(57)【要約】本発明は、局所および全身Treg数を調節し、皮膚関連または全身性疾患を治療または予防するための局所用医薬製剤を製造するための核因子κBリガンドのレセプターアクチベーター(RANKL)活性を有する化合物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性疾患を治療または予防するための局所用医薬製剤を製造するための核因子-κB リガンドのレセプターアクチベーター(RANKL)活性を有する化合物の使用。
【請求項２】
炎症性疾患が局所性炎症または全身性炎症であることを特徴とする請求項1記載の使用。
【請求項３】
炎症性疾患がアレルギー、特に接触性アレルギー、および/または自己免疫疾患であることを特徴とする請求項1または2記載の使用。
【請求項４】
炎症性疾患がウイルス性の炎症、細菌性の炎症、または放射線、特にUV照射、または刺激物への曝露による炎症であることを特徴とする請求項1〜3に記載の使用。
【請求項５】
炎症性疾患が皮膚関連疾患であることを特徴とする請求項1〜4に記載の使用。
【請求項６】
皮膚関連疾患が、乾癬、自己免疫性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、刺激性皮膚炎、接触性皮膚炎、円形脱毛症、完全(全頭性)脱毛症、不完全脱毛症(alopecia subtotalis)、全身性脱毛症、びまん性脱毛症、扁平苔癬、皮膚の皮膚筋炎、アトピー性湿疹、限局性強皮症、強皮症、尋常性乾癬、頭部乾癬、滴状乾癬、異型乾癬、蛇行型円形脱毛症、アンドロゲン性脱毛症、アレルギー性接触性湿疹、刺激性接触性湿疹、接触性湿疹、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、増殖性天疱瘡、瘢痕性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、皮膚炎、ジューリング疱疹皮膚炎、蕁麻疹、リポイド類壊死症、結節性紅斑、ビダール苔癬、単純性痒疹、結節性痒疹、急性痒疹、線状IgA皮膚病、多形光皮膚病、日光紅斑、硬化性萎縮性苔癬、皮膚の発疹、薬物性発疹、慢性進行性紫斑病、異汗性(dihidrotic)湿疹、湿疹、固定薬疹、光アレルギー性皮膚反応、苔癬、単純エリオラル(simplex eriorale)、皮膚炎、「移植片対宿主病」、にきび、酒さ(rosacea)、異常瘢痕化、ケロイド、光線角化症、過角化症、表皮剥離性過角化症、固定性へん豆状角化症、毛孔性角化症、魚鱗癬、皮膚癌、および白癬からなる群から選ばれることを特徴とする請求項5記載の使用。
【請求項７】
炎症性疾患が、関節リウマチ、多発性硬化症、I型糖尿病、橋本病、心筋炎(myokarditis)、アテローム性動脈硬化症、糸球体腎炎、ブドウ膜炎、自己免疫性肝炎、胆汁性肝硬変(biliary zhirrosis)、自己免疫性肝疾患、および炎症性大腸炎からなる群から選ばれることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
RANKLが組換え的に製造される請求項1〜7のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
製剤が、軟膏、ゲル、ローション、フォーム(foam)、エマルジョン、リポソーム、トランスフェロソーム、クリーム、ペースト、またはパッチであることを特徴とする請求項1〜8のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
化合物が製剤中に0.0001〜1%w/w、好ましくは0.001〜0.5%w/w、より好ましくは0.001〜0.05%w/wの濃度で含まれることを特徴とする請求項1〜9のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
製剤が、さらにコルチゾンおよびその誘導体、インターロイキン、特にIL-1、IL-6、およびIL-17、腫瘍壊死因子α、プロスタグランジンE2、およびビタミンD3からなる群から選ばれる少なくとも1の化合物を含むことを特徴とする請求項1〜10のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
核因子-κBリガンドのレセプターアクチベーター(RANKL)を含む局所用医薬製剤。
【請求項１３】
軟膏、ゲル、ローション、フォーム(foam)、エマルジョン、リポソーム、トランスフェロソーム、クリーム、ペースト、またはパッチであることを特徴とする請求項12記載の製剤。
【請求項１４】
0.0001〜1%w/w、好ましくは0.001〜0.5%w/w、より好ましくは0.001〜0.05%w/wの量の該化合物を含むことを特徴とする請求項12または13記載の製剤。
【請求項１５】
さらにコルチゾン、インターロイキン、特にIL-1、IL-6、およびIL-17、腫瘍壊死因子α、プロスタグランジンE2、およびビタミンD3からなる群から選ばれる少なくとも1の化合物を含むことを特徴とする請求項12〜14のいずれかに記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、制御性T細胞数を局所的および全身的に調節し、炎症性疾患を治療または予防するための医薬製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、限定されるものではないが、にきびおよび酒さ(rosacea)、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、薬疹、乾癬、脂漏性皮膚炎、結合組織病(例えば、狼瘡、強皮症、および関節リウマチ)、他の自己免疫疾患、例えば水疱形性疾患、水疱性類天疱瘡または天疱瘡、色素性疾患(例えば炎症後色素過剰、肝斑、および白癬)、蕁麻疹(urticariaまたはhives)、皮膚感染症に関連する炎症、体部白癬、または指または足の爪の真菌乾癬などを含む多くの皮膚障害または疾患における重要要素である。炎症反応の調節は上記病状の劇的な改善をもたらすことが示されている。標準的処置は、局所用コルチコステロイド、経口用コルチコステロイド、および炎症を調節する他の薬剤の使用を含む。しかしながら、局所用コルチコステロイドには、望ましくない副作用(例えば、皮膚アトピー、毛細血管拡張症)やその長期使用を制限する副腎機能抑制の可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、コルチゾンのような既知の医薬で一般的に生じる副作用を避けて、炎症性疾患および/または皮膚関連疾患の治療に用いる医薬製剤を提供することである。
【０００４】
したがって、本発明は炎症性疾患を治療または予防するための局所用医薬製剤を製造するための核因子-κB リガンドのレセプターアクチベーター(RANKL)活性を有する化合物の使用に関する。
【０００５】
RANKL活性を有する化合物、特にRANKL自体(例えばUS 6,419,929参照)は、一連の骨関連疾患、例えば骨粗鬆症、関節リウマチ、癌性骨破壊、転移、高カルシウム血症、または疼痛に関与することが知られている(例えば、Hofbauer、LC et al. (2001) Cancer 92: 460-470参照)。骨生物学に重要であるのに加えて、RANKLは、抗原特異的T細胞反応を制御することにより免疫系に役割を果たす(例えば、Anderson et al. (1997) Nature 390:175-9参照)。
【０００６】
制御性CD4+CD25+ T細胞は、免疫応答の抑制に重要な役割を果たす。末梢CD4+CD25+ T細胞の恒常性に必要なものはまだ完全には解っていない。RANKL (OPGL、TRANCE、またはODFとしても知られる)およびそのレセプターRANKは、骨の再形成や泌乳乳腺の形成の重要な調節因子である。さらに、RANK-RANKL相互作用は、リンパ節形成およびT細胞/樹状細胞情報伝達に関与する。
【０００７】
RANKLが炎症皮膚またはUV曝露皮膚の角化細胞に発現することは全く新規な発見であった。角化細胞におけるRANKLの過剰発現は、上皮および流入領域リンパ節の樹状細胞の機能変化、および制御性CD4+CD25+ T細胞の全身性増加をもたらす。皮膚の抗原提示細胞は、CD4+CD25+ T細胞の末梢性増加に役割を果たすことがわかった。すなわち、皮膚におけるRANKLの発現は、樹状細胞の機能を変化させ、CD4+CD25+ 制御性T細胞の末梢における恒常性を調節することができる。重要なことは、表皮RANKLトランスジェニックマウス由来の制御性T細胞はアレルギー性接触性過敏症反応および全身性自己免疫の発現を抑制した。したがって、皮膚における環境的刺激はRANKLを介する局所および全身的免疫系を再配線しうる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のRANKL活性を有する好ましい化合物は、例えばRANKL遺伝子(少なくともそのRANKLコーディング部分)が導入される発現系によるか、またはトランスジェニック遺伝子発現エレメント(プロモーター、エンハンサーなど)によるwt RANKLの活性化により産生された組換え生成RANKL分子である。
【０００９】
RANKL活性を有する化合物をin vivoおよびin vitroアッセイを用いて実験的に試験し、確認することができる。適切なアッセイには、限定されるものではないが、活性アッセイと結合アッセイが含まれる。例えば、RANKL活性アッセイ、例えば前破骨細胞またはRAW264.7細胞の破骨細胞への分化をモニターするための酒石酸抵抗性酸ホスファターゼアッセイ(tartrate resistant acid phosphatase assay)(TRAP；Matsuzaki et al.、Biochemical and biophysical research communications 246、199-204 (1998))、およびRANKを介する情報伝達をモニターするためのNF-.kappa.B (Wei et al.、Endocrinology 142、1290-I95、(2001))またはc-Jun (Srivastava et al.、JBC 276、8836-8840 (2001))またはNFATc1 (Takayanagi H. et al.、Dev. Cell. 3、889-901 (2002))転写因子活性化アッセイは、RANKL活性を有する化合物の同定に利用することができるスクリーニングである。RANKL誘導破骨細胞形成の他の生物学的マーカーには、多核TRAP染色細胞の算定、カルシトニンレセプター発現、破骨細胞のしわの辺縁(ruffled border)の存在、およびカテプシンK発現および活性(Suda et al.、Modulation of Osteoclast Differentiation and Function by the New Members of the Tumor Necrosis Fac-tor Receptor and Ligand Families; Endocrine Reviews 20(3):345-357 (1999)、およびGarnero et al.、The collagenolytic activity of cathepsin K is unique among mammalian proteinases; Journal of biochemistry 273(48):32347-32352 (1998)参照)が含まれる。
