(57)【要約】  本発明は、組換えスタフィロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子等及びその変異体が適する新規血栓溶解タンパク質分子であって、対象血栓溶解分子と、タンパク質導入ドメインを含有する強力な両親媒性のアルファヘリックスを含むタンパク質配列とを融合又は合成することのいずれかにより、脳組織又は他の任意の組織を対象とする新規血栓溶解タンパク質を開示している。タンパク質導入ドメインで改変された血栓溶解タンパク質分子は、そのような血栓溶解タンパク質は細胞膜及び血液脳関門を含む組織を通過しての摂取向上に有利であり、治療用に使用した場合、脳血栓症又は脳出血に起因する脳血管障害を含む血管内血栓の治療においての利用が見い出される。本発明は、その設計、並びにクローニング、発現、精製及びそのようなタンパク質が細胞膜を通過してタンパク質導入する方法を開示している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血栓溶解タンパク質及びその変異体の組成物であって、細胞膜を通過して前記タンパク質を導入することができるタンパク質導入ドメインを含むように変性された組成物。
【請求項２】
タンパク質が、組織プラスミノゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、スタフィロキナーゼからなる群より選択される、請求項１に記載の血栓溶解タンパク質の組成物。
【請求項３】
血栓溶解タンパク質が、細胞膜を通過してタンパク質を導入することができる血栓溶解タンパク質を生成するためにタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）と融合された配列番号１の成熟スタフィロキナーゼ（ＳＡＫ）のアミノ酸配列からなる、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
タンパク質が、タンパク質のあらゆる領域、Ｎ末端、又はＣ末端側終端、好ましくは或いはタンパク質のＮ末端において融合されたタンパク質導入ドメインからなる、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
タンパク質導入ドメインが、配列番号２に示される、アミノ酸配列５’ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ３’からなる、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
タンパク質導入ドメインが、配列番号３に示される、アミノ酸配列５’ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ３’からなる、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
タンパク質が、スタフィロキナーゼ等の血栓溶解タンパク質とタンパク質導入ドメインとの間のアミノ酸のリンカー配列からなる、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
リンカー配列が、血栓溶解タンパク質及びタンパク質導入ドメインの適正なフォールディングをさせるように付加された任意の配列のアミノ酸からなる、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
リンカー配列が、グリシン及びセリンアミノ酸残基、好ましくは配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒからなる、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
タンパク質導入ドメインとリンカー配列とを血栓溶解タンパク質に付加する方法であって、化学合成、化学接合、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるヌクレオチドレベルでの配列の付加のいずれかによって、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応によって付加する方法。
【請求項１１】
タンパク質が、原核生物又は真核生物発現系のいずれかにおいて発現する組換えタンパク質である、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
（ｉ）ベクターと（ii）請求項１〜１０に記載のアミノ酸配列をコードする少なくとも１つの核酸フラグメントとを含む組換えＤＮＡコンストラクト。
【請求項１３】
ベクターが、原核生物宿主、好ましくは大腸菌でクローン化された原核生物プラスミド発現ベクターである、請求項１１又は１２に記載の組換えＤＮＡコンストラクト。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の組換えタンパク質の発現を最適化する方法であって、ヌクレオチド配列全体が、好ましくは組換えタンパク質をコードするＮ末端領域が、大腸菌宿主中における発現のために最適化されたコドンである方法。
