(57)【要約】  本発明は、特にヒトにおいて、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）と結合する抗体、並びに診断及び治療の役割でのその用途を提供する。本発明は、このような抗体を産生するハイブリドーマをも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図８、図９、図１０、図１１、図１２、図１３、図１４、図３０、図３１、図３２、図３３、及び図３４に示す配列から選択されるアミノ酸配列に対して実質的な相同性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む抗体。
【請求項２】
図８、図９、図１２、及び図３２に示す配列から選択されるアミノ酸配列に対して実質的な相同性を有するアミノ酸配列を含む第１のＣＤＲ、
図１０、図１３、図３０、図３１、及び図３３に示す配列から選択されるアミノ酸配列に対して実質的な相同性を有するアミノ酸配列を含む第２のＣＤＲ、及び
図１１、図１４、及び図３４に示す配列から選択されるアミノ酸配列に対して実質的な相同性を有するアミノ酸配列を含む第３のＣＤＲを含む、
請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
図８、図９、図１０、図１１、図３０、及び図３１に示す配列から選択されるアミノ酸配列に対して実質的な相同性を有するアミノ酸配列を有する１つ又は複数のＣＤＲを含む重鎖を含む、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
図１２、図１３、図１４、図３２、図３３、及び図３４に示す配列から選択されるアミノ酸配列に対して実質的な相同性を有するアミノ酸配列を有する１つ又は複数のＣＤＲを含む軽鎖を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
図１５、図１６、図１７、図１８、図１９、図２０、図２１、図２２、図２３、図２４、図２５、図２６、図２７、図２８、図３５、図３６、図３７、図３８、図３９、図４０、図４１、図４２、及び図４３に示す配列から選択されるアミノ酸配列に対して実質的な相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
図４４、図４５、図４６、図４７、図４８、図４９、図５０、図６１、図６２、図６３、図６４、及び図６５に示す配列から選択されるヌクレオチド配列に対して実質的な相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲを含む抗体。
【請求項７】
ａ）図４４、図４５、図４８、及び図６３に示す配列から選択されるヌクレオチド配列に対して実質的な相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされる第１のＣＤＲ、
ｂ）図４６、図４９、図６１、図６２、及び６４に示す配列から選択されるヌクレオチド配列に対して実質的な相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされる第２のＣＤＲ、及び
ｃ）図４７、図５０、図６５に示す配列から選択されるヌクレオチド配列に対して実質的な相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされる第３のＣＤＲを含む、
請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
図４４、図４５、図４６、図４７、図６１、及び図６２に示す配列から選択されるヌクレオチド配列に対して実質的な相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされる１つ又は複数のＣＤＲを含む重鎖を含む、請求項６又は７に記載の抗体。
【請求項９】
図４８、図４９、図５０、図６３、図６４、及び図６５に示す配列から選択されるヌクレオチド配列に対して実質的な相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされる１つ又は複数のＣＤＲを含む軽鎖を含む、請求項６又は７に記載の抗体。
【請求項１０】
図５１、図５２、図５３、図５４、図５５、図５６、図５７、図５８、図５９、図６０、図６６、図６７、図６８、図６９、図７０、図７１、図７２、及び図７３に示す配列か
ら選択されるヌクレオチド配列に対して実質的な相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、請求項６〜９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
図２０、図２１、図２２、図２３、図３９、及び図４０に示す配列から選択されるアミノ酸配列に対して実質的な相同性を有する重鎖可変領域を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
図２４及び図４１に示す配列から選択されるアミノ酸配列に対して実質的な相同性を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
図５６、図５７、図５８、図５９、図７１、及び図７２に示す配列から選択されるヌクレオチド配列に対して実質的な相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域を含む、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
図６０及び図７３に示す配列から選択されるヌクレオチド配列に対して実質的な相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体と同一のエピトープと結合する抗体。
【請求項１６】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体がＩｇＧである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
ＥＣＡＣＣ寄託番号０６０３２９０１又は０６０３２９０２のハイブリドーマ。
【請求項１９】
請求項１８に記載のハイブリドーマによって産生される抗体。
【請求項２０】
活性分子と複合体を形成する、請求項１〜１７及び１９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２１】
前記活性分子が放射性ヨウ素である、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
請求項１〜１７及び１９〜２１のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬的組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１７及び１９〜２１のいずれか一項に記載の抗体をコードする単離核酸。
【請求項２４】
図４４、図４５、図４６、図４７、図４８、図４９、図５０、図５１、図５２、図５３、図５４、図５５、図５６、図５７、図５８、図５９、図６０、図６１、図６２、図６３、図６４、図６５、図６６、図６７、図６８、図６９、図７０、図７１、図７２、及び図７３に示す配列から選択される配列に対して実質的な相同性を有するヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【請求項２５】
請求項２３又は２４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２７】
抗体を産生する方法であって、
請求項２６に記載の宿主細胞又は請求項１８に記載のハイブリドーマを、該抗体の発現を可能にする条件下で培養すること、及び
該抗体を培養物から単離することを含む方法。
【請求項２８】
抗体を産生する方法であって、
ａ）置換されるべきＣＤＲ１、ＣＤＲ２、若しくはＣＤＲ３のコード領域を含むか、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、若しくはＣＤＲ３のコード領域を持たない、可変ドメインをコードする核酸のレパートリーを用意すること、
ｂ）該レパートリーと、図４４、図４５、図４６、図４７、図４８、図４９、図５０、図６１、図６２、図６３、図６４、図６５に示す配列から選択される配列と実質的に相同なヌクレオチド配列を有するドナー核酸とを組み合わせて、可変ドメインをコードする核酸のレパートリーを用意すること、及び
ｃ）該レパートリーから核酸を発現することを含む方法。
【請求項２９】
請求項２５又は２６に記載の方法によって生産される抗体。
【請求項３０】
治療で使用するためのものである、請求項１〜１７、１９〜２１、及び２７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３１】
腫瘍細胞の位置を突き止める方法であって、
ａ）請求項１〜１７、１９〜２１、及び２７のいずれか一項に記載の抗体を、患者に投与すること、
ｂ）続いて放射性ヨウ素を該患者に投与すること、
ｃ）放射性ヨウ素が存在するか否か該患者をスキャンすること、及び
ｄ）該患者の画像を作成することを含む方法。
【請求項３２】
腫瘍細胞の位置を突き止める方法であって、
ａ）請求項２１に記載の抗体を、患者に投与すること、
ｂ）放射性ヨウ素が存在するか否か該患者をスキャンすること、及び
ｃ）該患者の画像を作成することを含む方法。
【請求項３３】
腫瘍細胞を治療する方法であって、
ａ）請求項１〜１７、１９〜２１、及び２７のいずれか一項に記載の抗体を、患者に投与すること、及び
ｂ）続いて放射性ヨウ素を該患者に投与することを含む方法。
【請求項３４】
腫瘍細胞を治療する方法であって、
ａ）請求項２１に記載の抗体を、患者に投与することを含む方法。
【請求項３５】
癌の診断又は治療用の薬剤の製造における、請求項１〜１７、１９〜２１、及び２７のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項３６】
ＴＳＨＲ分子が結合した支持体、並びに請求項１〜１７、１９〜２１、及び２７のいずれか一項に記載の標識抗体を含む、試料中に抗ＴＳＨＲ抗体が存在するか否かをアッセイするキット。
【請求項３７】
抗ＴＳＨＲ抗体が存在するか否かアッセイする方法であって、
ａ）ＴＳＨＲが結合した支持体を用意すること、
ｂ）請求項１〜１７、１９〜２１、及び２７のいずれか一項に記載の標識抗体を前記支持体に加えること、
ｃ）試験試料を前記支持体に加えること、及び
ｄ）前記抗体が置換したか否かをアッセイすることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体、詳細には、特にヒトにおいて甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）と結合するヒト抗体及びその断片、並びに診断及び治療の役割でのそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
甲状腺は、既知の通り、身体内の１つの代謝制御部位である。甲状腺の癌はそれほど一般的ではないが、高い疾患再発率から長期の監視が必要である。通常、甲状腺の癌の治療中に、甲状腺腫瘍の大部分は切除されるが、少量が残存し、これを放射線療法で治療しなければならないことも多い。外科手術後、患者を甲状腺ホルモンで治療する必要があるのは、患者がもはやこれを産生できないためである。甲状腺の１つの役割は、身体からヨウ素を取り込むことである。それゆえ、任意の残存腫瘍細胞を放射性ヨウ素で治療することが可能なはずである。しかし、残念なことに、甲状腺癌細胞は、ヨウ素を十分には取り込まない。そこで、放射性ヨウ素が機能するように、患者は、組換えＴＳＨで治療されるか、又は天然のＴＳＨレベルを上昇させるために甲状腺ホルモン治療を中止するかのいずれかにより、ヨウ素の取り込みを刺激する必要がある。しかしながら、かなりの割合の治療患者は、しばらく経っても組換えＴＳＨに反応しない。さらに、組換えＴＳＨは非常に高価であり、全ての患者にこの治療を提供できないおそれがある。甲状腺ホルモンの中止にあたり、患者にとってかなり不快な副作用（特に、倦怠感、筋痙攣、腫張、及び便秘）が起こる。このような不快な副作用を引き起こすことのない、ヨウ素の取り込みを刺激する新規の、より安価な治療を見出すことができれば、有益である。
【０００３】
バセドウ病は、一次標的抗原が甲状腺刺激ホルモンに対する甲状腺濾胞細胞表面受容体（ＴＳＨＲ）として同定されている、一般的な抗体介在性の障害である。抗ＴＳＨＲ抗体の一群は、天然リガンドであるＴＳＨの受容体に対する作用を模倣するアゴニストとして振る舞い、甲状腺刺激抗体（ＴＳＡｂ）として知られている。ＴＳＡｂが甲状腺濾胞細胞を過刺激して、チロキシンを分泌する結果、甲状腺機能亢進症が生じる。別の群の抗ＴＳＨＲ抗体（ＴＳＢＡｂ）は、時として甲状腺機能低下症をもたらし得る、受容体に対するＴＳＨ結合のアンタゴニストとして作用し得る。アゴニスト活性もアンタゴニスト活性も有しない、ＴＳＨＲに対して中立な抗体も報告されているが、疾患におけるそれらの役割は未解明のままである。
