(57)【要約】  本発明は、ヘルペスウイルスを検出するための方法とマイクロアレイに関するものである。本発明はヘルペスウイルス、特にＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６Ａ、ＨＨＶ−６Ｂ、ＨＨＶ−７からなる群から選択されるヘルペスウイルス、を検出するための新しいプライマーとオリゴヌクレオチドを提供する。本発明の方法を使用することにより、同一の生体サンプル中に存在する複数の異なる種のヘルペスウイルスを同時に検出することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプル中の１種あるいはそれ以上の種のヘルペスウイルスを検出する方法であって、以下の工程：
ＤＮＡを生体サンプルから抽出し；
抽出したＤＮＡを増幅し；
増幅したＤＮＡを一本鎖ＲＮＡに転写し；
マイクロアレイ上で、一本鎖ＲＮＡを、検出するそれぞれのヘルペスウイルスに対応するオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズさせ；
ハイブリダイズした一本鎖ＲＮＡを検出可能なヌクレオチドの存在下でプライマーエクステンション法により伸長し；
適切な方法で検出可能なヌクレオチドのシグナルを検出する、
を含み、
該オリゴヌクレオチド配列が５０ヌクレオチド未満の長さを持ち、該配列が５’から３’の方向に、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８および配列番号２１からなる群から選択される配列あるいは、上記配列のいずれかと本質的に同一の配列からなる、方法。
【請求項２】
該マイクロアレイが少なくとも２種の異なるヘルペスウイルスに対応するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該マイクロアレイが少なくとも３種の異なるヘルペスウイルスに対応するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１あるいは２に記載の方法。
【請求項４】
該マイクロアレイが、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６Ａ、ＨＨＶ−６Ｂ、ＨＨＶ−７からなる群から選択されるヘルペスウイルスに対応するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
異なる種のヘルペスウイルスの検出を同時に行う、請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
他の病原体、好ましくはウイルス、の検出をさらに含む、請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患あるいは免疫不全症の検出をさらに含む、請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
エンテロウイルスあるいはボレリアの検出をさらに含む、請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
異なる種のヘルペスウイルス、及び、他の病原体の検出を同時に行う、請求項１乃至８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ＤＮＡの増幅が以下のプライマーＡ及びプライマーＢの群：
Aに配列番号１：Bに配列番号３；
Aに配列番号６：Bに配列番号７；
Aに配列番号９：Bに配列番号１０；
Aに配列番号１２：Bに配列番号１３；
Aに配列番号１５：Bに配列番号１６；
Aに配列番号１９：Bに配列番号２０；
あるいは上記配列と少なくとも９０％の同一性を持つ配列から選択されるプライマーのペアを用いて行われる、請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＡの増幅がマルチプレックスＰＣＲによる２つの反応によって行われる、請求項１乃至１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２が一方の反応で増幅され、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６Ａ、ＨＨＶ−６ＢおよびＨＨＶ−７がもう一方の反応で増幅される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ヘルペスウイルスを検出するためのマイクロアレイで、
少なくともひとつのアレイを有する固体支持体、および
少なくとも一種のヘルペスウイルスに特異的なオリゴヌクレオチドを含む上記アレイ、
を含み、
該オリゴヌクレオチド配列が５０ヌクレオチド未満の長さを持ち、該配列が５’から３’の方向に、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８および配列番号２１からなる群から選択される配列、上記配列のいずれかと本質的に同一の配列からなる、マイクロアレイ。
【請求項１４】
該固体支持体上のアレイ数が１から８０、好ましくは１０から６０である、請求項１３に記載のマイクロアレイ。
【請求項１５】
ひとつのマイクロアレイ上にあるオリゴヌクレオチドのスポット数が４から２００、好ましくは１０から１００である、請求項１３あるいは１４に記載のマイクロアレイ。
【請求項１６】
該マイクロアレイが、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６Ａ、ＨＨＶ−６BおよびＨＨＶ−７からなる群から選択されるヘルペスウイルスを検出するために使用される、請求項１３乃至１５のいずれかに記載のマイクロアレイ。
【請求項１７】
該マイクロアレイが、ヘルペスウイルスによって引き起こされるその他の疾患を検出するためのオリゴヌクレオチドを含む、請求項１３乃至１６に記載のマイクロアレイ。
【請求項１８】
該マイクロアレイが、その他の、エンテロウイルスやボレリアなどの病原体を検出するためのオリゴヌクレオチドを含む、請求項１３乃至１７のいずれかに記載のマイクロアレイ。
【請求項１９】
ヘルペスウイルスを検出するためのマイクロアレイを調製する方法で、以下の手順：
少なくとも１種のヘルペスウイルスに対応するオリゴヌクレオチドをアレイに付着させ；
アレイをスライドに拡張し、アレイの数を検出するサンプルの数に対応させる；
を含み、
該オリゴヌクレオチドの配列が５０ヌクレオチド未満の長さを持ち、該配列が５’から３’の方向に、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８および配列番号２１からなる群から選択される配列あるいは、上記配列のいずれかと本質的に同一の配列からなる、方法。
【請求項２０】
請求項１３乃至１８のいずれかに記載のマイクロアレイ及び、任意に、プライマー、バッファー、酵素、及び／あるいはヌクレオチドを含む、キット。
【請求項２１】
配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８および配列番号２１からなる群から選択される配列を含むオリゴヌクレオチドで、該オリゴヌクレオチドの配列が５０ヌクレオチド未満の長さを持ち、該配列が５’から３’の方向に上記配列を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
生体サンプル中の１種あるいはそれ以上の種のヘルペスウイルスを検出する方法であって、以下の工程：
ＤＮＡを生体サンプルから抽出し；
抽出したＤＮＡを増幅し；
増幅したＤＮＡを一本鎖ＲＮＡに転写し；
マイクロアレイ上で、一本鎖ＲＮＡを、検出するそれぞれのヘルペスウイルスに対応するオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズさせ；
−ハイブリダイズした一本鎖ＲＮＡを検出可能なヌクレオチドの存在下でプライマーエクステンション法により伸長し；
−適切な方法で検出可能なヌクレオチドのシグナルを検出する；
を含み、
該オリゴヌクレオチド配列が５０ヌクレオチド未満の長さを持ち、該配列が５’から３’の方向に、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９からなる群から選択される配列あるいは、上記配列のいずれかと本質的に同一の配列からなる、方法。
【請求項２３】
該マイクロアレイがさらに１種以上のオリゴヌクレオチドを含み、
該オリゴヌクレオチドの配列が５０ヌクレオチド未満の長さを持ち、該配列が５’から３’の方向に、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８および配列番号２１からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該マイクロアレイが少なくとも２種の異なるヘルペスウイルスに対応するオリゴヌクレオチドを含む、請求項２２あるいは２３に記載の方法。
