(57)【要約】  本発明は、T細胞などの免疫細胞を活性化することができ、可逆的に阻害された抗原結合部位を有する抗体を用いて免疫系を刺激する方法を提供する。免疫応答（例えば、放射線照射による）が必要とされる部位における抗原結合部位の選択的活性化は、当該部位において対応する免疫応答の活性化をもたらす。驚くべきことに、本発明の抗体が、免疫細胞の活性化が必要とされる部位における該抗体の選択的蓄積を引き起こす任意の標的化部位を有していない場合であっても、良好な結果が得られる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫応答を刺激するための医薬の製造における抗体の使用であって、
該抗体は免疫系細胞に結合し得る抗原結合部位を含んでおり、該抗体の該免疫系細胞への結合は該免疫系細胞を活性化し、
該抗原結合部位は、該免疫系細胞への結合から可逆的に阻害され、
且つ該抗体は、該免疫系細胞ではない細胞に結合し得る標的化部分を含まない、
前記使用。
【請求項２】
免疫系細胞がT細胞である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
T細胞が細胞傷害性T細胞である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
抗原結合部位がT細胞受容体(TCR)の成分に特異的である、請求項２または３に記載の使用。
【請求項５】
抗原結合部位がCD3に対して特異的である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
抗原結合部位が、OKT3またはUCHT-1に由来する少なくとも1つのCDRを含む、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
抗原結合部位が、OKT3またはUCHT-1に由来する全てのCDRを含む、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
抗体が、ヒト定常領域またはヒトフレームワーク領域を有する、請求項１〜７のいずれか1項に記載の使用。
【請求項９】
抗体が、ヒト化OKT3またはUCHT-1である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
抗体が、scFv、Fab、Fab'もしくはF(ab')2からなるか、またはscFv、Fab、Fab'もしくはF(ab')2を含む、請求項１〜９のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１１】
前記抗体の前記免疫系細胞への結合が、選択的に切断可能な基または結合を介して該抗体に結合した遮断部分によって可逆的に阻害されている、請求項１〜１０のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１２】
選択的に切断可能な基または結合が、放射線照射により切断可能である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
放射線照射が紫外線照射である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
選択的に切断可能な基または結合が、1-(2-ニトロフェニル)エチル(NPE)部分を含む、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
腫瘍に対する免疫応答を刺激するための、請求項１〜１４のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１６】
感染性生物または感染性生物に感染した宿主細胞に対する免疫応答を刺激するための、請求項１〜１４のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１７】
抗体を、免疫応答の刺激が必要とされる生理学的部位に投与する、請求項１〜１６のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１８】
抗体を、免疫応答の刺激が必要とされる生理学的部位から離れた部位に投与する、請求項１〜１６のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１９】
放射線照射が、免疫応答の刺激が必要とされる生理学的部位に適用される、請求項１２〜１４のいずれか1項に記載の使用。
【請求項２０】
CD3に特異的な抗原結合部位を有し、且つCD3に結合するとT細胞を刺激することができる抗体であって、該抗体が、少なくとも1つの光切断可能部分の存在によって、CD3への結合から可逆的に阻害されている、前記抗体。
【請求項２１】
被験体における免疫応答を刺激する方法であって、該被験体に有効量の抗体を投与するステップを含んでなり、ここで
該抗体の免疫系細胞への結合が該免疫系細胞を活性化するように、該抗体は該免疫系細胞に結合し得る抗原結合部位を含み、
該抗原結合部位は、該免疫系細胞への結合から可逆的に阻害され、
且つ該抗体は、該免疫系細胞ではない細胞に結合し得る標的化部分を含まず；
該方法が、該抗原結合部位が該免疫系細胞に結合する能力を回復させ、これにより該免疫系細胞を活性化させるステップをさらに含む、前記方法。
【請求項２２】
免疫応答を刺激するための抗体であって、
該抗体の免疫系細胞への結合が該免疫系細胞を活性化するように、該抗体は該免疫系細胞に結合し得る抗原結合部位を含み、
該抗原結合部位は、該免疫系細胞への結合から可逆的に阻害され、
且つ該抗体は、該免疫系細胞ではない細胞に結合し得る標的化部分を含まない、
前記抗体。
【請求項２３】
標的細胞に対する免疫応答を刺激するための医薬の製造における抗体の使用であって、
該抗体の免疫系細胞への結合が該免疫系細胞を活性化するように、該抗体は該免疫系細胞に結合し得る抗原結合部位を含み、
該抗原結合部位は、該免疫系細胞への結合から可逆的に阻害され、
且つ該抗体は、該標的細胞に結合しない、
前記使用。
【請求項２４】
標的細胞に対する免疫応答を刺激するための抗体であって、
該抗体の免疫系細胞への結合が該免疫系細胞を活性化するように、該抗体は該免疫系細胞に結合し得る抗原結合部位を含み、
該抗原結合部位は、該免疫系細胞への結合から可逆的に阻害され、
且つ該抗体は、該標的細胞に結合しない、
前記抗体。
【請求項２５】
被験体において標的細胞に対する免疫応答を刺激する方法であって、該被験体に有効量の抗体を投与するステップを含んでなり、ここで、
該抗体の免疫系細胞への結合が該免疫系細胞を活性化するように、該抗体は該免疫系細胞に結合し得る抗原結合部位を含み、
該抗原結合部位は、該免疫系細胞への結合から可逆的に阻害され、
且つ該抗体は該標的細胞に結合せず、
該方法が、該抗原結合部位が該免疫系細胞に結合する能力を回復させ、これにより該免疫系細胞を活性化させるステップをさらに含む、前記方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか1項に記載の抗体を、製薬上許容される担体と組み合わせて含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、身体の限定された領域（例えば、腫瘍部位）において特異的に免疫応答を刺激する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
