(57)【要約】  各プローブ分子がヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはその修飾体由来の配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子で官能化された基板支持体を含むことを特徴とするヒストンマイクロアレイ。プローブ分子が異なるヒストンタンパク質由来の配列を含むことを特徴とするヒストンマイクロアレイ。本発明のヒストンマイクロアレイは、ヒストンおよび特定のヒストン修飾に対して特異性をもつ抗体のスクリーニングおよび評価法に利用できる。また、ヒストン修飾が、ヒストン修飾酵素および結合タンパク質の活性と結合に及ぼす影響のスクリーニングおよび評価法にも利用できる。
2009536336.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのプローブ分子で官能化される基板支持体を有し、各プローブ分子は、ヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはその修飾体由来の配列を含むことを特徴とするヒストンマイクロアレイ。
【請求項２】
プローブ分子の少なくとも１つがヒストン免疫グロブリン標的分子への結合に適することを特徴とする、請求項１に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項３】
各プローブ分子が、ペプチド、誘導体またはそのアナログを含むことを特徴とする請求項１または２に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項４】
プローブ分子が、ヒストン１（Ｈ１）、ヒストン２Ａ（Ｈ２Ａ）、ヒストン２Ｂ（Ｈ２Ｂ）、ヒストン３（Ｈ３Ｂ）、ヒストン４（Ｈ４）から成るヒストンタンパク質群から別個に選択される、１または複数のヒストンタンパク質に由来する配列を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１つに記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項５】
ヒストンタンパク質が、ヒトのヒストンタンパク質であることを特徴とする、請求項４に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項６】
プローブ分子が、Ｈ１．０、  Ｈ１．１、  Ｈ１．２、  Ｈ１．３、  Ｈ１．４、  Ｈ１．５、  Ｈ２Ａ．１、  Ｈ２Ａ．２、  Ｈ２Ａ．３、  Ｈ２Ｂ．ａ、  Ｈ２Ｂ．ｂ、  Ｈ２Ｂ．ｃ，  Ｈ２Ａ．ｄ，  Ｈ２Ａ．ｅ， Ｈ２Ａ．ｆ、  Ｈ３．１、  Ｈ３．２、  Ｈ３．３、  Ｈ４、およびそれらに関連した他種のホモログから成る、ヒストンアイソフォーム群から別個に選択される、１または複数のヒストンアイソフォームに由来する配列を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１つに記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項７】
プローブ分子が、Ｈ２Ａ−Ｘ、Ｈ２Ａ−Ｚ、マクロ- Ｈ２Ａ，  Ｈ２Ａ−Ｂｂｄ，  CENP-A、およびそれらに関連した他種のホモログから成る、ヒストン変異体群から別個に選択される、１または複数のヒストン変異体に由来する配列を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１つに記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項８】
プローブ分子の配列が、ヒストンのリン酸化、メチル化、アセチル化、およびユビキチン化から成る、ヒストン修飾群から別個に選択される、１または複数のヒストン修飾を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１つに記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項９】
前記ヒストン修飾は、アルギニンもしくはリジンのメチル化、トレオニンもしくはセリンのリン酸化、リジンのアセチル化、またはリジンのユビキチン化から別個に選択されることを特徴とする、請求項８に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項１０】
リジンはモノメチル化、ジメチル化、またはトリメチル化されていることを特徴とする、請求項９に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項１１】
アルギニンはモノメチル化、またはジメチル化されていることを特徴とする、請求項９に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項１２】
前記プローブ分子は、少なくとも１０のアミノ酸の配列を含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１つに記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項１３】
前記プローブ分子は、１００未満のアミノ酸の配列を含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１つに記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項１４】
プローブ分子は、異なるヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体またはそれらの修飾体に由来することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１つに記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項１５】
プローブ分子は、同一のヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体またはそれらの修飾体に由来することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１つに記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項１６】
ヒストンＨ３タンパク質、アイソフォーム、変異体またはそれらの修飾体に由来する配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を含むことを特徴とする、請求項１５に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項１７】
SEQ ID No.1〜SEQ ID No.103として識別される配列、またはそれらの組合わせの群から別個に選択される配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を含むことを特徴とする、請求項１６に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項１８】
SEQ ID No.1〜SEQ ID No.103として識別される配列の実質的にすべて、またはそれらの組合わせ、を含む複数のプローブ分子を有することを特徴とする、請求項１６または１７に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項１９】
ヒストンＨ４タンパク質、アイソフォーム、変異体またはそれらの修飾体に由来する配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を含むことを特徴とする、請求項１５に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項２０】
SEQ ID No.104〜SEQ ID No.147として識別される配列、またはそれらの組合わせの群から別個に選択される配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を有することを特徴とする、請求項１９に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項２１】
SEQ ID No.104〜SEQ ID No.147として識別される実質的にすべての配列、またはそれらの組合わせ、を含む複数のプローブ分子を有することを特徴とする、請求項１９または２０に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項２２】
ヒストンＨ２Ａタンパク質、アイソフォーム、変異体またはそれらの修飾体に由来する配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を有することを特徴とする、請求項１５に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項２３】
SEQ ID No.148〜SEQ ID No.167として識別される配列、またはそれらの組合わせの群から別個に選択される配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を有することを特徴とする、請求項２２に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項２４】
SEQ ID No.148〜SEQ ID No.167として識別される実質的にすべての配列、またはそれらの組合わせ、を含む複数のプローブ分子を有することを特徴とする、請求項２２または２３に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項２５】
ヒストンＨ２Ｂタンパク質、アイソフォーム、変異体またはそれらの修飾体に由来する配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を有することを特徴とする、請求項１５に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項２６】
SEQ ID No.168〜SEQ ID No.206として識別される配列、またはそれらの組合わせの群から別個に選択される配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を有することを特徴とする、請求項２５に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項２７】
SEQ ID No.168〜SEQ ID No.206として識別される実質的にすべての配列、またはそれらの組合わせ、を含む複数のプローブ分子を有することを特徴とする、請求項２６または２７に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項２８】
ヒストンＨ２Ａタンパク質およびヒストン２Ｂタンパク質、アイソフォーム、変異体またはそれらの修飾体に由来する配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を有することを特徴とする、請求項１４に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項２９】
SEQ ID No.148〜SEQ ID No.206として識別される配列、またはそれらの組合わせの群から別個に選択される配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を有することを特徴とする、請求項２８に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項３０】
SEQ ID No.148〜SEQ ID No.206として識別される実質的にすべての配列、またはそれらの組合わせ、を含む複数のプローブ分子を有することを特徴とする、請求項２８または２９に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項３１】
ヒストンＨ１タンパク質、アイソフォーム、変異体またはそれらの修飾体に由来する配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を有することを特徴とする、請求項１５に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項３２】
SEQ ID No.1〜SEQ ID No.206として識別される配列、またはそれらの組合わせの群から別個に選択した配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を有することを特徴とする、請求項１４に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項３３】
SEQ ID No.1〜SEQ ID No.206として識別される実質的にすべての配列、またはそれらの組合わせ、を含む複数のプローブ分子を有することを特徴とする、請求項３２に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項３４】
少なくとも２つのプローブ分子は、実質的に互いに同じ配列であるが少なくとも１つのヒストン修飾を含むことを特徴とする、請求項１〜３３のいずれか１つに記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項３５】
少なくとも２つのプローブ分子は、実質的に互いに異なる配列であり、異なるヒストン修飾を含んでも含まなくてもよいことを特徴とする、請求項１〜３３のいずれか１つに記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項３６】
各プローブ分子が、（ｉ）ヒストン修飾がまったくない、（ｉｉ）少なくとも１つのヒストン修飾を含む、および／または（ｉｉ）複数のヒストン修飾を含む、ヒストンタンパク質配列に由来するペプチド配列を含む、複数のプローブ分子を有することを特徴とする、請求項１〜３５のいずれか１つに記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項３７】
少なくとも１つのプローブ分子が、１または複数の修飾アミノ酸を含む配列を有し、少なくとも別のプローブ分子は修飾アミノ酸を含まない配列を有することを特徴とする、請求項１〜３６のいずれか１つに記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項３８】
プローブ分子は、ヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはその修飾体由来の配列を、基板支持体に結合させる際支持体から隔離するような間隔手段を含むことを特徴とする、請求項１〜３７のいずれか１つに記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項３９】
