(57)【要約】  グルココルチコイド受容体の発現を調節するための化合物、組成物および方法が提供される。該組成物は、グルココルチコイド受容体をコードする核酸を標的とした、特定のｉｎ  ｖｉｖｏ特性を有するアンチセンス化合物、とりわけアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなる。グルココルチコイド受容体発現を調節するため、および疾患の処置のためのこれらの化合物の使用方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＣＣＲをコードする核酸分子を標的としかつ配列番号３４、３３、３５、３６、３７、４２、４５、５６、６１、６３若しくは９６の最低８核酸塩基部分を含んでなる、長さ２０核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、その５’および３’端で１ないし４個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接されている長さ１２、１３、１４、１５、１６、１７若しくは１８核酸塩基のデオキシヌクレオチド領域を含んでなり、かつ、該オリゴヌクレオチドがＧＣＣＲに特異的にハイブリダイズし、かつ、その発現を低下せしめる、上記オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
５’および３’端でデオキシヌクレオチド領域に隣接するヌクレオチドの数が同一である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
５’および３’端でデオキシヌクレオチド領域に隣接するヌクレオチドの数が同一でない、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号３７の核酸塩基配列を有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
その５’および３’端で２個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１６−デオキシヌクレオチドの領域を特徴とする、請求項６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである、請求項７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
その５’および３’端で３個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１４−デオキシヌクレオチドの領域を特徴とする、請求項６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項１０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである、請求項１０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
その５’および３’端で４個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１２−デオキシヌクレオチドの領域を特徴とする、請求項６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項１３に記載の
アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである、請求項１３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
その５’および３’端で１個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１８−デオキシヌクレオチドの領域を特徴とする、請求項６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである、請求項１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
その５’および３’端で１若しくは２個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１７−デオキシヌクレオチドの領域を特徴とする、請求項６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項１９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである、請求項１９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
配列番号３３の核酸塩基配列を有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
その５’および３’端で２個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１６−デオキシヌクレオチドの領域を特徴とする、請求項２２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項２３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである、請求項２３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
その５’および３’端で３個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１４−デオキシヌクレオチドの領域を特徴とする、請求項２２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項２６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである、請求項２６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
その５’および３’端で４個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１２−デオキシヌクレオチド領域のを特徴とする、請求項２２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項２９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである、請求項２９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
その５’および３’端で１個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１８−デオキシヌクレオチドの領域を特徴とする、請求項２２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項３２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである、請求項３２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
その５’および３’端で１若しくは２個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１７−デオキシヌクレオチド領域を特徴とする、請求項２２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項３５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである、請求項３５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
配列番号４５の核酸塩基配列を有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
その５’および３’端で２個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１６デオキシヌクレオチドの領域を特徴とする、請求項３８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項３９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである、請求項３９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
その５’および３’端で３個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１４−デオキシヌクレオチドの領域を特徴とする、請求項３８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項４２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである、請求項４２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
その５’および３’端で４個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１２−デオキシヌクレオチドの領域を特徴とする、請求項３８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４６】
最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項４５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４７】
最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである、請求項４５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４８】
その５’および３’端で１個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１８−デオキシヌクレオチドの領域を特徴とする、請求項３８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４９】
最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項４８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５０】
最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである、請求項４８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５１】
その５’および３’端で１若しくは２個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１７−デオキシヌクレオチドの領域を特徴とする、請求項３８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５２】
最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項５１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５３】
最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである、請求項５１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５４】
請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および、場合によっては、製薬学的に許容できる担体、希釈剤増強剤若しくは賦形剤を含んでなる、製薬学的組成物。
【請求項５５】
請求項５４に記載の製薬学的組成物と細胞若しくは組織を接触させることを含んでなる、前記細胞若しくは組織中のグルココルチコイド受容体の発現の低下方法。
【請求項５６】
組織が脂肪若しくは肝組織である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
請求項５４に記載の製薬学的組成物の有効量と動物を接触させることを含んでなる、前記動物でのグルココルチコイド発現により媒介される疾患若しくは状態の処置方法。
【請求項５８】
疾患若しくは状態が、糖尿病、肥満、代謝性症候群Ｘ、高血糖症若しくは高脂血症である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
疾患が２型糖尿病である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
疾患が、上昇された血中コレステロール若しくは上昇された血中トリグリセリド濃度を伴う高脂血症である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
状態が肝臓脂肪症である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
脂肪症が脂肪性肝炎である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
脂肪症が非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
請求項５４に記載の製薬学的組成物の治療的有効量を動物に投与することを含んでなる、前記動物での血糖値の低下方法。
【請求項６５】
動物がヒトである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
血糖値が空腹時血糖値である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
請求項５４に記載の製薬学的組成物の治療的有効量を動物に投与することを含んでなる、前記動物での血中脂質濃度の低下方法。
【請求項６８】
血中脂質濃度が血中コレステロール濃度である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
血中脂質濃度が血中トリグリセリド濃度である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
請求項５４に記載の製薬学的組成物の治療的有効量を動物に投与することを含んでなる、前記動物での肝トリグリセリド濃度の低下方法。
【請求項７１】
請求項５４に記載の製薬学的組成物の治療的有効量を動物に投与することを含んでなる、前記動物での体脂肪量の低下方法。
【請求項７２】
請求項５４に記載の製薬学的組成物の治療的有効量を動物に投与することを含んでなる、前記動物のインスリン感受性を低下せしめる改善方法。
【請求項７３】
請求項５４に記載の製薬学的組成物の治療的有効量を動物に投与することを含んでなる、前記動物での肝グルコース産生の阻害方法。
【請求項７４】
請求項５４に記載の製薬学的組成物の治療的有効量を動物に投与することを含んでなる、前記動物での血中脂質濃度若しくは血糖値の増加の発生の遅延若しくは予防方法。
【請求項７５】
付加的な治療効果を達成するための、ＰＰＡＲ−γ、二重ＰＰＡＲ若しくはパン（ｐａｎ）ＰＰＡＲアゴニストを包含するＰＰＡＲアゴニスト、ジペプチジルペプチダーゼ（ＩＶ）阻害剤、ＧＬＰ−１アナログ、インスリンおよびインスリンアナログ、インスリン分泌促進物質、ＳＧＬＴ２阻害剤、プラムリンチドを包含するヒトアミリンアナログ、グルコキナーゼ活性化物質、ビグアニドならびにα−グルコシダーゼ阻害剤を含んでなる群から選択される抗糖尿病薬と組合せの請求項１に記載の化合物を動物に投与することを含んでなる、代謝性疾患若しくは状態を有する動物の処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
３７，１２２バイト（ＭＳ−ＤＯＳで測定される）でありかつ２００６年９月１９日に作成された、ＢＩＯＬ００６５ＷＯＳＥＱ．ｔｘｔと命名されたファイルを含有するディスケット上のコンピュータで読出し可能な形態の配列表が、引用することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
細胞、組織若しくは動物のグルココルチコイド受容体の発現を調節するための化合物、組成物および方法が本明細書に開示される。
【背景技術】
【０００３】
