(57)【要約】  本発明は、ピキア・パストリス由来の自動誘導性ＮＰＳプロモーター、上記プロモーター及びこれに作動可能に連結された異種タンパク質をコードする核酸配列が含まれた組換え発現ベクター、上記組換え発現ベクターで形質転換または形質感染された宿主細胞及び上記宿主細胞を培養し、その培養物から異種タンパク質を分離し、異種タンパク質を製造する方法に関するものである。上記ＮＰＳプロモーターは誘導性物質無しにも、目的の異種タンパク質を大量に製造することを可能にする。
2009533049.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号４に示された塩基配列；
（２）配列番号４に示された３３７位から１０４４位までの塩基で構成された塩基配列;
（３）配列番号４に示された５７１位から１０４４位までの塩基で構成された塩基配列；及び
（４）配列番号４に示された７４３位から１０４４位までの塩基で構成された塩基配列よりなる群から選択された塩基配列を含むプロモーター。
【請求項２】
請求項１に記載のプロモーター及びこれに作動可能に連結された異種タンパク質をコードする核酸配列が含まれた組換え発現ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載の組換え発現ベクターで形質転換または形質感染された宿主細胞。
【請求項４】
酵母であることを特徴とする請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
ピキア・パストリスであることを特徴とする請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれかに記載の宿主細胞を培養して異種タンパク質が発現されるようにする工程；及び培養物から上記異種タンパク質を分離する工程；
を含む異種タンパク質の製造方法。
【請求項７】
上記宿主細胞はリンの濃度が１〜２０ｍＭの培地で培養されることを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピキア・パストリス由来の自動誘導性ＮＰＳプロモーター及びそれを用いた異種タンパク質の製造方法に関する。詳しくは、ピキア・パストリス由来の自動誘導性ＮＰＳプロモーター、上記プロモーター及びこれに作動可能に連結された異種タンパク質をコードする核酸配列が含まれた組換え発現ベクター、上記組換え発現ベクターで形質転換または形質感染された宿主細胞及び上記宿主細胞を培養し、異種タンパク質が発現されるようにする工程及び培養物から上記異種タンパク質を分離する工程を含む異種タンパク質の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の合成は、ＤＮＡに暗号化された遺伝情報がＲＮＡに複写される転写（transcription）過程を通して開示される。上記転写過程は遺伝子の上流に位置したプロモーターにＲＮＡポリメラーゼが結合することによって始まる。全てのプロモーターの塩基配列は完全に同一ではないが、共通された形態を有しており、このような塩基配列を共通塩基配列（consensus sequence）という。
【０００３】
転写開始部位には２個の短い塩基配列が共通塩基配列を形成している。その中の一つである“ＴＡＴＡ  ｂｏｘ（ＴＡＴＡＡＴ）”は転写開始点から１０個の塩基対前に位置している。他方の“ＴＴＧＡＣＡ”は転写開始点から３５個の塩基対前に中央点を有する−３５配列である。大部分のプロモーターは共通塩基配列の実際塩基配列及び転写開始点との距離において差がある。このような多様性が特定プロモーターで転写が始まる頻度、即ち、プロモーターの強度（promoter strength）を決定するものと認識されている。このようなプロモーターは、タンパク質生産の効率性を決定する重要因子の一つである。従って、様々な微生物から強力、且つ特異的なプロモーターが開発されている。
【０００４】
これと関連して、メチロトローフ酵母中の一つであるピキア・パストリス（Pichia Pastoris）はメタノール代謝及びペルオキシソーム生成研究に非常に有用なモデル生物体である一方、伝統酵母サッカロマイセス・セレヴィシエを凌駕するタンパク質の大量生産宿主システムである。また、ピキア・パストリスはユニークな代謝及び生理活性によって環境親和的生物工程に活用できる有用な産業資源中の一つとして認識されている。
【０００５】
ピキア・パストリスはメタノールをホルムアルデヒドとギ酸塩の中間工程を通した二酸化炭素への酸化を触媒する。このような反応はアルコール酸化酵素（ＡＯＸ）、ホルムアルデヒド脱水素化酵素（ＦＬＤ）及びギ酸塩脱水素酵素（ＦＭＤＨ）によりそれぞれ触媒される。ピキア・パストリスは２個のＡＯＸ遺伝子（ＡＯＸ１遺伝子及びＡＯＸ２遺伝子）を有する。ＡＯＸ１プロモーターは高活性を有し、メタノールを利用する酵母で異種タンパク質を高水準に発現させるために使われるのに対して、ＡＯＸ２プロモーター（特許文献１） は相対的に活性が弱いことが知られている（非特許文献１）。また、ＦＬＤ遺伝子のプロモーターも開発された（非特許文献２）。様々な微生物から強力な構成性プロモーターとして公知されたグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰ）遺伝子のプロモーターがピキア・パストリスでも開発された（非特許文献３）。