間隔手段は、少なくとも１つのアミノヘキサン酸（Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）５ＣＯ２Ｈ）分子を含むことを特徴とする、請求項３８に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項４０】
基板支持体が各プローブ分子の少なくとも２つの独立したコピーを有するような、１９６スポットのグリッドの少なくとも２つのコピーを含む、プローブ分子の集団を有することを特徴とする、前記請求項のいずれか１つに記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項４１】
グリッド上の列または行の近接する位置に同一のプローブ分子があることを特徴とする、請求項４０に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項４２】
少なくとも１つのコントロールプローブ分子をさらに有することを特徴とする、請求項１〜４１のいずれか１つに記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項４３】
（ｉ）ヒストン抗体の標的分子と、請求項１〜４２のいずれか１つにより規定されたヒストンマイクロアレイとの接触、  および
（ｉｉ）プローブ分子に付着しているヒストン抗体が存在するか否かの検出、を有することを特徴とする、ヒストン抗体の検出方法。
【請求項４４】
検出されたヒストン抗体の、スクリーニング、同定、単離、および/または評価をさらに有することを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
プローブ分子に付着するヒストン抗体の位置の検出をさらに有することを特徴とする、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
ステップ（ｉ）に先立ち、マイクロアレイがブロッキング試薬にさらされることを特徴とする、請求項４３〜４５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４７】
ステップ（ｉ）に続き、マイクロアレイの少なくとも１つの洗浄ステップを有することを特徴とする、請求項４３〜４６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４８】
ステップ（ｉｉ）は、マイクロアレイと検出抗体との接触を含むことを特徴とする、請求項４３〜４７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４９】
ステップ（ｉ）は、マイクロアレイと少なくとも２つの異なる標的抗体との接触を含むことを特徴とする、請求項４３〜４８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５０】
少なくとも２つのプローブ分子で基板支持体を官能化するステップを含み、各プローブ分子はヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはその修飾体由来の配列を含むことを特徴とする、請求項１〜４２のいずれか１つによるヒストンマイクロアレイの調製法。
【請求項５１】
プローブ分子は基板支持体に共有結合していることを特徴とする、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
プローブ分子はそれぞれビオチンを含み、基板支持体はストレプトアビジンを含むことを特徴とする、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
基板の官能化に用いられるプローブ分子濃度が５ｎｍｏｌｅ／ｍｌ未満であることを特徴とする、請求項５０〜５２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５４】
（ｉ）ヒストン特異的タンパク質の標的分子と、請求項１〜４２のいずれか１つによるヒストンマイクロアレイとの接触、  および
（ｉｉ）プローブ分子に結合または酵素的に反応するヒストン特異的タンパク質が存在するか否かの検出、を有することを特徴とする、ヒストン特異的タンパク質の検出方法。
【請求項５５】
ヒストン特異的タンパク質の標的分子はヒストン特異的酵素であることを特徴とする、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ヒストン特異的酵素が、ヒストンアセチルトランスフェラーゼおよびデアセチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼおよびデメチラーゼ、ヒストンＥ３ユビキチンリガーゼ、ならびにヒストンキナーゼおよびホスファターゼ、またはそれらの組合わせ、を含む酵素群から別個に選択されることを特徴とする、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
酵素に適当な基質分子を供給することを特徴とする、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５８】
ヒストン特異的タンパク質の標的分子はヒストン特異的結合タンパク質であることを特徴とする、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
ヒストン特異的結合タンパク質は、ＨＰ１、ヒストンＨ１、ＨＭＧＤ、ポリコームタンパク質、を含む結合タンパク質群から別個に選択されることを特徴とする、請求項５８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はヒストンに関し、特にヒストン特異的抗体およびヒストンの修飾に対する抗体に関する。本発明はそのような抗体をスクリーニングおよび／または同定するための装置、ならびにそのような装置を製造する方法に及ぶ。また本発明は、ヒストンおよびその修飾物に特異性を示す抗体のスクリーニング法と評価法にも及ぶ。本発明はまた、ヒストンの修飾が及ぼす、活性への影響やヒストン特異的酵素や結合タンパク質との結合への影響をスクリーニングし、評価する方法にも及ぶ。
【０００２】
ヒストンはＤＮＡのパッケージングに関与するタンパク質の１種で、アルギニンおよび／またはリジンに富む。ヒストンの主要なクラスはＨ１（‘リジンに富む’），Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ（‘わずかにリジンに富む’），Ｈ３，Ｈ４（‘アルギニンに富む’）に分類されている。ヒストンはＤＮＡと相互作用し、アルギニン／リジン残基の正電荷とＤＮＡのリン酸基の負電荷間で形成される塩橋を介してクロマチンを形成する。ヒストンは、遺伝子発現やＤＮＡ複製などのＤＮＡへの接近を必要とするすべての分子過程の制御に関与している。したがってヒストンは遺伝子の‘オン‘、‘オフ‘の切り換えに関与する。ヒストンは化学的な目印または’タグ‘（すなわち翻訳後修飾）が付着し、標識されることにより機能していると考えられている。これらのタグはいくつかの理由で複雑である。まず図１に示すように、ヒストンに起こる化学修飾にはアセチル化、メチル化、リン酸化など多くの種類があるからである。次に、化学修飾はヒストンタンパク質の多くの異なる残基上で起こるからである。
【０００３】
しかしながら、その修飾が何であるか、またそれがヒストンのどこで起こるのかが遺伝子制御にとって重要であるということは明らかである。ヒストンが介在する遺伝子制御は生物学の基礎知識として重要であり、また遺伝子制御がうまく行われないがんや白血病などの多くの疾病においても重要である。エピジェネティクスは、核内で起こる、ＤＮＡ配列の変化を必要としないプロセスの制御とそれに関連した治療を研究する分野であるが、場合によっては遺伝子発現をオンまたはオフに戻すことで遺伝子発現の欠陥を修復することを目指している。したがって、エピジェネティクスは加齢、遺伝病、がんなどの病気の治療に新しい方法をもたらすものである。
【０００４】
ヒストンとその様々な修飾に関する現在の研究は抗体が利用できるかどうかに大きく依存している。これらの抗体は、理想的には、特別のヒストンタンパク質、既知のヒストン修飾、およびたとえばヒストンＨ３のセリン１０のリン酸化などの特定の修飾部位に対しても高い特異性を有する。しかし、ヒストン抗体に関するひとつの問題は、抗体の性質がほとんどわかっておらず、特異性がないことがしばしばであるということである。たとえばヒストン抗体は、（ｉｉｉ）ヒストンＨ３のセリン残基１０における、すなわち配列ＡＫＳｐＴＧの関係におけるセリンのリン酸化というよりもむしろ、あらゆる（ｉ）アミノ酸残基のリン酸化、または（ｉｉ）セリンのリン酸化を認識し得る。抗体を利用する際さらに問題となるのは、近隣で起こる他の修飾も抗体の特異性に影響し得ることである。たとえば、ヒストンＨ３において、リジン９のメチル化がセリン１０のリン酸化の認識に影響するかもしれない。
【０００５】
したがって、エピジェネティク解析などのヒストンとその多様な修飾体を対象とする研究分野において、抗体の特異性が明確に決定されていないことが、学術的、商業的研究の大きな障害となっている。ヒストンタンパク質やその修飾体に対して高い特異性を示す抗体を得ることが困難だからである。したがってヒストン研究分野において、ヒストン抗体を検出し単離する装置と方法を提供することが大いに必要とされている。
【０００６】
その他ヒストンとその修飾体に関する研究は、ヒストンタンパク質のアミノ酸残基の修飾反応を触媒する、ヒストンに特異的な酵素の入手と利用に大きく依存している。これらの酵素も抗体と同様、特定のヒストンタンパク質の、既知のヒストン修飾、また、たとえばヒストンＨ３のセリン１０のリン酸化というような特定の修飾部位に対し高い特異性をもつ。
【０００７】
したがって本発明の目的は、ここに挙げたものであろうとなかろうと、先行技術の問題点のいくつかを解決または改善することであり、ヒストン特異的抗体や、多様なヒストン修飾に対し特異性を示す抗体を検出、スクリーニング、同定し、および／または単離する装置と方法を改良し提供することである。
【０００８】
そこで本発明者らは、多様なヒストンタンパク質（例えばＨ３，Ｈ４，Ｈ２ＡおよびＨ２Ｂ）とそれらの修飾体に対する抗体の特異性を解析した。結果は図１にまとめた。
【０００９】
ヒストンタンパク質またはそれらの修飾体由来の一連のペプチドをプローブ分子としてガラススライドに付着させ、ヒストンマイクロアレイを作製した。次にこのマイクロアレイを、ヒストンまたはヒストン修飾体に対し特異性をもつと考えられる多様な抗体を含む溶液にさらした。実施例１、２および図８−１３に示すように、このヒストンマイクロアレイは、多様なヒストンタンパク質、ヒストンアイソフォーム、それらの変異体だけでなく、予想外にも、そのようなヒストンタンパク質の翻訳後修飾に対する抗体の検出、単離、および／または評価においても非常に有効であった。
【００１０】
したがって、本発明の第１の態様により、少なくとも２つのプローブ分子で官能化された基板支持体を含むヒストンマイクロアレイが提供される。各プローブ分子は、ヒストンタンパク質、またはそのヒストンアイソフォーム、またはその変異体、またはその修飾体由来の配列を含む。
【００１１】
好ましくは、少なくとも１つのプローブ分子が、ヒストン抗体標的分子などの、ヒストン免疫グロブリン標的分子の結合するように適合される。しかしながら、各プローブ分子がヒストン抗体標的分子の結合するように適合されることが好ましい。したがって本発明によるマイクロアレイはヒストン抗体マイクロアレイあるいはスクリーンと呼んでよい。本発明によるマイクロアレイは、ヒストンタンパク質、またはそのアイソフォーム、またはその変異体、またはその修飾体由来の少なくとも２つのプローブ分子を含むので、アレイによって少なくとも２つのプローブ分子の抗体結合能を比較できる、ということを本発明者らは示した。したがってこのマイクロアレイは、ヒストンタンパク質およびそのアイソフォーム、変異体または修飾体に対し特異性をもつヒストン抗体を検出、スクリーニング、同定、単離、および／または評価するための、非常に効率よく簡便で安価な方法を提供する。
【００１２】
したがって、本発明の第２の態様により、ヒストン抗体の検出法が提供される。その方法は、（ｉ）ヒストン抗体標的分子を、ヒストンタンパク質、またはそのアイソフォーム、またはその変異体、またはその修飾体由来の配列を含む少なくとも２つのプローブ分子で官能化された基板支持体を含むヒストンマイクロアレイと接触させるステップと、（ｉｉ）プローブ分子に付着するヒストン抗体が存在するか否かを検出するステップを含む。
【００１３】
本方法は、好ましくは、検出ステップ（ｉｉ）の後に、検出したヒストン抗体をスクリーニング、同定、単離、および／または評価するステップを有する。したがって本発明は、ヒストンマイクロアレイを提供するとともに、ヒストン特異的抗体、およびヒストン変異体とアイソフォームとを含む、修飾されたヒストン特異的抗体をスクリーニングする方法も提供する。
【００１４】
好ましくは、各プローブ分子の配列は、ヒストンタンパク質、またはアイソフォーム、または変異体、またはそれらの修飾体に由来し、各ペプチド、その誘導体、またはそれらのアナログを含む。
【００１５】
用語“に由来する”とは、そのペプチド、誘導体またはそれらのアナログが、ヒストンタンパク質、またはアイソフォーム、または変異体、またはそれらの修飾体を構成するアミノ酸配列の誘導体または修飾体を含むか、または誘導体または修飾体そのものであることを意味する。したがって、基板支持体上に官能化される各プローブ分子は、ヒストンタンパク質、またはアイソフォーム、または変異体、またはそれらの修飾体を構成するアミノ酸配列に基づく、ペプチド、誘導体またはそれらのアナログを含む。特に、ヒストンタンパク質、またはアイソフォーム、または変異体、またはそれらの修飾体に由来する、ペプチド、誘導体、またはアナログは、マイクロアレイ上で機能的なプローブ分子として働き、特にヒストン抗体を検出するための有効なプローブとして働くことが示されている。“誘導体またはそれらのアナログ”とは、ヒストンタンパク質、またはアイソフォーム、または変異体、またはそれらの修飾体に由来する配列のアミノ酸残基が、側鎖またはペプチド構造の性質が似ている（天然アミノ酸、非天然アミノ酸またはアミノ酸疑似体いずれかの）残基に置換されることもある、ということである。さらにそのようなペプチドの末端は、アセチル基またはアミド基と似た性質をもつＮ末端またはＣ末端保護基で保護されていることもある。また、修飾アミノ酸は、本発明に従ったさらに好ましい誘導体またはアナログを形成する、当業者にとっては既知であるかもしれない多数のアミノ酸変異型を有するヒストン由来のペプチド、または誘導体またはそれらのアナログに置換されることも考えられる。そのような誘導体ペプチドまたはアナログペプチドは、修飾によって化学的性質が大きく変わらなければ、有効なプローブ分子となる。たとえば、アルギニン側鎖またはリジン側鎖のアミンの水素はメチレン基に置き換えられてよい（−ＮＨ２→−ＮＨ（Ｍｅ）または−Ｎ（Ｍｅ）２）。さらに、ペプチドのＮ末端アミノ基は、カルボキシル酸との相互作用により保護されていることもあり、Ｃ末端カルボキシル基は、アミンとの相互作用により保護されていることもある。より具体的には、本発明で用いられるペプチドのアナログはＤ−アミノ酸ペプチドを含む。