重要な臨床目的は、治療薬をできるだけ特異的にすることによってこれらの副作用を低減することである。治療用モノクローナル抗体産業は、免疫系の優れた特異性を活用し得るという期待に基づいて構築された。しかしながら、人体の複雑な環境中で所望のレベルの特異性を達成することが、依然として多くの難題をもたらすことは明らかである。
【０００３】
二重特異性抗体を用いて腫瘍に対する免疫応答を標的とすることが提案されている（非特許文献１〜４）。理論上、この抗体の一部分が特定の腫瘍抗原と反応して該腫瘍細胞の表面に結合する一方、この抗体の他の部分はT細胞マーカー(通常はCD3)と反応し、このようにして該T細胞を該腫瘍細胞に対して標的化させる。実際には、この方法には2つの重大な不利点がある。
【０００４】
第1に、抗体が腫瘍細胞と正常細胞とを区別するために必要な特異性を獲得することは極めて困難であるということが示されている（非特許文献５）。大部分の患者において、腫瘍組織に対する正常組織の比が大きいことを考慮すれば、これは驚くべきことではないだろう。このことは、大部分の腫瘍に対して達成し得る特異的局在化の程度を制限する。現在のところ、固形腫瘍に対する使用が認可されている抗体は極めて少ない（非特許文献６）。第2に、抗T細胞ベースの二重特異性構築物の導入は、該二重特異性抗体がその腫瘍標的に到達する前に、これらが末梢T細胞に結合される結果をもたらす。このため、二重特異性抗体が腫瘍に到達するのが妨げられると共に、末梢でT細胞を活性化して、T細胞の枯渇および望ましくないサイトカイン・ストームをもたらす（非特許文献１、４、７）。
【０００５】
WO96/34892は、二重特異性抗体の抗CD3の方の半分を、可逆的に阻害または不活性化すべきであると提案する。この抗体の抗腫瘍部分は自由に循環して腫瘍細胞に結合する状態を保つが、抗CD3部分は、末梢T細胞に結合し、これを活性化して、患者の血液循環から除去することができるようにすべきではない。この抗体の抗CD3部分は、必要とされる領域において再活性化されるまで不活性化されるため、抗腫瘍抗体の非特異的交差反応または特定の望ましくない結合は関係なくなるはずである。他の利点は、より高用量のコンジュゲートを投与し、腫瘍を標的とするためにより多くのコンジュゲートを与えることができることである。
【特許文献１】WO96/34892
【非特許文献１】Baeuerle PA, Kufer P, Lutterbuse R. Bispecific antibodies for polyclonal T-cell engagement.  Curr Opin Mol Therapeut 2003; 5: 413-419
【非特許文献２】Lum LG, Davol PA. Retargeting T cells and immune effector cells with bispecific antibodies. Cancer Chemother and Biological response modifiers 2005; 22: 273-291
【非特許文献３】van Spriel AB, van Ojik HH, van de Winkel JGJ. Immunotherapeutic perspective for bispecific antibodies. Immunology Today 2000; 21: 391-402
【非特許文献４】Withoff S, Helfrich W, de Leij LF, Molema G. Bi-specific antibody therapy for the treatment of cancer.  Curr Opin Mol Therapeut 2001; 3: 53-62
【非特許文献５】Morrow KJ, Jr. Challenges remain for antibody products. Genet Engineering News 2005; 25: No 19 pages 1,16-19
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【非特許文献１８】da Costa L, Renner C, Hartmann F, Pfreundschuh, M. Immune recruitment by bispecific antibodies for the treatment of Hodgkin disease. Cancer Chemother & Pharmacol 2000; 46: S33-36
【非特許文献１９】Katzenwadel A, Scheer H, Gierschner D, Wetterauer U, Elsasser-Beile U. Construction and in vivo evaluation of an anti-PSA x anti-CD3 bispecific antibody for the immunotherapy of prostate cancer.  Anticancer Res 2000; 20: 1551-1555
【非特許文献２０】Alegre M-L,et al. Cytokine release symdrome induced by the 145-2C11 anti-CD3 monoclonal antibody in mice: Prevention by high doses of methylprednisolone. J. Immunol. 146, 1184-1191, 1991
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、免疫細胞を活性化し得る、可逆的に阻害された抗体の治療可能性を研究して来た。このような抗体は、再活性化された場合、該抗体自体は免疫応答が必要とされる身体領域に対して自らを特異的に標的化する結合機能を有していないにも関わらず、局在化された免疫応答の刺激において驚くほど有効であるということが見出された。後述の実施例で、光切断可能部分によって不活性化されているT細胞活性化性抗体が、放射線照射によってその結合活性を回復すると、抗体を腫瘍に局在化させるいかなる標的化部位も存在していないにも関わらず、顕著な抗腫瘍応答を刺激し得ることを示す。
【０００７】
第1の態様において、本発明は、免疫応答を刺激するための医薬の製造における抗体の使用であって、
該抗体は免疫系細胞に結合し得る抗原結合部位を含み、該抗体の該免疫系細胞への結合は該免疫系細胞を活性化し、
該抗原結合部位は、該免疫系細胞への結合から可逆的に阻害され、
且つ該抗体は、該免疫系細胞ではない細胞に結合し得る標的化部分を含まない、
上記使用を提供する。
【０００８】
この抗体は、被験体に投与し得、抗原結合部位が、免疫系細胞上でその同種エピトープに結合する能力を回復することにより、免疫応答が求められる所与の生理学的部位において選択的に活性化され得る。その後この抗体は、免疫系細胞に結合して活性化させることができる。
【０００９】
上記の細胞は、所要の生理学的部位におけるこの細胞の活性化が、その部位の免疫応答を刺激または増強し得る任意の免疫系細胞であり得る。好適な細胞としては、αβT細胞およびγδT細胞などのT細胞が挙げられる。
【００１０】
この細胞は、細胞傷害性T細胞であり得る。細胞傷害性T細胞の活性化は、被験体自身の細胞の1つ（例えば、寄生された細胞（例えばウイルスを有する細胞）または形質転換された細胞（例えば癌細胞））に対する免疫応答を刺激することが望ましい場合、特に適切である。
【００１１】
