(57)【要約】  本発明は、パン酵母による１，１，１−トリフルオロアセトンの不斉微生物還元によって、＞９９％の鏡像体余剰を有する（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを製造するための、スケールアップ可能な生体触媒的方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
パン酵母による１，１，１−トリフルオロアセトンの不斉微生物還元によって、＞９９％の鏡像体余剰を有する（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを製造するための、スケールアップ可能な生体触媒的方法であって、
ａ）  ０．１〜０．４Ｍリン酸塩緩衝液中のパン酵母の懸濁液を、５０〜５２℃に６０分間かけて加熱し、
ｂ）  この懸濁液を、５０〜５２℃でさらに９０分間にわたって、維持し、
ｃ）  加熱した懸濁液を、緩衝液で酵母濃度２０〜３０％w/vになるように希釈して、１２０分以内に１０℃まで冷却し、
ｄ）  ４Ｍ  ＫＯＨ溶液の自動添加により、工程全体にわたりｐＨを７．４〜７．５で一定に維持し、
ｅ）  １，１，１−トリフルオロアセトンの沸点より低い温度で生物学的転換を行うために、１，１，１−トリフルオロアセトンを濃度１〜５％（w/v）になるように加え、
ｆ）  ５〜８日以内に、２０℃の温度で１，１，１−トリフルオロアセトンを、（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールに還元して、そして
ｇ）  一連の蒸留工程により、（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを単離する
工程を含む方法。
【請求項２】
生物学的転換を、室温で５〜８日間にわたって実施する、請求項１記載の生体触媒的方法。
【請求項３】
使用される緩衝液が０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７〜８であることを特徴とする、請求項１記載の生体触媒的方法。
【請求項４】
基質濃度が２〜４％w/vであることを特徴とする、請求項１記載の生体触媒的方法。
【請求項５】
基質濃度が３％w/vであることを特徴とする、請求項４記載の生体触媒的方法。
【請求項６】
最終蒸留工程が精留である、請求項１に記載の分離手順。
【請求項７】
精神的障害におけるＡＰＩのための構造ブロックとしての、請求項１〜６で製造される（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの使用。
【請求項８】
ＷＯ  ２００５／０１４５６３に記載されるＡＰＩのための構造ブロックとしての、請求項１〜７で製造される（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの使用。
【請求項９】
ＷＯ  ２００５／０１４５６３に記載されるＡＰＩを＞９９％ｅｅの異性体純度で製造してもよい、請求項１〜８記載の生体触媒的方法。
【請求項１０】
本明細書において、前に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，１，１−トリフルオロアセトンの不斉還元による生触媒を用いる鏡像異性体的に純粋な（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノール（＞９９％鏡像体余剰）の製造に関する。
【０００２】
鏡像異性体的に純粋な（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールは、神経障害および神経精神障害の処置のために使用される、異性体的に純粋な活性医薬品成分（ＡＰＩ）の製造のための重要な構造ブロックである。
ＡＰＩの製造のために、異性体的に純粋な構造ブロックおよび／または高度に立体選択的な手順を使用することが、ぜひ必要である。なぜならＡＰＩにおける副成分は、病気の処置において副作用を有することがある。それ故に、高い純度が、全てのＡＰＩに要求される。
【０００３】
本発明の目的は、＞９９％の鏡像体余剰（ｅｅ）を有する、鏡像異性体的に純粋な（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの製造であり、それは例えばＷＯ  ２００５／０１４５６３に記載されるような、鏡像異性体的に純粋なＡＰＩの製造のための重要な構造ブロックとして使用されてもよい。構造ブロック（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールも、個別のＡＰＩのための合成におけるその次の中間体も、いずれもその鏡像異性体純度も富化させることはできないので、その合成に＞９９％ｅｅの（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを使用することは、重要である。
【０００４】
