(57)【要約】  必要性のある対象におけるＩ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）を診断する方法が提供される。前記方法は、対象の生物学的サンプル中の抗ＣＣＬ３抗体の存在及び／又はレベルを決定することを含み、予め決定された閾値より上の前記存在又はレベルはＴ１ＤＭの指標であり、それにより対象におけるＴ１ＤＭを診断する。また、Ｔ１ＤＭを診断するためのキット及び抗糖尿病治療を監視する方法も提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要性のある対象におけるＩ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）を診断する方法であって、前記方法は、対象の生物学的サンプル中の抗ＣＣＬ３抗体の存在及び／又はレベルを決定することを含み、予め決定された閾値より上の前記存在又はレベルはＴ１ＤＭの指標であり、それにより対象におけるＴ１ＤＭを診断することを特徴とする方法。
【請求項２】
Ｔ１ＤＭを診断するためのキットであって、包装材料、及び対象の生物学的サンプル中の抗ＣＣＬ３抗体を決定するための少なくとも一つの試薬を含むことを特徴とするキット。
【請求項３】
必要性のある対象における抗糖尿病治療を監視する方法であって、前記方法は、
（ａ）対象を抗糖尿病治療にさらすこと；そして
（ｂ）対象の生物学的サンプル中の抗ＣＣＬ３抗体の存在及び／又はレベルを決定すること
を含み、ステップ（ａ）の後の前記生物学的サンプル中の抗ＣＣＬ３抗体のレベルの変化は治療効力の指標であることを特徴とする方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の後に、及び所望によりステップ（ａ）の前に行われることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗糖尿病治療が、インスリン、グルカゴン、グルコース、ビグアニド、クロム、ヤクヨウニンジン、マグネシウム及びバナジウムからなる群から選択される医薬を含むことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記抗糖尿病治療が、膵臓移植、小島細胞移植及び生活様式の管理からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記抗ＣＣＬ３抗体の存在及び／又はレベルを決定することが生体外で行われることを特徴とする、請求項１，２又は３のいずれかに記載の方法又はキット。
【請求項８】
Ｔ１ＤＭが、成人における潜在的自己免疫糖尿病（ＬＡＤＡ）を含むことを特徴とする、請求項１，２又は３のいずれかに記載の方法又はキット。
【請求項９】
前記抗ＣＣＬ３抗体の存在及び／又はレベルを決定することが、Ｔ１ＤＭ糖尿病状態に対して特異的な自己抗体の顕在化に先立って行われることを特徴とする、請求項１，２又は３のいずれかに記載の方法又はキット。
【請求項１０】
Ｔ１ＤＭ糖尿病状態に対して特異的な自己抗体の存在又はレベルを決定することをさらに含むことを特徴とする、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１１】
Ｔ１ＤＭ糖尿病状態に対して特異的な自己抗体の存在又はレベルを決定するための少なくとも一つの試薬をさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載のキット。
【請求項１２】
前記Ｔ１ＤＭ糖尿病状態に対して特異的な自己抗体が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、小島細胞抗原（ＩＣＡ）５１２／ＩＡ−２、及びインスリンからなる群から選択される抗原に対して特異的であることを特徴とする、請求項９，１０又は１１のいずれかに記載の方法又はキット。
【請求項１３】
前記閾値が、ｌｏｇ２Ａｂ  １０〜１５の抗ＣＣＬ３力価を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ｌｏｇ２Ａｂ  １０〜１５の抗ＣＣＬ３力価はＴ１ＤＭの指標であるという説明をさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載のキット。
【請求項１５】
前記決定することがＥＬＩＳＡによって行われることを特徴とする、請求項１，２又は３のいずれかに記載の方法又はキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ１ＤＭを診断するための新規の方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、インスリン分泌の欠陥、又はインスリン作用の欠陥、又はこれらの両者から生じる高血糖（グルコース）レベルによって特徴付けられる一群の慢性的な代謝疾患である。もし治療されずに放置されると、糖尿病は、腎不全、心臓病、脳卒中及び失明を含む深刻な合併症を生じることがある。約１５００万人のアメリカ人（人口の約８％）が糖尿病を有する。経済的な見通しから、１９９７年の糖尿病の総年間経済費用は、アメリカにおいて９８０億ドルであると見積られた。
【０００３】
Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）は、若年型糖尿病又はインスリン依存性糖尿病とも称され、幼年期又は青年期に発症し、最も一般的には８〜１２才で見出される。アメリカでは、診断された糖尿病の約５〜１０％がＴ１ＤＭである。
【０００４】
Ｔ１ＤＭは、膵臓のランゲルハンス島におけるインスリン分泌β細胞の器官特異的な自己免疫破壊の結果であり、これは身体によってインスリンが生産されない状態に導く。Ｔ１ＤＭは、Ｔ細胞によって媒介される多要因的な自己免疫疾患であり、そこではＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方、並びにマクロファージがβ細胞の破壊のために必要であるということが明らかになっている。前炎症性媒介因子及び接着分子は、これらの自己反応性白血球が膵臓のランゲルハンス島に侵入して蓄積されるように指向することに関与している。
【０００５】
Ｔ１ＤＭの特殊なサブグループは、成人における潜在的自己免疫糖尿病［ＬＡＤＡ；成年期の遅延発症の自己免疫糖尿病、「遅い発症のＩ型」糖尿病、又は「１．５型（Ｉ型及び半分）」糖尿病とも称される］に言及される。この医学的状態は、Ｉ型糖尿病と同様の小島自己抗体に関連しているが、その遅延した発症のため、しばしばＩＩ型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）と誤診される。
【０００６】
初期段階では、ＬＡＤＡは通常、非肥満ＩＩ型糖尿病の表現型を示す（患者はやせているか又は正常な体重である）。不幸なことに、その生理学的表示において、ＬＡＤＡは若年型（Ｉ型）糖尿病により良く似ており、代謝不全、遺伝、及び自己免疫特徴についてインスリン依存性糖尿病と共通する。
【０００７】
