(57)【要約】  本発明は、ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)感染処置のための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)に関する。ｄｓＲＮＡは、３０ヌクレオチド長未満、一般に１９−２５ヌクレオチド長であり、ＨＰＶ  Ｅ１、ＨＰＶ  Ｅ６、ヒトＥ６ＡＰ遺伝子から選択されるＨＰＶ標的遺伝子の少なくとも一部に実質的に相補性であるヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖を含む。本発明はまた、ｄｓＲＮＡを薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物；医薬組成物を使用したＨＰＶ感染およびＥ６ＡＰ遺伝子の発現が原因の疾患の処置方法；および細胞におけるＨＰＶ標的遺伝子の発現の阻害方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞でのヒトＥ６ＡＰ遺伝子発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)であって、該ｄｓＲＮＡは、互いに相補的である少なくとも２個の配列を含み、ここで、センス鎖は第一配列を含み、そしてアンチセンス鎖はＥ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補性である相補性の領域を含む第二配列を含み、そして、該相補性の領域は、３０ヌクレオチド長未満であり、ここで、該ｄｓＲＮＡは、該Ｅ６ＡＰを発現する細胞と接触すると、該Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する、ｄｓＲＮＡ。
【請求項２】
該第一配列が表１を構成する群から選択され、そして該第二配列が表１を構成する群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３】
少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４】
少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項５】
該修飾ヌクレオチドが：２'−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５'−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合した末端ヌクレオチドから成る群から選択される、請求項３または４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項６】
該修飾ヌクレオチドが：２'−デオキシ−２'−フルオロ修飾ヌクレオチド、２'−デオキシ−修飾ヌクレオチド、固定化(locked)ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２'−アミノ−修飾ヌクレオチド、２'−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミダイト、および非天然塩基含有ヌクレオチドから成る群から選択される、請求項３または４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項７】
該第一配列が表１を構成する群から選択され、そして該第二配列が表１を構成する群から選択される、請求項３または４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項８】
該第一配列が表１を構成する群から選択され、そして該第二配列が表１を構成する群から選択される、請求項６または７に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項９】
請求項１に記載のｄｓＲＮＡを含む、細胞。
【請求項１０】
生物におけるＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、ｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含み、ここで、該ｄｓＲＮＡは互いに相補的である少なくとも２個の配列を含み、ここで、センス鎖は第一配列を含み、そしてアンチセンス鎖はＥ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補性である相補性の領域を含む第二配列を含み、そして該相補性の領域は、３０ヌクレオチド長未満であり、ここで、該ｄｓＲＮＡは、該Ｅ６ＡＰを発現する細胞と接触すると、該Ｅ６ＡＰ遺伝子を少なくとも２０％阻害する、医薬組成物。
【請求項１１】
該ｄｓＲＮＡの該第一配列が表１を構成する群から選択され、そして該ｄｓＲＮＡの該第二配列が表１を構成する群から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
該ｄｓＲＮＡの該第一配列が表１を構成する群から選択され、そして該ｄｓＲＮＡの該第二配列が表１を構成する群から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
細胞におけるＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する方法であって：
(ａ)  細胞に二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)を導入し、ここで、該ｄｓＲＮＡは、互いに相補的である少なくとも２個の配列を含み、ここで、センス鎖は第一配列を含み、そしてアンチセンス鎖はＥ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補性である相補性の領域を含む第二配列を含み、そして、該相補性の領域は、３０ヌクレオチド長未満であり、ここで、該ｄｓＲＮＡは、該Ｅ６ＡＰを発現する細胞と接触すると、該Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害し；そして
(ｂ)  工程(ａ)で製造した細胞をＥ６ＡＰ遺伝子のｍＲＮＡトランスクリプトの分解を得るのに十分な時間維持し、それにより細胞でのＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する、方法。
【請求項１４】
ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)感染が仲介する病理学的過程を処置、予防または管理する方法であって、そのような処置、予防または管理を必要とする患者に、治療的または予防的有効量のｄｓＲＮＡを投与することを含み、ここで、該ｄｓＲＮＡは互いに相補的である少なくとも２個の配列を含み、ここで、センス鎖は第一配列を含み、そしてアンチセンス鎖はＥ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補性である相補性の領域を含む第二配列を含み、そして、該相補性の領域は、３０ヌクレオチド長未満であり、ここで、該ｄｓＲＮＡは、該Ｅ６ＡＰを発現する細胞と接触すると、該Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する、方法。
【請求項１５】
細胞でのＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害するためのベクターであって、該ベクターは、ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結した制御配列を含み、ここで、該ｄｓＲＮＡの鎖の一方が、Ｅ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補性であり、そして、該ｄｓＲＮＡが３０塩基対長未満であり、そして、該ｄｓＲＮＡは、該Ｅ６ＡＰを発現する細胞と接触すると、該Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する、ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１７】
細胞でのヒトＥ６ＡＰ遺伝子の発現レベルを低下させるための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)であって、ここで、該ｄｓＲＮＡは互いに相補的である少なくとも２個の配列を含み、ここで、センス鎖は第一配列を含み、そしてアンチセンス鎖はＥ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補性である相補性の領域を含む第二配列を含み、そして、該ｄｓＲＮＡは、該Ｅ６ＡＰを発現する細胞と接触すると、該Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現レベルを低下させる、ｄｓＲＮＡ。
【請求項１８】
該接触が、該Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現レベルを少なくとも４０％低下させる、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１９】
該接触を、インビトロで３０nM以下で行う、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項２０】
請求項１７に記載のｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む、生物でＥ６ＡＰ遺伝子の発現レベルを低下させるための医薬組成物。
【請求項２１】
ＨＰＶ関連障害の処置方法であって、そのような処置を必要とする患者に、治療的有効量の請求項１７に記載のｄｓＲＮＡを投与することを含む、方法。
【請求項２２】
Ｅ６ＡＰ関連障害の処置方法であって、そのような処置を必要とする患者に、治療的有効量の請求項１７に記載のｄｓＲＮＡを投与することを含む、方法。
【請求項２３】
表３に記載のものから選択される、ｄｓＲＮＡ。
【請求項２４】
請求項２３に記載のｄｓＲＮＡを含む、医薬組成物。
【請求項２５】
ＨＰＶ関連障害の処置方法であって、そのような処置を必要とする患者に、治療的有効量の請求項２３に記載のｄｓＲＮＡを投与することを含む、方法。
【請求項２６】
表５に記載のものから選択される、ｄｓＲＮＡ。
【請求項２７】
請求項２６に記載のｄｓＲＮＡを含む、医薬組成物。
【請求項２８】
ＨＰＶ関連障害の処置方法であって、そのような処置を必要とする患者に、治療的有効量の請求項２６に記載のｄｓＲＮＡを投与することを含む、方法。
【請求項２９】
表７に記載のものから選択される、ｄｓＲＮＡ。
【請求項３０】
請求項２９に記載のｄｓＲＮＡを含む、医薬組成物。
【請求項３１】
ＨＰＶ関連障害の処置方法であって、そのような処置を必要とする患者に、治療的有効量の請求項２９に記載のｄｓＲＮＡを投与することを含む、方法。
【請求項３２】
請求項２、２３、２６および２９に記載のものから選択される少なくとも２個のｄｓＲＮＡを含む、医薬組成物。
【請求項３３】
ＨＰＶ関連障害の処置方法であって、そのような処置を必要とする患者に、治療的有効量の請求項３２に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項３４】
少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項２６または２９に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３５】
該修飾ヌクレオチドが：２'−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５'−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合した末端ヌクレオチドから成る群から選択される、請求項３４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３６】
該修飾ヌクレオチドが：２'−デオキシ−２'−フルオロ修飾ヌクレオチド、２'−デオキシ−修飾ヌクレオチド、固定化(locked)ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２'−アミノ−修飾ヌクレオチド、２'−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミダイト、および非天然塩基含有ヌクレオチドから成る群から選択される、請求項３４に記載のｄｓＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)、およびヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)感染が仲介する病理学的過程、例えば子宮頚部癌、肛門癌、ＨＰＶ関連前癌病変、および性器疣贅を処置するためのＲＮＡ干渉の仲介におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
パピローマウイルス(ＰＶ)は、上皮の過増殖性病巣を誘発する無エンベロープＤＮＡウイルスである。パピローマウイルスは、天然に広く存在し、高級脊椎動物において認識されている。ウイルスは、とりわけ、ヒト、ウシ、ウサギ、ウマ、およびイヌから特徴付けされている。最初のパピローマウイルスは、１９３３年に、ワタウサギパピローマウイルス(ＣＲＰＶ)として記載された。それ以来、ワタウサギならびに１型ウシパピローマウイルス(ＢＰＶ−１)が、パピローマウイルスの試験のための実験的プロトタイプとして役立っている。ほとんどの動物パピローマウイルスは、純粋に上皮性増殖性病巣と関連しており、そして動物におけるほとんどの病巣は皮膚である。ヒトにおいて、１００種を超えるパピローマウイルス(ＨＰＶ)が同定されており、それらは感染部位：皮膚上皮および粘膜上皮(経口および性器粘膜)により分類されている。皮膚関連疾患は、扁平疣贅、足底疣贅などを含む。粘膜関連疾患は、喉頭パピローマおよび子宮頚部癌腫を含む肛門性器疾患を含む(Fields, 1996, Virology, 3rd ed. Lippincott-Raven Pub., Philadelphia, N.Y.;Bernard, H-U., 2005.  J. Clin. Virol. 328:S1-S6)。
【０００３】
ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)は、世界中で最も流行している性行為感染症の一つである。ＨＰＶ感染の大部分は有害ではない。ＨＰＶのいくつかのタイプは性器疣贅の原意であり、これは、男性および女性の、膣、頸、外陰(膣の外の領域)、陰茎、および直腸を含む性器領域の１個または複数個の隆起物として出現する。ＨＰＶに感染した多くのヒトは無症状である。
【０００４】
ほとんどのＨＰＶサブタイプは良性病巣をもたらすが、ある種のサブタイプはハイリスクであると見なされ、子宮頚部および肛門異形成のようなより重篤な病巣に至り得る。１５のＨＰＶタイプが、最近ハイリスク・タイプとして分類された(Munoz, N. et al. 2003. N. Engl. J. Med. 348(6):518-27.)。これらのハイリスク・サブタイプは、遺伝学的に異なり、主ウイルスカプシドタンパク質であるＬ１遺伝子で＞１０％の配列相違が証明されている。(Bernard, H-U., 2005. J. Clin. Virol. 328:S1-S6)。
【０００５】
ＨＰＶ感染を有する女性は、しばしば無症状であり、子宮頚部スクリーニング後にしかその病巣が発見されないかもしれない。子宮頚部スクリーニングは、Ｐａｐ試験を使用して広く実施されている。Ｐａｐ試験は、異常頚部細胞を同定するために使用される子宮頚部組織の組織学的評価である。Ｐａｐ試験の一部として、ＨＰＶ感染の存在および具体的サブタイプが、ＰＣＲのような核酸ベースのアッセイまたは市販のHybrid Capture II technique(HCII)(Digene, Gaithersburg, Maryland, U.S.A)を使用して決定できる。
【０００６】
異常子宮頚部細胞が、同定されたならば、癌に進行するリスクが低いＬＳＩＬ(低悪性度扁平上皮内病巣)(ＣＩＮ−１と命名された細胞(“子宮頚部上皮内腫瘍−１”)を含む)；または癌に進行する高い可能性を有する、ＣＩＮ−２およびＣＩＮ−３と命名されたＨＳＩＬ(高悪性度扁平上皮内病巣)として等級付けする。
【０００７】
約８５％の低悪性度病巣は自然に緩解し、残りは未変化のままであるか、または高悪性度病巣に進行する。約１０％の高悪性度病巣は、未処置のままにすると、癌性組織に変化する。ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８は、最も頻繁に異形成と関連付けられているが、他の数種のトランスフォーミングＨＰＶサブタイプも異形成と関連する。
【０００８】
最近の試験は、８９％までのＨＩＶ陽性の同性愛者男性は、このＨＰＶのハイリスク・サブタイプに感染し得ることを示す。ＨＩＶ陽性患者はまた、異形成進行の高いリスクと関連する、多くのＨＰＶのサブタイプに同時に感染する可能性も高い。
【０００９】
最近２０年にわたる証拠は、ＨＰＶ感染が、子宮頚部癌の発症に、十分ではないが、必要であるとの広い承認に至っている。子宮頚部癌におけるＨＰＶの存在は９９.７％と概算される。肛門癌は、ＨＰＶ感染と同様の関連を有すると考えられており、肛門異形成および肛門癌の発症は子宮頚部癌と同様である。肛門癌を有するＨＩＶ陰性患者の一つの試験で、ＨＰＶ感染は肛門癌の８８％に見られた。２００３年に米国で、子宮頚部癌の１２,２００の新症例および４,１００例の子宮頚部癌死が、肛門癌の４,０００の新症例および５００例の肛門癌死と共に予測された。子宮頚部癌の発生率は、広範な予防的スクリーニングにより最近４０年で低下しているが、肛門癌の発生率は増加している。肛門癌事例の増加は、ＨＩＶ陽性患者が一般的集団よりも高い肛門癌発生率を有するため、一部ＨＩＶ感染が関与し得る。肛門癌が、一般集団において１００,０００人あたり０.９例の発症率であるのに対し、肛門癌は、同性愛男性集団において１００,０００人中３５例およびＨＩＶ陽性同性愛男性集団において１００,０００人中７０−１００例の発生率である。実際、ＨＩＶ感染患者での肛門異形成の高い罹病率および肛門癌の増加傾向のため、２００３年のＨＩＶ陽性患者の日和見感染処置のためのＵＳＰＨＡ／ＩＤＳＡガイドラインは、肛門異形成と診断された患者の処置ガイドラインを含むであろう。
【００１０】
ＨＰＶ感染のための既知の治癒法はない。性器疣贅の処置方法はあるが、それらは処置しなくともしばしば消失する。処置方法は、性器疣贅のサイズおよび位置のような因子による。とりわけ使用される処置は、イミキモドクリーム、２０％ポドフィリン抗有糸分裂溶液、０.５％ポドフィロックス溶液、５％５−フルオロウラシルクリーム、およびトリクロロ酢酸である。ポドフィリンまたはポドフィロックスは、それらが皮膚に吸収され、先天異常をもたらし得るため、妊婦には推奨されない。５−フルオロウラシルクリームの使用も妊婦には推奨されない。小さい性器疣贅は、冷凍(冷凍手術)、燃焼(電気焼灼)またはレーザー処置により物理的に除去できる。他の処置に応答しない大きな疣贅は、手術で除去しなければならないかもしれない。性器疣贅は、物理的除去後再発することが知られている；このような場合、α−インターフェロンをこれらの疣贅に直接注射する。しかしながら、α−インターフェロンは高価であり、その使用は性器疣贅の再発率を減らさない。
