(57)【要約】本明細書では、膵臓の毛細血管内皮を通過するＴ細胞のトランスマイグレーションを阻害する組成物および方法と、ＭＴ１−ＭＭＰのインヒビターを用いてインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ；Ｉ型糖尿病）を処置する組成物および方法とが提供される。本発明は、膵臓の毛細血管内皮を通過するＴ細胞のトランスマイグレーションを阻害するための組成物であって、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）のインヒビターを含む組成物を提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵臓の毛細血管内皮を通過するＴ細胞のトランスマイグレーションを阻害する方法であって、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）のインヒビターを含む組成物を前記細胞に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記ＭＴ−ＭＭＰは、膜１型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞は、膵臓の毛細血管内皮を通過するＴ細胞のトランスマイグレーションを阻害する必要がある被検体の細胞またはその被検体由来の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記インヒビターは、天然のＭＭＰ組織インヒビター（ＴＩＭＰ）またはヒドキサマートである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒドロキサマートは、ＢＢ−９４、ＢＢ−１１０１、ＢＢ２５−１６、ＳＥ２０５、ＡＧ３３４０およびＣＧＳ  ２７０２３  Ａからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒドロキサマートは、ＡＧ３３４０である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＴＩＭＰは、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３およびＴＩＭＰ−４からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＩＭＰは、ＴＩＭＰ−２である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記方法は、ランゲルハンス島周囲の毛細血管内皮へのＴ細胞の固定化を引き起こす、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法は、Ｔ細胞のホーミングの減少を引き起こす、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記インヒビターは、機能的な膵島の再生を促進する、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｔ細胞は、インスリン特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記インヒビターは、実質的に前記Ｔ細胞を膵島内皮に固定化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
被検体のＩ型糖尿病を処置する方法であって、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）のインヒビターを含む組成物を前記被検体に投与することを含む、方法。
【請求項１５】
前記ＭＴ−ＭＭＰは、膜１型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記被検体は、Ｉ型糖尿病と診断される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記インヒビターは、内在性のＭＭＰ組織インヒビター（ＴＩＭＰ）またはヒドキサマートである、請求項１４に記載の方法
【請求項１８】
前記ヒドロキサマートは、ＢＢ−９４、ＢＢ−１１０１、ＢＢ２５−１６、ＳＥ２０５、ＡＧ３３４０およびＣＧＳ  ２７０２３  Ａからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヒドロキサマートは、ＡＧ３３４０である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＴＩＭＰは、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３およびＴＩＭＰ−４からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法
【請求項２１】
前記ＴＩＭＰは、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３およびＴＩＭＰ−４からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＴＩＭＰは、ＴＩＭＰ−２である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記インヒビターは、前記Ｔ細胞を膵島内皮に固定化する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記インヒビターは、機能的な膵島の再生を促進する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
分子を同定する方法であって、
ＭＴ１−ＭＭＰ活性を阻害する作用について候補分子をスクリーニングすることと、
膵臓の毛細血管内皮を通過するＴ細胞のトランスマイグレーションを前記候補分子が阻害できるかどうかを判定することと
を含む、方法。
【請求項２６】
分子を同定する方法であって、ＭＴ１−ＭＭＰ活性を阻害する分子が、膵臓の毛細血管内皮を通過するＴ細胞のトランスマイグレーションを阻害できるかどうかを判定することを含む、方法。
【請求項２７】
Ｔ細胞を膵臓の毛細血管内皮に固定化する方法であって、前記細胞と膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）のインヒビターを含む組成物とを接触させることを含む、方法。
【請求項２８】
前記ＭＴ−ＭＭＰは、膜１型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ）である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞は、膵臓の毛細血管内皮にＴ細胞を固定化する必要がある被検体と認められた被検体の細胞またはその被検体由来の細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
Ｉ型糖尿病の危険性がある被検体を処置する方法であって、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）のインヒビターを含む組成物を前記被検体に投与することを含む、方法。
【請求項３１】
前記ＭＴ−ＭＭＰは、膜１型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ）である、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００６年２月９日に出願された、米国仮特許出願第６０／７７２，０５８号の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府の支援による研究に関する声明
本発明は、国立保健研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により付与された助成金ＣＡ８３０１７、ＣＡ７７４７０およびＲＲ０２０８４３の下で政府支援によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有するものである。
【０００３】
発明の背景
Ｔ細胞が介在する消耗性の主要な自己免疫疾患として、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ；Ｉ型糖尿病）がある（Ｈｏｍａｎｎ，Ｄ．＆  ｖｏｎ  Ｈｅｒｒａｔｈ，Ｍ．（２００４年））。ＩＤＤＭの病因には、自己免疫性Ｔ細胞が活性化し、その後ランゲルハンス島にホーミングすることが関係している。ランゲルハンス島では、Ｔ細胞がインスリンを産生するβ細胞を直接破壊する（Ｍａｔｈｉｓ，Ｄ．ら（２００１年））。活性化Ｔ細胞においては、細胞表面接着受容体であるＣＤ４４が増加する。ＣＤ４４は、内皮ヒアルロナンとの相互作用を介して、内皮へのＴ細胞の接着およびその後のトランスマイグレーション現象に関与している（ＤｅＧｒｅｎｄｅｌｅ，Ｈ．Ｃ．ら（１９９７年））。
【０００４】
腫瘍細胞では、ＣＤ４４が、ＭＴ１−ＭＭＰのタンパク質分解の標的であることが確認されている。ＭＴ１−ＭＭＰによる切断を受けて、ＣＤ４４の細胞外ドメインが細胞表面から遊離し、ＣＤ４４細胞受容体の機能は不活化される（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。浸潤を促進する多機能の膜結合型酵素であるＭＴ１−ＭＭＰは、癌細胞において細胞周囲のタンパク質分解に伴う諸現象の主要なメディエーターの１つとして機能し、細胞表面受容体を直接切断している（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。本明細書は、ＭＴ１−ＭＭＰのインヒビターを用いてＩＤＤＭを処置する組成物および方法を提供するものである。
【非特許文献１】Ｍｏｒｉ，Ｈ．ら、（２００２年）ＥＭＢＯ  Ｊ．２１，３９４９−３９５９
【非特許文献２】Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．ら、（２００４年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４，８７６−８８２
【非特許文献３】Ｓｕｅｎａｇａ，Ｎ．ら、（２００５年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４，８５９−８６８
【非特許文献４】Ｅｇｅｂｌａｄ，Ｍ．＆  Ｗｅｒｂ，Ｚ．（２００２年）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２，１６１−１７４
【非特許文献５】Ｓａｂｅｈ，Ｆ．ら、（２００４年）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６７，７６９−７８１
【非特許文献６】Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．１９４，１−１１
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の簡単な要旨
本明細書は、膵臓の毛細血管内皮を通過するＴ細胞のトランスマイグレーションを阻害する方法であって、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）のインヒビターを含む組成物を細胞に投与することを含む、方法を提供するものである。
【０００６】
さらに、本明細書は、被検体のＩ型糖尿病を処置する方法であって、ＭＴ−ＭＭＰのインヒビターを含む組成物を被検体に投与することを含む、方法も提供するものである。
【０００７】
さらに、分子を同定する方法であって、ＭＴ−ＭＭＰ活性を阻害する能力があるかどうか候補分子をスクリーニングすることと、膵臓の毛細血管内皮を通過する細胞のトランスマイグレーションを候補分子が阻害できるかどうかを判定することとを含む、方法も提供する。
【０００８】
さらに、分子を同定する方法であって、ＭＴ−ＭＭＰ活性を阻害する分子が、膵臓の毛細血管内皮を通過するＴ細胞のトランスマイグレーションを阻害できるかどうかを判定することを含む、方法も提供する。
【０００９】
さらに、Ｔ細胞を膵臓の毛細血管内皮に固定化する方法であって、Ｔ細胞とＭＴ−ＭＭＰのインヒビターを含む組成物とを接触させることを含む、方法も提供する。この方法の細胞は、Ｔ細胞を膵臓の毛細血管内皮に固定化する必要がある被検体と認められた被検体の細胞であってもよいし、その被検体に由来する細胞であってもよい。
【００１０】
さらに、Ｉ型糖尿病の危険性がある被検体を処置する方法であって、ＭＴ−ＭＭＰのインヒビターを含む組成物を被検体に投与することを含む、方法も提供する。
【００１１】
ここに開示する方法および組成物のさらなる利点に関しては、以下の説明にも記載されており、その説明からある程度理解されるであろうし、あるいは、開示する方法および組成物を実施することで知ることができる。開示する方法および組成物の利点は、添付の特許請求の範囲に具体的に指摘する要素および組み合わせにより実現および達成されるであろう。上述の概要および以下の詳細な説明は、例示的および説明的なものにとどまり、特許請求の範囲に記載の本発明を限定するものではないことを理解すべきである。
【００１２】
本明細書に援用され、本明細書の一部を構成する添付図面は、開示する方法および組成物の諸実施形態を例示し、記述と相まって、開示する方法および組成物の原理を説明するのに役立つものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
本明細書では、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）インヒビターに関係する組成物および方法を提供する。
【００１４】
具体的な実施形態における以下の詳細な説明およびそこに含まれる実施例と、図ならびに図に対する先の説明および以下の説明とを参照することで、開示する方法および組成物を比較的容易に理解することができる。
【００１５】
当然のことながら、開示する方法および組成物に関しては、他に記載がない限り、特定の合成方法、特定の解析技法または個別の試薬に限定されるものではなく、したがって、変化しても構わない。また、本明細書に用いる用語は、個々の実施形態を記載することだけを目的としたものであり、限定することを意図するものではないことも理解すべきである。
【００１６】
Ａ．材料
開示する方法および組成物に用いることができる、開示する方法および組成物と一緒に用いることができる、開示する方法および組成物の調製に用いることができる、あるいは、開示する方法および組成物の産物である、材料、組成物および成分を開示する。本明細書は、こうした材料および他の材料を開示するものであるが、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などを開示する場合、こうした化合物の個別および全体の様々な組み合わせと順列との具体的な言及を１つ１つ明示的に開示していない場合でも、それぞれを具体的に意図して本明細書に記載していることが理解されよう。たとえば、インヒビターを開示して考察を行い、さらにインヒビターを含む多くの分子に対してなし得る変更を様々に考察する場合、特に異なる指定がない限り、インヒビターのありとあらゆる組み合わせおよび順列と可能である変更とを具体的に意図している。したがって、分子Ａ、ＢおよびＣのクラスを開示するとともに、分子Ｄ、ＥおよびＦのクラスおよび分子の組み合わせ例Ａ−Ｄも開示する場合、それぞれを個々に記載していなくても、それぞれを個別および全体として意図している。このため、この例の場合では（ｉｓ  ｔｈｉｓ  ｅｘａｍｐｌｅ）、ＡおよびＢおよびＣと、ＤおよびＥおよびＦと、組み合わせ例Ａ−Ｄとの開示から、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆをそれぞれ具体的に意図しており、これらを開示しているものとみなすべきである。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも具体的に意図しており、開示しているものである。よって、たとえば、ＡおよびＢおよびＣと、ＤおよびＥおよびＦと、組み合わせ例Ａ−Ｄとの開示から、Ａ−Ｅ、Ｂ−ＦおよびＣ−Ｅの亜群を具体的に意図しており、開示しているものとみなすべきである。この考え方を、開示組成物の製造方法および使用方法の各ステップを含むが、これに限定されるものではなく、本出願のすべての態様に適用する。以上のとおり、実施可能な追加ステップが多岐にわたる場合、開示方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせにより、こうした追加ステップをそれぞれ実施することができ、かかる組み合わせについては、具体的に意図しており、開示しているものとみなすべきであることが理解されるであろう。
【００１７】
１．インヒビター
