(57)【要約】本発明は、シュウ酸塩濃度の上昇と関係がある疾患の予防、治療、または進行を遅らせるための方法に関し、この方法はシュウ酸オキシダーゼ結晶、架橋結晶、またはこれらの結晶を含む組成物を個体に投与する工程を含む。シュウ酸オキシダーゼの架橋結晶などの安定化結晶を含む、個体に投与するためのシュウ酸オキシダーゼ結晶および組成物も提供される。本発明は、哺乳動物のシュウ酸塩濃度を低下させる方法も提供する。これらの方法は、シュウ酸塩濃度を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％低下させる。本発明の方法によって処置される疾患としては、腎臓疾患、骨疾患、肝臓疾患、消化管疾患、および膵臓疾患が挙げられる。さらなる態様において、疾患は、原発性高シュウ酸尿症、腸性高シュウ酸尿症、特発性高シュウ酸尿症、エチレングリコール中毒、尿石症、および腎臓結石症から選択される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物におけるシュウ酸塩濃度を低下させるための方法であって、シュウ酸オキシダーゼ結晶を該哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記シュウ酸オキシダーゼ結晶が安定化されている、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記シュウ酸オキシダーゼ結晶が、架橋剤によって共有結合されているシュウ酸オキシダーゼを含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記架橋剤が多官能性である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記架橋剤が二官能性である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記二官能性架橋剤がグルタルアルデヒドである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記投与が上部消化管を介する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記投与が経口である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記投与が体外装置を介する、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記装置が透析装置である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記シュウ酸オキシダーゼ結晶を、懸濁液、乾燥粉末、カプセル、または錠剤として投与する、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
さらに、前記哺乳動物の生体試料中のシュウ酸塩濃度を検出する工程を含む、請求項１または３記載の方法。
【請求項１３】
前記生体試料が尿、血液、血漿、および血清である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記シュウ酸オキシダーゼ結晶の投与が、結果としてシュウ酸塩濃度を少なくとも１０％低下させる、請求項１または３記載の方法。
【請求項１５】
シュウ酸オキシダーゼ結晶の投与が、結果としてシュウ酸塩濃度を少なくとも２０％低下させる、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
シュウ酸オキシダーゼ結晶の投与が、結果としてシュウ酸塩濃度を少なくとも３０％低下させる、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
尿、血液、血漿、および血清から選択される生体試料において前記低下を測定する、請求項１４、１５、または１６記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物におけるシュウ酸塩濃度の上昇に関連した疾患を処置するための方法であって、シュウ酸オキシダーゼ結晶を該哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項１９】
前記疾患が、腎臓疾患、骨疾患、肝臓疾患、消化管疾患、および膵臓疾患から選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記疾患が、原発性高シュウ酸尿症、腸性高シュウ酸尿症、特発性高シュウ酸尿症、エチレングリコール中毒、嚢胞性線維症、炎症性腸疾患、尿石症、および腎石症から選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
前記シュウ酸オキシダーゼを組換え産生する、請求項１または１８記載の方法。
【請求項２２】
個体におけるシュウ酸塩関連疾患を処置するための方法であって、シュウ酸および酸素分子の二酸化炭素および過酸化水素への変換を触媒することができる内因性ポリペプチドを該個体に提供する工程を含み、該ポリペプチドが安定化された結晶である、方法。
【請求項２３】
前記ポリペプチドを、架橋剤によって共有結合的に架橋する、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記架橋剤がグルタルアルデヒドである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
多官能性架橋剤によって架橋されている、シュウ酸オキシダーゼ結晶。
【請求項２６】
前記架橋剤がグルタルアルデヒドである、請求項２５記載の架橋されたシュウ酸オキシダーゼ結晶。
【請求項２７】
前記架橋剤が、少なくとも約０．１％の最終濃度で存在するグルタルアルデヒドである、請求項２６記載の架橋されたシュウ酸オキシダーゼ結晶。
【請求項２８】
前記架橋剤が、最終濃度４％で存在するグルタルアルデヒドである、請求項２７記載の架橋されたシュウ酸オキシダーゼ結晶。
【請求項２９】
前記架橋剤が、最終濃度１％で存在するグルタルアルデヒドである、請求項２８記載の架橋されたシュウ酸オキシダーゼ結晶。
【請求項３０】
前記シュウ酸オキシダーゼが、対応する可溶性シュウ酸オキシダーゼの活性の少なくとも７０％を保持している、請求項２５から２９のいずれか一項記載の結晶。
【請求項３１】
前記シュウ酸オキシダーゼが、対応する可溶性シュウ酸オキシダーゼの活性の少なくとも９５％を保持している、請求項２５から２９のいずれか一項記載の結晶。
【請求項３２】
前記シュウ酸オキシダーゼが、対応する可溶性シュウ酸オキシダーゼの活性の少なくとも９８％を保持している、請求項２５から２９のいずれか一項記載の結晶。
【請求項３３】
請求項２５から２９のいずれか一項記載の結晶を含む医薬組成物。
【請求項３４】
請求項３３記載の医薬組成物の有効量を投与する工程を含む処置方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
シュウ酸は、ＨＯ２Ｃ−ＣＯ２Ｈという化学式をもつジカルボン酸である。シュウ酸は、主に、シュウ酸エステルとして、すなわち、シュウ酸の塩形態で生体内に存在している。シュウ酸は、例えば、ホウレンソウ、ルバーブ、イチゴ、クランベリー、ナッツ、ココア、チョコレート、ピーナッツバター、ソルガム、および茶などの食物中に見られる。また、シュウ酸は、ヒトおよび他の哺乳動物においては代謝最終産物でもあり、腎臓によって尿の中に排出される。カルシウムに結合すると、シュウ酸は不溶性産物であるシュウ酸カルシウムを生成するが、これは、腎臓結石中に見られる最も一般的な化合物である。
【０００２】
哺乳動物は、シュウ酸を分解する酵素を合成しないため、個体内のシュウ酸レベルは、通常、排出や食物として摂取するシュウ酸の低吸収性によって抑えられている。シュウ酸の濃度上昇は、原発性高シュウ酸尿症、腸性高シュウ酸尿症、および特発性高シュウ酸尿症など、様々な病態を伴う。非特許文献１および非特許文献２。シュウ酸の増加は、食物由来のシュウ酸を食べ過ぎたり、腸管からシュウ酸を過剰吸収したり、シュウ酸産生が異常になったりすることによって引き起こされることがある。結腸および小腸におけるシュウ酸の過剰吸収は、胆汁酸の疾患もしくは脂肪吸収不全症、回腸切除が原因となる過剰吸収、または、例えば、セリアック症、膵外分泌機能不全、小腸疾患、もしくは肝疾患によって起こる脂肪便を伴う。
【０００３】
高シュウ酸尿症、すなわち、尿中へのシュウ酸排出は、シュウ酸カルシウムが腎組織に蓄積したり（腎石灰沈着）、尿管に蓄積したり（例えば、腎臓結石、尿路結石、および腎石症）することに関係するいくつかの健康上の問題を伴う。また、シュウ酸カルシウムは、例えば、眼、血管、関節、骨、筋肉、心臓、およびその他の主要組織にも蓄積して、それらを損傷する原因となる。例えば、非特許文献３および非特許文献４参照。シュウ酸レベルの増加による効果は、様々な組織に現れることがある。例えば、小血管への蓄積は、治癒することのない痛みを伴う皮膚潰瘍を引き起こし、骨髄への蓄積は貧血を引き起こし、骨組織への蓄積は骨折を引き起こしたり、子供の成長に影響したりし、また、心臓へのシュウ酸カルシウムの蓄積は心拍リズムの異常または心機能不全を引き起こす。
【０００４】
シュウ酸レベルの上昇を治療するための現行の方法は必ずしも効果的ではなく、原発性高シュウ酸尿症患者の多くで、集中的な透析および臓器移植が必要となる可能性がある。様々な高シュウ酸尿症に対する現行の治療法には、高用量のピリドキシン、オルトリン酸、マグネシウム、鉄、アルミニウム、クエン酸カリウム、コレスチラミン、およびグリコサミノグリカン治療や、食事および液体の摂取を調整する養生法、透析療法、および、腎臓移植および肝臟移植など、外科的処置療法などが含まれる。これらの療法（例えば、低シュウ酸または低脂肪の食事、ピリドキシン、適量のカルシウム、および液体の増加）は、部分的に有効なだけで、望ましくない副作用、例えば、オルトリン酸、マグネシウム、またはコレスチラミンの補充による消化管への影響、ならびに透析および手術の危険などを生じる可能性がある。したがって、身体から安全にシュウ酸を除去する方法が必要とされている。さらに、生体試料において、シュウ酸を分解してシュウ酸レベルを低下させる方法は、例えば、シュウ酸の吸収を阻止するだけか、シュウ酸のクリアランスを増加するだけの治療法よりも有利である。
【０００５】
シュウ酸分解性バクテリアを利用して、各個体のシュウ酸を減少させることが、例えば、特許文献１、特許文献２、および特許文献３に記載されている。一方、特許文献４には、シュウ酸経路に関係する酵素の投与について記載されている。しかし、これらのシュウ酸分解酵素は、胃の過酷な酸性環境に対して感受性である。５１４号公報は、例えば、これらの問題を解決するために腸溶コーティングを用いることを記載している。それでもなお、高活性で安定した、または他の有利な形態のシュウ酸分解酵素、例えばシュウ酸オキシダーゼが、シュウ酸塩関連疾患を治療するために必要とされている。
【０００６】
現在の治療法が最適なものではないため、シュウ酸塩関連疾患に罹った個体など、各個体におけるシュウ酸塩濃度の上昇に関連した疾患を治療または予防するための方法および組成物に対する必要も存在する。一例として、各個体が、臓器移などの手術を遅らせるか避けることができるように、植原発性高シュウ酸尿症を治療するための方法も必要である。
【特許文献１】米国特許第６，２００，５６２号明細書
【特許文献２】米国特許第６，３５５，２４２号明細書
【特許文献３】米国特許第６，６９９，４６９号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００４／０２３４５１４号明細書
【非特許文献１】Ｌｅｕｍａｎｎら、Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．（１９９９）１４：２５５６−２５５８
【非特許文献２】Ｅａｒｎｅｓｔ，Ａｄｖ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９７９）２４：４０７−４２７
【非特許文献３】Ｌｅｕｍａｎｎら、Ｊ  Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．（２００１）１２：１９８６−１９９３
【非特許文献４】Ｍｏｎｉｃｏら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２００２）６２：３９２−４００
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、例えば、結晶性シュウ酸オキシダーゼの経口投与によってシュウ酸塩関連疾患を可能にするための治療法および処方剤に役立つシュウ酸オキシダーゼの結晶を提供する。また、シュウ酸オキシダーゼの結晶は、例えば、シュウ酸塩濃度を調節したり、個体におけるシュウ酸カルシウムの蓄積によって起こる損傷を最小限に抑えたりするのに有効な方法に使用することもできる。また、本発明は、架橋したシュウ酸オキシダーゼ結晶、およびこれらの結晶を含む組成物も提供する。特に、実施形態において、これらの架橋剤は多官能性であり、一定の実施形態において、本剤は、グルタルアルデヒドなどの二官能性剤である。
【０００８】
ある場合には、これらの結晶は、植物、バクテリア、菌類などの天然源、特に、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、オートムギ、イネ、ホウレンソウ、ソルガム、バナナ、およびライムギに由来するシュウ酸オキシダーゼを含む。別の場合には、シュウ酸オキシダーゼは組換えによって作出される。
【０００９】
また、本発明は、シュウ酸オキシダーゼの結晶または架橋したシュウ酸オキシダーゼ結晶を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物のシュウ酸塩濃度を低下させる方法も提供する。これらの方法は、シュウ酸塩濃度を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％低下させる。
【００１０】
様々な実施形態において、シュウ酸オキシダーゼ結晶または架橋結晶は経口投与される。別の場合には、これらの結晶は上部消化管を経由して投与される。さらなる実施形態において、シュウ酸オキシダーゼは、対外装置によって、例えば、透析の過程で投与される。
【００１１】
また、本発明は、哺乳動物におけるシュウ酸塩濃度の上昇と関係がある疾患の治療、予防、または進行を遅らせるための方法であって、シュウ酸オキシダーゼ結晶または架橋結晶を哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、疾患は、腎臓疾患、骨疾患、肝臓疾患、消化管疾患、および膵臓疾患から選択される。さらなる態様において、疾患は、原発性高シュウ酸尿症、腸性高シュウ酸尿症、特発性高シュウ酸尿症、エチレングリコール中毒、尿石症、および腎臓結石症から選択される。
【００１２】
以上の開示および以下の説明は、特許請求の範囲に記載された発明を制限するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（詳細な説明）
本発明は、一部において、シュウ酸オキシダーゼ（ＯＸＯ）の結晶を投与すると高シュウ酸尿症が治療できるとの発見および実証に基づいている。本明細書で説明するように、経口で、または直接胃に投与された結晶性シュウ酸オキシダーゼは、食物中のシュウ酸を消費していない人など、個体内のシュウ酸レベルを低下させることができる。様々なシュウ酸塩関連疾患を治療するためにＯＸＯ結晶を投与する方法が本明細書に記載されている。さらに、ＯＸＯ結晶および架橋された結晶（ＣＬＥＣ）が、これらを含みかつ使用する組成物と同様に提供される。
【００１４】
定義
本発明がより容易に理解できるよう、まず、いくつかの用語を定義しておく。それ以外の定義も、詳細な説明全体の中に示されている。
【００１５】
本明細書において、「生体試料」とは、細胞、組織、器官、または生物から、例えば、分析物を検出するために集められた生物由来材料のことである。生体試料の例には、液体試料、細胞試料、または組織試料などがある。生体液には、例えば、血清、血液、血漿、唾液、尿、または汗などがある。細胞試料または組織試料には、生検、組織、細胞懸濁液、または、臨床試料などの他の標本および試料がある。
