(57)【要約】【解決手段】ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）の活性が低下したか若しくは実質的に活性がない、または、チミジル酸合成酵素（TS）の活性が低下したか若しくは実質的に活性がない、または、ジヒドロ葉酸還元酵素およびチミジル酸合成酵素（DHFR-TS）の両者の活性が低下した若しくは実質的に活性がない、繊毛虫細胞の製造方法が特許請求され、この方法は、ａ）内因性DHFR-TSをコードする遺伝子を変化させる対立遺伝子を含む構造物を、繊毛虫の大核（MAC）の内因性DHFR-TS遺伝子の少なくとも一つに挿入することによって、繊毛虫細胞を形質転換する工程、ｂ）形質転換された繊毛虫細胞において対立遺伝子の類別法を誘導して、MACのほとんどまたは全ての機能性DHFR-TS遺伝子において挿入された構造物を有する細胞を産生する工程、およびｃ）工程ｂ）で産生された細胞を、チミジンを有するか有しない培養によって同定する工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）内因性DHFR-TSをコードする遺伝子を変化させる対立遺伝子を含む構造物を、繊毛虫の大核（MAC）の内因性DHFR-TS遺伝子の少なくとも一つに挿入することによって、繊毛虫細胞を形質転換する工程、
ｂ）形質転換された繊毛虫細胞において対立遺伝子の類別法を誘導して、MACのほとんどまたは全ての機能性DHFR-TS遺伝子において挿入された構造物を有する細胞を産生する工程、
ｃ）工程ｂ）で産生された細胞を、チミジンを有するか有しない比較培養によって同定する工程
を含む、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）の活性が低下したか若しくは実質的に活性がない、または、チミジル酸合成酵素（TS）の活性が低下したか若しくは実質的に活性がない、または、ジヒドロ葉酸還元酵素およびチミジル酸合成酵素（DHFR-TS）の活性が低下した若しくは実質的に活性がない、繊毛虫細胞の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、工程ａ）において、内因性DHFR-TSをコードする遺伝子を変化させる対立遺伝子を含む構造物を、繊毛虫の小核（MIC）の内因性DHFR-TS遺伝子の少なくとも一つに挿入し、かつ、工程ｂ）において、MACのほとんどまたは全ての機能性DHFR-TS遺伝子において挿入された構造物を有する細胞が、他の繊毛虫細胞を用いて工程ａ）の細胞を搾ることによって産生されて、変化したMICに由来する新たなMACを含む後代を製造する、方法。
【請求項３】
請求項１および／または２に記載の方法であって、繊毛虫がテトラヒメナ(Tetrahymena)である、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、繊毛虫がテトラヒメナ好熱菌（Tetrahymena thermophila）である、方法、
【請求項５】
請求項１〜４の少なくとも１つに記載の方法であって、DHFR-TS遺伝子が配列番号１のヌクレオチド配列を有する、方法。
【請求項６】
請求項１〜５の少なくとも１つに記載の方法であって、DHFR-TS二元機能性酵素をコードする細胞の内因性遺伝子の１．５ｋｂの上流および下流の領域が、さらに変更される、方法。
【請求項７】
請求項１〜６の少なくとも１つに記載の方法であって、機能性非内因性DHFR-TS酵素をコードするDNAまたはRNA分子での細胞の形質転換によって、DHFR-TS活性を再構成する工程をさらに含む、方法。
【請求項８】
請求項１〜６の少なくとも１つに記載の方法であって、機能性内因性DHFR-TS酵素およびもう１つのタンパク質をコードするDNAまたはRNA分子での細胞の形質転換によって、DHFR-TS活性を再構成する工程をさらに含む、方法。
【請求項９】
請求項７および／または８に記載の方法であって、機能性DHFR-TS酵素をコードするDNAまたはRNA分子がアルベオラータ(alveolate)に由来する、方法。
【請求項１０】
請求項７〜９の少なくとも１つに記載の方法であって、機能性DHFR-TS酵素をコードするDNAまたはRNA分子が繊毛虫に由来する、方法。
【請求項１１】
請求項７〜１０の少なくとも１つに記載の方法であって、機能性DHFR-TS酵素をコードするDNAまたはRNA分子がテトラヒメナ(Tetrahymena)に由来する、方法。
【請求項１２】
請求項７〜１１の少なくとも１つに記載の方法であって、機能性DHFR-TS酵素をコードするDNAまたはRNA分子がアピコンプレクサ(apicomplexan)に由来する、方法。
【請求項１３】
請求項８に記載の方法であって、機能性DHFR-TS酵素をコードするDNAまたはRNA分子のヌクレオチド配列が配列番号１である、方法。
【請求項１４】
チミジン要求性を有する繊毛虫細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の繊毛虫細胞であって、DHFRの活性が低下したか若しくは実質的に活性がない、または、TSの活性が低下したか若しくは実質的に活性がない、または、DHFR-TSの両者の活性が低下した若しくは実質的に活性がない、繊毛虫細胞。
【請求項１６】
請求項１４に記載の繊毛虫細胞であって、請求項１に記載の方法によって得られ得る、DHFRの活性が低下したか若しくは実質的に活性がない、または、TSの活性が低下したか若しくは実質的に活性がない、または、DHFR-TSの両者の活性が低下した若しくは実質的に活性がない、繊毛虫細胞。
【請求項１７】
再構成DHFR-TS活性を有する繊毛虫細胞。
【請求項１８】
請求項７に記載の方法によって得られ得る、再構成DHFR-TS活性を有する繊毛虫細胞。