本明細書で提供する方法では、インヒビターは、天然のＭＭＰ組織インヒビター（ＴＩＭＰ）であってもよい。ＴＩＭＰは、ＴＩＭＰ−２であっても構わない。ＴＩＭＰは、ＴＩＭＰ−３であってもよい。ＴＩＭＰは、ＴＩＭＰ−４であって構わない。ＴＩＭＰの概説に関しては、本教示のため参照によってその全体を本明細書に援用するＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｌｏｓａａｒｉ，Ｈ（Ａｃｔａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓ  Ｏｕｌｕｅｎｓｉｓ  Ｍｅｄｉｃａ，Ｄ７３９，ＩＳＢＮ９５１−４２−７０７７−０）で確認することができる。
【００１８】
すべてのＴＩＭＰの特色として、１２個の保存システイン残基を持ち、相対位置が保存され、成熟タンパク質を産生するために切断される２３〜２９個のアミノ酸リーダー配列が存在することが挙げられる。ＴＩＭＰと、ＴＩＭＰ−１とＭＭＰ−３との複合体およびＴＩＭＰ−２とＭＴ１−ＭＭＰとの複合体など、ＭＭＰ−ＴＩＭＰ複合体との結晶構造については、報告がなされている（Ｇｏｍｉｓ−Ｒｕｔｈら１９９７年，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃａｔａｌａｎら１９９８年）。ＴＩＭＰは、互いに対向するポリペプチド鎖のＮ末端半分およびＣ末端半分からなる細長い連続的なくさび状である（Ｇｏｍｉｓ−Ｒｕｔｈら１９９７年）。ＭＭＰとの複合体において、ＴＩＭＰは、その辺縁部でＭＭＰの活性部位クレフトに全長にわたって結合している（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃａｔａｌａｎら１９９８年，Ｇｏｍｉｓ−Ｒｕｔｈら１９９７年）。
【００１９】
ＴＩＭＰ−２は、分子量２１ｋＤａの非グリコシル化タンパク質である（Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら１９８９年ａ，Ｂｏｏｎｅら１９９０年）。ＴＩＭＰ−２には、負電荷を持つ伸長したＣ末端がある（Ｂｏｏｎｅら１９９０年）。ＴＩＭＰ−２のプロモーターは、５つのＳＰ１結合部位、２つのＡＰ−２結合部位、１つのＡＰ−１結合部位および３つのＰＥＡ−３結合部位など、複数の調節要素を含むものである（Ｄｅ  Ｃｌｅｒｃｋら１９９４年，Ｈａｍｍａｎｉら１９９６年）。ＴＩＭＰ−２は、１．２ｋｂおよび３．８ｋｂの２つのｍＲＮＡに転写される（Ｈａｍｍａｎｉら１９９６年）。
【００２０】
ヒトＴＩＭＰ−２は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むものであり、配列番号３に記載の核酸配列（受託番号ＢＣ０７１５８６）によってコードされている。したがって、提供する方法のインヒビターは、配列番号２に記載のアミノ酸配列またはその生物活性フラグメントを含んでもよい。また、このインヒビターは、配列番号２に記載のアミノ酸配列またはその生物活性フラグメントとの相同性が少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％であるアミノ酸を含んでも構わない。さらに、提供する方法のインヒビターは、配列番号２に記載のアミノ酸配列またはその生物活性フラグメントをコードしている核酸を含んでもよい。前述のとおり、提供する方法のインヒビターは、配列番号３に記載の核酸配列を含んでもよい。さらに、このインヒビターは、配列番号３に記載の核酸配列との配列同一性が少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％である核酸を含んでもよく、その核酸は、少なくとも２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチドを含むものである。
【００２１】
ＴＩＭＰ−３のポリペプチド配列は、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２の配列との類似性がそれぞれ３７％および４２％である（Ａｐｔｅら１９９４年）。Ｃ末端の付近には、保存されたグリコシル化部位を持っている。ヒト組換えＴＩＭＰ−３のキャラクタリゼーションによって、２７ｋＤａのグリコシル化種と２４ｋＤａの非グリコシル化種の両方があることが明らかにされている（Ａｐｔｅら１９９５年）。ＴＩＭＰ−３は、グリコシル化形態でも非グリコシル化形態でもＥＣＭに局在している（Ｌａｎｇｔｏｎら１９９８年）。ＴＩＭＰ−３遺伝子には４つのＳＰ１部位があるが、プロモーターはＴＡＴＡボックスを持たない（Ａｐｔｅら１９９４年，Ｗｉｃｋら１９９５年）。この遺伝子から転写されるものに、２．４ｋｂ、２．８ｋｂおよび５．５ｋｂの３つのＴＩＭＰ−３ｍＲＮＡ種があり（Ａｐｔｅら１９９４年）、これらの種は、ヒト軟骨細胞により構成的に発現される（Ｓｕら１９９６年）。
【００２２】
ヒトＴＩＭＰ−３は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含み、配列番号５に記載の核酸配列（受託番号Ｘ７６２２７）によってコードされている。したがって、提供する方法のインヒビターは、配列番号４に記載のアミノ酸配列またはその生物活性フラグメントを含んでもよい。さらに、このインヒビターは、配列番号４に記載のアミノ酸配列またはその生物活性フラグメントとの相同性が少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％であるアミノ酸を含んでも構わない。提供する方法のインヒビターは、配列番号４に記載のアミノ酸配列またはその生物活性フラグメントをコードしている核酸を含んでもよい。前述のとおり、提供する方法のインヒビターは、配列番号５に記載の核酸配列を含んでもよい。さらに、このインヒビターは、配列番号５に記載の核酸配列との配列同一性が少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％である核酸を含んでもよく、この核酸は、少なくとも２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチドを含むものである。
【００２３】
ＴＩＭＰ−４は、分子量が２２ｋＤａであり、ＴＩＭＰ−１との同一性が３７％、ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−３との同一性が５１％である（Ｇｒｅｅｎｅら１９９６年）。ＴＩＭＰ−４は、生理条件下で最も中性（ｐＨ７．４）なＴＩＭＰタンパク質であり、等電点は、ヒトＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−３の値がそれぞれ８．００、６．４５および９．０４であるのに対し、７．３４である（Ｗｉｌｄｅら１９９４年，Ｇｒｅｅｎｅら１９９６年）。ＴＩＭＰ−４遺伝子は、１．４ｋｂのｍＲＮＡ種に転写される（Ｏｌｓｏｎら１９９８年）。ＴＩＭＰ−４は石灰化組織のうち、ヒト軟骨で検出されている（Ｈｕａｎｇら２００２年）。
【００２４】
ヒトＴＩＭＰ−４は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含み、配列番号７に記載の核酸配列（受託番号ＮＭ＿００３２５６）によってコードされているものである。したがって、提供する方法のインヒビターは、配列番号６に記載のアミノ酸配列またはその生物活性フラグメントを含んでもよい。さらに、このインヒビターは、配列番号６に記載のアミノ酸配列との相同性が少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％であるアミノ酸またはその生物活性フラグメントを含んでも構わない。さらに、提供する方法のインヒビターは、配列番号６に記載のアミノ酸配列またはその生物活性フラグメントをコードしている核酸を含んでも構わない。前述のとおり、提供する方法のインヒビターは、配列番号７に記載の核酸配列を含んでもよい。さらに、このインヒビターは、配列番号７に記載の核酸配列との配列同一性が少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％である核酸を含んでもよく、この核酸は、少なくとも２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチドを含むものである。
【００２５】
ＴＩＭＰはそれぞれ、相互作用性も親和性も異なる比率で標的ＭＭＰに結合するが、ほとんどの場合、化学量論的には１：１または２：２である。ＴＩＭＰ−１は、ＴＩＭＰ−２に比べてＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−９を効果的に阻害する（Ｈｏｗａｒｄら１９９１年，Ｂａｒａｇｉら１９９４年，Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら１９９４年，Ｎｇｕｙｅｎら１９９４年）。ＴＩＭＰ−２は、ＴＩＭＰ−１に比べて１０倍以上効果的にプロＭＭＰ−２を阻害する（Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら１９８９ａ年，Ｈｏｗａｒｄら１９９１年）。しかしながら、ＭＴ１−ＭＭＰ介在性のプロＭＭＰ−２活性化に際し、活性化の増強に必要なＴＩＭＰ−２の量は微量である一方、高濃度になるとＭＭＰ−２を阻害するため、ＴＩＭＰ−２は、ＭＭＰ−２に対して２つの機能的作用がある（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａら１９９８年）。ＴＩＭＰ−３は、少なくともＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を阻害する（Ｂｕｔｌｅｒら１９９９年）のに対し、ＴＩＭＰ−４は、特定のＭＭＰに対する著しい選択性がなく、ＭＭＰのすべてのクラスに対する優れたインヒビターである（Ｓｔｒａｔｍａｎｎら２００１年）。ＴＩＭＰ−４は、ＭＴ１−ＭＭＰを阻害することと活性化ＭＭＰ−２を阻害することとの両方でＭＭＰ−２活性を制御する（Ｂｉｇｇら２００１年，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｂａｒｒａｎｔｅｓら２００１年）。
【００２６】
ＭＭＰのこれ外のインヒビターは、３つの薬理学的カテゴリー：１）コラーゲンペプチド模倣物および非ペプチド模倣物、２）テトラサイクリン誘導体および３）ビスホスホナートに分類される。ＭＭＰインヒビター開発の概説に関しては、本教示のため参照によってその全体を本明細書に援用するＨｉｄａｌｇｏ  ＭおよびＥｃｋｈａｒｄｔ，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９３（３）：１７８〜９３で確認することができる。
【００２７】
ペプチド模倣物ＭＭＰのインヒビターは、コラーゲンを切断するためにＭＭＰが結合するコラーゲン部位の構造を模倣して合成された偽ペプチド誘導体である。このインヒビターは、ＭＭＰの活性部位で立体特異的に可逆的に結合し、酵素活性化部位で亜鉛原子をキレート化する。いくつかの亜鉛結合基については、活性部位で結合することによりＭＭＰを競合的に阻害する作用があるかどうか検査されている。これらの基には、カルボキシラート、アミノカルボン酸塩、スルフヒドリル、リン酸の誘導体およびヒドロキサマートがある。臨床開発中のＭＭＰインヒビターの大部分は、ヒドロキサマート誘導体である。このため、提供する方法のインヒビターは、ヒドロキサマートまたはヒドロキサマート誘導体であってもよい。よって、本明細書で「ヒドロキサマート」を用いる場合は、ヒドロキサマートその誘導体の両方をいう。非限定的な例として、ヒドロキサマートは、ＢＢ−９４、ＢＢ−１１０１、ＢＢ２５−１６、ＳＥ２０５、ＡＧ３３４０およびＣＧＳ２７０２３Ａからなる群から選択することができる。
【００２８】
癌患者で評価された最初のＭＭＰインヒビターであるバチマスタットは、非経口投与で効果を発揮する低分子量のヒドロキサマートである。この化合物は作用は強いが、選択性が比較的低く、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７およびＭＭＰ−９の阻害に関するＩＣ５０（酵素を５０％阻害する濃度）値は、１０ｎｇ／ｍＬ未満である。低分子量の合成ＭＭＰインヒビターであるマリマスタットは、バチマスタットと異なり、経口投与で効果を発揮するもので、前臨床試験では、絶対バイオアベイラビリティが２０％〜５０％である。この薬剤は、ＭＭＰの活性部位で亜鉛イオンをキレート化するコラーゲン模倣ヒドロキサマート構造を含むものである。マリマスタットは、バチマスタットと同様、特異性が比較的低く、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７およびＭＭＰ−９の活性を阻害し、そのＩＣ５０はそれぞれ２．５ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、１１５ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬおよび１．５ｎｇ／ｍＬである。
【００２９】
三次元Ｘ線結晶構造解析によるＭＭＰ活性部位のコンホメーションに基づいて、いくつかの非ペプチド性ＭＭＰインヒビターが合理的に合成されている。こうした分子の中には、前臨床モデルで抗腫瘍活性が明らかになり、臨床開発用に選択されたものもある。ＭＭＰインヒビターの合理的な化学的デザインにより、癌および関節炎など、一定の疾患で主に見られるＭＭＰサブタイプに対して特異的阻害活性を持つ化合物の合成が可能になった。たとえば、ＭＭＰ−２の相対的に選択的なインヒビターとして設計されたのがＡＧ３３４０、ＢＡＹ  １２−９５６６およびＢＭＳ−２７５２９１であるのに対し、骨関節疾患に関係することが多いＭＭＰ−１に特異的なものとして設計されたのがＲｏ３２−３５５５であり、このため、関節炎用のＲｏ３２−３５５５が開発中である。ＡＧ３３４０、ＢＡＹ  １２−９５６６、ＢＭＳ−２７５２９１およびＣＧ  Ｓ２７０２３Ａについては現在、癌患者を対象とした臨床評価を受けている。
【００３０】
ＢＡＹ  １２−９５６６（Ｂａｙｅｒ）は、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−９の強力なインヒビターである、経口投与で効果を発揮するビフェニル化合物で、ＩＣ５０は０．１３μｇ／ｍＬである。この化合物は、経口バイオアベイラビリティが７０％〜９８％で経口投与後に速やかに十分に吸収され、投与後０．５〜２時間でピーク血漿濃度に到達し、腸肝再循環も認められた。健常ボランティアを対象としたＢＡＹ  １２−９５６６の薬物動態は、１００ｍｇ／日までの用量において線形性を示した。この薬剤の反復投与の結果、クリアランスの上昇が認められ、したがって、薬剤曝露量が減少した。
【００３１】
ＡＧ３３４０（Ａｇｏｕｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ）は、タンパク質構造に基づく薬剤設計プログラムを用いて合成された、非ペプチド性のコラーゲン模倣ＭＭＰインヒビターである。この薬剤は、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−１３を阻害するもので、ＩＣ５０は、０．１３ｎｇ／ｍＬ未満である。ＡＧ３３４０は、親油性の低分子量化合物であり、血液脳関門を通過する。この薬物は、２〜１００ｍｇ／日の用量範囲で１日２用量とする連続経口投与スケジュールに従って投与された。ＡＧ３３４０による処置の結果、深刻な用量規制毒性は認められなかったものの、用量が２５ｍｇ／日を超えると、筋骨格への影響が現れたため、半分を超える被験者で投与中止が必要となった。この用量では、ＡＧ３３４０をミトキサントロン／プレドニゾンおよびカルボプラチン／パクリタキセルと併用しても安全である。
【００３２】
ＢＭＳ−２７５２９１（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏ）は、経口投与で効果を発揮する第Ｉ相臨床開発中のＭＭＰインヒビターである。前臨床試験において、ＢＭＳ−２７５２９１は、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９に対して強力な阻害活性を示した。この化合物は、非ペプチド性ＭＭＰインヒビターによる筋骨格への作用の一部に関与していると考えられるＴＮＦ受容体の細胞外ドメインを切断しない。
【００３３】
ＣＧＳ−２７０２３Ａ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ）は、ＭＭＰの広域スペクトルインヒビターである。ＣＧＳ−２１Ｑ２３Ａは、第Ｉ相臨床試験で評価されており、この臨床試験では、１５０〜６００ｍｇの用量範囲で分割投与する連続投与スケジュールに従って経口投与が行われた。１日２回の３００ｍｇを超える用量では、大きな毒性作用が見られたが、これは、皮膚毒性および筋骨格毒性であった。薬物動態解析によれば、臨床上許容される用量でＣＧＳ−２７０２３を投与すると、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−９のインビトロでのＩＣ５０に比べて血漿中濃度が数倍になり、これが、投与後１０時間を超えて持続した。
【００３４】
