(57)【要約】本発明は、酵素によって開裂されることができるリンカーを介して他の粒子二結合された粒子を含んでなる粒子凝集体を提供する。この粒子は、リンカーによって他の粒子に直接結合されてよく、または結合部分によって間接的に結合されてもよい。本発明はまた、酵素によって開裂されることができるリンカーを介して結合部分に結合された粒子を提供する。本発明は、酵素に関連した疾患または状態の診断において、またはこのような疾患または条件を治療するために使用されてよく、その場合、薬物はリンカーが酵素によって開裂されるまで粒子凝集体中に保持される。【選択図】      なし
2009517452.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素により開裂されることができるリンカーを介して他の粒子に連結された粒子を含んでなる粒子凝集体。
【請求項２】
請求項１に記載の凝集体であって、前記酵素によるリンカーの開裂が可逆的である凝集体。
【請求項３】
請求項１に記載の凝集体であって、前記酵素によるリンカーの開裂が不可逆的である凝集体。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の凝集体であって、前記酵素によるリンカーの開裂が、前記粒子上に現れる斥力部分を生じ、これは、該斥力部分の間の反発の故に前記凝集体のディスアセンブリーを向上させる凝集体。
【請求項５】
請求項４に記載の凝集体であって、前記斥力部分は、静電気的反発によって他の斥力部分を反発させる帯電部分である凝集体。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の凝集体であって、前記酵素がヒドロラーゼである凝集体。
【請求項７】
請求項６に記載の凝集体であって、前記リンカーがペプチドであり、前記酵素がプロテアーゼである凝集体。
【請求項８】
請求項５に従属するときの請求項７に記載の凝集体であって、前記帯電部分がアミンである凝集体。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載の凝集体であって、前記粒子がナノ粒子である凝集体。
【請求項１０】
請求項９に記載の凝集体であって、前記ナノ粒子が金ナノ粒子である凝集体。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか１項に記載の凝集体であって、前記粒子は前記リンカーによって他の粒子に直接連結される凝集体。
【請求項１２】
請求項１〜１０の何れか１項に記載の凝集体であって、前記粒子は結合部分によって間接的に連結される凝集体。
【請求項１３】
請求項１２に記載の凝集体であって、前記結合部分が多価である凝集体。
【請求項１４】
請求項１１または１２に記載の凝集体であって、前記結合部分がそれらの疎水性によって相互に結合する凝集体。
【請求項１５】
請求項１４に記載の凝集体であって、前記結合部分がフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）である凝集体。
【請求項１６】
請求項１〜１５の何れか１項に記載の凝集体であって、更に、前記リンカーが前記酵素によって開裂されるときに放出される薬物を含んでなる凝集体。
【請求項１７】
酵素によって開裂されることができるリンカーを介して結合部分に結合された粒子。
【請求項１８】
請求項１７に記載の粒子であって、請求項２〜１５の何れか１項に記載の特徴によって修飾された粒子。
【請求項１９】
請求項１〜１６の何れか１項に記載の粒子凝集体を製造する方法であって、粒子を、酵素によって開裂されることができるリンカーを介して他の粒子に連結することを含んでなる方法。
【請求項２０】
医薬において使用するための、請求項１〜１６の何れか１項に記載の粒子凝集体または請求項１７または１８に記載の粒子。
【請求項２１】
酵素に関連した疾患または状態を診断するための診断薬の製造における、請求項１〜１６の何れか１項に記載の粒子凝集体または請求項１７または１８に記載の粒子の使用。
【請求項２２】
酵素に関連した疾患または状態を診断するための診断薬の製造における、酵素により開裂されることができるリンカーを介して他の粒子に連結された粒子および薬物を含んでなる粒子凝集体の使用であって、前記薬物は、前記リンカーが前記酵素によって開裂されるまで前記凝集体の中に保持される使用。
【発明の詳細な説明】
【背景】
【０００１】
本発明は粒子に関する。更に特定すれば、それは酵素に応答した、粒子凝集体の選択的なディスアセンブリーおよび／またはアセンブリーに関する。一定の側面において、この酵素に応答した粒子凝集体の分解は、疾患の診断および治療において使用される。
【０００２】
最近、医療およびエンジニアリングサイエンスにおける検知、触媒、輸送および他の応用について潜在的に有用な新規材料および装置を生じさせるために、広範な研究的努力が、無機ナノ粒子の制御されたアセンブリーおよびディスアセンブリーに向けられてきた（Niemeyer, Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 4128）。これらの調整可能および／またはスイッチ可能なナノ材料は、バイオ検知および薬物送達のような医療科学における一定の応用についての可能性を有している。このような応用のために、生理学的にアクセス可能な環境的条件によってトリガーされるときに斯かる構造体を動的にアセンブリーおよびディスアセンブリーする能力は価値を有するであろう（Stevens, et al, Advanced Materials, 2004 16, 915）。以前の研究は、ナノ粒子の（ディス）アセンブリーを指令するために、ＤＮＡの高度に特異的なバイオ分子認識システム、ストレプトアビジン／ビオチンシステム、および抗体／抗原システムの使用を記載している（Mirkin, et al, Nature 1996, 382, 607; Rosi & Mirkin, Chem. Rev., 2005, 105, 1547−1562; Katz & Willner, Angewandte Chemie, 2004, 43, 6042-6108）。これらのシステムは、それらが敏感であり、迅速な応答を与え、専門的な装置に依存せず、また生物学的条件に適合するので、診断ツールとして莫大な能力を有している。ナノ構造を（ディス）アセンブルするために使用できる刺激には、温度、溶媒極性、イオン濃度（ｐＨを含む）、光、磁界または電界が含まれる。これらの刺激は、通常は微小環境を破壊するので、常に生物学的流体と適合するわけではない。殆どの生物学的相互作用は、極めて狭い環境的変動にしか耐えることができない。
【０００３】
ナノ粒子のアセンブリー状態を制御するために酵素の触媒作用を利用した、バイオ検知における用途を備えた多くのシステムが最近記載された。これらのシステムにおいて、ナノ粒子表面は、隣接するナノ粒子上の連結基との共有結合性または非共有結合性相互作用を形成できる酵素感受性分子で修飾される。酵素によってトリガーされるときに、ナノ粒子のアセンブリーおよびディスアセンブリーが生じ得る。Ｚｈａｏ等は、プロテアーゼ活性を検出するための磁気緩和スイッチとして、磁気ナノ粒子を含むアプローチを使用した（Zhao, et al, Angew. Chem., Int. Ed., 2003, 42, 1375−1378）。このアプローチにおいて、プロテアーゼ感受性配列には両端にビオチン分子が隣接していたのに対して、ナノ粒子はアビジンでコーティングされた。このアプローチでは、酵素作用の後に、ナノ粒子が別途添加される。このように、現在のところ、それは酵素作用のリアルタイムのモニタリングには向いていない。Ｋａｎａｒａｓ等は、多くのＤＮＡ制限酵素および連結酵素が、ＤＮＡ被覆された金ナノ粒子の異なるポピュレーションをアセンブルするために使用できることを示した（Kanaras, et al, Angew. Chem., Int. Ed., 2003, 42, 191−194）。このアプローチでは、ナノ粒子の２以上の別々のポピュレーションが必要とされる。
