(57)【要約】単離単球由来幹細胞（ＭＤＳＣ）からの膵島様細胞の生成が提供される。ＭＤＳＣは、ＭＤＳＣを１つ以上の分化因子に接触させることによって、膵島細胞に分化させる場合がある。膵島細胞を含む組成物、およびそれらを使用する方法も提供される。一局面において、この分化因子は、抗ＣＤ４０抗体、上皮成長因子（ＥＧＦ）、エキセンディン‐４、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子‐１（ＩＧＦ１）、インスリン様成長因子‐２（ＩＧＦ２）、ＬＰＳ、ニコチンアミド、またはこれらの組み合わせであり得る。ＭＤＩは、以下の遺伝子のいずれかを発現し得る：インスリン、ＩＧＦ２、ソマトスタチン、ｎｇｎ３、ＰＤＸ１、ｉｓｌｅｔ１、グルコーストランスポーター２（Ｇｌｕｔ２）、およびこれらの組み合わせ。幹細胞は、ＣＤ１１７、ｃ‐ペプチド、ＤＰＰＡ５、ＨＥＳ‐１、ＯＣＴ‐４、ＳＳＥＡ４、またはこれらの組み合わせを発現し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＤＩを生成する方法であって、
（ａ）幹細胞を含む組成物を提供する工程と、
（ｂ）該幹細胞を少なくとも１つの分化因子に接触させる工程と、
を含み、
該分化因子が該幹細胞のＭＤＩへの分化を誘導する、
方法。
【請求項２】
前記幹細胞が被験体に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞が単球に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞がＭＤＳＣである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）前記細胞を低濃度のグルコースに接触させる工程と、
（ｂ）該細胞を高濃度のグルコースに接触させる工程と、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記低濃度のグルコースが２〜１５ｍＭである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記低濃度のグルコースが５ｍＭである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記高濃度のグルコースが５〜４０ｍＭである、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記高濃度のグルコースが２５ｍＭである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記被験体が１型または２型糖尿病のいずれかを有する、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
糖尿病を治療する方法であって、請求項２に記載のＭＤＩを、処置を必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項１３】
前記被験体が前記患者と同じ個体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
単離されたＭＤＩであって、該ＭＤＩがグルコースの存在下でインスリンを分泌する、ＭＤＩ。
【請求項１５】
前記ＭＤＩがＭＤＳＣに由来する、請求項１４に記載のＭＤＩ。
【請求項１６】
請求項１４に記載の複数のＭＤＩを含む組成物であって、該組成物がα細胞、β細胞、γ細胞、δ細胞、またはそれらの組み合わせを含む、組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法によって作製される、単離されたＭＤＩ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵島様細胞を生成する方法、膵島様細胞の組成物、および膵島様細胞を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、正常な栄養ホメオスタシスを維持する身体の必要性を満たすために必要とされる十分なレベルのインスリンホルモンを生成するための膵β細胞の不全または欠失を特徴とする疾患である。糖尿病には、１型（若年性）と２型（成人晩発性）の２つの形態がある。１型糖尿病は、身体自体の免疫系が人のβ細胞を誤って攻撃または破壊した際の膵β細胞の完全欠失に起因する。２型糖尿病の原因ははるかに複雑であり、不明な部分が多いが、疾患の結果は、β細胞が正常なホメオスタシスを維持するのに十分な量のインスリンを生成できない点で類似している。インスリンの欠失は、血中グルコースレベルの上昇をもたらし、最終的には早発性心血管疾患、脳卒中、および腎不全を引き起こす。現在のところ糖尿病の治癒方法は存在しないが、インスリンの毎日の注入が血中グルコースレベルの調節に有用である。これらの患者には頻繁なモニタリングが重要であるが、これは、血中グルコース濃度を可能な限り正常近くに維持している患者は、いずれも時間の経過とともに発現する傾向がある網膜症（失明に繋がる可能性のある目の小血管の疾患）および心臓疾患などの糖尿病の合併症の多くを著しく減少させることができるためである。
【０００３】
最近では、膵臓および島細胞の移植がある程度の成功を収めている。毎年１，３００人を超える患者が膵臓移植を受けており、その内の８０％を超える患者が糖尿病の症状を示さず、正常な血中グルコースレベルを維持するためのインスリン摂取を必要としていない。しかし、膵臓および島細胞移植の療法は、死体ドナーの入手可能性の点で制限がある。さらに、移植した膵臓または島細胞を身体が拒絶するのを防止するために、患者は残りの人生を通して強い免疫抑制剤を服用しなければならない。その一方で、免疫抑制剤は、患者を他の多数の疾患に罹患しやすくする。多くの病院では、患者が腎臓移植も同時に必要としない限り膵臓移植が行われていないが、これは、免疫抑制剤療法による感染症のリスクの方が、糖尿病自体よりも大きな健康への脅威となり得るためである。
【０００４】
近年、糖尿病に対する細胞置換療法の進歩と移植可能な島細胞の不足により、移植に使用できるとされる再生可能なインスリン産生細胞の新しい供給源を生成することに関心が集まってきている。過去数年における進歩は、幹細胞技術がβ細胞置換療法のベースとなり得ることを明確に示している。現在、β細胞の遺伝子操作によって、あるいは多様な幹細胞株または前駆細胞株を使用することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにてインスリン産生細胞を生成する手法がいくつか探求されている。現在の幹細胞研究の取組みは、治療用前駆細胞になり得る胚性幹細胞と組織特異的成体幹細胞とに分類されている。最近の胚性幹（ＥＳ）細胞による実験では、これらの高増殖性、多能性細胞が膵臓様β細胞に分化できることが明らかにされている。ＥＳ細胞の主な課題は、その多能性と、これらの細胞が移植されると腫瘍の形成を誘導し得るというリスクである。これを踏まえると、成体組織特異的幹細胞とそれらの子孫は、潜在的な治療用細胞として非常に魅力的となっている。
【０００５】
組織特異的幹細胞は、ＥＳ細胞に優る２つの明確な利点を有する。第一に、これらの細胞は、骨髄、末梢血、またはその他の組織など、より管理しやすい供給源から単離できることであり、第二に、これらの細胞は、制御された条件下で種々の細胞系列に分化する能力を示すことである。制御された分化によって膵臓インスリン産生細胞が生成される幹細胞療法は、糖尿病の新規の治療を提供するのに有益であると考えられる。したがって、当該技術分野では、成体幹細胞から分化できるヒト幹細胞の再生可能な供給源を開発することが必要とされている。これらの成体幹細胞は、ヒト膵島細胞を産生する療法で発生させることができる適切な集団から細胞型を発生させるために、比較的利用しやすいものでなければならない。自家幹細胞を使用することで、糖尿病の疾患を治療し、症状を改善する療法が提供されることになる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書では、膵島様細胞または単球由来島細胞（ＭＤＩ）を生成する方法が提供される。幹細胞は、幹細胞を少なくとも１つの分化因子に接触させることによって、ＭＤＩに分化するように誘導される場合がある。分化因子は、抗ＣＤ４０抗体、上皮成長因子（ＥＧＦ）、エキセンディン‐４、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子‐１（ＩＧＦ１）、インスリン様成長因子‐２（ＩＧＦ２）、ＬＰＳ、ニコチンアミド、またはこれらの組み合わせである場合がある。ＭＤＩは、以下の遺伝子のいずれを発現する場合がある：インスリン、ＩＧＦ２、ソマトスタチン、ｎｇｎ３、ＰＤＸ１、ｉｓｌｅｔ１、グルコーストランスポーター２（Ｇｌｕｔ２）、およびこれらの組み合わせ。幹細胞は、ＣＤ１１７、ｃ‐ペプチド、ＤＰＰＡ５、ＨＥＳ‐１、ＯＣＴ‐４、ＳＳＥＡ４、またはこれらの組み合わせを発現する場合がある。幹細胞は、成体幹細胞である場合がある。幹細胞は、末梢血単球に由来する場合がある。幹細胞は、Ｍｅｇａｃｅｌｌ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２でよい無血清培地中にある場合がある。幹細胞は、１型または２型糖尿病に罹患する患者から単離される場合がある。