【００１０】
本発明の化合物は、RANKおよび/またはOPG (オステオプロテゲリン)に対する結合挙動が天然のRANKLと同じでなくとも同様な本発明の製剤に用いることもできるRANKLの「断片、誘導体、または類似体」であってもよい。これは、RANKとの結合を担う該タンパク質の少なくともそれら部分を含まなくてはならないRANKL断片にも適用される。例えば、種々の骨疾患の治療に用いることができうるRANKL断片、誘導体、または類似体は、例えばUS 5,843,678に記載されている。例えばWO 00/15807において、RANKL活性を下方調節する免疫応答の発生を誘導するRANKL変異体が開示されている。さらなるRANKL変異体が、WO 03/059281、WO 03/033663、US 2003/219864、およびUS 2004/167072Aに開示されている。もちろん、天然供給源から単離されるか、化学合成されたRANKLまたはRANKL変異体を医薬製剤に用いることができる。RANKL変異体は組換え的に生成してもよい。
【００１１】
本発明において、炎症疾患は好ましくは局所性炎症または全身性炎症でありうる。
【００１２】
RANKLの局所投与は投与部位に効果を示すだけでなく、全身効果も有する。したがって、RANKLの局所投与は、乾癬のような局所性炎症だけでなく、多発性硬化症、アテローム性硬化症、関節炎などの全身性炎症も治療または予防することができる。RANKLの局所投与により、例えば樹状細胞を活性化し、次いで全身性炎症性疾患の治療または予防に必要な制御性T細胞(Tregs)を全身性に活性化する。本発明の好ましい態様によれば、炎症性疾患は、限定されるものではないが、アレルギー、特に接触性アレルギー、および/または自己免疫疾患である。RANKLは局所および全身Treg数を調節することができるという事実により、RANKLの局所投与で、Treg制御疾患、特に例えば以下の疾患を治療することができる：糖尿病(Pop SM et al.、Diabetes 56(5) (2007)、1395-1402; Gregg RK et al.、J Immunol 173(12) (2004)、7308-16; Sia C.、Rev Diabet Stud 3(3) (2006)、102-7)、自己免疫性眼疾患(Taylor AW et al.、Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 52(2) (2006)、53-9)、乾癬 (Sugiyama H et al.、J Immunol 174(1) (2005)、164-73)、アレルギーおよび喘息(van Oosterhout AJ et al.、Eur Respir J. 26(5) (2005)、918-32; Doganci A et al.、J Clin Invest. 115(2) (2005)、313-25; Akbari O et al.、Curr Allergy Asthma Rep. 5(1) (2005)、56-61; Ostroukhova M et al.、Curr Allergy Asthma Rep. 5(1) (2005)、35-41; Cavani A et al.、J Immunol 171(11) (2003)、5760-8; Karlsson MR et al.、J Exp Med 199(12) (2004)、1679-88; Ring S et al.、Eur J Immunol 36(11) (2006)、2981-92)、脈管炎(Boyer O et al.、Blood 103(9) (2004)、3428-30)、自己免疫性大腸炎および大腸炎/炎症性腸疾患(Read S et al.、J Exp Med 192(2) (2000)、295-302; Marski M et al.、J Immunol 175(12) (2005)、7889-97)、再生不良性貧血(Solomou EE et al.、“Deficient CD4+ CD25+ FOXP3+ T regulatory cells in acquired aplastic anemia”、Blood (2007))、甲状腺自己免疫 (Ban Y et al.、“The regulatory T cell gene FOXP3 and genetic susceptibility to thyroid autoimmunity: An association analysis in Caucasian and Japanese cohorts”、J Autoimmun. (2007))、関節炎(van Amelsfort JM et al.、Arthritis Rheum. 56(3) (2007)、732-42; Frey O et al. Arthritis Res Ther. 7(2) (2005)、R291-301)、自己免疫性腎疾患(Huang H et al.、Med Hypotheses (2007)、PMID: 17324527)、狼瘡(Valencia X et al.、J Immunol 178(4) (2007)、2579-88; Wan S et al.、J Immunol 178(1) (2007)、271-9; Lee JH et al.、Immunology 117(2) (2006)、280-6)、自己免疫性筋無力症 (Liu R et al.、J Immunol 175(12) (2005)、7898-904)、多発性硬化症(MS、EAE) (Reddy J et al.、J Immunol 175(9) (2005)、5591-5; Haas J et al.、Eur J Immunol 35(11) (2005)、3343-52; Kumar V et al.、J Exp Med 184(5) (1996)、1609-17)、多腺性内分泌障害(Kekalainen E et al.、J Immunol 178(2) (2007)、1208-15)、胆汁性肝硬変(biliary zhirrosis) (Aoki CA et al.、J Autoimmun. 27(1) (2006)、50-3)、自己免疫性肝炎 (Longhi MS et al.、J Immunol 176(7) (2006)、4484-91)、同種免疫反応(例えば移植) (Kitazawa Y et al.、Transplantation 83(6) (2007)、774-82); Afzali B et al.、Clin Exp Immunol 148(1) (2007) 32-46; Adeegbe D et al.、J Immunol 176(12) (2006)、7149-53; Mizobuchi T et al.、J Immunol 171(3) (2003)、1140-7)、およびアテローム性動脈硬化症の抑制 (Yang K et al.、Cell Immunol 243(2) (2006)、90-5; Fulton A et al.、Breast Dis. 26 (2006-2007)、115-27; El Andaloussi A et al.、J Neurosurg 105(3) (2006)、430-7; Sempere JM et al.、AIDS Rev. 9(1) (2007)、54-60)。
【００１３】
したがって、本発明は局所および全身Treg数の調節方法も提供する。
【００１４】
驚くべきことに、局所用医薬製剤に製剤化したRANKLは、特に、局所性または全身性のアレルギー反応および自己免疫疾患の結果である炎症性疾患を治療するのに用いることができることがわかった。
【００１５】
炎症性疾患は、好ましくはウイルス性または細菌性の炎症または他の炎症である。
【００１６】
特に、ウイルス(例えば単純ヘルペスウイルス)および化学物質および放射線(例えば放射線照射)に対する曝露により生じる炎症は、本発明の医薬製剤を用いて治療することができる。
【００１７】
本発明の好ましい態様によれば、炎症性疾患は、皮膚関連疾患、特に以下からなる群から選ばれる皮膚関連疾患である：乾癬、自己免疫性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、刺激性皮膚炎、接触性皮膚炎、円形脱毛症、完全(全頭性)脱毛症、不完全脱毛症、全身性脱毛症、びまん性脱毛症、扁平苔癬、皮膚の皮膚筋炎、アトピー性湿疹、限局性強皮症、強皮症、尋常性乾癬、頭部乾癬、滴状乾癬、異型乾癬、蛇行型円形脱毛症、アンドロゲン性脱毛症、アレルギー性接触性湿疹、刺激性接触性湿疹、接触性湿疹、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、増殖性天疱瘡、瘢痕性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、皮膚炎、ジューリング疱疹皮膚炎、蕁麻疹、リポイド類壊死症、結節性紅斑、ビダール苔癬、単純性痒疹、結節性痒疹、急性痒疹、線状IgA水疱症、多形光皮膚病、日光紅斑、硬化性萎縮性苔癬、皮膚の発疹、薬物性発疹、慢性進行性紫斑病、異汗性(dihidrotic)湿疹、湿疹、固定薬疹、光アレルギー性皮膚反応、苔癬、単純エリオラル(simplex eriorale)、皮膚炎、「移植片対宿主病」、にきび、酒さ(rosacea)、異常瘢痕化、ケロイド、光線角化症、過角化症、表皮剥離性過角化症、固定性へん豆状角化症、毛孔性角化症、魚鱗癬、皮膚癌、および白癬。本発明により治療すべき特に好ましい疾患は、例えば狼瘡のようなUV照射(例えば日光)への曝露の減少が必要な疾患がある。
【００１８】
本発明によれば、特に制御性T細胞および免疫介在性炎症性皮膚疾患は本発明の化合物で治療することができる。これら皮膚疾患には、主としてアトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、刺激性皮膚炎、自己免疫性皮膚炎、円形脱毛症、扁平苔癬、硬化性萎縮性苔癬、白癬、乾癬、さらに光線角化症(in situ癌)、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、メラノーマの皮膚転移、皮膚T細胞リンパ腫、他の腫瘍の皮膚転移、およびリーシュマニア症の皮膚病変が含まれる。しかしながら、本発明化合物の使用は、Tregが有益であることが示された皮膚以外の疾患(例えば、糖尿病または関節リウマチ)にも有益である。
【００１９】