【請求項１５】
以下のステップを含む請求項１に記載のタンパク質を製造する方法：
（ａ）請求項１１〜１４のいずれかに記載の組換えＤＮＡコンストラクトでクローン化された宿主細胞を培養するステップ；
（ｂ）細胞を採取して、そこから組換えタンパク質を分離するステップ；
（ｃ）少なくとも以下の１つの方法によって前記タンパク質を精製するステップ：イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過、親和性クロマトグラフィー、塩分画、有機溶媒、遠心分離、電気泳動等による分画。
【請求項１６】
可溶性画分から又は変性状態下での封入体のいずれかから、請求項１〜１５のいずれかに記載の精製した組換えタンパク質を製造する方法であって、タンパク質可溶化が、尿素、塩酸グアニジン、又は他の任意の適切な変性剤のうち少なくとも１つを使用して実施される方法。
【請求項１７】
緩衝液が、リン酸緩衝液、クエン酸リン酸塩緩衝液、又は他の任意の薬学的及び生理学的に許容される緩衝液のいずれかを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１８】
タンパク質導入ドメインで変性された血栓溶解タンパク質が、インビトロで細胞膜を通過する導入効率の向上を示すとともに、インビボで投与された場合に組織内への摂取が向上する可能性がある、請求項１〜１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
血栓溶解タンパク質からなる組成物が、血管系及び組織における血塊を溶解する治療的血栓溶解タンパク質として使用できる、請求項１〜１８のいずれかに記載の血栓溶解タンパク質の使用方法。
【請求項２０】
血栓溶解タンパク質からなる組成物が、脳出血及び脳卒中を含むがこれらに限定されない脳血栓症及び任意の脳血管障害の治療のための治療的血栓溶解タンパク質として使用できる、請求項１〜１９のいずれかに記載の血栓溶解タンパク質の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質導入効果が向上した新規血栓溶解分子の生成及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管の閉塞は、血塊（血栓）が存在するために発生する。フィブリンと血球から構成される血栓は、静脈、動脈、心臓、微小循環を含む循環系のいかなる部分にも形成される可能性がある（Badimon L. and Badimon JJ. 1989）。血栓は、次第に構造的に変化し；凝集した血小板又は血漿タンパク質のタンパク質分解断片から放出された化学走化性因子によって引き付けられた白血球が、血栓中に取り込まれる。これら凝集した血小板は肥大し、分解して、徐々にフィブリンと入れ替わる。これらの塊は、心臓及び肺にしばしば影響を及ぼし、より微細な血管を弛緩したり閉塞したりすることがある。損傷した血管を通過しての正常で適時な血流には、繊維素溶解薬の使用が必要である。Chesbro JH., Knatterud G., Roberts R., et al (1987), Circulation, 76, 142 - 154の論文を参照されたい。
【０００３】
ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、またはウロキナーゼ及び組織プラスミノゲン活性化因子等の他の血栓溶解剤が、心筋梗塞症、肺疾患、動脈又は静脈血栓塞栓症、外科用癒着及び血栓が形成される他の例の治療に一般的に使用される。血栓溶解剤は、内因性プラスミノゲン（酵素前駆体）を、塊を溶解し、インビボで血栓溶解剤として使用できるプラスミン（活性酵素）に変換することによって作用する。プラスミノゲンは、天然型がアミノ末端グルタミン酸を有する単鎖糖タンパク質であり、Ａｒｇ−Ｖａｌ（５６０−５６１）ペプチド結合の切断によりプラスミドに変換される（Robbins KC. Summaria L. (1976): Methods in Enzymology. 45, 257 - 273）。
【０００４】
脳出血の場合、罹患した小動脈が破裂して、そして脳内に出血することがある。これら両事象は脳を損傷し、脳卒中（stroke）（脳血管障害又はＣＶＡ）と総称される。脳卒中は、通常、症状の突発を現す。疾患した動脈によって、麻痺、言語障害、並びに嚥下障害、視覚及び知覚障害の症状が含まれる。
【０００５】
外傷性が高く、しばしば治療効果が低く実質的な副作用を伴う侵襲的手法により、脳血栓症を治療することができる。脳卒中を治療する代替方法の１つとして、ストレプトキナーゼ、アシル化プラスミノゲン−ストレプトキナーゼ複合体、スタフィロキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子等の１又は複数の繊維素溶解薬を脳組織中に用いることができる。
【０００６】
しかしながら、すべてのタンパク質ではないにせよ、血液脳関門はほとんどのタンパク質に対して不浸透性であるため、そのようなタンパク質分子の脳への摂取には限界がある。