【０００７】
ＭＤＩは、α、β、またはδ様細胞である場合がある。複数のＭＤＩは、α、β、またはδ様細胞、あるいはこれらの組み合わせである場合がある。ＭＤＩは、グルコース、トルブタミン、およびこれらの組み合わせなどのインスリン作用物質に反応してインスリンを分泌する場合がある。ＭＤＩを使用して、１型糖尿病、２型糖尿病、高血糖症、高脂血症、肥満、代謝症候群、および高血圧症などの膵臓関連障害を治療することができる。
【０００８】
本明細書ではまた、糖尿病を治療する方法であって、ＭＤＩを必要とする患者に投与することを含む場合がある、方法も提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
１．ＭＤＩの生成方法
本明細書では、ＭＤＩを生成する方法が提供される。この細胞は、膵臓α、β、またはδ様細胞、あるいはそれらの群から構成されてもよい。ＭＤＩは、単離単球由来幹細胞を分化因子に接触させることによって、生成される場合がある。分化因子は、抗ＣＤ４０抗体、ＥＧＦ、エキセンディン‐４、ＨＧＦ、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、リポ多糖類（ＬＰＳ）、ニコチンアミド、またはこれらの組み合わせである場合がある。分化因子への暴露は、幹細胞のＭＤＩへの分化をもたらす場合がある。ＭＤＩは、Ｍｅｇａｃｅｌｌ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２などの無血清培地で生成または成長させる場合がある。無血清培地は、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）またはヒトＡＢ血清などの血清を含まない場合がある。
【００１０】
ＭＤＩは、インスリン、ｃ‐ペプチド、ｉｓｌｅｔ１、ＩＧＦ２、ｎｇｎ３、ＰＤＸ１、Ｇｌｕｔ２などのβ細胞マーカー、ソマトスタチンなどのδ‐細胞マーカー、またはグルカゴンを含むがこれに限定されないα細胞マーカーを発現する場合がある。ＭＤＩは、グルコース、トルブタミン、またはその他のインスリン作用物質、またはインスリン拮抗物質、およびこれらの組み合わせに反応してインスリンを分泌する場合がある。
【００１１】
ａ．幹細胞
幹細胞は、単球から脱分化させる場合がある。単球は、ヒト末梢血に由来する場合がある。単球は、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ‐ＣＳＦ）、またはこれらの組み合わせとの接触によって脱分化させる場合がある。脱分化幹細胞は、ＣＤ１１７、ＤＰＰＡ５、ＨＥＳ‐１、ＯＣＴ‐４、ＳＳＥＡ４、またはこれらの組み合わせなどの幹細胞特異的マーカーを発現する場合がある。さらに、膵島様集塊は、インスリン、ｃ‐ペプチド、グルカゴン、およびこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、膵臓因子またはホルモンを分泌する場合もある。
【００１２】
ｂ．分化
幹細胞は、分化因子または１つ以上の因子の組み合わせに接触させることによって、分化させる場合がある。分化因子は、ＣＤ４０抗体、ＥＧＦ、エキセンディン‐４、ＨＧＦ、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＬＰＳ、ニコチンアミド、およびこれらの組み合わせである場合がある。ＣＤ４０抗体の濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ〜２μｇ／ｍＬの範囲である場合がある。ＥＧＦの濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの範囲である場合がある。エキセンディン‐４の濃度は、１０ｍＭ〜４０ｍＭの範囲である場合がある。ＨＧＦの濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの範囲である場合がある。ＩＧＦ１の濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの範囲である場合がある。ＩＧＦ２の濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの範囲である場合がある。ＬＰＳの濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲である場合がある。ニコチンアミドの濃度は、５ｍＭ〜２０ｍＭの範囲である場合がある。分化因子は、培養培地の存在下で細胞に提示される場合がある。培養培地は、ＬＤＭＥＭ（低グルコースＤＭＥＭ）、ＨＤＭＥＭ（高グルコースＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、またはＭｅｇａｃｅｌｌ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２である場合がある。培養培地には、血清または血清タンパク質を添加する場合がある。あるいは、細胞は、血清または血清タンパク質を加えていない培養培地で成長させる場合もある。分化培地は、グルコースを含む場合があり、これは濃度２〜１５ｍｇ／ｄＬまたは５〜８ｍｇ／ｄＬである場合がある。分化培地は、最適な分化のために３日ごとに交換される場合がある。
【００１３】
分化は、当該技術分野で既知の種々の方法で監視する場合がある。幹細胞と分化因子処理細胞との間のパラメータの変化は、処理した細胞が分化したことを示す場合がある。顕微鏡法を使用して、分化中の細胞の形態を直接監視する場合がある。例として、分化膵臓細胞は、細胞の集合体または集塊を形成する場合がある。この集合体／集塊は、わずか１０個の細胞を含む場合もあれば、あるいは数百個もの細胞を含む場合もある。集合した細胞は、膵臓培養物中で懸濁状態で、あるいは接着細胞として成長させる場合がある。
【００１４】
遺伝子発現の変化も膵臓分化を示す場合がある。膵臓特異的遺伝子の発現増加は、抗体で染色することによって、タンパク質のレベルで監視する場合がある。インスリン、Ｇｌｕｔ２、Ｉｇｆ２、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）、グルカゴン、ニューロジェニン３（ｎｇｎ３）、膵臓および十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）、ソマトスタチン、ｃ‐ペプチド、およびｉｓｌｅｔ‐１に対する抗体が使用される場合がある。細胞は、当該技術分野で周知の方法を使用して固定および免疫染色する場合がある。例えば、一次抗体は、直接検出のために蛍光団または発色団で標識する場合がある。あるいは、一次抗体は、蛍光団または発色団で標識された二次抗体、あるいは酵素と結合した二次抗体によって検出する場合もある。蛍光団は、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃｙ‐３、Ｃｙ‐５、Ｃｙ‐５．５、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５９４、ＱｕａｎｔｕｍＤｏｔ５２５、ＱｕａｎｔｕｍＤｏｔ５６５、またはＱｕａｎｔｕｍＤｏｔ６５５である場合がある。二次抗体に結合した酵素は、ＨＲＰ、β‐ガラクトシダーゼ、またはルシフェラーゼである場合がある。標識された細胞は、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、または共焦点顕微鏡下で検査する場合がある。細胞または細胞培地の蛍光発光または吸光度は、蛍光計または分光光度計で測定する場合がある。
