(57)【要約】本開示は、スピン・エコー取得を利用した超短T2*緩和のMR測定のための新しい技法に向けられたものである。超短T2*緩和測定は、細胞移送および療法において、高濃度の鉄で標識付けされた細胞の定量のために使用できる。例示的な実施形態では、小さなフリップ角のRFパルスによって信号が誘導される。励起パルスに続いて、勾配読み出しが適用されてエコーが形成される。RFパルスと勾配読み出しの中央との間の時間はTEとして定義される。高濃度の鉄で標識付けされた細胞をもつ組織では、T2*は1ミリ秒未満となることがある。したがって、信号は数ミリ秒のエコー時間でノイズ・レベルにまで減衰できる。SPIOで標識付けされた細胞ではT2*はずっと長いので、スピン・エコーによって取得される信号は、グラジエント・エコーからの信号よりずっと大きくなる。よって、画像における大規模な信号損失に関連する負の効果が避けられる。次いで、超短T2*緩和マップが通常のT2*上に重ねられて、視野の最終的なT2*マップが生成できる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識付けされた細胞を測定する方法であって：
生体外で造影剤を用いて細胞に標識付けする段階と；
前記標識付けされた細胞の移動、増殖および／またはホーミングを磁気共鳴（MR）撮像を用いてモニタリングする段階と；
一連のスピン・エコー画像を取得することによってT2*減衰曲線をもつT2*緩和測定を測定する段階であって：
（ａ）第一のスピン・エコー画像を生成する第一のスピン・エコー信号を誘導し；
（ｂ）前記T2*減衰のあたりで好適なエコー・シフトからの一連の追加的な諸スピン・エコー画像を生成する複数のスピン・エコー信号を誘導し；
（ｃ）指数関数あてはめを使って諸T2*マップを導出することを含む段階とを有する、
方法。
【請求項２】
前記造影剤が超常磁性鉄酸化物（SPIO）である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
T2*が超短時間である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
T2*が応用ごとに変動し、ある種の応用では2ミリ秒以下である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記第一のスピン・エコー信号および前記第二のスピン・エコー信号がそれぞれ、第二の無線周波（RF）パルスがあとに続く第一の無線周波（RF）パルスによって形成される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記第一のRFパルスが、180°RFパルスがあとに続く90°RFパルスである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
T2減衰曲線が関係MSSe-t/T2によって定義される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記T2*減衰曲線が関係MSSe-TE/T2e-(t-TE)/T2*で定義される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記好適なエコー・シフトが、1または2ミリ秒未満のステップによってなされる、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記諸T2*マップが組み合わされて全体的なT2*マップとして表示される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記標識付けされた細胞が、細胞移送または細胞療法との関連で測定される、請求項１ないし１０のうちいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のうちいずれか一項記載の方法に基づいて標識付けされた細胞を測定するシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、磁気共鳴撮像を使った標識付けされた細胞の効果的な定量のために、速く減衰するT2*緩和を測定するシステムおよび方法に関する。開示されるシステムおよび方法は、細胞移送（cell  trafficking）および細胞療法（cell  therapy）を含む多様な応用で有用である。
【背景技術】
【０００２】
