(57)【要約】  本発明は抗体を安定化するための製剤および方法を提供する。一実施形態において、本発明は、ヒンジ領域における非酵素的切断を受けやすい抗体の安定な製剤を提供する。さらに他の実施形態において、本発明は、抗体を安定化する方法であって、抗体の水性製剤を凍結乾燥することを含む方法を提供する。本製剤は、加工中および貯蔵中の抗体を安定化するために凍結乾燥することができ、その後、医薬投与のために本製剤を再構成することができる。一実施形態において、本発明は、抗ＶＥＧＦＲ抗体を安定化する方法であって、抗ＶＥＧＦＲ抗体の水性製剤を凍結乾燥することを含む方法を提供する。本製剤は、加工中および貯蔵中の抗ＶＥＧＦＲ抗体を安定化するために凍結乾燥することができ、その後、医薬投与のために本製剤を再構成することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体と緩衝液とを含み、前記抗体の非酵素的断片化が実質的に減少する、安定な製剤。
【請求項２】
前記抗体が抗ＶＥＧＦＲ抗体である、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記抗体が抗ＶＥＧＦＲ２抗体である、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
前記ＶＥＧＦＲ２抗体がＩＭＣ−１１２１Ｂである、請求項３に記載の製剤。
【請求項５】
前記抗体の濃度が約５０〜約２００ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の製剤。
【請求項６】
前記緩衝液がヒスチジン緩衝液を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項７】
前記ヒスチジン緩衝液の濃度が約５ｍＭ〜約５０ｍＭである、請求項６に記載の製剤
【請求項８】
前記ヒスチジン緩衝液の濃度が約１０ｍＭである、請求項６に記載の製剤。
【請求項９】
前記ヒスチジン緩衝液のｐＨが約５．５〜約６．５である、請求項６に記載の製剤。
【請求項１０】
前記ヒスチジン緩衝液のｐＨが約６．０である、請求項６に記載の製剤。
【請求項１１】
前記緩衝液がクエン酸緩衝液を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１２】
前記クエン酸緩衝液のｐＨが約５．５〜約６．５である、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１３】
前記クエン酸緩衝液のｐＨが約６．０である、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１４】
前記緩衝液が酢酸緩衝液を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１５】
前記酢酸緩衝液のｐＨが約５．５〜約６．５である、請求項１４に記載の製剤。
【請求項１６】
前記酢酸緩衝液のｐＨが約６．０である、請求項１４に記載の製剤。
【請求項１７】
抗体と、
緩衝液と、
凍結乾燥保護剤と
を含み、前記抗体の非酵素的断片化が実質的に減少する安定な凍結乾燥製剤。
【請求項１８】
前記抗体が抗ＶＥＧＦＲ抗体である、請求項１７に記載の製剤。
【請求項１９】
前記抗体が抗ＶＥＧＦＲ２抗体である、請求項１７に記載の製剤。
【請求項２０】
前記ＶＥＧＦＲ２抗体がＩＭＣ−１１２１Ｂである、請求項１９に記載の製剤。
【請求項２１】
前記抗体の濃度が約５０〜約２００ｍｇ／ｍｌである、請求項１７に記載の製剤。
【請求項２２】
前記緩衝液がヒスチジン緩衝液を含む、請求項１７に記載の製剤。
【請求項２３】
前記ヒスチジン緩衝液の濃度が約５ｍＭ〜約５０ｍＭである、請求項２２に記載の製剤。
【請求項２４】
前記ヒスチジン緩衝液の濃度が約１０ｍＭである、請求項２２に記載の製剤。
【請求項２５】
前記ヒスチジン緩衝液のｐＨが約５．５〜約６．５である、請求項２２に記載の製剤。
【請求項２６】
前記ヒスチジン緩衝液のｐＨが約６．０である、請求項２２に記載の製剤。
【請求項２７】
前記緩衝液がクエン酸緩衝液を含む、請求項１７に記載の製剤。
【請求項２８】
前記クエン酸緩衝液のｐＨが約５．５〜約６．５である、請求項２７に記載の製剤。
【請求項２９】
前記クエン酸緩衝液のｐＨが約６．０である、請求項２７に記載の製剤。
【請求項３０】
前記緩衝液が酢酸緩衝液を含む、請求項１７に記載の製剤。
【請求項３１】
前記酢酸緩衝液のｐＨが約５．５〜約６．５である、請求項３０に記載の製剤。
【請求項３２】
前記酢酸緩衝液のｐＨが約６．０である、請求項３０に記載の製剤。
【請求項３３】
前記凍結乾燥保護剤が糖である、請求項１７に記載の製剤。
【請求項３４】
前記凍結乾燥保護剤がスクロースである、請求項３３に記載の製剤。
【請求項３５】
前記凍結乾燥保護剤がトレハロースである、請求項３３に記載の製剤。
【請求項３６】
界面活性剤をさらに含む、請求項１７に記載の製剤。
【請求項３７】
前記界面活性剤がＴｗｅｅｎ８０である、請求項３６に記載の製剤。
【請求項３８】
安定化剤をさらに含む、請求項１７に記載の製剤。
【請求項３９】
前記安定化剤がアスパラギン酸である、請求項３８に記載の製剤。
【請求項４０】
抗ＶＥＧＦＲ抗体と、
緩衝液と、
凍結乾燥保護剤と
を含む凍結乾燥製剤。
【請求項４１】
前記抗体がＶＥＧＦＲ２抗体である、請求項４０に記載の製剤。
【請求項４２】
前記ＶＥＧＦＲ２抗体がＩＭＣ−１１２１Ｂである、請求項４１に記載の製剤。
【請求項４３】
前記抗体の濃度が約５〜約５０ｍｇ／ｍｌである、請求項４２に記載の製剤。
【請求項４４】
前記緩衝液がヒスチジン緩衝液を含む、請求項４０に記載の製剤。
【請求項４５】
前記ヒスチジン緩衝液の濃度が約５ｍＭ〜約５０ｍＭである、請求項４４に記載の製剤。
【請求項４６】
前記ヒスチジン緩衝液の濃度が約１０ｍＭである、請求項４４に記載の製剤。
【請求項４７】
前記ヒスチジン緩衝液のｐＨが約５．５〜約６．５である、請求項４４に記載の製剤。
【請求項４８】
前記ヒスチジン緩衝液のｐＨが約６．０である、請求項４４に記載の製剤。
【請求項４９】
前記緩衝液がクエン酸緩衝液を含む、請求項４０に記載の製剤。
【請求項５０】
前記緩衝液が酢酸緩衝液を含む、請求項４０に記載の製剤。
【請求項５１】
前記凍結乾燥保護剤が糖である、請求項４０に記載の製剤。
【請求項５２】
前記凍結乾燥保護剤がスクロースである、請求項５１に記載の製剤。
【請求項５３】
前記凍結乾燥保護剤がトレハロースである、請求項５１に記載の製剤。
【請求項５４】
界面活性剤をさらに含む、請求項４０に記載の製剤。
【請求項５５】
前記界面活性剤がＴｗｅｅｎ８０である、請求項５４に記載の製剤。
【請求項５６】
安定化剤をさらに含む、請求項４０に記載の製剤。
【請求項５７】
前記安定化剤がアスパラギン酸である、請求項５６に記載の製剤。
【請求項５８】
抗ＶＥＧＦＲ２抗体と、
ヒスチジン緩衝液と、
凍結乾燥保護糖と
を含む凍結乾燥製剤。
【請求項５９】
前記ＶＥＧＦＲ２抗体がＩＭＣ−１１２１Ｂである、請求項５８に記載の製剤。
【請求項６０】
前記ヒスチジン緩衝液のｐＨが約５．５〜約６．５である、請求項５８に記載の製剤。
【請求項６１】
前記ヒスチジン緩衝液のｐＨが約６．０である、請求項５８に記載の製剤。
【請求項６２】
前記凍結乾燥保護剤がスクロースである、請求項５８に記載の製剤。
【請求項６３】
前記凍結乾燥保護剤がトレハロースである、請求項５８に記載の製剤。
【請求項６４】
界面活性剤をさらに含む、請求項５８に記載の製剤。
【請求項６５】
前記界面活性剤がＴｗｅｅｎ８０である、請求項６４に記載の製剤。
【請求項６６】
安定化剤をさらに含む、請求項５８に記載の製剤。
【請求項６７】
前記安定化剤がアスパラギン酸である、請求項６６に記載の製剤。
【請求項６８】
抗ＶＥＧＦＲ抗体と、
緩衝液と、
凍結乾燥保護剤と
を含む再構成された製剤を投与する工程を含む治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００６年２月１５日に出願された米国特許出願第６０／７７４，１０１号に基づく優先権を主張し、その全体が参照することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は抗体の安定化のための製剤および方法に関する。一実施形態において、本発明は、ヒンジ領域における非酵素的切断を受けやすい抗体を安定化するための製剤および方法を提供する。より詳細には、本発明は、緩衝液および凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を含む、ヒンジ領域における非酵素的切断を受けやすい抗体の製剤に関する。他の実施形態において、本発明は、抗ＶＥＧＦＲ抗体を安定化するための方法および製剤を提供する。
【背景技術】
【０００３】