【０００４】
本発明者等は、酵素反応によってトリガーされ、従って生物学的流体に適用できる、ナノ粒子凝集体を可逆的にアセンブリー／ディスアセンブリーするための戦略を見出した。
【０００５】
第一の側面において、本発明は、酵素によって開裂できる結合を介して他の粒子に結合された粒子を含んでなる粒子凝集体を提供する。
【０００６】
第二の側面において、本発明は、前記第一の側面の粒子凝集体を作製するための方法であって、酵素によって開裂できる結合を介して粒子を他の粒子に結合させることを含んでなる方法を提供する。
【０００７】
一つの実施形態において、当該粒子は、リンカーによって他の粒子に直接結合される。もう一つの実施形態において、当該粒子は結合部分によって間接的に結合される。この実施形態において、当該粒子はリンカーによって結合部分に結合され、該結合部分が相互に結合する。何れの実施形態においても、酵素による当該結合の開裂は、可逆的であっても不可逆的であってもよい。
【０００８】
第三の側面において、本発明は、酵素によって開裂できるリンカーを介して結合部分に結合された粒子を提供する。
【０００９】
添付の非限定的な図面を参照して、本発明を更に説明する。
【００１０】
本発明において、酵素は、粒子間の結合を制御するために使用され、従って、粒子凝集体のディスアセンブリーおよび／またはアセンブリーを媒介する。この点において、酵素は、従来の化学的方法に対して顕著な利点を有している：
・それらは独特に、化学的、位置的および鏡像体的に選択的である。
【００１１】
・それらは、温和な条件下で働く（例えば、水性、ｐＨ５〜８）；
・多くはインビボにおいて表面付近の反応を触媒し、従って界面における反応を触媒するように十分に装備される（Castner & Ratner, Surface Science 2002. 500, 28）；
・それらの反応は適切な条件下において可逆的であり、有利な方向が表面において調節できる（実際に最近になって、リパーゼおよびプロテアーゼの両者が、「逆加水分解」、即ち、適切な条件下の表面においてアミンまたはアルコールのカルボン酸への結合のために使用できることが示された（Doeze, et al, Chem., Int. Ed. Eng. 2004 43, 3138.; Ulijn, et al, J. Am. Chem. Soc. 2002 124, 10988; Humphrey, et al, J. Am. Chem. Soc. 2002 125, 13952.; Ulijn, et al, Org. Biomol. Chem. 2003 1, 1277））；
・現代の分子生物学技術を用いれば、異なる選択性を備えた広範なスペクトルの酵素が容易に入手可能である；
・それらは不可欠の細胞プロセスおよび疾患状態において重要な役割を果たし、従って、これら酵素に応答する材料は、診断および酵素反応性薬物送達に有益である。
【００１２】
酵素は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非汚染性リンカーが組込まれる表面付近において活性であり得ることが示されている（oeze, et al, Chem., Int. Ed. Eng. 2004 43, 3138.; Ulijn, et al, J. Am. Chem. Soc. 2002 124, 10988; Bosma,.et al. Chem. Commun.,2003  2790-2791.; Humphrey, et al, J. Am. Chem. Soc. 2002 125, 13952.; Ulijn, et al, Org. Biomol. Chem. 2003 1, 1277; Ulijn, et al J. Chem Soc., Perkin Trans. 2 2002, 1024.; Mrksich, Curr. Opin. Chem. Biol. 2002, 6, 794; Tirrell, et al, Surface Science 2002, 500, 61）。ナノ粒子が使用されるときは、増加する表面湾曲に伴って非特異的タンパク質吸着が減少するため、非汚染性リンカーの要件はより小さくてよい（Vertegel, et al, Langmuir, 2004, 20, 6800-6807）。また、酵素が活性の喪失または折畳み構造の喪失を伴わずに、ナノ粒子上の官能基を結合した表面と相互作用できることが示されている（Shenar & Rotello, Acc. Chem. Res. 2003, 36, 549）。
【００１３】
リンカーは、共有結合的に当該粒子に結合されてよい。或いは、それらは非共有結合的相互作用、例えばイオン結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、双極子−双極子結合、およびπ−π相互作用によってリンカーに取り付けられてよい。
【００１４】
本発明における使用に適したリンカーは、ヒドロラーゼのような酵素によって特異的または非特異的に開裂され得るものである。ヒドロラーゼは、種々の分子を高い選択性で適切な表面に開裂（または結合）させ、ナノ粒子凝集体のディスアセンブリーおよび／またはアセンブリーを選択的に制御することを可能にする能力を有している。一つの実施形態において、リンカーは、プロテアーゼによって開裂することができるペプチドである。哺乳類プロテオームの推定２〜３％は、プロテアーゼ、即ち、タンパク質およびペプチドを加水分解する酵素からなっている（Rawlings, et al, Nucleic Acids Res. 2002, 30, 343）。これら酵素の多くは、免疫学的防御および細胞分化のような不可欠な生理学的機能に関与している。幾つかのプロテアーゼは、例えばＨＩＶ，アルツハイマー病、Ｃ型肝炎、カンジダ感染症および膵臓炎のような疾患状態に関与している（Maly, et al, ChemBioChem 2002, 3, 16;  Davis, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002, 99, 2222-2227）。これら酵素によってトリガーされる物質は、生物学的流体において直接的にそれらの正確な検出および定量を可能にし、また薬物が必要とされる部位において、該薬物の局在化された送達を可能にすることができる。
【００１５】
適切なペプチドリンカーは、２，３，４，５または６以上のアミノ酸を含んでよい。多くの酵素は、開裂部位の何れかの側の３アミノ酸を認識するので、約６アミノ酸を有するリンカーが特に有用であり得る。
【００１６】
プロテアーゼの例には、セリンプロテアーゼ（例えばトリプシン、アルファ−１プロテイナーゼ、キモトリプシン、トロンビン）、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ（例えばパパイン、カテプシンＢ、インターロイキン−１−ベータ変換酵素（ＩＣＥ））、アスパラギン酸プロテアーゼ（例えばプラスメプシン、およびＨＩＶ−１プロテアーゼ）、メタロプロテアーゼ（例えばテルモリシン）、およびグルタミン酸プロテアーゼが含まれる。他のプロテアーゼが図６に記載されている。
【００１７】
本発明は、ペプチドであるリンカーに限定されない。他の実施形態において、リンカーは、グリコシダーゼにより開裂され得る糖、リパーゼにより開裂され得る脂質、ヌクレオシダーゼまたは制限酵素により開裂され得る核酸、エステラーゼにより開裂され得るエステルであることができる。実際に、当該リンカーは、キナーゼ、ホスファターゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、オキシダーゼおよびレダクターゼを含む、結合を破壊する酵素によって開裂され得る何れかの部分であることができる。
【００１８】
