(57)【要約】本発明は、Ｓｔｘ１タンパク質における１３Ｃ４抗体に対するエピトープの発見に基づく。本発明は、１３Ｃ４モノクローナル抗体エピトープに対するエピトープを含む、全長ではないＳｔｘ１ポリペプチドを特徴とする。また、本発明は、Ｓｔｘ１タンパク質の１３Ｃ４エピトープに対して特異的な抗Ｓｔｘ１抗体を産生するための方法を特徴とする。さらに、本発明は、１３Ｃ４エピトープを含むポリペプチド、または本発明の方法を使用して開発された抗Ｓｔｘ１抗体により、志賀毒素関連疾病（例、溶血性尿毒症症候群、ならびに、大腸菌および志賀赤痢菌の感染に関連する疾病）を罹患する、または発症する危険性がある対象を治療するための方法を特徴とする。さらに、本発明は、本発明の方法を使用して開発された抗体を用いる、試料におけるＳｔｘ１の検出を特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号：１、２、および３に記載されている配列から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドにより哺乳動物を免疫化する段階であって、該ポリペプチドが全長Ｓｔｘ１を含まない、段階；および
（ｂ）該哺乳動物の組織、または該組織を使用して作製したハイブリドーマ細胞から、Ｓｔｘ１タンパク質の１３Ｃ４エピトープに特異的に結合する抗Ｓｔｘ１抗体を精製する段階
を含む、志賀毒素１型（Ｓｔｘ１）タンパク質の１３Ｃ４エピトープに特異的に結合する抗Ｓｔｘ１抗体を産生する方法。
【請求項２】
Ｓｔｘ１タンパク質の１３Ｃ４エピトープに特異的に結合する抗Ｓｔｘ１抗体が、Ｓｔｘ２に結合しない、請求項１記載の方法。
【請求項３】
（ｃ）インビトロ中和アッセイにおいて、Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２に対する抗体をスクリーニングする段階であって、Ｓｔｘ１の細胞毒性の少なくとも５０％を中和する抗体が、Ｓｔｘ１タンパク質の１３Ｃ４エピトープに特異的に結合する抗Ｓｔｘ１抗体である、段階
をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ポリペプチドが、配列番号：１、２、および３に記載されているアミノ酸のうちの少なくとも２つを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ポリペプチドが、配列番号：４に記載されているアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ポリペプチドが配列番号：４のアミノ酸配列からなる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
段階（ａ）が、アジュバントを使用することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
抗体がポリクローナル抗体またはその断片である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
抗体がモノクローナル抗体またはその断片である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
抗体が修飾抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つのポリペプチドを薬学的に許容される担体とともに含む、Ｓｔｘ１に対する免疫反応を刺激するための組成物であって、該ポリペプチドが、配列番号：１、２、および３に記載されているアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含み、該ポリペプチドがＳｔｘ１の抗原性を有し、該ポリペプチドが全長Ｓｔｘ１を含まない、組成物。
【請求項１３】
ポリペプチドがキメラタンパク質である、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
キメラタンパク質が、配列番号：１、２、および３に記載されているアミノ酸配列、ならびにＳｔｘ１ではないタンパク質を含む、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
Ｓｔｘ１ではないタンパク質が足場（scaffold）タンパク質であり、配列番号：１、２、および３に記載されているアミノ酸配列が該足場タンパク質に挿入されている、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
Ｓｔｘ１ではないタンパク質が、ＳｔｘＢ２タンパク質またはその断片を含む、請求項１４記載の組成物。
【請求項１７】
Ｓｔｘ２に対する免疫反応を刺激しない、請求項１２記載の組成物。
【請求項１８】
キメラタンパク質が、配列番号：４に記載されているアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４記載の組成物。
【請求項１９】
キメラタンパク質が、配列番号：４に記載されているアミノ酸配列を含む、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
アジュバントをさらに含む、請求項１２記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１２または１８記載の組成物を対象に投与する段階を含む、対象においてＳｔｘ１に対する免疫反応を誘導する方法。
【請求項２２】
請求項１２または１８記載の組成物を対象に投与する段階を含む、対象において志賀毒素関連疾病を治療または予防する方法。
【請求項２３】
志賀毒素関連疾病が溶血性尿毒症症候群である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
志賀毒素関連疾病が大腸菌または志賀赤痢菌の感染に関連する、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
配列番号：１、２、および３に記載されているアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む志賀毒素１型（Ｓｔｘ１）タンパク質の１３Ｃ４エピトープに特異的に結合する、抗Ｓｔｘ１抗体、またはその断片であって、１３Ｃ４抗体（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７９４）、キメラ１３Ｃ４抗体、またはヒト化１３Ｃ４抗体の該Ｓｔｘ１タンパク質への結合を抑制する、抗Ｓｔｘ１抗体、またはその断片。
【請求項２６】
配列番号：１、２、および３に記載されている配列を含むポリペプチドのエピトープに特異的に結合する、請求項２５記載の抗体。
【請求項２７】
エピトープが配列番号：１、２、および３に記載されている配列を含む、請求項２６記載の抗体。
【請求項２８】
エピトープが立体配座エピトープである、請求項２６記載の抗体。
【請求項２９】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項２５記載の抗体またはその断片。
【請求項３０】
抗体がヒト化されている、請求項２５記載の抗体またはその断片。
【請求項３１】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項２５記載の抗体またはその断片。
【請求項３２】
Ｓｔｘ１と１３Ｃ４抗体との間の結合を抑制し、該１３Ｃ４抗体が０．５０ｎＭ以下のＫｄを有する、請求項２５記載の抗体またはその断片。
【請求項３３】
１３Ｃ４抗体が、マウス、ヒト化、またはキメラ１３Ｃ４抗体である、請求項３２記載の抗体またはその断片。
【請求項３４】
ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＡである、請求項２５記載の抗体またはその断片。
【請求項３５】
ＦａｂまたはＦｖ断片である、請求項２５記載の抗体またはその断片。
【請求項３６】
請求項２５記載の抗体またはその断片、および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項３７】
請求項２５記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項３８】
真核生物受容体であるグロボトリアオシルセラミドに対するＳｔｘ１の結合を抑制する、請求項２５記載の抗体。
【請求項３９】
（ａ）抗体とＳｔｘ１との間の複合体形成を可能とする条件下で、生体試料を請求項２５記載の抗体またはその断片と接触させる段階；および
（ｂ）該生体試料において該複合体を検出する段階
を含む、生体試料においてＳｔｘ１を検出する方法。
【請求項４０】
生体試料が、組織、細胞、細胞抽出物、体液、または生検標本に由来する、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、またはフローサイトメトリー法を使用して複合体を検出する、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
（ａ）対象から生体試料を採取する段階；
（ｂ）抗体とＳｔｘ１との間の複合体形成を可能とする条件下で、該生体試料を請求項２５記載の抗体またはその断片と接触させる段階；および
（ｃ）該生体試料において該複合体を検出する段階
を含む、対象において志賀毒素関連疾病を診断する方法であって、
該試料におけるＳｔｘ１の存在により、志賀毒素関連疾病を罹患する対象を診断する、方法。
【請求項４３】
志賀毒素関連疾病が溶血性尿毒症症候群である、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
志賀毒素関連疾病が大腸菌または志賀赤痢菌の感染である、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
請求項２５記載の抗体または抗原結合部分、および、該抗体を検出するための手段を含む、志賀毒素関連疾病を検出するための免疫検査キット。
【請求項４６】
請求項２５〜３６のいずれか一項記載の抗体またはその断片の薬学的有効量を対象に投与する段階を含む、対象において志賀毒素関連疾病を治療または予防する方法。
【請求項４７】
志賀毒素関連疾病が溶血性尿毒症症候群である、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
志賀毒素関連疾病が大腸菌または志賀赤痢菌の感染に関連する、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
配列番号：１、２、および３に記載されているアミノ酸配列の少なくとも１つを含むポリペプチドであって、全長Ｓｔｘ１を含まない、ポリペプチド。
【請求項５０】
配列番号：１、２、および３に記載されているアミノ酸配列を含む、請求項４９記載のポリペプチド。
【請求項５１】
Ｓｔｘ１ではないポリペプチドをさらに含むキメラタンパク質である、請求項４９または５０記載のポリペプチド。
【請求項５２】
Ｓｔｘ１ではないタンパク質が、ＳｔｘＢ２タンパク質またはその断片を含む、請求項５１記載のポリペプチド。
【請求項５３】
Ｓｔｘ１ではないタンパク質が足場タンパク質であり、配列番号：１、２、および３に記載されているアミノ酸配列が該足場タンパク質に挿入されている、請求項５１記載のポリペプチド。
【請求項５４】
配列番号：４に記載されているアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項５５】
配列番号：４に記載されているアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項５６】
配列番号：４に記載されているアミノ酸からなる、請求項５５記載のポリペプチド。
【請求項５７】
請求項４９、５４、または５５のいずれか一項記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項５８】
発現制御配列に動作可能に結合されている、請求項５７記載の単離された核酸分子。
【請求項５９】
請求項５８記載の単離された核酸分子を含む、ポリペプチドを発現することが可能なベクター。
【請求項６０】
請求項５９記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６１】
（ａ）請求項５２記載の核酸を宿主細胞に導入する段階、
（ｂ）宿主細胞からポリペプチドを精製する段階
を含む、配列番号：１、２、および３に記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドを調製する方法であって、該ポリペプチドが全長Ｓｔｘ１を含まない、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
概して、本発明は、志賀毒素関連疾病を治療および予防するための分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
