(57)【要約】  本発明はグルコシル・トランスフェラーゼ様タンパク質(ＧＴ)をコードする遺伝子と骨関節症(ＯＡ)との関連性の確認から生じる。従って、本発明はＧＴ遺伝子の全体または部分、その前駆体または産物(ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはタンパク質)を検出することにより、ＯＡを発症する患者の罹病率を判定する診断技法に関する。取分け、本発明はＧＴ遺伝子の対立遺伝子変異を分析するための方法と材料に、またＯＡ発症の個々人の危険性の同定におけるＧＴ多型の使用に関する。また、本発明はＧＴ遺伝子またはそのコードされたタンパク質を調節するＯＡのモジュレーターを同定する方法に導くものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＴにおける多型の診断方法であって、ヒトの１つ以上の多型位置における配列を決定し、ＧＴにおける多型を参照することにより、ヒトの状態を判定することを特徴とする方法。
【請求項２】
該多型の位置が、5283、21037、21134、25515、34419、59661、59968および73821..73842(それぞれ配列番号１の位置に対応する)からなる群より選択されるものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
ヒトにおける骨関節症(ＯＡ)発症の素因および／または罹病性を評価する方法であって、
ｉ)ヒトの１箇所以上：5283、21037、21134、25515、34419、59661、59968および73821..73842(それぞれ配列番号１の位置に対応する)の核酸の配列を決定すること、またはそれとＤ’０.９以上の連鎖不平衡にある多型を決定すること；および
ii)存在する多型を参照してヒトの状態を判定すること；
を特徴とする方法。
【請求項４】
位置5283にシトシン、および／または位置21037にチミン、および／または位置21134にチミン、および／または位置25525にチミン、および／または位置34419にチミン、および／または位置59661にシトシン、および／または位置59968にシトシン、および／または位置73821〜73842の欠失(それぞれ配列番号１の部位に対応する)の存在が、そのヒトがＯＡ発症の素因および／または罹病性を有することを示すものである請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＯＡを診断、予知またはモニターするための診断キットであって、ＧＴに選択的にハイプリダイズするか、または結合することの可能な１種以上の診断用プローブおよび／または診断用プライマーおよび／または抗体を含んでなるキット。
【請求項６】
当該プライマーおよびプローブが、5283、21037、21134、25515、34419、59661、59968および73821..73842(それぞれ配列番号１の位置に対応する)からなる群より選択される位置での多型を検出し得るものである請求項５に記載のキット。
【請求項７】
有望な治療的または予防的利益を有する化合物の同定方法であって、１種以上の試験化合物を、ＧＴポリペプチドを含有してなる選抜に付し、該ポリペプチドに結合するか、またはそれを遮断もしくは調節する試験化合物の能力を判定することを特徴とする方法。
【請求項８】
該ＧＴポリペプチドが配列番号２に示すアミノ酸配列を含んでなるものであるか、またはその相同体であるか、またはいずれかのフラグメントである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
表２に示した１つ以上の多型を含んでなるＧＴポリペプチドを利用する請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＧＴタンパク質スプライス変異体を利用する請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
有望な治療的または予防的利益がＯＡの処置に関係する請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ＧＴ活性を阻害することの可能な化合物を同定する方法であって、
(ｉ)試験化合物；
(ii)ＧＴを含んでなる細胞膜標本；
(iii)ＧＴによるグルコース付加を可能とし得るオリゴ糖；および
(iv)グルコース；
を接触させ；そして
(ｖ)グルコースをオリゴ糖に付加させるＧＴの能力に対し試験化合物が有する作用を測定する；
ことを特徴とする方法。
【請求項１３】
ＯＡの処置に潜在的に有用な化合物のスクリーニング方法であって、ＧＴの活性または量を直接的または間接的に調節する能力について、該化合物をアッセイすることを特徴とする方法。
【請求項１４】
該アッセイがＧＴポリペプチドを発現し得る細胞、またはＧＴポリペプチドを含んでなる細胞膜標本を含んでなる請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該細胞がＧＴポリペプチドを発現するように設計調製したものである請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＧＴの活性または量が以下から選択される方法により決定されるものである請求項１３に記載の方法：
(ｉ)ＧＴポリペプチドを発現する細胞、細胞株または組織を用いるか、または精製したＧＴポリペプチドを用いるＧＴ活性の測定；および
(ii)ＧＴポリペプチドを発現する細胞、細胞株または組織抽出物中のＧＴの転写または翻訳の測定。
【請求項１７】
ＯＡ罹患患者の処置方法であって、処置を必要とする対象に、ＧＴタンパク質に作用する小分子薬物またはＧＴ ｍＲＮＡに対して作用するアンチセンス・オリゴヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明者らは連鎖および関連分析を用いて骨関節症(ＯＡ)に対する罹病性につながる遺伝子を発見した。この遺伝子は本明細書ではＧＴという。従って、本発明はＯＡにおけるＧＴの役割を確認する。それ故、本発明はＯＡの検出の診断法に関し、またこの遺伝子のすべてもしくは一部、その前駆体または産物(ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはタンパク質)を検出することにより、ＯＡを発症する患者の罹病性を決定するための診断法に関する。また、本発明は該遺伝子内の多型とその検出方法に関する。特に、本発明はＧＴ遺伝子における対立遺伝子変異を分析する方法と材料に関し、また個々人のＯＡを発症する危険度の確認に、ＧＴ多型を使用することに関する。
【０００２】
また、本発明の多型は患者を層化することを可能とする。ＯＡ発症の危険度が上昇または低下していることを確認する個々人のサブグループは、それ自体、目標とする臨床試験プログラムのために使用可能であり、また恐らく薬理遺伝学療法にも使用し得る。また、本発明は骨関節症のモジュレーターを同定するための方法を目的とし、このモジュレーターは化合物、アンチセンス分子および抗体などであり、同定された遺伝子を調節するものである。本発明はまた該遺伝子中に見出されている一塩基多型(ＳＮＰ)に関し、またその検出方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
骨関節症という疾患は、関節内軟骨細胞と細胞外マトリックスの崩壊と合成、および軟骨下骨の正常なカップリングを不安定化させるメカニズムと生物学的事象双方から生じるものである(Creamer P. and Hochberg M.C., Lancet, 350, 503-508, 1997; Jones A. and Doherty M., Br. Med. J., 310, 457-460, 1995)。それらは数多くの因子、例えば、遺伝子的、発生学的、代謝などの環境的因子、および外傷的因子により開始され得るが、骨関節症という疾患は、可動関節の組織のすべてを巻き込んでいる。究極的に、骨関節症という疾患は、関節軟骨の軟化、線維化、潰瘍、喪失、軟骨下骨、骨増殖体、および軟骨下のう胞の硬化および象牙質化に導く細胞とマトリックス双方の形態学的、生化学的、分子的および生物機構的変化によって表現される。軟骨以外の他の組織、例えば、腱、靭帯、筋肉および半月なども疾患の開始と進行に寄与し得る。臨床的に明らかな場合、骨関節症の疾患は、主として顕性な全身作用のない関節痛、脆弱、運動の制限、関節摩擦音、しばしば見られる滲出液、および様々な程度の炎症により特徴づけられる(Kuettner and Goldberg. Osteoarthritic disorders(骨関節症障害). Rosemont: American Academy of Orthopaedic Surgeons, 1995)。
【０００４】
殆どの疫学的研究が、骨関節症の事例について、典型的なＸ線画像の特徴の存在に基づいて定義している。白人系の北米人および北欧人の集団においては、２５〜７４歳の成人の約３分の１が、少なくとも１つの末梢関節群に関わるＸ線画像による骨関節症の特徴を有する；最も一般的な部位は手であり、次いで、足、膝および股である(TD Spector and MC Hochberg, Ann Rheum Dis  53:43-46, 1994)。しかし、膝および股のＯＡは臨床的により重要である。
【０００５】
年齢は骨関節症の最も強力な決定因子であり、年齢の増加と共にすべての関節について症例率が上昇する。発症率も年齢と共に上昇するが、７０歳代でプラトーに達するという証明もある。年齢と共に骨関節症に罹患し易くなるそのメカニズムは不明である。肥満は横断および予測研究において膝の骨関節症に強く結びついており、頻度は少ないが、股の骨関節症につながる(Hochberg MC, Lethbridge-Cejku M.  Hamerman D, ed. Osteoarthritis: public health implications for an aging population(骨関節症；加齢集団について公衆衛生との関連). Baltimore: Johns Hopkins University Press, 1997:169-86)。
【０００６】
骨関節症の現状の治療法は、純粋にその症候を制御することに尽きるが、その理由は疾患自体を改変する骨関節症治療薬が未だに存在しないからである。処置有効性の主たる判断基準は伝統的に疼痛である。現在の選択薬物はプラセタモールである；これに対しては患者の一部が応答しないが、ＮＳＡＩＤ(非ステロイド抗炎症薬)から有益性を誘導するものと思われる。局所クリームでは、ＮＳＡＩＤもしくはカプサイシンが単一療法として、または経口鎮痛剤が加えられる場合、取分け、関わる関節が２〜３箇所である場合に、役に立つ。
【０００７】
関節内投与ステロイド剤は、骨関節症、特に膝の骨関節症に広く使用されている。疼痛軽快に対するそれらの有効性を支持するいくつかの証明があるが、１〜３週間に限ったものである；トリアムシノロンヘキサアセトニドは最も有効な製剤である。関節内投与ヒアルロン酸もまた膝骨関節症の患者において疼痛を調節する上で有効であることが示されている；この治療法は３〜５週間の毎週の注射を必要とし、関節内投与ステロイド剤の単回注射よりも有効性が高い。
【０００８】
骨関節症には遺伝的要素の存在することが、双子の遺伝率評価により、また兄弟姉妹における相対的リスク評価により証明されている。手と膝のＯＡについては、遺伝的影響が双子の場合、３９〜６５％と計算されている。手と関節円盤の別個の研究では、その評価がそれぞれ５６％および７５％であった。全股関節置換(ＴＨＲ)を必要とする重篤な股ＯＡの場合、兄弟姉妹の集団と比較した相対的リスクは全体として５.６と計算されており、この値は過少評価であり得るが、その理由は一般集団におけるＯＡの例数が多いからである。最近なされた女子双子の研究は、膝と股での骨関節症のＸ線画像の特徴を見る場合に、有意な遺伝性を示した(Spector et al, BMJ, 312 (1996), pp. 940-944)。II型コラーゲン(ＣＯＬ２Ａ１)の遺伝子における突然変異は、緩和な軟骨発育不全を伴う初期多関節性骨関節症と関連していた(Knowlton et al New Eng. J. Med. 322: 526-530, 1990)が、骨関節症に対する遺伝的寄与を完全に説明する単一の遺伝子が存在するとは思えない。しかし、ＯＡはかなりの臨床的不均一性を示しているので、ＯＡの特異的サブクラスの場合、特異的な遺伝子が存在するのかも知れない(Peach et al Trends Mol. Med. 11(4): 186-191, 2005)。
【０００９】
従って、ＯＡの発症と有意に関連性を有する遺伝子の同定が要望されている。これは化合物および抗体などの他の因子をスクリーニングすることにより、ＯＡに対する新規治療法の開発を可能となし得る；これらは関連した遺伝子がエンコードするタンパク質の活性を調節するか、または他のタンパク質もしくは分子とのそれらの相互作用を調節するものである。関連遺伝子配列の情報もまた関連遺伝子の発現を調節する新規な抗遺伝子法の開発を可能とし得るし、ＯＡを処置する新規な遺伝子療法の開発をも可能とする。関連遺伝子の発見は、以下に従い、ＯＡの新規診断方法を開発する際の一助ともなり得る；(ｉ)関連した一塩基多型(ＳＮＰ)の遺伝子型パターンの分析；(ii)罹患組織に存在する翻訳されたｍＲＮＡレベルの測定；および(iii)罹患組織におけるタンパク質レベルの測定。これらの方法によるＯＡの診断またはＯＡの素因の予測は、該疾患の古典的症候をまだ示していない患者において実施することが可能である。ＯＡへの罹患し易さのかかる定量または疾患発症の早期検出は、現在可能な段階よりもより早期の臨床介入に導き得るし、また、疾患のより有効な処置に導き得る。かかる技法は患者の階層化を可能とし、階層化は取分け臨床治験のための患者の選択に有用であり得る。
【００１０】
国際特許公開 WO 00/20632 では、染色体１１上、マイクロサテライト・マーカー D11S4046 および D11S1320 の間に２０ｃＭ領域を同定しているが、この領域はＯＡに対する可能な罹患性遺伝子座を含む。この領域は二段階ノンパラメトリック連鎖分析に従って同定した。この分析は染色体１１上に３つのマイクロサテライトを明らかにし、それについては連鎖の証拠があった。これらのマイクロサテライト中またはその周辺について詳細にマッピングすると、より確かな連鎖の証拠が提供され、結合した領域の解明を可能とした。連鎖不平衡分析は非重層化データ中に、マーカー D11S937 の２５３ｂｐ対立遺伝子(ゲノムデータベース(ＧＤＢ)に掲載された対立遺伝子１１)の過剰な伝達を確認した(ｐ＜０.００１)。このデータは１１ｑ上のＯＡ罹患性遺伝子座が D11S937 に接近しており、また２５８ｂｐの対立遺伝子が罹患傾向のある先祖染色体上に存在し得ることを示した。しかし、そこには単一遺伝子に対するＯＡの関連について何らの開示もなく、また、かかる遺伝子が開示された２０ｃＭ領域内に位置している可能性のある場合についても何の示唆もない。
【００１１】
本発明はグルコシル・トランスフェラーゼ様タンパク質(ＧＴまたはＧＴＯＡ)と呼称される単一遺伝子のＯＡとの関連についての我々の発見に基づくものである；この遺伝子は１１ｑ１３.５に D11S937 を含んでいる１１ｑ−１３−１４内の２.８ｃＭ領域を地図上に示す。
【００１２】
この遺伝子は既知の酵母酵素に類似していることで、グルコシル・トランスフェラーゼとして公的データベースで命名されており、タンパク質グリコシル化に際し、グルコース部分を付加する酵素である。本発明者らは酵母相補実験を４つの異なるグルコシル・トランスフェラーゼ(すなわち、ＡＬＧ６、ＡＬＧ８、ＡＬＧ６、ＡＬＧ１０)の活性を欠如する酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)株で実施したが、これらの実験は、ＧＴがＡＬＧ８の機能的オルソログであることを示した。グルコシル・トランスフェラーゼ活性は、多くの他のグルコシル・トランスフェラーゼ活性と共に、骨関節症軟骨からの軟骨細胞において上方制御されている。グルコシル・トランスフェラーゼ活性はコラーゲンにおいてヒドロキシプロリン残基のグリコシル化に関わっている；グリコシル化は繊維状形態を調整する際の因子である(Richard M, Vignon E, Peschard MJ, Broquet P, Carret JP and Louisot P (1990) Biochem. Int.  22:535-542)。このグルコシル・トランスフェラーゼ様遺伝子の場合、ＯＡへの関連についてはこれまでに記載されたことがない。