【０００７】
すべての小分子の９８％未満、及び大タンパク分子の１００％が血液脳関門を通過しないので、血液脳関門は、事実上、すべての脳薬剤開発プログラムにおいての制限因子である。分子レベルにおいて、血液脳関門は、密接に関連するアストロサイトの終足過程（end feet processes）と共に脳微小血管内の微小血管内皮細胞からなる。微小毛細血管内皮細胞は、脳組織からほとんどの血液感染性の物質を選択的に排除する拡散障壁を形成する脳内皮細胞間に密着結合が存在することを特徴とする。
【０００８】
脳内に薬剤を分布するには、経血管ルートを必要とし、この手法は、血液脳関門を透過する能力を必要とする。親水性カーゴを運搬するために、タンパク質をタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）と融合又は合成することによって、血液脳関門を通過してタンパク質分子を導入することに成功している。導入ペプチド、特にＳｙｎＢ（Rouselle et al. 2001）、ペネトラチン（Penetratin）（Mazel et al. 2001; Rouselle et al. 2000）、及びＴＡＴペプチド（TAT peptide）（Schwarz et al. 1999; Cao et al. 2002; Asoh et al. 2002）は、脳へのアクセスを顕著に増加させる。例えば、脳内への抗アポトーシスペプチド（Cao et al. 2002; Asoh et al. 2002）のターゲティングは、虚血性障害から保護するために使用されている。ホメオドメイン由来のペプチドは、Ｃ３−トランスフェラーゼ（Ｒｈｏを中和する低分子量ＧＴＰ結合タンパク質（small GTP-binding protein））を内在化し、損傷後の脊髄中の神経細胞の死を５０％回復させた（reversed neuronal death in the spinal cord by 50% after injury.）（Mainguy et al. 2000）。真核生物開始因子（eukaryotic initiation factor）をターゲティングする細胞透過性ペプチドは、癌細胞のアポトーシスを誘発するために使用されている（Herbert et al. 2000）。ターゲット分子中での細胞透過性ペプチドの使用は、タンパク質治療において無制限の範囲を提供する。本発明は、血管系中、及び脳血栓症の兆候を表す脳組織を含む組織中の血栓を溶解する新規血栓溶解分子を設計する技法を使用したそのような一例である。
【非特許文献１】Badimon L. and Badimon JJ. (1989): J.Clin.Invest. 84, 1134-1144
【非特許文献２】Rousselle, C. et al. (2001): Enhanced delivery of doxorubicin into the brain via a peptide-vector-mediated strategy: saturation kinetics and specificity. J. Pharmacol. Exp. Ther. 296, 124-131
【非特許文献３】Mazel, M. et al. (2001): Doxorubicin-peptide conjugates overcome multidrug resistance. Anticancer Drugs 12, 107-116
【非特許文献４】Rousselle, C. et al. (2000): New advances in the transport of doxorubicin through the blood-brain barrier by a peptide vector-mediated strategy. Mol. Pharmacol. 57, 679-686
【非特許文献５】Schwarze, S.R., Ho, A., Vocero-Akbani, A. & Dowdy, S.F. (1999): In vivoprotein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285, 1569-1572
【非特許文献６】Cao, G. et al. (2002).In vivo delivery of a Bcl-xL fusion protein containing the TAT protein transduction domain protects against ischemic brain injury and neuronal apoptosis. J. Neurosci. 22, 5423-5431
【非特許文献７】Asoh, S. et al. Protection against ischemic brain injury by protein therapeutics. Proc. Natl Acad. Sci USA 99, 17107-17112 (2002)