【０００４】
バセドウ病の治療は、ほぼ５０年間標準的になっている。バセドウ病を研究するのが非常に困難なのは、疾患に関与する抗体の存在レベルが非常に低いためである。バセドウ病に関する研究を推進するために、ＴＳＨＲを刺激する抗体を用いることは有用である。
【０００５】
ＴＳＨＲは、大きな細胞外ドメイン、７回膜貫通（ＴＭ）領域、及び短い細胞質尾部を有するＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーに属する。ＧＰＣＲのＴＭ領域は、ｃＡＭＰ、ジアシルグリセロール、及びイノシトールリン酸（ＩＰ３）等の小さな二次伝達物質を調節することによって、活性化シグナルを伝達する役割を担っている。ＴＳＨＲ活性化、及び結果として起こる細胞内調節カスケードの形態は、究極的には、中毒性の過形成（腺腫脹、甲状腺腫）、甲状腺以外の合併症、及び治療に対する反応に関して、異なる患者で観察されるばらつきの原因となり得る。ＴＳＨＲは、大きなＧＰＣＲファミリーの中でも、Ａサブユニット及びＢサブユニットとして知られている、２つのジスルフィド連結サブユニットへの開裂等の複雑な翻訳後修飾を受ける点で独特である。ＴＳＨＲの外部ドメインに相当する５３ｋＤのＡサブユニットは、ＴＳＡｂと優先的に結合し、その結果、血流中に放出された開裂断片は感受性個体において自己免疫を惹起する一次刺激と
なり得ると提唱されているので、特に関心が高い。
【０００６】
モノクローナル抗体（ｍａｂ）としてのＴＳＡｂの単離は、念願の目標となっているが、実現するのが並外れて難しいことが示されている。甲状腺機能亢進症であるバセドウ病の実験動物モデルの確立により、ＴＳＡｂ活性が制限されたＩｇＧ  ｍａｂが開発された。同時に、バセドウ病患者から開発された、ＴＳＨＲに対するヒトＩｇＧ  ｍａｂは、ナノグラムの範囲で強力な甲状腺活性を有することが示された。ヒトｍａｂは、ＴＳＨＲを、準飽和濃度のＴＳＨを用いるのと同等の最大刺激にまで活性化することによって、完全アゴニストとして作用した。つい最近、同様の効力を有し、ＴＳＨＲに対する完全アゴニストとして振る舞う、実験モデルから開発されたマウスｍａｂも報告された。さらに、ｍａｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体移入実験において病原性があり、報告によると、甲状腺のリンパ球浸潤をもたらした。完全アゴニスト、並びに他のマウスｍａｂの刺激及び阻害に対する受容体上の決定基は、立体構造中の三次元折畳み構造の外部ドメインに依存しており、馬蹄構造内のロイシン反復が多い領域に存在する。患者の血清中に存在する、ＴＳＨＲに対する完全アゴニスト自己抗体が少ないことは、バセドウ病の病因に影響を与え得るそれらの性質を比較する妨げとなった。本発明者らは、驚くべきことに、ＴＳＨＲに対して並外れて高い親和性を有し、結果的にＴＳＨＲを強力に刺激する２つの抗体を開発した。興味深いことに、２つのｍａｂは、ＴＳＨＲに対して完全アゴニスト活性を示すだけでなく、ＴＳＨＲに対するアンタゴニスト活性の観点でも、低濃度のＩｇＧで挙動の違いを殆ど示さなかった。ｍａｂは、マウスに導入する場合、ｉｎ  ｖｉｖｏで病原性であり、それにより、マイクログラム量のＩｇＧを単回注射すると、持続的な甲状腺機能亢進症をもたらすチロキシンの急速な過分泌が誘発され、相当な形態変化を伴うが、甲状腺における単核細胞浸潤は最小限である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明により、ＴＳＨＲ、特に、ヒトＴＳＨＲと高い親和性及び特異性で結合する抗体を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
したがって、図８、図９、図１０、図１１、図１２、図１３、図１４、図３０、図３１、図３２、図３３、及び図３４に示す配列から選択されるアミノ酸配列に対して実質的な相同性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む抗体を提供する。
【０００９】
特に、
図８、図９、図１２、及び図３２に示す配列から選択されるアミノ酸配列に対する実質的な相同性を有するアミノ酸配列を含む第１のＣＤＲ、
図１０、図１３、図３０、図３１、及び図３３に示す配列から選択されるアミノ酸配列に対する実質的な相同性を有するアミノ酸配列を含む第２のＣＤＲ、及び
図１１、図１４、及び図３４に示す配列から選択されるアミノ酸配列に対する実質的な相同性を有するアミノ酸配列を含む第３のＣＤＲを含む抗体を提供する。
【００１０】
図８、図９、図１０、図１１、図３０、及び図３１に示す配列から選択されるアミノ酸配列に対する実質的な相同性を有するアミノ酸配列を有する１つ又は複数のＣＤＲを含む重鎖を含む抗体をも提供する。
【００１１】
本発明はさらに、図１２、図１３、図１４、図３２、図３３、及び図３４に示す配列から選択されるアミノ酸配列に対する実質的な相同性を有するアミノ酸配列を有する１つ又は複数のＣＤＲを含む軽鎖を含む抗体を提供する。
【００１２】
さらに、図１５、図１６、図１７、図１８、図１９、図２０、図２１、図２２、図２３、図２４、図２５、図２６、図２７、図２８、図３５、図３６、図３７、図３８、図３９、図４０、図４１、図４２、及び図４３に示す配列から選択されるアミノ酸配列に対する実質的な相同性を有するアミノ酸配列を含む抗体を提供する。
【００１３】
本発明は、図２０、図２１、図２２、図２３、図３９、及び図４０に示す配列から選択されるアミノ酸配列に対する実質的な相同性を有する重鎖可変領域を含む抗体も提供する。
【００１４】
好ましくは、抗体は、図２４に示すアミノ酸配列に対する実質的な相同性を有する軽鎖可変領域を有する。代替的には、抗体は、図４１に示すアミノ酸配列に対する実質的な相同性を有する軽鎖可変領域を有する。
【００１５】
図２４及び図４１に示す配列から選択されるアミノ酸配列に対する実質的な相同性を有する軽鎖可変領域を含む抗体も提供する。
【００１６】
さらなる実施例において、図４４、図４５、図４６、図４７、図４８、図４９、図５０、図６１、図６２、図６３、図６４、及び図６５に示す配列から選択されるヌクレオチド配列に対する実質的な相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲを含む抗体を提供する。
【００１７】
特に、
ａ）図４４、図４５、図４８、及び図６３に示す配列から選択されるヌクレオチド配列に対する実質的な相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされる第１のＣＤＲ、
ｂ）図４６、図４９、図６１、図６２、及び図６４に示す配列から選択されるヌクレオチド配列に対する実質的な相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされる第２のＣＤＲ、及び
ｃ）図４７、図５０、及び図６５に示す配列から選択されるヌクレオチド配列に対する実質的な相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされる第３のＣＤＲを含む抗体を提供する。
【００１８】
図４４、図４５、図４６、図４７、図６１、及び図６２に示す配列から選択されるヌクレオチド配列に対する実質的な相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされる１つ又は複数のＣＤＲを含む重鎖を含む抗体も提供する。
【００１９】
さらに、図４８、図４９、図５０、図６３、図６４、及び図６５に示す配列から選択されるヌクレオチド配列に対する実質的な相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされる１つ又は複数のＣＤＲを含む軽鎖を含む抗体を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、図５１、図５２、図５３、図５４、図５５、図５６、図５７、図５８、図５９、図６０、図６６、図６７、図６８、図６９、図７０、図７１、図７２、及び図７３に示す配列から選択されるヌクレオチド配列に対する実質的な相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされる抗体を提供する。
【００２１】
図５６、図５７、図５８、図５９、図７１、及び図７２に示す配列から選択されるヌクレオチド配列に対する実質的な相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域を含む抗体をも提供する。
【００２２】
好ましくは、抗体は、図６０に示すヌクレオチド配列に対する実質的な相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む。代替的には、抗体は、図７
３に示すヌクレオチド配列に対する実質的な相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む。
【００２３】
さらに、図６０及び図７３に示す配列から選択されるヌクレオチド配列に対する実質的な相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。
【００２４】
別の実施例において、本発明の他の態様による抗体と同一のエピトープと結合する抗体を提供する。
【００２５】
本発明をよりよく理解することができるように、或る特定の用語を定義する。さらなる定義は本明細書全体参照のこと。
【００２６】
「抗体」という用語は、当該技術分野において既知である。本明細書中では、免疫グロブリン又は免疫グロブリンの任意の機能的な断片を意味する。抗原結合部位を有する任意のポリペプチドを含める。限定するものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異的抗体、多特異的抗体、非特異的抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体、移植抗体、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した抗体を含める。「抗体」という用語は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、及び抗原結合機能を保有する任意の他の抗体断片等の抗体断片を含める。一般的に、このような断片は抗原結合ドメインを含む。「完全」という語が先に来る場合、「抗体」という用語は、抗体分子全体、即ち２つの重鎖（それぞれ１つの可変領域及び３つの定常領域を含む）並びに２つの軽鎖（それぞれ１つの可変領域及び１つの定常領域を含む）を意味する。
【００２７】
完全抗体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）としても既知である。上記で示したように、完全抗体は、軽鎖及び重鎖を含む。軽鎖は、２つのアイソタイプに分類され、重鎖は、５つのアイソタイプ（Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、及びＭ）に分類される。重鎖のアイソタイプの中には、さらにアイソタイプのサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に分けられるものもある。本発明の抗体は、ＩｇＧ抗体であることが特に好ましい。特に、ＩｇＧ２ｂ抗体及びＩｇＧ２ａ抗体が好ましい。
【００２８】
異なる抗体のドメイン及び三次元構造は、当該技術分野において既知である。軽鎖は、定常ドメイン（ＣL）及びＮ末端の可変ドメイン（ＶL）から構成される。重鎖は、３つ又は４つの定常ドメイン（ＣH）、ヒンジ領域、及びＮ末端の可変ドメイン（ＶH）から構成される。ＶHドメインと隣接するＣHは、ＣH１と指定される。ＶHドメイン及びＶLドメインは、フレームワーク（ＦＲ）領域と呼ばれる保存配列の４つの領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含有し、これらが、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変配列の３つの領域に対する足場を形成する。ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、抗原と特異的に結合する抗体アミノ酸の殆どを含有する。重鎖ＣＤＲは、Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３で示される一方、軽鎖ＣＤＲは、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３で示される。「ＣＤＲ」という用語は、当該技術分野において既知である。当業者は、Kabatのナンバリングを使用することによって抗体又は断片中のＣＤＲを、及びＣＤＲのいずれかの側に見出されるアミノ酸を、認識することができる。
【００２９】
