(57)【要約】セルロース性基質を加水分解するのに減らしたセルラーゼ添加量を利用する方法が開示される。該方法は、ある時間内にある量のセルロース性基質を実質的に加水分解するのに必要とされる精製セルラーゼの量を決定すること、２〜５の因数で精製セルラーゼの量を減らし、減らしたセルラーゼの量を決定すること、及び好適な条件下、セルロース性基質の実質的加水分解を行うことができるのに十分な前記時間で、（１）減らしたセルラーゼ添加量と同等の濃度で細胞結合性セルラーゼを発現する微生物、又は（２）操作されて、減らしたセルラーゼ添加量と同等の濃度で細胞結合性セルラーゼを発現する発酵因子のいずれかをセルロース性基質に導入することを含む。
2009535067.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース性基質を加水分解するのに減らしたセルラーゼ添加量を利用する方法であって、
ある量のセルロース性基質をある時間内に実質的に加水分解するのに必要な精製セルラーゼの量を決定することと；
２〜５の間の因数で該精製セルラーゼの量を減らして、減らしたセルラーゼ添加量を決定することと；
好適な条件下にて、該セルロース性基質の実質的な加水分解を行うことができる該時間の間、減らしたセルラーゼ添加量と同等の濃度で細胞結合性のセルラーゼを発現している微生物を該セルロース性基質に導入することを含む方法。
【請求項２】
前記因数が２．８〜４．８の間である請求項１の方法。
【請求項３】
前記微生物が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ及びＰｙｒｏｍｙｃｅｓから選択される属のメンバーである請求項１の方法。
【請求項４】
前記微生物がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属のメンバーである請求項１の方法。
【請求項５】
前記微生物が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｒａｍｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ、Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ  ｓｕｂｓ．ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ  ｓｕｂｓ．ｔｈｅｒｍｏｌａｃｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ  ｓｕｂｓ．ｌｅｐｔｏｓｐａｒｔｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｕｎｇａｔｅｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｌｖｅｎｓ、Ｆｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｌｖｅｎｓ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ  ｓｐ．及びＰｙｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．からなる群より選択される請求項１の方法。
【請求項６】
前記微生物がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの１株である請求項１の方法。
【請求項７】
前記セルロース性基質が、草類、製糖残留物、農業廃棄物、まぐさ、林業廃棄物、反芻動物消化産物、都市ゴミ、製紙工場廃液、新聞紙、厚紙及びこれらの組み合わせから選択される請求項１の方法。
【請求項８】
前記微生物が嫌気性微生物である請求項１の方法。
【請求項９】
前記好適な条件が、実質的に酸素を含まない雰囲気を含む請求項８の方法。
【請求項１０】
減らしたセルラーゼ添加量を利用してセルロース性基質を加水分解する方法であって、
ある量のセルロース性基質をある時間内に実質的に加水分解するのに必要な精製セルラーゼの量を決定することと；
２〜５の間の因数で該精製セルラーゼの量を減らして、減らしたセルラーゼ添加量を決定することと；
好適な条件下にて、該セルロース性基質の実質的な加水分解と発酵を行うことができるのに十分な該時間の間、細胞結合性のセルラーゼを発現するよう操作された発酵因子を該セルロース性基質に導入することを含み、
該細胞結合性のセルラーゼは該減らしたセルラーゼ添加量に等しい濃度で存在する、方法。
【請求項１１】
前記因数が２．８〜４．８の間である請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記発酵因子が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｈａｆｆｉａ、Ａｒｘｕｌａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ及びＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓから選択される属のメンバーである請求項１０の方法。
