(57)【要約】  本発明は、昆虫細胞膜の生理的コレステロールレベル、又はコレステロールを担持していない昆虫細胞膜の対照調製物と比較して、増加したコレステロールレベルを有する昆虫細胞膜の新規なコレステロール担持調製物であって、その膜の増加したコレステロールレベルのために増加した基質輸送活性を有するＡＢＣ輸送タンパク質を含む、前記のコレステロール担持膜調製物を提供する。本発明は、本発明の調製物を含む試薬キットにも関する。本発明は、前記調製物を製造する方法、更にコレステロール担持膜中に存在するＡＢＣ輸送体の任意種の活性を測定する方法、このアッセイ系において化合物と、化合物及びＡＢＣ輸送体の相互作用とを調査又は試験する方法にも関する。本発明は、ＡＢＣ輸送タンパク質が、昆虫細胞膜中のコレステロールにより活性化できるか否かを試験するために有用な試験系も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
同種の昆虫細胞膜の生理的コレステロールレベルと比較して、増加したコレステロールレベルを含むコレステロール担持の昆虫細胞膜調製物であって、生理的コレステロールレベルを有する同種の昆虫細胞膜中に存在する場合のＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性と比較して、増加した基質輸送活性を有する該ＡＢＣ輸送タンパク質を含む、上記昆虫細胞膜調製物。
【請求項２】
同種の昆虫細胞の膜の生理的コレステロールレベルと比較して、増加したコレステロールレベルを含むコレステロール担持の昆虫細胞調製物であって、生理的コレステロールレベルを有する同種の昆虫細胞の膜中に存在する場合のＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性と比較して、増加した基質輸送活性を有する該ＡＢＣ輸送タンパク質を含む、上記昆虫細胞調製物。
【請求項３】
コレステロールレベルが、
哺乳類細胞膜の対応するコレステロールレベルの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％であり、
昆虫細胞膜の生理的コレステロールレベルの少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも４倍、非常に好ましくは少なくとも６倍であり、
総タンパク質含量に対するコレステロール含量として計算され、少なくとも２５μｇ／ｍｇ総タンパク質、好ましくは少なくとも５０μｇ／ｍｇ総タンパク質である
請求項１又は２に記載の調製物。
【請求項４】
ＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性が、
ａ）小胞輸送アッセイ、及び／又は
ｂ）基質賦活ＡＴＰアーゼアッセイ
により試験される、請求項１又は２に記載の調製物。
【請求項５】
ＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性が、生理的コレステロールレベルを有する同種の昆虫細胞膜の対照調製物中に存在する場合の該ＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性より、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍、非常に好ましくは少なくとも５倍高い、請求項４に記載の調製物。
【請求項６】
ＡＢＣ輸送タンパク質がＡＢＣＧ２である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の調製物。
【請求項７】
ＡＢＣ輸送タンパク質がＢＳＥＰである、請求項１から４までのいずれか一項に記載の調製物。
【請求項８】
ＡＢＣ輸送タンパク質の活性を評価する試薬キットであって、
請求項１から７までのいずれか一項に記載の調製物、並びに／或いは
昆虫細胞中に該ＡＢＣ輸送体を発現する手段と、昆虫細胞にコレステロール及び／又はコレステロール類縁体を担持する手段と、場合により昆虫細胞から膜調製物を調製する手段、並びに
所望であれば、以下のいずれか、即ち、ＡＢＣ輸送タンパク質の基質、ＡＴＰ、コレステロール又はコレステロール類縁体、緩衝剤、試薬、対照、ＡＢＣ輸送タンパク質の阻害剤又は賦活剤
を含む、上記試薬キット。
【請求項９】
増加した基質輸送活性を有するＡＢＣ輸送タンパク質を含み、ＡＢＣ輸送タンパク質アッセイに使用するための昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物を製造する方法であって、
ここで該方法が、
昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物中に基質輸送活性を有するＡＢＣ輸送タンパク質を提供するステップ、
昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物にコレステロールを担持し、それにより昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物のコレステロールレベルを増加させるステップ、
コレステロールを担持していない同種の昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物における同種活性と比較して増加したＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性について、コレステロールを担持した、得られた昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物を試験するステップ
を含む、上記方法。
【請求項１０】
ＡＢＣ輸送タンパク質を含んだ昆虫細胞から細胞膜調製物を調製し、
シクロデキストリン及びコレステロール又はコレステロール類縁体との複合体と細胞膜調製物をインキュベートし、
未結合複合体を除去する
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
昆虫細胞中にＡＢＣ輸送タンパク質を発現させ、
シクロデキストリン及びコレステロール又はコレステロール類縁体との複合体と、ＡＢＣ輸送タンパク質を発現する前又は最中の昆虫細胞をインキュベートし、
未結合複合体を除去し、
昆虫細胞から細胞膜調製物を調製する
請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
昆虫細胞中にＡＢＣ輸送タンパク質を発現させ、
昆虫細胞から細胞膜調製物を調製する際、以下のステップ
ｉ）膜の分離、
ｉｉ）均質化、
ｉｉｉ）シクロデキストリン及びコレステロール又はコレステロール類縁体との複合体と、均質化調製物とのインキュベーション、並びに
ｉｖ）超遠心分離
を少なくとも含む
請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ＡＢＣ輸送タンパク質の増加した基質輸送活性が、
ａ）小胞輸送アッセイ、及び／又は
ｂ）基質賦活ＡＴＰアーゼアッセイ
により試験される、請求項９から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ＡＢＣ輸送タンパク質がＡＢＣＧ２又はＢＳＥＰである、請求項９から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
昆虫細胞膜の生理的コレステロールレベルと比較して増加したコレステロールレベル、及び生理的コレステロール含量を有する昆虫細胞膜中のＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性と比較して増加した基質輸送活性の該ＡＢＣ輸送タンパク質を含む昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物であって、請求項９から１４までのいずれか一項に記載の方法により得ることのできる、上記昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物。
【請求項１６】
ある化合物とＡＢＣ輸送タンパク質との相互作用を、該ＡＢＣ輸送タンパク質の活性を評価することにより調査するアッセイ方法であって、該アッセイ方法が、
昆虫細胞又は昆虫細胞膜調製物中の活性なＡＢＣ輸送タンパク質を提供するステップ、
ある化合物をＡＢＣ輸送タンパク質と接触させるステップ、
該化合物の存在下及び非存在下でＡＢＣ輸送タンパク質の活性を測定するステップ、
化合物の存在下及び非存在下で得られた活性値を比較するステップ
を含み、
ここで昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物が、昆虫細胞膜の生理的コレステロールレベルと比較して増加したコレステロールレベルを有する、
上記アッセイ方法。
【請求項１７】
少なくとも２種の化合物及びＡＢＣ輸送タンパク質との同時相互作用を、輸送タンパク質の活性を評価することにより試験するアッセイ方法であって、該アッセイ方法が、
昆虫細胞又は昆虫細胞膜調製物中の活性なＡＢＣ輸送タンパク質を提供するステップ、
第１の化合物をＡＢＣ輸送タンパク質と接触させるステップ、
該第１の化合物の存在下及び非存在下で、ＡＢＣ輸送タンパク質の活性を測定するステップ、
該第１の化合物の存在下及び非存在下で得た活性値を比較するステップ、
第１の化合物の存在下で、第２の化合物をＡＢＣ輸送タンパク質と接触させるステップ、
同時に第１及び第２の化合物の存在下で、ＡＢＣ輸送タンパク質の活性を測定するステップ、
第２の化合物の存在下及び非存在下で得られた活性値を比較するステップ、
第１の化合物の存在下での活性に対する第２の化合物の効果を評価するステップ
を少なくとも含み、
ここで昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物が、昆虫細胞膜の生理的コレステロールレベルと比較して増加したコレステロールレベルを有する、
上記アッセイ方法。
【請求項１８】
以下の少なくとも１つ、即ち
ＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性、好ましくはＡＢＣ輸送体の基質賦活ＡＴＰアーゼ活性、及び／又はＡＢＣ輸送体による基質の小胞輸送、
ＡＢＣ輸送体によるヌクレオチドの閉塞／捕捉、
ＡＢＣ輸送体の基準ＡＴＰアーゼ活性
が決定される、請求項１６又は１７に記載のアッセイ方法。
【請求項１９】
請求項１から７まで、及び請求項１５のいずれか一項に記載の昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物が使用され、並びに／或いは昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物が、請求項９から１４までのいずれか一項に従って調製される、請求項１６から１８までのいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項２０】
ＡＢＣ輸送タンパク質がＡＢＣＧ２である、請求項１６から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＡＢＣ輸送タンパク質がＢＳＥＰである、請求項１６から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物において、昆虫細胞膜中に埋め込まれたＡＢＣ輸送タンパク質の活性を増加させるための、コレステロール又はコレステロール類縁体の使用。
【請求項２３】
ＡＢＣ輸送タンパク質の増加した活性が、
ａ）小胞輸送アッセイ、及び／又は
ｂ）基質賦活ＡＴＰアーゼアッセイ
により試験される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
コレステロールが、コレステロール及びシクロデキストリンとの複合体の形態で使用される、請求項２２又は２３のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、昆虫細胞膜の生理的コレステロールレベル、又はコレステロールを担持していない昆虫細胞膜の対照調製物と比較して、増加したコレステロールレベルを有する昆虫細胞膜の新規なコレステロール担持調製物であって、その膜の増加したコレステロールレベルのために増加した基質輸送活性を有するＡＢＣ輸送タンパク質を含む、前記のコレステロール担持膜調製物を提供する。本発明は、本発明の調製物を含む試薬キットにも関する。本発明は、前記調製物を製造する方法、更にコレステロール担持膜中に存在するＡＢＣ輸送体の任意種の活性を測定する方法、このアッセイ系において化合物と、化合物及びＡＢＣ輸送体の相互作用とを調査又は試験する方法、並びに膜のコレステロールレベルの増加により、ＡＢＣ輸送体の基質輸送活性を増加させる方法にも関する。本発明は、ＡＢＣ輸送タンパク質が、昆虫細胞膜中のコレステロールにより活性化できるか否かを試験するために有用な試験系も提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＢＣ輸送タンパク質
ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体スーパーファミリーのタンパク質は、膜貫通タンパク質の最大のファミリーを形成する。それらの大部分は、細胞内膜及び細胞外膜を介して基質を移送するために、ＡＴＰ加水分解からのエネルギーを使用する輸送タンパク質である。大部分の場合における輸送は一方向であり、普通、真核細胞は、細胞質から細胞外マトリックスへ基質を排出する。該輸送体ファミリーは、系統発生解析に従って７種のサブファミリー（ＡＢＣＡからＡＢＣＧまで）に分類された、多くの構成員（現在４９種のヒトＡＢＣタンパク質が知られている）を含む［Ｄｅａｎ，Ｍ，Ｒｚｅｔｓｋｙ，Ａ  ｅｓ  Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ  Ｒ．，「ヒトＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体スーパーファミリー（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  ＡＴＰ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＡＢＣ）Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）」，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００１  １１，１１５６−１１６６］。ＡＢＣ輸送体は、生体を健康で機能的に維持する上で枢要な役割を果たす。その欠陥又は機能異常は、遺伝病のような疾患を起こす恐れがある。その生理的機能に焦点を当てた研究は、未だ比較的早期の段階にある。
【０００３】
ＡＢＣ輸送体スーパーファミリーの中で、数種の輸送体は多剤耐性輸送体として作用する。多剤耐性輸送体は、能動輸送によって、薬物を含めた多様な生体異物を細胞から排出できる輸送タンパク質である。多くの場合に、その活性の増加は、薬物療法に対する耐性を生じる恐れがある。該輸送体ファミリーの数種の構成員、例えばＭＤＲ１、ＭＲＰ１及びＡＢＣＧ２（ＭＸＲ／ＢＣＲＰ）は、薬物耐性の発現において役割を演じていることが示されてきた。そうした輸送体は、過剰発現や活性増幅が全くない場合でも薬物吸収の速度に相当な影響を及ぼす。幾つかの薬物は多剤輸送体の基質であるので、薬物開発中には、既に早期（「吸収、分布、代謝、排泄」の頭字語であるＡＤＭＥの早期）に、このような輸送体の基質となり得る分子を潜在的薬物候補分子の集団から除外することが、決定的に重要である。
【０００４】
膜輸送体を調査するアッセイ
膜輸送体は、細胞又は膜に基づくアッセイで通常調査される。膜アッセイのために、対象とする輸送体を細胞系で過剰発現させ、輸送体の発現後、膜調製物をこれらの細胞から分離する。昆虫−バキュロウィルス系のような昆虫依拠発現系が、タンパク質発現のために適用されることもよくある。昆虫細胞は、蛾のスポドプテラ・フルギペルダの卵巣細胞に由来することが最も多く、その一例はＳｆ９細胞である。
【０００５】
したがって、ＡＢＣ輸送体を調査する方法は特に重要であり、この目的のために膜アッセイが通常適用される。出願人自体のＳｏｌｖｏは、輸送体と候補薬又は先導薬との相互作用の調査に適した数種の膜アッセイの配給業者でもある。Ｓｏｌｖｏは、ＡＢＣＧ２（ＭＸＲ−Ｍ）を発現する哺乳類細胞由来の膜を用いて、これまでに膜アッセイを開発した。
【０００６】
輸送体の活性は、普通、ｉ）ＡＴＰの消費速度、ｉｉ）標識基質の輸送のモニターのいずれかにより測定される。ＡＴＰアーゼアッセイ（ｉ）では、活性化剤とも呼称されるように、輸送される基質がＡＴＰアーゼ活性を高めるので、輸送自体を直接測定するのではなく、基質を介したＡＴＰアーゼ活性の賦活を測定する。輸送アッセイ（ｉｉ）の中では、小胞輸送の決定が輸送体の調査において特に重要である。このアッセイでは、昆虫細胞膜からの反転膜小胞が使用され、基質は小胞中に輸送された後、そこに蓄積し、検出することができる。
【０００７】
インビトロモデルは、生理的表現型を緊密に模倣することが肝要である。
【０００８】
人間又は他の哺乳類の発現系から調製した膜は、ＡＢＣ輸送体の分野で広く使用されてきた。遺憾ながら、こうした発現系は、普通、輸送体のＡＴＰアーゼ活性の測定には不十分な有意に低めの発現量を生じる。その上、アッセイ対象の輸送体を過剰発現すべきであるが、哺乳類宿主細胞が発現する他の輸送体が、バックグランドの原因になり、又は、特にそうした輸送タンパク質の基質特異性が重複する場合、妨害作用を生じる恐れがある。
【０００９】
よりロバストな昆虫細胞発現系は、より高い発現率を普通示し、他の輸送体を含まないという明確な利点を有しており、したがって唯一種の輸送タンパク質を調べることができる。昆虫細胞膜の調製物に基づくアッセイは、安定で信頼性があり、取り扱い易いアッセイとして特に好ましく、数種のアッセイ系（基質賦活ＡＴＰアーゼ、小胞輸送及び／又はヌクレオチド閉塞）の提供が極めて頻繁になされている。
【００１０】
しかし、それ以外の点では有効で都合よい、昆虫細胞及び昆虫細胞膜調製物に基づくアッセイは、哺乳類細胞に基づくアッセイと比較してある種の妨害的差異を示し、そのため、薬物開発において有用で適切なアッセイ系としてのこのアッセイの価値に、疑いが掛けられている。
【００１１】
ある種のＡＢＣ輸送体について、例えばＭＤＲ１（ＡＢＣＢ１）及びＡＢＣＧ２の場合にも、高い基準ＡＴＰアーゼ活性のために、基質賦活ＡＴＰアーゼアッセイの感度が低下することが報告されてきた。基質を添加せずに測定するその基準ＡＴＰアーゼ活性は、内因性基質による活性化に起因することもあり、又は輸送体の部分的に共役していないＡＴＰアーゼ活性を反映していることもあると提案されてきた［Ｍ．Ｍ．Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｔ．Ｆｏｊｏ，Ｓ．Ｅ．Ｂａｔｅｓ，「癌における多剤耐性：ＡＴＰ依存性輸送体の役割（Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ：ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ）」，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２（２００２）４８−５８；Ｇ．Ｓｚａｋａｃｓ，Ｊ．Ｋ．Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ａ．Ｌｕｄｗｉｇ，Ｃ．Ｂｏｏｔｈ−Ｇｅｎｔｈｅ，Ｍ．Ｍ．Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，「癌における多剤耐性のターゲティング（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ）」，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ５（２００６）２１９−２３４］。