Ｆａｂ断片（抗原結合断片）は、定常領域間のジスルフィド結合によって共有結合で連結された、ＶHドメイン、ＣH１ドメイン、ＶLドメイン、及びＣLドメインから成る。Ｆｖ断片は小さめで、非共有結合で連結された、ＶHドメイン及びＶLドメインから成る。非共有結合（non-covalently）ドメインの解離し易さを解決するために、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を構築することができる。ｓｃＦｖは、ＶHのＣ末端をＶLのＮ末端に連結するか、
又はＶLのＣ末端をＶHのＮ末端に連結する柔軟なポリペプチドを含有する。１５アミノ酸長の（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3ペプチドがリンカーとして使用できるが、他のリンカーも既知である。
【００３０】
本発明の抗体は、好ましくは、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）、特にヒトＴＳＨＲと結合することができる。抗体は、好ましくは、マウスＴＳＨＲとも交差反応する。さらに、好ましくは、受容体を作動する、即ち、甲状腺ホルモンの産生を刺激することができる。当該技術分野において既知の技法を使用して、これらの機能をスクリーニングすることが可能である。機能的な断片は、依然としてＴＳＨＲと結合可能な抗体断片である。さらに、機能的な断片は、好ましくは、ＴＳＨＲを作動することができる。
【００３１】
「抗原結合部位」、「抗原結合ドメイン」、及び「抗原結合断片」という用語は、抗体のうち抗原と特異的に結合する部分を意味する。抗原のうち抗体によって認識且つ結合される部分は、「エピトープ」と称される。抗原結合ドメインは通常、軽鎖（ＶL）及び重鎖（ＶH）の両方由来の可変領域を含むが、両方を含む必要はない。抗原結合断片としては、Ｆａｂ断片（ＶLドメイン、ＶHドメイン、ＣLドメイン、及びＣH１ドメインから成る一価の断片）；Ｆ（ａｂ’）2断片（ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片）；Ｆｄ断片（２つのＶHドメイン及びＣH１ドメイン）；Ｆｖ断片（ＶLドメイン又はＶHドメイン）、ｄＡｂ断片（Ward他（1989）、Nature
341: 544-546）、１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）；並びに単鎖Ｆｖが挙げられる。各種抗体断片は、当業者に既知の従来技法を使用して得ることができる。断片の機能性、例えば、受容体と結合し、作動することを、当該技術分野において既知の技法を使用してスクリーニングすることが可能である。
【００３２】
当該技術分野において既知のように、マウス及びラット由来のマウス抗体を、ヒトでの治療に使用することが可能である。しかしながら、齧歯類の抗体は、強いヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）免疫反応を惹起する傾向があるため、その有用性が同一の患者における反復適用に関して制限される。それゆえ、本発明による抗体は、好ましくは、キメラ抗体、ヒト化抗体（ＣＤＲ移植抗体又は再形成抗体）である。
【００３３】
「キメラ」という用語は、マウス又はラットの抗体の可変領域の全体が、ヒト定常領域と共に発現される、抗体を指す。これは、抗体にヒトのエフェクター機能を与えると共に、マウスのＦｃ領域によって引き起こされる免疫原性（ＨＡＭＡ）も低減させる。
【００３４】
「ヒト化」抗体（ＣＤＲ移植抗体又は再形成抗体とも呼ばれる）は、齧歯類の抗体のＶ領域由来の相補性決定領域のみが、ヒトＶ領域由来のフレームワーク領域と組み合わされる、キメラ抗体の代替物である。これらの抗体は、キメラ抗体よりもヒト様であるため、おそらくキメラ抗体よりも免疫原性が低いはずである。
【００３５】
トランスジェニックマウス又は他のトランスジェニック動物から、完全なヒト抗体を得ることも可能である。ヒト免疫グロブリン生殖細胞遺伝子セグメントのレパートリーを有するトランスジェニックマウスが作製されている。したがって、これらのマウスは免疫を与えると、ヒト様抗体を作り出す。このような免疫マウス由来のＢ細胞は、モノクローナル抗体の産生で使用することができる。
【００３６】
これらのタイプの抗体は全て、本発明によって包含される。
【００３７】
本発明の抗体及び核酸は、好ましくは単離される。「単離」という用語は、天然の環境を実質的に含まない分子を指す。例えば、単離タンパク質は、細胞又はそれが由来する組織起源由来の、細胞物質又は他のタンパク質を実質的に含まない。本用語はまた、単離タ
ンパク質が医薬的組成物に対して十分に純粋；又は少なくとも７０％（ｗ／ｗ）〜８０％（ｗ／ｗ）純粋；又は少なくとも８０％（ｗ／ｗ）〜９０％（ｗ／ｗ）純粋；又は少なくとも９０％〜９５％純粋；又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、９９％（ｗ／ｗ）、又は１００％（ｗ／ｗ）純粋である、調製品を指す。
【００３８】
「実質的に相同」という語句は、関連するアミノ酸又はヌクレオチド配列（例えば、ＣＤＲ（複数可）、ＶHドメイン又はＶLドメイン）が、具体的に特定した配列と同一であるか、又は違いが小さいことを意味する。小さな違いには、特定領域の５つのアミノ酸配列における１つ又は２つの置換等の小さなアミノ酸変化を含む。抗体の場合、第２の抗体は、同一の特異性を有し、その親和性の少なくとも５０％を有する。
【００３９】
本明細書中に開示される配列と実質的に同一又は相同な配列（例えば、少なくとも約８５％の配列同一性）も、本出願の一部である。幾つかの実施例において、配列同一性は、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上であり得る。特に、ＣＤＲの配列を取り扱う場合、実質的な相同性は、好ましくは、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を意味する。軽鎖可変領域又は重鎖可変領域の配列等、長めの配列を取り扱う場合、相同性は、少なくとも８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であり得る。定常領域を含む配列の相同性は低めで、例えば、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上であり得る。実質的に同一又は相同な配列はまた、選択的ハイブリダイゼーション条件（例えば、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下、具体的に特定した鎖の相補体とハイブリダイズする核酸配列を含む。同一性％は、標準的なアラインメントアルゴリズム、例えば、Altshul他によって記載された基本ローカルアラインメント検索ツール（Basic Local Alignment Tool：ＢＬＡＳＴ）（J. Mol. Biol., 215(1990), 403-410）；Needleman他のアルゴリズム（J. Mol. Biol., 48(1970), 444-453）；又はMeyers他のアルゴリズム（Comput. Appl. Biosci., 4(1988), 11-17）によって求めることができる。２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間の同一性％は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている、E. Meyers and W. Millerのアルゴリズム（CABIOS, 4(1989), 11-17）によって求めることができる。これは当業者によって既知である。
【００４０】
「ストリンジェントな」という用語は、ハイブリダイゼーション及び洗浄についての条件を説明している。ストリンジェントな条件は、当業者に既知であり、「分子生物学における現行のプロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」（John Wiley & Sons, N. Y.（1989）、6.3. 1-6.3. 6）の中で知ることができる。
【００４１】
抗体は、当該技術分野において既知の任意の方法で作製することができる。好ましい方法は、従来のハイブリドーマ技法（Kohler and Milstein, Nature, 256(1975), 495-499）を使用することである。さらなる抗体産生技法に関しては、Harlow他編「抗体：実験マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」（Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）を参照されたい。抗体の産生方法又は起源に関して、本発明に限定を加えるものではない。
【００４２】
本発明は、ＴＳＨＲと結合する抗体を提供する。さらに、当業者は、提示したＶH配列（複数可）及び／又はＶL配列（複数可）を変化させることによって、より多くの抗体を作製できると想定される。このような抗体は、当該技術分野において既知の技法を使用して当業者によって誘導されてもよく、本発明によっても含まれる。例えば、機能性が残存するという条件で、アミノ酸の置換、欠失、又は付加等の修飾を、抗体の任意の部分に導
入することができる。変更は、特に、例えば、抗体の安定性を向上させるために、フレームワーク領域に導入してもよい。変更は、ＴＳＨＲに対する抗体の親和性を変化させるために、ＣＤＲにも導入してもよい。ＴＳＨＲに対する抗体の親和性は、当該技術分野において既知の標準的な技法を使用して試験できる。
【００４３】
特に、ＶH配列及びＶL配列に対する保存的な修飾が想定される。このような変更により、修飾が為される抗体と同様の機能的特性及び化学的特性を有する分子が産生される。保存的な修飾は、一アミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸で置換する、例えば疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸で置換する等、抗体の形状又は機能を劇的に変化させる可能性の低い修飾である。
【００４４】
アミノ酸を置換する場合、天然アミノ酸を使用してもよく、同様に、例えば、化学合成によって作製した非天然アミノ酸を使用してもよい。
【００４５】
本発明による抗体は、他の分子と連結し得る。例えば、抗体は、タンパク質、又はポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリオキシアルキレン等の非タンパク質性ポリマーと連結し得る。抗体をこのような分子と連結することは、当該技術分野において既知であり、標準的な方法で行える。抗体をこのような分子と連結することは、抗体の或る特定の特性、例えば、血中半減期に対する効果を有し得る。
【００４６】
抗体と連結し得る他の分子は、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、放射標識、及び化学的残基（例えば、ビオチン）等の、検出可能又は機能的なタグ又は標識を含む。抗体はまた、毒素、細胞増殖抑制性又は細胞傷害性の分子、及び放射性同位体等の毒物と連結できる。また、抗体は、他の抗体と連結することもできる。
【００４７】
特に好ましい実施例において、抗体は、放射性ヨウ素と連結する。
【００４８】
このような分子を抗体に連結することは、当該技術分野において既知であり、標準的な技法、例えば、共有結合によって実現できる。
【００４９】
本発明は、抗体又はその機能的な断片を生成する方法を含む、抗体を作製する方法であって、
ａ）置換されるべきＣＤＲ１、ＣＤＲ２、若しくはＣＤＲ３のコード領域を含むか、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、若しくはＣＤＲ３のコード領域を持たない、可変ドメインをコードする核酸のレパートリーを用意すること、
ｂ）該レパートリーと、図４４、図４５、図４６、図４７、図４８、図４９、図５０、図６１、図６２、図６３、図６４、及び図６５中の配列から選択される配列と実質的に相同なヌクレオチド配列を有するドナー核酸とを、組み合わせて、可変ドメインをコードする核酸のレパートリーを用意すること、及び
ｃ）レパートリーから核酸を発現することを含む、抗体又はその機能的な断片を生成する方法を含む、抗体を作製する方法も提供する。
【００５０】
ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を置換又は挿入する場合、当業者は、標準的な技法を使用し、単離の際にＣＤＲ配列を挿入できるかどうか、又はフレームワーク領域も挿入すべきかどうかを理解するであろう。当業者は、必要に応じて、フレームワーク領域に適切な変更を加えることができる。
【００５１】
「レパートリー」という用語は、免疫グロブリンをコードする配列に完全に又は部分的に由来するヌクレオチド配列の遺伝的に多様な集合を指す。配列は、上記で示した方法、