【００１３】
ＧＴタンパク質(本明細書ではＧＴＯＡともいう)はデータベースにおいて AJ224875 として参照される。このタンパク質の予測されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。代替品についてはｍＲＮＡ鋳型からスプライスされる代替品の証明があるが、このものは代替のアミノ酸配列を生じる可能性がある。さらに、アミノ酸の変化を生じるヌクレオチド変異体が存在する。この変異体から生じる予測されるアミノ酸配列は、配列番号３に示す。ゲノム配列は配列番号１として開示されている。
【発明の開示】
【００１４】
本発明者らは染色体１１上の遺伝子と関連する骨関節症疾患を同定し、またこの遺伝子内の多型をも同定した。本出願は、それ故、骨関節症におけるＧＴＯＡの役割の直接の証明を提供する。ＧＴＯＡ遺伝子、それから由来するｍＲＮＡおよびタンパク質配列は、それ故、ＯＡの診断マーカーまたは予知マーカーとして使用し得るものであり、体液もしくは細胞サンプルなどの試験サンプルに存在する遺伝子もしくはｍＲＮＡの多型の存在を検出し得るか、または該ｍＲＮＡもしくはコードされたタンパク質のレベルを測定し得る特異的プローブを設計し、または抗体を生成させるために使用することができる。さらに、該遺伝子およびそれがコードするタンパク質は、骨関節症において治療的介在にとっての有力な標的である；例えば、ｍＲＮＡを標的とするアンチセンス核酸の開発において、またはより広範囲に、化学療法剤またはホルモン療法剤の同定または開発において使用し得る。当業者は同定した遺伝子を調節(例えば、活性化または阻害)する化合物(化学的または生物学的)を同定するためのスクリーニングアッセイ法を考案することが可能であり、その化合物は骨関節症および一般的な関節症を処置または予防する際の治療剤として有用であることを証明し得る。
【００１５】
発明の詳細な説明
以下の定義が本明細書に適用される。
「対立遺伝子」とは、遺伝子座の特定の形をいい、その特定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列により、他の形と識別するものである。
【００１６】
「発現」とは、遺伝子ＤＮＡ鋳型を転写して対応するｍＲＮＡを生じ、このｍＲＮＡを翻訳して対応する遺伝子産物(すなわち、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質)を生じることをいう。用語「遺伝子発現を活性化する」とは、ある処理に応答して遺伝子の転写を誘発または増加させることをいい、その場合、かかる誘発または増加は当該処理のない場合の遺伝子発現の量と比較される。同様に、用語「遺伝子発現を低下させる」または「遺伝子発現を下方制御する」とは、ある処置に応答して、遺伝子の転写を阻害または遮断することをいい、その場合、かかる低下または下方制御は当該処理のない場合の遺伝子発現の量と比較される。
【００１７】
「遺伝子型」は個体において、一対の相同染色体上の遺伝子座における１つ以上の多型部位に見出されるヌクレオチド対の非同期５’→３’配列である。
【００１８】
「単離された」核酸とは、本明細書にて言及する場合、その原初の環境(例えば、それが自然のままで存在する自然の環境)から取り出された物質をいい、従って、その自然の状態から人の手によって変化している。例えば、単離されたポリヌクレオチドとは、ベクターまたは合成物の一部であり得るか、または細胞内に含まれていることもあり、それもまた「単離された」ものである；その理由はベクター、合成物、または特定の細胞は、該ポリヌクレオチドの原初の環境ではないからである。
【００１９】
「遺伝子座」とは、遺伝子または物理的もしくは表現型の特徴に相当する染色体またはＤＮＡ分子上の部位をいう。
【００２０】
「多型部位」は集団内に少なくとも２つの代替配列が見出される遺伝子座内の位置である。「多型」は多型部位に個体において観察される配列変異をいう。多型はヌクレオチドの置換、挿入、欠失およびマイクロサテライトを含み、必要ではないが、遺伝子発現またはタンパク質機能に検出可能な差異を生じる。
【００２１】
従って、本発明の第一の局面によると、ＧＴタンパク質の作用を調節し得る化合物を同定する方法であって、１種以上の試験化合物を、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその相同体またはいずれかのフラグメントを含有してなる選抜に付すことを特徴とする方法が提供される。
【００２２】
用語「フラグメント」とは、本明細書にて使用する場合、全長配列の下位配列をいい、配列番号２に示した配列の少なくとも２５個、好ましくは少なくとも５０個、より好ましくは少なくとも１００個の連続するアミノ酸を含んでなる；好ましくは、フラグメントはＧＴタンパク質のＣ−末端およびＮ−末端のいずれか、または双方が末端切断されたポリペプチドである。
【００２３】
本発明で使用されるポリペプチドは、ＧＴタンパク質のフラグメントおよび相同体の双方であり得ると理解される。
【００２４】
好適な態様において、本発明のスクリーニング法は配列番号２に示したアミノ酸配列、または少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％および９９％(上昇順に優先)のアミノ酸配列同一性を有する配列を含んでなるポリペプチドを用いて実施する。かかる変異体は本明細書において「相同体」という。別の態様において、選抜はＧＴタンパク質のスプライス変異体により実施する。本発明で使用する適切な相同体は、その核酸が緊縮ハイブリッド形成条件において、配列番号２に示したポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリッド形成するものであり、その相同体はＧＴタンパク質の機能を保持するものである。
【００２５】
２つの配列間の配列同一性は、ベストフィット、ギャップまたはフレームアラインなどのプログラムを用いて、ペア−ワイズ・コンピューターアラインメント分析により決定し得る。好適なアラインメントツールはベストフィットである。実際には、配列データベース内から問題検索対象となる類似／同一配列を検索する場合、一般に、ブラスト(Blast)、ブラスト２、ＮＣＢＩブラスト２、ワッシュＵ(WashU)ブラスト２、ファストＡ(FastA)、ファスタ３(Fasta3)およびパイルアップ(PILEUP)、などの適当なソフトウエアおよびブロサム(Blosum)６２などの評点マトリックスを用いて、類似の配列の初期同定を実施することが必要である。かかるソフトウエアのパッケージは、スミス−ウォーターマン(Smith-Waterman)の「ゴールド−スタンダード」アラインメントアルゴリズムに近似するようにしたものである。従って、類似性の評価に使用すべき好適なソフトウエア／サーチエンジンプログラム、すなわち、如何にその一次ポリペプチド配列をアラインメントさせるかのプログラムは、スミス−ウォーターマンである。同一性は直接的に調和することをいい、類似性は同類置換を可能とする。
【００２６】
ＧＴタンパク質の対立遺伝子変異体または変形体は、ヒトの集団内に、特に、まったく別個の民族集団間に存在し得る。本発明のさらなる局面は、当該ＧＴ変形体のインビボでの活性を変換し得る化合物を発見するための選抜法に含めるべきＧＴタンパク質の適切な変形体の選択と使用を含む。研究者らは、目標の種々の変形体間の特異的な薬理活性を検出するために、ＧＴタンパク質の最も一般的に出現する変形体に対して、またＧＴタンパク質の頻度の低い変形体に対して、化合物を選抜したいと考えるだろう。本発明のさらなる局面は、様々な民族に基づく集団をスクリーニングし、当該集団内のＧＴ遺伝子における一塩基多型(突然変異)の対立遺伝子の頻度を測定することである。この情報はこれらの治療に応答しない可能性のある集団内でのＧＴの活性を変化させ得る新規化合物の有効性を評価する上で価値があるかも知れない。
【００２７】
本発明の別の局面によると、ＧＴの活性を阻害／拮抗することの可能な化合物を同定する方法であって、
(ｉ)試験化合物；
(ii)ＧＴを含んでなる細胞膜標本；
(iii)ＧＴによるグルコース付加を可能とし得るオリゴ糖；および
(iv)グルコース；
を接触させ；そして、グルコースをオリゴ糖に付加させるＧＴの能力に対する試験化合物が有する作用を測定することを特徴とする方法が提供される。
【００２８】
特定の態様によると、グルコースがオリゴ糖に付加するのを妨害または遮断する試験化合物は、ＧＴの活性を阻害／拮抗する化合物である。
【００２９】
細胞膜標本は真核細胞生物から調製される標本であり得る。適切な生物は、酵母または哺乳動物、例えば、ヒト、げっ歯類、サルである。唯一の要件は、細胞膜標本が活性なＧＴ酵素を含むかまたは含有してなるものである。特定の態様において、細胞はＧＴ酵素を発現し得る。真核細胞から発現されるＧＴは相同または異種であり得る。好ましくは、ＧＴ酵素はヒト起源のものである。特定の態様において、細胞膜標本は、酵母細胞から、ヒトＧＴを発現するように組換えにより設計調製される。別の態様において、該標本は、哺乳動物細胞からヒトＧＴを発現するように、組換えにより設計調製される。別の態様において、細胞は哺乳動物起源のものであり、内部にＧＴを発現する(すなわち、異種ＧＴを発現するように設計調製されていない)。用語「異種」とは、本明細書にて使用される場合、細胞に形質導入されたＤＲＲ遺伝子をいう；すなわち、該用語は非内在性のＤＲＲをいう。
【００３０】
当業者が利用し得る様々な細胞膜標本調製法がある。代表的な例は、ラドミンスカ−パンディアら(Radominska-Pandya et al. Methods Enzymol.400:116-47, 2005)またはシンマら(Shimma et al. Appl Environmental Microbiol. Aug 25 2006)が記載している。
【００３１】
オリゴ糖は、天然産(例えば、原核細胞または真核細胞由来)、小胞体(ＥＲ)膜に必須のもの、またはＥＲ膜から精製したもので、ドリコール部分をもつもの、もしくはもたないもの、(例えば、Kelleher et al, Glycobiology. 11(4):321-33, 2001)；または合成(例えば、Weiss & Unverzagt. Angew Chem Int Ed Engl. 42(35):4261-3, Sept 15 2003)のものでよい。オリゴ糖は、ＧＴがグルコース部分を付加し得る基質として作用するだけのものである。特定の態様において、オリゴ糖は全部である(すなわち、ＧlcＮac２、Ｍan９)。別の態様において、そのものはドリコール部分を有する。
【００３２】
オリゴ糖は遊離であっても、または脂質−結合していてもよい；また、遊離(非結合)であるか、または基質(例えば、ナイロン膜、プレート、ビーズなど)に結合していてもよい。また、オリゴ糖はドリコール−結合オリゴ糖を含む細胞膜標本から由来するものでもよい。
【００３３】
アッセイ系におけるグルコースは、好ましくは、タグ標識またはラベル標識化し、オリゴ糖に付加した後に、検出し得るようにする。適当なラベルまたはタグを使用することができる。代表的な例は、非放射性もしくは放射性標識(例：Ｐ３２、Ｓ３５、Ｉ１２５、Ｈ３)または非放射性標識(例：発蛍光体)、ビオチン／アビジン、光親和性プローブ(例：［β−３２Ｐ］５Ｎ３ＵＤＰ−Ｇlc (Drake et al., J. Biol. Chem. 267:1136011365, 1992))ならびにタンパク質(例：タグ標識抗体)などである。
【００３４】
グルコースとオリゴ糖との結合は、当業者既知の適切な方法で測定し得る。これらの方法は：フィルター結合アッセイ、シンチレーション近似アッセイ(ＳＰＡ)技法、ＥＬＩＳＡ、レクチン結合などである。事実、いずれの方法もタンパク質／糖タグ標識産物を捕捉または検出することができる。
【００３５】
候補化合物は様々な供給源から同定し得る；例えば、細胞、無細胞標品、化学ライブラリー、ペプチドと遺伝子ライブラリー、および天然物の混合物などである。化学ライブラリーはコンビナトリアル・ケミストリー・ライブラリー、特に、ＧＰＣＲと相互作用する化合物を含んでなるコンビナトリアル・ケミカル・ライブラリーである。このように同定したかかるアンタゴニストまたはインヒビターは、ＧＴタンパク質の事例の場合、天然もしくは修飾した基質、リガンド、レセプター、酵素、抗体(上記のような)などであり；またはその構造的もしくは機能的類似体であってもよい(参照：Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991))。
【００３６】
クロマトグラフィーまたは電気泳動を含む分析遠心分離アフィニティ結合研究などの技術を使用して、ＧＴと直接相互作用する分子を検出することができる。タンパク質−タンパク質相互作用の同定を可能とするその他の技法は、免疫沈降法および酵母ツーハイブリッド研究である。
【００３７】
阻害、活性化、または調節活性を有する化合物は、ＧＴ活性および／または発現のためのインビトロおよびインビボアッセイ、例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、およびそれらの相同体および類似体を用い、同定することができる。
【００３８】
本発明のさらなる局面は、表２に提示するように、ＧＴにおける一塩基変化多型(突然変異)の同定から生じる。
【００３９】
多型は集団内において、２つ以上の遺伝的に決定される代替対立遺伝子または配列の出現をいう。多型のマーカーは多様性が生じている部位である。好ましくは、マーカーは少なくとも２つの対立遺伝子を有し、それぞれが選択された集団の１％を超える頻度で、より好ましくは少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％以上の頻度で起こる。
【００４０】
一塩基多型(ＳＮＰ)は一般にその名称が暗示するように、種の一部メンバーの核酸配列に存在する単一のヌクレオチドまたはポイントの変化である。種内のかかる多型変化は一般に進化を通しての自然発生的突然変異の結果であると見なされる。突然変異と正常の配列は種の集団内で、時には安定なまたは準安定な平衡状態で、同時に存在する。またある時には、突然変異がその種にある有利な点を付与し、時と共に、その種のメンバーのすべてまたは大多数のゲノムに取り込まれ得る。
【００４１】
一部のＳＮＰはタンパク質コーディング配列を変化させ、その場合に、多型タンパク質形状は変異タンパク質の発現、潜在的には遺伝的疾患を生じる可能性のある異なるアミノ酸を有し得る。これらの機能の変化はいくつかのメカニズム、例えば、限定されるものではないが、タンパク質折りたたみの変化、リガンドおよび基質結合親和性の変化、および膜結合親和性の変化などにより仲介され、インビボでタンパク質の活性の獲得または喪失に導き得る。インビボでのタンパク質の活性のかかる変化は、ＯＡの発症における臨床的な意味を有する。タンパク質のアミノ酸配列の変化は、タンパク質と、その活性を調節することをスクリーニングすることにより選択した化合物との間の特異性を変化させることにより、ＯＡに対する薬物療法の有効性に影響を与え得る。他のＳＮＰは、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲにおける遺伝子の制御領域、プロモーター、スプライス供与体または受容体部位に起こる。かかる部位における変異体は、タンパク質コーディング変異体に限定されるものではなく、同様の方法で、遺伝子の機能および／または発現を変化させ得る。従って、スクリーニングよって選択された化合物は、異なる個体において、それらが担持する遺伝子の変化に応じて、タンパク質の活性を調節する上で、異なる有効性をもち得る。取分け、あまり一般的ではない遺伝子の変異体にホモ接合性である個体は、主要変異体に対する化合物をスクリーニングすることにより開発された治療法には十分に反応しない可能性がある。