米国では、志賀毒素産生性大腸菌（Ｓｈｉｇａ  ｔｏｘｉｎ（Ｓｔｘ）−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ））の感染は、年間、約１１０，０００件に上る。腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、特に血清型Ｏ１５７：Ｈ７は、Ｓｔｘ媒介疾病を発症することで知られているＳＴＥＣのサブセットである。Ｓｔｘ産生生物による感染から発症しうる合併症は、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）であり、溶血性貧血、トロンビンの血小板減少症、および腎不全を特徴とする。ＨＵＳを罹患する人の致死率は約５〜１０％であり、生存者は慢性的な腎障害を有する恐れがある。現在、Ｓｔｘ媒介疾病からの疾患を対処、または予防するためのＦＤＡに認可された療法またはワクチンはないが、今後のいくつかの有望な選択肢には、Ｓｔｘ２に結合し、中和するヒト化モノクローナル抗体と、中和反応を引き起こし、Ｓｔｘ１もしくはＳｔｘ２、またはＳｔｘ１およびＳｔｘ２の致死的処置に対して保護を提供するキメラＳｔｘＡ２／ＳｔｘＢ１トキソイドとが挙げられる。
【０００３】
本来、Ｓｔｘの２つの主な型は、Ｓｔｘ／Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２である。Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２が大腸菌から産生される一方、Ｓｔｘは、志賀赤痢菌１型から産生される。ＳｔｘおよびＳｔｘ１は、Ａサブユニットに１つだけアミノ酸の違いがあるが、ほぼ同一である。Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２の成熟ＡおよびＢサブユニットはそれぞれ、６８％および７３％の類似性を有する。アミノ酸配列の相違にも関わらず、ＳｔｘおよびＳｔｘ２の結晶構造は、著しく類似している（図１）。これらの毒素は、ポリクローナル抗血清により区別することができ、Ｓｔｘ１に対して生じるポリクローナル抗血清は、Ｓｔｘ２を中和せず、逆もまた同様である。Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２には変種が存在し、それには、Ｓｔｘ１ｃ、Ｓｔｘ１ｄ、Ｓｔｘ２ｃ、Ｓｔｘ２ｄ、活性化可能Ｓｔｘ２ｄ（Ｓｔｘ２−ａｃｔ．）、Ｓｔｘ２ｅ、およびＳｔｘ２ｆが含まれる。
【０００４】
志賀毒素は、ＡＢ５構造を有する複合体ホロトキシンである。活性ドメイン（Ａ）は、６０Ｓリボソームサブユニットの２８Ｓ  ｒＲＮＡを脱プリン化するＮ−グリコシダーゼを含み、それは、タンパク質合成を停止し、最終的には、細胞死に至らせる。Ａサブユニットは、約３２ｋＤａであり、トリプシンまたはフューリンによって、約２８ｋＤａのＡ１サブユニット、および単一ジスルフィド結合で結合した約５ｋＤａのＡ２ペプチドにタンパク質分解的に切断される。Ａ１サブユニットは、活性ドメインを含み、Ａ２ペプチドは、活性ドメインを結合ドメインに非共有結合する。結合ドメイン（Ｂ）は、Ａ２ペプチドのＣ末端が横断する５量体を形成する５つの同一の約７．７ｋＤａのモノマーからなる。Ｂサブユニットのそれぞれのモノマーは、それぞれのモノマー内でジスルフィド結合を形成する２つのシステイン残基を有する（図２）。Ｂの５量体は、真核生物の受容体であるグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）（またはＳｔｘ２ｅの場合、Ｇｂ４）を結合する。
【０００５】
これらの毒素の曝露の結果についての知識にも関わらず、現在、ＨＵＳに対する治療法またはワクチンは知られていない。抗生物質の使用は、細菌からの毒素放出を増加させて状況を悪化させる場合がある。従って、志賀毒素により産生されるＥＨＥＣの合併症を予防または治療するための化合物が必要とされる。ＣＮＳ、血液、および腎臓において感染した対象を治療、毒素の全身的作用を低下するためにこのような化合物を使用することができる。さらに、毒素を中和することが可能である場合、消化管の細菌を殺すために、抗生物質を与えることが可能である。またこのような化合物を使用して、ＥＨＥＣに感染する前に、曝露した個人、または高いリスクを有する個人を治療することにより、感染合併症を予防することも可能である。このような個人には、デイケアセンターの幼児または老人ホームの高齢者が含まれ、ＥＨＥＣによる下痢が認められてきた。これらの個人は、多くの場合、重度の合併症を伴い、ＥＨＥＣを発症する危険性が高まり、これらの環境でのＥＨＥＣのまん延は、珍しいことではない。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）１３Ｃ４は、Ｓｔｘ１のＢサブユニットを認識し、その細胞毒性を中和する。ＳｔｘＢ１とＳｔｘＢ２との間で類似した７３％のアミノ酸（ａａ）配列があるにも関わらず、１３Ｃ４  Ｍａｂは、ＳｔｘＢ２に結合しない。我々は、１３Ｃ４エピトープが、ＳｔｘＢ１とＳｔｘＢ２間の相違領域を包含することを発見した。１３Ｃ４  Ｍａｂは、ＳｔｘＢ１モノマー上に３つの領域が広がる不連続または立体配座エピトープを認識し、残基５５位を必要とする。３つの相違領域は（ａａ１〜６位（配列番号：１）、２５〜３２位（配列番号：２）および５４〜６１位（配列番号：３））、ＳｔｘＢ（ＳｔｘＢはＳｔｘＢ１と同一）の結晶構造上に互いに近接して位置することが分かった。２つの隣接領域（１〜６、５４〜６１位）のそれぞれは、システイン残基を含む。従って、１３Ｃ４エピトープは、配列番号：１、２、および３に記載されている少なくとも１つ、２つ、または３つすべての配列を含む。
【０００７】
従って、本発明は、Ｓｔｘ１の１３Ｃ４エピトープに特異的に結合する抗Ｓｔｘ１抗体（例、モノクローナルおよびポリクローナル抗体）および抗体断片を産生する方法を特徴とする。このような抗体または抗体断片は、Ｓｔｘ１に特異的に結合し、Ｓｔｘ２には結合しない。本方法は、配列番号：１、２、および３に記載されている少なくとも１つ、２つ、または３つすべての配列を含む、Ｓｔｘ１の断片（すなわち、全長ではないＳｔｘ１）を含むポリペプチドに対する哺乳動物の免疫付与を含み、本ポリペプチドには、全長Ｓｔｘ１を含まない。好ましくは、該方法は、配列番号：１および３を含むＳｔｘ１の使用を含む。一実施形態において、該方法は、配列番号：１、２、および３を含む、配列番号：４に記載されているアミノ酸配列と実質的に同一であるポリペプチドに対する哺乳動物の免疫付与を含む。
【０００８】
Ｓｔｘ１に特異的に結合し、Ｓｔｘ２に結合しない抗体を同定するために、抗Ｓｔｘ１抗体は、当技術分野において公知の、または例えば、本明細書に記載のインビトロ中和アッセイを含む本明細書に記載の標準方法を使用して、スクリーニングすることができる。また、抗原性ポリペプチド、本ポリペプチドを調製する方法も、本ポリペプチドをコードする核酸分子とともに（本核酸がベクターにおいて発現構築物に結合し、本ベクターが宿主細胞に挿入される場合を含む）、本発明の関連態様として含まれる。
【０００９】
また本発明は、Ｓｔｘ１の１３Ｃ４エピトープに特異的に結合する抗Ｓｔｘ１抗体を特徴とし、該抗体は、Ｓｔｘ１に特異的に結合し、Ｓｔｘ２には結合しない。本発明の好ましい抗体は、配列番号：１、２、および３に記載されている少なくとも１つ、２つ、または３つすべての配列を含むエピトープに、好ましくは配列番号：１および３により形成される結合部位に、最も好ましくは、３つすべてを含む部位に、結合する。エピトープは、アミノ酸配列が、エピトープ、またはＳｔｘ１タンパク質に存在する３つのエピトープ領域（配列番号：１、２、および３）を含むＳｔｘ２キメラタンパク質を含むＳｔｘ１ポリペプチドの立体構造に基づき、近接する、立体構造エピトープであり得る。該抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、Ｆａｂ、Ｆｖ、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、または抗体断片であり、本明細書に記載の方法により開発することができる。該抗体は、Ｓｔｘ１と１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ、または１ｐＭ以下のＫｄで結合することが好ましい。一例において、本発明の抗体は、１００ｎＭ〜１ｐＭの間のＫｄ値の抑制を含み、Ｓｔｘ１、または１３Ｃ４エピトープを含むキメラタンパク質への１３Ｃ４抗体の結合を抑制する。また、望ましくは、該抗体は、真核生物の受容体であるグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）への、Ｓｔｘ１の結合を抑制する。本発明の抗Ｓｔｘ１抗体は、１３Ｃ４、モノクローナル５−５Ｂ、または２Ｈ３抗体のマウス、ヒト化、またはキメラ型を含むことを意味していない。本発明は、本発明のいかなる抗体を産生するハイブリドーマ細胞系をもさらに含む。
【００１０】
本発明の別の態様は、少なくとも１つのペプチドを使用して、Ｓｔｘ１に対する免疫反応を刺激する組成物であり、ペプチドは、配列番号：１、２、および３に記載されている少なくとも１つ、２つ、または３つすべての配列を含み、全長Ｓｔｘ１ではない。該組成物は、アジュバントをさらに含むことができる。望ましくは、該ポリペプチドは、配列番号：４に記載されているアミノ酸配列、またはその断片に実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。また本発明は、１３Ｃ４エピトープを含むキメラペプチド（例、ＳｔｘＢ２など、足場（scaffold）タンパク質に挿入される配列番号：１、２、または３の少なくとも１つ、２つ、または３つすべてを含む、キメラペプチド）の使用を特徴とする。本ペプチドを使用して、溶血性尿毒症症候群、および大腸菌または志賀赤痢菌感染に関連する疾病を含むいかなる志賀毒素関連疾病に対しても免疫化する、または治療することができる。
【００１１】
本発明のさらに別の態様は、本発明の抗体のいずれかを使用して、生体試料（例、組織、細胞、細胞抽出物、体液、または生検）において、Ｓｔｘ１を検出する方法を特徴とする。本発明の検出方法は、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、またはフローサイトメトリー法を含む。本発明は、試料における、Ｓｔｘ１の同定に基づく志賀毒素関連疾病の診断を含む。また本発明は、志賀毒素関連疾病を検出するための免疫検査キットを特徴とし、該キットは、本発明の抗体および抗体を検出するための手段を含む。
【００１２】
本発明のさらに別の態様は、前述の方法のいずれかにより産生される抗体を使用して、志賀毒素関連疾病を治療する方法を特徴とする。志賀毒素関連疾病の例は、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）および大腸菌または志賀赤痢菌感染に関連する疾病を含む。これらの抗体は、他の志賀毒素関連タンパク質（例、Ｓｔｘ２）に特異的に結合する抗体を含むがこれらに限定されない他の療法との併用で投与することができる。
【００１３】
「１３Ｃ４エピトープ」とは、直線構造、あるいは、三次元配座の結果として、１３Ｃ４抗体に対する結合部位を形成するアミノ酸配列を意味する。本用語は、配列番号：１、２、および３に記載されている１つ、２つ、または３つの配列に実質的に同一である配列（例、配列番号：１および２、配列番号：２および３、配列番号：１および３、配列番号：１，２、および３）を含むいずれかの全長ではないＳｔｘ１タンパク質を含むことを意味する。１３Ｃ４エピトープを含むタンパク質の一例は、配列番号：４に記載されているアミノ酸配列に実質的に同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【００１４】
「Ｓｔｘ１の１３Ｃ４エピトープに特異的に結合する抗体」または「１３Ｃ４エピトープ特異的抗体」とは、１００ｎＭ〜１ｐＭのＫｄ値の１３Ｃ４エピトープを含む、Ｓｔｘ１タンパク質に結合する抗体を意味する。またこのような抗体は、Ｓｔｘ２タンパク質（例、Ｓｔｘ２に対して、１００ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、あるいは、１ｍＭ以上のＫｄ値を有する）への結合がほとんどない、または検出されないことを特徴とする。表面プラスモン共鳴ベースのアッセイ、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、および競合アッセイ（例、ＲＩＡ法）を含むが、これらに限定されない、当技術分野で公知のいかなるアッセイを使用して抗体親和性を決定してもよい。また、抗体は、本明細書に記載のように、インビトロ中和アッセイを施してもよい。１３Ｃ４エピトープに特異的に結合する抗体は、本明細書に記載のアッセイまたは当技術分野で公知のアッセイを使用して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、またはそれ以上、Ｓｔｘ１の細胞毒性を中和する。
【００１５】
「結合を抑制する」とは、例えば、ＥＬＩＳＡ法または本明細書に記載のＧｂ３受容体結合アッセイにより測定される場合、少なくとも５０％、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上、別のタンパク質に対するタンパク質の結合を減少させることを意味する。
【００１６】
「抗体」という用語は、広義に使用され、このような分子が望ましい生物活性（例、本明細書に記載のように、Ｓｔｘ１毒素の中和）を有するという条件で、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例、２重特異性抗体）、または抗体断片を含む。
【００１７】