Ｔ１ＤＭの現在の診断は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、小島細胞抗原（ＩＣＡ）５１２／ＩＡ−２、及びインスリンに対する自己抗体の検出に基づいている。不幸なことに、これらのテストは、すべてのＴ１ＤＭ患者をカバーするのには感度が十分でない。疾患の発症時には、抗ＧＡＤ，ＩＡ−２Ａ及び抗インスリン（ＩＡＡ）抗体を組合せて使用することにより８５％より高い感度が得られる。抗ＧＡＤ単独の感度は７０〜８０％であり、ＩＡ−２Ａは５０〜７０％であり、抗インスリン（ＩＡＡ）は３０〜５０％であり、研究間の集団差異を反映する範囲の変動を有する（Ｃｌｉｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｒｅｖｉｅｗｓ，５：４２４−４２８，２００６；Ｐｏｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，２４：３９８，２００１）；従って、現在のテストは、十分な診断精度及び信頼性を提供しない。
【０００８】
さらに、糖尿病の診断の後、患者はインスリン又はＩＣＡ５１２に対して顕著な抗体力価を示さず、限られた数の患者のみがＧＡＤに対して抗体力価を示す。従って、成人における自己免疫糖尿病の診断は、容易でなく、通常、患者を経口低血糖薬で治療することに失敗した後に（糖尿病の診断の数年後に）考慮される。この場合、少ない割合の患者のみが抗ＧＡＤ抗体の陽性力価を有するであろう。
【０００９】
上述の通り、ＬＡＤＡ患者は、診断時の彼らの年齢、及び自己抗体生産及びＣペプチドレベル（これは、膵臓によって生産されるインスリンレベルの指標を与える）を含む現在利用可能な診断ツールに基づいて、ＩＩ型糖尿病であるとしばしば誤診されている。かかる誤診はしばしば、誤った治療計画（発症時の経口インスリンの代わりにスルホニルウレア又は他の糖尿病薬）に導く。ＬＡＤＡ患者は経口糖尿病薬及び生活様式の変化に応答するかもしれないが、彼らのβ細胞は破壊され続けられており、ＬＡＤＡ患者は密に監視されるべきであるということに注意すべきである。従って、正しい治療を提供するために（ＬＡＤＡを含む）Ｉ型糖尿病を正確に診断することができることは極めて重要である。
【００１０】
ケモカインは、自己免疫疾患を媒介する前炎症性タンパク質である。この役割は、これらのタンパク質を効果的な治療標的にする。ケモカインＣＣＬ２（ＭＣＰ−１），ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）及びＣＣＬ４（ＭＩＰ−１β）は、マウスの実験モデルにおいてＴ１ＤＭ中に炎症を起こした膵臓で発現されることが見出されている［Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：１１０２（２０００）］。
【００１１】
加えて、ＣＣＬ３及びＣＣＬ４は、高レベルのＴ１ＤＭ特異的自己抗体（ＩＣＡ，ＧＡＤ及びＩＡ−２自己抗体）を発現した、Ｔ１ＤＭ進行の危険（家族歴）がある個体において上方制御されていることが見出された［Ｈａｎｉｆｉ−Ｍｏｇｈａｄｄａｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２３１：５６（２００６）］。重要なことに、ＣＣＬ３に対する自己抗体の存在は、以前の研究では決定されておらず、それは、潜在的な診断ツールとして示唆されていない。
【００１２】
従って、上述の制限を有さないＴ１ＤＭ糖尿病を診断するための方法及びキットを有することに対する幅広く認識された要求があり、また、かかる方法及びキットを有することは大いに有利であるだろう。
【発明の開示】
【００１３】
本発明の一つの側面によれば、必要性のある対象におけるＩ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）を診断する方法であって、前記方法は、対象の生物学的サンプル中の抗ＣＣＬ３抗体の存在及び／又はレベルを決定することを含み、予め決定された閾値より上の前記存在又はレベルはＴ１ＤＭの指標であり、それにより対象におけるＴ１ＤＭを診断することを特徴とする方法が提供される。
【００１４】
本発明の別の側面によれば、Ｔ１ＤＭを診断するためのキットであって、包装材料、及び対象の生物学的サンプル中の抗ＣＣＬ３抗体を決定するための少なくとも一つの試薬を含むことを特徴とするキットが提供される。
【００１５】
本発明のさらに別の側面によれば、必要性のある対象における抗糖尿病治療を監視する方法であって、前記方法は、対象を抗糖尿病治療にさらすこと；そして対象の生物学的サンプル中の抗ＣＣＬ３抗体の存在及び／又はレベルを決定することを含み、対象を抗糖尿病治療にさらした後の前記生物学的サンプル中の抗ＣＣＬ３抗体のレベルの変化は治療効力の指標であることを特徴とする方法が提供される。
【００１６】
以下に記述される本発明の好ましいさらなる特徴によれば、抗ＣＣＬ３抗体の存在及び／又はレベルを決定することは、対象を抗糖尿病治療にさらすステップの後に、及び所望によりかかるステップの前に行われる。
【００１７】
以下に記述される本発明の好ましいなおさらなる特徴によれば、前記抗糖尿病治療は、インスリン、グルカゴン、グルコース、ビグアニド、クロム、ヤクヨウニンジン、マグネシウム及びバナジウムからなる群から選択される医薬を含む。
【００１８】
以下に記述される本発明の好ましいなおさらなる特徴によれば、前記抗糖尿病治療は、膵臓移植、小島細胞移植及び生活様式の管理からなる群から選択される。
【００１９】
以下に記述される本発明の好ましいなおさらなる特徴によれば、前記抗ＣＣＬ３抗体の存在及び／又はレベルを決定することは生体外で行われる。
【００２０】
以下に記述される本発明の好ましいなおさらなる特徴によれば、Ｔ１ＤＭは、成人における潜在的自己免疫糖尿病（ＬＡＤＡ）を含む。
【００２１】
以下に記述される本発明の好ましいなおさらなる特徴によれば、前記抗ＣＣＬ３抗体の存在及び／又はレベルを決定することは、Ｔ１ＤＭ糖尿病状態に対して特異的な自己抗体の顕在化に先立って行われる。
【００２２】
以下に記述される本発明の好ましいなおさらなる特徴によれば、方法は、Ｔ１ＤＭ糖尿病状態に対して特異的な自己抗体の存在又はレベルを決定することをさらに含む。
【００２３】
以下に記述される本発明の好ましいなおさらなる特徴によれば、キットは、Ｔ１ＤＭ糖尿病状態に対して特異的な自己抗体の存在又はレベルを決定するための少なくとも一つの試薬をさらに含む。
【００２４】
以下に記述される本発明の好ましいなおさらなる特徴によれば、前記Ｔ１ＤＭ糖尿病状態に対して特異的な自己抗体は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、小島細胞抗原（ＩＣＡ）５１２／ＩＡ−２、及びインスリンからなる群から選択される抗原に対して特異的である。
【００２５】
以下に記述される本発明の好ましいなおさらなる特徴によれば、前記閾値は、ｌｏｇ２Ａｂ  １０〜１５の抗ＣＣＬ３力価を含む。
【００２６】
以下に記述される本発明の好ましいなおさらなる特徴によれば、キットは、ｌｏｇ２Ａｂ  １０〜１５の抗ＣＣＬ３力価はＴ１ＤＭの指標であるという説明をさらに含む。
【００２７】
以下に記述される本発明の好ましいなおさらなる特徴によれば、前記抗ＣＣＬ３抗体の存在及び／又はレベルを決定することはＥＬＩＳＡによって行われる。
