のため調製する場合、それらは好ましくは、製薬学的製薬剤若しくは単位投薬形態物を形成するために製薬学的に許容できる担体、希釈薬剤若しくは賦
形薬剤と組み合わせる。こうした製薬剤中の総有効成分は製薬剤の０．１から９９．９重量％までを含んでなる。「製薬学的に許容できる」により、担体、希釈薬剤、賦形薬剤および／若しくは塩が、製薬剤の他成分と適合性でなければならず、かつ、そのレシピエントに対し有害であってはならないことを意味している。経口投与のための有効成分は、散薬剤若しくは顆粒薬剤として；溶液、懸濁薬剤若しくは乳薬剤として；またはチューインガムからの有効成分の摂取のための合成樹脂のような達成可能な基薬剤中に存在しうる。有効成分はまたボーラス、舐薬剤若しくはパスタ薬剤としても提供しうる。
【０１９２】
該薬剤は、不活性希釈薬剤若しくは吸収可能な可食性担体のような製薬学的に許容できるベヒクルと組合せで例えば経口で全身投与しうる。それらは硬若しくは軟殻ゼラチンカプセル中に封入してもよく、錠薬剤に圧縮してもよく、または患者の食事の食物とともに直接組み込みうる。経口投与のためには、有効成分は１種若しくはそれ以上の賦形薬剤と組合せることができ、そして摂取可能な錠薬剤、頬側錠薬剤、トローチ薬剤、カプセル薬剤、エリキシル薬剤、懸濁薬剤、シロップ薬剤、カシェ薬剤などの形態で使用しうる。こうした組成物および製薬剤は少なくとも０．１％の有効成分を含有すべきである。組成物および製薬剤の割合はもちろん変動することができ、そして、便宜的には所定の単位投薬形態物の重量の約２ないし約６０％の間でありうる。こうした有用な組成物中の有効成分の量は、有効な投薬量レベルを得ることができるようである。
【０１９３】
本発明の薬剤を含有する製薬学的製薬剤は、公知かつ容易に入手可能な成分を使用して当該技術分野で既知の手順により製造し得る。例えば、該薬剤は、一般的な賦形薬剤、希釈薬剤若しくは担体とともに処方し得、そして錠薬剤、カプセル薬剤、懸濁薬剤、散薬剤などに形成し得る。こうした製薬剤に適する賦形薬剤、希釈薬剤および担体の例は、デンプン、糖、マンニトールおよびケイ酸誘導体のような賦形薬剤および増量薬剤；カルボキシメチルセルロース、ＨＰＭＣおよび他のセルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチンならびにポリビニルピロリドンのような結合薬剤；グリセロールのような湿潤薬剤；炭酸カルシウムおよび重炭酸ナトリウムのような崩壊薬剤；パラフィンのような溶解を遅延させるための薬剤；四級アンモニウム化合物のような再吸収促進薬剤；セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロールのような界面活性薬剤；カオリンおよびベントナイトのような吸着性担体；ならびにタルク、ステアリン酸カルシウムおよびマグネシウムのような滑沢薬剤、ならびに固体ポリエチルグリコールを包含する。
【０１９４】
例えば、本発明の薬剤を含有する錠薬剤若しくはカプレット薬剤は、炭酸カルシウム、酸化マグネシウムおよび炭酸マグネシウムのような緩衝薬剤を包含し得る。カプレット薬剤および錠薬剤はまた、セルロース、糊化済デンプン、二酸化ケイ素、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、結晶セルロース、デンプン、タルク、二酸化チタン、安息香酸、クエン酸、トウモロコシデンプン、鉱物油、ポリプロピレングリコール、リン酸ナトリウムおよびステアリン酸亜鉛などのような不活性成分もまた包含し得る。本発明の薬剤を含有する硬若しくは軟ゼラチンカプセルは、ゼラチン、結晶セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、タルクおよび二酸化チタンなどのような不活性成分、ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および植物油のような液体ベヒクルを含有し得る。さらに、本発明の薬剤の腸溶性カプレット薬剤若しくは錠薬剤を、胃中の崩壊に抵抗しかつ十二指腸のより中性ないしアルカリ性の環境で溶解するように設計する。
【０１９５】
錠薬剤、トローチ薬剤、丸薬剤、カプセル薬剤などは、以下、すなわちトラガカントガム、アラビアゴム、トウモロコシデンプン若しくはゼラチンのような結合薬剤；第二リン酸カルシウムのような賦形薬剤；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、アルギン酸などのような崩壊薬剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑沢薬剤もまた含有することができ；ならびに、ショ糖、果糖、乳糖若しくはアスパルテームのような甘味料、また
はペパーミント油、冬緑油若しくはサクランボ香味料のような着香料を添加しうる。単位投薬形態物がカプセル薬剤である場合、それは、上の型の物質に加えて植物油若しくはポリエチレングリコールのような液体担体を含有しうる。多様な他の物質が、コーティングとして、若しくは固体の単位投薬形態物の物理的形態を別の方法で改変するために存在しうる。例えば、錠薬剤、丸薬剤若しくはカプセル薬剤をゼラチン、蝋、セラック若しくは糖などでコーティングしうる。シロップ薬剤若しくはエリキシル薬剤は、有効成分、甘味料としてのショ糖若しくは果糖、保存薬剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、色素、ならびにサクランボ若しくはオレンジ香味料（ｆｌａｖｏｒ）のような香味料（ｆｌａｖｏｒｉｎｇ）を含有しうる。もちろん、いずれかの単位投薬形態物の製造において使用されるいかなる物質も、使用される量で製薬学的に許容できかつ実質的に非毒性であるべきである。加えて、有効成分は徐放製薬剤および装置に組み込みうる。
【０１９６】
本発明の薬剤は、便宜的経口投与のためのエリキシル薬剤若しくは溶液として、または例えば筋肉内、皮下若しくは静脈内経路による非経口投与に適切な溶液としてもまた処方し得る。
【０１９７】
本発明の薬剤の製薬学的製薬剤はまた、水性若しくは非水性溶液若しくは分散系の形態、または、あるいは乳薬剤若しくは懸濁薬剤の形態もとり得る。
【０１９８】
従って、治療的薬剤は、非経口投与（例えば注入、例えばボーラス注入若しくは連続注入による）のため処方することができ、そして、アンプル、充填済シリンジ、小容量注入容器、若しくは添加された保存薬剤を含む多用量容器中の単位投薬形態物で提供しうる。有効成分は、油性若しくは水性ベヒクル中の懸濁薬剤、溶液若しくは乳薬剤のような形態をとることができ、そして懸濁化薬剤、安定薬剤および若しくは分散助薬剤のような配合薬剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含有しうる。あるいは、有効成分は、使用前に適するベヒクル、例えば無菌の発熱物質を含まない水との構成のために無菌の固体の無菌的単離若しくは溶液からの凍結乾燥により得られる粉末の形態にありうる。
【０１９９】
これらの製薬剤は、従来技術で公知である製薬学的に許容できるベヒクルおよび補助物質を含有し得る。例えば、水に加えて、アセトン、エタノール、イソプロピルアルコールのような溶媒、名称「Ｄｏｗａｎｏｌ」の下で販売される製品のようなグリコールエーテル、ポリグリコールおよびポリエチレングリコール、短鎖酸のＣ１−Ｃ４アルキルエステル、好ましくは乳酸エチル若しくはイソプロピル、名称「Ｍｉｇｌｙｏｌ」の下で市販されている製品のような脂肪酸トリグリセリド、ミリスチン酸イソプロピル、動物、鉱物および植物油、ならびにポリシロキサンから選ばれる、生理学的観点から許容できる１種若しくはそれ以上の有機溶媒を使用して溶液を製造することが可能である。
【０２００】
本発明の組成物は、セルロースおよび／若しくはセルロース誘導体のような増粘薬剤もまた含有し得る。それらはキサンタン、グアール若しくはカルボガムまたはアラビアゴムのようなガム、あるいは、ポリエチレングリコール、ベントンおよびモントモリロナイトなども含有し得る。
【０２０１】
必要な場合は、抗酸化薬剤、界面活性薬剤、他の保存薬剤、薄膜形成薬剤、角質溶解若しくは面皰溶解薬剤、香料および着色薬剤から選ばれる補助物質を添加することが可能である。また、他の有効成分を、記述される状態のためであれいずれかの他の状態のためであれ添加しうる。
【０２０２】
例えば、抗酸化薬剤のなかで、ｔ−ブチルヒドロキノン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンおよびα−トコフェロールならびにその誘導体を挙げることができる。主として局所適用のため調整された（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）ガレノス
製薬剤の形態は、クリーム薬剤、乳液、ゲル薬剤、分散系若しくはマイクロエマルション、より大きい若しくは小さい程度まで増粘されたローション薬剤、含浸パッド、軟膏薬剤若しくは棒状物の形態、または、あるいはスプレー薬剤中のエアゾル製薬剤の形態、若しくは発泡薬剤の形態、または、あるいは石鹸の塊（ｃａｋｅ）の形態をとる。
【０２０３】
加えて、該薬剤は徐放投薬形態物などのような製薬剤に良好に適する。該製薬剤は、それらが単に有効成分のみを放出するか、または、それらを好ましくは腸若しくは気道の特定の一部分でおそらくある期間にわたり放出するように構成し得る。コーティング、エンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐ）および保護的マトリックスを、例えばポリラクチド−グリコール酸、リポソーム、マイクロエマルション、微粒子、ナノ粒子若しくは蝋のようなポリマー物質から作成しうる。これらのコーティング、エンベロープおよび保護的マトリックスは、体内に留置する装置、例えばステント、カテーテル、腹膜透析チューブなどを被覆するのに有用である。
【０２０４】
本発明の薬剤は経皮投与のための貼付薬剤を介して送達し得る。薬剤の経皮送達に適する貼付薬剤の例については米国特許第５，５６０，９２２号明細書を参照されたい。経皮送達のための貼付薬剤は、裏打ち層、および１種若しくはそれ以上の皮膚浸透薬剤と一緒に薬剤をその中に分散若しくは溶解させたポリマーマトリックスを含み得る。裏打ち層は該薬剤に不浸透性であるいずれかの適する物質から作成し得る。裏打ち層はマトリックス層の保護カバーとしてはたらき、そして支持機能もまた提供する。裏打ちは、それがポリマーマトリックスと本質的に同一の大きさの層であるように形成し得るか、あるいは、それは、それがポリマーマトリックスの側を超えて拡大し得るかまたはポリマーマトリックスの側（１つ若しくは複数）の上に被せ得、そしてその後裏打ち層の拡大の表面が接着手段の基薬剤になり得る様式で外側に拡大し得るように、より大きい寸法のものであり得る。あるいは、ポリマーマトリックスは、ポリアクリレート若しくはアクリレート／ビニルアセテートコポリマーのような接着性ポリマーを含有し得るか、若しくはそれから処方し得る。長期適用のためには、皮膚の水和若しくは浸軟が最小限にされ得るように、微小孔構造かつ／若しくは呼吸可能な裏打ち積層物を使用することが望ましいことができる。
【０２０５】
裏打ち層を作成するのに適する素材の例は、高および低密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリ（エチレンフタレート）のようなポリエステルの薄膜、金属箔、こうした適するポリマー薄膜の金属箔積層物などである。好ましくは、裏打ち層に使用される素材はアルミニウム箔のような金属箔とのこうしたポリマー薄膜の積層物である。こうした積層物中で、積層物のポリマー薄膜は通常、接着性ポリマーマトリックスと接触していることができる。
【０２０６】
裏打ち層は、所望の保護および支持機能を提供することができるいずれかの適切な厚さであり得る。適する厚さは約１０から約２００ミクロンまでであることができる。
【０２０７】
一般に、生物学的に許容できる接着ポリマー層を形成するのに使用されるポリマーは、制御された速度でその薬剤が通過し得る造形体（ｓｈａｐｅｄ  ｂｏｄｙ）、薄壁若しくはコーティングを形成することが可能なものである。適するポリマーは、生物学的および製薬学的に適合性、該装置が接触する体液若しくは組織中で非アレルギー性かつ不溶性およびそれらと適合性である。可溶性ポリマーの使用は、皮膚の水分によるマトリックスの溶解若しくは腐食が、薬剤の放出速度ならびに除去の便宜上正しい場所に留まる投薬単位の能力に影響を及ぼすとみられるため、回避されるべきである。
【０２０８】
接着性ポリマー層を二次加工するための例示的素材は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、エチレン／プロピレンコポリマー、エチレン／エチルアクリレートコポリマー、エチレン／ビニルアセテートコポリマー、シリコーンエラストマー、とりわけ医
