(57)【要約】  本発明は、免疫関連障害を患っている対象において、抗炎症性サイトカイン産生細胞に向けてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節する方法に関する。本発明の方法は、それを必要とする対象の天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させるステップを含む。本発明は、免疫関連疾患を患っている対象を治療する方法にさらに関する。治療的組成物およびこれらの組成物を調製する方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫関連障害を患っている対象において抗炎症性サイトカイン産生細胞に向けてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節する方法であって、
前記対象中の天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させるステップを含み、前記調節が前記対象免疫系の少なくとも１つの構成要素によって媒介され、
前記対象中の天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させるステップが、
Ｉ．前記対象に、
ａ．β−糖脂質、
ｂ．少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、
ｃ．天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、および
ｄ．上記のあらゆる組み合わせ、
のいずれか１つの有効量を投与するステップ、または
ＩＩ．前記対象免疫系の少なくとも１つの構成要素を
ａ．β−糖脂質、
ｂ．少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、
ｃ．天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、および
ｄ．上記のあらゆる組み合わせ、
のいずれか１つの有効量に曝露するステップ、
または
ＩＩＩ．（Ｉ）および（ＩＩ）のあらゆる組み合わせ、
によって実施される、方法。
【請求項２】
前記β−糖脂質が、単糖類セラミド、グルコシルセラミド、ガラクトシルセラミド、ラクトシル−セラミド、ｇａｌ−ｇａｌ−グルコシル−セラミド、ＧＭ２ガングリオシド、ＧＭ３ガングリオシド、グロボシドまたはあらゆるその他のβ−糖脂質よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記β−糖脂質が、β−ラクトシル−セラミドおよびあらゆるそれらの類似体または誘導体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記β−糖脂質の前記混合物が、少なくとも２つのβ−糖脂質を１：１〜１：１０００の定量的比率で含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記β−糖脂質の前記混合物が、β−ラクトシル−セラミドおよび少なくとも１つのその他のβ−糖脂質を１：１〜１：１０００の定量的比率で含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記混合物が、β−グルコシルセラミドおよびβ−ラクトシル−セラミドを１：１〜１：１０００の定量的比率で含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記混合物が、β−グルコシルセラミドおよびβ−ラクトシル−セラミドを１：１０の定量的比率で含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記混合物が、体重１ｋｇあたり約０．５〜５ｍｇのβ−グルコシルセラミドおよび体重１ｋｇあたり約５〜５０ｍｇのβ−ラクトシル−セラミドを１：１０の定量的比率で含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記混合物が、体重１ｋｇあたり０．７５ｍｇのβ−グルコシルセラミドおよび体重１ｋｇあたり７．５ｍｇのβ−ラクトシル−セラミドを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象免疫系の前記構成要素が、細胞性免疫反応要素、体液性免疫反応要素、およびサイトカインよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞性免疫反応要素がＮＫＴ細胞の集団である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＮＫＴ細胞をβ−糖脂質、β−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外もしくは血清レベルを増大させる物質、またはあらゆるそれらの組み合わせのいずれか１つの有効量に曝露するステップが、
ａ．ＮＫＴ細胞を前記対象から、または非自己の対象から得るステップと、
ｂ．ステップ（ａ）で得られた前記ＮＫＴ細胞を生体外で教育して、得られた教育ＮＫＴ細胞がＴｈ２抗炎症性サイトカイン産生細胞に向けてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節するステップと、
ｃ．Ｔｈ２抗炎症性サイトカイン産生細胞に向けてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節するステップ（ｂ）で得られた前記教育ＮＫＴ細胞を前記対象に再導入し、調節がＩＬ４およびＩＬ１０のいずれか１つとＩＦＮγとの定量的比率の増大をもたらすステップと、によって実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）の前記ＮＫＴを前記生体外で教育するステップが、前記ＮＫＴ細胞を
ａ．β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、およびあらゆるそれらの組み合わせ、
ｂ．前記免疫関連障害と関連付けられている抗原またはあらゆるそれらの組み合わせ、
ｃ．前記免疫関連障害を患っている寛容化または非寛容化対象のまたは前記対象の少なくとも１つの肝臓関連細胞、
ｄ．サイトカイン、接着分子またはあらゆるそれらの組み合わせの少なくとも１つ、
ｅ．抗原提示細胞、および
ｆ．（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）のいずれかの組み合わせ、
のいずれか１つの存在下で培養することによって実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記教育ＮＫＴ細胞が前記対象に養子免疫伝達によって再導入される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
場合により前記対象に、
ａ．β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、およびあらゆるそれらの組み合わせ、
ｂ．前記免疫関連障害を患っている同種供与者、異種起源および自己起源のいずれか１つに由来する構成要素、細胞、組織および／または臓器、および免疫学的機能同等物、およびそれらの組み合わせ、および
ｃ．上記のあらゆる組み合わせ、
を投与するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記投与するステップが、経口、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、非経口、経皮、膣内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所、直腸または皮下投与、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫関連障害が、自己免疫疾患、悪性および非悪性増殖性障害、移植片拒絶病状、炎症性疾患、遺伝的疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、または寄生虫感染症のいずれか１つである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記悪性増殖性障害が、癌腫、肉腫、メラノーマ、白血病、およびリンパ腫よりなる群から選択される固形および非固形腫瘍のいずれか１つである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記悪性障害が、肝細胞癌、メラノーマ、結腸癌、骨髄腫、急性および慢性白血病のいずれか１つである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、糖尿病、喘息、急性および慢性移植片対宿主病、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性硬化症、非アルコール性脂肪性肝疾患、高脂血症、アテローム性動脈硬化、代謝症候群またはそれを構成するいずれかの疾患、肥満症、炎症性腸疾患、および免疫介在性肝炎のいずれか１つである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ａ．β−糖脂質、
ｂ．少なくとも２つの天然のβ−糖脂質混合物、
ｃ．天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、
ｄ．β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、およびあらゆるそれらの組み合わせのいずれか１つの有効量に前暴露した前記対象免疫系の少なくとも１つの構成要素、
ｅ．（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）のいずれか１つを含む組成物、
ｆ．（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）のあらゆる組み合わせ、
のいずれか１つの有効量を対象に投与するステップを含む、それを必要とする哺乳類対象において免疫関連障害を治療する方法。
【請求項２２】
前記β−糖脂質が、単糖類セラミド、グルコシルセラミド、ガラクトシルセラミド、ラクトシル−セラミド、ｇａｌ−ｇａｌ−グルコシル−セラミド、ＧＭ２ガングリオシド、ＧＭ３ガングリオシド、グロボシドまたはあらゆるその他のβ−糖脂質よりなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記β−糖脂質が、β−ラクトシル−セラミドおよびあらゆるそれらの類似体または誘導体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記β−糖脂質混合物が、少なくとも２つのβ−糖脂質を１：１〜１：１０００の定量的比率で含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記混合物が、β−ラクトシル−セラミドおよび少なくとも１つのその他のβ−糖脂質を１：１〜１：１０００の定量的比率で含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記混合物が、β−グルコシル−セラミドおよびβ−ラクトシル−セラミドを１：１〜１：１０００の定量的比率で含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記混合物が、β−グルコシルセラミドおよびβ−ラクトシル−セラミドを１：１０の定量的比率で含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記混合物が、体重１ｋｇあたり約０．５〜５ｍｇのβ−グルコシルセラミドおよび体重１ｋｇあたり約５〜５０ｍｇのβ−ラクトシル−セラミドを１：１０の定量的比率で含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記混合物が、体重１ｋｇあたり０．７５ｍｇのβ−グルコシルセラミドおよび体重１ｋｇあたり７．５ｍｇのβ−ラクトシル−セラミドを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象免疫系の前記構成要素が、細胞性免疫反応要素、体液性免疫反応要素、およびサイトカインよりなる群から選択される、請求項２１（ｄ）に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞性免疫反応要素がＮＫＴ細胞の集団である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＮＫＴ細胞がβ−糖脂質、β−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外もしくは血清レベルを増大させる物質、またはあらゆるそれらの組み合わせのいずれか１つの有効量に曝露され、前記細胞の曝露が、
ａ．ＮＫＴ細胞を前記対象から、または非自己の対象から得るステップと、
ｂ．ステップ（ａ）で得られたＮＫＴ細胞を生体外で教育して、得られた教育ＮＫＴ細胞が抗炎症性サイトカイン産生細胞に向けてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節するようにするステップと、
ｃ．Ｔｈ２抗炎症性サイトカイン産生細胞に向けてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節するステップ（ｂ）で得られた前記教育ＮＫＴ細胞を前記対象に再導入し、調節がＩＬ４およびＩＬ１０のいずれか１つとＩＦＮγとの定量的比率の増大をもたらすステップと、によって実施される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ｂ）の前記ＮＫＴを前記生体外で教育するステップが、
ａ．β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外もしくは血清レベルを増大させる物質、またはあらゆるそれらの組み合わせ、
ｂ．前記免疫関連障害と関連付けられている抗原またはあらゆるそれらの組み合わせ、
ｃ．前記免疫関連障害を患っている寛容化または非寛容化対象の、または前記対象の肝臓関連細胞の少なくとも１つ、
ｄ．サイトカイン、接着分子またはあらゆるそれらの組み合わせの少なくとも１つ、
ｅ．抗原提示細胞、および
ｆ．（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）のいずれかの組み合わせ、
のいずれか１つの存在下で前記ＮＫＴ細胞を培養することによって実施される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記教育ＮＫＴ細胞が養子免疫伝達によって前記対象に再導入される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
場合により、前記対象に、
ａ．β−糖脂質、β−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外もしくは血清レベルを増大させる物質、またはあらゆるそれらの組み合わせ、
ｂ．前記免疫関連障害を患っている同種供与者、異種起源、および自己起源のいずれか１つに由来する構成要素、細胞、組織および／または臓器、および免疫学的機能同等物、またはそれらの組み合わせ、および
ｃ．上記のあらゆる組み合わせ、
を投与するステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記投与するステップが、経口、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、非経口、経皮、膣内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所、直腸または皮下投与、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
前記免疫障害が、自己免疫疾患、悪性および非悪性増殖性障害、移植片拒絶病状、炎症性疾患、遺伝的疾患，細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、または寄生虫感染症のいずれか１つである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記悪性増殖性障害が、癌腫、肉腫、メラノーマ、白血病およびリンパ腫よりなる群から選択される固形および非固形腫瘍のいずれか１つである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記悪性障害が、肝細胞癌、結腸癌、骨髄腫、メラノーマ、急性および慢性白血病のいずれか１つである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、糖尿病、喘息、急性および慢性移植片対宿主病、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性硬化症、非アルコール性脂肪性肝疾患、高脂血症、アテローム性動脈硬化、代謝症候群のあらゆる一部、過体重、炎症性腸疾患、免疫介在性肝炎のいずれか１つである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ａ．β−糖脂質、
ｂ．少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、
ｃ．天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、
ｄ．β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外もしくは血清レベルを増大させる物質、またはあらゆるそれらの組み合わせのいずれか１つに前暴露した教育ＮＫＴ細胞、および
ｅ．（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）のあらゆる組み合わせ、
のいずれか１つの活性成分を含む、哺乳類対象において免疫関連障害を治療するための治療的な組成物。
【請求項４２】
場合により、
ａ．前記免疫関連障害と関連付けられている抗原、
ｂ．前記免疫関連障害を患っている寛容化または非寛容化対象の、または前記対象の肝臓関連細胞の少なくとも１つ、
ｃ．サイトカイン、接着分子またはあらゆるそれらの組み合わせの少なくとも１つ、
ｄ．抗原提示細胞、および
ｅ．（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）のいずれかの組み合わせ、
