(57)【要約】本発明は、ヤトロファ・クルカス・エル植物の油含有量を増加させる方法に関する。本発明は、さらに、ヤトロファアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）をコードする部分および完全ｃＤＮＡ配列、ならびにヤトロファＡＣＣアーゼ遺伝子をクローニングおよび発現して、油含有量が増加した形質転換植物を産生する方法を提供する。細胞質ＡＣＣアーゼを過剰発現することにより、植物および種子の脂肪酸合成および伸長を制御する方法を開発した。本発明は、植物においてヤトロファのＡＣＣアーゼを発現することにより形質転換植物を産生することを意図する。このような方法は、さらに、細胞質ＡＣＣアーゼを植物細胞に形質転換すること、および当該細胞をカルスに、次いで植物に成長させること、または、代わりに、葉片の形質転換により直接的に形質転換植物を産生することを含む。
2009536029.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤトロファ・クルカス・エル（Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ  Ｌ．）由来の活性アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）を含む、単離および精製されたポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号４、配列番号６、配列番号８およびそれらのフラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ヤトロファ・クルカス・エル由来のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）遺伝子またはそれらのフラグメントをコードする、単離および精製された核酸。
【請求項４】
前記核酸が、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号７およびそれらのフラグメントからなる群から選択される、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
前記核酸が、配列番号９を含む、請求項３に記載の核酸。
【請求項６】
遺伝子改変されたヤトロファ・クルカス（Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ）植物を産生する方法であって、
（ｉ．）ヤトロファ・クルカス植物を提供すること、
（ｉｉ．）ＡＣＣアーゼをコードする核酸を含む発現カセット、および必要に応じて輸送ペプチドを、当該植物に導入すること、
（ｉｉｉ．）当該植物が遺伝子改変されているかどうかを判断するために、当該植物中でのＡＣＣアーゼの増加した活性または増加した発現を検出すること、および
（ｉｖ．）当該遺伝子改変されたヤトロファ・クルカス植物を再現すること
を含む、方法。
【請求項７】
前記ＡＣＣアーゼが、細胞質ヤトロファ・クルカスＡＣＣアーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＡＣＣアーゼが、ヤトロファ・クルカス中で発現可能なプロモータに作動可能に連結している、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＡＣＣアーゼが、前記遺伝子改変されたヤトロファ・クルカス植物中で発現する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記プロモータが、導入可能なプロモータである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロモータが、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモータ、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモータおよび胚乳特異的プロモータからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記胚乳特異的プロモータが、β−ファゼオリンプロモータ、ナピンプロモータおよびユビキチンプロモータからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記発現カセットが、発現ベクターを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記輸送ペプチドが、プロモータとＡＣＣアーゼ遺伝子との間に位置する葉緑体輸送ペプチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記発現カセットが、プロトプラスト形質転換、アグロバクテリウムにより媒介される形質転換、電気穿孔法および微粒子銃からなる群から選択される方法により前記植物に導入される、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現カセットが、１つまたはそれ以上の植物ＡＣＣアーゼ遺伝子の３’末端に連結した植物転写終結およびポリアデニル化シグナルおよび翻訳シグナルをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
前記遺伝子改変されたヤトロファ・クルカス植物が、油含有量が増加した種子を産生する、請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
前記油含有量が、天然に存在するヤトロファ・クルカス植物により産生される種子と比較して少なくとも１．２倍増加する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記油含有量が、天然に存在するヤトロファ・クルカス植物により産生される種子と比較して２〜２０倍増加する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記油含有量が３０％である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
実質的に実施例および図面を参照して本明細書に記載されたとおりの、上記特許請求の範囲に記載の活性アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）を含む単離精製されたポリペプチド、およびヤトロファ・クルカス・エル由来のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）遺伝子またはそれらのフラグメントをコードする核酸、および本明細書中に記載のその方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願への相互参照
本願は、２００６年５月９日に出願されたインド国仮特許出願第７２０／ＭＵＭ／２００６号の利益を主張し、インド国仮特許出願第７２０／ＭＵＭ／２００６号はその全体が本明細書において参考として援用される。
発明の分野