又は重鎖のＶセグメント、Ｄセグメント、及びＪセグメント、並びに軽鎖のＶセグメント及びＪセグメントのｉｎ  ｖｉｖｏでの再構成によって生成され得る。あるいは、配列は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの刺激に応じて再構成が起こる細胞から生成することができる。また、配列の一部又は全ては、ＤＮＡスプライシング、ヌクレオチド合成、突然変異誘発、及び他の方法（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい）で得ることができる。
【００５２】
本方法はさらに、ＴＳＨＲと結合する抗体を発現抗体から選別すること、及びそれを単離することを含み得る。ＴＳＨＲを作動する抗体を発現抗体から選別する工程、及びそれを単離する工程を含み得る。
【００５３】
本発明は、このような抗体のＣＤＲ、可変ドメイン、及び他の機能的な断片をコードするヌクレオチド、並びに実質的に相同な配列を含む、本発明による抗体をコードする単離核酸も提供する。核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含んでもよく、（完全に若しくは部分的に）合成又は（完全に若しくは部分的に）組換えであってもよい。
【００５４】
提示したヌクレオチド配列、及びそれに対する言及は、特定の配列を有するＤＮＡ分子を包含すると共に、ＵがＴの代わりに置換した特定の配列を有するＲＮＡ分子を含む。
【００５５】
核酸は、抗体の任意の部分、例えば、ＣＤＲ、可変領域、軽鎖、重鎖、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、抗体全体、又はそれらの任意の他の機能的な断片をコードすることができる。
【００５６】
特に、図４４、図４５、図４６、図４７、図４８、図４９、図５０、図５１、図５２、図５３、図５４、図５５、図５６、図５７、図５８、図５９、図６０、図６１、図６２、図６３、図６４、図６５、図６６、図６７、図６８、図６９、図７０、図７１、図７２、及び図７３に示す配列から選択される配列に対して実質的な相同性を有する単離核酸を提供する。
【００５７】
本発明の核酸は、提示した配列と実質的に相同である。特に、配列は、好ましくは、提示した配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同である。
【００５８】
本発明は、本発明による少なくとも１つの核酸を含む、プラスミド、ベクター、転写カセット又は発現カセット等の構築物も提供する。
【００５９】
少なくとも１つのこのような構築物を含む、宿主細胞も提供する。
【００６０】
さらに、適切な条件下で宿主細胞を培養すること、及びそれにより宿主細胞が核酸から抗体を発現することを含む、抗体を作製する方法を提供する。発現及び産生後、任意の所望の断片又は抗体は、任意の好適な技法を使用して単離及び／又は精製され、その後必要に応じて使用できる。
【００６１】
種々の宿主細胞においてポリペプチドをクローニング及び発現するシステムは、当該技術分野において既知である。好適な宿主細胞としては、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、又は原核細胞（例えば、大腸菌）が挙げられる。当該技術分野において非相同ポリペプチド発現に利用可能な哺乳類細胞としては、リンパ球細胞株（例えば、ＮＳＯ）、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、卵母細胞が挙げられる。
【００６２】
本発明の抗体はモノクローナル抗体であることが特に好ましい。モノクローナル抗体は
、最初にKohler and Milsteinによって記載されたような標準的な方法によって産生することができる。
【００６３】
特に、抗体は、ハイブリドーマを使用して産生され得る。ＥＣＡＣＣ寄託番号０６０３２９０１の第１のハイブリドーマを提供する。ＥＣＡＣＣ寄託番号０６０３２９０２の第２のハイブリドーマも提供する。
【００６４】
本発明によるハイブリドーマによって産生される抗体、又はその機能的な断片も提供する。
【００６５】
さらに、抗体の発現を可能にする条件下で本発明によるハイブリドーマを培養すること、及び培養物から抗体を単離することを含む、抗体を産生する方法を提供する。
【００６６】
当該技術分野において既知の通り、ハイブリドーマは、Ｂリンパ球との腫瘍細胞の融合によって人工的に作製される細胞である。このような細胞は、Kohler 及びMilsteinによって最初に記載されたように、モノクローナル抗体を産生する標準的な方法で産生される。
【００６７】
本発明の抗体には複数の用途がある。第１に、ＴＳＨＲ及びバセドウ病に関する試験の推進に使用され得る。
【００６８】
第２に、抗体には、治療及び診断の用途もある。１つの用途において、抗体は、標的癌細胞、特に甲状腺腫瘍細胞、及び甲状腺腫瘍の転移に使用され得る。抗体は、診断及び治療の両方の目的で、放射性ヨウ素等の放射性化合物を腫瘍細胞に輸送するために（「特効薬手法」）、又は放射性ヨウ素を取り込むように腫瘍細胞を刺激するために、使用することができる。腫瘍細胞は放射性ヨウ素を取り込むと死滅する。また、特効薬手法又は放射性ヨウ素取り込み手順のいずれかを使用して放射活性をスキャンすることによって、それらを同定することができる。
【００６９】
本発明による抗体を含む、医薬的組成物を提供する。
【００７０】
本組成物は、患者への投与に好適である。抗体の他に、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等の、１つ又は複数の適切な医薬的賦形剤を含み得る。医薬的組成物の調製及び賦形剤の使用は、当該技術分野において既知である。他の活性化合物も含まれ得る。医薬的組成物はまた、投与のための指示書と共に、容器、パック、又はディスペンサに同梱され得る。
【００７１】
本発明の医薬的組成物は、意図する投与経路に適合するように製剤化される。投与を実現する方法は、当業者に既知である。局所投与若しくは経口投与され得るか、又は粘膜を介して伝達可能であり得る組成物の作製が可能であり得る。例えば、投与は、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、又は経皮としてもよい。
【００７２】
皮内適用又は皮下適用に使用される溶液又は懸濁液は、典型的には、以下の成分：水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒等の滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム等の酸化防止剤；アセチルエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩等の緩衝剤；及び塩化ナトリウム又はデキストロース等の等張化剤のうち少なくとも１つを含む。ｐＨは、酸又は塩基で調整することができる。このような調製品は、アンプル、使い捨て注射器、又は複数用量のバイアルに封入してもよい。
【００７３】
静脈内投与に使用される溶液又は懸濁液は、生理食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（BASF、ニュージャージー州パーシッパニー）、エタノール、又はポリオール等のキャリアを含む。いずれの場合においても、組成物は、無菌であり、且つ容易に注入できるように流動性がある必要がある。適切な流動性は、レシチン又は界面活性剤を使用して得ることができる場合が多い。組成物はまた、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならない。微生物については、抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等を用いて防止することができる。多くの場合において、等張剤（糖）、ポリアルコール（マンニトール及びソルビトール）、又は塩化ナトリウムが組成物に含まれ得る。組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを添加することによって達成することができる。
【００７４】
経口組成物は、不活性希釈剤又は食用キャリアを含む。組成物は、ゼラチンに封入するか、又は押し固めて錠剤にすることができる。経口投与目的で、抗体に賦形剤を組み込み、例えば、錠剤又はカプセルとして調製することができる。経口組成物は、例えば、結合剤、賦形剤、滑沢剤、及び香料も含有し得る。
【００７５】
組成物は、経粘膜経路又は経皮経路でも投与できる。例えば、Ｆｃ部分を含む抗体は、（Ｆｃ受容体を介して）腸、口腔、又は肺の粘膜を通過できるようにしてもよい。経粘膜投与は、ロゼンジ、鼻腔スプレー、吸入器、又は坐薬の使用を通じて実現することができる。また、経皮投与は、当該技術分野において既知の、軟膏、軟膏剤、ゲル、又はクリームを含有する組成物の使用を通じて実現することができる。経粘膜投与又は経皮投与に関しては、浸透するバリアに対して適切な浸透剤が使用される。
【００７６】
吸入による投与に関しては、抗体は、噴射剤（例えば、液体若しくはガス）又は噴霧器を含有する、圧力容器又はディスペンサ、からエアゾール噴霧で輸送される。
【００７７】
或る特定の実施例において、本発明の抗体は、抗体が身体から迅速排泄されてしまわないように保護するためのキャリアを用いて調製される。生分解性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸）が使用されることが多い。
【００７８】
このような医薬的組成物を調製する方法は、当業者によって既知である。
【００７９】
本発明による抗体又は組成物は、例えば、患者の体重、性別、年齢、及び病状に基づいて決められる、治療的有効量で投与することができる。抗体又は組成物は、単一用量で、ボーラス投与として又は持続的療法として投与することができる。
【００８０】
「有効量」という用語は、甲状腺ホルモンを産生するか、又はヨウ素の取り込みを刺激するために、ＴＳＨＲ活性を刺激するのに十分な投与量又は量を指す。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、「被験者」及び「患者」という用語は、ヒト及びヒト以外の動物を含むことを意図する。被験者は、甲状腺癌又は甲状腺癌の転移を有するヒト患者を含み得る。
【００８２】
本発明の「ヒト以外の動物」という用語は、例えば、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等の全ての脊椎動物を含む。
【００８３】
さらに、療法で使用するための、本発明による抗体又はその機能的な断片を提供する。
【００８４】
特に、本発明は、癌の診断又は治療用の薬剤の調製における、本発明による抗体又はその機能的な断片の用途を提供する。
【００８５】
「癌」という用語は、特に甲状腺の癌、及びこのような癌の転移を指す。
【００８６】
腫瘍細胞の位置を突き止める方法であって、
１）本発明による抗体を患者に投与すること、
２）続いて放射性化合物を患者に投与すること、
３）放射性ヨウ素の存在、局在化、又は蓄積について患者をスキャンすること、及び
４）患者の画像を作成すること、を含む方法も提供する。
【００８７】
さらに、腫瘍細胞の位置を突き止める方法であって、
１）本発明による、放射性化合物と複合体を形成した抗体を、患者に投与すること、
２）放射性化合物の存在、局在化、又は蓄積について患者をスキャンすること、及び
３）患者の画像を作成すること、を含む方法を提供する。
【００８８】
好ましくは、前記放射性化合物は放射性ヨウ素である。
【００８９】
さらに、腫瘍細胞を治療する方法であって、
１）本発明による抗体を患者に投与すること、及び
２）続いて放射性ヨウ素を患者に投与すること、を含む方法を提供する。
【００９０】
腫瘍細胞を治療する方法であって、
１）本発明による、放射性ヨウ素と複合体を形成した抗体を、患者に投与することを含む方法をも提供する。
【００９１】
本発明による抗体は、抗ＴＳＨＲ抗体が存在するか否かについての競合アッセイ等のアッセイでも使用できる。ＴＳＨＲ分子が結合した支持体、及び本発明による標識抗体を含む、試料中に抗ＴＳＨＲ抗体が存在するか否かをアッセイするキットを提供する。
【００９２】
抗ＴＳＨＲ抗体が存在するか否かをアッセイする方法であって、
ａ）ＴＳＨＲが結合した支持体を用意すること、
ｂ）本発明による標識抗体を支持体に加えること、
ｃ）試験試料を支持体に加えること、及び
ｄ）抗体が置換したか否かをアッセイすること、を含む方法も提供する。
【００９３】
本方法において、標識抗体がＴＳＨＲと結合し、結合した抗体量を測定することができる。抗ＴＳＨＲ抗体が試験試料中に存在する場合、それらは標識抗体と競合してＴＳＨＲと結合する。試料中の抗ＴＳＨＲ抗体量は、試料を加える前後の結合した標識抗体量の違いを測定することによってアッセイすることができる。この種の競合アッセイは既知であり、当業者は適切な技法及び支持体装置を使用できる。標識抗体は、検出可能な標識が結合している抗体である。好適な標識は、当該技術分野において既知であり、例は上記で説明している。
【００９４】