本発明の別の好ましい態様によれば、炎症性疾患は、以下からなる群から選ばれる：関節リウマチ、多発性硬化症、I型糖尿病、橋本病、心筋炎(myokarditis)、アテローム性動脈硬化症、糸球体腎炎、ブドウ膜炎、自己免疫性肝炎、胆汁性肝硬変(biliary zhirrosis)、自己免疫性肝疾患、炎症性大腸炎、および他の炎症性疾患および自己免疫疾患。本発明の化合物は、ヒトおよび動物、特に家畜のような哺乳動物(例えばウシ、ニワトリ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ(競走馬)、イヌ、ネコ、七面鳥、ウサギなど)に生じる疾患の治療に用いることができる。
【００２０】
投与する用量および治療すべき疾患は、モデル系、好ましくはマウスモデル系を用いて決定することできる。
【００２１】
有効量のRANKL活性を有する化合物を含む本発明の医薬製剤は、好ましくは軟膏、ゲル、ローション、フォーム(foam)、エマルジョン、リポソーム、トランスフェロソーム、クリーム、またはペーストである。
【００２２】
本発明の化合物は、上記のあらゆる既知の局所用医薬製剤に製剤化することができる。該医薬製剤の製造方法は当業者に知られている。
【００２３】
透過性障壁である皮膚は分子量約750Da以上の分子はほとんど不透過性である。したがって、より大きな分子、特にRANKLのようなタンパク質およびその変異体に皮膚を横切らせるには、正常な浸透作用以外のメカニズムを用いる必要がある。したがって、本発明の医薬製剤は皮膚を通して表皮と真皮へのタンパク質の輸送を促進する物質(例えば担体、賦形剤)を含む必要がある。
【００２４】
単位剤形で存在しうる本発明の医薬製剤は、当該分野でよく知られた常套的技術に従って製造することができる。そのような技術には、活性成分と1またはそれ以上の医薬的担体または賦形剤を結合させることが含まれる。一般的に、該製剤は、活性成分と液体担体もしくは微細固体担体またはその両方を均一および密接に結合させることにより製造される。
【００２５】
本発明の組成物は、液体媒質中のサスペンジョンまたは水性溶液(ローション)として製剤化することができよう。水性サスペンジョンおよび溶液は、さらに例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、および/またはデキストランを含むサスペンジョンの粘性を増す物質を含んでよい。後者の物質の添加はゲルの形成をもたらす。該サスペンジョンおよび溶液は安定化剤(例えばプロテアーゼ)を含んでもよい。
【００２６】
本発明の別の態様において、該医薬製剤を製剤化し、フォーム(foam)として用いることができる。医薬フォームには、エマルジョン、クリーム、およびリポソームのような製剤が含まれる。基本的に性質が同様であるが、これら製剤は成分と最終生成物の粘稠度が異なる。そのような組成物および製剤を製造するノウハウは、一般に当業者によく知られており、本発明の組成物の製剤化に適用することができる。
【００２７】
本発明の組成物は、エマルジョンとして製造および製剤化することができる。エマルジョンは、1つの液体が別の液体に小滴の形で分散した不均一系である("Pharmaceutical Dosage Forms"、Lieberman、Rieger and Banker (編)、1〜3巻、Marcel Dekker (Publisher)、第2巻 1998)。一般的に、エマルジョンは、油中水(w/o)または水中油(o/w)のいずれかでありうる。エマルジョンは、分散層、ならびに水性相もしくは油相中の溶液または分離した層それ自身として存在しうる活性化合物に加えてさらなる成分を含みうる。医薬的賦形剤、例えば乳化剤、安定化剤、色素、および抗酸化剤も必要に応じてエマルジョン中に存在しうる。医薬的エマルジョンは、例えば油中水中油(o/w/o)および水中油中水(w/o/w)エマルジョンの場合のように2以上の相からなる多エマルジョンであってもよい。水性相は、好ましくは水、薬剤の水性溶液、グリセロール、PEG300、PEG400、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体でありうる。油相は、脂肪酸エステル、中鎖(C8-C12)モノ、ジ、およびトリ-グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪酸アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化C8-C10グリセリド、植物油、およびシリコン油であり得る。本発明のエマルジョンに用いる好ましい乳化剤は、合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体でありうる("Pharmaceutical Dosage Forms"、Lieberman、Rieger and Banker (編)、1〜3巻、Marcel Dekker (Publisher)、第2巻 1998)。合成界面活性剤(surface active agent)は、典型的には両親媒性であり、親水性部分と疎水性部分を含む。さらに、用いる好ましい界面活性剤には、非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両親媒性でありうる。エマルジョン製剤に用いる天然の乳化剤には、ラノリン、蜜ロウ、ホスファチド、レシチン、およびアカシアが含まれる。種々の非乳化物質もエマルジョン製剤に含まれ、エマルジョンの特性に寄与する。これらには、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪酸アルコール、脂肪酸エステル、保湿剤、親水性コロイド、保存料、および抗酸化剤が含まれる。親水性コロイドまたはヒドロコロイドは、天然ゴム、および合成ポリマー、例えばポリサッカライド(例えばアカシア、寒天、アルギン酸、カラギーナン、グアゴム、カラヤゴム、およびトラガカント)、セルロース誘導体(例えばカルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース)および合成ポリマー(例えばカルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー)を含む。これらは、水に分散するか、水で膨張して、分散相小滴のまわりに強い界面フィルムを形成して外層の粘性を増大させることによりエマルジョンを安定化させるコロイド溶液を形成する。
【００２８】
本発明の医薬製剤は、さらに保存料、例えばメチルパラベン、プロピルパラベン、第4級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、p-ヒドロキシ安息香酸のエステル、ホウ酸、およびフェノキシエタノールを含みうる。保存料の総量は、用いる剤形に左右され、一般的には約0.1%〜20%(重量)でありうる。例えば本発明の局所用エマルジョン組成物において、保存料混合物は、約0.1%〜10%、好ましくは0.5%〜8%、およびより好ましくは1%〜5%の量で存在するであろう。好ましい態様において、メチルパラベンおよびプロピルパラベンは約0.1%〜1%の量で、フェノキシエタノールは約1%〜5%の量で存在しうる。
【００２９】
通常、抗酸化剤も製剤の劣化を防ぐために局所用製剤に加える。用いる抗酸化剤は、フリーラジカルスカベンジャー、例えばトコフェロール、アルキルガレート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、または還元剤、例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、および抗酸化剤共同薬、例えばクエン酸、安息香酸、およびレシチンでありうる。
【００３０】
ベジクル(小胞)、例えばリポソームは、薬剤送達の観点からそれらがもたらす作用の特異性と持続時間により大きな興味を集めている。本発明で用いている用語「リポソーム」は、球状の二重層(単数または複数)に配置された両親媒性脂質からなるベジクルを意味する。リポソームは脂溶性物質と水性の内側から形成された膜を有する単層または多層ベジクルである。水性部分は送達すべき組成物を含む。
【００３１】
リポソーム製剤は、多くの薬剤の送達方法として集中的に研究されてきた。局所投与用にリポソームは他の製剤より種々の利点があることがわかってきた。そのような利点には、投与した薬剤の全身的な吸収性が高いことに関連した副作用の低下、投与した薬剤の望む標的への蓄積増加、および種々の薬剤(親水性および疎水性)を皮膚に投与する能力が含まれる。
【００３２】
例えば中性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)またはジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成することができるが、アニオン性融合リポソームは主としてジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)から形成することができる。別のタイプのリポソーム組成物は、例えばダイズPCおよび卵PCのようなホスファチジルコリン(PC)から形成される。別のタイプは、リン脂質および/またはホスファチジルコリンおよび/またはコレステロールの混合物から形成される。
【００３３】
トランスフェルソームはさらに別のタイプのリポソームであり、非常に変形しやすい脂質凝集体であり、薬剤送達ビークルの魅力的な候補である。トランスフェルソームは、そのように非常に変形しやすい脂質小滴であり、該小滴より小さな細孔を通して容易に浸透することができる。トランスフェルソームは、使用する環境に適応可能であり、例えば自己最適化し(皮膚の細孔の形に適合する)、自己修復し、断片化せずに標的に達することが多く、しばしば自己ローディングする。トランスフェルソームを製造するには、標準的リポソーム組成物に表面縁アクチベーター(surface edge-activator)、通常、界面活性剤を加えることができる。トランスフェルソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するのに用いられてきた。血清アルブミンのトランスフェルソーム介在送達は、血清アルブミン含有溶液の皮下注射と同様に有効であることが示された。
【００３４】
本発明に用いる好ましい界面活性剤には非イオン性界面活性剤が含まれ、これには非イオン性エステル、例えば、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、シュークロースエステル、およびエトキシル化エステルが含まれる。非イオン性アルカノールアミドおよびエーテル、例えば、脂肪酸アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールが含まれ、また、エトキシル化/プロポキシル化ブロックポリマーもこのクラスに含まれる。アニオン性界面活性剤には、カルボキシレート、例えば、石けん、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル、例えば硫酸アルキルおよびエトキシル化アルキルサルフェート、スルホネート、例えばアルキルベンゼンスルホネート、アシルイソチオネート、アシルタウレートおよびスルホスクシネート、およびホスフェートが含まれる。カチオン性界面活性剤には、第4級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが含まれる。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、N-アルキルベタイン、およびホスファチドが含まれる。医薬品、製剤、およびエマルジョンへの界面活性剤の使用については概説されている(Rieger、"Pharmaceutical Dosage Forms"中、Marcel Dekker、Inc.、New York、N.Y.、1988、p. 285)。