【非特許文献８】Mainguy, G. et al. An induction gene trap for identifying a homeoprotein-regulated locus. Nature Biotechnol. 18, 746-749 (2000)
【非特許文献９】Herbert, T.P., Fahraeus, R., Prescott, A., Lane, D.P. & Proud, C.G. Rapid induction of apoptosis mediated by peptides that bind initiation factor eIF4E. Curr. Biol. 10, 793-796 (2000)
【非特許文献１０】Ho A., Schwarze S.R. Mermelstein S.J. Waksman G., Dowdy S.F. (2001): Synthetic protein transduction domains: Enhanced transduction potential in vitro and in vivo. Cancer Research 61, 474-477
【非特許文献１１】Chesbro JH., Knatterud G., Roberts R., et al (1987), Circulation, 76, 142 - 154
【非特許文献１２】Robbins KC. Summaria L. (1976): Methods in Enzymology. 45, 257 - 273
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の主な目的は、血管系及び脳組織を含む組織における血栓症の治療のため、血液脳関門を含む組織内へのタンパク質の摂取を向上させるためのタンパク質導入ドメインで改変された新規血栓溶解剤を提供することである。適切な血栓溶解分子は、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、スタフィロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子等を含み、またその変異体に適しており、血栓を溶解する実証された潜在力がある。
【００１０】
別の目的は、タンパク質導入ドメインを含有する強力な両親媒性アルファヘリックスを含むタンパク質配列と候補の血栓溶解分子に融合すること、又はこれと合成することのいずれかにより、新しい組換えタンパク質を提供することである。さらに、介在リンカー配列の有無にかかわらず、タンパク質血栓溶解分子のＮ又はＣ末端のいずれかで融合させたタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）は、以下の配列のいずれかを含むことができる：ＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質のアミノ酸４７〜５７の配列に対応するＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、又は血液脳関門を通過して脳組織に入ることができるように細胞及び組織への導入を向上させるために強力な両親媒性ヘリックスを含有するように合成的に最適化したタンパク質配列。
【００１１】
タンパク質導入ドメインを取り込むために用いられる組換え血栓溶解タンパク質分子は、成熟スタフィロキナーゼである。記載された製造方法に従い、タンパク質をクローン化し、細胞内タンパク質として大腸菌（E.coli）中で組換えタンパク質として発現し、また、真核生物発現系においても同様に発現することができる。発現したタンパク質は、製剤処方に利用するため、さらに単離、及び精製される。
【００１２】
本発明は、かかる血栓溶解分子の設計、クローニング、組換え発現、及び精製方法を提供する。また本発明の別の目的は、脳血栓症、脳出血、脳卒中、又は脳組織を含む組織への血液の浸透により形成された血栓を溶解する必要があるあらゆる状態に起因する脳血管障害等の脳組織内の血管を含む血管系における血栓症の治療に使用されるように、タンパク質導入ドメインで改変された血栓溶解タンパク質分子を提供することである。
【００１３】
本発明は、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子、ウロキナーゼ、並びにそれらのあらゆる変異体及び誘導体等の任意のタンパク質血栓溶解剤が、治療用タンパク質をタンパク質導入ドメインから分離するリンカー配列の存在の有無に係わらず、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかで、タンパク質導入ドメインと融合又はこれと合成するのに適する方法を開示する。タンパク質の２つの機能ドメイン間にリンカー配列を付加することは、ドメインの適切なフォールディングを助長し、それにより、機能活性を保持することを促進する。タンパク質導入ドメインは、機能活性を喪失することなく、Ｎ又はＣ末端以外のタンパク質の任意の領域において導入することができる。
【００１４】
