(57)【要約】【解決手段】  結合特異性および生物活性が高いヒトモノクローナル抗体を分泌し、特に抗顆粒球マクロファージコロニー刺激因子活性を中和するハイブリドーマ株、および前記ハイブリドーマ株の作成法が提供される。標的抗原およびエピトープも提供される。前記抗体は、治療法、例えば癌、感染症、または自己免疫疾患の治療に利用できる。【選択図】      なし
2009526082.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合する単離ヒトモノクローナル抗体。
【請求項２】
請求項１記載の抗体において、前記重鎖ＣＤＲ３は配列ＩＤ番号４２のアミノ酸配列を有するものである。
【請求項３】
請求項１記載の抗体において、前記重鎖ＣＤＲ３は配列ＩＤ番号４８のアミノ酸配列を有するものである。
【請求項４】
請求項１記載の抗体において、前記重鎖は配列ＩＤ番号８のアミノ酸配列を有するものである。
【請求項５】
請求項１記載の抗体において、前記重鎖は配列ＩＤ番号１６のアミノ酸配列を有するものである。
【請求項６】
請求項１記載の抗体において、前記軽鎖は配列ＩＤ番号１２のアミノ酸配列を有するものである。
【請求項７】
請求項１記載の抗体において、前記軽鎖は配列ＩＤ番号１８のアミノ酸配列を有するものである。
【請求項８】
請求項１記載の抗体において、前記抗体の親和性は約１×１０−８未満である。
【請求項９】
請求項１記載の抗体において、この抗体は、２つの重鎖を有するものである。
【請求項１０】
請求項１記載の抗体において、この抗体は、２つの軽鎖を有するものである。
【請求項１１】
配列ＩＤ番号３５のアミノ酸配列を有するペプチドのエピトープに結合する抗体。
【請求項１２】
配列ＩＤ番号３６のアミノ酸配列を有するペプチドのエピトープに結合する抗体。
【請求項１３】
配列ＩＤ番号３７のアミノ酸配列を有するペプチドのエピトープに結合する抗体。
【請求項１４】
配列ＩＤ番号３８のアミノ酸配列を有するペプチドのエピトープに結合する抗体。
【請求項１５】
請求項１記載の抗体と薬学的に許容される担体とを有する組成物。
【請求項１６】
請求項１記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１６記載のポリヌクレオチドにおいて、前記重鎖の核酸配列は配列ＩＤ番号１０を有するものである。
【請求項１８】
請求項１６記載のポリヌクレオチドにおいて、前記重鎖の核酸配列は配列ＩＤ番号１７を有するものである。
【請求項１９】
請求項１６記載のポリヌクレオチドにおいて、前記軽鎖の核酸配列は配列ＩＤ番号１４を有するものである。
【請求項２０】
請求項１６記載のポリヌクレオチドにおいて、前記軽鎖の核酸配列は配列ＩＤ番号１９を有するものである。
【請求項２１】
請求項１２記載のポリヌクレオチド配列を有するベクター。
【請求項２２】
請求項１記載の抗体を発現する細胞。
【請求項２３】
請求項２２記載の細胞において、前記細胞はハイブリドーマである。
【請求項２４】
対象のＧＭ−ＣＳＦを介した炎症性疾患を治療する方法であって、前記対象に、薬学的に許容される担体と、およびＧＭ−ＣＳＦを介した炎症性疾患の治療に有効な量でＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合する少なくとも１つの抗体とを有する組成物を投与する工程を有する方法。
【請求項２５】
請求項２４記載の方法において、前記対象はヒトである。
【請求項２６】
請求項２４記載の方法において、前記抗体は配列ＩＤ番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を有するものである。
【請求項２７】
請求項２４記載の方法において、前記抗体は配列ＩＤ番号４８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を有するものである。
【請求項２８】
請求項２４記載の方法において、前記抗体は配列ＩＤ番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖を有するものである。
【請求項２９】
請求項２４記載の方法において、前記抗体は配列ＩＤ番号７のアミノ酸配列を有する重鎖を有するものである。
【請求項３０】
請求項２４記載の方法において、前記抗体は配列ＩＤ番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖を有するものである。
【請求項３１】
請求項２４記載の方法において、前記抗体は配列ＩＤ番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖を有するものである。
【請求項３２】
請求項２４記載の方法において、前記ＧＭ−ＣＳＦを介した炎症性疾患は関節リウマチである。
【請求項３３】
請求項２４記載の方法において、前記ＧＭ−ＣＳＦを介した炎症性疾患は多発性硬化症である。
【請求項３４】
請求項２４記載の方法において、前記ＧＭ−ＣＳＦを介した炎症性疾患は喘息である。
【請求項３５】
請求項２４記載の方法において、前記ＧＭ−ＣＳＦを介した炎症性疾患は肺胞タンパク症である。
【請求項３６】
請求項２４記載の方法において、前記ＧＭ−ＣＳＦを介した炎症性疾患は結腸癌、肺癌、乳癌、膵癌、白血病、または若年性骨髄単球性白血病である。
【請求項３７】
ＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作成する方法であって、
ａ．ｅｘ  ｖｉｖｏで末梢血単核細胞とＧＭ−ＣＳＦまたはその抗原フラグメントを混合し、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体を作成する、前記混合する工程と、
ｂ．前記抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合し、ハイブリドーマ細胞を作成する、前記融合する工程と、
ｃ．前記ハイブリドーマ細胞から産生された抗体のＧＭ−ＣＳＦに対する特異的結合性を決定する工程と、
ｄ．ＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択する工程と
を有し、それによりＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作成する方法。
【請求項３８】
請求項３７記載の方法において、前記抗原フラグメントは、配列ＩＤ番号３、４、５、３５、３６、３７、３８、または３９のアミノ酸配列を有するものである。
【請求項３９】
請求項３７記載の方法において、前記ハイブリドーマ細胞は、ミスマッチ修復の化学抑制剤に曝露されるものである。
【請求項４０】
請求項３７記載の方法において、前記骨髄腫細胞は、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ型をコードするポリヌクレオチドを発現するものである。
【請求項４１】
請求項４０記載の方法において、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ型を有する前記ポリヌクレオチドは、不活性化されるものである。
【請求項４２】
請求項３７記載の方法によって生産されるハイブリドーマ細胞。
【請求項４３】
請求項４２記載のハイブリドーマ細胞によって産生される抗体。
【請求項４４】
請求項３７記載の方法において、前記ハイブリドーマ細胞は、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を発現するものである。
【請求項４５】
請求項４４記載の方法において、前記ハイブリドーマ細胞は、前記ミスマッチ修復阻害剤により治癒するものである。
【請求項４６】
請求項１記載の抗体を作成する方法であって、前記抗体の産生に適した条件で宿主細胞を培養する工程と、前記細胞培養による抗体を回収する工程とを有する方法。
【請求項４７】
配列ＩＤ番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項４８】
配列ＩＤ番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項４９】
配列ＩＤ番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項５０】
配列ＩＤ番号３５のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項５１】
配列ＩＤ番号３６のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項５２】
配列ＩＤ番号３７のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項５３】
配列ＩＤ番号３８のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項５４】
配列ＩＤ番号３９のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項５５】
炎症性疾患を有する患者のヒトＧＭ−ＣＳＦの生物活性を阻害する方法であって、炎症性疾患患者に請求項１記載の抗体を投与する工程を有する方法。
【請求項５６】
請求項５５記載の方法において、前記炎症性疾患は関節リウマチである。
【請求項５７】
請求項５５記載の方法において、前記炎症性疾患は多発性硬化症である。
【請求項５８】
請求項５５記載の方法において、前記炎症性疾患は喘息である。
【請求項５９】
癌患者のヒトＧＭ−ＣＳＦの生物活性を阻害する方法であって、癌患者に請求項１記載の抗体を投与する工程を有する方法。
【請求項６０】
請求項５９記載の方法において、前記癌は白血病である。
【請求項６１】
請求項５９記載の方法において、前記癌は若年性骨髄単球性白血病である。
【請求項６２】
請求項５９記載の方法において、この方法は、さらに、化学療法薬を前記患者に投与する工程を有するものである。
【請求項６３】
請求項６２記載の方法において、前記抗体は前記化学療法薬と結合されるものである。
【請求項６４】
炎症性疾患を有する患者のヒトＧＭ−ＣＳＦの生物活性を阻害する方法であって、炎症性疾患患者に請求項１記載の抗体を投与する工程を有する、方法。
【請求項６５】
請求項６４記載の方法において、前記感染症は敗血症性ショックである。
【請求項６６】
標的抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作成する方法であって、末梢血単核細胞と対象抗原または対象抗原を発現する抗原提示細胞を有する細胞抽出物とをｅｘ  ｖｉｖｏで混合し、対象抗原に対する抗体を産生する抗体産生細胞を作成し、前記抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合し、親ハイブリドーマ細胞を形成し、前記ハイブリドーマ細胞がミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を発現する工程と、前記親ハイブリドーマ細胞をインキュベートし、突然変異を誘発させることで、過剰変異ハイブリドーマ細胞を形成する工程と、前記過剰変異ハイブリドーマ細胞から産生した抗体または前記親ハイブリドーマ細胞によって産生された抗体よりも力価が高い産生抗体について、抗原に対する抗体の結合をスクリーニングする工程と、前記親ハイブリドーマ細胞よりも抗原に対する親和性が高いか、力価が高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞を選択する工程とを有し、それによって、前記対象抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作成する方法。
【請求項６７】
標的抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する方法であって、末梢血単核細胞と対象抗原または対象抗原を発現する抗原提示細胞を有する細胞抽出物とをｅｘ  ｖｉｖｏで混合し、対象抗原に対する抗体を産生する抗体産生細胞を作成し、前記抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する工程と、前記ハイブリドーマ細胞から産生される抗体の抗原に対する結合をスクリーニングする工程と、前記抗原に対する抗体を哺乳類発現細胞に産生するハイブリドーマ細胞から免疫グロブリン遺伝子をクローニングし、前記哺乳類発現細胞がミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を発現し、前記ハイブリドーマ細胞よりも高い力価で抗体を産生する哺乳類発現細胞、または前記ハイブリドーマ細胞から産生される抗体と比較し、抗原に対する親和性の高い抗体を産生する哺乳類発現細胞をスクリーニングする工程とを有し、それによって、対象抗原に特異的に結合する抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する方法。
【請求項６８】
標的抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作成する方法であって、末梢血単核細胞と対象抗原または対象抗原を発現する抗原提示細胞を有する細胞抽出物とをｅｘ  ｖｉｖｏで混合し、対象抗原に対する抗体を産生する抗体産生細胞を作成し、前記抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合し、親ハイブリドーマ細胞を形成する工程と、ミスマッチ修復の化学抑制剤少なくとも１種類の存在下で前記親ハイブリドーマ細胞をインキュベートし、それによって過剰変異ハイブリドーマ細胞を形成する工程と、前記親ハイブリドーマ細胞よりも高い力価の抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞、または前記親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも親和性が高い抗原に結合する抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞をスクリーニングする工程と、前記親ハイブリドーマ細胞よりも力価が高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞、または前記親ハイブリドーマ細胞により産生される抗体よりも前記抗原に対する親和性が高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞を選択する工程とを有し、それによって、前記対象抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作成する方法。
【請求項６９】
標的抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する方法であって、末梢血単核細胞と対象抗原または対象抗原を発現する抗原提示細胞を有する細胞抽出物とをｅｘ  ｖｉｖｏで混合し、対象抗原に対する抗体を産生する抗体産生細胞を作成し、前記抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する工程と、前記ハイブリドーマ細胞から産生される抗体の抗原に対する結合をスクリーニングする工程と、抗原に対する抗体を哺乳類発現細胞に産生するハイブリドーマ細胞から免疫グロブリン遺伝子をクローニングする工程と、ミスマッチ修復遺伝子の化学抑制剤少なくとも１種類存在下、前記哺乳類発現細胞をインキュベートする工程と、前記ハイブリドーマ細胞から産生される抗体と比べ、抗原に対する親和性が高い抗体を分泌する哺乳類発現細胞をスクリーニングする工程とを有し、それによって、前記対象抗原に特異的に結合する抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する方法。
【請求項７０】
標的抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する方法であって、末梢血単核細胞と対象抗原または対象抗原を発現する抗原提示細胞を有する細胞抽出物とをｅｘ  ｖｉｖｏで混合し、対象抗原に対する抗体を産生する抗体産生細胞を作成し、前記抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する工程と、ミスマッチ修復遺伝子の化学抑制剤少なくとも１種類存在下、前記ハイブリドーマ細胞をインキュベートし、過剰変異ハイブリドーマ細胞を形成する工程と、抗原結合抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞をスクリーニングする工程と、前記親ハイブリドーマ細胞により産生される抗体よりも抗原に対する親和性が高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞を選択する工程と、前記過剰変異ハイブリドーマ細胞から哺乳類発現細胞に免疫グロブリン遺伝子をクローニングする工程とを有し、それによって、前記対象抗原に特異的に結合する抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する方法。
【請求項７１】
標的抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作成する方法であって、末梢血単核細胞と対象抗原または対象抗原を発現する抗原提示細胞を有する細胞抽出物とをｅｘ  ｖｉｖｏで混合し、対象抗原に対する抗体を作成する抗体産生細胞を作成し、前記抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合し、親ハイブリドーマ細胞を形成する工程であって、前記親ハイブリドーマ細胞はミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を有し、ミスマッチ修復が欠損しているものである、前記混合させる工程と、前記親ハイブリドーマ細胞をインキュベートし、突然変異を誘発させることにより、過剰変異ハイブリドーマ細胞を形成する工程と、前記過剰変異ハイブリドーマ細胞から産生した抗体の抗原に対する抗体結合性をスクリーニングする工程と、前記親ハイブリドーマ細胞から産生される抗体よりも抗原に対する親和性が高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞を選択する工程と、前記親ハイブリドーマ細胞と比べ、抗体の力価が上昇した過剰変異ハイブリドーマ細胞の２回目のスクリーニングを行う工程と、前記親ハイブリドーマ細胞よりも力価が高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞を選択する工程とを有し、それによって、前記対象抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作成する方法。
【請求項７２】
標的抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作成する方法であって、末梢血単核細胞と対象抗原または対象抗原を発現する抗原提示細胞を有する細胞抽出物とをｅｘ  ｖｉｖｏで混合し、対象抗原に対する抗体を産生する抗体産生細胞を作成し、前記抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合する工程であって、前記骨髄腫細胞は天然でミスマッチ修復が欠損しており、それによって、親ハイブリドーマ細胞を形成し、前記親ハイブリドーマ細胞のミスマッチ修復遺伝子が欠損しているものである、前記混合する工程と、前記親ハイブリドーマ細胞をインキュベートし、突然変異を誘発させることで、過剰変異ハイブリドーマ細胞を形成する工程と、前記過剰発現ハイブリドーマ細胞から産生された抗体の抗原に対する抗体結合性について、１回目のスクリーニングを行う工程と、前記親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも抗原への親和性が高い抗体を産生する、過剰変異ハイブリドーマ細胞を選択する工程と、親ハイブリドーマ細胞よりも高い力価の抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞、または前記親ハイブリドーマ細胞により産生される抗体よりも親和性の高い抗原に結合する抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞について、２回目のスクリーニングを行う工程と、前記親ハイブリドーマ細胞よりも力価が高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞、または前記親細胞により産生される抗体よりも、前記抗原に対する親和性が高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞を選択する工程とを有し、それによって、前記対象抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作成する方法。
【請求項７３】
標的抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する方法であって、末梢血単核細胞と対象抗原または対象抗原を発現する抗原提示細胞を有する細胞抽出物とをｅｘ  ｖｉｖｏで混合し、前記対象抗原に対する抗体を産生する抗体産生細胞を作成し、前記抗体産生細胞はミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を有し、前記抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合し、親ハイブリドーマ細胞を形成し、前記親ハイブリドーマ細胞はミスマッチ修復を欠損しているものである、前記混合する工程と、前記親ハイブリドーマ細胞をインキュベートし、突然変異を誘発させることで、過剰変異ハイブリドーマ細胞を形成する工程と、前記親ハイブリドーマ細胞よりも力価の高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞、または前記親ハイブリドーマ細胞により産生される抗体よりも親和性が高い抗原に結合する抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞をスクリーニングする工程と、前記親ハイブリドーマ細胞よりも力価の高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞または前記親ハイブリドーマ細胞により産生される抗体よりも前記抗原に対する親和性が高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞を選択する工程とを有し、それによって、前記対象抗原に特異的に結合する抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する方法。
【請求項７４】
標的抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する方法であって、末梢血単核細胞と対象抗原または対象抗原を発現する抗原提示細胞を有する細胞抽出物とをｅｘ  ｖｉｖｏで混合し、前記対象抗原に対する抗体を産生する細胞を作成し、抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合し、前記骨髄腫細胞が天然でミスマッチ修復を欠損することで、親ハイブリドーマ細胞を形成し、前記ハイブリドーマ細胞のミスマッチ修復が欠損している工程と、前記親ハイブリドーマ細胞をインキュベートし、突然変異を誘発させることで、過剰変異ハイブリドーマ細胞を形成する工程と、前記親ハイブリドーマ細胞よりも力価の高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞、または前記親ハイブリドーマ細胞により産生される抗体よりも親和性が高い抗原に結合する抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞をスクリーニングする工程と、前記親ハイブリドーマ細胞よりも力価の高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞または前記親細胞により産生される抗体よりも前記抗原に対する親和性が高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞を選択する工程と、前記過剰変異ハイブリドーマ細胞から哺乳類発現細胞に免疫グロブリン遺伝子をクローニングする工程とを有し、それによって、前記対象抗原に特異的に結合する抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する方法。
【請求項７５】
標的抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する方法であって、末梢血単核細胞と対象抗原または対象抗原を発現する抗原提示細胞を有する細胞抽出物とをｅｘ  ｖｉｖｏで混合し、前記対象抗原に対する抗体を産生する抗体産生細胞を作成し、抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合することで、親ハイブリドーマ細胞を形成し、前記ハイブリドーマ細胞から産生される抗体について抗原に対する抗体結合性をスクリーニングする工程と、前記ハイブリドーマ細胞から哺乳類発現細胞に免疫グロブリン遺伝子をクローニングし、前記発現細胞は天然でミスマッチ修復を欠損しており、前記発現細胞をインキュベートすることで突然変異を誘発し、前記親発現細胞よりも力価の高い抗体を産生する過剰変異発現細胞、または前記親発現細胞により産生される抗体よりも親和性が高い抗原に結合する抗体を産生する過剰変異発現細胞をスクリーニングする工程と、前記親発現細胞よりも力価の高い抗体を産生する過剰変異発現細胞または前記親細胞により産生される抗体よりも前記抗原に対する親和性が高い抗体を産生する過剰変異発現細胞を選択する工程とを有し、それによって、前記対象抗原に特異的に結合する抗体を産生する過剰変異発現細胞を作成する方法。
【請求項７６】
標的抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作成する方法であって、対象抗原を負荷した動物から単離された骨髄または末梢血細胞を培養し、前記対象抗原に対する抗体を産生する細胞を単離し、前記抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合し、親ハイブリドーマ細胞を形成し、前記ハイブリドーマ細胞はミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を発現する工程と、前記親ハイブリドーマ細胞をインキュベートし、突然変異を誘発させることで、過剰変異ハイブリドーマ細胞を形成する工程と、前記過剰変異ハイブリドーマ細胞から産生される抗体または前記親ハイブリドーマ細胞によって産生されるものよりも力価が高い産生細胞について、抗原に対する抗体結合性をスクリーニングする工程と、前記親ハイブリドーマ細胞よりも抗原に対する親和性が高いか、力価が高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞を選択する工程とを有し、それによって前記対象抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作成する方法。
【請求項７７】
標的抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する方法であって、対象抗原を負荷した動物から単離された骨髄または末梢血細胞を培養し、前記対象抗原に対する抗体を産生する細胞を単離し、前記抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する工程と、前記ハイブリドーマ細胞から産生される抗体の抗原に対する結合性をスクリーニングする工程と、前記抗原に対する抗体を産生するハイブリドーマ細胞から哺乳類発現細胞に免疫グロブリン遺伝子をクローニングし、前記哺乳類発現細胞がミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を発現し、前記ハイブリドーマ細胞よりも高い力価で抗体を産生する哺乳類発現細胞、または前記ハイブリドーマ細胞から産生される抗体と比べ、抗原に対する親和性の高い抗体を産生する哺乳類発現細胞をスクリーニングする工程とを有し、それによって、前記対象抗原に特異的に結合する抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する方法。
【請求項７８】
標的抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作成する方法であって、対象抗原を負荷した動物から単離された骨髄または末梢血細胞を培養し、前記対象抗原に対する抗体を産生する細胞を単離し、前記抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する工程と、ミスマッチ修復の化学抑制剤少なくとも１種類の存在下で前記親ハイブリドーマ細胞をインキュベートし、それによって過剰変異ハイブリドーマ細胞を形成する工程と、前記親ハイブリドーマ細胞よりも高い力価の抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞、または前記親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも親和性が高い抗原に結合する抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞をスクリーニングする工程と、前記親ハイブリドーマ細胞よりも力価が高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞、または前記親ハイブリドーマ細胞により産生される抗体よりも前記抗原に対する親和性が高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞を選択する工程とを有し、それによって、前記対象抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作成する方法。
【請求項７９】
標的抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する方法であって、対象抗原を負荷した動物から単離された骨髄または末梢血細胞を培養し、前記対象抗原に対する抗体を産生する細胞を単離し、前記抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する工程と、抗原に対する抗体を産生するハイブリドーマ細胞から哺乳類発現細胞に免疫グロブリン遺伝子をクローニングする工程と、ミスマッチ修復の化学抑制剤少なくとも１種類の存在下で前記哺乳類発現細胞をインキュベートする工程と、前記ハイブリドーマ細胞から産生される抗体と比べ、抗原に対する親和性の高い抗体を分泌する哺乳類発現細胞をスクリーニングする工程とを有し、それによって、前記対象抗原に特異的に結合する抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する方法。
【請求項８０】
標的抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する方法であって、対象抗原を負荷した動物から単離された骨髄または末梢血細胞を培養し、前記対象抗原に対する抗体を産生する細胞を単離し、前記抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する工程と、ミスマッチ修復の化学抑制剤少なくとも１種類存在下、前記ハイブリドーマ細胞をインキュベートし、過剰変異ハイブリドーマ細胞を形成する工程と、抗原結合抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞をスクリーニングする工程と、前記親ハイブリドーマ細胞により産生される抗体よりも抗原に対する親和性が高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞を選択する工程とを有し、それによって、前記対象抗原に特異的に結合する抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する方法。