修復および血管再生のための幹細胞および免疫細胞を使った細胞療法が臨床試験においてますます適用されつつある。標的器官への細胞の精確な送達が成否を分けることがある。標的組織（単数または複数）における送達された細胞の数を定量することは、細胞療法の用量（dose）およびタイミングを最適化するためにきわめて重要である。超常磁性酸化鉄（SPIO:  superparamagnetic  iron  oxide）エージェントが生体外で細胞に標識付けするために使われてきた。これにより研究者は、これらの細胞の移動、増殖およびホーミングを磁気共鳴（MR）撮像を用いてモニタリングできる。SPIO標識付けは、鉄濃度に対して線形に増加する強い緩和速度（R2*）効果を引き起こす。R2*は1/T2*として定義される。
【０００３】
T2*緩和測定（relaxometry）は通例、複数のグラジエント・エコー撮像によって達成される。高濃度の鉄で標識付けされた細胞を含む組織では、T2*は超短時間であることがある。精密なT2*周期は適用ごとに変動があるが、例示的な事例では、T2*は1ないし2ミリ秒未満である。グラジエント・エコーのエコー時間は一般にハードウェア構成によって制限される。実際的な構成で超短エコー時間を達成するのは自明なことではない。したがって、超短（ultrashort）T2*をもつ組織における信号減衰は一般に、通常のグラジエント・エコー撮像には速すぎる。
【０００４】
今日までの努力にもかかわらず、従来式の細胞定量技法に付随する困難および限界を克服するシステムおよび／または方法に対する必要性が残っている。さらに、ハードウェア修正および／または専用RFパルス設計を必要としない細胞定量技法に対する必要性が残っている。さらに、細胞療法などを含むさまざまな応用において、標識付けされた細胞レベル、たとえば標識化された幹細胞を効果的かつ信頼できる形でモニタリングおよび／または定量するシステムおよび方法が必要とされている。これらの必要性およびその他の必要性は開示されるシステムおよび方法によって満足させられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本開示は、さまざまな応用、たとえば細胞移送および細胞療法において細胞レベルを測定および／または定量するシステムおよび方法を提供する。開示されるシステムおよび方法の例示的な実施形態は生体外で造影剤または他の識別用特性を用いて標識付けされた細胞の使用を含む。標識付けされた細胞の移動、増殖および／またはホーミングを評価するよう、標識付けされた細胞はMR撮像を使ってモニタリングされる。典型的には、造影剤はSPIOであるが、本開示の精神や範囲から外れることなく代替的な造影剤を用いてもよい。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示によれば、細胞関係の多様な応用において標識付けされた細胞濃度を測定するのに、T2*緩和測定が有利に用いられる。高濃度の鉄で標識付けされた細胞ではT2*は超短時間なので、T2*緩和測定の測定のための有利なシステムおよび方法が本稿では開示される。そのようなシステムおよび方法は、望ましい結果を達成するために標準的なグラジエント・エコー撮像ではなくスピン・エコー撮像のシーケンスを使う。例示的な事例では、T2*は1ないし2ミリ秒未満である。ただし、開示されるシステムおよび方法は幅広い範囲のT2*の値にわたって有利な応用をもつ。そのようなT2*値は一般に応用（application）ごとに変動する。開示されるシステムおよび方法は、第一のスピン・エコー画像を生成する通常のスピン・エコー信号を誘導し、続いて前記T2*の減衰に向けた好適なエコー・シフトからの一連の追加的なスピン・エコー画像を生成する複数のスピン・エコー信号を誘導し、次いで指数関数あてはめを使ってT2*マップを導出する。
【０００７】
MR撮像のために細胞から出てくるスピン・エコー信号は、第一の無線周波（RF）パルスおよびそれに続く第二のRFパルスによってそれぞれ形成される。スピン・エコー信号を使ってT2曲線が生成される。ここで、T2はSPIO粒子／ナノ粒子で標識付けされた細胞についてはT2*よりもずっと長く、MSSe-t/Tで定義される。そのとき、スピン・エコーのT2*減衰曲線はMSSe-TE/T2e-(t-TE)/T2*で定義される。複数のスピン・エコー画像は、1ms未満であることもできるエコー・シフト・ステップによって定義される異なる間隔で撮られる。超短T2*マップは、第一のスピン・エコー画像および好適なエコー・シフトをもつ複数スピン・エコー画像によって、指数関数あてはめにより生成される。全体的なT2*マップは、通常のT2*マップ上に超短T2*マップを重ねることによって生成される。