T細胞は、多数の細胞表面抗原に対する抗体を用いて活性化させることができる。これらの抗原には、CD3分子などのT細胞受容体(TCR)の成分、並びにCD2、CD28、Thy-1、TAP(T細胞活性化タンパク質)およびLy-6(例えばLy-6C)などの他のタンパク質がある。したがって、本発明の抗体の抗原結合部位は、CD3、CD2、CD28、Thy-1、TAPまたはLy-6に対して特異的であり得る。
【００１２】
好ましくは、本発明の抗体は特に、治療が意図される種に由来する関連抗原の形態に向けられる。好適な実施形態において、ヒトの治療のために、本発明の抗体は、関連タンパク質のヒト型に向けられる。
【００１３】
ヒトタンパク質に対する抗体は、通常は非ヒト種に由来し、その結果として、ヒトに対するこれらの抗体の投与は、該抗体自体に対する望ましくない免疫応答を引き起こす可能性がある。非ヒト抗体由来の可変領域に融合させたヒト抗体由来の定常領域を含むキメラ抗体を作製することにより、免疫原性を低下させることができる。「ヒト化」抗体に対するさらに高度な取り組みは、非ヒト抗体由来のCDRをヒト抗体フレームワーク領域に移植することを包含する。現在、in vitro合成およびスクリーニングにより(例えば、ファージディスプレイにより）、またはヒト抗体遺伝子を導入した動物(例えばマウス)から抗体を作製することによって、完全ヒト抗体またはそのフラグメントを作製することも可能である。
【００１４】
このように、本発明の抗体は、ヒト定常領域と非ヒト抗体由来の可変領域とを含み得る。あるいは、本発明の抗体は、場合により非ヒト抗体由来のCDR（例えば、OKT3またはUCHT-1に由来する1種以上のCDR（例えば、OKT3またはUCHT-1に由来する1種、2種、3種、4種、5種もしくは全てのCDR））と共にヒトフレームワーク領域を含んでいてもよい。OKT3のCDR配列は、米国特許第6,750,325号に提供されている。
【００１５】
本発明の抗体は、ヒト化OKT3(例えば、米国特許第6,750,325号に記載のとおり)またはヒト化UCHT-1であってよい。
【００１６】
本発明の抗体は、２つのFab領域とFc領域を含み得る。あるいは、この抗体は、一本鎖Fv領域、Fabフラグメント、Fab'フラグメントもしくはF(ab')2フラグメントを含んでいてもよく、または一本鎖Fv領域、Fabフラグメント、Fab'フラグメントもしくはF(ab')2フラグメントから構成され得る。
【００１７】
本発明の抗体は、免疫細胞表面上の同種抗原に特異的な少なくとも2つの抗原結合部位(例えば、2つのFab領域)を有することが望ましい。これにより、抗体は細胞表面上の抗原に対して（抗原と特異的抗体の同一性に応じて）交差結合することが可能となり、この交差結合は、細胞活性化に必要とされ、または細胞活性化を増強することができる。抗体がこのような抗原結合部位を1つだけ有する場合、この抗体は、好ましくはFc領域を含む。
【００１８】
上記の抗原結合部位は、典型的には、選択的に切断可能な基または結合を介して抗体に結合された1つ以上の遮断部分の存在によって、免疫系細胞への結合から阻害される。この遮断部分は、抗原結合部位において、あるいは抗原結合部位に隣接して結合させることが可能であり、免疫系細胞上で、抗体とその同種エピトープ間の結合を立体的に妨げることができる。
【００１９】
選択的に切断可能な基または結合は、放射線照射によって切断することができる。遮断部分の種類に応じて、赤外(UV)線、可視光線、紫外(UV)線、マイクロ波、ガンマ線等を含む、いずれの放射周波数も好適であり得る。紫外線は特に便利である。選択的に切断可能な基または結合は、紫外線で切断可能な1-(2-ニトロフェニル)エチル(NPE)部分を含み得る。
【００２０】
本明細書中に記載される抗体は、特定の生理学的部位における免疫系の選択的活性化によって改善され得る任意の疾患の治療に有用である。疾患の例としては癌、特に卵巣癌、中皮腫、膵臓癌、黒色腫、肉腫、肝癌、結腸癌、肺癌、腎臓癌、乳癌、精巣癌、前立腺癌を含む固形腫瘍が挙げられる。他の例としては感染性疾患、特に感染の局在化した部位を同定し得る感染性疾患が挙げられる。原因となる感染因子は、細胞内または細胞外に存在する可能性があり、また細菌、ウイルス、真菌または任意の他の種類の感染性寄生生物および/もしくは感染性病原性生物であり得る。本発明の免疫応答は、上記の感染性生物自体、またはこの感染性生物が感染した宿主細胞に向けることができる。
【００２１】
本発明の抗体は、免疫応答の刺激が必要とされる生理学的部位に直接投与し得る。別法として、本発明の抗体は、免疫応答の刺激が必要とされる生理学的部位から離れた部位に投与することができる。
【００２２】
いずれの場合においても、結果として得られた免疫刺激は、抗体の結合能力の活性化の局在をもたらすことによって、必要とされる部位に限定される。例えば、抗体が光切断可能部分によって阻害される実施形態においては、活性化は、通常、免疫応答の刺激が必要とされる生理学的部位における放射線照射によって達成される。
【００２３】
本発明の実施例は、光切断可能部分によって阻害される抗体が、放射線照射によって再活性化された場合、顕著な治療効果を与えるだけでなく、実際、改変されていない形の同種の抗体よりも大きな効果を与えることも示す。
【００２４】
これらの実験では、特に転移性細胞株の懸濁液を用いて皮下投与した。本発明の可逆的に阻害された抗体は、腫瘍細胞を投与した領域のみにおいて放射線照射(そしてこれにより活性化）された。このため、細胞の一部が逃げて体の他の部分、特に肝臓に転移を形成するだろうと予想されていた。しかし、転移は観察されなかった。
【００２５】
本発明の抗体はまた、投与の直前にex vivoで放射線照射される場合、利益を与えることもできる。したがって、一部の実施形態においては、現在は推奨されていないが、本発明の抗体の結合能力を、被験体への投与の直前にex vivoで活性化させることが望ましいだろう。
【００２６】
別の態様において、本発明は、CD3に特異的な抗原結合部位を有し、且つCD3に結合するとT細胞を活性化することができる抗体であって、該抗体が、少なくとも1つの光切断可能部分の存在によって、CD3への結合から可逆的に阻害されている、上記抗体を提供する。
【００２７】
別の態様において、本発明は、被験体における免疫応答を刺激する方法であって、該被験体に有効量の抗体を投与するステップを含んでなり、ここで
該抗体の該免疫系細胞への結合が該免疫系細胞を活性化するように、該抗体は免疫系細胞に結合し得る抗原結合部位を含み、
該抗原結合部位は、該免疫系細胞への結合から可逆的に阻害され、
且つ該抗体は、該免疫系細胞ではない細胞に結合し得る標的化部分を含まず；
該方法が、該抗原結合部位が該免疫系細胞に結合する能力を回復させ、これにより該免疫系細胞を活性化するステップをさらに含む、上記方法を提供する。
【００２８】
別の態様において、本発明は、免疫応答を刺激するための抗体であって、
該抗体の該免疫系細胞への結合が該免疫系細胞を活性化するように、該抗体は免疫系細胞に結合し得る抗原結合部位を含み、
該抗原結合部位は、該免疫系細胞への結合から可逆的に阻害され、
且つ該抗体は、該免疫系細胞ではない細胞に結合し得る標的化部分を含まない、
上記抗体を提供する。
【００２９】
別の態様において、本発明は、標的細胞に対する免疫応答を刺激するための医薬の製造における抗体の使用であって、
該抗体の該免疫系細胞への結合が該免疫系細胞を活性化するように、該抗体は免疫系細胞に結合し得る抗原結合部位を含み、
該抗原結合部位は、該免疫系細胞への結合から可逆的に阻害され、
且つ該抗体は、標的細胞に結合しない、
上記使用を提供する。
【００３０】