液体製剤中の抗体は、加水分解、凝集、酸化、脱アミド、およびヒンジ領域における断片化を含むさまざまな化学的および物理的プロセスの影響を受けやすい。この断片化は、温度および／またはｐＨ依存性を有し得る非酵素的プロセスであり、典型的には、パパイン切断部位に近い重鎖ヒンジ領域で起こる。これらのプロセスは、機能的抗体の利用可能性を減少させ、それらの抗原結合特性を低減しまたは除去することにより、治療用抗体の臨床的有効度を変化させまたは除去する場合がある。本発明は、モノクローナル抗体（特にヒンジ領域における非酵素的切断を受けやすいもの）の安定な製剤の必要性に応えるものであり、さらに、これらの抗体を凍結乾燥するための方法および製剤を提供する。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、抗体調製物の安定化のための製剤および方法を対象とする。さらに本発明は、非酵素的切断を（特にヒンジ領域において）受けやすい抗体を安定化するための製剤および方法も対象とする。
【０００５】
一実施形態において、本発明は、非酵素的切断を受けやすい抗体と緩衝液とを含む安定な製剤を提供する。この製剤は一つ以上の安定化剤も含有し得る。さらに、この製剤は界面活性剤を含有し得る。
【０００６】
他の実施形態において、本発明は、凍結乾燥と適合し、凍結乾燥保護剤を含有し得る製剤を提供する。
【０００７】
他の実施形態において、本発明は、非酵素的切断を受けやすい抗体と、ヒスチジン緩衝液と、凍結乾燥保護糖（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｓｕｇａｒ）とを含む凍結乾燥製剤を提供する。
【０００８】
他の実施形態において、本発明は、非酵素的切断を受けやすい抗体を安定化する方法であって、ヒスチジン緩衝液および凍結乾燥保護糖中における製剤を含む方法を提供する。さらにまた、製剤は界面活性剤を含有し得る。この製剤は、加工中および貯蔵中の抗体を安定化するために凍結乾燥することができ、その後、医薬投与のために製剤を再構成することができる。さらなる実施形態では、再構成された抗体を複数回投与形式で使用することができる。
【０００９】
一実施形態において、本発明は、抗ＶＥＧＦＲ抗体と、緩衝液と、凍結乾燥保護剤とを含む安定な凍結乾燥製剤を提供する。この製剤は一つ以上の安定化剤も含有し得る。さらにまた、この製剤は界面活性剤を含有し得る。
【００１０】
他の実施形態において、本発明は、抗ＶＥＧＦＲ２抗体と、緩衝液と、凍結乾燥保護剤とを含む安定な凍結乾燥製剤を提供する。この製剤は一つ以上の安定化剤も含有し得る。さらにまた、この製剤は界面活性剤を含有し得る。
【００１１】
他の実施形態において、本発明は、抗ＶＥＧＦＲ２抗体と、ヒスチジン緩衝液と、凍結乾燥保護糖とを含む凍結乾燥製剤を提供する。
【００１２】
他の実施形態において、本発明は、抗ＶＥＧＦＲ抗体を安定化する方法であって、抗ＶＥＧＦＲ抗体の水性製剤を凍結乾燥する工程を含む方法を提供する。この製剤は、加工中および貯蔵中の抗ＶＥＧＦＲ抗体を安定化するために凍結乾燥することができ、その後、医薬投与のために製剤を再構成することができる。
【００１３】
他の実施形態において、本発明は、本発明の組成物を提供することによってＶＥＧＦＲ活性を阻害する方法を提供する。本発明は、哺乳動物、特にヒトにおけるＶＥＧＦ経路を阻害する方法であって、本発明の組成物を投与する工程を含む方法も提供する。本発明は、ＶＥＧＦＲ依存性疾患を治療する方法であって、本発明の組成物を投与する工程を含む方法も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、非酵素的切断を受けやすい抗体（その機能的フラグメントを含む）を冷凍乾燥するための製剤を提供する。この製剤は、安定化剤、界面活性剤、還元剤、担体、保存剤、アミノ酸、およびキレート剤などの追加要素を含み得る。本発明は、抗体組成物を安定化する方法であって、抗体の水性製剤を凍結乾燥保護剤の存在下で凍結乾燥する工程を含む方法も提供する。この製剤は、加工中および貯蔵中の抗体を安定化するために凍結乾燥し、医薬投与に先だって再構成することができる。好ましくは、抗体は、製造から投与まで、その物理的および化学的な安定性ならびに完全性を、実質的に保つ。本発明による安定性の強化には、緩衝液、界面活性剤、糖類、糖アルコール、糖誘導体、およびアミノ酸を含むさまざまな製剤成分が適し得る。本発明による安定性の強化には、製剤成分のｐＨおよび濃度を含むさまざまな製剤特性が適し得る。
【００１５】
本発明によれば、製剤のｐＨを維持するために緩衝液を使用することができる。緩衝液は外的変動によるｐＨの変動を最小限に抑える。本発明の製剤は、適切なｐＨ、好ましくは約５．５〜約６．５のｐＨ、最も好ましくは約６．０のｐＨの製剤が得られるように、一以上の緩衝液を含有する。緩衝液の典型例には、一般に有機緩衝液、例えばヒスチジン、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、および酢酸などがあるが、これらに限定されない。一実施形態では、緩衝液の濃度が約５ｍＭ〜約５０ｍＭである。さらに他の実施形態では、緩衝液の濃度が約１０ｍＭである。
【００１６】
本発明の製剤は、抗体の凝集および分解の予防に役立ち得る一以上の安定化剤を含有することができる。適切な安定化剤として、多価糖類（ｐｏｌｙｈｙｄｒｉｃ  ｓｕｇａｒｓ）、糖アルコール、糖誘導体、およびアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい安定化剤として、アスパラギン酸、ラクトビオン酸、グリシン、トレハロース、マンニトール、およびスクロースが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
本発明の製剤は一以上の界面活性剤を含有し得る。抗体溶液はその気液界面において高い表面張力を有する。この表面張力を低減するために、抗体は気液界面で凝集する傾向がある。界面活性剤は気液界面における抗体凝集を最小限に抑え、その結果、溶液における抗体の生物学的活性を維持するのに役立つ。例えば０．０１％のＴｗｅｅｎ８０を加えることにより、溶液における抗体凝集を低減することができる。製剤が凍結乾燥される場合、界面活性剤は再構成された製剤における微粒子の形成も低減し得る。本発明の凍結乾燥製剤では、界面活性剤を凍結乾燥される前の製剤、凍結乾燥製剤、および再構成された製剤のうちの一以上に加えることができるが、好ましくは凍結乾燥前製剤に加える。例えば、凍結乾燥前に、０．００５％のＴｗｅｅｎ８０を抗体溶液に加えることができる。界面活性剤として、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−６８、および胆汁酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、界面活性剤濃度が約０．００１％〜約１．０％である。
【００１８】
凍結乾燥プロセスでは、タンパク質またはポリペプチドを変性させ得るさまざまなストレスが生成し得る。これらのストレスには、温度低下、氷晶形成、イオン強度増加、ｐＨ変化、相分離、水和殻の除去、および濃度変化が含まれる。冷凍および／または乾燥プロセスのストレスに敏感な抗体は、一以上の凍結乾燥保護剤を添加することによって安定化することができる。凍結乾燥保護剤は、凍結乾燥に付随するストレスから保護する化合物である。従って、凍結乾燥剤の範疇には、冷凍プロセスから保護するだけの抗凍結剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）が含まれる。凍結乾燥に付随するストレスから保護するために一以上の凍結乾燥保護剤を使用することができ、それらは例えば、スクロースまたはトレハロースなどの糖；グルタミン酸一ナトリウムまたはヒスチジンなどのアミノ酸；ベタインなどのメチルアミン類；硫酸マグネシウムなどのリオトロピック塩；三価またはそれ以上の多価糖アルコール、例えばグリセリン、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトールなどのポリオール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；プルロニック；およびそれらの組み合わせであることができる。好ましい凍結乾燥保護剤の例には、上述の安定化剤および界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明は、凍結乾燥のプロセスによって調製され得る安定化された製剤を提供する。凍結乾燥は、物質をまず冷凍し、次に、溶媒の量を、最初は昇華（一次乾燥プロセス）によって、そして次に脱離（二次乾燥プロセス）によって、もはや生化学的活性または化学反応を支持しない値にまで減少させる安定化プロセスである。凍結乾燥製剤では、溶液に付随する加水分解反応、脱アミド反応、酸化反応および断片化反応を回避するか、著しく遅らせることができる。凍結乾燥製剤は、輸送中の短期間の温度変動による損傷を回避し、室温貯蔵を可能にすることもできる。本発明の製剤は、噴霧乾燥およびバブル乾燥など、当分野で既知である他の方法によって乾燥させてもよい。別段の指定がない限り、本発明の製剤は、凍結乾燥前の製剤において測定されるその成分濃度によって記載される。