【００１２】
輸送体の活性、並びに様々な基質（サルファサラジン、トポテカン、プラゾシン、ミトキサントロン及びメトトレキセート）に対する感受性の驚くほど大きな差異が、哺乳類又は昆虫の細胞膜に基づくアッセイ間で認められた。Ｓｆ９膜中に発現される数種の輸送体については、賦活剤／基質に対する活性の軽減及び基質感受性の低下が認められた。ある種の基質に対しては、昆虫細胞由来小胞で測定した場合、輸送体が活性を示さなかった。
【００１３】
例えば野生型のＡＢＣＧ２輸送体の場合、基準ＡＴＰアーゼ活性が顕著であるにもかかわらず、Ｓｆ９細胞膜における基質薬物の賦活は相対的に小さかった。対照的に、分離した哺乳類細胞膜においては、ＡＢＣＧ２−ＡＴＰアーゼ活性は、多種の薬物基質により有意に賦活することができた。また、野生型ＡＢＣＧ２タンパク質のＡＴＰアーゼ活性は、昆虫細胞膜中で発現した場合、既知のＡＢＣＧ２基質であるプラゾシンにより賦活することができないことも報告された［Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｔ．，Ｋａｓａｍａｔｓｕ，Ｓ．，Ｈａｇｉｗａｒａ，Ｙ．，Ｍｉｔｏｍｏ，Ｈ．，Ｋａｔｏ，Ｒ．ａｎｄ  Ｓｕｍｉｎｏ，Ｙ．（２００３）「昆虫細胞におけるヒトＡＢＣ輸送体ＡＢＣＧ２変異体の発現及び機能特性の決定（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ＡＢＣＧ２  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｎ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ）」，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ  １８：１９４−２０２．；Ｏｚｖｅｇｙ，Ｃ．，Ｌｉｔｍａｎ，Ｔ．，Ｓｚａｋａｃｓ，Ｇ．，Ｎａｇｙ，Ｚ．，Ｂａｔｅｓ，Ｓ．，Ｖａｒａｄｉ，Ａ．ａｎｄ  Ｓａｒｋａｄｉ，Ｂ．（２００１）「昆虫細胞において発現されるヒト多剤輸送体、ＡＢＣＧ２の機能特性の決定（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，ＡＢＣＧ２，ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ）」，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２８５：１１１−１１７．］。
【００１４】
Ｓｆ９細胞中に発現した際の膜タンパク質はグリコシル化不十分なため、グリコシル化の喪失で、ＡＢＣＧ２−ＡＴＰアーゼ活性のこうした変化が起こり得ると推測された。ＡＢＣＧ２に関しては、グリコシル化は、その活性、プロセシング、膜局在化のいずれにも何ら効果を及ぼさないことが示された［Ｋ．Ｍｏｈｒｍａｎｎ，Ｍ．Ａ．ｖａｎ  Ｅｉｊｎｄｈｏｖｅｎ，Ａ．Ｈ．Ｓｃｈｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｈ．Ｓｃｈｅｌｌｅｎｓ，「Ｎ連結グリコシル化のないことが、乳癌耐性タンパク質（ＢＣＲＰ／ＡＢＣＧ２）の形質膜局在化に影響しない（Ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ａｆｆｅｃｔ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＣＲＰ／ＡＢＣＧ２））」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５６（２００５）３４４−３５０．；Ｎ．Ｋ．Ｄｉｏｐ，Ｃ．Ａ．Ｈｒｙｃｙｎａ，「ヒトＡＢＣ輸送体ＡＢＣＧ２の５９６位アスパラギンにおけるＮ連結グリコシル化は、発現、輸送活性、又は形質膜への移送に必須ではない（Ｎ−Ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ＡＢＣＧ２  ｏｎ  ａｓｐａｒａｇｉｎｅ  ５９６  ｉｓ  ｎｏｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｏｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４（２００５）５４２０−５４２９．］。
【００１５】
これまでのところ、Ｓｆ９系及びヒト系において発現した輸送体の生化学的特性を比較した直接的研究は、行われていない。
【００１６】
したがって、改善された生理的適性及び／又は改善された効率を有する、昆虫細胞、特に昆虫細胞膜調製物に基づくＡＢＣ輸送体アッセイに対する恒久的必要性が、当技術分野には存在する。
【００１７】
本発明者等は、昆虫細胞膜にコレステロールを担持させようとした際、新規な手法を適用した。
【００１８】
コレステロールのＡＢＣ輸送体との相互作用
コレステロールの特定のＡＢＣ輸送体との相互作用に関しては、ＭＤＲ１（ＡＢＣＢ１、Ｐ糖タンパク質又はＰ−ｇｐ）はラフト／カルベオラ（ｃａｌｖｅｏｌａ）ドメインに位置し、特定の条件下でのその活性は、コレステロール依存性であることが示唆された［Ｔｒｏｏｓｔ  Ｊ，Ｌｉｎｄｅｎｍａｉｅｒ  Ｈ，Ｈａｅｆｅｌｉ  ＷＥ，Ｗｅｉｓｓ  Ｊ．「細胞コレステロールの調節は多剤耐性細胞においてＰ糖タンパク質活性を変化させる（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ａｌｔｅｒｓ  Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｃｅｌｌｓ）」，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００４  Ｎｏｖ；６６（５）：１３３２−９．］。
【００１９】
この現象に関連して、Ｋａｍａｓｕ  ＳＷ及び共同研究者（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ，２００５  ４１（７）２０７−１６）は、コレステロールの減耗が、膜脂質の組成に影響し、Ｐ−ｇｐの局在化を調節し、その機能喪失を起こすことを見出した。コレステロールの減耗の結果、膜中のＰ−ｇｐの量が減少し、「ラフト」分画から密度のより高い分画へ移動した。
【００２０】
米国特許第６８５５８１２号の特許出願において、Ｈａｎｓｃｏｍ及び共同研究者は、Ｐ糖タンパク質に基づく手順を記載している。彼等は、コレステロールが特定のＡＢＣ輸送体の発現に影響することを認識していたが、その活性の差異を何ら示唆しておらず、ＡＢＣ輸送体の活性又は膜アッセイの効率を高めるために、コレステロールを適用することに関しては何も触れなかった。
【００２１】
実際には、ＭＤＲ１は、コレステロールの輸送体活性に対する効果が詳細に調査されてきた唯一のＡＢＣ輸送体である［Ｇａｒｒｉｇｕｅｓ，Ａ．，Ｅｓｃａｒｇｕｅｉｌ，Ａ．Ｅ．ａｎｄ  Ｏｒｌｏｗｓｋｉ，Ｓ．（２００２）「多剤輸送体のＰ糖タンパク質は、細胞膜におけるコレステロールの再分布を能動的に媒介する（Ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ａｃｔｉｖｅｌｙ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）」，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９９：１０３４７−１０３５２．］。コレステロールはＡＢＣＢ１の基質であることが示唆されたが、これは後に異議を受けた結論である［Ｌｅ  Ｇｏｆｆ，Ｗ．，Ｓｅｔｔｌｅ，Ｍ．，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｄ．（２００６）「細胞コレステロールの恒常性における多剤耐性Ｐ糖タンパク質の役割の再評価（Ｒｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）」，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４７：５１−５８．］。
【００２２】
他の輸送体についても、少なくとも一部はラフト／カベオラ系内に局在化していることが提案されてきた。Ｙｕｎｏｍａｅ及び共同研究者は、ジメチル−β−シクロデキストリンのＰ−ｇｐ及びＭＲＰ２の機能に対する阻害効果が、カベオラ中のコレステロール減耗による二次的効果として、これらの輸送体が頂端膜から媒体中に放出されたことに帰することができ、一方、ｍＲＮＡレベルには全く効果を示さないことを示唆した。したがって、活性に対するコレステロールの直接効果は観察されなかった［Ｙｕｎｏｍａｅ  Ｋ，Ａｒｉｍａ  Ｈ，Ｈｉｒａｙａｍａ  Ｆ，Ｕｅｋａｍａ  Ｋ．「Ｃａｃｏ−２細胞におけるＰ糖タンパク質性糖タンパク質及びＭＲＰ２の機能に対するジメチル−β−シクロデキストリンの阻害効果へのコレステロールの関与」，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００３  Ｆｅｂ  １１；５３６（１−３）：２２５−３１．］。
【００２３】
その他の膜輸送体の中で、既知のコレステロール輸送体であるＡＢＣＡ１（ＡＢＣ１）が主として調査された。Ｆｅｎｇ，Ｂｏ及びＴａｂａｓ，Ｉｒａ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２  ２７７（４８）４３２７１−４３２８０）は、ＡＢＣＡ１に媒介されるコレステロール及びリン脂質の排出が、コレステロール担持マクロファージにおいて当初誘発されたが、後に、遊離（非エステル化）コレステロールの蓄積（アテローム性動脈硬化病変の進行と並行する過程）と共に、その排出が阻害され、ＡＢＣＡ１タンパク質の量も減少すると記載している。
【００２４】
幾つかの特許出願［例えば、国際公開第００／１８９１２号（Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ｇ及びＫｌｕｃｋｅｎ  Ｊ．）、米国特許ＵＳ第２００４／００９６８５１号（Ｗａｎｇ  Ｎ．等）、米国特許ＵＳ第６６１７１２２号（Ｈａｙｄｅｎ  Ｍ．Ｒ．等）］では、様々なＡＢＣ輸送体の発現に対するコレステロールの効果が記載されている。しかし、当方の知識によれば、こうした特許出願のいずれも、コレステロール自体が輸送活性を高めようとは記載されていないし、言及さえしていない。
【００２５】
ＵＳ第２００４／０１８５４５６号では、著者等（Ｄｅｎｅｆｌｅ  Ｐ．及び共同研究者）は、明細書の実施例１７においてＡＢＣ１タンパク質のアゴニスト及びアンタゴニストの同定について記載している。該タンパク質の基質（例えば、コレステロール及びリン脂質）を含有する小胞が適用されている。しかし、上記の基質がＡＢＣ１の活性に及ぼす効果に関しては何ら示されていない。
【００２６】
したがって、コレステロールがＡＢＣ輸送タンパク質の活性に及ぼす効果に関する当技術分野での唯一の観察は、結果がやや相反するものであるとしても、ＭＤＲ１に関するものである。そうとは言え、こうした実験全てにおいて、著者等は、哺乳類細胞又はそれから調製した膜を使用したようである。既述のように、著者等の誰も、ＡＢＣ輸送体の活性を高めるためのコレステロールの適用可能性に言及しておらず、その上、このような手順の必要性さえ示唆もしていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
昆虫細胞膜の性能を改善しようとする研究において、本発明者等は、コレステロール感受性輸送能を恐らく有すると当技術分野で報告された唯一のＡＢＣ輸送体、即ちＭＤＲ１から開始することに決定した。本発明者等は、膜コレステロールの調節が、ＭＤＲ１多剤輸送体の活性に無視し得るほどの効果しか及ぼさないことを見出した。ＡＢＣ輸送体に関する、昆虫細胞又は昆虫細胞膜調製物に基づくアッセイの改善は、昆虫細胞膜のコレステロール担持によっては不可能であるとの結論が、必然的に導き出された。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
失望的な結果にもかかわらず、本発明者等は、正常レベルのコレステロールを含む昆虫細胞膜と比較して、コレステロールを担持しており、このようなコレステロール担持膜中に輸送活性が増加したＡＢＣ輸送体を含む昆虫細胞膜調製物及び昆虫細胞を、予想外なことに調製することができた。
【００２９】
とりわけ、本発明者等は、昆虫細胞又はそれに由来する膜調製物を、野生型ＡＢＣＧ２又はＢＳＥＰ（ＡＢＣＢ１１）のようにＡＢＣ輸送体を発現する昆虫発現系により構築でき、その輸送体の活性及び／又はリガンド感受性が、膜のコレステロール含量を増加させることにより増加することができることを、予想外にも見出した。本発明者等は、コレステロール担持が、通常、基質賦活ＡＴＰアーゼ及び小胞輸送の両アッセイにおいて、Ｓｆ９細胞膜に基づくアッセイ系の活性化を誘発することを見出した。
【００３０】
本発明は、同種の昆虫細胞膜の生理的コレステロールレベルと比較して、増加したコレステロールレベルを含む昆虫細胞膜のコレステロール担持調製物であって、活性な膜輸送タンパク質、好ましくはＡＢＣ輸送タンパク質を含む、前記の昆虫細胞膜調製物に関する。前記輸送タンパク質は、生理的コレステロールレベルを有する同種の昆虫細胞膜中に存在する場合の前記輸送タンパク質の基質輸送活性又は基質感受性と比較して、増加した基質輸送活性又は基質感受性を有することが好ましい。或いは、本発明は、コレステロールを担持していない昆虫細胞膜の対照調製物と比較して、増加したコレステロールレベルを有する昆虫細胞膜のコレステロール担持調製物であって、膜輸送体、好ましくは、昆虫細胞膜の対照調製物中に存在する場合の同じＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性又は基質感受性と比較して、増加した基質輸送活性又は基質感受性を有するＡＢＣ輸送タンパク質を含む、前記コレステロール担持膜調製物に関する。
【００３１】
コレステロールという用語は、本明細書では任意のコレステロール類縁体又はコレステロール誘導体を包含する。
【００３２】
本発明は、更に、同種の昆虫細胞の膜の生理的コレステロールレベルと比較して、増加したコレステロールレベルを含む昆虫細胞のコレステロール担持調製物であって、膜輸送体、好ましくはＡＢＣ輸送タンパク質を含む、前記の昆虫細胞調製物に関する。前記輸送体は、生理的コレステロールレベルを有する同種の昆虫細胞の膜中に存在する場合の前記ＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性又は基質感受性と比較して、増加した基質輸送活性又は基質感受性を有することが好ましい。
【００３３】
好ましくは、本発明の調製物において、コレステロールレベルは、
哺乳類細胞膜の対応するコレステロールレベルの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％であり、
昆虫細胞膜の生理的コレステロールレベルの少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも４倍、非常に好ましくは少なくとも６倍であり、
総タンパク質含量に対するコレステロール含量として計算され、少なくとも２５μｇ／ｍｇ総タンパク質、好ましくは少なくとも５０μｇ／ｍｇ総タンパク質
である。
【００３４】
好ましくは、該膜輸送体、好ましくはＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性又は基質感受性は、ａ）小胞輸送アッセイ、及び／又はｂ）基質賦活ＡＴＰアーゼアッセイにより試験される。好ましくは、ＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性又は基質感受性は、生理的コレステロールレベルを有する同種の昆虫細胞膜の対照調製物中に存在する場合の前記ＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性又は基質感受性より、好ましくは少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍、非常に好ましくは少なくとも５倍又は１０倍さえも有意に高い。
【００３５】
非常に好ましい実施形態では、ＡＢＣ輸送タンパク質はＡＢＣＧ２である。なお更に非常に好ましい実施形態では、ＡＢＣ輸送タンパク質はＢＳＥＰである。
【００３６】
更なる実施形態によれば、本発明は、ＡＢＣ輸送タンパク質の活性を評価する試薬キットであって、
本発明による調製物、並びに／或いは
昆虫細胞中に前記ＡＢＣ輸送体を発現する手段と、昆虫細胞にコレステロール及び／又はコレステロール類縁体を担持する手段と、場合により昆虫細胞から膜調製物を調製する手段、並びに
所望であれば、以下のいずれか、即ち、ＡＢＣ輸送タンパク質の基質、ＡＴＰ、コレステロール又はコレステロール類縁体、緩衝剤、試薬、対照、ＡＢＣ輸送タンパク質の阻害剤又は賦活剤
を含む上記キットに関する。
【００３７】
本発明は、更に、増加した基質輸送活性又は基質感受性を有するＡＢＣ輸送タンパク質を含み、ＡＢＣ輸送タンパク質アッセイに使用するための昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物を製造する方法であって、
昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物中で基質輸送活性又は基質感受性を有するＡＢＣ輸送タンパク質を提供するステップ、
昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物にコレステロールを担持し、それにより昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物のコレステロールレベルを増加させるステップ、
コレステロールを担持していない同種の昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物における同種活性と比較して、増加したＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性又は基質感受性について、コレステロールを担持して得られた昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物を試験するステップ
を含む上記方法に関する。
【００３８】
本発明の方法の好ましい変法では、
ＡＢＣ輸送タンパク質を含んだ昆虫細胞から細胞膜調製物を調製し、
シクロデキストリン及びコレステロール又はコレステロール類縁体との複合体と細胞膜調製物をインキュベートし、
未結合複合体を除去する。
【００３９】
本方法の更なる変法では、
昆虫細胞中にＡＢＣ輸送タンパク質を発現させ、
シクロデキストリン及びコレステロール又はコレステロール類縁体との複合体と、ＡＢＣ輸送タンパク質を発現する前又は最中の昆虫細胞をインキュベートし、
未結合複合体を除去し、
昆虫細胞から細胞膜調製物を調製する。
【００４０】
本方法の非常に好ましい変法では、
昆虫細胞中にＡＢＣ輸送タンパク質を発現させ、
昆虫細胞から細胞膜調製物を調製する際、以下のステップ
ｉ）膜の分離、
ｉｉ）均質化、
ｉｉｉ）シクロデキストリン及びコレステロール又はコレステロール類縁体との複合体と、均質化調製物とのインキュベーション、並びに
ｉｖ）超遠心分離
を少なくとも含む。
【００４１】
非常に好ましくは、ＡＢＣ輸送タンパク質の増加した基質輸送活性は、
ａ）小胞輸送アッセイ、及び／又は