「単離」とは、その自然環境の構成要素から同定され、分離および／または回収されるタンパク質を意味する。その自然環境の汚染物質の構成要素は、タンパク質に対する診断用または治療用の使用を典型的に妨げる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含んでもよい。
【００１８】
「全長ではないＳｔｘ１」とは、全長Ｓｔｘ１ポリペプチドの９０％、８０％、７０％、６０％、またはそれ以下のアミノ酸を含むタンパク質を意味する。
【００１９】
「実質的に同一」とは、例えば、下記に記載の方法を使用して最適に配置される場合、例えば、配列番号：４に記載されているものなどのＳｔｘ１、Ｓｔｘ２、またはキメラタンパク質などの第２の核酸またはアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する核酸またはアミノ酸配列を意味する。「実質的な同一性」とは、全長配列、エピトープまたは抗原性ペプチド、機能ドメイン、コードおよび／または調節塩基配列、エクソン、イントロン、プロモータ、およびゲノム配列など、様々な型および長さの配列を指すために使用してもよい。２つのポリペプチドまたは核酸配列の間の同一性の程度は、例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔなどの市販のコンピュータソフトウェア（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍ．  Ｓ．  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−７）、ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ  Ｐｌｕｓ（商標）、Ｓｃｈｗａｒｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆ（１９７９）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｏ．，Ｅｄ  ｐｐ  ３５３−３５８に組み込まれているような「Ｂｅｓｔ  Ｆｉｔ」（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，４８２−４８９（１９８１））、ＢＬＡＳＴ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ、（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｗ．Ｇｉｓｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）、ＢＬＡＳＴ−２、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、ＢＬＡＳＴ−Ｘ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、当技術分野の技術内である様々な方法で決定する。さらに、当業者は、比較される配列の長さで最大配列を達成するために必要とされるいずれかのアルゴリズムを含む、配列を測定するための適切なパラメーターを決定することができる。一般に、タンパク質に対して、比較配列の長さは、少なくとも６つのアミノ酸、好ましくは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、または７０のアミノ酸、またはタンパク質の最大の全長であり得る。核酸に対して、比較配列の長さは、一般に、少なくとも１８、２５、５０、１００、１５０または２００のヌクレオチド、または核酸分子の最大の全長であり得る。配列の同一性を決定するために、ＤＮＡ配列をＲＮＡ配列と比較する場合、チミンヌクレオチドは、ウラシルヌクレオチドと同等であることを理解されたい。同類置換は、典型的に、以下の群：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン内の置換を含む。
【００２０】
「断片」とは、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上を含むポリペプチドまたは核酸分子の一部を意味する。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００以上のヌクレオチド、または１０、２０、３０、４０、５０、６０、または７０以上のアミノ酸を含んでもよい。志賀毒素１型または志賀毒素２型のタンパク質の断片は、全長タンパク質よりも小さい任意の部分を含むことができる（全長を基準点とし、その後、例示的な長さを特定する）。断片はまた、ＳｔｘＢ１およびＢ２などのＳｔｘ１または２サブユニットを含むことができる。
【００２１】
「志賀毒素関連疾病」とは、志賀毒素を発現する病原体から生じるいかなる疾病をも意味する。「志賀毒素関連疾病」という用語は、溶血性尿毒症症候群、細胞性赤痢、志賀毒素産生大腸菌または志賀赤痢菌感染から生じる疾病を含むことを意味する。
【００２２】
発明の詳細な説明
概して、本発明は、Ｓｔｘ１タンパク質の１３Ｃ４エピトープに特異的に結合する抗体の産生を特徴とする。発明者らは１３Ｃ４エピトープを発見し、本エピトープが、配列番号：１、２、および３に記載されている少なくとも１つ、２つ、または３つすべての配列を含むことが明らかとなった。さらに、志賀毒素関連疾病（例、溶血性尿毒症症候群および大腸菌または志賀赤痢菌感染に関連する疾病）を罹患する対象、または発症する可能性のある対象を、１３Ｃ４エピトープを含むポリペプチド、またはＳｔｘ１タンパク質の１３Ｃ４エピトープに特異的に結合する抗体で治療することができることも発見した。
【００２３】
Ｉ．適応
本発明の化合物および方法は、志賀毒素関連疾病を罹患する対象、または発症する可能性のある対象を治療するために有用である。このような対象は、デイケアセンターの幼児または老人ホームの高齢者を含む。一例において、対象は、ＥＨＥＣの下痢が認められる、デイケアセンターの幼児または老人ホームの高齢者を含む。本例において、対象は、疾病を発症している、あるいは、していない可能性がある。志賀毒素関連疾病は、志賀赤痢菌または腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、特に血清型Ｏ１５７：Ｈ７を発症する志賀毒素での感染から生じるものを含む。これらの感染は、多くの場合、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）を生じ、溶血性貧血、トロンビンの血小板減少症、および腎不全を特徴とする。
【００２４】
ＩＩ．抗体
本発明は、志賀毒素Ｉ型（Ｓｔｘ１）タンパク質の１３Ｃ４エピトープに特異的に結合する抗体の産生を含む。望ましくは、このような抗体は、Ｓｔｘ２に検出可能に結合しない。標的タンパク質を認識し、特異的に結合する抗体の特異な能力は、志賀毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）に関連する疾病を診断し、治療するための手法を提供する。本発明は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、マウスおよび他の哺乳動物抗体、抗体断片、２重特異性抗体、抗体２量体または４量体、１本鎖抗体（例、Ｆａｂ、２重特異性抗体、およびＦａｂ’断片などのｓｃＦｖおよび抗原結合性抗体断片）、抗体結合領域に基づく組み換え結合領域、キメラ抗体、霊長類化抗体、ヒト化およびヒト抗体、ドメイン検出した抗体、および検出可能なマーカーで標識化した抗体、または毒素もしくは放射性核種で結合した抗体を含むが、これらに限定されない抗体の産生を提供する。このような抗体は、当技術分野に公知の従来の方法で産生される。一態様において、本発明は、Ｓｔｘ１の１３Ｃ４エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体または抗体断片の調製を含み、該調製は、配列番号：１、２、または３に記載されている配列から選択される少なくとも１つ、２つ、または３つの配列を含む全長ではないＳｔｘ１の断片の使用を含む。このような断片の一例は、配列番号：４のタンパク質である。
【００２５】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、抗原を注射した後、適切な間隔で追加免疫することによりウサギまたは他の動物に免疫化することで調製することができる。動物から採血し、通常、ＥＬＩＳＡ法により精製したタンパク質に対して血清を化学分析する。
【００２６】
１３Ｃ４エピトープに特異的に結合するポリクローナル抗体は、抗原およびアジュバントの複数の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により、動物において、生じさせることができる。二官能性物質または誘導体化剤（例、マレイミドベンゾイルスルフォスクシンイミドエステル（システイン残基を介して接合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介して）、グルタルアルデヒド、または無水コハク酸）を使用して、免疫性のある種（例、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、またはダイズトリプシン抑制因子）において、抗原性であるタンパク質に、標的アミノ酸配列を含む抗原または断片を結合させることは、有用でありうる。
【００２７】
例えば、１μｇから１ｍｇのペプチドまたは複合体（ウサギまたはマウスそれぞれに対して）を３容量のフロイント完全アジュバントと混合し、複数の部位に溶液を経皮注射することにより、１３Ｃ４エピトープ、抗原性複合体、または誘導体に対する免疫性を動物に与えることができる。１ヶ月後、複数の部位に皮下注射することにより、ペプチドまたはフロイント完全アジュバントの複合体の元の量の１／５から１／１０で動物に追加免疫を行う。７日から１４日後、動物から採血し、抗原またはその断片への抗体滴定のために、血清を化学分析する。滴定が安定するまで、動物に追加免疫を行う。好ましくは、同一のポリペプチドの複合体で、動物に追加免疫を行うが、異なるタンパク質へ、および／または異なる架橋試薬によって結合する。また複合体は、タンパク質融合物として、組み換え細胞培養において作成することもできる。また、アルム（alum）などの凝集剤を適切に使用して、免疫反応を強化する。
【００２８】
キメラ、ヒト化、またはヒトポリクローナルは、ヒト免疫グロブリン遺伝子の遺伝子組み換え動物において、または出発物質に対して対象から２つ以上のＳｔｘ１反応性Ｂリンパ球を単離することにより、産生される場合がある。
【００２９】
また、モノクローナル抗体を得るために、必要ならば反復して、ポリクローナルを（配座固定した抗原ペプチドに対する親和性を通して）精製および選択してもよい。代替的に、または付加的に、リンパ球からの単一抗体をコードする核酸のクローニングを使用してもよい。
【００３０】
モノクローナル抗体
本発明の別の実施形態において、モノクローナル抗体を、実質的に均質抗体の一集団（すなわち、集団を含む個々の抗体は、微量に存在する自然に生じる突然変異を除いて同一である）から得る。従って、「モノクローナル」という用語は、別個の抗体の混合物ではない抗体の特徴を示す。
【００３１】
モノクローナル抗体は、骨髄腫細胞またはリンパ腫細胞などの継続的に複製する腫瘍細胞を有する、免疫化マウス由来の脾細胞を融合することにより、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ法などの当技術分野で公知の方法により調製することができる。（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７；Ｇｕｌｆｒｅ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７３：１−４６，Ｌａｎｇｏｎｅ  ａｎｄ  Ｂａｎａｔｉｓ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。その後、ハイブリドーマ細胞を、限界希釈法によってクローン化し、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、またはバイオアッセイによる抗体産生のために上澄みを分析する。別の実施形態において、モノクローナルを組み換えＤＮＡ法により調製してもよい。
【００３２】
１３Ｃ４エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の調製のために、培養において、連続継代細胞系による抗体分子の産生を提供するいかなる技術を使用してもよい。例えば、もともとＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより開発されたハイブリドーマ技術（上記の（１９７５）、ならびにＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７６）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２−２９５、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら（１９８１）ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−ＣｅＩｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．５６３−６８１）、およびトリオーマ技術（ｔｒｉｏｍａ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ．４：７２−７９）、およびヒトモトクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）がある。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそのいずれのサブクラスを含むいずれの免疫グロブリン集合であってもよい。本発明において、Ｍａｂｓを産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養されてもよい。本発明の追加の実施形態において、モノクローナル抗体は、無菌動物において、当技術分野に公知の技術を使用して、産生することができる。