【請求項２５】
該マイクロアレイが、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６Ａ、ＨＨＶ−６Ｂ、ＨＨＶ−７からなる群から選択されるヘルペスウイルスに対応するオリゴヌクレオチドを含む、請求項２２乃至２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
異なる種のヘルペスウイルスの検出を同時に行う、請求項２２乃至２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
他の病原体、好ましくはウイルス、の検出をさらに含む、請求項２２乃至２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患あるいは免疫不全症の検出をさらに含む、請求項２２乃至２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
エンテロウイルスあるいはボレリアの検出をさらに含む、請求項２２乃至２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
異なる種のヘルペスウイルス、及び、他の病原体の検出を同時に行う、請求項２２乃至２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
ＤＮＡの増幅が以下のプライマーＡ及びプライマーＢの群：
Aに配列番号２２：Bに配列番号２３；
Aに配列番号６：Bに配列番号７；
Aに配列番号９：Bに配列番号１０；
Aに配列番号１２：Bに配列番号１３；
Aに配列番号１５：Bに配列番号１６；
Aに配列番号１９：Bに配列番号２０、
あるいは上記配列と少なくとも９０％の同一性を持つ配列から選択されるプライマーのペアを用いて行われる、請求項２２乃至３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
ＤＮＡの増幅がマルチプレックスＰＣＲによる２つの反応によって行われる、請求項２２乃至３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２が一方の反応で増幅され、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６Ａ、ＨＨＶ−６ＢおよびＨＨＶ−７がもう一方の反応で増幅される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ヘルペスウイルスを検出するためのマイクロアレイで、
少なくともひとつのアレイを有する固体支持体、および
少なくとも一種のヘルペスウイルスに特異的なオリゴヌクレオチドを含む上記アレイ、
を含み、
該オリゴヌクレオチドの配列が５０ヌクレオチド未満の長さを持ち、該配列が５’から３’の方向に、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９からなる群から選択される配列、あるいは、上記配列のいずれかと本質的に同一の配列からなる、マイクロアレイ。
【請求項３５】
該マイクロアレイがさらに１種以上のオリゴヌクレオチドを含み、
該オリゴヌクレオチドの配列が５０ヌクレオチド未満の長さを持ち、該配列が５’から３’の方向に、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８および配列番号２１からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
該固体支持体上のマイクロアレイ数が１から８０、好ましくは１０から６０である、請求項３４あるいは３５に記載のマイクロアレイ。
【請求項３７】
ひとつのマイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドのスポット数が４から２００、好ましくは１０から１００である、請求項３４あるいは３６に記載のマイクロアレイ。
【請求項３８】
該マイクロアレイが、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６Ａ、ＨＨＶ−６ＢおよびＨＨＶ−７からなる群から選択されるヘルペスウイルスを検出するために使用される、請求項３４乃至３７のいずれかに記載のマイクロアレイ。
【請求項３９】
該マイクロアレイが、ヘルペスウイルスによって引き起こされるその他の疾患を検出するためのオリゴヌクレオチドを含む、請求項１３乃至１６に記載のマイクロアレイ。
【請求項４０】
該マイクロアレイが、他の、エンテロウイルスやボレリアなどの病原体を検出するためのオリゴヌクレオチドを含む、請求項３４乃至３９のいずれかに記載のマイクロアレイ。
【請求項４１】
ヘルペスウイルスを検出するためのマイクロアレイを調製する方法で、以下の手順：
少なくとも１種のヘルペスウイルスに対応するオリゴヌクレオチドをアレイに付着させ；
アレイをスライドに拡張し、アレイの数を検出するサンプルの数に対応させる、
を含み、
該オリゴヌクレオチドの配列が５０ヌクレオチド未満の長さを持ち、該配列が５’から３’の方向に、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９からなる群から選択される配列あるいは、上記配列のいずれかと本質的に同一の配列からなる、方法。
【請求項４２】
該マイクロアレイがさらに１種以上のオリゴヌクレオチドを含み、
該オリゴヌクレオチドの配列が５０ヌクレオチド未満の長さを持ち、該配列が５’から３’の方向に、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８および配列番号２１からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
請求項３４乃至４０のいずれかに記載のマイクロアレイ及び、任意に、プライマー、バッファー、酵素及び／あるいはヌクレオチドを含む、キット。
【請求項４４】
配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９からなる群から選択される配列を含むオリゴヌクレオチドで、該オリゴヌクレオチドの配列が５０ヌクレオチド未満の長さを持ち、該配列が５’から３’の方向に上記配列を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
生体サンプル中の２種のヘルペスウイルスを同時に検出する方法であって、以下の工程：
ＤＮＡを生体サンプルから抽出し；
抽出したＤＮＡを増幅し；
増幅したＤＮＡを一本鎖ＲＮＡに転写し；
マイクロアレイ上で、一本鎖ＲＮＡを、よく二重感染するヘルペスウイルスに対応するオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ；
ハイブリダイズした一本鎖ＲＮＡを検出可能なヌクレオチドの存在下でプライマーエクステンション法により伸長し；
適切な方法で検出可能なヌクレオチドのシグナルを検出する、
を含む方法。
【請求項４６】
配列番号１、配列番号３、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０あるいは上記配列と少なくとも９０％の同一性を持つ配列からなる群から選択されるプライマー。
【請求項４７】
配列番号２２、配列番号２３あるいは上記配列と少なくとも９０％の同一性を持つ配列からなる群から選択されるプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘルペスウイルスを検出するための方法とマイクロアレイに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヘルペスウイルスは多くの臨床的に重要なヒト疾患を引き起こす。特に、中枢神経系（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ：ＣＮＳ）の疾患や、免疫不全の患者における合併症が、単純ヘルペスウイルス１型および２型（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプステイン−バー−ウイルス（ＥＢＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）の感染あるいは再活性化によってもたらさていれる（非特許文献４；  非特許文献２４；  非特許文献２８，  非特許文献１）。ＨＨＶ−６のみならず、ヒトヘルペスウイルス７型（ＨＨＶ−７）もまた突発性発疹の原因病原体であると報告されており、また、臓器移植患者に重篤な合併症を引き起こすと記録されている（非特許文献３９；  非特許文献３８）。