(57)【要約】本発明は、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）を備える新規組成物、および多剤耐性を伴う、または伴わないアルファフェトプロテイン受容体（ＡＦＰＲ）を発現する悪性新生物を予防、治療、または抑制するための方法に関する。外因性ＡＦＰと、ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ９活性剤、カスパーゼ３活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも１つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物であって、少なくとも１つのアポトーシス誘導剤は、外因性ＡＦＰに可逆的に結合する、組成物を提供する。また本発明は、初期発生の期間に抽出される血液および羊水から得られるブタアルファフェトプロテインのブタノール抽出のための過程も提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）と、
ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ９活性剤、カスパーゼ３活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも１つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物であって、
前記少なくとも１つのアポトーシス誘導剤は、前記外因性ＡＦＰに可逆的に結合する、組成物。
【請求項２】
前記外因性ＡＦＰに可逆的に結合する２つのアポトーシス誘導剤が存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記アポトーシス誘導剤は、アトラクチロシド、ベツリン酸、タプシガルギン、ロテノン、ピエリシジンＡ、ロニダミン、ＣＤ４３７、三酸化ヒ素、Ａ２３１８７、イオノマイシン、ビタミンＤ２およびＤ３、デキサメタゾン、およびＡｃｃｕｔａｎｅを備える群より選択される、請求項１または２のいずれかに記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物の前記ＡＦＰは、細胞表面に少なくとも１つのＡＦＰ受容体を有する細胞に特異的に結合する、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記ＡＦＰは、ブタＡＦＰである、請求項１から４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記ブタＡＦＰは、妊娠約３週から約１４週のブタ胚から抽出される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は、経口投薬用のカプセル、ソフトゲル、または錠剤；坐薬；注射剤；吸入処方；点鼻薬；点眼薬；包帯；塗布薬；または局所製剤の形態である、請求項１から６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
哺乳類において、ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ９活性剤、カスパーゼ３活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも１つのアポトーシス誘導剤を、細胞表面に少なくとも１つのＡＦＰ受容体を有する癌細胞に送達するための外因性ＡＦＰの使用であって、前記少なくとも１つのアポトーシス誘導剤は、前記外因性ＡＦＰに可逆的に結合し、前記外因性ＡＦＰは、前記少なくとも１つのＡＦＰ受容体に特異的に結合する、使用。
【請求項９】
哺乳類において、少なくとも１つのアポトーシス誘導剤を、細胞表面に少なくとも１つのＡＦＰ受容体を有する癌細胞に標的化送達するための薬剤の調製における、
外因性アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）と、
ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ９活性剤、カスパーゼ３活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも１つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物の使用であって、
前記少なくとも１つのアポトーシス誘導剤は、前記外因性ＡＦＰに可逆的に結合し、前記外因性ＡＦＰは、前記少なくとも１つのＡＦＰ受容体に特異的に結合する、使用。
【請求項１０】
哺乳類の癌細胞の増殖の抑制のための、
外因性アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）と、
ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ９活性剤、カスパーゼ３活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも１つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物の使用であって、
前記癌細胞は細胞表面に少なくとも１つのＡＦＰ受容体を有し、前記少なくとも１つのアポトーシス誘導剤は、前記外因性ＡＦＰに可逆的に結合し、前記外因性ＡＦＰは、前記細胞表面上の前記少なくとも１つのＡＦＰ受容体に特異的に結合する、使用。
【請求項１１】
難治性悪性新生物における多剤耐性を治療するための、
外因性アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）と、
ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ９活性剤、カスパーゼ３活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも１つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物の使用であって、
前記難治性悪性新生物は、細胞表面に少なくとも１つのＡＦＰ受容体を有する癌細胞から成り、前記少なくとも１つのアポトーシス誘導剤は、前記外因性ＡＦＰに可逆的に結合し、前記外因性ＡＦＰは、前記細胞表面上の前記少なくとも１つのＡＦＰ受容体に特異的に結合する、使用。
【請求項１２】
哺乳類の癌細胞増殖を抑制する方法であって、前記癌細胞は細胞表面に少なくとも１つのＡＦＰ受容体を有し、前記方法は、
外因性ＡＦＰと、
ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ９活性剤、カスパーゼ３活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも１つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物の治療的有効量を、哺乳類に投与するステップを備え、
前記少なくとも１つのアポトーシス誘導剤は、前記外因性ＡＦＰに可逆的に結合し、前記外因性ＡＦＰは、前記細胞表面上の前記少なくとも１つのＡＦＰ受容体に特異的に結合する、方法。
【請求項１３】
難治性悪性新生物における多剤耐性を治療する方法であって、前記難治性悪性新生物は、細胞表面に少なくとも１つのＡＦＰを有する癌細胞を備え、
外因性ＡＦＰと、
ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ９活性剤、カスパーゼ３活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも１つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物の治療的有効量を、哺乳類に投与するステップを備え、
前記少なくとも１つのアポトーシス誘導剤は、前記外因性ＡＦＰに可逆的に結合し、前記外因性ＡＦＰは、前記細胞表面上の前記少なくとも１つのＡＦＰ受容体に特異的に結合する、方法。
【請求項１４】
（ａ）妊娠約３週から約１４週のブタ胚から血液および羊水を採取するステップと、
（ｂ）（ａ）で採取される前記血液および前記羊水を浮遊物および沈殿物に分離するステップと、
（ｃ）（ｂ）に起因する前記浮遊物を採取するステップと、
（ｄ）濃縮溶液を形成するように（ｃ）に起因する前記浮遊物を濃縮するステップと、
（ｅ）溶液中で約５％から約１０％のブタノールの最終濃度まで、（ｄ）の前記濃縮溶液にブタノールを添加するステップと、
（ｆ）（ｅ）に起因する前記ブタノール溶液を攪拌するステップと、
（ｇ）（ｆ）に起因する前記ブタノール溶液を、上層非水相および下層水相に分離するステップと、
（ｈ）非結合ブタＡＦＰを含む最終溶液を生成するように（ｇ）に起因する前記非水相を採取するステップ、
といった順次的なステップを備える、ブタノールを使用した、原料からのブタＡＦＰの抽出のための過程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願書は、内容がその全体において参照することにより本願に組み込まれる、米国特許第１１／２７４，９０６号からの優先権を請求する。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は、医学の分野、具体的には腫瘍学に関する。本発明は、アポトーシス誘導剤に結合するＡＦＰを備える、哺乳類における悪性細胞増殖を治療、予防、および抑制するための新規組成物および方法を提供する。また本発明は、初期発生の期間に抽出される血液および羊水から得られるブタアルファフェトプロテインのブタノール抽出のための過程も提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）は、シャトルの役割を果たし、３〜５日の半減期を有する、胎児中の主要な運搬体タンパク質である（非特許文献１；非特許文献２中）。ＡＦＰの発現は、発生期間に厳重に調節されるため、検出可能なレベルのＡＦＰ発現は、発生段階に左右されるところが大きい。研究によって、ＡＦＰが個体発生成長および腫瘍進行の両方の期間に成長調節因子の役割を果たすことを確証してきた。発生および腫瘍形成期間にＡＦＰが発現することから、ＡＦＰは腫瘍胎児抗原と呼ばれる。
【０００４】
ＡＦＰは、アルブミノイド遺伝子スーパーファミリに属する糖タンパク質であり、その中のアルブミンも構成要素である。ＡＦＰの分子量は、源、発生段階、およびその精製に使用される方法によって、６４，０００から７２，０００ダルトンまで様々であってもよい。炭水化物の関連割合は再度、源および発育段階によって、３％から５％まで様々である。
【０００５】
ＡＦＰは、１）非結合形態、および２）ＡＦＰが様々なリガンド（例えば、脂肪酸、エストロゲン、フィトステロイド）に共役する結合形態といった、２つの基本分子形態で存在すると考えられる。しかし、ＡＦＰの異型も確認されている。結合リガンドの性質および濃度に依存する、結合ＡＦＰの異なる立体構造（ホロ形態）が存在する。ヒトＡＦＰ（ＨＡＦＰ）の分子変異体が確認されており、該変異体は、炭水化物の微小不均一性（つまり、ＨＡＦＰ上のグリコシル化の部位における異なる炭水化物部分）が原因であり、ならびに等電点の差によるものである（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。ＨＡＦＰ  ｍＲＮＡの発生位相特異的な発現が原因である、ＨＡＦＰの遺伝的変異体が検出されている。
【０００６】
Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉ  Ｇ．Ｊ．ら（非特許文献７）は、ＡＦＰの循環生理機能を「発生時計」として説明している。著者らは、ＡＦＰの構造および機能が発生の経過の全体を通して変化し、その場合、胎児の発育中にタンパク質が変動的なレベルで発現し、発現レベルが生後にごくわずかなレベルにまで減少して、５０ｎｇ／ｍＬ未満の正常成人血清濃度を有することに注目している（非特許文献８）。しかし、ＡＦＰ血漿中濃度は、様々な癌がある個人においては１，０００倍高くなり得る（非特許文献９）。また、多数の癌はその細胞表面上で高レベルのＡＦＰ受容体を発現する（非特許文献１０中；非特許文献１１中）。したがって、ヒトでは、ＡＦＰは、胚形成の期間に胎児欠陥マーカーとなることに加えて、腫瘍マーカーの役割を果たす。
【０００７】
従来の技術で公知である、アルキル化剤、代謝拮抗物質、アルカロイド、抗生物質、ホルモン、および免疫賦活剤などの様々な化学製品を使用して癌を治療する。しかし、これらの製剤は、腫瘍細胞を特異的に標的とせず、正常な非腫瘍細胞も抗癌剤の影響を受けやすい、「バイスタンダー効果」と呼ばれるものを結果としてもたらす。悪性細胞の表面上でのＨＡＦＰ受容体（ＨＡＦＰＲ）の過剰発現は、正常細胞上での受容体のごくわずかな発現と比べて、特異的に癌細胞を標的にするための抗癌剤の担体／輸送体としてのＨＡＦＰの使用の研究を促進した（非特許文献１２；非特許文献１３）。ＨＡＦＰは、抗癌剤複合体を腫瘍細胞へと標的化することが可能であることが実証されている（非特許文献１４；非特許文献１５；特許文献１）。ＡＦＰに対する受容体を持つ癌細胞に対するＨＡＦＰの高特異性は、腫瘍細胞への特異的な標的化による、薬剤の有効性の増進を提供する。また、正常な周囲の細胞に危害が加えられないため、そのような様態の活性剤送達は患者にとってより安全である。