【０００８】
開示されるシステムおよび方法のさらなる特徴、機能および恩恵は以下の記載を特に付属の図面と併せて読んだときに明白となろう。
【０００９】
開示されるシステムおよび方法の作成および使用に際して当業者を支援するために、付属の図面が参照される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
ハードウェア修正および／または専用RFパルス設計の必要のない、細胞レベルを測定および／または定量するシステムおよび方法が開示される。開示されるシステム／方法は、細胞移送および細胞療法の応用を含む幅広い範囲にわたる有用性をもつ。標識付けされた細胞が、その移動、増殖および／またはホーミングを評価するよう、MR撮像によってモニタリングされる。本稿で記載されるように、標識付けされた細胞を効果的に定量するよう、高速で減衰するT2*緩和時間がMR撮像を使って測定される。
【００１１】
SPIOエージェントはT1、T2およびT2*緩和時間に影響する。細胞区画SPIO（cellular  compartmental  SPIO）について、T2*緩和に対する効果はT2緩和に対するよりも10倍高い。結果として、T2はSPIOで標識付けされた細胞よりずっと長い。開示されるシステムおよび方法は、超短T2*減衰に付随する大規模な信号損失にもかかわらずT2*値の決定を有利に容易化するために、一連のスピン・エコー画像を取得することによって、比較的長いT2減衰を利用する。
【００１２】
図１は、複数グラジエント・エコー・シーケンスを使った通常のT2*緩和測定の基本的な概略図である。信号は小さなフリップ角のRFパルスによって誘導される。励起パルスに続いて、勾配読み出しが適用されてエコーが形成される。RFパルスと勾配読み出しの中央との間の時間は「TE」として定義される。時間間隔TEがRFパルスならびにスライス選択勾配および読み出し勾配の勾配波形によって制約されることは明白である。よって、TEは、特に勾配の強さおよび勾配の立ち上がり時間を含むハードウェア構成によって制限される。
【００１３】
グラジエント・エコーで取得される信号はMSSe-TE/T2*によって定義される。ここで、MSSは定常状態（steady  state）での磁化である。高濃度の鉄で標識付けされた細胞をもつ組織では、T2*は1ないし2ミリ秒となることがありうる。よって、信号は数ミリ秒のエコー時間でノイズ・レベルまで減衰できる。TEを短縮しようとする従来の努力は、ハードウェアの修正またはシーケンス設計に対する多大な労力を伴うもので、いずれのアプローチも多くの従来の応用について最適および／または実際的でない。
【００１４】
図２は、本開示の例示的な実装に関連するさまざまなパラメータを示している。開示されるシステムおよび方法に基づいて画像を取得するためには、スピン・エコーが使用される。スピン・エコーの使用が、従来式のグラジエント・エコーの使用の代わりになる。本開示のある例示的な実施形態では、スピン・エコーは90°RFパルスおよびそれに続く180°RFパルスによって形成される。TEにおける信号強度は関係MSSe-TE/T2によって決定される。T2はSPIOで標識付けされた細胞においてずっと長いので、スピン・エコーによって得られる信号は、グラジエント・エコーからの信号よりずっと大きい。よって、画像中の大規模な信号損失に関連した負の効果が避けられる。次いで超短T2*緩和マップは通常のT2*マップ上に重ねられ、視野の最終的なT2*マップを生成できる。
【００１５】
超短T2*緩和の測定は、図２に示されるような一連のスピン・エコー画像の取得によって達成できる。第一のエコーは通常のスピン・エコー画像として得られる。次の諸画像は、読み出しを、T2*減衰曲線に向けて、好適なエコー・シフト・ステップだけシフトさせることによって取得される。好適なエコー・シフト・ステップは1ミリ秒未満であることができる。この方法は、スピン・エコー信号によって生成されたT2*減衰曲線のサンプリングを許容する。次いでT2*マップは指数関数あてはめを使って導出できる。
【００１６】
さらに図２を参照すると、一連の画像がスピン・エコー・シーケンスを用いて取得される。第一のスキャンは標準的なスピン・エコー画像として取得される。後続の諸スキャン（スキャン２〜スキャン５）は、関係MSSe-TE/T2e-(t-TE)/T2*で定義されるT2*減衰曲線に向けたエコー・シフトを用いて取得される。図２に例証されているように、開示されるシステムおよび方法は、有利なスピン・エコー利用を通じて、T2*に関連する高速減衰に関連する制限を克服することにおいて有効である。