【００１６】
具体的にヒストン抗体の検出にマイクロアレイを利用する際、ヒストンタンパク質、またはアイソフォーム、または変異体、またはそれらの修飾体に由来する配列をエピトープ配列とよんでよい。“エピトープ配列”とは、抗体が認識し標的とし得る配列である。
【００１７】
用語“ヒストンタンパク質”とは、たいていの真核細胞においてクロマチンの主要な成分を構成するタンパク質の１種を意味する。ヒストンタンパク質には、Ｈ１，Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３およびＨ４など、多様な種類があることは当業者にとって周知のことである。したがって本発明のマイクロアレイは、ヒストン１（Ｈ１）、ヒストン２Ａ（Ｈ２Ａ）、ヒストン２Ｂ（Ｈ２Ｂ）、ヒストン３（Ｈ３）、およびヒストン４（Ｈ４）から成るタンパク質の群から別個に選択されるヒストンタンパク質由来の配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を含むことが好ましい。したがって本マイクロアレイは、Ｈ１タンパク質、Ｈ２Ａタンパク質、Ｈ２Ｂタンパク質、Ｈ３タンパク質および／またはＨ４タンパク質、またはアイソフォーム、または変異体、またはこのようなヒストンタンパク質の修飾体由来の配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を含んでもよい。
【００１８】
好ましくは、本マイクロアレイは、ヒト・ヒストンタンパク質、またはそれらのアイソフォーム、変異体または修飾体由来の配列を含む、プローブ分子を含む。これらのタンパク質のアミノ酸配列は固有のアクセス番号によってもっともよく定義されており、この番号は‘Suissprot/Uniprot’データベース (http://www.ebi.uniprot.org/index.shtml)から簡単に入手できる。ヒストンタンパク質が進化的に最もよく保存されているタンパク質であることは、周知のことであろう。したがって、たいていの哺乳類のヒストンタンパク質は非常に似通っており、互いに同一なこともしばしばある。たとえば、ヒト・ヒストン１はサル・ヒストン１と非常に似ている。しかし、各ヒストンタンパク質の配列間には多少の差異がみられる傾向があり、この差異によりヒストンアイソフォームと各ヒストンタンパク質変異体が形成される。ヒストンアイソフォームは保存性の高いヒストンタンパク質で、すべての’標準的な’ヒストンタンパク質（すなわちＨ１，Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３およびＨ４）はアイソフォームをもつ。ヒストンアイソフォームは、少数（約１−３）のアミノ酸置換を含むことで、互いに異なる。それらは一般的に非常に豊富なタンパク質であるが、これらの異なるアイソフォームがなぜ存在するのか、機能上の理由は不明である。
【００１９】
たとえば、もっとも豊富なヒト・ヒストン１（Ｈ１）アイソフォームのSuissprotアクセス番号は、H1.0 (P16401), H1.1 (Q02539), H1.2 (P16403), H1.3 (P16402), H1.4 (P10412), H1.5 (P16401)である。 ヒト・ヒストン２Ａ（Ｈ２Ａ）アイソフォームのSuissprotアクセス番号は、H2A.1 (POCOS8), H2A.2 (Q6FI13), H2A.3 (P20671), H2A.3 (P20671)である。 ヒト・ヒストン２B（Ｈ２B）アイソフォームのSuissprotアクセス番号は、H2A.a (P62807), H2A.b (P58876), H2A.c (Q99880), H2A.d (Q99877), H2A.e (QQ99879), H2A.f (P33778)である。 ヒト・ヒストンH3（Ｈ3）アイソフォームのSuissprotアクセス番号は、H3.1 (P68431), H3.3 (P84243)である。ヒト・ヒストンH4（Ｈ4）アイソフォームのSuissprotアクセス番号はP62805である。
【００２０】
したがって、用語“ヒストンアイソフォーム”とは、アミノ酸配列にわずかな差異を含む、ヒストンタンパク質（すなわちＨ１，Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３またはＨ４）の修飾体を意味している。よってヒストンアイソフォームは、対応するヒストンタンパク質（たとえばヒトＨ３．１とヒトＨ３．３）と少なくとも約８５％の相同性をもつこともある。
【００２１】
したがって、好ましいヒストンアイソフォームは、プローブ分子として使用してもよく、H1.0、H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H1.5、H2A.1、H2A.2、H2A.3、H2Ｂ.a、H2Ｂ.b、H2Ｂ.c，H2A.d，H2A.e，H2A.f、H3.1、H3.2、H3.3、およびH４とそれらに関連する異種のホモログから成る、ヒストンアイソフォーム群から別個に選択される。
【００２２】
いくつかの標準的なヒストン（たとえばＨ３およびＨ２Ａ）には、ヒストンアイソフォームだけでなくヒストン変異体も存在する。ヒストン変異体は少なくとも２つの異なる領域から成る。ひとつは（ｉ）保存性の高い‘コア’領域（またはドメイン）で、実際には標準的なヒストン配列（たとえばＨ３）中の相当領域と同じである。もうひとつは（ｉｉ）タンパク質のＮ末端またはＣ末端‘尾部’にある、ひとつか２つの可変領域で、標準的なヒストン配列中の相当領域とは非常に異なっている。最新のデータは、ヒストン変異体がＤＮＡのパッケージングに関与すると示唆している。しかし、変異体タンパク質の配列によって機能的特徴が異なってくる。ヒストン変異体は染色体の機能的に異なる領域と関連している。
【００２３】
たとえば、ヒト・ヒストン変異体にはH2A-X （Suissprotアクセス番号P16104）, H2A-Ｚ（Suissprotアクセス番号POCOS5）, CENP-A（Suissprotアクセス番号P49450）が含まれる。CENP-Aはセントロメアで見出される。
【００２４】
よって、“ヒストン変異体”とは、ヒストンアイソフォームよりもアミノ酸配列に大きな差異を含む、たとえば、相当するヒストンタンパク質（たとえばヒトCENP-AとH3.1）との同一性が約８５％以下のような、ヒストンタンパク質の修飾体である。
【００２５】
したがって、好ましいヒストン変異体は、プローブ分子において用いてもよく、H2A-X、H2A-Ｚ、マクロ- H2A, H2A-Bbd, CENP-A、およびそれらに関連する異種のホモログから成る、変異体群から別個に選択される。
【００２６】
また、ヒストンタンパク質またはアイソフォームまたはそれらの変異体は、それらのアミノ酸残基に付加される化学的な‘標識’または‘タグ’ でそれぞれ化学修飾されてもよいと考えられる。これらのタグまたは標識は、アセチル化、メチル化、ユビキチン化、リン酸化から成り、ヒストンタンパク質またはアイソフォームまたはそれらの変異体の異なる多数の部分に付加してもよい。図１に示すように、たとえばヒストンの修飾は、リジンのメチル化、リジンのアセチル化、リジンのユビキチン化、セリンのリン酸化、トレオニンのリン酸化およびアルギニンのメチル化を含んでよい。
【００２７】
したがって、用語“ヒストン修飾”は、ヒストンタンパク質、アイソフォームまたはそれらの変異体中の少なくとも１つのアミノ酸残基の、翻訳後の化学修飾、標識化またはタグ化を意味する。好ましいヒストン修飾は、プローブ分子中の配列として利用してもよく、ヒストンのリン酸化、メチル化、アセチル化、およびユビキチン化から別個に選択し得る。特に好ましいヒストン修飾は、プローブ分子中の配列として利用してもよく、アルギニンまたはリジンのメチル化、トレオニンまたはセリンのリン酸化、リジンのアセチル化、リジンのユビキチン化から別個に選択し得る。さらに、リジンはモノメチル化、ジメチル化、またはトリメチル化されてもよく、アルギニンはモノメチル化またはジメチル化されてもよく、これらも好ましいヒストン修飾体を形成し得ることは評価されることであろう。
【００２８】
マイクロアレイに用いられるプローブ分子の配列は、プローブ分子をハイブリダイズやスクリーニングする、抗体標的分子の性質や配列に依存すると考えられる。したがって、ペプチドがヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはそれらの修飾体に由来するならば、本発明は特定のペプチド配列に限定されない、と当業者は考えるであろう。しかし、本ペプチド配列は、少なくとも１０個のアミノ酸を含むことが好ましく、より好ましくは、少なくとも１５アミノ酸残基長の配列を含む。短い（たとえば１０アミノ酸またはそれ未満）ペプチド配列ならば選択性と感度が制限される一方、より長い（たとえば１０アミノ酸またはそれより多い）ペプチドまたはポリペプチド配列ならば選択性と感度が広がる。さらに、より長い（たとえば１５アミノ酸またはそれより多い）ペプチド配列ならばより感度が広がる、と当業者は考えるであろう。したがって、より好ましくは、本ペプチド配列は少なくとも１７個のアミノ酸残基を含み、さらに好ましくは、少なくとも２０個のアミノ酸残基を含む。好ましくは、本ペプチド配列は、１００個未満のアミノ酸を含み、より好ましくは、５０個未満のアミノ酸残基を含み、最も好ましくは、３５個未満のアミノ酸長を含む。
【００２９】
１つの実施形態において、本マイクロアレイは、異なるヒストンタンパク質に由来する配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子で官能化されてよい。たとえば具体的には、マイクロアレイ上の少なくとも１つのプローブ分子は、ヒストンＨ３由来の配列を含んでもよいし、少なくとも１つのプローブ分子はヒストンＨ４由来の配列を含んでもよい。別の実施形態において、マイクロアレイ上の少なくとも１つのプローブ分子は、ヒストンＨ１由来の配列を含んでもよいし、少なくとも１つのプローブ分子はヒストンＨ２Ａ由来の配列を含んでもよい。ヒストン由来の配列の多種の組み合わせがあり得ると、当業者は考えるであろう。異なるヒストンに由来するプローブ分子を使用することにより、選択した２つのヒストンの比較実験が可能である。
【００３０】
しかし、好ましい実施形態では、本マイクロアレイはプローブ分子が同じヒストンタンパク質に由来する配列を含む。たとえば、ヒストンＨ１，ヒストンＨ３，ヒストンＨ４，またはヒストンＨ２Ａおよび／またはヒストンＨ２Ｂのいずれかにより、それぞれヒストンＨ１，Ｈ３，Ｈ４，Ｈ２Ａ，またはＨ２Ｂマイクロアレイが形成される。
【００３１】
したがって好ましい実施形態では、本マイクロアレイはヒストンＨ３タンパク質、アイソフォーム、変異体、またはそれらの修飾体由来の配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を含んでよい。たとえば、図４は、ヒト・ヒストンＨ３とその修飾体由来の適当な配列を選択したものを示す。ここで配列はSEQ ID No.1からSEQ ID No.103と名付けられている。SEQ ID No.1として識別される配列は、ヒト・ヒストンＨ３タンパク質の一部の21アミノ酸である。SEQ ID No.2として識別される配列は、最初のアルギニン残基（Ｒ）がモノメチル化されている以外はSEQ ID No.1と同一である。SEQ ID No.3として識別される配列は、最初のアルギニン残基（Ｒ）がジメチル化されている以外はSEQ ID No.1と同一である。SEQ ID No.4として識別される配列は、最初のアルギニン残基（Ｒ）がモノメチル化され、また最初のトレオニン残基（Ｔ）がリン酸化されている以外はSEQ ID No.1と同一である、などである。SEQ ID No.39-103として識別される配列は、ヒストンＨ３タンパク質の異なる領域に由来し、様々に修飾されているものもあり、そうでないものもある。
【００３２】
したがって、好ましいマイクロアレイは、SEQ ID No.1からSEQ ID No.103、またはそれらの組合わせとして識別される配列群から別個に選択した配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を含む。好ましくは、本マイクロアレイは  SEQ ID No.1からSEQ ID No.103として識別される実質的にすべての配列を含む、複数のプローブ分子を含む。
【００３３】
さらに好ましい実施形態において、本マイクロアレイは、ヒストンＨ４タンパク質、アイソフォーム、変異体、またはそれらの修飾体由来の配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を含んでよい。たとえば、図５は、ヒト・ヒストンＨ４およびその修飾体由来の適当な配列を選択したものを示す。ここで配列はSEQ ID No.104からSEQ ID No.147と名付けられている。SEQ ID No.104として識別される配列は、ヒト・ヒストンＨ３タンパク質の一部の21アミノ酸である。SEQ ID No.105として識別される配列は、最初のセリン残基（Ｓ）がリン酸化されている以外はSEQ ID No.104と同一である。SEQ ID No.106として識別される配列は、最初のアルギニン残基（Ｒ）がモノメチル化されている以外はSEQ ID No.104と同一である。SEQ ID No.107として識別される配列は、最初のアルギニン残基（Ｒ）がジメチル化されている以外はSEQ ID No.104と同一である、などである。SEQ ID No.123-147として識別される配列は、ヒストンＨ4タンパク質の異なる領域に由来し、様々に修飾されているものもあり、そうでないものもある。
【００３４】
したがって、好ましいマイクロアレイは、SEQ ID No.104からSEQ ID No.147として識別される配列、またはそれらの組合わせの群から別個に選択した配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を含む。好ましくは、本マイクロアレイはSEQ ID No.104からSEQ ID No.147として識別される実質的にすべての配列を含む、複数のプローブ分子を含む。
【００３５】
さらに好ましい実施形態において、本マイクロアレイは、ヒストンＨ２Ａタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはそれらの修飾体由来の配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を含んでよい。たとえば、図６は、ヒト・ヒストンＨ２Ａとその修飾体由来の適当な配列を選択したものを示す。ここでそれらの配列はSEQ ID No.148からSEQ ID No.167と名付けられている。SEQ ID No.148として識別される配列は、ヒト・ヒストンＨ2Aタンパク質の一部の23アミノ酸である。SEQ ID No.149として識別される配列は、最初のセリン残基（Ｓ）がリン酸化されている以外はSEQ ID No.148と同一である。SEQ ID No.150として識別される配列は、最初のセリン残基（Ｓ）がリン酸化され、最初のリジン残基（Ｋ）がアセチル化されている以外はSEQ ID No.148と同一である。SEQ ID No.151として識別される配列は、最初のリジン残基（Ｋ）がアセチル化されている以外はSEQ ID No.148と同一である、などである。SEQ ID No.158-167として識別される配列は、ヒストンＨ2Aタンパク質の異なる領域に由来し、様々に修飾されているものもあり、そうでないものもある。