【０００８】
ドキソルビシン、ダウノマイシン、カリケマイシン、カルボキシホスファミド、ブレオマイセチン、クロルブチン、シスプラチン、メトトレキサート、およびカルミノマイシンを含む、多数の抗癌剤と結合するＨＡＦＰが報告されている（非特許文献１６；非特許文献１７）。これらの例では、活性剤は化学共役法を使用してＨＡＦＰに結合され、抗癌剤へのＨＡＦＰの共有結合を結果としてもたらした。その生物活性の損失のない成分の結合および薬剤の標的化送達の両方を可能にする、ＡＦＰ−薬物複合体に対するＡＦＰ：薬剤の最適なモル比は、１：２であることが分かった（非特許文献１８）。同じモル比１：２は、ＡＦＰおよびダイオキシンの非共有結合において達成することが可能である（非特許文献１５）。
【０００９】
Ｈｅｒｖｅら（非特許文献１９）は、アルブミン上で見られるものと同様である、ラットＡＦＰ上のワルファリンおよびフェニルブタゾンの結合部位を実証した。また、彼らは、これらの薬剤が、エストロゲン、脂肪酸、ピラゾル化合物、およびプロピオン薬剤と同じ大型疎水ポケットにおいてＡＦＰに結合することを実証した。Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉ（非特許文献２０）において批評されるように、脂肪酸はヒトＡＦＰおよびげっ歯類ＡＦＰに結合することが可能であるが、植物エストロゲンはげっ歯類ＡＦＰのみに結合することが可能であることが示されており、ＡＦＰ結合能の種間差を示唆している。
【００１０】
ＡＦＰ／薬剤標的化送達の実験で使用されるＡＦＰの主要源は、女性の胎盤後血清（非特許文献１４）またはヒト胎児物質（ｗｗｗ．ａｌｆｅｔｉｎ．ｒｕ）のいずれかから抽出されるヒトＡＦＰである。ヒト胎児物質は、限定源（妊娠１２週までの中絶物質から抽出される）のため入手が困難であり、さらに高価である。ロシアでは、ヒト胎児ＡＦＰは、「Ａｌｆｅｔｉｎｕｍ」（０．０７５ｍｇの９５％純粋ＡＦＰを含む１アンプル）という名で免疫調節注射剤として登録されている。よって、癌細胞への細胞毒性薬の送達に有用なＡＦＰの代替源が有益となる。
【００１１】
異なる様態の作用がある抗癌剤は、化学感受性細胞におけるアポトーシスを誘発することが報告されている（非特許文献２１）。ミトコンドリア膜透過性および／または透過性遷移孔複合体変化などの、ミトコンドリア作用の変化は、抗癌剤によって誘導される細胞死を含むアポトーシス細胞死で主要な役割を果たす（非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６）。多くの従来の化学療法薬は、アポトーシスの生理学的制御に関与する、ｐ５３などの内因性エフェクタの誘導による間接的な方法で、ミトコンドリア透過化を引き出す。しかし、多くの異なるヒト癌におけるｐ５３の頻繁な突然変異は、癌を従来の化学療法薬に対して難治性にする。ロニダミン、亜ヒ酸塩、ベツリン酸、およびＣＤ４３７などのミトコンドリアに直接作用する細胞毒性薬の発見は、ｐ５３を伴うものなどの、内因性アポトーシス誘導経路の途絶により、従来の薬剤が機能しない状況における代替的治療方針を提供している（非特許文献２７において再考）。ベツリン酸などのミトコンドリアを標的にし、細胞のアポトーシスを誘導する細胞毒性薬が説明されている（非特許文献２８；特許文献２）。Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉらは、ミトコンドリア膜透過性の変化および／または透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）の変化によるミトコンドリア破壊を通してアポトーシスを誘導する機序を批評し、ミトコンドリアを標的にしてアポトーシスを誘導する細胞毒性薬を一覧化している（非特許文献２９）。
【００１２】
単一のＨＡＦＰ／抗癌剤複合体（つまり、ＨＡＦＰ−エストロン−ドキソルビシン複合体）の使用は、多くの異なる種類の癌が化学療法に対して難治性であり、多剤耐性（ＭＤＲ）を示すと言われている事実により、悪性新生物の治療における限定因子であると考えられる（非特許文献３０；非特許文献３１）。さらに、多数の抗癌剤は、ＤＮＡを標的にすることによって腫瘍細胞死を誘導するアルキル化剤および抗生物質であり、よって、損なわれていないｐ５３シグナル経路に頼るところが大きい（非特許文献３２）。機能的ｐ５３が欠けている多数の腫瘍を前提とすると、これらの治療はしばしば無効である。
【００１３】
したがって、容易に導き出され、生成が安価であり、非侵襲的手段によって送達可能であり、癌細胞の殺滅において効率的および特異的の両方である、細胞毒性薬を癌細胞に送達する改良された機序の必要性がある。
【００１４】
本発明は、本出願書を見直した後に当業者にとって明白となる、先行の利点またはその他の利点のうちの１つ以上を提供することができる。
【特許文献１】Ｍｕｒｇｉｔａ  米国特許第６，６３０，４４５号
【特許文献２】Ｐｅｚｚｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  米国特許出願公報第２００３０１８６９４５号
【非特許文献１】Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉ，Ｇ．Ｊ．，“ＡＦＰ  ａｎｄ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”，ｐｐ．５−３４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，１９８５
【非特許文献２】Ａｂｅｌｅｖ，ＧＩ，Ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ：２５  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｓｔｕｄｙ，Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０：６３−７４；１９８９
【非特許文献３】Ｋｅｅｌ，Ｂ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｌ  ２，２４−３１，１９８９
【非特許文献４】Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉ，Ｇ．Ｊ．，Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２２６（５）：３７７−４０８，２００１；
