(57)【要約】本発明は、N末端アミノ酸を欠くP450還元酵素、および該P450還元酵素をコードする核酸を提供する。このP450還元酵素は、シトクロムP450と同時発現された場合に、野生型P450還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/または発現と比較して、シトクロムP450の活性および/または発現を増加させる。本発明はまた、シトクロムP450、P450還元酵素、および/またはb5の発現を増加させるための特定のプロモーターの使用、ならびに本発明のタンパク質を発現させるための酵母のプロテアーゼ欠損株の使用も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
N末端アミノ酸を欠くP450還元酵素コードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子または組換え核酸分子であって、該P450還元酵素が、シトクロムP450と同時発現された場合に、野生型P450還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/または発現と比較して、シトクロムP450の活性および/または発現を増加させる、単離された核酸分子または組換え核酸分子。
【請求項２】
ヒトP450還元酵素をコードする、請求項1記載の核酸分子。
【請求項３】
P450還元酵素が少なくとも24個のN末端アミノ酸を欠く、請求項2記載の核酸分子。
【請求項４】
ヒトP450還元酵素がSEQ ID NO：26のアミノ酸配列を含む、請求項3記載の核酸分子。
【請求項５】
以下を含むかまたは以下からなる、単離された核酸分子または組換え核酸分子：
a) 請求項1〜4のいずれか一項記載のヌクレオチド配列；
b) SEQ ID NO：34もしくは37のヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつ、シトクロムP450と同時発現された場合に、野生型P450還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/もしくは発現と比較して、シトクロムP450の活性および/もしくは発現を増加させるP450還元酵素をコードする、ヌクレオチド配列；
d) a)、b)、もしくはc)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
e) a)、b)、c)、もしくはd)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項６】
前記核酸分子によってコードされるP450還元酵素が、エピトープタグを含むC末端のアミノ酸配列をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項７】
前記アミノ酸配列がP450還元酵素のC末端に連結されている、請求項6記載の核酸分子。
【請求項８】
エピトープタグがc-mycエピトープタグである、請求項7記載の核酸分子。
【請求項９】
SEQ ID NO：42の配列を含むか、またはその配列からなる、前記請求項のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド配列の発現を制御するプロモーターをさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１１】
プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項10記載の核酸分子。
【請求項１２】
プロモーターがGALプロモーターである、請求項11記載の核酸分子。
【請求項１３】
プロモーターが切断型GALプロモーターを含む、請求項12記載の核酸分子。
【請求項１４】
ヌクレオチド配列の発現を制御するために切断型GALプロモーターを含む、単離された核酸分子または組換え核酸分子。
【請求項１５】
切断型GALプロモーターが切断型GAL1プロモーターである、請求項14記載の核酸分子。
【請求項１６】
切断型GAL1プロモーターがヌクレオチド202において切断されたGAL1プロモーターである、請求項15記載の核酸分子。
【請求項１７】
切断型GAL1プロモーターがSEQ ID NO：2の配列を含むか、またはその配列からなる、請求項16記載の核酸分子。
【請求項１８】
転写終結配列をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１９】
終結配列がプロモーターの下流にある、請求項18記載の核酸分子。
【請求項２０】
プロモーターの制御下へのヌクレオチド配列の挿入を可能にする、GALプロモーターと終結配列との間の特有の制限部位を含む、請求項19記載の核酸分子。
【請求項２１】
転写終結配列が挿入ヌクレオチド配列のすぐ下流にあるか、または最小距離だけ離れている、請求項20記載の核酸分子。
【請求項２２】
転写終結配列が挿入ヌクレオチド配列から5〜25ヌクレオチドだけ離れている、請求項21記載の核酸分子。
【請求項２３】
終結配列がSUC2(SUC2t)終結配列である、請求項18〜22のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項２４】
SUC2終結配列がSEQ ID NO：28の配列を含むか、またはその配列からなる、請求項23記載の核酸分子。
【請求項２５】
プロモーターが、N末端アミノ酸を欠くP450還元酵素をコードするヌクレオチド配列の発現を制御する、請求項10〜13または14〜24のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項２６】
ヌクレオチド配列が、請求項1〜13のいずれか一項記載の核酸分子である、請求項25記載の核酸分子。
【請求項２７】
プロモーターが、シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列の発現を制御する、請求項10〜13または14〜24のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項２８】
ヌクレオチド配列がヒトシトクロムP450をコードする、請求項27記載の核酸分子。
【請求項２９】
ヌクレオチド配列が以下を含むかまたは以下からなる、請求項28記載の核酸分子：
a) SEQ ID NO：22のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項３０】
ヌクレオチド配列が、核酸分子のプロモーターと終結配列との間にBamH1-XbaI断片として挿入される、請求項20記載の、または請求項20に従属した場合の請求項21〜29のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項３１】
ベクターの形態で提供される、前記請求項のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項３２】
前記請求項のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３３】
標的細胞において前記核酸分子の発現を引き起こす、請求項32記載のベクター。
【請求項３４】
標的細胞が真核細胞である、請求項33記載のベクター。
【請求項３５】
標的細胞が酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞である、請求項34記載のベクター。
【請求項３６】
標的細胞のゲノムに組み込むことが可能な、請求項32〜35のいずれか一項記載のベクター。
【請求項３７】
形質転換細胞の選択を可能にする選択マーカーおよび/またはレポーター遺伝子などの1つまたは複数の発現マーカーを含む、請求項32〜36のいずれか一項記載のベクター。
【請求項３８】
レポーター遺伝子が、アルカリホスファターゼ(AP)、βガラクトシダーゼ(LacZ)、βグルクロニダーゼ(GUS)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、およびルシフェラーゼ(Luc)から選択される、請求項37記載のベクター。
【請求項３９】
選択マーカーが栄養要求性選択マーカー遺伝子である、請求項38記載のベクター。
【請求項４０】
栄養要求性選択マーカー遺伝子が、LEU2、TRP1、ADE2、URA3、HIS3、LYS2、HIS4、またはMET15、またはAUR1-Cから選択される、請求項39記載のベクター。
【請求項４１】
選択可能マーカー遺伝子が、相同組換えにより特定の染色体座において標的細胞のゲノムへの組込みを可能にする、請求項40記載のベクター。
【請求項４２】
酵母細胞に組み込むことが可能な、請求項41記載のベクター。
【請求項４３】
酵母ゲノムに組み込むことが可能な、請求項42記載のベクター。
【請求項４４】
各コピーがそれぞれのプロモーターの制御下にある請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子を2コピー含む、請求項32〜43のいずれか一項記載のベクター。
【請求項４５】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項４６】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子、および/または該核酸分子の発現を指向する請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、細胞を形質転換する段階を含む、請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子を細胞内で発現させる方法。
【請求項４７】
シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列の発現を指向する請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで細胞を形質転換する段階を含む、シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列を細胞内で発現させる方法。
【請求項４８】
シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列が以下を含むかまたは以下からなる、請求項47記載の方法：
a) SEQ ID NO：22のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項４９】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、酵母株を形質転換する段階を含む、請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子を発現する酵母株を作製する方法。
【請求項５０】
請求項49記載の方法で作製された、または請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで形質転換された、酵母株。
【請求項５１】
以下を含むタンパク質発現システム：
i) 請求項45記載の細胞または請求項50記載の酵母株；および
ii) 標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターであって、該配列が該ヌクレオチド配列の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある、ベクター。
【請求項５２】
ヌクレオチド配列が異種シトクロムP450をコードする、請求項51記載のタンパク質発現システム。
【請求項５３】
ヌクレオチド配列がヒトシトクロムP450をコードする、請求項52記載のタンパク質発現システム。
【請求項５４】
ヌクレオチド配列がシトクロムb5タンパク質をコードする、請求項51記載のタンパク質発現システム。
【請求項５５】
シトクロムb5タンパク質が異種シトクロムb5タンパク質である、請求項54記載のタンパク質発現システム。
【請求項５６】
ヌクレオチド配列が以下を含むかまたは以下からなる、請求項54または55記載のタンパク質発現システム：
a) SEQ ID NO：86のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項５７】
ベクターが、多様なプロモーターの制御下にあるシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列およびシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項51〜56のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項５８】
ベクターが、前記細胞または酵母ゲノムへの組込みに際して、前記ヌクレオチド配列または各ヌクレオチド配列の発現を引き起こす、請求項51〜57のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項５９】
ベクターが請求項32〜44のいずれか一項に定義される通りである、請求項51〜58のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項６０】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、請求項45記載の細胞または請求項50記載の酵母株を形質転換する段階を含む、活性が増加したおよび/または発現レベルが増加したシトクロムP450を生成する方法。
【請求項６１】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、細胞を形質転換する段階を含む、活性が増加したおよび/または発現レベルが増加したシトクロムP450を生成する方法。
【請求項６２】
シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、および/またはシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列の発現を指向する請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、前記細胞を形質転換する段階をさらに含む、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
ヌクレオチド配列が異種シトクロムP450をコードする、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、および/またはシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向するベクターで、前記細胞を形質転換する段階をさらに含む、請求項60〜63のいずれか一項記載の方法。
【請求項６５】
以下を含むかまたは以下からなる、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド：
a) N末端アミノ酸を欠くP450還元酵素であって、シトクロムP450と同時発現された場合に、野生型P450還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/もしくは発現と比較して、シトクロムP450の活性および/もしくは発現を増加させるP450還元酵素；
b) シトクロムP450と同時発現された場合に、野生型P450還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/もしくは発現と比較して、シトクロムP450の活性および/もしくは発現を増加させる、a)のポリペプチドの相同体；または
c) シトクロムP450と同時発現された場合に、野生型P450還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/もしくは発現と比較して、シトクロムP450の活性および/もしくは発現を増加させる、a)のポリペプチドもしくはb)の相同体の断片。
【請求項６６】
P450還元酵素がヒトP450還元酵素である、請求項65記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
【請求項６７】
P450還元酵素が24個のN末端アミノ酸を欠く、請求項66記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
【請求項６８】
SEQ ID NO：26のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、請求項65〜67のいずれか一項記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
【請求項６９】
エピトープタグを含むC末端のアミノ酸配列をさらに含む、請求項65〜68のいずれか一項記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
【請求項７０】
前記アミノ酸配列がポリペプチドのC末端に連結されている、請求項69記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
【請求項７１】
エピトープタグがc-mycである、請求項70記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
【請求項７２】
SEQ ID NO：27のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、請求項65〜71のいずれか一項記載の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
【請求項７３】
細胞においてプロテアーゼ分解酵素をコードする標的遺伝子の破壊を可能にする、単離された核酸分子または組換え核酸分子。
【請求項７４】
細胞が真核細胞である、請求項73記載の核酸分子。
【請求項７５】
細胞が酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞である、請求項74記載の核酸分子。
【請求項７６】
標的遺伝子がプロテアーゼ分解酵素をコードする、請求項73〜75のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項７７】
プロテアーゼが液胞プロテアーゼまたはプロテアソームプロテアーゼである、請求項76記載の核酸分子。
【請求項７８】
液胞プロテアーゼの欠失を可能にする、請求項77記載の核酸分子。
【請求項７９】
プロテアーゼが、PRA1(PEP4)、プロテアーゼB(PRB1)、カルボキシペプチダーゼY & S(CPY & CPS)、アミノペプチダーゼ、yscI、yscCo、HRD(HRD 1、HRD2、およびHRD3を含む)、UBC(UBC6およびUBC7を含む)、CUE1；およびCdc48p-Ufd1p-Hrd4p複合体から選択される、請求項78記載の核酸分子。
【請求項８０】
相同組換えを介して細胞のゲノムに組み込むことが可能な、請求項73〜79のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項８１】
標的化相同組換えによってプロテアーゼの欠失を可能にする、請求項80記載の核酸分子。
【請求項８２】
前記標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列が両側に隣接した、細胞のゲノムへの組込みを可能にするヌクレオチド配列を含む、請求項73〜81のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項８３】
前記標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列が、両側に隣接した選択可能マーカー遺伝子を含む、請求項82記載の核酸分子。
【請求項８４】
隣接ヌクレオチド配列が、前記標的遺伝子のコード領域または調節領域と実質的に同一である、請求項82または83記載の核酸分子。
【請求項８５】
隣接ヌクレオチド配列が、前記標的遺伝子の5'断片および3'断片と実質的に同一である、請求項84記載の核酸分子。
【請求項８６】
破壊しようとする遺伝子の5'断片が、以下から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなる、請求項85記載の核酸分子：
a) SEQ ID NO：51、58、65、または72のヌクレオチド配列；
b) a)のヌクレオチド配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、請求項82または83記載の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こすヌクレオチド配列；
c) a)またはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；
d) 請求項82または83記載の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こす、a)、b)、またはc)の断片。
【請求項８７】
破壊しようとする遺伝子の3'断片が、以下から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなる、請求項85または86記載の核酸分子：
a) SEQ ID NO：54、61、68、または75のヌクレオチド配列；
b) a)のヌクレオチド配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、請求項82または83記載の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こすヌクレオチド配列；
c) a)またはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；
d) 請求項82または83記載の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こす、a)、b)、またはc)の断片。
【請求項８８】
破壊しようとするプロテアーゼ遺伝子がPRA1(PEP4)である場合に、選択可能マーカーに隣接するPRA1の5'断片がSEQ ID NO：51のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなり、かつPRA1の3'断片がSEQ ID NO：54のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなる、請求項86または87記載の核酸分子。
【請求項８９】
破壊しようとするプロテアーゼ遺伝子がHRD1である場合に、選択可能マーカーに隣接するHRD1の5'断片がSEQ ID NO：58のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなり、かつHRD1の3'断片がSEQ ID NO：61のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなる、請求項86または87記載の核酸分子。
【請求項９０】
破壊しようとするプロテアーゼ遺伝子がHRD2である場合に、選択可能マーカーに隣接するHRD2の5'断片がSEQ ID NO：65のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなり、かつHRD2の3'断片がSEQ ID NO：68のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなる、請求項86または87記載の核酸分子。
【請求項９１】
破壊しようとするプロテアーゼ遺伝子がUBC7である場合に、選択可能マーカーに隣接するUBC7の5'断片がSEQ ID NO：72のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなり、かつUBC7の3'断片がSEQ ID NO：75のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなる、請求項86または87記載の核酸分子。
【請求項９２】
選択可能マーカー遺伝子が、TRP1、LEU2、ADE2、URA3、HIS3、LYS2、HIS4、またはMET15、またはAUR1-Cから選択される、請求項83〜91のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項９３】
選択可能マーカー遺伝子がTRP1であり、かつSEQ ID NO：47の配列を含むか、またはその配列からなる、請求項92記載の核酸分子。
【請求項９４】
ベクターの形態である、請求項73〜93のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項９５】
細胞の形質転換後に、標的細胞においてプロテアーゼ分解酵素をコードする遺伝子の破壊を可能にするベクターであって、請求項73〜93のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項９６】
請求項73〜94のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項95記載のベクターで、形質転換された細胞。
【請求項９７】
真核細胞である、請求項96記載の細胞。
【請求項９８】
酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞である、請求項97記載の細胞。
【請求項９９】
請求項73〜94のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項95記載のベクターで、細胞を形質転換する段階を含む、細胞においてプロテアーゼ分解酵素をコードする遺伝子を破壊する方法。
【請求項１００】
請求項73〜94のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項95記載のベクターで、酵母株を形質転換する段階を含む、プロテアーゼ欠損酵母株を作製する方法。
【請求項１０１】
請求項100記載の方法によって作製された、または請求項95記載のベクターで形質転換された、酵母株。
【請求項１０２】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、請求項96〜98のいずれか一項記載の細胞または請求項101記載の酵母株を形質転換する段階を含む、活性が増加したおよび/または発現レベルが増加したシトクロムP450を生成する方法。
【請求項１０３】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項102記載の方法。
【請求項１０４】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する前に、請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、該細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項102記載の方法。
【請求項１０５】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項102〜104のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０６】
多様なプロモーターの制御下にあるシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列およびシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階を含む、請求項102〜104のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０７】
シトクロムP450の発現を駆動することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/または請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を駆動することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/またはシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで、形質転換された、請求項96〜98のいずれか一項記載の細胞または請求項101記載の酵母株。
【請求項１０８】
以下を含むタンパク質発現システム：
i) 請求項96〜98のいずれか一項記載の細胞または請求項101記載の酵母株；および
ii) 標的タンパク質の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項１０９】
ヌクレオチド配列がシトクロムP450をコードする、請求項108記載のタンパク質発現システム。
【請求項１１０】
シトクロムP450が異種シトクロムP450である、請求項109記載のタンパク質発現システム。
【請求項１１１】
ベクターが、前記細胞または酵母株への組込みに際して、前記ヌクレオチド配列の発現を引き起こす、請求項108〜110のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１１２】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子を発現することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターをさらに含む、請求項108〜111のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１１３】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現することができるベクターをさらに含む、請求項108〜112のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１１４】
細胞において内因性P450還元酵素をコードする標的遺伝子の破壊を可能にする、単離された核酸分子または組換え核酸分子。
【請求項１１５】
細胞が真核細胞である、請求項114記載の核酸分子。
【請求項１１６】
細胞が酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞である、請求項115記載の核酸分子。
【請求項１１７】
前記標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列が両側に隣接した、細胞のゲノムへの組込みを可能にするヌクレオチド配列を含む、請求項114〜116のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１１８】
前記標的遺伝子と相同なヌクレオチド配列が隣接した選択可能マーカー遺伝子を含む、請求項117記載の核酸分子。
【請求項１１９】
前記標的遺伝子と相同なヌクレオチド配列が、相同組換えに際して該標的遺伝子が破壊されるように選択される、請求項118記載の核酸分子。
【請求項１２０】
隣接ヌクレオチド配列が以下を含むかまたは以下からなる、請求項117〜119のいずれか一項記載の核酸分子：
a) i) SEQ ID NO：84のヌクレオチド配列；
ii) ii)のヌクレオチド配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、この局面の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こすヌクレオチド配列；
iii) i)もしくはii)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
iv) この局面の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こす、i)、ii)、もしくはiii)の断片；および
b)  i) SEQ ID NO：85のヌクレオチド配列；
ii) i)のヌクレオチド配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、この局面の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こすヌクレオチド配列；
iii) i)もしくはiii)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
iv) この局面の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こす、i)、ii)、もしくはiii)の断片。
【請求項１２１】
選択可能マーカー遺伝子が、LEU2、TRP1、ADE2、URA3、HIS3、LYS2、HIS4、MET15、またはAUR1-Cから選択される、請求項118〜120のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１２２】
ベクターの形態である、請求項114〜121のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１２３】
細胞の形質転換後に、標的細胞においてP450還元酵素をコードする内因性遺伝子の欠失を可能にするベクターであって、請求項114〜122のいずれか一項記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１２４】
細胞の形質転換後に、標的細胞においてP450還元酵素をコードする内因性遺伝子の破壊を可能にするベクターであって、該標的細胞のゲノムへの組込みを可能にするためにベクターを線状化できるようにする1つまたは複数の特有の制限部位を含む前記標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列と、該細胞のゲノムへの組込みを可能にするヌクレオチド配列とを含む、ベクター。
【請求項１２５】
前記標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列が、以下を含むかまたは以下からなる、請求項124記載のベクター：
a) SEQ ID NO：81のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項１２６】
請求項114〜122のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項123〜125のいずれか一項記載のベクターで、形質転換された細胞。
【請求項１２７】
請求項114〜122のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項123〜125のいずれか一項記載のベクターで、細胞を形質転換する段階を含む、P450還元酵素をコードする内因性遺伝子を破壊する方法。
【請求項１２８】
請求項114〜122のいずれか一項記載の核酸分子、および/または請求項123〜125のいずれか一項記載のベクターで、細胞または酵母株を形質転換する段階を含む、シトクロムP450還元酵素が欠損した細胞または酵母株を作製する方法。
【請求項１２９】
請求項128の方法によって作製された、または請求項123〜125のいずれか一項記載のベクターで形質転換された、酵母株。
【請求項１３０】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、請求項126記載の細胞または請求項129記載の酵母株を形質転換する段階を含む、酵母において活性および/または発現が増加したシトクロムP450を生成する方法。
【請求項１３１】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項130記載の方法。
【請求項１３２】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する前に、請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、該細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項130記載の方法。
【請求項１３３】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項130〜132のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３４】
多様なプロモーターの制御下にあるシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列とシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列との発現を指向することができるベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階を含む、請求項130〜132のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３５】
シトクロムP450の発現を駆動することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/または請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/またはシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで、形質転換された、請求項126記載の細胞または請求項129記載の酵母株。
【請求項１３６】
以下を含むタンパク質発現システム：
i) 請求項126記載の細胞または請求項129記載の酵母株；および
ii) 標的タンパク質の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項１３７】
ヌクレオチド配列がシトクロムP450をコードする、タンパク質発現システム。
【請求項１３８】
ヌクレオチド配列がヒトシトクロムP450をコードする、タンパク質発現システム。
【請求項１３９】
ベクターが、前記細胞または酵母ゲノムへの組込みに際して、前記ヌクレオチド配列の発現を引き起こす、請求項136〜138のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１４０】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子を発現することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターをさらに含む、請求項136〜139のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１４１】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現することができるベクターをさらに含む、請求項136〜140のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１４２】
酵母シトクロムP450還元酵素の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある内因性酵母シトクロムP450還元酵素をコードするヌクレオチド配列を含むベクターをさらに含む、請求項136〜141のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１４３】
酵母シトクロムP450還元酵素の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある内因性酵母シトクロムP450還元酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子または組換え核酸分子。
【請求項１４４】
ヌクレオチド配列が以下を含むかまたは以下からなる、請求項143記載の核酸分子：
a) SEQ ID No: 78のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項１４５】
プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項143または144記載の核酸分子。
【請求項１４６】
プロモーターがGALプロモーターである、請求項145記載の核酸分子。
【請求項１４７】
プロモーターが切断型GALプロモーターである、請求項146記載の核酸分子。
【請求項１４８】
請求項143〜147のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１４９】
標的細胞において、特定の染色体座で酵母シトクロムP450還元酵素をコードするヌクレオチド配列の組込みを引き起こすように適合される、請求項148記載のベクター。
【請求項１５０】
特定の染色体座へのベクターの組込みを可能にする選択可能マーカー遺伝子を含む、請求項149記載のベクター。
【請求項１５１】
選択可能マーカー遺伝子が、LEU2、ADE2、HIS3、TRP1、URA3、LYS2、HIS4、MET15、またはAUR1-Cから選択される、請求項150記載のベクター。
【請求項１５２】
請求項143〜147のいずれか一項記載の核酸分子、または請求項148〜151のいずれか一項記載のベクターで、形質転換された細胞。
【請求項１５３】
請求項143〜147のいずれか一項記載の核酸分子、または請求項148〜151のいずれか一項記載のベクターで、酵母株を形質転換する段階を含む、内因性シトクロムP450還元酵素を発現する細胞または酵母株を作製する方法。
【請求項１５４】
請求項153記載の方法によって作製された、または請求項148〜151のいずれか一項記載のベクターによって形質転換された、酵母株。
【請求項１５５】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、請求項143〜147のいずれか一項記載の細胞または請求項154記載の酵母株を形質転換する段階を含む、酵母において活性および/または発現が増加したシトクロムP450を生成する方法。
【請求項１５６】
シトクロムP450が異種シトクロムP450である、請求項155記載の方法。
【請求項１５７】
シトクロムP450がヒトシトクロムP450である、請求項156記載の方法。
【請求項１５８】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項155〜157のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５９】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する前に、請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、該細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項155〜157のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６０】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項155〜159のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６１】
多様なプロモーターの制御下にあるシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列およびシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階を含む、請求項155〜159のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６２】
シトクロムb5タンパク質が異種シトクロムb5タンパク質である、請求項160または161記載の方法。
【請求項１６３】
シトクロムP450の発現を駆動することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/または請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/またはシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向することができるベクターで、形質転換された、請求項152記載の細胞または請求項154記載の酵母株。
【請求項１６４】
以下を含むタンパク質発現システム：
i) 請求項152記載の細胞または請求項154記載の酵母株；および
ii) 標的タンパク質の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項１６５】
ヌクレオチド配列がシトクロムP450をコードする、請求項164記載のタンパク質発現システム。
【請求項１６６】
シトクロムP450が異種シトクロムP450である、請求項165記載のタンパク質発現システム。
【請求項１６７】
ベクターが、前記細胞または酵母株への組込みに際して、前記ヌクレオチド配列の発現を引き起こす、請求項164〜166のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１６８】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子を発現することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターをさらに含む、請求項164〜167のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１６９】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現することができるベクターをさらに含む、請求項164〜168のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１７０】
プロモーターの制御下にあるシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子または組換え核酸分子。
【請求項１７１】
プロモーターが切断型GALプロモーターである、請求項170記載の核酸分子。
【請求項１７２】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、哺乳動物シトクロムb5タンパク質をコードする、請求項170または171記載の核酸分子。
【請求項１７３】
以下から選択される配列を含むか、またはその配列からなる、請求項172記載の核酸分子：
a) SEQ ID NO：86のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項１７４】
ベクターの形態である、請求項170〜173のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１７５】
請求項170〜174のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１７６】
標的細胞において、特定の染色体座でシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の組込みを引き起こすように適合される、請求項175記載のベクター。
【請求項１７７】