試料中の抗ＴＳＨＲ抗体を検出して、例えば、患者におけるバセドウ病又は甲状腺機能低下症を診断できることは有用である。上記で提示した方法は、診断方法として使用することができ、当該方法での試験試料は、患者から採取した血清の試料である。
【００９５】
ここで、本発明のごく一例を、図を参照しながら詳細に説明する。
【実施例】
【００９６】
＜材料及び方法＞
＜ＴＳＨＲ抗体の測定及び甲状腺機能検査＞
評価用試料に応じて、ＴＳＨＲに対する抗体を、原則として製造業者の指示書に従って、生血清５０μｌ及び１００μｌをそれぞれ必要とする、２つの異なるタイプのＴＳＨ結合阻害アッセイ（ブタＴＲＡＫ  ＲＩＡ及びＴＲＡＫ  ＩＩ［ＤＹＮＯｔｅｓｔ  ｈｕｍａｎ］キット）（BRAHMS GmbH、ドイツ）を使用して測定した（文献１）。結果を、125Ｉ−ＴＳＨ結合の阻害％として表した。平底９６ウェルプレート内に３０,０００細胞／ウェルを播種してから２４時間後、ＴＳＡｂ活性及びＴＳＢＡｂ活性を、ヒトＴＳＨＲを安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を使用するバイオアッセイによって測定した（文献１、２）。アッセイ前に、培地を、スクロース、及び０．５ｍＭイソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、Sigma-Aldrich）を補充したＨＥＰＥＳを含有する、塩化ナトリウムを含まない等張のHankの緩衝溶液（ＨＢＳＳ）で置換して、ホスホジエステラーゼ活性を阻害した（文献１、２）。アッセイは、スクロースを１３０ｍＭ  ＮａＣｌで置換した、等張のＨＢＳＳを含有する生理食塩水中でも行った。適切なＨＢＳＳ培地中で希釈した、ウシＴＳＨ（ｂＴＳＨ、Sigma-Aldrich）（４０μＵ／ｍｌ）、被検血清（３μｌ）、又は精製ＩｇＧを３連で各ウェルに添加し、３７℃で４時間インキュベートした。培地中に放出されたｃＡＭＰを、ＲＩＡ（R&D systems）で測定し、文献２に記載したように、結果を、ｐｍｏｌｓ／ｍｌ、又は培地で得られる基底値を上回る刺激として表した。先に記載したように（文献２）、ＴＳＢＡｂを、準飽和用量のｂＴＳＨ（４０μＵ／ｍｌ）に被検試料又は対照血清を添加し、ｃＡＭＰのＴＳＨ介在性刺激の低下を測定することによって同様に検出した。本発明者らの研究室では、アッセイ間及びアッセイ内のＴＳＡｂに対する変動係数を、それぞれ１６％未満及び１４％未満と測定し、ＴＳＢＡｂに対しては、それぞれ２４％及び１１％未満と測定した（文献２）。総甲状腺ホルモン（ＴＴ４）を、基底値決定用に４つの正常ＢＡＬＢ／ｃ動物由来の血清を使用して、血清２５μｌを用いたＲＩＡ（DS Labs、英国）によって求めた。
【００９７】
＜組換えアデノウイルス＞
ヒトＴＳＨＲホロ受容体を発現する組換えアデノウイルス（ＴＳＨＲ−Ａｄ）を、ＡｄＥａｓｙアデノウイルスベクターシステム（Quantum Biotechnologies）を使用して構築した。簡潔に述べると、ＴＳＨＲ  ｃＤＮＡ（文献２６）を、ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩによる消化によってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＳＫ−から切り出し、アデノウイルス導入ベクター（ｐＳｈｕｔｔｌｅＣＭＶ）（Quantum Biotechnologies）にライゲートした。ｐＳｈｕｔｔｌｅＣＭＶ／ｈＴＳＨＲ  ＣＭＶベクターのＰｍｅＩによる直鎖化、及びアルカリホスファターゼによる処理の後、直鎖ＤＮＡを、ウイルスＤＮＡであるｐＡｄＥａｓｙ−１を含有するスーパーコイルプラスミドと共に、エレクトロコンピテントな大腸菌ＢＪ５１８３への電気穿孔法によって同時形質転換した。組換え体を、カナマイシンで選別し、抽出し、ＰａｃＩで消化して、ＩＴＲを曝露し、最後にＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトすることにより、ウイルス粒子を生成した。ヒトＴＳＨＲ−Ａサブユニット（アミノ酸１〜２８９）を含有するアデノウイルス（Ａサブユニット−Ａｄと称される）を使用した。β−ガラクトシダーゼを発現するアデノウイルスを対照として使用し、ＡｄＥａｓｙシステムを使用して調製した。全てのウイルス構築物を、ＨＥＫ２９３細胞内で増殖させ、ＣｓＣｌ勾配遠心分離で２回精製し（文献３、４）、ＰＢＳに対して透析し、ウイルス濃度を、２８０ｎｍでの吸光度により求めた。精製アデノウイルスを分注し、−８０℃で保存した。
【００９８】
＜ハイブリドーマ用の動物の免疫及び選別＞
全てのマウスは、Harlan UK Ltd.から入手した。ヒトＴＳＨＲホロ受容体を発現する組換えアデノウイルス（ＴＳＨＲ−Ａｄ）を、ＡｄＥａｓｙアデノウイルスベクターシステ
ム（Quantum Biotechnologies）を使用して構築した。簡潔述べると、ＴＳＨＲ  ｃＤＮＡ（文献１）を、ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩによる消化によってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＳＫ−から切り出し、アデノウイルス導入ベクター（ｐＳｈｕｔｔｌｅＣＭＶ）（Quantum Biotechnologies）にライゲートした。ｐＳｈｕｔｔｌｅＣＭＶ／ｈＴＳＨＲ  ＣＭＶベクターのＰｍｅＩによる直鎖化、及びアルカリホスファターゼによる処理の後、直鎖ＤＮＡを、ウイルスＤＮＡであるｐＡｄＥａｓｙ−１を含有するスーパーコイルプラスミドと共に、エレクトロコンピテントな大腸菌ＢＪ５１８３への電気穿孔法によって同時形質転換した。組換え体を、カナマイシンで選別し、抽出し、ＰａｃＩで消化して、ＩＴＲを曝露し、最後にＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトすることにより、ウイルス粒子を生成した。ヒトＴＳＨＲ−Ａサブユニット（アミノ酸１〜２８９）を含有するアデノウイルス（Ａサブユニット−Ａｄと称される）を得た（文献３、４）。Ａサブユニット−Ａｄの注射では、１０9粒子の低用量免疫プロトコルを使用した（文献４）。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（１６匹、７週齢〜８週齢）を上記のように免疫し、２回目の注射後、１週間及び３週間生育し、個々にＴＳＡｂ活性を検査した。一貫してＴＳＡｂ活性が上昇した動物は、Ａサブユニット−Ａｄの３回目の注射を受けた。１週間後、これに続けて、ＧＰＩ−アンカーを介してＴＳＨＲ外部ドメインを発現するＣＨＯ細胞（ＰＢＳ  ５００μｌ中２×１０6細胞）の追加免疫腹腔内注射を行った（文献５）。３日後、動物を屠殺し、脾臓をハイブリドーマ産生用に無菌的に切除した後、血清用に心穿刺で採血し、組織学的分析用に甲状腺を切り出した。全ての動物実験は、獣医の福祉ケアを完備し、内務省規則（英国）及びロンドン大学キングスカレッジの承認の下で実施した。
【００９９】
＜ハイブリドーマのスクリーニング、及びクローニング＞
２０％  ＦＣＳ、２ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び０．０１％  ＰＳＦ（全てInvitrogen、英国製）を含有するＲＰＭＩ培地中のハイブリドーマ産生用のＰＥＧ融合培地（５０％溶液、Immune Systems Ltd、英国）を使用して、脾臓細胞懸濁液を、Ｘ６３−Ａｇ８６５３ミエローマ細胞と５：１の比で融合し、９６ウェルプレートに平板培養した。ハイブリドーマを、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地、Invitrogen）並びにＨＴ培地（Immune Systems Ltd）下で選別した。増殖を示すウェル由来の上清（１００μｌ）のＴＢＩＩ活性を、ＴＲＡＫ  ＩＩ（ＤＹＮＯｔｅｓｔ  ｈｕｍａｎ）キットを使用して検査した。陽性ウェルを拡大培養し、ハイブリドーマフィーダーサプリメントＤｏｍａ  Ｄｒｉｖｅ（Immune Systems Ltd）を１０％〜２０％補充した培地中で０．３細胞／ウェルで２回サブクローニングした。ハイブリドーマを、マウスモノクローナルアイソタイピングキット（Serotec、英国）を使用してアイソタイピングした。ＩｇＧを、プロテインＡセファロースクロマトグラフィによって組織培養上清から精製し（文献６）、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって純度を評価し、Bradfordのタンパク質アッセイによってタンパク質を定量した。
【０１００】
＜Ｆａｂ断片の調製＞
Ｆａｂ断片を、ＩｇＧ  ２．５ｍｇ、１Ｍシステイン（２５μｌ）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ（２５μｌ）、及び１ｍｇ／ｍｌのパパイン（Sigma-Aldrich）を含む酢酸緩衝液（５μｌ）を使用して、パパインで消化することによってＩｇＧから調製し、３７℃で一晩インキュベートした（文献６）。１００ｍＭヨードアセトアミド（１１０μｌ）を添加して反応を終結させた後、消化物を、プロテインＡセファロースと４℃で１時間混合した。短時間の微量遠心管遠心分離工程の後、上清を回収し、一晩ＰＢＳに対して透析した。Ｆａｂ断片の純度を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって調べ、ＴＳＨＲ反応性を、ＴＢＩＩ活性を評価することによって確認した。
【０１０１】
＜ＩｇＧ及びＦａｂ断片のヨウ素化、及び置換試験＞
ＰＢＳ  １０μｌ中の、０．２５ｎＭのＫＳＡｂ１又はＫＳＡｂ２の、ＩｇＧ又はＦａｂ断片を、ヨードジェン被覆チューブを使用して、室温で１０分間インキュベートするこ
とによって、125Ｉ−Ｎａ  ５μｌで標識した。遊離の同位体を、セファロースＧ２５カラムでのゲル濾過によって除去し、特異的な活性を算出した（文献７）。抗体親和性を飽和結合分析によって測定した。簡潔に述べると、異なる濃度の、ＫＳＡｂ１又はＫＳＡｂ２の125Ｉ標識ＩｇＧを、ヒトＴＳＨＲ被覆チューブ（ＴＲＡＫ  ＩＩ［ＤＹＮＯｔｅｓｔ  Ｈｕｍａｎキットによる）に２連で添加し、キットの結合緩衝液中で最終容積２００μｌで再懸濁し、平衡状態に達するまで低温室で一晩インキュベートした。チューブをキットの洗浄緩衝液中で３回洗浄した後、結合した125Ｉ−ＩｇＧを、γ線計数器（DPC laboratories、英国）で放射活性を計測することによって測定した。非特異的な結合を控除し、５０％飽和でのＫｄ値を、Ｅｘｃｅｌソフトウェアを使用して算出した。親和性の結果を、Ｋｄ値の逆数（Ｌ／ｍｏｌ）として表した。
【０１０２】
上記と同様に、競合試験を実行した。異なる濃度の非標識ＩｇＧ又はＦａｂ断片を、結合緩衝液（ＴＲＡＫ  ＩＩ［ＤＹＮＯｔｅｓｔ  ｈｕｍａｎ］キットによる）中で最終容積２００μｌで再懸濁し、キットのヒトＴＳＨＲ被覆チューブに添加した。室温で振盪しながら２時間のインキュベートした後、チューブを、キットの洗浄緩衝液で２回洗浄した。準飽和濃度の125Ｉ標識ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ又はＫＳＡｂ２  ＩｇＧを添加し、１時間インキュベーションを継続し、チューブを洗浄し、γ線計数器で計測した。バセドウ病患者由来の血清との競合では、血清１００μｌを、上記ヒトＴＳＨＲ被覆チューブに添加した。125Ｉ標識ＫＳＡｂ１又はＫＳＡｂ２の結合の阻害を求め、阻害％として表した。
【０１０３】
＜甲状腺をｉｎ  ｖｉｖｏで刺激するためのＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧの注射＞
異なる用量の、ＫＳＡｂ１又はＫＳＡｂ２の精製ＩｇＧの注射を、静脈内経路及び腹腔内経路で実施した。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（１８匹、７週齢〜８週齢）を、抗体１０μｇ又は１００μｇを含有する滅菌ＰＢＳ（５０μｌ）中のＫＳＡｂ１  ＩｇＧ又はＫＳＡｂ２  ＩｇＧの尾静脈への単回静脈内注射で処置した（各群３匹）。別の群のマウスを、滅菌ＰＢＳ中のＫＳＡｂ２  ＩｇＧ（１００μｇ）の単回腹腔内注射で処置した。対照用に、動物に、膵島細胞抗原、グルタミン酸脱炭酸酵素に特異的なアイソタイプ適合ＩｇＧ
ｍａｂ（ｍａｂ  ＧＡＤ−１）１００μｇを静脈内注射した。全ての動物を、注射後７時間、２８時間、及び７０時間生育し、血清ＴＴ４レベルを求めた。マウスを７０時間で屠殺し、甲状腺を組織学的分析用に切り出した。
【０１０４】
＜甲状腺組織診断＞
甲状腺をホルマリン中で固定し、ホルマリン中で加工した。幾つかの切片を、形態分析用にヘマトキシリン及びエオシンで染色した。固定した甲状腺切片上のＢ細胞及びＴ細胞を検出するために、抗マウスＣＤ２０（後にＩｍｍｕｎｏＣｒｕｚ抗ヤギキット（Santa Cruz Biotechnology）により検出される）、ラット抗マウスＣＤ４  ｍａｂ及びラット抗マウスＣＤ８  ｍａｂ（後にビオチン化抗ラット抗体（Vector laboratories、英国）により検出される）、及びストレプトアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体（Dako、デンマーク）を用いて免疫組織化学的検査を実施した。加圧加熱による染色前に、ＣＤ２０抗体及びＣＤ８抗体に関してはｐＨ６．０で、ＣＤ４抗体に関してはｐＨ９．０で、抗原回復を実施した。