【非特許文献５】Ｍｏｒｉｎａｇａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０（１５）：４６０４−８，１９８３；
【非特許文献６】Ｐａｒｋｅｒ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＡＦＰ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｌｋ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｇｏａｔｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，３８：１７７−１８３，２００４
【非特許文献７】Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．７（１）：１９−３６、１９８６
【非特許文献８】Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  ａｎｄ  Ｓｅｐｐａｌａ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８：３７４−３７８，１９７１
【非特許文献９】Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  ａｎｄ  Ｓｅｐｐａｌａ，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２９：２７５−３１０，１９７９
【非特許文献１０】Ｕｒｉｅｌ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ＡＦＰ”，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１０４−１１７
【非特許文献１１】Ｍｏｒｏ，Ｒ．，“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ＡＦＰ”，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１２０−１２７
【非特許文献１２】Ｓｅｖｅｒｉｎ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．３７（２）：３８５−９２，１９９５
【非特許文献１３】Ｓｅｖｅｒｉｎ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｏｋｌ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ  ３６６（４）：５６１−４，１９９９
【非特許文献１４】Ｍｏｓｋａｌｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ．２１（１２）：７９３−７９９，１９９７
【非特許文献１５】Ｓｏｔｎｉｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４５０：４９−５１，１９９９
【非特許文献１６】Ｍｏｓｋａｌｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．２１（１２）：７９３−７９９，１９９７
【非特許文献１７】Ｌｕｔｓｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１（６）：３６７−３７４，２０００
【非特許文献１８】Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｎ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６５：１１４０−１１４５，２０００
【非特許文献１９】Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｆｌｏｒｉｄａ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓｅｓ，ｅｄ．Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉ，Ｇ．Ｊ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｖｏｌ．１，１９８７
【非特許文献２０】Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉ，Ｇ．Ｊ．，“ＡＦＰ  ａｎｄ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”，ｅｄ．Ｇ．Ｊ．Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５
【非特許文献２１】Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃｅｌｌ  ７８：５３９−５４２，１９９４
【非特許文献２２】Ｋｒｏｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １８：４４−５１，１９９７
【非特許文献２３】Ｓｕｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：５−３７，１９９７
【非特許文献２４】Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８４：１１５５−１１６０，１９９６
【非特許文献２５】Ｚａｍｚａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１５３３−１５４４，１９９６
【非特許文献２６】Ｄｅｃａｕｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ  Ｒｅｓ  ５７：６２−６７，１９９７
【非特許文献２７】Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ９２：１０４２−１０５３，２０００
【非特許文献２８】Ｆｕｌｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８；２７３（５１）：３３９４２−８，１９９８
【非特許文献２９】Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（１３）：１０４２−５３，２０００
【非特許文献３０】Ｌｅｈｎｅｒｔ  Ｍ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３２Ａ：９１２−９２０，１９９６