【請求項１９】
請求項８に記載の方法によって得られ得る、別のタンパク質を発現する再構成DHFR-TS活性を有する繊毛虫細胞。
【請求項２０】
請求項１７および／または１８に記載の繊毛虫細胞の、DHFR-TS酵素活性に影響する化合物を検出するアッセイにおける使用であって、
ａ）該細胞を被験化合物と接触させる工程、
ｂ）該細胞のDHFR-TS酵素活性を測定する工程、および
ｃ）DHFR-TS酵素活性を対照細胞のDHFR-TS酵素活性と比較する工程
を含む、繊毛虫細胞の使用。
【請求項２１】
請求項１９に記載の繊毛虫細胞の、別のタンパク質の製造のための使用。
【請求項２２】
配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する、DHFR-TSタンパク質をコードする、単離された核酸。
【請求項２３】
配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する、単離されたDHFR-TSタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み換え分子生物学の分野に関し、特に、寄生原虫の研究において、形質転換体の選択を可能にし、薬物送達を促進する、テトラヒメナ(Tetrahymena)の二元機能性マーカー酵素の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
テトラヒメナ(Tetrahymena)は、原虫に属する繊毛虫真核単細胞生物であり、２つの核、１つの転写活性のない２倍体の生殖細胞系列の小核（MIC）および１つの転写活性のある倍数体の体細胞系列の大核（MAC）を有する。１９２３年に、ノーベル賞受賞者のアンドレ・ルオフ(Andre Lwoff)がテトラヒメナの純粋培養に成功し、モデル生物としてこのアルベオラータ(alveolate)を利用するための基礎が築かれた。テトラヒメナにおける画期的な発見は、ダイニン・モーター、テロメア、RNA媒介触媒、テロメラーゼおよび転写調節におけるヒストンアセチルトランスフェラーゼの機能の発見である。過去十年間の間に、分子生物学的手法は発展して、テトラヒメナのゲノムおよびプロテオームは変化し、DNAトランスフェクション方法は、とりわけ、MICとMACのエレクトロポレーションおよび遺伝子銃撃による、MAC中へのマイクロインジェクションを含む。rDNAレプリコンに基づくエピソーム・プラスミドは、相同的組み換えに基づくノックアウト／イン技術と同様に、利用可能である。タンパク質レベルでは、近縁種の異種発現が実施され、また内因性タンパク質は新規アンチセンス・リボソーム技術によって封じられた。生物工学的応用にテトラヒメナを用いる利点には、生育が早いこと、バイオマスが高いこと、通常の細菌／酵母装置において発酵すること、スケールアップ可能であること、および安価かつ化学的に確定した培地が存在することが挙げられる。
【０００３】
今のところ、テトラヒメナ(Tetrahymena)において使用可能な幾つかのマーカー、即ち、リボソーム点突然変異媒介抵抗性、プラスミドによるネオマイシン耐性、および、有糸分裂薬タキソールに抵抗性／感受性のある変異したチューブリンと組み合わせた誘導プロモーターを利用する複雑なβ−チューブリン選択マーカーが記載されている。抗生物質または薬物を使用しない選択を可能にする真の栄養要求性マーカーは、まだ得られていない。ここに本発明が適用される。
【０００４】
ピリミジン生合成における重要な酵素は、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）およびチミジル酸合成酵素（TS）である。DHFRは、ジヒドロ葉酸からテトラヒドロ葉酸の製造を触媒し；TSは、Ｎ5,Ｎ10−メチレン−テトラヒドロ葉酸からdUMPへのメチル基の移動を担うことにより、dTMPおよびテトラヒドロ葉酸を産生する。ピリミジン合成に極めて重要なこれらの酵素は、標的とした遺伝子の分裂により種々の系において栄養要求性マーカーとして用いられてきたが、多数の阻害剤（葉酸拮抗剤）もまた抗寄生虫薬として開発されている。動物、菌類および真正細菌においては、DHFRおよびTS遺伝子は別々に翻訳され、一方、植物であるアルベオラータ(Alveolata)およびユーグレノゾア(Euglenozoa)は、１つのタンパク質に結合し、両酵素の活性を有する（“DHFR-TS”）二元機能性の融合遺伝子を有する。
【０００５】
テトラヒメナ・ピリフォルミス(Tetrahymena pyriformis)における二元機能性酵素の発生は、１９８４年および１９８５年に仮定されていたが、機能性分析や、分子生物学的分析さえも実施されていなかった。未確定の“テトラヒメナ・ピリフォルミス様株”のDHFR-TSの部分的アミノ酸配列は、２００１年に発表されたが、この研究は、記載された部分的cDNAが酵素機能に関連する根拠を欠いている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、遺伝子構造、およびインビトロの機能データ等の酵素の機能データを含む、テトラヒメナ好熱菌(T. thermophila)DHFR-TS遺伝子の詳細な特徴を提供する。これらの結果とテトラヒメナのある珍しい特性との組み合わせにより、繊毛虫において最初に記載された単純な栄養要求性マーカーに加えて、例えばマラリア原虫(Plasmodium sp.)（マラリア）、トキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondii)（トキソプラズマ症）およびクリプトスポリジウム種(Cryptosporidium sp.)（クリプトスポリジウム症）のような寄生性アピコンプレクサ(apicomplexans)に対する新規な葉酸拮抗剤の開発および発見のための驚くべき強力なツールが得られる。