のいずれか１つをさらに含む、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記β−糖脂質が、単糖類セラミド、グルコシルセラミド、ガラクトシルセラミド、ラクトシル−セラミド、ｇａｌ−ｇａｌ−グルコシル−セラミド、ＧＭ２ガングリオシド、ＧＭ３ガングリオシド、グロボシド、およびあらゆるその他のβ−糖脂質よりなる群から選択される、請求項４１または４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記β−糖脂質が、β−ラクトシル−セラミドおよびあらゆるそれらの類似体または誘導体である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記β−糖脂質混合物が、少なくとも２つのβ−糖脂質を１：１〜１：１０００の定量的比率で含む、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４６】
前記混合物が、β−ラクトシル−セラミドおよび少なくとも１つのその他のβ−糖脂質を１：１〜１：１０００の定量的比率で含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記混合物が、β−グルコシル−セラミドおよびβ−ラクトシル−セラミドを１：１〜１：１０００の定量的比率で含む、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記混合物が、β−グルコシルセラミドおよびβ−ラクトシル−セラミドを１：１０の定量的比率で含む、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記混合物が、体重１ｋｇあたり約０．５〜５ｍｇのβ−グルコシルセラミドおよび体重１ｋｇあたり約５〜５０ｍｇのβ−ラクトシル−セラミドを１：１０の定量的比率で含む、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記混合物が、体重１ｋｇあたり０．７５ｍｇのβ−グルコシルセラミドおよび体重１ｋｇあたり７．５ｍｇのβ−ラクトシル−セラミドを含む、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記教育ＮＫＴ細胞が、Ｔｈ２抗炎症性サイトカイン産生細胞に向けてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節でき、前記教育ＮＫＴ細胞が、
ａ．β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外もしくは血清レベルを増大させる物質、またはあらゆるそれらの組み合わせ、
ｂ．前記免疫関連障害と関連付けられている抗原、
ｃ．前記免疫関連障害を患っている寛容化または非寛容化対象の、または前記対象の肝臓関連細胞の少なくとも１つ、
ｄ．サイトカイン、接着分子、およびあらゆるそれらの組み合わせの少なくとも１つ、
ｅ．抗原提示細胞、および
ｆ．（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）のいずれかの組み合わせ、
のいずれか１つの存在下で培養される、請求項４１または４２に記載の組成物。
【請求項５２】
前記免疫障害が、自己免疫疾患、悪性および非悪性増殖性障害、移植片拒絶病状、炎症性疾患、遺伝的疾患，細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、または寄生虫感染症のいずれか１つである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記悪性増殖性障害が、癌腫、肉腫、メラノーマ、白血病、およびリンパ腫よりなる群から選択される固形および非固形腫瘍のいずれか１つである、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記悪性障害が、肝細胞癌、メラノーマ、結腸癌、骨髄腫、急性および慢性白血病のいずれか１つである、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、糖尿病、喘息、急性および慢性移植片対宿主病、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性硬化症、非アルコール性脂肪性肝疾患、高脂血症、アテローム性動脈硬化、代謝症候群のあらゆる一部、過体重、炎症性腸疾患、免疫介在性肝炎のいずれか１つである、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５６】
免疫関連障害を治療する組成物の調製における、
ａ．β−糖脂質、
ｂ．少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、
ｃ．天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、
ｄ．β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外もしくは血清レベルを増大させる物質、またはあらゆるそれらの組み合わせのいずれか１つに前暴露した教育ＮＫＴ細胞、および
ｅ．（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のあらゆる組み合わせ、
のいずれか１つの治療的有効量の使用。
【請求項５７】
前記組成物が請求項４２〜５５のいずれか一項に記載される、請求項５６に記載の使用。
【請求項５８】
Ｉ．ａ．β−糖脂質、
ｂ．少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、
ｃ．天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、
ｄ．β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外もしくは血清レベルを増大させる物質、またはあらゆるそれらの組み合わせのいずれか１つに前暴露した教育ＮＫＴ細胞、および
ｅ．（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）のあらゆる組み合わせ、
のいずれか１つを含む免疫調節性化合物を提供するステップと、
ＩＩ．ステップ（ａ）で提供される前記免疫調節性化合物と薬学的に許容可能なキャリアとを混合するステップと、
を含む、それを必要とする対象において免疫関連障害を治療するための薬物を調製する方法。
【請求項５９】
ａ．β−糖脂質、
ｂ．少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、
ｃ．天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、
ｄ．β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外もしくは血清レベルを増大させる物質、またはあらゆるそれらの組み合わせのいずれか１つに前暴露した教育ＮＫＴ細胞、および
ｅ．（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のあらゆる組み合わせ、
のいずれか１つの免疫調節的有効量を活性成分として含む、Ｔｈ２抗炎症性サイトカイン産生細胞に向けてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節する組成物。
【請求項６０】
場合により、
ａ．前記免疫関連障害と関連付けられている抗原、
ｂ．前記免疫関連障害を患っている寛容化または非寛容化対象の、または前記対象の肝臓関連細胞の少なくとも１つ、
ｃ．サイトカイン、接着分子またはあらゆるそれらの組み合わせの少なくとも１つ、
ｄ．抗原提示細胞、および
ｅ．（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）のいずれかの組み合わせ、
のいずれか１つをさらに含む、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
前記β−糖脂質が、単糖類セラミド、グルコシルセラミド、ガラクトシルセラミド、ラクトシル−セラミド、ｇａｌ−ｇａｌ−グルコシル−セラミド、ＧＭ２ガングリオシド、ＧＭ３ガングリオシド、グロボシドおよびあらゆるその他のβ−糖脂質よりなる群から選択される、請求項５９または６０に記載の組成物。
【請求項６２】
前記β−糖脂質が、β−ラクトシル−セラミドおよびあらゆるそれらの類似体または誘導体である、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記β−糖脂質混合物が、少なくとも２つのβ−糖脂質を１：１〜１：１０００の定量的比率で含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６４】
前記混合物が、β−ラクトシル−セラミドおよび少なくとも１つのその他のβ−糖脂質を１：１〜１：１０００の定量的比率で含む、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記混合物が、β−グルコシル−セラミドおよびβ−ラクトシル−セラミドを１：１〜１：１０００の定量的比率で含む、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
前記混合物が、β−グルコシルセラミドおよびβ−ラクトシル−セラミドを１：１０の定量的比率で含む、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
前記混合物が、体重１ｋｇあたり約０．５〜５ｍｇのβ−グルコシルセラミドおよび体重１ｋｇあたり約５〜５０ｍｇのβ−ラクトシル−セラミドを１：１０の定量的比率で含む、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記混合物が、体重１ｋｇあたり０．７５ｍｇのβ−グルコシルセラミドおよび体重１ｋｇあたり７．５ｍｇのβ−ラクトシル−セラミドを含む、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
免疫関連障害を治療するための補助薬物としての請求項５９〜６８のいずれか一項に記載の免疫調節組成物の使用。
【請求項７０】
免疫関連障害に対するワクチンのためのアジュバントとしての請求項５９〜６８のいずれか一項に記載の免疫調節組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫調節物質としてのβ−糖脂質の使用に関する。より詳しくは、本発明は、免疫関連障害の治療のためのβ−糖脂質、好ましくはβ−ラクトシル−セラミド、β−グルコシルセラミド、β−ガラクトシル−セラミド、セラミド、および最も好ましくは、β−ラクトシル−セラミド、ならびにあらゆるそれらの混合物または組み合わせの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
免疫治療法は、調節不全免疫応答が荷担していると考えられる疾患過程と闘うために、様々な要素（サイトカイン、疾患関連抗原、および天然代謝産物）への免疫系構成要素の曝露を伴う。免疫調節不全は、様々な新生物性、炎症性、感染性、および遺伝的実体をはじめとする、多数の疾患過程の発病機序または疾患経過において重要な役割を果たすと考えられる。
【０００３】
これらの障害は、炎症促進性（Ｔｈ１）と抗炎症性（Ｔｈ２）サイトカインとの不均衡として認識でき、いくつかについて下述する。
【０００４】
炎症性腸疾患の発病機序における免疫系の役割
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、免疫応答のＴｈ１−炎症促進性サブタイプと、Ｔｈ２−抗炎症性サブタイプとの不均衡の結果であると認識できる一般的な胃腸障害である［Strober, W., et al., Immunol Today 18:61-64 (1997); Neurath, M., et al., J. Exp. Med. 183:2605-2616 (1996)］。
【０００５】
例えば自己免疫現象などのＩＢＤに伴ういくつかの腸外症状発現があり、免疫複合体は標的臓器障害に関与し、疾患を改善するためにグルココルチコイド、アザチオプリン、メトトレキサートおよびシクロスポリンなどの免疫抑制剤が使用される［Podolsky, D.K., et al., New Engl. J. Med., 325:928- 935(1991); Strober, W., et al., In Clinical Immunology, Mosby, St. Louis. R.R. Rich, Editor, 1401-14281-2 (1995)］。ＩＢＤがある患者は、結腸細胞構成要素およびいくつかの異なる細菌抗原に対する抗体を有する。これらの抗原は、上皮性損傷の帰結として免疫系へのアクセスを得る［Hibi, S., et al., Clin. Exp. Immunol. 54:163-168 (1983); Das, K.M., et al., Gastroenterology 98:464-69 (1990)］。同期間のアネルギーおよびＴ細胞刺激に対する応答性低減をはじめとするＴ細胞−媒介免疫の異常についてもまた、これらの患者において述べられている［Chiba, M., et al. Gut, 22:177-182 (1981); Raedler, A., et al., Clin. Exp. Immunol. 60:518-526 (1985)］。さらに粘膜ＩｇＧ細胞の濃度増大およびＴ細胞サブセットの変化をはじめとする粘膜細胞媒介免疫の変化が同定され、抗原刺激が示唆された［Dasgupta, A., et al., Gut 35:1712-17 (1994); Takahashi, F., et al., J. Clin. Invest. 76:311-318 (1985)］。感染性、免疫性、または中毒性障害後の標的抗原への曝露は粘膜免疫細胞の活性化をもたらし、粘膜炎症性応答をもたらすサイトカインにつながる［Neurath, M., et al., J. Exp. Med., 183:2605-2616 (1996)］。ＩＦＮγなどの炎症促進性サイトカインの分泌は、粘膜透過度の増大に寄与し、ＩＢＤの動物モデルで述べられている［Strober, W., et al., Immunol. Today 18:61-64. (1997)］。同様に、ＩＬ１およびＩＬ６によって媒介されるコラーゲン合成の増大が、これらの動物で検出できる［Strober, W., et al., ibid.］。Ｂａｌｂ／ＣマウスからＣＢ−１７重症複合免疫不全マウス中への正常なＣＤ４５ＲＢ  Ｔ細胞の養子免疫伝達によって、Ｔｈ１−媒介肉芽腫性結腸炎モデルが確立されている。ＣＤ４５ＲＢからのＣＤ４細胞をＣＤ４５ＲＢ集団と一緒に注射すると、疾患を予防することが示されている。この予防はＴＧＦβ１への抗体添加によって逆転できる［Sadlack, B., et al., Cell 75:253-261 (1993); Powrie, F., et al., Immunity 1:553-562 (1994)］。
【０００６】
炎症性腸疾患におけるＴｈ１／Ｔｈ２不均衡
ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球はどちらも、ＩＬ−２およびＩＦＮγを産生するＴｈ１細胞、またはＩＬ−４、およびＩＬ−１０を産生するＴｈ２細胞のどちらかとして分類できる。免疫系が異種および自己抗原に反応する様式は、２つの応答サブタイプ間の均衡の結果である[Weiner， H.L.， et al.， Immunol. Today 18: 335−343 (1997); Adorini， L.， et al.， Immunol. Today 18:209−211 (1997)]。Ｔｈ１タイプの応答は、ＩＢＤなどのいくつかの自己免疫および慢性炎症性疾患の発病機序に関与する[Adorini， L.， et al.， (1997) ibid.; Mizoguchi， A.， et al.， J. Exp. Med. 183:847− 856， (1996)]。したがって実験的結腸炎およびヒトのＩＢＤは、炎症促進性Ｔｈ１−タイプと抗炎症性Ｔｈ２−タイプサイトカインの間の不均衡として認識できる。動物およびヒトの双方で、ＩＬ１０などの抗炎症性サイトカインがＴｈ１−媒介サイトカインの炎症促進効果を下方制御し、それによって免疫介在性障害を改善できることが最近示されている[Mizoguchi， A.， et al.， (1996) ibid.; Madsen， KL.， et al.， Gastroenterology 113:151−159 (1997); Van Deventer Sander， J.， et al.， Gastroenterology 113:383−389 (1997)]。
【０００７】
非アルコール性脂肪性肝炎発病機序における免疫系の役割
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、アルコール消費の履歴がない患者における肝臓脂肪蓄積、炎症、および線維症からなる臨床病理学的実体である。それは２０％の症例で硬変に進行するかもしれず、西欧諸国における原因不明硬変の最も一般的な原因と見なされる［Caldwell, S. H. et al., Hepatology 29:664 (1999); Matteoni, CA. et al., Gastroenterology 116:1413 (1999)］。ＮＡＳＨは、障害の発病機序において寄与的役割を果たすことが示唆されるその他の代謝障害を患っている患者で一般的である。これらとしては、インシュリン抵抗性［Sanyal, A. J. et al., Gastroenterology 120:1183 (2001)]、肥満症関連ATP枯渇[Cortez-Pinto, H. et al., Jama 282:1659 (1999)］、遊離脂肪酸β過酸化増大［Hruszkewycz, A.M. Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:191 (1988)］、鉄蓄積［George, D.K. et al., gastroenterology 114:311 (1998)］、抗酸化剤枯渇［Harrison, S.A. et al., gastroenterology 123:M1332 (2002)］、およびレプチン欠損［Cohen, B. et al., Science 274:1185 (1996)］が挙げられる。にもかかわらず、体重減少、厳密な糖尿病管理、脂質レベル正常化、および抗酸化剤治療をはじめとする治療的介入のいずれも、一貫して障害の自然な進行の変更を示さなかった［Angulo, P. New England Journal of Medicine 346:1221-1231 (2002)］。