【００１５】
遺伝子発現の変化は、ＲＴ‐ＰＣＲまたは定量リアルタイムＰＣＲを使用して、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のレベルで監視する場合もある。ＲＮＡは、当該技術分野で既知の方法を使用して細胞から単離する場合があり、当該技術分野で周知のＰＣＲ条件およびパラメータを使用して所望の遺伝子産物を増幅する場合がある。増幅する場合がある遺伝子産物には、インスリン、インスリン‐２、Ｇｌｕｔ２、Ｉｇｆ２、ＩＡＰＰ、グルカゴン、ｎｇｎ３、ＰＤＸ１、ソマトスタチン、ｉｐｆ１、およびｉｓｌｅｔ‐１が含まれる。遺伝子発現の相対レベルの変化は、標準的な方法を使用して判定する場合がある。α、β、γ、およびδ細胞特異的マーカーの発現は、単球由来幹細胞（ＭＤＳＣ）に由来する細胞の集合体または集塊であるＭＤＩが、４種類すべての型と主要な３つの型の膵臓細胞から構成されることを示す場合がある。
【００１６】
機能性単球由来膵島（ＭＤＩ）の形成は、ＭＤＳＣ由来ＭＤＩの分化中に、インスリンおよびｃ‐ペプチドなどの因子の合成および分泌を監視することによって判定する場合がある。高レベルのグルコースとの接触は、ＭＤＩを刺激してインスリンまたはｃ‐ペプチドを分泌させる場合がある。トルブタミドまたはその他のインスリン作用物質との接触は、ＭＤＩを刺激してさらに高いレベルのインスリンを分泌させる場合がある。インスリンまたはｃ‐ペプチドのレベルは、ＥＬＩＳＡプロトコルを使用して、種々の細胞の培養培地において測定する場合がある。その他の当該技術分野で既知の方法を使用して、分化細胞によるインスリンまたはｃ‐ペプチドの分泌を監視する場合もある。
【００１７】
ｃ．増殖
ＭＤＩは、５〜４０ｍｇ／ｄＬ、１０〜２５ｍｇ／ｄＬ、または１８〜２５ｍｇ／ｄＬの濃度である場合がある、グルコースを含む分化培地に接触させることによって、増殖が誘導される場合がある。増殖は、ＭＤＩをヨウ化プロピジウムまたはＫｉ‐６７で染色した後、場合によりフローサイトメトリーを行うことによって監視する場合がある。
【００１８】
２．ＭＤＩの使用方法
ＭＤＩは、疾患または障害の治療として、かかる疾患または障害によって減少または根絶した細胞集団を補充するために、あるいは損傷または欠失した細胞または組織を置換するために使用される場合がある。ＭＤＩは、自家移植で提供される場合もあれば、あるいは同種異系で適合する被験体に提供される場合もある。
【００１９】
真性糖尿病は、体内の特定の型の細胞の不足または事実上の非存在に関連する病状の例である。この疾患では、膵β細胞は欠失しているか、または不完全であるか、または欠損している。この病態は、ＭＤＩの挿入によって治療することができるか、あるいはその症状の内の少なくとも１つを改善することができる。ＭＤＩは、健康な患者、あるいは１型または２型糖尿病に罹患する患者から単離されたＭＤＳＣに由来する場合がある。１型真性糖尿病（若年発症糖尿病またはインスリン依存性真性糖尿病）および２型真性糖尿病（成人発症型糖尿病）はいずれも、ＭＤＩで治療する場合がある。ＭＤＩで治療する場合がある他の障害には、高血糖症、高脂血症、肥満、代謝症候群、および高血圧症が含まれる。
【００２０】
ＭＤＩは、細胞の移入、移植、または注入によって体内に挿入する場合がある。細胞は単一の細胞または細胞の集塊として導入する場合がある。膵臓細胞を移植する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、ヒトへの挿入に適した生存細胞、好ましくは膵島細胞を含有する移植可能な人工組織マトリクス構造について記載する、米国特許（第４，９９７，４４３号および第４，９０２，２９５号）を参照されたい。さらに、ＭＤＩは、後に細胞移植を受ける個体と同一の個体の末梢血単球に由来する場合があるため、免疫抑制剤の使用が必要でない場合もある。
【００２１】
３．ＭＤＩの組成物
本明細書では、ＭＤＩを含む組成物も提供される。組成物は、単一細胞、細胞の集合体、または細胞の組織様集塊を含む場合がある。組成物は、１０〜１０，０００、１０〜１０００、または１０〜１０００個のＭＤＩを含む場合がある。組成物は、α細胞５〜６０％、β細胞３０〜９５％、δ細胞１〜３０％、γ細胞０〜５％、またはこれらの組み合わせを含む場合もある。
【００２２】
本発明の適用範囲から逸脱することなく、上記の化合物、方法、よび産物に種々の変更を加えることができるため、上記の説明および下記の実施例に含まれるすべての内容は、例示として解釈され、限定的な意味で解釈されないことが意図される。
【００２３】
以下の実施例は、本発明を例示するものであって、制限するものではない。
【実施例】
【００２４】
（実施例１）
ＭＤＩの分化
単離末梢血単球をＭｅｇａｃｅｌｌ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（カタログ番号Ｍ４１９２、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）とＡＩＭ  Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の２：１混合物中にプレーティングし、３７°Ｃ、５％のＣＯ２で一晩培養した。培養培地に、４ｍＭのＬ‐グルタミンおよびペニシリン‐ストレプトマイシンを添加した。細胞は、ＦＡＬＣＯＮ真空ガスプラズマ処理プレート上にプレーティングした。２４時間後、培養培地を除去し、細胞を２ｍＭのＥＤＴＡを含有する１×ＨＢＳＳで３回緩徐に洗浄した。１０ｎｇ／ｍＬ白血球阻害因子（ＬＩＦ；カタログ番号ＬＩＦ１０１０、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）および２５ｎｇ／ｍＬマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ‐ＣＳＦ；カタログ番号ＧＦ０５３、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を含有する、Ｍｅｇａｃｅｌｌ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＬＤＭＥＭ（低グルコースＤＭＥＭ）またはＨＤＭＥＭ（高グルコースＤＭＥＭ）である、脱分化培地を添加した。３日後、培地を除去し、新鮮な脱分化培地と交換した。培養６日後、細胞は単球由来幹細胞（ＭＤＳＣ）に脱分化した。
【００２５】
ＭＤＳＣは、１×ＨＢＳＳで２回洗浄した。細胞に膵臓分化培地を添加し、それらを培養した。膵臓分化培地は、Ｌ‐グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンを添加したＭｅｇａｃｅｌｌ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２（またはＬＤＭＥＭまたはＨＤＭＥＭ）と、さらに１μｇ／ｍＬ  ＣＤ４０  抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号ＭＡＢ６３２１、クローン８２１１１）、１００ｎｇ／ｍＬ  ＬＰＳ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ；カタログ番号ＬＰＳ２５）、１×ＩＴＳ、１０ｍＭのニコチンアミド、１％のＮ２添加物、２５ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ；カタログ番号ＧＦ００１）、２０ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ；カタログ番号ＧＦ１１６）、２５ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ；カタログ番号ＧＦ００６）、２５ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ２（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ；カタログ番号ＧＦ００７）、および２０ｍＭのエキセンディン‐４（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｅ７１４４）とを含むものとした。