組織ターゲティングのための本発明の治療用分子は、Ｎ末端側終端（ＤＥＬＴＡ１０ＳＡＫ）で最初の１０個のアミノ酸欠失を有する成熟スタフィロキナーゼに由来し、配列ＮＨ２−末端Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（the sequence NH2-terminal Lys-Gly-Asp）で始まり、その繊維素溶解活性は成熟スタフィロキナーゼ（ｍＳＡＫ）のものと同様である。タンパク質導入ドメインを含むように変性されたスタフィロキナーゼタンパク質は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲのＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質のアミノ酸４７〜５７を含む配列か、タンパク質導入特性を有する強力な両親媒性ヘリックスを含むように合成的に最適化された配列のいずれかと合成される。本発明の実施態様で言及されるそのような配列の１つは、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡである。タンパク質導入ドメインは、アミノ酸の長さが５〜２５であればどこであってもよい。細胞透過特性を有するあらゆるアミノ酸配列が、細胞膜を通過して、また脳血液関門を通過することによって脳組織を含む組織への導入潜在力を向上するようにタンパク質と融合して使用できることは、当業者にも周知である。
【００１５】
本設計には、さらに治療用タンパク質からタンパク質導入ドメインを分離するアミノ酸のリンカー配列を含む。タンパク質導入ドメイン及びリンカー配列はＰＣＲによって付加され、細胞内タンパク質として大腸菌宿主において発現するために、最終のＰＣＲ生産物がpET11B等の発現ベクター中にクローン化される。タンパク質が、大腸菌においてセクレタリータンパク質（secretary protein）として、又はイースト、昆虫若しくは哺乳類細胞等の細胞真核生物発現系において、セクレタリータンパク質若しくは細胞内タンパク質のいずれかとして発現し得ることも、当業者には周知である。
【００１６】
Ｎ末端かＣ末端のいずれかで、タンパク質導入ドメインで改変された血栓溶解タンパク分子は、ストレプトキナーゼ、遺伝子組換え型組織プラスミノゲン活性化因子、ウロキナーゼ、又はアニソイル化プラスミノゲンストレプトキナーゼ（anisoylated plasminogen streptokinase）等の成熟タンパク質を含んでもよく、これらは血栓溶解活性を有し、また、免疫原性を減少させ、及び／又はタンパク質の繊維素溶解活性を向上させるように配列が変性されたスタフィロキナーゼを含む上記の誘導体又は変異体を含んでもよい。
【００１７】
発現した組換えタンパク質は、スタフィロキナーゼをコードするプラスミドでタンパク質導入ドメインと共に形質転換した大腸菌細胞の可溶性画分から、又は尿素、塩酸グアニジン、若しくは他の任意の適切な変性剤で変性した後の封入体のいずれかから精製する。可溶性又は可溶化されたタンパク質は、カラムクロマトグラフィーによって精製し、精製したタンパク質は、全身注射用に適切な緩衝剤に調合する。精製した組換えタンパク質は、生物検定法（bioassay）及び他にもある手法のうちＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを含む分析法によって特徴づけられる。この方法は、組換え成熟ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子等、任意の他の血栓溶解タンパク分子又はそれらの誘導体及び変異体、並びに減少された免疫原性及び／若しくは向上された繊維素溶解活性のために改変されたスタフィロキナーゼのすべての変異体及び誘導体に適用することもできる。
【００１８】
タンパク質導入ドメインは、血液脳関門を含むすべての組織を通過するそのようなタンパク質血栓溶解分子の摂取向上のために有益であり、また脳出血、脳血栓症、及び脳卒中、又は脳組織内血管中に形成される血栓を溶解することが必要なあらゆる状況等、脳血管障害の治療での用途が見い出される。
【実施例１】
【００１９】
タンパク質導入ドメインの付加による新規スタフィロキナーゼの設計：
この設計は、１１のアミノ酸残基のタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）をスタフィロキナーゼ（配列番号１）のＮ末端に付加することを含む。ＰＴＤドメインとスタフィロキナーゼは、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒのアミノ酸リンカーによって隔てられている。ＰＴＤドメインなしの天然のスタフィロキナーゼ分子を、コントロールとして使用した。同じような配列のＰＴＤドメインからなるｅＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）は、実験中ポジティブコントロールとして使用した。ＳＡＫ−ＰＴＤ及びｅＧＦＰ−ＰＴＤ両方のクローニング方法は同じであった。ＳＡＫ−ＰＴＤ及びｅＧＦＰ−ＰＴＤの設計を、図１に示す。Ｎ末端配列ＫＧＤＤＡで始まるスタフィロキナーゼの１２７アミノ酸残基をコードする領域は、本発明において、スタフィロキナーゼ又はＳＡＫとして言及する。５’末端にＰＴＤドメインを付加したタンパク質は、ＳＡＫ−ＰＴＤとして言及する。ｅＧＦＰの５’末端にＰＴＤドメインを付加したタンパク質は、ｅＧＦＰ−ＰＴＤとして言及する。