【００２８】
本発明は、Ｔ１ＤＭを診断するための新規な方法及びキットを提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。
【００２９】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００３０】
図面の簡単な記述
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００３１】
図中、図１は、（診断の一週間以内に）Ｔ１ＤＭであると新たに診断された１０人の対象における自己抗体力価を示す棒グラフである。各患者について、棒は、左から右へ、ＩＰ−１０，ＣＸＣＬ８（ＩＬ−８），ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１），ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）及びＣＣＬ４（ＭＣＰ−１β）についての自己抗体力価を示す。１０人の対象のうち９人におけるＣＣＬ３に対する高度かつ選択的な自己免疫応答に注目されたい。
【００３２】
図２は、新しく発症した糖尿病を有する対象（ｎ＝３０）、前糖尿病対象（ｎ＝２０）、延長されたＴ１ＤＭ（ｎ＝３８）及び正常なコントロール（ｎ＝２０）における陽性ＣＣＬ３自己抗体力価を示す対象の割合を表す棒グラフである。
【００３３】
図３は、新しく発症した糖尿病を有する３０人の対象における、Ｔ１ＤＭ関連自己抗体：抗インスリン（ＣＩＡＡ）、抗ＩＣＡ、抗ＧＡＤ、三つの診断マーカーすべてと抗ＣＣＬ３の組合せについての陽性自己抗体力価を示す対象の割合を表す棒グラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明は、Ｔ１ＤＭを診断するための方法及びキットに関する。
【００３５】
本発明の原理および作用が、図面および付随する説明を参照してより十分に理解されることができる。
【００３６】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施または実行される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定であると見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００３７】
Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）は、膵臓のランゲルハンス島におけるインスリン分泌β細胞の器官特異的な自己免疫破壊の結果であり、これは身体によってインスリンが生産されない状態に導く。β細胞の破壊は、疾患の徴候が表れる何年も前に開始する。臨床上の発症時には、１０％の全β細胞のみが残っていると推定されている。従って、疾患が最終的に診断されたとき、臨床上のβ細胞の枯渇及びインスリン依存はすでに生じているかもしれない。
【００３８】
成人における潜在的自己免疫糖尿病（ＬＡＤＡ）は、Ｔ１ＤＭのサブグループであり、ＩＩ型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）の特徴であるその遅い発症のために、非肥満ＩＩ型糖尿病であるとしばしば誤診される。ＬＡＤＡ患者は典型的に、古典的なＴ１ＤＭより良く保存されたβ細胞機能を呈するが、診断から３年以内にβ細胞機能の顕著な損失を通常経験し、これは最終的にインスリン依存を生じる。ＬＡＤＡ患者はＴ２ＤＭに対する治療（経口低血糖糖尿病医薬及び生活様式の変更）に対して応答するかもしれないが、彼らのβ細胞は破壊されつづけており、従って、治療はしばしば経口治療の迅速な拡大及びインスリンの初期使用を必要とする。しかし、連続したβ細胞の破壊は、これらの患者を健康状態の悪化にさらし、これは寿命をおびやかす状態に導きうる。ＬＡＤＡを初期に同定するためのスクリーニングツールの使用は、血糖の制御を改善し、望ましくない合併症を防止するであろう。
【００３９】
もし治療されずに放置されると、糖尿病は、腎不全、心臓病、脳卒中及び失明を含む深刻な合併症を生じることがある。従って、Ｔ１ＤＭを正確にかつ初期に同定する方法は、徴候が表れて疾患が進行する前にＴ１ＤＭを診断するために必要である。
【００４０】
現在の抗体に基づいたＴ１ＤＭ診断方法（例えばＧＡＤ，ＩＣＡ  ５１２／ＩＡ−２及びインスリン）は、すべてのＴ１ＤＭ患者をカバーできるほど十分感度が高くない。
【００４１】
ＣＣＬ３は、マウスの実験モデルにおいてＴ１ＤＭ中に炎症を起こした膵臓において発現される他のケモカインと共に見出されたケモカインである［Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｍ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：１１０２（２０００）］。同様の結果は、ヒトの研究でも得られている［Ｈａｎｉｆｉ−Ｍｏｇｈａｄｄａｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２３１：５６（２００６）］。
【００４２】
本発明を実施に移している際に、本発明者らは、Ｔ１ＤＭであると診断された患者において一般的に、及び５年以上のＴ１ＤＭの持続を有する患者において特に、抗ＣＣＬ３自己抗体が顕在化していることを見出した。
【００４３】
以下の実施例の欄で示されるように、本発明者らは、初期に診断されたＴ１ＤＭ対象は、もっぱらＣＣＬ３に対する自己抗体応答を発展したが、他の炎症媒介因子に対しては自己抗体応答を発展しなかったことを示している（実施例の欄の実施例１）。また、本発明者らは、抗ＣＣＬ３自己抗体は９０％の対象に存在しており（実施例の欄の実施例２）、これは従来使用されている自己抗体（抗ＩＣＡ，ＧＡＤ及びＣＩＡＡ自己抗体−そこでは試験された９３％の対象が陽性であった）の組合された呈示について見出されているのと同じ割合である。加えて、本発明者らは、抗ＣＣＬ３自己抗体が、前糖尿病患者（例えば、陽性の自己抗体を有するＴ１ＤＭを有する患者の一親等の親類）並びに診断から５年以内の患者において高い割合で存在することを示している（実施例の欄の実施例２）。
【００４４】
全体として、今回の発見は、重度の疾患徴候の発症の充分前にＴ１ＤＭを診断するために活用されることができ、その感度は、現在使用されている三つの抗体に基づく検出アッセイのすべての組合された感度を置換できるようなものである。
【００４５】
従って、本発明の一つの側面によれば、必要性のある対象におけるＩ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）を診断する方法が提供される。前記方法は、対象の生物学的サンプル中の抗ＣＣＬ３抗体の存在及び／又はレベルを決定することを含み、予め決定された閾値より上の前記存在又はレベルはＴ１ＤＭの指標であり、それにより対象におけるＴ１ＤＭを診断する。
【００４６】