特定の染色体座へのベクターの組込みを可能にする選択可能マーカー遺伝子を含む、請求項176記載のベクター。
【請求項１７８】
請求項170〜174のいずれか一項記載の核酸分子、または請求項175〜177のいずれか一項記載のベクターで、形質転換された細胞。
【請求項１７９】
請求項170〜174のいずれか一項記載の核酸分子、または請求項175〜177のいずれか一項記載のベクターで、酵母株を形質転換する段階を含む、シトクロムb5タンパク質を発現する細胞または酵母株を作製する方法。
【請求項１８０】
請求項179記載の方法によって作製された、または請求項175〜177のいずれか一項記載のベクターで形質転換された、酵母株。
【請求項１８１】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、請求項178記載の細胞または請求項180記載の酵母株を形質転換する段階を含む、酵母において活性および/または発現が増加したシトクロムP450を生成する方法。
【請求項１８２】
シトクロムP450が異種シトクロムP450である、請求項181記載の方法。
【請求項１８３】
シトクロムP450がヒトシトクロムP450である、請求項182記載の方法。
【請求項１８４】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項181〜183のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８５】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する前に、請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで、該細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項181〜183のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８６】
内因性シトクロムP450還元酵素の発現を指向することができる請求項148〜151のいずれか一項記載のベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含む、請求項181〜185のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８７】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/または請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクター、および/または内因性シトクロムP450還元酵素の発現を指向することができる請求項148〜151のいずれか一項記載のベクターで、形質転換された、請求項178記載の細胞または請求項180記載の酵母株。
【請求項１８８】
以下を含むタンパク質発現システム：
i) 請求項178記載の細胞または請求項180記載の酵母株；および
ii) 標的タンパク質の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項１８９】
ヌクレオチド配列がシトクロムP450をコードする、請求項188記載のタンパク質発現システム。
【請求項１９０】
ヌクレオチド配列がヒトシトクロムP450をコードする、請求項189記載のタンパク質発現システム。
【請求項１９１】
ベクターが、前記細胞または酵母株への組込みに際して、前記ヌクレオチド配列の発現を引き起こす、請求項188〜190のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１９２】
請求項1〜31のいずれか一項記載の核酸分子を発現することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターをさらに含む、請求項188〜191のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１９３】
内因性シトクロムP450還元酵素の発現を指向することができる請求項148〜151のいずれか一項記載のベクターをさらに含む、請求項188〜192のいずれか一項記載のタンパク質発現システム。
【請求項１９４】
シトクロムP450の発現を指向することができる請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで形質転換された細胞を、以下の1つまたは複数と混和する段階を含む、活性が増加したシトクロムP450を生成する方法：
a) 請求項45記載の1つもしくは複数の細胞；
b) 請求項96〜98のいずれか一項記載の1つもしくは複数の細胞；
c) 請求項126記載の1つもしくは複数の細胞；
d) 請求項152記載の1つもしくは複数の細胞；および/または
e)請求項178記載の1つもしくは複数の細胞。
【請求項１９５】
細胞を混和する前に、培養物から該細胞を単離する段階をさらに含む、請求項194記載の方法。
【請求項１９６】
細胞を混和して均一な細胞混合物を生成する、請求項194または195記載の方法。
【請求項１９７】
以下の段階を含む、候補薬剤化合物の毒性を評価する方法：
a) 化合物を、シトクロムP450を発現する請求項50、107、135、163、および185のいずれか一項記載の細胞または酵母株と反応させる段階；ならびに
b) 阻害に関してIC50濃度を決定する段階。
【請求項１９８】
以下の段階を含む、シトクロムP450の阻害について化合物を評価する方法：
a) 試験化合物を、シトクロムP450を発現する請求項50、107、135、163、187のいずれか一項記載の細胞または酵母株と反応させる段階；および
b) 該化合物がシトクロムP450活性を低下させるかどうかを決定する段階。
【請求項１９９】
前記細胞または酵母株が、シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列の発現を指向する請求項32〜44のいずれか一項記載のベクターで形質転換されている、請求項198記載の方法。
【請求項２００】
決定段階b)が以下の段階を含む、請求項198または199記載の方法：
a) 細胞を培養する段階；
b) シトクロムP450の基質を該細胞に添加する段階；および
c) シトクロムP450の活性を測定する段階。
【請求項２０１】
基質が蛍光基質または発光基質である、請求項200記載の方法。
【請求項２０２】
細胞の培養中に種々の時点で活性を測定する、請求項200または201記載の方法。
【請求項２０３】
細胞内でシトクロムP450の発現を誘導するための試薬を添加した後に、該細胞を取り出すことによって活性を測定する、請求項200〜202のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０４】
前記方法において用いるために、高活性を有するシトクロムP450を発現する細胞または酵母株が選択される、請求項198〜203のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０５】
以下の段階を含むアッセイ法を用いて細胞または酵母細胞が選択される、請求項204記載の方法：
a) 細胞を培養する段階；
b) シトクロムP450の基質を該細胞に添加する段階；および
c) シトクロムP450の活性を測定する段階。
【請求項２０６】
請求項61〜64、102〜106、130〜134、150〜162、および/または181〜186のいずれか一項記載の方法によって生成されたシトクロムP450。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を発現させる方法に関する。特に、本発明は、シトクロムP450発現システムおよびシトクロムP450の生成に関する。
【背景技術】
【０００２】
シトクロムP450(CYP)は、大部分の調合薬、多くの食物性物質、および多種多様な環境化学物質を含む多様な生体異物の分解(すなわち、代謝)に関与する解毒酵素(人体の様々な部分、特に肝臓、腎臓、肺、中枢神経系に存在する)の大きなファミリーに属する。生体異物は、偶発的にまたは意図的にヒト生物内に導入された異質な化学物質と定義される。CYPは、人体内で起こる生体異物の代謝の90%に関与している。CYPは、生体異物の溶解度を上げて、排出されやすくする酸素の作用によって生体異物を代謝する。
【０００３】
薬剤開発の過程では、化合物をヒト臨床試験に導入するに先立ち、その代謝速度ならびに産物の性質および毒性を決定することが不可欠である。
【０００４】
CYPの現在の主な商業用途は、すでに開発中の薬剤化合物の代謝を調べるためのものである。CYPは、主に、代謝経路を確認するために二次アッセイにおいて節約して(コストが高いため)用いられる。
【０００５】
しかしながら、前臨床研究において膨大な数の潜在的薬剤候補のスクリーニングにCYPを用いることで、後期になって薬剤開発が不合格となることによる製薬会社のコストを大幅に削減できると考えられる。
【０００６】
したがって、薬剤化合物、特に薬剤候補の毒性に関するスクリーニングを可能にするために、高活性を有するCYPを発現させる、および/または高発現レベルでCYPを発現させる改良システムを開発する必要性が存在する。
【０００７】
P450還元酵素(RD)は、シトクロムP450アイソザイムの活性に必須である補因子として働く。通常、P450還元酵素は補因子として酵素活性を有する。P450還元酵素はNADPHから電子を取り出し、これをP450アイソザイムの活性部位に転移する。本質的に、P450還元酵素は活性酸素種(ROS)を生成する。そのため、P450還元酵素の発現は生細胞にとって有害である。実際に、ヒト細胞および昆虫細胞において、P450還元酵素の同時発現はP450発現に有害であると報告されている。しかしながら、上記したように、活性シトクロムP450をもたらすためには、P450還元酵素をシトクロムP450と同時発現させなければならない。
【０００８】
【非特許文献１】Peyronneau M-A et al., "Optimization of Yeast-Expressed Human Liver Cytochrome P450 3A4 Catalytic Activities by Coexpressing NADPH-Cytochrome P450 reductase and Cytochrome B-5" European Journal of Biochemistry, vol. 207, no. 1, 1992, pages 109-116
【発明の開示】
【０００９】
本発明の第1の局面は、N末端アミノ酸を欠くP450還元酵素をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子または組換え核酸分子を提供し、P450還元酵素は、シトクロムP450と同時発現された場合に、野生型P450還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/または発現と比較して、シトクロムP450の活性および/または発現を増加させる。
【００１０】
前記核酸分子によってコードされるP450還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/または発現が、野生型還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/または発現よりも高い場合に、活性および/または発現の増加が起こる。増加は1〜50倍の増加であってよく、1〜40倍、1〜30倍、1〜20倍、または1〜10倍の増加であってよい。増加は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10倍であってよい。
【００１１】
シトクロムP450の発現は、CO-差スペクトルを用いて、産生されたシトクロムP450の濃度を測定することによって測定することができる。CO-差スペクトルの使用は当業者に周知である(Omura T & Sato R. The carbon monoxide binding pigment of liver microsomes. I - evidence for its hemoprotein nature. Journal of Biological Chemistry 1964 239 2370-2378)。400〜500 nmで差スペクトルを測定して、シトクロムP450の濃度を計算することができる。
【００１２】
シトクロムP450の活性は、7-エトキシレゾルフィンO-デエチラーゼの活性の測定によって測定することができる(Klotz A.V., S. J. J. a. W. C.. An alternative 7-ethoxyresorufin O-deethylase activity assay: a continuous visible spectrophotometric method for measurement of cytochrome P450 monooxygenase activity. Analytical Biochemistry 140: 138-145, 1984)。この酵素は、NADPHおよび酸素の存在下で、7-エトキシレゾルフィンを蛍光分析で検出できるレゾルフィンに変換するものであり、このアッセイ法はERODアッセイ法として公知である。
2009536026.tif 000002
NADPHおよび試験しようとする試料を添加してから、生じたレゾルフィンの量を分光光度計で測定することができる。
【００１３】
大部分のシトクロムP450の活性、しかし好ましくはCYP1ファミリーの酵素の活性を決定するために、ERODアッセイ法を用いることができる。または、他の確立された方法を用いることもできる。用いる方法は、どのシトクロムP450活性を測定しようとしているのか、したがってどのシトクロムP450基質をアッセイに使用すべきかに依存する。このような基質の種々のもの(主に蛍光性であるが発色性のものもある)を用いることができる。基質は、当技術分野で十分に実証されている。実際に、当業者は、どのシトクロムP450活性を測定しようとしているのかに応じて、公知の基質のうちの1つまたは複数を使用することになる。
【００１４】
本発明はまた、本発明の核酸分子によってコードされる、P450還元酵素などのポリペプチドを提供する。核酸分子によってコードされるP450還元酵素は哺乳動物P450還元酵素であってよく、ヒトP450還元酵素であってよい。または、P450還元酵素は酵母P450還元酵素であってもよい。P450還元酵素は、少なくとも24個のN末端アミノ酸を欠く場合もある。P450還元酵素は、少なくとも32個のN末端アミノ酸、少なくとも41個のN末端アミノ酸、少なくとも44個のN末端アミノ酸、もしくは少なくとも56個のN末端アミノ酸、または少なくとも60個のN末端アミノ酸を欠く場合もある。P450還元酵素は、1〜24、1〜32、1〜41、1〜44、1〜56、または1〜60のN末端アミノ酸を欠く場合もある。ヒトP450還元酵素は、SEQ ID NO：26のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなってよい。本発明は、本明細書において一般的にヒトP450還元酵素に関して記載されるが、本発明はヒトP450還元酵素に限定されると見なされるべきではない。当業者は、例えば、P450還元酵素の各配列を比較することにより、ヒトP450還元酵素と同様の様式で他の哺乳動物P450還元酵素を操作できることが理解されよう。
【００１５】
本発明の第2の局面において、以下を含むかまたは以下からなる、単離された核酸分子または組換え核酸分子を提供する：
a) 第1の局面のP450還元酵素をコードするヌクレオチド配列；
b) SEQ ID NO：34もしくは37のヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつ、シトクロムP450と同時発現された場合に、野生型P450還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/もしくは発現と比較して、シトクロムP450の活性および/もしくは発現を増加させるP450還元酵素をコードするヌクレオチド配列；
d) a)、b)、もしくはc)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
e) a)、b)、c)、もしくはd)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【００１６】
シトクロムP450の発現および/または活性に有害でないヒトP450還元酵素(hRD)活性を得るために、hRDの変種を発現させた。このような変種により、酵母細胞のみならず昆虫細胞および哺乳動物細胞においても、シトクロムP450アイソザイム、特に組換え異種シトクロムP450アイソザイムの高発現レベルおよび/または高活性を可能にする最適なシステムが提供されるようになる。
【００１７】
SEQ ID NO：34または37の配列によってコードされるP450還元酵素変種は、野生型hRDの荷電したN末端の24アミノ酸を欠いている。野生型hRDでは、アミノ酸20〜39(http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html)または25〜44(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)によって疎水性膜アンカーが構成される。
【００１８】
本発明の核酸分子によってコードされるP450還元酵素は、エピトープタグを含むC末端のアミノ酸配列をさらに含み得る。アミノ酸配列は、P450還元酵素のC末端に提供され得る。エピトープタグは、アミノ酸配列EQKLISEEDLNGを含み得るc-mycであってよい。c-mycタグは、リンカーSSを用いてP450還元酵素に連結され得る。アミノ酸配列は、そのC末端においてアミノ酸SRLをさらに含み得る。本発明による1つのP450還元酵素は、SEQ ID NO :42のヌクレオチド配列によってコードされ得る。P450還元酵素は、SEQ ID NO :27のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなってよい。このP450還元酵素は、ヒトP450還元酵素の荷電したN末端の24アミノ酸およびCOOH末端の終止コドンを欠くが、C末端においてc-mycエピトープタグEQKLISEEDLNGを含む。12アミノ酸のc-mycタグは負に荷電したペプチドであり、リンカーであるSS(制限部位SpeIとXbaIの連結を通して形成されたTCTAGTによってコードされる)を介してC末端に連結されている。c-mycタグをコードするヌクレオチド配列は、酵母に偏ったコドンを用いて化学合成することができる。
【００１９】
「核酸分子」および「ヌクレオチド配列」という用語は、二本鎖および一本鎖のDNAおよびRNA分子、ならびにその骨格修飾物を含む。RNAでは遺伝暗号における「T」が「U」で置き代わるという事実を考慮すると、所与のRNA分子は所与のDNA分子の配列に相補的な配列を有する。本発明の核酸分子は、単離された形態、組換え形態、または化学合成形態であってよい。
【００２０】
核酸分子に関して本明細書で使用する「単離された」または「組換えの」とは、a) 例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってインビトロで増幅された、b) クローニングにより組換えで生成された、c) 例えばゲル分離によって精製された、またはd) 化学合成によるなどして合成された、のいずれかを意味する。
【００２１】
DNAおよびRNAを含む本発明の核酸分子は、従来の化学的アプローチまたはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅を用いるなど、当技術分野で公知の方法を用いて合成することができる。本発明の核酸分子はまた、例えば、cDNAライブラリー、ゲノムライブラリー、または発現ライブラリーのスクリーニングにより、同定済み遺伝子の同定およびクローニングを可能にする。
【００２２】
本発明は、上記の配列と相補的な配列を含む核酸分子を含む。したがって、例えば、二本鎖核酸分子の両鎖が本発明の範囲内に含まれる(それらが互いに会合しているか否かを問わない)。mRNA分子および相補的DNA分子(例えば、cDNA分子)もまた含まれる。
【００２３】
上記c)のヌクレオチド配列は、a)またはb)の配列と少なくとも85%、90%、または95%の同一性を有し得る。ヌクレオチド配列は、a)またはb)の配列と少なくとも96%、97%、98%、または99%の同一性を有し得る。
【００２４】
2つのアミノ酸配列または2つの核酸(ヌクレオチド)配列の「パーセント同一性」は、一般的に、最適な比較をするために配列をアラインメントし(例えば、他方の配列との最良のアラインメントのために、一方の配列にギャップを導入できる)、対応する位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較することにより決定される。「最良のアラインメント」とは、最も高いパーセント同一性をもたらす2つの配列のアラインメントである。パーセント同一性は、比較している配列中の同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドの数によって決まる(すなわち、%同一性＝一致した位置数/位置の総数×100)。
【００２５】
2つの配列間のパーセント同一性の決定は、当業者に公知の数学的アルゴリズムを用いて遂行することができる。2つの配列を比較するための数学的アルゴリズムの例は、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877などで改良されているKarlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムである。Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410のNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラムは、そのようなアルゴリズムを組み込んでいる。本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るには、NBLASTプログラム、スコア＝100、ワード長＝12を用いてBLASTヌクレオチド検索を行うことができる。本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るには、XBLASTプログラム、スコア＝50、ワード長＝3を用いてBLASTタンパク質検索を行うことができる。比較のためにギャップの入ったアラインメントを得るには、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されているように、Gapped BLASTを使用することができる。または、分子間の遠縁関係を検出する反復検索を行うために、PSI-Blastを用いることができる(同書)。BLAST、Gapped BLAST、およびPSI-Blastプログラムを使用する場合、各プログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)の初期設定パラメータを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。
【００２６】
配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの別の例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。GCG配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)は、そのようなアルゴリズムを組み込んでいる。当技術分野で公知の配列解析用の他のアルゴリズムには、Torellis and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10: 3-5に記載されているADVANCEおよびADAM；ならびにPearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8に記載されているFASTAが含まれる。FASTAでは、ktupが、検索の感度および速度を設定する制御オプションである。
【００２７】
本発明の核酸分子は、ヌクレオチド配列の発現を制御するプロモーターまたは他の調節配列をさらに含み得る。プロモーターは誘導性プロモーターであってよく、誘導性プロモーターはGALプロモーターであってよい。プロモーターは、切断型GALプロモーターを含み得る。または、誘導性プロモーターはADH2プロモーターであってよい。
【００２８】
第3の局面において、ヌクレオチド配列の発現を制御するために切断型GALプロモーターを含む、単離された核酸分子または組換え核酸分子を提供する。
【００２９】
切断型GALプロモーターは、切断型GAL1プロモーターであってよい。切断型GAL1プロモーターは、ヌクレオチド202において切断されたGAL1プロモーターであってよい。切断型GAL1プロモーターは、SEQ ID NO：2の配列を含むか、またはその配列からなってよい。
【００３０】
本発明の核酸分子は、プロモーターの下流にあってよい転写終結配列をさらに含み得る。核酸分子は、プロモーターの制御下にヌクレオチド配列を挿入できるようにする、GALプロモーターと終結配列との間の特有の制限部位を含み得る。転写終結配列は、挿入ヌクレオチド配列のすぐ下流にあってよく、または最小距離だけ離れていてよい。転写終結配列は、挿入ヌクレオチド配列から5〜25ヌクレオチドだけ離れていてよい。転写終結配列は、5〜20、5〜15、15〜20、5〜10、6〜9、または6〜8ヌクレオチドだけ離れていてよい。転写終結配列は、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドだけ離れていてよい。
【００３１】
終結配列は、任意の発現遺伝子に由来する終結配列であってよく、SUC2(SUC2t)、PHO5、ADH1、ADH2、またはCYC1から選択され得る。終結配列はSUC2(SUC2t)終結配列であってよく、SEQ ID NO：28の配列を含むか、またはその配列からなってよい。
【００３２】
プロモーターは、N末端アミノ酸を欠くP450還元酵素をコードするヌクレオチド配列の発現を制御し得る。ヌクレオチド配列は、第1および/または第2の局面の核酸分子であってよい。または、プロモーターは、シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列の発現を制御し得る。シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列は、ヒトシトクロムP450およびその他の生物由来のシトクロムP450(http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html)を含む、当技術分野で公知の配列から選択され得る。ヌクレオチド配列はヒトシトクロムP450をコードしてよく、以下から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなってよい：
a) SEQ ID NO：22のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【００３３】
ヌクレオチド配列は、核酸分子のプロモーターと終結配列との間に、BamH1-XbaI、BamH1-XhoI、BglII-XbaI、BglII-XhoI、BamH1-SpeI、またはBglII-SpeI断片として挿入することができる。
【００３４】
上記b)のヌクレオチド配列は、a)の配列と少なくとも85%、90%、または95%の同一性を有し得る。ヌクレオチド配列は、a)の配列と少なくとも96%、97%、98%、または99%の同一性を有し得る。
【００３５】
本発明の核酸分子は、ベクターの形態で提供することができる。
【００３６】
したがって、第4の局面において、第1、第2、および/または第3の局面の核酸分子を含むベクターを提供する。
【００３７】
「ベクター」という用語は、新たな核酸分子を取り入れることができ、適切な宿主においてそのような新たな配列を増やすことができるヌクレオチド配列を有する核酸分子を指す。
【００３８】
ベクターは、標的細胞において前記核酸分子の発現を引き起こし得る。標的細胞は真核細胞であってよく、酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞であってよい。ベクターは組込みベクターであってよい。ベクターは、標的細胞のゲノムに組み込むことが可能であり得る。ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、エピソームとして複製するベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルス随伴ウイルス(AAV)ベクター、アデノウイルスベクター、またはバキュロウイルスベクターから選択され得る。このようなベクターは当技術分野で公知であり、これらはいずれも本発明において使用することができる。ベクターは酵母組込みベクターであってよい。
【００３９】
ベクターは、ベクターでトランスフェクションされた(または形質転換された：これらの用語は本文書において互換的に用いられる)細胞の選択を可能にする、好ましくは異種DNAを組み込んでいるベクターを含む細胞の選択を可能にする、選択マーカーおよび/またはレポーター遺伝子などの1つまたは複数の発現マーカーを含み得る。適切な開始および終止シグナルが一般的に存在し、ベクターが発現を目的とするものである場合には、発現を駆動するための十分な調節配列が存在する。
【００４０】
使用できるレポーター遺伝子の例には、アルカリホスファターゼ(AP)、βガラクトシダーゼ(LacZ)、βグルクロニダーゼ(GUS)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、およびルシフェラーゼ(Luc)が含まれる。考えられる抗生物質選択可能マーカーには、アンピシリン、オーレオバシジン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、ホスフィノスリシン、ピューロマイシン、およびテトラサイクリンに対する耐性を付与するものが含まれる。選択マーカーは、栄養要求性選択マーカー遺伝子であってもよい。栄養要求性選択マーカー遺伝子は、最少培地において形質転換細胞の増殖を可能にし、LEU2、TRP1、ADE2、URA3、HIS3、LYS2、HIS4、またはMET15、またはAUR1-Cから選択され得る。
【００４１】
ベクターは、標的細胞のゲノム内の任意の特定遺伝子の座位において前記核酸分子の組込みを可能にし得る。
【００４２】
選択可能マーカー遺伝子は、特定の染色体座において標的細胞のゲノムへの組込みを可能にし得る。組込みは、当技術分野で公知の技法を用いる相同組換えによるものであってよい。染色体座は、LEU2、TRP1、ADE2、URA3、HIS3、LYS2、HIS4、MET15、もしくはAUR1-C、または抗生物質もしくは他の毒性化合物に対する耐性を付与するいくつかの他のマーカー遺伝子から選択され得る。
【００４３】
ベクターは酵母細胞に組み込むことが可能であってよく、酵母ゲノムに組み込むことが可能であってよい。
【００４４】
本発明のベクターおよび核酸分子は、ランダムな組込みによってまたは相同組換えによって、宿主細胞ゲノムに組み込むことができる。または、これらは、特定部位へ組み込むための部位特異的リコンビナーゼまたはインテグラーゼなど、当技術分野で公知の方法によって、宿主細胞内の特定の位置に標的化することができる。これにより、ベクターおよび/または核酸分子を、発現に許容的であるなど、特定の特徴を有する公知の領域に標的化すること、または宿主細胞の遺伝子への組込みを回避させることが可能になると考えられる。
【００４５】
宿主は真核生物であってよく、酵母、哺乳動物、または昆虫から選択され得る。
【００４６】
本発明の核酸分子および/またはベクターは、当技術分野で公知の種々の方法を用いて細胞に導入することができる。核酸分子および/またはベクターをインビトロで細胞に導入する場合には、トランスフェクション、リポソーム、ウイルス、または脂質試薬などの従来の技法を使用することができる。核酸分子および/またはベクターを細胞、特に哺乳動物細胞に導入するために、エレクトロポレーションを用いてもよい。
【００４７】
本発明のベクターおよび/または核酸分子による標的細胞の形質転換(またはトランスフェクション：これらの用語は本文書において互換的に用いられる)後、種々の選択技法および/またはスクリーニング技法を使用して、該ベクターおよび/または核酸分子が組み込まれたクローンを同定し、それらをさらに特徴づけることができる。選択可能マーカーまたはレポーター遺伝子を使用することにより、レポーター遺伝子の発現の探索、抗生物質選択、または最少培地での増殖によるなど、ベクターおよび/または核酸分子が組み込まれたクローンの選択が可能になると考えられる。
【００４８】
典型的には、一過性発現が薬剤耐性、レポーター遺伝子発現、または最少培地での増殖の理由とならないように、形質転換後に細胞を十分な期間培養する。例えば、細胞を3〜5日間培養することができる。選択および特徴づけの前に、細胞を1週間超、好ましくは10日間、より好ましくは2週間培養することができる。例えば、酵母細胞は3〜4日間培養することができる。
【００４９】
本発明のベクターおよび/または核酸分子を組み込んだクローンをさらに特徴づけることができる。例えば、サザンブロッティングまたはPCRを行って、ベクターおよび/または核酸分子の組込みを確認し、組み込まれたベクターおよび/または核酸分子の組込み部位ならびにコピー数を決定することができる。組込み部位の特徴づけを行って、妨害された部位が内因性の遺伝子またはその他の重要なエレメントでないことを保証することができる。ノーザンブロッティングまたは他のこのような技法を行って、核酸配列が発現されているかどうかを決定することもできる。
【００５０】
ベクターは、各コピーがそれぞれのプロモーターの制御下にある、本発明の第1、第2、および/または第3の局面の核酸分子を2コピー含み得る。プロモーターは誘導性プロモーターであってよく、GALプロモーターであってよい。プロモーターは切断型GALプロモーターであってよい。これらのベクターは、細胞の形質転換および宿主細胞ゲノムへの組込み後に、本発明の核酸分子の高発現を可能にする。したがって、このようなベクターは、細胞において、高活性を有するシトクロムP450アイソザイムのさらなる高発現レベルおよび産生の向上を提供し得る。
【００５１】
本発明の第5の局面は、第1、第2、もしくは第3の局面の核酸分子、および/または第4の局面のベクターで形質転換された細胞を提供する。第1、第2、もしくは第3の局面の核酸、および/または第4の局面のベクターは、該細胞のゲノムに組み込まれ得る。形質転換(またはトランスフェクション：これらの用語は本文書において互換的に用いられる)細胞は真核細胞であってよく、酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞であってよい。
【００５２】
本発明の第6の局面は、第1、第2、もしくは第3の局面の核酸分子、および/または該核酸分子の発現を指向する第4の局面のベクターで、細胞を形質転換する段階を含む、第1、第2、または第3の局面の核酸分子を細胞において発現させる方法を提供する。
【００５３】
第7の局面は、シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列の発現を指向する第4の局面のベクターで細胞を形質転換する段階を含む、シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列を細胞において発現させる方法を提供する。
【００５４】
前記ヌクレオチド配列は異種シトクロムP450をコードしてよく、ヒトシトクロムP450配列およびその他の生物由来の配列(http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html)を含む、当技術分野で公知の配列から選択され得る。ヌクレオチド配列は、以下から選択される配列を含むか、またはその配列からなってよい：
a) SEQ ID NO：22のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【００５５】
上記b)のヌクレオチド配列は、a)の配列と少なくとも85%、90%、または95%の同一性を有し得る。ヌクレオチド配列は、a)の配列と少なくとも96%、97%、98%、または99%の同一性を有し得る。
【００５６】
細胞は真核細胞であってよい。細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞であってよい。
【００５７】
本発明の第8の局面において、第1、第2、もしくは第3の局面の核酸分子、および/または第4の局面のベクターで酵母株を形質転換する段階を含む、第1、第2、または第3の局面の核酸分子を発現する酵母株を作製する方法を提供する。
【００５８】
本発明は、第9の局面において、第8の局面の方法によって作製された、または第4の局面のベクターで形質転換された酵母株をさらに提供する。
【００５９】
酵母株はサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)であってよい。酵母株は、当技術分野で公知の酵母株から選択され得る。酵母株は、酵母株JL20(Daum, G et al. Yeast Functional Analysis Report. Yeast Volume 15, Issue 7 , Pages 601 - 614)およびW303B(Furuchi, T et al. Functions of yeast helicase Ssl2p that are essential for viability are also involved in protection from the toxicity of adriamycin. Nucleic Acids Res. 2004; 32(8): 2578-2585.)から選択され得る。
【００６０】
第1、第2、または第3の局面の核酸分子を発現する酵母株は、シトクロムP450の活性および/または発現の増加をもたらすシステムの提供を可能にする。
【００６１】
本発明の第11の局面は、以下を含むタンパク質発現システムを提供する：
i) 第5の局面の細胞または第9の局面の酵母株；および
ii) 標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターであって、配列が該ヌクレオチド配列の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある、ベクター。
【００６２】
前記ヌクレオチド配列はシトクロムP450をコードしてよく、シトクロムP450は異種シトクロムP450であってよく、ヒトシトクロムP450であってよい。
【００６３】
前記ヌクレオチド配列は、またはシトクロムb5タンパク質をコードしてもよく、シトクロムb5タンパク質は異種シトクロムb5タンパク質であってよい。シトクロムb5タンパク質はヒトb5タンパク質であってよい。ヌクレオチド配列は、以下を含むかまたは以下からなってよい：
a) SEQ ID NO：86のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【００６４】
上記b)のヌクレオチド配列は、a)の配列と少なくとも85%、90%、または95%の同一性を有し得る。ヌクレオチド配列は、a)の配列と少なくとも96%、97%、98%、または99%の同一性を有し得る。
【００６５】
シトクロムb5タンパク質は、シトクロムP450活性に寄与する補因子である。
【００６６】
ベクターは、多様なプロモーターの制御下にある、シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列およびシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【００６７】
ベクターは、前記細胞または酵母ゲノムへの組込みに際して、該ヌクレオチド配列または各ヌクレオチド配列の発現を引き起こし得る。
【００６８】
ベクターは、第4の局面に定義される通りであってよい。
【００６９】
本発明はまた、第12の局面において、シトクロムP450の発現を指向し得る第4の局面のベクターで、第5の局面の細胞または第9の局面の酵母株を形質転換する段階を含む、活性が増加したおよび/または発現レベルが増加したシトクロムP450を生成する方法を提供する。
【００７０】
シトクロムP450は異種シトクロムP450であってよく、ヒトシトクロムP450であってよい。
【００７１】
本発明はまた、第13の局面において、第1、第2、もしくは第3の局面の核酸分子、および/または第4の局面のベクターで、細胞を形質転換する段階を含む、活性が増加したおよび/または発現レベルが増加したシトクロムP450を生成する方法を提供する。
【００７２】
本方法は、シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、および/またはシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列の発現を指向する第4の局面のベクターで前記細胞を形質転換する段階をさらに含み得る。
【００７３】
前記ヌクレオチド配列は異種シトクロムP450をコードしてよく、ヒトシトクロムP450であってよい。
【００７４】
第12および/または第13の局面の方法は、シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、および/またはシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向するベクターで前記細胞を形質転換する段階をさらに含み得る。
【００７５】
シトクロムP450の活性は、ERODアッセイ法によって、または当技術分野で公知の他のアッセイ法によって測定することができる。シトクロムP450の発現は、当技術分野で公知のように、CO-差スペクトルを用いて測定することができる。測定された発現および/または活性が、第1、第2、もしくは第3の局面の核酸分子、および/または第4の局面のベクターで形質転換されていない細胞におけるシトクロムP450の発現および/または活性よりも高い場合に、活性および/または発現の増加が起こる。
【００７６】
細胞は真核細胞であってよく、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞から選択され得る。
【００７７】
本発明は、第14の局面において、第6の局面の方法によって生成されたP450還元酵素を提供する。
【００７８】
第15の局面は、以下を含むかまたは以下からなる、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを提供する：
a) N末端アミノ酸を欠くP450還元酵素であって、シトクロムP450と同時発現された場合に、野生型P450還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/もしくは発現と比較して、シトクロムP450の活性および/もしくは発現を増加させるP450還元酵素；
b) シトクロムP450と同時発現された場合に、野生型P450還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/もしくは発現と比較して、シトクロムP450の活性および/もしくは発現を増加させる、a)のポリペプチドの相同体；または
c) シトクロムP450と同時発現された場合に、野生型P450還元酵素と同時発現された場合のシトクロムP450の活性および/もしくは発現と比較して、シトクロムP450の活性および/もしくは発現を増加させる、a)のポリペプチドもしくはb)の相同体の断片。
【００７９】
前記ポリペプチドはP450還元酵素であってよく、P450還元酵素はヒトP450還元酵素であってよい。P450還元酵素は、24個のN末端アミノ酸を欠く場合もある。ヒトP450還元酵素は、SEQ ID NO :26のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなってよい。
【００８０】
前記ポリペプチドは、エピトープタグを含むC末端のアミノ酸配列をさらに含み得る。エピトープタグは、アミノ酸配列EQKLISEEDLNGを含み得るc-mycであってよい。c-mycタグは、リンカーSSを用いてP450還元酵素に連結され得る。アミノ酸配列は、そのC末端にアミノ酸SRLをさらに含み得る。本発明による1つのポリペプチドは、SEQ ID NO :27の配列を含むか、またはその配列からなってよい。このポリペプチドは、ヒトP450還元酵素の荷電したN末端の24アミノ酸およびCOOH末端の終止コドンを欠くが、C末端においてc-mycエピトープタグEQKLISEEDLNGを含むP450還元酵素である。12アミノ酸のc-mycタグは負に荷電したペプチドであり、リンカーであるSS(制限部位SpeIとXbaIの連結を通して形成されたTCTAGTによってコードされる)を介してC末端に連結されている。
【００８１】
1つまたは複数の付加、欠失、置換等を含むポリペプチドは、本発明によって包含される。加えて、1つのアミノ酸を類似した「型」の別のアミノ酸と置換することが可能であると考えられる。例えば、疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸と置換することができる。
【００８２】
本発明のポリペプチドは、プロセシングもしくは他の翻訳後修飾などの天然の過程により、または当技術分野で周知の化学的修飾技法により修飾され得る。存在し得る多数の公知の修飾の中には、限定されないが、アセチル化、アシル化、アミド化、ADP-リボシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、脂質または脂質誘導体の共有結合、メチル化、ミリスチル化、ペグ化、プレニル化、リン酸化、ユビキチン化、または任意の類似の過程が含まれる。
【００８３】
相同体の場合、本明細書に記載されるポリペプチドとの同一性の程度は、相同体が該ポリペプチドの機能を保持すべきであるという点に比べれば、さほど重要ではない。しかしながら、本明細書に記載されるポリペプチドと少なくとも60%の同一性を有する相同体が提供されることが適切である。好ましくは、少なくとも70%の同一性、より好ましくは少なくとも80%の同一性を有する相同体が提供される。最も好ましくは、少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%、またはさらには99%もしくはそれ以上の同一性を有する相同体が提供される。
【００８４】
遺伝暗号の周知の縮重を考慮すると、本発明のポリペプチドは非常に様々な核酸分子によってコードされ得る。これらの分子はすべて、本発明の範囲内である。これらをベクターに挿入し、クローニングして、さらなる研究のために大量のDNAまたはRNAを提供することができる。当業者に公知の技法を用いて、適切なベクターを宿主細胞に導入して、本発明において用いられるポリペプチドを発現させることができる。
【００８５】
