(57)【要約】  本発明は、複数の標的分子がマイクロアレイの捕獲分子へ結合する間の、標的分子のリアルタイム定量化をモニターするための方法と装置に関する。本方法は、以下の工程を含む：支持体の特異的局在領域（２１）中に固定された少なくとも５種の捕獲分子（２０）を含むマイクロアレイが表面に固着した、前記支持体（１５）を、反応槽（１４）中に設置する工程；ラベルされた標的分子（１３）溶液を槽（１４）中へ導入する工程；前記標的と捕獲分子の間の結合を可能にする安定な制御された温度条件下で、前記ラベルされた標的分子をインキュベーションする工程；発光源（１）からの励起光（２）をマイクロアレイの表面上へ向ける工程；結合した標的分子からの、前記励起光に応じた電磁光放射（７）を、標的分子を含む溶液の存在下で測定する工程であって、各局在領域の放射表面は約０．１μm2〜１０mm2を含み、また少なくとも４つの局在領域の各々を経時的にモニターし、各局在領域（２１）につき少なくとも２回の測定を行う工程；および 種々の測定値を処理し記憶し、各前記標的に対して少なくとも１つの測定値を用いて、溶液中に存在する少なくとも４種の異なる標的分子を定量する工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロアレイ上での複数標的分子のリアルタイム定量化のための、以下の工程を含む方法：
それぞれが支持体の特異的局在領域（２１）中に固定された少なくとも５種の捕獲分子（２０）を含むマイクロアレイがその表面に固着した前記支持体（１５）を、反応槽（１４）中に設置する工程；
ラベルされた標的分子（１３）を含む溶液を、反応槽（１４）中へ導入する工程；
前記ラベルされた標的分子（１３）を、前記標的（１３）とそれらの対応する捕獲分子（２０）の間の特異的結合を可能にする条件下でインキュベーションする工程；
光源（１）からの励起光（２）を支持体の表面上へ向ける工程；
結合した標的分子からの、前記励起光（２）に応じた光放射（７）を、標的分子（１３）を含む溶液の存在下で測定する工程であって、１つの局在領域の放射表面は約０．１μm2〜約１０mm2を含み、少なくとも４つの局在領域の各々を経時的にモニターし、各局在領域（２１）につき少なくとも２回の測定を行う工程；および
種々の測定値を処理し記憶し、各前記標的に対して少なくとも１つの測定値を用いて、溶液中に存在する少なくとも４種の異なる標的分子を定量する工程。
【請求項２】
インキュベーションシステムが、マイクロアレイに接している溶液の厚みが全ての局在領域上で一定になるような条件を提供する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
２つの局在領域の上の液体の厚みの差異が、１００μm未満であり、好ましくは１０μm未満であり、またさらに１μm未満である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
マイクロアレイに接している溶液の厚みが、２回の測定間で変更される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
標的分子が蛍光色素、好ましくはシアニン３でラベルされる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
標的分子が、核酸、相同ヌクレオチド配列、またはタンパク質から成る群より選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項７】
タンパク質が、抗体、抗原、リガンド、レセプターから成る群より選ばれる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
結合反応の間の温度が、５℃未満の、好ましくは１℃未満の温度変化で一定に保持される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
測定が、１分間〜２４時間で行なわれる、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
温度が、計算期間の間、好ましくは計算期間の間少なくとも１分間、より好ましくは計算期間の間１〜６０分間、一定に保持される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
検出溶液中の標的分子の濃度が、約０．０００１〜約１０００nM、好ましくは約０．００１〜約１０nMである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
支持体（１５）が、捕獲分子がその上に固定されている基板を含み、基板は好ましくはガラスである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
マイクロアレイが２０を超え１０００未満の異なる捕獲分子を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
捕獲分子が、物理的手段により基板上に付着されるか、または基板上の予め規定された位置にインサイチューで合成される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
捕獲分子が、基板上の規定された位置に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
標的を検出するための局在領域の放射表面が、１μm2〜１mm2を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
捕獲分子を保持する支持体の表面が、３次元構造を有する、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
支持体が、物理的な境界によって分離された数個のマイクロアレイを有する、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
支持体がマルチウエル形式を有する、請求項２７記載の方法。
【請求項２０】
溶液中に存在する標的濃度の計算が、標的が特異的な方式で結合する局在領域において経時的に出現する信号の、反応速度係数の計算から；または、標的が特異的に結合する局在領域において経時的に得られる少なくとも３つの値から得られる信号の一次反応速度係数から、導出される、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
標的分子を含む溶液が、２回以上の測定の間に少なくとも２の、好ましくは３の異なる温度を有する温度サイクルに付される、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
温度サイクルおよび反応条件がＰＣＲを生じさせる、請求項３１の方法。
【請求項２３】
標的分子のハイブリダイゼーションのための最適なインキュベーション条件を決定するための、以下の工程を含む方法：
−  それぞれが支持体の特異的局在領域（２１）中に固定された少なくとも５種の捕獲分子（２０）を含むマイクロアレイがその表面に固着した前記支持体（１５）を、反応槽（１４）中に設置する工程；
−  ラベルされた標的分子（１３）を含む溶液を反応槽（１４）中へ導入する工程；
−  前記ラベルされた標的分子（１３）を、前記標的（１３）とそれらの対応する捕獲分子（２０）の間の特異的結合を可能にする条件下でインキュベーションする工程；
−  光源（１）からの励起光（２）を支持体の表面上へ向ける工程；
−  結合した標的分子からの、前記励起光（２）に応じた光放射（７）を、標的分子（１３）を含む溶液の存在下で測定する工程であって、１つの局在領域の放射表面が約０．１μm2〜１０mm2を含み、また少なくとも５つの局在領域の各々を経時的にモニターし、各局在領域（２１）につき少なくとも２回の測定を行う工程；および
−  種々の測定値を処理し記憶し、各前記標的に対して少なくとも１つの測定値を用いて、溶液中に存在する少なくとも５種の異なる標的分子を定量する工程。
【請求項２４】
標的配列と少なくとも１つのヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列の結合に対して非常に高い識別能力を有する特異的捕獲分子上の標的分子の、高い結合効率の決定のための方法であって、以下の工程を含む方法：
−  それぞれが支持体の特異的局在領域（２１）中に固定された少なくとも５種の捕獲分子（２０）を含むマイクロアレイがその表面に固着した前記支持体（１５）を、反応槽（１４）中に設置する工程；
−  ラベルされた標的分子（１３）を含む溶液を反応槽（１４）中へ導入する工程；
−  前記ラベルされた標的分子（１３）を、前記標的（１３）とそれらの対応する捕獲分子（２０）の間の特異的結合を可能にする条件下で、インキュベーションする工程；
−  光源（１）からの励起光（２）を支持体の表面上へ向ける工程；
−  結合した標的分子からの、前記励起光（２）に応じた光放射（７）を、標的分子（１３）を含む溶液の存在下で測定する工程であって、１つの局在領域の放射表面が約０．１μm2〜１０mm2を含み、少なくとも５つの局在領域の各々を経時的にモニターし、各局在領域（２１）につき少なくとも２回の測定を行う工程；および
−  種々の測定値を処理し記憶し、各前記標的に対して少なくとも１つの測定値を用いて、溶液中に存在する少なくとも５種の異なる標的分子を定量する工程。
【請求項２５】
標的配列中のＳＮＰを検出するためのハイブリダイゼーション条件を最適化するための、または同じ溶液中に存在する可能性のある複数標的配列中のＳＮＰのハイブリダイゼーションおよび検出の条件を最適化するための、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ラベルされた複数の標的分子（１３）をマイクロアレイ上でリアルタイム定量化するための、２つの部分を含む装置であって、
第１の部分は：
−  支持体の特異的局在領域（２１）に固定された少なくとも５種の捕獲分子（２０）を含み、前記ラベルされた標的分子（１３）と流体連絡しているマイクロアレイが表面上に固着した、前記支持体（１５）、
−  場合により、前記支持体を保持するための保持器（１２）、
−  温度制御システム（１６〜１７）；
から構成され、
第２の部分は：
−  励起光源（１）、
−  前記励起光源（１）からの励起光（２）を前記支持体上に向けて集束させ、励起光を４５〜１３５°の間に含まれる角度内のマイクロアレイ表面に到達させるための光学系、
−  前記励起光に応じて、放射表面が約０．１μm2〜約１０mm2を含む局在領域中の結合した標的分子からの電磁光放射（７）を、標的分子を含む溶液の存在下で測定するための検出器（１０）、
を含む、装置。
【請求項２７】
第２の部分が、さらに以下の部分を含む請求項２６記載の装置：
−  支持体の少なくとも５つの局在領域についての異なる測定データを記憶するための記憶システム、
−  マイクロアレイの各局在領域に対して励起、検出、および記憶の工程を少なくとも２回繰り返す制御器（１１）、
−  前記各標的につき少なくとも１つの測定値を用いて、溶液中に存在する少なくとも５種の異なる標的分子を記憶し定量するためのプログラム。
【請求項２８】
２つの部分が統合されている、または、
２つの部分が物理的に分離されている、または
プログラムがコンピューターの一部である、または
励起光がレーザービームである、または
インキュベーションシステムが、マイクロアレイに接する溶液の厚みを全ての局在領域上で一定にする条件を提供する、または
２つの局在領域間の液体の厚みの差異が、好ましくは１００μm未満、さらに１０μm未満、および１μm未満でさえある、または
インキュベーションシステムが、マイクロアレイに接する溶液の厚みが、２回の測定の間で変化するような条件を提供する、または
第１の部分がさらに流体混合システムを含む、または
マイクロアレイが少なくとも１の貯蔵器（１９）と流体連絡している、
請求項２６記載の装置。
【請求項２９】
励起光（２）を、液体を横切らずに支持体に向けて集束させる、または励起光（２）を、液体を通して支持体に向けて集束させる、請求項２６記載の装置。
【請求項３０】
支持体（１５）が、捕獲分子がその上に固定された基板を含む；または、マイクロアレイが、２０種を超え１０００種未満の異なる捕獲分子を含む；または、捕獲分子が、物理的手段によって基板上に付着されている；または、捕獲分子が、基板上の予め定められた位置で、インサイチュウで合成される；または、捕獲分子が、基板上の定められた位置に存在する、請求項２６記載の装置。
【請求項３１】
同一の分析で、溶液中に存在する１０００種を超える標的分子を定量する、請求項１記載の方法。
【請求項３２】
溶液中に存在する１〜１０００種の標的分子を、好ましくは１〜２０種を、より好ましくは１〜５種の標的分子を、同一分析で定量する、請求項１記載の方法。
【請求項３３】
測定が、二重鎖型であるラベルされた標的分子（１３）について行なわれる、請求項１記載の方法。
【請求項３４】
検出する標的が、溶液中の１nM未満の濃度のヌクレオチド分子である、請求項１記載の方法。
【請求項３５】
検出する標的が、溶液中の１μM未満の濃度の抗原または抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項３６】
励起光（２）が、支持体の表面に直接向けられる、請求項１記載の方法。
【請求項３７】
励起光（２）が、マイクロアレイの表面に向けられ、集束されるレーザービームである、請求項１記載の方法。
【請求項３８】
励起光（２）が、溶液を通してマイクロアレイの表面に向けられ、集束される、請求項１記載の方法。
【請求項３９】
励起光が、支持体を通してアレイの表面に表面に向けられ、集束される、請求項１記載の方法。
【請求項４０】
レーザービームが、アレイの表面を走査する、請求項１記載の方法。
【請求項４１】
放射光が、共焦点光として検出され、光電子増倍管による増幅の後に測定される、請求項１記載の方法。
【請求項４２】
マイクロアレイ上での複数の標的分子のリアルタイム定量化のための方法であって、以下の工程を含む方法：