【００４２】
多型の知識を、特定の医薬での治療に最も適する患者を同定する一助とするために使用することは、しばしば「薬理遺伝学」と称される。薬理遺伝学は薬物選定過程を支援するために、医薬研究にも使用され得る。多型はヒトのゲノムのマッピングに、また、疾患の遺伝的構成分の解明に使用される。多型検出の薬理遺伝学および他の用途に関する背景の詳細について知るために、読者を以下の文献に導く：Linder et al. Clinical Chemistry, 43:254, 1997; Marshall. Nature Biotechnology. 15:1249, 1997; International Patent Application WO 97/40462, Spectra Biomedical; and Schafer et al, Nature Biotechnology. 16:33, 1998。
【００４３】
ハプロタイプは単一(父性または母性)染色体上の(遺伝子内などの)結合多型部位に見出される対立遺伝子のセットである。遺伝子内の組換えがランダムである場合、２ｎという多くのハプロタイプが存在する；ただし、２は各ＳＮＰでの対立遺伝子の数であり、ｎはＳＮＰの数である。突然変異または多型(臨床応答と相関する)を同定する一つの方法は、対象の集団において同定し得るすべてのハプロタイプを用いる関連の検討を実施することである。各ハプロタイプの頻度は、その最も稀な対立遺伝子の頻度により限定され、その結果、低頻度対立遺伝子をもつＳＮＰが低頻度ハプロタイプのマーカーとして特に有用である。有害なまたは異常な事象などのある種の臨床的特徴と関連する特定の突然変異または多型は、集団内で低頻度であると思われるので、低頻度ＳＮＰがこれらの突然変異を同定する上で特に有用であり得る(参照例：シスタチオニン・ベータ・シンターゼ(ＣＢＳ)遺伝子座での連鎖不平衡およびＣＢＳ遺伝子座での遺伝子変化と血漿ホモシステインレベルとの間の関連性；De Stefano et al., Ann Hum Genet 62:481-90, 1998; and, Keightley et al., Blood 93:4277-83, 1999)。
【００４４】
臨床試験は、医薬による処置に対する患者の応答が、しばしば不均質であることを示した。従って、医薬の設計および治療、並びに臨床試験設計(患者の選択も含む)に改良された方法が必要である。薬物に対する適当な応答に基づいて、患者をグループに階層化することができるなら(例えば、安全性または有効性による)、それは治療的価値のある適切な薬物を同定するための探求において非常に有用である。
【００４５】
ポリペプチド中の点突然変異は次のように呼ばれる：天然アミノ酸(１文字または３文字命名法を用いる)、位置、新規アミノ酸。例えば(仮定として)、「Ｄ２５Ｋ」または「Ａsp２５Ｌys」は、２５位のアスパラギン酸(Ｄ)がリジン(Ｋ)に変っていることを意味する。１つのポリペプチド内の多重突然変異は、個々の変異をカンマで分けてかぎ括弧で示す。
【００４６】
特定の核酸塩基が多型位置に存在する場合には、多型位置の次の塩基によって表す。例えば(仮定として)、３００位置にアデニンが存在する場合、３００Ａと表す。我々は潜在的にＧＴタンパク質に影響を与える一塩基多型(突然変異)の例を提供する。これらを表４に示す。
【００４７】
プロモーターおよびＵＴＲ領域における一塩基多型(突然変異)は、ＧＴ遺伝子の転写および発現にも影響を与え、発現レベルの上昇もしくは下降、またはインビボにおいてＧＴタンパク質活性の非制御に導き得る。ＧＴタンパク質のインビボでの発現レベルのこのような変化は、臨床的に有意な機能の獲得または喪失として出現する。最近、アミノ酸の変化を生じないような多型現象でも潜在的に異なる生物機能を有するｍＲＮＡの異なる構造の折りたたみを惹き起こし得るということが報告されている(Shen et al., Proc Natl Acad Sci USA 96:7871-7876, 1999)。
【００４８】
本発明の一態様において、本明細書に記載のスクリーニング方法では、配列番号１に示した核酸配列から転写され、本明細書で同定し、表２に掲載した１つ以上のＳＮＰを含んでいるＧＴタンパク質変異体が利用される。
【００４９】
多型(突然変異)は疾患素因の診断マーカーとしても使用し得る。ＯＡに罹患している集団において、またＯＡに罹患してはいないが因子が対応する対照集団において、遺伝子型ＳＮＰは、限定されるものではないが、人種起源、起源国、性別、年齢および体格指数などであり、ＯＡの集団により広く存在するある種のＳＮＰ遺伝子型またはハプロタイプの遺伝性に応じて、対応する対照集団での発生率と比較して、研究者がＯＡ疾患の発症と関連する上昇した危険因子の同定を可能とする。これにより、症状のない個体内のこれらのＳＮＰの遺伝子型およびハプロタイプを測定することにより、ＯＡ発症の危険性の上昇している個体をスクリーニングすることができる。我々はＧＴ遺伝子にいくつかのＳＮＰを発見したが、これらはＯＡ発症の危険性上昇の診断に有用であり得る。これらのＳＮＰを表２に示す。
【００５０】
本発明によるスクリーニング方法は、常套の手法を用いて、例えば、選抜すべき試験化合物(類)と適当な基質を、ポリペプチドまたはそれを産生し得る細胞、またはその細胞膜標品と接触させ、標準技法に従ってポリペプチドとの親和性を決定することにより、操作し得る。
【００５１】
この方法により同定した化合物はいずれもヒトおよび／または他の動物の骨関節症の処置に有用であるとの証明がある。従って、本発明はインビボでＧＴタンパク質の活性を調節する能力を介して選択される化合物にも及ぶ；該能力は主として、該タンパク質の過剰−もしくは過少−活性または制御できない活性が関わる疾患の処置に使用する配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその相同体もしくはフラグメント、またはそれをコードする遺伝子(配列番号１に開示された遺伝子)を利用するスクリーニングアッセイにより決定される。
【００５２】
本発明のさらなる局面によると、潜在的疾患を改変する抗−ＯＡ薬物(ＤＭＯＡＤ)を同定するためのスクリーニングアッセイまたは方法であって、ＧＴの発現レベルに対抗する試験化合物の作用を検出し得るアッセイシステムを試験化合物により接触させ、ＧＴの発現レベルの変化を評価することを特徴とする方法が提供される。特定の態様において、ＯＡ傷害を処置するための潜在的な治療化合物は、ＧＴの発現レベルを低下させ得る化合物である。
【００５３】
ＧＴポリペプチドのＤＮＡまたはＲＮＡの発現を調節する化合物は、多様なアッセイシステムにより検出することができる。適切なアッセイシステムは単純な「イエス／ノー」アッセイであり、レポーター遺伝子の発現の変化、例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質または当業者既知の他のレポーター遺伝子発現の変化が存在するかを決定するアッセイであり得る(総説：Naylor, Biochem. Pharmacol. 58:749-57, 1999)。このアッセイシステムは試験サンプルの発現または機能と、標準サンプルにおける発現または機能のレベルとを比較することにより、定量化することができる。レポーター遺伝子の転写など、正のアウトプットを刺激するために転写因子を使用するシステムは、一般に「ワン−ハイブリッドシステム」という(Wang and Reed. Nature 364:121-126, 1993)。負のアウトプット(増殖阻害)を刺激するために転写因子を使用することは、従って、「逆ワン−ハイブリッドシステム」という(Vidal et al, 1996, 上記)。従って、本発明の一態様において、レポーター遺伝子はＧＴプロモーターの制御下に置かれる。本発明のさらなる局面において、我々はＧＴプロモーターの制御下のレポーター遺伝子を含んでなる細胞または細胞株を提供する。
【００５４】
本発明の別の局面によると、ＯＡの処置に潜在的に有用な化合物をスクリーニングする方法であって、ＧＴの活性または量を調節する能力について化合物をアッセイすることを特徴とする方法が提供される。好ましくは、このアッセイは以下から選択される：
ｉ)ＧＴポリペプチドを発現する細胞株を用いるか、または精製したＧＴポリペプチドを用いてＧＴ活性を測定；および
ii)ＧＴポリペプチドを発現する細胞株中でのＧＴの転写または翻訳の測定。
【００５５】
特定の態様において、ＯＡ傷害を処置するための有望な治療化合物は、ＧＴの活性または量を低下させ得る化合物である。
「ＧＴポリペプチド」は、ＧＴタンパク質(akaＧＴＯＡタンパク質)、その相同体、またはいずれかのフラグメントをいう。
【００５６】
従って、本発明のさらなる局面において、ＧＴポリペプチドを発現する細胞培養は、治療剤の選抜において使用することができる。試験化合物の作用はＧＴのｍＲＮＡまたはタンパク質の変化によりアッセイし得る。下に記載するように、細胞(すなわち、哺乳動物、細菌など)はＧＴポリペプチドを発現するように設計調製することができる。
【００５７】
従って、本発明のさらなる局面によると、骨関節症障害表現型を抑制する能力についての有望な治療薬を試験する方法であって、試験化合物と、ＧＴポリペプチドを発現するように設計調製した細胞とを接触させ；そして当該試験化合物がＧＴポリペプチドの発現を抑制するかどうかを判定することを特徴とする方法が提供される。
【００５８】
また、我々はＧＴ転写のインヒビターを同定する方法であって、潜在的治療剤と、上記の細胞または細胞株とを接触させ、レポーター遺伝子の発現欠如または低下を参照して、潜在的治療剤によるＧＴ転写の阻害を判定することを特徴とする方法を提供する。
【００５９】
手近な試験化合物または試験化合物のライブラリーを試験アッセイと組合わせて使用し得る。特定の試験化合物は、ヒトまたは動物用の医薬もしくは動物薬として適当な低分子量化学物質(好ましくは１５００ダルトン未満の分子量のもの)、または洗浄剤／無菌化剤などの非投与用途の、または農薬用途の化合物である。試験化合物はまた抗体などの天然の生物化合物であってもよい。
【００６０】
本発明のさらなる局面によると、本明細書に定義したスクリーニング方法により同定される化合物が提供される。
本発明の別の局面によると、ＯＡの処置のための医薬の製造におけるＧＴの活性または量を調節し得る化合物の使用が提供される。化合物によるＧＴ量の調節は、例えば、変更された遺伝子発現レベルまたはメッセージの安定性を介してもたらされ得る。化合物によるＧＴ活性の調節は、例えば、ＧＴタンパク質に結合する化合物を介してもたらされ得る。一態様において、ＧＴの調節はＧＴの活性または量を低下させ得る化合物を使用することからなる。別の態様においては、ＧＴの調節はＧＴの活性または量を上昇させ得る化合物を使用することからなる。
【００６１】
「ＯＡの処置のため」という用語、およびその言い換えは、治療的および予防的(防止的)処置を含むことが認識されよう。
本発明の別の局面によると、医薬組成物の製造法であって、
ｉ)本明細書に記載のスクリーニング方法に従い、ＯＡの処置のために有用である化合物を同定すること；および
ii)該化合物またはその医薬的に許容される塩と医薬的に許容される添加剤または賦形剤とを混合すること；
を特徴とする方法が提供される。
【００６２】
本発明のさらなる局面によると、ＯＡ罹患患者の処置方法であって、本発明のスクリーニング方法により同定される化合物または本明細書に記載する方法により製造される組成物の有効量を当該患者に投与することからなる方法が提供される。
【００６３】
本発明の組成物は経口使用に適する形状(例えば、錠剤、ロゼンジ、ハードもしくはソフトカプセル、水性もしくは油性懸濁液、エマルジョン、分散性粉末もしくは顆粒、シロップまたはエリキシルとして)、局所用の形状(例えば、クリーム、ゲル、または水性もしくは油性溶液もしくは懸濁液として)、吸入による投与形状(例えば、微粉末化粉末または液状エーロゾルとして)、空気吸入による投与形状(例えば、微粉末化粉末として)または非経口投与用形状(例えば、静脈内、皮下、関節内もしくは筋肉内用の無菌水性もしくは油性溶液として、または直腸投与用の坐剤として)とし得る。
【００６４】
本発明の組成物は、当該技術分野で周知の常套の医薬品添加物を用いて、常套の手法により入手し得る。従って、経口使用を企図する組成物は、例えば、１種以上の着色剤、甘味剤、芳香剤および／または保存剤を含み得る。
【００６５】
錠剤形成用の適切な医薬的に許容される添加剤は、例えば、不活性賦形剤(ラクトース、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウムなど)、顆粒化および崩壊剤(コーンスターチまたはアルジェン酸など)、結合剤(デンプンなど)、滑沢剤(ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなど)、保存剤(ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはプロピルなど)、および抗酸化剤(アスコルビン酸など)である。錠剤の製剤は未被覆であるか、または被覆してその崩壊性と引き続く胃腸管内での有効成分の吸収を改善するか、または安定性および／または概観を改善することができる；いずれの場合にも、常套のコーティング剤と当該技術上周知の手法を用いることができる。
【００６６】
経口使用の組成物は、ハードゼラチンカプセルの形状でもよく、その場合、有効成分は不活性の固体賦形剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンなどと混合する；またはソフトゼラチンカプセルとしてもよく、その場合、有効成分は水または油、例えば、落花生油、流動パラフィン、もしくはオリーブ油などと混合する。
【００６７】
水性懸濁液は、一般に、微粉末化した形状の有効成分を、１種以上の懸濁化剤、例えば、ナトリウム・カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドン、トラガカントガムおよびアラビアゴム；分散または湿潤剤、例えば、レシチンまたはアルキレンオキシドと脂肪酸(例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン)との縮合産物、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコール(例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール)との縮合産物、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合産物(例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール)、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコール(例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール)との縮合産物、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合産物(例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール)、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとの縮合産物(例えば、モノオレイン酸ポリエチレンソルビタン)などと一緒に含む。また、水性懸濁液は１種以上の保存剤(例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはプロピル)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸)、着色剤、芳香剤、および／または甘味剤(例えば、スクロース、サッカリンまたはアスパルテーム)を含み得る。