本発明のポリペプチド、相同体、またはそれらの断片は、単離された形態または組換え形態で提供することができ、また他の部分に融合させることができる。ポリペプチド、相同体、またはそれらの断片は、実質的に純粋な形態で、すなわち他のタンパク質を実質的な程度に含まない形態で提供することができる。したがって、ポリペプチドは、それが主要に存在する成分である(すなわち、溶媒または担体を除いて重量/重量基準で決定される場合に、少なくとも50%；好ましくは少なくとも75%、少なくとも90%、または少なくとも95%のレベルで存在する)組成物中に提供することができる。
【００８６】
結果として得られた長さが縮小されたポリペプチドが依然として所望の活性を有するか、または有用な抗体を生じさせることができるならば、ポリペプチドの長さを縮小することが有利である場合が多い。したがって、本発明のこの局面の特徴c)は、a)のポリペプチドまたはb)の相同体の断片を包含する。
【００８７】
「断片」とは、a)のアミノ酸配列の少なくとも5アミノ酸残基(好ましくは、少なくとも10アミノ酸残基、少なくとも15アミノ酸残基、少なくとも20アミノ酸残基、少なくとも25アミノ酸残基、少なくとも40アミノ酸残基、少なくとも50アミノ酸残基、少なくとも60アミノ残基、少なくとも70アミノ酸残基、少なくとも80アミノ酸残基、少なくとも90アミノ酸残基、少なくとも100アミノ酸残基、少なくとも125アミノ酸残基、少なくとも150アミノ酸残基、少なくとも175アミノ酸残基、少なくとも200アミノ酸残基、または少なくとも250アミノ酸残基)のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。断片は、a)で定義されるポリペプチドの機能活性を有する。
【００８８】
ポリペプチドに関して本明細書で使用する「単離された」とは、その天然環境から分離され、その同定または使用を可能にするのに十分な量で存在することを意味する。タンパク質またはポリペプチドに言及する場合の単離されたとは、例えば、(i) 発現クローニングにより選択的に産生された、または(ii) クロマトグラフィーもしくは電気泳動により精製されたことを意味する。単離されたポリペプチドは実質的に純粋であってよいが、そうである必要はない。「実質的に純粋な」という用語は、ポリペプチドが、それらの意図される用途に実際的かつ適切な程度にまで、天然またはインビボシステムにおいてそれらと共に見出され得る他の物質を本質的に含まないことを意味する。
【００８９】
「組換えポリペプチド」とは、宿主細胞においてポリペプチドの発現を駆動するように操作された組換えベクターで一過性にまたは安定して形質転換またはトランスフェクションされた異種細胞における発現によって単離された、精製された、または同定されたポリペプチドである。
【００９０】
標的細胞においてシトクロムP450の活性および/または発現の増加を提供するため、本発明者らは、標的細胞のゲノム内の各プロテアーゼ遺伝子を破壊することによって、シトクロムP450および/またはシトクロムP450還元酵素の分解を防ぐことができることを特定した。
【００９１】
酵母PEP4/PRA-1遺伝子は、液胞プロテアーゼの翻訳後プロセシングおよび機能成熟において重要な酵素である液胞プロテイナーゼA(yscA)をコードする。いくつかの出版物は、CYP2B1、CYP2E1、およびNADPH P450還元酵素を含む特定の内在性ERタンパク質が、プロテアソーム分解よりもむしろリソソーム分解を受け得ることを示している(Masaki, R. et al. 1987. Cytochrome P-450 and NADPH-cytochrome P-450 reductase are degraded in the autolysosomes in rat liver. J Cell Biol, 104: 1207-1215；Ronis, M. et al. 1991. Acetone-regulated synthesis and degradation of cytochrome P450E1 and cytochrome P4502B1 in rat liver. Eur J Biochem, 198(2): 383-389；Murray, B. et al. 2002. Native CYP2C11: heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae reveals a role for vacuolar proteases rather than the proteasome system in the degradation of this endoplasmic reticulum protein. Mol Pharmacol, 61: 1146-1153)。酵母の液胞は、サイトゾルタンパク質、液胞タンパク質、および内在性膜タンパク質を含む種々のタンパク質の分解部位として、哺乳動物のリソソームに類似している(Wolf, D. H. 2004. From lysosome to proteasome: the power of yeast in the dissection of proteinase function in cellular regulation and waste disposal. Cell Mol Life Sci, 61(13): 1601-1614)。
【００９２】
UBC(ユビキチン、Ub、結合)遺伝子、HRD(3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA還元酵素分解)遺伝子、およびDER(ERにおける分解)遺伝子は、Hmg2pおよびCPY*(ER内腔内に保持される誤って折りたたまれたカルボキシペプチダーゼ変異体)のER関連分解(ERAD)に重要なUBC/HRD/DER機構として同定された(Hampton, R. Y. 2000. ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation. Curr Opin Cell Biol, 14(4): 476-482；Kostova, Z., and Wolf, D. 2003. For whom the bell tolls: protein quality control of the endoplasmic reticulum and the ubiquitin-proteasome connection. EMBO J, 22(10): 2309-2317)。
【００９３】
ER関連Ub結合酵素(Ubc1p、Ubc6p、およびUbc7p)に関する研究により、種々のタンパク質の分解におけるユビキチン化の役割の特徴づけ、および関与する特異的Ubcの同定がもたらされた(Biederer, T., Volkwein, C., and Sommer, T. 1997. Role of cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science, 278(5344): 1806-1809；Hampton, R. Y., and Bhakta, H. 1997. Ubiquitin-mediated regulation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase. Proc Natl Acad Sci USA, 94(24): 12944-12948)。特に、2つのUbc(Ubc6pおよびUbc7p)が、酵母におけるER内腔タンパク質および膜結合タンパク質の分解における重要な酵素として同定された。Ubc6pは、触媒ドメインがサイトゾルに面した、内在性C末端繋留ER膜タンパク質である。Ubc7pは、酵母において、ER膜結合タンパク質(Sec61pなど)、ER内腔タンパク質(CPY*など)、およびさらには可溶性タンパク質の分解のために、そのパートナーである内在性膜繋留ERタンパク質、Cue1pとの会合を必要とするサイトゾルタンパク質である(Biederer, T., Volkwein, C., and Sommer, T. 1997. Role of cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science, 278(5344): 1806-1809；Sommer, T., and Wolf, D. H. 1997. Endoplasmic reticulum degradation: reverse protein flow of no return. FASEB J, 11(14): 1227-1233)。
【００９４】
Hrd2pは、26Sプロテアソーム機能に必須である19Sサブユニットである。Hrd1p/Hrd3p複合体はER関連Ubリガーゼである。HRD1遺伝子産物は、2つの異なるドメイン：複数の予測される膜貫通スパンを有するN末端疎水性領域、およびER内腔タンパク質の分解に必要なサイトゾルC末端親水性RING-Hモチーフを有する内在性ER膜タンパク質、Der3pと同一である(Sommer, T., and Wolf, D. H. 1997. Endoplasmic reticulum degradation: reverse protein flow of no return. FASEB J, 11(14): 1227-1233；Plemper, R. K. et al. 1999a. Genetic interactions of Hrd3p and Der3p/Hrdlp with Sec61p suggest a retro-translocation complex mediating protein transport for ER degradation. J Cell Sci, 112(22): 4123-4134)。Der3pは内在性タンパク質Hmg2pと同一である(Gardner, R. G. et al. 2000. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling: transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol, 151(1): 69-82)。単一のC末端膜アンカーおよびER内腔内の大きなN末端ドメインを有するER常在性糖タンパク質でもあるHRD3遺伝子産物の機能が、最近になって解明された(Gardner, R. et al. 2000. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling: transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol, 151(1): 69-82)。Hrd1pおよびHrd3pはいずれも、Ubc7p依存的ユビキチン化、およびそれに続く26Sプロテアソームへのポリトピック型HMGRの送達を促進するER関連Ubリガーゼ複合体を形成することが示されている(Gardner, R. G. et al. 2000. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling: transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol, 151(1): 69-82 Wilhovsky, S. et al. 2000. HRD Gene dependence of endoplasmic reticulum associated degradation. Mol Biol Cell, 11(5): 1697-1708；Bays, N. M. et al. 2001. Hrd1p/Der3p is a membrane-anchored ubiquitin ligase required for ER-associated degradation. Nat Cell Biol, 3(1): 24-29)。加えて、Hrd/Derタンパク質は、ER分解のためのタンパク質輸送においてSec61pと共に機能することが提唱されているだけでなく(Plemper, R. K. et al. 1999a. Genetic interactions of Hrd3p and Der3p/Hrd1p with Sec61p suggest a retro-translocation complex mediating protein transport for ER degradation. J Cell Sci, 112(22): 4123-4134；Plemper, R. K., and Wolf, D. H. 1999b. Endoplasmic reticulum degradation. Reverse protein transport and its end in the proteasome. Mol Biol Rep, 26(1-2): 125-130)、いくつかの内腔タンパク質および内在性ERタンパク質のER関連分解において、ならびに誤って折りたたまれたタンパク質またはさもなくば異常なタンパク質の除去におけるER品質制御において中心的な機構的役割を果たすと考えられている(Plemper, R. K. et al. 1999a. Genetic interactions of Hrd3p and Der3p/Hrd1p with Sec61p suggest a retro-translocation complex mediating protein transport for ER degradation. J Cell Sci, 112(22): 4123-4134：Wilhovsky, S. et al. 2000. HRD Gene dependence of endoplasmic reticulum associated degradation. Mol Biol Cell, 11(5): 1697-1708)。
【００９５】
Cdc48p-Ufd1p-Hrd4pは、ポリユビキチン化ERタンパク質の認識、それらのER転位、およびそれに続く26Sプロテアソームへの送達に関与する複合体である。
【００９６】
酵母HRD/DER機構の哺乳動物相同体は、ERAD過程の進化的保存性が高いことの証明となる(Kostova, Z., and Wolf, D. 2003. For whom the bell tolls: protein quality control of the endoplasmic reticulum and the ubiquitin-proteasome connection. EMBO J, 22(10): 2309-2317)。
【００９７】
標的細胞においてプロテアーゼをコードする遺伝子を破壊することで、シトクロムP450および/またはP450還元酵素の分解が減少し、ひいては活性が増加したおよび/または発現が増加したシトクロムP450および/またはP450還元酵素の生成が可能になる。実際に、プロテアーゼ欠損細胞の提供は、標的細胞において、高活性を有するシトクロムP450および/またはP450還元酵素を増産するのに有用である。
【００９８】
本発明の第16の局面は、細胞においてプロテアーゼ分解酵素をコードする標的遺伝子の破壊を可能にする、単離された核酸分子または組換え核酸分子を提供する。
【００９９】
細胞は真核細胞であってよく、酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞であってよい。細胞は酵母細胞であってよい。前記核酸分子は、細胞において前記標的遺伝子の欠失を可能にし得る。
【０１００】
前記標的遺伝子は、液胞プロテアーゼまたはプロテアソームプロテアーゼであってよいプロテアーゼ分解酵素をコードし得る。液胞プロテアーゼは、PRA1(PEP4)、プロテアーゼB(PRB1)、およびカルボキシペプチダーゼY & S(CPY & CPS)、タンパク質分解に関与するアミノペプチダーゼ、yscIおよびyscCoから選択され得る。プロテアソームプロテアーゼは、HRD(HRD 1、HRD2、およびHRD3を含む)、UBC(UBC6およびUBC7を含む)、CUE1；およびCdc48p-Ufd1p-Hrd4p複合体から選択され得る。前記核酸分子は、細胞のゲノムに組み込むことが可能であり得る。核酸分子は、相同組換えを介してゲノムに組み込まれ得る。核酸は、標的化相同組換えによってプロテアーゼの欠失を可能にし得る。核酸分子は、液胞プロテアーゼの破壊を可能にし得る。
【０１０１】
前記核酸分子は、前記標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列が両側に隣接した、細胞のゲノムへの組込みを可能にするヌクレオチド配列を含み得る。
【０１０２】
前記核酸分子は、前記標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列が両側に隣接した選択可能マーカー遺伝子を含み得る。隣接ヌクレオチド配列は、標的遺伝子のコード領域または調節領域と実質的に同一であってよい。隣接ヌクレオチド配列は、標的遺伝子の5'断片および3'断片と実質的に同一であってよい。
【０１０３】
破壊しようとする遺伝子の5'断片は、以下から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなってよい：
a) SEQ ID NO：51、58、65、または72のヌクレオチド配列；
b) a)のヌクレオチド配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、この局面の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こすヌクレオチド配列；
c) a)またはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；
d) この局面の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こす、a)、b)、またはc)の断片。
【０１０４】
上記b)のヌクレオチド配列は、a)の配列と少なくとも85%、90%、または95%の同一性を有し得る。ヌクレオチド配列は、a)の配列と少なくとも96%、97%、98%、または99%の同一性を有し得る。
【０１０５】
破壊しようとする遺伝子の3'断片は、以下から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなってよい：
a) SEQ ID NO：54、61、68、または75のヌクレオチド配列；
b) a)のヌクレオチド配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、この局面の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こすヌクレオチド配列；
c) a)またはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；
d) この局面の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こす、a)、b)、またはc)の断片。
【０１０６】
上記b)のヌクレオチド配列は、a)の配列と少なくとも85%、90%、または95%の同一性を有し得る。ヌクレオチド配列は、a)の配列と少なくとも96%、97%、98%、または99%の同一性を有し得る。
【０１０７】
d)の断片は、相同組換えを介して遺伝子の破壊を可能にするのに適した長さのものであってよい。断片は、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、または少なくとも60ヌクレオチドを含み得る。
【０１０８】
破壊しようとするプロテアーゼ遺伝子がPRA1(PEP4)である場合、選択可能マーカーに隣接するPRA1の5'断片は、SEQ ID NO：51のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなってよい。PRA1の3'断片は、SEQ ID NO：54のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなってよい。破壊しようとするプロテアーゼ遺伝子がHRD1である場合、選択可能マーカーに隣接するHRD1の5'断片は、SEQ ID NO：58のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなってよい。HRD1の3'断片は、SEQ ID NO：61のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなってよい。破壊しようとするプロテアーゼ遺伝子がHRD2である場合、選択可能マーカーに隣接するHRD2の5'断片は、SEQ ID NO：65のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなってよい。HRD2の3'断片は、SEQ ID NO：68のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなってよい。破壊しようとするプロテアーゼ遺伝子がUBC7である場合、選択可能マーカーに隣接するUBC7の5'断片は、SEQ ID NO：72のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなってよい。UBC7の3'断片は、SEQ ID NO：75のヌクレオチド配列を含むか、またはその配列からなってよい。
【０１０９】
選択可能マーカー遺伝子は、TRP1、LEU2、ADE2、URA3、HIS3、LYS2、HIS4、またはMET15、またはAUR1-Cから選択され得る。選択可能マーカー遺伝子はTRP1であってよく、SEQ ID NO：47の配列を含むか、またはその配列からなってよい。
【０１１０】
前記核酸分子による酵母標的細胞の形質転換に際して、前記標的遺伝子は、選択可能マーカー遺伝子ならびに標的遺伝子の隣接5'断片および3'断片を含む核酸分子によって破壊される。核酸分子の末端間での相同組換えにより、標的遺伝子は、破壊された遺伝子配列で置き換えられる。遺伝子破壊は、プライマーを用いてPCR増幅することにより確認することができる。
【０１１１】
第16の局面の核酸分子は、ベクターの形態であってよい。したがって、第17の局面では、細胞の形質転換後に、標的細胞においてプロテアーゼ分解酵素をコードする遺伝子の破壊を可能にするベクターを提供し、このベクターは第16の局面の核酸分子を含む。
【０１１２】
本発明の第18の局面は、第16の局面の核酸分子および/または第17の局面のベクターで形質転換された細胞を提供する。第16の局面の核酸分子および/または第17の局面のベクターは、該細胞のゲノムに組み込まれ得る。細胞は真核細胞であってよく、酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞であってよい。
【０１１３】
本発明の第19の局面は、第16の局面の核酸分子および/または第17の局面のベクターで、細胞を形質転換する段階を含む、細胞においてプロテアーゼ分解酵素をコードする遺伝子を破壊する方法を提供する。
【０１１４】
第20の局面は、第16の局面の核酸分子および/または第17の局面のベクターで酵母株を形質転換する段階を含む、プロテアーゼ欠損酵母株を作製する方法を提供する。
【０１１５】
酵母株はサッカロミセス・セレビシエであってよい。酵母株は、当技術分野で公知の酵母株から選択され得る。酵母株は、酵母株JL20(Daum, G et al. Yeast Functional Analysis Report. Yeast Volume 15, Issue 7 , Pages 601 - 614)およびW303B(Furuchi, T et al. Functions of yeast helicase Ssl2p that are essential for viability are also involved in protection from the toxicity of adriamycin. Nucleic Acids Res. 2004; 32(8): 2578-2585.)から選択され得る。
【０１１６】
第21の局面は、第20の局面の方法によって作製された酵母株を提供する。
【０１１７】
プロテアーゼ欠損酵母株の提供は、酵母において、異種シトクロムP450であってよいシトクロムP450の活性および/または発現のレベル増加を提供する。
【０１１８】
したがって、第22の局面において、本発明は、シトクロムP450の発現を指向し得る第4の局面のベクターで第18の局面の細胞または第21の局面の酵母株を形質転換する段階を含む、活性が増加したおよび/または発現レベルが増加したシトクロムP450を生成する方法を提供する。
【０１１９】
シトクロムP450は異種シトクロムP450であってよい。シトクロムP450はヒトシトクロムP450であってよい。
【０１２０】
シトクロムP450の活性および/または発現のさらなる増加を提供するために、本方法は、第1、第2、もしくは第3の局面の核酸分子、または第1、第2、もしくは第3の局面の核酸分子の発現を指向し得る第4の局面のベクターで、結果として得られた細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含み得る。
【０１２１】
または、本方法は、シトクロムP450の発現を指向し得る第4の局面のベクターで前記酵母株を形質転換する前に、第1、第2、もしくは第3の局面の核酸分子、または第1、第2、もしくは第3の局面の核酸分子の発現を指向し得る第4の局面のベクターで該細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含み得る。
【０１２２】
加えて、本方法は、シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向し得るベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含み得る。
【０１２３】
または、本方法は、多様なプロモーターの制御下にある、シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列およびシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向し得るベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する段階を含み得る。
【０１２４】
シトクロムb5タンパク質は異種シトクロムb5タンパク質であってよい。シトクロムb5タンパク質はヒトb5タンパク質であってよい。
【０１２５】
したがって、プロテアーゼが欠損し、また必要に応じて、第1、第2、もしくは第3の局面の核酸分子によってコードされるようなP450還元酵素を発現し、かつ/またはシトクロムb5タンパク質を発現する細胞または酵母株を考慮して、活性および/または発現レベルが増加したシトクロムP450を発現する細胞および/または酵母株を作製することが可能である。
【０１２６】
したがって、第23の局面において、シトクロムP450の発現を駆動し得る第4の局面のベクター、および/または第1、第2、もしくは第3の局面の核酸分子の発現を駆動し得る第4の局面のベクター、および/またはシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向し得るベクターで形質転換された、第18の局面の細胞または第21の局面の酵母株を提供する。
【０１２７】
本発明はまた、第24の局面において、以下を含むタンパク質発現システムを提供する：
i) 第18の局面の細胞または第21の局面の酵母株；および
ii) 標的タンパク質の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
【０１２８】
前記ヌクレオチド配列はシトクロムP450をコードしてよく、シトクロムP450は異種シトクロムP450であってよい。シトクロムP450はヒトシトクロムP450であってよい。ベクターは、前記細胞または酵母株への組込みに際して、該ヌクレオチド配列の発現を引き起こし得る。ベクターは、第4の局面に定義される通りであってよい。
【０１２９】
前記タンパク質発現システムは、第1、第2、または第3の局面の核酸分子を発現し得る第4の局面のベクターをさらに含み得る。
【０１３０】
前記タンパク質発現システムは、シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現し得るベクターをさらに含み得る。
【０１３１】
本発明者らはまた、酵母発現システムにおいてシトクロムP450の活性および発現を増加させるために、内因性シトクロムP450還元酵素(yRD)が混入していない酵母株を提供できることを見出した。さらに、内因性yRDが混入していない酵母株において、様々な染色体座においてyRDを発現させることによって、様々なyRD活性を有する酵母株を提供できることが見出された。
【０１３２】
第25の局面は、細胞において内因性P450還元酵素をコードする標的遺伝子の破壊を可能にする、単離された核酸分子または組換え核酸分子を提供する。
【０１３３】
細胞は真核細胞であってよく、酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞であってよい。
【０１３４】
前記核酸分子は、前記標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列が両側に隣接した、細胞のゲノムへの組込みを可能にするヌクレオチド配列を含み得る。核酸分子は、標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列が隣接した選択可能マーカー遺伝子を含み得る。標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列は、相同組換えに際して標的遺伝子が破壊されるように選択することができる。
【０１３５】
隣接ヌクレオチド配列は、以下を含むかまたは以下からなってよい：
a) i) SEQ ID NO：84のヌクレオチド配列；
ii) ii)のヌクレオチド配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、この局面の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こすヌクレオチド配列；
iii) i)もしくはii)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
iv) この局面の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こす、i)、ii)、もしくはiii)の断片；および
b) i) SEQ ID NO：85のヌクレオチド配列；
ii) i)のヌクレオチド配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、この局面の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こすヌクレオチド配列；
iii) i)もしくはii)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
iv) この局面の核酸分子の一部として提供される場合に、前記標的遺伝子の破壊を引き起こす、i)、ii)、もしくはiii)の断片。
【０１３６】
上記a)ii)およびb)ii)のヌクレオチド配列は、それぞれa)i)およびb)i)の配列と少なくとも85%、90%、または95%の同一性を有し得る。ヌクレオチド配列は、a)i)またはb)i)の配列と少なくとも96%、97%、98%、または99%の同一性を有し得る。
【０１３７】
a)iii)およびb)iii)の断片は、相同組換えを介して遺伝子の破壊を可能にするのに適した長さのものであってよい。断片は、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、または少なくとも60ヌクレオチドを含み得る。
【０１３８】
選択可能マーカー遺伝子は、LEU2、TRP1、ADE2、URA3、HIS3、LYS2、HIS4、MET15、もしくはAUR1-C、または他のマーカー遺伝子から選択され得る。
【０１３９】
前記核酸分子による酵母標的細胞の形質転換(Klebe, L. K. et al. 1983. A general method for polyethylenglycol-induced genetic transformation of bacteria and yeast. Gene, 25(2-3): 333-341；Schiestl, R. H., and Gietz, R. D. 1989. High efficiency transformation of intact yeast cells by using single stranded nucleic acid as carrier. Curr Genet, 16(5-6): 339-346)に際して、前記標的遺伝子は、選択可能マーカー遺伝子および隣接ヌクレオチド配列を含む核酸分子によって破壊される。核酸分子の末端間での相同組換えにより、標的遺伝子は、破壊された遺伝子配列で置き換えられる。遺伝子破壊は、プライマーを用いてPCR増幅することにより確認することができる。
【０１４０】
前記核酸分子はベクターの形態であってよい。したがって、第26の局面では、細胞の形質転換後に、標的細胞においてP450還元酵素をコードする内因性遺伝子の破壊を可能にするベクターを提供し、このベクターは第25の局面の核酸分子を含む。
【０１４１】
または、第27の局面は、細胞の形質転換後に、標的細胞においてP450還元酵素をコードする内因性遺伝子の破壊を可能にするベクターを提供し、このベクターは、該標的細胞のゲノムへの組込みを可能にするためにベクターを線状化できるようにする1つまたは複数の特有の制限部位を含む前記標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列と、該細胞のゲノムへの組込みを可能にするヌクレオチド配列とを含む。
【０１４２】
前記標的遺伝子と実質的に同一なヌクレオチド配列は、該標的遺伝子と少なくとも80%の同一性、少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%、またはさらには99%もしくはそれ以上の同一性を有し得る。ヌクレオチド配列は、以下から選択される配列を含むか、またはその配列からなってよい：
a) SEQ ID No: 81のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【０１４３】
第28の局面は、第25の局面の核酸分子および/または第26もしくは第27の局面のベクターで形質転換された細胞を提供する。
【０１４４】
細胞は真核細胞であってよく、酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞であってよい。
【０１４５】
第29の局面は、第25の局面の核酸分子および/または第26もしくは第27の局面のベクターで、細胞を形質転換する段階を含む、P450還元酵素をコードする内因性遺伝子を破壊する方法を提供する。
【０１４６】
第30の局面は、第25の局面の核酸分子および/または第26もしくは第27の局面のベクターで酵母株を形質転換する段階を含む、シトクロムP450還元酵素が欠損した細胞または酵母株を作製する方法を提供する。
【０１４７】
酵母株はサッカロミセス・セレビシエであってよい。酵母株は、当技術分野で公知の酵母株から選択され得る。酵母株は、酵母株JL20(Daum, G et al. Yeast Functional Analysis Report. Yeast Volume 15, Issue 7 , Pages 601 - 614)およびW303B(Furuchi, T et al. Functions of yeast helicase Ssl2p that are essential for viability are also involved in protection from the toxicity of adriamycin. Nucleic Acids Res. 2004; 32(8): 2578-2585)から選択され得る。
【０１４８】
第31の局面は、第30の局面の方法によって作製された、または第26もしくは第27の局面のベクターで形質転換された酵母株を提供する。
【０１４９】
第32の局面は、シトクロムP450の発現を指向し得る第4の局面のベクターで第28の局面の細胞または第31の局面の酵母株を形質転換する段階を含む、酵母において活性および/または発現が増加したシトクロムP450を生成する方法を提供する。
【０１５０】
シトクロムP450は異種シトクロムP450であってよい。シトクロムP450はヒトシトクロムP450であってよい。
【０１５１】
本方法は、第1、第2、または第3の局面の核酸分子の発現を指向し得る第4の局面のベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含み得る。
【０１５２】
または、本方法は、シトクロムP450の発現を指向し得る第4の局面のベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する前に、第1、第2、または第3の局面の核酸分子の発現を指向し得る第4の局面のベクターで該細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含み得る。
【０１５３】
加えて、本方法は、シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向し得るベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含み得る。
【０１５４】
または、本方法は、多様なプロモーターの制御下にあるシトクロムP450をコードするヌクレオチド配列およびシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向し得るベクターで、前記細胞または酵母株を形質転換する段階を含み得る。
【０１５５】
シトクロムb5タンパク質は異種シトクロムb5タンパク質であってよい。シトクロムb5タンパク質はヒトb5タンパク質であってよい。
【０１５６】
第33の局面において、シトクロムP450の発現を駆動し得る第4の局面のベクター、および/または第1、第2、もしくは第3の局面の核酸分子の発現を指向し得る第4の局面のベクター、および/またはシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向し得るベクターで形質転換された、第31の局面の酵母株を提供する。
【０１５７】
本発明はまた、第34の局面において、以下を含むタンパク質発現システムを提供する：
i) 第28の局面の細胞または第31の局面の酵母株；および
ii) 標的タンパク質の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
【０１５８】
前記ヌクレオチド配列はシトクロムP450をコードしてよく、シトクロムP450は異種シトクロムP450であってよい。シトクロムP450はヒトシトクロムP450であってよい。ベクターは、前記細胞または酵母株への組込みに際して、該ヌクレオチド配列の発現を引き起こし得る。ベクターは、第4の局面に定義される通りであってよい。
【０１５９】
前記タンパク質発現システムは、第1、第2、または第3の局面の核酸分子を発現し得る第4の局面のベクターをさらに含み得る。
【０１６０】
前記タンパク質発現システムは、シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現し得るベクターをさらに含み得る。
【０１６１】
前記タンパク質発現システムは、酵母シトクロムP450還元酵素の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある、内因性酵母シトクロムP450還元酵素をコードするヌクレオチド配列を含むベクターをさらに含み得る。
【０１６２】
本発明は、第35の局面において、酵母シトクロムP450還元酵素の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある、内因性酵母シトクロムP450還元酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子または組換え核酸分子を提供する。ヌクレオチド配列は、以下を含むかまたは以下からなってよい：
a) SEQ ID No: 78のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【０１６３】
上記b)のヌクレオチド配列は、a)の配列と少なくとも85%、90%、または95%の同一性を有し得る。該ヌクレオチド配列は、a)の配列と少なくとも96%、97%、98%、または99%の同一性を有し得る。
【０１６４】
本発明は、第36の局面において、第35の局面の核酸分子を含むベクターを提供する。
【０１６５】
プロモーターは誘導性プロモーターであってよく、誘導性プロモーターはGALプロモーターであってよい。プロモーターは、切断型GALプロモーターを含み得る。切断型GALプロモーターは、切断型GAL1プロモーターであってよい。切断型GAL1プロモーターは、ヌクレオチド202において切断されたGAL1プロモーターであってよい。切断型GAL1プロモーターは、SEQ ID NO：2の配列を含むか、またはその配列からなってよい。または、誘導性プロモーターはADH2プロモーターであってよい。
【０１６６】
前記核酸分子は、プロモーターの下流にあってよい転写終結配列をさらに含み得る。核酸分子は、プロモーターの制御下にヌクレオチド配列を挿入できるようにする、GALプロモーターと終結配列との間の特有の制限部位を含み得る。転写終結配列は、挿入ヌクレオチド配列のすぐ下流にあってよく、または最小距離だけ離れていてよい。転写終結配列は、挿入ヌクレオチド配列から5〜25ヌクレオチドだけ離れていてよい。転写終結配列は、5〜20、5〜15、15〜20、5〜10、6〜9、または6〜8ヌクレオチドだけ離れていてよい。転写終結配列は、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドだけ離れていてよい。
【０１６７】
終結配列は、任意の発現遺伝子に由来する終結配列であってよく、SUC2(SUC2t)、PHO5、ADH1、ADH2、またはCYC1から選択され得る。終結配列はSUC2(SUC2t)終結配列であってよく、SEQ ID NO：28の配列を含むか、またはその配列からなってよい。
【０１６８】
前記ベクターは、酵母細胞であってよい標的細胞において、特定の染色体座で酵母シトクロムP450還元酵素をコードするヌクレオチド配列の組込みを引き起こすように適合することができる。ベクターは、特定の染色体座へのベクターの組込みを可能にする選択可能マーカー遺伝子を含み得る。選択可能マーカー遺伝子は、LEU2、ADE2、HIS3、TRP1、URA3、LYS2、HIS4、MET15、またはAUR1-Cから選択され得る。
【０１６９】
第37の局面は、第35の局面の核酸分子または第36の局面のベクターで形質転換された細胞を提供する。
【０１７０】
第38の局面は、第35の局面の核酸分子または第36の局面のベクターで酵母株を形質転換する段階を含む、内因性シトクロムP450還元酵素を発現する細胞または酵母株を作製する方法を提供する。
【０１７１】
細胞は真核細胞であってよく、真核細胞は酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞であってよい。
【０１７２】
酵母株はサッカロミセス・セレビシエであってよい。酵母株は、当技術分野で公知の酵母株から選択され得る。酵母株は、酵母株JL20(Daum, G et al. Yeast Functional Analysis Report. Yeast Volume 15, Issue 7 , Pages 601 - 614)およびW303B(Furuchi, T et al. Functions of yeast helicase Ssl2p that are essential for viability are also involved in protection from the toxicity of adriamycin. Nucleic Acids Res. 2004; 32(8): 2578-2585.)から選択され得る。
【０１７３】
第39の局面は、第38の局面の方法によって作製された、または第36の局面のベクターで形質転換された酵母株を提供する。
【０１７４】
第40の局面は、シトクロムP450の発現を指向し得る第4の局面のベクターで第37の局面の細胞または第39の局面の酵母株を形質転換する段階を含む、酵母において活性および/または発現が増加したシトクロムP450を生成する方法を提供する。
【０１７５】
シトクロムP450は異種シトクロムP450であってよい。シトクロムP450はヒトシトクロムP450であってよい。
【０１７６】
本方法は、第1、第2、または第3の局面の核酸分子の発現を指向し得る第4の局面のベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含み得る。
【０１７７】
または、本方法は、シトクロムP450の発現を指向し得る第4の局面のベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する前に、第1、第2、または第3の局面の核酸分子の発現を指向し得る第4の局面のベクターで該細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含み得る。
【０１７８】
加えて、本方法は、シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向し得るベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含み得る。
【０１７９】
または、本方法は、多様なプロモーターの制御下にある、シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列およびシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向し得るベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する段階を含み得る。
【０１８０】
シトクロムb5タンパク質は異種シトクロムb5タンパク質であってよい。シトクロムb5タンパク質はヒトb5タンパク質であってよい。シトクロムb5タンパク質は、以下を含むかまたは以下からなるヌクレオチド配列によってコードされ得る：
a) SEQ ID NO：86のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【０１８１】
上記b)のヌクレオチド配列は、a)の配列と少なくとも85%、90%、または95%の同一性を有し得る。ヌクレオチド配列は、a)の配列と少なくとも96%、97%、98%、または99%の同一性を有し得る。
【０１８２】
または、シトクロムb5タンパク質は、当技術分野で公知のシトクロムb5タンパク質から選択され得る。(例えば：Yoo,M et al. The complete nucleotide sequence of human liver cytochrome b-5 mRNA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 156, 576-580 (1988).)