【請求項８１】
標的抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作成する方法であって、対象抗原を負荷した動物から単離された骨髄または末梢血細胞を培養し、前記対象抗原に対する抗体を産生する細胞を単離し、前記抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合し、親ハイブリドーマ細胞を形成し、前記親ハイブリドーマ細胞がミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を有し、ミスマッチ修復が欠損している工程と、前記親ハイブリドーマ細胞をインキュベートし、突然変異を誘発させることで、過剰変異ハイブリドーマ細胞を形成する工程と、前記過剰変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体の抗原に対する抗体結合性をスクリーニングする工程と、前記親ハイブリドーマ細胞から産生される抗体よりも抗原に対する親和性が高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞を選択する工程と、前記親ハイブリドーマ細胞と比べ、抗体の力価が上昇した過剰変異ハイブリドーマ細胞の２回目のスクリーニングを行う工程と、前記親ハイブリドーマ細胞によって産生されるものよりも力価が高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞を選択する工程とを有し、それによって、前記対象抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作成する方法。
【請求項８２】
標的抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作成する方法であって、対象抗原を負荷した動物から単離された骨髄または末梢血細胞を培養し、前記対象抗原に対する抗体を産生する細胞を単離し、前記抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合し、前記親骨髄腫細胞のミスマッチ修復が天然で欠損することで、親ハイブリドーマ細胞を形成し、前記ハイブリドーマ細胞のミスマッチ修復が欠損している工程と、前記親ハイブリドーマ細胞をインキュベートし、突然変異を誘発させることで、過剰変異ハイブリドーマ細胞を形成する工程と、前記過剰発現ハイブリドーマ細胞から産生された抗体の抗原に対する抗体結合性について、１回目のスクリーニングを行う工程と、前記親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも抗原への親和性が高い抗体を産生する、過剰変異ハイブリドーマ細胞を選択する工程と、親ハイブリドーマ細胞よりも高い力価の抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞、または前記親ハイブリドーマ細胞により産生される抗体よりも親和性の高い抗原に結合する抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞について、２回目のスクリーニングを行う工程と、前記親ハイブリドーマ細胞よりも力価が高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞、または前記親細胞により産生される抗体よりも前記抗原に対する親和性が高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞を選択する工程とを有し、それによって、前記対象抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作成する方法。
【請求項８３】
標的抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する方法であって、対象抗原を負荷した動物から単離された骨髄または末梢血細胞を培養し、前記対象抗原に対する抗体を産生する細胞を単離し、前記抗体産生細胞にミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を導入し、前記抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合して親ハイブリドーマ細胞を形成し、前記親ハイブリドーマ細胞のミスマッチ修復が欠損している工程と、前記親ハイブリドーマ細胞をインキュベートし、突然変異を誘発させることで、過剰変異ハイブリドーマ細胞を形成する工程と、前記親ハイブリドーマ細胞よりも力価の高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞、または前記親ハイブリドーマ細胞により産生される抗体よりも親和性が高い抗原に結合する抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞をスクリーニングする工程と、前記親ハイブリドーマ細胞よりも力価の高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞または前記親細胞により産生される抗体よりも前記抗原に対する親和性が高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞を選択する工程とを有し、それによって、前記対象抗原に特異的に結合する抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する方法。
【請求項８４】
標的抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する方法であって、対象抗原を負荷した動物から単離された骨髄または末梢血細胞を培養し、前記対象抗原に対する抗体を産生する細胞を単離し、抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合し、前記骨髄腫細胞が天然でミスマッチ修復を欠損することで、親ハイブリドーマ細胞を形成し、前記ハイブリドーマ細胞がミスマッチ修復を欠損し、前記親ハイブリドーマ細胞をインキュベートし、突然変異を誘発させることで、過剰変異ハイブリドーマ細胞を形成させる工程と、前記親ハイブリドーマ細胞よりも力価の高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞、または前記親ハイブリドーマ細胞により産生される抗体よりも親和性が高い抗原に結合する抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマ細胞をスクリーニングする工程と、前記過剰変異ハイブリドーマ細胞から哺乳類発現細胞に免疫グロブリン遺伝子をクローニングする工程とを有し、それによって、前記対象抗原に特異的に結合する抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する方法。
【請求項８５】
標的抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する方法であって、対象抗原を負荷した動物から単離された骨髄または末梢血細胞を培養し、前記対象抗原に対する抗体を産生する細胞を単離し、抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合することで、親ハイブリドーマ細胞を形成し、前記ハイブリドーマ細胞から産生される抗体について、抗原に対する抗体結合性をスクリーニングする工程と、前記ハイブリドーマ細胞から哺乳類発現細胞に免疫グロブリン遺伝子をクローニングし、前記発現細胞のミスマッチ修復が天然で欠損し、前記発現細胞をインキュベートし、突然変異を誘発させ、前記親発現細胞よりも力価の高い抗体を産生する過剰変異発現細胞、または前記親発現細胞により産生される抗体よりも親和性が高い抗原に結合する抗体を産生する過剰変異発現細胞をスクリーニングする工程と、前記親発現細胞よりも力価の高い抗体を産生する過剰変異発現細胞、または前記親細胞により産生される抗原に高い親和性を示す抗体を産生する過剰変異発現細胞を選択する工程とを有し、それによって、前記対象抗原に特異的に結合する抗体を産生する過剰変異発現細胞を作成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願書類の相互参照
この出願書類では、２００６年２月８日付出願の米国特許仮出願第６０／７７１，２５１号および２００６年２月１７日付出願の第６０／７７４，５００号に対して優先権を主張するものであり、各開示内容全体はこの参照により本明細書に組み込まれるものである。
【０００２】
本発明は、免疫治療薬の分野に関する。より具体的には、本発明は、モノクローナル抗体を生成する抗原、および自己免疫細胞および癌細胞を中和することができ、炎症反応を中和することができるモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
特許、公開された出願、技術文献、および学術文献を含む様々な文献が本明細書中に引用されている。これらの各引用文献は、すべての目的のためにこの参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【０００４】
現在いくつかの疾患関連抗原は、その特殊な薬理学的および安全性プロフィールのため、治療用モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）の標的とされている。前記疾患関連標的抗原は、ＣＤ２０、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などである。
【０００５】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は当初、マウス骨髄の前駆細胞から顆粒球およびマクロファージの両方を発生させることができるタンパク質として発見され、それに合わせて命名された（Ｂｕｒｇｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｂｌｏｏｄ  ５６：９４７−５８）。その後の研究では、ＧＭ−ＣＳＦに成熟したマクロファージおよび顆粒球の機能を高める役割も証明され（Ｈａｎｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｂｕｒｇｅｓｓ（１９７９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２２：１１３４−１１３７；Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０３：４３５−４４５；Ｇａｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：８６６７−８６７１）、炎症反応にＧＭ−ＣＳＦが関与していることが示唆された（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０３：４３５−４４５）。前記分子が研究されるにつれ、ＧＭ−ＣＳＦは、顆粒球、マクロファージ、および好酸球などのより成熟した骨髄性細胞の性質に影響できるところに起因する、他の機能を有することが明らかとなった。ＧＭ−ＣＳＦの機能は、低い親和性でＧＭ−ＣＳＦに結合する、コロニー刺激因子２受容体αとしても知られるＣＤ１１６、つまり顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体に結合することで調節される。ＩＬ３およびＩＬ５受容体も共有するＣＤ１３１と呼ばれるβサブユニットは、それ自体、検出できるＧＭ−ＣＳＦ結合活性を有していないが、高い親和結合でαサブユニットと結合するために必要であり、シグナル伝達において基礎的な役割を果たす。ＧＭ−ＣＳＦ受容体は骨髄始原細胞、および好中球、好酸球、単核食細胞、および単球を含む、成熟した骨髄性細胞に認められる。さらに、ＧＭ−ＣＳＦ受容体サブユニットは、ヒト胎盤、内皮、および中枢神経系の乏突起膠細胞など、正常な非造血組織に存在することも示された。
【０００６】
ＧＭ−ＣＳＦは、骨髄内の初期骨髄前駆細胞から顆粒球およびマクロファージが生成する過程で重要な生物学的役割を果たしている。外部刺激に対する宿主の反応と、炎症状態および自己免疫疾患におけるＧＭ−ＣＳＦのさらなる生理学的機能は、最初は評価されていなかったが、後に発見された。ごく初期の研究では、ＧＭ−ＣＳＦはリポ多糖類（ＬＰＳ）をマウスに注入した後の肺組織ならし培地から精製された（Ｂｕｒｇｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：１９９８−２００３）。ＧＭ−ＣＳＦは、多くの研究者から、顆粒球、マクロファージ、および好酸球系統の細胞数、および正常な生理的条件での活性化状態の主要な制御因子の１つであると考えられている。しかし、ＧＭ−ＣＳＦの異常発現は免疫および炎症反応を変化させ、病理的結果が伴うとも仮定されてきた。数年前、ＧＭ−ＣＳＦは炎症性サイトカイン（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ）として考える必要があると指摘された（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０３：４３５−４４５）。さらに、ＧＭ−ＣＳＦは関節リウマチ、自己免疫症状、炎症性腎疾患、および喘息および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの炎症性肺疾患など、複数のヒトの炎症症状の素因に関与していると考えられる。興味深いことに、多発性硬化症とＧＭ−ＣＳＦとの間に関連性があることが提唱された（ＭｃＱｕａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９４：８７３−８８１）。多発性硬化症のモデルである自己免疫性脳脊髄炎の実験モデルでは、ＧＭ−ＣＳＦが自己免疫性脱髄に関与していることが分かった。
【０００７】
単球、マクロファージ、および好中球をＧＭ−ＣＳＦで処理後のｉｎ  ｖｉｖｏ研究では、ＧＭ−ＣＳＦがこれらの細胞タイプを活性化し、生存特性を延長できることが証明された。さらに、ＧＭ−ＣＳＦの曝露はこれらの細胞タイプから炎症性メディエータを放出させ、さらなる研究では、これらの細胞の特定微生物および腫瘍細胞さえも殺傷する能力があることが証明された（Ｈａｍｉｌｔｏｎ（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １４：１８−２４；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，（１９９３）Ｌａｎｃｅｔ  ３４２：５３６−５３９；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，（１９９３）Ｂｌｏｏｄ  ８１：３５７−３６４）。前記ｉｎ  ｖｉｖｏ研究がｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＭ−ＣＳＦの機能を示していたか否かを判断するため、齧歯類での全身投与が行われた。前記タンパク質の腹腔内投与によりＧＭ−ＣＳＦの循環血液中濃度を人工的に上昇させると、循環血液中の好中球および循環中の腹腔マクロファージ数が増加し、齧歯類の腹腔内でＣＤ５＋マクロファージの発達および分化が亢進することが示された（Ｍｅｔｃａｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１５：１−９）。
【０００８】
ＧＭ−ＣＳＦは、より強く相乗的にＬＰＳまたはインターフェロンγなど第二の刺激に反応するように、細胞を「初回刺激する（ｐｒｉｍｅ）」ことができることも示された（Ｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：１５１６−１５２１）。マウスはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのいずれにおいてもＧＭ−ＣＳＦで初回刺激することができ、後でＬＰＳまたはＴＮＦ−αを負荷後に循環血液中の炎症性サイトカイン値が増加するようになる。
【０００９】
臨床条件では、腹膜透析患者にＧＭ−ＣＳＦを投与することで、マクロファージが顕著に増加した（Ｓｅｌｇａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５０：２０７０−２０７８）。興味深いことに、齧歯類の研究から予測される通り、臨床条件でのＧＭ−ＣＳＦの投与は炎症性サイトカインの生産を増強し、望ましくない副作用が生じる可能性がある。例えば、関節リウマチ患者にＧＭ−ＣＳＦを投与し、フェルティ症候群による好中球減少症を治療した場合、その関節炎が悪化した（Ｈａｚｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｌｏｏｄ  ７４：２７６９−２７７０）。別の臨床条件では、癌化学療法後のＧＭ−ＣＳＦ投与が関節リウマチ患者を悪化させた（ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：４９８５−４９９３）。ヒトドナーへのＧＭ−ＣＳＦの全身投与は単離顆粒球がスーパーオキシドを生産する能力を亢進させ、単球数を増加させるだけでなく、循環血液中の単球の細胞毒性を増強した（Ｐｅｒｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ａｍ  Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．４３：２７９−２８５）。ＧＭ−ＣＳＦの異常発現はヒトの肺疾患とも関連している。例えば、軽度の刺激物、エンドトキシン、または感染による肺ＧＭ−ＣＳＦのアップレギュレーションにより、ＴＨ２免疫偏向および喘息に罹りやすくなると思われる（Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６：１６４５−１６５１）。前記研究では、細胞増加、細胞生存の上昇、および／または活性化刺激を介して、ＧＭ−ＣＳＦが前記炎症プロセスの活性化に関与すると、上記の指摘をまとめた。
【００１０】
いくつかの関連性と実験データが、喘息におけるＧＭ−ＣＳＦの関与を示唆している。喘息マウスモデルで中和抗体を使用し、喘息の表現型を抑制できることが証明されたが（Ｙａｍａｓｈｉｔａ（２００２）Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１９：９２）、喘息患者のＢＡＬ液中のサイトカインを測定したいくつかの研究では、ＧＭ−ＣＳＦの増加が認められた（Ｇａｊｅｗｓｋａ（２００３）Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ２：２７９）。
【００１１】
関節リウマチ（ＲＡ）は慢性炎症性自己免疫疾患であり、ＧＭ−ＣＳＦが関与しているという十分なエビデンスがある。ＧＭ−ＣＳＦ値はＲＡ病変で上昇していることが分かり（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８３：８７６）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＩＬ−１およびＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインによる刺激後、常在関節細胞（軟骨細胞および滑膜線維芽細胞）により生産される（Ｌｅｉｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ  ７６：１９８９）。マウスのコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）は、ＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）に対する体液性および細胞性免疫反応に依存するＲＡの自己免疫モデルである（Ｓｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０，１４７７）。歴史的に、このＲＡ表現型はＨ−２ｑまたはＨ−２ｒハプロタイプを有するマウス株に限定され、ＤＢＡ／１マウスで機能する（Ｗｏｏｌｅｙ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１６２：３６１）。マウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子座がヌルのホモ接合性トランスジェニックマウスにおいて、一連の研究が実施された（Ｓｔａｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５５９２）。興味深いことに、ＧＭ−ＣＳＦ欠損マウスは、野生型の対照同産仔と比べ、コラーゲン誘導関節炎の導入に対して耐性を示す（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：３６３９−３６４４）。
【００１２】
さらに興味深い点は、ＧＭ−ＣＳＦヌルマウスの界面活性物質クリアランスには障害があり、これが、本明細書において説明するヒトの疾患をよく模倣したマウス肺胞タンパク症（ＰＡＰ）につながるということである。さらに、前記ＰＡＰの表現型は、前記ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の肺特異的輸送（Ｚｓｅｎｇａｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：２１０１−２１０９）、ＧＭ−ＣＳＦのエアロゾル化または造血を再構成するための骨髄移植（Ｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７６：Ｌ５５６−Ｌ５６３；Ｎｉｓｈｉｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２６５７−２６６２）により修正される可能性がある。
【００１３】
成人ヒト肺胞タンパク症（ＰＡＰ）は、肺胞にリン脂質およびサーファクタントタンパク質が蓄積することで特徴付けられるまれな疾患である。ＰＡＰは肺胞マクロファージおよびＩＩ型上皮細胞が過剰な界面活性物質を除去できないことによるものと仮定されてきた（Ｍａｚｚｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｌｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．６８：９７７−９９２）。ＰＡＰの診断には開胸肺生検が必要なことも多く、前記疾患の標準的な治療は全肺洗浄により蓄積した界面活性物質を物理的に除去するものである（Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｔｈｏｒａｘ  ５５：６７−７７）。さらに、ＰＡＰ患者は循環血液中に抗ＧＭ−ＣＳＦ中和抗体を有することが示され、そのためこのサイトカインが前記疾患の原因であると考えられてきた。この自己免疫反応がＧＭ−ＣＳＦに特異的なものか否かは分かっていない。しかし、ＰＡＰ患者の一部はＧＭ−ＣＳＦ療法で改善することが示されており、遺伝子破壊または抗体による中和からＧＭ−ＣＳＦがなくなると、ＰＡＰが発症するという仮説を支持している。
【００１４】
癌におけるＧＭ−ＣＳＦの関与を支持する証拠もある。例えば、ＧＭ−ＣＳＦは、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）など白血病の発生および進行に関与している（Ｅｍａｎｕｅｌ  ＰＤ（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｒｅｐ．３：２０３−２０９）。ＪＭＭＬは正常な造血機能が崩壊することで特徴付けられ、骨髄の未熟骨髄細胞が過剰に、不適切に増殖する。これらの増殖造血癌細胞は脾臓および肝臓に転移する可能性がある。興味深いことに、ＪＭＭＬ患者はＧＭ−ＣＳＦに対して感受性が高く、ＧＭ−ＣＳＦを過剰発現したトランスジェニックマウスと同様の病理学的特徴を示す（Ｌａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）５１：６７５−８６）。さらに、ＧＭ−ＣＳＦはＪＭＭＬの細胞増殖および生存を促すことが示された（Ｅｍａｎｕｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｌｏｏｄ  ７７：９２５−９）。ＪＭＭＬのトランスジェニックマウスモデルでは、ＧＭ−ＣＳＦを遮断することで、骨髄、血液、および脾臓のＪＭＭＬ時の細胞負荷が軽減した（Ｉｖｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｌｏｏｄ，９０：４９１０−７）。
【００１５】
ＧＭ−ＣＳＦをノックアウトしたマウス疾患モデル、および体循環で循環血液中に抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体が作成されるＰＡＰなどのヒト疾患から、このサイトカインが病状の重要な媒介物質であることは明らかである。従って、前記サイトカイン自体に対する抗体を開発するか、ＧＭ−ＣＳＦ受容体を遮断することで、ＧＭ−ＣＳＦの活性に拮抗できる薬物を開発するアプローチは、ヒトの治療に有益と考えられる。組み換えＧＭ−ＣＳＦ分子に対し、いくつかのポリクローナルおよびモノクローナル抗体が作成された。例えば、Ｂｅｆｆｙら（（１９９４），Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １３：４５７−４６８）は、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅウサギで組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦに対するポリクローナル抗体を作成し、Ｂａｌｂ／ｃマウスでモノクローナル抗体を作成した。これらのウサギおよび一部のマウスモノクローナル抗体は、ＭＯ７ｅ細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイにおいて、ＧＭ−ＣＳＦの活性を中和することができた。さらなる研究では、Ｎｉｃｅら（１９９０，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３，１５９−１６９）が、マウス抗ＧＭ−ＣＳＦ中和抗体の１つであるＬＭＭ１０２の結合部位でエピトープのマッピングを行った。組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦの一連の消化産物を作成し、逆相ＨＰＬＣ分画を用いて前記フラグメントを分離した後、さらにトリプシンフラグメントを黄色ブドウ球菌Ｖ８により消化し、ジスルフィド結合で結合した２ペプチドを有する生成物を定義することで、明確なエピトープが明らかとなった。３種類の抗ヒトＧＭ−ＣＳＦマウス抗体がＤｅｍｐｓｅｙら（１９９０，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ９，５４５−５５８）によって作成され、０．１〜１．７ナノモルの範囲でＥＣ５０を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系においてＧＭ−ＣＳＦを中和した。これらの抗体はマウスＧＭ−ＣＳＦまたは他の関連サイトカインと反応しなかった。上述の抗体はすべて、ヒト血清のＧＭ−ＣＳＦ検出、およびＧＭ−ＣＳＦのシグナル伝達を抑制するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの有用な試薬である。ただし、これらの抗体はすべてマウスまたはウサギの系に由来するものであるという事実のため、治療薬としての価値はほとんどない。マウス抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体からヒトの骨格に様々なドメインをサブクローニングすることにより、マウス抗体からキメラ抗体を作成する試みがなされてきた。この戦略により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＧＭ−ＣＳＦを中和することができ、治療薬として有用と考えられるキメラ抗体が作成された（ＷＯ  ０３／０６８９２４  Ａ２）。
【００１６】
治療用抗体の重要な態様は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などの免疫エフェクター機能を誘発できる点である。例えば、齧歯類のＭａｂｓは、Ｆｃ領域の配列が異なるため、ヒトではエフェクター機能の媒介が不十分であることが示されたため、キメラ化またはヒト化で最適な薬理学的特性を得る必要がある。さらに、完全なヒト配列を持ったＭＡｂｓは、ＭＡｂｓの天然型グリコシル化パターンを変化させる可能性がある非ヒト宿主細胞で産生されると、ＡＤＣＣを補助できない可能性がある（Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−７３）。
【００１７】
これらの事実を考慮し、ヒトＢ細胞による治療用抗体の産生が好ましい。ヒトＭＡｂｓを分泌するハイブリドーマの作成法はこれまでに報告されている（ＷＯ２００４／０４６３３０）。ヒトＢ細胞により作成された治療用ＭＡｂｓは、ヒトエフェクター機能を発揮することができ、天然型ヒト構造のため、免疫原性は非常に限られている。ヒトＢ細胞由来のハイブリドーマまたはエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球株の作成については以前報告があったが（Ｋｉｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｈｙｂｒｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ  ２１：４０５−１４；Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５；Ｚａｆｉｒｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００：１８１−９０）、長期的安定性、製造工程適合性、および抗体の薬理学的特性について、これらの抗体および株の特徴に関する情報は限られている（ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：３６８−７４）。
【００１８】
そのため、感染による炎症、炎症性疾患、自己免疫疾患、および癌など他疾患を治療するため、治療用ヒト抗体の需要はある。さらに、そのような抗体が免疫エフェクター機能を誘発し、ヒト患者での忍容性に優れていることも望まれる。本発明は、これらの長年にわたる需要に取り組むものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、ＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合する単離ヒト抗体について特徴付けたものである。前記抗体は、配列ＩＤ番号４２または４８を有する重鎖ＣＤＲ３を有する可能性がある。いくつかの好適な実施形態では、前記抗体が配列ＩＤ番号８または１６を有する重鎖を有する可能性がある。いくつかの好適な実施形態では、前記抗体が配列ＩＤ番号１２または１８を有する重鎖を有する可能性がある。一部の実施形態では、前記抗体が２つの重鎖を有する。一部の実施形態では、前記抗体が２つの軽鎖を有する。前記抗体は高親和性抗体であり、約１×１０−８Ｍ未満の親和性を有する可能性がある。好ましくは、前記抗体はモノクローナル抗体であり、より好ましくはヒトモノクローナル抗体である。極めて好適な実施形態では、前記抗体が配列ＩＤ番号３、４、５、３５、３６、３７、３８、または３９のアミノ酸配列を有するポリペプチド上のエピトープに特異的に結合する。ハイブリドーマ細胞など、そのような抗体を発現する細胞も提供される。
【００２０】
本発明では、ＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドについても特徴付ける。いくつかの好適な実施形態では、前記ポリヌクレオチドが配列ＩＤ番号１０または１７の重鎖配列を有する。いくつかの好適な実施形態では、前記ポリヌクレオチドが配列ＩＤ番号１４または１９の軽鎖配列を有する。そのようなポリヌクレオチドを有するベクターも提供される。
【００２１】