【００６８】
油性懸濁液は有効成分を植物油(例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油またはヤシ油)または鉱油(例えば、流動パラフィン)に懸濁することにより製剤化し得る。油性懸濁液はまた、蜂蜜、固形パラフィンまたはセチルアルコールなどの粘稠化剤を含み得る。上に提示したような甘味剤、および芳香剤は口当たりの良い経口製剤を提供するために添加してもよい。これらの組成物はアスコルビン酸などの抗酸化剤の添加により保存し得る。水の添加により水性懸濁液を調製するために適する分散性粉末および顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤および１種以上の保存剤と共に有効成分を一般に含む。適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤は、すでに上に示したものがその例示である。甘味剤、芳香剤および着色剤などのさらなる添加剤も存在し得る。
【００６９】
本発明の医薬組成物はまた水中油型のエマルジョンとすることもできる。油相はオリーブ油もしくは落花生油なとの植物油、または例えば、流動パラフィンなどの鉱油、またはそれらの混合物でよい。適切な乳化剤は、例えば、天然産のガム類(アラビアゴムまたはトラガカントガムなど)、天然産のホスファチド(ダイズ、レシチンなど)、脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導されるエステルもしくは部分エステル(例えば、モノオレイン酸ソルビタン)および当該部分エステルとエチレンオキシドとの縮合産物(例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン)でよい。エマルジョンは甘味剤、芳香剤および保存剤をも含有し得る。
【００７０】
シロップおよびエリキシルはグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、アスパルテームまたはスクロースなどの甘味剤により製剤化し、粘滑剤、保存剤、芳香剤および／または着色剤をも含有し得る。
【００７１】
また、医薬組成物は無菌の注射用水性または油性懸濁液の形状としてもよく、既知の手法に従い、上ですでに言及した１種以上の適切な分散または湿潤剤および懸濁化剤を用いて製剤化することができる。無菌の注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射用溶液または懸濁液、例えば、１,３−ブタンジオールの溶液としてもよい。
【００７２】
座薬の製剤は、常温では固体であるが、直腸温度では液体であり、その結果、直腸中で融解して薬物を放出する適当な非刺激性添加物と有効成分を混合することにより調製し得る。適当な添加物は、例えば、カカオ脂およびポリエチレングリコールである。
【００７３】
局所製剤、例えば、クリーム、軟膏、ゲルおよび水性もしくは油性溶液または懸濁液は、一般に、当該技術上周知の常套の手法により、有効成分を常套の局所的に許容される媒体または希釈剤で製剤化することにより入手し得る。
【００７４】
空気吸入により投与する組成物は、例えば、平均粒径が３０μ以下の粒子を含む微粉末化粉末の形状とし得る；粉末それ自体は有効成分単独で、またはラクトースなどの１種以上の生理的に許容される担体で希釈して含有する。空気吸入のための粉末は、次いで便利なものとして、例えば、既知薬剤クロモグリク酸ナトリウムの吸入のために使用されるようなターボ式吸入器で使用するために、有効成分１ないし５０ｍｇを容れたカプセルに保持する。
【００７５】
吸入により投与する組成物は、微粉末化固体または液滴を含むエーロゾルとして有効成分を調合投与するように配置した簡便な加圧エーロゾルの形状とし得る。簡便なエーロゾル噴射剤、例えば、揮発性のフッ素化炭化水素または炭化水素を使用することが可能であり、エーロゾル器具は計量した量の有効成分を調合投与するように簡便に配置する。
製剤に関するさらなる情報について、読者は文献、総合医化学(Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990)第５巻第２５.２章を参照されたい。
【００７６】
単一投与形態を製造するための１種以上の添加剤と組合わせる有効成分の量は、必然的に処置すべきホストおよび特定の投与経路に左右されて変るだろう。例えば、ヒトに対し経口投与しようとする製剤は、一般に、適切で簡便な量の添加剤と混合した０.５ｍｇないし２ｇの活性剤を含む；添加剤は組成物全重量に対し約５ないし約９８パーセントで変り得る。単位投与形態は、一般に、約１ｍｇないし約５００ｍｇの有効成分を含む。投与経路と投与計画に関するさらなる情報について、読者は文献、総合医化学(Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990)第５巻第２５.３章を参照されたい。
【００７７】
化合物の治療または予防目的の用量サイズは、当然ながら、周知の医薬の原理に従い、症状の性質および重篤度、動物または患者の年齢および性別、および投与経路により変わる。
【００７８】
治療または予防目的で化合物を使用する場合、一般に、例えば、体重１ｋｇあたり０.５ｍｇないし７５ｍｇの範囲の日用量が受容されるように投与し、要すれば分割投与とする。一般に、非経口経路を採用する場合、低用量が投与される。従って、例えば、静脈内投与の場合、例えば、体重１ｋｇあたり０.５ｍｇないし３０ｍｇの範囲の用量が使用される。同様に、吸入による投与の場合、例えば、体重１ｋｇあたり０.５ｍｇないし２５ｍｇの範囲の用量が使用される。しかし、経口投与が好ましい。
【００７９】
ＧＴ遺伝子がＯＡに関わっているということを確認したこと、このことは多くの分子診断の機会を提供する。当業者が知ることは、生体サンプル内に存在する核酸、タンパク質またはその他の分析対象のレベルを測定することにより、臨床的に意味のある情報が得られることである。核酸、タンパク質またはその他の分析対象が多型の形状で存在する場合、当該多型核酸、タンパク質またはその他の分析対象の種々の変形のいずれのものがサンプル内に存在するかを同定することにおいて、臨床的用途があり得る。
【００８０】
研究者はサンプル中に存在するＧＴタンパク質のレベルを測定すること、またはＧＴｍＲＮＡ転写物のレベルを測定することを望むかも知れない。研究者はまたサンプル内に存在する変異ヌクレオチド(ＳＮＰ)を検出するために、核酸配列分析を実施したいと思うかも知れない；これらの分析はサンプルのＤＮＡまたはＲＮＡフラクションのいずれでも実施可能であり、当業者周知である。研究者はまた当該技術上周知の分解に基づく技法により直接的にタンパク質配列分析を実施するか、または間接的にイムノアッセイなどの分子認識法により、またはタンパク質の物理的特性の変化を検出することに基づく方法、例えば、機能的もしくは基質特異的アッセイまたは等電点電気泳動法により配列分析を実施したいと思うかも知れない。
【００８１】
本発明のさらなる局面によると、ＯＡを診断または予知またはモニターする方法であって、ＧＴの異常レベルについて生体サンプルを試験することからなる方法が提供される。
【００８２】
「異常レベル」という用語は、正常範囲の外にあるレベルをいう。正常範囲は多くの正常組織を試験することにより決定し得るか、または正常もしくは対照サンプルと試験サンプルの並行比較から決定してもよい。本出願の目的上、異常な発現は対照の正常サンプルと比較して、疾患サンプル中の核酸レベルに１.５倍以上の差があることをいう。本明細書にて使用する場合の核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両者をいう。
【００８３】
試験サンプルは、簡便には、個体から得られる滑液、血液(血漿または血清を含む)、口腔内擦過物、尿もしくは他の体液または組織である。本発明はＯＡ疾患の罹患率につながる本明細書にて同定される遺伝子を同定することにある。従って、一部、本発明は、ここで同定されるＧＴ遺伝子の分化発現レベルを、対照組織での発現と比較して、単独またはパネルとして評価することのできる診断方法を目的とする。取分け、かかる方法は該遺伝子の異常発現レベルがＯＡの存在またはこの障害の発症の可能性上昇を示している場合のｍＲＮＡ転写レベルおよび／またはタンパク質レベルの評価につながる。
上記のように、一態様において、本発明はＧＴの１つ以上の多型の存在を検出するために採用される。
【００８４】
本発明の他の局面によると、ヒトにおける骨関節症の診断、または発症の罹患率を判定するための方法であって、当該ヒトの核酸配列をその１箇所以上の位置；5283、21037、21134、25515、34419、59661、59968および73821..73842(それぞれ配列番号１に対応)で、またはそれとＤ’０.９以上の連鎖不平衡にある多型を決定し、ＧＴ遺伝子における、またはその隣接位における多型を参照してヒトの状態を判定することを特徴とする方法が提供される。
【００８５】
本発明の他の局面によると、ＧＴにおける多型の診断方法であって、当該ヒトの核酸配列をその１箇所以上の位置；5283、21037、21134、25515、34419、59661、59968および73821..73842(それぞれ配列番号１に対応)で、またはそれとＤ’０.９以上の連鎖不平衡にある多型を決定し、ＧＴ遺伝子における、またはその隣接位における多型を参照してヒトの状態を判定することを特徴とする方法が提供される。
【００８６】
特定の態様において、この方法はヒトにおけるＯＡ発症の予知および／または罹患率を評価するために使用される(例えば、将来のデータでＯＡ発症の危険性を評価すること)。ＯＡとの関連性を示す特定の対立遺伝子を表３に特定する。
【００８７】
特定の態様において、位置5283のＣ(シトシン)および／または位置21037のＴ(チミン)および／または位置21134のＴおよび／または位置25525のＴおよび／または位置34419のＴおよび／または59661のＣおよび／または位置59968のＣおよび／または位置73821〜73842の配列の欠失の存在(それぞれ配列番号１の位置に対応する)が、ＯＡを発症する危険性(例えば、ＯＡの罹患率)の上昇を示すものである。
【００８８】
さらに留意すべきは、特定の位置(例えば、配列番号１の位置34419)のヌクレオチドとの塩基対である配列番号１に対する補体鎖におけるヌクレオチドの検出が、勿論、請求項に記載した発明の範囲内であることである。
【００８９】
本発明の別の局面によると、個々人の遺伝子型を決定する方法であって、当該ヒトの核酸配列をその１箇所以上の位置；5283、21037、21134、25515、34419、59661、59968および73821..73842(それぞれ配列番号１に対応)で、またはそれとＤ’０.９以上の連鎖不平衡にある多型を決定し、ＧＴ遺伝子における多型を参照してヒトの遺伝子型状態を決定することを特徴とする方法が提供される。個体の遺伝子型状態はさらにＯＡを発症する固体の危険性を詳細に測定するために使用することができる。
【００９０】
特定の態様において、これらの特定の局面は表２または３に特定した１つ以上の多型の検出に適用される。
「多型の診断」という用語は、多型位置での個体の遺伝子状態の決定をいう(その場合の個体は各位置でのホモ接合またはヘテロ接合であり得る)。
【００９１】
「状態」という用語はヒトの遺伝子状態をいい、ポリヌクレオチドまたは対応するタンパク質の限定された位置での潜在的配列変異により検出されるものである。
個体の状態を決定することは、単に、個体の遺伝子型を決定すること(すなわち、特定の多型での対立遺伝子の同定)および／またはその情報を臨床的意義に翻訳すること(例えば、ＯＡ発症の危険性の可能性ありとすること)であり得る。
【００９２】
本発明の多型はＯＡとの優位な関連性を証明する。しかし、当業者はＯＡが多遺伝子性疾患であり、従って、多型(例えば、ＳＮＰ)だけからなる診断試験、またはさらに本発明の１つ以上の多型を含むハプロタイプも、特定の個体にとって疾患発生の診断とはならないと認識している。それにも関わらず、我々はさらなる開発に従って、本発明の多型がマーカーのパネルの一部を形成し得るであろうこと、そのマーカーが組合わさって、臨床慣習に影響するに十分な通常の臨床基準内で、個体の疾患または罹病率を予知するものとなることを認識する。
【００９３】
本発明の別の局面によると、個体がＯＡに罹患し易い傾向にあるかどうかを判定する方法であって、ホモ接合またはヘテロ接合の形状において、個体のＧＴ遺伝子座において、または隣接位の遺伝子座(当該隣接遺伝子座は当該ＧＴ遺伝子座と連鎖不平衡にある)において、少なくとも１つのＯＡ関連遺伝子型の存在または不存在を決定し、それによって個体がＯＡに罹患し易い傾向にあるかどうかを判定することを特徴とする方法が提供される。
【００９４】
本発明の別の局面によると、個体のＯＡに対する素因および／または罹患率を評価する方法であって、
(ｉ)個体から取り出した核酸サンプルを準備すること；
(ii)個体のＧＴ遺伝子における多型部位での１つ以上のヌクレオチドを同定決定すること；そして
当該１つ以上のヌクレオチドに参照することにより、個体の状態を判定することを特徴とする方法が提供される。
【００９５】
本発明の別の局面において、ＯＡの診断方法またはＯＡを発症する罹患率を決定する方法であって、
ｉ)タンパク質または核酸含有サンプルを個体から入手すること；
ii)ＧＴタンパク質内の多型アミノ酸の存在に基づく変異体ＧＴ、またはＧＴ遺伝子配列内の多型塩基の存在または不存在を検出すること；そして
iii)ＧＴにおける多型の存在または不存在に参照して、ヒトの状態を判定すること；
を特徴とする方法が提供される。
【００９６】
当業者にとって明らかなことは、数多くの分析手法が存在することであり、それらが本発明の１つ以上の位置での変異体ヌクレオチドの存在または不存在を検出するために使用し得ることである。一般に、対立遺伝子変異体の検出には、突然変異の識別技法、任意工程としての増幅反応および任意工程としてのシグナル発生システムを必要とする。リスト１は多くの突然変異検出技法を掲載するが、そのあるものはポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)に基づくものである。これらは多くのシグナル発生システムと組合わせて使用し得る；その選択はリスト２に掲載する。さらに、増幅技法をリスト３に掲載する。対立遺伝子の多くの最新の方法については以下の文献(Nollau et al., Clin. Chem. 43, 1114-1120, 1997)および標準的教科書(例えば、「突然変異検出の実験室プロトコール」, Ed. by U. Landegren, Oxford University Press, 1996 および “PCR”, 2nd Edition by Newton & Graham, BIOS Scientific Publishers Limited, 1997)に概説されている。
【００９７】
【表１】
2009508513.tif 000002
【００９８】
リスト１−突然変異検出技法
一般：ＤＮＡ配列決定、ハイブリッド形成による配列決定
走査：ＰＴＴ＊、ＳＳＣＰ、ＤＧＧＥ、ＴＧＧＥ、クリバーゼ、ヘテロ二本鎖分析、ＣＭＣ、酵素ミスマッチ切断
＊ 注記：プロモーター多型の検出にとって有用ではない。
【００９９】
基礎とするハイブリッド形成：固相ハイブリッド形成：ドット・ブロット、ＭＡＳＤＡ、逆ドット・ブロット、オリゴヌクレオチド・アレイ(ＤＮＡチップ)
液相中ハイブリッド形成：タックマン(商標)−US-5210015およびUS-5487972 (ホフマン−ラ・ロシュ)、モレキュラー・ビーコン−Tyagi et al (1996), Nature Biotechnology, 14, 303; WO 95/13399 (Public Health Inst., New York)
基礎とする延長：ＡＲＭＳＴＭ−対立遺伝子特異的増幅(記載例：欧州特許EP-B-332435および米国特許US 5,595,890)、ＡＬＥＸＴＭ−欧州特許EP 332435 B1 (ゼネカ(株))、ＣＯＰＳ−Gibbs et al (1989), Nucleic Acids Research, 17, 2347。