【０００７】
葉酸拮抗剤による上記寄生虫のDHFR-TS標的化によってこれらの最も重篤な世界的問題と戦うため、大変な努力がなされている。マラリアに対する戦いにおいて最初の成功は、薬剤耐性マラリア原虫種の発生によって圧倒された。特に、マラリアの場合、様々な種類のDHFR-TSは、異種の発生（熱帯性マラリア原虫(P. falciparum)、三日熱マラリア原虫(P. vivax)、四日熱マラリア原虫(P.malariae)、卵形マラリア原虫(P.ovale)）、および何度となく新たな抵抗性を産生する高頻度のDNA−組み換え／突然変異による多様体である。変異体の結晶構造、ひいては抵抗性DHFR-TS酵素を明らかにすることによって、新たな低分子薬物が、コンピュータ支援分子モデリングによって開発されている。主な問題は、候補薬の効能試験である。即ち、内部寄生虫は培養が難しく、変わっていて複雑な生活環を有するので、新規化合物の直接的試験はほとんど不可能である。興味深い機能性寄生性DHFR-TS酵素を発現してdhr1欠損を再構成する、dhr1遺伝子欠損酵母菌株5を利用する迂回路が記載されている。しかしながら、このアプローチは多くの不利な点がある。即ち、寄生性アピコンプレクサのコドン使用は、大腸菌、酵母および哺乳類細胞系のような全ての通常使用される発現系と非常に異なり、翻訳が必要ないくつかのtRNAはこれらのモデル生物において豊富ではない。アルベオラータ(Alveolata)の系統発生群に属する、アピコンプレキサ／胞子虫類(Sporozoa)は、多くの特別な細胞生物学的特長を有し、最も注目すべきことは表層胞の存在であり、連続した層中に詰められた扁平なベシクルは膜を支える。薬物の取り込みおよび効力に影響するこの種の特性を有するモデル生物は、これまで記載されていなかった。
【０００８】
上述した全ての問題は、テトラヒメナ(Tetrahymena)の使用によって克服し得る。
即ち、これはアルベオラータ(Alveolata)に属し、アピコンプレキサに最も近い近縁種である。テトラヒメナは、二元機能性DHFR-TS酵素によるdTMP合成の機能性サルベージ経路を支持するチミジンの存在なしに、化学的に確定した培地中で培養することが可能である。この酵素活性における欠損により、チミジン添加培地においてのみ生長する細胞系が得られるべきである。DHFR-TS活性を破壊するため、例えば、標的遺伝子ノックアウト、必須アミノ酸の部位特異的突然変異およびランダム変異導入のような、様々な通常の技術を使用し得る。DHFR-TS欠損クローンのスクリーニングは、チミジンを含む（Ｔ＋）か含まない（Ｔ−）培地中でのレプリカ平板培養によって実施し得る。可能性のあるクローンはＴ＋でのみ生長し、Ｔ−では生長すべきではない。Ｔ−で生長するであろう細胞を産する機能性DHFR-TS酵素をコードするDNA断片で上記の細胞を形質転換することによって、酵素活性の再構成を成功裏に達成し得る。この方法によって、薬剤や抗生物質を使用せずに形質転換体を選択することが可能になる。寄生性アピコンプレキサに由来する外因性の組み換えDHFR-TSの場合、高スループットシステムにおいて容易に使用し得る、葉酸拮抗薬スクリーニングのための理想的なモデルシステムが達成される。
【０００９】
ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）の活性が低下したか若しくは実質的に活性がない、または、チミジル酸合成酵素（TS）の活性が低下したか若しくは実質的に活性がない、または、ジヒドロ葉酸還元酵素およびチミジル酸合成酵素（DHFR-TS）の両者の活性が低下したか若しくは実質的に活性がない、繊毛虫細胞の製造方法が特許請求され、この方法は、
ａ）内因性DHFR-TSをコードする遺伝子を変化させる対立遺伝子を含む構造物を、繊毛虫の大核（MAC）の内因性DHFR-TS遺伝子の少なくとも一つに挿入することによって、繊毛虫細胞を形質転換する工程、
ｂ）形質転換された繊毛虫細胞において対立遺伝子の類別を誘導して、MACのほとんどまたは全ての機能性DHFR-TS遺伝子において構造物が挿入された細胞を産生する工程、および
ｃ）工程ｂ）で産生された細胞を、チミジンを有するか有しない培養によって同定する工程
を含む。
【００１０】
また、本発明の方法は、小核（MIC）が有性後代の遺伝子情報を保有するという事実を利用することもできる。その結果、本発明の方法は、工程ａ）において、内因性DHFR-TSをコードする遺伝子を変化させる対立遺伝子を含む構造物を、繊毛虫の小核（MIC）の内因性DHFR-TS遺伝子の少なくとも一つに挿入すること、および工程ｂ）において、MACのほとんどまたは全ての機能性DHFR-TS遺伝子に構造物が挿入された細胞を、他の繊毛虫細胞で工程ａ）の細胞を搾ることによって産生し、変化したMICに由来する新たなMACを含有する後代を製造することを包含する。
【００１１】
本発明によれば、繊毛虫はテトラヒメナ(Tetrahymena)であることが好ましく、好ましくは、テトラヒメナ好熱菌(Tetrahymena thermophila)である。
【００１２】
本発明のDHFR-TS遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド配列を有し得る。
【００１３】
DHFR-TS二元機能性酵素をコードする、細胞の内因性遺伝子の１．５ｋｂの上流および下流の領域が、さらに変更されることが好ましいことがある。
【００１４】
本発明の方法は、機能性非内因性DHFR-TS酵素をコードするDNAまたはRNA分子での細胞のトランスフェクションによってDHFR-TS活性を再構成する、さらなる工程を含み得る。