ｂ）基質賦活ＡＴＰアーゼアッセイ
により試験される。
【００４２】
非常に好ましくは、ＡＢＣ輸送タンパク質はＡＢＣＧ２又はＢＳＥＰである。
【００４３】
本発明は、昆虫細胞膜の生理的コレステロールレベルと比較して増加したコレステロールレベル、及び生理的コレステロール含量を有する昆虫細胞膜中のＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性又は基質感受性と比較して、増加した基質輸送活性又は基質感受性の前記ＡＢＣ輸送タンパク質を含む昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物であって、本発明の方法により得ることのできる上記昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物にも関する。
【００４４】
本発明は、ＡＢＣ輸送タンパク質を含む膜のコレステロールの含量又はレベルを増加させることにより、ＡＢＣ輸送体活性を増加させる方法にも関する。この方法においては、本明細書に記載の任意の方法を適用することができる。
【００４５】
本発明は、ある化合物とＡＢＣ輸送タンパク質との相互作用を、前記ＡＢＣ輸送タンパク質の活性を評価することにより調査するアッセイ方法であって、前記アッセイ方法が、
昆虫細胞又は昆虫細胞膜調製物中の活性なＡＢＣ輸送タンパク質を提供するステップ、
ある化合物をＡＢＣ輸送タンパク質と接触させるステップ、
前記化合物の存在下及び非存在下でＡＢＣ輸送タンパク質の活性を測定するステップ、
前記化合物の存在下及び非存在下で得られた活性値を比較するステップ
を含み、ここで昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物が、昆虫細胞膜の生理的コレステロールレベルと比較して増加したコレステロールレベルを有する
上記アッセイ方法にも関する。
【００４６】
本発明は、少なくとも２種の化合物とＡＢＣ輸送タンパク質との同時相互作用を、前記輸送タンパク質の活性を評価することにより試験するアッセイ方法であって、前記アッセイ方法が、
昆虫細胞又は昆虫細胞膜調製物中の活性なＡＢＣ輸送タンパク質を提供するステップ、
第１の化合物をＡＢＣ輸送タンパク質と接触させるステップ、
前記第１の化合物の存在下及び非存在下でＡＢＣ輸送タンパク質の活性を測定するステップ、
前記第１の化合物の存在下及び非存在下で得られた活性値を比較するステップ、
第１の化合物の存在下で、第２の化合物をＡＢＣ輸送タンパク質と接触させるステップ、
同時に第１の化合物及び第２の化合物の存在下で、ＡＢＣ輸送タンパク質の活性を測定するステップ、
第２の化合物の存在下及び非存在下で得られた活性値を比較するステップ、
第１の化合物の存在下での活性に対する第２の化合物の効果を評価するステップ
を少なくとも含み、ここで昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物が、昆虫細胞膜の生理的コレステロールレベルと比較して増加したコレステロールレベルを有する
上記アッセイ方法にも関する。
【００４７】
本発明の好ましいアッセイ方法では、以下の少なくとも１つ、即ち
ＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性、好ましくはＡＢＣ輸送体の基質賦活ＡＴＰアーゼ活性、及び／又はＡＢＣ輸送体による基質の小胞輸送、
ＡＢＣ輸送体によるヌクレオチドの閉塞／捕捉、
ＡＢＣ輸送体の基準ＡＴＰアーゼ活性
が決定される。
【００４８】
本発明の更に好ましいアッセイ方法では、本発明による昆虫細胞調製物若しくは昆虫細胞膜調製物が使用され、及び／又は昆虫細胞調製物若しくは昆虫細胞膜調製物が、本発明の調製法のいずれかに従って調製される。
【００４９】
本発明のアッセイ方法では、ＡＢＣ輸送タンパク質はＡＢＣＧ２及び／又はＢＳＥＰである。
【００５０】
本発明は、昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物において、昆虫細胞膜中に埋め込まれたＡＢＣ輸送タンパク質の活性を増加させるための、コレステロール又はコレステロール類縁体の使用にも関する。好ましくは、ＡＢＣ輸送タンパク質は、ａ）小胞輸送アッセイ、及び／又はｂ）基質賦活ＡＴＰアーゼアッセイにより試験される。好ましくは、コレステロールは、コレステロール及びシクロデキストリンとの複合体の形態で使用される。
【００５１】
好ましい実施形態によれば、本発明において適用されるＡＢＣ輸送体はＭＤＲ１（ＡＢＣＢ１）とは異なる。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態によれば、輸送体、好ましくはＡＢＣ輸送体は、コレステロール結合領域を含む。好ましい実施形態では、本発明に従って有用なＡＢＣ輸送体は、触媒作用及び輸送に関与するその領域でコレステロールと相互作用をすることができる。更なる好ましい実施形態では、コレステロールは、ＡＢＣ輸送体に関してヌクレオチド閉塞を増加させる。
【００５３】
本発明は、ＡＢＣ輸送タンパク質が、昆虫細胞膜中でコレステロールにより活性化されることができるか否かを試験するために有用な試験系も提供する。本発明のこの実施形態では、ＡＢＣ輸送体の基質輸送活性と相関する、又はそれに対応する該タンパク質の活性を検出又は評価する任意のアッセイ又は測定方法は、コレステロールの添加がＡＢＣ輸送体を増加させたか否かを決定するために有用であり、適用することができる。好ましくは、このアッセイ方法によれば、ＡＢＣ輸送体は、コレステロールを担持した昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物、及びコレステロールを担持していない各対照調製物の中に与えられており、そのコレステロール担持調製物及び対照調製物について得られた活性値を比較し、前者の値が、対照試料について得た値より高い、好ましくは有意に高い、好ましくは少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍、非常に好ましくは少なくとも５倍高ければ、該ＡＢＣ輸送体は本発明において有用である。
【００５４】
定義
コレステロール類縁体は、コレステロールの化学構造の必須要素を含んだ化学構造を有し、少なくとも１つの機能的特徴、好ましくはコレステロールの以下の特徴：輸送体のコレステロール結合ドメインに結合すること、膜の流動性に影響すること、その環境中よりコレステロール含量の高い膜領域（ラフト又はカベオラなど）中に蓄積すること、基質としてコレステロールを輸送する輸送体の基質であること、の１つ又は複数を保持するコレステロール誘導体である。このようなコレステロール類縁体は、それだけに限らないが例えばステロイドホルモンである。
【００５５】
コレステロール誘導体は、置換又は付加から誘導できる化学構造を有するコレステロール類縁体を意味し、コレステロールの少なくとも１つの機能的特性、好ましくは以下の特性：任意の輸送体のコレステロール結合ドメインに結合すること、膜の流動性に影響すること、その環境中よりコレステロール含量の高い膜領域（ラフト又はカベオラなど）中に蓄積すること、基質としてコレステロールを輸送する輸送体の基質であること、の１つ又は複数を保持する。このようなコレステロール誘導体は、それだけに限らないが例えば、２，２−ヒドロキシコレステロール、２０，２２−ジヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、それらのＲ体及びＳ体、ケト変異体、ハロゲン又は擬ハロゲン類縁体及び誘導体などである。
【００５６】
好ましい変法によれば、コレステロール類縁体又は誘導体は、適切な検出手法を用いてコレステロールと共に検出でき、又は定量できる。例えば、適用される方法は、コレステロール及びコレステロール類縁体を部分的若しくは完全に一緒に溶出するクロマトグラフィー法でもよく、又はコレステロール及びコレステロール類縁体の特徴的なスペクトル成分が重複する分光法でもよい。
【００５７】
膜のコレステロール含量は、検出可能な総コレステロール含量、又はある種の場合にはコレステロール及びコレステロール類縁体（コレステロール誘導体など）の合計量を意味し、コレステロール含量は、コレステロール及びコレステロール誘導体などのコレステロール類縁体を全て一緒に測定できる、好ましくは定量的な、コレステロールの検出に適当な任意の方法により測定される。
【００５８】
コレステロール担持とは、コレステロール類縁体又はコレステロール誘導体の含量又はレベルを含めた、膜のコレステロール含量又はコレステロールレベルを増加させることを意味する。
【００５９】
コレステロール担持の膜又は細胞は、コレステロール含量を増加させるためにコレステロール担持を受けた膜又は細胞である。
【００６０】
生細胞の膜又は膜調製物のような細胞膜の生理的コレステロール含量又はレベルとは、例えば、上記のようにコレステロール類縁体及びコレステロール誘導体を含めた、コレステロールを含有しない培地又はコレステロールを補強しない培地における培養中の、コレステロールの担持又は減耗を人工的に誘発していないような細胞から誘導される、細胞膜又は任意の膜調製物において発現するコレステロール含量を意味する。この定義には、膜ドメインも含まれる。例えば、細胞型に依存する昆虫膜の生理的コレステロール含量は、哺乳類細胞膜と比較して約１０分の１である。
【００６１】
ＡＢＣ輸送タンパク質は、適当な条件下で、前記輸送体が存在する生体膜を介して前記輸送体の基質を輸送できるとき、「基質輸送活性」を有する。したがって、基質輸送活性は、前記活性の測定又は検出が可能であるか否かという事実に依存しない、ＡＢＣ輸送タンパク質の固有の生物学的性質である。ＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性は、以下のアッセイの１つ又は複数により通常、検出又は測定し得るものであり、該アッセイは、基質の輸送を直接示すことが普通可能である、細胞若しくは小胞輸送アッセイ、又はアッセイ条件を適当に設定すれば、通常、基質輸送を指示する、基質賦活ＡＴＰアーゼアッセイである。バナジン酸塩感受性又は阻害剤感受性ＡＴＰアーゼのアッセイを使用することが最も多い。基質感受性は、基質賦活ＡＴＰアーゼアッセイで測定した場合の活性に特異的に関係している。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】コレステロール含量が、ＡＢＣＧ２−Ｓｆ９（Ｓｆ９細胞由来）及びＡＢＣＧ２−Ｍ（哺乳類細胞由来で、特定の図ではＭＸＲ−Ｍ）からの膜調製物におけるバナジン酸塩感受性ＡＴＰアーゼ活性を調節することを示す図である。図１Ａ：様々な濃度の基質存在下での活性ＡＢＣＧ２含有昆虫膜［ＡＢＣＧ２−Ｓｆ９（Ａ）］のバナジン酸塩感受性ＡＴＰアーゼ活性。図１Ｂ：様々な濃度の基質存在下での活性ＡＢＣＧ２含有哺乳類細胞膜［ＡＢＣＧ２−Ｍ（Ｂ）］のバナジン酸塩感受性ＡＴＰアーゼ活性。膜タンパク質２０μｇを含有する膜調製物を様々な濃度の試験化合物と３７℃、４０分間インキュベートした後、バナジン酸塩感受性ＡＴＰアーゼ活性を決定した。図１Ｃ：ＡＢＣＧ２−Ｓｆ９（▲）膜及びＡＢＣＧ２−Ｍ（■）膜に、コレステロール＠ＲＡＭＥＢ複合体で処理することによりコレステロールを担持した。膜コレステロール含量は、コレステロールオキシダーゼ法で決定した。Ｘ軸上の濃度は、インキュベーション培地における総コレステロール濃度を表す。図１Ｄ：ＡＢＣＧ２−Ｓｆ９（▲）膜及びＡＢＣＧ２−Ｍ（■）膜のシクロデキストリン媒介コレステロール減耗を、図に示した濃度のＲＡＭＥＢの存在下で該膜を３７℃、３０分間インキュベートすることにより実施した。図１Ｅ及び図１Ｆ：コレステロール担持の最適化。担持手順の完了後、基準（●）活性及びサルファサラジン賦活（▲）活性をモニターした。インキュベーション時間を最適化するために、（Ｅ）ＡＢＣＧ２−Ｓｆ９膜を、図に示した時間、コレステロール＠ＲＡＭＥＢ（インキュベーション培地中の総コレステロール２ｍＭ）の存在下でインキュベートした。コレステロール担持を最適化するために、（Ｆ）ＡＢＣＧ２−Ｓｆ９膜を様々なコレステロール濃度の存在下で１時間インキュベートした。ＡＢＣＧ２−ＡＴＰアーゼ活性のデータは、２回の測定平均値±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図２】コレステロール担持Ｓｆ９膜含有ＡＢＣＧ２  ＡＢＣＧ２−Ｓｆ９細胞の活性化を、コレステロール＠ＲＡＭＥＢ（総コレステロール１ｍＭ）を用いて３７℃、３０分間コレステロールで担持したことを示す図である。ＡＢＣＧ２−Ｍ膜のコレステロール減耗を、ＲＡＭＥＢ８ｍＭを用いて３７℃、３０分実施したことを示す図である。図２Ａ：サルファサラジンで活性化したＳｆ９膜。上の曲線はコレステロール担持小胞、下の曲線は非処理対照。図２Ｂ：哺乳類膜由来の小胞のサルファサラジンによる活性化。下の曲線は、シクロデキストリンによるコレステロール減耗後の哺乳類細胞の残存活性を示す。上の曲線は非処理対照細胞を示す。図２Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ：トポテカン及びプラゾシンによる基質賦活を試験するために、トポテカン（Ｃ及びＤ）並びにプラゾシン（Ｅ及びＦ）で処理（３７℃、４０分）した際に、コレステロール担持（▲）及び対照（●）ＡＢＣＧ２−Ｓｆ９膜（Ｃ及びＥ）並びにコレステロール減耗（▲）及び対照（●）ＡＢＣＧ２−Ｍ膜（Ｄ及びＦ）のＡＢＣＧ２−ＡＴＰアーゼ活性化を決定した。データは、３回の平均値±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図３】ＡＢＣＧ２含有Ｓｆ９膜を用いた小胞輸送のコレステロール依存性を示す図である。図３Ａ：コレステロール担持前後の輸送活性。エストロン−３−硫酸の濃度０．０４６５μＭ、タンパク質含量２５μｇ／ウェル、インキュベーション時間１分。（実験を設定したとき、トリチウム標識エストロン−３−硫酸だけを使用したため、図５に示した実験と比較して低い濃度になっている）。図３Ｂ：コレステロール処理小胞におけるメトトレキセートの取込み量増加（実験設計：メトトレキセート１００μＭ、タンパク質含量５０μｇ／ウェル、インキュベーション時間１２分）。図３Ｃには、実験に用いた小胞のコレステロール含量を示してある。
【図４】ＡＢＣＧ２含有ＡＢＣＧ２−Ｓｆ９膜の小胞輸送活性に対するコレステロール担持の効果を示す図である。反転膜小胞が保持する標識化合物の量を、図に示したような様々な薬物濃度で測定した。図４Ａ：メトトレキセート濃度の関数としての小胞輸送活性（メトトレキセート取込み量）（メトトレキセート濃度曲線、タンパク質含量５０μｇ／ウェル、インキュベーション時間１２分）。図４Ｂ：コレステロール担持（▲）及び対照（●）反転膜小胞のプラゾシン取込みを３７℃、２０分実施した。データは、ＡＴＰ存在下及び非存在下での小胞取込み測定値の差として計算した。データは、２回の平均値±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図５】コレステロール担持ＡＢＣＧ２−Ｓｆ９膜調製物の試験を示す図である。コレステロール担持膜及び非担持膜のエストロン−３−硫酸小胞輸送の比較（エストロン−３−硫酸１μＭ、タンパク質含量２５μｇ／ウェル、インキュベーション時間１分）。
【図６】コレステロール−シクロデキストリン１ｍＭとの予備インキュベーション１０分の結果として、ｗｔ（野生型）ＡＢＣＧ２含有Ｓｆ９膜調製物のバナジン酸塩感受性ＡＴＰアーゼ活性の変化を示す図である。基準活性は、基質なしで測定した活性である。特異的ＡＢＣＧ２阻害剤活性のＫｏ１４３存在下では、活性を殆ど検出することができない。コレステロールの効果を調べるために、濃度所与の異なる３種の基質（ＥＫＩ、ＺＤ１８３９、プラゾシン）を適用した。
【図７】コレステロール予備インキュベートＳｆ９膜（１０分、コレステロール−シクロデキストリン１ｍＭ）のＡＴＰアーゼ活性に対する各種のＡＢＣＧ２基質及び阻害剤の効果を、濃度の関数として示す図である。
【図８】バキュロウィルス感染段階中にコレステロール担持を実施した場合のｗｔ  ＡＢＣＧ２含有Ｓｆ９膜調製物のバナジン酸塩感受性ＡＴＰアーゼ活性を示す図である。感受から２４時間後に、所与量のコレステロール＠ＲＡＭＥＢ複合体を培地に添加し、次いで更に４８時間インキュベートした。図は、処理していない膜調製物、又はコレステロール−シクロデキストリンの異なる３つの濃度でインキュベートした膜調製物のデータを表す。コレステロール−シクロデキストリン１ｍＭで、輸送体発現の減少を誘発した。膜調製物の最高コレステロール含量は、１６μｇ／ｍｇタンパク質を超えなかった。２種の基質（ＥＫＩ、プラゾシン）及び１種の特異的阻害剤（Ｋｏ１４３）の効果を所与濃度で試験した。
【図９】図９Ａは、均質化後の膜調製プロセス中にコレステロール担持を実施した場合のｗｔ  ＡＢＣＧ２含有Ｓｆ９膜調製物のバナジン酸塩感受性ＡＴＰアーゼ活性を示す。図９Ｂは、コレステロール−シクロデキストリン濃度の関数として膜のコレステロール含量の増加を示す。２種の基質（ＥＫＩ、プラゾシン）及び１種の特異的阻害剤（Ｋｏ１４３）の効果を所与濃度で試験した。
【図１０】反転Ｓｆ９膜小胞におけるＭＴＸのＡＴＰ依存性輸送に対するコレステロール又はシトステロール担持の効果を示す図である。ヒト野生型ＡＢＣＧ２（ＷＴ）又はＲ４８２Ｇ−ＡＢＣＧ２（Ｇ）輸送体を含有する膜小胞において、ＭＴＸ取込み量をＭＴＸ濃度１００μＭで３７℃、５分間測定した。黒色カラムは阻害剤なしのＭＴＸ小胞輸送、縞入りカラムは特異的ＡＢＣＧ２阻害剤Ｋｏ１４３の存在下でのＭＴＸ輸送。区画１は、非担持対照小胞（コレステロール８μｇ／ｍｇ膜タンパク質を含有する）におけるＭＴＸ取込み量を示し、区画２は、コレステロール−シクロデキストリン（Ｃ−ＣＤ）前処理小胞（コレステロール５６μｇ／ｍｇ膜タンパク質を含有する）におけるＭＴＸ取込み量を示し、区画３は、空虚シクロデキストリン（ＣＤ）前処理小胞（コレステロール５μｇ／ｍｇ膜タンパク質を含有する）におけるＭＴＸ取込み量を示す。区画４は、Ｓｆ９膜小胞におけるＭＴＸのＡＴＰ依存性取込み量に対するシトステロール担持の効果を示し、ＣＤ又はＣ−ＣＤ前処理同様にシトステロール−β−シクロデキストリン（Ｓ−ＣＤ）で小胞を前処理した。平均値±ＳＤを提示している。有意差を星印で示してある。
【図１１】Ｓｆ９膜小胞におけるＭＴＸ及びＥＳＧのＡＴＰ依存性取込み量に対するコレステロール担持の効果を示す図である。ヒト野生型ＡＢＣＧ２（ＷＴ）又はＲ４８２Ｇ−ＡＢＣＧ２（Ｇ）輸送体を含有する膜小胞において、ＭＴＸ及びＥＳＧの取込み量をＡＴＰ５ｍＭで３７℃、５分間測定した。この時間中、薬物取込み量は線形であった。平均値±ＳＤを提示している。図１１Ａ：ＭＴＸ取込み量のＭＴＸ濃度依存性。各基質濃度でのＡＢＣＧ２特異的取込み量は、Ｋｏ１４３ＡＢＣＧ２阻害剤１μＭの存在下で得た速度を差し引くことにより計算した。■：ヒト野生型ＡＢＣＧ２（ＷＴ）輸送体を含有する対照小胞（コレステロール８μｇ／ｍｇ膜タンパク質）におけるＭＴＸ取込み量、●：ヒト野生型ＡＢＣＧ２（ＷＴ）輸送体を含有するコレステロール担持小胞（コレステロール５６μｇ／ｍｇ膜タンパク質）におけるＭＴＸ取込み量、▲：ヒトＲ４８２Ｇ  ＡＢＣＧ２（Ｇ）輸送体を含有する対照小胞（コレステロール８μｇ／ｍｇ膜タンパク質）におけるＭＴＸ取込み量、△：ヒトＲ４８２Ｇ  ＡＢＣＧ２（Ｇ）輸送体を含有するコレステロール担持小胞（コレステロール６２μｇ／ｍｇ膜タンパク質）におけるＭＴＸ取込み量。図１１Ｂ：ＥＳＧ取込み量のＥＳＧ濃度依存性。■：ヒト野生型ＡＢＣＧ２（ＷＴ）輸送体を含有する対照小胞（コレステロール８μｇ／ｍｇ膜タンパク質）におけるＥＳＧ取込み量、□：Ｋｏ１４３の１μＭ存在下、ヒト野生型ＡＢＣＧ２（ＷＴ）輸送体を含有する対照小胞（コレステロール８μｇ／ｍｇ膜タンパク質）におけるＥＳＧ取込み量、●：ヒト野生型ＡＢＣＧ２（ＷＴ）輸送体を含有するコレステロール担持小胞（コレステロール５６μｇ／ｍｇ膜タンパク質）におけるＥＳＧ取込み量、○：Ｋｏ１４３の１μＭ存在下、ヒト野生型ＡＢＣＧ２（ＷＴ）輸送体を含有するコレステロール担持小胞（コレステロール５６μｇ／ｍｇ膜タンパク質）におけるＥＳＧ取込み量。図１１Ｃ：Ｓｆ９膜小胞におけるコレステロール担持によるＭＴＸ及びＥＳＧの輸送の相対的賦活。ヒト野生型ＡＢＣＧ２を含有するＳｆ９膜小胞において３７℃、５分、ＭＴＸ取込み量（●）はＭＴＸ濃度５０μＭで測定し、ＥＳＧ輸送量（□）はＥＳＧ  ２５μＭで測定した。同じ細胞調製物からの同量のＡＢＣＧ２を含有する各膜に、可変量のＣ−ＣＤ濃度を予備担持することにより、様々なコレステロール濃度を含有させた。図上の各データ点に対して、平均値±ＳＤを提示している。