J. W. C. Crawford (1967), J. Chem. Soc. (C) 2332-2333には、（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを産生するための方法が記載されており、ここで、（±）−１−（トリフルオロメチルエトキシ）プロピオン酸（アルコールとアクリル酸の付加物）を、そのキニーネ塩を経てその光学異性体に分離して、純粋な（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールをアルカリ加水分解と蒸留により鏡像異性体的に純粋なアルコキシ酸から得られた。この方法は、鏡像異性体的に高純度（旋光度：−５．６５°）の（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを得るが、この方法は大量生産には適さない。
【０００５】
T. C Rosenら (2004)、Chimica Oggi Suppl, 43-45では、それらの自然宿主中の、または大腸菌に発現させた組み換え酵素としてのいずれかのアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）を使用して、１，１，１−トリフルオロアセトンの不斉還元により（Ｒ）−および（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの両方を製造する。静止している全細胞または粗細胞のない抽出物を使用してもよく、後者の場合は、コファクター再生系の追加が必要である。得られた（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールは、Juelich Fine Chemicals社で購入できるが、提供された材料は、我々のニーズにとって不十分な鏡像異性体純度（＞９２．５％ｅｅ）である。
【０００６】
M. Buccierelliら (1983)、Synthesis 11, 897-899は、実験室規模で（静止している）パン酵母を使用した１，１，１−トリフルオロアセトンの還元による（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの製造を記載している。反応は速く開始するが（４時間）、基質に対して３００倍過剰の酵母が必要であり、基質の濃度はわずか２．５g/kg酵母懸濁液であって、そして（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールが、我々のニーズに低すぎる値、約８０％ｅｅ（純粋なアルコールの−５．６°と比較して、分離されたアルコールの−４．５°の旋光度から算出した）を有しただけで得られた。加えて、蒸留と組み合わせた反復溶媒抽出法をベースにした分離手順は、大規模では経済的に適用できない。
【０００７】
微生物還元の立体選択性を最適化するための、文献中で使用されるいくつかの方法がある。例えば、微生物細胞のアセトン処理、または有機溶媒中での生物学的転換の実行である。両方法は、溶媒を使用することで、より費用がかかる工程になり、かつより重要なことは、使用された溶媒が、７６〜７７℃の沸点を有する（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの分離のために、それでなくても必要とする手順をさらに複雑にするという不都合を有する。
【０００８】
立体選択性を向上させるための別の方法は、不要な異性体を産生する酵素を阻害する阻害物質を使用することである。A. C. Dahlら (1999)、Tetrahedron: Asymmetry 10, 551-559は、加熱処理していないパン酵母とアリルアルコールとを用いた、３−オキソペンタン酸エチルの３（Ｒ）−ヒドロキシ−ペンタン酸エチルへの還元を報告していた（収率１００％および９２〜９３％ｅｅ）。加熱処理したパン酵母（４８℃、６０分間）をアリルアルコールと組み合わせて使用した場合、生成物は収率８０〜９５％で得られ、ｅｅは９８％に増加した。しかしながら、反応を成功するために、約１g/Lの基質濃度が使用され、そして基質に対して２５０倍の酵母、基質に対して４倍の阻害物質が、それぞれ必要であった。
【０００９】
微生物還元の立体選択性に影響を与えるための別の方法は、不要な立体異性体を産生する酵素を不活性化するために、微生物細胞の加熱処理を行うことである。Y. Yasoharaら (1999)、Appl. Microbiol. Biotechnol. 51, 847-851は、さまざまな酵母を用いて４−クロロ−３−オキソ酪酸エチル（ＣＯＢＥ）の４−クロロ−（Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸（ＣＨＢＥ）への還元を研究した。Candida magnoliaのアセトン処理された細胞は、ＣＯＢＥを９１．０％ｅｅを有する（Ｓ）−ＣＨＢＥにモル収率７５％で変換した。C. magnoliaの細胞が加熱処理された場合（６０℃）、＞９８％ｅｅを有する（Ｓ）−ＣＨＢＥが収率７５％で得られた。一方、Saccharomyces cerevisiaeのアセトン処理した細胞が使用された（加熱処理されない）場合、（Ｓ）−ＣＨＢＥがモル収率５３％で得られたが、１４．８％ｅｅを有するだけであった。５０℃でS. cerevisiaeの細胞を加熱処理した後、５３．８％ｅｅを有する（Ｓ）−ＣＨＢＥが、収率わずか１０％得られた。６０℃で加熱処理した後、（Ｓ）−ＣＨＢＥが＞９８％ｅｅで得られた（収率８％）。実験室規模では、C. magnoliae、９０g/L  ＣＯＢＥを使用すると６０時間以内に９６．６％ｅｅで、また加熱処理した細胞を使用すると収率９７％および＞９９％ｅｅで、（Ｓ）−ＣＨＢＥにそれぞれ定量的に変換した。反応は、酢酸ｎ−ブチルを用いる二相系において行い、そして助酵素再生系（グルコース、ＮＡＤ（Ｐ）およびグルコース脱水素酵素）を必須とした。グルコース脱水素酵素に基づくコファクター再生系の必要性は、アセトン処理による内因性酵素の不活性化に起因している。