【００１５】
「非内因性」という用語は、DNAまたはRNA分子が異なる生物、好ましくは異なるアルベオラータ(alveolate)種に由来することを意味する。
【００１６】
さらに、本発明の方法は、機能性内因性DHFR-TS酵素およびもう１つのタンパク質をコードするDNAまたはRNA分子での細胞のトランスフェクションによってDHFR-TS活性を再構成する、さらなる工程を含むことができる。
【００１７】
機能性内因性または非内因性DHFR-TS酵素をコードするDNAまたはRNA分子は、アルベオラータ(alveolate)、好ましくは繊毛虫、さらにより好ましくはテトラヒメナ(Tetrahymena)、最も好ましくはテトラヒメナ好熱菌(Tetrahymena thermophila)に由来し得る。また、アピコンプレキサ(apicomplexan)に由来してもよい。
【００１８】
さらに、機能性DHFR-TS酵素をコードするDNAまたはRNA分子は、配列番号１で表すことができ、かつ酵素のアミノ酸配列は、配列番号３で表すことができる。
【００１９】
また本発明は、チミジン要求性を有する繊毛虫細胞を含む。好ましくは、本発明の繊毛虫細胞は、DHFRの活性が低下したか若しくは実質的に活性がない、または、TSの活性が低下したか若しくは実質的に活性がない、または、DHFR-TSの両者の活性が低下した若しくは実質的に活性がない。該繊毛虫細胞は、ここに記載した方法を用いて得られる可能性がある。
【００２０】
また、再構成DHFR-TS活性を有する繊毛虫細胞が開示され、それによるDHFR-TS酵素は内因性形態ではない。該繊毛虫細胞は、ここに記載した方法を用いて得てもよい。
【００２１】
さらに、本発明は、別のタンパク質を発現する再構成内因性DHFR-TS活性を有する繊毛虫細胞を包含する。該繊毛虫細胞は、ここに記載した方法を用いて得てもよい。
【００２２】
また、DHFR-TS酵素活性に影響する化合物を検出するアッセイにおける、再構成非内因性DHFR-TS酵素活性を有する本発明の繊毛虫細胞の使用が特許請求され、この使用は、
ａ）該細胞を被験化合物と接触させる工程、
ｂ）該細胞のDHFR-TS酵素活性を測定する工程、および
ｃ）DHFR-TS酵素活性を対照細胞のDHFR-TS酵素活性と比較する工程
を含む。
【００２３】
再構成内因性DHFR-TS酵素活性を有する本発明の繊毛虫細胞は、他のタンパク質の製造のために使用し得る。
【００２４】
また、配列番号１のヌクレオチド配列を有するDHFR-TSタンパク質をコードする単離された核酸、および配列番号３のアミノ酸配列を有する単離されたDHFR-TSタンパク質も、本発明の範囲内である。
【実施例】
【００２５】
以下の実施例は、本発明の具体例を示すために提供され、その範囲を制限することを意図するものではない。
【００２６】
細胞および細胞培養
テトラヒメナ好熱菌(Tetrahymena thermophila)B 1868.4株、B 1868.7株およびB 2068.1株を、ペーターＪ．ブランズ(Peter J. Bruns)に御提供いただき、ＳＰＰまたはＣＤＭ培地中の脱脂粉乳培地（2%脱脂粉乳、0.5%酵母抽出物、0.1%硫酸第一鉄キレート溶液および1%グルコース）において培養した。
【００２７】
テトラヒメナ好熱菌(T. thermophila)のDHFR-TS遺伝子の増幅
DHFR-TSのcDNA遺伝子およびその5'および3'隣接部位は、以下のプライマー対を用いて増幅し得る。小文字のヌクレオチドは、制限エンドヌクレアーゼの部位を記号化したものである。
【００２８】
DHFR-TS 5'隣接領域の増幅：
DHFR 5'1 F NotI: 5´-cccgcggccgcACAGAGTTAATGGAAATGGAGC-3´、
DHFR 5'2 R BamHI: 5´-gggggatccATATTTAAGCGATCTTTCAATGG-3；
DHFR-TSのcDNAおよびイントロンを有する遺伝子の増幅：
DHFR CDS F: 5´-cgcGAATTCATGAAAACAAGACATTTTGATATAGTTTTAGC-3´,
DHFR CDS R: 5´-gcgCTCGAGTCAGACAGCCATTTTCATTTATATTTTAGGG-3´, 
DHFR-TS 3´隣接領域の増幅：
DHFR 3'1 F XhoI: 5´-gggctcgagATGCTCATGTTTACTCTAATCACG-3´,
DHFR 3'1 R Acc65I: 5´-gggggtaccAGTAAAAATAGAGTAGAAGGAG-3´
【００２９】
プラスミドの構築
pKOI（ノックアウト／イン）プラスミドを以下の通り構築した：大腸菌における選択および増殖の骨格として、pBS II SKプラスミドを使用した。NotIおよびBamHI部位を用いてpBS II SK中にクローニングしたDHFR 5' 1 F NotIとDHFR 5' 2 R BamHIとのプライマー対を用いて、1.5 kbの5´-DHFR-TS挿入部位を増幅した。pH4T2 (neo2)由来の1.4 kbのパロモマイシン選択カセットを、BamHIおよびSmaI部位によって中間体pBS IISK中にクローニングした。最後に、プライマーDHFR 3' 1 F XhoIおよびDHFR 3' 1 R Acc65Iによって3´-DHFR-TS挿入部位を増幅し、XhoIおよびAcc65I部位を用いてクローニングして、DHFR-TSノックアウトカセットを完成した。
【００３０】