【図１２】分離したＳｆ９膜調製物におけるＡＢＣＧ２のＡＴＰアーゼ活性に対するコレステロール担持の効果を示す図である。図１２Ａ：分離したＳｆ９膜調製物におけるバナジン酸塩感受性ＡＴＰアーゼ活性に対するコレステロール担持の効果。小胞中のＡＴＰアーゼ活性は、ヒト野生型ＡＢＣＧ２（ＷＴ）、Ｒ４８２Ｇ−ＡＢＣＧ２（Ｒ４８２Ｇ）又はＲ４８２Ｔ−ＡＢＣＧ２（Ｒ４８２Ｔ）輸送体を含有する膜において、３７℃、２０分間測定した。基準ＡＴＰアーゼ活性、及びＡＢＣＧ２輸送体の潜在的基質２種の効果を調べた。プラゾシンは２０μＭ濃度で適用し、ＥＫＩは１μＭ濃度で使用した。特異的ＡＢＣＧ２阻害剤のＫｏ１４３の効果を１μＭ濃度で測定した。平均値±ＳＤを提示している。対照膜はコレステロール８μｇ／ｍｇ膜タンパク質を含んでおり、一方コレステロール担持膜は、ｗｔ  ＡＢＣＧ２の場合にコレステロール５６μｇ／ｍｇ膜タンパク質、ＡＢＣＧ２−Ｒ４８Ｇの場合にコレステロール６２μｇ／ｍｇ膜タンパク質、及びＡＢＣＧ２−Ｒ４８２  Ｔ変異体の場合にコレステロール６５μｇ／ｍｇ膜タンパク質を含んでいた。白抜きカラム：基準ＡＴＰアーゼ活性、黒色カラム：ＥＫＩ１μＭ、明灰色カラム：プラゾシン２０μＭ、縞入りカラム：Ｋｏ１４３  １μＭ。図１２Ｂ及び図１２Ｃ：対照（Ｂ）及びコレステロール担持（Ｃ）Ｓｆ９細胞膜調製物における、ＡＢＣＧ２のＡＴＰアーゼ活性に対する各種薬物の賦活効果の濃度依存性。ＡＴＰアーゼ活性は、コレステロールを担持していない（左パネル）又はコレステロールを担持している（右パネル）ヒト野生型ＡＢＣＧ２を含有する膜において、３７℃、２０分間測定した。ＡＢＣＧ２特異的ＡＴＰアーゼ活性は、Ｋｏ１４３感受性活性分率として決定した。Ｃ−ＣＤによるコレステロール担持は、方法の項に記載のようにして実現した。各薬物は、少なくとも２つの独自の膜調製物中で試験し、３回の測定をした代表的実験において平均値±ＳＤを提示している。対照膜はコレステロール８μｇ／ｍｇ膜タンパク質を含んでおり、一方コレステロール担持膜小胞は、コレステロール４２μｇ／ｍｇ膜タンパク質を含んでいた。□：ケルセチン、●：ＥＫＩ−７８５、△：イレッサ、▼：プラゾシン、◇：トポテカン、◆：フラボピリドール、×：ＳＮ−３８。
【図１３】分離したＳｆ９膜調製物におけるヒトＡＢＣＧ２の触媒中間体（ヌクレオチド捕捉）の形成に対するコレステロール担持の効果を示す図である。Ｓｆ９細胞膜中に発現したヒト野生型ＡＢＣＧ２タンパク質による８−アジドヌクレオチド捕捉を、方法の項に記載したように、Ｃｏ−８−アジドＡＴＰ（α−３２Ｐ−８−アジドＡＴＰを含有する）の存在下、３７℃、２分間測定した。ＵＶ照射、ゲル電気泳動及び電気泳動的転写（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）の後、標識したバンドをＰｈｏｓｐｈｏ−Ｉｍａｇｅｒで可視化した。矢印は、免疫ブロットで同定したＡＢＣＧ２タンパク質の位置を示す。同量の野生型ＡＢＣＧ２タンパク質を含有する分離Ｓｆ９細胞膜に、方法の項に記載したように、Ｃ−ＣＤ４ｍＭとの予備インキュベーションによりコレステロールを担持した。コレステロール担持膜小胞は、コレステロール５０μｇ／ｍｇ膜タンパク質を含んでおり、一方対照膜は、コレステロール８μｇ／ｍｇ膜タンパク質を含んでいた。このアッセイにおいて、ＥＫＩ又はＫｏ１４３の濃度は１μＭであり、プラゾシンの濃度は２０μＭであった。図では代表的実験が示されている。
【図１４】非処理及びコレステロール処理マウスＢｓｅｐ昆虫膜小胞（Ｓｆ９）のバナジン酸塩感受性基準ＡＴＰアーゼ活性を示す図である。図１４Ａ：コレステロール担持膜小胞中でのバナジン酸塩感受性ＡＴＰアーゼアッセイにおける、非処理マウスＢｓｅｐ膜に対するタウロコール酸（◆）、グリココール酸（■）及びタウロケノデオキシコール酸（▲）の効果。基準値（■）も示されている。図１４Ｂ：バナジン酸塩感受性ＡＴＰアーゼアッセイにおける、処理マウスＢｓｅｐ膜に対するタウロコール酸（◆）、グリココール酸（■）及びタウロケノデオキシコール酸（▲）の効果。基準値（■）も示されている。
【図１５】ヒト／マウス／ラットＢｓｅｐ輸送体の小胞タウロコール酸（ＴＣ）輸送活性に対する、反転膜小胞のコレステロール担持の効果を示す図である。コレステロール担持（■）、対照（◆）。図１５Ａ：ラットＢｓｅｐ輸送体の活性に対するコレステロールの効果。コレステロール担持（■）、対照（◆）。図１５Ｂ：ヒトＢｓｅｐ輸送体の活性に対するコレステロールの効果。コレステロール担持（■）、対照（◆）。図１５Ｃ：マウスＢｓｅｐ輸送体の活性に対するコレステロールの効果。対照（■）、コレステロール担持（◆）。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
薬物輸送体の効果を調べるために使用する多くのアッセイは、昆虫細胞から精製した膜又は時には昆虫細胞自体に基づいている。昆虫細胞の感染に有用なウィルス系は、当技術分野で周知である。しかし、いずれの異種発現系も、異種タンパク質の自然環境とは異なる環境として慎重な態度で使用すべきであり、そうして相関及び検証研究が正当化される。しかし、この問題に直接対処した研究は殆どない。
【００６４】
ＡＢＣ輸送タンパク質の昆虫細胞依拠アッセイを哺乳類細胞依拠アッセイに近似させ、当技術分野で報告されている差異をできれば縮めようとした際に、本発明者等は、昆虫及び人間の形質膜小胞の変化したグリコシル化が、基質輸送の欠如や基準ＡＴＰアーゼ活性の増加などの前記輸送体の活性化プロファイルに観察される差異の原因になり得るとの仮説を立てた。しかし、ヒトＡＢＣＧ２−Ｍ膜中に発現したヒトｗｔ  ＡＢＣＧ２の脱グリコシル化は、そのＡＴＰアーゼ活性に影響しなかった。
【００６５】
更なる差異は、異なる膜組成に存在し得る。例えば、Ｓｆ９細胞に由来する膜のコレステロール含量は、以前に文献に記載のように低く［Ｇｉｍｐｌ．Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４（４２），１３７９４−８０１（１９９５）；Ｋｏｐａｎｃｈｕｋ  Ｓ  ｅｓ  Ｒｉｎｇｅｎ  Ａ，Ｐｒｏｃ  Ｅｓｔｏｎｉａｎ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｃｈｅｍ，５０（４），２２９−２４０］、本発明者等は、該膜が、哺乳類膜で測定した含量の２０％を含有することを見出した。
【００６６】
ＭＤＲ１（ＡＢＣＢ１）のコレステロール調節は、これまで文献中に報告されている。しかし、本発明者等が、このような昆虫細胞依拠アッセイ系（膜小胞を含む）において、昆虫細胞膜のコレステロール含量の増加により、哺乳類細胞で得られる活性により近似した輸送体活性を得ることが可能となり得ると初めて提案したようである。
【００６７】
したがって、本発明者等は、幾つかの実験設定で、無処置細胞又はＳｆ９細胞膜調製物中に発現されるヒトＭＤＲ１タンパク質に対する膜コレステロールの効果を調査したところ、本研究においても使用される条件下で、膜コレステロールレベルのこうした輸送体に対する効果は、無視し得る程度であることを見出した。より綿密に言えば、ＭＤＲ１−ＡＴＰアーゼの基準活性は僅かに増加するが、ベラパミル５０μＭで測定したベラパミル賦活最大ＡＴＰアーゼ活性は、コレステロール担持Ｓｆ９膜中で実際上無変化であることが判明した。
【００６８】
とは言えその結果、本発明者等は、昆虫細胞中に活性型で発現できる実際上任意のＡＢＣ輸送タンパク質を、昆虫細胞又は昆虫細胞膜小胞にコレステロール（又はコレステロール類縁体）を担持した際、その活性を増加させることができるか否かに関して、アッセイ形式に応じて試験できる、信頼性のある試験系を創出した。本明細書では、活性型は、前記ＡＢＣ輸送体の少なくとも１種の基質の輸送が、従来からの昆虫細胞又は昆虫細胞膜のアッセイ系又は形式ではたとえ検出できなくても、好ましくはこの輸送を行うことができるものとして理解される。
【００６９】
したがって、コレステロール感受性であることがこれまで知られている唯一の輸送体についての否定的結果にもかかわらず、本発明者等は、実験を継続し、コレステロールレベルの増加した昆虫細胞膜が、ＡＢＣＧ２及びＢＳＥＰなどの他のＡＢＣ輸送体に改善された環境をもたらすことを見出した。
【００７０】
ＡＢＣＧ２タンパク質は、薬物のＡＤＭＥに関与する最も重要な多剤輸送体の１種である。
【００７１】
昆虫細胞調製物中で行われた小胞輸送の直接研究によれば、膜コレステロールレベルの増加によって、ＡＢＣＧ２の最大輸送速度が２０倍までにさえ増加できることが示された。各種のシクロデキストリン複合体及び脂質小胞の使用によって、発明者等は、ＡＢＣＧ２に対するこの効果が、膜コレステロールの変化に選択的であることを見出した。基質賦活ＡＴＰアーゼアッセイの結果により、この知見が確認された。
【００７２】
ＡＢＣ輸送体発現細胞膜調製物におけるバナジン酸塩感受性及び阻害剤感受性膜ＡＴＰアーゼ活性は、これらのタンパク質の輸送活性と相関することが示された［Ｂ．Ｓａｒｋａｄｉ，Ｌ．Ｈｏｍｏｌｙａ，Ｇ．Ｓｚａｋａｃｓ，Ａ．Ｖａｒａｄｉ，「ヒト多剤耐性ＡＢＣＢ及びＡＢＣＧ輸送体：化学免疫防御系での関与（Ｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ＡＢＣＢ  ａｎｄ  ＡＢＣＧ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ：ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｃｈｅｍｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ８６（２００６）１１７９−１２３６．］。
【００７３】
本明細書に示すように、類似の挙動がＢＳＥＰについても見出された。ＢＳＥＰ（ＡＢＣＢ１１）は、主要な肝臓胆汁塩輸送体である。ＢＳＥＰの阻害は、胆汁への胆汁酸輸送を損なう恐れがあり、したがって薬物性肝毒性の原因になり得ることが示された。
【００７４】
膜コレステロールのこの効果は、該輸送体のＲ４８２Ｇ変異体の場合には存在しなかった。
【００７５】
こうした知見及び本明細書に示す技術的教示に基づいて、当業者は、ＡＢＣ輸送体を更に試験するように促され、そうすることが可能である。当業者であれば、試験する所与の更なるＡＢＣ輸送タンパク質が、本明細書で教示するように、生理的コレステロールレベルを有する同種の昆虫細胞膜中に存在する場合の前記ＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性と比較して、増加した基質輸送活性を有する輸送タンパク質であるか否かを容易に判定することになろう。
【００７６】
小胞輸送アッセイ及び基質賦活ＡＴＰアーゼアッセイなどのＡＢＣ輸送体を試験するアッセイ系は、コレステロール担持法と共に本明細書に開示されている。このようなアッセイの好ましい多くの技術的詳細は、当技術分野では周知のことである［それだけに限らないが、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂ．Ｓａｒｋａｄｉ，Ｅ．Ｍ．Ｐｒｉｃｅ，Ｒ．Ｃ．Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｕ．Ａ．Ｇｅｒｍａｎｎ，Ｇ．Ａ．Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ，「昆虫細胞におけるヒト多剤耐性ｃＤＮＡの発現は、高活性の薬物賦活膜ＡＴＰアーゼを生成する（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｃＤＮＡ  ｉｎ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ａ  ｈｉｇｈ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｒｕｇ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＡＴＰａｓｅ）」，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７（１９９２）４８５４−４８５８；Ｍ．Ｍｕｌｌｅｒ，Ｅ．Ｂａｋｏｓ，Ｅ．Ｗｅｌｋｅｒ，Ａ．Ｖａｒａｄｉ，Ｕ．Ａ．Ｇｅｒｍａｎｎ，Ｍ．Ｍ．Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｂ．Ｓ．Ｍｏｒｓｅ，Ｉ．Ｂ．Ｒｏｎｉｎｓｏｎ，Ｂ．Ｓａｒｋａｄｉ，「ヒト多剤耐性タンパク質の変異体における変化した薬物賦活ＡＴＰアーゼ活性（Ａｌｔｅｒｅｄ  ｄｒｕｇ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ＡＴＰａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１（１９９６）１８７７−１８８３；Ｃ．Ｏｚｖｅｇｙ，Ａ．Ｖａｒａｄｉ，Ｂ．Ｓａｒｋａｄｉ，「ヒトＡＢＣＧ２多剤耐性輸送体による薬物輸送、ＡＴＰ加水分解、及びヌクレオチド捕捉の特性決定。点変異による基質特異性の調節（Ｃｈｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ，ＡＴＰ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｐｐｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＡＢＣＧ２  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ａ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）」，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７（２００２）４７９８０−４７９９０を参照されたい］。
【００７７】
本明細書では、ＡＢＣ輸送体に対するコレステロールの作用様式に関する更なる指針が提供される。この機構は理論領域に属しており、それにより発明の範囲を制限するつもりはないが、以下に考察する結果により、当業者は、本発明の昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物において有用な更なるＡＢＣ輸送体を見出す助力を得ることができる。
【００７８】
とりわけ、コレステロール担持は、ＡＢＣＧ２に対する親和性に相対的に殆ど作用せずに、主に酵素活性に影響を及ぼした。したがって、小胞輸送に関して、ＡＢＣＧ２基質並びに基質特異性を特定する目的で、昆虫細胞から調製した形質膜を用いて過去に生成したデータは影響を受けないが、昆虫細胞系で得た以前のＡＢＣＧ２−ＡＴＰアーゼのデータは、特に高親和性基質に関して偽陰性を与えた恐れがある。このことは、コレステロール担持ＡＢＣＧ２−Ｓｆ９膜が、ハイスループットで薬物−ＡＢＣＧ２相互作用を研究するための優れた試験系であるという考えを支持している。
【００７９】
発明者等は、その研究においてコレステロールが起こすＡＢＣＧ２輸送阻害の兆候を観察したことはなく、コレステロールの基質性を疑問視している。代替的には、コレステロールは、ＡＢＣＧ２機能に対するアロステリック調節剤として作用し得る。ＡＢＣＧ２−ＡＴＰアーゼ活性及び小胞輸送のコレステロール媒介増強の機構を解明するには、更なる研究が必要である。その上、ＡＢＣＧ２の膜局在化は、こうしたコレステロール調節実験の過程で変化しないことが判明した。
【００８０】
分離したＳｆ９細胞膜調製物におけるＡＢＣ輸送体の触媒中間体を反映した、ＡＢＣＧ２による捕捉ヌクレオチドのバナジン酸塩依存性形成も、研究されてきた［Ｃ．Ｏｚｖｅｇｙ，Ａ．Ｖａｒａｄｉ，Ｂ．Ｓａｒｋａｄｉ，「ヒトＡＢＣＧ２多剤耐性輸送体による薬物輸送、ＡＴＰ加水分解、及びヌクレオチド捕捉の特性決定。点変異による基質特異性の調節（Ｃｈｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ，ＡＴＰ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｐｐｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＡＢＣＧ２  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ａ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）」，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７（２００２）４７９８０−４７９９０］。本実験では、発明者等は、コレステロール富化Ｓｆ９細胞膜中では、輸送される基質が、野生型ＡＢＣＧ２においても触媒中間体の形成速度を増加させることを見出した。この知見は、コレステロールが、触媒中間体の形成速度を増加させ、ＡＢＣＧ２の薬物基質依存性回転率を高めることを示している。
【００８１】
この研究では、発明者等は、膜コレステロールの効果が、野生型ＡＢＣＧ２タンパク質の第３膜貫通ループの提案された細胞内膜領域にＡｒｇ（Ｒ）を含有する、該タンパク質に対して特異的であることを認めた。このＡｒｇのＧｌｙ又はＴｈｒによる置換は、ＡＢＣＧ２の基質特異性を相当に変化させ、そのコレステロール調節を除外するようである。本実験によれば、これらのＡＢＣＧ２変異体は、コレステロール不足Ｓｆ９細胞膜中でしか輸送活性の有意な上昇を示し得ず、また、増加する膜コレステロールレベルで、該野生型タンパク質は、変異体の輸送能に近い輸送能を実現し得ることが示される。
【００８２】
こうした知見は、コレステロールによるこのタンパク質の非特異的な安定化又は調節を排除し、また、コレステロールが、ＡＢＣＧ２の触媒／輸送領域中に含まれる、ある領域と相互作用し得ることを示唆している。したがって、この領域は、ＡＢＣＧ２の基質認識、コレステロール調節の双方においてこのタンパク質領域の特別な役割を有し得る。
【００８３】
したがって、本発明のある実施形態では、当業者は、触媒及び輸送に関わる領域においてコレステロールと相互作用することができるＡＢＣ輸送体を探索するように助言される。その上、コレステロールが、ＡＢＣＧ２に対する基質親和性に相対的に殆ど作用せずに（場合によりＫＭの小さな変動で表現される）、回転率を増加させる、即ち酵素活性（場合によりＶｍａｘで表現される）を増加させるならば、好ましいことである。
【実施例】
【００８４】
１．実験手順
別途明言しない限り、以下の実験手順を適用した。
【００８５】