【実施例２】
【００２０】
ＳＡＫ−ＰＴＤ及びｅＧＦＰ−ＰＴＤのクローニング及び組換え発現：
プラスミドpET23aでクローン化された配列番号１のスタフィロキナーゼ遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＳＡＫ−ＰＴＤの合成のためのテンプレートとして使用した。ＰＣＲ増幅は、ＳＡＫ−ＰＴＤを生成するために、スタフィロキナーゼ遺伝子の５’末端に、リンカー配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒの４個のアミノ酸残基と配列Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）、又は配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ）の１１個のアミノ酸残基を連続的に付加するように実施された。ＰＣＲ増幅は、連続する４つのステップにおいて、５’末端の開始剤Ｍｅｔを含む合計で１６個のアミノ酸残基を付加するようにプライマーセットを重複することで実施された。最終ＳＡＫ−ＰＴＤ断片の生成のため使用されるプライマーセットの例は：
ＢＴＮＴＦＰＩＳＡＫ−５’ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＧＡＡＡＧＧＣＧＡＴＧＡＣＧＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＴＧ３’；ＢＴＮＴＦＰ２ＳＡＫ−５’ＣＧＴＣＡＧＧＣＧＣＧＴＧＣＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＧＡＡＡＧ３’；ＢＴＮＴＦＰ３−５’ＧＣＡＣＧＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＣＡＧＧＣＧＣＧＴＧ３’；ＢＴＮＴＦＰ４−５’ＣＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＧＧＴＴＡＴＧＣＡＣＧＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡ３’；ＳＡＫＲＰ−５’ＣＡＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＡＴＡＡＣＡＡＣ３’である。ｅＧＦＰ−ＰＴＤの生成に使用されたプライマーセットは、以下の通りであった：ＧＦＰＲＰ−５’ＧＴＡＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＴＡＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＣＧＧ３’；ＧＦＰＦＰ−５’ＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧ３’；ＢＴＮＴＦＰ１ＧＦＰ−５’ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧ３’；ＢＴＮＴＦＰ２ＧＦＰ−５’ＣＧＴＣＡＧＧＣＧＣＧＴＧＣＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＧＧＴＧ３’；プライマーＢＴＮＴＦＰ３及びＢＴＮＴＦＰ４は、連続的増幅の最後の２ステップにおいてＳＡＫ−ＰＴＤ及びｅＧＦＰ−ＰＴＤ両方の増幅に共通であった。さらなる研究のためのＳＡＫ−ＰＴＤタンパク質は、可溶性画分から精製された。最終ＳＡＫ−ＰＴＤ生産物のＰＣＲ増幅は、図２に示されており、ｅＧＦＰ−ＰＴＤについては、図３に示されている。増幅の最終生産物は、１％アガロース・ゲルから精製されたゲルであり、ＥｃｏＲｌ及びＢａｍＨｌで消化して、熱誘導プロモーターの制御下でＴ４ＤＮＡリガーゼによりＰＧＳ１００ベクターへ結紮し、同じ制限酵素で切断した。結紮したベクターは、ＣａＣｌ２法により大腸菌ＤＨ５α株に形質転換した。クローンは、ジデキシオ法によるＤＮＡシーケンシングにより確認された。大腸菌株ＤＨ５αは最初の選択で、プラスミドの増幅。大腸菌ＤＨ５αから分離されたＳＡＫ−ＰＴＤ挿入体及びｅＧＦＰ−ＰＴＤ挿入体を含む組換えプラスミドは、発現のため大腸菌宿主株ＢＬ２１（λＤＥ３）ＲＩＬ株へ転換した。組換えプラスミドを内部に含む大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３ＲＩＬ細胞を一晩培養した物は、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１リットルのルリア培地で１：５０に希釈した。大腸菌細胞を、３０℃で振動培養してＡ６００の０．６を得た。インキュベーションの温度を４２℃に上昇させて標的タンパク質の発現を誘導した。