【００１１】
有効なＨＰＶ処置に対する満たされていない必要性がこのようなものとして存在する。驚くべきことに、これらの要求に合い、同様に他の利益も提供する化合物を発見した。
【００１２】
最近、二本鎖ＲＮＡ分子(ｄｓＲＮＡ)が、遺伝子発現を、ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)として既知の非常に保存された制御機構により遮断することが示されている。ＷＯ９９／３２６１９(Fire et al.)は、少なくとも２５ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡの使用が、C. elegansにおける遺伝子発現を阻害することを開示している。植物(例えば、ＷＯ９９／５３０５０、Waterhouse et al.；およびＷＯ９９／６１６３１、Heifetz et al.参照)、ショウジョウバエ(例えば、Yang, D., et al., Curr. Biol. (2000) 10:1191-1200参照)、および哺乳動物(ＷＯ００／４４８９５、Limmer；およびＤＥ１０１００５８６.５、Kreutzer et al.参照)を含む他の生物において、ｄｓＲＮＡはまた標的ＲＮＡを分解することも示されている。この天然機構は、現在、遺伝子の異常なまたは望まない制御が原因の障害の処置のための新クラスの医薬製剤の開発のために注目されてきている。
【００１３】
ＰＣＴ公報ＷＯ０３／００８５７３は、ＨＰＶ感染が原因の疾患の処置のための核酸ベースの医薬を開発するための以前の努力を開示する。この公報は、細胞ベースの系におけるＨＰＶ複製を阻害するためのＨＰＶ  ｍＲＮＡに対する２種のｓｉＲＮＡの使用を報告する；関連文献は、Jiang, M. et al. 2005. N. A. R. 33(18):e151に見られる。
【００１４】
ＲＮＡｉの分野における顕著な利益およびＨＰＶ感染が仲介する病理学的過程の処置における進歩にもかかわらず、ＨＰＶ感染の進行を阻止でき、そして、ＨＰＶ感染と関連する疾患を処置できる医薬に対する要求は続いている。このような医薬は、全体で高い程度の遺伝子型多様性を示すハイリスクＨＰＶサブタイプの全てを阻害するように設計すべきであるため、この試みは困難であった。
【発明の開示】
【００１５】
発明の要約
本発明は、ＨＰＶ増殖に必須の遺伝子発現を沈黙させるための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)の使用による、ＨＰＶ感染と関連する疾患の処置の問題の解決を提供する。Ｅ６ＡＰは、ＨＰＶが増殖のために必要とするヒト宿主種の保存遺伝子である。
【００１６】
本発明は、二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)、ならびにこのようなｄｓＲＮＡを使用した、細胞または哺乳動物におけるＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法を提供する。本発明はまた、子宮頚部癌および性器(gential)疣贅のようなＨＰＶ感染と関連するＥ６ＡＰ遺伝子の発現が原因の病的状態および疾患を処置するための組成物および方法も提供する。本発明のｄｓＲＮＡは、３０ヌクレオチド長未満、一般に１９−２４ヌクレオチド長であり、そしてＥ６ＡＰ遺伝子のｍＲＮＡトランスクリプトの少なくとも一部に実質的に相補性の領域を有するＲＮＡ鎖(アンチセンス鎖)を含む。
【００１７】
一つの態様において、本発明は、Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)分子を提供する。本ｄｓＲＮＡは、互いに相補的である少なくとも２個の配列を含む。本ｄｓＲＮＡは、第一配列を含むセンス鎖および第二配列を含むアンチセンス鎖を含む。本アンチセンス鎖は、Ｅ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補性のヌクレオチド配列を含み、該相補性領域は３０ヌクレオチド長未満、一般に１９−２４ヌクレオチド長である。本ｄｓＲＮＡは、Ｅ６ＡＰを発現する細胞と接触すると、Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を少なくとも４０％阻害する。
【００１８】
例えば、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、表１のセンス配列の群から選択されるｄｓＲＮＡの第一配列および表１のアンチセンス配列の群から選択される第二配列から成り得る。本発明のｄｓＲＮＡ分子は、天然に存在するヌクレオチドを含み得るか、または２'−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５'−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体に結合した末端ヌクレオチドのような少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含み得る。あるいは、本修飾ヌクレオチドは：２'−デオキシ−２'−フルオロ修飾ヌクレオチド、２'−デオキシ−修飾ヌクレオチド、固定化(locked)ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２'−アミノ−修飾ヌクレオチド、２'−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミダイト、および非天然塩基含有ヌクレオチドから成る群から選択できる。一般に、このような修飾配列は、表１のセンス配列の群から選択される該ｄｓＲＮＡの第一配列および表１のアンチセンス配列の群から選択される第二配列に基づく。
【００１９】
他の態様において、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡの一つを含む、細胞の一つを提供する。本細胞は、一般にヒト細胞のような哺乳動物細胞である。
【００２０】
他の態様において、本発明は、１個以上の本発明のｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体または送達媒体を含む、生物、一般にヒト対象のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害するための、医薬組成物を提供する。
【００２１】
他の態様において、本発明は、以下の工程を含む、細胞のＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する方法を提供する：
(ａ)  細胞に、互いに相補的である少なくとも２個の配列を含む、二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)を導入する。本ｄｓＲＮＡは、第一配列を含むセンス鎖および第二配列を含むアンチセンス鎖を含む。本アンチセンス鎖は、Ｅ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補性であり、ここで、該相補性領域は３０ヌクレオチド長未満、一般に１９−２４ヌクレオチド長であり、ここで、該ｄｓＲＮＡは、Ｅ６ＡＰを発現する細胞との接触により、Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現を、少なくとも４０％阻害し；そして
(ｂ)  工程(ａ)で製造した細胞Ｅ６ＡＰ遺伝子のｍＲＮＡトランスクリプトの分解を得るのに十分な時間維持し、それにより細胞でのＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する。
【００２２】
他の態様において、本発明は、ＨＰＶ感染が仲介する病理学的過程、例えば癌または性器(gential)疣贅を処置、予防または管理する方法であって、そのような処置、予防または管理を必要とする患者に、治療的または予防的有効量の１個以上の本発明のｄｓＲＮＡを投与することを含む、方法を提供する。
【００２３】
他の態様において、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡの一つの少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結した制御配列を含む、細胞でのＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害するためのベクターを提供する。
【００２４】
他の態様において、本発明は、細胞でのＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害するためのベクターを含む、細胞を提供する。本ベクターは、本発明のｄｓＲＮＡの一つの少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結した制御配列を含む。
【００２５】
図面の簡単な説明
図面はない。
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、ＨＰＶ増殖に必須の遺伝子発現を沈黙させるための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)の使用による、ＨＰＶ感染と関連する疾患の処置の問題の解決を提供する。特に、本発明のｄｓＲＮＡは、ＨＰＶの増殖に必要なヒト宿主種の保存遺伝子であるＨＰＶ遺伝子Ｅ１またはＥ６またはヒトＥ６ＡＰを沈黙させる。ここで、これらの遺伝子を、集合的にＨＰＶ標的遺伝子と呼ぶこともある。
【００２７】
本発明は、二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)、ならびに該ｄｓＲＮＡを使用した、細胞または哺乳動物でのＥ１、Ｅ６またはＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法を提供する。本発明はまた、ｄｓＲＮＡを使用する、ＨＰＶ感染と関連するＥ１、Ｅ６またはＥ６ＡＰ遺伝子の発現が原因の哺乳動物における病的状態および疾患を処置するための組成物および方法に関する。ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)として既知の工程を介するｍＲＮＡの配列特異的分解を指向する。
【００２８】
本発明のｄｓＲＮＡは、３０ヌクレオチド長未満、一般に１９−２４ヌクレオチド長であり、そしてＨＰＶ標的ｍＲＮＡトランスクリプトの少なくとも一部に実質的に相補性である領域を有するＲＮＡ鎖(アンチセンス鎖)を含む。これらのｄｓＲＮＡの使用は、哺乳動物におけるＨＰＶの複製および／または維持に関与する遺伝子のｍＲＮＡの標的分解を可能にする。細胞−ベースのおよび動物−ベースのアッセイを使用して、本発明者らは、非常に低用量のこれらのｄｓＲＮＡが、ＲＮＡｉを特異的にそして効率的に仲介し、Ｅ１、Ｅ６またはＥ６ＡＰ遺伝子の発現の顕著な阻害をもたらすことを証明した。故に、これらのｄｓＲＮＡを含む本発明の方法および組成物は、ＨＰＶ生活環に含まれる宿主因子遺伝子を標的とすることにより、ＨＰＶ感染が仲介する病理学的過程の処置に有効である。
【００２９】
ＨＰＶ標的：ＨＰＶ  Ｅ１およびＥ６およびヒトＥ６ＡＰの記載
ヒト宿主の細胞性ユビキチンリガーゼＥ６ＡＰは、ＨＰＶ、特に組み込み(非エピソーム)型のＨＰＶの複製に、そのウイルスのＥ６タンパク質との複合体化を介して関与する。Ｅ６は、細胞増殖経路を制御する多くのタンパク質に結合し、しばしばそれらの分解を引き起こす(Chakrabarti, O. and Krishna, S. 2003. J. Biosci. 28:337-348)。Ｅ６はＥ６ＡＰと複合体形成して、分解について腫瘍サプレッサーｐ５３を標的とする(Scheffner, M. et al., 1990. Cell. 63:1129-1136;およびScheffner, M. et al., 1993. Cell 75:495-505)。ｐ５３を不活性化することにより、本ウイルスは感染細胞のｐ５３仲介アポトーシスを防止し(Chakrabarti and Krishna, 2003)、そしてそうでなければｐ５３により遮断されているそのＤＮＡの複製を促進するだけでなく(Lepik, D. et al. 1998. J. Virol. 72:6822-6831)、ゲノム完全性に対するｐ５３仲介制御の低下により、発癌も助ける(Thomas, M. et al. 1999. Oncogene. 18:7690-7700)。
【００３０】
Ｅ１およびＥ６は、両方とも“Papillomaviridae:  Viruses and Their Replication” by Peter M. Howley, pp. 947-978, in: Fundamental Virology, 3rd ed. Bernard N. Fields, David M. Knipe, and Peter M. Howley, eds. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996にかなり詳細に記載されている。Ｅ１  ＯＲＦは、プラスミドＤＮＡ複製に必須の６８−７６kDタンパク質をコードする。完全長Ｅ１産物は、ＢＰＶ１のＬＣＲにおける複製起点に結合するリン酸化核タンパク質である。Ｅ１はまたＡＴＰに結合することおよびインビトロでＥ２転写トランス活性化因子(Ｅ２ＴＡ)と呼ばれる完全長Ｅ２タンパク質に結合し、それによりウイルス転写を促進することも示されている。Ｅ２への結合は、ＤＮＡ複製起点へのＥ１の親和性も強める。ＨＰＶ−１６において、Ｅ１は不死化に対して間接的効果を有する。
【００３１】
Ｅ６は、小塩基性細胞−トランスフォーミングタンパク質(例えば、ＨＰＶ１６  Ｅ６は１５１アミノ酸から成る)、約１６−１９kDであり、これは核マトリクスおよび非核膜画分に局在化する。Ｅ６遺伝子産物は、４個のＣｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓモチーフを含み、亜鉛結合の可能性を示す；これはまた核酸結合タンパク質として働き得る。ＨＰＶ−１６のようなハイリスクＨＰＶにおいて、Ｅ６およびＥ７タンパク質は、宿主−扁平上皮性細胞の不死化に必要かつ十分である。ハイリスクＨＰＶのＥ６遺伝子産物はｐ５３と複合体化し、そしてその分解を促進することが示されている。
【００３２】
以下の詳細な記載は、ｄｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ含有組成物をどのように製造し、ＨＰＶ標的遺伝子の発現を阻害するためにどのように使用するか、ならびにＨＰＶ感染が原因の疾患および障害、例えば子宮頚部癌および性器疣贅を処置するための組成物および方法を開示する。本発明の医薬組成物は、３０ヌクレオチド長未満、一般に１９−２４ヌクレオチド長であり、そしてＨＰＶ標的遺伝子のＲＮＡトランスクリプトの少なくとも一部と実質的に相補性である領域を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡを、薬学的に許容される担体と共に含む。本発明の一態様は、医薬製剤中で組合せた、所望により異なるＨＰＶ標的遺伝子を標的とする、１個を超えるｄｓＲＮＡの使用である。
【００３３】
従って、本発明のある局面は、本発明のｄｓＲＮＡを薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物、１個以上のＨＰＶ標的遺伝子の発現を阻害するための該組成物の使用方法、およびＨＰＶ感染が原因の疾患を処置するための該医薬組成物の処置方法を開示する。
【００３４】
Ｉ. 定義
簡便のために、明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で使用するある用語および句の意味を、以下に提供する。本明細書の他の部分でのこれらの用語の使用とこの章で提供するその定義の間に明らかな矛盾がある場合、この章の定義が優先する。
【００３５】
“Ｇ”、“Ｃ”、“Ａ”および“Ｕ”各々は、一般に塩基として各々グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを含むヌクレオチドを意味する。しかしながら、用語“リボヌクレオチド”または“ヌクレオチド”はまた、さらに詳細を以下に記載する修飾ヌクレオチド、または代理置換部分(surrogate replacement moiety)も意味し得ることは理解すべきである。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを、置換部分を担持するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変えることなく、他の部分と置換できることに気付くであろう。例えば、限定しないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対形成し得る。それ故に、ウラシル、グアニン、またはアデニン含有ヌクレオチドを、本発明のヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含むヌクレオチドに置き換え得る。このような置換部分を含む配列は、本発明の一態様である。
【００３６】
ここで使用する“Ｅ６ＡＰ”は、ユビキチンタンパク質リガーゼＥ３Ａ(ｕｂｅ３Ａ、Ｅ６関連タンパク質またはＥ６ＡＰとも呼ばれる)遺伝子またはタンパク質を意味する。種々のアイソフォームを示すＥ６ＡＰに対するヒトｍＲＮＡ配列は、GenBank Accession numbers NM_130838.1、NM_130839.1およびNM_000462.2として提供される。
【００３７】
ここで使用する“Ｅ１”は、ヒトパピローマウイルス１６型(ＨＰＶ１６)Ｅ１遺伝子(GenBank accession number NC_001526、ヌクレオチド８６５から２８１３)を意味する。ここで使用する“Ｅ６”は、ヒトパピローマウイルス１６型(ＨＰＶ１６)Ｅ６遺伝子(GenBank accession number NC_001526、ヌクレオチド６５から５５９)を意味する。Ｅ１およびＥ６遺伝子の多くの変異体も公的に開示されている。これらおよび将来的に公開されるであろうＥ１およびＥ６遺伝子変異体は、文脈から特に除外されない限り、“Ｅ１”および“Ｅ６”の使用によりここで包含することを意図する。
【００３８】
ここで使用する“標的配列”は、一次転写産物のＲＮＡ処理の産物であるｍＲＮＡを含み、ＨＰＶ標的遺伝子の一つの転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続部分を意味する。
【００３９】
ここで使用する用語“配列を含む鎖”は、標準ヌクレオチド命名法を使用して言及される配列により記載される、ヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
【００４０】