【００１７】
開示されるシステムおよび方法に関連付けられた使用および利点をさらに例解するために、以下の例を参照する。しかしながら、そのような例が本開示の範囲について限定するものではなく、単にその例示的な実装および／または有用性を例解するものであることは理解しておくものとする。
【実施例１】
【００１８】
高濃度の鉄で標識付けされた細胞を含む組織における高速減衰するT2*緩和の測定を、T2*減衰が通常の複数グラジエント・エコーT2*マッピングには速すぎる場合に容易にするために、以下の方法論が用いられる。開示される方法論が1ないし2ミリ秒までまたはそれ以下の超短T2*を定量するために使用できることを例証するために、鉄で標識付けされた腫瘍をもつラットでの生体環境MR実験が使われた。通常のT2*マッピングと組み合わされて、開示される技法は、重度に鉄で標識付けされた細胞を含む組織の生体環境中での定量およびモニタリングを改善するために使用されうる。
【００１９】
SPIOナノ粒子は、標識付けされた細胞および組織のT1、T2およびT2*緩和時間に影響するために広く使われている。T2*緩和時間はSPIOで標識付けされた細胞を検出するために最も敏感なパラメータであり、本稿で開示される有利なシステムおよび方法に基づいて、T2*緩和測定が、細胞療法における標識付けされた幹細胞の定量およびモニタリングにおいて効果的に用いられることができる。上記のように、T2*緩和測定は一般に複数グラジエント・エコー撮像によって実行される。しかしながら、高濃度の鉄で標識付けされた細胞を含む組織においては、T2*は2ミリ秒未満となることがあり、よって信号減衰は通常のグラジエント・エコー時間には速すぎる。細胞に境された（cell  bounded）SPIOの比較的長いT2減衰を利用して、開示されるシステム／方法は、一連のスピン・エコー画像を使って高速減衰するT2*緩和を測定するために用いられる。この例示的な事例では、鉄で標識付けされた腫瘍をもつラットにおける短いT2*の生体環境中での定量が調査された。
【００２０】
シーケンス開発：超短T2*の測定は、図２に示されるような一連のスピン・エコー画像の取得によって達成された。第一のエコーは通常のスピン・エコー画像として得られた。次の諸画像は、読み出しを、T2*減衰に向けて、1ミリ秒未満のステップだけシフトさせることによって取得された。これは、スピン・エコー信号からのT2*減衰曲線のサンプリングを許容する。
【００２１】
生体環境中での実験：C8161黒色腫細胞を、当技術分野で知られている標識付け手順を使って、フェリデックス（登録商標）‐プロタミン硫酸塩（FEPro）錯体で標識付けした。2×106個のFEProで標識付けされた黒色腫細胞または標識付けされていない黒色腫細胞（対照用）を5体のヌード・ラットの横腹に皮下的に対称的にインプラントした。腫瘍細胞の接種から約2週間後に、専用の7cmラット用ソレノイドRFコイルを使って3T  Intera全身スキャナ（フィリップス・メディカル・システム）でMRIを実行した。通常のT2*マップが複数グラジエント・エコー・シーケンス（MGES:  multiple  gradient  echo  sequence）［TR/TE＝1540/16ms、エコー数13、256×256マトリクス、スライス数17、スライスの厚さ＝1.0mm、FOV＝80mm、NEX＝4］を用いて取得された。短いT2*を測定するために、次のパラメータ：TR/TE＝1000/6.4、144×144マトリクス、スライス数17、スライスの厚さ＝1.5mm、FOV＝80mm、NEX＝4を用いて、読み出しエコーをそれぞれ0ms、0.4ms、0.8ms、1.2msおよび2.3msシフトさせてスピン・エコー画像の5つのセットを得た。
【００２２】
データ解析：IDLソフトウェア・ツールを使ってデータ解析を実行した。T2*マップを指数関数あてはめを使って導出した。両方のデータセット（すなわち、通常のT2*マップと短いT2*マップ）を組み合わせ、T2*マップとして表示した。
【００２３】