【０１０５】
＜結果＞
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＴＳＨＲホロ受容体を発現する組換えアデノウイルス（ＴＳＨＲ−Ａｄ）及びＴＳＨＲ−Ａサブユニットを発現する組換えアデノウイルス（Ａサブユニット−Ａｄ）で免疫して、バセドウ甲状腺機能亢進症を誘発した。抗ＴＳＨＲ抗体に対する初回評価を、全動物の個々の試料種のＴＳＡｂに対して実施した。
【０１０６】
２回目の注射の１週間後、９匹がＴＳＡｂ活性に関して陽性（５６％）であり、基底レ
ベルの３．１倍〜９２．６倍の範囲で活性が上昇した（表１）。１１匹（６８％）は、血清ＴＴ４レベルの有意な上昇を示したため、甲状腺機能亢進であった（表１）。これらの結果は、Chen及び共同研究者らのものと完全に一致する（文献４）。最も高く安定したＴＳＡｂレベルを有するこの群由来の１匹を、ハイブリドーマ産生用に選別し、Ａサブユニット−Ａｄの３回目の注射で追加免疫した。その１週間後、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカーによって原形質膜細胞表面に連結した、高レベルのヒトＴＳＨＲ外部ドメインを発現するＣＨＯ細胞を腹腔内注射して、抗体を分泌する脾臓Ｂ細胞集団を増殖させた。屠殺時に選別した動物由来の血清から、ＴＴ４が上昇して甲状腺機能亢進である（１３４μｇ／ｍｌ、対照ＢＡＬＢ／ｃマウス５６．２５μｇ／ｍｌ±８．２６μｇ／ｍｌ）と共に、ＴＢＩＩ活性に関して高度に陽性である（125Ｉ−ＴＳＨ結合を８７％阻害する）ことが示された。
【０１０７】
＜モノクローナル抗体＞
培養上清（１００μｌ）を、７０％〜８０％集密のウェルから回収し、ＴＲＡＫ  ＩＩ［ＤＹＮＯｔｅｓｔ  ｈｕｍａｎ］キットを使用して、ＴＢＩＩ活性を適切に検査した。２５０ウェル全部をスクリーニングした結果、３ウェルが陽性であった（ウェル９、９８％阻害；ウェル１７、９６％阻害、及びウェル２３３、８０％阻害）。増殖時、ウェル２３３の一次細胞株のＴＢＩＩ活性は急速に低下した。残る２系列を、１ウェル当たり０．３細胞で２回クローニングし、ＫＳＡｂ１及びＫＳＡｂ２と新たに命名し、これらを７ヶ月超の間、継代培養した。ＫＳＡｂ１及びＫＳＡｂ２の、重鎖及び軽鎖のサブタイプをそれぞれ、ＩｇＧ２ｂ／ｋ及びＩｇＧ２ａ／ｋと示す。
【０１０８】
＜ｍａｂの甲状腺刺激活性＞
ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧは共に、ヒトＴＳＨＲを安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞においてｃＡＭＰ産生を刺激した。初回の用量反応試験を、ＴＳＡｂ検出の感度上昇に日常的に使用される、ＮａＣｌを含まないスクロース含有培地中で行った（文献８）。図１Ａに示すように、用量反応試験において、ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧは共に、ＴＳＨＲを刺激して、準飽和用量のｂＴＳＨを用いて達成される反応の９８％超に到達することによって、典型的なＳ字形曲線を示した。しかしながら、両ｍａｂは、ほぼ最大のｃＡＭＰ刺激反応を達成することによって完全アゴニスト活性を示すが、低ＩｇＧの用量ではｃＡＭＰ刺激反応に違いを示した。したがって、全体としてＫＳＡｂ１及びＫＳＡｂ２はそれぞれ、基底値の１９９倍及び１８３倍の最大刺激を示し、１．２ｎｇ／ｍｌ及び２．２ｎｇ／ｍｌのＩｇＧで得られる刺激の３倍であった（図１Ａ）。ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧに対するＥＣ50値をそれぞれ、９．４ｎｇ／ｍｌ及び９３ｎｇ／ｍｌと確定した（図１Ａ）。ＫＳＡｂ１及びＫＳＡｂ２のＦａｂ断片は、完全親ＩｇＧに対しても同様のＴＳＡｂ反応を示す（図１Ａ）ため、ＴＳＨＲに対する完全アゴニストとしても働く。
【０１０９】
本発明者らは、生理的塩濃度下でも用量反応試験を実施したが、これらのアッセイ条件は、無塩のスクロース含有等張ＨＢＳＳ緩衝液の使用に比べて感度の低下を示した（文献８）。ＴＳＨ誘発ｃＡＭＰ産生の用量反応は、ＮａＣｌ含有緩衝液で有意に変化せず、４０μＵ／ｍｌで最大刺激を与えた（図示せず）。重要なことに、ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧは共に、完全アゴニスト活性を示し続け、最大のｃＡＭＰ刺激反応は、準飽和用量のｂＴＳＨを用いて得られる反応の９８％超に到達した（図１Ｂ）。典型的なＳ字形用量反応曲線が観察されたが、これも低用量では、ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧのｃＡＭＰ刺激活性の違いを示した（図１Ｂ）。生理的塩条件下、ＫＳＡｂ１及びＫＳＡｂ２はそれぞれ、１ｎｇ／ｍｌ未満及び３ｎｇ／ｍｌの濃度で活性であり続けた。ＩｇＧはそれぞれ、１６．５ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌというｎＭ範囲のＥＣ50値を示した（図１Ｂ）。さらに、ＫＳＡｂ１及びＫＳＡｂ２のＦａｂ断片も同様のｃＡＭＰ刺激活性を示した（図１Ｂ）。
【０１１０】
＜ＴＳＨ介在性刺激阻害（ＴＳＢＡｂ）活性＞
ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧがＪＰ０９細胞においてｃＡＭＰのＴＳＨ介在性刺激を阻害する能力を、ＴＳＨ介在性刺激阻害アッセイで測定した。アッセイでは、異なる濃度のＩｇＧを調べて、阻害活性が抗体濃度に依存しないことを保証した。ＫＳＡｂ１  ＩｇＧがＴＳＢＡｂ活性を殆ど示さない一方、ＫＳＡｂ２  ＩｇＧは、ＫＳＡｂ２のアゴニスト活性の準飽和濃度未満である、２４０ｎｇ／ｍｌに等価な検査した全ての抗体濃度（３０ｎｇ／ウェル以下）で、２０％超のＴＳＢＡｂ活性を再現性よく示した。結果的に、ＫＳＡｂ２は、ｃＡＭＰに対するＴＳＨ介在性刺激に対して弱く拮抗して作用した（図２）。興味深いことに、ＫＳＡｂ１  ＩｇＧもＫＳＡｂ２  ＩｇＧも、ＥＬＩＳＡによってＴＳＨＲ外部ドメインの一揃いの合成ペプチド中の特異的なペプチドとの反応性を全く示さず（文献２）、受容体上の立体構造エピトープの認識に関する有力な証拠を示した（図示せず）。
【０１１１】
＜ＴＳＨ結合阻害免疫グロブリン（ＴＢＩＩ）＞
ＴＲＡＫ  ＩＩ［ＤＹＮＯｔｅｓｔ  ｈｕｍａｎ］キットを使用するＴＢＩＩアッセイにおいて、ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧの用量反応分析から、３．３ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎｇ／ｍｌの濃度が125Ｉ−ＴＳＨ結合活性の５０％阻害を与えるのに十分であることが示された（図３）。さらに両ｍａｂに関して、０．７ｎｇ／ｍｌ〜４．４ｎｇ／ｍｌの濃度で２０％阻害を達成した一方、１００ｎｇ／ｍｌの濃度では、十分に９５％阻害を示せた（図３）。Ｆａｂ断片は、完全親ＩｇＧと同様のＴＢＩＩ活性を与えた（図３）。
【０１１２】
＜ＫＳＡｂ１及びＫＳＡｂ２の競合試験＞
ヒトＴＳＨＲ被覆チューブ（ＴＲＡＫ  ＩＩ［ＤＹＮＯｔｅｓｔ  ｈｕｍａｎ］キットによる）を使用する飽和結合分析によって、125Ｉ標識ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧは共に、受容体と高い親和性（それぞれＫｄ＝４．５×１０10Ｌ／ｍｏｌ及びＫｄ＝６．２５×１０10Ｌ／ｍｏｌ）で結合した（図４）。次に、ｍａｂの標識ＩｇＧ及びＦａｂ断片を、競合試験におけるトレーサーとして使用して、受容体上のエピトープについて試験した。本発明者らは、標識ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧが、バセドウ病患者由来のＴＳＨＲに対する異種自己抗体を置換するかどうかについて調査した。自己免疫の家族歴のない正常個体由来の血清を対照として使用した。図５Ａに示すように、バセドウ病患者由来の血清は、固定化受容体とのＫＳＡｂ１又はＫＳＡｂ２の結合を阻害した。さらに、異なる血清は、標識ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧの両方と同様程度競合したが、その阻害活性は異なり、異なる患者由来の血清における抗ＴＳＨＲ自己抗体の異種性が示唆される（図５Ａ）。他の病態で存在するＴＳＨＲ上の自己免疫決定基を調査するために、本発明者らは、受容体との結合でも標識ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ又はＫＳＡｂ２  ＩｇＧと競合する、自己免疫性甲状腺機能低下症患者由来の強い阻害活性を有する血清を評価した（図５Ａ）。最後に、ヒトＴＳＨＲ被覆チューブ上の準飽和濃度の125Ｉ−ＩｇＧを使用して、ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧを互いに競合させたところ、それらのエピトープがＴＳＨＲ上で重なり合うことが示された（図５Ｂ）。さらに、ＫＳＡｂ１及びＫＳＡｂ２のＦａｂ断片も互いに競合し、ＴＳＨＲ上のそれらの決定基の密接な関連が示唆された（図５Ｃ）。
【０１１３】
標識ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧをトレーサーとして使用する置換試験も、受容体上の直鎖の決定基に特異的であり、且つ甲状腺刺激活性を殆ど示さない別パネルの抗ＴＳＨＲ  ＩｇＧ  ｍａｂを用いて実施した（文献９）。ＫＳＡｂ１  ＩｇＧもＫＳＡｂ２  ＩｇＧも、受容体のアミノ領域、中間領域、及びカルボキシ末端領域にそれぞれ位置する残基に特異的なｍａｂ  Ａ１０、ｍａｂ  Ａ９、及びｍａｂ  Ａ７と全く競合を示さなかった（文献９）（図示せず）。したがって、ＴＳＨＲ上の刺激エピトープは、
このパネルの抗ＴＳＨＲ  ｍａｂによって認識される直鎖のエピトープとは異なる。
【０１１４】
＜ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧを用いた受身移入試験＞
本発明者らは、未処置マウスへのＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧのｉｎ  ｖｉｖｏでの注射の効果を、甲状腺機能亢進症誘発の観点から評価した。本発明者らは、２つのｍａｂが、有意に甲状腺機能が亢進したマウスに由来したので、ＫＳＡｂ１及びＫＳＡｂ２がマウスＴＳＨＲと交差反応すると予想した。各ｍａｂの２つのＩｇＧ用量１０μｇ及び１００μｇを、でマウスに静脈注射し、高チロキシン血症の誘発を異なる時点で判定した。対照として、膵島細胞抗原に対するアイソタイプ適合ｍａｂ  ＧＡＤ１を使用した。図６の結果は、ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧが共に病原性であることを示し、１０μｇ用量又は１００μｇ用量のＫＳＡｂ１及び１００μｇ用量のＫＳＡｂ２により、投与から７時間内に高チロキシン血症を特徴とする急速な甲状腺刺激反応を生じた。血清チロキシンレベルは、７０時間までに基線に戻った。１０μｇ用量でのＫＳＡｂ２の注射は、ＴＴ４レベルの上昇の際により遅延した反応を示し、２８時間でピークとなった（図６）。本発明者らは、ＫＳＡｂ２  ＩｇＧの腹腔内注射の効果も調べ、これは、静脈内送達によって介在される刺激と対応していた（図６）。これらの結果からも、マウスＴＳＨＲに対するＫＳＡｂ１及びＫＳＡｂ２の交差反応性が確認された。
【０１１５】
ＫＳＡｂ１及びＫＳＡｂ２処置マウス由来の甲状腺の組織学的分析から、対照ｍａｂで処置した動物由来の腺に比べて、濾胞及び上皮両方の変化が示された（図７、パネルＡ〜パネルＦ）。対照ＧＡＤ１  ｍａｂ処置動物由来の甲状腺（図７、パネルＡ）とは対照的に、ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧ処置マウス由来の甲状腺瀘胞は、大きさ及び形状が一定せず、焦点地域は、濾胞内腔の崩壊に関連した内腔コロイドの全損を示し、他のエリアでは、コロイドは、淡く、薄く、細かな空胞があるようにも見える（図７、パネルＢ〜パネルＥ）。さらに、淡いコロイドを含有する濾胞は、扁平で且つ減弱した上皮細胞に内側を覆われている一方、コロイドを含まない濾胞は、多層化した円柱細胞及び立方細胞から成る上皮細胞の内層を示した（図７の破線矢印）。さらに、個々の壊死細胞は、内腔コロイド内に存在し、ピクノティックな核を有する濾胞の内層上皮内にも存在する（図７、パネルＦ）。最後に、Ｈ＆Ｅ切片の組織学的分析からは、用量又は投与経路とは無関係に、ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧ処置動物の腺への単核細胞浸潤は明らかでなかった（図７、パネルＢ〜パネルＦ）。これは、甲状腺の免疫組織化学的染色によってさらに実証され、それにより、マウスＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ２０に対する抗体を用いた染色は、Ｂ細胞浸潤もＴ細胞浸潤も同定できなかった（図示せず）。