【００３３】
一般に、ハムスターなどのマウスまたは他の適切な宿主動物は、免疫付与に対して使用される抗原またはその断片に特異的に結合できる抗体を産生する、または産生することが可能なリンパ球を誘導するための１３Ｃ４エピトープを含むポリペプチドで免疫化する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化する。
【００３４】
免疫宿主動物（例、マウス）の脾細胞は、ハイブリドーマ細胞を形成するために、ポリエチレングリコールなどの適切な融剤を使用して、適切な骨髄腫細胞系で抽出し、融合される（Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。本発明によって、いかなる適切な骨髄腫細胞系も使用してもよいが、好ましい骨髄腫細胞は、効果的に融合し、選択した抗体産生細胞により抗体の安定した高レベル産生を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性であるものである。これらの中の好ましい骨髄腫細胞系は、米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡ）のＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来のものなどのマウス骨髄腫系、および米国メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ，ＵＳＡ）のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能なＳＰ−２細胞である。
【００３５】
従って、好ましくは、調製されたハイブリドーマ細胞を、融解していない、親骨髄腫細胞の増殖または生存を抑制する１つ以上の物質を含む適切な培地において、播種し、および生育させてもよい。その後、ハイブリドーマ細胞が保持される、このような選択および／または培地で得られるハイブリドーマ細胞を、化学分析し、１３Ｃ４エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体の産生を同定することができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、または放射免疫測定（ＲＩＡ）、あるいは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイ、もしくはＢｉａｃｏｒｅを使用して、決定される。例えば、モノクローナル抗体の結合親和性は、Ｍｕｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｏｄｂａｒｄ（１９８０）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０−２３９のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析により決定することができる。
【００３６】
望ましい特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、限界希釈法によって、クローンをサブクローン化し、標準方法により増殖してもよい（上記Ｇｏｄｉｎｇ）。さらに、動物において、ハイブリドーマ細胞を腹水癌などのインビボに増殖してもよい。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体を、例えば、タンパク質Ａセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析法、または親和性クロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、または血清から適切に分離する。
【００３７】
本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を使用して（例、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に、特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用）、容易に単離および配列する。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい源として役立つ。単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに配置され、その後、組み換え宿主細胞において、モノクローナル抗体の合成を得るために、大腸菌細胞、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの宿主細胞、またはその他免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞にトランスフェクトされる（例、Ｓｋｅｒｒａら（１９９３）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５：２５６−２６２およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ  （１９９２）  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．１３０：１５１−１８８を参照）。
【００３８】
またＤＮＡは、例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常領域に対するコード配列のすべて、または一部を置換することにより（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１−６８５５）、または非免疫グロブリンポリペプチドに対するコード配列のすべて、あるいは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合で結合することにより、修飾してもよい。そのような方法で、抗１３Ｃ４エピトープモノクローナル抗体の結合特異性を有するキメラまたはハイブリッド抗体を調製する。通常、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常領域に対し置換されるか、本発明による、１３Ｃ４エピトープに対して特異性を有する抗原結合部位と、異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を生み出すために、本発明の抗体の抗原結合部位の可変領域に対し置換される。
【００３９】
修飾抗体
本発明の修飾抗体は、キメラモノクローナル抗体（例えば、ヒト−マウスキメラ）、ヒトモノクローナル抗体、および霊長類化モノクローナル抗体を含むが、これらに限定されない。キメラ抗体は、マウスｍＡｂ由来のヒト免疫グロブリン定常領域および可変領域を有するものといった、異なる部分が異なる動物種に由来する、分子である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号および第４，８１６，３９７号を参照）。非ヒト（例、マウス）抗体のヒト化型は、非ヒト種からの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域などの非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列など）である（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照）。
【００４０】
ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、望ましい特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基により置き換えられる、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。一部の例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられる。またヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、導入されたＣＤＲ配列またはフレームワーク配列の中にも見られない残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通常は２つの可変領域の実質的にすべてを含むが、ＣＤＲ領域のすべて、または実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域と対応し、ＦＲ領域のすべて、または実質的にすべては、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のＦＲ領域である。またヒト化抗体は、好ましくは、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含み、通常はヒト免疫グロブリンのものである。
【００４１】
キメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、例えば、ＷＯ  ８７／０２６７１号、ＥＰ  １８４，１８７号、ＥＰ  １７１，４９６号、ＥＰ  １７３，４９４号、ＷＯ  ８６／０１５３３号、ＵＳ  ４，８１６，５６７号、ＥＰ  １２５，０２３号、Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３、Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：３４３９−３４４３、Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６、Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：２１４−２１８、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５、Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９、Ｓｈａｗら（１９８８）Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２２９：１２０２−１２０７、Ｏｉら（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．４：２１４；ＵＳ  ５，２２５，５３９号、Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４、およびＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記載の方法を使用して、当技術分野に公知の組み換えＤＮＡ技術により産生することができる。ヒト化抗体のさらなる考察、およびその関連方法に関しては下記を参照。
【００４２】
組み換え抗体を生成するための別の高効率の手段は、Ｎｅｗｍａｎ（（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１０：１４５５−１４６０）により開示される。また、米国特許第５，７５６，０９６号、第５，７５０，１０５号、第５，６９３，７８０号、第５，６８１，７２２号、および第５，６５８，５７０号も参照。
【００４３】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当技術分野に公知である。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよびその共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６を含む）に従って、げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列とヒト抗体の対応する配列とを置換することによって、本質的に実行され得る。従って、そのようなヒト化抗体は、キメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号および第６，３３１，４１５号）。実際には、ヒト化抗体は、典型的にいくつかのＣＤＲ残基およびおそらくはいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体における類似部位からの残基によって置換される抗体である。
【００４４】