本発明は、ヤトロファ・クルカス（Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ）植物の油含有量を増加させることによって、当該植物の価値を高める方法に関する。特に、本発明は、ヤトロファ（Ｊａｔｒｏｐｈａ）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）をコードする完全ｃＤＮＡ配列および部分的ＤＮＡ配列を含む核酸に関する。本発明はまた、ヤトロファＡＣＣアーゼ遺伝子をクローニングおよび発現させて、油含有量が増加した形質転換ヤトロファ植物を産生する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヤトロファ・クルカスは、ラテンアメリカ起源の植物であり、世界の乾燥熱帯地域および半乾燥熱帯地域にわたって広く分布している。ヤトロファは、１７０種以上を含む大きな属である。インドに一般的に存在する種は、ヤトロファ・クルカス、ヤトロファ・グランジュリフェラ（Ｊ．ｇｌａｎｄｕｌｉｆｅｒａ）、ヤトロファ・ゴシピフォリア（Ｊ．ｇｏｓｓｙｐｉｆｏｌｉａ）、ヤトロファ・マルチフィダ（Ｊ．ｍｕｌｔｉｆｉｄａ）、ヤトロファ・ナナ（Ｊ．ｎａｎａ）、ヤトロファ・パンディイロエフォリア（Ｊ．ｐａｎｄｕｒａｅｆｏｌｉａ）、ヤトロファ・ヴィロサ（Ｊ．ｖｉｌｌｏｓａ）およびヤトロファ・ポダグリカ（Ｊ．ｐｏｄａｇｒｉｃａ）である。ヤトロファ・クルカスは、蝋燭およびセッケンを製造するための非食用ヤトロファ油を製造するために、およびバイオディーゼルの製造のための原料として、用いられる。ヤトロファは、栄養補助食品、医薬品、皮膚科学的およびパーソナル・ケア製品において、多様な医薬用途を有する。ヤトロファ・クルカス由来のラテックスは、「ヤトロフィン」として知られるアルカロイドに関連する抗癌性を有する。
【０００３】
ヤトロファ種のほとんどは、油を産生する種であるヤトロファ・クルカスおよびヤトロファ・グランジュリフェラを除いて、装飾用である。種子は、医学的および獣医学的目的に有用であることが見出されている半乾性油を含む。油含有量は、種子中で２５〜３０％であり、核種中で５０〜６０％である。油は、２１％の飽和脂肪酸および７９％の不飽和脂肪酸を含む。
【０００４】
ヤトロファ油は、リノレン酸（Ｃ１８：２）およびオレイン酸（Ｃ１８：１）であり、それらは共に油組成の８０％までを占める。パルミチン酸（Ｃ１６：０）およびステアリン酸（Ｃ１８：０）は、この油中に存在する他の脂肪酸である。従って、ヤトロファ種に望ましい形質を導入する方法が必要である。種子収率および油含有量は、ヤトロファなどの種に最も望ましい形質である。
【０００５】
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ、ＥＣ６．４．１．２）は、植物脂肪酸の生合成を制御し、かつそれによって脂質生合成に影響を及ぼすのに非常に重要な調節的役割を有する。ＡＣＣアーゼは、アセチル−ＣｏＡのＡＴＰ依存的カルボキシル化を触媒して、マロニル−ＣｏＡを産生する。この反応は、ＨＣＯ３をカルボキシルドナーとして用いてビオチン補欠分子族をカルボキシル化し、次いで、カルボキシル基をビオチンからアセチル−ＣｏＡに伝達する２つの段階で起こる。ビオチンカルボキシラーゼ、カルボキシル転移酵素、およびＡＣＣアーゼのビオチン成分は、それぞれ、原核生物中の異なるポリペプチドと関連する。非特許文献１。対照的に、非植物真核生物のＡＣＣアーゼは、単一の多機能性ポリペプチドの多量体から構成される。
【０００６】
原核生物型および真核生物型ＡＣＣアーゼはいずれも、植物中で見出された。（Ｋａｎｎａｎｇａｒａ，Ｃ．Ｇ．ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１５２：８３−９１（１９７２）；Ｎｉｋｏｌａｕ，Ｂ．Ｊ．ら、“Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  Ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，”  Ｉｎ  Ｎ  Ｍｕｒａｔａ，Ｃ  Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ｅｄｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｄ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｔｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ｐｐ．１３８−１４９（１９９３）およびＳａｓａｋｉ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２５１１８−２５１２３（１９９３））（Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｊ．Ｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９：１０１−１３８（１９８８）。
【０００７】
ＡＣＣアーゼにより産生されるマロニル−ＣｏＡは、脂肪酸の合成および伸長、フラボノイドの合成、ならびにエチレン前駆物質であるアミノシクロプロパン−１−カルボン酸のマロニル化（ｍａｌｏｎａｔｉｏｎ）、ならびにアミノ酸および配糖体のマロニル化などの、植物におけるいくつかの生化学反応および経路に関与する。（Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｊ．Ｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９：１０１−１３８（１９８８））（Ｅｂｅｌ，Ｊ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７５：２０１−２０９（１９７７）Ｅｂｅｌ，Ｊ．ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２３２：２４０−２４８（１９８４）），（Ｌｉｕ，Ｙ．ら、Ｐｌａｎｔａ  １５８：４３７−４４１（１９８３）；Ｋｉｏｎｋａ，Ｃ．ら、Ｐｌａｎｔａ  １６２：２２６−２３５（１９８４））。
【０００８】
マロニル−ＣｏＡは、複数の細胞内位置で入手可能であるが、これは、脂肪酸合成などのこれらの反応のいくつかは色素体の内側で起こるがフラボノイド合成および脂肪酸伸長などの他の反応は色素体の外側で起こるからである。例えば，超長鎖脂肪酸は、原形質膜脂質の成分であり（Ｃａｈｏｏｎ，Ｅ．Ｂ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９５：５８−６８（１９９１））、かつ、空中組織および地下組織の両方の表面を被覆するためのクチクラワックスの合成にも必要とされる。Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｊ．Ｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９：１０１−１３８（１９８８）。これらの超長鎖脂肪酸は、色素体から排出される炭素数１６または１８の脂肪酸の伸張によって、色素体の外側で合成される。伸長反応のためのマロニル−ＣｏＡは、細胞質中に存在し、おそらく、細胞質ＡＣＣアーゼにより提供される。
【０００９】
マロニル−ＣｏＡは、時および組織に関して非常に異なる量で入手可能である。例えば、増加した量のマロニル−ＣｏＡは、種の種子の発生における脂肪酸合成に必要であり、多量のトリアシルグリセロールを貯蔵する。Ｐｏｓｔ−Ｂｅｉｔｅｎｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．ら、“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａｎ  Ｅｘａｍｐｌｅ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｅｄ  ｏｎ  ａ  Ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  Ｐａｔｈｗａｙ”，Ｉｎ  ＤＰＳ  Ｖｅｒｍａ，ｅｄ，Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．ｐｐ．１５７−１７４（１９９３）。花組織では、マロニル−ＣｏＡはフラボノイド色素の合成のためのカルコンシンターゼ反応において用いられ、この組織の乾燥重量の１５％までを占める。Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｔ．Ｗ．ら、“Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．５４５（１９８３）。いくつかの組織では、ＡＣＣアーゼは、マロニル−ＣｏＡを恒常的に提供して、膜の合成および維持のための脂肪酸を産生し、かつ、短期間にわたって、紫外光に曝露している間（Ｅｂｅｌ，Ｊ．ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７５：２０１−２０９（１９７７））または病原真菌の攻撃の間（Ｅｂｅｌ，Ｊ．ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２３２：２４０−２４８（１９８４））に、フラボノイドを合成する。
