(57)【要約】【課題】滅菌判定のためのホログラフィックセンサーの使用の提供。【解決手段】バイオロジカルインジケータを用いて滅菌処理の効果を判定する方法において、上記バイオロジカルインジケータは、ホログラフィックセンサー、及び、芽胞又は酵素を備える。上記方法、及び、上記バイオロジカルインジケータは、ホログラフィックセンサーに基づいて滅菌処理の効果を示し、従来のｐＨ指示薬、蛍光団、又は、発色団を必要としない。【選択図】図２
2009501592.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオロジカルインジケータを用いて滅菌処理の効果を判定する方法であって、
前記バイオロジカルインジケータがホログラフィックセンサーと芽胞とを有し、前記ホログラフィックセンサーが内部又は上部にホログラムが配置された支持媒体を備え、前記方法が以下の工程：
ａ）芽胞を滅菌剤と接触させる工程；
ｂ）前記芽胞を増殖培地と接触させ、生存芽胞が成長することを可能にする工程であって、芽胞の成長が前記支持媒体の物性の変化を引き起こし、且つ、その変化は前記ホログラフィックセンサーの光学特性の変化を引き起こす工程；及び、
ｃ）芽胞の成長に起因する変化を検知するために前記ホログラフィックセンサーの光学特性を観察する工程：
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
芽胞の成長に起因するｐＨの変化は、前記支持媒体の物性の変化を引き起こす
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記芽胞は前記支持媒体の内部又は上部にある
ことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
膨潤等の成長に起因する前記芽胞の物理的変化は、前記支持媒体の物性の変化を引き起こす
ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
芽胞の成長によって生成された代謝産物は、前記支持媒体と相互作用し、前記支持媒体の物性の変化を引き起こす
ことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記代謝産物はカルシウムイオン、グルコース、又は、ＤＰＡである
ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
バイオロジカルインジケータを用いて滅菌処理の効果を判定する方法であって、
前記バイオロジカルインジケータがホログラフィックセンサーと酵素とを有し、前記ホログラフィックセンサーが内部又は上部にホログラムが配置された支持媒体を備え、
前記酵素の活性が試験微生物の生存と相関しており、
前記酵素の活性が前記酵素と前記支持媒体との相互作用の程度を判定し、
前記酵素の前記支持媒体との相互作用が、支持媒体の物性の変化を引き起こし、且つ、その変化はホログラフィックセンサーの光学特性の変化を引き起こし、前記方法が以下の工程：
ａ）前記酵素を滅菌剤と接触させる工程；及び、
ｂ）前記酵素の活性の変化に起因する変化を検知するために前記ホログラフィックセンサーの光学特性を観察する工程：
を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
前記支持媒体はヒドロゲルマトリックスである
ことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒドロゲルマトリックスはｐＨバッファーである
ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ホログラフィックセンサーは、細菌に対しては不透過であるが、滅菌剤は透過するフィルムで覆われている
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ホログラフィックセンサーの光学特性の変化は、視覚的に認識可能である
ことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記観察は光学読み取り器を用いて行なわれる
ことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項での使用に適したバイオロジカルインジケータであって、