増大された糖新生は糖尿病での増大された糖産生の主供給源であると考えられるため、肝グルコース産生の阻害のための多数の治療標的が検討された。動物モデルの糖尿病を改善する、グルココルチコイド受容体（核受容体サブファミリー３、グループＣ、メンバー１；ＮＲ３Ｃ１；ＧＣＣＲ；ＧＣＲ；ＧＲＬ；グルココルチコイド受容体、リンパ球としてもまた知られる）のアゴニストの能力により、こうした化合物は探求されている潜在的治療薬のひとつである。しかしながら、ＨＰＡ系の活性化を包含する、グルココルチコイド受容体アンタゴニストの有害な全身的影響が存在する（非特許文献１）。増大されたＨＰＡ系の活動は免疫関連の炎症作用の抑制を伴い、これは感染性病原体および新生物に対する感受性を増大し得る。ＨＰＡ系若しくはその標的組織の欠陥による免疫媒介性の炎症の抑制と関連する状態は、クッシング症候群、慢性ストレス、慢性アルコール依存症およびメランコリー性うつ病を包含する（非特許文献２）。従って、肝および脂肪特異的グルココルチコイド受容体アンタゴニストを開発することは非常に価値がある。
【０００４】
【非特許文献１】Ｌｉｎｋ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ、２００３、４、４２１−４２９
【非特許文献２】Ｃｈｒｏｕｓｏｓ、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、１９９５、３３２、１３５１−１３６２
【発明の開示】
【０００５】
［発明の要約］
本発明は、ＧＣＣＲの発現を調節する、ＧＣＣＲをコードする核酸分子を標的としかつそれとハイブリダイズ可能なオリゴマー化合物に向けられる。５’および３’端のそれぞれで１ないし４個の２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチドから構成される「ウイング」で隣接されたデオキシヌクレオチド領域すなわち「ギャップ」を含んでなる、「ギャップマー」と称されるキメラオリゴヌクレオチドが本明細書で提供される。本発明のオリゴヌクレオチドのデオキシヌクレオチド領域は１０以上のデオキシヌクレオチドから構成され、従って、本発明のギャップマーは、米国特許公開第ＵＳ２００５−０１６４２７１号明細書（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に例示されるところのような１０デオキシヌクレオチドのギャップ領域を含んでなるキメラ化合物に比較して「ギャップ拡張（ｇａｐ−ｗｉｄｅｎｅｄ）」されている。いくつかの態様において、同一配列を有するがしかし５’および３’双方の端で５個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１０デオキシヌクレオチドの領域を含んでなるオリゴヌクレオチドと比較して、ギャップ拡張オリゴヌクレオチドは、肝でのオリゴヌクレオチドの高められた蓄積を伴わずに比較可能な若しくは改良された抗力を有する。従って、本発明の態様は、標的組織でのオリゴヌクレオチドの高められた蓄積を伴わず、同一配列を有するがしかし５’および３’双方の端で５個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１０デオキシヌクレオチドの領域を含んでなるオリゴヌクレオチドの効力に抗力が比較可能であるか若しくはそれより良好である、ＧＣＣＲを標的とするギャップ拡張オリゴヌクレオチドを包含する。
【０００６】
本発明の別の態様は、肝のような標的組織で抗力を維持若しくは改良しつつ、前記オリゴヌクレオチドの腎濃度が、同一配列を有するがしかし５’および３’双方の端で５個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１０デオキシヌクレオチドの領域を含んでなるオリゴヌクレオチドのものに匹敵する若しくはそれに関して低下されている、ＧＣＣＲを標的とするギャップ拡張オリゴヌクレオチドを包含する。
【０００７】
本発明の化合物若しくは組成物の１種若しくはそれ以上と細胞、組織若しくは動物を接触させることを含んでなる、前記細胞、組織若しくは動物でのＧＣＣＲの発現の調節方法がさらに提供される。例えば、一態様において、本発明の化合物若しくは組成物は細胞、組織若しくは動物でのＧＣＣＲの発現を低下するのに使用し得る。
【０００８】
一態様において、本発明は、本発明の化合物の有効量と動物を接触させることを含んでなる、動物でのグルココルチコイド発現により媒介される疾患若しくは状態の処置方法を提供する。該疾患若しくは状態は、糖尿病、２型糖尿病、肥満、代謝性症候群Ｘ、高血糖症、高脂血症若しくは肝臓脂肪症を包含する。いくつかの態様において、高脂血症は、血中コレステロールのような上昇された脂質若しくは上昇された血中トリグリセリドを伴う。血中脂質は血漿脂質および血清脂質を包含する。本発明の化合物を投与することによる、動物での血中脂質濃度の低下方法、体脂肪量の低下方法、肝トリグリセリド濃度の低下方法およびインスリン感受性の改善方法がさらに提供される。
【０００９】
本発明の化合物を投与することを含んでなる動物での血糖値の低下方法もまた提供される。血糖値は空腹時若しくは食後血糖値であることができ、また、血糖値は血清若しくは血漿グルコース値を包含する。インスリン感受性の増大方法および肝グルコース産生の阻害方法がさらに提供される。
【００１０】
本発明の別の局面は、本発明の化合物を投与することによる動物での血中脂質濃度若しくは血糖値の増大の発生の遅延若しくは予防方法である。
【００１１】
本出願は米国特許出願第６０／７１８，６８４号明細書（そっくりそのまま引用することにより組み込まれる）にもまた関する。本出願は米国特許出願第１１／２３１，２４３号およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３３８３７号明細書（それらのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）にもまた関する。
【００１２】
［詳細な記述］
概要
ＧＣＣＲをコードする核酸分子の発現の調節における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび他のアンチセンス化合物を包含するオリゴマー化合物を本明細書で開示する。これは、ＧＣＣＲをコードする１種若しくはそれ以上の標的核酸分子とハイブリダイズするオリゴマー化合物を提供することにより達成される。
【００１３】
ＧＣＣＲ（グルココルチコイド受容体；核受容体サブファミリー３、グループＣ、メンバー１；ＧＲ；ＧＲＬ；およびＮＲ３Ｃ１としてもまた知られる）の発現を調節するための組成物および方法が本発明による。ＧＣＣＲを標的とするオリゴマー化合物を設計するのに使用しうる配列のＧＥＮＢＡＮＫ（Ｒ）受託番号を表１に列挙する。本発明のオリゴマー化合物は、表１に示される１種若しくはそれ以上の標的核酸分子とハイブリダイズするオリゴマー化合物、ならびにＧＣＣＲをコードする他の核酸分子にハイブリダイズするオリゴマー化合物を包含する。
【００１４】
該オリゴマー化合物は、ＧＣＣＲをコードする核酸分子のいずれの領域、セグメント若
しくは部位も標的としうる。適する標的領域、セグメントおよび部位は、限定されるものでないが、５’ＵＴＲ、開始コドン、終止コドン、コーディング領域、３’ＵＴＲ、５’キャップ領域、イントロン、エキソン、イントロン−エキソン結合部、エキソン−イントロン結合部およびエキソン−エキソン結合部を挙げることができる。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
活性のオリゴマー化合物がハイブリダイズする標的核酸上の位置は本明細書で下で「有効標的セグメント（ｖａｌｉｄａｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｇｍｅｎｔ）」と称される。本明細書で使用されるところの「有効標的セグメント」という用語は、活性のオリゴマー化合物が標的とする標的領域の最低８核酸塩基部分と定義する。理論により束縛されることを願わない一方、これらの標的セグメントは、ハイブリダイゼーションのため接近可能である標的核酸の部分を表すと現在考えられている。
【００１７】
本発明はキメラ化合物であるオリゴマー化合物を包含する。キメラ化合物の一例は、デオキシヌクレオチド以外の領域すなわち「ウイング」により隣接される２’−デオキシヌクレオチド領域すなわち「ギャップ」を有するギャップマーでる。理論により束縛されることを願わない一方、ギャップマーのギャップは、ＲＮＡ標的に結合される場合にＲＮアーゼＨにより認識可能な基質を提示する一方、ウイングは至適の基質でないが、しかし二重鎖の安定性若しくは有利な薬物動態効果に寄与することのような他の特性を賦与し得る。各ウイングは１個若しくはそれ以上のデオキシオリゴヌクレオチド以外の単量体であり得る。一態様において、ギャップマーは５’および３’端のそれぞれで２個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドのウイングにより隣接された１６個の２’−デオキシヌクレオチドの領域から構成される。これは２−１６−２ギャップマーと称される。従って、このキメラオリゴマー化合物すなわちギャップマーの「モチーフ」は２−１６−２である。別の態様において、ヌクレオシド間結合の全部はホスホロチオエート結合である。別の態様においてギャップマーのシトシンは５−メチルシトシンである。
【００１８】
本発明の態様は、５’および３’端のそれぞれで最低１個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された、長さが１０核酸塩基以上のデオキシヌクレオチド領域を含んでなる、長さが１３ないし２６ヌクレオチドの配列を含んでなるオリゴマー化合物を包含する。好ましい「ギャップ拡張」オリゴヌクレオチドは該オリゴヌクレオチドのギャップ部分に１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７若しくは１８デオキシヌクレオチドを含んでなる。好ましい５’および３’隣接領域は、１、２、３若しくは４個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドを含んでなる。好ましいギャップ拡張ギャップマーは、１−１８−１、１−１７−２、２−１７−１、２−１６−２、３−１４−３および４−１２−４を包含するモチーフを有する。
【００１９】
好ましい態様において、オリゴマー化合物はＧＣＣＲ  ＲＮＡを標的とするか若しくはそれとハイブリダイズする。別の態様において、オリゴマー化合物はＧＣＣＲ  ＲＮＡの
発現を低下する。他の態様において、オリゴマー化合物はＧＣＣＲの発現を低下し、ＧＣＣＲの発現は、最低１０％、最低２０％、最低３０％、最低３５％、最低４０％、最低４５％、最低５０％、最低５５％、最低６０％、最低６５％、最低７０％、最低７５％、最低８０％、最低８５％、最低９０％、最低９５％若しくは最低１００％低下される。
【００２０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、同一配列を有するがしかし５’および３’双方の端で５個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１０デオキシヌクレオチドの領域を含んでなるオリゴヌクレオチドに関して、前記オリゴヌクレオチドの腎濃度が低下されるものを包含する。本発明のオリゴヌクレオチドは、同一配列を有するがしかし５’および３’双方の端で５個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１０デオキシヌクレオチドの領域を含んでなるオリゴヌクレオチドの腎濃度に関して、前記オリゴヌクレオチドの腎濃度が比較可能若しくは低下されるものを包含する。本発明のオリゴヌクレオチドは、標的の減少に関する効力すなわち治療効果が、標的組織でのオリゴヌクレオチドの高められた蓄積を伴わず、同一配列を有するがしかし５’および３’双方の端で５個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１０デオキシヌクレオチドの領域を含んでなるオリゴヌクレオチドのものと比較可能若しくはより良好であるものを包含する。好ましい標的組織は肝および脂肪組織を包含する。
【００２１】
本発明は、ＧＣＣＲをコードする核酸分子を標的とする長さ１３ないし２６核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、該オリゴヌクレオチドは第一の領域、第二の領域および第三の領域を含んでなり、前記第一の領域は最低１１デオキシヌクレオチドを含んでなり、かつ、前記第二および第三の領域は１ないし４個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドを含んでなり、前記第二および第三の領域は前記第一の領域の５’および３’端で第一の領域に隣接する。
【００２２】
いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドはＧＣＣＲに特異的にハイブリダイズしかつＧＣＣＲの発現を低下する。いくつかの態様において、「ギャップ」領域は１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７若しくは１８核酸塩基を含んでなる。いくつかの態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは長さが２０核酸塩基である。
【００２３】
オリゴマー化合物は、約８ないし約８０核酸塩基（すなわち約８から約８０個までの連結されたヌクレオシド）、好ましくは約１３ないし約２６の間の核酸塩基を含み得る。当業者は、企図している好ましいオリゴマー化合物が、長さが１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５若しくは２６核酸塩基である化合物を包含することを認識するであろう。
【００２４】
本発明の化合物は、具体的に説明するアンチセンス化合物の１種の５’末端からの最低８個の連続する核酸塩基を含んでなるオリゴヌクレオチド配列を包含する（残存する核酸塩基は、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能であるアンチセンス化合物の５’末端のすぐ上流で開始しかつ該オリゴヌクレオチドが約１３ないし約２６核酸塩基を含むまで連続する同一オリゴヌクレオチドの連続する伸長である）。他の化合物は、具体的に説明するアンチセンス化合物の１種の３’末端からの最低８個の連続する核酸塩基を含んでなるオリゴヌクレオチド配列により表される（残存する核酸塩基は、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能であるアンチセンス化合物の３’末端のすぐ下流で開始しかつ該オリゴヌクレオチドが約１３ないし約２６核酸塩基を含むまで連続する同一オリゴヌクレオチドの連続する伸長である）。化合物は、具体的に説明する化合物の配列の内部部分からの最低８個の連続する核酸塩基を含んでなるオリゴヌクレオチド配列により表されることができ、そして該オリゴヌクレオチドが約１３ないし約２６核酸塩基を含有するまでいずれか若しくは双方の方向に伸長しうることもまた理解される。
【００２５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＧＣＣＲをコードしかつ配列番号３４、３３、３５、３６、３７、４２、４５、５６、６１、６３若しくは９６の最低８核酸塩基部分を含んでなる核酸分子を標的とする長さ２０核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。一態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＧＣＣＲをコードしかつ配列番号３４、３３、３５、３６、３７、４２、４５、５６、６１、６３若しくは９６の配列を有する核酸分子を標的とする長さ２０核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは配列番号３７の核酸塩基配列を有する。
【００２６】
本発明は、配列番号３７の核酸塩基配列を含んでなるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。一態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号３７の核酸塩基配列の最低８核酸塩基部分を含んでなる。
【００２７】
一態様において、本発明は、ＧＣＣＲをコードしかつ配列番号３４、３３、３５、３６、３７、４２、４５、５６、６１、６３若しくは９６の最低８核酸塩基部分を含んでなる核酸分子を標的とする長さ２０核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、該オリゴヌクレオチドは、その５’および３’端で１ないし４個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接されている長さ１２、１３、１４、１５、１６、１７若しくは１８核酸塩基のデオキシヌクレオチド領域を含んでなり、かつ、該オリゴヌクレオチドはＧＣＣＲ  ＲＮＡに特異的にハイブリダイズしかつその発現を低下する。
