(57)【要約】  肥満、糖尿病、代謝症候群、変性疾患およびミトコンドリア機能障害に関連する疾患などのエネルギー過剰を伴う様々な疾患を、インビボまたはインビトロで、基質または補酵素としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈの使用を通じて、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ（ＮＱＯ１）などのオキシドレダクターゼによりＮＡＤ（Ｐ）＋濃度を上昇させることによるＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の上昇を介して有効に治療することが可能な方法と、それらに対する薬剤および治療薬のスクリーニング方法が提供される。
2009526839.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を、オキシドレダクターゼの調節または添加によりインビボまたはインビトロで上昇させる方法。
【請求項２】
前記ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の上昇を、哺乳動物において行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物がヒトであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記オキシドレダクターゼが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ１（ＮＱＯ１）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を、ＮＱＯ１の活性を増大させることにより上昇させることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＮＱＯ１による前記ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比における変化が、ＮＱＯ１における活性化物質の不在下でのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量を基準としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈの２０％を超える低下であり、それにより前記ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を上昇させることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの低下が３０％を超えることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＡＭＰ／ＡＴＰ比を、前記ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の上昇により上昇させることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
補酵素または基質としてのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの消費を、ＮＱＯ１タンパク質の量またはＮＱＯ１遺伝子の発現を高めることにより増大させることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
ＮＱＯ１の活性または量を増大させることが可能な化合物を用いてＮＱＯ１の活性を増大させることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物がＨ受容体であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物が、キノン化合物、キノン−イミン化合物、ニトロ化合物、アゾ化合物およびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物が、ナフトキノン化合物およびその誘導体よりなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物が、フマル酸エステルおよびその誘導体、オルチプラズ（４−メチル−５（２−ピラジニル）−１，２−ジチオール−３−チオン）、クルクミン、アネトールジチオールチオン、スルフォラファン、６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート、コーヒー酸フェネチルエステル、４’−ブロモフラボン、アヴィシンズ、フィセチン、レスベラトロールおよびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ナフトキノン化合物が、４−アミノアルキル−１，２−ナフトキノン、４−チオアルキル−１，２−ナフトキノン、４−アルコキシ−１，２−ナフトキノン、フラノ−ｏ−ナフトキノン、ピラノ−ｏ−ナフトキノンまたはそれらの誘導体であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記フマル酸エステルが、ジメチルフマレート、モノエチルフマレート、モノメチルフマレートまたはそれらの塩であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ナフトキノン化合物またはその誘導体が、式Ｉ：
【化１】
2009526839.tif 000008
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、アルコキシ、ヒドロキシまたは１〜６個の炭素原子を有する低級アルキルであり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、アルケン若しくはアルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール若しくはヘテロアリールであるか、或いはＲ３からＲ８のうちの２つの置換基が環状構造を形成する場合があり、
Ｘは酸素、窒素または硫黄であり、
ｍおよびｎはそれぞれ独立に０または１であり、但し、ｍおよびｎのうちのいずれかが０である場合に、ｍまたはｎに隣接する炭素原子が直接結合を介して環状構造を形成しうる）
によって表される化合物であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
Ｘは酸素であり、ｍは１であり、ｎは０または１であり、但し、ｎが０である場合に、ｎに隣接する炭素原子が直接結合を介して環状構造を形成することを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物が、式ＩＩ：
【化２】
2009526839.tif 000009
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は式Ｉにおける定義と同じである）
によって表されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物が、式ＩＩＩ
【化３】
2009526839.tif 000010
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は式Ｉにおける定義と同じである）
によって表されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物が２，２−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｈ］クロメン−５，６−ジオンであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を、インビボまたはインビトロでＮＱＯ１を介して上昇させることが可能な化合物を同定する方法であって、
候補化合物群をＮＱＯ１に接触させる工程；および
ＮＱＯ１の量または活性を監視する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
ＮＱＯ１を、スクリーニング対象の化合物およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈと所定の時間反応させる工程；および
得られたＮＡＤ（Ｐ）＋または残存するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを定量する工程
を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
生成されたＮＡＤ（Ｐ）＋の定量が、ヒドリド（Ｈ−）受容体として用いられるＤＣＰＩＰの還元を介する、吸収波長における変化に起因する着色の誘導による吸光度の変化を測定する工程を含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記残存するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの定量が、テトラゾリウム塩の着色に起因する吸光度の変化を測定する工程を含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ＮＱＯ１を、スクリーニング対象の化合物と所定の時間反応させる工程；および
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの低下を定量する工程
を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
ＮＱＯ１を、スクリーニング対象の化合物と所定の時間反応させる工程；および
細胞内のＡＴＰ濃度の低下または細胞内のＡＭＰ濃度の上昇を定量する工程
を含むことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記監視する工程が、細胞内のカルシウム濃度の上昇を観察する工程を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記監視する工程が、ＡＭＰＫのリン酸化および活性化の程度を観察する工程を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記監視する工程が、ＡＣＣのリン酸化の増大および／またはＡＣＣ活性の低下を観察する工程を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の低下を伴う疾患を治療または予防するための薬剤の製造における、ＮＱＯ１の量または活性を増大させることが可能な化合物の使用。
【請求項３２】
前記化合物が、キノン化合物、キノン−イミン化合物、ニトロ化合物、アゾ化合物およびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記化合物が、ナフトキノン化合物およびその誘導体、フマル酸エステルおよびその誘導体、オルチプラズ（４−メチル−５（２−ピラジニル）−１，２−ジチオール−３−チオン）、クルクミン、アネトールジチオールチオン、スルフォラファン、６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート、コーヒー酸フェネチルエステル、４’−ブロモフラボン、アヴィシンズ、フィセチン、レスベラトロール並びにそれらの任意の組み合わせよりなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記化合物が、４−アルコキシ−１，２−ナフトキノン化合物およびその誘導体、並びにジメチルフマレートおよびその類似体よりなる群から選択されることを特徴とする請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の低下を伴う疾患を治療または予防する方法であって、ＮＱＯ１の量または活性を増大させることが可能な治療有効量の化合物を、それらを必要とする対象に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
前記疾患が、肥満、肥満合併症、糖尿病、糖尿病性合併症、代謝症候群、変性疾患またはミトコンドリア機能障害であることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記化合物が、キノン化合物、キノン−イミン化合物、ニトロ化合物、アゾ化合物およびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
（ａ）ＮＱＯ１の量または活性を増大させることが可能な治療有効量の化合物；および
（ｂ）薬学的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤またはそれらの任意の組み合わせ
を含有することを特徴とするＮＱＯ１を促進する組成物。
【請求項３９】
前記化合物が、キノン化合物、キノン−イミン化合物、ニトロ化合物、アゾ化合物、およびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記化合物が、ナフトキノン化合物およびその誘導体、フマル酸エステルおよびその誘導体、オルチプラズ（４−メチル−５（２−ピラジニル）−１，２−ジチオール−３−チオン）、クルクミン、アネトールジチオールチオン、スルフォラファン、６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート、コーヒー酸フェネチルエステル、４’−ブロモフラボン、アヴィシンズ、フィセチン、レスベラトロール並びにそれらの任意の組み合わせよりなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記化合物が、４−アルコキシ−１，２−ナフトキノン化合物およびその誘導体、並びにジメチルフマレートおよびその類似体よりなる群から選択されることを特徴とする請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比をインビボで上昇させる方法であって、ＮＡＤ（Ｐ）＋或いはその誘導体、前駆体またはプロドラッグを、それらを必要とする対象に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項４３】
インビボでのＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の人為的上昇によって、対象の運動能力および／または耐久力の改善を誘発する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オキシドレダクターゼ、好ましくはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ（ＮＱＯ１）によりＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を制御するための方法に関する。より詳細には、本発明は、過剰なエネルギー摂取または異常なレドックス状態に伴う課題、例えば低いＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比により発症しうる疾患に伴う課題を、エネルギーレベルを反映するＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの高い比の誘導により解決可能な技術に関する。例えば、ＮＱＯ１は、基質としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いてインビボまたはインビトロでＮＡＤ（Ｐ）＋レベルを上昇させ、結果的にＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を上昇させる。従って、エネルギー過剰から生じうる様々な疾患、例えば肥満、糖尿病、代謝症候群、変性疾患およびミトコンドリア機能障害に関連する疾患に伴う課題を解決することが可能である。
【背景技術】
【０００２】
体脂肪の量が標準体重に対して異常に高い状態である肥満は、カロリー摂取がカロリー消費よりも多い場合での身体の脂肪組織内での余剰カロリーの蓄積に起因する疾患を指す。肥満により引き起こされる合併症は、例えば高血圧、心筋梗塞、静脈瘤、肺塞栓、冠動脈疾患、脳出血、老人性痴呆、パーキンソン病、ＩＩ型糖尿病、高脂血症、脳卒中、様々な癌（例えば子宮癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌など）、心臓疾患、胆嚢疾患、睡眠時無呼吸症候群、関節炎、不妊症、静脈性潰瘍、突然死、脂肪肝、肥大型心筋症（ＨＣＭ）、血栓塞栓症、食道炎、腹壁ヘルニア（Ｖｅｎｔｒａｌ  Ｈｅｒｎｉａ）、尿失禁、心血管疾患、内分泌疾患などを含む（非特許文献１）。  
【０００３】
糖尿病は複数の環境因子および遺伝因子に起因する全身性代謝異常であり、体内のインスリンの絶対的または相対的欠乏による血中グルコースレベルの異常な上昇によって特徴づけられる症状を指す。糖尿病の合併症は、例えば低血糖症、ケトアシドーシス、高浸透圧性昏睡、大血管合併症、勃起不全（インポテンス）、糖尿病性網膜症、糖尿病性ニューロパチー、糖尿病性ネフロパチーなどを含む。
【０００４】
代謝症候群は、中性脂肪血症、高血圧、糖代謝障害、血液凝固障害および肥満などの健康リスク因子を伴う症候群を指す。２００１年に発行された国立コレステロール教育プログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ）（ＮＣＥＰ）のＡＴＰ  ＩＩＩ分類によると、１）男性で４０インチ（１０２ｃｍ）以上および女性で３５インチ（８８ｃｍ）以上のウエストライン（ウエスト周囲で測定したときの中心的な肥満）、２）１５０ｍｇ／ｄＬを超えるトリグリセリドレベル、３）４０ｍｇ／ｄＬ未満（男性）または５０ｍｇ／ｄＬ未満（女性）の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベル、４）１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧、並びに５）１１０ｍｇ／ｄＬを超える空腹時血中グルコースレベルという要素のうちの３つ以上の存在により、個人が代謝症候群と診断される。
【０００５】
インスリン抵抗性は、インスリンが体内で正常に分泌される場合でも、インスリンによってなされる「グルコースの細胞への供給」が正常に機能しない現象を指す。従って、血中のグルコースが細胞に入ることができないことから、高血糖が誘発され、更に細胞自体がグルコースの欠乏によりその正常な機能を発揮することができず、それが原因で代謝症候群の徴候が現れる。
【０００６】
変性は病理所見に由来する用語であることから「酸素の消費における低下」を伴う症状を意味し、細胞内の酸素を用いてエネルギーを生成するオルガネラであるミトコンドリア機能障害が老化に関連する場合の変性疾患を示す。変性疾患の例として、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病などの神経変性疾患が挙げられうる（非特許文献２）。
【０００７】
ミトコンドリア機能障害に起因する疾患は、例えば、ミトコンドリア膜電位異常に起因するミトコンドリアの腫脹、例えば活性酸素種またはフリーラジカルの活性による酸化ストレスに起因する機能障害、遺伝因子に起因する機能障害、およびミトコンドリアのエネルギー生成における酸化的リン酸化機構の機能欠損に起因する疾患を含みうる。上記の病因により発症する疾患の特定の例として、多発性硬化症、脳脊髄炎、脳神経根炎（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｒａｄｉｃｕｌｉｔｉｓ）、末梢性ニューロパチー、ライ症候群、フリードリヒ運動失調症（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ’ｓ  ａｔａｘｉａ）、アルパース症候群（Ａｌｐｅｒｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ＭＥＬＡＳ、片頭痛、精神疾患、うつ病、発作および痴呆、麻酔性発作（ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ｅｐｉｓｏｄｅ）、視神経萎縮、視神経ニューロパチー、網膜色素変性、白内障、高アルドステロン血症（ｈｙｐｅｒａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅｍｉａ）、副甲状腺機能低下症、ミオパチー、筋萎縮、ミオグロビン尿症、筋緊張低下、筋肉痛、運動耐性の低下、腎尿細管炎（ｒｅｎａｌ  ｔｕｂｕｌｏｐａｔｈｙ）、腎不全、肝不全、肝機能不全、肝腫脹、赤血球貧血（鉄欠乏性貧血）、好中球減少症、血小板減少症、下痢、絨毛萎縮、複数の嘔吐、嚥下障害、便秘、感音難聴（ＳＮＨＬ）、てんかん、知的障害、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病が含まれうる（例えば、（特許文献１）；（特許文献２）；（非特許文献３）；（非特許文献４）；および（非特許文献５）を参照）。
【０００８】
以下、上記の肥満、糖尿病、代謝症候群、変性疾患およびミトコンドリア機能障害に関連する疾患は集合的に「疾患症候群（ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）」と称されることになる。
【０００９】
現在、かかる疾患症候群に伴う症状を改善するかまたはそれと戦うのに最も有効な方法は運動増進、減量、および食事制限であることが知られている。現在、「疾患症候群」と戦うのに有効なあらゆる方法は、それらがエネルギー代謝を促進することから、結果として体内の余剰エネルギーの消費が最大になり、エネルギー蓄積の阻止がもたらされるという事実を共通に有している。かかる余剰エネルギーの有効な消費が、疾患症候群を治療するための方法であると考えられる。代謝活性の促進が余剰エネルギーの有効な除去に不可欠である。このため、脂肪生成の阻害、グルコース新生の阻害、グルコース消費の促進、脂肪酸化の促進、エネルギー代謝の中央装置であるミトコンドリアの新生（ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）の促進、および代謝活性化に関与する因子の集合的な活性化を行うことが不可欠である。
【００１０】
しかし、疾患症候群の治療標的についてはほとんど知られていないが、専ら個々の疾患を治療するための極めて多数の標的タンパク質または遺伝子が知られており、それ故、上記の対応する標的タンパク質または遺伝子の使用を介する、かかる疾患を予防または治療するための方法がいくつか提案されている。しかし、個々の疾患、例えば肥満、糖尿病などを含む代謝症候群の治療であっても、まだ更なる有意な改善の余地が存在する。疾患の治療に関して極めて多数の研究が行われているという事実にもかかわらず、過剰なエネルギー摂取および老化に起因する様々な疾患の治療において使用可能な薬剤は今のところ全く存在しない。
【００１１】
肥満、糖尿病、代謝症候群、変性疾患およびミトコンドリア機能障害に関連する疾患を含む疾患の大部分、即ち「疾患症候群」を含む疾患の多数は、エネルギー代謝および酸化還元状態の不均衡が原因である。疾患のすべてが余分なＮＡＤ（Ｐ）Ｈに起因するエネルギー過剰により生じると考えられる。  
【００１２】
ＮＡＤＰＨは脂肪合成に関与する重要な因子であり、パルミチン酸塩の合成には１４個のＮＡＤＰＨ分子が必要である。ＮＡＤＰＨは還元剤であり、脂肪合成を含む生合成プロセスにて用いられる。他方、ＮＡＤＨはエネルギー生成反応にて用いられる。しかし、脂肪合成およびエネルギー生成の後に残存する余剰のＮＡＤ（Ｐ）Ｈが、反応性酸素種（ＲＯＳ）などのフリーラジカルが生成される間、原形質膜上に存在するＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼと称される酸化酵素により除去される。肥満および糖尿病における酸化ストレスの増大を担う主な原因がＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼであることが見出された（非特許文献６）。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼにより生成される反応性酸素種（ＲＯＳ）などのフリーラジカルが、癌、心血管疾患、高血圧、動脈硬化、心肥大、虚血性心疾患、敗血、炎症状態および疾患、血栓症、脳神経疾患（例えば脳溢血（脳卒中）、アルツハイマー病およびパーキンソン病）、老化促進などの様々な疾患の病原を担う主要な因子であることも見出された（非特許文献７）。