別の態様において、本発明は、標的細胞に対する免疫応答を刺激するための抗体であって、
該抗体の該免疫系細胞への結合が該免疫系細胞を活性化するように、該抗体は免疫系細胞に結合し得る抗原結合部位を含み、
該抗原結合部位は、該免疫系細胞への結合から可逆的に阻害され、
且つ該抗体は、標的細胞に結合しない、
上記抗体を提供する。
【００３１】
別の態様において、本発明は、被験体における標的細胞に対する免疫応答を刺激する方法であって、該被験体に有効量の抗体を投与するステップを含んでなり、ここで、
該抗体の該免疫系細胞への結合が該免疫系細胞を活性化するように、該抗体は免疫系細胞に結合し得る抗原結合部位を含み、
該抗原結合部位は、該免疫系細胞への結合から可逆的に阻害され、
且つ該抗体は標的細胞に結合せず、
該方法が、該抗原結合部位が該免疫系細胞に結合する能力を回復させ、これにより該免疫系細胞を活性化させるステップをさらに含む、上記方法を提供する。
【００３２】
他の態様において、本発明は、本発明の上記態様のいずれかに関連して記載した抗体を、製薬上許容される担体と組み合わせて含む、医薬組成物を提供する。
【００３３】
これらの本発明の態様の好適な特徴は、第一の態様に関連して上記されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明の組成物および方法において使用される抗体は免疫系細胞に結合し得る抗原結合部位を有し、結果として該免疫系細胞を活性化する。したがって、通常、本発明の抗体は、免疫細胞の表面で発現するマーカーに特異的である。このマーカーは、典型的にはタンパク質である。免疫系細胞は、典型的には、環境からシグナルを受け取ることにより(例えば、B細胞の表面で発現される抗体分子への抗原の結合によって、もしくは細胞表面上の特異的受容体への前炎症性サイトカインの結合により)、または他の細胞と直接相互作用することによって(例えば、抗原提示細胞の表面上で発現するMHC-抗原複合体または同族体によるT細胞受容体の連結によって)活性化される。このような相互作用は、免疫系細胞を同様に活性化し得る特定の「アゴニスト」抗体によって模倣し得る。
【００３５】
免疫系細胞の活性化は、この細胞がサイトカインを分泌し、増殖し、特定の細胞表面タンパク質(「マーカー」と呼ばれることが多い)の発現をアップレギュレートもしくはダウンレギュレートし、または細胞の休止レベルもしくはバックグラウンドレベルを上回るレベルでの免疫応答への関与の挙動特性を示すことの原因となり得る。従って、この細胞は、一旦活性化されると、関連の生理学的部位において免疫応答を開始させる、または既存の免疫応答を増強する機構に関与する。
【００３６】
例えば、T細胞は、分化した抗原提示分子に関連して、身体の他の細胞の表面上に提示された抗原に応答するリンパ球である。これらの抗原提示分子としては、MHCクラスIおよびMHCクラスII分子、並びに例えばCD1などの他の分子が挙げられる。大部分のT細胞(通常、αβT細胞受容体を発現している)は、MHC分子によって提示されるペプチド抗原に応答するが、他のT細胞(γδT細胞受容体を発現していることが多い)は、脂質などの非ペプチド抗原に応答する。
【００３７】
T細胞受容体は、T細胞の表面で発現し、CD3を含む複合体（それ自体が少なくとも5つの異なるポリペプチド鎖(γ、δ、ε、およびζと呼ばれる)を含む）の一部を形成する。1つのCD3複合体は、1本のγ鎖、1本のδ鎖、およびε鎖とζ鎖をそれぞれ2本ずつ含む。別の細胞の表面上の好適な抗原提示複合体がT細胞受容体と会合すると、CD3複合体を介してシグナル伝達を誘導し、このT細胞の活性化をもたらす。
【００３８】
様々な異なるT細胞サブタイプがある。「ヘルパー」T細胞(典型的にはCD4を発現し、それ自体Th1およびTh2などの他のサブタイプに分けられる)は、活性化されると、増殖し、サイトカインを分泌して他の免疫細胞種の活性化および増殖を促進する。「細胞傷害性」T細胞(典型的にはCD8を発現する)は、活性化されると、これらのT細胞が応答する抗原を提示している細胞(癌細胞および/またはウイルスなどの寄生生物に感染された細胞であることが多い)を殺傷することができる。
【００３９】
CD3に対する抗体が、T細胞を活性化してT細胞の増殖を誘導し得ることは、よく知られている。抗CD3抗体の例としては、いずれもヒトCD3に向けられている、OKT3およびUCHT-1が挙げられる。
【００４０】
T細胞の活性化は、Thy-1(AAB26353.2  GI:13195770)、TAP、Ly-6C、CD2(NP_001758.1  GI:4502653)およびCD28(NP_006130.1  GI:5453611)に対する抗体を使用して達成することもできる(Takada, S, Engleman, E G, J. Immunol. 139:3231 (1987); Langlet, C, Guimezanes, A, Kaldy, Pら, Cytotoxic T Cells: Biology and Relevance to Diseases. Battistoら編, Ann, N.Y. Acad. Sci. 532:33 (1988); Gunther, K C, Malek, T R, Shenvach, E M, J. Exp. Med. 159:716 (1984); Leo, O, Foo, M, Henkart, P Aら, J. Immunol. 139:3556 (1987))。
【００４１】
CD2を介して最適な刺激を誘導するために、CD2上でそれぞれ異なるエピトープに結合する、2種以上の異なる抗体を使用することが望ましい場合がある。公知の組み合わせとしては、T11.3抗体と、T11.1抗体もしくはT11.2抗体のいずれか(Meuer, S. C.ら (1984) Cell 36:897-906)、および9.6抗体(T11.1抗体と同じエピトープを認識する)と9-1抗体との組み合わせ(Yang, S. Y.ら(1986) J. Immunol. 137:1097-1100)が挙げられる。
【００４２】
別法として、1種以上のこれらのタンパク質に対する抗体を、CD3に対する抗体と併用してT細胞に共刺激シグナルを与え、これによりT細胞の活性化を増強することができる。共刺激抗体は、所望に応じて、可逆的に阻害されていてもよいし、可逆的に阻害されていなくてもよい。可逆的に阻害されている場合、1つの刺激で両方の抗体を活性化し得るように、抗CD3抗体と同じ機構によって阻害されていることが望ましい場合がある。
【００４３】
T細胞活性化の特徴は細胞サブタイプに応じて決まるが、細胞増殖の増大、IL-2受容体の発現の増大、IL-2に対する応答における増殖の増強、およびCD69の発現の増大を含み得る。ヘルパーT細胞は、前炎症性サイトカイン(例えば、特定のヘルパー細胞の種類に応じて、IL-2、IFN-γ、TNFβ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、GM-CSF、IL-10および/またはTNF-α)の増加量を分泌することができるが、他方、細胞傷害性T細胞は、細胞傷害性(細胞殺傷)活性の増強を示す。このように、抗体誘導性のT細胞活性化は、T細胞受容体相互作用を介したT細胞の抗原特異的活性化を模倣し、質的および/または量的に類似の応答を誘導する。
【００４４】