【００１０】
多様な知見により、ＡＣＣアーゼは油料種子の脂肪酸合成のための律速酵素であるとの考えに達した。基質および産物のプールサイズの解析により、ＡＣＣアーゼは、ホウレンソウの葉および葉緑体における脂肪酸合成の明暗制御と関係付けられた。非特許文献２および非特許文献３。さらに、ＡＣＣアーゼ活性は、油料種子作物の種子の発生における脂質の析出と共に増加する。非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６および非特許文献７。従って、アセチル−ＣｏＡのカルボキシル化を制御して脂肪酸合成物質マロニル−ＣｏＡを産生すると考えられる、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）をコードする遺伝子を提供することが望ましい。ヤトロファ・クルカスの植物、種子、培養物、細胞および組織において脂肪酸合成および伸長の長期制御を得るために、ＡＣＣアーゼ遺伝子の完全配列をクローン化および取得し、その後それを安定している植物プロモータ下でアグロバクテリウムが媒介する手段または微粒子銃の手段のいずれかにより植物組織中に形質転換することが望ましい。これは油含有量が高い遺伝子改変ヤトロファ・クルカス植物を提供し得るであろう。
【００１１】
非特許文献８は、細胞質アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）アイソザイムをコードするシロイヌナズナ遺伝子を特徴付けた。特許文献１は、プロモータに作動可能に連結した細胞質ＡＣＣアーゼを含む組換え核酸構築物を含むダイズ植物の種子を開示する。これらの種子は、ＡＣＣアーゼをコードする核酸で形質転換していない対応する植物により産生される種子と比較して、増加した油含有量を示す。しかしながら、これらの教示は、アブラナ種子に比較的特異的である。
【００１２】
また、ＡＣＣアーゼは、フラボノイド、イソフラボノイドおよび他の二次的代謝産物の合成に利用可能なマロニル−ＣｏＡの量を増加することもまた報告されている。逆に、ＡＣＣアーゼ遺伝子の発現を減少させることにより、植物に存在するマロニル−ＣｏＡの量が低減され得、かつアセチル−ＣｏＡの量が増加され得る。従って、ＡＣＣアーゼ遺伝子の発現を変化させることにより、その多くが病原体に対する植物防疫または薬用もしくは他の用途に価値を有する二次的植物産物の産生に利用可能なアセチル−ＣｏＡまたはマロニル−ＣｏＡの量が変化し得る。当該分野でのこの必要性の観点では、本発明まで、対応するＡＣＣアーゼ遺伝子はヤトロファ・クルカスから精製されなかった。
【００１３】
アブラナ、ダイズ、またはＡＣＣアーゼ遺伝子を過剰発現する他の油用種子作物は、種子の脂肪酸合成を増加させ、その結果、アブラナ、ダイズ、または他の油用種子作物の油含有量が増加することが観察されている。さらに、ＡＣＣアーゼ遺伝子発現を減少させることによって種子の脂肪酸合成を減少させる結果、低脂肪ピーナッツなどの「低脂肪」種子が得られることが観察されている。また、細胞質ＡＣＣアーゼ遺伝子を過剰発現させることにより種子の脂肪酸伸長を増加させることは、アブラナ、ハマナおよび他の油用種子植物におけるエルカ酸などの超長鎖脂肪酸の含有量を増加させるのにも有用であることが、Ｂａｔｔｅｙ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：１２２−１２５（１９８９）に報告されている。エルカ酸およびその誘導体は、潤滑剤、可塑剤およびナイロンの製造に用いられ、かつ、他の産業上の用途を有するので、このことは望ましい。エルカ酸は重要な産業上の用途を有するが、食物製品においてヒトが消費するには健康的ではないであろう。従って、アンチセンスＲＮＡ方法によって細胞質ＡＣＣアーゼ遺伝子の発現を減少させることによって脂肪酸伸長を減少させ、それによってエルカ酸含有量を減少させることもまた望ましい。このことにより、ヒトの消費に適したアブラナ、マスタード、ハマナおよび他の油用種子植物の種子油が得られ得るが、これはエルカ酸、エイコサノイル酸および他の超長鎖脂肪酸の含有量が減少するからである。
【００１４】
ＡＣＣアーゼはまた、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４８：１０３９−１０４４（１９８７）に報告されているように、アリールオキシフェノキシプロピオネートおよびシクロヘキサンジオンファミリーの除草剤のターゲットである。トウモロコシなどのいくつかの単子葉植物のＡＣＣアーゼは、双子葉種のＡＣＣアーゼと比べて、除草剤への感受性がずっと高い。従って、トウモロコシなどの感受性種の色素体において双子葉シロイヌナズナ由来ＡＣＣアーゼ遺伝子を過剰発現させることにより、希望する種において除草剤抵抗性がもたらされ得る。従って、除草剤は、遺伝子改変された植物種の分野において単子葉植物草を制御するのに有用であるであろう。アセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡは、種々の植物の二次的代謝産物の前駆物質であることが、研究により示されている。従って、ＡＣＣアーゼの発現を増加させることにより、フラボノイド、イソフラボノイド、植物脂肪酸合成および他の二次的代謝産物の合成に利用可能なマロニル−ＣｏＡの量が増加する。
【００１５】
当該分野では、ヤトロファ・クルカスの植物、種子、培養、細胞および組織における脂肪酸の合成および伸長の長期制御を得るため、ヤトロファ・クルカスＡＣＣアーゼ遺伝子の完全配列が必要とされている。従って、ＡＣＣアーゼ遺伝子の完全配列を構成する核酸をクローン化し、それを安定な植物プロモータ下で植物組織を形質転換するのに用いることが望ましいであろう。このことは、油含有量が高い遺伝子改変ヤトロファ植物を提供するであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第６，７２３，８９５号明細書
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｓａｍｏｌｓ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６４６１−６４６４（１９８８）
【非特許文献２】Ｐｏｓｔ−Ｂｅｉｔｅｎｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１８５８−１８６５（１９９１）
【非特許文献３】Ｐｏｓｔ−Ｂｅｉｔｅｎｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：９２３−９３０（１９９２）
【非特許文献４】Ｓｉｍｃｏｘ，Ｐ．Ｄ．ら、Ｃａｎａｄａ  Ｊ．Ｂｏｔ．５７：１００８−１０１４（１９７９）
【非特許文献５】Ｔｕｒｎｈａｍ，Ｅ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２１２：２２３−２２９（１９８３）