本発明において、酵素によるリンカーの開裂は、粒子上で露出される斥力部分をもたらしてよく（粒子上に直接、または開裂後に粒子上に残るリンカーの一部上の何れか）、これは斥力部分の間の反発に起因して凝集のディスアセンブリーを向上させる。該斥力部分は、静電的斥力により他のこのような部分を反発させる帯電（負または正）部分であってよい。リンカーがペプチドである場合、該帯電部分は正に帯電されたアミンであってよく、該リンカーの開裂は、相互に反発する陽イオン性粒子を生じる。その効果は、切断され易い結合の両側に反対に帯電したアミノ酸を備えた、両イオン性ペプチドリンカーを提供することによって向上させることができる。分散を誘導する他の手段は、π−π相互作用（芳香族アミノ酸または他の芳香族分子）のような、引力相互作用の除去を含むことができる。疎水性結合基または水素結合基の除去もまた、反発を達成するために使用されてよい。
【００１９】
何れか適切な粒子を、本発明において使用することができる。このような粒子の例は、マイクロ粒子、即ち、その寸法がマイクロメータ範囲である粒子である。好ましい粒子は、ナノ粒子、即ち、その寸法がナノメータ範囲の粒子であり、ナノチューブおよびナノロッド（その幅がナノメータ範囲のもの）を含む。ナノ粒子は、５０ｎｍ未満のサイズを有してよく、また該サイズは１０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲であってよい。本発明での使用に適したナノ粒子の一例は、金ナノ粒子である。
【００２０】
上記で述べたように、一つの実施形態において、粒子は結合部分によって間接的に結合される。この実施形態において、粒子はリンカーによって結合部分に結合され、該結合部分が相互に結合する。何れかの自己アセンブルモチーフ（例えば、受容体−リガンドまたはタンパク質モチーフ）も、結合部分として使用されてよい。適切な結合モチーフは、好ましくは多価である。該結合部分は、非共有結合的もしくは共有結合的相互作用によって相互に結合してよい。一つの実施形態において、結合部分はそれらの疎水性によって相互に結合する。即ち、該疎水性結合部分は、凝集体が水性媒質中で形成されることを保証する。適切な疎水性結合部分の例には、何れかの芳香族化合物、即ち、少なくとも一つのベンゼン環を含んでなる何れかの化合物が含まれる。当業者は、該リンカーに結合でき、且つ相互作用して粒子凝集体を形成できるであろう入手可能な多くの異なる種類の芳香族化合物が存在することを理解するであろう。しかし、リンカーが結合し得る適切な疎水性結合部分の例には、ベンゾイル（Ｂｚ）またはカルボキシベンゾイル（Ｃｂｚ）が含まれ、その両者はペプチド合成に使用される共通の保護基である。疎水性結合部分の一つの例はＦｍｏｃ、即ち、フルオレニルメトキシカルボニルである。更なる例には、ナフタレン、フェニルアラニン、チオフェン、チロシン、トリプトファン、ダンシル、ピレン、およびピリジンが含まれる。他の実施形態において、該結合部分は、それらの疎水性によって、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス力、および双極子−双極子結合を介して、または静電気相互作用または二分子認識を介して相互に結合する。
【００２１】
図１は、本発明に従う一つの粒子凝集体が、如何にして、プロテアーゼであるテルモリシンによってディスアセンブルされるかを示している。粒子（この場合は、金ナノ粒子）は、リンカー（この場合はペプチド）によって結合部分（この場合はＦｍｏｃ基）に結合される。水溶液中のＦｍｏｃ基の疎水性は、それらを相互に引き寄せて、粒子凝集体を形成する。しかし、凝集体が酵素（この場合はプロテアーゼであるテルモリシン）に露出されると、リンカーが破壊され、粒子凝集体は分散される。この分散は、ＵＶ−可視スペクトル分析または透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用して、分光測定により測定することができる（図２）。
【００２２】
図３（アプローチ１）は、本発明に従う一つの粒子凝集体を図示している。これにおいて、粒子の一つのポピュレーションは、プロテアーゼで開裂可能なリンカーおよびＦｍｏｃ基を有するシステイン含有ペプチドを用いて修飾される。該ペプチドリンカーの酵素的開裂の際には疎水性基が除去され、正電荷（アミン）が現れ、陽イオン粒子間の静電気的反発によってディスアセンブリーがトリガーされる。
【００２３】
もう一つの実施形態において、粒子は、リンカーによって他の粒子に直接結合される。図３（アプローチ２）は、本発明のこの実施形態に従った一つの粒子凝集体を示している。各々がシステイン含有ペプチドで修飾された粒子の二つの異なるポピュレーションが使用され、Ｃ末端またはＮ末端を介して粒子にアセンブリーされる。これらの修飾された粒子は、可逆システムのためのビルディングブロックを形成する。ペプチド配列を認識できる適切なプロテアーゼが、可逆的加水分解反応を介して、これらの粒子を可逆的にアセンブルまたはディスアセンブルするであろう。ペプチド材料および個々の粒子の間の平衡位置は、媒質のイオン強度およびｐＨのような因子に依存し、また有機共溶媒の存在に依存し、且つ調節可能であろう。
【００２４】
ペプチドにおけるアミド結合の加水分解は希薄水溶液中で観察されるが、逆反応、即ち、ペプチドを合成するためのアミノ酸カップリングは、固体／液体界面において立証されている。この発見は、固相上での直接の効率的なペプチド合成が、プロテアーゼ特異性スクリーニングに適用され得るプロテアーゼにより触媒されることを可能にする。図４は、可溶性の蛍光性（Ｆｍｏｃ）タグを付されたアミノ酸（ＡＡ１）が、選択的な「逆加水分解」反応において、プロテアーゼのアミノ酸優先性を測定するためのマイクロアレイフォーマットを使用して、如何にして表面固定されたアミノ酸（ＡＡ２）に結合するために使用できるかを図示している。即ち、スクリーニングされるプロテアーゼが、表面に固定されたアミノ酸（ＡＡ２）および可溶性蛍光（Ｆｍｏｃ）タグを付された結合アミノ酸（ＡＡ１）の間にペプチド結合を形成できるときにのみ、蛍光信号が観察される。同様に、リパーゼに触媒されたエステルの加水分解は、固体支持体上でエステルを合成するように反転させることができるであろう。これらの所見は、リガンドが固体表面に繋がれるときには、加水分解およびカップリング反応の両方のために、ヒドロラーゼが用いられ得ることを示している。
【００２５】
疑義を回避するために、当業者は、上記で述べたように、図２、図３および図４に示された粒子凝集体が、図示のペプチドリンカー以外のリンカーを有することができることを理解するであろう。
【００２６】
本発明は、疾患の診断および治療に使用することができる。粒子凝集体のディスアセンブリーは、特定の酵素の存在を示すことができ、従って、疾患または状態について診断的であることができる。こうして、更なる側面において、本発明は医薬において使用するための、第一の側面の粒子凝集体、または第三の側面の粒子を提供する。本発明はまた、酵素に関連した疾患または状態を診断するための診断薬の製造における、第一の側面の粒子凝集体または第三の側面の粒子の使用を提供する。例えば、前立腺癌は、本発明を使用して、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を検出することによって診断することができる。ＰＳＡにより特異的に開裂されるリンカー（例えばＳＳＦＹＳＧＧＧＣ）を含んだ粒子を使用すれば、ＰＳＡは、本発明による凝集体の分散をモニターすることによって検出することができる。
【００２７】
粒子凝集体のディスアセンブリーは、溶液中の色変化によってモニターすることができる。それはまた、該溶液をＴＬＣプレート上にスポッティングして、赤または青のドットを見ることによりモニターしてもよい（迅速スループットスクリーニング、または我々が病院またはＧＰクリニックにおいて単純なインビトロ診断キットにアクセス可能である）。
【００２８】