ヒトCD3に対する抗体としては、7D6、12F6、38.1、89b1、131F26、BL-A8、BW239/347、BW264/56、CD3-4B5、CLB-T3/3、CRIS-7、F111-409、G19-4.1、HIT3a、ICO-90、IP30、Leu-4、LY17.2G3、M-T301、M-T302、MEM-57、MEM-92、NU-T3、OKT3(米国特許第4,658,019号)、OKT3D、SMC2、T3、T3(2Ad2)、T3/2Ad2A2、T3/2AD、T3(2ADA)、T3/2T8-2F4、T3/RW2-4B6、T3/RW2-8C8、T10B9、T101-01、UCHT1、VIT3、VIT3b、X35-3、XXIII.46、XXIII.87、XXIII.141、YTH12.5、およびYTH12.5が挙げられる。詳細は、ヒト白血球分化抗原(HLDA)抗体のデータベースを参照されたい。
【００４５】
IgG2aアイソタイプを有する抗体は、細胞活性化において他のIgGアイソタイプの抗体より有効であると考えられている。したがって、本発明の抗体は、特にOKT3またはUCHT1などの抗CD3抗体である場合、IgG2aであってよい。
【００４６】
本発明の抗体は、場合によりグリコシル化を伴う、2つのFab領域およびFc領域を形成するように適切に折り畳まれた、ジスルフィド結合によって2本の完全な軽鎖に連結された2本の完全な重鎖からなる完全な天然抗体の構造を有し得る。しかし、全抗体のフラグメントは、抗原結合機能を果たし得ることがよく知られている。したがって、「抗体」という用語は、本明細書中で、抗体の抗原結合部分を含む任意の分子を包含するように用いられる。結合フラグメントの例として、(i)VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなるFabフラグメント;(ii)VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;(iii)単一の抗体のVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント；(iv)1つのVHドメインからなるdAbフラグメント(Ward, E.S.ら, Nature 341, 544-546 (1989))；(v)単離されたCDR領域；(vi)F(ab')2フラグメント、2つの連結されたFabフラグメントを含む二価のフラグメント、(vii)VHドメインとVLドメインが、2つのドメインが会合して抗原結合メンバーを形成することを可能とするペプチドリンカーで連結されている、一本鎖Fv分子(scFv)(Birdら, Science, 242, 423-426, 1988; Hustonら, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988)がある。
【００４７】
本明細書に記載される抗体は、免疫系細胞に結合し得る少なくとも1つの抗原結合部位を有する。これらの抗体は、2つ(またはそれ以上)のこのような抗原結合ドメインを含むことが望ましい場合がある。これにより、細胞活性化に必要（または最適）であり得る、免疫系細胞の表面上の同種抗原の架橋を容易にすることができる。
【００４８】
本発明の抗体が2つ以上の抗原結合部位を有する場合、抗原結合部位は全て、同種の免疫系細胞に対して、好ましくは免疫系細胞上の同種抗原に対して、また好ましくはその抗原上の同種エピトープに対して結合することができる。例えば、本発明の抗体の全ての抗原結合部位は同じであってよい。
【００４９】
しかしながら、一部の免疫細胞種の活性化は、2種以上の細胞表面受容体の連結を必要とし得る。この連結は、本明細書中に記載される2つの異なる種類の抗体（各抗体は免疫細胞上の受容体の1つに対して特異的である）の共投与によって達成することができる。別法として、各々が免疫細胞の表面上の異なる受容体に対して特異的な、2つの異なる抗原結合部位を含む抗体を使用することができる；すなわち、本発明の抗体は、二重特異性であり得る。例えば、本発明の抗体は、CD3とCD28の両方に結合し得る。
【００５０】
本発明の抗体は、活性化させる免疫系細胞以外の細胞種に結合し得る抗原結合部位を有さない。さらに、本発明の抗体は、該抗体を別の細胞種に対して標的化させる(すなわち、本発明の抗体を、標的化部位を有していない同じ抗体のバックグラウンド結合を著しく上回るレベルでその細胞に結合するようにさせる）任意の他の標的化部位を有するように改変または操作されていない。本発明の抗体は、さらに以下で説明する、抗体中に存在し得る遮断部分を除いて、任意の非抗体部分を有するように改変または操作されていない。したがって、該抗体は、他の細胞種上で発現される分子のためのリガンドまたは受容体を有するように操作されていない。当然ながら、抗体のFc領域は、様々な細胞種上で発現されるFc受容体に結合し得る。しかし、本発明では、このFc領域が、本発明の抗体が別の細胞種に結合することを可能とするために該抗体に意図的且つ人為的に導入された標的化部位であるとは考えていない。抗体の天然のグリコシル化も、このような標的化部位とは考えられていない。このように、好ましくは、本発明の抗体は、該抗体の抗原結合部位に対する同種抗原を発現している細胞、および(本発明の抗体がFcドメインを含む場合)Fc受容体を発現している細胞に対してのみバックグラウンドレベルを超えて結合する。
【００５１】
特に、本発明の抗体を、標的抗原または標的細胞種に対する免疫応答を刺激するために使用する場合、この抗体は、抗原結合部位を介しても、あるいは人為的手段(例えば、遺伝子操作または化学修飾)によって導入された異種部分を介しても、その標的抗原または標的細胞種に結合することはできない。
【００５２】
本発明の抗体は、その同種抗原への結合から可逆的に阻害されている。典型的には、この可逆的阻害は、本発明の抗体を活性化するために選択的に除去し得る遮断部分の化学的結合によって達成される。従って、遮断部分は、選択的に切断可能な基または結合によって本発明の抗体に連結させることができる。
【００５３】
好適な実施形態において、上記の選択的に切断可能な基または結合は、例えば、紫外線、赤外線、X線または可視光線の照射によって切断することができる。レーザー照射は、その送達を極めて厳密に制御することができるため、とりわけ治療方法に対して特に好適であり得る。このため、レーザーは、周囲の正常な組織に悪影響を及ぼすことなく疾患組織の部位(例えば腫瘍)のみに照射するために使用することができる。しかし、紫外線ランプによる照射も同様に適しているであろう。レシピエントの皮膚を通した放射線照射によって、本発明の抗体の結合能力を活性化し得るため、外科的介入の必要性を回避することができる。
【００５４】