テトラサイクリン誘導体は、ＭＭＰの活性ばかりでなく産生も阻害するため、変性変形関節症、歯周炎および癌などＭＭＰ系が増加する障害を処置する観点から検討が行われている。この薬物ファミリーは、テトラサイクリン、ドキシサイクリンおよびミノサイクリンなど、古典的テトラサイクリン抗生物質と、抗菌活性を除去（ジメチルアミノ基を「Ａ」環の炭素−４から除去するなど）するために化学修飾された新規のテトラサイクリン類縁体とを含む。これらの薬物は、１）酵素結合部位で亜鉛原子をキレート化することで成熟ＭＭＰの活性を遮断すること、２）プロＭＭＰを活性型にするタンパク質分解（ｐｒｏｔｅｏｌｉｔｉｃ）の活性化を阻害すること、３）ＭＭＰの発現を抑制することおよび４）ＭＭＰをタンパク質分解反応および酸化分解反応から保護することなど、複数の機序を介してコラゲナーゼであるＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−１３と、ゼラチナーゼであるＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９とを阻害するものである。ドキシサイクリンおよびＣｏｌ−３など、テトラサイクリン誘導体の中には、前臨床の癌モデルで評価が行われ、悪性疾患の患者を対象とした初期の臨床試験が始まっているものもある。
【００３５】
ビスホスホナートは、酵素活性の阻害など、ＭＭＰに対して様々な阻害作用を与えるものである。また、最もよく用いられるビスホスホナートの１つであるクロドロナートは、ＨＴ１０８０線維肉腫細胞系におけるＭＴ１−ＭＭＰタンパク質およびメッセンジャーＲＮＡの発現を阻害し、人工基底膜によりＣ８１６１メラノーマ細胞系およびＨＴ１０８０線維肉腫細胞系の浸潤も減少させるもので、そのＩＣ５０は、１０〜３５μｇ／ｍＬであった（Ｔｅｒｏｎｅｎ  ＯらＡｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １９９９年；８７８：４５３〜６５）。
【００３６】
ここに提供する方法のインヒビターは、周知のあるいは本明細書で提供するどのようなＭＴ１−ＭＭＰインヒビターであってもよく、単独あるいは他のＭＴ１−ＭＭＰインヒビターのいずれかと組み合わせても構わない。たとえば、提供する方法のインヒビターは、ＴＩＭＰとヒドロキサマートとの組み合わせを含んでもよい。したがって、提供する方法のインヒビターは、たとえば、ＴＩＭＰ−２と、ＢＢ−９４、ＢＢ−１１０１、ＢＢ２５−１６、ＳＥ２０５、ＡＧ３３４０およびＣＧＳ  ２７０２３Ａの１つまたは複数との組み合わせを含んでもよい。
【００３７】
２．配列類似性
本明細書で論じる場合、相同性および同一性という語は、類似性と同じ意味で用いられることが理解されるであろう。このため、たとえば、２つの非天然配列の間で相同性という語を使用する場合、当然のことながら、これは、必ずしもこの２つの配列間の進化的関係を示すものではなく、むしろその核酸配列間の類似性または関連性を指すものである。進化的に関連した２つの分子間の相同性を決定する方法の多くは、進化的に関連しているか否かにかかわらず、配列類似性の判定のために任意の２つ以上の核酸またはタンパク質に適用されるのが一般的である。
【００３８】
一般に、開示された遺伝子およびタンパク質の変異体および誘導体を同定する方法の１つは、既知の個々の配列との相同性によって変異体および誘導体を同定するものであることが理解されるであろう。また、本明細書に開示する個々の配列のこうした同一性については、本明細書の他の部分でも論じられる。全体として、本明細書に開示する遺伝子およびタンパク質の変異体は、明示された配列または天然配列との相同性が少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９パーセントであるのが通常である。当業者ならば、遺伝子などの２つのタンパク質または核酸の相同性の判定法を容易に理解するであろう。たとえば、相同性のレベルが最も高くなるように、２つの配列を整列させた後に相同性の計算を行ってもよい。
【００３９】
相同性の計算を、公表されたアルゴリズムにより、別の方法で行うこともできる。比較のための配列の最適なアラインメントに関しては、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１年）の局地的相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０年）の相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８年）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータインプリメンテーション（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，ウィスコンシン州マディソンのＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）または検査によって得ることができる。
【００４０】
核酸の場合は、たとえば、少なくとも核酸アラインメントに関係する材料のために参照によって本明細書に援用するＺｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８〜５２，１９８９年、ＪａｅｇｅｒらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６〜７７１０，１９８９年、ＪａｅｇｅｒらＭｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１〜３０６，１９８９年に開示されているアルゴリズムにより、同じタイプの相同性を得ることができる。通常、これらの方法のうちどれを用いてもよいが、場合によっては、これら種々の方法の結果が異なる可能性があることが理解されるであろう。とはいえ、これらの方法の少なくとも１つで同一性が見つかれば、その配列が、明示された同一性を有しているものとされ、本明細書に開示されているものであることを、当業者ならば、理解するであろう。
【００４１】
たとえば、本明細書で使用する場合、別の配列に対して特定のパーセント相同性を持つものとして記載された配列は、上記の計算法の１つまたは複数のいずれかで計算した場合に、その記載された相同性を持つ配列を指す。たとえば、Ｚｕｋｅｒの計算法により第２の配列に対する第１の配列の相同性を８０パーセントであると計算した場合、他の計算法のいずれかで計算して第２の配列に対する第１の配列の相同性が８０パーセントでなくても、本明細書で規定する場合、第２の配列に対する第１の配列の相同性は、８０パーセントである。別の例では、Ｚｕｋｅｒの計算法とＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎとの両方の計算法により第２の配列に対する第１の配列の相同性を８０パーセントであると計算した場合、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの計算法、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの計算法、Ｊａｅｇｅｒの計算法または他の計算法のいずれかで計算して第２の配列に対する第１の配列の相同性が８０パーセントでなくても、本明細書で規定する場合、第２の配列に対する第１の配列の相同性は、８０パーセントである。さらに別の例では、各計算法により第２の配列に対する第１の配列の相同性を８０パーセントであると計算した場合（実際には、計算法が異なれば、計算される相同性パーセンテージも異なる場合が多いが）、本明細書で規定する場合、第２の配列に対する第１の配列の相同性は、８０パーセントである。
【００４２】
３．組成物
本明細書に開示するＭＴ１−ＭＭＰなどのＭＴ−ＭＭＰのインヒビターを、本明細書で提供する方法の標的または被験者に投与することができる１種または複数種の物質と併用してもよい。たとえば、ＭＴ１−ＭＭＰなどのＭＴ−ＭＭＰの開示したインヒビターを、ＩＤＤＭの被検体に投与できる当該技術分野において公知の１種または複数種の物質と併用してもよい。ＭＴ１−ＭＭＰの開示したインヒビターを、Ｔ細胞に投与できる１種または複数種の物質と併用してもよい。この物質は、マーカーでもよいし、治療物質でもよいし、標的物質でもよい。治療物質は、標的組織（膵臓、膵島など）に所望の作用を与える任意の化合物、分子または合成物を含むものである。標的物質は、アプタマー、抗体またはそのフラグメントを含むものである。一例を挙げると、標的物質は、Ｔ細胞を標的とするものである。したがって、標的物質は、ＣＤ４４を標的としても構わない。
【００４３】
本明細書では、薬学的に許容されるキャリア中にＭＴ１−ＭＭＰなどのＭＴ−ＭＭＰのインヒビターを含む組成物を提供する。インヒビターは、公知のまたは本明細書に開示した任意のＭＭＰインヒビターの単独でもよいし、組み合わせでよい。このため、インヒビターは、天然のＭＭＰ組織インヒビター（ＴＩＭＰ）であっても構わない。ＴＩＭＰは、ＴＩＭＰ−２であってもよい。ＴＩＭＰは、ＴＩＭＰ−３であってもよい。ＴＩＭＰは、ＴＩＭＰ−４であってもよい。さらに、インヒビターは、ヒドキサマートであっても構わない。ヒドロキサマートは、ＢＢ−９４、ＢＢ−１１０１、ＢＢ２５−１６、ＳＥ２０５、ＡＧ３３４０およびＣＧＳ  ２７０２３Ａからなる群から選択される。したがって、インヒビターは、ＡＧ３３４０でもよい。
【００４４】
４．薬学的キャリア
薬学的に許容されるキャリア中の開示した組成物に関しては、インビボで投与することができる。「薬学的に許容される」とは、材料が生物学的にまたはその他の点で好ましいこと、すなわち、望ましくない生物学的作用を何か引き起こしたり、その材料を含む医薬組成物の他の成分のいずれかと有害相互作用を引き起こしたりすることなく、材料を被検体に投与できることをいう。当然ながら、キャリアについては、当業者において周知である活性成分の分解および被検体への副作用がある場合、これを最小限にとどめるように選択することになる。
【００４５】
好適なキャリアおよびその製剤に関しては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ１９９５年に記載されている。一般に、薬学的に許容される塩を製剤において適切な量で使用して製剤を等張にする。薬学的に許容されるキャリアの例として、生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液があるが、これに限定されるものではない。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、一層好ましくは約７〜約７．５である。さらに、キャリアは、マトリックスがフィルム、リポソームまたは微小粒子などの形状製品の形をとる、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなど、徐放性製剤を含むものである。たとえば、投与経路および投与する組成物の濃度次第で、特定のキャリアが一層好ましいものになり得ることが当業者には明らかであろう。たとえば、キャリアは、ヒトアルブミンまたはヒト血漿であってもよい。
【００４６】
医薬組成物は、キャリア、増粘剤、希釈薬、バッファー、保存剤、表面活性剤および目的の分子を加えた同種のものを含んでもよい。さらに、医薬組成物は、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬および同種のものなど１種または複数種の活性成分を含んでもよい。
【００４７】
Ｂ．方法
本明細書は、膵臓の毛細血管内皮を通過するＴ細胞のトランスマイグレーションを阻害する方法であって、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）のインヒビターを含む組成物を細胞に投与することを含む、方法を提供するものである。提供する方法の細胞は、膵臓の毛細血管内皮を通過するＴ細胞のトランスマイグレーションを阻害する必要がある被検体の細胞であってもよいし、その被検体に由来する細胞であってもよい。
【００４８】
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、細胞外基質成分の分解に関与している酵素のファミリーである。これまで報告されている１６種のタンパク質のうち、１０種類は通常、可溶性分子として検出されている。ＭＭＰタンパク質の中には、膜内在性タンパク質であることが明らかにされており、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）と呼ばれているものもある。現在では、ＭＴ−ＭＭＰファミリーは、ＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＴ２−ＭＭＰおよびＭＴ３−ＭＭＰ（それぞれＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５およびＭＭＰ１６とも呼ばれる）という少なくとも３つのメンバーからなっていることが知られている。これらのタンパク質はそれぞれ、細胞表面に局在化させるＣ末端の膜貫通ドメインを含んでいるが、独立に発現するものである。また、これらのタンパク質は、触媒ドメインに８アミノ酸の挿入を含むという点で、ＭＭＰファミリーの他のメンバーと異なる。ＭＴ１−ＭＭＰは、プロゼラチナーゼ  Ａ（ＭＭＰ−２、７２ｋｄａのＩＶ型コラゲナーゼ）を切断して活性型にするのに関与していると考えられるが、ＭＴ２−ＭＭＰおよびＭＴ３−ＭＭＰも、酵素前駆体ＭＭＰ−２の活性化に関わっている。したがって、提供する方法のＭＴ−ＭＭＰインヒビターは、ＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＴ２−ＭＭＰ、ＭＴ３−ＭＭＰまたはその組み合わせのインヒビターであってもよい。このため、このインヒビターは、ＭＴ１−ＭＭＰのインヒビターであって構わない。一態様では、インヒビターは、ＭＴ１−ＭＭＰに特異的である。別の態様では、インヒビターは、ＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＴ２−ＭＭＰおよびＭＴ３−ＭＭＰに特異的である。別の態様では、インヒビターは、非特異的にＭＭＰを阻害することができる。
【００４９】
「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」「阻害すること（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」および「阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」とは、活性、反応、病態、疾患またはこれ以外の生物学的パラメータを抑えることを意味する。これには、活性、反応、病態または疾患の完全な消失を含めてもよいが、これに限定されるものではない。さらに、これには、たとえば、正常レベル、天然レベルまたは対照レベルと比べて活性、反応、病態または疾患が１０％抑制されたことを含めてもよい。したがって、抑制は、たとえば、天然レベルまたは対照レベルとの比較で、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の抑制であってもよいし、その間の任意の量の抑制であってもよい。
【００５０】
さらに、本明細書は、被検体のＩ型糖尿病を処置する、阻害するまたは予防する方法であって、ＭＴ−ＭＭＰのインヒビター組成物を被検体に投与することを含む、方法も提供するものである。
【００５１】
疾患または病態のある被検体において、「処置する」または「処置」という語は、疾患もしくは病態および／または疾患もしくは病態の症状または作用の一部または全部を変化させる、を変える、抑制する、寛解させる、解消するまたは消失させるように試みて、被検体に作用するという意味で用いる。たとえば、処置は、疾患または病態の症状または作用を抑制する方法であってもよい。さらに、処置は、疾患もしくは病態の症状または影響ばかりではなく疾患または病態自体を抑制する方法であってもよい。処置は、たとえば、正常レベルまたは天然レベルから抑制されていれば、どのような抑制でもよく、疾患、病態または疾患もしくは病態の症状の完全な消失であってもよいが、これに限定されるものではない。たとえば、疾患がある被検体または対照被検体の天然レベルと比べて、同じ被検体の疾患の１つまたは複数の症状が１０％抑制されれば、開示したＩ型糖尿病を処置する方法を処置とみなす。したがって、抑制は、正常レベル、天然レベルまたは対照レベルとの比較で１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の抑制であってもよいし、その間の任意の量の抑制であってもよい。本明細書で使用する場合、「予防する」とは、何かが起こることを防止する、回避する、防ぐ、妨げる、止める、遅延させるまたは邪魔することをいい、特に事前の計画または措置によるものを指す。
【００５２】
さらに、分子を同定する方法であって、ＭＴ−ＭＭＰ活性を阻害する能力があるかどうか候補分子をスクリーニングすることと、膵臓の毛細血管内皮を通過する細胞のトランスマイグレーションを候補分子が阻害できるかどうかを判定することとを含む、方法も提供する。
【００５３】
