(57)【要約】  本発明は、変異ＤＮＡ結合ポリペプチド領域および変異または野生型ＤＮＡポリメラーゼポリペプチド領域を含むキメラＤＮＡポリメラーゼに関する組成物および方法に関する。
2009501530.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ結合領域およびポリメラーゼ領域を含むキメラＤＮＡポリメラーゼであって、前記ＤＮＡ結合領域が配列番号２のアミノ酸位置１３、１６、４０、４１、４５、５５、５６、６１もしくは６３、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の対応する位置に１つ以上の変異を有する、キメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
前記１つ以上の変異が、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ、Ｔ４０Ｓ、Ｇ４１Ａ、Ｖ４５Ｌ、Ｌ５５Ｖ、Ｑ５６Ｄ、Ｑ６１Ｅ、およびＫ６３Ｒ、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の対応する変異からなる群から選択される、請求項１に記載のキメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
前記ＤＮＡ結合領域が、Ｓｓｈ７ｂ、ＲｉｂｏＰ３、Ｓｔｏ７ｅ、Ｓａｃ７ｄ、Ｓａｃ７ｅおよびＳａｃ７ａからなる群から選択される、請求項１に記載のキメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
前記ＤＮＡ結合領域が、配列番号８、９、１０、１２、１４、および１６からなる群から選択される、請求項３に記載のキメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
ＤＮＡ結合領域およびポリメラーゼ領域を含むキメラＤＮＡポリメラーゼであって、前記ＤＮＡ結合領域が配列番号２のアミノ酸位置４０、４１、もしくは４５、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の対応する位置に１つ以上の変異を有する、キメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
前記１つ以上の変異が、Ｔ４０Ｓ、Ｇ４１Ａ、およびＶ４５Ｌ、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の対応する変異からなる群から選択される、請求項５に記載のキメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
前記ＤＮＡ結合領域が、Ｓｓｈ７ｂ、ＲｉｂｏＰ３、Ｓｔｏ７ｅ、Ｓａｃ７ｄ、Ｓａｃ７ｅ、およびＳａｃ７ａからなる群から選択される、請求項５に記載のキメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
前記ＤＮＡ結合領域が、配列番号８、９、１０、１２、１４、および１６からなる群から選択される、請求項７に記載のキメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項９】
ＤＮＡ結合領域およびポリメラーゼ領域を含むキメラＤＮＡポリメラーゼであって、前記ＤＮＡ結合領域が配列番号２のアミノ酸位置４０、４１、４５、５５、６１もしくは６３、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の対応する位置に１つ以上の変異を有する、キメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ結合領域変異が、Ｔ４０Ｓ、Ｇ４１Ａ、Ｖ４５Ｌ、Ｌ５５Ｖ、Ｑ６１ＥもしくはＫ６３、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の対応する変異からなる群から選択される、請求項９に記載のキメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ結合領域が、Ｓｓｈ７ｂ、ＲｉｂｏＰ３、Ｓｔｏ７ｅ、Ｓａｃ７ｄ、Ｓａｃ７ｅ、およびＳａｃ７ａからなる群から選択される、請求項９に記載のキメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ結合領域が、配列番号８、９、１０、１２、１４、および１６からなる群から選択される、請求項１１に記載のキメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１３】
ＤＮＡ結合領域およびポリメラーゼ領域を含むキメラＤＮＡポリメラーゼであって、前記ＤＮＡ結合領域が配列番号２のアミノ酸位置１３、１６、４０、４５、５５、５６、および６３、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の対応する位置に変異を有する、キメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１４】
前記変異が、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ、Ｔ４０Ｓ、Ｖ４５Ｌ、Ｌ５５Ｖ、Ｑ５６Ｄ、およびＫ６３Ｒ、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の対応する変異である、請求項１３に記載のキメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１５】
ＤＮＡ結合領域およびポリメラーゼ領域を含むキメラＤＮＡポリメラーゼであって、前記ＤＮＡ結合領域が配列番号４のアミノ酸配列を含む、キメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１６】
前記ＤＮＡ結合領域がＳｓｈ７ｂ、ＲｉｂｏＰ３、Ｓｔｏ７ｅ、Ｓａｃ７ｄ、Ｓａｃ７ｅ、およびＳａｃ７ａからなる群から選択される、請求項１３に記載のキメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ結合領域が配列番号８、９、１０、１２、１４および１６からなる群から選択される、請求項１６に記載のキメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１８】
ＤＮＡ結合領域およびポリメラーゼ領域を含むキメラＤＮＡポリメラーゼであって、前記ＤＮＡ結合領域が配列番号２のアミノ酸位置１３、１６、４０、４１、４５、５５、５６、６１、および６３、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の対応する位置に変異を有する、キメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１９】
前記ポリメラーゼ領域が古細菌ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１、５、９、１３、１５、１８または２０のいずれか一つに記載のキメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２０】
前記ポリメラーゼ領域が熱安定性ポリメラーゼ活性を有する、請求項１、５、９、１３、１５、１８または２０のいずれか一つに記載のキメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２１】
前記ポリメラーゼ領域がＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１、５、９、１３、１５または１８のいずれか一つに記載のキメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２２】
前記ポリメラーゼ領域が配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９５％は同一である、請求項２５に記載のキメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２３】
前記ポリメラーゼ領域がＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１、５、９、１３、１５または１８のいずれか一つに記載のキメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２４】
配列番号２０のアミノ酸配列を含む、キメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２５】
請求項１、５、９、１３、１５または１８、または２４のいずれか一つに記載のＤＮＡポリメラーゼを含む組成物。
【請求項２６】
請求項１、５、９、１３、１５または１８、または２４のいずれか一つに記載のキメラＤＮＡポリメラーゼをコードする、単離された核酸。
【請求項２７】
請求項３０に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２８】
請求項３１に記載のベクターで形質移入される、宿主細胞。
【請求項２９】
請求項１、５、９、１３、１５または１８、または２４のいずれか一つに記載のキメラＤＮＡポリメラーゼ、およびそのための包装材料を含むキット。
【請求項３０】
を含む、ＤＮＡを合成する方法。
【請求項３１】
ａ）請求項１、５、９、１３、１５または１８、または２４のいずれか一つに記載のキメラＤＮＡポリメラーゼを提供するステップと、
【請求項３２】
ｂ）前記キメラＤＮＡポリメラーゼを核酸鋳型に接触させることで、前記酵素のＤＮＡ合成を可能にするステップと、
【請求項３３】
前記ポリメラーゼ領域が変異ポリメラーゼを含む、請求項１、５、９、１３、１５または１８のいずれか一つに記載のキメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３４】
前記変異ポリメラーゼが、ウラシル検知活性の低下をもたらすＶ９３Ｒ、Ｖ９３Ｅ、Ｖ９３Ｄ、Ｖ９３ＫまたはＶ９３Ｎ変異を有する、請求項３５に記載のキメラＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３５】
前記変異ポリメラーゼが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性低下をもたらすＤ１４１Ａおよび／またはＥ１４３Ａ変異を有する、請求項３５に記載のキメラＤＮＡポリメラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、参照によってその全体を本明細書に援用する２００５年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／６９９，９３７号明細書に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼの特性を改変する１つの方法は、必要な活性を有する１つ以上のタンパク質領域とＤＮＡポリメラーゼが組み合わさったキメラＤＮＡポリメラーゼを発生させることである。パブロフら（Ｐａｖｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９９：１３５１０〜１３５１５頁（２００２年））に記載されるように、ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡトポイソメラーゼＶのヘリックス−ヘアピン−へリックスＤＮＡ結合モチーフにフレーム中で結合して、キメラＤＮＡポリメラーゼの伸長能、塩抵抗性、および熱安定性が増大されることが示されている。また、参照することにより全体が本明細書に含まれる国際特許出願公開第０１／９２５０１  Ａ１号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００４／００８１９６３  Ａ１号明細書で開示されるように、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）由来の野生型Ｓｓｏ７ｄまたはＳａｃ７ｄの配列非特異的ＤＮＡ結合タンパク質と、ＰｆｕまたはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼとの融合は、これらのＤＮＡポリメラーゼの伸長能を大幅に増大させることが示された。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、第１の領域および第２の領域を含むキメラＤＮＡポリメラーゼに関する。第１の領域は、変異型または野生型ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを含み、第２の領域は変異ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む。ＤＮＡ結合領域は完全なＤＮＡ結合ポリペプチド配列、またはその断片を含んでもよい。同様にＤＮＡポリメラーゼ領域は、完全なＤＮＡポリメラーゼポリペプチド配列、またはその断片を含んでもよい。
【０００４】
第１の態様において、本発明はＤＮＡ結合領域およびＤＮＡポリメラーゼ領域を有するキメラＤＮＡポリメラーゼに関する。キメラＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ結合領域は、配列番号２の１３、１６、４０、４１、４５、５５、５６、６１または６３からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の対応する位置が変異される。
【０００５】
関連する態様において、本発明はＤＮＡ結合領域およびＤＮＡポリメラーゼ領域を有するキメラＤＮＡポリメラーゼに関する。キメラＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ結合領域は、配列番号２のアミノ酸位置１３、１６、４０、４５、５５、５６、および６３、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の対応する位置が変異される。
【０００６】
別の態様において、本発明はＤＮＡ結合領域およびポリメラーゼ領域を有するキメラＤＮＡポリメラーゼを提供する。この態様では、ＤＮＡ結合領域は配列番号２のアミノ酸位置１３、１６、４０、４１、４５、５５、５６、６１、および６３、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の対応する位置が変異される。
【０００７】
さらに別の態様において、本発明はＤＮＡ結合領域およびＤＮＡポリメラーゼ領域を有するキメラＤＮＡポリメラーゼに関する。この態様では、ＤＮＡ結合領域は配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【０００８】
本発明のなお別の態様では、本発明はＤＮＡ結合領域が配列番号６のアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合領域およびポリメラーゼ領域を含む、キメラＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【０００９】
本発明のさらに別の態様では、本発明は、ＤＮＡ結合領域およびポリメラーゼ領域を含むキメラＤＮＡポリメラーゼを提供する。ＤＮＡポリメラーゼ領域はＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを含み、ＤＮＡ結合領域は変異Ｓｓｏ７ｄ  ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む。
【００１０】
本発明のさらに別の態様では、本発明は、キメラＤＮＡポリメラーゼが配列番号２０のアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合領域およびポリメラーゼ領域を含む、キメラＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【００１１】
本発明の別の態様では、本発明は、本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼを提供するステップと、キメラＤＮＡポリメラーゼと核酸テンプレートとを接触させるステップとを含む、ＤＮＡを合成する方法を提供する。
【００１２】
本発明のさらに別の態様では、本発明は、ここで述べるキメラＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸を発現することによって、キメラＤＮＡポリメラーゼを生成する方法を提供する。
【００１３】