【０１８３】
第41の局面において、シトクロムP450の発現を駆動し得る第4の局面のベクター、および/または第1、第2、もしくは第3の局面の核酸分子の発現を指向し得る第4の局面のベクター、および/またはシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を指向し得るベクターで形質転換された、第39の局面の酵母株をさらに提供する。
【０１８４】
本発明はまた、第42の局面において、以下を含むタンパク質発現システムを提供する：
i) 第37の局面の細胞または第39の局面の酵母株；および
ii) 標的タンパク質の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
【０１８５】
前記ヌクレオチド配列はシトクロムP450をコードしてよく、シトクロムP450は異種シトクロムP450であってよい。シトクロムP450はヒトシトクロムP450であってよい。ベクターは、前記細胞または酵母株への組込みに際して、該ヌクレオチド配列の発現を引き起こし得る。ベクターは、第4の局面に定義される通りであってよい。
【０１８６】
前記タンパク質発現システムは、第1、第2、または第3の局面の核酸分子を発現し得る第4の局面のベクターをさらに含み得る。
【０１８７】
前記タンパク質発現システムは、シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現し得るベクターをさらに含み得る。
【０１８８】
P450還元酵素と同様に、シトクロムb5タンパク質もシトクロムP450活性に寄与する補因子である。本発明者らは、高活性を有するシトクロムP450の発現を向上させるために、シトクロムb5タンパク質を標的細胞において同時発現させることができることを見出した。
【０１８９】
したがって、第43の局面において、プロモーターの制御下にあるシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子または組換え核酸分子を提供する。
【０１９０】
プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであってよい。プロモーターはGALプロモーターであってよく、GALプロモーターは切断型GALプロモーターであってよい。または、プロモーターはADH2プロモーターであってよい。構成的プロモーターは、ACTl、ADH1、GAPDH、PGK1、PMA1、TEF、TPI遺伝子由来のプロモーターから選択され得る。誘導性プロモーターは、ADH2、PH05、MET25、CYC1遺伝子から選択され得る。
【０１９１】
前記核酸分子は、プロモーターの下流にあってよい転写終結配列をさらに含み得る。該核酸分子は、プロモーターの制御下にヌクレオチド配列を挿入できるようにする、GALプロモーターと終結配列との間の特有の制限部位を含み得る。転写終結配列は、挿入ヌクレオチド配列のすぐ下流にあってよく、または最小距離だけ離れていてよい。転写終結配列は、挿入ヌクレオチド配列から5〜25ヌクレオチドだけ離れていてよい。転写終結配列は、5〜20、5〜15、15〜20、5〜10、6〜9、または6〜8ヌクレオチドだけ離れていてよい。転写終結配列は、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドだけ離れていてよい。
【０１９２】
終結配列は、任意の発現遺伝子に由来する終結配列であってよく、SUC2(SUC2t)、PHO5、ADH1、ADH2、またはCYC1遺伝子から選択され得る。終結配列はSUC2(SUC2t)終結配列であってよく、SEQ ID NO：28の配列を含むか、またはその配列からなってよい。
【０１９３】
シトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ヒトシトクロムb5タンパク質であってよい哺乳動物シトクロムb5タンパク質をコードし得る。ヌクレオチド配列は、以下から選択される配列を含むか、またはその配列からなってよい：
a) SEQ ID NO：86のヌクレオチド配列；
b) a)の配列と少なくとも80%の同一性を有し、かつシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列；
c) a)もしくはb)の配列と相補的なヌクレオチド配列；または
d) a)、b)、もしくはc)の配列と同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【０１９４】
上記b)のヌクレオチド配列は、a)の配列と少なくとも85%、90%、または95%の同一性を有し得る。ヌクレオチド配列は、a)の配列と少なくとも96%、97%、98%、または99%の同一性を有し得る。
【０１９５】
前記ヌクレオチド配列は、または、当技術分野で公知の配列から選択される配列を含み得る。
【０１９６】
前記核酸分子はベクターの形態であってよい。したがって、第44の局面において、第42の局面の核酸分子を含むベクターを提供する。
【０１９７】
前記ベクターは、酵母細胞であってよい標的細胞において、特定の染色体座でシトクロムb5タンパク質をコードするヌクレオチド配列の組込みを引き起こすように適合することができる。ベクターは、特定の染色体座へのベクターの組込みを可能にする選択可能マーカー遺伝子を含み得る。選択可能マーカー遺伝子は、LEU2、ADE2、HIS3、TRP1、URA3、LYS2、HIS4、またはMET15、またはAUR1-Cから選択され得る。
【０１９８】
第45の局面は、第43の局面の核酸分子または第44の局面のベクターで形質転換された細胞を提供する。
【０１９９】
第46の局面は、第43の局面の核酸分子または第44の局面のベクターで酵母株を形質転換する段階を含む、シトクロムb5タンパク質を発現する細胞または酵母株を作製する方法を提供する。
【０２００】
第47の局面は、第46の局面の方法によって作製された、または第44の局面のベクターで形質転換された酵母株を提供する。
【０２０１】
第48の局面は、シトクロムP450の発現を指向し得る第4の局面のベクターで第45の局面の細胞または第47の局面の酵母株を形質転換する段階を含む、酵母において活性および/または発現が増加したシトクロムP450を生成する方法を提供する。
【０２０２】
シトクロムP450は異種シトクロムP450であってよい。シトクロムP450はヒトシトクロムP450であってよい。
【０２０３】
本方法は、第1、第2、または第3の局面の核酸分子の発現を指向し得る第4の局面のベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含み得る。
【０２０４】
または、本方法は、シトクロムP450の発現を指向し得る第4の局面のベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する前に、第1、第2、または第3の局面の核酸分子の発現を指向し得る第4の局面のベクターで該細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含み得る。
【０２０５】
加えて、本方法は、内因性シトクロムP450還元酵素の発現を指向し得る第36の局面のベクターで前記細胞または酵母株を形質転換する段階をさらに含み得る。
【０２０６】
第49の局面において、シトクロムP450の発現を指向し得る第4の局面のベクター、および/または第1、第2、もしくは第3の局面の核酸分子の発現を指向し得る第4の局面のベクター、および/または内因性シトクロムP450還元酵素の発現を指向し得る第36の局面のベクターで形質転換された、第47の局面の酵母株をさらに提供する。
【０２０７】
本発明はまた、第50の局面において、以下を含むタンパク質発現システムを提供する：
i) 第45の局面の細胞または第47の局面の酵母株；および
ii) 標的タンパク質の発現を引き起こすプロモーターの制御下にある、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
【０２０８】
前記ヌクレオチド配列はシトクロムP450をコードしてよく、シトクロムP450は異種シトクロムP450であってよい。シトクロムP450はヒトシトクロムP450であってよい。ベクターは、前記細胞または酵母株への組込みに際して、該ヌクレオチド配列の発現を引き起こし得る。ベクターは、第4の局面に定義される通りであってよい。
【０２０９】
前記タンパク質発現システムは、第1、第2、または第3の局面の核酸分子を発現し得る第4の局面のベクターをさらに含み得る。
【０２１０】
前記タンパク質発現システムは、内因性シトクロムP450還元酵素の発現を指向し得る第36の局面のベクターをさらに含み得る。
【０２１１】
本発明者らはまた、別の細胞において、本発明のP450還元酵素、シトクロムb5タンパク質、または酵母シトクロムP450還元酵素の1つまたは複数とシトクロムP450を同時発現させ、その後それらの細胞を混和して細胞混合物を提供することにより、活性が増加したシトクロムP450を生成できることを見出した。次に、細胞混合物からミクロソームを調製して、シトクロムP450活性のレベル増加をもたらすことができる。
【０２１２】
したがって、第51の局面において、シトクロムP450の発現を指向し得る第4の局面のベクターで形質転換された細胞を、以下の1つまたは複数と混和する段階を含む、活性が増加したシトクロムP450を生成する方法を提供する：
a) 第5の局面の1つもしくは複数の細胞；
b) 第18の局面の1つもしくは複数の細胞；
c) 第28の局面の1つもしくは複数の細胞；
d) 第37の局面の1つもしくは複数の細胞；および/または
e) 第45の局面の1つもしくは複数の細胞。
【０２１３】
本方法は、細胞を混和する前に、培養物から該細胞を単離する段階をさらに含み得る。細胞は、混和する前に再懸濁することができる。細胞の混和は、細胞を混合する段階を含み得る。
【０２１４】
細胞を混和して、均一な細胞混合物を生成することができる。細胞混合物は、シトクロムP450を含む細胞と、第5、第18、第28、第37、および/または第45の局面の細胞を様々な比率で含み得る。このようにして、細胞混合物を用いてミクロソームを調製し、既定量のシトクロムP450と、明確なシトクロムP450比活性を提供する明確なP450還元酵素活性を含む均一なミクロソームのバッチを得ることができる。本方法はしたがって、細胞混合物からミクロソームを調製する段階をさらに含み得る。ミクロソームは、当技術分野で周知の方法によって調製することができる(Renaud JP et al,. Recombinant yeast in drug metabolism. Toxicology. 1993 Oct 5;82(1-3):39-52；Simula AP et al,. Heterologous expression of drug-metabolizing enzymes in cellular and whole animal models. Toxicology. 1993 Oct 5;82(l-3):3-20；Guengerich FP et al, . Expression of human cytochrome P450 enzymes in yeast and bacteria and relevance to studies on catalytic specificity. Toxicology. 1993 Oct 5;82(l-3):21-37；Hayashi K et al,. Coexpression of genetically engineered fused enzyme between yeast NADPH-P450 reductase and human cytochrome P450 3A4 and human cytochrome b5 in yeast. Arch Biochem Biophys. 2000 Sep 1;381(1):164-70；Pompon D, et al. Yeast expression of animal and plant P450s in optimized redox environments. Methods Enzymol. 1996;272:51-64；Guengerich FP et al. Expression of mammalian cytochrome P450 enzymes using yeast-based vectors. Methods Enzymol. 1991;206:130-45)。
【０２１５】
シトクロムP450の活性は、蛍光アッセイ法または発光アッセイ法のいずれかを用いて活性を測定することにより、測定することができる。例えば、CYP1B1、CYP1A1、CYP1A2の測定は、7-エトキシレゾルフィンO-デエチラーゼアッセイ法を使用する(Klotz A.V., S. J. J. a. W. C.. An alternative 7-ethoxyresorufin O-deethylase activity assay: a continuous visible spectrophotometric method for measurement of cytochrome P450 monooxygenase activity. Analytical Biochemistry 140: 138-145, 1984)。これらの酵素は、NADPHおよび酸素の存在下で、7-エトキシレゾルフィンを蛍光分析で検出できるレゾルフィンに変換するものであり、このアッセイ法はERODアッセイ法として公知である。他のシトクロムP450アイソザイムには、他のアッセイ法を用いることができる。そのようなアッセイ法は当技術分野で公知である。
【０２１６】
細胞混和後のシトクロムP450の活性が細胞混和前のシトクロムP450活性よりも高い場合に、シトクロムP450活性の増加が認められる。
【０２１７】
第52の局面は、候補薬剤化合物の毒性を評価するための本発明の細胞または酵母株の使用を提供する。アッセイ法を用いて、毒性を評価することができる。アッセイ法はハイスループットアッセイ法であってよい。
【０２１８】
第53の局面は、以下の段階を含む、候補薬剤化合物の毒性を評価する方法を提供する：
a) 化合物を、シトクロムP450を発現する本発明の細胞または酵母株と反応させる段階；および
b) 阻害に関してIC50濃度を決定する段階。
【０２１９】
IC50濃度は、蛍光アッセイ法または発光アッセイ法など、当技術分野で公知のアッセイ法を用いて決定することができる。化合物の毒性は、シトクロムP450の観察された阻害によって評価することができる。様々な濃度の化合物でIC50を決定することにより、シトクロムP450酵素が50%阻害される際の化合物の濃度が判明する。こうすることで、化合物の毒性を評価することができる。
【０２２０】
第54の局面は、以下の段階を含む、シトクロムP450の阻害について化合物を評価する方法を提供する：
a) 試験化合物を、シトクロムP450を発現する本発明の細胞または酵母株と反応させる段階；および
b) 該化合物がシトクロムP450活性を低下させるかどうかを決定する段階。
【０２２１】
前記細胞または酵母株は、シトクロムP450をコードするヌクレオチド配列の発現を指向する本発明のベクターで形質転換されてよい。シトクロムP450は異種シトクロムP450であってよく、ヒトシトクロムP450であってよい。
【０２２２】
決定段階b)は、
a) 細胞を培養する段階；
b) シトクロムP450の基質を該細胞に添加する段階；および
c) シトクロムP450の活性を測定する段階
を含み得る。
【０２２３】
活性は、基質の代謝を測定することによって測定することができる。基質は、蛍光基質または発光基質であってよい。基質は、細胞によって発現されるシトクロムP450に基づいて選択され得る。当業者は、本方法において用いるための適切な基質を容易に選択することができる。
【０２２４】
活性は、細胞の培養中に種々の時点で測定することができる。活性は、細胞においてシトクロムP450の発現を誘導するための試薬を添加した後に、該細胞を取り出すことによって測定することができる。試薬はガラクトースであってよい。
【０２２５】
分光光度計を用いて特定の励起/発光波長で測定を行って、シトクロムP450の活性を決定することができる。
【０２２６】
本方法において用いるために、高活性を有するシトクロムP450を発現する細胞または酵母株を選択することができる。細胞または酵母細胞は、以下の段階を含むアッセイ法を用いて選択することができる：
a) 細胞を培養する段階；
b) シトクロムP450の基質を該細胞に添加する段階；および
c) シトクロムP450の活性を測定する段階。
【０２２７】
さらなる局面において、本発明の第7、第12、第13、第22、第32、第40、第48、または第51の局面の方法によって生成されたシトクロムP450を提供する。
【０２２８】
本発明の各局面の好ましい特徴は、必要な変更を加えて他の各局面にも当てはまる。本明細書で言及した先行技術文献は、法により許容される最大限の範囲で組み入れられる。
【０２２９】
本発明をこれから、添付の図面を参照しながら実施例のみによって説明する
【０２３０】
実施例1. ガラクトースにより誘導可能な酵母GAL1/GAL10プロモーター変種の構築、および内因性酵母還元酵素の存在下でのCYP1B1の発現の比較解析
文献で報告されているGAL1/GAL10プロモーター(GAL1/GAL10は、糖ガラクトースにより誘導可能であり、グルコースにより抑制される2シストロン性プロモーターである)には、5種類の型が存在する：
(1) 〜907 bp全長GAL1/GAL10プロモーター(学術的研究所によって使用されている)、
(2) 〜650 bp切断型GAL1プロモーター(学術的研究所によって使用されている)、
(3) 〜675 bp GAL1プロモーター断片は学術的研究所によって使用されており、またStratageneから市販されているpESCベースのプラスミド中にも存在する、
(4) Invitrogenから市販されているpYES2ベースのプラスミド中の〜461 bp切断型GAL1プロモーター、
(5) コア(すなわち、基礎)CYC1プロモーターに連結されているGAL1/GAL10プロモーターの上流活性化配列(UAS)を含むハイブリッドプロモーター。これらのプロモーターの1つの変種(CYC1-GAL10UAS)は、US5635369で用いられている。US5635369で言及されているもう1つのプロモーターは、構成的に活性を有する。P450アイソザイムおよびその補因子P450還元酵素の強力な構成的発現は、酵母細胞にとって有害である可能性が非常に高い(すなわち、強力な構成的プロモーターが産生するP450タンパク質は、誘導性プロモーターが産生するP450タンパク質よりも常に少ない)。
【０２３１】
5種類の異なる型のプロモーターをすべて用いてCYP1B1遺伝子(シトクロムP450アイソザイム)を発現させて、内因性酵母P450還元酵素のみを含む基本的な酵母株において産生されるP450の量を比較した。内因性酵母P450還元酵素を含む株JL20およびW303-B(2つのMat a株)において、675 bp GAL1プロモーターが最大の発現を提供することが見出された。
【０２３２】
実施例1.1.
907 bp、675 bp、650 bp、および461 bp GAL1プロモーター(それぞれ、SEQ ID NO：1、2、3、および4)のDNA配列比較を以下に示す(配列が同じ部分を黄色で表示してある)。
2009536026.tif 000003
2009536026.tif 000004
【０２３３】
実施例1.2. 907 bp GAL1プロモーターのNgoMIV-BamHI断片としてのクローニング
3段階でクローニングを行った。第1段階はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含んだ。PCRを用いて、907 bp GAL1プロモーター(SEQ ID No. 1)をNgoMIV-BamHI断片として増幅した。それぞれ100 pモルのPCRプライマー(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000005
(SEQ ID NO：5 - 小文字はNgoMIV部位を示す)および：3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000006
(SEQ ID NO：6 - 小文字はBamHI部位を示す))を、鋳型としてのサッカロミセス・セレビシエ株S288C由来のゲノムDNA(50 ng)(Invitrogen、カタログ番号40802)と共に使用した。
【０２３４】
〜907 bpのPCR産物を、QiaQuickカラム(Qiagen UK、カタログ番号28104)で精製した。
【０２３５】
第2段階では、精製DNAを制限酵素NgoMIVおよびBamHI(いずれもNew England BioLabs、英国から入手)で消化し、この制限処理したDNA(挿入物) 〜100 ngを、NgoMIVおよびBamHIで消化しておいたベクター、pBlueScriptII SK(+)(Stratagene、英国) 50 ngに連結した。反応混合物15μl中、供給業者のプロトコールに従ってDNAリガーゼ(Roche Diagnostics、英国)を用いて、ベクターと挿入物との間で連結を行った。
【０２３６】
最終段階では、連結混合物3μlを、標準的なCaCl2プロトコール[1]で形質転換受容性とした大腸菌(Escherichia coli) DH5αコンピテント細胞に形質転換した。6個の個々のクローンからDNAを単離し、クローンの正確性を制限酵素解析によって確認し、DNA配列決定によってさらに確証した。正確なクローン1つをpBluSK(+)/Ngo-Bam/Gal1p-907(図1)と命名し、2ミクロン酵母発現ベクターへのクローニングにさらに使用した。
【０２３７】
全プロモーターおよび遺伝子断片の後のクローニングは、本実施例1.2と同様に行った。
【０２３８】
実施例1.3. NgoMIV-BamHI 907 bp GAL1プロモーター断片の酵母2ミクロン発現ベクターへのクローニング
pBluSK(+)/Ngo-Bam/Gal1p-907(図1)からNgoMIV-BamHI GAL1 907 bpプロモーター断片を単離し、NgoMIV-BamHIであらかじめ消化しておいたpYES2(Invitrogen；URA3栄養要求性マーカーを有する市販の2ミクロンベクター)の5190 bp断片に連結した。
【０２３９】
連結およびDH5α細菌細胞への形質転換後に得られた正確なクローン1つをpSYEGal1p-907(図2)と命名し、シトクロムP450アイソザイム(CYP)をコードする遺伝子の発現に使用した。クローンの正確性は、制限酵素解析によって確認した。
【０２４０】
実施例1.4. 675 bp GAL1プロモーターのNgoMIV-BamHI断片としてのクローニング
GAL1配列特異的プライマー((5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000007
(小文字はNgoMIV部位を示す - SEQ ID NO：7)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000008
(小文字はBamHI部位を示す - SEQ ID NO：8))を用いて、NgoMIV-BamHI GAL1プロモーター断片(SEQ ID No. 2)のpBlueScriptII SK(+)へのクローニングを実施例1.2と同様に行った。NgoMIV-BamHIで消化した増幅断片を、NgoMIV-BamHIで消化したpBlueScriptII SK(+)にクローニングした。
【０２４１】
連結およびDH5α細菌細胞への形質転換後に得られた正確なクローン1つをpBluSK/Ngo-Bam/Gal1p-675(図3)と命名し、2ミクロン酵母発現ベクターへのさらなるクローニングに使用した。クローンの正確性は制限酵素解析によって確認し、DNA配列決定によって確証した。
【０２４２】
実施例1.5. 675 bp GAL1プロモーターNgoMIV-BamHI断片の酵母2ミクロン発現ベクターへのクローニング
pBluSK(+)/Ngo-Bam/Gal1p-675(図3)からNgoMIV-BamHI GAL1 907 bpプロモーター断片を単離し、NgoMIV-BamHIであらかじめ消化しておいたpYES2(Invitrogen；URA3栄養要求性マーカーを有する市販の2ミクロンベクター)の5190 bp断片に連結した。
【０２４３】
連結およびDH5α細菌細胞への形質転換後に得られた正確なクローン1つをpSYE224(図4)と命名し、シトクロムP450アイソザイム(CYP)をコードする遺伝子の発現に使用した。クローンの正確性は、制限酵素解析によって確認した。
【０２４４】
実施例1.6. 650 bp GAL1プロモーターのNgoMIV-BamHI断片としてのクローニング
GAL1配列特異的プライマー(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000009
(小文字はNgoMIV部位を示す - SEQ ID NO：9)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000010
(小文字はBamHI部位を示す - SEQ ID NO：10)）を用いて、NgoMIV-BamHI GAL1プロモーター断片(SEQ ID No. 3)のpBlueScriptII SK(+)へのクローニングを実施例1.2と同様に行った。NgoMIV-BamHIで消化した増幅断片を、NgoMIV-BamHIで消化したpBlueScriptII SK(+)にクローニングした。
【０２４５】
連結およびDH5α細菌細胞への形質転換後に得られた正確なクローン1つをpBluSK/Ngo-Bam/Gal1p-650(図5)と命名し、2ミクロン酵母発現ベクターへのさらなるクローニングに使用した。クローンの正確性は制限酵素解析によって確認し、DNA配列決定によって確証した。
【０２４６】
実施例1.7. NgoMIV-BamHI 650 bp GAL1プロモーター断片の酵母2ミクロン発現ベクターへのクローニング
pBluSK(+)/Ngo-Bam/Gal1p-650(図5)からNgoMIV-BamHI GAL1 650 bpプロモーター断片を単離し、NgoMIV-BamHIであらかじめ消化しておいたpYES2の5190 bp断片に連結した。
【０２４７】
連結およびDH5α細菌細胞への形質転換後に得られた正確なクローン1つをpSYEGal1p-650(図6)と命名し、シトクロムP450アイソザイム(CYP)をコードする遺伝子の発現に使用した。クローンの正確性は、制限酵素解析によって確認した。
【０２４８】
実施例1.8. 461 bp GAL1プロモーターのNgoMIV-BamHI断片としてのクローニング
GAL1配列特異的プライマー(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000011
(小文字はNgoMIV部位を示す SEQ ID NO：11)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000012
(小文字はBamHI部位を示す - SEQ ID NO：12))を用いて、NgoMIV-BamHI GAL1プロモーター断片(SEQ ID No. 4)のpBlueScriptII SK(+)へのクローニングを実施例1.2と同様に行った。NgoMIV-BamHIで消化した増幅断片を、NgoMIV-BamHIで消化したpBlueScriptII SK(+)にクローニングした。
【０２４９】
連結およびDH5α細菌細胞への形質転換後に得られた正確なクローン1つをpBluSK/Ngo-Bam/Gal1p-461(図7)と命名し、2ミクロン酵母発現ベクターへのさらなるクローニングに使用した。クローンの正確性は制限酵素解析によって確認し、DNA配列決定によって確証した。
【０２５０】
実施例1.9. NgoMIV-BamHI 461 bp GAL1プロモーター断片の酵母2ミクロン発現ベクターへのクローニング
pBluSK(+)/Ngo-Bam/Gal1p-461(図7)からNgoMIV-BamHI GAL1 461 bpプロモーター断片を単離し、pYES2の5190 bp NgoMIV-BamHI断片に連結した。
【０２５１】
連結およびDH5α細菌細胞への形質転換後に得られた正確なクローン1つをpSYEGal1p-461(図8)と命名し、シトクロムP450アイソザイム(CYP)をコードする遺伝子の発現に使用した。クローンの正確性は、制限酵素解析によって確認した。pSYEGal1p-461は、市販のプラスミドpYES2と同じはずである。
【０２５２】
実施例1.10. HindIII-BamHI 269 bp CYC1コアプロモーター断片の酵母2ミクロン発現ベクターへのクローニング
2つの配列特異的プライマー(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000013
(小文字はHindIII部位を示す - SEQ ID NO：14)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000014
(小文字はBamHI部位を示す - SEQ ID NO：15))を用いて、269 bp HindIII-BamHI CYCコアプロモーター(SEQ ID No. 13) PCR断片を酵母ゲノムDNAから単離し(実施例1.2と同様)、制限酵素で消化したこの断片をpYES2の5389 bp HindIII-BamHI断片に連結した。
【０２５３】
連結およびDH5α細菌細胞への形質転換後に得られた正確なクローン1つをpSYECYC1p-core(図9)と命名した。挿入物の存在は、制限酵素解析およびDNA配列決定により確認した。このプラスミドを、GAL1プロモーターおよびGAL10プロモーター由来の、エンハンサーとしても知られる上流活性化配列(UAS)のさらなる導入に使用した。
【０２５４】
実施例1.11. CYC1コアプロモーターを既に含む酵母2ミクロンベクターへのNgoMIV-HindIII 385 bp GAL1UASプロモーター断片のクローニング
鋳型としてのpBluSK(+)/Ngo-Bam/Gal1p-675(図3)、および2つの配列特異的プライマー(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000015
(小文字はNgoMIV部位を示す - SEQ ID NO：17)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000016
(小文字はHindIII部位を示す - SEQ ID NO：18))を用いて、PCRによりNgoMIV-HinIII GAL1UAS 385 bpプロモーター断片(SEQ ID No. 16)を単離し、プラスミドpSYECYC1p-core(図9)の5449 bp NgoMIV-HindIII断片に連結した。
【０２５５】
連結およびDH5α細菌細胞への形質転換後に得られた正確なクローン1つをpSYECYC1-GAL1UAS(図10)と命名し、シトクロムP450アイソザイム(CYP)をコードする遺伝子の発現に使用した。クローンの正確性は、制限酵素解析によって確認した。
【０２５６】
実施例1.12. CYC1コアプロモーターを既に含む酵母2ミクロンベクターへのNgoMIV-HindIII 385 bp GAL10UASプロモーター断片のクローニング
鋳型としてのpBluSK(+)/Ngo-Bam/Gal1p-675(図3)、および2つの配列特異的プライマー(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000017
(小文字はNgoMIV部位を示す - SEQ ID NO :20:)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000018
(小文字はHindIII部位を示す - SEQ ID NO：21))を用いて、PCRによりNgoMIV-HinIII GAL10UAS 385 bpプロモーター断片(SEQ ID No.)を単離し、プラスミドpSYECYC1p-core(図9)の5449 bp NgoMIV-HindIII断片に連結した。
【０２５７】
連結およびDH5α細菌細胞への形質転換後に得られた正確なクローン1つをpSYECYC1-GAL10UAS(図11)と命名し、シトクロムP450アイソザイム(CYP)をコードする遺伝子の発現に使用した。クローンの正確性は、制限酵素解析によって確認した。
【０２５８】
実施例1.13. 1623 bp改変CYP1B1遺伝子の増幅およびpBlueScriptベクターへのクローニング