【００２８】
一態様において、隣接領域は対称（３’隣接領域と同一の数のヌクレオチドを５’隣接領域に有する）である。別の態様において、隣接領域は非対称（３’隣接領域に比較して異なる数のヌクレオチドを５’隣接領域に有する）である。
【００２９】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、最低１個の改変ヌクレオシド間結合を含有しうる。改変ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合を包含する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは最低１個の修飾核酸塩基もまた含有しうる。好ましい態様において、最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである。
【００３０】
他の態様において、本発明は配列番号３７の核酸塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その５’および３’端で４個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１２−デオキシヌクレオチドの領域、その５’および３’端で３個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１４−デオキシヌクレオチドの領域、その５’および３’端で２個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１６−デオキシヌクレオチドの領域、その５’および３’端で１若しくは２個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１７−デオキシヌクレオチドの領域、またはその５’および３’端で１個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１８−デオキシヌクレオチドの領域を特徴とする。
【００３１】
特定の一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号３７の核酸塩基配列を有し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドはその５’および３’端で４個の２’−Ｏ（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１２−デオキシヌクレオチドの領域を有する。さらなる一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドはＧＣＣＲに特異的にハイブリダイズしかつその発現を低下する。さらなる一態様において、最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。さらなる一態様において、最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである。
【００３２】
特定の一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号３７の核酸塩基配列を有し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その５’および３’端で３個の２’
−Ｏ（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１４−デオキシヌクレオチドの領域を有する。さらなる一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドはＧＣＣＲに特異的にハイブリダイズしかつその発現を低下する。さらなる一態様において、最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。さらなる一態様において、最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである。
【００３３】
特定の一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号３７の核酸塩基配列を有し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドはその５’および３’端で２個の２’−Ｏ（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１６−デオキシヌクレオチドの領域を有する。さらなる一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドはＧＣＣＲに特異的にハイブリダイズしかつその発現を低下する。さらなる一態様において、最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。さらなる一態様において、最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである。
【００３４】
特定の一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号３７の核酸塩基配列を有し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドはその５’および３’端で１若しくは２個の２’−Ｏ（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１７−デオキシヌクレオチドの領域を有する。さらなる一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドはＧＣＣＲに特異的にハイブリダイズしかつその発現を低下する。さらなる一態様において、最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。さらなる一態様において、最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである。
【００３５】
特定の一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号３７の核酸塩基配列を有し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドはその５’および３’端で１個の２’−Ｏ（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１８−デオキシヌクレオチドの領域を有する。さらなる一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドはＧＣＣＲに特異的にハイブリダイズしかつその発現を低下する。さらなる一態様において、最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。さらなる一態様において、最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである。
【００３６】
別の態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号３３の核酸塩基配列を有する。一態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号３３の核酸塩基配列の最低８核酸塩基部分を含んでなる。
【００３７】
他の態様において、本発明は配列番号３３の核酸塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その５’および３’端で４個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１２−デオキシヌクレオチドの領域、その５’および３’端で３個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１４−デオキシヌクレオチドの領域、その５’および３’端で２個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１６−デオキシヌクレオチドの領域、その５’および３’端で１若しくは２個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１７−デオキシヌクレオチドの領域、またはその５’および３’端で１個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１８−デオキシヌクレオチドの領域を特徴とする。
【００３８】
特定の一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号３３の核酸塩基配列を有し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その５’および３’端で４個の２’−Ｏ（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１２−デオキシヌクレオチドの領域を有する。さらなる一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドはＧＣＣＲに特異的にハイブリダイズしかつその発現を低下する。さらなる一態様において、最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。さらなる一態様において、最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである。
【００３９】
特定の一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号３３の核酸塩基配列を有し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その５’および３’端で３個の２’−Ｏ（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１４−デオキシヌクレオチドの領域を有する。さらなる一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドはＧＣＣＲに特異的にハイブリダイズしかつその発現を低下する。さらなる一態様において、最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。さらなる一態様において、最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである。
【００４０】
特定の一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号３３の核酸塩基配列を有し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その５’および３’端で２個の２’−Ｏ（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１６−デオキシヌクレオチドの領域を有する。さらなる一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドはＧＣＣＲに特異的にハイブリダイズしかつその発現を低下する。さらなる一態様において、最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。さらなる一態様において、最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである。
【００４１】
特定の一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号３３の核酸塩基配列を有し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その５’および３’端で１若しくは２個の２’−Ｏ（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１７−デオキシヌクレオチドの領域を有する。さらなる一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドはＧＣＣＲに特異的にハイブリダイズしかつその発現を低下する。さらなる一態様において、最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。さらなる一態様において、最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである。
【００４２】
特定の一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号３３の核酸塩基配列を有し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その５’および３’端で１個の２’−Ｏ（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１８−デオキシヌクレオチドの領域を有する。さらなる一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドはＧＣＣＲに特異的にハイブリダイズしかつその発現を低下する。さらなる一態様において、最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。さらなる一態様において、最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである。
【００４３】
本発明は配列番号４５の核酸塩基配列を含んでなるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。一態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号４５の核酸塩基配列の最低８核酸塩基部分を含んでなる。
【００４４】
他の態様において、本発明は配列番号４５の核酸塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その５’および３’端で４個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１２−デオキシヌクレオチドの領域、その５’および３’端で３個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１４−デオキシヌクレオチドの領域、その５’および３’端で２個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１６−デオキシヌクレオチドの領域、その５’および３’端で１若しくは２個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１７−デオキシヌクレオチドの領域、またはその５’および３’端で１個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１８−デオキシヌクレオチドの領域を特徴とする。
【００４５】
特定の一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号４５の核酸塩基配列を有し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その５’および３’端で４個の２’−Ｏ（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１２−デオキシヌクレオチドの領域を有する。さらなる一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドはＧＣＣＲに特異的にハイブリダイズしかつその発現を低下する。さらなる一態様において、最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。さらなる一態様において、最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである。
【００４６】