【００３５】
本発明の軟膏、クリーム、またはペーストは、外部適用用の活性成分の半固体製剤である。それらは、微細または粉末形の、または水性もしくは非水性液中の溶液またはサスペンジョン中の活性成分を、適切な機械を用いて脂肪性もしくは非脂肪性基剤と混合することにより製造することができる。該基剤は、炭化水素、例えば硬、軟、もしくは液体パラフィン、グリセロール、蜜ロウ、金属石けん；ゴム糊；天然油、例えばアーモンド油、コーン油、ラッカセイ油、カスター油またはオリーブ油；羊毛脂もしくはその誘導体または脂肪酸、例えば、ステアリン酸またはオレイン酸を、アルコール、例えば、プロピレングリコールまたはマクロゲルと共に含みうる。該製剤は、あらゆる適切な界面活性剤、例えばアニオン性、カチオン性、または非イオン性界面活性剤、例えば、ソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体を加えてよい。
【００３６】
本発明の好ましい態様によれば、RANKL活性を有する化合物は製剤中に濃度0.0001〜1%w/w、好ましくは0.001〜0.5%w/w、より好ましくは0.001〜0.05%w/wで含まれる。本発明の化合物は、好ましくは該製剤中に濃度1ng/ml〜10μg/ml、10ng/ml〜500ng/ml、または10ng/ml〜100ng/mlで含まれうる。
【００３７】
本発明の別の好ましい態様によれば、該製剤は、さらにコルチゾンおよびその誘導体(例えば、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメサゾンなど)、インターロイキン、特にIL-1、IL-6、およびIL-17、腫瘍壊死因子α、プロスタグランジンE2、およびビタミンD3からなる群から選ばれる少なくとも1の化合物を含む。
【００３８】
RANKLおよびRANKL活性を有する化合物は、本発明に従って皮膚疾患を治療するのに適したあらゆる他の薬剤と組み合わせて局所適用することもできる。
【００３９】
本発明の別の局面は、核因子κBリガンドのレセプターアクチベーター(RANKL)を含む局所医薬製剤に関する。
【００４０】
本発明のこの局面の医薬製剤は、RANKLまたは上記の化合物および成分を含みうる。
【００４１】
該製剤は、好ましくは軟膏、ゲル、ローション、フォーム、エマルジョン、リポソーム、トランスフェロソーム、クリーム、ペースト、およびパッチである。
【００４２】
本発明が提供するパッチの使用は、当該分野で知られた局所用製剤に関連した多くの問題を改善するのに有利でありうる。例えば、パッチの適用時間は、他の局所用組成物に比べて減少しうるし、皮膚を通した薬剤分子の浸透は他の通常の局所用剤形を用いるより速い。これら特徴は、薬剤のバイオアベイラビリティの増加、すなわちよりよい治療効果をもたらしうる。
【００４３】
本発明に用いるパッチには、スプレー式パッチ、経皮パッチ、フィジカルパッチ、または制御放出パッチが含まれうる。
【００４４】
本発明に用いる好ましいパッチは例えばUS 6,455,066に開示されている。
【００４５】
本発明の好ましい態様によれば、該パッチは0.0001〜1%w/w、好ましくは0.001〜0.5%w/w、より好ましくは0.001〜0.05%w/wの量のRANKL活性を有する化合物を含む。
【００４６】
本発明のパッチは、好ましくはさらにコルチゾン、インターロイキン、特にIL-1、IL-6、およびIL-17、腫瘍壊死因子α、プロスタグランジンE2、およびビタミンD3からなる群から選ばれる少なくとも1の化合物を含む。
【００４７】
本発明をさらに以下の図および実施例により例示するが、これらに限定されるものではない。
図1．表皮RANKL過剰発現は皮膚接触性過敏反応を抑制する。
【００４８】
a：RANKLは、炎症を起こした皮膚に発現する。野生型マウス由来の無処置、紫外線B照射(800 mJ/m2)、単純ヘルペスウイルス1型(HSV)感染皮膚(18)、CD40Lトランスジェニックマウス由来の炎症皮膚、PAM212角化細胞、および50ng/ml IFNγで刺激した後のPAM212細胞の逆転写酵素PCR分析。
【００４９】
b：RANKLは、ネズミおよびヒト角化細胞に発現し、UV照射によるかもしくは炎症時に上方調節される。
【００５０】
ネズミおよびヒト皮膚、および尋常性乾癬および紅斑性狼瘡患者由来の病変皮膚のサイトケラチンおよびRANKLに対する抗体を用いた免疫蛍光染色。初期倍率：200X。
【００５１】
c：基底角化細胞におけるK14-RANKL Tg発現。構築物は、ヒトK14-プロモーター、β-グロビンイントロン、mRANKL cDNA、およびK14-ポリアデニル化部位(ポリA)を含む。ネズミRANKLに対する抗体を用いる耳皮膚の免疫組織化学染色。基底角化細胞を矢印で示す。初期倍率：200X。
【００５２】
d：野生型(wt)およびK14-RANKL Tgマウスの血清中のRANKL濃度。RANKLレベルは、ELISAにより分析した。データを各群マウス5匹の平均±SDで示す。
【００５３】
e：K14-RANKL TgマウスにおけるCHS反応の低下。動物を、DNFBおよびDNFBを耳にチャレンジして感作するか、またはDNFBで感作し、オキサゾロンでチャレンジした。データは、3回の独立した実験のマウス15匹の代表の耳腫脹の平均±SDを示す。耳腫脹の代表的H&E組織像を各遺伝子型について示す。倍率X200。*は統計的有意差(Studentのt検定；p<0.05)を示す。
【００５４】
図2. 表皮RANKLは、CD4+CD25+制御性T細胞の恒常性を調節する。
【００５５】
a：皮膚におけるRANKL発現はCD4+CD25+ T細胞の増殖を誘導する。野生型(wt；分析した動物の総数、n=70)、K14-RANKL Tg (n=50)、RANK-Fc処置K14-RANKL Tgマウス(n=10)、コントロールFc処置K14-RANKL Tgマウス(n=5)、rankl-/-マウス(n=5)、野生型胸腺を移植した胸腺切除K14-RANKL Tgマウス(n=8)、およびK14-RANKL Tgマウス由来の胸腺組織を移植した胸腺切除wtマウス(n=8)由来の脾臓T細胞のフローサイトメトリー分析。8〜10週間後、リンパ節および脾臓由来のT細胞のCD4およびCD25発現をフローサイトメトリーで分析した。典型的ドットプロットを各試験群について示す。
【００５６】
b：K14-RANKL Tgマウス由来のCD4+CD25+ T細胞は、制御性T細胞に特徴的な表面マーカー発現を示す。K14-RANKL Tgマウスの脾臓由来のCD4+CD25- (灰色)およびCD4+CD25+ T細胞 (黒線)をフローサイトメトリーで分析した。CTLA-4染色を細胞浸透化後に行った。
【００５７】
c：CD4+CD25+ T細胞は、増殖性アネルギーを表現し、IL-10を分泌する。CD4+CD25-およびCD4+CD25+ T細胞をMACSにより分離し、組換えmIL-2 (20単位/ml)の存在下または非存在下で細胞2x105個を抗CD3+抗CD28で刺激することにより増殖アッセイを行った。サイトカイン生成のために、CD4+CD25-およびCD4+CD25+ T細胞(5x104)を抗CD3および抗CD28で刺激し、IL-10レベルをサイトメトリービーズアッセイ炎症キットを用いて分析した。データは3回の異なる実験の1つを示す。*は統計的有意差(Studentのt検定；p<0.05)を示す。
【００５８】
d：K14-RANKL Tgマウス由来のCD4+CD25+ T細胞は免疫抑制的である。CD4+CD25-およびCD4+CD25+ T細胞をMACSで分離し、wtまたはK14-RANKL Tgマウス由来のCD4+CD25+ T細胞数の増加の存在下または非存在下で野生型CD4+CD25- T細胞 (2x105)を抗CD3および抗CD28 Absで刺激することにより増殖アッセイを行った。3H-チミジン取り込みの平均値±SDは3つの実験の1つを示す。*は統計的有意差(Studentのt検定；p<0.05)を示す。
【００５９】
図3. 表皮ランゲルハンス細胞は、CD4+CD25+制御性T細胞の全身的恒常性を調節する。
【００６０】
a：K14-RANKL Tgマウスは、正常数の、RANK、ランゲリン(Langerin)、およびMHCクラスII I-A分子を発現する表皮LCを有する。野生型およびK14-RANKL Tgマウスの耳シートを示した分子に対するAbsで染色した。ランゲリンおよびRANKの結合画像を黄色で示す(倍率 X 400)。
【００６１】
b-c：K14-RANKL Tgマウス由来のリンパ節DC (b)および表皮LC (c)は、CD4+CD25+ T細胞の増殖を刺激する能力の増加を示す。DCは野生型およびK14-RANKL Tgマウスの流入領域皮膚リンパ節から単離し、LCは表皮シートから単離し、野生型CD4+CD25+ T細胞とT細胞：APC = 1:2の割合でインキュベートした。4日後、T細胞増殖を3Hチミジンの取り込みにより測定した。データは、3回の異なる実験からの平均±SDを示す。*は統計的有意差(Studentのt検定；p<0.05)を示す。
【００６２】
d：モメタゾンフロレートで局所的に処置した後のK14-RANKL Tgおよび野生型マウスにおけるLCの減少。
【００６３】
e：LCの減少は、野生型マウスおよびK14-RANKL Tgマウスにおける末梢CD4+CD25+ T細胞数を減少させる。処置の1週間後に、リンパ節および脾細胞のCD4+CD25+ T細胞の頻度をフローサイトメトリーで分析した。データを処置マウス対非処置マウスにおけるCD4+CD25+ T細胞数の減少パーセンテージで示す。3回の独立した実験の1つを示す。*は統計的有意差(Studentのt検定；p<0.05)を示す。
【００６４】
図4. 野生型マウスとK14-RANKL Tgマウス間のランゲルハンス細胞の表現型および機能的差。
【００６５】
a：表皮ランゲルハンス細胞におけるCD205およびCD86発現。wt表皮およびK14-RANKL Tg表皮由来のLCの表面マーカー発現をフローサイトメトリーで分析した。ランゲリン発現でゲートをかけた細胞のヒストグラムを示す。野生型LCを灰色で示す。K14RANK Tgから単離したLCを黒色で示す。
【００６６】
b：細胞死。wt表皮およびK14-RANKL Tg表皮由来のLCの自然細胞死をプロピジウムアイオダイドおよびアネクシンV染色を用いて分析した。細胞にCD11cでゲートをかけた。野生型LCを灰色で示す。K14RANK Tgから単離したLCを黒色で示す。