−  それぞれが支持体の特異的局在領域（２１）中に固定された少なくとも５種の捕獲分子（２０）を含むマイクロアレイがその表面に固着した前記支持体（１５）を、反応槽（１４）中に設置する工程；
−  ラベルされた標的分子（１３）を含む溶液を反応槽（１４）中へ導入する工程；
−  前記ラベルされた標的分子（１３）を、前記標的（１３）とそれらの対応する捕獲分子（２０）の間の特異的結合を可能にする条件下でインキュベーションする工程；
−  光源（１）からの励起光（２）を支持体の表面上へ向ける工程；
−  結合した標的分子からの、前記励起光（２）に応じた光放射（７）を、標的分子（１３）を含む溶液の存在下で測定する工程であって、１つの局在領域の放射表面が約０．１μm2〜１０mm2を含み、少なくとも５つの局在領域（２１）の各々を経時的にモニターし、各局在領域（２１）につき少なくとも２回の測定を行う工程；および
−  少なくとも５つの局在領域についての種々の測定値を処理し記憶し、各前記標的に対して少なくとも１つの測定値を用いて、溶液中に存在する標的分子を定量する工程。
【請求項４３】
特異的な捕獲プローブと突然変異を有する捕獲プローブとの間の信号の識別能力が、５、好ましくは１０より高い、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項４４】
ラベルされた複数の標的分子（１３）のマイクロアレイ上でのリアルタイム定量化のための装置であって：
−  支持体の特異的局在領域（２１）中に固定された少なくとも１つの捕獲分子（２０）を含み、前記ラベルされた標的分子（１３）と流体連絡しているマイクロアレイがその表面に固着した、前記支持体（１５）；
−  場合により、前記支持体を保持するための保持器（１２）；
−  電子的温度制御システム（１６〜１７）；
−  励起光源（１）；
−  前記励起光源（１）からの励起光（２）を前記支持体上に直接向けて集束させ、励起光を４５〜１３５°の間に含まれる角度内のマイクロアレイ表面に到達させるための光学系；
−  標的分子を含む溶液の存在下で、結合した標的分子からの前記励起光に応じた、局在領域の放射表面が約０．１μm2〜約１０mm2を含む電磁光放射（７）を測定するための検出器（１０）；
を含み、
標的分子溶液を支持体と調節された温度で流体連絡するように保ちながら、アレイの光放射を読み取るために、種々の部分が同一の装置へ統合された、
装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数標的分子の、マイクロアレイの捕獲分子への定量的結合を、リアルタイムでモニターするための方法および装置に関する。より詳細には、本発明は、マイクロアレイ上にスポットされた捕獲ＤＮＡ分子と、溶液中に存在する蛍光ラベルされたＤＮＡなどの試料ヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションを、リアルタイムで検出する工程を含む。
【０００２】
最小量の試料について最大限の情報を得ることが、分析科学の主な目的の１つである。これは特に、高度な平行分析の需要が存在する分子生物学およびすべての分子に基礎を置く生命科学において正しい。マイクロアレイ技術はこの要求への１つの答えである。それは、同一の溶液中で同時に行われる結合事象の大量並行測定および多重測定を可能にする。マイクロアレイは、通常、それぞれが同一の分子、即ち捕獲分子として作用する核酸またはタンパク質、を含む多くの微視的スポットを含む。スポットの数は１００未満から数千まで変化し得る。分子を固体の支持体に、好ましくは共有結合による接着により固定する。マイクロアレイ実験の第１の作業は、多くの結合事象を同時に検出することである。
【０００３】
高感度を提供するという理由で、蛍光が大部分の応用において結合事象を検出するためのラベルとして用いられる。実験を行う前に、適当な蛍光色素によって試料をラベルしなければならない。別個のインキュベーション工程で結合を行い、最終結果を、適切にマイクロアレイを洗浄し乾燥させた後に得る。マイクロアレイリーダーは、通常は結合過程の所定の時間に、それは理想的には熱力学的平衡に達した後の時間であるが、蛍光強度に関する情報を得る。しかし、チップ実験で採用される従来の条件下では、熱力学的平衡を得るのは難しく、反応速度、拡散定数および捕獲分子の濃度の差などのいくつかの制限のために、数桁は変化する可能性のある様々な濃度で生体試料中に存在する種々の標的が、熱力学的平衡に同時に到達することはない。
【０００４】
固定した実験設定では、捕獲分子に結合する標的の量が溶液濃度に正比例するような実験条件を決めることは、ほとんど不可能である。
【０００５】
マイクロアレイ上の結合工程に続く定量化工程は、洗浄の数工程の後に行なわれるが、これは、結合反応の速度などの、標的試料に関するいくつかの本質的な情報が確実に失われることを意味する。単一の試料中に存在する種々の標的の濃度依存的結合の問題に対する１つの解答は、溶液中に存在する個々の標的についての結合反応のリアルタイムでの観察であろう。
【０００６】
Bier et al.（2004, Anal. Bioanal. Chem., 378, 52-53）は、マイクロアレイ上のリアルタイム分析を可能にするためには、流体取扱い方法を統合された検出体系と組み合わせる必要があることを教示する。ラベルされた二本鎖ＤＮＡを有するスポット上での、リアルタイムの酵素反応の例が示されている。固定されたＤＮＡが、酵素を結合するレセプター、および酵素活性によって切断される基質、の両方として働く。補助因子Ｍｇ2+を加えた後で、ＤＮＡが酵素によって切断されたスポットが、蛍光強度の減少により同定される（ネガティブアッセイ）。
【０００７】
Bier and Kleinjung (2001, Fresenium J. Anal. Chem., 371, 151-156)は、マイクロアレイの各スポットの融解曲線を得ることにより、ハイブリダイゼーションの反応速度を主として解離段階において測定することを提案している。同じアイデアに従って、ＵＳ−Ｐ−６，５８９，７４０は、チップ上での蛍光標的のハイブリダイゼーション反応を検出する手段を開示している。容器に洗浄溶液を流し込みながら、バイオチップの温度を変化させながら、所定のタイミングで反応の画像を得る。温度を上昇させながらチップを洗浄することにより、融解曲線を得る。温度が上昇するとともに、より弱い結合能力を有する試料ＤＮＡがプローブＤＮＡから解離し始め、解離した試料ＤＮＡが洗浄溶液によってスポットから取り除かれる。従って、ハイブリダイズした蛍光ラベル試料ＤＮＡの量が時間経過と共に減少し、蛍光強度も同じく減少する。
【０００８】
ＵＳ−Ｐ−６，４１６，９５１は、リアルタイムでＲＮＡとポリヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションの反応速度を測定する別の方法を教示する。反応速度を、インターカレーション色素の存在下でハイブリダイダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーションの進行と共に起こる色素の分光学的性質の変化を記録すること、あるいは、ＲＮＡまたはプローブのいずれかにラベルを組み入れ、固体の支持体に非ラベル分子を付着させ、非ラベル分子の近接部でエバネッセント波を生成させ、エバネッセント波とラベルとの相互作用によって生成される信号の増加をハイブリダイゼーションの進行と共に記録すること、のいずれかにより測定する。
【０００９】
ＷＯ９９２０７８９は、エバネッセント波の生成に基づいて、導波管表面に置かれた複数のＤＮＡ捕獲帯に吸着された微粒子ラベルから光を散乱させる方法を開示している。エバネッセント波は、導波管表面から数百ナノメーターのみに広がるので、結合していない／解離したラベルは光を散乱させないため、洗浄工程は必要でない。光を散乱させるラベルの脱離をリアルタイムで研究することができる。
【００１０】
核酸の相互作用のリアルタイム検出を、全反射蛍光（Lehr et al. 2003, Anal. Chem. 75, 2414-20）によっても得ることができる。全反射蛍光（ＴＩＲＦ）の原理は、明・暗領域の交代パターンおよび能動的センサー領域の一様なエバネッセント光に基づく。
【００１１】
ＷＯ０３／０５２４２１が、核酸検出をモニターするための電気化学分析装置について記述する。装置は、複数のプローブが接着され、熱センサーが組み込まれた金の電極から作られたバイオセンサーを含む。分子相互作用の分析は、電気的検出に基づいて、バイオセンサー部位で行われる。
【００１２】
Wie et al. (2003, Biosensors and Bioelectronics, 18, 1157-1163) は、アルキル修飾されたシリコン表面上のＤＮＡハイブリダイゼーションを、リアルタイム電気容量測定によってモニターすることを提案している。
【００１３】
McQuain et al. (2004 Analytical Biochemistry 325,215-216) は、液体のカオス的移流に基づく流体ミキサーを用いることにより、マイクロアレイハイブリダイゼーション速度を増加させることを提案している。彼らは、インキュベーションおよび混合をその上で行なうミキサーを提案している。スライドガラスを、次に所定時間後に洗浄し、ハイブリダイズした標的の測定のために、分離したスキャナで処理する。
【００１４】
本発明の根底に存在する問題は、先行技術の方法に伴う欠点を除去して、標的プローブの捕獲分子との結合をリアルタイムで定量するための、改良された方法を提供することである。具体的には、方法は、実行が簡単で費用効果がよくなければならない。
【００１５】
本発明は、マイクロアレイ上での複数の標的分子の同時定量化のための、単純で有効な方法および装置を提案することにより、これらの制限のほとんどを克服することを目標とする。本発明は、本発明中に記述される決定的な改良の一部である定量的測定により、溶液中に存在するラベルされた標的の存在下で、標的の結合過程を連続モニターするための方法および装置を提案する。この方法はまた、ＰＣＲ増幅とオンラインであるなどのより複雑な実験設定において役立ち、またはタンパク質の親和性測定のような機能的な研究に適用可能である。
【００１６】
この方法は、溶液中に存在するラベルされた分子の存在下で、捕獲分子に結合したフェムトモル以下の標的分子をリアルタイムで検出することを可能にする。上述の目的を実現するために、マイクロアレイ上の溶液中に存在する複数のラベルされた標的分子（１３）のリアルタイムの定量化のための本発明の方法は、以下の工程を含む：
−  それぞれが支持体の特異的局在領域（２１）中に固定された少なくとも５種の捕獲分子（２０）を含むマイクロアレイがその表面に固着した前記支持体（１５）を、反応槽（１４）中に設置する工程；
−  ラベルされた標的分子（１３）を含む溶液を反応槽（１４）中へ導入する工程；
−  前記ラベルされた標的分子を、前記標的とそれらの対応する捕獲分子の間の特異的結合を可能にする安定な制御された温度条件下で、インキュベーションする工程；
−  光源（１）からの励起光（２）を支持体の表面上へ向ける工程；
−  結合した標的分子からの、前記励起光（２）に応じた電磁光放射（７）を、標的分子を含む溶液の存在下で測定する工程であって、１つの局在領域の放射表面が約０．１μm2〜約１０mm2を含み、また少なくとも４つの局在領域（２１）の各々を経時的にモニターし、各局在領域（２１）につき少なくとも２回の測定を行う工程；および
−  種々の測定値を処理して記憶し、各前記標的に対する少なくとも１つの測定値を用いて、溶液中に存在する少なくとも４種の異なる標的分子を定量する工程。
【００１７】
本発明による複数の標的分子（１３）のマイクロアレイ上でのリアルタイム定量化用の装置は２つの部分を含み、第１の部分は：
−  支持体の特異的局在領域（２１）に固定された少なくとも５種の捕獲分子（２０）を含み前記ラベルされた標的分子（１３）と流体連絡しているマイクロアレイがその表面上に固着した、前記支持体；
−  場合により、前記支持体を支えるための保持器（１２）、
−  温度制御システム（１６〜１７）；
から構成され、
第２の部分は：
−  励起光源（１）、
−  前記励起光源（１）からの励起光（２）を前記支持体上に向けて集束させ、励起光を４５〜１３５°の間に含まれる角度内のマイクロアレイ表面に到達させるための光学系、
−  前記励起光に応じて、放射表面が約０．１μm2〜約１０mm2を含む局在領域中の結合した標的分子からの電磁光放射（７）を、標的分子を含む溶液の存在下で測定するための検出器（１０）、
を含む。
【００１８】
装置はさらに、支持体の少なくとも４つの局在領域の種々の測定データを記憶するための記憶システム、および／または、マイクロアレイの各局在領域のために励起、検出、および記憶の工程を少なくとも２回繰り返す制御器（１１）、および／または、溶液中に存在する少なくとも４種の異なる標的分子の記憶および定量化を、各前記標的につき少なくとも１つの測定値を用いて行うためのプログラム、を含んでもよい。
【００１９】
定義
本出願および本発明において、次の定義を適用する：
【００２０】
用語「リアルタイム」とは、ある過程が生ずる時間枠／期間を指す。その過程の情報またはデータを経時的にモニターする。マイクロアレイとの関連では、リアルタイムとは、捕獲分子と標的分子の間の結合反応（それに対する信号を経時的に検出し分析する）を追うことを言う。過程のデータを、所定のタイミングで、またはオンライン検出とも呼ばれる連続的な方法でのいずれかで得る。
【００２１】
「標的」分子および「捕獲」分子とは、核酸、タンパク質、抗体、糖類、脂質、ペプチド、レクチン、触媒、レセプター、レセプターのアゴニストまたはアンタゴニスト、蛍光団、発色団、キレート化合物、ハプテン、イオン、種々のキラル構造を有する分子、コンビナトリアルケミストリーにより得られる新しい合成化学高分子または他の機能化されたマクロ構造、それらの部分または組合せ、から成る群より選ばれる、合成のまたは天然の分子である。