現在、ウイルス分離法、核酸検出法、および各種の血清学的診断法がヘルペスウイルスへの感染を検出するために用いられている（非特許文献８；  非特許文献３０；  非特許文献１３；  非特許文献３２；  非特許文献２１）。ヘルペスウイルスを短時間で検出するという要望に応えるため、マルチプレックスＰＣＲ法が開発された（非特許文献３１；  非特許文献２；  非特許文献１０；非特許文献２０）。非特許文献４４には複数種のヘルペスウイルスを同時に増幅するための単一管ＰＣＲ法が、非特許文献３４にはリアルタイムＰＣＲによってヒトヘルペスウイルスを分離し定量する方法が、それぞれ開示されている。特許文献４には、コンセンサスプライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲ法によってヘルペスウイルスＤＮＡの保存領域を増幅することにより、ヒトヘルペスウイルスを検出しタイピングする方法が開示されている。特許文献５には、ＤＮＡチップを用いてヘルペスウイルスを含む病原体を同時に検出する方法が開示されている。特許文献６には、ヘルペスウイルスをスクリーニングするための多重分析法が開示されている。特許文献７および非特許文献１４には、マイクロアレイを用いて複数種のヘルペスウイルスを同時に検出する方法が開示されている。非特許文献３７は、デンドリマーを用いたＤＮＡマイクロアレイによるヒトヘルペスウイルスの診断法に関する研究を開示している。非特許文献５は、中枢神経系への感染に長尺プローブを用いることにより、複数のヘルペスウイルスを含む１３の異なる病原体をマイクロアレイによって検出したと記している。
【０００３】
これらの先行文献には複数種のヘルペスウイルスを検出するための方法が多数開示されているが、それでもなお、検出の効率や速度が向上するような新しい方法が要望されている。また、同じ生体サンプルから同時に複数のヘルペスウイルスを検出することができる方法は少ない。特に、ＨＨＶ−６ＡとＨＨＶ−６Ｂを区別できる方法を記載した文献はわずかしかない。
【０００４】
いくつかのヘルペスウイルスを増幅させるためのプライマーは、特許文献８、特許文献１、非特許文献４１、非特許文献４４、非特許文献３、非特許文献４０、特許文献３、特許文献９、非特許文献３４により公知である。特定の核酸を増幅する際に用いられるＴ３  ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列は、特許文献２、特許文献１１、特許文献１０により公知である。
【０００５】
【特許文献１】ＪＰ  ６２５３９００
【特許文献２】ＪＰ  ２００１０９５５９０
【特許文献３】ＷＯ  ９３２５７０７
【特許文献４】ＵＳ  ２００４／０１１０１９５
【特許文献５】ＵＳ  ２００４００５３２６４
【特許文献６】ＵＳ  ２００３０２２８５９９
【特許文献７】ＵＳ  ２００３０１４３５７１
【特許文献８】ＵＳ  ６８９７０５７
【特許文献９】ＵＳ  ２００４０１１０１９５
【特許文献１０】ＵＳ  ２００４／０１２５７７４
【特許文献１１】ＥＰ  ５１００８５
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【非特許文献４５】Zuker M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 2003;13:3406-3415.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ヘルペスウイルスを検出するための新しく、また改良された方法を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明は特に、ひとつまたは複数の生体サンプルに含まれる一種またはより多くのヘルペスウイルスをより効率的にかつ短時間で検出するための方法を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は複数種のヘルペスウイルスを同時に、また、可能な限り効率的にかつ短時間で検出する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明はその他に、複数のヘルペスウイルスを効率的に短時間で検出するためのマイクロアレイを提供することを目的とする。
【０００９】
以下の明細書および特許請求の範囲に記載するとおり、本発明は、上記およびその他の課題、および公知の技術およびマイクロアレイと比べて有利な効果を達成している。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の方法はマイクロアレイ技術に基づく。この方法により、ひとつまたは複数の生体サンプルに含まれる、異なる種の複数のヘルペスウイルスを、同時に検出することができる。また、この方法により複数のヘルペスウイルスを同時に検査することも可能である。また、同じ反応においてウイルスの遺伝子タイプを決定することも可能である。
【００１１】
本発明の実施例において、本発明の方法は以下の手順を含む。
・生体サンプルからＤＮＡを抽出する
・抽出されたＤＮＡを増幅する
・増幅されたＤＮＡを一本鎖ＲＮＡに転写する
・マイクロアレイプレートの上でオリゴヌクレオチド配列に一本鎖ＲＮＡをハイブリダイズさせる。ここで、オリゴヌクレオチドは検出するそれぞれのヘルペスウイルスに対応する。
・ハイブリダイズした一本鎖ＲＮＡを、検出可能なヌクレオチドの存在下でプライマーエクステンション法により伸長する
・適切な方法で検出可能なヌクレオチドのシグナルを検出する。
【００１２】
より具体的には、本発明は請求項１、２２および４５に記載される内容を特徴とする。
【００１３】
本発明のその他の実施例において、ヘルペスウイルスを検出するためのマイクロアレイは以下の要素によって構成される。
・少なくともひとつのアレイを有する固体支持体
・少なくとも一種以上のヘルペスウイルスに特異的なオリゴヌクレオチドを含む上記アレイ
【００１４】
より具体的には、上記アレイは請求項１３および３４に記載される内容を特徴とし、ヘルペスウイルス検出用のマイクロアレイを調製する方法は請求項１９および４１に記載される内容を特徴とする。
【００１５】
マイクロアレイキットは請求項２０および４３に記載される内容を特徴とする。また、オリゴヌクレオチドは請求項２１および４４に記載される内容を特徴とする。
【００１６】
PCRによる診断では通常、一度に一種のヘルペスウイルスのみを検査するため、複数の種を検出するには長時間を要する。二種あるいは三種に同時に感染しているかどうかはPCRでは判別がつかないが、マイクロアレイでは多重感染していても１日で検出できる。複数種のヘルペスウイルスを同時に検出できることは非常に有益である。本発明の好適な実施例において、理想的な環境下におけるマイクロアレイ法の特異度は１００％に達する。マイクロアレイを使用した検出は、診断および研究のいずれの場面においても、複数のヘルペスウイルスを早く簡便に検出できる方法である。特にヘルペスウイルスの定性的検出にこの方法は適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
「ヘルペスウイルス」はヘルペスウイルス科に属し、正２０面体のカプシドとリン脂質二重幕に包まれた二重鎖ＤＮＡの核を持つ。
【００１８】
１００種以上のヘルペスウイルスが知られており、そのうち８種がヒトに感染する。ヒトヘルペスウイルスは複製周期および臓器特異性によって、アルファ−、ベータ−、ガンマ−の３亜科に分類される。単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）はアルファヘルペスウイルス亜科に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）、ヘルペスウイルス７型（ＨＨＶ−７）はベータヘルペスウイルス亜科に、エプステイン−バー−ウイルス（ＥＢＶ）、ヘルペスウイルス（ＨＨＶ−８）はガンマヘルペスウイルス亜科に分類される。ヒトへの感染性は高く、同時に２種以上のヘルペスウイルス（たとえばＨＳＶ−１とＨＳＶ−２など）に感染することもある。
【００１９】
本発明の方法により、生体サンプルに含まれる１種または２種以上のヘルペスウイルスを検出することができる。好ましくは、検出するウイルスはＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプステイン−バー−ウイルス（ＥＢＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６ＡおよびＨＨＶ−６Ｂ）、ヒトヘルペスウイルス７型（ＨＨＶ−７）のいずれかであることが望ましい。特に本発明では、ＨＨＶ−６ＡとＨＨＶ−６Ｂを区別することができる。
【００２０】