【０００６】
ピキア・パストリスを利用して組換えタンパク質を生産する場合に、最も多く使われるプロモーターはメタノール代謝に関与し、メタノールによって強力に誘導される誘導性プロモーターなどである。しかし、メタノール代謝に関連した遺伝子のプロモーターを使用する場合には、転写を誘導するために燃焼性の高いメタノールを使用しなければならないため、火気に注意しなければならなく、工場設備時、特別な措置及び点検が要求される。また、ＧＡＰプロモーターはタンパク質の発現率を調節するのに問題があり、他の構成性プロモーターも組換えタンパク質が菌体の成長に影響を与える場合には、菌体の不安定性を引き起こし、タンパク質を大量に生産することが難しい。
【０００７】
従って、組換えタンパク質の大量生産のために、所望の時点に組換えタンパク質の発現を調節しうる誘導性を備えながら、工程上に問題のない誘導性物質が利用されるか、誘導性物質が使用されなくても自動誘導性を示すと同時に、標的タンパク質を過発現させることができる強力な自動誘導性プロモーターの開発が要求されている。
【特許文献１】米国特許５，０３２，５１６
【非特許文献１】J. Tschopp et al., Nucleic Acids Res.1987, vol.15, pp.3859-3876
【非特許文献２】D. Resina et al., Journal of Biotechnology, 2004, vol.109, pp.103-113
【非特許文献３】Waterham et al., Gene, 1997, vol.186, pp.37-44
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、ピキア・パストリス由来ＮＰＳ遺伝子のプロモーターをクローニングした後、上記プロモーターを利用してタンパク質を製造した結果、適切なリンの初期濃度が選ばれれば、培養中の菌体成長によってリンの制限状態が保持され、自動的にＮＰＳ遺伝子のプロモーターが誘導され、誘導性物質の添加無しにも標的タンパク質が大量生産されることを確認し、本発明の完成に至った。
【０００９】
本発明は一観点として、（１）配列番号４に示された塩基配列；（２）配列番号４に示された３３７位から１０４４位までの塩基で構成された塩基配列；（３）配列番号４に示された５７１位から１０４４位までの塩基で構成された塩基配列；及び（４）配列番号４に示された７４３位から１０４４位までの塩基で構成された塩基配列よりなる群から選択された塩基配列を含むプロモーターを提供する。
【００１０】
他の観点として、上記プロモーター及びこれに作動可能に連結された異種タンパク質をコードする核酸配列が含まれた組換え発現ベクターを提供する。
【００１１】
さらに別の観点として、上記組換え発現ベクターで形質転換（トランスフォーム）または形質感染（トランスフェクト）された宿主細胞を提供する。
【００１２】
さらに別の観点として、上記宿主細胞を培養して異種タンパク質が発現されるようにする工程及び培養物から上記異種タンパク質を分離する工程を含む異種タンパク質の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ピキア・パストリスのリンの輸送に関与するＮａ＋−リン酸共輸送体（Na+-Phosphate Symporter；以下、“ＮＰＳ”という）の遺伝子に関するものである。上記ＮＰＳ遺伝子は、配列番号１に示された核酸配列で構成される。このようなＮＰＳ遺伝子は配列番号１に示された配列を参照して、化学的に合成するか、ピキア・パストリスのゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号１の両末端の一定部分に対応される配列を有するプロモーターを利用してＰＣＲを遂行することによって製造することができる。本発明に係るＮＰＳ遺伝子は、ピキア・パストリス由来であるので、少なくともピキア属微生物由来のＮＰＳ遺伝子を検出するプローブとして利用することができる。
【００１４】
また、本発明は上記ピキア・パストリスの発現を調節するＮＰＳ遺伝子のプロモーターに関するものである。上記ＮＰＳ遺伝子のプロモーターの一様態は配列番号４（１，０４４ｂｐ）に示した核酸配列で構成されている。一方、配列番号４に示された核酸配列の一部分（特に、ＴＡＴＡ部分、ＣＡＴ部分）だけでも配列番号４に示された核酸配列で構成されたプロモーターとほとんど類似な程度の機能を発揮しうる。本発明者らはＮＰＳ遺伝子のプロモーターがプロモーターとしての機能を保持するために求められる最小限の配列を同定するために、ＮＰＳ遺伝子のプロモーター（配列番号４）の塩基配列中で、１−３３６塩基、１−５７０塩基、１−７４２塩基、１−８３８塩基、１−８９１塩基及び１−９２１塩基が切断されたプロモーターを製造した後、これらのプロモーターが、それに作動可能に連結された異種タンパク質の遺伝子を発現するか否かを確認した。その結果、配列番号４の塩基配列中で、１−３３６塩基、１−５７０塩基及び１−７４２塩基が切断されたプロモーターは、上記異種タンパク質の遺伝子を発現することができるのに対して、１−８３８塩基、１−８９１塩基及び１−９２１塩基が切断されたプロモーターは異種タンパク質の遺伝子を発現することができないことが分かった。