学等級のポリジメチルシロキサン、ネオプレンゴム、ポリイソブチレン、ポリアクリレート、塩素化ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、塩化ビニル−ビニルアセテートコポリマー、架橋ポリメタクリレートポリマー（ヒドロゲル）、ポリ塩化ビニリデン、ポリ（エチレンテレフタレート）、ブチルゴム、エピクロロヒドリンゴム、エチレンビニルアルコールコポリマー、エチレン−ビニルオキシエタノールコポリマー；シリコーンコポリマー、例えばポリシロキサン−ポリカーボネートコポリマー、ポリシロキサン−ポリエチレンオキシドコポリマー、ポリシロキサン−ポリメタクリレートコポリマー、ポリシロキサン−アルキレンコポリマー（例えばポリシロキサン−エチレンコポリマー）、ポリシロキサン−アルキレンシランコポリマー（例えばポリシロキサン−エチレンシランコポリマー）など；セルロースポリマー、例えばメチル若しくはエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびセルロースエステル；ポリカーボネート；ポリテトラフルオロエチレン；などを包含する。
【０２０９】
好ましくは、生物学的に許容できる接着性ポリマーマトリックスは、室温より下のガラス転移温度をもつポリマーから選択すべきである。該ポリマーは室温である程度の結晶度を有しうるが、しかし必ずしも有する必要はない。架橋モノマー単位若しくは部位をこうしたポリマーに組み込み得る。例えば、架橋モノマーをポリアクリレートポリマーに組み込み得、それらは該薬剤をポリマー中に分散した後にマトリックスを架橋するための部位を提供する。ポリアクリレートポリマーのための既知の架橋モノマーは、ブチレンジアクリレートおよびジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレートなどのような多価アルコールのポリメタクリル酸エステルを包含する。こうした部位を提供する他のモノマーは、アリルアクリレート、アリルメタクリレート、ジアリルマレエートなどを包含する。
【０２１０】
好ましくは、可塑薬剤および／若しくは湿潤薬剤を接着性ポリマーマトリックス内に分散させる。水溶解性多価アルコールが一般にこの目的上適する。製薬剤中の湿潤薬剤の組み込みは、投薬単位が皮膚の表面上で水分を吸収することを可能にし、それは順に、皮膚刺激を低下させかつ送達系の接着性ポリマー層が作用しなくなることを予防するのを助ける。
【０２１１】
経皮送達系から放出される薬剤は皮膚の各層に浸透することが可能でなければならない。薬剤の浸透速度を増大させるため、経皮薬物送達系は、とりわけ、分子の浸透に対する最も大きい抵抗性を提供する皮膚の最外層すなわち角質層の浸透性を増大させることが可能でなければならない。薬剤の経皮送達のための貼付薬剤の二次加工は当該技術分野で公知である。
【０２１２】
吸入による上部（鼻）若しくは下部気道への投与のため、本発明の薬剤は、便宜的には、注入器、ネブライザー若しくは加圧パック、またはエアゾルスプレーを送達する他の便宜的手段から送達される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素若しくは他の適するガスのような適する噴射薬剤を含みうる。加圧式エアゾルの場合、投薬単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することにより決定しうる。
【０２１３】
あるいは、吸入若しくはガス注入による投与のため、組成物は乾燥粉末、例えば該薬剤および乳糖若しくはデンプンのような適する粉末基薬剤の粉末混合物の形態をとりうる。粉末組成物は、例えばカプセル若しくはカートリッジ、または、吸入器、注入器若しくは定量噴霧式吸入器の助けを借りてそれから該粉末を投与しうる例えばゼラチン若しくはブリスターパック中の単位投薬形態物で提供しうる。
【０２１４】
鼻内投与のためには、薬剤をプラスチック製瓶噴霧器若しくは定量噴霧式吸入器を介す
るような点鼻薬、液体スプレー薬剤を介して投与しうる。Ｍｉｓｔｏｍｅｔｅｒ（Ｗｉｎｔｒｏｐ）およびＭｅｄｉｈａｌｅｒ（Ｒｉｋｅｒ）が噴霧器の典型である。
【０２１５】
本発明の薬剤の局所送達は、薬剤を疾患の部位で若しくはその近くに投与する多様な技術によることもまたできる。部位特異的すなわち標的を定めた局所送達技術の例は、利用可能な技術を制限することを意図していないが、しかしそれらの具体的説明であることを意図している。例は、注入若しくは留置カテーテル、例えば針注入カテーテルのような局所送達カテーテル、シャントおよびステント、または他の植え込み式装置、部位特異的担体、直接注入あるいは直接適用を包含する。
【０２１６】
局所投与のためには、該薬剤は標的部位への直接適用について当該技術分野で既知であるとおり処方しうる。該薬剤は純粋な形態で、すなわちそれらが液体である場合に塗布しうる。しかしながら、固体若しくは液体でありうる皮膚科的に許容できる担体と組合せの組成物若しくは製薬剤としてそれらを皮膚に投与することが一般に望ましいであろう。本目的上の慣習的形態は、創傷包帯材（ｄｒｅｓｓｉｎｇ）、被覆包帯（ｂａｎｄａｇｅ）若しくは他のポリマー被覆（ｃｏｖｅｒｉｎｇ）、軟膏薬剤、クリーム薬剤、ローション薬剤、パスタ薬剤、ゼリー薬剤、スプレー薬剤およびエアゾル薬剤を包含する。軟膏薬剤およびクリーム薬剤は、例えば、適する増粘薬剤および／若しくはゲル化薬剤の添加を伴う水性若しくは油性基薬剤とともに処方しうる。ローション薬剤は水性若しくは油性基薬剤とともに処方することができ、そして一般に１種若しくはそれ以上の乳化薬剤、安定薬剤、分散助薬剤、懸濁化薬剤、増粘薬剤若しくは着色薬剤もまた含有することができる。有効成分は、例えば米国特許第４，１４０，１２２号；同第４，３８３，５２９号；若しくは同第４，０５１，８４２号明細書に開示されるところのイオントフォレーシスを介してもまた送達し得る。局所製薬剤中に存在する本発明の薬剤の重量パーセントは多様な因子に依存することができるが、しかし一般に製薬剤の総重量の０．０１％から９５％まで、および典型的には０．１〜２５重量％であることができる。
【０２１７】
有用な固体担体は、タルク、粘土、結晶セルロース、シリカ、アルミナなどのような微粉固体を包含する。有用な液体担体は、場合によっては非毒性界面活性薬剤の助けを借りて本化合物を有効濃度で溶解若しくは分散し得る、水、アルコール若しくはグリコールまたは水−アルコール／グリコール配合物を包含する。芳香薬剤のような補助物質および付加的な抗菌薬剤を所定の使用のために特性を至適化するように添加し得る。結果として生じる液体組成物は吸収薬剤パッドから塗布し得るか、包帯および他の包帯材を含浸するのに使用し得るか、またはポンプ型若しくはエアゾル噴霧器を使用して冒された領域に噴霧し得る。
【０２１８】
合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪アルコール、修飾セルロース若しくは改変無機物質のような増粘薬剤もまた、直接使用者の皮膚へ塗布のため、展性の（ｓｐｒｅｄａｂｌｅ）パスタ薬剤、ゲル薬剤、軟膏薬剤、石鹸などを形成するために液体担体とともに使用し得る。
【０２１９】
点眼薬若しくは点鼻薬のような滴薬剤は、１種若しくはそれ以上の分散助薬剤、可溶化薬剤若しくは懸濁化薬剤もまた含んでなる水性若しくは非水性基薬剤とともに処方しうる。液体スプレー薬剤は便宜上加圧パックから送達する。滴薬剤は、単純な眼のスポイトキャップ付き瓶を介して、若しくは液体内容物を一滴ずつ送達するよう適合されたプラスチック製瓶を介して、特別に造形されたクロージャーを介して、送達し得る。
【０２２０】
該薬剤は、口若しくは咽頭中の局所投与のためさらに処方しうる。例えば、有効成分を、香味づけた基薬剤、通常はショ糖およびアラビアゴム若しくはトラガカントをさらに含んでなる舐薬剤；ゼラチンおよびグリセリン若しくはショ糖およびアラビアゴムのような
不活性基薬剤中に組成物を含んでなる香錠；ならびに適する液体担体中に本発明の組成物を含んでなる含嗽薬剤として処方しうる。
【０２２１】
本明細書に記述される製薬剤および組成物は、抗菌薬剤若しくは保存薬剤のような他成分もまた含有しうる。さらに、有効成分は他薬剤、例えば気管支拡張薬とともにもまた使用しうる。
【０２２２】
本発明の薬剤は、単独で若しくは製薬学的に許容できる担体と組合せで哺乳動物に投与しうる。上で示されたとおり、有効成分および担体の相対比は、化合物の溶解性および化学的性質、選ばれた投与経路ならびに標準的な製薬学的実務により決定される。
【０２２３】
本薬剤の投薬量は、投与の形態、選ばれる特定の化合物および処置下の特定の患者の生理学的特徴とともに変動することができる。一般に、小投薬量を当初使用することができ、そして、必要な場合は該環境下で至適の影響が達せられるまで小増分ずつ増大することができる。
【０２２４】
該薬剤の有用な投薬量はそれらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性および動物モデルでのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を比較することにより決定し得る。マウスおよび他の動物における有効投薬量のヒトへの外挿方法は当該技術分野で既知であり；例えば米国特許第４，９３８，９４９号明細書を参照されたい。
【０２２５】
一般に、ローション薬剤のような液体組成物中の該薬剤の濃度は約０．１〜２５重量％から、好ましくは約０．５〜１０重量％からであることができる。ゲル薬剤若しくは散薬剤のような半固形若しくは固体組成物中の濃度は約０．１〜５重量％、好ましくは約０．５〜２．５重量％であることができる。
【０２２６】
単独で若しくは他の薬剤との使用に必要とされる該薬剤またはその活性の塩若しくは誘導体の量は、選択される特定の塩でのみならず、しかしまた投与経路、処置されている状態の性質、ならびに患者の齢および状態でもまた変動することができ、そして究極的には主治医若しくは臨床家の自由裁量であることができる。
【０２２７】
該薬剤は、便宜的に単位投薬形態物（例えば単位投薬形態物あたり５ないし１０００ｍｇ、便宜上１０ないし７５０ｍｇ、最も便宜的には５０ないし５００ｍｇの有効成分を含有する）中で投与しうる。
【０２２８】
一般に、しかしながら、適する用量は、１日あたりレシピエントの体重１ｋｇあたり３ないし約５０ｍｇのような、１日あたり約０．５から約１００ｍｇ／ｋｇまで、例えば約１０から約７５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、好ましくは６ないし９０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲、最も好ましくは１５ないし６０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあることができる。アポシニンを含有する組成物は、毎日の摂取に基づき、少なくとも５０μｇ、好ましくは少なくとも１００μｇ、１０００ｍｇまでのアポシニンを含有しうる。一例の１日摂取量は１と１００ｍｇの間のアポシニン；好ましくは少なくとも１５ｍｇ／日の投薬量である。例えば、アポシニンは、１日に３回３７５ｍｇの用量の根粉末として経口で、毎日の植物の根のアルコール性抽出物の筋肉内注入（４０ｍｇ／ｋｇ）により、若しくは合計２ｍｇについて８用量で投与されるエアゾル送達により、投与しうる。一例示的製薬剤および投薬量は３００ないし５００ｍｇの根粉末１日２回／１日３回を包含する。さらに、アポシニンのアナログをアポシニンの代わりに若しくはそれに加えて使用しうる。こうしたアナログは、とりわけ、４−ヒドロキシル基が具体的には２−ヒドロキシエチル、２，３−ジヒドロキシプロピルのようなヒドロキシル化アルキル基若しくは糖部分でエステル化されているものである。糖部分がβ−Ｄ−グルコースである後者のアナログはアンドロシンとして公知で
ある。これはアポシニンが新鮮根中に存在する通常の形態である。
【０２２９】
該有効成分は、約０．５から約７５μＭまで、好ましくは約１ないし５０μＭ、最も好ましくは約２ないし約３０μＭの有効成分の最高血漿濃度を達成するよう投与しうる。これは、例えば、場合によっては生理的食塩水中の有効成分の０．０５ないし５％溶液の静脈内注入により達成しうるか、若しくは約１〜１００ｍｇの有効成分を含有するボーラスとして経口投与しうる。所望の血中濃度は、約０．０１〜５．０ｍｇ／ｋｇ／時間を提供するための連続注入、若しくは約０．４〜１５ｍｇ／ｋｇの有効成分（１種若しくは複数）を含有する間歇的注入により維持しうる。
【０２３０】
所望の用量は、便宜的には、単一用量で、若しくは適切な間隔で投与される分割用量として、例えば１日あたり２、３、４若しくはそれ以上の下位用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）として提供しうる。該下位用量それ自身は、例えば、注入器からの複数の吸入、若しくは眼への複数の滴の適用によるような；多数の別個の大まかに間隔を空けた投与にさらに分割しうる。
【０２３１】
エンドソーム調製物を単離するための試薬
本発明は全般としてエンドソームの単離方法を提供する。一態様において、該方法は、Ｒａｃ融合タンパク質をコードする発現カセットを有する外因性核酸でトランスフェクトした組換え細胞を使用しうる。該方法は、細胞に一過性に若しくは安定にのいずれかで導入されている発現カセットからＲａｃ融合タンパク質を発現する細胞を使用しうる。発現カセットは融合タンパク質の発現を駆動するプロモーターを包含する。プロモーターは構成的プロモーター若しくは調節可能なプロモーター（例えば誘導可能）でありうる。
【０２３２】