【非特許文献３１】Ｇｅｒｍａｎｎ  Ｕ．Ａ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３２Ａ：９２７−９４４，１９９６
【非特許文献３２】Ｂｙｋｏｖ，Ｖ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８（３）：２８２−８，２００２
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の開示）
簡潔に述べると、本発明は、ＡＦＰを備える新規組成物、およびアルファフェトプロテイン受容体（ＡＦＰＲ）を発現する悪性新生物を予防、治療、または抑制するための方法を提供する。また本発明は、初期発生の期間に抽出される血液および羊水から得られるブタアルファフェトプロテインのブタノール抽出のための過程も提供する。
【００１６】
一実施形態では、本発明は、外因性アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）と、ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ９活性剤、カスパーゼ３活性剤、およびレチノイドを備える群から選択される少なくとも１つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物を提供し、少なくとも１つのアポトーシス誘導剤は、外因性ＡＦＰに可逆的に結合する。一実施形態では、該組成物は、外因性ＡＦＰに可逆的に結合することが可能な２つのアポトーシス誘導剤を備える。別の実施形態では、該組成物は、アトラクチロシド、ベツリン酸、タプシガルギン、ロテノン、ピエリシジンＡ、ロニダミン、ＣＤ４３７、三酸化ヒ素、Ａ２３１８７、イオノマイシン、ビタミンＤ２およびＤ３、デキサメタゾン、およびＡｃｃｕｔａｎｅを備える群より選択されるアポトーシス誘導剤を備える。
【００１７】
本発明は、哺乳類において、ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ９活性剤、カスパーゼ３活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも１つのアポトーシス誘導剤を、癌細胞に送達するための外因性ＡＦＰの使用も提供し、少なくとも１つのアポトーシス誘導剤は、外因性ＡＦＰに可逆的に結合し、癌細胞は少なくとも１つのＡＦＰ受容体を有し、外因性ＡＦＰは、少なくとも１つのＡＦＰ受容体に特異的に結合する。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、哺乳類において、少なくとも１つのアポトーシス誘導剤を、細胞表面に少なくとも１つのＡＦＰ受容体を有する癌細胞に標的化送達するための薬剤の調製における、外因性アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）と、ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ９活性剤、カスパーゼ３活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも１つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物の使用を提供し、少なくとも１つのアポトーシス誘導剤は、外因性ＡＦＰに可逆的に結合し、外因性ＡＦＰは、少なくとも１つのＡＦＰ受容体に特異的に結合する。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、哺乳類の癌細胞の増殖の抑制のための、外因性アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）と、ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ９活性剤、カスパーゼ３活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも１つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物の使用を提供し、前記癌は、細胞表面に少なくとも１つのＡＦＰ受容体を有し、少なくとも１つのアポトーシス誘導剤は、外因性ＡＦＰに可逆的に結合し、外因性ＡＦＰは細胞表面上の少なくとも１つのＡＦＰ受容体に特異的に結合する。
【００２０】
さらに別の実施形態では、本発明は、難治性悪性新生物における多剤耐性を治療するための、外因性アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）と、ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ９活性剤、カスパーゼ３活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも１つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物の使用を提供し、前記難治性悪性新生物は、細胞表面に少なくとも１つのＡＦＰ受容体を有する癌細胞から成り、少なくとも１つのアポトーシス誘導剤は、外因性ＡＦＰに可逆的に結合し、外因性ＡＦＰは、細胞表面上の少なくとも１つのＡＦＰ受容体に特異的に結合する。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、哺乳類の癌細胞増殖を抑制する方法も提供し、前記癌細胞は、細胞表面に少なくとも１つのＡＦＰ受容体を有し、前記方法は、外因性ＡＦＰと、ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ９活性剤、カスパーゼ３活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも１つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物の治療的有効量を哺乳類に投与するステップを備え、少なくとも１つのアポトーシス誘導剤は、外因性ＡＦＰに可逆的に結合し、外因性ＡＦＰは、細胞表面上の少なくとも１つのＡＦＰ受容体に特異的に結合する。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、難治性悪性新生物における多剤耐性を治療する方法を提供し、前記難治性悪性新生物は、細胞表面に少なくとも１つのＡＦＰ受容体を有する癌細胞から成り、該方法は、外因性ＡＦＰと、ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、イオノフォア、カスパーゼ９活性剤、カスパーゼ３活性剤、およびレチノイドを備える群より選択される少なくとも１つのアポトーシス誘導剤との、非共有結合複合体を備える組成物の治療的有効量を哺乳類に投与するステップを備え、少なくとも１つのアポトーシス誘導剤は、外因性ＡＦＰに可逆的に結合し、外因性ＡＦＰは、細胞表面上の少なくとも１つのＡＦＰ受容体に特異的に結合する。