【００３６】
したがって、好ましいマイクロアレイは、SEQ ID No.148からSEQ ID No.167として識別される配列、またはそれらの組合わせの群から別個に選択した配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を含む。好ましくは、マイクロアレイはSEQ ID No.148からSEQ ID No.167として識別される実質的にすべての配列を含む、複数のプローブ分子を含む。
【００３７】
さらに好ましい実施形態において、本マイクロアレイは、ヒストンＨ２Ｂタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはそれらの修飾体由来の配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を含んでよい。たとえば、図７は、ヒト・ヒストンＨ２Ｂおよびその修飾体由来の適当な配列を選択したものを示す。ここでそれらの配列はSEQ ID No.168からSEQ ID No.206と名付けられている。SEQ ID No.168として識別される配列は、ヒト・ヒストンＨ2Bタンパク質の一部の21アミノ酸である。SEQ ID No.169として識別される配列は、最初のリジン残基（Ｋ）がアセチル化されている以外はSEQ ID No.168と同一である。SEQ ID No.170として識別される配列は、最初のリジン残基（Ｋ）がモノメチル化されている以外はSEQ ID No.168と同一である。SEQ ID No.171として識別される配列は、最初のリジン残基（Ｋ）がジメチル化されている以外はSEQ ID No.168と同一である、などである。 SEQ ID No.178-206として識別される配列は、ヒストンＨ2Bタンパク質の異なる領域に由来し、様々に修飾されているものもあり、そうでないものもある。
【００３８】
したがって、好ましいマイクロアレイは、SEQ ID No.168からSEQ ID No.206として識別される配列、またはそれらの組合わせの群から別個に選択した配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を含む。好ましくは、本マイクロアレイはSEQ ID No.168からSEQ ID No.206として識別される実質的にすべての配列を含む、複数のプローブ分子を含む。
【００３９】
ヒストンＨ２ＡとＨ２Ｂは類似しているため、ヒストンＨ２Ａタンパク質とＨ２Ｂタンパク質、またはアイソフォーム、変異体、またはそれらの修飾体に由来する配列を含む複数のプローブ分子を含むマイクロアレイを得ることが有用であると考えるのは、当然であろう。したがって、そのような具体例として、本マイクロアレイは、SEQ ID No.148からSEQ ID No.206として識別される配列、またはそれらの組合わせの群から別個に選択した配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を含んでもよい。好ましくは、本マイクロアレイはSEQ ID No.148からSEQ ID No.206として識別される実質的にすべての配列を含む、複数のプローブ分子を含む。
【００４０】
さらに好ましい実施形態において、本マイクロアレイは、ヒストンＨ１タンパク質、アイソフォーム、変異体、またはそれらの修飾体由来の配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を含んでよい。前述の、または公的に利用可能なデータベースを用いて、当業者は多様なヒストンＨ１配列のペプチドを考え得るであろう。それらのペプチドは、Ｈ１ヒストンマイクロアレイを形成するためのプローブ分子として利用されてもよい。もっとも豊富に存在するヒト・ヒストンＨ１アイソフォームのSuissprotアクセス番号は、H1.0 (P16401), H1.1 (Q02539), H1.2 (P16403), H1.3 (P16402), H1.4 (P16412)およびH1.5 (P16401)である。
【００４１】
本マイクロアレイはヒストン特異的（たとえばＨ１のみに由来するプローブ、またはＨ３のみに由来するプローブなど）であってよい。また、本マイクロアレイはすべてのヒストンに由来するプローブ分子を含んでよい。したがって本発明によるマイクロアレイは、SEQ ID No.1からSEQ ID No.206として識別される配列のあらゆる組合わせを有する配列を含む、プローブ配列で官能化されてよいと考えられる。したがって、本発明は、１種だけのヒストンタンパク質、または多種のヒストンタンパク質のいずれかに由来する配列を含むプローブ分子で官能化された一連の多様なマイクロアレイを提供すると考えられる。したがってこれらのマイクロアレイは、たとえばヒストンＨ１マイクロアレイ、またはヒストンＨ３マイクロアレイ、などとして、第２の態様による方法を用いてＨ１またはＨ３特異的抗体を検出し、さらにそれらの性質を決定するのに利用できる、と考えられる。
【００４２】
本発明の実施形態において、マイクロアレイは、ヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはそれらの修飾体由来の配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を含んでよい。ここで、少なくとも２つの配列は実質的に互いに同じであるが、それらは少なくとも１つのヒストン修飾を含む。好ましくは、それらの修飾は異なっている。一つの例を挙げると、SEQ ID No.2-38として識別される配列は、SEQ ID No.1（ヒストンＨ３）と同一であるが、少なくともひとつのヒストン修飾を含む。これらの配列のいくつかは、少なくとも２つのヒストン修飾を含むと考えられる。ヒストンＨ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ１およびＨ４についても同様である。
【００４３】
しかし、別の実施形態において、本マイクロアレイは、ヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはそれらの修飾体由来の配列を含む少なくとも２つのプローブ分子を含んでよく、ここで、少なくとも２つの配列は実質的に互いに異なっており、それらは異なるヒストン修飾を含んでも含まなくてもよい。一つの例を挙げると、SEQ ID No.39-103として識別される配列はSEQ ID No.1（ヒストンＨ３）とは異なっており、配列には少なくともひとつのヒストン修飾があり、配列にはヒストン修飾がまったくない。ヒストンＨ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ１およびＨ４についても同じである。
【００４４】
本発明者らは、生細胞で観察されることを反映し、広範囲にわたる一連の配列を構成する複数のプローブ分子によって官能化されたマイクロアレイの作成を試みた。したがって、本マイクロアレイは、複数のプローブ分子によって官能化された基板支持体を含むことが好ましい。各プローブ分子は、（ｉ）ヒストン修飾がまったくない、（ｉｉ）少なくともひとつのヒストン修飾を含む、および／または（ｉｉ）複数のヒストン修飾を含む、ヒストンタンパク質配列に由来するペプチド配列を含む。
【００４５】
したがって、本発明によるマイクロアレイは、系統的なペプチド群を含み、それらを合わせて解析することで、どの抗体がどのペプチドに結合するのかという、抗体の特異性を決定するのに有効である。さらに、本発明による方法は、非修飾および修飾ヒストンプローブ分子の、包括的で系統的なアレイの使用に基づく。したがって、本発明によるマイクロアレイおよび方法は、（ｉ）ヒストン特異的抗体、（ｉｉ）本マイクロアレイを、抗体標的分子を含む溶液にさらすことによる特定のヒストン修飾体に対する抗体、および（ｉｉｉ）ある状況の配列中（すなわち、隣接している残基が修飾されていない場合）のヒストン修飾のみ認識する抗体、をスクリーニングおよび／または同定するのに効果的に利用できると本発明者らは考えている。したがって本発明は、ヒストン抗体の特異性を包括的にかつ非常に正確に決定できる、系統的な手法を提供する。
【００４６】
したがって、最も好ましい実施形態において、本マイクロアレイは、それぞれがヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはその修飾体由来の配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子で官能化された、基板支持体を含む。ここで少なくとも１つの配列は、１または複数の修飾アミノ酸を含み、また少なくとも別の配列は修飾アミノ酸を含まない。本発明者らは、プローブ分子のこの設定により、わずかに異なる２つまたはそれより多数の配列に対する抗体の結合を比較できることを見出した。
【００４７】
マイクロアレイ上の十分な数のプローブ分子は、ヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはその修飾体由来の配列を含むと考えられる。したがって、好適には、本発明によるマイクロアレイは少なくとも３つのプローブ分子、より好ましくは少なくとも４つのプローブ分子、さらに好ましくは少なくとも５つのプローブ分子を含んでよい。各プローブ分子は、ヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはその修飾体由来の配列を含む。本マイクロアレイは少なくとも１０個のプローブ分子を含み、より好適には少なくとも２０個のプローブ分子、さらに好適には少なくとも３０個のプローブ分子を含むと予想される。各プローブ分子は、ヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはその修飾体由来の配列を含む。好ましくは、本マイクロアレイは少なくとも４０個のプローブ分子を含み、より好ましくは少なくとも５０個のプローブ分子、さらに好ましくは少なくとも６０個のプローブ分子を含む。各プローブ分子は、ヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはその修飾体由来の配列を含む。さらに好ましくは、本マイクロアレイは少なくとも８０個のプローブ分子を含み、より好ましくは少なくとも１００個のプローブ分子、さらに好ましくはは少なくとも１２０個のプローブ分子を含む。各プローブ分子は、ヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはその修飾体由来の配列を含む。
【００４８】
また、ヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはその修飾体由来の配列を含む、マイクロアレイ上のプローブ分子の数は、そのようなヒストン由来プローブの数の、マイクロアレイ上のプローブ分子総数に対する割合から、計算可能である。したがって、本マイクロアレイの好ましい実施形態では、少なくとも１０％、より好適には、少なくとも２０％、さらに好適には、少なくとも３０％、そして最も好適には、少なくとも４０％のプローブ分子が、ヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはその修飾体由来の配列を含む。しかし、少なくとも５０％、より好適には、少なくとも６０％、さらに好適には、少なくとも７０％、そして最も好適には、少なくとも８０％のプローブ分子が、ヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはその修飾体由来の配列を含むのが好ましい。最も好ましい実施形態では、少なくとも８５％、より好適には、少なくとも９０％、さらに好適には、少なくとも９５％、そして最も好適には、少なくとも９８％のプローブ分子が、ヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはその修飾体由来の配列を含む。特に好ましい実施形態では、実質的にすべてのプローブ分子が、ヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはその修飾体由来の配列を含む。
【００４９】
したがって最も好ましい実施形態において、本発明はここで定義したようなペプチドプローブ分子を含むマイクロアレイを提供する。これらのプローブ分子により、すべての既知のヒストン修飾がまとめて明確になり、またそれらの修飾が多様なヒストン配列上のどこで起きているのかも明確になる。したがって、有利には、細胞に存在し得るプローブのあり得る組合わせを実質的にすべて含むプローブ分子を含む、本発明による系統的なマイクロアレイの利用は、ヒストン抗体の特異性を決定する３つの重要な因子を同定できる。第一に、その抗体がどの種類の化学修飾を認識しているのか（たとえばリジンのアセチル化、モノ-、ジ-、またはトリ-メチル化）を正確に同定できる。第二に、その抗体が認識する修飾の正確な場所、すなわち修飾されている残基とその周辺のアミノ酸配列を決定できる。第三に、近隣のヒストン修飾が抗体の認識に影響しているかどうかを決定することもできる。
【００５０】
したがって、ヒストン抗体を検出する際、第２の態様による方法によって抗体の詳細な特性を明らかにできる。すなわち（ｉ）その抗体がある種のヒストン修飾そのもの（たとえばリン酸化、アセチル化、メチル化など）に対し結合するよう設計されているのか、（ｉｉ）ある種のアミノ酸残基のヒストン修飾の種類（たとえばセリン残基のリン酸化）、または（ｉｉｉ）ヒストンタンパク質の特定のアミノ酸残基のヒストン修飾の種類（たとえばＨ３のセリン１０のリン酸化）を認識し結合するのか、などの特性である。
【００５１】
本発明者らはまた、第１の態様によるヒストンマイクロアレイの調製法もまた有用であると考えている。
【００５２】
したがって、第３の態様では、少なくとも２つのプローブ分子で基板支持体を官能化するステップを含む、ヒストンマイクロアレイの調製法が提供される。各プローブ分子はヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはその修飾体由来の配列を含む。
【００５３】