Z.H. Yangら(2004), Ind. Eng. Chem.Res. 43, 4871-4875にはまた、酵母によって触媒されたＣＯＢＥの（Ｓ）−ＣＨＢＥへの不斉還元が記載されている。酵母の加熱処理（５０℃）により、（Ｓ）−ＣＨＢＥのｅｅは、３０〜１２０分の前処理時間につれて増加して、８４％から９７％に増加した。一方で、ＣＯＢＥの変換率は、９６％から８２％に減少した。グルコースは、ＮＡＤ（Ｐ）からＮＡＤ（Ｐ）Ｈへ再生するために使用された。反応は、乾燥パン酵母から酵母で行った。記載された手順は、大規模で使用するには実用的ではなく、経済的でない。
【００１０】
K. Nakamuraら (1996)ら、Tetrahedron: Asymmetry 7, 409-412には、α−ケトンの対応するヒドロキシケト化合物への酵母還元が記載され、ここで、加熱処理は反応の立体選択性に影響していた。例えば、加熱処理した酵母を用いた１−フェニル−１，２−プロパンジオンの還元は、収率８０％で＞９８％ｅｅの１−フェニル−２−ヒドロキシ−１−プロパンを得るが、反応は比較的大量の酵母（基質に対して３０倍）を必要とした。
【００１１】
本発明の目的は、高い鏡像体純度（＞９９％ｅｅ）の（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを産生するための、効率的な手順を提供することである。
【００１２】
非常に安価な商業用パン酵母の立体選択性は特定の加熱処理により影響を受け、その結果、１，１，１−トリフルオロアセトンはほとんど定量的に高いｅｅの（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールに還元できることがわかった。
【００１３】
酵素阻害剤がなく、かつ助酵素再生系がないことが、９９％の望ましい高い鏡像体純度を達成するために必要である。幸いなことに、この加熱処理による生体触媒の不活性化は十分に制限されており、なお技術的に関連のある基質濃度が用いることができ、そしてバイオマスの量（活性喪失の埋め合わせとして利用されるべきもの）が効率的な仕上げをなお受け入れることができる。生物学的転換の間のエタノール生成は、効率的な仕上げを許容するレベルを保つことができる。さらに、技術的に魅力的な製品を回収する、蒸留だけに基づく方法が開発された。
【００１４】
本発明は、以下のように、より詳細に記載してもよい。
【００１５】
【化１】
2009501007.tif 000002
【００１６】
本発明は、パン酵母による１，１，１−トリフルオロアセトンの不斉微生物還元によって、＞９９％の鏡像体余剰を有する（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを製造するためのスケールアップ可能な生体触媒的方法であって、
ａ）  ０．１〜０．４Ｍリン酸カルシウム緩衝液中のパン酵母の懸濁液を、５０〜５２℃で６０分間かけて加熱し、
ｂ）  この懸濁液を、５０〜５２℃でさらに９０分間にわたって、維持し、
ｃ）  加熱した懸濁液を、緩衝液で酵母濃度２０〜３０％w/vになるように希釈して、１２０分以内に１０℃まで冷却し、
ｄ）  ４Ｍ  ＫＯＨ溶液の自動添加により、工程全体にわたりｐＨを７．４〜７．５で一定に維持し、
ｅ）  １，１，１−トリフルオロアセトンの沸点より低い温度で生物学的転換を行うために、１，１，１−トリフルオロアセトンを濃度１〜５％（w/v）になるように加え、
ｆ）  ５〜８日以内に、２０℃の温度で１，１，１−トリフルオロアセトンを（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールに還元して、そして
ｇ）  一連の蒸留工程により、（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを単離する
工程を含む方法に関する。
【００１７】
本明細書中で使用される「パン酵母」は、安価で標準的な商業用のパン酵母であり、例えばKlipfel AG, Rheinfelden（スイス）からバルクで入手可能である。
【００１８】
好ましい条件は、以下のとおりである。
ｉ）  生物学的転換を、５〜８日にわたって室温で行い、
ii）  使用される緩衝液は、ｐＨ７〜８の０．１Ｍリン酸塩緩衝液であり、
iii）  基質濃度が２〜４％w/vであり、
iv）  基質濃度が３％w/vであり、
ｖ）  最終蒸留工程が精留であり、
vi）  （Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールが、精神的障害におけるＡＰＩのための構造ブロックとして使用され、
vii）  （Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールが、ＷＯ  ２００５／０１４５６３に記載されるＡＰＩのための構造ブロックとして使用され、
viii）  ＞９９％ｅｅの異性体純度で、ＷＯ  ２００５／０１４５６３に記載されるＡＰＩを製造することができる。