超短T2*緩和測定マップおよびMGESの従来式のT2*マップを4体のラットについて得た。図３ａは、ラット中の横腹腫瘍のアキシャル方向のグラジエント・エコー画像を示している。標識付けされた腫瘍中の信号空白域は、図３ｃに示されるような高濃度の鉄で標識付けされた細胞によって誘導されたものである。しかしながら、細胞に境されたSPIOの比較的長いT2緩和時間のため、同じ腫瘍のスピン・エコー画像（図３ｂ）が被っている信号減衰のほうが少ない。MGESを使って測定されたT2*マップ（図４ａ）は、腫瘍境界上での高いT2*値の領域を示している。これは、腫瘍が生長するにつれFEPro標識付けの逐次的な希薄化を示している。MGESのT2*マップは、腫瘍中心における高濃度の標識付けされた細胞によって誘導される高速のT2*減衰のため、いかなる信号も検出できなかった。比較として、超短T2*マップ（図４ｂ）は、図３ａにおける高濃度の鉄で標識付けされた細胞の領域に対応する腫瘍の中心におけるT2*値が約1ms以下であることを例証している。
【００２４】
結論：この実験は、細胞および組織における超短T2*緩和時間の効果的な測定を例証した。生体環境中MR実験は、この方法が、高濃度の鉄で標識付けされた細胞における1msまでまたはそれ以下の超短T2*値を測定できることを例証した。通常のT2*マップと組み合わせて、開示された技法は、重度に鉄で標識付けされた細胞を含む組織の生体環境中での定量およびモニタリングを改善するために用いることができる。
【実施例２】
【００２５】
実験モデルにおける標的組織中の標識付けされた幹細胞の数を定量することは、臨床試験において細胞療法の用量およびタイミングを最適化するためにきわめて重要である。それらの移動、増殖および／またはホーミングをMR撮像によってモニタリングするために細胞に標識付けするために、SPIOエージェントが使われる。R2*（1/T2*）緩和速度は細胞間SPIOの定量的な検出のための敏感なパラメータである。
【００２６】
この例示的な事例では、腫瘍ラット・モデルにおける鉄で標識付けされた細胞の数とR2*緩和速度との間の定量的な関係を調査した。より具体的には、腫瘍ラット・モデルにおける鉄で標識付けされた細胞と組織R2*緩和速度との間の定量的な関係を調査した。生体環境中での実験は、鉄で標識付けされた細胞の数と組織のR2*との間にみごとな線形相関を例証した。データはさらに、R2*測定が、鉄で標識付けされた細胞の生体環境中での定量のための信頼できかつ敏感なアプローチであることを示す。
【００２７】
C8161黒色腫細胞およびC6神経膠腫細胞を、知られている手順を使って、フェリデックス（登録商標）‐プロタミン硫酸塩（FEPro）錯体で標識付けした。2×106個のFEProで標識付けされた黒色腫細胞および標識付けされていない黒色腫細胞（対照用）（n＝4）または1×106個のFEProで標識付けされた神経膠腫細胞および標識付けされていない神経膠腫細胞（n＝4）をヌード・ラットに皮下的に対称的にインプラントした。腫瘍細胞の接種から約2週間後に、専用の7cmラット用ソレノイドRFコイルを使って3T  Intera全身スキャナ（フィリップス・メディカル・システム）でMRIを実行した。通常のR2*マップが複数グラジエント・エコー・シーケンス［TR/TE＝1540/16ms、エコー数13、256×256マトリクス、スライス数17、スライスの厚さ＝1.0mm、FOV＝80mm、NEX＝4］を用いて取得された。高濃度の標識付けされた細胞をもつ組織におけるR2*緩和を測定するために、読み出しエコーをそれぞれ0ms、0.4ms、0.8ms、1.2msおよび2.3msシフトさせてスピン・エコー画像の5つのセットを得た［TR/TE＝1000/6.4、144×144マトリクス、スライス数17、スライスの厚さ＝1.5mm、FOV＝80mm、NEX＝4］。R2*緩和速度は、IDLソフトウェア・ツールを使って指数関数あてはめによって計算された。両方のデータセット（すなわち、通常のR2*マップと高濃度の標識付けされた細胞をもつ組織のR2*マップ）を組み合わせた。腫瘍のR2*緩和は、ピクセルごとのR2*緩和の腫瘍体積全体にわたる平均として計算された。mm3当たりの標識付けされた細胞の数は、インプラントされた腫瘍細胞の数を腫瘍体積で割ったものとして決定された。
【００２８】
結果：鉄の標識付けは腫瘍の生長を変えなかった。標識付けされた腫瘍と標識付けされない腫瘍との間で腫瘍サイズの有意な統計的差異はなかった。標識付けされた腫瘍サイズは撮像の時点で1890mm3ないし4950mm3の範囲であり、これは８つの腫瘍におけるmm3当たり325ないし1056の標識付けされた細胞に相当する。
【００２９】