成体ヒト肝臓cDNAライブラリー(研究室で調製)を鋳型として使用し、配列特異的プライマー(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000019
(小文字はBamHI部位を示し、イタリック体のDNAは酵母における高発現のための5'コンセンサス配列を示す - SEQ ID NO：23)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000020
(小文字はXbaI部位を示す - SEQ ID NO：24))を用いてPCRすることにより、野生型遺伝子のアミノ酸2〜4(GTS)をコードする配列を欠く改変CYP1B1遺伝子(SEQ ID No. 22)のBamHI-XbaIの1623 bp断片を増幅した。
【０２５９】
BamHI-XbaIで消化した増幅断片を、BamHI-XbaIで切断したpBlueScriptII KS(+)にクローニングした。クローンの正確性を制限酵素解析によって確認し、DNA配列決定によって確証した。
【０２６０】
連結およびDH5α細菌細胞への形質転換後に得られた正確なクローン1つをpBluKS/Bam-Xba/mCYP1B1(図12)と命名し、変種GAL1プロモーターを含む2ミクロン酵母発現ベクターへのさらなるクローニングに使用した。
【０２６１】
実施例1.14. 変種GAL1プロモーター、GAL1p-907、GAL1p-675、GAL1p-650、GAL1p-461によって駆動されるCYP1B1発現カセットを含む酵母発現プラスミドの構築
pBluKS/Bam-Xba/mCYP1B1(図12)からBamHI-XbaI 1623 bp改変CYP1B1遺伝子断片を単離し、以下の断片に連結した：
(i) pSYEGal1p-907の6028 bp BamHI-XbaI断片、
(ii) pSYE224の5824 bp BamHI-XbaI断片、
(iii) pSYEGal1p-650の5770 bp BamHI-XbaI断片、
(iv) pSYEGal1p-461の5581 bp BamHI-XbaI断片、
(v) pSYECYC1-GAL1UASの5747 bp BamHI-XbaI断片、
(vi) pSYECYC1-GAL10UASの5747 bp BamHI-XbaI断片。
親プラスミドはすべてBamHI-XbaIで消化した。
【０２６２】
それぞれの連結およびDH5α細菌細胞への形質転換により得られた正確なクローンを、以下のように命名した。
2009536026.tif 000021
クローンの正確性は、制限酵素解析によって確認した。
【０２６３】
実施例1.15. パン酵母における変種GAL1プロモーター、GAL1p-907、GAL1p-675、GAL1p-650、GAL1p-461からのヒトCYP1B1の発現
サッカロミセス・セレビシエ株
2009536026.tif 000022
を、ヒトCYP1B1保有プラスミド
2009536026.tif 000023
の形質転換に使用した。
【０２６４】
酵母の形質転換：
最少培地(SD)プレート(酵母株中の栄養要求性マーカーに応じて適切な栄養素を添加)から親株、JL20およびW303Bの単一コロニーを拾い、YPD培地(2% Bacto Peptone、1%酵母抽出物、2%グルコース) 10 mlに接種した。細胞を220 rpmで振盪しながら30℃で一晩培養した。一晩培養物1.5 mlを13,000 rpmで数秒間遠心分離して、細胞ペレットを回収した。形質転換DNA(すなわち、実施例1.11に見られるようなCYP1B1保有発現プラスミド) 0.5〜2μgおよび一本鎖サケ精子DNA 100μgをペレットに添加し、短時間ボルテックスした。PEG溶液(40% PEG 3350、0.1M酢酸リチウム pH 7.5、10 mM Tris-HCl pH 7.5、1 mM EDTA pH 7.5) 500μlおよび5〜10% DMSOを、形質転換混合物に添加した。すべての混合物を、Thermo-mixerにおいて400 rpmで振盪しながら25℃で15分間インキュベートし、次に42℃で15分間の熱ショックをかけた。10分後、5〜10%エタノールを添加した。細胞を8000 rpmで1分間ペレット化し、1×TE緩衝液で2回洗浄し、250μl〜500μlの1×TE pH 7.5に再懸濁した。細胞をSD寒天培地にプレーティングし、30℃で2〜3日間インキュベートした。
【０２６５】
得られた形質転換体を表1に示す。
【０２６６】
(表１)
2009536026.tif 000024
【０２６７】
ミクロソーム調製用の酵母培養物：
ミクロソーム調製用の酵母培養物の培養は5日間の実験である。
(1) 1日目に、SD寒天プレートからの白金耳量の新鮮な酵母細胞を、必要な栄養素およびCasamino Acid(Sigma、C-7585)を含むSD培地に接種した。培養物を220 rpmで振盪しながら30℃で一晩培養した。
(2) 2日目に、培養物のOD600(すなわち、600 nmで測定したOD)が4〜8 ODに達した時点で、500 mlフラスコ中の、適切な栄養素を添加した100 ml YPGE培地(1% Bacto Peptone、1%酵母抽出物、2%グリセロール、および2%エタノール)にこの培養物を接種した。特定のOD600範囲を有する一晩培養物から用いた接種容量を表2に示す。培養物を220 rpmで振盪しながら30℃で14時間培養した。
(3) 3日目に、OD600が3〜5に達した時点で、20%(w/v)フィルター滅菌ガラクトース溶液10 mlを、必要な栄養素の半量と共に各培養物に添加した。培養物を220 rpmで振盪しながら30℃で14時間培養した。
(4) 4日目に、OD600は17 ODに達するはずである。最終的なOD600はミクロソーム調製に使用するリチカーゼの量を計算するための基準となり得るため、このOD600は実験全体にとって非常に重要である。培養物をプラスチックバケットに移し、2831 gで12分間遠心沈殿させた。上清を慎重に廃棄し、ペレットを緩衝液A(10 mM Tris・Cl pH 7.5、0.65 Mソルビトール、1 mM EDTA pH 8.0)で2回洗浄した。2回目の洗浄後、できるだけ早く上清を廃棄し、バケットをペレットと共に秤量した。ペレットの重量は、通常3.5〜4.5 gである。ペレットは、ミクロソームの調製を開始する前の期間、-80℃で保持することができる。
【０２６８】
(表２)OD600範囲に対する接種容量
2009536026.tif 000025
【０２６９】
ミクロソームの調製：
酵母培養物の培養から得られたペレットを緩衝液B(10 mM Tris・Cl pH 7.5、2 Mソルビトール、0.1 mM EDTA pH 8.0、1 mM Pefabloc、0.1 mM DTT) 10 mlに再懸濁し、50 ml三角フラスコに移し、次に220 rpmで振盪しながら30℃で15分間インキュベートした。リチカーゼ(ICNカタログ番号152270)を7.5 U/OD600で細胞懸濁液に添加した(mgでのリチカーゼ量＝(最終OD600×細胞培養物の全容量×7.5 U)/81.6)。細胞懸濁液を110 rpmで振盪しながら30℃で1時間インキュベートした。20分ごとにOD600を測定した。20分の時間間隔中に、OD600は少なくとも2.5分の1に低下するはずである。以下の段階はすべて、低温室または冷却遠心機で行った。細胞を3500 rpm、4℃で10分間遠心分離した。上清を廃棄し、スフェロプラストペレットを、0.1 mM DTT、1 mM Pefablocを添加した緩衝液Aに再懸濁し、ペレットをホモジナイザー(Fisher)でほぐした。ホモジナイズしたペレットを、全出力の30%で、氷上にて3分間隔で8×10秒間超音波処理した。細胞を3500 rpm、4℃で10分間遠心した。上清をJA17 Beckman遠心分離機において10,000 rpm、4℃で10分間ずつ2回遠心分離した。その後、上清をTi50超遠心分離機(Optima L-100 XP超遠心分離機、Beckman Coulter)において45,000 rpm、4℃で90分間遠心分離した。ペレットを洗浄し、緩衝液C(10 mM Tris・Cl pH 7.5、1 mM EDTA pH 8.0、20%グリセロール、0.2 mM Pefabloc)に再懸濁した。ミクロソームの一定分量を液体窒素中で瞬時凍結し、CO差スペクトルを得るため、ならびに還元酵素アッセイおよび/またはERODアッセイを行うために-80℃で保存した。
【０２７０】
CO-差スペクトルによるP450量の決定：
プラスチック製の使い捨てキュベットを用いて、分光光度計(Lambda 16、Perkin Elmer)でミクロソーム調製物の差スペクトルを測定した。100 mMリン酸カリウムおよび20%グリセロールを含む溶液(pH 7.5) 850μlをキュベットに添加し、1分間置いた。次に、「数粒」の水硫化ナトリウムを添加し、キュベット中にいかなる気泡も形成されないように穏やかに混合し、もう1分間置いた。ミクロソーム150μlをキュベットに添加し、全懸濁液を穏やかに混合した。2つのキュベット(一方は水硫化ナトリウムを含むがミクロソームを含まず、もう一方は水流化ナトリウムとミクロソームを含む)を調製し、緩衝液およびミクロソーム混合物の光吸収の基線を、400 nm〜500 nmにわたりデュアルビーム分光光度計で記録した。1つの試料キュベットに、一酸化炭素を1気泡/秒でゆっくりと約1分間にわたり気泡形成させた。400 nm〜500 nmで光吸収を再度記録した。以下の式を用いて、490 nmにおける吸光度変化に対する450 nmにおける吸光度変化から、キュベット中のシトクロムP450の濃度を計算した：
P450含有量(nモル/ml)＝(A450−A490)×df×1000/消衰係数450 nm
P450濃度(nモル/mgタンパク質)＝P450含有量/総タンパク質
df＝希釈係数(キュベット中の全容量/ミクロソーム容量)
消衰係数420 nm＝110 mM-1cm-1
消衰係数450 nm＝91 mM-1cm-1
【０２７１】
消衰係数とは、関与媒体における単位距離当たりの、散乱および吸収で失われる光の割合である。消衰係数は、吸収係数と散乱係数の和である。
【０２７２】
結果：
比較解析を図19に示す。
【０２７３】
結論：
675 bp GAL1pからのCYP1B1の発現が最大である。得られた結果は、3回の観察の平均値である。このプロモーターを用いて、シトクロムP450アイソザイムをコードする配列を含むヌクレオチド配列の発現を制御することができる。
【０２７４】
実施例2‐675 bp GAL1-675プロモーターの制御下にヒトP450還元酵素(hRD)遺伝子の変種を有する酵母組込みプラスミドの構築
P450発現に有害となり得ないhRD活性を得るために、hRD遺伝子の2つの異なる変種を発現させた。本目的は、酵母においてヒトP450アイソザイムのより良好な生成を可能にする最適なシステムを考案することであった。最終的な目標は、酵母細胞のみならず昆虫細胞および哺乳動物細胞において、組換えヒトP450アイソザイムを生成するための代替えシステムを見出すことであった。
(1) 第1の変種は、荷電したNH2(N)末端の24アミノ酸のみを欠いている。野生型ヒト還元酵素では、アミノ酸25〜44によって疎水性膜アンカーが構成される。
(2) 第2の変種は、負に荷電した(負荷電アミノ酸5個＋潜在的正荷電アミノ酸1個)N末端の24アミノ酸およびCOOH末端の終止コドンを欠くが、COOH末端においてc-mycエピトープタグEQKLISEEDLNGを含む。12アミノ酸のc-mycタグもまた負に荷電したペプチドであり(負荷電アミノ酸4個＋正荷電アミノ酸1個を含む)、リンカーであるSS(制限部位である連結されたSpeIとXbaIの連結を通して形成されたTCTAGTによってコードされる)を介してhRDのC末端に連結されている。c-mycタグはまた、細胞内のP450還元酵素タンパク質産生をモニターできるようにする。c-mycタグのDNAは、酵母に偏ったコドンを用いて化学合成することができる。
(3) hRD変種および全長hRD遺伝子をクローニングするため、まず最初に、酵母株の異なる染色体座からGAL1-675プロモーターの制御下でhRDを発現できるようにする酵母組込みベクターを構築した。以下の段階を含んだ：
(1) それぞれLEU2、ADE2、HIS3、およびTRP1遺伝子を既に有する種々のpBlueScriptベースのベクター、pRS305、pRS402、pRS403、pRS404(ATCCから入手)に、GAL1-675プロモーターと下流のc-mycタグ化酵母SUC2ターミネーターをクローニングする段階。
(2) ヒト肝臓cDNAライブラリーに由来するhRD変種をpBlueScriptベクターにクローニングし、制限酵素解析およびDNA配列決定により挿入物を確認する段階。
(3) GAL1p-675-cmycSUCt(GAL1-675プロモーター＋c-mycタグ化SUC2t)カセットを含むpRS305、pRS402、pRS403、およびpRS404由来酵母組込みベクターに、hRD変種をサブクローニングする段階。hRD遺伝子変種は、GAL1-675プロモーターの下流でかつc-mycタグ化SUC2ターミネーターの上流にクローニングされる。
【０２７５】
実施例2.1. 野生型P450還元酵素(SEQ ID NO：25)と2つの変種、delNhRD(ΔN24hRD)(SEQ ID NO：26)およびdelNhRD-cmyc(ΔN24hRD-cmyc)(SEQ ID NO：27)のタンパク質配列比較を以下に提供する
配列が同じ部分は黄色で表示してある。荷電したN末端ドメイン(hRDに属する)およびC末端(c-myc)ペプチドは、青色で表示してある。24アミノ酸N末端ドメイン(ΔN24)は、負荷電アミノ酸(DまたはE)を5個、およびpH＜7で正に荷電する可能性を有するヒスチジン(H)を1個含む。一方、c-mycタグは、12アミノ酸の集中した領域に、負荷電アミノ酸(DまたはE)を4個および正荷電アミノ酸(K)を1個含む。
2009536026.tif 000026
2009536026.tif 000027
【０２７６】
実施例2.2. 酵母SUC2遺伝子からのターミネーターのXbaI-SacI断片のクローニング
3段階でクローニングを行った(実施例1と同様)。第1段階は、酵母SUC2遺伝子(SEQ ID No. 26)から291 bpターミネーターを303 bp XbaI-SacI断片として増幅するために用いたPCRを含んだ。それぞれ100 pモルのPCRプライマー(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000028
(小文字はXbaI部位を示す - SEQ ID NO：29)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000029
(小文字はSacI部位を示す - SEQ ID NO：30))を、鋳型としてのサッカロミセス・セレビシエ株S288C由来のゲノムDNA(50 ng)(Invitrogen)と共に使用した。303 bpのPCR産物を、QiaQuickカラム(Qiagen UK)で精製した。
【０２７７】
第2段階では、精製DNAを制限酵素XbaIおよびSacI(いずれもNew England BioLabs、英国から入手)で消化し、この制限処理したDNA(挿入物) 〜100 ngを、XbaIおよびSacIであらかじめ消化しておいたベクター、pBlueScriptII KS(+)(Stratagene、英国) 50 ngと連結した。反応混合物15μl中、供給業者のプロトコールに従ってDNAリガーゼ(Roche Diagnostics、英国)を用いて、ベクターと挿入物との間で連結を行った。
【０２７８】
最終段階では、連結混合物3μlをDH5αコンピテント細胞に形質転換した(実施例1.1を参照されたい)。6個の個々のクローンからDNAを単離し、クローンの正確性を制限酵素解析によって確認し、DNA配列決定によってさらに確証した。正確なクローン1つをpBluKS(+)/Xba-Sac/SUC2t(図20)と命名し、さらなる実験に使用した。
【０２７９】
実施例2.3. c-mycタグをコードする断片の一方向性クローニング
pBluKS(+)/Xba-Sac/SUC2t(実施例2.2を参照されたい)をXbaIで切断し、線状化されたDNAを細菌アルカリホスファターゼ(New England BioLabs)で脱リン酸化した。プロテイナーゼKで処理した後、3237 bpベクター断片をアガロースゲルで分離し、単離されたゲル断片をQiaQuickカラムで精製してこのベクターを得た。ベクターを、12アミノ酸c-mycタグをコードし、5'末端にXbaIオーバーハングおよび3'末端にSpeIオーバーハングを有する一対のデオキシオリゴヌクレオチド(SEQ ID No 31および32)と連結した。この配列は、c-myc癌遺伝子に由来し、組換えタンパク質をタグ化するために頻繁に用いられるペプチドであるc-mycペプチドタグ(EQKLISEEDLNG)に関して、酵母に偏ったコドンを用いて化学合成した。配列の5'末端はXbaI部位を再構築するが、SUC2ターミネーター(SUC2t)に隣接している3'末端は、XbaIによってもSpeIによっても再度開放され得ず、SUC2tの5末端の前に3'末端終止コドンを含む。連結およびDH5α細菌細胞への形質転換後に得られた正確なクローン1つをpBluKS(+)/Xba-Sac/mSUC2t(図21)と命名した。「m」はc-mycタグを表す。クローンの正確性は制限酵素解析によって確認し、DNA配列決定によって確証した。
【０２８０】
実施例2.4. GAL1-675プロモーターのXhoI-BamHI断片としてのクローニング
3段階でクローニングを行った。
【０２８１】
第1段階は、GAL1プロモーター(SEQ ID No. 2)(実施例1を参照されたい)をXhoI-BamHI断片として増幅するために用いたPCRを含んだ。それぞれ100 pモルのPCRプライマー(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000030
(小文字はXhoI部位を示す - SEQ ID NO：33)およびSEQ ID NO：8のプライマー)を、鋳型としてのBluSK/Eco-Bam/Gal1p(50 ng)と共に使用した。
【０２８２】
675 bpのPCR産物を、QiaQuickカラム(Qiagen UK)で精製した。
【０２８３】
第2段階では、精製DNAを制限酵素XhoIおよびBamHIで消化し、この制限処理したDNA(挿入物) 〜100 ngを、XhoIおよびBamHIで消化しておいたベクター、3228 bp pBluKS(+)/Xba-Sac/mSUC2t(実施例2.3を参照されたい；図21) 50 ngと連結した。DNAリガーゼを用いて、ベクターと挿入物との間で連結を行った。
【０２８４】
最終段階では、連結混合物3μlを大腸菌DH5αコンピテント細胞に形質転換した。6個の個々のクローンからDNAを単離し、クローンの正確性を制限酵素解析によって確認し、DNA配列決定によってさらに確証した。正確なクローン1つをpBluKS(+)/Gal1mS(図22)と命名し、さらなる実験に使用した。このpBluescriptベースのプラスミドは、プロモーターおよびターミネーターのカセット(すなわち、Gal1mS)を含む。このプラスミドはまた、関心対象の任意の遺伝子(すなわち、hRD変種等)をクローニングできるようにする、プロモーターとターミネーターとの間の適切な制限部位(すなわち、BamHI、SpeI、XbaI)を含む。
【０２８５】
実施例2.5. LEU2組込みプラスミドであるpRS305へのGal1mSカセットのクローニング
プラスミドpRS305(ATCC；選択マーカーとして、ロイシンを欠く最少培地で酵母細胞が増殖するためのサッカロミセス・セレビシエLEU2遺伝子を有する)をXhoIおよびSacIで消化し、大きな5421 bp断片を単離した。単離されたベクターを、pBluKS(+)/Gal1mS(図22)から単離されたXhoI-SacIプロモーター-ターミネーターGal1mSカセット(1028 bp)に連結した。連結およびDH5α細菌細胞への形質転換後に得られた正確なクローン1つをYILeuGAL1MS(図23)と命名した。クローンの正確性は制限酵素解析によって確認した。プラスミドYILeuGAL1MSは、酵母組込みプラスミド上にプロモーターおよびターミネーターのカセット(すなわち、Gal1mS)を含む。このプラスミドはまた、選択される遺伝子のクローニング、および関心対象の任意の遺伝子のLEU2座における酵母ゲノムへのプラスミドの組込みを可能にする、プロモーターとターミネーターとの間の適切な特有の制限部位(すなわち、BamHI、SpeI、XbaI)を含む。
【０２８６】
実施例2.6. ADE2組込みプラスミドであるpRS402へのGal1mSカセットのクローニング
実施例2.5と同様のプロトコールに従って、選択マーカーとして、最少培地で酵母細胞が増殖するためのサッカロミセス・セレビシエ(パン酵母)ADE2遺伝子を有するプラスミドpRS402(ATCC)から、酵母組込みプラスミドYIpAdeGAL1MS(図24)を得た。このプラスミドは、関心対象の任意の遺伝子のクローニング、およびADE2座における酵母ゲノムへの組込みを可能にする、プロモーターとターミネーターとの間の適切な特有の制限部位(すなわち、BamHI、SpeI)を含む。
【０２８７】
実施例2.7. HIS3組込みプラスミドであるpRS403へのGal1mSカセットのクローニング
実施例2.5と同様のプロトコールに従って、選択マーカーとして、最少培地で酵母細胞が増殖するためのS. セレビシエHIS3遺伝子を有するプラスミドpRS403(ATCC)から、酵母組込みプラスミドYIHisGAL1MS(図25)を得た。このプラスミドは、関心対象の任意の遺伝子のクローニング、およびHIS3座における酵母ゲノムへの組込みを可能にする、プロモーターとターミネーターとの間の適切な特有の制限部位(すなわち、BamHI、SpeI、XbaI)を含む。
【０２８８】
実施例2.8. TRP1組込みプラスミドであるpRS404へのGal1mSカセットのクローニング
実施例2.5と同様のプロトコールに従って、選択マーカーとして、最少培地で酵母細胞が増殖するためのS. セレビシエTRP1遺伝子を有するプラスミドpRS404(ATCC)から、酵母組込みプラスミドYITrpGAL1MS(図26)を得た。このプラスミドは、関心対象の任意の遺伝子のクローニング、およびTRP1座における酵母ゲノムへの組込みを可能にする、プロモーターとターミネーターとの間の適切な特有の制限部位(すなわち、BamHI、SpeI、XbaI)を含む。
【０２８９】
実施例2.9．肝臓cDNAライブラリーからの終止コドンを伴うΔN24hRD遺伝子の基礎プラスミドpBluescriptへのクローニング
3'末端終止コドンを伴うN末端切断型ヒトP450還元酵素遺伝子(SEQ ID No. 34)の1974 bp BamHI-XbaI断片(ΔN24hRD)を、BamHI-XbaI断片として増幅した。それぞれ100 pモルのPCRプライマー(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000031
(小文字はBamHI部位を示す - SEQ ID NO：35)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000032
(小文字はXbaI部位を示す - SEQ ID NO：36))を、鋳型としてのヒト肝臓由来cDNAライブラリーのDNA(500 ng)と共に使用した。実施例1と同様にΔN24hRD遺伝子をpBluescript KS+にサブクローニングして、プラスミドpBluKS(+)/DelN24hRD(図27)を得た。挿入物の配列を、制限酵素解析によって、およびDNA配列決定によって確認した。
【０２９０】
実施例2.10．肝臓cDNAライブラリーからの終止コドンを伴わないΔN24hRD遺伝子の基礎プラスミドpBluescriptへのクローニング
3'末端終止コドンを伴わないN末端切断型ヒトP450還元酵素遺伝子(SEQ ID No. 37)の1974 bp BamHI-XbaI断片(ΔN24hRD)を、BamHI-XbaI断片として増幅した。それぞれ100 pモルのPCRプライマー(5'プライマー：SEQ ID NO. 35および3'プライマー：
2009536026.tif 000033
(小文字はXbaI部位を示す - SEQ ID NO：38))を、鋳型としてのヒト肝臓由来cDNAライブラリーのDNA(500 ng)と共に使用した。実施例1と同様にΔN24hRD遺伝子をpBluescript KS+にサブクローニングして、プラスミドpBluKS(+)/DelN24hRDw/oStop(図28)を得た。挿入物の配列を、制限酵素解析によって、およびDNA配列決定によって確認した。
【０２９１】
実施例2.11．肝臓cDNAライブラリーからの終止コドンを伴う全長hRD遺伝子の基礎プラスミドpBluescriptへのクローニング
3'末端終止コドンを含む全長ヒトP450還元酵素遺伝子(hRD_fl)(SEQ ID No. 39)の2046 bp BamHI-XbaI断片を、BamHI-XbaI断片として増幅した。それぞれ100 pモルのPCRプライマー(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000034
(小文字はBamHI部位を示す - SEQ ID NO：40)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000035
(小文字はXbaI部位を示す - SEQ ID NO：41))を、鋳型としてのヒト肝臓由来cDNAライブラリーのDNA(500 ng)と共に使用した。実施例1と同様にhRD_fl遺伝子をpBluescript KS+にサブクローニングして、プラスミドpBluKS(+)/hRD_fl(図29)を得た。挿入物の配列を、制限酵素解析によって、およびDNA配列決定によって確認した。
【０２９２】
実施例2.12. (a) 終止コドンを伴うΔN24hRD遺伝子、(b) 終止コドンを伴わず、3'末端のc-mycタグとつながるΔN24hRD遺伝子(SEQ ID NO：42)、および(c) 終止コドンを伴う全長hRD遺伝子の酵母組込みプラスミドYILeuGAL1MSへのクローニング
(a) プラスミドpBluKS(+)/DelN24hRDStop(図27)に由来する、終止コドンを伴うΔN24hRD遺伝子、
(b) プラスミドpBluKS(+)/DelN24hRDw/oStop(図28)に由来する、終止コドンを伴わないΔN24hRD遺伝子、および
(c) プラスミドpBluKS(+)/hRD_fl(図29)に由来する、終止コドンを伴う全長hRD遺伝子、hRD_fl
のBamHI-XbaI断片を酵母組込みベクターYILeuGAL1MS(図23)にサブクローニングして、以下のプラスミドを得た。
2009536026.tif 000036
【０２９３】
実施例2.13. ヒトNADPH P450還元酵素のLEU2座における酵母株への組込み
酵母株W303B(実施例1.15を参照されたい)のLEU2座に組み込むため、まず最初に、組込み体プラスミドpSYI210(図30)、pSYI201(図31)、pSYI205(図32)に含まれる3つのヒト還元酵素遺伝子(hRD)変種の発現カセットをBstEIIで消化した。この制限酵素は、LEU2選択可能マーカー遺伝子内で、3つのプラスミドをそれぞれ特異的に切断する。次に、線状化されたプラスミドを用いて、酵母形質転換のBicine法により(または実施例1.15に記載される方法により)、酵母株BC300を形質転換し、形質転換体をロイシン栄養要求性について選択した。
【０２９４】
ヒト還元酵素遺伝子が組み込まれたならば、この遺伝子は酵母染色体の一部となり、したがっていずれの酵母染色体とも同じ高い忠実度で有糸分裂および減数分裂において分離する。2つのPCRプライマー(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000037
(ヒト還元酵素遺伝子の先頭部の一部 - SEQ ID NO：43)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000038
(ヒト還元酵素遺伝子の中央部由来の配列- SEQ ID NO：44)）を組込み体の確認に使用したが、これらのプライマーはヒトNADPH P450還元酵素遺伝子配列(SEQ ID No. 39)に基づいて設計した。鋳型としてヒト還元酵素遺伝子カセットを有する酵母ゲノムDNAを用いた場合の予測されるPCR産物は、2つのプライマーSEQ ID No. 43および44を用いてPCRを行った場合、約1.0 kbである。PCRは新たに増殖している酵母細胞で行い、DNAの増幅にはTaq DNAポリメラーゼを使用した。
【０２９５】
PCRにより組込みが成功したことを示す株を、以下のように命名した：
(1) YI001(W303B::pSYI210)、
(2) YI002(W303B::pSYI201)、
(3) YI003(W303B::pSYI205)。
対照として、hRD遺伝子挿入物を含まないプラスミド、YILeuG1MS(図23)のコピーが組み込まれた酵母株(4)を作製した；
(4) YI004(W303B::YILeuG1MS)。
【０２９６】
この株を作製するために用いた手順は、まさしく上記の通りであった。酵母への正確な組込みを確認するために使用したPCRプライマーは、SEQ ID No 7および30を有した。〜970 bpの増幅DNAが、予測される断片に相当した。
【０２９７】
株(1)〜(4)を振盪フラスコ培養で培養して(実施例1.15に記載される通り；上記を参照されたい)、これらの株に存在するミクロソームおよび可溶性(すなわち、サイトゾル)のP450還元酵素活性を評価した(実施例2.14に記載される通り；以下を参照されたい)。
【０２９８】
実施例2.14. W303BのLEU2座に還元酵素遺伝子変種が組み込まれている酵母株におけるヒトNADPH P450還元酵素活性の評価
P450還元酵素活性の測定用の、hRD変種を有する酵母細胞からのミクロソーム画分およびサイトゾル画分の調製
種々の酵母株からのミクロソームを、実施例1.15に記載される通りに調製した。Bio-Rad Bradfordアッセイによって測定された約100μgのミクロソームを使用し、MTT還元酵素活性の増加を400秒間にわたって追跡した。
【０２９９】
種々の酵母株を、実施例1.15に記載される通りにYPGE培地で培養した。細胞を回収し、遠心分離してペレット化した。細胞ペレットの10%を緩衝液B(10 mM Tris・Cl pH 7.5、2 Mソルビトール、0.1 mM EDTA pH 8.0、1 mM Pefabloc、0.1 mM DTT) 1 mlに再懸濁し、再懸濁された細胞をリチカーゼ(3〜5単位/細胞のO.D.；2200単位/mg；Sigma)で約1時間処理した。リチカーゼを用いて酵母細胞壁を酵素的に除去し、ペレットを遠心分離し、氷冷PBSで2回洗浄し、最終的に1 ml PBSに再懸濁した。懸濁液にガラスビーズを約0.5 ml添加し、各ボルテックス後に氷上で5分間の間隔をおいて、細胞を3回ボルテックスした。この細胞溶解物を、MTTベースの還元酵素アッセイに直接使用した。等量の細胞溶解物(Bio-Rad Bradfordアッセイによって測定された〜100μg)を使用し、MTT還元酵素活性の増加を上記の通り400秒間にわたって追跡した。
【０３００】
MTTベースのシトクロムP450還元酵素アッセイ法
酵素NADPH-シトクロムP450還元酵素は、NADPHからシトクロムP450、他のミクロソームタンパク質、およびシトクロムcへの電子の転移を媒介する。この還元酵素はまた、フェリシアン化カリウム、2,6-ジクロロインドフェノール、1,1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル(DPPH)、およびマイトマイシンCなどの多くの薬物および他の化合物の還元を触媒する。細胞増殖および細胞毒性アッセイ、酵素アッセイ、組織化学的手順、ならびに細菌学的スクリーニングに、テトラゾリウム塩が広く用いられている。これらの過程のそれぞれにおいて、テトラゾリウム塩は代謝的に還元されて、ホルマザンと称される着色の強い最終産物になる。化合物3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-臭化ジフェニルテトラゾリウム(MTT)はモノテトラゾリウム塩である。MTTの還元は、細胞増殖および細胞毒性を測定するために最も頻繁に用いられる方法の1つである。P450還元酵素によるMTTの還元は、酵母の産生した組換えP450還元酵素活性をモニターするための方法として評価されており、そのプロトコールはYim S-K, et al(Yim S-K., Y. C.-H. Ahn T., Hung H-C and Pan J-G. A continuous Spectrophotometric assay for NADPH-cytochrome P450 reductase activity using 3-(4,5 Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide. Journal of Biology and Molecular Biology 38: 366-369, 2005)によって公表された手順において明らかにされている。この物質の主な利点は、MTTの還元が、連続的な分光光度法によって反応媒体中で直接アッセイできる点である。P450還元酵素によりNADPHから放出される電子はMTTに転移され、次に青色ホルマザンの形成に起因するA610値の増加を測定することによって、還元MTTの量が分光光度的に評価される。MTTの消衰係数は11.3 mM-1cm-1である。この方法により、比較的安価な市販の基質を用いる短い解析時間の利点が提供される。古典的なアッセイ法は、基質として組換えシトクロムcを使用する。