本発明のさらに別の態様では、本発明は、本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼを含む組成物およびキットを提供する。キットは上記の組成物のいずれか１つ、およびそのための包装材料を含む。別の態様において、本発明は、ここで述べるキメラＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸およびベクターと、そのベクターで形質転換された宿主細胞とを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
定義
ここで定義される「キメラＤＮＡポリメラーゼ」とは、変異ＤＮＡ結合領域を含む第２のアミノ酸配列に結合する、本発明の野生型または変異ＤＮＡポリメラーゼ領域を含む、第１のアミノ酸配列との融合物である。本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼは、新しい機能性タンパク質を形成するように結合した、非関連タンパク質からの２つ以上のアミノ酸配列（例えば野生型または変異ＤＮＡポリメラーゼ領域をコードする配列と、変異ＤＮＡ結合領域をコードするポリペプチド）を含有する。一実施形態では、本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼに由来する第１のアミノ酸配列、および変異Ｓｓｏ７ｄ  ＤＮＡ結合タンパク質に由来する第２のアミノ酸配列を含む。本発明は、ＤＮＡ結合領域ポリペプチドが、ここで述べる野生型または変異ＤＮＡポリメラーゼ領域のＮ末端またはＣ末端で結合する、またはあらゆる内部位置に挿入される、キメラＤＮＡポリメラーゼを包含する。
【００１５】
「領域」とは、ポリペプチド部分配列、ポリペプチド全配列、または複数のポリペプチド配列を含む、タンパク質またはタンパク質複合体の単位を指す。
【００１６】
ここでの用法では「ポリメラーゼ領域」という語句は、ヌクレオチド重合を触媒するタンパク質領域を指す。ポリメラーゼ領域は、ここで述べる核酸ポリメラーゼおよび当該技術分野で知られているものを含む。
【００１７】
ここで「ポリメラーゼ」とは、ヌクレオチド重合を触媒する（すなわちポリメラーゼ活性）酵素を指す。一般に酵素は、ポリヌクレオチド鋳型配列にアニールされたプライマーの３’末端で合成を開始し、鋳型鎖の５’末端に向かって進行する。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシヌクレオチドの重合を触媒する。一実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは熱安定性である。別の実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは古細菌ＤＮＡポリメラーゼである。
【００１８】
本発明で使用される核酸ポリメラーゼは、中温性または好熱性であってもよく、好ましくは好熱性である。中温性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩなどを含む。本発明の方法で使用しうる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ、ストッフェル（Ｓｔｏｆｆｅｌ）断片、ＶＥＮＴ（商標）およびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ、Ｔｇｏ、ＪＤＦ３、およびその変異体、変異型、および誘導体が挙げられる（米国特許第５，４３６，１４９号明細書；米国特許第４，８８９，８１８号明細書；米国特許第４，９６５，１８Ｓ号明細書；米国特許第５，０７９，３５２号明細書；米国特許第５，６１４，３６５号明細書；米国特許第５，３７４，５５３号明細書；米国特許第５，２７０，１７９号明細書；米国特許第５，０４７，３４２号明細書；米国特許第５，５１２，４６２号明細書；国際特許出願公開第９２／０６１８８号パンフレット；国際特許出願公開第９２／０６２００号パンフレット；国際特許出願公開第９６／１０６４０号パンフレット；バーンズ，Ｗ．Ｍ．（Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．）、Ｇｅｎｅ  １１２：２９〜３５頁（１９９２年）；ローヤー，Ｆ．Ｃ．（Ｌａｗｙｅｒ，Ｆ．Ｃ．）ら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．Ａｐｐｌ．２：２７５〜２８７頁（１９９３年）；フラマン，Ｊ．−Ｍ（Ｆｌａｍａｎ，Ｊ．−Ｍ）ら、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２（１５）、３２５９〜３２６０頁（１９９４年））。
【００１９】
ここでの用法では、「古細菌」ＤＮＡポリメラーゼとは、ファミリーＢ／ｐｏｌ  Ｉ−型群（例えばＰｆｕ、ＫＯＤ、Ｐｆｘ、Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、Ｔｇｏ、Ｐｗｏ）またはｐｏｌ  ＩＩ群（例えばパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＰ１／ＤＰ２  ２−サブユニットＤＮＡポリメラーゼ）のどちらかに属するＤＮＡポリメラーゼを指す。一実施形態では「古細菌」ＤＮＡポリメラーゼとは、パイロコッカス種（フリオサス、ＧＢ−Ｄ種、ウーセイ（ｗｏｅｓｉｉ）、アビシ（ａｂｙｓｓｉ）、ホリコシ（ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ））と、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種（コダカレンシス（ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）ＫＯＤｌ、リトラリス（ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、ナイン・ディグリーズ・ノース（９  ｄｅｇｒｅｅｓ  Ｎｏｒｔｈ）−７種、ＪＤＦ−３種、ゴルゴナリアス（ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ））と、ピロディクチウム・オカルタム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍｓ）と、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）から単離されるＤＮＡポリメラーゼを含む熱安定性古細菌ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＣＲ可能）を指すが、これらに限定されるものではない。適切な古細菌は＞８０−８５℃の最大生育温度、または＞７０−８０℃の最適生育温度を示すことが推定される。Ｐｆｕ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ＫＯＤ（東洋紡（Ｔｏｙｏｂｏ））、Ｐｆｘ（ライフ・テクノロジーズ・インコーポレーテッド（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．））、Ｖｅｎｔ（ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ））、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ））、Ｔｇｏ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、および、Ｐｗｏ（ロシュ）を含む、古細菌ｐｏｌ  Ｉ  ＤＮＡポリメラーゼ群からの適切なＰＣＲ酵素が市販されている。上記に記載したものと関連するさらなる古細菌は、次の参考文献に記載される：ロブ，Ｆ．Ｔ．（Ｒｏｂｂ，Ｆ．Ｔ．）およびプレース，Ａ．Ｒ．（Ｐｌａｃｅ，Ａ．Ｒ．）編、「古細菌：実験室マニュアル（Ａｒｃｈａｅａ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９５年）。
【００２０】
ここで「熱安定性」とは、例えば同様の活性がある非熱安定性形態の酵素と比べて、熱に対して安定で耐熱性であって、例えば５０〜１００℃などの高温で機能する酵素を指す。例えばＰ．フリオサス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｍ．ジャナシィ（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、Ａ．フルギダス（Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ）またはＰ．ホリコシ（Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）などの好熱性生物に由来する熱安定性核酸ポリメラーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の核酸ポリメラーゼと比べて、高温でより安定しており活性がある。Ｐ．フリオサスから単離された代表的な熱安定性核酸ポリメラーゼ（Ｐｆｕ）については、ランドバーク（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ）ら、Ｇｅｎｅ、１０８：１〜６頁（１９９１年）に記載されている。さらに別の代表的な温度安定性ポリメラーゼとしては、例えば好熱性細菌サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、サーマス・ルバー（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（これは一覧の他のものよりもいくらか低い最適温度を有する）、サーマス・ラクテウス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ）、サーマス・ルーベンス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｎｓ）、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、または好熱性古細菌サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）およびメタノサーマス・フェルビズス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｅｒｖｉｄｕｓ）から抽出されたポリメラーゼを含む。
【００２１】
二重鎖核酸がＰＣＲサイクル中に高温（約９５℃）への曝露によって変性される熱サイクル工程では、温度安定性ポリメラーゼが好ましい。
【００２２】
ここで「変異ＤＮＡポリメラーゼ」とは、ＤＮＡ重合活性、塩基類似体検知活性、３’−５’または５’−３’エキソヌクレアーゼ活性、処理能力改良ヌクレオチド類似体組み込み活性、プルーフリーディング、忠実度、効率、特異性、室温での熱安定性および内的ホットスタート能力またはＤＮＡ重合低下、トリヌクレオチド反復伸長またはホモポリマー伸長がある鋳型上の増幅スリッページ低下、増幅サイクル減少、伸長時間減少、阻害剤（例えば高塩分、核酸精製試薬）に対する感受性低下、最適反応条件の変化（例えばｐＨ、ＫＣＬ）、およびここで述べる用途に必要なポリメラーゼ量の減少を含むが、これらに限定されるものではないと定義される１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ活性を調節する１つ以上の変異を含む、と定義されるＤＮＡポリメラーゼを指す。
【００２３】
ここで用語「ＤＮＡ結合領域」は、Ｓｓｏ７ｄポリペプチドまたはＳｓｏ７ｄ様ポリペプチド中に１つ以上の変異を含む、核酸およびポリペプチド変異体および種間相同体を指す。Ｓｓｏ７ｄ様ポリペプチドは、Ｓａｃ７ｄ、Ｓａｃ７ｅ、Ｓｓｈ７ｂ、ＲｉｂｏＰ３、Ｓｔｏ７ｅ、およびＳａｃ７ａを含む。一実施形態ではＤＮＡ結合領域は、配列番号２、４、６、８、９、１０、１２、１４および１６のアミノ酸配列中に、１またはそれ以上の変異を有する。変異は配列番号２のアミノ酸位置１３、１６、４０、４１、４５、５５、５６、６１または６３、およびその相同体中の対応するアミノ酸残基に起きる。本用語は、配列非特異的二本鎖ＤＮＡ結合活性を有する全長ポリペプチドとポリペプチド断片の両方を含む。ＤＮＡ結合領域については、どちらも参照によってその全体が本明細書に援用される、国際特許出願公開第ＷＯ０１／９２５０１号および米国特許出願公開第２００４／０２１９５５８号明細書中に記載される。
【００２４】
ここで「結合した」とは、ポリペプチド領域を機能性に結合するために当該技術分野で知られているあらゆる方法を指し、介在性領域ありまたはなしの組み換え融合、インテイン媒介融合、非共有結合会合、およびジスルフィド結合を含む共有結合、水素結合、静電結合、および立体配座結合が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２５】
用語「対応する」は、タンパク質配列間または領域間の類似性または相同性の文脈で使用される場合、第１のポリペプチド中の特定位置のアミノ酸が、第１のポリペプチドと最適大域配列アラインメントにある第２のポリペプチド中の対応するアミノ酸と同一または類似であることを意味する。最適大域アラインメントは、例えばニードルマン−ブンシュ・アルゴリズム（ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３頁（１９７０年））を使用して得られる。「同一性」とは、第１のポリペプチド中の特定位置のアミノ酸が第１のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと最適大域アラインメントにある、第２のポリペプチド中の対応するアミノ酸またはヌクレオチドと同一であることを意味する。同一性とは対照的に、「類似性」は同類置換であるアミノ酸を包含する。「同類」置換とは、ブロサム６２（ｂｌｏｓｕｍ６２）置換マトリックスに正のスコアを有するあらゆる置換である（ヘンチコフ（Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ）およびヘンチコフ（Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５〜１０９１９頁（１９９２年））。一般的な同類置換は、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅ間、ＳｅｒおよびＴｈｒ間、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、およびＡｓｎ残基間、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、およびＡｒｇ残基間、または芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒ間に見られる。
【００２６】
「対応する」配列または領域を判定するのに有用な、ポリペプチドアラインメントのためのニードルマン−ブンシュ・アラインメントアルゴリズムを使用した、最適大域配列アラインメントのパラメーターの例は、次のとおりである。置換マトリックス：ブロサム６２、ギャップスコア機能：−Ａ−Ｂ＊ＬＧ（式中、Ａ＝１１（ギャップペナルティ）、Ｂ＝１（ギャップ長ペナルティ）、およびＬＧはギャップ長である）。ニードルマン−ブンシュ・アルゴリズムとこれらのパラメーターを使用して、または当該技術分野で知られているその他のアラインメントソフトウェアを使用して、当業者は特定のアミノ酸、アミノ酸配列、または例えばＳｓｏ７ｄ（配列番号２）などの特定のＤＮＡ結合タンパク質の配列領域が、アミノ酸、アミノ酸の配列または例えばここで開示されるＳｓｈ７ｂ（配列番号８）などのＳｓｏ７ｄ様ＤＮＡ結合タンパク質の配列領域に「対応する」かどうかを容易に判定できる。
【００２７】
ここで用語「鋳型ＤＮＡ分子」は、例えばプライマー伸長反応において、ＤＮＡポリメラーゼによって相補的核酸鎖がそれから合成される核酸鎖を指す。
【００２８】
ここで「増幅産物」とは、ＰＣＲ増幅反応の終了時の二重鎖ポリヌクレオチド集団を指す。増幅産物は、元のポリヌクレオチド鋳型と、ＰＣＲ反応中にポリヌクレオチド鋳型からＤＮＡポリメラーゼによって合成されるポリヌクレオチドとを含有する。
【００２９】
ここで、用語「プライマー」は、ポリヌクレオチド鋳型とハイブリダイズして、第２のポリヌクレオチド鎖の酵素的合成を刺激できる一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。本発明に従った有用なプライマーは、１０〜１００ヌクレオチド長、好ましくは１７〜５０ヌクレオチド長、より好ましくは１７〜４５ヌクレオチド長である。
【００３０】
「相補的」とは、２つのポリヌクレオチド鎖領域間、または塩基対を通じた２つのヌクレオチド間の、配列相補性の幅広い概念を指す。アデニンヌクレオチドは、チミンまたはウラシルであるヌクレオチドと特異的水素結合（「塩基対」）を形成できることが知られている。同様にシトシンヌクレオチドは、グアニンヌクレオチドと塩基対合できることが知られている。