ここで使用する、用語“相補性”は、特記しない限り、当業者に理解される通り、第二ヌクレオチド配列に関して第一ヌクレオチド配列を記載するために使用するとき、第一ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、第二ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、一定条件下でハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する能力を意味する。このような条件は、例えば、ストリンジェントな条件であり得て、ここで、ストリンジェントな条件は：４００mM  ＮａＣｌ、４０mM  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６.４、１mM  ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２−１６時間、続く洗浄を含み得る。生物内で遭遇し得るような生理学的に関連する条件のような他の条件も適用できる。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的適用に従って、２個の配列の相補性を試験するための最も適当な一組の条件を決定できる。
【００４１】
これは、第一ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの第二ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに第一および第二ヌクレオチド配列への全長にわたる塩基対形成を含む。このような配列は、ここで互いに“完全に相補性”と言うことができる。しかしながら、第一配列をここで第二配列に対して“実質的に相補性”と言うとき、この２個の配列は完全に相補性であり得るか、または、その最終適用に最も適切な条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、ハイブリダイゼーションによりそれらは１個以上の、しかし一般に４個、３個または２個を超えないミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしながら、２個のオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーションにより、１個以上の一本鎖オーバーハングを形成するように設計したとき、そのようなオーバーハングは、相補性決定の観点でミスマッチと見なすべきではない。例えば、２個の２１ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドおよび他の２３ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡであって、長い方のオリゴヌクレオチドが短い方のオリゴヌクレオチドと完全に相補性であるヌクレオチドの配列を含むならば、本発明の目的でまだ“完全に相補性”と言うことができる。
【００４２】
ここで使用する“相補性”配列はまた、上記のそれらのハイブリダイズする能力についての要件が満たされている限り、非ワトソン・クリック塩基対からおよび／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含んでよく、またはこれらから完全に形成されてよい。
【００４３】
ここで用語“相補性”、“完全に相補性”および“実質的に相補性”は、それらが使用されている文脈から理解される通り、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の間、またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列の間の塩基マッチングに関して使用し得る。
【００４４】
ここで使用する、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)の“少なくとも一部に実質的に相補性の”ポリヌクレオチドは、目的のｍＲＮＡ(例えば、Ｅ６ＡＰをコードする)の連続部分に実質的に相補性であるポリヌクレオチドを意味する。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がＥ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの非中断部分と実質的に相補性であるならば、Ｅ６ＡＰ  ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補性である。
【００４５】
ここで使用する用語“二本鎖ＲＮＡ”または“ｄｓＲＮＡ”は、上記で定義の通り、２個の逆平行でありそして実質的に相補性の核酸鎖を含む二本鎖構造を有する、リボ核酸分子を意味する。二本鎖構造を形成する２個の鎖は、一つの大きなＲＮＡ分子の異なる部分であってよく、またはそれらは別々のＲＮＡ分子であってよい。別々のＲＮＡ分子であるとき、そのようなｄｓＲＮＡは、しばしばｓｉＲＮＡ(“低分子干渉ＲＮＡ”)として文献に記載されている。２個の鎖が一つの大きな分子の一部であり、故に、一方の鎖の３'末端と、二本鎖構造を形成する各他方の鎖の５'末端の間のヌクレオチドの中断されていない鎖により接続されているとき、この連結ＲＮＡ鎖を“ヘアピンループ”、“短ヘアピンＲＮＡ”または“ｓｈＲＮＡ”と呼ぶ。２個の鎖が、一方の鎖の３'末端と、二本鎖構造を形成する各他方の鎖の５'末端の間のヌクレオチドの中断されていない鎖以外の手段で共有的に連結されているとき、この連結構造は“リンカー”と呼ぶ。ＲＮＡ鎖は、同一または異なるヌクレオチド数を含み得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最短鎖のヌクレオチドから二本鎖に存在する何らかのオーバーハングを引いた数である。二本鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは１個以上のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。加えて、この明細書で使用する、“ｄｓＲＮＡ”は、複数ヌクレオチドでの実質的修飾を含み、そして、ここに開示のまたは当分野で既知の全てのタイプの修飾を含み、リボヌクレオチド、ヌクレオシド間結合、端基、キャップ、および接合部分への化学修飾を含み得る。ｓｉＲＮＡ型分子において使用される全てのこのような修飾は、本明細書および特許請求の範囲の目的で、“ｄｓＲＮＡ”により包含される。
【００４６】
ここで使用する“ヌクレオチドオーバーハング”は、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３'末端が他方の鎖の５'末端を超えて伸長しているとき、またはその逆であるとき、ｄｓＲＮＡの二本鎖構造から突出する不対ヌクレオチドまたはヌクレオチドを意味する。“平滑”または“平滑末端”は、ｄｓＲＮＡ末端に不対ヌクレオチドが存在しない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。“平滑末端”ｄｓＲＮＡは、その全長にわたって二本鎖である、すなわち、分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがないｄｓＲＮＡである。明確にするために、ｓｉＲＮＡの３'末端または５'末端にコンジュゲートした化学キャップまたは非ヌクレオチド化学部分は、ｓｉＲＮＡがオーバーハングを有するかまたは平滑末端であるかの決定に考慮しない。
【００４７】
用語“アンチセンス鎖”は、標的配列に実質的に相補性の領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を意味する。ここで使用する用語“相補性の領域”は、ここで定義の配列、例えば標的配列に実質的に相補性のアンチセンス鎖上の領域を意味する。相補性の領域が標的配列に完全に相補性ではない場合、ミスマッチは、末端領域において最も許容され、そして、存在するならば、一般に、例えば５'および／または３'末端から６、５、４、３、または２ヌクレオチド以内の１個または複数の末端領域である。
【００４８】
ここで使用する用語“センス鎖”は、アンチセンス鎖の領域に実質的に相補性である領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を意味する。
【００４９】
ｄｓＲＮＡを参照するとき、“細胞への導入”は、当業者には理解される通り、細胞への取り込みまたは吸収を促進する手段を意味する。ｄｓＲＮＡの吸収または取り込みは、自発的な拡散性または能動的細胞性過程を通して、または助剤またはデバイスにより起こり得る。この用語の意味は、インビトロの細胞に限定されない；ｄｓＲＮＡはまた生存生物の一部である“細胞に導入される”。このような場合、細胞への導入は、生物への送達を含む。例えば、インビボ送達のために、ｄｓＲＮＡを組織部位に注入するか、または全身性に投与できる。細胞へのインビトロでの導入は、エレクトロポレーションおよびリポフェクションのような当分野で既知の方法を含む。
【００５０】
用語“沈黙”および“の発現を阻害”は、それらがＨＰＶ標的遺伝子に関連している限り、ここで、ＨＰＶ標的遺伝子が転写され、そしてＨＰＶ標的遺伝子の発現が阻害されるように処理されている第一細胞または細胞群から単離し得るＨＰＶ標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量の、実質的に第一細胞または細胞群と同一であるが、そのように処理されていない第二細胞または細胞群(コントロール細胞)と比較した低下として現れるＨＰＶ標的遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を意味する。阻害の程度は、通常
【数１】
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として示される。
【００５１】
あるいは、阻害の程度は、ＨＰＶ標的遺伝子転写と機能的に関連しているパラメータ、例えば細胞により分泌されるＨＰＶ標的遺伝子によりコードされるタンパク質の量、またはある種の表現型、例えば、アポトーシスを示す細胞の数の低下の観点で示し得る。原則
として、ＨＰＶ標的遺伝子サイレンシングは、構成的であれゲノム工学によるものであれ標的を発現する細胞で、何らかの適当なアッセイで決定できる。しかしながら、あるｄｓＲＮＡが、一定の程度でＨＰＶ標的遺伝子を阻害し、それ故に本発明に含まれるかどうかを決定するために対照が必要である場合には、後記の実施例で提供されるアッセイが、このような対照となる。
【００５２】
例えば、ある場合、Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現が、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド投与により少なくとも約２０％、２５％、３５％、または５０％抑制される。ある態様において、Ｅ６ＡＰ遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により少なくとも約６０％、７０％、または８０％抑制される。ある態様において、Ｅ６ＡＰ遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により少なくとも約８５％、９０％、または９５％抑制される。表２は、種々の濃度で、種々のＥ６ＡＰ  ｄｓＲＮＡ分子を使用したインビトロアッセイで得られた転写の阻害についての広範な値を提供する。同様に、表６は、Ｅ１の転写の阻害についての広範な値を提供し；そして表８はＥ６の転写の阻害についての広範な値を提供する。
【００５３】
ここでＨＰＶ感染の文脈において使用する、用語“処置する”、“処置”などは、ＨＰＶ感染が仲介する病理学的過程の軽減または改善を意味する。このような記載は、ＨＰＶ感染の防止または予防のための本発明の治療剤、およびＨＰＶ感染が原因の症状または病状の軽減を含む。本発明の文脈において、以下の他の状態のいずれかに関連しているとき(ＨＰＶ感染が仲介する病理学的過程以外)、用語“処置する”、“処置”などは、このような状態に関連する少なくとも１種の症状の軽減または改善、またはこのような状態の進行の遅延または逆転を意味する。
【００５４】
ここで使用する句“治療的有効量”および“予防的有効量”は、ＨＰＶ感染が仲介する病理学的過程またはＨＰＶ感染が仲介する病理学的過程の明白な症状の処置、予防、または管理において治療的利益を提供する量を意味する。治療的に有効である具体的量は、通常の医療従事者には容易に決定でき、例えばＨＰＶ感染が仲介する病理学的過程のタイプ、患者の病歴および年齢、ＨＰＶ感染が仲介する病理学的過程のステージ、および他の抗病理学剤(anti-pathological agents)の投与のような当分野で既知の因子によって変化し得る。
【００５５】
ここで使用する“医薬組成物”は、薬理学的に有効量のｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む。ここで使用する“薬理学的に有効量”、“治療的有効量”または単に“有効量”は、意図する薬理学的、治療的または予防的結果を生ずるのに有効なｄｓＲＮＡの量を意味する。例えば、ある臨床処置は、疾患または障害と関連する測定可能なパラメータの少なくとも２５％減少があったとき有効と見なされるならば、そのような疾患または障害の処置のための治療的有効量の医薬は、そのパラメータで少なくとも２５％低下を起こすのに有効な量である。
【００５６】
用語“薬学的に許容される担体”は、治療剤の投与のための担体である。このような担体は、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せを含み、これらに限定されない。この用語は細胞培養培地を特異的に除外する。経口投与用医薬について、薬学的に許容される担体は、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、平滑剤、甘味剤、香味剤、着色剤および防腐剤のような薬学的に許容される賦形剤を含み、これらに限定されない。適当な不活性希釈剤は、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、およびラクトースを含み、一方コーンデンプンおよびアルギン酸が適当な崩壊剤である。結合剤は、デンプンおよびゼラチンを含み得、一方、平滑剤は、存在するならば、一般にステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクである。望むならば、錠剤を、胃腸管での吸収を遅延させるためにグリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートでコーティングしてよい。
【００５７】
ここで使用する“形質転換細胞”は、ｄｓＲＮＡ分子が発現され得るベクターが導入されている細胞である。
【００５８】
II. 二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)
一つの態様において、本発明は、細胞または哺乳動物でのＨＰＶ標的遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)分子を提供し、ここで該ｄｓＲＮＡが、ＨＰＶ標的遺伝子の発現において形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補性である相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含み、そして該相補性の領域が３０ヌクレオチド長未満、一般に１９−２４ヌクレオチド長であり、ここで、該ｄｓＲＮＡが、該ＨＰＶ標的遺伝子を発現する細胞と接触すると、該ＨＰＶ標的遺伝子の発現を少なくとも１０％、２５％、または４０％阻害する。
【００５９】
本ｄｓＲＮＡは、二本鎖構造を形成するためにハイブリダイズするのに十分に相補性である２個のＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖(アンチセンス鎖)は、ＨＰＶ標的遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列由来の標的配列に実質的に相補性、および一般に完全に相補性である相補性の領域を含み、他方の鎖(センス鎖)は、適当な条件下で合わせたときこの２個の鎖がハイブリダイズし、二本鎖構造を形成するようにアンチセンス鎖に相補性な領域を含む。一般的に、二本鎖構造は、１５〜３０、より一般的に１８〜２５、さらに一般的に１９〜２４、および最も一般的に１９〜２１塩基対長である。同様に、標的配列に対する相補性の領域は、１５〜３０、より一般的に１８〜２５、さらにより一般的に１９〜２４、および最も一般的に１９〜２１ヌクレオチド長である。本発明のｄｓＲＮＡは、さらに、１個以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含み得る。ｄｓＲＮＡは、さらに以下に記載するような当分野で既知の標準方法により、例えば、Biosearch, Applied Biosystems, Inc.から市販されているような、例えば、自動化ＤＮＡ合成装置を使用して、合成できる。好ましい態様において、ＨＰＶ標的遺伝子はヒトＥ６ＡＰ遺伝子である。特定の態様において、ｄｓＲＮＡは、表１のセンス配列の群から選択される鎖および表１のアンチセンス配列の群から選択される第二配列を含む。表１に提供される標的配列のどこかを標的とする別のアンチセンスは、標的配列およびフランキングＥ６ＡＰ配列を使用して容易に決定できる。
【００６０】
さらなる態様において、ｄｓＲＮＡは、表１に提供する配列の群から選択される少なくとも１個のヌクレオチド配列を含む。他の態様において、ｄｓＲＮＡは、この群から選択される少なくとも２個の配列を含み、ここで、少なくとも２個の配列の一方は少なくとも２個の配列の他方に相補性であり、そして少なくとも２個の配列の一方は、Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現において産生されるｍＲＮＡの配列に実質的に相補性である。一般に、ｄｓＲＮＡは、２個のオリゴヌクレオチドを含み、ここで、一方のオリゴヌクレオチドは、表１におけるセンス鎖として記載され、そして第二オリゴヌクレオチドは、表１においてアンチセンス鎖として記載されている。表１は、各好ましいｄｓＲＮＡの二本鎖名および配列番号を提供する。
【００６１】
さらなる態様において、ｄｓＲＮＡは、表５(Ｅ１  ｄｓＲＮＡ)または表７(Ｅ６  ｄｓＲＮＡ)に提供される配列の群から選択される、少なくとも１個の命名された二本鎖ｄｓＲＮＡを含む。
【００６２】
当業者は、ｄｓＲＮＡが、２０〜２３塩基対、特異的に２１塩基対の二本鎖構造が、ＲＮＡ干渉の誘発に特に有効であるとして認められていることに十分気付くであろう(Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888)。しかしながら、他者は、短いまたは長いｄｓＲＮＡｓが同様に有効であることを発見している。上記の態様において、表１、表５または表７において提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質ために、本発明のｄｓＲＮＡは、最小で２１ntの長さの少なくとも１個の鎖を含む。表１、表５または表７の配列の一つから、一端または両端上の数個のみのヌクレオチドを欠く配列を含む短いｄｓＲＮＡは、上記のｄｓＲＮＡと比較して、同様に有効であり得ることが合理的に予測される。それ故に、表１、表５または表７の配列の１個からの少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の連続ヌクレオチドの部分配列を含み、ＦＡＣＳアッセイまたは下記の他のアッセイにおいてＨＰＶ標的遺伝子の発現を阻害する能力が、完全配列を含むｄｓＲＮＡから５、１０、１５、２０、２５、または３０％阻害を超えずに異なるｄｓＲＮＡは、本発明により意図される。さらに、表１、表５または表７に提供される標的配列内で開裂されるｄｓＲＮＡは、提供される参照配列および標的配列を使用して容易に製造できる。