【００２６】
膵臓分化培地において、１８時間後に細胞の集合体を認めた（図１）。集合体の数とサイズは、その後数日にわたって増大した（図２）。膵島集合体または集塊は、種々の異なるサイズの細胞から構成され、これは１つの集合体または集塊につき総数が約１０個から数百個の細胞の範囲であった。集合体の数とサイズは、ＭＤＳＣの初期細胞密度により変動するものと思われた。典型的には、初期に高密度で播種した培養物は、初期低密度培養物からの培養物に比べて、より数が多くかつサイズが大きい集合体集塊を生成した。
【００２７】
培養６日後、集合体はプレートから分離し、浮遊集塊となった。４〜６日に始まり、インスリン、ｃ‐ペプチド、およびｇｌｕｔ２などの、膵臓因子またはホルモンが、まず膵臓分化条件下で培養したＭＤＳＣに由来するＭＤＩにおいて検出されたが、脱分化ＭＤＳＣ培養物においては膵臓因子またはホルモンは検出されなかった。この時点で、細胞を高グルコース条件で検証した。これらの実験のために、細胞は２５ｍＭのグルコースを含有する膵臓分化培地（標準膵臓分化培地は５ｍＭのグルコースを含有）に暴露した。集合体または集塊の数とサイズは、高グルコース条件存在下で増大した。さらに、いくつかの遺伝子の発現も変化した（実施例２を参照）。培養物は、２５ｍＭのグルコースを含有する膵臓分化培地を３日ごとに交換することによって、１ヶ月にわたり成長を維持することが認められた。
【００２８】
（実施例２）
膵臓遺伝子発現
ＭＤＳＣのＭＤＩへの分化を監視するために、リアルタイムＰＣＲによって膵臓特異的遺伝子の発現を分析した。以下の細胞特異的マーカーを検討した：β細胞特異的マーカーは、Ｇｌｕｔ２、ＩＡＰＰ、Ｉｇｆ２、インスリン、ｎｇｎ３、およびＰＤＸ１とし、α細胞特異的マーカーはグルカゴン、δ細胞特異的マーカーはソマトスタチンとした。ＭＤＳＣは、実施例１に記載の通り生成した。１組のＭＤＳＣを脱分化培地中に維持した。第２の組は、膵臓分化培地で６日間培養した後、高グルコース条件で検証した。
【００２９】
各時点で、細胞を収集し（１×１０５〜３×１０６細胞／ウェル）、Ｑｉａｇｅｎ  Ｒｎｅａｓｙ  Ｋｉｔ（カタログ番号７４１０３）を使用し、製造元の指示にしたがってＲＮＡを単離した。第一鎖ｃＤＮＡは、１ｎｇ〜５μｇのＲＮＡを１μＬの５００μｇ／ｍＬ  オリゴ（ｄＴ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号５５０６３）と、１μＬの１０ｍＭのｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号１８４２７‐０１３）と、１２μＬに等しくするための水とを混合することによって合成した。混合物を６５℃に５分間加熱し、氷上で冷却した。その後、４μＬの５×第一鎖緩衝液と、１μＬの０．１Ｍ  ＤＴＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号１８４２７‐０１３）と、４０ユニットのＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号１０７７７‐０１９）と、２００ユニットのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＮａｓｅＨ‐  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号１８０８０‐０９３）とを添加した。管を緩徐に混合し、５０℃にて６０分間インキュベートした。管を回転させ、７０℃にて１５分間加熱することによって、酵素を不活性化した。ｃＤＮＡの濃度は、分光光度計を使用して推定した。
【００３０】
リアルタイム（定量）ＰＣＲのために、１００ｎｇのｃＤＮＡを２００ｎＭの各プライマー、および０．５容量のＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ‐ＵＤＧ  ｗｉｔｈ  ＲＯＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号１１７４４）と混合した。サイクルパラメータは、５０℃にて２分間、９５℃にて数分間、その後６０℃にて３０秒間および９５℃にて３０秒間の４０サイクルとした。プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェアによってＴＭ＝６０℃にて設計した。プライマー配列およびサイズについては、表１を参照されたい。すべてのＰＣＲ反応は２回実行し、ΔＣＴ値に基づいて平均化した。相対的遺伝子発現を判定するために、対照（ＧＡＤＰＨおよびβ‐アクチン）のΔＣＴ値を膵臓遺伝子発現と比較した。相対的発現の割合を計算するために、以下の式を使用した。
Ｒ．Ｅ．（相対的発現）＝２ｎ‐（ΔＣＴ  遺伝子‐ΔＣＴ  ＧＡＰＤＨ）×１００
【００３１】
【表１】
2009536035.tif 000002
図３は、膵臓分化時における膵臓特異的遺伝子の発現の相対レベルを示す。インスリン、ｃ‐ペプチド、Ｉｇｆ２、ｉｓｌｅｔ１、およびＧｌｕｔ２の発現に増加が見られた。図４は、種々の条件下におけるｎｇｎ３、ＰＤＸ１、およびソマトスタチンの相対的遺伝子発現の割合を示す。
【００３２】
（実施例３）
インスリン分泌
分化ＭＤＩの機能性を評価するために、ＥＬＩＳＡキット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ；カタログ番号ＤＳＬ‐１０‐１６００）を使用して、種々の条件下でインスリン分泌を測定した。この「ワンステップ」サンドイッチ型イムノアッセイのために、標準物質、対照、および未知の血清試料をＨＲＰ標識抗インスリン抗体とともに、別の抗インスリン抗体でコーティングしたマイクロ滴定ウェル中でインキュベートした。インキュベーションと洗浄の後、ウェルを基質のテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とともにインキュベートした。次に酸性停止液を添加し、４５０および６２０ｎｍでの２波長吸光度測定によって、基質の酵素ターンオーバーの程度を判定した。測定した吸光度は、存在するインスリンの濃度に正比例した。１組のインスリン標準物質を使用して、インスリン濃度に対する吸光度の標準曲線をプロットし、これから未知の試料のインスリン濃度を計算した。
【００３３】
高グルコースでの検証の２４時間後、膵臓集合体が、培地中に２８．８μＬ  Ｕ／ｍＬの活性インスリンを合成した（図５）（一晩絶食後の正常成人被験体の範囲は５〜１０μＬ  Ｕ／ｍＬであり（基礎血漿インスリン）、摂食中では３０〜１５０μＬ  Ｕ／ｍＬの範囲であった）。培養下の時間が長くなると、島様細胞の集合体によってより多量のインスリンが合成および分泌された。
【００３４】
（実施例４）
ｃ‐ペプチド分泌
ＭＤＩの集合体の機能をさらに分析するために、ＥＬＩＳＡキット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ；カタログ番号ＤＳＬ‐１０‐７０００）を使用して、細胞から分泌されたｃ‐ペプチドのレベルを測定した。このアッセイでは、標準物質、対照、および未知の血清試料をＨＲＰ標識抗抗ｃ‐ペプチド抗体とともに、別の抗ｃ‐ペプチド抗体でコーティングしたマイクロ滴定ウェル中でインキュベートした。インキュベーションと洗浄の後、ウェルを基質のテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とともにインキュベートした。次に酸性停止液を添加し、４５０および６２０ｎｍでの２波長吸光度測定によって、基質の酵素ターンオーバーの程度を判定した。測定した吸光度は、存在するｃ‐ペプチドの濃度に正比例した。１組のｃ‐ペプチド標準物質を使用して、ｃ‐ペプチド濃度に対する吸光度の標準曲線をプロットし、これから未知の試料のｃ‐ペプチド濃度を計算した。図６は、分化集合体がｃ‐ペプチドを分泌するのに対し、脱分化ＭＤＳＣはｃ‐ペプチドを生成しないか、あるいは極めて低いレベルを生成することを示している。