pBS II SK骨格のSacI部位は、突然変異を導く部位によって破壊されており、このため3´-DHFR-TS挿入配列における内因性SacI 部位、およびpKOIにおける独特のクローニング部位であるXhoI 部位の使用が容易になる。これらの部位は、組み換え酵素（ノックイン）の発現のためのカセットの挿入に使用した。この実験において、我々はヒト組み換えDNase I発現／分泌カセットおよび繊毛虫内因性リパーゼ発現／分泌カセットを使用した。DNaseについては、カセットは内因性PLA1前駆体の最初の115 aaおよび成人DNase Iのaa 23-281より成る。この融合タンパク質の正確な翻訳を確かにするため、コドン最適化合成ヒトDNase I遺伝子を用いた。発現は、先に記載された誘発性MTT-1プロモータによって制御し、終結は、pH4T2のneo2カセットのような、BTU2ターミネーターによって制御する。
【００３１】
pKOIプラスミドの形質転換（遺伝子銃撃）
我々は、接合細胞、および、栄養増殖性非接合固定テトラヒメナ好熱菌(T. thermophila)株を使用した。テトラヒメナ好熱菌細胞の形質転換は、ゲルティッヒらによって先に記載されたとおり実施した。
【００３２】
選別、対立遺伝子類別およびDHFR-TSノックアウト分析
テトラヒメナ好熱菌(T. thermophila)細胞増殖分析：遺伝子銃撃後、最初の約１６時間、形質転換体を脱脂粉乳培地中で培養した。その後、形質転換細胞を、対立遺伝子の類別法を支持するためパロモマイシンの濃度を漸増した（100 μg/mL〜1000 μg/mL）SPP培地上で培養した。３〜４週間後、チミジン（10 mg/mL）含有または非含有CDMレプリカプレート上で、各クローンを培養した。機能性DHFR-TSノックアウトクローンのみが、チミジン添加CDM培地中で成長することが可能である。DHFR-TSノックアウト株の生存能力は、成長速度を測定することによってモニターした（図５）。
【００３３】
MACにおける内因性野生型DHFR-TS遺伝子の欠損、およびDHFR-TSノックアウトおよびrhDNase Iノックインカセットの完全な組み込みは、以下のプライマーを用いたPCRによって確認した：
DHFR01F: 5´-CTTTTTAACAGCCTGCTGCTCG-3´,
DHFR02R: 5´-GATTTTGATGCTTCAATAAGGTTG-3´,
DHFR03F: 5´-TTATTTGTTTTATCATAGTGGAAAAGG-3´,
DHFR04R: 5´-CAGACACCTCAATCATATCAAAG-3´, 
DHFR05F: 5´-GGTCCTCCATCAGATTGTGG-3´
DHFR06R: 5´-CGCGTCGAGTCAGACAGCCATTTTCATTTA-3´
Hex01F: 5´-ATGCAAAAGATACTTTTAATTACTTTC-3´
Hex02R: 5´- TATATTTTAGGAATGTTGTAATC-3´
【００３４】
同一のneo2およびDNase I発現／分泌カセットを有するpH4T2プラスミドをPCRのコントロールとして用いた。PCRの方策を図６に示す。
【００３５】
SDS-PAGEおよびウエスタンブロット
形質転換細胞およびSPP上澄の一定分量を試料緩衝液中に再懸濁し、15% SDS-PAGEで分離した。ゲルをニトロセルロース膜上にブロットし、0.05%のTween 20および5%の脱脂粉乳を含有するPBS(PBS-TM)においてブロックした。形質転換した繊毛虫における組み換えヒトDNase Iの発現を、ヒトDNase Iに対するウサギ由来の２つの特異的抗血清によって検出した（抗原：組換えヒトDNase I、パルモザイム、ロシュ）。両血清は組換えDNase I抗原を検出した。血清は、PBS-TMで1:500に希釈して使用した。PBS/Tで洗浄した後、HRP接合抗ウサギ血清を適用した。化学発光を用いてブロットを発現させた。
【００３６】
DNase I活性分析
メチルグリーンに基づくDNase活性分析を既刊のとおり実施した。サンプルをマイクロタイタープレート上、３７℃で２４時間インキュベートした。吸光度を620nmで測定した。各実験において、ロシュ(Roche)（CHO由来）のパルモザイムの規定されたDNase Iユニットを異なる量用い、線形回帰により、分析の検定を行った。半定量的ウエスタンブロット法と組み合わせたこれらの結果を用いて、発現されたDNase Iの比活性度を計算した。
【００３７】
リパーゼ活性分析
製造元の説明書に従って、リパーゼ活性分析を実施した（リフレクトクアント(登録商標) (Reflectoquant)試験紙および反射率計RQflex(登録商標)）（VWRインターナショナル社(VWR InteRNAtional GmbH)、独国ダームシュタッド(Darmstadt) 64295、ヒルペアシュトラーセ(Hilpertstrase) 20a、商品番号：1.05851.0001）。
【００３８】
実施例１：栄養要求性異核共存体の生成
原生動物であるテトラヒメナ好熱菌(T. thermophila)は繊毛虫に属する。これらの真核生物は、２つの核、体細胞系列の大核（MAC）および遺伝子の小核（MIC）よりなる。MICは、生殖細胞の核であり、すなわち、有性後代の遺伝情報を保持する。MICは２倍体であり、５対の染色体を含有する。これに対し、MACは体細胞核であり、MACのDNAは有性後代に受け継がれない。MACは、MICに由来する200〜300の自己複製断片（ARP）を含有する。これらのユニットはそれぞれ、細胞１個当り約10,000コピーに独立して増幅されるrDNAを除いて、約45コピー存在する。MACのDNAは転写されたDNAであるので、テトラヒメナ好熱菌の実際の表現型に関与する。
【００３９】
遺伝子工学は最終的に、タンパク質発現を管理する機能性MACの形質転換が必要であることは明らかである。異種発現のための最初のアプローチは、MAC発生の間にrDNA遺伝子の膨大な増幅を使用するプラスミドを用いることによってなされた。しかしながら、これらのプラスミドがエピソームに存在するかどうかは薬剤濃度により、プラスミドは内因性rDNAユニット内に同属的かつ非方向的に再結合する可能性がある。
