(57)【要約】  本発明は、腎毒性薬物によって引き起こされる腎障害を低減するための組成物及び方法を提供する。本発明は、陰イオン性に置換されたオリゴ糖、腎毒性薬物及び医薬として許容される担体を含む組成物を提供し、その場合、オリゴ糖は、該薬物の腎毒性効果を実質的に阻害するのに有効な量で存在する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
置換されたオリゴ糖、腎毒性薬物及び医薬として許容される担体を含む組成物であって、該オリゴ糖は、該薬剤の腎毒性効果を実質的に阻害するのに有効な量で存在する前記組成物。
【請求項２】
前記オリゴ糖が、１以上の荷電した部分で置換されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記部分が、ヒドロキシル、スルホネート、サルフェート、カルボキシレート、ホスホネート及びホスフェートからなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記オリゴ糖が、式：
オリゴ糖−［（Ｏ−Ｒ−Ｙ）-（Ｍｅ）+］n
（式中、
Ｒは、直鎖状若しくは分岐状のＣ1-10アルキル、アルケニル又はアルキニル；Ｃ3-8シクロアルキル及びＣ3-8アリール、各環は、場合により、Ｓ、Ｎ及びＯから選択される１以上のヘテロ原子を含む、からなる群から選択され；及び、場合により、ハロ又はヒドロキシルで置換され；
Ｙは、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ4、ＳＯ3、ＰＯ3Ｈ及びＰＯ4からなる群から選択される酸性基であり；
Ｍｅは、医薬として許容される陽イオン又は陰イオンであり；及び
ｎは、１を超える自然数である）
で表される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記オリゴ糖が、シクロデキストリンである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
Ｒが、場合によりハロ又はヒドロキシルで置換されるＣ1-10アルキルである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記シクロデキストリンが、α、β又はγシクロデキストリンからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
薬剤：オリゴ糖のモル比が１：１を超える、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
薬剤：オリゴ糖のモル比が少なくとも約２：１である、請求項１の組成物。
【請求項１０】
前記薬剤が、正に荷電した医薬である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記薬剤が、アミノグリコシドである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
医薬として活性な化合物の腎毒性効果を低減させる方法であって、前記化合物を置換されたオリゴ糖及び医薬として許容される担体と組み合わせること、該オリゴ糖は、前記医薬として許容される活性な化合物の該腎毒性効果を実質的に減少させるのに有効な量で存在する；及び、得られた組成物を被験者に投与することを含む前記方法。
【請求項１３】
腎毒性誘導薬物と関連した腎毒性を阻害する方法であって、置換されたオリゴ糖を含む医薬組成物、及び腎毒性誘導薬物を含む医薬組成物を被験者に同時に投与することを含む前記方法。
【請求項１４】
前記薬物が、メトトレキセート又はその誘導体若しくは医薬として許容される塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記置換されたオリゴ糖が、式：
シクロデキストリン−［（Ｏ−Ｒ−Ｙ）-（Ｍｅ）+］n
（式中、
Ｒは、直鎖状若しくは分岐状のＣ1-10アルキル、アルケニル又はアルキニル；Ｃ3-8シクロアルキル及びＣ3-8アリール、各環は、場合により、Ｓ、Ｎ及びＯから選択される１以上のヘテロ原子を含む、からなる群から選択され；及び、場合により、ハロ又はヒドロキシルで置換され；
Ｙは、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ4、ＳＯ3、ＰＯ3Ｈ及びＰＯ4からなる群から選択される酸性基であり；
Ｍｅは、医薬として許容される陽イオン又は陰イオンであり；及び
ｎは、１を超える自然数である）
で表される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記シクロデキストリンが、β−シクロデキストリンであり；（Ｏ−Ｒ−Ｙ）-（Ｍｅ）+が、−Ｏ−（ＣＨ2）4−ＳＯ3-Ｎａ+であり、及びｎが、約７である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
多発性硬化症と関連した症状を治療する方法であって、それを必要とする患者に治療的に有効量の請求項１５に記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項１８】
宿主における癌を治療する方法であって、それを必要とする宿主に治療的に有効量の請求項１５に記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項１９】
宿主における癌の成長を阻害する方法であって、それを必要とする宿主に治療的に有効量の請求項１５に記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項２０】
宿主における自己免疫障害を治療する方法であって、それを必要とする宿主に治療的に有効量の請求項１５に記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項２１】
前記薬物が、シスプラチン又は医薬として許容されるその塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記置換されたオリゴ糖が、式：
シクロデキストリン−［（Ｏ−Ｒ−Ｙ）-（Ｍｅ）+］n
（式中、
Ｒは、直鎖状若しくは分岐状のＣ1-10アルキル、アルケニル又はアルキニル；Ｃ3-8シクロアルキル及びＣ3-8アリール、各環は、場合により、Ｓ、Ｎ及びＯから選択される１以上のヘテロ原子を含む、からなる群から選択され；及び、場合により、ハロ又はヒドロキシルで置換され；
Ｙは、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ4、ＳＯ3、ＰＯ3Ｈ及びＰＯ4からなる群から選択される酸性基であり；
Ｍｅは、医薬として許容される陽イオン又は陰イオンであり；及び
ｎは、１を超える自然数である）
で表される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記シクロデキストリンが、β−シクロデキストリンであり；（Ｏ−Ｒ−Ｙ）-（Ｍｅ）+が、−Ｏ−（ＣＨ2）4−ＳＯ3-Ｎａ+であり、及びｎが、約７である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