本明細書で使用されるように、用語「Ｔ１ＤＭ」は、インスリン生産の減少又は完全な不存在によって特徴付けられる糖尿病に言及する。Ｔ１ＤＭは、「幼年期」、「若年型」又は「インスリン依存性」糖尿病としても言及される。異常病態生理学は、自己免疫によって媒介されることもあり、又は自己免疫に依存しないこともある。後者は、ビタミンＤ３、膵臓細胞を特異的に破壊する化学物質及び医薬（例えば、Ｎ−３−ピリジルメチル−Ｎ′−ｐ−ニトロフェニルウレア及びストレプトゾコシン）、及び外傷、膵臓炎及び腫瘍を含む他の膵臓の問題にさらすことを含みうる。本発明によるＴ１ＤＭは、幼年期の初期及び成年期に（例えば２５才以上の個体）発症するものでありうる。これらの疾患は、非インスリン依存性段階を伴って表れうる。従って、本発明によるＴ１ＤＭは、成人における潜在的自己免疫糖尿病（ＬＡＤＡ）及び若年期の成熟発症糖尿病（ＭＯＤＹ）をも含む。
【００４７】
本明細書で使用されるように、語句「必要のある対象」は、Ｔ１ＤＭの危険のある哺乳動物、好ましくはヒト対象（例えば、遺伝的素因のある対象、Ｔ１ＤＭの医学的及び／又は家族歴がある対象、医薬、化学物質又は病原体を含むＴ１ＤＭにさらされたことがある対象）、及び／又はＴ１ＤＭの疑いのある臨床上の徴候（例えば頻尿、煩渇多飲症、体重減少、及び血糖値が２００ｍｇ／ｄｌ以上又は絶食８時間後の血糖値が＞１２６ｍｇ／ｄｌ）を示す対象に言及する。対象は、抗糖尿病薬を受けていても受けていなくてもよい。追加的に又は代替的に、必要のある対象は、ルーチン検査を受ける健康なヒト対象であることができる。
【００４８】
本明細書で使用されるように、用語「診断する」は、疾患又は炎症性疾患としての徴候を分類し、かかる疾患の重篤度を決定し、疾患の進行を監視し、疾患の結果及び／又は回復の見込みを予測することに言及する。
【００４９】
上述の通り、本発明のこの側面の方法は、対象から得られた生物学的サンプル中の抗ＣＣＬ３抗体の存在又はレベルを決定することによって行われる。
【００５０】
本明細書で使用されるように、用語「ＣＣＬ３」（本明細書では、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）としても言及される）は、多形核白血球の動員及び活性化における急性炎症状態に典型的に関与する、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＰ  ００２９７４のＣ−Ｃケモカインに言及する。
【００５１】
本明細書で使用されるように、語句「抗ＣＣＬ３抗体」は、ＣＣＬ３のいかなるエピトープにも結合するいかなる自己抗体（自体）に言及する。本発明の自己抗体は、いかなるクラスのものであることができる（例えば、ＩｇＧ（サブクラス１−４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（サブクラス１−２）、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）。注目すべきことに、ＩｇＭにまさるＩｇＧ抗体集団がマウスにおける疾患進行に関連して見出されている［Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４６，５：７７９−７８４（１９９７）］。また、Ｉ型糖尿病への進行についての最高のリスクは、高力価のＩＡ−２Ａ及びＩＡＡ，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３、及び／又はＩｇＧ４サブクラス、及びＩＡ−２関連分子ＩＡ−２βに対する抗体に関連していることが見出されている［Ａｃｈｅｎｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＡＢＥＴＥＳ，５３：３８４−９２（２００４）］。
【００５２】
本発明の一実施態様によれば、本発明の自己抗体は、（対象から取り出された）生体外生物学的サンプルにおいて、又は生体内検出によって検出されることができる。
【００５３】
本明細書で使用されるように、語句「生物学的サンプル」は、対象から由来する細胞、組織、又は体液の抗体を含有するサンプルに言及する。サンプル中に存在する抗体は典型的に、細胞質膜結合区画（例えば小胞体及びゴルジ装置）内に、及び（抗体分子を合成する）Ｂリンパ球の表面上に、及び抗体分子を結合するための特異的な受容体を発現する、単核食細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びマスト細胞の如き免疫エフェクター細胞の表面上に見出される。抗体は、血液の血漿（即ち、流体成分）及び組織の間質体液中にも存在する。抗体は、特定の種類の抗体分子が特異的に移送される、粘液、滑液、精液及び乳の如き分泌体液中にも見出されることができる。
【００５４】
抗体を含有する生物学的サンプルの一般例は、以下のものを含むが、これらに限定されない：膵臓組織、消化管組織の如き組織サンプル、及び／又は血液、血清、血漿、リンパ液、胆汁、尿、唾液、痰、滑液、精液、涙、髄液、気管支肺胞液、腹水液、及び膿の如き生物学的体液。
【００５５】
対象から生物学的サンプルを得るための手順（即ち、生検）は、当該技術分野では周知である。かかる手順は、血液採取、関節液生検、髄液生検、及びリンパ節生検を含むが、これらに限定されない。組織を得るための又は体液生検のためのこれらの及び他の手順は、http://www.healthatoz.com/healthatoz/Atoz/search.aspに詳述されている。
【００５６】
好ましくは、糖尿病患者では、サンプルはインスリン治療の開始前に又はインスリン治療の開始から７日以内に採取される。可能なら、血清の如き生物学的サンプルは小分けにされてさらなる分析まで−８０℃で冷凍保存される。
【００５７】
上述の通り、本発明のこの側面の方法は、対象の生物学的サンプル中の抗ＣＣＬ３抗体の存在又はレベルを決定することによって行われ、予め決定された閾値（即ち、健康な個体から得られた生物学的サンプル中のレベル）より上の抗ＣＣＬ３抗体のレベルの存在は、Ｔ１ＤＭの指標である。
【００５８】
抗ＣＣＬ３抗体の存在又はレベルを検定するために選択される特定のアッセイプロトコールは重要でなく、上述の予め決定された閾値レベルの自己抗体を検出するために十分に感度の高いアッセイであることしか必要でない。β細胞破壊のごく初期段階でごく低レベルの自己抗体が存在しうることは理解されるであろう。従って、（例えば健康なサンプルの）陰性背景又はコントロールレベルより上のいかなる自己抗体の存在も、前糖尿病状態の診断になるであろう。
【００５９】
本発明の好ましい実施態様によれば、１０〜１５の抗ＣＣＬ３  ｌｏｇ２  Ａｂ力価を含む予め決められた閾値がＴ１ＤＭの指標である。
【００６０】
使用された手順とは無関係に、いったん生物学的サンプルが得られると、生物学的サンプル中のＣＣＬ３に対する抗体分子の力価（数）が決定される。
【００６１】
抗体力価は、ＥＬＩＳＡ（直接的又は間接的）、及び固定された抗原を使用するドットブロットの如き、当該技術分野では周知の技術によって決定されることができる（例えば、Ａｂｂａｓ，Ｌｉｃｈｔｍａｎ及びＰｏｂｅｒの「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」．Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  １９９４，ｐ．５６−５９を参照されたい）。特に、抗原（即ち、いかなるＣＣＬ３エピトープ又はその模倣体）は固体支持体上に固定されることが好ましい。抗体の非特異的な結合を回避するため、固体支持体は、非抗原性タンパク質でも被覆されることが好ましい。ペプチドは典型的に、水性媒体からの吸着によって固体支持体（マトリックス）上に固定されるが、当業者に周知の、タンパク質及びペプチドに適用可能な固定方法の他の様式も使用されることができる。