ヒト化抗体を調製するために使用される、軽鎖および重鎖の双方のヒト可変領域の選択は、抗原性を低下するために非常に重要である。いわゆる最良適合法に従い、げっ歯類抗体の可変領域の配列は、既知のヒト可変領域配列の全ライブラリに対して、スクリーニングされる。その後、げっ歯類配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体に対するヒトフレームワーク（ＦＲ）として認められる（Ｓｉｍｓら（１９９３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６−２３０８；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用する。同一のフレームワークは、いくつかの異なるヒト化抗体に使用してもよい（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５−４２８９；Ｐｒｅｓｔａら（１９９３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３−２６３２）。
【００４５】
また、抗体は、抗原（すなわち、Ｓｔｘ１の１３Ｃ４エピトープ）および他の好ましい生物学的特性に対する高親和性の保持によりヒト化されることが望ましい。この目的を達成するために、親ならびにヒト化配列の三次元のモデルを使用した、親配列および様々な概念的ヒト化生成物の分析を通じて、ヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択した候補免疫グロブリン配列の有望な三次元の立体配座構造を例示し、表示するコンピュータプログラムも使用可能である。これらの表示の検査は、候補免疫グロブリン配列の機能において、残基の可能性のある役割の分析、すなわち、その抗原に結合するための候補免疫グロブリンの能力に影響を及ぼす残基の分析を可能にする。このようにして、ＦＲ残基は、標的抗原に対する増大した親和性のような、望ましい抗体特性を達成するために、コンセンサスおよびインポート配列から選択され結合され得る。一般に、ＣＤＲ残基は直接、かつ最も実質的に、抗原結合への影響に関与する。
【００４６】
完全ヒト抗体は、ヒト対象の治療処置のために有用である。例えば、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現することはできないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができる遺伝子導入マウスを使用して、このような抗体を産生してもよい。例えば、１３Ｃ４エピトープを含むポリペプチドなどの選択した抗原で標準の方法において、遺伝子導入マウスに免疫を与えることができる。例えば、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ  ９４／０２６０２号、第ＷＯ  ００／７６３１０号、米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５４５，８０７号、第５，５６９，８２５号、第６，１５０，５８４号、第６，５１２，０９７号、および第６，６５７，１０３号、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：２５５１、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら（１９９３）Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３−４０、Ｍｅｎｄｅｚら（１９９７）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅ．１５：１４６−１５６、およびＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５を参照。
【００４７】
またヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法により作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の導入に対するヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系は、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ（１９８４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１−３００５、Ｂｒｏｄｅｕｒら（１９８７）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、およびＢｏｅｒｎｅｒら（１９９１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５に記載されている。
【００４８】
また選択したエピトープを認識する完全ヒト抗体は、誘導選択といわれる技術を使用して、生成することもできる。この手法では、例えば、マウス抗体などの選択された非ヒトモノクローナル抗体を使用して、同一のエピトープを認識する、完全ヒト抗体の選択を誘導する（Ｊｅｓｐｅｒｓら（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１２：８９９−９０３）。
【００４９】
１本鎖Ｆｖおよび抗体を産生するために使用できる技術例は、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号、Ｈｕｓｔｏｎら（１９９１）Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２０３：４６−８８、Ｓｈｕら（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０：７９９５−７９９９、およびＳｋｅｒｒａら  （１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０に記載されるものを含む。
【００５０】
あるいは、ファージ提示法（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３）を使用して、非免疫ドナー由来免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ヒト抗体およびインビトロ抗体断片を産生することができる。ファージ提示は、様々な形式において実施することができる。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌｉｉｓｗｅｌｌ（１９９３）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．３：５６４−５７１を参照。ファージ提示のために、Ｖ遺伝子セグメントのいくつかのソースを使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫マウスの膵臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムランダムコンビナトリアルライブラリからの抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。非免疫ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、多様なアレイの抗原（自己抗原を含む）に対する抗体は、Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７、またはＧｒｉｆｆｉｔｈら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４に記載される技術に本質的に従って単離することができる。
【００５１】
本発明は、１３Ｃ４エピトープを含むタンパク質に特異的に結合する、免疫グロブリン分子の機能的に活性な断片、誘導体またはアナログを提供する。この文脈において、「機能的に活性な」とは、断片、誘導体またはアナログが、断片、誘導体またはアナログが由来する抗体により認識される、同一の抗原を認識する抗抗イディオタイプ抗体（すなわち、３次抗体）を誘導することができることを意味する。具体的には、好ましい実施形態において、免疫グロブリン分子のイディオタイプの抗原性は、抗原を特異的に認識するＣＤＲ配列のＣ末端にあるフレームワークおよびＣＤＲ配列の削除により強化されてもよい。抗原に結合するＣＤＲ配列を決定するために、ＣＤＲ配列を含む合成ペプチドを、当技術分野に公知の任意の結合アッセイ法により抗原を有する結合アッセイに使用することができる。
【００５２】
本発明は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、およびｓｃＦｖなどだが、それに限定されない抗体断片を提供する。特異的エピトープを認識する抗体断片は、例えば、ペプシンまたはパパイン媒介分割などの公知の技術により生成することができる。
【００５３】
また本発明は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖２量体、またはＦｖまたは１本鎖抗体（ＳＣＡ）などのいずれかの最小断片（例、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｂｉｒｄ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２、Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９−５８８３、およびＷａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４に記載）、または本発明の抗体と同一の特異性を有する他の任意の分子を提供する。１本鎖抗体は、アミノ酸橋を介してＦｖ領域の重鎖および軽鎖断片を架橋することにより形成され、１本鎖ポリペプチドを得る。大腸菌における、機能的Ｆｖ断片アセンブリ法を使用してもよい（Ｓｋｅｒｒａら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１）。
【００５４】
あるいは、少なくとも抗体のＦａｂをコードするクローンを、特異的抗原を結合するＦａｂ断片のクローンに対して、Ｆａｂ発現ライブラリをスクリーニングすることにより（例、Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１に記載）、または抗体ライブラリをスクリーニングすることにより（例、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：  ６２４  −  ６２８、Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  （１９９７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９４：４９３７−４９４２を参照）、採取してもよい。
【００５５】
他の実施形態において、本発明は、本発明の免疫グロブリンの縮合タンパク質、またはその機能的に活性な断片を提供する。一例において、免疫グロブリンは、免疫グロブリンではない別のタンパク質のアミノ酸配列（またはその部分、好ましくはタンパク質の少なくとも１０、２０または５０のアミノ酸部分）のＮ末端またはＣ末端のいずれかにおいて、共有結合（例、ペプチド結合）を介して縮合される。好ましくは、免疫グロブリン、またはその断片は、定常ドメインのＮ末端で、他のタンパク質に共有結合される。上記のように、縮合タンパク質は、精製を促進し、インビボ半減期を増加し、免疫系への上皮バリアーを通して抗原の送達を強化する場合がある。
【００５６】
別の実施形態において、本発明は、プールした抗体、抗体断片、および本明細書に記載の他の抗体変異体の組成物および使用を提供する。例えば、２つ以上のモノクローナルを使用のためにプールしてもよい。
【００５７】
治療のための投与
また本発明は、志賀毒素関連疾病を罹患する対象、または発症する危険性がある対象に、上記の方法を使用して開発された抗体（例、Ｓｔｘ１の１３Ｃ４エピトープに特異的に結合する抗体）を投与することを特徴とする。
【００５８】
本発明の抗体は、良好な医療と合致する方法において、調剤され、投薬され、投与されるであろう。これに関連して、考慮すべき要因は、治療中の特定の疾患、治療中の特定の対象、個々の対象の病態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与法、投与計画、および医師に既知の他の要因を含む。投与されるＳｔｘ１の１３Ｃ４エピトープに特異的に結合する抗体の薬学的な有効量は、このような考慮事項に準拠し、志賀毒素関連疾病、またはそれと関連する症状を予防、回復、または治療、あるいは安定させるために必要な最小量である。１３Ｃ４エピトープに対する特異的な抗体は、任意で、志賀毒素関連疾病を予防または治療するために現在使用される１つ以上の薬剤（例、１１Ｅ１０およびＴＭＡ−１５、またはそのヒト化またはキメラ誘導体を含む、Ｓｔｘ２に対する特異的な抗体）で調剤されるが、必ずしもそうである必要はない。このような他の薬剤の有効量は、製剤に存在するＳｔｘ１の１３Ｃ４エピトープの特異的な抗体の量、疾患または治療の型、および上記に記載の他の要因により異なる。
【００５９】