特定の一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号４５の核酸塩基配列を有し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その５’および３’端で３個の２’−Ｏ（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１４−デオキシヌクレオチドの領域を有する。さらなる一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドはＧＣＣＲに特異的にハイブリダイズしかつその発現を低下する。さらなる一態様において、最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。さらなる一態様において、最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである。
【００４７】
特定の一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号４５の核酸塩基配列を有し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その５’および３’端で２個の２’−Ｏ（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１６−デオキシヌクレオチドの領域を有する。さらなる一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドはＧＣＣＲに特異的にハイブリダイズしかつその発現を低下する。さらなる一態様において、最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。さらなる一態様において、最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである。
【００４８】
特定の一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号４５の核酸塩基配列を有し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その５’および３’端で１若しくは２個の２’−Ｏ（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１７−デオキシヌクレオチドの領域を有する。さらなる一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドはＧＣＣＲに特異的にハイブリダイズしかつその発現を低下する。さらなる一態様において、最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。さらなる一態様において、最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである。
【００４９】
特定の一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号４５の核酸塩基配列を有し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その５’および３’端で１個の２’−Ｏ（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１８−デオキシヌクレオチドの領域を有する。さらなる一態様において、該アンチセンスオリゴヌクレオチドはＧＣＣＲに特異的にハイブリダイズしかつその発現を低下する。さらなる一態様において、最低１個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。さらなる一態様において、最低１個のシトシンが５−メチルシトシンである。
【００５０】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および、場合によっては、製薬学的に許容できる担体、希釈剤、増強剤若しくは賦形剤を含んでなる製薬学的組成物もまた本明細書で企図している。本発明の化合物は、ＧＣＣＲにより媒介されるグルココルチコイド活性に関係する疾患および障害の処置のための医薬品の製造でもまた使用し得る。
【００５１】
本発明の態様は、本発明の製薬学的組成物若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチドと細胞若しくは組織を接触させることを含んでなる、前記組織若しくは細胞でのＧＣＣＲの発現の低下方法、動物に本発明の製薬学的組成物を投与することを含んでなる、前記動物での血糖値、血中トリグリセリド濃度若しくは血中コレステロール濃度の低下方法を包含する。血中濃度は血漿若しくは血清濃度でありうる。本発明の製薬学的組成物を動物に投
与することを含んでなる、前記動物でのインスリン感受性の増大方法、肝トリグリセリド濃度の低下方法および肝グルコース産生の阻害方法もまた企図している。増大されたインスリン感受性は循環インスリン濃度の低下により示されうる。本発明の別の局面は動物の体脂肪量の低下方法である。
【００５２】
本発明の他の態様は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療的若しくは予防的有効量を動物に投与することを含んでなる、グルココルチコイド受容体発現と関連する疾患若しくは状態を有する動物の処置方法を包含する。該疾患若しくは状態は代謝性疾患若しくは状態でありうる。いくつかの態様において、代謝性疾患若しくは状態は、糖尿病、肥満、代謝性症候群Ｘ、高血糖症、高脂血症若しくはインスリン抵抗性である。いくつかの態様において、糖尿病は２型糖尿病である。いくつかの態様において、肥満は食餌誘発性である。いくつかの態様において、高脂血症は上昇された血中脂質濃度を伴う。脂質はコレステロールおよびトリグリセリドを包含する。一態様において、状態は肝臓脂肪症である。いくつかの態様において、脂肪症は脂肪性肝炎若しくは非アルコール性脂肪性肝炎である。
【００５３】
動物での上昇された血糖値若しくは血中脂質濃度の発生の予防若しくは遅延方法もまた提供される。
【００５４】
本発明の化合物は、ヒトのようなそれを必要とする動物でＧＣＣＲの発現を調節するのに使用し得る。制限しない一態様において、該方法は、ＧＣＣＲの発現を低下するアンチセンス化合物の有効量を前記動物に投与する段階を含んでなる。一態様において、本発明のアンチセンス化合物はＧＣＣＲ  ＲＮＡのレベル若しくは機能を効果的に低下する。ＧＣＣＲのｍＲＮＡレベルの低下は同様に発現のＧＣＣＲタンパク質産物の変化につながり得るため、こうした結果として生じる変化もまた測定し得る。ＧＣＣＲ  ＲＮＡ若しくは発現のタンパク質産物のレベル若しくは機能を効果的に低下する本発明のアンチセンス化合物は、活性のアンチセンス化合物とみなされる。一態様において、本発明のアンチセンス化合物はＧＣＣＲの発現を低下させて、本明細書の例示されるアッセイにより測定されるところの最低１０％、最低２０％、最低２５％、最低３０％、最低４０％、最低５０％、最低６０％、最低７０％、最低７５％、最低８０％、最低８５％、最低９０％、最低９５％、最低９８％、最低９９％若しくは１００％のＲＮＡの減少を引き起こす。
【００５５】
アンチセンスの機構
「アンチセンスの機構」は、ハイブリダイゼーションの結果若しくは影響が、関与する細胞の機構、例えば転写若しくはスプライシングの付随する失速を伴う標的の分解若しくは標的の占有のいずれかである、標的核酸との化合物のハイブリダイゼーションを伴う全部である。
【００５６】
標的
本明細書で使用されるところの「標的核酸」および「ＧＣＣＲをコードする核酸分子」という用語は、ＧＣＣＲをコードするＤＮＡ、こうしたＤＮＡから転写されたＲＮＡ（プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡ若しくはそれらの部分を包含する）、ならびにまたこうしたＲＮＡ由来のｃＤＮＡを包含するために便宜上使用する。
【００５７】
領域、セグメントおよび部位
ターゲッティング過程は、通常、所望の効果、例えば発現の調節が生じることができるような、アンチセンス相互作用が起こるための標的核酸内の最低１個の標的領域、セグメント若しくは部位の決定もまた包含する。「領域」は、最低１個の同定可能な構造、機能若しくは特徴を有する標的核酸の一部分と定義する。標的核酸の領域内にセグメントがある。「セグメント」は標的核酸内の領域のより小さいすなわち下位部分と定義する。本発明で使用されるところの「部位」は標的核酸内の独特の核酸塩基位置と定義する。
【００５８】
１個若しくはそれ以上の標的領域、セグメント若しくは部位が一旦決定されれば、所望
の効果を示すために標的に十分に相補的である、すなわち十分に良好にかつ十分な特異性でハイブリダイズするオリゴマー化合物を設計する。
【００５９】
バリアント
選択的ＲＮＡ転写物がＤＮＡの同一ゲノム領域から産生されうることもまた当該技術分野で既知である。これらの選択的転写物は「バリアント」として公知である。より具体的には、「プレｍＲＮＡバリアント」は、同一ゲノムＤＮＡから産生される他の転写物とそれらの開始若しくは終止位置いずれかが異なりかつイントロンおよびエキソン双方の配列を含有する、同一ゲノムＤＮＡから産生される転写物である。
【００６０】
スプライシングの間の１個若しくはそれ以上のエキソン若しくはイントロン領域またはそれらの部分の除去に際して、プレｍＲＮＡバリアントはより小さい「ｍＲＮＡバリアント」を生じる。結果、ｍＲＮＡバリアントはプロセシングされたプレｍＲＮＡバリアントであり、そして、各独特のプレｍＲＮＡバリアントは、スプライシングの結果として独特の１ｍＲＮＡバリアントを常に産生するはずである。これらのｍＲＮＡバリアントは「選択的スプライスバリアント」としてもまた知られる。プレｍＲＮＡバリアントのスプライシングが発生しない場合には、該プレｍＲＮＡバリアントはｍＲＮＡバリアントに同一である。
【００６１】
バリアントは、転写を開始若しくは終了させるための選択的シグナルの使用により産生され得ること、ならびに、プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡは１個以上の開始コドン若しくは終止コドンを有し得ることもまた当該技術分野で既知である。代替の開始コドンを使用するプレｍＲＮＡ若しくはｍＲＮＡから発するバリアントは、そのプレｍＲＮＡ若しくはｍＲＮＡの「選択的開始バリアント」として知られる。代替の終止コドンを使用する転写物はそのプレｍＲＮＡ若しくはｍＲＮＡの「選択的終止バリアント」として知られる。１つの特定の型の選択的終止バリアントは、産生される複数の転写物が、転写機構により「ポリＡ終止シグナル」の１個の選択的選択から生じて、それにより独特のポリＡ部位で終止する転写物を産生する「ポリＡバリアント」である。結果、本明細書に記述されるバリアントの型もまた適する標的核酸である。
【００６２】
標的発現の調節
「調節」は、機能の動揺、例えば発現の増大（刺激若しくは誘導）または減少（阻害若しくは低下）のいずれも意味している。別の例として、発現の調節はプレｍＲＮＡのプロセシングのスプライス部位の選択を動揺することを包含し得る。「発現」は、それにより遺伝子のコードされた情報が細胞中で存在しかつ作動する構造に変換される全部の機能を包含する。これらの構造は転写および翻訳の産物を包含する。「発現の調節」はこうした機能の動揺を意味している。「調節物質」は、ＧＣＣＲの発現を調節しかつ有効標的セグメントに相補的である最低８核酸塩基部分を含んでなる化合物である。
【００６３】
標的核酸の発現の調節は、いずれかの数の核酸（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）機能の変化により達成し得る。調節されるべきＤＮＡの機能は複製および転写を包含し得る。複製および転写は、例えば、内因性の細胞性鋳型、ベクター、プラスミド構築物または別の方法からであり得る。調節されるべきＲＮＡの機能は、限定されるものでないがタンパク質翻訳の部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡ合成の部位から離れている細胞内の部位へのＲＮＡの転位を挙げることができる転位機能、およびＲＮＡの転位からのタンパク質の翻訳を包含し得る。調節され得るＲＮＡプロセシング機能は、限定されるものでないが、１種若しくはそれ以上のＲＮＡ種を生じるためのＲＮＡのスプライシング、ＲＮＡのキャッピング、ＲＮＡの３’成熟、および該ＲＮＡに関与しうる若しくはそれにより助長されうる該ＲＮＡが関わる触媒活性若しくは複合体形成を挙げることができる。発現の調節は、一時的な若しくは正味の定常状態レベルによるのいずれかの、１種若しくはそれ以上の核酸種の増大されたレベルまたは１種若しくはそれ以上の核酸種の低下されたレベルをもたらし得る。
標的核酸の機能のこうした妨害の１つの結果がＧＣＣＲの発現の調節である。従って、一態様において、発現の調節は標的ＲＮＡ若しくはタンパク質レベルの増大若しくは低下を意味し得る。別の態様において、発現の調節は、１種若しくはそれ以上のＲＮＡスプライス産物の増大若しくは減少、または２種若しくはそれ以上のスプライス産物の比の変化を意味し得る。
【００６４】
ハイブリダイゼーションおよび相補性
「ハイブリダイゼーション」はオリゴマー化合物の相補鎖の対形成を意味している。特定の機構に制限されない一方、対形成の最も一般的な機構は、オリゴマー化合物の鎖の相補ヌクレオシド若しくはヌクレオチド塩基（核酸塩基）間のワトソン−クリック、フーグスティーン若しくは逆フーグスティーン水素結合でありうる水素結合を伴う。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成により対形成する相補核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは変動する環境下で起こり得る。オリゴマー化合物は、特異的結合が望ましい条件下、すなわちｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ若しくは治療的処置の場合には生理学的条件下、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合にはアッセイを実施する条件下で、該オリゴマー化合物の標的以外の核酸配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する場合に、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００６５】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」若しくは「ストリンジェントな条件」は、オリゴマー化合物がその標的配列にしかし最少数の他の配列にハイブリダイズすることができる条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存性でありかつ多様な環境で異なることができ、そして、オリゴマー化合物が標的配列にハイブリダイズする「ストリンジェントな条件」は、オリゴマー化合物の性質および組成、ならびにそれらが検討されているアッセイにより決定される。
【００６６】
本明細書で使用されるところの「相補性」は、１若しくは２本のオリゴマー化合物鎖上の２核酸塩基間の正確な対形成のための能力を指す。例えば、アンチセンス化合物のある１位置の核酸塩基が、標的核酸のある１位置の核酸塩基と水素結合することが可能である場合には、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間の水素結合の位置は相補的位置であるとみなされる。オリゴマー化合物およびさらなるＤＮＡ若しくはＲＮＡは、各分子中の十分な数の相補的位置が相互と水素結合し得る核酸塩基により占有される場合に、相互と相補的である。従って、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、安定かつ特異的な結合がオリゴマー化合物と標的核酸の間で発生するような、十分な数の核酸塩基にわたる十分な程度の正確な対形成すなわち相補性を示すのに使用される用語である。
【００６７】
