(57)【要約】  骨粗鬆症は、高齢化社会における主要な課題の１つである。骨粗鬆症は、個体群の年配者、特に閉経後の女性において骨折をもたらす。従来の医薬には、骨疾患を治療するための使用に対する潜在性を有する多くの天然の生薬がある。これまで、ブテア種の抗骨粗鬆症（骨形成）活性に関する文献として報告されていない。この植物の抗骨粗鬆症活性を試験することが考察された。したがって、本発明は、骨障害の予防又は治療のためのブテア・モノスペルマの抽出物由来の医薬組成物、それらの調整法及び使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨障害の予防又は治療のために医薬組成物であって、治療的に有効量の、ブテア（Ｂｕｔｅａ）種から得られた抽出物（単数または複数）若しくは画分（単数または複数）、あるいはこれらから若しくは他の天然資源から単離されたか又は合成された式１：
【化１】
2009536610.tif 000035
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、独立して、水素、メチル、ヒドロキシ、メトキシ基からなる群から選択される）
で表される化合物類、それらの類似体若しくは塩を単独で又は１〜１０の範囲の比率でいずれかの組合せにより含み、場合により医薬として許容される賦形剤を含む前記医薬組成物。
【請求項２】
使用される化合物（単数または複数）が、式Ｋ０５１、Ｋ０５２、Ｋ０５４、Ｋ０８０、Ｋ０８２、Ｋ０９５：
【化２】
2009536610.tif 000036
によって表される化合物からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記複数の化合物が、単独で、又は割合、モル濃度若しくはパーセント収率に基づく１〜１０の範囲の比率の組合せで使用される（図１１〜１５、表１０〜１１）、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
化合物Ｋ０５１及びＫ０５２が、単独で、又はモル濃度、パーセント収率、等しい若しくは任意の割合、好ましくは等しい割合に基づいた組合せで使用される（図１１〜１５、表１０〜１１）、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
化合物Ｋ０５１、Ｋ０５２及びＫ０９５が、単独で、又はモル濃度、パーセント収率、等しい若しくは任意の割合、好ましくは等しい割合に基づいた組合せで使用される（図１１〜１５、表１０〜１１）、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
化合物Ｋ０５４及びＫ０８０が、単独で、又はモル濃度、パーセント収率、等しい若しくは任意の割合、好ましくは等しい割合に基づいた組合せで使用される（図１１〜１５、表１０〜１１）、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
化合物Ｋ０５１、Ｋ０５２及びＫ０８０が、単独で、又はモル濃度、パーセント収率、等しい若しくは任意の割合、好ましくは等しい割合に基づいた組合せで使用される（図１１〜１５、表１０〜１１）、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
化合物Ｋ０５１、Ｋ０５２、Ｋ０５４、Ｋ０８０及びＫ０９５が、単独で、又はモル濃度、パーセント収率、等しい若しくは任意の割合、好ましくは等しい割合に基づいた組合せで使用される（図１１〜１５、表１０〜１１）、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
化合物Ｋ０５１、Ｋ０５２、Ｋ０５４、Ｋ０８０、Ｋ０８２及びＫ０９５が、単独で、又はモル濃度、パーセント収率、等しい若しくは任意の割合、好ましくは等しい割合に基づいた組合せで使用される（図１１〜１５、表１０〜１１）、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
単独又は組合せで使用される各化合物の濃度が、好ましくは０．１μＭである（図１１〜１５、表１０〜１１）、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
使用される医薬希釈剤が、単独又は適切な組合せで、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、微結晶性セルロース、スクロース、クエン酸ナトリウム、第二リン酸カルシウム又は類似の性質を有する任意の他の成分から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
使用される医薬賦形剤が、
［ａ］単独又は適切な組合せで、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、微結晶性セルロース、スクロース、クエン酸ナトリウム、第二リン酸カルシウム又は類似の性質を有する任意の他の成分から選択される希釈剤；
［ｂ］単独又は適切な組合せで、トラガントゴム、アカシアゴム、メチルセルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スターチ又は類似の性質を有する任意の他の成分から選択される結合剤；
［ｃ］単独又は適切な組合せで、寒天（ａｇａｒ−ａｇａｒ）、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ケイ酸塩、アルギン酸、コーンスターチ、ポテトタピオカスターチ、プリモゲル又は類似の性質を有する任意の他の成分から選択される崩壊剤；
［ｄ］単独又は適切な組合せで、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム又はステアリン酸塩、タルク、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム又は類似の性質を有する任意の他の成分から選択される潤滑剤；
［ｅ］単独又は適切な組合せで、コロイド状二酸化ケイ素又は類似の性質を有する任意の他の成分から選択される流動促進剤；
［ｆ］単独又は適切な組合せで、スクロース、サッカリン又は類似の性質を有する任意の他の成分から選択される甘味剤；
［ｇ］単独又は適切な組合せで、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ・フレイバー、バニラ・フレイバー又は任意の他の医薬として許容されるフレイバーから選択される香味剤；
［ｈ］単独又は適切な組合せで、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセリル又は任意の他の医薬として許容されるフレイバーから選択される湿潤剤；
［ｉ］単独又は適切な組合せで、カオリン、ベントナイト・クレイ又は任意の他の医薬として許容されるフレイバーから選択される吸収剤；及び
［ｊ］単独又は適切な組合せで、ワックス、パラフィン又は任意の他の医薬として許容されるフレイバーから選択される溶液緩染剤
からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
組成物の有効服用量が、０．１〜５０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１ｍｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、毎日、週に２回、毎週又はより多くの分割した服用量である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
組成物が、骨粗鬆症、骨喪失、骨形成、骨折治癒、成長期に投与された場合のより高いピークの骨量の到達、及びインビトロ／インビボでの新骨形成の促進によって引き起こされるいずれかの疾患及び症候群であってもよい骨障害の予防又は治療に有用である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
樹皮（ｓｔｅｍ  ｂａｒｋ）のエタノール抽出物が、２４時間及び４８時間の時間間隔で、対応するビヒクル（エタノール：ＤＭＳＯ、５０：５０、ｖ／ｖ）対照の骨芽細胞の培養物と比較すると、アルカリホスファターゼ染色においてより高い強度を示す（図１）、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
β−グリセロリン酸ナトリウムそれ自体の存在下での酵素活性の２８％増加と比較して、５８％のより高い全体のアルカリホスファターゼ活性を示すエタノール抽出物が骨を治療する（表１）、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
樹皮のエタノール抽出物が、０．０５％及び０．１％の濃度で、対応するビヒクル対照グループと比較すると、培養中の初代骨芽細胞の顕著な増殖を誘導し、ここで、生存細胞の割合は、ビヒクル対照グループの生存率を１００％として比較すると、それぞれ３３０％及び３６１％である（表２）、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
しかしながら、その骨発生（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）濃度（０．０５％及び０．１％）の樹皮のエタノール抽出物が、イシカワ（ヒト子宮腺上皮癌腫）又はＭＣＦ−７（ヒト乳癌）細胞株に対していずれの増殖効果を示さない、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記抽出物の骨芽細胞に特異的な増殖効果が、子宮内膜及び乳房レベルで該抽出物の任意のエストロゲンアゴニスト作用の欠損を示す、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
樹皮のエタノール抽出物が、１回の１０００ｍｇ／ｋｇ経口服用の７２時間後、２１日齢ラットの頭蓋冠におけるコラーゲン−１（骨芽細胞の増殖及び分化のマーカー）の発現において２．５倍を超える増加を示す（図３）、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
樹皮のエタノール抽出物が、１回の１０００ｍｇ／ｋｇ経口服用の７２時間後、２１日齢ラットの頭蓋冠における細胞外マトリックス成熟のマーカーであるオステオカルシンの発現において５倍を超える増加を示す（図４）、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
樹皮のエタノール抽出物が、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現に対して処理の効果を示さない（図３及び４）、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
樹皮のエタノール抽出物が、インビトロで鉱化の比率増加を示し、ここで、アリザリンレッド染色のより高い強度は、対応するビヒクル対照と比較して、２４時間及び４８時間の両方で骨芽細胞における新生（ｎａｓｃｅｎｔ）カルシウムの沈着増加を示す（図５）、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
樹皮のエタノール抽出物が、０．１％の濃度で、それ自体で処理される対応するβ−グリセロリン酸ナトリウム又はビヒクル対照培養物と比較して、インビトロで７日間培養した骨芽細胞における鉱化の比率増加を示す（図６）、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
１５日及び２５日間、樹皮のエタノール抽出物で処理した骨芽細胞の培養物における鉱化した小塊の発生率の増加が、新骨形成の速度増加を示す（図７）、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
アリザリン染色のより高い強度が、１８日及び３０日間、樹皮のエタノール抽出物の存在下で無菌のウシの骨スライス上で長期間培養した骨芽細胞で明らかである（図８）、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
有効な骨発生濃度を採用した場合の樹皮のエタノール抽出物が、トリ胎児骨培養アッセイにおいて、０．５以下のＴ／Ｃ比によって明らかにされる骨形成を促進することによって正の応答を示す（表３）、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
有効な骨発生濃度を採用又は投与した場合のエタノール抽出物が、１００μＭ濃度のラロキシフェン及びエストラジオール−１７βの存在下で、０．６６及び０．３７のＴ／Ｃ比と比較して、１．３４のＴ／Ｃ比である培養中のトリ胎児骨からの45ＣａのＰＴＨ誘導の再吸収を阻害しない（表４）、請求項１に記載の組成物。
【請求項２９】
連続３０日間、１０００ｍｇ／ｋｇの毎日の服用量で経口投与した場合のエタノール抽出物が、対応するビヒクル対照グループと比較して、未成熟の雌性スプラギュー・ドーリー（Ｓｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｙ）ラットの腰椎、大腿及び脛骨の全ての領域の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を顕著に増加する（５％〜６５％）（表５）、請求項１に記載の組成物。
【請求項３０】
前記抽出物で処理された未成熟ラットの骨はまた、ＴＫ２５２Ｃムロマチ（Ｍｕｒｏｍａｃｈｉ）骨強度テスターを用いて、第３腰椎の骨折及び圧迫のための３点曲げを使用した大腿骨を破壊するために必要とされるより大きな力によって明らかにされるように、より高い機械的強度も示す、請求項１に記載の組成物。
【請求項３１】
連続３０日間、１０００ｍｇ／ｋｇの毎日の服用量で経口投与した場合のエタノール抽出物が、カルシウム探索薬物である、処理初期時のテトラサイクリン及び処理終結時のカルセインの投与を伴う二重ラベリング技術、脱灰していない骨の切片化、並びにＵＶ光でのテトラサイクリンラベル及びオレンジフィルターでのカルセインの視覚化によって明らかにされるように、新骨形成を顕著に増加する（図９）、請求項１に記載の組成物。
【請求項３２】
樹皮のエタノール抽出物が、卵巣切除した未成熟ラットにおいて３日間、及び無傷の未成熟ラットにおいて３０日間、１０００ｍｇ／ｋｇの毎日の服用量で投与した場合、子宮レベルでいずれかのエストロゲンアゴニスト作用を欠損している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３３】
未成熟ラットにおける体重及び子宮重量の年齢に関連した増加率に対する樹皮のエタノール抽出物の効果がない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３４】
種子のエタノール抽出物を含む組成物が、エチニルエストラジオールの０．０１ｇ／ｋｇの毎日の服用によって誘導されるものと比較して、未成熟ラットのバイオアッセイにおける子宮の生重量の顕著な増加（４３３％）によって明らかにされるように、強力なエストロゲンアゴニスト活性を示す（表８）、請求項１に記載の組成物。
【請求項３５】
卵巣切除した未成熟ラットへの連続３日間投与した１０００ｍｇ／ｋｇの毎日の服用量での樹皮のエタノール抽出物が、抗エストロゲン性ラロキシフェンの０．２５ｍｇ／ｋｇの毎日の服用量で観察された３７％阻害と比較して、１７α−エチニルエストラジオール(０．０１ｍｇ／ｋｇ／日）誘導の子宮重量増加において４％阻害を生じる（表９）、請求項１に記載の組成物。
【請求項３６】
ブテア種が、ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）、ブテア・パルビフロラ（Ｂｕｔｅａ  ｐａｒｖｉｆｌｏｒａ）、ブテア・ミノル（Ｂｕｔｅａ  ｍｉｎｏｒ）及びブテア・スペルバ（Ｂｕｔｅａ  ｓｕｐｅｒｂａ）からなる群から選択され、好ましくはブテア・モノスペルマである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３７】
ブテア・モノスペルマから使用される植物部分が、樹皮、枝、葉、花、種子からなる群から選択され、好ましくは樹皮である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３８】
生理活性抽出物／画分が、アルコール抽出物、クロロホルム可溶性画分、ｎ−ブタノール可溶性画分からなる群から選択される（図１〜１０；表１〜９）、請求項１に記載の組成物。
【請求項３９】
樹皮のエタノール抽出物のｎ−ブタノール可溶性及びクロロホルム可溶性画分が、４８時間で、対応するビヒクル（エタノール：ＤＭＳＯ、５０：５０、ｖ／ｖ）対照骨芽細胞の培養物と比較すると、アルカリホスファターゼ染色においてより高い強度を示す（図１０）、請求項１に記載の組成物。
【請求項４０】
化合物Ｋ０５１、Ｋ０５２、Ｋ０５４、Ｋ０８０及びＫ０９５が、対応するビヒクル対照グループと比較した場合、プラスチック・カバースリップ（直径６ｍｍ）上に播種され、１０-11Ｍ〜１０-5Ｍの濃度範囲で４８時間インキュベートされた骨芽細胞において、アルカリホスファターゼ（骨芽細胞の分化マーカー）の発現を増加させる（図１１、表１０）、請求項1に記載の組成物。
【請求項４１】