【０００８】
ＮＡＳＨに関する情報の大多数は、レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウス、およびレプチン受容体欠損ｆａ／ｆａＺｕｃｋｅｒラットの２つの哺乳類モデルに由来している。レプチンは体重調節に関与するタンパク質である［Zhang, Y. et al., Nature 372:425-432 (1994)］。齧歯類およびヒトにおけるその欠乏症は、病的肥満症、グルコース不耐性、高脂血症、および重度の肝臓脂肪症からなる重症型代謝症候群（以前シンドロームＸと称された）をもたらす［Pelleymounter, M.A. et al., Science 269:540-543 (1995)］。にもかかわらず上述のように、これらの代謝障害のいくつかを補正することを目的とした介入は、肝臓脂肪症、線維症、および炎症の回復をもたらさなかった。
【０００９】
最近の証拠は、免疫系がレプチン欠損モデルにおけるＮＡＳＨの発病機序において、極めて重要な役割をはたしているかもしれないことを示唆する。レプチン欠損マウスでは、リポ多糖類による肝臓傷害誘発後に、肝臓マクロファージ（クッパー細胞）応答の欠陥が観察されている［Diehl, A.M. J. Physiol. Gastrointest. liver Physiol. 282:G1-G5 (2002)］。同様のモデルでは、ＩＬ６のＬＰＳ誘発が大きく増強された一方、ＩＬ１０のそれは阻害された［Loffreda, S, et al., FASEB J. 12:57-65 (1998)］。ＬＰＳへの曝露に答えて、ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓マクロファージは、対照マウスと比べてより多くのＩＬ１２とより少ないＩＬ１５を産生することが観察され、これがこれらのマウスで観察されたＮＫＴリンパ球数および機能の顕著な低下を説明するかもしれない［Yang et al., Proc Natl Acad Sci USA 94:2557-2562 (1997)］。その他の観察からは、レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスの血液および肝臓中ＣＤ４  Ｔリンパ球数の減少が示された［Howard, J.K. et al., J. Clin. Invest. 104:1051-1059 (1999) and Lord, et al., Nature 394:897-901 (1998)］。これがＣＤ４  Ｔリンパ球によって媒介されるコンカナバリンＡ肝炎に対する、レプチン欠損マウスの相対抵抗性を説明するかもしれない［Faggioni, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:2367-2372 (2000)］。
【００１０】
非アルコール性脂肪肝炎におけるＴｈ１／Ｔｈ２不均衡
ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球は、ＩＬ−２およびＩＦＮγを産生するＴｈ１細胞、またはＩＬ−４およびＩＬ−１０を産生するＴｈ２細胞のどちらかに分類される。免疫系は２つの応答サブタイプ間のバランスシフトによって、異種および自己抗原に反応する［Weiner, H.L. et al., Immunol. Today 18: 335-343 (1997); Adorini, L. et al., Immunol. Today 18:209-211 (1997)］。通常、Ｔｈ１タイプ応答が炎症促進反応を引き起こすのに対し［Adorini, L. et al., (1997) ibid.; Mizoguchi, A., et al., J. Exp. Med. 183:847- 856, (1996)］、ＩＬ１０などの抗炎症性サイトカインは、抗炎症性Ｔｈ２反応に向けてバランスをシフトし、それによって免疫介在性障害を改善する［Mizoguchi, A. et al., (1996) ibid.; Madsen, KL. et al., Gastroenterology 113:151-159 (1997); Van Deventer Sander, J. et al, Gastroenterology 113:383-389 (1997)]。ＮＫＴ細胞は、異なる内在性および外来性刺激に答えて、Ｔｈ１またはＴｈ２経路に向けた免疫系の方向づけにおいて、主要な役割を果たすと考えられる。
【００１１】
レプチンはＴｈ１とＴｈ２応答の間のバランスの免疫調節において主要な役割を果たすことが示されている［Lord, G.M. et al., Nature 394:897-901 (1998)］。レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスＮＡＳＨモデルにおいて、ＮＫＴ細胞の数および機能の変更は、Ｔｈ１応答に向けて免疫系を偏らせることが示唆されている。これはＬＰＳ誘発性肝毒性に対する感受性増大および、コンカナバリンＡの肝毒性効果に対する一意の抵抗性をもたらすことが示唆されている。違いは、それらの異なる病原性機序にあるのかもしれない。前者が、レプチン欠損マウスでは機能亢進性である生得的肝臓免疫系作用に依存するのに対し、後者は、レプチン欠損マウスでは抑止されて欠陥があるＮＫＴ−リンパ球の活性化に依存する［Faggioni, R. et al., PNAS 97:2367-2372 (2000), Zhiping, L.I. et al., Gastroenterology 123:1304-1310 (2002)］。
【００１２】
免疫系および肥満症
免疫系と脂肪組織代謝調節は、密接に関連し合っているようである。脂肪組織内の５０％に至る細胞は、多数の免疫細胞をはじめとする非脂肪細胞から構成される［Montague, CT. et al., Diabetes 47:1384-91 (1998)］。ほとんどの研究は、病的肥満症の免疫学的重要性に着目している。肥満動物およびヒトに存在することが知られている免疫学的変化としては、ＤＴＨおよびマイトジェン刺激リンパ球増殖応答低下  ［Chandra, R.K et al., Acta. Paediatr. Scand 69:25- 30 (1980)］、貪食細胞数および機能減損［Krishnan, E.G. et al., J. Surg. Res. 33:89-97 (1982)］、インシュリン誘発性リンパ球細胞毒性減衰［Koffler, M. et al., Diabetes 40:364-360 (1991)］、および特に体重減少試行中のＣＤ４／ＣＤ８比率変化［Field, C.J. et al., Am. J. Clin. Nutr. 54:123-129 (1991)］が挙げられる。
【００１３】
脂肪細胞は、ＴＮＦ−β［Hotamisligil, G.S. et al., Science 259:87-91 (1993)］およびＩＬ６［Purohit, A. et al., Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 80:3052-58 (1995)］をはじめとする炎症促進性サイトカインを分泌することが知られており、それらはどちらも脂肪過多症レベルに関係している［Hotamisligil, G.S. et al., Journal of Internal Medicine 245:621-625 (1999)］。これらのサイトカインのいくつかは、ＴＮＦ−βによって媒介されるインシュリン抵抗性［Ogawa, H. et al., Biochimica et biophysica acta 1003:131-135 (1989)］、およびＩＬ６によって媒介されるリポタンパク質リパーゼ阻害［Feingold, et al., Diabetes 41:97s-101s (1992)］などの代謝効果を有すると見なされる。ＴＮＦ−βノックアウトマウスは、それらの正常な同腹子よりも高いインシュリン感受性と、改善された脂質プロフィールを有する［Uysal, et al., Nature 389:610-614 (1997)］。脂肪細胞によって産生されるその他の免疫系構成要素としては、代案の補体系の不可分の一部であり、ヒト補体因子Ｄと同一に機能するタンパク質アジプシンが挙げられる［Rosen, B.S. et al., Science 244:1483-7 (1989)］。
【００１４】
肥満症メディエータとしての免疫系の役割に関しては、わずかな情報しか知られていないが、いくつかの最近の研究は、免疫系が肥満症の発生において重要な寄与的役割を有するかもしれないことを示唆する。いくつかのサイトカインは、脂肪組織制御因子として作用することが知られている。ＴＮＦ−βは、交感神経媒介脂肪分解に関与する脂肪細胞上のβ３アドレナリン受容体の発現を抑止する一方、ＩＬ１は脂肪レプチン分泌を刺激する［Sarraf, et al., Journal of experimental medicine 185:171-175 (1997)］。脂肪細胞の代謝活性度は、部分的にＩＬ４、ＩＬ６、およびＴＮＦ−βによって媒介される機序を通じて［Mattacks, CA. et al., Cytokine 11:334-346 (1999)］、それらに最も近いリンパ節からの距離と密接と相関することが観察されている［Pond, CM. et al., Proceedings of the nutrition society 60:365-374 (2001)］。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
肥満動物およびヒトは、免疫系の異なるアームの様々な変化もまた被っているかもしれないという事実を指し示すこれらの観察は、免疫系の調節が、病的肥満症発生の原因である発症機序のいくつかを変化させるかもしれないことを示唆する。
【００１６】
本発明者の知る限りでは、以前に用いられた免疫調節方法は、哺乳類の天然のβ−糖脂質および厳密に言えばβ−糖脂質混合物の免疫系構成要素への曝露を伴わなかった。
【００１７】
本発明者らによる先の公報である国際公開第２００５／０３２４６２号パンフレットは、免疫関連障害の治療における中間の代謝産物および好ましくはグルコセレブロシドの一般的使用を開示する。本発明は、今や、α−糖脂質でなくβ−糖脂質である特定の中間代謝産物、具体的にはβ−ラクトシルセラミド（ＬａｃＣ）、β−グルコシルセラミド（ＧｌｕＣ）、およびβ−ガラクトシル−セラミド（ＧａｌＣ）］およびセラミドが特に効果的であることを明らかに示す。意外にも本発明者らは、免疫調節のための好ましいβ−糖脂質として、β−ラクトシル−セラミドを使用してもよいことを初めて示した。
【００１８】
さらに本発明者らは、免疫関連障害の治療のための強力な薬物として使用してもよい、好ましくはβ−ラクトシル−セラミドとβ−グルコシルセラミドの混合物である２つのβ−糖脂質の特定の組み合わせの明白な相乗効果を示す。
【００１９】
本発明のこれらのおよびその他の目的は、説明の進展に伴って明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
発明の要約
第１の態様として、本発明は、免疫関連障害を患っている対象において抗炎症性サイトカイン産生細胞に向けて、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節する方法に関する。この方法は、それを必要とする対象において、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させるステップを含む。Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞バランスの調節は、前記対象免疫系の少なくとも１つの構成要素によって媒介されてもよい。この実施態様に従って、前記対象における天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させるステップは、
（Ｉ）β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、および上のあらゆる組み合わせのいずれか１つの有効量を投与するステップ、または
（ＩＩ）前記対象免疫系の少なくとも１つの構成要素をβ−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、および上のあらゆる組み合わせのいずれか１つの有効量に曝露するステップ、または
（ＩＩＩ）上のあらゆる組み合わせ
によって実施されてもよい。
【００２１】
第２の態様では、本発明はそれを必要とする哺乳類対象において免疫関連障害を治療する方法に関する。一実施態様に従って、治療する方法は、前記対象に、β−糖脂質、少なくとも２つの天然のβ−糖脂質混合物、および天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、ならびに前記物質を含む組成物のいずれか１つの有効量を投与するステップを含む。
【００２２】
本発明は、それを必要とする哺乳類対象において免疫関連障害を治療する方法をさらに提供する。この好ましい実施態様に従って、本発明の方法は、前記対象免疫系の少なくとも１つの構成要素を（ａ）β−糖脂質、（ｂ）少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、（ｃ）天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、および（ｄ）上のあらゆる組み合わせのいずれか１つの有効量に曝露することで、前記対象において天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させるステップを含む。
【００２３】
第３の態様では、本発明は、哺乳類対象において免疫関連障害を治療するための治療的組成物に関する。一実施態様に従って、本発明の組成物は、（ａ）β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、および上のあらゆる組み合わせ、（ｂ）前記免疫関連障害と関連付けられている抗原、（ｃ）前記免疫関連障害を患っている寛容化または非寛容化対象の、または前記対象の肝臓関連細胞の少なくとも１つ、（ｄ）サイトカイン、接着分子またはあらゆるそれらの組み合わせの少なくとも１つ、（ｅ）抗原提示細胞、および（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）のいずれかの組み合わせを活性成分として含んでもよい。
【００２４】
別の好ましい実施態様に従って、本発明の治療的な組成物は、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節できる教育ＮＫＴ細胞（ｅｄｕｃａｔｅｄ  ＮＫ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）を活性成分として含んでもよい。より具体的には、本発明の組成物中に含まれる教育ＮＫＴ細胞は、（ａ）β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外もしくは血清レベルを増大させる物質、またはあらゆるそれらの組み合わせ、（ｂ）前記免疫関連障害と関連付けられている抗原、（ｃ）前記免疫関連障害を患っている寛容化または非寛容化対象の、または前記対象の肝臓関連細胞の少なくとも１つ（ｄ）サイトカイン、接着分子、およびあらゆるそれらの組み合わせの少なくとも１つ、（ｅ）抗原提示細胞、（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）のいずれかの組み合わせのいずれか１つの存在下で培養される。
【００２５】
本発明のこれらのおよびその他の態様は、続く図および実施例によって明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
第１の態様として、本発明は、免疫関連障害を患っている対象において、抗炎症性サイトカイン産生細胞に向けてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節する方法に関する。この方法は、それを必要とする対象において天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させるステップを含む。調節が、前記対象免疫系の少なくとも１つの構成要素によって媒介されてもよいことに留意すべきである。この実施態様に従って、前記対象中の天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させるステップは、（Ｉ）治療対象に、β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、および上のあらゆる組み合わせのいずれか１つの有効量を投与するステップ、（ＩＩ）前記対象免疫系の少なくとも１つの構成要素をβ−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、および上のあらゆる組み合わせのいずれか１つの有効量に曝露するステップ、または（ＩＩＩ）上述の（Ｉ）および（ＩＩ）のあらゆる組み合わせによって実施されてもよい。
【００２７】
天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質は、前記対象において前記β−糖脂質の生成速度を増大させてもよく、または前記対象において前記β−糖脂質の分解または代謝回転速度を低下させてもよい。
【００２８】
好ましい一実施態様に従って、本発明の方法で使用されるβ−糖脂質は、単糖類セラミド、グルコシルセラミド、ガラクトシルセラミド、ラクトシル−セラミド、ｇａｌ−ｇａｌ−グルコシル−セラミド、ＧＭ２ガングリオシド、ＧＭ３ガングリオシド、グロボシドまたはあらゆるその他のβ−糖脂質よりなる群から選択されてもよい。好ましくは本発明の方法で使用されるβ−糖脂質は、β−ラクトシル−セラミドおよびあらゆるそれらの類似体または誘導体であってもよい。グルコシルセラミド以外のβ−糖脂質を使用する方法もまた、本発明の範囲内で考察されることを理解すべきである。したがって特定の実施態様に従って、本発明の方法では、前記β−糖脂質はあらゆるグルコシルセラミド以外のβ−糖脂質である。
【００２９】
さらに別の好ましい実施態様では、本発明の方法で使用されるβ−糖脂質混合物は、少なくとも２つのβ−糖脂質を１：１〜１：１０００の定量的比率（quantitative ratio）で含んでもよい。あらゆる定量的比率が使用されてもよいことを理解すべきである。非限定的例として、使用される定量的比率は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１５００、１：７５０、１：１０００であってもよい。本発明の混合物が３つ以上の糖脂質を含む場合、使用される定量的比率は、例えば１：１：１、１：２：３、１：１０：１００、１：１０：１００：１０００などであってもよいことにさらに留意すべきである。