化学薬品及び生化学薬品：［３Ｈ］−メトトレキセートは、Ｍｏｒａｖｅｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ブレア、ＣＡ、米国）から購入した。［３Ｈ］−エストロン−３−硫酸及び［３Ｈ］−プラゾシンは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／ＮＥＮ（ボストン、ＭＡ、米国）から購入した。トポテカンはＬＫＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（セントポール、ＭＮ、米国）から購入した。ＡＢＣＧ２に対する抗体はＡｂｃａｍ（ケンブリッジ、英国）から購入した。ランダムメチル化β−シクロデキストリン（ＲＡＭＥＢ）及びＲＡＭＥＢのコレステロール複合体［コレステロール＠ＲＡＭＥＢ（Ｐｉｅｌ等、２００６年）、コレステロール含量４．７４％］は、Ｃｙｃｌｏｌａｂ（Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（ブダペスト、ハンガリー）から提供された。Ｋｏ１３４及びＫｏ１４３（Ａｌｌｅｎ等、２００２年）は、ＧＪ  Ｋｏｏｍｅｎ教授（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、アムステルダム）からのご親切な贈呈品であった。他の試薬は、本文中に別途言及のない限りＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ＭＯ、米国）から購入した。
【００８６】
昆虫細胞でのタンパク質発現：Ｓｆ９細胞発現については、ヒトＡＢＣＧ２及びその変異体のｃＤＮＡを組換えバキュロウィルス移入ベクター中にクローニングし、昆虫細胞を培養し、バキュロウィルスに感染させたが、それについては［Ｃ．Ｏｚｖｅｇｙ−Ｌａｃｚｋａ，Ｇ．Ｋｏｂｌｏｓ，Ｂ．Ｓａｒｋａｄｉ，Ａ．Ｖａｒａｄｉ，「ＡＢＣＧ２多剤輸送体の単一アミノ酸（４８２）変異体：輸送能及び基質認識の主要な差異（Ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（４８２）ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＢＣＧ２  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ：ｍａｊｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）」，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １６６８（２００５）５３−６３］の記載に従った。ウィルス感染Ｓｆ９細胞を採集し、細胞膜を分離し、膜タンパク質濃度を以前に記載のように決定した［Ｃ．Ｏｚｖｅｇｙ，Ｔ．Ｌｉｔｍａｎ，Ｇ．Ｓｚａｋａｃｓ，Ｚ．Ｎａｇｙ，Ｓ．Ｂａｔｅｓ，Ａ．Ｖａｒａｄｉ，Ｂ．Ｓａｒｋａｄｉ，「昆虫細胞において発現されるヒト多剤輸送体、ＡＢＣＧ２の機能特性の決定（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，ＡＢＣＧ２，ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ）」，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２８５（２００１）：１１１−１１７．；Ｃ．Ｏｚｖｅｇｙ−Ｌａｃｚｋａ，Ｇ．Ｋｏｂｌｏｓ，Ｂ．Ｓａｒｋａｄｉ，Ａ．Ｖａｒａｄｉ，「ＡＢＣＧ２多剤輸送体の単一アミノ酸（４８２）変異体：輸送能及び基質認識の主要な差異（Ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（４８２）ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＢＣＧ２  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ：ｍａｊｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）」，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １６６８（２００５）５３−６３．；Ｍ．Ｍｕｌｌｅｒ，Ｅ．Ｂａｋｏｓ，Ｅ．Ｗｅｌｋｅｒ，Ａ．Ｖａｒａｄｉ，Ｕ．Ａ．Ｇｅｒｍａｎｎ，Ｍ．Ｍ．Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｂ．Ｓ．Ｍｏｒｓｅ，Ｉ．Ｂ．Ｒｏｎｉｎｓｏｎ，Ｂ．Ｓａｒｋａｄｉ，「ヒト多剤耐性タンパク質の変異体における変化した薬物賦活ＡＴＰアーゼ活性（Ａｌｔｅｒｅｄ  ｄｒｕｇ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ＡＴＰａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１（１９９６）１８７７−１８８３．］。
【００８７】
ＡＢＣＧ２の発現量は、ＢＸＰ−２１モノクローナル抗体及び強化化学発光法（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて免疫ブロットにより検出した。ＡＢＣＧ２発現の定量は、免疫ブロットのデンシトメトリーで実現した。
【００８８】
ＡＢＣＧ２脱グリコシル化：酵素的脱グリコシル化は、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼ  Ｆ（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）を用いて行った。５００単位／ｍｌの該酵素１μｌを、ＴＭＥＰ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭマンニトール、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、８μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、５０μｇ／ｍｌ  ＰＭＳＦ、２ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．０）中の膜懸濁液（５ｍｇタンパク質／ｍｌ）５０μｌに添加し、激しく混合し、３７℃、１０分間インキュベートした。脱グリコシル化はウェスタンブロットで検出した。
【００８９】
Ｓｆ９細胞のコレステロール担持：β−メチルシクロデキストリンコレステロール複合体（コレステロール＠ＲＡＭＥＢ複合体）を、Ｓｆ９細胞にコレステロールを担持するために使用した（Ｃｙｃｌｏｌａｂ  Ｌｔｄ．カタログ番号：ＣＹ−９００２．０）。文献中で知られているコレステロール担持のための任意の手順を適用できる（例えば、Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．１９９９，１４５（４）：８７７−８７を参照されたい）。Ｓｆ９細胞の感染から２４時間以内に、コレステロール＠ＲＡＭＥＢ複合体を培地に添加するように、通常使用される手法を改良した。この方法の好ましい変法では、例えばＢｓｅｐ測定では、ＨＢＳＳ緩衝液に希釈した膜調製中の感染細胞に、コレステロール−シクロデキストリンを添加するように、通常使用される手法を改良した。
【００９０】
Ｓｆ９小胞のコレステロール担持：β−メチルシクロデキストリンコレステロール複合体（コレステロール＠ＲＡＭＥＢ複合体）を、Ｓｆ９小胞にコレステロールを担持するために使用した（Ｃｙｃｌｏｌａｂ  Ｌｔｄ．カタログ番号：ＣＹ−９００２．０）。その手順は、文献中で知られているコレステロール担持のための手法に従った（Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．１９９９，１４５（４）：８７７−８７）。手短に言うと、コレステロール−シクロデキストリンの存在下でその膜を３０分間インキュベートした。「ろ板ろ過（ｆｉｌｔｅｒ  ｐｌａｔｉｎｇ）」又は遠心分離により、遊離しているシクロデキストリン又はコレステロール＠ＲＡＭＥＢ複合体を含有する培地から、小胞を分離した。このような処理膜をＡＴＰアーゼ及び小胞輸送の実験のために使用した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いたコレステロール含量の決定のために、試料の一部及び幾らかの非処理小胞を保管しておいた。
【００９１】
例えば、変異体及び野生型ＡＢＣＧ２を比較する際に使用するこの方法の変法では、分離した膜を既述のように調製したが、最終の遠心分離段階の前に、多様なＲＡＭＥＢシクロデキストリン調製物（Ｃｙｃｌｏｌａｂから得られるＣＤ、Ｃ−ＣＤ又はＳ−ＣＤ）の２〜４ｍＭと４℃、２０分間インキュベートした。シクロデキストリンは、次の高速遠心分離の過程で除去された。膜調製物を等分量に小分けして−８０℃で保存し、前記のように、Ａｍｐｌｅｘレッドキットによりコレステロール含量を見積もった。
【００９２】
以下の実験では、前記したコレステロール担持法の１つを採用した。
【００９３】
膜小胞の調製：膜小胞を以前に記載のように調製した（Ｓａｒｋａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．ＪＢＣ，１９９２，Ｖｏｌ．２６７，Ｎｏ．７，ｐｐ４８５４−８；Ｏｚｖｅｇｙ  ｅｔ  ａｌ．ＢＢＲＣ，２００１，Ｖｏｌ．２８５，ｐｐ．１１１−１１７）。
【００９４】
ヒト膜小胞調製物（ＡＢＣＧ２−Ｍ）並びにＡＢＣＧ２を発現する昆虫細胞から得た膜小胞調製物（ＭＸＲ−Ｓｆ９）を、Ｓｏｌｖｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ブダペスト、ハンガリー、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｌｖｏ．ｃｏｍ／）から入手した。両方の膜は、ＡＢＣＧ２の野生型体を過剰発現している。昆虫膜小胞調製物は、ＡＢＣＧ２をコードする組換えバキュロウィルスを用いて生成した（Ｏｚｖｅｇｙ等、２００２年）。以前に記載（Ｓａｒｋａｄｉ等、１９９２年）のように、Ｓｆ９細胞を培養し、組換えバキュロウィルス保存株で感染させた。本質的に以前に記載した（Ｓａｒｋａｄｉ等、１９９２年）ように、バキュロウィルス感染Ｓｆ９細胞からの精製膜小胞を調製した。膜のタンパク質含量は、ＢＣＡ法を用いて決定した（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ロックフォード、ＩＬ、米国）。
【００９５】
コレステロールの減耗：これは、ラフト及び／又はカベオラに位置する酵素、並びにシグナル伝達経路に関与するタンパク質の活性を阻害するために、文献中で知られているように行った（Ｋｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎｓ  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９８，Ｖｏｌ．１４０，Ｎｏ．６，ｐｐ１３５７−６７；Ｌｏｃｋｗｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，Ｖｏｌ．２７５，Ｎｏ．１６，ｐｐ１１９３４−４２；Ｖａｉｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．２００２，Ｖｏｌ．３９１，Ｐｔ３，ｐｐ９５−１００）。処理の後、前記のようにろ過（「ろ板」）又は遠心分離によりシクロデキストリンを除去した。処理膜、非処理膜の両方について、ＡＴＰアーゼ及び小胞輸送の活性を測定し、コレステロール含量を測定した。
【００９６】
コレステロール含量の決定：小胞を０．５％コール酸Ｎａを含有する希釈液中に懸濁した。この方法は、コレステロールの酵素的変換に基づいており、それをコレステロールオキシダーゼでコレスト−４−エン−３−オン誘導体に変換し、次いでその酸化残存物をＨＰＬＣで分析する。元のコレステロール及びシクロデキストリンのＨＰＬＣシグナルが干渉し合うので、この変換が必要であったし、必須である。
【００９７】
輸送活性の測定：輸送体のＡＴＰアーゼ活性は、文献中で知られているようにそのバナジン酸塩感受性に基づいて測定される（Ｎｏｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００１，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．５，ｐｐ１２２３−３１；Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ．Ｔｒａｎｓｍ．，ｉｎ  ｐｒｅｓｓ；Ｏｚｖｅｇｙ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．「昆虫細胞において発現されるヒト多剤輸送体、ＡＢＣＧ２の機能特性の決定（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，ＡＢＣＧ２，ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ）」，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００１  Ｊｕｌ  ６；２８５（１）：１１１−７．；Ｓａｒｋａｄｉ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）「昆虫細胞におけるヒト多剤耐性ｃＤＮＡの発現は、高活性の薬物賦活膜ＡＴＰアーゼを生成する（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｃＤＮＡ  ｉｎ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ａ  ｈｉｇｈ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｒｕｇ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＡＴＰａｓｅ）」，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７：４８５４−４８５８；ｗｗｗ．ｓｏｌｖｏｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍを参照されたい）。
【００９８】
ＡＢＣＧ２の場合には、各種の活性化剤（基質）（サルファサラジン、トポテカン、プラゾシン、ミトキサントロン及びメトトレキセート）の存在下、濃度依存的にＡＴＰアーゼ活性を測定した。シクロデキストリン又はコレステロール＠ＲＡＭＥＢ複合体で処理した試料を、非処理小胞と比較した。
【００９９】
Ｂｓｅｐの場合には、各種の活性化剤（基質）（タウロケノデオキシコール酸、タウロコール酸、グリココール酸）の存在下、濃度依存的にＡＴＰアーゼ活性を測定した。コレステロール＠ＲＡＭＥＢ複合体で処理した試料は、非処理小胞と比較した。
【０１００】
手短に言うと、例えば、ＡＴＰアーゼアッセイ緩衝液（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、４ｍＭアジ化ナトリウム、１ｍＭウアバイン）、５ｍＭ  ＡＴＰ及び各種濃度の試験薬物において、膜小胞（２０μｇ／ウェル）を３７℃、４０分間インキュベートした。ＡＴＰアーゼ活性は、１．２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムの存在下及び非存在下で測定した無機リン酸遊離量の差として決定した（バナジン酸塩感受性ＡＴＰアーゼ活性）。更なる実験では、基質２種及び／又は基質と阻害剤の組合せを試験するとき、製造業者の提案に従ってＡＢＣＧ２−ＡＴＰアーゼ活性を決定するために、ＰＲＥＤＥＡＳＹ  ＡＢＣＧ２−ＡＴＰａｓｅキット（ＳＢ−ＭＸＲ−ＨＡＭ−ＰＲＥＤＥＡＳＹ−ＡＴＰａｓｅキット；Ｓｏｌｖｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、セゲド、ハンガリー）を用いた。
【０１０１】
小胞輸送活性の測定：バキュロウィルス感染Ｓｆ９（スポドプテラ・フルギペルダ）細胞又は哺乳類（ＡＢＣＧ２−Ｍ）細胞から分離した、ＡＢＣＧ２又はＢｓｅｐを含有する精製膜小胞を用いて、輸送活性の測定を実施した。膜調製物は、５〜１６％の閉じた、反転配向した膜小胞を含有する。輸送体は、これらの小胞の内側で分子を移送する。小胞は、グラスフィルター又はニトロセルロース膜を通して膜懸濁液を（減圧を用いて）急速ろ過することにより、分離することができる。
【０１０２】
輸送される分子の定量的決定は、幾つかの方法で行うことができ、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳだけでなく蛍光又は放射標識も適切である。このアッセイではトリチウム標識基質を使用し、検出方式は液体シンチレーションであった。
【０１０３】
ＡＢＣＧ２の場合の小胞輸送活性の測定：より詳細には、例えば、反転膜小胞を４ｍＭ  ＡＴＰの存在下又は非存在下でインキュベートした。メトトレキセートの小胞輸送については、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、７０ｍＭ  ＫＣｌ中で３７℃、１２分間測定を実施した。その輸送を冷洗浄緩衝液（４０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、７０ｍＭ  ＫＣｌ）の添加により停止した。
【０１０４】
プラゾシンの小胞輸送については、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２５０ｍＭスクロース及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する緩衝液を３７℃、２０分間インキュベートした。その輸送を冷洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；２５０ｍＭスクロース及び１００ｍＭ  ＮａＣｌ）の添加により停止した。
【０１０５】
エストロン−３−硫酸の小胞輸送については、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２５０ｍＭスクロース及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する緩衝液を３２℃、１分間インキュベートした。その輸送を冷洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；２５０ｍＭスクロース及び１００ｍＭ  ＮａＣｌ）の添加により停止した。
【０１０６】
次いで、クラスＢガラス繊維フィルター（孔径０．１μｍ）を通してインキュベーション混合物を急速にろ過した。氷冷洗浄緩衝液５×２００μｌでフィルターを洗浄し、フィルター上に保持された放射活性を液体シンチレーション計数で測定した。ＡＴＰ存在下での値からＡＴＰ非存在下で得られた値を差し引くことにより、ＡＴＰ依存性輸送を計算した。
【０１０７】
ＡＢＣＧ２に対する例示的なアッセイ設計及び主要ステップ
アッセイ緩衝液中で適当な濃度の膜懸濁液を調製し、その懸濁液に非標識及び３Ｈ標識基質を添加する。９６ウェルマイクロタイタープレート中に懸濁液を分配する。
基質：
３Ｈ−エストロン−３−硫酸（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＮＥＴ−２０３／９．２５ＭＢｑ）
３Ｈ−メトトレキセート（Ｍｏｒａｖｅｋ、ＭＴ７０１）
エストロン−３−硫酸（Ｓｉｇｍａ、Ｅ０２５１）
メトトレキセート
インキュベーション温度で予備インキュベートし、ＭｇＡＴＰの添加によりアッセイを開始する。
インキュベートし、冷洗浄緩衝液（４℃）の添加により反応を停止する。
ろ板（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：ＭＳＦＢＮ６Ｂ１０）上でろ過し、洗浄緩衝液で洗浄する。
空フィルター上に既知量の膜懸濁液滴を置いて、１分当たり総カウント（ｃｐｍ）を決定する。