化合物Ｋ０５１、Ｋ０５２、Ｋ０５４、Ｋ０８０及びＫ０９５が、ＭＴＴアッセイにおいてビヒクル対照群と比較した場合、１０-11Ｍ〜１０-5Ｍの濃度範囲で、２４時間後の骨芽細胞の細胞増殖を増大する（図１２、表１１）、請求項１に記載の組成物。
【請求項４２】
化合物Ｋ０５１、Ｋ０５２、Ｋ０５４、Ｋ０８０、Ｋ０８２及びＫ０９５が、７日間培養され、アリザリン抽出法によって定量された骨芽細胞において、新生カルシウムの沈着増加によって明らかにされるように鉱化を増加する（図１３）、請求項１に記載の組成物。
【請求項４３】
化合物Ｋ０５１、Ｋ０５２、Ｋ０５４、Ｋ０８０、Ｋ０８２及びＫ０９５を単独又は組合せで用いて、１５日間、９６ウェルプレートで無菌のウシの骨スライス上で培養した骨芽細胞において新骨形成の比率増加を示すアリザリンレッド染色の強度を増加する（図１４及び１５）、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４４】
請求項１に記載されるブテア種からの生物活性画分を調製する方法であって、
ａ）アルコール溶媒中に粉末の植物部分を浸し、慣習的な方法によって溶媒を濃縮して、アルコール抽出物を得ること；
ｂ）工程（ａ）から得られたアルコール抽出物をヘキサンで粉砕し、ヘキサン可溶性画分及びヘキサン不溶性画分を得ること；
ｃ）ヘキサン不溶性画分をクロロホルムで粉砕し、クロロホルム可溶性画分及びクロロホルム不溶性画分を得ること；
ｄ）クロロホルム可溶性画分を繰り返しのクロマトグラフィーに供し、化合物Ｋ０８４、Ｋ０９０、Ｋ０９５、Ｋ１０３、Ｋ１０５、Ｋ１１３、Ｋ１１５を得ること；
ｅ）クロロホルム不溶性画分をｎ−ブタノール及び水で分割し、ｎ−ブタノール可溶性画分及び水性画分を得ること；
ｆ）ｎ−ブタノール可溶性画分に繰り返しのクロマトグラフィーに供し、化合物Ｋ０１０、Ｋ０３９、Ｋ０４０、Ｋ０５１、Ｋ０５２、Ｋ０５３，Ｋ０５４、Ｋ０６４、Ｋ０８０、Ｋ０８２、Ｋ０９８、Ｋ１１１を得ること
を含む前記方法。
【請求項４５】
抽出に使用されるアルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール又はそれらの適切な混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
化合物の単離に使用されるクロマトグラフィー法が、カラム、フラッシュ、中圧及びＨＰＬＣから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記化合物が、塩酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、酢酸フェニル、トリフルオロ酢酸塩、アクリレート、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、ブロモ安息香酸塩、ヨード安息香酸塩、ニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、アルキル安息香酸塩、アルキルオキシ安息香酸塩、アルコキシカルボニル安息香酸塩、ナフタレン−２−安息香酸塩、酪酸塩、フェニル酪酸塩、ヒドロキシ酪酸塩、カプリン酸塩、カプロン酸塩、桂皮酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、ヘプタン酸塩、馬尿酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、ニコチン酸塩、イソニコチン酸塩、シュウ酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、リン酸塩、リン酸一水素、リン酸二水素、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、プロピオル酸塩、プロピオン酸塩、フェニルプロピオン酸塩、サリチル酸塩、セバシン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、ピロ硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、スルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ブロモベンゼンスルホン酸塩、クロロベンゼンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩等からなる医薬として許容される塩に転換することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
場合により医薬として許容される賦形剤とともに、請求項１に記載される医薬組成物を、必要とする被験者に投与する工程を含む、骨障害の予防又は治療のための方法。
【請求項４９】
前記組成物が、経口、経皮、筋内、腹腔内、静脈、局所から選択される経路によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記組成物が、１〜５０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の服用量で使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
前記組成物が、錠剤、シロップ、粉末、カプセル、懸濁液、溶液、軟膏、混合物の形態で使用される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、医薬品及び有機化学の分野に関し、並びに新規な植物抽出物、それらの画分、サブ画分、これら若しくは他の天然資源から単離した又は合成した純粋な化合物、それらの医薬として許容される塩及び組成物であって、好ましくはヒト及び動物において引き起こされる疾患及び症候群、特に
ａ）骨粗鬆症、骨喪失、骨形成；
ｂ）ＩＩ型／年齢に関連した／老年性骨粗鬆症である骨形成、より高いピークの骨量、骨折治癒、欠損した骨の置換のためにインビトロ／インビボでの新骨形成の促進を達成するための発生及び成長の期間の骨形成；
ｃ）エストロゲンに関連した疾患又は症候群、好ましくは哺乳動物におけるエストロゲン欠乏状態によって引き起こされる疾患又は症候群；
ｄ）心臓血管系作用、より具体的には高脂質血症、血栓性及び血管運動系；
ｅ）脳梗塞、老年性認知症−アルツハイマー型及びパーキンソン病などの神経変性作用；
ｆ）顔面紅潮、泌尿生殖萎縮、うつ病、躁病、統合失調症等を含む更年期症候群、尿失禁、月経困難症の軽減、機能不全性子宮出血の軽減、卵巣発育の補助、座瘡及び多毛の処理；
ｇ）前立腺癌、乳癌、子宮癌、頸部癌及び結腸癌などの癌；
ｈ）ヒト及び他の動物における受精能力の調節又は制御；
ｉ）切迫流産又は習慣流産の予防における使用のため；
ｊ）産後の授乳の抑制；
ｋ）肥満、うつ病などの生理学的な障害
の予防又は治療におけるエストロゲンに独立した若しくは依存した疾患又は症候群の関連した種々の医学的兆候の予防又は治療に有用であるものを提供する。
【０００２】
本発明は、さらに、医薬として活性な抽出物、画分、サブ画分の調製、純粋な化合物の単離の方法、それらの医薬として許容される塩及び本発明の主要な局面の組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
骨粗鬆症は、「低骨量の状態」として定義されているが、高齢化社会において主要な課題の１つである。個体群の老齢者における骨の脆弱性の増大及び結果として骨折の危険性の増加をもたらす骨組織のマイクロアーチテクチャー劣化によって特徴付けられる疾患である。５０歳を超える女性の＞５０％、男性の３０％に影響を及ぼすことが知られている。女性では、また、閉経後すぐに、可変的な年月で骨喪失率の加速化が見られる。
【０００４】
骨折の危険因子及び発生率を減少させる努力は、骨の再吸収の阻害及び／又は骨形成の増大によって骨格量を保存する化合物の開発へと導いた（Ｄｗｉｖｅｄｉ，Ｉ，Ｒａｙ  Ｓ，１９９５“Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ”Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４５，２８９−３３８，Ｅｄｉｔｏｒ  Ｅ  Ｊｕｃｋｅｒ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｌａ；Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＤＨ，Ｈｏｒｓｍａｎｎ  Ａ，Ｎｏｒｄｉｎ  ＢＥＣ，１９７７，“Ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｓｔ−ｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ”Ａｃｔａ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｓｃａｎｄ（Ｓｕｐｐｌ）６５：４９−５６；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  ＴＡ，Ｐｏｌａｎｓｋｙ  ＳＭ，Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎ  ＡＲ，１９７９，“Ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｆｒａｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｈｉｐ  ａｎｄ  ｄｉｓｔａｌ  ｒａｄｉｕｓ：  Ａ  ｃａｒｅ−  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｔｕｄｙ”Ｌａｎｃｅｔ  ２：７０５−７０９）。エストロゲン代償療法はまた、ＣＶＳ＆ＣＮＳに関連した障害に正に影響する（Ｌｏｂｏ  ＲＡ，１９９０，“Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ”Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ＆  Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ  ７５：１８５−２４５；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ  ＭＥ，Ｋａｒａｓ  ＲＨ，１９９４，“Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌ  ｗａｌｌ”Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  １９９４：６１９−６２６；Ｓｔａｍｐｆｅｒ  ＭＪ，Ｃｏｌｄｉｔｚ  ＧＡ，１９９１，“Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ：ａ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ”Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０：４７−６３）。
【０００５】
カルシウム、ビタミンＤ及びその類似体、エストロゲン、カルシトニン、ビスホスホネート、ラロキシフェンなどの臨床使用に利用可能な薬理学的な薬物の大部分は、骨の再吸収の速度を減少させることによって作用し、骨喪失の速度を緩める。このような再吸収阻害剤の投与によって骨喪失を妨げる。しかしながら、一度喪失した骨は、このような再吸収阻害剤の使用によって回復することは不可能である。
【０００６】
伝統的な薬剤では、骨疾患を治療する可能性を有する多くの天然の生薬がある。しかしながら、ほとんどの実験室作業では、それらの可能な開発及び使用を評価するレポートは、この兆候のために臨床的に使用されている天然産物誘導体であるイプリフラボンを除いてはほとんどない。
【０００７】
本特許に含まれる天然産物は、骨芽細胞の増殖及び分化、マトリックス成熟及びインビトロでの多くのアッセイにおける鉱化を促進し、インビボでの長期の治療後に骨のミネラル密度及び骨の機械的強度を高めることが示され、年齢に関連した（ＩＩ型）骨粗鬆症の迅速な骨折治癒及び管理における多大な使用だけでなく、成長及び発育の期間中に投与された場合のより高いピーク骨量を到達するのを手助け、閉経後の骨粗鬆症を含むエストロゲン欠損状態における欠損した骨の置換及び再吸収の阻害のためのインビトロ／インビボでの新骨形成を促進もする。現在、骨形成活性を示すことが報告されている唯一の薬物は、（ａ）非経口に投与されなければならず、より高い服用量で骨の再吸収を増加する副甲状腺ホルモン、（ｂ）摂取過剰により骨粗鬆症を引き起こすことでも知られているフッ化物、及び（ｃ）それらの同化活性のためのアンドロゲンを含む。これは、天然源由来のその種の第一薬物であり、ヒト使用及び福祉のための経口製剤として開発されている。下記の明細書は、具体的には、本発明の性質及び実施されなければならない方法を記載し、究明する。
【０００８】
ブテア・モノスペルマ（Ｌａｍ．）Ｔａｕｂ（Ｓｙｎ．Ｂｕｔｅａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ；Ｆａｍｉｌｙ  Ｆａｂａｃｅａｅ）は、一般に、「ツルハナモツヤクノキ（ｄｈａｋ）」又は「パラス（ｐａｌａｓ）」として知られている。ブテアの種には、ブテア・モノスペルマ、ブテア・パルビフロラ、ブテア・ミノル及びブテア・スペルバが含まれる。これらは、インド全体に広範囲に分布している［Ｔｈｅ  Ｗｅａｌｔｈ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ−Ｒａｗ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ．３４１−３４６，１９８８，ＰＩＤ，ＣＳＩＲ，Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ］。この属の植物は、それらの有色物質に関して周知である。
【０００９】
ブテア・モノスペルマの根は、夜盲症及び他の眼疾患の治療に有用である［Ｍｅｎｇｉ，Ｓ．Ａ．，Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｓ．Ｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４７，９９７−１００１，１９９５］。避妊、媚薬、鎮静及び駆虫活性を有することが報告されている［Ｔｈｅ  Ｗｅａｌｔｈ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ−Ｒａｗ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｐｐ．３４１−３４６，１９８８，ＰＩＤ，ＣＳＩＲ，Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ］。ブテア・スペルバの塊茎は、卵胞ホルモン剤と同様にエストロゲン性物質を含むことが判明している［Ｓｃｈｏｅｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｄｏｈｒｎ，Ｍ．，Ｈｏｈｌｗｅｇ．Ｗ．Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ  ２８，５３２−５３３，１９４０］。ブテア・スペルバの根は、若返り活性を示す［Ｐａｎｇｓｒｉｖｏｎｇｓｅ，Ｋ．Ｒｅｖ．Ｆｉｌｉｐｉｎａ  Ｍｅｄ．Ｆａｒｍ．２９，１２−１４，１９３８］。ブテア・スペルバの根皮は、アセチルコリンエステラーゼに対して６５％の阻害活性を示す［Ｋｏｒｎｋａｎｏｋ，Ｉ．，Ｐｒａｐａｐａｎ，Ｔ．，Ｋａｎｃｈａｎａｐｏｒｎ，Ｃ，Ｔｈｉｔａｒｅｅ，Ｙ．，Ｗａｒａｗｉｔ，Ｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ８９，２６１−２６４，２００３］。ブテア・スペルバの根皮の調製物は、男性における勃起障害の代替の漢方治療として用いられている［Ｃｈｅｒｄｓｈｅｗａｓａｒｔ，Ｗ．，Ｎｉｍｓａｋｕｌ，Ｎ．Ａｓｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ  ５，２４３−２４６，２００３］。ブテア・モノスペルマの樹皮（ｓｔｅｍ  ｂａｒｋ）は抗真菌活性を示し、活性な構成要素（−）−メジカルピンの存在による［Ｂａｎｄａｒａ，Ｂ．Ｍ．，Ｋｕｍａｒ，Ｎ．Ｓ．，Ｓａｍａｒａｎａｙａｋｅ，Ｋ．Ｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２５，７３−７５，１９８９］。媚薬、駆虫、抗菌及び抗喘息特性を有することが報告されている［Ｔｈｅ  Ｗｅａｌｔｈ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ−Ｒａｗ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｐｐ．３４１−３４６，１９８８，ＰＩＤ，ＣＳＩＲ，ＮｅｗＤｅｌｈｉ］。ブテア・スペルバの茎から単離したフラボノール配糖体は、抗微生物活性を示す［Ｙａｄａｖａ，Ｒ．Ｎ．，Ｒｅｄｄｙ，Ｋ．Ｉ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｓｉａｎ  Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｓ．１，１３９−１４５，１９９８］。