本発明では、そのような治療を必要とする被験者においてＧＭ−ＣＳＦによる炎症性疾患を治療する方法についても特徴付ける。前記方法は、ＧＭ−ＣＳＦによる炎症性疾患の治療に有効な量で、薬学的に許容される担体およびＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合する抗体を少なくとも１つ有する組成を前記被験者に投与する工程を有する。これらの方法の好適な態様では、前記抗体は、配列ＩＤ番号４２または４８を有する重鎖ＣＤＲ３を有する可能性がある。いくつかの好適な実施形態では、前記抗体が配列ＩＤ番号８または１６を有する重鎖を有する可能性がある。いくつかの好適な実施形態では、前記抗体が配列ＩＤ番号１２または１８を有する重鎖を有する可能性がある。前記抗体は高親和性抗体であり、約１×１０−８Ｍ未満の親和性を有する可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本明細書および請求項を通して、本発明の方法および他の態様に関連する様々な用語が使用されている。そのような用語は、他に指示されていない限り、当該分野における通常の意味を与えられるものとする。他の具体的に定義された用語は、本明細書に提供された定義と一致するように解釈されるものとする。
【００２３】
本発明は特定の方法、試薬、化合物、組成物、または生物系に制限されることはなく、当然変更できることは理解されるものとする。また、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明する目的で、制限する意図はないことも理解されるものとする。本明細書および添付の請求項に用いられる場合、本文において明確に異なることが示されていない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数の言及も含む。従って、例えば「ａ  ｃｅｌｌ（細胞）」の言及は２若しくはそれ以上の細胞の組み合わせなどを含む。
【００２４】
本明細書に列挙された各範囲は、本明細書に含まれる特定の数字だけでなく、範囲内のすべての組み合わせおよび下位の組み合わせを含む。
【００２５】
本明細書に用いられる「約」という用語は、量、一時的な期間など、測定可能な値を指す場合、特定の値からの±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、さらに好ましくは±１％、まださらに好ましくは±０．１％のばらつきを含むことを意味し、それ自体、ばらつきは開示された方法を実施する上で妥当である。
【００２６】
「感染症」には、（これに限定されるものではないが）病原体、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫による感染を含む。ウイルスの例には、（これに限定されるものではないが）重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ；ＳＡＲＳ関連コロナウイルスによる）、Ｂ型またはＣ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、Ｉ型またはＩＩ型単純ヘルペスウイルス、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、乳頭腫ウイルス、パポーバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（ｅｃｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、およびＩ型またはＩＩ型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含む。細菌の例には、（これに限定されるものではないが）エボラ、ブドウ球菌属Ａ−Ｅ、プラスモディウム（マラリア）、結核菌、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ナイセリア、およびレジオネラを含む。寄生虫の例には、（これに限定されるものではないが）リケッチアおよびクラミジアを含む。
【００２７】
「炎症性疾患」には、関節リウマチ、自己免疫疾患、喘息および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの炎症性腎疾患および炎症性肺疾患、多発性硬化症、および自己免疫性脳脊髄炎などの（これに限定されるものではないが）急性および慢性の免疫および自己免疫症状を含む。
【００２８】
「自己免疫疾患」は、患者の自己組織または同時分離物またはその徴候またはその結果生じる症状に起因し、これらに向けられる疾患または疾病である。自己免疫疾患の例には、（これに限定されるものではないが）関節炎（急性関節炎、慢性関節リウマチ、痛風または痛風性関節炎、急性痛風性関節炎、急性免疫性関節炎、慢性炎症性関節炎、変性性関節炎、ＩＩ型コラーゲン誘導関節炎、感染性関節炎、ライム病関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、スティル病、椎骨関節炎、および若年発症関節リウマチなどの関節リウマチ、変形性関節症、関節炎クロニカプログレディエンテ（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｃｈｒｏｎｉｃａ  ｐｒｏｇｒｅｄｉｅｎｔｅ）、変形性関節炎、原発性慢性多発性関節炎（ｐｏｌｙａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｃｈｒｏｎｉｃａ  ｐｒｉｍａｒｉａ）、反応性関節炎、および強直性脊椎炎）、炎症性過剰増殖性皮膚疾患、プラーク乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬、および爪の乾癬などの乾癬、花粉症およびヨブ症候群などのアトピー性疾患を含むアトピー、接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、剥脱性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、疱疹状皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異性皮膚炎、一次刺激性接触皮膚炎、およびアトピー性皮膚炎を含む皮膚炎、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群、アレルギー性眼内炎症性疾患、慢性自己免疫性蕁麻疹、筋炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性表皮剥離症、（全身性強皮症を含む）強皮症を含む慢性アレルギー性蕁麻疹および慢性特発性蕁麻疹などの蕁麻疹、全身性硬化症などの硬化症、脊髄−視覚多発性硬化症（ＭＳ）、原発性進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）、および再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）などの多発性硬化症（ＭＳ）、全身性進行性硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、播種性硬化症（ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔａ）、失調性硬化症、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病、自己免疫性胃腸疾患、潰瘍性大腸炎、潰瘍性大腸炎（ｃｏｌｉｔｉｓ  ｕｌｃｅｒｏｓａ）、顕微鏡的大腸炎、コラーゲン蓄積大腸炎、ポリープ性大腸炎（ｃｏｌｉｔｉｓ  ｐｏｌｙｐｏｓａ）、壊死性腸炎、および貫壁性大腸炎などの大腸炎、および自己免疫性炎症性大腸炎）、腸炎、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、成人または急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む呼吸窮迫症候群、髄膜炎、ブドウ膜全体または一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫性血液疾患、リウマチ様脊椎炎、リウマチ性滑膜炎、遺伝性血管浮腫、髄膜炎に見られるような脳神経障害、妊娠性疱疹、妊娠類天疱瘡（ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ  ｇｅｓｔａｔｉｏｎｉｓ）、膣掻痒（ｐｒｕｒｉｔｉｓ  ｓｃｒｏｔｉ）、自己免疫性早発閉経、自己免疫疾患による突発性難聴、アナフィラキシーおよびアレルギー性およびアトピー性鼻炎などのＩｇＥ性疾患、ラスムッセン脳炎および辺縁系および／または脳幹脳炎などの脳炎、前部ブドウ膜炎、急性前部ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎（ｐｈａｃｏａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｕｖｅｉｔｉｓ）、後部ブドウ膜炎、または自己免疫性ブドウ膜炎などのブドウ膜炎、原発性糸球体腎炎（ＧＮ）、免疫性ＧＮ、膜性���Ｎ（膜性腎症）、特発性膜性ＧＮまたは特発性膜性腎症、Ｉ型およびＩＩ型を含む膜性または膜性増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）、および急速に進行するＧＮなどの慢性または急性糸球体腎炎などのネフローゼ症候群を併発するか併発しない糸球体腎炎、増殖性腎炎、自己免疫性多腺性内分泌不全、形質細胞限局性亀頭炎（ｂａｌａｎｉｔｉｓ  ｃｉｒｃｕｍｓｃｒｉｐｔａ  ｐｌａｓｍａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）を含む亀頭炎、亀頭包皮炎、遠心性環状紅斑、色素異常性固定性紅斑、多形性紅斑、環状肉芽腫、光沢苔癬、硬化性萎縮性苔癬、慢性単純性苔癬、棘状苔癬、扁平苔癬、葉状魚鱗癬、表皮剥離性角質増殖症、前癌性角化症、壊疽性膿皮症、アレルギー疾患および応答、アレルギー反応、アレルギー性またはアトピー性湿疹、乾皮性湿疹、発汗異常性湿疹、および水疱性掌蹠膿湿疹（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｐａｌｍｏｐｌａｎｔａｒ  ｅｃｚｅｍａ）を含む湿疹、気管支喘息、気管支喘息、および自己免疫性喘息などの喘息、Ｔ細胞浸潤が関与する状態および慢性炎症反応、妊娠中の胎児Ａ−Ｂ−Ｏ血液型などの外来抗原に対する免疫反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全症、ループス腎炎、ループス脳炎、小児狼蒼、腎外性ループス、腎外ループス、円板状ループスおよび円板状エリテマトーデスを含むループス、狼瘡性脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ  ｌｕｐｕｓ）、皮膚ＳＬＥまたは亜急性皮膚ＳＬＥ、新生児ループス症候群（ＮＬＥ）、および播種性紅斑性狼瘡などの全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、小児インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を含む若年型（Ｉ型）糖尿病、成人発症型糖尿病（ＩＩ型糖尿病）、自己免疫性糖尿病、特発性尿崩症、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性大動脈疾患、サイトカインおよびＴリンパ球を介する急性および遅延型過敏症に伴う免疫応答、結核、サルコイドーシス、リンパ腫様肉芽腫症を含む肉芽腫症、ウェゲナー肉芽腫症、無顆粒球症、血管炎、大血管炎（リウマチ性多発性筋痛および巨細胞（高安）動脈炎を含む）、中血管炎（川崎病および結節性多発動脈炎／結節性動脈周囲炎を含む）、顕微鏡的多発性動脈炎、免疫血管炎（ｉｍｍｕｎｏｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）、ＣＮＳ血管炎、皮膚血管炎、過敏性血管炎、全身性壊死性血管炎などの壊死性血管炎、およびチャーグ・ストラウス血管炎または症候群（ＣＳＳ）およびＡＮＣＡ関連小血管炎などのＡＮＣＡ関連血管炎を含む脈管炎、側頭動脈炎、再生不良性貧血、自己免疫性再生不良性貧血、クームス試験陽性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、悪性貧血（ａｎｅｍｉａ  ｐｅｍｉｃｉｏｓａ）、アジソン病、真性赤血球無形成症または形成不全（ＰＲＣＡ）を含む溶血性貧血または免疫性溶血性貧血、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球漏出が関与する疾患、ＣＮＳ炎症性疾患、敗血症、外傷、または出血に続発するような多臓器損傷症候群（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｒｇａｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、抗原抗体複合体による疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病／症候群、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症���群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、水疱性類天疱瘡（ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ  ｂｕｌｌｏｕｓ）および皮膚類天疱瘡（ｓｋｉｎ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）などの類天疱瘡、天疱瘡（尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ  ｍｕｃｕｓ−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ、および紅斑性天疱瘡を含む）、自己免疫性多腺性内分泌障害、ライター病または症候群、熱傷、子癇前症、免疫複合体性腎炎などの免疫複合体病、体液性腎炎、多発性神経障害、ＩｇＭ多発性ニューロパチーまたはＩｇＭによるニューロパチーなどの慢性ニューロパチー、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、輸血後紫斑病（ＰＴＰ）、ヘパリン起因性血小板減少症、および特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）などの慢性または急性ＩＴＰを含む自己免疫性または免疫性血小板減少症を含む（例えば心筋梗塞患者に発症するような）血小板減少症、ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｃｅｒａｔｏ−ｓｃｌｅｒｉｔｉｓなどの胸膜炎、上強膜炎、自己免疫性睾丸炎および卵巣炎を含む睾丸および卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、または亜急性甲状腺炎などの甲状腺炎を含む自己免疫性内分泌疾患、自己免疫性甲状腺疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブス病、自己免疫性多腺性症候群（または多腺性内分泌障害症候群（ｐｏｌｙｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｐａｔｈｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ））などの多腺性症候群、ランバート・イートン筋無力性症候群またはイートン・ランバート症候群などの神経腫瘍随伴症候群（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ  ｐａｒａｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）を含む腫瘍随伴症候群、スティフマンまたは全身強直性症候群、アレルギー性脳脊髄炎またはアレルギー性脳脊髄炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ａｌｌｅｒｇｉｃａ）および実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）などの脳脊髄炎、胸腺腫に伴う重症筋無力症、小脳変性症、神経ミオトニー、眼球クローヌスまたは眼球クローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、および感覚性ニューロパシーなどの重症筋無力症、多発性運動神経障害、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、慢性肝炎、ルポイド肝炎、巨細胞性肝炎、慢性活動性肝炎または自己免疫性慢性活動性肝炎、リンパ性間質性肺炎（ＬＩＰ）、閉塞性細気管支炎（非移植時）対ＮＳＩＰ、ギラン・バレー症候群、ベルジェ病（ＩｇＡ腎症）、特発性ＩｇＡ腎症、線状ＩｇＡ皮膚症、急性熱性好中球性皮膚症、角層下膿疱症、一過性棘融解性皮膚症、原発性胆汁性肝硬変および肺肝硬変（ｐｎｅｕｍｏｎｏｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）などの肝硬変、自己免疫性腸疾患症候群、セリアック病または小児脂肪便症、セリアック・スプルー（グルテン性腸症）、難治性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリック病）、冠動脈疾患、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）などの自己免疫性耳疾患、自己免疫性聴力損失、難治性または再発性または再発性多発性軟骨炎などの多発性軟骨炎、肺胞タンパク症、コーガン症候群／非梅毒性間質性炎症、ベル麻痺、スウィート病／症候群��自己免疫性酒さ（ｒｏｓａｃｅａ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ）、帯状疱疹に伴う疼痛、アミロイドーシス、非癌性リンパ球増加症、モノクローナルＢ細胞リンパ球増加症（例えば、良性単クローン性免疫グロブリン血症および意味未確定の単クローン性高ガンマグロブリン血症、ＭＧＵＳ）を含む原発性リンパ球増加症、末梢性ニューロパシー、腫瘍随伴症候群、てんかん、片頭痛、不整脈、筋疾患、難聴、失明、周期性四肢麻痺、およびＣＮＳのチャネロパチーなどのチャネロパチー、自閉症、炎症性筋疾患、巣状または分節状または巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、内分泌性眼病、ブドウ膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝疾患、線維筋痛、多発性内分泌腺腫、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮症、初老期認知症、自己免疫性脱髄疾患および慢性炎症性脱髄性多発神経障害などの脱髄疾患、ドレスラー症候群、円形脱毛症、完全脱毛症、クレスト症候群（石灰沈着症、レイノー現象、食道運動障害、手指硬化症、および毛細血管拡張症）、例えば抗精子抗体による男性および女性の自己免疫性不妊症、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、反復流産、農夫肺、多形性紅斑、心術後症候群、クッシング症候群、鳥飼育者肺、アレルギー性肉芽腫性血管炎、良性リンパ球性血管炎、アルポート症候群、アレルギー性肺胞炎および線維化性肺胞炎などの肺胞炎、間質性肺炎、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症などの寄生虫症、ｋｙｐａｎｏｓｏｍｉａｓｉｓ、住血吸虫症、回虫症、アスペルギルス症、Ｓａｍｐｔｅｒ症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維症、びまん性間質性肺線維症、間質性肺線維症、肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、Ｓｈｕｌｍａｎ症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、慢性毛様体炎、異時性毛様体炎（ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｎｉｃ  ｃｙｃｌｉｔｉｓ）、虹彩毛様体炎（急性または慢性）、またはフックス毛様体炎などの毛様体炎、ヘノッホ・シェンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、ＳＣＩＤ、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、エコーウイルス感染、敗血症、内毒素血症、膵炎、甲状腺機能亢進症、パルボウイルス感染症、風疹ウイルス感染、ワクチン接種後症候群、先天性風疹感染、エプスタインバーウイルス感染、おたふく風邪、Ｅｖａｎ症候群、自己免疫性
性腺機能不全、シデナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓ  ｕｂｉｔｅｒａｎｓ、甲状腺機能亢進症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞多発筋腫、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性ネフローゼ症候群、微少変化ネフローゼ、良性家族性および虚血再潅流傷害、移植臓器再潅流、自己免疫網膜症（ｒｅｔｉｎａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ）、関節の炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道／肺疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化症、ａｓｐｅｒｍｉｏｇｅｎｅｓｅ、自己免疫性溶血、Ｂｏｅｃｋ病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、ｅｎｄｏｐｈｔｈａｌｍｉａ  ｐｈａｃｏａｎａｐｈｙｌａｃｔｉｃａ、アレルギー性腸炎（ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ  ａｌｌｅｒｇｉｃａ）、癩性結節性紅斑、特発性顔面神経麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ熱（ｆｅｂｒｉｓ  ｒｈｅｕｍａｔｉｃａ）、ハンマン・リッチ病、急性感音難聴、ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎｕｒｉａ  ｐａｒｏｘｙｓｍａｔｉｃａ、性腺機能低下症、限局性回腸炎（ｉｌｅｉｔｉｓ  ｒｅｇｉｏｎａｌｉｓ）、白血球減少症、感染性単核球症（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｓａ）、横断性脊髄炎、原発性特発性粘液水腫、ネフローゼ、ｏｐｈｔｈａｌｍｉａ  ｓｙｍｐｈａｔｉｃａ、肉芽種性睾丸炎（ｏｒｃｈｉｔｉｓ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓａ）、膵炎、急性多発性神経根炎（ｐｏｌｙｒａｄｉｃｕｌｉｔｉｓ  ａｃｕｔａ）、壊疽性膿皮症、ケルヴァン甲状腺炎、後天性脾臓萎縮症、非悪性胸腺腫、白斑、毒素性ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞浸潤が関与する疾患、白血球接着不全症、サイトカインおよびＴリンパ球による急性および遅発性過敏症が関与する免疫反応、白血球漏出が関与する疾患、多臓器損傷症候群、抗原抗体複合体による疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫性多腺性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫性萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多腺性内分泌不全症、自己免疫性多腺性症候群Ｉ型、成人型特発性上皮小体機能低下症（ＡＯＩＨ）、拡張型心筋症などの心筋症、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、血色素症、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性または非化膿性副鼻腔炎、急性または慢性副鼻腔炎、篩骨洞炎、前頭洞炎、上顎洞炎、またはちょう形骨洞炎、好酸球増加症、肺好酸球増多症、好酸球増加・筋痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸球性肺炎、局所性肺好酸球増多症、気管支肺アスペルギルス症、アスペルギルス腫、または好酸球を含む肉芽種などの好酸球関連疾患、アナフィラキシー、血清反応陰性脊椎関節症（ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｐｏｎｄｙｌｏａｒｔｈｒｉｔｉｄｅｓ）、多内分泌自己免疫疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性粘膜皮膚カンジダ症、ブルトン症候群、乳児一過性低γグロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、血管拡張症、膠原病、リウマチ、神経疾患、リンパ節炎、血圧反応の低下、血管機能不全、組織傷害、心血管虚血、痛覚過敏、腎虚血、脳虚血、および血管新生を伴う疾患に伴う自己免疫疾患、アレルギー性過敏性疾患、糸球体腎炎、再���流傷害、虚血再潅流疾患、心筋または他組織の再潅流傷害、リンパ腫様気管気管支炎、炎症性皮膚疾患、急性炎症を伴う皮膚疾患、多臓器不全、水疱性疾患、腎皮質壊死、急性化膿性髄膜炎または他の中枢神経系炎症性疾患、眼球および眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘導毒性、ナルコレプシー、急性の重篤な炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、および子宮内膜症を含む。
【００２９】
「保存的修飾変異体」はアミノ酸および核酸配列の両方に当てはまる。特定の核酸配列について、保存的修飾変異体は、同一であるか、基本的に同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を指し、または前記核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、基本的に同一の配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が特定タンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべてアミノ酸のアラニンをコードする。従って、アラニンがコドンで特定されるすべての位置で、コードされるポリペプチドを変化させることなく、前記コドンを前述の対応するコドンのいずれかと変更することができる。そのような核酸変異は「サイレント変異」であり、保存的修飾変異体の一種である。ポリヌクレオチドをコードする本明細書のすべての核酸配列は、前記核酸の考えられるすべてのサイレント変異も描写する。当業者は、核酸の各コドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧと、通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾し、機能的に同一な分子を生じることができることは理解するだろう。従って、ポリヌクレオチドをコードする核酸の各サイレント変異は、発現生成物について描写された各配列で絶対的であるが、実際のプローブ配列については絶対的ではない。
【００３０】
例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関連して用いる場合の「組み換え型」は、前記細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが異種核酸またはタンパク質の導入、または天然型核酸またはタンパク質の変更により修飾されたか、前記細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組み換え型細胞は前記細胞の天然型（非組み換え型）には見られない遺伝子を発現しているか、そうでなければ異常に発現されるか、発現が少ないか、全く発現されていない天然型遺伝子を発現している。
【００３１】
前記「核酸」または「ポリヌクレオチド配列」という表現は、５’から３’末端に向かって読んだ、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖重合体を指す。核酸には、ポリメラーゼによる読み取りを補正することができ、例えば保存的修飾変異体を含む核酸でコードされるポリペプチドの発現を変化させない、修飾ヌクレオチドも含むことができる。
【００３２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は本明細書で同義的に使用され、アミノ酸残基の重合体を指す。前記用語は、１若しくはそれ以上のアミノ酸残基が対応する天然型アミノ酸の人工化学的ミメティックであるアミノ酸重合体、および天然型アミノ酸重合体および非天然型アミノ酸重合体にも当てはまる。本発明のポリペプチドには、保存的修飾変異体を含む。当業者は、コード化配列中の単一アミノ酸または少ない割合のアミノ酸を変更、付加、または欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列の置換、欠失、または付加は「保存的修飾変異体」であり、前記変化により、アミノ酸が化学的に類似のアミノ酸と置換されることは認識するだろう。機能的に類似のアミノ酸を提供する、保存的置換表は当該分野で周知である。そのような保存的修飾変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子に追加され、これを除外しない。以下の８群はそれぞれ互いに保存的置換のあるアミノ酸を含み、それは１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）である（３３）。前記「保存的置換」という用語は、そのようなポリペプチドが必要な結合活性も示す場合、非置換親アミノ酸に代わり置換アミノ酸を使用することも含む。
【００３３】
「アミノ酸」は、天然型および合成アミノ酸、および前記天然型アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸ミメティックを指す。天然型アミノ酸は、遺伝暗号でコードされたアミノ酸、および後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。「アミノ酸類似体」は、天然型アミノ酸と同じ基本的化学構造、つまり、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ群、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合するα炭素を有する化合物を指す。そのような類似体は、修飾されたＲ群（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然型アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。「アミノ酸ミメティック」は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然型アミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。
【００３４】
本明細書では、アミノ酸は一般的に知られる３文字記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する１文字記号で呼ぶ（以下の表１を参照）。同様に、ヌクレオチドは一般的に受け入れられている１文字コードで呼ぶ。
【００３５】
【表１】
2009526082.tif 000003
【００３６】
