(57)【要約】  本発明は、生物学的試料において偽陽性という結果につながりうる交差反応（非特異的）抗体を減少させることにより、感受性が高く特異的な抗ＨＳＶ−２抗体の検出法を提供する。本発明は、本発明方法を使用するための核酸、ポリペプチド、およびキットを含む構成も特色とする。  本発明は、生物学的試料中の抗単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）抗体の有無を検出する方法であって、抗体を含む生物学的試料が少なくともアミノ酸配列ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）を含む第一の抗原と接触させること、および、生物学的試料中の特異的な抗ＨＳＶ−２  ｇＧ２抗体の有無を検出することを含む前記検出方法を提供する。ある実施形態において、抗原はＪ２４、ＪＡ、ＪＡ１、およびＪＡ２より選択される。
2009501900.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料中の抗単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）抗体の有無を検出する方法であって、
抗体を含んでいる生物学的試料を、アミノ酸配列ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）を含んでいる少なくとも一つの第一の抗原と接触させることであって、前記接触が非特異的抗ＨＳＶ抗体が前記試料中で前記抗原と結合するのに適した条件下で行われ、前記第一の抗原は全長糖タンパク質Ｇ２（ｇＧ２）ポリペプチドではない該接触、および
前記試料中の特異的抗ＨＳＶ−２  ｇＧ２抗体の有無を検出することであって、前記試料中で検出された特異的抗ＨＳＶ−２抗体が前記抗原に結合しない該検出、
を含む前記検出方法。
【請求項２】
前記抗原がＪ２４、ＪＡ、ＪＡ１、またはＪＡ２である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
さらに、前述の検出の前に抗体に接触している前記生物学的試料をアミノ酸配列ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）を含んでいる少なくとも一つの第二の抗原と接触させることであって、前記接触が非特異的抗ＨＳＶ抗体が前記試料中で前記抗原と結合するのに適した条件下で行われる該接触を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記特異的な抗ＨＳＶ−２  ｇＧ２抗体の有無を検出することが、前記特異的抗ＨＳＶ−２抗体が前記ＨＳＶ−２  ｇＧ２抗原に結合するのに適した条件下で前記試料をＨＳＶ−２  ｇＧ２抗原と接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記検出が、さらに前記試料を一または複数の検出可能なよう標識された抗ヒト免疫グロブリン抗体と接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
第一の担体上に固定されたアミノ酸配列ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）を含んでいる抗原を含む組成物であって、前記抗原が１３０残基長よりも短い、該組成物。
【請求項７】
前記抗原がＪ２４、ＪＡ、ＪＡ１、またはＪＡ２である、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
前記第一の担体が微小粒子である、請求項６記載の組成物。
【請求項９】
前記微小粒子がアガロースビーズである、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
前記微小粒子が磁性ビーズである、請求項８記載の組成物。
【請求項１１】
前記第一の担体がニトロセルロース膜である、請求項６記載の組成物。
【請求項１２】
さらに第二の担体上に固定された特異的なＨＳＶ−２  ｇＧ２抗原を含んでいる、請求項６記載の組成物。
【請求項１３】
前記第二の担体が微小粒子である、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
前記微小粒子がアガロースビーズである、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
前記微小粒子が磁性ビーズである、請求項１３記載の組成物。
【請求項１６】
前記第二の担体がニトロセルロース膜である、請求項１２記載の組成物。
【請求項１７】
前記第一の担体が前記第二の担体と液体伝達する、請求項１２記載の組成物。
【請求項１８】
前記第一の担体と第二の担体が接触する、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
単離したポリペプチドであって、前記ポリペプチドが前記アミノ酸配列ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）を含む抗原を含んでおり、前記ポリペプチドが１３０残基長よりも短い、該ポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが検出可能なよう標識されている、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが融合タンパク質である、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１９に記載の前記ポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項２３】
請求項２２に記載の前記核酸を含んでいる発現ベクター。
【請求項２４】
アミノ酸配列ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）を含む第一のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが１３０残基長よりも短い該ポリペプチドおよび
前記第一のポリペプチドと異種で、前記第一のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に共有結合した第二のポリペプチド
を含む組成物。
【請求項２５】
さらに前記第二のおよび第三のポリペプチドが前記第一のポリペプチドに隣接するように、前記第一のポリペプチドに共有結合した第三のポリペプチドを含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記第二のポリペプチドが第一の担体に固定された、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
前記第一の担体が微小粒子である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
前記微小粒子がアガロースビーズである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記微小粒子が磁性ビーズである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
前記第一の担体がニトロセルロース膜である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３１】
第一の担体に固定された前記アミノ酸配列ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）を含む抗原を含んでいる組成物であって、前記抗原が１３０残基長よりも短い該組成物。
【請求項３２】
前記抗原がＪ２４、ＪＡ、またはＪＡ２である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記第一の担体が微小粒子である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記微小粒子がアガロースビーズである、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記微小粒子が磁性ビーズである、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
前記第一の担体がニトロセルロース膜である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３７】
さらに第二の担体上に固定された特異的ＨＳＶ−２  ｇＧ２抗原を含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３８】
前記第二の担体が微小粒子である、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記微小粒子がアガロースビーズである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記微小粒子が磁性ビーズである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４１】
前記第二の担体がニトロセルロース膜である、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４２】
前記第一の担体が前記第二の担体と液体連絡している、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４３】
前記第一の担体および第二の担体が接触する、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドがアミノ酸配列ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）を含む抗原を含んでおり、前記ポリペプチドが１３０残基長よりも短い、該ポリペプチド。
【請求項４５】
前記ポリペプチドが検出できるよう標識された、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
前記ポリペプチドが融合タンパク質である、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
請求項４４に記載の前記ポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項４８】
請求項４７に記載の前記核酸を含んでいる発現ベクター。
【請求項４９】
アミノ酸配列ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）を含んでいる第一のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが１３０残基長よりも短い、該第一のポリペプチド、および
前記第一のポリペプチドと異種であり、前記第一のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に共有結合した第二のポリペプチド
を含んでいる組成物。
【請求項５０】
さらに、前記第二のおよび第三のポリペプチドが前記第一のポリペプチドに隣接するように、前記第一のポリペプチドに共有結合した第三のポリペプチドを含む、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記第二のポリペプチドが第一の担体上に固定された、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５２】
前記微小粒子がアガロースビーズである、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記微小粒子が磁性ビーズである、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５４】
前記第一の担体がニトロセルロース膜である、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５５】
欠失を有するＨＳＶ−２糖タンパク質Ｇ２ポリペプチドをコードする、単離された核酸であって、前記欠失がＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）を含む該核酸。
【請求項５６】
前記核酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０のアミノ酸配列をコードする、請求項５５に記載の単離された核酸。
【請求項５７】
欠失を有するＨＳＶ−２糖タンパク質Ｇ２ポリペプチドをコードする、単離された核酸であって、前記欠失がＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０６）を含む該核酸。
【請求項５８】
前記核酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のアミノ酸配列をコードする、請求項５７に記載の単離された核酸。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
単純ヘルペスウイルス（“ＨＳＶ”）の感染は極めて流行しており、一時的な無症候性獲得から、重篤な病や免疫不全患者や新生児において生命を脅かす感染まで、さまざまな症状を有する。これらの感染症は２つのウイルス、単純ヘルペス１型（“ＨＳＶ−１”）および単純ヘルペス２型（“ＨＳＶ−２”）により引き起こされる。ＨＳＶ−１は口腔感染の主な原因であり、通常子供が感染するが、一方ＨＳＶ−２感染は通常性感染する性器感染症である。これらの区別ははっきりしないが、性器ヘルペスの最大２５％はＨＳＶ−１により引き起こされる。初期感染に続き、ウイルスは一生潜伏状態を確立して周期的に活性化し、臨床的に明白な損傷性発症または無症候性ウイルス出芽を引き起こす。
【０００２】
一般に、ＨＳＶは、膜に包まれた正十二面体のヌクレオカプシド中にパッケージングされた約１５０−１６０ｋｂｐのゲノムを有する、二重らせんＤＮＡウイルスである。膜（またはエンベロープ）は、１０またはそれ以上のウイルス特異的な糖タンパク質を含み、最も豊富な糖タンパク質はｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥである。ウイルスゲノムは、外被タンパク質ＶＰ１６を含め５０以上の他のタンパク質もコードしている。ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のウイルスゲノムは相関性があり、全ゲノムで５０％の相同性を有する。いくつかの遺伝子、たとえばｇＢやｇＤでは、２つのウイルス型間アミノ酸相同性は、８０−９０％まで増大する。この相同性の結果、多くのＨＳＶ特異的な抗体はどちらのウイルス型にも交差反応性である。ウイルス型間で、糖タンパク質遺伝子の限られた（１−２％）系−系配列多様性が存在する。
【０００３】
ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２間の強い交差中和、および集団におけるＨＳＶ−１に対する抗体の高い発生頻度により、無症候性ＨＳＶ−２感染の罹患率を決定するのは難しかった。疫学的なレベル、例えば性器ヘルペスと子宮頸癌との関係において、および、個人的なレベル、例えば偽陽性の結果が、妊婦に対する不適当な内科的治療や患者およびその配偶者における不当な心理的トラウマのような大きな問題につながりうる点において、ＨＳＶ感染が意味することにより、これらのアッセイの特異性は重要である。
【０００４】
ＨＳＶ−２の検出方法の領域においては、迅速に、鋭敏に、そして特にＨＳＶ−１とＨＳＶ−２間で正確に決定的に識別することができるという点について、特異的な方法が求められている。
本発明はこれらの必要性に対処するものである。
【特許文献１】米国特許第５，６５６，４５７号明細書
【特許文献２】米国特許第５，９６５，３５４号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６６５，５３７号明細書
【特許文献４】米国特許第５，９６５，３５７号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／００４９６５８号
【非特許文献１】Ａｓｈｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８８）  ２６：６６２−６６７
【非特許文献２】Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  （１９９１）  １６４：１１９６−１１９９
【非特許文献３】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８５）  ２２：６４１−６４４
【非特許文献４】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  （１９８６）  １４：１１１−１１８
【非特許文献５】ＭｃＧｅｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ，  ６８：１９−３８（１９８７）
【非特許文献６】Ｓｕｌｌｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｆ．  Ｄｉｓ．，  １５７（１）：  １６４−１７１（１９８８）
【非特許文献７】Ｏｌａｄｅｐｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉ．  Ｍｅｔｈ．  （２０００）  ８７：６３−７０
【非特許文献８】Ｐａｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃａｎ  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．（２００１）  ３３：７９４−７９６
【非特許文献９】Ｇｒａｂｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．（１９９９）  ８０：１７８９−１７９８