FEPro標識付けは腫瘍のR2*緩和速度を著しく伸ばした。図５ａおよび図５ｂは、標識付けされた腫瘍および標識付けされない腫瘍からのR2*マップをそれぞれ示している。R2*緩和に対する鉄標識付けの効果は、mm3当たり1056の標識付けされた細胞をもつ腫瘍（図６ａ）およびmm3当たり325の標識付けされた細胞をもつ腫瘍（図６ｂ）のR2*ヒストグラムによってさらに実証できる。標識付けされた腫瘍は、対照用の腫瘍（図６ｃ）と比べてずっと幅広いR2*分布を発達させた。腫瘍の平均R2*は、mm3当たりの標識付けされた細胞の数と非常に良好な線形相関を示し、相関係数は0.91であった（p＜0.01）。
【００３０】
結論：この例示的な実験では、鉄で標識付けされた細胞と組織のR2*緩和速度との間の定量的な関係を調査した。二つの異なる腫瘍細胞系列（lines）を使用したが、生体環境中データは、鉄で標識付けされた細胞の数と組織のR2*との間にみごとな線形相関を示した。実験データはさらに、R2*測定が、鉄で標識付けされた細胞の定量のための信頼できかつ敏感なツールであることを示した。したがって、開示されたシステムおよび方法は、生体環境中での鉄で標識された細胞の、効果的な定量的な非侵襲的評価のために用いられうる。
【００３１】
まとめると、本開示のシステムおよび方法は、多様な応用における標識付けされた細胞のMR測定のための著しく高められた技法を提供する。実際、細胞移送および療法における現在の調査は、大量のSPIOで標識付けされた細胞を特定部位に注入することで始まる。その結果、標識付けされた組織およびその周辺組織におけるT2*が非常に短くなる。開示されるシステムおよび方法は、標識付けされた細胞の定量における著しい改善を、そのような組織系で遭遇されることになる超短T2*減衰にもかかわらず、容易にする。開示されるシステムおよび方法は、T2およびT2*緩和に著しい差異を引き起こす他の造影剤の超短T2*を測定するために適用することもできる。
【００３２】
本開示は例示的な実施形態およびその実装を参照して記載してきたが、開示されるシステムおよび方法はそのような例示的な実施形態／実装に限定されるものではない。むしろ、本稿の記載から当業者には明白であろうように、開示されるシステムおよび方法は、本開示の精神および範囲から外れることなく修正、変更および改善を受けうるものである。したがって、本開示は、その範囲内に、そのような修正、変更および改善をもはっきりと包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】複数グラジエント・エコー・シーケンスを使った標準的なT2*緩和測定の概略図である。
【図２】スピン・エコー・シーケンスを使った超短T2*緩和測定シーケンスの概略図である。
【図３ａ】腫瘍ラットのアキシャル方向のグラジエント・エコー画像である。
【図３ｂ】0.8msのエコー・シフトをもつアキシャル方向のスピン・エコー画像である。
【図３ｃ】プルシアンブルーで染色した腫瘍スライスの図である。
【図４ａ】ノイズを除去するために信号閾値によってマスキングされた通常のT2*マップを示す図である。
【図４ｂ】通常のT2*マップ上に重ねられた超短T2*マップを示す図である。
【図５ａ】標識付けされた横腹腫瘍の代表的なR2*マップを示す図である。
【図５ｂ】標識付けされていない横腹腫瘍の代表的なR2*マップを示す図である。
【図６ａ】鉄で標識付けされた細胞の異なる数についての腫瘍のヒストグラムの一つである。
【図６ｂ】鉄で標識付けされた細胞の異なる数についての腫瘍のヒストグラムの一つである。
【図６ｃ】鉄で標識付けされた細胞の異なる数についての腫瘍のヒストグラムの一つである。
【図７】R2*とmm3当たりの標識付けされた細胞数との線形相関を示すグラフである。
【図１】
2009531705.tif 000003
【図２】
2009531705.tif 000004
【図３ａ】
2009531705.tif 000005
【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４Ａ】
2009531705.tif 000008
【図４Ｂ】
2009531705.tif 000009
【図５Ａ】
2009531705.tif 000010
【図５Ｂ】
2009531705.tif 000011
【図６Ａ】
2009531705.tif 000012
【図６Ｂ】
2009531705.tif 000013
【図６Ｃ】
2009531705.tif 000014
【図７】
2009531705.tif 000015
【国際調査報告】
2009531705.tif 000016
2009531705.tif 000017
2009531705.tif 000018