【請求項１３】
前記発酵因子が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属のメンバーである請求項１０の方法。
【請求項１４】
前記発酵因子が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉｅａ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ及びＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓからなる群より選択される、請求項１０の方法。
【請求項１５】
前記発酵因子が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉｅａである請求項１０の方法。
【請求項１６】
前記セルロース性基質が、草類、製糖残留物、農業廃棄物、まぐさ、林業廃棄物、反芻動物消化産物、都市ゴミ、製紙工場廃液、新聞紙、厚紙及びこれらの組み合わせから選択される請求項１０の方法。
【請求項１７】
前記発酵因子が嫌気性の発酵因子である請求項１０の方法。
【請求項１８】
前記好適な条件が、実質的に酸素を含まない雰囲気を含む請求項１７の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、２００６年５月１日に出願された米国仮特許出願第６０／７９６，６３５号（これは、参考として本明細書に援用される）への優先権の利益を主張する。
【０００２】
（政府の権利）
開発に関連する研究が米国国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ）によって契約番号６０ＮＡＮＢ１  Ｄ００６４のもとで、及び米国エネルギー省によって契約番号ＤＥ−ＦＧ０２−０２ＥＲ１５３５０のもとで、助成されたので、米国政府は、本発明に特定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
背景
セルロース性バイオマスは、発酵してエタノール又はそのほかの生成物を産出してもよい安価で容易に入手できる資源を代表する。生物変換された生成物の中で、エタノールは、持続可能性、安全性及び地方の経済的発展という点で利益を提供すればよい再生可能な家庭用燃料として産出されてもよいので、エタノールにおける関心が高い。
【０００４】
生物変換処理は、石油燃料技法と経済的に競合することを目指しているので、セルロースの単糖への加水分解に関連する難問に直面する。セルロース性バイオマスの処理の困難さを克服することに関連する処理工程は、一般に最もコストがかかり、Ｒ＆Ｄ主導の改善にとって最大の可能性を有する。セルロースの処理の困難さは通常、酸の予備処理に続くセルラーゼ酵素による予備処理されたセルロースの酵素分解によって克服される。セルラーゼ酵素についてのコストの概算は現在のところ、エタノールのガロン当たり０．３０〜０．５０ドルの範囲である。セルロース性バイオマスからエタノールを生産することにおいて制限因子として作用する酵素のコストと共に、エタノール生産に必要とされるセルラーゼの量を低減する手段は、重要な商業的目標のままである。従って、多成分セルラーゼ酵素系の作用の様式を理解すること、及びその有効性を改善することに過去の尽力が尽くされてきた。
【０００５】
酵素の加水分解は、細胞の非存在下で作用するセルラーゼ酵素が媒介し、細胞の存在下で作用するセルラーゼが媒介するが、細胞と酵素の結合はないか、又は細胞に結合したセルラーゼによるものである。後者の場合、加水分解には、二元のセルラーゼ／酵素（ＣＥ）複合体ではなく、三元のセルラーゼ／酵素／微生物（ＣＥＭ）の複合体が媒介する。
【０００６】
好気性微生物の細胞は、セルロースに接着しない（又は弱く接着するにすぎない）ことが知られている。従って、好気性の系におけるセルロースの加水分解の主な作用因子は、セルロースに結合して二元ＣＥ複合体を形成するセルラーゼ酵素である。これらのＣＥ複合体は、別々に作用する機能的に異なったタンパク質を特徴とする。対照的に、嫌気性の微生物はほとんどセルロースに接着し、セルロースの加水分解の主な作用因子は、三元のＣＥＭ複合体であり、すべてではないが多くの場合、「セルロソーム」が関与し、その際、複数の機能的に異なったタンパク質が共同して作用する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
組み合わせにおける２以上の成分により実現される比率が、成分が別々に作用するとき観察される比率の合計よりも大きいという、ＣＥ複合体の成分間の相乗効果の現象は、文献で認められ、評価されてきた。しかしながら、ＣＥＭ複合体の「酵素／微生物」の相乗効果は以前、評価されていなかったし、定量されていなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