【００１３】
従って、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比およびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ比がインビボまたはインビトロで低下することから余剰のＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ分子が残存する場合、それらは脂肪生合成プロセスにて用いられる。更に、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨが、過剰量で存在する場合に反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成を引き起こす主な基質としても用いられることから、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨはＲＯＳによって誘発される炎症性状態および疾患を含む重要な疾患における病原因子でありうる。これらの理由のため、インビボまたはインビトロにおける環境を確立することでＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比およびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ比の上昇した状態での安定な維持が保証されうる場合、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋による脂肪酸化および様々なエネルギー消費（代謝）が活性化されることになると考えられる。その結果、作用機序を持続的に活性化することでＮＡＤ（Ｐ）Ｈ濃度が低いレベルで維持可能である場合、肥満を含む様々な疾患がかかる余剰エネルギーの完全な消費の誘発により治療されうると考えられる。
【００１４】
最近、ＮＡ（Ｄ）Ｐ＋に対して多大な関心が向けられている。ＮＡ（Ｄ）Ｐ＋は、脂肪酸化を含む極めて多数の代謝に関与する様々な酵素に対する基質または補酵素として機能する。詳細には、ＮＡ（Ｄ）Ｐ＋は、インビボで極めて多数の生物学的代謝プロセスに関与する物質であり、エネルギー代謝、ＤＮＡの修復および転写の調節を担う様々な酵素の補酵素として用いられる。他方でＮＡＤ＋は、ＮＡＤ＋依存性ＤＮＡリガーゼ、ＮＡＤ＋依存性オキシドレダクターゼ、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、ＣＤ３８、ＡＭＰＫ、ＣｔＢＰおよびＳｉｒ２ｐファミリーメンバーを含む様々な種類の酵素に対する基質または補酵素として用いられる。ＮＡＤ＋は、転写調節、寿命、カロリー制限で媒介される寿命延長および老化関連疾患における上記のインビボでの作用を通じて重要な役割を果たすことが見出された。ＮＡＤ＋は、寿命および推定上のＮＡＤ＋依存性デアセチラーゼのＳｉｒ２ｐファミリーメンバーの調節を介する転写サイレンシングに作用する。
【００１５】
その一方で、細胞内のレドックス状態の主な調節因子であるＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比は、生体の代謝状態を反映する指標として見なされることが多い。ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比は、代謝プロセスにおける変化とともに変化する。特に、ＮＡＤ＋が代謝調節因子として機能することが知られている。種々の老化関連疾患は、直接的または間接的にＮＡＤ＋またはＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈのレドックス状態における変化に関連する。
【００１６】
タンパク質および遺伝子の代表例として、ＮＡＤ（Ｐ）＋により作用を受けるかまたは調節される場合の活性は以下の通りである。転写コリプレッサーＣｔＢＰ（Ｃ末端結合タンパク質）は、ＮＡＤ＋依存性の抗老化遺伝子Ｓｉｒ２と相まって、細胞内のエネルギー状態に応じてクロマチンの転写を制御するためのエネルギーセンサとして役立ち、腫瘍発生の調節において重要な役割を果たす（非特許文献８）。ＮＡＤ＋は、Ｓｉｒ２の作用を通じてｐ５３抗癌遺伝子を制御する（非特許文献９）。
【００１７】
ＮＡＤ＋依存性の遺伝子Ｓｉｒｔ１はＰＧＣ１−αの脱アセチル化を誘導して糖新生および解糖遺伝子を制御し、肝グルコース放出の刺激による、エネルギー恒常性、糖尿病、および寿命の調節に関連する（非特許文献１０）。
【００１８】
Ｓｉｒｔ１は、カロリー制限媒介性の寿命延長、老化関連疾患（例えば糖尿病、癌および心血管疾患）、脂肪組織ホルモン（アディポネクチン、レプチン、ＴＮＦαおよびレジスチン）の産生、インスリン感受性の増大、並びに脳神経疾患（例えばハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病および脳卒中）および反応性酸素種を含むフリーラジカルに起因する酸化損傷の低下による抗老化作用にて中心的な役割を果たすことが知られている（非特許文献１１）。Ｓｉｒｔ１がニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（Ｎｍｎａｔ）の活性を増大させて大脳および脊髄を保護することから、神経線維疾患および変性脳疾患（多発性硬化症、脳脊髄炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、ライ症候群、フリードリヒ運動失調、痙性対麻痺、難聴−失調（Ｄｅａｆｎｅｓｓ−ｄｙｓｔｏｎｉａ）症候群、ウイルソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病）の治療として治療的に有効であることが見出された（非特許文献１２）。Ｓｉｒｔ１は、ＰＰＡＲ−γ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体）の抑制により白色脂肪細胞内での脂肪動員を促進する（非特許文献１３）。Ｓｉｒｔ１がＴａｔ脱アセチル化を介してＨＩＶ転写を調節することから、Ｓｉｒｔ１がＨＩＶ感染症の治療における新しい標的であることが示される（非特許文献１４）。
【００１９】
更に、カロリー制限が、血中グルコース、トリグリセリドおよびホルモンのレベルを含む生理的特性の変化並びに生体の運動、活性および耐久力を含む挙動特徴に対する効果を有することが知られている。従って、Ｓｉｒｔ１遺伝子を用いる実験を通じ、カロリー制限に作用するＳｉｒｔ１が運動能、活性能および耐久力の促進に密接に関与することが高い有意性で実証された（非特許文献１５）。
【００２０】
その一方、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）が、生体におけるエネルギー状態、レドックス状態およびリン酸化度を検知するタンパク質であり、かつＡＭＰだけでなくＮＡＤ＋によっても活性化されることが確認された（非特許文献１６）。リン酸化により活性化されるＡＭＰＫは、例えば、脂肪合成の阻害、グルコース取り込みの促進、脂肪分解（リポリーシス）および脂肪酸化の促進、解糖の促進、インスリン感受性の向上、グリコーゲン合成の抑制、トリグリセリドおよびコレステロール合成の抑制、炎症の緩和（抗炎症作用）、血管拡張活性、心血管系の機能改善、ミトコンドリアの再生および筋肉の構造変化、抗酸化機能、抗老化および抗癌効果において様々な機能および作用を示すことが報告されている。更に、ＡＭＰＫは、上記の様々な活性および機能を用いることから、肥満、糖尿病、代謝症候群、脂肪肝、虚血性心疾患、高血圧、変性脳疾患、高脂血症、糖尿病合併症および勃起不全などの疾患の治療における標的タンパク質として認識されている（（非特許文献１７）；（非特許文献１８）；および（非特許文献１９））。
【００２１】
ＮＡＤ（Ｐ）＋の補酵素または基質としての直接的使用に加え、ＮＡＤ＋はＡＤＰリボシルシクラーゼ（ＣＤ３８）の作用により環状アデノシン二リン酸−リボース（ｃＡＤＰＲ）に変換する一方、ＮＡＤＰ＋はＡＤＰリボシルシクラーゼ（ＣＤ３８）の作用によりニコチン酸アデニンジヌクレオチドリン酸塩（ＮＡＡＤＰ）に変換する。ＣＤ３８により生成されるｃＡＤＰＲおよびＮＡＡＤＰは、細胞内のカルシウム（Ｃａ２＋）の動員に関与する二次メッセンジャーとして機能する。
【００２２】
かかる様々な機能を有することが知られるシグナルトランスデューサであるＮＡＤ（Ｐ）＋の濃度および比を増大させるための方法として、１）ＮＡＤ（Ｐ）＋生合成プロセスであるサルベージ合成の調節、２）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを基質または補酵素として用いる酵素の遺伝子またはタンパク質の活性化によるインビボでのＮＡＤ（Ｐ）＋濃度の上昇、並びに３）外部供給源からのＮＡＤ（Ｐ）＋或いはその類似体、誘導体、前駆体またはプロドラッグの供給を介するＮＡＤ（Ｐ）＋濃度の上昇に対して十分に検討することが可能である。
【００２３】
その一方、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．６．９９．２）（ＮＱＯ）は、ＤＴ−ジアホラーゼ、キノンレダクターゼ、メナジオンレダクターゼ、ビタミンＫレダクターゼ、またはアゾ染料レダクターゼとも称され、かかるＮＱＯはＮＱＯ１およびＮＱＯ２と称される２種のアイソフォームで存在する（非特許文献２０）。ＮＱＯはフラビンタンパク質であり、２電子還元およびキノンまたはキノン誘導体の解毒を触媒する。ＮＱＯは電子供与体としてＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの双方を用いる。ＮＱＯの活性は、極めて高度に反応性のあるキノン代謝産物の形成を阻害し、ベンゾ（ｄ）ピレンおよびキノンを解毒し、クロムの毒性を低下させる。ＮＱＯの活性は、あらゆる種類の組織内に見出されるが、組織間で変化する。一般にＮＱＯの高レベルの発現が癌細胞、肝臓、胃および腎臓の組織において確認された。ＮＱＯ遺伝子の発現が、外来異物（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓ）、酸化防止剤、酸化剤、重金属、ＵＶ光、被ばくなどにより引き起こされる。ＮＱＯは、酸化ストレスにより誘発される極めて多数の細胞防御機構の一部である。それに伴うＮＱＯ遺伝子発現を含むかかる細胞防御機構に関与する遺伝子の発現が、酸化ストレス、フリーラジカルおよび新生組織形成に対して細胞を保護するのに役立つ。ＮＱＯは極めて広範な基質特異性を有することから、そこではキノンに加え、基質としてキノン−イミン、ニトロおよびアゾ化合物の使用が可能である。
【００２４】
【特許文献１】米国特許第６，１８３，９４８号明細書
【特許文献２】韓国特許出願第２００４−７００５１０９号公報
【非特許文献１】Ｏｂｅｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第１２巻（８）、２００４年、１１９７−１２１１頁
【非特許文献２】Ｋｏｒｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｎｅｗｓ、２００４年、１１（２）、１６−２２頁
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １１１、３０３−３１２頁、２００３年
【非特許文献４】Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ７４、１１８８−１１９９頁、２００３年
【非特許文献５】Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １６５８（２００４年）８０−８８頁
【非特許文献６】Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．第３７巻、第１号、１１５−１２３頁、２００４年
【非特許文献７】Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００５年、５７（１）：１１１−１１６頁
【非特許文献８】Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００５年  １２（５）：４２３−８頁
【非特許文献９】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００４年、２４（２２）、９９５８−６７頁
【非特許文献１０】Ｎａｔｕｒｅ、４３４（３）、１１３−１１８頁、２００５年
【非特許文献１１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６，２９８−３０５頁、２００５年
【非特許文献１２】Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０５（１３）、１０１０−１０１３頁、２００５年
【非特許文献１３】Ｎａｔｕｒｅ  ４２９（１７）、７７１−７７６、２００４年
【非特許文献１４】ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３、２１０−２２０頁、２００５年
【非特許文献１５】Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１０（９）、２００５年、１６４１頁
【非特許文献１６】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４年１２月  １７；２７９（５１）：５２９３４−９頁
【非特許文献１７】Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００４年７月；１０（７）：７２７−３３頁
【非特許文献１８】Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ３、３４０−３５１頁、２００４年
【非特許文献１９】Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２７、１−６頁、２００４年
【非特許文献２０】ＲＯＭ．Ｊ．ＩＮＴＥＲＮ．ＭＥＤ．２０００−２００１年、第３８−３９巻、３３−５０頁
【非特許文献２１】「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」  ペンシルバニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）のマック・パブリッシング（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）、第１８版、１９９０年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
ＮＱＯ酵素の中ではＮＱＯ１が上皮および内皮細胞内に広く分布している。これはＮＱＯ１が空気、食道または血管を介して吸収される化合物に対する防御機構として作用しうることを意味する。レドックス機構によるｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子の安定化へのＮＱＯ１の関与を示す最近の研究では、ＮＱＯ１が腫瘍発生の抑制において重要な役割を果たすことが期待される。ＮＱＯ１が特に多数の固体腫瘍細胞内に高レベルで存在することから、特にキノン化合物により活性化されるＮＱＯ１には多大な注目が集まっている。
【００２６】
本発明は、インビボでのＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の人為的上昇により、運動能力および／または耐久力を必要とする対象においてそれらを増大させるための方法をも目的とする。更に本発明によると、インビボでのＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の人為的上昇により、エネルギーの生成能力の向上、疲労からの速やかな回復、生命力の増進、および反応性酸素種およびフリーラジカルの除去能力の改善ももたらされうる。
【００２７】
ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の人為的上昇における方法の例として、限定はされないが、ＮＡＤ（Ｐ）＋或いはその類似体、誘導体、前駆体またはプロドラッグの外部供給によるＮＡＤ（Ｐ）＋の濃度および比の人為的上昇のための方法、および基質または補酵素としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いる酵素の遺伝子またはタンパク質を活性化する化合物の外部供給によるＮＡＤ（Ｐ）＋の濃度の人為的上昇のための方法が含まれうる。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
上記の事実に基づく種々の大規模かつ徹底的な研究および実験の結果として、本発明の発明者は、オキシドレダクターゼ、好ましくはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ、および特にＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ１（ＮＱＯ１）が、酸化還元反応を通じたＮＡＤ（Ｐ）ＨからのＮＡＤ（Ｐ）＋の生成を介して細胞内のレドックス状態およびエネルギーレベルを制御する酵素として機能することを発見している。ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比がインビボまたはインビトロで上昇する場合、細胞がこの事象をエネルギー不足状態として認識することから、基質としてグルコース、脂肪およびグリコーゲンを含むエネルギー源を用いて不足したエネルギーを補償するため、細胞代謝はエネルギー生成系に変換されるように調節される。従って、ＮＱＯ１の活性化状態がエネルギー過剰または不均衡なレドックス状態の下で確立される場合、ＮＱＯ１が基質としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いてＮＡＤ（Ｐ）＋を生成する結果、細胞質内のＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比が上昇する。
【００２９】
即ち、ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の上昇した状態はエネルギーの欠乏として認識され、ここでそれにより細胞（生体）におけるエネルギー生成およびレドックスに関連する系が活性化され、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの欠乏が補償されうるように代謝活性の増大が可能になる。この事実は、ＮＱＯ１タンパク質（またはＮＱＯ１遺伝子）が疾患、例えば肥満、糖尿病、代謝症候群、変性疾患およびミトコンドリア機能障害に関連する疾患、即ち「疾患症候群」を治療可能な新しい標的タンパク質（または遺伝子）であることを意味する。
【００３０】
これらの事実に基づき、本発明者は、ＮＱＯ１を活性化するかまたはＮＱＯ１の生成を誘導する化合物が肥満、糖尿病および代謝症候群を含む変性疾患に対する治療薬の開発において有効であることを確認している。更に、かかる化合物の治療上の妥当性および治療薬の開発がＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比をインビボまたはインビトロ条件下で高レベルで維持することにより確実になりうることも確認した。これに関連し、本発明者は、エネルギー過剰または異常なレドックス状態から生じる低いＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比に起因して発症しうる疾患を予防しかつ治療することが可能な方法として、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを基質または補酵素として用いるＮＱＯ１の作用を介するＮＡＤ（Ｐ）＋濃度の上昇および結果として生じるＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の上昇により、エネルギー過剰または不均衡なレドックス状態に関連する問題に起因して発症しうるあらゆる種類の疾患を有効に治療することが可能であることを確認している。従って、本発明の発明者は、ＮＱＯ１がエネルギー過剰または異常なレドックス状態に起因して発症しうるあらゆる種類の疾患に対する治療標的であることを確認すると同時に、結果としてＮＱＯ１が、ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の上昇、それによりＮＡＤ（Ｐ）＋を基質または補酵素として必要とするタンパク質および遺伝子を活性化する結果としての代謝の調節による疾患の予防および治療にとって有効であることを実証した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明の一態様によると、オキシドレダクターゼ、好ましくはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ、特にＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ１（ＮＱＯ１）によりインビボまたはインビトロでＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を上昇させるための方法の提供により、上記および他の目的が達成されうる。
【００３２】
上記のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼに加え、基質または補酵素としてのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの使用を介してＮＡＤ（Ｐ）ＨをＮＡＤ（Ｐ）＋に変換可能な相同酵素の例として、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳまたはＮＯＳ  ＮＡＤＰＨ  ＤＴ−ジアホラーゼ）、チオレドキシン還元酵素（ＮＡＤＰＨで酸化されるチオレドキシンオキシドレダクターゼ、Ｅ．Ｃ．１．６．４．５）、グルタチオン依存性オキシドレダクターゼ（チオール−ジスルフィドオキシドレダクターゼ）、ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．６．９９．６）、ＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼ、琥珀酸塩：ユビキノンオキシドレダクターゼ、原形質膜オキシドレダクターゼ、チトクロームｃオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１０．２．２、ｂｃ（１）複合体）、オキソグルタル酸オキシドレダクターゼなどが含まれうる。
【００３３】
本発明の方法によると、ＮＡＤ（Ｐ）ＨのＮＡＤ（Ｐ）＋への変換が、インビボまたはインビトロ条件下での特定の化合物の添加を介してＮＱＯ１を活性化するかまたはＮＱＯ１の量を増加させ、結果としてＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を上昇させることにより誘導される。従って、エネルギー過剰または異常なレドックス状態によってもたらされる低いＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比に応じて生じうる、肥満を含む種々の疾患を予防しかつ治療することが可能である。更に、ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比が主にインビボでのエネルギー消費に伴って上昇し、かつかかるエネルギー消費が運動によりもたらされるという事実を考慮する際、ＮＱＯ１の活性または量の増大により、対象の活性および耐久力が増大する可能性がある。ＮＱＯ１の活性または量のかかる増大は、まさに運動に準じるもの（ｑｕａｓｉ−ｅｘｅｒｃｉｓｅ）に誘発される効果として表現される場合がある。