【００１６】
「結晶」とは、物質の固体状態の一形態であり、３次元で周期的に反復したパターンに並んだ原子を含む（例えば、Ｂａｒｒｅｔ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍｅｔｈａｌｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９５２）参照）。例えば、ポリペプチドの結晶型は、別の形態である非晶質固体状態とは異なる。結晶は、形、格子構造、溶媒の割合（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｓｏｌｖｅｎｔ）、および、例えば、屈折率などの光学的性質などの特性を示す。
【００１７】
「対外装置」とは、個体の治療においてＯＸＯ結晶と接触する体液を持ち込むための体内には置かれない構造物のことである。好ましくは、対外装置は、腎臓透析などの透析に使用される装置、持続的動静脈血液ろ過用装置、体外型膜型人工肺、または血流から老廃物をろ過するために使用される装置である。同様に、老廃物をろ過するための装置の構成要素も本用語に包含され、例えば、チューブ、多孔質材料、または膜が含まれる。特に、体外装置は、透析用装置であってよい。また、透析用装置の膜であってもよい。
【００１８】
ＯＸＯの「機能性断片」とは、シュウ酸の酸化を触媒することができるなど、ＯＸＯの生物活性を一つ以上保持している、ＯＸＯポリペプチドの一部である。本明細書において、機能性断片は、別段の記載がない限り、一方または両方の末端の末端切断を含み得る。例えば、機能性断片は、ＯＸＯポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシル末端から１、２、４、５、６、８、１０、１２、１５、または２０個、またはそれ以上の残基が除かれていてよい。好ましくは、切断は、一方または両方の末端から２０アミノ酸以下である。機能性断片は、任意には、一つ以上の異種配列に結合していてよい。
【００１９】
「個体」という用語は、哺乳動物を意味し、ヒト、ヒト以外の霊長類、ヒヒ、チンパンジー、サル、齧歯類（例えば、マウス、ラット）、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなど、哺乳動物に分類されている任意の動物を含む。
【００２０】
「単離された」という用語は、その本来の環境から実質的に切り離されている分子を意味する。例えば、単離されたタンパク質は、細胞内物質や、そのタンパク質が由来する細胞源または組織源に由来するその他のタンパク質を実質的に含まない。この用語は、単離されたタンパク質が、治療用組成物として投与するのに十分な純度、または少なくとも７０％から８０％（ｗ／ｗ）の純度、より好ましくは、少なくとも８０％から９０％（ｗ／ｗ）の純度、さらにより好ましくは、９０％から９５％（ｗ／ｗ）の純度、および最も好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％（ｗ／ｗ）の純度である調製物を意味する。
【００２１】
本明細書において、「シュウ酸塩関連疾患」とは、シュウ酸またはシュウ酸塩の病理レベルに関連した病気または疾患を意味し、高シュウ酸尿症、原発性高シュウ酸尿症、腸性高シュウ酸尿症、特発性高シュウ酸尿症、エチレングリコール（シュウ酸）中毒、特発性尿石症、腎不全（進行性、慢性、または末期の腎不全など）、脂肪便、吸収不全症、回腸切除、外陰部痛、心臓伝導疾患（ｃａｒｄｉａｃ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、炎症性腸疾患、嚢胞性線維症、膵外分泌機能不全、クローン病、潰瘍性大腸炎、腎石灰沈着症、尿石症、および腎石症を含むが、これらに限定されない。このような症状および疾患は、任意には急性または慢性であり得る。腎臓、骨、肝臓、消化管、および膵臓に関連したシュウ酸塩関連疾患が周知されている。さらに、シュウ酸カルシウムが、眼、血管、関節、骨、筋肉、心臓を含むが、これらに限定されない多様な組織、および他の主要な臓器に沈着することがあり、多くのシュウ酸塩関連疾患をもたらす。
【００２２】
「シュウ酸」は、尿および腸液のｐＨ（ＰＫａ１＝１．２３、ＰＫａ２＝４．１９）では、主に塩の形態、すなわちシュウ酸エステルの形態で（対応する共役塩基の塩類として）存在する。Ｅａｒｎｅｓｔ，Ａｄｖ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２４：４０７−４２７（１９７９）。「シュウ酸」および「シュウ酸エステル」という用語は、本開示を通じて同義のものとして用いられている。リチウム、ナトリウム、カリウム、および鉄（ＩＩ）を含むシュウ酸塩は可溶性であるが、シュウ酸カルシウムは、水の中では非常に可溶性が低く、１８℃では０．５８ｍｇ／１００ｍｌしか溶けない。Ｅａｒｎｅｓｔ，Ａｄｖ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２４：４０７−４２７（１９７９）。食物からのシュウ酸は、食事性シュウ酸とも呼ばれる。代謝過程で産生されるシュウ酸は、内生シュウ酸と呼ばれる。循環性シュウ酸は、血液などの循環体液中に存在するシュウ酸である。
【００２３】
「治療上有効な用量」または「治療上有効な量」という用語は、原発性高シュウ酸尿症または腸性高シュウ酸尿症などの高シュウ酸尿症を含む、シュウ酸関連症状の発症の開始を阻止、遅延させるか、症状の改善をもたらす化合物の量を意味する。治療上有効な量は、例えば、シュウ酸塩濃度の上昇に関連した疾患の一つ以上の症状を治療し、予防し、重篤度を低下させ、発症を遅延させ、または発生のリスクを低下させるのに十分である。有効な量は、当技術分野において周知の方法により、本説明の次章で説明するようにして決定することができる。
【００２４】
「治療」、「療法」、およびこれらの同族語は、治療および予防／防止する方法を意味する。治療を必要とする人々は、特定の医学上の疾患を既に有する個人と、その疾患に最終的に罹る可能性のある人々を含むことが可能である。治療の必要性は、例えば、疾患の発症に付随する一つ以上の危険因子の存在、疾患の出現または進行、または、疾患を有する患者の治療に対する受容力によって評価される。治療には、疾患の進行を遅延または逆転させることも含まれ得る。
【００２５】
シュウ酸オキシダーゼ
本明細書において、シュウ酸オキシダーゼ（ＯＸＯ）は、シュウ酸：酸素酸化還元酵素を意味する。シュウ酸オキシダーゼは、以下の反応にしたがって、酸素分子（Ｏ２）依存性酸化によって、シュウ酸が二酸化炭素および過酸化水素になるのを触媒することができる明確に定義された酵素群である：
ＨＯ２Ｃ−ＣＯ２Ｈ＋Ｏ２→２ＣＯ２＋Ｈ２Ｏ２。
【００２６】
シュウ酸オキシダーゼのアイソフォーム、およびこれらのアイソフォームのグリコフォームがこの定義に含まれる。コムギ、オオムギ、トウモロコシ、オートムギ、イネ、およびライムギなど真性の禾穀植物などの植物、バクテリア、および菌類に由来するＯＸＯが、この用語に含まれる。任意には、ＯＸＯはさらに、オオムギＯＸＯのように、スーパーオキシドジスムターゼの活性を可能にする。一定の状況において、ＯＸＯは、ＯＸＯ糖タンパク質ダイマーの三量体など、可溶性の六量体タンパク質である。
【００２７】
シュウ酸オキシダーゼは、高等植物、バクテリア、および菌類によって産生され、シュウ酸：酸素酸化還元酵素活性を有する。シュウ酸オキシダーゼは、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、オートムギ、イネ、およびライムギなど真性の禾穀植物によって産生されるシュウ酸オキシダーゼを含む。コムギのシュウ酸オキシダーゼがジャーミン（ｇｅｒｍｉｎ）としても知られているため、これらは、通常、ジャーミン型ＯＸＯ（Ｇ−ＯＸＯ）として同定される。ジャーミン様タンパク質（ＧＬＰ）は、一定の構造的特徴を共通にもつタンパク質の大きな分類群である。ＯＸＯの他の源は、コケ、ビート、ホウレンソウ、ソルガム、およびバナナである。Ｇ−ＯＸＯなどのＯＸＯは、例えば、六量体の糖タンパク質としての活性をもつ。ＯＸＯには、スーパーオキシドジスムターゼ活性を持つと報告されているものもある。
【００２８】
結晶を調製するために用いられ、かつ、本明細書記載の方法で使用されるシュウ酸オキシダーゼは、例えば、天然源から単離すること、すなわち、天然源に由来することが可能である。本明細書において、「由来する」とは、源において天然に存在するアミノ酸または核酸の配列をもつことを意味する。例えば、オオムギに由来するシュウ酸オキシダーゼは、オオムギのシュウ酸オキシダーゼタンパク質の一次配列を含むか、オオムギで見られるシュウ酸オキシダーゼをコードする配列を含む核酸、またはその縮退した核酸によってコードされている。ある源に由来するタンパク質または核酸は、その源から単離される分子、遺伝子組換えによって産生される分子、および／または化学的に合成ないし修飾される分子を包含する。本明細書で提供される結晶は、ＯＸＯのアミノ酸配列、またはシュウ酸酸化活性を保持しているＯＸＯの機能的断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドから形成させることができる。好ましくは、ＯＸＯは、シュウ酸の酸化を触媒することに加え、重合、マンガン要求性、および／またはスーパーオキシドジスムターゼ活性など、天然型ＯＸＯの機能的特性を少なくとも１つ保持している。
【００２９】
単離されたシュウ酸オキシダーゼ
シュウ酸オキシダーゼは以前から単離されているため、オオムギの幼植物体、根、および葉、ビートの茎、ビートの葉、コムギの胚、ソルガムの葉、およびバナナの皮など、多くの源から利用することができる。また、ＯＸＯは、例えば、Ｓｉｇｍａ社などの供給業者から購入することもできる。天然源からＯＸＯを単離する方法は、例えば、以下の文献に既に記載されている：Ｌｉｕら、Ｚｈｉ  Ｗｕ  Ｓｈｅｎｇ  Ｌｉ  Ｙｕ  Ｆｅｎ  Ｚｉ  Ｓｈｅｎｇ  Ｗｕ  Ｘｕｅ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ  ３０：３９３−８（２００４）（Ｅｎｇｌ．Ａｂｓｔ．ａｔ  ＰＭＩＤ  １５６２７６８７）；Ｒｏｄｒｉｇｕｉｅｚ−Ｌｏｐｅｚら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．９：４４−４８（２００１）；Ｐｕｎｄｉｒら、Ｃｈｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１２９−１３８（１９９９）；およびＡｇｕｉｌａｒら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３６６：２７５−８２（１９９９）。これらの単離シュウ酸オキシダーゼを用いて、本発明の結晶、架橋結晶、および組成物を生成させることができる。そして、これらの結晶、架橋結晶、および組成物を、本明細書に記載する方法に使用することができる。
【００３０】
組換えシュウ酸オキシダーゼ
あるいは、組換えＯＸＯを用いて、本明細書に記載の結晶および方法を形成することができる。いくつかの例において、組換えＯＸＯは、天然のＯＸＯ配列から得た配列に含まれるか、コードされている。さらに、天然型配列に相同であるか、実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＯＸＯが、本明細書に記載されている。また、天然のＯＸＯコード核酸に相同であるか、実質的に同一である核酸も提供されているため、本明細書に記載されているように結晶化および／または投与することができる。
【００３１】
本明細書において「組換え」と呼ばれるポリペプチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および／または制限酵素を用いてベクターにクローニングするなどの人為的組換え法による方法で作出されたポリペプチドなど、組換えＤＮＡ法によって製造されたポリペプチドである。また、「組換え」ポリペプチドは、宿主細胞などの細胞の中で組換えによって改変された発現をする天然型ポリペプチドなど、その発現が変化したポリペプチドでもある。
【００３２】
一つの実施形態において、ＯＸＯは、オオムギのＯＸＯの核酸配列に相同であって、例えば、異種の宿主内での組換え体産生を増加または最適化できるよう改変されている核酸から組換えによって産生される。このような改変配列の例は配列番号：１（核酸）に記載されており、オオムギＯＸＯのオープンリーディングフレームの核酸配列が、そのＧＣ含有量を下げるよう改変されており、また、α接合因子分泌シグナル配列およびに設計された制限酵素切断部位に結合している。配列番号：１にコードされるアミノ酸配列が配列番号：２に記載されている。別の反復例において、ＯＸＯは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｌ１５７３７で入手可能なオオムギの非改変核酸配列である配列番号：３から組換えによって産生される。
【００３３】
ＯＸＯ結晶を形成させるのに役立つＯＸＯポリペプチドは、ＯＸＯポリペプチドまたはその機能的断片をコードする配列を含む核酸構築物を含む宿主細胞などの宿主細胞内で発現させることができる。ＯＸＯを発現させるのに適した宿主細胞は、例えば、酵母、バクテリア、菌類、昆虫、植物、または哺乳動物細胞、または遺伝子組換え植物、遺伝子組換え動物もしくは無細胞系であり得る。好ましくは、宿主細胞は、ＯＸＯポリペプチドをグリコシル化することができ、ジスルフィド結合させることができ、ＯＸＯを分泌することができ、および／またはＯＸＯポリペプチドの多量体化を支持することができる。好適な宿主細胞は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂなど））、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、Ｓｆ９細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、２９３細胞（ヒト胎児腎臓）、およびその他のヒト細胞などであるが、これらに限定されない。また、遺伝子組換え植物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、鳥、およびウサギを含む遺伝子組換え動物も、ＯＸＯの産生のための適切な宿主である。
【００３４】
ＯＸＯの組換え体を産生するために、宿主または宿主細胞は、ＯＸＯまたはその機能的断片をコードする核酸を少なくとも一つ含む構築物を、プラスミド、ベクター、ファージミド、または転写カセットもしくは発現カセットの形で含まなければならない。単一コピーまたは多重コピーの中で維持される構築物、または宿主細胞の染色体の中に組み込まれる構築物など、様々な構築物を利用することができる。組換え体を発現させるための多くの組換え体発現系、構成成分、および試薬が、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）；Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社（Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，ＭＡ）；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；Ｎｏｖａｇｅｎ社（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ社（ＤＳＭＺ）（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）などから市販されている。あるいは、周知の遺伝子活性化技術によって、組換え体ＯＸＯを産生させることができる。
【００３５】
ＯＸＯの組換え体発現は、任意で、構成型および／または誘導型のプロモーターなど、異種プロモーターによって調節される。例えば、アルコール酸化酵素（ＡＯＸ）プロモーター、ジヒドロキシアセトン合成酵素（ＤＡＳ）プロモーター、Ｇａｌ  １，１０プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、銅メタロチオネイン（ＣＵＰ１）プロモーター、酸性ホスファターゼプロモーター、などのプロモーター、ならびにＴ７、ＣＭＶ、およびポリへドリンプロモーターも適している。特定のプロモーターは、宿主または宿主細胞に基づいて選択される。また、メタノール、硫酸銅、ガラクトース、低リン酸、例えばエタノールなどのアルコールによって誘導されるプロモーターを使用することもでき、これらは、当技術分野において周知である。