さらに、分子を同定する方法であって、ＭＴ−ＭＭＰ活性を阻害する分子が、膵臓の毛細血管内皮を通過するＴ細胞のトランスマイグレーションを阻害できるかどうかを判定することを含む、方法も提供する。
【００５４】
さらに、Ｔ細胞を膵臓の毛細血管内皮に固定化する方法であって、Ｔ細胞とＭＴ−ＭＭＰのインヒビターを含む組成物とを接触させることを含む、方法も提供する。この方法の細胞は、Ｔ細胞を膵臓の毛細血管内皮に固定化する必要がある被検体と認められた被検体の細胞であってもよいし、その被検体に由来する細胞であってもよい。
【００５５】
さらに、Ｉ型糖尿病の危険性がある被検体を処置する方法であって、ＭＴ−ＭＭＰのインヒビターを含む組成物を被検体に投与することを含む、方法も提供する。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「被検体」としては、動物、植物、バクテリア、ウイルス、寄生虫およびこれ以外の核酸を有する生体または実体が挙げられるが、これに限定されるものではない。被検体は、脊椎動物、さらに具体的に言えば、哺乳類（ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長類、雌ウシ、ネコ、モルモットまたは齧歯類など）、魚、トリまたは爬虫類もしくは両生類であってもよい。被検体は、無脊椎動物、さらに具体的には節足動物（昆虫および甲殻類など）に対して可能である。この語は、特定の年齢または性別を示すものではない。したがって、性別を問わず、成人および新生児の被検体ならびに胎児を含むことを意図している。患者とは、疾患または障害に悩む被検体をいう。「患者」という語は、ヒト被検体および動物被検体を含むものである。糖尿病ならびに開示する方法および組成物の文脈では、被検体は、糖尿病であるあるいは糖尿病になる可能性がある被検体であることが理解されるであろう。
【００５７】
本明細書で提供する方法の被検体は、Ｉ型糖尿病であると診断されていてもよい。１型糖尿病の徴候および症状は、血液中のグルコース量が増加する高血糖症と呼ばれる病態に関係している。１型糖尿病の最も多い症状として：排尿の増加と、強い口渇と、食欲亢進にもかかわらず体重が減少することと、疲労と、感染症に対する高感受性とが挙げられる。糖尿病の検査では、血液サンプルの採取および血液内のグルコース（糖）濃度の測定が行われる。随時血糖検査では、いつでも血液サンプルを採取して試験を行うことができる。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＤＡ）によれば、随時血糖値が２００ｍｇ／ｄｌを超えて糖尿病の典型的な症状を伴う場合、糖尿病であることが示唆される。空腹時血糖検査では、少なくとも８時間飲食をしない（水を除く）期間を経てから血液サンプルを採取する。血液は、ほとんどの場合、朝食前の早朝に採取される。ＡＤＡによれば、空腹時血糖値が２回にわたり１２６ｍｇ／ｄｌ以上である場合、糖尿病であることが示唆される。空腹時血糖検査は、糖尿病の診断に用いられる最も一般的な検査である。経口糖負荷試験では、最初に空腹時血糖（ｂｌｏｏｄ  ｓｕｇａｒ）を測定する。次いで、同じ人物に甘い飲料を飲んでもらう。その後、３０分ごとに２時間にわたり血糖値を測定する。２時間後の血糖値が１４０ｍｇ／ｄｌ未満であれば、正常とみなされる。２時間後の血糖値が２００ｍｇ／ｄｌを超えると、糖尿病であることが示唆される。２時間後の血糖値が１４０〜２００ｍｇ／ｄｌであれば、耐糖能異常（または前糖尿病）であることが示される。このような人については将来、糖尿病のモニターおよびスクリーニングを行う必要がある。また、耐糖能異常は、心疾患の危険因子でもある。血糖値が１８０ｍｇ／ｄｌを超えて上昇すると、グルコースは、尿に出始める。糖が尿に出たら、血糖検査を受けるべきである。体がエネルギー生成のため過剰な脂肪を分解し始めると、尿にケトンが出る。ケトンにより、脂肪が脂肪細胞から遊離するのを防ぐのに十分なインスリンがないことが示される。ケトンが認められる場合は、重篤で死に至ることもある、１型糖尿病の合併症が示唆されていることもある。
【００５８】
提供する方法は、ランゲルハンス島周囲の毛細血管内皮へのＴ細胞の固定化を強めるものである。ＣＤ４４は、内皮ヒアルロナンとの相互作用を介して、内皮へのＴ細胞の接着に関わっている。ＣＤ４４は、腫瘍細胞におけるＭＴ１−ＭＭＰによるタンパク質分解の標的であり、腫瘍細胞においてＭＴ１−ＭＭＰの切断により、ＣＤ４４の細胞外ドメインは細胞表面から遊離し、ＣＤ４４細胞受容体機能が不活化される。提供する方法では、ＭＴ１−ＭＭＰを阻害し、したがって、ＣＤ４４介在性のＴ細胞の接着を促進させる。このため、一態様では、本方法の結果、ランゲルハンス島周囲の毛細血管内皮へのＴ細胞の固定化は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％進む可能性がある。別の態様では、提供する方法のインヒビターは実質的に、膵島内皮にＴ細胞を固定化するものである。
【００５９】
提供する方法では、Ｔ細胞の膵臓へのホーミングが減少する可能性がある。ランゲルハンス島を破壊するには、まずインスリン特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＩＳ−ＣＤ８＋細胞）が膵島にホーミングしなければならない。たとえば、ホーミングには、受容体が介在する可能性がある。提供する方法は、ＭＴ１−ＭＭＰを阻害し、ＣＤ４４介在性のＴ細胞の接着を促進する。このＣＤ４４による接着が強化されれば、Ｔ細胞の膵臓へのホーミングが阻害される。したがって、この方法の結果、Ｔ細胞の膵臓へのホーミングが少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％抑制される。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「標的（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」または「ホーミング」という語は、非標的の化合物または組成物と比べて、Ｔ細胞または開示した組成物などの標的化合物または標的組成物が、ある部位または位置で優先的に移動、結合および／または蓄積することを指してもよい。たとえば、Ｔ細胞においては、「ホーミング」とは、Ｔ細胞の標的組織への移動をいう。被検体へのインビボ投与においては、「標的」または「ホーミング」は、非標的の組織、細胞および／または構造と比べて、開示した組成物などの化合物または組成物が、たとえば、標的組織、標的細胞および／または標的構造に優先的に移動、結合および／または蓄積することを指してもよい。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「標的組織」という語は、被検体への投与後にＴ細胞または開示した組成物など、標的化合物または標的組成物が蓄積する予定の部位をいう。たとえば、本明細書に開示した主題の方法は、子宮内膜症を含む標的組織を用いるものである。
【００６２】
本明細書に開示する場合、提供する方法のインヒビターは、機能的な膵島の再生も促進するものである。ＩＤＤＭの病因には、自己免疫性Ｔ細胞が、活性化した後にランゲルハンス島にホーミングすることが関係している。膵島では、Ｔ細胞がインスリンを産生するβ細胞を直接破壊する。提供する方法は、Ｔ細胞の膵臓へのホーミングを阻害するものである。提供する方法は、膵島細胞の破壊を阻害する以外に、機能的な膵島を再生させるものである。したがって、この方法の結果、機能的な膵島が少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％再生することがある。
【００６３】
提供する方法のＴ細胞は、インスリン特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＩＳ−ＣＤ８＋細胞）であってもよい。ＮＯＤマウスはＭＨＣクラスＩの発現が欠落していて自然発症糖尿病を発病しにくいため、ＮＯＤ／ＬｔＪ（ＮＯＤ）マウスでは、この疾患の発病のためにＣＤ８＋細胞が必要となる。ＭＨＣクラスＩ分子の場合、前糖尿病状態のＮＯＤマウスの膵臓浸潤内に確認されるインスリン特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、インスリンＢ鎖アミノ酸の１５〜２３（配列番号１）番目のペプチドを認識する。
【００６４】
１．投与
開示した組成物については、希望するのが局所処置あるいは全身処置であるか、および処置する領域に応じて、多くのやり方で投与することができる。投与は、局所（点眼、経膣、直腸、経鼻など）、経口、吸入または非経口（たとえば、点滴静注、皮下注射、腹腔内注射または筋肉内注射）であってもよい。したがって、開示した組成物を、経口、非経口（静脈内など）筋肉内注射、腹腔内注射、経皮、体外、局所または局所鼻腔投与もしくは吸入投与などの同種もので投与してもよい。
【００６５】
通常、組成物の非経口投与を用いる場合は、注射を特徴とする。注射剤に関しては、溶液もしくは懸濁液、注射前の液体懸濁液に好適な固形、あるいはエマルジョンとして従来の形態で調製することができる。最近になって見直された非経口投与のアプローチでは、ゆっくりとした放出または徐放性放出のシステムを用いるため、一定の投与量が保たれる。参照によって本明細書に援用する米国特許第３，６１０，７９５号などを参照されたい。
【００６６】
材料については、（たとえば、微小粒子、リポソームまたは細胞に組み込んで）溶液中、懸濁液中にあってもよい。こうした材料は、抗体、受容体または受容体リガンドを介してＴ細胞などの特定の細胞型を標的にしてもよい。
【００６７】
非経口投与製剤（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）は、無菌の水溶液または非水溶液、懸濁液およびエマルジョンを含むものである。非水性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。水性キャリアには、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは生理食塩水および緩衝培地などの懸濁液がある。非経口投与のビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース液、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液または固定油がある。静脈内投与のビヒクルには、流動栄養補液、電解質補液（リンゲルデキストロース液をベースとしたものなど）および同種ものがある。たとえば、抗菌物質、酸化防止剤、キレート化剤および不活性ガスならびに同種のものなど、保存剤およびその他の添加剤が存在しても構わない。
【００６８】
局所投与の剤形には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤および粉剤がある。従来型の薬学的キャリア、水性、粉体または油性の基剤、増粘剤および同種のものが必要になる、あるいは、望ましい場合もある。
【００６９】
経口投与組成物には、粉体または顆粒、水培地または非水系培地の懸濁液または溶液、カプセル、サッシェまたは錠剤がある。増粘剤、矯味矯臭剤、希釈薬、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましい場合もある。
【００７０】
この組成物の中には、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸およびリン酸などの無機酸との反応ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸およびフマル酸などの有機酸との反応、あるいは、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基と反応ならびにモノアミン、ジアミン、トリアルキルアミンおよびアリールアミンならびに置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応で形成される、薬学的に許容される酸付加塩または塩基付加塩として投与することができるものもある。
【００７１】
ｉ．核酸送達
本明細書に開示する場合、提供する方法は、被検体の細胞に外来のＤＮＡを投与することと取り込むことと（すなわち、遺伝子の導入またはトランスフェクション）を含んでもよい。たとえば、開示したインヒビターをコードしている核酸を細胞に送達してもよい。開示した核酸は、裸のＤＮＡまたはＲＮＡの形であってもよいし、核酸を細胞に送達するベクター内にあってもよく、したがって、抗体をコードしているＤＮＡフラグメントは、プロモーターの転写制御下にあってもよいことを当業者ならばよく理解するであろう。ベクターは、アデノウイルスベクター（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｌａｖａｌ，カナダケベック州）などの市販の製剤（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）であっても構わない。核酸またはベクターの細胞への送達は、種々の機構により行うことができる。一例として、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．，メリーランド州ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ））、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（ＱＩＡＧＥＮ，ドイツヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ｉｎｃ．，ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））ならびに当該技術分野における手順標準に準じて開発されたこれ以外のリポソームなど、市販されているリポソーム製剤（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を用いてリポソームにより送達することができる。さらに、開示した核酸またはベクターを、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ））から市販されている技術であるエレクトロポレーションおよびソノポレーションマシン（ＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ  ｍａｃｈｉｎｅ）（ＩｍａＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，アリゾナ州トゥーソン（Ｔｕｃｓｏｎ））によりインビボで送達することもできる。
【００７２】
一例として、組換えレトロウイルスゲノムをパッケージングすることができるレトロウイルスベクター系など、ウイルス系によりベクターを送達することができる（ＰａｓｔａｎらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：４４８６，１９８８年；ＭｉｌｌｅｒらＭｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５，１９８６年を参照のこと）。その後、この組換えレトロウイルスを用いて感染させることにより、その感染細胞に所望のＭＴ−ＭＭＰインヒビターをコードしている核酸（またはその活性フラグメント）を送達してもよい。言うまでもなく、この変質した核酸を哺乳類細胞に導入する具体的な方法は、レトロウイルスベクターの使用に限定されるものではない。こうした手順については、アデノウイルスベクター（ＭｉｔａｎｉらＨｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：９４１〜９４８，１９９４年）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（ＧｏｏｄｍａｎらＢｌｏｏｄ  ８４：１４９２〜１５００，１９９４年）、レンチウイルスベクター（ＮａｉｄｉｎｉらＳｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２６３〜２６７，１９９６年）、シュードタイプレトロウイルスベクター（ＡｇｒａｗａｌらＥｘｐｅｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：７３８〜７４７，１９９６年）を使用するなど、他の技法も広く用いられている。さらに、リポソーム送達ならびに受容体を介した機構および他のエンドサイトーシス機構など、物理的形質導入技法も用いられている（たとえば、ＳｃｈｗａｒｔｚｅｎｂｅｒｇｅｒらＢｌｏｏｄ  ８７：４７２〜４７８，１９９６年を参照こと）。この開示した組成物および方法を、これらまたは他の繁用されている遺伝子移入方法のいずれかとともに用いてもよい。
【００７３】