【０３０１】
MTTアッセイ法に用いられる溶液
10 mMリン酸カリウム緩衝液：pH 7.4：1M K2HPO4 8 mlおよび1M KH2PO4 2 mlにddH2Oを添加して1リットルにする。
10 mM MTT：MTT(Sigma、カタログ番号M2128) 41.4 mgを10 mMリン酸カリウムpH 7.4 10 mlに添加して10 mM MTTとする。
100 mMリン酸カリウム緩衝液：pH 7.6：1M K2HPO4 86.6 mlおよび1M KH2PO4 13.4 mlにddH2Oを添加して1リットルにする。
溶液A 1 ml保存液(-20℃で保存)：1 ml ddH2O中の1 M塩化マグネシウム溶液(Sigma、カタログ番号:M1028) 131μlとして、最終濃度66 mMにする。
NADP+(Sigma、カタログ番号:N0505、Mr 765.4) 43.5mg、最終濃度50 mM。
D-グルコース-6-リン酸二ナトリウムの含水塩(Sigma、カタログ番号:F7250、Mr 304.1) 172 mg、最終濃度500 mM。
溶液B(-20℃で保存)：5 mMクエン酸ナトリウム(14.7mg/ml)(三塩基性)(Sigma、カタログ番号:S46410) 340μl中の17 Uグルコース-6-リン酸脱水素酵素(Sigma、カタログ番号:G6378、250 U)。
【０３０２】
酵母由来組換えP450還元酵素を評価するために改良されたMTTベースのP450還元酵素アッセイ法
本実験には、使い捨てキュベットを使用した。リン酸カリウム緩衝液850μlをキュベットに添加した。酵母ミクロソーム100μg、または酵母のサイトゾル画分を含む細胞上清100μgを緩衝液に添加し、その後溶液B 10μlを添加した。得られる懸濁液中にいかなる気泡も形成されないように、内容物を穏やかに混合した。溶液A 10μlをキュベットに速やかに添加し、数回反転させることによって内容物を混合した。このキュベットを、空キュベットおよびその内容物(もう一方の試験キュベットと同様にすべての成分を含むが、ミクロソームも細胞懸濁液も含まなかった)と共に分光光度計に速やかに設置し、610 nmにおける値の増加を400秒間にわたって測定した。組換えP450還元酵素によりNADPHから放出された電子はMTTに転移され、そこで、青色ホルマザンの形成の結果としてのA610値の増加を測定することによって、MTTを還元する能力を分光光度的に評価した。消衰係数11.3 mM-1cm-1および式、ΔA610/分/11.3*0.1 mg/ml＝μモル還元MTT/分/mgタンパク質を用いて、A610値の変化からMTT還元速度を計算した。
【０３０３】
結果
実施例2.13において作製された株(1)〜(4)、
(1) ΔN24hRDStopを有するYI001(W303B::pSYI210)、
(2) ΔN24hRD-cmycStopを有するYI002(W303B::pSYI201)、
(3) hRD_flStopを有するYI003(W303B::pSYI205)、
(4) YI004(W303B::YILeuG1MS)、対照株
を振盪フラスコ培養で培養して(実施例1.15に記載される通り；上記を参照されたい)、これらの株に存在するミクロソームおよび可溶性(すなわち、サイトゾル)のP450還元酵素活性を評価した。図33に示されるy軸値(μM還元MTT/分/mgタンパク質)は、少なくとも3回の個別の決定の平均値である。
【０３０４】
図33の結果から以下のことが示される：
(1) ΔN24hRD変異体(N末端24アミノ酸荷電ドメインを欠いている)を有する株1は、酵母還元酵素プロモーターによって駆動される内因性酵母還元酵素のみを含む株4よりもわずかに高い活性を有する。株1は、ΔN24hRD変異体のみならず、内因性還元酵素も発現することに留意されたい。ΔN24hRDの活性の大部分は細胞の可溶性サイトゾル部分に存在するようであり、ΔN24hRDは小胞体(ER)膜に強く結合していない可能性があることが示される。P450アイソザイムはER膜結合性(すなわち、ミクロソーム結合性)であるため、最適なP450活性を得るためには、還元酵素もERと会合しているべきであると想定されよう。これらの実験から、ΔN24hRDのミクロソーム結合性還元酵素活性は最小であることが示されるが、これより後に本発明者らは、ΔN24hRDが異なる酵母染色体(遺伝子)座に組み込まれた場合、または異なる増殖条件下で株を培養した場合でさえ、この活性がどういうわけか増加することを記載する(以下を参照されたい)。
(2) ΔN24hRD-cmyc融合タンパク質を発現する株2は、ミクロソーム膜に結合する能力がΔN24hRDよりもはるかに優れている。
(3) ミクロソーム結合性ΔN24hRD-cmyc融合タンパク質は、その還元酵素活性が、野生型全長タンパク質よりも高い。しかしながら、そのサイトゾル活性も同様により高い。
【０３０５】
結論
(1) 新規hRD変種ΔN24hRDおよびΔN24hRD-cmyc融合物は、酵母においてシトクロムP450アイソザイム(ヒトおよび非ヒトの両方)を生成するための改良発現システムを考案する上で役立つ興味深い特徴を有する。
(2) この興味深い特徴は、酵母細胞、昆虫細胞、および/または哺乳動物細胞を使用する新規生成システムを考案する際に活用することができる。
【０３０６】
実施例3. いずれのタンパク質のタンパク質発現も675 bp GAL1-675プロモーターによって駆動される、hRD変種を同時発現する酵母株からのヒトP450アイソザイムCYP1B1の発現
実施例2において考察したように、hRDはP450アイソザイムの活性に必須である。P450還元酵素の過剰発現は生細胞にとって有害であるため、P450還元酵素の同時発現がP450発現に悪影響を及ぼすことが観察されたことは珍しいことではない。
【０３０７】
本実施例では、(実施例2に記載されるような)新規hRD変種がP450の発現および活性に及ぼす考えられる影響を調べた。
【０３０８】
実施例3.1 酵母の形質転換
実施例2.12において作製された株(1)〜(4)、
(1) ΔN24hRDStopを有するYI001(W303B::pSYI210)、
(2) ΔN24hRD-cmycStopを有するYI002(W303B::pSYI201)、
(3) hRD_flStopを有するYI003(W303B::pSYI205)、
(4) YI004(W303B::YILeuG1MS)、対照株
を、酵母形質転換のDMSO法を用いて(実施例1.15に記載される通り)、ヒトCYP1B1遺伝子を有するプラスミドpSYE225(図14)で形質転換して、以下の株を得た。
2009536026.tif 000039
【０３０９】
実施例3.2. 酵母ミクロソーム調製用の酵母培養物の培養
実施例1.15と同様の「ミクロソーム調製用の酵母培養物の培養」に用いた方法によって、株YI005、YI006、YI007、およびYI008による酵母細胞を培養した。改良手順では、エタノールを2日目に添加しガラクトースを3日目に添加する代わりに(実施例1.15を参照されたい)、3日目にエタノールとガラクトースを一緒に添加した。
【０３１０】
実施例3.3. 酵母ミクロソームの調製
実施例1.15と同様に、株YI005、YI006、YI007、およびYI008のミクロソームを調製した。
【０３１１】
実施例3.4. CO-差分光法によるP450量の測定
実施例1.15に記載の通り、プロトコール「CO-差分光法によるP450量の決定」を用いて、株YI005、YI006、YI007、およびYI008から得られたP450量を測定した。
【０３１２】
結果
図34に示した値は、少なくとも3回の個々の実験の平均値である。世界中の全研究者が、P450タンパク質(ヒトおよび非ヒト)のあらゆる組換え発現のために、野生型全長hRDしか使用していないことに留意されたい。
【０３１３】
結論
(1) ΔN24hRD変異体およびΔN24hRD-cmyc融合タンパク質を有する株YI005およびYI006が、シトクロムP450アイソザイムCYP1B1を産生する能力において最良である。
(2) 野生型全長hRDタンパク質(世界中のすべてのP450研究室で用いられている)を有する株YI007は、CYP1B1タンパク質の比較的低い産生をもたらす。
(3) タンパク質ΔN24hRDおよびΔN24hRD-cmyc融合物は、全長hRDタンパク質よりも多量の任意のP450タンパク質の生成に役立つ。したがって、これら2つの変種hRDタンパク質は、より高い活性を有するP450の生成に用いることができる。
【０３１４】
実施例3.5. ヒトCYP1B1、CYP1A1、CYP1A2タンパク質等を有する酵母ミクロソーム中のP450活性を決定するためのERODアッセイ法(多くのP450酵素は基質としてERODを使用するが、効率の程度が異なる。)
序論
P450酵素レベルを決定するための最もよく用いられかつ標準化されたアッセイ法の1つは、7-エトキシレゾルフィンO-デエチラーゼと称される酵素の活性の測定である(Klotz A.V., S. J. J. a. W. C.. An alternative 7-ethoxyresorufin O-deethylase activity assay: a continuous visible spectrophotometric method for measurement of cytochrome P450 monooxygenase activity. Analytical Biochemistry 140: 138-145, 1984)。この酵素は、NADPHおよび酸素の存在下で、7-エトキシレゾルフィンを蛍光検出できるレゾルフィンに変換するものであり、このアッセイ法はERODアッセイ法として公知である。
2009536026.tif 000040
NADPHおよび試験しようとする試料を添加してから、生じたレゾルフィンの量を分光光度計で測定する。試料は、サッカロミセス・セレビシエからのミクロソーム調製物であった。
【０３１５】
アッセイ法に用いられる溶液
溶液A 10 ml保存液(-20℃で保存)：
NADP+(Sigma、カタログ番号:N0505、Mr 765.4) 200 mg、最終濃度26.13 mM；D-グルコース-6-リン酸二ナトリウム含水塩(Sigma、カタログ番号:F7250、Mr 304.1) 200 mg、最終濃度65.77 mM、MgCl2(Sigma、カタログ番号:M1028、1 M溶液)、最終濃度65.42 mM。脱イオン水で溶液を10 mlにする。
溶液B 6.25 ml保存液(-20℃で保存)：5 mMクエン酸ナトリウム(三塩基性)(Sigma、カタログ番号:S46410) 6.25 ml中の250 Uグルコース-6-リン酸脱水素酵素(Sigma、カタログ番号:G6378、250 U)。
溶液C 新たに15 mlを調製：0.5M KPO4 pH 7.4 1.5 ml；溶液A 1.5 ml；溶液B 0.3 ml。脱イオン水11.5 mlで溶液を15 mlにする。
0.5 Mリン酸カリウム(KPO4) pH 7.4(Kpi緩衝液)：緩衝液A(1 M；136.1 g KH2PO4/L) 19.8 mlおよび緩衝液B(1 M；174.2 g K2HPO4/L) 80.2 mlを用いて滅菌水で200 mlにし、pHを7.4に調製する。
0.1 Mリン酸カリウム(KPO4) pH 7.4：緩衝液A(1 M；136.1 g KH2PO4/L) 1.98 mlおよび緩衝液B(1 M；174.2 g K2HPO4/L) 8.02 mlを用いて滅菌水で100 mlにし、pHを7.4に調製する。
50 mMクエン酸ナトリウム(三塩基性)：クエン酸ナトリウム(三塩基性)(Sigma、カタログ番号:S4641) 147 mgを脱イオン水10 mlに溶解する。
10% DMSO 100 ml：脱イオン水90 ml中の原液DMSO 10 ml。
1 mM 7-エトキシレゾルフィン：7-エトキシレゾルフィン(Sigma、カタログ番号:E3763、Fw: 241.2.2) 2.1412 mgを原液DMSO 10 ml中に取り込む。この溶液は後に、使用日に10% DMSOで0.1 mM溶液に希釈する。この溶液は極めて光感受性が高いため、褐色瓶で保存し、スズ箔で覆わなければならない。この溶液は-20℃で保存する。
10 mMレゾルフィン：レゾルフィン(Sigma、カタログ番号R3257、Fw: 235.17) 23 mgを原液DMSO 10 mlに溶解する。この溶液も極めて光感受性が高いため、褐色瓶で保存し、スズ箔で覆わなければならない。この溶液は-20℃で保存する。
【０３１６】
アッセイ手順
このアッセイに用いられる試薬は光感受性である。このアッセイに関与する操作はすべて、黄色く着色された窓を有する実験室内で行った。用いたアッセイ法は、Klotzの手順(Klotz A.V., S. J. J. a. W. C.. An alternative 7-ethoxyresorufin O-deethylase activity assay: a continuous visible spectrophotometric method for measurement of cytochrome P450 monooxygenase activity. Analytical Biochemistry 140: 138-145, 1984)を改良したものである。反応はすべて96ウェル黒色透明平底プレート(Fisher カタログ番号:FB86083)で行い、この反応を生成されたレゾルフィンの(Bio-Tek蛍光分光光度計およびソフトウェアKC4を使用する)検出に用いた(Hahn, M. E., Lamb, T. M., Schultz, M. E., Smolowitz, R. M. and Stegeman, J.J. Cytochrome P4501A induction and inhibition by 3,3',4,4'-tetrachlorobiphenyl in an Ah receptor-containing fish hepatoma cell line (PLHC-1). Aquatic Toxicology 26: 185-208, 1993)。
【０３１７】
アッセイを開始する前に、黒色プレートおよびすべての溶液を暗下で37℃であらかじめ温めた。吸収波長を530 nmに設定し、発光波長を590 nmに設定した。反応はすべて20〜40分行い、プレートは読み取り前に自動混合された。レゾルフィン検量線を作成するため、終点解析を行った。
【０３１８】
96ウェルプレート中、各反応物は0.1 M KPO4緩衝液中に、酵母ミクロソームに会合した組換えP450タンパク質 1.5pmol(総ミクロソームタンパク質約25μg中)を含む。すべての反応物が同量の総タンパク質を含むようにするため、内因性酵母還元酵素遺伝子を含まない(すなわち、yRD遺伝子が破壊された)基礎酵母株のミクロソームに由来する余分量の過剰なタンパク質を使用した。レゾルフィン検量線に使用したタンパク質は、煮沸したミクロソーム、または内因性酵母還元酵素破壊株から調製されたミクロソームのいずれかであった。
【０３１９】
ほとんどの場合、ミクロソーム調製物中に存在するP450の量は前もってわかっているため(CO-差スペクトルによる)、ERODアッセイ法によるP450活性は、pmol生成レゾルフィン/分/pmol P450として直接表すことができる。または、活性は、検量線を用いてpmol生成レゾルフィン/分としてとして表すこともできる。
【０３２０】
結果
図35は、酵母培養物の培養に関して標準手順(実施例1.15)および改良手順(実施例3.2)を用いて、株YI005、YI006、YI007、およびYI008から得られたミクロソーム中のCYP1B1の「相対」活性を示す。示した結果は、少なくとも3回の個々の実験の平均値である。
【０３２１】
結論
(1) hRDの新規ΔN24hRD-cmyc融合変種を有する株YI006は、酵母において産生されるCYP1B1の最大活性に寄与する。
(2) 他のP450アイソザイムを同時発現させるために、hRDの変種、ΔN24hRDおよびΔN24hRD-cmycの両方を使用しているところである。
(3) YI007は全長hRDを有し、全長hRDは酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞におけるP450アイソザイムの同時発現に一般的に用いられていることに留意されたい。株YI007はP450タンパク質をあまり産生しないばかりでなく(実施例3.3を参照されたい)、産生されたP450はYI006およびYI005において産生されたP450よりも活性が低い(本実施例)。
【０３２２】
実施例4. 組込みに関して異なる染色体座においてΔN24hRD変種を有する酵母株の構築：hRD活性の比較解析およびCYP活性との関連性
異なる染色体座においてΔN24hRD変異体を組み込むことに意義があるかどうかを調べた。これは主に、酵母株W303Bで利用できるすべての座位が、ΔN24hRD変異体から還元酵素活性を発現させる上で同等に効率的であるかどうかを決定するために行った。最終的に、目標は、酵母においてP450アイソザイムの同時発現を可能にする上で最も効率的な還元酵素座位を見出すことであった。
【０３２３】
実施例4.1. プラスミドの構築
プラスミドpBluKS(+)/DelN24hRDStop(図27)に由来する、終止コドンを伴うΔN24hRD遺伝子のBamHI-XbaI断片を酵母組込みベクター
2009536026.tif 000041
にサブクローニングして、以下のプラスミドを得た。
2009536026.tif 000042
【０３２４】
実施例4.2. 酵母の形質転換：酵母株W303Bの異なる染色体座へのΔN24hRD遺伝子の組込み
以下の制限酵素を用いてプラスミドを線状化した：
(1) pSYI217に対するStuI、
(2) pSYI224に対するNdeI、
(3) pSYI222に対するNarI。
酵母株W303BのADE2座およびHIS3座における組込みにはプラスミドpSYI217およびpSYI224を使用し、W303BのyRD遺伝子座における組込みにはpSYI222を使用した。酵母の形質転換に用いた形質転換プロトコールは、実施例1.15と同様であった。
【０３２５】
結果として得られた株は以下の通りであった：
(1) ADE2座においてΔN24hRDStopを有するYI009(W303B::pSYI217)、
(2) HIS3座においてΔN24hRDStopを有するYI010(W303B::pSYI224)、
(3) W303Bにおける内因性yRDがGAL1プロモーター駆動性のΔN24hRDStop遺伝子カセットの導入によって破壊されたことを意味する、yRD遺伝子座においてΔN24hRDStop遺伝子を有するYI011(W303B::pSYI222)。
組込み体株はすべて、プライマーSEQ ID No. 43および44を用いてPCRにより確認した。
【０３２６】
実施例4.3. 酵母ミクロソーム調製用の酵母培養物の培養
実施例1.15と同様の「ミクロソーム調製用の酵母培養物の培養」に用いた方法によって、株
(1) YI001(LEU2座においてΔN24hRDStopを有する)、
(2) YI009(ADE2座においてΔN24hRDStopを有する)、
(3) YI010(HIS3座においてΔN24hRDStopを有する)、
(4) YI011(yRD座においてΔN24hRDStopを有する)、および
(5) YI004(W303B::YILeuG1MS)、対照株
による酵母細胞を培養した。
【０３２７】
実施例4.4. 酵母ミクロソームの調製
実施例1.15に記載されるプロトコールに従って、株YI001、YI009、YI010、YI011、および対照株YI004のミクロソームを調製した。
【０３２８】
実施例4.5. MTTベースのアッセイ法による実施例4.3に記載される株の還元酵素活性の測定
実施例2.13に記載されるプロトコールを用いて、株YI001、YI009、YI010、YI011、および対照株YI004から得られた還元酵素活性を測定した。
【０３２９】
結果
図39に示した還元酵素活性値は、少なくとも3回の個々の実験の平均値である。
【０３３０】
結論
(1) 異なる染色体座からのΔN24hRDの発現は、還元酵素活性の異なる発現をもたらす。
(2) したがって、選択される任意のP450組換えアイソザイムについて広範なP450活性を提供することが可能である。
【０３３１】
実施例4.6. 異なる染色体座においてΔN24hRDを有する酵母株へのCYPB1含有プラスミド、pSYE225の形質転換
実施例1.15に詳述されるプロトコールを用いて、プラスミドpSYE225を株
(1) YI001(LEU2座においてΔN24hRDStopを有する)、
(2) YI009(ADE2座においてΔN24hRDStopを有する)、
(3) YI010(HIS3座においてΔN24hRDStopを有する)、
(4) YI011(yRD座においてΔN24hRDStopを有する)、および
(5) YI004(W303B::YILeuG1MS)、対照株
に形質転換して、結果的に生じた株を得た(株(i)および(v)は、実施例3.1において前に得られていた)。
2009536026.tif 000043
【０３３２】
実施例4.7. MTTベースのアッセイ法による実施例4.3に記載される株の還元酵素活性の測定
実施例2.13に記載されるプロトコールを用いて、株YI005、YI012、YI013、YI014、および対照株YI008から得られた還元酵素活性を測定した。
【０３３３】
結果
図40に示した値は、少なくとも3回の個々の実験の平均値である。細胞は、実施例1.15と同様の「ミクロソーム調製用の酵母培養物の培養」に用いた「標準」法によって培養し、ミクロソームも実施例1.15と同様の方法によって調製した。
【０３３４】
結論
(1) 株YI005、YI012、YI013、YI014、および対照株YI008(すべてヒトCYP1B1遺伝子を有する株)における還元酵素活性は、株YI001、YI009、YI010、YI011、および対照株YI004(すなわち、ヒトCYP1B1遺伝子を有さない株)における活性と同等である。
(2) ΔN24hRDが染色体に組み込まれた領域の近傍の遺伝子は、還元酵素の発現および活性に影響を及ぼすと考えられる(Brem, R. B. et al. Genetic dissection of transcriptional regulation in budding yeast. Science 296(5568): 752-756, 2002)。
【０３３５】
実施例4.8. ERODアッセイ法による実施例4.6に記載される株におけるP450活性の測定
株YI005、YI012、YI013、YI014、および対照株YI008から得られたミクロソーム(実施例1.15に記載される通り、標準培養条件下で調製)中のCYP1B1 P450活性を、実施例3.4に記載される通りERODアッセイプロトコールを用いて測定した。
【０３３６】
結果
図41に示した値は、少なくとも3回の個々の実験の平均値である。細胞は、実施例1.15と同様の「ミクロソーム調製用の酵母培養物の培養」に用いた「標準」法によって培養し、ミクロソームも実施例1.15と同様の方法によって調製した。
【０３３７】
結論
異なる酵母染色体座から発現された変異体ΔN24hRDの還元酵素活性とCYP1B1活性との間に直接的な相関関係があるようである。これは、より高い還元酵素活性がP450タンパク質の大幅なレベル低下を通常意味する全長hRDの発現と対照的であると考えられる。
【０３３８】
実施例5. 2つの異なる染色体座において2つのhRD変種を2コピー有する酵母株の構築：hRD活性の比較解析およびCYP活性との関連性
酵母で産生される組換えP450タンパク質の量および活性にプラスに影響する能力において、ΔN24hRDおよびΔN24hRD-cmycが全長hRDとそれほど異なって作用することは全く予想外であった。過剰な全長hRD活性は細胞にとって有害であり、またP450発現を妨げる。P450アイソザイムと2コピーのΔN24hRDまたはΔN24hRD-c-mycを同時発現させる意義を調べた。
【０３３９】
実施例5.1. プラスミドの構築
酵母ゲノムのLEU2座に単一コピーのΔN24hRDおよびΔN24hRD-c-mycを組み込めるようにするプラスミドは既に作製されている。得られたプラスミドをpSYI210(図30)およびpSYI201(図31)と命名した。
【０３４０】
酵母ゲノムのADE2座に単一コピーのΔN24hRDを組み込めるようにするプラスミドは既に作製されている。得られたプラスミドをpSYI217(図36)と命名した。
【０３４１】
ΔN24hRD-cmyc含有ADE2組込みプラスミドの構築
プラスミドpBluKS(+)/DelN24hRDw/oStop(図25)に由来する、終止コドンを伴わないΔN24hRD遺伝子のBamHI-XbaI断片を酵母組込みベクターYIAdeGAL1MS(図24)にサブクローニングして、プラスミドpSYI215(＝YIAdeG1MS/DelN24hRDw/oStop；図42)を得た。
【０３４２】
GAL1-675プロモーターによって駆動されるΔN24hRDおよびΔN24hRD-cmyc発現カセットの第2のコピーを含むLEU2およびADE2組込みプラスミドの構築
DNA構築物の作製は3段階を含んだ。
【０３４３】
段階1
GAL1p675プロモーターによって駆動されるΔN24hRD(終止コドンを伴う)およびΔN24hRD(終止コドンを伴わない)発現カセットの第2のコピーを作製するため、まず最初に、pBluKS(+)/Gal1mS(図22)からのXhoI-SacI Gal1mS断片を基礎ベクターpSP73(Promegaから入手)にサブクローニングして、プラスミドpSP73/Gal1mS(図43)を得た。
【０３４４】
段階2
次に、ΔN24hRDStop遺伝子およびΔN24hRDw/oStop遺伝子のBamHI-XbaI断片をpSP73/Gal1mS(図43)のBamHI、XbaI部位にサブクローニングして、プラスミドpSP73/Gal1hRDStopmS(図44)およびpSP73/Gal1hRDw/oStopmS(図45)を得た。
【０３４５】
段階3
最後に、Gal1hRDStopmSを含むpSP73/Gal1hRDStopmS(図44)からのXhoI-EcoRV断片を、HindIII(平滑末端化)、XhoIで消化したpSYI210(図30)およびpSYI217(図36)に連結して、プラスミドpSYI211(図46)およびpSYI218(図48)を得た。2つのベクターpSYI210およびpSYI217のHindIII部位は、クレノウポリメラーゼで平らにすることによって平滑末端化した。
【０３４６】
また、pSP73/Gal1hRDStopmS(図44)から単離されたGal1hRDw/oStopmSを含むXhoI-EcoRI断片を、XhoI、EcoRIで消化したpSYI201(図31)およびpSYI215(図42)に連結して、プラスミドpSYI202(図47)およびpSYI240(図49)を得た。
HindIII断片(クレノウポリメラーゼによってHindIII部位を平滑化)
【０３４７】
実施例5.2. 酵母の形質転換：酵母株W303BのLEU2染色体座およびADE2染色体座への2コピーのΔN24hRD遺伝子およびΔN24hRD-cmyc遺伝子の組込み
以下の制限酵素を用いてプラスミドを線状化した：
(1) pSYI211およびpSYI202に対するBstEII、
(2) pSYI217、pSYI218、およびpSYI240に対するStuI。
LEU2座における組込みにはプラスミドpSYI211およびpSYI202を使用し、酵母株W303BのADE2座における組込みにはpSYI218およびpSYI240を使用した。酵母の形質転換に用いた形質転換プロトコールは、実施例1.15と同様であった。
【０３４８】
結果として得られた株は以下の通りであった：
(1) ADE2座において1コピーのΔN24hRD-cmycを有するYI015(W303B::pSYI217)、
(2) LEU2座において2コピーのΔN24hRDStopを有するYI016(W303B::pSYI211)、
(3) LEU2座において2コピーのΔN24hRD-cmycを有するYI017(W303B::pSYI202)、
(4) ADE2座において2コピーのΔN24hRDStopを有するYI018(W303B::pSYI218)、
(5) ADE2座において2コピーのΔN24hRD-cmycを有するYI019(W303B::pSYI240)。
組込み体株はすべて、プライマーSEQ ID No. 45および46を用いてPCRにより確認した。
【０３４９】
実施例5.3. 酵母ミクロソーム調製用の酵母培養物の培養
実施例1.15と同様の「ミクロソーム調製用の酵母培養物の培養」に用いた方法によって、株
(1) YI001(LEU2座において1コピーのΔN24hRDStopを有する)、
(2) YI002(LEU2座において1コピーのΔN24hRD-cmycを有する)、
(3) YI009(ADE2座において1コピーのΔN24hRDStopを有する)、
(4) YI015(ADE2座において1コピーのΔN24hRD-cmycを有する)、
(5) YI016(LEU2座において2コピーのΔN24hRDStopを有する)、
(6) YI017(LEU2座において2コピーのΔN24hRD-cmycを有する)、
(7) YI018(ADE2座において2コピーのΔN24hRDStopを有する)、
(8) YI019(ADE2座において2コピーのΔN24hRD-cmycを有する)
による酵母細胞を培養した。
【０３５０】
実施例5.4. 酵母ミクロソームの調製
実施例1.15に記載されるプロトコールを用いて、株YI001、YI002、YI009、YI015、YI016、YI017、YI018、およびYI019のミクロソームを調製した。
【０３５１】
実施例5.5. MTTベースのアッセイ法による実施例5.3に記載される株の還元酵素活性の測定
実施例2.13に記載されるプロトコールに従って、株YI001、YI002、YI009、YI015、YI016、YI017、YI018、およびYI019から得られた還元酵素活性を測定した。
【０３５２】
結果
図50に示した還元酵素活性値は、少なくとも3回の個々の実験の平均値である。
【０３５３】
結論
(1) P450還元酵素活性が、特定の染色体座において発現される還元酵素変異体の型に依存することが極めて明白である。
(2) 2つの異なる染色体座(すなわち、酵母ゲノムにおいてLEU2遺伝子およびADE2遺伝子が存在する染色体)にhRD変種遺伝子を1コピーの代わりに2コピー導入することによって、より高い還元酵素活性を明確に得ることができる。
(3) より広範な一連の還元酵素活性を用いて、選択される任意の組換えP450アイソザイムについて、より広範な一連のP450活性を提供することが可能である。
【０３５４】
実施例5.6. 実施例5.3に記載される酵母株へのCYPB1含有プラスミド、pSYE225の形質転換
実施例1.15に詳述されるプロトコールを用いて、プラスミドpSYE225を株
(1) YI001(LEU2座において1コピーのΔN24hRDStopを有する)、
(2) YI002(LEU2座において1コピーのΔN24hRD-cmycを有する)、
(3) YI009(ADE2座において1コピーのΔN24hRDStopを有する)、
(4) YI015(ADE2座において1コピーのΔN24hRD-cmycを有する)、
(5) YI016(LEU2座において2コピーのΔN24hRDStopを有する)、
(6) YI017(LEU2座において2コピーのΔN24hRD-cmycを有する)、
(7) YI018(ADE2座において2コピーのΔN24hRDStopを有する)、