ろ板を乾燥する。
測定対象のウェルにシンチレーション混合液を添加する。
液体シンチレーション分析計で測定する。
得られたｃｐｍから輸送速度を計算する。
【０１０８】
Ｂｓｅｐの場合の小胞輸送活性の測定：バキュロウィルス感染Ｓｆ９（スポドプテラ・フルギペルダ）細胞から分離した、ヒト、ラット又はマウスのＢｓｅｐ（ＡＢＣＢ１１、ｓＰｇｐ）輸送体を含有する精製膜小胞を用いて、輸送活性の測定を実施した。膜調製物は、５〜１６％の閉じた、反転配向した膜小胞を含有する。輸送体は、これらの小胞の内側で分子を移送する。小胞は、グラスフィルター又はニトロセルロース膜を通して膜懸濁液を（減圧を用いて）急速ろ過することにより、分離することができる。
【０１０９】
輸送される分子の定量的決定は、幾つかの方法で行うことができ、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳだけでなく蛍光又は放射標識も適切である。このアッセイではトリチウム標識基質を使用し、検出方式は液体シンチレーションであった。
【０１１０】
Ｂｓｅｐに対するアッセイ設計及び主要ステップ
アッセイ緩衝液中で適当な濃度の膜懸濁液を調製し、その懸濁液に非標識及び３Ｈ標識基質を添加する。９６ウェルマイクロタイタープレート中に懸濁液を分配する。
基質：
３Ｈ−タウロコール酸（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＮＥＴ−３２２／９，２５ＭＢｑ）
タウロコール酸（Ｓｉｇｍａ、Ｔ０７５０）
インキュベーション温度で予備インキュベートし、ＭｇＡＴＰの添加によりアッセイを開始する。
インキュベートし、冷洗浄緩衝液（４℃）の添加により反応を停止する。
ろ板（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：ＭＳＦＢＮ６Ｂ１０）上でろ過し、洗浄緩衝液で洗浄する。
空フィルター上に既知量の膜懸濁液滴を置いて、１分当たり総カウント（ｃｐｍ）を決定する。
ろ板を乾燥する。
測定対象のウェルにシンチレーション混合液を添加する。
液体シンチレーション分析計で測定する。
得られたｃｐｍから輸送速度を計算する。
【０１１１】
コレステロール含量の決定：膜のコレステロール含量は、コレステロールオキシダーゼ法を用いて決定した（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ等、１９９２年）。反応混合物１０μｌ（５００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１００ｍｇ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．４）を１ｍｇ／ｍｌのコレステロールオキシダーゼ酵素（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、バーゼル、スイス）１０μｌ及び膜５０μｌと混合した。溶液を３７℃、３０分間インキュベートした。メタノール／エタノール溶液（５０％（ｖ／ｖ））１００μｌの添加により反応を停止し、更に３０分間０℃でインキュベートした。７００ｇ、５分間の遠心分離後、上清２５μｌをＨＰＬＣで分析した。クロマトグラフィー分離のために、ＨＰＬＣ（１１００シリーズセット、Ａｇｉｌｅｎｔ、サンタクララ、ＣＡ、米国）及びＣ１８逆相クロマトグラフィーカラム（３μＭ、１００＊２ｍｍ  Ｌｕｎａ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、トランス  ＣＡ、米国）を使用した。移動相として１％（ｖ／ｖ）酢酸／メタノールを用い、流速０．３ｍｌ／分で検体を分離した。２４１ｎｍでＵＶ検出器を用いて酸化されたコレステロールを検出した。コレステロールレベルを定量するために、コレステロール較正外部標準を使用した。
【０１１２】
データ分析：薬物濃度の対数の関数としてのＡＴＰ加水分解速度のプロットから、薬物のＡＴＰアーゼ活性を変化させる効力を、以下のＳ字形用量−反応一般式の非線形回帰により求めた。
【数１】
2009536832.tif 000002
【０１１３】
式中、ｖ＝反応（ｎｍｏｌ  Ｐｉ／分／ｍｇ）、Ｖｍｉｎ＝最小反応、Ｖｍａｘ＝最大反応、ＥＣ５０＝最大反応（効力）の５０％を生じるリガンド濃度、［Ａ］＝試験薬物の実濃度、及びヒル勾配は、協同性の程度を特徴付けるパラメーターである。ＥＣ５０は、国際薬理学連合委員会に従って定義されている（Ｎｅｕｂｉｇ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｐｅｄｄｉｎｇ，Ｍ．，Ｋｅｎａｋｉｎ，Ｔ．ａｎｄ  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．（２００３）「受容体の命名及び薬物の分類に関する国際薬理学連合委員会。ＸＸＸＶＩＩＩ。定量薬理学の用語及び記号に関する最新版（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＸＸＸＶＩＩＩ．Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｔｅｒｍｓ  ａｎｄ  ｓｙｍｂｏｌｓ  ｉｎ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ  ５５：５９７−６０６．）。
【０１１４】
輸送体は、同じ薬物に対して少なくとも１つの高親和性及び１つの低親和性阻害性結合部位を有することが多い。したがって、釣鐘形反応曲線を得ることが頻繁にあった。こうしたタイプの曲線については、２つのＳ字形反応を組み合わせた以下の式が使用された。
【数２】
2009536832.tif 000003
【０１１５】
式中、ｖ＝反応（ｎｍｏｌ  Ｐｉ／分／ｍｇ）、Ｖｍｉｎ１及びＶｍｉｎ２＝最小反応、Ｄｉｐ＝最大反応、ＥＣ５０１及びＥＣ５０１＝最大反応（効力）の５０％を生じるリガンド濃度、［Ａ］＝試験薬物の実濃度、並びにヒル勾配１及びヒル勾配２は、協同性の程度である。
【０１１６】
試験薬物濃度の関数としてのＡＴＰアーゼ活性のプロットから、次式の非線形回帰により、ミカエリス−メンテンパラメーターの最大速度（Ｖｍａｘ）及び薬物親和性（Ｋｍ）を求めた。
【数３】
2009536832.tif 000004
【０１１７】
式中、ｖ＝酵素活性（ｎｍｏｌ  Ｐｉ／分／ｍｇ）、Ｖｍａｘ＝最大ＡＴＰアーゼ活性（ｎｍｏｌ  Ｐｉ／分／ｍｇ）、Ｋｍ＝試験基質に対するミカエリス−メンテン定数（ｎＭ）、及び［Ｓ］は基質濃度（ｎＭ）である。式３は、小胞輸送のグラフ上での曲線の当てはめにも使用した。
【０１１８】
例えば、曲線の当てはめのために、Ｖｍａｘ及びＫｍ勾配計算のＰＲＩＳＭ３．０ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用することができる。
【０１１９】
２．昆虫膜及び人間膜を比較するための実験
２．１  基質の存在下及び非存在下でのＳｆ９膜及びヒト膜に関するＡＢＣＧ２−ＡＴＰアーゼアッセイの比較、パラメーターの最適化
Ｓｆ９膜調製物をヒト膜調製物と比較したとき、以下の結果を得た。両方の膜は、ＡＴＰ（ＡＢＣＧ２−Ｓｆ９膜及びＡＢＣＧ２−Ｍ膜について各々２．０ｍＭ及び２．２ｍＭ）に関するバナジン酸塩感受性基準ＡＴＰアーゼ活性、並びにメトトレキセート（３．９ｍＭ及び３．６ｍＭ）に関するＡＴＰ依存性［３Ｈ］メトトレキセート小胞輸送に対して、類似のＫＭ値を示した。両方の場合に、選択的ＡＢＣＧ２阻害剤のＫｏ１４３、１μＭで輸送を阻害することができた。
【０１２０】
しかし、類似性以外に、有意な差異が認められた。サルファサラジン、トポテカン及びプラゾシンのようなＡＢＣＧ２基質は、Ｓｆ９膜のＡＴＰアーゼ活性に僅かしか影響しなかった（サルファサラジンは弱い活性化剤であったが、トポテカン及びプラゾシンは弱い阻害剤であった。図１Ａを参照）が、以上の３化合物は、ヒト膜のＡＴＰアーゼ活性を有意に賦活した（図１Ｂ）。したがって、Ｓｆ９膜調製物はこれらの基質の試験に適していなかった。
【０１２１】
昆虫膜及び哺乳類膜の脂質組成は、有意に相違していることがこれまでに知られている［Ｇｉｍｐｌ，Ｇ．，Ｋｌｅｉｎ，Ｕ．，Ｒｅｉｌａｎｄｅｒ，Ｈ．ａｎｄ  Ｆａｈｒｅｎｈｏｌｚ，Ｆ（１９９５）「バキュロウィルス感染昆虫細胞におけるヒトオキシトシン受容体の発現：高親和性結合がコレステロール−シクロデキストリン複合体により誘発される（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｏｘｙｔｏｃｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ：ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１３７９４−１３８０１］。本発明者等は、ＡＢＣＧ２タンパク質を含有するＡＢＣＧ２−Ｓｆ９小胞及びＡＢＣＧ２−Ｍ小胞のコレステロール含量が、顕著に異なっており、ＡＢＣＧ２−Ｓｆ９はコレステロールレベルが約１／４〜１／５であることを見出した（６．５μｇ／ｍｇタンパク質対２８．９９μｇ／ｍｇタンパク質（図１Ｃ）及び６．２６対２３．６８（図１Ｄ））。コレステロール＠ＲＡＭＥＢ処理を用いた両方の膜へのコレステロール担持により、ＡＢＣＧ２−Ｓｆ９小胞ではコレステロール含量が約１５倍増加し、ＡＢＣＧ２−Ｍ小胞では３倍増加して、両膜において最終的なコレステロール含量が約９０μｇ／ｍｇタンパク質となった（図１Ｃ）。それに対し、ＲＡＭＥＢ処理により、両膜からコレステロールが非常に効率的に除去された（図１Ｄ）。
【０１２２】
更なる実験のために、ＡＢＣＧ２発現Ｓｆ９膜のコレステロール担持を、接触時間（図１Ｅ）及び担持コレステロール濃度（図１Ｆ）に関してＡＴＰアーゼ活性のために最適化した。図２及び図４に示した実験のために、最適な時間及び濃度として３０分及び１ｍＭコレステロール＠ＲＡＭＥＢを選定した。処理後の膜コレステロール含量は、約６０μｇ／ｍｇタンパク質で、ＡＢＣＧ２−Ｍ膜中より約２倍大きい。発明者等はこれらの値を選択したが、その理由は、こうした条件下では、膜コレステロール含量がいずれのパラメーターに対しても相対的に不感応性であり（図１Ｅ及びＦ）、そのためコレステロール担持膜の再現生成が可能であったからである。
【０１２３】
ＡＢＣＧ２−Ｍ膜のコレステロール減耗のために、８ｍＭのＲＡＭＥＢを用いた３０分処理を選択し、平均コレステロール含量３．５μｇ／ｍｇタンパク質の膜調製物を得た。
【０１２４】
２．２  コレステロールの担持又は減耗後、サルファサラジン存在下での昆虫細胞及び哺乳類細胞のＡＴＰアーゼ活性の比較
非処理Ｓｆ９小胞のバナジン酸塩感受性ＡＢＣＧ２（ＭＸＲ）ＡＴＰアーゼ活性は、サルファサラジンの存在下、２０ｎｍｏｌ／Ｐｉ／ｍｇ  ｐｒｏｔ／分（図２のパネルＡ、下方の曲線）から５ｎｍｏｌ／Ｐｉ／ｍｇ  ｐｒｏｔ／分増加した。コレステロール担持後、基準活性は、ほぼ３５ｎｍｏｌ／Ｐｉ／ｍｇ  ｐｒｏｔ／分に増加し（図２のパネルＡ、上方の曲線）、サルファサラジンにより５８ｎｍｏｌ／Ｐｉ／ｍｇ  ｐｒｏｔ／分（！）へ更に活性化することができた。
【０１２５】
哺乳類細胞から調製した小胞の基準活性は、２５ｎｍｏｌ／Ｐｉ／ｍｇ  ｐｒｏｔ／分未満であり、サルファサラジンにより４０ｎｍｏｌ／Ｐｉ／ｍｇ  ｐｒｏｔ／分へ増加することができたが、その細胞のコレステロール減耗により、両活性値とも有意に低下した（図２のパネルＢ、上方の曲線）。したがって、基準活性、サルファサラジン存在下で測定した最高活性の両方とも、非処理細胞では増加したが、コレステロール担持Ｓｆ９膜で得られた活性と比較すれば、共に有意に低かった。
【０１２６】
同様に、トポテカン及びプラゾシンとも、コレステロール担持ＡＢＣＧ２−Ｓｆ９膜（図２Ｃ及びＥ）並びにＡＢＣＧ２−Ｍ膜（図２Ｄ及びＦ）においてＡＢＣＧ２−ＡＴＰアーゼを有意に賦活したが、非処理ＡＢＣＧ２−Ｓｆ９膜（図２Ｃ及びＥ）並びにコレステロール減耗ＡＢＣＧ２−Ｍ膜（図２Ｄ及びＦ）は反応しなかった。ＡＢＣＧ２−ＡＴＰアーゼに関する速度データを表１に要約してある。このテータは、コレステロール担持ＡＢＣＧ２−Ｓｆ９膜及びＡＢＣＧ２−Ｍ膜について得たＶｍａｘ値間の良好な相関を示す。しかし、各基質に対して認めたＫｍ値は、コレステロール担持ＡＢＣＧ２−Ｓｆ９膜の方が約１．５〜３．０倍大きかった。
【表１】
2009536832.tif 000005
【０１２７】
異なる膜調製物の間で相違があるとはいえ、所与の各膜調製物内では、有意なコレステロール依存性が各場合において常に認められた。
【０１２８】
３．コレステロール担持の小胞輸送活性に対する効果
放射性同位体技術の支援を得て、ＡＴＰアーゼ活性の増加は、基質分子の実際の輸送と相関することを示すことができる。ＡＴＰアーゼアッセイ同様に、「反転」膜小胞を使用し、このアッセイは、標識基質のＡＴＰ依存性取込みを特徴としていた。ＡＴＰアーゼアッセイ同様に、輸送活性は、基質としてＥ３Ｓ（エストロン−３−硫酸、図３Ａ）又はメトトレキセート（図３Ｂ）のいずれかを使用したとき、小胞のコレステロール含量と相関していた（図３）。ＡＴＰアーゼ活性の測定で観察されたように、コレステロールは、哺乳類膜由来の小胞より、Ｓｆ９細胞から調製した小胞の輸送活性を多く増加させる。図３Ｃには、実験に使用した小胞のコレステロール含量を示す。
【０１２９】
図４に示すように、小胞輸送の基質濃度依存性をメトトレキセートで調べた。ミカエリス−メンテンの速度式が適用できるという仮定に基づいて、このデータを計算した。表２に示すように、Ｖｍａｘは６倍増加するが、ＫＭ値は僅かしか変化しない。
【表２】
2009536832.tif 000006
【０１３０】
図５では、Ｓｆ９のコレステロール処理膜及び非処理膜のエストロン−３−硫酸輸送を比較している。実施例１に詳述したように、Ｓｏｌｖｏが用いるＥ３Ｓ小胞アッセイの標準手順に従って実験を行った。
【０１３１】
４．異なる方法で異なるコレステロール担持をした膜を用いるＡＴＰアーゼ活性の測定
ＡＴＰアーゼアッセイでは、コレステロール担持の技術と関係なく、全ての野生型（ｗｔ）ＡＢＣＧ２発現Ｓｆ９膜調製物は、対照小胞と比較して、有意に高い基質依存性活性変化（一部の例では１００％）を示した。この試験に使用した基質の効果は、哺乳類起源の膜調製物を用いて既に前に示されていたが、ＳｆＳＦ９の場合には、基質が誘発する効果は、あるにしても無視できる程度に過ぎなかった。現在の知識に従えば、コレステロール処理が基質特異性を改変することはない。当該の系を最適化するために、Ｓｆ９膜のコレステロール担持を以下の３経路を介して行った。
ａ）ＡＴＰアーゼアッセイ直前のコレステロール担持。分離した膜小胞を１ｍＭのコレステロール−シクロデキストリン中で３７℃（９８．６Ｆ）、１０分間インキュベートした後、未結合のコレステロール＠ＲＡＭＥＢ複合体を遠心分離で除去し、次いでＡＴＰアーゼアッセイを実施した（図５及び７、下記の表３）。
ｂ）生細胞へのコレステロール担持。バキュロウィルスのＳｆ９感染から２４時間して、コレステロール＠ＲＡＭＥＢ複合体を所与濃度で培地へ添加し、更に４８時間培養した。こうした処理細胞から膜を調製した（図８）。
ｃ）膜調製中のコレステロール担持。均質化の後で超遠心分離の前に、コレステロール担持ステップを実施し、そのとき調製物を０．５〜２ｍＭのコレステロール−シクロデキストリンで＋４℃（３９．２Ｆ）、２０分間処理する。この方法は、最も有効であることが判明し、膜のコレステロール担持量が最高である一方、小胞の寸法及び量は未変化のままであった（図９）。
【０１３２】
コレステロール担持各種の結果を以下に簡潔に述べる。
【０１３３】
方法ａ）
ｗｔ  ＡＢＣＧ２含有Ｓｆ９膜調製物に対するコレステロール予備インキュベーションの効果を図６に示す。Ｓｆ９膜調製物の相対的に高い基準ＡＴＰアーゼ活性は、コレステロール処理の結果増加する。特異的ＡＢＣＧ２阻害剤Ｋｏ１４３の存在下では、その効果は無視し得る程度であり、コレステロールによって変化していない。調査した３種の基質（ＥＫＩ、ＺＤ１８３９及びプラゾシン）では、コレステロール処理は、効果が有意でなかった対照膜とは対照的に、非常に有意なＡＴＰアーゼ活性の増加を起こした。
【０１３４】
下記の表は、コレステロール処理ｗｔ  ＡＢＣＧ２膜（項目ａによる）を用いたＡＴＰアーゼアッセイで有効であった、調査対象のＡＢＣＧ２基質の効果を要約している。膜調製物をコレステロールで処理しなかったとき、＊＊標示基質では効果が認められなかった。ベラパミル、ミトキサントロン及びローダミンは、ＡＴＰアーゼアッセイにおいて、コレステロール処理膜を用いたときでも全く効果を示さなかった。
【表３】
2009536832.tif 000007
【０１３５】
図７は、コレステロールで予備インキュベートしたＳｆ９膜のＡＴＰアーゼ活性に対して示された、重要な特定のＡＢＣＧ２基質及び阻害剤に関する濃度依存性の賦活及び阻害効果を図示している。この結果から、活性化剤及び阻害剤の有効濃度は、哺乳類膜に適用される濃度に類似していることが確認される。
【０１３６】
方法ｂ）
Ｓｆ９細胞のバキュロウィルス感染中に生細胞へコレステロール担持をすることは、予備インキュベーション法と比較して、その効果が低いが、なお検出可能であった。しかし、この方法の使用は、輸送体発現が、早くも１ｍＭのコレステロール＠ＲＡＭＥＢ複合体で減少し、その上、この濃度を超えると複合体が毒作用を示す、という事実によって制限される。最終的小胞のコレステロール含量は、方法ｃ）を適用した場合よりはるかに低い。図８は、代表的実験の結果を示す。
【０１３７】
方法ｃ）
図９は、方法ｃ）に従って膜調製プロセス中に実行したときのコレステロール担持の効率を示す。他の独自の調製同様の結果が得られた。所与の担持濃度での基準活性に変化はないが、各基質の最大効果は、方法ａ）に従って担持した小胞の場合と同様な範囲にある。この結果によれば、コレステロール担持に２ｍＭのコレステロール−シクロデキストリンを使用することは、本発明のコレステロール担持のこの実施形態において好ましい。本発明のこの実施形態の非常に好ましい変法では、０．５５ｍＭのコレステロール＠ＲＡＭＥＢ複合体を含有するＨＢＢＳ（ｐＨ７．４）培地中で、膜調製物を３７℃（９８．６Ｆ）、３０分間インキュベートする。
【０１３８】
ＥＫＩが基質であるときのコレステロール担持膜では、基質存在下でのバナジン酸塩感受性ＡＴＰアーゼ活性は、低いＡＴＰ濃度（０．２〜０．４ｍＭ）でもより高いことに留意されたい。
【０１３９】
５．コレステロール担持のＡＢＣＧ２変異体に対する比較効果
この１組の実験では、野生型ＡＢＣＧ２のその変異体との系統的比較を実施した。
【０１４０】
５．１．分離Ｓｆ９細胞膜を用いた実験