要旨
所与の量のバイオマスの加水分解を達成するのに必要な酵素の量を減らす、又は或いは、所与の酵素量によって加水分解されてもよいバイオマスの量を増やす方法を提供することによって、本明細書で報告される手段は、当該技術を進歩させる。
【０００９】
実施態様の１つでは、セルロース性基質を加水分解するために減らしたセルラーゼ添加量（ｌｏａｄ）を利用する方法には、ある時間内にセルロース性基質の量を実質的に加水分解するのに必要な精製セルラーゼの量を決定すること；２〜５の間の因数で精製セルラーゼの量を減らし、減らしたセルラーゼ添加量を決定すること；及び好適な条件下、セルロース性基質の実質的な加水分解ができるのに十分な前記時間で、セルラーゼ添加量と同等の濃度で細胞結合性のセルラーゼを発現している微生物をセルロース性基質に導入することが含まれる。
【００１０】
実施態様の１つでは、セルロース性の基質を加水分解するために減らしたセルラーゼ添加量を利用する方法には、ある時間内にセルロース性基質の量を実質的に加水分解するのに必要な精製セルラーゼの量を決定すること；２〜５の間の因数で精製セルラーゼの量を減らし、減らしたセルラーゼ添加量を決定すること；並びに好適な条件下、セルロース性基質の実質的な加水分解及び発酵ができるのに十分な前記時間で、細胞結合性のセルラーゼを発現するよう操作された発酵因子をセルロース性基質に導入することが含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（詳細な説明）
セルラーゼが細胞結合性でない場合と比べたときの、微生物細胞の表面で発現することによるセルラーゼの有効性の向上を含む相乗効果を本明細書では記載する。そのような「酵素／微生物」の相乗効果が定量的に評価され、セルラーゼ酵素の有効性に実質的な増大を生じることが示された。
【００１２】
研究は、記載された微生物の中で最も高いセルロース利用（加水分解及び発酵）率を示す嫌気性の好温性の細菌であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍにて行われた。Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍは、セルラーゼ複合体又は「セルロソーム」を産出し、それは、ほとんどの培養条件下で細胞の表面に結合するセルロソームの実質的な分画を持つ。微小結晶性セルロース（Ａｖｉｃｅｌ）の加水分解は、以下の２つの系についてバッチ培養及び連続培養にて分析した。
（ａ）添加セルラーゼの非存在下、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの培養での増殖が関与する微生物性加水分解、その際、加水分解にはＣＥＭ複合体及びＣＥ複合体の双方が媒介する。
（ｂ）非セルロース分解性の好温性で嫌気性のＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍによる加水分解生成物の発酵を伴った、精製Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍセルロソームによる酵素的加水分解。このＳＳＦ処理では、加水分解はＣＥ複合体のみが媒介する。
【００１３】
セルロース加水分解の具体的比率は、同一生物からの精製セルラーゼ調製物に比べて、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの増殖培養で２〜５倍高いことが分かった。従って、加速された反応は、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍのセルラーゼが細胞に結合することなく作用する場合と比べて、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍのセルラーゼがセルロース接着性細胞の表面に提示される場合に起きる。
【００１４】
適用された科学の観点から、この２〜５倍の相乗効果は、酵素的加水分解のコストを下げる戦略の背景で有意である。特に、酵素／微生物の相乗効果の定量によって、セルロース分解性の微生物の非存在下で加水分解をセルラーゼ酵素によって行う場合と比べて、セルロースが、接着性のセルロース分解性微生物によって加水分解される処理構成において高い加水分解率が達成されてもよいという指示が提供される。
【００１５】
セルロース接着性のセルロース分解性微生物の存在は、発酵を介して阻害性の加水分解生成物の局所濃度を下げることによって加水分解率を高めてもよい。たとえば、セロビオース、及びさらに低い程度に、グルコースは、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍセルロソームを阻害することが知られている。さらに、基質へのアクセスが改善された生物は（細胞表面で高い基質濃度及び／又はバルク培地への基質の少ない喪失）、多分速く増殖するから、選択的優位性を有するので、接着性微生物は進化的視野から報いを受けてもよい。