内部又は上部にホログラムが配置された支持媒体を有するホログラフィックセンサー、及び、芽胞又は酵素を備えたバイオロジカルインジケータ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオロジカルインジケータを使用して滅菌処理の効果を判定する方法、及び、このような方法で使用するバイオロジカルインジケータに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオロジカルインジケータは、感染制御分野において、液体、蒸気又はガスプラズマ滅菌剤を使用した滅菌処理の効果をモニターするのに用いられる。滅菌対象物にはすべてバイオロジカルインジケータが備えられ、バイオロジカルインジケータは滅菌処理による抗菌効果を確認するための品質管理装置として働く。
【０００３】
バイオロジカルインジケータは、従来のバイオロジカルインジケータ、ラピッドリードアウトバイオロジカルインジケータ（ｒａｐｉｄ  ｒｅａｄｏｕｔ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）、及び、デュアルラピッドリードアウトバイオロジカルインジケータ（ｄｕａｌ  ｒａｐｉｄ  ｒｅａｄｏｕｔ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）に分類することができる。これらの種類のそれぞれにおいて、滅菌処理が不完全であれば、酵素、微生物、又は、その両者である生物試料での検知可能な変化によって示される。
【０００４】
従来のバイオロジカルインジケータは、インジケータ内の微生物の試験個体群への影響を測定することにより、滅菌処理の効果を判定する、正確、且つ、直接的な方法を提供する。滅菌処理により試験微生物にとって致死的な条件にならなければ、生存細胞は潜伏期及び成長期へ進み、検知される。試験微生物は、自然汚染により存在し得る微生物より、モニターする滅菌処理法に対して数倍の耐性を有する微生物であることが一般的である。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の芽胞等、強力な耐性を有する芽胞を用いることができる。
【０００５】
従来のバイオロジカルインジケータは、通常、増殖培地と、芽胞試験紙を有する別の外部容器で包まれたｐＨ指示薬染料とを含むアンプルから成る。滅菌中に、芽胞は滅菌剤に暴露されるが、増殖培地とインジケータとは接触しない。滅菌後、内部に増殖培地を含有するアンプルは破壊、開放され、増殖培地と芽胞との接触が可能になる。試験芽胞が滅菌処理後に生存している場合、その存在は、増殖培地のｐＨの変化、及び、それに伴うｐＨ指示薬染料の色の変化から検知され得る。
【０００６】
この種のバイオロジカルインジケータは、正確、且つ、自蔵型である（試験手順のいかなる時点においても開放する必要はない）が、時間がかかり、結果を得るために最大７日間要する。実際問題として、滅菌から確認結果を得るまでの期間、設備が休止することなく用いられることが多くなる。バイオロジカルインジケータが好ましくない結果を最初に出さないようにするのではなく、滅菌に関する実際の問題を同定し、改善するために、好ましくない結果も後で利用する。
【０００７】
より迅速な結果は、いわゆる「ラピッドリードアウト」バイオロジカルインジケータを用いて得られる。この場合、芽胞の代わりに酵素を用いる。通常、酵素は芽胞由来であり、滅菌後の酵素活性は芽胞の生存と相関している。酵素が滅菌剤に暴露されると、蛍光酵素基質又は色素酵素基質を含むアンプルが破壊され、活性を持ち得る酵素がまだ存在する場合、生じる酵素変性産物が、色又は発光の変化から検知される。
【０００８】
いわゆる「デュアルラピッドリードアウト」インジケータでは、従来の方法と酵素を用いた方法の両方を組み合わせているので、迅速に、３時間で結果を出すことが可能であり、結果を後に芽胞増殖試験により確認することができる。特許文献１は、液体滅菌剤の酵素を洗浄する傾向を防ぐために、不溶解性ゲルマトリックス内の沈殿物内に酵素が含まれるラピッドリードアウト滅菌に関する。
【０００９】
ホログラフィックセンサーは公知である。特に、特許文献２、及び、特許文献３に記述されている。このようなセンサーは、内部又は上部にホログラムが配置された支持媒体を有し、且つ、培地に作用した結果、センサーの光学特性に変化を引き起こす検体の存在に反応する。
【特許文献１】米国特許ＵＳ２００２／０１１５１３１号
【特許文献２】国際特許ＷＯ９５／２６４９９号
【特許文献３】国際特許ＷＯ９９／６３４００号
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要約）
本発明の第１の態様によれば、バイオロジカルインジケータを用いて滅菌処理の効果を判定する方法において、上記バイオロジカルインジケータがホログラフィックセンサーと芽胞とを有し、上記ホログラフィックセンサーが内部又は上部にホログラムが配置された支持媒体を備え、上記方法が以下の工程：
ａ）芽胞を滅菌剤と接触させる工程；