【００３４】
本明細書で用いられる「インビボ」という用語は生物学的対象における生理的状態を示し、「インビトロ」という用語は生物学的対象から単離された細胞の状態および細胞成分またはその一部よりなる細胞状態を包含する概念を示す。以下、「インビボおよびインビトロ」という用語は場合により単に「インビボ／インビトロ」と称されることになる。
【００３５】
本発明に記載の「インビボ」という用語が細胞レベルまでを包含する概念であることから、対象が生存可能である限り、インビボでの対象に対する特別な制限は全くない。好ましくは、対象は哺乳動物でありうる。好ましくは哺乳動物はヒトでありうる。
【００３６】
ＮＱＯ１の活性化を介するＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の上昇とともに、細胞がインビボ／インビトロでのＮＡＤ（Ｐ）＋比の上昇によりエネルギーの欠乏を認識し、次いで細胞がエネルギー生成に関与する遺伝子およびタンパク質を活性化するか、またはＮＡＤ（Ｐ）＋がドナー因子として直接機能することで、種々の代謝プロセスが調節される。
【００３７】
ＮＱＯ１によりＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を上昇させるための方法の例として、好ましくは、１）ＮＱＯ１の活性の増大による上記の限界率でのＮＡＤ（Ｐ）ＨからのＮＡＤ（Ｐ）＋の生成、２）ＮＱＯ１タンパク質の量またはＮＱＯ１遺伝子の発現における増大によるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ基質の消費の促進、および３）ＮＡＤ（Ｐ）＋或いはその誘導体またはプロドラッグの直接添加によるＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の上昇が含まれうる。
【００３８】
ＮＱＯ１に対する活性化物質の不在下でのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量に基づいて、ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比における変化が、好ましくはＮＱＯ１活性化物質により有効となるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量の２０％を超える減少の範囲内にある場合があり、その結果、ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の上昇がもたらされる。より好ましくは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの低下は３０％を超える場合がある。しかし、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの低下が過剰である場合、これはインビボ／インビトロでの代謝プロセスにおける課題を引き起こしうる。従って、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの低下が好ましくは８０％未満の範囲内でありうる。
【００３９】
ＮＱＯ１の活性および／またはＮＱＯ１タンパク質の量またはＮＱＯ１遺伝子の発現を増大させるため、例えばＮＱＯ１の活性または量を増大させる特定の化合物の使用が検討されうる。
【００４０】
かかる化合物はヒドリド受容体（Ｈ−受容体）として役立つ。本発明において使用可能な化合物の具体例として、限定はされないが、キノン化合物、キノン−イミン化合物、ニトロ化合物、およびアゾ化合物が含まれうる。更に、これらの化合物は単独またはそれらの任意の組み合わせで用いられうる。
【００４１】
キノン化合物の代表例として、ナフトキノン化合物およびその誘導体、例えば４−アミノアルキル−１，２−ナフトキノン、４−チオアルキル−１，２−ナフトキノン、４−アルコキシ−１，２−ナフトキノン、フラノ−ｏ−ナフトキノン、ピラノ−ｏ−ナフトキノンまたはそれらの誘導体が含まれうる。好ましい４−置換−１，２−ナフトキノンが、下記の式Ｉで表される。本明細書中で他に特に規定されない限り、治療的に有効なものとして表される化合物は、薬学的に許容できる塩、プロドラッグ、溶媒和物およびそれらの異性体を包含する。
【化１】
2009526839.tif 000003
（式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に水素、ハロゲン、アルコキシ、ヒドロキシまたは１〜６個の炭素原子を有する低級アルキルであり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８はそれぞれ独立に水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、アルケン若しくはアルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール若しくはヘテロアリールであるか、或いはＲ３からＲ８のうちの２つの置換基が環状構造を形成する場合があり、
Ｘは酸素、窒素または硫黄であり、かつ、
ｍおよびｎはそれぞれ独立に０または１である、但し、ｍおよびｎのうちのいずれかが０である場合に、ｍまたはｎに近接する炭素原子が直接結合を介して環状構造を形成しうる）
【００４２】
これらの化合物の中で、式Ｉの化合物が特に好ましい（式中、Ｘは酸素であり、ｍは１であり、かつｎは０若しくは１である、但し、ｎが０である場合に、ｎに近接する炭素原子が直接結合を介して環状構造を形成する）
【００４３】
好ましい化合物の例では、式Ｉの化合物（式中、ｎは０である）はフラノ−Ｏ−ナフトキノンとして表されうる一方、ｎ＝１を伴う式Ｉの化合物はピラノ−Ｏ−ナフトキノンとして表されうる。フラノ−Ｏ−ナフトキノンまたはピラノ−Ｏ−ナフトキノンの典型例として、式ＩＩまたはＩＩＩの化合物が含まれうる。
【化２】
2009526839.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は式Ｉにおける定義と同じである）
【化３】
2009526839.tif 000005
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は式Ｉにおける定義と同じである）
【００４４】
上記の物質は、ハーブ系医用植物、例えばタンジン（Ｄａｎｓｈｅｎ）（サルビア・ミルティオリザ（Ｓａｌｖｉａ  ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ））、ロシアンセージの花（Ｐｅｒｏｖｓｋｉａ  ａｂｒｏｔａｎｏｉｄｅｓ）などから人工的に合成されるかまたは抽出される場合がある。本発明に関係する当業者であれば、有機化学合成分野における一般の技術および慣行に基づき、上記の化学構造を有する化合物の合成を特別の困難を伴うことなく容易に行うであろう。更に、目的の活性成分をハーブ系医用植物、例えばタンジン（Ｄａｎｓｈｅｎ）から抽出する方法が当該技術分野で周知であることから、本開示ではその詳細な説明が省略されることになる。
【００４５】
本発明におけるＮＱＯ１とＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の間の関係を明らかにするため、以下の実験的試験が行われた。ＮＱＯ１は、天然および合成キノンに対して高い親和性を有する細胞質内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性オキシドレダクターゼ中に豊富に存在することから、ＮＱＯ１は治療標的におけるオキシドレダクターゼとして選択される。
【００４６】
（１）ＮＱＯ１の活性を測定するためのＤＣＰＩＰ（２，６−ジクロロフェノール−インドフェノール）方法を用い、ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比における変化を測定し、組織内でのＮＱＯ１の分布および活性が確認された。
【００４７】
（２）ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比がＮＱＯ１によってのみ上昇されうることを確認するため、ＮＱＯ１活性化薬がＮＱＯ１−／−細胞および正常細胞に添加され、ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比における変化が調べられ、ＮＱＯ１が細胞内のＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の調節において極めて重要な役割を果たすか否かが確認された。
【００４８】
（３）細胞内のＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比がＮＱＯ１により上昇することを実証するための別の実験として、ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比における変化がＮＱＯ１−／−細胞上のＮＱＯ１活性化薬のＮＱＯ１遺伝子の取り込みによる処理により測定された。
【００４９】
（４）ＮＱＯ１の存在／不在および活性化による作用を受けるタンパク質の確認においては、タンパク質の発現および活性に対するＮＱＯ１活性の効果が、ＡＭＰ−活性化キナーゼ（ＡＭＰＫ）のリン酸化というＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の変化による作用を受けることで知られる活性化についての確認を通じて確認された。ＮＱＯ１−／−細胞およびＮＱＯ１−／−細胞の上のＮＱＯ１活性化薬の各々のＮＱＯ１遺伝子の挿入による処理を介してＡＭＰＫタンパク質のリン酸化を確認することにより、ＮＱＯ１の活性化によるエネルギーレベルおよびレドックス状態における差異の影響を受けやすいタンパク質の発現および活性化に関するＮＱＯ１の効果が試験された。
【００５０】
（５）ＮＱＯ１の存在／不在および活性化による細胞内カルシウム流入を測定するため、ＮＱＯ１＋／＋細胞内およびＮＱＯ１−／−細胞内のＮＱＯ１活性化薬によりカルシウム流入の存在および程度を確認するための試みを行った。他方、ＮＱＯ１活性化薬およびＮＱＯ１阻害薬をＮＱＯ１＋／＋細胞上で処理し、カルシウム流入がＮＱＯ１活性化の抑制を介して作用を受けるか否かを確認した。
【００５１】
（６）ＮＱＯ１活性化薬がミトコンドリア新生および勃起不全を担う内皮での一酸化窒素（ＮＯ）生成に関与するか否かを試験するため、ｅＮＯＳ（内皮の一酸化窒素シンターゼ）タンパク質のリン酸化およびリン酸化度が確認された。
【００５２】
（７）ＮＱＯ１によるインビボでのレドックス状態における変化を確認するため、ＮＱＯ１活性化薬がマウスの静脈内に注射され、肝組織が摘出され、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＨの量における変化が測定された。
【００５３】
（８）ＮＡＤ＋の外部からの添加を介する治療効果が、ＮＡＤ＋またはその類似体、前駆体またはプロドラッグの外部からの添加後における、インビボでのＮＡＤ＋濃度の上昇に起因する体重変化、血液学的変化、組織学的変化、遺伝子発現およびタンパク質活性変化、脂肪分布の変化、ホルモンの変化、呼吸商、運動能力および耐久力についての確認を通じて試験された。
【００５４】
従って、本発明における様々なインビボおよびインビトロ実験を通じて実証されるように、ＮＱＯ１がインビボ／インビトロでのＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の上昇に対する直接的効果を有することから、ＮＱＯ１（またはＮＱＯ１遺伝子）が肥満、糖尿病、代謝症候群、変性疾患およびミトコンドリア機能障害に関連する疾患の予防および治療並びに活性、運動性および耐久力の改善にとって有効な優れた標的タンパク質（または遺伝子）であることが確認された。
【００５５】
より詳細には、上記の実験を通じ、ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の上昇が細胞質内およびミトコンドリアのカルシウムレベルにおける更なる上昇を促進し、ＡＭＰＫおよびＳｉｒｔタンパク質を活性化し、かつミトコンドリアの酸化的リン酸化および脂肪酸酸化を促進することが確認された。
【００５６】
ＮＱＯ１活性化物質および高レベルのＮＡＤ＋が、少なくとも２つのステップ、例えばＡＭＰのＡＭＰＫへの直接結合およびＡＭＰＫのＣａＭＫＫおよびＬＫＢ１によるリン酸化を含む反応機構を通じてＡＭＰＫを活性化する。ＣａＭＫＫが速やかな初期の活性化およびＡＭＰＫα  Ｔ１７２のリン酸化に関与し、かつＬＫＢ１が持続的なＡＭＰＫの活性化において特定の役割を果たすことが推定される。他方、ＮＱＯ１活性化物質がＤＩＯ（食餌誘導性肥満）マウスの視床下部におけるＡＭＰＫ活性を阻害することから、食欲低下、食餌摂取量の低下および体重減少がもたらされることが確認された。これらの実験結果は、ＮＱＯ１活性化物質による処理によりエネルギー消費が増大して体重減少が促進されうることを示唆する。
【００５７】
本発明の別の態様によると、ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を制御するための化合物を同定するための方法であって、候補化合物群をＮＱＯ１と接触させ、ＮＱＯ１を介してＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を上昇させる化合物を同定するステップと、前記候補化合物群によりＮＱＯ１の量または活性を監視するステップと、を含む、方法が提供される。
【００５８】
本明細書で用いられる「接触させる」という用語は、候補化合物群を含有する溶液とＮＱＯ１＋／＋細胞が注入される液体培地とを混合させることを指す。候補化合物群を含有する溶液は、化合物の細胞内への取り込みを促進するジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む他の成分を更に含有しうる。候補化合物を含有する溶液は、ピペットまたは注射器などの送達デバイスを用いて細胞が注入される培地に添加されうる。
【００５９】
本明細書で用いられる「監視する」という用語は、化合物の添加によって発揮される効果の観察を指す。例えば、化合物添加の効果は、ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比における変化、ＡＭＰＫの活性化、ＡＣＣ活性の阻害、ｅＮＯＳリン酸化の増大、エネルギー代謝に関与する遺伝子の発現、ミトコンドリア新生に関与する遺伝子の発現などとして観察されうる。
【００６０】
目的化合物を同定するための上記の方法の具体例として、ＮＱＯ１をスクリーニング対象の化合物およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈと所定の時間反応させるステップと、得られるＮＡＤ（Ｐ）＋または残存するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを定量するステップと、を含む方法が挙げられうる。
【００６１】
生成されるＮＡＤ（Ｐ）＋の量を定量するための方法の例として、ヒドリド（Ｈ−）受容体として用いられるＤＣＰＩＰの還元を介する吸収波長における変化に起因する着色の誘導により吸光度における変化を測定する方法が用いられうる。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの残存量を定量するための方法の例として、テトラゾリウム塩の着色に起因する吸光度における変化の測定を介してＮＡＤ（Ｐ）Ｈの残存量を定量する方法が挙げられうる。
【００６２】
ＮＱＯ１活性化化合物の具体例として、ナフトキノン化合物、フマル酸のエステル、オルチプラズ（ｏｌｔｉｐｒａｚ）（４−メチル−５（２−ピラジニル）−１，２−ジチオール−３−チオン）、クルクミン、アネトールジチオールチオン（ａｎｅｔｈｏｌｅ  ｄｉｔｈｉｏｌｅｔｈｉｏｎｅ）、スルフォラファン、６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート、コーヒー酸フェネチルエステル、４’−ブロモフラボン、アヴィシンズ（Ａｖｉｃｉｎｓ）、フィセチン、レスベラトロールおよびこれらの誘導体が含まれうる。フマル酸エステルの代表例として、ジメチルフマレート、モノエチルフマレート、モノメチルフマレートおよびこれらの塩が含まれうる。好ましい例では、化合物は４−アルコキシ−１，２−ナフトキノン化合物およびその誘導体並びにジメチルフマレートおよびその類似体でありうる。
【００６３】
本発明の更なる態様によると、ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の低下を伴う疾患の治療または予防における薬剤の製造においてのＮＱＯ１の量または活性を増大させることが可能な化合物の使用が提供される。
【００６４】
本発明の更に別の態様によると、ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の低下を伴う疾患を治療または予防するための方法であって、ＮＱＯ１の量または活性を増大させることが可能な化合物の治療有効量を、それらを必要とする対象に投与するステップを含む、方法が提供される。
【００６５】
本明細書で用いられる「ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の低下を伴う疾患」という語句は、ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の低下により直接的または間接的に引き起こされる様々なタイプの疾患を示し、例えば肥満、肥満合併症、糖尿病、糖尿病合併症、代謝症候群、変性疾患、およびミトコンドリア機能障害を含みうる。
【００６６】
本明細書で用いられる「治療」という用語は、目的の薬剤が、発症の徴候を呈する対象において用いられる場合での疾患の進行の停止または遅延を指す。「予防」という用語は、目的の薬剤が、発症の徴候を全く呈さないが発症に対して高いリスクを有する対象において用いられる場合での発症の徴候の停止または遅延を指す。
【００６７】
上記方法の実験的実証においては、肥満、糖尿病などに罹患した動物へのＮＱＯ１活性化薬の投与後での、ＮＱＯ１の活性化に起因する体重変化、血液学的変化、組織学的変化、遺伝子発現およびタンパク質活性変化、脂肪分布の変化、ホルモンの変化、呼吸商（ＲＱ）、対象の運動能力および耐久力についての確認を介し、ＮＱＯ１の活性化により治療可能な疾患の治療分野を確立する基礎を築くための試みがなされている。
【００６８】
具体的には、ＮＱＯ１の作用に基づくレドックスおよびエネルギー状態における変化を通じてＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を上昇させることにより、代謝症候群に関連する臨床的疾患の予防および／または治療を行うことが可能である。これらの臨床疾患の例として、限定はされないが、特徴的にインスリン抵抗性とともに出現する、一般的肥満、腹部肥満、高血圧、動脈硬化、高インスリン血症、高血糖、ＩＩ型糖尿病および脂質異常症が含まれうる。Ｂ表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  Ｂ）の粥腫形成性リポタンパク質（ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）の特性があるものとしても知られる脂質異常症は、非エステル化脂肪酸の有意な上昇、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）トリグリセリドに富む粒子の増加、ＡｐｏＢの高値、小さく密度の高い低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子の存在、表現型Ｂの存在下でのＡｐｏＢの高値、およびＡｐｏＡＩ粒子の低値に関連する高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の低値によって特徴づけられる。
【００６９】
本発明の方法は、レドックスおよびエネルギー状態における変化を通じてＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を上昇させることにより、合併型または混合型脂質異常症、または代謝症候群の他の徴候を有するか若しくは有しないハイパートリグリセリミア（ｈｙｐｅｒｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｍｉａ）を患う患者および様々な重症度の食後脂質異常症を患う患者を治療するのに有用であることが期待される。
【００７０】
本発明の方法は、レドックスおよびエネルギー状態における変化を介してＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を上昇させることにより、抗炎症特性および抗脂質代謝異常特性に起因する動脈硬化を伴う心血管疾患の罹患率および死亡率を低下させることが期待される。心血管疾患の例として、心筋梗塞、心不全、脳血管疾患、および下肢の末梢動脈不全を引き起こす様々な内部器官の大血管障害（ｍａｃｒｏ−ａｎｇｉｏｐａｔｈｉｅｓ）が挙げられる。他方、本発明の方法は、そのインスリン感作効果故に、代謝症候群の中のＩＩ型糖尿病の進行および妊娠中の糖尿病の発症を予防するかまたは遅延させることも期待される。従って、本発明の方法は、糖尿病における臨床的高血糖を伴う慢性合併症、例えば腎疾患、網膜障害および下肢の末梢血管疾患を引き起こす小血管障害（ｍｉｃｒｏ−ａｎｇｉｏｐａｔｈｉｅｓ）の進行を遅延させることも期待される。更に、本発明の方法は、インスリン抵抗性との関連性と無関係に、心血管系の障害以外の様々な疾患および症状、例えば多嚢胞卵巣症候群（ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｏｖａｒｉａｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、肥満、癌、炎症性疾患、並びに軽度認知機能障害（Ｍｉｌｄ  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）（ＭＣＩ）、アルツハイマー病、パーキンソン病および多発性硬化症などの神経変性疾患の治療において有用でありうる。
【００７１】
本発明の方法は、ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比をレドックスおよびエネルギー状態における変化を通じて上昇させることにより、脂肪肝（肝脂肪症）の発症に対する阻害効果を示し、更に脂肪酸のβ酸化を活性化することで、トリグリセロールの濃度の低下における役割を果たし、それ故にアルコール性および非アルコール性肝臓の脂肪代謝異常（ｄｙｓｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）から発症する脂肪肝、肝炎および肝硬変の予防または治療において有用であることが期待される。
【００７２】
本発明は、ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比をレドックスおよびエネルギー状態における変化を通じて上昇させることにより、様々な組織内の脂質組成物を変化させる。更に、本発明が脂肪含量並びに脂肪分布を変化させうることが確認された。
【００７３】
更に、本発明は血漿コレステロールおよびトリアシルグリセロールのレベルも低下させる。従って、血漿トリグリセリドおよびコレステロールのレベルが本発明により低下することが分かる。
【００７４】
本発明の方法は、レドックスおよびエネルギー状態における変化を通じてＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を上昇させることにより、ｅＮＯＳ（内皮の一酸化窒素シンターゼ）の活性化を介する内皮での一酸化窒素（ＮＯ）の生成にとって有効であることから、虚血性心疾患、ミトコンドリアミオパチー、変性脳疾患、糖尿病、心筋ミオパチー、老化関連疾患、血管疾患、高血圧および勃起不全の予防または治療にとって有用であることが期待される。高血圧を誘発する疾患として、心不全、心筋梗塞、脳血管系の破裂、血栓症および腎障害が挙げられうる。
【００７５】