【００３１】
用語「野生型」は、自然界に存在する原料から単離された際に、その遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。対照的に、用語「改変された」または「変異」は、野生型遺伝子または遺伝子産物と比べて、変更された特徴を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。例えば変異ＤＮＡ結合領域は、野生型ＤＮＡ結合領域とは異なる核酸およびアミノ酸配列を示す。
【００３２】
ここで「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養」という用語は同義的に使用でき、このような命名は全て後代を含む。したがって用語「形質転換体」または「形質転換細胞」は、転移数に関わらず初代検体細胞とそれに由来する培養物を含む。意図的または不注意な変異のために、全子孫がＤＮＡ含量において正確に同一でないかもしれないこともまた理解される。元の形質転換細胞中でのスクリーニングにより同一機能性を有する変異後代もまた含まれる。
【００３３】
ここで用語「ベクターで形質転換された生物」または「ベクターで形質転換された細胞」は、組み換え遺伝子構築物を保有する生物または細胞を指す。
【００３４】
ここで用語「組換え体」は、遺伝子操作によって（すなわちポリヌクレオチドまたはポリペプチドをコードする遺伝物質の改変または操作によって）、改変されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。
〔発明の詳細な説明〕
【００３５】
本発明は、第１の領域および第２の領域を含むキメラＤＮＡポリメラーゼに関する。第１の領域は変異型または野生型ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを含み、第２の領域は変異ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む。第１の態様では、本発明は、ＤＮＡ結合領域およびＤＮＡポリメラーゼ領域を有するキメラＤＮＡポリメラーゼに関する。キメラＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ結合領域は、Ｓｓｏ７ｄ（配列番号２）の位置１３、１６、４０、４１、４５、５５、５６、６１または６３、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の対応する位置の、１つ以上のアミノ酸が変異される。一実施形態では、ＤＮＡ結合領域の１つ以上の変異は、配列番号２のＥ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ、Ｔ４０Ｓ、Ｇ４１Ａ、Ｖ４５Ｌ、Ｌ５５Ｖ、Ｑ５６Ｄ、Ｑ６１ＥまたはＫ６３Ｒ、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の対応する変異を含む。アミノ酸の変更には、上記の保存的に改変された変異型が含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合領域はＳｓｏ７ｄ様ポリペプチドを含む。Ｓｓｏ７ｄ様ポリペプチドとしては、Ｓｓｈ７ｂ（配列番号８）、ＲｉｂｏＰ３（配列番号９）、Ｓｔｏ７ｅ（配列番号１０）、Ｓａｃ７ｄ（配列番号１２）、Ｓａｃ７ｅ（配列番号１４）、およびＳａｃ７ａ（配列番号１６）を含む。
【００３６】
関連する態様としては、本発明は、ＤＮＡ結合領域およびＤＮＡポリメラーゼ領域を有するキメラＤＮＡポリメラーゼに関する。キメラＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ結合領域は、配列番号２のアミノ酸位置１３、１６、４０、４５、５５、５６、および６３、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の、対応する位置が変異される。この態様の一実施形態ではＤＮＡ結合領域中の変異は、配列番号２のＥ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ、Ｔ４０Ｓ、Ｖ４５Ｌ、Ｌ５５Ｖ、Ｑ５６Ｄ、およびＫ６３Ｒ、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の対応する変異を含む。Ｓｓｏ７ｄ様タンパク質は、ＲｉｂｏＰ３、Ｓｔｏ７ｅ、Ｓａｃ７ｄ、Ｓａｃ７ｅまたはＳａｃ７ａでもよい。別の実施形態では、Ｓｓｏ７ｄ様タンパク質は、配列番号８、９、１２、１２、１４または１６のアミノ酸配列を有する。
【００３７】
別の態様では、本発明は、ＤＮＡ結合領域およびポリメラーゼ領域を含むキメラＤＮＡポリメラーゼを提供する。この態様では、ＤＮＡ結合領域は配列番号２のアミノ酸位置１３、１６、４０、４１、４５、５５、５６、６１、および６３、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の、対応する位置が変異される。この態様の一実施形態では、ＤＮＡ結合領域中のアミノ酸変化は、配列番号２のＥ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ、Ｔ４０Ｓ、Ｇ４１Ａ、Ｖ４５Ｌ、Ｌ５５Ｖ、Ｑ６１Ｅ、およびＫ６３Ｒ、または対応するＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の変化を含む。Ｓｓｏ７ｄ様タンパク質は、ＲｉｂｏＰ３、Ｓｔｏ７ｅ、Ｓａｃ７ｄ、Ｓａｃ７ｅまたはＳａｃ７ａであってもよい。別の実施形態では、Ｓｓｏ７ｄ様タンパク質は配列番号８、９、１２、１２、１４または１６のアミノ酸配列を有する。
【００３８】
さらに別の態様では、本発明はＤＮＡ結合領域およびＤＮＡポリメラーゼ領域を有するキメラＤＮＡポリメラーゼに関する。この態様では、ＤＮＡ結合領域は配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００３９】
本発明のさらに別の態様では、本発明は、ＤＮＡ結合領域が配列番号６のアミノ酸配列を含む、ＤＮＡ結合領域およびポリメラーゼ領域を含むキメラＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【００４０】
上記の態様の一実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ領域は古細菌ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを含む。さらなる実施形態では、古細菌ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドはＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドである。さらに別の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。上記の態様のさらに別の実施形態では、キメラＤＮＡポリメラーゼ領域は、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９５％は同一である。
【００４１】
ここで述べる態様の別の実施形態では、本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ領域は変異ＤＮＡポリメラーゼを含む。変異ＤＮＡポリメラーゼは、ウラシル非感受性を与える、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ中のＶ９３Ｒ，Ｋ，Ｅ，Ｄ変異を含んでもよい。さらなる実施形態では、変異ＤＮＡポリメラーゼはＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ中のＤ１４１Ａおよび／またはＥ１４３Ａを有し、それは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をなくす。
【００４２】
本発明のさらに別の態様では、本発明は、ここで述べる本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼを含む組成物およびキットを提供する。キットはここで述べる組成物のいずれか１つと、そのための包装材料を含む。別の態様では、本発明はここで述べるキメラＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸およびベクターと、ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００４３】
本発明の最後の態様では、本発明はＤＮＡを合成する方法を提供する。本方法は、ここで述べる本発明の実施形態のいずれかのキメラＤＮＡポリメラーゼを提供するステップと、キメラＤＮＡポリメラーゼを核酸鋳型に接触させてキメラＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ合成を可能にするステップとを含む。
【００４４】
Ｉ．Ｓｓｏ７ｄおよびＳｓｏ７ｄ様ポリペプチド
本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼは、Ｓｓｏ７ｄ（配列番号２）のアミノ酸位置１３、１６、４０、４１、４５、５５、５６、６１または６３、または例えばＳｓｈ７ｂ（配列番号８）、ＲｉｂｏＰ３（配列番号９）、Ｓｔｏ７ｅ（配列番号１２）、Ｓａｃ７ｄ（配列番号１２）、Ｓａｃ７ｅ（配列番号１４）およびＳａｃ７ａ（配列番号１６）などのＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の対応する位置に、１つ以上の変異を有するＤＮＡ結合領域を含む。
【００４５】
Ｓｓｏ７ｄは、超好熱性古細菌スルホロブス・ソルファタリカス由来の、小型の塩基性染色体タンパク質である。Ｓｓｏ７ｄは配列非依存様式でＤＮＡに結合し、結合する場合、条件によってはＤＮＡ変性温度を４０℃まで増大する（マッカーフィー（ＭｃＡｆｅｅ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１００６３〜１００７７頁（１９９５年））。野生型タンパク質配列は、配列番号２で記載される。
【００４６】
超好熱性古細菌Ｓ．アシドカルダリウス（ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）からのＳａｃ７ａ、Ｓａｃ７ｂ、Ｓａｃ７ｄ、およびＳａｃ７ｅ、スルホロブス・シバタエ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｈｉｂａｔａｅ）からのＳｓｈ７ａおよびＳｓｈ７ｂをはじめとする、いくつかの既知のＳｓｏ７ｄ様タンパク質があるが、これらに限定されるものではない。これらのタンパク質は、Ｓｓｏ７ｄと７８％〜９８％の範囲の同一性を有する。
【００４７】
Ｓｓｏ７ｄタンパク質またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質の変異アミノ酸位置は、配列番号２に記載されるＳｓｏ７ｄ配列を参照して判定される。ここで述べられる変異研究を通じて、本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼに悪影響を及ぼすことなく変異可能な残基が同定された。一実施形態では、アミノ酸残基は次の位置の１つ以上で変異される：配列番号２の位置１３のグルタミン酸をグルタミン（Ｅ１３Ｑ）に、配列番号２の位置１６のイソロイシンをスレオニン（Ｉ１６Ｔ）に、配列番号２の位置４０のスレオニンをセリン（Ｔ４０Ｓ）に、配列番号２の位置４１のグリシンをアラニン（Ｇ４１Ａ）に、配列番号２の位置４５のバリンをロイシン（Ｖ４５Ｌ）に、配列番号２の位置５５のロイシンをバリン（Ｌ５５Ｖ）に、配列番号２の位置５６のグルタミンをアスパラギン酸（Ｑ５６Ｄ）に、配列番号２の位置６１のグルタミンをグルタミン酸（Ｑ６１Ｅ）に、もしくは配列番号２の位置６３のリジンをアルギニン（Ｋ６３Ｒ）に、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の対応する変異。
【００４８】
これらの命名は、請求の範囲に記載されている分子中のどのアミノ酸残基が変異するかを示す。例えばＥ１３Ｑは、配列番号２のポリペプチドが配列番号２のアミノ酸位置１３で変異して、グルタミン酸からグルタミンへ変更することを示す。同様にＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の対応する位置または変異とは、例えばＳｓｈ７ｂなどのＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の対応するアミノ酸が変異することを意味する。対応するアミノ酸は、配列番号２のＳｓｏ７ｄタンパク質が、例えばＳｓｈ７ｂなどのＳｓｏ７ｄ様タンパク質と最大限に配列比較される場合に同定される。例えばＳｓｏ７ｄのＥ１３はＳｓｈ７ｂのＥ１３に対応する（図１）。配列比較は、ここで述べように手動で、または配列比較アルゴリズムを使用して実施しうる。
【００４９】
配列番号２の位置１３、１６、４０、４１、４５、５５、５６、６１または６３のアミノ酸の変更は、本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼの性能に悪影響を及ぼさない。Ｓｓｏ７ｄ様ポリペプチド間で変化する多数のアミノ酸は、Ｓｓｏ７ｄ−キメラＤＮＡポリメラーゼに悪影響を及ぼすことなく変更できないことが観察された。さらにＳｓｏ７ｄ様タンパク質間で変化しないいくつかのアミノ酸は、Ｓｓｏ７ｄ−キメラＤＮＡポリメラーゼの機能性の損失を引き起こすことなしには変更できなかった。
【００５０】
配列番号２の位置１３、１６、４０、４１、４５、５５、５６、６１または６３のアミノ酸、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の対応するアミノ酸は、多様なアミノ酸残基で置換できる。一実施形態では、ＤＮＡ結合領域の１つ以上の変異は、配列番号２のＥ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ、Ｔ４０Ｓ、Ｇ４１Ａ、Ｖ４５Ｌ、Ｌ５５Ｖ、Ｑ５６Ｄ、Ｑ６１ＥまたはＫ６３Ｒを含む。
【００５１】
一実施形態では、キメラＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸位置Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の対応するアミノ酸のＤＮＡ結合領域が変異される。
【００５２】
別の実施形態では、キメラＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸位置Ｔ４０Ｓ、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質の対応するアミノ酸のＤＮＡ結合領域が変異される。
【００５３】
別の実施形態では、キメラＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸位置Ｇ４１Ａ、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質の対応するアミノ酸のＤＮＡ結合領域が変異される。
【００５４】
別の実施形態では、キメラＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸位置Ｖ４５Ｌ、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質中の対応するアミノ酸のＤＮＡ結合領域が変異される。
【００５５】
別の実施形態では、キメラＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸位置Ｌ５５Ｖ、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質の対応するアミノ酸のＤＮＡ結合領域が変異される。
【００５６】
別の実施形態では、キメラＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸位置Ｑ５６Ｄ、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質の対応するアミノ酸のＤＮＡ結合領域が変異される。
【００５７】
別の実施形態では、キメラＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸位置Ｑ５６Ｄ、Ｔ４０Ｓ、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質の対応するアミノ酸のＤＮＡ結合領域が変異される。
【００５８】