“官能化する”とは、プローブ分子を基板支持体に付着またはカップリングさせることを意味する。“スポッティング”という用語が、官能化する作用を定義するために使用されることもある。当業者にとって、マイクロアレイの利用はよく知られており（たとえば、Schena, M., Microarray Biochp Technology, Eaton Publishing, Sunnyvale, CA, 87-187,2000）、マイクロアレイ技術で用いられる多様な基板支持体もまたよく知られている。よって基板支持体は、シリコン、ガラス、もしくはポリマーなど、またはナイロン膜、またはマイクロタイタープレートを含んでもよく、基板はプローブ分子で官能化される。
【００５４】
支持体の表面にプローブ分子を付着またはカップリングさせる技術もまた、当業者に知られており、プローブ分子と、支持体の表面にある、（ＷＯ95/35505に記載されているような）ポリＬ-リジンなどのポリカチオン性ポリマーのコーティングフィルムとの間の静電気的相互作用の利用を含む。また、支持体に共有結合させる手法もよく確立されている。また、表面が金属性の基板は、チオール結合が関与する自己集合によって、プローブ分子で官能化されてもよい。
【００５５】
しかし、第３の態様の好ましい方法は、自己集合した単層、あるいはアビジンまたはストレプトアビジンと、ビオチンとの反応による、共有化学的な付着法の利用を含む。したがって、各プローブ分子はビオチン分子を含み、基板はストレプトアビジンと、好ましくはストレプトアビジンでコーティングされたものを含んでもよい。図２と３に示すように、本基板はストレプトアビジン層であらかじめコートされたガラススライドを含む。ストレプトアビジン層はプローブ分子のアミノ末端に付加されたビオチンと非可逆的に結合し、マイクロアレイを形成する。
【００５６】
実験の過程で本発明者らは、もし、ヒストンタンパク質由来の(エピトープ)配列を基板表面に接近しすぎて置いた場合、本マイクロアレイは多様な抗体を明確に区別できるとは限らないことを見出した。そこで発明者らは、エピトープ配列と基板間に必要な正確な距離を決定するため一連の実験を行った。
【００５７】
その結果、実施の形態としてエピトープ配列が十分に基板表面から離れている場合に、マイクロアレイの特異性が大きく上がることがわかった。本発明者らは、いずれの仮説にも結び付けたくはないが、間隔を取ることでエピトープ配列が基板から十分に露出し、立体障害を避けることにより、抗体がプローブ分子とハイブリダイズできるようになると考えている。
【００５８】
したがって、本プローブ分子は間隔手段を含むことが好ましく、その手段は、ヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはその修飾体由来の配列を基板支持体に結合させる際、支持体から離れて結合させるような手段である。好ましくは、間隔手段（またはスペーサー）は、ヒストン由来の配列と、プローブ分子と基板支持体間にある付加部位との間に置かれる。好ましくは、実施の形態としてプローブを基板へ付加させるのにビオチンが用いられる場合、間隔手段は配列とビオチン分子の間に置かれる。
【００５９】
当業者であれば、どんな種類の鎖が間隔手段またはスペーサーとして、プローブ配列に取り込まれてよいかを考えるであろう。たとえば、間隔手段は、アルキル鎖、またはアミノ、エステル、アミドもしくはカルボニル基を含むアルキル鎖を含んでもよく、それらの鎖はプローブ配列中へ取り込まれるよう末端が適当に官能化されている。間隔手段のプローブ配列中への取り込みは、たとえば、エステルまたはアミド結合による。
【００６０】
間隔手段は少なくとも１つの、好ましくは少なくとも２つの、より好ましくは少なくとも３つの原子を鎖中に含んでよい。実際の原子種は、原子の数や大きさほど重要ではなく、エピトープ配列を基板支持体から離す効果を与える。したがって、一例を挙げると、間隔手段の原子は、炭素、酸素、またはそれらの組合わせでもよい。間隔手段は分岐鎖を含んでもよい。しかし、好ましくは、直鎖である。間隔手段またはスペーサーは、少なくとも５，１０，１５，２０，２５または３０あるいはそれ以上の原子を含むことが予想される。スペーサーの化学式と長さは、プローブ分子中のエピトープ配列の種類と長さにより決まると考えられる。
【００６１】
間隔手段は、複数のアミノ酸が結合したものを含んでもよい。エピトープ配列を基板支持体から離すための好適なスペーサーとするため、どのようにアミノ酸を結合させるかを当業者は考えるであろう。一例を挙げると、間隔手段は、ベータアラニン（ｘ３），ＧｌｙＳｅｒＧｌｙＳｅｒまたはＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙを含んでもよい。
【００６２】
間隔手段は、反復ユニット、または鎖を含んでもよい。たとえば、[-CH2- ]nを含んでもよく、ここでｎの値は少なくとも１である整数である。しかし、ｎは整数であり、１より大きいこともあり、したがって実際は[-CH2- ]nの反復ユニットである。間隔手段の別の好適な例では、[-CH2- Ｏ-CH2-]nを含み、ここでｎの値は少なくとも１である整数である。しかし、ｎは整数であり、１より大きいこともあり、したがって実際は[-CH2- Ｏ-CH2-]nの反復ユニットである。
【００６３】
間隔手段は、少なくとも１つのアミノヘキサン酸（Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）５ＣＯ２Ｈ）分子を含むことが最も好ましい。これは７原子長の鎖を構成すると考えられる。しかし、図２と３に示すように、本発明者らは最適な間隔手段が２分子のアミノヘキサン酸を含むことを見出した。したがって、各テストペプチドのビオチン残基が、連続する２つのアミノヘキサン酸（Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）５ＣＯ２Ｈ）スペーサー分子により、ヒストンまたはヒストン修飾体に相当するペプチド配列から隔てられていることが好ましい。これらのスペーサーは、分子の固定部からテストペプチド配列を移動させ、または隔てるために含まれる。      
【００６４】
わずか２分子のアミノヘキサン酸スペーサーにより、より迅速な合成が可能となり、マイクロアレイでスクリーニングされる抗体にスペーサーが認識される頻度を低下させることができる。
【００６５】
本マイクロアレイは、各プローブ分子溶液を基板支持体上にスポットし、各プローブ分子を単層状に基板に結合させ、適切なグリッド様の形態となるようにする、第三の態様の方法によって作製できる。したがって、プローブ分子は、好ましくは、溶液で調製し、たとえば、６０％アセトニトリル、４０％水および０．０５％トリフルオロ酢酸溶液で濃度約５nanomoles/mlに希釈する。本発明者らは、第２の態様の方法の検出段階で、かなり高濃度のプローブ分子がスメアリングを引き起こし、それが判定の支障となることを見出した。したがって、基板の官能化に使用されるプローブ分子の濃度は５nanomoles/mlより低いことが好ましい。
【００６６】
好ましい実施の形態では、本マイクロアレイは、同一群のものがお互いに近接するようマイクロアレイ上に順序よく配置された、プローブ分子のライブラリーまたは集団を含んでもよい。プローブ分子は、たとえば、グリッドの各列が同一または類似の特性をもつ群に相当するよう基板上のグリッドパターンに沿って配置される。たとえば、同一のヒストンタンパク質（たとえばH1）、または同一のヒストン修飾体の種類に由来する群などである。一例を挙げると、グリッドの最初の列は、ヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはその修飾体に特異的な抗体とハイブリダイズするようなプローブ分子を含んでもよい。そしてグリッドの２番目の列には、別のヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはその修飾体に特異的な抗体とハイブリダイズするようなプローブ分子を含んでもよい。
【００６７】
特に好ましい実施の形態では、本マイクロアレイは、ガラススライドが、抗体結合のいずれかのパターンの少なくとも２つの独立したコピーをもつような、１９６スポットのグリッドの少なくとも２つのコピーを含む、１集団のプローブ分子を含む。グリッドは、１つまたはそれより多いヒストン（たとえばヒストンＨ２ＡおよびH2B）に由来するペプチドの混合物を含んでよく、列であろうと行であろうと近接するスポットは好ましくは、同一のペプチドプローブ分子である。有利には、近接するペプチドの‘反復スポッティング’およびグリッド配置の複製のいずれによっても、明確で再現的な抗体結合のパターンを確実に得られる。
【００６８】
プローブ分子によって官能化される基板の位置を、センサー部位、プローブ部位、またはスポット部位と称する。マイクロアレイ基板上の特定のセンサー部位において、抗体とプローブ分子とのハイブリダイゼーションを検出することが重要である。また抗体そのものが存在するのか否かを検出することも重要である。したがって、本発明による方法は、第２の態様の方法のステップ（ｉｉ）に、抗体とプローブ分子のハイブリッドが形成された場所を検出することを含むのが好ましい。
【００６９】
したがって、基板上のプローブ分子の位置は、パターン化された金属層により各部位が決定されるようになっている。金などの金属層には、たとえば、自己集合する単層の化学反応を利用して、複数のプローブ分子が固定化されているが、固定化には位置を制御するためのスポッティング技術を含む場合も、含まない場合もある。したがって、基板は、少なくとも１集団の、固定化されたプローブ分子を含んでよい。しかし、基板上の異なるプローブ分子の集団が別の部位に固定化され、各部位が異なるプローブ分子の集団を維持することもある。各群は、主に単一種のプローブを含む。しかし、同じプローブがセンサー表面の別の部位で繰り返されることもある。この複製手法を利用することで、本方法の分析の信頼性を上げるためである。さらに、同じ基板上で異なる種類のプローブ分子を混合するのも好ましい。異なる抗体をきちんと識別しつつ、基板の表面積を縮小するためである。
【００７０】
好ましくは、基板支持体は少なくとも２つ以上のプローブ部位を含む。感度の高い用途には、プローブ部位の総数は少ないほうがよい。基板支持体の面積はできるだけ小さいほうがよく、各プローブ部位面積は直径約１０−１０００μｍで、より好ましくは直径約５０−７５０μｍ、さらに好ましくは直径約２００−５００μｍである。好ましくは、各プローブ部位は直径／幅約３００−４００μｍまたはそれより小さく、互いにごくわずかに離れている。好ましくは、各プローブ部位間の距離（すなわちスペース距離）は、できるだけ小さいが、各部位間で配列のクロスコンタミネーションが起こらない程度に大きい。またこの距離は、プローブ分子の配置法の空間的操作に依存する。好ましくは、プローブ部位の間隙は約５００μｍ以下で、より好ましくは約３００μｍ以下、最も好ましくは約２００μｍ以下である。
【００７１】
本マイクロアレイはさらに、対照標準を含んでよい。たとえば、基板支持体に官能化されたビオチン結合抗体（たとえばウサギ抗体）である。対照標準はマイクロアレイ基板の各四隅にスポットされてよい。これにより、実施例に記載されたように、テスト抗体の分布を検出するため標準的な抗ウサギ‘２次抗体’を使用した場合、マイクロアレイの限界を自動的に決定できる。
【００７２】
好ましくは、第２の態様による方法のステップ（ｉ）に先立ち、本マイクロアレイはブロッキング試薬にさらす。たとえば好適なブロッキング試薬は、ＰＢＳに溶解した１０％ウシ血清アルブミン溶液を含む。次に本方法のステップ（ｉ）に進む。ステップ（ｉ）は、ヒストンマイクロアレイが少なくとも１つの抗体（すなわちここでは‘標的’と呼ばれる）と接触することを含み、これは好ましくは溶液中で行われる。本アレイは好ましくは、スクリーニングされる抗体（一般にはウサギで免疫される）を含む溶液をＰＢＳで適当に希釈し、０．１％Ｔｗｅｅｎ存在下で約１時間反応させる。
【００７３】
好ましくは、第２の態様による方法は少なくとも１つの、より好ましくは少なくとも２つの洗浄ステップを含む。たとえば、本アレイは１Ｍ  ＮａＣｌ，１ｘ ＰＢＳ．０．１％  Ｔｗｅｅｎ中で約５分間洗浄され、それからＰＢＳ，０．１％  Ｔｗｅｅｎ中で3X1５分間再度洗浄される。洗浄ステップの後、第２の態様による方法の検出ステップ（ｉｉ）に進む。ステップ（ｉｉ）はマイクロアレイと検出抗体との接触を含んでよい。検出抗体は標的抗体に対する特異性をもち、適切な方法により検出される。たとえば、検出抗体は市販で入手可能な抗ウサギ抗体、または他のいくつかの適当な‘２次抗体’である。好ましくは、検出抗体は標識、たとえばセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲP）、を含む。しかし、本抗体はＬｉ−ｃｏｒ蛍光タグなどの蛍光タグを含むことが好ましい。マイクロアレイに結合している標的抗体の分布は、標的抗体に結合する２次抗体を、たとえば市販のスキャナー技術（Ｌｉ−ｃｏｒ）で検出することで、検出できる。
【００７４】
検出ステップ（ｉｉ）に続き、本方法は、検出されたヒストン抗体をスクリーニング、同定、単離、および／または評価するステップを含んでよい。したがって、本発明は、ヒストン特異的抗体、およびヒストン変異体とアイソフォームを含むヒストン修飾体に特異的な抗体のスクリーニング法、すなわちヒストン抗体スクリーンを提供する。本発明による方法は、標的抗体が、（ｉ）ヒストン修飾自体（たとえばリン酸化、アセチル化、ユビキチン化、またはメチル化など）、（ｉｉ）ある種類のアミノ酸残基のヒストン修飾（たとえばセリン残基のリン酸化など）、または（ｉｉｉ）特定のヒストンタンパク質中の特定のアミノ酸残基のヒストン修飾（たとえばＨ３のセリン１０のリン酸化）、に対して特異的かどうかを同定または識別するのに利用できる。
【００７５】
別の実施形態では、第２の態様による方法は、少なくとも２以上の異なる抗体を検出または識別するのに利用できる。したがって、本方法のステップ（ｉ）はマイクロアレイと少なくとも２つ以上の標的抗体との接触を含んでよく、それは同じ溶液中であってもなくてもよい。本発明者らは、異なる種で免疫された抗体を用い、続いて各々が異種の抗体に特異性をもち異なる標識を含む、種々の検出（‘２次’）抗体を用いることによって、各標的抗体と、種々のヒストン修飾自体、または上記にまとめたような各種の修飾に対するそれらの特異性を識別することが可能と考えている。例を挙げると、検出抗体はLi-cor CR800タグを含んでよく、また別の検出抗体はセイヨウワサビペルオキシダーゼタグを含んでよい。したがって、適切な検出器を用いて各検出抗体上の種々の標識を検出し、それによりマイクロアレイ上の種々の標的抗体の結合を検出、識別できる。
【００７６】
したがって、前述のことから、第１の態様による本マイクロアレイは、ヒストン特異的抗体の検出および評価に非常に有用であると考えられる。さらに、ここで述べたように、ヒストンは、標識、または、リン酸化、メチル化、アセチル化、もしくはユビキチン化などの修飾によって化学的に修飾され、これらの修飾のそれぞれはヒストン特異的酵素によって実施される。たとえば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼは、ヒストンのアセチル化、たとえばＨ３のリジン９、を触媒する酵素である。また、これらのヒストン特異的酵素の反応性および特異性を評価できることは、研究者らに大いに必要とされているとも考えられる。したがって、第１の態様による本マイクロアレイは、そのようなヒストン特異的酵素の特異性を検出または評価するのに利用できると、本発明者らは考える。