【０１１６】
＜抗体を用いた断片の比較＞
図７９に示す配列である、重鎖可変領域断片及び軽鎖可変領域断片を、大腸菌でｒＦａｂ断片として発現し、精製し、ＴＳＨ結合阻害アッセイ、及びＴＳＨＲ刺激後のｃＡＭＰ蓄積の測定によってＴＳＨＲとの結合を検査した。両断片はＴＳＨＲと結合した。断片及び抗体間の結合の違いは、断片の立体障害に起因する可能性があり、使用する発現系に由来する。図７５及び図７６に、アッセイの結果を示す。
【０１１７】
＜抗体はクローン的に関連する＞
２つの抗体の進化的発生の調査から、両方とも同一の前駆未処置Ｂ細胞から生じることが示唆される。抗体は、同一の生殖細胞系列の遺伝子再構成を有する。ＶH領域及びＶL領域には、多数の体細胞超変異がある。しかしながら、ＶH領域が明確に共通の祖先を有し、且つ多数の変異を共通して有する一方、ＶL領域はこのような保存配列を有さない。特定の理論に縛られることなく、本発明者らは、ＶH領域が抗体及び断片におけるアゴニスト機能の主な役割に貢献することを提唱した。このことを確認するために、本発明者らは、抗体の軽鎖を入れ替え、ＴＳＨ結合阻害アッセイ及びｃＡＭＰアッセイを実施した。図７７及び図７８に、これらのアッセイの結果を示す。この結果から、ＶH領域が機能決定
の際に重要であることが示唆される。
【０１１８】
＜考察＞
ＴＳＨＲに対するアゴニスト活性を有するｍａｂの生成は、多くの研究室の念願の目標となっており、つい最近になって実現された（文献１０）。この業績の進展は、抗体誘発性甲状腺機能亢進症の実行可能な実験モデルの確立に依存してきた。しかしながら、１つの大きな例外が、真の病原抗体の本質的性質すべてを有するヒトＩｇＧモノクローナル抗体の顕著な業績であった（文献１１）。実験モデルに由来する幾つかの甲状腺刺激ｍａｂのうち、１つのみが、完全アゴニスト活性、及びヒトの障害に存在するものと適合する力価を示した（文献１２）。この試験で記載されるｍａｂである、ＫＳＡｂ１及びＫＳＡｂ２がこのカテゴリーの疾患関連抗体に入るのは、それらが（ｉ）ヒトＴＳＨＲに対する完全アゴニスト活性、（ｉｉ）ナノグラム量のＩｇＧでの力価、（ｉｉｉ）１０10Ｌ／ｍｏｌ範囲でのヒトＴＳＨＲに対する高親和性、及び（ｉｖ）甲状腺機能亢進症の誘発を伴うｉｎ  ｖｉｖｏでの病原性を示すためである。
【０１１９】
本発明者らの結果は、ＴＳＨＲ上のＫＳＡｂ１及びＫＳＡｂ２のエピトープが、事実上立体構造であり、且つ患者の自己抗体によって認識される自己反応性決定基と重なり合う可能性が高いことを示す。ＴＳＨＲ上のそれらのエピトープが、互いに密接に関連する可能性が高いのは、ＫＳＡｂ１及びＫＳＡｂ２の小さめのＦａｂ断片も、受容体との結合を競合するためである。さらに、これらのエピトープも、ＴＳＨＲと結合するＴＳＨに対する強い拮抗作用に関連した決定基と重なり合うという本発明者らの知見は、受容体刺激及びＴＳＨ拮抗作用に関連した受容体エピトープの密接な関係に関する先の試験と一致する（文献１２、１３）。
【０１２０】
ＫＳＡｂ１及びＫＳＡｂ２を用いた本発明者らの試験の顕著な態様は、完全アゴニストＴＳＨＲ活性を有する２つの甲状腺刺激ｍａｂの誘導に基づいており、それらの挙動の比較を可能にする。ＫＳＡｂ１及びＫＳＡｂ２は同程度の親和性を有するが、特に、非常に低用量のＴＳＨでｃＡＭＰ生成に違いを示す。
【０１２１】
強力なＴＳＡｂ活性を有する抗体は病原性であり、甲状腺機能亢進状態の直接の原因となる。個々のマウスにおける血清チロキシンレベルの調査から、ホルモンレベルが血清ＴＳＡｂ活性と相関しない多くの動物が示された。このことが驚くべきことでないのは、不一致も、ヒト患者、及び誘発性バセドウ病の各種モデルの両方で認められるためである（文献１、３、１４、１５）。本発明者らは、急性試験において、ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧの受身移入によってこれらの抗体が動物で急速な甲状腺機能亢進症をもたらすことを確認した。さらに、ＫＳＡｂ２注射の腹腔内経路も、血清ＴＴ４レベルの上昇につながり、その動態は静脈内経路と対応していた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの実験において低用量で観察されるＫＳＡｂ１及びＫＳＡｂ２間の力価の違いもｉｎ  ｖｉｖｏでの試験で明らかであった。したがって、被検用量１０μｇ及び１００μｇで血清チロキシンの上昇の同様な誘発を示したＫＳＡｂ１による誘発性甲状腺機能亢進症とは対照的に、ＫＳＡｂ２のＩｇＧ  １０μｇという低用量の静脈内注射は、動物において誘発性甲状腺機能亢進症の遅延した動態を示した。しかしながら、１０μｇ用量又は１００μｇ用量のいずれかの、ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ又はＫＳＡｂ２  ＩｇＧのいずれかを用いて、最大血清チロキシンレベルに達すると、ホルモンレベルは、注射後７０時間までに基底レベルに達するまで同様の動態で減少した。
【０１２２】
興味深いことに、注射後７０時間での甲状腺の組織学的分析により、刺激効果及び細胞障害効果の両方を示唆する形態変化が示された。刺激効果は、多層化及び内腔の崩壊に関連したコロイド形成の減少を伴う過形成濾胞の病巣から明らかなように、増殖性の上皮変化を特徴とした。細胞障害効果は、内層上皮内の個々の細胞壊死、及びコロイド物質内に
存在する瀕死の甲状腺細胞として示された。これらの細胞障害効果は、ＴＳＡｂによって腺内で誘発された甲状腺ホルモン産生の増加の結果として媒介され、甲状腺濾胞の先端面内での過酸化水素の大量蓄積につながる可能性が高い（文献１６、１７）。バセドウ病患者の腺に存在するような単核細胞浸潤物の証拠はなかった。ｍａｂ投与の長期慢性試験は、甲状腺内に炎症性変化をもたらし得ることができるが、それらの強力なＴＳＡｂ  ｍａｂを用いた同様の急性試験において、Costagliola及び共同研究者らのグループが、甲状腺機能亢進マウスの腺への単核細胞浸潤を報告したのは興味深い（文献１２）。ＴＳＡｂ
ｍａｂ単回注射後の彼らの試験での時間枠は、この報告での急性試験の時間枠と類似しているため、このことは、おそらくＴＳＨＲ上の異なるエピトープに対する抗体が、甲状腺における炎症性反応に関係し得ることを示唆している（文献１２）。Davies及び共同研究者らによる別の最近の試験では、この試験（文献１８）で報告されるものより弱いＴＳＡｂ活性を有する、ＴＳＨＲに対するハムスターｍａｂを使用して、マウスに対するｍａｂ投与の急性効果及び慢性効果の両方が調べられた（文献１９）。このハムスターｍａｂを、本明細書中で報告される強力な刺激ｍａｂと関連付けるのは難しいが、慢性刺激は、動物で高チロキシン血症を誘発しなかったが、受容体の脱感作、並びに甲状腺における肥大及びコロイド欠乏等の相当な形態変化をもたらした（文献１９）。にもかかわらず、ハムスターｍａｂによる慢性刺激後の動物の甲状腺への単核細胞浸潤の報告はなかった（文献１９）。
【０１２３】
ＫＳＡｂ１及びＫＳＡｂ２等の強力な甲状腺刺激ｍａｂの開発は、自己免疫疾患に関連したＴＳＨＲ及びエピトープの分子的精査に道を開く。ＫＳＡｂ１及びＫＳＡｂ２によって認識されるＴＳＨＲ上の立体構造エピトープのマッピングは、突然変異誘発を併用したファージランダムペプチドライブラリースクリーニングによって実施できる（文献２０）。これは、ＴＳＨＲ上の甲状腺刺激に関連したエピトープ、及びそれら細胞内シグナル伝達様式の特性化に役立つ。これらのシグナル伝達事象の理解は、ＴＡＯ及び限局性粘液水腫等のバセドウ病の合併症にも関連し得る。最後に、ＫＳＡｂ１及びＫＳＡｂ２に対する抗イディオタイプ抗体を生成して、バセドウ病患者に存在する、個々のクローン型の抗ＴＳＨＲ抗体特異性を同定することにより、将来の試験を治療への反応に関連付けることができるため、再発の危険性のない個々の患者に対するテーラー療法が可能になる。
【０１２４】
【表１】
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【０１２５】
【表２】
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【０１２６】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−８】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
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【表３−１２】
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【表３−１３】
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【表３−１４】
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【０１２７】
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【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】ヒトＴＳＨＲを安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞における、バイオアッセイによって評価したＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＦａｂ断片、並びにＫＳＡｂ２  ＩｇＧ及びＦａｂ断片の甲状腺刺激抗体活性（ＴＳＡｂ）の用量反応曲線を示す図である。材料及び方法の項で記載したように、様々な濃度のＫＳＡｂ１  ＩｇＧ（■―■）及びＦａｂ断片（■---■）並びにＫＳＡｂ２  ＩｇＧ（▲―▲）及びＦａｂ断片（▲---▲）（ｎｇ／ｍｌ）を、（Ａ）スクロース及びＨＥＰＥＳを含有し、塩化ナトリウムを含有しない等張ＨＢＳＳ緩衝液、又は（Ｂ）塩化ナトリウムを含有する生理的等張ＨＢＳＳ緩衝液中で、ヒトＴＳＨＲを安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に添加して、刺激されたｃＡＭＰを測定した（ｐｍｏｌ／ｍｌ）。塩化ナトリウムを含有せずかつ生理的等張の培地における準飽和用量のｂＴＳＨのｃＡＭＰ反応はそれぞれ、１６４ｐｍｏｌ／ｍｌ及び１５７ｐｍｏｌ／ｍｌであった。示した結果は、３連で実施した、少なくとも３つの独立した実験の代表例である。
【図２】ＫＳＡｂ１（□）ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２（■）ＩｇＧの甲状腺刺激阻害活性（ＴＳＢＡｂ）を、準飽和濃度の４０μＵ  ｂＴＳＨを使用して、ＪＰ０９細胞で測定した。ＴＳＨ誘発性ｃＡＭＰの阻害％として表されるＴＳＢＡｂ活性を、材料及び方法の項で記載したように算出した。異なる濃度のＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧを調べて、阻害活性が抗体濃度に依存しないことを保証した。示した結果は、３連で実施した、少なくとも２つの独立した実験の代表例である。
【図３】ＴＲＡＫ（ＤＹＮＯｔｅｓｔ  ｈｕｍａｎ）キットを用いて測定した、ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ（■―■）及びＦａｂ断片（■---■）並びにＫＳＡｂ２  ＩｇＧ（▲―▲）及びＦａｂ断片（▲---▲）のＴＳＨ結合阻害免疫グロブリン（ＴＢＩＩ）活性の用量反応曲線を示す図である。正常ヒト血清中で希釈した異なる濃度のＩｇＧ又はＦａｂ断片（ｎｇ／ｍｌ）を、アッセイ用のヒトＴＳＨＲ被覆チューブに添加した。示した結果は、３連で実施した、少なくとも３つの独立した実験の代表例である。
【図４】非標識ＩｇＧの濃度上昇を伴うか又は伴わない、固定化受容体及び125Ｉ標識ｍａｂ（約２．５μＣｉ／ｍｌ）の供給源としてＴＲＡＫ（ＤＹＮＯｔｅｓｔ  ｈｕｍａｎ）キットのヒトＴＳＨＲ被覆チューブを使用した飽和結合実験による、（Ａ）ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及び（Ｂ）ＫＳＡｂ２  ＩｇＧの抗体親和性（Ｋｄ）の測定を示す図である。ＩＣ50及びＫｄ値を、Ｅｘｃｅｌを使用して算出した。抗体親和性を、Ｋｄ値の逆数（Ｌ／ｍｏｌ）として表した。無関連ＩｇＧ  ｍａｂ（ＧＡＤ１）を使用する非特異的結合は５％未満であった。全ての決定は２連の試料で実施した。