【００３６】
ＯＸＯをコードする核酸は、任意で異種配列を含むことができる。例えば、分泌配列は、いくつかの実施形態において、ＯＸＯポリペプチドのＮ末端に含まれる。α接合因子、ＢＧＬ２、酵母酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ）、キシラナーゼ、αアミラーゼなどに由来するシグナル配列、別の酵母分泌タンパク質に由来するシグナル配列、および、宿主細胞からの分泌を指示することができる、他の生物種に由来する分泌シグナルペプチドなどのシグナル配列も有用である。同様に、リンカー（例えば、切断ないし制限酵素部位を含むもの）、および一つ以上の発現調節因子、エンハンサー、ターミネーター、リーダー配列、および一つ以上の翻訳シグナルなど、その他の異種配列も、本明細書の範囲に含まれる。これらの配列は、任意で、構築物に含ませることも、および／または、ＯＸＯをコードする核酸に結合させることもできる。別段の記載がない限り、「結合させた」配列は、互いに直接的または間接的に結合しているものでもよい。
【００３７】
同様に、ヒスチジン、ＨＡ（ヘマグルチニンペプチド）、マルトース結合タンパク質、登録商標ＡｖｉＴａｇ、ＦＬＡＧ、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどのエピトープまたはアフィニティータグを、任意で、ＯＸＯポリペプチドに結合させることができる。タグは、任意には、ＯＸＯが産生または精製された後、ＯＸＯから切断することも可能である。当業者は、例えば、適合する宿主細胞、構築物、プロモーター、および／または分泌シグナル配列など、適当な異種配列を容易に選択することができる。
【００３８】
ＯＸＯの相同体または変異体は、ＯＸＯの参照配列と１個以上の残基が異なっている。構造的に類似したアミノ酸を、例えば、特定のアミノ酸のいくつかと置換することができる。構造的に類似したアミノ酸は、（Ｉ，Ｌ，Ｖ）；（Ｆ，Ｙ）；（Ｋ，Ｒ）；（Ｑ，Ｎ）；（Ｄ，Ｅ）；および（Ｇ，Ａ）などである。アミノ酸の欠失、付加、または置換も、本明細書記載のＯＸＯ相同体に含まれる。このような相同体および変異体には、多型変異体、および天然または人工突然変異体、ならびに１個以上の残基が改変されている改変ポリペプチド、および１個以上の改変された残基を含む突然変異体などがある。
【００３９】
ＯＸＯのポリペプチドまたは核酸が参照配列と、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％一致するとき、それは「相同」（または「相同体」）である。相同体が参照配列と一致しない場合は「変異体」である。相同体は、その塩基配列またはアミノ酸配列が参照配列と（例えば、切断、欠失、置換、または付加によって）１、２、３、４、５、８、１０、２０、または５０残基以下の違いがあり、かつ、シュウ酸の酸化を触媒する能力を保持（または、保持するポリペプチドをコードする）場合に「実質的に同一である」という。シュウ酸オキシダーゼの断片は、変異体および／または実質的に同一の配列などの相同体であってよい。例として、相同体は、ＯＸＯの様々な源に由来することが可能であり、または、切断変異、欠失変異、置換変異、または付加変異によって参照配列に由来したり、関係したりすることが可能である。２つの塩基配列またはアミノ酸配列の一致率は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されている基本的局所整列用ツール（ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ，４８：４４４−４５３（１９７０）のアルゴリズム、またはＭｅｙｅｒｓら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７（１９８８）のアルゴリズムなどの標準的な整列によって決定することができる。このようなアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、および「ＢＬＡＳＴ２配列」プログラム（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ参照）に取り込まれている。このようなプログラムを利用するとき、デフォルトパラメーターを用いることができる。例えば、塩基配列では、「ＢＬＡＳＴ２配列」について以下の設定を用いることができる：ＢＬＡＳＴＮプログラム、一致した場合の報酬２、不一致の場合のペナルティー−２、オープンギャップおよび伸長ギャップのペナルティーは、それぞれ５および２、ギャップＸ＿ドロップオフ値５０、期待値１０、ワードサイズ１１、フィルター有り。アミノ酸配列では、「ＢＬＡＳＴ２配列」について以下の設定を用いることができる：ＢＬＡＳＴＰプログラム、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、オープンギャップおよび伸長ギャップのペナルティーは、それぞれ５および２、ギャップＸ＿ドロップオフ値５０、期待値１０、ワードサイズ３、フィルター有り。本明細書記載の結晶を形成するのに適したＯＸＯに対するアミノ酸配列および核酸配列は、相同配列、変異体配列、または実質的に同一な配列などであってよい。
【００４０】
シュウ酸オキシダーゼの精製
シュウ酸オキシダーゼのタンパク質またはポリペプチドは、結晶化する前に、天然源または組換え体源などの源から精製することができる。本明細書において「単離された」と言われるポリペプチドとは、その本来の由来源（例えば、細胞、組織（すなわち、植物組織）、または液体もしくは媒体（分泌されるポリペプチドの場合）であるタンパク質、脂質、および／または核酸など、天然の環境から実質的に切り離されているポリペプチドのことである。単離されたポリペプチドには、本明細書記載の方法、またはその他適当な方法によって得られるポリペプチなどがあり、実質的に純粋または本質的に純粋なポリペプチドを含み、また、化学合成法、組換え製造法、または生物学的方法と化学的方法とを組み合わせたものによって産生されたポリペプチドなどがある。任意には、単離されたタンパク質は、精製工程によるなどして、それが産生された後に更なる処理を受けた。
【００４１】
精製は、バッファー交換工程およびクロマトグラフィー工程を含むことができる。任意で、例えば、透析、等電点電気泳動クロマトグラフィー、および／またはバッファー交換を伴う濃縮工程を用いることができる。一定の例では、スルホプロピルセファロースクロマトグラフィー、またはＧＭ５２もしくは同様の陽イオン交換カラムなどの陽イオン交換クロマトグラフィーを精製に用いることができる。バッファー交換は、任意には、クロマトグラフィー分離の前に行い、濾過透析などのタンジェンシャルフロー濾過によって行うことができる。一定の調製物では、ＯＸＯは、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％、または９９．９％の純度である。
【００４２】
ＯＸＯを調製するには、グラム単位での精製を行うことが適しているため、処理手順を効率的で安価な製造規模でのＯＸＯ精製になるよう最適化する。例えば、精製処理で、少なくとも０．５、１、２、５、１０、２０、５０、１００、５００、または１０００グラム以上のＯＸＯがもたらされる。処理の一例において、少なくとも１０Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、またはそれ以上の出発試料のタンジェンシャルフロー濾過が提供され、バッファー交換および混入タンパク質の沈殿が行われる。シングルＳＰ−セフロースカラムが、ＯＸＯを精製するために任意で使用される。
【００４３】
また、精製されたＯＸＯの結晶化は、混入物を除去して、例えば、ＯＸＯ調製物をさらに精製することもできる。例えば、実施例６に記載されているような結晶化されたＯＸＯは、可溶型の精製ＯＸＯに較べて、低分子混入物の量が少ない。いくつかの態様において、０〜１０ｋＤａ、１〜１０ｋＤａ、０．５〜５ｋＤａ、２〜５ｋＤａの（マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって）測定された質量を持つ混入物が、結晶型から選択的に排除される。例えば、濾過透析およびＳＰ−セファロースによって精製され、実施例６の（ａ）の部分に記載された大規模結晶化処理法によって結晶化されたＯＸＯのＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析によって、約２．５、３．０、３．７、３．８、４．０、４．２、および５．０ＫＤａの測定分子量を持つ混入物が、結晶化によって実質的に除去されることが実証されている。結晶化による精製は、例えば、発酵用媒体を含む粗シュウ酸オキシダーゼを用いて行うこともできる。
【００４４】
シュウ酸オキシダーゼの結晶化
シュウ酸オキシダーゼの結晶は、上記したような六量体などのＯＸＯポリペプチドを用いて調製することができる。Ｗｏｏら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４３７：８７−９０（１９９８）；Ｗｏｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：１０３６−１０４０（２０００）参照。例えば、蒸気拡散法（例えば、ハンギングドロップ法およびシッティングドロップ法など）、および結晶化のバッチ法を用いることができる。シュウ酸オキシダーゼ結晶は、タンパク質の制御結晶化法によって、水溶液、または有機溶媒を含む水性溶液から成長することができる。制御される条件は、例えば、溶媒の蒸発速度、適当な共存溶質の存在、ならびにバッファー、ｐＨ、および温度などである。
【００４５】
シュウ酸レベルに関係する症状または疾患を治療するなど、治療用に投与するには、様々なＯＸＯ結晶サイズが適している。一定の実施形態において、平均寸法が約５００μｍよりも小さな結晶が投与される。また、長さが約０．０１、０．１、１、５、１０、２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１０００μｍの（例えば）平均寸法、最大寸法、または最小寸法を持つシュウ酸オキシダーゼ結晶も提供される。微結晶シャワー（ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｓｈｏｗｅｒ）も適当である。
【００４６】
範囲は適当であり、当業者に明らかであろう。例えば、タンパク質結晶は、約０．０１μｍと約５００μｍとの間に、あるいは約０．１μｍと５０μｍとの間に最も長い寸法を有し得る。特定の実施形態において、最も長い寸法の範囲は、約０．１μｍから約１０μｍである。また、結晶は、球状、針状、棹状、六角形および正方形などのプレート状、ひし形、立方体、および角柱状から選択された形も有し得る。例示的な実施形態において、この結晶は、最長寸法が５μｍよりも短い立方体である。例えば、図５〜７参照。
【００４７】
通常、結晶は、結晶化すべきタンパク質を適当な水性溶媒、または、塩や有機溶媒など適当な結晶化剤を含む水性溶媒と組み合わせることによって生成される。この溶媒をタンパク質と混合して、任意には、結晶を誘導するのに適し、かつタンパク質の活性および安定性を維持するのに適していると実験的に決定された温度で撹拌を行う。この溶媒は、任意で、２価陽イオン、補助因子、またはカオトロープなどの共存溶質、ならびにｐＨを調節するためのバッファー種を含むことができる。結晶化を容易にするための共存溶質およびそれらの濃度についての必要性は実験的に決定する。工業規模での処理法においては、タンパク質、沈殿剤、共存溶質、および、任意には、例えば、バッチ処理ではバッファーを組み合わせることによって、結晶化をもたらす制御された沈殿を行うことができる。透析または蒸気拡散法など、実験室における別の結晶化法および結晶化条件を用いることもできる（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１４：１１２−２０（１９８５）およびＧｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｊ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ９０：５１−５９（１９９８））。時には、架橋剤と結晶化媒体との間に不適合があって、架橋する前にバッファー（溶媒）を変える必要があるかもしれない。
【００４８】
実施例に示したように、シュウ酸オキシダーゼは、広いｐＨ範囲（例えば、ｐＨ３．５から８．０など）を含む、多くの条件下で結晶化する。いくつかの実施形態では、低分子ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ２００など）などの沈殿剤、または２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）などの共溶媒が含まれる。また使用することができる一般的な塩は塩化ナトリウムおよび酢酸亜鉛である。
【００４９】
シュウ酸オキシダーゼは、結晶化溶液中で、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍｇ／ｍｌ、またはそれ以上の濃度にすることが可能である。結晶化反応の効率または收率は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上である。一つの実施形態において、シュウ酸オキシダーゼの結晶は、バッチ法により、シュウ酸オキシダーゼの溶液を適当なバッファーと混合することによって成長し、生成される。一定の実施形態において、バッファーは６５ｍＭのクエン酸−リン酸バッファー、ｐＨ３．５、および２８．５％のＰＥＧ６００である。
【００５０】
安定化結晶
適当な媒体中でシュウ酸オキシダーゼが成長したところで、任意には、架橋するなどして安定化させることができる。架橋によって、結晶の構成タンパク質分子の間に共有結合が導入されることにより、結晶格子の安定化がもたらされる。こうすることによって、これ以外では結晶格子の存在に不適合であるか、さらには、本来のタンパク質が存在するのにも不適合であるかもしれない代替環境にタンパク質を移入することが可能になる。シュウ酸オキシダーゼ結晶は、例えば、リジンアミン基、チオール（スルフヒドリル）基、および炭水化物成分を介して架橋することができる。架橋された結晶も、本明細書ではＣＬＥＣ  ＯＸＯまたはＣＬＣと呼ぶ。
【００５１】
架橋された結晶は、酵素の安定性（例えば、ｐＨ、温度、機械、および／または化学的安定性）、ＯＸＯ活性のｐＨの特徴、可溶性、結晶の大きさまたは体積の均一性、結晶からの酵素の放出速度、および／または下層にある結晶格子中の各酵素分子間の孔の大きさおよび形状を変え得る。
【００５２】
好都合には、本発明による架橋または安定化は、結晶が、未改変のＯＸＯと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％、もしくは９９．９％、またはそれ以上の活性を示すＯＸＯを含むようなやり方で行われる。安定性は、未改変のＯＸＯと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、またはそれ以上増加させることができる。安定性は、例えば、ｐＨ安定性、温度安定性、腸プロテアーゼに対する安定性、溶解安定性、およびインビボにおける生体安定性などの貯蔵条件下で測定することができる。
【００５３】
一定の場合に、架橋すると、結晶状態のＯＸＯポリペプチドの溶液への溶解が遅くなり、タンパク質分子を微結晶粒子の中に効果的に固定する。架橋タンパク質結晶のまわりの環境中、例えば、貯蔵条件ではなく使用条件下で、開始剤に曝露されると、タンパク質分子がゆっくりと溶解し、活性型ＯＸＯポリペプチドを放出するか、および／またはＯＸＯ活性を上昇させる。この溶解速度は、例えば、以下の因子の一つ以上によって調節される：架橋の程度、タンパク質の結晶を架橋剤に曝露する時間の長さ、架橋剤をタンパク質結晶に添加する速度、架橋剤の性質、架橋剤の鎖長、ｐＨ、温度、システイン、グルタチオンのようなスルファヒドリル（ｓｕｌｆａｈｙｄｒｙｌ）試薬の存在、架橋されたタンパク質結晶の表面積、架橋されたタンパク質結晶の大きさ、および架橋されたタンパク質結晶の形。