８０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行った後、４時間後に細胞を採取し、ＳＡＫ−ＰＴＤ及びｅＧＦＰ−ＰＴＤの組換え発現を、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分析した。細菌ペレットを、緩衝剤Ａ中（ｐＨ７．４の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０５ＭのＮａＣｌ、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ１００、１０ｍＭのＥＤＴＡ、及び５ｍＭのＰＭＳＦ）に再縣濁した。細胞は、氷上において１５ミクロンの振幅で６０秒間隔で４５秒間を３５サイクル行い、超音波処理により溶解され、細菌溶解物は、細菌の破片を除去するために８０００ｇで２０分間、遠心分離機にかけた。封入体中に存在する画分は、同じ緩衝液中８Ｍの尿素で８時間可溶化し、１ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ８．０の１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈ��ｌにおいて透析した。ＳＡＫ−ＰＴＤ（図４参照）及びｅＧＦＰ−ＰＴＤタンパク質の主な画分は、大腸菌の可溶性画分において発現した。ＰＧＳ１００中でクローン化された天然のｅＧＦＰは、４２℃で４時間の熱誘導により、発現及び誘導された。タンパク質は、可溶性画分において高いレベルで発現した。pET23aベクターでクローン化された天然のスタフィロキナーゼ遺伝子を１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド）で、３７℃で４時間誘導した。天然のＧＦＰ及びスタフィロキナーゼタンパク質の両方を、それぞれコントロールとして、ＳＡＫ−ＰＴＤ及びｅＧＦＰ−ＰＴＤのインビトロでの細胞摂取に関する実験において使用した。
【実施例３】
【００２１】
タンパク質の精製：ＳＡＫ−ＰＴＤ及びＧＦＰ−ＰＴＤ：
大腸菌溶解物の可溶性画分において発現されたＳＡＫ−ＰＴＤタンパク質を、ｐＨ８．０の１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で１２時間透析し、同じ緩衝液で平衡化したＱ−セファロースカラムにロードした。緩衝液でカラムを洗浄した後、同じ緩衝液中で、５０ｍＭ〜２５０ｍＭのＮａＣｌで溶出した。ＳＡＫ−ＰＴＤを７０ｍＭのＮａＣｌで溶出した。タンパク質を含有する画分をプールし、ｐＨ８．０の１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌで平衡化したフェニルセファロースカラムにロードした。カラムを１００ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液で広範囲に洗浄した後、タンパク質を水中に溶出した。大腸菌溶解物の可溶性画分において発現されたｅＧＦＰは、最初に、ｐＨ７．５の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したＱ−セファロースカラムにおいて精製し、１５０ｍＭの同じ緩衝液中にＮａＣＬで溶出した。タンパク質を含有する画分をプールし、ｐＨ７．５の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したフェニルセファロースカラムにロードした。カラムは、同じ緩衝液中０．５ＭのＮａＣｌ〜２０ｍＭのＮａＣｌで広範囲に洗浄し、タンパク質を低塩濃度で緩衝液中に溶出した。タンパク質をｐＨ７．４の１０ｍＭのリン酸塩緩衝液で透析した。精製したタンパク質の画分をプールして、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。精製したＳＡＫ及びＳＡＫ−ＰＴＤを図５に示す。スタフィロキナーゼ及び天然ｅＧＦＰタンパク質を同様の条件下で精製した。
【実施例４】
【００２２】
スタフィロキナーゼ及びＳＡＫ−ＰＴＤタンパク質のＦＩＴＣ接合体：
１ｍｇ／ｍｌの精製したスタフィロキナーゼ及びＳＡＫ−ＰＴＤタンパク質の各々に、１Ｍの炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液を添加し、０．１Ｍの最終濃度とした。５μｌの新たに調製したＦＩＴＣ溶液を添加し、穏やかに連続的混合をした。反応バイアルを、３７℃で２時間インキュベートし、光から保護した。インキュベーションの最後に１Ｍの塩化アンモニウム溶液の１／２０体積を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＦＩＴＣ接合タンパク質を、１５４ｍＭのＮａＣｌを含有する１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４の１０ｍＭのリン酸塩）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラムにおいて溶出した。画分の吸収度は、Ａ２８０ｎｍでモニターした。ＦＩＴＣ接合ＳＡＫ−ＰＴＤ及び天然のＳＡＫを含有する画分は、インビトロでのタンパク質導入研究に使用された。