具体的には、本感染ではひとつのサンプルから同時に２種以上の、好ましくは３種以上の、さらに好ましくは４種以上の、異なるヘルペスウイルスを検出することができる。本発明の好ましい実施例においては、アルファ、ベータあるいはガンマの同じ亜科に属するヘルペスウイルスを同時に検出することができる。
【００２１】
本発明の他の実施例においては、患者に二重感染や三重感染することが多いヘルペスウイルスを同時に検出することができる。
【００２２】
さらに、ヘルペスウイルスと同時に感染することが多い他の病原体も同時に検出することができる。
【００２３】
本発明における「生体サンプル」とは、生物由来のあらゆるサンプルを意味する。特に、臨床サンプルであること、好ましくはヒト由来の臨床サンプルであることが望ましい。サンプルには、全血、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプル、生検試料、尿、便、唾液、粘液、骨髄、皮膚、毛髪、爪、病変や潰瘍のスワブ、子宮頸部や膣のスワブ、鼻咽頭のスワブ、気管支肺胞洗浄液、気管吸引液および、その他の臨床サンプルが含まれる。好ましい臨床サンプルは、血漿、全血、脳脊髄液（ＣＳＦ）である。
【００２４】
本発明の方法には、対象となる生体サンプルからのＤＮＡの抽出が含まれる。ＤＮＡは前記生体サンプルから既知のＤＮＡ抽出法により抽出することができる。抽出には、例えば、市販のＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ  インスツルメントにトータル核酸キット（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社、スイス、バーゼル）を使用する方法、ハイピュア ウイルス核酸キット（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）、またはフェノール・クロロホルム抽出が使用可能である。
【００２５】
抽出されたＤＮＡは適当な方法で増幅してよい。好ましい増幅方法はＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法である。ＰＣＲは対象となる混合ＤＮＡの標的配列部分の濃度を、クローニングや精製をせずに増幅する手法である。標的配列の増幅は、標的配列を含む混合ＤＮＡに２種類のオリゴヌクレオチドのプライマーを大量に導入し、その後、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で温度を正確に上下させるというプロセスからなる。２種類のプライマーは二重鎖になっている標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。本発明における標的配列は検出するヘルペスウイルスのもつ配列となる。また、検出しようとする他の病原体の配列を使用することもできる。標的配列中の増幅しようとする部分が混合された凝縮中で大多数（高濃度）となるため、それらが「ＰＣＲ増幅産物」といわれる。
【００２６】
ＰＣＲに使用するプライマーは既知の方法、あるいはＳａｍｂｒｏｏｋ，ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）著の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）」などに記載された方法により用意することができる。プライマーのペアは通常、検出するヘルペスウイルスの配列にそれぞれ対応したフォワードプライマー（センス）とリバースプライマー（アンチセンス）からなる。プライマーのペアは、Ｐｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−  ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ；  非特許文献３３） や ＤＮＡ ｍｆｏｌｄ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｍｆｏｌｄ／ｏｌｄ／ｄｎａ／；  非特許文献４５）などの市販のプライマー設計支援ソフトウェアで設計できる。
【００２７】
サンプルＤＮＡの増幅は１回あるいは複数回のＰＣＲ増幅により達成される。２以上のプライマーのペアを使用する方法はマルチプレックスＰＣＲと呼ばれる。サンプルＤＮＡは１回または複数回のマルチプレックスＰＣＲによって増幅することができる。たとえば、本発明の実施例においてはひとつのマルチプレックスＰＣＲにおいて複数種のヘルペスウイルスのプライマーペアを増幅し、それとは別に行うマルチプレックスＰＣＲにおいて別の複数種のヘルペスウイルスのプライマーペアを増幅している。ひとつのサンプル中のＤＮＡを複数回のＰＣＲによって増幅した場合、次の段階に移行する前にそれぞれのＰＣＲの結果物をひとつにまとめても問題ない。
【００２８】
本明細書に記載の通り、プライマーのペアは検出するヘルペスウイルスごとに設計される。プライマーのペアは下記のプライマーAとプライマーBのペアの組み合わせからなる。
Aに配列番号１：Bに配列番号３；
Aに配列番号６：Bに配列番号７；
Aに配列番号９：Bに配列番号１０；
Aに配列番号１２：Bに配列番号１３；
Aに配列番号１５：Bに配列番号１６；
Aに配列番号１９：Bに配列番号２０
【００２９】
本発明の好ましい実施例において、配列番号１の代わりに配列番号２２を使用することが可能であり、配列番号３の代わりに配列番号２３を使用することが可能である。これらの配列はもとの配列と組み合わせて使用することも可能である。
【００３０】
好ましくは、プライマーAはフォワードプライマーで、プライマーBはリバースプライマーである。
【００３１】
上記プライマーAおよびBの配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上の同一性を持つプライマー配列は同一のものとして扱われる。さらに好ましくは、同一なプライマー配列は上記配列と９９％以上の同一性を持ち、最も好ましくは１００％の同一性を持つ。相違点は特にプライマーの５’末端に存在する。
【００３２】
「実質的に同一の配列をもつプライマー配列」とは、配列番号１、配列番号３、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３において、１つのヌクレオチドが欠失されるか、挿入されるか、あるいは置換されたプライマー配列を意味する。同一の混合物中で使用することができる代替プライマーのいずれにおいても、プライマー中の核酸の偏り（たとえばＴ／Ｃなど）は少ないほうがよい。
【００３３】
本発明において、プライマーは、連続した１０から５０、好ましくは２０から４０、より好ましくは２０から３０のヌクレオチドからなる。ＰＣＲに使用されるプライマーは、核酸分子が重合を開始するに十分な長さの適当な配列を包含する。
【００３４】
具体的には、配列番号1と配列番号３のペアはＨＳＶ−１とＨＳＶ−２を増幅するために設計され、配列番号６と配列番号７のペアはＶＺＶを、配列番号９と配列番号１０のペアはＣＭＶを、配列番号１２と配列番号１３のペアはＥＢＶを、配列番号１５と配列番号１６のペアはＨＨＶ−６を、配列番号１９と配列番号２０のペアはＨＨＶ−７を増幅するために設計されている。本発明の好ましい代替的な実施例において、配列番号２２と配列番号２３はＨＳＶ−１とＨＳＶ−２を増幅するために設計されている。
【００３５】
適切な状況下において、ＰＣＲ増幅は反応混合物中のＤＮＡポリメラーゼの働きにより進行する。反応混合物は、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類すべてのヌクレオチド三リン酸、適切な緩衝剤および、必要に応じて塩類とその他の試薬を加えたものからなる。増幅は、例えば、９５℃での１０分間の変性の後、９３−９７℃、好ましくは９６℃に１０秒、５０−６０℃、好ましくは５５℃に２０秒、６９−７４℃、好ましくは７２℃に２０秒のサイクルを４０回繰り返し、最後に６９−７４℃、好ましくは７２℃で５分間伸長させて行う。
【００３６】
別の方法では、増幅は、例えば、９５℃で１０分間変性させた後、その後、９３−９７℃、好ましくは９６℃に１０秒、４５−７０℃、好ましくは６５℃に２０秒（１回ごとに０．５度ずつ下げる）、６９−７４℃、好ましくは７２℃に２０秒のサイクルを３０回繰り返し、９３−９７℃、好ましくは９６℃に１０秒、５５−６５℃、好ましくは６０℃に２０秒のサイクルを１０回繰り返し、最後に６９−７４℃、好ましくは７２℃で５分間伸長させる。
【００３７】
増幅されたDNA（アンプリコン）の長さは、好ましくは１５０から２５０ｂｐ、より好ましくは１７０から２３０ｂｐである。
【００３８】