オリゴマー化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるためにその標的核酸の配列に１００％相補的である必要はないことが当該技術分野で理解されている。さらに、オリゴヌクレオチドは、介在若しくは隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないような１個若しくはそれ以上のセグメントにハイブリダイズしうる（例えばループ構造、塩基対不適正若しくはヘアピン構造）。本発明のオリゴマー化合物は、それらが標的とされる標的核酸配列内の標的領域に対する最低７０％、若しくは最低７５％、若しくは最低８０％、若しくは最低８５％、若しくは最低９０％、若しくは最低９２％、若しくは最低９５％、若しくは最低９７％、若しくは最低９８％、若しくは最低９９％の配列相補性を含んでなる。例えば、アンチセンス化合物の２０核酸塩基の１８個が標的領域に相補的でありかつ従って特異的にハイブリダイズするとみられるオリゴマー化合物は、９０パーセントの相補性を表すとみられる。この例で、残存する非相補的核酸塩基は集団を形成していても若しくは相補的核酸塩基とともに散在していてもよく、そして相互に若しくは相補核酸塩基に連続する必要はない。であるから、標的核酸と完全に相補的な２領域により隣接される４個の非相補的核酸塩基を有する長さ１８核酸塩基であるオリゴマー化合物は、標的核酸と７７．８％の全体的相補性を有するとみられ、そして従って本発明の範囲内にあるとみられる。標的核酸の一領域とのオリゴマー化合物の相補性パーセントは、当該技術分野で既知のＢＬＡＳＴプログラム（基本的局所アライメント検索ツール（ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌｓ）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０、２１５、４０３−４１０；ＺｈａｎｇとＭａｄｄｅｎ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１９９７、７、６４９−６５６）を使用して慣例に決定し得る。相同性パーセント、同一性若しくは相補性パーセントは、例えば、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、１９８１、２、４８２−４８９）を使用する、デフォルトの設定を使用するＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、ウィスコンシン州マディソン）により決定し得る。
【００６８】
オリゴマー化合物
「オリゴマー化合物」という用語は、核酸分子の一領域にハイブリダイズすることが可能なポリマー構造を指す。本用語は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチドアナログ、オリゴヌクレオチド模倣物、およびこれらのキメラの組合せを包含する。オリゴマー化合物は慣例に直鎖状に製造されるが、しかし環状になるように結合され得るか若しくは別の方法で製造し得る。さらに分枝状構造が当該技術分野で既知である。「アンチセンス化合物」若しくは「アンチセンスオリゴマー化合物」は、それがハイブリダイズしかつその発現を調節（増大若しくは減少）する核酸分子の領域に少なくとも部分的に相補的であるオリゴマー化合物を指す。結果、全部のアンチセンス化合物はオリゴマー化合物と言われることができる一方、全部のオリゴマー化合物がアンチセンス化合物ではない。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は核酸に基づくオリゴマーであるアンチセンス化合物である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは化学修飾し得る。オリゴマー化合物の制限しない例は、プライマー、プローブ、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、外的ガイド配列（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｇｕｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、選択的スプライス体（ｓｐｌｉｃｅｒ）およびｓｉＲＮＡを包含する。であるから、これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、分枝状若しくはヘアピンの形態で導入し得、そして内的若しくは末端バルジ若しくはループのような構造要素を含有し得る。オリゴマーの二本鎖化合物は、二本鎖化合物を形成するようにハイブリダイズされた二本鎖、または、ハイブリダイゼーションおよび完全に若しくは部分的に二本鎖の化合物の形成を見込むのに十分な自己相補性をもつ一本鎖であり得る。
【００６９】
本発明の情況での「キメラ」オリゴマー化合物若しくは「キメラ」は、それぞれが最低１個の単量体単位、すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドを含んでなる２個若しくはそれ以上の化学的に別個の領域を含有する、オリゴヌクレオチドのような一本若しくは二本鎖オリゴマー化合物である。
【００７０】
「ギャップマー」は、デオキシヌクレオチド以外のセグメントにより隣接された２’−デオキシオリゴヌクレオチド領域を有するオリゴマー化合物、一般にはオリゴヌクレオチドと定義する。中央領域は「ギャップ」と称される。隣接セグメントは「ウイング」と称される。ウイングの一方が０個のデオキシオリゴヌクレオチド以外の単量体を有する場合は「ヘミマー」が記述される。
【００７１】
ＮＡＦＬＤ
「非アルコール性脂肪肝疾患」（ＮＡＦＬＤ）という用語は、肝細胞中の単純なトリグリセリド蓄積（肝臓脂肪症）から炎症を伴う肝臓脂肪症（脂肪性肝炎）、線維症および肝硬変までの範囲にわたる疾患範囲を包含する。非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、トリグリセリドの沈着を超えたＮＡＦＬＤの進行から発生する。壊死、炎症および線維症を誘導することが可能な第二の的中がＮＡＳＨの発生に必要とされる。該第二の的中の候補は、広範な範疇、すなわち酸化的ストレスの増大を引き起こす因子および炎症前サイトカインの発現を促進する因子にグループ分けし得る。増大された肝トリグリセリドが動物およびヒトの肝細胞での増大された酸化的ストレスにつながることが示唆され、肝トリグリセリド蓄積、酸化的ストレスおよび肝臓脂肪症のＮＡＳＨへの進行の間の潜在的因果関係を示す（ＢｒｏｗｎｉｎｇとＨｏｒｔｏｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２００４、１１４、１４７−１５２）。高トリグリセリド血症および高脂肪酸血症は、末梢組織でのトリグリセリド蓄積を引き起こし得る（Ｓｈｉｍａｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２００４、３２２、１０８０−１０８５）。本発明の一態様は、本発明のオリゴマー化合物の予防的若しくは治療的有効量を投与することによる動物の肝の脂質の減少方法である。本発明の別の態様は、本発明のオリゴマー化合物の予防的若しくは治療的有効量を投与することによる動物での肝臓脂肪症の処置方法である。いくつかの態様において、脂肪症は脂肪性肝炎である。いくつかの態様において、脂肪症はＮＡＳＨである。
【００７２】
化学修飾
修飾および代替核酸塩基
本発明のオリゴマー化合物は、該化合物中のヌクレオチド位置の１個若しくはそれ以上に異なる塩基が存在するバリアントもまた包含する。例えば、第一のヌクレオチドがアデノシンである場合、この位置にチミジン、グアノシン若しくはシチジンを含有するバリアントを製造しうる。これは該オリゴマー化合物の位置のいずれでも行いうる。これらの化合物をその後、ＧＣＣＲ  ｍＲＮＡの発現を低下させるそれらの能力を決定するために本明細書に記述される方法を使用して試験する。
【００７３】
オリゴマー化合物は核酸塩基（しばしば、複素環塩基若しくは単に「塩基」ともまた当該技術分野で称される）の修飾若しくは置換もまた包含し得る。本明細書で使用されるところの「未修飾」若しくは「天然の」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を包含する。「置換」は未修飾すなわち天然の塩基の別の未修飾すなわち天然の塩基での置き換えである。「修飾」核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、とりわけ５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンのような他の合成および天然の核酸塩基を意味している。さらなる修飾核酸塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換フェノキサジンシチジン（例えば９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド（４，５−ｂ）インドル−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド（３’，２’：４，５）ピロロ（２，３−ｄ）ピリミジン−２−オン）のようなＧ−クランプ（Ｇ−ｃｌａｍｐ）のような三環性ピリミジンを包含する。修飾核酸塩基は、プリン若しくはピリミジン塩基が他の複素環で置換されているもの、例えば７−デアザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンもまた包含しうる。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されるもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５８−８５９ページ、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３により開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、第１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒ���ｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９−３０２ページ、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．とＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３により開示されるものを包含する。これらの核酸塩基のあるものは、本発明の化合物の結合アフィニティーを増大させるのに適するとして当業者に既知である。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニンを包含するＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン、５−プロピルウラシルならびに５−プロピルシトシンを包含する。５−メチルシトシン置換は核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃増大させることが示されており、そして、なおより具体的には２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組合せられる場合に、現在適する塩基置換である。塩基の修飾は、核酸配列中の置換を生じさせるためのような化学修飾を伴わないことが当該技術分野で理解されている。
【００７４】
上に示される修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基のあるものの製造法を教示する代表的米国特許は、限定されるものでないが、上で示された米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに米国特許第４，８４５，２０５号；５，１３０，３０２号；５，１３４，０６６号；５，１７５，２７３号；５，３６７，０６６号；５，４３２，２７２号；５，４５７，１８７号；５，４５９，２５５号；５，４８４，９０８号；５，５０２，１７７号；５，５２５，７１１号；５，５５２，５４０号；５，５８７，４６９号；５，５９４，１２１号、５，５９６，０９１号；５，６１４，６１７号；５，６４５，９８５号；５，８３０，６５３号；５，７６３，５８８号；６，００５，０９６号；５，６８１，９４１号；および５，７５０，６９２号明細書を挙げることができる。
【００７５】
本発明のオリゴマー化合物は、天然に存在する複素環塩基部分の１個若しくはそれ以上の代わりに多環複素環化合物もまた包含し得る。多数の三環性複素環化合物が以前に報告されている。これらの化合物は、修飾鎖の標的鎖への結合特性を増大させるためのアンチセンスの応用で慣例に使用されている。最も研究された修飾はグアノシンを標的とし、これゆえにそれらはＧ−クランプ若しくはシチジンアナログと命名された。第二鎖中のグアノシンと３個の水素結合を作成する代表的シトシンアナログは、１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｋｕｒｃｈａｖｏｖら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９７、１６、１８３７−１８４６）、１，３−ジアザフェノチアジン−２−オン、（Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｙ．；Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｊ．；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５、１１７、３８７３−３８７４）および６，７，８，９−テトラフルオロ−１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｗａｎｇ，Ｊ．；Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｙ．，Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９８、３９、８３８５−８３８８）を包含する。オリゴヌクレオチドに組み込まれて、これらの塩基修飾は相補グアニンとハイブリダイズすることが示され、そして後者はアデニンとハイブリダイズし、かつ、拡大されたスタッキング相互作用によりらせんの熱安定性を高めることもまた示された（米国特許付与前公開第２００３０２０７８０４号および同第２００３０１７５９０６号明細書もまた参照されたい）。
【００７６】
さらなるらせん安定化特性が、柔軟性のない１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン足場構造に結合したアミノエトキシ部分をシトシンアナログ／代替物が有する場合に観察された（Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｙ．；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．
１９９８、１２０、８５３１−８５３２）。結合研究は、単一の取り込みが、５−メチルシトシン（ｄＣ５ｍｅ）に関して１８℃までのΔＴｍを伴い、モデルオリゴヌクレオチドのその相補標的ＤＮＡ若しくはＲＮＡへの結合アフィニティーを高め得ることを示し、これは単一修飾の高アフィニティー増強である。他方、らせん安定性の増大は該オリゴヌクレオチドの特異性を損なわない。
【００７７】
本発明での使用に従いやすいさらなる三環性複素環化合物およびそれらの使用方法は、米国特許第６，０２８，１８３号および同第６，００７，９９２号明細書に開示される。
【００７８】
それらの損なわれない配列特異性と一緒のフェノキサジン誘導体の高められた結合アフィニティーは、それらを、より強力なアンチセンスに基づく薬物の開発のための貴重な核酸塩基アナログにする。事実、フェノキサジン置換を含有するヘプタヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨを活性化し、細胞取り込みを高めかつ増大されたアンチセンス活性を表すことが可能であることを示す有望なデータがｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験から得られている（Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｙ；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８、１２０、８５３１−８５３２）。該活性増強は、単一置換が２０ｍｅｒの２’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を有意に向上することを示したため、Ｇ−クランプの場合になおより顕著であった（Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｗ．Ｍ．；Ｗｏｌｆ，Ｊ．Ｊ．；Ｏｌｓｏｎ，Ｐ．；Ｇｒａｎｔ，Ｄ．；Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｙ．；Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．Ｗ．；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９９、９６、３５１３−３５１８）。
【００７９】
