(57)【要約】  全層の関節軟骨欠損などの人間の患者又は患畜における軟骨の欠損を修復するために、インプラントボディ（２）を有するインプラント（１）が使用され、インプラントボディは自然の軟骨マトリックスを含み、かつ軟骨産生能を有する細胞、好ましくは自己細胞によって覆われている。インプラントボディは、そこに一体化した生軟骨細胞を伴う自己の軟骨組織からなっていることが好ましく、軟骨組織はインビトロでの組織培養によって生成される。軟骨組織を生成するための細胞とインプラントボディの表面を覆うための細胞とは同じであることが好ましい。これらの細胞は、軟骨生検から単離された軟骨細胞由来のインビトロでの細胞増殖によって産生される。細胞増殖の間に脱分化した軟骨細胞は、組織培養中に再分化し、インプラントボディの軟骨マトリックスを生成及び維持するのに特に適している。また、インプラントボディの表面に付着している細胞は、細胞増殖によって脱分化しており、再分化していない軟骨細胞であり、それ故に欠損部におけるインプラントの融合に特に適していることが好ましい。インプラントボディの表面へ付着している細胞によって、インプラントは欠損部周囲の生組織にうまく融合する。
2009508600.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人又は動物の患者における軟骨の欠損（７）の修復に適したインプラント（１）であって、インプラントボディ（２）と、軟骨産生能を有しかつインプラントボディ（２）の表面に付着している生細胞（４）を有し、
インプラントボディ（２）は、インビトロにおける組織培養によって細胞（１６）から生成された、又は取り出された軟骨組織から生成された自然の軟骨マトリックスを有するインプラント。
【請求項２】
インプラントボディ（２）の表面に付着している細胞（４）が自己細胞である請求項１のインプラント。
【請求項３】
インプラントボディ（２）の表面に付着している細胞（４）がインビトロでの増殖によって脱分化した軟骨細胞である請求項１のインプラント。
【請求項４】
インプラントボディ（２）の表面に付着している細胞（４）が単一の細胞層を形成する請求項１のインプラント。
【請求項５】
インプラントボディ（２）の軟骨マトリックスが、インビトロでの組織培養によって自己細胞（１６）又は取り出された自己の軟骨組織から生成されており、生軟骨細胞を含む請求項１のインプラント。
【請求項６】
インプラントボディ（２）の軟骨マトリックスが、インビトロでの組織培養によって同種又は異種のドナー細胞（１６’）又はドナーから取り出された軟骨組織から生成されており、死滅した軟骨細胞を含む請求項１のインプラント。
【請求項７】
インプラントボディ（２）がディスク型であり、ディスクの少なくとも二つの対向する面が付着した細胞（４）を有する請求項１のインプラント。
【請求項８】
インプラントボディ（２）がチャネル（６）を有しており、チャネルの内向面が付着した細胞（４）を有する請求項１のインプラント。
【請求項９】
インプラントの製造方法であって、自然の軟骨マトリックスを有するインプラントボディ（２）をコーティングする段階を有しており、軟骨マトリックスはインビトロにおける組織培養によって細胞（１６）から生成される、又は取り出された軟骨組織から生成されており、それは軟骨産生能を有する細胞（１６）を有しており、インプラントボディをコーティングする段階が、細胞（１６）がインプラントボディ（２）の表面に付着するのに十分な時間にわたって細胞（１６）を含む懸濁液（２３）中においてインビトロで培養することを含む方法。
【請求項１０】
インプラントボディ（２）が自己細胞（１６）で覆われている請求項９の方法。
【請求項１１】
コーティング中に重力に対するインプラントボディ（２）の空間的定位が継続的又は定期的に変更される請求項９の方法。
【請求項１２】
コーティングが半透性の壁を有する中空の転がるボディの使用を含み、インプラントボディ（２）及び細胞の懸濁液（２３）が中空の転がるボディの中に入れられ、中空の転がるボディが適切な培地で満たされた容器の中に配置される請求項１１の方法。
【請求項１３】
インビトロで細胞を増殖する段階を更に含み、細胞の懸濁液用の細胞（１６）が軟骨生検から単離された軟骨細胞の増殖によって産生される請求項９の方法。
【請求項１４】
インプラントボディ（２）が幹細胞又は軟骨産生能を有する細胞で覆われており、前記細胞が軟骨以外の組織由来である請求項９の方法。
【請求項１５】