抗体は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻腔内を含む、いずれかの適切な手段により投与される。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与を含む。さらに、抗体は、特に次第に低下する抗体の用量を用いる、パルス注入により適切に投与される。ある程度、投与が一時的または慢性であるかどうかにより、好ましくは、注射により、最も好ましくは、静脈注射または皮下注射により投薬される。
【００６０】
ＩＩＩ．ワクチン
本発明は、Ｓｔｘ１タンパク質に対して免疫反応を刺激するための組成物を特徴とする。
【００６１】
志賀毒素関連疾病を罹患する対象、または発症する危険性がある個人を、本発明の１３Ｃ４エピトープを含む組成物（例、ワクチン）の、好ましくは抗原性有効量における投与により治療することができ、ここで、該ポリペプチドは、全長Ｓｔｘ１ポリペプチドを含まない。該ペプチドは、予防的および／または治療的に投与することができる。
【００６２】
異なるワクチンの型を当技術分野に公知の標準手順に従い、開発することができる。例えば、ワクチンは、ペプチド、核酸、細菌またはウイルスから作られるワクチンであってよい。１３Ｃ４エピトープを含むポリペプチドをコードするポリペプチドまたは核酸を含むワクチン製剤は、安定剤を含む様々な他の成分を含んでよい。またワクチンは、１つ以上の適切なアジュバントを含む、またはそれと併用することもできる。ワクチンにおける１３Ｃ４エピトープを含むアジュバントとポリペプチドとの比率は、当業者による標準方法で決定してもよい。
【００６３】
別の実施形態において、ペプチドワクチンは、以下を含む多くの方法において、予防または治療ワクチンとして、１３Ｃ４エピトープまたはその機能的な誘導体を含むペプチドを使用してもよい：１）同一配列のモノマーまたは多量体として、２）１３Ｃ４エピトープの抗原性を増加するために、エピトープ（例、クラスＩ／ＩＩ標的配列）および／または追加的な抗体、ＴヘルパーまたはＣＴＬエピトープの凝集を促進し、提示またはプロセシングを促進することができる追加的配列と連続的、または非連続的に結合、３）ワクチン（例、脂肪酸またはアシル鎖、ＫＬＨ、破傷風トキソイド、またはコレラ毒素）の抗原性または送達を増加する薬剤に化学修飾、または共役、４）上記のいずれかの組み合わせ、５）水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、フロイントアジュバントなどの油中水乳剤、アルミニウム塩、サポニンまたはトリペルテン、ＭＰＬ、コレラ毒素、ＩＳＣＯＭ’Ｓ(登録商標)、ＰＲＯＶＡＸ(登録商標)、ＤＥＴＯＸ(登録商標)、ＳＡＦ、フロイントアジュバント、Ａｌｕｍ(登録商標)、Ｓａｐｏｎｉｎ(登録商標)など、特に、米国特許第５，７０９，８６０号、第５，６９５，７７０号、第５，５８５，１０３号に記載される特定のものを含むが、これらに限定されないアジュバント；および／またはリポソーム、ＶＰＬまたはウイルス様粒子、マイクロエマルジョン、弱毒化細菌または死細菌およびウイルスベクター、ならびに分散性ミクロスフェアを含むが、これらに限定されない送達媒体（例、Ｋｅｒｓｔｅｎ  ａｎｄ  Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ（２００４）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．３：４５３−４６２、Ｓｈｅｉｋｈら（２０００）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２：３７−５４を参照）、と上記の任意の組み合わせ、および６）任意の経路による投与、またはエクスビボで抗原により細胞を負荷する手段として。
【００６４】
志賀毒素関連疾病に対する予防的治療または治療のいずれかとして投与した、ポリペプチドが全長ではないＳｔｘ１である、１３Ｃ４エピトープを含むポリペプチドの用量は、当業者により決定することができる。通常、用量は、約１０μｇから１，０００ｍｇ、好ましくは約１０ｍｇから５００ｍｇ、さらに好ましくは約３０ｍｇから１２０ｍｇ、さらに好ましくは約４０ｍｇから７０ｍｇ、最も好ましくは約６０ｍｇの１３Ｃ４エピトープを含むポリペプチドを含む。
【００６５】
１３Ｃ４エピトープを含むポリペプチドの少なくとも１用量が、対象に投与され、好ましくは少なくとも２用量、さらに好ましくは４用量、投与の最大総用量は６以上までである。初回量を投与する場合、最後に免疫付与してから１週間または２週間の間隔で、１３Ｃ４エピトープを含むポリペプチドの追加抗原投与量、１３Ｃ４エピトープより少ない、または同一量を含む１つの追加抗原投与量を投与することが望ましい場合がある。一例において、免疫付与の投与計画は、１週間間隔で、４用量で投与されるであろう。ポリペプチドまたは核酸が胃で分解される恐れがあるため、免疫付与は、非経口投与（例、皮下、筋肉内、静脈内、または皮内投与）が好ましい。免疫性を与えられた対象の経過は、一般の医学的評価、血清および／または胃内視鏡検査による感染に対するスクリーニングにより追跡してもよい。
【００６６】
ＩＶ．実施例
マウス１３Ｃ４モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、ＳｔｘＢ１に結合し、Ｓｔｘ１を中和するが、約７３％のアミノ酸の類似性があるにもかかわらず、ＳｔｘＢ２に結合せず、Ｓｔｘ２を中和しない（図３に記載される配列）。１３Ｃ４  ＭＡｂエピトープは、ＳｔｘＢ１において、６つの連続アミノ酸のいずれにも及ばない非線形エピトープであったことを上記に示した。Ｂｏｙｄら（（１９９１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：７５０−７５７）は、１３Ｃ４  ＭＡｂエピトープは、立体配座エピトープであり、それぞれのＳｔｘ１Ｂモノマー内に形成されるジスルフィド結合は、１３Ｃ４  ＭＡｂがＳｔｘ１に結合するのに適切な立体構造を生成するために不可欠であるという結論を下した（図４）。近年、１３Ｃ４  ＭＡｂは、成熟Ｂサブユニットにおいて、３つのアミノ酸のみＳｔｘ１とは異なるＳｔｘ１ｄを検出しないことが報告された。本願では、Ｓｔｘ１に結合し、中和する１３Ｃ４  ＭＡｂのエピトープマッピングを記載する。
【００６７】
１３Ｃ４  ＭＡｂは、Ｓｔｘ１、ＳｔｘＢ１、および、ＳｔｘＢ１の３つの固有領域全てを含む３重キメラＢサブユニットと強力に反応したが、ＳｔｘＢ１の２つの隣接領域を含む２重キメラＢサブユニットとは、弱く反応するのみであった。他のキメラについては、シグナルを検知しなかった。３重キメラＢサブユニットで免疫化したマウスは、Ｓｔｘ１の致死的処置に対して保護されたが、Ｓｔｘ２に対してはそうではなかった。この結果は、同定されたアミノ酸が１３Ｃ４エピト−プであることを実証し、また、このＳｔｘＢ１エピトープをＳｔｘ２Ｂ五量体に組み込むことで、抗Ｓｔｘ２中和抗体の誘導に必要なＳｔｘＢ２上の部位を遮断、あるいは置換したであろうことを示唆する。１３Ｃ４  ＭＡｂは、Ｓｔｘ１からの成熟Ｂサブユニット内において３つのアミノ酸が異なるＳｔｘ１変異型であるＳｔｘ１ｄを検出できないため、単一のアミノ酸置換をＳｔｘＢ１において行い、Ｓｔｘ１ｄを模倣させるようにした（Ｔ１Ａ、Ｇ２５Ａ、およびＮ５５Ｔ）。１３Ｃ４  ＭＡｂは、Ｔ１ＡおよびＧ２５Ａ変異型のＳｔｘＢ１のどちらをも認識したが、Ｎ５５Ｔ変異型は認識しなかった。この結果は、残基５５位が１３Ｃ４  ＭＡｂエピトープにとって重大な意味を持つことを示唆している。１３Ｃ４  ＭＡｂはまた、Ｎ５５Ｔ変異型のＳｔｘ１ホロ毒素を中和することはできなかったが、Ｓｔｘ１ならびにＴ１ＡおよびＧ２５Ａ変異型のＳｔｘ１ホロ毒素のどちらをも中和した。ここで、１３Ｃ４  ＭＡｂは、ＳｔｘＢ１上の３領域にまたがる不連続、あるいは立体配位のエピトープを認識し、残基５５位を必要とすることが結論付けられる。
【００６８】
材料および方法
細菌株、プラスミドおよび培地
組み換えプラスミドの選択のため、ルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）培地またはＬＢ寒天（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｓｐａｒｋｓ，ＭＡ）で細菌を増殖させ、必要に応じて、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補った。
【００６９】
キメラｓｔｘＢ１／ｓｔｘＢ２をコードするプラスミドの構築
１３Ｃ４  ＭＡｂエピトープを含む１つ、２つ、または３つすべての推定ＳｔｘＢ１領域を含む７つのキメラｓｔｘＢ１／ｓｔｘＢ２セットを、一連のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生成し、続いて、オーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）工程を行った。初めに、ｓｔｘＢ１およびｓｔｘＢ２を、ＰＣＲによりｓｔｘ１またはｓｔｘ２を含むクローンから増幅し、ｓｔｘＡ１およびｓｔｘＡ２遺伝子を除去し、ｓｔｘ１およびｓｔｘ２天然プロモータ領域ならびにｓｔｘＢ１およびｓｔｘＢ２を、それぞれＳＯＥにより共にスプライスした。これらの構築物は、その後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ−に連結した（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。次に、キメラｓｔｘＢ１／ｓｔｘＢ２遺伝子をＰＣＲで増幅し、発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓ２  Ｃに連結し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）にトランスフォーメーションした。このＰＣＲの間、天然ｓｔｘ１またはｓｔｘ２プロモータを除去し、最適化されたシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列（ＴＡＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧ（配列番号：１５））を翻訳開始コドンの上流に添加した。さらに、６つのヒスチジンコドンに対応する１８の塩基対を、すべてのＢサブユニット上で共通の６つのヒスチジンエピトープを組み入れるために、Ｂ遺伝子の下流に直ちに添加した。この方法における、Ｂサブユニットに対する遺伝子のクローニングは、ｐＴｒｃプロモータの制御下で、キメラ遺伝子の発現を可能にし、すべての構造に共通エピトープを添加する。この共通エピトープは、同一の溶解物上で仮のウエスタンブロット法を行い、６つのヒスチジンエピトープを認識するＭＡｂで検出することにより、Ｂサブユニットの標準化を可能にした。３つの追加の個別変異は、成熟ＳｔｘＢ１ｄとＳｔｘＢ１（ＴｌＡまたはＧ２５ＡまたはＮ５５Ｔ）との間の３つのアミノ酸の相違を模倣するために、ｓｔｘＢ１のＳＯＥ  ＰＣＲにより生成された。構成物は、正しい変異を生成したことを確認するために、Ｕｎｉｆｏｒｍｅｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｅａｌｔｈ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて配列決定された。
【００７０】
ウエスタンブロット法
精製したＳｔｘ１、または、ＳｔｘＢ１、ＳｔｘＢ２もしくはキメラＳｔｘＢ１／ＳｔｘＢ２のｈｉｓタグ融合タンパク質を発現する全細菌溶解物を、前述の記載のように、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウエスタンブロット法に供した（Ｓｍｉｔｈら（２００６）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：４１２２−４２１２９）。簡潔に述べると、ｐＴｒｃＨｉｓ２  Ｃ−ｓｔｘＢ１またはｓｔｘＢ２を含んだ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、または、７つのキメラｓｔｘＢ１／ｓｔｘＢ２クローンを一晩培養した培地を、を１：５０で５ｍＬのＬＢ培地に希釈した。３時間後、培地を１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、さらに５時間培養した。その後、誘導した培地をミクロチューブに等分し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（０．６Ｍのジチオスレイトール、１０％のドデシル硫酸ナトリウムを含む）を添加し、試料を−８０℃で保存した。１５％のポリアクリルアミドゲルに充填する前に、試料を９５℃で５分間加熱した。野生型または充填したキメラＢサブユニットの濃縮を、抗６連ヒスチジンモノクローナル抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ）で検出することにより、予備的なウエスタンブロット法で標準化し、イメージＪプログラム（ＮＩＨ）を使用して定量化した。２回目のウエスタンブロット法を標準化試料上で１次抗体として、１３Ｃ４  ＭＡｂハイブリドーマ組織培地の上澄みを使用して、実施した。双方のウエスタンブロット法に対する２次抗体は、１：３，０００の希釈で、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に共役したヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）であった。２次抗体をＥＣＬ−Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットを使用して、化学発光により検出した（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｂｕｃｋｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）。