【００７７】
したがって、本発明の第四の態様により、ヒストン特異的タンパク質の検出方法が提供される。本方法は、（ｉ）ヒストン特異的タンパク質の標的分子と、ヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはそれらの修飾体に由来する配列をそれぞれ含む、少なくとも２つのプローブ分子で官能化された基板支持体を含むヒストンマイクロアレイとを接触させること、および（ｉｉ）プローブ分子へ結合または酵素的に反応しているヒストン特異的タンパク質が存在するか否かを検出することとを含む。
【００７８】
‘ヒストン特異的タンパク質’とは、ヒストンタンパク質に対し特異性をもつ、アミノ酸配列のことで、すなわち、ヒストン特異的結合タンパク質のことである。たとえば、抗体がこの定義に当てはまる。しかし、好ましくは、本マイクロアレイと接触し、検出されるべきヒストン特異的タンパク質は、ヒストン特異的酵素を含む。当業者は、多様なヒストン特異的酵素が存在すると考えるであろう。したがってヒストン特異的酵素は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼおよびデアセチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼおよびデメチラーゼ、ヒストンＥ３ユビキチンリガーゼ、ならびにヒストンキナーゼおよびホスファターゼ、またはそれらの組合わせを含む酵素群から別個に選択されることが好ましい。以下の実験例３では、ヒストン修飾がヒストン修飾酵素の酵素活性に及ぼす影響を解析するために、本発明のヒストンマイクロアレイの利用を示している。
【００７９】
好ましいヒストン修飾は、酵素によって行うことが可能であるが、ヒストンのリン酸化、メチル化、アセチル化、もしくはユビキチン化、またはこれらの修飾の除去を含む。特に好ましいヒストン修飾は、酵素によって行うことが可能であるが、アルギニンまたはリジンのメチル化、トレオニンまたはセリンのリン酸化、リジンのアセチル化、あるいはリジンのユビキチン化を含む。
【００８０】
ヒストン特異的酵素が、たとえばリジンのメチル化、リジンのアセチル化もしくはユビキチン化、またはセリンのリン酸化のような、プローブ分子の修飾反応を触媒するために、本方法は、好ましくは、酵素へのたとえば、Ｓ−アデノシルメチオニン、アセチルCo-A、またはATPのような適当な基質の供給を含むと考えられる。好ましくは、基質分子は、たとえば放射標識（たとえばＰ３２，Ｓ３５およびＨ３）または適当な蛍光色素で標識されている。基質分子の標識により、マイクロアレイを使用する際、本方法のステップ（ｉｉ）で、酵素によるヒストン修飾反応が起こっているかどうか、もし反応が起きているならどのプローブ分子が修飾されたのかを検出できる。
【００８１】
より好ましくは、酵素による基質分子の修飾や修飾の除去は、特定のヒストン残基の特定の修飾に特異的な抗体を利用して検出する。このことで、特定の残基の修飾や修飾の除去をどちらも感度よく検出できる。また、異なるヒストンペプチドにおいて活性の程度を比較することで、どの配列や修飾が酵素活性に寄与しているのかを同定できる。
【００８２】
本発明の様態の方法はヒストン由来のアミノ酸配列に対する、ヒストン特異的結合タンパク質の結合の検出にも利用できる。本発明の実施の形態では、マイクロアレイはヒストン特異的タンパク質にさらされて、その結合タンパク質とプローブ分子との結合の有無、結合量または特異性が測定される。当業者は、多様なヒストン特異的結合タンパク質が存在すると考えるであろう。したがってヒストン特異的結合タンパク質は、ＨＰ１、ヒストンＨ１、ＨＭＧＤ、ポリコームタンパク質を含む、結合タンパク質群から別個に選択されることが好ましい。
【００８３】
本発明のこのような実施の形態は、ヒストン修飾がヒストン特異的結合タンパク質の結合能に及ぼす影響を調べるのに用いられる。本発明の方法によって、たとえば、結合タンパク質のヒストン結合部位またはその近くのヒストン修飾の変化による影響を調べられる。さらに、本発明の様態の実施形態は、様々な反応条件下でのヒストン特異的結合タンパク質の活性測定に応用できる。たとえば、反応が核抽出物存在下で行われた場合の、本発明のヒストンマイクロアレイに対するヒストン特異的結合タンパク質（たとえばＨＰ１）の結合能を測定できる。本発明の方法を応用し、タンパク質を時間をかけて精製せずに、ヒストン特異的結合タンパク質の結合能を測定できる。さらに、このようなアッセイは、核抽出物中に存在するかもしれない新たなまたは未同定の生化学的活性の役割の同定または研究に利用できる。
【００８４】
当業者が考え得るように、本発明のヒストンマイクロアレイ上の１つまたはそれより多いプローブ分子に対する、ヒストン特異的結合タンパク質の結合は、ヒストン特異的結合タンパク質に特異的な抗体を利用して評価できる。
【００８５】
基板支持体上の少なくとも２つのプローブ分子は、ヒストンＨ１タンパク質、ヒストンＨ２Ａタンパク質、ヒストンＨ２Ｂタンパク質、ヒストン３タンパク質、および／またはヒストン４タンパク質、アイソフォーム、変異体、またはそのようなヒストンタンパク質の修飾体に由来する配列を含んでよい。これらのプローブ分子はいずれも、たとえばアセチル化リジン、リン酸化トレオニン、リン酸化セリン、ユビキチン化リジンなどの、ヒストン修飾を行ったり、除去したりするヒストン特異的修飾酵素による触媒反応により修飾されてよい。
【００８６】
ここに記載したすべての特徴（付随するいずれの請求項、要約および図を含む）、および／または開示されたいずれかの方法または過程のすべてのステップは、上記のいずれの様態とどのように組合わせてもよいが、そのような特徴および／またはステップの少なくともいくつかが互いに矛盾するような組合わせの場合は例外である。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】ヒストンの概図である。Ｈ３，Ｈ４，Ｈ２ＡおよびＨ２Ｂと、それらの既知の修飾体を示す。修飾体にはアセチル化（Ａ）、メチル化（Ｍｅ）、リン酸化（Ｐ）、およびユビキチン化（Ｕ）（ＡｂＣａｍ  Ｌｔｄ，ＵＫの宣伝用文献より引用）を含む。
【図２】本発明によるマイクロアレイを形成する、‘テスト’ペプチドプローブ分子とガラス基板表面の模式図である。基板表面にペプチドプローブが結合する前の構成要素を示す。
【図３】本発明によるマイクロアレイを形成する、基板表面に結合したペプチドプローブの模式図である。
【図４】本発明によるアレイで、ヒストンＨ３とその修飾体を検出するためのプローブとして用いられる１連のペプチドを示す。
【図５】本発明によるアレイで、ヒストンＨ４とその修飾体を検出するためのプローブとして用いられる１連のペプチドを示す。
【図６】本発明によるアレイで、ヒストンＨ２Ａとその修飾体を検出するためのプローブとして用いられる１連のペプチドを示す。
【図７】本発明によるアレイで、ヒストンＨ２Ｂとその修飾体を検出するためのプローブとして用いられる１連のペプチドを示す。
【図８】ヒストンＨ４リジン５のアセチル化に特異的な抗体（１）のスクリーニングアッセイの結果を示す。
【図９】ヒストンＨ４リジン１６のアセチル化に特異的な抗体（２）のスクリーニングアッセイの結果を示す。
【図１０】ヒストンＨ４リジン８のアセチル化に特異的な抗体（３）のスクリーニングアッセイの結果を示す。
【図１１】ヒストンＨ３セリン１０のリン酸化（Ｈ３ｓｅｒ１０ｐｈｏｓｐ）に特異的な抗体のスクリーニングアッセイの結果を示す。
【図１２】ヒストンＨ３リジン４のトリメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）に特異的な抗体のスクリーニングアッセイの結果を示す。
【図１３】ヒストンＨ３リジン４のトジメチル化（Ｈ２Ｋ４ｍｅ２）に特異的な抗体のスクリーニングアッセイの結果を示す。
【図１４】ヒストン尾部は、多数の対立するヒストン修飾酵素ファミリーに対する基質である。修飾酵素は表面上の‘標識’を付加または除去するもので、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣｓ）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴｓ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴｓ）とヒストンデメチラーゼ（ＨＤＭｓ）を含む。
【図１５】マイクロアレイに結合したペプチドのＳＥＴ７／９依存的メチル化。４８個の異なるヒストンＨ３ペプチドの２連のアレイ（破線ボックス）を含むマイクロアレイスライド。ペプチドは、特定残基の様々なヒストン修飾を含む。これらのスライドをメチルトランスフェラーゼＳＥＴ７／９（下図）またはバッファー（酵素を含まない）（コントロール、上図）とインキュベートし、その後抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ１抗体で検出した。
【００８８】
本発明をより良く理解し実施するために、例として添付の概略図を参照して説明する。
実験
本発明者らは、図１に示すような多様なヒストンタンパク質とヒストン修飾に対する抗体の特異性を調べ、（ｉ）ヒストン特異的抗体、および（ｉｉ）特定のヒストン修飾に対する抗体をスクリーニングおよび／または同定するためのマイクロアレイシステムを開発した。
【００８９】
本アレイは、一連のペプチド配列またはエピトープ（すなわちここでは‘プローブ’とよぶ）で‘官能化された’または覆われている支持体表面または基板から成る。一連の配列は図１に示すように、多様なヒストンタンパク質（Ｈ３，Ｈ４，Ｈ２ＡおよびＨ２Ｂ）とヒストン修飾体に相当する。本マイクロアレイを抗体（すなわちここでは‘標的’とよぶ）を含む溶液にさらし、その標的抗体が、（ｉ）ある種のヒストン修飾そのもの（たとえばリン酸化、アセチル化、メチル化など）、（ｉｉ）ある種のアミノ酸残基のヒストン修飾の種類（たとえばセリン残基のリン酸化）、または（ｉｉｉ）ヒストンタンパク質の特定のアミノ酸残基のヒストン修飾の種類（たとえばＨ３のセリン１０のリン酸化）に対し大別される特異性をもつかどうかを、同定または選別した。
【００９０】
材料と方法
(Ａ)  ペプチド合成
ヒストンタンパク質またはその修飾体に相当し、基板表面の被覆に用いた’テスト‘ペプチドまたはプローブは、すべて固相合成法で合成した。ＣｈａｎとＷｈｉｔｅの概説（Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ．，  Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ．，（２０００）“Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）  のように、合成レジンを含む従来のＦｍｏｃ保護法を用いた。ただしペプチド合成機はどんなものを使ってもよい。
【００９１】
ほとんどのペプチドプローブは約２１アミノ酸長で、図２に示すように各ペプチドはビオチン残基を含む。ビオチン残基はペプチドの基板表面への付着を助ける。各テストペプチドのビオチン残基は、連続する２つのアミノヘキサン酸（Ｈ２Ｎ(CH2)5ＣＯ２Ｈ）スペーサー分子によって、ヒストンまたはヒストン修飾体に相当するペプチド配列から隔てられている。これらのスペーサーは、分子の固定部からテストペプチド配列を移動させ、または隔てるために含まれる。  ペプチドは、ＣｈａｎとＷｈｉｔｅの方法のように、標準的な酸処理と適当なスカベンジャー分子を利用して合成レジンから切り離される。
【００９２】
（Ｂ）ペプチドプローブ
図４に示すのは、基板官能化用のプローブ配列の一覧である。配列はヒト・ヒストン３（Ｈ３）とその修飾体に相当する。図中の略語は、ヒストンＨ３の多様な修飾を表す。全部で１０３のペプチド配列をヒストンＨ３のプローブとして用いた。
【００９３】
図５に示すのは、ヒストンＨ４（Ｈ４）とその修飾体のプローブとして用いたペプチド配列の一覧である。全部で４４の配列をヒストンＨ４のプローブとして用いた。
【００９４】
図６に示すのは、ヒト・ヒストン２Ａ（Ｈ２Ａ）とその修飾体に相当するペプチド配列の一覧である。全部で２０の配列をヒストンＨ２Ａのプローブとして用いた。
【００９５】
図７に示すのは、ヒト・ヒストン２Ｂ（Ｈ２Ｂ）とその修飾体に相当するペプチドの一覧である。全部で３９の配列をヒストンＨ２Ａのエピトープとして用いた。
【００９６】
したがって、図４−７に示すペプチド配列は４つのヒト・ヒストンタンパク質Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３およびＨ４に対するプローブの、包括的で系統的なアレイを構成する。しかし、図４−７が異なるヒストン変異体、アイソフォームおよび異種のアミノ酸配列の差異を網羅しているわけではないと考えられる。したがって、ここに示したペプチドプローブの一覧は、ヒストン抗体の特異性を決定するための包括的／系統的なプローブアレイの作成するための、考え方の一例を提示するものである。
【００９７】
（Ｃ）ペプチドマイクロアレイの作成
図２と３に示すように、ペプチドプローブ配列（２１アミノ酸長）を、基板表面となる顕微鏡用スガラスライド上に固定した。したがって本マイクロアレイは、一連のテストペプチドプローブに覆われたガラス基板から成る。図２と３に示すように、スライドはストレプトアビジン層であらかじめ覆われている。ストレプトアビジンはタンパク質の１種で、テストペプチド上に存在するビオチン化合物と非可逆的に結合する。すべてのペプチドは、アミノ末端に付加されたビオチン分子を含み、ストレプトアビジン層と接触するとビオチン分子が基板上に結合し、マイクロアレイを形成する。本アレイは、処理済みの顕微鏡スライド上に各テストペプチドの溶液をスポットして作成した。各ペプチドプローブは、単層として被覆スライド基板上に結合し、適切なグリッド様に配列された。
【００９８】
（Ｄ）アレイプリンティング
テストペプチドを基板スライド上にスポットできるものであれば、どんな装置でもアレイのプリンティングに使える。本アレイのスポットの大きさは、直径約２００から５００ミクロンで、いずれの検出器によっても読み取り可能な大きさであった。合成したペプチドは、６０％アセトニトリル、４０％水、および０．０５％トリフルオロ酢酸溶液で濃度約５ nanomoles/mlに希釈した。ペプチドプローブの濃度がより高いと分析ステップ中にスメアになりやすく、判定の際問題を生じると考えられる。したがって、濃度は５ nmole/ml以下とした。典型的には０．１−０．２マイクロリットルの十分なペプチドプローブ溶液を用い、スライド上に２連で、直径約２００から５００ミクロンのスポットを形成した。分析データの信頼性を高めるために２連で実験を行うことが重要であることが見出された。
【００９９】
対照実験として、ビオチン結合ウサギ抗体をマイクロアレイ基板の４隅にスポットした。このスポットにより、標準的な抗ウサギ‘２次抗体’を用いてテスト抗体の分布を検出する際のアレイの限界を自動的に決定できた。スポット後、スライドは窒素またはアルゴン置換したスライドコンテナ中に保存した。