【００２２】
本明細書で用いられる「捕獲分子」とは、１個の標的分子、標的分子の１ファミリー、または複数の標的分子の１以上の構成メンバー、あるいはそれらの部分、に特異的に結合することができる分子、またはそれらの複合体もしくは組合せを指す。捕獲分子は、支持体の表面にインサイチューで化学的に合成された、またはそこに置かれた核酸またはタンパク質が好適である。核酸結合は、２つのポリヌクレオチド間の塩基の対合によって達成され、その一方は固定された捕獲分子であり、他方は検出されるべき標的分子である。タンパク質の結合は、与えられたポリペプチドまたはタンパク質の捕獲に対して特異的な抗体を用いて、最も好適に行なわれる。抗体の一部、もしくは抗体の一部（通常は可変ドメイン）を組込んだ組換えタンパク質、あるいは他のタンパク質もしくはペプチドまたはヌクレオチドを、それらがいくつかの与えられたポリペプチドのタンパク質を特異的に認識する限り、捕獲分子として用いることができる。
【００２３】
用語「核酸、マイクロアレイ、プローブ、標的核酸、実質的に結合する、特異的にハイブリダイズする、バックグランド、定量化する」とは、国際特許出願ＷＯ９７／２７３１７に記載された通りであり、そられは参照により本明細書に組み入れられる。
【００２４】
「ヌクレオチド三リン酸」またｄＮＴＰとも呼ばれる用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらかの中に存在するヌクレオチドを指し、したがってアデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシルを塩基として組み入れ、糖部分がデオキシリボースまたはリボースであるヌクレオチドを含む。従来の塩基であるアデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシルの１つと塩基対合できる他の修飾された塩基が用いられる場合もある。そのような修飾塩基には、例えば８−アザグアニンおよびヒポキサンチンが含まれる。
【００２５】
本明細書で用いられる用語「ヌクレオチド」とは、前記の核酸の塩基と比較して、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）中に存在するヌクレオシドを指し、上述の通常のまたは修飾された塩基を含むヌクレオチドが含まれる。
【００２６】
ヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどへの言及には、糖−リン酸主鎖が修飾および／または置換された類似の分子種が、もしそれらのハイブリダイゼーション特性が破壊されなければ、含まれる。例として、主鎖をペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる等価な合成ペプチドと置換してもよい。
【００２７】
本明細書に記述されている用語、１以上の遺伝子またはゲノム配列に相補的な「ポリヌクレオチド」配列とは、少なくとも前記遺伝子またはゲノムのヌクレオチド配列またはそれらのコピーの一部へ厳密条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドにはまた、特定の条件下で用いることができる２塩基を超えるが１００塩基より短い長さのオリゴヌクレオチドが含まれる。そのようなハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、前記遺伝子またはゲノムに対してヌクレオチドレベルで通常は少なくとも約７５％の配列同一性を、好ましくは約８０％または９５％の配列同一性を、または好ましくは、前記遺伝子またはゲノムへの９５％以上のヌクレオチド配列同一性を示すであろう。それらは分析のための特異性および感度の必要性に依存して、通常は１５〜３０塩基の長さの小さな配列、または３０〜１００の間のより長い配列のいずれかからなるか、または１００〜８００塩基のさらに長い配列から成る。
【００２８】
用語「タンパク質」は、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを包含する。用語、「抗体」には、ジスルフィド結合によって連結された２つの軽鎖および２つの重鎖からなる免疫グロブリンならびにＦａｂ、（Ｆａｂ）2、Ｆｖ、または一本鎖可変部位断片（ｓｃＦｖ）などの断片が含まれる。本明細書で用いられる用語「レセプター」とは、与えられたリガンドへの親和性を有する分子を指す。レセプターは自然に存在する分子、または合成分子でよい。
【００２９】
用語「ホモロジー」とは、あるポリヌクレオチド配列の、別のポリヌクレオチド配列に対する同一性の程度を意味する意図である。２つ以上のポリヌクレオチド間に完全なホモロジー（すなわち１００％の同一性）が存在する可能性がある。ホモロジー度を配列のアラインメントの後に計算し、また当業者に周知の任意の方法によって決定することができる。
【００３０】
「マイクロアレイ」とは、複数の捕獲分子が、与えられた特異的標的分子に結合できるようにその上に固定された支持体を意味する。マイクロアレイは選択的に、支持体の表面上もしくは内部の、または支持体を覆う基板上の、特異的局在領域に存在する捕獲分子より成る。特異的局在領域は、決められた標的分子に対して特異的な捕獲分子が結合されて含まれる表面の領域である。特異的局在領域は、マイクロアレイを構築する方法によって知られるか、または検出中にまたは検出後に明らかになる。スポットは、特異的な標的分子がその捕獲分子上に固定され、検出器によって観察される領域である。スポットは、特異的な標的分子がその捕獲分子上に固定され、検出器によって観察される領域である。本発明の１つの特定の応用では、捕獲分子のマイクロアレイは、別々の支持体が特異的な捕獲分子を含み、互いに識別できて特異的な標的分子を定量することができる限り、別々の支持体上に提供される場合もある。これを、特定の特徴を有し互いに識別されることができて、結合した分子を定量できるビーズの混合物を用いることにより、達成することができる。１個のビーズまたはビーズの集団を、その場合１種の標的分子に特異的な捕獲分子を有するスポットと見なす。
【００３１】
用語「バックグラウンド」または「バックグラウンド信号強度」とは、ラベルされた標的核酸とポリヌクレオチドマイクロアレイの構成要素（例えば、ポリヌクレオチドプローブ、対照プローブ、マイクロアレイ基板など）との間の非特異的結合または他の非特異的な相互作用からもたらされる、ハイブリダイゼーション信号を指す。バックグラウンド信号は、マイクロアレイの構成要素自体の内因性蛍光によっても生成される可能性がある。単一のバックグラウンド信号をマイクロアレイ全体について計算することができ、また、種々のバックグラウンド信号を各標的核酸について計算することもできる。好ましい実施態様では、バックグラウンドは、各スポットにつき個々に計算され、それは特異的な捕獲分子を保持していないスポットの周りの表面上の信号レベル強度である。
【００３２】
標的分子は、通常は標的に付された１以上の「ラベル」を検出することにより検出する。ラベルを、ＷＯ９９／３２６６０（参照により本明細書に組み入れられる）に詳述されているような、当業者に周知の多くの任意の手段によって組込むことができる。ラベルは直接にまたは間接法によって検出する。
【００３３】
標的分子とは、関心対象の生体物質中に存在し、検出するべきポリヌクレオチドまたはタンパク質を意味するものとする。用語「生体物質」は、その意味の中に、生物体、器官、組織、細胞、または細胞培養によって生成された生体物質を含む。
【００３４】
用語、安定な（あるいは一定の）制御された温度とは、温度調節装置である制御されたシステムによって得られ、与えられた測定の時間経過中に標的のハイブリダイゼーション速度の１０％を越える変化を避けるために十分な程度に、安定している温度を意味する。典型的な安定温度は、５℃を越えては、また好ましくは１℃を越えては、少なくとも１分間、より良くは５分間、さらにより良くは６０分間、または２４時間さえも、変化しない温度である。
【００３５】
用語「直接に支持体の表面上に」とは、光ビームの主要部分が支持体の表面に向けられ、それ自身が表面に存在する蛍光分子を励起することを意味する。
【００３６】
標的は、検出されるラベルされた分子である。それらは、好ましくは生体試料である試料中に存在する関心対象分子の抽出または精製のいずれかの後に得られる。標的は、ラベルされた関心対象分子それ自身、あるいはこれらの分子のコピーまたは増幅物である。標的はこれらの過程の間にラベルを取り込んでもよいしまたは取り込まなくてもよい。標的分子にはまた、タンパク質またはポリペプチドと相互作用する化学的分子または生体分子が含まれる。化学的標的の典型は、レセプターに結合するリガンドである。
【００３７】
主な実施態様では、標的および／または捕獲分子は、タンパク質または核酸または糖である生体分子である。捕獲分子は、好ましくは共有結合によって支持体の表面のある部分に結合される。別の実施態様では、支持体は基板を含み、その上に捕獲分子が固定される。また別の実施態様では、捕獲分子は、検出方法の実施中に溶液中に有意に放出されない限り、支持体に吸着されている。
【００３８】
捕獲分子の基板への付着は、好ましくは、ピンまたは「ピンおよび輪」を表面へ接触させることなどの物理的手段によって、あるいはピエゾまたはナノディスペンサーなどの方法による溶液の微小滴の放出によって、行なわれる。あるいは、基板上での捕獲分子のインサイチュー合成は、本発明の実施態様の１つであって、それは、５，７４４，３０５および６，３４６，４１３に提供されているような、光の間隔分解能での、予め定められた位置でのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド合成である。捕獲分子は、基板上の定められた位置に存在することが好適である。
【００３９】
ある好ましい実施態様では、標的検出のための局在領域は１μm2〜１mm2から成る表面を有する。
【００４０】
実施態様の１つでは、標的分子は溶液中に存在するラベルされたポリヌクレオチドであり、マイクロアレイの異なる局在領域に存在するそれらの特異的な捕獲分子への結合は、マイクロアレイに結合した標的から放射される電磁光を、経時的にモニターして、検出するべき各標的につき少なくとも２回の測定することにより、追跡される。
【００４１】
別の実施態様では、溶液中に存在する標的の数は、１〜５種であり、１〜２０種がより良く、２０〜１０００種および１０００種より多い数がさらに良い。主な実施態様では、方法は、溶液中の少なくとも４種の標的分子を定量することができるように設計されている。しかし標的は、常に同一試料中に一緒に存在するわけではないので、その結果、単一の分析において定量する標的の数は、それらを検出するために設計された捕獲プローブの数より小さくなる場合があり；１つの試料液で１つの標的しか検出されないような小さい数の場合もある。
【００４２】
好ましい実施態様では、マイクロアレイに接触している溶液の厚みは、全ての局在領域上で一定である。
【００４３】
さらに別の実施態様では、表面の２つの局在領域またはスポットに接触している溶液の厚みの差異は、１００マイクロメートル未満、１０マイクロメートル未満、および１マイクロメートル未満でさえある。
【００４４】
別の実施態様では、マイクロアレイに接している溶液の厚みは２つの測定の間で変化したり、マイクロアレイに接している溶液の厚みは２つの測定で一定であったりする。
【００４５】
別の実施態様では、標的分子を生体試料中に存在するｍＲＮＡから得る。ｍＲＮＡをｃＤＮＡにコピーし、その後マイクロアレイ上で、オンラインでｃＤＮＡの検出を行う。
【００４６】
別の実施態様では、ｃＤＮＡを、Ｔ７ポリメラーゼ結合配列を有するポリｄＴポリヌクレオチド配列を用いて、ｍＲＮＡから得る。Ｔ７ポリメラーゼを用いて、ＷＯ９７１０３６５に記述されているように、ｃＤＮＡをＲＮＡ配列にコピーする。ＲＮＡ分子を、好ましくはアルカリ溶液中で、またはマグネシウムイオンの存在下で加熱することにより、ランダムに断片化する。ＲＮＡ断片の少なくとも１つを次に、上述した方法によりマイクロアレイ上でオンライン検出する。ｃＤＮＡは１００塩基以上の配列を有するポリヌクレオチドである。
【００４７】
別の実施態様では、標的分子を、生体試料中に存在するＤＮＡから得る。ＤＮＡを試料から抽出し、好ましくはＰＣＲによって増幅し、アンプリコンを特異的な捕獲分子上に固定することによってオンラインで検出する。特定の実施態様の１つでは、標的分子は相同ヌクレオチド配列であり、ＷＯ０１７７３７２に記述されているようなコンセンサスプライマーによるゲノムＤＮＡの増幅の後で、オンラインでマイクロアレイ上で検出され、および／または定量される。
【００４８】
別の実施態様では、増幅されたＤＮＡは、好ましくは制限酵素による消化、ＤＮＡ分解酵素処理、または化学的切断のいずれかによって、より小さなポリヌクレオチド断片に切断される。１つの標的当たり少なくとも１つのＤＮＡ断片が、次に、上に記述された方法の１つによって、マイクロアレイ上でオンライン検出される。
【００４９】
別の実施態様では、本発明の方法を、溶液中に存在する１つの標的の、および好ましくは同じ溶液中に存在するいくつかの標的の最適のハイブリダイゼーション条件の決定のために用いる。
【００５０】
別の実施態様では、本発明の方法を、標的分子が、一方で標的配列と少なくとも１つのヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列の結合については非常に高い識別能力を有するそれの特異的捕獲分子へ、高い結合効率を有することを決定するために用いる。
【００５１】
別の実施態様では、本発明を、少なくとも１つのヌクレオチドが異なる２つのヌクレオチド配列を区別するために用いる。本発明は、標的がその捕獲分子上に特異的結合をするときのハイブリダイゼーションの最適条件を決定するために特に有用である。最適条件は、様々な厳格溶液または／およびインキュベーション温度をテストし、識別する標的から与えられる信号を短期間記録することにより、素速く見出される。識別度が１０を越え、好ましくは２０を越え、およびさらに好ましくは１００以上であり、それでも必要な標的の有意な信号を与える条件を、更なる研究のために選択する。より厳格には、最良の条件は、実験で用いられる変数（主にＴ°または厳格性）によって表わされる最大値に対する％でハイブリダイゼーション収率を与える曲線と、最大値に対する％で識別性を与える曲線との交点から与えられる。