このように、本発明の抗体は、光切断可能部分によって、その同種抗原への結合から阻害され得る。このような光切断可能部分は、当技術分野において周知である。抗体は、ヒドロキシ残基またはアミノ残基と結合する適切な試薬を用いて好適に誘導体化することができる。このように、ホスゲン、ジホスゲンまたはDCCI(ジシクロヘキシルカルボジイミド)を用いて、広範囲のアルコール類から光切断可能なエステル、アミド、カーボネート等を生成することができる。これに関連して、ニトロフェニル誘導体を使用し得る。ニトロフェニルメチルアルコール、1-ニトロフェニルエタン-1-オール、および置換アナログなどの置換アリールアルカノールを使用することができる。Thompsonら(Biochem. Biophys. Res. Com. 201, 1213-1219 (1994) and Biochem. Soc. Trans. 225S, 23 (1995))は、1-(2-ニトロフェニル)エチル(NPE)部分の付加によるタンパク質機能の可逆的阻害について記載している。他の光切断可能部分は、例えば、“Biological Applications of Photochemical Switches”, H. Morrison (編), Bioorganic Photochemistry Series, Volume 2, J. Wiley & Sons. (特に第1章、第4節、第34〜50頁を参照されたい)から、当業者に周知であろう。他の好適な光切断可能部分としては、1-(2-ニトロフェニル)ジアゾエタン(L. Bedouetら, Recovery of the oxidative activity of caged bovine haemoglobin after UV photolysis, BBRC,320 (2004) 939-944)、2-ニトロフェニルグリシン(M. Endoら, Design and synthesis of photochemically controllable caspase-3, Angew. Chem. Int. Ed 2004, 43, 5643-5645)、6-ニトロベラチル(M. Endoら, Design and synthesis of photochemically controllable restriction endonumclease BamHI by manipulation of the salt-bridge network in the dimmer interface, J.Org. Chem, 2004, 69, 4292-4289)、o-ニトロベンジルおよび4-ヒドロキシフェナシルが挙げられる。
【００５５】
本明細書に記載される抗体は、通常、医薬組成物の形態でレシピエントに投与される。これらの組成物は、本発明の抗体に加えて、当業者に周知の製薬上許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または他の物質を含み得る。このような物質は無毒でなければならず、且つ活性成分の有効性を妨げるものであってはならない。担体または他の物質の正確な性質は、投与経路（例えば、経口、静脈内、皮膚もしくは皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内の経路または局所適用など）によって決定し得る。多くの場合、静脈内、筋肉内または皮下投与が適している可能性が高いが、他の投与方法も可能である。
【００５６】
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、粉末剤または液剤の形態であってよい。錠剤は、固体担体（例えばゼラチン）またはアジュバントを含み得る。液体医薬組成物は、通常、水、石油、動物油もしくは植物油、鉱油または合成油などの液体担体を含む。生理食塩水、デキストロースもしくは他のサッカライド溶液またはグリコール類（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール）も含まれ得る。
【００５７】
静脈内注射、皮膚注射もしくは皮下注射、または注入（免疫刺激が求められる部位でもよいし、該部位でなくともよい）のために、活性成分は、発熱物質を含まず、且つ適切なpH、等張性および安定性を有する非経口的に許容可能な水溶液の形態とされる。関連の当業者は、例えば、等張ビヒクル（塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液など）を用いて、好適な溶液の調製を上手く行うことができる。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤および/または他の添加剤を含み得る。
【００５８】
投与は、好ましくは、個体に対する利益を示すのに十分な「有効量」でなされる。実際の投与量、ならびに投与速度および投与経過は、治療する対象の性質および重篤度によって決まる。治療の処方（例えば用量の決定等）は、一般開業医および他の医師の職責の範囲内であり、通常、治療対象の障害、個々の患者の症状、送達部位、投与方法および開業医に知られている他の要素を考慮に入れる。好適な担体、アジュバント、賦形剤等は、標準的な薬の教科書（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第20版, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins出版；およびHandbook of Pharmaceutical Excipients, 第2版, 1994）に見られる。しかし、その投与量は、免疫応答を抑制するというよりはむしろ免疫細胞を刺激するのに適している。一般的に、低用量の抗CD3はT細胞を刺激すると考えられているが、高用量の抗CD3は、恐らくT細胞を枯渇させることにより、免疫応答を抑制する可能性がより高い。Bluestone, J A, Science 242:569 (1988)、および米国特許第6,406,696号を参照されたい。当業者であれば、任意の所与の状態に対する好適な用量を確認することができるだろう。
【００５９】
本明細書に記載される組成物および方法は、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは、霊長類（例えば、ヒト、類人猿もしくはサル)、家庭内動物(例えば、ネコ科の動物、イヌ科の動物等)、実験動物(例えば、げっ歯目の動物、ウサギ目の動物等)または家畜動物(例えば、ウシ亜科の動物、ウマ科の動物、ブタ等)の治療に使用される。
【実施例】
【００６０】
方法
抗体と細胞株
CD3+ T細胞株 H9は、ETCCから入手した。OKT3分泌ハイブリドーマはATCCから入手し、(NH4)2SO4沈殿によって無血清培地からOKT3を得た。馴化RPMI培地を作成するために使用したヒト卵巣細胞株OAW42は、Derby General HospitalのA Wilson博士のご好意により提供された。
【００６１】
CD3+マウス細胞株EL4は、この研究所内で保存していた。この細胞株を、10％FCSを含有するRPMI1640培地中で増殖させた。145-2C11モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマは、ECACCから入手した。この抗体は、(NH4)2SO4を用いて無血清培地から沈殿させ、その後大規模に透析した。
【００６２】
抗体の可逆的阻害
OKT3(1mlの0.1M重炭酸塩中0.5mg)を、15μlのNPE-塩化カルボニル(ジオキサン中)を20℃で4時間添加することによって不活性化させ、その後遠心分離と透析を行って過剰な試薬と不溶性の反応生成物を除去した。これにUV-A光を照射すると、上記のNPE基が開裂し、抗体を再活性化させた。初期の実験では、NPE-コーティングしたOKT3は、T細胞に添加する前に、石英キュベット中で放射線照射した（図１）。後の研究では、NPE-OKT3複合体は、T細胞の存在下、96穴プレート中で(図２)放射線照射した。
【００６３】
同様に、1.5mlの145-2C11(0.1M重炭酸塩中0.5mg/ml)を、10μlのNPE-塩化カルボニル(ジオキサン中)を20℃で4時間添加することによって不活性化させ、その後10mMのリン酸緩衝液(pH7.5)中で繰り返し透析し、結合していないNPE基を除去した(1)。13,000gで10分間遠心分離を行い、不活性化された145-2C11をペレットとして得た。これを、1mlのリン酸緩衝生理食塩水中で再懸濁し、0.19mg/mlの、OD280値が1.4の不活性化抗体を含む懸濁液を得た。抗体のOD280値(0.26)を引いた後、残りのOD 1.14は、約300個のNPE残基が各抗体分子上に結合していることに等しい。この数字は、NPE-コーティングした抗体が濁った懸濁液となり、光線を吸収するというよりもむしろ反射していることに起因して、ほぼ間違いなく過度に高い。この懸濁液にUV-A光線を照射すると、NPE基が開裂し、抗体が再活性化した。