【００５４】
架橋は、多官能性剤など、多種多様な架橋剤の一つまたは組合せたものを用いて、同時（並行して）に、または連続して行うことができる。周囲の環境中に存在する開始剤に曝露されると、または一定の時間をかけて、そのような多官能性剤と架橋したタンパク質結晶間の架橋が低下または弱体化して、タンパク質溶解または活性の放出がもたらされる。あるいは、結合点で架橋が崩壊して、タンパク質溶解または活性の放出がもたらされる。米国特許第５，９７６，５２９号および第６，１４０，４７５号を参照。
【００５５】
いくつかの実施形態において、架橋剤は、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上の活性部分を有する多官能性の架橋剤である。様々な実施形態において、この薬剤は、グルタルアルデヒド、スクシンアルデヒド、オクタンジアルデヒド、グリオキサール、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオン酸）、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオン酸）、ジメチル３，３’−ジチオビスプロプリオンイミデートＨＣｌ、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸、ヘキサメチレンジアミン、ジアミノオクタン、エチレンジアミン、無水コハク酸、無水フェニルグルタル酸、サリチルアルデヒド、アセトイミデート、ホルマリン、アクロレイン、コハク酸セミアルデヒド、ブチルアルデヒド、ドデシルアルデヒド、グリセルアルデヒド、およびトランス−オクタ−２−エナルから選ぶことができる。
【００５６】
さらに別の多官能性架橋剤には、例えば塩化シアヌルなどのハロトリアジン類；例えば２，４，６−トリクロロ／ブロモピリミジンなどのハロピリミジン類；例えば無水マレイン酸、塩化（メタ）クリロイル、塩化クロロアセチルなどの脂肪族もしくは芳香族のモノカルボン酸もしくはジカルボン酸の無水物またはハロゲン化物；例えばＮ−メチロイルクロロアセトアミドなどのＮ−メチロール化合物；例えばフェニレン−１，４−ジ−イソシアネートなどのジイソシアネート類またはジイソチオシアネート、およびアジリジン類などがある。その他の架橋剤には、例えば、ジエポキシド、トリエポキシド、およびテトラエポキシドなどのエポキシド類がある。本発明の一つの実施形態において、架橋剤は、二官能性薬剤であるグルタルアルデヒドであり、グルタルアルデヒドは、単独、またはエポキシドと連続して使用される。別の架橋試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社の１９９６年のカタログ参照）を同時に（並行して）、または、下記に記載するような可逆的架橋剤と連続して使用することもできる。
【００５７】
本発明の代替的な実施形態によれば、可逆的架橋剤を用いて、並行して、または連続して架橋を行うことができる。得られた架橋タンパク質結晶は、反応性の多官能性架橋剤によって特徴づけられ、その中にトリガーが別の基として取り込まれている。反応性官能基は、反応性のアミノ酸側鎖を一緒に結合してタンパク質にすることに関与し、トリガーは、周囲の環境の条件（例えば、ｐＨ、還元剤の存在、温度、または水の熱力学的活性）の一つ以上を変えることによって破壊され得る結合からなる。
【００５８】
架橋剤は、同種官能性であっても、異種官能性であってもよい。反応性官能基（または部分）は、例えば、以下の官能基の一つから選ぶことができる（但し、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、およびＲ’’’は、アルキル基、アリール基、または水素基であってよい）：
Ｉ．反応性アシル供与体、例えば：カルボン酸エステルＲＣＯＯＲ’、アミドＲＣＯＮＨＲ’、アジ化アシルＲＣＯＮ３、カルボジイミドＲ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’、Ｎ−ヒドロキシイミドエステル、ＲＣＯ−Ｏ−ＮＲ’、イミドエステルＲ−Ｃ＝ＮＨ２＋（ＯＲ’）、無水物ＲＣＯ−Ｏ−ＣＯＲ’、炭酸ＲＯ−ＣＯ−Ｏ−Ｒ’、ウレタンＲＮＨＣＯＮＨＲ’、酸ハロゲン化物ＲＣＯＨａｌ（但し、Ｈａｌ＝ハロゲン）、アシルヒドラジドＲＣＯＮＮＲ’Ｒ’’、およびＯ−アシルイソウレアＲＣＯ−Ｏ−Ｃ＝ＮＲ’（−ＮＲ’’Ｒ’’’）など。
【００５９】
ＩＩ．反応性カルボニル基、例えば：アルデヒドＲＣＨＯ、およびケトンＲＣＯＲ’、アセタールＲＣＯ（Ｈ２）Ｒ’、ケタールＲＲ’ＣＯ２Ｒ’Ｒ’’など（タンパク質固定および架橋の技術分野における当業者に知られている反応性カルボニル含有官能基は、文献に記載されている（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ．（１９９４）；Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９９１））；
ＩＩＩ．アルキル供与体またはアリール供与体、例えば：ハロゲン化アリキルまたはハロゲン化アリールＲ−Ｈａｌ、アジドＲ−Ｎ３、硫酸エステルＲＳＯ３Ｒ’、リン酸エステルＲＰＯ（ＯＲ’３）、アルキルオキソニウム塩Ｒ３Ｏ＋、スルホニウムＲ３Ｓ＋、硝酸エステルＲＯＮＯ２、マイケル受容体ＲＣＲ’ＣＲ’’’ＣＯＲ’’、フッ化アリールＡｒＦ、イソニトリルＲＮ＋≡Ｃ−、ハロアミンＲ２Ｎ−Ｈａｌ、アルケン、およびアルキン；
ＩＶ．硫黄含有基、例えば：ジスルフィドＲＳＳＲ’、スルフヒドリルＲＳＨ、およびエポキシド
【００６０】
【化１】
2009501136.tif 000002
；および
Ｖ．塩類、例えば：アルキルアンモニウム塩もしくはアリールアンモニウム塩Ｒ４Ｎ＋、カルボン酸ＲＣＯＯ−、硫酸ＲＯＳＯ３−、リン酸ＲＯＰＯ３−およびアミンＲ３Ｎ−など。
【００６１】
可逆的架橋剤は、例えば、トリガーを含む。トリガーは、架橋すべきタンパク質と反応することができる活性化基をもつアルキル鎖、アリール鎖、またはその他の鎖を含む。これらの反応基は、求核置換、フリーラジカル置換、または求電子置換に対して感受性の基など、とりわけ、ハロゲン化物、アルデヒド、カーボネート、ウレタン、キサンタン、エポキシドなど、様々な基であり得る。例えば、反応性基は、酸、塩基、フッ化物、酵素、還元、酸化、チオール、金属、光分解、ラジカル、または熱に対して不安定であってよい。
【００６２】
可逆的架橋剤のさらなる例が、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｅｄｓ．）（１９８１）に記載されている。可逆的保護基に使用される様々な方法が、可逆的で制御された可溶化を行うことができる架橋されたタンパク質結晶を製造するのに適した架橋剤に取り込むことができる。様々なアプローチが、本題に関するＷａｌｄｍａｎｎの概説、Ａｎｇｅｗａｎｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３５：２０５６（１９９６）に列挙されている。
【００６３】
別のタイプの可逆的架橋剤は、ジスルフィド結合含有架橋剤である。このような架橋剤によって形成される、トリガー破壊架橋（ｔｒｉｇｇｅｒ  ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ）は、架橋したタンパク質結晶の環境にシステインなどの還元剤を付加することである。ジスルフィド架橋剤の例は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（１９９４−１９９５）に記載されている。このような架橋剤と方法の例は、米国特許第６，５４１，６０６号に記載されており、その関連部分が、参照して本明細書に組み込まれる。
【００６４】
また、炭水化物部分間、または炭水化物部分とアミノ酸との間を架橋する架橋剤を使用することもできる。
【００６５】
架橋結晶を形成させるには、架橋剤の濃度は、溶液中で、０．５％、１％、２％、３％、３．５％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、または２０％ｗｔ／ｖであり得る。架橋する前にバッファーを交換する必要であり得る。ＣＬＥＣなどの結晶は、任意で、凍結乾燥させるか、あるいは製剤することができる。
【００６６】
架橋結晶などの結晶、および本明細書記載のこれらの結晶および架橋結晶を含む組成物は、本明細書記載に記載されている、治療法およびシュウ酸レベルを低下させる方法において有用である。ＯＸＯ結晶、架橋結晶、および組成物も、工業工程に関係する方法（例えば、合成、加工、バイオレメディエーション、消毒、滅菌など）、および、植物菌感染など、例えば、Ｓｖｅｄｒｕｚｉｃら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．４３３：１７６−１９２（２００５）で概説されているような植物の処理法においても有用である。可溶性または非晶質のＯＸＯの治療以外の用途が、例えば、米国特許第５，８６６，７７８号、第６，２１８，１３４号、第６，２２９，０６５号、第６，２３５，５３０号、および第６，５０３，５０７号に記載されている。本明細書記載の結晶は、シュウ酸オキシダーゼ酵素の安定性が増すなど、上記記載の安定化されたＯＸＯ結晶の一つ以上の性質に基づいて、これらの用途に使用することができる。
【００６７】
組成物
架橋結晶などのＯＸＯ結晶は、医薬組成物などの組成物として提供される（例えば、タンパク質の結晶の製剤および組成物について記載されている、米国特許第６，５４１，６０６号参照）。ＯＸＯ結晶を含む医薬組成物は、ＯＸＯ結晶を、糖類および生体適合性ポリマーなど、一つ以上の成分または賦形剤とともに含む。賦形剤の例は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎとｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎによって共同出版されたＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓに記載されているが、さらなる例を下記に示す。
【００６８】
ＯＸＯ酵素は、多様な生理学的に許容される塩のいずれかの形態で、および／または医薬組成物の一部である許容される薬学的担体および／または添加剤とともに、組成物中の結晶として投与することができる。生理学的に許容される塩の形態、および標準的な医薬製剤技術、および賦形剤は、当業者に周知されている（例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ）２００３，５７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，２００２；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，ｅｄｓ．Ｇｅｎｎａｄｏら、２０ｔｈ  ｅｄ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００参照）。本出願の目的上、「製剤」は「結晶製剤」を含む。
【００６９】
本発明の方法において有用なシュウ酸オキシダーゼは、賦形剤と組み合わせることができる。本発明によれば、「賦形剤」は、医薬組成物中で使用される充填剤または充填剤の混合物として働く。組成物中で使用するための成分および賦形剤の例は、以下に示すとおりである。
【００７０】
生体適合性ポリマー、すなわち、非抗原性（アジュバントとして使用しない場合）、非発癌性、非毒性のポリマーであって、その他の点でも生体と不適合ではないポリマーを、本明細書記載のＯＸＯ結晶組成物に使用することができる。例には、ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（乳酸）またはＰＬＡなどのポリ（エステル）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）またはＰＬＧＡ、ポリ（β−ポリヒドロキシ酪酸）、ポリ（カプロラクトン）、およびポリ（ジオキサノン）；ポリ（エチレングリコール）、ポリ（（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）、ポリ［（オルガノ）ホスファゼン］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテルコポリマー、多価ポリオール、アルブミン、アルギン酸、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖類、グリコアミノグリカン、硫酸化多糖類、これらの混合物およびコポリマーなどがある。
【００７１】
生物分解性ポリマー、すなわち、加水分解または可溶化によって分解するポリマーを、ＯＸＯ結晶化合物に含ませることができる。分解は不均一、すなわち、まず粒子の表面で起きてよく、または均一、すなわち、ポリマー基質全体にわたって一律に分解されてよい。
【００７２】
１種類以上の賦形剤などの成分、または薬学的な成分または賦形剤を、ＯＸＯ結晶化合物に含ませることができる。成分は、不活性な成分であっても、活性型成分であってもよい。
【００７３】
シュウ酸塩関連疾患をＯＸＯ結晶によって治療する方法
本発明の方法は、シュウ酸レベルの増加に関連する症状を治療または予防し、またはそのような症状が発生するリスクを低下させるために、シュウ酸オキシダーゼを哺乳動物被検体に投与することを含む。シュウ酸レベルの上昇は、例えば、尿、血液、血清、または血漿などの体液など、被検体から得た生体試料で検出することができる。一定の実施形態において、尿中シュウ酸レベルを検出する。結晶および／または結晶含有組成物を、本明細書記載の方法で投与することができる。
【００７４】
いくつかの実施形態において、原発性高シュウ酸尿症、腸性高シュウ酸尿症、外科的介入に起因する高シュウ酸尿症、特発性高シュウ酸尿症、シュウ酸症などを患う個体における高シュウ酸尿症を治療するための方法が提供される。別の例では、腎臓、骨、肝臓消化管、および膵臓の高シュウ酸塩関連疾患が、本明細書に開示された方法による治療に適している。さらに、本明細書で提供されている方法によって治療できる更なる疾患または病気には、エチレングリコール（シュウ酸）中毒、特発性尿結石症、腎不全（進行性、慢性、または末期の腎不全など）、脂肪便、吸収不全、回腸切除、外陰部痛、心臓伝導疾患、炎症性腸疾患、嚢胞性線維症、膵外分泌機能不全、クローン病、潰瘍性大腸炎、腎石灰沈着症、骨粗しょう症、尿石症、および腎石症などがある。このような症状および疾患は、任意には急性または慢性であり得る。
【００７５】
本発明の方法は、被検体におけるシュウ酸レベルを、無処理または対照用の被検体でのレベルと較べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上低下させることができる。いくつかの実施形態において、被検体におけるシュウ酸レベルを、ＯＸＯを投与する前後で比較することによって低下を測定する。いくつかの実施形態において、本発明は、シュウ酸に関係した症状または疾患を治療または改善して、症状または疾患の一つ以上の病徴を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上改善させる方法を提供する。一定の実施形態において、本方法は、内生シュウ酸のレベルおよび／または食事性シュウ酸の吸収を低下させる。
【００７６】
いくつかの実施形態において、例えば、アラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ、グリオキシル酸還元酵素／ヒドロキシピルビン酸還元酵素、肝臓グリコール酸オキシダーゼ、またはシュウ酸代謝に関与するか、高シュウ酸尿症に関連する別の酵素などの活性を低下させる突然変異体についてホモ接合またはヘテロ接合の個体など、高シュウ酸症に関連する遺伝子型をもつ個体を治療する方法が提供される。別の実施形態において、シュウ酸分解菌（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ）の腸内コロニー形成が少ないか、全くない個体を治療する方法が提供される。