(8) YI019(ADE2座において2コピーのΔN24hRD-cmycを有する)
に形質転換して、結果的に生じた株を得た(株(i)、(ii)、および(iii)は、実施例3.1および4.6において前に得られていた)。
2009536026.tif 000044
【０３５５】
実施例5.7. CO-差分光法による実施例5.6に記載される株におけるP450量の測定
実施例1.15に記載の通り、プロトコール「CO-差分光法によるP450量の決定」を用いて、株YI005、YI006、YI012、YI020、YI021、YI022、YI023、およびYI024から得られたP450量を測定した。
【０３５６】
結果
図51に示した値は、少なくとも3回の個々の実験の平均値である。細胞は、実施例1.15と同様の「ミクロソーム調製用の酵母培養物の培養」に用いた「標準」法によって培養し、ミクロソームも実施例1.15と同様の方法によって調製した。
【０３５７】
結論
異なる株で産生されたCYP1B1の量には差がある。しかしながら、還元酵素変異体によって現れる還元酵素活性と産生されたP450の量との間に厳密な相関関係はないと考えられる。標準増殖条件下において、ΔN24hRD-cmyc融合物を有する株の産生するP450はより少ない。上記の通り(実施例3.2)、ΔN24hRD-cmyc保有株における産生レベルは、「改良」増殖条件を用いて高めることができる。
【０３５８】
実施例5.8. ERODアッセイ法による実施例5.6に記載される株におけるP450活性の測定
株YI005、YI006、YI012、YI020、YI021、YI022、YI023、およびYI024から得られたミクロソーム(実施例1.15に記載される通り、「標準」培養条件下で調製)中のCYP1B1 P450活性を、実施例3.4に記載される通りERODアッセイプロトコールを用いて測定した。
【０３５９】
結果
図52に示した値は、少なくとも3回の個々の実験の平均値である。細胞は、実施例1.15と同様の「ミクロソーム調製用の酵母培養物の培養」に用いた「標準」法によって培養し、ミクロソームも実施例1.15と同様の方法によって調製した。
【０３６０】
結論
(1) P450還元酵素活性とEROD蛍光ベースアッセイ法によって測定されたCYP1B1 P450活性との間に直接的な相関関係があるようである。
(2) 酵母において異なるP450還元酵素活性を生じる能力により、様々に異なる触媒活性を有する組み換えP450の生成が可能になる。
【０３６１】
実施例6. CYPアイソザイムの発現向上のためのプロテアーゼ欠損酵母株の構築
実施例6.1. TRP1保有プラスミドの構築
2つのPCRプライマー(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000045
(小文字はBamHI部位を示す - SEQ ID NO：48)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000046
(小文字はXhoI部位を示す - SEQ ID NO：48))を用いて、S. セレビシエTRP1遺伝子(SEQ ID No. 47)の829 bp BamHI-XhoI断片を基礎pBlueScriptKS+にクローニングして、プラスミドpBluKS+/TRP1(図53)を得た。
【０３６２】
実施例6.2. 相同組換えにより酵母株においてPRA1(PEP4)欠失を可能にするプラスミドの構築
PRA1遺伝子(SEQ ID No 50)をその染色体座から欠失させるため、破壊プラスミドを2段階で構築した。
【０３６３】
最初に、PRA1遺伝子の5'末端のSacI-BamHI断片(520 bp、SEQ ID No 51)をPCRによって単離し(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000047
(イタリック体の文字はSacI部位を示す - SEQ ID NO：52)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000048
(イタリック体の文字はBamHI部位を示す - SEQ ID NO：53)を使用)、プラスミドpBluKS+/TRP1(図53)にサブクローニングして、プラスミドpBlu/5'PRA1-TRP1(図54)を得た。
【０３６４】
第2段階では、PRA1遺伝子の3'末端のXhoI-KpnI断片(446 bp、SEQ ID No 54)をPCRによって単離し(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000049
(イタリック体の文字はXhoI部位を示す - SEQ ID No 55)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000050
(イタリック体の文字はKpnI部位を示す - SEQ ID No 56)を使用)、プラスミドpBlu/5'PRA1-TRP1(図54)にサブクローニングして、機能的TRP1によってPRA1遺伝子の破壊を可能にする遺伝子破壊プラスミドpSL001(図55)を得た。
【０３６５】
実施例6.2. 相同組換えにより酵母株においてHRD1欠失を可能にするプラスミドの構築
HRD1遺伝子(SEQ ID No 57)をその染色体座から欠失させるため、破壊プラスミドを2段階で構築した。
【０３６６】
最初に、HRD1遺伝子の5'末端のSacI-BamHI断片(520 bp、SEQ ID No 58)をPCRによって単離し(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000051
(イタリック体の文字はSacI部位を示す - SEQ ID No 59)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000052
(イタリック体の文字はBamHI部位を示す - SEQ ID No 60)を使用)、プラスミドpBluKS+/TRP1(図53)にサブクローニングして、プラスミドpBlu/5'HRD1-TRP1(図56)を得た。
【０３６７】
第2段階では、HRD1遺伝子の3'末端のXhoI-KpnI断片(553 bp、SEQ ID No 61)をPCRによって単離し(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000053
(イタリック体の文字はXhoI部位を示す - SEQ ID No 62)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000054
(イタリック体の文字はKpnI部位を示す - SEQ ID No 63)を使用)、プラスミドpBlu/5'HRD1-TRP1(図54)にサブクローニングして、機能的TRP1によってHRD1遺伝子の破壊を可能にする遺伝子破壊プラスミドpSL002(図57)を得た。
【０３６８】
実施例6.4. 相同組換えにより酵母株においてHRD2欠失を可能にするプラスミドの構築
HRD2遺伝子(SEQ ID No 64)をその染色体座から欠失させるため、破壊プラスミドを2段階で構築した。
【０３６９】
最初に、HRD2遺伝子の5'末端のSacI-BamHI断片(443 bp、SEQ ID No 65)をPCRによって単離し(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000055
(イタリック体の文字はSacI部位を示す - SEQ ID No 66)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000056
(イタリック体の文字はBamHI部位を示す - SEQ ID No 67)を使用)、プラスミドpBluKS+/TRP1(図53)にサブクローニングして、プラスミドpBlu/5'HRD2-TRP1(図58)を得た。
【０３７０】
第2段階では、HRD2遺伝子の3'末端のXhoI-KpnI断片(526 bp、SEQ ID No 68)をPCRによって単離し(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000057
(イタリック体の文字はXhoI部位を示す - SEQ ID No 69:)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000058
(イタリック体の文字はKpnI部位を示す - SEQ ID No 70)を使用)、プラスミドpBlu/5'HRD2-TRP1(図54)にサブクローニングして、機能的TRP1によってHRD2遺伝子の破壊を可能にする遺伝子破壊プラスミドpSL003(図59)を得た。
【０３７１】
実施例6.5. 相同組換えにより酵母株においてUBC7欠失を可能にするプラスミドの構築
UBC7遺伝子(SEQ ID No 71)をその染色体座から欠失させるため、破壊プラスミドを2段階で構築した。
【０３７２】
最初に、UBC7遺伝子の5'末端のSacI-BamHI断片(520 bp、SEQ ID No 72)をPCRによって単離し(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000059
(イタリック体の文字はSacI部位を示す - SEQ ID NO：73)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000060
(イタリック体の文字はBamHI部位を示す - SEQ ID No 74:)を使用)、プラスミドpBluKS+/TRP1(図53)にサブクローニングして、プラスミドpBlu/5'UBC7-TRP1(図60)を得た。
【０３７３】
第2段階では、UBC7遺伝子の3'末端のXhoI-KpnI断片(553 bp、SEQ ID No 75)をPCRによって単離し(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000061
(イタリック体の文字はXhoI部位を示す - SEQ ID NO：76)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000062
(イタリック体の文字はKpnI部位を示す - SEQ ID No 77)を使用)、プラスミドpBlu/5'UBC7-TRP1(図60)にサブクローニングして、機能的TRP1によってUBC7遺伝子の破壊を可能にする遺伝子破壊プラスミドpSL004(図61)を得た。
【０３７４】
実施例6.6. 遺伝子破壊によってPEP4、HRD1、HRD2、およびUBC7遺伝子が欠損した酵母株の構築
1段階遺伝子破壊法を使用するPEP4、HRD1、HRD2、およびUBC7遺伝子の破壊に、プラスミドpSL001、pSL002、pSL003、およびpSL004(実施例6.2〜6.5を参照されたい)を用いた。
【０３７５】
プラスミドをSacIおよびKpnI制限酵素で消化することによって、pSL001、pSL002、pSL003、およびpSL004からΔpra1/TRP1、Δhrd1/TRP1、Δhrd2/TRP1、およびΔubc7/TRP1の精製断片を単離した(QIAGENキットを使用)。高効率酵母形質転換法を用いて、この断片を相同組換えにより酵母染色体に組み込んだ。必要な栄養素を含むがトリプトファンを欠く最少培地SDプレート上で、組込み体を選択した。
【０３７６】
図62は、PEP4遺伝子の破壊に用いたプロトコールを例として用いて、遺伝子破壊に使用した一般的戦略を示す。選択可能マーカー遺伝子(TRP1)および選択可能マーカーの両側に隣接しているDNA(Δpra1)を含むDNA断片によって、標的遺伝子(PEP4)が中断されている。このDNA断片の末端間での組換えにより、標的遺伝子は、破壊された遺伝子配列で置き換えられる。遺伝子破壊の成功は、4つの遺伝子のいずれかの5'末端断片を増幅するために使用した5'プライマーおよび3'-TRP1プライマー(SEQ ID No 49)、またはあるいは5'-TRP1プライマー(SEQ ID No 48)および4つの遺伝子のいずれかの3'末端断片を増幅するために使用した3'プライマーを用いてPCRすることにより確認する。
【０３７７】
PEP4、HRD1、HRD2、およびUBC7遺伝子の破壊には、株
(1) YI001(LEU2座において1コピーのΔN24hRDStopを有する)、および
(2) YI016(LEU2座において2コピーのΔN24hRDStopを有する)
を用いた。得られた株を以下のように命名した。
2009536026.tif 000063
【０３７８】
実施例6.7. 実施例6.6に記載されるプロテアーゼ欠損株におけるpSYE225の形質転換
実施例6.6において構築された酵母株を、CYP1B1遺伝子を有する2ミクロン酵母発現プラスミドpSYE225(実施例14)で形質転換して、結果として生じた株を得た。
2009536026.tif 000064
【０３７９】
実施例6.8. CO-差分光法による実施例6.5に記載される株におけるP450量の比較
実施例1.15に記載の通り、プロトコール「CO-差分光法によるP450量の決定」を用いて、株YI005(YI001::pSYE225)、YI021(YI016::pSYE225)、YI033、YI034、YI035、YI036、YI037、YI038、YI039、およびYI040から得られたミクロソーム中のP450量を測定した。
【０３８０】
結果
図63に示した値は、少なくとも3回の個々の実験の平均値である。細胞は、実施例1.15と同様の「ミクロソーム調製用の酵母培養物の培養」に用いた「標準」法によって培養し、ミクロソームも実施例1.15と同様の方法によって調製した。
【０３８１】
結論
(1) 1コピーのΔN24hRDStopを含みPRA1遺伝子を欠く株YI033では、1コピーのΔN24hRDStopを含みまたPRA1遺伝子も存在する株YI005と比較して、CYP1B1量が〜80%増加している。
(2) 2コピーのΔN24hRDStopを含みUBC7遺伝子を欠く株YI040では、2コピーのΔN24hRDStopを含みまたUBC7遺伝子も存在する株YI021と比較して、CYP1B1量が2倍増加している。おそらくは2コピーのΔN24hRDが単一コピーのΔN24hRDよりも多くの還元酵素活性を提供するために、YI021において産生されるCYP1B1は、YI005において産生されるCYP1B1の約2倍の活性を有する。しかしながら、YI021の産生するP450タンパク質はYI005よりもはるかに少ない。したがって、これらのプロテアーゼ欠損株は、ΔN24hRDよりも還元酵素活性がはるかに強いΔN24hRD-cmyc融合物(実施例5を参照されたい)を同時発現する株からの高活性P450アイソザイムの生成に非常に有用である。
(3) プロテアーゼ欠損株はまた、酵母P450還元酵素(yRD)およびP450アイソザイムを同時発現する株においても非常に有用であると考えられる。yRD酵素は、hRDおよびその変種よりも非常に強力である。しかし、これらの株で産生されるP450量は最小である(しかし非常に高活性である)。このことから、本発明者らは、プロテアーゼ欠損株は、yRDおよびP450アイソザイムの同時発現においてもやはり非常に有用であると考える。
【０３８２】
実施例7. 異なる染色体座においてyRDを有する酵母株の構築：yRD活性の比較解析およびCYP活性との関連性
実施例7.1. S. セレビシエゲノムライブラリーからの内因性酵母P450還元酵素(yRD)遺伝子の基礎プラスミドpSP73へのクローニング
全長タンパク質をコードする2076 bp酵母P450還元酵素(hRD)遺伝子(SEQ ID No. 78)を、BglII-XbaI断片として増幅した。それぞれ100 pモルのPCRプライマー(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000065
(小文字はBglII部位を示す - SEQ ID NO：79)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000066
(小文字はXbaI部位を示す - SEQ ID NO：80))を、鋳型としての株S288C由来の酵母ゲノムライブラリーのDNA(500 ng)と共に使用した。yRD遺伝子を基礎プラスミドpSP73(Promegaから購入)にサブクローニングして、プラスミドpSP73/BglII-XbaI/yRD(図64)を得た。DNA配列決定によって挿入物の配列を確認した。
【０３８３】
実施例7.2. 酵母株におけるyRD遺伝子の欠失
第1段階
プラスミドpSP73/BglII-XbaI/yRD(図64)をMunI制限酵素で消化した。これによって、yRDのコード配列の682 bpが除去される。5'末端および3'末端をクレノウポリメラーゼによって平滑化し、このプラスミドを再連結した。得られたプラスミドをpSP73/delta-yRD(図65)と命名した。
【０３８４】
第2段階：yRD遺伝子破壊プラスミドの構築
pSP73/delta-yRD(図65)からΔyRD由来のEcoRV-SalI断片を単離し、SmaIおよびSalI制限酵素で消化したpAUR101(TaKaRaから購入)に挿入して、新規プラスミドpAUR101/delta-yRD(図66)を得た。
【０３８５】
第3段階：yRD遺伝子破壊のための線状化pAUR/delta-yRDの組込み
プラスミドpAUR101/delta-yRD(図66)を、delta-yRD断片のほぼ中央に存在する制限酵素、SwaIで消化した。SwaIはまた、プラスミドpAUR101/delta-yRDにおける特有の制限部位でもある(図67)。SwaI消化されたDNAはpAUR101/delta-yRDを線状化し、酵母株BC300のyRD染色体座における相同組換えを可能にし、その結果内因性yRD遺伝子が破壊される。オーレオバシジン耐性のスクリーニングにより、細胞を選択する。酵母はこの抗生物質に対して極めて感受性が高い。
【０３８６】
delta-yRD遺伝子はSEQ ID No. 81の配列を有する。
【０３８７】
0.5μg/μlの抗生物質オーレオバシジンを含むSDプレート上で、組込み体を選択した。yRD遺伝子の破壊を確認するため、delta-yRD遺伝子を増幅するように設計されたプライマー(SEQ ID No. 82および83)を用いてPCR解析を行った。無傷のyRDを有する野生型株BC300から増幅されたDNAは、破壊プラスミドであるpAUR101/ΔyRD(図67)を用いてyRDが破壊されている株から得られたyRDよりも大きなサイズ(＋〜650 bp)を有する。観察された〜1.3 kbのバンドは、delta-yRDの予想されるサイズと一致した。得られた株をYI041(BC300、yrd::Aur+)と命名した。
【０３８８】
第4段階：MTTアッセイ法を用いるP450還元酵素活性の測定
株YI041から得られた酵母ミクロソーム(実施例1.15)中の還元酵素活性を、実施例2.13に記載されるプロトコールを用いて測定した。実験誤差内で、還元酵素活性はゼロであった。
【０３８９】
実施例7.3. yRD活性を完全に欠く酵母株であるYI041の異なる染色体座においてyRD発現カセットの組込みを可能にするプラスミドの構築
BamHI-XbaIで消化したプラスミドYILeuGAL1MS(図23)、YIAdeGAL1MS(図24)、YIHisGAL1MS(図25)、およびYITrpGAL1MS(図26)を、pSP73/BglII-XbaI/yRD(図64)から得られた酵母P450還元酵素遺伝子、yRDのBglII-XbaI断片のクローニングに使用した。得られたプラスミドをpSYI220(図68)、pSYI209(図69)、pSYI225(図70)、およびpSYI223(図71)と命名した。
【０３９０】
実施例7.4. 酵母株YI041の異なる染色体座におけるyRD発現カセットの組込み
内因性yRD活性をすべて欠く酵母株YI041に組み込むために、プラスミドpSYI220(図68)、pSYI209(図69)、pSYI225(図70)、およびpSYI223(図71)を以下の制限酵素で線状化した：AflII(pSYI220に対する)、StuI(pSYI209に対する)、NheI(pSYI225に対する)、およびNarI(pSYI223に対する)。線状化されたpSYI220はLEU2座に組み込まれ、pSYI209はADE2座に組み込まれ、pSYI225はHIS3座に組み込まれる。プラスミドpSYI223は、本発明者らのGAL1-675プロモーターによって駆動される機能的yRD遺伝子をyRD座において組み込むために使用する。
2009536026.tif 000067
【０３９１】
実施例7.5. GAL1p-675プロモーターyRDを含む酵母株におけるP450還元酵素活性の比較
実施例1.15と同様に、株YI042、YI043、YI044、YI044、ならびに対照株YI016(LEU2座において2コピーのΔN24hRDStopを有する)およびYI017(LEU2座において2コピーのΔN24hRD-cmycを有する)からミクロソームを調製した。実施例2.13に記載されるプロトコールを用いて、ミクロソーム中の還元酵素活性を測定した。
【０３９２】
結果
図72に示した還元酵素活性値は、少なくとも3回の個々の実験の平均値である。
【０３９３】
結論
(1) 異なる染色体座において発現された「酵母」P450還元酵素(yRD)活性は、2つの「ヒト」P450還元酵素(hRD)変種、ΔN24hRDおよびΔN24hRD-cmyc融合タンパク質を有する株YI016およびYI017と比較して極めて高い。
(2) GAL1p-675プロモーターによって駆動されるyRD活性は、座位に応じて異なる。酵母株のyRD座において発現された組換えyRDは、最も低い活性を生じる。
(3) したがって、一連の還元酵素活性を有する種々のP450発現システムを提供できる可能性がある。
【０３９４】
実施例7.6. ヒトCYP1B1遺伝子をコードする2ミクロンプラスミド、pSYE225の実施例7.4に記載される酵母株への形質転換
得られた株は以下の通りである。
2009536026.tif 000068
【０３９５】
実施例7.6. 実施例7.6の株から得られたP450の量および活性の比較
実施例1.15に記載の通り、プロトコール「CO-差分光法によるP450量の決定」を用いて、株YI046、YI047、YI048、YI049のミクロソーム中のP450量を測定した。
【０３９６】
株YI046、YI047、YI048、YI049から得られたミクロソーム(実施例1.15に記載される通り、標準培養条件下で調製)中のCYP1B1 P450活性を、実施例3.4に記載される通りERODアッセイ法を用いて測定した。
【０３９７】
結果
興味深いことに、これらの株のいずれにも測定可能なP450タンパク質は存在しなかったが、ERODアッセイ法によって測定された活性は、P450量を測定することができた他の株と比較して非常に高かった。
【０３９８】
結論
この結果は、非常に高い還元酵素活性が、測定可能なP450が形成されるのを妨げるということのみを意味し得る。CO-差分光法は、産生された微量のP450を測定するほどの感度がない可能性があるが、細胞内の非常に高い還元酵素活性のために、このような少量で極めて高い活性を有する。
【０３９９】
この難問を回避するために、(実施例6に記載されるような)プロテアーゼ欠損株を用いることができる。
【０４００】
実施例8. LEU2栄養要求性マーカーおよびGal1p-675プロモーターを含む酵母2ミクロンプラスミドの構築
原理
同じ酵母細胞から2種類のP450遺伝子を同時発現できるようにするため、URA3ベースの2ミクロン酵母シャトルベクターがそのうちの一方を有し(すなわち、pSYE225)、LEU2ベースの2ミクロン酵母シャトルベクターが他方を有する。
【０４０１】
実施例8.1. S. セレビシエLEU2遺伝子によるpYES2プラスミド(Invitrogen)内のURA3遺伝子の置換
プラスミドpYES2(Invitrogenから購入)をEsp31およびNheIで消化し、平滑末端を得るために末端をクレノウポリメラーゼで平滑化した。大きなベクター断片を単離した。酵母シャトルベクターYep13(ATCCから購入)をXhoIで消化し、平滑末端を得るためにクレノウポリメラーゼで平滑化し、その後ScaI(平滑末端を生じる)で消化した。〜2220 bp LEU2を、pYES2から得られた大きなベクター断片に連結した。βラクタマーゼ遺伝子(Amp-r；大腸菌での選択に使用)と同じ方向にLEU2遺伝子を有するプラスミドを、診断的制限酵素消化により選択した。このプラスミドをpYESLEUと命名した(図73)。
【０４０２】
実施例8.2. 〜675 bp GAL1プロモーターによるpYES2プラスミド(Invitrogen)内に存在する〜450 bp GAL1プロモーターの置換
pYESLEUをNgoMIVで消化し、末端を平滑化し、その後BamHIで消化した。大きなベクター断片を単離した。プラスミドpBluSK/Ngo-Bam/Gal1p-675(図3；実施例1.4)から、HincII(平滑末端を生じる)およびBamHIで消化後、GAL1プロモーター断片の〜675 bp HincII-BamHI断片を単離した。ベクターとプロモーター断片を連結して、2ミクロンLEU2ベース酵母シャトルベクターであるプラスミドpSYE257(図74)を得た。このベクターは、プロモーターの下流でかつターミネーターの上流に位置するBamHI、SpeI、XbaI制限部位を含む。
【０４０３】
実施例9. GAL1p-675プロモーターを用いるb5タンパク質の発現
P450還元酵素と同様に、b5タンパク質はP450活性に寄与する別の補因子である。
【０４０４】
2つのPCRプライマー(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000069
(小文字はBglII部位を示す - SEQ ID No 87)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000070
(小文字はSpeI部位を示す - SEQ ID No 88))を用いて、ヒトシトクロムb5をBglII-SpeI断片(SEQ ID No. 86)としてベクターpBluKS(+)/Gal1mS(図22)およびYITrpGal1mS(図26)にクローニングして、プラスミドpBGal1b5mS(図75)およびYITrpGal1b5mS(図76)を得た。
【０４０５】
プラスミドpBGal1b5mS(図75)をさらに用いてb5発現プラスミドを構築する一方(以下を参照されたい)、TRP1座において酵母に組み込むためにYITrpGal1b5mSを直接使用した。
【０４０６】
ヒトb5の発現のために、3つの他のプラスミドを構築した。
【０４０７】
プラスミド1：ヒトb5および選択される任意のP450(Bam HI-Xba/Spe部位の間)を発現させるために用いることができる2ミクロンプラスミド
pSYE224(図4)からの5553 bp HindIII-SwaI断片を、Gal1pb5mS(図75)の1767 bp断片に連結して、プラスミドpSYE209(図77)を得た。
【０４０８】
プラスミド2：オーレオバシジン(抗生物質)での選択を可能にするpAUR101に基づく組込みプラスミド
pAUR101(TaKaRa)からの6292 bp SalI-NaeI断片を、pBGal1pb5mS(図75)の1782 bp SalI-NaeI断片に連結して、プラスミドpAUR101/Gal1pb5S(図78)を得た。
【０４０９】
プラスミド3：オーレオバシジン(抗生物質)での最初の選択を可能にし、その後、酵母細胞をオーレオバシジン培地で選択するためにさらに用いることができるように、プラスミド内相同組換えによって選択マーカーを除去することができる、pAUR135に基づく組込みプラスミド
pAUR135(TaKaRa)からの5911 bp EcoRI-EgeI断片を、pBGalpb5mS(図75)の1755 bp EcoRI-NaeI断片に連結して、プラスミドpAUR135/Gal1pb5S(図79)を得た。
【０４１０】
実施例10. 高レベルの比活性を有するCYPを生成するための、ミクロソーム調製前の、CYP、還元酵素、またはb5タンパク質を個々に産生する異なる細胞の混合
P450還元酵素は、いずれの真核細胞(酵母細胞、ヒト細胞、または昆虫細胞)にとっても有害である。hRDの潜在的な毒性の問題を回避するために、ヒトP450還元酵素(hRD)変種を作製した。本発明者らは、一般的な法則として、任意のシトクロムP450(CYP)の比活性が、CYPと還元酵素を同時発現する(すなわち、同時産生する)酵母細胞において生成されるCYPの「量」と反比例することを認める。
【０４１１】
本発明者は、選択されるCYP、還元酵素、またはb5タンパク質を異なる細胞培養物において発現させることによって、この難問を解決することを試みた。CYP、還元酵素、またはb5タンパク質を含む細胞の2種または3種を細胞回収中に混合し、次にこの細胞混合物からミクロソームを調製する。ミクロソームの調製中に、膜融合が起こる可能性がいくらかあり、これらの融合膜が異なるレベルの活性をもたらすかもしれないと推測することができる。本発明者らは、驚くべきことに、この方法によって生成されたミクロソームが一貫して高レベルのCYP活性をもたらすことを観察した。
【０４１２】
実験の概要
関心対象の酵母株において発現されたCYPの最終的なミクロソーム比活性が還元酵素によって増加するかどうかを解明するために、この細胞を、hRD変種または酵母P450還元酵素(yRD)のいずれかを含む別の株と混合する(混和する)。これは、以下の例で示されるように、種々の順列/組み合わせによって行うことができる：
1. CYPをΔN24hRD＋低い内因性レベルのyRD(内因性＝任意の酵母株に存在する天然yRD)と混和する
2. CYPをΔN24hRD-cmyc＋低い内因性レベルのyRDと混和する
3. CYPを高レベルのyRDと混和する
4. CYPをΔN24hRDと混和する
5. CYPをΔN24hRD-cmycと混和する
【０４１３】
段階1〜5はまた、結果として得られるミクロソーム中のCYP活性のさらなる増加を達成するために、別にb5を含む細胞を混和することによって行うこともできる。
【０４１４】
実験プロトコール
600 nmでの吸光度(OD)を測定し、1/10希釈する。培養物が発現時間の必要な長さ(すなわち、適切なOD)に達したならば、細胞を回収する。
【０４１５】
この段階で、CYP含有細胞(異なる酵母細胞培養物から回収された)および還元酵素またはb5を含む細胞(異なる組の酵母細胞培養物から別々に回収された)を、ミクロソームCYP活性の最大増加を達成するために様々な比率で混和する。
【０４１６】
例えば、発現されたCYPを含む酵母細胞100 mlを、酵母還元酵素を含む酵母細胞100 mlと混和し、均一な細胞混合物を生成する。空の乾燥した滅菌遠心バケットの重量を記録してから、酵母細胞培養混合物を移す。必要に応じて、滅菌培地でバケットのバランスをとる。培養物を2831 g(Sorvallにおいて3622 rpm)、4℃で12分間遠心分離する。上清を流し捨て、混合細胞を洗浄溶液A(0.65 Mソルビトール、10 mM Tris-HCl pH 7.5、0.1 mM EDTA pH 8.0) 100 mlで穏やかに再懸濁する。再懸濁された細胞を遠心分離し、その都度洗浄された細胞をペレット化してから(遠心分離による)洗浄溶液Aで2回洗浄する。バケットの重量を最後に記録して、最終ペレット重量を示す。次に、ペレットを直ちに-80℃で凍結するか、または凍結せずにペレットを直ちに処理する。
【０４１７】
図80は、典型的な混和実験を通して見られ得る、CYP活性の増加の代表的な例である。この図から、上記に概説したプロトコールによって混和された2組の培養物(一方はCYP1B1のみを産生し、もう一方はyRDのみを産生する)からミクロソームを調製した場合に、CYP1B1活性(すなわち、7-エトキシレゾルフィン活性)が劇的に増加することが示される。
【０４１８】
実施例11. 細胞全体の生アッセイ法
このアッセイ法は、動態生アッセイ法で種々のCYPの比活性を決定する、迅速でかつ比較的安価な手段(ミクロソーム活性の解析と比較して)である。生アッセイ法により、ミクロソームを調製する必要なしにCYPの阻害剤をスクリーニングできるようになる。細胞全体の活性は、ミクロソームの活性よりも2〜3倍高い。
【０４１９】
酵母細胞の培養中の様々な時点で細胞を採取し、蛍光基質の代謝を解析してCYPの比活性を決定する。細胞を培養する時間およびアッセイに必要な細胞の量は、発現されるCYP、使用する酵母の株、および生アッセイに使用する基質に応じて変動し得る。
【０４２０】
GAL1プロモーターからCYPの発現を誘導するために使用する糖、ガラクトースを添加してから約12〜13時間後の指数増殖中に、細胞を採取する。
【０４２１】