加えて、本発明に従う粒子凝集体の酵素によるディスアセンブリーは、薬物送達のために使用することができる。こうして、薬物は本発明の粒子凝集体内に保持することができ、粒子凝集体が疾患部位において酵素と接触するに至り、凝集体が該酵素によりディスアセンブリーされるときにのみ放出されることができる。従って、更なる側面において、本発明は下記の発明を提供する：
酵素によって開裂されることができるリンカーを介して他の粒子に連結された粒子および薬物を含んでなる粒子凝集体であって、前記薬物は、前記リンカーが前記酵素によって開裂されるまで前記凝集体の中に保持される凝集体；
酵素に関連した疾患または状態を治療する方法であって、前記疾患または状態に罹患している患者に対して、酵素によって開裂されることができるリンカーを介して他の粒子に連結された粒子および薬物を含んでなる粒子凝集体を投与することを含んでなり、前記薬物は、前記リンカーが前記酵素によって開裂されるまで前記凝集体の中に保持される方法；および
酵素に関連する疾患または状態を診断するための診断薬の製造における、酵素によって開裂されることができるリンカーを介して他の粒子に連結された粒子および薬物を含んでなる粒子凝集体の使用であって、前記薬物は、前記リンカーが前記酵素によって開裂されるまで前記凝集体の中に保持される使用。
【００２９】
上記で述べたように、幾つかのプロテアーゼが、ＨＩＶ、アルツハイマー病、Ｃ型肝炎、カンジダ感染症、膵臓炎癌、炎症および創傷治癒を含む疾患状態に関与することが知られている。
【００３０】
本発明による医薬は、通常は、正規に医薬的に許容可能なキャリアを含むであろう滅菌された医薬組成物の一部として供給されるであろう。この医薬組成物は、適切な形態であってよい（それを患者に投与する望ましい方法に依存して）。それは、単位投与量形態で提供されてよく、一般には密封容器中に提供されるであろうし、キットの一部として提供されてもよい。このようなキットは、通常は（必ずではないが）、使用のための指示書を含むであろう。それは、複数の前記単位投与量形態を含んでもよい。
【００３１】
医薬組成物は、何れか適切な経路、例えば蛍光（バッカルまたは舌下を含む）、直腸、鼻内、局所（バッカル、舌下または経皮）、膣、または非経腸的（皮下、筋肉内、静脈内、または皮内）経路による投与のために適合されてよい。このような組成物は、薬学の技術分野で知られた何れかの方法、例えば、滅菌条件下で活性成分をキャリアまたは賦形剤と混合することによって調製されてよい。
【００３２】
経口投与のために適合される医薬組成物は、カプセルまたは錠剤のような個別的な単位として；粉末または顆粒として；溶液、シロップまたは懸濁液（水性もしくは非水性液体中；または食用フォームまたはホイップとして；またはエマルジョンとして）として提示されてよい。錠剤または硬質ゼラチンカプセルのための適切な賦形剤には、乳糖、とうもろこしデンプンもしくはその誘導体、ステアリン酸もしくはその塩が含まれる。軟質ゼラチンカプセルと共に使用するための適切な賦形剤には、例えば植物油、ワックス、脂肪、半固体もしくは液体のポリオールが含まれる。溶液およびシロップの調製のために、使用され得る賦形剤には、例えば水、ポリオールおよび糖が含まれる。懸濁液の調製のためには、油（例えば植物油）を使用して、水中油または油中水懸濁液を提供してよい。経皮投与のために適合された医薬組成物は、長期に亘ってレシピエントの皮膚に密接に接触して残すことを意図した個別のパッチとして提示されてよい。例えば、Pharmaceutical Research, 3(6):318 (1986)に一般的に記載されているように、活性成分は、イオントフォーレシスによってパッチから送達されてよい。局所投与のために適合された医薬組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、または油として処方されてよい。眼または他の外部組織、例えば口および皮膚の感染のために、該組成物は、好ましくは局所的な軟膏またはクリームとして塗布される。軟膏として処方されるとき、活性成分は、パラフィン系もしくは水混和性の軟膏基材と共に用いられてよい。或いは、活性成分は、水中油クリーム基材、または油中水基材と共にクリーム中に処方されてよい。眼への局所的投与のために適合された医薬組成物には、活性成分が適切なキャリア、特に水性溶媒中に溶解または懸濁される点眼液が含まれる。口の中の局所的投与のために適合された医薬組成物には、ロゼンジ、トローチおよびマウスウオッシュが含まれる。
【００３３】
直腸投与のために適合された医薬組成物は、座薬または浣腸として与えられてよい。キャリアが個体である鼻投与のために適合された医薬組成物には、２０〜５００ミクロンの範囲の粒子サイズを有する粗い粉末が含まれ、これは鼻から吸う方法で、即ち、鼻に近接して保持された粉末の容器から鼻通路を通しての迅速吸入により投与される。鼻スプレーまたは点鼻液として投与するためのキャリアが液体である適切な組成物には、活性成分の水溶液または油溶液が含まれる。吸入による投与のために適合された医薬組成物には、種々のタイプの計量投与量の加圧エアロゾル、ネブライザまたは吸入器によって発生されてよい微細粒子のダストまたはミストが含まれる。膣投与のために適合された医薬組成物は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレーの処方剤として提示されてよい。非経腸的投与のために適合された医薬組成物には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および当該処方剤をレシピエントの血液と実質的に等張にする溶質を含んでよい水性および非水性の滅菌注射溶液；並びに懸濁剤および濃化剤を含んでよい水性および非水性の滅菌懸濁液が含まれる。注射溶液のために使用してよい賦形剤には、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油が含まれる。当該組成物は、単回投与量または複数回投与量の容器、例えば密封されたアンプルおよびバイアルの中に与えられてよく、また使用の直前に、例えば注射用水のような滅菌液体キャリアの添加だけを必要とするように、凍結乾燥条件において保存されてよい。即席の注射溶液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製されてよい。
【００３４】
医薬組成物は、保存剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、付香剤、塩（本発明の物質はそれ自身が、医薬的に許容可能な塩の形態で提供されてよい）、緩衝液、コーティング剤または抗酸化剤を含んでよい。それらはまた、本発明の物質に加えて、治療的活性剤を含有してもよい。
【００３５】
本発明の物質の投与量は、治療すべき疾患または障害、治療すべき個体の年齢および状態等に応じて広範に変化することができ、最終的には、医師が使用すべき適切な投与量を決定するであろう。この投与量は、適切である限り頻繁に繰り返される。もし副作用が発生するならば、通常の臨床実務に従って、投与の量および／または頻度を低減することができる。本発明の粒子凝集体は、水性サンプルにおける酵素の存在を試験するために使用されてよい。検出される酵素が特定の微生物、例えば大腸菌に特異的であれば、該試験は当該微生物の存在を示すであろう。従って、一定の微生物関連酵素に特異的な粒子−リンカー−「バインダ」結合のアレイは、多くの異なる微生物を平行して間接的に試験することができるであろう。このようなアッセイが使用され得る一つの例は、飲料水の品質の試験においてである。例えば、β−Ｄ−グルクロニダーゼは大腸菌の存在を示し；β−Ｄ−ガラクトシダーゼおよびβ−Ｄ−グルコシダーゼは、水中での微生物活性の指標である大腸菌および腸球菌をそれぞれ検出するために使用することができる（Manafi, OECD Worksop Molecular Methods for Safe Drinking Water, Interlaken ’98, 1-16参照）。