本発明の方法は、レドックスおよびエネルギー状態における変化を通じてＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を上昇させることにより、周囲組織内での脂肪酸化およびエネルギー消費の促進を誘導することから、一般的な肥満の治療または予防や、例えば、脂肪が局所的に沈着した特定の領域に由来する脂肪の除去、例えば眼瞼（ｅｙｅ−ｌｉｄｓ）、腕および尻の隆起部分に由来する皮下脂肪、腹部脂肪および特定の領域の脂肪、例えばセリュライトの除去などが望ましい場合、皮下脂肪および腹部脂肪などの局在化された沈着脂肪の除去においても有効であることが期待される。
【００７６】
更に、本発明の方法がインスリン過剰症を患う動物の血中グルコースレベル、それに関する血漿インスリン濃度を低下させることが確認された。更に、本発明の方法が低下したインスリン感受性を有する動物におけるインスリンの効果を高めることが確認された。
【００７７】
本発明の方法は、レドックスおよびエネルギー状態における変化を通じてＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を上昇させることにより、ミトコンドリア新生を促進し、それによりミトコンドリアの活性能を増大させ、それと同時に筋肉組織の運動組織への変換を誘発し、それにより運動能力の改善、耐久力の向上、エネルギー生産性の改善、疲労からの回復、生命力の増進、反応性酸素種（ＲＯＳ）およびフリーラジカルに対する除去能の増強を通じての酸化ストレスの低下がもたらされ、それ故に本方法は関連疾患の治療にとって有効であることが期待される。反応性酸素種（ＲＯＳ）により誘発されうる疾患としては、動脈硬化、糖尿病、虚血性心疾患、心肥大、神経疾患、腎疾患、肝硬変、血栓症、炎症状態および炎症性疾患、関節炎、未熟児網膜症、片眼性ブドウ膜炎（ｏｃｕｌａｒ  ｕｖｅｉｔｉｓ）、老人性白内障、放射線療法の副作用による障害、喫煙による気管支損傷、制癌薬の副作用による障害、脳浮腫、敗血症、肺浮腫、足の浮腫、脳梗塞、溶血性貧血、早老症、てんかん、アルツハイマー病、ダウン症候群、クローン病および膠原病が挙げられうる。
【００７８】
本発明は、レドックスおよびエネルギー状態における変化を通じてＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を上昇させることにより、肥満および肥満合併症、例えば高血圧、心筋梗塞、静脈瘤、肺塞栓、冠動脈疾患、脳出血、老人性痴呆、パーキンソン病、ＩＩ型糖尿病、高脂血症、脳卒中、様々な癌（子宮癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌など）、心臓疾患、胆嚢疾患、睡眠時無呼吸症候群、関節炎、不妊症、静脈性潰瘍、突然死、脂肪肝、肥大型心筋症（ＨＣＭ）、血栓塞栓症、食道炎、腹壁ヘルニア（Ｖｅｎｔｒａｌ  Ｈｅｒｎｉａ）、尿失禁、心血管疾患、内分泌疾患などを含む疾患を治療するための治療標的として有効であることが期待される。
【００７９】
本発明は、レドックスおよびエネルギー状態における変化を通じてＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を上昇させることにより、糖尿病並びに例えば低血糖症、ケトアシドーシス、高浸透圧性昏睡、大血管合併症、糖尿病性網膜症、糖尿病性ニューロパチー、糖尿病性ネフロパチーなどを含む糖尿病合併症の予防または治療において有効であることが期待される。
【００８０】
本発明は、レドックスおよびエネルギー状態における変化を通じてＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を上昇させることにより、酸素消費の低下に起因するミトコンドリア機能障害、細胞のオルガネラにおける少ないエネルギー生成、および老化関連変性疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病などの神経変性疾患を治療するための治療標的として有効であることが期待される。
【００８１】
具体的には、本発明は、レドックスおよびエネルギー状態における変化を通じてＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を上昇させることにより、多発性硬化症、脳脊髄炎、脳神経根炎、末梢性ニューロパチー、ライ症候群、フリードリヒ運動失調、アルパース症候群、ＭＥＬＡＳ、片頭痛、精神疾患、うつ病、発作および痴呆、麻酔の発作、視神経萎縮、視神経ニューロパチー、網膜色素変性、白内障、高アルドステロン症、副甲状腺機能低下症、ミオパチー、筋萎縮、ミオグロビン尿症、筋緊張低下、筋肉痛、運動耐性の低下、腎尿細管炎、腎不全、肝不全、肝機能不全、肝腫脹、赤血球貧血（鉄欠乏性貧血）、好中球減少症、血小板減少症、下痢、絨毛萎縮、複数回の嘔吐、嚥下障害、便秘、感音難聴（ＳＮＨＬ）、てんかん、知的障害、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病を含むミトコンドリア機能障害、例えばミトコンドリアの膜機能障害に起因する腫脹、例えば反応性酸素種またはフリーラジカルの作用による酸化ストレスに起因する機能障害、遺伝因子に起因する機能障害、並びにエネルギー生成のためのミトコンドリアの酸化的リン酸化における欠陥に起因する疾患から発症する疾患を治療するための治療標的として有効であることが期待される。
【００８２】
本発明は、レドックスおよびエネルギー状態における変化を通じてＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を上昇させることにより、特徴的に、特にインスリン過剰症、インスリン抵抗性、肥満、グルコース不耐性、ＩＩ型糖尿病、脂質異常症、心血管疾患または高血圧とともに出現する多発性（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）代謝症候群（代謝症候群）の治療および／または予防における治療標的として有効であることが期待される。
【００８３】
必要に応じ、望ましい治療または効果がＮＡＤ＋の外部供給源から対象への直接添加によりなされうる。これに関連し、本発明では、対象における体重変化、血液学的変化、組織学的変化、遺伝子発現およびタンパク質活性変化、脂肪分布の変化、ホルモンの変化、呼吸商（ＲＱ）、運動能力および耐久力についての確認により、ＮＡＤ＋濃度の上昇を通じての外部からのＮＡＤ＋の添加の治療効果が確認されている。
【００８４】
更に、本発明は、（ａ）ＮＱＯ１の量または活性を増大させることが可能な治療有効量の化合物および（ｂ）薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤、或いはそれらの任意の組み合わせを含有する医薬組成物、即ちＮＱＯ１を促進する（ＮＱＯ１−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）組成物を提供する。
【００８５】
本明細書で用いられる「医薬組成物」という用語は、上記化合物と担体または希釈剤などの他の化学成分との混合物を意味する。医薬組成物は化合物の生物への投与を容易にする。化合物を投与する様々な技術は当該技術分野で既知であり、限定はされないが、経口投与、注射投与、エアロゾル投与、非経口投与および局所投与を含む。医薬組成物は、目的化合物を塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの酸と反応させることによっても得られうる。
【００８６】
「治療有効量」という用語は、化合物が投与される場合での、治療を必要とする疾患の１つ若しくは複数の徴候をある程度軽減または低減するか或いは予防を必要とする疾患の臨床マーカーまたは徴候の開始を遅延させるのに有効な活性成分の量を意味する。従って、治療有効量は、（ｉ）疾患の進行の速度を逆転させ、（ｉｉ）疾患の更なる進行をある程度阻害し、かつ／或いは、（ｉｉｉ）疾患に関連する１つ若しくは複数の徴候をある程度軽減する（または好ましくは取り除く）効果を示す活性成分の量を示す。治療有効量は、治療を必要とする疾患における既知のインビボおよびインビトロモデル系において関連する化合物を用いて実験することにより経験的に決定されうる。
【００８７】
「担体」という用語は、細胞または組織への化合物の取り込みを促進する化合物を意味する。例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、生物の細胞または組織への多数の有機化合物の取り込みを促進することから一般に用いられる担体である。
【００８８】
「希釈剤」という用語は、目的化合物を溶解させるとともに化合物の生物活性形態を安定化することになる水中で希釈される化合物を規定する。当該技術分野では、緩衝溶液中に溶解される塩が希釈剤として用いられる。一般に用いられる１つの緩衝溶液が、ヒト体液のイオン強度条件を再現することからリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）である。緩衝塩が低濃度で溶液のｐＨを制御可能であることから、希釈緩衝液が化合物の生物学的活性を修飾することはまれである。
【００８９】
本明細書中に記載の化合物は、本質的にヒト患者に、または併用療法などでの他の活性成分または適切な担体または賦形剤と混合される医薬組成物の形態で投与可能である。化合物の調合および投与における技術については、（非特許文献２１）にて見出されうる。
【００９０】
本発明の医薬組成物は、例えば、従来式の混合、溶解、粒状化、ドラジェ（Ｄｒａｇｅｅ）作製、粉末化、乳化、カプセル化、包括固定化または凍結乾燥化プロセスを利用し、本質的に既知の方法で製造可能である。
【００９１】
従って、本発明に従って用いられる医薬組成物が、活性化合物の薬学的に使用可能な製剤への加工を容易にする賦形剤および助剤を含有する１種若しくは複数種の薬学的に許容できる担体を用いて従来の方法で調合されうる。適切な製剤については選択される投与の経路に依存する。周知の技術、担体、および賦形剤のいずれかを、適切であり、例えば上記の（非特許文献２１）にて当該技術分野で理解されているものとして利用可能である。本発明では、式Ｉの化合物は、意図される目的に応じて注射可能でかつ非経口の製剤に調合可能である。
【００９２】
注射においては、本発明の作用物質は、水溶液中、好ましくはハンクス溶液、リンガー溶液、または生理食塩緩衝液などの生理学的に適合性のある緩衝液中で調合されうる。経粘膜投与においては、浸透されるべき障壁に対して適切な浸透剤が製剤において用いられる。かかる浸透剤は、一般に当該技術分野で既知である。
【００９３】
経口投与においては、化合物は活性化合物を当該技術分野で周知の薬学的に許容できる担体と結合させることによって容易に調合されうる。かかる担体は、本発明の化合物における、患者による経口摂取用のタブレット、ピル、粉末、顆粒、ドラジェ、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとしての調合を可能にする。カプセル、タブレット、ピル、粉末および顆粒は好ましく、かつカプセルおよびタブレットは特に有用である。タブレットおよびピルは、好ましくは腸溶コーティング中で調製される。経口使用における医薬製剤については、必要に応じて適切な助剤を添加してタブレットまたはドラジェコアを得た後、１種若しくは複数種の賦形剤を本発明の１種若しくは複数種の化合物と混合し、場合により得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を加工することにより得られうる。適切な賦形剤が、乳糖、スクロース、マンニトールおよびソルビトールを含む糖類、並びに例えばトウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、ゴムトラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース物質などの充填剤でありうる。必要に応じ、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩を例とする崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、並びに結合剤などの担体（ｃａｒｒｉｅｓ）が添加されうる。
【００９４】
経口で使用可能な医薬製剤には、ゼラチン製の押し込み型カプセルおよびゼラチン製の密封型ソフトカプセル並びにグリセリンまたはソルビトールなどの可塑剤が含まれうる。押し込み型カプセルは、乳糖などの充填剤、澱粉などの結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤と混合される活性成分を含有しうる。ソフトカプセルでは、活性化合物は、脂肪酸、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な溶媒中に溶解または分散されうる。更に、安定化剤も添加されうる。経口投与用のすべての製剤が、かかる投与に適する剤形である必要がある。
【００９５】
化合物は、注射、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に調合されうる。注射用製剤は、防腐剤が添加された単位剤形、例えばアンプルまたはマルチドーズ容器でありうる。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態をとるとともに、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔｓ）を含有しうる。
【００９６】
或いは、活性成分は、使用前では適切な賦形剤、例えば無菌のパイロジェンを含まない水との併用における粉末形態でありうる。
【００９７】
化合物は、例えばココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤の基剤を含有する坐剤または保持浣腸（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｅｎｅｍａｓ）などの直腸組成物中にも調合可能である。
【００９８】
本発明での使用に適する医薬組成物には、活性成分がその意図される目的を達成するのに有効な量で含有される場合の組成物が含まれる。より詳細には、治療有効量とは疾患の徴候を予防、緩和または改善するか或いは治療対象を延命するのに有効な化合物の量を意味する。治療有効量についての判定は、特に本明細書で提供される詳細な開示の観点から当業者の能力の範囲内で十分に行われる。
【００９９】
本発明の医薬組成物が単位剤形内に調合される場合、活性成分としての化合物は好ましくは約０．１〜５，０００ｍｇの単位用量中に含有される。投与される化合物の量は、治療される患者の体重および年齢、疾患の性質および重症度に応じて担当医により決定されることになる。しかし、成人患者においては、患者に投与される活性成分の用量が、投与の頻度および強度に応じ、典型的には約１〜１０００ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ／日の範囲内にある。成人患者への筋肉内または静脈内投与においては、単回投与として全部で１日当たり約１〜５００ｍｇが十分となるが、一部の患者においては１日当たりより高用量の使用が好ましい場合がある。
【０１００】
本発明の上記および他の目的、特徴並びに他の利点が添付の図面とともに記載される以下の詳細な説明からより明白に理解されるであろう。
【実施例】
【０１０１】
ここで本発明は、以下の実施例についてより詳細に記載されることになる。これらの実施例はあくまで本発明を図示する目的で提供され、本発明の範囲および趣旨を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１０２】
材料および方法
以下に、本発明で用いられる材料および方法が提供されることになる。
【０１０３】
（１）材料
実験で用いられる培地、細胞培養試薬および材料をそれぞれ、ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、およびフィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から購入した。ＮＱＯ１抗体をサンタクルーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）から購入し、ＡＣＣ、ｐＳ７９ＡＣＣ、ＡＭＰＫ、ｐＴ１７２ＡＭＰＫおよびＨＡ抗体をニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）から購入し、Ｆｌｕｏ−４をモレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）から購入し、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８キット）をドジンド・ラボラトリーズ（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から購入した。１４Ｃ−パルミチン酸をパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）から購入した。アクチン抗体およびＮＡＤ＋、ＮＡＤＨおよびｈｒＮＱＯ１を含む他の試薬をシグマ（Ｓｉｇｍａ）から購入した。
【０１０４】
（２）プラスミド
この実験で用いられるプラスミドはｐＳＧ５α−ＨＡ（ヘマグルチニン）−ＮＱＯ１（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ）およびｐＳＧ５α−ＨＡ−ＮＱＯ１−Ｃ６０９Ｔ（１）であった。
【０１０５】
（３）細胞培養
ＨＥＫ２９３、ＭＣＦ−７、ＭＮ９ＤおよびＭＮ９Ｘ細胞を培養し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ内、５％ＣＯ２下、３７℃で成長させた。ヒトヘパトーマ細胞系ＨｅｐＧ２を１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地内で成長させた。これらの培地は１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有した。
【０１０６】
（４）形質移入
プラスミドの細胞への形質移入をＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  Ｐｌｕｓ試薬（カルフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）のインヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて行った。まずプラスミドを混合し、Ｐｌｕｓ試薬と１５分間反応させ、次いで反応混合物を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥの添加とともに更に１５分間反応させた。得られた反応生成物を細胞上で処理し、次いで３時間維持した。その後、培地を血清を含む培地と交換し、細胞を２４時間更に成長させた。
【０１０７】
（５）イムノブロッティング
細胞をＳＤＳ試料緩衝液（６２．５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、６％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、３０％グリセリン、１２５ｍＭ  ＤＴＴ、および０．０３％（ｗ／ｖ）のブロモフェノールブルー（ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ））中に溶解した。細胞溶解液全体を１００℃の温度で５分間沸騰させ、ナトリウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、タンパク質をニトロセルロース膜上に移した。膜をＴＢＳ（５％（ｗ／ｖ）ミルクおよび０．１％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０）中で１時間反応させ、次いで一次抗体と２時間反応させた。次いで、膜をＨＲＰとの複合二次抗体（Ｐｈｏｔｏｔｏｐｅ−ＨＲＰウエスタンブロット検出キット、マサチューセッツ州ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）のニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））を用いて展開した。
【０１０８】
（６）カルシウム流入
細胞を培地内のカバースリップ上で２４時間成長させ、ＲＰＭＩ  １６４０血清を含まない培地内で１時間維持し、カルシウム指示薬Ｆｌｕｏ−４（５μＭ）で３０分間前処理した。前処理後、カバースリップをスライドグラス上に載せた。細胞内のカルシウム濃度における変化を蛍光顕微鏡（カール・ツァイス（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ））を用いて３０秒間観察し、細胞を候補化合物（例えばピラノ−１，２−ナフトキノン）で処理すると同時に、蛍光顕微鏡（カール・ツァイス（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ））を用いてカルシウム変化を２秒間連続撮影した。ジクマロールをＦｌｕｏ−４（５μＭ）で３０分間前処理し、カバースリップをスライドグラス上に載せた。細胞内のカルシウム濃度における変化を蛍光顕微鏡（カール・ツァイス（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ））を用いて３０秒間観察し、細胞をピラノ−１，２−ナフトキノン（１０μＭ）で処理した後、蛍光顕微鏡を用いてカルシウム変化を２秒間連続撮影した。ＬＳＭ  Ｉｍａｇｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒプログラム（カール・ツァイス（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ））を用い、２秒ごとに１０分間撮影した３００枚の画像を時系列にソートして整理し、グラフ上にプロットした。
【０１０９】
（７）ＮＱＯ１を介したＮＡＤ＋の生成の増大についての検出および確認（ＮＡＤＨの低下についての確認）
ＨＰＬＣ−ＭＳ（高性能液体クロマトグラフィー質量分析）を用いてマウス組織（肝臓および筋肉）内のＮＡＤ＋およびＮＡＤＨを定量することが可能でありうる一方、細胞培養を介するＮＡＤＨの定量がＮＡＤＨのレベルが極めて低い（検出範囲内に該当しない）ことから容易ではない。従って、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８）を用いて相対比較を行った。
【０１１０】
１）ＬＣ−ＭＳ：試料を、Ｇ１３２２Ａ脱気装置、Ｇ１３１２Ａバイナリポンプ、Ｇ１３１５Ａフォトダイオードアレイ検出器、５９９８７Ａエレクトロスプレーインタフェースおよび５９８９Ｂ質量分析器を具備するＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＬＣ／ＭＳＤシステムを用いて分析した。ＥＳ−ＭＳ分析を、六重極イオンガイドが取り付けられたＡｇｉｌｅｎｔ  Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＡＰＩ）インタフェースを具備するＡｇｉｌｅｎｔ  ５９８９エレクトロスプレー（ＥＳ）質量分析器（ＭＳ）を用いて行った。クロマトグラムをケムステーション（Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ）ソフトウェアを活用して自動的に取り込み、濃度を標準検量曲線を用いて判定した。
【０１１１】
１−１）細胞および肝組織からのアデニンおよび酸化されたピリジンヌクレオチド（ＡＯＰＮ）の抽出：細胞および肝組織におけるＡＯＰＮ濃度を分析するため、酸抽出を用いた。６％  ＨＣｌＯ４  ４００μｌを１００ｍｍのディッシュ内で培養した細胞に添加する一方、６％  ＨＣｌＯ４の２倍の容量を肝組織に添加し、次いでそれを直ちに均質化した。各混合物を１４，０００ｇおよび４℃で１０分間遠心し、得られた上清を、７５％の量で４ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐＨ１１）の添加により中和した。試料を分取し、−８０℃の温度で保存した。