宿主における癌を治療する方法であって、それを必要とする宿主に治療的に有効量の請求項２１に記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項２５】
宿主における癌の成長を阻害する方法であって、それを必要とする宿主に治療的に有効量の請求項２１に記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項２６】
前記薬物が、ドキソルビシン又は医薬として許容されるその塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記置換されたオリゴ糖が、式：
シクロデキストリン−［（Ｏ−Ｒ−Ｙ）-（Ｍｅ）+］n
（式中、
Ｒは、直鎖状若しくは分岐状のＣ1-10アルキル、アルケニル又はアルキニル；Ｃ3-8シクロアルキル及びＣ3-8アリール、各環は、場合により、Ｓ、Ｎ及びＯから選択される１以上のヘテロ原子を含む、からなる群から選択され；及び、場合により、ハロ又はヒドロキシルで置換され；
Ｙは、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ4、ＳＯ3、ＰＯ3Ｈ及びＰＯ4からなる群から選択される酸性基であり；
Ｍｅは、医薬として許容される陽イオン又は陰イオンであり；及び
ｎは、１を超える自然数である）
で表される、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記シクロデキストリンが、β−シクロデキストリンであり；（Ｏ−Ｒ−Ｙ）-（Ｍｅ）+が、−Ｏ−（ＣＨ2）4−ＳＯ3-Ｎａ+であり、及びｎが、約７である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
宿主における癌を治療する方法であって、それを必要とする宿主に治療的に有効量の請求項２６に記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項３０】
宿主における癌の成長を阻害する方法であって、それを必要とする宿主に治療的に有効量の請求項２６に記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
多数の薬物及び他の物質は、腎毒性であることが知られ、尿細管への直接的な毒性、アレルギー性間質性腎炎、及び尿細管内の薬物の結晶化を含む様々な機構を介した腎不全を引き起こし得て、急性乏尿性腎不全へと導き得る。腎毒性薬物には、抗癌剤、例えばシスプラチン、メトトレキセート、及びドキシルビシン、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ）、例えばＣＯＸ−２阻害剤、抗生物質（例えば、アミノグリコシド、アンフォテリシン）、抗ウイルス剤（例えば、アシクロビル、インディナビル）、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬（ＡＢＲ）、リチウム及びＸ線撮影造影剤が含まれる。
腎毒性薬物が原因となる腎障害を減少させる必要性がある。
【発明の開示】
【０００２】
発明の概要
本発明は、腎毒性薬物によって引き起こされる腎不全を低減させるための組成物及び方法を提供する。本発明は、アニオン性に置換されたオリゴ糖、腎毒性薬物及び医薬として許容される担体を含む組成物を提供し、このオリゴ糖は、該薬剤の腎毒性効果を実質的に阻害するのに有効な量で存在する。
【０００３】
腎毒性効果を有する医薬として活性な化合物、及びポリアニオン性のオリゴ糖を含む低減させた腎毒性効果を有する組成物も提供され、このオリゴ糖は、医薬として活性な化合物の腎毒性効果を実質的に減少させるのに有効な量で存在する。
【０００４】
本明細書には、医薬として活性な化合物とポリアニオン性のオリゴ糖とを接触させることを含む該化合物の腎毒性の効果を低減させる方法も開示される。さらに、腎毒性薬物と関連した腎毒性を阻害する方法が開示され、該方法は、環状多糖サルフェート、腎毒性誘導薬物、及び場合により医薬として許容される担体を含む医薬組成物を投与することを含む。
【０００５】
発明の詳細な説明
本発明の組成物は、典型的には、アニオン性に置換されたオリゴ糖、腎毒性薬物及び典型的には、当該技術分野において通常用いられている医薬として許容される担体又は他の賦形剤を含む。オリゴ糖は、薬物の腎毒性効果を実質的に阻害するのに有効な量で存在する。一態様では、オリゴ糖は、カチオン性物質又はアニオン性物質などの極性又は荷電した部分で置換されている。一態様では、アニオン性に置換されたオリゴ糖は、スルホネート、サルフェート、カルボキシレート、ホスホネート及びホスフェートから選択される１以上のアニオン性置換基を有するシクロデキストリンを含むポリアニオン性オリゴ糖である。別の態様では、オリゴ糖は、環状多糖サルフェート、好ましくはα、β又はγ−シクロデキストリンサルフェートである。
【０００６】
また、本発明は、腎毒性を誘導する効果を有する医薬として活性な化合物及びポリアニオン性オリゴ糖を含む低減した腎毒性効果を有する組成物を提供する。腎毒性とは、本明細書中で使用するとき、腎臓に対する毒性若しくは有害、又はその成分のいずれかを意味する。
【０００７】
置換されたオリゴ糖類
置換されたオリゴ糖類は、一般的に、一分子当たり少なくとも１つの置換基を有するオリゴ糖、好ましくは荷電した又は極性の置換基を指す。オリゴ糖類は、好ましくは、約５〜約１０個の糖単位の糖類であり、未置換の場合、約６５０〜約１３００の分子量を有する。オリゴ糖がアニオン性に置換される場合、一般的には、置換基は、スルホネート、サルフェート、カルボキシレート、ホスホネート及びホスフェート基、並びにそれらの組合せからなる群から選択されることが好ましい。置換基は、好ましくは、糖単位当たり、約０．５〜約３個の置換基の範囲で分子中に存在する。特に好ましい組成物は、糖単位当たり約１個のスルホネート置換基を有するオリゴ糖に基づいたものである。他の好ましい組成物は、糖単位当たり、約２〜約３個の置換基を有するオリゴ糖類に基づき、ここで、該置換基は、サルフェート、スルホネート及び／又はホスフェート置換基を含む。
【０００８】
オリゴ糖は、グルコース単位などのいくつかの糖単位の鎖であって、グリコシド酸素原子を介して連結されている。本明細書中で用いられるとき、接頭語「オリゴ」は、１個、又はスクロースではせいぜい２個の単糖単位、及び２０個以上の糖単位及び高分子量を有する多糖と比較して、中間数の糖又はサッカリド単位を示す。このような全てのオリゴ糖は、本発明の範囲内に操作可能であると考えられるが、そのオリゴ糖は、好ましくは、１分子当たり約５〜約１０個のサッカリドを有する。この範囲は、約６５０〜約１３００の範囲の分子量を有する未置換のサッカリドに対応する。１分子当たり約５〜約１０個のサッカリドを有するオリゴ糖は、本明細書中、「単一」又は「低分子量」のオリゴ糖を指す場合がある。オリゴ糖は、通常、スターチ又はセルロースの分解手段によって得られ、幅広い範囲のサイズであるオリゴ糖断片をもたらす。
【０００９】