【００６３】
加えて、表１、表５および表７に提供されるＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉベースの開裂に感受性である各ＨＰＶ標的ｍＲＮＡにおける部位を同定する。それ自体、本発明は、さらに、本発明の薬剤の一つにより標的化される配列内を標的とするＲＮＡｉ剤を含む。ここで使用される第二ＲＮＡｉ剤は、第二ＲＮＡｉ剤が、第一ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖に相補性のｍＲＮＡ内のどこかのメッセージを開裂するとき、第一ＲＮＡｉ剤の配列内を標的とすると言う。このような第二剤は、一般に、ＨＰＶ標的遺伝子における選択配列に連続する領域から取ったさらなるヌクレオチド配列に結合した、表１、表５または表７に提供される配列の一つからの少なくとも１５連続ヌクレオチドから成る。例えば、標的Ｅ６ＡＰ遺伝子からの隣の６ヌクレオチドと組み合わさった配列番号１の最後の１５ヌクレオチド(付加したＡＡ配列を欠く)は、表１に提供される配列の一つに基づく２１ヌクレオチドの一本鎖剤を産生する。
【００６４】
本発明のｄｓＲＮＡは、標的配列に対する１個以上のミスマッチを含み得る。好ましい態様において、本発明のｄｓＲＮＡは３個を超えないミスマッチを含む。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列のミスマッチを含むとき、ミスマッチの領域が相補性の領域の中心に位置しないことが好ましい。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列に対するミスマッチを含むとき、ミスマッチが、いずれかの末端から５ヌクレオチド、例えば相補性の領域の５'末端または３'末端いずれかから５、４、３、２、または１ヌクレオチドに限定されることが好ましい。例えば、ＨＰＶ標的遺伝子の領域に相補性である２３ヌクレオチドｄｓＲＮＡ鎖について、ｄｓＲＮＡ一般には、中央１３ヌクレオチド内にミスマッチを何も含まない。本明細書に記載の方法は、標的配列に対するミスマッチを含むｄｓＲＮＡが、ＨＰＶ標的遺伝子の発現の阻害に有効であるか否かを決定するために使用できる。ＨＰＶ標的遺伝子の発現阻害におけるミスマッチを有するｄｓＲＮＡの効果の考察は、とりわけＨＰＶ標的遺伝子における特定の相補性の領域が、本ウイルスにおいて(Ｅ１またはＥ６であるならば)またはヒト集団内で(Ｅ６ＡＰ)多型配列変異を有することが既知であるならば、重要である。
【００６５】
一つの態様において、ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の末端は、１〜４、一般に１または２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。少なくとも１ヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、それらの平滑末端対応物よりも予期されない優れた阻害特性を有する。さらに、本発明者らは、１個のみのヌクレオチドオーバーハングの存在が、その全体的安定性に影響することなく、ｄｓＲＮＡの干渉活性を増強することを発見した。１個のみのオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、インビボ、ならびに種々の細胞、細胞培養培地、血液、および血清において特に安定であり、有効であることが証明されている。一般に、一本鎖オーバーハングは、アンチセンス鎖の３'−末端、あるいは、センス鎖の３’−末端に位置する。ｄｓＲＮＡはまた、一般にアンチセンス鎖の５'末端に位置する平滑末端も有し得る。このようなｄｓＲＮＡは改善された安定性および阻害活性を有し、故に、低用量、すなわち、１日あたり５mg／レシピエント体重kg未満での投与を可能にする。一般に、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３'末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、そして５'末端は平滑である。他の態様において、オーバーハングにおける１個以上のヌクレオチドは、ヌクレオシドチオホスフェートに置換される。
【００６６】
さらに他の態様において、ｄｓＲＮＡは、安定性を高めるために化学的に修飾される。本発明の核酸は、ここに引用により包含させる“Current protocols in nucleic acid化学”, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載のような当分野で十分に確立された方法により合成および／または修飾できる。化学修飾は、２'修飾、他の部位のオリゴヌクレオチドの糖または塩基の修飾、オリゴヌクレオチド鎖への非天然塩基の導入、リガンドまたは化学部分への共有結合的結合、およびヌクレオチド間ホスフェート結合の、チオホスフェートのような他の結合への置換を含み、これらに限定されない。このような修飾の１種以上を用い得る。
【００６７】
２個の別々のｄｓＲＮＡ鎖の化学架橋は、種々の既知の技術のいずれか、例えば共有、イオンまたは水素結合の導入により；疎水性相互作用、ファン・デル・ワールスまたはスタッキング相互作用により；金属イオン配位により、またはプリン類似体の使用を介して、達成できる。一般に、ｄｓＲＮＡの修飾に使用できる化学基は、限定しないが、メチレンブルー；二機能性基、一般にビス−(２−クロロエチル)アミン；Ｎ−アセチル−Ｎ'−(ｐ−グリオキシルベンゾイル)シスタミン；４−チオウラシル；およびソラレンを含む。一つの態様において、リンカーは、ヘキサ−エチレングリコールリンカーである。この場合、ｄｓＲＮＡは固相合成により製造され、ヘキサ−エチレングリコールリンカーは標準方法に従い、導入される(例えば、Williams, D.J., and K.B. Hall, Biochem. (1996)35:14665-14670)。特定の態様において、アンチセンス鎖の５'末端およびセンス鎖の３'末端は、ヘキサエチレングリコールリンカーを介して化学的に連結している。他の態様において、ｄｓＲＮＡの少なくとも１個のヌクレオチドは、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート基を含む。ｄｓＲＮＡの末端の化学結合は、一般に三重螺旋構造により形成される。表１は、本発明の修飾ＲＮＡｉ剤の例を提供する。
【００６８】
さらに他の態様において、２個の一本鎖の一方または両方でのヌクレオチドを、例えば、限定しないが、ある種のヌクレアーゼのような細胞性酵素の分解活性を防止または阻止するために修飾し得る。核酸に対する細胞性酵素の分解活性を阻害するための技術は、２'−アミノ修飾、２'−アミノ糖修飾、２'−Ｆ糖修飾、２'−Ｆ修飾、２'−アルキル糖修飾、非荷電主鎖修飾、モルホリノ修飾、２'−Ｏ−メチル修飾、およびホスホラミダイトを含み、これに限定されない(例えば、Wagner, Nat. Med. (1995)1:1116-8参照)。故に、ｄｓＲＮＡ上のヌクレオチドの少なくとも１個の２'−ヒドロキシル基を、化学基、一般に２'−アミノまたは２'−メチル基により置換する。また、少なくとも１個のヌクレオチドを、固定化ヌクレオチドを形成するために修飾し得る。このような固定化ヌクレオチドは、リボースの２'−酸素とリボースの４'−炭素を連結するメチレン架橋を含む。固定化ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、Koshkin, A.A., et al., Tetrahedron(1998), 54:3607-3630)およびObika, S. et al., Tetrahedron Lett. (1998), 39:5401-5404)に記載されている。固定化ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドへの導入は相補性配列に対する親和性を高め、融解温度を数度上げる(Braasch, D.A. and D.R. Corey, Chem. Biol. (2001), 8:1-７)。
【００６９】
ｄｓＲＮＡへのリガンドのコンジュゲートは、その細胞性吸収ならびに特定の組織へのターゲティングまたは膣上皮のような特的細胞型による取り込みを増大できる。ある場合、疎水性リガンドを、細胞膜の直接通過を促進するためにｄｓＲＮＡにコンジュゲートする。あるいは、ｄｓＲＮＡにコンジュゲートしたリガンドは、受容体仲介エンドサイトーシスの基質である。これらの試みは、アンチセンスオリゴヌクレオチドならびにｄｓＲＮＡ剤の細胞透過を促進するために使用されている。例えば、コレステロールが、種々のアンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされており、それらの非コンジュゲートアナログと比較して、実質的により活性な物質をもたらす。Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103参照。オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている他の親油性化合物は、１−ピレン酪酸、１,３−ビス−Ｏ−(ヘキサデシル)グリセロール、およびメントールを含む。受容体仲介エンドサイトーシスのためのリガンドの一例は葉酸である。葉酸は、細胞に、葉酸受容体仲介エンドサイトーシスにより入る。葉酸を担持するｄｓＲＮＡ化合物は、葉酸受容体仲介エンドサイトーシスを介して細胞に効率的に輸送される。Ｌｉおよび同僚らは、葉酸のオリゴヌクレオチド３'末端への結合は、オリゴヌクレオチドの細胞性取り込みの８倍増加をもたらすと報告している。Li, S.;Deshmukh, H. M.;Huang, L. Pharm. Res. 1998, 15, 1540。オリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている他のリガンドは、ポリエチレングリコール、炭水化物クラスター、架橋剤、ポルフィリンコンジュゲート、および送達ペプチドを含む。
【００７０】
ある場合、カチオン性リガンドのオリゴヌクレオチドへのコンジュゲートは、ヌクレアーゼに対する改善した抵抗性をもたらす。カチオン性リガンドの代表例は、プロピルアンモニウムおよびジメチルプロピルアンモニウムである。興味深いことに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、カチオン性リガンドをオリゴヌクレオチド全体に分散させたときに、ｍＲＮＡに対する高結合親和性を保持することが報告された。M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103およびその中の引用文献参照。
【００７１】
本発明のリガンド−コンジュゲートｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ上の結合分子の結合に由来する基のようなペンダント反応性官能基を担持するｄｓＲＮＡの使用により合成できる。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、種々の保護基のいずれかを担持して合成されたリガンド、または結合した結合部分を有するリガンドと直接反応できる。本発明の方法は、、ある好ましい態様において、リガンドに適当にコンジュゲートしており、さらに、固体支持物質上に結合していてよいヌクレオシドモノマーの使用により、リガンド−コンジュゲートｄｓＲＮＡの合成を促進する。このような所望により固体支持物質に結合しているリガンド−ヌクレオシドコンジュゲートは、選択した血清−結合リガンドとヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの５'位に位置する結合部分の反応を介して、いくつかの本発明の方法の好ましい態様に従い製造する。ある場合、ｄｓＲＮＡの３'末端に結合したアラルキルリガンドを担持するｄｓＲＮＡは、最初に、モノマー構成要素を、制御された多孔性ガラス支持体に長鎖アミノアルキル基を介して結合させることにより製造する。次いで、ヌクレオチドを、標準固相合成技術を使用して、固体支持体に結合したモノマー構成要素に結合する。本モノマー構成要素は、固相合成と適合するヌクレオシドまたは他の有機化合物であり得る。
【００７２】
本発明のコンジュゲートに使用するｄｓＲＮＡは、固相合成の既知の技術を介して、慣用的におよび日常的に製造できる。このような合成のための装置は、例えば、Applied Biosystems(Foster City, CA)を含む数社から販売されている。当分野で既知のこのような合成のための何らかの他の手段を、これに加えて、またはこの変わりに用い得る。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のような他のオリゴヌクレオチドを製造するための類似技術を使用することも既知である。
【００７３】
特定の修飾オリゴヌクレオチドの合成に関する教示は、以下の米国特許に見ることができる：ポリアミンコンジュゲートオリゴヌクレオチドに関する米国特許５,１３８,０４５および５,２１８,１０５；キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドの製造のためのモノマーに関する米国特許５,２１２,２９５；修飾主鎖を有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許５,３７８,８２５および５,５４１,３０７；主鎖修飾オリゴヌクレオチドおよび還元的カップリングを介するそれらの製造に関する米国特許５,３８６,０２３；３−デアザプリン環系に基づく修飾核酸塩基およびその方法に関する米国特許５,４５７,１９１；Ｎ−２置換プリンに基づく修飾核酸塩基に関する米国特許５,４５９,２５５；キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドの製造方法に関する米国特許５,５２１,３０２；ペプチド核酸に関する米国特許５,５３９,０８２；β−ラクタム主鎖を有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許５,５５４,７４６；オリゴヌクレオチド合成のための方法および材料に関する米国特許５,５７１,９０２；アルキルチオ基を有するヌクレオシド(ここで、このような基は該ヌクレオシドの種々の任意の位置に結合する他の部分に対するリンカーとして使用し得る)に関する米国特許５,５７８,７１８；高キラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許５,５８７,３６１および５,５９９,７９７；２'−Ｏ−アルキルグアノシンおよび２,６−ジアミノプリン化合物を含む関連化合物の製造方法に関する米国特許５,５０６,３５１；Ｎ−２置換プリンを有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許５,５８７,４６９；３−デアザプリンを有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許５,５８７,４７０；両方ともコンジュゲート４'−デスメチルヌクレオシドアナログに関する米国特許５,２２３,１６８、および米国特許５,６０８,０４６；主鎖修飾オリゴヌクレオチドアナログに関する米国特許５,６０２,２４０、および５,６１０,２８９；とりわけ、２'−フルオロ−オリゴヌクレオチドの合成方法に関する米国特許６,２６２,２４１、および５,４５９,２５５。
【００７４】
本発明の配列特異的に結合したヌクレオシドを担持するリガンド−コンジュゲートｄｓＲＮＡおよびリガンド−分子において、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは、既に結合部分を担持する標準ヌクレオチドまたはヌクレオシド前駆体、またはヌクレオチドもしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、既にリガンド分子を担持するリガンド−ヌクレオチドもしくはヌクレオシド−コンジュゲート前駆体、または非ヌクレオシドリガンド担持構成要素を利用して、適当なＤＮＡ合成装置で組み立て得る。
【００７５】
既に結合部分を担持するヌクレオチド−コンジュゲート前駆体を使用するとき、配列特異的に結合したヌクレオシドの合成を典型的に完了し、次いでリガンド分子を結合部分と反応させて、リガンド−コンジュゲートオリゴヌクレオチドを形成する。ステロイド、ビタミン、脂質およびレポーター分子のような種々の分子を担持するオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以前に記載されている(Manoharan et al.、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／０７８８３参照)。好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドまたは結合したヌクレオシドは、市販されており、日常的にオリゴヌクレオチド合成に使用されている標準ホスホラミダイトおよび非標準ホスホラミダイトに加えて、リガンド−ヌクレオシドコンジュゲート由来のホスホラミダイトを使用した自動化合成装置により合成する。
【００７６】
オリゴヌクレオチドのヌクレオシドへの２'−Ｏ−メチル、２'−Ｏ−エチル、２'−Ｏ−プロピル、２'−Ｏ−アリル、２'−Ｏ−アミノアルキルまたは２'−デオキシ−２'−フルオロ基の導入は、オリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーション特性の増強を付与する。さらに、ホスホロチオエート主鎖含有オリゴヌクレオチドは、増加したヌクレアーゼ安定性を有する。故に、官能化された、結合した本発明のヌクレオシドは、ホスホロチオエート主鎖または２'−Ｏ−メチル、２'−Ｏ−エチル、２'−Ｏ−プロピル、２'−Ｏ−アミノアルキル、２'−Ｏ−アリルまたは２'−デオキシ−２'−フルオロ基の両方またはいずれかを含むように増大される。当分野で既知のオリゴヌクレオチド修飾のいくつかを挙げる要約は、例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ２００３７０９１８に見られる。
【００７７】
ある態様において、５'末端にアミノ基を有する本発明の官能化ヌクレオシド配列は、ＤＮＡ合成装置を使用し、次いで、選択したリガンドの活性エステル誘導体と反応させることにより製造する。活性エステル誘導体は、当業者に既知である。代表的活性エステルは、Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル、テトラフルオロフェノール性エステル、ペンタフルオロフェノール性エステルおよびペンタクロロフェノール性エステルを含む。アミノ基と活性エステルの反応により、選択したリガンドが結合基を介して５'位に結合しているオリゴヌクレオチドを製造する。５'末端のアミノ基を、５'−アミノ−モディファイヤーＣ６試薬を使用して製造できる。一つの態様において、リガンド分子は、コンジュゲートは、リガンド−ヌクレオシドホスホラミダイトの使用により５'位でオリゴヌクレオチドにコンジュゲートし得て、ここで、リガンドは、５'−ヒドロキシ基に直接的またはリンカーを介して間接的に結合する。このようなリガンド−ヌクレオシドホスホラミダイトは、典型的に自動化合成法の最後に使用し、リガンドを５'末端に担持するリガンド−コンジュゲートオリゴヌクレオチドを製造する。