【０１００】
（Ｅ）抗体スクリーニング
抗体のスクリーニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９）-“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に従い、広く用いられている‘ＥＬＩＳＡ’または‘ウェスタンブロッティング’法と基本的には同様に行った。本発明の方法に必要な溶液量が最小となるよう、スクリーニングは密閉したバッグ中で行った。本ペプチドマイクロアレイを１０％ウシ血清アルブミン溶液（Ｓｉｇｍａ）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：リン酸ナトリウムＮａＣｌ  ｐＨ８）中で１時間インキュベーションすることにより、まず‘ブロック’した。それからアレイを、スクリーニングする抗体（一般にはウサギで免疫した）を含む溶液をＰＢＳ，０．１％Ｔｗｅｅｎで適当に希釈したものと１時間インキュベートした。その後アレイを１Ｍ  ＮａＣｌ，１ｘ ＰＢＳ，０．１％  Ｔｗｅｅｎ中で５分間洗浄し、さらにＰＢＳ．０．１％  Ｔｗｅｅｎ中で３ｘ１５分、再度洗浄した。
【０１０１】
洗浄ステップ後、アレイを市販の抗ウサギ抗体、または他の適当な‘２次抗体’（たとえば、Ｌｉ−ｃｏｒ蛍光タグの抗ウサギ抗体、ＩＲＤｙｅ  ８００  ＣＷ  ヤギ抗ウサギ抗体）とインキュベートした。抗ウサギ抗体を１０％ウシ血清アルブミン、ＰＢＳ，０．１％  Ｔｗｅｅｎで適当な濃度（１：３０００）に希釈し、１時間インキュベートし、スライドをＰＢＳ，０．１％  Ｔｗｅｅｎ中で短時間洗浄（５分）した。最後に、結合した抗体の分布を、市販のスキャナー技術（Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｌｉ−ｃｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４３０８  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ａｖｅｎｕｅ，ＰＯ  Ｂｏｘ  ４０００，Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｎｅｂｒａｓｋａ，ＵＳＡ  ６８５０４−５０００）によりマイクロアレイ基板上で検出した。
【０１０２】
実施例
本発明者らは多数の異なる種類の抗体をスクリーニングした。抗体は、（ｉ）別々の部位で起こっている同一のヒストン修飾（すなわち特定のヒストン残基での修飾）、または（ｉｉ）異なる種類の翻訳後ヒストン修飾、のいずれかに対するものである。
【０１０３】
実施例１−ヒストンアセチル化抗体
最初のテストでは、ヒストン（Ｈ４）アミノ酸配列中の特定のアセチル化残基に対する、多数の抗体を用いた。特定のアセチル化残基は図１にまとめて示した。特異性の異なる３種類のヒストンアセチル化修飾抗体について調べた。
（１）  ヒストンＨ４リジン５のアセチル化（Ｈ４Ｋ５ａｃ）、
（２）  ヒストンＨ４リジン１６のアセチル化（Ｈ４Ｋ１６ａｃ）、および
（３）  ヒストンＨ４リジン８のアセチル化（Ｈ４Ｋ８ａｃ）
図８−１０に、それぞれ抗体（１）、（２）、（３）のマイクロアレイ基板上での結合実験結果を示す。プローブアレイをグリッド様にスポットし、ガラススライド基板当たり、一続きの１０カラム５列で２連に配置されるようにした。対照マーカーカラム（Ｍ）（すなわちビオチン化ウサギ抗体）はカラム１１に（すなわち略図中の黒丸）スポットした。図中にみられる同一の２連スポットは、左側が最初の１１カラムセット（すなわちカラム１−１０とＭ）、右側が第２の１１カラムセット（すなわちカラム１−１０とＭ）である。
【０１０４】
ガラス基板上にスポットされたプローブはヒストンＨ４配列の最初の２４アミノ酸残基（図５に示すＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０４）から成るビオチン化ペプチドを含む。ペプチドのアセチル化リジンは以下の残基である。
カラム：
【０１０５】
【表１】
2009536336.tif 000003
【０１０６】
図８−１０中の列は、希釈限界を調べるために同一のペプチドプローブを連続的に希釈したものを含む（すなわち最上列２００μｇ／ｍｌから最下列１２．５μｇ／ｍｌまで）。
【０１０７】
結果
図８に示すように、抗体（１）、すなわちヒストンＨ４Ｋ５のアセチル化特異的抗体は、予想通りＫ５ａｃを含むスポット（すなわちカラム２，６，８−１０）に強く結合した。しかし予想外に、弱い‘非特異的’結合もＫ１２ａｃ（２，３と７）で検出された。
【０１０８】
図９に示すように、抗体（２）、すなわちヒストンＨ４リジン１６のアセチル化（Ｈ４Ｋ１６ａｃ）特異的抗体は、予想通りＫ１６ａｃを含むスポット（すなわちカラム５，６，７，８，９）に強く結合した。しかしＫ５ａｃを含むスポット（２と１０列）、Ｋ８ａｃを含むスポット（３と１０列）またはＫ１２ａｃを含むスポット（２−４と１０列）では、‘非特異的’結合は検出されなかった。
【０１０９】
図１０に示すように、抗体（３）、すなわちヒストンＨ４リジン８のアセチル化（Ｈ４Ｋ８ａｃ）特異的抗体は、カラム３と７のスポットに強く結合した。このことはリジン８のアセチル化が認識されたことを示す。しかし興味深いことに、リジン５がアセチル化されている場合、この結合はブロックされる（すなわちカラム９と１０）。
【０１１０】
まとめ
したがって、以上のように、本発明者らが作成したマイクロアレイを用いたＥＬＩＳＡ法により次のことが示された。抗体（１）は、リジン残基５だけでなく、リジン８と１２のアセチル化も認識するので非特異的である。しかし抗体（２）と（３）は、修飾、残基および前後配列の組合わせに対して特異性が高い。また、これらの結果は、抗体（３）が、近隣の残基の修飾により、プローブ配列との結合を立体的にブロックまたは障害されることを示唆している。
【０１１１】
実施例２−その他の種類の抗体をプローブとするマイクロアレイ
これらのアレイは実施例１に示したものより複雑で、２４個のペプチドが隣り合う一対となるようスポットされた４つのグリッドを含む。すなわち１２カラム（１−１２）、６対の隣り合うペプチドｘ４列（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄで表示）を含んでいる。基板にスポットされたペプチドは、ヒストンＨ３に由来し、１つまたは複数箇所が修飾されている。文字は標準のアミノ酸コードを表し、以下の文字は修飾アミノ酸を表す。
【０１１２】
Ｚ  リン酸化トレオニン
Ｘ  リン酸化セリン
Ｊ  ジメチル化リジン
Ｏ  トリメチル化リジン
Ｃ  アセチル化リジン
Ｗ  モノメチル化リジン
Ａ１／２        ＡＲＺＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ
Ａ３／４        ＡＲＺＯＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ
Ａ５／６        ＡＲＴＷＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ
Ａ７／８        ＡＲＴＪＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ
Ａ９／１０      ＡＲＴＯＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ
Ａ１１／１２    ＡＲＴＯＱＴＡＲＣＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ
Ｂ１／２        ＡＲＴＯＱＴＡＲＯＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ
Ｂ３／４        ＡＲＴＫＱＴＡＲＣＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ
Ｂ５／６        ＡＲＴＫＱＴＡＲＣＸＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ
Ｂ７／８        ＡＲＴＫＱＴＡＲＣ  ＳＺＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ
Ｂ９／１０      ＡＲＴＫＱＴＡＲＣＸＺＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ
Ｂ１１／１２      ＡＲＴＫＱＴＡＲＷＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ
Ｃ１／２        ＡＲＴＫＱＴＡＲＪＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ
Ｃ３／４        ＡＲＴＫＱＴＡＲＯＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ
Ｃ５／６        ＡＲＴＫＱＴＡＲＯＳＺＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ 
Ｃ７／８        ＡＲＴＫＱＴＡＲＯＸＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ
Ｃ９／１０      ＡＲＴＫＱＴＡＲＯＸＺＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ
Ｃ１１／１２    ＡＲＴＫＱＴＡＲＫＸＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ
Ｄ１／２        ＫＡＰＲＫＱＬＡＴＫＡＡＲＷＳＡＰＡＴＧＧ
Ｄ３／４        ＫＡＰＲＫＱＬＡＴＫＡＡＲＪＳＡＰＡＴＧＧ
Ｄ５／６        ＫＡＰＲＫＱＬＡＴＫＡＡＲＯＳＡＰＡＴＧＧ
Ｄ７／８        ＫＡＰＲＫＱＬＡＴＫＡＡＲＫＳＡＰＡＴＧＧ
Ｄ９／１０      ＫＡＰＲＫＱＬＡＴＫＡＡＲＯＸＡＰＡＴＧＧ
Ｄ１１／１２    ＫＡＰＲＫＱＬＡＴＫＡＡＲＫＳＡＰＡＴＧＧ
【０１１３】
ヒストンアセチル化修飾に特異的な異なる３種類の抗体について調べた。
（ａ）  ヒストンＨ３セリン１０のリン酸化（Ｈ３ｓｅｒ１０ｐｈｏｓ）、
（ｂ）  ヒストンＨ３リジン４のトリメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）、および
（ｃ）  ヒストンＨ３のジメチル化Ｋ４（Ｈ２Ｋ４ｍｅ２）
【０１１４】
（ａ）  ヒストンＨ３セリン１０のリン酸化（Ｈ３ｓｅｒ１０ｐｈｏｓ）
図１１に示すように、この抗体はスポットＣ１１−Ｃ１２に結合することからＨ３Ｓ１０ｐｈｏｓに対して高い特異性をもつ。しかしこの部位での結合は、アセチル化（スポットＢ５／Ｂ６）やトリメチル化（スポットＣ７／Ｃ８）などの隣接するリジン９の修飾によりブロックされる。
【０１１５】
（ｂ）  ヒストンＨ３リジン４のトリメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）
図１２に示すように、この抗体は、（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）由来の修飾ペプチドに特異的であるだけでなく、よく似たエピトープ（Ｈ３Ｋ４ｍｅ２）にも結合する。この抗体は、リジン４のトリメチル化体（Ｂ１／Ｂ２）およびこの残基のジメチル化体（Ａ７／Ａ８）に結合するが、この残基のモノメチル化体（Ａ５／Ａ６）やヒストンＨ３の他のリジン残基のトリメチル化体（リジン９−Ｃ３／Ｃ４）には結合しない。抗体の結合は隣接部位の修飾（トレオニン３のリン酸化―Ａ３／Ａ４参照）によってブロックされるが、より離れた部位の修飾（リジン９のアセチル化―Ａ１１／Ａ１２参照）ではブロックされない。
【０１１６】
（ｃ）  ヒストンＨ３のジメチル化Ｋ４（Ｈ２Ｋ４ｍｅ２）
図１３に示すように、この抗体はジメチル化Ｋ４体（Ａ７／Ａ８）に結合し、この残基のモノ（Ａ５／Ａ６）またはトリ（Ａ９／Ａ１０）メチル化体には結合しないことから、高い特異性をもつ。
【０１１７】
まとめ
要約すると、本発明者らは、ヒストンタンパク質由来の約２０６ペプチドの２つの複製コピーを含むマイクロアレイを合成した。これらのペプチドは、１つのヒストン配列に由来する２１アミノ酸ペプチドから成り、細胞内で観察されることを反映して（ｉ）非修飾、  （ｉｉ）１つの修飾、  または（ｉｉｉ）多数の修飾を含んでいる。マイクロアレイを、抗体（すなわちここでは’標的‘とよばれる）を含む溶液にさらし、標的抗体が特異性をもつかどうかを同定または識別した。抗体の特異性は大別して、（ｉ）ヒストン修飾自体（たとえばリン酸化、アセチル化、またはメチル化など）、  （ｉｉ）ある種類のアミノ酸残基のヒストン修飾（たとえばセリン残基のリン酸化など）、  または（ｉｉｉ）特定のヒストンタンパク質中の特定のアミノ酸残基のヒストン修飾（たとえばＨ３のセリン１０のリン酸化）に対するものである。
【０１１８】
このように本発明は、非常に類似した多数のプローブの系統的かつ包括的なアレイを提供する。抗体の結合（または非結合）を調べることで、抗体の特異性を包括的かつ正確に決定できる。本マイクロアレイと方法は、ヒトだけでなくすべての生物種のヒストン、ヒストンアイソフォームおよびヒストン変異体タンパク質に起こる、多種類の翻訳後修飾のスクリーニングを可能にすると考えられる。
【０１１９】
実施例３−修飾酵素とタンパク質の結合特異性に対するマイクロアレイアッセイ
ヒストン尾部と相互作用する多数の異なるクラスのタンパク質によって、エピジェネティック制御を解析できる。最大のクラスは多様なヒストン修飾酵素で、標識の付加（または除去）を触媒することにより、ヒストン標識のターゲティングとターンオーバーを制御している（図１４）。これらの酵素は、引き続いて機能的な‘エフェクター’タンパク質を動員することにより、転写制御において重要な役割をしており、特に、ヒストンアセチルトランスフェラーゼとメチルトランスフェラーゼの不適切な制御がある種の白血病と関連していることから、生物学的にも臨床的にも広く興味がもたれている。多数の‘エフェクター’タンパク質もまた、クロマチン再モデリング複合体、リンカーヒストン、およびヘテロクロマチン（ＨＰ１）の安定化に関わるタンパク質を含む、ヒストン標的と結合する。
【０１２０】
そのような酵素は“ヒストン修飾酵素”とよばれている。ヒストンのアセチル化についてはよく研究されており、多数のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴｓ）、およびヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣｓ）が同定されている。同様に、ヒストンのリン酸化、およびメチル化は、他のクラスの酵素により制御されている。しかしヒストンリジンデメチラーゼ（ＨＤＭｓ）の多くは未だ同定されていない。
【０１２１】