複素環塩基として有用なさらなる修飾多環複素環化合物は、限定されるものでないが上で示された米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに米国特許第４，８４５，２０５号；５，１３０，３０２号；５，１３４，０６６号；５，１７３，２７３号；５，３６７，０６６号；５，４３２，２７２号；５，４３４，２５７号；５，４５７，１８７号；５，４５９，２５５号；５，４８４，９０８号；５，５０２，１７７号；５，５２５，７１１号；５，５５２，５４０号；５，５８７，４６９号；５，５９４，１２１号、５，５９６，０９１号；５，６１４，６１７号；５，６４５，９８５号；５，６４６，２６９号；５，７５０，６９２号；５，８３０，６５３号；５，７６３，５８８号；６，００５，０９６号；および５，６８１，９４１号；ならびに米国特許付与前公開第２００３０１５８４０３号明細書に開示される。
【００８０】
組合せ
本発明の組成物は２種若しくはそれ以上のオリゴマー化合物を含有し得る。別の関係する態様において、本発明の組成物は、第一の核酸を標的とする１種若しくはそれ以上のアンチセンス化合物、とりわけオリゴヌクレオチド、および第二の核酸標的を標的とする１種若しくはそれ以上の付加的なアンチセンス化合物を含有し得る。あるいは、本発明の組成物は、同一の核酸標的の異なる領域を標的とする２種若しくはそれ以上のアンチセンス化合物を含有し得る。２種若しくはそれ以上の組合せた化合物は一緒に若しくは連続して使用しうる。
【００８１】
併用療法
本発明の化合物は、本発明の１種若しくはそれ以上の化合物および状態を処置するための１種若しくはそれ以上の他の適する治療／予防的化合物を投与することにより付加的な効果が達成される併用療法で使用しうる。適する治療／予防的化合物（１種若しくは複数）は、限定されるものでないが血糖降下薬、抗肥満薬および脂質低下薬を挙げることができる。血糖降下薬は、限定されるものでないが、ホルモン、ホルモン模倣物若しくはインクレチン模倣物（例えば吸入インスリンを包含するインスリン、ＧＬＰ−１、またはリラグルチド若しくはエキセナチドのようなＧＬＰ−１アナログ）、ＤＰＰ（ＩＶ）阻害剤、スルホニル尿素（例えばアセトヘキサミド、クロルプロパミド、トルブタミド、トラザミド、グリメピリド、グリピジド、グリブリド若しくはグリクラジド）、ビグアニド（メトホルミン）、メグリチニド（例えばナテグリニド若しくはレパグリニド）、チアゾリジンジオン若しくは他のＰＰＡＲ−γアゴニスト（例えばピオグリタゾン若しくはロシグリタゾン）α−グルコシダーゼ阻害剤（例えばアカルボース若しくはミグリトール）、あるいはＧＣＧＲを標的としないアンチセンス化合物を挙げることができる。二重ＰＰＡＲアゴニスト（例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂにより開発されているムラグリタザール（ｍｕｒａｇｌｉｔａｚａｒ）、若しくはＡｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａにより開発されているテサグリタザル（ｔｅｓａｇｌｉｔａｚａｒ））もまた包含される。開発中の他の糖尿病処置（例えば、Ｎｏｖａｒｔｉｓにより開発されているＬＡＦ２３７；Ｍｅｒｃｋにより開発されているＭＫ−０４３１；若しくはＳａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓにより開発されているリモナバン（ｒｉｍｏｎａｂａｎｔ））もまた包含される。抗肥満薬は、限定されるものでないが、食欲抑制剤（例えばフェンテルミン若しくはＭｅｒｉｄｉａＴＭ）、オルリスタットのような脂肪吸収阻害剤（例えばＸｅｎｉｃａｌＴＭ）、および食欲を刺激する飢餓シグナルを阻害する改変された形態の毛様体神経栄養因子を挙げることができる。脂質低下薬は、限定されるものでないが、胆汁酸塩捕捉樹脂（例えばコレスチラミン、コレスチポールおよび塩酸コレセベラム）、ＨＭＧＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えばロバスタチン、プラバスタチン、アトロバスタチン、シンバスタチンおよびフルバスタチン）、ニコチン酸、フィブリン酸誘導体（例えばクロフィブラート、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、ベザフィブラートおよびシプロフィブラート）、プロブコール、ネオマイシン、デキストロチロキシン、植物スタノールエステル、コレステロール吸収阻害剤（例えばエゼチミブ）、ＣＥＴＰ阻害剤（例えばトルセトラピブおよびＪＴＴ−７０５）ＭＴＰ阻害剤（例えばインプリタピド（ｉｍｐｌｉｔａｐｉｄｅ））、胆汁酸輸送体の阻害剤（ａｐｉｃａｌ  ｓｏｄｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、肝ＣＹＰ７ａの調節物質、ＡＣＡＴ阻害剤（例えばＡｖａｓｉｍｉｂｅ）、エストロゲン補充治療薬（例えばタモキシゲン）、合成ＨＤＬ（例えばＥＴＣ−２１６）、抗炎症薬（例えばグルココルチコイド）、若しくはＧＣＧＲを標的としないアンチセ���ス化合物を挙げることができる。これらの薬物の１種若しくはそれ以上を、付加的な治療効果を達成するためにＧＣＧＲのアンチセンス阻害剤の１種若しくはそれ以上と組合せうる。
【００８２】
オリゴマー合成
修飾および未修飾ヌクレオチドのオリゴマー化は、ＤＮＡ（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ、Ａｇｒａｗａｌ編（１９９３）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）および／若しくはＲＮＡ（Ｓｃａｒｉｎｇｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００１）、２３、２０６−２１７。ＲＮＡ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ、Ｓｍｉｔｈ編（１９９８）中Ｇａｉｔら、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ＲＮＡ、１−３６。Ｇａｌｌｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００１）、５７、５７０７−５７１３）についての文献の手順、ならびに米国特許公開第ＵＳ２００５−０１６４２７１号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に従って慣例に実施し得る。
【００８３】
本発明のオリゴマー化合物は固相合成の公知の技術により便宜的かつ慣例に作成し得る。こうした合成の機器は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）を包含するいくつかの供給元により販売されている。当該技術分野で既知のこうした合成のいずれの他の手段も付加的に若しくは代替で使用しうる。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチドを製造するために類似の技術を使用することが公知である。
【００８４】
オリゴマーの精製および分析
オリゴヌクレオチドの精製および分析方法は当業者に既知である。分析方法はキャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびエレクトロスプレー質量分析を包含する。こうした合成および分析方法はマルチウェルプレートで実施し得る。
【００８５】
制限しない開示および引用することによる組込み
本発明のある種の化合物、組成物および方法をある態様に従って特殊性を伴い記述した一方、本明細書の実施例は本発明の化合物を具体的に説明するためのみにはたらき、そしてそれを制限することを意図していない。本出願で引用される参考文献、ＧＥＮＢＡＮＫ（Ｒ）受託番号などのそれぞれは、そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる。
【実施例１】
【００８６】
発現の調節のアッセイ
ＧＣＣＲ発現の調節は当該技術分野で既知の多様な方法でアッセイし得る。ＧＣＣＲ  ｍＲＮＡレベルは、例えばノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）若しくはリアルタイムＰＣＲにより定量し得る。ＲＮＡ分析は当該技術分野で既知の方法により全細胞ＲＮＡ若しくはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで実施し得る。ＲＮＡの単離方法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、ｐｐ．４．１．１−４．２．９および４．５．１−４．５．３、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９３に教示される。
【００８７】
ノーザンブロット分析は当該技術分野で慣例であり、そして、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、ｐｐ．４．２．１−４．２．９、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９６に教示される。リアルタイム定量的（ＰＣＲ）は、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティから入手可能かつ製造元の説明書に従って使用する、商業的に入手可能なＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ７７００配列検出装置を使用して便宜的に達成し得る。
【００８８】
ＧＣＣＲによりコードされるタンパク質のレベルは、免疫沈降法、ウエスタンブロット分析（イムノブロッティング）、ＥＬＩＳＡ若しくは蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）のような当該技術分野で公知の多様な方法で定量し得る。ＧＣＣＲによりコードされるタンパク質に向けられる抗体は、ＭＳＲＳ抗体カタログ（Ａｅｒｉｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミシガン州バーミンガム）のような多様な供給源から同定しかつ得ることができるか、若しくは慣習的抗体生成法を介して製造し得る。ポリクローナル抗血清の製造方法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、ｐｐ．１１．１２．１−１１．１２．９、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９７に教示される。モノクローナル抗体の製造法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、ｐｐ．１１．４．１−１１．１１．５、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９７に教示される。
【００８９】
免疫沈降法は当該技術分野で標準的であり、そして例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、ｐｐ．１０．１６．１−１０．１６．１１、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９８に見出し得る。ウエスタンブロット（イムノブロット）分析は当該技術分野で標準的であり、そして例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、ｐｐ．１０．８．１−１０．８．２１、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９７に見出し得る。酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）は当該技術分野で標準的であり、そして例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、ｐｐ．１１．２．１−１１．２．２２、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９１に見出し得る。
【００９０】
標的核酸発現に対する本発明のオリゴマー化合物の影響は多様な細胞型のいずれでも試験し得るが、但し、標的核酸が測定可能なレベルで存在する。標的核酸発現に対する本発明のオリゴマー化合物の影響は、例えばＰＣＲ若しくはノーザンブロット分析を使用して慣例で測定し得る。細胞株は正常組織および細胞型、ならびに多様な障害（例えば過剰増殖障害）と関連する細胞の双方に由来する。複数の組織および種由来の細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）、日本癌研究資源バンク（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｂａｎｋ）（東京）、若しくは応用微生物学研究センター（Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（英国ウィルトシャー州）から得ることができる。
【００９１】
初代細胞、すなわち動物から単離されかつ連続培養にかけられていない細胞は、当該技術分野で既知の方法に従って製造し得るか、若しくは多様な商業的供給元から得ることができる。加えて、初代細胞は臨床の設定でドナーヒト被験体（すなわち血液ドナー、外科手術患者）から得るものを包含する。
【００９２】
細胞型
標的核酸発現に対するオリゴマー化合物の影響はＨｅｐＧ２細胞および初代ラット肝細胞で試験した。
【００９３】
ＨｅｐＧ２細胞：
ヒト肝芽細胞腫細胞株ＨｅｐＧ２はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州マナサス）から得た。ＨｅｐＧ２細胞は、１０％ウシ胎児血清、１ｍＭ非必須アミノ酸および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充したイーグルＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）中で慣例に培養した。細胞は、それらがおよそ９０％コンフルエンスに達した場合にトリプシン処理および希釈により慣例に継代した。マルチウェル培養プレートは、１型ラット尾コラーゲン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ベッドフォード）のリン酸緩衝生理的食塩水中１００倍希釈で被覆することにより細胞培養のため準備する。コラーゲン含有プレートを３７℃でおよそ１時間インキュベートし、その後コラーゲンを除去しかつウェルをリン酸緩衝生理的食塩水で２回洗浄した。細胞を、オリゴマー化合物トランスフェクション実験での使用のため、およそ８，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３５３８７２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ベッドフォード）に播種した。
【００９４】
初代ラット肝細胞：
初代ラット肝細胞は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ（マサチューセッツ州ウィルミントン）から購入したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから調製し、そして１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）、１ｍＬあたり１００単位のペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）を補充した高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）中で慣例に培養する。細胞を、およそ４，０００〜６，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３５３８７２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ベッドフォード）に播種する本発明のオリゴマー化合物での処理。
【００９５】
オリゴマー化合物での処理
細胞が適切なコンフルエンシーに達した場合に、記述されるところのトランスフェクション法を使用してそれらをオリゴヌクレオチドで処理した。当該技術分野で既知の他の適するトランスフェクション試薬は、限定されるものでないがＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭおよびＦＵＧＥＮＥＴＭを挙げることができる。当該技術分野で既知の他の適するトランスフェクション法は限定されるものでないが電気穿孔法を挙げることができる。
【００９６】
ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ
細胞が６５〜７５％コンフルエンシーに達した場合にそれらをオリゴヌクレオチドで処理する。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの所望の濃度、および１００ｎＭオリゴヌクレオチドあたり２．５若しくは３μｇ／ｍＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ濃度を達成するように、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＴＭ−１減血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）中でＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）と混合する。このトランスフェクション混合物を室温でおよそ０．５時間インキュベートする。９６ウェルプレート中で増殖する細胞について、ウェルを１００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭＴＭ−１で１回洗浄し、そしてその後１３０μＬのトランスフェクション混合物で処理する。２４ウェルプレート若しくは他の標準的組織培養プレートで増殖する細胞は、適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して同様に処理する。２検体若しくは３検体で細胞を処理しかつデータを得る。３７℃でおよそ４〜７時間の処理後に、トランスフェクション混合物を含有する培地を新鮮培地で置き換える。オリゴヌクレオチド処理の１６〜２４時間後に細胞を収集する。
【００９７】
ＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮＴＭ
細胞が６５〜７５％コンフルエンシーに達した場合にそれらをオリゴヌクレオチドで処理する。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの所望の濃度、および１００ｎＭオリゴヌクレオチドあたり２若しくは４μｇ／ｍＬのＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮＴＭ濃度を達成するように、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＴＭ−１減血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）中でＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）と混合する。このトランスフェクション混合物を室温でおよそ０．５時間インキュベートする。９６ウェルプレート中で増殖する細胞について、ウェルを１００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭＴＭ−１で１回洗浄し、そしてその後１３０μＬのトランスフェクション混合物で処理する。２４ウェルプレート若しくは他の標準的組織培養プレートで増殖する細胞は、適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して同様に処理する。２検体若しくは３検体で細胞を処理しかつデータを得る。３７℃でおよそ４〜７時間の処理後に、トランスフェクション混合物を含有する培地を新鮮培地で置き換える。オリゴヌクレオチド処理の１６〜２４時間後に細胞を収集する。
【００９８】
対照オリゴヌクレオチド
対照オリゴヌクレオチドは特定の細胞株の至適のオリゴマー化合物濃度を決定するために使用する。さらに、本発明のオリゴマー化合物をオリゴマー化合物スクリーニング実験若しくは表現型アッセイで試験する場合、対照オリゴヌクレオチドを本発明の化合物と同時に試験する。いくつかの態様において、対照オリゴヌクレオチドを陰性対照オリゴヌクレオチド、すなわち遺伝子発現若しくは表現型に対する影響の非存在を測定するための手段として使用する。代替の態様において、対照オリゴヌクレオチドを陽性対照オリゴヌクレオチド、すなわち遺伝子発現若しくは表現型に影響を及ぼすことが既知のオリゴヌクレ
オチドとして使用する。対照オリゴヌクレオチドを表２に示す。「標的名」は該オリゴヌクレオチドが標的とする遺伝子を示す。「標的の種」は該オリゴヌクレオチドが標的ｍＲＮＡに完全に相補的である種を示す。「モチーフ」は該オリゴヌクレオチドを含んでなる化学的に別個の領域を示す。表２のある化合物は、「ウイング」により双方の側（５’および３’）で隣接されている２’−デオキシヌクレオチドよりなる中央の「ギャップ」領域から構成されるキメラオリゴヌクレオチドである。ウイングは、２’−ＭＯＥヌクレオチドとしてもまた知られる２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドから構成される。各ギャップマーオリゴヌクレオチドの「モチーフ」は表２に具体的に説明され、そして各ギャップ領域およびウイングのヌクレオチドの数を示し、例えば、「５−１０−５」は５ヌクレオチドのウイングにより隣接された１０ヌクレオチドのギャップ領域を有するギャップマーを示す。ＩＳＩＳ  ２９８４８は無作為化オリゴマー化合物の混合物であり、その配列は表２に示し、ここでＮはＡ、Ｔ、Ｃ若しくはＧであり得る。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は表２のオリゴヌクレオチド全体でホスホロチオエートである。未修飾のシトシンはヌクレオチド配列中で「Ｃ」により示し；全部の他のシトシンは５−メチルシトシンである。
【００９９】
【表２】
2009508527.tif 000003
【０１００】
使用されるオリゴヌクレオチドの濃度は細胞株ごとに変動する。特定の１細胞株の至適のオリゴヌクレオチド濃度を決定するため、細胞をある範囲の濃度の陽性対照オリゴヌクレオチドで処理する。陽性対照は表２に示す。例えば、ヒトおよびヒト以外の霊長類の細
胞について、陽性対照オリゴヌクレオチドはＩＳＩＳ  ３３６８０６若しくはＩＳＩＳ  １８０７８から選択しうる。マウスおよびラット細胞について、陽性対照オリゴヌクレオチドは例えばＩＳＩＳ  １５７７０でありうる。ＩＳＩＳ  １５７７０に対する標的ｍＲＮＡ、例えばラットＲａｆキナーゼＣの８０％低下をもたらす陽性対照オリゴヌクレオチドの濃度をその後、その細胞株の後の実験での新たなオリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として利用する。８０％低下が達成されない場合は、標的ｍＲＮＡの６０％低下をもたらす陽性対照オリゴヌクレオチドの最低濃度をその後、その細胞株の後の実験でのオリゴヌクレオチドスクリーニング濃度として利用する。６０％低下が達成されない場合は、その特定の細胞株はオリゴヌクレオチドトランスフェクション実験に不適と思われる。本明細書で使用するアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、リポソーム試薬を使用して該アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトする場合に５０ｎＭから３００ｎＭまで、および電気穿孔法により該アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトする場合に１μＭないし４０μＭである。
【実施例２】
【０１０１】
ＧＣＣＲ  ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量的ＰＣＲ分析
ＧＣＣＲ  ｍＲＮＡレベルの定量は、製造元の説明書に従ってＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ
７６００、７７００若しくは７９００配列検出装置（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用するリアルタイム定量的ＰＣＲにより達成した。
【０１０２】
ＲＴ、リアルタイムＰＣＲにより得られる遺伝子標的量は、その発現が一定である遺伝子ＧＡＰＤＨの発現レベルを使用して、若しくはＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．オレゴン州ユージーン）を使用して全ＲＮＡを定量することによるかのいずれかで正規化した。全ＲＮＡはＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ  ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．オレゴン州ユージーン）を使用して定量した。１７０μＬのＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ作業試薬（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５で３５０倍希釈したＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ試薬）を、３０μＬの精製した細胞ＲＮＡを含有する９６ウェルプレートにピペットで移した。４８５ｎｍの励起および５３０ｎｍの測定を用いてＣｙｔｏＦｌｕｏｒ  ４０００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で該プレートを読取った。
【０１０３】
ＧＡＰＤＨ発現は、標的の定量と同時に若しくは別個にのいずれかでＲＴ、リアルタイムＰＣＲにより定量した。標的レベルの測定と同時の測定のため、測定されている標的遺伝子に特異的なプライマー−プローブ組を、定量的ＰＣＲ分析の前に、ＧＡＰＤＨ増幅反応で「多重化される（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ）」それらの能力について評価した。多重化は単一チューブ中の複数のＤＮＡ種（この場合は標的および内因性ＧＡＰＤＨ対照）の検出を指し、これはＧＡＰＤＨのプライマー−プローブ組が標的の増幅を妨害しないことを必要とする。
【０１０４】
リアルタイムＰＣＲでの使用のためのプローブおよびプライマーは標的特異的配列にハイブリダイズするよう設計した。プライマーおよびプローブの設計方法は当該技術分野で既知である。リアルタイムＰＣＲでの使用のためのプライマーおよびプローブの設計は、商業的に入手可能なソフトウェア、例えばＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｒ）、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティを使用して実施し得る。該プライマーおよびプローブ、ならびにそれらがハイブリダイズする標的核酸配列を表４に提示する。標的特異的ＰＣＲプローブは、５’端に共有結合されたＦＡＭおよび３’端に共有結合されたＴＡＭＲＡ若しくはＭＧＢを有し、ここでＦＡＭは蛍光色素でありかつＴＡＭＲＡおよびＭＧＢはクエンチャー色素である。
【０１０５】
単離後に、ＲＮＡを連続逆転写（ＲＴ）反応およびリアルタイムＰＣＲ（その双方は同一ウェル中で実施する）にかける。ＲＴおよびＰＣＲ試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州カールズバッド）から得た。ＲＴ、リアルタイムＰＣＲは、２０μＬのＰＣＲカクテル（ＭｇＣｌ２を除く２．５×ＰＣＲ緩衝液、６．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３７５μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰのそれぞれ、３７５ｎＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマーのそれぞれ、１２５ｎＭのプローブ、４単位のＲＮＡアーゼ阻害剤、１．２５単位のＰＬＡＴＩＮＵＭ（Ｒ）Ｔａｑ、５単位のＭｕＬＶ逆転写酵素、ならびに２．５×ＲＯＸ色素）を、３０μＬの全ＲＮＡ溶液（２０〜２００ｎｇ）を含有する９６ウェルプレートに添加することにより同一で実施した。ＲＴ反応は４８℃で３０分間のインキュベーションにより実施した。ＰＬＡＴＩＮＵＭ（Ｒ）Ｔａｑを活性化するための９５℃での１０分インキュベーション後に、４０サイクルの２段階ＰＣＲプロトコルを実施した。すなわち９５℃１５秒間（変性）次いで６０℃１．５分間（アニーリング／伸長）。
【０１０６】
本発明の化合物は、ヒトＧＣＣＲにハイブリダイズするよう設計したプライマー−プローブ組を使用する本明細書の他の実施例で記述されるところの定量的リアルタイムＰＣＲにより、ヒト標的ｍＲＮＡレベルに対するそれらの影響について評価した。例えば：
フォワードプライマー：ＴＴＧＡＣＡＴＴＴＴＧＣＡＧＧＡＴＴＴＧＧＡ（配列番号１７として本明細書に組み込まれる）
リバースプライマー：ＣＣＡＡＧＧＡＣＴＣＴＣＡＴＴＣＧＴＣＴＣＴＴＴ（配列番号１８として本明細書に組み込まれる）
およびＰＣＲプローブ：
ＦＡＭ−ＴＴＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＣＣ−ＭＧＢ（配列番号１９として本明細書に組み込まれる）、ここでＦＡＭは蛍光色素でありかつＭＧＢは非蛍光のクエンチャー色素である。
【０１０７】
本発明の化合物は、ラットＧＣＣＲにハイブリダイズするよう設計したプライマー−プローブ組を使用する本明細書の他の実施例で記述されるところの定量的リアルタイムＰＣＲにより、ラット標的ｍＲＮＡレベルに対するそれらの影響について評価した。例えば：フォワードプライマー：ＡＡＡＣＡＡＴＡＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＡＴＴＡＣＣ（配列番号２０として本明細書に組み込まれる）
リバースプライマー：ＣＡＴＡＣＡＡＣＡＣＣＴＣＧＧＧＴＴＣＡＡＴＣ（配列番号２１として本明細書に組み込まれる）
およびＰＣＲプローブ：
ＦＡＭ−ＡＣＣＣＣＴＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴＣＡＣＴＧＣＴ−ＴＡＭＲＡ（配列番号２２として本明細書に組み込まれる）、ここでＦＡＭは蛍光色素でありかつＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。
【０１０８】
本発明の化合物は、マウスＧＣＣＲにハイブリダイズするよう設計したプライマー−プローブ組を使用する本明細書の他の実施例で記述されるところの定量的リアルタイムＰＣＲにより、マウス標的ｍＲＮＡレベルに対するそれらの影響について評価した。例えば：フォワードプライマー：ＧＡＣＡＴＣＴＴＧＣＡＧＧＡＴＴＴＧＧＡＧＴＴ（配列番号２３として本明細書に組み込まれる）
リバースプライマー：ＡＡＣＡＧＧＴＣＴＧＡＣＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＴ（配列番号２４として本明細書に組み込まれる）
およびＰＣＲプローブ：
ＦＡＭ−ＣＧＧＧＴＣＣＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＡＧＡＣＡＡＡＣＧＡ−ＴＡＭＲＡ（配列番号２５として本明細書に組み込まれる）、ここでＦＡＭは蛍光色素でありかつＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。
【実施例３】
【０１０９】
５−１０−５ギャップマーによるヒトＧＣＣＲ発現のアンチセンス阻害
一連のオリゴマー化合物を、表１に引用される公表された配列を使用して、ヒトＧＣＣＲの多様な領域を標的とするよう設計した。該化合物を表３に示す。表３の全化合物は、５ヌクレオチドの「ウイング」により双方の側（５’および３’）で隣接されている１０個の２’−デオキシヌクレオチドよりなる中央「ギャップ」領域から構成される長さ２０ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウイングは、２’−ＭＯＥヌクレオチドとしてもまた知られる２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は該オリゴヌクレオチド全体でホスホロチオエートである。全部のシチジン残基は５−メチルシチジンである。該オリゴヌクレオチドの配列、および該化合物が結合する標的配列上の第一（最も５’）の位置である標的部位を表３に示す。該化合物を、ヒトＧＣＣＲにハイブリダイズするよう設計したプライマー−プローブ組を使用する本明細書の他の実施例に記述されるところの定量的リアルタイムＰＣＲにより、遺伝子標的のｍＲＮＡレベルに対するそれらの影響について分析した。
【０１１０】
データは、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭを使用して、開示されるオリゴマー化合物５０ｎＭでＨｅｐＧ２細胞を処理した３回の実験からの平均である。発現の減少は表３で阻害パーセントとして表す。存在する場合、「Ｎ．Ｄ．」は「測定されず」を示す。これらのオリゴマー化合物がそれに対し阻害性である標的領域は、本明細書で「有効標的セグメント」と称する。