【非特許文献６】Ｃｈａｒｌｅｓら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．２５：５５−５９（１９８６）
【非特許文献７】Ｄｅｅｒｂｕｒｇ，Ｓ．ら、Ｐｌａｎｔａ  １８０：４４０−４４４（１９９０）
【非特許文献８】Ｒｏｅｓｌｅｒ（１９９４）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０５：６１１−６１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
発明の目的
本発明の目的は、ヤトロファＡＣＣアーゼ酵素をコードする完全ｃＤＮＡ配列およびゲノムＤＮＡ配列を提供することである。
【００１９】
本発明の目的は、植物細胞において機能的なプロモータに作動可能に連結したアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼまたはその機能的変異体をコードする遺伝子を含む発現カセットを提供することである。
【００２０】
本発明の目的は、ヤトロファアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子を植物細胞中に導入しかつ発現することにより、植物の油含有量を変化させる方法を提供することである。
【００２１】
本発明の目的はまた、少なくとも１．５〜２倍増加した油含有量を有する形質転換植物を提供することによって、植物の商業的価値を増強することである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
発明の要旨
本発明は、ヤトロファ植物においてアセチル−ＣｏＡのカルボキシル化を増加および減少させて、マロニル−ＣｏＡを産生するのに用いられ得る核酸配列に関する。本発明では、本発明者らは、その発現によってアセチル−ＣｏＡのカルボキシル化を制御してマロニル−ＣｏＡを産生することができる、部分的に配列決定された細胞質ＡＣＣアーゼを開示する。マロニル−ＣｏＡが植物および種子中での脂肪酸合成および伸長に必要であることを念頭に置いて、本発明の発明者らは、細胞質ＡＣＣアーゼを過剰発現することにより、植物および種子の脂肪酸合成および伸長を制御する方法を首尾よく開発した。従って、本発明は、構築物によりこれらの植物においてヤトロファのＡＣＣアーゼを発現することにより形質転換植物を産生することを意図する。このような方法は、さらに、細胞質ＡＣＣアーゼを植物細胞に形質転換すること、および当該細胞をカルスに、次いで植物に成長させること、または、代わりに、葉片の形質転換により直接的に形質転換植物を産生することを含む。
【００２３】
本発明は、植物においてアセチル−ＣｏＡのカルボキシル化を一般的に増加および減少させてマロニル−ＣｏＡを産生するのに用いられ得る配列を単離することに関する。本発明において、本出願人は、その発現がアセチル−ＣｏＡのカルボキシル化を制御してマロニル−ＣｏＡを産生することができる、部分的に配列決定された細胞質ＡＣＣアーゼを開示した。本発明は、特に、ヤトロファアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼをコードする完全ｃＤＮＡ配列およびゲノムＤＮＡ配列を提供する。
【００２４】
本発明は、さらに、ヤトロファ・クルカスの油含有量を増加させる方法を提供する。本発明は、また、ヤトロファＡＣＣアーゼ遺伝子をクローニングおよび発現させて、油含有量が増加した形質転換植物を形成する方法を提供する。従って、本発明は、ヤトロファのＡＣＣアーゼ遺伝子を発現させることによる形質転換植物の産生を意図する。ＡＣＣアーゼは、発現構築物によって、植物に導入することができる。これは、細胞質ＡＣＣアーゼを含む構築物を植物細胞に形質転換し、当該細胞をカルスに、およびその後植物に成長させることを含む。あるいは、形質転換植物は、葉片の形質転換により直接的に産生させることもできる。
【００２５】
１つの実施態様では、本発明は、単離および精製された、ヤトロファＡＣＣアーゼ遺伝子をコードするｃＤＮＡのセグメントを含むｃＤＮＡ分子を提供する。植物アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼをコードするｃＤＮＡ分子は、植物アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子またはその部分に実質的に相補的なアンチセンスｃＤＮＡ配列をコードする未改変の植物アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼまたは改変された植物アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼをコードすることができる。本発明のｃＤＮＡ分子はまた、ヤトロファアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子に作動可能に連結したアミノ末端植物葉緑体輸送ペプチド配列をさらに含むこともできる。
【００２６】
他の実施態様では、本発明は、油含有量が増加または変化したヤトロファ植物を産生する方法を提供する。当該方法は、植物ＡＣＣアーゼ遺伝子を植物細胞に導入しかつ発現することを含む。当該方法は、さらに、植物細胞のプロモータ機能に作動可能に連結した植物アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼあるいはその改変されたまたは機能的な変異体をコードする遺伝子を含むキメラｃＤＮＡ分子を植物細胞に導入する工程、および当該遺伝子を、植物細胞の油含有量を変化させるのに有効な量で発現させることを含む。
【００２７】
他の実施態様では、本発明は、油含有量を変化させる方法であって、そのタイプの植物細胞に通常存在する全油含有量の変化、または細胞に存在する油のタイプの変化を含む、方法に関する。本発明の方法による植物細胞中での油含有量の変化は、以下を含む少なくとも２つの方法により、達成される：（１）改変された植物アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子の発現の増加または減少、あるいは（２）改変されたまたは機能的な変異体植物アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子を導入することによる。
【００２８】
１つの実施態様では、当該方法は、以下の工程を含む：（ｉ）ヤトロファにおけるＡＣＣアーゼ遺伝子の単離および同定、（ｉｉ）ＡＣＣアーゼをコードするｃＤＮＡクローンの形成、（ｉｉｉ）発現カセットの調製、（ｉｖ）発現カセットの植物細胞への導入／伝達、（ｖ）形質転換植物におけるコードされた遺伝子の発現／活性の検出、および（ｖｉ）植物の再現。
【００２９】
１つの実施態様では、ヤトロファにおけるＡＣＣアーゼをコードする遺伝子の単離および同定は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）により記載された標準的な方法を用いる縮重プライマーストラテジーを用いて単離および同定されたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡプールを含む。部分的ＡＣＣアーゼ遺伝子は、本明細書中で詳細な説明において援用される。植物ＡＣＣアーゼ遺伝子の単離された全長コピーの存在は、植物アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の部分配列解析によるかまたは発現解析により検証される。
【００３０】
