(57)【要約】  本発明は、ルチリア・セリカータから得られるものなど、昆虫の幼虫から取得可能であり、ＤＮＡなどの核酸を分解し、変性し、消化し、切り取り又は切断することができるという点でヌクレアーゼとしての活性を有するポリペプチドに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を分解し、変性し、切り取り又は切断する能力を有する、昆虫の幼虫から単離されたポリペプチド又はその合成類縁体。
【請求項２】
幼虫がルチリア・セリカータ（Ｌｕｃｉｌｉａ  ｓｅｒｉｃａｔａ）由来の幼虫である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドが昆虫の幼虫の排泄物／分泌物から単離される、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
核酸がＤＮＡである、請求項１から３の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチドが原核生物の核酸及び真核生物の核酸をともに分解する、請求項１から４の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ポリペプチドが細菌の核酸及び哺乳動物の核酸をともに分解する、請求項１から５の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドが以下のうち何れか１つに係る少なくとも１つの配列を含む、請求項１から６の何れか一項に記載のポリペプチド。
【化１】
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【請求項８】
ポリペプチドが配列番号１から７の２つ又はそれ以上を含む、請求項１から７の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ポリペプチドが配列番号１から７の配列の全てを含む、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列が番号順に存在する、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１から１０の何れか一項に記載のポリペプチドによってコードされるヌクレアーゼ。
【請求項１２】
先行する請求項の何れか一項に記載のポリペプチドによってコードされるフェリチン。
【請求項１３】
感染の治療若しくは予防における使用のための、又は創傷の治療のための、先行する請求項の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
先行する請求項の何れか一項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１５】
先行する請求項の何れか一項に記載のポリペプチドを取り込んだ包帯。
【請求項１６】
感染の治療において慣用の抗生物質を補助するための、先行する請求項の何れか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１７】
感染が全身性又は局所的である、請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幼虫の産物に関する。より具体的には、本発明は、ルチリア・セリカータ（Ｌｕｃｉｌｉａ  ｓｅｒｉｃａｔａ）（フェニシア・セリカータ（Ｐｈａｅｎｉｃｉａ  ｓｅｒｉｃａｔａ）とも称される。）の幼虫から単離された１つ又はそれ以上のポリペプチドであり、核酸を分解し、消化し、切り取り又は切断する能力を有するポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
創傷の治癒における昆虫の幼虫又はうじの使用に伴う利点は、何世紀も前に初めて観察され、認知されているが、「バイオ外科手術」と名付けられたこのような使用に再び取り組み、うじ虫治療の復活が始まったのは、特に抗生物質耐性微生物が増加している近年になってからに過ぎない１０。現在臨床的に使用されている幼虫は、クロバエ類であるルチリア・セリカータの幼虫である。
【０００３】
幼虫又はうじ虫は、創傷を郭清し、消毒する顕著な能力を有すると考えられている。より最近になって、この能力は、組織再生の刺激及び創傷閉鎖に及ぶことが判明している。抗生物質、抗微生物剤、殺菌剤、外科的創傷郭清及び排膿法などの従来の治療法が進行性の組織破壊を抑制又は停止させることができない場合に、多くの慢性的な創傷の治癒速度を向上させ、増大させるために、臨床状況において、幼虫を使用することが可能である１１。このような慢性的な創傷は、様々な症状に起因し、糖尿病性の足部潰瘍、静脈性下腿潰瘍、感染性手術創、整形外科的創傷、骨髄炎及び褥瘡が含まれる。
【０００４】
患者の一部にとって、幼虫又はうじ虫を丸ごと使用することには不快感があり、これを克服する試みで、幼虫そのものではなく、幼虫から得られた製品を使用することに向けた動きが存在する。幼虫の排泄／分泌（ＥＳ）産物又は幼虫の抽出物の構成成分は、幼虫を丸ごと使用することと等しい有効性があると考えられている。幼虫の産物の構成成分は、うじ虫の作用を説明するために提唱されている幾つかの機序を用いて、うじ虫が創傷治癒を促進する方法の中核を成す。創傷郭清は、１つには、幼虫が摂取可能な形態へ壊死組織を分解し、創傷表面から瘡蓋を除去するように作用する、ＥＳ又は抽出物中に存在する成分コラーゲナーゼ及びセリンプロテアーゼのタンパク質分解作用を介して達成されると考えられている１２，１３。ＥＳ中に同定された２つの抗微生物因子は、グラム陰性及びグラム陽性細菌に対して活性を示しており、これらの因子の１つはＭＲＳＡに対して顕著な活性を示す１４。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）再構築及び閉鎖の刺激は、フィブロネクチンを生物活性ペプチドへと分解するように作用する、ＥＳ中に存在する１つ又はそれ以上のキモトリプシン様セリンプロテアーゼの作用に起因することも提唱されてきた。これらの生物活性ペプチドは、次いで、繊維芽細胞の接着及び遊走を刺激することが可能であり１８、おそらくは、治癒の加速の原因である１５と考えられている。ＥＳは、繊維芽細胞の増殖に対しても効果を有し得る。
【発明の開示】
【０００５】
本発明者らは、幼虫のＥＳ及び抽出物が何れも、核酸を分解し、変性し、消化し又は切り取り又は切断することができる１つ又はそれ以上のポリペプチドを含有することを決定した。好ましくは、このポリペプチド又は各ポリペプチドは、以下に示されている配列の１つ又はそれ以上を含む。
【０００６】
理論に拘泥されることを望むものではないが、本発明者らは、これらのポリペプチドの少なくとも１つが、核酸、特にＤＮＡを分解し、変性し、消化し、切断し又は切り取るという点で、ヌクレアーゼである、又はヌクレアーゼとして機能すると推論している。これに関して、以下でさらに論述されているように、それらの少なくとも幾つかが公知の昆虫ヌクレアーゼに対して相同性を示さないとしても、ヌクレアーゼとして機能する点において、前記ポリペプチドはヌクレアーゼであると考えられる。
【０００７】
本発明者らは、幼虫のＥＳ又は抽出物から得られたヌクレアーゼ機能を有するポリペプチド配列の、昆虫配列データベース中のポリペプチドに対する相同性を比較し、同定された最も近い相同性は、昆虫のフェリチンタンパク質の一部に対するものであった。フェリチンは、２４のタンパク質サブユニットからなる球状タンパク質複合体であり、原核生物及び真核生物の両者で、主な細胞内鉄貯蔵タンパク質であり、可溶性で無毒の形態に鉄を保つ。フェリチンは、古典的には、ヌクレアーゼとして記載されていないが、フェリチンから反応媒体中に放出された鉄が、核酸、特にＤＮＡに対して作用し得、デオキシリボヌクレアーゼと同等の結果を与え得ることが見出されている２１−２２。