【００１９】
パン酵母による１，１，１−トリフルオロアセトンの高度に立体選択的な不斉還元の障害は−また引用文献により部分的に示されるように−一方で立体選択性を増加するが（より劣った選択性の還元酵素を、主として明らかに不活性化することにより）、他方では活性を減少させる（選択的な酵素もまた明らかに不活性化することにより）、加熱処理の悪影響である。この障害は、より高い、技術的により関連のある（しかし生理学的な利得がより少ない）基質濃度では、さらに顕著であることが見込まれる。
【００２０】
パン酵母の加熱処理のための条件の極めて狭い橋が、選択的な酵素の活性および安定性に過剰に作用することなく、不要な酵素の活性を有意に減少させるために存在する（５０〜５２℃、９０〜２４０分間）ことが、今や意外にも見出された。
【００２１】
次いで、このような予備調整されたパン酵母を使用して、なお技術的に関連のある基質濃度で、および優れた収率を有する仕上げ手順を可能にする許容されるバイオマス濃度３０％w/v酵母（基質に対する酵母の１０倍過剰）で、１，１，１−トリフルオロアセトンの還元により、＞９９％ｅｅを有する（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを−追加の酵素阻害剤の使用なしに−製造することができた。
【００２２】
基質のほとんど定量的な還元−助酵素再生系の必要なしに−は、高価な基質のために、この方法にとって同様に重要である。加熱処理のための非常に限られた温度範囲が、不十分な選択性と触媒失活の間にあることがわかった。
【００２３】
さらに、パン酵母は、市販されているだけでなく、それ故に発酵装置は工程を実行するための生体触媒を製造することを必要としないだけでなく、それは非常に安価でもある。加えて、これは工程の節約に貢献する。
【００２４】
工程はまた他の製造会社から、例えばDSM（ドルドレヒト、オランダ）、Proofex（ダブリン、アイルランド）、S.I. de Leuvre FaIa（ストラスブール、フランス）、Suomen Hiiva Oy（ラハティ、フィンランド）またはHefe Fabrik Giegold（シュワルツェンバッハ、ドイツ）からのパン酵母を使用して実行することができる。全ての場合において、生物学的転換とそれに続く５０℃での加熱処理で製造されたＴＦＩＰの鏡像体余剰は、≧９９％である（下記の表参照）。その加熱処理が試験された全ての酵素の選択性に広く同様の影響を与えることは、いくつかの市販のパン酵母が、記述された工程において使用することができることを示している。
【００２５】
【表１】
2009501007.tif 000003
【００２６】
結果は、以下のとおり達成している：
それぞれ酵母５０ｇを、ｐＨ７．４の０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液中で最終容積１００mlになるように懸濁し、２５０mlガラス瓶に移した。懸濁した酵母を、温水浴中で５０℃、２時間の加熱処理に付した。氷で冷却後、酵母を、緩衝液を用いて３０％w/vに希釈した。次に、２．５mlの小分け量を１０ml血清瓶に移し、水中のＴＦＡＣ９４０g/Lの８６μlを、３％w/vの最終濃度になるように加えた。ゴム製シールを用いて密封した後、瓶を２０℃で回転させながら６日間インキュベートした。試料を定期的に採取し、そしてＴＦＡＣ（１，１，１−トリフルオロアセトン）、ＥｔＯＨ（エタノール）およびＴＦＩＰ（１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノール）の定量ならびに生成物の鏡像体余剰の測定のために、ＧＣおよびキラルＧＣにより分析した。
【００２７】
そのうえ、そして重要性が下がらないことに、この高密度のバイオブロスから高い純度と収率で生成物を回収するための、単純で予想外に効率的な仕上げ手順が見出された。この工程は蒸留だけに基づく。生成物を回収するために、抽出溶媒を使用しなかった。
【００２８】
（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの製造の全工程（スキーム１）を、形式上、３工程に細かく分けてもよい。
【００２９】
１．パン酵母の前処理
酵母（２〜４kg）を、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝７．４）中に懸濁して、懸濁液を所望の最終容量６Ｌにした。懸濁液を５０℃に６０分間かけて加熱して、さらに９０分間にわたりその温度に保った。９０分後に加熱を停止し、さらに冷たいリン酸カリウム緩衝液の一部を加えて、酵母濃度を３０％w/vに調整した。懸濁液を９０分間かけて５〜２０℃に冷却した。
【００３０】
２．生物学的転換
１，１，１−トリフルオロアセトン（０．１５〜０．３kg）を、第一工程で得られた冷却した酵母懸濁液に加えて、温度を２０℃にした。反応ブロスにおいてエタノール濃度を低く保持するために、ｐＨを４Ｍ  ＫＯＨ溶液の制御された添加により、７．４〜７．５に維持した。（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノール（沸点７６〜７７℃）とエタノール（沸点７８℃）の沸点が非常に近似していることから、反応混合物中の低濃度のエタノールは、（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを、エタノールのない高収率の状態で単離させることに必須であった。この特徴が、本手順の必須部分であった。