【００２０】
一実施形態において、本発明は、ヒンジ領域で起こり得る非酵素的分解を受けやすい抗体を安定化するための方法および製剤を提供する。抗体に非酵素的切断が起こりやすくする要因には、アミノ酸配列、コンフォメーションおよび翻訳後プロセッシングが含まれる。抗体が非酵素的切断を受けるかの決定は、抗体を水性溶液中でインキュベートすることによって達成することができる。このインキュベーションは、典型的には、研究の継続時間を短縮するために、温度を上げて行われる。例えば４０℃または５０℃で３ヶ月間のインキュベーションである。インキュベーション後に、サイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を使って、分解産物を分析することができる。
【００２１】
当分野で公知であるさまざまな分析技術で、再構成された凍結乾燥製剤の抗体安定性を測定することができる。そのような技術には、例えば（ｉ）主融解温度（Ｔｍ）を決定するために示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使って熱安定性を決定すること、（ｉｉ）室温において制御撹拌を用いて機械的安定性を決定すること、（ｉｉｉ）約−２０℃、約４℃、室温（約２３℃〜２７℃）、約４０℃、および約５０℃の温度で実時間等温加速温度安定性（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を決定すること、（ｉｖ）約３５０ｎｍで吸光度を監視することによって溶液濁度を決定すること、および（ｖ）ＳＥＣ−ＨＰＬＣを使ってモノマー、凝集物および分解物の量を決定することが含まれる。安定性は、選択した期間、選択した温度で測定することができる。
【００２２】
一実施形態において、凍結乾燥製剤は再構成時に高濃度の抗体を与える。さらなる実施形態において、安定な凍結乾燥製剤は、凍結乾燥前の製剤の抗体濃度より約１〜１０倍高い抗体濃度を有する溶液が形成されるように、液体で再構成することができる。例えば、一実施形態では、凍結乾燥製剤を１ｍＬ以下の水で再構成して、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの抗体濃度を有する粒子を含まない再構成された製剤を得る。
【００２３】
天然の抗体は、典型的に、二本の同一重鎖および二本の同一軽鎖を有し、各軽鎖が鎖間ジスルフィド結合によって重鎖に共有結合的に連結されている。さらに、複数のジスルフィド結合が二本の重鎖を互いに連結する。個々の鎖は、サイズ（１１０〜１２５アミノ酸）および構造は類似するが機能は異なるドメインへと、フォールディングすることができる。軽鎖は一つの可変ドメイン（ＶＬ）および／または一つの定常ドメイン（ＣＬ）を含むことができる。重鎖も一つの可変ドメイン（ＶＨ）および／または抗体のクラスもしくはアイソタイプに依存して、三つもしくは四つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）を含むことができる。ヒトの場合、アイソタイプはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、ＩｇＡおよびＩｇＧはさらにサブクラスまたはサブタイプ（ＩｇＡ１−２およびＩｇＧ１−４）に分類される。
【００２４】
一般に、可変ドメインは、抗体ごとに、とりわけ抗原結合部位の位置では、かなりのアミノ酸配列可変性を示す。超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる三つの領域が、ＶＬおよびＶＨのそれぞれに見出され、それらはフレームワーク可変領域と呼ばれる可変性の低い領域によって支えられる。
【００２５】
ＶＬおよびＶＨドメインからなる抗体の一部はＦｖ（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ）と呼ばれ、抗原結合部位を構成する。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、一本のポリペプチド鎖上にＶＬドメインおよびＶＨドメインを含有する抗体フラグメントであり、一方のドメインのＮ末端と他方のドメインのＣ末端とが柔軟なリンカーによって接続されている（例えば米国特許第４，９４６，７７８号（Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、ＷＯ８８／０９３４４（Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）参照）。ＷＯ９２／０１０４７（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．）には、バクテリオファージなどの可溶性組換え遺伝子ディスプレイパッケージの表面でのｓｃＦｖフラグメントのディスプレイが記載されている。
【００２６】
単鎖抗体は、それが由来する完全な抗体の定常ドメインの一部または全部を欠く。従って単鎖抗体は、完全な抗体の使用に付随する問題の一部を克服することができる。例えば単鎖抗体は、重鎖定常領域と他の生物学的分子の間の一定の望ましくない相互作用を伴わない傾向がある。さらにまた、単鎖抗体は完全な抗体よりもかなり小さく、完全な抗体よりも大きな透過性を有することができるため、単鎖抗体は、ターゲット抗原結合部位に、より効率よく局在化し、結合することができる。さらにまた、単鎖抗体はサイズが比較的小さいため、レシピエントにおいて不要な免疫応答を惹起する可能性が完全な抗体よりも低い。
【００２７】
第１ペプチドリンカーによって共有結合的に連結された一つのＶＨドメインおよび一つのＶＬドメインを各単鎖が有する複数の単鎖抗体を、少なくとも一つ以上のペプチドリンカーで共有結合的に連結することにより、単一特異性または多重特異性であることができる多価単鎖抗体を形成させることができる。多価単鎖抗体の各鎖は、可変軽鎖フラグメントおよび可変重鎖フラグメントを含み、少なくとも一つの他の鎖に、ペプチドリンカーによって連結される。ぺプチドリンカーは少なくとも１５個のアミノ酸残基から構成される。アミノ酸残基の最大数は約１００である。
【００２８】
二つの単鎖抗体を組み合わせて、二価二量体としても公知であるダイアボディを形成させることができる。ダイアボディは二本の鎖と二つの結合部位とを有し、単一特異性または二重特異性であることができる。ダイアボディの各鎖はＶＬドメインにつながれたＶＨドメインを含む。これらのドメインは、同じ鎖上のドメイン間での対形成を防止し、よって、異なる鎖上の相補的ドメイン間での対形成が推進され、その結果、二つの抗原結合部位が再形成されるように、十分に短いリンカーでつながれる。
【００２９】
三つの単鎖抗体を組み合わせて、三価三量体とも呼ばれるトリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）を形成させることができる。トリアボディは、ＶＬドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸末端がＶＬドメインまたはＶＨドメインのカルボキシル末端に直接融合されるように、すなわちリンカー配列を伴わずに、構築される。トリアボディは三つのＦｖの先端を有し、ポリペプチドは環状かつ頭尾的に配置される。トリアボディの取り得るコンフォメーションは、三つの結合部位が一平面内で互いに１２０度の角度で位置している平面状のコンフォメーションである。トリアボディは単一特異性、二重特異性または三重特異性であることができる。
【００３０】
Ｆａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ，ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）とは、ＶＬドメイン  ＣＬドメイン  ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなる抗体のフラグメントを指す。単にパパイン消化後に生成するものはＦａｂと呼ばれ、重鎖ヒンジ領域を保持していない。ペプシン消化後は、重鎖ヒンジを保持したさまざまなＦａｂが生成する。鎖間ジスルフィド結合が損なわれていない二価フラグメントはＦ（ａｂ’）２と呼ばれ、一方、ジスルフィド結合が保持されていない場合は、一価のＦａｂ’が生じる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは抗原に対して一価Ｆａｂフラグメントよりも高いアビディティを有する。
【００３１】