【００７８】
修飾ヌクレオシド間結合または主鎖の例は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３'−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３'−アミノホスホラミダイトおよびアミノアルキルホスホラミダイトを含むホスホラミダイト、チオノホスホラミダイト、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の３'−５'結合を有するボラノホスフェート、これらの２'−５'結合アナログ、およびヌクレオシド単位の隣接対が３'−５'から５'−３'または２'−５'から５'−２'に結合している逆極性を有するものを含む。種々の塩、混合塩および遊離酸形も含む。
【００７９】
上記リン−原子含有結合の製造に関連する代表的米国特許は、各々引用により本明細書に包含させる米国特許３,６８７,８０８；４,４６９,８６３；４,４７６,３０１；５,０２３,２４３；５,１７７,１９６；５,１８８,８９７；５,２６４,４２３；５,２７６,０１９；５,２７８,３０２；５,２８６,７１７；５,３２１,１３１；５,３９９,６７６；５,４０５,９３９；５,４５３,４９６；５,４５５,２３３；５,４６６,６７７；５,４７６,９２５；５,５１９,１２６；５,５３６,８２１；５,５４１,３０６；５,５５０,１１１；５,５６３,２５３；５,５７１,７９９；５,５８７,３６１；５,６２５,０５０；および５,６９７,２４８を含むが、これらに限定されない。
【００８０】
リン原子を含まない修飾ヌクレオシド間結合または主鎖(すなわち、オリゴヌクレオシド)の例は、短鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキル糖間結合、または１個以上の短鎖ヘテロ原子のまたはヘテロ環の糖間結合により形成される主鎖である。これらはモルホリノ結合(一部ヌクレオシドの糖部分から形成)；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチル(formacetyl)およびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；および混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素部分を有するその他を含む。
【００８１】
上記オリゴヌクレオシドの製造に関する代表的米国特許は、各々引用により本明細書に包含させる米国特許５,０３４,５０６；５,１６６,３１５；５,１８５,４４４；５,２１４,１３４；５,２１６,１４１；５,２３５,０３３；５,２６４,５６２；５,２６４,５６４；５,４０５,９３８；５,４３４,２５７；５,４６６,６７７；５,４７０,９６７；５,４８９,６７７；５,５４１,３０７；５,５６１,２２５；５,５９６,０８６；５,６０２,２４０；５,６１０,２８９；５,６０２,２４０；５,６０８,０４６；５,６１０,２８９；５,６１８,７０４；５,６２３,０７０；５,６６３,３１２；５,６３３,３６０；５,６７７,４３７；および５,６７７,４３９を含み、これに限定されない。
【００８２】
ある場合、オリゴヌクレオチドを非リガンド基により修飾し得る。多くの非リガンド分子が、オリゴヌクレオチドの活性、細胞性分配または細胞性取り込みを高めるためにオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされており、このようなコンジュゲーションを実施する工程は、科学文献において利用可能である。このような非リガンド部分は、コレステロールのような脂質部分(Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553)、コール酸(Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053)、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306;Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765)、チオコレステロール(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111;Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327;Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49)、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１,２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777)、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969)、またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651)、パルミチル部分(Mishra et al., Biochem. Biophys. Acta, 1995, 1264:229)、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923)を含んでいる。このようなオリゴヌクレオチドコンジュゲートの製造を教示する代表的米国特許は、上記である。典型的コンジュゲーションプロトコールは、配列の一個所以上にアミノリンカーを担持するオリゴヌクレオチドリンカーの合成を含む。次いで、アミノ基を、コンジュゲートする分子と、適当なカップリング剤または活性化試薬を使用して反応させる。コンジュゲーション反応は、まだ固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドでまたはオリゴヌクレオチドの開裂後に液相で行い得る。ＨＰＬＣによるオリゴヌクレオチドコンジュゲートの精製は、典型的に純粋コンジュゲートを提供する。コレステロールコンジュゲートの使用は、このような部分がＨＰＶ感染部位である膣上皮細胞へのターゲティングを高めるため、特に好ましい。
【００８３】
本明細書は、ＨＰＶ標的遺伝子を沈黙させ、それ故にＨＰＶ関連障害を処置するのに有用なｄｓＲＮＡの広範な態様を記載する。具体的な治療剤の設計は、種々の形態を取り得るが、ある種の機能的特性が好ましいｄｓＲＮＡを他のｄｓＲＮＡと区別する。特に、全て当業者により測定可能な良好な血清安定性、高い効力、免疫応答非誘発、および良好な医薬様行動のような特性を、本発明の好ましいｄｓＲＮＡを同定するために試験する。ある状況において、これらの機能的局面の全てが好ましいｄｓＲＮＡに存在するものではない。しかし、当業者は、これらの可変因子およびその他を最適化して、好ましい本発明の化合物を選択することが可能である。
【００８４】
多くのヌクレオチド修飾が可能であるが、本発明者らは、薬理学的、免疫学的および最終的に治療的利益を顕著に改善する化学修飾のパターンを同定している。表９は、本発明の表１、表５および表７に明示の二本鎖ｄｓＲＮＡで使用するのに好ましい化学修飾のパターンを示す。これらの修飾のいくつかは表３にも説明する。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
ＲＮＡｉ剤をコードするベクター
本発明のｄｓＲＮＡは、細胞内のインビボで組み換えウイルスベクターからも発現できる。本発明の組み換えウイルスベクターは、本発明のｄｓＲＮＡをコードする配列およびｄｓＲＮＡ配列を発現するための何らかの適当なプロモーターを含む。適当なプロモーターは、例えば、Ｕ６またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  IIIプロモーター配列およびサイトメガロウイルスプロモーターを含む。他の適当なプロモーターの選択は、当分野の技術範囲内である。本発明の組み換えウイルスベクターはまた、特定の組織または特定の細胞内環境でのｄｓＲＮＡの発現のための誘導性または調節可能プロモーターも含み得る。本発明のｄｓＲＮＡをインビボで細胞に送達するための組み換えウイルスベクターは、下記にさらに詳しく述べる。
【００８７】
本発明のｄｓＲＮＡは、組み換えウイルスベクターから２個の別々の相補性ＲＮＡ分子として、または２個の相補性領域を有する１個のＲＮＡ分子として発現できる。
【００８８】
発現すべきｄｓＲＮＡ分子(複数もある)のコード鎖を許容できる全てのウイルスベクター、例えばアデノウイルス(ＡＶ)；アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)；レトロウイルス(例えば、レンチウイルス(ＬＶ)、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス)；ヘルペスウイルスなどから由来するベクターを使用できる。ウイルスベクターの向性は、適当であれば、エンベロープタンパク質または他のウイルスからの他の表面抗原でベクターを偽型(pseudotyping)することにより、または異なるウイルスカプシドタンパク質で置換することにより、修飾できる。
【００８９】
例えば、本発明のレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス(ＶＳＶ)、狂犬病、エボラ、モコラなどからの表面タンパク質で偽型できる。本発明のＡＡＶベクターは、ベクターを異なるカプシドタンパク質血清型を発現するように操作することにより、異なる細胞を標的とするようにできる。例えば、血清型２ゲノム上に血清型２カプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２と呼ぶ。ＡＡＶ２／２ベクターのこの血清型２カプシド遺伝子を、血清型５カプシド遺伝子で置換してＡＡＶ２／５ベクターを製造できる。異なるカプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターの製造法は当分野の技術範囲内である；例えば、その開示の全体を引用により本明細書に包含するRabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801参照。
【００９０】
本発明での使用に適当な組み換えウイルスベクターの選択、ｄｓＲＮＡを発現させるための核酸配列のベクターへの挿入方法、およびウイルスベクターを目的細胞に送達する方法は、当分野の技術範囲内である。例えば、それらの開示の全体を引用により本明細書に包含するDornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30; and Rubinson D A et al., Nat. Genet. 33: 401-406参照。
【００９１】
好ましいウイルスベクターはＡＶおよびＡＡＶ由来のベクターである。特に好ましい態様において、本発明のｄｓＲＮＡを、例えば、Ｕ６またはＨ１  ＲＮＡプロモーター、またはサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターのいずれかを含む組み換えＡＡＶベクターから、二つの別々の、相補性一本鎖ＲＮＡ分子として発現する。
【００９２】
本発明のｄｓＲＮＡを発現する適当なＡＶベクター、組み換えＡＶベクターの構築方法、およびベクターの標的細胞への送達方法は、Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20:1006-1010に記載されている。
【００９３】
本発明のｄｓＲＮＡを発現するための適当なＡＡＶベクター、組み換えＡＶベクターの構築方法、およびベクターの標的細胞への送達方法は、それらの開示の全体を引用により本明細書に包含するSamulski R et al. (1987), J. Virol. 61:3096-3101；Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70:520-532；Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63:3822-3826；米国特許５,２５２,４７９；米国特許５,１３９,９４１；国際特許出願ＷＯ９４／１３７８８；および国際特許出願ＷＯ９３／２４６４１に記載されている。
【００９４】
III. ｄｓＲＮＡ含有医薬組成物
一つの態様において、本発明は、ここに記載のｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。ｄｓＲＮＡ含有医薬組成物は、ＨＰＶ感染が仲介する病理学的過程のようなＨＰＶ標的遺伝子の発現または活性と関連する疾患または障害の処置に有用である。そのような医薬組成物は、送達の形態に基づき製剤する。一例は、子宮頚への局所投与または非経腸送達を介する全身投与のいずれか用に製剤された組成物である。
【００９５】
本発明の医薬組成物は、ＨＰＶ標的遺伝子の発現の阻害に十分な量で投与する。本発明者らは、その改善された効果のために、本発明のｄｓＲＮＡ含有組成物は、驚くべきことに低用量で投与できることを測定している。５mg  ｄｓＲＮＡ／レシピエント体重kg／日が、ＨＰＶ標的遺伝子の発現の発現の阻害または抑制に十分であり、疣贅または子宮頚部または肛門処置の場合、感染組織に直接適用してよい。
【００９６】
一般に、ｄｓＲＮＡの適当な用量は、０.０１〜５.０mg／レシピエント体重kg／日、一般に１μg〜１mg／レシピエント体重kg／日の範囲である。本医薬組成物は１日１回投与でき、またはｄｓＲＮＡを、１日を通して適当な間隔で２回、３回またはそれ以上の分割量で、または連続輸液または膣ゲルの制御放出製剤を通した送達を使用してさえ、投与できる。この場合、各分割量に含まれるｄｓＲＮＡは、全１日量を達成するために相応して少量でなければならない。投与単位はまた、例えば、数日にわたりｄｓＲＮＡの持続放出を提供する慣用の持続放出製剤を使用して、数日にわたって送達するために合成もできる。持続性放出製剤は当分野で既知であり、本発明の薬剤で使用され得るような、薬剤の膣送達に特に有用である。この態様において、投与単位は、１日量の対応する複数倍量を含む。
【００９７】
当業者は、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の一般的健康状態および／または年齢、および存在する他の疾患を含み、これに限定されないある種の因子が、対象を効率的に処置するのに必要な投与量およびタイミングに影響し得ることは認識しよう。さらに、治療的有効量の組成物での対象の処置は、１回処置または一連の処置を含み得る。本発明に包含される個々のｄｓＲＮＡの有効量およびインビボ半減期の概算は、慣用法を使用して、または、本明細書の他の場所に記載の適当な動物モデルを使用したインビボ試験を使用して成し得る。
【００９８】
本発明者らは、ＨＰＶ遺伝子型の多様性を含む種々の理由のために、ＨＰＶ感染を、１種以上の本発明のｄｓＲＮＡで同時に処置することが望ましいかもしれないことを認識している。ある態様において、ｄｓＲＮＡの組合せを、ｄｓＲＮＡの混合物をできるだけ複雑にせずに、広範なＨＰＶ遺伝子型を標的とするように選択する。１種以上のタイプのｄｓＲＮＡを含む本発明の医薬組成物は、ここに記載の個々のｄｓＲＮＡの投与量を含むことが予測される。
【００９９】
ｄｓＲＮＡの組合せは、１回投与形態医薬組成物に一緒に提供され得る。あるいは、ｄｓＲＮＡの組合せは別々の投与形態で提供でき、この場合、それらを同時にまたは異なる時点で、そして恐らく異なる手段で投与し得る。それ故に、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡの望む組合せを含む医薬組成物を提供する；そして、組合せレジメンの一部として提供されることが意図される１個のｄｓＲＮＡの医薬組成物も意図する。後者の場合、組合せ治療発明は、それ故に、組成物事項よりむしろ投与方法事項である。
【０１００】
マウス遺伝学の進歩は、ＨＰＶ感染が仲介する病理学的過程のような種々のヒト疾患の研究のための多くのマウスモデルを作成している。このようなモデルを、ｄｓＲＮＡのインビボ試験、ならびに治療的有効量の決定に使用する。
【０１０１】
本発明のｄｓＲＮＡを、ＨＰＶで感染した細胞を含む哺乳動物に投与するために、任意の方法を使用できる。例えば、投与は、局所(例えば、膣、経皮など)；経口；または非経腸(例えば、皮下、室内、筋肉内、または腹腔内注射、または静脈内点滴)であり得る。投与は急速であり得るか(例えば、注射)、または一定期間にわたり起こり得る(例えば、ゆっくりの輸液または遅延放出製剤の投与による)。
【０１０２】
典型的に、ＨＰＶで感染した細胞を有する哺乳動物を処置するとき、ｄｓＲＮＡ分子を局所的に膣ゲルまたはクリームで投与する。例えば、リポソーム有りまたは無しで製剤したｄｓＲＮＡは、子宮頚、肛門路または性器疣贅のようなＨＰＶ病巣に直接局所的に適用できる。局所投与のために、ｄｓＲＮＡ分子を、滅菌および非滅菌水性溶液、アルコールのような一般的溶媒中の非水性溶液、または液体または固体油基剤中の溶液のような組成物に製剤できる。このような溶液はまた緩衝剤、希釈剤、および他の適当な添加剤も含み得る。局所投与用組成物は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、坐薬、スプレー、液体、および粉末の形に製剤できる。ゲルおよびクリームは、当分野で既知のポリマーおよび透過剤(permeabilizer)を使用して製剤できる。ｄｓＲＮＡおよび関連する賦形剤を含むゲルまたはクリームは、子宮頚に子宮頚部キャップ、膣ペッサリー、被覆コンドーム、コンドーム(glove)などを使用して適用できる。慣用の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、濃化剤などを添加できる。
【０１０３】
非経腸、髄腔内、または室内投与のために、ｄｓＲＮＡ分子を、緩衝剤、希釈剤、および他の適当な添加剤(例えば、浸透促進剤、担体化合物、および他の薬学的に許容される担体)も含み得る滅菌水性溶液のような組成物として製剤できる。
【０１０４】
加えて、ｄｓＲＮＡ分子を、ＨＰＶ感染細胞を含む哺乳動物に、例えば、米国特許６,２７１,３５９に記載のような生物学的または非生物学的手段のような非ウイルス方法を使用して、投与できる。非生物学的送達は、限定しないが、(１)リポソームのここで提供したｄｓＲＮＡ酸分子での負荷および(２)核酸−脂質または核酸−リポソーム複合体形成のためのｄｓＲＮＡ分子と脂質またはリポソームとの複合体化を含み、これに限定されない。リポソームは、インビトロで細胞のトランスフェクトに一般的に使用されるカチオン性および中性脂質から成り得る。カチオン性脂質は、負に荷電した核酸と複合体化(例えば、荷電関連)し、リポソームを形成できる。カチオン性リポソームの例は、限定しないが、リポフェクチン、リポフェクタミン、リポフェクテース(lipofectace)、ＤＯＴＡＰ(１,２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン)、ＤＯＴＭＡ(Ｎ−[１,２(２,３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム)、ＤＯＳＰＡ(２,３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−[２−(スペルミンカルボキサミド)エチル]−Ｎ,Ｎ−ジ(dei)メチル−１−プロパンアミニウム)、ＤＯＧＳ(ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン)、およびＤＣ−コール(３,[Ｎ−Ｎ１,Ｎ−ジメチルエチレンジアミン)−カルバモイル]コレステロール)。