【００３０】
特に好ましい実施態様に従って、本発明の方法で使用される好ましいβ−糖脂質混合物は、β−ラクトシル−セラミドおよび少なくとも１つのその他のβ−糖脂質を１：１〜１：１０００の定量的比率で含む。より好ましくはこのような混合物は、β−グルコシルセラミド（ＧＣ）およびβ−ラクトシル−セラミド（ＬＣ）を１：１〜１：１０００の定量的比率で含む。最も好ましくは、本発明の方法で使用される混合物は、β−グルコシルセラミド（ＧＣ）およびβ−ラクトシル−セラミド（ＬＣ）を１：１０および１：１００のいずれか１つ、好ましくは１：１０の定量的比率で含んでもよい。
【００３１】
続く実施例で示すように、異なるモデル系を使用して、ＧＣおよびＬＣの異なる濃度での異なる比率の異なる組み合わせを調べた。例えばＴＮＢＳ誘発結腸炎マウスモデル。実施例４で示すように、１５μｇＧＣ＋１５０μｇＬＣ（１：１０）および１．５μｇＧＣ＋１５０μｇＬＣ（１：１００）の毎日の経口混合物は、最良の抗炎症効果を示した。これらの結果に基づいて、このような好ましい混合物の一日量は、体重１ｋｇあたり約０．０１〜５０、好ましくは０．５〜５ｍｇのβ−グルコシルセラミドおよび体重１ｋｇあたり約０．１〜５００、好ましくは５〜５０ｍｇのβ−ラクトシル−セラミドを１：１０〜１：１００、好ましくは１：１０の定量的比率で含有してもよい。
【００３２】
特定の実施態様に従って、本発明の方法で使用される混合物は、体重１ｋｇあたり０．７５ｍｇのβ−グルコシルセラミドおよび体重１ｋｇあたり７．５ｍｇのβ−ラクトシル−セラミドを含んもよい。
【００３３】
これらの活性成分の好ましい量は、特定の免疫関連障害である結腸炎に特異的であることを理解すべきである。あらゆるその他の免疫関連障害に適切な濃度は、治療を行う医師によって判定されるべきである。
【００３４】
ここで前述したように、抗炎症性サイトカインに向けたＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランス調節の過程は、対象免疫系の少なくとも１つの構成要素によって媒介されてもよい。好ましい実施態様に従って、このような構成要素は、細胞性免疫反応要素、体液性免疫反応要素、およびサイトカインよりなる群から選択されてもよい。好ましくはこのような構成要素は、細胞性免疫反応要素であってもよい。
【００３５】
本発明の方法は、治療対象の免疫系構成要素によって媒介されるのに加えて、糖脂質に前暴露した細胞構成要素を使用して実施されてもよいことに留意すべきである。
【００３６】
特定の実施態様に従って、細胞性免疫反応要素は、ＮＫＴ細胞の集団であってもよい。ＮＫＴ細胞は、骨髄、肝臓、脾臓、または子宮から得ることができるが、また血球分離法によって末梢血から得てもよい。
【００３７】
したがって特に好ましい実施態様に従って、本発明の方法により、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させるステップは、好ましくはＮＫＴ細胞である前記対象免疫系の少なくとも１つの構成要素をβ−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、およびあらゆる上の組み合わせのいずれか１つの有効量に曝露するステップによって実施されてもよい。
【００３８】
この特に好ましい実施態様に従って、本発明の方法は、（ａ）前記対象から、または非自己の対象からＮＫＴ細胞を得るステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で得られたＮＫＴ細胞を生体外で教育して、得られた教育ＮＫＴ細胞が、抗炎症性サイトカイン産生細胞に向けてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節する能力を有するようにするステップと、（ｃ）抗炎症性サイトカイン産生細胞に向けてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節できるステップ（ｂ）で得られた教育ＮＫＴ細胞を治療対象に再導入するステップによって実施される。この調節は、ＩＬ４およびＩＬ１０いずれか１つとＩＦＮγとの定量的比率の増大をもたらす。
【００３９】
より詳しくは、ステップ（ｂ）の生体外でＮＫＴを教育するステップは、ＮＫＴ細胞を（ａ）β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、およびあらゆるそれらの組み合わせ、（ｂ）前記免疫関連障害と関連付けられている抗原またはあらゆるそれらの組み合わせ、（ｃ）前記免疫関連障害を患っている寛容化または非寛容化対象の、または前記対象の肝臓関連細胞の少なくとも１つ、（ｄ）サイトカイン、接着分子またはあらゆるそれらの組み合わせの少なくとも１つ、（ｅ）抗原提示細胞、および（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）のいずれかの組み合わせのいずれか１つの存在下で培養するステップによって、実施されてもよい。
【００４０】
一実施態様に従って、ＮＫＴ細胞は、治療する前記免疫関連障害と関連付けられている抗原に曝露されてもよい。これらの抗原は、例えば前記免疫関連障害を患っている供与者対象から得られた同種抗原、異種抗原、同系抗原、自己抗原、非自己抗原、および組み換え的に調製された抗原、およびあらゆるそれらの組み合わせのいずれか１つであってもよい。これらの抗原は、対象に関しては天然または非天然であることができる。それらは天然または合成、改変または無修飾、それらの全体または断片であることができる。断片は、断片としての合成、または消化、またはより大きな実体から断片を作り出すその他の改変手段に由来することができる。このような抗原または抗原群としては、タンパク質、糖タンパク質、酵素、抗体、組織適合性決定因子、リガンド、受容体、ホルモン、サイトカイン、細胞膜、細胞構成要素、ウイルス、ウイルス性構成要素、ウイルス性ベクター、非ウイルス性ベクター、ホールセル、組織または臓器が挙げられるが、これに限定されるものではない。抗原は、単一分子から、または多様な個々の分子の混合物からなることができる。抗原は、ウイルス表面、細胞表面、膜、マトリックス、または受容体、リガンド、抗体またはあらゆるその他の結合パートナーとの複合体またはコンジュゲートという脈絡の中で出現できる。
【００４１】
重合および分解、分画、および化学修飾は全て、可能な免疫応答の観点から特定の抗原の特性を変更できる。これらの小型セグメント、断片またはエピトープは、単離または合成できる。
【００４２】
本発明の方法は、組み換え的に調製された抗原をさらに包含する。組み換え抗原の調製は、技術分野でよく知られている一般分子生物学技術の使用を伴う。このような技術としては、例えば所望の抗原の適切な発現ベクターへのクローニングが挙げられる。
【００４３】
肝臓は、Ｔ細胞分化において役割を果たすことが示された。ＣＤ３−ＣＤ４＋／ＣＤ８＋ＴＣＲβ細胞およびＣＤ３−４−ＴＣＲβ＋細胞は、肝臓実質細胞との培養によってＣＤ４−８−ＴＣＲβ胸腺欠損ヌード骨髄細胞から発生させることができる［Mabuchi, A., et al., J. Leukocyte Biology, 63:575-583 (1998)］。したがって別の特定の実施態様では、ＮＫＴ細胞の生体外教育は、これらの細胞を肝臓関連細胞存在下で培養して実施されてもよい。これらの細胞は、例えばクッパー細胞、星状細胞、肝臓内皮細胞、肝臓関連幹細胞またはあらゆるその他の肝臓関連リンパ球であってもよい。
【００４４】
同一免疫関連障害を患っている寛容化または非寛容化患者からの、または治療対象からの末梢性リンパ球存在下におけるＮＫＴ細胞の同時培養もまた、本発明で考察される。対象、特にヒト対象からリンパ球を得るために、それによって多数の白血球を得ながら、その他の血液構成要素は同時に対象に戻される手順である、血球分離によって患者から血液を採取する。
【００４５】
別の実施態様に従って、ＮＫＴ細胞は樹状細胞であってもよい抗原提示細胞に曝露されてもよい。
【００４６】
別の特定の実施態様では、ＮＫＴ細胞の生体外教育は、ＩＬ４、ＩＬ１０、ＴＧＦβ、ＩＦＮγ、ＩＬ１２、およびＩＬ１５などのサイトカインの存在下、またはインテグリン、セレクチン、およびＩＣＡＭなどの接着分子の存在下で細胞を培養して実施されてもよい。
【００４７】
特に好ましい実施態様では、上述のように生体外教育されたＮＫＴ細胞を治療対象に再導入してもよい。これは養子免疫伝達と称される方法によって実施できる。伝達のために使用される特定の教育ＮＫＴ細胞は、好ましくは対象（自己伝達）に由来してもよい。同系または非同系供与者（非自己伝達）は除外されない。伝達細胞の保存、生育または増殖は、生体内で、生体外（ex vivo）でまたは生体外（in vitro）で起きてもよい。
【００４８】
細胞治療法は、例えば静脈内などの注射によって、または上述の手段のいずれかによってもよい。投与の時間または様式のどちらも本発明に対する制限ではない。細胞治療計画は、当業者に知られているその他の考慮事項の内、教育細胞の可能な細胞毒性、病期、および患者の病状などの要因を考慮して容易に調節されてもよい。
【００４９】
別の実施態様に従って、生体外教育ＮＫＴ細胞を治療対象に導入するのに加えて、本発明の方法は、（ａ）β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、およびあらゆるそれらの組み合わせ、（ｂ）前記免疫関連障害を患っている同種供与者、異種起源、および自己起源のいずれか１つに由来する構成要素、細胞、組織および／または臓器、および免疫学的機能同等物、およびそれらの組み合わせ、および（ｃ）上のあらゆる組み合わせを前記対象に投与するステップをさらに含んでもよい。
【００５０】
ＮＫＴ細胞はまた、上述のあらゆる方法を通じて生体内で教育されてもよく、それらは、既述のβ−糖脂質、抗原またはあらゆるその他の構成要素への曝露に先だって、またはそれに続くあらゆる時点で調節できるものと理解すべきである。
【００５１】
特に好ましい実施態様に従って、本発明の方法による、抗炎症性サイトカイン産生細胞に向けてのＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスの調節は、β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、およびあらゆる上の組み合わせのいずれか１つの有効量を投与して実施されてもよい。この実施態様に従って投与するステップは、経口、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、非経口、経皮、膣内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所、直腸または皮下投与、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む。
【００５２】
さらに別の好ましい実施態様では、本発明の方法は、特に免疫関連障害を患っている対象においてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節することを意図する。この特定の実施態様に従って、免疫関連障害は、自己免疫疾患、悪性および非悪性増殖性障害、移植片拒絶病状、炎症性疾患、遺伝的疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、または寄生虫感染症のいずれか１つであってもよい。
【００５３】
特定の実施態様に従って、悪性増殖性障害は、癌腫、肉腫、メラノーマ、白血病およびリンパ腫よりなる群から選択される固形および非固形腫瘍のいずれか１つであってもよい。より詳しくは、悪性障害は、肝細胞癌、メラノーマ、結腸癌、骨髄腫、急性または慢性白血病であってもよい。
【００５４】
さらに別の実施態様では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、糖尿病、喘息、急性および慢性移植片対宿主病、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性硬化症、非アルコール性脂肪性肝疾患、高脂血症、アテローム性動脈硬化、代謝症候群またはそれを構成するいずれかの疾患、肥満症、炎症性腸疾患、および免疫媒介肝炎のいずれか１つであってもよい。
【００５５】
特定の一実施態様に従って、本発明の方法は、特に糖尿病を患っている対象においてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節することを意図する。
【００５６】
特定の一実施態様に従って、本発明の方法は、特に喘息を患っている対象においてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節することを意図する。
【００５７】
別の特定の一実施態様に従って、本発明の方法は、特に非アルコール性脂肪性肝疾患を患っている対象においてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節することを意図する。
【００５８】
別の特定の一実施態様に従って、本発明の方法は、特に高脂血症を患っている対象においてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節することを意図する。
【００５９】
別の特定の一実施態様に従って、特に代謝症候群またはそれを構成するいずれかの疾患を患っている対象においてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節することを意図する。
【００６０】
別の特定の一実施態様に従って、本発明の方法は、特に肥満症を患っている対象においてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節することを意図する。
【００６１】
別の特定の一実施態様に従って、本発明の方法は、特に炎症性腸疾患、特に結腸炎を患っている対象においてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節することを意図する。
【００６２】
別の特定の一実施態様に従って、本発明の方法は、特に免疫媒介、ウイルス性または化学物質媒介肝炎を患っている対象においてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節することを意図する。
【００６３】
特定の実施態様に従って、ウイルス感染症はＨＢＶ、ＨＣＶまたはＨＩＶを含む。
【００６４】
第２の態様では、本発明は、それを必要とする哺乳類対象において免疫関連障害を治療する方法に関する。一実施態様に従って、治療する方法は、（ａ）β−糖脂質、（ｂ）少なくとも２つの天然のβ−糖脂質混合物、（ｃ）天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、（ｄ）β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、およびあらゆるそれらの組み合わせのいずれか１つの有効量に前暴露した前記対象免疫系の少なくとも１つの構成要素、（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）のいずれか１つを含む組成物、（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）のあらゆる組み合わせのいずれか１つの有効量を前記対象に投与するステップを含む。
【００６５】
一実施態様に従って、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質は、前記対象中の前記β−糖脂質生成速度を増大させてもよく、または前記対象中の前記β−糖脂質分解または代謝回転速度を低下させてもよい。
【００６６】
別の好ましい実施態様に従って、本発明の方法によって使用されるβ−糖脂質は、単糖類セラミド、グルコシルセラミド、ガラクトシルセラミド、ラクトシル−セラミド、ｇａｌ−ｇａｌ−グルコシル−セラミド、ＧＭ２ガングリオシド、ＧＭ３ガングリオシド、グロボシドまたはあらゆるその他のβ−糖脂質よりなる群から選択されてもよい。好ましくは本発明の方法によって使用されるβ−糖脂質は、β−ラクトシル−セラミドおよびあらゆるそれらの類似体または誘導体であってもよい。この態様の特定の実施態様は、グルコシルセラミド以外のβ−糖脂質の本発明の方法のための使用に関する。
【００６７】
さらに別の好ましい実施態様では、本発明の方法によって使用されるβ−糖脂質混合物は、少なくとも２つのβ−糖脂質を１：１〜１：１０００の定量的比率で含んでもよい。あらゆる定量的比率を使用してもよいと理解すべきである。例えば：１：２、１：５０、１：２００、１：３５０。
【００６８】
特に好ましい実施態様に従って、本発明の方法によって使用される好ましいβ−糖脂質混合物は、β−ラクトシル−セラミドおよび少なくとも１つのその他のβ−糖脂質を１：１〜１：１０００の定量的比率で含んでもよい。より好ましくは、このような混合物は、β−グルコシルセラミド（ＧＣ）およびβ−ラクトシル−セラミド（ＬＣ）を１：１〜１：１０００の定量的比率で含む。最も好ましくは本発明の方法によって使用される混合物は、β−グルコシルセラミド（ＧＣ）およびβ−ラクトシル−セラミド（ＬＣ）を１：１０および１：１００のいずれか１つ、好ましくは１：１０の定量的比率で含んでもよい。
【００６９】
異なる免疫関連障害のために、ＧＣおよびＬＣの異なる濃度での異なる比率の異なる組み合わせを使用してもよい。好ましい混合物中の活性成分の一日量は、体重１ｋｇあたり約０．０１〜５０、好ましくは０．５〜５ｍｇのβ−グルコシルセラミド（ＧＣ）、および体重１ｋｇあたり約０．１〜５００、好ましくは５〜５０ｍｇのβ−ラクトシル−セラミド（ＬＣ）を１：１０〜１：１００、好ましくは１：１０の定量的比率で含有してもよい。
【００７０】
特定の実施態様に従って、本発明の方法によって使用される混合物は、体重１ｋｇあたり０．７５ｍｇのβ−グルコシルセラミドおよび体重１ｋｇあたり７．５ｍｇのβ−ラクトシル−セラミドを含んでもよい。
【００７１】
これらの活性成分の好ましい量は、特定の免疫関連障害である結腸炎に特異的であることを理解すべきである。あらゆるその他の免疫関連障害に適切な濃度は、治療を行う医師によって判定されるべきである。
【００７２】