【００１６】
主としてＣＥＭ複合体を介してセルロースの加水分解に媒介するセルロース分解性の嫌気性微生物のリストを表１に示す。
【００１７】
（表１  セルロース分解性の嫌気性微生物）
【００１８】
【表１】
2009535067.tif 000003
酵素／微生物の相乗効果の利益は、セルロース性基質の加水分解に表１で示された嫌気性宿主のいずれかを利用することによって活用されてもよい。さらに、表１の宿主を変えて（たとえば、遺伝子工学又は進化的挑戦に続く選抜を介して）、酵素／微生物の相乗効果を保持する一方で、改善された生成物産出特性（たとえば、力価、収率）を有することが有利であってもよい。
【００１９】
或いは、天然にはセルロース分解性ではない発酵因子を操作して、表１の生物の１つに由来するセルラーゼを発現させてもよい。そのような組換え生物が細胞表面にセルロソームを発現してもよく、得られた生物がＣＥＭ複合体を形成し、酵素／微生物の相乗効果の結果として、セルロースの高い加水分解率を達成してもよい。繋留されたセルラーゼ酵素を発現する組換え生物及びそのような生物の製造方法は、たとえば、参照によって特別に本明細書に組み入れられる米国特許出願第６０／８６７，０１８号に記載されている。操作されてセルラーゼを発現し得る例示となる発酵因子を表２に列記する。
【００２０】
（表２  セルラーゼを発現するよう操作され得る発酵因子）
【００２１】
【表２】
2009535067.tif 000004
本手段に従って加水分解されてもよいセルロース性基質には、たとえば、スイッチグラス、スパルティナ、ホソムギ、クサヨシ、ススキ又はこれらの組み合わせのような草類、たとえば、サトウキビの搾りカスのような、しかし、これに限定されない製糖残留物、たとえば、稲わら、籾殻、オオムギわら、トウモロコシの穂軸、コムギわら、カノーラわら、カラスムギわら、カラスムギ籾殻、及びトウモロコシ繊維、まぐさ、たとえば、大豆まぐさ、トウモロコシ、まぐさのような、しかし、これらに限定されない農業廃棄物、再生木材パルプ繊維、木屑、堅木、軟木、又はこれらの組み合わせのような、しかし、これらに限定されない林業廃棄物、反芻動物消化産物、都市ゴミ、製紙工場廃液、新聞紙、厚紙並びに上述の基質の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。エタノール製造のために考慮される堅木の例には、ヤナギ、カエデ、カシ、クルミ、ユーカリ、ニレ、カバノキ、トチノキ、ブナ及びセイヨウトネリコが挙げられる。エタノール製造のために考慮される軟木の例には、サザンイエローパイン、モミ、スギ、イトスギ、アメリカツガ、カラマツ、マツ及びトウヒ又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【実施例】
【００２２】
実施例１
単離した酵素媒介性セルロースの加水分解  対  微生物媒介性セルロースの加水分解
セルロース加水分解の可溶性生成物を利用することが可能である非セルロース分解性で好温性のＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍの存在下及び非存在下で、精製したＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍセルロソームによって行われる酵素媒介性加水分解に対して、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍによる微生物媒介性セルロースの加水分解を体系的に比較した。微生物媒介性加水分解の場合、三元のＣＥＭ複合体が存在するが、酵素媒介性加水分解の場合、二元ＣＥ複合体の作用によるセルロースの加水分解が専ら生じる。
【００２３】
Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ及び関連する対照のバッチ培養
Ｎ２雰囲気下で、３連一組の２００ｍＬの密閉型血清用バイアル（Ｂｅｌｌｃｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｉｎｅｌａｎｄ，  ＮＪ）にて２ｇ／ＬのＡｖｉｃｅｌＰＨ１０５（ＦＭＣ  Ｃｏｒｐ．，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ）及び１０ｇ／ＬのＭＯＰＳ緩衝液（当初ｐＨ７．６）を含有する１００ｍＬのＭＴＣ培地に５ｍＬのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ（ＡＴＣＣ２７４０５）のストック培養物を注射器によって植菌した。２００ｒｐｍで回転振盪しながら、温度制御された水槽にて培養物を６０℃でインキュベートした。視覚的検査によって測定されたとき、いったん２ｇ／ＬのＡｖｉｃｅｌが消費されると、補完のＡｖｉｃｅｌを４０ｇ／Ｌの無菌懸濁液として２ｇ／Ｌの濃度に加え、４ＭのＮａＯＨの添加によってｐＨを７．６に調整し、ろ過滅菌したＮ２を勢いよく流すことによって気相を置き換えた。