一態様において、Ｒａｃペプチド若しくはポリペプチドは、連結されたＲａｃポリペプチドを単離、精製若しくは検出するのに有用な他の配列、例えばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）配列、Ｈｉｓ標識、カルモジュリン結合ペプチド、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、プロテインＡ  ＩｇＧ結合ドメインなど、若しくは配列の組合せに融合されているものである。一態様において、Ｈｉｓ−Ｒａｃ１が支持体、例えばマルチウェルプレートに固定される。
【０２３３】
形質転換のためのＲａｃ融合をコードする発現カセットを製造するため、組換えＤＮＡ配列若しくはセグメントは環状若しくは直鎖状の二本鎖若しくは一本鎖でありうる。目的の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡ配列に実質的に相補的であるＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列は、典型的には、相対する向きで（すなわち５’から３’よりはむしろ３’から５’）カセットにクローン化された「センス」ＤＮＡ配列である。一般に、ＤＮＡ配列若しくはセグメントは、細胞中での該ＤＮＡの発現を促進する制御配列により隣接されているコーディング領域もまた含有し得る、プラスミドＤＮＡのようなキメラＤＮＡの形態にある。本明細書で使用されるところの「キメラ」は、ベクターが、少なくとも２種の異なる種からのＤＮＡを含んでなるか、または該種の「天然のもの」すなわち野生型に存在しない様式で連結若しくは連合されている同一種からのＤＮＡを含んでなることを意味している。
【０２３４】
転写単位若しくはそれらの部分としてはたらくＤＮＡ配列は別にして、ＤＮＡの一部分は転写されずに調節若しくは構造機能を供しうる。例えば、ＤＮＡは、真核生物細胞例えば哺乳動物細胞中で、若しくはある種の細胞型で活性であるプロモーターをそれ自身が含みうるか、または、リンパ増殖性ウイルスの形質転換標的であるゲノム中に既に存在するプロモーターを利用しうる。こうしたプロモーターは、ＣＭＶプロモーターならびにＳＶ４０後期プロモーターおよびレトロウイルスＬＴＲ（末端反復配列エレメント）を包含するとは言え、当該技術分野で公知の多くの他のプロモーター領域、例えばＭＭＴＶ、ＲＳ
Ｖ、ＭＬＶ若しくはＨＩＶ  ＬＴＲを本発明の実務で使用しうる。
【０２３５】
イントロン、エンハンサー、ポリアデニル化配列などのような宿主細胞中で機能的な他のエレメントもまた組換えＤＮＡの一部でありうる。こうしたエレメントは、ＤＮＡの機能に必要であっても若しくはなくてもよいが、しかし転写、ｍＲＮＡの安定性などに影響を及ぼすことによりＤＮＡの改良された発現を提供しうる。こうしたエレメントは、細胞中での形質転換するＤＮＡの至適の性能を得るために所望のとおりＤＮＡに包含しうる。
【０２３６】
細胞中に導入されるべき組換えＤＮＡは、形質転換されるために探求される細胞の集団からの形質転換細胞の同定および選択を容易にするために、選択可能なマーカー遺伝子若しくはレポーター遺伝子のいずれか、または双方を含有しうる。あるいは、選択可能なマーカーは別個のＤＮＡ片上に保有されかつ共形質転換手順で使用しうる。選択可能なマーカーおよびレポーター遺伝子の双方は、宿主細胞中での発現を可能にするように適切な制御配列で隣接されうる。有用な選択可能なマーカーは当該技術分野で公知であり、そして、例えばｎｅｏ、ｈｐｔ、ｄｈｆｒ、ｂａｒ、ａｒｏＡ、ｐｕｒｏ、ｈｙｇ、ｄｐａＡなどのような抗生物質および除草薬剤耐性遺伝子を包含する。Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔら（米国特許第５，８４８，９５６号明細書）の表１に列挙される遺伝子もまた参照されたい。
【０２３７】
レポーター遺伝子は、潜在的に形質転換された細胞を同定しかつ制御配列の機能性を評価するために使用する。容易にアッセイ可能なタンパク質をコードするレポーター遺伝子が当該技術分野で公知である。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物体若しくは組織中に存在しないか若しくはそれらにより発現されずかつその発現が何らかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性により明示されるタンパク質をコードする遺伝子である。例示的レポーター遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＴｎ９からのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃａｔ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｕｉｄＡ遺伝子座のβ−グルクロニダーゼ遺伝子（ｇｕｓ）、緑色、赤色若しくは青色蛍光タンパク質遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子を包含する。レポーター遺伝子の発現は、該ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後適する時点でアッセイする。
【０２３８】
標的細胞を形質転換し得る組換えＤＮＡの一般的構築方法は当業者に公知であり、そしてその組成物および構築方法を利用して本発明で有効なＤＮＡを製造しうる。
【０２３９】
組換えＤＮＡは、目的のＤＮＡ配列が宿主細胞により発現されるように、組換えＤＮＡを有する形質転換された（トランスジェニック）細胞を生じるための特定の細胞への導入に有用ないずれかの処置、例えば物理的若しくは生物学的方法による、組換えＤＮＡを含んでなる発現ベクターでのトランスフェクションにより、宿主細胞、例えば哺乳動物、細菌、酵母若しくは昆虫細胞または原核生物細胞に容易に導入し得る。一態様において、組換えＤＮＡは細胞のゲノムに安定に組込まれる。
【０２４０】
宿主細胞への組換えＤＮＡの物理的導入方法は、カルシウム媒介性の方法、リポフェクション、粒子照射、微小注入法、電気穿孔法などを包含する。宿主細胞への目的のＤＮＡの生物学的導入方法はＤＮＡおよびＲＮＡウイルスベクターの使用を包含する。ウイルスベクター、例えばレトロウイルス若しくはレンチウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞のような真核生物細胞に遺伝子を挿入するための広範に使用される方法となった。他のウイルスベクターは、ポックスウイルス、例えばワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルスなどに由来し得る。
【０２４１】
宿主細胞中で組換えＤＮＡ配列の存在を確認するため、多様なアッセイを実施しうる。こうしたアッセイは、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲのような当業者に公知の分子生物学的アッセイ；例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳ
Ａおよびウエスタンブロット）若しくは他の分子アッセイにより特定の遺伝子産物の存在若しくは非存在を検出することのような生化学的アッセイを包含する。
【０２４２】
導入された組換えＤＮＡセグメントから産生されるＲＮＡを検出かつ定量するためにＲＴ−ＰＣＲを使用しうる。ＰＣＲのこの応用において、最初に逆転写酵素のような酵素を使用してＲＮＡをＤＮＡに逆転写すること、そしてその後慣習的ＰＣＲ技術の使用により該ＤＮＡを増幅することが必要である。大部分の場合で、ＰＣＲ技術は有用な一方でＲＮＡ産物の完全性を示さないことができる。ＲＮＡ産物の性質についてのさらなる情報はノーザンブロッティングにより得ることができる。この技術は、ＲＮＡ種の存在を示しかつそのＲＮＡの完全性に関する情報を与える。ＲＮＡ種の存在若しくは非存在はドット若しくはスロットブロットノーザンハイブリダイゼーションを使用してもまた決定し得る。これらの技術はノーザンブロッティングの変法であり、そしてＲＮＡ種の存在若しくは非存在のみ示す。
【０２４３】
サザンブロッティングおよびＰＣＲを問題の組換えＤＮＡセグメントを検出するのに使用しうる一方、それらは、該組換えＤＮＡセグメントが発現されているかどうかに関して情報を提供しない。発現は、導入されたＤＮＡ配列のペプチド産物を特異的に同定すること、若しくは宿主細胞中での導入されたＤＮＡセグメントの発現によりもたらされる表現型変化を評価することにより評価しうる。
【０２４４】
本発明は以下の制限しない実施例によりさらに記述されるであろう。
【０２４５】
実施例
【実施例１】
【０２４６】
方法
ウイルス、細胞培養およびウイルス感染
ルシフェラーゼ（ＡＶ２Ｌｕｃ）若しくは第ＶＩＩＩ因子（ＡＶ２ＦＶＩＩＩ）導入遺伝子をコードする組換え２型アデノ随伴ウイルスを多様な細胞型の感染に使用した。ＨｅＬａおよびＩＢ３細胞は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および抗生物質を補充したＤＭＥＭ中で培養した。Ｎｏｘ１およびＮｏｘ２ノックアウトならびに野生型（ｗｔ）同腹仔対照マウス皮膚線維芽細胞を、Ｂｏｓｕら（２００１）および下に記述されるとおり新生マウスから生成した。全部の感染について、ウイルスを無血清ＤＭＥＭ中の細胞に適用し、そして等容量の２０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを感染後２時間に添加した。
【０２４７】
ウイルス形質導入の効率を評価する研究で、ＡＶ２Ｌｕｃウイルスを１，０００粒子／細胞に等しい感染多重度（ＭＯＩ）で使用し、そしてルシフェラーゼ活性を感染後２４時間に測定した。ウイルス侵入を評価する研究で、ウイルスを除去すること、細胞を洗浄すること、および３７℃に細胞を移動することの前に、細胞を１，０００粒子／細胞のＡＶ２ＦＶＩＩＩと４℃で３０分間インキュベートした。細胞をその後示された時間インキュベートし、そして後核上清（ｐｏｓｔｎｕｃｌｅａｒ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）（ＰＮＳ）を細胞内ＡＡＶ２の分析のため調製した。Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲを使用して、Ｄｉｎｇら（２００６）に記述されるプライマー組および方法を使用して感染後の多様な細胞内画分中のウイルスゲノムの豊富さを定量化した。ＡＡＶ２形質導入を誘導するためプロテアソーム阻害薬剤を添加した場合に、ＬＬｎＬ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）および／若しくはドキソルビシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州サンディエゴ）がそれぞれ４０μＭおよび５μＭの濃度で培地中に存在した。エンドソームＲＯＳの調節は、培地に、１ｍｇ／ｍＬの精製ウシＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ）（Ｏｘｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、オレゴン州ポートランド）および／若しくはカタラーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ
州セントルイス）を添加することにより達成し、その培地はその後、別の方法で示されない限りウイルス感染の２０分前に細胞に適用した。ＳＯＤおよび／若しくはカタラーゼは、別の方法で示されない限り感染の間培地中に留まった。
【０２４８】
小胞分画およびＮＡＤＰＨ依存性スーパーオキシド産生についてのアッセイ
小胞分画は、小さい改変を伴う以前に記述されたプロトコル（Ｌｉら、２００６ｂ）を使用して実施した。簡潔には、掻き取ることおよび４℃のリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗浄することにより細胞を収集した。細胞をその後ペレットにし、そして１ｍＬの予め冷却した（４℃）均質化緩衝液（０．２５Ｍショ糖、１０ｍＭトリエタノールアミン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび１００μｇ／ｍＬアプロチニン）に氷上で再懸濁し、そして窒素減圧容器（Ｐａｒｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、イリノイ州モリーン）を使用して均質化した。ＰＮＳ生成、小胞画分のイオジキサノール単離、サンプル収集、品質管理およびＮｏｘ活性アッセイの方法は、Ｌｉら（２００６ｂ）に記述されたとおり実施した。
【０２４９】