幾分関連した材料のファミリーには、グリコサミノグリカン類がある。それらは、多糖骨格を有する構造であり、窒素、硫黄及び酸素原子を含み、グルコサミン、イズロネート、グルクロネートなどの種々のセグメントを含む様々な置換基によって修飾される。それらの構造は、コンドロイチン類、デルマタン類、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸類、及びヘパリン類などの同名称群の異なる試料間で変化し得る。各ファミリーは、異種、即ち、組成物の混合物であることが知られている。それらの分子量は、通常、１０，０００〜２５，０００の範囲である。
【００１０】
置換されたオリゴ糖、特に、極性又は荷電した置換基を有する単一及び低分子量のオリゴ糖は、ある種の分類の薬物の腎毒性効果から腎臓を保護する能力を有する。アニオン性に置換されたシクロデキストリン類は、少なくとも部分的には好ましく、それは、ＯＨなどの他の極性置換基が用いられてもよいが、このような化合物の生成の相対的な均一性及び容易性のためである。
【００１１】
アニオン性置換基は、例として、米国特許第３，４２６，０１１号に記載されているものが含まれる。オリゴ糖は、一般式：
オリゴ糖−［（Ｏ−Ｒ−Ｙ）-（Ｍｅ）+］n
であってもよく、式中、Ｒは、直鎖状若しくは分岐状のＣ1-10アルキル、アルケニル又はアルキニル；Ｃ3-8シクロアルキル及びＣ3-8アリール、各環は、場合により、Ｓ、Ｎ及びＯから選択される１以上のヘテロ原子を含む、からなる群から選択され；及び、場合により、ハロ（即ち、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）又はヒドロキシルで置換され；
Ｙは、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ3、ＳＯ4、ＰＯ3Ｈ若しくはＰＯ4などの酸性基、又は亜リン酸、亜ホスフィン酸、ホスホン酸、ホスフィン酸、チオホスホン酸、チオホスフィン酸及びスルホン酸であり；
【００１２】
Ｍｅは、医薬として許容される陽イオン又は陰イオンであり、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、若しくはアルミニウム、又は有機第一級、第二級、若しくは第三級アミン、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルフェネチルアミン、１−エフェナミン、及びＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ピペリジン、ピペラジンなどであり；及び
【００１３】
ｎは、オリゴ糖当たりの置換基の数であり、各々は独立して選択され、即ち、各置換基は同一であるか又は異なっていてもよい。「Ｎ」は、１を超える自然数であり、上限は、特定のオリゴ糖に依存している。一群のオリゴ糖では、ｎは、１分子当たりの置換基の平均数を表すことが理解される。
【００１４】
一態様によれば、Ｒは、Ｃ1-10アルキル、好ましくはメチル、エチル、プロピル及びブチルから選択されるＣ1-4アルキル、各々は、場合により、ハロ又はヒドロキシルで置換される。具体的には、１以上の基において、ＹがＳＯ3であるオリゴ糖が好ましい。得られる好ましい、ポリアニオン性の置換されたオリゴ糖は、約１６００〜約４０００の分子量を有する。
【００１５】
シクロデキストリン
好ましい態様では、オリゴ糖は、環状多糖、好ましくはシクロデキストリン、及びより好ましくは誘導されたシクロデキストリンである。
【００１６】
シクロデキストリン（「ＣＤ」又は「複数のＣＤ」とも呼ばれる）は、少なくとも６個のグルコピラノース単位からなる環状のオリゴ糖である。最大１２個のグルコピラノース単位を有するＣＤが知られているが、たった最初の３つのホモログが頻繁に試験され、α、β、及びγであって、それぞれ、６、７及び８個のグルコピラノース単位を有する。例えば、β−シクロデキストリン分子は、７個のα−１，４−連結したグルコピラノース単位からできていて、親水性の外部表面及び中心に脂溶性の空洞を有するコーン形状の分子を形成する。シクロデキストリンは、コーンの小端に位置される第一のヒドロキシ群、及びコーンに対して大開口に位置される第二のヒドロキシ群を有する円錐形状の分子として存在する。
【００１７】
【化１】
2009517402.tif 000002
【００１８】
立体形状的には、ＣＤは、円環面として表すことができ、上部縁は、第一の−ＣＨ2ＯＨ基で整列され、下部縁は、第二のヒドロキシル基で整列される。α、β、及びγ−ＣＤに関して、それぞれ約５、６又は７．５Ａ．Ｕ．径のチャネル様空洞は、同軸的に円環面で整列される。これらの空洞は、適切な径の疎水性のゲスト分子と包接化合物を形成し得るシクロデキストリンを作製する。
【００１９】
合理的に大多数のＣＤ誘導体が調製され、文献に記載されている。一般的に、これらの化学的に修飾されたＣＤは、α（１→４）ヘミアセタール連結を妨害することなしに、炭素２、３又は６に結合した第一又は第二のヒドロキシル基の反応によって形成される。このような概要の調製は、参照により本明細書中に援用される、Ｃｒｏｆｔら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９８３）３９（９）：１４１７−１４７４）に与えられている。グルコピラノース単位上のヒドロキシル基を介した置換は、α−ＣＤに対して最大１８個；β−ＣＤに対して最大２１個；及び、γ−ＣＤに対して２４個を含む。シクロデキストリンは、式：
シクロデキストリン−［（Ｏ−Ｒ−Ｙ）-（Ｍｅ）+］n
のデキストリンから選択されてもよく、式中、Ｒ、Ｙ、Ｍｅ及びｎは、上述される通りである。明らかなように、ｎは、α−ＣＤに関しては１〜１８であり；β−ＣＤに関しては１〜２１であり；及び、γ−ＣＤに対しては、１〜２４である。
【００２０】
好ましくは、シクロデキストリンは、ヒドロキシル、スルホネート、サルフェート、カルボキシレート、ホスホネート及びホスフェートからなる群から選択される１以上の置換基を有する。一態様によれば、Ｒは、直鎖状又は分岐状のＣ1-10アルキル、好ましくは、メチル、エチル、プロピル及びブチルから選択されるＣ1-4アルキルであり、各々は、場合によりハロ又はヒドロキシルで置換される。具体的には、１以上の基において、ＹがＳＯ3であるオリゴ糖が好ましい。
【００２１】
好ましいＣＤは、α、β、及びγ−シクロデキストリンのサルフェート誘導体又はスルホネート誘導体である。シクロアミロースサルフェート及びスルホネート、及び修飾されたシクロデキストリンサルフェート及びスルホネートの製造は、当該技術分野において説明されている。例えば、各々が、参照により本明細書中に援用される、米国特許第２，９２３，７０４号；第４，０２０，１６０号；第４，２４７，５３５号；第４，２５８，１８０号；第４，５９６，７９５号及び第４，７２７，０６４号を参照されたい。これらのシクロデキストリンサルフェート及びスルホネートは、典型的には、生理学的に許容されるカチオンと関連している。
【００２２】
別の態様によれば、ヒドロキシル基は、式−Ｏ−（Ｃ1−Ｃ8アルキル）−ＳＯ3のアルキルエーテルスルホネートで置換されている。一態様では、市販されているカプチゾール（Ｃａｐｔｉｓｏｌ）（登録商標）（Ｃｙｄｅｘ）を用いることができ、これは、シクロデキストリン１分子当たり平均して７個のスルホブチルエーテル基を有するβ−シクロデキストリンのスルホブチルエーテル誘導体である（即ち、Ｏ−Ｒ−Ｙは、−Ｏ−（ＣＨ2）4−ＳＯ3-Ｎａ+）。カプチゾールは、誘導化されていないβ−シクロデキストリンと関連した腎毒性を示さない。追加のシクロデキストリン誘導体は、各々が参照により本明細書中に援用される、米国特許第５，１３４，１２７号；第６，１６５，９９５号及び第６，０６０，５９７号に開示されている。