【００１０】
ブテア・モノスペルマの葉は、ウサギにおいて眼球の抗炎症活性［Ｍｅｎｇｉ，Ｓ．Ａ．，Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｓ．Ｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４７，９９７−１００１，１９９５］及び強力な抗菌活性［Ｚａｆｆａｒ，Ｒ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｐ．，Ｓｉｄｄｉｑｉ，Ａ．Ａ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｆｏｒｅｓ．１２，３２８−３２９，１９８９］を示す。
【００１１】
ブテア・モノスペルマの花からの抽出物は、肝障害の治療にインドでは使用され、２つの抗肝毒性フラボノイドであるイソブトリン及びブトリンは、該抽出物から単離されている［Ｗａｇｎｅｒ，Ｈ．，Ｇｅｙｅｒ，Ｂ．，Ｆｉｅｂｉｇ，Ｍ．，Ｋｉｓｏ，Ｙ．，Ｈｉｋｉｎｏ，Ｈ．Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄｉｃａ  ５２，７７−７９，１９８６］。それは、トリテルペンの存在に起因して、抗痙攣活性を示す［Ｋａｓｔｕｒｅ，Ｖ．Ｓ．，Ｋａｓｔｕｒｅ，Ｓ．Ｂ．，Ｃｈｏｐｄｅ，ＣＴ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ７２，９６５−９７２，２００２］。ブテア・モノスペルマの花のアルコール抽出物はまた、抗エストロゲン活性［Ｓｈａｈ，Ｋ．Ｇ．，Ｂａｘｉ，Ａ．Ｊ．，Ｓｈｕｋｌａ，ＶＪ．，Ｄａｖｅ，Ｋ．Ｋ．，Ｄｅ，Ｓ．，Ｒａｖｉｓｈａｎｋｅｒ，Ｂ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５２，２７２−５，１９９０；Ｌａｕｍａｓ，Ｋ．Ｒ．，Ｕｎｉｙａｌ，Ｊ．Ｐ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４，２４６，１９６６］及び避妊活性［Ｒａｚｄａｎ，Ｍ．Ｋ．，Ｋａｐｉｌａ，Ｋ．，Ｂｈｉｄｅ，Ｎ．Ｋ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １４，５７−６０，１９７０］を示すことが報告されている。その花から単離された部チンは、男性及び女性の避妊薬の可能性を示す［Ｂｈａｒｇａｖａ，Ｓ．Ｋ．Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ  ５９，１６３−１７７，１９８８］。この植物の花はまた、ハンセン病、白帯下及び通風に効果的［Ｔｈｅ  Ｗｅａｌｔｈ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ−Ｒａｗ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｐｐ．３４１−３４６，１９８８，ＰＩＤ，ＣＳＩＲ，Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ］。
【００１２】
この植物の種子は、駆虫薬としてアーユルベーダ系で用いられる［Ｋａｔｔｉ，Ｍ．Ｃ．Ｔ．，Ｍａｎｊｕｎａｔｈ，Ｂ．Ｌ．Ｊ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６，８３９−８４５，１９２９；Ｒａｊ，Ｒ．Ｋ．，Ｋｕｒｕｐ，Ｐ．Ａ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６，１８１８−１８２５，１９６８；Ｐｒａｓｈａｎｔｈ  Ｄ；Ａｓｈａ  Ｍ．Ｋ．，Ａｍｉｔ  Ａ．，Ｐａｄｍａｊａ，Ｒ．Ｆｉｔｏｔｅｒｐｉａ  ７２，４２１−４２２，２００１；Ｊａｉｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｎａｑｖｉ，Ｓ．Ｍ．Ａ．Ｊ  Ｒｅｓ．Ａｙｕｒ  Ｓｉｄｄｈａ  ７，３−２２，１９８６］。有意な抗排卵活性及び抗着床活性はまた、ラット及びウサギに与えられた場合、種子の熱アルコール抽出物において報告されている。この有効成分は、ブチンとして同定されている［Ｂｈａｒｇａｖａ，Ｓ．Ｋ．Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １８，９５−１０１，１９８６］。ブチンはまた、男性の避妊特性を示す［Ｄｉｘｉｔ，Ｖ．Ｐ．，Ａｇｒａｗａｌ，Ｍ．，Ｂｈａｒｇａｖａ，Ｓ．Ｋ．，Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｓ．，Ｊａｉｎ，Ｇ．Ｃ．ｌｕｇｏｓｌａｖｉｃａ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｅｓ  ｅｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃｓ  Ａｃｔａ  １７，１５１−１６２，１９８１］。
【００１３】
ブテア・フロンドサの種子抽出物の避妊効果は、マウスにおいて報告されている［Ｒａｚｄａｎ，Ｍ．Ｋ．，Ｋａｐｉｌａ，Ｋ．，Ｂｈｉｄｅ，Ｎ．Ｋ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １４，５７−６０，１９７０，Ｒａｚｄａｎ，Ｍ．Ｋ．，Ｋａｐｉｌａ，Ｋ．，Ｂｈｉｄｅ，Ｎ．Ｋ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １３，２３９−２４９，１９６９，Ｐｏｒｗａｌ，Ｍ．；Ｍｅｈｔａ，Ｂ．Ｋ．，Ｇｕｐｔａ，Ｄ．Ｎ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（Ｉｎｄｉａ）１１，８１−８４，１９８８；Ｂｉｌｌｏｒｅ，Ｋ．Ｖ．，Ａｕｄｉｃｈｙａ，Ｋ．Ｃ．Ｊ．Ｒｅｓ．Ｉｎｄ．Ｍｅｄ．Ｙｏｇａ  ａｎｄ  Ｈｏｍｅｏ．１３，１０５，１９７８］。赤血球凝集能は、ヒトの赤血球に対して活性を示すブテア・フロンドサの種子において報告されている［Ｂｈａｌｌａ，Ｖ．，Ｗａｌｔｅｒ，Ｈ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｎｊａｂ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４８，８７−９４，１９９９；Ｗｏｎｇｋｈａｍ，Ｓ．，Ｂｏｏｎｓｉｒｉ，Ｐ．，Ｔｒｉｓｏｎｔｈｉ，Ｃ，Ｓｉｍａｓａｔｈｉａｎｓｏｐｈｏｎ，Ｓ．，Ｗｏｎｇｋｈａｍ，Ｃ，Ａｔｉｓｏｏｋ，Ｋ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｔｈａｉｌａｎｄ  ２１，２７−３６，１９９５］。
【００１４】
ブテア・モノスペルマの種子から抽出したブテア・モノスペルマ凝集素（ＢＭＡ）などのレクチンは、凝集特性に関与する［Ｇｈｏｓｈ，Ｂ．，Ｄａｓｇｕｐｔａ，Ｂ．，Ｓｉｒｃａｒ，Ｐ．Ｋ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  １８，１６６−１６９，１９８１；Ｈｏｒｅｊｓｉ，Ｖ．，Ｔｉｃｈａ，Ｍ．，Ｎｏｖｏｔｎｙ，Ｊ．，Ｋｏｃｏｕｒｅｋ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ６２３，４３９−４４８，１９８０］。ブテア・フロンドサの種子の石油エーテル抽出物は、ダイスデルクス・シミリス（Ｄｙｓｄｅｒｃｕｓ  ｓｉｍｉｌｉｓ）（Ｆ）［Ｋｕｍａｒ，Ｂ．，Ｈａｒｅｓｈ，Ｔ．Ｓ．Ｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ３６，２０９−２１７，１９８９］に対する増殖制御活性［ｊｕｖｅｎｉｌｅ  ｈｏｒｍｏｎｅ（ＪＨ）］を示した。Ｂ．モノスペルマの種油は、インビトロの試験では有意な殺菌及び真菌殺傷効果を示す［Ｍｅｈｔａ，Ｂ．Ｋ．，Ｄｕｂｅｙ，Ａ．，  Ｂｏｋａｄｉａ，Ｍ．Ｍ．，Ｍｅｈｔａ，Ｓ．Ｃ．Ａａｔａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ  Ｈｕｎｇａｒｉｃａ  ３０，７５−７７，１９８３；Ｐｏｒｗａｌ，Ｍ．，Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．，Ｍｅｔｈａ，Ｂ．Ｋ．Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ  ５９，１３４−１３５，１９８８］。ブテア・スペルバ種子の石油エーテル抽出物は、駆虫活性及び降圧作用を示す［Ｓｉｄｄｉｑｕｉ，Ｈ．Ｈ．，Ｉｎａｍｄａｒ，Ｍ．Ｃ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２５，２７０−２７１，１９６３］。ブテア・モノスペルマガムはまた、慢性下痢の症例に有用であることが判明している。それは強力な収斂剤であり、また、ビリルビンレベルを減少させる［Ｒａｓｈｅｅｄ，Ａ．，Ａｌａｍ．Ｍ．Ｔｕｆａｉｌ，Ｍ．，Ｋｈａｎ，Ｆ．Ｚ．Ｈａｍｄａｒｄ  Ｍｅｄｉｃｕｓ  ３６，３６−３９，１９９３］。
【００１５】
純粋化合物
種々の化合物ブテラ種から単離されている。ブテア・モノスペルマの根には、グルコース、グリシン、グリコシド（アグリコン）及び芳香族ヒドロキシ化合物が含まれる［Ｔａｎｄｏｎ，Ｓ．Ｐ．，Ｔｉｗａｒｉ，Ｋ．Ｐ．Ｓａｘｅｎａ，ａｎｄ  Ｖ．Ｋ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｄｉａ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３９，２３７−２３９，１９６９］。ブテア・スペルバの塊茎から、３，７，３’−トリヒドロキシ−４’−メトキシフラボン及び３，３’−ジヒドロキシ−４’−メトキシフラボン−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドが単離されている［Ｒｏｅｎｇｓｕｍｒａｎ，Ｓ．，Ｐｅｔｓｏｍ，Ａ．，Ｎｇａｍｒｏｊａｎａｖａｎｉｃｈ，Ｎ．，Ｒｕｇｓｉｌｐ，Ｔ．，Ｓｉｔｔｉｗｉｃｈｅａｎｗｏｎｇ，Ｐ．，Ｋｈｏｒｐｈｕｅｎｇ，Ｐ．，Ｃｈｅｒｄｓｈｅｗａｓａｒｔ，Ｗ．，Ｃｈａｉｃｈａｎｔｉｐｙｕｔｈ，Ｃ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ｃｈｕｌａｌｏｎｇｋｏｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ２５，１６９−１７６，２０００］。
【００１６】
ブテア・モノスペルマの茎からフラボノイド８−Ｃ−プレニルクエルセチン７，４’−ジ−Ｏ−メチル−３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル（１−４）−α−Ｌラムノピラノシドが単離されている［Ｙａｄａｖ，Ｒ．Ｎ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｒ．Ｋ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  （Ｉｎｄｉａ）７０，９−１１，１９９８］。ブテア・モノスペルマの樹皮の石油及び酢酸エチル抽出物から単離した抗真菌化合物は、（−）−３−ヒドロキシ−９−メトキシプテロカルパン［（−）−メジカルピン］として単離されている。（−）−メジカルピン及びその酢酸塩は、クラドスポリウム・クラドスポリオイデス（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）に対して活性であった。その石油エーテル抽出物もまた、ルペノン、ルペオール及びシトステロールを得た。エーテル酢酸抽出物から単離したイソフラボンは、５−メトキシゲニステイン及びプルネチンであることが分かっている［Ｂａｎｄａｒａ，Ｂ．Ｍ．Ｒ．，Ｋｕｍａｒ，Ｎ．Ｓ．，Ｗｉｍａｌａｓｉｒｉ，Ｋ．Ｍ．Ｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ｓｒｉ  Ｌａｎｋａ  １８，９７−１０３，１９９０；Ｂａｎｄａｒａ  Ｂ．Ｍ．Ｒ．，Ｋｕｍａｒ  Ｎ．Ｓ．，Ｓａｍａｒａｎａｙａｋｅ  Ｋ．Ｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２５，７３−７５，１９８９］。
【００１７】
スチグマステロール−３−α−Ｌ−アラビノピラノシドに加えて、ブテア・モノスペルマの茎から単離した４つの化合物は、３−メトキシ−８．９−メチレンジオキシプテロカルプ−６−エン、２１−メチレン−２２−ヒドロキシ−２４−オキソオクタコサン酸Ｍｅエステル、４−ペンタコサニルフェノール及びペンタコサニル−β−Ｄ−グルコピラノシド［Ｓｈｕｋｌａ，Ｙ．Ｎ．，Ｍｉｓｈｒａ，Ｍ．，Ｋｕｍａｒ，Ｓ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｂ  ４１Ｂ，  １２８３−１２８５，２００２］、スチグマステロール、スチグマステロール−β−Ｄ−グルコピラノシド、ノンアコサノン酸、３α−ヒドロキシエウフ−２５−エン及び２，１４−ジヒドロキシ−１１，１２−ジメチル−８−オキソ−オクタデク−１１−エニルシクロヘキサンも単離された［Ｍｉｓｈｒａ，Ｍ．，Ｓｈｕｋｌａ，Ｙ．Ｎ．，Ｋｕｍａｒ，Ｓ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５４，８３５−８３８，２０００］。
【００１８】
ロイコシアニジンの四量体は、−Ｃ−Ｃ−及び−Ｃ−Ｏ−Ｃ−連結を有するブテア・モノスペルマのガム及びバークから単離された［Ｓｅｓｈａｄｒｉ，Ｔ．Ｒ．Ｔｒｉｋｈａ，Ｒ．Ｋ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９，１２０１−１２０３，１９７１］。抗菌フラボノールグルコシドである３，５，７，３’，４’−ペンタヒドロキシ−８−メトキシ−フラボノール−3−Ｏ−α−Ｄ−キシロピラノシル（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシド［Ｙａｄａｖａ，Ｒ．Ｎ．，Ｒｅｄｄｙ，Ｋ．Ｉ．Ｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｓｉａｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １，１３９−１４５，１９９８］及び３，７−ジヒドロキシ−８−メトキシフラボン７−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシドは、ブテア・スペルバの茎から単離した［Ｙａｄａｖａ，Ｒ．Ｎ．；Ｒｅｄｄｙ，Ｋ．Ｉ．Ｓ．Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ  ６９，２６９−２７０，１９９８］。
【００１９】
２つの化合物である３，９−ジメトキシプテロカルパン、及びトリテルペノイドエステル、３α−ヒドロキシエウフ−２５−エニルヘプタコサノエートは、ブテア・モノスペルマの葉から単離された［Ｓｈｕｋｌａ，Ｙ．Ｎ．，Ｍｉｓｈｒａ，Ｍ．，Ｋｕｍａｒ，Ｓ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｂ  ４１Ｂ，８８１−８８３，２００２］。
【００２０】