【００３５】
（実施例５）
トルブタミド誘導時のインスリン分泌
これらの分化島様細胞の機能をさらに検討するために、トルブタミドおよびグルコースの効果を並行して試験した。１０μＭ  トルブタミドの存在下または非存在下で、グルコースの漸増濃度（５、６、７、１０、１２、１５、１８、２１、および２５ｍＭ）に、細胞をそれぞれ１２分間暴露した。インスリンの分泌は、インスリンＥＬＩＳＡキット（実施例３を参照）を使用して分析した。これらの実験のために、膵臓集塊を収集し、５ｍＭのグルコースを含有するＫｒｅｂｓ‐ｒｉｎｇｅｒ重炭酸緩衝液２ｍＬを含む２４ウェルフォーマット中にプレーティングした。図７は、トルブタミドが、これらの膵島集塊によるインスリン分泌を刺激したことを示している。さらにこれらの集塊は、グルコース濃度の増加に反応した。これらの集塊は、１４０〜２７０ｎｇ／ｍＬの範囲の生理的に適切なレベルのインスリンを生成した。別のインスリン作用物質を使用しても類似する結果が示されたが、インスリン拮抗物質の添加は一般的にインスリン分泌の減少をもたらした。
【００３６】
（実施例６）
単球由来島細胞が増殖の増加を示す
以下では、単球由来島細胞（ＭＤＩ）が、膵臓培地および高グルコースレベル（２５ｍＭ）に反応して増殖の増加を示すことを明らかにする。ＭＤＳＣおよびＭＤＩの増殖をアッセイするために、細胞増殖と厳密に関連するマーカーであるＫｉ‐６７の発現をアッセイした。間期の間、この抗原は核内のみで検出できるが、有糸分裂時には、タンパク質のほとんどが染色体の表面に移動される。Ｋｉ‐６７タンパク質は、細胞周期のすべての活動期（Ｇ（１）、Ｓ、Ｇ（２）、および有糸分裂）に含まれるが、静止細胞（Ｇ（０））には含まれないことから、Ｋｉ‐６７タンパク質は、所定の細胞集団のいわゆる増殖分画を判定するのに優れたマーカーとなる。
【００３７】
図８には、Ｋｉ‐６７によって測定した、高グルコースのＭＤＩ増殖への影響を示す。この分析のために、フローサイトメトリーを使用して、２日目から１２日目までのＭＤＳＣ培養物において、Ｋｉ‐６７陽性に染色された細胞の割合を計算した。この実験中、ＭＤＳＣは、Ｍ‐ＣＳＦおよびＬＩＦを含有する脱分化培地で６日間培養した。６日後、ＭＤＳＣを低グルコース（５ｍＭ）を含有する膵臓培地に移した。さらに６日後、培養物を高グルコース（２５ｍＭ）を含有する膵臓培地に移した。６日目まで増加する、比較的低レベルの増殖が認められた。最初の６日間、ＭＤＳＣは分化期間を経て、典型的には低レベルの増殖を示した。膵臓培地で処理してからは（７〜１２日目）、増殖は極めて低レベルであった。この期間中、ＭＤＳＣは、いくつかの形態変化を示し、繊維芽細胞状態からより神経系の外観へと推移した。さらに、細胞は集合体を形成し、最終的には浮遊集塊を形成した。しかし１２日目に多量のグルコースを添加した後、ＭＤＩは、全体の細胞増殖の劇的な増加を示した。
【００３８】
この影響は以下の表２で詳細に説明されており、これはフローサイトメトリー分析でヨウ化プロピジウム（ＰＰＩ）レベルにより測定した、２、６、８、１２および１７日目のＳ期、Ｇ０／Ｇ１期、およびＧ２／Ｍ期の細胞の割合を示している。より高速の増殖は、Ｓ期における細胞のより高い割合によって示される。
【００３９】
【表２】
2009536035.tif 000003
上記の結果は、高レベルのグルコースを含む膵臓培地がＭＤＩの増殖を増加させることを示している。
【００４０】
（実施例７）
高グルコースレベルが単球由来島細胞集合体の数を増加させる
以下では、高グルコースレベルがＭＤＩ集合体の数を増加させることを明らかにする。ＭＤＳＣを、無血清条件下でＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で６日間培養した後、５ｍＭのグルコースを含有する膵臓培地で培養した。膵臓集合体は膵臓培地中３日後に小型の浮遊集塊を形成した。培養物は、低グルコース条件（５ｍＭ）下で、６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）において１ウェル当たり約２００個の集塊を生成した。しかし、ＭＤＩを高グルコース（２５ｍＭ）で培養した場合、６ウェルプレートにおいて１ウェル当たり約６００個の集塊が生成された。これらの研究では、１ウェル当たり２０×１０６個のＰＢＭＣをプレーティングした。
【００４１】
図９はこれらの実験の結果を示しており、これは培養下で生成されたＭＤＩの数が、グルコースレベルにより変動することを示している。６ウェルディッシュフォーマットで成長したＭＤＩの数を計数した。数種類の培養したＭＤＩを膵臓分化培地における低グルコース濃度および高グルコース濃度の両方で計数したところ、高グルコース条件での処理後（２１日目）であり低グルコースでの処理前に集塊総数の増加が認められた。上記の結果は、高レベルのグルコースを含む膵臓培地がＭＤＩ集合体の数を増加させることを示している。
【００４２】
（実施例８）
高グルコースレベルが単球由来島細胞集塊のサイズを増大させる
以下では、高グルコースレベルがＭＤＩ集塊のサイズを増大させることを明らかにする。初期脱分化のために、ＭＤＳＣを、無血清条件下で、ＬＩＦおよびＭ‐ＣＳＦを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にて６日間培養した。６日後、ＭＤＳＣを５ｍＭのグルコースを含有する膵臓培地で処理した。この期間に膵臓集合体の形成が認められた。低グルコースを含む膵臓培地で継続して細胞を処理すると、最終的には浮遊集塊が産生された。低グルコース膵臓培地中６日後、ＭＤＩを低または高グルコース（それぞれ５ｍＭまたは２５ｍＭ）で処理した。これらの条件下では、培養下のＭＤＩのサイズおよび数の増大が認められた。これらの実験の結果は図１０に示されており、これは種々の段階（１０日目、１４日目、２１日目、および２６日目）でのＭＤＩ集塊の直径を示している。
【００４３】
表３は、５．１スコープイメージングソフトウェアを搭載したＬｅｉｃａ  ＤＭｉｒｅ２顕微鏡を使用して、ＭＤＩのサイズをミクロンで示している。６種類のＭＤＩ培養物の複数の試料を測定し、サイズの平均値を計算し、プロットした。
【００４４】
【表３】
2009536035.tif 000004
上記の結果は、膵臓培地中の高レベルのグルコースがＭＤＩのサイズと数を増大させることを示している。
【００４５】
（実施例９）
単球由来島細胞がインスリンおよびグルカゴン発現の増加を示す
以下では、高グルコースレベルの膵臓培地を使用するＭＤＳＣに由来するＭＤＩが、増殖速度の増加に関連して、内分泌特異的マーカーを発現することを明らかにする。これらの実験のために、インスリン、ｃ‐ペプチド、およびＰｄｘ１を含むβ細胞に対して特異的な抗体、およびα細胞（グルカゴン）に対して特異的な抗体を使用した免疫蛍光法によって、内分泌特異的マーカーの発現を検討した。ＭＤＩにおけるこれらの因子の発現プロファイルが種々の段階で認められた。
【００４６】
図１１は、２１日目のＭＤＩにおけるインスリンおよびグルカゴン発現を示している。インスリン発現は、２１日目のＭＤＩ集塊において検出された（Ａ〜Ｃ）。小集塊（Ａ）および大集塊（Ｂ）内の細胞の約７０％が、インスリンを発現した。種々のＭＤＩ培養物に免疫蛍光発光を使用すると、インスリンが７０％を超える細胞において検出された（Ｃ）。またＭＤＩは、サイトスピンで処理した後、グルカゴンに対する抗体で染色も行った（Ｄ）。ＭＤＩ培養物内のインスリンおよびグルカゴン陽性細胞は、それぞれβ細胞およびα細胞の存在を示した。
【００４７】
図１２は、２１日目のＭＤＩにおけるｃ‐ペプチド（Ａ）およびＰｄｘ‐１（Ｂ）発現を示しており、β細胞の存在が示唆されている。ＭＤＩは、培養２１日後にｃ‐ペプチドおよびＰｄｘ１で染色し、サイトスピンを行った。
【００４８】
上記の結果は、ＭＤＩが内分泌特異的マーカーを発現し、主要膵臓細胞型（α、β、およびδ）から構成されることを明らかにしている。リアルタイムＰＣＲは、γ細胞またはＰＰ細胞として知られる、膵臓前駆体に対する既知のマーカーであるｎｇｎ３が発現されたことを示した。ＭＤＩの組成は、およそβ細胞６０％超、α細胞１０〜２５％、およびδ細胞１〜５％であった。ＭＤＩは、ヒトの膵島で見られるものと類似する細胞組成を示した。