一例として、核酸をアデノウイルスベクターで被検体の細胞に送達する場合、アデノウイルスのヒトへの投与量は、１回の注射につき約１０７〜１０９プラーク形成単位（ｐｆｕ）までの幅があってもよいが、１０１２ｐｆｕという高投与量でもよい（Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：９８５〜１００１，１９９７年；ＡｌｖａｒｅｚおよびＣｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：５９７〜６１３，１９９７年）。被検体には単回注射してもよいし、追加注射が必要な場合は、無期限に６ヶ月（あるいは、当業者が決定する他の適切な時間間隔）おきにおよび／または処置効果が確立されるまで繰り返してもよい。
【００７４】
核酸またはベクターの非経口投与を用いる場合は通常、注射を特徴とする。注射剤に関しては、溶液もしくは懸濁液、注射前の液体懸濁液に好適な固形、あるいはエマルジョンとして従来の形態で調製することができる。最近になって見直された非経口投与のアプローチでは、ゆっくりとした放出または徐放性放出のシステムを用いるため、一定の投与量が保たれる。治療用化合物に好適な剤形および様々な投与経路のさらなる考察については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ著，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ペンシルベニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ），１９９５年を参照されたい。
【００７５】
２．治療用途
組成物を投与するのに有効な投与量およびスケジュールについては、経験的に決定してもよいが、かかる決定は、当該技術分野の技術の範囲内で行うものである。組成物の投与量範囲は、障害の症状に影響を与え、所望の作用を得るのに十分な投与量範囲である。投与量は、不要な交差反応、アナフィラキシー反応および同種のものなど、副作用を引き起こすほど多くしてはならない。通常、投与量は、患者の年齢、病態、性別および疾患の程度、投与経路またはその治療法に他の薬剤が含まれるかどうかにより異なるものであり、当業者が決定しても構わない。投与量については、任意の禁忌事象が認められた場合、医師が個別に調節してもよい。投与に関しては、多様であってもよく、１日あるいは数日間にわたり、毎日単回投与または反復投与を行ってもよい。一定のクラスの医薬品の適切な投与量については、ガイダンスを文献で確認することができる。単独使用の場合、提供した組成物の典型的な１日投与量は、上述の要因に応じて、約１ｍｇ／ｋｇ体重から約１０ｍｇ／ｋｇ体重など、１日あたり約１ｍｇ／ｋｇ体重から最大１００ｍｇ／ｋｇ体重あるはそれ以上までの幅があってもよい。
【００７６】
ＡＧ３３４０などのヒドロキサマート抗癌剤によるＭＴ１−ＭＭＰの薬理学的阻害は、ＩＤＤＭ患者に好ましい結果をもたらす。このインヒビターは、血液中のＴ細胞の細胞表面に結合したＭＴ１−ＭＭＰに直ちにアクセするため、ＩＤＤＭに必要とされるインヒビターは低濃度である。対照的に、癌のＭＭＰの阻害に必要なインヒビターは、血管新生が不十分な腫瘍への送達を要するため高濃度である。さらに、ＩＤＤＭを対象としたＭＭＰインヒビターの必要投与量は、副作用（ｓｉｄｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ）を引き起こすと考えられるレベル未満でもある。
【００７７】
ＩＤＤＭを処置する、阻害するまたは予防する開示した組成物を投与した後、治療用組成物の有効性を、当業者に周知の様々な方法で評価することができる。たとえば、当業者ならば、血糖（ｂｌｏｏｄ  ｓｕｇａｒ）の低下を観察すれば、本明細書に開示した組成物が被検体のＩＤＤＭの処置または阻害に有効であることを理解するであろう。
【００７８】
Ｃ．定義
当然のことながら、開示する方法および組成物は、記載した特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されるものではなく、変更が可能である。また、本明細書に用いる用語は、個々の実施形態を説明するためだけのものであって、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものでないことも理解されるであろう。
【００７９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形である「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数についての言及を含むことに留意しなければならない。したがって、たとえば、「インヒビター（ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」とは、複数のかかるインヒビターを含み、「インヒビター（ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」とは、当業者に公知の１種または複数種のインヒビターおよびその等価物等をいうものであり、以下同様である。
【００８０】
「任意の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「任意に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」とは、後に記載する現象、状況または材料が起こっても起こらなくてもよいこと、あるいは、存在しても存在しなくてもよいこと、さらに、その記載が、その現象、状況または材料が起こるまたは存在する場合と、それが起こらないまたは存在しない場合とを含むことを意味する。
【００８１】
本明細書では、範囲を、「約（ａｂｏｕｔ）」を前置したある特定の値からおよび／または「約」を前置した別の特定の値までと表すことができる。このように範囲を表す場合、その範囲も明確に意図しており、文脈上特に他の意味に解すべき場合を除き、一方の特定の値からおよび／または他方の特定の値までの範囲を開示しているとみなされる。同様に、先行詞「約」を用いることにより値を近似値として表す場合、特定の値は、文脈上特に他の意味に解すべき場合を除き、明確に意図した別の実施形態を形成しており、その実施形態を開示しているとみなすべきであることも理解されるであろう。さらに、各範囲の端点は、文脈上特に他の意味に解すべき場合を除き、他方の端点との関連でも他方から切り離しても意味があることも理解されるであろう。最後に、個々の値および明示的に開示した範囲内に含まれる各値の下位の範囲もすべて、明確に意図しており、文脈上特に他の意味に解すべき場合を除き、開示しているとみなすべきであることを理解されたい。こうした実施形態の一部または全部を明示的に開示している特殊な場合であっても、上記を適用する。
【００８２】
他に記載がない限り、本明細書に使用した技術用語および科学用語はすべて、開示した方法および組成物が属する技術分野の当業者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。本方法および組成物の実施または試験では、本明細書に記載したものと類似または同等の任意の方法および材料を用いることもできるが、特に有用な方法、装置および材料は、記載したとおりである。本明細書に引用する刊行物および刊行物に記載の材料については、参照により本明細書に明確に援用する。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明によるかかる開示に対し、先行する権利がないと認めているものと解釈してはならない。任意の参考文献が従来技術を構成することを自認するものではない。参考文献の考察は、著者が主張する内容を記載したものであり、出願人は、引用文献の正確性および妥当性に異議を申し立てる権利を留保する。本明細書では多くの刊行物に言及しているが、かかる言及は、こうした文献のいずれかが当該技術分野の共通一般知識の一部をなすことを承認するものではないことが明らかに理解されるであろう。
【００８３】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などのこの語の変形は、「含むが、これに限定されるものではない」を意味し、たとえば、他の添加剤、成分、整数またはステップを除外することを意図しているものではない。
【００８４】
当業者ならば、通常の実験だけで、本明細書に記載する方法および組成物の具体的な実施形態の等価物を多数認識するか、確認することができるであろう。かかる等価物については、下記の特許請求の範囲により包含されることを意図している。
【実施例】
【００８５】
Ｄ．実施例
以下の実施例は、本明細書で特許請求している化合物、組成物、製品、装置および／または方法の製造方法および評価方法の完全な開示および説明を当業者に提示するもので、純粋に例示的なものを意図しており、本開示を限定することを意図するものではない。数字（量、温度など）に対する正確性を確保するように努力したが、一部に誤差および偏差があることを考慮すべきである。他に記載がない限り、部は重量部であり、温度は℃単位または周囲温度であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
【００８６】
１．実施例１：制癌剤により膜１型マトリックスメタロプロテイナーゼを阻害すると、糖尿病誘発Ｔ細胞の膵臓へのホーミングが干渉される。
【００８７】
材料および方法
マウスおよび細胞−ＮＯＤ／ＬｔＪ系統のＮＯＤマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。ＩＳ−ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＮＯＤマウスの膵臓に由来するＴＧＮＦＣ８クローンのインスリン特異的ＣＤ８陽性Ｋｄ拘束性Ｔ細胞）（Ｗｏｎｇ，Ｆ．Ｓ．ら（２００３年））を、５％ウシ胎児血清と、２×１０−５Ｍβ−メルカプトエタノールと、２０ｍＭペニシリン−ストレプトマイシンと、３ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミンと、５単位／ｍｌ組換えマウスインターロイキン−２とを補充したクリック培地で維持した（Ｓａｖｉｎｏｖ，Ａ．Ｙ．ら（２００３年））。ＩＳ−ＣＤ８＋細胞を３週間ごとに、Ｌ１５ＹＬＶＣＧＥＲＧ２３（配列番号１）インスリンＢ鎖ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）を注入した放射線放射線照射ＮＯＤ脾細胞（２０００ラド）と混合した（Ｗｏｎｇ，Ｆ．Ｓ．ら（１９９９年））。
【００８８】
ＮＯＤマウスへの糖尿病の導入−ＩＳ−ＣＤ８＋細胞を、ＡＧ３３４０（５０μＭまたは２１μｇ／ｍｌ）を用いる場合と用いない場合とで２時間インキュベートし、次いで５〜８週齢の放射線照射（事前に７２５ラドで２４時間）マウス（１×１０７細胞／動物）に静脈内注射した。マウスを２１日間モニターした。細胞の注射後０、２、４、６、８および１０日目に、マウスにＡＧ３３４０（３０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）またはリン酸緩衝生理食塩水単独の腹腔内注射を行った。糖尿病の発現を、尿中のグルコース濃度をＤｉａｓｔｉｘ（登録商標）ストリップ（Ｂａｙｅｒ）で評価して確認した。３日間連続して尿中のグルコース濃度が＞２０００ｍｇ／ｄｌのマウスを糖尿病とみなした。ＡＧ３３４０（分子量＝４２１Ｄａ）を入手した。尿中のグルコース濃度は、血液中のグルコース濃度と密接に連動する（Ｔｒａｉｓｍａｎ，Ｈ．Ｓ．およびＧｒｅｅｎｗｏｏｄ，Ｒ．Ｄ．（１９７３年））。尿中のグルコースの測定は、ＮＯＤマウスの糖尿病の発生を調査するのに一般に受け入れられている方法である（Ｐｏｍｅｒｌｅａｕ，Ｄ．Ｐ．ら（２００５年））。
【００８９】
蛍光追跡および形態計測解析−トラフィッキング試験のため、ＩＳ−ＣＤ８Ｔ細胞を、５％ウシ胎児血清および蛍光色素である０．００７５ｍｇ／ｍｌの１，１’−ジドデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロラート（ＤｉＩ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ））を含む完全なクリック培地において、１×１０７細胞／ｍｌで３７℃にて３０分間暗所でインキュベートした。インキュベーション後、この細胞をリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、過剰なＤｉＩを除去した。標識ＩＳ−ＣＤ８＋細胞（１×１０７細胞）を０．２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水に加えて、放射線照射（事前に７２５ラドで２４時間）ＮＯＤマウスに静脈内注射した。ＤｉＩ標識細胞を注射してから２４時間後、マウスを屠殺した。脾臓および膵臓を切除し、０．１Ｍ過ヨウ素酸−リシン−パラホルムアルデヒドのリン酸緩衝液で固定した。次いでこの臓器をスクロース飽和させ、ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，カリフォルニア州）で凍結成形を行い、凍結切断片を作成した。膵臓全体の中で厚さ７μｍのクリオスタット切片を、Ｌｅｉｃａ  ＣＭ１９００クリオトームを用いて６０μｍ間隔で調製した。膵島内のＤｉＩ標識ＣＤ８＋細胞の分布を蛍光顕微鏡を用いて調べた。マウス１匹（４〜５マウス／実験群）あたり少なくとも１００個の島を調べた。凍結切片では、膵島特有の形態を容易に確認できる。個々の膵島に関係する領域内のＤｉＩ標識細胞を計数した（代表的な画像である図３を参照のこと；膵島に関係する領域を白の実線で示し、膵島の境界を白の点線で示す）。膵島の境界と比較して各ＩＳ−ＣＤ８＋標識細胞の位置を判定した。膵島の境界内に局在する標識細胞を「内側」とみなし、膵島に隣接するが膵島の境界の外側の標識細胞を「エントランス」とみなした。この方法については、かなり詳細に報告されている（これらの方法を教示しているためその全体を本明細書に参照して援用するＳａｖｉｎｏｖ，Ａ．Ｙ．ら（２００３年）およびＳａｖｉｎｏｖ，Ａ．Ｙ．ら（２００１年）を参照のこと）。
【００９０】
ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＡＴによる細胞の処置−ＭＴ１−ＭＭＰ（ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＡＴ；３μｇ）の触媒ドメインを、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ０．２ｍｌと、１０ＭｍのＣａＣｌ２と、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２と、５０μＭのＺｎＣｌ２と、０．０１％Ｂｒｉｊ−３５緩衝液（ｐＨ６．８）とに加えたＩＳ−ＣＤ８＋細胞（１×１０７細胞）とともに３７℃にて２時間同時インキュベートした。指示により、このサンプルにＧＭ６００１（５０μＭ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，カリフォルニア州テメキュラ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ））を加えた。処理後に、この細胞を放射線照射マウスに注射するか、あるいは、ＤｉＩ標識、ウエスタンブロッティング、ＦＡＣＳ分析およびこれ以外の解析手順に用いた（Ｓａｖｉｎｏｖ，Ａ．Ｙ．ら（２００３年）；Ｄｅｒｙｕｇｉｎａ，Ｅ．Ｉ．ら（２００１年）；Ｒｏｚａｎｏｖ，Ｄ．Ｖ．ら（２００１年））。
【００９１】
ウエスタンブロッティング−０．１ｍｇ／ｍｌスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ，イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ））により、ＩＳ−ＣＤＳ＋細胞表面を４℃にて１時間ビチオン化した。ビオチンを除去するため洗浄した後、細胞を、無血清の無添加クリック培地でＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＡＴとともに２時間同時インキュベートした。次いでこの細胞を、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２およびフッ化フェニルメチルスルホニル（１ｍＭ）と、アプロチニンと、ペプスタチンと、ロイペプチン（各１μｇ／ｍｌ）とを含むプロテアーゼインヒビター混合物を加えたリン酸緩衝生理食塩水に加えた５０ｍＭのＮ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドに溶解させた。ビオチン標識ＣＤ４４を、ストレプトアビジンアガロースビーズで細胞可溶化物および培地のアリコートから捕獲した。捕獲サンプルを、ＣＤ４４（クローンＩＭ７．８．１）抗体を用いたウエスタンブロッティングで調べて、培地サンプル中の遊離した可溶性ＣＤ４４細胞外ドメインおよび細胞可溶化物における残りの膜アンカー型ＣＤ４４の細胞を判定した。
【００９２】