【００７１】
ＳｔｘＢ１／ＳｔｘＢ２の３重キメラＢサブユニットの精製
ｐＴｒｃＨｉｓ２  Ｃ−ｓｔｘＢ１／ｓｔｘＢ２の３重キメラＢサブユニットクローンｐＭＪＳ３６ＡＢＣを含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を一晩培養したものを、１：５０で３ＬのＬＢ培養液に希釈した。増殖してから３時間後、培養物を１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、さらに５時間培養した。細菌を遠心分離機で分離し、沈殿させ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．６を含む４０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（超音波処理緩衝液）において再懸濁することにより、７５倍に濃縮した。その後、濃縮した細菌懸濁液を超音波で分解し、遠心分離機で分離することにより清澄化した。その後、ヒスチジン標識化ＳｔｘＢ１／ＳｔｘＢ２の３重キメラＢサブユニットを有する清澄溶解物をニッケル親和性カラム（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ．）に適用し、２０ｍＭ  イミダゾールを含む超音波処理緩衝液で洗浄し、２５０ｍＭイミダゾールを含む超音波処理緩衝液で溶離した。溶離タンパク質をリン酸塩で緩衝された生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）に対して透析し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３，０００分子量カットオフフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で濃縮し、０．２μｍフィルタでろ過した。ろ過後、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）で決定したＳｔｘＢ１／ＳｔｘＢ２の３重キメラＢサブユニット調製物の総タンパク質濃度は、２８８ｎｇ／μｌであった。１３Ｃ４  ＭＡｂおよび銀染色ゲルを使用したウエスタンブロット法により、いくつかの他の微量タンパク質を共精製したが、主要の精製タンパク質はＳｔｘＢ１／ＳｔｘＢ２の３重キメラＢサブユニットであることが示された。
【００７２】
マウス免疫付与および処置
前免疫血清を１４〜１６ｇの体重である１３ＣＤ−１雄マウスから採取した（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）。その後、マウスは、油中水アジュバントであるＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ（ＴｉｔｅｒＭａｘ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）（全容積１００μｌ）と１：１で混合したＰＢＳ中の精製された約１４．４μｇのＳｔｘＢ１／ＳｔｘＢ２  ３重キメラＢサブユニットを使用して、腹腔内に（ｉ．ｐ．）免疫化された。マウスは、合計４回の追加免疫のために、３週間間隔で、同量の精製したキメラＢサブユニットで追加免疫された。最終の追加免疫から２週間後、１３匹の免疫マウスは、７匹（Ｂ群）および６匹（Ｄ群）のマウスを含む２つの群に分けられ、それぞれは、５０％致死量（ＬＤ５０）の１０倍のＳｔｘ１（１，２５０ｎｇ）またはＳｔｘ２（１０ｎｇ）いずれかを使用して処置された。１４匹の非免疫ＣＤ−１雄マウスは、７匹ずつのマウスを含む２つの群に分けられ、１０ＬＤ５０のＳｔｘ１またはＳｔｘ２のいずれかで処置された（処置Ａ群およびＣ群）。
【００７３】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
４回目と最終の追加免疫をしてから１０日後、血清を免疫マウスから採取し、以前に報告されたように、ＳｔｘＢ１またはＳｔｘＢ２に対する、血清免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）レベルを決定するために、免疫付与前および免疫付与後の免疫マウスからの血清、および１４匹の実験未使用のマウスからの血清を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）に使用した（Ｓｍｉｔｈら（２００６）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：４１２２−４２１２９）。つまり、ＰＢＳ中の１００ｎｇの精製したＳｔｘ１またはＳｔｘ２を抗原として使用し、マウス血清を０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に希釈後、１次抗体として使用した。ＰＢＳＴ中に１：３，０００で希釈した、２次抗体であるＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧを添加した。ＥＬＩＳＡ滴定値は、バックグラウンドを差し引いた後、採血前の値を上回る＋０．１Ｏ．Ｄ．４０５ユニットである免疫付与後の血清の希釈値として定義された。
【００７４】
インビトロ中和アッセイ
以前に報告されたように、免疫付与前および免疫付与後の１３匹の免疫マウスからの血清、および１４匹の実験未使用のマウスからの血清をＳｔｘ１およびＳｔｘ２に対するインビトロ中和アッセイに使用した。約１０  ＣＤ５０および２５  ＣＤ５０の精製したＳｔｘ１およびＳｔｘ２をそれぞれ使用した。実験後、実際のＣＤ５０値を遡って算出した。１３Ｃ４  ＭＡｂは、Ｓｔｘ１ｄを検出しないため、抗体は、野生型Ｓｔｘ１またはＢサブユニット（ＴｌＡまたはＧ２５ＡまたはＮ５５Ｔ）における３つの単一アミノ酸変異のうちの１つを含むＳｔｘ１のいずれかを発現した細菌の清澄超音波溶解物に対する中和アッセイに使用された。約１０ＣＤ５０のＳｔｘ１またはＢサブユニット変異のうちの１つを含むＳｔｘ１をこれらの中和実験に使用した。中和滴定は、マウス血清またはベロ細胞上のＳｔｘ１またはＳｔｘ２の細胞毒性の５０％を中和した１３Ｃ４  ＭＡｂの希釈として定義された。これらのアッセイを二つ組測定で１度実施した。
【００７５】
真核生物受容体グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）結合抑制アッセイ
１３Ｃ４  Ｍａｂが、Ｓｔｘ１とその受容体との相互作用を抑制できるかどうか決定するために、Ｇｂ３結合アッセイを使用した。簡潔に述べると、１，２００ｐｇの精製したＳｔｘ１を０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０および０．１％ウシ血清アルブミンを含んだＰＢＳ（ＰＢＳＴ−８０）（以下、結合液と称する）に希釈し、Ｓｔｘ１の等容積を、結合液、未希釈１３Ｃ４  ＭＡｂ（Ｈｙｃｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、または結合液中に遂次希釈（１：４）した１３Ｃ４  ＭＡｂのいずれかと混合した。毒素抗体混合物（全容積、１２０μｌ）は、５％ＣＯ２において、３７℃で２時間インキュベーションされ、その後、ＰＢＳＴ−８０で洗浄済のＧｂ３（Ｍａｔｒｅｙａ，Ｉｎｃ．，Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＰＡ）でコーティングされたマイクロタイタープレート（１μｇ／ｗｅｌｌ）に１００μｌを適用した。試料は、結合液中で１：５，０００に希釈された１次抗体、ウサギ抗Ｓｔｘ１ポリクローナル抗体で、２時間３７℃でインキュベーションされた。ＰＢＳＴ−８０およびＰＢＳで、ウェルから非結合１次抗体を洗浄した後、１：１，０００に希釈して、２次抗体であるＨＲＰに共役したヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。ＰＢＳＴ−８０、ＰＢＳの順でさらに洗浄した後、２次抗体をテトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ酵素免疫基質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で検出し、色素変化を起こすために、マイクロタイタープレートを室温で１５分間インキュベーションした。その後、反応混合物を未使用のマイクロタイタープレートに移し、６００ｎｍで読み込んだ。これらのアッセイを三組み測定で２度実施した。本実験の対照は、アイソタイプが一致した無関係なＭＡｂ（１１Ｅ１０；Ｈｙｃｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に、または抗体を伴わずにＳｔｘ１をインキュベーションすることを含んだ。
【００７６】
結果
ＳｔｘＢ１およびＳｔｘＢ２のアミノ酸配列の分析もしくはＳｔｘおよびＳｔｘ２の結晶構造の比較
成熟ＳｔｘＢ１およびＳｔｘＢ２タンパク質のアミノ酸を配置する時、２つのタンパク質の間の相違性が高い３つの領域は明らかである（図５）。これらの領域のうちの２つは、タンパク質のＮ末端およびＣ末端でシステイン残基周辺に中心があり、アミノ酸１〜６および５４〜６１位のそれぞれを含む。第３の領域は、アミノ酸２５〜３２位に及ぶＳｔｘＢ１の中央である。これらの３つの領域の相違性は、ＳｔｘＢの結晶構造上に互いに近接して位置することがわかり（ＳｔｘＢは、ＳｔｘＢ１と同一である）、図５において、ＳｔｘＢ５量体の結晶構造上に示された。
【００７７】
キメラＳｔｘＢ１／ＳｔｘＢ２タンパク質の構造
野生型ＳｔｘＢ１およびＳｔｘＢ２、ならびに、特異ＳｔｘＢ１領域のうちの１つ、２つ、または３つすべてからなる７つのキメラＳｔｘ１／Ｓｔｘ２  Ｂサブユニットは、１連のＰＣＲおよびオーバーラップ伸長反応によるスプライシングにより生成された（図６）。さらに、これらのＢサブユニットは、Ｂサブユニットの標準化を可能にするためにＣ末端でヒスチジン標識化された。
【００７８】
１３Ｃ４モノクローナル抗体を有するキメラＳｔｘＢ１／ＳｔｘＢ２タンパク質のウエスタンブロット分析
予備のウエスタンブロット法を、タグ融合された野生型ＳｔｘＢ１、ＳｔｘＢ２またはキメラＳｔｘＢ１／ＳｔｘＢ２タンパク質を含む全細胞細菌溶解物の同一試料に関して、Ｎｏｖａｇｅｎ  α−６−ヒスチジンＭＡｂを使用して実施した。これらの試料においてＢサブユニットの量は、イメージＪプログラムを使用して標準化され、その後、１次抗体として１３Ｃ４  ＭＡｂを使用して、第２のウエスタンブロット法を実施した。１３Ｃ４  ＭＡｂは、Ｓｔｘ１、ＳｔｘＢ１およびＳｔｘＢ１の３つすべての特異領域を含んだ３重キメラＢサブユニットと強力に反応したが、ＳｔｘＢ１の２つの隣接領域を含んだ２重キメラＢサブユニットとは、弱くのみ反応し、他のキメラの場合は、シグナルを検出しなかった（図７）。領域１〜６および５４〜６１位により形成された抗体結合部位および、２５〜３２位領域を介した結合部位に対する配座効果を示す。
【００７９】
ウエスタンブロット法および１３Ｃ４  ＭＡｂでのインビトロ中和による単一アミノ酸変異を含むＳｔｘＢ１の分析
１３Ｃ４  ＭＡｂは、Ｓｔｘ１から成熟Ｂサブユニットにおいて、３つだけアミノ酸の相違を有するＳｔｘ１ｄを認識しない（図８およびＢｕｒｋら（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：２１０６−２１１２）。このため、これらの３つの相違（Ｔ１Ａ、Ｇ２５ＡおよびＮ５Ｔ）を模倣する３つの単一ＳｔｘＢ１変異型を生成し、ウエスタンブロット分析により、１３Ｃ４  ＭＡｂで精査した。１３Ｃ４  ＭＡｂは、Ｓｔｘ１、ＳｔｘＢ１およびＴ１ＡおよびＧ２５Ａ変異型を有するＳｔｘＢ１を検出したが、Ｎ５５Ｔ変異は検出しなかった（図７）。ＳｔｘＢ１における単一アミノ酸変異に機能的に結合する１３Ｃ４  ＭＡｂの能力をさらに調査するために、インビトロ中和アッセイを実施した。ｓｔｘＡ１をコードする第２のプラスミドを、ＳｔｘＢ１、または、Ｔ１ＡまたはＧ２５ＡまたはＮ５５Ｔ変異を有するＳｔｘＢ１に同時形質転換し、これらのプラスミドで同時形質変換された細菌がホロ毒素を産生するようにした。Ｓｔｘ１ホロ毒素を形成する細菌の清澄超音波溶解物は、１３Ｃ４  ＭＡｂを用いて、インビトロ中和アッセイを受けた（毒素あたり約１０ＣＤ５０）。１３Ｃ４  ＭＡｂは、野生型Ｓｔｘ１、ならびに、ＳｘｔＢ１  Ｔ１ＡおよびＧ２５Ａ変異を有するＳｔｘＢ１を中和するが、Ｎ５５Ｔ変異は中和しない。１３Ｃ４が、単一のＮ５５Ｔ変異を有するＢサブユニットを認識せず、Ｎ５５Ｔ変異を有するＳｔｘ１を中和しないという事実は、残基５５位が機能的な１３Ｃ４結合に対して必須残基であることを強く示唆する。
【００８０】
ＳｔｘＢ１／ＳｔｘＢ２の３重キメラＢサブユニット免疫付与への免疫反応