【００１５】
従って、本発明に係るＮＰＳ遺伝子のプロモーターは、（１）配列番号４に示された塩基配列；（２）配列番号４に示された３３７位から１０４４位までの塩基で構成された塩基配列；（３）配列番号４に示された５７１位から１０４４位までの塩基で構成された塩基配列；及び（４）配列番号４に示された７４３位から１０４４位までの塩基で構成された塩基配列よりなる群から選択された塩基配列を含むプロモーターであってもよい。特に、本発明に係るＮＰＳ遺伝子のプロモーターは少なくとも配列番号４に示された７４３−１０４４塩基（即ち、配列番号１５に示された核酸配列）を含むことが好ましい。
【００１６】
このようなＮＰＳ遺伝子のプロモーターは、本発明によって開示された配列を参照して化学的に合成するか、ピキア・パストリスのゲノムＤＮＡを鋳型として本発明によって開示された配列の両末端の一定部分に対応される配列を有するプロモーターを利用してＰＣＲを遂行することによって製造することができる。本発明に係るＮＰＳ遺伝子のプロモーターは、ピキア・パストリス由来であるので、少なくともピキア属微生物由来ＮＰＳ遺伝子のプロモーターを検出するプローブとして利用することができる。
【００１７】
本発明者らは、ピキア・パストリスのＮＰＳ遺伝子はリンが制限された状態で培養された菌体で過発現されることを確認した（実施例１参照）。また、ＮＰＳプロモーターをレポーター遺伝子に結合して、タンパク質の発現程度を調べた結果、適切な初期リンの濃度が選ばれれば、培養中に菌体が成長しながらリンを摂取し、リンが制限されることによって自動的にＮＰＳプロモーターが誘導され、誘導性物質の添加無しにも標的タンパク質を大量生産できることを確認した（実施例４参照）。即ち、ＮＰＳプロモーターは、菌体の成長中にリンが制限されれば、上記プロモーターに作動可能に連結された遺伝子を自動的に強力に発現しうるため、ピキア・パストリス由来“ＮＰＳ遺伝子のプロモーター”は自動誘導性プロモーターとして利用できる。
【００１８】
“プロモーター（promoter）”は、ＲＮＡポリメラーゼが結合する遺伝子の上流に位置する核酸配列であり、遺伝子の発現のために、必ず必要な基本的な調節配列である。一般的にプロモーターは２つ群に分類され得る。“誘導性プロモーター（inducible promoter）”は誘導性物質（inducer）が存在する場合に、上記プロモーターの調節下に置かれた遺伝子の発現を促進することができる。このように誘導性プロモーターを利用して遺伝子を発現させる場合には、高価の誘導性物質を利用しなければならなく、場合に応じて、誘導性物質が人体または特定宿主細胞に毒性を引き起こす問題がある。また、誘導性物質を投入する時間及び培地内の誘導性物質の濃度など培養中に考慮すべき事項が多いという短所がある。一方、“構成性プロモーター（constitutive promoter）”は特定の条件無しに、即ち、誘導性物質無しに、その調節下に置かれた遺伝子の転写を促進することができる。しかし、発現時点を調節できない特性により標的タンパク質が宿主細胞に毒性を引き起こすか、成長に影響を与える場合には、標的タンパク質を大量生産することが難しい短所がある。これとは対照的に“自動誘導性プロモーター（auto-inducible promoter）”は誘導性物質を用いることなく、培養条件または特定営養分の制限によって特定の時点に発現を誘導することができるため、上記で記述した誘導性プロモーター及び構成性プロモーターの短所を解決することができる。
【００１９】
一方、ＮＰＳ遺伝子の発現量を分析することによって、本発明に係るＮＰＳ遺伝子のプロモーターがその調節下に位置した遺伝子の発現にどのような影響を及ぼすのかを予測することができる。一様態として、ＮＰＳ遺伝子のｍＲＮＡに対する定量分析方法を利用して確認することができるが、上記定量分析方法は当業界に公知された方法で遂行することができる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、ＤＮＡアレイを用いたハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロビーズ法などが用いられる。
【００２０】