【００６４】
in vitroでのコンジュゲートの光分解
NPE-コーティングしたOKT3サンプルに、総UV-A照射が約16mW/cm2であるVL-206BL UV-Aランプ(2 x 6W管)を用いて1cmの距離から放射線照射した。予備実験では、照射は石英キュベット中で6分間行い、このときに、90％超のNPE残基が、抗体活性を変性させることなく開裂することが示された。細胞とNPE複合体とを一緒に放射線照射したときには、96穴プレートのプラスチック蓋による紫外光の吸収を見込んでより長時間の紫外線照射(10分)を用いた。
【００６５】
FACS分析によるOKT3抗体のH9 T細胞への結合
250μlアリコートのH9細胞(10％FCSを含有するRPMI1640培地中106細胞/ml)に、30μlの、未処理のまたはNPE-コーティングしたOKT3(0.1mg/ml)を添加し、4℃で1時間置いた。洗浄後この細胞を、100μlのFITC-標識したヤギ抗マウス(BD Pharmingen社製、リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)(PBS)中、5μlを1mlに希釈)に再懸濁し、4℃で30分間置いた。さらに3回洗浄した後、この細胞をPBSに再懸濁し、FACSによってOKT3結合を分析した。
【００６６】
H9細胞によるCD69とIL2の発現
FACSを使用して、活性化マーカーCD69の発現を分析した。H9ヒトT細胞をOAW馴化RPMI培地に再懸濁し、150μlアリコート（150,000個のT細胞を含む）を、96穴プレートの個々のウェルに加えた。20μlの、未処理のまたはNPE-コーティングしたOKT3(0.2 mg/ml)をウェルに加え、抗体の存在下、上記のT細胞にプレートの蓋を通して10分間放射線照射した。次いで、放射線照射されていない、NPE-コーティングしたOKT3を関連のウェルに加え、上記の細胞を37℃で3時間置いた後、上清を除去した(IL2分析用)。洗浄後、この細胞を、FITC-標識した抗CD69を含む50μlのPBSに再懸濁し(106細胞毎に5μl)、4℃で1時間置いた。さらに3回洗浄した後、細胞をPBSに再懸濁し、FACSを使用して直ぐ分析した。IL2濃度は、BD Biosciences社製のヒトIL2 ELISAキットを用いて測定した。H9細胞がCD69とIL2を発現するためには、OAW馴化培地(OAW42細胞のコンフルエント培養液中に3日間置いた、10％FCSを含有するRPMI1640培地)が必要であった。
【００６７】
腫瘍増殖
C57BL6マウスを8週齢の時点で購入し、新たな環境に慣れさせるため少なくとも1週間置いた後、腫瘍を注射した。液体窒素保存庫から、M5076腫瘍の凍結切片を解凍した。この切片を、199培地中でできるだけ細かく刻み、50μlの、充填された刻んだ腫瘍を、ファインゲージ注射針を用いて各動物に皮下注射した。約3週間後、上記の腫瘍を切除し、新たに刻んだ腫瘍(50μl)を、5μgの145-2C11コンジュゲートを含有する50μlの培地と同時に注射した。対照は、培地のみを含んでいた。
【００６８】
in vivo光分解のため、ヘアクリッパー（バリカン）を使用してマウスの側腹部上の小領域を剃り、剃られた領域の下に腫瘍と抗体を注射し、携帯ランプ（以下参照）を用いて、マウスの上2〜3cmの距離から上記の剃られた領域を5分間放射線照射した。
【００６９】
結果
in vitroでのOKT3の可逆的阻害と、T細胞の活性化
抗CD3モノクローナル抗体OKT3の生物学的活性を阻害するため、光切断可能な2-(ニトロフェニル)エタノール(NPE)基のコーティングを使用した。その後、FACSを使用して、OKT3のH9ヒトCD3+細胞株への結合の阻害および再活性化を研究した。天然の、コーティングされていない抗体を、100％の結合を示す抗体とした(図1b)。抗体をNPEでコーティングすると、この抗体のT細胞株への結合は著しく低下して蛍光を発する細胞はわずか2.5％のみとなった(図1c)。この図は、第2層の抗体のみと共にインキュベートした対照細胞によって得られた図と類似している(図1a)。UV-A光線を用いた放射線照射はNPE基を除去し、未処理の天然のOKT3(図1d)によって得られる抗体結合の約80％まで増大した抗体結合によって示されるとおり、抗体を再活性化させた。
【００７０】
光特異的結合およびそれに続くH9 T細胞株の活性化は、NPE-OKT3複合体添加の3時間後の、初期T細胞活性化マーカーの発現によって確認された。放射線照射されていないNPE-OKT3で処理したT細胞では、活性化マーカーCD69のレベル(図2c)は、バックグラウンド蛍光からわずかに増大したにすぎなかった(図2a)。しかし、このCD69レベルは、NPE-OKT3の存在下、放射線照射されたT細胞上で、放射線照射はされたがコーティングはされていない対照の抗体(図2b)を用いて得られたCD69レベルと同様のレベルまで著しく増大した(図2d)。この、H9細胞の光制御された活性化は、細胞培養上清中のIL-2レベルの分析によって確認した。被覆された抗体を受け入れていない対照H9細胞に由来する培地は、11 ± 3pg/mlのIL2を含んでいた。NPE-OKT3で処理した細胞に由来する培地では、IL2の濃度は、54 ± 13pg/ml IL2まで増大した。(これは予想外ではなく、恐らく、被覆されていない抗体の少量の残留画分の存在を示していた)。しかし、H9細胞とNPE-OKT3との混合物への照射は、IL2濃度を211 ± 30pg/ml(3つの個別の実験の平均値と偏差)まで増大させた。
【００７１】
ここでは、i)H9細胞の存在下、該細胞に損傷を与えることのない生理学的条件下で再活性化を行った点と、ii)96穴プレートのプラスチック蓋を通して放射線照射を行ったにも関わらず、OKT3抗体を再活性化させるには携帯ランプから発せられる光で十分であったことを指摘しておくことが重要である。
【００７２】
本発明者らは、上記の結果と極めて類似した結果を用いて、第2の抗ヒトCD3抗体であるUCHT-1の可逆的阻害を示すこともできた。これは、本明細書に記載される手順の再現性を確立するものである。
【００７３】
145-2C11の可逆的阻害
本発明者らは、マウス抗ヒトT細胞抗体であるOKT3を可逆的に不活性化させることに成功したため、次に、類似のハムスター抗マウスCD3抗体、145-2C11(20)を用いてこの効果を再現することができるか否か検証することを決定した。本発明者らは、この検証により、同系のC57BL6マウス系において、本発明の方法の可能性のある抗癌効果を研究することができるだろうと考えた。このため、145-2C11抗体をNPEでコーティングした。この抗体は、過剰のNPEを除去するための透析中に溶液から出やすいことが分かった。等張生理食塩水中の懸濁液に再懸濁すると、NPE-コーティングした145-2C11抗体は、CD3を発現するマウスリンパ腫細胞株EL4に結合することができなかった。しかし、紫外線で10分間照射した後、この抗体(70％の抗体は、コーティングされていない抗体であった)のEL4細胞への結合を相当量検出することができた(表1)。
【００７４】