別の実施形態では、キメラＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸位置Ｔ４０Ｓ、Ｖ４５Ｌ、Ｌ５５Ｖ、Ｑ５６Ｄ、Ｋ６３Ｒ、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ、またはＳｓｏ７ｄ様タンパク質の対応するアミノ酸のＤＮＡ結合領域が変異される。
【００５９】
一般的に、置換アミノ酸残基は、置換されたアミノ酸と共に保存されたものである。置換された残基は、天然配列中のアミノ酸残基よりも小さな容積をしばしば占める。例えばトリプトファンの側鎖は、天然のアミノ酸の内で最大容積を占める。したがってトリプトファンは、よりかさばらないアミノ酸、特により小さな空間を占めるアラニン、グリシン、またはバリンなどの残基で置換できる。さらに例えばプロリンなどのポリペプチド中により大きな構造的変化を導入する残基、または例えばシステインなどのこのような変化を導入する能力がある残基は、一般的に避けられる。アミノ酸を置換する際は、電荷および疎水性もまた考慮される。
【００６０】
その他のＳｓｏ７ｄ様部分は、Ｓｓｏ７ｄとの配列相同性に基づいて同定できる。一般的に、Ｓｓｏ７ｄ様タンパク質は、Ｓｓｏ７ｄと約７８％、８０、８５、９０または９５〜９８％のアミノ酸配列同一性を有する。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の百分率同一性を判定するために、配列を最適比較目的のために整列させる（例えば第２のアミノ酸または核酸配列との最適アラインメントのために、ギャップを第１のアミノ酸配列または核酸配列中に導入できる）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の百分率同一性は、配列に共通する同一位置の数の関数である（すなわち、百分率同一性＝同一位置の数／位置の総数（例えば重複位置）×１００）。
【００６１】
２つの配列間の百分率同一性判定は、数学的アルゴリズムを使用して達成できる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的例は、次のアルゴリズムである：カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４〜２２６８頁（１９９０年）、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５８７７頁（１９９３年）により修正。このようなアルゴリズムは、アルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９０年）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施され、本発明の核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチは、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施され、本発明のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得ることができる。
【００６２】
比較目的でギャップドアラインメントを得るために、およびＳｓｏ７ｄ様タンパク質中のアミノ酸に対応するＳｓｏ７ｄ中のアミノ酸を同定するために、アルシュールらに記載の（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２頁（１９９７年））、ギャップドＢＬＡＳＴを利用できる。あるいはＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施できる。ＢＬＡＳＴ、ギャップドＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを用いる場合、それぞれのプログラムの初期パラメーター（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を使用できる。配列比較で利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的例は、マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１〜１７頁（１９８８年）のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列比較ソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを使用する際、ＰＡＭ１２０重み残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用できる。局所配列類似性およびアラインメントの領域を同定するためのさらに別の有用なアルゴリズムは、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４〜２４４８頁（１９８８年）に記載のＦＡＳＴＡアルゴリズムである。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列を比較するためにＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用する場合、例えばｋ組値（ｋ−ｔｕｐｌｅ  ｖａｌｕｅ）２と共にＰＡＭ１２０重み残基表が使用できる。
【００６３】
ＩＩ．発明に従ったＤＮＡポリメラーゼ
本発明は、ポリメラーゼ領域およびＤＮＡ結合領域を含むキメラＤＮＡポリメラーゼを提供する。ポリメラーゼ領域は、野生型または変異ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを含むことができる。本発明の有用なＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性ありまたはなし、すなわちプルーフリーディングまたは非プルーフリーディングであり、好ましくは熱安定性である。
【００６４】
本発明で有用なさらなる核酸ポリメラーゼを下に列挙する。
【００６５】
Ａ．バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼ（３７℃アッセイのために有用）：
５’−３’エキソヌクレアーゼ活性は別個のポリペプチドによってコードされるため、バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼはこの活性を欠いている。適切なＤＮＡポリメラーゼの例は、Ｔ４、Ｔ７、およびφ２９ＤＮＡポリメラーゼである。市販される酵素はＴ４（例えばエピセントレ社（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）などの多くの供給元から市販される）およびＴ７（例えばエピセントレからの無修飾ＤＮＡポリメラーゼ、およびＵＳＢからの３’−５’  エキソ−  Ｔ７「シーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）」ＤＮＡポリメラーゼなどの多くの供給元から市販される）である。
【００６６】
Ｂ．古細菌ＤＮＡポリメラーゼ：
古細菌中で同定されている２つの異なるＤＮＡポリメラーゼのクラスがある：１）ファミリーＢ／ｐｏｌ  Ｉタイプ（パイロコッカス・フリオサスからのＰｆｕ相同体）、および２）ｐｏｌ  ＩＩタイプ（Ｐ．フリオサスのＤＰ１／ＤＰ２  ２−サブユニットポリメラーゼ相同体）。双方のクラスからのＤＮＡポリメラーゼは、付随する５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を元来欠いており、３’−５’エキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性を有することが示されている。適切なＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ  Ｉまたはｐｏｌ  ＩＩ）は、目的のアッセイ温度とほぼ同じ最適生育温度で、古細菌から得ることができる。
【００６７】
熱安定性古細菌ＤＮＡポリメラーゼは、パイロコッカス種（フリオサス、ＧＢ−Ｄ種、ウーセイ、アビシ、ホリコシ）と、サーモコッカス種（コダカレンシスＫＯＤｌ、リトラリス、ナイン・ディグリーズ・ノース−７種、ＪＤＦ−３種、ゴルゴナリアス）と、ピロディクチウム・オカルタムと、アーケオグロブス・フルギダスとから単離された。適切な古細菌は＞８０〜８５℃の最大生育温度、または＞７０〜８０℃の最適生育温度を示すことが推定される。古細菌ｐｏｌ  Ｉ  ＤＮＡポリメラーゼ群からの適切なＰＣＲ酵素は市販されている、Ｐｆｕ（ストラタジーン）、ＫＯＤ（東洋紡）、Ｐｆｘ（ライフ・テクノロジーズ・インコーポレーテッド）、ベント（ニュー・イングランド・バイオラブス）、ディープ・ベント（ニュー・イングランド・バイオラブス）、Ｔｇｏ（ロシュ）、およびＰｗｏ（ロシュ）を含む。
【００６８】
上に列挙したものと関連する追加的な古細菌ＤＮＡポリメラーゼは、次の参考文献に記載される：ロブ，Ｆ．Ｔ．（Ｒｏｂｂ，Ｆ．Ｔ．）およびプレース，Ａ．Ｒ．（Ｐｌａｃｅ，Ａ．Ｒ．）編、「古細菌：実験室マニュアル（Ａｒｃｈａｅａ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９５年）およびクリスティアンソン，Ｊ．Ｋ．（Ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎ，Ｊ．Ｋ．）編、「好熱性細菌（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ）」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９２年）。
【００６９】
したがって本発明は、ファミリーＢ／ｐｏｌ  Ｉタイプまたはｐｏｌ  ＩＩタイプのいずれかの熱安定性古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにその変異体または誘導体を提供する。
【００７０】
本発明の一実施形態では、キメラＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ領域は古細菌ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを含む。さらに別の実施形態では、古細菌ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドはＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドである。上記の態様のさらに別の実施形態では、キメラＤＮＡポリメラーゼ領域は、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９５％は同一である。
【００７１】
（表１）
表１．クローン化ファミリーＢポリメラーゼのアクセッション情報
ベント  サーモコッカス・リトラリス
アクセッション             ＡＡＡ７２１０１
ＰＩＤ               ｇ３４８６８９
バージョン           ＡＡＡ７２１０１．１  ＧＩ：３４８６８９
ＤＢＳＯＵＲＣＥ     遺伝子座ＴＨＣＶＤＰＥ
アクセッションＭ７４１９８．１
ＴＨＥＳＴ  サーモコッカス種（ＴＹ株）
アクセッション       Ｏ３３８４５
ＰＩＤ               ｇ３９１３５２４
バージョン           Ｏ３３８４５  ＧＩ：３９１３５２４
ＤＢＳＯＵＲＣＥ     ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＴＨＥＳＴ，
アクセッションＯ３３８４５
Ｐａｂ  パイロコッカス・アビシ
アクセッション       Ｐ７７９１６
ＰＩＤ               ｇ３９１３５２９
バージョン           Ｐ７７９１６  ＧＩ：３９１３５２９
ＤＢＳＯＵＲＣＥ     ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＰＹＲＡＢ，
アクセッションＰ７７９１６
ＰＹＲＨＯ  パイロコッカス・ホリコシ
アクセッション       Ｏ５９６１０
ＰＩＤ               ｇ３９１３５２６
バージョン           Ｏ５９６１０  ＧＩ：３９１３５２６
ＤＢＳＯＵＲＣＥ     ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＰＹＲＨＯ，
アクセッションＯ５９６１０
ＰＹＲＳＥ  パイロコッカス種（ＧＥ２３株）
アクセッション       Ｐ７７９３２
ＰＩＤ               ｇ３９１３５３０
バージョン           Ｐ７７９３２  ＧＩ：３９１３５３０
ＤＢＳＯＵＲＣＥ     ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＰＹＲＳＥ，
アクセッションＰ７７９３２
ディープ  ベント  パイロコッカス種
アクセッション       ＡＡＡ６７１３１
ＰＩＤ               ｇ４３６４９５
バージョン           ＡＡＡ６７１３１．１  ＧＩ：４３６４９５
ＤＢＳＯＵＲＣＥ     遺伝子座ＰＳＵ００７０７
アクセッションＵ００７０７．１
Ｐｆｕ  パイロコッカス・フリオサス
アクセッション       Ｐ８００６１
ＰＩＤ               ｇ３９９４０３
バージョン           Ｐ８００６１  ＧＩ：３９９４０３
ＤＢＳＯＵＲＣＥ     ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＰＹＲＦＵ，
アクセッションＰ８００６１
ＪＤＦ−３  サーモコッカス種
未発表
Ｂａｒｏｓｓ  ｇｉ｜２０９７７５６｜ｐａｔ｜ＵＳ｜５６０２０１１｜１２  
米国特許第５６０２０１１号明細書からの配列１２
９ｄｅｇＮ  サーモコッカス種（９ＯＮ−７株）
アクセッション       Ｑ５６３６６
ＰＩＤ               ｇ３９１３５４０
バージョン           Ｑ５６３６６  ＧＩ：３９１３５４０
ＤＢＳＯＵＲＣＥ     ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＴＨＥＳ９，
アクセッションＱ５６３６６
ＫＯＤ  パイロコッカス種
アクセッション       ＢＡＡ０６１４２
ＰＩＤ               ｇｌ６２０９１１
バージョン           ＢＡＡ０６１４２．１  ＧＩ：１６２０９１１
ＤＢＳＯＵＲＣＥ     遺伝子座ＰＹＷＫＯＤＰＯＬ
アクセッションＤ２９６７１．１
Ｔｇｏ  サーモコッカス・ゴルゴナリアス
アクセッション       ４６９９８０６
ＰＩＤ               ｇ４６９９８０６
バージョン           ＧＩ：４６９９８０６
ＤＢＳＯＵＲＣＥ     ｐｄｂ：ｃｈａｉｎ６５，１９９９年２月２３日公開
ＴＨＥＦＭ  サーモコッカス・フミコランス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ）
アクセッション       Ｐ７４９１８
ＰＩＤ               ｇ３９１３５２８
バージョン           Ｐ７４９１８  ＧＩ：３９１３５２８
ＤＢＳＯＵＲＣＥ     ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＴＨＥＦＭ，
アクセッションＰ７４９１８
ＭＥＴＴＨ  メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）
アクセッション       Ｏ２７２７６
ＰＩＤ               ｇ３９１３５２２
バージョン           Ｏ２７２７６  ＧＩ：３９１３５２２
ＤＢＳＯＵＲＣＥ     ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＭＥＴＴＨ，
アクセッションＯ２７２７６
Ｍｅｔｊａ  メタノコッカス・ヤナシイ
アクセッション       Ｑ５８２９５
ＰＩＤ               ｇ３９１５６７９
バージョン           Ｑ５８２９５  ＧＩ：３９１５６７９
ＤＢＳＯＵＲＣＥ     ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＭＥＴＪＡ，
アクセッションＱ５８２９５
ＰＯＣ  ピロディクチウム・オカルタム
アクセッション       Ｂ５６２７７
ＰＩＤ               ｇｌ３６３３４４
バージョン           Ｂ５６２７７  ＧＩ：１３６３３４４
ＤＢＳＯＵＲＣＥ     ｐｉｒ：遺伝子座Ｂ５６２７７
ＡｐｅＩ  アエロピラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）
アクセッション       ＢＡＡ８１１０９