ｂ）上記芽胞を増殖培地と接触させ、生存芽胞が成長することを可能にする工程であって、芽胞の成長が上記支持媒体の物性の変化を引き起こし、且つ、その変化は上記ホログラフィックセンサーの光学特性の変化を引き起こす工程；及び、
ｃ）芽胞の成長に起因する変化を検知するために上記ホログラフィックセンサーの光学特性を観察する工程：
を含むことを特徴とする方法。
【００１１】
本発明の第２の態様によれば、バイオロジカルインジケータを用いて、滅菌処理の効果を判定する方法において、上記バイオロジカルインジケータがホログラフィックセンサーと酵素とを有し、上記ホログラフィックセンサーが内部又は上部にホログラムが配置された支持媒体を備え、
上記酵素の活性が試験微生物の生存と相関しており、
上記酵素の活性が上記酵素と上記支持媒体との相互作用の程度を判定し、
上記酵素の上記支持媒体との相互作用が、支持媒体の物性の変化を引き起こし、且つ、その変化はホログラフィックセンサーの光学特性の変化を引き起こし、
上記方法が以下の工程：
ａ）上記酵素を滅菌剤と接触させる工程；及び、
ｂ）上記酵素の活性の変化に起因する変化を検知するために上記ホログラフィックセンサーの光学特性を観察する工程：
を含むことを特徴とする方法。
【００１２】
本発明の第３の態様によれば、上述した方法での使用に適したバイオロジカルインジケータは、内部又は上部にホログラムが配置された支持媒体を有するホログラフィックセンサー、及び、芽胞又は酵素を備える。
【００１３】
本発明の方法、及び、バイオロジカルインジケータは、ホログラフィックセンサーに基づいて滅菌処理の効果を示し、従来のｐＨ指示薬、蛍光団、又は、発色団を必要としない。ホログラフィックセンサーの光学特性は、肉眼又は光学読み取り器で読み取り可能である。滅菌処理の効果を判定するためにホログラフィックセンサーを用いることで、精度が向上し、且つ、公知のインジケータより迅速に結果を出すことができる。
（図面の簡単な説明）
【００１４】
図１は、本発明の実施形態によるバイオロジカルインジケータの断面図である。
【００１５】
図２は、本発明の別の実施形態によるバイオロジカルインジケータの断面図である。
【００１６】
（発明の説明）
ホログラフィックセンサーは非常に用途が広く、様々な条件に対して感受性を有するように構成することができる。例えば、ホログラフィックセンサーは、酵素を有していてもよく、その活性は試験微生物の生存と相関する。この場合、ホログラフィックセンサーは、酵素と相互作用する培地を有していてもよく、相互作用の程度は酵素の活性に応じて変動してもよい。
【００１７】
好ましい実施形態では、センサーは、微生物の芽胞を有する。この実施形態では、増殖培地が滅菌剤と接触し、生存芽胞の成長が始まった後、ホログラフィックセンサーと接触することができるように、増殖培地が備えられている。ホログラフィックセンサーは、バイオマーカー（Ｈ＋、ＤＰＡ等）として用いられる芽胞代謝産物に感受性を有するように構成することができる。芽胞がセンサー自体に組み込まれているので、バイオロジカルインジケータの感受性が向上し、且つ、反応時間が迅速になる。また、芽胞の成長に起因する膨潤等の物理的変化が単独で、支持媒体との相互作用をもたらし、ホログラフィックセンサーの光学特性に検知可能な変化を引き起こしてもよい。
【００１８】
また、従来のｐＨバイオロジカルセンサーと同じ機序に基づくものであるが、より迅速に結果を出すことができるｐＨ感受性ホログラムを用いてもよい。
【００１９】
本発明において観察するホログラフィックセンサーの光学変化は、言葉で表されたホログラム画像の変化であってもよい。従って、滅菌の成否について、成功裏に滅菌されたことを示すレ印等で、わかりやすく示すことができる。また、「安全（ｓａｆｅ）」、「無菌（ｓｔｅｒｉｌｅ）」、「汚染（ｐｏｌｌｕｔｅｄ）」等の言葉を用いてもよい。
【００２０】
本発明の方法は、ホログラフィックセンサーを有するバイオロジカルインジケータを使用する。ホログラフィックセンサーは、内部又は上部にホログラムが配置された支持媒体を有する。上記支持媒体は、ヒドロゲルマトリックスであることが望ましい。このようなセンサーは、国際特許ＷＯ９５／２６４９９号公報、国際特許ＷＯ９９／６４３００号公報、及び、国際特許ＷＯ０３／０８７８９９号公報に概して記述されており、上記明細書の内容は参照として本明細書に組み込まれる。
【００２１】
ホログラフィックセンサーは、化学種、生物種、又は、物理的条件のような様々な刺激と相互作用を起こす。上記相互作用によって支持媒体の物性が変化し、このような変化が、ホログラフィックセンサーの光学特性を遠隔検知可能に変化させる。
【００２２】