【非特許文献１０】Ｎｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈ．（２００３）  １０７：２１−２７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、生物学的試料において偽陽性という結果につながりうる交差反応（非特異的）抗体を減少させることにより、感受性が高く特異的な抗ＨＳＶ−２抗体の検出法を提供する。本発明は、本発明方法を使用するための核酸、ポリペプチド、およびキットを含む構成も特色とする。
【０００６】
本発明は、生物学的試料中の抗単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）抗体の有無を検出する方法を提供する。この方法は、抗体を含む生物学的試料が少なくともアミノ酸配列ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）を含む第一の抗原と接触させることであって、抗原がｇＧ２ポリペプチドの全長ではなく、その接触が試料中の非特異的抗ＨＳＶ抗体の抗原への結合に適した条件下で行われるものであり、前記接触は結合していない特異的な抗ＨＳＶ−２  ｇＧ２抗体を減少させないものである該接触、および、生物学的試料中の特異的な抗ＨＳＶ−２  ｇＧ２抗体の有無を検出することであって、試料中で検出された特異的な抗ＨＳＶ−２抗体は抗原に結合しないものからなる該検出を含む。ある実施形態において、抗原はＪ２４、ＪＡ、ＪＡ１、およびＪＡ２より選択される。ある実施形態において、その方法は、さらに前述の検出の前に、抗体を含んでいる生物学的試料を少なくともアミノ酸配列ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）を含む第二の抗原と接触させることであって、その接触が試料中の非特異的抗ＨＳＶ抗体の抗原への結合に適した条件下で行われるものを含む。
【０００７】
ある実施形態において、前記の特異的な抗ＨＳＶ−２  ｇＧ２抗体の有無の検出は、ＨＳＶ−２  ｇＧ２抗原への特異的な抗ＨＳＶ−２抗体の結合に適した条件下で、その試料をＨＳＶ−２  ｇＧ２抗原に接触させることを含む。ある実施形態において、検出は、さらにその試料を一または複数の検出可能なよう標識された抗ヒト免疫グロブリン抗体と接触させることを含む。
【０００８】
本発明は、第一の担体上に固定されたアミノ酸配列ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）を含んでいる抗原であって、１３０残基長未満である抗原を含む組成物も提供する。ある実施態様において、抗原はＪ２４、ＪＡ、ＪＡ１、またはＪＡ２である。ある実施形態において、第一の担体は、例えばアガロースビーズや電磁ビーズのような微小粒子である。他の実施態様において、第一の担体はニトロセルロース膜である。
【０００９】
ある実施態様において、組成物はさらに第二の担体上に固定された特異的なＨＳＶ−２ｇＧ２抗原を含む。ある実施態様において、第二の担体は、例えばアガロースビーズや電磁ビーズのような微小粒子である。他の実施態様において、第二の担体はニトロセルロース膜である。一部の実施態様において、第一の担体は第二の担体と液体連絡している。さらなる実施態様において、第一の担体および第二の担体は接触している。
【００１０】
本発明は、単離したポリペプチドも提供し、そのポリペプチドはアミノ酸配列ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）を含んでいる抗原を含むものであって、１３０残基長未満のものである。ある実施態様において、ポリペプチドは検出可能なよう標識される。他の実施態様において、ポリペプチドは融合タンパク質である。
【００１１】
本発明は、ポリペプチドをコードしている核酸も提供し、そのポリペプチドはアミノ酸配列ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）を含んでいる抗原を含むものであって、１３０残基長未満のものである。
【００１２】
本発明は、ポリペプチドをコードする核酸を含んでいる発現ベクターも提供し、そのポリペプチドはアミノ酸配列ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７）を含んでいる抗原を含むものであって、１３０残基長未満のものである。
【００１３】
本発明は、アミノ酸配列ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）を含む第一のポリペプチドであって、そのポリペプチドが１３０残基長未満のもの、および第一のポリペプチドとは異種であり、第一のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に共有結合した第二のポリペプチドを含む組成物も提供する。ある実施態様において、組成物はさらに、第二のおよび第三のポリペプチドが第一のポリペプチドに隣接するように第一のポリペプチドに共有結合した第三のポリペプチドも含む。ある実施態様において、第二のポリペプチドは第一の担体上に固定される。ある実施態様において、第一の担体は、例えばアガロースビーズや磁性ビーズのような微小粒子である。他の実施態様において、第一の担体はニトロセルロース膜である。
【００１４】
本発明は、第一の担体上に固定されたアミノ酸配列ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）を含む抗原を含む組成物も提供し、その抗原は１３０残基長未満である。ある実施態様において、抗原はＪ２４、ＪＡ、またはＪＡ２である。ある実施態様において、第一の担体は、例えばアガロースビーズや磁性ビーズのような微小粒子である。他の実施態様において、第一の担体はニトロセルロース膜である。
【００１５】
ある実施態様において、組成物はさらに、第二の担体上に固定された特異的なＨＳＶ−２  ｇＧ２抗原を含む。ある実施態様において、第二の担体は、例えばアガロースビーズや磁性ビーズのような微小粒子である。他の実施態様において、第二の担体はニトロセルロース膜である。一部の実施態様において、第一の担体は第二の担体と液体連絡している。さらなる実施態様において、第一の担体および第二の担体は接触している。
【００１６】
本発明は、アミノ酸配列ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）を含む抗原を含んでいる単離したポリペプチドも提供し、そのポリペプチドは１３０残基長未満である。ある実施態様において、ポリペプチドは検出可能なよう標識される。他の実施態様において、ポリペプチドは融合タンパク質である。
【００１７】
本発明は、アミノ酸配列ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）を含む抗原を含んでいるポリペプチドをコードしている核酸も提供し、そのポリペプチドは１３０残基長未満である。
【００１８】
本発明は、ポリペプチドをコードする核酸を含んでいる発現ベクターも提供し、そのポリペプチドはアミノ酸配列ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）を含む抗原を含んでいるものであって、１３０残基長未満のものである。
【００１９】
本発明は、アミノ酸配列ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）を含む第一のポリペプチドであって、そのポリペプチドが１３０残基長未満のもの、および第一のポリペプチドとは異種であり、第一のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に共有結合した第二のポリペプチドからなる組成物も提供する。ある実施態様において、組成物はさらに、第二のおよび第三のポリペプチドが第一のポリペプチドに隣接するように第一のポリペプチドに共有結合した第三のポリペプチドも含む。ある実施態様において、第二のポリペプチドは第一の担体上に固定される。ある実施態様において、第一の担体は、例えばアガロースビーズや磁性ビーズのような微小粒子である。他の実施態様において、第一の担体はニトロセルロース膜である。
【００２０】
本発明は、欠失あるＨＳＶ−２糖タンパク質Ｇ２ポリペプチドをコードしている単離した核酸であって、その欠失がＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）のアミノ酸配列を含むものも提供する。ある実施態様において、その核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸配列をコードしている。
【００２１】
本発明は、欠失あるＨＳＶ−２糖タンパク質Ｇ２ポリペプチドをコードしている単離した核酸であって、その欠失がＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）のアミノ酸配列を含むものも提供する。ある実施態様において、その核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のアミノ酸配列をコードしている。
これらと他の物、および本発明の利益は、以下の詳細な説明から明らかとなる。
図１Ａは野生型ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｇ２（ｇＧ２）のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１）を示す。
図１Ｂは野生型ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｇ２（ｇＧ２）の核酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）を示す。
図２はヒト血清中でＨＳＶ−２非0特異的抗体と反応しているエピトープを同定するため設計および表現された、ＨＳＶ−２ｇＧ２遺伝子、および特異的ｇＧ２抗原、および交差反応性抗原の図を示す。
図３は例となる交差反応性抗原の図を示す。配列位置は図１ＡのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１と対応する。
図４Ａは例となる交差反応性抗原の配列比較を示す。
図４Ｂは野生型ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｇ２欠失変異型（ｇＧ２ΔＭＣＲＳ１）のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）を示す。
図４Ｃは野生型ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｇ２置換変異型（ｇＧ２ｓｕｂＭＣＲＳ１）のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）を示す。
図４Ｄは野生型ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｇ２欠失変異型（ｇＧ２ΔＭＣＲＳ２）のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を示す。
図４Ｅは野生型ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｇ２置換変異型（ｇＧ２ｓｕｂＭＣＲＳ２）のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を示す。
図５はＨＳＶ−２ｇＧ２遺伝子の異なるペプチド断片のヒト血清との反応性を示すウエスタンブロットである。ペプチドはＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動され、ニトロセルロース膜にトランスファーされた。そしてヒト血清で染色した。１８、１９、および２５−３２レーンは通常であり、１−５、１０−１３、および１６レーンはＨＳＶ−２陽性であり、６−９、１４、１５、１７、２０、２１、２３、２４レーンはＨＳＶ−２偽陽性である。その結果は、陽性血清の多くはペプチドＪ２４およびＪＡと反応することを示した。よってＪ２４およびＪＡは、ＨＳＶ−２非特異的ヒト抗体と反応するエピトープを含む。
図６は交差反応性抗原ＪＡ存在下および非存在下、全長ＨＳＶ−２  ｇＧ２でコートしたＥＬＩＳＡにおいて、真陽性血清（Ｐとマーク）の効果と比較した偽陽性血清（ＦＰとマーク）に対する阻害効果を示すグラフである。試料希釈液中にＪＡの有る時および無い時のＥＬＩＳＡ（全ｇＧ２抗原に基づいて）指標値が図に示されている。阻害は、血清試料希釈液中でＪＡと混合することにより達成される。ＪＡは、顕著に偽陽性血清由来の反応性を阻害する一方、真陽性血清には効果を及ぼさない。
図７は交差反応性抗原ＪＡのあるときとないとき間での指標補正を示したグラフであり、交差反応性ｇＧ２抗原は真陽性および真陰性試料には作用しないが、偽陽性の反応性は阻害することを示している。多くの偽陽性（ピンク）、多くの真陽性（黄色）、および陰性（青）。ＪＡはＥＬＩＳＡ試料希釈液中で混合された。ＪＡのない希釈液由来の指標値およびＪＡのある希釈液由来の指標値は、散布図となった。通常のおよび真陽性の血清は、類似の結果を与え、対角線上にのるが、一方で偽陽性血清は対角線からはずれており、ＪＡが偽陽性活性を阻害していることを示している。
図８は交差反応性抗原ＪＡ、ＪＡ１、およびＪＡ２を用いた、血清群（陽性、Ｐ；陰性、Ｎ；と、偽陽性、ＦＰ、不定、ＥＱ）へのＥＬＩＳＡ阻害研究の結果を示す。試料希釈液の４種（異なるＪＡペプチドありまたはなし）を比較した（ＪＡなし、ＪＡ１あり、ＪＡ２あり、ＪＡ１とＪＡ２あり、組換えＪＡあり）。ＪＡなしの希釈液の値と様々なＪＡありの希釈液の値を比較したとき、真陽性および真陰性の血清では、解釈と同様、ＯＤと指標値は顕著には変化しない。偽陽性の血清では、顕著な変化が見られた。
図９は図８のデータ表の値から指標値の変化を表したグラフである。ｘ軸はＪＡなしの希釈液に基づく値を表す。ｙ軸はＪＡありの希釈液に基づく値を表す。点円は偽陽性であるが、他の点は真陽性または真偽性である。偽陽性の点は対角線上から落ち、ＪＡまたはＪＡ１またはＪＡ２の阻害作用を示している。
【００２２】
定義
“糖タンパク質Ｇ２”、“ｇＧ２”、“ＨＳＶ−２  ｇＧ”、および“ＨＳＶ−２  ｇＧ２”の語は、２１アミノ酸シグナル配列、４つの潜在的なＮ末端糖化部位と６つのシステイン残基を有する６２６アミノ酸からなる第一の多様な極性領域、２５アミノ酸からなる膜貫通結合ドメイン、２４アミノ酸からなるＣ末端細胞質ドメインを含んでいる、２０９７塩基対遺伝子によりコードされるＨＳＶ−２の６９９アミノ酸エンベロープタンパク質（図１Ａ）を表す。ＨＳＶ−２  ｇＧは、ＭｃＧｅｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ，  ６８：１９−３８（１９８７）に、より詳細に記載されている。ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｇ２（ｇＧ２）のアミノ酸配列は、図１Ａにおいて提供される。
【００２３】
ここで使われる場合、“特異的なｇＧ２抗原”の語は、ＨＳＶ−２に対する抗体に特異的に結合する一または複数のエピトープ領域を含むｇＧ２に由来するポリペプチドを意味する。典型的な、特異的ｇＧ２抗原は、ＭｃＧｅｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，中により詳細に詳述されるように、ＨＳＶ−２のエンベロープタンパク質糖タンパク質Ｇ（ｇＧ）の４８６アミノ酸部分をコードする、ＨＳＶ−２に特異的でＨＳＶ−１糖タンパク質Ｇ遺伝子には見られない、独特の（全長コード配列の９９−１５５９残基にわたる）１４６１塩基対核酸に由来する。“ＨＳＶ−２ｇＧの独特の配列”という言い回しは、ここでは、前記ＨＳＶ−２ｇＧの独特の配列と実質的に同じものであり、実質的に同じ生物活性を有するヌクレオチド配列を含むと解釈する。
【００２４】
ある実施態様において、特異的なｇＧ２抗原は、欠失または異なるアミノ酸配列に置換されたＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）のアミノ酸配列を含んだ最低限の交差反応性抗原配列を有している、ＨＳＶ−２  ｇＧ２（ｇＧ２）抗原の変異型である。欠失したＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）を含んだ最低限の交差反応性抗原配列を有している、野生型ＨＳＶ−２ｇＧ２の欠失変異型の典型的なアミノ酸配列は、図４Ｂにおいて提供される。異なるアミノ酸配列に置換されたＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）を含んだ最低限の交差反応性抗原配列を有している、野生型ＨＳＶ−２  ｇＧ２の置換変異型の典型的なアミノ酸配列は、図４Ｃにおいて提供される。
【００２５】
ある実施態様において、特異的なｇＧ２抗原は、欠失または異なるアミノ酸配列に置換されたＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）のアミノ酸配列を含んだ最低限の交差反応性抗原配列を有している、ＨＳＶ−２  ｇＧ２（ｇＧ２）抗原の変異型である。欠失したＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）を含んだ最低限の交差反応性抗原配列を有している、野生型ＨＳＶ−２  ｇＧ２の欠失変異型の典型的なアミノ酸配列は、図４Ｄにおいて提供される。異なるアミノ酸配列に置換されたＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）を含んだ最低限の交差反応性抗原配列を有している、野生型ＨＳＶ−２  ｇＧ２の置換変異型の典型的なアミノ酸配列は、図４Ｅにおいて提供される。
【００２６】
ここで使われる場合、“交差反応性ｇＧ２抗原”、“ｇＧ２ポリペプチドの交差反応性抗原”、または“交差反応性抗原”の語は、ＨＳＶ−２に特異的ではない抗体により結合される抗原を意味し、抗体は標的抗原としてｇＧ２抗原を使用するＨＳＶ−２アッセイにおいて偽陽性という結果としうる。“交差反応性”抗原は、そのような抗原は一般にアミノ酸配列ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）を含むという条件で、ＨＳＶ−２  ｇＧ２ポリペプチドまたはＨＳＶ−２  ｇＧ２以外の源に由来しうる。本発明の交差反応性抗原の例は、以下の詳細な説明に記載するように、Ｊ２４ペプチド、ＪＡペプチド、ＪＡ１ペプチド、ＪＡ２ペプチドを含む。