【００４０】
より期待できる方法は、細胞の安定的形質転換である。これは、テトラヒメナ好熱菌のMACおよび／またはMIC中への発現カセットの安定的組込みを意味する。MIC形質転換は、２倍体MICの染色体DNAを安定的に形質転換することによって達成し得る。２つの異なる接合型が接合した後、接合細胞の古いMACは消滅し、新しい情報を運ぶ組換えMICに由来する後代に新しいMACが構築された。全工程は、メンデル遺伝学の統計値に従う。このアプローチの有意点は、遺伝的特性を維持する安定なクローンが得られ、古典的遺伝学によって交差されて異なるテトラヒメナ好熱菌株の種々の特性を組み合わせ得ることである。このアプローチは非常に精巧で、多大な時間を必要とする。さらに、最近、古いMACに由来する走査RNAは、生殖細胞のMICから体細胞MACが発生する間、DNA排除において重要な役割を演じることが示された。これらの小さなRNAの一次配列により、親のMACがどのように新しいMACにおけるゲノム再配列を後成的に制御するかが説明される。安定なMIC形質転換体の場合、このRNAi様のメカニズムは、新しいMACの発生において、外来発現カセットの確立および維持を阻害する。
【００４１】
プラスミドに基づくrDNAによるエピソーム形質転換またはMICの安定的形質転換の代わりに、安定的MAC形質転換と対立遺伝子の類別アプローチとの組み合わせによる簡約法を用いた。この組み合わせは幾つかの利点を有する。第一に、MAC形質転換は、遺伝子座あたり少なくとも約45の可能な組み込み部位があるため、はるかにより効率的である。第二に、接合するのみではなく、非接合によっても、規定の菌株は形質転換され得る。最後に、走査RNAメカニズムによって制御されるMACの発現において、最近報告されたゲノム再配列は、対立遺伝子の類別と組み合わせたMAC形質転換によって短絡化され得る。
【００４２】
ノックアウト／イン実験を実施するため、テトラヒメナ好熱菌DHFR-TS遺伝子および隣接領域を、5´領域非コード領域用のプライマー対DHFR 5'1 F Not, DHFR 5'2 R BamHI、3´領域用のプライマー対DHFR 3'1 F XhoI: 5, DHFR 3'1 R Acc65I、およびコード領域増幅用のプライマーDHFR CDS F, DHFR CDS Fを用いて増幅した。DHFR-TS構造遺伝子のコード領域とDHFR-TS cDNA（同じDHFR CDS F /Rプライマー対で増幅）の比較によって、構造のエクソン−イントロン構造が明らかになった（図１）。
【００４３】
DHFR-TSノックアウト実験を開始するために、プラスミドpKOIを構築した（図２）。pH4T2のneo2カセットを使用して、パロモマイシンに対する選択によるプラスミドの取り込みの成功をモニターした。pKOIのneo2カセットは、それぞれ、DHFR-TS遺伝子の非コード領域の、1.5kb断片の5´および3´領域に隣接する（図２）。pKOIは適当な複製起点が欠損しているので、パロモマイシン抵抗性テトラヒメナ好熱菌クローンは、DHFR-TS遺伝子座において適切な相同的組み換えを支持する。それでもなお、DHFR-TS遺伝子座中への正確な組み込みの最も説得力のある証拠は、形質転換株におけるDHFR-TS活性の欠損である。繊毛虫類の場合、これは、ノックアウトカセットを含むにARPよる、染色体のDHFR-TS野生型対立遺伝子全て（〜45 ARP）の置換を要する。対立遺伝子の類別によって、我々はこれを達成した。この対立遺伝子または表現型の類別は、有糸分裂の間のMAC染色体ユニット（ARP）のランダム分布に基づく。類別法を所望の方向、即ち組み換え抵抗遺伝子に適用するために、形質転換細胞は、逓増的な濃度のパロモマイシン剤を用いて少なくとも２〜３週間培養した。単一クローンを単離し、チミジン含有（+T）および非含有（-T）最小既知組成培地（CDM）を用いてDHFR-TS欠損を試験した。図４および図５において、発見したDHFR-TSノックアウトクローンが真の栄養要求性株であることを実証する：突然変異体は、野生型菌株または不完全対立遺伝子類別を伴う菌株のように、チミジンを含有するCDM中で培養することが可能である。チミジンを含まないCDMにおいて、それらは培養することができない（図４および図５参照）。
【００４４】
実施例２：興味のある遺伝子におけるノックのためのノックアウトDHFR-TS
テトラヒメナ好熱菌(T. thermophila)の内因性DHFR-TS遺伝子のノックアウトもまた、DHFR-TSノックアウト株において異種発現し得るさらなる外来遺伝子においてノックする可能性を与える。この目的のため、pKOI DVLプラスミドを構築した。これは、PLA1遺伝子の前駆体配列の最初の115個のアミノ酸（aa）および成人DNase I（アミノ酸23〜281）をコードする、さらなる発現カセットを有するpKOI骨格よりなる。内因性リパーゼ発現のための構築物は、内因性繊毛虫リパーゼプレプロペプチド配列および成熟内因性繊毛虫リパーゼを含有する。
【００４５】
PLA1プレプロペプチド（aa 1〜110）は、カテプシンＬ群の構成員に有意な類似性を有し、培地への分泌を媒介する。PLA1プレプロペプチドに類似して、内因性繊毛虫リパーゼプレプロペプチドは、培地中へのリパーゼの分泌を媒介する。
【００４６】