ＭＴ１−ＭＭＰ依存性ＭＭＰ−２の活性化およびゼラチンザイモグラフィー−ＩＳ−ＣＤ８＋細胞（１×１０６）を、無血清の無添加クリック培地において２％ゼラチンでコーティングしたプラスチックに４時間接着させるか、あるいは、溶液中で保持した。こうした実験条件下、大部分の細胞は、ゼラチンに結合した。４時間して、培地サンプル（それぞれ３０μＬ）を採取し、ゼラチンザイモグラフィーで解析し（Ｄｅｒｙｕｇｉｎａ，Ｅ．Ｉ．ら（２００１年））、ＩＳ−ＣＤ８＋細胞で自然に合成されたＭＭＰ−２のタンパク質分解活性および活性化状態を確認した。指示により、細胞に外部から精製プロＭＭＰ−２（２０ｎｇ）を加えた。プロＭＭＰ−２については、ＨＴ１０８０線維肉腫細胞系から得たｐ２ＡＨＴ２Ａ７２細胞のコンディション培地から単離し、続いてＥ１ＡおよびＭＭＰ−２ｃＤＮＡをトランスフェクトした（Ｓｔｒｏｎｇｉｎ，Ａ．Ｙ．ら（１９９５年））。
【００９３】
モノクローナル抗体およびＦＡＣＳ分析−ＩＳ−ＣＤ８＋細胞を、ＭＴ１−ＭＭＰ（Ａｂ８１５；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）モノクローナル抗体、ＣＤ４４（クローンＩＭ７．８．１）モノクローナル抗体、ＣＤ３（クローン１７Ａ２）モノクローナル抗体、ＣＤ４９ｄ（クローン  ＳＧ３１）モノクローナル抗体（すべてＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）製）およびＣＤ２９モノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で染色し、続いてフルオレセインイソチオシアナートまたはフィコエリトリンコンジュゲート二次抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色してから、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ニュージャージー州フランクリンレイクス（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ））で解析した。ＣＤ４４レベルを判定するため、ＩＳ−ＣＤ８＋細胞をさらに可溶性蛍光標識ヒアルロン酸（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州）で染色した。ＩＳ−Ｃ８＋細胞をフィコエリトリンまたはフルオレセインイソチオシアナート−コンジュゲート抗ＣＤ８抗体（Ｓｉｇｍａ）で対比染色した。
【００９４】
結果
ＭＴ１−ＭＭＰはＣＤ４４の細胞をシェディングする−ＭＴ１−ＭＭＰによるＴ細胞のＣＤ４４のタンパク質分解が、Ｔ細胞の接着およびその後のトランスマイグレーションおよび膵臓へのホーミングを制御していると判定した。ＭＴ１−ＭＭＰ抗体およびＣＤ４４抗体ならびにフルオレセインイソチオシアナート標識ヒアルロナンを用いたＦＡＣＳ分析から、懸濁液に加えたＩＳ−ＣＤ８＋細胞では、細胞表面に結合したＭＴ１−ＭＭＰおよびＣＤ４４が高レベルで存在することが示された（図１Ａ）。ＩＳ−ＣＤ８＋細胞は、Ｋｄ主要組織適合性複合体クラスＩ分子の場合、インスリンＢ鎖由来のＬ１５ＹＬＶＣＧＥＲＧ２３（配列番号１）ペプチドを認識する（Ｗｏｎｇ，Ｆ．Ｓ．ら（１９９９年））。ＩＳ−ＣＤ８＋細胞を注射すると、致死量以下で放射線照射したＮＯＤ／ＬｔＪマウスに１週間で糖尿病が誘発される（Ｓａｖｉｎｏｖ，Ａ．Ｙ．ら（２００３年））。ＮＯＤマウスは、ＩＤＤＭの最良の動物モデルとして広く用いられている（Ｄｅｌｏｖｉｔｃｈ，Ｔ．Ｌ．およびＳｉｎｇｈ，Ｂ．（１９９７年））。ＭＴ１−ＭＭＰに対するＡｂ８１５抗体はプロテアーゼのヒンジドメインを認識するため、ＦＡＣＳ試験では、酵素前駆体と、活性酵素型と、ＭＴ１−ＭＭＰとメタロプロテイナーゼ−２の組織インヒビターなどのメタロプロテイナーゼの組織インヒビターとの不活性な複合体とは識別されない。
【００９５】
ＣＤ４４のレベルは、触媒として強力な外部の精製ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＡＴと同時インキュベートした大半のＩＳ−ＣＤ８＋細胞で大きく減少した（図１Ａ）。この処置は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２９およびＣＤ４９など、他のＴ細胞受容体のレベルあるいはＴ細胞の生存状況には影響を与えなかった。こうした観察結果を裏付けるため、ＩＳ−ＣＤ８＋細胞表面を膜非透過性ビオチンで標識してから、さらにＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＡＴとともに同時インキュベートを行った。次に遊離した可溶性ＣＤ４４フラグメントをストレプトアビジンアガロースビーズで捕獲し、ウエスタンブロッティングにより検出した。こうした研究から、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＡＴをＩＳ−ＣＤ８＋細胞とともに同時インキュベートする過程で、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＡＴは、量は少なくても、ＣＤ４４の細胞の消化したフラグメントを大量に遊離させ、細胞表面に結合したＣＤ４４の残留レベルを低下させた。こうしたデータは、図１Ａに示したＦＡＣＳ分析の結果と整合している。ＣＤ４４の切断におけるＭＴ１−ＭＭＰの関与を裏付けるように、ＧＭ６００１により、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＡＴの作用は消失した（図１Ｂ）。さらに、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＡＴとともに同時インキュベートしたＩＳ−ＣＤ８＋細胞を蛍光ＤｉＩ色素で標識し、次いで放射線照射ＮＯＤマウスに注射した。２４時間して、ＩＤＤＭにおける標識細胞を計数した（Ｄｅｌｏｖｉｔｃｈ，Ｔ．Ｌ．およびＳｉｎｇｈ，Ｂ．（１９９７年））。ＭＴ１−ＭＭＰに対するＡｂ８１５抗体はプロテアーゼのヒンジドメインを認識するため、ＦＡＣＳ試験では、酵素前駆体と、活性酵素型と、ＭＴ１−ＭＭＰとメタロプロテイナーゼ−２の組織インヒビターなどのメタロプロテイナーゼの組織インヒビターとの不活性な複合体とは識別されない。
【００９６】
ＣＤ４４のレベルは、触媒として強力な外部の精製ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＡＴと同時インキュベートした大半のＩＳ−ＣＤ８＋細胞で大きく減少した（図１Ａ）。この処置は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２９およびＣＤ４９など、他のＴ細胞受容体のレベルあるいはＴ細胞の生存状況には影響を与えなかった。こうした観察結果を裏付けるため、ＩＳ−ＣＤ８＋細胞表面を膜非透過性ビオチンで標識してから、さらにＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＡＴとともに同時インキュベートを行った。次に遊離した可溶性ＣＤ４４フラグメントをストレプトアビジンアガロースビーズで捕獲し、ウエスタンブロッティングにより検出した。こうした研究から、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＡＴをＩＳ−ＣＤ８＋細胞とともに同時インキュベートする過程で、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＡＴは、量は少なくても、ＣＤ４４の細胞の消化したフラグメントを大量に遊離させ、細胞表面に結合したＣＤ４４の残留レベルを低下させた。こうしたデータは、図１Ａに示したＦＡＣＳ分析の結果と整合している。ＣＤ４４の切断におけるＭＴ１−ＭＭＰの関与を裏付けるように、ＧＭ６００１（ＭＴ１−ＭＭＰの強力なヒドロキサマートインヒビター）により、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＡＴの作用は消失した（図１Ｂ）。
【００９７】
さらに、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＡＴとともに同時インキュベートしたＩＳ−ＣＤ８＋細胞を蛍光ＤｉＩ色素で標識し、次いで放射線照射ＮＯＤマウスに注射した。２４時間して、ランゲルハンス島の標識細胞を計数した。ＭＴ１−ＭＭＰによるＣＤ４４のタンパク質分解は、細胞のホーミングを約４．５分の１に減少させ、マウスの糖尿病の発現をほぼ２倍遅らせる（図１Ｃ）。こうした結果から、外部のＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＡＴによりＴ細胞のＣＤ４４が切断されると、膵臓内皮のヒアルロナンに接着する能力があるＩＳ−ＣＤ８＋細胞の数が減少することが示された。結果として、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＡＴとの同時インキュベーション後、トランスマイグレートする細胞の数も減少した。
【００９８】
ＭＴ１−ＭＭＰは、接着ＩＳ−ＣＤ８＋細胞において活性化される−内在性のＭＴ１−ＭＭＰは、非接着ＩＳ−ＣＤ８＋細胞に潜伏しているが、ＩＳ−ＣＤ８＋細胞が接着すると、ＭＴ１−ＭＭＰの活性化、ＣＤ４４の切断およびＴ細胞のトランスマイグレーションに対する刺激が誘発される。したがって、ＩＳ−ＣＤ８＋細胞には、ゼラチンに接着した場合に限り、ＭＴ１−ＭＭＰにより直接活性化されることが知られている酵素ＭＭＰ−２を活性化できる作用があった（図２）。非接着細胞は、ＭＭＰ−２を活性化しなかった。同様に、ＣＤ４４タンパク質分解フラグメントが培地に遊離することが検出されたのは、接着ＩＳ−ＣＤ８＋細胞においてのみであった。非接着細胞のＣＤ４４は、そのままの状態が続いた。ＧＭ６００１は、接着細胞においてＭＭＰ−２の活性化とＣＤ４４のシェディングとの両方を遮断した（図２）。これらの結果から、ＭＴ１−ＭＭＰによるＣＤ４４のタンパク質分解は、糖尿病誘発細胞が基層に接着した場合のみに起こるものであることが示される。接着後、活性化ＭＴ１−ＭＭＰは、ＣＤ４４の切断が可能となり、この現象により、Ｔ細胞の遊離が促進され、続いて内皮を通過するＴ細胞のトランスマイグレーションおよびランゲルハンス島へのホーミングが見られる。逆に、ＭＴ１−ＭＭＰを阻害すれば、Ｔ細胞の接着が亢進され、トランスマイグレーションの効率が低下する可能性がある。
【００９９】
ＭＴ１−ＭＭＰを阻害すれば、ＩＳＣＤ８＋細胞の糖尿病誘発性が抑制される−Ｔ細胞によるトランスマイグレーション、ホーミングおよび糖尿病発症におけるＭＴ１−ＭＭＰの役割を確認するため、別の有力なヒドロキサマートインヒビターであるＡＧ３３４０（Ｓｈａｌｉｎｓｋｙ，Ｄ．Ｒ．ら（１９９９年））を用いた。ＡＧ３３４０は、ナノモル以下の範囲のＫｉでＭＴ１−ＭＭＰを阻害する。ＡＧ３３４０は、癌の第Ｉ〜ＩＩＩ相臨床試験で用いられた（Ｈａｎｄｅ，Ｋ．Ｒ．ら（２００４年））。ＡＧ３３４０を評価するため、新たな糖尿病ＮＯＤマウスから単離したＩＳ−ＣＤ８＋細胞および脾細胞（Ｓａｖｉｎｏｖ，Ａ．Ｙ．ら（２００３年））を用いた。この細胞をＡＧ３３４０とともに同時インキュベートし、あるいは、処置を行わず、次いでＮＯＤマウスに注射し、その後ＡＧ３３４０（３０ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ）または溶媒単独（対照）を投与した。ＡＧ３３４０は対照と比較して、１ｍｇ／ｋｇという低濃度で糖尿病の発現を約２倍遅らせた（図３Ａ）。
【０１００】
同様に、ＡＧ３３４０は、膵臓内皮のヒアルロナンにしっかりと接着したままのＩＳ−ＣＤ８＋細胞の数を増加させて、Ｔ細胞のランゲルハンス島への侵入プロセスを大きく遅らせた。ＡＧ３３４０とともに同時インキュベートし、ＤｉＩで標識したＩＳ−ＣＤ８＋細胞をＮＯＤマウスに注射した。２４時間して、標識ＩＳ−ＣＤ８＋細胞を膵島周囲および膵島内側の両方で計数した（図３Ｂおよび図３Ｃ）。ＡＧ３３４０の存在下では、膵島のエントランスでＴ細胞を検出し、膵島内側で確認した細胞は少数であった。ＡＧ３３４０の非存在下では、この状況が消失し、Ｔ細胞は、効率的に膵島にトランスマイグレートした。これらの所見から、Ｔ細胞ＭＴ１−ＭＭＰの阻害は、齧歯類の一般に認められたＩＤＤＭモデルにおける糖尿病の発現を遅らせるうえで重要であることが示される。ＭＴ１−ＭＭＰによるＣＤ４４のタンパク質分解が血管外遊出を制御する推定機序を図３Ｄに説明してある。
【０１０１】
２．実施例２：自然発症１型糖尿病においてＴ細胞膜プロテイナーゼを標的とする
材料および方法
マウスおよび細胞−ＮＯＤ／ＬｔＪ系統のＮＯＤマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。ＩＳ−ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＮＯＤマウスの膵臓に由来するＴＧＮＦＣ８クローンのインスリン特異的ＣＤ８陽性Ｋｄ拘束性Ｔ細胞）（Ｗｏｎｇ，Ｆ．Ｓ．ら（１９９６年））を、５％ＦＣＳと、２×１０−５Ｍβ−メルカプトエタノールと、２０ｍＭペニシリン−ストレプトマイシンと、３ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミンと、５Ｕ／ｍｌ組換えマウスＩＬ−２とを補充したクリック培地で維持した（Ｓａｖｉｎｏｖ，Ａ．Ｙ．ら（２００３年））。ＩＳ−ＣＤ８＋細胞を３週間ごとに、Ｌ１５ＹＬＶＣＧＥＲＧ２３（配列番号１）インスリンＢ鎖ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）を注入した放射線照射ＮＯＤ脾細胞（２０００ラド）と混合した（Ｗｏｎｇ，Ｆ．Ｓ．ら（１９９９年））。
【０１０２】
新たな糖尿病ＮＯＤマウス−ＮＯＤマウスは、生後およそ５ヶ月で糖尿病を発症した。自然発症糖尿病の発現を、尿中のグルコース濃度をＤｉａｓｔｉｘ（登録商標）ストリップ（Ｂａｙｅｒ）で評価して確認した。３日間連続して尿中のグルコース濃度が＞２０００ｍｇ／ｄｌのマウスを糖尿病とみなした。尿中のグルコース濃度は、血液中のグルコース濃度と密接に連動する（Ｔｒａｉｓｍａｎ，Ｈ．Ｓ．＆  Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，Ｒ．Ｄ．（１９７３年）。尿中のグルコースの測定は、ＮＯＤマウスの糖尿病の発生を調査するのに一般に受け入れられている方法である（Ｐｏｍｅｒｌｅａｕ，Ｄ．Ｐ．ら（２００５年））。糖尿病の発生後、インスリン（１５〜２０Ｕ／ｋｇ；２〜３日ごとに１回注射）をマウスに皮下注射した。対照動物（マウス６匹／群）にはインスリンを単独投与し、実験群（マウス５匹／群）にはインスリンの皮下投与と一緒にＡＧ３３４０を腹腔内投与した（１ｍｇ／ｋｇ；２〜３日ごとに１回注射）。ＡＧ３３４０（分子量＝４２１Ｄ）を用いた。注射を４０日間継続して、その後マウスを屠殺した。白血球および粒状のβ細胞を、パラホルムアルデヒド固定パラフィン包埋の膵臓切片ごとにそれぞれＨ＆Ｅおよびアルデヒドフクシンで染色した。膵島（≧１００／マウス）を以下のとおりスコア評価した：０、病変なし；１は膵島周囲の白血球凝集に加えて管周囲の浸潤；２は膵島の破壊が＜２５％；３は膵島の破壊が＞２５％；および４は膵島の全体的な破壊。ホルモン産生細胞を同定するため、この切片をインスリンに対する抗体（Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，モンタナ州セントチャールズ（Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ））およびグルカゴンに対する抗体（ＤａｃｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，カリフォルニア州カーピンテリア（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ））で染色し、続いて種特異的西洋わさびペルオキシダーゼ−コンジュゲート二次抗体および３，３’−ジアミノベンジジン基質で染色した。
【０１０３】
蛍光追跡および形態計測解析−トラフィッキング試験のため、ＩＳ−ＣＤ８＋Ｔ細胞を、５％ＦＣＳおよび蛍光色素である０．００７５ｍｇ／ｍｌの１，１’−ジドデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロラート（ＤｉＩ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を含む完全なクリック培地において、１×１０７細胞／ｍｌで３７℃にて３０分間暗所でインキュベートした。インキュベーション後、この細胞をＰＢＳで３回洗浄し、過剰なＤｉＩを除去した。標識ＩＳ−ＣＤ８＋細胞（１×１０７細胞）を０．２ｍｌのＰＢＳに加えて、放射線照射（事前に７２５ラドで２４時間）ＮＯＤマウスに静脈内注射した。ＤｉＩ標識細胞を注射してから２４時間後、マウスを屠殺した。指示により、ＤｉＩ標識ＩＳ−ＣＤ８＋Ｔ細胞を静脈内注射する３０分前に、ＣＤ４４に対する機能阻害抗体ＩＭ７．８．１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＡＧ３３４０をそれぞれＮＯＤマウスに静脈内注射（それぞれ０．１ｍｇ／動物および１ｍｇ／ｋｇ）した。２４時間して、脾臓および膵臓を切除し、０．１Ｍ過ヨウ素酸−リシン−パラホルムアルデヒドのリン酸緩衝液で固定した。次いでこの臓器をスクロース飽和させ、ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  Ｉｎｃ．）で凍結成形を行い、凍結切断片を作成した。膵臓全体の中で厚さ７μｍのクリオスタット切片を、Ｌｅｉｃａ  ＣＭ１９００クリオトームを用いて６０μｍ間隔で調製した。膵島内のＤｉＩ標識ＣＤ８＋細胞の分布を、蛍光顕微鏡を用いて調べた。マウス１匹あたり（各実験群につきマウス４〜５匹）少なくとも１００個の膵島を調べた。凍結切片では、膵島特有の形態を容易に確認できる。個々の膵島に関係する領域内のＤｉＩ標識細胞を計数した。膵島の境界と比較して各ＩＳ−ＣＤ８＋標識細胞の位置を判定した。膵島の境界内に局在する標識細胞を「内側」とみなし、膵島に隣接するが膵島の境界の外側の標識細胞を「エントランス」とみなした。