簡潔には、小胞画分を、既知のエンドソームＲａｂタンパク質を含有しかつ原形質膜およびミトコンドリアのマーカーを欠くことを、ウエスタンブロットにより確認した。Ｎｏｘ活性は、化学発光性のルシゲニンに基づく系を使用して・Ｏ２−生成の速度を測定することにより分析した。アッセイの開始前に、小胞画分をＰＢＳ中５μＭルシゲニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）と合わせ、そして室温で暗所で１０分間インキュベートした。１００μＭのＮＡＤＰＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）の添加により反応を開始し、そして発光の変化を３分の経過にわたり測定した（５示度／秒）。発光曲線（１分あたりの相対光単位［ＲＬＵ］）の傾き（ｒ＞０．９５）を使用して、・Ｏ２−形成の速度をＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の指標として計算した。
【０２５０】
ｒＡＡＶ２のＡｌｅｘａ５４６標識および蛍光顕微鏡検査
およそ２×１０１２の精製ＡＶ２ＦＶＩＩＩビリオンを５００μＬの複合緩衝液（０．１Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．３）で希釈し、５０ｎＭのＡｌｅｘａ５４６反応性色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）と室温で１時間インキュベートしかつ継続混合した。反応を停止するために１ｍＬの１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）を溶液に添加した。標識ウイルスをその後、Ｋａｌｕｄｏｖら（２００２）に記述されたところのイオン交換高速液体クロマトグラフィーを使用して精製した。精製した標識ウイルスの最終濃度は、ウイルスＤＮＡプローブを使用するスロットブロットハイブリダイゼーションにより決定されたとおり１×１０１２粒子／ｍＬであった。ＥＧＦＰ−Ｒａｃ１プラスミドはＫｌａｕｓ  Ｈａｈｎ博士からの恵与であり、そして標準的電気穿孔法プロトコルに従ってＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後３６時間に、トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を４℃に１０分間前冷却し、次いで細胞を１０４粒子／細胞のＭＯＩのＡｌｅｘａ５４６標識したＡＶ２ＦＶＩＩＩと４℃で１時間インキュベートした。未結合のウイルスをその後新鮮培地で洗浄することにより除去し、そして、細胞を示された時間３７℃に移動することによりウイルス侵入を開始した。細胞をその後４％パラホルムアルデヒド中での固定前にＰＢＳで４回洗浄した。固定した細胞をＶｅｃｔｒａＳｈｉｅｌｄマウント媒体でマウントし、そしてＹｏｋｏｇａｗａ  ＣＳＵ１０共焦点顕微鏡で検査した。
【０２５１】
Ｎｏｘ２ノックアウト（ＫＯ）マウスへのＡＡＶ２媒介性遺伝子移入を評価するｉｎ  ｖｉｖｏ研究
Ｃ５７ＢＬ６背景のＮｏｘ２  ＫＯおよび同腹仔野生型マウスをメトキシフルランチャンバー中で軽く麻酔した。１×１０１１粒子のＡＶ２Ｌｕｃを、鼻吸引により４０μＬの容量中の２０μＭドキソルビシン／ＰＢＳとともに投与した。マウスを感染後２週間に安
楽死させ、そしてルシフェラーゼ発現アッセイのため肺を収集した。
【０２５２】
精製ＡＡＶ２ウイルスを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）活性アッセイ
１０１０精製ＡＶ２ＦＶＩＩＩビリオンを、精製ビリオンのキャプシド中のＰＬＡ２活性を活性化するために多様な条件で処理した。これは、３７℃で１５分間の多様な濃度のＨ２Ｏ２とのウイルスのプレインキュベーション、若しくは７０℃で２分間の部分的熱変性を包含した。ＰＬＡ２活性アッセイ前にＨ２Ｏ２を捕捉するため、処理期間の終了時に、Ｈ２Ｏ２処理したウイルスにカタラーゼを添加した。ビリオンのＰＬＡ２活性を、Ｚａｄｏｒｉら（２００１）により記述されたプロトコルを使用する１，２−ジ［１−１４Ｃ］オレオイルＬ−３−ホスファチジルコリン（ＰＣ）からの放射活性脂肪酸の遊離により測定した。
【０２５３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を使用するＡＡＶ２ビリオンのトリプシン感受性アッセイ
熱変性若しくはＨ２Ｏ２への曝露後のビリオンのキャプシド構造のわずかな変化を、トリプシン消化後のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を使用してアッセイした。簡潔には、１０１０ＡＡＶ２粒子を、上述されたとおりＨ２Ｏ２（その後２０ｍＭトリス、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０に対する１時間の透析により除去した）で処理したか、若しくは７０℃に加熱し、そしてその後、２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．０）中５００ｎｇのブタトリプシンと３７℃で１６時間インキュベートした。消化された生成物をその後、システイン残基を還元かつ修飾するために１０ｍＭ  ＤＴＴおよび５５ｍＭのヨードアセトアミドと連続してインキュベートした。元のサンプルの１／２０をＢｒｕｋｅｒ  Ｂｉｆｌｅｘ  ＩＩＩ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳでアッセイした。システイン修飾の分析のため、個々のシステインを含有するペプチドの理論的ｍ／ｚ値を、修飾なし、ヨードアセトアミド修飾および多様な酸化的（スルフェン酸、スルフィン酸若しくはスルホン酸）修飾を伴い予測した。ＥｘＰＡＳｙ（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｅｐｔｉｄｅ−ｍａｓｓ．ｈｔｍｌ）を使用してスペクトルを評価し、そして多様なＶＰタンパク質の理論的スペクトルと比較した。
【０２５４】
ビリオンのエンドソームエスケープについてのアッセイ
３０％イオジキサノールクッション（ｃｕｓｈｉｏｎ）を使用するプロトコルを、細胞質中のＡＡＶ２ビリオンをエンドソームの内側のものから分離するため開発した。簡潔には、ウイルスを除去すること、細胞を洗浄すること、および細胞を３７℃に移動することの前に、ＨｅＬａ細胞を１，０００粒子／細胞のＡＡＶ２と４℃で３０分間インキュベートした。細胞をその後示された時間インキュベートしかつＰＮＳを調製した。総容量５００μｌのＰＮＳをその後２５０μｌの３０％イオジキサノールの上に負荷し、次いで１００，０００×ｇで１時間遠心分離した。上清およびペレット内のウイルスゲノムをリアルタイムＰＣＲにより定量した。
【０２５５】
Ｃ２９８Ｓキャプシド変異体ＡＡＶ２の生成
Ｃ２８９を含有するキャプシドドメインを、Ｋｐｎ  Ｉを使用してｐＡＶ２ＲｅｐＣａｐからｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）にクローン化した。結果として生じるプラスミド、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＡＶ２Ｃａｐを、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してＣ２８９Ｓ突然変異誘発を実施するのに使用した。Ｃ２８９Ｓ突然変異をもつキャプシドドメインをその後、Ｋｐｎ  Ｉを使用してｐＡＶ２ＲｅｐＣａｐに戻しクローン化して、ｐＡＶ２ＲｅｐＣａｐＣ２８９Ｓをもたらした。突然変異をその後配列決定により確認した。ルシフェラーゼをコードする組換えＡＡＶ２を、それぞれ野生型若しくはＣ２９８Ｓキャプシドを提供するｐＡＶ２ＲｅｐＣａｐ若しくはｐＡＶ２ＲｅｐＣａｐＣ２８９Ｓを用い、Ｙａｎら（２００２）に記述された３プラスミドトランスフェク
ションプロトコルに従って生成した。組換えＡＡＶ２を、Ｙａｎら（２００２）に以前に記述された標準的プロトコルを使用して双方のベクターから精製した。ウイルス力価をリアルタイムＰＣＲおよびスロットブロットハイブリダイゼーションにより決定した。精製ウイルスの力価は、ｗｔキャプシドをもつＡＡＶ２について６．５×１０１１粒子／ｍｌ、およびＡＡＶ２−Ｃ２８９Ｓキャプシドについて５×１０１１粒子／ｍｌであった。
【０２５６】
ＮＡＤＰＨオキシダーゼ欠損マウスおよび皮膚線維芽細胞。
これらの研究で使用したＮｏｘ１およびＮｏｘ２ノックアウト系統はＰｏｌｌｏｃｋら（１９９５）およびＧａｖａｚｚｉら（２０００）に記述されている。全部の比較研究において、ＫＯおよびＷＴ同腹仔対照を使用した。マウス皮膚線維芽細胞はＢａｓｕら（２００１）に記述されたとおり新生マウスから生成した。簡潔には、初代皮膚線維芽細胞の培養物を樹立するため、皮膚を新生マウスから取り出しそして０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ中４℃で一夜インキュベートした。皮膚の真皮層をその後表皮から分離し、そしてＤＭＥＭ中０．２％コラゲナーゼ中３７℃で１時間インキュベートし、次いで激しく振とうして線維芽細胞を遊離させた。遊離した線維芽細胞をその後ペレットにし、再懸濁し、そして１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を補充したＤＭＥＭ中の培養物で維持した。
【０２５７】
結果
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は遺伝子治療ベクターとしてのそれ使用について最も公知の小型一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである（Ｃａｒｔｅｒ、２００５）。その単純な４．７ｋｂのゲノムは、そのゲノムの複製およびキャプシド形成に必要とされる２種のウイルス遺伝子ＲｅｐおよびＣａｐをコードする。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は遺伝子治療ベクターとして広範に研究されており、そしてこのベクターを使用する臨床試験が急速に増加している。であるから、ＡＡＶ感染の過程は、これまで同定された１０を上回る血清型の生物学を詳細に分析するための試みにおいてますます研究されつつある。今日まで最も十分に研究された血清型はＡＡＶ２型である。ウイルスの型の多くでのように、ＵＶ照射若しくはＨ２Ｏ２によるレドックスストレスがＡＡＶ２形質導入を増大させることが知られており、そしてＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）のような抗酸化薬剤が形質導入を阻害する（Ｓａｎｌｉｏｇｌｕら、２００４；Ｓａｎｌｉｏｇｌｕら、１９９９）。しかしながら、この観察結果の原因であるレドックスで調節される事象は未知のままである。下述されるとおり、ｒＡＡＶ−２のＲＯＳ媒介性の形質導入の原因である機構を詳細に分析した。
【０２５８】
エンドソーム輸送および細胞内プロセシングがＡＡＶ２形質導入の律速段階とみなされている（Ｄｕａｎら、２０００；Ｈａｎｓｅｎら、２０００；Ｈａｕｃｋら、２００４）。この情況において、プロテアソーム阻害は、今までのところ不十分に定義される機構によりウイルスの核取り込みを増大させることによりｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＡＡＶ形質導入を劇的に高める。ＡＡＶ２のエンドソームプロセシングが非効率的でありかつＨ２Ｏ２がＡＡＶ２形質導入を高めることが既知であることを考えれば、エンドソームのＲＯＳが感染後のビリオンのプロセシングに重要でありうる。この目的のため、精製カタラーゼをエンドソームに負荷することによりエンドソームのＨ２Ｏ２の消失がＡＡＶ２の形質導入を阻害することができるかどうかを試験した。ＨｅＬａ細胞上の培地への１ｍｇ／ｍＬカタラーゼの添加は、精製したエンドソームの内側のプロナーゼ非感受性カタラーゼの蓄積につながった（図１Ａ）。事実、カタラーゼのエンドソーム負荷は、組換えルシフェラーゼ導入遺伝子の発現により反映されるとおり、ＩＢ３（形質転換気管支上皮細胞株）およびＨｅＬａ細胞双方のＡＡＶ２形質導入を有意に阻害した（図２Ａ）。顕著には、カタラーゼ負荷は、ＡＡＶ２形質導入を高めるプロテアソーム阻害薬剤の能力もまた双方の細胞株で完全に消失させた（Ｙａｎら、２００４）（図２Ａ）。エンドソームのカタラーゼ負荷の阻害効果は損なわれたウイルス取り込みによらなかった（図１Ｂ）
。感染の間および後の多様な時点でカタラーゼを負荷する時間経過研究は、カタラーゼがウイルス感染の比較的早い段階でＡＡＶ２形質導入を阻害するよう作用することを示唆した（図２Ｂ）。感染後３０分までに、ウイルス形質導入を阻害するカタラーゼ負荷の能力は有意に減少し、そして感染後６０分までに完全に非存在となった。これは、Ｈ２Ｏ２が感染過程の早期に形質導入を高めるよう作用したことを示唆した。
【０２５９】