【図５】125Ｉ標識したＫＳＡｂ１  ＩｇＧ又はＦａｂ断片、及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧ又はＦａｂ断片を使用した、（Ａ）患者の血清、（Ｂ）ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧ間、並びに（Ｃ）ＫＳＡｂ１  Ｆａｂ断片及びＫＳＡｂ２  Ｆａｂ断片間での、固定化ヒトＴＳＨＲとの結合に対する競合試験を示す図である。バセドウ病患者由来の血清（ｎ＝６）、及びＴＳＢＡｂレベルの高い甲状腺機能低下症患者由来の血清（ｎ＝６）を使用した。対照として、自己免疫疾患の家族歴のない個体由来の正常ヒト血清（ｎ＝４）を利用した。結果を、125Ｉ−ＩｇＧ結合として表す。結果は、125Ｉ標識したＫＳＡｂ１  ＩｇＧ又はＫＳＡｂ２  ＩｇＧを用いた、バセドウ病患者及びＴＳＢＡｂ陽性甲状腺機能低下症患者由来の全ての血清の阻害活性の広域スペクトルを示し、モノクローナル抗体が、患者の血清によってみられたのと同様のＴＳＨＲ上の自己反応性エピトープと結合することが確認された。対照の正常血清は殆ど阻害を示さなかった（１５％未満）。
【図６】（Ａ）ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ（■―■）及び（Ｂ）ＫＳＡｂ２  ＩｇＧ（▲―▲）の、静脈内注射による受身移入後の、ＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスにおける各種時点での血清チロキシン（ＴＴ４）レベルを示す図である。０時間（ｍａｂの注射前）、７時間、２６時間、及び７０時間での、各群由来の個々のマウス（ｎ＝３）におけるＴＴ４値（μｇ／ｍｌ）を示す。腹腔内注射によるＫＳＡｂ２  ＩｇＧの投与結果を、（Ｃ）に示す。無関連ＩｇＧ（ＧＡＤ１  ｍａｂ）で処置した対照マウスも示す（---）。**はｐ＜０．０１を示す。
【図７】ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ又はＫＳＡｂ２  ＩｇＧを受身移入して、甲状腺機能亢進疾患を誘発した後のマウス由来の甲状腺の組織像を示す図である。パネルＡは対照ＧＡＤ１処置マウス由来の甲状腺を；パネルＢ及びパネルＣはそれぞれ１０μｇ用量及び１００μｇ用量でのＫＳＡｂ１  ＩｇＧを；パネルＤはパネルＢによる崩壊濾胞の詳細図を；パネルＥ及びパネルＦはそれぞれ１０μｇ用量及び１００μｇ用量でのＫＳＡｂ２  ＩｇＧを示す。倍率×６０である。コロイド内のアポトーシス上皮細胞（―>）、及び多層化した円柱細胞及び立方細胞から成る上皮細胞の内層を呈したコロイドを含まない濾胞（-->）を示す。
【図８】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図９】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図１０】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図１１】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図１２】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図１３】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図１４】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図１５】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図１６】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図１７】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図１８】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図１９】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図２０】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図２１】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図２２】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図２３】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図２４】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図２５】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図２６】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図２７】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図２８】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図２９】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図３０】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図３１】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図３２】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図３３】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図３４】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図３５】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図３６】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図３７】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図３８】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図３９】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図４０】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図４１】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図４２】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図４３】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図４４】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図４５】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図４６】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図４７】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図４８】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図４９】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図５０】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図５１】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図５２】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図５３】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図５４】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図５５】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図５６】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図５７】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図５８】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図５９】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図６０】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図６１】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図６２】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図６３】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図６４】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図６５】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図６６】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図６７】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図６８】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図６９】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図７０】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図７１】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図７２】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図７３】本発明の例である抗体の配列を示す図である。本図は、２つの抗体の各種断片を示す。各図の配列が関係する断片を、表２に定義する。
【図７４】還元性条件下での精製ｒＦａｂ調製品のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す図である。ｒＦａｂの重鎖断片を矢印で示す。Ｍ＝標準的な分子量マーカー。
【図７５】ＴＲＡＫアッセイで評価した、ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧ（それぞれＩｇＧ  ９及びＩｇＧ  １７と呼ぶ）及び精製ｒＦａｂ断片（それぞれＦａｂ  ９及びＦａｂ  １７と呼ぶ）のＴＳＨ結合阻害活性を示す図である。
【図７６】スクロースを含有する等張ＨＢＳＳ緩衝液中で評価した、ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧ（それぞれＩｇＧ  ９及びＩｇＧ  １７と呼ぶ）及び精製ｒＦａｂ断片（それぞれＦａｂ  ９及びＦａｂ  １７と呼ぶ）の甲状腺刺激抗体活性を示す図である。
【図７７】ＴＲＡＫアッセイで評価した、ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧ（それぞれＩｇＧ  ９及びＩｇＧ  １７と呼ぶ）、精製ｒＦａｂ断片（それぞれＦａｂ  ９及びＦａｂ  １７と呼ぶ）並びにｒＦａｂ断片の軽鎖を入れ替えたもの（それぞれＦａｂ  ９．１−１７Ｌ及びＦａｂ  １７．４−９Ｌと呼ぶ）のＴＳＨ結合阻害活性を示す図である。
【図７８】スクロースを含有する等張ＨＢＳＳ緩衝液中で評価した、ＫＳＡｂ１  ＩｇＧ及びＫＳＡｂ２  ＩｇＧ（それぞれＩｇＧ  ９及びＩｇＧ  １７と呼ぶ）、精製ｒＦａｂ断片（それぞれＦａｂ  ９及びＦａｂ  １７と呼ぶ）並びにｒＦａｂ断片の軽鎖を入れ替えたもの（それぞれＦａｂ  ９．１−１７Ｌ及びＦａｂ  １７．４−９Ｌと呼ぶ）の甲状腺刺激抗体活性を示す図である。
【図７９】甲状腺刺激抗体ＶH及びＶL遺伝子配列と、対応するマウスＶ領域遺伝子ファミリーの配列のアラインメントを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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