【０１１２】
１−２）肝組織由来の還元されたピリジンヌクレオチド（ＲＰＮ）の抽出：組織内でのＲＰＮ濃度の分析をアルカリ抽出を用いて行った。等容量の氷冷した０．５Ｍ  ＫＯＨを肝組織に添加し、次いでそれを直ちに均質化した。その後、氷冷した蒸留水の２倍の容量を添加し、肝組織と２分間混合し、混合物をアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）限界濾過膜（ミリポア（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ））を用いて１４，０００ｇおよび４℃で４０分間遠心した。このようにして得られた濾過物を、１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）の１０％の量で添加することにより中和した。試料を分取し、−７０℃の温度で保存した。濃度の判定を７２時間以内に行った。
【０１１３】
１−３）クロマトグラフィー分析条件：移動相は１００ｍＭの酢酸アンモニウム：ＭｅＯＨ（９８：２、ｖ／ｖ）であり、製剤を０．２２μｍのミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルタを通して濾過した。流速を０．８ｍＬ／分に設定し、２５４ｎｍで検出を行った。分離をゾルバックス（ＺＯＲＢＡＸ）Ｂｏｎｕｓ−ＲＰ  Ｃ１８カラム（３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ  Ｉ．Ｄ．、米国ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ））を用いて行った。試料を、カラム上に負荷されるまで、サーモスタット付きのオートサンプラー内に４℃で維持した。
【０１１４】
２）生体細胞内の水溶性のテトラゾリウム塩−８（ＷＳＴ−８）を用いる細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの測定：水溶性のテトラゾリウム塩を用い、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量を黄色のホルマザン染料へのその還元を通じて監視した。培地内の生存細胞内部のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの総量を分光光度計により周期的に測定した。細胞を９６ウェルプレート（２×１０４細胞／ウェル）内に播種し、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および抗生物質を有する１００μｌの培地内で２４時間培養した。候補化合物（例えばピラノ−１，２−ナフトキノン）によるＣＣＫ−８溶液（ドジンゴ・モレキュラー・テクノロジー（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））の指示濃度および１／１０容量での細胞の処理の直後、吸光度の測定を分光光度計を用いて行った。ＣＣＫ−８溶液は、電子メディエーターとして水溶性の２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノナトリウム塩（ＷＳＴ−８、５ｍＭ）および１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート（１−メトキシＰＭＳ、０．２ｍＭ）からなるものであった。ＷＳＴ−８により、電子担体の１−メトキシＰＭＳおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下でまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈにより直接にその生物還元を通じて水溶性の黄色のホルマザン染料が生成された。従って、テトラゾリウム塩における還元の大部分は細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量に依存する。培地内の生体細胞によって生成されるホルマザン染料の量を分光光度計により４５０ｎｍ（参照フィルタ：６５０ｎｍ）の波長で周期的に測定し、対照の値と比較した。更に、ブランク培地を培地および生理食塩水のみで調製した。
【０１１５】
（８）Ｓ９上清の分離
様々な組織（肝臓、脳、筋肉、肺、腎臓など）をＤＩＯ（食餌誘導性肥満）マウスから摘出し、０．２５Ｍスクロースを含有する４倍の容量の５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）緩衝液およびプロテアーゼ阻害剤のカクテル（ロシェ（Ｒｏｃｈｅ））を添加して組織を均質化した。均質化物に１０５，０００ｇおよび４℃での超遠心分離を１時間施し、細胞質内画分を取得した。上清の蓄積がＮＱＯ１活性における低下をもたらすことから、その調製直後に上清を用いることが好ましい。ＮＡＤＨリサイクリングアッセイにおけるＳ９上清を分取し、その使用まで−８０℃で保存し、７２時間以内に測定を行った。
【０１１６】
（９）ＮＱＯ１活性の測定
酵素反応溶液が、２５ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．２ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２００μＭ  ＮＡＤＨ（電子供与体）、５０μＭ  ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ、電子受容体）および１０μｇのＳ９タンパク質を含有した。ジクマロールに感受性があるＮＱＯ１活性を１０μＭジクマロールの存在／不在下で測定した。酵素反応をＳ９上清の添加で開始し、３７℃で実施した。反応速度を、６００ｎｍでのＤＣＰＩＰの還元による吸光度の低下を１０分間観察することにより判定した。ＮＱＯ１活性の測定においては、ジクマロールに感受性があるＮＱＯ１活性を１０μＭジクマロールの存在／不在下での反応速度の差異に基づいて測定した。
【０１１７】
（１０）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈリサイクリングアッセイ
ＮＡＤＨリサイクリングアッセイを上で抽出したＳ９上清またはヒト組換えＮＱＯ１（ｈｒＮＱＯ１）を用いて実施した。２０μｇのＳ９上清または０．５単位のｈｒＮＱＯ１を２００μＭのＮＡＤ（Ｐ）Ｈと併せて、０．２ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを含有する２５ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）溶液に添加した。酵素反応を２００μＭ候補化合物の添加で開始し、吸光度の変化を３４０ｎｍで１０分間監視して記録した。ＮＱＯ１活性アッセイのように、１０μＭのジクマロール（ＮＱＯ１阻害剤）の存在／不在下での反応速度の差異に基づき、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈリサイクリングの程度を計算することが可能である。
【０１１８】
（１１）β酸化アッセイ
１）１４Ｃ−パルミチン酸の注射の調製：０．０２Ｎ  ＮａＯＨを１００％ＥｔＯＨ中に溶解した１−１４Ｃパルミチン酸に添加し、次いでそれを乾燥した。このように粉末にしたパルミチン酸ナトリウムを溶解し、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で均質的に混合し、４０℃に温めた。
【０１１９】
２）アルブミンに結合した１４Ｃ−パルミチン酸の注射：セクション１で調製した注射溶液をＤＩＯマウスの尾静脈に１０μＣｉ／１５０μｌ／頭部の用量で注射し、肝臓を１０分後に摘出した。
【０１２０】
３）肝組織からの脂肪抽出：摘出した肝臓をすぐに速やかに液体窒素中で凍結させ、秤量した。０．２５Ｍスクロース、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭメルカプトエタノールおよび０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する５倍の重量の５ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝溶液を肝組織に添加し、次いでそれらを均質化した。同量の各試料を採取し、各々を２．５倍の量のＣ／Ｍ溶液（クロロホルム：ＭｅｔＯＨ＝２：１）が添加された新しい１５ｍＬの容器に移した。混合物を、ホモジナイザーを用いて２分間完全に混合し、２５００ｒｐｍで２０分間遠心し、クロロホルム層を分離し、次いでそれを新しい容器に移した。残存物質を２倍の量のＣ／Ｍ溶液と２分間完全に混合し、遠心し、クロロホルム層を分離した。このサイクルを２〜３回繰り返した。このようにプールしたクロロホルム層を濃縮した後、５ｍＭデオキシコール酸塩を添加し、シンチレーションバイアルに移した。次いで、１０倍を超える量のトルエンカクテル溶液をバイアルのクロロホルム層に添加し、混合物を撹拌器を用いて完全に混合し、放射能をシンチレーションカウンターを用いて測定した。
【０１２１】
（１２）光学顕微鏡観察
従来の方法により、摘出された組織を適切な大きさに切断し、１０％ホルマリンに固定し、水で洗浄し、パラフィン包埋してブロックを調製した。このように調製したブロックを４μｍの厚みに切断し、全般的変化の観察のため、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を施した。
【０１２２】
（１３）透過電子顕微鏡観察
細胞微細構造の観察においては、摘出された組織を１ｍｍ３の大きさにスライスし、２．５％グルタルアルデヒド（０．１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４、４℃）中に２〜４時間、前固定し、洗浄し、１％四酸化オスミウム溶液中に２時間、後固定した。次いで従来の方法により、組織を連続濃度のエタノールで脱水し、溶媒を酸化プロピレンと交換した。組織をエポキシ樹脂混合物中に包埋し、包埋組織に熱重合を施してブロックを調製した。このように調製したブロックを、超ミクロトームを用いて０．５〜１μｍの厚みに切断し、トルイジン（ｔｏｌｕｄｉｎｅ）ブルーで染色した。観察部位を光学顕微鏡下で選択し、組織を６０〜７０ｎｍの厚みに細切断した。細切断された標本に酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛の二重染色を施し、それを７５ｋＶの加速電圧での透過電子顕微鏡（Ｈ−６００、日本の日立（Ｈｉｔａｃｈｉ））下で観察した。
【０１２３】
（１４）オイルレッドＯ染色
凍結切断した（ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎｅｄ）組織を５μｍの厚みに切断し、大気中で１時間乾燥し、濾過された０．５％オイルレッドＯ溶液中で２０分間反応させた。組織切片を生水で洗浄し、それらにギルヘマトキシリンで二重染色を２０〜３０秒間施し、水で洗浄し、観察した。
【０１２４】
（１５）ペリリピン染色
脂肪組織を３μｍの厚みに切断し、脱パラフィン化し、クエン酸塩緩衝液中の抗原に高圧下で４分間暴露し、洗浄した。混合物を３％過酸化水素溶液中で１０分間反応させ、反応生成物をＴＢＳＴ溶液で３分間、３回洗浄した。生成物を、２００倍希釈したペリリピンに対する一次抗体（モルモット、抗ペリリピン）と１時間反応させ、ＴＢＳＴ溶液で洗浄した。二次抗体（ロバ抗モルモット、ｃｙ３と複合）を添加し、生成物と３０分間反応させた。反応生成物をＴＢＳＴ溶液で３分間、３回洗浄し、Ｆｌｕｏｒｍｏｕｎｔ  Ｇとともにマウントし、次いで蛍光顕微鏡下で観察した。
【０１２５】
（１６）オリゴヌクレオチド配列
【表１】
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【０１２６】
（１７）食餌摂取を介するＤＩＯマウスの作成およびマウスに対する候補化合物の処理
動物に高脂肪食ペレットを３〜４週間連続与えることにより、ＤＩＯマウスを確立した。マウスを飼育室内で１２時間／１２時間の明／暗（Ｌ／Ｄ）サイクル下で飼育した。動物を３群、即ち生理食塩水の投与を伴う群（ｎ＝３）、賦形剤の投与を伴う群（ｎ＝５）および候補化合物５０ｍｇ／ｋｇの投与を伴う群（ｎ＝７）に分けた。試料を動物に毎日経口投与した。７、２８および５６日目に各組織を摘出し、液体窒素中に凍結させ、−８０℃で短期間および長期間保存した。
【０１２７】
（１８）リアルタイム定量ＰＣＲ
７、２８および５６日目に肝臓、脂肪および筋肉組織を食餌誘導されたＤＩＯマウスの２群から単離し、全ＲＮＡを、トリゾル（Ｔｒｉｚｏｌ）を用いて抽出した。ｃＤＮＡを１μｇの全ＲＮＡを用いて合成し、製造業者により指示される方法に従い、ＰＣＲ用に用いられるポリメラーゼをＭ−ＭＬＶポリメラーゼを用いて調製した。リアルタイム定量ＰＣＲを調製されたｃＤＮＡを用いて実施した。各オリゴにおけるＰＣＲを上記の表で示されるＴｍ値を用いて実施した。
【０１２８】
（１９）ｃＤＮＡマイクロアレイ分析
ｃＤＮＡマイクロアレイ分析をアフィメトリクス（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）マウスゲノム４３０Ａ  ２．０アレイチップを用いて実施した。７、２８および５６日目に、トリゾルを用い、ＤＩＯマウスの肝臓、脂肪および筋肉組織に由来する約１３μｇの全ＲＮＡを１μｇ／１μｌを超える濃度で抽出してからマイクロアレイ分析を行った。機能分類をアフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）ウェブサイトから利用可能なＮｅｔＡｆｆｘを用いて行った。
【０１２９】
（２０）ＡＭＰＫキナーゼアッセイ
ＡＭＰＫキナーゼの活性を試験するため、実験で用いられる組織をＡＭＰＫ反応溶液（２０ｍＭヘペス（ＨＥＰＥＳ）−ＮａＯＨ、ｐＨ７．０、０．４ｍＭジチオトレイトール、および０．０１％  ブリッジ−３５）中に溶解し、タンパク質を分離した。タンパク質をＡＭＰＫ認識抗体と２時間結合させた。その後、タンパク質Ａ／Ｇアガロースを用い、ＡＭＰＫタンパク質を１時間の反応後にタンパク質全体から分離し、ＳＡＭＳ基質ペプチド７μｌおよびγ［３２Ｐ］ＡＴＰ（１ｍＣｉ／１００μｌ）１０μｌをそれに添加し、３０℃で１５分間反応させた。反応生成物を２ｃｍ×２ｃｍ四方のＰ８１紙上にスポットし、０．７５％リン酸で５分間、３回洗浄し、紙と併せてシンチレーションカクテル５ｍＬをバイアル内に蒔き、シンチレーションカウンターを用いてカウント毎分（ＣＰＭ）を測定した。
【０１３０】
（２１）動物モデル
すべての実験動物の手順を動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）、忠南大学医学校（Ｃｈｕｎｇｎａｍ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）のガイドラインに従って行った。ＯＬＥＴＦラットをＯｔｓｕｋａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入した。雄ｏｂ／ｏｂおよびＣ５７ＢＬ／６マウスをジャクソン研究所（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から購入した。動物を２℃の一定温度および１２時間／１２時間の明／暗（Ｌ／Ｄ）サイクルで維持された飼育室内に収容した。４週齢Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスに高脂肪食（ＨＦＤ、２４％（ｗ／ｗ）および脂肪分として４５％のカロリー、米国ニュージャージー州０８９０１ニューブランズウィック（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）のリサーチ・ダイエット（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｉｎｃ．））を７週間、無制限に与えた。マウス群を未処理群、賦形剤で処理された群（ケイ酸カルシウム）、ペアフェド（ｐａｉｒ−ｆｅｄ）群および候補化合物で処理された群（ケイ酸カルシウムでコーティングされたβＬナノ粒子）に分けた。動物の体重および食餌摂取量を毎日測定した。実験の終了時、各群における一部のマウスは麻酔され、ＭＲＩ検査を受けた。各群における残りのマウスを解剖し、それらの組織重量を測定した。精巣上体（Ｅｐｉｄｙｄｉｍａｌ）脂肪、肝臓、ヒラメ筋および長趾伸筋（ｅｘｔｅｎｓｏｒ  ｄｉｇｉｔｏｒｕｍ  ｌｏｎｇｕｓ）（ＥＤＬ）を調製し、分析のために免疫組織化学的なオイルレッドＯおよびｐＨに感受性のあるＡＴＰａｓｅ染色を行った。
【０１３１】
（２２）細胞およびウエスタンブロット分析
ＨｅｐＧ２（ヒトヘパトーマ細胞系）、ＨＥＫ２９３（ヒト胚腎細胞系）、およびＣ２Ｃ１２／Ｌ６筋芽細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（米国バージニア州マナサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）のＡＴＣＣ）から購入した。ＬＫＢ−／−ＭＥＦをＲ．Ａ．デピンホ（Ｒ．Ａ．ＤｅＰｉｎｈｏ）から購入した。ラットの心室筋細胞を、既知の方法により成体マウスの心臓から酵素的に単離した。ＡＭＰＫ（Ｔｈｒ１７２）およびＡＣＣ（Ｓｅｒ７９）のリン酸化について、セル・シグナリング・テクノロジー（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および汎特異的抗体およびリン特異的抗体（ニューヨーク州レイクプラシッド（Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ）のアップステート・バイオテクノロジー（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．））を用い、ウエスタンブロット分析により測定した。
【０１３２】
（２３）蛍光イメージング
実験を、乾式蛍光対物レンズ（４０倍、開口数０．８５）、光電子増倍管（Ｒ１５２７型、日本、浜松の浜松ホトニクス（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ））、およびデルタスキャン（Ｄｅｌｔａｓｃａｎ）照明器（ニュージャージー州ローレンスヴィル（Ｌａｗｒｅｎｃｅｖｉｌｌｅ）のフォトン・テクノロジー・インターナショナル（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．））を具備する反転型蛍光顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ３００、日本のニコン（Ｎｉｋｏｎ））を含むマイクロフルオロメトリック（ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ）システムを用いて行った。
【０１３３】
単色蛍光（３５０ｎｍ）を監視するため、１０Ｈｚのチョッパーホイールを介して指向させた７５Ｗキセノンアークランプを用いて光を照明し、特定の蛍光強度を４０５±１５ｎｍおよび４６０±１０ｎｍの波長で測定した。４６０ｎｍでの自己蛍光が未知の細胞内成分または細胞質内ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから生じうるとしても、本発明の方法により検出される光の大部分がミトコンドリアのＮＡＤ（Ｐ）Ｈから発生した。
【０１３４】
（２４）ミトコンドリア膜電位の測定
内部ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）の測定においては、蛍光指示薬として２０ｎＭのＴＭＲＥ（テトラメチルローダミンエチルエステル）を連続的に適用し、細胞上に負荷した。ミトコンドリアのＣａ２＋を監視するため、グラスカバースリップ上の細胞に、冷却負荷／温かい温度のインキュベーションを介して１０μＭ  Ｒｈｏｄ−２  ＡＭを負荷した。細胞質内Ｃａ２＋を監視するため、細胞に１０μＭ  Ｆｌｕｏ−４  ＡＭを３７℃で３０分間、同時負荷した。細胞をＫＢ溶液で２回洗浄し、灌流チャンバー内にマウントした。蛍光イメージングを、適切なレーザー線およびフィルタセットと連携した２００倍および４００倍の倍率の共焦点レーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ−５１０  ＭＥＴＡ、カール・ツァイス（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ））を用いて行った。画像分析をＬＳＭ−５１０  ＭＥＴＡソフトウェア（ツァイス（Ｚｅｉｓｓ））を用いて行った。ＴＭＲＥ（赤色蛍光）、Ｒｈｏｄ−２（赤色蛍光）およびＦｌｕｏ−４（緑色蛍光）における画像を６３倍の開口数、１．４油浸ｐｌａｎａｐｏｃｈｒｏｍａｔレンズを具備するツァイス（Ｚｅｉｓｓ）の反転型５１０ＭＥＴＡ共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて取得した。緑色蛍光および赤色蛍光を４８８ｎｍおよび５４３ｎｍの光で照射した。入射光を５４５ｎｍダイクロイックミラーを通過させ、５００〜５３０ｎｍのバンドパス（緑色）フィルタおよび５６０ｎｍのロングパス（赤色）バリアフィルタを介して観察した。
【０１３５】
（２５）酵素アッセイ
酵素アッセイにおいては、細胞質をマウス組織から抽出した。ジクマロールに感受性があるＮＱＯ１活性を当該技術分野で既知の従来の方法により測定した。この方法はＤＣＰＩＰの生物還元に起因する６００ｎｍでの吸光度の低下に基づくものである。ＡＭＰＫ活性全体を合成「ＳＡＭＳ」ペプチドおよび［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いる既知の方法で測定した。ＡＣＣ活性を、ＡＣＣのアロステリック活性化物質としてのクエン酸塩（２ｍＭ）の存在／不在下で１４ＣＯ２の酸に安定な生成物への固定を定量することにより測定した。ＣＰＴ（カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ）活性を、既知の方法により、Ｌ６筋芽細胞およびヒラメ筋において測定した。ＨＡＤ（３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）活性をＬ６筋芽細胞およびヒラメ筋において、アセトアセチル−ＣｏＡのＬ−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへの変換およびＮＡＤＨのＮＡＤ＋への同時酸化を監視することにより測定した。反応を既知の方法により３４０ｎｍで監視した。
【０１３６】
（２６）脂肪酸酸化
［１４Ｃ］パルミトイル−ＣｏＡ（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））酸化を、Ｌ６筋芽細胞およびヒラメ筋において、標識されたＣＯ２および塩化ベンゼトニウム溶液０．２ｍＬを用いて既知の方法により測定した。
【０１３７】
（２７）マロニル−ＣｏＡ含量の測定
マロニル−ＣｏＡの含量を既知の方法、例えばＨＰＬＣにより測定した。Ａｃｙｌ−ＣｏＡエステルを０．２Ｍ酢酸アンモニウムを含有するアセトニトリル／水（１．７５：９８．２５）を用いてＨＰＬＣにより分離した。試料を２０分間洗浄し、それに０．２Ｍ酢酸アンモニウムを含有するアセトニトリル／水（１０：９０）から１００分の線形勾配溶離を施した。
【０１３８】
（２８）生理学的測定