細胞シグナル伝達で重要なエンドソームのＨ２Ｏ２の主供給源は、最近、・Ｏ２−を産生するＨＡＤＰＨオキシダーゼであると同定された（Ｌｉら、２００６）。この情況で、・Ｏ２−不均化はＨ２Ｏ２形成につながり、そして、この反応は多くのエンドソーム区画で通常見出される低ｐＨで非常に速い速度で自発的に起こり得る（Ｂｉｅｌｓｋｉら、１９８５）。従って、ＡＡＶ２感染は、エンドソームのＮｏｘ活性およびこれゆえにスーパーオキシド産生を刺激しうる。ルシゲニンに基づく化学発光アッセイ（Ｌｉら、２００６）を使用して、ＡＡＶ２感染がイオジキサノール分画したエンドソーム中のエンドソームのＮＡＤＰＨ依存性の・Ｏ２−産生を促進したかどうかを決定した。事実、ＮＡＤＰＨ依存性の・Ｏ２−産生の２〜３倍増大がＡＡＶ感染後の双方の細胞株の小胞画分で見られた（図２Ｃ〜Ｄ）。加えて、エンドソーム画分中のウイルスで誘導されたＮＡＤＰＨ依存性の・Ｏ２−産生は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの既知の阻害薬剤ＤＰＩにより阻害された（データは示されない）。これらの知見は、エンドソーム区画中でのＮｏｘ活性化がＡＡＶ２感染後に起こることを示唆した。興味深いことに、ＡＡＶ２感染に対するこれら２種の細胞株の許容性およびエンドソーム区画中のＮＡＤＰＨ依存性の・Ｏ２−を生成する能力で相関が観察され；ＨｅＬａ細胞の小胞画分はＩＢ３細胞のものより１００倍以上高レベルの・Ｏ２−を生成し、これはＡＡＶ２ベクターでの形質導入のそれらの相対レベルと直接相関した（図２ＡおよびＣ〜Ｄ）。これらの知見もまた、エンドソームのＲＯＳがＡＡＶ２感染に正に影響するという仮説を裏付けた。
【０２６０】
これまでのデータは、エンドソーム区画中のＨ２Ｏ２がＡＡＶ２感染に機能上重要であったことを示唆した。しかしながら、・Ｏ２−およびＨ２Ｏ２がヒドロキシルラジカルを形成するように反応し得ることを考えれば、Ｈ２Ｏ２がＡＡＶ２のエンドソームプロセシングを媒介する機能上重要なＲＯＳであったかどうかは不明であった。この疑問を扱うため、精製したスーパーオキシドジスムターゼ−１（ＳＯＤ１）および／若しくはカタラーゼを用いてエンドソーム負荷実験を実施した。・Ｏ２−がエンドソーム区画中のＡＡＶ２プロセシングに決定的に重要であった場合には、ＳＯＤ１による・Ｏ２−→Ｈ２Ｏ２の高められた転化がＡＡＶ２形質導入を阻害するであろうという仮説を立てた。しかしながら、エンドソームのＮｏｘ媒介性の・Ｏ２−産生をクエンチすることが既知の条件（Ｌｉら、２００６ｂ）下での精製ＳＯＤ１のエンドソームへの負荷は、プロテアソーム阻害薬剤の非存在若しくは存在下でＡＡＶ２形質導入を変えることに失敗した（図２Ｅ）。これらの知見は、・Ｏ２−が増殖性ＡＡＶ２感染に必要でないこと、および・Ｏ２−→Ｈ２Ｏ２の自発的不均化の速度がＡＡＶ２プロセシングに重要なエンドソーム区画中で制限しないことを示唆した。
【０２６１】
Ｒａｃ１  ＧＴＰアーゼは、Ｎｏｘ１およびＮｏｘ２双方の酵素複合体の活性化の補助因子であることが報告されている（Ｌａｍｂｅｔｈ、２００４；Ｐａｒｋら、２００４）。加えて、ＡＡＶ２感染はＲａｃ１−ＧＴＰの活性化を刺激し、また、ドミナントネガティブなＮ１７Ｒａｃ１変異体はＡＡＶ２感染を有意に阻害する（Ｓａｎｇｌｉｏｇｌｕら、２０００）。これらの知見は、ＡＡＶ２感染におけるＲａｃ１で調節されるＮｏｘ活性化の潜在的重要性を裏付ける。この目的のため、Ｒａｃ１が結合したエンドソームにＡＡＶ２が直接エンドサイトーシスされたかどうかを、ＧＦＰ−Ｒａｃ１およびＡｌｅｘａ５４６標識ＡＡＶ２を使用して評価した。ウイルス感染の非存在下で、Ｒａｃ１は主として細胞質全体に均一に分布された（図３Ａ）。ウイルス感染後２分で開始して、ＥＧＦＰ−Ｒａｃ１局在化が、Ａｌｅｘａ５４６標識ＡＡＶ２と共局在化してエンドソーム中で増大
することが見られ、そして、この共局在化は感染後３０分までに核周囲領域（ＡＡＶ２を蓄積することが既知の領域）の小胞構造に漸進的に移動した（図３Ｂ〜Ｄ）。興味深いことに、定量的形態計測を使用して、小胞のＡＡＶ２−Ｒａｃ１共局在化の程度の減少が感染後２分（＞９５％）から１０分（約６０％）まで観察された。これらの形態学的観察結果は、ＡＡＶ２を含有する新たに形成された小胞中のＮｏｘ活性化と矛盾しない、Ｒａｃ１とＡＡＶ２のエンドソームプロセシングの間の緊密な関連を裏付ける。
【０２６２】
Ｒａｃ１はＮｏｘ１およびＮｏｘ２の既知の活性化因子であるため、ＡＡＶ２感染後に生成されるＲＯＳがエンドソーム区画中のＮｏｘ１および／若しくはＮｏｘ２いずれかの活性化の結果であったという仮説を立てた。この仮説を扱うため、Ｎｏｘ１−／−およびＮｏｘ２−／−ノックアウト初代マウス皮膚線維芽細胞（ＰＭＤＦ）のＡＡＶ２形質導入が野生型同腹仔の対照ＰＭＤＦに比較して低下されたかどうかを評価した。これらの研究からの結果（図４Ａ）は、Ｎｏｘ１の存在がＰＭＤＦのＡＡＶ２形質導入に有意に影響しなかったことを示し；基礎およびプロテアソーム阻害薬剤で誘導したＡＡＶ２形質導入は、Ｎｏｘ１＋／＋およびＮｏｘ１−／−ＰＭＤＦの間で同様であり、また、カタラーゼのエンドソーム負荷もまたこれらの条件の全部で形質導入を阻害した。対照的に、プロテアソーム阻害薬剤の非存在および存在下でのＡＡＶ２形質導入は、Ｎｏｘ２＋／＋同腹仔対照細胞と比較してＮｏｘ２−／−ＰＭＤＦで有意に（ｐ＜０．００１）低下された（図４Ａ）。この低下は、ウイルスゲノムコピーの取り込みの差異がＮｏｘ２＋／＋およびＮｏｘ２−／−ＰＭＤＦの間で観察されなかった（図４Ｂ）ため、ノックアウト細胞中の損なわれたウイルス取り込みによらなかった。Ｎｏｘ２＋／＋ＰＭＤＦと対照的に、エンドソームのカタラーゼ負荷はＮｏｘ２−／−ＰＭＤＦでのＡＡＶ２形質導入を有意に変えず（図４Ａ）、Ｎｏｘ２の欠如が、ＡＡＶ２のエンドソームプロセシングを助長するのに必要とされるエンドソームのＨ２Ｏ２の大多数を消失させるのに十分であったことを示唆した。Ｎｏｘ２−／−ＰＭＤＦは、ＡＡＶ２感染後のエンドソーム画分でＮＡＤＰＨ依存性の・Ｏ２−産生を誘導することにもまた失敗した一方、２倍の誘導がＮｏｘ２＋／＋ＰＭＤＦを見られた（図４Ｃ〜Ｄ）。
【０２６３】
ＡＡＶ２形質導入でのＮｏｘ２の重要性をさらに確証するため、付加的なｉｎ  ｖｉｖｏ実験を肺への組換えＡＡＶ２送達で実施した。初代ＰＭＤＦで見られたとおり、ウイルスの鼻送達後の肺のＡＡＶ２形質導入は、Ｎｏｘ２＋／＋同腹仔に比較してＮｏｘ２−／−マウスでの約５倍より低いレベルのルシフェラーゼ導入遺伝子発現を示した（図４Ｅ）。これらの知見は、Ｎｏｘ２がＡＡＶ２感染に応答してのエンドソームのＲＯＳ産生の主供給源であること、および、Ｎｏｘ２に駆動されるＲＯＳがＡＡＶ２形質導入に機能上重要であることを強く示唆する。ＮＡＤＰＨオキシダーゼもまた形質転換細胞での形質導入に必要とされたことを確認するため、ＨｅＬａ細胞のＡＡＶ２形質導入をＤＰＩ（ＮＡＤＰＨオキシダーゼの既知の阻害薬剤）の存在若しくは非存在下で実施した。これらの実験からの知見は、ＤＰＩがプロテアソーム阻害薬剤の非存在（１００倍）および存在（１０００倍）下でＡＡＶ２形質導入を効果的に阻害したことを明瞭に示した（図４Ｆ）。対照的に、ミトコンドリア呼吸（アンチマイシンＡおよびロテノン）若しくは一酸化窒素合成酵素（ＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニン酢酸塩、Ｌ−ＮＭＭＡ）の２種の阻害薬剤はＡＡＶ２形質導入に有意に影響せず（図３Ｇ）、ＲＯＳ産生のこれらの経路が関与しなかったことを示唆した。
【０２６４】
これまでの研究は、Ｒａｃ１およびＮｏｘ２が、レドックス依存性形質導入を助長するように感染後にＡＡＶ２含有エンドソームに補充されること、ならびに、ＡＡＶ２含有エンドソームのカタラーゼ負荷がこの過程を阻害したことを示唆した。これゆえに、Ｒａｃ１、Ｎｏｘ２およびエンドソームに負荷したウシカタラーゼは、全部、感染後にＡＡＶ２ウイルスを含むエンドソーム区画に分画されるはずである。これを確認するため、これらの成分のそれぞれを、培地中の外因性に補充したウシカタラーゼの存在および非存在下で
感染後にＨｅＬａ細胞の細胞内分画により位置推定した。これらの研究からの結果は、実際にＲａｃ１、Ｎｏｘ２、ウシカタラーゼおよびウイルスゲノムが全部、ウイルス感染により誘導される最高のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性と一致して、エンドソーム画分に分離されたことを示した（図５）。対照的に、内因性の細胞カタラーゼは、カタラーゼが見出されるより高密度のペルオキシソームと一致して、より高密度の画分（＃７）に分離された。これらの研究は、カタラーゼ負荷が、感染後のこの早い時点（２０分）でエンドソーム区画中のＮｏｘ活性若しくはウイルス蓄積に影響を及ぼさなかったこともまた明瞭に示した。さらに、ＡＡＶ２感染後に、エンドソーム画分中のＮｏｘ２およびＲａｃ１双方の顕著な増大が見られ、これらの因子が感染後にＡＡＶ２含有エンドソームに補充されるという事実を裏付けた。
【０２６５】
ＡＡＶ２のキャプシドは、それらのＮ末端領域が異なる３種のタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３から構成される（図６Ｈ）。感染後にＡＡＶキャプシドで発生する機能上決定的に重要なプロセシング事象の詳細な理解は不明なままである。これらの研究で見られるＡＡＶ２形質導入に対するエンドソームのＲＯＳの機能的重要性を考え、エンドソームのＲＯＳがＡＡＶ２ビリオンをプロセシングするのに重要であったという仮説を立てた。
【０２６６】
ＡＡＶ２ビリオンの大きな形態学的変化が、５０ないし１０００ｎＭのＨ２Ｏ２での処理後に電子顕微鏡検査を使用して観察され得なかった（データは示されない）ため、レドックス媒介性のＡＡＶ２キャプシド変化は、ありそうには非常にわずかな構造改変であった。この目的のため、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳトリプシン感受性アッセイを、Ｈ２Ｏ２処理により誘導されるＡＡＶ２ビリオンの小さな構造変化を分析するために開発した。無傷のＡＡＶ２ビリオンはトリプシン消化に対し極めて抵抗性であり、そしてＭＳにより認識可能なトリプシンフラグメントを生じさせなかった（図６Ａ）。対照的に、７０℃で５分間の精製ＡＡＶ２ビリオンの熱処理は、完全なトリプシン消化、およびＶＰアミノ酸配列の＞９０％を包括するＶＰのトリプシンペプチドフラグメントの大多数のその後の同定を見込んだ（図６Ｂ）。顕著には、１００ｎＭのＨ２Ｏ２でのＡＡＶ２ビリオンの前処理は、熱変性させたウイルスで見られたペプチドのサブセットを遊離する、有意に高められたトリプシン消化をもたらした（図６Ｃ）。それらがウイルスキャプシドタンパク質の一次配列に対応するところのＨ２Ｏ２で遊離されるトリプシンペプチドフラグメントの対応する位置を図６Ｈおよび図７に示す。興味深いことに、これらのペプチドはいくつかの大きな領域、すなわちＰＬＡ２活性を伴うＶＰ１の独特のＮ末端中の１個（図６Ｈ）およびビリオン中の提案された高い表面接近可能性をもつアミノ酸残基（Ｘｉｅら、２００２）に隣接する２個に集中される。
【０２６７】
これらの知見は、ＡＡＶ２の細胞内プロセシングにおけるエンドソームのＨ２Ｏ２の機能のいくつかの重要な関連を示唆する。
【０２６８】
ＡＡＶ２ビリオンの構造変化を媒介する原因であるＨ２Ｏ２により誘導される分子改変を詳細に分析するため、ウイルスキャプシド上のシステイン残基のレドックス修飾がこの機構を助長しうるという仮説を立てた。移動される電子の数に依存して、チオール基のレドックス修飾は、他者に加えてジスルフィド結合、スルフェン酸、スルフィン酸、スルホン酸を包含する多様な産物をもたらし得る（Ｐａｇｅｔら、２００３）。ヨードアセトアミドシステイン修飾およびトリプシン消化を使用して、ＡＡＶ２  ｃａｐ  ＯＲＦ中の５個のシステインの状態（図６Ｈ）を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより無傷、熱変性若しくはＨ２Ｏ２処理したビリオンで分析した（図６、８および９）。結果は、熱変性ビリオン中で全部のシステインがヨードアセトアミドにより修飾され（図６ＢおよびＥ、図８ならびに図９）、また、システインの標識は無傷のビリオンで観察されなかった（図６ＡおよびＤ、図８ならびに図９）ことを示した。対照的に、１００ｎＭのＨ２Ｏ２でのビリオ
ンの処理は、ＶＰ１（Ｃ２８９）、ＶＰ２（Ｃ１５２）およびＶＰ３（Ｃ８７）に共通の単一システインのチオール基でのスルホン酸（Ｒ−ＳＯ３−）修飾につながった（図６Ｆ）。加えて、１０００ｎＭのＨ２Ｏ２でのＡＡＶ２ビリオンの処理は、ヨードアセトアミド修飾を同時に減少させつつこの特定のシステインのスルホン酸修飾を増大させた（図６Ｇ）。
【０２６９】
対照的に、Ｈ２Ｏ２処理したビリオン内のＣ４８２（ＶＰ１配列に参照される）は、ヨードアセトアミド修飾のみ示した（図８〜９）。キャプシド中に残存するシステインを含有する対応するペプチドはビリオンのＨ２Ｏ２処理後に検出されず（図９）、これらの領域がＨ２Ｏ２処理後に効率的なトリプシン消化のために露出されなかったことを示唆した。対照的に、スルホン酸を形成するシステイン（Ｃ２８９）およびレドックス修飾されないシステイン（Ｃ４８２）は、１００ｎＭのＨ２Ｏ２での処理後にトリプシン消化に到達可能なキャプシドの領域に配置され、それぞれペプチドＦＨＣＨＦＳＰＲおよびＮＷＬＰＧＰＣＹＲをもたらした（図６Ｈおよび図７）。Ｃ２８９およびＣ４８２を含有するＶＰ２の領域もまた、キャプシド中で表面到達可能なアミノ酸に隣接することが提案されている（Ｘｉｅら、２００２）（図６Ｈ）。
【０２７０】