また、本発明に係るＮＰＳ遺伝子のプロモーターが多数個存在することによって、これらが異種タンパク質の発現を実質的に強力に誘導することができるか否かを確認する必要がある。一様態として、レポーター遺伝子をＮＰＳ遺伝子のプロモーターの調節を受けるようにして発現させた後、上記レポーター遺伝子の発現量を測定することによって確認することができる。この時、上記レポーター遺伝子には、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）、ｕｉｄＡ（β−グルクロニダーゼ）、ｎｅｏ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）、ｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸還元酵素）、ａｐｈＩＶ（ホスホトランスフェラーゼ）またはｌｕｘ（ルシフェラーゼ）が挙げられる。本発明ではレポーター遺伝子としてセルロースバインディングドメインとバシラス・ステアロサーモフィラス由来のリパーゼが連結された融合タンパク質（Ahn et al., Journal of Microbiol. Biotechnol. 2003, vol.13, p.451）を利用することが好ましい。上記融合タンパク質はセルロースバインディングドメインによって分泌効率が増加し、分泌されたリパーゼの活性を測定することによって、タンパク質の発現量を正確に測定することができるだけでなく、細胞に毒性を引き起こすこともないからである（実施例２参照）。
【００２１】
レポーター遺伝子によって発現されたタンパク質の定性及び定量分析も当業界に知らされた方法で測定することができる。レポーター遺伝子の種類によって異なるが、当該リポータータンパク質またはその断片に特異的に結合され得る抗体を使用して実施することが好ましい。当該抗体としては、ポリクロナール抗体とモノクロナール抗体の両方を含み、 公知技術によって修飾された抗体または抗体の誘導体、例えば、Ｆａｂ断片、単一鎖抗体を含む。上記抗原−抗体反応を介して分析物を同定及び定量する場合には、凝集分析（agglutination assay）、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫分析法（ＲＩＡ）、酵素免疫検査法（ＥＩＡ）、蛍光免疫分析法（ＦＬＡ）及び免疫沈降法などが挙げられる。
【００２２】
本発明に係るＮＰＳ遺伝子のプロモーターは、上記周知のように、誘導性物質無しにも、所望の時点に上記プロモーターに作動可能に連結された遺伝子を強力に発現させるので、異種タンパク質の製造に有効に利用することができる。ここで、異種タンパク質（組み換えタンパク質）は工学技術を利用して製造しようとする任意のタンパク質を意味するものであり、特に制限的ではなく、本発明では、用語“標的タンパク質”と相互交換的に利用されていてもよい。
【００２３】
異種タンパク質を製造するためには、ＮＰＳ遺伝子のプロモーターとこれに作動可能に連結された異種タンパク質の核酸配列を含む組換え発現ベクターの製造が先行されなければならない。このような組換え発現ベクターが本発明一側面を構成する。上記組換え発現ベクターは公知されているか、商業的に入手可能なベクターを利用して製造することができるが、このような場合には、上記ベクターに、本来含まれたプロモーターと本発明に係るＮＰＳ遺伝子のプロモーターとを置換して製造できる。また、本発明に係るＮＰＳ遺伝子のプロモーターとベクターに通例的に含有される調節配列とを含むように組み合わせて製造することができる。
【００２４】
本発明の明細書で、用語“ベクター”は異種タンパク質の核酸配列を宿主細胞内に安定的に運搬しうる運搬体としてのＤＮＡ分子を意味する。有用なベクターになるためには、複製可能であり、宿主細胞内に流入可能であり、自分の存在を検出しうる手段を備えなければならない。
【００２５】
本発明の明細書で、用語“組換え発現ベクター”は一般的に異種タンパク質が宿主細胞で発現することができるようにベクターに作動可能に連結され、形成された環状のＤＮＡ分子を意味する。当業界に周知のように、宿主細胞で形質感染された遺伝子の発現水準を高めるためには、当該遺伝子が選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び解毒発現調節配列に作動可能に連結されなければならない。好ましくは調節配列、細菌選択マーカー及び複製開始点（replication origin）を共に含んでいる一つのベクター内に含まれる。
【００２６】
本発明の明細書で、“調節配列”は異種タンパク質の発現に必須であるか、有益な核酸配列を意味する。そのような調節配列には、これに制限されないが、分泌配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド（propeptide）配列、エンハンサー（enhancer）または上流（upstream）活性化配列及び転写終結因子などを含む。本発明で調節配列は、最小限プロモーターを、好ましくはプロモーターと分泌配列を含んでいてもよい。その他の調節配列は標的タンパク質の発現量をさらに増加させるために選択的に含まれていてもよい。
【００２７】
上記調節配列中の“分泌配列”は発現されたタンパク質を細胞膜外に輸送されるように誘導するアミノ酸配列であり、異種タンパク質の分離及び精製を容易にするために使われる調節配列である。一般的に細胞膜外に輸送される表面タンパク質または分泌タンパク質は、細胞膜で、シグナルペプチダーゼで切断されるＮ−末端配列を有している。本発明では分泌配列として、これに制限されないが、α−因子分泌配列、キラー毒素リーダ分泌配列（killer toxin leader signal sequence）、インベルターゼ分泌配列（invertase signal sequence）、α−アミラーゼ分泌配列（α-amylase signal sequence）などが挙げられる。