ＤＮＡを増幅した後、生成物を一本鎖の核酸に変性すること、好ましくは一本鎖ＲＮＡに転写することが望ましい。反応におけるこの段階を促進するため、プライマーのペアの一方に本反応で使用するポリメラーゼのプロモーターを含めてもよい。本明細書で開示されている内容においては、Ｔ３  ＲＮＡのプロモーターがリバースプライマーに含まれている。プライマーにポリメラーゼのプロモーターが含まれている場合、プライマーの長さは2倍になる。本明細書において、Ｔ３  ＲＮＡのプロモーターは配列番号２を含むことが好ましい。転写反応には、市販のＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅＴＭ  Ｔ３  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、マディソン、ウィスコンシン州）やＡｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅＴＭ  Ｔ３−ＦｌａｓｈＴＭ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、マディソン、ウィスコンシン州）などを使用することができる。
【００３９】
一本鎖ＲＮＡは適切な状況において、マイクロアレイプレート上で、検出するヘルペスウイルスに対応したオリゴヌクレオチド配列を合成する。
【００４０】
本発明において、「マイクロアレイ」は、ガラススライド、シリコン、プラスチック、ポリマーマトリックスや、その他の適当な固体支持体などの基盤上で特徴的なオリゴヌクレオチドを合成したアレイを意味する。マイクロアレイは、当業者に既知の手法によって調製および使用できる。固体支持体として、例えば、顕微鏡用のスライドガラスやシランコートガラスなどを使用できる。スライドガラスは、アミノ化ＤＮＡ−オリゴヌクレオチドがガラス基盤に共有結合できるように、イソチオシン酸塩で被膜されていることが望ましい（非特許文献２５）。
【００４１】
ヘルペスウイルス用のオリゴヌクレオチドは、Ｐｒｉｍｅｒ−３（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ；  非特許文献３３）やＤＮＡ  ｍｆｏｌｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／Ｍｆｏｌｄ／Ｏｌｄ／Ｄｎａ／；  非特許文献４５）などの適切なソフトウェアを使用して設計することができる。オリゴヌクレオチドは固体支持体上に適切な手段で固定される。固体支持体上のシラン−イソチオシン層と共有結合するように、例えば、オリゴヌクレオチドの５’末端にアミノ基を導入してもよい。オリゴヌクレオチドは５’末端において、３’−アミノプロピルトリメチオキシシランと１，４−フェニレンジイソチオシアネートで皮膜されたガラス表面に共有結合を形成して付着する。オリゴヌクレオチドは、好ましくは５’末端の特定オリゴヌクレオチド配列の前にポリ（Ｔ）プライマー（Ｔスペーサー）を有する。Tスペーサーの長さは６から１２、好ましくは８から１０、一般的には９塩基である。また、Ａｓｐｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＳＡＬ−１マイクロアレイスライドなどの、市販の、表面が適当な化学的性質を持つマイクロアレイガラスを使用してもよい。
【００４２】
本発明で使用するオリゴヌクレオチドは、１０から５０塩基の、好ましくは１５から３０塩基の、一般的には３０塩基未満の長さを持つ連続した配列である。さらに好ましくはオリゴヌクレオチドは１５から２５塩基の、最も好ましくは１６から２３塩基の長さを持つ。一般的には約２０塩基の長さを持つ。
【００４３】
上記マイクロアレイに付着したオリゴヌクレオチドは、サンプル中の検出するヘルペスウイルスの一本鎖ＲＮＡのハイブリダイゼーションをもたらすのに十分な長さと適当な配列を含む。
【００４４】
オリゴヌクレオチドは、例えば市販のＯｍｎｉｇｒｉｄ(登録商標)（Ｇｅｎｅｍａｃｈｉｎｅ、ハンティンドン、イギリス）などのマイクロアレイヤーを使用するなどの適当な方法により固体支持体上に滴下してよい。アレイには検出するヘルペスウイルス用のオリゴヌクレオチドがマトリックス状に並ぶ。アレイには、対照として、ウイルスに特異的でないオリゴヌクレオチドも含まれる。さらに、アレイにはヘルペスウイルスではなく他の病原体に特異的な配列を持つオリゴヌクレオチドも含まれる。固体支持体は１から８０の、好ましくは１０から６０のアレイを含む。これによって、ひとつの固体支持体で同時に最大８０のサンプルを検査することができる。
【００４５】
アレイは、４から２００、好ましくは１０から１００、より好ましくは２０から５０、一般的には３０から４０のスポットからなる。スポットは２連あるいは３連のオリゴヌクレオチドからなる。例えば１０から２５、一般的には１５から２０のオリゴヌクレオチドが２連スポットされている。
【００４６】
スポットあたりのオリゴヌクレオチドの量は０．５から１．５ｐｍｏｌ、一般的には１ｐｍｏｌである。
【００４７】
ひとつのアレイには約２００のスポットが存在し、固体支持体あたりでは、例えばスライドの場合は約１６０００になる。
【００４８】
一本鎖ＲＮＡはオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、適切な条件化でプライマー伸長反応が進行する。ハイブリダイゼーションの温度は４０から４５℃、好ましくは４２℃である。ハイブリダイゼーションに要する時間は１５から３０分である。ハイブリダイゼーションはさまざまな塩分濃度、例えばさまざまなＮａＣｌ量で、進行する
【００４９】
プライマー伸長反応は逆転写酵素とヌクレオチド三リン酸および、必要に応じて適当な緩衝液、塩、試薬の存在下で進行する。この反応は４２℃以上、好ましくは４９から５５℃、より好ましくは５２℃で進行する。反応は１５から３０分、好ましくは約２０で完了する。反応混合物は検出可能なヌクレオチド、例えば、蛍光ヌクレオチドのような、シグナルを適当な方法で検出可能なものを含むことが望ましい。
【００５０】
検出可能なヌクレオチドにはレポーターやシグナル部分を含んでよい。ただし、放射性同位体、酵素、抗原、抗体、吸光分析用試薬、発光試薬、蛍光試薬その他の発光物質には限定されない。
【００５１】
マイクロアレイは、ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  、ＳｃａｎＡｒｒａｙＴＭ、ＱｕａｎｔＡｒｒａｙＴＭ（パーキンエルマー、ウェレスリー、マサチューセッツ州）などの適切な方法で分析してよい。オリゴヌクレオチドを滴入したスポットのシグナル（とバックグラウンドノイズとの差分）を非特異的なオリゴヌクレオチドのシグナルと比較する。シグナルの強度は正と負の結果を補整される。本明細書においては、比較して少なくとも３倍以上のときに結果が陽性であるとした。
【００５２】
オリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８および配列番号２１より選択されるヌクレオチド配列からなる。本発明の好ましい実施態様において、配列番号４の代わりに配列番号２４を使用することができ、配列番号５の代わりに、配列番号２５、一般的なオリゴヌクレオチド配列である配列番号２６、配列番号２７およびそれらの混合物を使用することができ、配列番号８の代わりに配列番号２８、配列番号２９およびそれらの混合物を使用することができる。代替オリゴヌクレオチド配列は元のオリゴヌクレオチド配列に加えて（と共に）使用することができる。
【００５３】
配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上の同一性を持つ配列は同一のものとして扱われる。さらに好ましくは、同一な配列は上記配列と９９％以上の同一性を持ち、最も好ましくは１００％の同一性を持つ。相違点がある場合、相違点はオリゴヌクレオチドの５’末端に存在することが好ましい。
【００５４】
「実質的に同一の配列をもつオリゴヌクレオチド配列」とは、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９において、１つのヌクレオチドが欠失されるか、挿入されるか、あるいは置換されたオリゴヌクレオチド配列を意味する。
【００５５】
ヌクレオチドの挿入はオリゴヌクレオチドの配列のいずれの末端で行われていてもよい。しかし、挿入により二次構造が影響を受け、ハイブリダイゼーションの成功度が下がることがある。オリゴヌクレオチドは、融解温度Ｔｍが４９から５４℃になるように設計する。温度にもよるが、オリゴヌクレオチドの５’末端にはいくらかの量のハイブリダイズしていないヌクレオチドが存在する。本発明で開示している内容では、５’末端にはＴスペーサーが含まれている。Ｔスペーサーのほかに１個か２個の挿入されたヌクレオチドが存在してもよい。しかし、５’末端にはヌクレオチドが挿入されていないことが好ましい。また、５’末端から１個か２個のヌクレオチドが欠失している場合もある。この場合も、５’からの欠失はないほうが好ましい。
【００５６】