【００５２】
好ましい実施態様では、本発明の方法を、ある標的配列中でＳＮＰを検出および／または定量化するためのハイブリダイゼーション条件の最適化ために用いる。別の実施態様では、恐らく同一溶液中に存在する複数の標的配列中のＳＮＰのハイブリダイゼーションおよび検出の条件を最適化するために本発明の方法を用いる。
【００５３】
主な実施態様の１つでは、標的分子は、溶液中に存在する１０〜９９ヌクレオチドの長さのラベルされたオリゴヌクレオチドであり、マイクロアレイの種々の局在領域中に存在する特異的捕獲分子上へのそれらの結合を経時的にモニターして、検出する各標的について少なくとも２回の測定を行う。
【００５４】
好ましい実施態様では、捕獲分子として用いられるポリヌクレオチドは、１０〜１０００ヌクレオチドの長さ、好ましくは１００〜４００ヌクレオチドの長さである。同一試料中に存在する可能性のある相同配列の特異的結合のために、ポリヌクレオチド捕獲分子は、特許ＷＯ０１７７３７２によるスペーサーを含む。同一試料中に存在する可能性のある相同配列またはＳＮＰの特異的結合は、１０〜３０ヌクレオチドの特異的な部分を有する捕獲分子を用いて得られる。
【００５５】
好ましい実施態様では、捕獲分子として用いられるポリヌクレオチドは、固体支持体の表面cm2当たり１０fmolesを越す密度で、好ましくは１００fmolesで、マイクロアレイの局在領域上に存在する。
【００５６】
ある実施態様では、標的分子は、溶液中に存在するラベルされたタンパク質であり、マイクロアレイの種々の局在領域中に存在するそれらの特異的捕獲分子上へのそれらの結合を、マイクロアレイに結合した標的によって放射される電磁光を経時的にモニターして追跡し、検出する各標的について少なくとも２回の測定を行う。
【００５７】
さらに別の実施態様では、標的は、定量される種々の抗原を特異的に認識する捕獲分子への結合によって検出される抗原であり、特異的な捕獲分子には、それの抗体またはその部分、またはアプタマーまたは他のタンパク質などの、抗原に対して相補的な構造を有する分子がある。
【００５８】
さらに別の実施態様では、標的は、定量される溶液中に存在する抗体であり、捕獲分子はそれらのそれぞれの抗原、またはそれらの一部またはエピトープである。さらに別の実施態様では、標的はタンパク質またはリガンドであり、その特異的レセプターがマイクロアレイ上に捕獲分子として存在する；逆の状況では、タンパク質またはリガンドが捕獲分子として用いられ、レセプターが標的として検出される。
【００５９】
さらに別の実施態様では、標的分子が転写因子であり、それはマイクロアレイ上に捕獲分子として固定されている特異的なＤＮＡ配列を認識する。
【００６０】
好ましい実施態様では、捕獲分子として用いられるタンパク質の、適切な分析系を提供するのに十分な量を、一般に約２〜１０ng/μlの、好ましくは３〜６ng/μlのスポット溶液の量を、支持体上に置く。
【００６１】
そのような支持体を、この目的に従来から用いられている任意の材料から作成し、好ましくは、スライド、ディスク、ゲル層、および／またはビーズの群より選ばれた型式に調製されたガラス、電子装置、プラスチック、シリコン支持体、シリカ、金属、またはそれら混合物から成る群より選ぶ。好ましい実施態様では、支持体はガラスである。
【００６２】
別の好ましい実施態様では、捕獲分子を保持する支持体は３次元の多孔構造を有する。従来のスライドガラスはその表面に６０％未満の二酸化ケイ素を有する。これが、表面で利用可能な化学結合の量を本来的に制限する。多孔性物質は、捕獲分子の搭載能力を増加させる。典型的な多孔質支持体は、ゲルパッド、融合した繊維マトリックス、および繊維状ポリマーマトリクスである。マイクロアレイは、全体を多孔性物質で作成してもよいし、またはガラス、プラスチック、または金属のような平坦な面の上に積層された多孔性物質の層を含んでもよい。
【００６３】
別の実施態様では、捕獲分子は、別々の支持体上に存在し、それは好ましくは化学的または物理的特徴を備え、ある特異的捕獲分子を有すると同定することができるビーズである。
【００６４】
さらに別の実施態様では、支持体は、物理的または化学的境界によって分離された数個のマイクロアレイを保持する。好ましい実施態様では、支持体はマルチウエル型である。物理的障壁の例はウエルであり、例えば支持体は９６、３８４、または１５３６穴のマルチウェルプレートであって、捕獲分子が個々にスポットされる分離されたウエルを有する。３８４ウエルおよび１５３６ウエルのプレートは、細胞ベースの分析用にＢＤ Ｆａｌｃｏｎ（Merck Eurolab sa, Leuven, Belgium）から、またはＮｕｎｃ Ａ/Ｓ（Roskilde, Denmark）から入手できる。６１４４フォーマットのマイクロタイタープレートが、Parallel Synthesis Technologies Inc. (PSTI, Menlo Park, CA, USA)から入手可能である。マルチウエルは、１つのプレートとしてまたは帯として存在する。他の物理的障壁は、９６、３８４、１５３６、またはさらに６１４４のチューブなどの、支持体の表面に置かれたチューブである。チューブはウエル型に似ているが、平らな底を持っておらず、支持体の表面上に置かれると互いに単離した局在領域を生成する。化学的な障壁の例は、例えば、ＤＥ ００１９９４９７３５Ａ１に記述されており、疎水性の表面内の定められた領域に親水性のアンカーが付けられていて、固体の支持体上の捕獲分子の正確な位置および拘留を可能にしている。
【００６５】
本発明によるマイクロアレイは、cm2当たり４〜１００，０００のスポットを、好ましくはcm2当たり２０〜１０００のスポットを含み、各スポットは１種の捕獲分子の局在領域である。好ましい実施態様では、マイクロアレイは、２０を超え１０００未満の異なる捕獲分子を含む。
【００６６】
本発明での使用に適する検出可能なラベルには、電磁光放射の検出に基づく任意の方法によって検出可能な任意の組成物が含まれる。
【００６７】
標的分子は蛍光色素でラベルすることができる。蛍光ラベルは、酵素反応または化学反応によって標的に取り込まれる。典型的な酵素反応には、ラベルされたヌクレオチド三リン酸の標的への取込みが含まれる。あるいはＤＮＡまたはＲＮＡをコピーするか増幅する間に、５’末端が蛍光色素でラベルされたプライマーが標的に取り込まれる。蛍光色素はまた、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基を有する蛍光色素の、標的のアミンまたはスルフヒドリル基との反応などの、化学反応によって標的に取り込まれる。本発明における有用な蛍光色素には、シアニン色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７）、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、グリーン蛍光タンパク質が含まれる。そのようなラベルの使用を教示する特許には、ＵＳ−Ｐ−３，８１７，８３７；３，８５０，７５２；３，９３９，３５０；３，９９６，３４５；４，２７７，４３７；４，２７５，１４９；および４，３６６，２４１が含まれる。好ましい実施態様では、蛍光色素はシアニン３である。
【００６８】
蛍光特性を有するナノ結晶粒子などのいくつかの蛍光ラベルは、特に興味深い。最もよく知られている１つが、量子ドット（Han et al., Nature Bio-technology 19, 631-635, 2001）である。それらは蛍光性であり、時間とともにまたは照明によって褪色しない。それらの安定性のために、それらは特に本発明で提案される連続的な読み取り中での使用に適する。さらに量子ドットは、これらの粒子に特異性を与える金属を含み、その結果、捕獲プローブ上にそれらが付着しているのを追跡するため蛍光以外の方法を用いることができる。これらの粒子の加熱は、経時的に追跡できるパラメータの１つである。金属が、光ビーム好ましくはレーザーのエネルギーを吸収し、粒子の加熱を引き起こすという事実は、支持体上の低密度の金粒子の検出の基礎として用いられてきており、単一粒子さえも検出される（Boyer et al., Science, 297,1160-2002）。この方法を光熱干渉コントラストと呼ぶ。
【００６９】
ナノ粒子を直接測定するための別の技術は、レーリー散乱である。この方法は、金属粒子中の電子の振動を得るのに適した光ビームの使用に基づいており、その結果粒子から電磁放射が得られ、それが検出できる（Stimpson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (2003), 11350-11353; real-time detection of DNA hybridization and melting on oligonucleotide arrays by using optical wave guides；）。この方法は、生体試料への応用には感度が足りない。
【００７０】
あるいは、ラマン散乱および表面プラズモン共鳴を本発明に適用できる可能性がある。これらの技術は抗体／抗原結合の検出に広く用いられてきたが、アレイの多変数測定および生体試料に必要な感度にもよく適合している (Thiel et al., Analytical Chemistry, 69 (1997), 4948-4956)。
【００７１】
別の実施態様では、水晶微量天秤を適用することもできる。それは現在十分に感度が高く、ナノグラムより小さい質量変化を測定することができる (Caruso et al., Analytical Chemistry 69 (1997), 2043-2049 を参照のこと)。これはリアルタイムでのマイクロアレイ検出のための１つの提案である。
【００７２】
カンチレバーは、マイクロアレイ上のＤＮＡを検出するためのもう１つの選択である (McKendry et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99 (2002), 9783-9788）。
【００７３】
さらに別の技術が、金属特性を考慮に入れたナノ粒子の電気的検出である。最初に電気化学的検出が適用されたが、低感度であった。より進歩した感度の高い方法が、微分パルスボルタンメトリーによる検出である (Ozsoz et al., Analytical Chemistry 75 (2003), 2181-2197)。
【００７４】
金属の抵抗率と電気容量特性もまた、電子チップで検出される最良の特性の１つである。２つの電極間に金属が存在すると、抵抗率と電気容量の変化が引き起こされることになり；捕獲分子が電極の１つの上に存在するときには、ＤＮＡまたはタンパク質の検出が観察される (Moreno-Hagelsieb et al., Sensors and Actuators B-Chemical, 98, 269-274, 2004)。Guiducci et al., ESSDERC 2002 は、金でラベルされたＤＮＡの電気容量分析について記述した。電子チップをいくつかの区画から作成することができるので、異なる標的を異なる区画で検出し、抵抗率または電気容量の変化を記録することもできる。方法が、生体試料に必要な信頼性および感度をまだ示すことができていないとしても、しかしそれらのうちのいくつかは、リアルタイム検出のための必要条件を満たすことに成功するであろうことが予想される。
【００７５】
これらの方法を、本発明で提案されるＤＮＡ増幅と一緒に、ＤＮＡの検出に有利に用いることができる。
【００７６】
特定の実施態様では、標的分子は、蛍光分子によって認識されるラベルを有し、この蛍光分子がマイクロアレイ上でオンラインで検出される。典型的なヌクレオチドラベルは、蛍光色素を有するストレプトアビジンまたは抗ビオチン抗体によって認識されるビオチンである。
【００７７】
好ましい実施態様では、この方法を、約０．０００１〜約１０００nM、好ましくは０．００１〜１０nMの濃度で検出溶液中に存在するいくつかの標的分子の検出に用いる。
【００７８】
好ましい実施態様では、結合反応、検出、および定量化を、統合された装置中で行なう。それらは、洗浄または染色もしくは検出可能な信号を得るための試薬の添加などの反応手続きの操作を必要としない。
【００７９】
好ましい実施態様では、定量化が高精度で得られ、測定の標準偏差は、反応の間のある時間に行なわれた単一の測定値と比較して２倍、また好ましくは５倍少ない。
【００８０】
別の好ましい実施態様では、同じ精度で標的の定量化を得るために必要な信号読み取りの合計時間は、１回検出方法と比較して、２倍または５倍も短縮される。
【００８１】
別の好ましい実施態様では、種々の標的の定量化計算のための信号の値が、それらが溶液中の標的濃度に比例する時間枠中に得られる。時間枠は、種々の標的で異なり、溶液中のそれらの濃度に依存する。
【００８２】
本発明の特徴の１つは、標的のその捕獲分子への結合に対する反応速度の値を得ることであり、反応速度の値は溶液中の前記標的の濃度に比例する。反応速度の値は通常は、０次、１次、または２次、あるいはより複雑な反応速度係数である。好ましい実施態様では、反応条件は、初速度が、検査するすべての標的について一次、および捕獲分子については０次であるように選ばれる。そうすると、所定の時間における結合した標的分子（ｘ）の濃度が、方程式Ｃ（ｘ）＝ｋｔで与えられ、ここでｋは標的に対する反応速度係数、ｔは反応時間である。反応の開始時点では、また捕獲分子が高密度であるような適切な条件では、反応速度係数は標的分子の最初の濃度（Ｃｉ）に比例し、それが溶液中の標的濃度を計算する方法を簡単にする。
【００８３】