【００６２】
本明細書で使用されるように、語句「固体支持体」は、関心のある試薬（例えばＣＣＬ３エピトープ）が付着できる非水性マトリックスに言及する。固体支持体の例は、ガラス（例えば、制御された多孔質ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから部分的に又は全体的に形成される固体支持体を含むが、これらに限定されない。特定の実施態様では、文脈に応じて、固体支持体は、ポリスチレン又はポリ塩化ビニル製の管、プレート、アッセイ又はマイクロ力価プレートのウェルを含むことができる。他の実施態様では、それは精製カラム（例えばアフィニティークロマトグラフィーカラム）である。この用語は、米国特許第４２７５１４９号に記述されるような離散粒子の不連続固体支持体も含む。かかる材料は、水不溶性であり、架橋されたデキストラン（例えば、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標），Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、アガロース、直径約１μｍ〜約５ｍｍのポリスチレンビーズ、ポリ塩化ビニル、架橋されたポリアクリルアミド、シート、ストリップ又はパドルの如きナイロンセルロース又はナイロンベースのウェブを含む。
【００６３】
ＣＣＬ３エピトープは、アミドもしくはエステル結合を介した共有結合又は吸着の如き技術によって固体支持体に共有結合又は非共有結合されることができる。ＣＣＬ３タンパク質が固体支持体に付着された後、固体支持体は、支持体表面へのタンパク質の非特異的吸着を低減させるためにブロッカー（例えば動物タンパク質）で後被覆されることができる。
【００６４】
抗体を含有する生物学的サンプルは、粗サンプル又は免疫グロブリン精製されたサンプル（例えば、硫酸アンモニウムで沈殿された画分及び／又はクロマトグラフィーで単離された画分）であることができる。
【００６５】
固体支持体は、抗体（もし存在するならば）が抗原によって捕獲されるように生物学的サンプルにさらされる。典型的には、固体支持体上の抗原は、自己抗体の全量が結合できるように過剰に存在するであろう。次に、血清サンプルから固体支持体を取り出すことによって、捕獲された自己抗体は、非特異的に結合したサンプル成分から取り除かれることができる。
【００６６】
免疫複合体の検出は、スタフィロコッカスのプロテインＡの如き標識化された抗体結合分子を添加することによって行われることができる。検出可能な標識は、検出可能な信号を直接的に又は間接的に生成することができるいかなる標識であることもできる。例えば、検出可能な標識は、放射性同位元素、蛍光又は化学発光化合物、又はタグ（上述されたものであって、標識化された抗体が結合できるようなもの）であることができる。
【００６７】
従って、標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素であることができる。酵素の選択は、生物学的サンプルの起源にかなり依存するであろう。例えば、血液細胞中には高レベルのペルオキシダーゼが存在し、これは非特異的な信号を生じうる。しかし、ブロッキング処理（例えば、ペルオキシダーゼについてはメタノール中の０．３％Ｈ２Ｏ２溶液での）を使用することができる。
【００６８】
主要な指標群がＨＲＰ又はグルコースオキシダーゼの如き酵素である場合、免疫複合体が形成されたことを示すためには追加の試薬が必要である。ＨＲＰのためのかかる追加の試薬は、過酸化水素及びジアミノベンジディンの如き酸化染色前駆体である。グルコースオキシダーゼのための追加の有用な試薬は、２，２−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−Ｇ−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）である。
【００６９】
放射性標識も本発明に従って使用されることができる。例示的な放射性標識試薬は、１２５Ｉの如きγ線を放出する放射性元素である。タンパク質標識化の方法は、当該技術分野で周知であり、Ｇａｌｆｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｏｌ．，７３：３−４６（１９８１）によって詳述されている。活性化された官能基を通してタンパク質をコンジュゲート化又は結合する技術も利用可能である。例えば、Ａｕｒａｍｅａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８（７）：７−２３（１９７８）；Ｒｏｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３：８８９−８９４（１９８４）；及び米国特許第４４９３７９５号を参照されたい。上述の手順によって標識化されたペプチドは、本発明によって上述のように意図される生体内検出のためにも使用されることができる。
【００７０】
抗ＣＣＬ３抗体は、競合的結合アッセイ、直接的及び間接的サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイの如きいかなる公知のアッセイ方法によっても検出されることができる［Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）］。
【００７１】
特に好ましいのは、上述されそして米国特許第３７９１９３２号、第３８３９１５３号、第３８５０７５２号、第３８７９２６２号、及び第４０３４０７４号に詳述されている感受性酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）方法である。かかるＥＬＩＳＡアッセイは、自己抗体の極めて低力価の測定を与えることができる。
【００７２】
別の典型的な実施態様は、上述のようにして調製された固体支持体を使用して行われる放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）を含む。固体支持体は、固定された抗原への結合について競合することができる放射性標識された自己抗体の存在下で生物学的サンプルにさらされる。このようにして、固体相に結合された放射性標識の量は、生物学的サンプル中に最初に存在する自己抗体の量に反比例するであろう。固体支持体の分離後、非特異的に結合した放射性標識は洗浄によって除去され、固体支持体に結合した放射性標識の量が決定される。結合した放射性標識の量は、サンプル中に最初に存在する自己抗体の量に関連されることができる。
【００７３】
以下の実施例の欄の実施例２に示されるように、抗ＣＣＬ３自己抗体は、前糖尿病の対象の血清中に存在することが見出されている。ＣＣＬ３に対する自己抗体の存在は、前糖尿病患者の血清中に存在する他の自己抗原に対する自己抗体の量と重複することが見出されている。従って、本発明は、診断精度を改良するために、本発明の教示と組合せて、抗ＣＣＬ３抗体（例えば、ＧＡＤ，ＩＣＡ及びインスリンに対する自己抗体の少なくとも一つ）の存在又はレベルを決定することも意図する。