【００２３】
腎毒性薬物は、宿主に投与されると、腎障害を引き起こす小分子及びペプチドを含む任意の医薬品であってもよい。このような薬剤には、例として、ＮＳＡＩＤ、ＡＣＥ阻害剤、シクロスポリン、タクロリムス、放射線造影剤、インターロイキン−２、血管拡張剤（ヒドララジン、カルシウムチャネル遮断剤、ミノキシジル、ジアゾキシド）、マイトマイシンＣ、抱合卵胞ホルモン、キニーネ、５−フルオロウラシル、チクロピジン、クロピドグレル、インターフェロン、バラシクロビル、ゲムシタビン、ブレオマイシン、ヘパリン、ワルファリン、ストレプトキナーゼ、アミノグリオシド、シスプラチン、ネダプラチン、メトキシフルラン、テトラサイクリン、アムフォテリシンＢ、セファロリジン、ストレプトゾシン、タクロリムス、カルバマゼピン、ミトラマイシン、キノロン、フォスカネット、ペンタミジン、静脈ガンマグロブリン、フォスファミド、ゾレドネート、シドフォビル、アデフォビル、テノフォビル、マンニトール、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチ、ロバスタチン、エタノール、コデイン、バルビツール、ジアゼパム、キニーネ、キニジン、スルホンアミド、ヒドララジン、トリアムテレン、ニトロフラントイン、メフェニトイン、ペニシリン、メチシリン、アンピシリン、リファンピン、スルホンアミド、チアジド、シメチジン、フェニトイン、アロプリノール、セファロスポリン、シトシンアラビノシド、フロセミド、インターフェロン、シプロフロキサシン、クラリトロマイシン、テリトロマイシン、ロフェコキシブ、パントプラゾール、オメプラゾール、アタザナビル、金、ペニシルアミン、カプトプリル、リチウム、メフェナメート、フェノプロフェン、水銀、インターフェロン、パミドロネート、フェンクロフェナック、トルメチン、フォスカルネット、アシクロビル、メトトレキセート、スルファニルアミド、トリアムテレン、インジナビル、フォスカルネット、ガンシクロビル、メチセルギド、エルゴタミン、ジヒドロエルゴタミン、メチルドーパ、ピンドロール、ヒドララジン、アテノロール、タキソール、腫瘍壊死因子、クロラムブシル、インターロイキン、ブレオマイシン、エトポシド、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ドキソルビシン、シスプラチンなどが含まれる（概して、Ｄｅｖａｓｍｉｔａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ（２００６）２，８０−９１を参照されたい）。
【００２４】
メトトレキセート
一態様によれば、腎毒性薬物は、メトトレキセート、又はその誘導体若しくは医薬として許容される塩である。メトトレキセート（Ｎ−［４−［［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸）は、種々の新生物、具体的にはＣＮＳリンパ腫の治療に用いられるＳ期の化学療法的な代謝拮抗物質である。ＭＴＸは、最も広範囲に用いられている抗癌剤の１つであって、腫瘍性疾患、例えば、妊娠性絨毛癌、骨肉種、破壊性絨毛腺腫、胞状奇胎、急性リンパ性白血病、乳癌、頭部及び頸部の扁平上皮癌、進行性菌状息肉腫、肺癌、及び非ホジキンリンパ腫の治療に採用されている（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（４５版），Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，１１８５−８９（Ｄｅｓ  Ｍｏｉｎｅｓ，Ｉｏｗａ（１９９１）））。ＭＴＸはまた、効果的な免疫抑制剤であり、組織移植に起因し得る移植片対宿主反応の阻害、及び炎症疾患の管理において有用である。結論として、ＭＴＸは、重篤であり、身体に影響を及ぼす乾癬及び関節リウマチの治療に採用し得る（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９３）３０：６９−７３；Ｊａｆｆｅ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９８８）３１：２９９）。
【００２５】
しかしながら、メトトレキセートは、典型的には、最大有効性に必要とされる「高服用量処方計画」に適用される場合、腎臓毒性及び肝臓毒性と関連する（Ｂａｒａｋら，Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌ．Ｎｕｔｒ．（１９８４）３：９３−９６）。
【００２６】
多数の特許には、ＭＴＸ及びＭＴＸ類似体が開示され、それらのいずれかは、本発明を実施するために用いることができる。例えば、各々が、参照により本明細書中に援用される、米国特許第２，５１２，５７２号、第３，８９２，８０１号、第３，９８９，７０３号、第４，０５７，５４８号、第４，０６７，８６７号、第４，０７９，０５６号、第４，０８０，３２５号、第４，１３６，１０１号、第４，０９３，６０７号、第４，２７９，９９２号、第４，３７６，７６７号、第４，４０１，５９２号、第４，４８９，０６５号、第４，６２２，２１８号、第４，６２５，０１４号、第４，６３８，０４５号、第４，６７１，９５８号、第４，６９９，７８４号、第４，７８５，０８０号、第４，８１６，３９５号、第４，８８６，７８０号、第４，９１８，１６５号、第４，９２５，６６２号、第４，９３９，２４０号、第４，９８３，５８６号、第４，９９７，９１３号、第５，０２４，９９８号、第５，０２８，６９７号、第５，０３０，７１９号、第５，０５７，３１３号、第５，０５９，４１３号、第５，０８２，９２８号、第５，１０６，９５０号、第５，１０８，９８７号、第４，１０６，４８８号、第４，５５８，６９０号、第４，６６２，３５９号、第６，５５９，１４９号を参照されたい。他のＭＴＸ類似体及び関連する抗葉酸剤化合物には、トリメトレキセート、エダトレキセート、ＡＧ３３１、ピリトレキシム、１８５３Ｕ８９、ＬＹ２３１５１４、ＺＤ９３３１、ラルトリトレキセド、ロメトレキソール、ＭＴＡ及びＡＧ３３７が含まれる（Ｔａｋｉｍｏｔｏ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（１９９７）２４：Ｓ１８−４０−５１；Ｓｏｒｂｅｌｌｏら，Ｈａｅｍａｔｏｌｉｇｉｃａ（２００１）８６：１２１−２７）；ＣＢ３７１７，ＬＹ３０９８８７（Ｃａｌｖｅｒｔ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（１９９９）２６：Ｓ６，３−１０；Ｒｏｓｏｗｓｋｙ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６：１−２３７））。
【００２７】
したがって、本明細書中に開示されている組成物は、癌を治療するか、又は癌の増殖を阻害するために用いられ；並びに、多発性硬化症、及びそれと関連した症状を治療するために用いられ得る。この組成物は、インターフェロンなどの他の活性剤と結合させるか又は組み合わせて用いることができる。さらに、この組成物は、狼瘡関節炎及び関節リウマチなどの自己免疫障害を治療するために用いることができる。