ある好ましい実施態様では、溶液中に存在する標的濃度の計算は、標的が特異的に結合する局在領域において経時的に信号が出現する反応速度係数の計算から導出される。
【００８４】
別の好ましい実施態様では、溶液中に存在する標的の濃度を、標的が特異的に結合する局在領域中で経時的に得られた少なくとも３つの値から得られた信号の一次反応速度係数から計算する。
【００８５】
別の実施態様では、信号が特定の閾値に達するのに必要な時間から溶液中に存在する標的の濃度を計算する。
【００８６】
ある実施態様では、結合反応の間の温度は、経時的に行なわれる２以上の測定の間、５℃より小さい温度変化で、好ましくは１℃より小さい温度変化で制御され、安定していなければならない。
【００８７】
さらなる実施態様では、温度が、計算期間中に、少なくとも１分間、好ましくは１〜５分間、さらに好ましくは１〜６０分間、またよりさらに好ましくは１分〜２４時間の間、安定している。
【００８８】
別の実施態様では、１分〜２４時間の間で読み取りを行なう。ある実施態様では、方法によって、少なくとも４桁、よりよくは５桁、またさらによくは６桁の濃度差さえがある標的を検出することが可能である。さらなる実施態様では、この方法によって、少なくとも４桁、よりよくは５桁、またさらによくは６桁の濃度差さえの差がある標的を定量することが可能である。
【００８９】
この方法は、光励起を制御することには特によく適している。それは支持体の表面上に光を導き、各位置での励起の均質度を望むように決定し、修正することができるからである。ある好ましい実施態様では、光ビームは、蛍光分子を直接励起するために、アレイの表面に焦点を合わせたレーザービームである。レーザービームは、好ましくは溶液を通してまたは支持体を通してのいずれかによりアレイの表面に垂直に焦点を結ぶ。放射光を励起レーザービームの反対方向から検出する。放射光を、好ましくは共焦点光として検出し、光電子増倍管による増幅の後に、測定する。好ましい実施態様では、アレイの表面を、レーザービームが、結合した標的の最大の光励起を得るために走査する。
【００９０】
ある特定の実施態様では、検出される標的は、溶液中の１nM未満の濃度のヌクレオチド分子である。別の実施態様では、二重鎖の形のラベルされた分子について測定を行なう。さらに、標的分子はＰＣＲ増幅された分子であってよい。また検出される標的は、溶液中の１μM未満の濃度の抗原または抗体である。
【００９１】
ある特定の実施態様では、この方法が標的分子のハイブリダイゼーション用の最適条件を決定するために非常に有用である。温度または塩組成などのハイブリダイゼーション条件を変更し、ハイブリダイゼーション速度論を前の条件と比較して、ハイブリダイゼーション速度に影響を及ぼすパラメータを急速に最適化する。
【００９２】
別の実施態様では、この方法を、１つの標的のハイブリダイゼーションのより速い反応速度を得るためだけでなく、標的の、自分と相補的な捕獲分子へのハイブリダイゼーションが、同じ配列を有するが単一のヌクレオチドが異なる同じ捕獲分子へのハイブリダイゼーションと比較して、５以上、または１０以上でさえもある非常に高い識別力を得るためのハイブリダイゼーション条件の最適化に用いる。これは一塩基変異多型（ＳＮＰ）の検出および／または定量化に役立つ。
【００９３】
上記の実施態様はまた、前記支持体の特異的局在領域（２１）に固定された少なくとも５種の捕獲分子（２０）を含むマイクロアレイに当てはまり、少なくとも５つの各局在領域を経時的にモニターし、少なくとも５つの局在領域上で得られた種々の測定値を、試料中に存在する可能性のある標的分子を定量するために処理する。
【００９４】
本発明はまた、マイクロアレイ上での複数の標的分子のリアルタイム定量化のための、以下の工程を含む方法に関する：
−  それぞれが支持体の特異的局在領域（２１）中に固定された少なくとも５種の捕獲分子（２０）を含むマイクロアレイがその表面に固着した前記支持体（１５）を、反応槽（１４）中に設置する工程；
−  ラベルされた標的分子（１３）を含む溶液を反応槽（１４）中へ導入する工程；
−  前記ラベルされた標的分子（１３）を、前記標的（１３）とそれらの対応する捕獲分子（２０）の間の特異的結合を可能にする条件下でインキュベーションする工程；
−  光源（１）からの励起光（２）を支持体の表面上へ向ける工程；
−  結合した標的分子からの、前記励起光（２）に応じた光放射（７）を、標的分子（１３）を含む溶液の存在下で測定する工程であって、１つの局在領域の放射表面が約０．１μm2〜１０mm2を含み、また少なくとも５つの局在領域（２１）の各々を経時的にモニターし、各局在領域（２１）につき少なくとも２回の測定を行う工程；および
−  少なくとも５つの局在領域についての種々の測定値を処理し記憶し、各前記標的に対して少なくとも１つの測定値を用いて、溶液中に存在する標的分子を定量する工程。
【００９５】
ある特定の実施態様では、標的分子を含む溶液を、２回以上の測定の間に、少なくとも２のまた好ましくは３の異なる温度を有する温度サイクルに付する。サイクル数は、好ましくは２以上であり、より好ましくは１０以上で、およびさらに好ましくは２０を超え、また好ましくは５０サイクルに制限される。マイクロアレイ上に固定された標的の測定を、好ましくは少なくとも１サイクル中に、好ましくは５サイクル、またより良くは１０サイクル、さらに良くは２０以上のサイクル中に行われる少なくとも２回の測定により行なう。増幅された分子は、変性工程の後で、捕獲分子にハイブリダイズすることができる。元のヌクレオチド分子は増幅前にラベルする必要はなく、増幅工程の間に増幅されたラベル付き標的分子をもたらす。
【００９６】
好ましい実施態様では、各サイクルで少なくとも２つの測定がされ、また検出レベルが、検査された各標的についてサイクル数と共に表わされる。次に、閾値に達するのに必要なサイクル数を比較することによって、標的の定量化が得られる。好ましい実施態様では、定量化を補正するために既知の濃度の少なくとも１つの内部標準を溶液に組み入れる。そうして、標的の絶対量を、内部標準について得られたデータを参照して計算する。好ましくは、異なる濃度の３以上の内部標準を標的の溶液に組み入れ、これらの内部標準で得られた標準曲線を参照して計算して標的を定量化する。
【００９７】
特定の実施態様の１つでは、オンライン測定をサイクル中の１つの固定温度で行なう。別の実施態様では、オンライン測定を最後のサイクルの後に行なう。
【００９８】
好ましい実施態様では、溶液は、ポリメラーゼがＤＮＡまたはＲＮＡをコピーできるように、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ、必要なｄＮＴＰまたはＮＴＰ、および必要な塩緩衝液、ならびに試薬を含む。
【００９９】
ある実施態様では、溶液は、ポリメラーゼがマイクロアレイ上で検出されるべき標的配列をコピーするためのアンカーとして役立つ５'末端をラベルされたオリゴヌクレオチドまたはプライマーを含む。
【０１００】
別の実施態様では、溶液はラベルされたｄＮＴＰまたはＮＴＰを含み、これがポリメラーゼによって標的配列に取り込まれ、マイクロアレイ上で検出される。
【０１０１】
ある好ましい実施態様では、温度サイクルおよび反応条件がＰＣＲを生じさせるものである。別の実施態様では、温度サイクルおよび反応条件が、ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写のものである。
【０１０２】
ある好ましい実施態様では、マイクロアレイ上でのＰＣＲのために用いられるポリメラーゼは、６２℃で作用するｈｏｔ Ｍａｓｔｅｒ（5 Prime, Colorado, USA）である。好ましい実施態様では、６０℃〜６８℃に含まれる同一温度でマイクロアレイ上のアニーリング、伸長、およびハイブリダイゼーションの工程を行なう。そのような実施態様では、リアルタイム検出分析を伸長工程と一緒に行ない、またアニーリングと伸長工程の間に行うのがさらによい。
【０１０３】
好ましい実施態様の１つでは、マイクロアレイ上に存在する捕獲分子は、溶液中に存在するコピーされたまたは増幅された標的配列の少なくとも一部と相補的である。
【０１０４】
ある実施態様では、捕獲分子がポリメラーゼによって伸長され、同時にサイクルの間に溶液中に蓄積する増幅された生成物とハイブリダイズする。実施態様の１つでは、伸長された捕獲分子をラベルし、サイクル中に、またはサイクルの終わりにオンラインで検出する。この場合、伸長を、好ましくはラベルされたｄＮＴＰの存在下で行なう。
【０１０５】
ある実施態様では、捕獲分子は好ましくは、ポリメラーゼによって伸長されるか、またはサイクルの間に溶液中に蓄積する増幅された生成物とハイブリダイズするか、のどちらかである。
【０１０６】
ある好ましい実施態様では、伸長できない捕獲プローブを用いることにより伸長よりもハイブリダイゼーションが促進される。この場合、捕獲分子は、それらの３’末端に塩基ターミネーターまたはｐｏｌｙＡなどの同一塩基の長い伸張を含めばよい。あるいは、捕獲分子は、その３’末端で支持体に固定されていてもよく、自由な５’末端はポリメラーゼによって延長できない。
【０１０７】
別の実施態様では、１つのプライマーが過剰に存在し、別のプライマーが少量存在する状態でＰＣＲを行なうことにより、ハイブリダイゼーションより伸長が促進される。
【０１０８】
ある実施態様では、マイクロアレイが、１以上の標的配列のコピーまたは増幅を行なうための試薬に接している。ある好ましい実施態様では、標的配列は、コンセンサスプライマーでコピーされた、または増幅された相同配列である。好ましい実施態様では、マイクロアレイの各捕獲分子を、１以上の他の相同配列の存在下でコンセンサスプライマーを用いて増幅された特定の相同標的配列に向ける。
【０１０９】
本発明による方法を実施するために用いられる装置は、本質的に２つの異なる機能を遂行するための２つの異なる部分を含む。
【０１１０】
第１の部分は、標的のその捕獲分子への結合反応に必要な条件を提供するインキュベーションシステムを含む。好ましくは、第１の部分は結合反応の間に温度を調節し制御するための温度制御システムを含む。
【０１１１】
ある好ましい実施態様では、温度調節装置は、制御されたペルチエ、Ｍｉｎｃｏ製のＴｈｅｒｍａｌ−Ｃｌｅａｒ（商標）透明ヒーターのような光学級ポリエステルシートに挟まれた形のマイクロ細線発熱体、または外部より温度調節される流体を循環する流体系から成る群より選ばれる。
【０１１２】
ある好ましい実施態様では、温度調節装置を、支持体を保持する保持器に装着する。温度調節装置は、好ましくは保持器と支持体の間に設置する。
【０１１３】
別の実施態様では、温度調節装置は支持体に装着し、保持器には接触しない。
【０１１４】
ある好ましい実施態様では、インキュベーションシステムは、マイクロアレイに接する溶液の厚みが、配列されたスポットまたは局在領域全体の上で一定になるような条件を提供する。配列された表面の２つのスポットまたは局在領域の間の厚さの差異は、好ましくは１００マイクロメートル未満、さらに１０マイクロメートル未満、またさらに１マイクロメートル未満である。
【０１１５】
別の実施態様では、インキュベーションシステムは、マイクロアレイに接する溶液の厚みが２つの測定間で変化する条件を提供する。
【０１１６】
装置の第１の部分はまた、好ましくは液体を反応槽の内部で移動させ、反応速度を増加させる混合または撹拌システムを含む。好ましい実施態様では、ポンプ、開閉バルブ、静電波、またはピエゾ電気振動などの物理的手段による液体の移動によって混合が行なわれる。
【０１１７】
第２の部分は、対応する捕獲分子に結合した標的からの光放射を検出するために必要な検出システムを含む。光源が、支持体上のラベルされた標的を励起する光ビームを生成する。好ましい実施態様では、検出部分は、解析するべきマイクロアレイによって覆われた表面全体で同じ検出効率が得られるように置かれていなければならない。
【０１１８】
ある好ましい実施態様では、励起光は、好ましくは約５３２nmの波長を有し、約１５mWの出力で送られるレーザービームであり、ダイバージェンスは１．２mrad未満である。別の実施態様では、検出システムは２または４ものレーザーを含む。
【０１１９】
ある好ましい実施態様では、光源（１）によって生成されたレーザービーム（２）はほとんど平行にされていて、ほとんどガウス的である。関心対象の波長だけを集めるために交換可能な励起フィルタ（４）を用いる。好ましくは付加フィルタホイール（３）を置き、正確にレーザー出力を調節するための減衰フィルタとして用いる。このフィルタホイールは、可変の既知の吸収レベルに、様々に暗くする。レンズ（５）（反射防止コーティングしてもよい）を、レーザービームを支持体（１５）に集束させるために用いる。光源と、レンズおよび支持体との距離は、集束が可能になるように可変である。
【０１２０】
その後で、光はダイクロイックミラー即ちビームスプリッタ（６）を通過する。このミラーは、約５３０nmより短い波長を有する光は通過させるが、５６０nmより長い波長を有する光は反射する。その結果、レーザーから来る５３２nmの光は、ダイクロイックミラーを、支持体の方へ通過する。その後、光が反応槽（１４）および蛍光ラベルされた試料（１３）を通り抜けて、支持体（１５）に達し、そこで結合したラベル標的が励起され、約５６０nmで蛍光を放射する。放射された蛍光の測定を、反応槽を有する支持体で行なう。
【０１２１】
放射光（７）は次に、その中に存在する光子数を検出するために、集束レンズ（９）を通して光電増倍管（１０）へ集束される。
【０１２２】
ある特別の実施態様では、約５５０nmより長い波長を有する光を通過させる追加の放射フィルタ（８）を加える。したがって、光電子増倍管（１０）は、実質的に蛍光光のみを検出する。光電子増倍管は、検出された各光子についてパルスを生成する。これらの各パルスを増幅し、光電効果によって電子信号に変換する。次に、データ収集ボードまたは制御器（１１）が、生じた信号を集める。制御器は温度制御装置を含む。
【０１２３】