本発明の他の実施態様では、５’、中央および３’末端の部分をコードするＤＮＡフラグメントが得られ、これらはＡＣＣアーゼ遺伝子を含む発現カセットを構築するのに用いられる。この方法は、発現カセットの単一または複数のコピーを植物細胞に導入することを含む。好ましい実施態様では、単離された不変のＡＣＣアーゼ遺伝子は、植物細胞においてＡＣＣアーゼ遺伝子の発現を促進するプロモータと組み合わされるか、またはそれに連結される。発現カセットは、機能的プロモータに連結されたＡＣＣアーゼ遺伝子を含む。他の実施態様では、機能的プロモータに連結されたＡＣＣアーゼ遺伝子は、発現ベクター中で提供される。
【００３１】
本発明の１つの実施態様では、高レベルの遺伝子発現に用いられるプロモータは、強いプロモータとしても知られる誘導性プロモータである。１つの実施態様では、用いられる強いプロモータは、異種性遺伝子発現のために単離された配列であり、これは形質転換細胞の検出および選択を促進する一方、所望される場合は、高レベルの遺伝子発現を提供する。本発明の好ましい実施態様では、プロモータは、植物においてＡＣＣアーゼ遺伝子またはその機能的変異体の過剰発現を特異的に促進し、それによってアセチル−ＣｏＡを増加させ、最終的には、植物中でのマロニル−ＣｏＡレベルの増加をもたらす。このようなプロモータには、３５Ｓカリフラワーモザイクウイルスプロモータ、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモータ、ならびにβ−ファゼオリン、ナピンおよびユビキチンなどのいくつかの他の胚乳特異的プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明の他の実施態様では、発現カセットは、必要に応じて、他のＤＮＡ配列を含むことができる。
【００３３】
本発明の他の実施態様では、発現カセットは、さらに、プロモータと植物ＡＣＣアーゼ遺伝子との間で作動可能に連結した葉緑体輸送ペプチド配列を含む。  
【００３４】
本発明の他の実施態様では、植物細胞に導入される発現カセットは、植物ＡＣＣアーゼ遺伝子の３’末端に連結した植物転写末端およびポリアデニル化シグナルおよび翻訳シグナルを含む。
【００３５】
本発明の他の実施態様では、輸送ペプチドをコードするＤＮＡフラグメントは、輸送ペプチドの公知配列から全体的にまたは部分的にのいずれかで化学的に合成される。
【００３６】
本発明の他の実施態様では、ＡＣＣアーゼ遺伝子を含む発現カセットは、公知の発現ベクターにサブクローン化される。当該方法は、発現ベクターを宿主細胞に導入すること、ならびに植物ＡＣＣアーゼ遺伝子の発現を検出および／または定量化することを含む。適切なベクターには、プラスミドまたは他のバイナリーベクターが挙げられる。発現ベクターは、プロトプラスト形質転換、アグロバクテリウムにより媒介される形質転換、電気穿孔法、マイクロプロジェクタイル法または任意の当該分野で公知の技術により、原核細胞または真核細胞に導入することができる。形質転換細胞の選択は、発現ベクター内でコードされるマーカーを用いて行うことができる。
【００３７】
本発明の１つの実施態様では、遺伝子発現の検出は、ＰＣＲ技術またはＷｅｓｔｅｒｎブロットによる定量的検出により行われる。特異的酵素活性の変化は、形質転換細胞において酵素活性を測定することにより検出される。油含有量の変化は、標準的な方法により検討される。
【００３８】
本発明の１つの実施態様では、方法は、油含有量の変化または量の変化またはＡＣＣアーゼ遺伝子の特異的活性を示す形質転換植物および種子を再現することを含む。形質転換植物は、当該分野で公知の標準的技術および本明細書中の教示を用いて産生される。好ましい実施態様では、本発明は、少なくとも１．５〜２倍の増加した油含有量を有することによって植物の商業的価値が高まった種子を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
以下の図面は、本明細書の部分を構成し、本開示の特定の局面をさらに示すために含まれ、その発明は、１つまたはそれ以上のこれらの図面を、本明細書中に示される特定の実施態様の詳細な説明と共に参照することにより、より良く理解することができる。
【図１】図１は、ヤトロファ・クルカス由来のＡＣＣアーゼ遺伝子の６２５塩基対ゲノムフラグメントの増幅を図解する。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、ヤトロファ・クルカス由来のＡＣＣアーゼ遺伝子の５９７塩基対中間フラグメントを含むｐＧＥＭ：Ｊｌクローンのヌクレオチド配列を図解する。プライマー結合部位（ＭＥ２３およびＭＥ２５）には下線を付している。
【図３Ａ】図３は、ヤトロファ・クルカス由来のＡＣＣアーゼ遺伝子の１．２５ｋｂ中間フラグメントを含むクローン番号Ｊ−２  Ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号２）およびＪ−２  Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号３）のヌクレオチド配列を図解する。
【図３Ｂ】図３は、ヤトロファ・クルカス由来のＡＣＣアーゼ遺伝子の１．２５ｋｂ中間フラグメントを含むクローン番号Ｊ−２  Ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号２）およびＪ−２  Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号３）のヌクレオチド配列を図解する。
【図４】図４は、ヤトロファ・クルカス由来のＡＣＣアーゼ遺伝子の１．２５ｋｂ増幅されたフラグメントの確認を図解する。
【図５】図５は、クローン番号Ｊ２  Ｒｅｖｅｒｓｅを有する配列番号３の配列リストを図解する。長さ：６２６塩基タイプ：核酸らせん型：二重トポロジー：線状分子型：ＤＮＡ（ゲノムの）
【図６】図６は、ヤトロファ・クルカスＪ−１アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子部分配列の翻訳されたペプチド配列である配列番号４を図解する。
【図７】図７は、ヤトロファ・クルカスクローンＪ−２アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ配列の部分配列である配列番号５を図解する。長さ：６１１塩基、タイプ：核酸、らせん：一重、トポロジー：線状、および分子型：ｍＲＮＡ
【図８】図８は、ヤトロファ・クルカスクローンＪ−２アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子の翻訳されたペプチド配列である、配列番号６の部分配列を図解する。長さ：３０３、タイプ：タンパク質
【図９Ａ】図９Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは、ヤトロファ・クルカスアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼｍＲＮＡの部分配列（配列番号７）を図解する。長さ：６６３４タイプ：核酸らせん：一重トポロジー：線状分子型：Ｍｒｎａ
【図９Ｂ】図９Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは、ヤトロファ・クルカスアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼｍＲＮＡの部分配列（配列番号７）を図解する。長さ：６６３４タイプ：核酸らせん：一重トポロジー：線状分子型：Ｍｒｎａ
【図９Ｃ】図９Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは、ヤトロファ・クルカスアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼｍＲＮＡの部分配列（配列番号７）を図解する。長さ：６６３４タイプ：核酸らせん：一重トポロジー：線状分子型：Ｍｒｎａ