【００２３】
さらに別の実施形態では、本発明は、
（ａ）妊娠約３週から約１４週のブタ胚から血液および羊水を採取するステップと、
（ｂ）（ａ）で採取される前記血液および前記羊水を浮遊物および沈殿物に分離するステップと、
（ｃ）（ｂ）に起因する前記浮遊物を採取するステップと、
（ｄ）濃縮溶液を形成するように（ｃ）に起因する前記浮遊物を濃縮するステップと、
（ｅ）溶液中で約５％から約１０％のブタノールの最終濃度まで、（ｄ）の前記濃縮溶液にブタノールを添加するステップ、
（ｆ）（ｅ）に起因する前記ブタノール溶液を攪拌するステップと、
（ｇ）（ｆ）に起因する前記ブタノール溶液を、上層非水相および下層水相に分離するステップと、
（ｈ）非結合ブタＡＦＰを含む最終溶液を生成するように（ｇ）に起因する前記非水相を採取するステップ、
という順次的なステップを備える、ブタノールを使用した、原料からのブタＡＦＰの抽出のための過程を提供する。
【００２４】
特定の具体的実施形態内で、上記のような組成物は、独自の用量を有する第１および第２のアポトーシス誘導剤から成る。
【００２５】
一実施形態では、該組成物で使用される外因性ＡＦＰは、哺乳類源由来である。別の実施形態では、ＡＦＰはブタ源からである（ＰＡＦＰ）。その他の実施形態では、ＡＦＰは、霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、またはヒツジ源からである。ＡＦＰは自然から分離することができ、またはＡＦＰの組み換え型であってもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、癌細胞へのアポトーシス誘導剤の標的化送達に有用な組成物に関する。本発明の組成物は、ミトコンドリア作用に直接影響を及ぼし、初期核シグナル伝達を通してアポトーシス応答を引き出す必要性を回避することによって、アポトーシスを誘導する化合物に非共有複合する外因性ＡＦＰから成る。ＡＦＰの源は、一実施形態ではブタであり、別の実施形態では、妊娠３週から１４週の胚および羊水から抽出されるブタＡＦＰである。本発明におけるＡＦＰとの非共有結合性会合に有用な具体的化合物は、アトラクチロシド、ベツリン酸、タプシガルギン、ＣＤ４３７、ロテノン、ピエリシジンＡ、およびロニダミンを含む。
【００２７】
本願で使用されるようなアポトーシス誘導剤という用語は、アポトーシス細胞死を誘導する能力がある化学または天然化合物を指す。本発明の一実施形態では、アポトーシス誘導剤は、ミトコンドリアに直接作用する。そのような化合物は、ミトコンドリア膜透過性、ミトコンドリア孔開放の誘導、ミトコンドリア膜電位、ならびにカスパーゼ３および９などの実行カスパーゼの活性化のうちのいずれかに影響することによって、アポトーシスを誘導することができる。
【００２８】
本発明との関連で、アポトーシス誘導剤は、細胞表面上でＡＦＰ受容体を発現する標的化癌細胞のアポトーシスを誘導する。本発明での使用に適したアポトーシス誘導剤の例は、アトラクチロシド、ベツリン酸、タプシガルギン、ＣＤ４３７、ロニダミン、三酸化ヒ素、およびロテノンなどのミトコンドリア膜透過性誘導剤；Ｐａｃ−１などのカスパーゼ活性剤（Ｐｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５４３−５５０，２００６）、カルシマイシン／Ａ２３１８７およびバリノマイシンなどのイオノフォア；およびＡｃｃｕｔａｎｅおよびシスレチノイン酸などのレチノイド；ならびにデキサメタゾンなどの既知の化学療法薬；オリゴマイシンＢなどの抗生物質；リン酸ヒドロキシクロロキン；ケルセチンなどの酸化防止剤、ビタミンＡ、ビタミンＤ２およびＤ３、クルクミン、およびカプサイシン；および亜鉛、鉛、銅、ニッケル、およびカドミウムなどの重金属（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ／ｓｅａｒｃｈ／ＴａｂｌｅＰａｇｅ／９５６０３２３、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｍｏｌ．ｃｏｍ／Ｏｎｌｉｎｅ＿Ｃａｔａｌｏｇ／Ｏｎｌｉｎｅ＿Ｃａｔａｌｏｇ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／３６／？ｃａｔｅｇｏｒｙＩｄ＝２３４、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｈｔｍｌ／ｃｂｃ／ａｐｏｐｔｏｓｉｓ＿ｉｎｄｕｃｅｒｓ．ｈｔｍｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｘｘｏｒａ．ｃｏｍ／ａｐｏｐｔｏｓｉｓ＿ｉｎｄｕｃｅｒｓ＿＿ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ／ｏｐｆａ．１０１４．２．１．０．ｈｔｍｌ）を含むか、またはそれらに由来するが、それらに限定されない。
【００２９】
本願で使用されるような可逆的という用語は、元の（「非結合」）状態に戻ることが可能であることを意味し、外因性ＡＦＰは、第１のアポトーシス誘導剤（つまり、アトラクチロシド、タプシガルギン、ベツリン酸、ＣＤ４３７、三酸化ヒ素、ロテノン、およびロニダミン）を腫瘍細胞に送達した後、非結合形態で細胞外培地へ再循環され、その場合、それが固有結合親和力を有する別の化合物（つまり、アトラクチロシド、タプシガルギン、ベツリン酸、ＣＤ４３７、三酸化ヒ素、ロテノン、およびロニダミン）に結合することが可能である。外因性ＡＦＰが１度以上細胞外培地に再循環されることは可能である。以前に、多数のインビトロ研究は、ＡＦＰがＡＦＰ受容体媒介エンドサイトーシスを介して、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を細胞に送達することが可能であり、後に細胞外培地へ分解されずに再循環されることを実証した（Ｔｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７：１１０−１１７，１９９１；Ｕｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｆｌｏｒｉｄａ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓｅｓ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉ，ＧＪ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｖｏｌ．２，１９８７中；およびＬａｂｏｒｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４０：３１４−３１８，１９８７）。これらの研究は、再循環ＡＦＰは、２度目に細胞外空間へ戻されると、アポトーシス誘導剤に結合することが可能であることを示唆している。