【００２４】
補完のＡｖｉｃｅｌを添加した直後、最初（時間ゼロ）のデータポイントで微生物のセルロース利用のデータを取る。微生物対照１は、補完のＡｖｉｃｅｌ添加と併せて、３８．５ｍＭの最終濃度にて滅菌した１Ｍのアジ化ナトリウム溶液を加えたこと以外は、上記のように行った。上記で特定したようなアジドの添加は、ＨＰＬＣで測定したとき、時間外の発酵生成物の一定の濃度によって示されるように発酵の停止を生じる。
【００２５】
セルロソームの調製及び精製
バッチＳＳＦ実験で使用されるセルロソームは、４ｇ／Ｌの当初濃度で増殖基質としてのＡｖｉｃｅｌを伴った２００ｍＬフラスコでのＭＴＣ培地中で増殖させたＣ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍのバッチ培養物から得た。連続ＳＳＦ実験用のセルロソームは、０．０５２ｈｒ−１の稀釈率（流速／発酵作動容量）及び４ｇ／Ｌの供給セルロース濃度にてＭＴＣ培地中で増殖させたＣ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの定常状態の連続培養物から得た。セルロソームは、親和性消化によって培養ブロスの上清から精製した。バッチ及び連続のＳＳＦ実験に用いた精製セルロソーム調製物は、トリス緩衝液中（５０ｍＭ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．８）で２．８ＩＵ／ｍｇセルラーゼの比活性を持つ約１．２ｇ／Ｌのセルラーゼを含有した。精製したセルロソーム調製物における可溶性の加水分解生成物の濃度は、ＳＳＦ実験の解釈を複雑にしないように十分に低い（＜０．００２ｇ／Ｌ）であることがＨＰＬＣで確認された。
【００２６】
バッチＳＳＦ及び関連する酵素対照
Ｎ２雰囲気下で、３連一組の２００ｍＬの血清用バイアルにて２ｇ／ＬのＡｖｉｃｅｌＰＨ１０５及び２ｇ／Ｌのセルビオースを含有する１００ｍＬのＭＴＣ培地に５ｍＬのＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ３１９６０）のストック培養物を植菌した。２００ｒｐｍで回転振盪しながら、温度制御された水槽にて培養物を６０℃でインキュベートした。ＨＰＬＣによって測定されたとき、セルビオースがいったん消費されたら、ｐＨを７．６に調整して、精製したセルロソーム調製物（上記）をろ過滅菌し（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，  ０．２２ｕｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）、最終濃度１００ｍｇ／Ｌで注射器を介して培養物に加えた。セルラーゼを添加した直後、最初（時間ゼロ）のデータポイントでＳＳＦのデータを取った。細胞を含まない対照１は、発酵生物が存在しないことを除いて２ｇ／ＬのＡｖｉｃｅｌ及び１００ｍｇ／Ｌの精製セルロソームの存在下で上記のように行った。細胞を含まない対照２は、１Ｍの滅菌したアジ化ナトリウムを最終濃度３８．５Ｍで加えたことを除いて、細胞を含まない対照１のように行った。
【００２７】
連続培養
オーバーフローサイドアーム（ｉ．ｄ．０．３８”）及び０．５Ｌの作動容量を持つ改変した１Ｌの発酵槽（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，  Ｄｅｐｅｎｄａｂｌｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ，  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ＮＤＳ）をＣ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍによる微生物発酵及び連続モードで行われたＳＳＦの双方に用いた。４ＭのＮａＯＨの添加によってデルタＶプロセス制御システム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  Ｉｎｃ．，  Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，  ＭＡ）によりｐＨを６．８で制御し、発酵槽を２５０ｒｐｍで撹拌し、発酵槽ジャケットを介して水を循環させることによって温度を６０℃で制御した。４ｇ／ＬのＡｖｉｃｅｌＰＨ１０５を含有するＭＴＣ培地をペリスタポンプで供給し、所望の滞留時間を達成した。ＳＳＦ実験については、追加のペリスタポンプを使用して、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ６．８）に４℃で保存されている精製セルロソームを送達した。ＳＳＦ実験に用いたＭＴＣ培地の組成及びＡｖｉｃｅｌの濃度は、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの発酵実験（たとえば、４ｇ／ＬＡｖｉｃｅｌの最終濃度）で使用されたものと同一の濃度が提供されるように調整した。２ｇ／Ｌのセルビオースで補完した４ｇ／ＬのＡｖｉｃｅｌを含有するＭＴＣ培地にＴ．ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍの後期対数期培養物５０ｍＬを植菌することによってＳＳＦ実験を開始した。いったん増殖が明らかになったら、セルラーゼの添加を開始した。連続発酵に関する定常状態の値を算出するのに使用される試料は、少なくともレジデンス１つの間隔で取った。