【０００８】
本発明者らによって同定されたポリペプチドは、核酸の、又はより具体的にはＤＮＡのヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断することができ、ＤＮＡ骨格中のホスホジエステル結合の加水分解的切断を触媒することができ、従って、ヌクレアーゼの一種であるという点で、ヌクレアーゼの定義に合致する。従って、本願において、ヌクレアーゼ又はデオキシリボヌクレアーゼという用語は、ポリペプチドがヌクレアーゼ又はデオキシリボヌクレアーゼと古典的に記載されているかどうかに関わらず、ポリペプチド中に存在しているこの活性の観察に基づいて、本発明のポリペプチドを記載するために使用される。
【０００９】
本発明者らは、ルチリア・セリカータ（ファエニシア・セリカータとも称される。）の幼虫から得られるＥＳ及び抽出物が少なくとも１つのヌクレアーゼを含むことを決定した。本ヌクレアーゼは、創傷、やけどなどの治療において、又は感染の治療若しくは予防において使用され得る。本ヌクレアーゼは、特に、現行のデオキシリボヌクレアーゼ療法の代替法として、嚢胞性繊維症の治療においても使用され得る。
【００１０】
従って、本発明は、昆虫の幼虫から単離されたヌクレアーゼ又はその合成類縁体若しくは様式を提供する。好ましくは、ヌクレアーゼは、以下に示されているポリペプチド配列の１つ又はそれ以上を含む。
【００１１】
【化２】
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【００１２】
上記ポリペプチド配列を取得するために使用される方法（ペプチド結合を無作為に切断する質量分析法）の故に、特に、これらのペプチドが二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に単一の斑点として分離されるという事実に照らせば、これらのペプチドは、より長いポリペプチド又はタンパク質の分解産物である可能性がある。従って、本発明は、上記ポリペプチド配列の２つ又はそれ以上を含むポリペプチド配列も包含する。理想的には、本発明は、場合によっては、単一のポリペプチド鎖中に上記配列の全てを含むポリペプチド配列を含む。２つ又はそれ以上のポリペプチドは、記載されている番号順である必要はない。このようなポリペプチドの何れもが上記ヌクレアーゼ機能を有することが好ましい。
【００１３】
配列番号１から７のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び記載されている配列を有する合成又は組換えポリペプチドの調製におけるそれらの使用も本発明の範囲内に含まれる。
【００１４】
好ましくは、前記ヌクレアーゼは、感染の治療若しくは予防における使用に適しており、又は創傷の治療に適している。前記ヌクレアーゼは、医薬組成物中において使用され得、又は包帯中に取り込まれ得る。
【００１５】
本明細書において使用される「創傷」という用語は、傷害によるか、又は疾病によるかを問わず、皮膚、表皮又は結合組織への一切の損傷を定義することが意図され、従って、切り傷、刺し傷、術創、潰瘍、褥瘡、やけど（熱、凍結、化学物質、電気及び放射線によって引き起こされたやけどなど）、皮膚の擦過又は暴行（ａｓｓａｕｌｔ）、骨髄炎並びに整形外科的創傷が含まれるが、これらに限定されるものではない。創傷は、感染された状態であり得る。さらに、創傷は、慢性又は急性であり得る。
【００１６】
好ましくは、幼虫は、ルチリア・セリカータ（フェネシア・セリカータとしても知られる。）由来の幼虫である。
【００１７】
産物はヌクレアーゼであり得、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ又はこれらの混合物の何れかであり得る。
【００１８】
理想的には、ヌクレアーゼは、原核生物及び真核生物の核酸の両方、特に、細菌及び哺乳動物の核酸の両方を分解する。しかしながら、本発明のヌクレアーゼは、ウイルス複製の治療又は予防においても使用され得る。
【００１９】
ヌクレアーゼは、全身性であるか、又は局所的であるかを問わず、感染の治療において慣用の抗生物質を補助するために使用され得る。
【００２０】
デオキシリボヌクレアーゼ酵素などのヌクレアーゼは、創傷郭清を補助することが示唆されており、慢性創傷の創傷郭清を促進するために使用される医薬中に取り込まれている。創傷環境中で使用される場合、ウシ膵臓から得られたデオキシリボヌクレアーゼは、慢性創傷の壊死組織中に存在するデオキシリボ核タンパク質及びデオキシリボ核酸を分解することが示されている１６。ストレプトコッカスのＬａｎｃｅｆｉｅｌｄ群Ｃ株であるストレプトコッカス・エキシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）から得られる微細な細胞外産物は、医薬Ｖａｒｉｄａｓｅ（Ｒ）の構成成分を形成する。Ｖａｒｉｄａｓｅ（Ｒ）は、化膿性創傷の創傷郭清のための局所剤であり、ストレプトドルナーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｄｏｒｎａｓｅ）と称されるデオキシリボヌクレアーゼ成分を含有する。ストレプトドルナーゼによる細胞外ＤＮＡの分解は、膿を液状化し、これにより、細胞外核タンパク質の存在下で凝集塊を形成し、増強された食作用及び創傷治癒をもたらす白血球の自由な移動を可能とすると考えられている２。しかしながら、幼虫源由来のヌクレアーゼ、特に、ルチリア・セリカータ由来のヌクレアーゼは、選択された金属イオンの存在又は不存在に対するそれらの耐性及びそれらの熱関連活性においてより頑強であることが見出された。
【００２１】
本発明者らは、ＥＳ及び幼虫の抽出物内に金属イオン依存性デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）活性を見出した。これは、非生存組織内の遊離のＤＮＡを分解し、従って、滲出液又は焼痂の粘性を低減することによって、創傷郭清に寄与し得る。本発明者らは、ＥＳデオキシリボヌクレアーゼのデオキシリボヌクレアーゼ活性を市販のデオキシリボヌクレアーゼＩ調製物と比較し、デオキシリボヌクレアーゼ基質が限定的でない場合には、ＥＳデオキシリボヌクラーゼが市販のデオキシリボヌクレアーゼより低い反応速度（Ｖｍａｘ）を有するが、基質が限定的でない場合には、ＤＮＡに対してより高い親和性（より高いＫｍ）を有することを見出した。本発明者らは、温度勾配が存在する創傷状態に適した範囲（冷たい壊死組織は周囲温度であり、包帯が交換されたときに、又は血液供給が損なわれたときに、他の組織の温度が低下する。）である２０から４０℃の間の温度に対して、ＥＳデオキシリボヌクレアーゼがより耐性を示すことも見出した１７。さらに、本発明者らは、ＥＳが、市販のデオキシリボヌクレアーゼより、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）によって阻害されにくく、高いＣａ２＋及びＮａ＋イオン濃度に対してより抵抗力があることを示す結果を有する。これらの結果は、市販の調製物に比べて、ＥＳデオキシリボヌクレアーゼ活性が金属イオン濃度の変化に対してより頑強であることを示す。
【００２２】
以下に記載されているように、ヌクレアーゼ活性は、幼虫から得られた抽出物中にも検出された。
【００２３】
ここで、添付の図面を参照しながら、添付の図面によって例示されているように、例として、本発明を記載する。
【実施例１】
【００２４】
ヌクレアーゼ、特に、ＥＳ由来のデオキシリボヌクレアーゼを同定し、性質決定するために以下の実験を行った。
【００２５】
ルチリア・セリカータの幼虫の排泄／分泌産物の収集