【００３０】
本願で使用されるような治療的有効量という用語は、患者に投与されると、本願で説明される癌（固体または非固体）の症状を改善または緩和する、本発明の組成物の量を意味する。本発明により投与される組成物の具体的用量は、勿論、例えば、投与される組成物、投与の経路、患者の状態、および治療されている癌の種類を含む、症例をめぐる特定の状況によって決定される。本発明による治療に適した癌は、癌細胞がＡＦＰＲを発現する癌である。ＡＦＰＲの実証された発現を伴う癌の例は、膀胱癌、乳癌、結腸および直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌（腎細胞）、白血病、肝臓癌、肺癌、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌（非黒色腫）、精巣癌、および甲状腺癌を含むが、それらに限定されない（Ｍｏｒｏ−Ｖｉｄａｌ，Ｒ．，，Ｃｕｒｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，ｗｗｗ．ｂｉｏｃｕｒｅｘ．ｃｏｍ）。
【００３１】
患者という用語は、ヒトを含むあらゆる哺乳類を意味する。患者の例は、ヒト、その他の霊長類、ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、およびウサギを含む。
【００３２】
本発明は、直接癌細胞に対するアポトーシス誘導剤の担体または輸送体の役割を果たす、外因性アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）の使用を伴い、癌細胞のアポトーシスを結果としてもたらす。米国特許第６，６３０，４４５号および第６，５３４，４７９号は、細胞毒性薬との共役のための組み換え型ヒトＡＦＰの使用を説明している。以前に、Ｎｉｓｈｉら（Ａｎｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２５９：１０９−１１８，１９７５）は、ＡＦＰの代替哺乳類源の可能性を高める免疫学的および抗原特性に関して、哺乳類ＡＦＰ間の異種間類似点を実証した。ブタおよびヒトＡＦＰ間の類似点は、ブタＡＦＰは、ヒトＡＦＰの代わりに、アポトーシス誘導剤を癌細胞へ送達するために使用することが可能であることを示唆している（表１）。
【００３３】
【表１】
2009515909.tif 000003
【００３４】
本願で使用されるような外因性という用語は、患者または生物外に起因することを意味する。
【００３５】
本発明は、外因性ＡＦＰ、およびインビトロで外因性ＡＦＰに可逆的に結合してＡＦＰ−第１アポトーシス誘導剤複合体を形成する第１のアポトーシス誘導剤の組成物に関し、第２のアポトーシス誘導剤を含むことも可能であり、第１のアポトーシス誘導剤および第２のアポトーシス誘導剤は、抗癌剤（つまり、アトラクチロシド、タプシガルギン、ベツリン酸、ＣＤ４３７、三酸化ヒ素、ロテノン、およびロニダミン）であり、第２のアポトーシス誘導剤は、インビボで再循環された外因性ＡＦＰに可逆的に結合することが可能である。第１のアポトーシス誘導剤および第２のアポトーシス誘導剤は同じであってよく（つまり、ベツリン酸）、または異なってもよい（つまり、ベツリン酸およびＣＤ４３７）。
【００３６】
ＡＦＰ上の複数の結合領域の存在は、１つ以上の部類のアポトーシス誘導剤が、インビトロで同時にＡＦＰに結合することができる可能性を高める（Ｈｉｒａｎｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３１：１８９−１９１，１９８５；Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉ，Ｇ．Ｊ．，Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２２６（５）：３７７−４０８，２００１）。これは、一部の結合領域は疎水性薬物と相互作用する一方で、その他の結合領域は親水性または両親媒性薬物と相互作用するという事実によるものである。
【００３７】
本発明の一実施形態によると、癌患者は、１日用量の本発明組成物の投与を受け、ＡＦＰの総１日摂取量は、患者および疾病の悪性度によって、０．０７ｍｇから１．２ｍｇの間となる。ＡＦＰのこの濃度は、妊娠中の循環中でよく見られるＡＦＰの生理的濃度に基づく。マウスのカウンターパートでは、「Ｎａｔｕｒａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」（Ｂｏｉｋ，Ｊ．，Ｎａｔｕｒａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｒｅｇｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，２００１，ｐｐ．８−１０）で定められているガイドラインによると、同程度の用量は０．００１４ｍｇから０．０２４ｍｇである。
【００３８】
本発明の組成物は、等モル比からＡＦＰに関する第１のアポトーシス誘導剤の過多まで、および等モル比からＡＦＰに関する第２のアポトーシス誘導剤の過多までなど、第１および第２のアポトーシス誘導剤の様々なモル比を含むことができる。第１のアポトーシス誘導剤およびＡＦＰのインビトロ結合条件は、第１のアポトーシス誘導剤の特性（つまり、親水性または疎水性）に左右される。典型的に、ＡＦＰは、第１のアポトーシス誘導剤と混合され、その場合、ＡＦＰおよび第１のアポトーシス誘導剤のモル比は１：１から１：３に及ぶ。さらに典型的に、ＡＦＰは、第１のアポトーシス誘導剤と混合され、その場合、ＡＦＰおよび第１のアポトーシス誘導剤のモル比は１：１から１：３未満に及ぶ。第１のアポトーシス誘導剤は、１つ以上の抗癌剤から成ることができる。しかし、複数の薬剤が使用される場合、それぞれが上記のようにＡＦＰ上の異なる結合領域に結合することを確認しなければならない。
【００３９】