【００２７】
“抗ＨＳＶ−２特異的抗体”または“特異的な抗ＨＳＶ−２抗体”は、ＨＳＶ−２への曝露に対する反応において生産された抗体を意味し、ＨＳＶ−２抗原に特異的である。代表的な特異的ＨＳＶ−２抗原は、ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｃポリペプチド（“ｇＣ２”）およびその特異的なペプチドエピトープ；ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｇポリペプチド（“ｇＧ２”）、および例えばｇＧ２のアミノ酸３５７−３６４、５５３−５７２、５７３−５８０および６０１−６０８等のような、その型特異的なペプチドエピトープ；ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｂ（“ｇＢ２”）、ｇＢ２のアミノ酸１８−２２８（Ｇｏａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，第３４回Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｖｉｒａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、１９９４年１０月４−７日の要旨、要旨Ｈ６参照）；およびＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄ（“ｇＤ２”）、およびその型特異的ペプチドエピトープである。
【００２８】
“エピトープ”とは、特異的なＢ細胞およびＴ細胞が反応する抗原上の部位を意味する。この語は、“抗原決定基”または“抗原決定部位”と互換的にも用いられる。エピトープは、エピトープに独特な空間的構造において、３つまたはそれより多くのアミノ酸を含むことができる。一般に、エピトープは少なくとも５つのそのようなアミノ酸からなり、より通常には、少なくとも８−１０個のそのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的構造を決定するための方法は技術的に知られており、例えば、Ｘ線結晶学および2次元核磁気共鳴を含む。さらに、あるタンパク質におけるエピトープの同定は、技術的によく知られた技術を用いて容易に行うことが出来る。例えば、Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９８４）  ８１：３９９８−４００２（ある抗原における免疫原性のエピトープの位置を決定するためのペプチドを迅速に合成する一般的な方法）；米国特許４，７０８，８７１（抗原のエピトープの同定および化学的合成の手順）；およびＧｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８６）  ２３：７０９−７１５（ある抗体への高い親和性を用いてペプチドを同定する技術）。同じエピトープを認識する抗体は、ある抗体がもう一方の抗体の標的抗原への結合を阻害する能力を示す単純な免疫アッセイにおいて、同定することができる。
【００２９】
“特異的に結合”または“特異的に結合する”とは、特異的な抗原に対する抗体の、高い結合活性および／または高い親和性ある結合を意味する。この特異的な抗原上のエピトープに結合している抗体は、他のどんなエピトープ、特に、興味のある特異的な抗原のような、分子内に関連して、または同じ試料中に存在しうるエピトープに対する同じ抗体の結合より強い結合活性および／または親和性である。興味のあるポリペプチドに特異的に結合する抗体は、弱いが検出は可能なレベル（例えば、興味のあるポリペプチドに対して示す結合の１０％またはそれより少なく）で他のポリペプチドに結合することができるものであってもよい。そのような弱い結合、またはバックグラウンドの結合は、例えば適当な対照を用いることにより、興味のあるポリペプチドに対する特異的な抗体の結合から容易に識別することができる。
【００３０】
“検出可能なよう標識された抗体”、または“検出可能なよう標識された二次抗体”とは、取り付けられた検出可能な標識を有する抗体（または結合特異性の残っている抗体断片）を意味する。検出可能な標識は、化学的な結合により付けられることも可能であるが、標識がポリペプチドの場合、代わりに遺伝子工学技術により付けられることも可能である。検出可能な標識タンパク質を生産する方法は、技術的によく知られている。検出可能な標識は、技術的に知られた多様なそのような標識から選択されうるが、通常、放射性同位体、蛍光色素分子、酵素（例えば西洋わさびペルオキシダーゼ）、または、検出可能なシグナル（例えば放射活性、蛍光、色）を放つ、またはその基質への標識の曝露後に検出可能なシグナルを放つ他の部分や化合物である。多様な検出可能な標識／基質ペア（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ／ジアミノベンジジン、アビジン／ストレプトアビジン、ルシフェラーゼ／ルシフェリン）、抗体を標識する方法、および抗原（例えば、ＨＳＶ−２に対するヒト抗体のような）を検出するために標識された二次抗体を用いる方法は、技術的によく知られている（例えば、Ｈａｒｌａｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  ｅｄｓ．（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．））。
【００３１】
ここで使われる場合“単離した”という語は、単離した化合物との関連で用いられるとき、化合物が自然に発生する環境とは異なる環境にある、関心のある化合物を表す。“単離した”とは、関心のある化合物について実質的に濃縮された試料および／または関心のある化合物が部分的または実質的に精製された試料中にある化合物を含むことを意味する。“単離した”という語は、ある自然の状態では通常関連している少なくともいくつかの材料によって化合物が伴われていない場合を包含する。例えば、ポリペプチドについての“単離した”という語は、一般に、全部または一部において、通常自然では関連している配列を欠いているアミノ酸分子；または自然に存在しているが、それらと関連した非相同的な配列を有する配列を表す。
【００３２】
ここで使われる場合、“精製した”とは、列挙した材料が全タンパク質の少なくとも約７５重量％含むことであり、より好ましくは少なくとも約８０重量％含むことであり、特に好ましくは少なくとも約９０重量％含むことを意味する。ここで使われる場合、“実質的に純粋”という語は、その自然の環境から除去され、自然に関連している他の化合物を少なくとも６０％含まない、好ましくは７５％含まない、そして最も好ましくは９０％含まない化合物を表す。
【００３３】
一般に、“配列同一性”は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列それぞれに対応する、正確なヌクレオチド−ヌクレオチドまたはアミノ酸−アミノ酸の一致を表す。％同一性は、配列を整列させること、２つの整列した配列間で一致する正確な数を数えること、より短い配列の長さによって分けること、および結果を１００倍することによって、２分子間の配列情報の直接的な比較により決定することが出来る。
【００３４】
すぐに利用できるコンピュータープログラムは、相同性と同一性の分析を補助するために使用されうる。例えばＤＮＡＳＴＡＲ，  ＩｎｃからのＬＡＳＥＲＧＥＮＥ；およびＡＬＩＧＮ，  Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．  Ｏ．  ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｍ．  Ｏ．  Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，  ５  Ｓｕｐｐｌ．  ３：３５３−３５８，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ等があり、それらはペプチド解析のため、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２−４８９，１９８１の局所的な相同性アルゴリズムを適応する。ヌクレオチド配列の相同性を決定するためのプログラムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｍａｄｓｏｎ，  Ｗｉｓ．から利用できる）を利用でき、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに基づいたＢＥＳＴＦＩＴ，  ＦＡＳＴＡ  ａｎｄ  ＧＡＰ  ｐｒｏｇｒａｍｓがある。これらのプログラムは、製造業者により推奨され、上述のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅに記載された初期設定のパラメーターですぐに利用できる。例えば、特定のヌクレオチド配列と参照配列の％同一性は、初期設定のスコアリング表と６つのヌクレオチド位置のギャップペナルティとともにＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを用いて、決定されうる。
【００３５】
本発明との関連で％相同性を確立するその他の方法は、エディンバラ大学により著作権が取得され、Ｊｏｈｎ  Ｆ．  ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ  Ｓ．  Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  Ｃａｌｉｆ．）により流通されたプログラムのＭＰＳＲＣＨ  ｐａｃｋａｇｅを使用することである。この一組のパッケージから、初期設定のパラメーターがスコアリング表のために用いられる場合（例えば、１２のギャップオープンペナルティ、１のギャップ伸張ペナルティ、および６のギャップ）には、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを採用することも可能である。データから、生成された“Ｍatch”値は、“配列相同性”を反映する。配列間の％同一性または相同性を計算するための他の適したプログラムは、技術的に一般的に知られており、例えば、その他の配列プログラムがＢＬＡＳＴであり、初期設定のパラメーターとともに用いられる。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは次の初期設定のパラメーターを用いて、使用されうる：ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；  ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；  ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；  ｃｕｔｏｆｆ＝６０；  ｅｘｐｅｃｔ＝１０；  Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；  Ｄｉｓｃｒｉｐｔｉｏｎ＝５０  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；  ｓｏｒｔ  ｂｙ＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；  Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ、Ｇｅｎｂａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋Ｇｅｎｂａａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）および国立医学図書館により提供されたインターネット上のウェブサイトで発見しうる（例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴのワールドワイドウェブサイトを参照）。
【００３６】
ここで使われる場合、“生物学的試料”とは、対象から単離した組織または体液を表すものであって、本発明の構成において一般に抗ＨＳＶ−２抗体を含んでいると思われる試料を表し、試料は任意の処理の後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにて分析されうる。関心のある典型的な試料は、限定される必要はないが、血液、血漿、血清、血液細胞、唾液、および粘液を含む。試料は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養の構成物試料も含むが、培養液中での細胞および組織の成長から生じる培養上清に限定せず、例えば組換え細胞や細胞構成物も含む。
【００３７】
“評価すること”の語は、測定のいかなる形式も含み、要素が存在するかどうかを決定することも含む。“決定すること”、“測定すること”、“審査すること”、“評価すること”、および“アッセイすること”の語は相互に使用され、量的および質的な決定を含む。評価することは、相対的または絶対的となりうる。“−の存在を評価すること”は、何か存在する量を決定すること、および／または、存在するかしないかを決定することを含む。ここで使われる場合、“決定すること”、“測定すること”、および“評価すること”、および“アッセイすること”の語は相互に使用され、量的および質的な決定のどちらをも含む。
“正確さ”は、ある試料の同じまたは比較可能な結果を再現性よく生むアッセイの能力を表す。
【００３８】
請求項はいかなる任意の要素を除外して作成されてもよいことを、さらに指摘する。そのようなものとして、この記述が請求項の要素の詳述との関連で“もっぱら”、“唯一の”などの排他的な術語の使用または“否定的な”限定の使用の根拠として役目を果たすことを意図する。
【００３９】
本発明を記述する前に、当然のことながら、本発明が記載された特定の実施態様に限定するものではなく、したがってもちろん変化しうることが理解されるべきである。本発明の範囲は添付した請求項によってのみ限定されるので、当然のことながら、ここで使われる術語は、特定の実施態様を記載するのみの目的のためであり、限定することを意図するのではない。
【００４０】
値の範囲が提供されている場合、文脈が明確に異なるように指示しない限り、該範囲の上限および下限の間で、下限のユニットの１０分の１までの各値は特に開示されていることが理解される。任意の記載される値または記載される範囲における間の値と、その他の記載される値またはその記載される範囲における間の値の間の、それぞれのより小さな範囲は、本発明に包含される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立してその範囲に含まれてもよく、除外されてもよく、一方または両方の限度がそのより小さな範囲に含まれるかまたは含まれないそれぞれの範囲も、記載される範囲において特定的に除外されない限り、本発明に包含される。記載される範囲が一方または両方の限度を含む場合、それらの含まれた限度のどちらかまたは両方を除外した範囲も本発明に含まれる。
【００４１】
異なるように定義されない限り、ここで使われるすべての技術的および科学的な語は本発明の属する技術分野における通常の技術を有するものにより通常理解されているのと同じ意味を有する。ここに記載されたものと同様または等価ないかなる方法および材料が本発明の実施または試験に使用されうるとしても、好ましい方法および材料は現に記載されている。ここで言及したすべての刊行物は、方法および／または材料を開示し記載するため、刊行物を引用することに関連して参照によりここに組み入れられる。本開示は、矛盾がある程度まで、組み入れた刊行物のいかなる開示に優先すると理解される。
【００４２】
ここで使われる場合、および添付した請求項において、条件が明確に異なるように記載されていない限り、単数形の“ａ”、“ａｎ”、および“その”は、複数形の指示対象を含む。よって、例えば、“一つのペプチド”の言及はそのようなペプチドの複数形を含み、“その試料”の言及は、一または複数の試料および当業者に知られたその等価な物等を含む。
【００４３】
ここで議論した刊行物は、本適用の出願日よりも前の開示のためにもっぱら提供される。本発明が前の発明の効力により、そのような刊行物に先行する権利がないという承認として解釈すべきではない。さらに、提供された刊行物の日付は、独立に確認する必要があるだろうが、実際の刊行日とは異なる可能性がある。
【００４４】
本発明の実施は、異なるように指示されない限り、化学、生物化学、組換えＤＮＡ技術、およびウイルス学のその技術分野内で通常の方法を採用する。そのような技術は文献中で十分に説明される。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｖｏｌ．  Ｉ＆ＩＩ（Ｂ．  Ｎ．  Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｍ．  Ｋｎｉｐｅ  ｅｄｓ．）；  Ａ．  Ｌ．  Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．，  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚａｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．  Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．  Ｋａｐｌａｎ  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．  Ｇａｉｔ，  ｅｄ．，  １９８４）；  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
発明の詳細な説明