【実施例５】
【００２３】
スタフィロキナーゼ及びｅＧＦＰへのＰＴＤドメイン付加の効果を調査するため、天然タンパク質、並びにスタフィロキナーゼ及びｅＧＦＰを含有するＰＴＤドメインのインビトロでの細胞摂取の調査をベロ細胞において実施し、蛍光顕微鏡下で可視化した。ベロ細胞を６個のウェルの組織培養プレートに播種し、３７℃で、５％のＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含有するＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）で培養した。７０〜８０％コンフルエンスに成長した細胞を同じ培地で２度洗浄した。２回の別個の実験では、ベロ細胞を１％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地において３７℃でそれぞれ１５分、３０分間、５０μｇのスタフィロキナーゼ又はＳＡＫ−ＰＴＤタンパク質でインキュベートした。インキュベーションの最後に、細胞を同じ培地で少なくとも３回洗浄し、４％のホルムアルデヒドで室温において３０分間、細胞を固定して、又は固定せずに蛍光顕微鏡で青色光の下可視化した。細胞をホルムアルデヒドで固定した場合には、ＰＢＳ（１５４ｍＭのＮａＣｌを含有するｐＨ７．４の１０ｍＭのリン酸塩）で３回洗浄した。励起波長は４５０ｎｍ〜４９０ｎｍであり、発光は５２０ｎｍであった。同様の実験をｅＧＦＰ及びｅＧＦＰ−ＰＴＤで、タンパク質の細胞摂取におけるタンパク質導入ドメインの効果を調査するため平行して行った。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ｅＧＦＰ−ＰＴＤ及びＳＡＫ−ＰＴＤタンパク質の設計を示す図である。ＰＴＤ−タンパク質導入ドメインのアミノ酸配列：ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ又はＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；Ｌ−リンカー領域の配列：Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＧＧＧＳ）；ＳＡＫ−Ｎ末端配列ＫＧＤＤＡで始まるスタフィロキナーゼの１２７アミノ酸残基をコードする領域は、本発明においてスタフィロキナーゼ又はＳＡＫと称する。５’末端でＰＴＤドメインが付加されたタンパク質は、ＳＡＫ−ＰＴＤと称する。ｅＧＦＰの５’末端でＰＴＤドメインが付加されたタンパク質は、ｅＧＦＰ−ＰＴＤと称する。
【図２】Ａ−１００ｂｐラダーの図。Ｂ−ＳＡＫ−ＰＴＤの最終ＰＣＲ増幅生産物〜４２９ｂｐ。
【図３】Ａ−１００ｂｐラダーの図。Ｂ−ｅＧＦＰ−ＰＴＤの最終ＰＣＲ増幅生産物。
【図４】熱誘導プロモーターの下での大腸菌における組換えＳＡＫ−ＰＴＤの発現；Ａ−封入体において発現したＳＡＫ−ＰＴＤタンパク質；Ｂ−精製されたＳＡＫタンパク質；Ｃ−可溶性タンパク質として発現されたＳＡＫ−ＰＴＤ；分子サイズマーカー。
【図５】Ａ−精製したｅＧＦＰ−ＰＴＤの摂取；Ｂ−３７℃で３０分間のインキュベーション後、蛍光顕微鏡で青色光の下観察したベロ細胞におけるｅＧＦＰコントロール；Ｂ−ｅＧＦＰコントロール；Ｃ−３７℃で３０分間インキュベーション後のベロ細胞へのＦＩＴＣ標識のＳＡＫタンパク質の摂取；コントロールとしてのＦＩＴＣ標識のＳＡＫタンパク質。
【００２５】
配列番号１：
ＭＫＧＤＤＡＳＹＦＥＰＴＧＰＹＬＭＶＮＶＴＧＶＤＧＫＧＮＥＩＬＳＰＨＹＶＥＦＰＩＫＰＧＴＴＬＴＫＥＫＩＥＹＹＶＥＷＡＬＤＡＴＡＹＫＥＦＲＶＶＥＬＤＰＳＡＫＩＥＶＴＹＹＤＫＮＫＫＫＥＥＴＫＳＦＰＩＴＥＫＧＦＶＶＰＤＬＳＥＨＩＫＮＰＧＦＮＬＩＴＫＶＶＩＥＫＫ
【００２６】
配列番号２：
ＭＧＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＧＧＧＳＫＧＤＤＡＳＹＦＥＰＴＧＰＹＬＭＶＮＶＴＧＶＤＧＫＧＮＥＩＬＳＰＨＹＶＥＦＰＩＫＰＧＴＴＬＴＫＥＫＩＥＹＹＶＥＷＡＬＤＡＴＡＹＫＥＦＲＶＶＥＬＤＰＳＡＫＩＥＶＴＹＹＤＫＮＫＫＫＥＥＴＫＳＦＰＩＴＥＫＧＦＶＶＰＤＬＳＥＨＩＫＮＰＧＦＮＬＩＴＫＶＶＩＥＫＫ
【００２７】
配列番号３：
ＭＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＧＧＳＫＧＤＤＡＳＹＦＥＰＴＧＰＹＬＭＶＮＶＴＧＶＤＧＫＧＮＥＩＬＳＰＨＹＶＥＦＰＩＫＰＧＴＴＬＴＫＥＫＩＥＹＹＶＥＷＡＬＤＡＴＡＹＫＥＦＲＶＶＥＬＤＰＳＡＫＩＥＶＴＹＹＤＫＮＫＫＫＥＥＴＫＳＦＰＩＴＥＫＧＦＶＶＰＤＬＳＥＨＩＫＮＰＧＦＮＬＩＴＫＶＶＩＥＫＫ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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