基板のある領域からデータを集めた後、支持体（１５）上の異なる領域へ励起光を導くように、保持器（１２）が支持体を移動させる。その過程を、基板上のすべての領域を走査し終わるまで繰り返す。別の実施態様では、支持体を固定し、支持体の表面上の１つの部分から別の部分へと光励起ビームを移動させる。さらに別の実施態様では、マイクロアレイの全体を照射し、各局在領域からの光放出を検出する。
【０１２４】
実施態様の１つでは、支持体それ自身が保持器である。ある好ましい実施態様では、溶液中のおよび元の生体試料中の種々の標的分子の量または濃度の計算のために、データを記憶し処理する。データ記憶およびデータ処理を、好ましくは本発明の装置に組み込まれるプログラム可能なコンピューターを用いて行なう。データ処理は、データ記憶の後にいつ行なってもよい。
【０１２５】
実施態様の１つでは、支持体を、読み込みの間に検出システムに対して移動させる。支持体が励起光に対して移動することによって、支持体の種々の部位の読み込みが可能になる。励起光は固定していてもよいし、支持体を走査するために一方向に移動させてもよい。
【０１２６】
他のある実施態様では、支持体をインキュベーションシステムおよび検出システムの両方に対して移動する。インキュベーション中、支持体は温度制御システムに接している（インキュベーション位置）。読み込みを実施しなければならない場合は、支持体をインキュベーションシステムから検出システム（読み取り位置）へ移動する。読み込みの間、支持体を励起光に対して移動するか、または固定する。読み込みの後、支持体を最初の位置へ戻す。読み込みの間インキュベーション部分に対して支持体を移動させることの１つの利点は、加熱装置の、検出システム部分への有害作用を回避することである。
【０１２７】
別の実施態様では、装置の２つの部分は固定されて一緒に作動し、堅固な支持体はインキュベーション部分と検出部分に対して移動しない。この場合に用いられる典型的な検出器は、マイクロアレイ全体の像を撮影することができるＣＣＤカメラである。
【０１２８】
図１のフローチャートは、システムの２つ部分のパラメータを制御するプログラム可能なコンピューターが、リアルタイム装置を制御する特別の実施態様について記述する。スキャナは、Ａｘｏｎ社のスクリプト可能なＧｅｎｅｐｉｘ ５．１ソフトウェアと組み合わせたＡｘｏｎ社のＧｅｎｅｐｉｘ ４２００Ａスキャナに匹敵するものである。
【０１２９】
ステップ１ではユーザーに、分解能、ＰＭＴの電圧、レーザーパワー、走査数、走査間の時間、走査領域などの、必要なパラメータの記入を促す。基板の温度は、基板上に設置された加熱システム（ペルチエ装置でよい）に別に設定する。
【０１３０】
システムのパラメータ：
分解能がピクセルサイズを規定する。一般に、ピクセルサイズは、局在領域当たり１つを超えるピクセルに、好ましくは１０〜１００に決まるよう選ぶ。高すぎる分解能に設定することは、データの過負荷を生じ、一方で小さすぎるピクセルサイズは質の低下をもたらす。ＰＭＴの電圧は検出された信号を増幅する。レーザーパワーを高めることは、各ピクセル中の光子計数を増大させることになる。
【０１３１】
「走査数」パラメータは、ユーザーが基板を走査したい回数に対応し、「走査間の時間」パラメータは、次の走査を始める前の待時間の長さを制御する。このようにしてユーザーは、反応の速度論を追跡するために一連の走査を行なうことができる。
【０１３２】
走査領域パラメータは、テストする基板のサイズに対応する。温度パラメータは検出を行う温度を制御する。温度は、テストしているポリマーの型に依存して変化する可能性がある。好ましくは、テストを、最大の結合親和性を作り出し、一方でミスマッチを最小限にする温度で行う。
【０１３３】
次に、システムを初期化する：レーザーパワーを検査している間に、保持器を、定位置に移動する。ステップ２では、第１の走査を行ない、基板のマイクロアレイを含む選択した領域で放射された蛍光を集める。走査を行ってから、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔのコールバックが実行される（ステップ３）。予定の走査数に達しない場合は、プログラムは、ユーザーが要求する遅れ時間の間待つ。つぎにステップ４で画像を保存し、もし必要なら新しい走査を行なう（ステップ５）。ＪａｖａＳｃｒｉｐｔのコールバックは、ループの続行を可能にする。ステップ６でデータから値を抽出し、ステップ７で、計算と分析を行なう。この目的のために、測定するマイクロアレイの行および列の数を含むグリッドをマイクロアレイ上に置く。グリッドは円から成り、ピクセルで測ったその直径が定量するスポットの直径に対応する。その直径は、走査用に選択した分解能に依存する。円の内部のピクセル強度の平均が、スポット信号を与える。次に、この信号を時間毎に計算し、インキュベーション時間に対してプロットする。ステップ６は、好ましくは走査された１６ビット画像を、信号の強さを定量するために用いられるソフトウェア「ＩｍａＧｅｎｅ４．０」(BioDiscovery, Los Angeles, CA, USA）へ取り入れることにより実施される。
【０１３４】
【表１】
2009530589.tif 000002
2009530589.tif 000003
2009530589.tif 000004
2009530589.tif 000005
【０１３５】
図２は、２つのプロセスの部分が同じ区画中に存在する本発明の実施態様の１つを表わす。２つのプロセスは、技術的な部分（規格を備えるために必要な）が両立しうる限り、総合されたシステムで行なわれる。光源（１）を、支持体（１５）の、定温に保持されている保持器（１２）に接触している面の反対側の面に向ける。制御器（１１）は温度制御装置を含む。
【０１３６】
好ましい実施態様では、励起光（２）は、４５°〜１３５°の、好ましくは６０°〜１２０°の、より好ましくは８０°〜１００°の角度内のマイクロアレイの表面に到達する。光励起は、ラベルされた標的の直接励起であって、エバネッセント波によって与えられるような光の内部反射は用いない。
【０１３７】
図３は、２つのプロセスが、装置の２つの異なる部分に物理的に分離されている、本発明の別の実施態様を表わす。いくつかの部分は移動される：即ち、機械の一部および支持体（１５）は静止しているか、または支持体が２つの要求されたプロセスの１つを行なうことができる位置にあるように装置のある部分から別の部分へ移るか、あるいは標的溶液（１３）がブロックとしてまたは部分として移動して、例えば、１つの部分で加熱され、他の部分で反応するかまたは検出が行なわれる。読み取り励起光（２）を、支持体のどちらが照射されるかによって、液体を横切らない（Ａ）か、または液体を通過する（Ｂ）かして、支持体（１５）に向け、集束させる。
【０１３８】
実施態様の１つでは、励起光（２）を、液体を横切ることなく、支持体に向け、集束させる。別の実施態様では、励起光（２）を、液体を通過させて支持体に向け、集束させる。
【０１３９】
図４は、保持器（１２）が流体混合システムを含む、本発明のさらに別の実施態様を表わす。好ましい実施態様では、標的と捕獲分子の間の結合が起こる反応槽（１４）が、貯蔵器（１９）と流体連絡している。保持器（１２）および温度調節装置（１６）は温度制御装置（１７）から分離していてもよい。制御器（１１）はまた、反応槽（１４）を圧縮するための装置（１８）を操作してもよい。反応槽（１４）は、その装置（１８）によって圧縮され、流体が貯蔵器を満たすことが可能になる。槽の圧縮と減圧の連続によって、溶液の混合が可能になる。マイクロアレイの読み取りを、好ましくは反応槽が圧縮されるときに行なう。２つの読み取りを、同じ圧縮で行う。
【０１４０】
別の実施態様では、反応槽中に存在する液体を、反応槽（１４）へスライドガラスを挿入することによって、貯蔵器（１９）に移動させる。
【０１４１】
別の実施態様では、マイクロアレイの読み取りの間は、反応槽中の液体の厚みは０．１〜５００μm、好ましくは１０〜１００μmから成る。
【０１４２】
別の実施態様では、マイクロアレイの読み取りの間、反応槽中の液体の厚さは、貯蔵器と比較して２〜１００倍薄い。
【０１４３】
ある特定の実施態様では、装置は、ラベルされた複数の標的分子（１３）のマイクロアレイ上でのリアルタイム定量化を行ない：
−  支持体の特異的局在領域（２１）中に固定された少なくとも１個の捕獲分子（２０）を含み前記ラベルされた標的分子（１３）と流体連絡絡しているマイクロアレイが表面に固着した、前記支持体（１５）；
−  場合により、前記支持体を保持するための保持器（１２）；
−  電子的温度制御システム（１６〜１７）；
−  励起光源（１）；
−  前記励起光源（１）からの励起光（２）を前記支持体上に直接向けて集束させ、励起光を４５〜１３５°の間に含まれる角度内のマイクロアレイ表面に到達させるための光学系；
−  前記励起光に応じて、各放射表面が約０．１μm2〜約１０mm2を含む局在領域中の結合した標的分子からの電磁光放射（７）を、標的分子を含む溶液の存在下で測定するための検出器（１０）、
を含み、
−  種々の部分は、標的分子の溶液を支持体と流体連絡するように保ちながら、調節された温度でアレイの光放出を読み取るために同一の装置へ組み込まれている。
【実施例１】
【０１４４】
同一濃度の６つの異なるポリヌクレオチドの、マイクロアレイの相補的な捕獲分子への、一定温度でのリアルタイムハイブリダイゼーション
捕獲ヌクレオチド配列の固定化
Diaglassスライド（Eppendorf, Hamburg, Germany）を、特許出願ＷＯ０２／１８２８８に記述された方法により、アルデヒドの存在で機能化する。この特許出願に記述されたプロトコルに従って、アルデヒド誘導体化されたガラスへアミノ化ＤＮＡを移植した。アミノ化捕獲ヌクレオチド配列を、３μMの濃度で溶液からスポットした。２５０μmのピンを用い、自作のロボット装置により顕微スライドガラス上に捕獲ヌクレオチド配列を印刷した。スポットは直径が４００μmであり、また、投与する体積は約０．５nlである。スライドを室温で乾燥させ、用いるまで４℃で貯蔵した。
【０１４５】
捕獲プローブは、転写因子のＤＮＡ結合部位に特異的であるように設計され、次の配列を有する：
【表２】
2009530589.tif 000006
【０１４６】
ハイブリダイゼーション
ラベルされたプローブは、固定された捕獲プローブに相補的に設計され、次の配列を有する：
【表３】
2009530589.tif 000007
【０１４７】
５’末端をＣｙ３でラベルされた６つのポリヌクレオチドプローブ（ＰＥＬＫ１、ＰＡＰ１、ＰＳＴＡＴ２、ＰＮＦＡＴ、ＰＭＹＣおよびＰＣＲＥＢ）を各々、２５μlの全容積の０．２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４中の０．３nM濃度で、マイクロアレイの相補的捕獲分子（ＴＥＬＫ１、ＴＡＰ１、ＴＳＴＡＴ２、ＴＮＦＡＴ、ＴＭＹＣ、およびＴＣＲＥＢ）上にハイブリダイズさせた。マイクロアレイの捕獲分子に対して非特異的なネガティブコントロール（ＣＴＬ−）も同時にインキュベーションする。その溶液（２５μl）を、９×９mmおよび３１０μmの厚さで平らなカバーガラスで密封されたハイブリダイゼーション室に囲まれたマイクロアレイに載せ、１℃の精度を有する温度制御システムを備える装置の恒温化部分中で、撹拌せずに５５℃でインキュベーションした。マイクロアレイ上の液体の厚みは３１０μmであった。３分毎に、スライドを装置のインキュベーション部から走査部へ移し、スキャナ中に上下を逆に置き、励起波長５３２で走査した。走査が終わると、次のスキャンまで恒温化装置にスライドを再び入れておいた。スライドを、時間０、３、６、９、１２、１５、３０、４５、および５５分に走査した。この実施例においては、装置のインキュベーション部が、物理的に走査部から分離している。リアルタイム検出の結果を、図５に示す。
【実施例２】
【０１４８】
種々の濃度の同一ポリヌクレオチド（ＣＲＥＢ）の、マイクロアレイの相補的な捕獲分子への、一定温度でのリアルタイムハイブリダイゼーション
捕獲プローブの固定化を、実施例１に記述したように行った。ＰＡＰ１（配列番号：８）の５’末端をＣｙ３でラベルされた１つのポリヌクレオチドプローブ ＰＡＰ１（配列番号：８）を、全容積２５μlの０．２Mリン酸緩衝液ｐＨ７．４中の３つの異なる濃度（０．８および０．２nM）で、相補的な捕獲分子ＴＡＰ１（配列番号：２）を含む３つの別々のマイクロアレイへ、ハイブリダイズさせた。その溶液をマイクロアレイに載せ、実施例１で説明したようにして、検出を行なった。スライドを５５℃でインキュベーションし、時間２、４、７、９、１２、１５、および１８分に走査した。リアルタイム検出の結果を図６に示す。
【実施例３】
【０１４９】
野生型ポリヌクレオチド（ＡＰ１）の、マイクロアレイの野生型の相補的捕獲分子からの、温度増加によるオンライン脱ハイブリダイゼーション
捕獲プローブの固定化を実施例１に記述したように行った。５’末端をＣｙ３でラベルされた１つのポリヌクレオチドプローブＰＡＰ１（配列番号：８）を、マイクロアレイの２つの捕獲分子、１つは完全一致（ＴＡＰ１（配列番号：２））、１つは突然変異したもの（ＴＡＰ１Ｍ（配列番号：１３））、と同時にハイブリダイズさせておいた。
【０１５０】
【表４】
2009530589.tif 000008
野生型ＴＡＰ１配列に対する突然変異塩基にアンダーラインが引かれている。
【０１５１】
ラベルされたポリヌクレオチドを、全容積２５μlの０．２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４中の０．３nM濃度でインキュベーションした。その溶液を、ハイブリダイゼーション室によって囲まれたマイクロアレイに載せ、カバーガラスで密閉した。マイクロアレイ上の液体の厚みは、３１０μmであった。スライドを、その背部にペルチエ素子を貼り付けて５５℃でインキュベーションし、実験全体の間、ペルチエを所持するスライドをスキャナ中に上下を逆にして設置する。５５℃６０分後、ペルチエの温度を２３℃まで低下させ、次に、５５℃まで３分間上昇させた。温度を次に、６２℃まで４分間、次に７５℃まで６分間、８５℃まで１分間、上昇させた。マイクロアレイを、インキュベーション中に３２秒毎に、スキャナを組み入れた同じ装置中で励起波長５３２で走査した。結果を図７に示す。