本発明は、生物学的試料のような試料中の抗ＨＳＶ−２抗体の存在とＨＳＶ−２に対して特異的でなくＨＳＶ−２アッセイにおいて偽陽性となりうる抗体の存在の間の識別を提供するために、交差反応性（非特異的）抗原を用いて、感受性が高く特異的な抗ＨＳＶ−２抗体の検出法を提供する。本発明は、本発明方法を使用するための核酸、ポリペプチド、およびキットを含む構成も特色とする。
【００４６】
本発明は、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）の糖タンパク質−２（ｇＧ２）の交差反応性（例えば非特異的な）領域の発見に基づいており、例えば生物学的試料のような試料中の抗ＨＳＶ−２抗体を検出するためのアッセイの特異性を高めるため、“前吸収型”抗原としての役目を果たすことができる。交差反応性抗原は、試料と接触させることができる。特に、交差反応性抗原を含んでいるポリペプチド断片を特異的なｇＧ２抗原とともに使用することは、抗ＨＳＶ−２抗体またはＨＳＶ−２に特異的でなく、ＨＳＶ−２アッセイにおいて偽陽性となりうる抗体を検出するという効果がある。これらのアッセイの特異性および簡便性は、ＨＳＶ血清型間の検出および識別のための迅速な、信頼できる、そして高価でないアッセイを容易にし、特にＨＳＶ−２の検出の効率を良くする。
本発明の組成物および方法は、以下により詳細に記述される。
【００４７】
組成物
本発明は、交差反応性抗原を用いて、抗ＨＳＶ−２抗体のアッセイにおいて妨げとなりうる（例えば、偽陽性解釈という結果となる）試料中のＨＳＶ−２に特異的でない抗体を除去することによる、試料中の抗ＨＳＶ−２抗体の検出を提供する。すなわち、本発明は交差反応性抗原ポリペプチドを、同じものをコードしている核酸と同様に提供する。
【００４８】
ここで使われる場合“最低限の交差反応性”または“ＭＣＲＳ”とは、野生型ｇＧ２に存在し、抗ＨＳＶ−２抗体により結合され、ならびにＨＳＶ−２に対して特異的でなく、ＨＳＶ−２アッセイにおいて偽陽性となりうる抗体により結合されるエピトープを定義する、最低限のアミノ酸配列を意味する。
【００４９】
ある実施態様において、最低限の交差反応性配列は、次のアミノ酸配列を含む：
ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）（ＭＣＲＳ１）。
【００５０】
ある実施態様において、最低限の交差反応性配列は、次のアミノ酸配列を含む：
ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）（ＭＣＲＳ２）。
【００５１】
ある実施態様において、交差反応性抗原は最低限の交差反応性配列（例えば、ＭＣＲＳ１またはＭＣＲＳ２）を含み、交差反応性抗原は約１３０アミノ酸長またはそれより多くまで可能であり、約１２０アミノ酸長、１１０アミノ酸長、１００アミノ酸長、９０アミノ酸長、８０アミノ酸長、７０アミノ酸長、７５アミノ酸長、６５アミノ酸長、６０アミノ酸長、５５アミノ酸長、５０アミノ酸長、４５アミノ酸長、４０アミノ酸長、３８アミノ酸長、３６アミノ酸長、３４アミノ酸長、３０アミノ酸長、２８アミノ酸長、２６アミノ酸長、２４アミノ酸長、２２アミノ酸長、２０アミノ酸長、２０アミノ酸長、１８アミノ酸長、１６アミノ酸長、１５アミノ酸長、１４アミノ酸長、１３アミノ酸長、１２アミノ酸長、１１アミノ酸長、１０アミノ酸長、９アミノ酸長を含むものであって、交差反応性抗原は全長ｇＧ２ポリペプチドではない。
【００５２】
ある実施態様において、交差反応性抗原は次の式を含む：
Ｚ(0+n1)−ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ−Ｘ(0+n2)（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０８）
ＺおよびＸは、天然に生じるもの、または非天然に生じるもの、遺伝学的にコードされるもの、または遺伝学的にコードされないものを含むすべてのアミノ酸から独立に選択され、残基およびｎ１およびｎ２は、独立に選択された約０から約６０までのすべての整数の形であり、約２から約５８まで、約２から約５８まで、約４から約５６まで、約６から約５４まで、約８から約５２まで、約１０から約５０まで、約１２から約４８まで、約１４から約４６まで、約１６から約４４まで、約１８から約４２まで、約２０から約４０まで、約２２から約３８まで、約２４から約３６まで、約２６から約３４まで、約２８から約３２までを含む。そのようなものとして、フランキング領域Ｚ(0+n1)およびＸ(0+n2)は、同じ長さまたは異なる長さとすることができる。
【００５３】
他の実施態様において、交差反応性抗原は次の式を含む：
Ｚ(0+n1)−ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ−Ｘ(0+n2)（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０９）
ＺおよびＸは、天然に生じるもの、または非天然に生じるもの、遺伝学的にコードされるもの、または非遺伝学的にコードされるものを含むすべてのアミノ酸から独立に選択され、残基およびｎ１およびｎ２は、独立に選択された約０から約６０までのすべての整数の形であり、約２から約５８まで、約２から約５８まで、約４から約５６まで、約６から約５４まで、約６から約５４まで、約８から約５２まで、約１０から約５０まで、約１２から約４８まで、約１４から約４６まで、約１６から約４４まで、約１８から約４２まで、約２０から約４０まで、約２２から約３８まで、約２４から約３６まで、約２６から約３４まで、約２８から約３２までを含む。そのようなものとして、フランキング領域Ｚ(0+n1)およびＸ(0+n2)は、同じ長さまたは異なる長さとすることができる。
【００５４】
本発明の方法中での使用に適した交差反応性抗原の例は、次のものを含む：
Ｊ２４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１の３９９−４９７残基）：
ＴＶＡＶＴＰＥＥＴＡＶＡＳＰＰＡＴＡＳＶＥＳＳＰＬＰＡＡＡＡＡＴＰＧＡＧＨＴＮＴＳＳＡＳＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰＴＴＰＰＰＴＳＴＨＡＴＰＲＰＴＴＰＧＰＱＴＴＰＰＧＰＡＴＰＧＰＶＧＡＳＡＡＰＴＡＤＳＰＬ
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０２）
ＪＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１の４１６−４５５残基）：
ＡＳＶＥＳＳＰＬＰＡＡＡＡＡＴＰＧＡＧＨＴＮＴＳＳＡＳＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰＴＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０３）
ＪＡ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１の４２３−４４２残基）：
ＬＰＡＡＡＡＡＴＰＧＡＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０４）；および
ＪＡ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１の４３４−４５３残基）：
ＧＨＴＮＴＳＳＡＳＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０５）
例となる交差反応性抗原の配列アラインメントは、図３において図式の形で、図４Ａにおいて配列の形で示される。
【００５５】
本発明は、ｇＧ２ポリペプチドのＭＣＲＳが欠失している変異ｇＧ２ポリペプチド、ならびにこのポリペプチドをコードする核酸を提供する。ある実施態様において、特異的なｇＧ２抗原は、ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）（ＭＣＲＳ１）のアミノ酸配列を含んでいる少なくとも最低限の交差反応性抗原配列が欠失しているＨＳＶ−２  ｇＧ２（ｇＧ２）抗原の変異型である。ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）（ＭＣＲＳ１）が欠失している野生型ＨＳＶ−２  ｇＧ２の欠失変異型の例となるアミノ酸配列は、図４Ｂにおいて提供される。他の実施態様においては、特異的なｇＧ２抗原は、ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）（ＭＣＲＳ２）を含んでいる少なくとも最低限の交差反応性抗原配列が欠失しているＨＳＶ−２  ｇＧ２（ｇＧ２）抗原の変異型である。ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）（ＭＣＲＳ２）が欠失している野生型ＨＳＶ−２  ｇＧ２の欠失変異型の例となるアミノ酸配列は、図４Ｄにおいて提供される。
【００５６】
ある実施態様において、ｇＧ２欠失変異型は、最低限の交差反応性配列に隣接する付加的なアミノ酸配列が欠失していてもよい。そのようなものとして、他の例となるｇＧ２欠失変異型は、Ｊ２４アミノ酸配列が欠失しているｇＧ２ポリペプチド（ｇＧ２ΔＪ２４）、ＪＡアミノ酸配列が欠失しているｇＧ２ポリペプチド（ｇＧ２ΔＪＡ）、ＪＡ１アミノ酸配列が欠失しているｇＧ２ポリペプチド（ｇＧ２ΔＪＡ１）、ＪＡ２アミノ酸配列が欠失しているｇＧ２ポリペプチド（ｇＧ２ΔＪＡ２）を含む。
【００５７】
本発明は、ｇＧ２ポリペプチドのＭＣＲＳ（例えばＭＣＲＳ１またはＭＣＲＳ２）が異なるアミノ酸配列に置換されている変異ｇＧ２ポリペプチド、ならびにこのポリペプチドをコードする核酸を提供する。そのような実施態様において、置換されたアミノ酸配列は一般に試料中の抗ＨＳＶ−２抗体の検出を妨げないように選択され、例えば、グリシン残基を含むアミノ酸配列がある。そのようなものとして、抗ＨＳＶ−２抗体ならびにＨＳＶ−２に対して特異的でない抗体と交差反応しないように、置換されたアミノ酸配列は選択される。すなわち、アミノ酸配列は、抗ＨＳＶ−２抗体ならびにＨＳＶ−２に対して特異的でなく、ＨＳＶ−２アッセイにおいて偽陽性となりうる抗体によって結合されるエピトープを規定しない。
【００５８】
ある実施態様において、特異的な変異型組換えｇＧ２抗原は、異なるアミノ酸配列に置換されたＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）（ＭＣＲＳ１）を含む、少なくとも最低限の交差反応性抗原配列を有する。例となる、グリシン残基を含むアミノ酸配列で置換されたアミノ酸配列ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）（ＭＣＲＳ１）を有する野生型のＨＳＶ−２  ｇＧ２の置換変異型のアミノ酸配列は、図４Ｃにおいて提供される。
【００５９】
他の実施態様において、特異的な変異型組換えｇＧ２抗原は、異なるアミノ酸配列に置換されたＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）（ＭＣＲＳ２）を含む、少なくとも最低限の交差反応性抗原配列を有する。例となる、グリシン残基を含むアミノ酸配列で置換されたアミノ酸配列ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）（ＭＣＲＳ２）を有する野生型ＨＳＶ−２  ｇＧ２の置換変異型のアミノ酸配列は、図４Ｅにおいて提供される。
【００６０】
ある実施態様において、ｇＧ２置換変異体は、野生型の配列とは異なるアミノ酸配列で置換された、最低限の交差反応性配列を隣接する付加的なアミノ酸配列を有することができる。そのようなものとして、他の例となるｇＧ２置換変異型は、Ｊ２４アミノ酸配列が置換されたｇＧ２ポリペプチド（ｇＧ２ｓｕｂＪ２４）、ＪＡアミノ酸配列が置換されたｇＧ２ポリペプチド（ｇＧ２ｓｕｂＪＡ）、ＪＡ１アミノ酸配列が置換されたｇＧ２ポリペプチド（ｇＧ２ｓｕｂＪＡ１）、ＪＡ２アミノ酸配列が置換されたｇＧ２ポリペプチド（ｇＧ２ｓｕｂＪＡ２）を含む。
【００６１】
本発明は、最低限の交差反応性配列を欠失したｇＧ２ポリペプチド断片を含む変異型ｇＧ２ポリペプチド断片、ならびにこのポリペプチド断片をコードする核酸を提供する。ある実施態様において、最低限の交差反応性抗原配列を欠失している特異的なｇＧ２ポリペプチド断片はＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）（ＭＣＲＳ１）のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、最低限の交差反応性抗原配列を欠失している特異的なｇＧ２断片はＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）（ＭＣＲＳ２）のアミノ酸配列を含む。
【００６２】
ある実施態様において、ｇＧ２ポリペプチド断片は、最低限の交差反応性配列に隣接する付加的なアミノ酸を欠失している。そのようなものとして、他の例となるｇＧ２ポリペプチド断片としては、Ｊ２４アミノ酸配列が欠失しているｇＧ２ポリペプチド断片、ＪＡアミノ酸配列が欠失しているｇＧ２ポリペプチド断片、ＪＡ１アミノ酸配列が欠失しているｇＧ２ポリペプチド断片、ＪＡ２アミノ酸配列が欠失しているｇＧ２ポリペプチド断片が挙げられる。
【００６３】
ある実施態様において、本発明の抗原（例えば交差反応性抗原）は、非天然に生じる環境、例えば天然に生じる環境から隔離した環境にある。ある実施態様において、対象タンパク質は対象の抗原が豊富にある組成物中に存在する。例えば、精製した抗原が提供される。精製されたとは、タンパク質が、興味のあるポリペプチド以外のものが実質的にない組成物中に存在することを意味し、実質的にないとは、組成物の９０％より少なく、通常は６０％より少なく、そしてより通常は５０％より少ない割合を興味のあるポリペプチド以外のものが占めることを意味する。対象発明の抗原は単離したものとしても存在することができ、それは他のタンパク質およびオリゴ糖、ポリヌクレオチドとそれらの断片等の他の天然に生じる生物的分子が実質的にないことを意味し、“実質的にない”という語は、この場合、単離したタンパク質を含んでいる組成物の７０％より少なく、通常は６０％より少なく、そしてより通常は５０％より少ない割合が、何か他の天然に生じる生物的分子であることを意味する。ある実施態様において、タンパク質は実質的に生成された形で存在し、“実質的に生成された形”とは少なくとも９５％、通常は少なくとも９７％、そしてより通常は少なくとも９９％純粋であることを意味する。
【００６４】
他の実施態様において、本発明にかかる抗原（例えば交差反応性抗原）は、融合タンパク質であり、ここで交差反応性抗原とは異種の第二のポリペプチドは、交差反応性抗原のＣ末端またはＮ末端に共有結合する。そのような実施態様において、第二のポリペプチドはいかなる長さともすることができ、抗原の担体（例えば、ニトロセルロース膜や微小粒子（例えばラテックスビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ等）の固体または半固体）への固定を提供することができる。さらなる実施態様において、交差反応性抗原は、第二のおよび第三のポリペプチドが交差反応性抗原に隣接するように交差反応性抗原に共有結合した第三のポリペプチドを含む。そのような実施態様において、第二のおよび第三のポリペプチドは、交差反応性抗原とは異種である（例えば、通常は交差反応性抗原に関係しない）アミノ酸配列からなる。さらに第二のおよび第三のポリペプチドは抗ＨＳＶ−２抗体に結合しないアミノ酸配列からなる。
【００６５】
ある実施態様において、組成物は、生物学的試料を希釈するのに適した溶液で提供される。一般に、生物学的試料を希釈するのに適した溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液を含み、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）などの非特異的ブロッキング試薬や、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００などの界面活性剤等、追加項目を含みうる。
【００６６】
ポリペプチドの生産
本発明の診断法において使用するためのポリペプチドは、さまざまな技術を用いて生産することができる。例えば、特異的なｇＧ２および交差反応性抗原は、当業者に知られた方法を用いて、固相または溶液ペプチド合成などの化学合成により生産することができる。ペプチドの化学合成は、当の抗原が比較的小さい場合に適している可能性がある。例えば、固相ペプチド合成技術のためにＪ．  Ｍ．  Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｄ．  Ｙｏｕｎｇ，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＩＩ．（１９８４）およびＧ．Ｂａｒａｎｙ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｂ．  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｅ．  Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ，  ｖｏｌ．２、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  （１９８０），  ｐｐ．  ３−２５４；  伝統的な溶液合成のためにＭ．  Ｂｏｄａｎｓｋｙ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ（１９８４）およびＥ．  Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ，  Ｅｄｓ．，  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｓｕｐｒａ，  Ｖｏｌ．１参照。
【００６７】