【００２８】
抗体
アミノグリコシド抗体、例えばゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン及びトブラマイシンは、一般に、例えば、グラム陽性菌、グラム陰性菌、及び抗酸菌に対して効果的な広範囲な抗菌剤として利用されている。しかしながら、アミノグリコシドは、多くの場合、腎毒性及び中毒性難聴などの望ましくない副作用と関連する。本発明の実施に用いることができる他の抗体は、Ｒｏｃｅｐｈｉｎ（登録商標）及びＫｅｆｚｏｌなどのバンコマイシン及びセファロスポリンを含む。
【００２９】
非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）
ＮＳＡＩＤは全て、腎臓毒性を示す。ＮＳＡＩＤは、典型的には、鎮静剤誘導体の使用を避けながら、疼痛を減少させるために用いられる。２つの幅広く用いられているＮＳＡＩＤは、Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから製造されているインドメタシン及びＴｏｒａｄｏｌ（登録商標）である。
【００３０】
抗真菌剤
カスポフンギン及びアンフォテリシンＢはともに、腎毒性であることが知られ、開示された発明の実施に用いることができる。
【００３１】
抗癌剤
多くの抗癌剤は、用量制限的な腎臓毒性を示し、本発明の実施に用いることができる。このような薬剤には、例として、シスプラチン、ドキシルビシン、シクロフォスファミド、ブタスルファンなどが含まれる。
【００３２】
造影剤
造影剤は、Ｘ線スキャン前に患者に注入される。造影剤は、高濃縮された（５０〜６６％溶液）ヨウ化化合物である。この高濃度を考慮すると、唯一造影剤とシクロデキストリンとの比が最大１：１であることが必要であるようである。造影剤による腎障害に対して保護されるシクロデキストリンの可能な使用例には、イオヘキソール及びイオベルソールが挙げられる。本発明の実施に用いることができる他の造影剤には、ジアトリゾエート・メグルミン及びイオキサグレートが含まれる。
【００３３】
投与
オリゴ糖は、腎毒性薬物と複合化することができるが、組成物の抗腎毒性保護効果に対して必要であるとは考えられない。薬物とオリゴ糖との比は、腎臓を通過する薬物の経過時間を考慮すれば、薬物は、典型的には、腎臓内に見出されるｐＨで沈殿しないような範囲にあることが好ましい。ある場合には、インビボでは、オリゴ糖の量を最小にすることが望まれてもよい。実施例に記載されるように、試料のインビトロでの溶解性実験は、腎障害から効果的に保護するのに必要とされるオリゴ糖の最小量を決定するために用いられてもよい。一態様では、薬物：オリゴ糖の比は、１：１を超え、約１．１：１〜約５０：１、好ましくは１．２５：１〜約２５：１；より好ましくは、約１．７５：１〜約２：１〜１０：１の範囲であり得る。メトトレキセートの場合には、例としてのみ、約２：１のメトトレキセート：カプチゾールのモル比が、インビトロで溶液インターフェロン中にメトトレキセートを維持するのに十分に働き、所望の腎毒性効果を提供することが判明した。低量のオリゴ糖が望まれる場合、追加の安定化剤が用いられることが意図されるが、ただし、腎臓の保護効果を提供するのに十分である組成物中のオリゴ糖の量が維持される。
【００３４】
ある場合では、薬物とオリゴ糖の比が１：１よりも低いことが望まれてもよく、その場合、例えば、薬物の結合定数は低いか、又は薬物がシクロデキストリンよりも低い比率で腎臓によってプロセスを受ける場合、過剰なモル数のオリゴ糖を有することが有利であり得る。これは、多くの種類の薬物に対して真実であり、その場合、治療効果に必要とされる薬物の服用量は低く、従って、オリゴ糖のモル比は高いが、インビボでの絶対量又は濃度は、必ずしも増加しない。そのようにして、組成物は、約２〜約５０倍；約２〜約２０倍；又は約２〜約１０倍のモル過剰のオリゴ糖を含み、又は好ましくは、約１〜約５：１
の範囲、より好ましくは約２〜約５：１のオリゴ糖と薬物の比を含むことができる。
【００３５】
化合物とポリアニオン性オリゴ糖とを接触させることを含む、医薬として活性な化合物の腎毒性効果を減少させる方法がさらに提供される。腎毒性薬物と関連した腎毒性を阻害するか又は減少させる方法が含まれ、ポリアニオン性オリゴ糖、腎毒性薬物及び場合によりインターフェロン担体を含む医薬組成物を投与することを含む。投与は、単回服用として生じることが好ましいが、特に、オリゴ糖が薬物の溶解を手助けする場合、この方法はまた、ポリアニオン性オリゴ糖を含む医薬組成物、及び腎毒性を誘導する薬物を含む医薬組成物を同時に、即ち別々の服用で投与することによって達成されてもよい。この薬物及びオリゴ糖は単回服用ユニットに合わせられる場合、それらは、医薬として許容される担体、例えば、不活性なインターフェロン溶媒又は分散剤などと組み合わせることができる。
【００３６】
あるいは、オリゴ糖は、インターフェロン材料を用いて別々に調合され、別々に投与することができ、薬物と同時であるか又は薬物投与の前後１時間以内のいずれかである。同時とは、オリゴ糖と薬物の両方が、インビボで存在するように、別個の服用の投与は実質的に同時期に生じることを意味する。あるいは、投与は、連続して生じてもよいが、ただし、腎臓内の薬物濃度が、薬物の毒性効果が生じ得るレベルまで増加するので、オリゴ糖は、腎臓環境内で存在する。
【００３７】
投与様式、服用量及び服用頻度は、医薬製剤を用いて慣用的に採用されている投与様式及び服用考察によって支配されている。このようにして、例えば、本発明の種々の組合せは、筋内又は静脈内に投与することができ、採用される特定の薬物又は試薬の所望の使用に関連した医学的及び薬理学的な実施によって指示される。投与は、経口的又は非経口的に達成することができ、特に、局所投与、静脈内、動脈内又は皮下注射が含まれ、吸収、並びに身体の隙間又は開口部への注射及び導入が含まれる。
【００３８】
任意の特定の患者に対する特定の服用レベルは、採用される特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、排出速度、薬物の組合せ及び治療を受けている特定の疾患の重症度を含む種々の因子に依存する。
【００３９】
本発明の他の特徴は、本発明の例証のために提供される例示的な太陽の下記の説明の過程で明らかとなり、それに限定することを意図していない。
【実施例】
【００４０】
実施例１．ＭＴＸの溶解性に対するｐＨの効果
溶解性試験は、カプチゾールが腎臓を通過するＭＴＸの通過時間（即ち、２分未満）よりも長い時間経過でＭＴＸの沈殿を妨げることができるかどうかを決定するために実行される。溶液は、表１に示されるように調製した。各溶液は、ＨＣｌで酸性にし、遠心分離し、上清のアリコートを時間の関数として取り出し、溶液中のＭＴＸ濃度を分光分析的に測定した。
【００４１】
図１に示されるように、カプチゾールは、濃度依存的にＭＴＸの沈殿を妨げた。１：１のモル比で、ＭＴＸは、いつまでも溶液中に残存している。より低い比率では、沈殿は、濃度依存的な比率で生じる。カプチゾールとＭＴＸの比が０．５０：１では、ＭＴＸは、少なくとも１５分間溶液に残存し、０．２５：１の比では、その大部分は、１０分間残存している。腎臓内での迅速な一時的なろ過時間を考えると、腎障害を妨げるためのＭＴＸとカプチゾールの最適な比を決定するインビボ実験を行うことができる。