Ｆｃ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）は、対を為した重鎖定常ドメインを含む抗体の一部またはフラグメントの名称である。例えばＩｇＧ抗体の場合、ＦｃはＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。ＩｇＡ抗体またはＩｇＭ抗体のＦｃは、さらにＣＨ４ドメインを含む。Ｆｃは、Ｆｃ受容体結合、補体仲介性細胞傷害の活性化、および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関連する。複数のＩｇＧ様タンパク質の複合体であるＩｇＡおよびＩｇＭなどの抗体の場合、複合体形成はＦｃ定常領域を必要とする。
【００３２】
最後に、ヒンジ領域は、抗体のＦａｂ部分およびＦｃ部分とを隔て、Ｆａｂを互いに対して、そしてＦｃに対して、可動にすると共に、二本の重鎖を共有結合で連結するために複数のジスルフィド結合を含む。
【００３３】
従って本発明の抗体には、抗原と特異的に結合する天然の抗体、（Ｆａｂ’）２などの二価フラグメント、Ｆａｂなどの一価フラグメント、単鎖抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、多価単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明の抗体またはそのフラグメントは、例えば、単一特異性または二重特異性であることができる。二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、二つの異なる抗原結合特異性または抗原結合部位を有する抗体である。抗体が二つ以上の特異性を有する場合、認識されるエピトープは一つの抗原に関連するものであってもよいし、二つ以上の抗原に関連するものであってもよい。従って本発明は、二つの異なる抗原に結合する二重特異性抗体またはそのフラグメントを提供する。
【００３５】
抗体またはそのフラグメントの特異性は、アフィニティおよび／またはアビディティに基づいて決定することができる。抗原と抗体の解離に関する平衡定数（Ｋｄ）によって表されるアフィニティは、抗原決定基および抗体結合部位の間の結合強度を測定する。アビディティは、抗体とその抗原の間で起こる結合の強さの尺度である。アビディティは、エピトープと抗体上のその抗原結合部位との間のアフィニティと、抗体の結合価（これは特定エピトープの抗原結合部位の数を指す）との両方に関係する。抗体は、典型的には、１０−５〜１０−１１リットル／モルの解離定数（Ｋｄ）で結合する。１０−４リットル／モルに満たないＫｄは、一般に、非特異的結合を示すとみなされる。Ｋｄの値が低いほど、抗原決定基および抗体結合部位の間の結合強度は強い。
【００３６】
本明細書で使用する「抗体」および「抗体フラグメント」には、特異的抗原に対する特異性を保持した修飾も含まれる。そのような修飾として、化学療法剤（例えばシスプラチン、タキソール、ドキソルビシン）または細胞毒素（例えばタンパク質または非タンパク質有機化学療法剤）などのエフェクター分子へのコンジュゲーションが挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、検出可能なレポーター部分へのコンジュゲーションによって修飾することができる。半減期などの非結合特性に影響を及ぼす改変（例えばＰＥＧ化）を有する抗体も含まれる。
【００３７】
タンパク質剤および非タンパク質剤は、当分野で既知である方法によって、抗体にコンジュゲートすることができる。コンジュゲーション方法として、直接結合、共有結合的に取り付けたリンカーを介した結合、および特異的結合対メンバー（例えばアビジン−ビオチン）が挙げられる。そのような方法には、例えば、ドキソルビシンのコンジュゲーションに関してＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０，６６００−６６０７（１９９０）に記載されているもの、および白金化合物のコンジュゲーションに関してＡｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３０３，７９−９０（１９９１）およびＫｉｓｅｌｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（ＵＳＳＲ）２５，５０８−５１４（１９９１）に記載されているものなどが挙げられる。
【００３８】
本発明の抗体には、さらに、直接的突然変異、親和性成熟方法、ファージディスプレイ、またはチェインシャフリングによって結合特性が改良されているものも含まれる。アフィニティおよび特異性は、ＣＤＲを突然変異させ、所望の特性を有する抗原結合部位についてスクリーニングすることによって、変更または改良することができる（例えばＹａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４：３９２−４０３（１９９５）参照）。ＣＤＲにはさまざまな方法で突然変異が導入される。一つの方法は、本来であれば同一な抗原結合部位の集団において、２０種のアミノ酸の全てが特定位置に見出されるように、個々の残基または残基の組み合わせをランダム化することである。もう一つの選択肢として、変異性ＰＣＲ法によって、ある範囲のＣＤＲ残基に突然変異が導入される（例えばＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９−８９６（１９９２）参照）。例えば、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子を含有するファージディスプレイベクターを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異誘発株中で増殖させることができる（例えばＬｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０：３５９−３６８（１９９６）参照）。これらの突然変異誘発方法は、当業者に既知である数多くの方法を例示するものである。
【００３９】
本発明の抗体の各ドメインは完全な免疫グロブリンドメイン（例えば重鎖または軽鎖の可変ドメインまたは定常ドメイン）であることができるし、天然ドメインの機能的等価物または突然変異体もしくは誘導体、あるいは例えばＷＯ９３／１１２３６（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されているような技術を使ってインビトロで構築された合成ドメインであってもよい。例えば、少なくとも一つのアミノ酸を欠く抗体可変ドメインに相当するドメインを、一つにつなぐことができる。抗体の重要な特徴は抗原結合部位の存在である。可変重鎖フラグメントおよび可変軽鎖フラグメントという用語は、特異性に対して重大な影響を有さない変異体を除外する用語であるとみなしてはならない。
【００４０】
本発明の抗体および抗体フラグメントは、例えば天然の抗体、またはＦａｂもしくはｓｃＦｖのファージディスプレイライブラリーから取得することができる。ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む抗体から単一ドメイン抗体を作製するには、結合、発現または溶解度を高めるために、ＣＤＲの外側での特定のアミノ酸置換が望ましい場合があることは理解されている。例えば、本来であればＶＨ−ＶＬの境界に埋まっているアミノ酸残基を修飾することが望ましい場合がある。
【００４１】
さらに、本発明の抗体および抗体フラグメントは、ヒト免疫グロブリンガンマ重鎖およびカッパ軽鎖を産生するトランスジェニックマウス（例えばＭｅｄａｒｅｘ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＫＭマウス）を使って、標準的なハイブリドーマ技術（Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，ｅｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２１１−２１３（１９９８）、この文献は引用することにより本明細書の一部をなすものとする）により、取得することができる。好ましい実施形態では、ヒト抗体産生ゲノムの大部分をマウスのゲノムに挿入して、内因性マウス抗体の産生が欠失した状態にする。そのようなマウスは、完全フロイントアジュバント中のターゲット分子の一部または全部で、皮下（ｓ．ｃ．）免疫することができる。
【００４２】
本発明は、再構成された製剤を投与することを含む治療方法も提供する。再構成された製剤は、本発明の凍結乾燥製剤を、例えば１ｍＬの水で再構成することによって調製される。再構成時間は好ましくは１分未満である。高濃度の再構成製剤は柔軟な投与を可能にする。例えば、再構成された製剤は希釈された形態で静脈内に投与することができるし、それよりより高濃度の形態で注射によって投与することもできる。本発明の高濃度の再構成製剤は、特定の対象および／または特定の投与経路に合わせた濃度まで希釈することができる。従って本発明は、治療有効量の抗体を、それを必要とする哺乳動物、特にヒトに投与することを含む治療方法を提供する。本明細書で使用する「投与する」という用語は、本発明の抗体組成物を哺乳動物に、求めている結果を達成できる任意の方法で送達することを意味する。再構成された製剤は、例えば静脈内または筋肉内に投与することができる。一実施形態では、高濃度の再構成製剤を注射によって投与する。