好ましい一実施態様に従って、治療する方法は、治療対象の免疫系構成要素を異なるβ−糖脂質に曝露することに基づいてもよい。好ましい実施態様に従って、このような構成要素は、細胞性免疫反応要素、体液性免疫反応要素、およびサイトカインよりなる群から選択されてもよい。好ましくはこのような構成要素は、細胞性免疫反応要素であってもよい。
【００７３】
特定の実施態様に従って、細胞性免疫反応要素はＮＫＴ細胞の集団であってもよい。
【００７４】
より具体的には、ＮＫＴ細胞を本発明のβ−糖脂質の有効量に曝露するステップは、（ａ）ＮＫＴ細胞を前記対象から、または別の対象から得るステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で得られたＮＫＴ細胞を生体外で教育して、得られた教育ＮＫＴ細胞が抗炎症性サイトカイン産生細胞に向けてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節する能力を有するようにするステップと、（ｃ）抗炎症性サイトカイン産生細胞に向けてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節できるステップ（ｂ）で得られた教育ＮＫＴ細胞を前記対象に再導入するステップによって実施されてもよい。このような調節は、ＩＬ４およびＩＬ１０のいずれか１つとＩＦＮγとの定量的比率の増大をもたらす。
【００７５】
より詳しくは、ＮＫＴを生体外で教育するステップ（ｂ）は、（ａ）β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、およびあらゆるそれらの組み合わせ、（ｂ）前記免疫関連障害と関連付けられている抗原またはあらゆるそれらの組み合わせ、（ｃ）前記免疫関連障害を患っている寛容化または非寛容化対象の、または前記対象の肝臓関連細胞の少なくとも１つ、（ｄ）サイトカイン、接着分子またはあらゆるそれらの組み合わせの少なくとも１つ、（ｅ）抗原提示細胞、および（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）のいずれかの組み合わせのいずれか１つの存在下で、前記ＮＫＴ細胞を培養して実施されてもよい。
【００７６】
一実施態様に従って、ＮＫＴ細胞は、前記免疫関連障害と関連付けられている抗原に曝露されてもよい。このような抗原は、例えば前記免疫関連障害を患っている供与者対象から得られた同種抗原、異種抗原、同系抗原、自己抗原、非自己抗原、および組み換え的に調製された抗原、およびあらゆるそれらの組み合わせのいずれか１つであってもよい。
【００７７】
別の実施態様に従って、ＮＫＴ細胞は、クッパー細胞、星状細胞、肝臓内皮細胞、肝臓関連幹細胞、およびあらゆるその他の肝臓関連リンパ球よりなる群から選択されてもよい肝臓関連細胞に曝露されてもよい。
【００７８】
さらに別の実施態様では、ＮＫＴ細胞は、ＩＬ４、ＩＬ１０、ＴＧＦβ、ＩＦＮγ、ＩＬ１２、ＩＬ２、ＩＬ１８、およびＩＬ１５などのサイトカインに曝露されてもよい。
【００７９】
なおもさらにＮＫＴ細胞は、インテグリン、セレクチン、およびＩＣＡＭよりなる群から選択される接着分子に曝露されてもよい。
【００８０】
別の実施態様に従って、ＮＫＴ細胞は、樹状細胞であってもよい抗原提示細胞に曝露されてもよい。
【００８１】
特に好ましい実施態様では、教育ＮＫＴ細胞は養子免疫伝達によって治療対象に再導入されてもよい。
【００８２】
別の実施態様に従って、生体外教育ＮＫＴ細胞導入するステップに加えて、本発明の方法は、（ａ）β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、およびあらゆるそれらの組み合わせ、（ｂ）前記免疫関連障害を患っている同種供与者、異種起源、および自己起源に由来する構成要素、細胞、組織および／または臓器のいずれか１つ、および免疫学的機能同等物、およびそれらの組み合わせ、および（ｃ）上のあらゆる組み合わせを治療対象に投与するステップをさらに含んでなってもよい。
【００８３】
別の実施態様に従って、本発明の方法は、β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、およびあらゆる上の組み合わせのいずれか１つの有効量を治療対象に投与するステップを含む。この実施態様に従って投与するステップは、経口、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、非経口、経皮、膣内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所、直腸または皮下投与、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む。
【００８４】
治療的な調合物は、あらゆる従来の製剤形態で投与されてもよい。調合物は、典型的に１つ以上の許容可能なそのキャリアと共に、上で定義したような少なくとも１つの活性成分を含む。
【００８５】
各キャリアは、その他の成分と適合性であり患者に有害でないと言う意味で、薬学的にもまた生理学的にも許容可能でなくてはならない。調合物としては、経口、直腸、経鼻、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、および皮内をはじめとする）投与に適したものが挙げられる。調合物は、好都合には単位容量形態で存在してもよく、薬学技術分野でよく知られているあらゆる方法によって調製されてもよい。このような全ての化合物の性質、利用可能性、および起源、そして対象において望ましい効果を得るのに必要な有効量をはじめとする投与については、技術分野でよく知られており、ここでさらに述べるに及ばない。
【００８６】
好ましい一実施態様に従って、本発明の方法は、自己免疫疾患、悪性および非悪性増殖性障害、移植片拒絶病状、炎症性疾患、遺伝的疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、または寄生虫感染症などの免疫障害の治療に向けたものである。
【００８７】
別の特に好ましい実施態様では、本発明の方法は悪性病変の治療に向けたものである。癌性の状況では、ＮＫＴ細胞の調節は、炎症促進応答を誘発し、または抗腫瘍関連抗原免疫を増強する方向であってもよい。本発明について述べるためのここでの用法では、「癌」、「腫瘍」、および「悪性病変」は全て、組織または臓器の過形成に同等に関連している。組織がリンパまたは免疫系の一部である場合、悪性細胞は循環細胞の非固形腫瘍を含んでもよい。その他の組織または臓器の悪性腫瘍は、固形腫瘍を生じるかもしれない。一般に本発明の方法および組成物は、非固形および固形腫瘍の治療で使用してもよい。
【００８８】
本発明で考察される悪性病変は、癌腫、メラノーマ、リンパ腫、および肉腫よりなる群から選択されてもよい。本発明が役立つかもしれない悪性腫瘍としては、血液学的悪性腫瘍（白血病、リンパ腫、および骨髄増殖障害をはじめとする）、再生不良性および再生不能性貧血（ウイルス誘発および特発性双方の）、骨髄増殖性症候群、全タイプの腫瘍随伴症候群（免疫媒介および特発性双方の）、および固形腫瘍（肺、肝臓、乳、結腸、前立腺、消化管、膵臓、およびカポジをはじめとする）が挙げられるが、これに限定されるものではない。より詳しくは、悪性障害は、肝細胞癌、結腸癌、メラノーマ、骨髄腫、急性または慢性白血病であってもよい。
【００８９】
さらに別の実施態様では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、糖尿病、喘息、急性および慢性移植片対宿主病、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性硬化症、非アルコール性脂肪性肝疾患、高脂血症、アテローム性動脈硬化、代謝症候群またはそれを構成するいずれかの疾患、肥満症、炎症性腸疾患、および免疫媒介肝炎のいずれか１つであってもよい。
【００９０】
特定の実施態様に従って、ウイルス性感染症は、ＨＢＶ、ＨＣＶまたはＨＩＶのいずれか１つによって引き起こされてもよい。
【００９１】
治療対象が上述の疾患のいずれかを患っている、特に好ましい実施態様に従って、本発明の方法による治療の好ましい結果は、例えばグルコース耐性増大、肝臓脂肪含量減少またはサイトカイン応答の変化、腫瘤減少、生存率増大、および疾患症状の回復であってもよい。このような結果は、続く実施例によって実証される。
【００９２】
特定の一実施態様に従って、本発明の方法は、特に糖尿病を患っている対象の治療に向けたものである。
【００９３】
別の特定の一実施態様に従って、本発明の方法は、特に喘息を患っている対象の治療に向けたものである。
【００９４】
別の特定の一実施態様に従って、本発明の方法は、特に非アルコール性脂肪性肝疾患を患っている対象の治療に向けたものである。
【００９５】
別の特定の一実施態様に従って、本発明の方法は、特に高脂血症を患っている対象の治療に向けたものである。
【００９６】
別の特定の一実施態様に従って、本発明の方法は、特に代謝症候群またはそれを構成するあらゆる疾患を患っている対象の治療に向けたものである。
【００９７】
別の特定の一実施態様に従って、本発明の方法は、特に肥満症を患っている対象の治療に向けたものである。
【００９８】
別の特定の一実施態様に従って、本発明の方法は、特に結腸炎などの炎症性腸疾患を患っている対象の治療に向けたものである。
【００９９】
別の特定の一実施態様に従って、本発明の方法は、特に免疫媒介、ウイルス性または化学物質媒介肝炎を患っている対象の治療に向けたものである。
【０１００】
本発明の方法は、特にヒトにおける免疫関連障害の治療に向けたものであるが、その他の哺乳類も含まれている。非限定的例として、哺乳類対象としては、サル、ウマ、畜牛、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびブタが挙げられる。
【０１０１】
第３の態様では、本発明は、哺乳類対象において免疫関連障害を治療する治療的な組成物に関する。一実施態様に従って、本発明の組成物は、（ａ）β−糖脂質、（ｂ）少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、（ｃ）天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、（ｄ）β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外もしくは血清レベルを増大させる物質、またはあらゆるそれらの組み合わせのいずれか１つに前暴露した教育ＮＫＴ細胞、および（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のあらゆる組み合わせのいずれか１つを活性成分として含んでもよい。
【０１０２】
別の実施態様では、本発明の組成物は、場合により、（ａ）前記免疫関連障害と関連付けられている抗原、（ｂ）前記免疫関連障害を患っている寛容化または非寛容化対象の、または前記対象の肝臓関連細胞の少なくとも１つ、（ｃ）サイトカイン、接着分子またはあらゆるそれらの組み合わせの少なくとも１つ、（ｄ）抗原提示細胞、および（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）のいずれかの組み合わせのいずれか１つをさらに含んでなってもよい。
【０１０３】
一実施態様に従って、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質は、前記対象中の前記β−糖脂質の生成速度を増大させる物質、または前記対象中の前記β−糖脂質の分解または代謝回転率を低下させる物質であってもよい。
【０１０４】
別の好ましい実施態様に従って、本発明の組成物に含まれるβ−糖脂質は、単糖類セラミド、グルコシルセラミド、ガラクトシルセラミド、ラクトシル−セラミド、ｇａｌ−ｇａｌ−グルコシル−セラミド、ＧＭ２ガングリオシド、ＧＭ３ガングリオシド、グロボシドまたはあらゆるその他のβ−糖脂質よりなる群から選択されてもよい。好ましくは本発明の方法で使用されるβ−糖脂質は、β−ラクトシル−セラミドおよびあらゆるそれらの類似体または誘導体であってもよい。グルコシルセラミド以外のβ−糖脂質を含む組成物もまた、本発明の範囲内である。
【０１０５】
さらに別の好ましい実施態様では、本発明の組成物によって使用されるβ−糖脂質混合物は、少なくとも２つのβ−糖脂質を１：１〜１：１０００の定量的比率で含んでもよい。あらゆる定量的比率を使用してもよいものと理解すべきである。
【０１０６】
特に好ましい実施態様に従って、本発明の組成物に含まれる好ましいβ−糖脂質混合物は、β−ラクトシル−セラミドおよび少なくとも１つのその他のβ−糖脂質を１：１〜１：１０００の定量的比率で含んでもよい。より好ましくは、このような混合物は、β−グルコシルセラミドおよびβ−ラクトシル−セラミドを１：１〜１：１０００の定量的比率で含む。最も好ましくは、本発明の組成物で使用される混合物は、β−グルコシルセラミド（ＧＣ）およびβ−ラクトシル−セラミド（ＬＣ）を１：１０および１：１００のいずれか１つ、好ましくは１：１０の定量的比率で含んでもよい。
【０１０７】
異なる免疫関連障害で有用な組成物のために、ＧＣおよびＬＣの異なる濃度での異なる比率の異なる組み合わせを使用してもよい。好ましい混合物中の活性成分の一日量は、体重１ｋｇあたり約０．０１〜５０、好ましくは０．５〜５ｍｇのβ−グルコシルセラミド（ＧＣ）、および体重１ｋｇあたり約０．１〜５００、好ましくは５〜５０ｍｇのβ−ラクトシル−セラミド（ＬＣ）を１：１０〜１：１００、好ましくは１：１０の定量的比率で含有してもよい。
【０１０８】
特定の実施態様に従って、本発明の組成物のために使用される混合物は、体重１ｋｇあたり０．７５ｍｇのβ−グルコシルセラミドおよび体重１ｋｇあたり７．５ｍｇのβ−ラクトシル−セラミドを含んでもよい。
【０１０９】
これらの好ましい活性成分量は、結腸炎治療のための組成物で好ましいものと理解すべきである。あらゆるその他の免疫関連障害に適切な濃度は、治療を行う医師によって判定されるべきである。
【０１１０】
別の好ましい実施態様に従って、本発明の治療的な組成物は、抗炎症性サイトカイン産生細胞に向けてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節できる教育ＮＫＴ細胞を活性成分として含んでもよい。より具体的には本発明の組成物に含まれる教育ＮＫＴ細胞は、（ａ）β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外もしくは血清レベルを増大させる物質、またはあらゆるそれらの組み合わせ、（ｂ）前記免疫関連障害と関連付けられている抗原、（ｃ）前記免疫関連障害を患っている寛容化または非寛容化対象の、または前記対象の肝臓関連細胞の少なくとも１つ、（ｄ）サイトカイン、接着分子、およびあらゆるそれらの組み合わせの少なくとも１つ、（ｅ）抗原提示細胞、および（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）のいずれかの組み合わせのいずれか１つの存在下で培養される。
【０１１１】
別の好ましい実施態様に従って、本発明の組成物は、生体外教育されたＮＫＴ細胞を含む。これらの細胞は、治療する免疫関連障害と関連付けられている抗原に曝露される。このような抗原は、例えば前記免疫関連障害を患っている供与者対象から得られた同種抗原、異種抗原、同系抗原、自己抗原、非自己抗原、および組み換え的に調製された抗原、およびあらゆるそれらの組み合わせである。
【０１１２】
一実施態様に従って、ＮＫＴ細胞は、前記免疫関連障害と関連付けられている抗原に曝露されてもよい。このような抗原は、例えば前記免疫関連障害を患っている供与者対象から得られた同種抗原、異種抗原、同系抗原、自己抗原、非自己抗原、および組み換え的に調製された抗原、およびあらゆるそれらの組み合わせのいずれか１つであってもよい。
【０１１３】
別の実施態様に従って、ＮＫＴ細胞は、クッパー細胞、星状細胞、肝臓内皮細胞、肝臓関連幹細胞、およびあらゆるその他の肝臓関連リンパ球よりなる群から選択されてもよい肝臓関連細胞に曝露されてもよい。
【０１１４】
さらに別の実施態様では、ＮＫＴ細胞は、ＩＬ４、ＩＬ１０、ＴＧＦβ、ＩＦＮγ、ＩＬ１２、ＩＬ２、ＩＬ１８、およびＩＬ１５などのサイトカインに曝露されてもよい。
【０１１５】
なおもさらにＮＫＴ細胞は、インテグリン、セレクチン、およびＩＣＡＭよりなる群から選択される接着分子に曝露されてもよい。
【０１１６】
別の実施態様に従って、ＮＫＴ細胞は、樹状細胞であってもよい抗原提示細胞に曝露されてもよい。
【０１１７】
一実施態様に従って、本発明の組成物は、自己免疫疾患などの免疫障害、悪性および非悪性増殖性障害、移植片拒絶病状、炎症性疾患、遺伝的疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、または寄生虫感染症の治療に向けたものである。
【０１１８】
特定の実施態様に従って、悪性増殖性障害は、癌腫、肉腫、メラノーマ、白血病、およびリンパ腫よりなる群から選択される固形および非固形腫瘍のいずれか１つであってもよい。より詳しくは、悪性障害は、メラノーマ、肝細胞癌、結腸癌、骨髄腫、急性または慢性白血病であってもよい。
【０１１９】
さらに別の実施態様では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、糖尿病、喘息、急性および慢性移植片対宿主病、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性硬化症、非アルコール性脂肪性肝疾患、高脂血症、アテローム性動脈硬化、代謝症候群またはそれを構成するいずれかの疾患、肥満症、炎症性腸疾患、および免疫媒介肝炎のいずれか１つであってもよい。
【０１２０】
本発明の組成物は、特に糖尿病の治療に適していることに留意すべきである。
【０１２１】
本発明の組成物は、特に喘息の治療に適していることに留意すべきである。
【０１２２】
別の特定の一実施態様に従って、本発明の組成物は、特に非アルコール性脂肪性肝疾患を患っている対象の治療に向けたものである。
【０１２３】
別の特定の一実施態様に従って、本発明の組成物は、特に高脂血症を患っている対象の治療に向けたものである。
【０１２４】
別の特定の一実施態様に従って、本発明の組成物は、特に代謝症候群またはそれを構成するいずれかの疾患を患っている対象の治療に向けたものである。
【０１２５】
別の特定の一実施態様に従って、本発明の組成物は、特に肥満症を患っている対象の治療に向けたものである。
【０１２６】
別の特定の一実施態様に従って、本発明の組成物は、特に炎症性腸疾患を患っている対象の治療に向けたものである。
【０１２７】
別の特定の一実施態様に従って、本発明の組成物は、特に免疫媒介、ウイルス性または化学物質媒介肝炎を患っている対象の治療に向けたものである。
【０１２８】
特定の実施態様に従って、ウイルス感染症はＨＢＶ、ＨＣＶまたはＨＩＶを含む。