ＶＰ１キャプシドタンパク質中のＮ末端領域が、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）様モチーフ、および大部分のパルボウイルスのあいだで高度に保存されている脂質鎖を切断するための活性を含有することが報告されている（Ｇｉｒｏｄら、２００２；Ｚａｄｏｒｉら、２００１）。ＡＡＶ２中で見出されるＰＬＡ２モチーフ中の突然変異は、ウイルス侵入後の１段階でｗｔ  ＡＡＶ２の複製を有意に損なう（Ｇｉｒｏｄら、２００２；Ｚａｄｏｒｉら、２００１）。ＰＬＡ２変異体ＡＡＶ２若しくはブタパルボウイルスが細胞に効果的に進入しかつ核周囲の後期エンドソーム／リソゾーム領域に効率的に輸送するが、しかしウイルスＤＮＡ複製を開始することに失敗するという事実に基づけば、ＶＰ１のＰＬＡ２活性は核へのウイルスのエンドソームプロセシングに決定的に重要でありうる。ＡＡＶ２キャプシドの電子低温顕微鏡検査は、ＶＰ１のＮ末端が無傷のビリオンの内側に埋められ、そして部分的変性がこの領域およびＰＬＡ２活性を露出させるために必要とされることを示した（Ｇｉｒｏｄら、２００２；Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇら、２００５；Ｋｒｏｎｅｎら、２００１；Ｚａｄｏｒｉら、２００１）。エンドソームの酸性化がマウス微小ウイルス（パルボウイルス科の１メンバー）のＮ−ＶＰ１の露出を助長することが報告された（Ｍａｎｉら、２００６）とは言え、ＡＡＶ２のＰＬＡ２をｉｎ  ｖｉｖｏで活性化する機構は明確でない。
【０２７１】
ＡＡＶ２感染によるＶＰ１のＮ末端のレドックスに指図される曝露が、ＶＰ１のＰＬＡ２活性を遊離するビリオンのコンホメーション変化の指図において重要でありうるという仮説を立てた。この仮説を検証するため、Ｈ２Ｏ２処理が精製組換えＡＡＶ２ビリオン中でウイルスＰＬＡ２活性を誘導し得たかどうかを検討した。ウイルスを、３０：１から１，２００：１までの範囲にわたるＨ２Ｏ２：ビリオン比にて増大する濃度のＨ２Ｏ２（２５ないし．１，０００ｎＭ）で処理した。処理したビリオンを、Ｌ−３−ホスファチジルコリン（１，２−ジ［１−１４Ｃ］オレオイル）（ＰＬＡ２の基質）とのインキュベーションによりＰＬＡ２活性について評価した。興味深いことに、ＰＬＡ２活性は、５０から５００ｎＭまでの範囲にわたるＨ２Ｏ２の濃度でＡＡＶ２ビリオンから移動された（図６Ａ）。ビリオンのトリプシン感受性を最大に誘導した濃度でもまたあった１００ｎＭのＨ２Ｏ２という至適の濃度で、ＰＬＡ２活性は、こうした活性を評価するのに以前に使用されていた部分的なビリオン熱変性後に見られたものより大きかった（図６Ｉ、レーン４をレーン８と比較されたい）。これらの結果は、Ｈ２Ｏ２濃度の比較的狭い窓がＡＡＶ２ビリオン中でＰＬＡ２活性を活性化し得たことを示した。
【０２７２】
これまでの研究は、ＰＬＡ２活性を誘導するＡＡＶ２キャプシドのコンホメーション変
化をＨ２Ｏ２処理が促進することを示した。キャプシドＰＬＡ２のレドックス依存性の活性化がビリオンのエンドソームエスケープに重要であったという仮説を立てた。この仮説を検証するため、遊離の細胞質ビリオンをエンドソームの内側のものから分離するためのイオジキサノールクッション（図１０Ａ、上図）。再構成実験を使用して、ＰＢＳ若しくはＨｅＬａ細胞核後上清（ＰＮＳ）をスパイクした（ｓｐｉｋｅｄ）精製ビリオンが、高速遠心分離（１００，０００×ｇ）後に３０％イオジキサノールを通って大部分がペレット化した（ｐｅｌｌｅｔｅｄ）ことが示された（図１０Ａ、下図）。対照的に、ＡＡＶ２に１時間感染させたＨｅＬａ細胞からのＰＮＳ中のビリオンの大多数（＞８５％）は上清中に留まった一方、分画前のＰＮＳへの０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加は＞９５％のビリオンをペレット中に遊離した（図１０Ａ、下図）。ＡＡＶ２のエンドソームエスケープでのＨ２Ｏ２の重要性を研究するため、この系をカタラーゼのエンドソーム負荷とともに利用した。結果は、エンドソームからのウイルスエスケープ（すなわちペレット中の％）がカタラーゼの非存在下で感染後１時間に最高点に達した（約１５％）一方、カタラーゼ負荷がウイルスエスケープを約３倍有意に阻害した（図８Ｂ）ことを示した。対照（カタラーゼなし）サンプル中の感染後２時間の細胞質画分中の遊離ウイルスの減少は、ありそうには遊離の細胞質ビリオンの迅速な核輸送を表す。これらの結果は、ＡＡＶ２形質導入に対するカタラーゼの阻害効果と矛盾せず、そして、ビリオンのＨ２Ｏ２で助長されるプロセシングがウイルスのエンドソームエスケープに重要であるという仮説を裏付ける。
【０２７３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は、Ｈ２Ｏ２媒介性のＡＡＶ２形質導入を制御するレドックス事象におけるＣｙｓ２８９（ＶＰ１配列に参照される）のスルホン酸修飾を関係させる。このシステインがｉｎ  ｖｉｖｏでＡＡＶ２感染にどのように影響を及ぼすかをより良好に理解するために、Ｃ２８９Ｓキャプシド突然変異をもつ組換えＡＡＶ２ウイルスを製造し、そしてＨｅＬａ細胞中の形質導入のそのレドックス感受性について試験した。事実、ＡＡＶ２−Ｃ２９８Ｓウイルスは、ｗｔキャプシドを含有する組換えウイルスに比較して、有意に低下された形質導入効率および損なわれたエンドソームエスケープを示した（図１０Ｃ）。重要なことに、ＡＡＶ２−Ｃ２９８Ｓウイルスでの残余の形質導入はカタラーゼ負荷に感受性でなく（図１０Ｃ）、この変異体ウイルスへの感染がもはやレドックス感受性でなかったことを示唆した。対照として、われわれは、ビリオンのＨ２Ｏ２処理後に露出されなかったシステイン（Ｃ３６１）もまた変異させた。組換えＡＡＶ２−Ｃ３６１Ｓ変異体ルシフェラーゼウイルスでの形質導入の分析は、導入遺伝子発現が野生型キャプシドをもつウイルスのものと有意に異ならなかったことを示した（図１０Ｃ）。Ｃ２９８Ｓキャプシド突然変異もカタラーゼ負荷も、感染後のＰＮＳ中のウイルスゲノムの総量により反映されるとおり、ウイルス侵入の効率を変えなかった（データは示されない）。キャプシドのレドックス依存性プロセシングに重要であるＣ２９８を裏付けて、精製ＡＡＶ２−Ｃ２９８Ｓビリオンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｈ２Ｏ２処理は、ｗｔキャプシドを含有するビリオンに比較してＰＬＡ２活性を誘導することに失敗した（図１０Ｄ、レーン１２〜１６をレーン７〜１１と比較されたい）。興味深いことに、熱変性Ｃ２８９Ｓビリオンが野生型ビリオンに匹敵するレベルのＰＬＡ２活性を表したため、Ｃ２９８Ｓ突然変異はＰＬＡ２ドメインを機能上破壊しなかった（図１０Ｄ、レーン６をレーン５と比較されたい）。これらの知見は、Ｃ２９８がキャプシドＰＬＡ２ドメインのレドックス活性化に重要であること、および活性化のこの過程がＡＡＶ２のエンドソームエスケープを促進することを示す。
【０２７４】
電子低温顕微鏡検査を使用するＡＡＶ２キャプシドの構造分析は、ＰＬＡ２モチーフを含有するＶＰ１のＮ末端のが無傷のビリオンの内側に埋められた球状構造として構成されていることを示した（Ｇｉｒｏｄら、２００２）。部分的変性が、キャプシド上の５回軸チャンネルを通るこの領域の露出（Ｇｉｒｏｄら、２００２）およびウイルスキャプシドＰＬＡ２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇら、２００５）に必要とされ
る。ＡＡＶ２キャプシドによるＰＬＡ２活性化が核移行に必要とされるウイルスプロセシングに不可欠であることが提案されている（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇら、２００５）とは言え、ＡＡＶ２  ＰＬＡ２のｉｎ  ｖｉｖｏ活性化の機構は不明である。これらの研究は、エンドソームのＮＡＤＰＨオキシダーゼがＡＡＶ２による増殖性感染をそのキャプシドの酸化により助長する機構を発見した。この情況で、極めて低レベルのＨ２Ｏ２は、キャプシド内の独特なシステイン（１個若しくは複数）でスルホン酸を形成することによりビリオンを構造的に変えるように作用し得る。このレドックス媒介性事象は、順に、エンドソームエスケープを助長するのに重要なビリオンからＰＬＡ２活性を遊離する。キャプシドはおよそ６０個のＶＰタンパク質サブユニットから構成される（その全部がＣ２８９を含有する）ため、何個のシステインがＰＬＡ２活性を遊離するために酸化されなければならいかは現在不明である。しかしながら、１００ｎＭ  Ｈ２Ｏ２処理後のビリオンの定量的システイン標識は、キャプシド中でスルホン酸を形成するシステインの数が極めて少ないかも知れない（＜５％、データは示されない）ことを示唆する。ウイルスキャプシドに対するレドックス依存性の構造変化のさらなる解明は、遺伝子治療のためのパルボウイルスの改良につながりうる。さらに、これらの研究をＢ１９のようなＰＬＡ２モチーフをまた含有する病原性パルボウイルスに拡大することは、抗ウイルス薬としての抗酸化薬剤の開発においてもまた補助しうる。
【０２７５】
要約
ウイルスは、細胞の自然免疫機構を不活性すること、若しくはこうした機構をウイルスの生存の利益に適合させることのいずれかにより、宿主細胞を効果的に感染させるように進化した。食細胞のＮＡＤＰＨオキシダーゼ（Ｎｏｘ２ｇｐ９１ｐｈｏｘ）由来の活性酸素種（ＲＯＳ）は、典型的には病原体破壊との関連する自然免疫応答の一例である。本明細書に記述されるとおり、ＡＡＶ２への感染はＮｏｘ２依存性のエンドソームのＲＯＳ産生を刺激し、そして結果として生じるＨ２Ｏ２をビリオンの増殖性エンドソームプロセシングを助長するために利用した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析は、ｎＭ量のＨ２Ｏ２が、パルボウイルス感染に決定的に重要であることが示されたホスホリパーゼＡ２モチーフの活性化につながるビリオン内のＶＰ１のＮ末端キャプシドタンパク質の露出を促進したことを示した。それらの知見は、ウイルスがエンドソーム中でそのキャプシドを増殖性にプロセシングするのに宿主経路を利用し得る新たな機構を示し、そしてウイルス−宿主感染への洞察を提供する。
【０２７６】
ウイルスと細胞のレドックス均衡の間の相互作用でのさらなる解明は、多様なウイルスの生活環の理解を改良するが、しかしまた、病原性ウイルスの複製を阻害する、若しくは遺伝子治療のアプローチで使用される組換えウイルスでの形質導入を促進する薬物標的を同定することも助ける。
【実施例２】
【０２７７】
方法
細胞内分画
浮遊密度遠心分離を、細胞内分画およびＮｏｘ２活性を含有するエンドソームの単離に使用した。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、そして同一緩衝液を使用して１．５ｍＬ微小遠心管に廃棄した（ｓｃｒａｐｐｅｄ）。細胞をペレットにし、そして０．２５Ｍショ糖、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、およびＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害薬剤カクテルを含有する均質化緩衝液（ＨＭＢ）に再懸濁した。細胞を、細胞破壊高圧チャンバー（Ｐａｒｒ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、イリノイ州モリーン）中で窒素キャビテーションを使用して均質化した。圧を５分間６５０−ｐｓｉに上昇させ、そして突然遊離した。ホモジェネートを３０００×ｇで１５分間遠心分離して、未破壊細胞、核および重ミトコンドリア（ｈｅａｖｙ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）をペレットにした。重ミトコンドリア上清（ＨＭＳ）を、改変を伴う以前に記述された方法（Ｇｒａｈ
ａｍら、１９９４；Ｘｉａら、１９９８）を使用して、１２．５ｍＬ  ＳＷ４１Ｔｉ超遠心管中のイオジキサノール不連続勾配中に底部負荷した。
【０２７８】
該不連続勾配は、ＥＤＴＡを含まない１．２５ｍＬ  ＨＭＢ、次いで１．０ｍＬの２．５％、１．０ｍＬの５％、１．５ｍＬの９％、１．５ｍＬの１４％、２．５ｍＬの１９％、１．５ｍＬの２６％、および最後に２ｍＬ  ３２％中のＨＭＳを連続的に伴うイオジキサノール段階％の底部負荷から構成された。イオジキサノール濃度は、ＥＤＴＡを含まないＨＭＢで希釈した５０％イオジキサノール作業溶液（ＷＳ）を使用して新たに調製した。ＷＳは、０．２５Ｍショ糖および１２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４を含有する１部分の緩衝液を５部分のイオジキサノール６０％ストック溶液に添加することにより調製した。該勾配を、ＳＷ４１Ｔｉスイングローターを使用し１００，０００×ｇで４℃で一夜遠心分離した。画分は、フラクションコレクター（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、ミズーリ州カンサスシティ）を使用し、氷上で５００μＬ画分で管の上部から収集した。密度勾配は、以前の研究（Ｂｉｌｌｉｎｇｔｏｎら、１９９８；Ｇｒａｈａｍら、１９９４；Ｇｒａｈａｍら、２００２；Ｇｒａｈａｍら、１９９６；Ｐｌｏｎｎｅら、１９９９）に基づき、以下の区画、すなわち画分＃１〜５  原形質膜（密度１．０３〜１．０５ｇ／ｍＬ）；画分＃７〜１３  エンドソーム区画（密度１．０５５〜１．１１ｇ／ｍＬ）；画分＃８〜１０  ゴルジ装置（密度１．０６〜１．０９ｇ／ｍＬ）；画分＃１０〜１３  軽小胞体（ｌｉｇｈｔ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）（密度１．０９〜１．１１ｇ／ｍＬ）；画分＃１３〜１８  リソソーム（密度１．１１〜１．１３ｇ／ｍＬ）；画分＃１８〜２１  軽ミトコンドリア（密度１．１３〜１．１５ｇ／ｍＬ）；画分＃１９〜２０  重小胞体（密度１．１４５ｇ／ｍＬ）；画分＃２１〜２４  ペルオキシソーム（密度１．１８〜１．２ｇ／ｍＬ）；および画分＃２２〜２４  サイトゾルタンパク質（密度１．２６ｇ／ｍＬ）を至適に分離するよう設計した。