いくつかのフラボノイド、ブテイン、ブチン、ブトリン、イソブトリン、イソブチン（ｉｓｏｂｕｔｙｉｎｅ）、コレオプシン、イソコレオプシン、スルフレイン、モノスペルモシド、イソモノスペルモシド、パラシトリン、３’，４’７−トリヒドロキシフラボン［Ｍｉｓｈｒａ，Ｍ．，Ｓｈｕｋｌａ，Ｙ．Ｎ．，Ｋｕｍａｒ，Ｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ａｎｄ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２４，１９−２２，２００２；Ｇｕｐｔａ，Ｓ．Ｒ．，Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈ，Ｂ．，Ｓｅｓｈａｄｒｉ，Ｔ．Ｒ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９，２２３１−２２３５，１９７０；Ｐｕｒｉ，Ｂ．，Ｓｅｓｈａｄｒｉ，Ｔ．Ｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＆  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２Ｂ，４６２−４６６，１９５３；Ｐｕｒｉ，Ｂ．，Ｓｅｓｈａｄｒｉ，Ｔ．Ｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＆  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４Ｂ，１５８９−１５９２，１９５５］は、ブテア・モノスペルマ花から単離された。イソブトリン及びブトリンは、肝臓保護作用活性を示した［Ｗａｇｎｅｒ，Ｈ．，Ｇｅｙｅｒ，Ｂ．，Ｆｉｅｂｉｇ，Ｍ．，Ｋｉｓｏ，Ｙ．，Ｈｉｋｉｎｏ，Ｈ．Ｐｌａｎｔｓ  Ｍｅｄｉｃａ  ５２，７７−７９，１９８６］。ブトリンはまた、ブテア・スペルバの花から単離された［Ｒａｏ，Ｖ．Ｓ．，Ｓｅｓｈａｄｒｉ，Ｔ．Ｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＆  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８Ｂ，１７８−１７９，１９４９］。スチグマステロール−３−β−Ｄ−グルコピラノシド、γ−シトステロールグルコシド、シトステロール［Ｍｉｓｈｒａ，Ｍ．，Ｓｈｕｋｌａ，Ｙ．Ｎ．，Ｋｕｍａｒ，Ｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ａｎｄ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２４，１９−２２，２００２；Ｍｕｒｔｉ，Ｐ．，Ｂｈａｓｋａｒａ  Ｒ．，Ｓｅｓｈａｄｒｉ，Ｔ．Ｒ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ−Ｉｎｄｉａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  ２０Ａ，２７９−９１，１９４４；Ｍｕｒｔｉ，Ｐ．，Ｂｈａｓｋａｒａ  Ｒ．，Ｓｅｓｈａｄｒｉ，Ｔ．Ｒ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ−Ｉｎｄｉａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ（１９４１），１３Ａ，３９５−８］は、ブテア・モノスペルマの花から報告された。抗痙攣活性を示すトリテルペン（ＴＢＭ）［Ｋａｓｔｕｒｅ，Ｖ．Ｓ．，Ｋａｓｔｕｒｅ，Ｓ．Ｂ．，Ｃｈｏｐｄｅ，ＣＴ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ７２，９６５−９７２，２００２］及びトリテペングリコシド［Ｍｕｒｔｉ，Ｐ．Ｂ．Ｒ．，Ｓｅｓｈａｄｒｉ，Ｔ．Ｒ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｉｎｄｉａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  ２０Ａ１  ２７９−２９１，１９４４］はまた、ブテア・モノスペルマの花から単離されている。ミリシルアルコール、ステアリン酸、パルミチン酸、アラキドン酸及びリグノセリン酸［Ｍｕｒｔｉ，Ｐ．Ｂｈａｓｋａｒａ，Ｒ．，Ｋｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙ，Ｈ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ−Ｉｎｄｉａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  １２Ａ  ４７２−４７６，１９４０］、グルコース、フコース、ヒスチジン、アスパラギン酸、アラニン及びフェニルアラニンはまた、ブテア・フロンドサ花から単離された［Ｓｈａｈ，Ｋ．Ｃ．，Ｂａｘｉ，Ａ．Ｊ．，Ｄａｖｅ，Ｋ．Ｋ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｄｒｕｇｓ  ２９，４２２−３，１９９２］。
【００２１】
ブテア・モノスペルマの種子抽出物から、いくつかのフラボノイド、即ち、５，６，７，４’−テトラヒドロキシ−８−メトキシイソフラボン６−Ｏ−ラムノピラノシドが報告されている［Ｓａｘｅｎａ，Ｖ．Ｋ．，Ｓｈａｒｍａ，Ｄｅｖｅｎｄｒａ，Ｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ（Ｉｎｄｉａ）７０，２１８−２２０，１９９８］。種子から単離したブチンは、男性及び女性の避妊活性を示すことが報告されている［Ｂｈａｒｇａｖａ，Ｓ．Ｋ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １８，９５−１０１，１９８６；Ｄｉｘｉｔ，Ｖ．Ｐ．，Ａｇｒａｗａｌ，Ｍ．，Ｂｈａｒｇａｖａ，Ｓ．Ｋ．，Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｓ．，Ｊａｉｎ，Ｇ．Ｃ．ｌｕｇｏｓｌａｖｉｃａ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａ  ｅｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ａｃｔａ  １７，１５１−１６２，１９８１］。α−アミリン、β−シトステロール、β−シトステロール−β−Ｄ−グルコシド及びスクロースは、ブテア・フロンドサ種子から単離された［Ｃｈａｎｄｒａ，Ｓ．，Ｌａｌ，Ｊ．，Ｓａｂｉｒ．Ｍ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ３９，７９−８０，１９７７］。
【００２２】
パラソニン、駆虫本質は、ブテア・フロンドサ種子から単離された［Ｋｕｍａｒ，Ｄ．，Ｍｉｓｈｒａ，Ｓ．Ｋ．，Ｔａｎｄｏｎ，Ｓ．Ｋ．，Ｔｒｉｐａｔｈｉ，Ｈ．Ｃ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２７，１６１−１６６，１９９５；Ｃｈａｎｄｒａ，Ｓ．，Ｌａｌ，Ｊ．，Ｓａｂｉｒ，Ｍ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ４０，９７−９８，１９７８；Ｒａｊ，Ｒ．Ｋ．，Ｋｕｒｕｐ，Ｐ．Ａ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６，１８１８−１８２５，１９６８］。モノスペルミン［Ｍｅｈｔａ，Ｂ．Ｋ．，Ｂｏｋａｄｉａ，Ｍ．Ｍ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ（Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕ．Ｋ．）９８，１９８１］及び酸アミド［Ｂａｒｕａ，Ａ．Ｋ．，Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｐ．Ｉ．，Ｄａｓ，Ｋ．Ｇ．，Ｎａｉｒ，Ｍ．Ｓ．Ｂ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ（Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕ．Ｋ．）１３７６，１９７０］は、ブテア・モノスペルマの種子から単離された。イミドであるパラソニン−Ｎ−フェニルイミドは、ブテア・モノスペルマの鞘から単離された［Ｇｕｈａ，Ｐ．Ｋ．，Ｐｏｉ，Ｒ．，Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ，Ａ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９，２０１７，１９９０］。
【００２３】
１−カルボメトキシ−２−カルボミルヒドラジン［Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．，Ｂａｔｒａ，Ａ．，Ｍｅｈｔａ，Ｂ．Ｋ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｂ  ３ＯＢ，１５−１６，１９９１］、２−ヒドロキシ−ω−メチルアロファン酸［Ｐｏｒｗａｌ，Ｍ．，Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．，Ｍｅｈｔａ，Ｂ．Ｋ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｂ  ２７Ｂ，２８１−２８２，１９８８］、４−カルボメトキシ−３，６−ジオキソ−５−ヒドロ−１，２，４−トリアジン［Ｐｏｒｗａｌ，Ｍ．，Ｍｅｈｔａ，Ｂ．Ｋ．，Ｇｕｐｔａ，Ｄ．Ｎ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（Ｉｎｄｉａ）１１，８１−８４，１９８８］は、ブテア・モノスペルマの種皮から単離された。脂肪酸、例えばミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、リノール酸及びリノレン酸は、ブテア・モノスペルマ種子から単離［Ｓｅｎｇｕｐｔａ，Ａ．，Ｂａｓｕ，Ｓ．Ｐ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ５５，５３３−５３５，１９７８］。
【００２４】
１５−ヒドロキシペンタコサノン酸［Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．，Ｂａｔｒａ，Ａ．，Ｍｅｈｔａ，Ｂ．Ｋ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｂ  ３０Ｂ，７１５−７１６，１９９１］、ｎ−ヘネイコサン酸δ−ラクトン［Ｂｉｓｈｎｏｉ，Ｐ．，Ｇｕｐｔａ，Ｐ．Ｃ．Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄｉｃａ  ３５，２８６−２８８，１９７９］、及び１０，１６−ジヒドロキシヘキサデカン［Ｃｈａｔｔｅｒｊｅａ，Ｊ．Ｎ．，Ｓｅｎｇｕｐｔａ，Ｓ．Ｃ．，Ｍｉｓｒａ，Ｇ．Ｓ．，Ａｇａｒｗａｌ，Ｓ．Ｃ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｂ  １４Ｂ，７１９−７２１，１９７６］は、ブテア・モノスペルマの種子から単離された。ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルイノシトールは、ブテア・モノスペルマの種子の主要な成分として同定された［Ｐｒａｓａｄ，Ｒ．Ｂ．Ｎ．，Ｒａｏ，Ｙ．Ｎ．，Ｒａｏ，Ｓ．Ｖ．Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６４，１４２４−１７２７，１９８７］。
【００２５】
ブテア・モノスペルマの種子から単離したレクチンは、凝集活性を示す［Ｗｏｎｇｋｈａｍ，Ｓ．，Ｂｏｏｎｓｉｒｉ，Ｐ．，Ｔｒｉｓｏｎｔｈｉ，Ｃ，Ｓｉｍａｓａｔｈｉａｎｓｏｐｈｏｎ，Ｓ．，Ｗｏｎｇｋｈａｍ，Ｃ，Ａｔｉｓｏｏｋ，Ｋ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｔｈａｉｌａｎｄ  ２１，２７−３６，１９９５；Ｇｈｏｓｈ，Ｂ．，Ｄａｓｇｕｐｔａ，Ｂ．，Ｓｉｒｃａｒ，Ｐ．Ｋ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  １８，１６６−１６９，１９８１］。ブテア・パルビフロラの種油は、パルミチン酸、ステアリン酸、リグノセリン酸、オレイン酸及びリノール酸のグリセリドを提供する［Ｇａｒｇ，Ｓ．Ｋ．Ｆｅｔｔｅ，Ｓｅｉｆｅｎ，Ａｎｓｔｒｉｃｈｍｉｔｔｅｌ  ７３，４３７−４３８，１９７１］。
【００２６】
４つの酸エステル、ジャラリック（ｊａｌａｒｉｃ）エステルＩ及びＩＩ、ラクシジャラリック（ｌａｃｃｉｊａｌａｒｉｃ）エステルＩ及びＩＩ、アレウリチン酸及びアルデヒド酸は、ブテア・フロンドサのシードラックの軟性レジンから単離された［Ｓｉｎｇｈ，Ａ．Ｎ．，Ｕｐａｄｈｙｅ，Ａ．Ｂ．，Ｍｈａｓｋａｒ，Ｖ．Ｖ．，Ｄｅｖ，Ｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３０，８６７−８７４，１９７４；Ｋｈｕｒａｎａ，Ｒ．Ｇ．；Ｓｉｎｇｈ，Ａ．Ｎ．，Ｕｐａｄｈｙｅ，Ａ．Ｂ．，Ｍｈａｓｋａｒ，Ｖ．Ｖ．，Ｄｅｖ，Ｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２６，４１６７−４１７５，１９７０；Ｍａｄｈａｖ，Ｒ．，Ｓｅｓｈａｄｒｉ，Ｔ．Ｒ．，Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｇ．Ｂ．Ｖ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５，１８２−１８４，１９６７］。
【００２７】
（＋）−ロイコシアニジン、３’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラバン−３，４−ジオール及びロイコアントシアニジン［Ｇａｎｇｕｌｉ，Ａ．Ｋ．，Ｓｅｓｈａｄｒｉ，Ｔ．Ｒ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ６，２１−２３，１９５９；Ｇａｎｇｕｌｉ，Ａ．Ｋ．，Ｓｅｓｈａｄｒｉ，Ｔ．Ｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＆  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７Ｂ，１６８，１９５８］、並びにリボフラビン及びチアミン［Ｂｒｏｋｅｒ，Ｒ．Ｉ；Ｂｈａｔ，Ｊ．Ｖ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２，３４３，１９５３］は、ブテア・フロンドサガムから単離された。
【発明の開示】
【００２８】
発明の実施
骨粗鬆症は、我々の高齢化社会における主要な課題の１つである。骨粗鬆症は、個体群の高齢者、特に閉経後の女性における骨折をもたらす。従来の薬物では、骨疾患を治療するための使用に可能性のある多くの天然の生薬がある。これまで、ブテア種の抗骨粗鬆症（骨形成）活性に関する文献としての報告はない。この植物の抗骨粗鬆症活性を研究することが考えられた。
【００２９】
前述の検討から、理想的な薬理学的プロフィールを有し、新しい骨形成を促進する、植物起源の薬物を発見及び開発する緊急な必要性があるように思われる。ブテア・モノスペルマは、このような活性を研究するための適切なケースであり、実験は、それが、骨の形成活性を促進することを有することを示す。
【００３０】
したがって、本発明は、新規な植物抽出物、それらの画分、サブ画分、これら若しくは他の天然資源から単離した又は合成した純粋な化合物、それらの医薬として許容される塩及び組成物であって、好ましくはヒト及び動物において引き起こされる疾患及び症候群、特に
ａ）骨粗鬆症、骨喪失、骨形成；
ｂ）ＩＩ型／年齢に関連した／老年性骨粗鬆症である骨形成、より高いピークの骨量、骨折治癒、欠損した骨の置換のためにインビトロ／インビボでの新骨形成の促進を達成するための発生及び成長の期間の骨形成；
ｄ）エストロゲンに関連した疾患又は症候群、好ましくは哺乳動物におけるエストロゲン欠乏状態によって引き起こされる疾患又は症候群；
ｅ）心臓血管系作用、より具体的には高脂質血症、血栓性及び血管運動系；
ｆ）脳梗塞、老年性認知症−アルツハイマー型及びパーキンソン病などの神経変性作用；
ｇ）顔面紅潮、泌尿生殖萎縮、うつ病、躁病、統合失調症等を含む更年期症候群、尿失禁、月経困難症の軽減、機能不全性子宮出血の軽減、卵巣発育の補助、座瘡及び多毛の処理；
ｈ）前立腺癌、乳癌、子宮癌、頸部癌及び結腸癌などの癌；
ｉ）ヒト及び他の動物における受精能力の調節又は制御；
ｊ）切迫流産又は習慣流産の予防によける使用のため；
ｋ）産後の授乳の抑制；
ｌ）肥満、うつ病などの生理学的な障害
の予防又は治療におけるエストロゲンに独立した若しくは依存した疾患又は症候群の関連した種々の医学的兆候の予防又は治療に有用であるものを提供する。
【００３１】
本発明は、さらに、医薬として活性な抽出物、画分、サブ画分の調製、純粋な化合物の単離の方法、それらの医薬として許容される塩及び本発明の主要な局面の組成物に関する。
【００３２】
発明の概要
したがって、本発明は、骨障害の予防又は治療のために医薬組成物を提供し、該医薬組成物は、治療的に有効量の、ブテア（Ｂｕｔｅａ）種から得られる抽出物若しくは画分あるいはブテア種若しくは他の天然資源から単離されるか又は合成される式１：
【化１】
2009536610.tif 000002
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、独立して、水素、メチル、ヒドロキシ、メトキシ基である）
で表される化合物を単独又は１〜１０の範囲の比率でいずれかの組合せにより含み、場合により医薬として許容される賦形剤を伴う。
【００３３】
本発明の態様では、前記化合物は、式Ｋ０５１、Ｋ０５２、Ｋ０５４、Ｋ０８０、Ｋ０８２、Ｋ０９５：
【化２】
2009536610.tif 000003
によって表される化合物からなる群から選択される。
【００３４】
別の態様では、前記化合物は、単独又は割合、モル濃度若しくはパーセント収率に基づく１〜１０の範囲の比率の組合せで使用される（図１１〜１５、表１０〜１１）。
【００３５】
別の態様では、化合物Ｋ０５１及びＫ０５２は、単独又はモル濃度、パーセント収率、等しいか若しくはいずれかの割合で、好ましくは等しい割合に基づいた組合せで使用される（図１１〜１５、表１０〜１１）。
【００３６】
別の態様では、化合物Ｋ０５１、Ｋ０５２及びＫ０９５は、単独又はモル濃度、パーセント収率、等しいか若しくはいずれかの割合で、好ましくは等しい割合に基づいた組合せで使用される（図１１〜１５、表１０〜１１）。
【００３７】