場合により、基質を供給バッチタイプ工程に添加することができた。
本発明の方法に使用された基質の濃度は、従来記載されている濃度より有意に高かった。このより高い容積生産性は、反応および生成物の単離に必要なより少容量のおかげで費用削減を結果として来した。反応時間が５〜８日である場合、基質が事実上完全転換していることが見出された。
【００３１】
３．（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの単離および精製
（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを、第２工程で得たバイオブロスから単離した。第１のバッチ蒸留において、生成物容積を１／１０にし、約２５％w/wのＴＦＩＰ水溶液を得た。予期しなかったことに、バイオブロスの高いバイオマス含有量（失われた酵素活性を補給するために使用された）にもかかわらず、生成物を事実上定量的な収率で回収することができた。
塩化ナトリウム上の第２のバッチ蒸留において、約９０％m/mの生成物を提供するために、生成物の含水量をさらに減らした。あるいは、第２バッチ蒸留を塩化ナトリウムなしに行い、約８０％w/wの生成物をもたらすことができた。
第３の蒸留：充填塔での精留において、微量の未反応１，１，１−トリフルオロアセトンおよびエタノールのような不要な副生物を除去した。精製した（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを、最後に、水分５％と有機不純物＜０．２％を伴う９５％w/w生成物として得た。エタノールの含有量は、臨界であり（それが、続く反応工程中に反応するであろうし、そのうえ、ＡＰＩの純度を減らすであろうから）、そして生物学的転換と仕上げにとってむしろ目標である＜０．５％であるべきである。
場合により、無水（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを、最終蒸留工程の前か後に分子篩を用いる乾燥工程を導入することにより、または抽出蒸留もしくはパーベーパレーションを使用することにより、製造してもよい。
【００３２】
酵母濃度を６０％w/vに上昇することが、生産規模上の費用削減に潜在的につながる９５％収率に達するために必要な反応時間（因子２）の、重要な短縮につながることもまた示されている。１０Ｌ規模の生物学的転換において、酵母濃度を３０%w/vから６０％w/vへと倍増した効果を、以下の表に示す。
【００３３】
【表２】
2009501007.tif 000004
【００３４】
先に述べたように、得られた（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを、Ｓ−配置の１，１，１−トリフルオロプロパン−２−イルエーテル部分を有する薬学的に活性な化合物の製造のための構造ブロックとして使用することができる。例として、スキーム２に、そのような構造ブロックを使用する、グリシン輸送体の阻害物質である薬学的に活性な化合物の製造を示す。そのような化合物は、ＷＯ２００５／０１４５６３に開示している。
【００３５】
スキーム２において製造された化合物は、収束合成の一分野における最後から２番目の合成工程において、（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの構造ブロックを経由して分子中に導入される、Ｓ−配置の１，１，１−トリフルオロプロパン−２−イルエーテル部分を含有する（スキーム２参照）。
【００３６】
【化２】
2009501007.tif 000005
【００３７】
結晶化の手順は、ＡＰＩまでの中間体を鏡像異性体的に富化させることが今のところ見出されていない。そのために、ＡＰＩの合成のために鏡像異性体純度＞９９％の（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを使用することが最も重要である。
【００３８】
実施例
実験室規模
例１（パン酵母の前処理）
【００３９】
パン酵母３．０kg（Klipfel AG, Rheinfelden（スイス）のブロック酵母；製品番号１０１０１０）を、ｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液中に分散させて、容積を同緩衝液を用いて６Ｌにした（５０％w/v）。次に、分散した酵母を、温度制御された１５Ｌガラス製反応器に移した。上端に取り付けられた撹拌器を、混合するために使用した（２００rpm）。次に、酵母懸濁液を周囲温度から５０℃まで、６０分の期間で加熱して、この温度をこの値でさらに９０分間持続した。この時点で加熱を停止した。次に、さらに冷緩衝液（４℃）４Ｌを、全容積が１０Ｌ（３０％w/v酵母）になるように加えた。ブロスを１０℃、約９０分にわたって冷却した。７．４〜７．５のｐＨ値を、ｐＨ−スタットを使用して、４Ｍ  ＫＯＨ溶液の自動添加により維持した。
【００４０】
【表３】
2009501007.tif 000006
【００４１】
例２（生物学的転換）