【００７７】
開示された方法は、治療上有効な量のシュウ酸オキシダーゼを、シュウ酸レベルの増加に関連した症状を発症する危険があるか、それに感受性があるか、それに苦しんでいる哺乳動物被検体に投与することを含む。本発明の方法によって治療できる集団は、例えば、原発性高シュウ酸尿症または腸性高シュウ酸尿症などのシュウ酸塩関連疾患を患っているか、それを発症する危険のある被検体などであるが、それらに限定されない。
【００７８】
本発明の方法によって治療される被検体は、ヒト、ヒト以外の霊長類、霊長目の動物、ヒヒ、チンパンジー、サル、齧歯類（例えば、マウスやラット）、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどであるが、これらに限定されない。
【００７９】
適応、病徴、および病気の指標
多くの方法が、シュウ酸塩関連疾患またはシュウ酸レベルの増加に関連した症状の発症または進行を判定するために利用できる。このような疾患には、上記したような症状、病気、または疾患が含まれるが、それらに限定されない。シュウ酸塩関連疾患の発症または進行は、例えば、尿中シュウ酸、血漿中シュウ酸を測定することによって、腎臓または肝臓の機能を測定することによって、または、シュウ酸カルシウムの沈着を検出することによって判定することができる。
【００８０】
例えば、尿試料中、またはその他の生体試料もしくは体液の中のシュウ酸塩濃度を検出または測定することによって、症状、病気、または疾患を同定することができる。高シュウ酸尿症の初期の病徴は、典型的には腎臓結石であるが、これは、重度または突然の腹痛または側腹痛、血尿、頻繁な尿意、排尿時の痛み、または発熱および悪寒を伴うことがある。腎臓結石は症状を示すこともあるが、無症状のこともあり、例えば、ｘ線、超音波、またはコンピュータ断層撮影（ＣＴ）法によって腹部を画像化することによって可視化することができる。高シュウ酸症を抑制できないと、腎臓が損傷されて、腎臓の機能が低下する。腎臓が機能不全になることもある。腎不全（および腎機能低下）は、排尿（糸球体ろ過量）の減少または排尿停止、全身違和感、疲労感、および顕著な倦怠感、吐き気、嘔吐、貧血、および／または幼児における正常な発達および成長の不全によって同定することができる。他の組織や器官におけるシュウ酸カルシウム沈着も、直接可視化（例えば、目視で）、ｘ線、超音波、ＣＴ、心エコー図、または生検（例えば、骨、肝臓、または腎臓）などの方法によって検出することができる。
【００８１】
シュウ酸塩濃度だけでなく、腎臓および肝臓の機能も、周知の直接アッセイ法および間接アッセイ法を用いて判定することができる。尿、血液、または他の生体試料の化学物質含有量を、周知技術によって試験することもできる。例えば、シュウ酸、グリコール酸、およびグリセリン酸レベルを測定することができる。肝臓および腎臓の機能のアッセイ法は周知されており、例えば、酵素欠損について肝臓組織を分析したり、シュウ酸沈着について腎臓組織を分析したりする。また、原発性高シュウ酸尿症の原因となることが知られているＤＮＡの変化について、試料を試験することもできる。
【００８２】
他の治療の適応は、既に検討されていて、以下の節で検討されている危険因子など、一つ以上の危険因子が存在することを含むが、それに限定されない。症状、病気、または疾患を発症させるリスクがあるか、それに感受性のある被検体、または、シュウ酸オキシダーゼによる治療に対して特に受容的である可能性のある被検体を、そのような危険因子、診断指標、または予後指標の一つ以上の有無を確認することによって同定することができる。同様に、シュウ酸塩関連疾患を発症するリスクをもつ個体を、一つ以上の遺伝子マーカーまたは表現型マーカーを分析することによって同定することができる。
【００８３】
開示された方法は、２４時間当り少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、または４００ｍｇ、またはそれ以上の尿中シュウ酸レベルになる被検体において有用である。一定の実施形態において、シュウ酸レベルは、一つ以上の病徴または病理に関係する。シュウ酸レベルは、血液、血清、血漿、または尿を含む体液などの生体試料において測定することができる。任意には、シュウ酸を、尿中クレアチンなど、標準的なタンパク質または物質に対して標準化する。いくつかの実施形態において、本願の方法は、シュウ酸オキシダーゼを投与して、１、３、５、７、９、１２、または１５日以内に、被検体における循環液中のシュウ酸レベルを検出不能レベルまで、または、治療前の被検体におけるシュウ酸レベルの１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％以下に低下させることを含む。
【００８４】
ヒトの高シュウ酸尿症は、一日あたり４０ｍｇ（約４４０μｍｏｌ）または３０ｍｇよりも多い尿中シュウ酸排出量があることで特徴付けることができる。臨床的カットオフレベルの例は、例えば、男性では４３ｍｇ／日（約４７５μｍｏｌ）、また女性では３２ｍｇ／日（約３５５μｍｏｌ）である。また、高シュウ酸尿症は、１グラムの尿中クレアチンにつき一日当り３０ｍｇよりも多い尿中シュウ酸排出があることと定義することもできる。軽度の高シュウ酸尿症の人は、一日当り少なくとも３０〜６０または４０〜６０ｍｇのシュウ酸を排出し得る。腸性高シュウ酸尿症の人は、例えば、一日当り少なくとも８０ｍｇの尿中シュウ酸を排出し得、また、原発性高シュウ酸尿症の人は、一日当り少なくとも２００ｍｇを排出し得る。（Ｓｈｅｋａｒｒｉｚ，ｗｗｗ．ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｃｏｍ／ｍｅｄ／ｔｏｐｉｃ３０２７．ｈｔｍ）参照。
【００８５】
化合物および組成物の投与
本発明の方法に従ってシュウ酸オキシダーゼを投与するのは、特定の送達系に限られるものではなく、上部消化管、例えば、口（例えば、カプセル、懸濁液、錠剤にして、または食物と一緒に）もしく胃を経由して、または上部腸を経由して（例えば、チューブまたは注射によって）投与して、各個体のシュウ酸レベルを低下させることを含む。一定の実施形態では、内生シュウ酸レベルおよび／または濃度を低下させるためにＯＸＯを投与する。また、ＯＸＯは、透析装置、または各個体からの生体試料に接触する構造物ないし装置などの体外装置によって提供することもできる。
【００８６】
各個体への投与は、単回投与で行うことも、反復投与で行うこともでき、多様な生理学的に許容される形態のいずれかで行うことができ、および／または医薬組成物の一部として許容される医薬用担体および／または添加剤（上記）とともに行うこともできる。開示された方法では、シュウ酸オキシダーゼを単独で投与し得、一種類以上の付加的生物活性剤、例えば、ピリドキシン（ビタミンＢ−６）、オルトリン酸、マグネシウム、グリコサミノグリカン、カルシウム、鉄、アルミニウム、マグネシウム、クエン酸カリウム、コレスチラミン、有機海洋性ハイドロコロイド（ｏｒｇａｎｉｃ  ｍａｒｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄ）、例えば、バナナの茎のジュースもしくはビートのジュースなどの植物ジュース、またはＬ−システインなどともに、重複または非重複する一定間隔の期間にわたって同時並行して、または連続的に投与したりすることができる。シュウ酸レベルを低下させるか、またはＯＸＯの活性または利用可能性を増加させる生物活性剤が提供される。連続投与法では、シュウ酸オキシダーゼおよび付加的薬剤をどのような順序で投与してよい。いくつかの実施形態において、重複する期間の長さは２週間、４週間、６週間、１２週間、２４週間、４８週間、またはそれ以上であってよい。
【００８７】
シュウ酸オキシダーゼは、単独の活性化合物として、または別の活性化合物または組成物と一緒に投与することができる。別段の記載がない限り、シュウ酸オキシダーゼは、病気の症状の重篤度および進行に応じて、約１０μｇ／ｋｇから２５ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。ＯＸＯの適当な治療上有効量は、治療に当たる臨床医によって選択され、その範囲は約１０μｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇから１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇから２５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇから２５ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇから２５ｍｇ／ｋｇであり得る。さらに、実施例またはＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ）２００３，５７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，２００２に記載されている具体的な投薬量を用いることもできる。
【００８８】
以下の実施例は、本発明の例示的な実施形態を提供する。当業者には、本発明の趣旨および範囲を変更せずに実施することができる数多くの修正および改変があることが分かっているはずである。そのような修正および改変は、本発明の範囲に含まれる。本実施例は、いかなる意味でも、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００８９】
（実施例１：シュウ酸オキシダーゼの組換え体の作製）
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞において：ＯＸＯをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターにクローニングする。配列を確認した後、ベクターを直鎖状にし、予め播種しておいてＨＥＫ２９３細胞への、直鎖状にしたベクターの形質転換を、直径６ｃｍの培養皿の中で、商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００トランスフェクション試薬を用いて行うことができる。適当な媒体で形質転換を行った後ほぼ一晩培養してから、０．５ｇ／Ｌのネオマイシンを添加した培地の中で形質転換体を選択する。ネオマイシン含有媒体の中で最長３週間増殖させた後、安定的に形質転換されたＨＥＫ２９３細胞のクローンを同定する。そして、クローンを単離して増殖させ、ＯＸＯ発現に用いる。
【００９０】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において：ＯＸＯ遺伝子をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターにクローニングする。次に、培養ＣＨＯｌｅｃ３．２．８．１細胞を、トリプシン分解によって剥離し、遠心分離によって採取した。そして、細胞を、エレクトロポレーションリン酸緩衝化生理食塩水バッファー（ＥＰＢＳ）に、最終濃度が約１×１０７／ｍｌになるよう懸濁し、直鎖状にしたベクターを用いてエレクトロポレーションにより形質転換する。一晩培養した後、媒体を０．５ｇ／Ｌのネオマイシンを添加した媒体に交換し、適当な形質転換ＣＨＯ細胞クローンをスクリーニングするために媒体を交換し続ける。安定した形質転換細胞クローンが確立し、増殖されたら、これらの細胞をＯＸＯ発現に用いる。
【００９１】
ピキア・パストリスにおいて：ＯＸＯ遺伝子をコードするＤＮＡ、例えば、配列番号：１を適当な発現ベクターにクローニングする。配列を確認した後、ベクターを直鎖状にしてから、ピキア・パストリス宿主細胞に形質転換することができる（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７：１３６−１４５（２００２）参照）。形質転換体をゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）で選択し、緩衝化グリセロール複合媒体（ＢＭＧＹ）で展開して、メタノールで誘導する。そして、培養媒体からＯＸＯを単離することができる。
【００９２】
出芽酵母において：上記の合成ＯＸＯ遺伝子を、例えば、Ｇａｌ１プロモーター（ｐＧａｌ）および発現用ターミネーターを含む適当な発現ベクターの中にクローニングすることもできる。配列を確認した後、発現ベクターを、形質転換受容能を持つ出芽酵母Ｗ３０３−１の中にエレクトロポレーションによって形質転換する。ＯＸＯ発現に用いる前に、形質転換体をスクリーニングして増殖させる。
【００９３】
昆虫細胞において：ＯＸＯをコードするＤＮＡは、例えば、バキュロウイルス系など適当な発現ベクターにクローニングすることができる。配列を確認した後、ベクターを、形質転換受容能を持つＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌細胞中に形質転換することができ、組換えバクミド（ｂａｃｍｉｄ）を含む大腸菌細胞をスクリーニングして確認する。組換えバクミドＤＮＡを単離し、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ試薬などの試薬を用いてＳｆ９昆虫細胞を形質転換するために使用する。そして、組換えバキュロウイルス粒子を単離し、増殖させ、力価調整した後、ＯＸＯ発現用のＳｆ９細胞に感染させるために使用することができる。
【００９４】
大腸菌において：ＯＸＯをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターにクローニングする。配列を確認した後、ベクターを、形質転換受容能をもつ大腸菌ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）に形質転換するが、この菌株内では、発現された組換えタンパク質でジスルフィド結合の形成が可能になる。抗生物質を含む栄養培地皿上で形質転換体を増殖させて、形質転換体を選択し、ＯＸＯ遺伝子特異的プライマーを用いたコロニーＰＣＲによって確認する。そして、形質転換体を液体媒体中で培養し、ＯＸＯを発現させるためにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導する。
【００９５】
（実施例２：ＯＸＯの精製）
５Ｌのプールした発現媒体［由来は？］からＯＸＯを精製し、２０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に対して濾過透析した。発現培地を１０倍に濃縮した後、１００ｍｌのＤＥ５２陰イオン交換樹脂の５０％スラリーを加えて、混合物を４℃で１時間撹拌した。シュウ酸オキシダーゼは、遠心分離によって分離したＤＥ５２樹脂には結合しない。次に、この培地を５０ｍＭのコハク酸バッファー（ｐＨ４．５）に対して濾過透析した。そして、濾過透析された調製物を、ＳＰセファロース（商標）陽イオン交換カラムに充填して、そこから、５０ｍＭコハク酸バッファー中の１Ｍ硫酸アンモニウムの直線的濃度勾配によって結合ＯＸＯを溶出させた。シュウ酸オキシダーゼ活性について各画分を測定し、活性画分をプールした。表１参照。
【００９６】
【化２】
2009501136.tif 000003
酵母発現媒体から精製されたオオムギ由来の組換えシュウ酸オキシダーゼは、標準的な測定条件下（実施例１１）で約７〜１２Ｕ／ｍｇの比活性を示す。
【００９７】
（実施例３：ＯＸＯの精製（大規模））
方法Ａ：４００Ｌの酵母培養物からの発現媒体を、２０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に対して濾過透析して、約２０Ｌの容量に濃縮した。濃縮した媒体は、精製するまで凍結して保存した。シュウ酸オキシダーゼの精製は、９５６０ｍｌの濃縮した発現媒体を５０ｍｌのクエン酸リン酸バッファー（ｐＨ４．０）に対して濾過透析し、その後の濃度を２５２０ｍｌの容量になるよう実施した。この工程で沈殿するタンパク質の混入物を遠心分離によって除去した。この上清を０．２２μｍのフィルターで濾過した後に５×４５ｃｍのＳＰセファロース（商標）陽イオン交換カラムに充填した。結合したＯＸＯを、総容量の６倍を超える５０ｍＭクエン酸リン酸バッファー（ｐＨ８．０）の０〜１００％の直線的濃度勾配によって溶出させた。この２段階処理法によって、５３％の收率で、４．７ｇを上回る精製シュウ酸オキシダーゼが得られた。この精製処理を表２に要約した。精製されたＯＸＯは、１０．７Ｕ／ｍｇの比活性を有する。