無処置細胞で観察したコレステロール効果の分子的詳細を探るために、ＡＢＣＧ２及びその変異体Ｒ４８２Ｇ、Ｒ４８２ＴをＳｆ９細胞中に発現させた。こうした細胞は、ほぼ等しい輸送タンパク質量でヒトＡＢＣＧ２変異体を多量に発現するように操作された［Ｏｚｖｅｇｙ−Ｌａｃｚｋａ  ｅｔ  ａｌ，「ＡＢＣＧ２多剤輸送体の単一アミノ酸（４８２）変異体：輸送能及び基質認識の主要な差異（Ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（４８２）ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＢＣＧ２  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ：ｍａｊｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）」，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １６６８（２００５）５３−６３］。その上、Ｓｆ９細胞の分離膜では、直接小胞輸送、薬物賦活ＡＴＰアーゼ活性、触媒的中間体形成（ヌクレオチド捕捉）のいずれも調べることができた［Ｏｚｖｅｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，「ヒトＡＢＣＧ２多剤耐性輸送体による薬物輸送、ＡＴＰ加水分解、及びヌクレオチド捕捉の特性決定。点変異による基質特異性の調節（Ｃｈｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ，ＡＴＰ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｐｐｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＡＢＣＧ２  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ａ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）」，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７（２００２）４７９８０−４７９９０］。同じこの系で、発明者等は、以前に記載されたように、ヒトＭＤＲ１タンパク質に対するコレステロールの効果も調べた［Ｓａｒｋａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．「昆虫細胞におけるヒト多剤耐性ｃＤＮＡの発現は、高活性の薬物賦活膜ＡＴＰアーゼを生成する（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｃＤＮＡ  ｉｎ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ａ  ｈｉｇｈ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｒｕｇ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＡＴＰａｓｅ）」，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７（１９９２）４８５４−４８５８］。
【０１４１】
内因性コレステロールを相対的に低レベルで含有するＳｆ９細胞膜のコレステロール担持のために、発明者等は、コレステロール−βシクロデキストリン（Ｃ−ＣＤ、コレステロール＠ＲＡＭＥＢ）との４℃での該膜の短い予備インキュベーションを施した後、この作用剤をその後の遠心分離ステップ中に除去した。Ｓｆ９細胞膜調製物における当初の膜コレステロール含量は、５〜８μｇ／ｍｇ膜タンパク質であって、１〜５ｍＭのＣ−ＣＤ予備インキュベーションにより、このコレステロール含量は、６０〜８０μｇ／ｍｇ膜タンパク質まで徐々に増加することができた。
【０１４２】
小胞輸送試験：こうした実験では、発明者等は、ＡＢＣＧ２発現Ｓｆ９細胞の分離した反転膜小胞を使用して、ＡＴＰ依存性基質輸送の直接測定を実施した。
【０１４３】
図１０は、こうした膜小胞におけるヒトＡＢＣＧ２タンパク質のメトトレキセート（ＭＴＸ）輸送活性に対して、膜コレステロール担持が及ぼす効果を示す。膜へのコレステロール（Ｃ−ＣＤ）担持は、初期の膜コレステロールを６５μｇコレステロール／ｍｇ膜タンパク質へ上げたとき、野生型ＡＢＣＧ２の輸送活性を大幅に増加させ、１５〜２０倍の増加を生じた。発明者等は、コレステロール担持後に、Ｓｆ９膜小胞におけるエストラジオールβ−１７−グルクロニド（ＥＳＧ、下記を参照）及びエストロン３−硫酸（Ｅ３Ｓ、示していない）のＡＢＣＧ２依存性取込みの同様に大きな増加を見出した。発明者等は、遊離シクロデキストリン（ＣＤ）で前処理しても、ヒトＡＢＣＧ２タンパク質のＭＴＸ（図１０を参照）、ＥＳＧ又はＥ３Ｇに対する輸送活性に有意な影響はないことを見出した。また、予備インキュベーション中にシトステロール（Ｓ）担持ＣＤ（図１０、第４区画）又はホスファチジルコリン小胞（示していない）を適用したとき、ＡＢＣＧ２依存性輸送活性には全く効果がなかった。ＡＢＣＧ２の特異的阻害剤Ｋｏ１４３は、対照、コレステロール担持双方の膜小胞で基質輸送を停止させた。
【０１４４】
ＡＢＣＧ２のＲ４８２Ｇ又はＲ４８２Ｔ変異体は、野生型タンパク質とは有意に異なる基質取扱い特性を有する。こうした変異体は、特定の負荷電化合物、例えばＭＴＸ、ＥＳＧ又はＥ３Ｓを非常に低い活性でしか輸送しない。図１０に示すように、ＡＢＣＧ２−Ｒ４８２Ｇ変異体によるＭＴＸ輸送は、対照、コレステロール担持双方のＳｆ９膜小胞で非常に低かった。同様に、ＡＢＣＧ２−Ｒ４８２Ｔ変異体によるＭＴＸ輸送速度は、膜コレステロール含量に関係なく、５０ｐｍｏｌ／ｍｇ膜タンパク質／分未満であった。発明者等は、膜小胞のコレステロール含量に関係なく、Ｒ４８２Ｇ及びＲ４８２Ｔ変異体によるＥＳＧ及びＥ３Ｓの有意な輸送が同様に欠如していることを見出した（示していない）。
【０１４５】
本明細書に記録した輸送実験では、輸送実験前の小胞へのコレステロール担持は影響しなかったが、膜調製中のコレステロール担持は、内因性カルシウム輸送活性で測定したとき、膜小胞の相対含量をやや減少させた（２０〜３０％）。したがって、ＡＢＣＧ２の小胞輸送活性の何らかの増加は、多分過少評価さえされている（発明者等は、この見積りに基づく系統的な補正を行わなかった）。
【０１４６】
以上の実験から、Ｃ−ＣＤの効果は野生型ＡＢＣＧ２に特異的であったことが示唆され、Ｓｆ９細胞膜の他の脂質成分の減耗（例えば、非担持ＣＤによる）、膜脂質の非特異的増加、又は透過性の非特異的変化（例えば、シトステロール−ＣＤ、即ちＳ−ＣＤ、若しくはＰＣ小胞）では、観察された効果を説明することができなかった。
【０１４７】
５．２  ＡＢＣＧ２及びその変異体によるＭＴＸ及びＥＳＧ輸送の速度パラメーターに対する、コレステロール担持の効果
以下の実験では、発明者等は、ＡＢＣＧ２によるＭＴＸ及びＥＳＧ輸送の速度パラメーターに対して、コレステロール担持がどのように影響するかを調べた。図１１Ａは、それぞれ対照及びコレステロール担持のＳｆ９膜小胞における、ＡＢＣＧ２依存性ＭＴＸ取込みのＭＴＸ濃度依存性を示す。元の非処理Ｓｆ９膜小胞（６〜８μｇコレステロール／ｍｇ膜タンパク質を含有する）では、ＭＴＸ取込み速度は低く、見掛けのＶｍａｘは約０．５ｎｍｏｌ  ＭＴＸ／ｍｇ膜タンパク質／分であった。対照的に、Ｃ−ＣＤ前処理小胞（この実験では、５５μｇコレステロール／ｍｇ膜タンパク質を含有する）では、ＭＴＸ取込みは、約１０ｎｍｏｌ  ＭＴＸ／ｍｇ膜タンパク質／分の推定Ｖｍａｘを示した。ＭＴＸ取込みの見掛けＫｍは、両例で約０．５ｍＭであったが、これらの実験におけるＫｍ値及びＶｍａｘ値の適正な決定は、３ｍＭを超える濃度でＭＴＸの溶解度が低いため、妨げられた。図１１Ａは、ＡＢＣＧ２のＲ４８２Ｇ変異体が、調べたＭＴＸ濃度に関係なく、非常に低いＭＴＸ輸送活性を有していたことも記録している。
【０１４８】
ＡＢＣＧ２含有Ｓｆ９膜小胞において、ＭＴＸ取込みのＡＴＰ濃度依存性に対する膜コレステロールの効果を調べたところ、発明者等は、膜コレステロール含量に関係なく、ＭＴＸ輸送は、見掛けＫｍが０．６〜０．８ｍＭ  ＡＴＰの飽和型ＡＴＰ依存性、及び約５ｍＭ  ＡＴＰでの最大輸送速度を示すことを見出した。これらの値は、ＡＢＣＧ２による小胞輸送のＡＴＰ依存性に関する文献中のデータと一致している。この場合も、Ｒ４８２Ｇ、Ｒ４８２Ｔのいずれの変異体も、Ｓｆ９細胞膜小胞のＡＴＰ濃度又はコレステロール含量に関係なく、全くＭＴＸ輸送活性を示さなかった。
【０１４９】
以下の実験では、発明者等は、Ｓｆ９膜小胞におけるＡＴＰ依存性ＥＳＧ取込みのＥＳＧ濃度依存性を調べた（図１１Ｂ）。ＭＴＸで見られたことと同様、コレステロール担持小胞では、この輸送は単純な飽和速度特性を示し、見掛けＶｍａｘが７００ｐｍｏｌ  ＥＳＧ／ｍｇ膜タンパク質／分である一方、ＥＳＧについての見掛けＫｍは約４５μＭであった。対照Ｓｆ９膜小胞では、ＥＳＧ取込みが低過ぎてＫｍを適正に推定できなかった。この取込みの見掛けの飽和も、ＥＳＧ１００μＭを超えて到達し、見掛けＶｍａｘは５０ｐｍｏｌ  ＥＳＧ／ｍｇ膜タンパク質／分未満であった。
【０１５０】
これらの実験は、膜コレステロールによるＭＴＸ及びＥＳＧ輸送の調節は、Ｖｍａｘに対して主たる効果を及ぼす、即ち、この活性輸送体の基質輸送活性を増加させることを示唆している。コレステロールは、基質親和性及び輸送体／基質相互作用も僅かに調節し得るが、これについては更なる研究が必要である。
【０１５１】
図１１Ｃは、反転Ｓｆ９細胞膜小胞における、異なる膜コレステロールレベルによるＭＴＸ及びＥＳＧ輸送の賦活を示す。小胞輸送に対するコレステロールの効果を、飽和値未満のＭＴＸ及びＥＳＧ濃度（各々ＭＴＸ５０μＭ及びＥＳＧ２５μＭ）で測定した。こうした実験では、同量のヒトＡＢＣＧ２を含有するが、担持コレステロールレベルが異なるプールした膜調製物を適用した。これらの活性化曲線には若干の差異を認め得るが、ＡＢＣＧ２依存性のＭＴＸ及びＥＳＧ輸送に対するコレステロールの効果は、５５μｇコレステロール／ｍｇ膜タンパク質を超えたところで最大であった。したがって、ＡＢＣＧ２輸送活性のコレステロール調節は、各種哺乳類細胞膜の生理的コレステロールレベルの範囲で最も顕著であった。
【０１５２】
まとめると、膜コレステロールは、野生型ＡＢＣＧ２による基質輸送を大幅に選択的に増加させたが、ＡＢＣＧ２タンパク質変異体の基質取扱い特性にはコレステロールによる大きな変化は見出されなかった。
【０１５３】
５．３．膜ＡＴＰアーゼの測定
以下の実験では、ＭＤＲ１及びＡＢＣＧ２タンパク質の膜ＡＴＰアーゼ活性に対するコレステロール担持の効果を調べた。特異的阻害剤で選択的に遮断されるバナジン酸塩感受性膜ＡＴＰアーゼ活性は、多数のＡＢＣ多剤輸送体の輸送活性を反映する（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，「癌における多剤耐性：ＡＴＰ依存性輸送体の役割（Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ：ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ）」，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２（２００２）４８−５８；Ｓａｒｋａｄｉ  ｅｔ  ａ．，「ヒト多剤耐性ＡＢＣＢ及びＡＢＣＧ輸送体：化学免疫防御系での関与（Ｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ＡＢＣＢ  ａｎｄ  ＡＢＣＧ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ：ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｃｈｅｍｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ８６（２００６）１１７９−１２３６；Ｓａｒｋａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，「昆虫細胞におけるヒト多剤耐性ｃＤＮＡの発現は、高活性の薬物賦活膜ＡＴＰアーゼを生成する（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｃＤＮＡ  ｉｎ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ａ  ｈｉｇｈ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｒｕｇ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＡＴＰａｓｅ）」，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７（１９９２）４８５４−４８５８］。以前に報告されたように、ＡＢＣＧ２−ＡＴＰアーゼ活性は、フミトレモルギンＣ又はその類縁体Ｋｏ１４３により特異的に阻害することができる。この「基準」ＡＢＣＧ２−ＡＴＰアーゼ活性は、分離したＳｆ９細胞膜小胞では相対的に高いが、Ｓｆ９細胞膜調製物中の野生型タンパク質の場合、有意な基質活性化を検出することができなかった。
【０１５４】
図１２Ａは、２種の潜在的輸送基質の非存在下、存在下双方における、野生型ＡＢＣＧ２並びにＲ４８２Ｇ及びＲ４８２Ｔのバナジン酸塩感受性膜ＡＴＰアーゼ活性を示す。これらの試験では、プラゾシン及びＥＫＩ−７８５チロシンキナーゼ阻害剤（ＥＫＩ）を選択したが、その理由は、これらの化合物が、ＡＢＣＧ２の野生型並びにＲ４８２Ｇ又はＲ４８２Ｔの双方の基質であることが示されたことである［Ｃ．Ｏｚｖｅｇｙ−Ｌａｃｚｋａ，Ｇ．Ｋｏｂｌｏｓ，Ｂ．Ｓａｒｋａｄｉ，Ａ．Ｖａｒａｄｉ，「ＡＢＣＧ２多剤輸送体の単一アミノ酸（４８２）変異体：輸送能及び基質認識の主要な差異（Ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（４８２）ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＢＣＧ２  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ：ｍａｊｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）」，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １６６８（２００５）５３−６３］。
【０１５５】
図１２Ａには、異なる２つの膜コレステロール濃度で、即ち各々、対照（６〜８μｇコレステロール／ｍｇ膜タンパク質）及びコレステロール担持（５０〜６５μｇコレステロール／ｍｇ膜タンパク質）のＳｆ９細胞膜中で測定した各ＡＴＰアーゼ活性を記録している。Ｋｏ１４３は、こうした全てのＡＢＣＧ２変異体において、輸送活性を完全で選択的に阻害することが示され、対照Ｓｆ９細胞膜におけるバナジン酸塩感受性内因性ＡＴＰアーゼ活性のレベルは、ＡＢＣＧ２発現膜中、Ｋｏ１４３の存在下で測定したレベルの範囲にあった（約８〜１０ｎｍｏｌ／ｍｇ膜タンパク質／分）。こうしたデータは、膜ＡＴＰアーゼ活性のＫｏ１４３感受性分画が、ＡＢＣＧ２タンパク質の活性と密接に相関していることを示す。
【０１５６】
図１２Ａに記録されているように、Ｓｆ９細胞膜のコレステロール担持は、これら３種全てのＡＢＣＧ２変異体の基準ＡＴＰアーゼ活性に有意に影響せず、又はそれを僅かしか増加させず、Ｋｏ１４３の存在下で測定した低いバックグランドＡＴＰアーゼ活性にも影響しなかった。しかし、コレステロール担持は、両基質の存在下で野生型ＡＢＣＧ２の薬物賦活ＡＴＰアーゼ活性を大幅に増加させ、一方、Ｒ４８２Ｇ又はＲ４８２Ｔ変異体の場合にはこのような効果を示さなかった。したがって、薬物賦活ＡＴＰアーゼ活性に対するコレステロールの効果は、直接的な小胞基質輸送で認めた変化と密接に相関しているが、基準ＡＴＰアーゼ活性はこの輸送と直接関係ないとも思われる。
【０１５７】
以下の実験では、分離したＳｆ９細胞膜におけるＡＢＣＧ２−ＡＴＰアーゼ活性（Ｋｏ１４３感受性分画）に対する数種の輸送基質の効果を、０．１〜５０マイクロモルの濃度範囲で調べた。発明者等の以前の研究によれば、この系では、調査した化合物によるＡＢＣＧ２−ＡＴＰアーゼ活性の少しの賦活も観察しなかった、又はそれだけの活性しか得られなかった。図１２Ｂ及びＣに示すように、ＡＢＣＧ２の輸送基質であることが既に示された化合物、即ち、チロシンキナーゼ阻害剤のＩｒｅｓｓａ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、広範に適用されているトポテカン、イリノテカン代謝物のＳＮ３８、実験的制癌剤フラボピリドール、及びフラボノイド化合物のケルセチンは全て、コレステロール担持Ｓｆ９細胞膜においてＡＢＣＧ２−ＡＴＰアーゼ活性の大きな賦活を生じた（図１２Ｂ）が、対照膜中では少ししか賦活が起こらなかった（図１２Ｃ）。ケルセチン及び一部のチロシンキナーゼ阻害剤の場合、この賦活が早くもマイクロモル未満の濃度で観察され、非常に高い最大ＡＴＰアーゼ活性レベルを生じた。こうしたデータは、コレステロール担持Ｓｆ９膜では、Ｋｏ１４３感受性ＡＴＰアーゼ活性の測定に基づくＡＢＣＧ２基質スクリーニングを、効率的で信頼性をもって行うことができることを示している。
【０１５８】
６．ヌクレオチド捕捉測定
ヒトＡＢＣＧ２に対するコレステロール効果の分子機構を探索するために、それぞれ対照及びコレステロール担持の分離Ｓｆ９細胞膜においてバナジン酸塩感受性ヌクレオチド捕捉を調べた。大部分の活性ＡＢＣ輸送体は、バナジン酸塩の存在で安定化される触媒中間体を形成し、その中間体は、ＵＶ依存性光架橋、及びα３２Ｐ−８−アジド−ＡＴＰによる共役結合性標識を介して可視化することができる［Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，「癌における多剤耐性：ＡＴＰ依存性輸送体の役割（Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ：ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ）」，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２（２００２）４８−５８］。発明者等が以前に記録したように、ＡＢＣＧ２の場合、この実験にはＣｏ−α３２Ｐ−８−アジド−ＡＴＰの使用が必要であり、ヌクレオチド捕捉は完全にバナジン酸塩依存性である。
【０１５９】
ヒトＡＢＣＧ２含有Ｓｆ９細胞膜にて実施した以前のヌクレオチド捕捉実験において、発明者等は、野生型ＡＢＣＧ２の場合、薬物、例えばプラゾシンの添加により、この中間体の形成は増加せず、むしろ僅かに減少することを見出した（Ｏｚｖｅｇｙ  ｅｔ  ａｌ．「ヒトＡＢＣＧ２多剤耐性輸送体による薬物輸送、ＡＴＰ加水分解、及びヌクレオチド捕捉の特性決定。点変異による基質特異性の調節（Ｃｈｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ，ＡＴＰ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｐｐｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＡＢＣＧ２  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ａ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）」，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７（２００２）４７９８０−４７９９０を参照されたい］。対照的に、ＡＢＣＧ２−Ｒ４８２Ｇ変異体におけるヌクレオチド捕捉は、輸送基質によって有意に増加した。
【０１６０】
現試験では、ＡＢＣＧ２を発現するＳｆ９細胞膜において、コレステロールの予備担持をせずに、又は予備担持してこうした実験を繰り返した。図１３に示すように、対照Ｓｆ９細胞膜では、バナジン酸塩依存性ヌクレオチド捕捉が良好に測定できたが、プラゾシン又はＥＫＩを添加すると、この中間体の形成は僅かだけ減少した。独自の３実験の平均値をＡＢＣＧ２の免疫ブロット付着対照で補正して計算すると、ＡＢＣＧ２の標識率は、プラゾシンにより４５％に、ＥＫＩにより５５％に減少した。コレステロール担持は、ＡＢＣＧ２のヌクレオチド捕捉の基準レベル（ＡＢＣＧ２平均標識率の値は１０５％であった）を変えなかった。しかし、コレステロール担持膜では、プラゾシンの添加（１２５％に相対的増加）又ははるかに有意なことには、ＥＫＩの添加（１８０％に増加）によって、ヌクレオチド捕捉が賦活され、これは、非担持対照膜におけるこれらの薬物が起こす顕著な減少と対照的であった。こうしたヌクレオチド捕捉試験では、同様な結果が異なる２時点（２分及び５分）で得られた。全ての場合に、Ｋｏ１４３を添加するとＡＢＣＧ２依存性ヌクレオチド捕捉が消失した。