１，１，１−トリフルオロアセトン  ３０４ｇを冷ブロス（１０Ｌ）に加えて、この場合５日である反応期間中、温度を２０℃に保持した。容器中の反応ブロスを、持続的に窒素で覆った（安全上の理由）。ｐＨ−スタットから４Ｍ  ＫＯＨ溶液の自動添加により、ｐＨを７．４〜７．５に維持した。周期的に試料を採取して、ＴＦＡＣ（１，１，１−トリフルオロアセトン）、ＥｔＯＨ（エタノール）およびＴＦＩＰ（１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノール）の定量、ならびに生成物の鏡像体余剰の測定を、ＧＣおよびキラルＧＣにより分析した。
【００４２】
【表４】
2009501007.tif 000007
【００４３】
例３（バイオブロスからの（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの単離およびその富化）
バイオブロス  １０．９kgを、冷却トラップ（ドライアイス）を備えた２０Ｌ丸底フラスコを有するＢｕｃｈｉ  Ｒ１５２ロータベーパーに移した。蒸留を、１４０mbarの減圧で、浴温６０℃およびコンデンサー温度１５℃で行った。観測された蒸留温度は５５℃であった。留分１（以下参照）を、冷却トラップで得た生成物（二相性溶液）と混ぜ合わせた。生成物の組成をＧＣにより分析した。
【００４４】
【表５】
2009501007.tif 000008
【００４５】
第１蒸留からの生成物（留分１と冷却トラップからの生成物）に、塩化ナトリウム  ３００ｇを加えて、混合物を１時間撹拌した。ＴＦＩＰ、水相および塩化ナトリウムの混合物を得た。混合物全体を、２Ｌ丸底フラスコを有するＢｕｃｈｉ  Ｒ１２４ロータベーパーに移した。蒸留を、周囲圧力で、浴温９０〜９８℃およびコンデンサー温度１５℃で行った。第１のＴＦＩＰ留分を８２〜８５℃で、第２の留分を８５〜９８℃で得た。
【００４６】
【表６】
2009501007.tif 000009
【００４７】
留分１と２を合わせることによって得た生成物を、最終蒸留に使用した。
【００４８】
例４（（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの最終精製）
１０Ｌ規模の２つの生物学的転換反応から第２蒸留後に得た、富化された（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノール  ６２５ｇを、最終留分蒸留のために使用された。蒸留を、５×１５０cm蒸留塔（Sulzer packing BX）に接続した１Ｌ丸底フラスコを使用して実施した。蒸留塔には、上端に還流分割器を備えた。蒸留を、周囲圧力で、浴温１５０℃、およびコンデンサー温度５℃で行った。選択された還流比（１：２０〜１：９９）は、得られた生成物の品質（ＧＣ上でモニタリングすることにより）に依存した。留出物の除去のための時間は、１秒であった。
【００４９】
【表７】
2009501007.tif 000010
【００５０】
留分２〜８を合わせることによって得られた最終生成物（２９９ｇ）は、以下の分析データを示した。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）とＨＰＬＣ／ＭＳによる同定；合致；
組成（ＧＣ）：ＴＦＩＰ  ９４．８％w/w、ＴＦＡＣ  ０．４％w/w、エタノール  ０．０２％w/w；
含水量（カール−フィッシャー法）：４．８％w/w；
鏡像体余剰（キラルＧＣ）：９９．３％。
【００５１】
大規模製造
例５（パン酵母の前処理）
ａ）  パン酵母の加熱処理
ステンレス製８００Ｌ反応器を、１０℃に冷却したｐＨ７．５の０．１Ｍリン酸塩緩衝液  ２４０Ｌで満たした。緩衝液は、脱イオン水  ８０４Ｌ中にリン酸二水素カリウム（製品番号  ６００２０；Fluka／スイス）１０．８８kgと水酸化カリウム（製品番号  ６０３７０；Fluka／スイス）４．０８kgを溶解することにより製造した。パン酵母  ２４０kg（製品番号１０４０２０、sackhefe Klipfel AG, Rheinfelden／スイス）を、撹拌しながら加えた。混合物を１０℃で６０分間さらに撹拌して、酵母懸濁液を均質にした。懸濁液に浸した温度プローブを取り付け、反応器を不活性ガスで満たした。酵母懸濁液を８３分以内に５０．３℃（±０．５℃）に加熱して、５０．３℃（±０．５℃）を９０分間持続した。次に、１０℃のｐＨ７．５の０．１Ｍ  リン酸塩緩衝液  ３２０Ｌを加えて、混合物を６７分以内に１０℃に冷却した。加熱処理の間、懸濁液のｐＨ値を、５０％水酸化カリウム溶液（１２．０kg）の制御された（ｐＨ−スタット）添加により、ｐＨ７．５に維持した。製造された酵母懸濁液を、ｐＨ７．５の制御を維持しながら（５０％  水酸化カリウム溶液  ５．８kgを消費した）、反応器中に１０℃、２５時間、一時的に貯蔵した。
【００５２】
ｂ）  加熱処理したパン酵母の使用試験
高価な１，１，１−トリフルオロアセトンの添加前に製造された酵母の所望の活性／立体選択性を検証するために使用試験を行った。加熱処理された酵母懸濁液２Ｌを、理化学用ガラス反応器２Ｌに入れた。１，１，１−トリフルオロアセトン６０ｇを、冷却した懸濁液（１０℃）に撹拌しながら加えた。続いて、反応混合物を６０分以内に２１℃に加熱した。生物学的転換の間、反応混合物のｐＨ値を、２５％水酸化カリウム溶液の制御された（ｐＨ−スタット）添加（２０時間以内に１６ｇ加えた）により、ｐＨ７．５に維持した。反応時間２０時間の後、（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを、収率３２％および９９．２％ｅｅで得た（試験基準：１５〜３０時間反応時間後、収率＞２５％および＞９８．９％ｅｅ）。