【図１０Ａ】図１０は、ヤトロファ・クルカスアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼｍＲＮＡの翻訳されたペプチド配列である、部分配列（配列番号８）を図解する。長さ：２２１１およびタイプ：タンパク質
【図１０Ｂ】図１０は、ヤトロファ・クルカスアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼｍＲＮＡの翻訳されたペプチド配列である、部分配列（配列番号８）を図解する。長さ：２２１１およびタイプ：タンパク質
【図１１】図１１Ａ〜Ｆは、ヤトロファ・クルカスのゲノムＤＮＡ配列である。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜Ｆは、ヤトロファ・クルカスのゲノムＤＮＡ配列である。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜Ｆは、ヤトロファ・クルカスのゲノムＤＮＡ配列である。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜Ｆは、ヤトロファ・クルカスのゲノムＤＮＡ配列である。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜Ｆは、ヤトロファ・クルカスのゲノムＤＮＡ配列である。
【図１１Ｅ】図１１Ａ〜Ｆは、ヤトロファ・クルカスのゲノムＤＮＡ配列である。
【図１１Ｆ】図１１Ａ〜Ｆは、ヤトロファ・クルカスのゲノムＤＮＡ配列である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
発明の詳細な説明
定義：
本明細書中で用いられる「遺伝子導入」は、外来性のＤＮＡを、生物体の細胞内に、通常、ベクターにより（しかし、必ずしもそうではない）取り込むことを意味する。
【００４１】
本明細書中で用いられる用語「形質転換された」は、構築物などの外来性ポリヌクレオチド分子が導入された細胞、組織、器官または生物体について述べている。好ましくは、導入されたポリヌクレオチドは、導入するポリヌクレオチド分子が引き続く子孫により受け継がれるように、レシピエントの細胞、組織、器官または生物体のゲノムＤＮＡに一体化される。
【００４２】
「遺伝子改変植物」は、１つまたはそれ以上の個別の遺伝子を植物にコピーおよび伝達してその遺伝的構成を変化させ、次いで植物に特定の特徴を取り込むかまたはそれから除去する技術により、遺伝子的に改変された植物である。
【００４３】
「形質転換植物」は、新しい機能を付与し得る新しい遺伝子（導入遺伝子）を有する遺伝子改変植物を意味する。例えば、形質転換植物は、新しい特徴（例えば、増加した油含有量）を有する植物を作製するための組換えＤＮＡ技術を用いて遺伝子操作された植物である。形質転換植物は、１つまたはそれ以上の遺伝子を、しばしば形質転換により植物ゲノムに加えることにより、産生される。
【００４４】
「形質転換」または「形質転換された」細胞または生物体には、細胞または生物体の子孫、およびこのような形質転換植物を親として交配に用いる育種プログラムから産生され、かつ外来性ポリヌクレオチド分子の存在から得られる改変表現型を示す子孫が挙げられる。
【００４５】
本明細書中で用いられる「アグロバクテリウムが媒介する形質転換」は、ＤＮＡを伝達して植物遺伝子工学の目的で利用される細胞を培養するためのアグロバクテリウムの使用である。
【００４６】
本明細書中で用いられる「増加した」または「変化した」または「高い」「油含有量」のヤトロファ・クルカス植物は、油含有量が増加した種子を有するものである。例えば、３０％を超える油含有量の種子を有するヤトロファ・クルカスは、「油含有量が高い」植物であると考えられる。
【００４７】
実施態様に従って、本発明は、ヤトロファ植物におけるＡＣＣアーゼ遺伝子の単離および同定を提供する。植物ＡＣＣアーゼをコードする遺伝子は、縮重プライマーストラテジーを用いて、ヤトロファ・クルカス・エルのｇＤＮＡまたはｃＤＮＡプールから同定および単離された。その部分配列は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されるような標準的方法で得られたが、当該方法は、本発明において本明細書中で参照として援用される。配列相同性は、他の公知のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼと比較された。得られた５’、中央および３’末端の部分をコードするＤＮＡフラグメントが、ＡＣＣアーゼ遺伝子を含む発現カセットを構築するのに用いられた。植物ＡＣＣアーゼ遺伝子の単離された全長コピーの存在は、部分配列解析により、または植物アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の発現により、検証された。
【００４８】
次いで、ｃＤＮＡまたは部分的ＤＮＡ配列を適切なプロモータと組み合わせて、組換え型発現カセットを形成する。次いで、この発現カセットを、植物細胞中で伝達、導入および発現させる。次いで、植物細胞の酵素活性または遺伝子発現を検出し、次いで、さらに、油含有量が高い植物を再現する。
【００４９】
植物ＡＣＣアーゼ遺伝子を得て増幅した後、次いで、これを、植物細胞中で機能的な適切なプロモータと併用して、発現カセットを形成することができる。本発明の発現カセットは、植物細胞中で機能的なプロモータに作動可能に連結した植物アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼまたはその機能的変異体をコードする遺伝子を含む。当該遺伝子は、植物細胞の油含有量を変化させることができる植物ＡＣＣアーゼをコードすることができる。本発明の発現カセットはまた、プロモータに作動可能に連結したＡＣＣアーゼ遺伝子またはその部分に相補的なアンチセンスＤＮＡ配列を含む。プロモータは、恒常的なプロモータまたは胚乳特異的プロモータなどの組織特異的プロモータから選択される。ＡＣＣアーゼ遺伝子のアンチセンスＤＮＡを有する発現カセットは、植物細胞中でＡＣＣアーゼの発現を減少させるのに用いることができる。
【００５０】
ほとんどの遺伝子は、プロモータとして知られるＤＮＡ配列の領域を有し、これは遺伝子発現を制御する。プロモータ領域は、代表的には、原核細胞および真核細胞の両方におけるコード配列からの上流の隣接するＤＮＡ配列において見出される。プロモータ配列は、下流の遺伝子配列の転写の制御を提供し、代表的には、約５０〜約２０００のヌクレオチド塩基対を含む。プロモータ配列はまた、遺伝子発現のレベルに影響し得るエンハンサー配列などの制御配列を含む。いくつかの単離されたプロモータ配列は、未変性または相同の遺伝子とは異なる遺伝子である異種性遺伝子の遺伝子発現を提供することができる。プロモータ配列はまた、強いまたは弱いまたは誘導性であることが知られている。強いプロモータは、高レベルの遺伝子発現を提供するが、弱いプロモータは、非常に低レベルの遺伝子発現を提供する。誘導性プロモータは、外因的に加えられた因子または発生上の刺激の環境に応答して、遺伝子発現の作動および停止を提供するプロモータである。プロモータはまた、組織特異的または発生上の制御を提供することができる。異種性遺伝子の強いプロモータである単離プロモータ配列は有利であるが、これは、形質転換細胞の容易な検出および選択を可能にするのに十分なレベルの遺伝子発現を提供し、かつ、所望の場合に高レベルの遺伝子発現を提供するからである。植物細胞で機能的な特異的プロモータには、３５Ｓカリフラワーモザイクウイルスプロモータ、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモータなどが挙げられる。発現に好ましいプロモータは、３５Ｓカリフラワーモザイクウイルスプロモータ、ならびにβ−ファゼオリン、ナピンおよびユビキチンなどのいくつかの胚乳特異的プロモータであるが、本発明は、このようなプロモータに限定されない。