インビトロにおいて組織培養する段階を更に含み、インプラントボディが軟骨産生能を有する自己、同種、又は異種の細胞（１６）から生成される請求項９の方法。
【請求項１６】
インプラントボディを生成するための細胞が自己細胞であり、軟骨生検から単離された軟骨細胞のインビトロにおける細胞増殖によって産生される請求項１５の方法。
【請求項１７】
インプラントボディが取り出された自己、同種又は異種の軟骨組織を有する請求項９の方法。
【請求項１８】
コーティング前に、インプラントボディの軟骨マトリックスに含まれる軟骨細胞を死滅させる段階を更に有する請求項１７の方法。
【請求項１９】
請求項９の方法を実施するための装置であって、装置が細胞に対して非透過性である半透性の壁を有する中空の転がるボディを有する装置。
【請求項２０】
中空の転がるボディが中空の球（２５）である請求項１９の装置。
【請求項２１】
中空の転がるボディが回転可能な容器（３０）内に配置されている請求項１９の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療技術の分野に属し、人間の患者または患畜の軟骨の欠損の修復、特に関節軟骨における全層にわたる欠損の修復のためのインプラントに関する。本発明はさらにインプラントを製造する方法にも関連する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨の欠損を修復するための複数の周知の方法は、患者由来の細胞、すなわち自己細胞、特に自己の軟骨細胞、又は軟骨産生能を有する自己細胞を用いる。これらの細胞は内在性の軟骨に似ている軟骨マトリックスをインビボ又はインビトロで生成および維持することができ（更に分化した後のみに可能であろう）、及び／又はそのようなマトリックスの助けによってインプラントを内在性の軟骨及び／又は欠損部の周囲に位置する骨組織に結合させることができると考えられている。
【０００３】
公報ＵＳ４８４６８３５号（グランデ）は、自己細胞の懸濁液を関節軟骨の欠損部に導入し、欠損部に細胞を保持するために欠損部を骨膜の断片で接合することで欠損部を閉じることを提案しており、それらは（インビボで）軟骨組織を生成し、同時にこの組織を周りの内在性の軟骨又は骨組織に結合すると考えられている。複数の別の公報（例えばＷＯ２００４／０００９３、センターパルス  バイオロジックス（Centerpulse  Biologics））は、足場として機能する多孔性又は繊維質のボディ（例えばコラーゲンのスポンジ）に細胞を播種して、少なくとも細胞が足場の内面に付着するまでインビトロで細胞と共に足場を培養し、その後に細胞と共に足場を欠損部に配置して適切な手段で欠損部に固定することを提案する。
【０００４】
上述の公報ＷＯ２００４／０００９３（センターパルス  バイオロジックス）において、足場の異なる領域に異なる細胞を導入する事が提案されており、例えばもともと用いられている細胞は軟骨産生能を有する細胞（幹細胞性の細胞又は脱分化した軟骨細胞）である。最初に、細胞は足場の内部領域に播種されるのみであり、その後にインビトロで足場が培養されることで細胞は軟骨細胞に分化又は再分化し、軟骨マトリックスを産生し始める。その後に初めて、足場の外部又は周辺領域が内部領域への播種に用いたものと同じ細胞を播種されて、後で導入されたために分化の少ない細胞を含む外部領域が欠損部周囲の健康な組織に接触するように足場が移植される。足場の外部領域に低分化状態の細胞を用いる方針は、完全に分化していない軟骨細胞は欠損部におけるインプラントの融合を補助するのにより適しているという知見に基づいている。多分そのような知見は、これらの完全に分化していない細胞は完全に分化した軟骨細胞より移動及び増殖するより高い能力を有し、治療措置に関する機能を果たすことにより向いているせいである。
【０００５】
公報ＷＯ−９７／４６６６５（ズルツァー（Sulzer）整形外科）は、例えば自己の軟骨細胞からインビトロの三次元組織培養で軟骨組織を生成することを提案しており、組織培養する前に、軟骨細胞は通常インビトロで増殖され、人工の足場は使用されない。そこでは、インビトロで増殖し、それ故に脱分化した軟骨細胞が組織培養中に再分化され、これらの細胞によって産生されたマトリックスは自然の軟骨マトリックスに非常に似ている。インビトロの組織培養によってもたらされた軟骨組織は、その後に軟骨の欠損部に配置され、適切な手段によってそこに固定される。
【０００６】