本発明の好ましい実施態様において、マイクロアレイには２種の、好ましくは３種以上の、より好ましくは４種以上の異なるヘルペスウイルスに反応するオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明の好ましい実施態様において、マイクロアレイには２から８種の異なるヘルペスウイルスに反応するオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明の最も好ましい実施態様において、マイクロアレイには５種以上の、好ましくは６種以上の、より好ましくは７種あるいは８種以上の異なるヘルペスウイルスに反応するオリゴヌクレオチドが含まれる。ＨＨＶ−６ＡとＨＨＶ−６Ｂを区別する検査法はほとんどなかった。本発明の特に優れている部分は、上に挙げた８種すべてのヘルペスウイルスを、ひとつのサンプルから同時に検出できる箇所である。
【００５７】
本発明の好ましい実施態様の一例において、ヘルペスウイルスを同時に検出するため、少なくとも配列番号４および配列番号５からなるグループから選択された配列を含むオリゴヌクレオチド、あるいは、少なくとも配列番号４、配列番号５および配列番号８からなるグループから選択された配列を含むオリゴヌクレオチドが使用される。
【００５８】
別の実施態様では、少なくとも配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７からなるグループから選択された配列を含むオリゴヌクレオチド、あるいは少なくとも配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９からなるグループから選択された配列を含むオリゴヌクレオチドが使用される。
【００５９】
さらに別の好ましい実施態様では、ヘルペスウイルスを同時に検出するため、少なくとも配列番号１１、配列番号１７および配列番号１８からなるグループから選択された配列を含むオリゴヌクレオチド、あるいは少なくとも配列番号１１、配列番号１７、配列番号１８および配列番号２１からなるグループから選択された配列を含むオリゴヌクレオチドが使用される。
【００６０】
本発明のさらに別の好ましい実施態様においては、患者に二重感染や三重感染することが多いヘルペスウイルスを同時に検出するための配列を含むオリゴヌクレオチドを、本発明の方法を使用することにより、同時に検出することができる。
【００６１】
本発明のまたさらに別の好ましい実施態様においては、同じ生体サンプルから別の病原体や別のウイルスを同時に検出することが本発明の方法に含まれる。この場合の他の病原体やウイルスとは、ヘルペスウイルスと同時に感染することが多いものである。あるいは、他の病原体やウイルスは中枢神経系の疾患や免疫不全症を引き起こすものでもよい。他の病原体は例えば、エンテロウイルスやボレリアなどである。
【００６２】
本発明はまた、マイクロアレイと、反応に必要な試薬を任意に含むマイクロアレイキットも提供する。試薬は例えば、酵素、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰｓ）、緩衝液などである。
【００６３】
本発明において、「ｑＰＣＲ」は定量的ＰＣＲを意味する。
本発明において、「質的ＰＣＲ」はＰＣＲによる診断を意味する。
【００６４】
本発明の方法は本明細書において、８種のヘルペスウイルスを検出するためのマイクロアレイを記載することにより例示した。マイクロアレイによる検出は、日常的なＰＣＲによる診断と比較した。日常的なＰＣＲによる診断は、マルチプレックスＰＣＲを２つ記載することにより例示した。
【００６５】
臨床試料は実際に患者から採取したものを使用した。ＰＣＲによる診断の結果とマイクロアレイの結果は８９％一致した。４例において、ＰＣＲによる診断の結果は陰性だったのに対し、マイクロアレイでは陽性の結果がでた。
【００６６】
ＣＭＶ陽性の血漿検体において、マイクロアレイでは二重感染を２例（ＣＭＶとＥＢＶ）検出した。この検体は腎臓と骨髄を移植した患者から採取したものである。いずれの患者も、血清反応ではＥＢＶとＣＭＶに陽性だった。ＥＢＶ陽性の検体において、マイクロアレイでは二重感染を二例（ＥＢＶとＣＭＶ、ＥＢＶとＨＨＶ−７）発見した。ＥＢＶとＣＭＶに二重感染していた患者は骨髄を移植しており、血清反応においてＥＢＶに陽性で、ＣＭＶのＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体を保有していた。ＥＢＶとＨＨＶ−７に感染していたサンプルは腎臓を移植した患者から採取したもので、血清反応ではＨＨＶ−７に陰性を示した。ＶＺＶ陽性の２つのＣＳＦサンプルは、マイクロアレイによる検出では、ＶＺＶとＨＨＶ−６Ｂ、ＶＺＶとＥＢＶに陽性だった。先行研究によると、ＶＺＶとＨＨＶ−６Ｂの双方に陽性な患者は鞘内にこれらのウイルスに対する抗体を持つことがわかっている。ＶＺＶとＥＢＶに二重感染している可能性のあるサンプルでは、血清からＶＺＶのＩｇＧが確認された。マイクロアレイによる検出では、三重感染（ＨＳＶ−２、ＨＨＶ−７、ＨＨＶ−６Ｂ）の可能性のあるサンプルが見つかった。このサンプルは血清反応においてＨＨＶ−７に対し陰性で、ＰＣＲによる診断においてＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に対し陰性だった。
【００６７】
ＣＳＦの細胞数、タンパク質およびグルコースの量は、３人のＶＺＶ陽性患者と１人のＨＳＶ−２陽性（三重感染の可能性もある）患者でのみ可能であった。そのうち２つのサンプルでは異常は見られなかったが、残りの２つのサンプルでは白血球および赤血球数の増加が見られ、グルコース量は異常がなかったがタンパク質の量が増加していた。このＨＳＶ−２陽性の患者は、ＣＳＦにＨＳＶのＩｇＭ抗体を保有していた。
【００６８】
診断において、ＰＣＲによる臨床検体中のＨＨＶ−７の診断は行わなかった。マイクロアレイでＨＨＶ−７に陽性を示した４つの検体は採取した時点で血清反応においてＨＨＶ−７に陰性を示していた。そのため、急性感染の可能性が除外できない。ＨＨＶ−７は、例えば移植患者などで極めてよく見られる（非特許文献１１）。
【００６９】
ＰＣＲによる診断は、通常、１回につき１種のヘルペスウイルスに対して行う。そのため、複数主のヘルペスウイルスを検出する場合、より長い時間がかかる。二重感染や三重感染はＰＣＲでは検出できないが、マイクロアレイは多重感染も１日で検出可能である。それゆえ、マイクロアレイによる検出は、診断および研究の場面において、より早くかつ簡単に複数種のヘルペスウイルスを検出する手段であるといえる。
【実施例１】
【００７０】
ウイルスＤＮＡと臨床検体
マルチプレックスＰＣＲとマイクロアレイの準備をするに際し、１０倍に連続希釈した市販のウイルスＤＮＡコントロール（１００万コピーあるいはウイルス粒子数から出発）と細胞培養上澄みを使用した。
【００７１】
表１  マルチプレックスＰＣＲとマイクロアレイの最適化と試験に使用した市販のウイルスＤＮＡコントロール（Ａｕｔｏｇｅｎ  Ｂｉｏｃｌｅａｒ、ウィルトシャー、イギリス）と細胞上澄みの一覧
【表１】
2009531048.tif 000002
【００７２】
予備実験で使用した材料のうちから、血漿（７３）、全血（１０）、脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプル（２３）、精度管理試験用検体（１０）（ＱＣＭＤ、グラスゴー、スコットランド、イギリス）の、全部で１１６の臨床検体を採取した。血漿、全血、ＣＳＦサンプルは固形臓器および骨髄を移植した患者、あるいは神経学的症状を呈している患者から採取した。精度管理試験用検体のうち、４／１０はＶＺＶの、６／１０はＨＳＶの２００４年の精度管理試験（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｐｒｏｇｒａｍ  ２００４）のものである（表２）。マイクロアレイの特異度を調べるため、流行性腎症の疑いのある患者から採取した７０の血清と、試験の結果ＨＳＶ，ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７のＤＮＡに陰性を示した３０のＣＳＦと、１１の２００４年のエンテロウイルス精度管理試験用検体（表２）を使用した。
【００７３】
表２  マイクロアレイの試験に使用した、精度管理試験用検体のウイルス精度管理試験名、系統、ＤＮＡ量、パネル型
【表２】
2009531048.tif 000003
【００７４】
ＤＮＡ抽出
ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ  インスツルメントに、トータル核酸キット（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社、バーゼル、スイス）、ハイピュア ウイルス核酸キット（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）、またはフェノール・クロロホルム抽出を使用して、診断に使われる方法により、ＤＮＡを抽出した。