【００４２】
【表１】
2009517402.tif 000003
【００４３】
実施例２．カプチゾール−ＭＴＸの保護効果
Ｃ５７ＢＬ６マウスにおけるミエリン−乏突起膠細胞−糖タンパク質（ＭＯＧ）誘導の実験的自己免疫脳脊髄炎のカプチゾール（登録商標）の有無によるＭＴＸ４０ｍｇ／ｋｇ（モル比１：１）の効果の比較を行った。臨床徴候、ＣＮＳ病理学及び腎臓病理学を測定した。
【００４４】
ＥＡＥは下記のように誘導した。マウスをＡｖｅｒｔｉｎ（２２２トリブロモエタノール）で麻酔し、２５０μｇのＭ．ツベルキュロシスＨ37ＲＡ（全服用量５００μｇ）を含む等量のフロインド不完全アジュバント中で乳化したＰＢＳ中の１５０μｇのＭＯＧ（全服用量３００μｇ）の２回の皮下注射を行った。１回目の注射は、首筋に行い、２回目の注射は、背中に行った。百日咳毒素（１００ｎｇ；尾静脈を通じたｉ．ｖ．）を脳炎誘発物質後の０、３、及び７日目に投与した。
【００４５】
ストックＭＴＸは、２５ｍｇ／ｍｌ（Ｂｅｄｆｏｒｄラボラトリーズ）で用いた。ＭＴＸストックをＰＢＳ（２ｍｌストック＋５．３４ｍｌ  ＰＢＳ）で３．６７倍に希釈し、全量を７．３４ｍｌ、濃度を６．８ｍｇ／ｍｌ（１４．９ｍＭ）とした。
【００４６】
３．００ｍｌの希釈したＭＴＸ溶液を分注し、９６．６ｍｇのカプチゾール粉末を天下し、溶液をボルテックスして混合した。得られた溶液は、大部分が透明であるが、黄白色であった。全ての溶液は、すぐに注射できるまで、室温、暗くして維持された。９６．６ｍｇ／３ｍｌ＝３２．２２８ｍｇ／ｍｌ＝１４．９ｍＭ；ＭＴＸ：カプチゾールのモル比１：１。
【００４７】
試験混合物は、５グループのマウス（グループＩ−Ｖ；表２を参照）に投与された。
【００４８】
【表２】
2009517402.tif 000004
【００４９】
症状が出現してから２４時間後、ＭＴＸ（４０ｍｇ／ｋｇ体重）を尾静脈に投与した。注入容積は、１００〜１２０μｌであった。ＭＴＸ＋カプチゾールは、１００〜１２０μｌの溶液で尾静脈を介して注入された。ロイコボリン（２０ｍｇ／ｋｇ体重 ）は、ＭＴＸを注射してから４時間後、再度２４時間後に尾静脈を介して注射した。ロイコボリンは、葉酸の活性な代謝物であり、典型的には、正常細胞を保護する手助けをする抗癌化学療法においてメトトレキセートと共に与えられる。
【００５０】
毎日、動物を計量し、臨床徴候についてスコアを記録した。スコアは、下記の徴候に基づく：
０  −  正常
１  −  弛緩した尾、立毛、及び／又は減量
２  −  後肢脱力、直立困難
３  −  直立不能を引き起こす後肢脱力
４  −  不全麻痺、肢歩行、及び／又は失禁
５  −  部分的な後肢麻痺
６  −  両後肢麻痺＋前肢脱力
７  −  両後肢麻痺＋前肢不全麻痺又は麻痺
８  −  死又は屠殺を必要とする瀕死状態
【００５１】
マウスは、疾患の重症度について毎日スコアを記録し、次に、疾患の１０日目に屠殺した。脳、腎臓及び脾臓をホルマリン固定した。Ｔ細胞のＣＮＳへの浸潤を評価するために、ＣＤ３＋免疫組織化学は、未処置のＥＡＥマウス並びにＭＴＳ及びカプチゾールの同時処置したＥＡＥマウスのパラフィン包埋した８ミクロン厚の後部脳切片で行った。光学顕微鏡調査については、腎臓は、１０％緩衝化ホルマリンで固定し、日常的にパラフィン包埋について加工した。５ミクロメートルの組織切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、Ｎｉｋｏｎ  ｃｏｏｌｐｉｘ光学顕微鏡で調べた。
【００５２】
全腎障害の重症度は、記載されるような障害の半定量的な測定によって評価した。腎臓の各組織切片は、糸球体構造、糸球体の込み合い及び密集度の変性、ボーマン嚢腔の膨張、近位及び遠位細管の変性、並びに尿細管の膨張、血管のうっ血、及び炎症細胞の浸潤について評価した。糸球体萎縮については、２０を超える核を含む糸球体は、スコアを「０」、１０未満の各を含むものは、スコアを「４」とした。中間段階は、１、２及び３とした。他の基準は、０〜３スケールでスコアを記録した：０＝なし；１＝軽度；２＝中程度；３＝重症度。
【００５３】
各組織の顕微鏡スコアは、各基準に与えられるスコアの合計として計算され、少なくとも１００の腎単位（糸球体＋周辺管）を切片当たり分析した。データは、平均±ＳＥＭとして表した（図２を参照されたい）。
【００５４】
ＭＯＧ処理したマウスは、１０〜１１日目に始まり、重篤な臨床的徴候を発症した。それらは、１３日目で屠殺するまで維持した。全ての動物に影響があった。部分的又は完全な後肢が麻痺した（臨床スコア）。
【００５５】
ＭＴＸ  ４０ｍｇ／ｋｇ＋カプチゾールの有効性は、ＭＴＸのみの処置で見られる有効性に匹敵していた。
【００５６】
ＣＮＳ病理学の結果−ＣＤ３+免疫染色は、未処理のＥＡＥマウスが後部脳及び脊髄におけるＣＤ３+Ｔ細胞の広域浸潤であったことを示した（データ示さず）。徴候後にＭＴＸ＋カプチゾール（４０ｍｇ／ｋｇ＋カプチゾール１：１比）を同時に用いて処置したＥＡＥマウスは、Ｔ細胞浸潤の８０〜９０％減少を示した（データ示さず）。ＭＴＸ＋カプチゾールの有効性は、ＭＴ処置単独での有効性に匹敵していた。
【００５７】
腎臓病理学スコアを図３に示す。ＭＴＸ  ４０ｍｇ／ｋｇで処置した３種のＥＡＥマウス由来の腎臓切片は、尿細管の膨張及び近位細管の変性を示した。ＭＴＸ＋カプチゾールを同時に用いて処置したマウス由来の腎臓切片は、細管において保護効果を示した。４０ｍｇ／ｋｇのＭＴＸの１回の静脈ボーラス注射は、腎臓にいて形態変化を生じさせ、大部分は、皮質における尿細管の膨張に限定された。ＭＴＸとのカプチゾールの同時投与は、ＥＡＥマウスにおける病理学スコアにおける減少をもたらした。
【００５８】
実施例３．種々のモル比でのカプチゾール−ＭＴＸ
種々のモル比での同時のカプチゾールの有無による１回のボーラス静脈ＭＴＸ後の腎臓における組織病理学的変化の試験を行った。
【００５９】
ＭＴＸ溶液は下記のように調製した。溶液Ａ（２４ｍｇ／ｍｌ（５３ｍＭ））は、無菌のＰＢＳ（全量６ｍＬ）中の２５ｍｇ／ｍｌ（Ｂｅｄｆｏｒｄラボラトリーズのメトトレキセート）のストック溶液から調製した。溶液Ｂは、ＰＢＳで１：１．３３まで３ｍｌの溶液Ａを希釈することによって調製し、１８ｍｇ／ｍＬ（３９．６ｍＭ）の作業希釈液、ｐＨ７．４を得た。溶液Ｃは、２ｍＬの溶液Ａを１：２に希釈することによって調製し、１２ｍｇ／ｍＬ（２６．４ｍＭ）、ｐＨ２の作業希釈液を得た。
【００６０】
ＭＴＸ＋カプチゾール溶液は、下記の通り調製した。溶液Ｄは、溶液Ａの５００マイクロリットルのアリコートに５７．３２ｍｇのカプチゾールを添加することによって作製した（モル比１：１、中性ｐＨ）。溶液Ｅは、溶液Ｂの１ｍＬのアリコートに８５．６ｍｇのカプチゾールを添加することによって作製した（モル比１：１、中性ｐＨ）。溶液Ｆは、溶液Ｃの１ｍＬのアリコートに５７．１０ｍｇのカプチゾールを添加することによって作製した。溶液Ｇは、溶液Ｂの１ｍＬのアリコートに４２．８ｍｇのカプチゾールを添加することによって調製した。溶液Ｈは、溶液Ｃの１ｍＬのアリコートに２８．６ｍｇのカプチゾールを添加することによって作製した。
【００６１】