公報ＵＳ６６６２８０５（ジョーンズ  ホプキンス大学、コンドロス社（Chondros  Inc.））は、支持粒子上で軟骨細胞を増殖させ、その後にそのような細胞の多い粒子の凝集物を形成し、軟骨の欠損部にその凝集物を移植する事を提案しており、別の細胞の懸濁液がインプラントと内在性の軟骨又は場合によっては欠損部周囲の骨との間に導入される。粒子の凝集物における細胞は、例えば軟骨細胞であり、懸濁液中の細胞はインビトロにおいて幹細胞から派生した細胞であり、それ故にさらに分化することで軟骨細胞の、繊維芽細胞の、筋芽細胞の、又は骨芽細胞の表現型の細胞になることができる。これは、ここでも分化した軟骨細胞がインプラント内で用いられており、インプラントとインプラント周囲の内在性の組織との間の領域において分化度の低い細胞が用いられていることを意味する。
【０００７】
本発明の目的は、生細胞を有しており軟骨の欠損、特に関節軟骨における全層にわたる欠損を修復するために用いるのに適しており、内在組織におけるインプラントの融合が非常に優れており、自己の材料のみからインプラントを作る事ができ、周知及び改良された移植方法を用いてインプラントを移植することができるインプラントを作る事である。本発明の別の目的は、インプラントを製造する方法を創出することである。
【０００８】
この目的は、特許請求の範囲に規定されているインプラント及びインプラントの製造方法によって達成される。
【特許文献１】米国特許第４８４６８３５号公報
【発明の開示】
【０００９】
本発明によるインプラントは、マトリックスをもともと産生した軟骨細胞が生きている及び／又は死んでいる状態で存在している自然の軟骨マトリックスからなるインプラントボディを有する。別の細胞がインプラントボディの表面に付着しており、これらの表面細胞は軟骨産生能を有している（すなわち、完全に分化した軟骨細胞ではなく、完全に分化した軟骨細胞に分化又は再分化する能力を有する）。その中で、マトリックスは関連のある多孔を有しておらず、表面細胞は自己の細胞であることが有益である。
【００１０】
発明のある実施形態のインプラントは、関節軟骨における欠損を修復するのに役立ち、比較的薄いディスク又はプレートとして形成されたインプラントボディを有する。ディスク又はプレートは欠損部の形状に適合する形状を有しており、ディスクの厚みは修復される関節軟骨の厚みより大きい事はない。ディスク型のインプラントボディの両面において、付着している表面細胞が存在し、例えば表面細胞は自己細胞である。また、場合によって表面細胞はインプラントボディの狭い側に付着し、また場合によってはインプラントボディ内に及び／又はインプラントボディを通って延びる開口の内面上に付着する。本発明の別の実施形態によるインプラントが別の軟骨の欠損を修復するのに役立つ場合、インプラントボディはこの欠損に適合する形状である。
【００１１】
本発明の好適な実施形態のインプラントは、インビトロにおける自己細胞からの組織培養によって生成された軟骨組織からなるインプラントボディを有し、軟骨組織はあらゆる人工又は免疫原性のマトリックス材料を含まず、そして軟骨細胞は生きた状態で軟骨組織に存在する。また、インプラントボディの表面に付着している自己の表面細胞は、例えば自己の軟骨細胞由来のインビトロにおける増殖によって生み出された脱分化した軟骨細胞である。同様に、骨髄から採取された幹細胞、又は軟骨産生能を有しており、かつ他の組織から採取された細胞をインプラントボディの表面に付着することができる。
【００１２】
本発明の好適な実施形態のインプラントは、例えば以下のように作られる。軟骨細胞が、患者から採取された軟骨生検から単離される。単離された軟骨細胞はインビトロで単層培養によって増殖され（インビトロでの細胞増殖段階）、それらは脱分化される。増殖した細胞の第一の部分はインビトロの組織培養において軟骨組織へと培養され、それは細胞の再分化及び三次元組織片の成長に適した条件下で行われる（インビトロでの組織培養段階）。増殖した細胞の他の部分は、例えば凍結によって脱分化状態に維持される。最終段階において、インビトロで生成された軟骨組織片からなるインプラントボディが、脱分化した細胞がインプラントボディの表面に付着するまで脱分化した細胞の懸濁液中で培養される（インプラントコーティング段階）。その後に、上述の手順で調製されたインプラントは周知の方法で欠損部に移植され、可能であれば適切な手段によって周囲の組織に固定される。
【００１３】