【０１００】
基礎とする取り込み：ミニ−配列決定、ＡＰＥＸ
基礎とする制限酵素：ＲＦＬＰ、制限部位生成ＰＣＲ
基礎とする連結反応：ＯＬＡ
その他：インベーダー・アッセイ、ハイブリッド形成保護アッセイ
【０１０１】
リスト２−シグナル発生または検出システム
蛍光：ＦＲＥＴ、蛍光消光、蛍光偏光−英国特許2228998 (ゼネカ(株))
その他：化学発光、電気化学発光、ラマン、放射性、呈色、質量分析、ＳＥＲＲＳ- WO 97/05280 (ストラスクライド大学 (University of Strathclyde))。
【０１０２】
リスト３−さらなる増幅方法
ＳＳＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ｂ−ＤＮＡ
好適な突然変異検出技法は、ＡＲＭＳＴＭ−対立遺伝子特異的増幅、タックマンＴＭ、ミニ配列決定、配列決定、ＲＦＬＰ、ＡＬＥＸＴＭ、ＯＬＡ、制限部位に基づくＰＣＲおよびＦＲＥＴ技法である。
取分け好適な方法は、ＡＲＭＳＴＭ−対立遺伝子特異的増幅、ＯＬＡ、およびＲＦＬＰに基づく方法である。ＡＲＭＳＴＭ−対立遺伝子特異的増幅は取分け好適な方法である。
【０１０３】
ＡＲＭＳＴＭ−対立遺伝子特異的増幅(記載例：欧州特許EP-B-332435、米国特許US 5,595,890 および Newton et al. (Nucleic Acids Research, Vol. 17, p.2503; 1989))は、プライマーとその鋳型の３’末端ヌクレオチドの相補性に基づくものである。プライマーの３’末端ヌクレオチドは検出すべき特異的突然変異、対立遺伝子または多型に相補的であるか非相補的である。３’末端ヌクレオチドが塩基変異、対立遺伝子または多型に相補性であるプライマーからのプライマー延長のために、選択的な有益性がある。鋳型配列と３’末端ミスマッチを有するこれらのプライマーは、酵素プライマー延長を厳しく阻害または防止する。ポリメラーゼ連鎖反応または一方向プライマー延長反応は、従って、プライマーの３’末端ヌクレオチドが鋳型と相補性である場合、生成物の増幅に至るが、３’末端ヌクレオチドが鋳型と相補性でない場合には、増幅しないか、または効果的でない。
【０１０４】
正しく評価されることは、試験サンプルが等しく試験サンプル中の配列に対応する核酸配列であり得ること、すなわち、サンプル核酸のすべてまたは一部の領域が、分析の前に何らかの簡便な方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によって先ず増幅され得ることである。該核酸はゲノムＤＮＡまたは分画したもしくは全細胞ＲＮＡであってもよい。一態様において、ＲＮＡは全細胞ＲＮＡであり、ランダムプライマーまたはポリＡプライマーを用いて、第一鎖ｃＤＮＡを標識するための鋳型として直接使用される。試験サンプル中の核酸またはタンパク質は、標準的な方法論に従って、サンプルから抽出し得る(Sambrook et al. “Molecular Cloning- A Laboratory manual”, second edition. Cold Spring Harbor, NY (1989))。
【０１０５】
明らかなことは、ＧＴについて開示されている遺伝子配列(配列番号１に示すように)は代表的な配列であることである。正常な個体においては、各遺伝子について２つのコピー、母性および父性のコピーが存在し、それらがある種の配列差異を有する可能性があって、さらには集団内で遺伝子配列の多数の対立遺伝子変異体が存在する(天然の対立遺伝子変異体)。正しく評価されることは、本発明の診断方法および他の局面が、これらの配列変異体のいずれについても検出などに拡張することである。好適な配列変異体は、配列番号１または２に描出したＧＴに対し、少なくとも９０％、好ましくは９５％の配列同一性(核酸またはアミノ酸)を有するものである。核酸配列同一性はハイブリッド形成検討により正確に測定し得るが、その際、緊縮ハイブリッド形成と洗浄条件下において、密接に関係する配列のみ(例えば、＞９０％同一性を有するもの)がハイブリダイゼーション複合体を形成し得る。
【０１０６】
アミノ酸配列診断法は、好ましくは、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)などの免疫方法により決定されるものである。
ＧＴのレベルは試験サンプル中に存在するｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはポリペプチド配列の相対的量から評価することができる。ＲＮＡを使用する場合、ＲＮＡを相補性ｃＤＮＡに変換することが望ましく、この過程において、適切な検出可能なラベルをｃＤＮＡに取り込ませることが望ましいこともある。
【０１０７】
特定の態様において、本発明方法はｍＲＮＡ転写レベルを検出することによる。これにはサンプル中のＧＴの相対的ｍＲＮＡ転写レベルの評価と、サンプルデータと対照データとの比較が関わる。遺伝子転写は個々に検出可能であるか、または、好ましくは、転写プロファイルを引き出しえる他の疾患−関連遺伝子ＧＴのパネルの中で検出する。試験サンプル中のＧＴｍＲＮＡレベルは、当該技術分野において既知の技法により検出し得る。これらの技法はノーサンブロット分析、逆転写酵素−ＰＣＲ増幅(ＲＴ−ＰＣＲ)、マイクロアレイ分析およびＲＮアーゼ保護である。
【０１０８】
一態様において、サンプル中のＧＴ ＲＮＡレベルはノーサンブロットアッセイにより測定し得る。ここで、組織ＲＮＡは電気泳動により分画し、ニトロセルロースまたはナイロンなどの固体膜支持体に固定するか、または検出すべきＧＴ ＲＮＡと選択的にハイブリッド形成し得るプローブ(１つまたは複数)にハイブリッド形成させる。実測レベルは対照となる１種以上の自家保有遺伝子に参照して定量し得る。プローブは単独で、または組合わせて使用し得る。これにより、プローブにより検出されるｍＲＮＡのサイズに関する情報も提供し得る。自家保有遺伝子は一般的な代謝または細胞の維持に関わる遺伝子であり、細胞の型、生理的状態または細胞周期の段階に関係なく、一定のレベルで発現されると考えられる。適切な自家保有遺伝子の例は以下のとおりである：ベータアクチン、ＧＡＰＤＨ、ヒストンＨ３.３、またはリボソームタンパク質Ｌ１３(Koehler et al., Quantitation of mRNA by Polymerase Chain Reaction(ポリメラーゼ連鎖反応によるｍＲＮＡの定量). Springer-Verlag, Germany (1995))。
【０１０９】
相対的発現レベルを正確に測るために、試験サンプルと並行して対照サンプルにつき実施するか、または試験結果／値を正常もしくは対照組織にて予測されるＧＴ発現レベルと比較することができる。これらの対照値は、ＧＴについての平均または正常範囲の値を得るために、正常なまたは対照の組織を用いる先の試験実験から得ることができる。
【０１１０】
別の態様において、組織サンプル中のＧＴ核酸は増幅し、定量的にアッセイする。ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)の手法は、オリゴヌクレオチドプライマー(配列番号１に従い設計)の変性、アニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの延長を含む一連の反復工程を介して、具体的核酸配列を増幅するために使用することができる(参照例：Mullis, et al., 米国特許US 4,683,202; Loh et al., Science 243:217, 1988)。逆転写酵素−ＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲ)において、この手法ではｍＲＮＡのコピー数の大量増幅を可能とする逆転写工程が先行する(Koehler et al., 上記)。その他の既知核酸増幅手法は、転写に基づく増幅システム(ＴＡＳ)、例えば、核酸に基づく配列適用 (ＮＡＳＢＡ) および３ＳＲ (Kwoh et al., Proc Natl. Acad Sci USA 86:1173, 1989；Gingeras et al., ＰＣＴ出願WO 88/10315)、リガーゼ連鎖反応 (ＬＣＲ；欧州出願 EP 320308)、鎖置換増幅 (ＳＤＡ)、「race」、「一側ＰＣＲ」、その他(Frohman, PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications(ＰＣＲプロトコール；方法と応用への手引き). Academic Press, NY (1990); Ohara et al., Proc Natl Acad Sci. USA 86:5673-5677, 1989))である。ＲＴ−ＰＣＲ産物の定量は、反応産物を指数関数的に構築しながら実施し、診断学的に有用な臨床データを作成することができる。一態様において、分析は１種以上の自家保有遺伝子(このものもＲＴ−ＰＣＲにより増幅する)を参照することにより実施する。ＲＴ−ＰＣＲ産物の定量は、例えば、上で検討した対照の自家保有遺伝子または遺伝子群に関連して、ゲル電気泳動可視検査または画像分析、ＨＰＬＣ(Koehler et al., 上記)により、または蛍光検出方法、例えば、インターカレーション標識、タックマンプローブ(Taqman probe；Higuchi et al., Biotechnology 10:413-417, 1992)、分子ビーコン(Piatek et al., Nature Biotechnol. 4:359-363, 1998)、プライマーまたはスコーピオンプライマー(Whitcombe et al., Nature Biotech 17:804-807, 1999)；または他の蛍光検出方法により実施し得る。
【０１１１】
ＧＴ ＲＮＡ測定は滑液、血液または血清サンプルについても実施し得る。好ましくは、ＲＮＡは末梢血液サンプルから得られる。血液血清中に可溶性であるＲＮＡの場合は、予測されるｍＲＮＡの低存在量のために、ＲＴ−ＰＣＲのような高感度試験が必要となる(Kopreski et al., Clin Cancer Res 5:1961-5, 1999)。全血勾配は有核細胞を単離するために実施可能であり、全ＲＮＡはＲＮアゾールＢ(Rnazole B)法(Tel-Test Inc., Friendsworth, Tex.) により、または当該技術分野で既知の方法の改良法(記載例：Sambrook et al., (上記))により抽出する。
【０１１２】
本発明の一態様において、本発明の診断／検出法は、マイクロアレイ分析法を用いてＧＴ転写体レベルを評価することからなる。マイクロアレイ技法は１回の実験で、何千もの遺伝子の発現を同時に検討することを可能にする。ヒトの組織(例えば、組織診または死後組織)における遺伝子発現の分析は、疾患の診断および予知および疾患に対する危険性の評価に役立ち得る。規定された病理的疾患症状の患者からの種々遺伝子の発現レベルと、正常患者とを比較することは、疾患の特徴である発現プロファイルを創出することを可能とする。
【０１１３】
プローブは試験サンプルにおける標的ＧＴ遺伝子の配列に選択的にハイブリッド形成させる。これらのプローブは、恐らく、他のプローブおよび対照プローブと一緒になって、ナイロンフィルターまたは顕微鏡スライドなどの適当な支持媒体上の別々の局在位置に結合して、転写プロファイルアレイを形成する。該診断方法は臨床サンプル中のＧＴの相対的ｍＲＮＡ転写体レベルを評価することからなる。これは当該技術分野において周知の多くの方法により、組織ｍＲＮＡを放射性標識するか、または非放射性標識することにより実施可能であり、該ｍＲＮＡは全ＲＮＡから任意に精製し得る(Sambrook et al., 上記)。該プローブは標的とするＧＴｍＲＮＡのいずれかの一部または全部に向け得る。
【０１１４】
本発明の別の態様においては、総量のＧＴ ＲＮＡまたはＤＮＡを定量し、対照組織におけるレベル、または予め試験した標準から予測されるレベルと比較する。ＤＮＡおよび／またはＲＮＡはしばしばサンプル内の内部対照ｍＲＮＡレベルに参照して、しばしば自家保有遺伝子に関連して定量する(Koehler et al., 上記)。
【０１１５】
特定の態様において、生成するハイブリッド形成は、ナイロン膜などの固体支持体上のプローブのマイクロアレイにハイブリッド形成させた放射性標識組織ＲＮＡに露光したリン光発光スクリーン上の画像をコンピューターソフトウエア分析することにより測定する。もう一つ、定量は放射線−感受性フィルム(例えば、Ｘ線フィルム)の濃度測定により測定するか、または目視手段により評価する。別の態様において、定量は蛍光的に標識したプローブの使用により測定するが、これは組織片と、異なる発蛍光団で示差標識した正常ＲＮＡとの混合物でよく、ＧＴｍＲＮＡの量を正常レベルに対する比として表わすことを可能とする。この種の実験における固体支持体は、一般に、顕微鏡用スライドガラスであり、検出は蛍光顕微鏡とコンピューター画像化による。
【０１１６】
特異的相互作用の検出は、標識された標的がアレイに付着する位置を検出することにより実施し得る。放射性標識プローブは常套のオートラジオグラフィー技法により検出し得る。デジタル化スキャナーと結果を分析する適当なソフトウエアを備える走査オートラジオグラフィーを使用するのが好ましい。標識が蛍光標識である場合、例えば、国際公開WO 90/15070; US 143,854 または US 5,744,305に記載された装置が有利に適用され得る。事実、殆どのアレイフォーマットにおいて、標識した捕捉：標的二重鎖形成を検出するための蛍光読み出し装置が使用される。レーザー共焦点蛍光顕微法は常套的に使用されるもう一つの技法である(Kozal et al., Nature Medicine 2:753-759, 1996)。質量分析法もＤＮＡアレイに結合したオリゴヌクレオチドを検出するために使用し得る(Little et al, Analytical Chemistry 69: 4540-4546, 1997)。レポーターシステムが使用される場合、膨大な数の読み出し値を意味のあるデータとして解釈するためには、高機能の小道具とソフトウエアが必要となり得る(記載例：米国特許US 5, 800, 992 または国際公開WO 90/04652)。
【０１１７】
マイクロアレイ試験の特定の態様において、ＧＴ ＲＮＡ測定値は、一定であるか、比較的一定であることの知られる内部基準(すなわち、自家保有遺伝子)に比例する値として生成する。ヒストンＨ３.３とリボソームタンパク質Ｌ１９自家保有遺伝子は、細胞周期非依存性であり、すべての組織において構成的に発現されることが示されている(Koehler et al., 上記)。データを正規化するために、数種の自家保有遺伝子を使用し、平均の自家保有測定値を生成させることができる。
ＯＡ障害またはその罹患し易さを検出するためのマイクロアレイまたはＲＴ−ＰＣＲは、ｍＲＮＡを含む組織サンプルが入手可能である場合に使用し得る。
【０１１８】
ＲＮＡ抽出用のサンプルは、ＲＮＡの分解を避けるために迅速に処理しなければならない(Sambrook et al., 上記)。これは、例えば、フェノール−ベースの試薬または、例えば、液体窒素中での急速凍結による迅速抽出を必然的に伴う。サンプルは後日ＲＮＡを抽出し得るときまで、−７０℃以下に保存し得る。専用の試薬が利用可能であり、これにより組織または細胞は室温で数日間、また４℃で数ヶ月まで簡便に保存し得る(例えば、ＲＮＡレイター、アンビオン・インク、テキサス)。抽出前の摩砕、混合または均一化が、適切な抽出バッファーに組織を分散させるために使用される。典型的なプロトコールでは、次いで溶媒抽出と選択的沈殿技法を用いる。
【０１１９】
別の態様において、選択的にＧＴ核酸にハイブリッド形成し得るオリゴヌクレオチドプローブは、ＧＴ遺伝子発現のレベルを検出するために使用することができる。