【００５３】
例６（生物学的転換）
氷冷した１，１，１−トリフルオロアセトン  ２４．７kgを、撹拌しながら冷却した（１０℃）酵母懸濁液に、浸漬管を通して５５分以内に移した。さらに２０分間撹拌した後、反応混合物の温度を５５分以内に２０℃に上げた。生物学的転換の間、反応混合物のｐＨ値を、５０％水酸化カリウム溶液の制御された（ｐＨ−スタット）添加（１５９時間以内に１６．８kg消費した）により、ｐＨ７．５に維持した。反応時間１５９時間の後、（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを、収率９６％および９９．４％ｅｅで得た。反応混合物８６０kgを得た。次に、反応混合物を、蒸留生成物の回収を予備開始する前に、２０℃で１日および６℃で３日貯蔵した。
【００５４】
例７（バイオブロスからの（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの単離およびその富化）
ａ）  第１蒸留
蒸留は、コンデンサーを備えた反応器の外で行った。蒸留をジャケット温度６０℃、圧力１４０mbarおよびコンデンサー温度６〜８℃で実施した。過剰発泡を防止するため、Basildon消泡剤（製品番号  ＢＣ８６／０１３；Basildon chemical Company Ltd／英国）を加えた。生成物の組成をＧＣにより分析した。蒸留は、乾燥氷冷トラップ中に生成物を含む工程−１生成物  １０１kgが得られた。生成物組成が、１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノール  １９．８m/m−％、１，１，１−トリフルオロアセトン  ０．２％、エタノール  ２．５％および水  ７７．５％であった。
【００５５】
ｂ）  第２蒸留
工程−１の生成物の蒸留を、蒸留フラスコ  ５０Ｌを備えたＢｕｅｃｈｉ  Ｒ１８７ロータベーパー上のそれぞれ約３０Ｌの３個のバッチにおいて行った。浴温９０℃およびコンデンサー温度１２〜１５℃で、第１留分を、ヘッド温度が＜６０℃に下がるまで、標準圧で採取した。第２留分を７００mbar、そして第３留分を５００mbarで採取した。得られた留分の品質をＧＣを用いて分析して、適切な留分の貯留は、エクセル計算を使用して設定純度基準に従って行った（１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールとエタノールの比＞１５）。工程−２の生成物を、合計２８．５kg得た。生成物の組成は、（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノール  ７９．３m/m−％、１，１，１−トリフルオロアセトン  ０．７％、エタノール  ４．９％および水  １５．２％であった。
【００５６】
ｃ）  第３蒸留
工程−２の生成物の蒸留を、２０Ｌ丸底フラスコを備えた５×１５０cmの精留塔（Sulzer packing BX）上のそれぞれ約１４kgの２個のバッチで行った。精留塔には、上端に還流分割器を備えた。蒸留を、浴温１１５℃、周囲圧力およびコンデンサー温度５℃で行った。選択された還流比（１：１０〜１：５０）は、得られた生成物の品質（ＧＣ上でモニタリングすることにより）に依存した。留出物除去のための時間は１秒であった。適切な純度の生成物留分の貯留を、エクセル計算を使用して設定純度基準に従って行った。共沸水５％およびエタノール＜０．１％を含有する純粋な（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを、７６．７℃〜７６．８℃で蒸留した。２個のバッチにおける蒸留は、工程−３の生成物  ２０．５kg（基準：（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノール≧９０％、エタノール≦０．５％）、および工程−３の副生成物  ２．２kg（基準：（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノール≧８０％、エタノール≦５％）〔これは、次に、再蒸留後、順に別の工程−３生成物  １．４kgを産生した〕が得られた。全体で、分留で、精製した（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノール  ２１．８kgを得られた。
【００５７】
生成された（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの特性
蒸留から集められた生成物（２１．８kg）は、以下の分析データを示した。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）とＨＰＬＣ／ＭＳによる同定；合致；
組成（ＧＣ）：ＴＦＩＰ  ９５．１％w/w、ＴＦＡＣ＜０．１％w/w、エタノール＜０．１％w/w；
含水量（カール−フィッシャー法）：５．２％w/w；
鏡像体余剰（キラルＧＣ）：９９．４％。
【００５８】
【表８】