【０１０５】
リポソームの形成法は、当分野で既知である。リポソーム組成物を、例えば、ホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミンから形成できる。リポフェクチン.RTM. (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, Calif.)およびEffectene.TM. (Qiagen, Valencia, Calif.)を含む多くの親油性試薬が市販されている。加えて、全身送達方法を、ＤＤＡＢまたはＤＯＴＡＰのような市販のカチオン性脂質を使用して最適化でき、これら各々をＤＯＰＥまたはコレステロールのような中性脂質と混合できる。ある場合、Templeton et al. (Nature Biotechnology, 15:647-652(1997))に記載のようなリポソームを使用できる。他の態様において、ポリエチレンイミンのようなポリカチオンを使用して、インビボおよびエキソビボ送達を達成できる(Boletta et al., J. Am Soc. Nephrol. 7:1728(1996))。核酸送達のためのリポソームの使用についてのさらなる情報は、米国特許６,２７１,３５９、ＰＣＴ公報ＷＯ９６／４０９６４およびMorrissey, D. et al. 2005. Nat Biotechnol. 23(8):1002-7に見ることができる。
【０１０６】
ＨＰＶ感染細胞を含む哺乳動物にｄｓＲＮＡ分子を投与する他の非ウイルス方法は、リポプレックスおよびナノエマルジョンのようなカチオン性脂質−ベースの送達系(リポソームに加えて)を含む。さらに、キトサン、ポリ(Ｌ−リシン)(ＰＬＬ)、ポリエチレンイミン(ＰＥＩ)、デンドリマー(例えば、ポリアミドアミン(ＰＡＮＡＭ)デンドリマー)、およびポロキサミンを含み、これに限定されない縮合重合送達系(すなわち、ＤＮＡ−ポリマー複合体、または“ポリプレックス”)を使用し得る。さらに、ポロキサマー、ゼラチン、ＰＬＧＡ(ポリ乳酸−コ−グリコール酸)、ＰＶＰ(ポリビニルピロリドン)、およびＰＶＡ(ｐｏｌｙビニルアルコール)を含み、これに限定されない非縮合重合送達系を使用し得る。
【０１０７】
上記送達または投与技術は当分野で既知である。例えば、縮合重合送達系は、アニオン性ＤＮＡ分子と容易な縮合により働く；例えば、ポリ(Ｌ−リシン)(ＰＬＬ)は、負に荷電した細胞表面と相互作用し、続いて急速な内在化に付される正に荷電した複合体の形成により働く。
【０１０８】
生物学的送達は、限定しないが、ウイルスベクターの使用を含み、これに限定されない種々の方法で達成できる。例えば、ウイルスベクター(例えば、アデノウイルスおよびヘルペスウイルスベクター)は、ｄｓＲＮＡ分子を皮膚細胞および子宮頚部細胞に送達するために使用できる。標準分子生物学技術を使用して、１個以上のここで提供するｄｓＲＮＡを、以前に細胞への核酸送達のために開発された多くの様々なウイルスベクターの一つを使用して導入できる。これらの得られるウイルスベクターを使用して、１個以上のｄｓＲＮＡを、例えば、感染により細胞に送達できる。
【０１０９】
本発明のｄｓＲＮＡを、薬学的に許容される担体または希釈剤と製剤できる。“薬学的に許容される担体”(ここでは“賦形剤”とも呼ぶ)は、薬学的に許容される溶媒、懸濁化剤、または全ての他の薬理学的に不活性媒体である。薬学的に許容される担体は液体でも固体でもよく、望むバルク、粘稠度、および他の適切な輸送および化学特性を提供するために計画される投与方法と共に選択し得る。典型的薬学的に許容される担体は、例示であって、限定ではなく：水；食塩水溶液；結合剤(例えば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース)；増量剤(例えば、ラクトースおよび他の糖、ゼラチン、または硫酸カルシウム)；平滑剤(例えば、デンプン、ポリエチレングリコール、または酢酸ナトリウム)；崩壊剤(例えば、デンプンまたはナトリウムデンプングリコラート)；および湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)を含む。
【０１１０】
加えて、ＨＰＶ標的遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡは、他の分子、分子構造、または核酸混合物と混合した、カプセル化された、コンジュゲートした、または他の方法で関連したｄｓＲＮＡを含む組成物に製剤できる。例えば、Ｅ６ＡＰ遺伝子を標的とできる１個以上のｄｓＲＮＡ剤を含む組成物は、抗炎症剤(例えば、非ステロイド性抗炎症剤およびコルチコステロイド)および抗ウイルス剤(例えば、リバビリン(ribivirin)、ビダラビン、アシクロビル、およびガンシクロビル)のような他の治療剤を含み得る。ある態様において、組成物は、角質溶解剤と組み合わせた、ＨＰＶ標的遺伝子に配列相補性を有する１個以上のｄｓＲＮＡを含む。角質溶解剤は、表皮の角質層を分離するまたは軟化する薬剤である。角質溶解剤の例は、限定しないが、サリチル酸である。他の例は米国特許５,５４３,４１７に提供される。角質溶解剤は、ｄｓＲＮＡの、例えば、皮膚のような組織への浸透を高めるために有効な量で使用できる。例えば、角質溶解剤を、性器疣贅に適用したｄｓＲＮＡを疣贅に浸透させる量で使用できる。
【０１１１】
このような化合物の毒性および治療的効果は、例えば、ＬＤ５０(集団の５０％に致死の量)およびＥＤ５０(集団の５０％に治療的有効量)を決定するための、細胞培養または実験動物における標準医薬法により決定できる。毒性および治療的効果の用量比は治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表し得る。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
【０１１２】
細胞培養アッセイおよび動物試験で得たデータを、ヒトで使用するための投与量の範囲の計算に使用できる。本発明の組成物の投与量は、一般に、ほとんどまたは全く毒性がないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内に入る。投与量は、用いる投与形態および利用する投与経路によって、この範囲内で変わり得る。本発明の方法で使用する全ての化合物について、治療的有効量は、最初細胞培養アッセイから概算できる。この用量を動物モデルに公式化し、細胞培養で決定したＩＣ５０(すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する化合物濃度)を含む、化合物または、適当であれば、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲(例えば、ポリペプチドの濃度低下を達成する)を達成し得る。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定できる。血漿濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定できる。
【０１１３】
上記のような、１個または複数個でのそれらの投与に加えて、本発明のｄｓＲＮＡはＨＰＶ感染が仲介する病理学的過程の処置に有効な他の既知の薬剤と組み合わせて投与できる。いずれにしても、投与する医師は、当分野で既知のまたはここに記載の効果の標準測定を使用して観察される結果に基づいて、ｄｓＲＮＡ投与の量およびタイミングを調節できる。
【０１１４】
ｄｓＲＮＡの組合せは、好ましい一つのｄｓＲＮＡの同定に用いるのと同じ方法を使用して、インビトロおよびインビボで試験できる。このような組合せは、純粋に広範囲の遺伝子型をカバーする最小量のｓｉＲＮＡを選択するバイオインフォマティクスベースで選択できる。あるいは、このような組合せを、一ｄｓＲＮＡ剤についてここに記載のものに沿ったインビトロまたはインビボ評価に基づいて選択できる。ｄｓＲＮＡの組合せを試験するための好ましいアッセイは、ＨＰＶ１６陽性癌細胞株におけるｓｉＲＮＡ仲介ＨＰＶ標的ノックダウンの表現型結果(例えば例えば、Hengstermann et al. (2005)Journal Vir. 79(14):9296;およびButz et al. (2003)Oncogene 22:5938に記載のようなSiHaまたはCaski)、または例えば、Jeon et al. (1995)Journal Vir. 69(5):2989に記載のような器官型培養系の評価である。
【０１１５】
本発明者らは、ＨＰＶ感染の処置に使用し得るｄｓＲＮＡのある種の好ましい組合せを同定している。最も一般的な観点で、ｄｓＲＮＡの組合せは、表１、表３、表５および表７から選択される１個を超えるｄｓＲＮＡを含む。故に、本発明は、組合せ治療における表１、表３、表５および表７から選択される２個、３個、４個、５個またはそれ以上のｄｓＲＮＡ二本鎖の使用を意図する。原則として、治療的産物の単純さのために最小数のｄｓＲＮＡが好ましい。これは、有害なまたは有害な可能性のあるＨＰＶ遺伝子型の最大数をカバーするｄｓＲＮＡの選択を強い、実際必ずしも全てのこのようなＨＰＶ遺伝子型をカバーしない組合せの選択を正当とし得る。
【０１１６】
以下のｄｓＲＮＡが特に組合せやすい：
Ｅ１から：ＮＤ−９０７２；ＮＤ−９１４２；ＮＤ−９０９２；ＮＤ−９１６２；ＮＤ−９０９７；ＮＤ−９１６７；ＮＤ−９０６６；ＮＤ−９１２３；ＡＬ−ＤＰ−８０８２；ＡＬ−ＤＰ−８０９５；
Ｅ６から：ＮＤ−８９０３；ＮＤ−８９９１；ＮＤ−８９１４；ＮＤ−９００２；ＮＤ−８９０６；ＮＤ−８９９４；ＮＤ−８９４３；ＮＤ−９０３１；ＮＤ−９０３２；ＮＤ−８９２０；ＮＤ−８９５２；ＮＤ−８９５１；ＮＤ−９００８；ＮＤ−９０４０；ＮＤ−９０３９；ＡＬ−ＤＰ−７７８３；ＡＬ−ＤＰ−７７８４；
Ｅ６ＡＰから：ＡＬ−ＤＰ−７３６５；ＡＬ−ＤＰ−７３７１；ＡＬ−ＤＰ−７４９９；ＡＬ−ＤＰ−７５４５；ＡＬ−ＤＰ−７４９２；ＡＬ−ＤＰ−７４７３；ＡＬ−ＤＰ−７４７８；ＡＬ−ＤＰ−７５５４；ＡＬ−ＤＰ−７５１４；ＡＬ−ＤＰ−７３９７、ＮＤ−９３００。
【０１１７】
ＨＰＶ感染が原因の疾患の処置方法
ここに記載の方法および組成物は、臨床的または無症状性パピローマウイルス感染の結果であり得る、ヒトパピローマウイルスが原因の疾患および状態の処置に使用できる。“ＨＰＶ関連障害”または“ＨＰＶ感染が仲介する病理学的過程”とここで呼ぶこともあるこのような疾患および状態は、例えば、上皮性悪性物、皮膚癌(非黒色腫または黒色腫)、子宮頚部癌のような肛門性器悪性物、ＨＰＶ関連前癌病変(ＬＳＩＬまたはＨＳＩＬ子宮頚部組織を含む)、肛門癌腫、悪性病巣、良性病巣、パピローマ癌腫、乳頭腺嚢腫、パピローマ神経障害(neuropathicum)、乳頭腫、皮膚および粘膜パピローマ、コンジローマ、線維芽細胞腫瘍、およびパピローマウイルスと関連する他の病的状態を含む。
【０１１８】
例えば、ここに記載の組成物は、ＨＰＶが原因の疣贅の処置に使用できる。このような疣贅は、例えば、一般的疣贅(尋常性疣贅)、例えば、手掌、足底、および爪周囲疣贅；扁平および糸状疣贅；肛門、口、咽頭、喉頭、および舌パピローマ；および、ＨＰＶ感染の最も重篤な所見の一つである性器疣贅としても既知の性器の疣贅(condyloma accuminata)(例えば、陰茎、外陰、膣および子宮頚部疣贅)を含む。ＨＰＶ  ＤＮＡは、全グレードの子宮頚部上皮内腫瘍(ＣＩＮ  Ｉ−III)に見ることができ、ＨＰＶタイプの特異的サブセットは、子宮頚の上皮内癌腫でみられ得る。結果として、特異的ＨＰＶタイプを含む性器疣贅を有する女性は、子宮頚部癌の発症のリスクが高いと見なされる。
【０１１９】
パピローマウイルス感染と関連する最も一般的な疾患は良性皮膚疣贅、または一般的疣贅である。一般的疣贅は、一般にＨＰＶタイプ１、２、３、４または１０を含む。パピローマウイルスが原因の他の状態は、例えば、喉頭の良性上皮性腫瘍である喉頭パピローマを含む。２種のパピローマウイルスタイプ、ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１が、最も一般的に喉頭パピローマと関連する。ここに記載の組成物はこれらの疾患および状態の処置に使用できる。
【０１２０】
ここに記載の組成物は、また、小さい赤みがかった斑点として出現する散在性の扁平疣贅により特徴付けられる稀な遺伝学的疾患である疣贅状表皮発育異常症(ＥＶ)の処置にも使用できる。
【０１２１】
加えて、ここに記載の組成物は、ＨＰＶが病原因子である細胞形質転換に由来する病巣の処置に、例えば、子宮頚部癌の処置に使用できる。
【０１２２】
ここに記載の組成物は、またＨＰＶ誘発異形成、例えば、陰茎、外陰、子宮頚部、膣、口部、肛門、および咽頭異形成の処置に、およびＨＰＶ誘発癌、例えば、陰茎、外陰、子宮頚部、膣、肛門、口部、咽頭、および頭頚部癌の処置にも使用できる。
【０１２３】
本発明はまた、任意の慣用の化学療法剤のような他の抗癌化学療法剤と組み合わせた特定のｄｓＲＮＡを含むことにより、実施できる。特異的結合剤とこのような他の薬剤の組合せは、化学療法的プロトコールを増強し得る。多くの化学療法的プロトコールが、本発明の方法に取りこむことができるとして、それら自体当業者の心に浮かぶであろう。アルキル化剤、代謝拮抗剤、ホルモンおよびアンタゴニスト、放射性同位体、ならびに天然産物を含む、任意の化学療法剤を使用できる。例えば、本発明の化合物を、ドキソルビシンおよび他のアントラサイクリンアナログのような抗生物質、シクロホスファミドのような窒素マスタード、５−フルオロウラシルのようなピリミジンアナログ、シスプラチン、ヒドロキシウレア、タキソールおよびその天然および合成誘導体などと投与できる。他の例として、腫瘍がゴナドトロピン依存性およびゴナドトロピン非依存性細胞を含む乳房の腺癌のような混合型腫瘍の場合、本化合物をリュープロリドまたはゴセレリン(ＬＨ−ＲＨの合成ペプチドアナログ)と組み合わせて投与できる。他の抗新生物プロトコールは、例えば、手術、放射線などのような他の治療モダリティとのテトラサイクリン化合物の使用は、ここで、“補助抗新生物モダリティ”とも呼ぶ。故に、本発明の方法は、副作用の軽減および効果の増強の利益を伴い、このような慣用のレジメンと共に用い得る。
【０１２４】
さらなる代替として、ｄｓＲＮＡターゲティングＥ６ＡＰを、神経学および行動障害の処置に用い得る。Ｅ６ＡＰは、アンジェルマン症候群を有する患者におけるＥ６ＡＰ変異の同定を介して神経学および行動障害に結びつけられている。アンジェルマン症候群(ＡＳ)は、精神遅滞、言葉の欠乏、過剰な笑い、発作、失調、および特徴的ＥＥＧパターンにより特徴付けられるインプリントされた(imprinted)神経行動学的障害である。(Hitchins, M.P. et al. 2004.  Am J Med Genet A. 125(2):167-72.)恐らく、このような状態を誘発することは処置の意図ではない；むしろ、多くの遺伝的欠損において観察されるとおり、Ｅ６ＡＰが神経学および行動状態に重要な役割を有するとのこの証拠は、この標的がヒト病状において種々の役割を有し得て、Ｅ６ＡＰの沈黙が他の他の生化学欠損または疾患を補うであろうこのクラスの他の疾患の適切な標的である可能性を示す。ここで使用される“Ｅ６ＡＰ関連障害”は、上記およびのＨＰＶ関連障害および他の神経学および行動障害を含む。
【０１２５】
Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現の阻害方法
さらに他の局面において、本発明は、哺乳動物におけるＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、標的Ｅ６ＡＰ遺伝子の発現が沈黙するように、哺乳動物に本発明の表１の組成物を投与することを含む。それらの高い特異性のため、このような本発明のｄｓＲＮＡは、標的Ｅ６ＡＰ遺伝子のＲＮＡ(一次または加工)を特異的に標的とする。このようなｄｓＲＮＡを使用したこれらのＥ６ＡＰ遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法は、本明細書に記載の通り実施できる。
【０１２６】
一つの態様において、本方法は、ｄｓＲＮＡを含む組成物を投与することを含み、ここで、該ｄｓＲＮＡは、処置すべき哺乳動物のＥ６ＡＰ遺伝子のＲＮＡトランスクリプトの少なくとも一部に相補性であるヌクレオチド配列を含む。処置すべき生物がヒトのような哺乳動物であるとき、本組成物を、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道(エアロゾル)、経鼻、直腸、膣および局所(バッカルおよび舌下を含む)投与を含む経口または非経腸経路を含みこれに限定されない当分野で既知の任意の手段により投与し得る。好ましい態様において、本組成物を局所／膣投与または静脈内輸液または注射により投与する。
【０１２７】
他に定義しない限り、すべての技術用語よび科学用語は、本発明が属する分野の当業者に共通して理解されているのと同じ意味を有する。ここに記載のものに類似したまたは同等な方法および材料を本発明の実施または試験に使用できるが、適当な方法および材料は以下に記載する。ここに記載のすべての刊行物、特許出願、特許、および他の引用文献は、その全体を引用により本明細書に包含させる。矛盾がある場合は、定義を含めて本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は単に説明であり、限定すると意図すべきでない。
【実施例】
【０１２８】
Ｅ６ＡＰ遺伝子の遺伝子歩行
ｓｉＲＮＡ設計を、ヒトユビキチンタンパク質リガーゼＥ３Ａ(ｕｂｅ３Ａ、Ｅ６ＡＰとも呼ぶ)を標的とするｓｉＲＮＡを同定するために行った。種々のアイソフォーム(NM_130838.1、NM_130839.1、NM_000462.2)を表すＥ６ＡＰに対するヒトｍＲＮＡ配列を使用した。
【０１２９】
BioEditソフトウエアのClustalW multiple alignment function(Thompson J.D., et al., 核酸 Res. 1994, 22:4673)を全ヒトＥ６ＡＰアイソフォームで使用して、ｍＲＮＡ配列NM_130838.1を最短配列として同定し、ならびに全Ｅ６ＡＰアイソフォームの効率的ターゲティングに必要な、参照配列の５〜４４９１位(末端位置)から保存されている配列を確認した。
【０１３０】
Ｅ６ＡＰ参照配列にわたるNM_130838.1全ての可能な重複１９量体(ｓｉＲＮセンス鎖配列を示す)を同定し、４４７３個の１９量体候補配列を同定した。合わせて、これらの候補標的配列はＥ６ＡＰ  ｍＲＮＡの５'ＵＴＲ、コードおよび３'ＵＴＲドメイン、およびこれらのドメインの接合部をカバーする。
【０１３１】