【００２８】
宿主細胞で発現するためには、本発明に係るプロモーターを含む上記調節配列に異種タンパク質をコードする核酸配列が作動可能に連結されなければならない。用語“作動可能に連結された”は核酸配列が他の核酸配列と機能的関係で配置された状態を意味する。例えば、分泌配列が成熟したタンパク質の分泌に参与することで、機能を発揮したとすれば、そのタンパク質に作動可能に連結されたのである。プロモーターがコーディング配列の転写を調節したとすれば、その配列に作動可能に連結されたのである。リボソーム結合部位がコーディング配列の解読が可能な位置に置かれているのであれば、その配列に作動可能に連結されたのである。一般的に“作動可能に連結された”は連結されたＤＮＡ配列が接触し、分泌リーダの場合には接触して、リーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは接触する必要がない。
【００２９】
上記組換え発現ベクターで形質転換または形質感染された宿主細胞は本発明の他の側面を構成する。上記宿主細胞は、大腸菌、シュードモナス、バチルス、ストレプトマイセス、真菌、酵母のような周知の真核及び原核宿主、スポドプテラ・フルギペルダ（ＳＦ９）のような昆虫細胞、ＣＨＯ及びマウス細胞のような動物細胞、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０及びＢＭＴ１０のようなアフリカミドリザル細胞及び組織培養されたヒト細胞及び植物細胞などが含まれる。本発明では宿主細胞として酵母が好ましく、本発明に係るＮＰＳプロモーターと同じ起源を持つピキア・パストリスがより好ましい。
【００３０】
上記形質転換または形質感染はDavis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 1986のような基本的な実験指針書に記述された方法で遂行できる。好ましい例には、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質転換（DEAE-dextran mediated transfection）、電気穿孔（electroporation）、形質導入（transduction）、リン酸カルシウム形質転換（calcium phosphate transfection）、カチオン脂質−媒介形質転換（cationic lipid-mediated transfection）、スクレイプローディング（scrape loading）及び感染（infection）などが含まれる。
【００３１】
本発明の他の側面は、上記形質感染または形質転換された宿主細胞を培養し、異種タンパク質が発現されるようにする工程及び上記発現された異種タンパク質を分離する工程を含む異種タンパク質の製造方法に関するものである。
【００３２】
本発明で宿主細胞は公知された技術によって異種タンパク質の生産に適した栄養培地で、即ち、初期（培養開始時点）リンの濃度が０．００１〜０．０２ｍＭの培地で培養できる。例えば、宿主細胞は適切な培地と標的タンパク質が発現及び／又は分離されることを許容する条件下で、実施された実験室または産業用発酵機で小規模或いは大規模発酵、振盪フラスコ培養によって培養することができる。培養は公知された技術を使用して、炭素、窒素供給源及び無機塩を含む、適した栄養培地で行う。適した培地は商業的な供給者から入手可能であり、例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクションのカタログなどに記載された成分及びこれらの組成割合に応じて作ることができる。本発明の宿主細胞は回分式または流加式培養で培養することができる。
【００３３】
“回分式培養”は全ての栄養素が発酵初期に添加される培養方式中の一つを意味する。回分式培養で宿主細胞は培地内の必須栄養素中一つが枯渇する時まで、または発酵にこれ以上好ましくない条件（例、ｐＨが微生物成長を阻害する値に減少される場合）が形成される時まで増殖しうる。
【００３４】
“流加式培養”は一つ以上の栄養素を発酵開始直後または培養物がある工程に達した後に、または供給された栄養素が培養物から枯渇する場合、培養物に連続的に供給する方式の培養を意味する。流加式培養では、例えば、ｐＨ調節を利用して好ましい成長条件を保持するように一般的に基準を定め、必須栄養素を培養物に供給し、１種以上の必須栄養素の枯渇を防止する。栄養素供給速度によって決定される成長速度で酵母宿主細胞は継続増殖するはずである。一般的に単一栄養素、炭素源が成長の制限因子となる。他の種類の栄養素制限を利用することもできる。例えば、窒素源による制限、酸素による制限、ビタミンまたはアミノ酸のような特定栄養素による制限（微生物がその化合物に対する栄養要求性の場合）がある。
【００３５】