【０１０４】
ウエスタンブロッティング−０．１ｍｇ／ｍｌスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）により、ＩＳ−ＣＤＳ＋細胞表面を４℃にて１時間ビチオン化した。ビオチンを除去するため洗浄した後、この標識細胞を無血清培地において２％Ｉ型コラーゲン／ゼラチンでコーティングしたプラスチックに４時間接着させるか、あるいは、懸濁液中で保持した。こうした実験条件下、大部分の細胞は、ゼラチンに結合した。指示により、この細胞にＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２（それぞれ１００ｎｇ／ｍｌ）およびＡＧ３３４０（５０μＭまたは２１μｇ／ｍｌ）を加えた。次いでこの細胞を、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２およびフッ化フェニルメチルスルホニル（１ｍＭ）と、アプロチニンと、ペプスタチンと、ロイペプチン（各１μｇ／ｍｌ）とを含むプロテアーゼインヒビターカクテルを加えたＰＢＳに加えた５０ｍＭのＮ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドに溶解させた。ビオチン標識ＣＤ４４を、ストレプトアビジンアガロースビーズで細胞可溶化物および培地のアリコートから捕獲した。捕獲サンプルを、ＣＤ４４（クローンＩＭ７．８．１）抗体を用いたウエスタンブロッティングで調べて、培地サンプル中の遊離した可溶性ＣＤ４４細胞外ドメインおよび細胞可溶化物の残りの膜アンカー型ＣＤ４４の細胞を判定した。
【０１０５】
ＭＴ１−ＭＭＰ依存性ＭＭＰ−２の活性化およびゼラチンザイモグラフィー−ＩＳ−ＣＤ８＋細胞（１×１０６）を、無血清の無添加クリック培地において２％ゼラチンでコーティングしたプラスチックに４時間接着させるか、あるいは、溶液中で保持した。１８時間して、培地サンプル（それぞれ３０μＬ）を採取し、ゼラチンザイモグラフィーで解析（Ｄｅｒｙｕｇｉｎａ，Ｅ．Ｉ．ら（２００１年））し、ＩＳ−ＣＤ８＋細胞で自然に合成されたＭＭＰ−２のタンパク質分解活性および活性化状態を確認した。指示により、細胞に外部から精製プロＭＭＰ−２（２０ｎｇ）、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２（それぞれ１００ｎｇ／ｍｌ）ならびにＡＧ３３４０（５０μＭまたは２１μｇ／ｍｌ）を加えた。プロＭＭＰ−２については、ＨＴ１０８０線維肉腫細胞系から得たｐ２ＡＨＴ２Ａ７２細胞のコンディション培地から単離し、続いてＥ１ＡおよびＭＭＰ−２ｃＤＮＡをトランスフェクトした（Ｓｔｒｏｎｇｉｎ，Ａ．Ｙ．ら（１９９５年））。
【０１０６】
結果および考察
ＣＤ４４は、糖尿病誘発Ｔ細胞における主要な接着受容体である−Ｔ細胞のホーミングにおけるＣＤ４４の役割を定量的に評価するため、ＮＯＤマウスに７２５ラドで放射線照射を行った。２４時間して、ＣＤ４４に対する機能阻害抗体およびＡＧ３３４０をそれぞれマウスに注射した。３０分後、この注射に続いて、蛍光色素ＤｉＩで標識したＩＳ−ＣＤ８＋Ｔ細胞を静脈内注射した。細胞を注射してから２４時間後にマウスを屠殺した。膵臓を切除し、凍結切断片を作成した。膵島内のＤｉＩ標識ＩＳ−ＣＤ８＋細胞の分布を、蛍光顕微鏡を用いて調べた。個々の膵島に関係する領域内のＤｉＩ標識細胞を計数した。図４は、ＩＳ−ＣＤ８＋細胞が対照マウスの膵島内側に効率的ホーミングする一方で、ＣＤ４４機能を遮断すると、Ｔ細胞のホーミングの効率が大幅に低下したことを示す。このように、ＣＤ４４介在性の接着（Ｗｅｉｓｓ，Ｌ．ら（２０００年））は、Ｔ細胞の膵島へのホーミングにおいて極めて重要な役割を果たしていることが確認された。また、ＡＧ３３４０も（接着Ｔ細胞においてＭＴ１−ＭＭＰによるＣＤ４４のタンパク質分解を阻害することで）Ｔ細胞のホーミングを５０％低下させた。代表的な画像は、抗ＣＤ４４とＡＧ３３４０との主な違いを示すもので、前者はＴ細胞の接着を抑制し、そのためＤｉＩ標識細胞のホーミングを減少させたのに対し、後者は膵島のエントランスで膵臓内皮に接着したＴ細胞の作用を失わせた。
【０１０７】
ＭＴ１−ＭＭＰとＣＤ４４のシェディングとの因果関係−次に、ＣＤ４４のシェディングにおけるＭＴ１−ＭＭＰ活性の意義を判定し、接着ＩＳ−ＣＤ８＋細胞におけるこの２つの因果関係を特定した。こうした目的のため、膜非透過性ビオチンでＩＳ−ＣＤ８＋細胞表面をビオチン化し、次いでこの標識細胞をゼラチンコーティングプラスチックに接着させるか、あるいは、溶液中で保持した。その後、この細胞を溶解させ、ビオチン標識ＣＤ４４を、ストレプトアビジン−アガロースビーズで細胞可溶化物および培地のアリコートから捕獲した。捕獲サンプルをウエスタンブロッティングで調べて、培地サンプル中の遊離した可溶性ＣＤ４４細胞外ドメインと細胞可溶化物の残りの膜アンカー型ＣＤ４４の細胞との両方の量を測定した。また、培地サンプルをゼラチンザイモグラフィーで解析し、ＩＳ−ＣＤ８＋細胞で自然に合成されたＭＭＰ−２の活性化状態を確認した。ＭＭＰ−２は、ＭＴ１−ＭＭＰにより直接活性化されることが知られている酵素である（Ｅｇｅｂｌａｄ，Ｍ．＆  Ｗｅｒｂ，Ｚ．（２００２年）；Ｓｔｒｏｎｇｉｎ，Ａ．Ｙ．ら（１９９５年））。指示により、細胞に外部から精製プロＭＭＰ−２を補充した。この細胞サンプルにＴＩＭＰ−２（ＭＴ１−ＭＭＰの強力なインヒビター）、ＴＩＭＰ−１（ＭＴ１−ＭＭＰの弱いインヒビター）およびＡＧ３３４０をそれぞれ加えて、ＭＴ１−ＭＭＰの役割と細胞表面に結合した他のプロテアーゼによると推定される個々の作用とを区別した（Ｗｉｌｌ，Ｈ．ら（１９９６年））（図５）。
【０１０８】
実施例１の観察結果と一致して、内在性ＭＴ１−ＭＭＰは非接着細胞に潜伏していたが、Ｔ細胞が接着すると、ＭＴ１−ＭＭＰの活性化が誘発され、続いてＭＭＰ−２の活性化およびＣＤ４４の切断が見られた。したがって、ＩＳ−ＣＤ８＋細胞には、ゼラチンに接着した場合に限り、ＭＭＰ−２を活性化する作用があった。非接着細胞は、ＭＭＰ−２を活性化しなかった。同様に、ＣＤ４４フラグメントが培地に遊離することが検出されたのは、接着ＩＳ−ＣＤ８＋細胞においてのみであった。非接着細胞のＣＤ４４は、そのままの状態が続いた。ＡＧ３３４０およびＴＩＭＰ−２はそれぞれ、接着細胞におけるＭＭＰ−２の活性化およびＣＤ４４のシェディングを完全に遮断した。これに対し、ＴＩＭＰ−１は、ＭＭＰ−２の活性化に何ら影響を及ぼさなかった。ＴＩＭＰ−１では、軽微ながら特記すべきＣＤ４４タンパク質分解の阻害作用が示された。こうした結果から、ＭＴ１−ＭＭＰは、Ｔ細胞のＣＤ４４のシェディングにおける唯一のメディエーターではなく、主要な個別メディエーターであることが確認された。これ以外のプロテアーゼ（ＡＤＡＭなど）（中村博幸ら（２００４年））も、ＣＤ４４のタンパク質分解に関与している。しかしながら、こうした他のプロテアーゼを合わせた作用は、ＭＴ１−ＭＭＰの作用に比べると小さい（図５）。
【０１０９】
自然発症ＩＤＤＭにおいてＭＴ１−ＭＭＰによるＣＤ４４のタンパク質分解を阻害する−ＡＧ３３４０に治療上の翻訳作用があるかどうかを評価するため、このインヒビターを、自然発症糖尿病を発症したＮＯＤ雌マウスに用いた。対照動物にはインスリンを単独投与し、実験群には、インスリンと一緒にＡＧ３３４０を投与した。使用したＡＧ３３４０の用量は、癌の第Ｉ相試験で用いる最低投与量よりも１桁少なくした（Ｈａｎｄｅ，Ｋ．Ｒ．ら（２００４年））。４０日して、膵臓を切除して切片を作成し、膵島を解析して、観察した膵島炎に応じて分類した。さらに、切片をインスリンおよびグルカゴンに対する抗体で染色し、生存している膵島および新たに形成された膵島の機能性を確認した（Ｌｕｏ，Ｘ．ら（２００５年））。
【０１１０】
ＡＧ３３４０による短期処置は、明らかな糖尿病ＮＯＤマウスを正常血糖に回復させるには不十分であった。しかしながら、膵島炎の重症度は、対照と比較して顕著で確かな低下を示した（図６）。ＡＧ３３４０により、正常な膵島および膵島周囲の膵島炎が限定的である膵島の数が増加した。面白いことに、ＡＧ３３４０により、膵実質に膵島様構造が新規形成された。こうした小さい再生膵島では、単核細胞浸潤が見られず、インスリン（図６）およびグルカゴンが産生されたため、ホルモン分泌α細胞およびβ細胞の機能再生が明らかになった。反対に、未処理の対照では、集中的な単核細胞浸潤、膵島の明らかな破壊およびホルモン産生の大幅な減少が見られた。これらの所見は、養子移入したＴ細胞の血管外遊出においてＡＧ３３４０がＣＤ４４−ＭＴ１−ＭＭＰ軸をコントロールする役割と整合している。全体として、こうした結果から、ＡＧ３３４０には、膵島を破壊する自己免疫を効果的にコントロールし、インスリン産生β細胞およびランゲルハンス島の機能再生を刺激することで、糖尿病の予防効果があったことが示される。
【０１１１】
３．実施例３：１型糖尿病におけるＴ細胞膜プロテイナーゼおよびＣＤ４４の役割の規定
ＩＤＤＭにおけるＴ細胞ＭＴ１−ＭＭＰの特異的な役割：糖尿病雄性および高脂肪食雌性のＺｕｃｋｅｒ糖尿病肥満ラットにおいて、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１２およびＭＴ１−ＭＭＰは、非糖尿病の痩せたラットと比較して上方制御された（Ｚｈｏｕ，Ｙ．Ｐ．ら２００５年）。膵島の細胞外基質分子のターンオーバーを低下させることでβ細胞塊を保護しているものとして、ＰＤ１６６７９３［（Ｓ）−２−（４’−ブロモ−ビフェニル−４−スルホニルアミノ）−３−メチル−酪酸］（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１３およびＭＴ１−ＭＭＰに対するこのインヒビターのＥＣ５０値はそれぞれ、６１００ｎＭ、４７ｎＭ、１２ｎＭ、７２００ｎＭ、７９００ｎＭ、８ｎＭおよび２４０ｎＭと広範囲にわたる）Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｐ．Ｍ．ら２０００年；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｔ．ら２００１年）が考えられる。
【０１１２】
Ｔ細胞ＭＴ１−ＭＭＰの特異的役割を検証し、さらにＩＤＤＭのＮＯＤモデルにおける他のＭＭＰの潜在的意義を解明するため、ＡＧ３３４０に加えて２つのインヒビターＥＧＣＧおよびＳＢ−３ＣＴを用いた。ＥＧＣＧおよびＳＢ−３ＣＴはともにＭＴ１−ＭＭＰの弱いインヒビターであるが、ＭＴ１−ＭＭＰと異なるＭＭＰを標的とする能力がある。これら２つのインヒビターがＣＤ４４シェディングを強力に阻害するかどうかを判定するため、膜非透過性スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンでＩＳ−ＣＤ８＋Ｔ細胞表面をビオチン化した。次いでこの標識細胞をゼラチンコーティングプラスチックに接着させるか、あるいは、溶液中で保持した。その後この細胞を溶解させ、ビオチン標識ＣＤ４４を、ストレプトアビジン−アガロースビーズで細胞可溶化物および培地のアリコートから捕獲した。捕獲サンプルをウエスタンブロッティングで調べて、培地サンプル中の遊離した可溶性ＣＤ４４細胞外ドメインおよび細胞可溶化物の残りの膜アンカー型ＣＤ４４の細胞の量を測定した。さらに、培地サンプルをゼラチンザイモグラフィーで解析し、ＭＭＰ−２の活性化状態を確認した。ＭＭＰ−２は、ＭＴ１−ＭＭＰにより直接活性化されることが知られている酵素である（Ｓｔｒｏｎｇｉｎ，Ａ．Ｙ．ら１９９５年）。指示により、細胞にＡＧ３３４０、ＳＢ−３ＣＴおよびＥＧＣＧを補充した（図７）。内在性ＭＴ１−ＭＭＰは、非接着細胞に潜伏していたが、Ｔ細胞が接着すると、ＭＴ１−ＭＭＰの活性化が誘発され、続いてＭＭＰ−２の活性化およびＣＤ４４の切断が見られた。非接着細胞は、ＭＭＰ−２を活性化しなかったことから、効果的にＣＤ４４のシェディングを行う能力がない。ＡＧ３３４０は、固着Ｔ細胞においてＭＭＰ−２の活性化およびＣＤ４４のシェディングの両方を完全に阻害した。一方、ＳＢ−３ＣＴ（ＭＴ１−ＭＭＰの弱いインヒビター）が、ＭＭＰ−２活性化、ＣＤ４４のシェディングのいずれにもまったく影響を及ぼさなかったのに対し、ＥＧＣＧは、５００ｍＭという非常に高濃度とした場合に限られるが、ＣＤ４４のタンパク質分解に何ら顕著な作用を及ぼすことなくＭＭＰ−２の活性化を部分的に阻害した。
【０１１３】
これに対し、ＳＢ−３ＣＴは、ＭＭＰ−２によるα１−アンチトリプシン（感受性が高く入手しやすいＭＭＰのタンパク質基質）のタンパク質分解を阻害し（Ｌｉ，Ｗ．ら２００４年；Ｍａｓｔ，Ａ．Ｅ．ら１９９１年）、この６１ｋＤａのセルピンを、α１−アンチトリプシン分子のＮ末端部分に相当する５５ｋＤａの分解フラグメントに変換する作用が非常に強かった。したがって、ＳＢ−３ＣＴは、インビトロにおいてナノモル範囲の濃度でα１−アンチトリプシンの切断を完全に遮断した（図７）。
【０１１４】
ＳＢ−３ＣＴおよびＥＧＣＧの抗糖尿病性をＡＧ３３４０の抗糖尿病性と対比して判定するため、各インヒビターを必要な濃度でＮＯＤマウスに腹腔内注射した。ＩＳ−ＣＤ８＋細胞を蛍光色素であるジドデシル−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロラート（ＤｉＩ）で前標識し、次いでＮＯＤマウスに静脈内注射した。２４時間して、標識ＩＳ−ＣＤ８＋細胞を膵島周囲および膵島内側の両方で計数した（図８）。ＡＧ３３４０の非存在下では、Ｔ細胞は、効率的に膵島にトランスマイグレートした。ＡＧ３３４０の存在下では、この状況が消失し、膵島のエントランスで検出されるＴ細胞が多くなり、膵島内側で認められた細胞は数分の１になった。反対に、ＳＢ−３ＣＴおよびＥＧＣＧでは、どちらもＡＧ３３４０よりもはるかに高濃度で用いたが、ＩＳ−ＣＤ８＋細胞のホーミングに影響を及ぼさなかった。
【０１１５】
これらの結果をさらに裏付けるため、ＩＳ−ＣＤ８＋細胞をＮＯＤマウスに注射した。細胞注射の３０分前に、各インヒビターまたはＰＢＳ（対照）のいずれかをマウスに腹腔内投与した。マウスが糖尿病を発症するまで、インヒビターの注射を１日おきに続けた。ＡＧ３３４０は、対照と比べて１ｍｇ／ｋｇという低濃度で糖尿病の発現をおよそ２倍遅らせた（図９）。反対に、ＳＢ−３ＣＴおよびＥＧＣＧ（どちらもＭＴ１−ＭＭＰを除くＭＭＰの強力なインヒビター）を投与したマウスでは、移入糖尿病の発現に遅れは見られなかった。
【０１１６】
ＮＯＤマウスの移入糖尿病モデルでは、ＭＴ１−ＭＭＰのアンタゴニストであるＡＧ３３４０だけが、臨床的に関連する作用を示した。ＭＭＰインヒビターは広範囲の特異性を示すため、ＡＧ３３４０、ＳＢ−３ＣＴおよびＥＧＣＧを同時に評価する場合、認められる結論としては、Ｔ細胞ＭＴ１−ＭＭＰは、ＩＤＤＭにおいて重要な役割を果たしている一方で、どちらもＳＢ−３ＣＴにより効率的に阻害されるＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９など、他のすべてのＭＭＰを合わせた作用は、重要性がはるかに小さいということにとどまった。こうした結果から、糖尿病誘発Ｔ細胞の血管内皮細胞間隙遊走およびランゲルハンス島へのホーミングの効率性に関与するＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＤ４４軸の機能的重要性が認められる。
【０１１７】
ＩＤＤＭのＭＴ１−ＭＭＰを標的にする潜在的な臨床的意義：ＡＧ３３４０をインスリンとともに低投与量で注射すると、Ｔ細胞の糖尿病誘発の効率が低下し、Ｔ細胞が内皮に固定化され、糖尿病誘発Ｔ細胞のランゲルハンス島へのホーミングが抑制され、急性糖尿病ＮＯＤマウスの膵島炎および単核細胞浸潤が軽減された。これらを合わせた現象により、新たに発症したＩＤＤＭの糖尿病ＮＯＤマウスにおけるインスリン産生β細胞の回復が促進された。再生した機能性β細胞の発生源は、β細胞自体ではなく血管内皮前駆幹細胞である。
【０１１８】
インスリンを産生するβ細胞が再生されたことを証明するため、ＮＯＤマウスにＩＤＤＭを発生させた。次いで疾患マウスに４０日間インスリンを単独投与するか、あるいは、インスリンをＡＧ３３４０と一緒に投与した。その後インスリン注射を中断した。疾患の発現後にインスリンを投与したマウスは、およそ２〜３日で高血糖になり、その後ＮＩＨガイドラインに従ってマウスを屠殺した。一方、インスリンをインヒビターと一緒に投与したマウスは、インスリン産生β細胞のプールを回復した。インスリン注射を中止しても、このβ細胞プールはこうしたマウスの生存には十分なものであり、外部のインスリンを用いなくても正常血糖／軽度の高血糖の状態が数週間続いた。