【００７５】
マルチプレックスＰＣＲプライマーとオリゴヌクレオチド
ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２（マルチプレックスＰＣＲ１）のためのプライマーのペアには、公知のプライマー（非特許文献２７）を改良したものを使用した。ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６Ａ、ＨＨＶ−６Ｂ、ＨＨＶ−７（マルチプレックスＰＣＲ２）のためのプライマーのペアおよびオリゴヌクレオチドは、Ｐｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３_ｗｗｗ．ｃｇｉ；  非特許文献３３） および ＤＮＡ ｍｆｏｌｄ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ/ｍｆｏｌｄ/ｏｌｄ/ｄｎａ/；非特許文献４５）を使用して設計した。Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をマルチプレックスＰＣＲのリバースプライマーに含めた（表３、表４）。
【００７６】
本発明の別の実施態様では、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６Ａ、ＨＨＶ−６Ｂ、ＨＨＶ−７（マルチプレックスＰＣＲ１、２）のオリゴヌクレオチドとプライマーをＰｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ-ｂｉｎ/ｐｒｉｍｅｒ３/ｐｒｉｍｅｒ３_ｗｗｗ．ｃｇｉ；  非特許文献３３） および ＤＮＡ ｍｆｏｌｄ （ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ/ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ/ｍｆｏｌｄ/ｏｌｄ/ｄｎａ/；  非特許文献４５）を使用して設計した。代替配列は、表３において配列番号２２から配列番号２６まで、表４において配列番号２８と配列番号２９である。
【００７７】
表３  マルチプレックスＰＣＲ１に使用したプライマーとマイクロアレイのオリゴヌクレオチド
【表３】
2009531048.tif 000004
【００７８】
表４  マルチプレックスＰＣＲ２に使用したプライマーとマイクロアレイのオリゴヌクレオチド
【表４】
2009531048.tif 000005
【００７９】
マルチプレックスＰＣＲによる増幅
マルチプレックスＰＣＲ１はＨＳＶを同定するために行い、結果として２６４−ｂｐの、代替実施態様では２４９−ｂｐのアンプリコンが調製された。マルチプレックスＰＣＲ２はＣＭＶ、ＥＢＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６Ａ、ＨＨＶ−６Ｂ、ＨＨＶ−７のためのプライマーのペアを含み、それぞれ２２０ｂｐ、２７３ｂｐ、１８６ｂｐ、１７９ｂｐ（ＨＨＶ−６Ａ、ＨＨＶ−６Ｂいずれも）、２３０ｂｐのアンプリコンが調製された。すべてのサンプルに対して、両方のマルチプレックスＰＣＲを行った。
【００８０】
マルチプレックスＰＣＲ１は、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）のゼラチン、０．２ｍＭのｄＮＴＰｍｉｘ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、エスポー、フィンランド）、０．６μＭのプライマー、１２．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（アプライドバイオシステム社、フォスターシティ、カリフォルニア州）、２ｍＭのＭｇＣｌ２を含み、最終量を５０μｌに調整して行った。
【００８１】
マルチプレックスＰＣＲ２は、４７．２ｍＭのＫＣｌ、９．４ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、０．００９％（ｗ／ｖｏｌ）のゼラチン、０．１９ｍＭのｄＮＴＰｍｉｘ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、エスポー、フィンランド）、０．５６μＭのプライマー、１２．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（アプライドバイオシステム社）、１．９ｍＭのＭｇＣｌ２を含み、最終量を５３μｌに調整して行った。増幅は９５℃で１０分間の変性行い、９６℃を１０秒、５５℃を２０秒、７２℃を２０秒のサイクルを４０回行い、最後に７２℃で５分間伸長した。
【００８２】
日常的な診断におけるＰＣＲ
日常的な診断のためのＰＣＲにおいて、ＣＭＶとＥＢＶのための２つのリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）と、ＨＳＶ、ＨＨＶ−６、ＶＺＶのための３つの質的ＰＣＲが用いられている。臨床検体に対し、平行して、同時に抽出したＤＮＡを用いて上記ＰＣＲのうちひとつの方法とマイクロアレイを用いた方法を行い、その結果を質的に比較した。用いるＰＣＲは予備診断テストの結果と臨床情報に基づいて選択した。
【００８３】
ＣＭＶとＥＢＶに対するｑＰＣＲは、それぞれ、非特許文献２９と改良した非特許文献１に従って行った。後者に対しては、非特許文献２２に記載されているＥＢＶのプライマーとプローブを用いた。ＨＳＶに対するｑＰＣＲは、非特許文献４１の報告しているプローブを用いて、非特許文献２７に従って行った。ＨＨＶ−６に対するＰＣＲには非特許文献１６が設計したプライマーと、非特許文献３０のＨＨＶ−６プローブを用いた。ＶＺＶに対するＰＣＲは、非特許文献１２と非特許文献２３に従って行った。質的ＰＣＲ生成物の検出には、発光定量を用いたＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法（非特許文献４１）を使用した。
【００８４】
マイクロアレイの準備
非特許文献１７の記載および、非特許文献２６の改良に基づき、顕微鏡用ガラススライドを活性化した。マイクロアレイヤー（ＯｍｎｉＧｒｉｄ(登録商標)、ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅｓ、ハンティンドン、イギリス）を使用して、ＮＨ２で修飾されたオリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｌｉｇｏ、パリ、フランス）をスライドにスポットした。アレイには８種のヘルペスウイルス用オリゴヌクレオチド（表３、表４）およびウイルスに特異的ではない６種のオリゴヌクレオチドを、５×１２のマトリックス状に並べた。被膜したスライドは５０のアレイからなり、各アレイにはヘルペスウイルスに特異的なオリゴヌクレオチドを３連×２回スポットし、ネガティブハイブリダイゼーションコントロールとして非特異的なオリゴヌクレオチドを2回スポットした。スポットした溶液には、２０μMのオリゴヌクレオチドおよび０．３μMの炭酸ナトリウム緩衝材（ｐＨ９．０）、あるいは最終的に１０μｌになるように、１倍の市販のマイクロアレイスポット用溶液（ＭＳＳ、ＡｒｒａｙＩｔ、Ｔｅｌｅｃｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、サニーベール、カリフォルニア州）を含有させていた。スポッティングは室温、５０％の湿度のもとで行われた。スライドは使用前に室温で一晩保存された。
【００８５】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ転写とマイクロアレイ反応
ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅＴＭ  Ｔ３  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、マディソン、ウィスコンシン州）あるいは代わりにＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅＴＭ  Ｔ３  Ｆｌａｓｈ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、１時間４２℃）を使用して一本鎖ＲＮＡに転写する前に、製造者の使用説明書に従い、２つのマルチプレックスＰＣＲ生成物を沈殿させた。抽出、マルチプレックスＰＣＲ、ＰＣＲのネガティブコントロールも含まれていた。
【００８６】