【０１２９】
本発明の医薬品組成物は、一般に、そのモル浸透圧濃度を調節する薬剤である緩衝剤、および場合により、技術分野で知られている１つ以上の薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤、および／または添加剤を含む。補足的活性成分もまた、組成物に組み込むことができる。キャリアは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、適切なそれらの混合物、および植物油を含有する、溶剤または分散媒であることができる。適切な流動度は、例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合は必要な粒度の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持できる。
【０１３０】
ここでの用法では「薬学的に許容可能なキャリア」とは、あらゆるそして全ての溶剤、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤などを含む。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用については、技術分野でよく知られている。活性成分と不適合である従来の媒体または薬剤を除いて、治療的な組成物中でのその使用が考察される。
【０１３１】
さらなる態様では、本発明は、免疫関連障害を治療する組成物の調製における、（ａ）β−糖脂質、（ｂ）少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、（ｃ）天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、（ｄ）β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外もしくは血清レベルを増大させる物質、またはあらゆるそれらの組み合わせのいずれか１つに前暴露した教育ＮＫＴ細胞、および（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）のあらゆる組み合わせのいずれか１つの治療的有効量の使用に関する。特定の実施態様に従って、組成物は本発明によって述べられるものである。
【０１３２】
本発明は、それを必要とする対象において免疫関連障害を治療する薬物を調製する方法をさらに提供する。本発明の方法は、（ａ）前記対象から、または別の対象から前記対象の免疫系構成要素を得るステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で得られた前記構成要素を得られた構成要素が抗炎症性サイトカイン産生細胞に向けてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節する能力を有するように、β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外もしくは血清レベルを増大させる物質、またはあらゆるそれらの組み合わせのいずれか１つの有効量と共に培養またはインキュベートして、生体外で曝露するステップを含んでもよい。
【０１３３】
一実施態様に従って、前記対象免疫系の構成要素は、細胞性免疫反応要素であってもよい。より具体的には、ＮＫＴ細胞の集団。
【０１３４】
特に好ましい実施態様に従って、本発明の方法は、（ａ）前記対象から、または別の対象からＮＫＴ細胞を得るステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で得られたＮＫＴ細胞を（ｉ）β−糖脂質、β−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外もしくは血清レベルを増大させる物質、またはあらゆるそれらの組み合わせ、（ｉｉ）前記免疫関連障害と関連付けられている抗原またはあらゆるそれらの組み合わせ、（ｉｉｉ）前記免疫関連障害を患っている寛容化または非寛容化対象の、または前記対象の肝臓関連細胞の少なくとも１つ、（ｉｖ）サイトカイン、接着分子またはあらゆるそれらの組み合わせの少なくとも１つ、（ｖ）抗原提示細胞、および（ｖｉ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）のいずれかの組み合わせのいずれか１つの存在下で培養することで、前記ＮＫＴ細胞を生体外で教育するステップによって実施されてもよい。
【０１３５】
この好ましい実施態様に従って、得られた教育ＮＫＴ細胞は、抗炎症性サイトカイン産生細胞に向けてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節する能力を有する。
【０１３６】
本発明は、（Ｉ）（ａ）β−糖脂質、（ｂ）少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、（ｃ）天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、（ｄ）β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外もしくは血清レベルを増大させる物質、またはあらゆるそれらの組み合わせのいずれか１つに前曝露された教育ＮＫＴ細胞、および（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）のあらゆる組み合わせのいずれか１つを含む免疫調節性化合物を提供するステップと、（ＩＩ）ステップ（ａ）で提供された免疫調節性化合物を薬学的に許容可能なキャリアと混合するステップを含む、それを必要とする対象において免疫関連障害を治療する薬物を調製する方法をさらに提供する。
【０１３７】
さらなる態様では、本発明は、Ｔｈ２抗炎症性サイトカイン産生細胞に向けてＴｈ１／Ｔｈ２細胞バランスを調節する組成物に関する。本発明の組成物は、（ａ）β−糖脂質、（ｂ）少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、（ｃ）天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外または血清レベルを増大させる物質、（ｄ）β−糖脂質、少なくとも２つのβ−糖脂質混合物、天然のβ−糖脂質の細胞内、細胞外もしくは血清レベルを増大させる物質、またはあらゆるそれらの組み合わせのいずれか１つに前暴露した教育ＮＫＴ細胞、および（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）のあらゆる組み合わせのいずれか１つの免疫調節的有効量を活性成分として含む。
【０１３８】
一実施態様に従って、本発明の免疫調節組成物は、場合により、（ａ）前記免疫関連障害と関連付けられている抗原、（ｂ）前記免疫関連障害を患っている寛容化または非寛容化対象の、または前記対象の肝臓関連細胞の少なくとも１つ、（ｃ）サイトカイン、接着分子またはあらゆるそれらの組み合わせの少なくとも１つ、（ｄ）抗原提示細胞、および（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）のいずれかの組み合わせのいずれか１つをさらに含んでもよい。
【０１３９】
別の実施態様では、前記β−糖脂質は、単糖類セラミド、グルコシルセラミド、ガラクトシルセラミド、ラクトシル−セラミド、ｇａｌ−ｇａｌ−グルコシル−セラミド、ＧＭ２ガングリオシド、ＧＭ３ガングリオシド、グロボシドおよびあらゆるその他のβ−糖脂質よりなる群から選択される。好ましくはβ−糖脂質は、β−ラクトシル−セラミドおよびあらゆるそれらの類似体または誘導体であってもよい。
【０１４０】
別の好ましい実施態様に従って、本発明の組成物に含まれるβ−糖脂質は、単糖類セラミド、グルコシルセラミド、ガラクトシルセラミド、ラクトシル−セラミド、ｇａｌ−ｇａｌ−グルコシル−セラミド、ＧＭ２ガングリオシド、ＧＭ３ガングリオシド、グロボシドまたはあらゆるその他のβ−糖脂質よりなる群から選択されてもよい。好ましくは本発明の方法で使用されるβ−糖脂質は、β−ラクトシル−セラミドおよびあらゆるそれらの類似体または誘導体であってもよい。グルコシルセラミド以外のβ−糖脂質を含む組成物もまた、本発明の範囲内である。
【０１４１】
さらに別の好ましい実施態様では、本発明の組成物によって使用されるβ−糖脂質混合物は、少なくとも２つのβ−糖脂質を１：１〜１：１０００の定量的比率で含んでもよい。あらゆる定量的比率を使用してもよいものと理解すべきである。
【０１４２】
特に好ましい実施態様に従って、本発明の組成物に含まれる好ましいβ−糖脂質混合物は、β−ラクトシル−セラミドおよび少なくとも１つのその他のβ−糖脂質を１：１〜１：１０００の定量的比率で含んでもよい。より好ましくはこのような混合物は、β−グルコシルセラミドおよびβ−ラクトシル−セラミドを１：１〜１：１０００の定量的比率で含む。最も好ましくは、本発明の組成物で使用される混合物は、β−グルコシルセラミド（ＧＣ）およびβ−ラクトシル−セラミド（ＬＣ）を１：１０および１：１００のいずれか１つ、好ましくは１：１０の定量的比率で含んでもよい。
【０１４３】
異なる免疫関連障害で有用な組成物のために、ＧＣおよびＬＣの異なる濃度での異なる比率の異なる組み合わせを使用してもよい。好ましい混合物中の活性成分の一日量は、体重１ｋｇあたり約０．０１〜５０、好ましくは０．５〜５ｍｇのβ−グルコシルセラミド（ＧＣ）、および体重１ｋｇあたり約０．１〜５００、好ましくは５〜５０ｍｇのβ−ラクトシル−セラミド（ＬＣ）を１：１０〜１：１００、好ましくは１：１０の定量的比率で含有してもよい。
【０１４４】
特定の実施態様に従って、本発明の組成物のために使用される混合物は、体重１ｋｇあたり０．７５ｍｇのβ−グルコシルセラミドおよび体重１ｋｇあたり７．５ｍｇのβ−ラクトシル−セラミドを含んでもよい。
【０１４５】
本発明は、免疫関連障害を治療するための支援薬物としての本発明の免疫調節組成物の使用をさらに提供する。
【０１４６】
なおもさらに、本発明は、本発明に従った免疫調節組成物の免疫関連に対するワクチンのためのアジュバントとしての使用を提供する。
【０１４７】
開示され述べられるように、ここで開示されるような方法、ステップ、および組成物はいくぶん変動してもよいので、本発明はここで開示される特定の実施例、方法、ステップ、および組成物に限定されるものではないと理解される。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびそれらの同等物によってのみ限定されるので、ここで使用される用語法は、特定の実施態様のみについて述べる目的で使用され、限定は意図されないこともまた理解される。
【０１４８】
本明細書および添付の特許請求範囲の用法では、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、含量が明確に異なって指示する場合を除いて、複数指示対象を含むことに留意されたい。
【０１４９】
この明細書および実施例および続く特許請求の範囲の全体を通じて、文脈がそれ以外のことを必要とする場合を除いて、「を含む(comprise)」と言う言葉、および「を含む(comprises)」および「を含む(comprising)」などのバリエーションは、述べられた整数またはステップ、または整数またはステップの群の包含を暗示するが、あらゆるその他の整数またはステップ、または整数またはステップの群の排除を暗示しないものと理解される。
【０１５０】
続く実施例は、本発明の態様を実施する上で本発明者らによって用いられた技術の典型である。これらの技術は、本発明の実施について好ましい実施態様を例示しながら、当業者は本開示に照らして、本発明の精神と意図される範囲を逸脱することなく多数の修正ができることを認識するであろうことを理解すべきである。
【実施例】
【０１５１】
実施例
実験手順
動物
＊正常な同系交配２〜４ヶ月齢のＣ５７Ｂ１オスマウスは、米国のジャクソン・ラボラトリーズ(Jackson Laboratories(USA))から得た。
【０１５２】
＊正常な同系交配２〜４ヶ月齢Ｂａｌｂ／Ｃオスマウスは、米国のジャクソン・ラボラトリーズ(Jackson Laboratories(USA))から得た。
【０１５３】
＊１０週齢のオスレプチン欠損Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよびリーン(lean)Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ハーラン・ラボラトリーズ(Harlan laboratories)から購入した。
【０１５４】
＊８週齢のオスＣ５７／ｂｌマウスは、米国メイン州バー・ハーバーのジャクソン・ラボラトリーズ(Jackson Laboratories((Bar Harbor,ME,USA))から得た。
【０１５５】
全ての動物はハダーサ・ヘブライ大学医学部(Hadassah-Hebrew University Medical School)の動物コア(Animal Core)で維持した。マウスに標準研究室固形飼料および水を不断給餌し、１２時間の明暗サイクルに置いた。動物実験は、実験動物の管理および使用に関するヘブライ大学ハダーサ施設委員会(Hebrew University-Hadassah Institutional Committee for Care and Use of Laboratory Animals)のガイドラインに従って、委員会の認可を得て実施した。
【０１５６】
β−糖脂質
次のβ−糖脂質を使用した。β−グルコシルセラミド（ＧｌｕＣまたはＧＣとも示す）、β−ラクトシル−セラミド（ＬａｃＣまたはＬＣとも示す）、およびβ−ガラクトシル−セラミド（ＧａｌＣ）、ｉＧｂ３、およびセラミド。
【０１５７】
結腸炎の誘発
［Collins, C, et al., Eur. J. Immunol. 26:3114-3118 (1996)］で述べられるように、１００ｍＬの５０％エタノールに溶解したＴＮＢＳをマウス１匹あたり１ｍｇで結腸内投与して、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）結腸炎を誘発した。
【０１５８】
結腸炎の臨床アセスメント
研究全体を通じて毎日下痢について経過観察した。
【０１５９】
結腸炎の巨視的スコア
結腸炎誘発に続いて１４日めに、標準パラメーター［Madsen, K.L., et al., Gastroenterology 113:151-159 (1997); Trop, S., et al., Hepatology 27:746-755 (1999)］を使用して、結腸炎アセスメントを実施した。
【０１６０】
４つの巨視的パラメーター、すなわち結腸潰瘍化の程度、腸と腹膜の癒着、壁厚、および粘膜浮腫の程度について判定した。０（完全に正常）から４（最も重度）のスケールで、２人の熟練した試験者が盲検法で各パラメーターを等級付けした。
【０１６１】
組織学的病変の格付け
炎症の組織学的評価のために、遠位結腸組織（最後の１０ｃｍ）を除去して１０％ホルムアルデヒド中で固定した。次に標準技術を使用して、各マウスからの５枚のパラフィン切片をヘマトキシリン−エオジン染色した。結腸の顕微鏡的断面の炎症の程度を半定量的に０〜４で等級付けした  ［Madsen et al., (1997) ibid.; Trop et al., Hepatology 27:746-755 (1999)］。等級０：炎症徴候がなく正常；等級１：非常に低レベルの白血球浸潤；等級２：低レベルの白血球浸潤；および等級３：高血管密度および腸壁肥厚を伴う高レベルの浸潤；等級４：杯状細胞損失、高血管密度、壁肥厚、および正常な腸構造の崩壊を伴う経壁浸潤巣。２人の熟練した試験者が、盲検法で等級付けを実施した。
【０１６２】
脾臓および肝臓リンパ球の単離
以前述べられたようにして、脾細胞を単離し赤血球を除去した［Vicari, A.P., et al., Immunology Today 17(2):71 (1996)]。いくつかの修正を加えて以前述べられたようにして、研究終了時に全マウス群から肝臓内リンパ球を単離した［Vicari et al., (1996) ibid.; Bleicher, P.A., et al., Science 250:679-682 (1990)］。下大静脈を横隔膜の上で切断し、５ｍＬの冷ＰＢＳで肝臓が蒼白になるまで洗い流した。結合組織および胆嚢を除去し、肝臓を１０ｍＬディッシュの冷無菌ＰＢＳに入れた。ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー(Sigma Chemical Co.,(St.Louis,MO))からのステンレスメッシュ（サイズ６０）を通して、肝臓および脾臓を押しつぶした。細胞懸濁液を５０ｍＬ試験管に３分間入れて、冷ＰＢＳで２回洗浄し（１，２５０×ｒｐｍで１０分間）残骸を除去した。細胞をＰＢＳに再懸濁し、細胞懸濁液をＰＢＳに予浸されたナイロンメッシュに通して、非結合細胞を収集した。細胞を４５ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した（１，２５０×ｒｐｍ、室温）。肝臓および脾臓リンパ球単離のためには、５０ｍＬ試験管内で、７ｍＬのＰＢＳに懸濁した細胞の下側に、ミズーリ州セントルイスのシグマ・ダイアグノスティックス（Sigma Diagnostics(St.Louis,MO))からの２０ｍＬのヒストパック(Histopague)１０７７を緩慢に入れた。試験管を室温で１５分間１，６４０ｒｐｍで遠心分離した。境界面の細胞を収集して５０ｍＬ試験管内で希釈し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した（１，２５０ｒｐｍで１０分間）。マウス肝臓１個あたりおよそ１×１０６個の細胞が回収された。トリパンブルー染色による生存度は９５％を超えた。全実験群の全動物から、脾細胞および肝臓関連リンパ球の双方を単離した。
【０１６３】
ＣｏｎＡ肝炎の誘発
シグマ(Sigma)からのＣｏｎＡを、発熱物質を含まないＰＢＳに溶解して、マウス１匹あたり５００μｇ（およそ１５ｍｇ／ｋｇ）の用量で、尾静脈内注射した。
【０１６４】
ＮＫＴ、ＣＤ４、およびＣＤ８マーカーのための肝臓内および脾臓内リンパ球のＦＡＣＳ