ＬａｒｖＥＴＭ、Ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃａｒｄｉｆｆ、ＵＫから取得した約３００の、孵化直後のルチリア・セリカータを繰り返し洗浄し、それらの分泌物（ＥＳ）を集め、無菌条件下で工程を実施した。無菌リン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）１ｍＬを幼虫に添加し、次いで、幼虫を３０分間放置した。この後、ＰＢＳ及び分泌物を除去し、回収するために、幼虫を３０分間放置した。この工程を約４回実施した。次いで、使用するために、集めたＥＳをプールした。
【００２６】
ルチリア・セリカータ排泄／分泌産物の性質決定
Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキットを用いて、ＰＢＳ中のＥＳタンパク質濃度を測定した。（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ，  Ｕ．Ｓ．Ａ）１
ＥＳプロテイナーゼ活性を測定するために、ＦＩＴＣカゼインアッセイを行った。５．３％ＦＩＴＣ−カゼイン連結物を含有する０．１ｍｏｌＬ−１Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で、ＥＳを１：２０希釈し、次いで、３７℃で２時間、これを温置した。次いで、反応を停止するために、トリクロロ酢酸５％を添加し、室温で４５分間放置した。ペレットを形成するために、形成されたタンパク質沈殿を遠心し、得られた上清を０．５ｍｏｌＬ−１Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）と、１：１０で混合した。４８５ｎｍの励起波長および５３８ｎｍの発光波長で蛍光を測定した。ＥＳ盲検試料から検出された蛍光を、得られた蛍光値から差し引いた。
【００２７】
ＤＮＡ及びメチルグリーンを用いてアッセイされたデオキシリボヌクレアーゼ活性
ＤＮＡは、メチルグリーンに対して強い親和性を有しており、本色素と複合体を形成する。デオキシリボヌクレアーゼ活性は、メチルグリーンに対するＤＮＡの親和性を喪失させ、緑から無色への溶液の色の変化が生じる。標準的なデオキシリボヌクレアーゼＩ酵素の活性とＥＳを比較した。１ｍｇ／ｍｌデオキシリボヌクレアーゼを１：５０希釈し、この溶液１２５μＬを０．２ｍｇ／ｍＬＤＮＡメチルグリーン基質溶液１８７５μＬに添加した。１６２．３μｇ／ｍＬＥＳ１２５μＬも、ＤＮＡ−メチルグリーン基質溶液１８７５μＬに添加した。従って、得られた濃度は、１．２８μｇ／ｍＬデオキシリボヌクレアーゼおよび１０．１４μｇ／ｍＬＥＳであった。
【００２８】
次いで、水槽中において、３７℃でこれらの溶液を温置した。５分間隔で２５分間、及び１時間ごとに５時間、１００μＬの分取試料を採取した（各時間間隔において、試料は、３つ組みにて採取した。）。９６ウェルプレート中のクエン酸ナトリウム１５０μＬに、これらの分取試料を添加した。全ての試料が採取された時点で、プレートを一晩静置した。次いで、Ａｎｔｈｏｓ  Ｌｕｃｙ１マイクロプレートルミノメータ中にて、６３０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００２９】
次いで、ＥＳの様々な濃度（５．０９μｇ／ｍｌ、２．５４μｇ／ｍｌ、１．２７μｇ／ｍｌ、０．６３４μｇ／ｍｌ、０．３１７μｇ／ｍｌ，０．１５９μｇ／ｍｌＥＳ）及び１．２５μｇ／ｍＬデオキシリボヌクレアーゼを用いて、２分間隔で、このアッセイを繰り返した。より長い期間にわたる、及びより高いＥＳの濃度を用いた見掛けの基質の枯渇による、反復を実施した。
【００３０】
ゲルを含有するＤＮＡメチルグリーン中の電気泳動を介してアッセイされたデオキシリボヌクレアーゼ活性
この方法の基礎を成す原理は、デオキシリボヌクレアーゼ酵素がゲルを移動して、本酵素がゲル中でＤＮＡメチルグリーン複合体を分解した場所にバンドをもたらすことである。２つのゲルを作製した。何れも、０．０６７ｍｇ／ｍＬのＤＮＡメチルグリーン濃度を有するＳＤＳポリアルクリアミドゲルであった。それぞれ、ＰＢＳ及び水中での、系列希釈を介して、ＥＳ（１０．１４μｇ／ｍｌ、５．０７μｇ／ｍｌ、２．５４μｇ／ｍｌ、１．２６８μｇ／ｍｌ）及びデオキシリボヌクレアーゼ（１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ）の漸減する濃度の試料２０μＬを得た。これらの試料のそれぞれに、非還元試料緩衝液２０μＬを添加した後、３７℃で３０分間温置した。予め染色された標準及びＰＢＳ／Ｈ２Ｏ対照に加えて、異なるゲル上に、デオキシリボヌクレアーゼ試料及びＥＳ試料を搭載した。０．１％ＳＤＳ走行緩衝液を使用し、電流を印加した。ゲルが走行した時点で、２．５％ＴＷＥＥＮ（Ｒ）とともにゲルを温置し、続いて、蒸留水中で３０分間洗浄し、７．５ｍＭＭｇＳＯ４を含有する０．５ＭＴＲＩＳ緩衝液中にて、３７℃で一晩放置した。この後に、臭化エチジウムでゲルを染色し、トランスルミネータ下で結果を可視化した。
【００３１】
用量依存曲線
ＥＳの性質をさらに決定するために、ＥＣ５０値を測定できるように、用量依存曲線を作製した。ＰＢＳ中、１３．４０μｇ／ｍＬの濃度になるようにＥＳを希釈し、次いで、この後に、ＰＢＳ中への１：１０希釈を行った。１０μｇ／ｍＬの濃度になるように、ＰＢＳ中にデオキシリボヌクレアーゼを希釈し、次いで、これも１：１０希釈に供した。９６ウェルプレート中の０．２ｍｇ／ｍＬＤＮＡメチルグリーンの１８０μＬに、各希釈２０μＬを添加した（３つ組みで実行した。）。次いで、３、１８及び２４時間後に、Ａｎｔｈｏｓ  Ｌｕｃｙ１マイクロプレートルミノメータ中にて、６３０ｎｍで吸光度の読み取りを行った。統計解析プログラムＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍＴＭ中で、平均吸光度（６３０ｎｍ）に対してｌｏｇ１０濃度（ｍｃｇ／ｍＬ）をプロットすることによって、用量依存曲線を作成した。
【００３２】
阻害剤の存在下でのデオキシリボヌクレアーゼ活性
大豆トリプシン阻害剤及びＥＤＴＡの存在下での試料の電気泳動
デオキシリボヌクレアーゼに対するこれらの阻害剤の効果を観察するために、ＥＤＴＡ及び大豆トリプシン阻害剤の不存在及び存在下で、細菌のゲノムＤＮＡ及びＥＳ又はデオキシリボヌクレアーゼを含有する試料を、アガロースゲル上に搭載した。
【００３３】
大豆トリプシン阻害剤（Ｓｉｇｍａ）をＰＢＳで４回洗浄し、各回ごとに、ペレット中に遠心し、ＰＢＳを上清として除去した。５回目の洗浄後すぐに、トリプシン阻害剤を懸濁するために、ＰＢＳ５００μＬを使用し、処理されるべき試料の間に、これを等しく分配した。存在する全てのセリンプロテイナーゼを除去するために、ＥＳ１６２．３μｇ／ｍＬ及びＰＢＳ（対照）の試料を大豆トリプシン阻害剤で処理した。セリンプロテイナーゼの最大の除去を達成するために、ＳＴＩでこれらの試料を３回処理し、再度、各処理後に、溶液を遠心し、ＥＳ／ＰＢＳを上清として除去した。洗浄後に、これらの溶液を新鮮なＥｐｐｅｎｎｄｏｒｆに移した。
【００３４】
１．３８５ｍｇ／ｍＬ細菌のゲノムＤＮＡの１５．３４μＬを、無菌ＰＢＳ又は５ｍＭＥＤＴＡの１８４．６μＬ中に、０．１ｍｇ／ｍＬになるように希釈した。１２１．１μｇ／ｍＬデオキシリボヌクレアーゼも作製した（ＰＢＳ７２．６μＬ中に、１ｍｇ／ｍＬの１０μＬを希釈した。）。試料を作製するために、ＳＴＩ３．１２５μＬを加えたこれらのＤＮＡ溶液の適切な１つ５０μＬを、デオキシリボヌクレアーゼ／ＥＳ／ＰＢＳで処理し／処理しなかった。搭載緩衝液（Ｓｉｇｍａ）１０μＬを各試料に添加し、３７℃で２０分間、試料を温置し、次いで、臭化エチジウム５μＬを含有する１．６％（ｗ／ｖ）アガロースゲル５０ｍＬ上に搭載した。
【００３５】
従って、ゲル内のレーン中は、ＤＮＡ約１μｇ及びデオキシリボヌクレアーゼ７．５６μｇ／ｍＬ又はＥＳ１０．１４μｇ／ｍＬの有効濃度であった。結果は、トランスルミネータ中で可視化された。
【００３６】
ＥＤＴＡの存在下でのＥＳ及びデオキシリボヌクレアーゼ活性のＤＮＡメチルグリーンアッセイ