【００６７】
c：K14-RANKL Tg表皮由来のLCによるサイトカイン産生の増加。LCの自然サイトカイン産生をサイトメトリービーズアッセイ炎症キットにより測定した。データは同様の結果を示す3回の異なる実験の1つを示す。
【００６８】
d：CD4+CD25+制御性T細胞の養子導入は、宿主マウスのアレルギー性CHS反応を抑制する。野生型宿主をDNFBまたはオキサゾロンで感作し、耳をDNFBでチャレンジした。チャレンジの24時間前に、感作野生型マウスに示したごとくK14-RANKLTgドナー由来の1x106個のT細胞を注射した。チャレンジの12時間前に、導入した細胞をオキサゾロンの経皮適用により活性化した。データは、耳の腫脹の平均±SDを示し、3つの独立した実験の21匹のマウスの代表である。*は統計的有意差(Studentのt検定；p<0.05)を示す。
【００６９】
図5. 皮膚におけるRANKLの過剰発現は、アレルギー性過敏反応および全身性自己免疫を抑制する。
【００７０】
a：表皮RANKLは、CD40L誘発全身性自己免疫を抑制する。CD40L TgマウスをK14-RANKL Tgマウスと交配し、自己免疫性皮膚炎の発症を異なる実験群で試験した(倍率 X 200；皮膚組織のH&E染色)。CD40L/K14-RANKL二重TgマウスのRANK-Fcによる処置はin vivoの表皮RANKL効果を無効にする。データは各群につきマウス10匹から得た。*は統計的有意差(log-rank検定；p<0.05)を示す。
b：表皮RANKLは抗核抗体の発現を抑制した。K14-RANKL Tg、CD40L Tg、およびCD40L/K14-RANKL二重Tgマウス由来の血清とインキュベートしたHEp2細胞の間接蛍光染色。(倍率 X 200；血清希釈1:80)
【００７１】
c：CD40L Tgマウスにおける表皮RANKL過剰発現によるタンパク尿の減少と腎機能の救済。自己免疫性CD40L Tg (n=10)、K14-RANKL Tg (n=10)、およびCD40L/K14-RANKL二重Tg (n=10)マウスから尿を採取した。タンパク質濃度をBradford試薬を用いて定量した。*は統計的有意差(Studentのt検定；p<0.05)を示す。
【００７２】
d：RANK-RANKL情報伝達の遮断は、接触性過分反応のUV誘発抑制を防ぐ。野生型マウス (n = 6)を、コントロールFcまたはRANK-Fc (10μgを1週間に1回、2週間)で処理し、4日間連続(100 mJ/日)UV照射し、UV曝露皮膚を介してDNFBで感作した。さらなるwtマウス群(n=5)にwtまたはrankl-/-マウス由来の5cm2皮膚バイオプシーを移植した。4週間後に移植したマウスにUV照射し、移植皮膚をDNFBで感作した。データは、耳の腫脹の平均±SDである。統計的有意差はStudentのt検定で計算した：* p<0.05 対野生型皮膚移植、** p<0.05 対ラットIgG抗体注射。
【００７３】
図6は、RANKLの局所適用はマウスの刺激性皮膚炎および接触性アレルギーにおける耳の腫脹を減少させることを示す。
【００７４】
a：RANKLを、刺激性皮膚炎または接触性アレルギーの部位に適用した。
【００７５】
b：RANKLをマウスの背部皮膚に投与し、異なる部位である耳に接触性アレルギーを誘導した。
【実施例】
【００７６】
材料と方法：
RANKLトランスジェニックマウスの作製：
ネズミRANKリガンドの遺伝子をヒトKeratin-14 (K14)プロモーター(32)の制御下に置いた。K14発現カセットは、K14プロモーター、ウサギβ-グロビンイントロン、BamH1クローニング部位、およびK14ポリアデニル化部位を含んだ。BamH1クローニング部位をこの部位にポリリンカーを連結することにより修飾し、制限酵素部位SalI、BglII、BamH1、およびXbaIを含む多クローニング部位を生じさせた。RANKL cDNAをプライマーAM47（5’−TCCGTCGACGCCACCATGCGCCGGGCCAGCCGA-３’（Kozak配列GCCACCを含む))およびAM48 (5’−TCCTGATCAAGATCTTCAGTCTATGTCCTGAA-3’)(MWG Biotech、Ebersberg、Germany)を用いるPCRによりSalIおよびBglIIリンカーと隣接させた。用いた増幅プロトコールは、95℃、3min(分間)、次いで95℃、1min；52℃、1 min；72℃、2 min x 30；72℃、5 minの40サイクルであった。RANKL cDNAは、Bgl IIに対する内部制限部位を有し、完全長cDNAは、Sal IおよびBgl IIで部分消化して得られた。次いで、得られた断片を、K14発現カセットのSalI/BglII部位にクローンした。挿入の方向を制限分析およびシーケンシングにより確認した。マイクロインジェクションに用いたプラスミドDNAをJet Star Maxiprep Kit (Genomed、Bad Oeyenhausen、Germany)を用いて精製した。XbaIおよびXhoIで消化後電気泳動により挿入物をベクター配列から分離し、ゲルから抽出し、TE緩衝液(10 mM Tris pH 7.4；1 mM EDTA)に再懸濁し、次いで2ng/μlの濃度でマウスC57BL/6/C3H/HeN F1 x C57BL/6およびFVB/N卵母細胞にマイクロインジェクションした。同様のトランス遺伝子発現を有する2つのファウンダー(創始)系をPCR (AM28：5’-CAATGATATACACTGTTTGAGATGA-3’；AM72：5’-CATTGATGGTGAGGTGTGCAA-3’；サイクリングプロフィール：95℃、3min；[95℃、1 min；54℃、1 min；72℃、1 min x 35；72℃、5 min]およびSouthernブロッティングにより同定した。C57BL/6/C3HHeNバックグラウンドのTgマウスを用いて実験を行った。CD40L Tgおよびrankl-/-マウスは以前に記載されている(5、19)。すべてのマウスは、特定病原体フリー(SPF)条件下で飼育し、全ての実験は施設の規定に従って行った。
皮膚移植：
【００７７】
6週齢のwtマウスをケタミンおよびキシラジンで麻酔した。皮膚移植は、レシピエントマウスの剃毛した背部から5cm2皮膚バイオプシーを切除し、その皮膚を性別および年齢適合野生型またはrankl-/-ドナーマウスから得た同等のバイオプシーで置換した。両野生型およびrankl-/-マウスはC57Bl/6バックグラウンドであった。傷をBeriplast組織接着剤(Aventis、Frankfurt、Germany)を用いて閉じ、施設の指針に従ってモニターした。移植は全例で成功したことに注目すべきである(顕微鏡分析、血流、および毛の発育で測定した)。
逆転写PCR：
【００７８】
マウス組織を急速凍結し、次いでRNA単離し、逆転写(RT)した。マウス群(n=5)を、剃毛した背部を800 mJ/cm2 UVB照射するか、または記載のごとく単純ヘルペスウイルス1型で経皮感染させた(18)。次に、RNAを、凍結組織またはネズミ角化細胞株pAM212からRNeasyカラム(Qiagen、Hilden、Germany)を使用説明書に従って用い抽出した。cDNAは、ランダムヘキサヌクレオチドプライマーおよび逆転写系(Promega、Madison、WI)を用いて総RNA 1μgから合成した。用いたプライマーは、RANKLフォワード、5’-TCGCTCTGTTCCTGTACTTTCG-3’、およびRANKLリバース、5’-GTAGGTACGCTTCCCGATGT-3’；β-アクチンフォワード、5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’、およびβ-アクチンリバース、5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’であった(サイクリングプロフィール：94℃、4 min；[94℃、1 min；56℃、1 min；72℃、1 min] x 40；72℃、5 min)。PCR生成物の部分標本を1.5%アガロースゲル上で電気泳動し、エチジウムブロミド染色で可視化した。
免疫組織化学および免疫蛍光法：
【００７９】
免疫組織化学は、標準的方法(5)に従ってアセトン固定した種々の患者由来のヒト皮膚のクリオスタット切片または表皮耳シート(6〜8μm)を用いて行った。耳を鉗子で背部および腹部側に機械的に広げ、2mM EDTA中でインキュベートし、PBSで洗浄し、アセトンで固定した。スライドを適切に希釈した抗体(抗サイトケラチン、抗ネズミRANKL、および抗ヒトRANKL；すべてR&D Systems、Germanyから購入)、またはアイソタイプコントロール中でインキュベートし、次いで、ホースラディッシュパーオキシダーゼ(HRP)結合、オレゴングリーン標識、またはテキサスレッド標識二次抗体(Molecular Probes、Leiden、The Netherlands)とインキュベートした。パーオキシダーゼ活性を、3-アミノ-9-エチルカルバゾールを色原体に用いて可視化した。組織をマイヤーのヘマラウン溶液(Merck、Darmstadt、Germany)で対比染色した。LC染色用に、表皮シートを1% FCS/PBS中でブロックし、抗体で一夜染色した(抗マウスRANK、R&D Systems；抗マウスI-A、クローンM5/114、BD-PharMingen、Germany、および抗マウスCD207 (ランゲリン)、クローン929F3、(Dr. S. Saeland、Schering-Plough、Dardilly、Franceより分与)。次に、シートをオレゴングリーンまたはテキサスレッド結合二次抗体(Molecular Probes)とインキュベートし、スライドにマウントし、次いでオリンパスBX61顕微鏡およびMetaMorphソフトウエア(Visitron Systems、Germany)を用いて試験した。表皮LCを取り出すために、マウスを1週間に4日間連続で4週間モメタゾンフロエート(Ecural(登録商標)、Essex Pharma、Germany)で局所処置し、最終処置後1週間でバイオプシーした。最終モメタゾンフロエート処置後1週間で脾臓および所属リンパ節を除去し、フローサイトメトリー用に単細胞浮遊液を作製した。
RANKL血清分析：
【００８０】
心臓穿刺により得た血清中のRANKLタンパク質レベルを市販のELISAキット(R&D Systems)を使用説明書に従って用いて測定した。
接触性過敏症(CHS):
【００８１】