【０２７９】
Ｒａｃ１レドックス活性エンドソームの小胞免疫単離
ＨＡ標識Ｒａｃ１エンドソームの親和性単離を、Ｒａｂ５エンドソームの免疫吸収（ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）について以前に記述された（Ｌｉら、２００５；Ｔｒｉｓｃｈｌｅｒら、１９９９）方法を使用して実施した。細胞を、１ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１β処理４８時間前に、ＨＡ標識Ｒａｃ１を発現する組換えアデノウイルス（Ａｄ．ＨＡ−Ｒａｃ１）に感染させた。細胞内小胞のイオジキサノール単離後に、合わせたピーク小胞画分の一方の半分をスーパーオキシド産生の生化学的分析に直接使用し、また、他方の半分は、抗ＨＡ抗体で被覆したＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−５００（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用する免疫親和性単離に使用した。使用前に、ビーズは後に続くとおり抗体で被覆した。すなわち、二次抗体（抗ラット）を、０．１Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）中でＤｙｎａｂｅａｄｓ（４×１０８ビーズ／ｍＬ）に２５℃でゆっくり揺らしながら２４時間複合させた。ビーズをその後磁石に３分間入れ、そして０．１％（ｗ／ｗ）ＢＳＡ／ＰＢＳ中４℃で５分間洗浄した。０．２Ｍトリス（ｐＨ８．５）／ＢＳＡでの最終洗浄を２４時間実施した。最後にビーズをＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁し、そして１０７ビーズあたり４μｇの一次抗ＨＡ抗体に４℃で一夜複合させ、そしてその後ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した。小胞画分を、２ｍＭＥＤＴＡ、５％ＢＳＡおよびプロテアーゼ阻害時を含有するＰＢＳ中で７００μＬの被覆ビーズと混合した。該混合物をゆっくり揺らしながら４℃で６時間インキュベートし、次いで磁性捕捉しかつ同一チューブ中で３回（各１５分）洗浄した。ＨＡ濃縮したエンドソームを伴うビーズをその後ＰＢＳに再懸濁した。結合したペレット（Ｐ）および洗浄上清（Ｓ）をその後、ＮＡＤＰＨ依存性のスーパーオキシド産生、ならびにウエスタンブロッティングによるＨＡ−Ｒａｃ１、ｐ６７ｐｈｏｘ、ＳＯＤ１、ＩＬ−１Ｒ１、ＴＲＡＦ６、ＴＮＦＲ１、ＴＲＡＦ２およびＲａｂ５の会合について評価した。
【０２８０】
結果
粗小胞画分へのＨＡ−Ｒａｃ１取り込みはＩＬ−１β刺激により有意に高められた（図１１、レーン４）。Ｒａｃ１は未刺激小胞中で低レベルでのみ見出された（レーン１）。これらの知見は、Ｒａｃ１（Ｎｏｘ２の不可欠の活性化因子）がＩＬ−１β刺激後にエンドソーム区画に特異的に補充されるという考えを裏付ける。ＨＡ−Ｒａｃ１結合したエンドソームの免疫親和性単離は、該精製手順がＨＡ免疫反応性エンドソームのおよそ７５％を単離することが可能であったことを示した（レーン５対レーン６）。これは、この細胞株からのＨＡ−Ｒａｂ５単離について以前報告されたもの（Ｌｉら、２００５）と類似の効率であった。予期されたとおり、抗ＨＡに結合したペレット中のＨＡ−Ｒａｃ１についてのこの画分の濃縮は、ＮＡＤＰＨ依存性の・Ｏ２−を産生するその能力で見られた濃縮に酷似した。同様に、ＳＯＤ１、ｐ６７ｐｈｏｘ（Ｎｏｘ２活性化因子サブユニット）、ＩＬ−１Ｒ１およびＩＬ−１Ｒ１特異的エフェクターＴＲＡＦ６は全部、一般的エンドソームマーカー（Ｒａｂ５）に関してＨＡ−Ｒａｃ１エンドソームで濃縮された。ＩＬ−１β刺激の非存在下で、ＳＯＤ１およびｐ６７ｐｈｏｘはエンドソーム膜に補充することに失敗し、そしてエンドソーム区画中の低レベルのみのＩＬ−１Ｒ１／ＴＲＡＦ６が見られた（レーン１）。シグナル特異性の陰性対照として、ＴＮＦＲ１およびその特異的エフェクターＴＲＡＦ２もまた評価した。ＴＮＦＲ１／ＴＲＡＦ２は、ＩＬ−１βで活性化したＲａｃ１含有エンドソームに補充されなかった（レーン５）。これらの知見は、リガンドで活性化されたＩＬ−１Ｒ１／ＴＲＡＦ６複合体およびＲａｃ１を含有するレドックス活性のエンドソーム中のＳＯＤ１の濃縮についての直接の証拠を提供する。
【０２８１】
従って、ウイルス感染後のＨＡ標識Ｒａｃ１エンドソームの親和性単離は、ＡＡＶ若しくは他のパルボウイルス受容体の侵入経路にとって重要な新たな受容体を同定するのに有用であることができ、そしてＮｏｘ活性のエンドソームにより動くいかなる型のウイルスにも応用可能である。
【０２８２】
【表１】
2009535034.tif 000012
【０２８３】
【表２】
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【０２８４】
【表３】
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【０２８５】
【表４】
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【０２８６】
【表５】
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【０２８７】
全部の刊行物、特許および特許出願は引用することにより本明細書に組込まれる。前述の明細において、本発明はそのある好ましい態様に関して記述され、そして多くの詳細が具体的な説明の目的上示された一方、本発明は付加的な態様を許すことができること、および本明細書の詳細のあるものが本発明の基本原理から離れることなくかなり変動されうることが、当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２８８】
【図１】カタラーゼ負荷はＡＡＶ２取り込みに影響を及ぼさない。Ａ）ＨｅＬａ細胞を、１ｍｇ／ｍＬウシカタラーゼを含有する培地で小胞単離前に２０分間処理した。小胞画分をその後、ＰＢＳ（レーン１）、プロナーゼ（レーン２）若しくはプロナーゼおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（レーン３）と３７℃で３０分間インキュベートした。サンプルをその後ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そして抗カタラーゼ抗体を用いるウエスタンブロットによりアッセイした。Ｂ）ＨｅＬａ細胞を、１ｍｇ／ｍＬカタラーゼの非存在若しくは存在下にＡＶ２Ｌｕｃ（５×１０３粒子／細胞）と４℃で１時間プレインキュベートした。洗浄後、対照培地若しくは１ｍｇ／ｍＬカタラーゼを含有する培地中で指定された時間３７℃で感染を追跡した。細胞をその後均質化し、そしてＰＮＳ中のウイルスゲノムをＴａｑｍａｎ  ＰＣＲを使用して定量した。
【図２】ＡＡＶ２形質導入はエンドソームのＨ２Ｏ２に依存し、また、ウイルス感染がエンドソーム区画中のＮＡＤＰＨ依存性のスーパーオキシド産生を刺激する。Ａ）ＨｅＬａ若しくはＩＢ３細胞を、プロテアソーム阻害薬剤（４０μＭ  ＬＬｎＬおよび５μＭドキソルビシン）の非存在若しくは存在下でのＡＶ２Ｌｕｃ（１０３粒子／細胞）への感染２０分前に、１ｍｇ／ｍＬカタラーゼを伴い若しくは伴わずに前処理した。Ｂ）ＨｅＬａ細胞を、ウイルスの除去、３７℃に細胞を移動すること、および感染後多様な時点でカタラーゼ含有培地（１ｍｇ／ｍＬ）を用いて追跡することの前に、ＡＶ２Ｌｕｃ（５×１０３粒子／細胞）と４℃で１時間プレインキュベートした。Ｃ）およびＤ）ＨｅＬａおよびＩＢ３細胞を、対照培地、ビオチン−トランスフェリン（１０μｇ／ｍｌ）若しくはＡＶ２Ｌｕｃ（１０３粒子／細胞）を含有する培地で２０分間処理した。細胞をその後均質化し、そしてエンドソーム分画のためのイオジキサノール勾配にＰＮＳを負荷した。各画分のＮｏｘ活性をその後測定した。Ｃ）の下のウエスタンブロットは対応する画分のＲａｂ５（初期エンドソームマーカー）分布を描く。Ｅ）ＨｅＬａ細胞を、ＡＶ２Ｌｕｃ（１０３粒子／細胞）の感染前に、ＳＯＤ（１ｍｇ／ｍＬ）、カタラーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）ならびに／若しくはプロテアソーム阻害薬剤（ＰＩ）［４０μＭ  ＬＬｎＬおよび５μＭドキソルビシン］の組合せで処理された。Ａ）およびＥ）で、カタラーゼおよび／若しくはＳＯＤはＡＡＶ２感染の間継続的に存在した。相対ルシフェラーゼ活性を各群についてウイルス感染２４時間後に測定した。値は平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝４）を表す。有意差は印を付けた比較についてＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して解析した。
【図３】ＡＡＶ２はＲａｃ１陽性エンドソームと共局在化する。ＨｅＬａ細胞を、（Ａ）ＡＡＶ２感染なし、若しくは（Ｂ−Ｄ）４℃で１時間の１０４粒子／細胞のＡｌｅｘａ５４６標識ＡＡＶ２の結合前に、ｐＥＧＦＰ−Ｒａｃ１で２４時間トランスフェクトした。ウイルスをその後洗浄することにより除去し、そして、細胞を、固定および共焦点顕微鏡検査による分析前に（Ｂ）２分、（Ｃ）１０分若しくは（Ｄ）３０分間３７℃に移動した。核をＤＡＰＩで染色した。ｂ１およびｄ１は図ＢおよびＤ中の囲み領域の拡大図である。カラー画像の右の白黒図は対応する緑色（ＥＧＦＰ−Ｒａｃ１）若しくは赤色（Ａｌｅｘａ５４６標識ＡＡＶ２）の単一チャンネル画像である。矢印は共局在化したＲａｃ１およびＡＡＶ２を含むいくつかのエンドソームを描く。（Ｅ）感染後多様な時点でのＨｅＬａ細胞中のＡＡＶ２−Ｒａｃ１共局在化の程度を、ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪ方法に記述されるところのＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪを使用して決定した。値は平均＋／−ｓ．ｅ．ｍ．（各時点でｎ＝１０細胞）を表す。
【図４】Ｎｏｘ２はＡＡＶ２感染により誘導されるエンドソームＲＯＳの主供給源であり、そして効率的形質導入に必要とされる。ａ、Ｎｏｘ１およびＮｏｘ２野生型（ＷＴ）およびノックアウト（ＫＯ）ＰＭＤＦを、示されるとおり培地に添加したカタラーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）ならびに／若しくはプロテアソーム阻害薬剤（ＰＩ）［４０μＭ  ＬＬｎＬおよび５μＭドキソルビシン］の存在若しくは存在下で１０３粒子／細胞のＭＯＩのＡＶ２Ｌｕｃに感染させた。感染後２４時間に相対ルシフェラーゼ活性を測定した。値は平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝４）を表す。ｂ、Ｎｏｘ２  ＫＯおよびＷＴのＰＭＤＦ中のウイルスゲノムの取り込みを、５×１０３粒子／細胞の４℃１時間の結合、細胞の洗浄、およびその後３７℃での指定された追跡期間後に評価した。追跡期間の終了時に細胞を収集し、そしてＰＮＳ中のウイルスゲノムをＴａｑｍａｎ  ＰＣＲを使用して定量した。ｃ、ＡＶ２Ｌｕｃに感染させたＮｏｘ２  ＷＴおよびＫＯのＰＭＤＦのエンドソーム画分中のＮＡＤＰＨ依存性のスーパーオキシド産生。小胞画分を１０３粒子／細胞への感染後２０分に単離した。ｄ、エンドソーム画分（画分２〜４）中の総Ｎｏｘ活性をプロットし、値は平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）を表す。ｅ、鼻吸引を使用する５μＭ  Ｄｏｘｉｌ（４０μｌ容量）中の１×１０１１粒子のＡＶ２ＬｕｃへのＮｏｘ２  ＫＯおよびＷＴマウス肺のｉｎ  ｖｉｖｏ感染。感染後２週に肺ホモジェネート中の相対ルシフェラーゼ活性をアッセイした。値は平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝各時点について独立の４動物）を表す。ｆ、ＨｅＬａ細胞を、示されるところの培地中でＤＰＩ（１０μＭ）および／若しくはプロテアソーム阻害薬剤（ＰＩ）の存在若しくは存在下で１０３粒子／細胞のＭＯＩのＡＶ２Ｌｕｃに感染させた。感染１６時間後の相対ルシフェラーゼ活性を測定した。値は平均＋／−ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）を表す。ｇ．ＨｅＬａ細胞を、示されるところの対照培地（ベヒクル）またはアンチマイシンＡ（ミトコンドリア複合体ＩＩＩの阻害薬剤、１０μＭ）、ＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニン酢酸塩（Ｌ−ＮＭＭＡ、ＮＯ合成酵素の阻害薬剤、５ｍＭ）若しくはロテノン（ミトコンドリア複合体Ｉの阻害薬剤、２ｎＭ）を含有する培地中で１０３粒子／細胞のＭＯＩのＡＶ２Ｌｕｃに感染させた。感染１６時間後に相対ルシフェラーゼ活性を測定した。値は平均＋／−ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）を表す。有意差は、印を付けた比較についてＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して解析した（†、★、ｐ＜０．００１；全部の他の比較についてｐ値を示す）。