【００９８】
【化３】
2009501136.tif 000004
方法Ｂ：分泌された組換えシュウ酸オキシダーゼを含む無細胞発酵ブロスを、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）／セントラメイト（Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ）カセット、およびＰａｌｌマニフォールドを用いて、１６Ｌから約４Ｌに濃縮し、その後、５０ｍＭのクエン酸リン酸バッファー（ｐＨ４）で５倍に希釈した。この処理を４回繰り返した。媒体を最終容量である約６．５Ｌに濃縮してから、沈殿したタンパク質を分離するために９５００ｒｐｍで遠心分離した。上清を、蠕動ポンプを用いて、０．４５μｍのＳａｒｔｏｂｒａｎカプセルによって濾過して不要な破片を取り除いた。
【００９９】
濾過した上清を、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣ装置を用いて、５０ｍＭのクエン酸リン酸バッファー（ｐＨ４）で平衡化したＳＰセファロース（商標）カラム（１Ｌ包装総容量）に充填した。未結合のタンパク質を３カラム容量（ＣＶ）の５０ｍＭクエン酸リン酸バッファー（ｐＨ４．０）で洗浄した。直線のｐＨ勾配（ｐＨ４．０〜８．０）を流速２０ｍＬ／分で６ＣＶのコースにわたって実施して、５ｍＬの画分を回収した。シュウ酸オキシダーゼは、５０ｍＭのクエン酸リン酸バッファーにより約ｐＨ６．０のところで単一のピークとして溶出した。そして、２ＣＶの５０ｍＭクエン酸リン酸バッファー（ｐＨ８．０）でカラムを洗浄した。
【０１００】
溶出された画分を、実施例１５に記載したようにシュウ酸オキシダーゼ活性を測定して解析した。活性画分を２Ｌボトルにプールし、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  Ｂｉｏｍａｘ  １０  ＴＦＦ装置を用いて約４００ｍＬ（約２０ｍｇ／ｍＬ）に濃縮した。
【０１０１】
プールした画分の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、酵素活性をシュウ酸オキシダーゼ活性測定法によって測定した。５．３％の２−メルカプトエタノールを含む試料バッファー５μＬを加え、９９℃で５分間加熱して試料を変性させた。電気泳動を定電圧１２Ｖで約２時間行った。ゲルをクーマシーブルー染色法で染色し、Ｍｉｃｒｏｔｅｋ  ＳｃａｎＭａｋｅｒ  ４走査装置／Ａｄｏｂｅソフトウエアを用いて走査した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いてタンパク質の濃度を決定した。表３は、この精製法が非常に効率的で、回収率が７９％よりも高いことを示している。
【０１０２】
【化４】
2009501136.tif 000005
（実施例４：ＯＸＯの結晶化（蒸気拡散法））
ハンギングドロップ結晶化法：以下の市販されている低密度マトリックス結晶化キットを用いてハンギングドロップ結晶化実験を行った：Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ａｌｉｓｏ  Ｖｉｅｊｏ，ＣＡ）、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ２（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｗｉｚａｒｄ  Ｉ（Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｌａｎｄ，ＷＡ）、Ｗｉｚａｒｄ  ＩＩ（Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｃｒｙｏ  Ｉ（Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、およびＣｒｙｏ  ＩＩ（Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。
【０１０３】
６００μｌの試薬を各ウエルに入れた。３μｌの試薬を顕微鏡のカバーガラス上に分注して、３μｌのシュウ酸オキシダーゼを、できるだけ混合しないように試薬の液滴中に分注した。この６μｌの試薬およびシュウ酸オキシダーゼの液滴から最大５滴の滴下を行った。液滴はほとんど混合されていないため、その後（より小さな）液滴はそれぞれ、異なった未知のタンパク質対試薬の割合になっているため、短時間で結晶が得られる可能性が高まった。一晩室温でインキュベートした後、顕微鏡下で結晶についてハンギングドロップを調べた。表４に示すように、多数の結晶化条件が得られた。
【０１０４】
【化５】
2009501136.tif 000006
【０１０５】
【化６】
2009501136.tif 000007
【０１０６】
【化７】
2009501136.tif 000008
（実施例５：ＯＸＯの結晶化（マイクロバッチ法））
以下のいくつかの結晶化条件からマイクロバッチ法によってシュウ酸オキシダーゼを結晶化することができた。
【０１０７】
（ａ）Ａ２８０ｎｍで２７ｍｇ／ｍｌの濃度の２０μｌの精製したシュウ酸オキシダーゼを、０．１Ｍリン酸−クエン酸、ｐＨ４．２の中４０％のＰＦＧ６００からなる１０μｌの混合液と混合した。さらに１０μｌのＰＦＧ６００を加えて混合した。最後に、５μｌのグリセロールを加えて、念入りに混合した。結晶化が１０分以内に起きた。收率は７５％であった。沈殿はなかった。
【０１０８】
（ｂ）１００μｌのシュウ酸オキシダーゼ（２７ｍｇ／ｍｌ）を、０．１Ｍリン酸−クエン酸、ｐＨ４．２の中４０％のＰＦＧ６００からなる５５μｌの溶液と混合した。さらに２５μｌのＰＦＧ６００を加えて念入りに混合した。
【０１０９】
（ｃ）１００μｌのシュウ酸オキシダーゼ（２７ｍｇ／ｍｌ）を、０．１Ｍリン酸−クエン酸、ｐＨ４．２の中４０％のＰＦＧ６００からなる５０μｌの溶液と混合した。さらに３０μｌのＰＦＧ６００を加えて念入りに混合した。シュウ酸オキシダーゼの結晶立方体が２時間以内に発生した。
【０１１０】
（ｄ）シュウ酸オキシダーゼ（２７ｍｇ／ｍｌ）を、０．１Ｍクエン酸、ｐＨ４．５の中で４０％（ｖ／ｖ）のＰＦＧ３００からなる２０μｌの溶液と混合した。
【０１１１】
（ｅ）９．３４ｍｇ／ｍｌの濃度の６６．６μｌのシュウ酸オキシダーゼを、０．１Ｍ  ＭＥＳ、ｐＨ６．００の中４０％（ｖ／ｖ）のＰＦＧ４００、および５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ３０００からなる１３３．４μｌの溶液と混合した。
【０１１２】
（ｆ）２３．２５μｌのシュウ酸オキシダーゼ（４３ｍｇ／ｍｌ）に、１．６５μｌの１Ｍトリス、ｐＨ７．００を加えて混合し、その後、４．１５μｌの２Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５μｌの１００％グリセロール、１２μｌの１００％ＰＥＧ６００、７．４５μｌの水を段階的に加えて混合した。最終濃度：２０ｍｇ／ｍｌのシュウ酸オキシダーゼ、１６６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．３３Ｍのトリス、ｐＨ７．００、３％グリセロール、２４％ＰＥＧ６００、２０ｍｇ／ｍｌシュウ酸オキシダーゼ。
【０１１３】
（実施例６：ＯＸＯの結晶化（バッチ法））
バッチ結晶化法：以下のいくつかの結晶化条件からバッチ法によってシュウ酸オキシダーゼを結晶化することができた。
【０１１４】
（ａ）結晶化の条件は、１３．９ｍｇ／ｍｌのシュウ酸オキシダーゼ、６５ｍＭクエン酸−リン酸バッファー、ｐＨ３．５、および２８．５％ＰＦＧ６００。結晶は、５μｍよりも小さな大きさの立方体であった。
【０１１５】
（ｂ）１．１９μｌのシュウ酸オキシダーゼ（４３ｍｇ／ｍｌ）に段階的な方法で、０．３５μｌの１００％ＰＥＧ６００、０．１２μｌの２Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２０μｌの１Ｍトリス、ｐＨ７．００、および０．２６μｌの水を加えた。１時間以内に立方体の形をした結晶が現れた。
【０１１６】
大規模結晶化法：前臨床試験のための材料を供給するために、結晶化の規模を１５ｍｌのバッチに拡大した。
【０１１７】
（ａ）２１．５ｍｇ／ｍｌの濃度の１０ｍｌの精製したシュウ酸オキシダーゼを、２ｍｌの０．５Ｍクエン酸−リン酸バッファー、ｐＨ３．５０と混合した。４．７ｍｌの１００％のＰＦＧ６００を加えて、念入りに混合した。結晶化している溶液を、室温で一晩転倒撹拌した。收率は９４％であった。
【０１１８】
（ｂ）精製したＯＸＯを、４０％ＰＥＧ４００、０．１Ｍ  ＭＥＳ、ｐＨ６、５％ＰＥＧ３００を含む結晶化バッファーと１：２の割合で混合し、室温で一晩転倒撹拌した。この処理によって、菱形のＯＸＯ結晶が高い收率（＞７０％）で生成した。
【０１１９】
（ｃ）６５ｍＭクエン酸−リン酸バッファーｐＨ３．５中２．１５ｍｇ／ｍｌのＯＸＯを、２８．５％のＰＥＧ６００と混合して、室温に一晩放置した。
【０１２０】
実施例７Ａ：ＯＸＯ結晶の架橋
グルタルアルデヒドを用いて、シュウ酸オキシダーゼの結晶［由来は？］を架橋した。結晶化後、シュウ酸オキシダーゼ結晶を２０〜３０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。３．２ｍｌの２５％グルタルアルデヒドを２０ｍｌの結晶に加えて、４％グルタルアルデヒドの溶液を作り、結晶を室温にて１６℃で転倒撹拌した。架橋結晶を、１００ｍＭトリス、ｐＨ７．００で５回洗浄し、１０ｍＭトリス、ｐＨ７．００に再懸濁した。
【０１２１】
可溶性シュウ酸オキシダーゼおよびＣＬＥＣシュウ酸オキシダーゼの比活性を比較（６回試行）したところ、様々な調製物において、架橋シュウ酸オキシダーゼ結晶が、可溶性タンパク質の本来の活性の７０％以上から９５％以上を保持していることが明らかになった。
【０１２２】
実施例７Ｂ：シュウ酸オキシダーゼ結晶の架橋
実施例６（大規模法）に記載したように調製したシュウ酸オキシダーゼ結晶を、グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を加えて架橋した。シュウ酸オキシダーゼ結晶の１ｍｌの等量液（６０ｍｇ／ｍｌ）を、２５℃にて１２時間、ｐＨ４．２の様々な濃度のグルタルアルデヒド（最終濃度は０．０５％から２％）で架橋した。架橋された結晶をエッペンドルフチューブに入れて２０００ｒｐｍで遠心分離により分離し、１ｍｌの１００ｍＭトリス、ｐＨ７．０の中で架橋された結晶を再懸濁することによって架橋を停止させた。そして、ＣＬＥＣをｐＨ７．５の１００ｍＭトリスバッファーで５回洗浄した後、ｐＨ７．５の１０ｍＭトリスバッファーで３回洗浄した。
【０１２３】
実施例７Ｃ：架橋されたシュウ酸オキシダーゼの架橋結晶のｐＨ制御された可溶性
ｐＨを７．５から３．０まで低下させた後、様々な架橋シュウ酸オキシダーゼ結晶の可溶性を調べた。架橋結晶を、５０ｍＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ３）中で１ｍｇ／ｍｌにしてインキュベートした。３７℃で５時間撹拌しながらインキュベートした後、等量液を取り出した。非溶解の架橋結晶を２０００ｒｐｍで遠心分離により分離し、上清を０．２２μフィルターに通した後、ＯＤ２８０ｎｍで可溶性タンパク質の濃度を測定した。結果を下記の表５に示す。
【０１２４】
【化８】
2009501136.tif 000009
実施例７Ａの結果と合わせると、これは、実質的に安定したグルタルアルデヒドによるシュウ酸オキシダーゼ架橋結晶が、少なくとも約０．１％（最終濃度の）グルタルアルデヒドの存在下で形成されることを示している。好ましくは、少なくとも０．５％の最終濃度、また、より好ましくは、４％が用いられる。
【０１２５】
実施例７Ｄ：様々なｐＨにおける架橋シュウ酸オキシダーゼ結晶の安定性
実施例７Ｂに記載されているようにして調製されたシュウ酸オキシダーゼの結晶を、グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を加えて架橋した。シュウ酸オキシダーゼ結晶の１ｍｌの等量液（６０ｍｇ／ｍｌ）を、２５℃にて１２時間、ｐＨ４．２の１％グルタルアルデヒド（最終濃度）で架橋した。架橋された結晶をエッペンドルフチューブに入れて２０００ｒｐｍで遠心分離により分離し、１ｍｌの１００ｍＭトリス、ｐＨ７．０の中で架橋された結晶を再懸濁することによって架橋を停止させた。そして、ＣＬＥＣをｐＨ７．５の１００ｍＭトリスバッファーで５回洗浄した後、ｐＨ７．５の１０ｍＭトリスバッファーで３回洗浄した。
【０１２６】
２０ｍｇ／ｍｌの架橋シュウ酸オキシダーゼ結晶を３７℃で２つの異なったｐＨ２．０（５０ｍＭグリシンＨＣｌバッファー）および７．００（５０ｍＭトリスＨＣｌバッファー）にてインキュベートして、架橋シュウ酸オキシダーゼ結晶の安定性を調べた。様々な時間間隔で等量液を取り出して、実施例１１に記載したようにｐＨ３．８における活性を測定した。結果を表６に記す。
【０１２７】
【化９】
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実施例７Ｅ：架橋シュウ酸オキシダーゼ結晶のｐＨ活性のプロフィール
実施例７Ｂに記載されているようにして調製されたシュウ酸オキシダーゼ結晶を、グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を加えて架橋した。シュウ酸オキシダーゼ結晶の１ｍｌの等量液（６０ｍｇ／ｍｌ）を、２５℃にて１２時間、ｐＨ４．２の４％グルタルアルデヒド（最終濃度）で架橋した。架橋された結晶をエッペンドルフチューブに入れて２０００ｒｐｍで遠心分離により分離し、１ｍｌの１００ｍＭトリス、ｐＨ７．０の中で架橋された結晶を再懸濁することによって架橋を停止させた。そして、ＣＬＥＣをｐＨ７．５の１００ｍＭトリスバッファーで５回洗浄した後、ｐＨ７．５の１０ｍＭトリスバッファーで３回洗浄した。以下の様々なバッファーおよびｐＨを用いて、実施例１１に記載されているようにシュウ酸オキシダーゼの架橋結晶の活性を測定することにより、架橋シュウ酸オキシダーゼ結晶のｐＨ活性プロフィールを調べた：ｐＨ２．０および３．０の５０ｍＭグリシンＨＣｌバッファー、ｐＨ４．０、５．０、６．０の５０ｍＭコハク酸バッファー、ならびにｐＨ７．０の５０ｍＭトリスバッファー。これらの結果を図１１に示す。比較のため、可溶性シュウ酸オキシダーゼも示されている。
【０１２８】
（実施例８：Ｉ型原発性高シュウ酸尿症の動物モデルにおけるＯＸＯ療法）
Ｉ型原発性高シュウ酸尿症のマウスモデル：ＡＧＴ１ノックアウトマウスは、肝臓のペルオキシゾーム酵素であるアラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼを持たず、その欠乏の結果、Ｉ型原発性高シュウ酸尿症となる。これらのノックアウトマウスは、軽度の高シュウ酸尿症を示す。ＡＧＴ１のＫＯマウスは、野生型マウスと比較して約５倍に上昇した尿中シュウ酸レベルを示す（毎日の排泄量は、正常な尿量である０．２ｍｍｌｏ／Ｌに対し、約１〜２ｍｍｌｏ／Ｌである）。
【０１２９】
全部で３７匹の雄マウス（Ｌａ  Ｌａｇｕｎａ  Ｔｅｎｅｒｉｆｅ，ＳｐａｉｎのＳａｌｉｄｏ博士によって開発されたＡＧＴ１  ＫＯ／Ｃ５７ＢＬ６系統）を３回の実験で用いた。マウスを１つの対照群と２つの実験群に分けた。マウスの体重は２０〜２５グラムで、６月齢未満であった。
【０１３０】
ＯＸＯ結晶の投与：マウスは、処理前に、個々の代謝ケージ（Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）に７日間馴化させ、０．０２〜０．０８％未満のシュウ酸、および０．５％未満のカルシウムを含む標準的な繁殖用飼料（タンパク質１７％、脂肪１１％、炭水化物５３．５％）が与えられた。
【０１３１】