ＰＩＤ               ｇ５１０５７９７
バージョン           ＢＡＡ８１１０９．１  ＧＩ：５１０５７９７
ＤＢＳＯＵＲＣＥ     遺伝子座ＡＰ００００６３
アクセッションＡＰ００００６３．１
ＡＲＣＦＵ  アーケオグロブス・フルギダス
アクセッション       Ｏ２９７５３
ＰＩＤ               ｇ３１２２０１９
バージョン           Ｏ２９７５３  ＧＩ：３１２２０１９
ＤＢＳＯＵＲＣＥ     ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＡＲＣＦＵ，
アクセッションＯ２９７５３
デスルフロコッカス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）種Ｔｏｋ
アクセッション       ６４３５７０８
ＰＩＤ               ｇ６４３５７０８９
バージョン           ＧＴ：６４３５７０８
ＤＢＳＯＵＲＣＥ     ｐｄｂ．ｃｈａｉｎ６５，１９９９年６月２日公開
【００７２】
Ｃ．真正細菌ＤＮＡポリメラーゼ：
３つのクラスの真正細菌ＤＮＡポリメラーゼｐｏｌ  Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩがある。Ｐｏｌ  Ｉ  ＤＮＡポリメラーゼファミリー中の酵素は５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、特定のメンバーはまた３’−５’エキソヌクレアーゼ活性も示す。Ｐｏｌ  ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を元来欠いているが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す。Ｐｏｌ  ＩＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼは細胞の主要な複製的ＤＮＡポリメラーゼに相当し、複数サブユニットから構成される。ｐｏｌ  ＩＩＩ触媒サブユニットは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているが、場合によっては３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が同一ポリペプチド中に位置する。
【００７３】
様々な市販のＰｏｌ  Ｉ  ＤＮＡポリメラーゼがあり、それらのいくつかは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が低下または消滅しているように改変されている。
【００７４】
適切な熱安定性ｐｏｌ  Ｉ  ＤＮＡポリメラーゼは、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）およびサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｔｍａ  ＵｌＴｍａ）などのサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種、およびサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）をはじめとする多様な好熱性真正細菌から単離できる。
【００７５】
上記に列挙したものと関連したさらなる真正細菌については、クリスティアンソン，Ｊ．Ｋ．（Ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎ，Ｊ．Ｋ．）編、「好熱性細菌（ＴｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃＢａｃｔｅｒｉａ）」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９２年）に記載される。
【００７６】
一実施形態では、キメラＤＮＡポリメラーゼはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを含むポリメラーゼ領域を含む。
【００７７】
本発明は、参照によってその内容全体を本明細書に援用する、米国特許第５，６７７，１５２号明細書、米国特許第６，４７９，２６４号明細書、および米国特許第６，１８３、９９８号明細書で開示される方法に従い、化学的に改変されたＤＮＡポリメラーゼをさらに提供する。
【００７８】
Ｄ．本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼで使用する変異ＤＮＡポリメラーゼ
本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼは、任意の野生型ＤＮＡポリメラーゼ、または野生型ポリメラーゼとは異なる挙動をするようにさせる１つ以上の点変異、Ｎ−および／またはＣ−切断、内部欠失または挿入を含む、これらに限定されない１つ以上の変異を含有するように改変されたＤＮＡポリメラーゼのどちらからでも作成することができる。本発明で有用なＤＮＡポリメラーゼ変異としては、塩基類似体またはウラシル非感受性を与え、ヌクレオチド類似体組み込みを改善し、忠実度を増大させ、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をなくしまたは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性をなくし、またはポリメラーゼ活性を低下させる変異を含むが、これらに限定されない。有用な変異または切断の特定例としては、ウラシル非感受性を与えるＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ中のＶ９３Ｒ，Ｋ，Ｅ，Ｄと、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をなくすＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ中のＤ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａと、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性（ＫｌｅｎＴａｑ）をなくすＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのＮ末端切断を含むが、これらに限定されない。ＤＮＡポリメラーゼ変異の作成方法については以下に記載され、その他の方法については当該技術分野で知られている。
【００７９】
野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸およびＤＮＡコード配列は、配列番号１８（ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）アクセッション番号Ｐ８００６１）で示される。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの構造および機能の詳細な説明は、例えば参照によってその全体を本明細書に援用する、米国特許第５，９４８，６６３号明細書、米国特許第５，８６６，３９５号明細書、米国特許第５，５４５，５５２号明細書、米国特許第５，５５６，７７２号明細書中の他の箇所にある。例えばウラシル検知活性が低下したＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを調製するための非限定的な詳細手順は、参照によってその内容全体を本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００４／０１９７８００号明細書（２００３年１１月５日出願）で提供される。
【００８０】
本発明は、参照によってその内容全体を本明細書に援用する、係属中の米国特許出願公開第２００４／００９１８７３号明細書（ホッゴレフ（Ｈｏｇｒｅｆｅ）ら、２００２年１１月１８日出願）で開示される、塩基類似体検知活性を低下させる１つ以上の変異があるＤＮＡポリメラーゼ領域を含む、キメラＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【００８１】
一実施形態では、キメラＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸位置９３においてバリンからアルギニン、バリンからグルタミン酸、バリンからリジン、バリンからアスパラギン酸またはバリンからアスパラギンへの置換を含有するＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼポリペプチド領域を含む。
【００８２】
本発明は、参照によってその内容全体を本明細書に援用する、係属中の米国特許出願第１０／０３５，０９１号明細書（ホッゴレフ（Ｈｏｇｒｅｆｅ）ら、２００１年１２月２１日出願）、係属中の米国特許出願第１０／０７９，２４１号明細書（ホッゴレフ（Ｈｏｇｒｅｆｅ）ら、２００２年２月２０日出願）、係属中の米国特許出願公開第２００３／０１８０７４１号明細書（ホッゴレフ（Ｈｏｇｒｅｆｅ）ら、２００２年７月３０日出願）、および係属中の米国特許出願公開第２００３／０１４３５７７号明細書（ホッゴレフ（Ｈｏｇｒｅｆｅ）ら、２００２年８月２３日出願）中で開示される、ＤＮＡ重合を低下させる１つ以上の変異を含有するウラシル検知活性が低下したＶ９３変異Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを含む、キメラＤＮＡポリメラーゼをさらに提供する。
【００８３】
一実施形態では、本発明は、Ｇ３８７Ｐ変異があるＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ領域を含むキメラＤＮＡポリメラーゼを提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、ＤＮＡ重合活性とウラシル検知活性が低下した、Ｖ９３Ｒ／Ｇ３８７Ｐ、Ｖ９３Ｅ／Ｇ３８７Ｐ、Ｖ９３Ｄ／Ｇ３８７Ｐ、Ｖ９３Ｋ／Ｇ３８７ＰまたはＶ９３Ｎ／Ｇ３８７Ｐ二重変異があるＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ領域を含む、キメラＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【００８４】
本発明は、係属中の米国特許出願第０９／６９８，３４１号明細書（ゾルゲ（Ｓｏｒｇｅ）ら、２０００年１０月２７日出願）中で開示される、ウラシル検知活性低下をもたらすＶ９３Ｒ、Ｖ９３Ｅ、Ｖ９３Ｄ、Ｖ９３ＫまたはＶ９３Ｎ変異があるＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ領域を含み、さらに３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を低下させるかまたはなくす１つまたは複数の変異を含有する、キメラＤＮＡポリメラーゼをさらに提供する。
【００８５】
一実施形態では、本発明は、低下した３’−５’エキソヌクレアーゼ活性およびウラシル検知活性を持つ、Ｖ９３Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ三重変異Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを有するポリメラーゼ領域を含む、キメラＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【００８６】
本発明のＤＮＡ重合活性が低下したＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを作成するために使用される方法は、参照によってその内容全体を本明細書に援用する、係属中の米国特許出願第１０／０３５，０９１号明細書（ホッゴレフ（Ｈｏｇｒｅｆｅ）ら、２００１年１２月２１日出願）、係属中の米国特許出願第１０／０７９，２４１号明細書（ホッゴレフ（Ｈｏｇｒｅｆｅ）ら、２００２年２月２０日出願）、係属中の米国特許出願第１０／２０８，５０８号明細書（ホッゴレフ（Ｈｏｇｒｅｆｅ）ら、２００２年７月３０日出願）、および係属中の米国特許出願第１０／２２７，１１０号明細書（ホッゴレフ（Ｈｏｇｒｅｆｅ）ら、２００２年８月２３日出願）中で開示される。
【００８７】
Ｄ１４１ＡおよびＥ１４３Ａ変異を含む３’−５’エキソヌクレアーゼ欠損ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼを作成するために使用される方法は、係属中の米国特許出願第０９／６９８，３４１号明細書（ゾルゲ（Ｓｏｒｇｅ）ら、２０００年１０月２７日出願）中で開示される。係属中の米国特許出願第０９／６９８，３４１号明細書（ゾルゲ（Ｓｏｒｇｅ）ら、２０００年１０月２７日出願）の教示を保有する当業者にとっては、係属中の米国特許出願第０９／６９８，３４１号明細書中で開示されるように、確立された部位特異的変異誘発方法を使用して、例えば非キメラＶ９３  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼｃＤＮＡをはじめとする本発明のＤＮＡポリメラーゼに、対応するＤ１４１ＡおよびＥ１４３Ａ変異の両方またはその他の３’−５’エキソヌクレアーゼ変異を導入することは、難しくはないであろう。
【００８８】
ＩＩＩ．本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼで使用するＤＮＡポリメラーゼポリペプチド変異体およびＤＮＡ結合ポリペプチド変異体の調製
本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ結合領域およびポリメラーゼ領域は、多数のアミノ酸変化または変異を含有してもよい。当業者は、適切なアミノ酸変化をもたらす変異を作成する多数の方法があることを認識するであろう。このような既知の方法としては、部位特異的変異誘発、縮重オリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲ増幅、目的のオリゴヌクレオチドの化学合成（例えば大型核酸を発生させるライゲーションおよび／またはクローニングと併せて）、およびその他のよく知られている技術が挙げられる。ギルマン（Ｇｉｌｉｍａｎ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｇｅｎｅ  ８：８１〜９７頁（１９７９年）、ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７３１〜７３４（１９８７年）、およびサムブルック、イニス、およびオースベル（全て前出）を参照されたい。
【００８９】
例えば変異Ｓｓｏ７ｄ結合領域ポリペプチドは、遺伝的改変によって（例えば野生型Ｓｓｏ７ｄポリペプチドのＤＮＡ配列を改変することで）作成することができる。ＤＮＡ配列のランダム変異ならびに標的突然変異を可能にするいくつかの方法が、当該技術分野で知られている（例えばオースベルら、「分子生物学における短いプロトコル（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９５年）を参照されたい）。さらに従来法およびＰＣＲ法の両方を含む、市販の部位特異的変異誘発キットがいくつかある。例としては、ストラタジーンのクイックチェンジ（ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ）（登録商標）部位特異的変異誘発キット（カタログ番号２００５１８）が挙げられる。
【００９０】
さらにＤＮＡ結合領域は、当業者に知られている方法に従って、挿入変異または切断（Ｎ末端、内部またはＣ末端）によって作成してもよい。
【００９１】
当該技術分野で知られている部位特異的変異誘発の古い方法は、一本鎖ＤＮＡ鋳型の単離を可能にする、Ｍ１３バクテリオファージベクターなどのベクター中への変異させる配列のサブクローニングに依存する。これらの方法では、変異原プライマー（すなわち変異させる部位にアニールできるが、変異させる部位と１つ以上のミスマッチヌクレオチドを持つプライマー）を一本鎖鋳型にアニールし、次に変異原プライマーの３’末端から開始して鋳型の相補鎖を重合する。次に得られた二本鎖を宿主細菌に形質転換して、目的の変異についてプラークをスクリーニングする。
【００９２】
最近、部位特異的変異誘発では、一本鎖鋳型を必要としない利点を有するＰＣＲ法が用いられている。さらにサブクローニングを必要としない方法が開発されている。ＰＣＲベースの部位特異的変異誘発を実施する際には、いくつかの問題を考慮すべきである。第一に、これらの方法ではＰＣＲサイクル数を減少させて、ポリメラーゼによって導入される望ましくない変異の増殖を避けることが望ましい。第二に、反応中に残存する非変異型親分子の数を減らすための選択をしなくてはならない。第三に、単一ＰＣＲプライマーセットの使用を可能にするためには、伸長（ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｌｅｎｇｔｈ）ＰＣＲ法が好ましい。第四に、いくつかの熱安定性ポリメラーゼの非鋳型依存性末端伸長活性のため、ＰＣＲで生じた変異生成物の平滑末端ライゲーションに先だって、末端平滑化ステップを工程に組み込むことが多くの場合必要である。