インビトロでの組織培養によって成長した軟骨組織片に代えて及び／又は加えて、患者から採取された自己の軟骨組織又はドナーの軟骨細胞由来のインビトロにおける培養によって生成された軟骨組織、又は同種及び／又は異種の軟骨組織外植片が、本発明のインプラント用インプラントボディとして用いることが可能である。インプラントボディが非自己であるが同種又は異種の軟骨組織からなる場合、インプラントコーティングの段階前に組織中に一体化した軟骨細胞を死滅させるのに有利である。いずれの場合においても、インプラントボディは移植前に別の細胞（軟骨産生能を有する自己細胞）の懸濁液中でインビトロにおいて培養され、それは可能な限り懸濁液中に細胞が残らなくなり、できればインプラントボディの全ての表面にこれらの別の細胞が付着するまで行われる。また、インプラントボディの複数の部分を別の細胞の懸濁液中で別々に培養し（コーティングの予備段階）、その後に予備的に被覆された部分を相互に接触させてコーティングの最終段階に移すことも可能であり、インプラントボディの部分は、部分の集合体が一つのインプラントと同様に扱う事ができる程度までコーティングの予備段階で付着した表面細胞によって相互に結合される。
【００１４】
本発明の実施例によるインプラント及びそのようなインプラントの製造方法は以下の図によって詳細に説明される。
【００１５】
図１は本発明のある実施形態によるインプラントを表しており、それは関節軟骨の欠損の修復に適したものである。インプラントはディスク型のインプラントボディ２を有しており、それは断面で示されている。インプラントボディは自然の軟骨組織、すなわち軟骨細胞によって生成され、コラーゲン及びプロテオグリカンを含むマトリックスを有しており、軟骨細胞３がマトリックス中に一体化している。軟骨細胞３は自己細胞であり生きた状態である。又は、それらは同種又は異種であり、免疫原性に依存して生きた状態及び／又は死んだ状態である。インプラントボディ２の表面は自己の表面細胞４で覆われている若しくは播種されている事が好ましく、それはこの表面に付着しており、軟骨産生能を有する細胞（例えば、インビトロで増殖している間に脱分化した軟骨細胞又は幹細胞の性質を有する細胞）である。
【００１６】
インプラントボディ２の表面に付着している表面細胞４は、インプラントボディの全ての表面に付着していることが有益であり、細胞がほぼコンフルエント又はコンフルエントに近い状態で、単一の細胞層を形成していることが有益である。しかしながら、表面細胞４は複数の多層細胞層として存在することも可能である。インプラントボディがインビトロにおける組織培養によって生成され、その後に特定の欠損部に適合させるためにトリミングされる場合、トリミングは移植の直前、すなわちコーティング段階の後に行われることで、インプラントボディ２の狭い側部５が付着した表面細胞４を有さないことが好ましい。
【００１７】
本発明の別の実施形態においては、インプラント１はインプラントボディ２を通る全層チャネル６を有し、インプラントボディ２は組織培養の段階において対応する形状の空間を用いて形成される（図４の説明を参照）。また、チャネル６の内向面は表面細胞４によって埋められている。そのようなチャネルはインプラントボディ２の表面を増加させ、及び／又はインプラント内の細胞の移動を促進させるのに役立つであろう。
【００１８】
図１によるインプラントは、例えば０．５から３ｍｍの厚みであり、５から３０ｍｍ以上の直径を有する。チャネル６は例えば０．５から２ｍｍの直径を有する。
【００１９】
本発明によるインプラントは、関節軟骨の欠損部の修復ではなく、例えば半月板、耳介／耳輪又は鼻中隔の修復に用いられる場合、インプラントボディはディスク型ではなく修復される欠損部の個々の形状に出来る限り適合されることも可能である。
【００２０】
図２及び３は関節軟骨の欠損部７に配置されているインプラント１を通る断面図である。欠損部は周知の方法によって、例えば自然の軟骨層１０を下の骨組織１２から分離している軟骨下骨板１１に至るまで損傷した又は変性した軟骨組織を除去することによって移植の準備がなされる。軟骨下骨板は下の骨組織よりも密度の高い骨材料からなり、移植前に周知の方法で穴があけられるであろう。欠損部にインプラントを固定するためには、圧入で十分であろう。また、インプラントをそこに固定するために欠損部上に髄膜片を縫う事もできる（図示しない）。
【００２１】
図２に図示されるインプラント１は図１のインプラントに相当する。図３に図示されるインプラント１は二つのインプラントボディのパーツ２．１及び２．２を有する。自己の表面細胞４はインプラントボディのパーツ表面に付着する。図３に示されるようなインプラントを形成するために、インプラントのパーツは相互に分離されてコーティングの予備段階に供され、隣接する位置でコーティングの最終段階へと移される。