変化を呈する支持媒体の物性は、電荷密度、体積、形、密度、粘度、強度、硬度、電荷、疎水度、膨張度、整合度、架橋密度等の任意の物性であってもよい。上記物性が変化すると、ホログラムの分極率、反射率、屈折率、又は、吸光度等の光学特性も変化する。上記ホログラムの光学特性の変化は、色の可視変化として観察可能な波長の変化であることが好ましい。
【００２３】
ホログラフィックセンサーは、ミラーが背面に設置された透明な基板（プラスチック又はガラス）上を覆う、特別な構成の検体応答性ヒドロゲルに１本の分光レーザービームを透過させることにより得られる。写真の現像及び固定の前に、入射レーザービームと反射レーザービームとの干渉によって、ヒドロゲル表面にほぼ平行な平面状にホログラフィック縞が形成される。通常の白色光照明の下では、各縞平面からの部分反射間の建設的干渉により、ブラッグの式を満たす波長を有する特有のスペクトルピークが生じる。
【００２４】
縞の間隔又は平均屈折率の変化によって、肉眼又は分光測光法で識別可能な反射ホログラムの波長（色）に観察可能な変化が生じることとなる。生物種との相互作用の結果、ポリマーマトリクスが膨潤する場合、縞の間隔は増大し、より長い波長の光が反射されることとなる。反対に、相互作用の結果、ポリマーマトリクスが収縮する場合、長い波長の反射光から短い波長の反射光に変わる。
【００２５】
本発明で使用されるバイオロジカルインジケータはまた、生物種を有し、生物種は芽胞又は酵素であってもよい。芽胞が用いられる場合、自然汚染により存在する可能性が高いいずれの微生物よりも数倍高い滅菌に対する耐性を有する細菌又は菌類の芽胞であることが一般的である。本発明では、適切な芽胞を用いることができ、例えば、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）又は枯草菌の芽胞を用いることができる。芽胞は、支持媒体の内部又は上部のホログラフィックセンサーに組み込まれてもよく、センサーから離れた芽胞ディスク上に配置されてもよい。
【００２６】
酵素を用いる場合、酵素の活性は試験微生物の生存と相関する。例えば、米国特許第２００２／０１１５１３１号に、適切な酵素が記載されている。酵素は、ホログラフィックセンサーの支持媒体の内部又は上部に配置される。
【００２７】
製造の際に、通常はヒドロゲルの支持媒体中に芽胞又は酵素を懸濁することによって、芽胞又は酵素をセンサーに組み込むことができる。芽胞又は酵素を懸濁前に洗浄し、沈殿物へ遠心分離することができる。強力な滅菌剤に対する芽胞又は酵素の耐性は、芽胞又は酵素がホログラフィックセンサーの製造に関わる緩和な条件では概して影響されないことを意味する。芽胞又は酵素がセンサーに組み込まれている場合、いかなる物理的変化によっても支持媒体との相互作用が変化し、高い感受性が得られる。
【００２８】
本発明の一実施形態では、ホログラフィックセンサーが、芽胞成長に起因するｐＨの変化に感受性を有する。この場合、ホログラフィックセンサーは、芽胞ディスクに配置することができる芽胞から離れていてもよい。
【００２９】
また、ホログラフィックセンサーは、膨潤等の芽胞成長に起因する物理的変化、又は、芽胞成長によって生成された代謝産物（例えば、グルコース、カルシウムイオン、又は、ＤＰＡ（ジピコリン酸））に感受性を有していてもよい。
【００３０】
本発明の方法の第１工程は、滅菌剤と芽胞又は酵素とが接触することである。本発明においては、気体滅菌剤（蒸気又は抗菌性ガス等）、及び、液体滅菌剤（過酢酸液、活性塩素化合物、活性ヨウ素化合物、活性臭素化合物、過酸化水素、アルデヒド又はフェノール化合物等）を含めた任意の滅菌剤を用いることができる。
【００３１】
上記インジケータの生物種が芽胞である場合、芽胞は、生存芽胞の成長を可能にする増殖培地と接触する。本実施形態では、バイオロジカルインジケータは、任意の従来の培養培地を有する密封された容器を備える。芽胞が滅菌剤と接触した後、容器は損傷を受ける。
【００３２】
センサーの光学特性の変化は、肉眼で観察することができるが、光学読み取り器で観察するのが好ましい。光学読み取り器は、解像度１ｎｍで数百ものスペクトルバンドを測定する能力を有する分光測光器であってもよい。対照的に、人間の目は、３つのスペクトルバンド、すなわち、３つの視覚色素に対応する青、緑、赤に依存している。非常に高感度な結果が得られる分光測光器は、光学特性の非常に小さな変化をも検知することができる。
【００３３】
本発明を、添付図面を参照して実施例によって説明する。図１及び図２に、本発明の異なる実施形態で使用されるバイオロジカルインジケータを示す。
【００３４】