【００４９】
さらに、ＭＤＩは、高グルコース条件での培養時に増殖速度が上昇する。この増殖の増加は、ＭＤＩ培養物内の新しい島前駆体の形成に関する、ｎｇｎ３、ｐｄｘ１、およびソマトスタチンバイオマーカーの発現の増加と相関する。
【００５０】
（実施例１０）
単球由来島細胞は糖尿病被験体の単球由来幹細胞から生成できる
以下では、ＭＤＩが糖尿病被験体のＭＤＳＣから得られることを明らかにする。１型および２型糖尿病被験体からＭＤＳＣおよびＭＤＩを生成する能力を試験するために、糖尿病に罹患する被験体から末梢血単球（ＰＢＭＣ）を単離し、脱分化培地を使用してＭＤＳＣを産生した。糖尿病に罹患する被験体から得たＭＤＳＣから機能性ＭＤＩを生成できるかどうかを判定するために、これらのＭＤＳＣを膵臓分化条件下で培養した。
【００５１】
ＰＢＭＣは、糖尿病に罹患する被験体１４例から単離した。これらの被験体は、インスリン依存性１型または２型糖尿病と診断された。これらの被験体それぞれに複数回の採血を行い、それぞれの採血は少なくとも２週間の間隔を空けた。これにより、再現性を確実にするための２回分の試料を得た。
【００５２】
前述の膵島を得るための方法を使用して、ＭＤＳＣを単離、生成し、培養下で最長３０日間監視した。ｃ‐ペプチドレベルを監視するために、ｃ‐ペプチドＥＬＩＳＡ（ＤＳＬ）とウェスタンブロット分析を行った。各試料に免疫組織化学分析およびＰＣＲ分析を行い、島形成の過程においていくつかの膵臓および増殖マーカーの発現を検査した。Ｌｕｍｉｎｅｘを使用して、各被験体の血漿中のインスリン、ｃ‐ペプチド、およびグルカゴンのレベルを検査した。
【００５３】
以下の表４には、糖尿病に罹患する被験体からＭＤＳＣおよびＭＤＩを生成した結果をまとめる。
【００５４】
【表４】
2009536035.tif 000005
（＋）は、典型的には集塊当たり５０〜１００個の細胞からなる比較的小さなＭＤＩの形成を示し、
（＋＋）は、高グルコース条件での処理後における、典型的には集塊当たり２００個を超える細胞からなる比較的大きなＭＤＩの形成を示す。
【００５５】
さらに、製造元のプロトコルにしたがってＬｕｍｉｎｅｘアッセイ（Ｌｉｎｃｏ）を行うことにより、糖尿病被験体から採取した血漿中のインスリン、グルカゴン、およびｇｌｐ‐１のレベルを測定した。これにより、これらの特定のホルモンのついてのベースラインレベルが得られた。各アッセイに血漿２５μＬを使用し、より正確で信頼できるデータを得るために、すべての試料を２回アッセイした。
【００５６】
【表５】
2009536035.tif 000006
図１３は、１型被験体からのＭＤＩの生成を示している。まず、１型糖尿病に罹患する被験体から採取したＰＢＭＣから、ＭＳＤＣを生成した。脱分化培地中６日後、５ｍＭのグルコースを含有する膵臓分化培地でＭＤＳＣを処理した。ＭＤＳＣはＭＤＩを形成した（Ａ）。膵臓培地中６日後、ＭＤＩ集合体は浮遊集塊を形成した（Ｂ）。さらにＭＤＩ培養物を高グルコース（２５ｍＭ）を含有する膵臓培地で処理すると、ＭＤＩのサイズおよび数が増大した（ＣおよびＤ）。
【００５７】
上記の結果は、ＭＤＩが糖尿病に罹患する被験体から単離したＭＤＳＣから形成できることを明らかにしている。
【００５８】
（実施例１１）
糖尿病被験体から生成するＭＤＩがα細胞およびβ細胞マーカーを発現する
以下では、１型または２型糖尿病に罹患する被験体から単離されたＭＤＳＣから生成するＭＤＩが、αおよびβ細胞マーカーを発現することを明らかにする。１型および２型糖尿病に罹患する被験体から生成したＭＤＩの機能性を検討するために、β細胞マーカー（ｃ‐ペプチドおよびＰｄｘ１）およびα細胞マーカー（グルカゴン）に特異的な抗体による免疫蛍光染色を行った。
【００５９】
図１４は、糖尿病に罹患する被験体から得たＭＤＩが、β細胞マーカー（ｃ‐ペプチドおよびＰｄｘ１）およびα細胞マーカー（グルカゴン）を発現したことを示している。免疫染色の前に、ＭＤＩにサイトスピンを行った。ｃ‐ペプチドおよびＰｄｘ１は、１型（Ａ、Ｃ）および２型（Ｄ、Ｆ）糖尿病の両方の約７０％の細胞で検出された。グルカゴン染色は、１型（Ｂ）および２型（Ｅ）の細胞の約３０％で認められた。
【００６０】
αおよびβ細胞マーカーを発現するだけでなく、糖尿病に罹患する被験体から得たＭＤＩは、インスリンを分泌する。これは、被験体の血液と、ＭＤＩ成長中に収集した上澄みとにＥＬＩＳＡおよびＬｕｍｉｎｅｘアッセイを行うことによって明らかにされた。ＥＬＩＳＡアッセイは、標準操作手順にしたがい、ＤＳＬまたはＭｅｃｏｄｉａキットのいずれかを使用して行った。Ｌｕｍｉｎｅｘは、インスリン、ｃ‐ペプチド、およびグルカゴンを含むＬｉｎｃｏ糖尿病キットを使用して行った。各試料において、Ｌｕｍｉｎｅｘを３回行い、ブランクおよび標準物質対照と比較して分析した。
【００６１】
図１５はこれらの実験の結果を示している。ＥＬＩＳＡ分析では、糖尿病に罹患する被験体から得たＭＤＩが、グルコースに反応する形でインスリン（図１５）およびｃ‐ペプチド（図示なし）を合成および分泌することが明らかになった。ＭＤＩを、高グルコースを含有する膵臓分化培地で１５〜４０日間培養し、上澄み１ｍＬを収集し、３日おきに交換した。上澄み５０μＬをＥＬＩＳＡアッセイに使用し、培地ブランクおよび既知濃度の標準物質と比較した。ＭＤＩからのインスリン放出の増加は、２．５（１５日目）〜４ｎｇ／ｍＬ（３５日目）の範囲であった。
【００６２】
表６もまた、１型糖尿病に罹患する被験体から得たＭＤＩによるインスリン分泌を示している。ＥＬＩＳＡインスリンキット（ＤＳＬ）を使用して、１５〜４０日目に、ＭＤＩから分泌されたインスリンの量を測定した。採取時の被験体の血漿中のインスリンレベルも検査した。
【００６３】
【表６】
2009536035.tif 000007
上記の結果は、ＭＤＳＣおよびＭＤＩが１型（７例）または２型（７例）糖尿病に罹患する被験体から生成できることを明らかにしている。これらのＭＤＩは、内分泌特異的マーカーを発現し、インスリンおよびｃ‐ペプチドを合成および分泌することができる。ＥＬＩＳＡおよびＬｕｍｉｎｅｘ分析では、糖尿病に罹患する被験体から得たＭＤＩが、グルコースに反応する形でインスリンおよびｃ‐ペプチドを合成および分泌する能力を有することが明らかになった。
【００６４】
（実施例１２）
ヒト単球由来島細胞は糖尿病マウスを治療できる
以下では、ヒト被験体から単離したＭＤＳＣに由来するＭＤＩが、マウスにおける糖尿病を治療できることを明らかにする。Ｉｎ  ｖｉｖｏにて生成したインスリン産生細胞が高血糖症を回復に向かわせる能力を検討するために、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスモデルを使用した。
【００６５】
０．１  Ｍクエン酸塩緩衝剤に溶解したばかりのストレプトゾトシン（ＳＴＺ）４０ｍｇ／体重ｋｇを３回注入することによって、生後８〜１０週の雄ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に高血糖症を誘発した。ＳＴＺ注入後３〜５日の間に安定した高血糖症が発症し、３００〜６００ｍｇ／ｄＬの血中グルコースレベルをもたらした。グルコメーターを使用して、尾静脈血中のグルコースレベルを測定した。安定した高血糖症が確立されてから４８時間後に、マウスに細胞または緩衝賦形剤を移植した。
【００６６】
マウスの右腎皮膜下空間に、約５００個のインスリン産生集塊（または約１×１０６個の細胞を含む懸濁液）またはヒト被験体由来の５×１０６個のＭＤＳＣを移植した。移植後６〜１２週間、２日おきに血中グルコースを監視した。移植片を片側腎摘出術によって摘出し、正常血糖への逆転を試験し、またグルコースモニタリングを継続した。実験の最後に、インスリンおよびｃ‐ペプチド分析のため、マウスから血清を採取した。ＥＬＩＳＡおよびＬｕｍｉｎｅｘアッセイを使用して、インスリンおよびｃ‐ペプチドレベルを監視した。マウス２０〜４０匹の群に同時試験を行った。
【００６７】
Ａ〜Ｄ群を以下に記載の通りに処置した（マウス合計２４匹）。
【００６８】
（Ａ）成熟ＭＤＳＣを移植して３〜１２週間監視し、移植片を摘出した後、さらに２週間のグルコースモニタリングを継続した。