細胞150〜250μl(約2×10 E+07〜2×10 E+09個細胞)を1.5 mlエッペンドルフチューブに分注し、卓上遠心分離機で13000 rpmで30秒間遠心分離する。
【０４２２】
細胞ペレットを壊さないように注意深くピペット操作することにより、上清を除去する。次に、細胞ペレットをTE緩衝液(50 mM Tris-HCl pH 7.4、1 mM EDTA) 450μlに再懸濁する。
【０４２３】
再懸濁された細胞を、13000 rpmで30秒間再度遠心分離する。注意深くピペット操作して上清を除去し、TE緩衝液450μlに再懸濁する。懸濁液を13000 rpmで30秒間遠心分離する。注意深くピペット操作して上清を除去し、細胞ペレットを最終的にTE緩衝液50μlに再懸濁する。
【０４２４】
次に、得られた細胞懸濁液を黒色透明平底96ウェルプレートに移して、解析しようとする特定のシトクロムP450(CYP)に対する関連蛍光基質を添加する準備をする。
【０４２５】
関連基質(以下の表3を参照されたい)をTE緩衝液50μlで希釈し、96ウェルプレート中の再懸濁細胞に添加する。
【０４２６】
アッセイパラメータ
適切な励起/発光フィルター(表3を参照されたい)および適切な獲得感度設定を用いて、30〜40分の時間内で測定を行い、Synergy HT BioTekプレートリーダーから最大の動態出力を得る。プレートリーダーは、各読み取りの間に、強度4で5秒間プレートを振盪するように設定する。動態解析は30℃で行う。
【０４２７】
以下の表3は、CYP活性をアッセイするために用いられる基質のいくつかを含む。
【０４２８】
（表３）CYP基質、およびCYPの比活性を決定するための特定の励起/発光波長で測定される蛍光産物
2009536026.tif 000071
2009536026.tif 000072
【０４２９】
実施例12：CYP2D6、CYP1A2、およびその他のCYPの高発現を可能にする、エタノールによって誘導可能な酵母ADH2プロモーター
ADH2プロモーターによって駆動される(a) CYP2D6および(b) CYP1A2の発現を、PGK1(構成的)、GAPDH(構成的)、およびGAL1(誘導性)プロモーターからのこれらの酵素の発現と比較した。そのために、まず最初に、
(A) CYP2D6遺伝子およびCYP1A2遺伝子を、酵母2ミクロンプラスミド内の
(1) ADH2プロモーター、
(2) PGK1プロモーター、
(3) GAPDHプロモーター、または
(4) GAL1プロモーター
の下流にクローニングし、
(B) delN24hRD-cmyc(ΔN24hRD-cmyc)遺伝子を、酵母LEU2組込みプラスミド内の
(5) ADH2プロモーター、
(6) PGK1プロモーター、
(7) GAPDHプロモーター、または
(8) GAL1プロモーター
の下流にクローニングした。
【０４３０】
次に、種々のプロモーターによって駆動されるΔN24hRD-cmyc遺伝子を有する酵母LEU2組込みプラスミドを酵母株W303B(以前に使用したものと同様)に組み込んで、4つの異なる酵母株を得た。これら4つの株をそれぞれ、一方がCYP2D6を有し、もう一方がCYP1A2を有する2つの2ミクロンプラスミドで形質転換した。
【０４３１】
CYP2D6産生株およびCYP1A2産生株から得られたP450の量および酵素活性を比較した。結果から、ADH2プロモーターによって駆動されるCYP発現が、他のプロモーターからの発現よりも優れていることが示される。
【０４３２】
実施例12.1：酵母ADH2プロモーターを用いて機能的酵素CYP2D6およびCYP1A2の発現を可能にするプラスミドの構築を以下に記載する。
実施例12.1.1 573 bp酵母ADH2プロモーターのSalI(NgoMIV)-(HindIII)BamHI断片としてのクローニング
ADH2プロモーター配列特異的プライマー(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000073
(イタリック体の最初の6文字はSalI部位を示し、次の6文字はNgoMIV部位を示す - SEQ ID No. 90)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000074
(イタリック体の最初の6文字はBamHI部位を示し、次の6文字はHindIII部位を示す - SEQ ID No. 91))を用いて、実施例1.2と同様にして、SalI(NgoMIV)-(HindIII)BamHI ADH2プロモーター断片(SEQ ID No. 89)のpBlueScriptII SK(+)へのクローニングを行った。SalI-BamHIで消化した増幅断片を、SalI-BamHIで消化したpBlueScriptII KS(+)にクローニングした。
【０４３３】
連結およびDH5α細菌細胞への形質転換後に得られた正確なクローン1つをpBluKS(+)/ ADH2p-573(図81)と命名し、2ミクロンベクターおよび組込み酵母発現ベクターへのさらなるクローニングに使用した。クローンの正確性は制限酵素解析によって確認し、DNA配列決定によって確証した。
【０４３４】
実施例12.1.2 ADH2プロモーターの酵母2ミクロンベクターへのクローニング
585 bp NgoMIV-BamHI ADH2プロモーター断片をpBluKS(+)/ ADH2p-573(図81)から単離し、NgoMIVおよびBamHIで消化したpYES2(Invitrogenから入手した酵母2ミクロンベクター)にクローニングして、プラスミドpSYE263(図82)を得た。
【０４３５】
実施例12.1.3 ヒトCYP2D6遺伝子のpSYE263へのクローニング
ヒトCYP2D6遺伝子(SEQ ID No. 92)を含む1506 bp BamHI-XbaI断片を、BamHIおよびXbaIで消化したpSYE263(図82)にクローニングして、プラスミドpSYE264(図83)を得た。
【０４３６】
実施例12.1.4 ヒトCYP1A2遺伝子のpSYE263へのクローニング
ヒトCYP1A2遺伝子(SEQ ID No. 93)を含む1563 bp BamHI-XhoI断片を、BamHIおよびXhoIで消化したpSYE263(図82)にクローニングして、プラスミドpSYE265(図84)を得た。
【０４３７】
実施例12.1.5 ADH2プロモーターの酵母組込みベクターへのクローニング
591 bp bp SalI-BamHI ADH2プロモーター断片をpBluKS(+)/ ADH2p-573(図81)から単離し、SalIおよびBamHIで消化したYILEUGAL1MS(図23；酵母LEU2組込みベクター)にクローニングして、プラスミドYILEUADH2MS(図85)を得た。
【０４３８】
実施例12.1.6 delN24hRD(ΔN24hRD)遺伝子のYILEUADH2MSへのクローニング
delN24hRD(ΔN24hRD)遺伝子(SEQ ID No 37)のBamHI-XbaI 1965 bp断片を、BamHIおよびXbaIで消化した酵母組込みベクターYILEUADH2MS(図85)にクローニングして、プラスミドYILEUADH2MS/delN24hRD(図86)を得た。このプラスミドはΔN24hRD-cmyc遺伝子をコードする。
【０４３９】
実施例12.2. 酵母PGK1プロモーターを用いて機能的酵素CYP2D6およびCYP1A2の発現を可能にするプラスミドの構築
実施例12.2.1 650 bp酵母PGK1プロモーターのSalI-BamHI断片としてのクローニング
PGK1プロモーター配列特異的プライマー(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000075
(イタリック体の最初の6文字はSalI部位を示し、次の6文字はNgoMIV部位を示す - SEQ ID No. 95)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000076
(イタリック体の文字はBamHI部位を示す - SEQ ID No. 96))を用いて、実施例1.2と同様にして、SalI(NgoMIV)-BamHI PGK1プロモーター断片(SEQ ID No. 94)のpBluKS(+)へのクローニングを行った。SalI-BamHIで消化した増幅断片を、SalI-BamHIで消化したpBlueScriptII KS(+)にクローニングした。連結およびDH5α細菌細胞への形質転換後に得られた正確なクローン1つをpBluKS(+)/Sal-Bam/PGK1p-650(図87)と命名し、2ミクロンベクターおよび組込み酵母発現ベクターへのさらなるクローニングに使用した。クローンの正確性は制限酵素解析によって確認し、DNA配列決定によって確証した。
【０４４０】
実施例12.2.2 PGK1プロモーターの酵母2ミクロンベクターへのクローニング
656 bp NgoMIV-BamHI PGK1プロモーター断片をpBluKS(+)/Sal-Bam/PGK1p-650(図87)から単離し、NgoMIVおよびBamHIで消化したpYES2(Invitrogenから入手した酵母2ミクロンベクター)にクローニングして、プラスミドpSYE239(図88)を得た。
【０４４１】
実施例12.2.3 ヒトCYP2D6遺伝子のpSYE239へのクローニング
ヒトCYP2D6遺伝子(SEQ ID No. 92)を含む1506 bp BamHI-XbaI断片を、BamHIおよびXbaIで消化したpSYE239(図88)にクローニングして、プラスミドpSYE278(図89)を得た。
【０４４２】
実施例12.2.4 ヒトCYP1A2遺伝子のpSYE239へのクローニング
ヒトCYP1A2遺伝子(SEQ ID No. 93)を含む1563 bp BamHI-XhoI断片を、BamHIおよびXhoIで消化したpSYE239(図88)にクローニングして、プラスミドpSYE279(図90)を得た。
【０４４３】
実施例12.2.5 PGK1プロモーターの酵母組込みベクターへのクローニング
662 bp SalI-BamHI ADH2プロモーター断片をpBluKS(+)/Sal-Bam/PGK1p-650(図87)から単離し、SalIおよびBamHIで消化したYILEUGAL1MS(図23；酵母LEU2組込みベクター)にクローニングして、プラスミドYILEUPGK1MS(図91)を得た。
【０４４４】
実施例12.2.6 delN24hRD(ΔN24hRD)遺伝子のYILEUPGK1MSへのクローニング
delN24hRD(ΔN24hRD)遺伝子(SEQ ID No 37)のBamHI-XbaI 1965 bp断片を、BamHIおよびXbaIで消化した酵母組込みベクターYILEUPGK1MS(図91)にクローニングして、プラスミドYILEUPGK1MS/delN24hRD(図92)を得た。このプラスミドはΔN24hRD-cmyc遺伝子をコードする。
【０４４５】
実施例12.3 酵母GAPDHプロモーターを用いて機能的酵素CYP2D6およびCYP1A2の発現を可能にするプラスミドの構築
【０４４６】
実施例12.3.1 275 bp pBR322断片の下流に連結された696 bp酵母GAPDHプロモーターのSalI-BamHI断片としてのクローニング
pBR-GAPDHプロモーター配列特異的プライマー(5' PCRプライマー：
2009536026.tif 000077
(イタリック体の最初の6文字はSalI部位を示し、次の6文字はNgoMIV部位を示す - SEQ ID No. 98)および3' PCRプライマー：
2009536026.tif 000078
(イタリック体の文字はBamHI部位を示す - SEQ ID No. 102))を用いて、実施例1.2と同様にして、SalI(NgoMIV)-BamHI pBR-GAPDHプロモーター断片(SEQ ID No. 97)のpBluKS(+)へのクローニングを行った。SalI-BamHIで消化した増幅断片を、SalI-BamHIで消化したpBlueScriptII KS(+)にクローニングした。連結およびDH5α細菌細胞への形質転換後に得られた正確なクローン1つをpBluKS(+)/Sal-Bam/pBR-GAPDHp(図93)と命名し、2ミクロンベクターおよび組込み酵母発現ベクターへのさらなるクローニングに使用した。クローンの正確性は制限酵素解析によって確認し、DNA配列決定によって確証した。
【０４４７】
実施例12.3.2 pBR-GAPDHプロモーターの酵母2ミクロンベクターへのクローニング
680 bp NgoMIV-BamHI pBR-GAPDHプロモーター断片(部分消化による)をpBluKS(+)/Sal-Bam/pBR-GAPDHp(図93)から単離し、NgoMIVおよびBamHIで消化したpYES2(Invitrogenから入手した酵母2ミクロンベクター)にクローニングして、プラスミドpSYE280(図94)を得た。
【０４４８】
実施例12.3.3 ヒトCYP2D6遺伝子のpSYE280へのクローニング
ヒトCYP2D6遺伝子(SEQ ID No. 92)を含む1506 bp BamHI-XbaI断片を、BamHIおよびXbaIで消化したpSYE280(図88)にクローニングして、プラスミドpSYE281(図95)を得た。
【０４４９】
実施例12.3.4 ヒトCYP1A2遺伝子のpSYE280へのクローニング
ヒトCYP1A2遺伝子(SEQ ID No. 93)を含む1563 bp BamHI-XhoI断片を、BamHIおよびXhoIで消化したpSYE280(図88)にクローニングして、プラスミドpSYE282(図96)を得た。
【０４５０】
実施例12.3.5 PGK1プロモーターの酵母組込みベクターへのクローニング
686 bp SalI-BamHI pBR-GAPDHプロモーター断片(部分消化による)をpBluKS(+)/Sal-Bam/pBR-GAPDHp(図93)から単離し、SalIおよびBamHIで消化したYILEUGAL1MS(図23；酵母LEU2組込みベクター)にクローニングして、プラスミドYILEUpBRGAPDHMS(図97)を得た。
【０４５１】
実施例12.3.6. delN24hRD(ΔN24hRD)遺伝子のYILEUpBRGAPDHMSへのクローニング
delN24hRD(ΔN24hRD)遺伝子(SEQ ID No 37)のBamHI-XbaI 1965 bp断片を、BamHIおよびXbaIで消化した酵母組込みベクターYILEUpBRGAPDHMS(図97)にクローニングして、プラスミドYILEUpBRGAPDHMS/delN24hRD(図98)を得た。このプラスミドはΔN24hRD-cmyc遺伝子をコードする。
【０４５２】
実施例12.4. 酵母GAL1プロモーターを用いて機能的酵素CYP2D6およびCYP1A2の発現を可能にするプラスミドの構築
【０４５３】
実施例12.4.1 ヒトCYP2D6遺伝子のpSYE224へのクローニング
ヒトCYP2D6遺伝子(SEQ ID No. 92)を含む1506 bp BamHI-XbaI断片を、BamHIおよびXbaIで消化したpSYE224(図4)にクローニングして、プラスミドpSYE224/hCYP2D6(図99)を得た。
【０４５４】
実施例12.4.2 ヒトCYP1A2遺伝子のpSYE224へのクローニング
ヒトCYP1A2遺伝子(SEQ ID No. 93)を含む1563 bp BamHI-XhoI断片を、BamHIおよびXhoIで消化したpSYE224(図4)にクローニングして、プラスミドpSYE224/hCYP1A2(図100)を得た。
【０４５５】
実施例12.5. 種々のプロモーターによって駆動されるヒトNADPH P450還元酵素変種、ΔN24hRD-c-myc遺伝子のLEU2座における酵母株W303Bへの組込み
プラスミドYILEUADH2MS/delN24hRD(図86)、YILEUPGK1MS/delN24hRD(図92)、YILEUpBRGAPDHMS/delN24hRD(図97)、およびpSYI201(図31)を用いて、実施例2.12と同様に組込みを行った。プラスミドはすべてBstEIIで線状化してから組み込んだ。得られた株を以下のように命名した。
2009536026.tif 000079
組込みはすべて、ΔN24hRD-cmyc遺伝子に特異的なプライマーを用いてPCRにより確認した。
【０４５６】
実施例12.6 酵母の形質転換
実施例12.4において作製された株(1)〜(4)、
2009536026.tif 000080
を、プラスミドで(株#1はプラスミドAおよびBで、株#2はプラスミドCおよびDで、株#3はプラスミドEおよびFで、株#4はプラスミドpSYE224/hCYP2D6およびpSYE224/hCYP1A2で)形質転換した。
2009536026.tif 000081
酵母形質転換のDMSO法を用いて(実施例1.15に記載される通り)、以下の株が得られた。
2009536026.tif 000082
【０４５７】
実施例12.7. 酵母ミクロソームの調製用の酵母培養物の培養
実施例1.15と同様の「ミクロソーム調製用の酵母培養物の培養」に用いた方法によって、株YI053〜YI059による酵母細胞を培養した。PGK1プロモーターおよびpBR-GAPDHプロモーターについては、細胞をグルコース中で40時間培養した。ADH2プロモーターについては、グルコース中で一晩培養した後にエタノールを添加した。実施例1.15と同様にしてミクロソームを調製した。
【０４５８】
実施例12.8 P450の測定および活性
実施例1.15に記載の通り、CO-差分光法によってP450量を測定した。CYP2D6活性およびCYP1A2活性は、Gentestウェブサイト内のプロトコールに記載されている通り、蛍光分析で測定した。
【０４５９】
実施例12.9 結果
種々のプロモーターがCYP2D6およびCYP1A1の量に及ぼす効果の結果を、それぞれ図100および102に示す。P450の量および活性の比較を以下の表4に示す。
2009536026.tif 000083
【０４６０】
シトクロムP450の発現に関して、ADH2が極めて有用なプロモーターであり得ることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【０４６１】
【図１】クローンpBluSK(+)/Ngo-Bam/Gal1p-907を示す。
【図２】クローンpSYEGal1p-907を示す。
【図３】クローンpBluSK/Ngo-Bam/Gal1-p675を示す。
【図４】クローンpSYE224を示す。
【図５】クローンpBluSK/Ngo-Bam/Gal1p-650を示す。
【図６】クローンpSYEGal1p-650を示す。
【図７】クローンpBluSK/Ngo-Bam/Gal1p-461を示す。
【図８】クローンpSYEGal1p-461を示す。
【図９】クローンpSYECYC1p-coreを示す。
【図１０】クローンpSYECYC1-GAL1UASを示す。
【図１１】クローンpSYECYC1-GAL10UASを示す。
【図１２】クローンpBluSK/Bam-Xba/mCYP1B1を示す。
【図１３】クローンpSYEGal1p907/m1B1を示す。
【図１４】クローンpSYE225を示す。
【図１５】クローンpSYEGal1p650/m1B1を示す。
【図１６】クローンpSYEGal1p461/m1B1を示す。
【図１７】クローンpSYECYC1-GAL1UAS/m1B1を示す。
【図１８】クローンpSYECYC1-GAL10UASを示す。
【図１９】異なるGALプロモーターからのヒトCYP1B1の発現の比較解析を示す。
【図２０】クローンpBluSK(+)/Xba-Sac/SUC2tを示す。
【図２１】クローンpBluKS(+)/Xba-Sac/mSUC2tを示す。
【図２２】クローンpBluKS(+)/Gal1mSを示す。
【図２３】クローンYILeuGAL1MSを示す。
【図２４】酵母組込みプラスミドYIpAdGAL1MSを示す。
【図２５】酵母組込みプラスミドYIHisGAL1MSを示す。
【図２６】酵母組込みプラスミドYITrpGAL1MSを示す。
【図２７】プラスミドpBluKS(+)/DelN24hRDStopを示す。
【図２８】プラスミドpBluKS(+)/DelN24hRDw/oStopを示す。
【図２９】プラスミドpBluKS(+)/hRD_flを示す。
【図３０】プラスミドpSYI210を示す。
【図３１】プラスミドpSYI201を示す。
【図３２】プラスミドpSYI205を示す。
【図３３】酵母株YI001、YI002、YI003、およびYI004のP450還元酵素活性を示す。
【図３４】酵母株YI005、YI006、YI007、およびYI008から得られたP450量を示す。
【図３５】酵母株YI005、YI006、YI007、およびYI008から得られたミクロソーム中のCYP1B1の相対活性を示す。
【図３６】プラスミドpSYI217を示す。
【図３７】プラスミドpSYI224を示す。
【図３８】プラスミドpSYI222を示す。
【図３９】酵母株YI001、YI009、YI010、YI011、および対照株YI004のP450還元酵素活性を示す。
【図４０】酵母株YI005、YI012、YI013、YI014、および対照株YI008のP450還元酵素活性を示す。
【図４１】酵母株YI005、YI012、YI013、YI014、および対照株YI008から得られたミクロソーム中のCYP1B1 P450活性を示す。
【図４２】プラスミドpSYI215を示す。
【図４３】プラスミドpSP73/Gal1mSを示す。
【図４４】プラスミドpSP73/Gal1hRDStopmSを示す。
【図４５】プラスミドpSP73/Gal1hRDw/oStopmSを示す。
【図４６】プラスミドpSYI211を示す。
【図４７】プラスミドpSYI202を示す。
【図４８】プラスミドpSYI218を示す。
【図４９】プラスミドpSYI240を示す。
【図５０】酵母株YI001、YI002、YI009、YI015、YI016、YI017、YI018、およびYI019のP450還元酵素活性を示す。
【図５１】酵母株YI005、YI006、YI012、YI020、YI021、YI022、YI023、およびYI024から得られたP450量を示す。
【図５２】酵母株YI005、YI006、YI012、YI020、YI021、YI022、YI023、およびYI024から得られたミクロソーム中のCYP1B1 P450活性を示す。
【図５３】プラスミドpBluKS+/TRP1を示す。
【図５４】プラスミドpBlu/5'PRA1-TRP1を示す。
【図５５】遺伝子破壊プラスミドpSL001を示す。
【図５６】プラスミドpBlu/5'HRD1-TRP1を示す。
【図５７】遺伝子破壊プラスミドpSL002を示す。
【図５８】プラスミドpBlu/5'HRD2-TRP1を示す。
【図５９】遺伝子破壊プラスミドpSL003を示す。
【図６０】プラスミドpBlu/5'UBC7-TRP1を示す。
【図６１】遺伝子破壊プラスミドpSL004を示す。
【図６２】PEP4遺伝子の破壊を例として用いて、遺伝子破壊に使用した一般的戦略を示す。
【図６３】酵母株YI005、YI021、YI033、YI034、YI034、YI035、YI036、YI037、YI038、YI039、およびYI040から得られたミクロソーム中のP450量を示す。
【図６４】プラスミドpSP73/BglII-XbaI/yRDを示す。
【図６５】プラスミドpSP73/delta-yRDを示す。
【図６６】プラスミドpAUR101/delta-yRDを示す。
【図６７】プラスミドpAUR101/delta-yRDの特有の制限部位を示す。
【図６８】プラスミドpSYI220を示す。
【図６９】プラスミドpSYI209を示す。
【図７０】プラスミドpSYI225を示す。
【図７１】プラスミドpSYI223を示す。
【図７２】GAL1p-675プロモーターyRDを含む酵母株における還元酵素活性を示す。
【図７３】プラスミドpYESLEUを示す。
【図７４】プラスミドpSYE257を示す。
【図７５】プラスミドpBGal1b5mSを示す。
【図７６】プラスミドYITrpGal1b5mSを示す。
【図７７】プラスミドpSYE209を示す。
【図７８】プラスミドpAUR101/Gal1pb5Sを示す。
【図７９】プラスミドpAUR135/Gal1pb5Sを示す。
【図８０】実施例10によるシトクロムP450活性の増加の代表的な例を示す。
【図８１】プラスミドpBluKS(+)/ADH2p-573を示す。
【図８２】プラスミドpSYE263を示す。
【図８３】プラスミドpSYE264を示す。
【図８４】プラスミドpSYE265を示す。
【図８５】プラスミドYILEUADH2MSを示す。
【図８６】プラスミドYILEUADH2MS/delN24hRDを示す。
【図８７】プラスミドpBluKS(+)/Sal-Bam/PGK1p-650を示す。
【図８８】プラスミドpSYE239を示す。
【図８９】プラスミドpSYE278を示す。
【図９０】プラスミドpSYE279を示す。
【図９１】プラスミドYILEUPGK1MSを示す。
【図９２】プラスミドYILEUPGK1MS/delN24hRDを示す。
【図９３】プラスミドpBluKS(+)/Sal-Bam/pBR-GAPDHpを示す。
【図９４】プラスミドpSYE280を示す。
【図９５】プラスミドpSYE281を示す。
【図９６】プラスミドpSYE282を示す。
【図９７】プラスミドYILEUpBRGAPDHMSを示す。
【図９８】プラスミドYILEUpBRGAPDHMS/delN24hRDを示す。
【図９９】プラスミドpSYE224/hCYP2D6を示す。
【図１００】プラスミドpSYE224/hCYP1A2を示す。
【図１０１】GAL1、GAPDH、PGK1、およびADH2プロモーターのそれぞれに関して産生されたCYP2D6の量を示すグラフ(吸光度単位 対 光の波長として表示)である。
【図１０２】GAL1、GAPDH、PGK1、およびADH2プロモーターのそれぞれに関して産生されたCYP1A1の量を示すグラフ(吸光度単位 対 光の波長として表示)である。
【図１】
2009536026.tif 000084
【図２】
2009536026.tif 000085
【図３】
2009536026.tif 000086
【図４】
2009536026.tif 000087
【図５】
2009536026.tif 000088
【図６】
2009536026.tif 000089
【図７】
2009536026.tif 000090
【図８】
2009536026.tif 000091
【図９】
2009536026.tif 000092
【図１０】
2009536026.tif 000093
【図１１】
2009536026.tif 000094
【図１２】
2009536026.tif 000095
【図１３】
2009536026.tif 000096
【図１４】
2009536026.tif 000097
【図１５】
2009536026.tif 000098
【図１６】
2009536026.tif 000099
【図１７】
2009536026.tif 000100
【図１８】
2009536026.tif 000101
【図１９】
2009536026.tif 000102
【図２０】
2009536026.tif 000103
【図２１】
2009536026.tif 000104
【図２２】
2009536026.tif 000105
【図２３】
2009536026.tif 000106
【図２４】
2009536026.tif 000107
【図２５】
2009536026.tif 000108
【図２６】
2009536026.tif 000109
【図２７】
2009536026.tif 000110
【図２８】
2009536026.tif 000111
【図２９】
2009536026.tif 000112
【図３０】
2009536026.tif 000113
【図３１】
2009536026.tif 000114
【図３２】
2009536026.tif 000115
【図３３】
2009536026.tif 000116
【図３４】
2009536026.tif 000117
【図３５】
2009536026.tif 000118
【図３６】
2009536026.tif 000119
【図３７】
2009536026.tif 000120
【図３８】
2009536026.tif 000121
【図３９】
2009536026.tif 000122
【図４０】
2009536026.tif 000123
【図４１】
2009536026.tif 000124
【図４２】
2009536026.tif 000125
【図４３】
2009536026.tif 000126
【図４４】
2009536026.tif 000127
【図４５】
2009536026.tif 000128
【図４６】
2009536026.tif 000129
【図４７】
2009536026.tif 000130
【図４８】
2009536026.tif 000131
【図４９】
2009536026.tif 000132
【図５０】
2009536026.tif 000133
【図５１】
2009536026.tif 000134
【図５２】
2009536026.tif 000135
【図５３】
2009536026.tif 000136
【図５４】
2009536026.tif 000137
【図５５】
2009536026.tif 000138
【図５６】
2009536026.tif 000139
【図５７】
2009536026.tif 000140
【図５８】
2009536026.tif 000141
【図５９】
2009536026.tif 000142
【図６０】
2009536026.tif 000143
【図６１】
2009536026.tif 000144
【図６２】
2009536026.tif 000145
【図６３】
2009536026.tif 000146
【図６４】
2009536026.tif 000147
【図６５】
2009536026.tif 000148
【図６６】
2009536026.tif 000149
【図６７】
2009536026.tif 000150
【図６８】
2009536026.tif 000151
【図６９】
2009536026.tif 000152
【図７０】
2009536026.tif 000153
【図７１】
2009536026.tif 000154
【図７２】
2009536026.tif 000155
【図７３】
2009536026.tif 000156
【図７４】
2009536026.tif 000157
【図７５】
2009536026.tif 000158
【図７６】
2009536026.tif 000159
【図７７】
2009536026.tif 000160
【図７８】
2009536026.tif 000161
【図７９】
2009536026.tif 000162
【図８０】
2009536026.tif 000163
【図８１】
2009536026.tif 000164
【図８２】
2009536026.tif 000165
【図８３】
2009536026.tif 000166
【図８４】
2009536026.tif 000167
【図８５】
2009536026.tif 000168
【図８６】
2009536026.tif 000169
【図８７】
2009536026.tif 000170
【図８８】
2009536026.tif 000171
【図８９】
2009536026.tif 000172
【図９０】
2009536026.tif 000173
【図９１】
2009536026.tif 000174
【図９２】
2009536026.tif 000175
【図９３】
2009536026.tif 000176
【図９４】
2009536026.tif 000177
【図９５】
2009536026.tif 000178
【図９６】
2009536026.tif 000179
【図９７】
2009536026.tif 000180
【図９８】
2009536026.tif 000181
【図９９】
2009536026.tif 000182
【図１００】
2009536026.tif 000183
【図１０１】
2009536026.tif 000184
【図１０２】
2009536026.tif 000185
【配列表】
2009536026000001.app
【国際調査報告】
2009536026.tif 000186
2009536026.tif 000187
2009536026.tif 000188
2009536026.tif 000189
2009536026.tif 000190
2009536026.tif 000191
2009536026.tif 000192
2009536026.tif 000193