別の態様では、化合物Ｋ０５４及びＫ０８０は、単独又はモル濃度、パーセント収率、等しいか若しくはいずれかの割合で、好ましくは等しい割合に基づいた組合せで使用される（図１１〜１５、表１０〜１１）。
【００３８】
別の態様では、化合物Ｋ０５１、Ｋ０５２及びＫ０８０は、単独又はモル濃度、パーセント収率、等しいか若しくはいずれかの割合で、好ましくは等しい割合に基づいた組合せで使用される（図１１〜１５、表１０〜１１）。
【００３９】
別の態様では、化合物Ｋ０５１、Ｋ０５２、Ｋ０５４、Ｋ０８０及びＫ０９５が、単独又はモル濃度、パーセント収率、等しいか若しくはいずれかの割合で、好ましくは等しい割合に基づいた組合せで使用される（図１１〜１５、表１０〜１１）。
【００４０】
別の態様では、化合物Ｋ０５１、Ｋ０５２、Ｋ０５４、Ｋ０８０、Ｋ０８２及びＫ０９５は、単独又はモル濃度、パーセント収率、等しいか若しくはいずれかの割合で、好ましくは等しい割合に基づいた組合せで使用される（図１１〜１５、表１０〜１１）。
【００４１】
別の態様では、単独又は組合せて使用される各化合物の濃度は、好ましくは０．１μＭである（図１１〜１５、表１０〜１１）。
【００４２】
別の態様では、使用される医薬的な希釈剤は、単独又は適切な組合せで、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、微結晶性セルロース、スクロース、クエン酸ナトリウム、第二リン酸カルシウム、又は類似の性質を有する任意の他の成分から選択される。
【００４３】
別の態様では、使用される医薬的な賦形剤は下記から選択される：
ａ）単独又は適切な組合せで、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、微結晶性セルロース、スクロース、クエン酸ナトリウム、第二リン酸カルシウム又は類似の性質を有する任意の他の成分から選択される希釈剤；
ｂ）単独又は適切な組合せで、トラガントゴム、アカシアゴム、メチルセルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スターチ又は類似の性質を有する任意の他の成分から選択される結合剤；
ｃ）単独又は適切な組合せで、寒天（ａｇａｒ−ａｇａｒ）、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ケイ酸塩、アルギン酸、コーンスターチ、ポテトタピオカスターチ、プリモゲル又は類似の性質を有する任意の他の成分から選択される崩壊剤；
ｄ）単独又は適切な組合せで、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム若しくはステアリン酸塩、タルク、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム又は類似の性質を有する任意の他の成分から選択される潤滑剤；
ｅ）単独又は適切な組合せで、コロイド状二酸化ケイ素又は類似の性質を有する任意の他の成分から選択される流動促進剤；
【００４４】
ｆ）単独又は適切な組合せで、スクロース、サッカリン又は類似の性質を有する任意の他の成分から選択される甘味剤；
ｇ）単独又は適切な組合せで、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ・フレイバー、バニラ・フレイバー又は任意の他の医薬として許容されるフレイバーから選択される香味剤；
ｈ）単独又は適切な組合せで、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセリル又は任意の他の医薬として許容されるフレイバーから選択される湿潤剤；
ｉ）単独又は適切な組合せで、カオリン、ベントナイト・クレイ又は任意の他の医薬として許容されるフレイバーから選択される吸収剤；及び
ｊ）単独又は適切な組合せで、ワックス、パラフィン又は他の医薬として許容されるフレイバーから選択される溶液緩染剤。
【００４５】
別の態様では、組成物の有効服用量は、０．１〜５０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１ｍｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、毎日、週に２回、毎週又はより多く分割した服用量である。
【００４６】
別の態様では、前記組成物は、骨障害の予防又は治療に有用であり、骨粗鬆症、骨喪失、骨形成、骨折治癒、成長期に投与された場合のより高いピークの骨量の到達、及びインビトロ／インビボでの新骨形成の促進によって引き起こされるいずれかの疾患及び症候群が含まれる。
【００４７】
別の態様では、樹皮のエタノール抽出物は、２４時間及び４８時間の間隔で対応するビヒクル（エタノール：ＤＭＳＯ、５０：５０、ｖ／ｖ）対照の骨芽細胞の培養物と比較すると、アルカリホスファターゼ染色においてより高い強度を示した（図１）。
【００４８】
別の態様では、β−グリセロリン酸ナトリウムそれ自体の存在下での酵素活性の２８％増加と比較して５８％のより高い全アルカリホスファターゼ活性を示す樹皮のエタノール抽出物は骨を治療した（表１）。
【００４９】
別の態様では、該樹皮のエタノール抽出物は、０．０５％と０．１％の濃度で、対応するビヒクル対照グループと比較すると、培養中の初代骨芽細胞の顕著な増殖を誘導し、ここで、生存細胞の割合は、ビヒクル対照グループを１００％として比較するとそれぞれ３３０％及び３６１％である（表２）。
【００５０】
しかしながら、別の態様では、その骨発生（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）濃度（０．０５％及び０．１％）での樹皮のエタノール抽出物は、イシカワ（ヒト子宮腺上皮癌腫）又はＭＣＦ−７（ヒト乳癌）細胞株におけるいずれかの増殖効果を示さない（図２）。
【００５１】
別の態様では、前記抽出物の骨芽細胞特異的な増殖効果は、子宮内膜及び乳房レベルで該抽出物の任意のエストロゲンアゴニスト作用の欠損を示す。
【００５２】
別の態様では、樹皮のエタノール抽出物は、１回の１０００ｍｇ／ｋｇ経口服用の７２時間後、２１日齢ラットの頭蓋冠におけるコラーゲン−１（骨芽細胞の増殖及び分化のマーカー）の発現において２．５倍を超える増加を示す（図３）。
【００５３】
別の態様では、樹皮のエタノール抽出物は、１回の１０００ｍｇ／ｋｇ経口服用の７２時間後、２１日齢ラットの頭蓋冠における細胞外マトリックス成熟のマーカーであるオステオカルシンの発現において５倍を超える増加を示す（図４）。
【００５４】
別の態様では、樹皮のエタノール抽出物は、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現における処理の効果を示さない（図３及び４）。
【００５５】
別の態様では、樹皮のエタノール抽出物は、インビトロで鉱化の比率を増加させ、ここで、アリザリンレッド染色のより高い強度は、対応するビヒクル対照と比較して、２４時間及び４８時間の両方で骨芽細胞における新しいカルシウムの沈着増加を示す（図５）。
【００５６】
別の態様では、樹皮のエタノール抽出物は、０．１％の濃度で、それ自体で処理される対応するβ−グリセロリン酸ナトリウム又はビヒクル対照培養物と比較して、インビトロで７日間培養した骨芽細胞における鉱化の比率の増加を示す（図６）。
【００５７】
別の態様では、１５日及び２５日間、樹皮のエタノール抽出物で処理した骨芽細胞の培養物における鉱化した小塊の発生率の増加は、新骨形成の速度増加を示す（図７）。
【００５８】
別の態様では、アリザリン染色のより高い強度が、１８日及び３０日間、樹皮のエタノール抽出物の存在下で、無菌のウシの骨スライス上で長期間培養した骨芽細胞において、新骨形成の速度増加を示していることは明らかである（図８）。
【００５９】
別の態様では、有効な骨形成濃度を採用する樹皮のエタノール抽出物は、トリ胎児骨培養アッセイにおいて、０．５以下のＴ／Ｃ比によって明らかにされる骨形成を促進することによって正の応答を示す（表３）。
【００６０】
別の態様では、有効な骨形成濃度を採用又は投与するエタノール抽出物は、１００μＭ濃度のラロキシフェン及びエストラジオール−１７βの存在下で、０．６６及び０．３７のＴ／Ｃ比と比較して、１．３４のＴ／Ｃの培養中のトリ胎児骨からの45ＣａのＰＴＨ誘導の再吸収を阻害しなかった（表４）。
【００６１】
別の態様では、連続３０日間、１０００ｍｇ／ｋｇの毎日の服用量で経口投与におけるエタノール抽出物は、対応するビヒクル対照グループと比較して、未成熟の雌性スプラギュー・ドーリー（Ｓｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｙ）ラットの腰椎、大腿及び脛骨の全ての領域の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を顕著に増加させた（５％〜６５％）（表５）。
【００６２】
別の態様では、前記抽出物で処理した未成熟ラットの骨は、ＴＫ２５２Ｃムロマチ（Ｍｕｒｏｍａｃｈｉ）骨強度テスターを用いて、第３腰椎の骨折及び圧迫のための３点曲げを使用した大腿骨を破壊するために必要とされるより大きな力によって明らかにされるようにより高い機械的強度も示す（表６）。
【００６３】
別の態様では、連続３０日間、１０００ｍｇ／ｋｇの毎日の服用量で経口投与におけるエタノール抽出物は、カルシウム探索薬物である、処理初期時のテトラサイクリン及び処理終結時のカルセインの投与を伴う二重ラベリング技術、脱灰していない骨の切片化、並びにＵＶ光でのテトラサイクリンラベル及びオレンジフィルターでのカルセインの視覚化によって明らかにされるように新骨形成を顕著に増加させた（図９）。
【００６４】
別の態様では、樹皮のエタノール抽出物は、卵巣切除した未成熟ラットにおいて３日間、及び無傷の未成熟ラットにおいて３０日間、１０００ｍｇ／ｋｇの毎日の服用量で投与されると、子宮レベルでいずれかのエストロゲンアゴニスト作用を欠損する。
【００６５】
別の態様では、未成熟ラットにおける体重及び子宮重量の年齢に関連した増加率に対する樹皮のエタノール抽出物の効果がない（表７及び８）。
【００６６】
別の態様では、種子のエタノール抽出物を含む組成物が、エチニルエストラジオールの０．０１ｇ／ｋｇの毎日の服用によって誘導されるものと比較して、未成熟ラットのバイオアッセイにおける子宮の生重量の顕著な増加（４３３％）によって明らかにされるように強力なエストロゲンアゴニスト活性を示した（表８）。
【００６７】
別の態様では、卵巣切除した未成熟ラットへの連続３日間投与した１０００ｍｇ／ｋｇの毎日の服用量で樹皮のエタノール抽出物は、抗エストロゲン性ラロキシフェンの０．２５ｍｇ／ｋｇの毎日の服用量で観察された３７％阻害と比較して、１７α−エチニルエストラジオール(０．０１ｍｇ／ｋｇ／日）誘導の子宮重量増加において４％阻害を生じた（表９）。
【００６８】
別の態様では、ブテア種は、ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）、ブテア・パルビフロラ（Ｂｕｔｅａ  ｐａｒｖｉｆｌｏｒａ）、ブテア・ミノル（Ｂｕｔｅａ  ｍｉｎｏｒ）及びブテア・スペルバ（Ｂｕｔｅａ  ｓｕｐｅｒｂａ）からなる群から選択され、好ましくはブテア・モノスペルマである。
【００６９】
別の態様では、ブテア・モノスペルマから使用される植物部分が、樹皮、枝、葉、花、種子からなる群から選択され、好ましくは樹皮である。
【００７０】
別の態様では、生理活性抽出物／画分は、アルコール抽出物、クロロホルム可溶性画分、ｎ−ブタノール可溶性画分からなる群から選択される（図１〜１０；表１〜９）。
【００７１】
別の態様では、樹皮のエタノール抽出物のｎ−ブタノール可溶性及びクロロホルム可溶性画分は、４８時間で対応するビヒクル（エタノール：ＤＭＳＯ、５０：５０、ｖ／ｖ）対照骨芽細胞の培養物と比較すると、アルカリホスファターゼ染色において高い強度を示した（図１０）。
【００７２】
別の態様では、化合物Ｋ０５１、Ｋ０５２、Ｋ０５４、Ｋ０８０及びＫ０９５は、対応するビヒクル対照グループと比較して、プラスチック・カバースリップ（直径６ｍｍ）上に播種され、１０-11Ｍ〜１０-5Ｍの濃度範囲で４８時間インキュベートされた骨芽細胞において、アルカリホスファターゼ（骨芽細胞の分化マーカー）の発現を増加させた（図１１、表１０）。
【００７３】
別の態様では、化合物Ｋ０５１、Ｋ０５２、Ｋ０５４、Ｋ０８０及びＫ０９５は、ＭＴＴアッセイにおいてビヒクル対照群と比較して、１０-11Ｍ〜１０-5Ｍの濃度範囲で２４時間後の骨芽細胞の細胞増殖を増大する（図１２、表１１）。
【００７４】
別の態様では、化合物Ｋ０５１、Ｋ０５２、Ｋ０５４、Ｋ０８０、Ｋ０８２及びＫ０９５は、７日間培養した骨芽細胞において、新生カルシウムの沈着の増加によって明らかにされ、アリザリン抽出法によって定量された（図１３）。
【００７５】
別の態様では、化合物Ｋ０５１、Ｋ０５２、Ｋ０５４、Ｋ０８０、Ｋ０８２及びＫ０９５を単独又は組み合わせて用いて、１５日間、９６ウェルプレートにおいて無菌のウシの骨スライス上で培養した骨芽細胞において新骨形成の比率増加を示すアリザリンレッド染色の強度を増加させた（図１４及び１５）。
【００７６】
本発明は、さらに、請求項１に記載されるブテア種からの生物活性画分を調製する方法を提供し、該方法は下記を含む：
ａ）アルコール溶媒中に粉末の植物部分を浸し、慣習的な方法によって溶媒を除去及び濃縮して、アルコール抽出物を得ること；
ｂ）工程（ａ）から得られたアルコール抽出物をヘキサンで粉砕し、ヘキサン可溶性画分及びヘキサン不溶性画分を得ること；
ｃ）ヘキサン不溶性画分をクロロホルムで粉砕し、クロロホルム可溶性画分及びクロロホルム不溶性画分を得ること；
ｄ）クロロホルム可溶性画分を繰り返しのクロマトグラフィーに供し、化合物Ｋ０８４、Ｋ０９０、Ｋ０９５、Ｋ１０３、Ｋ１０５、Ｋ１１３、Ｋ１１５を得ること；
ｅ）クロロホルム不溶性画分をｎ−ブタノール及び水で分割し、ｎ−ブタノール可溶性画分及び水性画分を得ること；
ｆ）ｎ−ブタノール可溶性画分を繰り返しのクロマトグラフィーに供し、化合物Ｋ０１０、Ｋ０３９、Ｋ０４０、Ｋ０５１、Ｋ０５２、Ｋ０５３，Ｋ０５４、Ｋ０６４、Ｋ０８０、Ｋ０８２、Ｋ０９８、Ｋ１１１を得ること。
【００７７】
別の態様では、抽出に使用されるアルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール又はそれらの適切な混合物からなる群から選択される。
【００７８】
別の態様では、化合物の単離に用いられるクロマトグラフィー法は、カラム、フラッシュ、中圧及びＨＰＬＣから選択される。
【００７９】
別の態様では、前記化合物は、塩酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、酢酸フェニル、トリフルオロ酢酸塩、アクリレート、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、ブロモ安息香酸塩、ヨード安息香酸塩、ニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、アルキル安息香酸塩、アルキルオキシ安息香酸塩、アルコキシカルボニル安息香酸塩、ナフタレン−2−安息香酸塩、酪酸塩、フェニル酪酸塩、ヒドロキシ酪酸塩、カプリン酸塩、カプロン酸塩、桂皮酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、ヘプタン酸塩、馬尿酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、ニコチン酸塩、イソニコチン酸塩、シュウ酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、リン酸塩、リン酸一水素、リン酸二水素、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、プロピオル酸塩、プロピオン酸塩、フェニルプロピオン酸塩、サリチル酸塩、セバシン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、ピロ硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、スルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ブロモベンゼンスルホン酸塩、クロロベンゼンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩等からなる医薬として許容される塩に転換することができる。
【００８０】
別の態様では、前記方法は、場合により医薬として許容される賦形剤とともに、前述される医薬組成物を必要とする被験者に投与する工程を含む。
【００８１】
別の態様では、前記組成物は、経口、経皮、筋内、腹腔内、静脈、局所から選択される経路によって投与される。
【００８２】
別の態様では、前記組成物は、１〜５０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の服用量で使用される。
【００８３】
別の態様では、前記組成物は、錠剤、シロップ、粉末、カプセル、懸濁液、溶液、軟膏、混合物の形態で使用される。
【００８４】