【０１１１】
【表３】
2009508527.tif 000004
【０１１２】
【表４】
2009508527.tif 000005
【０１１３】
ＧＣＣＲ発現を最低３０％低下した、表３に示される５−１０−５ギャップマーオリゴヌクレオチドが好ましい。これらの好ましい配列が相補的である標的セグメントは、本明
細書で「好ましい標的セグメント」と称され、そして従って本発明の化合物により標的とするのに好ましい。本発明の別の局面は、配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２若しくは１１３の８核酸塩基部分を含んでなる、ＧＣＣＲを標的とするアンチセンス化合物であり、前記化合物はＧＣＣＲと特異的にハイブリダイズしかつその発現を低下する。一態様において、アンチセンス化合物は、その５’および３’端で５個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１０デオキシヌクレオチド領域を特徴とする長さ２０核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一態様において、ヌクレオシド間結合の全部がホスホロチオエート結合である。一態様において、シトシンの全部が５−メチルシトシンである。
【実施例４】
【０１１４】
ギャップ拡張オリゴヌクレオチドによるヒトＧＣＣＲ発現のアンチセンス阻害
本発明により、表４に記述される化合物と同一の配列を有するギャップ拡張オリゴヌクレオチドもまた試験した。表４の全化合物は、双方の側（５’および３’）で２ヌクレオチドの「ウイング」により隣接されている１６個の２’−デオキシヌクレオチドよりなる中央の「ギャップ」領域から構成される長さ２０ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウイングは２’−ＭＯＥヌクレオチドとしてもまた知られる２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は該オリゴヌクレオチド全体でホスホロチオエートである。全部のシチジン残基は５−メチルシチジンである。該オリゴヌクレオチドの配列、および該化合物が結合する標的配列上の第一（最も５’）の位置である標的部位を表４に示す。２−１６−２モチーフの化合物を、本明細書に記述されるところの定量的リアルタイムＰＣＲにより遺伝指標的ｍＲＮＡレベルに対するそれらの影響について分析した。
【０１１５】
データは、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭを使用して、開示されるオリゴマー化合物５０ｎＭでＨｅｐＧ２細胞を処理した３回の実験からの平均である。発現の減少は表４で阻害パーセントとして表す。存在する場合、「Ｎ．Ｄ．」は「測定されず」を示す。これらのオリゴマー化合物がそれに対し阻害性である標的領域は、本明細書で「有効標的セグメント」と称される。
【０１１６】
【表５】
2009508527.tif 000006
【０１１７】
【表６】
2009508527.tif 000007
【０１１８】
ＧＣＣＲ発現を最低３０％低下した、表４に示される２−１６−２オリゴヌクレオチドが好ましい。これらの好ましい配列が相補的である標的セグメントは、本明細書で「好ま
しい標的セグメント」と称され、そして従って本発明の化合物により標的とするのに好ましい。
【０１１９】
本発明の別の局面は、配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２若しくは１１３の８核酸塩基部分を含んでなる、ＧＣＣＲを標的とするアンチセンス化合物であり、前記化合物はＧＣＣＲと特異的にハイブリダイズしかつその発現を低下する。一態様において、アンチセンス化合物は、その５’および３’端で２個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで隣接された１６デオキシヌクレオチドの領域を特徴とする長さ２０核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一態様において、ヌクレオシド間結合の全部がホスホロチオエート結合である。一態様において、シトシンの全部が５−メチルシトシンである。
【実施例５】
【０１２０】
ＧＣＣＲを標的とする異種間（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ）オリゴヌクレオチド
前の実施例に記述される数種のオリゴヌクレオチドは種を横断して相補的であり、そして従って種を横断してグルココルチコイド受容体の発現を低下することが期待される。こうした異種間オリゴヌクレオチドの配列、ならびに該オリゴヌクレオチドの５−１０−５モチーフバージョンおよび２−１６−２モチーフバージョンのＩＳＩＳ番号を表５に示す。該化合物が結合するヒト標的配列（ＮＭ＿０００１７６．１、配列番号１として本明細書に組み込まれる）上の第一（最も５’）の位置である標的部位もまた各配列について示す。ヒト、カニクイザル、ラットおよびマウスＧＣＣＲ  ｍＲＮＡに対する相補性を示す（「ｙｅｓ」は完全な相補性を意味し、そして「１ｍｍ」は完全な相補性からの１個の塩基対不適正を意味している）。
【０１２１】
【表７】
2009508527.tif 000008
【実施例６】
【０１２２】
ヒトおよびラットＧＣＣＲ  ｍＲＮＡレベルのアンチセンス阻害−５−１０−５ギャップマーでの用量応答試験
本発明のさらなる一態様において、１１種のオリゴヌクレオチドを付加的な用量応答試験に選択した。初代ラット肝細胞を、５、１０、２５、５０、１００若しくは２００ｎＭのＩＳＩＳ  １８０２７４、ＩＳＩＳ  １８０２７５、ＩＳＩＳ  １８０２７６、ＩＳＩＳ  １８０２８１、ＩＳＩＳ  １８０３０４、ＩＳＩＳ  ３６１１３７、ＩＳＩＳ  ３６１１４１、ＩＳＩＳ  ３６１１５１、ＩＳＩＳ  ３６１１５６、ＩＳＩＳ  ３４５１９８、ＩＳＩＳ  ３６１１３７、若しくは陰性対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ  １４１９２３（ＣＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＧＧＴＴＣＣＴＣＣ、配列番号１１４として本明細書に組み込まれる）で処理し、そしてｍＲＮＡレベルを本明細書の他の実施例に記述されるとおり測定した。ＩＳＩＳ  １４１９２３は、２’−ＭＯＥウイングにより隣接された１０デオキシヌクレオチドのギャップ、およびホスホロチオエートバックボーンを含んでなる５−１０−５ギャップマーである。全部のシトシンは５−メチルシトシンである。それに対しデータを正規化した未処理細胞が対照としてはたらいた。
【０１２３】
これらの試験の結果を表６に示す。標的ｍＲＮＡレベルは本明細書に記述されるところのリアルタイムＰＣＲにより測定した。データは３回の実験からの平均であり、そして未処理対照に関する阻害パーセントとして表す。
【０１２４】
【表８】
2009508527.tif 000009
【０１２５】
本発明のさらなる一態様において、同一オリゴヌクレオチドを、示される用量でのＧＣＣＲ  ｍＲＮＡ発現を低下するそれらの能力について、ヒトＨｅｐＧ２細胞株で試験した。それに対しデータを正規化した未処理細胞が対照としてはたらいた。
【０１２６】
これらの試験の結果を表７に示す。標的ｍＲＮＡレベルは本明細書に記述されるところのリアルタイムＰＣＲにより測定した。データは３回の実験からの平均であり、そして未処理対照に関する阻害パーセントとして表す。
【０１２７】
【表９】
2009508527.tif 000010
【０１２８】
表６および表７に示されるとおり、ＧＣＣＲを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトおよびラット双方の標的ｍＲＮＡレベルの低下で用量依存性の様式で有効である。
【実施例７】
【０１２９】
ラットＧＣＣＲ  ｍＲＮＡレベルのアンチセンス阻害−５−１０−５ギャップマーでのｉｎ  ｖｉｖｏ用量応答試験
５−１０−５ギャップマーモチーフのオリゴヌクレオチドの５種（ＩＳＩＳ  １８０２８１、ＩＳＩＳ  ３６１１３７、ＩＳＩＳ  ３４５１９８、ＩＳＩＳ  １８０３０４およびＩＳＩＳ  ３６１１４１）を、肝のＧＣＣＲ  ｍＲＮＡレベルを低下させるそれらの能力についてラットで多様な用量で評価した。８週齢のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを処置群に分割し、それらは１種の指定されるオリゴヌクレオチドの５０、２５もしくは１２．５ｍｇ／ｋｇの用量を注入を介して受領した。各処置群は４動物から構成され、そして週２回３週間投与した。生理的食塩水単独を注入した動物が対照群としてはたらいた。動物は標準的血液パラメータ（ＡＬＴ／ＡＳＴ、コレステロール、トリグリセリドおよびグルコース）について週１回評価した。動物を試験の終了時に殺し、そして肝組織を収集し、かつ本明細書に記述されるリアルタイムＰＣＲ分析法を使用して標的の減少について分析した。結果を、示される用量の示されるオリゴヌクレオチドで処置後に測定したＧＣＣＲ  ｍＲＮＡの減少パーセントとして、表８ａおよび８ｂ（別個の実験）に示す。
【０１３０】
【表１０】
2009508527.tif 000011
【０１３１】
【表１１】
2009508527.tif 000012
【０１３２】
表８ａおよび８ｂのデータは、ＧＣＣＲを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの発現の低下で用量依存性の様式で有効であることを示す。ＩＳＩＳ  ３４５１９８（ＧＴＣＡＡＡＧＧＴＧＣＴＴＴＧＧＴＣＴＧ；配列番号３７）を、ギャップの至適化を焦点とする構造活性実験でのさらなる評価のため選んだ。この化合物は、マウス、ラット、ヒト、サル、ウサギおよびモルモットのグルココルチコイド受容体ＲＮＡに完全に相補的である。
【実施例８】
【０１３３】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＣＣＲ  ｍＲＮＡレベルのアンチセンス阻害−ギャップ至適化試験
変動する大きさのデオキシヌクレオチドギャップおよび２’−ＭＯＥウイングをもつ一連のオリゴマー化合物を、ＧＣＣＲを標的とするよう設計した。試験したオリゴヌクレオチドのそれぞれは同一の核酸塩基配列（ＧＴＣＡＡＡＧＧＴＧＣＴＴＴＧＧＴＣＴＧ、配列番号３７として本明細書に組み込まれる）を有し、そして従って配列番号１の同一セグメント（核酸塩基６８９ないし７０９）を標的とする。実施例５に示されるとおり、本オリゴヌクレオチドはラットＧＣＣＲにもまた完全に相補的である。
【０１３４】
該化合物を表９に示す。標準文字はデオキシヌクレオチドを示し、そして核酸塩基は太字で示し、下線を付けた文字は２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドである。ヌクレオシド間結合は全体でホスホロチオエートであり、そして全部のシトシンは５−メチルシトシンである。該オリゴヌクレオチドを含んでなる化学的に別個の領域を示す各化合物の「モチーフ」を表９に示す。
【０１３５】
【表１２】
2009508527.tif 000013
【０１３６】
９週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄性ラットを、５０、２５、１２．５および６．２５ｍｇ／ｋｇの用量の表９に提示されるオリゴヌクレオチドで週２回３週間処置した。生理的食塩水単独を注入した動物が対照としてはたらいた。各処置群は４動物から構成され、そして動物は血漿トランスアミナーゼ、脂質、グルコース濃度および体重増加について週１回モニターした。正常動物について期待されたとおり、グルコースの実質的変化は観察されなかった。基礎（処置の開始前）の血漿コレステロール（ＣＨＯＬ）およびトリグリセリド（ＴＲＩＧ）濃度ならびに第３週に測定した濃度を、各処置群の平均として表１０にｍｇ／ｄＬで示す。
【０１３７】
【表１３】
2009508527.tif 000014
【０１３８】
表１０に示されるとおり、ＧＣＣＲを標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置は、コレステロールおよびトリグリセリド濃度の用量依存性の低下を引き起こした。従って、本発明の一態様は、動物にギャップ拡張オリゴヌクレオチドを投与することを含んでなる前記動物での血中脂質濃度の低下方法である。好ましい一態様において、ギャップ拡張オリゴヌクレオチドは配列番号３７の配列を有する。他の好ましい態様において、ギャップ拡張オリゴヌクレオチドはＩＳＩＳ  ３７２３３９、ＩＳＩＳ  ３７７１３０若しくはＩＳＩＳ  ３７７１３１である。
【０１３９】
試験の終了時に動物を殺し、臓器重量を測定し、そして標的の減少およびオリゴヌクレオチド濃度の測定のため組織を収集した。
【０１４０】
白色脂肪組織を、本明細書に記述されるリアルタイムＰＣＲ分析法を使用して、標的の減少について分析した。結果を、示される用量の示されるオリゴヌクレオチドでの処置後に測定したＧＣＣＲのｍＲＮＡの減少パーセントとして表１１ａ、１１ｂおよび１１ｃ（別個の実験）に示す。各ギャップ拡張オリゴヌクレオチドで処置した動物からの組織を、比較のための５−１０−５モチーフオリゴヌクレオチドで処置した動物からの組織と一緒に、標的の減少についてアッセイした。
【０１４１】
【表１４】
2009508527.tif 000015
【０１４２】
【表１５】
2009508527.tif 000016
【０１４３】
【表１６】
2009508527.tif 000017
【０１４４】
肝組織もまた、本明細書に記述されるリアルタイムＰＣＲ分析法を使用して、標的の減少について分析した。結果を、示される用量の示されるオリゴヌクレオチドでの処置後に測定したＧＣＣＲのｍＲＮＡの減少パーセントとして表１２ａ、１２ｂおよび１２ｃ（別個の実験）に示す。各ギャップ拡張オリゴヌクレオチドで処置した動物からの組織を、比較のための５−１０−５モチーフオリゴヌクレオチドで処置した動物からの組織と一緒に、標的の減少についてアッセイした。
【０１４５】
【表１７】
2009508527.tif 000018
【０１４６】
【表１８】
2009508527.tif 000019
【０１４７】
【表１９】
2009508527.tif 000020
【０１４８】
表１１ａ、１１ｂおよび１１ｃに示されるとおり、試験したギャップ拡張オリゴヌクレオチドの全部が、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＣＣＲ濃度の低下で用量依存性の様式で有効であった。加えて、ギャップ拡張オリゴヌクレオチドは、肝で５−１０−５ギャップマーより大きい効力への傾向を示す。
【０１４９】
加えて、薬物動態に対するギャップの大きさを変えることの影響を決定するため、腎および肝のオリゴヌクレオチド濃度を測定した。組織中のオリゴヌクレオチド濃度の測定方法は当該技術分野で既知である（Ｇｅａｒｙら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９９、２７４、２４１−２４８）。全オリゴヌクレオチドは組織中で検出される全オリゴヌクレオチド代謝物の総和である。示される濃度の示されるオリゴヌクレオチドで処置した動物の肝の全濃度および完全長オリゴヌクレオチドの濃度（μｇ／ｇで）を表１２に示す。
【０１５０】
【表２０】
2009508527.tif 000021
【０１５１】
表１２に示されるとおり、肝の完全長オリゴヌクレオチドの濃度は、ＩＳＩＳ  ３７２３３９およびＩＳＩＳ  ３７７１３０について、ＩＳＩＳ  ３４５１９８と比較して比較可能であるか若しくは低下される。表１１に示されるところの標的の減少と結合して、これらのデータは、ギャップ拡張化合物の高められた効力が肝での該化合物の高められた蓄積によらないことを示す。従って、本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、標的組織での該化合物の高められた蓄積を伴わずに、対応する５−１０−５ギャップマーまでの標的の減少に関する高められた若しくは比較可能な効力を示すギャップ拡張オリゴヌクレオチドを包含する。いくつかの態様において、標的組織は脂肪であり、そしていくつかの態様において、標的組織は肝である。
【配列表】
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【国際調査報告】
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2009508527.tif 000023
2009508527.tif 000024
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