特異的なgＧ2および交差反応性抗原は、当該技術分野においてよく知られた組換えの方法を用いて生産してもよい。この点について、ＨＳＶ−２由来のｇＧ２遺伝子は、これを含んでいる細胞および組織から、フェノール抽出などの知られた技術を用いて直接的に単離することができ、さらに配列を操作して求める切断を作ることができる。例えば、ＤＮＡを得て単離するために用いられる技術について記載のあるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ参照。さらに、特異的なｇＧ２抗原および交差反応性ｇＧ２抗原をコードしている核酸は、既知配列に基づいて合成的に生産することができる。ヌクレオチド配列は、求める特定のアミノ酸配列に適合したコドンでデザインすることができる。一般に、配列を発現させる対象とする宿主にとって好ましいコドンを選択する。完全な配列は一般に、重複しているオリゴヌクレオチドから標準的な方法により組み立てられ、完全なコード配列に組み立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）  Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７５６；  Ｎａｍｂａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９；  Ｊａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５９：６３１１。
【００６８】
ひとたび求めるタンパク質の配列をコードする核酸が単離されまたは合成されると、それらは多様な系において発現させるため任意のベクターまたはレプリコンにクローニングされることができ、系は当技術分野においてよく知られた、哺乳類の、バクテリアの、ウイルスの、および酵母の発現系を含む。バクテリアのおよび哺乳類の細胞発現系は、当技術分野でよく知られており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａに記載されている。酵母の発現系も当技術分野において知られており、例えばＹｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９８９）  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，  Ｌｏｎｄｏｎに記載されている。
【００６９】
Ｔｏｍｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  （１９９３）  ６７：４０１７−４０２６およびＳｅｌｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  （１９９３）  ７４：１１０３−１１１３に記載されているように、感染／トランスフェクションシステムに基づくワクシニア等のようなウイルスの系は、本発明において用いることができる。この系において、細胞は最初にｉｎ  ｖｉｔｒｏで、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換え体をトランスフェクションされる。このポリメラーゼは、Ｔ７プロモーターを持っているテンプレートのみを転写するという点で、優れた特異性を示す。感染に続いて、細胞が関心のあるＤＮＡをトランスフェクションされ、Ｔ７プロモーターによりドライブされる。ワクシニアウイルス組換え体から細胞質中で発現されたポリメラーゼは、トランスフェクションされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、次に宿主翻訳機構によりタンパク質に翻訳される。その方法は、多量のＲＮＡおよびその翻訳物の高水準で一時的な細胞質生産を提供する。
【００７０】
選択した発現系および宿主次第で、本発明の抗原は、関心のある抗原が発現している条件下、発現ベクターにより形質転換した宿主細胞を培養することによって生産される。抗原は次に宿主細胞から単離され精製される。発現系が抗原の分泌を提供する場合、抗原は培養液から直接精製されうる。抗原が分泌されない場合、それは細胞溶解物から単離される。適した培養条件および回復方法の選択は、当技術分野における技術の範囲内で行われる。
【００７１】
検出方法
前述のように、本発明は、生物学的試料中のＨＳＶ−２に対する抗体の有無を判定する方法を提供する。本発明の方法は、特異的なｇＧ２抗原および交差反応性抗原を、ＨＳＶ−２感染を正確に検出すること、およびＨＳＶ−２特異的抗体とＨＳＶ−２に特異的でなくＨＳＶ−２アッセイにおいて偽陽性となりうる抗体との間の識別をすることのために利用する。その方法は一般に、抗ＨＳＶ−２特異的抗体を含んでいると思われる生物学的試料を少なくとも第一の交差反応性抗原と接触させること、および次に抗ＨＳＶ−２特異的抗体の有無を特異的なｇＧ２抗体で検出することを含む。ある実施態様において、生物学的試料は少なくとも２つの交差反応性抗原と接触し、第一の交差反応性抗原はアミノ酸配列ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）を含み、第二の交差反応性抗原はアミノ酸配列ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）を含む。代表的な実施態様において、交差反応性抗原は全長野生型ｇＧ２ポリペプチドからなることはない。
【００７２】
一般に、生物学的試料を交差反応性抗原と接触させることは、生物学的試料中の交差反応性抗体の減少という結果となる一方で、抗ＨＳＶ−２特異的抗体は減少しない。つまり、もし存在すれば、抗ＨＳＶ−２特異的抗体は試料中に検出可能なレベルで残存している（例えば、ここに記載したように特異的抗ＨＳＶ−２抗体を検出するためのアッセイを使用することによって）。それゆえ、生物学的試料と接触させるために使用された交差反応性抗原は一般に、前吸収された生物学的試料中の抗ＨＳＶ−２特異的抗体の有無を検出するために使用されるＨＳＶ−２特異的抗原からなることはない。接触は、例えば、ここに記載したように、生物学的試料を一または複数の交差反応性抗原と接触させることにより、達成されうる。生物学的試料は、順次の工程において交差反応性抗原と、次に特異的な抗原と接触させることができ、または生物学的試料は、一または複数の交差反応性抗原および特異的なＨＳＶ−２抗原のどちらとも同時に（例えば同一の溶液、例えば同一の容器）接触させることができる。ある実施態様において、試料中の特異的抗ＨＳＶ−２抗体の検出前に試料由来の非特異的抗体を“前吸収”するため、生物学的試料は本発明に従って交差反応性抗原と接触させられる。明確に異なるように指示されない限り、ここで使われる場合“前吸収”は、生物学的試料はまず交差反応性抗原と接触させられ、次に試料を特異的な抗原と接触させることを必ずしも暗示するものではなく、むしろ試料が交差反応抗原に曝露されるまで、特異的な抗ＨＳＶ−２抗体は検出されないことを意味する。
【００７３】
本発明と共に用いるのに適した特異的ｇＧ２抗原は、一般に、ＨＳＶ−２に対する抗体に特異的に結合する一または複数のエピトープ領域を含むｇＧ２に由来する。例となる特異的なｇＧ２抗原は、ＨＳＶ−２のエンベロープタンパク質糖タンパク質Ｇ（ｇＧ）の４８６アミノ酸部分をコードしている、独特の１４６１塩基長の核酸配列（配列をコードしている全長の９９−１５５９残基にわたる）であって、ＭｃＧｅｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．により詳細に詳述されるように、ＨＳＶ−２に特異的であり、ＨＳＶ−１糖タンパク質Ｇ遺伝子中に発見されない上記核酸配列に由来する。
【００７４】
ある実施態様において、特異的なｇＧ２抗原はＨＳＶ−２  ｇＧ２（ｇＧ２）（図１Ａ）である。他の実施態様において、特異的なｇＧ２抗原は、ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）（ＭＣＲＳ１）のアミノ酸配列が欠失しているかまたは異なるアミノ酸配列に置換されている、最低限の交差反応性抗原配列を有するＨＳＶ−２  ｇＧ２（ｇＧ２）の変異型である。アミノ酸配列ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）（ＭＣＲＳ１）が欠失した、最低限の交差反応性配列を有する野生型ＨＳＶ−２  ｇＧ２の欠失変異型の例となるアミノ酸配列は、図４Ｂにおいて提供される。アミノ酸配列ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）（ＭＣＲＳ１）が異なるアミノ酸配列に置換されている、最低限の交差反応性配列を有する野生型ＨＳＶ−２  ｇＧ２の置換変異型の例となるアミノ酸配列は、図４Ｃにおいて提供される。
【００７５】
他の実施態様において、特異的なｇＧ２抗原は、ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）（ＭＣＲＳ２）のアミノ酸配列が欠失しているかまたは異なるアミノ酸配列に置換されている、最低限の交差反応性抗原配列を有するＨＳＶ−２  ｇＧ２（ｇＧ２）の変異型である。アミノ酸配列ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）（ＭＣＲＳ２）が欠失した、最低限の交差反応性配列を有する野生型ＨＳＶ−２  ｇＧ２の欠失変異型の例となるアミノ酸配列は、図４Ｄにおいて提供される。アミノ酸配列ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）（ＭＣＲＳ２）が異なるアミノ酸配列に置換されている、最低限の交差反応性配列を有する野生型ＨＳＶ−２  ｇＧ２の置換変異型の例となるアミノ酸配列は、図４Ｅにおいて提供される。
【００７６】
ただちにわかるように、ここに記載されたアッセイのデザインは、種々の変更が可能であり、多くの形式が当技術分野において知られている。次の記載は単にガイダンスとして提供され、当業者は、当技術分野においてよく知られた技術を用いて、記載された手順を容易に修正することが出来る。
【００７７】
試料の調製
本発明の方法の実施において、被験者からの試料についてＨＳＶ−２に対する抗体の存在を検査する。検査される試料は、ＨＳＶ−２に対する抗体を含む任意の最初の源であるか、またはそれに由来する試料である。したがって、適した試料の源は、ＨＳＶ−２に対する抗体が放出された体液に由来する。関心のある試料の源は、限定するものではないが、多くの異なる体液、特に血液または血液を調製したもの、例えば血清、血漿、および全血などを含む。試料の量は、特異的なアッセイ形式に適合する任意の量とすることができる。ある実施態様において、試料は、ＨＳＶ−２に対する抗体の有無を検査する前に、適した溶液に希釈される。一般に、生物学的試料を希釈するために適した溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などのような緩衝液を含み、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）などの非特異的ブロッキング試薬や、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００などの界面活性剤等、追加項目を含んでもよい。
【００７８】
アッセイのために適当な対照試料は、抗ＨＳＶ−２抗体を有さないヒト被験者から集めた血液、血清、若しくは全血、または抗ＨＳＶ−２抗体を既知の、所定の量を含む試料（すなわち正の対照）を含む。
【００７９】
多くの実施態様において、ヒト被験者に適した最初の源は、血液試料である。すなわち、本発明のアッセイにおいて採用される試料は、一般に血液由来試料である。血液由来試料は、全血またはその分画、例えば血清、血漿などに由来してもよく、ある実施態様において、試料は、アッセイに使用するために凝固させた血液および分離され集められた血清に由来する。
【００８０】
試料が血清または血清由来試料である実施態様において、試料は一般に液体試料である。液体の血清試料を生産する任意の便利な方法論を、採用してもよい。多くの実施態様において、方法論は、皮膚の穿刺（例えば指先穿刺、静脈穿刺）により静脈血を凝固または血清分離チューブに引きいれること、血液を凝固させること、および凝固した血液から血清を遠心分離することを採用する。血清は次に集められ、検査するまで保存される。ひとたび患者由来の試料を得ると、試料は抗ＨＳＶ−２抗体の存在を判定するため検査される。
【００８１】
抗ＨＳＶ−２抗体の存在の検出を強化するため、対象試料は多様な方法で処置することもできる。例えば、試料が血液である場合、赤血球はアッセイの前に試料から除去してもよい（例えば遠心によって）。抗ＨＳＶ−２抗体の存在の検出は、当技術分野においてよく知られた手順（例えば、酸沈殿、アルコール沈殿、塩沈殿、疎水性沈殿、ろ過（３０ｋＤａより大きな分子を保持できるフィルターを用いて、例えばＣｅｎｔｒｉｍ  ３０TM）、アフィニティ精製）を用いて試料を濃縮することによっても強化してもよい。
【００８２】
アッセイ形式
特異的および交差反応性抗原は、生物学的試料中の反応性抗ＨＳＶ−２抗体の有無を検出するための診断法として、本発明において用いられる。一形態において、本発明は、生物学的試料中の抗単純ヘルペス２型（ＨＳＶ−２）抗体を検出する方法であって、生物学的試料を、試料中の非特異的抗ＨＳＶ−２抗体の抗原への結合に適した条件下、アミノ酸配列ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）を含む少なくとも一つの交差反応性ＨＳＶ−２糖タンパク質−Ｇ（ｇＧ２）抗原と接触させること、および、生物学的試料中の抗ＨＳＶ−２抗体の有無を検出することを含む上記方法であり、特異的抗ＨＳＶ−２抗体は交差ＨＳＶ−２  ｇＧ２抗原に結合しない。ある実施態様において、生物学的試料は少なくとも２つの交差反応性抗原と接触するものであって、一つ目の交差反応性抗原はアミノ酸配列ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）を含み、二つ目の交差反応性抗原はＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）を含む。
【００８３】
一般に、生物学的試料を少なくとも一つの交差反応性抗原と接触させることは、生物学的試料中で偽陽性の結果に導きうる交差反応性抗体の減少という結果となる。代表的な実施態様において、生物学的試料の抗原による前吸収は、顕著には特異的抗ＨＳＶ−２抗体を減少させない。特に、接触させることは、生物学的試料中に存在する特異的抗ＨＳＶ−２抗体を顕著には減少させない。“顕著に減少する”とは、抗原を試料と接触させることは、試料中の特異的抗ＨＳＶ−２抗体の結合という結果になり、それによって試料中の利用できる遊離型特異的抗ＨＳＶ−２抗体が減少することを意味する。
【００８４】
ある実施態様において、生物学的試料はアッセイの前に適した溶液中に希釈される。一般に、生物学的試料を希釈するために適した溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液を含み、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）などの非特異的ブロッキング試薬や、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００などの界面活性剤等、追加項目を含みうる。
【００８５】
ある実施態様において、抗ＨＳＶ−２抗体の有無は、競合、直接反応、またはサンドウィッチ型アッセイなどのような免疫アッセイを含む、標準的な電気泳動および免疫診断の技術を用いて検出されうる。そのようなアッセイは、限定するものではないが、ウエスタンブロット；  凝集試験；  ＥＬＩＳＡのような酵素標識および介在免疫アッセイ；  ビオチン／アビジン型アッセイ；  ラジオイムノアッセイ；  免疫電気泳動法；  免疫沈降等を含む。その反応は一般に、蛍光、化学発光、放射活性、酵素標識、または色素分子等の標識、または抗原抗体間での、若しくはそれと反応した抗体間での複合体の形成を検出するための他の方法などのような標識を明らかにすることを含む。
【００８６】
典型的には、上記アッセイは一般に、抗原−抗体複合体が結合する固体担体から液相中の遊離型抗体の分離を含む。本発明の実施に用いられうる固体担体は、ニトロセルロース（例えば膜やマイクロタイターウェルの形で）；  ポリ塩化ビニル（例えばシートやマイクロタイターウェルの形で）；  ポリスチレンラテックス（例えばビーズやマイクロタイタープレートで）；  ポリフッ化ビニリデン；  ジアゾ化紙；  ナイロン膜；  活性化ビーズ、磁性反応ビーズ等のような基質を含む。
【００８７】
一般に、組成物が十分に担体に固定化されている等のような結合に適した条件下で、固体担体を最初に固相の成分（例えば一または複数の特異的なｇＧ２抗原）と反応させる。任意に、担体への抗原の固定は、最初に抗原をよりよい結合性質を有するタンパク質と共役カップリングさせることにより強化することができる。共役に適したタンパク質は、限定するものではないが、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含めて血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、卵白アルブミン、および当業者によく知られた他のタンパク質などの高分子を含む。抗原を担体に結合させるために使用することが出来る他の分子は、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体のアミノ酸、アミノ酸共重合体などを含む。そのような分子や抗原にこれらの分子を共役させる方法は、当業者によく知られている。例えばＢｒｉｎｋｌｅｙ，  Ｍ．  Ａ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．（１９９２）  ３：２−１３；  Ｈａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４）  ６：５６−６３；  およびＡｎｊａｎｅｙｕｌｕ  ａｎｄ  Ｓｔａｒｏｓ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．（１９８７）  ３０：１１７−１２４参照。
【００８８】