候補のプールからｓｉＲＮＡをランク付けおよび選択するために、無関係標的との相互作用の予測潜在性(オフターゲット潜在性)を、ランキングパラメータとして取った。低オフターゲット潜在性のｓｉＲＮＡを好ましいとして定義し、インビボでより特異的であると仮定した。
【０１３２】
ｓｉＲＮＡ特異的オフターゲット潜在性を予測するために、以下の仮説を立てた：
１)  鎖(シード領域)の２〜９位(５'から３'に計数)における標的遺伝子への相補性は、その鎖と、標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡの相互作用および続く下方制御に十分である(Jackson AL, et al. Nat Biotechnol. 2003 Jun;21(6):635-7)
２)  各鎖の１位および１９位はオフターゲット相互作用に無関係である
３)  シード領域は、配列の残りよりもよりオフターゲット潜在性に関与し得る
４)  鎖の開裂部位領域１０位および１１位(５'から３'に計数)は、開裂部位への配列３'(非シード領域)よりもオフターゲット潜在性に関与し得るが、シード領域ほどではない
５)  オフターゲットコアは、仮説１〜４を考慮しながら、ｓｉＲＮＡ鎖配列の遺伝子の配列への相補性およびミスマッチ位置に基づいて各遺伝子および各鎖で計算できる
６)  導入された内部修飾によりセンス鎖活性が無くなる可能性を考慮して、アンチセンス鎖のオフターゲット潜在性のみが関連する
７)  ｓｉＲＮＡのオフターゲット潜在性は、我々の基準で最高の相同性を示す遺伝子(最良オフターゲット遺伝子)から推論でき、故に、それぞれの遺伝子のオフターゲットコアにより示すことができる
【０１３３】
潜在性オフターゲット遺伝子を同定するために、１９量体アンチセンス配列を、公的に利用可能なヒトｍＲＮＡ配列に対する相同性サーチに付した。この目的で、fastA(version 3.4)試験を、全１９量体候補アンチセンス配列で、ヒトRefSeqデータベースに対して行った。パール・スクリプトを使用して、候補１９量体配列からアンチセンス配列を作成した(パール・スクリプト２)。fastA試験を、１９量体の完全長にわたる相同性を考慮に入れるため、およびアウトプットを次工程のスクリプト解析に適当な形にするために、パラメータ／値ペア  −ｇ  ３０  −ｆ  ３０  −Ｌ  −ｉ  −Ｈで行った。本試験は、候補ｓｉＲＮＡについて潜在性オフターゲット遺伝子のリストをもたらした。
【０１３４】
さらに、fastA試験パラメータを、完全１９量体長の相同性を示しながら、fastAアウトプットファイルに非常に移されそうである、１９量体センス鎖配列と同一の８個以上の連続核酸塩基のデータベースエントリーを作るために、値  −Ｅ  １５０００で行った(仮説１参照)。
【０１３５】
最良オフターゲット遺伝子およびそのオフターゲットコアを同定するために、fastAアウトプットファイルを解析した。各１９量体インプット配列について以下のオフターゲット特性を、各潜在性オフターゲット遺伝子について抽出した：
シード領域中のミスマッチ数
非シード領域中のミスマッチの数
開裂部位領域中のミスマッチの数
【０１３６】
各オフターゲット遺伝子についてのオフターゲットコアを以下の通り計算した：
(シードミスマッチ数×１０)＋(開裂部位ミスマッチ数×１.２)＋非シードミスマッチ数
最低オフターゲットコアを、各インプット１９量体配列について抽出し、インプット１９量体配列に対応する全ｓｉＲＮＡについてのオフターゲットコアのリストをもたらすアウトプットファイルに連続的に書き出した。
【０１３７】
ｓｉＲＮＡのランキングを作成するために、オフターゲットコアを結果の表に挿入した。全ｓｉＲＮＡを、最後にオフターゲットコアについて下向きでソートし、一列で３個以上のＧを有する伸長を含む配列を選択から除外した。
【０１３８】
≧３のオフターゲットコアの１５６個のｓｉＲＮＡを選択し、合成した(表１)。
【表２】
2009531433.tif 000004
【表３】
2009531433.tif 000005
【表４】
2009531433.tif 000006
【表５】
2009531433.tif 000007
【表６】
2009531433.tif 000008
【０１３９】
ｄｓＲＮＡ合成
試薬供給源
ここで試薬の供給源を具体的に記載していないとき、このような試薬は、分子生物学における適用に標準的なる品質／純度での分子生物学用の試薬の任意の供給者から得ることができる。
【０１４０】
ｓｉＲＮＡ合成
一本鎖ＲＮＡを、１μmole規模で、Expedite 8909合成装置(Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Germany)および固体支持体として制御された多孔性ガラス(CPG, 500Å, Prオリゴ Biochemie GmbH, Hamburg, Germany)を使用して、固相合成により製造した。ＲＮＡおよび２'−Ｏ−メチルヌクレオチド含有ＲＮＡを、各々対応するホスホラミダイトおよび２'−Ｏ−メチルホスホラミダイトを用いる固相合成により製造した(Prオリゴ Biochemie GmbH, Hamburg, Germany)。これらの構成要素を、 Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載のような標準ヌクレオシドホスホラミダイト化学を使用して、オリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択部位に導入した。ホスホロチオエート結合を、ヨウ素酸化剤溶液を、Beaucage試薬(Chruachem Ltd, Glasgow, UK)のアセトニトリル(１％)溶液に置き換えることにより導入した。さらに、補助試薬をMallinckrodt Baker(Griesheim, Germany)から得た。
【０１４１】
脱保護および粗オリゴリボヌクレオチドのアニオン交換ＨＰＬＣによる精製を、確立された方法に従い行った。収率および濃度を、分光光度計(DU 640B, Beckman Coulter GmbH, Unterschleissheim, Germany)を使用して、２６０nmの波長で各ＲＮＡの溶液のＵＶ吸収を測定することにより決定した。二本鎖ＲＮＡを、アニーリング緩衝液(２０mM  リン酸ナトリウム、ｐＨ６.８；１００mM  塩化ナトリウム)中に相補性鎖の等モル量溶液を混合し、水浴で８５−９０℃で３分加熱し、３−４時間にわたり室温に冷却することにより製造した。アニールされたＲＮＡ溶液を使用するまで−２０℃で貯蔵した。
【０１４２】
３'−コレステロール−コンジュゲートｉＲＮＡｓ(ここで−コール−３'と呼ぶ)の合成のために、適当に修飾された固体支持体をＲＮＡ合成のために使用した。修飾固体支持体を以下の通り製造した：
ジエチル−２−アザブタン−１,４−ジカルボキシレートＡＡ
【化１】
2009531433.tif 000009
４.７Ｍ水酸化ナトリウム水溶液(５０mL)を、撹拌し、氷冷しているエチルグリシネートヒドロクロライド(３２.１９ｇ、０.２３mole)の水(５０mL)溶液に添加した。次いで、アクリル酸エチル(２３.１ｇ、０.２３mole)を添加し、混合物を室温で反応の完了がＴＬＣで確認されるまで撹拌した。１９時間後、溶液をジクロロメタン(３×１００mL)で分配した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣を蒸留して、ＡＡ(２８.８ｇ、６１％)を得た。
【０１４３】
３−{エトキシカルボニルメチル−[６−(９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル−アミノ)−ヘキサノイル]−アミノ}−プロピオン酸エチルエステルＡＢ
【化２】
2009531433.tif 000010
Ｆｍｏｃ−６−アミノ−ヘキサン酸(９.１２ｇ、２５.８３mmol)をジクロロメタン(５０mL)に溶解し、氷冷した。ジイソプロピルカルボジイミド(３.２５ｇ、３.９９mL、２５.８３mmol)を０℃で溶液に添加した。次いで、ジエチル−アザブタン−１,４−ジカルボキシレート(５ｇ、２４.６mmol)およびジメチルアミノピリジン(０.３０５ｇ、２.５mmol)を添加した。溶液を室温にし、さらに、６時間撹拌した。反応の完了がＴＬＣで撹拌された。反応混合物を真空下で濃縮し、酢酸エチルを添加して、ジイソプロピルウレアを沈殿させた。懸濁液を濾過した。濾液を５％水性塩酸、５％重炭酸ナトリウムおよび水で洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、粗産物を得て、それをカラムクロマトグラフィー(５０％ＥｔＯＡＣ／ヘキサン)で精製して、１１.８７ｇ(８８％)のＡＢを得た。
【０１４４】
３−[(６−アミノ−ヘキサノイル)−エトキシカルボニルメチル−アミノ]−プロピオン酸エチルエステルＡＣ
【化３】
2009531433.tif 000011
３−{エトキシカルボニルメチル−[６−(９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ)−ヘキサノイル]−アミノ}−プロピオン酸エチルエステルＡＢ(１１.５ｇ、２１.３mmol)を２０％ピペリジンのジメチルホルムアミド溶液に０℃で添加した。溶液を１時間撹拌し続けた。反応混合物を真空下で濃縮し、水を残渣に添加し、生成物を酢酸エチルで抽出した。粗生成物を、その塩酸塩の変換により精製した。
【０１４５】
３−({６−[１７−(１,５−ジメチル−ヘキシル)−１０,１３−ジメチル−２,３,４,７,８,９,１０,１１,１２,１３,１４,１５,１６,１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ[ａ]フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ]−ヘキサノイル}エトキシカルボニルメチル−アミノ)−プロピオン酸エチルエステルＡＤ
【化４】
2009531433.tif 000012
３−[(６−アミノ−ヘキサノイル)−エトキシカルボニルメチル−アミノ]−プロピオン酸エチルエステルＡＣ塩酸塩(４.７ｇ、１４.８mmol)をジクロロメタンに取り込んだ。懸濁液を氷上で０℃に冷却した。懸濁液にジイソプロピルエチルアミン(３.８７ｇ、５.２mL、３０mmol)を添加した。得られた溶液に、コレステリルクロロホルメート(６.６７５ｇ、１４.８mmol)を添加した。反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１０％塩酸で洗浄した。生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した(１０.３ｇ、９２％)。
【０１４６】
１−{６−[１７−(１,５−ジメチル−ヘキシル)−１０,１３−ジメチル−２,３,４,７,８,９,１０,１１,１２,１３,１４,１５,１６,１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ[ａ]フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ]−ヘキサノイル}−４−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エチルエステルＡＥ
【化５】
2009531433.tif 000013
カリウムｔ−ブトキシド(１.１ｇ、９.８mmol)を、３０mLの乾燥トルエンでスラリー化した。混合物を氷上で０℃に冷却し、５ｇ(６.６mmol)のジエステルＡＤを、撹拌しながら２０分以内にゆっくり添加した。温度を添加中５℃以下に保った。撹拌を３０分、０℃で続け、１mLの氷酢酸を添加し、直後に４ｇのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏの４０mLの水溶液を添加した。得られた混合物を２回各１００mLのジクロロメタンで抽出し、合わせた有機抽出物を２回各１０mLのリン酸緩衝液で洗浄し、乾燥させ、蒸発乾固した。残渣を６０mLのトルエンに溶解し、０℃に冷却し、３回５０mLずつの冷ｐＨ９.５炭酸緩衝液で抽出した。水性抽出物をリン酸でｐＨ３に合わせ、５回４０mLずつのクロロホルムで抽出し、それを合わせ、乾燥させ、蒸発乾固した。残渣を２５％酢酸エチル／ヘキサンを使用するカラムクロマトグラフィーで精製して、１.９ｇのｂ−ケトエステル(３９％)を得た。
【０１４７】
[６−(３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン−１−イル)−６−オキソ−ヘキシル]−カルバミン酸１７−(１,５−ジメチル−ヘキシル)−１０,１３−ジメチル−２,３,４,７,８,９,１０,１１,１２,１３,１４,１５,１６,１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ[ａ]フェナントレン−３−イルエステルＡＦ
【化６】
2009531433.tif 000014
メタノール(２mL)を、１時間にわたり、還流しているｂ−ケトエステルＡＥ(１.５ｇ、２.２mmol)および水素化ホウ素ナトリウム(０.２２６ｇ、６mmol)混合物のテトラヒドロフラン(１０mL)溶液に滴下した。撹拌を還流温度で１時間続けた。室温に冷却後、１Ｎ  ＨＣｌ(１２.５mL)を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した(３×４０mL)。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮して、生成物を得て、それをカラムクロマトグラフィー(１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３)で精製した(８９％)。
【０１４８】
(６−{３−[ビス−(４−メトキシ−フェニル)−フェニル−メトキシメチル]−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル}−６−オキソ−ヘキシル)−カルバミン酸１７−(１,５−ジメチル−ヘキシル)−１０,１３−ジメチル−２,３,４,７,８,９,１０,１１,１２,１３,１４,１５,１６,１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ[ａ]フェナントレン−３−イルエステルＡＧ
【化７】
2009531433.tif 000015
ジオールＡＦ(１.２５gm  １.９９４mmol)を、ピリジン(２×５mL)との真空での蒸発により乾燥させた。無水ピリジン(１０mL)および４,４'−ジメトキシトリチルクロライド(０.７２４ｇ、２.１３mmol)を撹拌しながら添加した。反応を室温で一晩行った。反応をメタノール添加によりクエンチした。反応混合物を真空下で濃縮し、残渣にジクロロメタン(５０mL)を添加した。有機層を１Ｍ  水性重炭酸ナトリウムで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残留ピリジンをトルエンとの蒸発により除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー(２％ＭｅＯＨ／クロロホルム、５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３中Ｒｆ＝０.５)で精製した(１.７５ｇ、９５％)。
【０１４９】
コハク酸モノ−(４−[ビス−(４−メトキシ−フェニル)−フェニル−メトキシメチル]−１−{６−[１７−(１,５−ジメチル−ヘキシル)−１０,１３−ジメチル２,３,４,７,８,９,１０,１１,１２,１３,１４,１５,１６,１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ[ａ]フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ]−ヘキサノイル}−ピロリジン−３−イル)エステルＡＨ
【化８】
2009531433.tif 000016
化合物ＡＧ(１.０ｇ、１.０５mmol)をコハク無水物(０.１５０ｇ、１.５mmol)およびＤＭＡＰ(０.０７３ｇ、０.６mmol)と混合し、４０℃で一晩撹拌した。混合物を無水ジクロロエタン(３mL)に溶解し、トリエチルアミン(０.３１８ｇ、０.４４０mL、３.１５mmol)を添加し、溶液を室温でアルゴン雰囲気下１６時間撹拌した。次いでそれをジクロロメタン(４０mL)で希釈し、氷冷水性クエン酸(５ｗｔ％、３０mL)および水(２×２０mL)で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮乾固した。残渣を次工程にそのまま使用した。
【０１５０】
コレステロール誘導耐化ＣＰＧ  ＡＩ
【化９】
2009531433.tif 000017
スクシネートＡＨ(０.２５４ｇ、０.２４２mmol)をジクロロメタン／アセトニトリル(３：２、３mL)混合淵に溶解した。その溶液に、ＤＭＡＰ(０.０２９６ｇ、０.２４２mmol)のアセトニトリル(１.２５mL)溶液、２,２'−ジチオ−ビス(５−ニトロピリジン)(０.０７５ｇ、０.２４２mmol)のアセトニトリル／ジクロロエタン(３：１、１.２５mL)溶液を連続的に添加した。得られた溶液に、トリフェニルホスフィン(０.０６４ｇ、０.２４２mmol)のアセトニトリル(０.６ml)溶液を添加した。反応混合物は明オレンジ色に変わった。溶液をリスト・アクション・シェーカー(５分)で短く撹拌した。長鎖アルキルアミン−ＣＰＧ(ＬＣＡＡ−ＣＰＧ)(１.５ｇ、６１mM)を添加した。懸濁液を２時間撹拌した。ＣＰＧを焼結漏斗を通して濾過し、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびエーテルで連続的に洗浄した。未反応アミノ基を酢酸無水物／ピリジンを使用してマスクした。達成されたＣＰＧの負荷を、ＵＶ測定(３７mM／ｇ)を取ることにより測定した。
【０１５１】
５'−１２−ドデカン酸ビスデシルアミド基を担持するｓｉＲＮＡ(ここで“５'−Ｃ３２−”とも呼ぶ)または５'−コレステリル誘導体基(ここで“５'−コール−”とも呼ぶ)の合成を、コレステリル誘導体について、核酸オリゴ量体の５'末端にホスホロチオエート結合を導入するためにBeaucage試薬を使用して酸化工程を行った以外、ＷＯ２００４／０６５６０１に記載の通り実施した。
【０１５２】
ｄｓＲＮＡ発現ベクター
本発明の他の局面において、Ｅ６ＡＰ遺伝子発現活性を調節するＥ６ＡＰ特異的ｄｓＲＮＡ分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現される(例えば、Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10;Skillern, A., et al.、国際ＰＣＴ公報ＷＯ００／２２１１３、Conrad、国際ＰＣＴ公報ＷＯ００／２２１１４、およびConrad、米国特許６,０５４,２９９参照)。これらの導入遺伝子は、直鎖状構築物、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入でき、これは、宿主ゲノムに組み込まれた導入遺伝子として、組み込まれ遺伝し得る。導入遺伝子はまたそれが染色体外プラスミドとして遺伝されるようにも構築できる(Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1995)92:1292)。
【０１５３】