【００２２】
図４から６は、本発明の様々な実施形態によるインプラント１を製造する方法の３つの実施例を示す図である。図４に図示される方法によって作られるインプラントは、インビトロで生成された自己の生軟骨組織からなる。図５において図示される方法によって作られるインプラントのインプラントボディは、ドナーの細胞由来の軟骨マトリックスであり、軟骨細胞はそのマトリックス中で死滅している事が好ましい。図６に図示される方法で作られるインプラントのインプラントボディは、ドナー由来の（取り出された（ex  vivo））同種または異種の軟骨マトリックスからなり、軟骨細胞は死滅している。これらのいずれかの方法による形成の後に、インプラントは様々な方法によって患者Ｐに移植できる。３つの図において、同じ要素には同じ参照番号が記されている。
【００２３】
図４は以下の方法の段階を含む方法を示す。
段階I（細胞入手段階）：患者Ｐから軟骨の生検を切り取り、生検から自己の軟骨細胞１５を単離することで自己の軟骨細胞を採取する。
段階II（インビトロにおける細胞増殖段階）：単層培養による自己の軟骨細胞１５のインビトロでの増殖。軟骨細胞は増殖し、結果的に脱分化して脱分化した軟骨細胞になる。
段階III（インビトロにおける組織培養段階）：段階IIにおいて生み出された脱分化した軟骨細胞１６の第１の部分からインビトロでの三次元組織培養によってインプラント２を作る。
段階IV（インプラントのコーティング段階）：段階IIにおいて生み出された脱分化した軟骨細胞１６の第２の部分を含む懸濁液中でインプラントボディを培養する事によって、軟骨産生能を有する自己の表面細胞４をインプラントボディ２の表面に播種する。
【００２４】
段階I、II、III及び移植IMにおいて周知の様々な方法が利用できる。生検から単離された軟骨細胞の数に応じて、インビトロでの増殖段階は複数の継代段階を含むであろう。約３０ｍｍ径のディスク型のインプラントを形成し、関節軟骨の欠損部の修復に適合させるためには、約８０，０００，０００から１００，０００，０００個の細胞がインビトロにおける組織培養の段階に必要であり、約１０，０００，０００から２０，０００，０００個の細胞がインプラントコーティングの段階に必要である。
【００２５】
段階II（インビトロにおける組織培養段階）にとって、上述の公報ＷＯ−９７／４６６６５の方法は好適な方法であり、二つの部分的な段階III．１及びIII．２が行われる事が好ましい。第１の部分段階III．１において、細胞の懸濁液が半透性の壁を有する細胞空間２０に入れられ、細胞空間は、約２週間にわたって適切な培地２１中でその空間的定位を変えることなく維持される。第２の部分段階III．２においては、細胞空間２０において生成された軟骨組織はさらに約２週間適切な培地中で自由に浮かせて培養され、組織はさらに成長し、特に機械的な強度を得る。
【００２６】
細胞空間２０の形成は所望されるインプラントの形状に合わせられる。関節軟骨の欠損を修復するためのディスク型のインプラントを作るためには、細胞空間２０は平らである。作られるインプラントボディ２が図１に示されるようなチャネル６を有する場合、細胞空間２０は細胞空間の全長にわたって延びる対応するカラム（図示しない）を備える。細胞空間２０の半透性の壁は栄養物などに対して透過性であり、それらは細胞及び細胞によって産生される巨大分子に対しては透過性ではない。
【００２７】
部分段階III．１及びIII．２に用いられる培地２１は、脱分化した軟骨細胞の再分化を促進するものを含んでいる（例えば、適切な成長因子を含む）。
【００２８】
段階IV（インプラントコーティング段階）において、インビトロでの組織培養段階（段階III）で生成され、かつ再分化した生軟骨細胞３（図１）を含む自己の軟骨組織からなるインプラントボディ２の表面に、インビトロでの細胞増殖段階（段階II）において産生される脱分化した軟骨細胞１６が播種される。インプラントボディ２は脱分化した軟骨細胞を含む懸濁液２３中に配置され、懸濁液中のその位置は継続的または定期的に変えられることが好ましい。そのような変更によって、重力によってインプラントボディ２の上に降りてそこに付着すると考えられる浮遊した細胞１６が全ての表面領域に均一に付着することで、全面に渡ってインプラントボディを被覆することが保証される。このため、懸濁液２３を含む容器の壁は細胞接着を促進しない及び／又は阻害する材料で作られる。時間が経過することで、懸濁液中のコンドロジェニック（condrogenic）細胞はそれぞれの細胞周囲のマトリックスを成長させて粘性になることで、クラスタ形成を促進すると共に同時にインプラントボディ２への結合を促進する。