このような培養物から異種タンパク質は当業界に公知された方法で分離することができる。例えば、異種タンパク質はこれに制限されないが、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、または沈澱を含む伝統的な方法で培養物から分離することができる。また、異種タンパク質はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性及びサイズ別排除）、電気泳動、分別溶解度（例えば、硫安沈澱）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは抽出を含み、当業界に公知された様々な方法で精製することができる。
【００３６】
本発明のよりよい理解は説明のために記述された下記実施例によって得られるが、本発明はこれら実施例によって制限されるものではない。
【実施例１】
【００３７】
ピキア・パストリス由来のＮＰＳプロモーターのクローニング
リンが制限された状態で、ピキア・パストリスの過発現遺伝子をスクリーニングするために、本出願人が２００４年１１月２７日付けで出願した大韓民国特許出願２００４−９８３０３号に記載された方法によって、リンが制限された培地を用いて連続培養を行った。このように培養された菌体から得たｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ―ＰＣＲを遂行し、過発現遺伝子らのバンクを得た。過発現遺伝子に対する配列検索結果、リンの代謝に関連した遺伝子であるＮａ＋−リン酸共輸送体（ＮＰＳ）の遺伝子が含まれていた。
【００３８】
上記遺伝子の発現を調節するプロモーター部分をクローニングするために、先にクローニングされたＮａ＋−リン酸共輸送体（ＮＰＳ）の遺伝子をプローブとして逆方向ＰＣＲを遂行するために、まず、合成プライマー（配列番号２及び配列番号：３）を製造し、逆方向ＰＣＲの鋳型としては種々の制限酵素で切断されたピキア・パストリスゲノム遺伝子を使用した。このように逆方向ＰＣＲを遂行した結果、制限酵素ＫｐｎＩで切断したゲノム遺伝子でＮａ＋−リン酸共輸送体（ＮＰＳ）の遺伝子が確認された。このように得られた遺伝子をｐＳＴＢｌｕｅ−１ベクターにクローニングした。このように形成された組換えベクターを“ｐＳＴ１” と命名した。塩基配列分析結果、ＮＰＳのオープンリーディングフレームとその上流、即ち、プロモーター部分である１，０４４ｂｐ（配列番号４）を得ることができた。上記のように得られたプロモーターを“ＰＮＰＳ”と命名した。
【００３９】
上記遺伝子がリン制限状態で過発現されるか否かを確認するために、リン制限状態で培養された菌体のｍＲＮＡからＮＰＳ遺伝子をノーザンブロットした結果、ＮＰＳ遺伝子が過発現されることを確認することができた（図１参照）。
【実施例２】
【００４０】
プロモーターＰＮＰＳを含む組換え発現ベクターの製造
先にクローニングされたＰＮＰＳプロモーターの活性を確認するために、レポーター遺伝子としてリパーゼ酵素の遺伝子を用いた。詳細には、セルラーゼ結合ドメインをコードする遺伝子が結合された形態のリパーゼＬ１Ｆ（ＣＢＤ−Ｌ１−Ｌｉｐａｓｅ）を用いた。これはリパーゼＬ１をより安定的に発現できるからである（Ahn et al., Journal of Microbiol. Biotechnol. 2003,vol.13, p.451）。プロモーターＰＮＰＳを用いてリパーゼ遺伝子の発現ベクターを製造するために、ｐＰＩＣ９ベクター（Invitrogen,米国）を用いた。
【００４１】
図２にＰＮＰＳプロモーターの調節下で、レポーター遺伝子であるリパーゼが含まれた組換え発現ベクターの製造方法を図示した。まず、信号配列であるα−アミラーゼ及びリパーゼを含む遺伝子はｐＹＥＧＡ―ＡＭ―ＣＬＬｉｐ（Ahn et al., Journal of Microbiol. Biotechnol. 2003,vol.13, p.451）を鋳型として配列番号５及び配列番号６を有する合成プライマー（それぞれ、制限酵素ＡｖｒＩＩ及びＮｏｔＩ切断部位を含む)を用いたＰＣＲによって得た。また、実施例１でクローニングしたｐＳＴ１を鋳型として配列番号７及び配列番号８を有する合成プライマー（それぞれ、制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＡｖｒＩＩ切断部位を含む）を用いたＰＣＲによってプロモーターＰＮＰＳ部分を得た。このように得られた信号配列であるα−アミラーゼ及びリパーゼを含む遺伝子はＡｖｒＩＩとＮｏｔＩで切断しており、プロモーターＰＮＰＳはＢｇｌＩＩとＡｖｒＩＩで切断した。次いで、信号配列であるα−アミラーゼ及びリパーゼを含む遺伝子とプロモーターＰＮＰＳを部分的にＢｇｌＩＩとＮｏｔＩで切断されたｐＰＩＣ９ベクターに連結した。その結果、プロモーターＰＮＰＳを用いて、分泌配列としてα−アミラーゼを使用してリパーゼを細胞外に分泌させる組換え発現ベクターを得た。これを“ｐＮＰＳ−ＡＭ−ＣＬＬｉｐ”と命名した。
【実施例３】
【００４２】
ピキア・パストリスの形質転換