【図４】Ｈ２Ｏ２は、キャプシド中の単一システイン残基のスルホン酸修飾により付随されるＡＡＶ２キャプシドのコンホメーション変化を誘導する。ＡＡＶ２の１０１０精製ビリオンを、３７℃で一夜トリプシン消化、ＤＴＴ処理、およびヨードアセトアミド標識、ならびにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析前に、（Ａ、Ｄ）対照緩衝液で処理、（Ｂ、Ｅ）７０℃で５分間熱変性、（Ｃ、Ｆ）１００ｎＭ若しくは（Ｇ）１，０００ｎＭ  Ｈ２Ｏ２で１５分間処理した。Ａ−Ｃ）示された処理後のトリプシンキャプシドペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（ｍ／ｚ範囲１，０００〜４，０００）。Ｄ−Ｇ）トリプシンペプチドＦＨＣＨＦＳＰＲ（ＶＰ１配列に関してＣ２８９）に位置するＡＡＶ２  ｃａｐＯＲＦの第二のシステイン（Ｈの緑色の菱形として印を付ける）の拡大ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル。システイン残基に多様な修飾をもつこのペプチドの検出されたｍ／ｚ値をピークの上に表示する。理論的ｍ／ｚ値は、修飾なしで１０３０．４７、ヨードアセトアミド修飾を伴い１０８７．４９、およびスルホン酸修飾を伴い１０７８．４７である。Ｈ）Ｈ２Ｏ２処理により露出されたＡＡＶ２キャプシドの特定領域を、Ｃａｐ  ＯＲＦの図解中で異なる色（青色、緑色および桃色）で強調する。矢印はＶＰ１、２および３の開始コドンを示し；褐色の三角形：提案された高い表面接近可能性をもつアミノ酸残基２２；橙色の菱形：システイン残基の場所。Ｉ）示された濃度のＨ２Ｏ２で１５分間処理したＡＡＶ２ビリオン（レーン１〜６）を、薄層クロマトグラフィーを使用してＰＬＡ２活性についてアッセイした。対照は、熱処理ビリオン（レーン７）、ハチ毒ＰＬＡ２（レーン８）、無傷の未処理ＡＡＶ２ビリオン（レーン９）、緩衝液対照（レーン１０）を包含した。矢印はＰＬＡ２切断の反応生成物を示し（左）、また、Ｃ１４標識（*）ホスファチジルコリン前駆体および切断の生成物の図解構造を右に示す。
【図５】Ｒａｃ１、Ｎｏｘ２、ＡＡＶゲノムおよび外因性に負荷されたカタラーゼは全部、ＡＡＶ２感染後にエンドソーム区画に分画する。ＨｅＬａ細胞を、対照培地（ウイルス若しくはカタラーゼなし）（左図）、ＡＶ２Ｌｕｃ（１０３粒子／細胞）を含有する培地（中図）またはＡＶ２Ｌｕｃ（１０３粒子／細胞）およびカタラーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）を含有する培地（右図）で２０分間処理した。細胞をその後均質化し、そしてＰＮＳをエンドソーム分画のためイオジキサノール勾配に負荷した。各画分中のＮｏｘ活性をその後、方法の節に記述されるところのＮＡＤＰＨ依存性のルシゲニンに基づくアッセイを使用して測定した。各画分中のウイルスの量もまた、方法の節に記述されるところのＴａｑＭａｎ  ＰＣＲを使用するベクターゲノムの定量により測定した。各図の下のウエスタンブロットは、各対応する画分中のカタラーゼ、Ｒａｃ１およびＮｏｘ２の分布を描く。小胞画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン分析前に１００，０００×ｇで１時間の高速遠心分離により濃縮した。
【図６】Ｈ２Ｏ２は、ＡＡＶ２キャプシドのコンホメーション変化およびキャプシド中の単一システイン残基のスルホン酸修飾を誘導する。ＡＡＶ２の１０１０精製ビリオンを、３７℃での一夜トリプシン消化、ＤＴＴ処理およびヨードアセトアミド標識、ならびにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析前に、（Ａ、Ｄ）対照緩衝液で処理、（Ｂ、Ｅ）７０℃で５分間熱変性、（Ｃ、Ｆ）１００ｎＭ若しくは（Ｇ）１，０００ｎＭ  Ｈ２Ｏ２で１５分間処理した。Ａ−Ｃ）示された処理後のトリプシンキャプシドペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（ｍ／ｚ範囲１，０００〜４，０００）。Ｄ−Ｇ）トリプシンペプチドＦＨＣＨＦＳＰＲ（ＶＰ１配列に関してＣ２８９）に位置するＡＡＶ２  ｃａｐ  ＯＲＦの第二のシステイン（Ｈの緑色の菱形として印を付ける）の拡大ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル。システイン残基に多様な修飾をもつこのペプチドの検出されたｍ／ｚ値をピークの上に表示する。理論的ｍ／ｚ値は、修飾なしで１０３０．４７、ヨードアセトアミド修飾を伴い１０８７．４９、およびスルホン酸修飾を伴い１０７８．４７である。Ｈ、Ｈ２Ｏ２処理により露出されたＡＡＶ２キャプシドの特定領域を、ｃａｐ  ＯＲＦの図解中で異なる色（青色、緑色および桃色）で強調する。矢印はＶＰ１、２および３の開始コドンを示し；褐色の三角形：提案された高い表面接近可能性をもつアミノ酸残基（Ｘｉｅら、２００２）；橙色の菱形：システイン残基の場所。Ｉ）示された濃度のＨ２Ｏ２で１５分間処理したＡＡＶ２ビリオン（レーン１〜６）をＰＬＡ２活性についてアッセイした。対照は、熱処理ビリオン（レーン７）、ハチ毒ＰＬＡ２（レーン８）、無傷の未処理ＡＡＶ２ビリオン（レーン９）および緩衝液対照（レーン１０）を包含した。矢印はＰＬＡ２切断の反応生成物を示し（左）、また、Ｃ１４標識（*）ホスファチジルコリン前駆体および切断の生成物の図解構造を右に示す。
【図７】Ｈ２Ｏ２処理により遊離されたＡＡＶキャプシドタンパク質のトリプシンペプチドの質量。トリプシン消化およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ後に、Ｈ２Ｏ２処理ビリオン（図６Ｃ）中の（しかし無傷のビリオン（図６Ａ）中でない）ＭＳにより可視化されたペプチド質量を要約する。パラメータは、それらのｍ／ｚ値、正確なアミノ酸配列、およびＶＰ１から開始するｃａｐ  ＯＲＦ上の残基の位置推定を包含する。これらのペプチドの相対位置を、対応する色を用いてｃａｐ  ＯＲＦの図解（上）にプロットする。矢印はＶＰ１、２および３の開始コドンを示し；褐色の三角形：提案された高い表面接近可能性をもつアミノ酸残基；橙色の菱形：システイン残基の場所。
【図８】Ｈ２Ｏ２はＡＡＶ２キャプシド中のＣ４８２の露出を誘導するがしかし酸化的修飾は誘導しない。ＡＡＶ２の１０１０精製ビリオンを、ＤＴＴの存在下３７℃での一夜トリプシン消化、ヨードアセトアミド標識、およびその後ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析前に、（Ａ）対照緩衝液で処理、（Ｂ）７０℃で５分間熱変性、（Ｃ）１００ｎＭ  Ｈ２Ｏ２で１５分間若しくは（Ｄ）１，０００ｎＭ  Ｈ２Ｏ２で１５分間処理した。ＡＡＶ２  ｃａｐＯＲＦ中の５番目のシステイン（図６Ｈ中の最後の橙色の菱形）のＭＳスペクトルを描く。このシステインはトリプシンペプチドＮＷＬＰＧＰＣＹＲ（ＶＰ１配列に関しＣ４８２）に位置する。このペプチドの対応するシグナルは、システインＣ４８２（矢印により印を付ける）でのヨードアセトアミド修飾の期待されるｍ／ｚ（１０６２．５５）に一致した。このペプチド中の未修飾（１１０５．５２、印を付けない）およびスルホン酸修飾（１１５３．５０、矢印により印を付ける）システインＣ４８２の期待されるｍ／ｚは観察されなかった。
【図９】Ｈ２Ｏ２処理後のＡＡＶ２キャプシド中のシステイン残基の状態。個々のシステイン残基を含有する対応するＡＡＶ２トリプシンペプチドの特徴を要約する。パラメータは、ＶＰ１、２および３からの参照としてのｃａｐ  ＯＲＦ上のそれらのアミノ酸位置、期待されるｍ／ｚ値、ならびにそれらの検出されたｍ／ｚ値を包含する。条件は、無傷（Ｃｔｒｌ）、熱変性（ＨＤ）若しくは１００ｎＭ  Ｈ２Ｏ２処理ビリオンを包含する。Ｎ／Ｄ−検出されない。
【図１０】Ｈ２Ｏ２媒介性のキャプシドＰＬＡ２活性化はＡＡＶ２のエンドソームエスケープに不可欠である。Ａ）上図：エンドソームの内側のビリオンから細胞質中の遊離ビリオンを分離するためのアプローチ。下図：ＨｅＬａ細胞（２×１０７）をＡＶ２Ｌｕｃ（１０３ＭＯＩ）と４℃で１時間プレインキュベートし、次いで３７℃で１時間感染を追跡した。細胞をその後均質化し、そして５００μｌのＰＮＳを収集した。ＰＢＳと混合した遊離ＡＡＶ２ビリオン、未感染細胞からのＰＮＳと混合した遊離ＡＡＶ２ビリオン、ＡＡＶ２に感染させた細胞からのＰＮＳ、若しくは０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とインキュベートしたＡＡＶ２に感染させたＰＮＳを、２５０μＬの３０％イオジキサノールの上に負荷し、次いで１００，０００×ｇで１時間遠心分離した。上清およびペレット内のウイルスゲノムをリアルタイムＰＣＲにより定量し、そして全ゲノムのそれらの対応するパーセントをプロットする。値は平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝４）を表す。Ｂ）ＨｅＬａ細胞（２×１０７）をＡＶ２Ｌｕｃ（１０３ＭＯＩ）と４℃で１時間プレインキュベートし、次いで３７℃で指定された時間、感染を追跡した。ウイルスのエスケープをその後分析した（各時点でｎ＝５；†ｐ＜０．００１、*ｐ＜０．００５）。Ｃ）野生型キャプシド若しくはＣ２８９Ｓキャプシド中にキャプシド形成されたＡＶ２Ｌｕｃ（１０３粒子／細胞）を使用して、１ｍｇ／ｍＬカタラーゼの非存在または存在下でＨｅＬａ細胞を感染させた。相対ルシフェラーゼ活性（左図）およびウイルスのエンドソームエスケープ（右図）を各群につきそれぞれウイルス感染後２４時間および１時間に測定した。値は平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝５）を表し、†*ｐ＜０．００１。有意差は、印を付けた比較についてＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して解析した。Ｄ）野生型（Ｗ）若しくはＣ２８９Ｓ（Ｍ）キャプシドにキャプシド形成されたＡＡＶ２ビリオンを、示される濃度のＨ２Ｏ２で１５分間処理し（レーン７〜１６）、そして薄層クロマトグラフィーを使用してＰＬＡ２活性についてアッセイした。対照は、ハチ毒ＰＬＡ２（レーン１）、緩衝液対照（レーン２）、無傷の未処理ＡＡＶ２ビリオン（レーン３および４）、熱処理ビリオン（レーン５および６）を包含した。矢印はＰＬＡ２切断の反応生成物を示す。下図は、ホスホイメジャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）を使用する各レーンの基質切断％の定量化を示す。結果は３回の独立した実験を代表する。
【図１１】Ｒａｃ１を含有するレドックス活性エンドソームの単離。ＭＣＦ−７乳腺上皮細胞を、５００粒子／細胞の感染多重度のＨＡ標識ｗｔＲａｃ１を発現する組換えアデノウイルスに感染させた。このレベルの感染は、以前に報告された（Ｌｉら、２００５）とおり、導入遺伝子を発現するおよそ８５％の細胞を生じさせた。アデノウイルス感染４８時間後に細胞をＩＬ−１β（１ｎｇ／ｍＬ）で２０分間刺激し、そして小胞画分を以前に記述された（Ｌｉら、２００５）とおり単離した。合わせた粗小胞ピーク＃２〜４画分の半分を、ＨＡ−Ｒａｂ５エンドソームの単離のため開発された手順（Ｌｉら、２００５）を使用する抗ＨＡ結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓを使用するＨＡ−Ｒａｃ１会合エンドソームの免疫親和性単離に使用した。粗小胞サンプル（Ｖ）、免疫単離したペレット（Ｐ）および上清（Ｓ）を、示されるタンパク質のＮＡＤＰＨ依存性・Ｏ２−産生およびウエスタンブロッティングについて評価した。・Ｏ２−産生の値は各サンプル（Ｖ、Ｐ若しくはＳ）中の総活性を示す。各サンプル（Ｖ、Ｐ若しくはＳ）の等しい割合を各ウエスタンブロットレーンに負荷した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｂ１】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｄ１】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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