ＭＴＸ及びカプチゾールは、１００〜１２０μＬの容積で、１回注射による尾静脈を介した８匹のマウス群（グループＩ〜ＶＩＩＩ；表３を参照）に投与された。動物を４８時間後に屠殺した。臨床徴候、体重を記録した。腎臓を病理学用に保存（１回凍結、１回ホルマリン固定）した。ロイコボリンは、４時間で、及び１８時間後に与えた。尿をアルカリ性にしなかった。
【００６２】
【表３】
2009517402.tif 000005
【００６３】
ＭＴＸ  ８０ｍｇ／ｋｇ、１２０ｍｇ／ｋｇ、及びＭＴＸとカプチゾールのモル比が１：１及び１：０．５であるＭＴＸ＋カプチゾールの組合せで処理したマウスにおける全腎障害の半定量的な評価を図４に示す。対照の腎臓に対するスコアは、３〜４の間であった（グラフに示されていない）。パラフィン包埋した腎臓のヘマトキシリン及びエオシン切片は、腎障害の程度について顕微鏡観察的に分析した。データは、平均±ＳＥＭとして表す。ＭＴＸ  １６０ｍｇ／ｋｇについてのデータは、このグループではたった１匹のマウスであったため、グラフには含まれていない。
【００６４】
ヘマトキシリン及びエオシン（示さず）を用いて染色した腎臓のパラフィン切片は、８０ｍｇ／ｋｇのＭＴＸを投与されたマウスからの腎臓は、細管が膨張し、細管の変性変化、糸球体の過形成、及び間質細胞と尿細管の異型集合を有することを示した。ＭＴＸとカプチゾールのモル比が１：１である８０ｍｇ／ｋｇ  ＭＴＸ＋カプチゾール、及びＭＴＸとカプチゾールのモル比が１：０．５である８０ｍｇ／ｋｇ  ＭＴＸ＋カプチゾールを投与されたマウスからの腎臓は、細管の軽度の変性、正常な糸球体、及び炎症細胞の浸潤なしを示した。しかしながら、腎臓保護の程度は、ＭＴＸとカプチゾールのモル比が１：０．５である場合、非常に高かった。
【００６５】
ヘマトキシリン及びエオシン（示さない）で染色した腎臓のパラフィン切片は、１２０ｍｇ／ｋｇ  ＭＴＸ、ＩＶを投与されたマウス由来の腎臓は、糸球体萎縮、ボーマンカプセルの基底膜の変性、細管の変性変化、糸球体の過形成、及び単核細胞の浸潤を有することを示した。ＭＴＸとカプチゾールのモル比が１：１である１２０ｍｇ／ｋｇ  ＭＴＸ＋カプチゾール、及びＭＴＸとカプチゾールのモル比が１：０．５である１２０ｍｇ／ｋｇ  ＭＴＸ＋カプチゾールを投与されたマウス由来の腎臓は、大部分が正常な糸球体、近位及び遠位細管の保護、並びに炎症細胞の浸潤なしを示した。
【００６６】
実施例４．カプチゾール−ＭＴＸの時間分析
ＭＴＸ−カプチゾール混合物を表４に記載されるように投与した。
【００６７】
【表４】
2009517402.tif 000006
【００６８】
光学顕微鏡調査のために、腎臓を１０％緩衝化したホルマリンで固定し、パラフィン包埋については日常的に加工した。５ミクロメートルの組織切片は、ヘマトキシリン及びエオリンで染色し、Ｎｉｋｏｎ  ｃｏｏｌｐｉｘ光学顕微鏡で調べ、Ｎｉｃｏｎ  Ｃｏｏｌｐｉｘカメラで撮影した。全腎障害の重症度は、下記に記載されるように障害の半定量的な測定によって評価した。腎臓の各組織切片は、糸球体構造、糸球体の込み合い及び密集度の変性、ボーマン嚢腔の膨張、近位及び遠位細管の変性、並びに尿細管の膨張、血管のうっ血、及び炎症細胞の浸潤について評価した。糸球体萎縮については、２０を超える核を含む糸球体は、スコアを「０」、１０未満の各を含むものは、スコアを「４」とした。中間段階は、１、２及び３とした。他の基準は、０〜３スケールでスコアを記録した：０＝なし；１＝軽度；２＝中程度；３＝重症度。
【００６９】
各組織の顕微鏡スコアは、各基準に与えられるスコアの合計として計算され、少なくとも１００個の腎単位（糸球体＋周辺細管）を切片当たり分析した。例えば、Ｂｈａｔら，ＰＮＡＳ（２００３）１００（７）；Ｓｅｎｅｒら，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ（２００６）２２：４７０−６０。
【００７０】
図５に言及すると、ＭＴＸ処理したマウスの腎組織は、２４時間及び４８時間後に過度の組織病理学的な変化を示している。２４時間及び４８時間で、糸球体の萎縮、ボーマン嚢腔の変性及び膨張、並びに間質及び細管変性における炎症細胞の浸潤があった。カプチゾール＋ＭＴＸ処理したグループは、軽度の糸球体及び細管変化、並びに炎症性細胞の少ない浸潤を示した。しかしながら、２４時間後に見られた変化のいくつかは、可逆的であるようであり、それは、累積病理学的スコアが２４時間と比較して、４８時間でより少なかったためである。
【００７１】
腎臓における組織病理学的な変化は、カプチゾールの同時投与の有無でのＭＴＸ注射後の２４時間で試験した。マウスは、ＭＴＸ又はＭＴＸ＋カプチゾールの同時投与後の２４時間後に屠殺した。腎臓のパラフィン切片は、ヘマトキシリン及びエオシン（データ示さず）を用いて染色した。ＭＴＸ  １６０ｍｇ／ｋｇの投与は、糸球体構造の変性及びボーマン嚢腔の膨張、近位及び遠位細管の変性、並びに炎症性細胞の浸潤をもたらした。軽度の糸球体及び細管変性は、ＭＴＸとカプチゾールのモル比が１：１であるＭＴＸ  １６０ｍｇ／ｋｇ＋カプチゾールについて観察された。ＭＴＸとカプチゾールのモル比が１：０．５であるＭＴＸ  １６０ｍｇ／ｋｇ＋カプチゾールは、糸球体及び細管構造の保存に最も効果的であった。炎症細胞の浸潤は、全くなかった。１：０．２５のモル比で用いたＭＴＸ  １６０ｍｇ／ｋｇ＋カプチゾールは、腎障害に対して保護しなかった。
【００７２】
組織病理学的な変化は、カプチゾールの同時投与の有無でのＭＴＸ注射後の４８時間で腎臓について記録した。ＭＴＸ又はＭＴＸ＋カプチゾール投与後の４８時間後に屠殺した。腎臓のパラフィン切片をヘマトキシリン及びエオシン（データ示さず）で染色した。注射４８時間後に、ＭＴＸ  １６０ｍｇ／ｋｇ投与（静脈）は、糸球体構造の変性、ボーマン嚢腔の膨張、近位及び遠位細管の膨張、近位及び遠位細管の変性、及び炎症性細胞の浸潤をもたらした。軽度の糸球体及び細管変性は、ＭＴＸ  １６０ｍｇ／ｋｇ＋カプチゾール（ＭＴＸとカプチゾールのモル比１：１）について観察された。モル比１：０．５であるＭＴＸ  １６０ｍｇ／ｋｇ＋カプチゾールは、糸球体及び細管構造の保存に相対的に良好な保存をもたらした。炎症細胞の浸潤は、全くなかった。１：０．２５のモル比で用いたＭＴＸ  １６０ｍｇ／ｋｇ＋カプチゾールは、ＭＴＸ誘導の障害から腎臓を保護する効果はなかった。最大の保護は、ＭＴＸとカプチゾールのモル比が１：０．５である場合に見られた。
【００７３】
組織病理学的な変化はまた、ＭＴＸを投与して１週間後に腎臓について試験した。マウスは、ＭＴＸ  １６０ｍｇ／ｋｇの１回ｉ．ｖ．ボーラス投与の１週間後に屠殺した。腎臓のパラフィン切片は、ヘマトキシリン及びエオシン（示さず）で染色した。ＭＴＸのみの投与は、主に、部分的な糸球体萎縮又は込み合いを伴う近位及び遠位細管の変性をもたらした。近位及び遠位細管に裏打ちしている、膨張した核を有する変性細胞が見られた。時折、いくつかの細管は、二重の細胞層によって整列していることが観察された。いくつかの細管は、好酸性物質で充満していた。病理学的な変化は、大部分、腎臓の皮質領域で見られた。大部分の糸球体構造は正常であった。
【００７４】