ＤＮＡメチルグリーン（０．２ｍｇ／ｍＬ）及び５ｍＭＥＤＴＡを含有するＤＮＡメチルグリーン１８７５μＬの両者に、８１．１５μｇ／ｍＬＥＳの１２５μＬを添加した。従って、最終濃度は、５．０７μｇ／ｍＬＥＳ及び４．７ｍＭＥＤＴＡである。１２１．１μｇ／ｍＬになるように、デオキシリボヌクレアーゼを１：２に希釈し、ＤＮＡメチルグリーン及びＥＤＴＡを含有するＤＮＡメチルグリーン１８７５μＬに添加した。ＥＤＴＡの存在下で、又はＥＤＴＡの不存在下で、ＳＴＩ処理されたＥＳの活性も同じようにアッセイした。次いで、水槽中において、３７℃でこれらの試料を温置した。２分ごとに（３つ組みで）、１００μＬの試料を採取し、９６ウェルプレート中の０．０８３Ｍクエン酸ナトリウム１５０μＬに添加した。プレートを一晩静置し、次いで、Ａｎｔｈｏｓ  Ｌｕｃｙ１マイクロプレートルミノメータ中にて、６３０ｎｍで吸光度を読み取った。
【００３７】
様々な金属イオンの存在下でのＥＳの活性
ＥＳを無菌ＰＢＳ及びＥＤＴＡで１：１０に希釈し、５ｍＭＥＤＴＡ及び１６．２３μｇ／ｍＬＥＳの濃度を得た。次いで、特定のイオン（銅、亜鉛、マグネシウム、ナトリウム、ニッケル、カルシウム）の７．５ｍＭを含有する０．２ｍｇ／ｍＬＤＮＡメチルグリーン１８７５μＬに、この溶液１２５μＬを添加した。従って、最終濃度は、０．３１２５ｍＭＥＤＴＡ及び１．０１４μｇ／ｍＬＥＳであった。２分ごとに、１００μＬの試料を採取し、９６ウェルプレート中の０．０８３Ｍクエン酸ナトリウム１５０μＬに（３つ組みで）添加し、試料の残りは３７℃に保った。再び、プレートを室温で一晩静置し、Ａｎｔｈｏｓ  Ｌｕｃｙ１マイクロプレートルミノメータ中にて、６３０ｎｍで吸光度の読み取りを行った。
【００３８】
ＥＳに対するＭｇ２＋、Ｃａ２＋及びＮａ＋の最適なイオン濃度を推定するために、１０ｍＭＭｇ２＋、１０ｍＭＣａ２＋及び２ｍＭＮａ＋を含有する３つの０．２ｍｇ／ｍＬＤＮＡメチルグリーン原溶液から、一連の濃度を作製した。（濃度は、ＤＮＡメチルグリーンを含有する非イオン中での希釈によって達成された。）
【００３９】
ＤＮＡ−メチルグリーン濃度を含有するイオン９０μＬに、０．２μｇ／ｍＬＥＳの１０μＬを添加した。（ＥＳは、０．５ＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．５中の原液から希釈した）従って、ＤＮＡメチルグリーン中のＥＳの最終濃度は、０．０２μｇ／ｍＬであった。平均吸光度を与えるために、各濃度の３つ組みを作製した。イオンがＤＮＡメチルグリーンの色を変化させ、従って、吸光度を変化させたので、盲検も作製した。従って、実際のプレートと盲検の両者の吸光度の読み取りを、Ａｎｔｈｏｓ  Ｌｕｃｙ１マイクロプレートルミノメータ中において、６３０ｎｍで行った。盲検と結果のプレート間の吸光度の変化を計算し、イオン濃度に対してプロットした。
【００４０】
結果
幼虫の排泄／分泌産物（ＥＳ）のデオキシリボヌクレアーゼ活性の測定
実施されたＤＮＡメチルグリーンアッセイは、図１に図示されている、経時的な吸光度の減少として統計学的に明らかであるように、ＤＮＡメチルグリーン複合体の著しい分解によって、ＥＳのデオキシリボヌクレアーゼ活性を示した。デオキシリボヌクレアーゼ及びＥＳ試料の両者に対して、吸光度の明確な低下が生じ、ＥＳが、実際に、デオキシリボヌクレアーゼ活性を示すことを示唆している。特に、ＥＳに関して、作製された曲線の著しい平坦化が存在し、おそらくは、使用されたＥＳの高い濃度による基質の枯渇によるものであるか、又は試料採取の間隔が長すぎたからであると考えられる。後に、ＤＮＡメチルグリーン複合体及びデオキシリボヌクレアーゼ活性の分解を停止するために使用されたクエン酸ナトリウムが反応を完全には阻害しなかった可能性もあると考えられた。従って、プレートが一晩静置された時点で、反応を継続した。結果は、ＤＮＡメチルグリーンアッセイ（０．２ｍｇ／ｍＬＤＮＡメチルグリーン基質溶液中の１．２８μｇ／ｍＬデオキシリボヌクレアーゼ及び１０．１４μｇ／ｍＬＥＳ）を示す図１ａに示されている。溶液を２５分間温置し、５分間隔で、１００μＬの試料を（３つ組みで）採取した。反応を停止するために、（９６ウェルプレート中の）クエン酸ナトリウム１５０μＬに試料を添加し、翌日、吸光度の読み取りを行い、これらの読み取りが図１ａに示されている。
【００４１】
従って、２分間隔での試料採取及びＥＳの様々な濃度を用いて、実験を繰り返した。５．０９μｇ／ｍＬ未満のＥＳの濃度において、作製された曲線は、最小のデオキシリボヌクレアーゼ活性を示したが、５．０９μｇ／ｍＬでは、直線が生成され、この濃度でのＥＳの有意なデオキシリボヌクレアーゼ活性を示した。図１ｂのＤＮＡメチルグリーンアッセイ（０．２ｍｇ／ｍＬＤＮＡメチルグリーン基質溶液中の５．０９μｇ／ｍＬＥＳ）に、結果が示されている。３７℃で溶液を温置し、２分ごとに、１００μＬの試料を採取した。反応を停止するために、（９６ウェルプレート中の）クエン酸ナトリウム１５０μＬに試料を添加し、翌日、吸光度の読み取りを行った。読み取りは、図１ｂに示されている。
【００４２】
このデオキシリボヌクレアーゼ活性は、０．０６７ｍｇ／ｍＬＤＮＡメチルグリーンを含有するドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって確認された。２つのゲルが使用され、１つには、デオキシリボヌクレアーゼの漸減濃度が搭載され、１つには、ＥＳの漸減濃度が搭載された。ＥＳは、ゲル中のＤＮＡメチルグリーンの分解として見ることができる明瞭なデオキシリボヌクレアーゼ活性を示した。ＥＳのより低い濃度で分解のより大きなレベルが存在するが、この知見の実現可能性を評価するために、これは反復する必要がある。結果は、ＥＳによるゲルのＤＮＡメチルグリーン成分の分解である図２に示されている。レーン１−予め染色された標準、レーン２−ＰＢＳ対照、レーン３−１．２６８μｇ／ｍｌＥＳ、レーン５−２．５４μｇ／ｍｌＥＳ、レーン７−５．０７μｇ／ｍｌＥＳ、レーン９−１０．１４μｇ／ｍｌＥＳ並びにレーン４、６、８及び１０は、空である。
【００４３】
用量依存曲線
ＥＳ（１３．４０μｇ／ｍＬ）及びデオキシリボヌクレアーゼ（１０μｇ／ｍＬ）溶液の系列希釈、９６ウェルプレート中のＤＮＡメチルグリーン１８０μＬへの各希釈の２０μＬの添加、及び３７℃でのこれらのウェルプレートの温置によって、２つの用量依存曲線の構築が可能となった。３、１８及び２４時間に、吸光度の読み取りを行い、２４時間での読み取りから曲線を構築した（図３参照）。用量依存曲線から、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍＴＭを用いて、ＥＣ５０値を算出することも可能であった。ＥＳ及びデオキシリボヌクレアーゼのＥＣ５０値は、それぞれ、３時間で０．５８８５μｇ／ｍＬ及び０．１９２１μｇ／ｍＬ、１８時間で０．０２４８μｇ／ｍＬ及び０．０．６０５μｇ／ｍＬ、並びに２４時間で０．０１５１μｇ／ｍＬ及び０．０５７１μｇ／ｍＬであることが明らかとなり、これにより、使用したデオキシリボヌクレアーゼがＥＳより３倍強力であることが示された。結果は、図３に示されている。
【００４４】
ＥＳのイオン依存性
何れもイオンキレート物質ＥＤＴＡを加えた及び加えない、トリプシン阻害剤で処理された及び処理されていない細菌のゲノムＤＮＡ及びＥＳ又はデオキシリボヌクレアーゼの様々な試料を使用し、アガロースゲル上に搭載した。デオキシリボヌクレアーゼ酵素の活性がＥＤＴＡによって阻害され、従って、イオン依存性であることが明らかかどうかを決定するために、これを行った。トリプシン阻害剤での処理は、一切のトリプシン及びキモトリプシン酵素を除外し、これにより、デオキシリボヌクレアーゼ活性がこれらの酵素とは独立しているかどうかを特定するはずである。ＰＢＳを含有する対照試料は、予想通り、ＤＮＡ分解を示さず、未分解のＤＮＡは同じ明瞭なバンドとして現れる（レーン２から５）。キモトリプシンの不存在下でＤＮＡがなお分解されたので、ＥＳを含有する試料に対して得られた結果は、観察されたデオキシリボヌクレアーゼ活性がキモトリプシン活性によるものではないことを示した（レーン８）。レーン９中にはＤＮＡ分解が存在しないので、デオキシリボヌクレアーゼ活性がＥＤＴＡによって阻害されることも明瞭であり、従って、ＥＳの活性がイオン依存性であることを示唆する。