【００９３】
以下で述べる手順は、以下のステップを通じてこれらの考慮に対応する。第一に、使用される鋳型濃度は従来のＰＣＲ反応で使用されるものよりもおよそ１０００倍高く、生成物収率を著しく低下させることなしに、２５〜３０から５〜１０へのサイクル数減少を可能にする。第二に、最も一般的な大腸菌Ｄａｍ株は自らのＤＮＡを配列５−ＧＡＴＣ−３でメチル化するので、制限エンドヌクレアーゼＤｐｎ  Ｉ（認識標的配列：５−Ｇｍ６ＡＴＣ−３、Ａ残基はメチル化される）を使用して、親ＤＮＡと対して選択する。第三に、長いＰＣＲ生成物（すなわち全長プラスミド）の比率を増大させるために、ＰＣＲ混合物中でＴａｑエクステンダーを使用する。最後に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用した分子内ライゲーションに先だって、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲ生成物末端を平滑化する。変異誘発手順のさらに別の例は、実施例１で述べられる。
【００９４】
変異ＤＮＡ結合タンパク質またはポリメラーゼ単離のための非限定的な例を以下で詳細に述べる。
【００９５】
プラスミド鋳型ＤＮＡ（およそ０．５ｐｍｏｌｅ）を、以下を含有するＰＣＲ混合物に添加する。１×変異誘発緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；８ｍＭ  ＭｇＣｌ２；４０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）；各１２〜２０ｐｍｏｌｅのプライマー（塩基組成やプライマー長、意図される緩衝液塩濃度などのオリゴヌクレオチドプライマーのアニール特性に影響する要因を考慮して、必要に応じて変異原プライマーが当業者によって設計されてもよく、１つのプライマーは目的の変異を含有しなくてはならず、（同一または別の）１つのプライマーは後のライゲーションを促進するために５’リン酸を含まなくてはならない）；各２５０μＭのｄＮＴＰ；２．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ；および２．５ＵのＴａｑエクステンダー（ストラタジーンから入手できる、ニールソン（Ｎｉｅｌｓｏｎ）ら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ７：２７頁（１９９４年）、および米国特許第５，５５６，７７２号明細書を参照されたい）。プライマーは、参照によって本明細書に援用するマテューシ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５〜３１９１頁（１９８１年）のトリエステル法を使用して調製できる。あるいは、好ましくは自動化された合成で、例えばシアノエチルホスホラミダイト化学反応を使用してバイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）８７００  ＤＮＡ合成機上で行われる。
【００９６】
ＰＣＲサイクルは次のようにして実施される：９４℃で４分、５０℃で２分および７２℃で２分が１サイクル、それに続く９４℃で１分、５４℃で２分、および７２℃で１分が５〜１０サイクル。親鋳型ＤＮＡおよび変異原プライマーを組み込んだＰＣＲ生成直鎖ＤＮＡをＤｐｎＩ（１０Ｕ）およびＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ）で処理する。これは生体内でメチル化された親鋳型およびハイブリッドＤＮＡのＤｐｎＩ消化ならびに、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼによる、直鎖ＰＣＲ生成物上の非鋳型誘導Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ伸長塩基の除去をもたらす。反応を３７℃で３０分間、次に７２℃にしてさらに３０分間温置した。０．５ｍＭ  ＡＴＰを含有する変異誘発緩衝液（１１５μｌの１倍希釈溶液）をＤｐｎＩ消化され、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼで平滑化されたＰＣＲ生成物に添加する。溶液を混合し、１０μｌを新しい微量遠心管に取って、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（２〜４Ｕ）を添加する。ライゲーションを３７℃で６０分以上温置する。最後に標準法に従って、処理溶液をコンピテント大腸菌中に形質転換する。
【００９７】
ひとたび変異ＤＮＡ結合またはポリメラーゼポリペプチドが作製されたら、当該技術分野で知られている評価技術およびここで述べるものを使用して、評価する。
【００９８】
変異誘発によって生じた目的の変異ＤＮＡ結合ポリペプチドおよび変異ポリメラーゼポリペプチドの遺伝子を配列決定して、変異部位および数を同定してもよい。１つ以上の変異を含む変異において、特定の変異によって生じた、別の変異からの単離部位特異的変異誘発によって野生型遺伝子に同定された変異を導入することで、特定変異の効果を評価してもよい。次にこのようにして生じた単一変異のスクリーニングアッセイは、変異のみの効果の判定を可能にする。
【００９９】
一実施形態では、本発明はＤＮＡ結合領域およびポリメラーゼ領域を含むキメラＤＮＡポリメラーゼを提供し、前記ＤＮＡ結合領域は配列番号２の位置１３、１６、４０、４１、４５、５５、５６、６１または６３に対応するアミノ酸に１つ以上の変異を有する。
【０１００】
別の実施形態では、本発明はキメラＤＮＡポリメラーゼを提供し、１つまたはそれ以上の変異は、Ｅ１３Ｑ、Ｉｌ６Ｔ、Ｔ４０Ｓ、Ｇ４１Ａ、Ｖ４５Ｌ、Ｌ５５Ｖ、Ｑ５６Ｄ、Ｑ６１Ｅ、およびＫ６３Ｒからなる群から選択される。
【０１０１】
ＩＶ．キメラＤＮＡポリメラーゼの生成
本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼは、共有結合する少なくとも２つのポリペプチドを有するＤＮＡポリメラーゼ融合ポリペプチドであり、その中の１つのポリペプチドは、例えばＤＮＡポリメラーゼなどの１つのタンパク質配列または領域に由来し、もう１つのポリペプチドは、例えばＤＮＡ結合タンパク質などの別のタンパク質配列または領域に由来する。本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ結合領域およびポリメラーゼ領域は、当業者によく知られている方法によって結合できる。これらの方法には、化学的手段および組み換え手段の両方が含まれる。
【０１０２】
本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼに組み込まれる領域をコードする核酸は、組み換え遺伝子技術分野の所定の技術を使用して得ることができる。本発明で使用される一般方法を開示する基礎的な教科書としては、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）、「分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第３版（２００１年）；クリーグラー（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ）、「遺伝子の導入と発現：実験室マニュアル（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」（１９９０年）；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、「分子生物学の現行プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（１９９４〜１９９９年）を含む。
【０１０３】
ＤＮＡ結合ポリペプチドおよびポリメラーゼポリペプチドをコードする核酸配列は、多様な方法を使用して得ることができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードする核酸配列がプローブとのハイブリダイゼーションによってｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡライブラリーからクローン化され、またはオリゴヌクレオチドプライマーによる増幅技術を使用して単離される。より一般には、増幅技術が、ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型を使用してＤＮＡ結合領域およびポリメラーゼ配列の増幅および単離に使用される（例えばディエッフェンファック（Ｄｉｅｆｆｅｎｆａｃｈ）およびドゥベクスラー（Ｄｖｅｋｓｌｅｒ）、「ＰＣＲプライマー：実験室マニュアル（ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」（１９９５年）を参照されたい）。あるいは、重複するオリゴヌクレオチドは合成的に生成および結合させて、１つ以上の領域を生成することが可能である。触媒性領域または二本鎖核酸結合領域をコードする核酸はまた、抗体をプローブとして使用して、発現ライブラリーからも単離できる。本発明のＤＮＡ結合領域およびポリメラーゼ領域を単離するためのその他の適切な方法については、ここで述べられる。
【０１０４】
ポリペプチドは、直接、または例えばポリグリシンリンカー等のアミノ酸リンカー、もしくは例えば炭水化物リンカー、脂質リンカー、脂肪酸リンカー、ポリエーテルリンカー（ＰＥＧなど）等の、別のタイプの化学リンカーなどの共有結合リンカーのいずれかを介して結合できる（例えばヘルマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６年）参照」）。融合ポリペプチドを形成するポリペプチドは、一般的にＣ末端とＮ末端で結合するが、それらはまた、Ｃ末端とＣ末端、Ｎ末端とＮ末端またはＮ末端とＣ末端で結合してもよい。１つまたはそれ以上のポリペプチド領域が、本発明のＤＮＡポリメラーゼ中の内部位置に挿入されてもよい。融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序であることができる。キメラＤＮＡポリメラーゼは、融合タンパク質を連続的にコードする組み換えポリヌクレオチドを調製することで、例えばＰｆｕなどの１つのタンパク質配列からのアミノ酸鎖を、例えば変異Ｓｓｏ７ｄなどの別のタンパク質配列からのアミノ酸鎖に共有結合させて、生成してもよい。融合タンパク質中の異なるアミノ酸鎖は、直接につなぎ合わせて、または化学結合基もしくは長さが１〜１００個のアミノ酸が一般的である、約２００個以上のアミノ酸であるアミノ酸結合基を通じて、間接的につなぎ合わせてもよい。いくつかの実施形態では、リンカー中にプロリン残基が組み込まれて、リンカーによる顕著な二次的構造要素の形成を防止する。リンカーは多くの場合、組み換え融合タンパク質の一部として合成される可動性のアミノ酸部分配列である。このような可動性のリンカーは当業者に知られている。
【０１０５】
本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼを調製する方法はまた、その全体を本明細書に援用する国際特許出願公開第０１／９２５０１  Ａ１号パンフレット、米国特許出願公開第２００４／００８１９６３号明細書（２００２年１０月２３日出願）、およびパブロフ（Ｐａｖｌｏｖ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１３５１０〜１３５１５頁（２００２年）にも記載されている。
【０１０６】
一実施形態では、本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼは、変異ＤＮＡ結合タンパク質に結合する野生型ＤＮＡポリメラーゼを含む。
【０１０７】
別の実施形態では、本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼは、変異ＤＮＡ結合タンパク質に結合する変異ＤＮＡポリメラーゼを含む。
【０１０８】
Ｖ．本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼの発現
当該技術分野で知られている方法を応用して、本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼを発現させ単離してもよい。多くの細菌発現ベクターは、外来性配列によってコードされるタンパク質の高レベル誘導性発現を可能にする配列要素または配列要素の組み合わせを含有する。例えば組み込まれた誘導性形態Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現する細菌を、Ｔ７プロモーターに結合したキメラＤＮＡポリメラーゼ構築物を有する発現ベクターで形質転換してもよい。例えばｌａｃ−誘導性プロモーターのためのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）などの適切な誘導因子の付加によるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの誘導は、Ｔ７プロモーターからのキメラＤＮＡポリメラーゼの高レベル発現を誘発する。
【０１０９】
適切な細菌宿主株は、当該技術分野で当業者が入手できるものから選択されてもよい。非限定的な例として、大腸菌株ＢＬ−２１が、その他の大腸菌と比べてプロテアーゼが欠損していることから、外来性タンパク質発現のために一般に使用される。ＢＬ−２１株は、ＷＪ５６およびＥＲ２５６６を含む誘導性Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する（ガードナー（Ｇａｒｄｎｅｒ）およびジャック（Ｊａｃｋ）、１９９９年、前出）。特定ポリメラーゼ遺伝子のコドン使用頻度が大腸菌遺伝子で通常見られるのと異なる状況では、例えばクローン古細菌酵素遺伝子などのクローンタンパク質遺伝子の高効率発現を可能にする、より稀なアンチコドンがあるｔＲＮＡをコードするｔＲＮＡ遺伝子（例えばａｒｇＵ、ｉｌｅＹ、ｌｅｕＷ、およびｐｒｏＬ  ｔＲＮＡ遺伝子）を運ぶように改変されたＢＬ−２１株がある（例えばレアコドンｔＲＮＡを運ぶいくつかのＢＬ２１−コドンＰＬＵＳＴＭ細胞株は、ストラタジーンから入手できる）。
【０１１０】
本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼの精製に適した多くの方法が、当業者に知られている。例えばローヤー（Ｌａｗｙｅｒ）ら（ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．＆  Ａｐｐ．２：２７５頁（１９９３年））の方法は、元々Ｔａｑポリメラーゼの単離用に設計されているため、大腸菌中で発現されるキメラＤＮＡポリメラーゼの単離によく適している。あるいは、宿主タンパク質を破壊する熱変性ステップ、および２つのカラム精製ステップ（ＤＥＡＥ−セファロースおよびヘパリン−セファロースカラム上の）を用いて、高度に活性で純度およそ８０％のＤＮＡポリメラーゼを単離する、参照によって本明細書に援用するコン（Ｋｏｎｇ）ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５頁（１９９３年））の方法を使用してもよい。さらにキメラＤＮＡポリメラーゼは、硫酸アンモニウム分画とそれに続くＱセファロースおよびＤＮＡセルロースカラムによって単離してもよく、またはＨｉＴｒａｐ  Ｑカラム上へ夾雑物吸着と、それに続くＨｉＴｒａｐヘパリンカラムからの勾配溶離によって単離してもよい。
【０１１１】
ＶＩ．本発明の応用
一態様では、本発明は、本発明の組成物を使用して、ＤＮＡを合成するための方法を提供する。一般的にポリヌクレオチドの合成は、合成プライマー、合成鋳型、新しく合成されたポリヌクレオチド中への組み込みのためのポリヌクレオチド前駆物質（例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）などを必要とする。ポリヌクレオチド合成を実施する詳細な方法は当業者によく知られており、例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９年）中にある。