１２日間の治療期間が続く間、各マウスに、曲がったステンレス鋼製の１８ゲージ飼育用針（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｉｎｃ．；Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）で一日に２回、午前１０時および午後５時に強制的に経口投与した。対照群のマウスには、１．２ｍｌの食塩水を一日に２回、強制経口投与し、実験群のマウスには、一日に５０ｍｇのシュウ酸オキシダーゼを、可溶性酵素として、または、架橋シュウ酸オキシダーゼ結晶の懸濁液として強制経口投与した（１．２ｍｌ容量を一日に２回）。すべての実験群で動物は、強制経口投与に対して僅かに有害な効果を示した。可溶性シュウ酸オキシダーゼは、ｐＨ６．２の５０ｍＭクエン酸−リン酸バッファーに入れて投与した。架橋シュウ酸オキシダーゼ結晶は、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）中の懸濁物にして投与した。
【０１３２】
尿試料の分析：２４時間の尿試料を、代謝ケージの中に、尿中アスコルビン酸がシュウ酸に自然分解するのを最小限に抑えるために、酸（３〜４ｍｌの尿について１Ｎの塩酸を１５μｌ）上で収集した。試料は、さらに分析する時まで−７０℃で保存した。毎日の利尿、シュウ酸およびクレアチンの排出を測定した。シュウ酸およびクレアチンの測定法については、実施例１１に記載されている。シュウ酸の尿内排出を、クレアチンの尿内排出のモル比として表した。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いてデータを統計的に解析した。
【０１３３】
図８に示すように、可溶性ＯＸＯを投与したことによる尿中シュウ酸に対する作用は測定されなかったが、架橋ＯＸＯ結晶で処理すると、処理後１２日で尿中シュウ酸レベルの統計的に有意な低下がもたらされた。
【０１３４】
（実施例９：腸性高シュウ酸尿症の動物モデルにおけるＯＸＯ療法）
腸性高シュウ酸尿症のラットモデル：高シュウ酸飼料で飼養された雄のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットは、腸性高シュウ酸尿症の研究に適した動物モデルを構成する。腸内シュウ酸を分解する腸内細菌であるオキサロバクター・ホルミゲネスを除去するために１．５％の食事性シュウ酸アンモニウムを、抗生物質治療とともに投与すると、本実験で、尿中シュウ酸が５倍から１０倍増加する結果となった。
【０１３５】
３５日齢よりも若く、体重が１００〜１２０グラムのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを、対照群および実験群（各群当り６匹のラットで、予備群には６匹のラット）に無作為に分けた。処理前に、ラットをそれぞれの代謝ケージ（ＬａｂＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．；Ｓｅａｆｏｒｄ，ＤＥ）に７日間馴化させた。この期間中、テトラサイクリン系抗生物質であるＴｅｒｒａｍｙｃｉｎ（商標）（５００ｍｇ／Ｌ）を添加した酸性化水をラットに不断供給して、オキサロバクター・ホルミゲネスを除去し、１．５％のシュウ酸アンモニウムと低濃度（０．５％）のカルシウムを含む合成飼料（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  ＴＤ８９２２２ＰＷＤ；Ｈａｒｌｅｎ  Ｔｅｋｌａｄ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で飼育した。処理が継続される間、この餌でラットを飼養した。抗生物質による処理は、最初の７日間の馴化期間の後は中断した。
【０１３６】
ＯＸＯを強制経口投与によって、１２日間の処理期間の間、１８ゲージの強制経口投与用針（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｉｎｃ．；Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて、一日に３回毎日投与した（午前９時、午後１２時および４時）。強制経口投与対照群には１ｍｌの水を投与した。実験群のラットには、１ｍｌの架橋（４％グルタルアルデヒド、実施例７参照）シュウ酸オキシダーゼ結晶の懸濁液を、１０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）に入れ、強制経口投与（１５ｍｇ／ラット／日）によって投与した。
【０１３７】
尿試料の分析：２４時間の尿試料を、代謝ケージに、尿中アスコルビン酸がシュウ酸に自然分解するのを最小限に抑えるために、酸（１０ｍｌの尿試料について１Ｎの塩酸を１５μｌ）上で収集した。試料は、さらに分析する時まで−７０℃で保存した。毎日の利尿、シュウ酸およびクレアチンの排出を測定した。シュウ酸およびクレアチンの測定法については、実施例１１に記載されている。シュウ酸の尿内排出を、クレアチンの尿内排出のモル比として表した。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いてデータを統計的に解析した。
【０１３８】
図９に示すように、７日目に、架橋シュウ酸オキシダーゼ結晶の投与によって、尿中シュウ酸排出の有意かつ持続的な低下がもたらされ、処理後１２日で、尿中シュウ酸レベルが最大４０％まで低下した。
【０１３９】
（実施例１０：ヒトにおけるシュウ酸塩関連疾患に対するＯＸＯ療法）
シュウ酸塩関連疾患の治療または予防を必要とするヒトを、シュウ酸オキシダーゼ結晶を経口投与して治療する。シュウ酸オキシダーゼ結晶は、治療にあたる臨床医が、病状の重篤度および病気の進行に応じて決定するところにしたがって、約１０μｇ／ｋｇから２５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇから２５ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの投薬量で投与される。グルタルアルデヒドを用いて架橋されたシュウ酸オキシダーゼの結晶を毎日１回、２回、３回、４回、または５回投与するか、例えば、週に１回か２回など、より少ない頻度で投与する。シュウ酸オキシダーゼ結晶で治療すると、尿中シュウ酸レベルが少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％またはそれ以上低下する結果となる。
【０１４０】
（実施例１１：アッセイ法）
タンパク質濃度の測定：２８０ｎｍでの吸光度を測定して、シュウ酸オキシダーゼの濃度を決定した。１光学的密度（ＯＣ）の吸光を１ｍｇ／ｍｌとみなした。
【０１４１】
ＯＸＯ活性アッセイ法：以下のＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社のプロトコール（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｓｓａｙ  ｏｆ  Ｏｘａｌａｔｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ  ＥＣ１．２．３．４）を用いて、シュウ酸オキシダーゼ（ＯＸＯ）の活性を測定した。酵素活性の単位は以下のように定義される。すなわち、１ユニットは、室温、ｐＨ３．８で１分間あたり、シュウ酸から１．０μモルのＨ２Ｏ２を発生させる。
【０１４２】
アッセイ試料を、０．７９ｍＭのＮ，Ｎ−ジメチルアニリン（ＤＭＡ）（Ｓｉｇｍａ）、０．１１ｍＭの２−メチル−２−ベンゾチアゾロンヒドラゾン塩酸（ＭＢＴＨ）（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ３．８を含む５０ｍＭのコハク酸バッファー溶液中０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度に標準化させ、氷上に置いたが、タンパク質の濃度は２８０ｎｍでの吸光度で決定した。１ｍｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ溶液を、使用前に冷ｄｉＨ２Ｏ中で調製し、氷上に置いておいた。他の試薬はすべて室温に置いた。測定は室温で行った。最初の反応がＯ２依存性であるため、シュウ酸オキシダーゼを加える前にマスター混合液に酸素を送り込むことが重要である。試薬を５０ｍｌチューブに以下の順序で加えていった。すなわち、１Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを３．８に調整した２７ｍＬの５０ｍＭコハク酸バッファー；１ｍＬの１００ｍＭ  ＥＤＴＡ；および１ｍｌの蒸留水、そして、３０分間強力に酸素を送り込んだ。まず、２．９ｍｌの酸素含有実験溶液を３ｍｌのプラスチック製キュベットに移して、ｐＨ３．８の２００ｍＭシュウ酸溶液２０μｌ、および１０μｌの１ｍｇ／ｍＬのペルオキシダーゼと十分に混合した。そして、１０μｌのシュウ酸オキシダーゼを加え、密閉したチューブを３回転倒させてすばやく混合した。６００ｎｍにおける吸光度の変化を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｂｉｏｓｐｅｃを用いて直ちに読み取って、１０秒間隔で最長３分間まで記録した。曲線の直線部分（０から１２０秒の間）を用いて、試験およびブランクの両方について、１分間毎の６００ｎｍにおける吸光度の変化を評価した。ブランク用試料は、シュウ酸オキシダーゼ以外のすべてのアッセイ試薬からなっていた。
【０１４３】
酵素の比活性を以下のように計算した。
【０１４４】
Ｕ／ｍＬ酵素＝｛（ΔＡ６００／分）（２．９５）（希釈係数）｝／｛（２６．４）（０．０２）｝
および
Ｕ／ｍｇ固体＝｛Ｕ／ｍＬ酵素｝／｛ｍｇ固体／ｍＬ酵素｝｝
ただし、式中、２．９５＝アッセイのミリリットル単位での総容量、ｄｆ＝希釈係数、２６．４＝６００ｎｍにおけるインダミン色素のミリモル吸光係数、および０．０２＝使用された酵素の容量をミリリットル単位で表したもの。
【０１４５】
具体的な実験において、シュウ酸オキシダーゼの架橋結晶（ＣＬＥＣ  ＯＸＯ）（一晩転倒撹拌して４％グルタルアルデヒドと架橋された菱形の結晶）を可溶性ＯＸＯと比較した。図４に示すように、ＣＬＥＣ  ＯＸＯは、対応する可溶性のＯＸＯ調製物の活性の９５％を保持している。
【０１４６】
比色法によるシュウ酸測定法：尿中のシュウ酸を定量的に測定するためのシュウ酸比色キットを、Ｔｒｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＵＳＡ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＧｒｅｉｎｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＡＧ（Ｄｅｎｎｌｉｗｅｇ  ９，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。製造業者の指示に従って、尿試料を希釈して処理した。この測定法は、２つの酵素反応、すなわち（ａ）シュウ酸が、シュウ酸オキシダーゼによって二酸化炭素および過酸化水素水になり、（ｂ）このようにして生成した過酸化水素水は、ペルオキシダーゼ存在下で３−メチル−２−ベンゾチアゾロンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）および３−（ジメチルアミノ）安息香酸（ＤＭＡＢ）と反応して、５９０ｎｍにおける吸光度で検出することができるインダミン色素を産生する。発生する色の強度は、試料中のシュウ酸塩濃度と直接比例する。尿中シュウ酸値を標準曲線から計算する。
【０１４７】
比色法によるクレアチン測定法：尿中のクレアチンを定量的に測定するためのクレアチン比色キットを、Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；ＭＥＴＲＡ  Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）またはＲａｎｄｏｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｎｔｒｉｍ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）から購入した。本測定法は、クレアチンが、アルカリ性溶液内でピクリン酸と反応して、４９２ｎｍにおいて吸光度を持つ産物を生成するという原理に基づいている。生成される複合体の量は、クレアチン濃度に直接比例する。単一の代謝ケージから収集した、ラットの２４時間尿試料を二重蒸留水（ｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ）で１５倍に希釈した。２０μｌの希釈尿試料を、２０μｌのピクリン酸／水酸化ナトリウム（１：１）と混合した。室温で２分間インキュベートした後、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。尿中クレアチン値を標準曲線から計算した。
【０１４８】
過ヨウ素酸シッフ染色：可溶性および結晶性のシュウ酸オキシダーゼを４〜２０％のトリス−グリシンゲルで分離した。泳動が終ったら、ゲルを半分に切り分けた。左半分（レーン１〜５）をクーマシーブルー染色法によって染色し、右半分（レーン７〜１０）をＰＡＳ染色法によって染色した。ＰＡＳ染色をするには、４０％メタノールおよび７％酢酸で、ゲルを１回の洗浄につき１０分間ずつ４回洗浄した。洗浄したゲルを新しい４０％メタノール、７％酢酸溶液で室温にて一晩振とうした。脱イオン水で数回洗浄した後、ゲルを、１％ピルビン酸および３％酢酸を含む溶液の中で１時間振とうしながらインキュベートした。シッフ試薬との最後のインキュベーションを、ＤＩ水で丹念に洗浄した後、暗黒下で１時間行った（図２）。
【０１４９】
（実施例１２：原発性高シュウ酸尿症の動物モデルにおけるＯＸＯ療法）
ＡＧＴ１  ＫＯ（Ｃ５７Ｂ１６）マウス（実施例８に記載した表現型）をエチレングリコール（ＥＧ）で攻撃して、重度の高シュウ酸尿症を誘発した。ＥＧは、肝臓でシュウ酸に代謝される普通のアルコールである。
【０１５０】
マウスは、処理前に、それぞれの代謝ケージ（Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）に７日間馴化させ、０．０２〜０．０８％未満のシュウ酸、および約０．５〜０．９％のカルシウムを含む標準的な繁殖用飼料（タンパク質１７％、脂肪１１％、炭水化物５３．５％）が与えられた。馴化期間の後、マウスには、７日間、０．７％ＥＧを添加した水を不断に与え、実験期間中同じことを続けた。攻撃の数日後、これらのマウスは、日々のシュウ酸排出量が３〜６ｍｍｏｌ／Ｌである野生型マウスと比較して約１０〜２０倍多いシュウ酸を排出していた。
【０１５１】
ＯＸＯ−ＣＬＥＣ酵素の投与：全部で８匹の雄マウス系統ＡＧＴ１  ＫＯ／Ｃ５７Ｂ１６に、７日間ＥＧを予備抗原投与してから、架橋結晶（４％グルタルアルデヒド、例えば実施例７参照）として処方した組換えシュウ酸オキシダーゼの単回用量を、凍結／乾燥食物酵素混合物として１１日間連続して経口により投与した（１０ＭＭトリスＨＣｌバッファー（ｐＨ７）の懸濁液中の５０ｍｇの酵素を、凍結乾燥された５ｇｍの食物と混合して、毎朝、〜７ｇｍの食物／酵素混合液で食事用容器に補充した）（「用量５０」）。マウスを無作為に対照群と実験群とに分けた。マウスは体重が２０〜２５グラムで、６月齢よりも若かった。
【０１５２】
尿試料の分析：２４時間の尿試料を、代謝ケージの中に、尿中アスコルビン酸がシュウ酸に自然分解するのを最小限に抑えるために、酸（３〜４ｍｌの尿について１Ｎの塩酸を１５μｌ）上で収集した。試料は、さらに分析する時まで−２０℃で保存した。毎日の利尿、シュウ酸およびクレアチンの排出を測定した。シュウ酸およびクレアチンの測定法については、実施例１０に記載されている。シュウ酸の尿内排出を、２４時間尿試料（ｍＬ）中に排出されているシュウ酸のμｍｏｌ数として表した。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いてデータを統計的に解析した。実施例１２参照。
【０１５３】
図１２に示すように、ＯＸＯ−ＣＬＥＣをＥＧ  ＡＧＴ１ＫＯ（Ｃ５７Ｂ１６）マウスに経口投与すると、対応する未処理の対照マウスと比較して、処理開始後６日目から実験が終わるまで、尿中シュウ酸レベルの統計的に有意な低下がもたらされた。
【０１５４】
（実施例１３：重度高シュウ酸尿症の動物モデルにおけるＯＸＯ療法、若いＡＧＴ１  ＫＯ（１２９／ｓｖ）マウス）