主要な態様に従って、本発明は、新規な植物抽出物、それらの画分、サブ画分、これら若しくは天然資源から単離された又は合成された純粋な化合物、それらの医薬として許容される塩、並びに好ましくはヒト及び動物において引き起こされる疾患及び症候群の予防又は治療においてエストロゲンに依存しないか若しくは依存した疾患又は症候群と関連した種々の医薬兆候の予防又は治療に有用である。
【００８５】
重要な態様では、本発明は、治療的に有効量の新規な植物抽出物、それらの画分、サブ画分、これら若しくは天然資源から単離された又は合成された純粋な化合物、それらの医薬として許容される塩及びその組合せを、単独で、混合形態で、あるいは医薬として活性な若しくは不活性な薬剤又は１以上の医薬として許容される担体若しくは賦形剤の組合せて含む医薬組成物を提供する。
【００８６】
別の態様では、本発明は、新規な植物抽出物、それらの画分、サブ画分、これら若しくは他の天然資源から単離した又は合成した純粋な化合物、それらの医薬として許容される塩、及びこれら若しくは他の天然資源から単離された又は合成した純粋な化合物、それらの医薬として許容される塩、並びにそれらの訴を採用する医学的方法、並びに哺乳動物及び動物においてエストロゲンに依存した又は独立した状態、特に骨粗鬆症、骨喪失、骨形成及び心臓血管系作用の予防又は治療のためにこのような薬剤を使用する方法を提供する。
【００８７】
本発明の医学的方法の別の態様では、新規な植物抽出物、それらの画分、サブ画分、これら若しくは他の天然資源から単離した又は合成した純粋な化合物、それらの医薬として許容される塩及びこれら若しくは他の天然資源から単離した又は合成した純粋な化合物、それらの医薬として許容される塩及びその組成物は、エストロゲンに依存した又はエストロゲンに独立した癌の予防又は治療に用いられる。医学的方法のさらに別の代替の態様では、本発明の新規な植物抽出物、それらの画分、サブ画分、これら若しくは他の天然資源から単離した又は合成した純粋な化合物、それらの医薬として許容される塩及び組成物は、ヒト及び他の動物における多産の調節又は制御を含む内因性エストロゲンに対する異常な生理学的応答と関連した疾患状態又は障害の予防又は治療において用いられる。
【００８８】
発明の説明
本発明は、新規な植物抽出物、それらの画分、サブ画分、これら若しくは他の天然資源から単離された又は合成された純粋な化合物、それらの医薬として許容される塩及びこれら若しくは他の天然資源から単離された若しくは合成された純粋な化合物、並びにヒト及び／又は動物において引き起こされるエストロゲンに独立した若しくは依存した疾患又は症候群と関連した種々の医学的兆候の症状の予防又は治療のためにこのような薬剤を使用する方法を提供する。
【００８９】
用語「医薬として許容される塩」は、本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて使用されるとき、Ｂｅｒｇｅら（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６（１）．１−１９，１９７７）による記事に開示されている種類の塩を示す。適切な医薬として許容される塩には、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、次リン酸等によって形成される塩、並びに有機酸、例えば脂肪族モノ及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸から誘導される塩が含まれる。このような医薬として許容される酸付加塩には、ギ酸塩、酢酸塩、酢酸フェニル、トリフルオロ酢酸塩、アクリレート、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、ブロモ安息香酸塩、ヨード安息香酸塩、ニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、アルキル安息香酸塩、アルキルオキシ安息香酸塩、アルコキシカルボニル安息香酸塩、ナフタレン−２−安息香酸塩、酪酸塩、フェニル酪酸塩、ヒドロキシ酪酸塩、カプリン酸塩、カプロン酸塩、桂皮酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、ヘプタン酸塩、馬尿酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、ニコチン酸塩、イソニコチン酸塩、シュウ酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、リン酸塩、リン酸一水素、リン酸二水素、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、プロピオル酸塩、プロピオン酸塩、フェニルプロピオン酸塩、サリチル酸塩、セバシン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、ピロ硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、スルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ブロモベンゼンスルホン酸塩、クロロベンゼンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩等が含まれる。最も好ましい塩は、フマル酸塩又はアスコルビン酸塩又は塩酸塩である。
【００９０】
本発明の薬物の「医薬として許容される組成物」なる用語は、本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて使用されるとき、当該技術分野において知られている医薬として許容される賦形剤を用いて当該技術分野において知られている手法によって調製されてもよい。
【００９１】
本明細書中に言及されている障害又は疾患状態を予防又は治療する方法は、このような治療を必要とする個々のヒト若しくは任意の他の哺乳動物又は任意の他の動物に、治療的に有効な量の１以上の本発明の薬物若しくは医薬として許容される塩又はそれらの医薬として許容される組成物を１以上の医薬として許容される担体、賦形剤等と一緒に投与することを含む。
【００９２】
本発明の薬物若しくは医薬として許容される塩又はそれらの医薬として許容される組成物並びに１以上の医薬として許容される担体、賦形剤等の用量・用法及び投与様式は、本明細書に記載されている障害又は疾患状態の種類に従って変更し、関与する医師の判断に任せられる。
【００９３】
本発明の薬物若しくは医薬として許容される塩又はそれらの医薬として許容される組成物並びに１以上の医薬として許容される担体、賦形剤等は、０．１ｍｇ〜５０００ｍｇの範囲の服用量、より好ましくは０．５〜１０００ｍｇの範囲の服用量、又はさらにより好ましくは１ｍｇ〜５０００ｍｇの範囲の服用量で、週に１回又は週に２回又は毎日又は１日２回又は１日３回又はさらにより分割した服用回数で効果的に投与されてもよい。
【００９４】
治療的に有効な量の本発明の薬物又はその医薬として許容される組成物は、ゼラチンカプセルに封入されるか又は錠剤若しくはカプセルに圧搾されてもよく、あるいはロゼンジ、シクロデキストリン誘導体との封入複合体、注射可能なデポ調合物、エアロゾル、顆粒、粉末、経口液体、粘膜付着調合物、ゲル調合物、トローチ、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハース、リポソーム送達システム、インプラント、坐剤、ペッサリー、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、ミクロ粒子、ナノ粒子、放出制御送達システム、経皮送達システム、標的化送達システム、例えばモノクローナル抗体又は他の適切な担体部分との結合体の形態で調合されてもよい。
【００９５】
このような薬剤は、任意の適切な経路、例えば経口、全身、局部又は局所送達、例えば静脈、動脈、粘膜、皮下、腹腔、皮内、口腔、鼻内、吸入、膣、直腸、経皮によって投与されてもよく、あるいは本発明の薬物若しくは医薬として許容される塩又はそれらの医薬として許容される組成物並びに１以上の医薬として許容される担体、賦形剤等の従来の送達、制御送達又は標的送達を達成するために任意の従来の液体又は固体における任意の他の手段によって投与されてもよい。
【００９６】
本発明の薬物若しくはその医薬として許容される塩又はその医薬として許容される組成物の投与の好ましい様式は経口である。
【００９７】
経口組成物は、一般に、本発明の薬物又は医薬として許容される組成物及び１以上の医薬として許容される賦形剤から構成される。
【００９８】
経口組成物、例えば錠剤、丸薬、カプセル、粉剤、顆粒等は、下記の医薬として許容される賦形剤のいずれかを含んでもよい：
１．単独又は適切な組合せで、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、微結晶性セルロース、スクロース、クエン酸ナトリウム、第二リン酸カルシウム又は類似の性質を有する任意の他の成分などの希釈剤；
２．単独又は適切な組合せで、トラガントゴム、アカシアゴム、メチルセルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スターチ又は類似の性質を有する任意の他の成分などの結合剤；
３．単独又は適切な組合せで、寒天、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ケイ酸塩、アルギン酸、コーンスターチ、ポテトタピオカスターチ、プリモゲル又は類似の性質を有する任意の他の成分などの崩壊剤；
４．単独又は適切な組合せで、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム若しくはステアリン酸塩、タルク、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム又は類似の性質を有する任意の他の成分などの潤滑剤；
５．単独又は適切な組合せで、コロイド状二酸化ケイ素又は類似の性質を有する任意の他の成分などの流動促進剤；
【００９９】
６．単独又は適切な組合せで、スクロース、サッカリン又は類似の性質を有する任意の他の成分などの甘味剤；
７．単独又は適切な組合せで、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ・フレイバー、バニラ・フレイバー又は任意の他の医薬として許容されるフレイバーなどの香味剤；
８．単独又は適切な組合せで、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセリル又は任意の他の医薬として許容されるフレイバーなどの湿潤剤；
９．単独又は適切な組合せで、カオリン、ベントナイト・クレイ又は任意の他の医薬として許容されるフレイバーなどの吸収剤；
１０．単独又は適切な組合せで、ワックス、パラフィン又は任意の他の医薬として許容されるフレイバーなどの溶液緩染剤。
【０１００】
抽出物及び画分を調製するための試験手順
ブテア・モノスペルマの樹皮
エタノールを用いた抽出
ブテア・モノスペルマの粉末にした樹皮（５．５ｋｇ）をエタノール（２５Ｌ）とともにガラスパーコレーターに設置し、室温で約１６時間（一晩）放置した。パーコレイトを回収した。この抽出プロセスは、４回繰り返した。組み合わせた抽出物をろ過し、４５℃で濃縮した；得られた抽出物の重量は３８０ｇ（６．９０％、Ｃ００３）であった。
【０１０１】
エタノール抽出物の分割
エタノール抽出物（３００ｇ）をヘキサン（５００ｍｌ×１５）で粉砕した。次に、ヘキサン可溶性画分は、減圧下、４０℃で濃縮し、得られたヘキサン画分の重量は１５．５ｇ（０．２８％、Ｆ００４）であった。次いで、ヘキサンで粉砕した後に得られた残渣をクロロホルム（４００ｍｌ×１０）で粉砕した。その後、クロロホルム可溶性画分は、減圧下、４０℃で濃縮し、得られたクロロホルム画分の重量は１５ｇ（０．２７％、Ｆ００５）であった。ヘキサン及びクロロホルムによる連続抽出後に得られた残渣は、分液漏斗中の水（８００ｍｌ）に懸濁させ、水で飽和したｎ−ブタノール（３００ｍｌ×１４）で抽出し、その後、減圧下、４５℃で濃縮した。得られたｎ−ブタノール画分の重量は１２４．０ｇ（２．２５％、Ｆ００６）であった。水溶性画分は、ロータベーパ（ｒｏｔａｖａｐｏｒ）を用いて真空下、４５℃で濃縮し、得られた水溶性画分の重量は２０６．５０ｇ（３．７５％、Ｆ００７）であった。
【０１０２】
エタノール抽出物（３００ｇ）をヘキサン（５００ｍｌ×１５）で粉砕した。次に、ヘキサン可溶性画分は、減圧下、４０℃で濃縮し、得られたヘキサン画分の重量は１５．５ｇ（０．２８％、Ｆ００４）であった。次いで、ヘキサンで粉砕した後に得られた残渣をクロロホルム（４００ｍｌ×１０）で粉砕した。その後、クロロホルム可溶性画分は、減圧下、４０℃で濃縮し、得られたクロロホルム画分の重量は１５ｇ（０．２７％、Ｆ００５）であった。ヘキサン及びクロロホルムによる連続抽出後に得られた残渣は、分液漏斗中の水（８００ｍｌ）に懸濁させ、水で飽和したｎ−ブタノール（３００ｍｌ×１４）で抽出し、その後、減圧下、４５℃で濃縮した。得られたｎ−ブタノール画分の重量は１２４．０ｇ（２．２５％、Ｆ００６）であった。水溶性画分は、ロータベーパ（ｒｏｔａｖａｐｏｒ）を用いて真空下、４５℃で濃縮し、得られた水溶性画分の重量は２０６．５０ｇ（３．７５％、Ｆ００７）であった。
【０１０３】
【化３】
2009536610.tif 000004
【０１０４】
ブテア・モノスペルマの枝
エタノールによる抽出
ブテア・モノスペルマの粉末にした枝（１．０ｋｇ）をエタノール（２．０Ｌ）とともにガラスパーコレーターに設置し、室温で（約１６時間）放置した。パーコレイトを分離し、この抽出プロセスを４回繰り返した。組み合わせた抽出物をろ過し、４５℃で濃縮した。得られた濃縮抽出物の重量は１３２．０ｇ（１．３２％、Ａ００１）であった。
【０１０５】
ブテア・モノスペルマの葉
エタノールによる抽出
ブテア・モノスペルマの粉末にした葉（１３．０ｋｇ）をエタノール（２０Ｌ）とともにガラスパーコレーターに設置し、室温で（約１６時間）放置した。パーコレイトを分離し、この抽出プロセスを４回繰り返した。組み合わせた抽出物をろ過し、４５℃で濃縮した。得られた濃縮抽出物の重量は１３００ｇ（１０％、Ｃ００７）であった。
【０１０６】
ブテア・モノスペルマの花
エタノール抽出
ブテア・モノスペルマの粉末にした花（３．０ｋｇ）をエタノール（１５Ｌ）とともにガラスパーコレーターに設置し、室温で（約１６時間）放置した。パーコレイトを分離し、この抽出プロセスを４回繰り返した。組み合わせた抽出物をろ過し、４５℃で濃縮した。得られた濃縮抽出物の重量は４３０ｇ（１４．３３％）であった。
【０１０７】
ブテア・モノスペルマの種子
エタノール抽出
ブテア・モノスペルマの粉末にした種子（１０．０ｋｇ）をエタノール（１４Ｌ）とともにガラスパーコレーターに設置し、室温で（約１６時間）放置した。パーコレイトを分離し、この抽出プロセスを４回繰り返した。組み合わせた抽出物をろ過し、４５℃で濃縮した。得られた濃縮抽出物の重量は１．７５ｋｇ（１７．５％）であった。
【０１０８】
ブテア・モノスペルマのエタノール抽出物の画分由来の化合物の単離のための試験手順
クロロホルム可溶性画分（Ｆ００５）
クロロホルム可溶性画分（Ｆ００５、１５．０ｇ）のカラムクロマトグラフィーを繰り返して、７個の化合物、Ｋ０８４、Ｋ０９０、Ｋ０９５、Ｋ１０３、Ｋ１０５、Ｋ１１３及びＫ１１５を得た。これらの化合物は、詳細なスペクトル試験から特徴付けられた。これらの化合物は、文献に知られている：
１．Ｋ０８４（２−メチル，７−アセチルオキシ，４’−メトキシイソフラボン）の物理的及びスペクトルデータ
【０１０９】
【化４】
2009536610.tif 000005
【０１１０】
２．Ｋ０９０（ドコサン酸）の物理的及びスペクトルデータ
【０１１１】
【化５】
2009536610.tif 000006
【０１１２】
３．Ｋ０９５（３−ヒドロキシ−９−メトキシプテロカルパン、通常、メジカルピン（ｍｅｄｉｃａｒｐｉｎ）として知られている）の物理的及びスペクトルデータ
【０１１３】
【化６】
2009536610.tif 000007
【０１１４】
４．Ｋ１０３（３−メトキシ−８，９−メチレンジオキシクメスタン、通常、フレムミクハッパリン（ｆｌｅｍｍｉｃｈａｐｐａｒｉｎ）として知られている）の物理的及びスペクトルデータ
【０１１５】
【化７】
2009536610.tif 000008
【０１１６】
５．Ｋ１０５（３−メトキシ−８，９−メチレンジオキシ−６ａ，１１ａ−デヒドロプテオカルパン）の物理的及びスペクトルデータ
【０１１７】
【化８】
2009536610.tif 000009
【０１１８】
６．Ｋ１１３（ルペオノン（ｌｅｐｅｏｎｏｎｅ）（ルプ−２０（２９）−エン−３−オン））物理的及びスペクトルデータ
【０１１９】
【化９】
2009536610.tif 000010
【０１２０】
７．Ｋ１１５（ルペオール（ｌｕｐｅｏｌ）（ルプ−２０（２９）−エン３□−オール））の物理的及びスペクトルデータ
【０１２１】
【化１０】
2009536610.tif 000011
【０１２２】
ブテア・モノスペルマの樹皮のエタノール抽出物のｎ−ブタノール可溶性画分（Ｆ００５）由来の化合物の単離のための試験手順
ｎ−ブタノール可溶性画分（１００．０ｇ）のカラムクロマトグラフィーを繰り返して、１２個の化合物、Ｋ０１０、Ｋ０３９、Ｋ０４０、Ｋ０５１、Ｋ０５２、Ｋ０５３、Ｋ０５４、Ｋ０６４、Ｋ０８０、Ｋ０８２、Ｋ０９８及びＫ１１１を得た。これらの化合物は、詳細なスペクトル試験から特徴付けられた。これらの化合物は、文献に知られている：