【００７４】
従って、一実施態様によれば、上述の抗ＣＣＬ３の存在又はレベルを決定することは、Ｔ１ＤＭ疾患状態に対して特異的な自己抗体の存在又はレベルを決定することをさらに含む。特に、別の実施態様によれば、検出は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、小島細胞抗原（ＩＣＡ）５１２／ＩＡ−２、及びインスリンからなる群から選択される抗原に対して特異的である自己抗体に対するものであることができる。
【００７５】
従って、本発明の別の実施態様によれば、抗ＣＣＬ３抗体の存在及び／又はレベルを決定することは、Ｔ１ＤＭ糖尿病状態に対して特異的な自己抗体の顕在化に先立って行われる。
【００７６】
好ましくは、ＩＣＡは、ヒト血液群Ｏドナー膵臓の凍結切片を使用した間接的免疫蛍光によって測定される［Ｖａｎｄｅｗａｌｌｅ  ＣＬ  ｅｔ  ａｌ  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ３６：１１５５−１１６２，（１９９３）に記述されるようにして］。抗インスリンＩＡＡ，ＧＡＤＡ及びＩＡ−２Ａは、トレーサーとしてそれぞれ１２５Ｉ標識化インスリン、３５Ｓ標識化ＧＡＤ６５、及び３５Ｓ標識化ＩＡ−２細胞内ドメイン（ＩＡ−２ｉｃ）を使用した液相放射性結合アッセイによって決定される［Ｄｅｃｏｃｈｅｚ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２３：８３８−８４４，（２０００）］。
【００７７】
Ｔ１ＤＭ糖尿病状態に対して特異的な他の自己抗体は抗ＣＣＬ３と共に検出されることができることは理解されるであろう。これらは、以下の表に最も一般的に使用される自己抗体と共に掲載されるエピトープに対する自己抗体を含むが、これらに限定されない。患者の血清中のこれらの自己抗体を検出するために好適な他の自己抗体及び方法及び組成物は、以下の表１及びＤｅｖｅｎｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔ  Ｍｅｄ  Ｊ  ３２８（７４４２）：７５０−７５４（２００４）に詳述されている。
【００７８】
2009526219.tif 000002
【００７９】
本発明の方法は、必要性のある対象における抗糖尿病治療を監視するために使用されることができる。
【００８０】
これは、対象を抗糖尿病治療にさらすこと；そして対象の生物学的サンプル中の抗ＣＣＬ３抗体の存在及び／又はレベルを（上述のようにして）決定することによって行われることができ、抗糖尿病治療の後の前記生物学的サンプル中の抗ＣＣＬ３抗体のレベルの変化は治療効力の指標である。
【００８１】
抗ＣＣＬ３抗体を決定することは、治療の影響を評価するために抗糖尿病治療の後に、及び抗糖尿病治療に先立って行われることができる。
【００８２】
本発明のこの側面に従って使用されることができる抗糖尿病治療の例は、以下のものを含むがこれらに限定されない：注射（例えば注射器又は高空気圧ジェット注射器を使用したもの）、点滴、吸入（例えばＢｅｌｌａｒｙ  ａｎｄ  Ｂｒｎｅｔｔ，Ｄｉａｂ  Ｖａｓｅ  Ｄｉｓ  Ｒｅｓ．Ｄｅｃ；３（３）：１７９−８５，２００６によるような、又はＤｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｏｒｅｃａｓｔ（５８（１）：ＲＧ１６，ＲＧｌ  ９−２２，ＲＧ２４−６，２００５に記載されるような外部インスリンポンプによるもの）によるようなインスリン投与。インスリン投与のための他の経路は、例えば消化抵抗性の丸薬、皮膚パッチ、鼻腔内又は口腔内スプレー（Ｌａｓｓｍａｎｎ−  Ｖａｇｕｅ  ａｎｄ  Ｒａｃｃａｈ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ．３２：５１３−２２，（２００６）にさらに記載されるようなもの）を含む。追加的に、ある場合には、Ｔ２ＤＭを治療するために与えられるビグアニド（例えばメトホルミン）がＴ１ＤＭを治療するのに有用である。
【００８３】
重篤な症例（例えば、腎不全又はインスリンに対する無反応）では、Ｔ１ＤＭ対象は膵臓移植によって治療される。移植は、器官生存率を増大させるために腎臓移植と同時に行われることができる。代替的に、対象の具体的な状態及び外科医の推奨に従って移植は、腎臓移植の後に、又は膵臓移植だけが行われることができる［Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓ  Ｄ  Ｊ  Ｍｅｄ．５７（７）：２６９−７２，（２００４）にさらに記載される］。他の代替的な移植戦略は、器官全体ではなく小島細胞の移植（Ｂｅｒｔｕｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  ＭｏＩ  Ｍｅｄ．Ｊｕｎ；６（４）：３６９−７４，２００６）、又は培養された膵臓／β細胞の移植（Ｖｉｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭｅｄＧｅｎＭｅｄ．６：１２，２００４にさらに記載される）であることができる。
【００８４】
糖尿病を治療するための他の非慣習的な療法は、鍼、生物学的フィードバック、及びクロム、ヤクヨウニンジン、マグネシウム及びバナジウムの投与を含むが、これらに限定されない。
【００８５】
追加的に、及び上述の治療と共に、Ｔ１ＤＭは、砂糖摂取を釣り合わせるための食事の変化及びグルコースレベルを制御するための運動の変化によって治療されることができる。これは、血液グルコースレベルの監視と共に、Ｔ１ＤＭの効果を低下させるのに役立つ。
【００８６】
上述の試薬のいずれもキットに含まれることができる。
【００８７】
従って、本発明の別の側面によれば、Ｔ１ＤＭを診断するためのキットであって、包装材料、及び対象の生物学的サンプル中の抗ＣＣＬ３抗体を決定するための少なくとも一つの試薬を含むことを特徴とするキットが提供される。
【００８８】
従って、例えば、抗体及び／又は化学薬品は、好適な緩衝液及び保存剤と共に一つ以上の容器に包装され、診断のために使用されることができる。
【００８９】
好ましくは、容器はラベルを含む。好適な容器は、例えば瓶、バイアル、注射器及び試験管を含む。容器は、ガラスやプラスチックの如き様々な材料から形成されることができる。
【００９０】
追加的に、安定化剤、緩衝液、ブロッカーなどの他の添加剤も添加されることができる。
【００９１】
キットは、テストされる対象が、Ｔ１ＤＭに罹患しているか又はＴ１ＤＭの危険があるかどうかを決定するための説明も含む。
【００９２】
従って、例えば血液をスクリーニングするためのキットは、以下の成分を好ましくは別個の容器中に含むことができる：
（ａ）ＣＣＬ３エピトープペプチドで被覆された固体支持体；
（ｂ）血清又は血漿サンプルのための希釈剤、例えば正常なヤギ血清又は血漿；
（ｃ）標識化された抗（ヒトＩｇＧ）抗体、例えば約１％ヤギ血清又は血漿を含む、緩衝化された水溶液中のヤギ抗（ヒトＩｇＧ）抗体；