ｄｓＲＮＡの個々の鎖は、２個の別々の発現ベクター上のプロモーターにより転写され、標的細胞に共トランスフェクトされ得る。あるいはｄｓＲＮＡの各個々の鎖は、両方共が同じ発現プラスミド上に位置するプロモーターにより転写できる。好ましい態様において、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡが幹およびループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列により接続された逆方向反復として発現される。
【０１５４】
組み換えｄｓＲＮＡ発現ベクターは、一般にＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。ｄｓＲＮＡ発現ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス(レビューのために、Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992)158:97-129)参照)；アデノウイルス(例えば、Berkner, et al., BioTechniques(1998)6:616), Rosenfeld et al. (1991, Science 252:431-434), およびRosenfeld et al. (1992), Cell 68:143-155)参照)；またはアルファウイルスならびに当分野で既知のその他を含み、これに限定されないウイルスに基づいて構築できる。レトロウイルスは、種々の遺伝子を、上皮性細胞を含む多くの異なる細胞タイプに、インビトロおよび／またはインビボで導入するのに使用されている(例えば、Eglitis, et al., Science (1985) 230:1395-1398; Danos and Mulligan, Proc. NatI. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al., 1990, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 87:61416145; Huber et al., 1991, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al., 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem. et al., 1992, Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89:7640-19 ; Kay et al., 1992, Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al., 1992, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al., 1993, J. Immunol. 150:4104-4115；米国特許４,８６８,１１６；米国特許４,９８０,２８６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５；およびＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３参照)。細胞のゲノムに挿入された遺伝子を形質導入および発現できる組み換えレトロウイルスベクターは、組み換えレトロウイルスゲノムを、ＰＡ３１７およびＰｓｉ−ＣＲＩＰのような適当なパッケージング細胞株にトランスフェクトすることにより製造できる(Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349)。組み換えアデノウイルスベクターは、感受性宿主における細胞および組織の広範な細胞の感染に使用でき(例えば、ラット、ハムスター、イヌ、およびチンパンジー)(Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166:769)、そしてまた感染のために有糸分裂的に活性な細胞を必要としない利点も有する。
【０１５５】
本発明のＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターいずれかにおけるｄｓＲＮＡ発現を駆動するプロモーターは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ(例えばリボソームＲＮＡプロモーター)、ＲＮＡポリメラーゼII(例えばＣＭＶ早期プロモーターまたはアクチンプロモーターまたはＵ１  ｓｎＲＮＡプロモーター)または一般にＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーター(例えばＵ６  ｓｎＲＮＡまたは７ＳＫ  ＲＮＡプロモーター)または原核生物プロモーター、例えばＴ７プロモーターである(ただし、発現プラスミドはまたＴ７プロモーターからの転写に必要なＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの発現もコードする)。プロモーターはまた、膵臓への導入遺伝子発現も指示できる(例えば膵臓へのインスリン制御配列(Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511-2515)参照)。
【０１５６】
加えて、導入遺伝子発現は、例えば、ある種の生理学的制御因子、例えば、循環しているグルコースレベル、またはホルモンに感受性の制御配列のような誘導性制御配列および発現系により、厳密に制御できる(Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24)。細胞または哺乳動物における導入遺伝子発現の制御に適当なこのような誘導性発現系は、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学インデューサー、およびイソプロピル−ベータ−Ｄ１−チオガラクトピラノシド(ＥＰＴＧ)による制御を含む。当業者は、ｄｓＲＮＡ導入遺伝子の意図される使用に基づき適当な制御／プロモーター配列を選択できる。
【０１５７】
一般に、ｄｓＲＮＡ分子の発現ができる組み換えベクターを以下のように送達し標的細胞に存続させる。あるいは、ウイルスベクターを、ｄｓＲＮＡ分子の一過性発現を提供するように使用できる。このようなベクターは、必要に応じて反復投与し得る。発現したら、ｄｓＲＮＡは標的ＲＮＡに結合し、その機能または発現を調節する。ｄｓＲＮＡ発現ベクターの送達は、静脈内または筋肉内投与、患者から外植した標的細胞への投与とその後の患者への再導入、または望む標的細胞への導入を可能にする他の任意の手段によるように全身的であり得る。
【０１５８】
ｄｓＲＮＡ発現ＤＮＡプラスミドは、典型的にカチオン性脂質担体(例えばオリゴフェクタミン)または非カチオン性脂質−ベースの担体(例えばＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯＴＭ)と複合して標的細胞にトランスフェクトする。１週間以上の期間にわたる、一Ｅ６ＡＰ遺伝子または複数Ｅ６ＡＰ遺伝子の種々の領域を標的とするｄｓＲＮＡ仲介ノックダウンのための複数脂質トランスフェクションも本発明により意図される。本発明のベクターの宿主細胞への成功する導入は、種々の既知の方法を使用してモニターできる。例えば、一過性トランスフェクションは、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)のような蛍光マーカーのようなレポーターと共に表示される。エキソビボ細胞の安定なトランスフェクションは、特異的環境因子(例えば、抗生物質および医薬)に対する耐性、例えばハイグロマイシンＢ耐性をトランスフェクト細胞に提供するマーカーを使用して確実にできる。
【０１５９】
Ｅ６ＡＰ特異的ｄｓＲＮＡ分子もまたベクターに導入でき、ヒト患者用遺伝子治療ベクターとして使用できる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与(米国特許５,３２８,４７０参照)または定位的注射(例えば、Chen et al. (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057)により対象に送達できる。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、遺伝子治療ベクターを許容される希釈剤内に含むか、または遺伝子送達媒体が包埋されている遅延放出マトリクスを含む。あるいは、完全遺伝子送達ベクターを、組み換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから無傷で製造でき、医薬製剤は、遺伝子送達系を産生する１個以上の細胞を含み得る。
【０１６０】
ＨＣＴ−１１６細胞でのＥ６ＡＰ  ｓｉＲＮＡスクリーニング
ＨＣＴ−１１６細胞をＤＳＭＺ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) (Braunschweig, Germany, cat. No. ACC 581)から得て、１０％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)、ペニシリン１００Ｕ／ml、ストレプトマイシン１００μg／mlおよび２mM  Ｌ−グルタミンを含むように補ったMcCoys(Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No. F1015)で、３７℃で５％ＣＯ２の雰囲気中、加湿インキュベーターで培養した。
【０１６１】
ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションのために、ＨＣＴ−１１６細胞を９６ウェルプレートに２.０×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、直接トランスフェクトした。ｓｉＲＮＡ(一用量スクリーンのために３０nMおよび３nM)のトランスフェクションを、製造者の指示に従ってリポフェクタミン２０００(Invitrogen)と共に行った。
【０１６２】
トランスフェクション２４時間後、ＨＣＴ−１１６細胞を溶解し、標準プロトコールに従ってＥ６ＡＰ  ｍＲＮＡ発現レベルをQuantigene Explore Kit(Panomics, Inc. (Fremont, CA)(以前Genospectra, Inc.))で定量した。Ｅ６ＡＰ  ｍＲＮＡレベルをＧＡＰ−ＤＨ  ｍＲＮＡに対して標準化した。各ｓｉＲＮＡについて、４個の独立したデータ点を集めた。Ｅ６ＡＰ遺伝子と無関係のｓｉＲＮＡ二本鎖をコントロールとして使用した。あるＥ６ＡＰ特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖の活性を、コントロールｓｉＲＮＡ二本鎖で処置した細胞のＥ６ＡＰ  ｍＲＮＡ濃度に対する処置細胞のＥ６ＡＰ  ｍＲＮＡ濃度％として示した。
【０１６３】
以下の表２は結果を示す。Ｅ６ＡＰ遺伝子を標的とする多くの活性ｓｉＲＮＡ分子が同定された。
【０１６４】
【表７】
2009531433.tif 000018
【表８】
2009531433.tif 000019
【表９】
2009531433.tif 000020
【表１０】
2009531433.tif 000021
【０１６５】
Ｅ６ＡＰを標的化する化学修飾したｄｓＲＮＡの試験
化学修飾したｄｓＲＮＡを、細胞におけるＥ６ＡＰをコードするｍＲＮＡの発現レベルを低下させる関連能力を同定するために試験した。ＨＣＴ−１１６細胞について上記のアッセイ条件を用いた。あるＥ６ＡＰ特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖の活性を、コントロールｓｉＲＮＡ二本鎖で処理した細胞におけるＥ６ＡＰ  ｍＲＮＡ濃度に対する処理細胞におけるＥ６ＡＰ  ｍＲＮＡ濃度％として示した。
【０１６６】
１. 化学修飾したｄｓＲＮＡ
以下の表３は、本発明のｄｓＲＮＡ組成物を示す。この表において、未修飾配列の後に、１個以上のヌクレオチド修飾を含む同じ配列に続く。
【０１６７】
【表１１】
2009531433.tif 000022
【表１２】
2009531433.tif 000023
【表１３】
2009531433.tif 000024
【表１４】
2009531433.tif 000025
【表１５】
2009531433.tif 000026
【表１６】
2009531433.tif 000027
【０１６８】
表４は、表３に記載のｄｓＲＮＡの試験結果を示す。
【表１７】
2009531433.tif 000028
【表１８】
2009531433.tif 000029
【表１９】
2009531433.tif 000030
【表２０】
2009531433.tif 000031
【表２１】
2009531433.tif 000032
【表２２】
2009531433.tif 000033
【０１６９】
ＨＰＶ  Ｅ１遺伝子発現を標的とするｓｉＲＮＡの設計
表５は、本発明のｄｓＲＮＡ組成物を示す。
【０１７０】
【表２３】
2009531433.tif 000034
【表２４】
2009531433.tif 000035
【表２５】
2009531433.tif 000036
【表２６】
2009531433.tif 000037
【表２７】
2009531433.tif 000038
【表２８】
2009531433.tif 000039
【表２９】
2009531433.tif 000040
【表３０】
2009531433.tif 000041
【０１７１】
ＨＰＶ  Ｅ１遺伝子発現を標的とするｓｉＲＮＡの試験
非修飾および化学修飾したｄｓＲＮＡを、細胞におけるＨＰＶ  Ｅ１遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現レベルを低下させる関連能力を同定するために試験した。
用いたアッセイ条件は以下の通りであった：Ｃ３３Ａ細胞をＡＴＣＣから得た。ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ１をコードする配列を、ＹＦＰ融合トランスクリプトとしての発現のために、ｐＮＡＳ−０５５ベクター(Husken et al,. Nucleic Acids Research, 31:e102, 2003)にクローン化した。得られたプラスミドを、Ｃ３３Ａ細胞にトランスフェクトし、これらの融合トランスクリプトを発現する安定な株を、製造者のプロトコール(Invitrogen)に従い、ゼオシンにより誘導させた。ＨＰＶ１６  Ｅ６またはＨＰＶ１６  Ｅ１に対するｓｉＲＮＡでのトランスフェクションのために、各細胞を、９６ウェルプレートに２.０×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、直接トランスフェクトした。製造者の指示に従ってｓｉＲＮＡのトランスフェクション(示す通り３０nM、３nMまたは３００pm)を、一用量としてリポフェクタミン２０００(登録商標)(Invitrogen)と共に行った。
【０１７２】
トランスフェクション２４時間後、細胞を溶解し、標準プロトコールに従って、融合ＹＦＰ  ｍＲＮＡ発現レベルQuantigene Explore Kit(Panomics, Inc. (Fremont, CA)(以前Genospectra, Inc.))で定量した。融合ＹＦＰ  ｍＲＮＡレベルをＧＡＰ−ＤＨ  ｍＲＮＡに対して標準化した。各ｓｉＲＮＡについて、４個の独立したデータ点を集めた。ＨＰＶ１６  Ｅ１またはＥ６遺伝子と無関係のｓｉＲＮＡ二本鎖をコントロールとして使用した。あるｓｉＲＮＡ二本鎖の活性を、コントロールｓｉＲＮＡ二本鎖で処理した細胞における融合ＹＦＰ  ｍＲＮＡ濃度に対する、処理細胞における同トランスクリプトの濃度％として示した。
表６は、本発明のＥ１  ｄｓＲＮＡの結果を示す。
【０１７３】
【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【０１７４】
ＨＰＶ  Ｅ６遺伝子発現を標的とするｄｓＲＮＡの設計
表７は本発明のｄｓＲＮＡ組成物を示す。
【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【０１７５】
ＨＰＶ  Ｅ６遺伝子発現を標的とするｓｉＲＮＡの試験
非修飾および化学修飾したｄｓＲＮＡを、細胞におけるＨＰＶ  Ｅ６遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現レベルを低下させる関連能力を同定するために試験した。
用いたアッセイ条件は以下の通りであった：Ｃ３３Ａ細胞をＡＴＣＣから得た。ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ１をコードする配列を、ＹＦＰ融合トランスクリプトとしての発現のために、ｐＮＡＳ−０５５ベクター(Husken et al,. Nucleic Acids Research, 31:e102, 2003)にクローン化した。得られたプラスミドを、Ｃ３３Ａ細胞にトランスフェクトし、これらの融合トランスクリプトを発現する安定な株を、製造者のプロトコール(Invitrogen)に従い、ゼオシンにより誘導させた。ＨＰＶ１６  Ｅ６またはＨＰＶ１６  Ｅ１に対するｓｉＲＮＡでのトランスフェクションのために、各細胞を、９６ウェルプレートに２.０×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、直接トランスフェクトした。製造者の指示に従ってｓｉＲＮＡのトランスフェクション(示す通り３０nM、３nMまたは３００pm)を、一用量としてリポフェクタミン２０００(登録商標)(Invitrogen)と共に行った。
【０１７６】
トランスフェクション２４時間後、細胞を溶解し、標準プロトコールに従って、融合ＹＦＰ  ｍＲＮＡ発現レベルQuantigene Explore Kit(Panomics, Inc. (Fremont, CA)(以前Genospectra, Inc.))で定量した。融合ＹＦＰ  ｍＲＮＡレベルをＧＡＰ−ＤＨ  ｍＲＮＡに対して標準化した。各ｓｉＲＮＡについて、４個の独立したデータ点を集めた。ＨＰＶ１６  Ｅ１またはＥ６遺伝子と無関係のｓｉＲＮＡ二本鎖をコントロールとして使用した。あるｓｉＲＮＡ二本鎖の活性を、コントロールｓｉＲＮＡ二本鎖で処理した細胞における融合ＹＦＰ  ｍＲＮＡ濃度に対する、処理細胞における同トランスクリプトの濃度％として示した。
表８は本発明のＥ６  ｄｓＲＮＡの結果を示す。
【０１７７】
【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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【表４９】
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【表５０】
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【０１７８】
当業者は、本明細書に具体的に明示した方法および組成物に加えて、本発明を添付の特許請求の範囲の完全な範囲まで実施することを可能とするであろう明示した方法および組成物を熟知している。
【国際調査報告】
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