マウスを、アセトン/オリーブオイル(4/1)中の0.5% DNFB 100μlを剃毛した背部に塗布して感作した。CHS反応を顕在化するために12μlの0.3% DNFBを第5日に左耳の両側に塗布した。チャレンジ後の示した時点で、マイクロメーター(Mitutoyo、Japan)で測定した非チャレンジの右耳の厚さと比較したハプテン曝露した左耳の腫脹の程度によりCHSを測定した。以前に感作することなく耳をチャレンジしたマウスをネガティブコントロールに用いた。CHS反応のAg特異性を検討するため、野生型およびK14-RANKL TgマウスをDNFB感作し、10μl 0.5%オキサゾールでチャレンジした。接触性過敏反応のUV誘導抑制は、マウスの剃毛した背部を100 mJ/cm2/日で4日間連続照射して行った。皮膚移植片のみをUV照射するため、周囲の皮膚領域をUV透過を防ぐ局所適用亜鉛ペーストで覆った。第5日にマウスを、照射皮膚上に0.5 % DNFBを100μl塗布して感作した。CHS反応を、感作後5日に左耳の両側に0.3% DNFB 12μlを適用して誘発した。
RANK-Fc遮断試験:
【００８２】
in vivoのRANK-RANKL相互作用を阻害するため、マウスを先に記載のごとくRANK-Fcを注射した(3)。簡単には、K14-RANKL Tgおよび野生型コントロールマウスに、10μg RANK-Fcを1週間に1回、3週齢から始めて4週間静脈注射した。コントロール群には10μg ラットIgG抗体(BD-Pharmingen、Germany)を投与した。CD40L/K14-RANKL二重Tgマウスを、10μg RANK-Fcで1週間に1回、16週齢から始めて6週間処置した。接触性過敏症実験において、野生型マウスを10μg RANK-FcまたはラットIgG抗体で1週間に1回、8週齢から始めて2週間静脈注射した。
全身性自己免疫：
【００８３】
自己免疫の発現を記載のごとく試験した(5)。簡単には、CD40L Tg群(n=10)およびCD40L/K14-RANKL二重Tg群(n=10)における皮膚縁の発現を、2名の独立した研究者により1週間に3回評価した。皮膚の炎症性病変(皮膚炎；赤耳；頬、鼻、頭、および首などの肉眼病変)の局在、数、およびサイズを記録した。140日後、全群のマウスを屠殺し、T細胞サブセット、抗核抗体、皮膚病変の組織学、ならびに腎臓のIg沈着およびタンパク尿を記載のごとく分析した(5)。
細胞調製物およびフローサイトメトリー：
【００８４】
脾臓、リンパ節、および胸腺の単細胞浮遊液を記載のごとく調製した(5、18)。LCを回収するため、表皮シートはマウスの耳を鉗子を用いて背部と腹部側に機械的に広げて作製した。LCを、表皮から3日間培養液中に移動させた。細胞表面マーカーおよび細胞内マーカーの発現をCELLQuest(登録商標)ソフトウエア(BD PharMingen)を用い、FACScalibur(登録商標)サイトメーター(BDPharMingen)を用いる4色フローサイトメトリーにより分析した。細胞をBD-Pharmingenの以下の抗体を用い、1% FCS含有PBS中で染色した：抗CD205 (クローンNLDC145)、フルオレセインイソチオシアネート結合抗CD45RB (クローン16A)、抗CD62L (クローンMel-14)、抗I-A (クローンM5/114)、抗CD103 (クローン2E7)、ポリクローナルヤギ抗ラットIg、ポリクローナルヤギ抗ウサギIg、フィコエリスリン結合抗CD25 (クローンPC61)、抗CTLA-4 (クローンUC10-4F10-11)、抗CD86 (クローンGL1)；ペリジニンクロロフィルタンパク質結合抗CD4 (クローンRM4-5)、アロフィコシアニン結合抗CD11c (クローンHL3)、抗CD25 (クローンPE61)、マウスモノクローナルAb抗ニューロピリン-1(クローンH286；Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA)、抗GITR (R&D Systems)、フルオレセインイソチオシアネート標識ロバ抗ヤギIg (Dianova、Hamburg、Germany)、およびCy5結合抗CD207 (クローン929F3)。アイソタイプ適合コントロール抗体が各染色に含まれた。アポトーシス細胞および壊死細胞を、アネクシンVアポトーシス検出キット(BD-PharMingen)を使用説明書に従って用いて確認した。
養子(免疫)導入：
【００８５】
ドナーマウスを、第0日に剃毛した背部に100μl DNFB (0.5%、アセトン/オリーブ油4/1中)または100μlオキサゾロン(2%、アセトン/オリーブ油4/1中)を塗布して感作した。第5日に、脾臓および領域リンパ節を除去し、単細胞浮遊液を先に記載のごとく調製し、CD4+CD25-およびCD4+CD25+細胞をMACS (Miltenyi、Germany)により単離し、次いで1 x 106個のCD4+CD25-またはCD4+CD25+T細胞を各レシピエントマウス内にi.v.注射した。24時間後、レシピエントを、左耳の両側に12μl 0.3% DNFBおよび12μl 1%オキサゾロンを塗布してチャレンジし、示した時点で耳の腫脹を評価した。
増殖アッセイ：
【００８６】
CD4+CD25-およびCD4+CD25+細胞をMACS (Miltenyi)によりソートした。CD4+CD25+T細胞 (1x106/ml単独または示した割合で混合)を96ウェル丸底プレートでトリプリケートで培養し、1μg/ml 抗CD3 (クローン2c11)および1μg/ml 抗CD28 (クローン37.51；共にBD-PharMingen)で刺激した。増殖アッセイを最終容量200μlで培養し、1μCi/ウェルの3H-チミジンを実験の最後の12時間に加え、チミジンの取り込みをシンチレーションカウンティングにより測定した。組換えネズミIL-2をR&D Systemsから購入し、示した濃度でアッセイに加えた。いくつかの増殖アッセイにおいて、0.3μmのポアサイズのトランスウェル系 (BD Falcon、Germany)を用いて抑制の接触依存性を評価した。
サイトメトリービーズアレイ(CBA)：
【００８７】
K14-RANKL Tgおよびwt マウス由来のCD4+CD25+、CD4+CD25-、またはランゲルハンス細胞の培養上清中のサイトカイン活性をCBA (BD PharMingen)により使用説明書に従ってアッセイした。T細胞(2 x 106/ml)またはランゲルハンス細胞(1 x 106/ml)を、96ウェル丸底プレート(BD Falcon、Germany)中、容量200μlの10%FCS含有RPMI中で37℃および5% CO2で、如何なる刺激もなしにか、または抗CD3および抗CD28抗体(1μg/ml、各Ab)の組み合わせとともに4日間インキュベートした。上清を回収し、CBAキットを用いるサイトカイン定量に供した。
混合リンパ球反応：
【００８８】
同種T細胞(1 x 106/ml)を、96ウェル丸底プレート中、最終容量200μlでトリプリケートで培養し、樹状細胞をCD11c結合磁性ビーズを用いるMACSにより領域リンパ節から単離し、次いでランゲルハンス細胞を示した割合で加えた。ランゲルハンス細胞を表皮シートから移動させた。混合リンパ球反応物を最終容量200μlで96h培養した。同種T細胞(H-2d)の増殖は実験の最後の12時間に加えた3H-チミジンの取り込み(1μCi/ウェル)により評価した。
胸腺摘出および胸腺移植：
【００８９】
3日齢のマウスをケタミン(Sanofi-Cerva、Germany)とキシラジン(SanofiCerva)の混合物20μg/g体重で麻酔した。胸腺摘出は、wtまたはK14-RANKL Tgマウスの胸骨直上の皮膚の小切開口から胸腺の両葉を吸引して行い、胸腺切除の成功を剖検により確認した。切開口をヒストアクリル組織接着剤(Aesculap、Germany)を用いて閉じた。偽胸腺摘出マウスは胸腺を完全に残す以外は同じ手順を受けた。胸腺移植は胸腺摘出動物の左腎臓嚢下に新生児の胸腺の2葉を配置することにより行った。
ランゲルハンス細胞の移動：
【００９０】
LCの移動をフルオレセインイソチオシアネート(FITC)をトレーサーに用いてモニターした。wtおよびK14-RANKL Tgマウスの耳に15μl FITC (30μg/μl、5% DMSO添加ジブチルフタレート/アセトン1：1中、Sigma、Taufkirchen、Germany)を塗布した。処置の16時間後に、耳介後リンパ節を調製し、単細胞浮遊液についてCD207 (ランゲリン)の発現を分析した。
RANKLの局所投与：
【００９１】
RANKLは、2.5μg/mlの組換えヒトRANKLを含む10%エタノール溶液として局所投与した。該溶液の投与部位は、疾患に罹患した部位または罹患部位から離れた部位であった。
実施例1：角化細胞におけるRANKLの発現
【００９２】
RANKLが、炎症後の皮膚の角化細胞に誘導されるか否かを分析した。正常皮膚角化細胞は、RANKLを発現しなかったが、UV曝露または単純ヘルペスウイルス (HSV)感染による皮膚の炎症はRANKLの発現をもたらした(図1a)。さらに、RANKLの発現は、ネズミ角化細胞系PAM212にみられた (図1a)。ヒト皮膚におけるRANKLの発現を検討するため、健康ボランティア、乾癬患者および紅斑性狼瘡患者由来のバイオプシーをRANKL抗体およびサイトケラチン抗体を用いて二重染色した。図1bのデータは、RANKLの発現がヒト皮膚の基底層および基底層直上の角化細胞に検出できることを示す。乾癬病変では、RANKLの強い発現が全ての表皮層の角化細胞にみられたが、皮膚紅斑性狼瘡の炎症病変にはRANKLの発現は検出されなかった(図1b)。これらの予期しないデータは、RANKLの発現が炎症および環境的刺激への曝露中に角化細胞で上方調節されることを示す。
実施例2：皮膚の免疫反応におけるRANKLの役割
【００９３】
皮膚免疫反応におけるRANKLの情報伝達の潜在的役割を検討するため、Keratin-14 (K14)プロモーターの皮膚免疫転写制御下で完全長ネズミRANKLを過剰発現するトランスジェニックマウスを作製した(図1c)。2つのトランスジェニックファウンダー系を樹立した。記載したすべての結果は両系で同様であった。導入遺伝子についてホモ接合性のマウスは繁殖力があり、明らかな異常は見られない。導入遺伝子の正しい発現が免疫組織化学(図1c)およびPCRにより確認された。RANKLタンパク質は、ヒト皮膚でみられた発現パターンと同様に、K14-RANKL Tg動物の表皮の基底層角化細胞に発現するが、野生型コントロールマウスの表皮にはみられなかった。皮膚におけるRANKLの過剰発現は、皮膚構造および皮膚の付属器の発現を変化させなかった。RANKLは開裂して可溶形になることができるので(1、3、4)、RANKLのK14プロモーター誘導過剰発現が全身RANKLレベルの増加をもたらすか否かを分析した。しかしながら、皮膚におけるRANKLの過剰発現は、血清RANKLレベルの増加をもたらさなかった。(図1d)。
実施例3：炎症性皮膚接触過敏症に対するRANKLの効果
【００９４】