【００３６】
本発明を実施および使用できる、より詳細で且つ非限定的な方法を説明する。本発明がペプチドリンカーを含む場合、これらペプチドは、次のようにして金ナノ粒子の表面に固定することができる。１０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲であるが、このサイズ範囲には限定されない金ナノ粒子（ＮＰ）の異なるポピュレーションが使用される。粒子は最初に、例えば、二カリウム・ビス（ｐ−スルホナトフェニル）フェニルホスフィン二水和物での錯化によって安定化される。末端システイン残基（ペプチド鎖のＮ末端またはＣ末端）を備えたペプチドが合成され、金ナノ粒子（TedPella, Redding, CA）の溶液に添加されて、システイン残基の硫黄基を金表面に直接結合させる。このペプチド／ナノ粒子のカップリング効率は、温和な遠心分離によってＮＰを溶液から分離することによりモニターされ、次いで可溶性ペプチド濃度の減少が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびＵＶ−可視スペクトル分析によってモニターされる。加えて、最近になってShenar & Rotello, Acc. Chem. Res. 2003, 36, 549に示されたように、赤外（ＩＲ）スペクトル分析を用いて表面上のアミドの存在が測定および定量される。ペプチドは、当該技術において周知のＦｍｏｃ戦略を使用し、手動で、または自動化されたペプチド合成機を使用して合成される。
【００３７】
図３に記載したアプローチ１については、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＰが合成されるが、これらの修飾ペプチドは、B. thermoproteolyticus Rokko由来のテルモリシンによって開裂されるであろう。図３に記載したアプローチ２については、ＮＰ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＧｌｙおよびＰｈｅ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＰの両方が、テルモリシンの基質として調製される。テルモリシンは非常に安定な酵素であり、疎水性アミノ酸のＮ末端におけるペプチド結合を優先的に加水分解し、Ｃ末端アミノ酸に対してはむしろ非特異的である。Ｃ末端およびＮ末端で固定されたアミノ酸を担持する金ナノ粒子は、最初に化学的にカップリングされて、アセンブリーされた出発材料を生じる。ナノ粒子の化学的カップリングは、従来のヒドロキシベンゾトリアゾール／ジイソプロピルカルボジイミドカップリング剤を使用して、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で行われる。ＮＰ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＧｌｙおよびＰｈｅ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＰの１：１混合物が、最初に使用される。化学的カップリングの効率は、投下型電子顕微鏡（ＴＥＭ）およびＩＲスペクトル分析を使用して評価される。化学的にアセンブルされたナノ粒子構造体は、温和な遠心分離により反応媒質から単離され、緩衝溶液中に再懸濁される。
【００３８】
タンパク質分解酵素がナノ粒子に連結されるペプチドを開裂できるかどうかを試験するために、アプローチ１に従って上記で説明したように、Ｆｍｏｃ末端のオリゴペプチドをＮＰ上に固定する。このペプチドは、テルモリシンによって開裂されることが知られた配列からなっている（例えば、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−テルモリシンは、Ｐｈｅ残基の間で開裂すると予想される）。この修飾されたＮＰを種々の時間に亘ってテルモリシンに露出させ、次いでＮＰ懸濁液を遠心分離し、開裂されたＦｍｏｃ−Ｐｈｅの存在について上清をＨＰＣＬで分析する。対照には、酵素的に開裂されないＤ−ペプチドが含められる（Ulijn, et al, J. Am. Chem. Soc. 2002 124, 10988）。
【００３９】
異なる長さのグリシンリンカーは、最適なリンカー長を評価するために使用することができる。ポリグリシンは、最適なコンホメーション的可撓性を与え、固相合成を使用して直接に結合させることができる。Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（Ｇｌｙ）ｎ−Ｃｙｓ［ｎ＝３，５，１０のグリシン残基］が比較されることができる。対照実験としては、Ｆｍｏｃ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（Ｇｌｙ）ｎ−Ｃｙｓで修飾されたナノ粒子が用いられる。テルモリシンはＬアミノ酸を排他的に認識するので、ここでは酵素的加水分解はなく、従って、ナノ粒子のディスアセンブリーは観察されないはずである。初期および最終のナノ粒子凝集体のＴＥＭが行われる。
【００４０】
上記のアプローチ１を採用すると、熱量試験を使用して酵素濃度を定量することができる。最適量の凝集したペプチドナノ粒子を含む９６ウエルプレートの個々のウエルに、異なる濃度のテルモリシンを添加し（試験される何れの酵素も適切なリンカーと共に使用できるが）、ＵＶ−可視スペクトルにおける表面プラズモン共鳴に生じるシフトを利用することにより、熱量計プレートリーダを使用してリアルタイムで速度論的応答を測定する。
【００４１】
上記で述べたアプローチ２を採用する場合は、ＵＶ−可視スペクトル解析を使用してリアルタイムでナノ粒子の凝集を追跡することを可能にするように、条件（酵素濃度、ｐＨ、イオン強度）が選択される。ナノ粒子は凝集して大きなアセンブリーを形成するので、ＵＶ−可視スペクトルにおいては、表面プラズモン共鳴ピークの赤色シフトに反映されるであろう。９６ウエルプレートの個々のウエルにおいては、異なる濃度の酵素が使用される。（ナノ粒子から出発した）アセンブリーおよび（アセンブリーから出発した）ディスアセンブリーの反応速度が比較される。これら反応において形成されるカルボン酸およびアミン粒子に起因して、静電気的引力による非特異的凝集が観察されてよい。共有結合的(酵素的)凝集および非共有結合的（例えば静電気的）凝集を識別する主な方法は、適切な対照の選択によるものである。酵素的カップリングは、Ｌアミノ酸が使用されるときにのみ予測され、従って、Ｄアミノ酸を使用するときに観察される如何なる凝集も非共有結合的である。もう一つの方法は、如何なる非共有結合的相互作用をも破壊するための共溶媒を添加することである：非共有結合的なアセンブリーはディスアセンブリーされるのに対して、共有結合的アセンブリーは完全なまま残るであろう。非特異的凝集が最小化される条件を同定するために、共通の塩（ＫＣｌ、ＮａＣｌ）または高イオン強度の緩衝液を使用することによるイオン強度の変化が使用される。
【００４２】
種々の因子が、酵素的ＮＰアセンブリー反応の平衡位置に影響する。全体の平衡定数は、遊離粒子に対するアセンブリーされた粒子の比率として表すことができる［Ｋｅｑｌ＝ＮＰａｓｓ／（ＮＰ１．ＮＰ２）］。Ｋｅｑは、三つの別々の平衡で構成されている：遊離カルボン酸基でのペプチドＮＰのイオン化（Ｋ１）；遊離アミンでのペプチドＮＰのイオン化（Ｋ２）；およびアミド合成／加水分解それ自身（Ｋ３）である（図５参照）。アミドの加水分解平衡は、希釈水性媒質中において（Ulijn, et al J. Chem Soc., Perkin Trans. 2 2002, 1024）、およびポリマーヒドロゲルに対して（Ulijn, et al, Org. Biomol. Chem. 2003 1, 1277）、以前に深く研究されている。これらの以前の発見に基づいて、イオン化平衡Ｋ１およびＫ２（図５）は、平衡位置に顕著に貢献するであろうことが予想される。ペプチドがＮＰ上に固定されるときには、等しい電荷の近隣に電荷を形成するのは困難であるため、イオン化が抑制されることが予想される。Ｋ１およびＫ２は、ＮＰの酸−塩基滴定によって定量されるのに対して、Ｋ３は、ＴＥＭ、ＵＶ化しスペクトル分析およびＩＲを使用して、アセンブルされたナノ粒子と遊離ナノ粒子の比率の測定から得られる。平衡に達したことを確認するために、反応は両方の方向から出発されるであろう（即ち、遊離ナノ粒子およびアセンブルされた構造体が上記のようにして調製される）。