上記の実験は、生理学的条件下の細胞の存在下で行われたため、この結果は極めて重要であった。
【００７５】
in vivoでの腫瘍増殖の阻害
その後、本発明者らは、NPE-コーティングした145-2C11抗体を利用して、C57BL6マウス中でM5076卵巣腫瘍細胞株の増殖を調節することができるか否かを決定するために幾つかの初期研究を行った。最初の毒性研究は、高用量の145-2C11とNPE-コーティングした145-2C11(30μg/マウス)が、マウスに悪影響を及ぼさなかったことを示した。本発明者らは、C57BL6マウス中でM5076卵巣腫瘍を増殖させ、結果として得られた腫瘍を細かく刻み、50μlの刻んだ腫瘍を、5μgの様々な145-2C11コンジュゲートを含有する50μlの培地と共に6匹のマウスのグループに継代した。約3週間後、マウスを人道的に屠殺し、最終的な腫瘍の重量を計測した。2つの別個の実験から得られた結果を表2に示す。
【００７６】
第1の実験において、移植された刻んだ腫瘍と共に培地のみを与えたマウスにおける対照の腫瘍の平均重量は200mgであった。対照の、コーティングされていない145-2C11を刻んだ腫瘍と共に注射した場合、最終的な腫瘍の重量は、約20mgまで顕著に低下した。これは、二重特異性抗体によって抗CD3抗体が当該腫瘍に対して特異的に標的化されていないときでも、抗CD3抗体が腫瘍に隣接した領域に存在する場合にはこの抗体が免疫応答を刺激することを示しているため、それ自体興味深い発見である。NPE-コーティングした不活性化抗体を、刻んだ腫瘍と共に注射した場合、最終的な腫瘍の平均重量は、ほぼもとの対照の腫瘍のレベルまで大きさが増大した(予想通り)。NPE-コーティングした145-2C11にin vitroで(キュベット中で)5分間放射線照射し、次いで移植された腫瘍と共に注射した場合、最終的な腫瘍の重量は著しく低下したが、コーティングされていない抗体を用いたときに見られたレベルまでは低下しなかった。しかし、上記の腫瘍とNPE-コーティングした145-2C11との2成分を注射した後、in vivoでこれらに放射線照射したときには、25日後に6匹のマウス中5匹において腫瘍が検出し得ない程度まで、その後の腫瘍の増殖に大きな低下が見られた。この結果は、コーティングされていない抗体による効果よりもさらに顕著である。この事実は、in situでのNPE-コーティングした145-2C11と腫瘍への照射が、いくらかの付加的な有効性を与えたことを示唆していた。
【００７７】
これらの結果を確認するため、実験を繰り返した。腫瘍増殖は、この腫瘍の継代においてより活発であり、対照の腫瘍および放射線照射されていない不活性化145-2C11で処理した腫瘍は、わずか22日の増殖後、400mgの大きさに達した。コーティングされていない抗体を用いて処理すると、腫瘍増殖は対照値の約25％まで再び著しく低下したが、他方、in vitroで放射線照射された、NPE-コーティングした抗体は、最終的な腫瘍の大きさを、対照値の半分を少し上回るまで再び低下させた。この実験では腫瘍がより活発に増殖しているにも関わらず、145-2C11を再活性化させるためにin vivoで放射線照射した動物に再び獲得される腫瘍はごくわずかであった。
【００７８】
その後第3の実験を行い、この実験では、NPE不活性化145-2C11で処理した動物に加えて、剃られた皮膚の一画を通して対照の腫瘍に放射線照射した(表3)。この実験では、前と同様に、腫瘍は先の実験で得られた大きさと非常によく似た大きさ(365mg)までさらに活発に増殖した。放射線照射を受けた対照の腫瘍は、放射線照射を受けていない対照の腫瘍と比較して小さくはなく、腫瘍増殖の低下が再活性化された145-2C11抗体に起因することを裏付けていた。移植された腫瘍がNPE-コーティングした抗体の存在下で放射線照射を受けた後者のグループの腫瘍は、ほとんど検出することができなかった。この実験には、高齢のマウスが使用され、周囲の脂肪から小さな腫瘍を区別して細かく調べることは極めて困難であった。このグループの最終的な腫瘍の重量について得られた数字は、脂肪混入による過大評価である。
【表１】
2009530361.tif 000002
【００７９】
200,000個のEL4細胞を含む100μlのアリコートを96穴プレートの個々のウェルに加えた。10μlのNPE-コーティングした145-2C11(0.19 mg/ml)をこれらのウェルに加え、抗体の存在下で、上記の細胞に、プレートの蓋を通して10分間放射線照射した。その後、放射線照射されていない、NPE-コーティングした145-2C11を関連のウェルに加え、細胞を4℃で1時間置いた後洗浄した。洗浄後この細胞を、100μlの、1/100希釈のビオチン化-抗ハムスターIgG(Vector labs社製)に30分間再懸濁し、洗浄し、100μlの、1/1000希釈のストレプトアビジン-FITC(Sigma社製)を加え、4℃でさらに30分間置いた。さらに3回洗浄した後、細胞をPBSに再懸濁し、FACSを用いて直ちに分析した。得られた値は、FACSピークの平均蛍光である。
【表２】
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【００８０】
1グループが6匹のマウスからなる複数のグループに、50μlの刻んだM5076腫瘍と50μlの145-2C11コンジュゲートを含む培地を同時に(皮下に)注射した。約3週間後、結果として得られた皮下腫瘍を切除し、重さを量った。各動物について、腫瘍の重量値(グラム)を示す。異なるグループ間の腫瘍の重量の差異は極めて大きいため、統計解析は必要ではない。2回の別のセットの実験についてデータを示す。
【表３】
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【００８１】
1グループが4匹のマウスからなる3つのグループに、50μlの刻んだM5076腫瘍と、50μlの培地(2グループ)またはNPE-コーティングした145-2C11(1グループ)を同時に注射した。対照のグループのうちの1つと、NPE-コーティングした抗体を注射したグループに、皮膚の毛を剃った一画を通して5分間放射線照射した。
【００８２】
本発明は、上記の例となる実施形態と共に記載されているが、この開示内容を参照すれば、多くの同等の改変と変形は当業者に明らかであろう。従って、記載された本発明の例となる実施形態は例示であって、限定ではないと見なされるべきである。本明細書に記載される実施形態には、本発明の思想および範囲から逸脱することなく様々な変更を加えることができる。本明細書に引用される参考文献の全ては明確に参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】FACSを用いて測定した、OKT3抗体のH9 T細胞への結合。
【００８４】
a. 対照細胞のみ。  b. T細胞 + OKT3抗体。  c. T細胞 + NPE-コーティングしたOKT3。  d. T細胞 + UV-A照射された、NPE-コーティングしたOKT3。
【図２】FITC-抗CD69コンジュゲートとFACSを用いて示したT細胞の活性化。
【００８５】
a. T細胞のみ。  b. T細胞とOKT3。  c. 細胞への放射線照射の後に添加したNPE-OKT3とT細胞。  d. 放射線照射されたT細胞とNPE-OKT3。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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