【実施例４】
【０１５２】
マイクロアレイ上でのＳＮＰのオンライン検出
捕獲プローブ固定化を実施例１に記述したように行った。この実験中で用いられる捕獲プローブは次の配列を有する：
【０１５３】
【表５】
2009530589.tif 000009
【０１５４】
捕獲プローブＡ、Ｂ、Ｃと、それらの対応物Ａ’、Ｂ’、Ｃ’、の間のヌクレオチド差にアンダーラインを引く。ＴＡ’プローブには、ＴＡプローブと比較して、３’末端からの位置５にアデニン（Ａ）の欠失がある。ＴＢ’プローブには、ＴＢプローブと比較して、５’末端からの位置５にチミン（Ｔ）の欠失がある。ＴＣ’には、５’末端からの位置５に置換（Ｇ→Ａ）がある。
【０１５５】
各捕獲プローブは、ＷＯ０１７７３７２に提案されているように、その５’末端にスペーサーを含む。
ハイブリダイゼーション
ラベルされたプローブは、固定された捕獲プローブＡ、Ｂ、Ｃ、に相補的であるように設計され、次の配列を持つ：
【０１５６】
【表６】
2009530589.tif 000010
【０１５７】
５’末端をＣｙ３でラベルされ、捕獲分子Ａ、Ｂ、およびＣ（ＴＡ（配列番号：１４）、ＴＢ（配列番号：１６）、ＴＣ（配列番号：１８））にそれぞれ特異的である３つのポリヌクレオチドプローブ（ＰＡ（配列番号：２０）、ＰＢ（配列番号：２１）、ＰＣ（配列番号：２２））を、全容積２５μlの０．２Mのリン酸緩衝液ｐＨ７．４中、０．３nMの濃度で、突然変異捕獲分子（ＴＡ’(配列番号：１５）、ＴＢ’(配列番号：１７）、ＴＣ’(配列番号：１９））もさらに含む同一のマイクロアレイ上へ、ハイブリダイズさせた。
【０１５８】
溶液をマイクロアレイに載せ、実施例３のように処理した。特異的（ＴＡ、ＴＢ、ＴＣ捕獲プローブ上への）および非特異的ハイブリダイゼーション（ＴＡ’、ＴＢ’、ＴＣ’捕獲プローブ上への）を、時間２、４、６、９、２４および３１分にマイクロアレイを走査することにより、経時的に追跡した。６５℃でのオンライン検出の結果を図８に示す。この結果は、ハイブリダイゼーションの特異性に対するプローブの影響を示す：プローブＰＣが最もよく識別する。ＰＢもまた識別するが、ＰＣより低く、またＰＡは識別しない。温度（５０℃および６５℃）は、ＳＮＰ検出に明確な影響がある。６５℃では、プローブＰＣには良好な識別能があるが、一方で５０℃では識別能が観察されなかった。
【実施例５】
【０１５９】
マイクロアレイ上での、抗体のそれぞれの抗原への結合のオンライン検出
捕獲タンパク質の固定化
Diaglassスライド（Eppendorf, Hamburg, Germany）を、特許出願ＷＯ０２／１８２８８に記述された方法によって、アルデヒドの存在で機能化した。そこに記述されたプロトコルに従って、アルデヒド誘導体化されたガラスに抗体を移植した。抗体は２００μMの濃度で溶液からスポットした。捕獲ヌクレオチド配列を、顕微スライドガラス上に、自作のロボット装置により２５０μmのピンを用いて印刷した。スポットは直径が４００μmであり、また、投与した体積は約０．５nlである。スライドを室温で乾燥させ、用いるまで４℃で貯蔵した。
【０１６０】
抗体を以下のように種々の提供先から購入した：
マウス抗体：Ａ(Santa Cruz, N°SC-7972)、Ｂ(Upstate, N°05-454)、Ｃ(BD, N°612.169)、Ｄ(Biosource, N°AHO0782)、Ｅ(R&D, N°MAB869)、Ｆ(Cell signaling, N°9216)、Ｇ(Santa Cruz, N°SC-7973)、Ｈ(BD, N°612.281)、Ｉ(BD, N°612.289)。
ウサギ抗体：Ａ’(Sigma, N°M0800)、Ｂ’(Santa Cruz, N°SC-535)、Ｃ’(Santa Cruz, N°SC-728)、Ｄ’(Santa Cruz, N°SC-7149)、Ｅ’(R&D, N°AF8691)、Ｆ’(R&D, N°AF869)、Ｇ’(Biosource, N°44 684 Z)、Ｈ’(Santa Cruz, N°SC-7975-R)。
【０１６１】
マイクロアレイ上の抗体反応
マイクロアレイに、９種の異なるマウス抗体（Ａ〜Ｉ）および８種の異なるウサギ抗体（Ａ’〜Ｈ’）を、２つの濃度（２００μg/mlおよび２０μg/ml）でスポットしておいた。溶液をマイクロアレイに載せ、実施例３のようにして検出を行なった。Ｃｙ３でラベルされたヤギ抗ウサギ抗体（Jackson Immunoresearch, N°111-165-003）をＰＢＳ＋ＢＳＡ１％＋Ｔｗｅｅｎ０．５％で１０００×に薄め、マイクロアレイ上で、３０分間槽中で、最終体積２５μlでインキュベーションした。別のアレイ上で、１０００×に薄められた、Ｃｙ３でラベルされたヤギ抗マウス抗体（Jackson Immunoresearch, N°115-165-003）で同様な処理を行った。スキャナを組み入れた同じ装置中で、スライドを上下逆にして、２０℃でインキュベーションを行った。特異的および非特異的反応を、マイクロアレイを、２０分までのインキュベーションでは毎分、次に３０分までのインキュベーションでは５分毎に走査することにより、オンラインでモニターした。図９は、２００μg/mlでスポットしたマウス抗体(Ｉ, BD N°612.289)および２００μg/mlスポットしたウサギ抗体（A', Sigma, N°M0800）の、ヤギ抗マウス抗体−Ｃｙ３との３０分間のオンライン検出を示す。
【実施例６】
【０１６２】
マイクロアレイ上でのｃＤＮＡのリアルタイム検出
ｃＤＮＡ合成
ラット肝臓からの全ＲＮＡ（１０μg/μl）（Ambion）１μlを、２μlのオリゴ（ｄＴ）１２〜１８（０．５μg/μl、Roche）、３．５μlのＨ2Ｏ、および２μlの６つの異なる明確に定義された合成ポリ（Ａ＋）ＲＮＡ溶液と、混合した。これらの合成ポリ（Ａ＋）ＲＮＡは、分析に続く工程の間に導入される実験的変動の定量化および評価を補助するための内部標準として役立った。６つの内部標準ＲＮＡは、異なる濃度で存在する：ＩＳ１＝１０ng/ml、ＩＳ２＝１ng/ml、ＩＳ３＝１００pg/ml、ＩＳ４＝３０pg/ml、ＩＳ５＝１０pg/ml、ＩＳ６＝５pg/ml。
【０１６３】
７０℃での１０分間のインキュベーション、氷上の５分間の後、反応混合液９μlを加えた。反応混合液は、４μlの５×Reverse Transcription Buffer（Gibco BRL）、１μlのRNAsin Ribonuclease Inhibitor（４０U/ml、Promega）、およびｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ（各５mM、Roche）、ｄＣＴＰ（８００μM、Roche）、およびＣｙ３−ｄＣＴＰ（８００μM、NEN）で作られた、２μlの１０×ｄＮＴＰ混合物から成っていた。
【０１６４】
室温で５分の後、１．５μlのSuperscript II（２００U/ml、Gibco BRL）を加えて、４２℃で９０分間インキュベーションを行なった。Superscriptの追加およびインキュベーションを、もう１回繰り返した。次に、混合液を７０℃に１５分間置き、１μlのリボヌクレアーゼＨ（２U/μl）を３７℃で２０分間加えた。最後に、３分間の変性工程が９５℃で行われた。逆転写工程の後、Ｇ２５スピンカラム（Pierce,#89849）上でＲＴ生成物を、フリーのｄＣＴＰ−Ｃｙ３を除いて精製する。精製された蛍光ｃＤＮＡを、−２０°Ｃで保存した。
【０１６５】
Ｃｙ３ ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション
２０μlの精製されたＣｙ３ラベルされたＲＴ生成物を、DualChip rat hepato（Eppendorf, Hamburg, Germany）へ、ＳＳＣ ２× ＳＤＳ４％全容積２５μl中でハイブリダイズさせた。その溶液をマイクロアレイに載せて、実施例１のようにして検出を行なった。スライドを、装置のインキュベーション部で、２２時間６５℃で、１４００rpmで混合してインキュベーションした。読み取りの時に、撹拌を停止してスライドを装置の走査部へ移し、上下を逆にして、励起波長５３２で走査した。スライドを、時間２分、９０分、２００分、６時間、１４時間、２２時間に走査した。図１０は、ＩＳ１ ｃＤＮＡのリアルタイムハイブリダイゼーションを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】プログラム可能なコンピューターよってリアルタイム装置が制御される特定の実施態様について記述するフローチャート。
【図２】支持体（１５）、保持器（１２）、温度調節装置（１６）、および検出器（１０）を含む統合装置の一般的な模式図。
【図３】恒温化された保持器が検出器から物理的に分離されている装置の一般的な模式図。図は、溶液を通して（Ｂ）または支持体を通して（Ａ）マイクロアレイに達する光励起と共に、装置の保持器部分を示す。
【図４】読み取り中に液体を移送するための貯蔵槽（１９）を含む装置保持器の模式図。結合反応中には、反応槽は満たされており、貯蔵槽は空であるか、ほとんど空である（Ａ）。マイクロアレイの読み取り中は、反応槽（１４）の厚みは縮小し、貯蔵槽は満たされている（Ｂ）。
【図５】Ｃｙ３でラベルされた６つの異なるポリヌクレオチド（ＰＥＬＫ１、ＰＡＰ１、ＰＳＴＡＴ２、ＰＮＦＡＴ、ＰＭＹＣおよびＰＣＲＥＢ）の、マイクロアレイ上でのそれらと相補的な捕獲分子へのオンラインハイブリダイゼーション。ポリヌクレオチドを０．３nMの濃度でマイクロアレイに載せ、一定温度でインキュベーションする。マイクロアレイの捕獲分子に対して非特異的なネガティブコントロール（ＣＴＬ−）を同時にインキュベーションする。
【図６】２つの異なる濃度（１×および４×）の、Ｃｙ３でラベルされた１つのポリヌクレオチド（ＰＡＰ１）の、マイクロアレイの相補的捕獲分子へのオンラインハイブリダイゼーション。各濃度のポリヌクレオチドを別々のマイクロアレイ上で５５℃でインキュベーションする。
【図７】Ｃｙ３でラベルされた野生型（ＰＡＰ１）ポリヌクレオチドの、温度を２３℃から８５℃に上昇させる間のマイクロアレイからのオンライン脱ハイブリダイゼーション。２つの型の捕獲分子：野生型ポリヌクレオチドの完全対合物（ＴＡＰ１）および突然変異ポリヌクレオチド（ＴＡＰ１Ｍ）、がマイクロアレイ上に存在する。
【図８】マイクロアレイ上でのＳＮＰのオンライン検出。ハイブリダイゼーションの特異性に対するプローブ配列の影響。Ｃｙ３ラベルされた３つのポリヌクレオチド（ＰＡ、ＰＢ、ＰＣ）が、マイクロアレイ上のそれらの相補的捕獲分子（ＴＡ、ＴＢ、ＴＣ）に、突然変異捕獲分子（ＴＡ’、ＴＢ’、ＴＣ’）の存在下、６５℃でハイブリダイズする。
【図９】抗体のオンライン検出。Ｃｙ３ラベルされたヤギ抗マウス抗体の、マイクロアレイ上のマウス抗体への結合を、固定されたウサギ抗体存在下、リアルタイムで検出する。検出画像を３０分間のインキュベーション中に得る。
【図１０】Ｃｙ３ラベルされたｓｓ ｃＤＮＡ（ＩＳｌ）の、マイクロアレイの相補的捕獲分子へのオンラインハイブリダイゼーション。検出画像を２２時間のインキュベーション中に得る。
【図１１】ラベルされたプライマーを用いる、ＰＣＲ生成物のマイクロアレイ上でのオンライン検出。種々の捕獲分子を含むマイクロアレイの存在下でＰＣＲを行なう。１つの反応サイクル中の、アニーリング、伸長、および変性の交互の工程は、ラベルされた生成物の蓄積をもたらし、それはマイクロアレイ上に存在するそれらの捕獲分子にハイブリダイズする、しかし生成物は各変性サイクルの後にそれらの特異的捕獲分子から脱ハイブリダイズする。
【図１２】ラベルされたｄＮＴＰを用いる、ＰＣＲ生成物のマイクロアレイ上でのオンライン検出。種々の捕獲分子を含むマイクロアレイの存在下でＰＣＲを行なう。１つの反応サイクルの間の、アニーリング、伸長、および変性の交互の工程は、ラベルされた生成物の蓄積をもたらし、その一部は各変性サイクルの後にその特異的捕獲分子に組み入れられ、検出される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年8月3日(2006.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロアレイ上での異なった標的分子のリアルタイム定量化のための、以下の工程を含む方法：
それぞれが支持体の特異的局在領域（２１）中に固定された少なくとも５種の捕獲分子（２０）を含むマイクロアレイがその表面に固着した前記支持体（１５）を、反応槽（１４）中に設置する工程；
ラベルされた標的分子（１３）を含む溶液を、反応槽（１４）中へ導入する工程；
前記ラベルされた標的分子（１３）を、前記標的（１３）とそれらの対応する捕獲分子（２０）の間の特異的結合を可能にする条件下でインキュベーションする工程；
光源（１）からの励起光（２）を支持体の表面上へ向け、励起光を４５〜１３５°の間に含まれる角度内のマイクロアレイ表面に到達させる工程；
結合した標的分子からの、前記励起光（２）に応じた光放射（７）を、標的分子（１３）を含む溶液の存在下で測定する工程であって、１つの局在領域の放射表面は約０．１μm2〜約１０mm2を含み、少なくとも４つの局在領域の各々を経時的にモニターし、各局在領域（２１）につき少なくとも２回の測定を行う工程；および
種々の測定値を処理し記憶し、各前記標的に対して少なくとも１つの測定値を用いて、溶液中に存在する少なくとも４種の異なる標的分子を定量する工程。
【請求項２】
インキュベーションシステムが、マイクロアレイに接している溶液の厚みが全ての局在領域上で一定になるような条件を提供する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
２つの局在領域の上の液体の厚みの差異が、１００μm未満であり、好ましくは１０μm未満であり、またさらに１μm未満である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