【００２９】
コーティング段階（段階IV）においては、５，０００から５００，０００個の細胞、好ましくは１０，０００から１００，０００個の細胞が播種される表面のｃｍ2あたりに用いられ、又は約７０，０００から１００，０００個の細胞／ｃｍ2が一つのコンフルエントな細胞層を付与するのにおよそ十分な値である。
【００３０】
接着培養の段階（段階IV）を行うための好適な装置は、例えば中空の球２５である回転できる形状である中空のボディである。回転可能な中空のボディが別の培地２４中で自由に回転できるように沈められる。インプラントボディ２と自己細胞１６の細胞懸濁液２３とは球の内部に入れられ、球は半透性、すなわち栄養素及び添加物に対しては透過性であるが、細胞に対しては非透過性である壁を有する。その装置は図７においてより詳細に示されている。
【００３１】
インプラントボディの表面に播種するために用いられる自己細胞が、インビトロでの組織培養段階（段階III）に用いられた細胞と同じインビトロで増殖された自己の軟骨細胞１６である場合、注意が払われなければならない。コーティング段階（段階IV）に用いられる細胞はほぼ同じ状態で維持され、インビトロでの組織培養段階（段階III）に用いられる約４週間にわたって生存能力を保持する。これは例えば細胞１６を凍結することによって実現される。もちろん、二つの異なる培養における生検から単離された細胞１５を増殖させる事も可能であり、コーティング段階に用いられる細胞の増殖はインビトロにおける組織培養の段階に用いられる細胞よりゆっくりと増殖されることも可能であり、それは例えば培地及び／又は培養温度の対応する選択によって実現される。或いは、患者から採取された生検の別の部分が必要な時間にわたって細胞懸濁液中に保持され、生検のこの別の部分の消化による細胞の入手は、軟骨ボディの生成の達成進度に応じて予定が組まれる。インプラントボディのコーティングのための細胞は、その後に手術に同意した移植日の直前に使用するため準備がなされる。
【００３２】
しかしながら、発明のあらゆる実施形態において、インプラントコーティングの段階（段階IV）に用いられる自己細胞が脱分化した軟骨細胞であることは必要ではない。軟骨産生能を有する代わりの他の自己細胞、例えば別の組織から単離された幹細胞が使用可能である。
【００３３】
インプラントコーティングの段階（段階IV）は、軟骨細胞又は類似細胞が軟骨表面に容易に付着する事実に基づいており、例えばA.C.Chenらによる文献（"Chondrocyte  transplantation  to  Articular  Cartilage  Explants  in  Vitro"、J.  Orthopaedic  Research、第１５号、１９９７年、７９１−８０２貢）及びR.M.Schinaglらによる文献（"Effect  of  Seeding  Duration  on  the  Strength  of  Chondrocyte  Adhesion  to  Articular  Cartilage"、J.  Orthopaedic  Research、第１７号、１９９９年、１２１−１２９貢）から周知である。M.S.Kurtisらの文献（"Integrin-mediated  Adhesion  of  human  Articular  Chondrocytes  to  Cartilage"、Arthritis  &  Rheumatisme、第４８／１号、２００３年、１１０−１１８貢）から、特定のインテグリンが軟骨細胞の軟骨表面への接着に関連する役割を担っていることがさらに知られている。
【００３４】
インプラントコーティングの段階（段階IV）において、インプラントボディは約１から２日の間、上述の方法で培養される。
【００３５】
図３に関して述べたように、インプラントボディ２が複数のインプラントボディのパーツ２．１及び２．２を有する実施形態において、インプラントボディのパーツはコーティングの予備段階に供され、インプラントボディのパーツは別々に被覆される。被覆されたインプラントボディのパーツ２．１及び２．２は、その後に相互に接触して配置され、１から２日間同様の細胞懸濁液を用いるコーティングの最終段階に供される。このコーティングの最終段階の後に、インプラントボディのパーツは、インプラントボディが一つの部品として扱う事が十分できるように表面細胞を介して相互に固定される。