本明細書では、すべてのアミノ酸配列が、左から右の方向が従来のアミノ末端からカルボキシ末端の方向である式で表されていることに注意する。
【００３７】
本明細書に用いられる「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」または「ｅｘ  ｖｉｖｏ」という用語は、人工環境、および例えば試験管および細胞培養などの（これに限定されるものではないが）人工的な環境で発生するプロセスまたは反応を指す。前記「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、自然環境（例えば、動物または細胞）および自然環境で発生するプロセスまたは反応を指す。
【００３８】
「薬学的に許容される」、「生理学的に忍容性の」、およびその文法的変形形態は、組成、担体、希釈剤、および試薬を指す場合は同義的に用いられ、前記組成の投与を阻害する程度の好ましくない生理学的効果を生じずに、前記物質をヒトに投与できることを示す。
【００３９】
「薬学的に許容される担体」という用語は、適切な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比と釣り合い、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の合併症を生じずに、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した、試薬、添加物、細胞、化合物、物質、組成、および／または投与形態を指す。本明細書でさらに詳細に説明するとおり、本発明での使用に適した薬学的に許容される担体には、気体、液体、および半固体および固体物質を含む。
【００４０】
記載がある場合を除き、「被験者」または「患者」は同義的に用いられ、ヒト患者およびヒト以外の霊長類などの哺乳類、およびウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、その他の動物などの実験動物を指す。従って、本明細書に用いられる「被験者」または「患者」は本発明の組成を投与することができるすべての哺乳類患者または被験者を意味する。本発明の一部の実施形態では、前記患者が感染症または炎症性疾患、または自己免疫疾患に罹患する。本発明の一部の実施形態では、前記患者が癌と診断されている。本発明の典型的な実施形態では、本発明に沿った治療の候補患者を特定するため、一般に認められたスクリーニング方法を採用し、被験者の既存の疾患または状態の状況、または標的となるか疑わしい疾患または状態と関連したリスクファクターを決定する。これらのスクリーニング方法には、例えば、被験者が感染症、炎症性疾患、癌、または自己免疫疾患に罹患しているか否かを決定する検査を含む。このようなルーティンな方法により、臨床医は治療が必要な被験者を選択することができる。
【００４１】
「治療」は、例えば、感染症、ＧＭ−ＣＳＦによる炎症性疾患などの炎症性疾患、癌、または自己免疫疾患の治療または改善が成功した兆候を指し、軽減；寛解；症状の減少または患者が疾患状態に耐えられるようにすること；変性または低下の速度が遅くなること；または変性の最終段階の消耗性が低くなることなどの客観的または主観的パラメータを含む。症状の治療または改善は、検査結果などの客観的または主観的パラメータに基づくことができる。従って、前記「治療」という用語には、本発明の化合物または試薬を投与し、癌、感染症、ＧＭ−ＣＳＦによる炎症性疾患などの炎症性疾患、または自己免疫疾患に伴う症状または状態の発症を遅延、軽減、または停止または抑制することを含む。治療には、例えば、異型細胞増殖の抑制、癌または腫瘍性疾患進行の抑制、腫瘍増殖抑制の維持、および寛解の導入を含む。
【００４２】
本明細書に用いられる「治療用化合物」は癌、感染症、炎症性疾患、または自己免疫疾患などの疾患または状態の予防または治療に有用な化合物を指す。
【００４３】
「治療効果」は、前記被験者における前記疾患、前記疾患の症状、または前記疾患の副作用の軽減、排除、または予防を指す。「有効量」は、望みの作用を生じるために必要な量を指す。「治療有効量」は、疾患、状態、または障害を治療するために被験者に投与する場合、その疾患の治療を達成するために十分な量を意味する。
【００４４】
本明細書に用いられる「併用投与」、「同時投与」、または「併用」には、同時にまたは併用して、一緒に、または互いに前後して活性薬物（例えば、ＭＡｂｓ、化学療法薬、生体分子）を投与することを含む。前記複数の薬物は、すべての薬物が作用部位で十分有効濃度を達成することができる方法で投与される限り、同じ経路または異なる経路で、同時にまたは順次投与することができる。当業者であれば、特定の薬物と本発明の組成を投与する適切なタイミング、順序、および用量を決定することは難しくないだろう。
【００４５】
「ドナー細胞」は広義に用いられ、ハイブリドーマを作成するためにヒトＢ細胞に融合した細胞を指す。前記細胞には、（これに限定されるものではないが）当業者に理解される通りの齧歯類骨髄腫；齧歯類細胞株；ヒト細胞株；トリ細胞株を含む。細胞株は、当業者に既知のいかなる方法によっても得ることができる。
【００４６】
「免疫グロブリン」または「抗体」は広義に用いられ、抗体分子と様々な抗体由来分子の両方を指し、前記免疫系の主要成分である、高等哺乳動物で発生する一連の糖タンパク質の一員を含む。前記「抗体」という用語は最も広義の意味で用いられ、望みの生物活性を示す限り、具体的にはモノクローナル抗体、多エピトープ特異性を持つ抗体組成、二重特異性抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、および単鎖分子、また抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）を網羅する。免疫グロブリン分子には抗原結合ドメインを含み、それぞれが軽鎖と、重鎖の末端タンパク質、および補体の固定など様々な機能に必要なＦｃ領域を含む。免疫グロブリンには５種類のクラスがあり、前記Ｆｃ領域の重鎖の主要構造が前記免疫グロブリンのクラスを決める。具体的には、α、δ、ε、γ、およびμ鎖がそれぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに対応する。本明細書に用いる通り、「免疫グロブリン」または「抗体」にはα、δ、ε、γ、およびμのすべてのサブクラスを含み、４鎖の免疫グロブリン構造の天然（例えば、ＩｇＡおよびＩｇＭ）または合成多量体も指す。抗体は、非共有結合的に、特異的に、および可逆的に抗原と結合する。
【００４７】
本明細書に用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、かなり均質な抗体集団から得られる抗体を指し、つまり、少量で存在することができ、自然に発生した可能性のある変異を除き、前記集団を有する個々の抗体は同一である。例えば、モノクローナル抗体は抗体産生細胞の単一クローンにより作成することができる。ポリクローナル抗体と異なり、モノクローナル抗体は単一特異的である（例えば、単一抗原の単一エピトープに対して特異的である）。前記「モノクローナル」という修飾語は、かなり均質な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、いかなる特定の方法でも前記抗体の作成が必要であるとは解釈されない。例えば、本発明に従って使用される前記モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５で最初に報告されたハイブリドーマ法により作成することができるか、組み換えＤＮＡ法により作成することができる。前記「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７，１９９１に報告されている技術を利用し、ファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
【００４８】
本明細書に使用される場合、「キメラ化」は免疫グロブリンを指し、重鎖および軽鎖の可変領域がヒト由来のものではなく、前記重鎖および軽鎖の定常領域がヒト由来のものである。
【００４９】
「ヒト化」は抗体などの免疫グロブリンを指し、前記アミノ酸が直接抗原結合に関与し、前記重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒト由来ではないが、残りの免疫グロブリン分子、可変重鎖および軽鎖のフレームワーク領域、および前記重鎖および軽鎖の定常領域がヒト由来のものである。
【００５０】
「完全ヒト」とは、抗体などの免疫グロブリンを指し、前記分子全体がヒト由来であるか、前記抗体のヒト型と同一のアミノ酸配列から成る。
【００５１】
「エピトープ」は、抗体結合部位として機能する、抗原の免疫決定部分を指す。本明細書に用いられる「立体構造エピトープ」という用語は、連続したアミノ酸以外の、抗原のアミノ酸同士の空間関係によって形成される不連続エピトープを指す。
【００５２】
「ハイブリドーマ」は、培養した腫瘍化リンパ球と、親細胞の特異的免疫力を発現し初回刺激を受けたＢまたはＴリンパ球との細胞融合生成物を指す。
【００５３】
「ＧＭ−ＣＳＦ」は、顆粒球および単球−マクロファージの生産、分化、および機能を制御する、糖タンパク質成長因子のファミリーを指す。そのような分子の唯一の形態を意味するものではないが、模範的なものは、米国特許第５，６０２，００７（３４）号明細書に見ることができ、参考文献として盛り込まれている。
【００５４】
本明細書に用いられる「生体分子」という用語は、複合体を形成し、同時投与され、抗体の投与前後に投与され、またはそれ以外で本発明の抗体と関連して使用することができるすべての分子を指す。生体分子には、（これに限定されるものではないが）酵素、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、脂質、炭水化物、およびフラグメント、相同体、類似体、または誘導体、およびその組み合わせを含む。生体分子の例には、（これに限定されるものではないが）インターロイキン−２、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、リツキサン、ゼバリン、ハーセプチン、エルビタックス、およびアバスチンを含む。前記生体分子は、天然型、組み換え型、または合成とすることができ、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、ミリスチル化などにより、その天然型から修飾することもできる。本明細書に用いるとおり、前記生体分子という用語は、天然型の分子に限定されず、生物由来ではない合成分子を含む。
【００５５】
本発明に従ったポリペプチドは、ポリペプチド分野の当業者に既知の技術により、アミノ酸から合成することができる。一般に、これらの方法は、ペプチド鎖を伸長するため、１若しくはそれ以上のアミノ酸残基または適切に保護されたアミノ酸残基を順次追加する工程を有する。通常は、最初のアミノ酸のアミノ基またはカルボニル基が適切な、選択的に取り外し可能な保護基で保護される。異なる選択的に取り外し可能な保護基は、反応性側鎖（例えば、リジン）を含むアミノ酸に利用される。
【００５６】
本発明のポリペプチドを調整する様々な方法は当該分野で既知である（ＷＯ  ８９／０６６５７、ＷＯ  ９２／２２３１５、ＷＯ  ９８／４９１９１、米国特許第５，２６０，２７３号、第５，１６４，３６９号、第５，４０７，９１４号；第５，７８９，３８１号、第５，９５２，３０３号、第６，０１３，６１９号、第６，０１３，７６４号、第６，１２０，７９５号、第６，６１３，７３４号明細書）。
【００５７】
本発明のポリペプチドがラベルまたは固体基質、または担体に共有結合することができる「リンカー」を提供する目的などのため、本発明のポリペプチドのいずれの末端にも追加残基を追加することができる。本発明のポリペプチドと一緒に利用可能なラベル、固体基質、および担体は当該分野で既知であり、いくつかの例は本明細書にも説明されている。
【００５８】
アミノ酸残基のリンカーは通常少なくとも１残基であり、４０若しくはそれ以上、より多くは１〜１０残基とすることができる。連結に用いられる典型的なアミノ酸残基は、チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸などである。さらに、本発明のポリペプチドは、末端ＮＨ２のアシル化、例えばアセチル化、またはチオグリコール酸のアミド化、末端カルボキシルのアミド化、例えばアンモニア、メチルアミンなどにより修飾される配列が天然配列とは異なる可能性がある。
【００５９】
例えば配列ＩＤ番号１〜５など、多くの有用なポリペプチドが本明細書に開示されることは理解されるが、まれであるが天然型のアミノ酸、天然アミノ酸の代謝物および異化産物、置換アミノ酸、およびアミノ酸類似体、また「Ｄ」配置のアミノ酸を含む広範な他の分子が、本発明の分子および組成に有用であることも真実である。さらに、「設計された」アミノ酸誘導体、類似体、およびミメティックも本発明の様々な化合物、組成、および方法に有用であり、非アミド結合から成る骨格構造を含むポリマーも有用である。
【００６０】
本明細書に用いられるように、ポリペプチドおよびアミノ酸残基の「類似体」および「誘導体」は、アミノ酸の代謝物および異化産物、および「天然型」のＬ型アミノ酸と呼ばれる通常認められるものとは異なる結合、骨格、側鎖、または側基を含む分子を含むことを意図する（前記「類似体」および「誘導体」という用語は、本明細書において都合よく置き換えて使用できる）。従って、アミノ酸および「設計された」側鎖を有するアミノ酸を模倣した（つまり、界面活性作用を有する分子の１若しくはそれ以上のアミノ酸を置換することのできる）分子であるＤ−アミノ酸も、本明細書の前記「類似体」および「誘導体」という用語に含まれる。
【００６１】
例えば、表１に掲載されたＬ−アミノ酸に加え、ホモアルギニン、シトルリン、オルニチン、およびα−アミノブタン酸などのアミノ酸代謝物も、本発明の分子および組成に有用である。
【００６２】
別の変形形態では、より「硬い」立体構造を導入した分子を構築したいと考えることも可能であり、これを達成する１つの方法は、アミノ酸のα炭素原子にメチル基などを追加することである。
【００６３】
さらに、タンパク質に由来しないが、天然では知られている置換アミノ酸は本明細書に開示した通り有用であり、以下の例、つまりＬ−カナバニン；１−メチル−Ｌ−ヒスチジン；３−メチル−Ｌ−ヒスチジン；２−メチルＬ−ヒスチジン；α，ε−ジアミノピメリン酸（Ｌ型、メソ型、または両方）；サルコシン；Ｌ−オルニチンベタイン；ヒスチジンのベタイン（ｈｅｒｚｙｎｉｎｅ）；Ｌ−シトルリン；Ｌ−ホスホアルギニン；Ｄ−オクトピン；ｏ−カルバミル−Ｄ−セリン；γ−アミノブタン酸；およびβ−リジンを含む。Ｄ−アラニン、Ｄ−セリン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−アロイソロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−プロリン、およびＤ−アロヒドロキシプロリンなどを含むＤ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸類似体も、本発明のタンパク質、ペプチド、および組成に有用である。前述のアミノ酸は、本発明のＧＭ−ＣＳＦポリペプチドにも利用できる。
【００６４】
本発明には、修飾が発生した時間または位置とは無関係に、類似体、代謝物、異化産物、および誘導体を含む広範な修飾アミノ酸を含むことも理解されるものとする。基本的に、修飾アミノ酸は、（１）アミノ酸の異化産物および代謝物、（２）翻訳後修飾（例えば、側鎖の修飾）により発生させた修飾アミノ酸、および（３）非代謝または非異化プロセスによるアミノ酸の修飾（例えば、実験室での修飾アミノ酸または誘導体の合成）の３つのカテゴリーに入れることができる。
【００６５】
本発明では、直鎖、分岐鎖、または炭化水素または複素環配列のメチレン基を追加または取り除くことにより側鎖を長くするか、短くしたアミノ酸残基単位の側鎖を容易に設計することができるようにも意図している。前記直鎖および分岐鎖構造は、Ｓ、Ｏ、またはＮなどの非炭素原子を含むこともできる。脂肪酸も、本明細書の界面活性分子の有用な成分となる可能性がある。設計された側鎖は（Ｒ’）で終結するか、（Ｒ）が負荷されないか、極性基が付加されないで終結する可能性もある。
【００６６】
様々なリンカーを使用して生じた分子を含む類似体も、本発明のペプチドに有用である。アミド結合以外の結合によりともに結合した側鎖のある分子、例えば、数例を挙げると、その構成要素がカルボキシまたはホスホエーテル、エチレン、メチレン、ケトン、またはエーテル結合で結合したアミノ酸側鎖または他の側鎖（Ｒ−またはＲ’−）を含む分子も、本明細書で開示される通り有用である。基本的に、すべてのアミノ酸側鎖、ＲまたはＲ’基を含む分子が本明細書で開示される通り有用である可能性がある。
【００６７】
本発明では、適切なリンカーで結合したペプチド二量体、例えば、システイン分子で結合したペプチド二量体を有する分子も意図している。（当業者が承知の通り、２つのシステイン分子は、チオール基の酸化によって形成するジスルフィド架橋によって互いに結合することができる。）そのため、そのようなリンカーまたは架橋は、異なるポリペプチド鎖、二量体、三量体などに架橋を形成することができる。ペプチド二量体および／または他のペプチド多量体を接続するために使用できる他の有用なリンカーには、例えば、上述のカルボキシまたはホスホエーテル、エチレン、メチレン、ケトン、またはエーテル結合などを含む。
【００６８】
当業者は、得られた分子が本明細書に説明する生物活性（例えば、抗原活性）を有する限り、個々のアミノ酸、結合、および／または鎖自体に様々な修飾を加えることができ、その修飾は本発明の範囲内に入る分子を生じることは理解するだろう。
【００６９】
本発明の好適な抗原ポリペプチドは、ＧＭ−ＣＳＦ（配列ＩＤ番号１）および好ましくは成熟ＧＭ−ＣＳＦ（配列ＩＤ番号２）の抗原ペプチドである。一部の実施形態では、前記抗原ペプチドが、配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号２に示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも５つの連続アミノ酸を有する。他の実施形態では、前記抗原ペプチドが、配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号２に示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも１０連続アミノ酸を有する。他の実施形態では、前記抗原ペプチドが、配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号２に示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも１５連続アミノ酸を有する。他の実施形態では、免疫原性部分が、配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号２に示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも２０連続アミノ酸を有する。さらに他の実施形態では、前記免疫原性部分が、配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号２に示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも２５連続アミノ酸を有する。本発明の特定の好適な実施形態では、前記ＧＭ−ＣＳＦタンパク質の抗原ペプチドが、成熟ＧＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号２）中のアミノ酸１４−２８（配列ＩＤ番号３）、アミノ酸９−２３（配列ＩＤ番号４）、またはアミノ酸８０−９４（配列ＩＤ番号５）である。
【００７０】
本発明の一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦまたはその抗原ペプチドが免疫原性タンパク質に結合し、前記抗原の免疫原性を高める。前記免疫原性タンパク質は、破傷風トキソイドＣ（ＴＴ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、アルブミン、オボアルブミン、ニワトリアルブミン（ＣＡＢ）、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、ジフテリア類毒素、ＢＣＧ、コレラ毒素など（これに限定されるものではないが）、細胞の免疫反応を高めるすべてのタンパク質が考えられる。いくつのかの実施形態では、前記抗原が前記成熟タンパク質の変性により生成される。
【００７１】
一次ヒトＢ細胞を用い、ハイブリドーマ分泌ヒトＭＡｂｓの作成についてこれまでに報告された方法（ＷＯ２００４／０４６３３０）が本明細書で採用された。末梢血単核細胞、好ましくはヒトＰＢＭＣｓをｅｘ  ｖｉｖｏで標的抗原存在下、免疫化し、次にドナー細胞と細胞融合させることで不死化する。代わりに、血清が対象抗原に高い免疫反応を示す特定のＰＢＭＣｓを同定することもある。
【００７２】
前記ドナー細胞由来のハイブリッド細胞は、標的抗原特異的ＭＡｂｓの分泌をスクリーニングされる。一部の実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏで免疫化した免疫グロブリン産生細胞から、標的抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作成する方法が提供され、（ａ）免疫グロブリン産生細胞を有する末梢血単核細胞と標的抗原とをｅｘ  ｖｉｖｏで合わせる工程、（ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞とドナー細胞を融合してハイブリドーマ細胞を形成する工程、（ｃ）前記ハイブリドーマ細胞から産生された抗体による抗原結合を決定する工程、（ｄ）前記標的抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択する工程を有し、それによって、前記標的抗原に対する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作成する。好適な実施形態では、前記ＰＢＭＣｓが健常ドナーのものである。前記標的抗原は好ましくはＧＭ−ＣＳＦであり、より好ましくは、配列ＩＤ番号３５−３８の１つのアミノ酸配列を有する。
【００７３】
或いは、標的となる疾患関連抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作成する方法は、（ａ）疾患を有する患者またはドナー細胞に抗原曝露したドナー由来の免疫グロブリン産生Ｂ細胞を有する末梢血単核細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する工程、（ｂ）前記ハイブリドーマ細胞から標的抗原に対して産生された抗体による結合を決定する工程、および（ｃ）前記標的抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択する工程を有し、それによって前記標的抗原に対する抗体を発現したハイブリドーマ細胞を作成する。好ましくは、前記標的抗原は疾患関連抗原であり、好ましくは癌、感染症、または自己免疫疾患と関連している。より好ましくは、前記疾患関連抗原はＧＭ−ＣＳＦである。前記標的抗原は好ましくはＧＭ−ＣＳＦであり、より好ましくは、配列ＩＤ番号３５〜３８の１つのアミノ酸配列を有する。好適な実施形態では、前記抗原曝露したドナーはＧＭ−ＣＳＦに曝露したか、肺胞タンパク症（ＰＡＰ）を有することもある。
【００７４】
本発明によると、ｅｘ  ｖｉｖｏで免疫化した免疫グロブリン産生細胞から、標的抗原（例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはその抗原ペプチド）に対する抗体を産生するハイブリドーマ細胞の作成法が提供され、（ａ）ｅｘ  ｖｉｖｏで免疫グロブリン産生細胞を含む末梢血単核細胞を標的抗原と混合する工程、（ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞とドナー細胞を融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する工程、（ｃ）前記ハイブリドーマ細胞により産生された免疫グロブリンの標的抗原に対する結合をスクリーニングする工程を有し、それによって、標的抗原に対する抗体産生ハイブリドーマ細胞を作成する。好適な実施形態では、前記ＰＢＭＣｓが健常ドナーのものである。一部の実施形態では、前記標的抗原が本発明の抗原ポリペプチドを有する。前記標的抗原は、好ましくは配列ＩＤ番号１〜５の１つのアミノ酸配列を有し、好ましくは配列ＩＤ番号３〜５のいずれか１つである。
【００７５】
或いは、本発明によると、標的抗原（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、またはその抗原ペプチド）に対する抗体を産生するハイブリドーマ細胞の作成法が提供され、（ａ）抗原曝露したドナーから免疫グロブリン産生細胞を含む末梢血単核細胞を選択する工程、（ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞と骨髄腫細胞を融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する工程、（ｃ）前記ハイブリドーマ細胞により産生される免疫グロブリンの標的抗原に対する結合をスクリーニングする工程を有し、それによって、前記標的抗原に対する抗体産生ハイブリドーマ細胞を作成する。一部の実施形態では、前記標的抗原が本発明の抗原ポリペプチドを有する。前記標的抗原は、好ましくは配列ＩＤ番号１〜５、より好ましくは配列ＩＤ番号３〜５の１つのアミノ酸配列を有する。好適な実施形態では、前記ドナーはＧＭ−ＣＳＦ、またはその抗原ペプチドに曝露したか、肺胞タンパク症（ＰＡＰ）を有することもある。
【００７６】
一部の実施形態では、前記ドナー（例えば、骨髄腫）細胞がミスマッチ修復のタンパク質阻害剤を発現している。いくつかの態様では、前記ハイブリドーマ細胞がミスマッチ修復のタンパク質阻害剤を発現している。本発明の方法の一部の実施形態では、ミスマッチ修復のタンパク質阻害剤が、免疫グロブリン産生細胞と前記骨髄腫を融合させた後、前記ハイブリドーマ細胞に導入される。他の実施形態では、前記ミスマッチ修復のタンパク質阻害剤が、前記免疫グロブリン産生細胞との融合前に前記ドナーまたは骨髄腫細胞に導入される。さらに他の実施形態では、前記ドナーまたは骨髄腫細胞または抗体産生細胞のミスマッチ修復が自然に欠損している。
【００７７】
ミスマッチ修復のタンパク質阻害剤には、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を含む。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子には、（これに限定されるものではないが）ＰＭＳ２、ＰＭＳ１、ＰＭＳＲ３、ＰＭＳＲ２、ＰＭＳＲ６、ＭＬＨ１、ＧＴＢＰ、ＭＳＨ３、ＭＳＨ２、ＭＬＨ３、またはＭＳＨ１のドミナントネガティブ対立遺伝子、およびｍｕｔＬおよびｍｕｔＳ遺伝子の相同体を含む。さらに、ミスマッチ修復に干渉することのできるポリペプチドを利用することもできる。例えば、ｍｕｔＬ  ＰＭＳ２のドミナントネガティブ対立遺伝子は、最初の１３３アミノ酸であるＰＭＳ２を有する。さらにｍｕｔＬ相同体のアミノ酸を描写すると、アミノ酸ＬＳＴＡＶＫＥＬＶＥＮＳＬＤＡＧＡＴＮＩＤＬＫＬＫＤＹＧＶＤＬＩＥＶＳＤＮＧＣＧＶＥＥＥＮＦＥ（配列ＩＤ番号６）およびＬＲＱＶＬＳＮＬＬＤＮＡＩＫＹＴＰＥＧＧＥＩＴＶＳＬＥＲＤＧＤＨＬＥＩＴＶＥＤＮＧＰＧＩＰＥＥＤＬＥ（配列ＩＤ番号７）またはそのフラグメントが明らかとなる。従って、ミスマッチ修復のタンパク質阻害剤には、配列ＩＤ番号６および７およびそのフラグメントを含む。好適な実施形態では、前記ミスマッチ修復のタンパク質阻害剤が不活性化される。例えば、前記ミスマッチ修復のタンパク質阻害剤は、前記標的抗原に対するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞の同定前後に不活性化することができる。前記ミスマッチ修復のタンパク質阻害剤の不活性化は、例えば、誘導因子を除去するか、細胞から前記ミスマッチ修復のタンパク質阻害剤を除去する（つまり、前記ミスマッチ修復のタンパク質阻害剤の細胞を治療する）など、当該分野で既知のいかなる方法によっても行うことができる。前記ミスマッチ修復阻害剤の不活性化は、過剰変異ハイブリドーマのゲノムを安定化する。
【００７８】
本発明のハイブリドーマ細胞の作成法に関する一部の実施形態では、前記ハイブリドーマ細胞がミスマッチ修復の化学抑制剤に曝露される。本発明の方法に関する特定の実施形態で使用されるミスマッチ修復の化学抑制剤には、（これに限定されるものではないが）ミスマッチ修復タンパク質をコードするヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする、アントラセン、ＡＴＰアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、ＲＮＡ干渉分子、ポリメラーゼ阻害剤、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含む（ＷＯ２００４／０４６３３０）。好適な実施形態では、前記化学抑制剤は以下の化学式を有するアントラセン化合物であり、
【００７９】
【化１】
2009526082.tif 000004
【００８０】
Ｒ１〜Ｒ１０は独立して水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アラルキルオキシ、アリールアルキル、アルキルアリールオキシ、アリールスルホニル、アルキルスルホニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、グアニジノ、カルボキシ、アルコール、アミノ酸、スルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、ＣＮ、ＮＯ２、アルデヒド基、エステル、エーテル、クラウンエーテル、ケトン、有機硫黄化合物、有機金属基、カルボン酸、有機ケイ素、または炭水化物であり、任意選択で１若しくはそれ以上のアルキル化ヒドロキシル基を含み、前記ヘテロアルキル、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールが酸素、硫黄、金属原子、リン、ケイ素、または窒素である少なくとも１つのヘテロ原子を含み、前記置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アリール、および置換ヘテロアリールの前記置換基がハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、低級アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルコキシ、グアニジノ、アルコキシカルボニル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、およびアミノであり、前記アミノ基は任意選択で、アシル基、または１〜３アリールまたは低級アルキル基と置換される。特定の実施例では、Ｒ５およびＲ６が水素である。他の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１０が独立して水素、ヒドロキシ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、フェニル、トリル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシプロピル、またはヒドロキシブチルである。前記アントラセンの限定されない例には、１，２−ジメチルアントラセン、９，１０−ジメチルアントラセン、７，８−ジメチルアントラセン、９，１０−デュフェニルアントラセン（９，１０−ｄｕｐｈｅｎｙｌａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）、９，１０−ジヒドロキシメチルアントラセン、９−ヒドロキシメチル−１０−メチルアントラセン、ジメチルアントラセン−１，２−ジオール、９−ヒドロキシメチル−１０−メチルアントラセン−１，２−ジオール、９−ヒドロキシメチル−１０−メチルアントラセン−３，４−ジオール、および９，１０−ジ−ｍ−トリルアントラセンを含む。