リンパ球単離のすぐ後に、三連の２〜５×１０４個の細胞／５００μＬ  ＰＢＳをファルコン(Falcon)２０５２試験管に入れて、４ｍＬの１％ＢＳＡと共に１０分間インキュベートし、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離した。抗ＮＫ１．１、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、および抗ＣＤ−８抗体を使用して、リンパ球亜集団の分析を実施した。細胞を１％ＢＳＡ中で２回洗浄して、読み取りまで４℃に保った。対照群には、５μＬの１％ＢＳＡのみを添加した。ベクトン・ディキンソン(Becton Dickinson)からの蛍光活性化細胞選別機（ファクスタープラス(FACSTAR plus)）によって、各群からの１×１０４個の細胞に対して分析的細胞選別を実施した。生細胞のみを計数し、得られたレベルから非抗体処理リンパ球からの背景蛍光を差し引いた。ゲートを前方−および側方−散乱に設定して、死細胞および赤血球を除外した。カリフォルニア州オックスナードのベクトン・ディキンソン(Becton Dickinson(Oxnard,CA))からのコンソート(Consort)３０二色輪郭プロットプログラム、またはセルクエスト(CELLQuest)プログラムによってデータを分析した。
【０１６５】
サイトカインレベルの測定
全群のマウスから血液を採取して、１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。マサチューセッツ州のジェンザイム・ダイアグノスティックス(Genzyme Diagnostics(MA))からのＧ酵素診断用キットを使用して、「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡによって血清ＩＦＮγ、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ１０、およびＩＬ−１２レベルを測定した。
【０１６６】
グルコース耐性試験
体重１ｋｇあたり１ｇのグルコースの経口投与によって、グルコース耐性を評価した。０’、１５’、３０’、６０’、９０’、１２０’、および１８０’において尾から採取した血液をグルコースについて測定した。グルコースレベルは、エリート(Elite)グルコース試験ストリップおよびグルコメーター(glucometer)によって測定した。
【０１６７】
肝臓脂肪含量のＭＲＩ測定
マウス肝臓中の脂肪アセスメント／定量化のために、単回収集で同相および逆相画像を提供する、二重エコー化学シフト勾配エコー磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）配列を使用して、肝臓脂肪含量を測定した。Ｔ１−加重逆相ＭＲ画像法技術は、比較的少量の組織脂肪検出において感度が高い。ＭＲＩ画像は、米国ミルウォーキーのＧＥ(GE(Milwaukee,USA))からの１．５−Ｔシステム（シグマＬＸ(SigmaLX)）によって実施した。二重エコーＭＲ画像法は、１２５ｍｓｅｃの繰返し時間（ＴＲ）、４および６．５ｍｓｅｃの二重エコー時間（ＴＥｓ）、および８０°のフリップ角で実施した。画像法パラメーターには、３ｍｍのセクション厚さ、１３ｃｍの視野、２５６＊１６０のマトリックス、およびニーコイルを使用しての単一シグナル獲得が含まれた。３ｍｍのセクション厚さおよび交差ギャップなしで、肝臓レベルにおいて横行性（軸方向）および冠状画像を獲得した。同相および逆相画像間のＳＩ変化のシグナル強度（ＳＩ）測定の定量的アセスメントは、以前の報告で述べられるようにして計算した［Mitchell, D.G. et al., Invest. Radiol 26:1041-1052 (1991); Tomohiro, N. et al., Radiology 218:642-646 (2001)］。ＳＩ指数は次のようにして計算した。
ＳＩ指数＝（ＳＩｉｐ−Ｓｉｏｐ）／ＳＩｉｐ
式中、ＳＩｉｐは同相画像上のＳＩであり、Ｓｉｏｐは逆相画像上のＳＩである。ＳＩ指数は、同相画像上のＳＩと比較した逆相画像上のＳＩ損失の割合を反映する。
【０１６８】
組織学的検査
パラフィン包埋肝臓切片のヘマトキシリン／エオジン染色を実施した。２人の熟練した病理学者が、実験条件について盲検法で切片を検査した。
【０１６９】
実施例１
免疫媒介結腸炎治療のためのβ−糖脂質の使用
実験的結腸炎のマウスモデルに対する、β−グルコシルセラミド（ＧｌｕＣ）、β−ラクトシル−セラミド（ＬａｃＣ）、およびβ−ガラクトシル−セラミド（ＧａｌＣ）などのβ−糖脂質投与、およびセラミド投与の臨床および免疫学的効果を判定するために、各１０匹のマウスからなる９群のＣ５７Ｂ１マウスを調べた。表１に要約するように、Ａ〜Ｅ群で、１および５日目にトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）の結腸内投与によって結腸炎を誘発した。Ａ群のマウスには常用の固形飼料を給餌した。Ｂ〜Ｅ群のマウスには、それぞれ経口（ＰＯ）１５μｇのＧｌｕＣ、ＬａｃＣ、ＧａｌＣ、およびセラミドを毎日与えた。Ｆ〜Ｉ群のマウスはＴＮＢＳで処置しなかったが、それぞれ経口（ＰＯ）１５μｇのＧｌｕＣ、ＬａｃＣ、ＧａｌＣ、およびセラミドを毎日与え、対照群とした。
【０１７０】
マウスを巨視的および顕微鏡的結腸炎スコアについて経過観察した。ＮＫＴ、ＣＤ４、およびＣＤ８マーカーに関する肝臓内および脾臓内リンパ球のＦＡＣＳ分析によって、そして血清ＩＦＮγ、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ４、およびＩＬ１０サイトカインレベルの測定によって、ＧＣの免疫調節効果を判定した。
【０１７１】
【表１】
2009517378.tif 000002
【０１７２】
図１に示すように、β−糖脂質の投与は結腸炎の改善をもたらし、ＬａｃＣで最も著しく、対照と比較して顕微鏡的結腸炎スコアの改善があった。β−糖脂質処置による結腸炎の改善は、肝臓内ＣＤ８＋Ｔ細胞捕捉の顕著な増大と関連付けられた（図３）。ＴＮＢＳ結腸炎に対するβ−糖脂質の有益な効果は、肝臓内ＮＫＴ細胞数の増大と関連付けられた。図２に明らかに示されるように、β−糖脂質の投与は、血清ＩＦＮγレベルの低下およびＩＦＮγ／ＩＬ−１０比率の低下をもたらした。対照群（Ｆ−Ｉ）によって実証されるように、無処置マウスへの異なるβ−糖脂質の投与は、機能の状態、体重、肝臓および結腸病理学に悪影響を及ぼさなかった。
【０１７３】
データは明らかに、β−糖脂質がマウスのモデルにおいて実験的結腸炎を改善することを示唆する。この改善には肝臓内ＮＫＴリンパ球増大、肝臓内ＣＤ８Ｔリンパ球捕捉増大、およびＴｈ２サイトカインプロフィールに向けたシフト（ＩＦＮγ／ＩＬ−１０比率の低下によって示唆されるように）が伴った。この効果の程度は、使用される異なる糖脂質に従って変動する。この点においては、ラクトシル−セラミド（ＬＣ）が最も強力であることが分かった。
【０１７４】
実施例２
免疫媒介結腸炎の治療におけるβ−糖脂質混合物の相乗効果
異なるβ−糖脂質混合物の可能な免疫調節効果を判定するために、結腸炎のマウスモデルを使用してβ−グルコセレブロシド（ＧＣ）およびβ−ラクトシル−セラミド（ＬＣ）の混合物の効果を試験した。
【０１７５】
表２に要約するように、それぞれ１０匹からなる５群のマウスについて調べた。Ａ、Ｂ、およびＤ群で、１日目および５日目にトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）の結腸内投与によって結腸炎を誘発した。Ａ群のマウスには常用の固形飼料を給餌した。Ｂ群のマウスにはβ−ＧｌｕＣ（ＧＣ）およびβ−ＬａｃＣ（ＬＣ）の混合物を経口（ＰＯ）で毎日１５μｇ投与し、Ｄ群にはβ−ＬａｃＣのみを投与した。ＣおよびＥ群のマウスはＴＮＢＳで処置しなかったが、それぞれβ−ＧｌｕＣおよびβ−ＬａｃＣの混合物、またはβ−ＬａｃＣのみを経口（ＰＯ）で毎日１５μｇ投与して対照群とした。
【０１７６】
マウスを巨視的および顕微鏡的結腸炎スコアについて、ならびに生存率および機能の状態および体重について経過観察した。
【０１７７】
【表２】
2009517378.tif 000003
【０１７８】
β−ＧｌｕＣ＋β−ＬａｃＣ混合物の明らかな相乗効果が、図４によって実証される。この図によって示されるように、β−ＧｌｕｃＣおよびβ−ＬａｃＣ双方の混合物の投与は、下痢、潰瘍紅斑、厚さ、および癒着減少によって示唆されるように、ＴＮＢＳ誘発性結腸炎の顕著な回復をもたらした。この効果は、β−ＬａｃＣ単独の効果と比較すると、β−ＧｌｕＣ＋β−ＬａｃＣ混合物群においてはるかにより顕著であった。表３によって示唆されるように、β−ＧｌｕＣ＋β−ＬａｃＣ混合物の相乗効果は、改善された機能の状態、体重、および生存率の４０％増大によってさらに実証された。
【０１７９】
【表３】
2009517378.tif 000004
【０１８０】
実施例３
免疫媒介結腸炎の治療に対するβ−糖脂質混合物の効果
結腸炎のための薬物療法としてのβ−糖脂質の可能な利用についてさらに調べるために、本発明者らは次に、肝臓内ＮＫＴ調節リンパ球およびリンパ球捕捉に対するＧＣおよびＬＣの組み合わせの効果を判定した。
【０１８１】
４群のマウスについて調べた。トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）の結腸内投与によって免疫媒介結腸炎を全群で誘発した。Ｂ〜Ｄ群は、それぞれグルコシルセラミド（ＧＣ）、ラクトシルセラミド（ＬＣ）、およびＧＣとＬＣ双方の組み合わせ（１：１比率）の毎日の投与で処置した。対照Ａ群のマウスには溶剤のみを投与した。巨視的および顕微鏡的結腸炎スコアについて、マウスを評価した。ＮＫＴ、ＣＤ４、およびＣＤ８マーカーに関する肝臓内および脾臓内リンパ球のＦＡＣＳ分析によって、そして血清サイトカインレベルの測定によってβ−糖脂質の免疫調節因子効果を判定した。
【０１８２】
表４に示すように、β−糖脂質の投与は、肝臓内／末梢性ＮＫＴ比率の増大（ｐ＜０．０５）、および末梢性／肝臓内ＣＤ４＋／ＣＤ８＋比率の低下をもたらした。β−糖脂質は、生存率の４３％の増大と、巨視的および顕微鏡的スコアの改善（ｐ＜０．０５）がある顕著な結腸炎の改善とをもたらし、Ａ群との比較で（ｐ＜０．０１）、Ｂ〜Ｄ群中の血清ＩＦＮγレベルおよびＩＦＮγ／ＩＬ−１０比率の低下をもたらした。
【０１８３】
これらの結果は、ＧＣおよびＬＣの組み合わせが、ＮＫＴ調節リンパ球再分布、肝臓内Ｔリンパ球捕捉の増大をもたらして、免疫媒介結腸炎を改善することを明らかに示唆する。
【０１８４】
【表４】
2009517378.tif 000005
【０１８５】
実施例４
結腸炎における混合糖脂質−異なる混合比率の判定
２つの最も強力なβ−糖脂質であるβ−グルコセレブロシドおよびβ−ラクトシル−セラミドの異なる組み合わせを試験して、最も効果的な混合物の組み合わせを同定するために、結腸炎のマウスモデルを使用して双方の糖脂質の異なる定量的比率（１：１、１：１０、および１：１００）を使用した。
【０１８６】
表５に要約するように、それぞれ１０匹のマウスからなる９群のＣ５７ＢＬマウスを調べた。全群で１日目および５日目に、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）の結腸内投与によって結腸炎を誘発した。Ａ群のマウスには常用の固形飼料を給餌した。Ｂ〜Ｆ群のマウスには、表に示すような異なる比率のβ−ＧｌｕＣおよびβ−ＬａｃＣ（ＧＣおよびＬＣ）混合物を毎日経口（ＰＯ）投与した。Ｇ−Ｉ群には、β−ＬａｃＣのみを投与した。
【０１８７】
マウスを巨視的および顕微鏡的結腸炎スコアについて、ならびにＦＡＣＳによって脾臓および肝臓（プールしたものでない）内の異なる細胞集団であるＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫＴについて、そしてＥＬＩＳＡによって血清サイトカインであるＩＦＮγおよびＩＬ４について経過観察した。
【０１８８】
図５によって示されるように、異なる比率でのβ−ＧｌｕｃＣおよびβ−ＬａｃＣの異なる混合物の投与は、下痢、潰瘍紅斑、厚さ、および癒着の減少によって示唆されるように、ＴＮＢＳ誘発性結腸炎に顕著な回復をもたらした。この効果はβ−ＬａｃＣ単独の効果と比較すると、全ての３つの異なる混合比率で特に顕著であった。図６によって示されるように、血清ＩＦＮγレベルの検査は、１５μｇＧＣ＋１５０μｇＬＣおよび１．５μｇＧＣ＋１５０μｇＬＣの混合物の双方が、ＩＦＮγレベルの顕著な減少を引き起こす上で最も効果的であることを明らかに示唆した。これはＴｈ２応答に向けた有益なシフトを反映する。これらの２つの混合物、特に１５μｇＧＣ＋１５０μｇＬＣの混合物はまた、ＩＦＮγ／ＩＬ４比率の低下においても最も効果的であり、図７によって示されるように有益なＴｈ２シフトが示唆された。図８および９によって示されるように、これらの混合物の有益な効果はまた、肝臓内ＮＫＴおよびＣＤ８リンパ球の増大も伴った。要約すると、生存率改善（４０％の増大）、機能の状態と体重の改善、およびＴｈ２応答への明らかなシフトによってもまた実証されるように、ＧＣおよびＬＣの異なる組み合わせは、ＴＮＢＳ誘発性結腸炎の顕著な回復をもたらした。最も有益な効果は、１５μｇＧＣ＋１５０μＬＣ混合物によって引き起こされることが示唆される。
【０１８９】
【表５】
2009517378.tif 000006
【０１９０】
実施例５
免疫肝細胞癌の治療のためのβ−糖脂質の使用
結腸炎モデルによって実証された異なるβ−糖脂質、および特にＧＣ＋ＬＣ混合物の免疫調節効果は、本発明者らに、肝細胞癌（ＨＣＣ）などのその他の免疫関連障害をさらに調査するよう促した。そのため次に、ヒトＨｅｐ３Ｂ  ＨＣＣを組織移植したマウスを使用して、肝細胞癌（ＨＣＣ）に対するβ−グルコシルセラミド（ＧｌｕＣ）、β−ラクトシル−セラミド（ＬａｃＧ）、およびβ−ガラクトシル−セラミド（ＧａｌＣ）、およびセラミドの投与の臨床および免疫学的重要性を調査した。各８匹のマウスからなる５群の胸腺欠損Ｂａｌｂ／ｃマウスに亜致死量放射線を照射して、ヒトＨｅｐ３Ｂ  ＨＣＣを組織移植し、ＧｌｕＣ、ＬａｃＣ、ＧａｌＣ、セラミド（１００μＬのＰＢＳ中１．５μｇ）またはＰＢＳ（１００μ）の毎日の腹腔内注射が、２５日間にわたってそれに続いた。腫瘍のサイズおよび重量、肝臓内および脾臓内リンパ球亜集団、血清サイトカインレベル、および脾細胞中のＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ４、およびＳＴＡＴ６発現について、動物を経過観察した。異なる試験群を表６に要約する。
【０１９１】
【表６】
2009517378.tif 000007
【０１９２】
図１０に示すように、β−糖脂質およびセラミドの投与は、ＨＣＣの著しい抑止をもたらした。腫瘍は、１００％の対照と比較して、ＧｌｕＣ、ＬａｃＣ、ＧａｌＣ、およびセラミド処置動物のそれぞれ８７％、４３％、７１％、および５０％で発生した。図１１はさらに、最大腫瘍体積が、対照の１０１．１４ｍｍ３（ｐ＜０．０５）と比較して、ＧｌｕＣ、ＬａｃＣ、ＧａｌＣ、およびセラミド処置動物において、それぞれ７１．４、７７．９、８６．１、および６４．４ｍｍ３であったことを示す。さらに図１２は、対照（ｐ＜０．０５）における腫瘍体積の１０％の増大とは対照的に、ＧｌｕＣ、ＬａｃＧ、ＧａｌＣ、およびセラミド処置マウスにおいて、腫瘍体積がそれぞれ４３％、７８％、４９％、および８１％減少したことを示す。体重は、群毎に顕著に異ならなかった。図１３に示すように、有益なβ−糖脂質の効果は肝臓内のＮＫＴリンパ球の増大と関連付けられた（Ａ、Ｂ、Ｄ、およびＥ群における群肝臓／脾臓のＮＫＴリンパ球比率は、それぞれ６．１３、１．９４、０．８５、および０．３８である；ｐ＜０．０５）。図１４は、β−糖脂質の効果が、肝臓内ＣＤ８Ｔリンパ球捕捉の増大とさらに関連付けられていることを示す。図１５に示すように、脾細胞中のＳＴＡＴ１の発現は、対照と比較して糖脂質処置マウスで増大し、ＳＴＡＴ４およびＳＴＡＴ６発現はＬａｃＣ、ＧａｌＣ、およびセラミド処置動物において増大した。血清サイトカインレベルが、群間で顕著に異ならなかったことに留意すべきである（データ示さず）。
【０１９３】
これらの結果は、ＨＣＣなどのその他の免疫関連障害治療のために、β−糖脂質を使用することの実現可能性を明らかに実証する。β−糖脂質の投与は、肝臓内ＮＫＴリンパ球増大、肝臓内ＣＤ８Ｔリンパ球捕捉増大、および脾細胞中のＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ４、およびＳＴＡＴ６の発現増大を伴うＨＣＣの抑止をもたらした。これらの結果は、糖脂質糖のα構造が、ＮＫＴ細胞関連抗腫瘍効果のために必須でないかもしれないことを示唆する。
【０１９４】
実施例６
免疫肝細胞癌の治療に対するβ−糖脂質混合物の効果
本発明者らは、β−糖脂質の異なる組み合わせ、特にマウスＨＣＣモデルを使用して、結腸炎モデルで効果的であることが示されたＧＣおよびＬＣ（ＩＧＬ）の混合物の効果をさらに分析した。胸腺欠損Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝８／群）に亜致死量放射線を照射してヒトＨｅｐ３ＢＨＣＣを組織移植し、ＰＢＳ、ＧＣ、ＬＣまたはＩＧＬ（１００μＬのＰＢＳ中１．５μｇ；Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤの各群）の毎日の腹腔内注射が、２５日間にわたってそれに続いた。血清α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、および肝臓内および脾臓内のリンパ球亜集団について動物を経過観察した。
【０１９５】
ＧＣ、ＬＣ、およびＩＧＬの投与は、ＨＣＣの抑制を反映して血清ＡＦＰ低下をもたらし、それはＧＣ処置動物で最も顕著であった（Ａ群の１６９６００ｎｇ／ｍＬに対してＢ群では３４５６０ｎｇ／ｍＬ）。β−糖脂質の有益な効果は、肝臓内ＮＫＴリンパ球の増大と関連付けられている（、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ群で、それぞれ０．３８、６．１３、１．９４、および３．４１の肝臓／脾臓ＮＫＴリンパ球比率；ｐ＜０．０５）。
【０１９６】
したがってβ−糖脂質による脾細胞中の脂質ラフトの変更は、これらの化合物によるＨＣＣ抑止と関連付けられている免疫調節性抗腫瘍効果によって仲介されるかもしれない。
【０１９７】
実施例７
ＣｏｎＡ誘発性肝炎に対するβ−糖脂質およびそれらの混合物の効果
次に本発明者らは、ＣｏｎＡを注射したＣ５７／ｂｌマウスモデルを使用して、ＣｏｎＡ誘発性肝炎に対する異なるβ−糖脂質およびそれらの混合物の効果を分析した。
【０１９８】
群あたり１２匹のマウスの１４の実験群および対照群について調べた（表７）。実験群Ａ〜ＧのマウスにＣｏｎＡを注射した。Ａ群のマウスには、ＣｏｎＡのＩＶ投与２時間前に、１００μＬのＰＢＳを単回腹腔内注射で投与した。Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦ群のマウスには、ＣｏｎＡのＩＶ投与２時間前に、β−グルコシルセラミド、β−ガラクトシルセラミド、β−ラクトシルセラミド、ｉＧｂ３、セラミド、およびＩＧＬ（１：１比率のβ−グルコシルセラミドおよびβ−ラクトシルセラミド）をそれぞれ単回腹腔内注射（１００μＬのＰＢＳ中の１μｇ）で投与した。Ｈ〜Ｎ群のマウスには、ＣｏｎＡ投与なしで異なる糖脂質を同様に注射した。動物を糖脂質注射の１０時間後、ＣｏｎＡ注射の８時間後に屠殺した。