図１に、ホログラフィックセンサー５がｐＨ感受性支持媒体を有する実施形態を示す。このような支持媒体は、ポリマー骨格に１つ以上のイオン若しくはイオン性単量体を有すること、又は、架橋性ユニットが存在することによりｐＨ感受性を有するヒドロゲルであることが好ましい。支持媒体は、リプレイカラーが試料溶液のｐＨに依存する反射ホログラムを含んでいる。
【００３５】
滅菌剤はポート１からバイオロジカルインジケータに進入することができ、芽胞ディスク４と接触する。バイオロジカルインジケータは、さらに増殖培地３を有する容器２、及び、ｐＨ感受性ホログラフィックセンサー５を備える。滅菌剤がポート１に進入し、芽胞５と接触した後、インジケータの蓋６が押し下げられ、容器を破壊し、増殖培地を解放して芽胞と接触する。生存芽胞が成長し、ｐＨの変化を引き起こす。なお、ｐＨ感受性ホログラフィックセンサーは、従来のインジケータのｐＨ指示薬染料よりも、ｐＨの変化を検知する。
【００３６】
従来のｐＨ指示薬とは異なり、ｐＨ感受性ホログラムは非常に適応性があり、特有の特性を有する支持媒体を選択することで異なるｐＨ範囲に適合するようにｐＨ感受性ホログラムを選択することができる。例えば、ポリマー骨格の疎水性、又は、機能性単量体のｐＫａは、任意の芽胞にとって最適な結果となるように構成してもよい。
【００３７】
ｐＨ感受性ホログラフィックセンサーの別の利点は、色の適応性に加えて、ｐＨの変化に対する非常に高い感受性である。非常に小さなｐＨの変化に対して大きな波長の変化が生じ得る。この変化は従来のｐＨ指示薬の波長の変化に比べ、はるかに劇的である。例えば、波長を５００ｎｍ変更すると、ｐＨが０．２変化する。
【００３８】
ホログラフィックセンサーの光学特性の変化を検知するために、光学読み取り器と組み合わせて用いた場合、芽胞成長に関わる非常に小さなｐＨの変化をもモニターすることができる。波長解像度が１ｎｍの安価な携帯型光学読み取り器が一般的に用いられ、ｐＨ０．１単位未満の変化を検知することできる。
【００３９】
本発明の向上した感受性により、検知時間が著しく改善される。
【００４０】
本発明にはさらに、ヒドロゲルマトリックスがｐＨバッファーとして機能することができるという利点がある。芽胞成長は、炭水化物が代謝されるので、ｐＨの低下を伴う。しかしながら、炭水化物が不足してくると、微生物はアミノ酸を代謝することがあり、その結果、ｐＨが上昇し、従来のｐＨ指示薬では初期色に戻り、誤検出が起きる。従来のバイオロジカルインジケータではこれを回避するために、リバージョンバッファーを添加し、いかなる色変化をも不可逆にする場合が多い。本発明においては、ヒドロゲルは固有の緩衝能力を有していてもよく、カラーリバージョンバッファーを必要としなくてもよい。
【００４１】
図２に、ホログラフィックセンサー７又はその付近に芽胞８が配置された、本発明の実施形態で使用されるバイオロジカルインジケータを示す。バイオロジカルインジケータは、滅菌剤がバイオロジカルインジケータへ進入するためのポート１、蓋６、容器２、及び、増殖培地３を有していてもよい。公知のバイオロジカルインジケータ等、従来のものは、例えば、米国特許ＵＳ２００２／０１１５１３１号にあるように、インジケータが周囲に存在する細菌に対して不透過である。
【００４２】
滅菌剤がポートに進入し、芽胞８と接触した後、蓋が押し下げられ、芽胞８と接触する増殖培地３が解放される。その後、生存芽胞が成長し、光学特性の変化を引き起こすセンサーの物理的又は化学的相互作用が起きる。
【００４３】
本発明の一実施形態では、代謝産物受容体は、芽胞の成長で生成又は消費された代謝産物と反応する支持媒体に組み込まれる。支持媒体中又はその上部に芽胞を配置すると、生成又は消費された代謝産物が支持媒体に集中し、非常に早い反応時間で媒体と直ちに相互作用することとなる。この方法では、迅速に結果が得られ、一般的には３時間未満で結果が得られることを見出した。
【００４４】
代謝産物感受性センサーを用いなくとも、芽胞の成長に関連した物理的変化が培地に影響を及ぼし、センサーに観察可能な変化をもたらす。
【００４５】
酵素を用いる場合、酵素とホログラフィックセンサーの支持媒体との相互作用は、試験微生物の生存と相関している酵素の活性によって判定されるので、増殖培地を必要としない。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、本発明の実施形態によるバイオロジカルインジケータの断面図である。
【図２】図２は、本発明の別の実施形態によるバイオロジカルインジケータの断面図である。
【図１】
2009501592.tif 000003
【図２】
2009501592.tif 000004
【国際調査報告】
2009501592.tif 000005
2009501592.tif 000006
2009501592.tif 000007
2009501592.tif 000008