固定担体を固相成分と接触させた後、任意の非固定固相成分は洗浄により担体から除去される。担体に結合した成分は、次にリガンド部分（例えば固定抗原に対する抗体）を含んでいると思われる生物学的試料と結合に適した条件下で接触させられる。任意の非結合リガンドを除去するために洗浄した後、二次結合部分は結合に適した条件下で添加され、ここで二次結合剤は結合リガンドに選択的に結合することができる。二次結合剤の存在は当技術分野でよく知られた技術を用いて検出されうる。
【００８９】
さらに特に、ある実施態様においては、ＥＬＩＳＡ法を使用することができ、マイクロタイタープレートのウェルは特異的ｇＧ２抗原でコートされる（例えば特異的ｇＧ２抗原は表面に固定される）。抗ＨＳＶ−２免疫グロブリン分子を含んでいるまたは含んでいると思われる生物学的試料は、次にマイクロタイタープレートの表面に固定化されていない交差反応性抗原の存在下で、コートされたウェルに添加される。任意に、抗ＨＳＶ−２抗体を既知の濃度含んでいる一連の標準は、対照としての役目を果たすために試料またはその一定分量と並行して検査することができる。一般に、希釈されたまたは別の方法により処理された約０．００１から１ｍｌまでの試料は、十分であり、通常約０．０１ｍｌで十分である。さらに、ある実施態様において、各試料および標準は、それぞれの平均値を得られるよう、多数のウェルに添加される。テストおよび対照試料は、固定担体とともに、抗原への抗体の結合が生じるために十分な時間培養される。一般に、約０．１から３時間で十分であり、通常は１時間で十分である。
【００９０】
抗体が固定されたｇＧ２抗原および固定されていない交差反応性抗原に結合するのに十分な培養期間の後、プレートは結合しなかった抗体および交差反応性抗原に結合した抗体を除去するため、洗浄されうる。一般に、低濃度の、適したｐＨ、一般に７−８の非イオン性界面活性剤は、洗浄手段として使用される。リン酸緩衝生理食塩水等の等張の緩衝液は、洗浄工程において採用してもよい。試料中に存在する非特異的に結合したタンパク質を完全に洗浄するのに十分な量で、１から６回の洗浄が採用されうる。好ましくは洗浄工程は、固定されたｇＧ２抗原に結合した抗体の解離を引き起こさない。洗浄に続いて、検出可能なよう標識された二次結合分子が添加される。二次結合分子は任意の捕捉した試料抗体（例えば、表面に固定された特異的ｇＧ２抗原に結合した抗体）と反応させることができ、プレートは洗浄されて二次結合分子の存在は当技術分野でよく知られた方法を用いて検出される。
【００９１】
代わりの実施態様において、抗ＨＳＶ−２抗体免疫グロブリン分子を含んでいるまたは含んでいると思われる生物学的試料は、最初に溶液中で交差反応性抗原と接触させられ、前吸収された混合物が得られる。抗体が交差反応性抗原に結合するために十分な培養期間の後、前吸収された混合物は特異的ｇＧ２抗原でコートされたマイクロタイタープレートのウェルにその後添加される。前吸収された混合物から結合していない抗体を、固定したｇＧ２抗原に結合させるために十分な培養期間の後、プレートは結合していない抗体および交差反応性抗原に結合した抗体を除去するために洗浄されうる。洗浄に続いて、検出可能なよう標識された二次結合分子が添加される。好ましくは、洗浄工程は、固定されたｇＧ２抗原に結合した抗体の解離を引き起こさない。二次結合分子は、任意に捕捉された試料抗体（例えば、表面に固定された特異的なｇＧ２抗原に結合した抗体）と反応することができ、プレートは洗浄されて二次結合分子の存在は当技術分野でよく知られた方法を用いて検出される。
【００９２】
それゆえ、ひとつの特定の実施態様において、生物学的試料からの結合した抗体の存在は、抗体リガンドに対する抗体を含んでいる二次結合剤を用いて容易に検出されうる。多くの抗ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）分子が、当技術分野において知られているものであり（例えば、商業的に利用できるヤギ抗ヒトＩｇまたはウサギ抗ヒトＩｇ）、直接のまたは間接の抗原−ＨＳＶ−２抗体―二次抗体複合体の検出を促進するために、検出可能な標識と容易にコンジュゲートすることができる。免疫複合体の直接の測定が可能な標識の例は、3Ｈ、125Ｉ等の放射標識、蛍光、色素、ビーズ、化学発光、コロイド粒子等を含む。免疫複合体の間接の測定が可能な標識の例は、基質が着色されたまたは蛍光の生産物を提供することが可能な酵素を含む。ある実施態様において、抗体は適した基質を添加した後の生産物の検出可能な生産物のシグナルを提供できる、共有結合した酵素で標識される。複合体に使用するために適した酵素の例は、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ等を含む。商業的に入手できない場合、そのような抗体−酵素複合体は、当業者に知られた技術により容易に生産される。
【００９３】
そのようなアッセイにおいて、二次抗体の濃度は一般に約０．１から５０μｇ／ｍｌであり、好ましくは約１μｇ／ｍｌである。二次抗体を含んでいる溶液は一般に約ｐＨ６．５−９．５の範囲に緩衝される。培養時間は、二次抗体が利用可能な分子に結合するために十分でなければならない。一般に、０．１から３時間で十分であり、通常は１時間で十分である。二次抗体が結合した後、不溶性の担体は一般に非特異的に結合する材料をなくすよう、再び洗浄されるが、基本的に先の洗浄について述べたとおりである。非特異的に結合する材料をなくした後、結合した複合体により生産されるシグナルは、標準の手段により検出される。酵素複合体が使用されている場合、検出可能な生産物が形成されるよう、適当な酵素の基質が提供される。さらに特異的には、ペルオキシダーゼが選択された酵素複合体である場合、好ましい基質の組み合わせは、適当な反応条件下で色のついた生産物を得るＨ2Ｏ2およびＯ−フェニレンジアミンである。上記のような他の酵素複合体の適当な基質は、当業者に知られている。多くの便利な複合体またはそれらの生産物を検出するための方法と同様に、適した反応条件も当業者に知られている。例えば基質Ｏ−フェニレンジアミンの生産物については、４９０−４９５ｎｍでの光吸収が分光光度計で簡便に測定される。
【００９４】
ウイルスのタンパク質およびそれらのタンパク質に特異的な抗体が沈殿する条件下で複合体を形成するように、アッセイは溶液中でも行うことができる。一つの特定の実施態様において、特異的なｇＧ２抗原は、例えば直接の化学的なまたは間接の結合によるような当技術分野において知られている結合技術を用いて、固相粒子（例えばアガロースビーズ等）に付着することができる。抗原でコートした粒子および遊離の交差反応性抗原（例えば固相粒子に結合しない）を、適した結合条件下、抗ＨＳＶ−２抗体を含んでいると思われる生物学的試料と接触させる。結合抗体間の架橋は、粒子−抗原−抗体複合体凝集の形成を引き起こし、その凝集は洗浄および／または遠心を用いて沈殿され試料から分離されうる。反応混合物は前述の免疫診断方法のような標準的な方法のいくつかを用いて、抗体−抗原複合体の有無を検出するために分析されうる。
【００９５】
さらなる実施態様において、第一の固相粒子および第二の固相粒子が異なる場合に、特異的なｇＧ２抗原は第一の固相粒子（例えばアガロースビーズ等）に固定されることが可能であり、交差反応性抗原は第二の固相粒子（例えば磁性ビーズ）に固定されることが可能である。そのような実施態様において、交差反応性抗原でコートした粒子および特異的なｇＧ２抗原でコートした粒子は、結合に適した条件下、抗ＨＳＶ−２抗体を含んでいると思われる生物学的試料と接触させられる。粒子−交差反応性抗原−抗体複合体は試料から分離することができる。例えば、交差反応性抗原が磁性ビーズ等のような第一の粒子に付着した場合、粒子−交差反応性抗原−抗体複合体は、標準的な方法のいくつかを用いて溶液から分離することができる。反応混合物は前述の免疫診断方法のような標準的な方法のいくつかを用いて、抗体−特異的ｇＧ２抗原複合体の有無を検出するために分析することができる。
【００９６】
その他の実施態様において、本発明を用いてＨＳＶ−２感染を診断する方法は、伝統的なウエスタンと、ドットブロッティング技術を組み合わせた、例えばＨＥＲＰＥＳＥＬＥＣＴTM（Ｆｏｃｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．，  Ｃｙｐｒｅｓｓ，  Ｃａｌｉｆ．）テスト等の当技術分野において知られている条片免疫ブロットアッセイ（ＳＩＡ）技術の使用に関連する。これらのアッセイにおいて、特異的なｇＧ２抗原および交差反応性ｇＧ２抗原は個別に、膜性担体テスト条片上で個々のバンドとして固定される。抗ヒトＩｇＭおよびヒトＩｇＧ等のような内部対照も条片上に存在することができる。
【００９７】
そのような実施態様において、生物学的試料中の抗ＨＳＶ−２反応の視覚化は、比色分析酵素基質との共同で抗ヒトＩｇＧ酵素複合体を用いて達成することも可能である。したがって、特異的ｇＧ２抗原に対する反応がなく、交差反応性抗原に対する反応がない試料は、ＨＳＶ−２に陰性であると推測される。特異的ｇＧ２抗原に対する反応があり、交差反応性抗原に対する反応がない試料は、ＨＳＶ−２に陽性であると推測される。特異的ｇＧ２抗原に対する反応があり、交差反応性抗原に対する反応がある試料は、ＨＳＶ−２抗体およびＨＳＶ−２に特異的でなくＨＳＶ−２アッセイにおいて偽陽性に導きうる抗体に陽性であると推測される。そのようなアッセイは、手作業で行うことができ、または自動のフォーマットで用いられることも出来る。
【００９８】
さらにその他の実施態様において、本発明を利用したＨＳＶ−２感染を診断する方法は、特異的なｇＧ２抗原と交差反応しうる任意の抗体を除去するために最初に試料を交差反応性抗原に接触させること、および試料を試料中の任意のＨＳＶ−２抗体に結合する特異的なｇＧ２抗原と接触させることによって生物学的試料中の抗ＨＳＶ−２抗体の有無を検出するためのアッセイ装置の使用に関連する。そのような実施態様において、アッセイ装置は少なくとも試料適用領域、前吸収区画、および検出区画からなり、ニトロセルロース膜条片のような流動を導くことが出来る膜を含む。任意に、膜はポリエチレン条片のような強固なまたは準強固な支持表面上に提供される。代表的な実施態様において、前吸収区画は試料適用領域と検出区画の間に置かれる。区画の位置は、膜に沿った液体の側方流動が、全ての試料の組成物が最初に前吸収区画と接触し、その後検出区画と接触するように置かれる。そのようなものとして、試料適用領域から前吸収区画および次に検出区画までの膜に沿った流動が膜を通した毛細管現象により促進される。例となる側方流動アッセイ装置および側方流動アッセイ装置を採用した検出方法は、例えば米国特許番号６，１４６，５８９に提供され、その開示は参照により組み込まれる。
【００９９】
代表的な実施態様において、交差反応性抗原は前吸収区画に固定化され、特異的ｇＧ２抗原は検出区画に固定化される。抗ＨＳＶ−２抗体の有無の検出は、試料適用領域に最初に試料を加えること、および試料を膜条片を通した毛細管現象によって移動させることより実行される。膜条片を通して試料が移動するにつれて、試料は最初に、前吸収区画において固定化された交差反応性抗原と接触して、前吸収された試料を提供する。前吸収された試料は次に検出区画に移動し、そこで固定化された特異的ｇＧ２抗原と接触する。特異的ｇＧ２抗原に結合した抗体の有無は、その後上述のように検出可能なよう標識された第二の結合分子を用いて検出される。第二の結合分子は任意の捕捉された試料抗体（例えば膜上に固定化された特異的ｇＧ２抗原に結合した抗体）と反応することができ、第二の結合分子の存在は上述のおよび当技術分野においてよく知られた方法を用いて検出される。
【０１００】
キット
上述のように、本発明の方法を実施するために用いられるキットも提供される。対象方法を実施するためのキットは、少なくともヒト患者に由来する試料を抗ＨＳＶ−２抗体の有無について検査するための試薬を含むものであって、そのようなキットは以下のものを含んでもよい。それは、特異的ｇＧ２抗原および交差反応性抗原、または特異的ｇＧ２抗原および交差反応性抗原をコードしている核酸、および／または抗体、酵素基質等のようなシグナル産生系と同じものからなる免疫アッセイ装置；  対象検出アッセイを実行するにおいて使用する多様な緩衝液；  試料中の抗ＨＳＶ−２抗体の有無を検出するための基準等である。
【０１０１】
ある実施態様において、ポリペプチド組成物は、生物学的試料を希釈するために適した溶液中で提供される。一般に、生物学的試料を希釈するために適した溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液を含み、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような非特異的ブロッキング試薬やＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００のような界面活性剤等の追加項目を含みうる。
【０１０２】
キットはさらに、例えばヘパリン、フィコール・ハイパック、溶解緩衝液、プロテアーゼ阻害剤等のような、患者由来試料の準備において使用されうる一または複数の試薬を含んでもよい。加えて、本発明のキットはさらに、例えばポリアクリルアミドゲルの乾燥した前駆物質、一または複数の緩衝溶液またはその組成物等、電気泳動の溶液またはその前駆物質のような試料の分別において採用される一または複数の組成物も含んでもよい。
【０１０３】
ある実施態様において、キットはさらに少なくともＨＳＶ−２感染を診断するために比較できるアッセイ結果の参照データ、すなわち抗ＨＳＶ−２抗体の存在に陽性にまたは陰性に関連する参照データを含む情報記憶装置および提示媒体を含む。情報記憶装置および提示媒体は、パッケージ挿入物上に印刷された情報、例えば磁気ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ等のような電子記憶媒体上に表された電子ファイルなどのように、任意の便利な形にしてもよい。さらに他の実施態様において、キットは参照データを得るための代替の方法、例えば“オンラインで”参照データを得るためのウェブサイトを含んでもよい。
【０１０４】
キットはさらに対象試料を得るための方法、例えば注射器を含んでもよい。本発明のキットはさらに典型的に本発明の方法を実行するための指示を含み、これらの指示はパッケージ挿入物上および／またはキットのパッケージ上にあってもよい。最後に、キットはさらに抗ＨＳＶ−２抗体の存在を検出するために用いられる追加の生化学アッセイから一または複数の試薬を含んでもよい。
【０１０５】
キットは分かれた容器に存在し、一または複数の組成物は同じ容器に存在することが可能であり、容器は貯蔵容器および／またはキットがデザインされたアッセイ中に使用される容器とすることができる。
【０１０６】
装置
上述のように、本発明の方法を実施するために用いられる装置も提供される。本発明の方法を実施するための装置は少なくともヒト患者に由来する試料を抗ＨＳＶ−２抗体の有無について検査するための試薬を含むものであって、そのような装置は固体担体の表面に固定された特異的ｇＧ２抗原および交差反応性抗原を含んでもよい。
【０１０７】
装置とともに実施されるための方法において必須のまたは望ましい追加項目が存在する可能性があり、該追加項目は、限定するものではないが、患者試料を得るための方法、例えば注射器；  患者由来試料の準備に必要な一または複数の試薬、例えばヘパリン、フィコール・ハイパック、溶解緩衝液、プロテアーゼ阻害剤等；  対象装置を用いて対象方法を実施するための指示；  抗ＨＳＶ−２抗体の有無を検出するために用いられている追加の生化学アッセイからの一または複数の試薬を含む。
【０１０８】
ある実施態様において、装置は生物学的試料を希釈するために適した溶液とともにも提供される。一般に、生物学的試料を希釈するために適した溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液を含み、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような非特異的ブロッキング試薬やＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００のような界面活性剤等の追加項目を含んでもよい。
【０１０９】
多くのそのような装置が当技術分野において知られている。ひとつの非限定的な例において、装置は固相粒子（例えばアガロースビーズ、磁性ビーズ等）に、当技術分野において知られた結合技術を用いて、例えば直接の化学的なまたは間接的な結合により固定された交差反応性抗原からなる。粒子―交差反応性抗原複合体は、その後前述のアッセイにおいて使用されうる。ある実施態様において、交差反応性抗原は例えばポリペプチドのような架橋部分によって固相粒子に固定される。
【０１１０】
その他の非限定的な例において、器具は一般に、ニトロセルロース膜のような適したフィルターまたは膜の連続した流路を採用し、その器具は少なくとも３つの領域、液体移送領域、試料領域、および測定領域を有する。試料領域は液体移動が、試料を受け取っている前の流路の他の部分と接触しないようにする。試料領域が試料を受け取った後、液体移送領域との液体移動関係に持ち込まれる（例えば、試料領域は液体移送領域と液体連絡している）。液体移送領域は、交差反応性ＨＳＶ抗体を結合するため、固定された交差反応性抗原を有する。液体移送領域が試料を受け取った後、測定領域との液体移動関係に持ち込まれる（例えば、液体移送領域は測定領域と液体連絡している）。測定領域は、固定された特異的ｇＧ２抗原、および検査された試料および前記のアッセイと組み合わされた二次標識された抗体を有してもよい。
【０１１１】
さらにその他の非限定的な例において、装置はディップスティックであり、その表面の別々の領域には：  （１）特異的なｇＧ２抗原および（２）交差反応性抗原および親和性試薬が結合されている。そのような例となる装置において、ディップスティックに結合した特異的なｇＧ２抗原および交差反応性抗原に抗ＨＳＶ−２抗体が結合するのに適した条件下、ディップスティックはヒト被験者に由来する試験試料（例えば血液、血清、または尿）に直接挿入される。ディップスティックはその後引き抜かれ、必要であれば非特異的に結合した材料を除去するため洗浄してもよい。ディップスティックはその後検出可能なよう標識された二次抗ヒト抗体、または特にヒト抗体に結合する断片もしくはそれらの模倣剤を含んでいる容器に挿入される。ヒト抗ＨＳＶ−２抗体−抗原複合体に二次抗体が結合するのに十分な時間培養された後、ディップスティックは洗浄され、二次抗体の結合は標準的な方法により検出されうる。二次抗体の検出が必要な場合、ディップスティックは二次抗体上の検出可能な標識を活性化する試薬を含んでいる二番目の容器に挿入してもよい。