【０１６１】
ＡＢＣＧ２−Ｒ４８２Ｇ変異体の場合、ヌクレオチド捕捉のプラゾシン及びＥＫＩによる賦活は、既に対象膜で起こっていたが、この場合に、本研究におけるＳｆ９細胞膜のコレステロール富化による有意差は、見つからなかった（データは示していない）。
【０１６２】
こうした実験は、ヒトＡＢＣＧ２タンパク質によるヌクレオチド捕捉の速度に対する膜コレステロールの有意な効果を示している。直接的な小胞基質輸送の加速観察及び薬物賦活ＡＴＰアーゼ活性の発生と相関して、コレステロール担持は、触媒中間体形成の薬物賦活を促進し、野生型輸送体の回転率のコレステロール賦活を示すことが判明した。
【０１６３】
６．Ｂｓｅｐ輸送体を含有する、コレステロール担持及び非担持のＳｆ９膜を比較するための実験
６．１  コレステロール担持及び非担持のマウスＢｓｅｐ膜のＡＴＰアーゼ活性の比較
非処理マウスＢｓｅｐ小胞のバナジン酸塩感受性基準ＡＴＰアーゼ活性は、タウロケノデオキシコール酸の存在下、３７ｎｍｏｌ  Ｐｉ／ｍｇ  ｐｒｏｔ／分から６４ｎｍｏｌ  Ｐｉ／ｍｇ  ｐｒｏｔ／分へ増加した（図１４Ａ）。コレステロール担持後、その基準活性は４．７ｎｍｏｌ  Ｐｉ／ｍｇ  ｐｒｏｔ／分へ減少し、この活性はタウロケノデオキシコール酸によって３９ｎｍｏｌ  Ｐｉ／ｍｇ  ｐｒｏｔ／分へ活性化することができた（図１４Ｂ）。この方法は、非担持膜と比較してマウスＢｓｅｐ  ＡＴＰアーゼアッセイの良好なシグナル対ノイズ比を生じ、化合物のスクリーニングに、より適している。
【０１６４】
処理及び非処理マウスＢｓｅｐ−Ｓｆ９小胞を用いて、タウロコール酸及びグリココール酸による活性化に有意差を認めた（図１４Ａ、Ｂ）。
【０１６５】
６．２  ヒト／マウス／ラットＢｓｅｐ輸送体の小胞輸送活性に対するコレステロール担持の効果
ＡＴＰアーゼアッセイと同様に、「反転」膜小胞を使用し、アッセイを標識基質のＡＴＰ依存性取込みで特徴付けた。コレステロールは、ラット／ヒト／マウスＢｓｅｐ輸送体を含有するＳｆ９細胞から調製した小胞のタウロコール酸輸送活性を増加させる（図１５Ａ、Ｂ、Ｃ）。この効果は、ラットＢｓｅｐ輸送体活性の場合に最高度に認められた（図１５Ａ）。ミカエリス−メンテンの速度式が適用できるという仮定を用いて、ＫＭ値及びＶｍａｘ値を計算した。表３に見られるように、Ｖｍａｘ値が有意に増加する一方、ＫＭ値は僅かしか変化しない。
【表４】
2009536832.tif 000008
【産業上の利用可能性】
【０１６６】
本発明者等は、この現象が、当技術分野で公知のアッセイ系と比較して、好ましい実施形態を有するアッセイ系の設定に適していることを明らかにした。
【０１６７】
本発明の重要な結果は、コレステロール予備担持膜の使用によって、この技術が、ＡＢＣＧ２−ＡＴＰアーゼ活性の測定により非常に多様な基質分子のスクリーニングを可能にすることである。
【０１６８】
実際に、コレステロール担持は、小胞輸送実験において調べた基質について、薬物賦活ＡＴＰアーゼの速度、及び最大輸送速度を特異的に改良した。昆虫細胞膜のコレステロール担持により、高レベルの内因性コレステロールを含有する哺乳類膜に類似するＡＴＰアーゼ特性及び輸送特性が得られる。したがって、コレステロールを担持し、ＡＢＣ輸送体、例えばＢＳＥＰ又はＡＢＣＧ２を過剰発現する昆虫細胞膜は、輸送体機能の調査に適切なモデルである。
【符号の説明】
【０１６９】
略語
ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ（輸送体）：ＡＴＰ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ（ＡＴＰ結合カセット輸送体）
ＡＢＣＰ：ｐｌａｃｅｎｔａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（胎盤特異的ＡＢＣ輸送体）
ＡＤＭＥ：Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ（吸収、分布、代謝、排泄）
ＢＣＲＰ：ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（乳癌抵抗性タンパク質）
ＣＤ：ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ（シクロデキストリン）
Ｃ−ＣＤ：ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ  ｌｏａｄｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（コレステロール担持シクロデキストリン）
Ｓ−ＣＤ：ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ  ｌｏａｄｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ（シトステロール担持シクロデキストリン）
ＥＫＩ：ＥＫＩ−７８５  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｆｉｂｉｔｏｒ（ＥＫＩ−７８５チロシンキナーゼ阻害剤）
ＥＳＧ：ｅｓｔｒａｄｉｏｌ  １７−ｂｅｔａ  ｇｌｕｃｒｏｎｉｄｅ（エストラジオール１７−βグルクロニド）
Ｅ３Ｓ：ｅｓｔｒｏｎｅ  ３−ｓｕｌｆａｔｅ（エストロン３−硫酸）
ＭＤＲ１：Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（多剤耐性プロテイン１）
ＭＲＰ１：ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（多剤耐性関連プロテイン１）
ＭＴＸ：ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ（メトトレキセート）
ＭＸＲ：ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ミトキサントロン耐性関連タンパク質）
Ｐ−ｇｐ：Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ糖タンパク質）
ＰｈｅＡ：Ｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ  Ａ（フェオフォルビドＡ）
ＰＮＧａｓｅ  Ｆ：Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ（ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼ）
ＲＡＭＥＢ：ｒａｎｄｏｍｌｙ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ（ランダムメチル化β−シクロデキストリン）
Ｓｆ９  ｃｅｌｌｓ：Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃｅｌｌｓ（スポドプテラ・フルギペルダ卵巣細胞）
【図１−１】
2009536832.tif 000009
【図１−２】
2009536832.tif 000010
【図２−１】
2009536832.tif 000011
【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
2009536832.tif 000022
【図１１−２】
2009536832.tif 000023
【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
2009536832.tif 000026
【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年1月8日(2008.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同種の昆虫細胞膜の生理的コレステロールレベルと比較して、増加したコレステロールレベルを含むコレステロール担持の昆虫細胞膜調製物であって、該昆虫細胞膜調製物が、生理的コレステロールレベルを有する同種の昆虫細胞膜中に存在する場合のＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性と比較して、増加した基質輸送活性を有する該ＡＢＣ輸送タンパク質を含み、該ＡＢＣ輸送タンパク質がＭＤＲ１とは異なる、上記昆虫細胞膜調製物。
【請求項２】
同種の昆虫細胞の膜の生理的コレステロールレベルと比較して、増加したコレステロールレベルを含むコレステロール担持の昆虫細胞調製物であって、該昆虫細胞調製物が、生理的コレステロールレベルを有する同種の昆虫細胞の膜中に存在する場合のＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性と比較して、増加した基質輸送活性を有する該ＡＢＣ輸送タンパク質を含み、該ＡＢＣ輸送タンパク質がＭＤＲ１とは異なる、上記昆虫細胞調製物。
【請求項３】
コレステロールレベルが、
哺乳類細胞膜の対応するコレステロールレベルの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％であり、
昆虫細胞膜の生理的コレステロールレベルの少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも４倍、非常に好ましくは少なくとも６倍であり、
総タンパク質含量に対するコレステロール含量として計算され、少なくとも２５μｇ／ｍｇ総タンパク質、好ましくは少なくとも５０μｇ／ｍｇ総タンパク質である
請求項１又は２に記載の調製物。
【請求項４】
ＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性が、
ａ）小胞輸送アッセイ、及び／又は
ｂ）基質賦活ＡＴＰアーゼアッセイ
により試験される、請求項１又は２に記載の調製物。
【請求項５】
ＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性が、生理的コレステロールレベルを有する同種の昆虫細胞膜の対照調製物中に存在する場合の該ＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性より、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍、非常に好ましくは少なくとも５倍高い、請求項４に記載の調製物。
【請求項６】
ＡＢＣ輸送タンパク質がＡＢＣＧ２である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の調製物。
【請求項７】
ＡＢＣ輸送タンパク質がＢＳＥＰである、請求項１から４までのいずれか一項に記載の調製物。
【請求項８】
ＡＢＣ輸送タンパク質の活性を評価する試薬キットであって、
請求項１から７までのいずれか一項に記載の調製物、並びに／或いは
昆虫細胞中に該ＡＢＣ輸送体を発現する手段と、昆虫細胞にコレステロール及び／又はコレステロール類縁体を担持する手段と、場合により昆虫細胞から膜調製物を調製する手段、並びに
所望であれば、以下のいずれか、即ち、ＡＢＣ輸送タンパク質の基質、ＡＴＰ、コレステロール又はコレステロール類縁体、緩衝剤、試薬、対照、ＡＢＣ輸送タンパク質の阻害剤又は賦活剤
を含み、該ＡＢＣ輸送タンパク質がＭＤＲ１とは異なる、上記試薬キット。
【請求項９】
増加した基質輸送活性を有するＡＢＣ輸送タンパク質を含み、ＡＢＣ輸送タンパク質アッセイに使用するための昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物を製造する方法であって、
ここで該方法が、
昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物中に基質輸送活性を有するＡＢＣ輸送タンパク質を提供するステップ、
昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物にコレステロールを担持し、それにより昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物のコレステロールレベルを増加させるステップ、
コレステロールを担持していない同種の昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物における同種活性と比較して増加したＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性について、コレステロールを担持した、得られた昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物を試験するステップ
を含み、該ＡＢＣ輸送タンパク質がＭＤＲ１とは異なる、上記方法。
【請求項１０】
ＡＢＣ輸送タンパク質を含んだ昆虫細胞から細胞膜調製物を調製し、
シクロデキストリン及びコレステロール又はコレステロール類縁体との複合体と細胞膜調製物をインキュベートし、
未結合複合体を除去する
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
昆虫細胞中にＡＢＣ輸送タンパク質を発現させ、
シクロデキストリン及びコレステロール又はコレステロール類縁体との複合体と、ＡＢＣ輸送タンパク質を発現する前又は最中の昆虫細胞をインキュベートし、
未結合複合体を除去し、
昆虫細胞から細胞膜調製物を調製する
請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
昆虫細胞中にＡＢＣ輸送タンパク質を発現させ、
昆虫細胞から細胞膜調製物を調製する際、以下のステップ
ｉ）膜の分離、
ｉｉ）均質化、
ｉｉｉ）シクロデキストリン及びコレステロール又はコレステロール類縁体との複合体と、均質化調製物とのインキュベーション、並びに
ｉｖ）超遠心分離
を少なくとも含む
請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ＡＢＣ輸送タンパク質の増加した基質輸送活性が、
ａ）小胞輸送アッセイ、及び／又は
ｂ）基質賦活ＡＴＰアーゼアッセイ
により試験される、請求項９から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ＡＢＣ輸送タンパク質がＡＢＣＧ２又はＢＳＥＰである、請求項９から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
昆虫細胞膜の生理的コレステロールレベルと比較して増加したコレステロールレベル、及び生理的コレステロール含量を有する昆虫細胞膜中のＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性と比較して増加した基質輸送活性の該ＡＢＣ輸送タンパク質を含む昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物であって、請求項９から１４までのいずれか一項に記載の方法により得ることのできる、上記昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物。
【請求項１６】
ある化合物とＡＢＣ輸送タンパク質との相互作用を、該ＡＢＣ輸送タンパク質の活性を評価することにより調査するアッセイ方法であって、該アッセイ方法が、
昆虫細胞又は昆虫細胞膜調製物中の活性なＡＢＣ輸送タンパク質を提供するステップ、
ある化合物をＡＢＣ輸送タンパク質と接触させるステップ、
該化合物の存在下及び非存在下でＡＢＣ輸送タンパク質の活性を測定するステップ、
化合物の存在下及び非存在下で得られた活性値を比較するステップ
を含み、
ここで昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物が、昆虫細胞膜の生理的コレステロールレベルと比較して増加したコレステロールレベルを有し、該ＡＢＣ輸送タンパク質がＭＤＲ１とは異なる、上記アッセイ方法。
【請求項１７】
少なくとも２種の化合物及びＡＢＣ輸送タンパク質との同時相互作用を、輸送タンパク質の活性を評価することにより試験するアッセイ方法であって、該アッセイ方法が、
昆虫細胞又は昆虫細胞膜調製物中の活性なＡＢＣ輸送タンパク質を提供するステップ、
第１の化合物をＡＢＣ輸送タンパク質と接触させるステップ、
該第１の化合物の存在下及び非存在下で、ＡＢＣ輸送タンパク質の活性を測定するステップ、
該第１の化合物の存在下及び非存在下で得られた活性値を比較するステップ、
第１の化合物の存在下で、第２の化合物をＡＢＣ輸送タンパク質と接触させるステップ、
同時に第１及び第２の化合物の存在下で、ＡＢＣ輸送タンパク質の活性を測定するステップ、
第２の化合物の存在下及び非存在下で得られた活性値を比較するステップ、
第１の化合物の存在下での活性に対する第２の化合物の効果を評価するステップ
を少なくとも含み、
ここで昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物が、昆虫細胞膜の生理的コレステロールレベルと比較して増加したコレステロールレベルを有し、該ＡＢＣ輸送タンパク質がＭＤＲ１とは異なる、上記アッセイ方法。
【請求項１８】
以下の少なくとも１つ、即ち
ＡＢＣ輸送タンパク質の基質輸送活性、好ましくはＡＢＣ輸送体の基質賦活ＡＴＰアーゼ活性、及び／又はＡＢＣ輸送体による基質の小胞輸送、
ＡＢＣ輸送体によるヌクレオチドの閉塞／捕捉、
ＡＢＣ輸送体の基準ＡＴＰアーゼ活性
が決定される、請求項１６又は１７に記載のアッセイ方法。
【請求項１９】
請求項１から７まで、及び請求項１５のいずれか一項に記載の昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物が使用され、並びに／或いは昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物が、請求項９から１４までのいずれか一項に従って調製される、請求項１６から１８までのいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項２０】
ＡＢＣ輸送タンパク質がＡＢＣＧ２である、請求項１６から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＡＢＣ輸送タンパク質がＢＳＥＰである、請求項１６から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
昆虫細胞調製物又は昆虫細胞膜調製物において、昆虫細胞膜中に埋め込まれたＡＢＣ輸送タンパク質の活性を増加させるための、コレステロール又はコレステロール類縁体の使用であって、該ＡＢＣ輸送タンパク質がＭＤＲ１とは異なる、上記使用。
【請求項２３】
ＡＢＣ輸送タンパク質の増加した活性が、
ａ）小胞輸送アッセイ、及び／又は
ｂ）基質賦活ＡＴＰアーゼアッセイ
により試験される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
コレステロールが、コレステロール及びシクロデキストリンとの複合体の形態で使用される、請求項２２又は２３のいずれか一項に記載の使用。
【国際調査報告】
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2009536832.tif 000031
2009536832.tif 000032
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