【０１９９】
血清アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）、アラニンアミノ転移酵素（ＡＬＴ）レベルの測定、および肝臓検体の組織学的検査によって、全試験群における肝障害に対する異なるβ−糖脂質による処置の効果を評価した。免疫応答に対するβ−糖脂質の効果のアセスメントは、肝臓内および脾臓内のリンパ球のＮＫＴマーカーについてのＦＡＣＳ分析、および血清サイトカインレベルの測定によって判定した。
【０２００】
【表７】
2009517378.tif 000008
【０２０１】
免疫応答に対するβ−糖脂質の効果の評価を図１６〜１８によって実証する。本発明者らは最初に、脾臓および肝臓内ＮＫＴリンパ球に対する効果を調べた。図１６Ａによって示されるように、ＣｏｎＡ投与は、ＮＫＴリンパ球数の顕著な減少と関連付けられた（ＨおよびＡ群で、それぞれ２２．５５対１．６６；ｐ＜０．００５）。ＣｏｎＡ処置群中では、β−糖脂質の投与が肝臓内ＮＫＴ細胞数の増大をもたらした（Ａ群と比較してＢ〜Ｇ群で；ｐ＜０．００２）。異なる糖脂質の効果間にばらつきが見られたが、これらの差はいずれも有意でなかった。
【０２０２】
無処置マウス（Ｉ〜Ｎ群）への糖脂質の投与は、肝臓内ＮＫＴ細胞数の減少をもたらした（２２．５から１．３まで；ｐ＜０．００５、Ｉ〜Ｎと比較してＩ群で）。異なる糖脂質間に顕著な差は見られなかった。脾臓では、ＣｏｎＡ投与ありまたはなしの全てのβ−糖脂質処置群において、ＮＫＴリンパ球数に統計学的に有意でない増大が観察された（図１６Ｂ）。
【０２０３】
肝臓／脾臓ＮＫＴ比率は、ＣｏｎＡを投与し、β−糖脂質で処置した全群で増大した。β−グルコシルセラミド、β−ラクトシルセラミド、およびＩＧＬは、図１６Ｃで実証されるように、試験されたその他の全糖脂質と比較して異なる効果を有した。３物質の全てについて、無処置動物では、Ｊ、Ｌ、およびＭ群との比較で、Ｉ、Ｋ、およびＮ群で、それぞれ２．０３、２．４４、および２．１６の有意により高い比率（ｐ＞０．００５）が見られた。同様にβ−グルコシルセラミド、β−ラクトシルセラミド、およびＩＧＬは、ＣｏｎＡ処置群において、肝臓／脾臓ＮＫＴリンパ球比率に対して異なる効果を発揮した。Ｃ、Ｅ、およびＦ群と比較して、Ｂ、Ｄ、およびＧ群のマウスは比較的より低い比率を有した（１．７９、２．６１、２．９１と比較して、それぞれ１．１６、１．２８、１．４６；ｐ＜０．００５；それぞれＢ、Ｄ、およびＧとＣ、Ｅ、およびＦとの比較）。
【０２０４】
次に図１７で実証されるように、脾臓および肝臓内ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球に対するβ−糖脂質の効果を調べた。脾臓対肝臓ＣＤ４／ＣＤ８リンパ球比率の顕著な低下（Ｂ、Ｄ、およびＧ群のマウスの１．２３、１．３８、および１．２４に対して、それぞれＣ、Ｅ、およびＦ群の１．５３、１．６１、および１．５３；ｐ＞０．００５；それぞれＢ、Ｄ、およびＧとＣ、Ｅ、およびＦとの比較）によって明らかなように、肝臓においてβ−グルコシルセラミド、β−ラクトシルセラミド、およびＩＧＬは、肝臓内ＣＤ８捕捉を顕著に低下させた。
【０２０５】
同様の肝臓内ＣＤ８捕捉減少効果は、β−グルコシルセラミド、β−ラクトシルセラミド、およびＩＧＬを投与した無処置動物でも見られた（図１７）。
【０２０６】
ｃｏｎＡ誘発性肝炎モデルにおける血清サイトカインレベルに対するβ−糖脂質の効果は、図１８によって実証される。図によって示されるように、血清ＩＦＮγレベルは、β−グルコシルセラミド、βラクトシルセラミド、およびＩＧＬ処置動物で顕著に低下した（Ｂ、Ｄ、およびＧ群のマウスの８６．１、１２６．８、および１８８．８ｐｇ／ｍＬに対して、それぞれＣ、Ｅ、およびＦ群の１２６４、１３４３、および１０５１；ｐ＜０．００５；それぞれＢ、Ｄ、およびＧとＣ、Ｅ、およびＦとの比較）。
【０２０７】
β−糖脂質で処置した動物では、ＣｏｎＡのみ（ｐＮＳ）で処置したものと比較して血清ＩＬ−１０レベルが低下した。処置および未処置群の間で血清ＩＬ−１２レベルに顕著な変化は見られなかった。
【０２０８】
これらの結果によって明らかに実証されるβ−グルコシルセラミド、βラクトシルセラミド、およびＩＧＬの有益な効果は、末梢性対肝臓内ＣＤ４／ＣＤ８リンパ球比率の低下と関連付けられており、相対的な肝臓内ＣＤ８リンパ球の減少が示唆される。この効果はまた、血清ＩＦＮγレベルの低下によって気づかれるように、ＣｏｎＡ誘発性肝炎の発病機序において重要な役割を果たすと考えられる、Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインパラダイムの変更とも関連付けられている。
【０２０９】
これらの結果に促されて本発明者らは、ＣｏｎＡ肝炎モデルを使用して肝臓損傷に対する異なるβ−糖脂質の効果をさらに調べた。したがって図１９ＡおよびＢによってそれぞれ実証されるように、全ての試験された群について、血清ＡＳＴおよびＡＬＴレベルを判定した。
【０２１０】
図で示されるように、β−グルコシルセラミド（ＧＣ）、β−ラクトシルセラミド（ＬＣ）、およびＩＧＬ混合物の投与は、血清ＡＳＴおよびＡＬＴレベルの低下（Ａ群の未処置動物の１８８１ＩＵと比較して、Ｂ、Ｄ、およびＧ群のマウスでそれぞれ１８２、２４４、および１７５ＩＵ；ｐ＜０．００５）によって明らかにされるように、ＣｏｎＡ誘発性肝炎を顕著に改善する。その他のβ−糖脂質は、有益な効果を発揮できなかった（Ｃ、Ｅ、およびＦ群でそれぞれ１４７８、１３３１、および８２３ＩＵ；ｐ＜０．００５；Ｂ、Ｄ、およびＧ群との比較）。
【０２１１】
興味深いことに、ＣｏｎＡ処置動物で有益な効果を発揮しなかった糖脂質のいくつかは、無処置マウスにおいて軽度の肝炎を誘発した。同様の効果は、ＡＳＴ血清レベルに対しても見られた。
【０２１２】
図２０によって示されるように、組織学的肝障害は、β−グルコシルセラミド、β−ラクトシルセラミド、およびＩＧＬ処置群において著しく弱毒化されていた。非処置対照Ａ群の６．０、およびＣ、Ｅ、およびＦ群のマウスのそれぞれ２．６６、３．０、および２．３３と比較すると、Ｂ、Ｄ、およびＧ群のマウスでは総肝臓スコアがそれぞれ１．５、１．７５、および１．１６に低下した（Ｂ、Ｄ、およびＧについてｐ＜０．００５；Ｃ、Ｅ、およびＦのそれぞれとの比較）。
【０２１３】
これらの結果は、ＣｏｎＡ誘発性肝炎などの免疫関連障害の治療に糖脂質、および特にＬＣおよびそれらの混合物を使用することの実現可能性を明らかに実証する。
【０２１４】
実施例８
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）治療のためのβ−糖脂質
β−糖脂質およびそれらの混合物の糖尿病に対する効果
糖尿病に対する異なるβ−糖脂質およびそれらの混合物の効果を評価するために、それぞれ１２匹のマウスからなる１２群のＣ５７ｂｌマウスについて調べる。Ａ〜Ｆ群のマウスはｏｂ／ｏｂマウスであるのに対し、Ｇ−Ｋ群はＣ５７ｂｌマウスである。Ａ〜Ｅ群およびＧ〜Ｋ群のマウスに、１４日間にわたって一日おきに１００μＬのＰＢＳ中１．５μｇの次のβ−糖脂質を腹腔内注射する。ＧｌｕＣ（Ａ、Ｇ群）、ＬａｃＣ（Ｂ、Ｈ）群、ＧａｌＣ（Ｃ、Ｉ群）、セラミド（Ｄ、Ｊ群）、およびＧｌｕＣとＬａｃＣの混合物（Ｆ、Ｌ群）。Ｆ群およびＬ群は、それぞれ無処置ｏｂ／ｏｂマウスおよび無処置Ｃ５７ｂｌマウスであり、無処置のまま対照の役割をする。
【０２１５】
１４日目に、各群の６匹のマウスに対してグルコース耐性試験を実施する。
【０２１６】
経口投与されたβ−糖脂質およびそれらの混合物のＮＡＳＨに対する効果
ＮＡＳＨモデルの様々な代謝および免疫構成要素に対する異なるβ−糖脂質およびそれらの混合物の効果を評価するために、それぞれ１２匹からなる１２群のＣ５７ｂｌマウスについて調べる。Ａ〜Ｆ群のマウスはｏｂ／ｏｂマウスであるのに対し、Ｇ〜Ｋ群はＣ５７ｂｌマウスである。Ａ〜Ｅ群およびＧ〜Ｋ群のマウスに、毎日量１５μｇの次のβ−糖脂質を１４日間にわたって経口投与する。ＧｌｕＣ（Ａ、Ｇ群）、ＬａｃＣ（Ｂ、Ｈ群）、ＧａｌＣ（Ｃ、Ｉ群）、セラミド（Ｄ、Ｊ群）、およびＧｌｕＣとＬａｃＣの混合物（Ｆ、Ｌ群）。Ｆ群およびＬ群は、それぞれ無処置ｏｂ／ｏｂマウスおよび無処置Ｃ５７ｂｌマウスであり、無処置のまま対照の役割をする。
【０２１７】
１４日目に、各群の６匹のマウスに対してグルコース耐性試験を実施する。
【０２１８】
肝臓脂肪含量に対するβ−糖脂質の効果
肝臓脂肪含量に対するβ−糖脂質およびそれらの混合物の効果を判定するために、それぞれ１２匹からなる１２群のＣ５７ｂｌマウスについて調べる。Ａ〜Ｆ群のマウスはｏｂ／ｏｂマウスであるのに対し、Ｇ〜Ｋ群はＣ５７ｂｌマウスである。Ａ〜Ｅ群およびＧ〜Ｋ群のマウスに、１４日間にわたって一日おきに１００μＬのＰＢＳ中１．５μｇの次のβ−糖脂質を腹腔内注射する。ＧｌｕＣ（Ａ、Ｇ群）、ＬａｃＣ（Ｂ、Ｈ）群、ＧａｌＣ（Ｃ、Ｉ群）、セラミド（Ｄ、Ｊ群）、およびＧｌｕＣとＬａｃＣの混合物（Ｆ、Ｌ群）。Ｆ群およびＬ群は、それぞれ無処置ｏｂ／ｏｂマウスおよび無処置Ｃ５７ｂｌマウスであり、無処置のまま対照の役割をする。
【０２１９】
肝臓脂肪含量を判定するために、実験の１４日目に全試験群のマウスに腹部ＭＲＩを行う。肝臓脂肪含量を判定して、ＳＩ指数ＩＰ−ＯＰ／ＩＰとして記述する。肝臓サイズもまた、面積で判定する。
【０２２０】
実施例９
糖尿病のプサモミス(psammomys)モデルにおける混合β−糖脂質
β−糖脂質の異なる組み合わせ、および特にβ−グルコセレブロシドとβ−ラクトシル−セラミドの混合物の糖尿病、代謝症候群、および肝臓脂肪症に対する効果を判定するために、糖尿病のプサモン(Psammon)モデルを使用した。栄養誘発性ＩＩ型糖尿病のモデルであるデブスナネズミ(Psammomys obesus)は、高エネルギー食によって、顕著な高インシュリン血症、高血糖症、および高トリグリセリド血症を生じる。高エネルギー食を与えた３群の５ヶ月齢のスナネズミを調べた（群あたりｎ＝１０匹）。動物を２５日間にわたって毎日、ＧＣ（Ａ群）、ＩＧＬ（Ｂ群）、またはＰＢＳ（Ｃ群）の腹腔内注射で処置した。２５日目に全てのプサモミス(psammomys)を屠殺して、次の分析によって調べた。
【０２２１】
肝臓脂肪含量および炎症の判定は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、肝臓生検、および血清アラニンアミノ転移酵素（ＡＬＴ）とアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）レベルの測定によって実施した。体重および食後血清グルコース、インシュリン、トリグリセリドおよび遊離脂肪酸（ＦＦＡ）レベルを評価した。Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスに対するＩＧＬの効果の機序を判定するために、転写因子ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、およびＳＴＡＴ６の発現を脾細胞中で判定した。
【０２２２】
表８によって示されるように、２つのβ−糖脂質ＧＣおよびＬＣ（ＩＧＬ）の組み合わせは、デブスナネズミ(P.obesus)の代謝変更を顕著に回復させ、ＧＣのみよりもさらに良い結果を示した。処置動物では、血漿インシュリンレベル低下（ｐ＝０．０１７、Ｂ群およびＣ間）、および血漿ＦＦＡ低下（ｐ＜０．０１）と並んで、平均食後グルコースレベルが低下した（ｐ＜０．０１、ＢおよびＣ群間）。この表によって明らかに示唆されるように、肝臓生検における肝臓脂肪症および脂肪性肝炎の回復、および血清ＡＬＴおよびＡＳＴレベルの正常化が見られた。ＩＧＬ処置動物ではＳＴＡＴ１および４の発現増大が観察された。しかし体重、肝重量、および血漿トリグリセリドレベルに顕著な変化は見られなかった。
【０２２３】
これらの結果は、デブスナネズミ(Psammomys obesus)において、２つのβ−糖脂質の組み合わせが血漿ＦＦＡレベルの低下と並んで、インシュリン抵抗性および肝臓損傷を顕著に回復したことを明らかに示唆する。したがってこれらの天然化合物はＮＡＦＬＤおよび代謝症候群の双方の治療のための有望な作用物質である。
【０２２４】
【表８】
2009517378.tif 000009
【０２２５】
実施例１０
糖尿病のコーエン(Cohen)ラットにおける非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および代謝症候群の回復は、膵臓損傷の低下と関連付けられている
糖尿病、肝臓脂肪症、および代謝症候群に対するβ−グルコセレブロシドとβ−ラクトシルセラミドの混合物の効果を判定するために、本発明者らはコーエン(Cohen)ラットモデルを使用した。コーエン(Cohen)ラットは、痩せ型のＩＩ型糖尿病非インシュリン抵抗性モデルであり、ゾーン１および２混合型小滴性および大滴性脂肪症と、血清アミノ基転移酵素上昇とを特徴とする。
【０２２６】
４群のコーエン(Cohen)ラットについて調べた（ｎ＝１０匹／群）。動物を４５日間にわたって毎日ＧＣ（Ａ群）、ＬＣ（Ｂ群）、ＩＧＬ（Ｃ群）、またはＰＢＳ（Ｄ群）の腹腔内注射で処置した。ＮＡＦＬＤの評価はＭＲ造影、肝臓生検、および血清アミノ基転移酵素測定によって実施した。代謝経過観察のパラメーターは、体重、経口グルコース耐性試験（ＯＧＴＴ）、血清脂質、および膵臓組織学を含んだ。免疫調節は、肝臓内および脾臓内のリンパ球のＦＡＣＳ分析によって評価した。
【０２２７】
表９で明らかに要約されるように、ＬＣおよびＩＧＬの投与は、肝臓脂肪含量および血清アミノ基転移酵素（ＡＬＴおよびＡＳＴ）の低下をもたらした。ＯＧＴＴでは、糖脂質はグルコース曲線下領域で顕著に減少し、インシュリン曲線下領域で増大した。ＩＧＬによる処置は、血清トリグリセリドの顕著な低下をもたらした。対照群膵臓（Ｄ群）に特徴的な著しい脂肪浸潤、萎縮症および線維症とは対照的に、全ての処置群において膵臓の組織学は著しく改善された。β−糖脂質処置は、体重、肝臓組織学または血清コレステロールに影響しなかった。ＬＣおよびＩＧＬ処置動物では肝臓内ＣＤ８Ｔリンパ球捕捉の増大、ＧＧ処置動物では肝臓内／脾臓内ＮＫＴ細胞比率の増大が観察された。
【０２２８】
これらの結果は、ＧＣおよびＬＣの組み合わせが、いずれかの糖脂質単独での治療的利点を超える治療的利点を有したことを示し、処置動物における膵臓傷害の著しい回復および改善されたインシュリン分泌と関連付けられた。処置群におけるリンパ球亜集団の変化は、追加的免疫調節効果を示唆するかもしれない。したがってこのモデルの使用はまた、β−糖脂質組み合わせの投与が、ＮＡＦＬＤおよび代謝症候群のための治療様式として有望であることも明らかに示唆する。
【０２２９】
【表９】
2009517378.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【０２３０】
図面の簡単な説明
【図１】ＴＮＢＳ結腸炎誘発マウスモデルの病状スコアに対する糖脂質の効果。略語：ｓｃ．（スコア）、Ｅｘｔ．（程度）、Ｉｎｆｌａｍ．（炎症）、Ｄａｍ．（損傷）、Ｒｅｇ．（再生）、ＯＰ（経口）。
【図２】ＴＮＢＳ結腸炎誘発マウスモデルの血清サイトカインレベルに対する糖脂質の効果。略語：ＯＰ（経口）、ｐｇ／ｍＬ（ピコグラム／ミリリットル）。
【図３】ＴＮＢＳ結腸炎誘発マウスモデルのＴリンパ球分布に対する糖脂質の効果。略語：ＯＰ（経口）、Ｐｅｒ．（末梢性）、Ｌｉｖ．（肝臓）、Ｒａｔ．（比率）。
【図４】結腸炎の巨視的スコアに対するＧＣおよびＬＣの組み合わせによる処置の効果。略語：Ｄｉａ（下痢）、Ｕｌｃ．（潰瘍）、Ｅｒｙ．（紅斑）、Ｔｈ．（厚さ）、Ａｄ．（癒着）。
【図５】結腸炎の巨視的スコアに対するＧＣおよびＬＣの異なる比率の組み合わせによる処置の効果。略語：Ｄｉａ（下痢）、Ｕｌｃ．（潰瘍）、Ｅｒｙ．（紅斑）、Ｔｈ．（厚さ）、Ａｄ．（癒着）。
【図６】ＴＮＢＳ誘発結腸炎マウスの血清ＩＦＮγレベルに対するＧＣおよびＬＣの異なる比率の組み合わせによる処置の効果。
【図７】ＴＮＢＳ誘発結腸炎マウスのＩＦＮγ／ＩＬ４比率に対するＧＣおよびＬＣの異なる比率の組み合わせによる処置の効果。
【図８】ＧＣおよびＬＣの異なる比率の組み合わせによる処置は、肝臓ＣＤ８およびＮＫＴの増大をもたらし、ＴＮＢＳ誘発結腸炎マウスにおける試験された糖脂質の有益な効果を実証する。略語：ｌｉｖ．（肝臓）。
【図９】ＴＮＢＳ誘発結腸炎マウスの肝臓内ＣＤ８＋Ｔリンパ球捕捉（脾臓／肝臓ＣＤ４／ＣＤ８比率）に対するＧＣおよびＬＣの異なる比率の組み合わせによる処置の効果。略語：ｌｉｖ．（肝臓）、ｓｐ．（脾臓）。
【図１０】ＨＣＣマウスモデルを使用した腫瘍発達（％）に対する糖脂質の効果。
【図１１】ＨＣＣマウスモデルを使用した最大腫瘍体積（ｍｍ３）に対する糖脂質の効果。
【図１２】ＨＣＣマウスモデルを使用した腫瘍進行（最大体積からの％変化）に対する糖脂質の効果。
【図１３】ＨＣＣマウスモデルを使用した肝臓／脾臓のＮＫＴリンパ球比率に対する糖脂質の効果。
【図１４】ＨＣＣマウスモデルを使用した肝臓内ＣＤ８＋Ｔリンパ球捕捉（脾臓／肝臓ＣＤ４／ＣＤ８比率）に対する糖脂質の効果。
【図１５】ＨＣＣマウスモデルを使用したＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ４、およびＳＴＡＴ６の発現（ＯＤ×ｍｍ２）に対する糖脂質の効果。
【図１６Ａ−１６Ｃ】ＣｏｎＡ誘発する肝炎モデルに対する脾臓および肝臓内ＮＫＴリンパ球に対する異なるβ−糖脂質の効果。
【図１６Ａ】肝臓内ＮＫＴ細胞。
【図１６Ｂ】脾臓ＮＫＴ細胞。
【図１６Ｃ】肝臓／脾臓ＮＫＴ細胞比率。略語：Ｅｘｐ．（実験的）、ｇｒ．（群）。
【図１７】ＣｏｎＡ誘発肝炎モデルを使用した脾臓および肝臓内ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球に対するβ−糖脂質の効果。略語：Ｅｘｐ．（実験的）、ｇｒ．（群）。
【図１８】ＣｏｎＡ誘発肝炎モデルを使用した血清サイトカインレベル（ＩＦＮγ）に対するβ−糖脂質の効果。略語：Ｅｘｐ．（実験的）、ｇｒ．（群）
【図１９Ａ−１９Ｂ】ＣｏｎＡ誘発肝炎モデルを使用した肝障害に対する異なるβ−糖脂質の効果。
【図１９Ａ】血清ＡＳＴレベル。
【図１９Ｂ】血清ＡＬＴレベル。略語：Ｅｘｐ．（実験的）、ｇｒ．（群）。
【図２０】ＣｏｎＡ誘発肝炎モデルを使用した肝臓組織学に対するβ−糖脂質の効果。略語：Ｅｘｐ．（実験的）、ｇｒ．（群）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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