本発明の種々の局面に使用する簡便なＤＮＡ配列は、通常の分子生物学的手法を用いること、例えば、ヒトゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを、本明細書に記載のヌクレオチド配列を使用して設計した１０個以上の相接するヌクレオチドを含む１個以上の標識したオリゴヌクレオチドプローブでプローブすることにより入手し得る。別法として、一方がセンス鎖に対応し、他方がアンチセンス鎖に対応するオリゴヌクレオチドの対は、本明細書に記載したヌクレオチド配列を用いて、ＤＮＡの特異的領域が隣接するように設計して、ｃＤＮＡライブラリーからそのＤＮＡを増幅するために使用し得る。
【０１２０】
本発明方法のいずれかで使用するプライマーまたはプローブは、常套の合成方法を用いて製造し得る。かかる方法の例は、標準的な教科書(例えば、“Protocols for Oligonucleotides and Analogues; Synthesis and Properties,(オリゴヌクレオチドと類似体についてのプロトコール；合成と性質)” Methods in Molecular Biology Series; Volume 20; Ed. Sudhir Agrawal, Humana ISBN: 0-89603-247-7, 1993; 1st Edition)に見出し得る。プライマーは、要すれば、標識して検出し易くし得る。
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、ＧＴの特定のＳＮＰの遺伝子型検出に特に適している。
【０１２１】
多くの常套の検出可能な標識が存在する；例えば、本発明のプライマーまたはプローブと組合わせて使用し得る放射性同位体、蛍光標識、化学発光化合物、標識した結合タンパク質、磁気標識、分光学的マーカーおよび連鎖的酵素などである。当該技術分野において周知の特別の一例は、３２Ｐによる末端標識である。蛍光標識は、それらが放射性標識よりも危険性が少なく、強いシグナルを生じて、バックグラウンドが低値であり、さらに異なる波長で光を吸収するか、および／または異なる色シグナルを放出することの可能な種々の異なる発蛍光団が存在して、同じ分析において競合的分析を可能とする故に、好ましい。例えば、フルオレセインは緑色を放出し、ローダミンは赤色を放出し、両者は一緒になって黄色を放出する。
【０１２２】
増幅に好適なプライマーは、その長さが１５ないし６０ｂｐ、より好ましくは、１７ないし３５ｂｐである。プローブの配列は約２５個のヌクレオチドの長さ以上のものであればよい。目標とする配列が２ｋｂの大きさの遺伝子であるとすれば、そのプローブ配列は完全な遺伝子配列の補体であり、従って、大きさも２ｋｂであり得る。
【０１２３】
好ましくは、プローブ配列はゲノムの配列、またはより好ましくはｃＤＮＡ、標的配列のフラグメントであり、５０ないし２０００ｂｐ、好ましくは、２００ないし７５０ｂｐである。認識されることは、複数のプローブであって、それぞれがＧＴ核酸の異なる標的配列に選択的にハイブリッド形成し得るプローブは、恐らくＧＴ遺伝子配列の全長に及ぶものであり、診断試験において調製し、一緒に使用し得ることである。プライマーまたはプローブは標的配列に完全に対応し得るか、または間違いのない鋳型配列に結合する際の特異性を介助するための１個以上のミスマッチを含み得る。対象の標的配列に選択的にハイブリッド形成し得る配列は、いずれも適切なプライマーまたはプローブ配列として用い得る。プローブまたはプライマーが標的の鋳型核酸にハイブリッド形成しなければならないことは認識されよう。標的核酸が二本鎖(ゲノムまたはＤＮＡ)である場合、プローブまたはゲノム配列は、センス鎖またはアンチセンス鎖にハイブリッド形成し得る。しかし、もし標的がｍＲＮＡ(一本鎖センス鎖)である場合、プライマー／プローブ配列はアンチセンス補体でなければならないであろう。
【０１２４】
適切なハイブリッド形成溶液の例は、核酸がナイロン膜に固定され、プローブ核酸が５００塩基または塩基対を超える場合、６×ＳＳＣ(クエン酸ナトリウム食塩水)、０.５％ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム)、１００μｇ／ｍｌ変性超音波処理サケ精子ＤＮＡである。ハイブリッド形成は、６８℃で少なくとも１時間実施し、次いでフィルターは６８℃で１×ＳＳＣ、またはより高度の緊縮条件、０.１×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳで洗浄する。
【０１２５】
「緊縮ハイブリッド形成条件」の替わり得る例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(７５０ｍＭ−ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸トリナトリウム)、５０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７.５)、５×デンハルト(Denhardt)溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｐｇ／ｍｌ変性せん断サケＤＮＡからなる溶液中、４２℃で一夜培養、次いで０.１×ＳＳＣ中、６５℃で少なくとも１時間、フィルターを洗浄することである。
【０１２６】
核酸がナイロン膜に固定されていて、プローブが１２個ないし５０個の塩基のオリゴヌクレオチドである場合の適切なハイブリッド形成溶液の例は、３Ｍ塩化トリメチルアンモニウム(ＴＭＡＣｌ)、０.０１Ｍリン酸ナトリウム(ｐＨ６.８)、１ｍＭ−ＥＤＴＡ(ｐＨ７.６)、０.５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性超音波処理サケ精子ＤＮＡおよび０.１乾燥脱脂乳である。最適のハイブリッド形成温度(Ｔｍ)は、ハイブリッド鎖のＴｉ以下の５℃となるように通常選択する。Ｔｉはプローブとその標的間で形成されるハイブリッドの不可逆性融解温度である。プローブと標的間に何らかのミスマッチが存在する場合、Ｔｍはより低くなる。一般的な手引きとして、３Ｍ−ＴＭＡＣｌ中の１７量体に対する推奨されるハイブリッド形成温度は４８〜５０℃である；１９量体については５５〜５７℃；そして２０量体については５８〜６６℃である。
【０１２７】
ＧＴ遺伝子発現のレベルは、ポリペプチド(ＧＴタンパク質)のレベルについてスクリーニングすることによっても検出し得る。例えば、ＧＴタンパク質と免疫反応するモノクローナル抗体は、試験サンプルを選抜するために使用され得る。かかる免疫学的アッセイ法は当該技術分野において既知の簡便なフォーマットで実施し得る。それらはウエスタンブロット、免疫組織化学的アッセイ法およびＥＬＩＳＡアッセイ法である。機能的アッセイ法もまた、タンパク質結合決定など、使用し得る。
【０１２８】
本発明のＧＴタンパク質およびその相同体またはフラグメントは、そのタンパク質に選択的に結合し、そうすることでそのタンパク質の活性を調節する物質を生成させるために使用し得る。かかる物質は、例えば、抗体であり、本発明は取分け配列番号２に示すタンパク質に結合することのできる抗体にまで及ぶ。特に、該抗体は中和化抗体であり得る。
【０１２９】
本明細書にて使用する場合、抗体という用語は、全抗体またはそのフラグメント、例えば、Ｆ(ab)2、Ｆab、ＦＶ、ＶＨまたはＶＫフラグメント、一本鎖抗体、多量体単一特異性抗体もしくはそのフラグメント、または二もしくは多重特異的抗体もしくはそのフラグメントを意味するものと理解すべきである。これらのタイプの抗体誘導体およびそれらの頭字語は当業者周知である。
【０１３０】
別の特定の態様において、ＧＴタンパク質に向けられた抗体は、ＯＡ疾患の検出、予知、診断および病期判定に使用し得る。当該技術分野で既知の種々の組織学的染色法、例えば、免疫化学的染色方法も使用し得る。銀染色はＧＴタンパク質を検出する一方法である。本発明において有用なその他の染色方法は、文献(例えば、A Textbook of Histology, Eds. Bloom and Fawcett, W.B. Saunders Co., Philadelphia (1964))を参照されたい。
【０１３１】
本発明のさらなる局面によると、ＯＡの診断または予知またはモニターするためのアッセイ法におけるＧＴタンパク質に選択的な抗体の使用が提供される。本発明のこの局面で使用する抗体は、ＧＴタンパク質／ポリペプチドを用いて調製し得る。
【０１３２】
標識抗体を作製し、検出する方法は周知である(Campbell; Monoclonal Antibody Technology, in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology(モノクローナル抗体技術；生化学と分子生物学における実験室技法), Volume 13. Eds: Burdon R et al. Elsevier, Amsterdam (1984))。抗体という用語は、モノクローナル抗体(実質的に均一の集団)およびポリクローナル抗体(不均質の集団)の双方を含む。この用語はまた特にヒト化およびキメラ抗体をも含む。特異的抗原に対するモノクローナル抗体は、当業者既知の方法により、例えば、ハイブリドーマ細胞、ファージディスプレイ・ライブラリーまたは他の方法から得ることができる。モノクローナル抗体は、特に、ヒト、ラットまたはマウス由来のものでよい。ヒトのモノクローナル抗体の生産のためには、ハイブリドーマ細胞を、免疫した動物、例えば、マウスからの脾臓細胞と腫瘍細胞とを融合することにより調製し得る。適切に分泌するハイブリドーマ細胞をその後に選択することができる(Koehler & Milstein, Nature 256:495-497, 1975); Cole et al., “Monoclonal antibodies and Cancer Therapy(モノクローナル抗体および癌治療法)”, Alan R Liss Inc, New York N.Y. pp 77-96, 1985)。かかる抗体は免疫グロブリンクラスのいずれでもよい；例えば、ＩgＧ、ＩgＭ、ＩgＥ、ＩgＡ、ＩgＤおよびそのサブクラスである。
【０１３３】
ポリクローナル抗体は動物(例えば、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ヒツジなど)を抗原、例えば、本発明にて使用されるＧＴタンパク質のなどで免疫させることにより生成させ得る。
【０１３４】
ＧＴポリペプチド(類)は当業者既知の種々の技法により調製し得る。ＲＮＡ転写物は既知方法(Sambrook et al.、上記)に従い、インビトロ翻訳技法により本発明のポリペプチドを調製するために使用することができる。別法として、ＧＴポリペプチド(類)は化学的に合成することができる。例えば、メリーフィールド法(Merryfield technique (J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1968)))による。多数の自動化ポリペプチド合成装置、例えば、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)４３１Ａペプチド合成装置も現在は存在する。別法として、ＧＴポリペプチド(類)は組換え発現技法を用いて、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から製造される。様々な発現／宿主システムをＧＴコード配列の発現のために使用し得る。これらは限定されるものではないが、微生物類、例えば、プラスミド、コスミドもしくはバクテリオファージで発現されるバクテリア；発現ベクターで形質転換した酵母；バキュロウイルス発現系を形質導入した昆虫細胞系；植物ウイルス発現系を形質導入した植物細胞系、例えば、カリフラワーモザイクウイルス；または哺乳動物細胞系(例えば、アデノウイルスベクターを形質導入したもの)などである；最も適切な系の選択は選択の問題である。好ましくは、ＧＴタンパク質は真核細胞、取分け哺乳動物、昆虫および酵母細胞で発現される。哺乳動物細胞は組換えＧＴタンパク質への翻訳後修飾を提供する；該修飾は折りたたみおよび／またはリン酸化である。
【０１３５】
発現ベクターは通常、複製の起点、プロモーター、翻訳開始部位、選択肢としてシグナルペプチド、ポリアデニル化部位、および転写終結部位を含む。これらのベクターは通常選択のために、１つ以上の抗生物質耐性マーカーを含む。上に記載したように、適当な発現ベクターはプラスミド、コスミドまたはウイルス(ファージまたはレトロウイルスなど)でよい。ポリペプチドのコード配列は、ポリペプチドをエンコードする核酸配列が、発現ベクターの構築物により形質転換または形質導入された宿主中でＲＮＡに転写されるように、適切なプロモーター、制御要素および転写ターミネーターの制御下に置かれる。コード配列は、該ポリペプチドを宿主細胞から分泌させるために、シグナルペプチドまたはリーダー配列を含んでいてもよいし、いなくてもよい。ＧＴポリペプチドの発現と精製は、当該技術分野で周知の方法を用いて容易に実施し得る(例えば、Sambrook et al.、上記)。
【０１３６】
このように製造されたＧＴポリペプチドは動物の接種に使用し、その動物から、導入したＧＴタンパク質／ポリペプチドに対し特異的な抗体を含む血清標品をその後に得ることができる。
【０１３７】
げっ歯類の抗体は当該技術分野で既知の技法に従って、組換えＤＮＡ技法を用いてヒト化し得る。あるいは、当該技術分野で既知の技巧を用いて、本発明のポリペプチドに対するキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆabフラグメントを開発してもよい(Huse et al., Science 256:1275-1281, 1989)。このように製造される抗体は、当該技術分野の分子生物学者または免疫学者にとって明らかな多くの用途を有する。かかる用途は限定されるものではないが、酵素発現のモニター、酵素活性を測定するアッセイ法の開発、および治療剤としての使用などである。酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)は当該技術分野で周知であり、試験サンプル中のＧＴタンパク質またはそのポリペプチドフラグメントを検出するのに特に適している。
【０１３８】
ＧＴ特異的抗体は、体液中のＧＴタンパク質を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイに、または免疫組織学化学的もしくは他の手段によって使用し得る。さらに、抗体はディップスティック上または同様の診断ディバイス上、個々に、または複数抗体のパネルの一部として、共通のタンパク質に反応する対照抗体を一緒に、使用することができよう。
【０１３９】
試験サンプル中のＧＴを検出するために必要な必須の材料および試薬は、すべてキットの中に一緒にまとめてもよい。かかるキットは１つ以上の診断ｃＤＮＡプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーを、対照プローブ／プライマーと共に構成され得る。キットはマイクロアレイ基板、例えば、フィルター膜またはシリコンベースの基板などに固定したプローブを含み得る。キットは対照となるべき種々の生理的状態(正常、ＢＰＨ、限られた腫瘍および転移腫瘍)の組織から由来する総ＲＮＡを含み得る。また、キットは適切な包装とし、本発明方法での使用のための説明書を含み得る。
【０１４０】
本発明の別の局面によると、ＯＡを診断または予知またはモニターするための診断キットであって、ＧＴに選択的にハイブリッド形成もしくは結合し得る１種以上の診断プローブおよび／または診断プライマーおよび／または抗体を含んでなるキットが提供される。
【０１４１】
「診断キット」という用語は、このキットを診断用にのみ限定しようとするものではなく、他の用途、例えば、予知、病期モニターおよび治療効果の研究での用途も包含することが認識されよう。
好適な態様においては、診断(検出)プローブがマイクロアレイ上で提供される。
【０１４２】