【００４３】
溶液のイオン強度は、ペプチド加水分解／合成の平衡位置に向けて優位に寄与すると予測される。低イオン強度媒質中ではイオン化が有意に抑制されて、合成および得られたＮＰアセンブリーの増大を導く。高イオン強度の加水分解においては、ディスアセンブリーが有利であると予測される。これらの効果は、異なるイオン強度値（異なる濃度で緩衝溶液を使用して得られる）において、遊離酸およびアミノ末端を備えたＮＰの両者を滴定することによって定量することができる。全体の平衡常数Ｋｅｑのイオン強度に対する依存性は、上記で説明した方法を使用して定量される。
【００４４】
エントロピーとエンタルピーの間のバランスが、平衡に近い条件下でアセンブリーを可能にする条件が選択される。これは、可逆的なアセンブリーおよび或る程度のエラー訂正を可能にし、最も安定な構造が形成されるのを保証する。
【００４５】
ペプチド加水分解酵素の主要な特異性は、アミド結合の何れかの側のアミノ酸についての優先性を記載する（側鎖Ｒ１およびＲ’１を備えたアミノ酸…図５参照）。このアプローチの有効性を試験するために、三つの異なるプロテアーゼが比較される：商業的に入手可能なウシ膵臓αキモトリプシン、B. thermoproteolyticus Rokko由来のテルモリシン、ブタ膵臓由来のエラスターゼ。これらのプロテアーゼは、Ｒ１／Ｒ’１のアミノ酸の組合せについて、逆であるが相補的な特異性を示す…表１参照。αキモトリプシンは疎水性アミノ酸について選択的であり、Ｒ’１残基についてはむしろ非特異的である。対照的に、テルモリシンはＲ’１における大きな疎水性残基についての選択性を示し、Ｒ１においては非特異的である。エラスターゼは、両方の位置における小さいアミノ酸についての選択性を有する。従って、Ｇｌｙ−Ｌｅｕにおけるアミド結合の加水分解／合成は、テルモリシンによって触媒されるであろうこと、およびＬｅｕ−Ｇｌｙの加水分解／合成は、αキモトリプシン等によって選択的に触媒されることが予測される。この高度に特異的な挙動は、ポリマーヒドロゲルに連結されたペプチドについて最近立証された（Doeze, et al, Chem., Int. Ed. Eng. 2004 43, 3138）。この特異性がナノ粒子混合物の特異的なアセンブリーにおいて利用できるかどうかを試験するために、四つの異なるタイプのナノ粒子が調製された：Ｎ末端グリシン−ＮＰ，Ｃ末端グリシン−ＮＰ、Ｎ末端ロイシン−ＮＰおよびＣ末端ロイシン−ＮＰ。異なるサイズの粒子を使用して、それらの間の容易な識別を可能にする。全ての三つの酵素が、ＮＰ固定化されたペプチドに対して触媒的に活性であるかどうかが試験される。条件が最適化され、ＮＰの四元混合物が、上記で挙げた酵素の各々に露出される。ナノ粒子の凝集体が、酵素の選択性に一致するナノ粒子の組み合わせについてだけ観察されるかどうかが評価される。このアセンブリープロセスは、ＵＶ−可視スペクトル分析およびＴＥＭによってモニターされる。酵素の量は、該システムの感度を樹立するうえで可能な限り低下される。これらの実験は、バイオ検出におけるこれら材料の使用概念の証明を提供する。
【表１】
2009517452.tif 000003
【００４６】
本発明のナノ粒子アセンブリーのバイオ医薬に関連した用途の特別の例として、慢性創傷体液中のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）が研究される。現在は体液の希釈およびｐＨ調節を必要とする（Greener, B., et al, J. Wound Care, 12, 2）、非治癒性（慢性）創傷の体液内における正確で且つ直接的なプロテアーゼ活性の測定を可能にする装置についての、緊急の必要性が存在している。これらＭＭＰは、最適な開裂のための少なくとも６アミノ酸残基からなる特異的ペプチド配列を選択的に加水分解することができる。創傷治癒において重要な役割を果たすＭＭＰが同定され、ナノ粒子／ペプチド系が設計され、９６ウエルプレートフォーマットを使用して、選択性（生物学的流体における単一のＭＭＰの検出）、感受性（検出できる最小濃度）および再現性が試験された。
【００４７】
図６は、（ｉ）コラーゲナーゼ（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３）；（ii）ゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９）；（iii）ストロメリシン（ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１）；およびＭＭＰ−１２の詳細を提供する。加えて、図６は、好中球エラスターゼ、トロンビンおよびエラスターゼの詳細を与える。図６はまた、列記された各プロテアーゼのための種々の基質の詳細を提供し、加えて、興味ある各プロテアーゼ（標的プロテアーゼ）の基質特異性に関する詳細、即ち、各プロテアーゼが認識して加水分解するアミノ酸配列を与える。例えば、ＭＭＰ−１プロテアーゼは、（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩ）のような異なる範囲のコラーゲン；ゼラチン；アグレカン；テナシン；Ｌ−セレクチン；ＩＬ−１β；プロテオグリカン；エンタクチン；オボスタチン；ＭＭＰ−２；ＭＭＰ−９についての触媒特異性を有する。より詳細に言えば、ＭＭＰ−１は以下の配列を認識し、これを加水分解する：
（ｉ）Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ〜Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＥｔ；
（ii）Ｍｃａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ〜Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２；
（iii）Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ〜Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ；
（iv）Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ〜Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ；
（ｖ）Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ〜Ｎｖａ−Ｔｒｐ−ＮＨ２；
（vi）Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ；
（vii）Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ〜Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ；
（viii）Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ〜Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ。
【００４８】
本発明の各側面の好ましい特徴は、必要な変更を加えれば、他の側面の各々についての特徴と同じである。
【００４９】