上記実施例２で製造したｐＮＰＳ−ＡＭ−ＣＬＬｉｐでピキア・パストリスＧＳ１１５を形質転換させた。具体的に、ピキア・パストリスＧＳ１１５のゲノム上ｈｉｓ４部分に、実施例２で製造した発現ベクターを挿入させるために、ｈｉｓ４遺伝子内にあるＢｓｐＥＩで切断された上記組換え発現ベクターをリチウム／ＴＥ方法（Hill et al., Nucl. Acids. Res. 1991, vol.19, p.5791）で、ピキア・パストリスでそれぞれ形質転換させた。詳しくは、ＢｓｐＥＩで切断した組換え発現ベクターとキャリア遺伝子（carrier DNA）、ＰＥＧ／ＬｉＡｃを混合して、３０℃で、３０分間反応させた。その後、ＤＭＳＯを添加し、４２℃で、１５分間反応した。反応が終わった後、遠心分離して沈澱させた後、２００μＬのＴＥ溶液に懸濁した。この懸濁液をＨｉｓ（−）平板培地（ブドウ糖２％、酵母窒素源０．６７％、ヒスチジンを除いたアミノ酸混合物０．０７７％、寒天２％）に塗抹し、２−３日間、培養した。上記で得た形質転換体中から、組換え発現ベクターがゲノム上に単一コピー（single copy）に挿入された形質転換体を選定した。
【実施例４】
【００４３】
プロモーターＰＮＰＳによるリパーゼ発現
本発明で得たプロモーターＰＮＰＳの培地中のリンの濃度による発現様相を確認するためにレポーター遺伝子を用いた。
詳細には、実施例３で選ばれたｐＮＰＳ−ＡＭ−ＣＬＬｉｐで形質転換されたピキア・パストリスを表１に示すように、それぞれ相違する初期リンの濃度（リンの濃度は営養分であるＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏの濃度に調節した）を有した培地を利用して回分式培養を実施した。このように培養された菌体を除去した培養物でリパーゼの発現量を比較した。
【００４４】
このとき、回分式培養時間毎に菌体の乾燥重量、リパーゼ活性、ブドウ糖の濃度、グリセロールの濃度及びリンの濃度を測定した。それぞれの測定方法は下記の通りである。
【００４５】
（１）細胞乾燥量測定：培養液を遠心分離して細胞を得た後、等張緩衝液で洗浄し、８０℃で乾燥し、重さを測定した。
（２）リパーゼの定量法：リパーゼの力価はｐＨ―ｓｔａｔ方法を使用して測定した。
（３）グルコースの定量法：グルコースの定量はグルコース分析器を利用した。
（４）リンの定量法：Ｆｉｓｋｅ―Ｓｈｕｂｂａｒｏｗの方法（Fiske et al., Journal of Biological Chemistry, 1925, vol.66, p.375）を利用して培養液中のリンの濃度を測定した。
【００４６】
【表１】
2009533049.tif 000003
【００４７】
図３Ａ、３Ｂ及び３ＣはｐＮＰＳ−ＡＭ−ＣＬＬｉｐで形質転換されたピキア・パストリスをそれぞれ相違する初期リンの濃度を有した培地を利用し、回分式培養した結果、リパーゼ活性、リン濃度、菌体濃度及びブドウ糖濃度での変化を示している。
【００４８】
回分式培養結果、初期リンの濃度の高い培地を使用した培養のほうが、菌体成長速度と炭素源であるブドウ糖の摂取速度が高かった。即ち、リンの濃度が２０ｍＭの最も高い培養Ｃ（リン過剰）の場合は、培養２２時間後に初期のブドウ糖５０ｇ／Ｌが完全に消耗され、菌体は７０Ｏ．Ｄ．まで成長した。また、初期リンの濃度が２．０ｍＭの培養Ｂ（リン制限）の場合は、培養３７．５時間に初期のブドウ糖５０ｇ／Ｌが完全に消耗され、菌体は６１Ｏ．Ｄ．まで成長した。また、初期リンの濃度が０．２０ｍＭと最も少ない培養Ａ（リン枯渇）の場合は、培養開始後４０時間が過ぎても培地中のブドウ糖が４３ｇ／Ｌ余り、菌体は１５Ｏ．Ｄ．まで成長した。このような結果は、リンの濃度が菌体の成長に影響を及ぼすことを意味することであり、培養Ｃは対数末期にのみ培地内のリンの濃度が少なく、リンによって菌体の成長が制限されない培養であり、培養Ｂは培養開始後１２時間からリンによって菌体の成長が制限される培養である。また、培養Ａは非常に少ない量のリンが提供され、培養初期からリンによって菌体の成長が制限され、円滑な菌体の成長がほとんどなされなかった。
【００４９】
リパーゼの活性は、培養Ｂで観察され、培養Ａと培養Ｃではほとんど観察されなかった。これは図４に示されたウェスタンブロット結果からも確認することができた。結果的に、本発明に係るＮＰＳプロモーターは適切なリンの初期濃度下で、菌体が成長のためにリンを摂取することによって、リンが制限状態になった時、自動誘導され、標的タンパク質を大量生産する反面に、菌体の増殖がリンによって制限されないリンの過剰状態であるか、初期からリンが枯渇して菌体の増殖が阻害される状態では、標的タンパク質をほとんど生産できないことを確認することができた。即ち、ＮＰＳプロモーターはリンの濃度によって調節が可能であり、誘導性物質を添加することなくリンが制限された状態で発現される自動誘導性の特性を有していることが分かった。
【実施例５】
【００５０】
ＮＰＳプロモーターの必須調節領域探索
先にクローニングされた１，０４４ｂｐ（配列番号４）のＰＮＰＳプロモーター遺伝子の中にプロモーターの核心部分をわかるためにＰＮＰＳプロモーター遺伝子を５’−末端部分から段階的に切断し、実施例２で製造されたｐＮＰＳ−ＡＭ−ＣＬＬｉｐベクターのようにレポーター遺伝子であるリパーゼ酵素の遺伝子に結合させた。
【００５１】