【００４３】
本発明の抗体は、好ましくはヒト抗体である。一実施形態において、本発明の組成物は、固形腫瘍および非固形腫瘍を含む腫瘍性疾患の治療、および過剰増殖性疾患の治療に使用することができる。
【００４４】
治療有効量とは、哺乳動物に投与した場合に、例えばＶＥＧＦＲ活性を低減もしくは中和する、腫瘍成長を抑制する、または非癌性過剰増殖性疾患を治療するなどといった望ましい治療作用を生じさせるのに有効な、本発明の抗体の量を意味する。上述した抗体の投与は、他の抗体または任意の従来の治療剤、例えば抗腫瘍剤の投与と組み合わせることができる。
【００４５】
本発明の一実施形態では、組成物を、一つ以上の抗腫瘍剤と組み合わせて投与することができる。化学療法剤、放射線またはそれらの組み合わせなど、任意の適切な抗腫瘍剤を使用することができる。抗腫瘍剤はアルキル化剤または代謝拮抗剤であることができる。アルキル化剤の例には、シスプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、およびダカルバジンを含むが、これらに限定されない。代謝拮抗剤の例には、ドキソルビシン、ダウノルビシン、パクリタキセル、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、およびトポテカンを含むが、これらに限定されない。抗腫瘍剤が放射線である場合、放射線源は、治療される患者に対して外部（外照射療法、ＥＢＲＴ）にあっても、内部（近接照射療法、ＢＴ）にあってもよい。投与される抗腫瘍剤の用量は、例えば薬剤のタイプ、治療される腫瘍のタイプおよび重症度、ならびに薬剤の投与経路を含む数多くの要因に依存する。しかし本発明はどの特定用量にも限定されないことが強調されるべきである。
【００４６】
本発明の抗体は、限定するわけではないが、ＶＥＧＦＲ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＥＧＦＲおよびＰＤＧＦＲに対する抗体であってもよい。
【００４７】
一実施形態では、本発明の抗体またはそのフラグメントがＶＥＧＦＲに対して特異的である。他の実施形態では、本発明は、二つの異なる抗原に結合し、ＶＥＧＦＲに対して少なくとも一つの特異性を有する、二重特異性抗体またはそのフラグメントを提供する。ＶＥＧＦＲとは、ＶＥＧＦＲ−１（ＦＬＴ１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ）、ＶＥＧＦＲ−３（ＦＬＴ４）を含むヒトＶＥＧＦ受容体のファミリーを指す。
【００４８】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は血管形成の重要な媒介因子である。健常なヒトでは、ＶＥＧＦは発生中の胚、治癒中の創傷、および女性生殖周期において、血管形成を促進する。しかしながら、ＶＥＧＦは、癌遺伝子の発現、成長因子、および低酸素によってアップレギュレートされると、腫瘍における血管形成を媒介する。一定のサイズを超えた腫瘍が、栄養素および酸素の制限された拡散によって成長するために、血管形成は不可欠である。
【００４９】
従って、一実施形態では、抗ＶＥＧＦＲ抗体がＶＥＧＦＲに結合し、ＶＥＧＦなどのリガンドの結合を遮断する。この遮断は、ＶＥＧＦＲ活性化の効果を妨害することにより、腫瘍浸潤、転移、細胞修復、および血管形成の阻害を含む腫瘍成長の阻害をもたらし得る。
【００５０】
一実施形態では、抗体が、ＷＯ０３／０７８４０（ＰＣＴ／ＵＳ０３／０６４５９）に開示されている抗ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ）抗体、ＩＭＣ−１１２１Ｂ（ＩｇＧ１）である。ＩＭＣ−１１２１Ｂに関して、ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および配列番号２で表す。ＩＭＣ−１１２１Ｂに関して、ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３および配列番号４で表す。
【００５１】
本発明の抗体またはそのフラグメントの等価物には、本明細書に記載する完全長抗ＶＥＧＦＲ抗体の可変領域または超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。実質的に同じアミノ酸配列とは、本明細書においては、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２４４４−８（１９８８））に従ってＦＡＳＴＡ検索法で決定されるように、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％のホモロジーを有する配列と定義される。
〔実施例〕
【００５２】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するものであるが、以下の実施例が本発明を限定すると解釈してはならない。タンパク質の解析に使用される方法など、従来の方法の詳細な説明は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ発行）などの数多くの刊行物から得られることができる。本明細書で言及する全ての参考文献は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【実施例１】
【００５３】
［抗ＶＥＧＦＲ−２抗体、ＩＭＣ−１１２１Ｂの断片化］
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−１１２１Ｂを、４０℃で３ヶ月間インキュベートした。このインキュベーション後に、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＮ末端配列決定を使って、分解産物を解析した。ＰＢＳ中の分解ＩＭＣ−１１２１ＢのＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを図１に示す。分解産物は、凝集物（フラクション１）ピークおよびモノマーピークの他に、二つの分解物ピーク（フラクション２およびフラクション３）を有する。Ｎ末端配列解析のために、フラクションコレクターを使ってフラクションを収集した。ＩＭＣ−１１２１Ｂ重鎖のｃＤＮＡ配列を図２に示す。シグナル配列、可変領域および定常領域を、それぞれ下線、二重下線、および普通文字で示す。分解試料ならびにフラクション２およびフラクション３のＮ末端配列決定解析により、重鎖中に二つの断片化部位が示された（図２で灰色に強調した文字）。Ｎ末端から１５６番目の残基にある部位は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３）上で、約４０ＫＤバンドおよび約１５ＫＤバンドとして検出される二つの重鎖フラグメントをもたらす。Ｎ末端から２２０番目の残基にあるヒンジ領域中のもう一つの断片化部位は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約３３ＫＤバンドおよび約２７ＫＤバンドをもたらす（図３）。
【実施例２】
【００５４】
［緩衝液製剤の最適化］
ＩＭＣ−１１２１Ｂの冷凍乾燥製剤を２段階で開発した。第１段階では、表１に概説する一部実施要因モデリング（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒｉａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ）による実験アプローチ設計（ＤＯＥ）を用いて、溶媒緩衝液を最適化した。この最適化プロセスでスクリーニングされる要因は、緩衝液、ｐＨ、塩、アミノ酸、糖界面活性剤、および糖誘導体とした。溶媒の最適化は５ｍｇ／ｍＬの１１２１Ｂ濃度で行った。室温で３００ｒｐｍの制御撹拌を用いて、機械的安定性を調べた。熱安定性はＤＳＣおよび加速温度を使って調べた。ＤＯＥ予測は伝統的な一事一時法（ｏｎｅ−ｆａｃｔｏｒ−ａｔ−ａ−ｔｉｍｅ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）を使って確認した。線形回帰分析を使って、結果の有意性を決定した。
【表１】
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【００５５】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）研究
ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ−ＤＳＣを使って融解温度または転移温度（Ｔｍ）を測定した。タンパク質濃度は５ｍｇ／ｍＬに設定し、温度傾斜は５℃から９５℃まで１．５℃／分の走査速度とした。さまざまな製剤（表１）におけるＩＭＣ−１１２１Ｂの熱融解曲線を収集した。試験される変数がＴｍに及ぼす作用を推定するために、主転移ピーク（分子の５０％が変性する）に対応する融解温度を、線形回帰モデルに当てはめた。このモデルはｐ＝０．０００６で統計的に有意だった。有意な要因（ｐ＜０．０５）はｐＨおよび緩衝液の種類だった。緩衝液の種類およびｐＨに伴うＴｍ変動に関する回帰プロットを図４に示す。最適ｐＨは、ヒスチジン、クエン酸および酢酸緩衝液の場合に約６．０であり、これはｐＨ６．０のリン酸緩衝液よりも優れていた。他の変量はＴｍに対して統計的に有意な作用を有さなかった。
【００５６】
撹拌研究
抗体溶液を、３００ｒｐｍのプラットフォームシェーカー上で、室温で撹拌した。２０ｍＬガラスバイアル中、５ｍＬの５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−１１２１Ｂを、さまざまな製剤（表１）中で、８４時間まで撹拌した。溶液濁度、モノマー百分率、凝集物百分率、および分解物百分率を、以下のように決定した。溶液濁度は、島津１６０１バイオスペック分光光度計を使って、３５０ｎｍにおける吸光度によって測定した。モノマー百分率、凝集物百分率、および分解物百分率は、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＣｓＣｌ、ｐＨ７．０を移動相とし、Ｔｏｓｏｐｈ  Ｂｉｏｓｅｐ  ＴＳＫ  ３０００カラムを使って、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＬＣで行われるＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定した。ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＮＣ）を使って線形回帰モデルに当てはめることにより、試験される変数が濁度、モノマー百分率、凝集物百分率および分解物百分率に及ぼす作用を推定した。実測値−予測値（Ａｃｔｕａｌ  ｂｙ  Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ）プロットに関してｐ値は＜０．００２だった。有意な変数であるｐＨ、Ｔｗｅｅｎ８０、ＮａＣｌおよび時間が濁度、モノマー百分率、凝集物百分率および分解物百分率に及ぼす作用を図５に示す。
【００５７】
４０℃における実時間加速温度安定性
５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−１１２１Ｂを、さまざまな製剤（表１）中で、４０℃で１４日までインキュベートした。溶液濁度、モノマー百分率、凝集物百分率および分解物百分率を上述のように決定した。試験される変数が濁度、モノマー百分率、凝集物百分率および分解物百分率に及ぼす作用を、ＪＭＰソフトウェアを使ってそれを線形回帰モデルに当てはめることによって推定した。実測値−予測値プロットに関してｐ値は＜０．００１だった。有意な変数が濁度、モノマー百分率、凝集物百分率および分解物百分率に及ぼす作用を図６に示す。最適な緩衝液はｐＨ６．０のヒスチジンだった。塩はモノマーを低減し、凝集を増加させた。しかし分解には影響を及ぼさなかった。グリシンはモノマー、凝集物または分解物に対する作用を有さない。
【００５８】
−２０℃における実時間冷凍温度安定性
５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−１１２１Ｂ抗体を、さまざまな製剤（表１）中で、−２０℃で１６日までインキュベートした。溶液濁度、モノマー百分率、凝集物百分率および分解物百分率を上述のように推定した。ＪＭＰソフトウェアを使って線形回帰モデルに当てはめることにより、試験される変数が濁度、モノマー百分率、凝集物百分率および分解物百分率に及ぼす作用を決定した。実測値−予測値プロットに関してｐ値は＜０．００１だった。有意な変数が濁度、モノマー百分率、凝集物百分率および分解物百分率に及ぼす作用を図７に示す。最適なｐＨは６．０だった。アスパラギン酸はモノマーを増加させ、凝集を減少させたが、分解に及ぼす作用は無視できる程度だった。ＮａＣｌおよびグリシンは濁度、モノマー、凝集物および分解物に対して無視できる程度の作用しか有さなかった。
【実施例３】
【００５９】
［ＰＢＳ製剤および１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）製剤におけるＩＭＣ−１１２１Ｂ安定性の比較］
ＤＯＥスクリーニング研究では、ＩＭＣ−１１２１Ｂ抗体が、ＰＢＳ中よりも、１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）製剤中で、有意により良い安定性を有することが予測された。この研究では、ＤＯＥ予測を確認するために、１０ｍＭヒスチジンｐＨ６．０中およびＰＢＳ中の濃度５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−１１２１Ｂの安定性を、さまざまな技術を使って調べた。
【００６０】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）研究
ＰＢＳ製剤および１０Ｍヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）製剤におけるＩＭＣ−１１２１Ｂの熱安定性を、方法の項で記載した手法に従って調べた。主転移に関する融解温度は、ＰＢＳ中および１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）中のＩＭＣ−１１２１Ｂについて、それぞれ７０．０および７６．６℃だった。
【００６１】
４０℃および室温における実時間加速温度安定性
５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−１１２１Ｂを、ＰＢＳ製剤中および１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）製剤中、４０℃および室温（ＲＴ）で、１５０日までインキュベートした。インキュベーション後に、試料を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＩＥＣ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＥＦで、以下に述べるように分析した。
【００６２】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析
４０℃および室温で１５０日間インキュベートした後のＰＢＳ中または１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）中のＩＭＣ−１１２１ＢのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析は、上述の手法に基づいて行った。ＨＰＬＣクロマトグラムを図８に示す。対照試料、ＲＴ試料および４０℃試料における凝集物の総百分率は、ＰＢＳの場合、それぞれ０．９０、１．４９および３．９０であり、１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）の場合、それぞれ０．８０、０．８２および０．７５だった。対照試料、ＲＴ試料および４０℃試料における総分解物百分率は、ＰＢＳの場合、それぞれ１．３２、２．５６および１２．５４であり、１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６．０製剤の場合、それぞれ１．２３、２．０９および９．００だった。モノマー百分率、凝集物百分率、および分解物百分率の変化を、インキュベーション時間の関数として、それぞれ図９、図１０および図１１に示す。ＰＢＳ製剤中では、１０ｍＭヒスチジン（ｐＨ６．０）中よりも速い速度で、モノマー百分率が減少し、凝集物百分率および分解物百分率が増加した。１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）の方が、ＩＭＣ−１１２１Ｂ抗体の保全にとって優れた環境を提供する。
【００６３】
ＩＥＣ−ＨＰＬＣ解析