かかるキットはさらに適切な緩衝剤および／または熱安定ポリメラーゼなどのポリメラーゼ、例えば、taq ポリメラーゼなどを含み得る。それらはまた併用／定常プライマーおよび／または対照プライマーまたはプローブを含み得る。併用／定常プライマーはＰＣＲを実施するために使用されるプライマー対の一部であるプライマーである。かかるプライマーは通常鋳型鎖に正確に相補性である。キットはまた１個の発蛍光団(例えば、Ｃy５)で標識した対照の典型的な骨関節症ＲＮＡを含み得る。使用に際し、生検または体液または細胞から由来する患者のＲＮＡは、別の発蛍光団(例えば、Ｃy３)で標識することができ、従って、ＲＮＡは混合してアレイにハイブリッド形成させ得よう。蛍光比、例えば、Ｃy３：Ｃy５の比を検出する機器が利用可能であり、ＧＴの過剰発現を検出するために使用できよう。
【０１４３】
別の態様において、キットは組織切片中でｍＲＮＡにハイブリッド形成させるために適する１種以上の特異的プローブを含んでなる。該キットはまた呈色または蛍光顕微検出用のハイブリッド形成緩衝剤および検出試薬をも含み得る。別の態様において、キットはＧＴｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる定量のために、任意に標識した特異的オリゴヌクレオチドのセットを含んでなる。これらのプライマーは特異的ＰＣＲ産物の正確な定量を可能とするスコーピオンプライマーであり得る(Whitcombe et al., Nature Biotechnol. 17:804-807, 1999)。別法として、タックマン(Taqman)またはモレキュラービーコン・プローブがこの目的のために、キットで提供され得る。キットの一形態は数個のウエルに特異的試薬を容れたマイクロタイタープレートであり、このウエルに抽出ＲＮＡの一部分をピペット添加する。マイクロタイタープレートは適切な機器上で温度循環させ得るが、この機器はまたプレートウエルからの蛍光発光を読み取ることができるものである(例えば、パーキン・エルマー７７００)。
【０１４４】
別の態様において、キットは免疫組織化学的分析に使用するＧＴタンパク質に特異的な１種以上の抗体を含んでなる。
別の態様において、キットは本明細書に同定したＧＴタンパク質に特異的な１種以上の抗体を含んでなるＥＬＩＳＡキットである。
【０１４５】
本発明の別の局面においては、ＯＡに罹患する患者の処置方法であって、当該患者に有効量のＧＴ特異抗体を投与することを特徴とする方法が提供される。
本発明の別の局面によると、ＧＴ遺伝子は遺伝子療法に使用し得る；例えば、インビボで該タンパク質の産生を修飾したい場合であり、本発明はかかる使用にまで及ぶ。
【０１４６】
経路マッピングは、ＧＴタンパク質が相互作用する細胞中の各タンパク質、言い換えると、これらのタンパク質のそれぞれも相互作用するタンパク質を決定するために使用し得る。この方式において、疾患の刺激を細胞の応答につなぐ特異的な重要なシグナル伝達経路を同定することが可能であり、それによって治療に介在する新規の潜在的標的の同定が可能となる。
【０１４７】
本発明のさらなる局面によると、ＯＡに関わるさらなる遺伝子標的を同定する研究においての、ＧＴ遺伝子またはそのフラグメントの使用が提供される。
【０１４８】
本発明による遺伝子についての情報はまた、例えば、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡの使用により、その発現を調節する能力を提供する。特定の遺伝子(例えば、本明細書に同定されるＧＴ)の発現レベルを阻害または低下させる一つの治療手段は、アンチセンス療法を使用することである。アンチセンス療法はアンチセンス核酸分子を利用する；この核酸分子はＤＮＡまたはＲＮＡ(“オリゴヌクレオチド”)の合成セグメントであり、鏡像特異的ｍＲＮＡ配列として設計され、タンパク質産生を遮断する。一度形成されたｍＲＮＡは、細胞のタンパク質製造「工場」であるリボソームに結合する；リボソームは効率的にＲＮＡ配列を読み取り、遺伝子により指定された特異的タンパク質分子を製造する。アンチセンス分子が細胞に送達された場合(例えば、本来のオリゴヌクレオチドとして、または適当なアンチセンス発現ベクターを経由して)、それがメッセンジャーＲＮＡに結合するが、その理由はその配列が塩基の標的配列の補体となるように設計したからである。一度二本鎖が結合すると、ｍＲＮＡは最早リボソームによるコードされたタンパク質の製造を指令し得なくなり、細胞の酵素により急速に分解される；その結果、アンチセンス・オリゴヌクレオチドが開放され、それが別のｍＲＮＡの同一メッセンジャー鎖を求め、その能力を奪う。
【０１４９】
従って、本発明の別の局面によると、ＯＡの罹患患者を処置する方法であって、当該患者に、ＧＴ遺伝子のｍＲＮＡに結合し得る有効量のアンチセンス分子を投与し、ＧＴ遺伝子のタンパク質産物の発現を阻害することを特徴とする方法が提供される。
タンパク質生産の完全な阻害は、事実、有害であり得る。正常組織におけると同様の状態に阻害することが望ましいと思われる。
【０１５０】
アンチセンス療法のこの局面は、ＯＡ障害が問題のＧＴ遺伝子の過剰発現の直接の原因である場合に適用可能であるが、当該遺伝子が間接的にＯＡ障害を惹き起こす場合にも、同様に適用可能である。ＧＴ遺伝子とｍＲＮＡ配列の情報により、当業者は適切なアンチセンス核酸治療分子を設計し、それを必要に応じ、投与することができる。
【０１５１】
治療剤の可能性をもつアンチセンス・オリゴヌクレオチド分子は、確立された技法を用いて実験的に決定することができる。哺乳動物細胞における本発明のＧＴ遺伝子のダウンレギュレーション発現方法を可能とするために、例示としてのアンチセンス発現構築物は、例えば、pＲＥＰ１０ベクター(インビトロゲン・コーポレーション)を用いて、容易に構築することができる。転写物はこのタイプの構築物を形質移入された細胞中の遺伝子の翻訳を阻害することが期待される。アンチセンス転写物は、本来の遺伝子転写物の翻訳を阻害するために有効であり、本明細書に記載の作用(例えば、組織生理の調節)を誘導することができる。ＧＴ遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの部分と相補性であり、ハイブリッド形成可能なオリゴヌクレオチドは、治療用途が期待される。米国特許 US 5,639,595, “Identification of Novel Drugs and Reagents(新規医薬品および試薬の同定)”(１９９７年６月１７日発行)はインビボ活性を示すオリゴヌクレオチド配列を同定する方法について徹底的に記載しており、これを参照により本明細書の一部とする。ＧＴ遺伝子配列から由来するランダム・オリゴヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、細胞中に形質転換される。次いで、このオリゴヌクレオチドの所望の活性から生じる表現型について、この細胞をアッセイする。所望の表現型を含む細胞が同定されたことで、所望の活性を有するオリゴヌクレオチドの配列を同定することができる。同定はベクターを回収することにより、またはポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)増幅と挿入された核酸物質を含む領域の配列決定により実施し得る。アンチセンス分子は、アンチセンス療法用に合成することができる。これらのアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートなどのＤＮＡの安定な誘導体、ＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡなどのＲＮＡの安定な誘導体、または他のオリゴヌクレオチド類似体などである。米国特許 US 5,652,355 “Hybrid Oligonucleotide Phosphorothioates(オリゴヌクレオチド・ホスホロチオエート)”(１９９７年７月２９日発行)および US 5,652,356 “Inverted Chimeric and Hybrid Oligonucleotides(反転キメラおよびハイブリッド・オリゴヌクレオチド)”(１９９７年７月２９日発行)は、生理的に安定なアンチセンス分子の合成と作用について記載している(これらを参照により取り込む)。アンチセンス分子はマイクロインジェクション、リポソーム被包形成によるか、またはアンチセンス配列を取り込むベクターからの発現により、細胞に導入することができる。
【０１５２】
上に記載したように、アンチセンス核酸分子は、ＲＮＡの一部の安定な形状が当該技術分野において、半減期の長いことが知られており、ベクターを使用せずに直接投与し得るという理由で、ＲＮＡとしても提供し得る。さらに、ＤＮＡ構築物はリポソーム、リポソーム介在形質移入および当該技術分野において既知の他の方法により送達し得る。
【０１５３】
配列番号１の遺伝子と共に操作するアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡは、常套の手段を用いて、標準的な分子生物学により、および／または上記の化学合成により製造することができる。所望により、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡは化学的に修飾して、インビボでの分解を防止するか、または細胞膜の通過および／またはｍＲＮＡを不活性化することの可能な物質の通過を容易にするようにする(例えば、リボザイムがそこに結合し得る)；本発明はかかる構築物に及ぶ。アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡは、ＧＴ遺伝子産物の過剰または過少−調節産生が関わっている疾患または障害の処置に有用であり得る。
【０１５４】
別法として、リボザイム分子はインビボでＧＴｍＲＮＡを切断し、分解するように設計し得る。リボザイムは高特異性を有するエンドリボヌクレアーゼ活性を有するＲＮＡ分子である。ハンマーヘッド型リボザイムはハイブリッド形成領域および触媒領域を含んでなり、その前者の領域はヌクレオチド配列において、標的ＲＮＡの少なくとも一部に相補性であり、また後者の領域は標的ＲＮＡを認識し、切断するように改造される。ハイブリッド形成領域は、好ましくは少なくとも９個のヌクレオチドを含む。かかるリボザイムの設計、構築および使用については当該技術分野において周知であり、文献(Haselhoff and Gerlach, Nature. 334:585-591, 1988)により完全に記載されている。別の代替法においては、ＧＴ遺伝子の５’−領域にハイブリッド形成し、三重へリックス構造を形成するように設計したオリゴヌクレオチドは、ＧＴ遺伝子の転写を遮断または減少させるために使用し得る。別の代替法においては、プラスミドベクターにクローン化したＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)オリゴヌクレオチドまたは短鎖(１８〜２５ｂｐ)ＲＮＡｉ ＧＴ配列は、二本鎖ＲＮＡを哺乳動物細胞に導入し、ＧＴメッセンジャーＲＮＡを阻害し、および／または分解させるように設計する。ＧＴ ＲＮＡｉ分子はアデニン／アデニン(ＡＡ)または少なくとも(いずれかの塩基−Ａ,Ｕ,ＣまたはＧ)Ａ…で始まる１８または１９または２０または２１または２２または２３、または２４または２５個の塩基対の二本鎖ＲＮＡ分子からなり、好適な長さは２１塩基対であって、２つのヌクレオチド３’オーバーハングまたはヘアピン形成４５〜５０量体のＲＮＡ分子をもつ個々のＧＴ配列に特異的である。かかる小型の阻害性ＲＮＡ分子の設計、構築および使用は、当該技術分野において周知であり、以下の文献により完全に記載されている：Elbashir et al., (Nature. 411(6836):494-498, 2001); Elbashir et al., (Genes & Dev. 15:188-200, 2001); Harborth, J. et al. (J. Cell Science 114:4557-4565, 2001); Masters et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:8012-8017, 2001); and, Tuschl et al.,  (Genes & Dev. 13:3191-3197, 1999)。
【０１５５】
本発明のさらなる局面によると、ＧＴタンパク質に対して作用する小分子薬物またはＧＴｍＲＮＡに対して作用する阻害性核酸分子により処置することの必要なヒトを処置する方法であって、
ｉ)ヒトにおけるＧＴ遺伝子の、またはそれに隣接する多型を検出することであり、その診断が好ましくはＧＴ遺伝子の：5283、21037、21134、25515、34419、59661、59968および73821..73842(配列番号１の位置として定義)位置からなる群より選択される１箇所以上の位置での配列を決定すること、またはそれとＤ’０.９以上の連鎖不平衡にある多型を決定することからなる； 
ii)ＧＴ遺伝子における、またはそれに隣接する多型を参照してヒトの状態を判定すること；および
iii)ＧＴタンパク質に対して作用する薬物またはＧＴｍＲＮＡに対して作用する阻害性核酸分子の有効量を投与すること；
を特徴とする方法が提供される。
【０１５６】
別の態様において、この局面は表２に示した検出または１つ以上の多型に適用される。
【０１５７】
本発明のさらなる局面によると、ＧＴタンパク質に対して作用する小分子薬物またはＧＴｍＲＮＡに対して作用する阻害性核酸分子により処置することの必要なヒトを処置する方法であって、
ｉ)ヒトから入手した組織サンプル中のＧＴｍＲＮＡのレベルを測定すること；および
ii)ＧＴｍＲＮＡの正常レベルを参照してヒトの状態を判定すること；および
iii)有効量の薬物を投与すること；
を特徴とする方法が提供される。
【０１５８】
本発明のさらなる局面によると、ＧＴタンパク質に対して作用する小分子薬物またはＧＴｍＲＮＡに対して作用する阻害性核酸分子により処置することの必要なヒトを処置する方法であって、
ｉ)ヒトから入手した組織サンプル中のＧＴタンパク質のレベルを測定すること；および
ii)ＧＴタンパク質の正常レベルを参照してヒトの状態を判定すること；および
iii)有効量の薬物を投与すること；
を特徴とする方法が提供される。
【０１５９】
本発明のさらなる局面によると、ＯＡ障害に罹患する患者の処置方法であって、ＧＴの転写または発現を低下させ得る化合物を該患者に投与することを特徴とする方法が提供される。
【０１６０】
本発明のさらなる局面によると、ＯＡ障害に罹患する患者の処置方法であって、ＧＴのｍＲＮＡに対し標的とした阻害性核酸分子を該患者に投与することを特徴とする方法が提供される。
【０１６１】
本発明のさらなる局面によると、ＯＡ障害を処置するための医薬の製造における、ＧＴを対象とする阻害性核酸分子または抗体の使用が提供される。
【０１６２】
本発明の上記局面のそれぞれにおいて、「阻害性核酸分子」は、アンチセンス、リボゾーム、三重ラセンアプテマーおよびＲＮＡｉ分子からなる群より選択される。
【０１６３】
本発明のそれぞれの局面は、一次および二次ＯＡを含むＯＡに適用可能であるばかりでなく、他の関節症、例えば、椎間板変性症および顎関節症；代謝性関節症、例えば、ＣＰＰＤおよびヒドロキシアパタイトを含む慢性結晶沈着性疾患ならびにリウマチ様関節炎などの炎症性疾患に寄与する関節症にも適用し得る。
【０１６４】