【０１２３】
８．Ｋ０１０（ペンタコサン酸２，３−ジヒドロキシ−プロピルエステル）の物理的及びスペクトルデータ
【０１２４】
【化１１】
2009536610.tif 000012
【０１２５】
９．Ｋ０３９（２’−ヒドロキシゲニステイン）の物理的及びスペクトルデータ
【０１２６】
【化１２】
2009536610.tif 000013
【０１２７】
１０．Ｋ０４０（７，４’−ジヒドロキシイソフラボン、通常、ダイドゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）として知られている）の物理的及びスペクトルデータ
【０１２８】
【化１３】
2009536610.tif 000014
【０１２９】
１１．Ｋ０５１（２’，４’，５−トリヒドロキシ−７−メトキシイソフラボン、通常、カジャニン（ｃａｊａｎｉｎ）として知られている）の物理的及びスペクトルデータ
【０１３０】
【化１４】
2009536610.tif 000015
【０１３１】
１２．Ｋ０５２（４’−ヒドロキシ，７−メトキシ−イソフラボン、通常、イソホルモネンチン（ｉｓｏｆｏｒｍｏｎｅｎｔｉｎ）として知られている）の物理的及びスペクトルデータ
【０１３２】
【化１５】
2009536610.tif 000016
【０１３３】
１３．Ｋ０５３（４’，５，７−トリヒドロキシイソフラボン、通常、ゲニステインとして知られている）の物理的及びスペクトルデータ
【０１３４】
【化１６】
2009536610.tif 000017
【０１３５】
１４．Ｋ０５４（７，３’−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラボン、通常、カリコシン（ｃａｌｙｃｏｓｉｎ）として知られている）の物理的及びスペクトルデータ
【０１３６】
【化１７】
2009536610.tif 000018
【０１３７】
１５．Ｋ０６４（ノナコサン酸２’，３’−ジヒドロキシ−プロピルエステル）の物理的及びスペクトルデータ
【０１３８】
【化１８】
2009536610.tif 000019
【０１３９】
１６．Ｋ０８０（７−ヒドロキシ，４’−メトキシ−イソフラボン、通常、ホルモネンチンとして知られている）の物理的及びスペクトルデータ
【０１４０】
【化１９】
2009536610.tif 000020
【０１４１】
１７．Ｋ０８２（２−メチル，７−ヒドロキシ，４’−メトキシイソフラボン）の物理的及びスペクトルデータ
【０１４２】
【化２０】
2009536610.tif 000021
【０１４３】
１８．Ｋ０９８（４’，５−ジヒドロキシ，７−メトキシイソフラボン、通常、プルネチン（ｐｒｕｎｅｔｉｎ）として知られている）の物理的及びスペクトルデータ
【０１４４】
【化２１】
2009536610.tif 000022
【０１４５】
１９．Ｋ１１１（ホルモネンチン（ｆｏｒｍｏｎｅｎｔｉｎ）７−Ｏ−β−Ｄ−グリコピラノシド、通常、オノニン（ｏｎｏｎｉｎ）として知られている）の物理的及びスペクトルデータ
【０１４６】
【化２２】
2009536610.tif 000023
【０１４７】
生物学的評価
本発明の植物抽出物／画分／サブ画分／純粋な化合物は、骨発生又は骨形成の増加、動物におけるエストロゲン欠乏又は喪失状態を含むエストロゲン欠損又は喪失の症状、特に、ヒト及び他の動物における骨粗鬆症、骨形成、骨喪失の予防又は治療のための使用に関して評価された。本発明の樹皮のエタノール抽出物及びその画分並びに単離された化合物のための詳細な手順は後述される。予備的な評価では、枝、葉、花及び種子のエタノール抽出物は、不活性であることが判明したか、又は低いオーダーの活性を示し、したがって、続けなかった。さらに、種子のエタノール抽出物は、強力なエストロゲンアゴニスト活性を示した。しかしながら、下記の実施例に例示される活性試験は、本発明の範囲を制限するように構成されていない。
【０１４８】
骨発生又は骨形成活性の測定のための試験手順
本発明の試験抽出物の試験溶液は、０．００１％〜１％の濃度範囲、最も好ましくは０．１％の濃度で適切な溶媒に調製される。３〜５μｌの各濃度は、インビトロで形成する骨の評価のために用いられる。対照実験では、等量の適切な溶媒が試験薬物の代わりに用いられる。
【０１４９】
骨芽細胞培養
骨芽細胞は、多能性間葉細胞の幹細胞から生じる。培養中、骨芽細胞は、段階特異的な遺伝子の発現を伴う主要な３つの段階を受ける。
・増殖＆分化：１〜１２日
アルカリホスファターゼ、コラーゲン−Ｉ、オステリックス、ｃｂｆａ１
・細胞外マトリックス成熟：１２〜１８日
オステオカルシン、オステオポンチン、フィブロネクチン
・鉱化：１４〜３５日
石灰化（小塊形成）
【０１５０】
新生児マウスの頭蓋冠細胞培養物は、僅かに変更を加えて、前述（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３９：４７４３）のように調製される。簡単には、初代骨芽細胞培養に関して、Ｂａｌｂ／ｃマウス新生児（１〜３日齢）からの前頭骨及び頭頂骨は、α−ＭＥＭ中の０．１％コラゲナーゼ／０．１％ディスパーゼにおいて消化させ、５つの連続した消化物を得る。５個の消化物の２番目を合わせ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン、非必須アミノ酸溶液及びピルビン酸ナトリウムを補足したα−ＭＥＭ中で、３７℃、空気中５％のＣＯ2でコンフルエントになるまで増殖させる。薬物の鉱化は、下記の試験を用いて分析した：
【０１５１】
ａ）骨芽細胞の増殖及び分化
アルカリホスファターゼ活性の発現
培養した骨芽細胞において
プラスチックのカバースリップ（直径６ｍｍ）上に播種した細胞（約１０4細胞）を薬物の有無で２４時間及び４８時間インキュベートし、ホルマリンで固定した。ホスファターゼ活性（ＡＬＰ）活性は、ＡＬＰ基質溶液（０．１Ｍ  ＴＢＳ、ｐＨ９．５の２４ｍｌ中、５ｍｇナフトールＡＳ−ＭＸリン酸塩、０．２５ｍｌエチレングリコールモノメチルエステル、１０ｍｇファースト（Ｆａｓｔ）レッドＴＲ）とともに１時間室温でインキュベートすることによって表示させる。
【０１５２】
ブテア・モノスペルマの樹皮のエタノール抽出物の存在下で培養した細胞は、両時間間隔で対応するビヒクル（エタノール：ＤＭＳＯ、５０：５０、ｖ／ｖ）対照培養物と比較した場合、アルカリホスファターゼ染色においてより高い強度を示した（図１）。
【０１５３】
培養したラット胎児骨において
１９日齢のラット胎児の長骨を単離し、１００μＭグリセロリン酸塩及び／又は本発明の抽出物の存在下で、４８時間、ＢＧＪb培地中で培養し、次に、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−１００を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）の９容積中でホモジナイズされる。ホモジネートを５０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心分離される。上清を酵素溶液として用いる。アルカリホスファターゼの活性は、ＡＬＰキット（Ｒｏｃｈｅ，ドイツ）及びｐ−ニトロフェノールホスフェートを基質として用いて測定される。
【０１５４】
全体のアルカリホスフェート活性は、骨を処理したβ−グリセロリン酸ナトリウムそれ自体の存在下での酵素活性におけるたった２８％増加と比較すると、ブテア・モノスペルマの樹皮のエタノール抽出物の存在下で５８％に高くなることが判明した（表１）。
【０１５５】
【表１】
2009536610.tif 000024
【０１５６】
細胞増殖についてのＭＴＴアッセイ
初代骨芽細胞の細胞培養
ＭＴＴアッセイは、細胞増殖を評価するために通常用いられているアッセイであり、そこでは、テトラゾリウム塩は、ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ酵素によってホルマゾン結晶に還元され、次にＤＭＳＯに溶解させる。代謝的に活性な細胞数が増すと、形成されるホルマゾン結晶が多くなる。簡単には、骨芽細胞は、９６ウェルプレート中で、１０％ＦＣＳ及び１％抗生物質溶液を補足されたα−ＭＥＭ培地中に維持される。細胞が４０％コンフルエントに達したとき、２％ＦＣＳを補足された培地中で薬物の有無において２４時間処理される。２４時間後、ＭＴＴ塩が細胞に添加される。４時間後、形成されるホルマゾン結晶をＤＭＳＯに溶解し、５７０ｎｍの波長で読み取りを行う。
【０１５７】
０．０５（３３０％）及び０．１（３６１％）濃度での抽出物は、対応するビヒクル対照グループと比較すると、培養中の初代骨芽細胞の顕著な増殖を誘導した（表２）。
【０１５８】
【表２】
2009536610.tif 000025
【０１５９】
イシカワ及びＭＣＦ−７細胞株
しかしながら、骨発生濃度（０．０５％及び０．１％）の抽出物は、イシカワ（ヒト子宮腺上皮癌腫）及びＭＣＦ−７（ヒト乳癌）細胞株には何ら増殖効果は示さなかった。対照的に、エストラジオール−１７β（１０ｎＭ及び１μＭ）は、ＭＣＦ−７及びイシカワ細胞の両方の増殖において顕著な増加を誘導し、ラロキシフェン（１０ｎＭ及び１μＭ）の場合では、増殖増加はイシカワ細胞株にだけ観察され、子宮／子宮内膜レベルでのその報告されているエストロゲン性作用を確認した（図２）。抽出物による骨芽細胞の増殖効果を示唆しながら、これらの知見は、子宮内膜及び乳房レベルでの抽出物のいずれかのエストロゲンアゴニスト作用の欠損を示し、したがって、ＥＲＴ／ＨＲＴ関連の健康被害を欠いているべきである。
【０１６０】
コラーゲン−Ｉの発現
コラーゲン−Ｉ（骨芽細胞の増殖及び分化の指標）の発現における２．５倍を超える増加もまた、ブテア・モノスペルマの樹皮のエタノール抽出物の１回の１０００ｍｇ／ｋｇの経口服用後の７２時間で２１日齢のラットの頭蓋冠に明らかになった。ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨに対する処理の効果はなかった（図３）。
【０１６１】
ｂ）細胞外マトリックス成熟段階
オステオカルシンの発現
これは、ブテア・モノスペルマの樹皮のエタノール抽出物の１回の１０００ｍｇ／ｋｇ経口服用の７２時間後、２１日齢ラットの頭蓋冠における細胞外マトリックス成熟のマーカーであるオステオカルシンの発現において５倍を超える増加と関連した（図４）。
【０１６２】
ｃ）鉱化
骨芽細胞のアリザリンレッド染色
細胞は、９６ウェルプレート中のプラスチックのカバースリップ（６ｍｍ、Ｔｈｅｒｍａｎｏｘ，Ｎｕｎｃ，米国）上に播種し、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン、非必須アミノ酸溶液、ピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸塩及び５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸を補足したα−ＭＥＭを含む培養液で処理される。２４時間及び４８時間後、細胞培養物を冷却したＰＢＳで２回洗浄し、冷却した７０％エタノールで１時間固定し、水で１回洗浄し、４０ｍＭアリザリンレッド（ｐＨ４．７）で３０分間染色し、次に、ＰＢＳ中で洗浄して、過剰の染料を除去する。
【０１６３】
ブテア・モノスペルマの樹皮のエタノール抽出物を用いて処理された培養物は、より高い強度のアリザリンレッド染色を示し、これは、対応するビヒクル対照に比べて、２４時間及び４８時間の両方で骨芽細胞における新生カルシウムの沈着増加を示し、ブテア・モノスペルマの樹皮のエタノール抽出物の存在下、インビトロでの鉱化の増加率を表す（図５）。
【０１６４】
ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ銀染色：インビトロでのカルシウム沈着検出
プラスチックのカバースリップ上の播種した細胞は、最終濃度０．１％でブテア・モノスペルマの樹皮のエタノール抽出物の有無で７日間培養され、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ銀染色で染色した。ブテア・モノスペルマの樹皮のエタノール抽出物を用いて処理された培養物は、対照とするβ−グリセロリン酸ナトリウムそのもので処理されたか又はビヒクル対照培養物と比較して、より高い強度の染色及び細胞増殖を示し、ブテア・モノスペルマの樹皮のエタノール抽出物の存在下、インビトロでの鉱化の増殖率を表す（図６）。
【０１６５】
骨小塊形成アッセイ
ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ銀染色
細胞を９６ウェルプレート中でプラスチックのカバースリップ（６ｍｍ、Ｔｈｅｒｍａｎｏｘ、Ｎｕｎｃ、米国）上に播種され、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン、非必須アミノ酸溶液、ピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸塩及び５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸を補足したα−ＭＥＭを含む培地を用いて処理された。培地は、隔日ごとに取り替えた。培養の終結時に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、リン酸バッファーホルマリン中で１０分間固定し、水で１回洗浄し、７０％  ９５％及び１００％エタノール（各２回）で連続して脱水し、空気乾燥させる。次に、プレートは、水に対して１００％、９５％、８０％で再水和される。硝酸銀（２％溶液）を添加し、プレートを日光に３０分間晒し、その後、水でリンスする。チオ硫酸ナトリウム（５％）を添加し、３分間、プレートを水中でリンスする。
【０１６６】
１５日及び２５日間、ブテア・モノスペルマの樹皮のエタノール抽出物を用いて処理された培養物中に鉱化した小塊の増加兆候が見られ、新しい骨形成の比率の増加を示す（図７）。
【０１６７】
アリザリンレッド染色
細胞を９６ウェルプレート中で無菌の骨スライス上に播種され、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン、非必須アミノ酸溶液、ピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸塩及び５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸を補足したα−ＭＥＭを含む培地を用いて処理される。培地は、隔日ごとに取り替えた。培養の終結時に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、冷却した７０％エタノールで１時間固定し、水で１回洗浄し、４０ｍＭアリザリンレッド（ｐＨ４．７）で３０分間染色し、次に、ＰＢＳ中で洗浄して過剰な染料を取り除く。より高い強度の色が、抽出物の存在下、培養物中で認められ、新骨形成の比率の増加を示す（図８）。
【０１６８】
ニワトリ退治骨培養アッセイ
Ｒａｉｓｚ（Ｎａｔｕｒｅ  １９７：１０１５−１０１６，１９６３）の方法を僅かに変更して採用した。大腿骨は、１１日後の排卵にニワトリ胚から単離し、実体顕微鏡でドライＷｈａｔｍａｎ（Ｉ）フィルターペーパー上で各骨を注意深く回転させることによって付着している結合組織を取り除く。次に、各大腿骨は、ペニシリン（０．０７５ｍｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．０５ｍｇ／ｍｌ）、ＨＥＰＥＳ（２．３８２ｍｇ／ｍｌ）及びＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を補足したＢＧＪb培地（ｐＨ７．３）中で培養する前に１滴のＰＢＳに置き、45ＣａＣｌ2（０．５μＣｉ／３００μｌ培地）を含むＢＧＪｂ培地に移し、２時間３７℃で、空気中５％ＣＯ2下でインキュベートされる。その後、標識した大腿骨は、２４時間３７℃で、空気中５％ＣＯ2下でＢＧＪb培地で洗浄される。培地のアリコートは、最初の２４時間、骨から培地に放出された45Ｃａの測定のために取り出される。次に、標識した骨は、副甲状腺ホルモン（０．４μＭ）を含むＢＧＪb培地に移し、ＢＧＪb培地中の薬物又はビヒクルの有無において９６時間追跡培養される。適切な溶媒は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸バッファー、エタノール、ＤＭＳＯ（最終濃度０．１％）のような溶媒を単独で又はそれらの適切な組合せから選択される。
【０１６９】
各胎児の反対側の大腿を対応する対照として用いる。各ウェル中でそれぞれ処理された培地を４８時間後に取り替える。培地のアリコートは、処理の２４、４８及び９６時間で骨から培地に放出された45Ｃａの測定について取り出された。９６時間で培養を終了し、骨を０．１Ｎ  ＨＣｌに２４時間移す。培養の２４、４８及び９６時間で回収した使用済みの培地及び培養９６時間でのＨＣｌ抽出物における４５Ｃａによる放射活性は、シンチレーション液（ＡＣＳ  ＩＩシンチレーションカクテル、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，英国）の１０ｍｌ中においてＬｉｑｕｉｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒによって定量される。この試験手順は、骨形成並びに薬物の抗再吸収活性を測定するために用いられた。