４０℃および室温で３０日間および１５０日間インキュベートした後のＩＭＣ−１１２１Ｂのイオン交換クロマトグラフィーを、Ｄｉｏｎｅｘ  ＰｒｏＰａｃ  ＷＣＸ−１０分析用カラムを使って、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＬＣで行った。３２分で１０ｍＭリン酸（ｐＨ７．０）、２０ｍＭのＮａＣｌから、１０ｍＭリン酸（ｐＨ７．０）、１００ｍＭのＮａＣｌへの直線的勾配によって試料を溶出させた。ＩＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを図１２に示す。室温および４０℃でインキュベートすると、どちらの製剤でも、短い保持時間側への（すなわち酸性ｐＨ側への）ピークのシフトが起こった。しかしながら、そのシフトは、１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）製剤中よりも、ＰＢＳ製剤中の方がかなり大きかった。
【００６４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析
ＰＢＳ中または１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）中のＩＭＣ−１１２１Ｂ抗体（５ｍｇ／ｍＬ）を室温または４０℃で１５０日間インキュベートしてから、標準的プロトコールに従って還元および非還元のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％トリス−グリシン勾配ゲル）で分析した。バンドの強度で測定したところ、ＰＢＳ中でインキュベートした試料は、１０ｍＭヒスチジン（ｐＨ６．０）中でインキュベートした試料よりも多量の分解産物を有した（図１３）。
【００６５】
等電点電気泳動（ＩＥＦ）分析
ＲＴおよび４０℃で１５０日間インキュベートした後のＰＢＳ製剤中および１０ｍＭヒスチジン（ｐＨ６．０）製剤中の５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−１１２１Ｂを、ＩＥＦ（ｐＨ範囲６．０〜１０．５）で分析した。等電点電気泳動分析は、６．０〜１０．５までのｐＨ範囲を有するＩｓｏＧｅｌ（登録商標）アガロースＩＥＦプレートで行った。その結果得られたバンドはＰＢＳ製剤でもヒスチジン製剤でも酸性ｐＨ側に移動した。しかしながら、そのシフトは、１０ｍＭヒスチジン（ｐＨ６．０）製剤よりも、ＰＢＳ製剤の方が大きかった（図１４）。
【実施例４】
【００６６】
［冷凍乾燥製剤スクリーニング］
最適化の第２段階では、１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）中、２０ｍｇ／ｍＬの固定した抗体濃度で、充填剤ならびに抗凍結剤および凍結乾燥保護剤を最適化した。試験した添加剤は、実験マトリックス設計（表２）に示すように、マンニトール、グリシン、スクロースおよびトレハロースである。対照として、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中または１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）を含む溶液製剤（冷凍乾燥なし）中の、濃度５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−１１２１Ｂ抗体を分析した。
【表２】
2009526856.tif 000003
【００６７】
冷凍乾燥プロセス
Ｌｙｏｓｔａｒ  ＩＩ冷凍乾燥機を使って生成物を凍結乾燥した。凍結乾燥トレーに室温で試料を入れた。生成物を−５０℃で２時間浸漬した。一次乾燥を−３０℃で１０時間行った後、二次乾燥を２０℃でさらに１０時間行った。冷却速度および加熱速度は０．５℃／分とした。一次乾燥および二次乾燥中のチャンバー圧は５０ｍＴとした。凍結乾燥が完了したら、試料チャンバーをＮ２で満たして、蓋をした。凍結乾燥プロセスは約２４時間で完了した。棚設定温度および生成物温度を実行時間の関数として図１５に示す。凍結乾燥プロセスは、生成物温度が棚設定温度に到達（または棚設定温度と交差）した時に完了したとみなした。
【００６８】
加速温度安定性
凍結乾燥した抗体製剤を４０℃または５０℃で１００日間インキュベートした。インキュベーション期間後に、生成物を１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）で５ｍｇ／ｍＬに再構成した。再構成時間は１分未満だった。インキュベーション後に残っているモノマー百分率を図１６に示す。４％スクロースまたは４％トレハロースを含む冷凍乾燥製剤は、４０℃および５０℃で１００日間のインキュベーション後に、最も高いモノマー百分率を保っていた。
【００６９】
冷凍乾燥製剤と溶液製剤の加速温度安定性の比較
冷凍乾燥製剤、（１）２０ｍｇ／ｍＬ  ＩＭＣ−１１２１Ｂ、４％スクロース、１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）、および（２）２０ｍｇ／ｍＬ  ＩＭＣ−１１２１Ｂ、４％トレハロース、１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）を、溶液製剤（１）ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−１１２１Ｂおよび（２）１０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）中の５ｍｇ／ｍＬ  ＩＭＣ−１１２１Ｂと比較した。試料を４０℃または５０℃で１００日までインキュベートした。インキュベーション期間後に、凍結乾燥生成物を１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）で５ｍｇ／ｍＬに再構成した。再構成した凍結乾燥試料および溶液試料をＳＥＣ−ＨＰＬＣで分析した。モノマー百分率、凝集物百分率および分解物百分率の変動を、４０℃または５０℃におけるインキュベーション時間の関数として、図１７〜２３に示す。分解百分率はどちらの溶液製剤でも時間と共に増加したが、凍結乾燥製剤では無変化のままだった（図１９および図２２）。
【実施例５】
【００７０】
［高濃度抗体用の冷凍乾燥製剤］
先の結果は、試験した化合物のうち、４％スクロースまたは４％トレハロースが、濃度２０ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−１１２１Ｂ抗体の冷凍乾燥製剤に、最大の安定性を与えることを実証した。この研究では、濃度５０ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−１１２１Ｂを製剤することを目標として、ＩＭＣ−１１２１Ｂ濃度を２０ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬまで上昇させ、スクロース濃度を４％から８％に変化させた。対照として、２０ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−１１２１Ｂも、４％スクロースの存在下で凍結乾燥した。凍結乾燥生成物および対照溶液製剤を室温、４０℃および５０℃で３ヶ月までインキュベートした。対照溶液製剤は、ＩＭＣ−１１２１Ｂ抗体に関して最適化された現時点で推奨される溶液製剤（１０ｍＭヒスチジン、１３３ｍＭグリシン、７５ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０中で、５ｍｇ／ｍＬ）からなった。インキュベーション期間後に、凍結乾燥生成物を１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）で５ｍｇ／ｍＬに再構成し、次にＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＩＥＣ−ＨＰＬＣ、ならびに還元および非還元のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００７１】
５０℃インキュベーション後の凍結乾燥化ＩＭＣ−１１２１Ｂおよび溶液製剤化ＩＭＣ−１１２１ＢのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析
凍結乾燥の前および後、ならびに５０℃で１ヶ月および３ヶ月インキュベートした後の試料で、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを行った。凍結乾燥生成物は、インキュベーション後に、１０ｍＭヒスチジン（ｐＨ６．０）で再構成した。モノマー百分率、凝集物百分率および分解物百分率の変動をそれぞれ図２３、２４および２５に示す。８％スクロース試料の場合に、モノマー百分率は最大であり、凝集物は最少だった。凍結乾燥試料が含有する分解物は溶液製剤化試料よりも有意に少なかった。
【００７２】
室温および４０℃でインキュベートした後の凍結乾燥化ＩＭＣ−１１２１Ｂおよび溶液製剤化ＩＭＣ−１１２１ＢのＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＩＥＣ−ＨＰＬＣ分析