【００６９】
（Ｂ）５００個の島集塊（初期）（高グルコース条件下で３〜６日間培養）（１５日目すなわち「１５日目」のＭＤＩ）を移植して３〜１２週間監視し、移植片を摘出した後、さらに２週間のグルコースモニタリングを継続した。１５日目ＭＤＩは高グルコース条件に３日間暴露されており、ＰＤＸ１、ソマトスタチン、およびｎｇｎ３発現の増加を示した。１５日目ＭＤＩは低レベルのインスリンも発現した。集塊の増殖速度も上昇した。１５日目ＭＤＩのサイズは１００〜３００ミクロンであった。さらに、６ウェルプレートの１ウェル中の１５日目ＭＤＩの総数は、１００〜５００集塊であった。
【００７０】
（Ｃ）５００個の島集塊（後期）（高グルコース条件下で７〜１２日間培養）（すなわち、２３日目ＭＤＩ）を移植して３〜１２週間監視し、移植片を摘出した後、さらに２週間のグルコースモニタリングを継続した。２３日目ＭＤＩは高グルコース条件に１１日間暴露されており、６ウェルプレートのウェル当たりのインスリンレベルの増加（２〜８ｎｇ／ｍＬ）を示した。免疫蛍光によって、２３日目ＭＤＩは集塊内でインスリン、グルカゴン、およびソマトスタチンの発現を示した。２３日目ＭＤＩの増殖速度は、１５日目ＭＤＩに比べて比較的不変であった。２３日目ＭＤＩのサイズは２００〜１０００ミクロンであった。６ウェルプレートの１ウェル中の２３日目ＭＤＩの総数は２００〜１０００集塊であった。
【００７１】
（Ｄ）Ｃａ２（賦形剤対照）注入を伴わない、ｋｒｅｂｓ‐ｒｉｎｇｅｒ重炭酸緩衝食塩液の偽移植片を６週間監視し、移植片を摘出した後、さらに２週間のグルコースモニタリングを継続した。
【００７２】
Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋから入手した健常人ドナーの軟膜から、標準操作手順書にしたがってＭＤＳＣを生成した。これらの試料は、発送前に血液センターによって選別された。試料は、通常のリンパ球分離方法によって処理し、この方法では、単核分画を収集し、洗浄してＶｉ‐ｃｅｌｌ粒子計数器を使用して先述のように計数した。ＭＤＳＣは上述の通りにＰＢＭＣから調製した。
【００７３】
次いで、単核分画から収集したＰＢＭＣを培地に再懸濁させ、処理した組織培養ディッシュ上に播種した。次に細胞を３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートした。ＭＤＳＣが完全に発達したら、サブセットを回収し、対照注入の準備を行った。
【００７４】
ＭＤＩを生成するために、ＭＤＳＣを脱分化培地で６日間さらに成長させた。その後、ＭＤＳＣを洗浄し、低グルコース（５ｍＭ）を含有する膵臓培地を６日間添加した。次に、高グルコース（２５ｍＭ）を含有する膵臓培地で培養物を処理した。その後、ＭＤＩを３７℃、５％のＣＯ２で、３日間または１１日間インキュベートした後、回収した。ＭＤＩは、ファルコン管に入れた後、５００ｒｐｍにて５分間遠心分離を行って回収した。次いで、培地を除去し、膵臓培地と交換した。細胞は注入まで３７℃にて保管した。
【００７５】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの注入前に、ＭＤＩを５００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、新鮮な膵臓培地で洗浄した。その後、細胞を再び前述の通りに遠心分離し、膵臓培地５０μＬ中に再懸濁させた。次に、細胞を小型ゲージ針に収集し、腎臓から腎臓被膜内に注入した。すべてのマウスの外科処置は、承認された動物プロトコルにしたがって無菌条件下で行った。
【００７６】
マウス腎臓被膜内への注入前に、フローサイトメトリー、免疫組織化学、およびリアルタイムＰＣＲによって、ＭＤＳＣおよび島様集塊を特徴付けた。ＭＤＳＣの表現型は、インスリン、ｃ‐ペプチド、ソマトスタチン、およびグルカゴンを含む内分泌特異的マーカーを使用することによって判定した。ＭＤＩの機能性を試験するために、免疫組織化学およびリアルタイムＰＣＲの両方でインスリン、ｃ‐ペプチド、グルカゴン、およびソマトスタチンの発現を検査した。
【００７７】
ＰＣＲによる特徴付けのために、ＭＤＳＣおよびＭＤＩの両方から全ＲＮＡを抽出し、標準プロトコルを使用してｃＤＮＡを合成した。いくつかの膵臓遺伝子の相対的発現を判定するために、Ｓｙｂｒ  ｇｒｅｅｎおよび／またはＴａｑｍａｎ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲアッセイを使用した。すべての試料をＧＡＤＰＨおよびＢアクチン標準物質と比較して、相対的遺伝子発現を判定した。
【００７８】
ＭＤＳＣ対照細胞、食塩水対照、あるいは１５日目または２３日目ＭＤＩをＳＴＺ誘発高血糖ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの腎臓被膜内に注入した後、血中グルコースレベルを６０日にわたって監視した。早期ＭＤＩ（１５日目）の血中グルコースレベルを下げる能力を後期ＭＤＩ（２３日目）と比較した。
【００７９】
図１６はこれらの実験の結果を示している。野生型マウスの血中グルコースレベルは約１５０〜２００ｍｇ／ｄＬであるのに対し、ＳＴＺ誘発ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの血中グルコースレベルは約６００ｍｇ／ｄＬまで上昇した。１５日目ＭＤＩを注入したＳＴＺ誘発高血糖ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、野生型に近い血中グルコースレベルを示し、２３日目ＭＤＩを注入したマウスも同様であった。但し、２３日目ＭＤＩを注入したマウスは、６〜７週後に血中グルコースレベルの上昇を示した。
【００８０】
表７もまた、野生型、および食塩水対照、ＭＤＳＣ、あるいは１５日目または２３日目ＭＤＩを注入したＳＴＺ誘発ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける血中グルコースレベルの測定結果を示している。
【００８１】
【表７】
2009536035.tif 000008
１５日目ＭＤＩを移植したＳＴＺ誘発高血糖ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの体重も７３日間検査し、野生型、および食塩水対照、ＭＤＳＣ、または１５日目ＭＤＩのいずれか注入したＳＴＺ誘発高血糖ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスと比較した。これらの実験の結果は、図１７および表８に示される。野生型マウスの体重は、２４グラムから２８グラムに徐々に増加した。ＳＴＺ誘発マウスは、２４グラムから２２グラムへと減少を示した。１５日目ＭＤＩを注入したマウスは、移植後２１日目から、全体重の増加を示した。しかしＭＤＳＣを注入したマウスの体重は増加せず、経時的にＳｔｚ誘発のレベルまで減少した。
【００８２】
【表８】
2009536035.tif 000009
１５日目ＭＤＩを移植したＳＴＺ誘発高血糖ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて、α細胞（グルカゴン）およびβ細胞（インスリン）マーカー発現も検査した。１５日目ＭＤＩを注入したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの腎臓を注入後１時間以内に収集し、１０％のホルマリンで一晩固定した後、パラプラスト内で処理した。次に組織を切断して、インスリンおよびグルカゴンに対する抗体で染色した。
【００８３】
図１８はこれらの実験の結果を示している。インスリン（Ａ、Ｂ）およびグルカゴン（Ｃ、Ｄ）染色が、腎臓被膜下に注入されたＭＤＩにおいて認められ、ＭＤＩがαおよびβ細胞を共に含むことが示された。
【００８４】