【０１１２】
当業者に本発明をどうやって作成し使用するかについて完全な開示および記載を提供するため、以下の実施例が提案され、該実施例は発明者が彼らの発明とみなす範囲に限定しようとするものではなく、そしてまた彼らが以下の実施例がすべてであるまたは行った唯一の実施例であることを表そうとするものでもない。使用した数字（例えば量、温度等）についての正確性を確認するために努力がなされたが、いくつかの実験の誤りおよび偏差は説明されなくてはならない。異なるように指示されない限り、割合は重さによる割合であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧下またはその付近である。
【０１１３】
材料および方法
次の材料および方法は以下の実施例において使用された。
ｇＧ２断片のＰＣＲ増幅
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いることにより、全ＨＳＶ−２ｇＧ２遺伝子の多数のより短い領域を増幅するため、プライマーはデザインされた。ＰＧＥＸ  ４Ｔ−３ベクターとＤＮＡ挿入断片を連結すること、およびウェスタンブロットにおいて検出するため各コンストラクトのＣ末端に６Ｘ−ヒスチジンタグを追加することの両方が可能となるよう、プライマーに追加の配列が加えられた。プライマー（Ｑｉａｇｅｎ）は、テンプレートとしてＦｏｃｕｓ  ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのＨＳＶ−２クローンを利用してセグメントを増幅するため、野生型のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）と一緒に使用された。ＰＣＲ反応はＧｅｎｅＡｍｐ  ９７００  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒで行われた。単位複製配列は、各コンストラクトについて予測したバンドサイズを確認するため２％アガロースゲルで流され、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを用いて精製された。図２は、ヒト血清中でＨＳＶ−２非特異的抗体と反応しているエピトープを同定するため設計および発現された、ＨＳＶ−２ｇＧ２遺伝子、および特異的ｇＧ２抗原、および交差反応性抗原の図を示す。
【０１１４】
クローニングおよび発現
精製した複製単位配列およびＰＧＥＸ  ４Ｔ−３ベクターは、制限酵素での消化を受け、互いに正確な連結が出来るよう調製された。分解されたＤＮＡ挿入断片およびＰＧＥＸ  ４Ｔ−３ベクターは、その後２％アガロースで流され、Ｑｕｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてゲルから抽出された。ＤＮＡ挿入断片のＰＧＥＸ  ４Ｔ−３ベクターとの連結は、ＩｎｖｉｔｏｒｇｅｎのＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を用いて行われた。次に環状プラスミド（ＤＮＡ挿入断片を含んでいる）は、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ  １０  ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換され、ＩｍＭｅｄｉａ  ＡＭＰ  ａｇａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に蒔かれた。選択されたクローンはその後、プラスミド量が増加するようにＩｍＭｅｄｉａ液中で培養され、プラスミドはその後ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製された。制限酵素での消化の後、ＤＮＡ挿入断片の正しい連結を確認するため、明白に識別されたクローンが大規模の発現用に選択された（イソプロピルチオール−ｂ−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導により）。
【０１１５】
ウェスタンブロットアッセイ
組換えｇＧ２抗原をＳａｍｐｌｅ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）およびＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて変性させた後、ｇＧ２抗原は１２％ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に載せられ、ニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にトランスファーさせた。トランスファーが完了した後、ブロットはブロッキング溶液（１Ｘ  ＴＢＳＴ中に４％ミルク）で処理され、１：２０００で抗Ｈｉｓ−ＡＰ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１％ミルク（１Ｘ  ＴＢＳＴ中）と温置された。ウエスタンブロットによりｇＧ２の陽性確認をした後、大規模に発現させたｇＧ２抗原は、ＰｒｏＢｏｎｄ  Ｎｉ+  Ｒｅｓｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてバッチ精製され、ウエスタンブロットにおいて１：２０００で抗Ｈｉｓ−ＡＰ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてもう一度確認された。次に、組換えｇＧ２抗原のすべてがウエスタンブロットにおいて同じ反応強度となるよう、組換えｇＧ２抗原をヒト血清試料にさらす前に、ｇＧ２抗原は用量設定された。ウエスタンブロット条片は、組換えｇＧ２抗原群がすべて一つの条片上にあるように調製された。ウエスタンブロット条片をヒト血清と温置する前に、ヒト血清試料は大腸菌溶菌液で前吸収された。ｇＧ２抗原はＮｉ+レジンを用いてバッチ精製されたが、ヒト血清は大腸菌に対する抗体を含んでおり、組換えｇＧ２抗原は大腸菌中に発現されたので、この工程は誤った反応性に対する追加の予防措置であった。
【０１１６】
阻害アッセイ
阻害アッセイにおいて使用された交差反応性抗原は、次のもの：  組換えＪＡならびに合成ＪＡ１およびＪＡ２を含む。ＥｌｉｓａプレートｇＧ２  Ｌｏｔ  ０２１００５．  ２８  Ｓｅｒａ（ＨＳＶ１およびＨＳＶ２  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓａｔｅを用いた、我々の社内のＨＳＶ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎにより特徴付けられた）は、陽性試料、陰性試料、偽陽性試料、および不確かな試料の阻害の確認のために使用された。８つの（８）陽性試料は次の通り：Ｗｅｓｔｏｖｅｒ  Ｈｅｉｇｈｔｓ  Ｃｌｉｎｉｃから４つの試料、ニューヨークにあるＭｏｎｔｅｆｉｏｒｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから３つの試料、Ｑｕｅｓｔから１つの試料が使用された。７つの（７）陰性試料は次の通り：Ｆｏｃｕｓ  ｄｏｎｏｒｓ（ＤＢＳ、Ｄｒｉｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｐｏｔｓ）から２つの試料、ニューヨークにあるＭｏｎｔｅｆｉｏｒｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから３つの試料、およびワシントンにあるＷｅｓｔｏｖｅｒ  Ｈｅｉｇｈｔｓ  Ｃｌｉｎｉｃから２つの試料が使用された。１０個の（１０）偽陽性試料は次の通り：ニューヨークにあるＭｏｎｔｅｆｉｏｒｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから１つの試料、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｉｎ−Ｈｏｕｓｅパネルから５つの試料、およびワシントンにあるＷｅｓｔｏｖｅｒ  Ｈｅｉｇｈｔｓ  Ｃｌｉｎｉｃから４つの試料が使用された。３つの（３）不確かな試料は次の通り：Ｆｏｃｕｓ  ｄｏｎｏｒｓ（ＤＢＳ、Ｄｒｉｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｐｏｔｓ）から１つの試料、ニューヨークにあるＭｏｎｔｅｆｉｏｒｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから１つの試料、およびＬｕｍｉｎｅｘ  ｉｎ−ｈｏｕｓｅパネルから１つの試料が使用された。
【０１１７】
特徴付けられた血清は、我々のキットＥｌｉｓａ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ中で合成ＪＡ１（０．６３μｇ／ｍｌ）および組換えＪＡ（２μｇ／ｍｌ）の濃度にさらされた。試料はＭａｒｓｈ  Ｔｕｂｅｓ中で必要とされる推薦される希釈要素で２倍に希釈された。試料はその後、ポリプロピレンプレートにて阻害する合成および組換えペプチドの推薦される２倍の濃度で混合された。用量設定により混合した後、１００μｌはＥＬＩＳＡ  ＨＳＶ−２プレートに移された。ＥＬＩＳＡの手順は、ＨｅｒｐｅＳｅｌｅｃｔTM  ２  ＥＬＩＳＡ  ＩｇＧのパッケージ挿入物により指示されたように従った。ＯＤおよび指標値は、非ペプチド添加試料希釈剤と比較して評価された。
【実施例１】
【０１１８】
偽陽性血清試料に対する交差反応性抗原の反応性
交差反応性抗原の反応性は、ＨＳＶ−２アッセイを用いて、偽陽性シグナルを産生すると知られている血清試料について、最初に評価された。ウェスタンブロットが行われ、そこで最初に交差反応性抗原Ｄ１、ＪＡ、ＪＢ、ＪＣ、Ｊ２４、およびＨ１がＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて電気泳動され、その後ニトロセルロース膜にトランスファーされた。電気泳動された交差反応性抗原を有するニトロセルロース膜は、ＨＳＶ−２抗体（例えば通常）に陰性、ＨＳＶ−２抗体に陽性、またはＨＳＶ−２抗体に偽陽性と知られているヒト血清で染色された。実験結果は図５において提供される。図５の下部分は、全長ＨＳＶ−２  ｇＧ２ポリペプチドの３１−６９１アミノ酸からなる組換え６６１アミノ酸ｇＧ２についての、異なる交差反応性抗原（Ｄ１、ＪＡ、ＪＢ、ＪＣ、Ｊ２４、およびＨ１）の模式的な配列を示す。
【０１１９】
１８、１９、および２５−３２レーンはＨＳＶ−２抗体に陰性であり、１−５、１０−１３、および１６レーンはＨＳＶ−２抗体に陽性であり、６−９、１４、１５、１７、２０、２１、２３、および２４レーンはＨＳＶ−２抗体に偽陽性であると知られている。その結果は、ＨＳＶ−２抗体に偽陽性であると知られている血清と同様にＨＳＶ−２抗体に陽性であると知られているたいていの血清が、Ｊ２４およびＪＡ交差反応性抗原と反応することを示す。ゆえに、その結果は、交差反応性ｇＧ２抗原Ｊ２４およびＪＡは非ＨＳＶ−２ヒトＩｇＧ抗体に反応するエピトープを含むことを示す。
【実施例２】
【０１２０】
ｇＧ２  ＥＬＩＳＡ上での偽陽性血清試料の阻害
次に、交差反応性抗原が、ＨＳＶ−２  ｇＧ２  ＥＬＩＳＡ上で偽陽性試料の検出を阻害することができるかを調べた。ＨＳＶ−２に対する抗体に陽性であると知られている試料（Ｐとマーク）、およびＨＳＶ−２に対する抗体に偽陽性であると知られている試料（例えば、試料がＨＳＶ−２に対する抗体に陰性であることが知られている時、ＨＳＶ−２に対する抗体の陽性の存在を示す）（ＦＰとマーク）は、ＥＬＩＳＡを用いてＨＳＶ−２に対する抗体の存在を試験された。実験は、ＨＳＶ−２に非特異的で、ｇＧ２抗原を標的抗原として用いたＨＳＶ−２アッセイにおいて偽陽性と導きうる交差反応性抗体を前吸収するための阻害剤として、交差反応性抗原ＪＡの使用あり（ＪＡとマークされたカラム）、およびなし（ｎｏ−ＪＡとマークされたカラム）で実施された。
【０１２１】
その結果は図６において提供され、真陽性血清（Ｐ）への効果と比較した、偽陽性血清（ＦＰとマーク）に対するＪＡ交差反応性抗原の効果の阻害を示している。試料希釈液におけるＪＡあり、およびなしのＥＬＩＳＡ（全ｇＧ２抗原に基づいた）の指標値は、図表にされた。その結果は、ＨＳＶ−２抗体検出アッセイを行う前に血清試料希釈液中でＪＡ交差反応性抗原を混合することにより阻害が達成されたことを示す。その結果はさらにＪＡ交差反応性抗原は顕著に偽陽性血清からの反応性を阻害するが、一方真陽性血清アッセイにおいてＨＳＶ−２抗体の検出に効果がないことを示す。
【実施例３】
【０１２２】
交差反応性抗原は真陽性および真陰性試料に作用しないが、偽陽性反応を阻害する
次に、交差反応性抗原が真陽性血清試料および真陰性血清試料に影響を与えるかどうかを検査した。ＥＬＩＳＡ試料希釈液中の交差反応性抗原の存在が結果に影響を与えるかどうかを判定するため、ＥＬＩＳＡは、ＨＳＶ−２に対する抗体に陽性と知られている試料、ＨＳＶ−２に対する抗体に偽陽性と知られている試料、およびＨＳＶ−２に対する抗体に陰性の試料について実施した。ＪＡ交差反応性抗原なしの希釈液からの指標値およびＪＡ交差反応性抗原ありの希釈液からの指標値は、散布図にされた。その結果は図７において提供される。結果は、真陰性血清（菱形および“Ｎｅｇ．”で示した）および真陽性血清（三角および“Ｐｏｓ．”で示した）は比較可能な結果を与え、対角線上にあるが、一方で偽陽性血清（四角および“ＦＰ”で示した）は対角線上から落ちていることを示し、それによりＪＡ交差反応性抗原は偽陽性血清試料の反応性を阻害するが、真陽性または真陰性血清試料には影響を与えないことを示す。
【０１２３】
ＥＬＩＳＡは、その次にＪＡに加えて交差反応性抗原ＪＡ１およびＪＡ２を用いて行われた。ＥＬＩＳＡは、不確かな試料（ＥＱと示した）を追加して前述のように行われた。データは図８において表の形で、図９においてグラフの形で提供される。図８は血清群（陽性、Ｐ；陰性、Ｎ；および偽陽性、ＦＰ、不確か、ＥＱ）のＥＬＩＳＡの結果を示す。試料希釈液の４種類（異なるＪＡペプチドありまたはなし）は、比較された（ＪＡなし、ＪＡ１あり、ＪＡ２あり、ＪＡ１およびＪＡ２あり、組換えＪＡあり）。ＪＡのない希釈液からの値を様々なＪＡありの希釈液からの値と比較するとき、真陽性および真陰性血清にとって、解釈と同様にＯＤおよび指標値は顕著には変化しない。その結果は偽陽性血清にとって顕著な変化が観察されたことも示す。
【０１２４】
図８の値への指標値変化は、さらに図９においてグラフの形で示されている。ｘ軸はＪＡのない希釈液からの値を表す。ｙ軸はＪＡのある希釈液からの値を表す。点円は偽陽性であり、一方他の点は真陽性または真陰性である。その結果は、偽陽性の点は対角線上から落ちることを示し、偽陽性試料におけるＪＡまたはＪＡ１またはＪＡ２阻害効果を示しているが、真陰性または真陽性の解釈を妨げるものではない。
【実施例４】
【０１２５】
ＭＣＲＳ２を用いたｇＧ２  ＥＬＩＳＡにおける偽陽性血清試料の阻害
ＨＳＶ−２  ＥＬＩＳＡを任意の交差反応性抗原を含まない標準的な希釈液中で行ったとき、例えば試料Ｑ−１１のようなある試料は偽陽性の結果を与えた（偽陽性試料は、阻害アッセイに基づいて野生型のＨＳＶ−２溶解物で確認される）。さらに、ＪＡ１交差反応性抗原を希釈液に添加したとき、交差反応性は残存した。しかしながら、その結果は、ＪＡ２交差反応性抗原、またはＪＡ交差反応性抗原が試料希釈液中でスパイクされたとき、偽陽性活性は除去される（表１参照）。さらにＪＡ１濃度を２倍（２Ｘ）にしたとき、交差反応性はまだ残存した。それゆえ、その結果は、この特定の被検査物において示された偽陽性活性はＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）（ＭＣＲＳ２）のアミノ酸配列を含むＪＡ２上のアミノ酸配列に向かっていることを示す。
【０１２６】
【表１】
2009501900.tif 000003
【実施例５】
【０１２７】
最低限の交差反応性配列欠失変異型の生成
交差反応性抗原の発見に基づいて、最低限の交差反応性配列の欠失を含むさらに特異的な組換え抗原を生成することができる。例えば、ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）（ＭＣＲＳ１）のアミノ酸配列を含んでいる少なくとも最低限の交差反応性抗原配列が欠失している特異的な変異型組換えｇＧ２抗原が生成される。ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）（ＭＣＲＳ１）のアミノ酸配列が欠失した野生型ＨＳＶ−２  ｇＧ２の欠失変異型の例となるアミノ酸配列は、図４Ｂにおいて提供される。
【０１２８】
そのような変異型は、ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）（ＭＣＲＳ１）のアミノ酸配列を含んでいる最低限の交差反応性配列に隣接する野生型ｇＧ２遺伝子核酸配列を増幅するようにＰＣＲプライマーを設計することにより生成される。一つ目のプライマーセットは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の１から１２９９までのヌクレオチドを含む核酸配列を増幅するよう設計され、該配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１の１から４４３までのアミノ酸残基をコードするものである。二つ目のプライマーセットは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の１３２９から２０９７までのヌクレオチドを含む核酸配列を増幅するよう設計され、該配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１の４４３から６９９までのアミノ酸残基をコードするものである。その二つの核酸配列は、その後、一つ目の配列の３’端を経由して２つ目の配列の５’端まで連結される。欠失変異をコードしている連結された核酸配列は、その後、適した実験系、例えば大腸菌、酵母、または哺乳類の系において、クローン化される。