【０１１２】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、特異的ポリヌクレオチド鋳型配列を増幅する試験管内方法を指す。ＰＣＲ技術については、Ｍ．Ｊ．マクファーソン（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ）ら、「ＰＣＲ：実用的なアプローチ（ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１年）；イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら、「ＰＣＲプロトコル：方法と応用ガイド（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０年）；およびＨ．Ａ．エーリッヒ（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ）、「ＰＣＲ技術：ＤＮＡ増幅のための原理と応用（ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）をはじめとする多数の出版物に記載されている。ＰＣＲについてはまた、それぞれ参照によって本明細書に援用する、米国特許第４，６８３，１９５号明細書、米国特許第４，６８３，２０２号明細書、米国特許第４，８００，１５９号明細書、米国特許第４，９６５，１８８号明細書、米国特許第４，８８９，８１８号明細書、米国特許第５，０７５，２１６号明細書、米国特許第５，０７９，３５２号明細書、米国特許第５，１０４，７９２号明細書、米国特許第５，０２３，１７１号明細書、米国特許第５，０９１，３１０号明細書、および米国特許第５，０６６，５８４号明細書をはじめとする多くの米国特許明細書にも記載されている。
【０１１３】
本発明によって提供される利点の理解を容易にするために、ＰＣＲの概要を提供する。ＰＣＲ反応は反復される一連の温度サイクルを含み、一般的に５０〜１００μｌの容積で実施される。反応混合物はｄＮＴＰ（それぞれｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの４つのデオキシヌクレオチド）、プライマー、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ、およびポリヌクレオチド鋳型を含む。ＰＣＲは、増幅される二本鎖標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする２つのプライマーを必要とする。ＰＣＲではこの二本鎖標的配列が変性されて、変性標的の各鎖に１つのプライマーがアニールされる。プライマーは、互いに離れた部位で、１つのプライマー伸長生成物がその相補体と分離すると、もう一方のプライマーとハイブリダイズできるような向きで、標的ポリヌクレオチドにアニールする。ひとたび特定プライマーが標的配列にハイブリダイズしたら、プライマーはＤＮＡポリメラーゼの作用によって伸長される。次に伸長生成物を標的配列から変性して、工程を繰り返す。
【０１１４】
この工程の連続サイクルにおいては、初期サイクルで生成する伸長生成物が、ＤＮＡ合成のための鋳型の役割をする。第２のサイクルに始まって、増幅生成物は対数的速度で蓄積し始める。増幅生成物は、第１のプライマーの配列を含有し、第２のプライマーに相補的な配列が最終的にそれに続く第１の鎖、および第１の鎖に相補的な第２の鎖を含む分離した二本鎖ＤＮＡ分子である。
【０１１５】
ＰＣＲ工程において可能な莫大な増幅により、意図的に添加された鋳型ＤＮＡ不在下でも、高ＤＮＡレベルサンプル、陽性対照鋳型または以前の増幅から持ち越された小さなレベルのＤＮＡから、ＰＣＲ生成物をもたらすことができる。可能ならば全ての反応混合物は、ＰＣＲ生成物分析およびサンプル調製とは離れた区域に配置する。ＲＮＡ／ＤＮＡ調製、反応混合、およびサンプル分析のための専用または使い捨て容器、溶液、およびピペット（好ましくは容積式ピペット）の使用が相互汚染を最小化する。参照によって本明細書に援用する、ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）およびクウォック（Ｋｗｏｋ）、Ｎａｔｕｒｅ、３３９：２３７〜２３８頁（１９８９年）、およびイニス（Ｉｎｎｉｓ）ら編、「ＰＣＲプロトコル：方法と応用ガイド（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ（１９９０年）中のクウォック（Ｋｗｏｋ）およびオレゴ（Ｏｒｒｅｇｏ）もまた参照されたい。
【０１１６】
Ａ．熱安定性酵素
ＰＣＲ増幅のために、本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼを含むポリメラーゼ領域を含んでもよい。ここでの用法では、「熱安定性」とは、熱に対して安定な酵素が耐熱性であり、例えば５０〜９０℃の高温で機能することを指す。本発明の熱安定性酵素は、増幅反応のために効果的であるという単一基準を満たさなくてはならず、すなわち酵素は、二本鎖ポリヌクレオチドの変性をもたらすのに必要な時間の間高温に曝されたとき、不可逆的に変性（不活性化）されてはならない。これに関連して使用される「不可逆的変性」とは、恒久的で完全な酵素的活性喪失をもたらす過程を意味する。変性に必要なに加熱条件は、例えば緩衝液塩濃度および変性されるポリヌクレオチドの長さとヌクレオチド組成に依存するが、温度は一般的により短いポリヌクレオチド用の８５℃から１０５℃の範囲であり、時間は主に温度とポリヌクレオチド長に依存し、一般的により短いポリヌクレオチド用の０．２５分からより長いＤＮＡ断片用の４．０分にわたる。緩衝液塩濃度および／またはポリヌクレオチドのＧＣ組成物を増大させると、より高い温度に耐えられる。好ましくは、酵素は９０〜１００℃で不可逆的に変性されない。本発明の不可逆的に変性されない酵素は、増幅反応中に少なくとも１０％、または少なくとも２５％、または少なくとも５０％もしくはそれ以上の機能または活性を保持する。
【０１１７】
Ｂ．ＰＣＲ反応混合物
本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼに加えて、当業者はその他のＰＣＲパラメーターを用いて、合成／増幅反応の忠実度を増大させてもよい。ＰＣＲ忠実度が、ｄＮＴＰ濃度、反応あたりの使用酵素単位、ｐＨ、および反応中のＭｇ２＋とｄＮＴＰとの比率の変化などの要因によって、影響されうることが報告されている（マティラ（Ｍａｔｔｉｌａ）ら、１９９１年、前出）。
【０１１８】
Ｍｇ２＋濃度は、プライマー−鋳型相互作用を安定化することでオリゴヌクレオチドプライマーの鋳型ＤＮＡへのアニールに影響し、またポリメラーゼと鋳型プライマーの複製複合体も安定化する。したがって非特異的アニールも増大させて、望ましくないＰＣＲ生成物も生じ得る（ゲル中で複数バンドを生じる）。非特異的増幅が起きると、増幅の正確さと特異性を増大させるため、Ｍｇ２＋濃度の低減の必要があり、またはＥＤＴＡをＭｇ２＋をキレートするために添加してもよい。
【０１１９】
Ｍｎ２＋またはＣｏ２＋などのその他の二価の陽イオンもまた、ＤＮＡ重合に影響する。各ＤＮＡポリメラーゼに適した陽イオンは当該技術分野で知られている（例えば「ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」第２版、前出）。二価の陽イオンは、ＭｇＣｌ２、Ｍｇ（ＯＡｃ）２、ＭｇＳＯ４、ＭｎＣｌ２、Ｍｎ（ＯＡｃ）２、またはＭｎＳＯ４などの塩の形態で提供される。トリス−ＨＣｌ緩衝液中で使用できる陽イオン濃度は、ＭｎＣｌ２で０．５〜７ｍＭ、好ましくは０．５〜２ｍＭの間、およびＭｇＣｌ２では０．５〜１０ｍＭである。ビシン／ＫＯＡｃ緩衝液中で使用できる陽イオン濃度は、Ｍｎ（ＯＡｃ）２では１〜２０ｍＭ、好ましくは２〜５ｍＭの間である。
【０１２０】
ＤＮＡポリメラーゼが必要とする一価の陽イオンは、塩化物または酢酸塩どちらかのカリウム、ナトリウム、アンモニウム、またはリチウム塩によって提供されてもよい。ＫＣｌでは濃度は１〜２００ｍＭの間、好ましくは濃度は４０〜１００ｍＭの間であるが、最適濃度は反応で使用されるポリメラーゼ次第で変更してもよい。
【０１２１】
デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）は、二ナトリウムまたはリチウム塩などのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、およびｄＴＴＰ塩の溶液として添加される。本方法では、それぞれ１μＭ〜２ｍＭの範囲の最終濃度が適切であり、１００〜６００μＭが好ましいが、ヌクレオチドの最適濃度は、ＰＣＲ反応中の全ｄＮＴＰならびに二価の金属イオン濃度、および緩衝液、塩、特定のプライマー、および鋳型次第で、変更してもよい。より長い、すなわち１５００ｂｐを超える生成物では、トリス−ＨＣｌ緩衝液を使用する場合、各５００μＭのｄＮＴＰが好ましいかもしれない。
【０１２２】
ｄＮＴＰは二価の陽イオンにキレートするので、使用する二価の陽イオンの量は、反応中のｄＮＴＰ濃度に従って変化させることが必要たりうる。過剰量のｄＮＴＰ（例えば１．５ｍＭ以上）はエラー率を増大させ、場合によりＤＮＡポリメラーゼを阻害する。したがってｄＮＴＰ濃度を（例えば１０〜５０μＭに）低下させることは、エラー率を低下させうる。より大きなサイズの鋳型を増幅するためのＰＣＲ反応では、より多いｄＮＴＰが必要たりうる。
【０１２３】
１つの適切な緩衝剤は、トリス−塩基／トリス−ＨＣｌまたはトリス−塩基／トリス−Ｈ２ＳＯ４であり、好ましくはｐＨ１０であるが、ｐＨ８．０〜１１．５の範囲であってもよい。トリス−塩基／トリス−ＨＣｌまたはトリス−塩基／トリス−Ｈ２ＳＯ４濃度は５〜２５０ｍＭであるが、１０〜１００ｍＭが最も好ましい。
【０１２４】
ＰＣＲはＤＮＡ増幅のための非常に強力なツールであり、したがって非常にわずかな鋳型ＤＮＡしか必要ない。しかしいくつかの実施形態ではエラーの可能性を低下させるためにより高いＤＮＡ濃度を使用してもよいが、過剰量の鋳型は夾雑物量を増大させて、効率を低下させうる。
【０１２５】
通常３μＭまでのプライマーを使用してもよいが、高いプライマーと鋳型の濃度比率は、非特異的増幅およびプライマー二量体形成をもたらす。したがって、通常はプライマー配列をチェックしてプライマー二量体形成を避けることが必要である。
【０１２６】
本発明は、鋳型中のシトシン脱アミノ化の効果を最小化およびより長い変性時間と高い変性温度での使用を可能にすることで、ＧＣに富むＤＮＡ鋳型のＰＣＲを促進する、ウラシル検知活性が低下したＰｆｕ  Ｖ９３Ｒ、Ｖ９３Ｅ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３Ｄ、またはＶ９３ＮＤＮＡポリメラーゼを有するポリメラーゼ領域を含む、キメラＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【０１２７】
Ｃ．サイクルパラメーター
鋳型のＧＣ含量が高い場合、変性時間を増大させてもよい。高いＧＣ含量のプライマーまたはより長いプライマーには、より高いアニール温度が必要である。勾配ＰＣＲはアニール温度を判定するのに有用な方法である。より大きなＰＣＲ生成物増幅のためには、伸長時間を延長すべきである。しかし伸長時間は酵素の損傷を抑えるため、可能ならば常に短縮する必要がある。
【０１２８】
サイクル数は、鋳型ＤＮＡ分子数が非常に小さい場合には増大でき、多量の鋳型ＤＮＡを使用する場合は減少できる。
【０１２９】
Ｄ．ＰＣＲ促進因子
ＰＣＲ促進因子もまた使用して、増幅効率を改善できる。ここで、「ＰＣＲ促進因子」または「ポリメラーゼ促進因子」（ＰＥＦ）とは、ポリヌクレオチドポリメラーゼ促進活性を有する複合体またはタンパク質を指す（どちらも参照によって本明細書に援用する、ホッゴレフ（Ｈｏｇｒｅｆｅ）ら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  １０：：９３〜９６（１９９７年）および米国特許第６，１８３，９９７号明細書）。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼでは、ＰＥＦは、Ｐ４５を天然形態（Ｐ５０とＰ４５との複合体として）または組み換えタンパク質のいずれかとして含む。Ｐｆｕ  Ｐ５０およびＰ４５の天然複合体中では、Ｐ４５のみがＰＣＲ促進活性を示す。Ｐ５０タンパク質は細菌フラボタンパク質と類似の構造である。Ｐ４５タンパク質はｄＣＴＰデアミナーゼおよびｄＵＴＰａｓｅと類似の構造であるが、ｄＵＴＰをｄＵＭＰおよびピロリン酸塩に転換するｄＵＴＰａｓｅとしてのみ機能する。本発明のＰＥＦはまた、以下からなる群から選択することができる：古細菌源（例えばパイロコッカス・フリオサス）から得られた、単離または精製された天然型ポリメラーゼ促進タンパク質；ポリメラーゼ促進活性を有するＰｆｕ  Ｐ４５と同一のアミノ酸配列を有する全長または部分的合成タンパク質またはその類似体；１つまたはそれ以上の前記天然または全長または部分的合成タンパク質のポリメラーゼ促進混合物；１つまたはそれ以上の前記天然または全長または部分的合成タンパク質ポリメラーゼ促進タンパク質の複合体；ならびに１つまたはそれ以上の前記天然のタンパク質を含有するポリメラーゼ促進性の部分的精製細胞抽出物（米国特許第６，１８３，９９７号明細書、前出）。ＰＥＦのＰＣＲ促進活性は、当該技術分野でよく知られている手段によって規定される。ＰＥＦの単位の定義は、ｄＵＴＰからのピロリン酸塩（ＰＰｉ）生成をモニタリングして判定されるＰＥＦ（Ｐ４５）のｄＵＴＰａｓｅ活性に基づく。例えばＰＥＦがｄＵＴＰ（１×クローンＰｆｕ  ＰＣＲ緩衝液中の１０ｍＭ  ｄＵＴＰ）と共にインキュベートされ、その間にＰＥＦはｄＵＴＰをｄＵＭＰとＰＰｉに加水分解する。シグマ（Ｓｉｇｍａ）から市販される共役酵素的アッセイシステム（＃Ｐ７２７５）を使用して、生じたＰＰｉ量を定量化する。１活性単位は、毎時（８５℃で）４．０ｎｍｏｌｅのＰＰｉを生じることと、機能的に定義される。
【０１３０】
その他のＰＣＲ添加剤もまた、ＰＣＲ反応の正確さと特異性に影響しうる。増幅反応混合物中に０．５ｍＭ未満のＥＤＴＡが存在してもよい。トウィーン−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）（商標）およびノニデットＰ−４０（ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０）（商標）などの界面活性剤が酵素希釈緩衝液中に存在する。およそ０．１％以下の非イオン性洗浄剤の最終濃度が適切であるが、０．０１〜０．０５％が好ましく、ポリメラーゼ活性を妨げない。同様に酵素調製物中にグリセロールが多くの場合存在し、一般に反応混合物中で１〜２０％の濃度に希釈される。ＧＣ含量が高い鋳型ＤＮＡ、または長い（例えば＞１ｋｂ）鋳型ＤＮＡのＰＣＲでは、グリセロール（５〜１０％）、ホルムアミド（１〜５％）またはＤＭＳＯ（２〜１０％）が添加できる。これらの添加剤は、プライマーと鋳型のハイブリダイゼーション反応のＴｍ（変性温度）およびポリメラーゼ酵素の熱安定性を変化させる。ＢＳＡ（０．８μｇ／μｌまで）は、ＰＣＲ反応効率を改善できる。ＧＣ含量が高く長いＤＮＡ断片のＰＣＲには、ベタイン（０．５〜２Ｍ）もまた有用である。塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ、＞５０ｍＭ）、塩化テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡＣ）、およびトリメトラミンＮ−酸化物（ＴＭＡＮＯ）もまた使用してもよい。試験ＰＣＲ反応を実施して、上述の各添加剤の最適濃度を判定してもよい。
【０１３１】
本発明は、抗体（ホットスタートＰＣＲ用）およびｓｓｂ（一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、より高い特異性）をはじめとする添加剤を提供するが、これらに限定されない。本発明はまた、例えば参照によってその全体を本明細書に援用する、米国特許第６，３３３，１５８号明細書、および国際特許出願公開第０１／０９３４７  Ａ２号パンフレットに記載されるような副次的要素と組み合わせた変異古細菌ＤＮＡポリメラーゼも意図する。
【０１３２】
様々な特異的ＰＣＲ増幅用途が当該技術分野で利用できる（総説については、例えばそれぞれ参照によって本明細書に援用する、エルリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）、Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１：．１２７〜３４頁（１９９９年）；プレディガー（Ｐｒｅｄｉｇｅｒ），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６０：４９〜６３頁（２００１年）；ジュレシック（Ｊｕｒｅｃｉｃ）ら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：３１６〜２１頁（２０００年）；トリグリア（Ｔｒｉｇｌｉａ），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３０：７９〜８３頁（２０００年）；マッケランド（ＭａＣｌｅｌｌａｎｄ）ら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．４：Ｓ６６〜８１頁（１９９４年）；アブラムソン（Ａｂｒａｍｓｏｎ）およびメーヤーズ（Ｍｙｅｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４１〜４７頁（１９９３年）を参照されたい）。