αおよびβ細胞マーカーの発現は、上述のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスからの血漿においても分析された。血漿は、未処理対照マウス、およびＭＤＳＣまたはＭＤＩを注入したＳＴＺ誘発高血糖ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスから採取した。これらの実験の結果を表９に示す。マウス１３４および１４５では、ヒトグルカゴンレベルの上昇が認められた。両マウスにはＭＤＩが注入されていた。マウス１３４には初期島細胞が、マウス１４５は後期島細胞が注入されていた。両マウスは血中グルコースレベルの減少を示した。未処理またはＭＤＳＣ注入マウスには、グルカゴンレベルの変化が認められなかった。
【００８５】
【表９】
2009536035.tif 000010
上述の実験は、ＭＤＳＣが血中グルコースレベルに作用しないことを明らかにしている。さらに、ＳＴＺ誘発ＮＯＤ／ＳＣＩＤ高血糖マウスに注入された１５日目ＭＤＩは、血中グルコースレベルを長期間にわたり正常に近いレベルに低下させ、体重を正常範囲に回復することができる。２３日目ＭＤＩも、ＳＴＺ誘発マウスにおける５００ｍｇ／ｄＬを超えるレベルとは対照的に、血中グルコースレベルを３００ｍｇ／ｄＬまで低下させた。但し、２３日目ＭＤＩは６週間のみ有効であり、その後マウスは糖尿病状態に戻った。
【００８６】
上記の実験は、初期（１５日目）ＭＤＩが腎臓被膜内で増殖または再生できることに矛盾していないが、より最終分化した後期（２３日目）ＭＤＩの増殖は限られていた。さらに、ヒトグルカゴン分泌の増加がＭＤＩを注入したＳＴＺ誘発ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて認められ、これらのマウスの血中グルコースレベルは低下していた。ＭＤＩを移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて検出されたグルカゴンのレベルは、ヒトの生理的範囲内であった。
【００８７】
上記の結果は、ヒトＭＤＳＣから生成されたＭＤＩが、血中グルコースレベルの上昇を含む糖尿病の症状を治療することができることを明らかにしている。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】種々の条件下で培養した単球由来幹細胞の顕微鏡写真を示す。図１Ａおよび図１Ｄは、脱分化培地で維持された細胞の２種類の調製物を示す。図１Ｂおよび図１Ｃは、膵臓分化培地中１８時間後の細胞の調製物の種々の拡大図を示す。図１Ｅおよび図１Ｆは、膵臓分化培地中１８時間後の別の細胞調製物の種々の拡大図を示す。
【図２】膵臓分化培地中２〜３日後の島様細胞の集塊の顕微鏡写真を示す。右下の図は、脱分化培地で維持された対照細胞を示す。
【図３】膵臓分化１〜１２日目の間の膵臓遺伝子の発現を示すグラフを示す。遺伝子発現はリアルタイムＰＣＲにより分析した。低濃度または高濃度グルコースの存在下における脱分化培地（ｄｅ‐ｄｉｆｆ）または膵臓分化培地（Ｐａｎ  ｄｉｆｆ）で成長させた細胞の発現プロファイルが示されている。
【図４】膵臓分化１〜１２日目の膵臓遺伝子の発現を示すグラフである。遺伝子発現はリアルタイムＰＣＲにより分析した。低濃度または高濃度グルコースの存在下における脱分化培地（ｄｅ‐ｄｉｆｆ）または膵臓分化培地（Ｐａｎ  ｄｉｆｆ）で成長させた細胞の発現プロファイルが示されている。
【図５】ＭＤＩ集塊によるインスリンの分泌を示すグラフである。低濃度または高濃度グルコースの存在下における脱分化培地（ｄｅ‐ｄｉｆｆ）または膵臓分化培地（Ｐａｎ  ｄｉｆｆ）で成長させた細胞の培養物におけるインスリンの量を示す。
【図６】ＭＤＩ集塊によるｃ‐ペプチドの分泌を示すグラフである。低濃度または高濃度グルコースの存在下における脱分化培地（ｄｅ‐ｄｉｆｆ）または膵臓分化培地（Ｐａｎ  ｄｉｆｆ）で成長させた細胞の培養物におけるｃ‐ペプチドの量を示す。
【図７】グルコースおよびトルブタミドに反応した、ＭＤＩ集塊によるインスリンの分泌を示すグラフである。漸増濃度のグルコースにトルブタミドの存在下または非存在下で暴露した膵臓細胞の培養物におけるインスリンの量を示す。
【図８】１７日間にわたり、脱分化培地またはグルコースに反応して、細胞増殖のマーカーであるＫｉ‐６７タンパク質を発現する単球由来幹細胞（ＭＤＳＣ）または単球由来島細胞（ＭＤＩ）の割合を示すグラフである。
【図９】膵臓培地と低レベル（５ｍＭ）または高（２５ｍＭ）レベルのいずれかのグルコースとに暴露したＭＤＳＣから生成されたＭＤＩの数を示すグラフである。
【図１０】２０日間にわたり、低レベル（四角）または高レベル（菱形）のグルコースに反応したＭＤＩ集塊サイズ（μＭ）を示すグラフである。
【図１１】培養２１日後の小さな（Ａ、Ｃ）および大きな（Ｂ）ＭＤＩ集塊におけるβ細胞マーカーのインスリンの発現の顕微鏡写真を示す。α細胞マーカーのグルカゴンの発現は、サイトスピンで処理したＭＤＩ培養物において検出された（Ｄ）。（Ａ）および（Ｂ）は２００倍の倍率で、（Ｃ）および（Ｄ）は４００倍の倍率で示す。
【図１２】培養２１日後のＭＤＩ集塊におけるβ細胞マーカーのｃ‐ペプチド（Ａ）およびＰｄｘ１（Ｂ）の発現の顕微鏡写真を示す。（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ６００倍および２００倍の倍率で示す。
【図１３】１型糖尿病に罹患するヒト被験体の末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）から生成されたＭＤＳＣの顕微鏡写真を示す。ＰＢＭＣは、脱分化培地で６日間インキュベートし、ＭＤＳＣを形成した。（Ａ）培養８日後、脱分化培地、５ｍＭグルコース（すなわち、膵臓培地）で処理したＭＤＳＣから形成されたＭＤＩ。（Ｂ）膵臓培地中６日後に集合して浮遊集塊となったＭＤＩ。（Ｃ）および（Ｄ）高グルコース濃度（２５ｍＭ）を有する膵臓培地中６日後に数とサイズが増大したＭＤＩ集塊。（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）と（Ｄ）のスケールバーは、それぞれ２０μＭ、７０μＭ、および１１０μＭを表す。
【図１４】１型（Ａ〜Ｃ）および２型（Ｄ〜Ｅ）糖尿病に罹患するヒト被験体から得たＭＤＩにおけるβ細胞およびα細胞マーカー発現の顕微鏡写真を示す。（Ａ）および（Ｄ）はβ細胞マーカーのｃ‐ペプチドの発現を示し、（Ｂ）および（Ｅ）はα細胞マーカーのグルカゴンの発現を示し、（Ｃ）および（Ｆ）はβ‐細胞マーカーのＰｄｘ‐１の発現を示す。スケールバーは３０μＭを表す。
【図１５】ＥＬＩＳＡおよびＬｕｍｉｎｅｘで測定した、被験体の血液（「血漿」）からの血漿中インスリンレベル（ｎｇ／ｍＬ）、および糖尿病に罹患する被験体から得たＭＤＩから、ＭＤＩの成長中（１５日目〜４０日目）に採取した上澄み中のインスリンレベル（ｎｇ／ｍＬ）を示すグラフである。
【図１６】ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示すグラフである。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、野生型（グレーの菱形）、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処理（四角）、ＳＴＺ処理後ＭＤＳＣ注入（三角）、ＳＴＺ処理後１５日目ＭＤＩ注入（丸）、またはＳＴＺ処理後２３日目ＭＤＩ注入（黒の菱形）とした。
【図１７】野生型、ストレプトゾトシン処理、ＳＴＺ処理後ＭＤＳＣ注入、ＳＴＺ処理後１５日目ＭＤＩ注入である、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの体重（ｇ）を示すグラフである。
【図１８】１５日目ＭＤＩを注入されたＳＴＺ処理ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの腎臓被膜下に注入したＭＤＩにおけるインスリン（Ａ、Ｂ）およびグルカゴン（Ｃ、Ｄ）発現の顕微鏡写真を示す。（Ｂ）および（Ｄ）は、それぞれ（Ａ）および（Ｃ）に示す腎臓被膜部のより高倍率の拡大図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年3月26日(2009.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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