動物におけるＯ２消費を既知の方法により記録した。間接熱量測定においては、マウスを個別に熱量測定チャンバー（Ｏｘｙｍａｘ  ＯＰＴＯ−Ｍ３システム；オハイオ州コロンバスのコロンバス・インスツルメンツ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））内に収容した。実験に先立ち動物を新しい環境に４８時間慣れさせておき、Ｏ２の消費量およびＣＯ２の生成量を２４時間、３０分ごとに測定した。最初の２４時間はマウスを食料および飲み水に自由に近寄れるようにし、次の２４時間は動物を飲み水のみに近寄れるようにした。血液試料をヘパリン処理した毛細管から採取するとすぐに氷上に置き、遠心し、以降の使用に備えて−２０℃で保存した。トリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール、遊離脂肪酸、およびグルコースの定量においては酵素呈色法を用いた（ベックマン・インスツルメンツ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、カリフォルニア州）。血漿インスリン（ミズーリ州のリンコ・リサーチ（Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））、ＴＮＦα（アールアンドディー・システム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ））、アディポネクチン（ミズーリ州のリンコ・リサーチ（Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））、レジスチン（コメッド（ＫＯＭＥＤ））およびレプチン（ミズーリ州のリンコ・リサーチ（Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））を、ＥＬＩＳＡを用いて定量した。
【０１３９】
（２９）ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
アッセイＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＮＡＤおよびＮＡＤＰレベルのアッセのため、５ｍＭ酢酸アンモニウム４５０μｌを、過塩素酸（ＨＣｌＯ４）を用いて抽出した肝臓試料５０μｌに添加し、次いでそれを１０倍に希釈した。希釈試料をボルテックスし、１分間混合し、混合物を０．２μｍのナイロンシリンジフィルタ（英国ブレントフォード（Ｂｒｅｎｔｆｏｒｄ）のワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ））を通して濾過した。次いで、各一定分量５μｌをＨＰＬＣシステムに注射した。これらの分析物用の各標準溶液（５０μｌ）を２−クロロアデノシン（内部標準）を含有する抽出溶液５０μｌおよび５ｍＭ酢酸アンモニウム４００μｌに添加し、上記の試料などと同様に混合しかつ濾過した。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの分析においては、水酸化カリウム（ＫＯＨ）溶液で抽出された肝臓試料の各１００μｌを同量の５ｍＭ酢酸アンモニウム（標準用ＫＯＨ溶液）で２倍に希釈した。ＨＰＬＣシステムは、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズの真空脱気装置、バイナリーポンプ、オートサンプラー、サーモスタット付きカラム区画、およびＤＡＤ検出器（カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）のアジレント・テクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））からなるものである。アデニンおよびヌクレオチド類似体を、勾配方法を用いるウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）ＸＴｅｒｒａ  ＭＳ  Ｃ１８  ２．１×１５０ｍｍ、３．５μｍカラム（米国マサチューセッツ州ミルフォード（Ｍｉｌｆｏｒｄ）のウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ））クロマトグラフィーにより分離した。アデニンおよびヌクレオチド類似体における移動相は、５ｍＭ酢酸アンモニウム（Ａ）およびメタノール（Ｂ）であった。ＮＡＤ＋−関連化合物を８分の時点で初期の９８％（Ａ）から最終の７０％（Ｂ）にかけての線形勾配溶離により分離した。移動相を７０％（Ｂ）で７分間展開した。最後に移動相を１６の時点で９８％（Ａ）に戻し、９８％（Ａ）に１２分間再平衡化した。すべての時点にわたり流速を０．２ｍＬ／分に設定した。注射容量は５μｌであった。エレクトロスプレー−イオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）をＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ４０００  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（カリフォルニア州オンタリオ（Ｏｎｔａｒｉｏ）のアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて陽イオンモードで行った。分析物を複数の反応監視（ＭＲＭ）モードにおける単位分解能で観察し、遷移ｍ／ｚ：ＡＴＰ、ｍ／ｚ５０８→１３６；ＡＤＰ、ｍ／ｚ４２８→１３６；ＡＭＰ、ｍ／ｚ３４８→１３６；ＮＡＤ、ｍ／ｚ６６４→１３６；ＮＡＤＰ、ｍ／ｚ７４４→１３６；ＮＡＤＨ、ｍ／ｚ６６５→１３６；ＮＡＤＰＨ、ｍ／ｚ７４５→１３６；および２−クロロアデノシン、ｍ／ｚ３０２→１７０を監視した。
【０１４０】
（３０）グルコース寛容性試験およびインスリン刺激試験
１２時間絶食したマウスにおいて、グルコース寛容性試験（ＧＴＴ）を既知の方法により行った。上記のように、１２時間絶食したマウスはインスリン刺激試験を受けた。
【０１４１】
（３１）ＤＮＡマイクロアレイおよび定量ＰＣＲ
賦形剤または候補化合物で４週間処理した雄マウスに由来する脂肪、肝臓または筋肉組織をプールし、プールした組織にマイクロアレイ分析を施した。全ＲＮＡを、トリゾル試薬（カルフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）のインヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で均質化した組織から調製した。マイクロアレイ分析用プローブを１０μｇの全ＲＮＡから調製し、マウス４３０Ａ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（カルフォルニア州サンタクララ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ）のアフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ））にハイブリダイズした。ハイブリダイズされたアレイを走査し、生データをＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｕｉｔｅ  ５．０（アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ））を用いて抽出した。ＰＣＲ定量においては、１μｇの全ＲＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩおよびオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてｃＤＮＡに逆転写した。作成されたｃＤＮＡを、製造業者の使用説明書（インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）のロシェ・ダイアグノスティクス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））に従い、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩキットおよびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒを用いて増幅した。発現データをβ−アクチン発現に対して正規化した。
【０１４２】
（３２）ＩＣＶの挿管および注射
既知の方法を用い、２３ゲージのステンレス鋼製カニューレ（バージニア州ロアノケ（Ｒｏａｎｏｋｅ）のプラスティクス・ワン（Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｏｎｅ））をマウスの第三心室に移殖した（ブレグマに対して１．８ｍｍの尾部および矢状静脈洞に対して５．０ｍｍの腹部）。７日の回復期および一晩の絶食の後、マウスに対し、１分かけて２μｌの用量で賦形剤（０．２％ＤＭＳＯ）または候補化合物の脳室内（ＩＣＶ）注射を行った。動物の食餌摂取量を化合物の注射の７時間後に監視し、マウスの体重を化合物の注射の２４時間後に測定した。別々に評価した後、分析においては正確な位置にカニューレを有する動物から得た結果のみを含めた。
【０１４３】
（３３）統計分析
実験結果を平均±ＳＤまたは平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表した。各群間の統計的有意性における差異をスチューデントのｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）および分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて試験した。統計的有意性における差異をＰ＜０．０５について考慮した。
【０１４４】
（３４）他の方法
タンパク質の濃度をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を用いて測定した。参照タンパク質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた。すべての実験を３通りに行った。
【０１４５】
実施例１：ＮＱＯ１活性化物質による細胞内のＮＡＤＨにおける変化
この実験では、ＮＱＯ１活性化物質ピラノ−１，２−ナフトキノン（以下「βＬ」と称されることが多い）の還元がＮＱＯ１に依存するように様式で生じることを実証しようとした。
【０１４６】
図１Ａは、ＮＱＯ１活性を有するヒトヘパトーマ細胞系ＨｅｐＧ２をＮＱＯ１活性化物質ピラノ−１，２−ナフトキノンにより２時間処理した後の細胞内のＮＡＤＨ濃度のリアルタイム測定時に、ＮＡＤＨがＮＱＯ１活性化物質の濃度に依存して低下することを示す。
【０１４７】
図１Ｂは、ＮＱＯ１活性を全く有しないＨＥＫ２９３細胞をピラノ−１，２−ナフトキノンにより２時間処理する間の細胞内のＮＡＤＨ濃度のリアルタイム測定時に、ＮＱＯ１活性化物質の濃度および時間と無関係にＮＡＤＨ濃度が全く変化しないことを示す。
【０１４８】
図１Ｃは、ＮＱＯ１活性を全く有しないＨＥＫ２９３細胞にＮＱＯ１遺伝子を挿入した後の、細胞のピラノ−１，２−ナフトキノンにより２時間処理する間の細胞内のＮＡＤＨ濃度のリアルタイム測定時に、ＮＡＤＨがＮＱＯ１活性化物質の濃度に依存して低下することを示す。この結果は、ピラノ−１，２−ナフトキノンによるＮＡＤＨの低下がＮＱＯ１依存性であることを示す。
【０１４９】
具体的には、ＮＱＯ１活性およびＮＱＯ１活性の存在／不在下での細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの蛍光濃度の変化が、ＨｅｐＧ２、ＨＥＫ２９３細胞内およびｐＳＧ５  ＨＡ−ＮＱＯ１若しくはｐＳＧ５  ＨＡ−ＮＱＯ１  Ｃ６０９Ｔが挿入されたＨＥＫ２９３細胞内で測定される。結果は、βＬがＮＱＯ１依存性のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの酸化を促進することにより、ＮＱＯ１活性を有するＨｅｐＧ２細胞内および心筋細胞内でＮＡＤ（Ｐ）Ｈにおける約４０％の低下がもたらされることを示した（図２および３を参照）。
【０１５０】
しかし、ＮＱＯ１活性を有しないＨＥＫ２９３細胞の対照群がかかる変化を全く示さず、野生型ＮＱＯ１遺伝子の挿入を伴うＨＥＫ２９３細胞がβＬで促進されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの酸化を示し、触媒活性のないＮＱＯ１Ｃ６０９Ｔ遺伝子の挿入を伴うＨＥＫ２９３細胞がＮＡＤ（Ｐ）Ｈの酸化を全く示さなかった（図４参照）。更に、βＬで促進されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの酸化が特異的ＮＱＯ１阻害剤ジクマロールにより制限された（図５参照）。
【０１５１】
実施例２：少脂肪（Ｌｅａｎ）マウスおよびＤＩＯマウスの組織内でのＮＱＯ１の量および活性における変化
組織内および細胞内でのＮＱＯ１の分布を確認するため、マウスの様々な組織を採取し、超遠心分離した。精製した細胞質内画分を用い、ジクマロール感受性のＮＱＯ１活性を１０μＭジクマロールの存在／不在下での反応速度における差異に基づいて測定した。ＮＱＯ１の活性値を、還元された２，６−ジクロロフェノールインドフェノール／分／ｍｇのタンパク質として表した。
【０１５２】
図６は、少脂肪マウスおよびＤＩＯマウスの様々な組織のＮＱＯ１活性の存在を示す。少脂肪マウスおよびＤＩＯマウスの組織間でＮＱＯ１活性を比較した。図６に示されるように、ＤＩＯマウスの筋肉および肝臓におけるＮＱＯ１活性は、少脂肪マウスの場合よりも特に高かった。
【０１５３】
実施例３：ＮＱＯ１活性化物質による細胞内のＡＴＰ濃度の変化
図７は、ピラノ−１，２−ナフトキノンにより神経細胞の細胞内のＡＴＰ濃度が急激に低下することを示す。ドーパミン作動性（ＭＮ９Ｄ）および非ドーパミン作動性（ＭＮ９Ｘ）神経細胞を５μＭのピラノ−１，２−ナフトキノンで処理し、ＡＴＰ濃度を周期的に測定した。その結果、ＡＴＰ濃度はＭＮ９ＤおよびＭＮ９Ｘ細胞内で低下し、ＭＮ９Ｄ細胞はピラノ−１，２−ナフトキノンに対してＭＮ９Ｘ細胞よりも高感度の応答性を示した。
【０１５４】
実施例４：ＮＱＯ１による細胞内のエネルギーレベルにおける変化
この実施例では、細胞内でＮＱＯ１を活性化する薬剤での細胞の処理によりエネルギー濃度の変化を確認することにより、ＮＱＯ１がエネルギー濃度の制御において重要な役割を果たすか否かを検討しようとした。
【０１５５】
図８Ａは、ヘパトーマ細胞系ＨｅｐＧ２を１０μＭのピラノ−１，２−ナフトキノンで２時間処理する間、ＬＣ−ＭＳによる細胞内でのＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰレベルの経時的測定時、細胞をピラノ−１，２−ナフトキノンで処理した３０分後、ＡＴＰの量が最小値に低下しかつＡＭＰの量が最大値に増加したことを示す。図８Ｂは、ＮＱＯ１活性を全く有しないＨＥＫ２９３細胞をピラノ−１，２−ナフトキノンで２時間処理する間、ＬＣ−ＭＳによる細胞内でのＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰレベルの経時的測定時、ＨＥＫ２９３細胞が示す細胞内でのＡＴＰレベルにおける変化がＨｅｐＧ２細胞の場合と比べて全く有意でないことを示す。従って、ＮＱＯ１活性化物質によるＡＴＰ濃度の低下がＮＱＯ１依存性であることが分かる。
【０１５６】
実施例５：ＮＱＯ１活性化物質による生体内でのＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ、ＡＭＰ／ＡＴＰおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ比における変化
この実施例では、ＮＱＯ１活性化物質が、ＮＱＯ１によるインビボでのＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比の変化に対する効果を有するか否かを検討しようとした。５ｍｇ／ｋｇのピラノ−１，２−ナフトキノンをＤＩＯマウスの尾静脈に静脈内投与し、肝組織でのＮＡＤＨの量およびＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比における変化を６時間かけて試験した。
【０１５７】
図９Ｂは、細胞に対するβＬの処理の結果、３０分時点でＡＭＰ濃度の最大の増加が得られ、ＡＭＰ濃度が１２０分時点で正常レベルに回復する一方、ＡＭＰ／ＡＴＰ比が３０分時点で最高レベルに上昇し、続いて漸減し、３６０分時点で初期状態に回復したことを示す。
【０１５８】
図９Ｃは、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比の観点でのＮＡＤ＋およびＮＡＤＨの量における変化のパターンを示す。図示のように、ＮＡＤ＋の量およびＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比が１２０分時点で最大値に増加し、続いて漸減した。即ち、βＬの静脈内（ＩＶ）注射の結果、ＮＡＤ＋およびＡＭＰレベルの一時的な上昇がもたらされたことから、実験群は、対照群と比べて肝臓内でのＡＭＰ／ＡＴＰおよびＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比の上昇を示した。
【０１５９】
更に、図９Ｄは、βＬ処理の結果として得られたＮＡＤＰ＋の数値における変化が全く有意でなかったが、１２０分時点でＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ比はＮＡＤＰＨ濃度の低下に起因して最大値に上昇したことを示す。上記と同じ実験方法に従い、βＬを少脂肪マウスおよびＤＩＯマウスの各々に投与した。ＡＭＰ／ＡＴＰ比およびＮＡＤ＋／ＮＡＤＰ比における変化の結果をそれぞれ図１０および１１に示す。図１０および１１から分かるように、少脂肪マウスが示すＡＭＰ／ＡＴＰ比およびＮＡＤ＋／ＮＡＤＰ比における変化が対照群と比べて少ない一方、ＤＩＯマウスが示すＡＭＰ／ＡＴＰおよびＮＡＤ＋／ＮＡＤＰ比における変化は有意であり、それはそれらの比が少脂肪マウスにおける値に経時的に変換することを示した。従って、肥満対象においてはＮＱＯ１活性化化合物がＡＭＰ／ＡＴＰ比およびＮＡＤ＋／ＮＡＤＰ比における変化に多大に寄与することが分かる。
【０１６０】
実施例６：Ｃ５７ＢＬ／６マウスのβ酸化に対するＮＱＯ１の効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウスのβ酸化に対するＮＱＯ１活性化物質ピラノ−１，２−ナフトキノンの効果を検討するための試験を実施した。
【０１６１】
図１２は、１４Ｃ−パルミチン酸を、賦形剤または５０ｍｇ／ｋｇのピラノ−１，２−ナフトキノンを７日間与えられたＤＩＯマウスの尾静脈にＩＶ注射した後の、肝臓（トリグリセリド、ＴＧ）に取り入れられた１４Ｃ−パルミチン酸の量の測定結果を示す。１０μＣｉの１４Ｃ−パルミチン酸をマウスの尾静脈にＩＶ注射し、１０分後、肝臓を摘出し、均質化した。脂肪を均質化物から抽出し、放射能を液体シンチレーションカウンターにより測定した。ピラノ−１，２−ナフトキノンで処理されたマウスにおける肝性トリグリセリド（ＴＧ）に取り入れられた１４Ｃ−パルミチン酸の量は、賦形剤で処理されたマウス（対照群）の場合に対して約４５％低かった。この結果は、ピラノ−１，２−ナフトキノンで処理されたマウスが肝外組織内で対照群の場合よりも多い量のパルミチン酸を利用することを示す。
【０１６２】
図１３−ｊおよび１３−ｋは、ＣＰＴおよびミトコンドリアの脂肪酸酸化の重要な阻害剤であるＡＣＣ活性およびマロニルＣｏＡレベルがβＬ処理に応答して低下したことを示す。他方、図１３−ｌ、１３−ｍおよび１３−ｎは、βＬで処理されたＤＩＯマウスの筋肉内でＣＰＴおよびＨＡＤの活性並びに１４Ｃ−パルミトイルＣｏＡのβ酸化が対照群と比べて有意に増大したことを示す。これらの結果は、βＬ処理により、ＮＱＯ１媒介性のＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の一時的上昇がもたらされ、次いでそれによりインビボでＡＭＰＫが活性化され、かつミトコンドリアの酸化的リン酸化および脂肪酸の酸化が促進されることを示唆する。即ち、かかる事実は、βＬの長期にわたる処理により、ミトコンドリアの酸化的リン酸化が促進され、適応的なミトコンドリア新生が促進されることを意味する。従って、βＬを代謝疾患用の治療薬として使用してもよい。
【０１６３】
実施例７：ＮＱＯ１活性化物質によるＡＭＰＫおよびＡＣＣのリン酸化の調節
ＮＱＯ１活性化物質がＮＱＯ１を通じて、細胞内のエネルギーを調節するタンパク質であるＡＭＰＫおよびＡＣＣのリン酸化に対して効果を有するか否かを確認するために、この実施例を実施した。ＮＱＯ１活性化物質ピラノ−１，２−ナフトキノンによるＡＭＰキナーゼおよびＡＣＣ（アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ）のリン酸化について試験するため、ＨｅｐＧ２細胞（ヒトヘパトーマ細胞系）を１×１０５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレート上に播種し、ＲＰＭＩ＋１０％  ＦＢＳ培地内で培養した。細胞を２４時間成長させた後、培地を、血清を含まないＲＰＭＩ培地と交換し、細胞を対照（ＤＭＳＯ）と併せ、ピラノ−１，２−ナフトキノン（１０μＭ）で３０分間、１時間、２時間、４時間および６時間処理した。Ａｎｔｉ−ＡＣＣおよびＡｎｔｉ−ｐＳ７９−ＡＣＣを用いてリン酸化ＡＣＣを観察する一方、Ａｎｔｉ−ＡＭＰＫおよびＡｎｔｉ−ｐＴ１７２−ＡＭＰＫを用いてリン酸化ＡＭＰキナーゼを観察した。図１４に示されるように、ピラノ−１，２−ナフトキノンによるＡＭＰキナーゼのリン酸化を最初の時点（３０分）から観察でき、かかるリン酸化効果が最大で６時間持続したことを確認できる。更に、ＡＭＰキナーゼの標的タンパク質として知られるＡＣＣもリン酸化されたことが確認されうる。これらの結果は、ＮＱＯ１活性化物質によるＡＭＰＫの活性化が、脂肪生成における重要な調節酵素であるアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を抑制可能であり、結果としてＮＱＯ１が脂肪酸酸化において特定の役割を果たしうることを示す。
【０１６４】
賦形剤またはβＬで２日間処理したＤＩＯマウスの肝臓、性腺脂肪（ｇｏｎａｄａｌ  ｆａｔ）（ＷＡＴ）、ＥＤＬおよびヒラメ筋から抽出した様々なタンパク質を用い、各組織内のＡＭＰＫαのＴ１７２リン酸化およびＡＣＣのＳ７９リン酸化をウエスタンブロット分析により測定した。結果として、ＡＣＣのＳ７９リン酸化およびＡＭＰＫαのＴ１７２リン酸化が肝臓内および筋肉（ＥＤＬ、ヒラメ筋）内で増大する一方、βＬ処理に対応するＤＩＯマウスの性腺脂肪がかかる効果を全く示さなかった（図１５参照）。
【０１６５】
実施例８：ＡＭＰＫのリン酸化に対するＮＱＯ１の効果
ＡＭＰキナーゼのリン酸化におけるＮＱＯ１タンパク質の重要性について検討するため、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ−７およびＨＥＫ２９３細胞を６０ｍｍプレート上に１×１０６細胞／プレートの密度で播種した。細胞を２４時間成長させた後、培地を血清を含まない培地と交換し、対照群（ＤＭＳＯ）と併せ、細胞をそれぞれピラノ−１，２−ナフトキノン（１０μＭ）で３０分間処理した。細胞をＲＩＰＡ緩衝液中に溶解させ、すべてのタンパク質の量を分光光度計を用いて定量し、５０μｇのタンパク質に電気泳動を施した。ＡＭＰキナーゼのリン酸化についてＡｎｔｉ−ＡＭＰＫおよびＡｎｔｉ−ｐＴ１７２−ＡＭＰＫを用いて試験する一方、ＮＱＯ１タンパク質をＡｎｔｉ−ＮＱＯ１を用いてアッセイした。ピラノ−１，２−ナフトキノン（１０μＭ）によるＡＭＰキナーゼのリン酸化がＨＥＫ２９３細胞内で観察されなかったという事実から、ＮＱＯ１タンパク質がＡＭＰキナーゼのリン酸化にとって重要であることが分かる。
【０１６６】
図１６は、ＡＭＰキナーゼのリン酸化に対するＮＱＯ１の効果を示す。ＮＱＯ１の活性がＡＭＰキナーゼのリン酸化にとって重要であることについて試験するため、ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレート上に１×１０５細胞／ウェルの密度で播種し、２４時間培養し、ｐＳＧ５−ＨＡ−ＮＱＯ１（５００ｎｇ）およびｐＳＧ５−ＨＡ−ＮＯＱ１−Ｃ６０９Ｔ（５００ｎｇ）プラスミドを形質移入した。２４時間後、培地を血清を含まない培地と交換し、対照（ＤＭＳＯ）と併せ、細胞をピラノ−１，２−ナフトキノン（１０μＭ）およびＡＩＣＡＲ（２ｍＭ）で３０分間処理した。ＡＭＰキナーゼのリン酸化をＡｎｔｉ−ＡＭＰＫおよびＡｎｔｉ−ｐＴ１７２−ＡＭＰＫを用いてアッセイする一方、形質移入されたＮＱＯ１をＡｎｔｉ−ＨＡを用いてアッセイした。ＮＱＯ１活性を全く有しないＮＱＯ１−Ｃ６０９ＴにおいてＡＭＰキナーゼがリン酸化されないことから、ＮＱＯ１タンパク質の酵素活性はピラノ−１，２−ナフトキノンによるＡＭＰキナーゼのリン酸化にとって重要である。