【００４５】
ＥＤＴＡの不存在下及び存在下の何れにおいても、デオキシリボヌクレアーゼ試料（レーン１１及び１２）は、デオキシリボヌクレアーゼ活性を示さない。ＥＤＴＡの不存在下では、ＤＮＡを分解すると予想されるので、従って、デオキシリボヌクレアーゼは細菌のゲノムＤＮＡに対して不活性である可能性があり得る。結果は、ＥＤＴＡの存在下での、及び大豆トリプシン阻害剤（ＳＴＩ）で処理した際のデオキシリボヌクレアーゼ活性の測定である図４に示されている。
【００４６】
レーン１−ＤＮＡラダー；レーン２−ＤＮＡ＋非処理ＰＢＳ；レーン３−ＤＮＡ＋ＳＴＩ処理されたＰＢＳ；レーン４−ＤＮＡ＋非処理ＰＢＳ＋ＥＤＴＡ；レーン５−ＤＮＡ＋ＳＴＩ処理されたＰＢＳ＋ＥＤＴＡ；レーン６−空；レーン７−ＤＮＡ＋非処理ＥＳ；レーン８−ＤＮＡ＋ＳＴＩ処理されたＥＳ；レーン９−ＤＮＡ＋非処理ＥＳ＋ＥＤＴＡ；レーン１０−ＤＮＡ＋ＳＴＩ処理されたＥＳ＋ＥＤＴＡ；レーン１１−ＤＮＡ＋非処理デオキシリボヌクレアーゼ；レーン１２−ＤＮＡ＋非処理デオキシリボヌクレアーゼ＋ＥＤＴＡ。
【００４７】
ＥＤＴＡの存在下でのＥＳ及びデオキシリボヌクレアーゼＩのデオキシリボヌクレアーゼ活性
デオキシリボヌクレアーゼ及びＥＳは何れも、ＥＤＴＡによって阻害されることが示されたが、デオキシリボヌクレアーゼがより顕著に阻害され、ＥＤＴＡの存在下では、その活性は殆ど消滅した。図５は、このＤＮＡメチルグリーンアッセイの結果を示しており、このアッセイでは、ＤＮＡメチルグリーン複合体が分解されるにつれて、生じた吸光度の低下によって、デオキシリボヌクレアーゼ活性が示される。ＥＤＴＡの不存在下では、ＥＳ及びデオキシリボヌクレアーゼは、これらの濃度で比較的類似の活性を有する（それぞれ、５．０７μｇ／ｍＬ及び３．７８μｇ／ｍＬ）。結果は、ＥＤＴＡの存在下での、ＥＳ及びデオキシリボヌクレアーゼＩのデオキシリボヌクレアーゼ活性のＤＮＡメチルグリーンアッセイを示すグラフである図５に示されている。
【００４８】
ＥＳのデオキシリボヌクレアーゼ活性に対する様々な金属イオンの効果
７．５ｍＭ銅、亜鉛、マグネシウム、ナトリウム、ニッケル及びカルシウムイオンの存在下で、ＥＳ活性をモニターした。マグネシウムイオンは、ＥＳデオキシリボヌクレアーゼ活性に対して正の影響を発揮することが示され、ナトリウムの影響を受けた可能性もあるが、作製された直線はマグネシウムアッセイにおいて作製されたものほど説得力があるものではない（図６ａ及び６ｂ）。図６ａは、７．５ｍＭＭｇ２＋の存在下でＥＳを用いたＤＮＡメチルグリーンアッセイを示している。ＤＮＡメチルグリーン複合体の分解及びその結果生じる吸光度の低下から明らかであるように、マグネシウムはＥＳを活性化させることが分かる。図６ｂは、７．５ｍＭＮａ＋の存在下でＥＳを用いたＤＮＡメチルグリーンアッセイを示している。Ｎａ＋もＥＳを活性化するが、Ｍｇ＋ほど顕著ではないようである。
【００４９】
続いて、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋及びＮａ＋は全て、ＥＳデオキシリボヌクレアーゼ活性を刺激することが明らかとなった。Ｃａ２＋及びＭｇ２＋イオンの濃度を増加させることによって、ある点までＥＳ活性が増加し、その後、活性は、比較的一定のレベルに留まることが見出された。最適なＭｇ２＋濃度は３ｍＭであることが見出され、最適なＣａ２＋濃度は０．９ｍＭであった。Ｎａ＋イオンの存在下でのＥＳ活性は急速に増加し、０．２ｍＭで最適な活性となり、その後、ＥＳの活性は着実に減少することが見出された。これらの様々な陽イオンの存在下でのＥＳの活性は、ＥＳを含有しないＤＮＡメチルグリーン中の各イオン濃度の「盲検」を使用し、２４時間の温置後に、ＥＳを含有する実際の濃度の吸光度の値からこれらの吸光度の値を差し引くことによって求めた。結果は、図７から９に示されている。
【００５０】
考察
ルチリア・セリカータ排泄／分泌産物は、以前に同定されたキモトリプシン様セリンプロテアーゼとは独立に、明確なデオキシリボヌクレアーゼ活性を示し、これにより、幼虫の分泌物に対する新たなデオキシリボヌクレアーゼ成分が同定された。従って、これは、うじ虫が慢性的な創傷の治癒を促進するように作用するさらなる過程を示唆する。以前の研究は、創傷部位中の細胞外核タンパク質が白血球の凝集及び凝集塊形成をもたらし、これが不良な創傷排膿に寄与していることに着目した。改善された白血球の移動及び食作用をもたらす、ＤＮＡ分解、膿の液状化に際して、創傷治癒の改善が達成される２。
【００５１】
使用した実験操作は、ＤＮＡメチルグリーン基質を用いるデオキシリボヌクレアーゼＩ活性の比色分析測定及び確認を可能とした３。創傷部位に対してより大きな関係があるのは、ＥＳ中に存在するデオキシリボヌクレアーゼは、細菌のゲノムＤＮＡも分解できることを明らかにしたことであり、デオキシリボヌクレアーゼ活性は創傷郭清を補助するのみならず、以前にはプロテアーゼ活性４並びにうじ虫による細菌の摂取及び破壊５に帰せられていたうじ虫の抗細菌効果において役割を有し得る可能性をもたらした。幼虫のデオキシリボヌクレアーゼは、他のデオキシリボヌクレアーゼ中で観察されたものと同様の金属イオン依存性の触媒を示した。ルチリア・セリカータによって排泄／分泌されるデオキシリボヌクレアーゼの活性は、本実施例において、マグネシウム、ナトリウム及びカルシウムイオンによって刺激されることが示された。活性は、Ｍｇ２＋によって、最大の程度まで刺激され、続いてＣａ２＋、続いてＮａ＋によって刺激されるように見受けられた。既に市販されている創傷治癒用の製品であるＶａｒｉｄａｓｅ（Ｒ）のストレプトドルナーゼ成分の耐性に比べると、ストレプトドルナーゼのデオキシリボヌクレアーゼ活性は、幼虫のデオキシリボヌクレアーゼより、陽イオンの存在下で、ずっと能力が少ないように見受けられる。マグネシウムは、低い濃度においてのみ（３ｍＭの幼虫デオキシリボヌクレアーゼと比べて０．０６ｍＭが最適）、デオキシリボヌクレアーゼ活性を刺激し、その後、活性は急速に悪化する。Ｍｇ２＋と組み合わせて使用された場合を除き、Ｃａ２＋及びＮａ＋は、全ての濃度で阻害的である２。慢性的な創傷中のイオン濃度は、調査されずに放置されてきた領域であるが、イオン濃度の極めて幅広い範囲に対する幼虫デオキシリボヌクレアーゼの抵抗性及びその継続的な活性は、創傷環境中でのその効力に関して明瞭な利点である。
【００５２】
Ｎａ＋、Ｍｇ２＋及びＣａ２＋濃度の幅広い範囲にわたってデオキシリボヌクレアーゼの活性を調査したときに得られた結果に伴う問題は、吸光度の変化を計算するために使用される盲検が、理想的には、実験試料と同じ期間にわたって温置されるべきであったということである。盲検に対する吸光度の読み取りは直ちに行われ、ＤＮＡメチルグリーン複合体がイオンの存在に起因する何らかの不安定性を示した場合には、吸光度の変化を計算する際にこれが考慮に入れられておらず、誤差の余地が残っていることを意味している。従って、この実験は、これらの知見を確認するために実験用プレートと同じ期間にわたって温置された盲検を用いて反復すべきである。
【００５３】
幼虫のＥＳのデオキシリボヌクレアーゼ活性は、標準的なデオキシリボヌクレアーゼが使用された場合より、ＥＤＴＡの存在下でより抵抗性が高いことも注目され、標準的なデオキシリボヌクレアーゼの活性は、イオンキレート物質の存在下でほぼ消滅したのに対して、幼虫のデオキシリボヌクレアーゼは有意な活性を保持した。
【００５４】