１３ＣＤ−１マウスは、３重キメラＳｔｘＢ１／ＳｔｘＢ２タンパク質で免疫性を与えられ、合計４回の追加免疫のために、３週間間隔で追加免疫された。最終の追加免疫をしてから１０日後、免疫付与後の血清を採取し、ＥＬＩＳＡ法およびインビトロ中和アッセイで評価し、適切な前免疫血清および１４匹の非免疫マウスから採取した血清と比較した。免疫マウスは、上記のバックグラウンドより、Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２のそれぞれが５．１２および３．７７対数値だけＥＬＩＳＡ滴定が高いことを示した（表１）。１３匹の免疫マウスからの前免疫血清または１４匹の非免疫マウスからの血清は、いずれもＳｔｘ１またはＳｔｘ２に対する検知できるＥＬＩＳＡ滴定値を示さなかった。
【００８１】
【表１】
2009536818.tif 000002
ａ  Ｓｔｘ１またはＳｔｘ２に対するＩｇＧ血清滴定対数値の相乗平均。エラーバーは±１Ｓ．Ｄ．を示す。
ｂ  それぞれ、Ｓｔｘ１またはＳｔｘ２の約１０または２５  ＣＤ５０に対する５０％中和滴定対数値。エラーバーは±１Ｓ．Ｄ．を示す。
ｃ  １３匹のうちの１２匹または２匹の血清は、それぞれＳｔｘ１またはＳｔｘ２を中和した。Ｓｔｘ１またはＳｔｘ２を中和しなかった試料には、０．３の値を割り当てた。
【００８２】
インビトロ中和滴定がＥＬＩＳＡ滴定よりも保護免疫反応の良好な指標であるため、インビトロ中和滴定を、精製したＳｔｘ１またはＳｔｘ２に対して血清試料上で実施した（それぞれ１０または２５ＣＤ５０）。１３匹の免疫マウスのうち１２匹が、Ｓｔｘ１に対して高い中和滴定を示した一方、２匹のマウスのみがＳｔｘ２への中和滴定を示した（表２）。１３匹の免疫マウスからの前免疫血清、および１４匹の非免疫マウスからの血清は、いずれもＳｔｘ１またはＳｔｘ２への中和滴定を示さなかった。これらのデータは、Ｓｔｘ１であるキメラＢサブユニットの領域が中和エピトープを示すことを示唆する。
【００８３】
【表２】
2009536818.tif 000003
ａ  ＬＤ５０は、Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２のそれぞれに対して１２５および１ｎｇ／マウスであることを事前に決定した。
ｂ  処置時のマウスの平均体重は４４．９ｇであった。
【００８４】
致死毒素の試験に対する免疫マウスの保護
最終の追加免疫から２週間後、１３匹の免疫マウスおよび１４匹の対照マウスをＳｔｘ１またはＳｔｘ２のいずれかの１０ＬＤ５０で処置した。１３匹の免疫マウスは、２つの処置群に分けられ、Ｓｔｘ１の試験群（Ｂ群）は、７匹のマウスを含み、Ｓｔｘ２の試験群（Ｄ群）は、６匹のマウスを含んだ。１４匹の非免疫マウスを７匹の２つの群に分け、Ｓｔｘ１（Ａ群）またはＳｔｘ２（Ｃ群）のいずれかで試験した。７匹の免疫マウスのうち６匹がＳｔｘ１処置で生存し、一方、６匹の免疫マウスのうち１匹がＳｔｘ２処置で生存した（表２）。１４匹の非免疫マウスは、Ｓｔｘ１またはＳｔｘ２処置で一匹も生存せず、４日目ですべて死亡した。
【００８５】
Ｇｂ３結合抑制アッセイ
１３Ｃ４  ＭＡｂがＧｂ３へのＳｔｘ１の結合を防ぐことが可能であるかを決定するために、インビトロ結合抑制アッセイを使用した。Ｓｔｘ１および１３Ｃ４  ＭＡｂは、ともにインキュベーションされ、その後、Ｇｂ３コーティングしたマイクロタイタープレートにオーバーレイした。Ｇｂ３へのＳｔｘ１結合は、１３Ｃ４  ＭＡｂが０．１ｍｇ／ｍｌのストックから、１：５１２を超えて希釈されるまでは、検出されなかった（図９）。最大のＳｔｘ１結合は、１３Ｃ４が１：８，０００またはそれ以上に希釈されてから生じた。これらの結果は、１３Ｃ４  Ｍａｂが、用量依存の形態で、Ｇｂ３への１，０００ｐｇのＳｔｘ１の結合を完全に抑制することを示す。
【００８６】
考察
ＳｔｘＢ１およびＳｔｘＢ２のアミノ酸配列の比較、および、ＳｔｘＢ５量体の結晶構造の分析後、我々は、１３Ｃ４  ＭＡｂエピトープに対するＳｔｘＢ１上の３つの非線状領域を特定した。一連のＳｔｘＢ１／ＳｔｘＢ２キメラタンパク質のウエスタンブロット分析では、１３Ｃ４  ＭＡｂが、Ｓｔｘ１、ＳｔｘＢ１、およびＳｔｘＢ１の３つすべての特異領域を含んだ３重キメラＢサブユニットと強力に反応したが、ＳｔｘＢ１の第一および第三の領域を含んだ２重キメラＢサブユニットとは、弱くのみ反応し、他のキメラの場合は、シグナルを検出しなかったことを示した。
【００８７】
一連の部位特異的突然変異型は、１３Ｃ４  ＭＡｂが、野生型Ｓｔｘ１、ＳｔｘＢ１およびＴ１ＡおよびＧ２５Ａ変異を含むＳｔｘＢ１に特異的に結合するが、Ｎ５５Ｔ変異を含むＳｔｘＢ１には特異的に結合しないことを示した。さらに、１３Ｃ４  ＭＡｂは、野生型Ｓｔｘ１、およびＴ１ＡおよびＧ２５Ａ変異を有するＳｔｘ１を中和するが、Ｎ５５Ｔ変異を含むものは中和しない。これらのデータを総合すると、ＳｔｘＢ１の残基５５位のアスパラギンは、１３Ｃ４  ＭＡｂエピトープにとって決定的に重要なアミノ酸であることを示す。また、ＳｔｘＢ１の残基５５位おけるアスパラギンは、Ｓｔｘ１  Ｂサブユニットに結合するがＳｔｘ１ｄを認識できない別のＳｔｘ１抗体であるモノクローナル５−５Ｂの結合に対する、決定的に重要なアミノ酸である（Ｎａｋａｏら（２００２）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４６：７７７−７８０）。さらに、ＳｔｘＢ１を認識するが、ＳｔｘＢ１ｄは認識しない第３のＭＡｂ（２Ｈ３）が産生されており、残基５５位がその相違にも役割を果たしている可能性がある（Ｂｕｒｋら（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：２１０６−２１１２）。最後に、別のＭＡｂであるＶＴｍ１．１（後に、ヒト化され、およびＴＭＡ−１５と称する）は、ＳｔｘＢ２に結合し、Ｓｔｘ２を中和するが（Ｎａｋａｏら（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：５７１７−５７２２，Ｋｉｍｕｒａら（２００２）Ｈｙｂｒｉｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ．２１：１６１−１６８）、５６番目のアミノ酸を突然変異させた場合（Ｅ５６Ｈ）、ＳｔｘＢ２に結合できない。ＳｔｘＢ１の残基５５位およびＳｔｘＢ２の残基５６位の双方は、ほぼ同一の位置において、Ｂモノマーの外側に位置する。我々の結果および上記に概説した結果は、ＳｔｘＢ１およびＳｔｘＢ２の、それぞれ５５番目および５６番目のアミノ酸が、Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２に対して行われるＭａｂの中和に対して決定的に重要な残基であるという考えを支持する。
【００８８】
ＳｔｘＢ１／ＳｔｘＢ２の３重キメラＢサブユニットは、大部分ＳｔｘＢ２を含み（７１のアミノ酸のうちの２２のみがＳｔｘＢ１である）、より高いＳｔｘ１のＥＬＩＳＡおよび中和滴定値は、３重キメラＢサブユニットで免疫性を与えた後、達成された。１３Ｃ４エピトープを含む２２のアミノ酸が、Ｂ５量体の外側にあり、免疫優性であり、抗体を中和する良好な標的であるためである可能性がある。これは、１３Ｃ４  ＭＡｂエピトープを含む２２のアミノ酸がＳｔｘＢ２に挿入される場合、７匹のマウスのうちの６匹が１０ＬＤ５０のＳｔｘ１による致死的処置で生存したが、６匹のマウスのうちの１匹のみが１０ＬＤ５０のＳｔｘ２による致死的処置で生存した理由を説明しうる。
【００８９】
他の実施形態
本発明の、記載された方法および組成物の種々の修正および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明白となるであろう。本発明は、特定の望ましい実施形態に関連して記載されているが、請求の範囲に記載される本発明は、そのような特定の実施形態に必要以上に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際には、医学、免疫学、薬理学、内分泌学の分野、または関連分野における当業者に明白である、本発明を実施するために記載された形態の種々の修正は、本発明の範囲内であることが意図される。
【００９０】
すべての特許、特許出願、および本明細書に記載の刊行物は、それぞれの独立した刊行物が具体的かつ個別に参照により組み入れられるように、同程度で参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ＳｔｘおよびＳｔｘ２の結晶構造を示す。
【図２】志賀毒素の一般構造を示す。
【図３】望ましいＳｔｘタンパク質の核酸およびアミノ酸配列を示す。
【図４】ＢサブユニットのＭａｂ  １３Ｃ４認識を示すウエスタンブロット法を示す。カルボキサミドメチル化Ｂサブユニット（レーン１）、非還元試料緩衝液において変性したＢサブユニット（レーン２）、およびβ−メルカプトエタノールの存在下で変性したＢサブユニット（レーン３）をＳＤＳ−Ｐａｇｅにより分析し、続いて、クマーシーブルー染色（Ａ）またはＭａｂ  １３Ｃ４を有するウエスタンブロット法（Ｂ）またはペプチド１−２５に対する抗血清（Ｃ）で分析した（Ｂｏｙｄら（１９９１）Ｉｎｆｅｃｔ  ｌｍｍｕｎ．５９：７５０−７５７））。
【図５】図５Ａは、ＳｔｘＢ２およびＳｔｘＢ１のアミノ酸配列を示す。下線を付したアミノ酸は、非保存アミノ酸を示す。それ以外の示されたＳｔｘＢ１アミノ酸は保存されており、点は同一性を示す。１、２、および３と標識がつけられた配列の領域はそれぞれ、配列番号：１（ＴＰＤＣＶＴ）、配列番号：２（ＧＤＫＥＬＦＴＮ）、および配列番号：３（ＴＮＡＣＨＮＧＧ）に対応する。１３Ｃ４  Ｍａｂの３つのセグメントは、パネルＡにおいて、囲まれ、図５Ｂに番号で示される。これらのセグメントは、ＳｔｘＢ２タンパク質に挿入される場合、配列番号：４に記載されているアミノ酸配列を形成する（ＴＰＤＣＶＴＧＫＩＥＦＳＫＹＮＥＤＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＷＮＬＱＰＬＬＱＳＡＱＬＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＡＥＶＱＦＮＮＤ）。ＳｔｘＢ１とＳｔｘＢ１ｄとの間の３つのアミノ酸の相違は、ＳｔｘＢ１配列の真下に星印で示し、最後の星は、臨界アスパラギン残基を示す。図５Ｂは、ＳｔｘＢ５量体の結晶構造の下面図および側面図を示す。矢印は、ジスルフィド結合を生じる２つのシステイン残基を示す。
【図６】キメラＳｔｘＢ１／ＳｔｘＢ２タンパク質の図解を示す。ＳｔｘＢ１を黒色で示し、Ｓｔｘ２を白色で示し、６つのヒスチジンの標識は、網がけで示す。ＳｔｘＢ１の領域をキメラＢサブユニットの真下に記入する。それぞれのＢサブユニットの２つのシステイン残基をＢサブユニットの上の棒で表示する。
【図７】キメラＳｔｘＢ１／ＳｔｘＢ２タンパク質（上のパネル）、およびα−６  Ｈｉｓ  Ｍａｂまたはα−１３Ｃ４  ＭＡｂ（下のパネル）でプロービングした単一アミノ酸の変異（下のパネル）を有するＳｔｘＢ１のウエスタンブロット分析を示す。上のパネル：レーン１、１００ｎｇ  Ｓｔｘ１；レーン２、ベクターのみ；レーン３、ＳｔｘＢ１；レーン４、ＳｔｘＢ２；レーン５、ＳｔｘＢ１＝１〜６；レーン６、ＳｔｘＢ１＝２５〜３２；レーン７、ＳｔｘＢ１＝５４〜６１；レーン８、ＳｔｘＢ１＝２５〜３２、５４〜６１、レーン９、ＳｔｘＢ１＝１〜６、２５〜３２；レーン１０、ＳｔｘＢ１＝１〜６、５４〜６１、レーン１１、ＳｔｘＢ１＝１〜６、２５〜３２、５４〜６１。下のパネル：レーン１、１００ｎｇ  Ｓｔｘ１；レーン２、ベクターのみ；レーン３、ＳｔｘＢ１；レーン４、ＳｔｘＢ１  ＴｌＡ；レーン５、ＳｔｘＢ１  Ｇ２５Ａ；レーン６、ＳｔｘＢ１  Ｎ５５Ｔ。
【図８】Ｓｔｘ１、Ｓｔｘ１ｃおよびＳｔｘ１ｄのＢサブユニットのアミノ酸配置を示す（配列番号：９）。成熟タンパク質を生成するために除去される２０のアミノ酸リーダー配列をＳｔｘ１に下線を付す。ＳｔｘＢ１とＳｔｘＢｄ１との間の３つのアミノ酸の相違を囲んだ。矢印は、保存アミノ酸残基を示し、示された残りのＳｔｘ１ｃおよびＳｔｘ１ｄアミノ酸残基は、非保存アミノ酸である。点は、同一のアミノ酸を示す。
【図９】１３Ｃ４  ＭＡｂが、用量依存的にＧｂ３へのＳｔｘ１の結合を抑制することを示すグラフである。個々の円は、三つ組で行なった２つの実験の平均を示し、エラーバーは、標準偏差（＋／−１）を示す。実線は、バックグラウンド（１次抗体のないＳｔｘ１および２次抗体の１μｇ  Ｇｂ３＋１，０００ｐｇ）を示し、一方、破線は、１３Ｃ４  ＭＡｂ  Ｏ．Ｄ．６００（光学濃度６００ｎｍ）を添加しないＳｔｘ１結合を示す。
【図１】
2009536818.tif 000004
【図２】
2009536818.tif 000005
【図３−１】
2009536818.tif 000006
【図３−２】
2009536818.tif 000007
【図３−３】
2009536818.tif 000008
【図４】
2009536818.tif 000009
【図５】
2009536818.tif 000010
【図６】
2009536818.tif 000011
【図７】
2009536818.tif 000012
【図８】
2009536818.tif 000013
【図９】
2009536818.tif 000014
【配列表】
2009536818000001.app
【国際調査報告】
2009536818.tif 000015
2009536818.tif 000016
2009536818.tif 000017
2009536818.tif 000018