組織病理学的な変化は、ＭＴＸ＋カプチゾール注射後の１週間後に腎臓について記録された。マウスは、ＭＴＸ＋カプチゾールの同時投与後の１週間後に屠殺された。腎臓のパラフィン切片は、４匹の別々のマウスからヘマトキシリン及びエオシンで染色した（示さず）。ＭＴＸとカプチゾールのモル比が１：１であるＭＴＸ  １６０ｍｇ／ｋｇ＋カプチゾールで同時投与されたマウスの腎臓は、糸球体の崩壊が有意に少なく、細管がより多く保存されたことを示した。炎症細胞の浸潤は無かった。
【００７５】
実施例５．マウスのドキソルビシン誘導の腎毒性モデルにおけるカプチゾールの腎毒性効果の評価
雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ドキソルビシン（１０ｍｇ／ｋｇ）の１回投薬を静脈に注射された。マウスは、７２時間後に屠殺された。ドキソルビシン及びドキソルビシン＋化合物後の糸球体及び尿細管間質損傷の出現は、腎臓組織学の手段で評価された。５μＭのパラフィン切片を切断し、Ｈ＆Ｅ及び過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色した。それらは、光学顕微鏡で調べられ、盲目的な様式でスコアを記録した。３０個の糸球体及び隣接する細管は、表面皮質（カプセルの表面近傍）でスコアが記録された。１００個の糸球体及び隣接する細管は、深部腎皮質及び外部髄質の外部ストリップ周辺でスコアが記録された。
【００７６】
図６は、表面的な腎皮質レベルでの各処置群についての平均的な病理学スコアを示す。図７は、表面な腎皮質レベルでのドキソルビシン又はドキソルビシン＋カプチゾールを用いて処理した個々のマウスについての腎臓病理学スコアを示す。図８は、深部腎皮質＋外部髄質のレベルでの各処置群についての平均的な病理学的スコアを示す。図９は、深部腎皮質＋外部髄質のレベルでのドキソルビシン又はドキソルビシン＋カプチゾールを用いて処理した個々のマウスについての腎臓病理学的なスコアを示す。
【００７７】
対照又はカプチゾールで処理したマウスは、いかなる尿細管間質性変化もなかった。ドキソルビシンで処理したグループは、いくつかの近位細管において、細管円柱、多くの拡張した細管及び刷子縁の中程度の喪失を示した。糸球体のいくつかは、崩壊し、分解の種々の段階にあった。病理学は、腎皮質の外周においてより顕著であることを示した。細管萎縮又は好中球浸潤は見られなかった。ドキソルビシン＋カプチゾール処置したマウスでは、変性がほぼ７１％減少し、細管膨張がほぼ７２％減少した。深部の腎皮質で、糸球体変性が９０％減少し、細管膨張が５０％減少した。
【００７８】
実施例６．マウスにおけるシスプラチン誘導の腎毒性モデルにおけるカプチゾールの腎毒性効果の評価
雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、シスプラチンとカプチゾールのモル比が１：１、１：０．５及び１：０．２５（それぞれ、Ｎ＝５、Ｎ＝４及びＮ＝６）での（１０ｍｇ／ｋｇ）シスプラチン（Ｎ＝５）又はシスプラチン＋カプチゾールの単回投薬で静脈に注射した。動物を７２時間後に屠殺した。
【００７９】
シスプラチン後の糸球体及び尿細管間質損傷の発生、及びシスプラチン＋カプチゾールによる保護は、腎臓組織学の手段によって評価した。５μＭのパラフィン切片を切断し、Ｈ＆Ｅ及び過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色した。それらは、光学顕微鏡で調べられ、盲目的な様式でスコアを記録した。３０個の糸球体及び隣接する細管は、表面皮質（カプセルの表面近傍）でスコアが記録された。１００個の糸球体及び隣接する細管は、深部腎皮質及び外部髄質の外部ストリップ周辺でスコアが記録された。
【００８０】
図１０は、表面的な腎皮質レベルでのシスプラチン及びシスプラチン＋カプチゾール処置したグループ（シスプラチンとカプチゾールのモル比は１：１、１：０．５、及び１：０．２５である）についての平均的な病理学スコアを示す。図１１は、表面な腎皮質レベルでの各処置群における個々のマウスについての腎臓病理学スコアを示す。図１２は、深部腎皮質＋外部髄質のレベルでのシスプラチン及びシスプラチン＋カプチゾール処理したグループ（シスプラチンとカプチゾールのモル比は１：１、１：０．５、及び１：０．２５である）についての平均的な病理学的スコアを示す。図１３は、深部腎皮質及び外部髄質のレベルでの各処置群における個々のマウスについての腎臓病理学的なスコアを示す。
【００８１】
対照マウスは、いかなる尿細管間質性変化もなかった。シスプラチンで処理したマウスは、いくつかの近位細管において、壊死、細管の上皮細胞の腐肉の形成、及び刷子縁を示した。膨張した細管の多くの提示は、シスプラチン誘導の腎毒性の顕著な特徴であった。糸球体のいくつかは崩壊し、いくつかは初期の変性変化を示した。これらの全ての変化は、シスプラチン＋カプチゾールを用いた処置によって顕著に明確とはならず、カプチゾールが、シスプラチン：カプチゾール１：１とシスプラチン：カプチゾール１：０．５の両方で腎臓を保護したことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は、水性酸性溶液中におけるメトトレキセート（ＭＴＸ）及びカプチゾールを用いた溶解性試験の結果を示す。
【図２】図２は、ＭＴＸ及びＭＴＸ＋カプチゾールで処理後、ミエリン−乏突起膠細胞−糖タンパク質（ＭＯＧ）誘導の実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）における全腎臓障害を示す腎病理学スコアを示す。
【図３】図３は、ＥＡＥマウスにおけるＭＴＸ又はＭＴＸ＋カプチゾールでの処理後の臨床スコアを示す。
【図４】図４は、正常マウスにおける種々のモル比での同時のカプチゾールの有無による単回ボーラスＭＴＸ後の腎切片における腎病理学スコアを示す。
【図５】図５は、種々のモル比での同時のカプチゾールの有無によるＭＴＸ処理後２４時間及び４８時間のマウスの腎組織における腎病理学スコアを示す。
【図６】図６は、表在性腎皮質のレベルでの各処置群に関するドキソルビシン誘導の腎毒性モデルにおける平均病理学スコアを示す。
【図７】図７は、表在性腎皮質のレベルでのドキソルビシン又はドキソルビシン＋カプチゾールで処理した個々のマウスの腎病理学スコアを示す。
【図８】図８は、深部腎皮質＋外部髄質のレベルでの各処置群に関するドキソルビシン誘導の腎毒性モデルにおける平均病理学スコアを示す。
【図９】図９は、深部腎皮質＋外部髄質のレベルでのドキソルビシン又はドキソルビシン＋カプチゾールで処理した個々のマウスに関する腎病理学スコアを示す。
【図１０】図１０は、シスプラチン及びシスプラチン＋カプチゾール処置群における表面皮質のレベルでの平均スコアを示す。
【図１１】図１１は、表在性腎皮質のレベルでの各処置群における個々のマウスのシスプラチン誘導の腎毒性モデルにおける病理学スコアを示す。
【図１２】図１２は、シスプラチン及びシスプラチン＋カプチゾール処置群における深部皮質及び外部のレベルでの平均スコアを示す。
【図１３】図１３は、深部腎皮質及び外部髄質での書く処置群における個々のマウスのシスプラチン誘導の腎毒性モデルにおける病理学スコアを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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