創傷中の幼虫デオキシリボヌクレアーゼ活性は創傷郭清プロセスを補助し、創傷環境中でのうじ虫の抗細菌効果に寄与し得、細菌ＤＮＡのオリゴヌクレオチドへの分解は免疫系を調節するようにも作用し得るという仮説も立てられ得る。免疫系の成分は細菌細胞の含有物に応答することが知られている。細菌のＤＮＡの配列はある種の免疫細胞、特に、樹状細胞及びマクロファージの他、Ｂ細胞に対して免疫刺激効果を有し得ることも見出されている６。細菌のＣｐＧＤＮＡは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ；ｐａｔｈｏｇｅｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ）である。ＰＡＭＰは、多くの病原体によって共有されているが、宿主によって発現されていないパターンであり、従って、これらは、自然免疫系に対する重要な刺激として作用する。ＣｐＧＤＮＡは免疫刺激的であり、Ｔｏｌｌ９受容体を活性化することにより、細胞応答を開始させることが示されている７。幼虫デオキシリボヌクレアーゼによる細菌ＤＮＡの分解は、細菌ＤＮＡのこのような免疫刺激性オリゴヌクレオチドをもたらし得る。Ｔｏｌｌ様受容体のＣｐＧ−ＯＤＮ活性化は、反応性窒素及び酸素中間体分子、抗菌ペプチド、接着分子、サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ｐ４０及びＩＬ−６）及び急性期タンパク質が発現される防御反応をもたらす６、８。樹状細胞及びマクロファージ中のＴｏｌｌ様受容体の活性化が、Ｔリンパ球上のＣＤ２８と相互作用するＣＤ４０及びＣＤ８６などの同時刺激分子の発現を引き起こし、従って、適応免疫系の抗原提示及び刺激において不可欠な役割を果たすことも示されている８、９。従って、幼虫のデオキシリボヌクレアーゼが、中央のメチル化されていないシトシン−グアノシンコアを有するオリゴヌクレオチドへ細菌のゲノムＤＮＡを分解したのであれば、これは、サイトカインの放出と免疫系の活性化をもたらし得、うじ虫によって誘発される治癒過程を補助するさらなる効果である。
【００５５】
イオン実験も適切な対照を用いて反復されるべきであり、金属イオンの異なる組み合わせを用いて実施することもできる。ＬｏｃｋｅとＣａｒｐｅｎｔｅｒ２は、Ｖａｒｉｄａｓｅ（Ｒ）のストレプトドルナーゼ成分のデオキシリボヌクレアーゼ活性が、硫酸マグネシウム及び塩化カルシウムの等濃度の存在下において最大であることを見出し、ストレプトドルナーゼ酵素が２つの結合部位を有するという仮説を立てたが、これは、幼虫のデオキシリボヌクレアーゼに関して調べることができる領域である。産生されたオリゴヌクレオチドが調節的役割を有し得るかどうかを評価するために、樹状細胞、マクロファージ及びＢリンパ球などの様々な細胞種に対する、幼虫デオキシリボヌクレアーゼによって分解された細菌ＤＮＡの効果を調べることも興味深い。
【００５６】
総合すると、これらの初期の研究及び幼虫排泄／分泌産物の確認されたデオキシリボヌクレアーゼ活性は、可能性があるさらなる機序を導入し、うじ虫がどのようにしてこれほど首尾よく慢性的創傷の治癒を郭清し、浄化し、促進できるかについての増大している説明をさらに増加させる。このデオキシリボヌクレアーゼ活性は陽イオン依存性であることが示され、より大きな抵抗性を示し、イオンキレート物質ＥＤＴＡの存在下で、標準的なデオキシリボヌクレアーゼに比べて、デオキシリボヌクレアーゼ活性を維持し、化膿した創傷の浄化のために使用されているＶａｒｉｄａｓｅ（Ｒ）（ストレプトキナーゼ−ストレプトドルナーゼ医薬）のデオキシリボヌクレアーゼ成分であるストレプトドルナーゼの活性に比べて、漸増するイオン濃度の存在下で、より大きな活性を示した。従って、同定されたこのデオキシリボヌクレアーゼ活性は、創傷治癒を促進する上での増大する多様なＥＳの作用に、重大な作用をさらに付け加えることが明らかである。
【実施例２】
【００５７】
Ｌ．セリカータＥＳ内のデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）活性
図２及び１０に示されているように、本発明者らは、ＥＳ内にデオキシリボヌクレアーゼ活性を同定した。図２は、ＤＮＡ／メチルグリーン基質ポリアクリルアミドゲル内における非変性条件下でのＥＳの電気泳動を示している。臭化エチジウムでゲルを対比染色し、レーン３中の暗い領域は、うじ虫分泌物中のヌクレアーゼ活性によってＤＮＡが消化されている場所を示す。１．染色前の標準（分子量は、ｋＤａで表示されている。）。２．緩衝液対照。３．ＥＳ（１３ｎｇ）。図１０は、イー・コリＤＮＡのアガロースゲル電気泳動を示している。臭化エチジウムで染色されたＤＮＡのバンド。１．１００塩基対標準（塩基対の数が示されている。）。２．イー・コリＤＮＡ（１μｇ）のみ。３．イー・コリＤＮＡ（１μｇ）＋ＥＳ（７．５μｇ／ｍＬ）。４．イー・コリＤＮＡ（１μｇ）＋ＥＳ（７．５μｇ／ｍＬ）＋５ｍＭＥＤＴＡ。
【００５８】
デオキシリボヌクレアーゼは、非生存組織内の遊離のＤＮＡを分解し、従って、滲出液の粘性を低減することによって、創傷郭清に寄与し得るので、これは興味深い。これは、中性ｐＨ（図１１）で最もよく機能し、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）によって阻害され（図４）、その活性が金属イオン依存性であることを示唆する。図１１は、表記ｐＨの緩衝液内で、０．０２μｇ／ｍＬＥＳの不存在下又は存在下において、３７℃で１０分温置した後のイー・コリＤＮＡ（０．５ｎｇ／レーン）のアガロースゲル電気泳動を示す。臭化エチジウムで染色されたＤＮＡのバンド。対照：１．ＤＮＡのみ、処理せず；２．、３．、４．ＥＳの不存在下で、それぞれ、緩衝液ｐＨ４．０、７．０又は１０内のＤＮＡ。標準は、１００塩基対の標準を表す（塩基対の数が示されている。）。デオキシリボヌクレアーゼ活性はｐＨ５．０から８．５の範囲内で生じ、ｐＨ７．０において最適な活性を示す。図４は、７．５６μｇ／ｍＬＥＳ（処理せず、又は架橋された４％ビーズ化されたアガロース上に固定化された大豆トリプシン阻害剤（ＳＴＩ）の過剰に、３回、予め曝露）、５ｍＭＥＤＴＡ、又はＥＳと等しい容量のＰＢＳ（処理せず、又は固定されたＳＴＩの過剰に、３回、予め曝露）の存在下又は不存在下で、３７℃で２０分温置後に、イー・コリＤＮＡのアガロースゲル電気泳動（１μｇ／レーン）を示している。臭化エチジウムで染色されたＤＮＡのバンド。標準は、１００塩基対の標準を表す（塩基対の数が示されている。）。ＥＳのデオキシリボヌクレアーゼ活性はＳＴＩ処理によって影響を受けず、実際には、増強された可能性があり（ゲルの底部方向への微かなバンドの低下に注目されたい。）、ＥＳ中のセリンプロテイナーゼ活性の除去が小さなＤＮＡ断片の増強された分解をもたらすことを示唆している。固定化された大豆トリプシン阻害剤（ＳＴＩ）（セリンプロテイナーゼ活性を除去する。）へのＥＳの事前曝露はこれを阻害しないので（図４）、これは、セリンプロテイナーゼではない。実際、ＳＴＩ処理は、活性の僅かな増強をもたらし得る。次いで、本発明者らは、市販のデオキシリボヌクレアーゼＩ調製物との、ＥＳ中のデオキシリボヌクレアーゼ活性の比較を続行した。図１２は、３０分間所定の温度に予め曝露され、冷却させたＥＳ又は市販のデオキシリボヌクレアーゼによる、３７℃で２４時間にわたるＤＮＡ−メチルグリーン複合体の分解を示している。結果は、４℃±１ＳＤで予め温置されたＥＳ又はデオキシリボヌクレアーゼ調製物と比較した、デオキシリボヌクレアーゼ活性の平均レベルとして表されている（ｎ＝３）。図１２に示されているように、ＥＳデオキシリボヌクレアーゼは、創傷状態に適した範囲である２０から４０℃の間の温度に対してより耐性を示す。さらに、本発明者らは、ＥＳデオキシリボヌクレアーゼが、市販のデオキシリボヌクレアーゼより、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）によってより阻害されにくいことを示す結果を有する（図１３）。