【００８１】
前記化学抑制剤は、前記細胞の増殖培地に導入することができる。一部の実施形態では、前記細胞のゲノムを再安定化するため、前記化学抑制剤を過剰変異ハイブリドーマ細胞から取り出すことができる。代わりに、前記方法が前記ミスマッチ修復の化学抑制剤の不活性化を有し、それによって、前記過剰変異ハイブリドーマのゲノムを安定化することができる。
【００８２】
一部の実施形態によると、前記方法は、さらに、前記抗体産生細胞から免疫グロブリン産生遺伝子をクローニングする工程、および前記免疫グロブリン遺伝子を哺乳類発現細胞に導入する工程を有し、前記免疫グロブリン遺伝子は操作により発現制御配列に結合される。
【００８３】
本発明は、ｅｘ  ｉｎｖｏで免疫性を与えた免疫グロブリン産生細胞から、標的抗原に対する高親和性抗体を産生する哺乳類発現細胞を産生する方法も提供し、（ａ）免疫グロブリン産生細胞を有する末梢血単核細胞と標的抗原とをｅｘ  ｖｉｖｏで合わせる工程、（ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞とドナー細胞を融合してハイブリドーマ細胞を形成する工程、（ｃ）前記ハイブリドーマ細胞から産生された抗体による抗原結合を決定する工程、（ｄ）ミスマッチ修復を阻害することで前記ハイブリドーマの抗体産生を最適化する、または前記ハイブリドーマから哺乳類発現細胞に免疫グロブリン遺伝子をクローニングし、前記哺乳類発現細胞のミスマッチ修復が阻害される工程、および（ｅ）前記標的抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択する工程を有し、それによって、前記標的抗原に対する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作成する。工程（ａ）および（ｂ）の代わりの方法として、疾患を有する患者または抗原に曝露したドナー由来の免疫グロブリン産生Ｂ細胞を有する末梢血単核細胞をドナー細胞とｅｘ  ｖｉｖｏで融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する工程も利用できる。
【００８４】
本発明は、ｅｘ  ｉｎｖｏで免疫性を与えた免疫グロブリン産生細胞から、標的抗原に対する高親和性抗体を産生する哺乳類発現細胞を産生する方法も提供し、（ａ）免疫グロブリン産生細胞を有する末梢血単核細胞と標的抗原とをｅｘ  ｖｉｖｏで合わせる工程；（ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞と骨髄腫細胞を融合してハイブリドーマ細胞を形成する工程；（ｃ）前記ハイブリドーマ細胞から産生された抗体の標的抗原への結合をスクリーニングする工程、（ｄ）ミスマッチ修復を阻害することで前記ハイブリドーマの産生を最適化する、または前記ハイブリドーマから哺乳類発現細胞に免疫グロブリン遺伝子をクローニングし、前記哺乳類発現細胞のミスマッチ修復が阻害される工程；および（ｅ）前記ハイブリドーマまたは組み換え細胞から産生された抗体と比較し、標的抗原に対して高い親和性を持つ抗体を分泌する哺乳類発現細胞をスクリーニングする工程を有する。
【００８５】
本発明は、ｅｘ  ｉｎｖｏで免疫性を与えた免疫グロブリン産生細胞から、高力価の高親和性抗体を産生する哺乳類発現細胞を産生する方法も提供し、（ａ）免疫グロブリン産生細胞を有する末梢血単核細胞と標的抗原とをｅｘ  ｖｉｖｏで混合する工程、（ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞とドナー細胞を融合してハイブリドーマ細胞を形成する工程；（ｃ）前記ハイブリドーマ細胞から産生される抗体による抗原結合を決定する工程；（ｄ）前記ハイブリドーマから親哺乳類発現細胞に免疫グロブリン遺伝子をクローン化し、前記哺乳類発現細胞のミスマッチ修復が阻害される工程、（ｅ）前記親哺乳類発現細胞またはハイブリドーマ発現細胞を培養し、突然変異を誘発させることで、過剰変異哺乳類発現細胞を形成する工程、（ｆ）親ハイブリドーマ細胞から産生される抗体と比較し、標的抗原に対する親和性が高い抗体を分泌する過剰変異哺乳類発現細胞を選択するか、または親哺乳類発現細胞よりも高い力価の抗体を分泌する過剰発現哺乳類発現細胞を選択する工程を有し、それによって、ｅｘ  ｖｉｖｏで免疫性を与えた免疫グロブリン産生細胞から、標的抗原に対する抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する。工程（ａ）および（ｂ）の代わりの方法として、疾患を有する患者または抗原に曝露したドナー由来の免疫グロブリン産生Ｂ細胞を有する末梢血単核細胞をドナー細胞とｅｘ  ｖｉｖｏで融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する工程も利用できる。
【００８６】
本発明は、ｅｘ  ｉｎｖｏで免疫性を与えた免疫グロブリン産生細胞から、高力価の高親和性抗体を産生する哺乳類発現細胞を産生する方法も提供し、（ａ）免疫グロブリン産生細胞を有する末梢血単核細胞と標的抗原をｅｘ  ｖｉｖｏで混合する工程、（ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞と骨髄腫細胞を融合してハイブリドーマ細胞を形成する工程、（ｃ）前記ハイブリドーマ細胞から産生される抗体による抗原結合をスクリーニングする工程、（ｄ）前記ハイブリドーマから親哺乳類発現細胞に免疫グロブリン遺伝子をクローニングし、前記哺乳類発現細胞のミスマッチ修復が阻害されるか、ミスマッチ修復を阻害することで前記ハイブリドーマの産生を最適化する工程、（ｅ）前記親哺乳類細胞またはハイブリドーマ発現細胞を培養し、突然変異を誘発させることで、過剰変異哺乳類発現細胞を形成する工程、（ｆ）前記ハイブリドーマ細胞から産生される抗体と比較し、標的抗原に対する高い親和性を持つ抗体を分泌する過剰変異哺乳類発現細胞をスクリーニングする工程、および（ｇ）親哺乳類発現細胞よりも高い力価の抗体を分泌する過剰変異哺乳類発現細胞をスクリーニングする工程を有し、それによって、ｅｘ  ｖｉｖｏで免疫性を与えた免疫グロブリン産生細胞から、高力価の高親和性抗体を産生する哺乳類発現細胞を作成する。
【００８７】
本発明の方法に関する一部の実施形態では、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイまたは当該分野で既知の抗体抗原結合を測定することができる他のアッセイにより、抗体がスクリーニングされる。Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｊ．Ｒ．（２００１）Ｔｈｅ  ＥＬＩＳＡ  ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ，１ｓｔ  ｅｄ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ。
【００８８】
一部の実施形態によると、前記スクリーニングで、前記親ハイブリドーマにより産生される抗体よりも親和性が高い抗体を産生する過剰変異ハイブリドーマのスクリーニングをアッセイする。
【００８９】
一部の実施形態によると、本発明の方法は、さらに、最初に選択された細胞により産生される抗体よりも力価の高い過剰変異抗体産生細胞を選択する工程を有する。
【００９０】
免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞およびそのような方法で有用な骨髄腫細胞に融合する方法は、当該分野で既知である。Ｋｏｈｌｅｒ  &  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７６．６：５１１−９．Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ。
【００９１】
ヒトへの投与を目的として設計されたＭａｂｓの生成に使用されるヒトＢ細胞は、ウイルス伝播が可能な媒体とすることができる。融合の相手となる細胞およびドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を事前にスクリーニングし、例えば、ＰＣＲにより、免疫不全−１および２ウイルス、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペス−６ウイルス、およびエプスタインバーウイルスを含むウイルスＤＮＡがないことを確認できる。
【００９２】
本発明の方法に従い産生されたハイブリドーマ細胞は、本発明の範囲内に含まれる。
【００９３】
本発明は、本発明の方法に従い作成されたハイブリドーマ細胞により産生される標的抗原に対する抗体も有する。本発明の抗体は、本発明のポリヌクレオチドを用い、遺伝子組み換えにより作成された抗体も有する。本発明の好適な抗体は、モノクローナル抗体である。本発明の抗体は好ましくは完全にヒトであり、より好ましくは完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００９４】
本発明の好適な抗体は、標的抗原のエピトープ、例えば立体構造エピトープに特異的に結合する。本発明の抗体は、例えば（これに限定されるものではないが）ＧＭ−ＣＳＦ、好ましくはヒトＧＭ−ＣＳＦ（配列ＩＤ番号１）、より好ましくは成熟ヒトＧＭ−ＣＳＦ（配列ＩＤ番号２）など、好ましくは疾患関連抗原に向かう。一部の実施形態では、前記抗原が結合するエピトープが、配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号２で示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも５個の連続アミノ酸を有する。他の実施形態では、前記抗原が結合するエピトープが、配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号２で示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも１０個の連続アミノ酸を有する。他の実施形態では、前記抗原が結合するエピトープが、配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号２で示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも１５個の連続アミノ酸を有する。他の実施形態では、前記抗原が結合するエピトープが、配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号２で示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも２０個の連続アミノ酸を有する。さらに他の実施形態では、前記抗原が結合するエピトープが、配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号２で示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも２５個の連続アミノ酸を有する。本発明の特定の好適な実施形態では、前記抗体が結合するＧＭ−ＣＳＦのエピトープが、配列ＩＤ番号３３−３６の少なくとも１つのアミノ酸配列を有する。抗体産生細胞は２００７年１月１８日（１０Ｇ９）、および２００７年１月３１日（Ｅ１０）にＡｍｅｒ．Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔ．Ｃｏｌｌ．（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９）に掲載され、受入番号 を割り当てられた。本発明の抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の例は、そのような細胞によって産生される抗体である。
【００９５】
当業者は、抗体の特異性が主にＣＤＲの６領域、特にＨ鎖ＣＤＲ３によって決まることを認識するだろう（Ｋａｌａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２：５３５−４１；Ｍｏｒｅａ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７５：２６９−９４；およびＣｈｏｔｈｉａ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−１７）。ただし、抗体のフレームワーク領域は抗原−抗体相互作用に関与する可能性があり（Ｐａｎｋａ  ＤＪ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：３０８０−４）、特に、ＣＤＲループの立体構造に関与する可能性がある（Ｆｏｏｔｅ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−９９）。従って、本発明の抗体は、ＨまたはＬ鎖ＣＤＲまたはＧＭ−ＣＳＦに抗体特異性を与えるＦＷＲ領域のいかなる組み合わせも有することができる。当該分野でルーティンに実施されるドメインシャッフリング実験（Ｊｉｒｈｏｌｔ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅ  ２１５：４７１−６；Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：８５２−６）を利用し、本明細書に説明、例示される明細に従い、ＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合する抗体を作成することができる。そのようなドメインシャッフリング実験で作成される抗体は、本発明の範囲内である。
【００９６】
従って、一部の実施形態では、前記抗体は配列ＩＤ番号４０または４６と実質的に同一または等しい重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、前記抗体は配列ＩＤ番号４１または４７と実質的に同一または等しい重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を有する。いくつかの特に好適な実施形態では、前記抗体は配列ＩＤ番号４２または４８と実質的に同一または等しい重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、前記抗体は配列ＩＤ番号４３または４９と実質的に同一または等しい軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、前記抗体は配列ＩＤ番号４４または５０と実質的に同一または等しい軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、前記抗体は配列ＩＤ番号４５または５１と実質的に同一または等しい軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、前記抗体は配列ＩＤ番号５２または５８と実質的に同一または等しい重鎖ＦＷＲ１アミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、前記抗体は配列ＩＤ番号５３または５９と実質的に同一または等しい重鎖ＦＷＲ２アミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、前記抗体は配列ＩＤ番号５４または６０と実質的に同一または等しい重鎖ＦＷＲ３アミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、前記抗体は配列ＩＤ番号５５または６１と実質的に同一または等しい軽鎖ＦＷＲ１アミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、前記抗体は配列ＩＤ番号５６または６２と実質的に同一または等しい軽鎖ＦＷＲ２アミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、前記抗体は配列ＩＤ番号５７または６３と実質的に同一または等しい軽鎖ＦＷＲ３アミノ酸配列を有する。
【００９７】
いくつかの好適な実施形態では、本発明の抗体が配列ＩＤ番号８、９、または１６のアミノ酸配列を有する重鎖を有する。前記重鎖は、配列ＩＤ番号１０、１１、または１７のヌクレオチド配列を有する核酸配列によってコードされる可能性がある。いくつかの好適な実施形態では、本発明の抗体が配列ＩＤ番号１２、１３、または１８のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する。前記軽鎖は、配列ＩＤ番号１４、１５、または１９のヌクレオチド配列を有する核酸配列によってコードされる可能性がある。
【００９８】
重鎖と軽鎖およびそれをコードする遺伝子に存在する可能性のある天然の配列変化のため、当業者はアミノ酸配列またはそれをコードする遺伝子にある程度の変化はあるが、それでも本発明の抗体に独特の結合性（例えば、特異性および親和性）を維持することを期待するだろうことは、理解されるものとする。そのような期待は、一部は遺伝コードの縮重、および保存的アミノ酸配列の変化における既知の進化的成功が原因であり、コード化されたタンパク質の性質はあまり変化させない。従って、そのような変異体および相同体は、実質的に互いに同一と考えられ、本発明の範囲内に含まれる。
【００９９】
そのため、本発明の抗体には、単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、または交換を有し、本発明の抗体の生物学的特性（例えば、結合親和性または免疫エフェクター活性）を保持する変異体を含む。当業者は、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加、または交換を有する変異体を作成することができる。これらの変異体には、とりわけ、（ａ）１若しくはそれ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸と置換された変異体、（ｂ）１若しくはそれ以上のアミノ酸が前記ポリペプチドに追加されるか、前記ポリペプチドから欠失した変異体、（ｃ）１若しくはそれ以上のアミノ酸が置換基を含む変異体、および（ｄ）例えば、抗体エピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオチン部分など、前記ポリペプチドに有用な特性を与えることができる、融合パートナー、タンパク質標識、または他の化学部分など、別のペプチドまたはポリペプチドと、前記ポリペプチドが融合した変異体を含むことがある。本発明の抗体には、保存的または非保存的な位置で、１種のアミノ酸残基が別の種の対応する残基と置換された変異体を含むこともある。他の実施形態では、非保存的な位置のアミノ酸残基が保存的または非保存的残基と置換される。遺伝的（抑制、欠失、変異など）、化学的、および酵素的技術を含む、これらの変異体を得る技術は、当業者に周知である。
【０１００】
いくつかの好適な実施形態では、前記抗体が配列ＩＤ番号８のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列ＩＤ番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖を有することができる。いくつかの好適な実施形態では、前記抗体が配列ＩＤ番号１６のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列ＩＤ番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖を有することができる。一部の実施形態では、前記抗体が配列ＩＤ番号９のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列ＩＤ番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖を有することができる。ただし、当業者は、場合によっては、特定の重鎖と様々な軽鎖の組み合わせ、または特定の軽鎖と様々な重鎖の組み合わせが、天然の組み合わせと同一またはそれ以上の特異性および／または親和性を持つ抗体を産生することは認識するだろう。従って、本発明は、ＨおよびＬ鎖の好ましい組み合わせに限定されず、そのため本発明の抗体は、ＧＭ−ＣＳＦに対する特異的な高い親和性の結合を得るため、本明細書に説明されるＨおよびＬ鎖、または当業者に周知であるか、それ以外に本明細書に説明されるＨおよびＬ鎖と適合すると実験的に判断された他のＨまたはＬ鎖を含む（これに限定されるものではないが）ＨおよびＬ鎖の様々な組み合わせを含む。
【０１０１】
本発明の好適な抗体は２つの重鎖を有する。本発明の好適な抗体は２つの軽鎖を有する。より好ましくは、本発明の２つの重鎖および２つの軽鎖を有する抗体である。
【０１０２】
本発明の抗体には、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加、または交換を有し、本発明の抗体の生物学的特性（例えば、結合親和性または免疫エフェクター活性）を保持する変異体を含む。当業者は、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加、または交換を有する変異体を作成することができる。これらの変異体には、とりわけ、（ａ）１若しくはそれ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸と置換された変異体、（ｂ）１若しくはそれ以上のアミノ酸が前記ポリペプチドに追加されるか、前記ポリペプチドから欠失した変異体、（ｃ）１若しくはそれ以上のアミノ酸が置換基を含む変異体、および（ｄ）例えば、抗体エピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオチン部分など、前記ポリペプチドに有用な特性を与えることができる、融合パートナー、タンパク質標識、または他の化学部分など、別のペプチドまたはポリペプチドと、前記ポリペプチドが融合した変異体を含むことがある。本発明の抗体には、保存的または非保存的な位置で、１種のアミノ酸残基が別の種の対応する残基と置換された変異体を含むこともある。別の実施形態では、非保存的な位置のアミノ酸残基が保存的または非保存的残基と置換される。遺伝的（抑制、欠失、変異など）、化学的、および酵素的技術を含む、これらの変異体を得る技術は、当業者に周知である。本発明の抗体には抗体フラグメントも含む。「フラグメント」とはポリペプチド配列を指し、好ましくは少なくとも約４０、より好ましくは少なくとも約５０、より好ましくは少なくとも約６０、より好ましくは少なくとも約７０、より好ましくは少なくとも約８０、より好ましくは少なくとも約９０、より好ましくは少なくとも約１００アミノ酸長であり、例えば、結合親和性または結合活性および免疫エフェクター活性など、前記完全な長さの配列の生物活性または免疫活性を一部保持する。
【０１０３】
本発明の抗体は標的抗原に対する結合親和性を有し、解離定数（ＫＤ）は１×１０−２未満を含む。一部の実施形態では、前記ＫＤが１×１０−３未満である。他の実施形態では、前記ＫＤが１×１０−４未満である。一部の実施形態では、前記ＫＤが１×１０−５未満である。さらに他の実施形態では、前記ＫＤが１×１０−６未満である。他の実施形態では、前記ＫＤが１×１０−７未満である。他の実施形態では、前記ＫＤが１×１０−８未満である。他の実施形態では、前記ＫＤが１×１０−９未満である。他の実施形態では、前記ＫＤが１×１０−１０未満である。さらに他の実施形態では、前記ＫＤが１×１０−１１未満である。一部の実施形態では、前記ＫＤが１×１０−１２未満である。他の実施形態では、前記ＫＤが１×１０−１３未満である。他の実施形態では、前記ＫＤが１×１０−１４未満である。さらに他の実施形態では、前記ＫＤが１×１０−１５未満である。
【０１０４】
本発明の抗体には、例えば、あらゆるタイプの分子と前記抗体との共有結合により、共有結合が前記抗体のエピトープへの結合を阻害しないように修飾された誘導体を含む。適切な誘導体の例には、（これに限定されるものではないが）グリコシル化抗体およびフラグメント、アセチル化抗体およびフラグメント、ポリエチレングリコール化抗体およびフラグメント、リン酸化抗体およびフラグメント、およびアミド化抗体およびフラグメントを含む。本発明の抗体は、それ自体、既知の保護基／封鎖基、タンパク質分解的切断、細胞のリガンドまたは他のタンパク質との結合などにより誘導体化することができる。さらに、本発明の抗体は、上述の通り、１若しくはそれ以上の非古典的アミノ酸を含むことができる。本発明の一部の実施形態では、ＧＭ−ＣＳＦまたはそのエピトープが免疫原性タンパク質に接合し、前記抗原の免疫原性を高める。前記免疫原性タンパク質は、破傷風トキソイドＣ（ＴＴ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、アルブミン、オボアルブミン、ニワトリアルブミン（ＣＡＢ）、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、ジフテリア類毒素、ＢＣＧ、コレラ毒素など（これに限定されるものではないが）、細胞の免疫反応を高めるすべてのタンパク質が考えられる。いくつのかの実施形態では、前記抗原が前記成熟タンパク質の変性により生成される。
【０１０５】
本発明の抗体は、抗体の活性または安定性を改良する翻訳後部分を有することもできる。これらの部分には硫黄、メチル、炭水化物、リン、および免疫グロブリン分子に一般的に認められる他の化学基を含む。
【０１０６】
本発明の抗体は、いかなるアイソタイプとすることもできる。それによって、抗体のアイソタイプは、ｉｎ  ｖｉｖｏクラススイッチまたは遺伝子組み換え技術により変化させることができる。
【０１０７】
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が提供される。本発明の核酸には、（これに限定されるものではないが）ゲノムＤＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、二本鎖および一本鎖核酸、およびその相補的配列を含む。
【０１０８】
本発明の好適なポリヌクレオチドには、配列ＩＤ番号８および／または配列ＩＤ番号１２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、前記抗体の重鎖が配列ＩＤ番号１０を有するポリヌクレオチドでコードされる。一部の実施形態では、前記抗体の軽鎖が配列ＩＤ番号１４を有するポリヌクレオチドでコードされる。配列ＩＤ番号８のアミノ酸配列および配列ＩＤ番号１２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドも提供される。好ましくは、そのようなポリヌクレオチドが、配列ＩＤ番号１０および／または配列ＩＤ番号１４の核酸配列を有する。
【０１０９】
本発明の好適なポリヌクレオチドには、配列ＩＤ番号１６および／または配列ＩＤ番号１８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、前記抗体の重鎖が配列ＩＤ番号１７を有するポリヌクレオチドでコードされる。一部の実施形態では、前記抗体の軽鎖が配列ＩＤ番号１９を有するポリヌクレオチドでコードされる。配列ＩＤ番号１６のアミノ酸配列および配列ＩＤ番号１８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドも提供される。好ましくは、そのようなポリヌクレオチドが、配列ＩＤ番号１７および／または配列ＩＤ番号１９の核酸配列を有する。
【０１１０】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（およびそれらがコードするペプチド）がリーダー配列を含む。当該分野で既知のいかなるリーダー配列も利用することができる。前記リーダー配列には、（これに限定されるものではないが）制限酵素認識部位および／または翻訳開始部位を含むことができる。例えば、本発明では、配列ＩＤ番号９および／または配列ＩＤ番号１３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を提供する。一部の実施形態では、前記抗体の重鎖が配列ＩＤ番号１１を有するポリヌクレオチドでコードされる。一部の実施形態では、前記抗体の軽鎖が配列ＩＤ番号１５を有するポリヌクレオチドでコードされる。配列ＩＤ番号９のアミノ酸配列および配列ＩＤ番号１３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドも提供される。好ましくは、そのようなポリヌクレオチドが、配列ＩＤ番号１１および／または配列ＩＤ番号１５の核酸配列を有する。
【０１１１】
本発明では、本発明のポリヌクレオチドを有する発現ベクター、および本発明の前記ポリヌクレオチドを発現した組み換え宿主細胞などの（これに限定されるものではないが）宿主細胞も検討される。
【０１１２】
対象ポリペプチドをコードする配列を有する組み換え発現ベクターも提供される。前記発現ベクターは、制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）、選択マーカー、およびポリアデニル化信号などの（これに限定されるものではないが）１若しくはそれ以上の追加配列を含むことができる。
【０１１３】
本発明の組み換え発現ベクターには、操作により適切な制御要素に結合可能な少なくとも１つの組み換えタンパク質をコードする合成、ゲノム、またはｃＤＮＡ由来の核酸フラグメントを含む。そのような制御要素には、転写プロモーター、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳の停止を制御する配列を含むことができる。発現ベクター、特に哺乳類発現ベクターには、複製起点、発現される遺伝子に結合する適切なプロモーターおよびエンハンサー、他の５’または３’側方非転写配列、（必要なリボソーム結合部位などの）５’または３’非翻訳配列、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、または転写終止配列など、１若しくはそれ以上の非転写要素を含むこともある、宿主に複製能力を与える複製起点も含めることができる。
【０１１４】
形質転換脊椎動物細胞に使用される発現ベクターの転写および翻訳制御配列は、ウイルス原料によって提供される。典型的なベクターは、Ｏｋａｙａｍａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０に説明される通り、作成することができる。
【０１１５】
前記系で使用可能な選択マーカーには、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ペニシリン耐性遺伝子）、ＨＳＶ−ＴＫ、ガンシクロビル選択用のＨＳＶ−ＴＫ誘導体、または６−メチルプリン選択用の細菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子など（これに限定されるものではないが）、ポジティブおよびネガティブ選択マーカーなどの当該分野で既知のマーカーを含む（Ｇａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１７３８−１７４３）。［００３４］選択マーカーをコードする核酸配列またはそのクローニング部位は、対象ポリペプチドをコードする核酸配列またはそのクローニング部位の上流または下流にある可能性がある。
【０１１６】
一部の実施形態では、前記ベクターに、構成的、誘導、宿主特異的、および／または組織特異的プロモーターなど（これに限定されるものではないが）、１若しくはそれ以上のプロモーターを含む。例えば、一般に使用されるプロモーターおよびエンハンサーは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス２、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、およびポリオーマに由来する。ウイルスゲノムプロモーター、制御および／またはシグナル配列を利用し、適合する宿主細胞に依存する発現を誘導することができる。前記ベクターが発現される細胞タイプの同一性により、ハウスキーピング遺伝子由来のプロモーターも利用することができる（例えば、β−グロビン、チミジンキナーゼ、およびＥＦ−１αプロモーター）。一部の実施形態では、プロモーターが１若しくはそれ以上の対象ポリペプチドをコードする核酸配列の上流にある。