詳細に、ＰＮＰＳプロモーター遺伝子（配列番号４）の塩基配列中で、１−３３６塩基、１−５７０塩基、１−７４２塩基、１−８３８塩基、１−８９１塩基及び１−９２１塩基が切断されたプロモーターをクローニングするために、それぞれ配列番号９及び配列番号８、配列番号１０及び配列番号８、配列番号１１及び配列番号８、配列番号１２及び配列番号８、配列番号１３及び配列番号８、配列番号１４及び配列番号８をプライマーとして用いて、実施例２で製造されたｐＮＰＳ−ＡＭ−ＣＬＬｉｐを鋳型としてＰＣＲを通して得た。このように得られたＰＣＲ産物を、それぞれＢｇｌＩＩとＡｖｒＩＩで切断し、事前にＢｇｌＩＩとＡｖｒＩＩで切断されたｐＮＰＳ−ＡＭ−ＣＬＬｉｐにそれぞれ連結させた。得られた組換え発現ベクターをｐＮＰＳ（Δ３３６）−ＡＭ−ＣＬＬｉｐ、ｐＮＰＳ（Δ５７０）−ＡＭ−ＣＬＬｉｐ、ｐＮＰＳ（Δ７４２）−ＡＭ−ＣＬＬｉｐ、ｐＮＰＳ（Δ８３８）−ＡＭ−ＣＬＬｉｐ、ｐＮＰＳ（Δ８９１）−ＡＭ−ＣＬＬｉｐ及びｐＮＰＳ（Δ９２１）−ＡＭ−ＣＬＬｉｐと命名した。このように製造された発現ベクターを実施例３のようにピキア・パストリスＧＳ１１５を形質転換させ、形質転換体中で上記組換え発現ベクターがゲノム上に単一コピー（single copy）で挿入された形質転換体がそれぞれ選ばれた。
【００５２】
それぞれ選ばれた形質転換体をリパーゼ活性平板培地で培養してリパーゼの活性有無を調べた。図５に示すように、ｐＮＰＳ（Δ３３６）−ＡＭ−ＣＬＬｉｐ、ｐＮＰＳ（Δ５７０）−ＡＭ−ＣＬＬｉｐ及びｐＮＰＳ（Δ７４２）−ＡＭ−ＣＬＬｉｐで、それぞれ形質転換されたピキア・パストリスでは互いに類似なリパーゼの活性を示し、ｐＮＰＳ（Δ８３８）−ＡＭ−ＣＬＬｉｐ、ｐＮＰＳ（Δ８９１）−ＡＭ−ＣＬＬｉｐ及びｐＮＰＳ（Δ９２１）−ＡＭ−ＣＬＬｉｐでそれぞれ形質転換されたピキア・パストリスではリパーゼの活性が現れなかった。従って、配列番号４のＰＮＰＳプロモーター遺伝子で３’−末端から５’−末端方向に３０２ｂｐの塩基が配列番号４のＰＮＰＳプロモーターの核心部であることが分かった。このようなＰＮＰＳプロモーター遺伝子の核心部分は配列番号１５に示した。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明に係るピキア・パストリス由来のＮＰＳプロモーターは適切なリンの初期濃度が選定されれば、培養中の菌体の成長によって、リンの制限状態が保持され、自動的にＮＰＳプロモーターが誘導され、誘導性物質を添加することなく、標的タンパク質を大量に生産することができる。このような自動誘導性ＮＰＳプロモーターを用いて、誘導性または構成性発現システムを利用して組換えタンパク質大量生産する既存工程で発生する生産菌株の安定性問題及び発酵工程上の問題を解決することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】リンの制限培地で培養されたピキア・パストリス培養物のＮＰＳ遺伝子に対するノーザンブロット結果を示したものである（１：菌体の比成長速度が０．１４のとき、２：０．０８のとき、３：０．０３のとき）。
【図２】ピキア・パストリス由来のＮＰＳ遺伝子のプロモーター及びこれに作動可能に連結されたレポーター遺伝子が含まれた組換え発現ベクターｐＮＰＳ−ＡＭ−ＣＬＬｉｐの製造方法を示した概略図である。
【図３Ａ】組換え発現ベクターｐＮＰＳ−ＡＭ−ＣＬＬｉｐで形質転換されたピキア・パストリスを培地中の初期リンの濃度を多様化して回分式培養した結果、リパーゼ活性での変化を示したグラフである（●：リン枯渇、▼：リン制限、■：リン過剰）。
【図３Ｂ】組換え発現ベクターｐＮＰＳ−ＡＭ−ＣＬＬｉｐで形質転換されたピキア・パストリスを培地中の初期リンの濃度を多様化して回分式培養した結果、リン濃度での変化を示したグラフである（○：リン枯渇、▽：リン制限、□：リン過剰）。
【図３Ｃ】組換え発現ベクターｐＮＰＳ−ＡＭ−ＣＬＬｉｐで形質転換されたピキア・パストリスを培地中の初期リンの濃度を多様化して回分式培養した結果、ブドウ糖濃度及び菌体濃度での変化を示したグラフである［ブドウ糖濃度−（○：リン枯渇、▽：リン制限、□：リン過剰）菌体濃度−（●：リン枯渇、▼：リン制限、■：リン過剰）］。
【図４】組換え発現ベクターｐＮＰＳ−ＡＭ−ＣＬＬｉｐで形質転換されたピキア・パストリスを培地中の初期リンの濃度を多様化して回分式培養して得た培養物のウェスタンブロット結果を示したものである（標的タンパク質：リパーゼ）。
【図５】本発明に係るＮＰＳプロモーターの生物学的機能を保持するのに要求される最小限の配列を探索するための戦略を簡略に示した概略図である （＋：リパーゼの活性が現れたことを意味、ＮＤ：リパーゼの活性が現れないことを意味する）。
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図５】
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【図１】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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