DNaseの場合、５個のさらなるアミノ酸（aa 111〜115）は、内因性プロペプチダーゼによるプロPLA1-DNase I融合タンパク質の至適開裂を保証すべきである。neo2カセットと対比して、ppPLA115-DNase I融合タンパク質の発現は、誘導性MTT1プロモータによって制御される。異種発現された組み換えヒトDNase IのDNase活性と少なくとも２つの内因性DNaseによる定常活性の間に明らかな区別があることから、誘導系を選択した。このことによれば、誘導系は、内因性リパーゼ活性の基礎レベルと相同性過剰発現内因性リパーゼ活性の間に明らかな区別があることから、リパーゼの場合においても選択された。形質転換、陽性クローンの選択および目的の対立遺伝子類別を実施例１に概説した通り行った。さらに、DHFR-TS遺伝子座における両発現カセット（neo2およびDNase I）の正確かつ完全な組み込みをPCR法によって試験した。図６は、これがその場合であることを示す。
【００４７】
pKOIの概念を実証するために、ppPLA115-DNase発現カセットを有する、これらのDHFR-TSノックアウト株の細胞を、カドミウムで、およびカドミウムを用いず、処理した。誘導された株のみが、上澄においてDNase活性の上昇を示した（図７）。この酵素データを確認するため、ヒトDNase Iに対する特異的抗血清を用いて、ウエスタンブロットによって、これらのヒトDNase発現DHFR-TSノックアウト株の細胞抽出物および上澄を分析した。その結果は、DHFR-TSノックアウト株が機能性組み換えヒトタンパク質を発現および分泌する能力があることを示す（図８）。
【００４８】
実施例３：高スループットの葉酸拮抗剤スクリーニング用菌株を創出するためのDHFR-TS活性の組み換え体再構築
DHFR-TS欠損テトラヒメナ(Tetrahymena)株におけるDHFR-TS活性の再構築は、他のアルベオラータ(Alveolata)の二元機能性DHFR-TS酵素を異種発現することによってなし得る。序文で既に記した通り、この系統群は、繊毛虫類(Ciliata)、渦鞭毛藻虫類(Dinoflagellata)およびアピコンプレキサ(Apicomplexa)／胞子虫類(Sporozoa)よりなる。特に、アピコンプレキサは、全ての構成員が細胞内寄生体であり、それらの幾つかが非常に重篤な疾病（マラリア、トキソプラズマ症、クリプトスポリジウム症）を引き起こすことから、大いに医学的興味が持たれる。
【００４９】
DHFR-TSプラスミド／ベクターと組み合わせたDHFR-TS欠損テトラヒメナ好熱菌(T. thermophila)株が分子生物学の新たなマーカーを提供するという事実とは別に、同一のシステムは、薬剤開発用途のための規定された試験株の産生に使用し得る。近接した系統発生学的関係のため、アルベオラータ(Alveolata)群の他の構成員由来のDHFR-TS酵素によって欠損テトラヒメナ株においてDHFR-TS活性を回復することもまた可能である。このことは、新規な抗DHFR-TS薬（葉酸拮抗薬）の探索および試験に、DHFR-TS欠損テトラヒメナ好熱菌株が適用されることを暗示する。葉酸拮抗薬はマラリアとの戦いにおける最も有望な薬剤の一つであるため、このことは非常に重要である。抗DHFRTS薬は、例えばマラリア患者には長期間投与されてきたという事実は、最近の数十年の間、多数の寄生虫が耐性を持つようになったことによる。現在のところ、寄生虫のDHFR-TS酵素に対する、新規でより特異的かつ有効な薬剤を発見するため、多数のアプローチが探索されている。新規な葉酸拮抗薬の探索は、NMRおよび結晶化技術を用いる構造決定に依存するので、これらのアプローチの殆どは、非常に時間がかかり、コストが大きい。
【００５０】
活性な寄生虫のDHFR-TSを発現するDHFR-TS欠損テトラヒメナ株は、チミジンを含まない培地中で培養可能であるだけではなく、新規な葉酸拮抗薬の探索にもまた好適である。従って、寄生虫の同種の二酵素系によって回収されるDHFR-TS欠損株は、アピコンプレキサ(Apicomplexa)群の他の疾病を引き起こす寄生虫に適用できる、簡単で柔軟なインビボの試験システムを代表する。例えば、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)株に対する葉酸拮抗剤は、高スループットのアプローチのための適切で柔軟なインビボのシステムが利用できないことから、検討されていなかった。これは、トキソプラズマ症またはクリプトスポリジウム症を引き起こすアピコンプレキサ／胞子虫類(Sporozoa)由来の酵素と同様に、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫(Plasmodium malariae)、卵形マラリア原虫(Plasmodium ovale)の相同二酵素を用いて、テトラヒメナ好熱菌株のDHFR-TS活性を回復することによって、容易になし得る。図９はこの概念を示す。ピリメタミン感受性熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)3D7株のDHFR-TS酵素を用いて、DHFR-TS活性が欠損したテトラヒメナ好熱菌におけるDHFR-TS活性を回復させた。平行して、ピリメタミン処理に抵抗性の熱帯熱マラリア原虫株（例えばDHFR-TS S108N突然変異体）のDHFR-TSを試験する。２つの異なる形質転換体についての用量反応曲線において、ピリメタミンの効果を測定することによって、薬剤耐性および感受性を容易に定量し得る。その後、新規な候補薬剤を培地に添加して、なお抵抗性の突然変異体に対する有効性を示し得る。
【００５１】
参考文献一覧
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８．ゲーティッヒ(Gaertig), J.およびグロフスキ(Gorovsky), M. A. テトラヒメナにおけるDNA媒介形質転換(DNA-mediated transformation in Tetrahymena). Methods Cell Biol. 47巻, 559-569頁 (1995年).