【０１１７】
本発明のベクターには、１若しくはそれ以上の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含むことができる。融合ベクターにＩＲＥＳ配列を含めることは、一部のタンパク質発現を亢進させる上で有益と考えられる。
【０１１８】
一部の実施形態では、前記ベクターの系に１若しくはそれ以上のポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０）を含み、これは、前述の核酸配列のいずれかの上流または下流にある可能性がある。
【０１１９】
ベクター成分は隣接して結合しているか、遺伝子産物を発現させるために最適な間隔を提供するように（つまり、ＯＲＦｓ間に「スペーサー」ヌクレオチドを導入することで）配列されているか、別の方法で配置されている可能性がある。ＩＲＥＳモチーフなどの制御要素は、発現に最適な間隔を提供するように配列することもできる。
【０１２０】
本発明の発現ベクターを形質移入した細胞をポジティブ選択の条件で選択するか、および／または、組み換えタンパク質を発現させるためにスクリーニングすることができる。組み換え陽性の細胞を増殖し、望みの表現型を発現したサブクローンをスクリーニングする。
【０１２１】
本発明の発現ベクターを用い、真核および原核細胞を含む細胞を形質転換することができる。従って、本発明の別の実施形態では、本発明の発現ベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。本発明の細胞は、好ましくは真核細胞であり、より好ましくは植物、齧歯類、またはヒト由来の細胞であり、例えば（これに限定されるものではないが）ＮＳＯ、ＣＨＯ、ｐｅｒＣ．６、Ｔｋ−ｔｓ１３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９細胞、ＣＯＳ−７、Ｔ９８Ｇ、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＮＳ１、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞、およびＢＨＫ細胞株などである。
【０１２２】
一般に、形質移入は細胞懸濁液、または単細胞を用いて実施されるが、前記処理細胞または組織の十分な分画が前記ポリヌクレオチドを含む限り、他の方法を適用することもでき、それにより形質移入した細胞が増殖、利用できるようにする。形質移入の技術も周知である。いくつかの形質転換プロトコールが当該分野で既知である。例えば、Ｋａｕｆｍａｎ（１９８８）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：５３７を参照。当業者に容易に理解される通り、適切な形質転換プロトコールは宿主細胞の種類および対象遺伝子の性質により決まる。そのようなプロトコールの基本要素には、対象タンパク質をコードする核酸配列を適切な宿主細胞に導入する工程、および、次に安定した発現様式でベクターＤＮＡを組み入れた宿主細胞を同定および単離する工程を含む。ポリヌクレオチドの導入技術には、これに限定されるものではないが、電気穿孔法、形質導入、細胞融合、塩化カルシウムの利用、前記ポリヌクレオチドと脂質のパッケージングにより対象細胞と融合させる方法を含む。前記形質移入が安定し、前記選択可能なマーカー遺伝子が多数の細胞世代で一貫したレベルで発現されていれば、細胞株が生じる。
【０１２３】
哺乳類細胞に形質移入する１つの一般的な方法は、リン酸カルシウム沈殿である。別の方法は、哺乳類細胞を用い、細菌原形質体をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により融合するものである。Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１６３。さらに別の方法は電気穿孔法であり、これはＤＮＡを直接宿主細胞の細胞質に導入するために利用することもでき、例えば、Ｐｏｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ  ８１：７１６１に報告されている。
【０１２４】
ＤＮＡの形質移入はリポフェクチンおよびリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）から入手可能）などのポリリソソーム試薬を用いて行うことができ、これが脂質−核酸複合体（またはリポソーム）を形成し、培養細胞に使用すると、細胞への核酸の取り込みを促進する。
【０１２５】
望みのタンパク質を発現した細胞が同定されると、これを増殖、選択することができる。形質移入細胞は様々な方法で選択できる。例えば、対象ポリペプチドを発現した細胞を選択することができる。ベクターが抗生物質耐性遺伝子も含む細胞では、前記細胞の抗生物質耐性が選択され、これにより前記ベクターを含む細胞をポジティブに選択する。他の実施形態では、前記細胞を選択的条件で増殖させることができる。
【０１２６】
タンパク質を産生するクローンが同定されると、その系をさらにスクリーニングし、例えば、タンパク質の修飾および／または翻訳後修飾の変更により、高力価の発現、増殖特性の向上、および／または望みの生化学特性を持つタンパク質を産生する能力を示す細胞など（これに限定されるものではないが）望みの表現型を１若しくはそれ以上有するサブクローンを同定することができる。これらの表現型は、特定サブクローンに固有の特性または変異誘発性によるものと考えられる。変異誘発性は、化学物質の使用、ＵＶ波長光、放射線、ウイルス、挿入変異誘発要因、不完全ＤＮＡ修復、またはそのような方法の組み合わせによりもたらされる。
【０１２７】
本発明の別の観点は、本発明の抗体の薬学的組成を特徴としている。前記薬学的組成を使用し、患者の疾患、例えば、癌、感染症、または炎症性疾患を治療することができる。
【０１２８】
本発明では、（これに限定されるものではないが）癌、感染症、または炎症性疾患などの疾患を治療するため、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化された、１若しくはそれ以上のＭＡｂｓを有する薬学的組成を提供する。
【０１２９】
予防的応用では、薬学的組成が疾患または病状（例えば、癌、感染症、または炎症性疾患）に罹患しやすいか、そうでない場合はそのリスクがある患者に予防有効量で投与される。リスクがある人には、（これに限定されるものではないが）癌、感染症、または炎症性疾患の家族歴がある人、これまでに癌、感染症、または炎症性疾患の治療を受けたことがある人、および癌、感染症、または炎症性疾患を発症する可能性が上昇していることが示唆される他の臨床徴候を示している人を含む。代わりに述べると、リスクがある人は、癌、感染症、または炎症性疾患を発症するリスクが一般集団よりも高いと考えられる人である。「予防有効量」の用語の意味は、癌、感染症、または炎症性疾患の発症または再発の予防として観察される効果を生じる製剤の量を指す。製剤の予防有効量は、典型的には、活性薬物を含まない第二の製剤を同状況の個人に投与した場合に観察される効果と比べ、認められる効果によって判断される。
【０１３０】
治療的応用では、そのような疾患に罹患していることが疑われるか、すでに罹患している患者に対し、前記疾患発症時の合併症および中間病理学的表現型を含む疾患の症状を（生化学的および／または組織学的に）治癒または少なくとも部分的に停止させるのに十分な治療有効量で組成が投与される。
【０１３１】
予防的および治療的体制のいずれにおいても、通常、十分な反応が得られるまで数回に分けて薬物が投与される。典型的には、前記反応はモニターされ、反応が弱くなり始めた場合は繰り返し投与される。
【０１３２】
本明細書に説明した通り、例えば癌、感染症、または炎症性疾患などの疾患を治療するモノクローナル抗体の有効量は、投与方法、標的部位、前記患者の生理的状態、前記患者がヒトか動物か、他の投与薬物、および投与が予防的か治療的かを含む、様々な多くの要因によって変化する。通常、前記患者はヒトであるが、ヒト以外の哺乳類にも投与可能である。
【０１３３】
用量は、治療される疾患状態の重症度および反応性に依存し、治療コースは数日から数ヵ月、または治癒が達成されるか、疾患状態の軽減が達成されるまで継続される。最適な投与スケジュールは、患者または被験者の身体の薬物蓄積を測定することで計算可能である。当業者は、最適用量、投与法、および繰り返し周期を容易に決定することができる。最適用量は個々の抗体の相対的力価、および併用投与の場合は、疾患の治療に使用される既知薬物の相対的力価によって変化する可能性がある。最適用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルで効果があることが分かっているＥＣ５０ｓに基づき推定することができる。
【０１３４】
一般に、用量は体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇであり、１日、１週、１月、または１年で１回若しくはそれ以上投与することができ、または２〜２０年ごとに１回投与することもできる。投与量と投与頻度は、治療が予防的か治療的かによって変化する可能性がある。予防的応用では、長期間にわたり、比較的低頻度の間隔で、比較的低用量が投与される。患者によっては、残りの生涯治療を受け続ける者もいる。治療的応用では、疾患の進行が軽減または停止するまで、および好ましくは前記患者が疾患症状の部分的または完全な寛解を示すまで、比較的短期間の間隔で比較的高用量が必要となることもある。その後、前記患者は予防的体制で投与することができる。
【０１３５】
個人の必要性は変化する可能性があるが、製剤有効量の最適範囲の決定は当該分野の技術の範囲内とする。ヒトの用量は動物研究から外挿することができる（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，２０ＴＨ  ＥＤ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，２０００）。当業者が調節することのできる製剤有効量を提供するために必要な用量は、年齢、健康状態、身体状態、体重、投与者の疾患または病気の種類および程度、投与頻度、（あれば）併用療法の性質、および望みの効果の性質および範囲によって変化する。
【０１３６】
本発明の薬学的組成は、薬学的に許容される担体とともに製剤化されることもある。適切な薬学的に許容される担体には、水、ＰＢＳ、食塩水（リンガー溶液など）、アルコール、オイル、ゼラチン、およびラクトース、アミロース、またはデンプンなどの炭水化物、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニル・ピロリジンを含む。そのような製剤は滅菌し、望ましい場合は、潤滑剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩、緩衝液、および着色剤などの助剤と混合することができる。本発明での使用に適した薬学的担体は当該分野で既知である（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，２０ＴＨ  ＥＤ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，２０００）。
【０１３７】
単位投与形態で都合よく提示することができる薬学的製剤は、薬学産業で周知の従来の技術により調整可能である。そのような技術には、前記薬学的担体と前記活性成分を結合させる工程を含む。一般に、前記製剤は前記活性成分を液体担体または微粉化した固体担体またはその両方と均一および密接に結合させることで調整される。前記製剤は、例えば密閉されたアンプルおよびバイアルなど、単位用量または複数回用量の容器で提示することができ、使用直前に滅菌液体担体を追加するだけでよい凍結または凍結乾燥された状態で保存できる。
【０１３８】
前記薬学的組成は、滅菌、実質的に等張とし、米国食品医薬品局のすべての医薬品製造管理および品質管理基準（ＧＭＰ）に完全に従い、製剤化される。
【０１３９】
製剤、用量、投与法に関する追加指針が当該分野で利用できる（Ｂｅｒｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＴＨＥ  ＭＥＲＣＫ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＭＥＤＩＣＡＬ  ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ，Ｈｏｍｅ，ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｎ．Ｊ．；Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，ＧＯＯＤＭＡＮ&ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ  ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ，９ｔｈ  ｅｄ．ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｅｂａｄｉ，１９９８，ＣＲＣ  ＤＥＳＫ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ  ＯＦ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．；Ｋａｔｚｕｎｇ，２００１，ＢＡＳＩＣ  &  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ，８ＴＨ  ＥＤ．Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｏｏｋｓ／ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂ．Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓｐｅｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＡＶＥＲＶ’Ｓ  ＤＲＵＧ  ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ：Ａ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＴＨＥ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＣＨＯＩＣＥ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＵＳＥ  ＡＮＤ  ＥＣＯＮＯＭＩＣ  ＶＡＬＵＥ  ＯＦ  ＤＲＵＧＳ  ＩＮ  ＤＩＳＥＡＳＥ  ＭＡＮＡＧＥＭＥＮＴ，４ＴＨ  ＥＤ．Ａｄｉｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ａｕｃｋｌａｎｄ／Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）。
【０１４０】
薬学的治療に用いる場合、本発明の組成は単独で投与するか、癌、感染症、または炎症性疾患の治療に用いられる他の化合物または製剤と併用投与することができる。本明細書では「補助化合物」または「補助組成」と呼ばれるそのような化合物の例には、（これに限定されるものではないが）抗生物質、抗サイトカイン、抗喘息薬、抗ホスホリパーゼ（例えば、ホスホリパーゼ阻害薬）、血管拡張薬（例えば、アデノシン、β−アドレナリン作動薬または拮抗薬、β−アドレナリン遮断薬、α−アドレナリン遮断薬、利尿薬、平滑筋血管拡張薬、硝酸塩、およびアンギオテンシン変換酵素阻害薬）、生体分子、細胞増殖抑制剤、および化学療法薬を含む。本発明の薬学的組成は、例えば、１若しくはそれ以上の補助化合物を有することができる。一部の実施形態では、前記抗体が前記補助化合物と結合される。
【０１４１】
本発明のさらに別の観点では、例えば癌、感染症、または炎症性疾患治療用のキットが提供される。
【０１４２】
本発明のキットは、本発明の抗体または抗体組成、および患者の癌、感染症、または炎症性疾患を治療する方法において前記キットを使用するか、標的抗原（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）の生物活性を阻害するための使用説明書を有する。前記キットは、少なくとも１つの補助化合物を有することができる。前記キットは、前記抗体または抗体組成を、例えば注射により投与するための使用説明書および／または手段を有することもある。
【０１４３】
本発明の抗体を使用し、血液血清など（これに限定されるものではないが）生物サンプル中の抗原を検出することができる。フローサイトメトリーなど（これに限定されるものではないが）、当該分野で既知のいかなる方法も利用することができる。例えば、本発明の抗体と生物サンプルをインキュベートした後、洗浄し、標識した二次抗体とインキュベートすることができる。例えば、前記二次抗体を軽鎖に向かわせ、検出用ＦＲＴＣまたはフィコエリトリンに結合させることができる。
【０１４４】
本発明の抗体の活性を中和する抗原は、当該分野で既知のいかなる方法によっても、抗原中和アッセイで検査することができる。例えば、前記抗体の中和活性は、抗原依存性の細胞株により評価することができる。ＧＭ−ＣＳＦ依存性細胞株の例には、（これに限定されるものではないが）ＴＦ−１およびＡＭＬ−１９３を含む。
【０１４５】
最初の抗原中和アッセイでは、抗原依存性細胞を被験抗体またはアイソタイプの対照抗体と１時間プレインキュベートしたアッセイ培地、アッセイ培地、抗原、または抗原に懸濁する。前記インキュベーション期間後、当該分野で既知のいかなる方法によっても、増殖抑制が評価される。例えば、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州）を添加した後、さらにインキュベートし、分光光度計で４９０ｎｍの光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を測定し、サンプルから培地のバックグラウンドを差し引くことができる。抗原中和の割合は１００−［Ｏ．Ｄ．（Ｉｇあり）／Ｏ．Ｄ．（Ｉｇなし））ｘ１００］から計算される。
【０１４６】
別の中和アッセイでは、抗原を本発明の抗抗原抗体と混合する。抗原依存性細胞を前記混合物に添加した後、インキュベートする。このインキュベーション期間後、増殖阻害を測定する。例えば、前記ＤＮＡ増殖マーカーのＭＴＳを追加した後、色素の取り込みを測定することができる。前記抗抗原抗体存在下と比較した抗体存在下での色素取り込みの減少は、抗原が中和されたことを示している。
【０１４７】
代わりに、抗原存在下で抗原依存性細胞を増殖させた後、培地に増量した抗体を追加し、前述の通り中和活性を測定する。
【０１４８】
本発明の治療法には、例えばＧＭ−ＣＳＦなど標的抗原の生物活性を抑制する方法、および本発明の抗体の薬学的組成を、それを必要とする患者または被験者に投与することで、癌、感染症、または炎症性疾患など（これに限定されるものではないが）の疾患を治療する方法を含む。ＧＭ−ＣＳＦの生物活性には、（これに限定されるものではないが）ＧＭ−ＣＳＦ受容体への結合を含む。前記方法を利用し、例えば、癌、感染症、または炎症性疾患など（これに限定されるものではないが）の疾患の予防的または治療的投与を行うことができる。
【０１４９】
本発明の治療的方法は、ヒトおよび非ヒト動物での使用に適している。本発明の利益を受ける非ヒト動物には、ペット、外国産（例えば、動物園の動物）および国産家畜を含む。好ましくは、前記非ヒト動物は哺乳類である。
【０１５０】
本発明で使用される抗体は、カプセル、錠剤、水性懸濁液、溶液など、許容される剤形であれば経口投与することができる。前記抗体は非経口投与することもできる。その場合、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、鼻腔内、局所、くも膜下腔内、肝内、病巣内、および頭蓋内注射または注入法の投与経路とする。前記抗体は、筋肉内または静脈内注射として提供される。
【０１５１】
本発明の抗体は、単独、または許容されるアジュバント、賦形剤、および添加物を含む、薬学的に許容される担体との併用で投与することができる。
【０１５２】
本発明の抗体は、別の治療薬の前、後、または同時に投与することができる。例えば、本発明の抗体は、単独投与、または補助化合物と併用投与することができる。
【０１５３】
本発明の抗体は、非結合型または結合型抗体の均一混合物として、または非結合型または結合型抗体の不均一混合物として投与することができる。
【０１５４】
治療が有効であるかについては、様々な方法で評価することができる。１つの実施形態では、癌、感染症、または炎症性疾患の治療が有効であることが、疾患の進行が遅くなったことで判断される。さらに他の実施形態では、体重増加、体力回復、疼痛軽減、成長、および健康回復に関する前記患者からの主観的指標などの徴候を含む、前記患者の幸福（ｗｅｌｌ−ｂｅｉｎｇ）向上により、治療が有効であると測定される。
【０１５５】
以下の例は、より詳細に本発明を説明するために提供される。これらは本発明を図示するためのものであるが、制限する意図はない。
【実施例１】
【０１５６】
ＧＭ−ＣＳＦに対する抗原特異的ヒトＭＡｂｓの作成
材料と方法
ヒトＢ細胞、ｅｘ  ｖｉｖｏでの免疫化、および細胞培養。以下のすべての手順において、３７℃、５％ＣＯ２中で細胞を増殖した。破傷風トキソイド（ＴＴ）ワクチンを接種した健常人からｌｅｕｋｏｐａｃｋｓを得た。ＰＢＭＣｓはＦｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）により精製し、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞はＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）ヒトＣＤ４およびＣＤ１９選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりそれぞれＰＢＭＣｓから単離し、混合してＢ細胞／Ｔ細胞プール（ＢＴ４細胞）を作成した。ＢＴ４細胞は、１０％熱不活性ヒト血清ＡＢ（Ｎａｂｉ、フロリダ州）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５５μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州）を含むＲＰＭＩ１６４０完全培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州）で培養した。
【０１５７】
ｅｘ  ｖｉｖｏでの免疫化については、ＢＴ４細胞をＴおよびＢ細胞エピトープ存在下で共培養した。簡単には、ＢＴ４細胞を、１：１の比で照射自己ＰＢＭＣｓ存在下、破傷風トキソイド（ＴＴ）１Ｌｆ／ｍＬを含むＲＰＭＩ完全培地（Ｃｙｌｅｘ、メリーランド州）に１０６／ｍＬの密度で播種し、活性化Ｔ細胞（Ｔプール）を作成した。抗原活性化Ｂ細胞（Ｂプール）を作成するには、１０％ヒト血清ＡＢを含む完全ＲＰＭＩ、活性化Ｔ細胞、２０Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２、０．５ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−６、１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−１０（ＰｒｅｐｏＴｅｃｈ、ニュージャージー州）、および２５０ｎｇ／ｍＬのペプチド混合物（ｂｉｏ−Ｗｏｒｌｄ、オハイオ州）から作成した５％ならし培地中、３ｘ１０６細胞／ｍＬの密度でＢＴ４を播種し、これは前述の通りＴおよびＢ細胞エピトープを含むように合成された標的抗原の様々な領域を示した（Ｚａｆｉｒｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００：１８１−９０）。
【０１５８】
ＧＭ−ＣＳＦで選択されたＢ細胞エピトープは、ＥＨＶＮＡＩＱＥＡＲＲＬＬＮＬ（配列ＩＤ番号３）、ＳＴＱＰＷＥＨＶＮＡＩＱＥＡＲ（配列ＩＤ番号４）、ＭＡＳＨＹＫＱＨＣＰＰＴＰＥＴ（配列ＩＤ番号５）であった。
【０１５９】
ＴおよびＢプールは７日間別に培養した後、照射ＣＨＯ支持細胞の単層で、１０％熱不活性ヒトＡＢ血清および４００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−４を含むＲＰＭＩ完全培地中（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ニュージャージー州）、それぞれ１：１０の比で共培養した（１０６細胞／ｍＬ）。５日後、共培養したＴおよびＢプールを融合し、説明した通りハイブリドーマを作成した。
【０１６０】
肺胞タンパク症（ＰＡＰ）患者のＢ細胞を不死化するには、１００ｍＬの全血を処理し、ＰＢＭＣｓを精製した。照射ＣＨＯ支持細胞存在下、熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カンサス州）、２ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ニュージャージー州）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５５μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州）、５０μｇ／ｍＬトランスフェリン、５ｎｇ／ｍＬホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）、および０．５μｇ／ｍＬシクロスポリンＡ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州）を含むＲＰＭＩ完全培地中、７〜１０日間リンパ球を培養した。次に、以下に説明する通り、リンパ球を電気融合した。
【０１６１】
抗原反応性ハイブリドーマの細胞融合および酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）スクリーニング。ヒトへの投与を目的として設計されたＭａｂｓの生成に使用されるヒトＢ細胞は、ウイルス伝播が可能な媒体とすることができる。融合の相手となる細胞および健常ドナーのＰＢＭＣｓを事前にスクリーニングし、ＰＣＲにより、免疫不全−１および２ウイルス、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペス−６ウイルス、およびエプスタインバーウイルスを含むウイルスＤＮＡがないことを確認した。Ｋ６Ｈ６／Ｂ５比に対してリンパ球を１：１とし、ＣＹＴＯＰＵＬＳＥ  ＣＥＥＦ−５０装置（Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、メリーランド州）を用い、リンパ球をＫ６Ｈ６／Ｂ５細胞（ＡＴＣＣ、バージニア州）と融合した。
【０１６２】
融合後、１０％熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５５μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州）、１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、および１６μＭチミジン（ＨＡＴ、Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州）を含むＲＰＭＩ完全培地中、約５，０００細胞／ウェルで平底９６ウェルマイクロプレートに細胞を播種した。培地は毎週交換し、抗原反応スクリーニングが終了するまで（３〜５週間）ＨＡＴ選択を継続した。
【０１６３】
抗原反応性ＭＡｂｓの同定では、プレートウォッシャーおよび分光光時計一体型ＢＩＯＭＥＫ  ＦＸ液体分注装置を用い、ＥＬＩＳＡによるスクリーニングをロボット制御で行った。簡単には、コーティングバッファー（５０ｍＭ炭酸塩−重炭酸塩、ｐＨ９．４）に希釈した自社作成組み換え抗原（１μｇ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦ）５０μＬ／ウェルを用い、マイクロタイタープレートを室温で６時間コーティングした。次に、室温で２時間、プレートを結合バッファー（１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州）を含むＰＢＳ）でブロッキングした。プレートを洗浄用バッファー（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ）で洗い、５０μＬ／ウェルのハイブリドーマ上清を前記ＥＬＩＳＡプレートに移した。結合反応は室温で２時間行った。その後、プレートを４回洗い、結合バッファーに１：１０，０００で希釈した１００μＬの西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋Ｍ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ペンシルバニア州）を添加し、室温で１．５時間反応を行った。最後に、プレートを４回洗い、１００μＬ／ウェルのＳｕｒｅＢｌｕｅ基質（ＫＰＬ、メリーランド州）を１０分間加えた。５０μＬ／ウェルの１Ｎ硫酸を加えて反応を停止し、４５０ｎｍで吸光度を決定した。
【０１６４】
蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）による分析。Ｉｇ結合および細胞洗浄の工程はカルシウムまたはマグネシウムを含まない氷冷した結合バッファー（ＤＰＢＳ）（０．５％  ＢＳＡ）を用いて行い、Ｖ底マイクロプレートに反応をセットし、ＦＡＣＳＡｒｉａ装置（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州）によりサンプルを分析した。図３Ａに示すＦＡＣＳ実験では、１０６個のマウス抗ＧＭ−ＣＳＦハイブリドーマ細胞（Ｍｕｌ１９／２）を１００ｎｇ／反応のＧＭ−ＣＳＦで充填した後、抗ＧＭ−ＣＳＦヒトＭＡｂ  Ｅ５でインキュベートした。ＧＭ−ＣＳＦ特異的ＭＡｂｓの結合は１０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、アラバマ州）により検出した。図３Ｂに示すＦＡＣＳ実験では、Ｅ１０ハイブリドーマ細胞を洗い、９０μＬの用量、５００，０００細胞／ウェルで播種した。次に１０μＬのフィコエリトリン（ＰＥ）標識ＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、ミネソタ州）を各ウェルに加え、細胞を氷上で１時間インキュベートした。非標識ＧＭ−ＣＳＦの競合については、前記ハイブリドーマ細胞を５μｇ／ｍＬ組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ニュージャージー州）とともに室温で１時間プレインキュベートし、３回洗った後、分析前に上述の通りＰＥ−ＧＭ−ＣＳＦとインキュベートした。図４に示すＦＡＣＳ実験では、Ａ４３１およびＡ４３１−Ｋ５細胞（米国国立癌研究所Ｉｒａ  Ｐａｓｔａｎ博士の寄贈）を結合バッファーで希釈した１０μｇ／ｍＬのＣ１２  ＭＡｂまたは正常ヒトＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ペンシルバニア州）で染色し、上述の通り反応を行った。
【０１６５】
ＧＭ−ＣＳＦ中和バイオアッセイ。ＧＭ−ＣＳＦ依存性ヒト赤白血病細胞株のＴＦ−１（ＡＴＣＣ、バージニア州）は、１０ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ニュージャージー州）を含むＲＰＭＩ  １６４０完全培地（上記参照）で増殖した。実験前日、ＴＦ−１細胞をＧＭ−ＣＳＦのない０．１％  ＦＢＳで増殖した。飢餓細胞を２回洗い、アッセイ培地に再懸濁し、１０，０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルマイクロプレートに播種した。ウェルには、１００ｐｇ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦ、または図の説明に示した濃度で被験Ｉｇまたはアイソタイプの対照Ｉｇを１時間プレインキュベートしたＧＭ−ＣＳＦのいずれかのアッセイ培地を含めた。３日後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州）４０μＬを各ウェルに追加し、プレートをさらに３７℃で１時間インキュベートした。分光光時計にて４９０ｎｍの光学密度（Ｏ．Ｄ．）を測定し、培地のバックグラウンドをすべてのサンプルから差し引いた。ＧＭ−ＣＳＦ中和の割合は１００−［Ｏ．Ｄ．（Ｉｇあり）／Ｏ．Ｄ．（Ｉｇなし））ｘ１００］から計算した。