ＡＧＴ１  ＫＯ（１２９／ｓｖ）マウスをエチレングリコール（ＥＧ）で攻撃して、重度の高シュウ酸尿症と、腎実質中にてシュウ酸カルシウムの沈着を誘発した。通常、攻撃の２〜６週間後に、マウスは、多様な尿中シュウ酸排出量、腎石灰沈着の多様な程度、およびクレアチンクリアランスの低下から判断される腎機能障害の徴候を示す。
【０１５５】
マウスは、処理前に、それぞれの代謝ケージ（Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）に７日間馴化させ、０．０２〜０．０８％未満のシュウ酸、および０．５〜０．９％未満のカルシウムを含む標準的な繁殖用飼料（タンパク質１７％、脂肪１１％、炭水化物５３．５％）が与えられた。
【０１５６】
ＯＸＯ−ＣＬＥＣ酵素の投与：全部で２２匹の雄マウス系統ＡＧＴ１  ＫＯ／１２９／ｓｖに、７日間ＥＧを予備攻撃した。この期間中、マウスには、０．７％エチレングリコール水を不断に与えて、重度の高シュウ酸尿症を創出した。予備処理の７日後、架橋結晶（４％グルタルアルデヒド、例えば実施例７参照）として処方した組換えシュウ酸オキシダーゼ（１０ＭＭトリスＨＣｌバッファー（ｐＨ７）に懸濁された５０ｍｇのＯＸＯ酵素）の単回用量を、凍結／乾燥食物酵素混合物として３１日間連続して経口により投与した（上記したように懸濁した５０ｍｇの酵素を、凍結乾燥された３．５ｇｍの食物と混合して、毎朝、約７ｇｍの食物／酵素混合液で食事用容器に補充した）。マウスを無作為に対照群と実験群とに分けた。マウスは体重が２０〜２５グラムで、８〜１０週齢よりも若かった。
【０１５７】
尿試料の分析：２４時間の尿試料を、代謝ケージの中に、尿中アスコルビン酸がシュウ酸に自然分解するのを最小限に抑えるために、酸（３〜４ｍｌの尿について１５μｌの１Ｎ塩酸）上で収集した。試料は、さらに分析する時まで−２０℃で保存した。毎日の利尿を記録し、尿中シュウ酸およびクレアチンの濃度を週に２回測定した。シュウ酸の測定法については、実施例１１に記載されている。シュウ酸の尿中排出を、２４時間尿試料（ｍＬ）中に排出されたシュウ酸のμｍｏｌ数として表した。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いてデータを統計的に解析した。図１３参照。
【０１５８】
図１３に示すように、ＯＸＯ−ＣＬＥＣをＥＧ  ＡＧＴ１ＫＯ（１２９／ｓｖ）マウスに経口投与すると、対応する未処理の対照マウスと比較して、処理開始後３日目から、尿中シュウ酸量の低下がもたらされ、低下は、処理の１０日後に最大かつ有意になった。
【０１５９】
クレアチンクリアランス測定による腎機能の評価：実験の終わりに、４週間にわたるＥＧ抗原投与を生き延びた動物をすべて殺して、血液を収集して、血漿クレアチンおよびクレアチンクリアランスを測定した。血清クレアチンを測定するには、Ｓｌｏｔ．Ｃ，１９６５およびＨｅｉｎｅｇａｒｄ  Ｄ，１９７３，ｋｉｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈによる、若干の修正を加えたヤッヘ（Ｊａｆｆｅ）反応法を用いた。８０μｌの未希釈の血清試料を、キュベット中で８００μｌのピクリンアルカリと混合して、室温で３０分間インキュベートした。分光光度法により、５１０ｎｍのところで発色を測定したが、その時点で非特異的反応を消去するために３３．３μＬの６０％酢酸を加えた。試料を念入りに混合し、室温で５分間インキュベートした後、５１０ｎｍのところで再び読み取りを行った。最終的な吸光度は、２回の読み取りの差分として提示する。１ｍＭクレアチン溶液の連続希釈を標準曲線に使用した。
【０１６０】
クレアチンクリアランスは、排出速度（Ｕｃｒ×Ｖ）として表されるが、ここで、Ｕｃｒは、血漿クレアチン（Ｐｃｒ）で割った尿試料中のクレアチン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を表す。これは以下のように表される。すなわち、
Ｃｃｒ＝（Ｕｃｒ×Ｖ）／Ｐｃｒ＝ｍＬ／ｈ。
【０１６１】
図１４に示すように、ＯＸＯ−ＣＬＥＣで４週間治療すると、クレアチンクリアランスで表される正常な腎機能が維持された（７／１１）が、対照群では、２匹のマウスだけ（２／１１）がＥＧ攻撃後に生き残ったが、それらの腎臓濾過速度は正常な範囲を下回っていた（４．７６ｍｌ／ｈ）。
【０１６２】
腎臓の組織病理学的分析：腎臓の完全な断面を得るために、マウスの腎臓を、パラフィン包埋用に通常通り処理した。各腎臓を、腎臓当り４μｍの１２個の連続切片に切って、通常の組織検査用のヘマトキシリン−エオシン染色によるか、または、腎組織中に存在するシュウ酸カルシウムの結晶を検出するための特異的Ｙａｓｕｅ金属置換組織化学的方法によって染色した。顕微鏡下、２０倍の倍率でスライドを検査し、検査者は、切片を４つのカテゴリ尺度でスコアを付け、腎臓の解剖学的領域（腎臓皮質、腎臓髄質、および腎乳頭）のそれぞれに同じカテゴリを適用した。スコアは、なし、すなわち、どの領域にもシュウ酸の結晶なし、最小限、すなわち、いずれかの領域に１〜５個の結晶、中度、すなわち、いずれかの領域に５〜１０個の結晶、および重度、すなわち、すべての領域に多数の結晶の集まり。図１５および表６参照。
【０１６３】
【化１０】
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表６および図１５に示すように、シュウ酸デカルボキシラーゼ−ＣＬＥＣによる４週間の経口処理によって、エチレングリコールで攻撃されたＡＧＴ１ＫＯマウスの腎実質においてシュウ酸カルシウムの沈着が形成されるのが防止された。処理群の５匹のマウス（５／１１）は、シュウ酸カルシウムの結晶の痕跡すら見られず、完全に正常な腎臓の形態を持っていたが、未処理群のマウスは１００％ＣａＯｘ沈着を示した（１１／１１）。
【０１６４】
Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ推定量による生存率分析：エチレングリコールで攻撃されたマウスの生存率に対するＯＸＯ−ＣＬＥＣの効果を、ある時点で死んだ被検体の生存、その時点でまだ実験が行われている被検体の数で割るＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ法を用いて分析した。この方法は、簡単で、同じ実験の中の２つ以上の群間の差異をグラフで図示する。計算のため、カレイダグラフ（Ｋａｌｅｉｄａ  Ｇｒａｐｈ）やＳＴＡＳなどの統計用プログラムをしばしば使用する。
【０１６５】
図１６に示すように、シュウ酸オキシダーゼ−ＣＬＥＣによる４週間の経口処理によって、エチレングリコールで攻撃されたＡＧＴ１ＫＯマウスの生存率が有意に増加した。概算された生存時間の中央値（処理群の５０％のマウスが生き残っていた時間）は３１日間であり、本実験を実際に継続した期間である。
【０１６６】
本明細書は、本明細書内で引用された参考文献の教示内容を踏まえて完全に理解することができる。本明細書内の実施形態は、本発明の実施形態を例示したものであって、本発明の範囲を限定するものと解すべきではない。当業者には、他の多くの実施形態が本発明に含まれることを容易に認識できる。本開示で引用されている刊行物、特許、および生物の配列はすべて、それら全体が参照されて組み込まれる。組み込まれた資料が矛盾するか、本明細書と整合しない場合は、本明細書がそのような資料よりも優先する。本明細書におけるいかなる参考文献の引用も、その文献が本発明に対する先行技術であると認めるものではない。
【０１６７】
別段の記載がない限り、請求項を含み本明細書で使用されている、成分、細胞培養、処理条件などの量を表すすべての数字は、すべての場合において、「約」という用語で修飾されていると理解されるべきである。したがって、そうではないとの別段の記載がない限り、数字による変数は近似値であり、本発明によって得ることが求められている所望の性質に応じて変化し得る。別段の記載がない限り、一連の要素の前に付けられた「少なくとも」という用語は、その一連の要素のすべての要素を意味する。当業者は、通常の実験だけを用いて、本明細書に記載された発明の具体的な実施形態と同等のものが数多くあることを認識するか、確認することができるであろう。そのような同等物も、以下の請求の範囲に含まれるものとする。
【０１６８】
本明細書および本明細書に開示した発明の実施を考慮すれば、本発明の他の実施形態が、当業者には明らかとなろう。本明細書および実施例は例示的なものにすぎないと見なされ、本発明の真の範囲および趣旨は以下の請求の範囲の記載されているものと考える。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】還元条件下（レーン１〜４）および非還元条件下（レーン６〜８）での４〜２０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥ濃度勾配ゲルにおける、精製されたシュウ酸オキシダーゼ（「ＯＸＯ」）（可溶性型および結晶型）の見かけの移動度を示す。還元条件下では、ＯＸＯはモノマーである。非還元条件下では、ＯＸＯの大部分はヘキサマーとして存在する。レーン１：分子量マーカー；レーン２：可溶性ＯＸＯ；レーン４：結晶性ＯＸＯ；レーン６：可溶性ＯＸＯ；レーン８：結晶性ＯＸＯ；レーン１０：分子量マーカー。結晶性ＯＸＯは、実施例６のバッチ結晶化法にしたがって調製した。
【図２】重複サンプルを４〜２０％のトリス−グリシンゲルで分離して二等分したものをグリコペプチドに対して過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＤ）染色、およびクーマシーブルー染色（「常法」）したものを示す。左半分（レーン１〜５）をクーマシーブルー染色し、右半分（レーン７〜１０）をＰＡＳで染色した。レーン１：分子量マーカー；レーン３：可溶性ＯＸＯ；レーン５：結晶性ＯＸＯ；レーン７：可溶性ＯＸＯ；レーン９：結晶性ＯＸＯ。結晶性ＯＸＯは、実施例６のバッチ結晶化法にしたがって調製した。
【図３】非還元ＳＤＳゲルで分離したＯＸＯのシュウ酸オキシダーゼ反応性を示す。インサイチュでのシュウ酸オキシダーゼ分析により、様々なＯＸＯ調製物で活性が検出された。この活性は、見かけの分子量が約１２０ｋＤａのポリペプチドと関連していた。レーン１：分子量マーカー；レーン３：精製した可溶性ＯＸＯ；レーン５：ｐＨ６．０の１０ｍＭ  ＭＥＳ中の脱塩した可溶性ＯＸＯ；レーン７：水中に溶解した結晶性ＯＸＯ（４０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ４００、ｐＨ６．０のＭＥＳ、５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ３０００から結晶化したもの）；レーン９：水中に溶解した結晶性ＯＸＯ（４０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ４００、ｐＨ９．５のＣＨＥＳ、から結晶化したもの）。
【図４】可溶性ＯＸＯおよび架橋したＯＸＯ結晶（実施例６参照）の反応速度の特徴を比較したプロット図であり、結晶化ＯＸＯが、非結晶化ＯＸＯの活性の９５％を保持していることを示している。
【図５Ａ】図５Ａは、蒸気拡散によって成長したＯＸＯ結晶の一連の写真である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、蒸気拡散によって成長したＯＸＯ結晶の一連の写真である。
【図６】マイクロバッチ法によって成長させたＯＸＯ結晶の写真である。
【図７】バッチ法によって成長させたＯＸＯ結晶（図７Ａ）、およびバッチ法によって成長させた架橋ＯＸＯ結晶（図７Ｂ）を示している。
【図８】原発性高シュウ酸尿症のマウスモデルにおけるシュウ酸オキシダーゼ（ＯＸＯ）療法の結果を示す。オスのＡＧＴ１ノックアウトマウスに、胃管栄養法によって可溶性ＯＸＯ（図８Ａ）、架橋したＯＸＯ結晶（図８Ｂ）、または模擬処理物（対照群）を投与した。２４時間後の尿試料における尿中のシュウ酸およびクレアチンを測定した。エラーバーは、標準偏差をｎの平方根で割って計算される標準誤差（ＳＥ）（ｎ＝５〜８）を示している。アステリスクは、対照群と実験群との間に統計的に有意な（Ｐ＜０．０５）差があることを示している。
【図９】腸性高シュウ酸尿症のラットモデルにおけるＯＸＯ療法の結果を示す。オスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに架橋したＯＸＯ結晶（１５ｍｇ／ラット）または模擬処理物（対照群）を投与した。２４時間後の尿試料における尿中のシュウ酸およびクレアチンを測定した。エラーバーは標準誤差（ＳＥ）（ｎ＝６）を示している。アステリスクは、対照群と実験群との間に統計的に有意な（Ｐ＜０．０５）差があることを示している。
【図１０】配列番号：１〜３の配列情報を示す。
【図１１】様々なｐＨにおける可溶性シュウ酸オキシダーゼのシュウ酸オキシダーゼ活性と比較した、グルタルアルデヒドに架橋したシュウ酸オキシダーゼ結晶（４％）のシュウ酸オキシダーゼ活性（％）のグラフを描いたものである。
【図１２】ＥＧ  ＡＧＴ１  ＫＯマウスをＯＸＯ−ＣＬＥＣで経口処理した１〜１１日間、対照よりも尿中シュウ酸レベルが低下したことを示している。処理群（ｎ＝５）に、ＯＸＯ−ＣＬＥＣを、経口で５０用量投与した（適量の酵素スラリーを５ｇｍの食物と混ぜ、凍結乾燥して、毎朝、えさ箱に〜７ｇｍの食物／酵素混合物を再補充した）。対応する対照群はｎ＝３で、試験品を含まない同じタイプの食物を投与した。各バーは、平均値±ＳＥを示している。
【図１３】ＥＧ  ＡＧＴ１  ＫＯマウスをＯＸＯ−ＣＬＥＣで経口処理した３１日後に、対照よりも尿中シュウ酸レベルが低下したことを示している。処理群（ｎ＝１１）に、ＯＸＯ−ＣＬＥＣを、経口で５０用量投与した（適量の酵素スラリーを３．５ｇｍの食物と混ぜ、凍結乾燥して、毎朝、えさ箱に〜７ｇｍの食物／酵素混合物を再補充した）。対応する対照群はｎ＝１１で、試験品を含まない同じタイプの食物を投与した。基準尿中シュウ酸レベルを３日目について示す。各バーは平均値±ＳＥを示している。＊は、対照群と実験群との間に有意な差があることを示している。これらの結果を、独立した両側スチューデントのｔ検定によって分析した。実験を開始する際に、各群にｎ＝１１のマウスがいたが、何匹かが、エチレングリコールの攻撃が原因となって投与実験の途中で死亡したため、実験の終わりに尿中シュウ酸を測定した特定の日に生きていたマウスのみ、すなわち、対照群ではｎ＝２および５０ｍｇＯＸＯ−ＣＬＥＣ群ではｎ＝７のみについて示す。したがって、統計的有意性とは関連が薄い。それよりも、これらの結果は、下記に記載した結果と相俟って、本発明による治療法の有効性の証拠を提供している。
【図１４】レアチニンクリアランスによって測定したところによると、極度の高シュウ酸尿症状態における正常な腎機能を維持する上で、ＯＸＯ−ＣＬＥＣ処理が有効であることを示している。示された結果は、１ヶ月の全実験期間を生き延びたマウスだけである；すなわち、５０ｍｇ群（ｎ＝７）および対照群（ｎ＝２）。対照群と比較すると、１匹あたり毎日５０ｍｇのＯＸＯ−ＣＬＥＣを投与されたマウスでは、クレアチンクリアランスが有意に高かった。各バーは、平均値±ＳＥを示している。正常な腎機能をもつマウスにおけるクレアチンクリアランスは＞１０ｍｌ／ｈである。
【図１５】５０ｍｇＯＸＯ−ＣＬＥＣで処理した群（図１５Ａ）および対照群（図１５Ｃ）のマウスの腎実質におけるＹａｓｕｅ陽性シュウ酸カルシウム結晶を示す。代表的なスライドを２０倍に拡大して示す。シュウ酸カルシウムの蓄積を示さない正常な腎実質を（Ａ）に示し、中度の腎石灰沈着をスライド（Ｂ）に示し、重度の腎石灰沈着をスライド（Ｃ）に示す。黒い矢印は、シュウ酸カルシウム沈着を示し、橙色の矢印は、形態が僅かに変化した糸球体を示し、また、茶色の矢印は、間質が線維化した広範な領域を示している。
【図１６】エチレングリコール攻撃された、ＯＸＯ−ＣＬＥＣで処理されたマウスと、対照群のマウスと生存時間を比較したＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒの生存曲線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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