（ｄ）陽性コントロール、例えばＣＣＬ３タンパク質に対する抗体を含む血清；及び／又は
（ｅ）陰性コントロール、例えばＣＣＬ３タンパク質に対する抗体を含まない血清。
【００９３】
もし標識が酵素であるなら、キットの追加成分は酵素のための基質であることができる。
【００９４】
本明細書で使用されるように、用語「約」は±１０％に言及する。
【００９５】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴が、限定であることが意図されない下記の実施例を検討したとき、当業者には明らかになる。加えて、本明細書中上記に描かれるような、また、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【００９６】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【００９７】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）、Ａｕｓｕｂｅｌ他著；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ他、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎ他編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号および５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ他編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている：米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号および５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（１９８４）；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（１９８５）；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（１９８４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．著（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ他、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９９６）；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【００９８】
実施例１
診断直後のＴ１ＤＭ対象の血清における抗ＣＣＬ３自己抗体の検出
自己抗体力価は、初期に診断されたＴ１ＤＭを有する対象における炎症性媒介因子について決定された。ＣＣＬ３に対する高い自己抗体力価が示された。
【００９９】
材料及び実験手順
実験計画−自己抗体応答は、Ｔ１ＤＭと診断された１０人の対象で決定された（Ｉ型糖尿病センター、Ｒａｍｂａｍ，Ｈａｉｆａ、イスラエル）。特に、以下のケモカインに対する自己抗体が分析された：ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１），ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）及びＣＣＬ４（ＭＩＰ−１β）。これらのケモカインは、マウスの実験モデルでＴ１ＤＭ中に炎症した膵臓で発現されることが見出された［Ｃａｍｅｒｏｎ  ＭＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：１１０２（２０００）］。追加的に、ヒトでもっぱら発現されるケモカインであって炎症性自己免疫疾患と関連している可能性があるケモカインであるケモカインＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）に対する自己抗体［Ｐａｌａｃｉｏｓ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１１：５８８（１９９８）］が分析された。炎症性自己免疫疾患と関連している可能性がある追加の媒介因子の自己抗体力価は、同様に試験された：ケモカインＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５），ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９），ＩＴＡＣ（ＣＸＣＬ１１）及びＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）；炎症性サイトカインＩＬ−１５及びＩＬ−１β及びＴＮＦファミリーメンバーＣＤ４０Ｌ，ＦＡＳＬ及びＴＲＡＩＬ。
【０１００】
自己抗体の検出−ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ，Ｒｏｆｋｉｌｂｅ、デンマーク）は、１０ｎｇ／ウェルのヒトＣＣＬ３（Ｒ  ＆  Ｄ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、米国）で被覆され、２００μｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳブロッキング緩衝液で室温で１時間インキュベートされた。血清サンプルは、上述のブロッキング緩衝液での連続した（×２）希釈に供され、ＥＬＩＳＡプレートに添加され（１００μｌ／ウェル）、一晩インキュベートされ、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）で４回洗浄された。その後、５０μｌのヤギ抗ｈＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、米国）が１％ＢＳＡ／ＰＢＳに（製造者のプロトコールに従って）１時間添加され、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）で４回洗浄された。次に、基質溶液（ＴＭＢ，ＤＡＫＯ，ＣＡ、米国）がウェルあたり５０μｌ添加された。反応は、５０μｌのＨ２ＳＯ４（１Ｍ）を添加することによって、青色の出現で停止された。ＯＤは６３０ｎｍにセットされた参照フィルターを使用して４５０ｎｍで決定された。
【０１０１】
結果
初期に診断されたＴ１ＤＭ対象では、高い自己抗体力価がＣＣＬ３に対して見出された−図１に示されるように、診断直後（診断から１週間以内）に、１０人の初期に診断されたＴ１ＤＭ対象のうち９人がＣＣＬ３に対する選択的な自己抗体応答を発展させたが、他の炎症性媒介因子のいずれに対しても自己抗体応答は見出されなかった。コントロールの対象は、ＣＣＬ３を含むいずれの媒介因子に対しても顕著な抗体力価を発展させなかった。
【０１０２】
実施例２
延長された及び初期に診断されたＴ１ＤＭ対象における陽性ＣＣＬ３自己抗体応答の検出
【０１０３】
材料及び実験手順