【０１６６】
抗体クラススイッチ。ハイブリドーマ細胞を１回１０ｍＬのＰＢＳで洗い、ＲＰＭＩ完全培地に再懸濁し、平底９６ウェルマイクロプレートに播種し、３７℃で５％  ＣＯ２中、インキュベートした。４日後、細胞をピペット操作により再懸濁し、１００μＬを２．３μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ペンシルバニア州）でコーティングした２０  ＥＬＩＳＰＯＴプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州）に移した。組織プレートの残りの細胞に１００μＬの追加ＲＰＭＩ完全培地を加えた。一晩インキュベートした後、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで３回洗い、次に１００μＬの２μｇ／ｍＬヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰを加え、前記プレートを１時間室温で振盪しながらインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗い、次に１００μＬのＡＥＣ基質溶液（Ｓｉｇｍａ、ミズーリー州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）をウェルに加え、振盪しながら室温で９０分インキュベートした。基質を吸引し、プレートをｄＨ２０で洗い、風乾させた。（ＩｇＧ産生を示した）陽性スポットを示すウェルのクローンを増殖させた。１０００、１００、１０、および０．２５細胞／ウェルで陽性クローンを再播種することで前記工程を連続して繰り返し、この間、ＩｇＧを分泌する単一細胞のコロニーが同定されるまで陽性ウェルを追跡した。
【０１６７】
中空繊維および攪拌式バイオリアクターを用いた発酵。１Ｌ  ＨｙＱＣＤＭ４ＮＳ０無血清培地（ＨｙＣｌｏｎｅ、ユタ州）を含む２Ｌのバイオリアクター（Ｂ  Ｂｒａｕｎ  Ｓｔａｔ  Ｂ−ＤＵ）に２．５×１０５／ｍＬで細胞を播種し、グルコースとグルタミンをそれぞれ６ｇ／Ｌおよび４ｍＭで維持した。制御した設定ポイントは、ｐＨ  ７．１、空気と飽和度４０％のｄＯ２、温度３７℃、および攪拌速度８０ｒｐｍであった。２ｍＬのサンプルを毎日回収し、１ｍＬはＣｅｄｅｘ装置を用いた細胞計数に、１ｍＬはＥＬＩＳＡによりＩｇ濃度を測定するために用いた。中空繊維を走らせる場合は、１０８個の生存細胞を１５ｍＬのＲＰＭＩ完全培地を含むＦｉｂｅｒＣｅｌｌ系（Ｂｅｌｌｃｏ、ニュージャージー州）に播種し、５０％のグルコースが消費された段階で、１Ｌの新鮮培地を含む直列容器を用い、再供給した。
【０１６８】
ハイブリドーマ株の遺伝的多様性を増加させるミスマッチ修復の阻害。ハイブリドーマ細胞は、ＲＰＭＩ完全培地（ネガティブコントロール）または２５０μＭまたは５００μＭのＭＭＲ阻害アントラセン化合物を含むＲＰＭＩ完全培地で増殖させた。ｍｏｒｐｈｏｃｅｎｅを用いた場合と用いない場合で、３〜４日ごとに１：５希釈で細胞を新鮮培地に通し、３週間後、細胞を収集し、ＦＡＣＳバッファー（１％  ＢＳＡを用いたＰＢＳ）に２×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。細胞は、３０分間氷上で、１０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）により染色した。細胞は１０ｍＬの氷冷ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、３ｍＬのＦＡＣＳに再懸濁した。１０μＬ  Ｖｉａｐｒｏｂｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）を５分間にわたり氷上で追加し、Ｉｇ表面染色が強い生存細胞をＦＡＣＳＡｒｉａセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で選別した。ゲートはＩｇ表面染色が最も強い亜集団５％となる細胞を選別するように設定した。力価が高いクローンを選択するため、ＦＡＣＳで選別した細胞をＵ底９６ウェルプレートに播種し、１週間３７℃で５％  ＣＯ２中インキュベートした。５０μＬの上清をウェルから採取し、ヤギ抗ヒトＩｇＭ＋Ｇコーティングプレートを用いたＥＬＩＳＡにより、ＩｇＭ産生を分析した。内部標準として、各ＥＬＩＳＡプレートにつき３ウェルに、５０μＬの１０ｎｇ／ｍＬヒトＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を播種した。内部標準のウェルの平均値に対して、４５０ｎｍで得られたＯ．Ｄ．値を正規化した。高ＩｇＭシグナルを示すウェルを増殖し、さらに分析した。マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）分析では、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、親細胞またはｍｏｒｐｈｏｃｅｎｅ処理細胞からＤＮＡを抽出した。Ｄ４蛍光標識ＢＡＴ−２６−Ｆ（５’−ｔｃａｃｃａｔｃｃａｔｔｇｃａｃａｇｔｔ−３’）（配列ＩＤ番号２０）およびＢＡＴ−２６−Ｒ（５’−ｃｔｇｃｇａｇａａｇｇｔａｃｔｃａｃｃｃ−３’）（配列ＩＤ番号２１）プライマー、ｐｆｕＵｌｔｒａ（商標）高性能ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州）を用いてＢＡＴポリＡ繰り返しマーカー（７）を増幅し、反応は以下の通りインキュベートした：９５℃５分とし；９４℃１分、６０℃１分、および７２℃２分を９サイクルとし、アニーリング温度を各サイクル１℃ずつ低下させ；９４℃１分、５２℃１分、７２℃２分を３０サイクルとし；最終増殖７２℃１０分とした。ＤＮＡ希釈によりマーカー対立遺伝子の単一コピーを得、前記ＰＣＲ反応の５０％のみで単位複製配列が得られた。ＰＣＲ産物をＣＥＱサンプル充填溶液で１：１０に希釈した後、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣＥＱ  ８０００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍに装填し、フラグメントを分析した。
【０１６９】
抗原特異的ヒトＭＡｂｓの作成。上述の通り、ボランティア被験者（健常ドナー）から入手した冷凍保存Ｂ細胞を用い、ｅｘ  ｖｉｖｏでの免疫化を行った。もう一つの方法として、血清に対象抗原に特異的なＭＡｂｓを高力価で含むヒト被験者から、Ｂ細胞を入手した。後者のアプローチの理論的根拠は、一部の抗原特異的ＭＡｂｓは異常な免疫反応により生じるか（自己免疫疾患患者の場合など）、腫瘍、微生物、またはワクチン抗原に対するｉｎ  ｖｉｖｏ免疫反応に由来するという可能性に端を発している。
【０１７０】
いくつかの抗原反応性ヒトＭＡｂｓは、ｅｘ  ｖｉｖｏ免疫化細胞の融合後に、ＰＡＰ患者のＢ細胞から作成されたハイブリドーマライブラリから同定された。さらに研究するために４種類のハイブリドーマ株Ｅ５（ＩｇＭ）、Ｇ７（ＩｇＭ）、Ｅ１０（ＩｇＧ）、およびＧ９（ＩｇＧ）が選択され、これらが産生するヒトＭＡｂｓの特異性がＥＬＩＳＡにより検討された。図１は、Ｅ５、Ｇ７、およびＥ１０ヒトＭＡｂｓはヒトＧＭ−ＣＳＦとしか反応せず、マウスＧＭ−ＣＳＦなど、ヒト相同体と５３％同一であるが、関連性のない、他に検討された抗原１０種類とは反応しなかった。同様の結果がＧ９ハイブリドーマでも得られた。ＦＡＣＳ分析を行い、これらのヒトＭＡｂｓの特異性が確認された。ヒトＧＭ−ＣＳＦは、異なるエピトープでヒトＧＭ−ＣＳＦに特異性を示す膜結合型ＭＡｂｓを発現するマウスハイブリドーマ細胞表面に結合するようにした。蛍光強度のシフトで示される通り、Ｅ５  ＭＡｂはこれらの条件で上記細胞表面に結合した（図２Ａ、下図）。この結果は、Ｅ５  ＭＡｂが天然型ヒトＧＭ−ＣＳＦに結合できることを証明している。細胞結合ＧＭ−ＣＳＦがない場合、Ｅ５  ＭＡｂはこれらのハイブリドーマ細胞に発現された膜結合型タンパク質のいずれとも交差反応を示さなかった（図２Ａ、中図）。同様に、Ｅ１０  ＭＡｂはＦＡＣＳ分析により高い特異性が示された。さらに、Ｅ１０  ＭＡｂは前記ハイブリドーマ細胞の膜に結合することが分かったため、ＦＡＣＳでＥ１０  ＭＡｂが可溶性のフィコエリトリン（ＰＥ）標識ＧＭ−ＣＳＦに結合できることが示された（図２Ｂ、中図）。結合特異性は、前記Ｅ１０ハイブリドーマ細胞と過剰な非標識ＧＭ−ＣＳＦをプレインキュベートすることで証明された（図２Ｂ、下図）。
【０１７１】
ヒトＭＡｂｓのデノボクラススイッチ。上述の２種類の戦略により、様々なヒトおよび非ヒト抗原に対するＩｇＧおよびＩｇＭヒトＭＡｂｓを作成した。市場で最も治療に用いられる抗体はＩｇＧのアイソタイプであるが、治療に用いられる可能性のあるＩｇＭ  ＭＡｂｓを検討する癌試験は、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍が退行することを示していた（１６，１７）。これらの臨床反応は、補体経路を強力に固定、活性化し、腫瘍細胞を効果的に殺すＩｇＭの能力に起因する可能性がある。ＩｇＧはマクロファージおよびＮＫ細胞のＦｃ受容体に結合するため、腫瘍細胞に対するＡＤＣＣ活性を媒介する可能性がある。特異性が同じ（同じ抗原およびエピトープ）ＩｇＧおよびＩｇＭ両方の最高薬理活性を、ｉｎ  ｖｉｖｏで検討することができる。ＩｇＧアイソタイプが好ましい場合、迅速で着実なＩｇＭのデノボクラススイッチ法（材料および方法）を追跡した。例としてＥ５株を用い、前記増殖条件でＩｇＧアイソタイプにクラススイッチした細胞サブセットを同定した。Ｅ５  ＩｇＧは、親Ｅ５  ＩｇＭと可変領域のヌクレオチド配列が同一で、ＧＭ−ＣＳＦに対する反応性が同等であることが示された（図３）。
【０１７２】
ヒトＭＡｂｓの生物活性。疾患の可溶性メディエータを標的とする治療用ＭＡｂｓに求められる薬学的特性には、増殖因子を中和する能力を含む。上述の通り、そのような例の１つはＲＡメディエータのＧＭ−ＣＳＦである（９−１１）。ヒト赤芽球様細胞（ＴＦ１）の増殖が培地中のこのサイトカインの有無に依存する、細胞に基づくアッセイにより、ヒトＭＡｂｓがＧＭ−ＣＳＦの機能を遮断する能力を評価した。図４に示す通り、Ｅ１０およびＧ９はいずれもＧＭ−ＣＳＦ依存性細胞の増殖を有意に阻害したが、ヒトＩｇＧアイソタイプの対照は作用を示さなかった。Ｅ１０とＧ９の間にみられる効果の差は、見かけの親和性がそれぞれ８７０ピコモルと１４ピコモルであることに関連している。Ｅ５  ＭＡｂは親和性が低いことと一致し、中和活性が最小限であることしか示されなかった（５ｎＭ）。
【０１７３】
ヒトＭＡｂｓを分泌するハイブリドーマの力価および安定性の評価。ＭＡｂ製造ラインの重要な特性は、製造サイクル全体でのＩｇ分泌の安定性である。サイクルの期間が約２ヵ月である１つのシナリオでは、２４時間ごとに２倍になるラインは、解凍から回収まで約６０世代進むことになる。Ｅ５株を、我々の方法により作成したハイブリドーマのＭＡｂ力価および生産安定性を検証するためのモデルとして用いた。この株に由来するクローン３Ｄ２は倍加時間が２４時間であることが示され、２ヵ月以上の連続培養後の希釈を制限し、再評価した。クローン産生の頻度はＥＬＩＳＡにより決定し、細胞密度を正規化したならし培地のＩｇ濃度を測定した。図５Ａは、検討したすべてのＥ５−３Ｄ２サブクローンが高レベルのＩｇを分泌することを示しており、６０世代後のこの細胞集団でＩｇ産生が均一に維持されていることを証明している。次に、少量（１５ｍＬ）の中空繊維系を用い、Ｉｇ産生を評価した。中空繊維カートリッジに細胞を播種し、新鮮培地１リットルを含む直列容器を用いて連続的に供給した。５日目から、前記カートリッジのならし培地すべて（１５ｍＬ）を毎日回収し、新鮮培地と交換した。さらに４日発酵させ、この間、既知の濃度の標準Ｉｇを用い、毎日Ｉｇ力価をＥＬＩＳＡにより決定した。４日間で累積１．２ｇ／Ｌの力価が記録された。８〜９日目の間にグルコース消費量がピークとなり（１日２グラム／Ｌ）、細胞は非常に高い細胞密度でも十分耐性があることを示していた。生産の性能は、攪拌したバイオリアクター系を用い、１リットルの量の半回分培養実験でも評価した。凍結したアンプルの細胞はまず解凍し、振盪フラスコに播種した後、無血清培地１リットルを含む攪拌したバイオリアクター（Ｂａｕｅｒ）に播種した。細胞生存度が６０％未満に低下するまで（６日目）発酵させた。Ｉｇ産生および細胞密度は１〜５日目に記録し、図５Ｂに示されている。対数期（１〜４日目）は、倍加時間２３．４時間で比産生率（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）は２４ｐｇ／細胞／日と測定され、これらの細胞は高い力価を維持したまま、フラスコからバイオリアクターに良好にスケールアップできることが示唆された。
【０１７４】
ミスマッチ修復の制御によるヒトＭＡｂｓ分泌ハイブリドーマの遺伝子最適化。ＭＭＲを一時的に制御する形態形成と呼ばれる工程により、ＭＡｂ産生細胞株の質を改善することの有用性はこれまでに報告されてきた（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３０：１９５−２０６；およびＮｉｃｏｌａｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−４１．）。この方法により細胞プールの遺伝的多様性を増加させた後、高性能スクリーニングを行い、高い力価、親和性を示すサブクローン（Ｇｒａｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔ．２：５８−６４；およびＮｉｃｏｌａｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０５９：１−１１）、または増殖率が上昇したサブクローン（Ｇｒａｓｓｏ，Ｌ．、個人的所見）を同定したＥ５細胞を形態形成させ、我々のハイブリドーマ法により作成したＭＡｂ分泌株で表現型の多様性を増加できることが証明された。ＭＭＲ阻害は、ＢＡＴ  ｐｏｌｙ−Ａ繰り返しマーカーのマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を検出することでモニターした。前記形態形成の工程を行った細胞で分析したＢＡＴ対立遺伝子２４個のうち、３対立遺伝子が変化を示し、これには図６Ａで示す一塩基欠失および挿入が含まれていた。親細胞のＢＡＴ対立遺伝子２４個では、ＭＳＩは検出されなかった。その後、希釈を制限し、親細胞または形態形成処理した細胞をマイクロプレートに播種した。細胞クローンに１週間ＭＡｂｓを分泌させ、ＥＬＩＳＡによりそのならし培地のＩｇ濃度を分析した。Ｏ．Ｄ．が１以上の（Ｉｇ分泌が多い）クローンの頻度をスクリーニングしたクローン総数から決定し（親細胞で３，７６３、ｍｏｒｐｈｏｃｅｎｅプールで２，４３７）、前記形態形成処理細胞では２６０％上昇することが分かった（ｐ＝０．００１４）（図６Ｂ）。
【０１７５】
要約
本研究は、最適化されたｅｘ  ｖｉｖｏでの免疫化およびヒトＢ細胞の不死化工程とミスマッチ修復の阻害を併用し、免疫療法用にヒトＭＡｂｓを開発するため実行可能な戦略を示している。このアプローチにより、安定したハイブリドーマ株により分泌される、非常に特異性の高く生物学的に活性なＭＡｂｓを作成することができる。
【０１７６】
本発明の方法に従い、倍加６０回以上にわたり安定なＭＡｂ、および４日間の中空繊維発酵実験で１リットルあたりＭＡｂ  １グラム以上を産生することができ、本発明で作成したハイブリドーマ細胞は灌流系、および可能性としては大量製造に適していることが示唆された。さらに、この工程で作成したハイブリドーマは半回分培養バイオリアクター実験でも優れた性能を示し、これらの株を商業的に応用できる可能性が示唆された。まとめると、本明細書に示した基盤となる工程は、免疫療法に用いる高品質の完全ヒト抗体を、迅速かつ高い費用対効果で開発するもう一つのアプローチを提供している。
【実施例２】
【０１７７】
完全ヒト抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の作成；ＰＡＰ細胞の単離
成人ヒト肺胞タンパク症（ＰＡＰ）患者は、肺胞にリン脂質およびサーファクタントタンパク質が蓄積する。ＰＡＰは肺胞マクロファージおよびＩＩ型上皮細胞が過剰な界面活性物質を除去できないことが原因と考えられてきた。上述の通り、肺の界面活性物質の恒常性制御におけるＧＭ−ＣＳＦの役割はマウスモデルで確立され、拡大解釈すればヒトの病理の原因となる。さらに、ＰＡＰ患者は循環血液中に抗ＧＭ−ＣＳＦ中和抗体を有することが示され、そのためこのサイトカインが前記疾患の原因であると考えられてきた。この自己免疫反応がＧＭ−ＣＳＦに特異的なものか否かは分かっていない。しかし、ＰＡＰ患者の一部はＧＭ−ＣＳＦ療法で改善することが示されており、遺伝子破壊または抗体による中和からＧＭ−ＣＳＦがなくなると、ＰＡＰが発症するという仮説を支持している。
【０１７８】
ＧＭ−ＣＳＦ特異的抗体の単離。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）をＰＡＰ患者から単離した。簡単には、前記ＰＡＰ患者のＢ細胞を全血から回収した。前記全血を当量のＰＢＳ−／−で希釈し、容器を逆さにして内容物を静かに混和した。２５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、スウェーデンＵｐｐｓａｌａ）を含む５０ｍｌ試験管に、２５ｍｌの希釈した血液を上から注いだ。前記試験管を室温で３０分間２，０００ｒｐｍで遠心分離した。界面層から１０ｍｌピペットでＰＢＭＣｓを回収し、新しい５０ｍｌ試験管に移し、ＰＢＳ−／−で２回洗った。前記ＰＢＭＣのペレットを１０ｍｌのＡＣＫ溶解バッファー（１５０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．２）に再懸濁し、室温で５分間インキュベート、赤血球を溶解し、ＰＢＳ−／−で２回洗った。
【０１７９】
ＰＡＰ  Ｂ細胞と骨髄腫細胞株を融合し、ハイブリドーマを作成。以下の方法により、ＰＡＰ患者の濃縮Ｂ細胞を様々な骨髄腫細胞（ヒト−マウスヘテロハイブリドーマ、ＡＴＣＣ、ＶＡ、ＵＳＡ）；ＣＢＦ−７細胞（ヒト−マウスヘテロハイブリドーマ）；ＨＥＫ２９３；ヒト骨髄腫細胞と融合した。前記Ｂ細胞と融合の相手となる細胞は生存度が良好であると考えられた（生存度９０％以上、対数期）。いずれの細胞タイプも最初の培地中で計数し、１：１の比で１５ｍｌ試験管に混合した後、４℃で６分間、１，０００ＲＰＭで遠心分離した。１０〜１５ｍｌの冷却ＣＰＦＭ（ＣＹＴＯＰＵＬＳＥ融合培地、Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国メリーランド州）を用い、細胞を３回洗浄した。最終的なペレットを１０×１０６細胞／ｍｌのＣＰＦＭで再懸濁した。ＣＹＴＯＰＵＬＳＥ  ＣＥＥＦ−５０（Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国メリーランド州）により、電気融合を行った。融合パラメータは製造業者のガイドラインおよび経験的ガイドラインにより最適化し、融合効率の平均はパルスした細胞５，０００個あたりハイブリッド１個であった。融合後、平底９６ウェルのマイクロプレートに１０％の熱不活性化ＦＢＳ、１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、および１６μＭのチミジンを含むＲＰＭＩ完全培地（ＨＡＴ、Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリー州）を入れ、約５，０００細胞／ウェルで細胞を播種した。培地は毎週交換し、抗原の反応が終了するまでＨＡＴ選択を継続した。
【０１８０】
ＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイ。抗原反応性ＭＡｂｓの同定では、プレートウォッシャーおよび分光光時計一体型ＢＩＯＭＥＫ  ＦＸ液体分注装置を用い、ＥＬＩＳＡによるスクリーニングをロボット制御で行った。簡単には、コーティングバッファー（５０ｍＭ炭酸塩−重炭酸塩、ｐＨ  ９．４）に希釈した自社作成組み換え抗原（１μｇ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦ）５０μＬ／ウェルを用い、マイクロタイタープレートを室温で６時間コーティングした。次に、室温で２時間、プレートを結合バッファー（３％  ＢＳＡ（ミズーリー州Ｓｉｇｍａ）および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（カリフォルニア州ＢｉｏＲａｄ）を含むＰＢＳ）でブロッキングした。プレートを洗浄用バッファー（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ）で洗い、５０μＬ／ウェルのハイブリドーマ上清を前記ＥＬＩＳＡプレートに移した。結合反応は室温で２時間行った。その後、プレートを４回洗い、結合バッファーに１：１０，０００で希釈した１００μＬのＨＲＰ−結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋Ｍ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ペンシルバニア州）を添加し、室温で１．５時間反応を行った。最後に、プレートを４回洗い、１００μＬ／ウェルのＳＵＲＥＢＬＵＥ基質（ＫＰＬ、メリーランド州）を１０分間加えた。５０μＬ／ウェルの１Ｎ硫酸を加えて反応を停止し、４５０ｎｍで吸光度を決定した。
【０１８１】
ＦＡＣＳ分析およびソーティング。すべての研究で、氷冷した結合バッファー（ＤＰＢＳ、カルシウムまたはマグネシウムなし、０．５％  ＢＳＡ）を用い、Ｉｇの結合工程および細胞洗浄工程を行った。前記ＰＢＭＣまたはハイブリドーマ細胞は洗浄し、５００，０００細胞／ウェルで播種した。ＦＩＴＣおよびフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ヒトＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、アラバマ州）、およびＰＥ標識ＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、ミネソタ州）を加え（１０〜１００倍希釈）、氷上で１時間インキュベートした。前記細胞を結合バッファーで３回洗浄し、ＦＡＣＳＡＲＩＡ装置（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州）により分析、分類した。Ｍａｂ  Ｅ１０のアイソタイプ分析の結果を図９に示す。Ｅ１０のアイソタイプを決定するため、抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、Ｌκ、およびＬλ  Ｆｃ特異的抗体を用いた標準的な分析を行い、前記アイソタイプを導き出した。
【０１８２】
ＧＭ−ＣＳＦ中和バイオアッセイ。ヒトＧＭ−ＣＳＦ依存性ヒト赤白血病細胞株のＴＦ−１（ＡＴＣＣ、バージニア州）は、１０ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ニュージャージー州）を含むＲＰＭＩ  １６４０完全培地（上記参照）で増殖した。実験前日、ＴＦ−１細胞をＧＭ−ＣＳＦのない０．５％  ＦＢＳで増殖した。飢餓培養した前記ＴＦ−１細胞を回収し、アッセイ培地（０．５％  ＢＳＡを含むＲＰＭＩ単純培地）で２回洗った。細胞をアッセイ培地に再懸濁し、１０，０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルマイクロプレートに播種した。ウェルには、１００ｐｇ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦ、または図に示した濃度で被験Ｉｇまたはアイソタイプの対照Ｉｇを１時間プレインキュベートしたＧＭ−ＣＳＦのいずれかのアッセイ培地を含めた。３日後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州）４０μＬを各ウェルに追加し、プレートをさらに３７℃で１時間インキュベートした。分光光時計にて４９０ｎｍの光学密度（Ｏ．Ｄ．）を測定し、培地のバックグラウンドをすべてのサンプルから差し引いた。ＧＭ−ＣＳＦ中和の割合は１００−［Ｏ．Ｄ．（Ｉｇあり）／Ｏ．Ｄ．（Ｉｇなし））ｘ１００］から計算した。図４は、完全なヒトＭＡｂｓによるＴＦ−１細胞株のＧＭ−ＣＳＦ依存性増殖抑制を証明している。
【０１８３】
ハイブリドーマ株の遺伝的多様性を増加させるミスマッチ修復の阻害。ミスマッチ修復を阻害することで、産生、細胞増殖、または抗体活性が上昇した遺伝的に多様な同種細胞ができる。ＭＡｂ活性および細胞増殖を改善するため、ＲＰＭＩ完全培地（ネガティブコントロール）または２５０μＭまたは５００ｕＭのミスマッチ修復阻害剤ｍｏｒｐｈｏｃｅｎｅ（９，１０−ジメチルアントラセン、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、カリフォルニア州）を含むＲＰＭＩ完全培地でハイブリドーマ細胞を増殖した。ｍｏｒｐｈｏｃｅｎｅを用いた場合と用いない場合で、３〜４日ごとに１：５希釈で細胞を新鮮培地に通し、３週間後、細胞を収集し、ＦＡＣＳバッファー（１％  ＢＳＡを用いたＰＢＳ）に２×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。細胞は、３０分間氷上で、１０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）により染色した。細胞は１０ｍＬの氷冷ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、３ｍＬのＦＡＣＳに再懸濁した。１０μＬ  ＶＩＡＰＲＯＢＥ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）を５分間氷上で追加し、Ｉｇ表面染色が強い生存細胞をＦＡＣＳＡＲＩＡセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で選別した。ゲートはＩｇ表面染色が最も強い亜集団５％となる細胞を選別するように設定した。ミスマッチ修復（ＭＭＲ）の化学阻害物質がある場合とない場合で１週間この集団を増殖し、前記手順をさらに２回繰り返した。力価が高いクローンを選択するため、ＦＡＣＳで選別した細胞を、２００μＬのＲＰＭＩ完全培地を含むＵ底９６ウェルプレートに０．８細胞／ウェルで播種した。プレートは１週間３７℃で５％ＣＯ２中、インキュベートした。５０μＬの上清をウェルから採取し、ヤギ抗ヒトＩｇＭ＋Ｇコーティングプレートを用いたＥＬＩＳＡにより、ＩｇＭ産生を分析した。内部標準として、各ＥＬＩＳＡプレートにつき３ウェルに、５０μＬの１０ｎｇ／ｍＬヒトＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を播種した。内部標準のウェルの平均値に対して、４５０ｎｍで得られたＯ．Ｄ．値を正規化した。高ＩｇＭシグナルを示すウェルを増殖し、さらに分析した。ＭＳＩ分析では、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、親細胞またはＭＭＲ阻害剤処理細胞からＤＮＡを抽出した。Ｄ４蛍光標識ｍＢＡＴ−２６−Ｆ（５’−ｔｃａｃｃａｔｃｃａｔｔｇｃａｃａｇｔｔ−３’）（配列ＩＤ番号２０）およびｍＢＡＴ−２６−Ｒ（５’−ｃｔｇｃｇａｇａａｇｇｔａｃｔｃａｃｃｃ−３’）（配列ＩＤ番号２１）プライマー、ｐｆｕＵｌｔｒａ（商標）高性能ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州）を用いてＢＡＴポリＡ繰り返しマーカーを増幅し、反応は以下の通りインキュベートした。９５℃５分、９４℃１分、６０℃１分、および７２℃２分を９サイクル行い、アニーリング温度を各サイクル１℃ずつ低下させ、９４℃１分、５２℃１分、７２℃２分を３０サイクル行い、最終増殖７２℃１０分とした。ＤＮＡ希釈によりマーカー対立遺伝子の単一コピーを得、前記ＰＣＲ反応の５０％のみで単位複製配列が得られた。ＰＣ��産物をＣＥＱサンプル充填溶液で１：１０に希釈した後、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣＥＱ  ８０００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍに装填し、フラグメントを分析した（Ｂｌａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ．（２００１）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：１８６７−７０）。
【実施例３】
【０１８４】
ＧＭ−ＣＳＦに高い特異性を示すモノクローナル抗体Ｅ１０の作成
いくつかの抗体はＰＡＰ患者のＢ細胞由来のものであった。これらの抗体はＩｇＭ、ＩｇＧアイソタイプであった。これらの抗体は、本明細書に説明した特異性アッセイにより、それぞれＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合することが分かった。いずれかの骨髄腫細胞と融合した肺胞タンパク症（ＰＡＰ）患者のＢ細胞から抗ＧＭ−ＣＳＦヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体Ｅ１０を１種類作成し、その後、上述の通り、ＥＬＩＳＡにより抗ヒトＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体をスクリーニングした。
【０１８５】
ＰＡＰ患者の血液（全血９１ｍｌ）を用い、合計４９５０万個のＰＢＭＣｓを単離した。これらの細胞の生存度は９９．０％であった。ＦＡＣＳ分析の結果を表２に示す。ＩＬ−４  ２ｎｇ／ｍｌ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、トランスフェリン５０ｕｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）、ＰＭＡ５ｎｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）、およびシクロスポリンＡ０．５ｕｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）と支持細胞を用い、ｃＲＰＭＩ１６４０（１０ｍｌ）で約２５００万個のＰＢＭＣｓを培養することで、前記Ｂ細胞を増殖した。１１日間の培養後、１２００万個の細胞が残り、この後電気融合（ＣｙｔｏＰｕｌｓｅ  ＣＥＥＦ−５０）により骨髄腫細胞と融合した。ＦＡＣＳ分析の結果を表２に示す。
【０１８６】
【表２】
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【０１８７】
融合した細胞は、１０％  ＦＢＳ、熱不活性化（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カンサス州）、Ｌ−グルタミン、２００ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州）、非必須アミノ酸、１０ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州）、ピルビン酸ナトリウム溶液、１００ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州）、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州）、２−メルカプトエタノール、５５ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州）、および１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリー州）とともにＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州）で培養した。