【００２８】
残ったセルロース及び発酵生成物の測定
定量的糖化によって残ったセルロースを測定した。溶出液としての０．０１％（ｖ／ｖ）のＨ２ＳＯ４及び屈折率検出器を伴い５５℃で操作されるＢｉｏ−ＲａｄのＨＰＸ−８７Ｈカラムを用いたＨＰＬＣによって、糖（セルビオース、グルコース）及び発酵生成物（乳酸、酢酸及びエタノール）の濃度を分析した。Ｅｈｒｍａｎ，  Ｃ．Ｉ．，  Ｍ．  Ｅ．  Ｈｉｍｍｅｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ８（２）：  ９９  （１９９４）によって報告された改変ＮＲＥＬ加水分解後の手順に従って、オリゴマー糖を分析した。
【００２９】
タンパク質、セルロソーム及びセルラーゼ活性の測定
ウシ血清アルブミンを標準としてブラッドフォードタンパク質アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，  Ｍ．  Ｍ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７２，  ２４  （１９７６））に従って、上清試料におけるタンパク質含量を測定した。以前、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｚｈａｎｇ，  Ｙ．−Ｈ．  Ｐ，  Ｌ．  Ｒ．  Ｌｙｎｄ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８７，  ９９  （２００５））によって記載されたペレットタンパク質アッセイを用いてペレットにおけるタンパク質含量を測定した。上清及びペレットのセルロソーム濃度は、Ｄｕｂｏｉｓ，  Ｍ．，  Ｋ．  Ｇｉｌｌｅｓ，  Ｊ．  Ｋ．  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｐ．Ａ．  Ｒｅｂｅｒｓ，  Ｆ．  Ｓｍｉｔｈ．  Ｎａｔｕｒｅ．  １６８，  １６７  （１９５１）によって報告されたＥＬＩＳＡ法によって測定した。Ｄｕｂｏｉｓ（１９５１）のフェノール硫酸法によって測定されるような可溶性の糖生成物に基づいてＺｈａｎｇ（２００５）の方法を用いて、６０℃にて上清及びペレットの試料におけるアビセラーゼ活性を測定した。結果は、国際単位（ＩＵ）＝１マイクロモルのグルコース当量／Ｌ／分に換算して表す。
【００３０】
バッチの結果
制御された条件下でのバッチ培養では、微生物による加水分解は、２ｇ／Ｌのセルビオースを完全に加水分解するのに１６時間を要し、その間にセルロソームと細胞タンパク質の濃度はそれぞれ、４８ｍｇ／Ｌから９８ｍｇ／Ｌ及び１２５ｍｇ／Ｌから２６４ｍｇ／Ｌにおおまかに倍化した（図１）。図２に示すように、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍの存在下で精製セルロソームを用いたＳＳＦ（酵素的加水分解）は、完全な加水分解に３２時間必要とし、その間、セルロソームの濃度は１００ｍｇ／Ｌであり、細胞タンパク質の濃度は１６０ｍｇ／Ｌから」２６０ｍｇ／Ｌに増加した。
【００３１】
微生物による加水分解とＳＳＦが生じる条件は似ていた。図１及び図２の反応についての生成物濃度と時間に対するｐＨをそれぞれ図３及び図４に示す。モニターされた生成物は、エタノール（Ｅｔｈ）、アセテート（Ａｃｔ）、セルビオース（ＣＢ）及びグルコース同等物（Ｇｌｕ  Ｅｑｖ）であった。増殖培地中の加水分解生成物（可溶性グルカンの合計又はグルコース同等物の合計）は、微生物による加水分解及びＳＳＦの双方について常に≦０．０２ｇ／Ｌであり、５０％の阻害が一般に観察される濃度よりも２桁低い値だった。表３に示されるように、セルロソームの比活性は、微生物による加水分解と酵素的加水分解の双方で全く類似しており、実験全体を通してほぼ一定のままだった。
【００３２】
（表３  Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍのバッチ培養とＳＳＦと関連する酵素対照との比較）
【００３３】
【表３】
2009535067.tif 000005
＊  Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍのバッチ培養及びＳＳＦの相２（図１及び２の０時間〜４８時間）の開始０時間を参照のこと。