凍結乾燥の前および後、ならびに室温および４０℃で１ヶ月および３ヶ月インキュベートした後の試料で、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＩＥＣ−ＨＰＬＣを行った。凍結乾燥生成物は、インキュベーション後に、１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）で再構成した。モノマー百分率、凝集物百分率および分解物百分率の変動を、４０℃でインキュベートした試料についてはそれぞれ図２６、２７および２８に、また室温でインキュベートした試料についてはそれぞれ図３０、３１および３２に示す。凍結乾燥試料が含有する分解物は、溶液製剤化試料よりも有意に少なかった。８％スクロースを含有する溶液状態または凍結乾燥状態で３ヶ月間インキュベートしたＩＭＣ−１１２１ＢのＩＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを図２９（４０℃インキュベーション）および図３３（室温インキュベーション）に示す。比較のために参照ＩＭＣ−１１２１Ｂ試料を含めた。冷凍乾燥試料のクロマトグラムは参照ＩＭＣ−１１２１Ｂと類似しているが、溶液製剤化ＩＭＣ−１１２１Ｂのクロマトグラムは酸性ｐＨ側にシフトした。
【００７３】
３ヶ月間インキュベートした後の凍結乾燥化ＩＭＣ−１１２１Ｂおよび溶液製剤化ＩＭＣ−１１２１ＢのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
凍結乾燥生成物を１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）で再構成した。３ヶ月間のインキュベーション後に、溶液状態で維持したＩＭＣ−１１２１Ｂ、および１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）中に再構成したＩＭＣ−１１２１Ｂ冷凍乾燥試料を、４〜２０％還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３４）および４〜２０％非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３５）で分析した。凍結乾燥製剤（４％スクロースを含む２０ｍｇ／ｍｌ抗体および８％スクロースを含む５０ｍｇ／ｍｌ抗体）が示す重鎖の分解は、非凍結乾燥製剤と比較して有意に減少していた。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】４０℃で３ヶ月インキュベートした後のＰＭＳ中のＩＭＣ−１１２１Ｂ抗体のサイズ排除クロマトグラフィー高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）クロマトグラムを示す。
【図２】ＩＭＣ−１１２１Ｂの重鎖のアミノ酸配列、および非酵素的切断が起こる部位を示す。
【図３】分解したＩＭＣ−１１２１Ｂおよびそのサイズ排除フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図４】ＩＭＣ−１１２１ＢのＤＳＣ解析に関する回帰プロットを示す。
【図５】撹拌実験に関する予測プロファイラーを示す。
【図６】４０℃におけるＩＭＣ−１１２１Ｂの実時間加速温度安定性の予測プロファイラーを示す。
【図７】−２０℃におけるＩＭＣ−１１２１Ｂの実時間加速温度安定性の予測プロファイラーを示す。
【図８】ＰＢＳ中および１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）中、４０℃および室温で１５０日間インキュベートした後のＩＭＣ−１１２１ＢのＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図９】ＰＢＳ中および１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）中のＩＭＣ−１１２１Ｂのモノマー百分率の変動を、４０℃および室温におけるインキュベーション時間の関数として示す。
【図１０】ＰＢＳ中および１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）中のＩＭＣ−１１２１Ｂの凝集物百分率の変動を、４０℃および室温におけるインキュベーション時間の関数として示す。
【図１１】ＰＢＳ中および１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）中のＩＭＣ−１１２１Ｂの分解物百分率の変動を、４０℃および室温におけるインキュベーション時間の関数として示す。
【図１２】室温および４０℃で３０日および１５０日間インキュベートした後のＩＭＣ−１１２１ＢのＩＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１３】室温および４０℃で１５０日間インキュベートした後のＰＢＳ中および１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）中のＩＭＣ−１１２１Ｂの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図１４】室温および４０℃で１５０日間インキュベートした後のＩＭＣ−１１２１Ｂの等電点電気泳動を示す。
【図１５】ＩＭＣ−１１２１Ｂ凍結乾燥プロセスの冷凍−乾燥サイクルを示す。
【図１６】４０℃および５０℃で１００日間インキュベートした後のＩＭＣ−１１２１Ｂ凍結乾燥生成物に関する残存モノマー百分率を示す。
【図１７】凍結乾燥製剤および溶液製剤中のＩＭＣ−１１２１Ｂに関する残存モノマー百分率を、５０℃におけるインキュベーション時間の関数として示す。
【図１８】凍結乾燥製剤および溶液製剤中のＩＭＣ−１１２１Ｂに関する凝集物百分率を、５０℃におけるインキュベーション時間の関数として示す。
【図１９】凍結乾燥製剤および溶液製剤中のＩＭＣ−１１２１Ｂに関する分解物百分率を、５０℃におけるインキュベーション時間の関数として示す。
【図２０】凍結乾燥製剤および溶液製剤中のＩＭＣ−１１２１Ｂに関する残存モノマー百分率を、４０℃におけるインキュベーション時間の関数として示す。
【図２１】凍結乾燥製剤および溶液製剤中のＩＭＣ−１１２１Ｂに関する凝集物百分率を、４０℃におけるインキュベーション時間の関数として示す。
【図２２】凍結乾燥製剤および溶液製剤中のＩＭＣ−１１２１Ｂに関する分解物百分率を、４０℃におけるインキュベーション時間の関数として示す。
【図２３】５０℃でインキュベートした後の凍結乾燥製剤化されたＩＭＣ−１１２１Ｂおよび溶液製剤化されたＩＭＣ−１１２１Ｂに関する残存モノマー百分率を示す。
【図２４】５０℃でインキュベートした後の凍結乾燥製剤化されたＩＭＣ−１１２１Ｂおよび溶液製剤化されたＩＭＣ−１１２１Ｂに関する凝集物百分率を示す。
【図２５】５０℃でインキュベートした後の凍結乾燥製剤化されたＩＭＣ−１１２１Ｂおよび溶液製剤化されたＩＭＣ−１１２１Ｂに関する分解物百分率を示す。
【図２６】４０℃でインキュベートした後の凍結乾燥製剤化されたＩＭＣ−１１２１Ｂおよび溶液製剤化されたＩＭＣ−１１２１Ｂに関する残存モノマー百分率を示す。
【図２７】溶液製剤および冷凍乾燥製剤中、４０℃でインキュベートしたＩＭＣ−１１２１Ｂに関する凝集物百分率を示す。
【図２８】４０℃でインキュベートした後の凍結乾燥製剤化されたＩＭＣ−１１２１Ｂおよび溶液製剤化されたＩＭＣ−１１２１Ｂに関する分解物百分率を示す。
【図２９】溶液製剤および冷凍乾燥製剤中、４０℃で３ヶ月間インキュベートしたＩＭＣ−１１２１ＢのＩＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３０】室温でインキュベートした後の凍結乾燥製剤化されたＩＭＣ−１１２１Ｂおよび溶液製剤化されたＩＭＣ−１１２１Ｂに関する残存モノマー百分率を示す。
【図３１】室温でインキュベートした後の凍結乾燥製剤化されたＩＭＣ−１１２１Ｂおよび溶液製剤化されたＩＭＣ−１１２１Ｂに関する凝集物百分率を示す。
【図３２】室温でインキュベートした後の凍結乾燥製剤化されたＩＭＣ−１１２１Ｂおよび溶液製剤化された１１２１Ｂに関する分解物百分率を示す。
【図３３】室温で３ヶ月間インキュベートした後の溶液製剤中および冷凍乾燥製剤中のＩＭＣ−１１２１ＢのＩＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３４】室温、４０℃および５０℃で３ヶ月間インキュベートした後の溶液製剤中および冷凍乾燥製剤中のＩＭＣ−１１２１Ｂの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図３５】室温、４０℃および５０℃で３ヶ月間インキュベートした後の溶液製剤中および冷凍乾燥製剤中のＩＭＣ−１１２１Ｂの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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