【００３６】
図５は本発明による方法の別の実施形態を図示しており、その方法はインプラント１を製造するのに役立つ。この場合のインプラント１はインプラントボディ２を有しており、それは自己細胞１６からではなく、軟骨産生能を有し、人若しくは動物のドナーS由来の同種（すなわち同種異系）又は可能であれば異種の細胞１６’から生成される。このため、免疫反応をほとんど生じないことが知られているドナー細胞（例えば若い軟骨細胞、幹細胞又は遺伝学的に改変されているドナー細胞）が用いられる事が好ましい。これらの細胞は採取されてインビトロで増殖される（段階II'）。インビトロでの組織培養段階（段階III'）において細胞１６’から生成されており生軟骨細胞を含むインプラントボディ２’は、コーティング段階の前に追加段階VIに供される事が可能であり、インプラントボディ２の軟骨マトリックスに一体化した同種又は異種の軟骨細胞は死滅される。これは、例えば凍結及び融解を繰り返すサイクルによって、又は適切な染色液（メチレンブルーなど）で処理した後にインプラントボディを紫外線に曝すことによって行われる。
【００３７】
図６は、軟骨の欠損の修復に適したインプラント１の製造に役立つ本発明に基づく方法の別の実施例を図示する。この場合は、インプラントボディはドナーＳ由来であり、好ましくは人のドナーであるが、動物のドナーであっても良い。したがって、インプラントボディは取り出された軟骨組織（組織外植片）からできており、図５に関して説明された追加段階VIに供される事が好ましい。追加段階において、インプラントボディの軟骨マトリックスに一体化した同種又は異種の軟骨細胞は死滅される。このように前処理されたインプラントボディ２は、その後にインプラントコーティング（段階IV）に供され、その表面に（段階I及びIIで生じた脱分化した軟骨細胞などの）自己細胞１６が播種される。そして、インプラントは移植される（IM）。
【００３８】
あるいは、インプラントボディ用の軟骨組織は患者Ｐから採取される（自己移植）。そのような自己のインプラントボディの場合は、追加段階VIは省略されることが好ましい。
【００３９】
図７はインプラントコーティングの段階（段階IV）を実施するための装置をいくらか拡大した縮尺で示しており、インプラントボディの表面には自己細胞が播種されており、その段階はインプラントボディの表面に細胞が良く付着するのに十分な時間にわたって行われる。上述のように、この段階中において継続的又は定期的にインプラントボディの空間的定位を変更することで、細胞がインプラントボディの全ての表面に降下し、これら全ての表面に付着することが好ましい。
【００４０】
装置は中空の球２５を例とする中空の転がる（roller）ボディを有しており、それは容器３０の底に配置される。容器３０が回転される際に、中空の球は継続的又は定期的にその底に沿って回転する。中空の球２５は二つの部分を有しており、それらは例えば一緒にスナップ固定又はネジ固定されることで連結されている。中空の球の壁は上述のように半透性である。
【００４１】
インプラントボディ及び細胞の懸濁液は中空の球に入れられて、その後に閉じられ、容器３０の底に配置され、そして培地２４に浸される。中空の球２５の回転運動によって、重力はインプラントボディに対して方向を変えるように作用することで、細胞がインプラントボディの全ての表面に降下してそこに付着する。このように、インプラントボディの全ての表面に細胞を播種することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】発明のある実施形態によるインプラントであり、人間の患者又は患畜の関節軟骨の欠損を修復するのに適したインプラントの模式的な断面図
【図２】本発明の代替形態であり、関節軟骨の欠損部に配置されているインプラントの模式的な断面図
【図３】本発明の代替形態であり、関節軟骨の欠損部に配置されているインプラントの模式的な断面図
【図４】本発明のインプラントを製造する方法の異なる実施形態を表す図
【図５】本発明のインプラントを製造する方法の異なる実施形態を表す図
【図６】本発明のインプラントを製造する方法の異なる実施形態を表す図
【図７】インプラントボディの表面が自己の表面細胞などの表面細胞で覆われている方法の拡大図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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