【０１６７】
更に、ＮＱＯ１の活性によるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの酸化とＡＭＰＫのリン酸化／活性化の関係が、ＮＱＯ１の高発現を伴うβＬで処理されたＨｅｐＧ２細胞内、ＮＱＯ１の低発現を伴うＭＣＦ−７細胞内、およびＮＱＯ１の発現を全く伴わないＨＥＫ２９３細胞内で観察された。
【０１６８】
図１７−ｊは、βＬで処理された細胞内でのＮＱＯ１の活性化がＡＭＰＫのＴ１７２リン酸化と相関することを示す。図１７−ｋは、ＨＥＫ２９３細胞をＡＩＣＡＲ（５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミド−１−β−Ｄ−リボフラノシド）で処理することで、ＡＭＰＫのリン酸化における増大ももたらされることを示す。更に、ＡＭＰＫのリン酸化／活性化が、野生型ＮＱＯ１を形質移入したＨＥＫ２９３細胞を除くＨＥＫ２９３細胞内で促進されなかった。図１７−ｌおよび図１８は、βＬがＨｅｐＧ２細胞内でＡＣＣ（アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ）のリン酸化およびＡＭＰＫのリン酸化／活性化を促進しかつＡＣＣの活性化を低下させることを示す。
【０１６９】
実施例９：細胞内のカルシウム濃度およびミトコンドリア膜電位における変化に対するＮＱＯ１の効果
この実施例では、ＮＱＯ１活性化物質ピラノ−１，２−ナフトキノンによるＨｅｐＧ２細胞内のカルシウム流入、およびＮＱＯ１阻害剤ジクマロールによるカルシウム流入における変化について試験しようとした。細胞を２４時間培養し、次いでＦｌｕｏ−４で３０分間前処理した。カバースリップ上に固定化した細胞をスライドガラスに移し、ピラノ−１，２−ナフトキノン（１０μＭ）で処理し、同時に画像を蛍光顕微鏡を用いて１０分間、２秒ごとに取得した。ジクマロール（５μＭ）による細胞内カルシウム流入における変化を監視するため、細胞をＦｌｕｏ−４（５μＭ）およびジクマロールで３０分間前処理した後、ピラノ−１，２−ナフトキノン（１０μＭ）での処理および蛍光顕微鏡観察を行った。
【０１７０】
図１９に示されるように、ピラノ−１，２−ナフトキノンによるカルシウム流入がその処理の約１０秒後の時点でカルシウムのピークを示し、カルシウム流入がジクマロールにより阻害されることが観察された。更に、カルシウムのピークは、ＮＱＯ１が欠けたＨＥＫ２９３細胞内では見られなかった。この事実は、ＮＱＯ１活性がカルシウム流入と密接に関連することを示す。
【０１７１】
図２０に示されるように、ＴＭＲＥ（テトラメチルローダミンエチルエステル）蛍光がβＬで処理されたＮＱＯ１が十分に存在するＨｅｐＧ２細胞内および心筋細胞内で約２０％低下することにより、ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）における変化がもたらされた。しかし、かかる効果はＨＥＫ２９３細胞内で観察されなかった。ΔΨｍに対するβＬの効果は一時的なものであり、ジクマロールで処理された細胞はかかる効果を示さなかった。従って、ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）における変化がＮＱＯ１依存性であることが分かる。
【０１７２】
他方、カルシウム依存性キナーゼ（ＣＤＫ）、ミトコンドリア酵素または任意の他のカルシウム依存性プロセスの活性が、カルシウム恒常性における変化で調節される。図２１は、Ｆｌｕｏ４およびＲｈｏｄ−２−ＡＭ蛍光の測定結果を示し、各々、細胞質内のＣａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｃ）およびミトコンドリアのＣａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｍ）を表す。即ち、βＬで処理された細胞内での細胞質内のＣａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｃ）およびミトコンドリアのＣａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｍ）の上昇が類似の速度論的挙動を示すことが持続的に観察された。更に、細胞内のカルシウム濃度に対するβＬの効果がジクマロールによるＮＱＯ１活性の阻害の影響を受けやすいことが示された。これらの結果は、ＮＱＯ１活性がカルシウム濃度と密接に相関することを示唆する。
【０１７３】
更に図２２は、ＨｅｐＧ２細胞内および心筋細胞内のミトコンドリアの酸素消費がβＬにより増大するが、かかる増大した酸素消費がＨＥＫ２９３細胞内で観察されないことを示す。これらの結果は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの速やかな酸化を伴うＮＱＯ１媒介性のβＬの還元により細胞のレドックス状態が変化しかつミトコンドリアの酸化的リン酸化が促進されることを示唆する。
【０１７４】
実施例１０：ＮＱＯ１とＡＭＰＫα、βまたはγとの間の結合の確認
ＮＱＯ１とＡＭＰＫα、βまたはγとの間の結合を確認するため、ＨＥＫ２９３細胞を１００ｍｍプレート内のＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地上に播種し、培養することで細胞質量が８０％に達し、ＨＡ−ＮＱＯ１を形質移入した。形質移入の２４時間後、細胞を溶解させ、５００μｇのタンパク質を用いて免疫沈降を行った。
【０１７５】
図２３に示されるように、ＮＱＯ１がＡＭＰＫα、βおよびγのいずれにも全く結合しなかったことが分かる。
【０１７６】
実施例１１：内皮の一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）のリン酸化に対するＮＱＯ１活性化物質の効果
ＡＭＰＫの活性化によりＮＲＦ−１が活性化されかつミトコンドリア新生が促進されることは周知である。更に、ＮＯ／ｃＧＭＰがＰＧＣ−１αおよびＮＲＦ−１を活性化することでミトコンドリア新生が促進される。ＡＭＰＫを活性化するＮＱＯ１活性化物質が一酸化窒素（ＮＯ）の生成に関与するか否かを確認するため、内皮の一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）の活性における増大をもたらすリン酸化の程度を判定した。ＮＱＯ１活性化物質の活性によるｅＮＯＳのリン酸化について試験するため、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を６０ｍｍプレート上に１×１０５細胞の密度で播種し、ＥＢＭ２＋５％  ＦＢＳ培地内で２４時間培養した。培地を血清を含まないＥＢＭ２培地と交換し、細胞をピラノ−１，２−ナフトキノン（１０μＭ）で所定の時間処理した。リン酸化ｅＮＯＳをＡｎｔｉ−ｐＳ１１７７  ｅＮＯＳを用いて観察した。
【０１７７】
図２４に示されるように、ｅＮＯＳのリン酸化がピラノ−１，２−ナフトキノンでの処理の３０分後に最大の増大に至り、次いで漸減したことから２時間後には観察されなかった。ピラノ−１，２−ナフトキノンによるｅＮＯＳのリン酸化における増大が、ピラノ−１，２−ナフトキノンが虚血性心疾患およびミトコンドリアミオパチー並びにミトコンドリア機能障害に関連する疾患（例えば、変性脳疾患、糖尿病、心筋ミオパチー、および老化に関連する疾患）に対して治療的に使用可能であるという可能性を提示する。
【０１７８】
実施例１２：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡＭＰＫの活性化に対するＮＱＯ１活性化物質の効果
図２５は、ＮＱＯ１活性化物質がＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡＭＰＫを活性化することを示す。賦形剤および５ｍｇ／ｋｇのピラノ−１，２−ナフトキノンをＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈にそれぞれ２時間および４時間かけて投与した。肝組織および性腺脂肪組織を摘出し、ＡＭＰＫキナーゼの活性に対してアッセイした。活性化の程度を放射性同位体のＣＰＭ値として表した。同様の方法を用い、ヒト肝臓由来の細胞系ＨｅｐＧ２細胞を１０μＭピラノ−１，２−ナフトキノンで３０分間処理し、次いでＡＭＰＫキナーゼ活性に対するアッセイを行った。ＨｅｐＧ２細胞内でＡＭＰＫの活性が増大することが確認された。図２５における結果から分かるように、ピラノ−１，２−ナフトキノンの投与により、肝組織および性腺脂肪組織内並びに肝細胞内でＡＭＰＫ活性の増大がもたらされる。
【０１７９】
実施例１３：ＤＩＯマウスにおけるＡＭＰＫおよびＡＣＣのリン酸化に対するＮＱＯ１活性化物質の効果
図２６は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡＭＰＫおよびＡＣＣのリン酸化に対するＮＱＯ１活性化物質の効果を示す写真である。ＮＱＯ１活性化物質の抗肥満効果について検討するため、ＮＱＯ１活性化物質をＤＩＯマウスに毎日、経口経路を介して５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、肝組織および性腺脂肪組織におけるエネルギー代謝および脂肪生成において重要な役割を果たすＡＭＰＫおよびＡＣＣのリン酸化に対するＮＱＯ１活性化物質の効果について試験した。図２６に示されるように、ＮＱＯ１活性化物質ピラノ−１，２−ナフトキノンがＣ５７ＢＬ／６  ＤＩＯマウスの性腺組織および肝組織におけるＡＭＰＫおよびＡＣＣのリン酸化に対する効果を有することがウエスタンブロット分析を通じて確認された。リン酸化ＡＭＰＫは、エネルギーに関連する代謝を活性化すると考えられる。それ故、ＡＭＰＫの活性化による影響を受けるＡＣＣがリン酸化され、次いでその脂肪合成活性が阻害され、次いでそれが肥満の阻害を含む脂質代謝に対して何らかの効果を発揮することになると考えられる。
【０１８０】
図２７は、ＤＩＯマウスの肝臓、ＥＤＬ（長趾伸筋）およびヒラメ筋におけるＡＭＰＫ活性が、βＬの５０ｍｇ／ｋｇの用量での経口投与に伴い、賦形剤で処理された対照群の場合よりも高まったことを示す。βＬの経口投与効果が投与の２時間後に最大に達し、その投与の約６時間後まで持続した（データは示さず）。
【０１８１】
実施例１４：ＤＩＯマウスの脂質代謝に関与する遺伝子の発現に対するＮＱＯ１活性化物質の効果
ＮＱＯ１活性化物質の抗肥満効果について検討するため、ＮＱＯ１活性化物質をＤＩＯマウスに経口経路を介して５０ｍｇ／ｋｇの用量で毎日投与し、かつ、リアルタイム定量ＰＣＲにより、肝組織および性腺脂肪組織における脂質代謝に関与する、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）１、ＡＣＣ２、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、およびステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ１（ＳＣＤ１）のｍＲＮＡのレベルを確認しようと試みた。これらの酵素は脂質代謝にとって極めて重要である。即ち、ＡＣＣがアセチルＣｏＡからのマロニルＣｏＡの形成を触媒し、ＦＡＳがマロニルＣｏＡからのパルミチン酸塩の形成を触媒し、かつＳＣＤ１が一価不飽和脂肪の形成を触媒することで、主なエネルギー貯蔵であるトリアシルグリセロールの形成において重要な役割を果たすことは知られている。従って、これらの酵素は肥満、糖尿病、および脂質代謝関連疾患と密接に相関する。図２８に示されるように、ピラノ−１，２−ナフトキノンが投与された実験群におけるＡＣＣ１およびＡＣＣ２、ＦＡＳ、ＬＰＬ、並びにＳＣＤ１のｍＲＮＡの発現レベルが対照群の場合と比べて著しく低下し、実験群におけるＬＰＬ  ｍＲＮＡレベルが対照群の場合と比べて約２倍高まった。従って、上記の酵素に対する遺伝子の発現におけるかかる増大または低下についての結果から、ＮＱＯ１が代謝疾患の治療における治療標的として有望となることが示唆されうる。
【０１８２】
実施例１５：ＤＩＯマウスのグルコース代謝に関与するタンパク質の遺伝子発現に対するＮＱＯ１活性化物質の効果
ピラノ−１，２−ナフトキノンを、ＤＩＯマウスに経口経路を介して５０ｍｇ／ｋｇの用量で毎日投与し、肝組織および性腺脂肪組織におけるヘキソキナーゼ２（ＨＫ２）、グルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ）２およびＧＬＵＴ４におけるｍＲＮＡのレベルをリアルタイム定量ＰＣＲにより確認した。ＧＬＵＴは肝臓などの器官、脂肪細胞および筋細胞における血中グルコースの細胞内取り込みおよび消費を媒介するタンパク質として周知である一方、グルコキナーゼクラスに属する酵素ＨＫ２が、このようにグルコース分解経路に入ることが許容されるタンパク質をリン酸化する。図２９の結果から分かるように、ＨＫ２のｍＲＮＡレベルが対照群の場合と比べて低下する一方、グルコース輸送に関与する２種の酵素、ＧＬＵＴ２およびＧＬＵＴ４のｍＲＮＡがそれらの発現において有意な上昇を示した。ＧＬＵＴ２およびＧＬＵＴ４の上昇レベルが血中グルコースの細胞内取り込みを促進することから、糖尿病の治療における標的としてのＮＱＯ１の可能性が提示される。
【０１８３】
実施例１６：ＤＩＯマウスのミトコンドリア新生に関与するタンパク質の遺伝子発現に対するＮＱＯ１活性化物質の効果
ピラノ−１，２−ナフトキノンをＤＩＯマウスに経口経路を介して５０ｍｇ／ｋｇの用量で毎日投与し、肝組織および性腺組織におけるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体コアクチベーターα１（ＰＧＣ１α）、核呼吸因子１（ＮＲＦ１）、ミトコンドリア転写因子（ｍｔＴＦＡ）、並びにチトクロームｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）４およびＣＯＸ７のｍＲＮＡのレベルをリアルタイム定量ＰＣＲにより確認した。図３０に示されるタンパク質が、細胞内でのエネルギーの生合成において重要な役割を果たすミトコンドリアの新生の調節を担う代表的酵素であり、様々な細胞生理的プロセスの調節に関与することも知られている。これらの酵素の間のｍＲＮＡの量にわずかな差異があるが、ピラノ−１，２−ナフトキノンの投与群におけるあらゆる酵素のｍＲＮＡのレベルが対照群の場合と比べて上昇することが示された。ミトコンドリアの異常な活性が種々の代謝症候群において報告されていることから、これらの結果は、ＮＱＯ１が代謝疾患、ミトコンドリア機能障害に関連する疾患およびエネルギー代謝に関連する疾患の治療におけるかかる現象の改善を介する治療標的でありうるという可能性を示す。
【０１８４】
実施例１７：ＤＩＯマウスのエネルギー代謝に関与する遺伝子の発現に対するＮＱＯ１活性化物質の効果
ピラノ−１，２−ナフトキノンをＤＩＯマウスに経口経路を介して５０ｍｇ／ｋｇの用量で毎日投与し、肝組織および性腺組織におけるエネルギー代謝に関与する遺伝子の転写因子のレベルをリアルタイム定量ＰＣＲを用いて測定した。図３１に示される酵素によると、ＰＰＡＲαおよびγはエネルギー消費に関与する酵素の転写調節を担う酵素であり、ＡＭＰＫは細胞内のＡＭＰ／ＡＴＰ比の検知による細胞でのエネルギー恒常性の維持において中心的な役割を果たし、ＡＯＸは脂質代謝プロセスにおける特定のステップにて存在するアシルＣｏＡの酸化を介して酸化的リン酸化の活性化を触媒する。更に、ＣＰＴ１はエネルギー代謝に関与する酵素でもあり、トリアシルグリセロールの合成に向けての経路をとることなく長鎖アシルＣｏＡのミトコンドリアへの通過を可能にする酵素として周知である。ピラノ−１，２−ナフトキノンが投与された群においては、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）αのｍＲＮＡのレベルが変化しない一方で、ＰＰＡＲγはそのｍＲＮＡレベルにおいて約２倍の上昇を示した。更に、アシルＣｏＡオキシダーゼ（ＡＯＸ）、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）α１およびＡＭＰＫα２、並びにカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１の間においてはある程度のｍＲＮＡレベルでの差異があるとはいえ、ピラノ−１，２−ナフトキノンの投与群におけるかかる酵素のｍＲＮＡのレベルが対照群の場合と比べて上昇することが示された。かかる遺伝子の発現レベルの上昇は、ＮＱＯ１がエネルギー代謝に関連する疾患の治療におけるタンパク質標的としてありうるという可能性を示す。
【０１８５】
実施例１８：ＤＩＯマウスにおけるＳＩＲＴ関連転写因子の発現に対するＮＱＯ１活性化物質の効果
ピラノ−１，２−ナフトキノンをＤＩＯマウスに経口経路を介して５０ｍｇ／ｋｇの用量で毎日投与し、性腺脂肪組織内のサーチュイン（Ｓｉｒｔｕｉｎ）（ＳＩＲＴ）遺伝子の転写因子のレベルを、リアルタイム定量ＰＣＲを用いて投与の７、２８および５６日目に測定した。ＳＩＲＴ関連転写因子については、ヒトにおける転写因子として既知の７種が存在する。特に、ＳＩＲＴ１は寿命に関与する酵素として周知であり、カロリーが制限付きで消化される場合にＳＩＲＴ１が著しく増大することも報告されている。図３２から分かるように、実験群と対照群の間でのＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ５およびＳＩＲＴ７が示す差異が全く注目に値しない一方、ＳＩＴＲ１、ＳＩＲＴ３およびＳＩＲＴ６が有意に増大した。
【０１８６】
実施例１９：ＤＩＯマウスにおけるＵＣＰ１およびＵＣＰ２遺伝子の転写因子の発現に対するＮＱＯ１活性化物質の効果
ピラノ−１，２−ナフトキノンをＤＩＯマウスに経口経路を介して５０ｍｇ／ｋｇの用量で毎日投与し、肝組織および性腺組織における脱共役タンパク質１および２（ＵＣＰ１および２）遺伝子の転写因子のレベルを、リアルタイム定量ＰＣＲを用いて測定した。ＵＣＰ１および２は、発熱を介してエネルギーを消費する酵素であり、これらの酵素が反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成を伴うことなくエネルギーを消費するように機能し、肥満の発生率とも密接に相関することが報告されている。図３３に示されるように、ピラノ−１，２−ナフトキノンの投与により、ＵＣＰ１および２のｍＲＮＡレベルにおける有意な増大がもたらされている。これらの結果は、ＮＱＯ１が、エネルギー生成プロセスにおいて追加的に生成されるＲＯＳに起因するストレスの低下による代謝症候群の治療における安全な治療薬として有望であることを示す。
【０１８７】
実施例２０：様々な器官内でのグルコースおよび脂質代謝に関与する遺伝子の発現に対するＮＱＯ１活性化物質の効果
肝臓、骨格筋および白色脂肪組織（ＷＡＴ）内でのグルコースおよび脂質代謝に関与する遺伝子の発現に対するβＬの効果を検討するため、遺伝子発現マイクロアレイ分析およびマウスＡ４２用アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）ＧｅｎｅＣｈｉｐを用いて実験を行った。
【０１８８】
図３４は、賦形剤で処理されたマウスおよびβＬで処理されたマウスにおける指定の遺伝子の遺伝子発現率についてのＲＴ−ＰＣＲ定量の結果を示す。図３４−ｈおよび３４−ｉは、βＬで処理されたマウスにおけるミトコンドリア新生およびエネルギー代謝に関連する数種の遺伝子の発現が増大することを示す。例えば、βＬ処理が肝臓内および筋肉内（図３４−ｈおよび３４−ｉ）でのミトコンドリア新生に関与するＰＧＣ−１αおよびＮＲＦ−１の発現を有意に誘発し、ミトコンドリア遺伝子ＣＯＸ４、ＣＯＸ７、ＡＯＸ、ＵＣＰ２およびＵＣＰ３がβＬ処理群の筋肉内で強力に上方制御された（図３４−ｉ）。
【０１８９】
グルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ）２およびＧＬＵＴ４の発現がβＬで処理されたマウスの筋肉において誘発された（図３４−ｉ）。興味深いことに、重要なことにカロリー制限を担うＳｉｒｔ１およびＳｉｒｔ３が、βＬで処理されたマウスの筋肉およびＷＡＴにおいて誘発された（図３４−Ｉおよびｊ）。
【０１９０】
更に、βＬで処理されたマウスにおける脂肪組織内での脂肪分解遺伝子ＬＰＬおよびＡＴＧＬ、脂肪酸酸化遺伝子ＰＰＡＲαおよびＳＩＲＴ１、並びにグルコース取り込み遺伝子Ｇｌｕｔ２およびＧｌｕｔ４の発現が賦形剤で処理されたマウスにおける場合よりも高かった（図３４−ｊ）。
【０１９１】
実施例２１：ＤＩＯマウスでの体重および食餌摂取量における経時的変化に対するＮＱＯ１活性化物質の投与の効果
図３５は、ピラノ−１，２−ナフトキノンを肥満マウスに経口経路を介して５０ｍｇ／ｋｇの用量で毎日投与した後の５６日間の食餌摂取量／体重および重量変化における変化を示す。ピラノ−１，２−ナフトキノン投与群における食餌摂取量が最初の２週間で減少を示し、その後、食餌摂取レベルは対照群のレベル並みに回復した。これらの結果は、脂肪の分解の促進故に十分な量のエネルギーが生成されることに起因すると考えられる。更に、マウスに高脂肪食が与えられても、動物は対照群と比べて５６日間にわたる継続的な体重減少を示した。図３６における冠状断面および横断面のＭＲＩ画像で示されるように、かかる体重減少は皮下および内臓脂肪組織における減少に起因するものであった。
【０１９２】
図３７は、ピラノ−１，２−ナフトキノンのＣ５７ＢＬ／６  ＤＩＯへの５６日間の投与後での、処理群と対照群の間における様々な器官内での重量変化を比較するグラフである。図３７に示されるように、皮下脂肪、腸間膜脂肪、脂肪被膜および性腺脂肪の量がピラノ−１，２−ナフトキノンの投与後の最初の４週間にわたり漸減した後、残りの４週間は安定状態であった。
【０１９３】
図３８は、ピラノ−１，２−ナフトキノンのＣ５７ＢＬ／６  ＤＩＯマウスへの５６日間の投与後での動物の全開腹状態並びに肝組織内での脂肪蓄積に関するオイルレッドＯ染色およびＥＭ試験の結果について示す。
【０１９４】
図３８Ａから分かるように、ピラノ−１，２−ナフトキノンの５６日間の投与を受けたＣ５７ＢＬ／６  ＤＩＯマウスが、内臓脂肪および体重における著明な減少および赤色に変化した肝組織の大きさの減少を示した。脂肪肝の症状における改善を確認するため、肝臓内の蓄積脂肪を、オイルレッドＯ染色を用いて染色し、その結果、対照群と比べて脂肪が９０％以上減少していることを確認した（図３８Ｂ）。図３８Ｃは肝組織のＥＭであり、対照群と比べて脂肪胞およびグリコーゲン貯蔵における著明な低下、正常なミトコンドリアの形態の回復、ミトコンドリア数の有意な増加、および小胞体の形態の改善を示している。
【０１９５】
図３９に示されるように、未処理の動物の筋肉が腫脹、ミトコンドリアの拡大および不十分な数を呈する一方、βＬで処理されたＤＩＯマウスおよびｏｂ／ｏｂマウスが正常な形態およびミトコンドリアの数の増加を示した。更に、図４０に示されるように、βＬで処理されたＤＩＯマウスのヒラメ筋においてはタイプ１の筋線維の数が増加した。
【０１９６】
図４１は、ピラノ−１，２−ナフトキノンをＣ５７ＢＬ／６  ＤＩＯマウスに経口経路を介して５０ｍｇ／ｋｇの用量で毎日投与してから５６日目での、動物における開腹後の性腺脂肪組織のペリリピン染色の結果を示す。図４１から分かるように、脂肪細胞の大きさは著しく減少した。
【０１９７】
図４２は、ピラノ−１，２−ナフトキノンをＣ５７ＢＬ／６  ＤＩＯマウスに経口経路を介して５０ｍｇ／ｋｇの用量で毎日投与してから３、７、１４、２８および５６日目に回収した血中のトリグリセリド（ＴＧ）、コレステロール、遊離脂肪酸、グルコース、インスリン、ＴＮＦα、レジスチンおよびレプチンのレベルにおける変化を示す。同図から分かるように、血中の脂肪およびグルコースのレベルが有意に改善され、更にインスリン抵抗性およびレプチン抵抗性も改善された。更に、インスリン抵抗性を誘発するレジスチンの血中レベルも有意に改善された。これらの結果から、ピラノ−１，２−ナフトキノンが脂肪肝、高脂血症、ＩＩ型糖尿病およびインスリン抵抗性の治療において極めて有効となることが期待される。
【０１９８】
図４３は、ピラノ−１，２−ナフトキノンをＣ５７ＢＬ／６  ＤＩＯマウスに経口経路を介して５０ｍｇ／ｋｇの用量で毎日投与してから５６日目でのマウスの褐色脂肪組織のＨ＆Ｅ染色結果を示す。図４３から分かるように、脂肪細胞の大きさは著しく減少した。