今や、多数のエフェクタータンパク質が異なるヒストン修飾に応答して結合したり活性を調節したりすることが知られている。このことは、構造クロマチン結合タンパク質ＨＰ１も、ヒストン修飾酵素ＬＳＤ１も  近隣のヒストン残基の標識に応答して‘制御されて’いる、または結合アフィニティーを変化させる、という最近の知見と一致する。このように、クロマチンの結合とタンパク質の修飾を解析することが、相互作用の相手または基質となり得るヒストンペプチド修飾体を広く調べる理想的な方法であろう。しかし、実際に、１つのヒストン尾部に存在しうる無数の修飾の組合わせを実験的に確かめるには、費用も時間もかかるのが現実である。
【０１２２】
したがって我々は、ヒストン修飾が、（１）ヒストン修飾酵素の活性と、（２）多数のクロマチン結合タンパク質のヒストンとの結合、に及ぼす影響を解析するのにヒストンペプチドマイクロアレイが利用できるかどうかを調べた。現在のデータ（図１５）は、これらの手法が実験的に有効であることを示唆している。
【０１２３】
ヒストンペプチドマイクロアレイに基づくメチル化アッセイ（ＳＥＴ７／９）
メチル化アッセイは、組み換えヒト・ヒストンメチルトランスフェラーゼＳＥＴ７／９を用い、標準的なメチル化条件下で行った。本発明のマイクロアレイ上でのアッセイは、カバースリップ下で行い、アッセイ当たりの試薬量が少量（７０μｌ）で済むようにした。酵素によるメチル化は、メチル化ヒストン特異的抗体（すなわち抗ヒストンＨ３モノメチルＫ４）にり、標準的なウェスタンブロッティング条件で検出する。
【０１２４】
図１５に示すデータは、対照実験のインキュベーション条件下（１２時間、３０℃メチル化バッファー）または高濃度（１００μＭ，７０μｌ）のＳＥＴ７／９酵素存在下で、マイクロアレイ上に検出されたメチル化標識の分布を示す。抗体は、対照実験条件下でこのエピトープ（＊）を含むスポットを検出するが、ＨＭＴａｓｅとインキュベーション後に新たに出現した、このエピトープを含む多数の部位も検出する。重要なのは、異なるペプチドに、再現的な修飾パターンが現れる（破線のボックスは、４８個のエピトープスポットの２連のアレイを含む）ことで、同定した修飾のメチル化転移酵素への影響が解析できることである。
【０１２５】
示したデータは、ガラスに結合したヒストンペプチドが、効率的な酵素反応のために接近可能でかつ十分な濃度であることを示唆する。また酵素産物（すなわちメチル化リジンＫ４）が、特異的抗体で検出されるのに十分量存在することを示唆する。したがって、これによって、様々なヒストン修飾が酵素反応に及ぼす影響を解析でき、多数の実験手法が開発できる。
【０１２６】
結合実験
同定されたヒストン修飾がヒストンまたはクロマチン結合タンパク質の結合に及ぼす影響を調べ得ることは、広い関心を集める可能性もある。図１５に示すデータは、ガラスに結合したヒストンペプチドが結合可能なことを示唆している。この手法は、特異性の高い抗体が入手可能ならば、すべての高アフィニティーのヒストン結合タンパク質を調べるのに有効であろう。この技術は、高度に精製したタンパク質、または核抽出物（すなわちＨｅＬａまたは他の組織培養系統由来）中でのタンパク質いずれの結合解析にも有効であろう。これにより、時間をかけて精製することなく天然のタンパク質複合体のまま、推定ヒストン結合タンパク質(または実験による変異体)の解析実験が容易にできるので、この技術は特に有効である。
【０１２７】
まとめ
本発明者らは、エピジェネティック制御を解析する研究ツールとして本マイクロアレイの応用例を説明し、本発明のヒストンマイクロアレイが、ヒストン修飾酵素の活性検出に利用できるという成果を示した。ヒストン修飾がヒストンやクロマチン結合タンパク質の結合能に及ぼす影響の解析を含め、さらに本マイクロアレイの応用が考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年1月8日(2009.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのプローブ分子で官能化される基板支持体を有し、各プローブ分子は、ヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはその修飾体由来の配列を含むことを特徴とするヒストンマイクロアレイ。
【請求項２】
プローブ分子の少なくとも１つがヒストン免疫グロブリン標的分子への結合に適することを特徴とする、請求項１に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項３】
各プローブ分子が、ペプチド、誘導体またはそのアナログを含むことを特徴とする請求項１または２に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項４】
プローブ分子が、Ｈ１．０，Ｈ１．１，Ｈ１．２，Ｈ１．３，Ｈ１．４，Ｈ１．５，Ｈ２Ａ．１，Ｈ２Ａ．２，Ｈ２Ａ．３，Ｈ２Ｂ．ａ，Ｈ２Ｂ．ｂ，Ｈ２Ｂ．ｃ，Ｈ２Ａ．ｄ，Ｈ２Ａ．ｅ，Ｈ２Ａ．ｆ,Ｈ３．１，Ｈ３．２，Ｈ３．３，Ｈ４、およびそれらに関連した他種のホモログから成る、ヒストンアイソフォーム群から別個に選択される、１または複数のヒストンアイソフォームに由来する配列を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１つに記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項５】
プローブ分子が、Ｈ２Ａ−Ｘ、Ｈ２Ａ−Ｚ、マクロ−Ｈ２Ａ，Ｈ２Ａ−Ｂｂｄ，ＣＥＮＰ−Ａ、およびそれらに関連した他種のホモログから成る、ヒストン変異体群から別個に選択される、１または複数のヒストン変異体に由来する配列を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１つに記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項６】
プローブ分子が、アルギニンもしくはリジンのメチル化、トレオニンもしくはセリンのリン酸化、リジンのアセチル化、またはリジンのユビキチン化から別個に選択される、１または複数のヒストン修飾に由来する配列を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１つに記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項７】
前記プローブ分子は、少なくとも１０のアミノ酸の配列および／または１００未満のアミノ酸の配列を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１つに記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項８】
プローブ分子は、異なるヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体またはそれらの修飾体に由来し、または同一のヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体またはそれらの修飾体に由来することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１つに記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項９】
プローブ分子は、同一のヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体またはそれらの修飾体に由来し、ヒストンＨ３タンパク質、アイソフォーム、変異体またはそれらの修飾体に由来する配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を含むことを特徴とする、請求項８に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項１０】
SEQ ID No.1〜SEQ ID No.103として識別される配列、またはそれらの組合わせの群から別個に選択される配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を含むことを特徴とする、請求項９に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項１１】
ヒストンＨ４タンパク質、アイソフォーム、変異体またはそれらの修飾体に由来する配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を含むことを特徴とする、請求項８に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項１２】
SEQ ID No.104〜SEQ ID No.147として識別される配列、またはそれらの組合わせの群から別個に選択される配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を有することを特徴とする、請求項１１に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項１３】
ヒストンＨ２Ａタンパク質、アイソフォーム、変異体またはそれらの修飾体に由来する配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を有することを特徴とする、請求項８に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項１４】
SEQ ID No.148〜SEQ ID No.167として識別される配列、またはそれらの組合わせの群から別個に選択される配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を有することを特徴とする、請求項１３に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項１５】
ヒストンＨ２Ｂタンパク質、アイソフォーム、変異体またはそれらの修飾体に由来する配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を有することを特徴とする、請求項８に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項１６】
SEQ ID No.168〜SEQ ID No.206として識別される配列、またはそれらの組合わせの群から別個に選択される配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を有することを特徴とする、請求項１５に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項１７】
プローブ分子は、異なるヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体またはそれらの修飾体に由来し、ヒストンＨ２Ａタンパク質およびヒストン２Ｂタンパク質、アイソフォーム、変異体またはそれらの修飾体に由来する配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を有することを特徴とする、請求項８に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項１８】
SEQ ID No.148〜SEQ ID No.206として識別される配列、またはそれらの組合わせの群から別個に選択される配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を有することを特徴とする、請求項１７に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項１９】
ヒストンＨ１タンパク質、アイソフォーム、変異体またはそれらの修飾体に由来する配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を有することを特徴とする、請求項８に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項２０】
SEQ ID No.1〜SEQ ID No.206として識別される配列、またはそれらの組合わせの群から別個に選択した配列を含む、少なくとも２つのプローブ分子を有することを特徴とする、請求項８に記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項２１】
各プローブ分子が、（ｉ）ヒストン修飾がまったくない、（ｉｉ）少なくとも１つのヒストン修飾を含む、および／または（ｉｉ）複数のヒストン修飾を含む、ヒストンタンパク質配列に由来するペプチド配列を含む、複数のプローブ分子を有することを特徴とする、請求項１〜２０のいずれか１つに記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項２２】
プローブ分子は、ヒストンタンパク質、アイソフォーム、変異体、またはその修飾体由来の配列を、基板支持体に結合させる際支持体から隔離するような間隔手段を含み、間隔手段は、少なくとも１つのアミノヘキサン酸（Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）５ＣＯ２Ｈ）分子を含むことを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか１つに記載のヒストンマイクロアレイ。
【請求項２３】
（ｉ）ヒストン抗体の標的分子と、請求項１〜２２のいずれか１つにより規定されたヒストンマイクロアレイとの接触、および
（ｉｉ）プローブ分子に付着しているヒストン抗体が存在するか否かの検出、を有することを特徴とする、ヒストン抗体の検出方法。
【請求項２４】
（ｉ）ヒストン特異的タンパク質の標的分子と、請求項１〜２３のいずれか１つによるヒストンマイクロアレイとの接触、および
（ｉｉ）プローブ分子に結合または酵素的に反応するヒストン特異的タンパク質が存在するか否かの検出、を有することを特徴とする、ヒストン特異的タンパク質の検出方法。
【請求項２５】
ヒストン特異的タンパク質の標的分子はヒストン特異的酵素であり、ヒストンアセチルトランスフェラーゼおよびデアセチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼおよびデメチラーゼ、ヒストンＥ３ユビキチンリガーゼ、ならびにヒストンキナーゼおよびホスファターゼ、またはそれらの組合わせ、を含む酵素群から別個に選択されることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ヒストン特異的タンパク質の標的分子はヒストン特異的結合タンパク質であり、ＨＰ１、ヒストンＨ１、ＨＭＧＤ、ポリコームタンパク質、を含む結合タンパク質群から別個に選択されることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【国際調査報告】
2009536336.tif 000026
2009536336.tif 000027
2009536336.tif 000028