図１３は、５ｍＭＥＤＴＡの存在下又は不存在下において、３７℃で、表記の時間にわたって、ＥＳ又はデオキシリボヌクレアーゼに曝露した後におけるＤＮＡ−メチルグリーン複合体の分解を示す。６３０ｎ���の吸光度の減少は、複合体の分解を示す。結果は、平均吸光度±１ＳＤとして示されている（ｎ＝３）。また、適切な公報との比較によっても、ストレプトキナーゼ／ストレプトドルナーゼ（図１４）を含有する市販の創傷郭清調製物であるＶａｒｉｄａｓｅより、高いＭｇ２＋濃度によって阻害されにくい。図１４は、１μｇ／ｍＬＥＳ及び表記マグネシウムイオンの濃度の存在下において、３７℃で、１９時間温置した後のＤＮＡメチルグリーンの分解を示している。結果は、温置期間の終了後における、６３０ｎｍ波長の吸光度の変化（０時間に採取された測定−１９時間に採取された測定）として表される。吸光度の変化が大きいほど、ＤＮＡメチルグリーン複合体の分解が大きい。（低イオン濃度領域の拡大を示す）図１４の挿入図に示されているように、低いＭｇ２＋濃度はＥＳデオキシリボヌクレアーゼ活性を僅かに増加させる。０．１ｍＭより上から、イオン濃度はほとんど効果を有さず、より高いイオン濃度で観察された活性は僅かに減少するに過ぎない。これらの知見を、０．０６ｍＭを上回るＭｇ２＋濃度でＶａｒｉｄａｓｅ活性が強く阻害されている図１中のＬｏｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ  （２００２）２のものと比較されたい。
【００５９】
本発明者らは、ＥＳデオキシリボヌクレアーゼが高いＣａ２＋及びＮａ＋イオン濃度に対してより抵抗性があることを示唆する予備的結果も有する。これらの結果は、市販の調製物と比べて、ＥＳデオキシリボヌクレアーゼ活性が金属イオン濃度の変化に対してより頑強であることを示す。
【実施例３】
【００６０】
ヌクレアーゼ、特に、幼虫の抽出物由来のデオキシリボヌクレアーゼを同定し、性質決定するために以下の実験を行った。
【００６１】
幼虫の抽出物の調製
ルチリア・セリカータの第三齢幼虫を均質化する。ホモジネートをリン酸緩衝化生理的食塩水などの緩衝液中に希釈し、可溶性タンパク質を抽出するために遠心する。上清を吸引し、うじ虫抽出物として使用する。
【００６２】
デオキシリボヌクレアーゼ活性の検出
ウシ胸腺ＤＮＡが４ｍｇ／ｍＬの濃度で分解ゲル中に取り込まれるＳＤＳ−ＰＡＧＥ基質ゲル法を用いて、デオキシリボヌクレアーゼ活性を検出する。上のように調製された第３齢うじ虫抽出物を、基質ゲル上への搭載前に、３７℃で３０分間、非還元試料緩衝液（０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％グリセロール、４％ＳＤＳ、０．０４％ブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８）中で予め温置する。電気泳動後（２０ｍＡ）／ゲルに、ゲルを２．５％Ｔｒｉｔｏｎ（３０分）で、続いて水（３０分）で洗浄した。
【００６３】
ＤＮＡが消化されるようにするために、７．５ｍＭＭｇＣｌ２を加えたリン酸緩衝化された生理的食塩水（ＰＢＳ）中において、３７℃で一晩、ゲルを温置した。最後に、５μｇ／ｍＬ臭化エチジウムで染色し、ＵＶトランスイルミネータ上で視覚化することによって、デオキシリボヌクレアーゼ活性を可視化した（図１５Ａ）。
【００６４】
タンパク質の検出
０．１％クマシーブリリアントブルーＲ２５０での染色後に、タンパク質バンドが可視化されるまで、２５％メタノール、１０％酢酸で脱染色することによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中でタンパク質を検出した（図１５Ｂ）。
【００６５】
図１５に示されているように、Ｌ．セリカータ抽出物中に存在するデオキシリボヌクレアーゼ活性のＤＮＡ基質（パネルＡ）及びタンパク質（パネルＢ）分析。デオキシリボヌクレアーゼ活性は、典型的には、約３５から４５ｋＤａの間に分解する（パネルＡ）。しかしながら、この領域中には、極めて少ない対応するタンパク質が観察される（パネルＢ）。Ｌ．セリカータ分泌物中に、同様の活性が示され得る。
【００６６】
デオキシリボヌクレアーゼ活性の精製
Ｌｏｃｋｅら１９によって記載されているようにデオキシリボヌクレアーゼ精製を試みた。上のように調製された第３齢のうじ虫３．５ｇを、低塩緩衝液（５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、１０％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ、２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．１）１５ｍＬ中に抽出し、遠心し（１３０００ｇ、１０分）、上清を２２μＭフィルターに通過させた。うじ虫抽出物の適用前に、ＤＮＡセルロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を低塩緩衝液で平衡化した。適用後、洗浄緩衝液の２８０ｎｍでのＡｂｓがゼロになるまで、低塩緩衝液でカラムを洗浄した。結合されたタンパク質を、高塩緩衝液（２ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、１０％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．１）で溶出し、１ｍＬ画分を集め、２８０ｎｍでそれらの吸光度を測定し、溶出されたタンパク質ピークをＰＢＳに対して透析した。デオキシリボヌクレアーゼ活性に関しては、ＤＮＡ基質ゲル分析によって（図１６Ａ）、タンパク質含量に関してはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１６Ｂ）によって、出発材料及び溶出されたタンパク質を分析した。
【００６７】
図１６に示されているように、ＤＮＡセルロース上での精製後における、Ｌ．セリカータ抽出物由来のデオキシリボヌクレアーゼ活性のＤＮＡ基質（パネルＡ）及びタンパク質（パネルＢ）分析。カラムからの溶出後に、デオキシリボヌクレアーゼ活性（パネルＡ）は約４５ｋＤａにおいて分解され、クマシー染色後に、同じ分子量のタンパク質バンドに対応した（パネルＢ）。
【００６８】
精製されたＬ．セリカータデオキシリボヌクレアーゼによる創傷ＤＮＡ消化
ＳｉｇｍａのＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡｐｒｅｐキットを用いて、治癒していない創傷の焼痂由来のゲノムＤＮＡを調製した。ＤＮＡ−セルロース上でＬ．セリカータ抽出物から精製されたＤＮＡの１及び２μｇを、３７℃で１時間、精製されたデオキシリボヌクレアーゼの約０．５μｇとともに温置した。消化産物を１％アガロースゲル上に走行させ（図１７）、先述されているように、臭化エチジウム染色によって検出した。図１７は、精製されたＬ．セリカータデオキシリボヌクレアーゼによる、治癒していない創傷の焼痂からのＤＮＡの消化を示している。
【００６９】
精製されたＬ．セリカータデオキシリボヌクレアーゼの二次元ゲル分析
ＤＮＡ−セルロースカラムから溶出するデオキシリボヌクレアーゼ活性の約１００μｇを、固定化されたｐＨグラジエント（３から１０）を含有する一次元等電点電気泳動片に適用した。製造業者の指示書に従って、ＢｉｏｒａｄＰｒｏｔｅｉｎＩＥＦキットを用いて、この片に対して等電点塩基泳動を実施した。等電点電気泳動後、先述のような非還元条件下で、ＤＮＡ基質ゲル（図１８Ａ）及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１８Ｂ）を用いて、片のデオキシリボヌクレアーゼ活性及びタンパク質特性を分析した。図１８は、ＤＮＡセルロース及び二次元電気泳動上での精製後におけるＬ．セリカータ抽出物から得られたデオキシリボヌクレアーゼ活性のＤＮＡ基質（パネルＡ）及びタンパク質（パネルＢ）分析の結果を示す。同じく、デオキシリボヌクレアーゼ活性は、約４５ｋＤａのタンパク質を伴い（パネルＡ）、クマシー染色後に、同じ分子量のタンパク質スポットに対応した（パネルＢ）。質量分析法によってこのスポットの配列を決定し、以下の結果を得た。