＃  Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍのバッチ培養では１６時間を参照し、ＳＳＦ及び酵素対照では３２時間を参照する相２（図１及び２の０時間〜４８時間）の終了
図５にて、時間に対してセルロース濃度を、微生物による加水分解（図１から）、ＳＳＦ（図２から）、及び以下の対照について；微生物対照１：３８．５ｍＭのアジ化ナトリウムと共にＣ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの培養（１００ｍｇ／Ｌのセルロソーム、２６４ｍｇ／Ｌの細胞タンパク質）、細胞を含まない対照１：発酵生物を伴わずに１００ｍｇ／Ｌの精製セルロソーム、細胞を含まない対照２：３８．５ｍＭのアジ化ナトリウムを伴って細胞を含まない対照１と同様、についてプロットした。セルロソームの濃度が微生物対照１（１００ｍｇ／ｍＬ、セルロソーム）よりも微生物による加水分解に関するほとんどの実験（図１を参照）で低いという事実にもかかわらず、加水分解率は、代謝的に不活性の細胞（微生物対照１）よりも増殖している細胞（微生物による加水分解）の方が実質的に高い。代謝的に不活性の細胞による加水分解の比率の低さは、アジド存在下又は非存在下で観察される細胞を含まない加水分解率が類似しているので、一義的にはセルロソームに対するアジドの効果によるものではない。
【００３４】
図６は、細胞を含まない対照１についてのセルロースの加水分解及び生成物の蓄積を示す。加水分解生成物の濃度は、ＳＳＦよりも細胞を含まない対照１の方が１桁高いが（図２と比較した図６）、加水分解率は似ていることを観察することができる。従って、バルク発酵ブロスにおける加水分解性生物の蓄積は、微生物による加水分解とＳＳＦの間の顕著な差異のもっともらしい説明ではない。
【００３５】
バッチの結果は、酵素／微生物の相乗効果の程度を支持し、２．８〜４．７（表４）の間の、微生物の系で見られたセルロソームで正規化された加水分解率を酵素の系のそれで割った比率に等しい。酵素／微生物の相乗効果の定量のさらなる記載については実施例２を参照のこと。
【００３６】
連続培養の結果
定常状態の連続培養においても微生物による加水分解とＳＳＦを比較した。４以上の定常状態のデータポイントの平均値を表４で、表５におけるセルラーゼの比活性と共に報告する。微生物の定常状態１及び２はそれぞれ、６．８時間及び９．８時間の滞留時間（τ＝発酵槽容量／供給流速）にて得た。微生物の定常状態１については、３９ｍｇ／Ｌのセルロソームの総濃度の存在下で供給セルロースの６５．３％が加水分解されたが、微生物の定常状態２では、６３ｍｇ／Ｌのセルロソームで７６．８％の加水分解が達成された。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍによる発酵と併せて、精製Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍセルロソームが媒介する定常状態の連続ＳＳＦを選択された条件で行い、微生物によるセルロース利用で認められたものと類似した変換及びセルロソームの総濃度を達成した。ＳＳＦの定常状態１については、微生物の定常状態１に比べて、τ＝２４．４時間にて６７％のセルロースの加水分解が認められ、加えたセルロソームは５２ｍｇ／Ｌだった。ＳＳＦの定常状態２については、τ＝１９．２３時間及び６３ｍｇ／Ｌのセルロソームにて７５．３％のセルロース加水分解が認められた。セルロースの加水分解生成物の濃度は、微生物の定常状態及びＳＳＦの定常状態の双方について、検出限界（２．５ｍｇ／Ｌ）を下回った。ＳＳＦデータの経時変化を図７（ＳＳＦの定常状態１）及び図８（ＳＳＦの定常状態２）に表す。実験は、１６８時間で連続方式からバッチ方式に変換してセルビオースのさらなる蓄積を防いだ；連続供給は、１８４時間で再開した。セルラーゼの比活性は、微生物の定常状態とＳＳＦの定常状態で類似していた（表５）。
【００３７】
（表４  連続培養の結果及び相乗効果の計算の程度）
【００３８】
【表４】
2009535067.tif 000006
（表５  Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍとＳＳＦの連続培養）
【００３９】
【表５】
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連続培養のデータは、酵素／微生物の相乗効果の程度を支持し、２．８〜４．８（表４）の間の、微生物の系で見られたセルロソームで正規化された加水分解率を酵素の系のそれで割った比率に等しい。酵素／微生物の相乗効果の定量のさらなる記載については実施例２を参照のこと。
【００４０】