Ｍｉｎｉ  Ｐａｐ  Ｐｅｎ（Ｚｙｍｅｄ社、サウスフランシスコ、カリフォルニア州）を使用してアレイエリアの周囲を円形に囲んだ。６μｌの一本鎖ＲＮＡと１．５ｍＭのＮａＣｌを含有する、最終的に８．５μｌの一本鎖ＲＮＡ溶液を、９５℃で１．５分間加熱した後、４２℃で２０分間反応させた。別の方法では、６μｌの一本鎖を９６℃で2分間加熱した。加熱した後、６μｌの一本鎖ＲＮＡと１．５ｍＭのＮａＣｌを含有する、最終的に８．５μｌの一本鎖ＲＮＡ溶液は４２℃で２０分間反応させた。インキュベーションの後、マイクロアレイはアレイ洗浄用緩衝液（０．５×ＴＥ（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５ｍＭ  Ｅｄｔａ）、０．３Ｍ  ＮａＣｌ  ０．１％  および、  ０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｋｅｍｉａ、ヘルシンキ、フィンランド））および滅菌水で洗浄した。
【００８７】
５５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１１ｍＭのＭｇＣｌ２、８３ｍＭの塩化カリウム、１１ｍＭのＤＴＴ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、０，６μｌのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ−ＣＹ５、およびｄＣＴＰ−ＣＹ５（アマシャム・バイオサイエンス株式会社、リトルチャルフォント、イギリス）、５ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素、（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）と０．５Ｍのトレハロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および８．３％のグリセロール（ＭＰバイオメディカルズ、アーバイン、カリフォルニア）を含有する、最終的に４．５μｌのプライマー伸長溶液を加え、５２℃で２０分間反応させた。蛍光スキャンをする前に、マイクロアレイをアレイ洗浄緩衝液で洗浄し、乾燥した。
【００８８】
マイクロアレイのスキャニングと分析
マイクロアレイは、ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｃａｎｎｅｒ、ＳｃａｎＡｒｒａｙＴＭ、およびＱｕａｎｔＡｒｒａｙＴＭ（パーキンエルマー、ウェレスリー、マサチューセッツ州）を用いて分析した。分析にあたり、カットオフ値はそれぞれのアレイについて個別に設定した。オリゴヌクレオチドのスポットのシグナル（とバックグラウンドノイズとの差分）を非特異的なオリゴヌクレオチドのシグナルと比較した。シグナル比が３倍以上のときに結果が陽性であるとした。マイクロアレイは２重に行った。定量化されたシグナルの数は検体中のウイルスの数とは関連していなかった。
【００８９】
分析感度
マルチプレックスＰＣＲは高い分析感度を示した（表５）。これは、それぞれのヘルペスウイルスについて最低３回は市販のコントロールの希釈の効果を検査したためである。抽出とマルチプレックスＰＣＲにおける水分量の影響はマイクロアレイでは見られなかった。ＨＨＶ−６ＡとＨＨＶ−６Ｂとの間以外では交差反応は見られなかった。１００００以上のＨＨＶ−６Ｂのコピー／反応において、遺伝子型の特異的なオリゴヌクレオチドとの交差反応が見られた。しかし、ＨＨＶ−６Ａの濃度が高い場合には、交差反応は検出されなかった。市販のコントロールは検出において正常に作用し（図１）、ハイブリダイゼーションが正しく行われたことを表していた。
【００９０】
表５  市販のウイルスＤＮＡコントロールを用いたマルチプレックスＰＣＲとマイクロアレイの感度
【表５】
2009531048.tif 000006
【００９１】
臨床検体の分析と特異度
１１６の検体すべてを同時に、ＰＣＲの一方による診断あるいはマイクロアレイを用いて試験した。７３の血漿サンプルにＣＭＶあるいはＥＢＶのｑＰＣＲを行い、１０の全血サンプルにＨＨＶ−６の質的ＰＣＲを行った（表６）。２３のＣＳＦにＨＳＶあるいはＶＺＶの質的ＰＣＲを行った（表７）。１０の精度管理試験用検体（表８）にはＨＳＶとＶＺＶの質的ＰＣＲを行った。１１６のうち１０３の臨床検体において（８９％）、ＰＣＲとマイクロアレイの結果は一致した。
【００９２】
表６  血漿と全血における日常的ＰＣＲ診断とマイクロアレイによる検出の結果
【表６】
2009531048.tif 000007
【００９３】
ＰＣＲで陰性だった３２の血漿サンプルのうち、マイクロアレイでは２８のサンプルが陰性を示した（表６）。本来的に陰性である血漿サンプルのうち、４例がマイクロアレイでは陽性を示した。ＣＭＶに陽性の血漿サンプルのうち、２４／２６でｑＰＣＲとマイクロアレイは同じ結果を示した。mlあたり１２８０および８１０のゲノム当量（GEｑ）の、ｑPCRではCMVに陽性を示した２つのサンプルが、マイクロアレイでは陰性を示した。ＣＭＶとEBVの二重感染（それぞれ、ＣＭＶが５４２０ＧＥｑ／ｍｌでＥＢＶが６２８０ＧＥｑ／ｍｌ、およびＣＭＶが４２００ＧＥｑ／ｍｌでＥＢＶが４１３０ＧＥｑ／ｍｌ）がＣＭＶ陽性のケースで検出された。
【００９４】
ＰＣＲでＥＢＶに陽性だった１５のサンプルのうち、１つを除いた残りすべてのサンプルはマイクロアレイでも陽性を示した。検出されなかった検体はｑＰＣＲでは８６０ＧＥｑ／ｍｌだった。マイクロアレイで二重感染は二例（ＥＢＶとＣＭＶ、およびＥＢＶとＨＨＶ−７）検出された。ｑＰＣＲにおいてＥＢＶは前者が１５×１０６、後者は９９０ＧＥｑ／ｍｌだった。
【００９５】
ＰＣＲでＨＨＶ−６に陽性だった１０の検体のうち、マイクロアレイは９つの検体でＨＨＶ−６Ｂを検出した。また、マイクロアレイは４例の二重感染を検出した。そのうち２例はＨＨＶ−６ＢとＥＢＶで、残りの２例はＨＨＶ−６ＢとＨＨＶ−７に感染していた。
【００９６】
ＣＳＦの検体のうち、ＰＣＲでは１０／２３の検体が陰性を示し、１３／２３が陽性を示した。ＰＣＲで陰性であったＣＳＦの検体はすべてマイクロアレイでも陰性を示した。ＨＳＶに陽性だった３つの検体のうち、マイクロアレイではＨＳＶ−２陽性の検体を１つ検出できなかった。マイクロアレイで１例の三重感染（ＨＳＶ−２、ＨＳＶ−７、ＨＨＶ−６Ｂ）を検出した。ＨＨＶ−６に陽性の検体２例は陰性だったが、ＶＺＶに陽性の８例の検体はすべてマイクロアレイでも陽性を示した。（表７）
【００９７】
表７  ＣＳＦ検体における日常的ＰＣＲ診断とマイクロアレイによる検出の結果
【表７】
2009531048.tif 000008
【００９８】
１０の精度管理試験用検体のうち、２つが、ＰＣＲでもマイクロアレイでも陰性だった。ＰＣＲで陽性だった８つの検体は、ＱＣＭＤの情報の通り、２つはＨＳＶ−１に、２つはＨＳＶ−２に、４つはＶＺＶに陽性だった。マイクロアレイではＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に陽性の検体でそれぞれ１例ずつ陰性を示したが、それ以外の結果はＰＣＲのものと一致した。ＶＺＶに陽性の検体のうち１つで、ＶＺＶのシグナルの他に非常に弱いＨＨＶ−６Ｂのシグナルも検出された。（表７−）
【００９９】
ヘルペスウイルスに陰性のパネル（血漿７０例、ＣＳＦ３０例、精度管理試験用検体１１例）はマルチプレックスＰＣＲとマイクロアレイで陰性だった。よって、特異度は１００％となった。（結果は表に含めていない）
【０１００】
表８  ＱＣＭＤ検体における日常的ＰＣＲ診断とマイクロアレイの結果
【表８】
2009531048.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】マイクロアレイを用いた方法による８種のヘルペスウイルスの判別結果を画像で表示したもの。各アレイにヘルペスウイルスに特異的なオリゴヌクレオチドを３連で２箇所に注入し、非特異的なオリゴヌクレオチドを２箇所に注入した。アレイは６０のスポット（５×１２の格子）からなる。非特異的なオリゴヌクレオチドからはシグナルは検出されなかった。ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＨＶ−７、ＶＺＶの画像は平均的なレベルのウイルスＤＮＡコントロールのものである（１０００−５０００コピーあるいはＶＰｓの範囲）。ＨＨＶ−６Ａおよび−６Ｂの画像では、低レベルのウイルスＤＮＡにおいて転換反応は見られなかった（画像のレベルはそれぞれ２９０コピーおよび２２０ＶＰｓ）
【図１】
2009531048.tif 000010
【配列表】
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【国際調査報告】
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