次に、以下の非限定的実施例を参照して本発明を更に詳細に説明する。
【実施例】
【００５０】
実施例１：  B. Thermoproteolyticus rokko由来のテルモリシンによって作動されることができる、自己アセンブルされたペプチド感応化ナノ粒子ネットワーク
一般的手順：  直径１０ｎｍの金ナノ粒子をＢＢＩインターナショナル社（アーガーサンエンティフィック、ＵＫ）から購入した。ＴＥＭにより測定されたそれらの直径は、８．５±１．０ｎｍであることが認められた。二カリウム・ビス（ｐ−スルホナトフェニル）フェニルホスフィン二水和物は、ストレムケミカル社（Strem Chemicals；ＭＡ）から購入した。他に指示しない限り、他の試薬および材料はシグマ−アルドリッチ社（ＵＫ）から入手した。全ての溶液は、高純度の脱イオン化水（トリプルレッド・ラボラトリーテクノロジー社（ＵＫ）からのナノピュア・ダイアモンドシステム上で精製した）を使用して調製した。
【００５１】
ペプチド合成：  アミノ酸および樹脂をノババイオケム（Novabiochem：ＵＫ）から購入し、固相合成のための他の全ての試薬は、ＡＧＴＣバイオプロダクツ（AGTC Bioproducts：ＵＫ）から入手した。ペプチド１（Fmoc-Gly-Phe-Cys）およびペプチド２（Fmoc-Gly-d-Phe-d-Cys）を、標準の固相Ｆｍｏｃ戦略を使用して合成した。ペプチドを真空中で乾燥し、０．１％ＴＦＡを含む２０％〜６５％の水／アセトニトリル勾配を使用した逆相ＨＰＬＣ（Ｇｉｌｓｏｎ）によって精製した。ペプチドの同一性は、質量スペクトル分析（Micromass Ltd., Altrincham, UK）およびＮＭＲ（JEOL 270NMR Spectrometer）によって確認された。
【００５２】
ペプチドを用いたナノ粒子の感応化：  ８．５ｎｍの金ナノ粒子を、二カリウム・ビス（ｐ−スルホナトフェニル）フェニルホスフィン・二水和物を用いて１２時間錯化することにより安定化させた。この安定化された金ナノ粒子は、室温の水溶液中で数ヶ月に亘って安定であった。安定化された金ナノ粒子の最終溶液（受け取ったままの濃度）を、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８）および１００ｍＭのＮａＣｌ中で調製し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中における２０μＬのペプチド１（５０μＭ）と共に室温で一晩インキュベートして、金ナノ粒子複合体を形成した。過剰なペプチドを遠心分離により除去し、上清を除去した後、リン酸緩衝液（ｐＨ８）、０．０５％ｗ／ｖのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および１００ｍＭのＮａＣｌと共に、ナノ粒子を初期容積に再懸濁させた。
【００５３】
酵素的加水分解のモニター：  全ての反応は、使い捨てのプラスチック製キュベット内で行われ、分析はインサイチューで２回行われた。熱分解溶液は、必要とされる濃度範囲において、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８）の中で新たに調製された。ペプチド感応化された金複合体にテルモリシンを添加した後に、ＵＶ−可視スペクトルを室温で記録した。Ｕｎｉｃａｍ・ＵＶ−５００・ＵＶ−可視スペクトル光度計上で、２００〜８００ｎｍに亘ってスペクトルを記録した。分解能は１ｎｍであり、１ｃｍ経路長のポリスチレンキュベット中でリン酸緩衝液、ＮａＣｌおよび０．０５％ｗ／ｖのＢＳＡを使用したバックグラウンド補正を使用した。
【００５４】
ＴＥＭ特徴付け：  電子顕微鏡サンプルを、アーガー・サイエンティフィック社から入手した炭素コートした３００メッシュの穴あき銅ＴＥＭグリッド上に調製した。ＴＥＭグリッドを医療用ティッシュペーパー上におき、一滴の溶液をピペットから該グリッド上に適用した。このティッシュペーパーは、過剰な溶液を拭い去るために役立った。次いで、上記の手順の後に、該グリッドを５滴の脱イオン水で洗浄して、過剰の塩をグリッド表面から除去した。２００ＫＶで動作するＪＥＯＬ・ＴＥＭ・ＦＸ（ＩＩ）上でＴＥＭを行った。
【００５５】
トリペプチドであるＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（ペプチド１）を使用して、B. Thermoproteolyticus rokko由来のテルモリシンによって駆動されるべき自己アセンブルされたペプチド感応化ナノ粒子ネットワークが設計された。末端Ｃｙｓ−ＮＨ２は、金−チオレート結合の形成を介した金ナノ粒子の表面への結合を容易にする。テルモリシンは、Ｐ１’（Ｐｈｅ）位における大きな疎水性残基に対する選択性を示し、またＰ１（Ｇｌｙ）残基に対しては非特異的である。従って、Ｇｌｙ−Ｐｈｅのアミド結合の加水分解は、テルモリシンによって特異的に触媒され、同時にナノ粒子の分散および目に見える色変化を生じる。
【００５６】
安定化された金ナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像は、十分に分散されたナノ粒子集団を明らかにする（図７Ａ）。ペプチド１での感応化の後に、ナノ粒子の凝集が観察された（図７Ｂ）。この観察は、ＵＶ−可視表面プラズモン共鳴ピークと一致し、ここでは５２２ｎｍに単一のピーク（分散された粒子に特徴的な）を備えた安定化された金ナノ粒子が、ペプチド１で感応化すると、５６５ｎｍまでのブロード化および赤色シフトを示し、ナノ粒子アセンブリーのサイズの増大を示した。
【００５７】
当該システムの酵素反応を試験するために、ペプチド感応化されたナノ粒子を、７．２ｎＭ（７．２×１０−９Ｍ）〜２．０８ｚＭ（単一分子、２．０８×１０−２１Ｍ）の範囲の濃緯度のテルモリシンと共に室温でインキュベートした。テルモリシン添加後の投下型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像は、充分に分散したナノ粒子集団を明らかにしている（図７Ｃ）。ＵＶ−可視スペクトルは、７．２ｎＭテルモリシン添加後のプラズモン共鳴ピークにおける５６５ｎｍ〜５３２ｎｍへの明瞭なシフトを示している（図８Ａ）。約３０ｎｍ付近の試験したテルモリシン濃度範囲について、異なる時間スケールで同様のＵＶ−可視スペクトルシフトが観察された。上清のＨＰＬＣによってＦｍｏｃ−Ｇｌｙのみの存在が検出され、これはトリペプチド１の開裂断片であることを示しており、従って、酵素的加水分解の部位が確認される。対照実験において、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−ＮＨ２で感応化された８．５ｎｍの金粒子は、ペプチドをＰ１位におけるＡｒｇまたはＬｙｓ残基で排他的に開裂する酵素であるトリプシンの導入に際してディスアセンブルされなかった。予想したとおり、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ｄ−Ｐｈｅ−ｄ−Ｃｙｓで感応化されたナノ粒子は、テルモリシンの導入に際しても分散されなかった。
【００５８】
プラズモン共鳴シフトの直接観察による加水分解反応のモニタリングは、大きなスペクトルシフトについてのみ可能である。スペクトル形状における変化を低了するための高度に敏感で且つ正確な方法は、プラズモン共鳴ピーク下の面積についてのＡ／Ｄ（凝集面積／分散面積）比の変化を計算することによって達成することができる。図８Ｂは、その下において、試験された全てのサンプルのＵＶ−可視スペクトルについて積分が計算される領域を示しており、領域Ｄ（分散）は４６９〜５４０ｎｍに亘っており、また領域Ａ（凝集）は５５０〜７００ｎｍに亘っている。サンプルを分析して、異なる時点についてのＡ／Ｄ比を得た。このアプローチを使用することにより、ナノ粒子の分散はリアルタイムで追跡することができた（図８Ｃ）。酵素濃度を変化させることによって、４桁の大きさに亘って直線的な依存性が観察された。