K14-RANKL Tgマウスは、「健康」皮膚の明らかな変化を示さなかったので、RANKLの過剰発現が炎症性皮膚接触過敏症(CHS)反応に影響を及ぼすか否かを試験した。2,4-ジニトロフルオロベンゼン(DNFB)で免疫し、次いで耳に局所チャレンジすると、野生型マウスはアレルギー性過敏症反応を発現した(図1e)。興味深いことに、K14-RANKL Tg動物は、CHS反応の有意な低下を示した。野生型マウスおよびK14-RANKL Tgマウスの両方において、このCHS反応は抗原特異的であった(図1e)。この知見は、TNFスーパーファミリーのRANKLと最も近いホモログである(3、4)CD40LのK14プロモーター誘導過剰発現が皮膚に多くの免疫刺激作用を引き起こし、CHS反応を著しく増大させる以前の本発明者らのデータ(5)と全く対照的である。これらのデータは、角化細胞におけるRANKLの過剰発現が抗原特異的皮膚免疫を阻害し、アレルギー性接触過敏症の消失をもたらすことを示す。
実施例4：制御性T細胞におけるRANKLの効果
【００９５】
CHS反応はT細胞によって調節されるので(6)、K14-RANKL Tgマウスの脾臓およびリンパ節中のT細胞数およびT細胞サブポピュレーションを分析した。脾臓およびリンパ節中のCD4+ Tヘルパー細胞、CD8+細胞障害性T細胞、およびB細胞の比、総数、および表面レセプターの発現/レベルは、K14-RANKL Tgとコントロール同腹仔で同程度であった。興味深いことに、K14-RANKL Tgマウスの脾臓およびリンパ節は、野生型コントロールに比べてCD4+CD25+制御性T細胞数の2〜3倍の増加を示した(図2a)。K14-RANKL TgマウスにおけるCD4+CD25+制御性T細胞数のこの増加は、この経路をRANK-Fcにより遮断するとCD4+CD25+制御性T細胞の正常数への減少をもたらすことからRANKL介在性情報伝達に依存性であった。RANK-Fcによる処置は、野生型マウスでもCD4+CD25+制御性T細胞数を正常レベルから約20〜30%減少させた。さらに、rankl-/-マウスは、同腹仔コントロールに比べて脾臓CD4+CD25+ T細胞数の著しい減少を示した(図2a)。すなわち、RANKLはCD4+CD25+制御性T細胞数を調節した。CD4+CD25+ T細胞は胸腺で発現し、K14の発現は、基底層角化細胞だけでなく胸腺髄質上皮細胞についても記載されている(7、8)。RANKLの免疫組織学的およびWesternブロット分析は、野生型胸腺標本に比べてTg胸腺で同様の発現パターンを示し、K14-RANKL Tgおよび野生型マウスの胸腺で同数のCD4+CD25+ T細胞を検出できた。さらに、脾臓CD4+CD25+ T細胞はrankl-/-マウスで減少するが、このノックアウトマウスは、正常数の胸腺CD4+CD25+ T細胞 (野生型(総胸腺細胞の)2.65% n=10；rankl+/-2.31% n=5；rankl-/-：2.91% n=5)を有した。それにも関わらず、胸腺上皮細胞におけるRANKLの発現は、CD25+CD4+ T細胞数の増加に関与する可能性があった。この可能性を試験するため、胸腺摘出K14-RANKL Tgマウスに野生型胸腺を移植し、胸腺切除野生型マウスにK14-RANKL Tgマウス由来の胸腺組織を移植した(図2a)。移植後8〜10週間で、リンパ節および脾臓のCD4+CD25+ T細胞数を評価した。K14-RANKL Tgマウス由来の胸腺を移植した野生型マウスは、正常数のCD4+CD25+ T細胞を発現した。また、CD4+CD25+ T細胞数の増加が、野生型胸腺を移植したK14-RANKL Tgマウスにみられた (図2a)。すなわち、RANK-RANKL相互作用は、CD4+CD25+制御性T細胞の胸腺における発生より維持および/または末梢性増殖と関連があるようである。
【００９６】
次に、K14-RANKL Tgマウスの増加したCD4+CD25+ポピュレーションが制御性T細胞に特徴的なマーカーを発現し、機能的特性を表現するか否かを分析した。特に、K14-RANKL Tgマウス由来のCD4+CD25+制御性T細胞は、原型的な表面マーカー、例えば、CD45RBlow、ニューロフィリン-1 (Nrp-1)、細胞内CTLA-4、またはインテグリンaEb7 (CD103)を発現した (図2b) (7、9〜11)。K14-RANKL Tgおよび野生型マウス由来のCD4+CD25+ T細胞は、同レベルのFoxp3を発現したことが定量的リアルタイムPCRで証明された。同様に、すべての胸腺移植実験において(図2a)、得られた末梢CD4+CD25+ T細胞は、制御性T細胞に特徴的なマーカー、すなわち、CD45RBlow、Nrp-1、およびCTLA-4を発現した。CD4+CD25+制御性T細胞は、T細胞レセプターコンプレックスと反応する細胞分裂促進性Absに反応して増殖することができない(7、14)。したがって、K14-RANKL Tgマウス由来のCD4+CD25+ T細胞は、可溶性抗CD3/CD28 Absで刺激しても増殖できなかった (図2c)。このアネルギー状態は、IL-2を添加することにより克服されるであろう。
【００９７】
K14-RANKL Tgマウス由来のCD4+CD25+ T細胞は、野生型マウスのCD4+CD25+ T細胞と比べて同レベルのIL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、およびIFN-γを産生した。
【００９８】
野生型およびK14-RANKL Tg両マウス由来のCD4+CD25+ T細胞は、刺激するとIL-10を産生した(図2c)。
【００９９】
ヒトおよびマウスにおいて、CD4+CD25+制御性T細胞は、自己反応性T細胞を抑制することにより免疫寛容に重要な役割を果たす(7、13、14)。K14-RANKL Tgマウス由来のCD4+CD25+ T細胞が実際に機能的に抑制性であるか否かを試験するため、野生型およびK14-RANKL Tgマウス由来のCD4+CD25+制御性T細胞を野生型またはK14-RANKL Tgマウス由来のCD4+CD25- T細胞と一緒にインキュベートした。抗CD3 + 抗CD28で刺激すると、K14-RANKL Tgおよび野生型マウス由来のCD4+CD25+ T細胞は、同程度に野生型CD4+CD25- T細胞の増殖を抑制した(図2d)。さらに、K14-RANKL Tgマウスから単離したCD4+CD25- T細胞は、野生型またはK14-RANKL Tg制御性T細胞により抑制することができ、皮膚におけるRANKL発現は、制御性T細胞により抑制されるCD4+CD25- T細胞の感受性を変化させないことを示唆する。トランス-ウェル実験は、K14-RANKL Tgマウス由来のCD4+CD25+ T細胞の接触依存性抑制に必要であることを示すために行った。CD4+ T細胞サブセットが互いに接触しないときin vitroでサプレッサー機能を失った。すなわち、角化細胞におけるRANKLの発現は、制御性T細胞の表現型的および機能的特性を示すCD4+CD25+FOXP3+ T細胞の全身性増殖を生じる。
実施例5：リンパ系組織中の制御性T細胞数に対する皮膚におけるRANKLの局所発現の影響
【０１００】
表皮におけるRANKLの過剰発現は、可溶性RANKLの全身レベルを変化させず(図1d)、RANKLレセプターRANKの発現は、CD4+CD25+ T細胞に検出されなかった。マクロファージおよび破骨細胞に加えて、樹状細胞サブセットは、RANKLレセプターRANKを構成的に発現する(1、4、15)。したがって、表皮の固有の樹状細胞であるランゲルハンス細胞(LC)がRANKを発現するか否かを試験した。実際に、表皮LCはRANKタンパク質を発現する(図3a)。
【０１０１】
定常状態条件下でLCは連続的に皮膚から流入領域リンパ節に移動し、抗原特異的なT細胞活性化の誘導に重要な役割を果たす(16、17)。K14-RANKL Tgおよびコントロール同腹仔マウスにおける表皮LC数と抗原保持LCの移動能力を分析した。LCの分子マーカーとしてMHCクラスII I-Aおよびランゲリンを可視化する免疫組織化学を用いて、野生型マウスに比べて表皮LCの正常な数と分布がK14-RANKL Tgでみられた(図3a)。抗原保持LCの局所リンパ節への移動挙動を試験するため、K14-RANKL Tgおよびコントロール野生型マウスの皮膚に蛍光ハプテンFITCを塗布した。また、同数のFITC+/ランゲリン+ LCが、FITC適用後の野生型(総リンパ節細胞の1.15±0.33%)およびK14-RANKL Tg (1.60±1.07%) マウスの皮膚流入領域リンパ節に検出された。この結果は、RANKLの過剰発現はLCの数、分布、または移動挙動に明らかな影響を与えないことを示す。
実施例6：LCの機能に対するRANKLの影響
【０１０２】
次に、角化細胞におけるRANKLの発現がLCの機能を変化させ、次いでCD4+CD25+ T細胞の末梢増殖をもたらすか否かを検討した。K14-RANKL Tgマウス由来のDCがCD4+CD25+ T細胞を増殖させることができるか否かを直接観察するため、野生型およびK14-RANKL Tgマウスの末梢皮膚流入領域リンパ節由来のCD11c+ DCを野生型マウスのCD4+CD25+ T細胞に加えた。興味深いことに、K14-RANKL Tgマウス由来のDCは、野生型コントロール由来のDCに比べて有意なCD4+CD25+ T細胞の増殖の増強を誘導した(図3b)。次に、LCを、野生型およびK14-RANKL Tgマウスの表皮シートから調製した。リンパ節DCと同様に、K14-RANKL Tg皮膚由来の表皮LCは、CD4+CD25+ T細胞の増殖を誘導する能力の増加を示した(図3c)。CD4+CD25+ T細胞の増殖は、DC-T細胞の接触に依存性であった。これらデータは、K14-RANKL Tgマウス由来の表皮LCおよびリンパ節由来DCがCD4+CD25+ T細胞の増殖の増加を誘導することを示す。
実施例7：末梢制御性T細胞数の調節におけるLCの関与
【０１０３】
LCが実際にin vivoの末梢CD4+CD25+ T細胞数の調節に関与するか否かを試験するため、表皮LCをK14-RANKL Tgおよび野生型表皮からモメタゾンフロエートの局所処置により枯渇させた(18)。モメタゾンフロエートの局所適用は、約2週間、表皮からLCを枯渇させたが、流入領域リンパ節のDCポピュレーションに影響を及ぼさず、K14誘導性の導入遺伝子発現を変化させない(18)。表皮LCの枯渇に次いで(図3d)、CD4+CD25+ T細胞の頻度を分析した。LCの枯渇は、野生型マウスにおける末梢CD4+CD25+ T細胞数の有意な17〜25%の減少を誘導した(図3e)。CD4+CD25+ T細胞のこの減少は、LC枯渇後のK14-RANKL Tgマウスにおいて顕著に増大した(図3e)。反対に、野生型およびK14-RANKL TgマウスにおけるCD4+CD25-およびCD3+CD8+ T細胞ポピュレーションの総数および相対数は、モメタゾンフロエートの局所処置による影響を受けなかった。これらの知見は表皮LCが制御性CD4+CD25+ T細胞の末梢恒常性を調節し得ることを示す。
実施例8：野生型マウス由来のランゲルハンス細胞とK14-RANKL Tgマウス由来のランゲルハンス細胞の表現型的および機能的相違
【０１０４】