実験計画−血液サンプル中の抗ＣＣＬ３自己抗体の存在は、四つの異なる群で決定された：新たに診断されたＴ１ＤＭ対象（診断から１週間以内；ｎ＝３０）；延長されたＴ１ＤＭ（診断から５年以上；ｎ＝３８）、健康な対象（コントロール；ｎ＝２０）、及び前糖尿病対象（陽性自己抗体を有するＴ１ＤＭ対象の一親等；ｎ＝２０）。すべての患者について、Ｉ型糖尿病関連自己抗体；抗インスリン（ＣＩＡＡ），ＩＣＡ及びＧＡＤに対する力価も決定された。
【０１０４】
自己抗体の検出−自己抗体の検出は、実施例１で記述された方法と同様の方法で行われた。
【０１０５】
結果
初期に診断された及び延長された前糖尿病対象におけるＣＣＬ３に対する自己抗体応答−図２に示されるように、Ｔ１ＤＭであると診断された直後の対象の９０％（２７／３０）は、ＣＣＬ３に対する陽性の自己免疫応答を有することが見出された。高い割合の陽性免疫応答は、前糖尿病対象及び延長されたＴ１ＤＭ対象でも同様に証明され、そこではそれぞれ１９／２０（９５％）及び２７／３８（７１％）が自己抗体応答を提示した。図２において見られるように、ＣＣＬ３に対する陽性自己抗体力価は、もっぱらＴ１ＤＭ対象についてのものであり、健康なコントロールの１／２０（５％）のみがこの抗体について陽性であった。
【０１０６】
他のＴ１ＤＭ関連自己抗体と比較したＣＣＬ３に対する自己抗体応答−Ｔ１ＤＭを決定するための従来の診断ツールと比較すると、結果は、図３に表されるように、ＣＣＬ３自己抗体は９０％の対象（２７／３０）で陽性であったが、他のＩ型糖尿病関連自己抗体；抗インスリン（ＣＩＡＡ）、抗ＧＡＤ及びＩＣＡ抗体は、それぞれ対象の７０％、６０％及び６３％で陽性であった（三つの糖尿病関連自己抗体の少なくとも一つが検出された３０人の対象のうちの２８人）。従って、ＣＣＬ３に対する自己抗体は、従来のツールよりずっと高感度で三つの従来のツールを一緒にしたより高感度の単一の診断ツールである。
【０１０７】
総合的に、本結果は、ＣＣＬ３に対する陽性自己抗体力価は、現在使用されている三つの従来のあまり感度が高くない診断ツールを置換することができる単一の高感度バイオマーカーであることを実証する。ＣＣＬ３に対する抗体力価は、糖尿病の診断の数年後でも陽性でありつづける。このことは、本発明で見出されたマーカーが、（ＬＡＤＡを含む）成人Ｉ型糖尿病とＩＩ型糖尿病とを区別する、長年必要とされてきた目的のための新規かつ効果的な診断ツールであることをさらに実証する。
【０１０８】
明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０１０９】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許、特許願およびＧｅｎＢａｎｋアクセション番号はすべて、個々の刊行物、特許、特許願またはＧｅｎＢａｎｋアクセション番号が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】（診断の一週間以内に）Ｔ１ＤＭであると新たに診断された１０人の対象における自己抗体力価を示す棒グラフである。
【図２】新しく発症した糖尿病を有する対象（ｎ＝３０）、前糖尿病対象（ｎ＝２０）、延長されたＴ１ＤＭ（ｎ＝３８）及び正常なコントロール（ｎ＝２０）における陽性ＣＣＬ３自己抗体力価を示す対象の割合を表す棒グラフである。
【図３】新しく発症した糖尿病を有する３０人の対象における、Ｔ１ＤＭ関連自己抗体：抗インスリン（ＣＩＡＡ）、抗ＩＣＡ、抗ＧＡＤ、三つの診断マーカーすべてと抗ＣＣＬ３の組合せについての陽性自己抗体力価を示す対象の割合を表す棒グラフである。
【図１】
2009526219.tif 000003
【図２】
2009526219.tif 000004
【図３】
2009526219.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月7日(2008.10.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要性のある対象におけるＩ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）を診断する方法であって、前記方法は、対象の生物学的サンプル中の抗ＣＣＬ３抗体の存在及び／又はレベルを生体外で決定することを含み、予め決定された閾値より上の前記存在又はレベルはＴ１ＤＭの指標であり、それにより対象におけるＴ１ＤＭを診断することを特徴とする方法。
【請求項２】
Ｔ１ＤＭを診断するためのキットであって、包装材料、及び対象の生物学的サンプル中の抗ＣＣＬ３抗体を決定するための少なくとも一つの試薬を含むことを特徴とするキット。
【請求項３】
対象の生物学的サンプル中の抗ＣＣＬ３抗体の存在及び／又はレベルを決定するための少なくとも一つの試薬、及び抗糖尿病治療を含む、Ｔ１ＤＭを監視するためのキット。
【請求項４】
前記抗糖尿病治療が、インスリン、グルカゴン、グルコース、ビグアニド、クロム、ヤクヨウニンジン、マグネシウム及びバナジウムからなる群から選択される医薬を含むことを特徴とする、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
前記抗糖尿病治療が、膵臓移植、小島細胞移植及び生活様式の管理からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載のキット。
【請求項６】
Ｔ１ＤＭが、成人における潜在的自己免疫糖尿病（ＬＡＤＡ）を含むことを特徴とする、請求項１，２又は３のいずれかに記載の方法又はキット。
【請求項７】
前記抗ＣＣＬ３抗体の存在及び／又はレベルを決定することが、Ｔ１ＤＭ糖尿病状態に対して特異的な自己抗体の顕在化に先立って行われることを特徴とする、請求項１，２又は３のいずれかに記載の方法又はキット。
【請求項８】
Ｔ１ＤＭ糖尿病状態に対して特異的な自己抗体の存在又はレベルを決定することをさらに含むことを特徴とする、請求項１又は３に記載の方法又はキット。
【請求項９】
Ｔ１ＤＭ糖尿病状態に対して特異的な自己抗体の存在又はレベルを決定するための少なくとも一つの試薬をさらに含むことを特徴とする、請求項２又は３に記載のキット。
【請求項１０】
前記Ｔ１ＤＭ糖尿病状態に対して特異的な自己抗体が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、小島細胞抗原（ＩＣＡ）５１２／ＩＡ−２、及びインスリンからなる群から選択される抗原に対して特異的であることを特徴とする、請求項７，８又は９のいずれかに記載の方法又はキット。
【請求項１１】
前記閾値が、ｌｏｇ２Ａｂ  １０〜１５の抗ＣＣＬ３力価を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ｌｏｇ２Ａｂ  １０〜１５の抗ＣＣＬ３力価はＴ１ＤＭの指標であるという説明をさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載のキット。
【請求項１３】
前記決定することがＥＬＩＳＡによって行われることを特徴とする、請求項１，２又は３のいずれかに記載の方法又はキット。
【国際調査報告】
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