2009501007.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月6日(2008.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パン酵母による１，１，１−トリフルオロアセトンの不斉微生物還元によって、＞９９％の鏡像体余剰を有する（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを製造するための、スケールアップ可能な生体触媒的方法であって、
ａ）  ０．１〜０．４Ｍリン酸塩緩衝液中のパン酵母の懸濁液を、５０〜５２℃に６０分間かけて加熱し、
ｂ）  この懸濁液を、５０〜５２℃でさらに９０分間にわたって、維持し、
ｃ）  加熱した懸濁液を、緩衝液で酵母濃度２０〜３０％w/vになるように希釈して、１２０分以内に１０℃まで冷却し、
ｄ）  ４Ｍ  ＫＯＨ溶液の自動添加により、工程全体にわたりｐＨを７．４〜７．５で一定に維持し、
ｅ）  １，１，１−トリフルオロアセトンの沸点より低い温度で生物学的転換を行うために、１，１，１−トリフルオロアセトンを濃度１〜５％（w/v）になるように加え、
ｆ）  ５〜８日以内に、２０℃の温度で１，１，１−トリフルオロアセトンを、（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールに還元して、そして
ｇ）  一連の蒸留工程により、（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを単離する
工程を含む方法。
【請求項２】
生物学的転換を、室温で５〜８日間にわたって実施する、請求項１記載の生体触媒的方法。
【請求項３】
使用される緩衝液が０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７〜８であることを特徴とする、請求項１記載の生体触媒的方法。
【請求項４】
基質濃度が２〜４％w/vであることを特徴とする、請求項１記載の生体触媒的方法。
【請求項５】
基質濃度が３％w/vであることを特徴とする、請求項４記載の生体触媒的方法。
【請求項６】
最終蒸留工程が精留である、請求項１に記載の分離手順。
【請求項７】
精神的障害におけるＡＰＩのための構造ブロックとしての、請求項１〜６で製造される（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの使用。
【請求項８】
ＷＯ  ２００５／０１４５６３に記載されるＡＰＩのための構造ブロックとしての、請求項１〜７で製造される（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの使用。
【請求項９】
ＷＯ  ２００５／０１４５６３に記載されるＡＰＩを＞９９％ｅｅの異性体純度で製造してもよい、請求項１〜８記載の生体触媒的方法。
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月20日(2008.10.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パン酵母による１，１，１−トリフルオロアセトンの不斉微生物還元によって、＞９９％の鏡像体余剰を有する（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを製造するための、スケールアップ可能な生体触媒的方法であって、
ａ）  ０．１〜０．４Ｍリン酸塩緩衝液中のパン酵母の懸濁液を、５０〜５２℃に６０分間かけて加熱し、
ｂ）  この懸濁液を、５０〜５２℃でさらに９０分間にわたって、維持し、
ｃ）  加熱した懸濁液を、緩衝液で酵母濃度２０〜３０％w/vになるように希釈して、１２０分以内に１０℃まで冷却し、
ｄ）  ４Ｍ  ＫＯＨ溶液の自動添加により、工程全体にわたりｐＨを７．４〜７．５で一定に維持し、
ｅ）  １，１，１−トリフルオロアセトンの沸点より低い温度で生物学的転換を行うために、１，１，１−トリフルオロアセトンを濃度１〜５％（w/v）になるように加え、
ｆ）  ５〜８日以内に、２０℃の温度で１，１，１−トリフルオロアセトンを、（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールに還元して、そして
ｇ）  一連の蒸留工程により、（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを単離する
工程を含む方法。
【請求項２】
生物学的転換を、室温で５〜８日間にわたって実施する、請求項１記載の生体触媒的方法。
【請求項３】
使用される緩衝液が０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７〜８であることを特徴とする、請求項１記載の生体触媒的方法。
【請求項４】
基質濃度が２〜４％w/vであることを特徴とする、請求項１記載の生体触媒的方法。
【請求項５】
基質濃度が３％w/vであることを特徴とする、請求項４記載の生体触媒的方法。
【請求項６】
最終蒸留工程が精留である、請求項１に記載の生体触媒的方法。
【国際調査報告】
2009501007.tif 000012
2009501007.tif 000013
2009501007.tif 000014
2009501007.tif 000015
2009501007.tif 000016
2009501007.tif 000017