次に、LCの表現型の潜在的相違を明らかにするために表皮LCの細胞表面マーカーの発現を分析した。野生型およびK14-RANKL Tg表皮から単離したLCは、MHCクラスII(I-A)、ランゲリン、およびCD80の同様の発現を示した(図4a)。さらに、ランゲリン+DC数の増加は、皮膚流入領域リンパ節にはみられず、K14-RANKL TgマウスにおけるCD4+CD25+制御性T細胞数の高さはLC代謝回転の増加の結果ではないことを示した。重要なことは、K14-RANKL Tgマウス由来のLCは、コントロールに比べてCD205 (DEC205)およびCD86の発現増加を示す(図4a)。CD205発現は、本来CD4+CD25+制御性T細胞のDC介在性誘導と関連があり(19)、CD86は自発自己免疫反応からの保護に関与している(20)。さらに、Tg 表皮シートから移動したLCでは、コントロールLCに比較して検出されるアポトーシスの細胞が少なく、RANK-RANKL情報伝達がDCの寿命を延長することを裏付けた(図4b)。重要なことは、野生型およびRANKL Tg皮膚由来のLCは、TNF-α、IL-6、IL-10、およびIFN-γのサイトカイン分泌プロフィールも異なった(図4c)。すなわち、LCは、K14-RANKL Tgマウスの皮膚では正常分布、正常なMHCクラスII、RANK、およびランゲリン発現、ならびに正常数を示す。しかしながら、LCの表皮RANKLに対する曝露は、アポトーシスが少なく、サイトカイン産生が増加し、本来免疫抑制性DC機能と関連した表面レセプターの発現の変化を示すLCをもたらす。重要なことは、K14-RANKL Tgマウス由来のLCは、in vitroおよびin vivoでCD4+CD25+制御性T細胞を増殖させる能力が増強されている。表皮におけるRANKLの過剰発現は、CD4+CD25+制御性T細胞数を増加させ、これは皮膚免疫反応が下方調節される分子メカニズムを示す。したがって、これら細胞がin vivoで抗原特異的免疫反応を抑制するか否かを検討した。最初に、制御性T細胞の養子移入が皮膚のアレルギー性接触性過敏反応(CHS)の抑制をもたらすか否かを試験した。DNFBで感作したK14-RANKL Tgマウス由来のCD4+CD25- T細胞をDNFB感作野生型レシピエントマウスに静脈内注射した。予期したように、このレシピエントは、DNFBチャレンジに対して強いCHS反応を生じることができた(図4d)。反対に、DNFB感作K14-RANKL Tgマウス由来のCD4+CD25+ T細胞のDNFB感作野生型マウスへの養子移入は、DNFBチャレンジ後のCHS反応を有意に抑制した。
【０１０５】
同様に、DNFB感作野生型制御性T細胞は、レシピエントマウスにおけるCHS反応を強く抑制する。CD4+CD25+制御性T細胞の抗原特異的活性化は、抗原非特異的に免疫反応を抑制することができることが報告されている(7、12)。これを直接検討するため、オキサゾロン感作K14-RANKL Tgマウス由来のCD4+CD25+ T細胞をDNFB感作野生型レシピエントに注射した(図4d)。DNFBチャレンジすると正常CHS反応が測定され、CD4+CD25+制御性T細胞が特異抗原により活性化される必要があるという概念が裏付けられた。さらに、オキサゾロン感作K14-RANKL Tgマウス由来のCD4+CD25+ T細胞をDNFB感作レシピエントに注射した。しかし、この実験の筋書きでは、レシピエントマウスの皮膚にオキサゾロンを塗布し、次いでDNFBを耳にチャレンジした。この処置計画は、レシピエントマウスにおけるCHS反応を強く抑制した(図4d)。これらの所見は、一度特異抗原で活性化されたら、K14-RANKL Tgマウス由来のCD4+CD25+ T細胞は抗原非特異的にCHS反応を抑制することができることを示唆する。
実施例9：皮膚におけるRANKLの過剰発現は、アレルギー性過敏反応およびCD40L誘導全身性自己免疫を抑制する。
【０１０６】
次に、K14-RANKL Tgマウス由来のCD4+CD25+ T細胞が表皮CD40Lの過剰発現により誘導される全身性自己免疫の発現も抑制するか否か(5)、すなわち、角化細胞のRANKLが全身性自己免疫を誘発するCD40Lの作用を無効にすることができるか否かを試験した。したがって、自己免疫性CD40L TgとK14-RANKL Tgマウスを交配し、二重突然変異マウスを得た。先に記載のごとく(5)、CD40L一重Tgマウスは、強皮症様皮膚炎、抗核抗体、腎炎、およびタンパク尿を含む全身性自己免疫疾患を発現する(5)。しかしながら、K14-RANKL/CD40L二重Tgマウスは、自己免疫性皮膚炎と体重損失の発生の有意な減少と遅延を示した(図5a)。K14-RANKL/CD40L二重TgマウスにおけるCD8+ T細胞の分析は、活性化CD8+ T細胞数の顕著な減少も示し、RANKL情報伝達がCD8+ T細胞の細胞障害性エフェクターへの分化を抑制することを示唆した。
【０１０７】
興味深いことに、CD40L Tgマウスにおけるすべての自己免疫の発現、すなわち、皮膚炎、抗核抗体、腎炎、およびタンパク尿の発現は、K14-RANKL/CD40L二重Tgマウスでは阻害された(図5a-c)。RANK-RANKL情報伝達を遮断するための二重TgマウスのRANK-Fcによる処置は、表皮RANKL発現の保護効果を逆転した(図5a)。これらのデータは、皮膚におけるRANKL発現が局所皮膚過剰アレルギー反応およびCD40L誘導全身性自己免疫を抑制することができることを示す。
【０１０８】
皮膚は、環境との相互作用がしばしば免疫系を刺激する器官である。他方、UV曝露または皮膚の炎症は免疫抑制をもたらし得ることが知られている。さらに、最近、自己抗原性ペプチドで経皮免疫すると実験的アレルギー性脳炎を抑制することができ(21)、また制御性T細胞を誘導することが知られている表現型的に未熟なLCは、マウスおよびヒトにおいて炎症皮膚から局所リンパ節に慢性的に流出することがわかってきた(22、23)。すなわち、皮膚の炎症の質、すなわち角化細胞におけるある種の分子の上方調節は、免疫反応の結果に影響するようである。皮膚が調節する免疫恒常性に重要な分子は知られていない。UV照射は皮膚のRANKLを上方調節するので(図1b)、皮膚RANKLは、UV照射と免疫抑制をつなぐ失われた環(missing link)である。これは以前に確立されたCHS反応のUV介在抑制のモデルを用いて試験した(24)。興味深いことに、照射野生型マウスにRANK-Fcを注射すると、UV誘導免疫抑制に対する保護をもたらし、RANK-RANKL相互作用がUV作用に関与することを示唆した(図5d)。UV誘導免疫抑制が皮膚RANKL発現の上方調節を介して関与することを証明するため、野生型マウスに野生型皮膚またはrankl-/-皮膚を移植した。移植後、マウスをUV照射し、移植皮膚組織を介して感作した。興味深いことに、野生型皮膚ではなくrankl-/-皮膚を移植した野生型マウスは正常CHS反応で示されるようにUV誘導免疫抑制から保護された(図5d)。これらの知見は、UV照射は皮膚のRANKL発現を上方調節することができ、より重要なことに、RANKLはUV誘導免疫抑制に関与することを示す。
【０１０９】
RANKLおよびRANKは、破骨細胞分化の根本的調節因子であり、妊娠中の泌乳乳腺の形成を調節する(1、2、25)。さらに、RANKLの発現は活性化T細胞を誘導し、RANK発現はDCに見出すことができる(1、3)。RANKLは腸DCを活性化するのに重要であるかもしれず、また、RANKL-RANKの阻害は大腸炎の減少をもたらしたと報告された(26)。他方、RANK-Fc処置は、糖尿病の炎症介在性Tgモデルにおいて疾患を悪化させることができ、膵臓関連組織におけるCD4+CD25+制御性T細胞数を減少させることが示された(27)。しかしながら、同じ実験において、CD40L/CD40相互作用の阻害は、RANKL/RANK遮断と同じ効果があった(27)。したがって、本発明者らのデータは、RANKLの発現は角化細胞で誘導可能であり、これは表皮と局所および全身性免疫抑制を結びつける分子経路であることを初めて示す。重要なことは、RANKL発現の最も強い誘導因子の1つがビタミンD3であり、これは皮膚に生じ、免疫抑制性であることが以前から知られている。例えば、局所用ビタミンD3誘導体は、乾癬の治療にうまく使用される(28)。さらに、T細胞のデキサメサゾンおよびビタミンD3処置は制御性T細胞を誘導することができる(29)。
実施例10：本実施例は、RANKLの局所適用はマウスにおける炎症を有意に減少させることができることを示す。結果を図6に示す。2つのマウスモデル、接触性アレルギーマウスと刺激性マウスを用いた。20μl組換えヒトRANKL(2.5μg/ml、10%エタノールに溶解)を第-15、-8、および-1日に両モデルの左耳の各側に(図6a参照)塗布した。さらに、20μl RANKL (2.5μg/ml、10%エタノールに溶解)を第-15、-8、および-1日にマウスの剃毛した背部に塗布した(図6b参照)。
【０１１０】
接触性アレルギーについては、正常野生型マウス(例えば「C57BL6」)を第0日に剃毛した背部に100μlの0.5% DNFBを塗布して感作した。接触性アレルギーを誘発するため、第5日の左耳の両側に12μlの0.3% DNFBを塗布した。接触性アレルギーは、チャレンジして48時間後の非チャレンジ右耳の厚さと比較したハプテン曝露した左耳の腫脹の程度により測定した。
【０１１１】
刺激性皮膚炎については、正常野生型マウス(例えば「C57BL6」)の左耳の両側を第0日に15μlの1%クロトン油で処置した。刺激性皮膚炎は、クロトン油適用後24時間における非処置右耳と比較した処置左耳の腫脹の程度により測定した。
【０１１２】
これらの結果は、刺激物でチャレンジした側(耳)へのRANKLの直接局所投与は接触性アレルギーおよび刺激性皮膚炎の特徴的症状を減少させることを示す。刺激物を直接接触させなかったマウスの部位へのRANKLの適用は刺激物を投与した部位の接触性アレルギーの症状を減少させることもわかった。これは局所適用したRANKLが全身作用を示すことを示す。
(参考文献)
【０１１３】
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【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】表皮RANKL過剰発現は皮膚接触性過敏反応を抑制する。
【図２】表皮RANKLは、CD4+CD25+制御性T細胞の恒常性を調節する。
【図３】表皮ランゲルハンス細胞は、CD4+CD25+制御性T細胞の全身的恒常性を調節する。
【図４】野生型マウスとK14-RANKL Tgマウス間のランゲルハンス細胞の表現型および機能的差。
【図５】皮膚におけるRANKLの過剰発現は、アレルギー性過敏反応および全身性自己免疫を抑制する。
【図６ａ】RANKLの局所適用はマウスの刺激性皮膚炎および接触性アレルギーにおける耳の腫脹を減少させることを示す。
【図６ｂ】RANKLの局所適用はマウスの刺激性皮膚炎および接触性アレルギーにおける耳の腫脹を減少させることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【国際調査報告】
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