【０１９９】
図４４は、ピラノ−１，２−ナフトキノンをＣ５７ＢＬ／６  ＤＩＯマウスに経口経路を介して５０ｍｇ／ｋｇの用量で毎日投与してから５６日目に採取した褐色脂肪組織のＥＭ試験の結果を示す。同図から分かるように、脂肪細胞の大きさは著しく減少した。
【０２００】
実施例２２：ＯＬＥＴＦラットのインスリン感受性およびグルコース寛容性における経時的変化に対するＮＱＯ１活性化物質の投与の効果
図４５は、賦形剤で処理されたＯＬＥＴＦラットおよびβＬで処理されたＯＬＥＴＦラットにおいて測定されたグルコース寛容性およびインスリン感受性を示すグラフである。グルコースおよびインスリンをｉ．ｐ．およびｉ．ｖ．でそれぞれ注射し、血中グルコースレベルを測定した。その結果、図４５ａおよび４５ｃと図４５ｂおよび４５ｄに示されるように、ＯＬＥＴＦラットはβＬ処理後の３日目および２１日目にグルコース寛容性およびインスリン感受性における改善を示した。
【０２０１】
実施例２３：ＮＱＯ１活性化物質の投与によるレプチン受容体の欠損した（ｏｂ／ｏｂ）マウスにおける変化
図４６および４７は、ピラノ−１，２−ナフトキノンをレプチン受容体の欠損した（ｏｂ／ｏｂ）マウスに経口経路を介して２００ｍｇ／ｋｇの用量で毎日投与して５６日間の食餌摂取量／体重における変化および体重における変化を示す。食餌摂取量／体重は投与の約１０日目に著しく減少し、その後、食餌摂取レベルが対照群のレベルの７０％に回復した。これらの結果は、ピラノ−１，２−ナフトキノンの投与によりレプチン受容体の欠損した（ｏｂ／ｏｂ）マウスにおいても体重が有効に減少することを示す。
【０２０２】
肝組織内での脂肪蓄積を試験するため、ピラノ−１，２−ナフトキノンの投与後の５６日目に動物を開腹し、肝組織上でＨ＆Ｅ染色およびＥＭ試験を行った。図４８は、肝組織上のＨ＆Ｅ染色の結果を通じ、脂肪胞のほぼ全部が対照群の場合と比べて消失していることを示す。かかる結果は、ピラノ−１，２−ナフトキノンの投与がレプチン受容体の欠損した（ｏｂ／ｏｂ）マウスにおける脂肪肝の治療においても極めて有効となるという予想を表している。図４９から、肝組織に対するＥＭ試験の結果は、対照群と比べて脂肪胞およびグリコーゲン貯蔵における著明な低下、正常なミトコンドリアの形態の回復、ミトコンドリア数の有意な増加および小胞体の形態の改善を示した。図５０から、動物の四肢の筋肉組織に対するＥＭ試験の結果は、対照群にて示されるミトコンドリアの奇妙な形態に対する処理群における正常なミトコンドリアの形態の回復、およびミトコンドリア数の有意な増加を示した。
【０２０３】
実施例２４：自発運動活性に対するＮＱＯ１活性化物質の効果
ピラノ−１，２−ナフトキノンをＣ５７ＢＬ／６  ＤＩＯマウスに投与し、３時間後、自発運動活性をＶｅｒｓａ  ＭＡＸ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒｓ  ＆  Ａｎａｌｙｚｅｒ（米国オハイオ州コロンバス（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ）のアキュスキャン・インスツルメンツ（ＡｃｃｕＳａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））を用いて測定した。動物の運動の測定に用いられるモニターは、赤外線をｘ軸およびｙ軸に沿って各々２．５ｃｍの間隔で装備する４１ｃｍｘ４１ｃｍのプレキシグラス（Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ）チャンバー（高さ：３０ｃｍ）であったが、それにより１６本の走査線の各々がチャンバーの前側／後側および右側／左側に並べられる。自発運動と常同／グルーミング行動を識別するため、マウスによって引き起こされる２つの異なる走査線の連続的干渉を有効な判定基準とすることにより動物の活動を測定した。ピラノ−１，２−ナフトキノン投与群、賦形剤投与群および対照群をそれぞれ各測定装置に入れ、動物の活動および運動を７時間測定した。動物を新しい環境に順応させるため、マウスを測定の２時間前に装置に入れた。このようにして得られた測定結果を図５１に示す。図５１に示されるように、賦形剤投与群および対照群は両者間で実質的な差異を全く示さなかったが、ピラノ−１，２−ナフトキノン投与群は動物の運動および活動において有意な差異を示した。
【０２０４】
実施例２５：身体耐久力の向上に対するＮＱＯ１活性化物質の効果
この実施例では、水泳試験を通じてマウスの身体耐久力における差異を測定しようとした。このため、水を９．５ｃｍの直径および２５ｃｍの高さを有する円筒状の餌入れ（ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ  ｔｒｏｕｇｈ）内に入れ、ピラノ−１，２−ナフトキノンをＣ５７ＢＬ／６  ＤＩＯマウスに投与した。３時間後、試料投与群および対照群を測定のために円筒状の餌入れの各々に同時に入れ、各群の身体耐久力を測定し、比較した。このようにして得られた結果を図５２に示す。図５２に示されるように、ピラノ−１，２−ナフトキノン投与群が、対照群と比べ、ピラノ−１，２−ナフトキノンの単回投与の場合であっても水泳時間が約２倍長くなることを示すことが確認された。
【０２０５】
実施例２６：呼吸商（ＲＱ）に対するＮＱＯ１活性化物質の効果
この実施例では、呼吸商（ＲＱ）の測定を介し、脂肪代謝に対するピラノ−１，２−ナフトキノンの効果について試験しようとした。酸素消費および二酸化炭素の生成についてＯｘｙｓｃａｎ開回路の間接熱量計（オハイオ州コロンバス（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ）のアキュスキャン・インスツルメンツ（ＡｃｃｕＳａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））を用いて測定した。この装置はアクリル製の閉鎖チャンバー（２１×２１×２１ｃｍ）からなるものであった。新鮮な空気を１５００ｍＬ／分の速度で各チャンバーに引き込み、次いでＯ２およびＣＯ２を検出器に通過させておいた。気体の濃度をｍＬ／ｋｇ体重／分で記録した。ＣＯ２の生成量（ＶＣＯ２）をＯ２の消費量（ＶＯ２）で除したものとしてＲＱを計算した。ピラノ−１，２−ナフトキノン投与群、賦形剤投与群および対照群を各装置に入れ、ＲＱを７時間測定した。動物を新しい環境に順応させるため、マウスを測定の２時間前に装置に入れた。図５３に示されるように、このように測定された結果では、ピラノ−１，２−ナフトキノン投与群がＲＱ値において賦形剤投与群および対照群と比べて有意な差異を示すことが確認されている。
【０２０６】
間接熱量測定では、夜間および昼間での酸素消費が増大し（図５４）、かつβＬで処理されたマウスにおけるエネルギー消費が対照群の場合と比べて増大すること（図５５）が示された。マウスを４℃の周囲温度に１２時間暴露した後、動物の平均体温の測定時に、βＬで処理されたマウスにおける低温に対する耐性が高まった（図５６）。
【０２０７】
実施例２７：体重減少に対するＮＡＤ＋投与の効果
この実施例では、ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比をインビボで上昇させることが可能な方法である、ＮＡＤ（Ｐ）＋の任意の外部供給により変化するインビボでのＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の効果について試験しようとした。１００ｍｇ／ｋｇのＮＡＤ＋をレプチン受容体の欠損した（ｏｂ／ｏｂ）マウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）経路を介して毎日投与した。対照マウス群に生理食塩水を同用量で腹腔内投与した。食餌摂取量／体重における変化（Ａ）および体重における変化（Ｂ）を３０日間測定した。
【０２０８】
図５７で示されるように、処理群の食餌摂取量／体重はＮＡＤ＋投与の約１０日目に著しく減少し、その後、動物が対照群と同様の食餌摂取量を示した。これは、処理群と対照群の間での食餌摂取量が類似するのに対し、ＮＡＤ＋投与群においては脂肪分解が促進され、それ故に十分な量のエネルギーが生成されたためである。更に、それらが遺伝的にレプチンの欠損したｏｂ／ｏｂマウスであるにしても、ＮＡＤ＋が投与されたマウスは対照群と比べて３０日間にわたる連続的な重量減少を示した。これらの結果は、ＮＡＤ（Ｐ）＋の処理により、レプチン受容体の欠損した（ｏｂ／ｏｂ）マウスの体重が、ＮＡＤ（Ｐ）＋の外部投与を介するＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比の上昇によって有効に減少しうることを示す。
【０２０９】
実施例２８：体重減少に対するＮＱＯ１活性化物質ジメチルフマレート（ＤＭＦ）の投与の効果
図５８は、ＮＱＯ１活性化物質ジメチルフマレート（ＤＭＦ）のレプチン受容体の欠損したｏｂ／ｏｂマウスへの投与後での体重および食餌摂取量における変化を示す。２００ｍｇ／ｋｇのＤＭＦをレプチン受容体の欠損した（ｏｂ／ｏｂ）マウスに経口経路を介して毎日投与した。対照群には生理食塩水を同用量で毎日、腹腔内投与した。体重における変化（Ａ）および食餌摂取量における変化（Ｂ）を３０日間測定した。処理群の食餌摂取量が対照群の６０〜７０％レベルに調節されることが確認された。これらの結果は、ＮＱＯ１活性化物質ジメチルフマレート（ＤＭＦ）の投与によりレプチン受容体の欠損した（ｏｂ／ｏｂ）マウスの体重が有効に減少することを示す。
【０２１０】
実施例２９：ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの低下および体重減少に対して様々なＮＱＯ１を活性化する候補化合物の効果があるか否かについての実験
下記の表１に挙げる種々のＮＱＯ１を活性化する候補化合物においては、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの低下を上記の実験方法（上記セクション１０で開示：ＮＡＤＨリサイクリングアッセイ）に基づいて測定した。更に、実施例２３で示した実験方法により、４週後にｏｂ／ｏｂマウスの体重を測定した。
【０２１１】
このようにして得られた結果を下記の表１に示す。これに関連し、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの低下度を、ＮＱＯ１活性化物質ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの不在下でのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量を１００にすることによる、ＮＱＯ１を活性化する候補化合物の投与時に測定されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの相対量として表した。更に、体重減少の程度を、ＮＱＯ１を活性化する候補化合物の投与を受けたｏｂ／ｏｂマウスの体重の、４週後にＮＱＯ１を活性化する候補化合物の投与を受けていないｏｂ／ｏｂマウスの体重（対照）に対する百分率として表した。
【０２１２】
【表２】
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【０２１３】
表１から分かるように、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの低下が有意な体重減少を伴った。特に、４−置換−１，２−ナフトキノン、例えば２−メチル−２，３−ジヒドロ−ナフト［１，２−ｂ］フラン−４，５−ジオン、２，３，３−トリメチル−２，３−ジヒドロ−ナフト［１，２−ｂ］フラン−４，５−ジオン、２，２−ジメチル−２，３−ジヒドロ−ナフト［１，２−ｂ］フラン−４，５−ジオン、２，２，３−トリメチル−２，３−ジヒドロ−ナフト［１，２−ｂ］フラン−４，５−ジオン、２，２−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｈ］クロメン−５，６−ジオン、または１０−イソプロピル−７ａ−メチル−７ａ，８，９，１１ａ−テトラヒドロ−７Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−５，６−ジオンの投与により、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの有意な低下、ひいては体重減少がもたらされることが確認されうる。
【産業上の利用可能性】
【０２１４】
上記から明らかなように、本発明によると、ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比をインビボまたはインビトロでＮＱＯ１などのオキシドレダクターゼの活性化を介して上昇させることにより、肥満、糖尿病、代謝症候群、変性疾患およびミトコンドリア機能障害に関連する疾患を含む様々な疾患を治療しかつ生物の運動活性および耐久力を増大させることが可能である。更に、標的としてＮＱＯ１タンパク質および遺伝子を用い、ＮＡＤ（Ｐ）＋／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比を上昇させることが可能な薬剤化合物をスクリーニングしかつ開発することが可能である。
【０２１５】
本発明の好ましい実施形態が例示目的で開示されているが、当業者は添付の特許請求の範囲にて開示される本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく様々な改良、付加および置換を行うことが可能であることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２１６】
【図１】ＮＱＯ１による細胞内のＮＡＤＨ濃度の変化を示すグラフである。
【図２】ＮＱＯ１−活性化酵素の存在／不在におけるＮＱＯ１の活性を示す棒グラフである。
【図３】ＮＱＯ１活性の存在／不在における細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ蛍光濃度の変化を示す図面である。
【図４】ＮＱＯ１遺伝子の存在／不在におけるＨＥＫ細胞のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ蛍光濃度の変化を示す図面である。
【図５】ジクマロールの処理による細胞内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ蛍光濃度の変化を示す図面である。
【図６】少脂肪マウスおよびＤＩＯマウスの組織内で測定されたＮＱＯ１の量および活性を示す棒グラフである。
【図７】ＮＱＯ１活性化物質による細胞内のＡＴＰ濃度の変化を示す棒グラフである。
【図８】ＮＱＯ１による細胞内のエネルギー濃度の経時的変化を示すグラフである。
【図９】インビボでのＮＱＯ１活性化物質によるＡＭＰ／ＡＴＰ、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ比の変化を示す棒グラフである。
【図１０】ＮＱＯ１活性化物質の少脂肪マウスおよびＤＩＯマウスへの各投与後におけるＡＭＰ／ＡＴＰの経時的変化を示す棒グラフである。
【図１１】ＮＱＯ１活性化物質の少脂肪マウスおよびＤＩＯマウスへの各投与後におけるＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比の経時的変化を示す棒グラフである。
【図１２】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける脂肪酸のβ酸化に対するＮＱＯ１の効果を示す棒グラフである。
【図１３】ＡＣＣ、ＣＰＴおよびＨＡＤの活性並びにＤＩＯマウスにおけるマロニル−ＣｏＡおよび１４Ｃパルミトイル−ＣｏＡの酸化に対するＮＱＯ１活性化物質の効果を示す棒グラフである。
【図１４】細胞内でのＡＭＰＫおよびＡＣＣのリン酸化の調節に対するＮＱＯ１の効果を示す写真である。
【図１５】ＤＩＯマウスの肝臓、ＷＡＴ、ＥＤＬおよびヒラメ筋において測定されたＡＭＰＫαおよびＡＣＣのリン酸化を示す写真である。
【図１６】ＡＭＰＫのリン酸化に対するＮＱＯ１の効果を示す写真である。
【図１７】ＡＭＰＫαおよびＡＣＣのリン酸化に対するＮＱＯ１活性化物質の効果を示す写真である。
【図１８】ＡＭＰＫおよびＡＣＣの活性に対するＮＱＯ１活性化物質の効果を示す棒グラフである。
【図１９】細胞内のカルシウム濃度の変化に対するＮＱＯ１の効果を示すグラフである。
【図２０】ＴＭＲＥ蛍光および共焦点顕微鏡を用いて測定されたミトコンドリア膜電位におけるリアルタイム変化を示すグラフである。
【図２１】細胞質（［Ｃａ２＋］ｃ）内およびミトコンドリア（［Ｃａ２＋］ｍ）内でのＣａ２＋イオンの濃度をそれぞれ表すＦｌｕｏ４およびＲｈｏｄ−２−ＡＭ蛍光の測定結果を示すグラフである。
【図２２】クラーク型酸素電極を用いてのミトコンドリアの酸素消費の監視結果を示すグラフである。
【図２３】ＮＱＯ１とＡＭＰＫα、βまたはγとの結合を確認する写真である。
【図２４】内皮の一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）のリン酸化に対するＮＱＯ１活性化物質の効果を示す写真である。
【図２５】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡＭＰＫの活性化に対するＮＱＯ１活性化物質の効果を示す棒グラフである。
【図２６】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡＭＰＫおよびＡＣＣリン酸化に対するＮＱＯ１活性化物質の効果を示す写真である。
【図２７】ＤＩＯマウスの様々な器官におけるＡＭＰＫ活性に対するＮＱＯ１活性化物質の効果を示す棒グラフである。
【図２８】Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脂肪代謝に関与するタンパク質の転写産物発現に対するＮＱＯ１活性化物質の効果を示す棒グラフである。
【図２９】Ｃ５７ＢＬ／６マウスのグルコース代謝に関与するタンパク質の転写産物発現に対するＮＱＯ１活性化物質の効果を示す棒グラフである。
【図３０】Ｃ５７ＢＬ／６マウスのミトコンドリア新生に関与するタンパク質の転写産物発現に対するＮＱＯ１活性化物質の効果を示す棒グラフである。
【図３１】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるエネルギー代謝に関与するタンパク質の転写産物発現に対するＮＱＯ１活性化物質の効果を示す棒グラフである。
【図３２】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＳＩＲＴ関連タンパク質の転写産物発現に対するＮＱＯ１活性化物質の効果を示す棒グラフである。
【図３３】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＵＣＰ１およびＵＣＰ２遺伝子の転写産物発現に対するＮＱＯ１活性化物質の効果を示す棒グラフである。
【図３４】様々な器官内の指定される遺伝子の遺伝子発現率に対するＮＱＯ１活性化物質の効果を示す棒グラフである。
【図３５】ＮＱＯ１活性化物質のＣ５７ＢＬ／６  ＤＩＯマウスへの投与後での体重および食餌摂取量における経時的変化を示すグラフである。
【図３６】未処理の少脂肪マウス群（ｎ＝５）、未処理のＤＩＯマウス群（ｎ＝１０）、賦形剤で処理されたＤＩＯマウス群（ｎ＝１０）およびβＬで処理されたＤＩＯマウス群（ｎ＝１０）（８週間の処理後に開腹）における内臓脂肪を示すＭＲＩである。
【図３７】ＮＱＯ１活性化物質のＤＩＯマウスへの投与後における非処理群、処理群および対照群の間での様々な器官内での重量変化を比較するグラフである。
【図３８】ＮＱＯ１活性化物質のＣ５７ＢＬ／６  ＤＩＯマウスへの投与後における動物の全開腹状態並びに肝組織内の脂肪蓄積に対するオイルレッドＯ染色およびＥＭ試験の結果を示す写真である。
【図３９】賦形剤で処理されたＤＩＯマウスおよびβＬで処理されたＤＩＯマウスにおけるヒラメ筋についてのＥＭ試験の結果および分析を示す顕微鏡写真である。
【図４０】賦形剤で処理されたＤＩＯマウスおよびβＬで処理されたＤＩＯマウスにおけるタイプ１のヒラメ筋線維のＥＭである。
【図４１】ＮＱＯ１活性化物質のＣ５７ＢＬ／６  ＤＩＯマウスへの投与後における性腺脂肪組織内の脂肪細胞の大きさの比較結果を示す写真である。
【図４２】代謝パラメーター（ＴＧ、総コレステロール、遊離脂肪酸、グルコース、インスリン、ＴＮＦα、アディポネクチン、レジスチン、レプチンなど）に対するＮＱＯ１活性化物質の効果を示すグラフである。
【図４３】ＮＱＯ１活性化物質のＣ５７ＢＬ／６  ＤＩＯマウスへの投与後における褐色脂肪組織のＨ＆Ｅ染色の比較結果を示す写真である。
【図４４】ＮＱＯ１活性化物質のＣ５７ＢＬ／６  ＤＩＯマウスへの投与後における褐色脂肪組織のＥＭである。
【図４５】賦形剤またはβＬで処理されたＯＬＥＴＦラットにおけるグルコース寛容性およびインスリン感受性を示すグラフである。
【図４６】ｏｂ／ｏｂマウスに対する賦形剤またはβＬの処理後における食餌摂取量／体重における変化を示すグラフである。
【図４７】ｏｂ／ｏｂマウスに対する賦形剤またはβＬの処理後における体重における変化を示すグラフである。
【図４８】ｏｂ／ｏｂマウスに対する賦形剤またはβＬの処理後における脂肪蓄積量および組織を示すＥＭであり、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された肝組織の顕微鏡写真（スケールバー、１００μｍ）である。
【図４９】ｏｂ／ｏｂマウスに対する賦形剤またはβＬの処理後における脂肪蓄積量および組織を示すＥＭであり、肝組織のＴＥＭ分析を示す顕微鏡写真（スケールバー、５μｍ）である。
【図５０】ｏｂ／ｏｂマウスに対する賦形剤またはβＬの処理後における脂肪蓄積量および組織を示すＥＭであり、ＥＤＬ筋肉組織のＴＥＭ分析を示す顕微鏡写真（スケールバー、２０μｍ）である。
【図５１】ＮＱＯ１活性化物質のＣ５７ＢＬ／６  ＤＩＯマウスへの投与後における自発運動活性に対するＮＱＯ１活性化物質の効果を示すグラフである。
【図５２】ＮＱＯ１活性化物質のＣ５７ＢＬ／６  ＤＩＯマウスへの投与後における身体耐久力の増進に対するＮＱＯ１活性化物質の効果を示すグラフである。
【図５３】ＮＱＯ１活性化物質のＣ５７ＢＬ／６  ＤＩＯマウスへの投与後における呼吸商（ＲＱ）に対するＮＱＯ１活性化物質の効果を示すグラフである。
【図５４】間接熱量測定による、賦形剤またはβＬで処理された動物におけるＶＯ２の測定結果を示すグラフである。
【図５５】間接熱量測定による、賦形剤またはβＬで処理された動物におけるエネルギー消費の測定結果を示すグラフである。
【図５６】賦形剤またはβＬで処理された動物において測定された平均体温を示すグラフである。
【図５７】レプチン受容体の欠損したｏｂ／ｏｂマウスへのＮＡＤ＋の投与後での体重および食餌摂取量における変化を示すグラフである。
【図５８】レプチン受容体の欠損したｏｂ／ｏｂマウスへのジメチルフマレートの投与後での体重および食餌摂取量における変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１８】
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【図２５】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３７】
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【図４２】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５８】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２６】
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【図３６】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５７】
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【国際調査報告】
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