バッチ実験及び連続培養実験の双方について、調べた条件下では、ＳＳＦに比べて、微生物による加水分解の間、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍセルラーゼ複合体は実質的にさらに効果的である。そのような酵素／微生物の相乗効果は、代謝的に活性のあるセルロース分解性の微生物の存在を必要とし、バルク発酵ブロスからの加水分解生成物の除去によっては説明されない。微生物による加水分解とＳＳＦの間の鍵となる明らかな差異は、微生物による加水分解の間、ＣＥＭ複合体が存在するが、ＳＳＦについては、これは当てはまらないということである。
【００４１】
実施例２．酵素／微生物の相乗効果の定量
セルロソームを基にしたセルロソーム特異的な加水分解率（ｒＥＣ、セルロースのｇ／セルロソームのｇ／時間）は以下の式を用いて算出されてもよい。
【００４２】
【数１】
2009535067.tif 000008
式中、Ｃ０は、当初の（バッチ反応の）又は供給における（定常状態の連続反応の）いずれかのｇ／Ｌでのセルロース濃度であり、Ｃは時間ｔ後（バッチ）又は定常状態での（連続）発酵槽のセルロース濃度であり、τは、経過時間（バッチ）又は滞留時間（連続）であり、Ｅは、経過時間（バッチ）にわたる又は複数の滞留時間ポイント（連続）の間のｇ／Ｌでの平均セルロソーム濃度である。酵素／微生物の相乗効果、ＤＳＥＭは、以下の式を用いて微生物による加水分解及びＳＳＦで認められるセルロソーム特異的な加水分解率から算出されてもよい。
【００４３】
【数２】
2009535067.tif 000009
総セルロソームを基にした相乗効果の程度、ＤＳＥＲＥＭは、総セルロソーム、方程式（１）におけるＥτを用いて見い出される。或いは、ペレットのセルロソームを基にした相乗効果の程度、ＤＳＥＲＥＭは、ペレットのセルラーゼ濃度（Ｅｐ、ＣＥ及びＣＥＭ双方の複合体を潜在的に含む）を使用するならば見い出される。
【００４４】
バッチのデータ及び連続のデータから算出されたＤＳＥＲＥＭの値を表４に提示する。８時間後のバッチのデータに基づくＤＳＥＲＥＭは、４．６９であった。完全なセルロースの加水分解が達成された後、ＤＳＥＲＥＭが算出されると、２．７８の値が得られる。連続培養では、微生物及びＳＳＦの定常状態２に基づいて２．８０のＤＳＥＲＥＭの値が得られ、それについて約７５％のセルロースが加水分解される。微生物及びＳＳＦの定常状態１については、約６６％の加水分解が達成される場合、ＤＳＥＲＥＭは４．８１に等しい。ペレットのセルラーゼを基にした酵素／微生物相乗効果の値、ＤＳＥｐＥＭは、連続培養、微生物及びＳＳＦの定常状態２での２．８４並びに微生物及びＳＳＦの定常状態１での４．７７に全く類似する。相乗効果の低下は、バッチ培養及び連続培養の双方でセルロース加水分解の程度の上昇及び基質対酵素の比の低下と共に見られる。
【００４５】
本明細書の範囲を逸脱することなく、上記の方法及びシステムにおいて変更が行われてもよい。従って、上記の記載に含有されること又は添付の図面に示されることは説明として解釈されるべきであって限定の意味はないことが言及されるべきである。以下のクレームは、本明細書に記載される一般的及び特定の特徴すべてを網羅することが意図され、並びに言語としてそれらの間に入ると言われてもよい本方法の範囲内のすべての記述を網羅することが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、加水分解にＣＥＭ複合体及びＣＥ複合体の双方が媒介する微生物によるセルロースの利用を示す図である。
【図２】図２は、ＣＥ複合体が関与して糖化と発酵の反応を同時に行って（ＳＳＦ）いる間のセルロースの酵素的加水分解を示す図である。
【図３】図３は、図１で示した実験について時間外のｐＨ及び生成物濃度における変化を説明する図である。
【図４】図４は、図２で示した実験について時間外のｐＨ及び生成物濃度における変化を説明する図である。
【図５】図５は、対照実験と同様に図１及び図２で示した微生物及びＳＳＦ実験に関するセルロース濃度曲線を示す図である。
【図６】図６は、細胞を含まない対照１についてのセルロースの加水分解及び生成物の蓄積を示す図である。
【図７】図７は、０．０６４ｇ／Ｌの精製したＣ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍセルロソームの存在下、  Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍによるＡｖｉｃｅｌの連続ＳＳＦについてのセルロースの加水分解及び生成物の蓄積を示す図である。
【図８】図８は、０．０５２ｇ／Ｌの精製したＣ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍセルロソームの存在下、  Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍによるＡｖｉｃｅｌの連続ＳＳＦについてのセルロースの加水分解及び生成物の蓄積を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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