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【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、テトラヒメナ好熱菌(T. thermophila)のDHFR-TS二元機能性酵素のゲノム構造を表す。  テトラヒメナ好熱菌のDHFR-TS遺伝子構造は、３つのエクソン（灰色）および２つのイントロン（黒）よりなる。相同的組み込みのためDNAを増幅し、かつCDSまたはcDNAを増幅するプライマー対を下部に示す。
【図２】図２は、pKOI: DHFR-TSノックアウト構築物を表す。  図２は、テトラヒメナ好熱菌(T. thermophila)のDHFR-TS遺伝子の標的化ノックアウトに使用されるノックアウト構築物を示す。これは、パロモマイシン抵抗性を与える機能性ネオマイシンカセットによって破壊される、テトラヒメナ好熱菌のDHFR-TS遺伝子の3'および5'隣接領域およびそのコード配列（CDS）の一部よりなる。
【図３】図３は、対立遺伝子の類別による、DHFR-TS欠損株の産生を表す。  野生型株はpKOIを用いて形質転換される。45のARPのうちの一つの複製物において、内因性DHFR-TS遺伝子はノックアウト構築物によって置換される（工程２）。MACの無糸分裂および高淘汰圧により、全ての内因性遺伝子を選別し、組み換え体のみを保持し、DHFR-TS遺伝子を欠損するクローンが発生するであろう（工程３）。
【図４】図４は、チミジンでの生長によるDHFR-TSノックアウト細胞の選択を表す。  破壊されたDHFR-TS遺伝子を有するテトラヒメナ細胞（クローン１〜３）はチミジンの存在なくしては生長せず（CDM-T）、一方、野生型細胞は生長する。培地へのチミジンの添加により（CDM+T）、生長が回復する。
【図５】図５は、野生型と比較したDHFR-TS欠損テトラヒメナの生長を表す。  チミジンを含むか含まない培地中で、野生型細胞と比較したDHFR-TSノックアウト細胞の生長速度は、ノックアウト株（pKOI）がチミジン添加培地（CDM+T）上では野生型細胞と同等の速度で生長していることを示す。ノックアウト細胞は、チミジンの存在なくしては（CDM-T）死滅する。曲線は、少なくとも３回の独立した実験の平均値により計算する。
【図６】図６は、DHFR-TSノックアウト構築物の適切な組み込みを表す。  この図は、ノックアウト／イン構築物がDHFR-TS遺伝子座中に組み込まれたことを確定する、PCRアプローチを示す。  ３つの異なる細胞を試験した：K1は野生型対照であり、K2は、破壊カセットのみを有し、DHFR-TS遺伝子配列を持たないプラスミドを導入した細胞であり、pKOI DVLは、pKOI DVLプラスミドで形質転換した細胞である。PCR1は、β−ヘキソサミニダーゼ遺伝子の369塩基対を増幅する対照反応である。PCR2は、内因性DHFR-TSを検出するものである（pKOI DVL細胞において、MICの野生型遺伝子がなおも存在することに注目のこと）。PCR3は、正確に組み込まれたpKOI DVL DNAのPCR産物のみを産する。PCR4は、発現カセットの全長を組み込んだことを示す。
【図７】図７は、標的におけるノックの酵素機能（DNase）を表す。  pKOI DVLで形質転換した３つのクローンの上澄のDNase活性を分析した。誘導された細胞（＋）のみが高レベルのDNase活性を示す。形質転換されたが誘導されない細胞は、基礎的なプロモーター活性が低いため、野生型細胞と比較して酵素活性はわずかな上昇を示す。
【図８】図８は、標的におけるノックの発現を表す。  ウエスタンブロットにより、組み換えヒトDNase Iの発現が示される：形質転換され、かつ誘導された細胞（＋）のみが、抗DNase I抗体のため、強いシグナルを示す。細胞内PLA1-DNase融合タンパク質は、細胞溶解物のサンプルによる左のブロット上に視覚化される。バンドは、成熟かつ処理された陽性対照より分子量が大きいところに現れている。右では、上澄をウエスタンブロット法に付したが、テトラヒメナの分泌タンパク質のサイズは、陽性対照と比較した場合、修正処理を支持する。
【図９】図９は、ノックインによるDHFR-TS活性の再構築の概観を表す。  工程Ｉは、破壊されたテトラヒメナDHFR-TS遺伝子座中への異なる外因性DHFR-TS遺伝子の相同的組み換えに要される構築物を示す。実施例１で記載した菌株を、チミジンを含まない培地によって分泌可能となる、これらのDNAを用いて形質転換する（工程III）。対立遺伝子の類別の後、抗葉酸薬スクリーニングに使用し得る、異なる組み換えDHFR-TS特性を有する安定な細胞系列を得る（工程IV）。
【図１０】図１０は、標的におけるノックの酵素（内因性リパーゼ）機能を表す。  図６に相当して、内因性繊毛虫リパーゼの遺伝子を、テトラヒメナDHFR-TS遺伝子の誘導プロモーターおよび隣接領域と組み合わせた。続いて、構築物を形質転換ベクターに組み込み（pKOIX_M_Lipaseと呼ばれる構築物）、テトラヒメナ中に形質転換させた。DHFR-TS構築物のテトラヒメナDHFR-TS座中への相同的組み込み、および続くクローン分泌の後（図３〜図６に記載した方法に相当）、pKOIX_Mで形質転換した一つのクローンの上澄のリパーゼ活性を分析した。組み込まれたpKOIX_Mリパーゼ構築物を有する細胞のみが、高レベルのリパーゼ活性を示す。野生型細胞は、内因性リパーゼプロモーターのプロモーター活性が低いため、低レベルのリパーゼ酵素活性を示す。下のグラフは、組み込み構築物の全長を示す。図１０は、リフレクトクアント(Reflectoquant(登録商標)リパーゼ試験の製造元の使用説明書に従ったリパーゼ酵素分析で測定した、野生型細胞および誘導形質転換体の上澄中のリパーゼ活性を示す。
【図１１】図１１は、リパーゼ（pKOIX_M_Lipase）の組み込み／発現カセット全長の構築を示し、これは内因性繊毛虫リパーゼの過剰発現を得るために、テトラヒメナ細胞中に形質転換された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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