【００７０】
【化３】
2009533411.tif 000004
【００７１】
ＬＬＥＹＬＳＭＲ（配列番号１）及びＳＬＧＮＰＥＬＰＴＥＷＬＤＬＲ（配列番号４）は、ツェツェバエグロシナ・モルシタンス（Ｇｌｏｓｓｉｎａ  ｍｏｒｓｉｔａｎｓ）由来のフェリチン重鎖の一部と高い相同性を有する。
【００７２】
【化４】
2009533411.tif 000005
【００７３】
ＳＹＥＹＬＬＬＡＴＨＦＮＳＹＱＫ（配列番号３）は、ツェツェバエグロシナ・モルシタンス及びショウジョウバエドロソフィラ由来のフェリチン軽鎖の一部と極めて高い相同性を有する。
【００７４】
【化５】
2009533411.tif 000006
【００７５】
ＳＦＤＤＴＬＤＭＬＫ（配列番号２）は、現在のところ、使用したデータベース２２中の何れとも強い相同性を有さず、見出された最も近い合致はＤＮＡメチラーゼに対するものである。
【００７６】
ＥＬＤＡＳＹＱＹＬＡＭＨＫ（配列番号５）、ＶＦＶＮＳＧＴＳＬＭＤＶＲ（配列番号６）及びＡＮＦＮＶＶＨＥＳＳ（配列番号７）は、公知のヌクレアーゼ配列を含むデータベース上の何れの公知の配列とも信頼できる相同性を有さないように見受けられ、従って、未だ同定されていない、又は昆虫タンパク質配列データベースに付加されるべき新規ヌクレアーゼ配列に相当するように見受けられる。
【００７７】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１ａ】図１は、幼虫ＥＳの高い（図１ａ）及び低い（図１ｂ）濃度でのＤＮＡメチルグリーンアッセイの結果を示す一対のグラフである。
【図１ｂ】図１は、幼虫ＥＳの高い（図１ａ）及び低い（図１ｂ）濃度でのＤＮＡメチルグリーンアッセイの結果を示す一対のグラフである。
【図２】図２は、ＥＳによるゲルのＤＮＡメチルグリーン成分の分解を示すゲルの写真である。
【図３】図３は、３、１８及び２４時間の時点における、ＥＳ及び市販のデオキシリボヌクレアーゼの一連の用量依存曲線である。
【図４】図４は、ＥＤＴＡの存在下での、及び大豆トリプシン阻害剤（ＳＴＩ）で処理した際のデオキシリボヌクレアーゼ活性の測定を示すゲルの写真である。
【図５】図５は、ＥＤＴＡの存在下での、ＥＳ及びデオキシリボヌクレアーゼＩのデオキシリボヌクレアーゼ活性のＤＮＡメチルグリーンアッセイを示すグラフである。
【図６ａ】図６は、７．５ｍＭＭｇ２＋（図６ａ）及び７．５ｍＭＮａ＋（図６ｂ）の存在下でＥＳを用いたＤＮＡメチルグリーンアッセイを示すグラフである。
【図６ｂ】図６は、７．５ｍＭＭｇ２＋（図６ａ）及び７．５ｍＭＮａ＋（図６ｂ）の存在下でＥＳを用いたＤＮＡメチルグリーンアッセイを示すグラフである。
【図７】図７は、マグネシウムイオンの異なる濃度の存在下でのＥＳの活性を示すグラフである。
【図８】図８は、ナトリウムイオンの異なる濃度の存在下でのＥＳの活性を示すグラフである。
【図９】図９は、カルシウムイオンの異なる濃度の存在下でのＥＳの活性を示すグラフである。
【図１０】図１０は、イー・コリＤＮＡのアガロースゲル電気泳動を示すゲルの写真である。
【図１１】図１１は、表記ｐＨの緩衝液内で、０．０２μｇ／ｍＬＥＳの不存在下又は存在下において、３７℃で１０分温置した後のイー・コリＤＮＡ（０．５ｎｇ／レーン）のアガロースゲル電気泳動を示す。
【図１２】図１２は、３０分間所定の温度に予め曝露され、冷却されたＥＳ又は市販のデオキシリボヌクレアーゼによる、３７℃で２４時間にわたるＤＮＡ−メチルグリーン複合体の分解を示すグラフである。
【図１３】図１３は、５ｍＭＥＤＴＡの存在下又は不存在下において、３７℃で、表記の時間にわたって、ＥＳ又はデオキシリボヌクレアーゼに曝露した後におけるＤＮＡ−メチルグリーン複合体の分解を示すグラフである。
【図１４】図１４は、１μｇ／ｍＬＥＳ及び表記マグネシウムイオンの濃度の存在下において、３７℃で、１９時間温置した後のＤＮＡメチルグリーンの分解を示すグラフである。
【図１５】図１５は、ＤＮＡ基質（パネルＡ）及びＬセリカータ抽出物中に存在するデオキシリボヌクレアーゼ活性のタンパク質（パネルＢ）分析を示すゲルの写真である。
【図１６】図１６は、ＤＮＡセルロース上での精製後におけるＬセリカータ抽出物から得られたデオキシリボヌクレアーゼ活性のＤＮＡ基質（パネルＡ）及びタンパク質（パネルＢ）分析を示すゲルの写真である。
【図１７】図１７は、精製されたＬセリカータデオキシリボヌクレアーゼによる、治癒していない創傷の焼痂からのＤＮＡの消化を示すゲルの写真である。
【図１８】図１８は、ＤＮＡセルロース及び二次元電気泳動上での精製後におけるＬセリカータ抽出物から得られたデオキシリボヌクレアーゼ活性のＤＮＡ基質（パネルＡ）及びタンパク質（パネルＢ）分析を示すゲルの写真である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
2009533411.tif 000019
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2009533411.tif 000023
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年12月12日(2008.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を分解し、変性し、切り取り又は切断する能力を有する、昆虫の幼虫から単離されたポリペプチド又はその合成類縁体。
【請求項２】
幼虫がルチリア・セリカータ（Ｌｕｃｉｌｉａ  ｓｅｒｉｃａｔａ）由来の幼虫である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドが昆虫の幼虫の排泄物／分泌物から単離される、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
核酸がＤＮＡである、請求項１から３の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチドが原核生物の核酸及び真核生物の核酸をともに分解する、請求項１から４の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ポリペプチドが細菌の核酸及び哺乳動物の核酸をともに分解する、請求項１から５の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項１から６の何れか一項に記載のポリペプチドによってコードされるヌクレアーゼ。
【請求項８】
感染の治療若しくは予防における使用のための、又は創傷の治療のための、請求項１から６の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
請求項１から６の何れか一項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１から６の何れか一項に記載のポリペプチドを取り込んだ包帯。
【請求項１１】
感染の治療において慣用の抗生物質を補助するための、請求項の１から６何れか一項に記載のポリペプチドの使用。
【手続補正書】
【提出日】平成21年3月12日(2009.3.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009533411000001.app
【国際調査報告】
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