【００５９】
２．０８ｚＭテルモリシンまでのΔ比Ａ／Ｄを測定することによって、単一の酵素分子検出が決定された。Δ比Ａ／Ｄは、７．２ｎＭおよび２．０８ｚＭについて、それぞれ９６．５％および２．５．２％まで、７４時間に亘って増大する。
【００６０】
図８Ｄは、試験した異なる濃度のテルモリシンについて、｛（Δ比Ａ／Ｄ）／Δｔ｝のグラフ的表現である。７．２ｎＭ〜０．１ｆＭ（０．１．１０−１２Ｍ）テルモリシンに亘る濃度について、酵素濃度が定量され得る直線的回帰を得ることが可能である。
【００６１】
この実施例は、迅速な酵素検出を可能にし、且つ従来報告されたものよりも遥かに感度の高い（単分子）、酵素反応性ペプチドで感応化された金ナノ粒子アセンブリーシステムを例示している。ここでの該システムはまた、温和な条件下に発生されたアセンブリーに対するダイナミックな制御を提供し、これは薬物送達および酵素のインビボモニタリングにおける適用を備えた、新規な生物学的に制御されたダイナミックな材料の開発のために有用であることを証明することができる。更に、モジュールアプローチ［アンカー（例えばシステイン−ＮＨ２基）、酵素開裂可能なリンカー、アクチュエータ（例えばＦｍｏｃ）］は、広範な酵素を高い感度で容易に検出するためのシステムを作製するための基礎として使用することができる。
【００６２】
実施例２：  前立腺特異的抗原のスクリーニング
現在、前立腺癌は西側世界における最も優勢な形態の癌であり、男性における癌関連死の二番目の原因である（Mazhar, et al., BJU International, 2006. 98(4):p.725-730）。前立腺癌のスクリーニングおよび早期検出のために最も広く使用される方法は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）血液試験であり、これは血清中におけるＰＳＡのレベルを測定するものである。合衆国の食品医薬品局は、５０歳以上の男性における前立腺癌の検出を補助するために、デジタル直腸試験と共にＰＳＡ試験を使用すること、並びに、前立腺癌が治療後に再発したかどうかをモニターするためにＰＳＡ試験を使用することを承認した。
【００６３】
ＰＳＡの産生は、正常な前立腺においてはアンドロゲン依存性であり、思春期後の健康な男性の血清中において検出することができる。ＰＳＡは、前立腺上皮によって産生され、精液中に分泌され、ここでは０．２〜５ｇ／Ｌの濃度で見出されることができる（Wang, et al., Prostate, 1981. 2(1): p. 89-96）。循環系において、ＰＳＡの濃度は正常には非常に低く（≦２．０ｎｇ／ｍＬ）、血清全ＰＳＡ（ｔＰＳＡ）の増大したレベルは前立腺癌の増大したリスクに関連している。
【００６４】
熱量計センサを用いて酵素的に活性なＰＳＡを同定する能力は、特に２．５〜４．０ｎｇ／ｍＬ範囲のＰＳＡを有する男性についての、前立腺癌のスクリーニングを補助するであろう。
【００６５】
金ナノ粒子を、フルオレニル−９−メトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）−ＳＳＦＹ┼ＳＧＧＧＣ−ＣＯＮＨ２を用いて感応化させた。ペプチド配列は、ＰＳＡ酵素開裂について特異的であるように選ばれた（Coombs, et al., Chem Biol, 1998. 5(9): p. 475-88）。┼は、加水分解の部位を示している。Ｃ末端におけるシステイン残基の組み込みは、金−チオレート結合を介しての金表面への結合を提供し、また該菌ナノ粒子の凝集は、Ｎ末端におけるＦｍｏｃ基の間のπ−π相互作用によって誘導される。
【００６６】
こうして形成された凝集体に、０．４５ｎｇ／ｍＬまたは１．０ｎｇ／ｍＬの濃度のＰＳＡが添加され、ＳＳＦＹＳＧＧＧＣペプチド配列のＰＳＡ開裂による凝集体の分散がモニターされた。
【００６７】
図９は、当該ナノ粒子に基づくシステムを使用して得られた実験結果を示している。ＰＳＡ濃度の区別は、５分後に見られる。このナノ粒子システムは、低い酵素濃度に対して感度が高く、０．４５ｎｇ／ｍＬと１．０ｎｇ／ｍＬの間に明確な分離を見ることができる。従って、この検出方法は、ＰＳＡ並びにＰＳＡ−Ａ２Ｍの酵素形態を選択的に認識し、ここでのＰＳＡの一部は、免疫検定では拾われないα２−マクログロブリン（ＡＷＭ）と錯化する。これは、金ナノ粒子に基づくシステムを作製するために、低分子量の合成ペプチド基質が使用されるからであろう。該システムは、従来の免疫検定に比較して遥かに単純であり、色の視覚的変化を用いた容易な検出を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、本発明に従う一つの粒子凝集体、並びに、それがプロテアーゼであるテルモリシンにより如何にしてディスアセンブルされ得るかを示している。
【図２】図２Ａは、本発明に従ってアセンブルされたナノ粒子凝集体の透過型電子顕微鏡画像である。図２Ｂは、酵素に露出された後の、ナノ粒子凝集体の透過型電子顕微鏡画像である。
【図３】図３は、本発明に従った粒子の酵素的ディスアセンブリーのための、二つの異なるアプローチを示している。
【図４】図４は、酵素の特異性をスクリーニングするために、本発本発明による粒子凝集体のアセンブリーおよびディスアセンブリーが如何にして使用され得るかを示している。
【図５】図５は、本発明による可逆的な粒子アセンブリーの平衡常数を示している。
【図６−１】図６は、創傷治癒に関与するプロテアーゼを記載した表である。
【図６−２】図６は、創傷治癒に関与するプロテアーゼを記載した表である。
【図７】図７Ａは、本発明による一つの粒子凝集体と、それがプロテアーゼであるテルモリシンによって如何にしてディスアセンブルされ得るかを示している；図７Ｂは、実施例に記載したペプチド１で官能化した後の、ｐＨ８における８．５ｎｍの金ナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である；図７Ｃは、テルモリシンの添加後の対応するＴＥＭ画像である。
【図８】図８Ａは、酵素を添加する前のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−ＮＨ２金（実線）、および７．２ｎＭテルモリシンの添加後６時間における＋Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−ＮＨ２−金（一点鎖線）、のＵＶ−可視スペクトルを示している；図８Ｂは、全てのサンプルについて計算された曲線の面積を位示すＵＶ−可視スペクトルのプロットである；図８Ｃは、７．２ｎＭおよび１ｎＭ濃度のテルモリシンについて、５分間隔で、Δ比Ａ／Ｄヲプロットしたグラフである；図８Ｄは、２時間での｛（Δ比Ａ／Ｄ）／ΔＴ｝ vs. ｌｏｇ［テルモリシン］をプロットするグラフである。
【図９】図９は、０．４５ｎｇ／ｍＬ（実線）および１ｎｇ／ｍＬのＰＳＡが、ＰＳＡにより開裂され得るペプチドにより一緒に保持された金ナノ粒子の凝集体に添加されるときに、時間に対する強度変化パーセンテージをプロットするグラフである。
【図１】
2009517452.tif 000004
【図２】
2009517452.tif 000005
【図３】
2009517452.tif 000006
【図４】
2009517452.tif 000007
【図５】
2009517452.tif 000008
【図６−１】
2009517452.tif 000009
【図６−２】
2009517452.tif 000010
【図７】
2009517452.tif 000011
【図８】
2009517452.tif 000012
【図９】
2009517452.tif 000013
【配列表】
2009517452000001.app
【国際調査報告】
2009517452.tif 000014
2009517452.tif 000015
2009517452.tif 000016