【００５１】
ＡＣＣアーゼ遺伝子は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋに記載の標準的な方法により、プロモータと組み合わせることができる。簡便には、３５Ｓカリフラワーモザイクウイルスプロモータなどのプロモータを含むプラスミドは、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｅ  ５：３８７（１９８７））に記載のように構築することができるか、またはＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ（例、ｐＢＩ１２１またはｐＢＩ２２１）から得ることができる。代表的には、これらのプラスミドは、プロモータから下流の異なる制限酵素に特異性を有する複数のクローニング部位を提供するために構築される。植物ＡＣＣアーゼの遺伝子は、制限酵素を用いてプロモータから下流にサブクローン化されて、遺伝子が発現されることができるように遺伝子がプロモータに対して正しい方向で挿入されることを確実にすることができる。好ましいバージョンでは、ヤトロファ・クルカスＡＣＣアーゼは、３５ＳＣａＭＶ、あるいはｐＢＩ１２１またはｐＢＩ２２１などのプラスミド中のβ−ファゼオリンまたはナピンまたはユビキチンプロモータに作動可能に連結する。一旦植物ＡＣＣアーゼ遺伝子がプロモータおよびプラスミドに作動可能に連結すると、このように形成された発現カセットは、他のプラスミドまたはベクターにさらにサブクローン化することができる。
【００５２】
発現カセットは、必要に応じて、他のＤＮＡ配列を含むことができる。発現カセットは、さらに、プロモータに作動可能に連結した葉緑体輸送ペプチド配列および隣接する植物ＡＣＣアーゼ遺伝子を含むこともできる。発現カセットを植物細胞に導入する場合、発現カセットはまた、植物ＡＣＣアーゼ遺伝子の３’末端に連結した植物転写末端およびポリアデニル化シグナルおよび翻訳シグナルを含むこともできる。植物ＡＣＣアーゼに関与する生合成経路の１つの部位は葉緑体であるので、必要であれば、発現カセットを、葉緑体輸送ペプチドをコードするＤＮＡ配列と組み合わせることができる。葉緑体輸送ペプチドは、代表的には、長さが４０〜７０アミノ酸であり、翻訳後にタンパク質を葉緑体（ｃｈｏｌｏｒｏｐｌａｓｔ）に指向するよう機能する。輸送ペプチドは、葉緑体への移入の間または直後のいずれかに切断されて、成熟タンパク質を生じる。植物ＡＣＣアーゼをコードする遺伝子の完全コピーは、葉緑体輸送ペプチド配列を含み得る。この場合、外因的に含まれる葉緑体輸送ペプチド配列を発現カセットに組み合わせる必要はないかもしれない。
【００５３】
輸送ペプチド配列は、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ、フェリドキシン、葉緑素ａ／ｂ結合タンパク質などの小さなサブユニットである。あるいは、輸送ペプチドをコードするＤＮＡフラグメントは、輸送ペプチドの公知配列から全体的にまたは部分的にのいずれかで化学的に合成され得る。輸送ペプチドの供給源に関係なく、これは、翻訳開始コドン、および宿主植物の葉緑体により認識されかつその中で適切に機能するアミノ酸配列を含む。輸送ペプチドおよび植物ＡＣＣアーゼの間の接合部におけるアミノ酸配列は、実質的に切断に関連して、成熟タンパク質（例えば、酵素）を生じる。
【００５４】
本発明はまた、宿主細胞において植物ＡＣＣアーゼを産生する方法を提供する。当該方法は、植物ＡＣＣアーゼをコードする遺伝子を含む発現カセットを導入する工程を含む。発現カセットは、真核細胞または原核細胞のいずれかで機能的なプロモータを含むことができる。好ましくは、発現カセットは、組換えで産生されるタンパク質の産生に常套的に用いられる大腸菌などの原核細胞に導入される。発現カセットは、プロトプラスト形質転換、アグロバクテリウムが媒介する形質転換、微粒子銃、電気穿孔法などの標準的な方法により、単子葉植物または双子葉のいずれかに導入することができる。形質転換された組織または細胞は、選択可能なマーカー遺伝子の存在のために選択することができる。
【００５５】
植物ＡＣＣアーゼ遺伝子の発現または過剰発現をスクリーニングする方法もまた、本発明により提供される。ＡＣＣアーゼ遺伝子を含む発現カセットは、一旦形成されると、公知の発現ベクターにサブクローン化することができる。このスクリーニング方法は、発現ベクターを宿主細胞に導入する工程、および植物ＡＣＣアーゼ遺伝子の発現を検出および／または定量化する工程を含む。
【００５６】
植物ＡＣＣアーゼ遺伝子の一過性の発現は、形質転換細胞中で検出および定量化することができる。遺伝子発現は、クローンＡＣＣアーゼに特異的な抗体を用いる定量的ウエスタンブロットまたは酵素の比活性の増加を検出することにより、定量化することができる。植物ＡＣＣアーゼの過剰発現を提供する発現カセットは、単子葉植物および／または双子葉組織を形質転換して形質転換植物および種子を再現するのに用いることができる。
【００５７】
本発明はまた、植物中の油含有量を変化させる方法を提供する。当該方法は、植物細胞中で機能的なプロモータに作動可能に連結する植物ＡＣＣアーゼをコードする遺伝子を含む発現カセットを植物組織の細胞に導入する工程、および遺伝子を植物細胞の油含有量を変化させるのに有効な量で発現させる工程を含む。植物細胞における油含有量の変化には、植物細胞に通常存在する油含有量に対する全油含有量の変化を挙げることができる。植物細胞の油含有量を変化させるのに有効な量での遺伝子の発現は、当該遺伝子が不変のＡＣＣアーゼあるいは遺伝子の変異体または改変型のいずれをコードするかに依存する。不変の植物ＡＣＣアーゼの有効な量での発現は、当該植物細胞中で通常存在する油含有量に対して当該細胞中で少なくとも約１．２〜２倍の油含有量の変化を提供し得る量であり、好ましくは、ＡＣＣアーゼの量を、当該植物細胞中に存在する酵素の量に対して約２〜２０倍増加させる。酵素の改変型は、未変性の酵素のレベルに匹敵する量で、または当該酵素の改変型がより高い特異的活性を有する場合はより低いレベルで、発現し得る。
【００５８】
以下の実施例は、本発明の実施態様を説明する。以下の実施例に開示された技術は、本発明の実施にあたってより良く機能することが本発明者によって発見された技術を代表することが、当業者に理解されるであろう。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示された特定の実施態様に多くの改変をすることができ、かつ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく類似または同様の結果を得ることができることを理解すべきである。
【実施例】
【００５９】
実施例１：ヤトロファにおけるＡＣＣアーゼ遺伝子の単離および同定。
【００６０】
ヤトロファ・クルカスの成熟種子は、南インドのアーンドラ・プラデーシュ（Ａｎｄｈｒａ  Ｐｒａｄｅｓｈ）で得た。種子を、自然の野原で出芽させた。２〜３ヶ月の実生から非常に若い葉を収集した。材料を、使用するまで−７０℃で貯蔵した。上記葉材料由来のゲノムＤＮＡを、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎ  Ｅｌｕｔｅ（商標）Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ社、アメリカ合衆国）に提供された方法に従って抽出した。
実施例２：ＡＣＣアーゼをコードするｃＤＮＡクローンの形成。
（ａ）変性オリゴヌクレオチドプライマーの設計：