【０１２９】
ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）（ＭＣＲＳ２）のアミノ酸配列を含んでいる少なくとも最低限の交差反応性抗原配列が欠失している、特異的な変異型組換えｇＧ２抗原も生成される。ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）（ＭＣＲＳ２）のアミノ酸配列が欠失している、野生型ＨＳＶ−２  ｇＧ２の欠失変異型の例となるアミノ酸配列は、図４Ｄにおいて提供される。
【０１３０】
そのような変異型も、ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）（ＭＣＲＳ２）のアミノ酸配列を含んでいる最低限の交差反応性配列に隣接する野生型ｇＧ２遺伝子核酸配列を増幅するようにＰＣＲプライマーを設計することにより生成される。一つ目のプライマーセットは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の１から１３２６までのヌクレオチドを含む核酸配列を増幅するよう設計され、該配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１の１から４４２までのアミノ酸残基をコードするものである。二つ目のプライマーセットは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の１３６２から２０９７までのヌクレオチドを含む核酸配列を増幅するよう設計され、該配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１の４５４から６９９までのアミノ酸残基をコードするものである。その二つの核酸配列は、その後、一つ目の配列の３’端を経由して２つ目の配列の５’端まで連結される。欠失変異をコードしている連結された核酸配列は、その後、適した実験系、例えば大腸菌、酵母、または哺乳類の系において、クローン化される。
【０１３１】
ｇＧ２欠失変異型は、最低限の交差反応性配列に隣接する追加のアミノ酸が欠失していてもよい。そのようなｇＧ２欠失変異型は、上述の方法を用いて生成される。そのようなものとして、他の例となるｇＧ２欠失変異型は、Ｊ２４アミノ酸配列が欠失したｇＧ２ポリペプチド（ｇＧ２ΔＪ２４）、ＪＡアミノ酸配列が欠失したｇＧ２ポリペプチド（ｇＧ２ΔＪＡ）、ＪＡ１アミノ酸配列が欠失したｇＧ２ポリペプチド（ｇＧ２ΔＪＡ１）、およびＪＡ２アミノ酸配列が欠失したｇＧ２ポリペプチド（ｇＧ２ΔＪＡ２）を含む。
【実施例６】
【０１３２】
ｇＧ２ｓｕｂＭＣＲＳの生成
交差反応性抗原の発見に基づいて、最低限の交差反応性配列の、異なるアミノ酸配列との置換を含むより特異的な抗原を生成することができる。一般に、置換したアミノ酸配列は、例えばグリシン残基を含むアミノ酸配列のように、配列が試料中の抗ＨＳＶ−２抗体の検出を妨げないよう、一般に選択される。例えば、ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）（ＭＣＲＳ１）のアミノ酸配列を含んでいる少なくとも最低限の交差反応性抗原配列が異なるアミノ酸配列に置換された、特異的な変異型組換えｇＧ２抗原が生成される。ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）（ＭＣＲＳ１）のアミノ酸配列がグリシン残基からなるアミノ酸配列で置換された野生型ＨＳＶ−２  ｇＧ２の置換変異体の例となるアミノ酸配列は、図４Ｃにおいて提供される。
【０１３３】
そのような変異型は、ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）（ＭＣＲＳ１）のアミノ酸配列を含んでいる最低限の交差反応性配列に隣接する野生型ｇＧ２遺伝子核酸配列を増幅するようにＰＣＲプライマーを設計することにより生成される。一つ目のプライマーセットは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の１から１２９９までのヌクレオチドを含んでいる核酸配列を増幅するよう設計され、該配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１の１から４４３までのアミノ酸残基をコードするものである。二つ目のプライマーセットは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の１３２９から２０９７までのヌクレオチドを含む核酸配列を増幅するよう設計され、該配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１の４４３から６９９までのアミノ酸残基をコードするものである。
【０１３４】
野生型ｇＧ２アミノ酸配列において置換されるべきアミノ酸配列をコードしているオリゴヌクレオチドはその後、設計され、化学的に合成される。ＭＣＲＳ１配列を置換するため、９つのグリシン残基をコードするオリゴヌクレオチドが合成される。合成されたオリゴヌクレオチドの核酸配列は次の通り：
５’−ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）。
【０１３５】
配列およびオリゴヌクレオチドをコードしているｇＧ２核酸から増幅された二つの核酸配列は、オリゴヌクレオチドが一つ目と二つ目の増幅されたｇＧ２配列間に挿入されるように連結される。特に、一つ目の増幅されたｇＧ２配列は、一つ目の配列の３’端を経由してオリゴヌクレオチドの５’端までオリゴヌクレオチドに連結される。連結された配列はその後、オリゴヌクレオチドの３’端を経由して二つ目のｇＧ２配列の５’端まで、二つ目の増幅されたｇＧ２配列に連結される。置換変異体をコードしている連結された核酸配列はその後、適した発現系、例えば大腸菌、酵母、および哺乳類の系においてクローン化される。
【０１３６】
ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）（ＭＣＲＳ２）のアミノ酸配列を含んでいる少なくとも最低限の交差反応性抗原配列が異なるアミノ酸配列に置換された、特異的な変異型組換えｇＧ２抗原も生成される。ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）（ＭＣＲＳ２）のアミノ酸配列がグリシン残基からなるアミノ酸配列に置換された、野生型ＨＳＶ−２  ｇＧ２の置換変異型の例となるアミノ酸配列は、図４Ｅにおいて提供される。
【０１３７】
そのような変異型は、ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）（ＭＣＲＳ２）のアミノ酸配列を含んでいる最低限の交差反応性配列に隣接する野生型ｇＧ２遺伝子核酸配列を増幅するようにＰＣＲプライマーを設計することにより生成される。一つ目のプライマーセットは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の１から１３２６までのヌクレオチドを含む核酸配列を増幅するよう設計され、該配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１の１から４４２までのアミノ酸残基をコードするものである。二つ目のプライマーセットは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の１３６２から２０９７までのヌクレオチドを含む核酸配列を増幅するよう設計され、該配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１の４５４から６９９までのアミノ酸残基をコードするものである。
【０１３８】
野生型ｇＧ２アミノ酸配列において置換されるべきアミノ酸配列をコードしているオリゴヌクレオチドはその後、設計され、化学的に合成される。ＭＣＲＳ２配列を置換するため、９つのグリシン残基をコードするオリゴヌクレオチドが合成される。合成されたオリゴヌクレオチドの核酸配列は次の通り：
５’−ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）。
【０１３９】
配列およびオリゴヌクレオチドをコードしているｇＧ２核酸から増幅された二つの核酸配列は、オリゴヌクレオチドが一つ目と二つ目の増幅されたｇＧ２配列間に挿入されるように連結される。特に、一つ目の増幅されたｇＧ２配列は、一つ目の配列の３’端を経由してオリゴヌクレオチドの５’端までオリゴヌクレオチドに連結される。連結された配列はその後、オリゴヌクレオチドの３’端を経由して二つ目のｇＧ２配列の５’端まで、二つ目の増幅されたｇＧ２配列に連結される。置換変異体をコードしている連結された核酸配列はその後、適した発現系、例えば大腸菌、酵母、および哺乳類の系においてクローン化される。
【０１４０】
ｇＧ２置換変異型は、野生型の配列よりも異なるアミノ酸配列で置換された最低限の交差反応性配列に隣接している追加のアミノ酸を有してもよい。そのようなｇＧ２置換変異型は、上述の方法を用いて生成される。そのようなものとして、他の例となるｇＧ２置換変異型は、Ｊ２４アミノ酸配列が置換されたｇＧ２ポリペプチド（ｇＧ２ｓｕｂＪ２４）、ＪＡアミノ酸配列が置換されたｇＧ２ポリペプチド（ｇＧ２ｓｕｂＪＡ）、ＪＡ１アミノ酸配列が置換されたｇＧ２ポリペプチド（ｇＧ２ｓｕｂＪＡ１）、ＪＡ２アミノ酸配列が置換されたｇＧ２ポリペプチド（ｇＧ２ｓｕｂＪＡ２）を含む。
【実施例７】
【０１４１】
ｇＧ２断片ポリペプチドの生成
交差反応性抗原の発見に基づいて、最低限の交差反応性配列を欠失しているｇＧ２断片ポリペプチドを含む、より特異的な組換え抗原を生成することができる。例えば、ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）（ＭＣＲＳ１）のアミノ酸配列を含む最低限の交差反応性抗原配列が欠失している、特異的なｇＧ２断片ポリペプチドが生成される。
【０１４２】
そのようなｇＧ２ポリペプチド断片は、ＧＨＴＮＴＳＳＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０７）（ＭＣＲＳ１）のアミノ酸配列を含んでいる最低限の交差反応性配列に隣接する野生型ｇＧ２遺伝子核酸配列を増幅するようにＰＣＲプライマーを設計することにより生成される。一つ目のプライマーセットは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の１から１２９９までのヌクレオチドを含む核酸配列を増幅するよう設計され、該配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１の１から４４３までのアミノ酸残基をコードするものである。二つ目のプライマーセットは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の１３２９から２０９７までのヌクレオチドを含む核酸配列を増幅するよう設計され、該配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１の４４３から６９９までのアミノ酸残基をコードするものである。その後二つの核酸配列は適した発現系、例えば大腸菌、酵母、または哺乳類の系において、クローン化される。
【０１４３】
ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）（ＭＣＲＳ２）のアミノ酸配列を含む最低限の交差反応性抗原を欠失している特異的組換えｇＧ２断片ポリペプチド抗原も生成される。そのようなｇＧ２断片ポリペプチドは、ＡＡＫＴＰＰＴＴＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６）（ＭＣＲＳ２）のアミノ酸配列を含んでいる最低限の交差反応性配列に隣接する野生型ｇＧ２遺伝子核酸配列を増幅するようにＰＣＲプライマーを設計することにより生成される。一つ目のプライマーセットは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の１から１３２６までのヌクレオチドを含む核酸配列を増幅するよう設計され、該配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１の１から４４２までのアミノ酸残基をコードするものである。二つ目のプライマーセットは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の１３６２から２０９７までのヌクレオチドを含む核酸配列を増幅するよう設計され、該配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１の４５４から６９９までのアミノ酸残基をコードするものである。その後、二つの核酸配列は適した発現系、例えば大腸菌、酵母、または哺乳類の系において、クローン化される。
【０１４４】
そのｇＧ２断片ポリペプチドは、最低限の交差反応性配列に隣接している付加的なアミノ酸を欠失するように生成してもよい。そのようなｇＧ２断片ポリペプチドは前述の方法を用いて生成される。そのようなものとして、他の例となるＪ２４アミノ酸配列を欠失しているｇＧ２断片ポリペプチド、ＪＡアミノ酸配列を欠失しているｇＧ２断片ポリペプチド、ＪＡ１アミノ酸配列を欠失しているｇＧ２断片ポリペプチド、ＪＡ２アミノ酸配列を欠失しているｇＧ２断片ポリペプチドが挙げられる。
【０１４５】
前述のものは単に本発明の原理を示すものである。当然のことながら、当業者は多様な処置を考案することができ、その処置はここに明確に記載され、または示されていないが、本発明の原理を具現化し、その精神および範囲中に含まれる。さらに、ここに列挙されたすべての例および条件付の専門用語は、主に読者が本発明の原理および発明者が技術の拡大に寄与した概念を理解するのを助けることを意図するものであり、そのような特に列挙された例や条件に限定しないものと解釈されるものである。さらに、本発明の特異的な例と同様に、ここに列挙されているそれらの原理、解釈、および実施態様の全ての記述は、それらの構造的および機能的に等価などちらのものも包含することを意図する。さらに、そのような等価なものは、現在知られている等価なものおよび将来開発される等価なもの、すなわち構造にかかわらず、同様の機能を果たす開発された要素のどちらも含むことを意図する。本発明の請求の範囲は、それゆえ、ここに示し、記載した、例となる実施態様に限定されることを意図しない。さらに、本発明の請求の範囲および精神は、添付の請求項によって具現化される。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１Ａ】野生型ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｇ２（ｇＧ２）のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１）。
【図１Ｂ】野生型ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｇ２（ｇＧ２）の核酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）。
【図２】ヒト血清中でＨＳＶ−２非特異的抗体と反応しているエピトープを同定するため設計および表現された、ＨＳＶ−２ｇＧ２遺伝子、および特異的ｇＧ２抗原、および交差反応性抗原の図。
【図３】例となる交差反応性抗原の図。
【図４Ａ】例となる交差反応性抗原の配列比較。
【図４Ｂ】野生型ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｇ２欠失変異型（ｇＧ２ΔＭＣＲＳ１）のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）。
【図４Ｃ】野生型ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｇ２置換変異型（ｇＧ２ｓｕｂＭＣＲＳ１）のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）。
【図４Ｄ】野生型ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｇ２欠失変異型（ｇＧ２ΔＭＣＲＳ２）のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）。
【図４Ｅ】野生型ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｇ２置換変異型（ｇＧ２ｓｕｂＭＣＲＳ２）のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）。
【図５】ＨＳＶ−２ｇＧ２遺伝子の異なるペプチド断片のヒト血清との反応性を示すウエスタンブロット。
【図６】交差反応性抗原ＪＡ存在下および非存在下、全長ＨＳＶ−２  ｇＧ２でコートしたＥＬＩＳＡにおいて、真陽性血清（Ｐとマーク）の効果と比較した偽陽性血清（ＦＰとマーク）に対する阻害効果を示すグラフ。
【図７】交差反応性抗原ＪＡのあるときとないとき間での指標補正を示したグラフ。
【図８】交差反応性抗原ＪＡ、ＪＡ１、およびＪＡ２を用いた、血清群（陽性、Ｐ；陰性、Ｎ；と、偽陽性、ＦＰ、不定、ＥＱ）へのＥＬＩＳＡ阻害研究の結果。
【図９】図８のデータ表の値から指標値の変化を表したグラフ。
【図１Ａ】
2009501900.tif 000004
【図１Ｂ】
2009501900.tif 000005
【図２】
2009501900.tif 000006
【図３】
2009501900.tif 000007
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図４Ｃ】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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