マイクロアレイに接している溶液の厚みが、２回の測定間で変更される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
標的分子が蛍光色素、好ましくはシアニン３でラベルされる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
標的分子が、核酸、相同ヌクレオチド配列、またはタンパク質から成る群より選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項７】
タンパク質が、抗体、抗原、リガンド、レセプターから成る群より選ばれる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
結合反応の間の温度が、５℃未満の、好ましくは１℃未満の温度変化で一定に保持される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
測定が、１分間〜２４時間で行なわれる、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
温度が、計算期間の間、好ましくは計算期間の間少なくとも１分間、より好ましくは計算期間の間１〜６０分間、一定に保持される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
検出溶液中の標的分子の濃度が、約０．０００１〜約１０００nM、好ましくは約０．００１〜約１０nMである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
支持体（１５）が、捕獲分子がその上に固定されている基板を含み、基板は好ましくはガラスである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
マイクロアレイが２０を超え１０００未満の異なる捕獲分子を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
捕獲分子が、物理的手段により基板上に付着されるか、または基板上の予め規定された位置にインサイチューで合成される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
捕獲分子が、基板上の規定された位置に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
標的を検出するための局在領域の放射表面が、１μm2〜１mm2を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
捕獲分子を保持する支持体の表面が、３次元構造を有する、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
支持体が、物理的な境界によって分離された数個のマイクロアレイを有する、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
支持体がマルチウエル形式を有する、請求項２７記載の方法。
【請求項２０】
溶液中に存在する標的濃度の計算が、標的が特異的な方式で結合する局在領域において経時的に出現する信号の、反応速度係数の計算から；または、標的が特異的に結合する局在領域において経時的に得られる少なくとも３つの値から得られる信号の一次反応速度係数から、導出される、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
標的分子を含む溶液が、２回以上の測定の間に少なくとも２の、好ましくは３の異なる温度を有する温度サイクルに付される、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
温度サイクルおよび反応条件がＰＣＲを生じさせる、請求項３１の方法。
【請求項２３】
標的分子のハイブリダイゼーションのための最適なインキュベーション条件を決定するための、以下の工程を含む方法：
−  それぞれが支持体の特異的局在領域（２１）中に固定された少なくとも５種の捕獲分子（２０）を含むマイクロアレイがその表面に固着した前記支持体（１５）を、反応槽（１４）中に設置する工程；
−  ラベルされた標的分子（１３）を含む溶液を反応槽（１４）中へ導入する工程；
−  前記ラベルされた標的分子（１３）を、前記標的（１３）とそれらの対応する捕獲分子（２０）の間の特異的結合を可能にする条件下でインキュベーションする工程；
−  光源（１）からの励起光（２）を支持体の表面上へ向ける工程；
−  結合した標的分子からの、前記励起光（２）に応じた光放射（７）を、標的分子（１３）を含む溶液の存在下で測定する工程であって、１つの局在領域の放射表面が約０．１μm2〜１０mm2を含み、また少なくとも５つの局在領域の各々を経時的にモニターし、各局在領域（２１）につき少なくとも２回の測定を行う工程；および
−  種々の測定値を処理し記憶し、各前記標的に対して少なくとも１つの測定値を用いて、溶液中に存在する少なくとも５種の異なる標的分子を定量する工程。
【請求項２４】
標的配列と少なくとも１つのヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列の結合に対して非常に高い識別能力を有する特異的捕獲分子上の標的分子の、高い結合効率の決定のための方法であって、以下の工程を含む方法：
−  それぞれが支持体の特異的局在領域（２１）中に固定された少なくとも５種の捕獲分子（２０）を含むマイクロアレイがその表面に固着した前記支持体（１５）を、反応槽（１４）中に設置する工程；
−  ラベルされた標的分子（１３）を含む溶液を反応槽（１４）中へ導入する工程；
−  前記ラベルされた標的分子（１３）を、前記標的（１３）とそれらの対応する捕獲分子（２０）の間の特異的結合を可能にする条件下で、インキュベーションする工程；
−  光源（１）からの励起光（２）を支持体の表面上へ向ける工程；
−  結合した標的分子からの、前記励起光（２）に応じた光放射（７）を、標的分子（１３）を含む溶液の存在下で測定する工程であって、１つの局在領域の放射表面が約０．１μm2〜１０mm2を含み、少なくとも５つの局在領域の各々を経時的にモニターし、各局在領域（２１）につき少なくとも２回の測定を行う工程；および
−  種々の測定値を処理し記憶し、各前記標的に対して少なくとも１つの測定値を用いて、溶液中に存在する少なくとも５種の異なる標的分子を定量する工程。
【請求項２５】
標的配列中のＳＮＰを検出するためのハイブリダイゼーション条件を最適化するための、または同じ溶液中に存在する可能性のある異なった標的配列中のＳＮＰのハイブリダイゼーションおよび検出の条件を最適化するための、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ラベルされた異なった標的分子（１３）をマイクロアレイ上でリアルタイム定量化するための、２つの部分を含む装置であって、
第１の部分は：
−  支持体の特異的局在領域（２１）に固定された少なくとも５種の捕獲分子（２０）を含み、前記ラベルされた標的分子（１３）と流体連絡しているマイクロアレイが表面上に固着した、前記支持体（１５）、
−  場合により、前記支持体を保持するための保持器（１２）、
−  温度制御システム（１６〜１７）；
から構成され、
第２の部分は：
−  励起光源（１）、
−  前記励起光源（１）からの励起光（２）を前記支持体上に向けて集束させ、励起光を４５〜１３５°の間に含まれる角度内のマイクロアレイ表面に到達させるための光学系、
−  前記励起光に応じて、放射表面が約０．１μm2〜約１０mm2を含む局在領域中の結合した標的分子からの電磁光放射（７）を、標的分子を含む溶液の存在下で測定するための検出器（１０）、
を含み、
前記第１の部分と前記第２の部分は固定され、共に動作する装置。
【請求項２７】
第２の部分が、さらに以下の部分を含む請求項２６記載の装置：
−  支持体の少なくとも５つの局在領域についての異なる測定データを記憶するための記憶システム、
−  マイクロアレイの各局在領域に対して励起、検出、および記憶の工程を少なくとも２回繰り返す制御器（１１）、
−  前記各標的につき少なくとも１つの測定値を用いて、溶液中に存在する少なくとも５種の異なる標的分子を記憶し定量するためのプログラム。
【請求項２８】
２つの部分が統合されている、または、
２つの部分が物理的に分離されている、または
プログラムがコンピューターの一部である、または
励起光がレーザービームである、または
インキュベーションシステムが、マイクロアレイに接する溶液の厚みを全ての局在領域上で一定にする条件を提供する、または
２つの局在領域間の液体の厚みの差異が、好ましくは１００μm未満、さらに１０μm未満、および１μm未満でさえある、または
インキュベーションシステムが、マイクロアレイに接する溶液の厚みが、２回の測定の間で変化するような条件を提供する、または
第１の部分がさらに流体混合システムを含む、または
マイクロアレイが少なくとも１の貯蔵器（１９）と流体連絡している、
請求項２６記載の装置。
【請求項２９】
励起光（２）を、液体を横切らずに支持体に向けて集束させる、または励起光（２）を、液体を通して支持体に向けて集束させる、請求項２６記載の装置。
【請求項３０】
支持体（１５）が、捕獲分子がその上に固定された基板を含む；または、マイクロアレイが、２０種を超え１０００種未満の異なる捕獲分子を含む；または、捕獲分子が、物理的手段によって基板上に付着されている；または、捕獲分子が、基板上の予め定められた位置で、インサイチュウで合成される；または、捕獲分子が、基板上の定められた位置に存在する、請求項２６記載の装置。
【請求項３１】
同一の分析で、溶液中に存在する１０００種を超える標的分子を定量する、請求項１記載の方法。
【請求項３２】
溶液中に存在する１〜１０００種の標的分子を、好ましくは１〜２０種を、より好ましくは１〜５種の標的分子を、同一分析で定量する、請求項１記載の方法。
【請求項３３】
測定が、二重鎖型であるラベルされた標的分子（１３）について行なわれる、請求項１記載の方法。
【請求項３４】
検出する標的が、溶液中の１nM未満の濃度のヌクレオチド分子である、請求項１記載の方法。
【請求項３５】
検出する標的が、溶液中の１μM未満の濃度の抗原または抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項３６】
励起光（２）が、支持体の表面に直接向けられる、請求項１記載の方法。
【請求項３７】
励起光（２）が、マイクロアレイの表面に向けられ、集束されるレーザービームである、請求項１記載の方法。
【請求項３８】
励起光（２）が、溶液を通してマイクロアレイの表面に向けられ、集束される、請求項１記載の方法。
【請求項３９】
励起光が、支持体を通してアレイの表面に表面に向けられ、集束される、請求項１記載の方法。
【請求項４０】
レーザービームが、アレイの表面を走査する、請求項１記載の方法。
【請求項４１】
放射光が、共焦点光として検出され、光電子増倍管による増幅の後に測定される、請求項１記載の方法。
【請求項４２】
マイクロアレイ上での異なった標的分子のリアルタイム定量化のための方法であって、以下の工程を含む方法：
−  それぞれが支持体の特異的局在領域（２１）中に固定された少なくとも５種の捕獲分子（２０）を含むマイクロアレイがその表面に固着した前記支持体（１５）を、反応槽（１４）中に設置する工程；
−  ラベルされた標的分子（１３）を含む溶液を反応槽（１４）中へ導入する工程；
−  前記ラベルされた標的分子（１３）を、前記標的（１３）とそれらの対応する捕獲分子（２０）の間の特異的結合を可能にする条件下でインキュベーションする工程；
−  光源（１）からの励起光（２）を支持体の表面上へ向ける工程；
−  結合した標的分子からの、前記励起光（２）に応じた光放射（７）を、標的分子（１３）を含む溶液の存在下で測定する工程であって、１つの局在領域の放射表面が約０．１μm2〜１０mm2を含み、少なくとも５つの局在領域（２１）の各々を経時的にモニターし、各局在領域（２１）につき少なくとも２回の測定を行う工程；および
−  少なくとも５つの局在領域についての種々の測定値を処理し記憶し、各前記標的に対して少なくとも１つの測定値を用いて、溶液中に存在する標的分子を定量する工程。
【請求項４３】
特異的な捕獲プローブと突然変異を有する捕獲プローブとの間の信号の識別能力が、５、好ましくは１０より高い、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項４４】
ラベルされた異なった標的分子（１３）のマイクロアレイ上でのリアルタイム定量化のための装置であって：
−  支持体の特異的局在領域（２１）中に固定された少なくとも１つの捕獲分子（２０）を含み、前記ラベルされた標的分子（１３）と流体連絡しているマイクロアレイがその表面に固着した、前記支持体（１５）；
−  場合により、前記支持体を保持するための保持器（１２）；
−  電子的温度制御システム（１６〜１７）；
−  励起光源（１）；
−  前記励起光源（１）からの励起光（２）を前記支持体上に直接向けて集束させ、励起光を４５〜１３５°の間に含まれる角度内のマイクロアレイ表面に到達させるための光学系；
−  標的分子を含む溶液の存在下で、結合した標的分子からの前記励起光に応じた、局在領域の放射表面が約０．１μm2〜約１０mm2を含む電磁光放射（７）を測定するための検出器（１０）；
を含み、
標的分子溶液を支持体と調節された温度で流体連絡するように保ちながら、アレイの光放射を読み取るために、種々の部分が同一の装置へ統合された、
装置。
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月28日(2008.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009530589000001.app
【国際調査報告】
2009530589.tif 000023
2009530589.tif 000024
2009530589.tif 000025