ＰＣＲによる縮重プライマーストラテジーを用いる、ヤトロファ・クルカス・エルからの細胞質ＡＣＣアーゼ遺伝子の増幅およびその部分配列を、本明細書中に示す。縮重度割合が低い複数のプライマー（特に３’末端および中間フラグメントにおける）を、トウモロコシ（ｇｉ１０４５３０４）、イネ（ジャポニカ栽培品種群）（ｇｉ３７５３３４６）、アルファルファ（ｇｉ４９５７２４）、シロイヌナズナ（ｇｉ５０１１５１）、アブラナ（ｇｉ  １２０５７０６８）、コムギ（ｇｉ：５１４３０５）およびダイズ（クローン５１３および１２２１）（ｇｉ１０６６８５６）のＡＣＣアーゼ遺伝子ファミリーの保存配列モチーフに基づいて設計した。配列は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗを用いて整列させた。２３の逆方向および順方向の両方の変性オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを設計し、ヤトロファ・クルカスのゲノムＤＮＡについて試験した。
【００６１】
６２５塩基対保存領域の増幅：ヤトロファＡＣＣアーゼ遺伝子を特徴付けするために、遺伝子の部分のＰＣＲによる増幅を、縮重ヌクレオチドプライマーを用いて行った。縮重プライマーＭＥ２３（５’−ＧＡＧＧＴＳＴＡＹＡＧＣＴＴＹＣＡＳＡＴＧＣ−３’順方向プライマー）およびＭＥ２５（５’−ＣＴＧＡＡＧＤＡＴＴＣＣＴＴＣＲＡＡＶＡＧ−３’逆方向プライマー）を用いて、約６２５塩基対の中間フラグメントを、それが真に保存モチーフであることを示すアルファルファ、シロイヌナズナおよびヤトロファ・クルカス（図１）のゲノムＤＮＡから増幅した。増幅は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（９６ウェル）システム中、９４℃で４５秒、５５℃で４５秒および７２℃で１分の３５サイクルで行った。最初の１０サイクルは、サイクル毎に１℃ずつ低下させる６５℃〜５５℃のＴｏｕｃｈ  Ｄｏｗｎプログラムを用い、残りの２５サイクルについては、５５℃のアニーリング温度を維持した。最終サイクルの後、増幅を７２℃で７分延長した。縮重プライマーＰＣＲ反応の産物を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に従ってゲル電気泳動（１％アガロース、作動緩衝液としてＴＡＥを用いた）に供し、長さ６２５塩基対のＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡ  Ｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲルから回収した。次いで、この産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ、アメリカ合衆国）にクローン化し、大腸菌ＤＨ５α（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に形質転換した。構築物を、ｐＧＥＭ：Ｊ１クローンと命名した。
（ｂ）ｐＧＥＭ：Ｊ１クローンの配列決定：陽性組換え型コロニーを単離し、プラスミドＤＮＡを調製した。配列決定を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを用い、Ｍ１３順方向および逆方向汎用プライマーを用いて行った。５９７塩基対配列決定の結果については、図２を参照されたい。
（ｃ）種々のＡＣＣアーゼ遺伝子ファミリーメンバー間での配列の類似性および比較：ヤトロファ・クルカス由来のＡＣＣアーゼ遺伝子の６２５塩基対保存モチーフを含むクローンｐＧＥＭ：Ｊ１のコーディングヌクレオチド配列を、ＧｅｎＢａｎｋ配列に対するＢＬＡＳＴｎ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）に供した。
【００６２】
Ｂｌａｓｔｎ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎデータベース）でのデータベース検索は、他のＡＣＣアーゼ遺伝子ファミリーと比較的高い類似性を示した。ダイズ（ｇｉ９９２９１６）との類似率は８４％であり、アルファルファ（ｇｉ４９５７２４）との類似率は８４％であり、インゲンマメ（ｇｉ７８３９２５１）との類似率は８４％であり、アブラヤシのマイクロサテライト（ｇｉ１２０５３７８７）との類似率は１００％であった。
（ｄ）ＡＣＣアーゼ遺伝子からの１．２５ｋｂ中間フラグメントの増幅：ヤトロファ・クルカスの保存配列モチーフ由来の５９７塩基対中間フラグメントの配列（図２）を用いて、５９７塩基対領域での遺伝子特異的順方向プライマー、および変性ヌクレオチドである３’末端からの逆方向プライマーを設計した。遺伝子特異的順方向プライマーＭＥ−５０  ５’ＧＴＣＴＣＡＧＡＴＧＡＴＣＴＡＧＡＡＧＧＴＧＴＡＴＣ  ３’および変性逆方向プライマーＭＥ−５９  ５’ＡＧＣＡＡＧＷＣＣＴＴＧＷＧＧＹＡＧＡＧＣＴＴＧ３’を、アルファルファ、シロイヌナズナおよびダイズの保存領域に基づいて３’領域で設計した。ＭＥ５０およびＭＥ５９での産物は、上述のように増幅されかつゲル溶出された１．３ｋｂフラグメントであった。ＰＣＲ産物を配列決定し、Ｊ−２と命名した（図３）。上記１．３ｋｂフラグメントの配列決定の結果に基づき、遺伝子特異的順方向（ＭＥ−７５：５’ＧＴＧＧＡＣＣＣＡＴＡＧＴＴＡＴＧＧＣＡＡＣＣ  ３’）および逆方向プライマー（ＭＥ−７６：５’ＡＧＡＡＡＧＣＴＴＣＡＴＣＡＴＴＣＣＣＣＣＡＡＧ  ３’）を、ＡＣＣアーゼ遺伝子の１．２５ｋｂフラグメントを３’末端に向かって増幅するように設計した。結果を表４に示す。増幅を、ＢｉｏＲａｄ  ｉ−Ｃｙｌｃｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（９６ウェル）システム内で、９５℃で４５秒、５４℃で４５秒、および７２℃で６分の３３サイクルで行った。最初の８サイクルは、サイクル毎に１℃ずつ低下させる６２℃〜５４℃のＴｏｕｃｈ  Ｄｏｗｎプログラムを用い、残りの２５サイクルについては、５４℃のアニーリング温度を維持した。最終サイクルの後、増幅を７２℃で２０分延長した。ＰＣＲ反応の産物を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に従ってゲル電気泳動（１％アガロース、作動緩衝液としてＴＡＥを用いた）に供し、長さ１．２５ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡ  Ｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲルから回収した。ＰＣＲ産物は、１．２５ｋｂフラグメントの存在を確認した（図４）。
【００６３】
本明細書中で開示されかつ特許請求された全ての組成物および方法は、本開示に照らして、過度の実験を行うことなく作製されかつ実施され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施態様の点から記載されているが、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物および／または方法ならびに方法の工程または工程の順番に改変が応用され得ることは、当業者に明らかとなろう。より詳細には、化学的または生理学的に関連する特定の試薬は、同じまたは類似の結果が達成されるであろう本明細書に記載の試薬で置き換えられ得ることが明らかとなろう。当業者に明らかな全てのこのような類似の置換および改変は、本発明の概念、範囲および趣旨の範囲内にあるとみなされる。確かに、当業者に理解される本発明を実施するために記載された態様の種々の改変は、特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。本明細書中で引用された全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【国際調査報告】
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