【０１８８】
１２日間培養後、前記ハイブリドーマ培地の約４８％が増殖を示した。次に、前記ハイブリドーマを組み換えＧＭ−ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、米国ニュージャージー州）とともに、ＧＭ−ＣＳＦ特異的ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。ＧＭ−ＣＳＦに陽性を示すものなど、数種類のクローンを単離した。これらのクローンはＥＬＩＳＡで再検査し、前記組み換えＧＭ−ＣＳＦに特異的で、破傷風毒素（ＴＴ）には特異的ではないことを確認した。クローン４Ｅ１０はＧＭ−ＣＳＦと特異的反応を示したが、ＴＴは特異的に反応しなかった。続いてクローン４Ｅ１０をサブクローニングした。３週間後、培養したサブクローンをＥＬＩＳＡでスクリーニングし、ＧＭ−ＣＳＦに対する特異性が維持されていることを確認し、さらに以下に説明する特性を決定した。
【０１８９】
Ｅ１０の特性解析。抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体Ｅ１０の特異性を決定するため、様々な抗原で抗原特異的ＥＬＩＳＡを行った（図８）。図８では、抗原ｈＩＬ−１ａ、ｈ  ＩＬ−２、ｈ  ＩＬ−３、ｈ  ＩＬ−４、ｈ  ＩＬ−５、ＩＬ−６、ｈＩＬ−１３、ｈＧＭ−ＣＳＦ、ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＢＳＡ、およびＴＴに対する結合性を比較している。その後の研究では、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の結合をヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭｅｓｏｔｈｉｌｉｎ、ＳＥＢ、ＢＧＧ、ＣＡＢ、ＨＥＬ、ＴＴ、ＢＳＡ、ヤギＩｇＧ、ヒトムチン、およびマウスＩｇＧと比較した（データは図示せず）。いずれの研究でも、４Ｅ１０のみがヒトＧＭ−ＣＳＦと反応した。
【０１９０】
Ｅ１０のアイソタイプを決定するため、抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、Ｌκ、およびＬλを用いた標準的な分析を行い、前記アイソタイプを導き出した。この分析は、４Ｅ１０がＩｇＧ１およびκ抗体であることを証明した（図９を参照）。
【０１９１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＧＭ−ＣＳＦの生物活性を中和するＥ１０の能力を、生存および増殖をこのサイトカインに依存している細胞株ＴＦ−１により検討した（図８を参照）。ヒトＧＭ−ＣＳＦ依存性ヒト赤白血病細胞株のＴＦ−１（ＡＴＣＣ、バージニア州）は、１０ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ニュージャージー州）を含むＲＰＭＩ  １６４０完全培地で増殖した。実験前日、ＴＦ−１細胞をＧＭ−ＣＳＦのない０．１％ＦＢＳで増殖した。飢餓培養した前記ＴＦ−１細胞を回収し、アッセイ培地（０．５％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ単純培地）で２回洗った。細胞をアッセイ培地に再懸濁し、１０，０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルマイクロプレートに播種した。ウェルには、１００ｐｇ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦ、または２０μｇ／ｍＬ〜０．３１５μｇ／ｍＬの範囲の濃度で被験Ｉｇまたはアイソタイプの対照Ｉｇを１時間プレインキュベートしたＧＭ−ＣＳＦのいずれかのアッセイ培地を含めた。３日後、ＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州）４０ｕＬを各ウェルに追加し、プレートをさらに３７℃で１時間インキュベートした。分光光時計にて４９０ｎｍの光学密度（Ｏ．Ｄ．）を測定し、培地のバックグラウンドをすべてのサンプルから差し引いた。ＧＭ−ＣＳＦ中和の割合は１００−［Ｏ．Ｄ．（Ｉｇあり）／Ｏ．Ｄ．（Ｉｇなし））ｘ１００］から計算した。抗体４Ｅ１０はｉｎ  ｖｉｔｒｏ、濃度１００ｐｇ／ｍｌでＧＭ−ＣＳＦの活性を中和することができた。
【０１９２】
Ｅ１０を用いてウエスタンブロット分析を行い、前記抗体がヒト組み換えＧＭ−ＣＳＦと交差反応を起こすか否かを決定した。図１０に示す通り、還元条件でＥ１０はヒトＧＭ−ＣＳＦと交差反応を示した。
【０１９３】
Ｅ１０の結合親和性を決定するため、ＢＩＡＣＯＲＥ分析を以下の通り実施した。Ｅ１０の結合定数は約８７０ｐＭである（図１１）。
【実施例４】
【０１９４】
ＧＭ−ＣＳＦに高い特異性を示すモノクローナル抗体Ｇ９の作成
Ｋ６またはＣＢＦ−７のいずれかと融合した肺胞タンパク症（ＰＡＰ）患者のＢ細胞から抗ＧＭ−ＣＳＦヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体Ｇ９を作成し、その後、上述の通り、ＥＬＩＳＡにより抗ヒトＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体をスクリーニングした。
【０１９５】
ＰＡＰ患者の血液（全血９１ｍｌ）を用い、合計４９５０万個のＰＢＭＣｓを単離した。これらの細胞の生存度は９９．０％であった（データは図示せず）。ＩＬ−４  ２ｎｇ／ｍｌ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、トランスフェリン５０ｕｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）、ＰＭＡ  ５ｎｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）、およびシクロスポリンＡ  ０．５ｕｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）と支持細胞を用い、ｃＲＰＭＩ１６４０（１０  ｍｌ）で約２５００万個のＰＢＭＣｓを培養することで、Ｂ細胞を増殖した。１１日間の培養後、１２００万個の細胞が残り、この後電気融合（ＣｙｔｏＰｕｌｓｅ  ＣＥＥＦ−５０）により骨髄腫細胞と融合した。
【０１９６】
融合した細胞は、１０％  ＦＢＳ、熱不活性化（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カンサス州）、Ｌ−グルタミン、２００ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州）、非必須アミノ酸、１０ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州）、ピルビン酸ナトリウム溶液、１００ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州）、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州）、２−メルカプトエタノール、５５ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州）、および１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリー州）とともにＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州）で培養した。
【０１９７】
１２日間培養後、前記ハイブリドーマ培地の約４８％が増殖を示した。次に、前記ハイブリドーマを組み換えＧＭ−ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、米国ニュージャージー州）とともに、ＧＭ−ＣＳＦ特異的ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。ＧＭ−ＣＳＦに陽性を示すものなど、数種類のクローンを単離した。これらのクローンはＥＬＩＳＡで再検査し、前記組み換えＧＭ−ＣＳＦに特異的で、破傷風毒素（ＴＴ）には特異的ではないことを確認した。Ｇ９集団はＧＭ−ＣＳＦに非常に特異的な反応を示したが、ＴＴには特異的反応を示さなかった。次に、前記Ｇ９集団をサブクローニングし、純粋培養を得た。３週間後、培養したサブクローンをＥＬＩＳＡでスクリーニングし、ＧＭ−ＣＳＦに対する特異性が維持されていることを確認し、さらに以下に説明する特性を決定した。
【０１９８】
Ｅ９の特性解析。抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体Ｅ９の特異性を決定するため、様々な抗原で抗原特異的ＥＬＩＳＡを行った（図８）。図８では、抗原ｈＩＬ−１ａ、ｈ  ＩＬ−２、ｈ  ＩＬ−３、ｈ  ＩＬ−４、ｈ  ＩＬ−５、ＩＬ−６、ｈＩＬ−１３、ｈＧＭ−ＣＳＦ、ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＢＳＡ、およびＴＴに対する結合性を比較している。その後の研究では、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の結合をヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトｍｅｓｏｔｈｉｌｉｎ、ＳＥＢ、ＢＧＧ、ＣＡＢ、ＨＥＬ、ＴＴ、ＢＳＡ、ヤギＩｇＧ、ヒトムチン、およびマウスＩｇＧを比較した（データは図示せず）。いずれの研究でも、Ｇ９のみがヒトＧＭ−ＣＳＦと反応した。
【０１９９】
Ｇ９のアイソタイプを決定するため、抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、Ｌκ、およびＬλを用いた標準的な分析を行い、前記アイソタイプを導き出した。この分析は、Ｇ９がＩｇＧ１およびκ抗体であることを証明した（図１２）。
【０２００】
Ｇ９中和バイオアッセイ。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＧＭ−ＣＳＦの生物活性を中和するＧ９の能力を、生存および増殖をこのサイトカインに依存している細胞株ＴＦ−１により検討した（図４）。ヒトＧＭ−ＣＳＦ依存性ヒト赤白血病細胞株のＴＦ−１（ＡＴＣＣ、バージニア州）は、１０ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ニュージャージー州）を含むＲＰＭＩ  １６４０完全培地で増殖した。実験前日、ＴＦ−１細胞をＧＭ−ＣＳＦのない０．１％  ＦＢＳで増殖した。飢餓培養した前記ＴＦ−１細胞を回収し、アッセイ培地（０．５％  ＢＳＡを含むＲＰＭＩ単純培地）で２回洗った。細胞をアッセイ培地に再懸濁し、１０，０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルマイクロプレートに播種した。ウェルには、１００ｐｇ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦ、または２０μｇ／ｍＬ〜０．３１５μｇ／ｍＬの範囲の濃度で被験Ｉｇまたはアイソタイプの対照Ｉｇを１時間プレインキュベートしたＧＭ−ＣＳＦのいずれかのアッセイ培地を含めた。３日後、ＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州）４０ｕＬを各ウェルに追加し、プレートをさらに３７℃で１時間インキュベートした。分光光時計にて４９０ｎｍの光学密度（Ｏ．Ｄ．）を測定し、培地のバックグラウンドをすべてのサンプルから差し引いた。ＧＭ−ＣＳＦ中和の割合は１００−［Ｏ．Ｄ．（Ｉｇあり）／Ｏ．Ｄ．（Ｉｇなし））ｘ１００］から計算した。抗体Ｇ９はｉｎ  ｖｉｔｒｏ、濃度１００ｐｇ／ｍｌでＧＭ−ＣＳＦの活性を中和することができた。
【０２０１】
Ｇ９を用いてウエスタンブロット分析を行い、前記抗体がヒト組み換えＧＭ−ＣＳＦと交差反応を起こすか否かを決定した。図１０に示す通り、還元性条件でＧ９はヒトＧＭ−ＣＳＦと交差反応を示した。
【０２０２】
Ｇ９の結合親和性を決定するため、ＢＩＡＣＯＲＥ分析を上述の通り実施した。Ｇ９の結合定数は約１１〜１７ｐＭである（図１３）。
【実施例５】
【０２０３】
完全ヒト抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体Ｇ９およびＥ１０をコードするヌクレオチド配列
抗体Ｇ９。完全ヒト抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体Ｇ９のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は標準的な方法によって得られた。簡単には、製造業者の使用説明に従い、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により全ＲＮＡをハイブリドーマＧ９から単離した。前記製造業者の使用説明に従い、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素により、伝達内容をｃＤＮＡに合成した。軽鎖および重鎖可変領域を増幅するため、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と、軽鎖にはプライマー配列ＩＤ番号２２および配列ＩＤ番号２３、重鎖には配列ＩＤ番号２４および配列ＩＤ番号２５を用い、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、大腸菌Ｍａｃｈ１細胞に形質転換し、形質転換細胞はＬＢ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎプレートで選択した。上記と同じプライマーペアが挿入されたコロニーをスクリーニングし、４つの陽性コロニーそれぞれを用い、ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりＤＮＡ配列を決定する鋳型ＤＮＡを作成した。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＴＣＳ配列決定試薬を用い、プライマー配列ＩＤ番号２６および配列ＩＤ番号２７でＤＮＡ挿入断片の配列を決定した後、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＣＥＱ２０００でデータを獲得、分析した。軽鎖にリーダーペプチド配列を加えるため、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ＤＮＡポリメラーゼを用い、プライマー配列ＩＤ番号２８および配列ＩＤ番号２３で陽性クローンを再増幅した。リーダーペプチド配列を含む重鎖の全長（配列ＩＤ番号１１）を作成するため、鋳型としてもとのｃＤＮＡを用い、プライマー配列ＩＤ番号２９および配列ＩＤ番号３０でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＴＡクローニングし、Ｍａｃｈ１細胞に形質転換し、陽性クローンを上述の通り同定した。プライマー配列ＩＤ番号２５、配列ＩＤ番号２６、配列ＩＤ番号３１、配列ＩＤ番号３２、配列ＩＤ番号３３、配列ＩＤ番号３４、配列ＩＤ番号２７、および配列ＩＤ番号３０とＴｅｍｐｌｉＰｈｉ試薬で作成した鋳型ＤＮＡを用い、Ｇ９重鎖ｃＤＮＡの全長の配列を決定した。Ｇ９（配列ＩＤ番号１１）の重鎖の全長およびＧ９（配列ＩＤ番号１５）の軽鎖の全長について得られたＤＮＡ配列を以下に示す。配列ＩＤ番号１１および配列ＩＤ番号１５由来の予想翻訳産物は、それぞれ配列ＩＤ番号９および配列ＩＤ番号１３に示されている。配列ＩＤ番号１０および配列ＩＤ番号１４由来の予想翻訳産物は、それぞれ配列ＩＤ番号８および配列ＩＤ番号１２に示されている。下線を引いた配列ＩＤ番号１１および配列ＩＤ番号１５の配列は、ＰＣＲで追加されたリーダー配列を示している。配列ＩＤ番号１０および配列ＩＤ番号１４のポリヌクレオチド配列は、それぞれ、リーダー配列が加えられていないＧ９抗体の重鎖および軽鎖をコードしている。配列ＩＤ番号９および１３の小文字配列は、前記ＰＣＲ反応で追加されたヒトリーダーペプチドを示している。配列ＩＤ番号８、９、１２、および１３の下線付き配列はＣＤＲ領域を示している。配列ＩＤ番号８、９、１２、および１３の残りの配列は、可変領域および定常領域のフレームワークである。重鎖の定常領域はアミノ酸配列ＷＧＱＧ（配列ＩＤ番号８のアミノ酸１１１または配列ＩＤ番号９の１３０）で始まり、軽鎖の定常領域はアミノ酸配列ＦＧＱＧ（配列ＩＤ番号１２のアミノ酸９８または配列ＩＤ番号１３の１１７）で始まる。
【０２０４】
抗体Ｅ１０。完全ヒト抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体Ｅ１０のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は標準的な方法によって得られた。簡単には、製造業者の使用説明に従い、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により全ＲＮＡをハイブリドーマＥ１０から単離した。前記製造業者の使用説明に従い、、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素により、伝達内容をｃＤＮＡに合成した。軽鎖および重鎖可変領域を増幅するため、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と、軽鎖にはプライマー配列ＩＤ番号２２および配列ＩＤ番号２３、重鎖には配列ＩＤ番号２４および配列ＩＤ番号２５を用い、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、大腸菌Ｍａｃｈ１細胞に形質転換し、形質転換細胞はＬＢ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎプレートで選択した。上記と同じプライマーペアが挿入されたコロニーをスクリーニングし、４つの陽性コロニーそれぞれを用い、ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりＤＮＡ配列を決定する鋳型ＤＮＡを作成した。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＴＣＳ配列決定試薬を用い、プライマー配列ＩＤ番号２６および配列ＩＤ番号２７でＤＮＡ挿入断片の配列を決定した後、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＣＥＱ２０００でデータを獲得、分析した。Ｅ１０（配列ＩＤ番号１７）の重鎖可変領域およびＥ１０（配列ＩＤ番号１９）の軽鎖の全長をコードする、得られたＤＮＡ配列を以下に示す。配列ＩＤ番号１７および配列ＩＤ番号１９由来の予想翻訳産物は、それぞれ配列ＩＤ番号１６および配列ＩＤ番号１８に示されている。配列ＩＤ番号１６および１８の下線付き配列はＣＤＲ領域を示している。配列ＩＤ番号１６、および１８の残りの配列は、可変領域および定常領域のフレームワークである。重鎖の定常領域はアミノ酸配列ＷＧＱＧ（配列ＩＤ番号１６のアミノ酸１１５）で始まり、軽鎖の定常領域はアミノ酸配列ＦＧＱＧ（配列ＩＤ番号１８のアミノ酸９８）で始まる。
【実施例６】
【０２０５】
抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体のエピトープマッピング
Ｇ９が結合するＧＭ−ＣＳＦのエピトープをマッピングするため、ヒトＧＭ−ＣＳＦの長さに及ぶ一連の重複ペプチドを作成した（図１４）。簡単には、ヒトＧＭ−ＣＳＦ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ５２５７８、残基１４〜１４４）を網羅する２５種類の１２ｍｅｒ重複ペプチドを、７アミノ酸の重複を含むように設計した。各ペプチドのＣ末端を誘導体化セルロース膜の表面に結合することで（ＳＰＯＴｓ法、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）、固相合成により３．７ｍｍ×３．７ｍｍの個別スポットとしてペプチドを作成した。標準的なウエスタンブロット分析を利用し、どのペプチドがＧ９と交差反応するかを決定した（図１５）。前記セルロース膜をメタノールに浸し、４℃で一晩ブロッキング溶液（５％ＢＳＡ、１ＸＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％ＮａＮ３）でブロックした。１ｍｇ／ｍｌの精製１０Ｇ９抗体を含む新鮮なブロッキング溶液を加え、ブロットを４℃で一晩インキュベートした。前記ブロットをそれぞれ５分間ＴＢＳ−Ｔ（１ＸＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗い、希釈剤（５％ＢＳＡ、１ＸＴＢＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）にＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ｃａｔ．１０９−０３５−０８８）を１：１０，０００倍希釈した溶液で、１時間インキュベートした。前記ブロットをＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  ＥＣＬ基質キット（Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔ．３４０９５）を用いて開発した後、ＢｉｏＭＡＸフィルム（Ｋｏｄａｋ）に１秒間曝露した。この方法で、ペプチド番号６、１３、１４、１５、および可能性としてはペプチド番号２３が前記Ｇ９抗体によって特異的に認識され、これはそれぞれ配列ＩＤ番号１８、配列ＩＤ番号１９、配列ＩＤ番号２０、配列ＩＤ番号２１、および配列ＩＤ番号４７に対応した。
【０２０６】
本発明は上記に説明、例示した実施形態に限るものではなく、添付の請求項の範囲で変更、修正できるものとする。
配列ＩＤ番号１
【０２０７】
【表３】
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【０２０８】
【表４】
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【０２０９】
【表５】
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【０２１０】
【表６】
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【０２１１】
【表７】
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【０２１２】
【表８】
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【０２１３】
【表９】
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【０２１４】
【表１０】
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【０２１５】
【表１１】
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【０２１６】
【表１２】
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【０２１７】
【表１３】
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【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１】図１は、抗原特異的ヒトＭＡｂｓを選択するための抗原パネルＥＬＩＳＡを図示している。前記パネルでは、３種類のＧＭ−ＣＳＦ特異的ヒトＭＡｂｓ（Ｅ５、Ｇ７、Ｅ１０）がヒトＧＭ−ＣＳＦと反応し、他の抗原とは反応しなかった。抗体２１５はマウスＭＡｂであり、ヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｈＧＭ−ＣＳＦ）およびマウスＧＭ−ＣＳＦ（ｍＧＭ−ＣＳＦ）に結合する。
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、天然型ヒトＧＭ−ＣＳＦに対するヒトＭＡｂｓの特異性が高いことを図示したものである。図２Ａに示す通り、可溶性ヒトＧＭ−ＣＳＦは、ヒトＧＭ−ＣＳＦに対する細胞表面免疫グロブリン（Ｉｇ）を提示したマウスハイブリドーマ細胞に結合した。その後、反応液にＭＡｂ  Ｅ５が追加され、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇを用い、ヒトＧＭ−ＣＳＦに対する結合が測定された。Ｅ５は前記マウスハイブリドーマ細胞に発現された表面タンパク質のいずれにも結合しなかったが（中図）、細胞表面Ｉｇに捕獲された可溶性ＧＭ−ＣＳＦのみと結合した（下図）。
【図２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、天然型ヒトＧＭ−ＣＳＦに対するヒトＭＡｂｓの特異性が高いことを図示したものである。図２Ｂに示す通り、フィコエリトリン（ＰＥ）標識ヒトＧＭ−ＣＳＦ（ＰＥ−ＧＭ）は、Ｅ１０細胞表面に発現されたＩｇと反応することができる。過剰な非標識ＧＭ−ＣＳＦ（下図）はＰＥ−ＧＭ結合に競合した。
【図３】図３は、クラススイッチしたハイブリドーマ細胞による抗原結合ＩｇＧの分泌を証明した図である。ハイブリドーマＥ５細胞（親）は、材料および方法に示した通り処理した。クラススイッチ（スイッチ）したハイブリドーマクローンは、ＥＬＩＳＰＯＴに基づくスクリーニング法により同定した。プレートにコーティングされたヒトＧＭ−ＣＳＦへの特異的結合を測定するＥＬＩＳＡを行い、ＩｇＭまたはＩｇＧの結合を評価した。スイッチしたＩｇＧ  ＭＡｂｓは、親ＩｇＭと同等の抗原結合性を示した。
【図４】図４は、完全ヒトＭＡｂｓによるＴＦ−１細胞株のＧＭ−ＣＳＦ依存性増殖抑制を証明している。ヒトＧＭ−ＣＳＦ依存性ヒト赤白血病細胞株のＴＦ−１（ＡＴＣＣ、バージニア州）は、１０ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ニュージャージー州）を含むＲＰＭＩ  １６４０完全培地で増殖した。実験前日、ＴＦ−１細胞をＧＭ−ＣＳＦのない０．１％  ＦＢＳで増殖した。飢餓培養した前記ＴＦ−１細胞を回収し、アッセイ培地（０．５％  ＢＳＡを含むＲＰＭＩ単純培地）で２回洗った。細胞をアッセイ培地に再懸濁し、１０，０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルマイクロプレートに播種した。ウェルには、１００ｐｇ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦ、または図に示した濃度で被験Ｉｇまたはアイソタイプの対照Ｉｇを１時間プレインキュベートしたＧＭ−ＣＳＦのいずれかのアッセイ培地を含めた。３日後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州）４０μＬを各ウェルに追加し、プレートをさらに３７℃で１時間インキュベートした。分光光時計にて４９０ｎｍの光学密度（Ｏ．Ｄ．）を測定し、培地のバックグラウンドをサンプルから差し引いた。ＧＭ−ＣＳＦ中和の割合は１００−［Ｏ．Ｄ．（Ｉｇあり）／Ｏ．Ｄ．（Ｉｇなし））ｘ１００］から計算した。
【図５Ａ】図５Ａは、検討したすべてのＥ５−３Ｄ２サブクローンが高レベルのＩｇを分泌することを示したＥＬＩＳＡ結果を図示したものである。ハイブリドーマＥ５−３Ｄ２株を６０代継代増殖し、次に細胞産生の頻度を分析することで産生の安定性を評価した。限界希釈した３Ｄ２細胞由来のサブクローン（Ｘ１−Ｘ１０）をランダムに選択し、そのＩｇ産生をＥＬＩＳＡに基づくアッセイで測定した。細胞を含むウェルを目視検査することで、吸光度４０５ｎｍのコロニーサイズを正規化した。
【図５Ｂ】図５Ｂは、無血清培地１リットルを含む攪拌したバイオリアクターに３Ｄ２細胞を播種し、Ｉｇを産生させ、１〜５日目に生細胞数を記録後、対数期に測定した比産生率は２４ｐｇ／細胞／日であることを示した図である。
【図６Ａ】図６Ａは、ミスマッチ修復阻害剤で処理したＥ５ハイブリドーマ細胞に認められる、ＢＡＴマーカーの一塩基欠失の例を示した図である。ヒストグラム中央のピークを横切る点線は、野生型（ｗｔ）または短縮した（−１ｎｔ）フラグメントのサイズを示している。
【図６Ｂ】図６Ｂは、親細胞およびミスマッチ修復を阻害した細胞をマイクロプレートに播種し、それぞれ３，７６３および２，４３７個のＩｇ分泌クローン（Ｏ．Ｄ．>０．２）が得られた図である。Ｉｇ濃度はＥＬＩＳＡにより決定し、Ｏ．Ｄ．値が１を超えるクローンの頻度を記録し、分泌されたクローン総数の割合として表した。
【図７】図７では、完全ヒトハイブリドーマ細胞株の作成について各工程を説明したダイアグラム式フローチャートを提供している。
【図８】図８は、抗原特異的ヒトＭＡｂｓを選択するための抗原パネルＥＬＩＳＡを図示している。前記パネルでは、３種類のＧＭ−ＣＳＦ特異的ｈｕＭＡｂｓ、Ｅ１０、Ｇ９、およびＥ５（説明せず）がヒトＧＭ−ＣＳＦと反応し、他の抗原とは反応しなかった。アッセイ感度を高めるため、様々な抗原に対して特異的ＭＡｂｓを用い、効率的な抗原コーティングを最適化した。６１５および２１５の２つは抗ヒトＧＭ−ＣＳＦマウスＭＡｂｓである。
【図９】図９は、ＭＡｂ  Ｅ１０のアイソタイプ決定について示している。Ｅ１０のアイソタイプを決定するため、抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、Ｌκ、およびＬλ  Ｆｃ特異的抗体を用いた標準的な分析を行い、前記アイソタイプを導き出した。
【図１０】図１０はＥ１０およびＧ９  ＭＡｂｓを用いたウェスタン分析を示している。Ｅ１０およびＧ９を用いてウエスタンブロット分析を行い、前記抗体がヒト組み換えＧＭ−ＣＳＦと交差反応を起こすか否かを決定した。ｍＡｂ２１５は、ポジティブコントロールとしてモノクローナル抗体を中和するマウス抗ヒトＧＭ−ＣＳＦであり、レーン：１はタンパク質のネガティブコントロールとして腫瘍細胞溶解物を充填し、レーン：２は５００ｎｇ  ｒｈ  ＧＭ−ＣＳＦ（ＰｅＰｒｏＴｅｃｈ、米国ニュージャージー州）を充填した。図５に示す通り、Ｅ１０およびＧ９はヒトＧＭ−ＣＳＦと反応した。
【図１１】図１１はＥ１０のＢＩＡＣＯＲＥ分析を示している。Ｅ１０．２０は、会合速度定数（ｋａ）＝２．４７ｘ１０４、解離速度定数（ｋｄ）＝２．１６ｘ１０−５、全体的な親和性（ＫＤ）は０．８７ｎＭであった。
【図１２】図１２は、ＭＡｂ  Ｇ９のアイソタイプ決定について示している。Ｇ９のアイソタイプを決定するため、抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、Ｌκ、およびＬλ特異的抗体を用いた標準的な分析を行い、前記アイソタイプを導き出した（サンプル２種類、図３）。
【図１３】図１３はＧ９のＢＩＡＣＯＲＥ分析を示している。１０Ｇ９．１は、会合速度定数（ｋａ）＝８．４７ｘ１０６、解離速度定数（ｋｄ）＝９．２７ｘ１０−５、全体的な親和性（ＫＤ）は０．８７ｎＭであった。
【図１４】図１４はＧ９エピトープマッピングの戦略を図示している。Ｇ９エピトープ結合位置のマッピングに用いた重複ペプチドは、配列ＩＤ番号３５〜３８、および６４〜８５のアミノ酸配列に対応する。
【図１５】図１５は、配列ＩＤ番号３５〜３８、および６４〜８５のアミノ酸配列に対応するヒトＧＭ−ＣＳＦタンパク質配列を網羅する重複ペプチドを用いた、ウエスタンブロット分析によるＧ９エピトープマッピング分析を示している。抗体陽性ペプチドには配列ＩＤ番号３５〜３８を含む。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2009526082.tif 000028
【図１０】
2009526082.tif 000029
【図１１】
2009526082.tif 000030
【図１２】
2009526082.tif 000031
【図１３】
2009526082.tif 000032
【図１４】
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【図１５】
2009526082.tif 000034
【国際調査報告】
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