【０１３３】
以下の本発明は、ＰＣＲ用途で使用できるが、これに限定されるものではない：ｉ）非特異的増幅を低下させるホットスタートＰＣＲ；ｉｉ）高アニール温度で開始させて、次にアニール温度を段階的に低下させて非特異的ＰＣＲ生成物を低下させる、タッチダウンＰＣＲ；ｉｉｉ）プライマーのアウターセットおよびプライマーのインナーセットを使用して、より信頼性の高い生成物を合成するネステッドＰＣＲ；ｉｖ）既知配列の近傍領域の増幅のためのインバースＰＣＲ。この方法では、ＤＮＡを消化して目的の断片をライゲーションによって環状化させ、次に外側に延びる既知の配列に相補的なプライマーを使用してＰＣＲを行う；ｖ）ＡＰ（任意刺激）−ＰＣＲ／ＲＡＰＤ（ランダム増幅多形ＤＮＡ）。これらの方法は、任意のオリゴヌクレオチドを使用した増幅によって、ほとんど分かっていない標的配列がある種からゲノムのフィンガープリントを作り出す；ｖｉ）ＲＮＡ誘導ＤＮＡポリメラーゼ（例えば逆転写酵素）を使用してｃＤＮＡｓを合成し、次にそれをＰＣＲのために使用する、ＲＴ−ＰＣＲ；この方法は組織または細胞中の特異的配列の発現を検出するのに、極めて感受性が高い。またこれを使用してｍＲＮＡ転写物を定量化してもよい；ｖｉｉ）ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅）。これはＤＮＡ／タンパク質配列に関する情報が限られる場合に使用される。この方法はそれぞれ１つの特異的プライマーのみ（１つのアダプタプライマーを加える）で、ｃＤＮＡの３’または５’末端を増幅してｃＤＮＡ断片を発生させる。次に重複するＲＡＣＥ生成物を組み合わせて、全長ｃＤＮＡを生成できる；ｖｉｉｉ）異なる組織中の差別的に発現された遺伝子を同定するのに使用される、ＤＤ−ＰＣＲ（ディファレンシャル・ディスプレイＰＣＲ）；ＤＤ−ＰＣＲの最初のステップはＲＴ−ＰＣＲを伴い、次に、短く、意図的に非特異的なプライマーを使用して増幅が実施される；ｉｘ）同一試料中の２つ以上の独自のＤＮＡ配列標的が同時に増幅されるマルチプレックス−ＰＣＲ。１つのＤＮＡ配列を対照として使用して、ＰＣＲの質を検証できる；ｘ）同一セットのプライマーについて標的ＤＮＡ（競合的ＰＣＲ）と競合する内部対照（ただし異なるサイズ）ＤＮＡ配列を使用する、Ｑ／Ｃ（定量比較的）−ＰＣＲ；ｘｉ）遺伝子を合成するのに使用されるリカーシブＰＣＲ。この方法で使用されるオリゴヌクレオチドは、遺伝子ストレッチ（＞８０塩基）に相補的であり、あるいは末端重複（約２０塩基）して、センスおよびアンチセンス鎖に相補的である；ｘｉｉ）非対称性ＰＣＲ；ｘｉｉｉ）原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ＰＣＲ；ｘｉｖ）部位特異的ＰＣＲ変異誘発。
【０１３４】
本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼを使用した追加的方法は、参照によってその内容全体を本明細書に援用する、２００４年３月１９日に出願された米国特許出願公開報第２００５／００４８５３０号明細書に記載される。
【０１３５】
本発明は、いかなる特定の増幅システムにも限定されないものとする。その他のシステムが開発されれば、それらのシステムは本発明の実施によって恩恵を受けるかもしれない。
【０１３６】
ＶＩＩ．キット
ここで本発明はまた、本発明の組成物の１つ以上の容器を有する包装単位を含むキット形態、およびＰＣＲ中の合成を含むポリヌクレオチド合成のための様々な試薬の容器を含むいくつかの実施形態についても意図する。キットはまた、ポリヌクレオチド前駆物質、プライマー、緩衝液、使用説明書、および対照を含む、１つまたはそれ以上の物品を含有してもよい。キットは、本発明に従った方法を実施するために適切な比率で共に混合された試薬の容器を含んでもよい。試薬の容器は、好ましくは、本発明の方法を実施する際に測定ステップを不必要にする単位量の試薬を含有する。
【０１３７】
本発明は、本発明に従ったキメラＤＮＡポリメラーゼの組み合わせと、ＰＣＲ促進試薬と、ＰＣＲ増幅、ＤＮＡ配列決定または変異誘発のための試薬とを含むキットを意図する。
【０１３８】
ＤＮＡの配列決定をするためのキットは、いくつかの容器手段を含む。第１の容器手段は、例えば本発明のポリメラーゼの実質的に精製されたサンプルを含んでもよい。第２の容器手段は、ＤＮＡ鋳型に相補的なＤＮＡ分子を合成するのに必要な、１つまたはいくつかのヌクレオチドを含んでもよい。第３の容器手段は、１つまたはいくつかの異なるタイプのターミネーター（ジデオキシヌクレオシド三リン酸など）を含んでもよい。第４の容器手段は、ピロホスファターゼを含んでもよい。上記の容器手段に加えて、１つまたはいくつかのプライマーおよび／または適切な配列決定緩衝液を含む、追加的な容器手段がキット中に含まれてもよい。
【０１３９】
核酸の増幅するまたは合成のために使用されるキットは、例えば実質的に純粋な本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼを含む第１の容器手段と、単一タイプのヌクレオチドまたはヌクレオチド混合物を含む１つまたはいくつかの追加的容器手段とを含む。
【０１４０】
核酸変異誘発のために使用されるキットは、例えば実質的に純粋な本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼを含む、第１の容器手段を含んでもよい。第２の容器手段は、単一タイプのヌクレオチドまたはヌクレオチド混合物を含んでもよい。第３の容器手段は、適切な反応緩衝液を含んでもよい。追加的容器手段は、コンピテント細胞を含んでもよい。
【０１４１】
キット中に、様々なプライマー、ならびに適切な増幅または合成緩衝液が含まれてもよい。
【０１４２】
所望ならば、本発明のキットは、核酸分子の合成または配列決定中に使用可能な、検出可能な標識ヌクレオチドを含む容器手段を含んでもよい。多数の標識の１つを使用して、このようなヌクレオチドを検出してもよい。例示的な標識としては、限定されるものではないが、放射性同位体、蛍光性標識、化学発光標識、生物発光標識、および酵素標識が挙げられる。
【０１４３】
ここで一般に述べられる本発明について概説したが、同発明は、例示の目的で提供され、特に断りのない限り本発明を限定することを意図しない、以下の実施例を参照してより容易に理解される。
【実施例】
【０１４４】
実施例１  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ領域およびＳｓｏ７ｄ  ＤＮＡ結合領域を有するＤＮＡキメラポリメラーゼの構築
Ｓｓｏ７ｄのＮ末端をパイロコッカス・フリオサスＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ）のＣ末端に結合して、Ｐｆｕ−Ｓｓｏ７ｄ融合物を作り出した。６個のアミノ酸のリンカー配列（ＧＩｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）をＳｓｏ７ｄのＮ末端に付加した。野生型Ｐｆｕ−Ｓｓｏ７ｄキメラをコードする核酸およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１８および２０で示される。
【０１４５】
製造業者の使用説明書に従って、クイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）部位特異的変異誘発キット（ストラタジーン、カタログ番号２００５１８）によって、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼキメラのＳｓｏ７ｄ部分に点変異を導入した。
【０１４６】
簡単に述べると、目的変異の領域内中の、Ｓｓｏ７ｄ配列の逆鎖に相補的な（点変異を除く）プライマーのセットを使用して、ＰＣＲ反応により各変異を導入した。サイクル条件は、９５℃で２分間を１サイクル；９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で１０分間を１８サイクル；および６８℃で１０分間を１サイクルであった。次に反応をＤＰＮ  Ｉで処理して、非変異プラスミドを分解した。ＸＬ−１０ゴールド（Ｇｏｌｄ）スーパーコンピテント細胞を変異プラスミドで形質転換して播種した。変異プラスミドのプラスミド調製物を配列決定して、変異の付加を確認した。
【０１４７】
以下の変異のセットがＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼキメラのＳｓｏ７ｄ部分に導入された。
１．配列番号２のＫ４Ｒ、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ
２．配列番号２のＴ２Ｓ、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ
３．配列番号２のＡ１Ｖ、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ
４．配列番号２のＥ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ
５．配列番号２のＷ２３、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ
６．配列番号２のＩ２９Ｖ、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ
７．配列番号２のＴ３２Ｓ、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ
８．配列番号２のＥ３５Ｄ、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ
９．配列番号２のＧ３７Ａ、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ
１０．配列番号２のＴ４０Ｓ、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ
１１．配列番号２のＧ４１Ａ、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ
１２．配列番号２のＶ４５Ｌ、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ
１３．配列番号２のＬ５５Ｖ、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ
１４．配列番号２のＱ５６Ｄ、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ
１５．配列番号２のＱ５６Ｄ、Ｔ４０Ｓ、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ
１６．配列番号２のＴ４０Ｓ、Ｖ４５Ｌ、Ｌ５５Ｖ、Ｑ５６Ｄ、Ｋ６３Ｒ、Ｅ１３Ｑ、Ｉ１６Ｔ
【０１４８】
実施例２  ＤＮＡポリメラーゼキメラのＤＮＡ伸長能の比較
増幅産物収率に対する変異の効果を判定するため、ＰＣＲ増幅反応を実施して、各変異型Ｓｓｏ７ｄ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼキメラを野生型Ｓｓｏ７ｄ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼキメラと比較した。
【０１４９】
ＰＣＲ反応物は１２．５ｎｇ〜１００ｎｇの変異型または野生型キメラＤＮＡポリメラーゼ、ｐＨ１０のＰＣＲ反応緩衝液、各２００μＭのｄＮＴＰ、ヒトα−１抗トリプシンに特異的な各１００ｎｇの順方向および逆方向プライマー、および１００ｎｇのゲノムＤＮＡを含有した。反応をサーマルサイクラー内において、次のサイクルパラメーターの下で実施した：９５℃で２分間を１サイクル；９５℃で１０秒間、５８℃で５秒間、および７２℃で１０秒間を３０サイクル。増幅生成物をアガロースゲル上で分析し、それらの相対収率を評価した。
【０１５０】
ＤＮＡゲルシフトアッセイを実施して、各変異型Ｓｓｏ７ｄ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼキメラのＤＮＡ結合能力を野生型Ｓｓｏ７ｄ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼキメラと比較した。各Ｓｓｏ７ｄ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼキメラ（１００〜６００ｎｇ）を別々の反応混合物中で、室温で１０分間インキュベートした。反応混合物はまた、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液中の１００ｎｇのゲノムＤＮＡも含有した。反応混合物を６％アガロースゲル上で泳動して分析し、キメラＳｓｏ７ｄ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ結合能力を評価した。
【０１５１】
結果は、ＤＮＡポリメラーゼキメラ中でＳｓｏ７ｄの機能性損失を引き起こすことなしに、限られた数のアミノ酸のみが変更できることを示唆した。さらにＳｓｏ７ｄタンパク質の特定領域は、他の領域よりもアミノ酸変化についてより融通が利いた。
【０１５２】
ＤＮＡポリメラーゼキメラのＳｓｏ７ｄ部分のＮ末端に導入されたアミノ酸変化（Ａ１Ｖ、Ｔ２Ｋ、Ｔ２Ｓ、およびＫ４Ｒ）は、ＰＣＲ増幅およびゲノムＤＮＡゲルシフトアッセイにおいて、野生型コンストラクトと比べてＰＣＲ収率およびＤＮＡ結合活性の低下をもたらした。Ｅ１３ＱおよびＩ１６Ｔのアミノ酸変化については、ＰＣＲ収率またはＤＮＡ結合活性は観察されなかった。
【０１５３】
ＤＮＡポリメラーゼキメラのＳｓｏ７ｄ部分に導入されたアミノ酸変化（Ｗ２３Ｆ、Ｉ２９、Ｔ３２Ｓ、Ｅ３５Ｄ、およびＧ３７Ａ）は、野生型構築物に比べると、キメラのＰＣＲ収率およびＤＮＡ結合活性を低下させた。Ｗ２３ＦおよびＴ３２Ｓが保存アミノ酸であるのに対し、Ｉ２９、Ｅ３５、およびＧ３７は非保存アミノ酸である。非保存アミノ酸Ｉ２９をＩ２９Ｖ、Ｉ２９Ｌ、およびＩ２９Ａに変化させた。アミノ酸ＬおよびＡは、Ｉと構造的に非常に類似しているにもかかわらず、全ての変化は野生型構築物と比べて、機能的に欠損したキメラをもたらした。
【０１５４】
ＤＮＡポリメラーゼキメラのＳｓｏ７ｄ部分にアミノ酸の変化Ｔ４０Ｓ、Ｇ４１Ａ、およびＶ４５Ｌを生じさせた場合、ＰＣＲ収率およびＤＮＡ結合活性の低下は観察されなかった。非保存アミノ酸Ｌ５５からＶへの変異もまた、アミノ酸変化Ｌ５５Ｖは、Ｓａｃ７ｅ中のこの部位のアミノ酸と異なるにもかかわらず、キメラの機能性に悪影響を及ぼさなかった。キメラＤＮＡポリメラーゼ（Ｑ５６Ｄ、Ｑ６１Ｅ、およびＫ６３Ｒ）のＳｓｏ７ｄ部分のＣ末端αへリックスに生じた変異は、キメラに機能性損失を引き起こさなかった。
【０１５５】
Ｅ１３Ｑ、Ｉｌ６Ｔ、Ｔ４０Ｓ、Ｖ４５Ｌ、Ｌ５５Ｖ、Ｑ５６Ｄ、およびＫ６３Ｒに変異を有するＳｓｏ７ｄ領域があるキメラＤＮＡポリメラーゼは、野生型キメラＤＮＡポリメラーゼと同程度のＤＮＡ収率およびＤＮＡ結合活性を有した（図３）。
【０１５６】
ここで引用したあらゆる特許、特許出願、および公開された参考文献は、参照によってその全体を本明細書に援用する。本発明を特にその好ましい実施形態を参照して示し説明したが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更ができることが当業者によって理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】Ｓｓｏ７ｄとＳｓｏ７ｄ様ポリペプチド（Ｓｓｈ７ｂ、ＲｉｂｏＰ３、Ｓｔｏ７ｅ、Ｓａｃ７ｄ、Ｓａｃ７ｅ、およびＳａｃ７ａ）の間のタンパク質配列比較を表す。
【図２】Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼキメラのＳｓｏ７ｄ領域に生じた変異（カラム１）の同定を表す。キメラに悪影響を与えた変異はカラム２で、一方カラム３はキメラに悪影響を与えなかった変異を示す。
【図３】野生型Ｓｓｏ７ｄポリペプチドを含むキメラＤＮＡポリメラーゼと変異Ｓｓｏ７ｄポリペプチドを含むキメラＤＮＡポリメラーゼとを比較する、増幅反応およびゲルシフトアッセイの結果を表す。Ｓｓｏ７ｄポリペプチドの変異はＥ１３Ｑ、Ｉｌ６Ｔ、Ｔ４０Ｓ、Ｖ４５Ｌ、Ｌ５５Ｖ、Ｑ５６Ｄ、およびＫ６３Ｒである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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