【０１７０】
骨形成活性
骨形成活性は、下記の式：
骨形成活性（ｃｐｍ）＝Ａ×（Ａ／Ｂ）1/2×45Ｃａとの２４時間インキュベーション中に骨に取り込まれた全放射活性
によって表現され、ここで、全放射活性は、最初の２４時間のインキュベーション中に培地に放出された45Ｃａ＋２４〜９６時間のインキュベーション中に培地に放出された45Ｃａ＋大腿に残存している45Ｃａを意味する。Ａ及びＢは、それぞれ培養の２４及び９６時間での骨に残存している45Ｃａの割合である。
【０１７１】
上記の試験手順に従って、その効果的な骨発生濃度を採用している抽出物は、≦０．５のＴ／Ｃ比によって明らかなように骨形成を促進することによって正の応答を示す（表３）。単一に近いＴ／Ｃ比は、何れかの骨形成活性の欠損を示す。骨発生剤である副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ；アミノ酸１−３４）は、正の対照として採用した。上記の試験手順における活性は、本発明の抽出物が骨形成の速度の減少によって引き起こされる骨粗鬆症の治療及び骨折治癒のための骨形成剤として有用である。
【０１７２】
【表３】
2009536610.tif 000026
【０１７３】
骨の抗再吸収活性
骨の抗再吸収活性は、培地中に放出された45Ｃａの割合として表され、本発明の薬物の効果は、対応する反対側の対照の割合又は下記に示されるＴ／Ｃ比として表される。既知の抗再吸収剤であるラロキシフェン及びエストラジオール−１７βは、正の対照として用いられた。単一に近いＴ／Ｃ比は、任意の再吸収活性の欠損を示す。
Ｔ／Ｃ比＝（ＰＴＨ＋試験薬物の存在下での45Ｃａ再吸収）／（ＰＴＨ＋ビヒクルの存在下での45Ｃａ再吸収）
【０１７４】
上記の試験手順に従って、効果的な骨発生の濃度を採用又は投与した場合の本発明の抽出物は、１００μＭ濃度のラロキシフェン及びエストラジオール−１７βの存在下での０．６６及び０．３７のＴ／Ｃ比と比較して、１．３４のＴ／Ｃである培養中のニワトリ胎児骨からのＰＴＨ誘導の45Ｃａの再吸収を阻害しなかった（表４）。
【０１７５】
【表４】
2009536610.tif 000027
【０１７６】
インビボでの骨発生活性
２１日齢の未成熟雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを無作為に選び、３０日間連続して経口経路で、抽出物又はビヒクル（蒸留水中のアカシアゴム）の１０００ｍｇ／ｋｇの毎日の服用によって処理した。骨形成の評価に関しては、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）測定、機械強度及びヒストモルホメトリーによって行った。動物を３１日で解剖し、腰椎、大腿及び脛骨を単離し、洗浄し、生理食塩水中の７０％エタノールで固定、ＢＭＤ測定まで−２０℃で保存される。ＢＭＤ測定は、対象とする同一部分（腰椎：広範囲、Ｌ１−Ｌ４；大腿：広範囲、頸部及び骨幹中央部；脛骨：広範囲、近接及び脛腓分離点に約２ｍｍ近い領域）を用いて、Ｈｏｌｏｇｉｃヒドロキシアパタイトの擬人化された脊椎像で毎日較正させるＨｏｌｏｇｉｃ  ＱＤＲ−４５００Ａファン−ビーム密度測定上で、製造業者によって提供された小動物用のソフトウェア及び１ｍｍ／秒のスキャンスピード（４ライン／ｍｍ）を用いて行った（表５）。これらのラットの骨折及び第３要椎の圧縮に対する三点曲げ試験を用いた大腿骨の機械特性は、ＴＫ２５２Ｃムロマチ骨強度テスターを用いて試験した（表６）。ヒストモルホメトリーに関しては、各ラットは、処理の開始時にテトラサイクリン、及び処理の完了時にカルセインを投与され、脱灰されていない骨を切片にし、ＵＶ光でテトラサイクリン標識、及びオレンジフィルターでカルセインを視覚化した。テトラサイクリン及びカルセインは、カルシウム探索剤である（図９）。各ラットの最初と最後の体重及び子宮重量も解剖時に記録した（表７）。
【０１７７】
骨ミネラル密度測定
連続して３０日間、１０００ｍｇ／ｋｇの毎日の服用による抽出物の経口投与は、対応するビヒクル対象グループと比較すると未成熟の雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの腰椎、大腿及び脛骨の全ての領域のＢＭＤが顕著に増加した（表５）。
【０１７８】
【表５】
2009536610.tif 000028
【０１７９】
機械特性
抽出物を用いて処理された成熟ラットの骨は、ＴＫ２５２Ｃムロマチ骨強度テスターを用いた骨折及び第３要椎の圧縮のための三点曲げ試験により大腿骨を折るのに必要なより大きな力によって明らかにされるようにより高い機械強度を示す（表６）。
【０１８０】
【表６】
2009536610.tif 000029
【０１８１】
最終力は、骨折のための三点曲げ試験を用いた限界点での最大力である。
【０１８２】
テトラサイクリン及びカルセインラベリング
抽出物（１０００ｍｇ／ｋｇ、３０日間、ｐｏ）を用いて処理された成熟ラットの大腿骨及び脛骨はまた、処理の開始時のカルシウム探索薬物であるテトラサイクリン、及び処理の完了時のカルセインの投与、脱灰していない骨の切片化、並びにＵＶ光でのテトラサイクリンラベル及びオレンジフィルター下でのカルセインの視覚化を含む二重ラベリング技術によって明らかにされるように骨形成の増加率を示した（図９）。
【０１８３】
体重及び子宮重量
体重又は子宮重量における年齢に関連した増加の割合における抽出物の鉱化はない（表７）。見解は、ラットにおける試験された服用量及びスケジュールでの抽出物のいずれかのエストロゲンアゴニスト活性の欠損を示唆する。
【０１８４】
【表７】
2009536610.tif 000030
【０１８５】
ホルモン特性
エストロゲンアゴニスト活性
ブテア・モノスペルマの樹皮、葉及び種子のエタノール抽出物及び画分のエストロゲンアゴニスト活性は、双方卵巣摘出された未成熟ラットにおいて評価された。試験薬物は、経口経路によって連続して３日間、１日１回投与され、対応するビヒクル対照グループと比較した子宮重量増加を測定した。１７α−エチニルエストラジオールは、参照標準として用いられた。この植物の樹皮（７％）、枝（２３％）及び葉（４４％）のエタノール抽出物は、ごく僅か〜弱い子宮肥大効果を示した。対照的に、この植物の種子のエタノール抽出物は、子宮の生体重における顕著な増加（４３３％）を誘導し、この効果は、１７α−エチニルエストラジオールの０．０１ｇ／ｋｇの毎日の服用によって誘導されるものにほとんど匹敵した。また、ごく僅か〜弱い子宮増加率は、樹皮のエタノール抽出物のｎ−ブタノール可溶性画分において観察された（表８）。
【０１８６】
【表８】
2009536610.tif 000031
【０１８７】
エストロゲンアンタゴニスト活性
ブテア・モノスペルマの樹皮、葉及び種子のエタノール抽出物及び画分のエストロゲンアゴニスト活性の評価については、双方卵巣切除された未成熟ラットは、経口経路によって連続して３日間、１日１回、試験薬物及び０．０１ｇ／ｋｇの毎日の服用のエチニルエスとラジオールを用いて処理された。最終処理後の解剖２４時間で、エチニルエストラジオール誘導の子宮重量増加における阻害を測定した。１０００ｍｇ／ｋｇの毎日の服用でブテア・モノスペルマの樹皮のエタノール抽出物は、抗エストロゲン性ラロキシフェンの０．２５ｍｇ／ｋｇの毎日の服用を用いて観察された３７％阻害と比較して、１７α−エチニルエストラジオール誘導の子宮重量増加において４％阻害を生じさせた（表９）。
【０１８８】
【表９】
2009536610.tif 000032
【０１８９】
Ｂ．ブテア・モノスペルマのエタノール抽出物の画分の生物学的評価
パラメータとして４８時間培養した初代骨芽細胞によるアルカリホスファターゼの発現を用いて、有望な骨芽細胞増殖活性は、抽出物のｎ−ブタノール可溶性格物に局在化していた。中程度の活性はまた、クロロホルム可溶性画分に観察され、ヘキサン及び水溶性画分は不活性であった（図１０）。
【０１９０】
Ｃ．ブテア・モノスペルマのエタノール抽出物のクロロホルム及びｎ−ブタノール可溶性画分から単離された化合物の生物学的評価
インビトロでの骨芽細胞増殖及び鉱化に対するアルカリホスファターゼ発現及びＭＴＴアッセイに基づいて、有望な骨発生活性は、６個の化合物、Ｋ０５１、Ｋ０５２、Ｋ０５４、Ｋ０８０、Ｋ０８２（ｎ−ブタノール可溶性画分から単離された）及びＫ０９５（クロロホルム可溶性画分から単離された）において観察された（図１１−１５；表１０−１１）。
【０１９１】
【表１０】
2009536610.tif 000033
【０１９２】
アルカリホスファターゼ活性の評価
ｐ−ニトロフェノールホスフェートは、無色の基質であり、アルカリホスファターゼ酵素によって着色したｐ−ニトロフェノールに加水分解される。ｐ−ニトロフェノールホスフェートの加水分解速度は、試料中に存在する酵素に比例する。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の発現に関して、プラスチックのカバースリップ（直径６ｍｍ）上に播種された骨芽細胞（約１０４）は、試験薬物の有無により４８時間インキュベートされ、ホルマリン中で固定され、アルカリホスファターゼ渇しは、ＡＬＰ基質溶液（５ｍｇナフトールＡＳ−ＭＸホスフェート、０．２５ｍｌエチレングリコールモノメチルエーテル、１０ｍｇ  ＦａｓｔレッドＴＲ、０．１Ｍ  ＴＢＳ  ２４ｍｌ中、ｐＨ９，５）とともに１時間室温でインキュベーションすることにより提示される。見解は、純粋な化合物Ｋ０５１、Ｋ０５２、Ｋ０５４、Ｋ０８０及びＫ０９５が、対応するビヒクル対照グループと比較すると、１０-11Ｍ〜１０-5Ｍの濃度ハイブリダイゼーションにで、骨芽細胞の文化マーカーであるアルカリホスファターゼの発現を増加させたことを表す（図１１、表１０）。
【０１９３】
細胞増殖に対するＭＴＴアッセイ
このアッセイは、ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ酵素によって、テトラゾリウム塩を還元してホルマゾン結晶を形成する生存細胞の能力に基づく。ＭＴＴアッセイでは、骨芽細胞は、９６ウェルプレートに１０％ＦＣＳ及び１％抗生物質溶液を補足したα−ＭＥＭ培地に維持される。細胞が４０％コンフルエントに達したとき、２％ＦＣＳを補足した培地中の試験薬物の有無により、２４時間処理される。２４時間後、ＭＴＴ円を細胞に添加する。４時間後、ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ酵素によるテトラゾリウム塩の還元によって形成されるホルマゾン結晶をＤＭＳＯに溶解させ、５７０ｎｍの波長で読み取りを行った。５個全ての純粋な化合物Ｋ０５１、Ｋ０５２、Ｋ０５４、Ｋ０８０及びＫ０９５は、ビヒクル対照グループと比較して、１０-11Ｍ〜１０-5Ｍの濃度範囲で２４時間後、骨芽細胞の細胞増殖を増加させた。これらのうち、化合物Ｋ０５２が最も強力であることが分かり、順にＫ０８０、Ｋ０９５、Ｋ０５１及びＫ０５４であった（図１２、表１１）。
【０１９４】
【表１１】
2009536610.tif 000034
【０１９５】
鉱化の定量
骨芽細胞における新生カルシウムの沈着増加を用いて測定される鉱化の定量に関しては、試験化合物の存在下で７日間、細胞を培養し、アリザリンレッドで染色した。アリザリンレッドは、酢酸で抽出され、鉱化の程度に正比例する染色強度を４０５ｎｍで読む。結果は、ビヒクル対照グループと比較すると、６個全ての純粋な化合物Ｋ０５１、Ｋ０５２、Ｋ０５４、Ｋ０８０、Ｋ０８２及びＫ０９５は、アリザリン抽出法によって定量されるように鉱化を増加させた（図１３）。
【０１９６】
無菌のウシ骨スライス上に播種した骨芽細胞の場合では、細胞は、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン、非必須アミノ酸溶液、ピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸塩及び５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸を補足されたα−ＭＥＭ中で、試験化合物又はそれらの混合物の有無により、９６ウェルプレートで培養される。培地は、二日ごとに取り替える。１５日後の培養の終了時に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、冷却した７０％エタノール中で１時間固定し、水で１回洗浄し、４０ｍＭアリザリンレッド（ｐＨ４．７）を用いて３０分間染色し、次にＰＢＳ中で洗浄して、過剰の染料を取り除く。結果は、新骨形成の増加率を示す色のより高い強度が５個全ての試験化合物及びそれらの混合物の存在下の培養物中に明らかとなった。Ｋ０９５が最も強力であることが分かった（図１４及び１５）。
【図面の簡単な説明】
【０１９７】
【図１】ブテア・モノスペルマの樹皮のエタノール抽出物の存在下で、２４時間及び４８時間培養した骨芽細胞におけるアルカリホスファターゼ活性の発現。
【図２】ＭＴＴアッセイによるイシカワ（ヒト子宮腺上皮癌腫）又はＭＣＦ−７（ヒト乳癌）細胞株におけるブテア・モノスペルマの樹皮のエタノール抽出物の増殖活性。
【図３】ブテア・モノスペルマの樹皮のエタノール抽出物の１回の１０００ｍｇ／ｋｇ経口服用の７２時間後、２１日齢ラットの頭蓋冠におけるコラーゲンＩの発現の転写レベル。
【図４】ブテア・モノスペルマの樹皮のエタノール抽出物の１回の１０００ｍｇ／ｋｇ経口服用の７２時間後、２１日齢ラットの頭蓋冠におけるオステオカルシンの発現の転写レベル。
【図５】アリザリンレッド染色によるブテア・モノスペルマの樹皮のエタノール抽出物の存在下での２４時間及び４８時間培養した骨芽細胞における新しいカルシウムの沈着。
【図６】ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ銀染色によるブテア・モノスペルマの樹皮のエタノール抽出物の存在下で７日間培養した骨芽細胞における鉱化。
【図７】ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ銀染色後、ブテア・モノスペルマの樹皮のエタノール抽出物の存在下で１５日及び２５日間培養した骨芽細胞によるインビトロでの小塊形成。
【図８】アリザリンレッド染色後、ブテア・モノスペルマの樹皮のエタノール抽出物の存在下での１８日及び３０日間、ウシ骨スライス上で培養した骨芽細胞によるインビトロでの鉱化及び小塊形成。
【図９】テトラサイクリン及びカルセイン標識を用いて、３０日間ブテア・モノスペルマの樹皮のエタノール抽出物の１０００ｍｇ／ｋｇ服用量で処理した未成熟ラットの大腿及び脛骨における骨の付加（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）率。
【図１０】ブテア・モノスペルマの樹皮のエタノール抽出物の種々の画分の存在下での４８時間培養した骨芽細胞におけるアルカリホスファターゼ発現。
【図１１】ブテア・モノスペルマの樹皮の活性なエタノール抽出物から単離した様々な濃度の純粋な化合物の存在下で培養した骨芽細胞におけるアルカリホスファターゼ活性の定量。
【図１２】ＭＴＴアッセイを用いたブテア・モノスペルマの樹皮の活性なエタノール抽出物から単離した様々な濃度の純粋な化合物の存在下で２４時間培養した骨芽細胞増殖。
【図１３】酢酸抽出によるブテア・モノスペルマの樹皮の活性なエタノール抽出物から単離した様々な濃度の純粋な化合物の存在下で７日間培養した骨芽細胞における鉱化の定量。
【図１４】アリザリンレッド染色後、ブテア・モノスペルマの樹皮の活性なエタノール抽出物から単離した純粋な化合物の存在下で１５日間、ウシ骨スライス上で培養した骨芽細胞によるインビトロでの鉱化。
【図１５】アリザリンレッド染色後、等モル濃度で混合したブテア・モノスペルマの樹皮の活性なエタノール抽出物から単離した純粋な化合物の存在下で１５日間、ウシ骨スライス上で培養した骨芽細胞のインビトロでの鉱化。
【図１】
2009536610.tif 000037
【図２】
2009536610.tif 000038
【図３】
2009536610.tif 000039
【図４】
2009536610.tif 000040
【図５】
2009536610.tif 000041
【図６】
2009536610.tif 000042
【図７】
2009536610.tif 000043
【図８】
2009536610.tif 000044
【図９】
2009536610.tif 000045
【図１０】
2009536610.tif 000046
【図１１】
2009536610.tif 000047
【図１２】
2009536610.tif 000048
【図１３】
2009536610.tif 000049
【図１４】
2009536610.tif 000050
【図１５】
2009536610.tif 000051
【国際調査報告】
2009536610.tif 000052
2009536610.tif 000053
2009536610.tif 000054
2009536610.tif 000055
2009536610.tif 000056
2009536610.tif 000057