本明細書にて使用するすべての技術・科学用語はすべて、特に他の定義をしない限り、当業者が共通して理解する意味と同じ意味を有する(例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリッド形成技法および生化学)。標準技法が、分子、遺伝子および生化学的方法のために使用される。全般的参照例：Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(分子クローニング；実験室手引書), 3d ed. (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology(分子生物学における簡潔なプロトコール)(1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.; ならびに Guthrie et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(酵母遺伝学と分子生物学への手引き), Methods in Enzymology, Vol. 194, Academic Press, Inc., (1991), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, Calif.), McPherson et al., PCR Volume 1, Oxford University Press, (1991), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique(動物細胞の培養；基礎技術の手引書), 2nd Ed. (R. I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, N.Y.), and Gene Transfer and Expression Protocols(遺伝子移動および発現プロトコール), pp. 109-128, ed. E. J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.)。これらの文献を参照により本明細書の一部とする。
【０１６５】
以下の非制限実施例により本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【０１６６】
ＯＡと関連する遺伝子としてのＧＴの同定
我々はＳＮＰ遺伝子型決定に基づく連鎖−ベースの方法により、対象の１１ｑ領域を検討した。
【０１６７】
１．方法
WO 00/20632 に記載された２０ｃＭ１１ｑ領域を、マイクロサテライト・マーカーＤ１１Ｓ４０４６およびＤ１１Ｓ１３２０により、その範囲を定めた。連鎖不平衡分析により、対照(例えば、患者の無症候配偶者)と比較した事例(すなわち、関節置換を受けたＯＡと診断された患者)におけるマーカーＤ１１Ｓ９３７の２５８ｂｐの対立遺伝子の過剰透過を同定した。
【０１６８】
この領域を詳細にマップ化するために、我々はＳＮＰの発見と遺伝子型決定を実施し、マーカー間の距離を開けた。遺伝子型決定は膝または股のＯＡに罹患し、関節置換を受けている対象からの６００種のＤＮＡについて実施した。この事例の無症候配偶者からの５００種の対照ＤＮＡの遺伝子型決定も実施した。
【０１６９】
Ａ．ＳＮＰ発見
マーカーＤ１１Ｓ４０４６およびＤ１１Ｓ１３２０の間に存在するＳＮＰは、以下の方法により同定した。
(ｉ)ＢＡＣ(バクテリア人工染色体)ショットガン・ライブラリー・スクリーニング
デジョン(deJong)ＲＣＰＩ−１１ＢＡＣライブラリー(Osoegawa et al. Genome Research. 11(3):483-496, 2001)に対するハイブリッド形成は、対象領域のＳＴＳ(配列タグ標識部位)由来の３２Ｐ末端標識オリゴ体のプールにより実施した。次いで、ＢＡＣをＰＣＲにより個々にチェックし、１３７の個々のＢＡＣを単離した。
【０１７０】
ＢＡＣ ＤＮＡは５００ｍｌの一夜培養物から抽出キット(ヌクレオン／テップネル(Nucleon/Tepnel)、マンチェスター、英国)を用いて調製した。２つの方法を用いてライブラリーを構築した。第一の方法では、ＢＡＣ ＤＮＡをＳau３aで部分的に消化し、アガロース電気泳動により分離した。０.５〜４ｋｂサイズ範囲のフラグメントをゲルから切り出し、精製した。このフラグメントをｐＺＥＲＯプラスミドベクター(インビトロゲン)にショットガンクローン化し、単一クローンを取り出し、常套のＴ７およびＳＰ６プライマーを用いて、その挿入断片をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物は色素ターミネーター化学を用いて配列決定した。第二の方法においては、ＢＡＣ ＤＮＡはヒドロシェアー(Hydroshear；ジーンマシン、サンカルロス、カリフォルニア)を用いて１Ｋｂのサイズにせん断し、ｐＺＥＲＯプラスミドベクターにサブクローンした。単一クローンを取り出し、その挿入断片を、常套のＭ１３前進および逆進プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物はＭ１３Ｆ＆Ｒプライマーを用いて、メガベース(MegaBace；アマーシャム・ファルマシア、リットル・シャルフォント、英国)上で配列決定した。
【０１７１】
すべてのライブラリー中のＰＣＲ産物から描かれた配列を、セックマン(SeqMan)パッケージ(ＤＮＡスター、マジソン、ウィスコンシン)を用いてコンティグに構築した。５００ｂｐ以上のサイズの配列を分析し、ベクターと高品質とするために平滑断端とし、反復／大腸菌ＤＮＡに対して遮蔽し、新規のＢＡＣ配列を同定した。プライマーはこの配列に対して多型スクリーニングプロトコールに使用するために、４００〜６００ｂｐのＰＣＲ産物を生成するように設計した。スクリーニングのために総計８３７のＳＴＳを生成させた。プライマー対はすべて３種の別個の増幅条件で試験し、作業プライマーは１プール(１７個体)において多型選抜を受け、３個体について前進および逆進方向の配列決定を行った。配列分析は、フレッド／フラップ／コンスド(Phred/Phrap/Consed)を用いて実施した。
【０１７２】
ショットガン・ライブラリーの分析は、総計１３２のＳＮＰを生成した。分析した１.６ｋｂの配列ごとに、平均１個のＳＮＰが見出された。
【０１７３】
(ii)ゲノムクローンの分析
我々は対象の領域のマッピングのために３３０のゲノムクローン(リサーチ・ジェネティックス)を同定し、その配列を用いて直接多型スクリーニング用の配列を提供することができた。ゲノムクローン配列を用いて、各クローンにつき少なくとも６個のプライマー対を設計し、引き続くスクリーニングはウエイブ(WAVE；トランスゲノミック・インク、クリュー、英国)と配列分析を組合わせて実施した。
この方法により１４１個のＳＮＰが見出された。
【０１７４】
(iii)ＳＮＰ集合体ＳＮＰ
ヒト一塩基多型のＳＮＰ集合体データベースの第４公開は、１０２,７１９のＳＮＰを含んでおり、そのすべてが放射線ハイブリッド・マッピングおよび／またはゲノム配列作業ドラフトへの「インシリコ」マッピングによるヒトゲノムに支えられていた。
総計１６８個のユニーク提示ＳＮＰが対象の２０Ｍｂ領域から検索された。
【０１７５】
Ｂ．ＳＮＰ遺伝子型
工程Ａにおいて発見されたＳＮＰは、膝または股のＯＡに罹患していて、関節置換を受けている対象からの６００のＤＮＡについて、およびこの事例の非症候配偶者からの５００の対照ＤＮＡについて、遺伝子型を決定した。遺伝子型決定は対立遺伝子特異的増幅(ＡＲＭＳ)および一ヌクレオチドプライマー延長を用いて実施した。
【０１７６】
Ｃ．マイクロサテライト・遺伝子型決定
１０種のマイクロサテライト・マーカー、Ｄ１１Ｓ９１６、Ｄ１１Ｓ１３２１、Ｄ１１Ｓ４０８１、Ｄ１１Ｓ４１２８、Ｄ１１Ｓ４１７９、Ｄ１１Ｓ９１１、Ｄ１１Ｓ４０７９、Ｄ１１Ｓ９０６、Ｄ１１Ｓ９３７、Ｄ１１Ｓ４１６６は、この症例の対照同齢集団において遺伝子型決定した。
【実施例２】
【０１７７】
連鎖分析
Ａ．マイクロサテライト
マイクロサテライトの分析はクランプ(CLUMP)プログラム(著者：D. Curtis、ヒトゲノム・マッピング・プロジェクト)において実施した。このプログラムは症例全般と対照を比較し、単一のｐ値を生じるものであり、従って、各対立遺伝子(各マーカーではない)に対する多重試験の補正を必要としないものである。このプログラムはモンテ・カルロ・シミュレーションを実施し、データに対する正確なｐ値を生ずる。
関連はＤ１１Ｓ９３７(ｐ＝０.０４)について確認された；また、さらなる関連はＤ１１Ｓ４０８１(ｐ０.０２)に見られた；これはＤ１１Ｓ９３７から約０.７ｃＭの地図上にある。
【０１７８】
Ｂ．ＳＮＰ
対立遺伝子の頻度は症例と対照間の各ＳＮＰについて比較した；ＯＤＤ比は９５％信頼区間で計算した (Jurg Ott, Analysis of Human Genetic Linkage 3rd Ed, John Hopkins Univ. Press, 1999)。ハーディ−ワインバーグ(Hardy-Weinberg)平衡にある＞５％の対立遺伝子頻度をもつＳＮＰの分析は、この疾患との有意な関連性(ｐ.０１−０.０５)を示す９となった(配列番号４〜１１および表３)。これらは多重試験実施のために補正しなかった。９個のＳＮＰすべてが同じ３ｃＭ放射ハイブリッド区間(区間Ｄと呼称)内に存在し、それがまた１１ｑ１３.５に位置するマイクロサテライト・マーカーＤ１１Ｓ９３７に接近する地図上にあることが判明した。
【実施例３】
【０１７９】
遺伝子発見
３５種のバクテリア人工染色体(ＢＡＣ)は、区間Ｄに地図上位置することが判明した。セックマン(Seqman)を用いる分析に従った。ＢＡＣは２.８Ｍｂをカバーする１３８コンティグに組み入れた。ＧＴと呼称するこの遺伝子はこの区間内に見出された。
【実施例４】
【０１８０】
多型発見
この領域に対するアンサンブル配列の公開に従い、ＧＴのｃＤＮＡは、エキソン／イントロン境界、ＵＴＲおよび潜在的なプロモーター領域を同定するために、ゲノム配列にマップ化した。
【０１８１】
ＰＣＲプライマーは、エキソン、ＵＴＲ、潜在的なプロモーター領域および隣接するイントロン配列に及ぶように設計した。配列決定は、２９名の関係のない白人種について実施し、多型を同定するために、この配列をポリフレッド／フラップ／コンスドにアラインメントさせた。
見出された多型を表２に示す。
【０１８２】
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【０１８３】
【表７】
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【０１８４】
【表８】
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【実施例５】
【０１８５】
ＧＴ活性のアッセイおよびＧＴ活性のインヒビター検出のためのアッセイ
粗製酵母膜の調製
定常期まで一夜増殖の酵母(サッカロミセス・セレビシエ株Y01759−ユーロスカーフ(EUROSCARF)、フランクフルト、ドイツ)培養物を１リットルの適切な酵母培地にＯＤ６００ｎｍ＝０.２まで希釈し、ＯＤ６００ｎｍが１.５ないし２に達するまで、３０℃、２２０ｒｐｍでの振盪により培養した。ソルバル(Sorval)ＲＣ５Ｃ遠心機とＳＬＡ３０００ローターによる４℃、４０００ｒｐｍでの１０分間の遠心分離により、細胞をペレット化した。培地を流し出し、細胞ペレットは先に進める準備が整うまで−２０℃に保存した；細胞は３７℃の水浴で２分以内で融解し、十分に冷却した溶解バッファー(５０ｍＭトリス・バッファー、ｐＨ７.５＋１ｘ完全ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ・インヒビター錠(ロシュ：１８７３５８０)／１００ｍｌバッファー)を加え、ＯＤ６００ｎｍ＝１が２ｘ１０７細胞／ｍｌに等しいことに基づいて、細胞を１ｘ１０９／ｍｌの密度とした。等容量の酸洗浄ガラスビーズ４２５〜６６０ミクロン(シグマＧ８７７２)を加え、２分間、フルスピードでボルテックス処理することにより、細胞を溶解した。細胞懸濁液を氷上で冷却し、２分間ボルテックスで再処理し、氷に戻した。単層のミラクロス(カルビオケム；４７５８５５)を通してガラスビーズを濾去した。濾過した懸濁液を５０ｍｌのチューブに移し、ソルバル(Sorval)ＲＴ６０００Ｂ遠心機にて、(１２００Ｘｇ)４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を取り出し、１４ｍｌベックマン・ウルトラクリアー・チューブ(３４４０６０)に上部０.５ｃｍまで満たし、１００,０００Ｘｇ、４℃で９０分間、遠心分離した。膜ペレットを０.５〜１ｍｌの５０ｍＭトリス・バッファーｐＨ７.５＋１０％グリセロールに再懸濁し、バイオラッドタンパク質アッセイキット(５００−０００６)を用いて、タンパク質濃度を測定した。膜は瞬間凍結し、−８０℃で保存した。
【０１８６】
小胞体酵母膜の調製
この調製は上記のように、粗製の酵母膜の調製のように実施したが、ただし、以下に詳述するようにさらにスピンを加えた。４０００ｒｐｍ(１２００Ｘｇ)での遠心分離からの上清をソルバル(Sorval)ＲＣ５Ｃ遠心機とＳＳ３４ローターによる４℃、９２００ｒｐｍ(１０,０００Ｘｇ)で１５分間、遠心分離した。さらなるスピンからの上清を１４ｍｌベックマン・ウルトラクリアー・チューブに移し、１００,０００Ｘｇで遠心分離した。上記のように操作を進めた。
【０１８７】
脂質結合オリゴ糖の調製
脂質結合オリゴ糖は、文献(Glycobiology vol 11(4):321-333, 2001)に詳述されているとおりに調製した。１０.５リットル未満の酵母培養物を用いる場合、容量は適切にその規模を下げた。溶媒はジーンバック(GeneVac)Ｈ−４シリーズII遠心エバポレーター中、減圧下に蒸発させた。
【０１８８】
グルコシル・トランスフェラーゼ活性のための合成基質
ＧlcＮＡc２Ｍan９(a1-３)Ｇlc１はデキストラ・ラボラトリーズ(Dextra Laboratories；英国、バークシャーＲＧ６ ６ＢＺ) が注文合成した。
ＧlcＮＡc２Ｍan９(a1-３)Ｇlc１オリゴ糖は、ＧＴの活性を測定するために開発されたアッセイ法において、ＧＴの合成基質として利用することができる。
【０１８９】
濾過アッセイによるグルコシル・トランスフェラーゼ活性の測定
グルコシル・トランスフェラーゼ酵素活性は、変化する量の酵母膜(０.２５〜２０ｕｇ)を１００μｌのアッセイバッファー(５０ｍＭトリスｐＨ７.５、１ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム)中、２μＣｉウリジンジホスホ−Ｄ−［６−３Ｈ］グルコース(アマーシャムＴＲＫ３８５)、１０μＭ冷ウリジン５’−ジホスホ−グルコース(アマーシャムＵ４６２５)、６０μｇ／ｍｌデオキシノジリマイシン(シグマＤ９３０５)と、３７℃で９０分間培養することにより測定した。膜は、パッカード・フィルターメイト・セル・ハーベスターを用いて、ＧＦ／Ｃフィルタープレート(ライフ・サイエンス６００５１７４)で濾過し、６×２００μｌ／ウエルのアッセイバッファーで洗浄した。フィルタープレートは３７℃で６０分間乾燥し、２５μｌのマイクロシント４０(パッカード６０１３６４１)を加え、シールし、パッカード・トップ・カウントＮＸＴを用いて計測した。
【０１９０】
シンチレーション近接アッセイ(ＳＰＡ)によるグルコシル・トランスフェラーゼ活性の測定
グルコシル・トランスフェラーゼ酵素活性は、変化する量の酵母粗製膜(０.２５〜２０ｕｇ)を１００μｌのアッセイバッファー(５０ｍＭトリスｐＨ７.５、１ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム)中、１０μＣｉウリジンジホスホ−Ｄ−［６−３Ｈ］グルコース(アマーシャムＴＲＫ３８５)、１〜１０μｇ合成基質(デキストラ・ラボラトリーズ(Dextra Laboratories)ＭＣ１１３１)または５〜５０ｕｌのＬＬＯ、６０μｇ／ｍｌデオキシノジリマイシン(シグマＤ９３０５)と、３７℃で９０分間培養することにより測定した。０.５ｍｇの麦芽アグルチニンＰＶＴ ＳＰＡビーズ(アマーシャムＲＰＮＱ０００１)を加え、室温でゆるやかに攪拌しながら１２０分間培養した：５０μｌの７.５Ｍ塩化セシウムを加え、攪拌せずに１２０分間培養することによりビーズを浮かせ、次いで、パッカード・トップ・カウントＮＸＴを用いてプレートを計測した。
上記のＧＴ活性アッセイおよびオリゴ糖基質は、ＧＴ活性を調節し得る化合物を選抜するために適合させ得る。
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年5月20日(2008.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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