【０１１９】
Ｅ．参考文献
【０１２０】
【数１】
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【０１２１】
【数２】
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【０１２２】
【数３】
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【０１２３】
【数４】
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【０１２４】
【数５】
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【０１２５】
【数６】
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【０１２６】
【数７】
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Ｆ．配列表
【０１２７】
【数８】
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【０１２８】
【数９】
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【０１２９】
【数１０】
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【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１Ａ】図１は、ＭＴ１−ＭＭＰがＣＤ４４を過剰にタンパク質分解すると、Ｔ細胞が膵島にホーミングする割合が低下し、マウスにおける糖尿病の発現が遅れることを示す。図１Ａは、ＩＳ−ＣＤ８＋細胞のＦＡＣＳ分析結果を示す。ＩＳ−ＣＤ８＋細胞をＭＴ１−ＭＭＰ抗体およびＣＤ４４抗体で染色し、続いてフルオレセインイソチオシアナート−コンジュゲート二次抗体で染色し、その後ＦＡＣＳ分析に付した。ＣＤ４４を可溶性蛍光標識ヒアルロン酸で染色した場合も、類似の結果を得た。左のパネルは、ＭＴ１−ＭＭＰの染色である（太線はＭＴ１−ＭＭＰ；点線はアイソタイプコントロール）。右のパネルは、ＣＤ４４の染色である（太線は未処理細胞；点線は、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＡＴとともに同時インキュベートされた細胞）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＭＴ１−ＭＭＰがＣＤ４４の細胞をシェディングし、その可溶性フラグメントを培地に放出させることを示す。ＩＳ−ＣＤ８＋細胞表面をビオチン化し、次いでＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＡＴとともに同時インキュベートした。その後、この細胞をＮ−オクチル−β−Ｄグルコピラノシドで溶解させ、プロテアーゼインヒビター混合物を追加した。ビオチン標識ＣＤ４４を細胞可溶化物から捕獲し、捕獲サンプルを、ＣＤ４４抗体を用いたウエスタンブロッティングで調べて、遊離した可溶性ＣＤ４４細胞外ドメイン（培地）および残りの膜アンカー型ＣＤ４４（細胞）を判定した。指示により、このサンプルにＧＭ６００１を加えた。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＭＴ１−ＭＭＰによるＣＤ４４のタンパク質分解により、ＩＳ−ＣＤ８＋細胞の糖尿病誘発性が低下することを示す。左のパネルでは、細胞をＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＡＴとともに同時インキュベートし、蛍光色素ＤｉＩで標識し、次いでＮＯＤマウスに注射した。２４時間して、膵臓のクリオスタット切片ごとに膵島の標識細胞数を計数した。右のパネルでは、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＡＴで処理済みおよび未処理のＩＳ−ＣＤ８＋細胞をＮＯＤマウスに注射した。糖尿病の発生率は、未処理の細胞では、１００％（６匹中６匹）、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＡＴとともに同時インキュベートした細胞では、７０％（１０匹中７匹）であった。
【図２】図２は、タンパク質分解活性ＭＴ１−ＭＭＰがＭＭＰ−２を活性化し、接着ＩＳ−ＣＤ８＋細胞におけるＣＤ４４の細胞を切断することを示す。ＩＳ−ＣＤ８＋細胞をゼラチンでコーティングしたプラスチックに固着させるか、あるいは、溶液中で保持した。上のパネルでは、懸濁液中のゼラチンコーティングプラスチックに固着した細胞（Ａ）および非固着細胞（ＮＡ）を精製ＭＭＰ−２（ＭＭＰ−２単独；細胞なし）とともに同時インキュベートした。４時間して、培地サンプルを採取し、ゼラチンザイモグラフィーで解析してＭＭＰ−２のタンパク質分解活性および活性化状態を確認した。Ｔ細胞で自然に合成されたＭＭＰ−２の活性化を観察するため、左の２つのサンプルには外部からＭＭＰ−２を加えなかった。Ｐ、ＩおよびＥは、ＭＭＰ−２の６８ｋＤａの酵素前駆体、６４ｋＤａの中間体および６２ｋＤａの活性成熟酵素である。下のパネルでは、細胞表面をビオチン化してゼラチン固着させるか、あるいは、懸濁液中で保持した。細胞可溶化物および培地のアリコートをストレプトアビジンアガロースビーズで捕獲した。捕獲サンプルのＣＤ４４を、ＣＤ４４抗体を用いたウエスタンブロッティングで解析した。
【図３Ａ】図３は、ヒドロキサマートインヒビターであるＡＧ３３４０が、ＭＴ１−ＭＭＰを不活化し、Ｔ細胞におけるＣＤ４４のシェディングを遮断し、移入を受けたＮＯＤマウスの糖尿病の発現を遅らせることを示す。図３Ａは、ＡＧ３３４０が、養子移入を受けたＮＯＤマウスの糖尿病の発現を遅らせることを示す。ＩＳ−ＣＤ８＋の細胞および脾細胞をそれぞれＮＯＤマウスに静脈内注射した（それぞれマウス１匹あたり細胞１×１０７個およびマウス１匹あたり細胞１．５×１０７個；マウス６匹／群）。細胞の注射後の０、２、４、６、８および１０日目に、マウスにＡＧ３３４０の腹腔内注射を行った（３０ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＡＧ３３４０が、ＩＳ−ＣＤ８＋細胞のランゲルハンス島へのトランスマイグレーションを阻害することを示す。ＩＳ−ＣＤ８＋細胞を、ＡＧ３３４０（５０μＭまたは２１μｇ／ｍｌ）を用いておよび用いずに２時間同時インキュベートし、次いでＤｉＩで標識した。次にこの標識細胞をＮＯＤマウスに静脈内注射した。２４時間して、膵臓全体の中で、膵島のエントランスおよびランゲルハンス島内の標識細胞をそれぞれうちクリオスタット切片ごとに計数した。ｎは、各実験群における膵島の総数である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＤｉＩ標識ＩＳ−ＣＤ８＋細胞の注射を受けたＮＯＤマウスから得たランゲルハンス島の代表的な画像を示す。画像は、注射の２４時間後に撮ったものである。膵島は、点線で囲んである。白色の実線は、ＤｉＩ標識細胞を計数した、膵島に関連する領域を示す。下のパネルは、細胞をＡＧ３３４０とともにプレインキュベートしたものであり、上のパネルは、無処理細胞のものである。ＩＳ−ＣＤ８＋細胞が膵島に入り込むのをＡＧ３３４０がブロックしている点に留意されたい。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＭＴ１−ＭＭＰのタンパク質分解が血管外遊出におけるＴ細胞のＣＤ４４の機能性を動的に制御することを示す。ＭＴ１−ＭＭＰは、低レベルの場合、Ｔ細胞のヒアルロナンリッチ内皮への接着を刺激する。Ｔ細胞の接着後、Ｔ細胞ＭＴ１−ＭＭＰは活性化される。ＭＴ１−ＭＭＰ活性は高レベルになると、ＣＤ４４の欠損の原因になる。この現象により、Ｔ細胞の血管内皮細胞間隙遊走が刺激される。ＣＤ４４の過剰が持続すると、Ｔ細胞のホーミングおよび血管外遊出が抑制される。
【図４】図４は、ＣＤ４４が、糖尿病誘発ＩＳ−ＣＤ８＋Ｔ細胞のランゲルハンス島へのホーミングに大きな役割を果たしていることを示す。ＣＤ４４に対する機能阻害抗体ＩＭ７．８．１およびＡＧ３３４０をそれぞれＮＯＤマウスに静脈内注射した。３０分して、この注射に続いてＤｉＩ標識ＩＳ−ＣＤ８＋Ｔ細胞を静脈内注射した。２４時間後、膵島のエントランスおよびランゲルハンス島内の標識細胞をそれぞれ、蛍光顕微鏡を用いて膵臓のクリオスタット切片ごとに計数した。マウス１匹あたり少なくとも１００島（マウス４〜５匹／群）を調べた。結果を左のパネルにまとめてある。＊および＊＊は、フィッシャーの検定でｐ＜０．０５であった。代表切片は、未処理動物のＴ細胞の効率的なホーミングと、機能阻害ＣＤ４４抗体の著しい阻害作用と、膵島のエントランスでのＡＧ３３４０によるＴ細胞の固定化とを示す。
【図５】図５は、阻害解析から、内因性ＭＴ１−ＭＭＰがＩＳ−ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞表面のＣＤ４４を切断することが確認されることを示す。上のパネルでは、細胞表面をビオチン化し、次いで無血清培地においてＩコラーゲン／ゼラチンでコーティングしたプラスチックに接着させるか（接着、Ａ）、あるいは、懸濁液中で保持した（非接着、ＮＡ）。指示により、この細胞に、ＴＩＭＰ−１（１００ｎｇ／ｍｌ；ＭＴ１−ＭＭＰの弱いインヒビター）と、どちらもＭＴ１−ＭＭＰの非常に強力なインヒビターであるＴＩＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＡＧ３３４０（５０μＭ）とを加えた。細胞可溶化物および培地のアリコートをストレプトアビジンアガロースビーズで捕獲した。捕獲サンプルのＣＤ４４を、ＣＤ４４細胞外ドメインに対する抗体を用いたウエスタンブロッティングで解析した。下のパネルは、ＭＭＰ−２を解析するため、無血清培地において接着細胞および非接着細胞をそれぞれ１８時間インキュベートしたものを示す。この細胞に精製ＭＭＰ−２（２０ｎｇ；ＭＭＰ−２単独；細胞なし）を加えた。ＭＭＰ−２の活性化を、培地のアリコートのゼラチンザイモグラフィーで解析した。ウエスタンブロッティング実験（上の２つのパネル）では、外的なＭＭＰ−２を用いなかった。
【図６Ａ】図６は、ＡＧ３３４０が膵島炎を抑制し、自然発症糖尿病のＮＯＤマウスにおける膵島の再生を刺激することを示す。自然発症糖尿病の発症後、インスリン（１５〜２０Ｕ／ｋｇ；２〜３日ごとに１回注射）をマウスに皮下注射した。対照動物（マウス６匹／群）にはインスリンを単独投与したのに対し、実験群（マウス５匹／群）には、インスリンの皮下投与と一緒にＡＧ３３４０を腹腔内投与した。各注射を４０日間続けてから、マウスを屠殺した。膵臓の切片において、白血球および粒状のβ細胞をそれぞれＨ＆Ｅおよびアルデヒドフクシンで染色した。膵島の膵島炎の重症度（≧１００／マウス）をスコア評価した（０は病変なし；１は膵島周囲の白血球凝集に加えて管周囲の浸潤；２は膵島の破壊が＜２５％；３は膵島の破壊が＞２５％；および４は膵島の全体的な破壊）。＊および＊＊は、フィッシャーの検定でそれぞれｐ＝０．０４２およびｐ＝０．０３７であった。膵臓切片の代表的な画像は、インスリン抗体で染色した対照マウスおよびＡＧ３３４０処理したマウスのものである。対照では、膵島の単核細胞浸潤および膵島炎の広がりが見られることと、ＡＧ３３４０を投与したマウスでは、膵島周囲炎が抑えられているとともに小型の再生インスリン陽性膵島が形成されていることに留意されたい。
【図６Ｂ】図６は、ＡＧ３３４０が膵島炎を抑制し、自然発症糖尿病のＮＯＤマウスにおける膵島の再生を刺激することを示す。自然発症糖尿病の発症後、インスリン（１５〜２０Ｕ／ｋｇ；２〜３日ごとに１回注射）をマウスに皮下注射した。対照動物（マウス６匹／群）にはインスリンを単独投与したのに対し、実験群（マウス５匹／群）には、インスリンの皮下投与と一緒にＡＧ３３４０を腹腔内投与した。各注射を４０日間続けてから、マウスを屠殺した。膵臓の切片において、白血球および粒状のβ細胞をそれぞれＨ＆Ｅおよびアルデヒドフクシンで染色した。膵島の膵島炎の重症度（≧１００／マウス）をスコア評価した（０は病変なし；１は膵島周囲の白血球凝集に加えて管周囲の浸潤；２は膵島の破壊が＜２５％；３は膵島の破壊が＞２５％；および４は膵島の全体的な破壊）。＊および＊＊は、フィッシャーの検定でそれぞれｐ＝０．０４２およびｐ＝０．０３７であった。膵臓切片の代表的な画像は、インスリン抗体で染色した対照マウスおよびＡＧ３３４０処理したマウスのものである。対照では、膵島の単核細胞浸潤および膵島炎の広がりが見られることと、ＡＧ３３４０を投与したマウスでは、膵島周囲炎が抑えられているとともに小型の再生インスリン陽性膵島が形成されていることに留意されたい。
【図７】図７は、ＡＧ３３４０が、ＭＴ１−ＭＭＰと、ＩＳ−ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ４４のシェディングとを阻害することを示す。上のパネルは、ＭＭＰ−２のゼラチンザイモグラフィーを示す。細胞のＭＴ１−ＭＭＰによるＭＭＰ−２の活性化を解析するため、接着細胞および非接着細胞をそれぞれ無血清培地で１８時間インキュベートした。この細胞に精製ＭＭＰ−２（２０ｎｇ）を加えた。ＭＭＰ−２の活性化を、培地のアリコートのゼラチンザイモグラフィーで解析した結果、６８ｋＤａのＭＭＰ−２酵素前駆体が６２ｋＤａのＭＭＰ−２成熟酵素に変換されることが観察された。指示により、この細胞にＡＧ３３４０、ＳＢ−３ＣＴおよびＥＧＣＧを１８時間加えた。真ん中のパネルは、ＣＤ４４のウエスタンブロッティングを示す。細胞表面をビオチン化してから、無血清培地において、Ｉコラーゲン／ゼラチンでコーティングしたプラスチックに接着させるか（接着、Ａ）、あるいは、懸濁液のままにしておいた（非接着、ＮＡ）。指示により、この細胞にＡＧ３３４０、ＳＢ−３ＣＴおよびＥＧＣＧを加えた。細胞可溶化物および培地のサンプルをストレプトアビジンアガロースビーズで捕獲した。捕獲サンプルのアリコート（それぞれ総タンパク質５０μｇ）のＣＤ４４を、ＣＤ４４細胞外ドメインに対する抗体を用いたウエスタンブロッティングで解析した。下のパネルは、低濃度のＳＢ−３ＣＴがＭＭＰ−２を阻害することを示す。α１−アンチトリプシンをＭＭＰ−２とともにインキュベートした。消化したサンプルを、ＳＤＳ−ゲル電気泳動を還元して解析した。指示により、このサンプルにＳＢ−３ＣＴを図に示した濃度で加えた。
【図８】図８は、ＡＧ３３４０が、ＩＳ−ＣＤ８＋Ｔ細胞の膵島内ホーミングを阻害することを示す。ＮＯＤマウスにＡＧ３３４０、ＳＢ−３ＣＴおよびＥＧＣＧをそれぞれ注射した。３０分して、各注射に続いてＤｉＩ標識ＩＳ−ＣＤ８＋Ｔ細胞を注射した。２４時間後、蛍光顕微鏡で膵臓のクリオスタット切片を調べた。ＤｉＩ標識細胞は、膵島のエントランスまたはランゲルハンス島内に位置しており、これを計数した。マウス１匹あたり少なくとも１００島（マウス４〜５匹／群）を調べた。膵島については、蛍光の減弱および緻密で高密度な構造など、その形態学的特徴から容易に見分けることができる。ＤｉＩ標識細胞を注射したＮＯＤマウスから得たランゲルハンス島の代表的な画像を示す。
【図９】図９は、ＡＧ３３４０が、ＩＳ−ＣＤ８＋Ｔ細胞の血管内皮細胞間隙遊走を阻害し、ＮＯＤマウスの移入糖尿病の発症を遅らせることを示す。図９Ａは、ＡＧ３３４０が、ＩＳ−ＣＤ８＋細胞のランゲルハンス島へのトランスマイグレーションを阻害することを示す。マウスには、この細胞を注射する３０分前に、ＡＧ３３４０、ＳＢ−３ＣＴ、ＥＧＣＧまたはＰＢＳのいずれかを投与しておいた。ＩＳ−ＣＤ８＋細胞をＤｉＩで標識してから、ＮＯＤマウスに注射した。２４時間して、膵臓全体の中で膵島内にある標識細胞をクリオスタット切片ごとに計数した。図９Ｂは、ＡＧ３３４０が、養子移入を受けたＮＯＤマウスの糖尿病の発現を遅らせることを示す。ＩＳ−ＣＤ８＋細胞をＮＯＤマウスに注射した。マウスには、糖尿病を発現するまで（およそ１〜２週間）、ＡＧ３３４０、ＳＢ−３ＣＴおよびＥＧＣＧあるいはＰＢＳを１日おきに１回投与した。ＳＢ−３ＣＴ（６０ｍｇ／ｍｌ）、ＥＧＣＧ（５０ｍｇ／ｍｌ）およびＡＧ３３４０（５０ｍｇ／ｍｌ）の原液については、５０％ＤＭＳＯで製造しておいた。注射の直前に、ＥＧＣＧおよびＳＢ−３ＣＴをそれぞれＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。ＡＧ３３４０をＰＢＳで濃度０．４ｍｇ／ｍｌになるように希釈した。ＰＢＳ含有３．％ＤＭＳＯをビヒクル対照として用いた。Ｄｉａｓｔｉｘの試薬ストリップで尿中グルコース濃度を測定して、糖尿病の発現を毎日モニターした。３日連続して尿中グルコース濃度が≧２０００ｍｇ／ｄｌであるマウスを糖尿病とみなした。＊および＊＊は、フィッシャーの検定でそれぞれｐ＝０．０２およびｐ＝０．０１５であった。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
2009533318000001.app
【国際調査報告】
2009533318.tif 000027