抽出された物質は、透析ろ過の対象となり、ＰＡＦＰ−アポトーシス誘導剤複合体を阻害することなく、小非結合分子を排除する。以前に、Ｓｏｔｎｉｃｈｅｎｋｏら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４５０：４９−５１、１９９９）は、ヒト胎児ＡＦＰが１：２のモル比でダイオキシンとの複合体を形成し、ゲルろ過がＡＦＰ−ダイオキシン複合体を阻害することなく、非結合分子を効果的に排除することを実証した。
【００４０】
典型的に、第２のアポトーシス誘導剤は、従来技術で説明される方法で使用される量よりも、少なくとも１０倍少ない量で存在する。例えば、Ｐｅｚｚｕｔｏら（米国特許出願公報第２００３０１８６９４５号）は、３，０００μｇ（０．２ｍｇから５００ｍｇの１日経口用量）のベツリン酸の用量を推奨したが、本発明では、ベツリン酸（第２のアポトーシス誘導剤）の用量は１５０μｇほども少なくなり得る。本発明では、０．６ｍｇのＰＡＦＰは０．００７ｍｇのベツリン酸と複合される。別の実施形態では、０．１５ｍｇの非結合別リン酸が剤形に含まれる。。
【００４１】
ＰＡＦＰは不安定であり、以前に説明されている化学共役過程のものなど、操作中に凝集、沈殿、または不活性化し得る（Ｇ．Ｊ．Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉ，“Ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ  ｏｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｕｌｒｉｃｈ  Ｗｅｓｔｐｈａｌ，Ｓｔｅｒｏｉｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ＩＩ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ、Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ，Ｔｏｋｙｏ，１９８６，ｐｐ．３２０−３５６中；Ｎｕｎｅｚ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ，ｐｈｙｓｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ＡＦＰ  ｄｅｐｅｎｄ  ｏｎ  ｉｔｓ  ｌｉｇａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ａｌｌｉｅｄ  Ｓｃｉ．，３３：１８−１６，１９８９）。本発明において、１８〜２５℃で第１のアポトーシス誘導剤へのＰＡＦＰのインビトロ結合を達成するために必要とされる時間は、１０分であり、これは、１８〜２５℃での固定時間が１０〜１２時間である、従来技術で説明されている非共有結合過程によって必要とされる時間よりも大幅に短い（例えば、Ｐａｋらの米国特許第６，８７８，６８８号を参照）。ＰＡＦＰおよび第１のアポトーシス誘導剤のインビトロ結合を達成するための短縮された時間は、（１）本発明の限外ろ過およびブタノール抽出法によって得られる濃縮物中に存在する、結合に利用可能なより高い濃度の非結合ＰＡＦＰ、および（２）上記のように、微小不均一性である、その他の方法によって得られるＨＡＦＰと比べた、本発明の過程によって得られるＰＡＦＰの微小均一性（Ｗｕ，Ｊ．Ｔ．ａｎｄ  Ｃｌａｙｔｏｎ，Ｆ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＡＦＰ”，“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ＡＦＰ”，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．３−１４中；Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉ，Ｇ．Ｊ．，Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．２２６（５）：３７７−４０８，２００１）が原因であってよい。
【００４２】
典型的に、第１のアポトーシス誘導剤は、１部類の抗癌剤であり、わずか１５０μｇの１日濃度で存在する。本発明において有用なアポトーシス誘導剤は、好ましくは、ミトコンドリア膜透過剤、ミトコンドリア孔開放誘導剤、カスパーゼ９活性剤、カスパーゼ３活性剤、イオノフォア、およびレチノイドを備える群より選択される。
【００４３】
多剤耐性（ＭＤＲ）は、癌細胞の表面における高発現レベルのｇｐ１７０ポンプと関連することが多い（Ｌｅｈｎｅｒｔ  Ｍ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ３２Ａ：９１２−９２０，１９９６；Ｇｅｒｍａｎｎ  Ｕ．Ａ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３２Ａ：９２７−９４４、１９９６；Ｔｈｏｍａｓ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  １０（２）：１５９−１６５、２００３）。しかし、ＭＤＲは、損傷ｐ５３またはＢｃｌ−２などのアポトーシス阻害物質の上方調節された発現を伴う細胞中で発生することも知られている（Ｊａａｔｔｅｌａ，Ｍ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２４８：３０−４３，１９９９）。多くの化学療法薬は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、テロメラーゼ、およびトポイソメラーゼなど、ｐ５３活性の上流に標的を有する。これらの薬剤は、損傷ｐ５３または上方調節されたＢｃｌ−２を伴う細胞中のアポトーシスを誘導するのに無効である（Ｅｖａｎ，Ｇ．Ｉ．ａｎｄ  Ｖｏｕｓｄｅｎ，Ｋ．Ｈ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：３４２−３４８，２００１）（図１）。Ｍｏｓｋａｌｅｖａら（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．，２１（１２）：７９３−７９９，１９９７）は、ＡＦＰ−薬物複合体は、ＭＤＲ（ｐ糖タンパク質薬物排出ポンプ）を過剰発現する多剤耐性癌細胞を殺滅するのに効果的であったことを実証し、ＡＦＰ−薬物複合体の受容体媒介エンドサイトーシスが多剤耐性癌を克服することを示唆した。本発明では、アポトーシス誘導剤は、ｐ５３の下流である、ミトコンドリアのレベルでアポトーシスを誘導するその能力に基づいて選択される。ミトコンドリア膜透過性およびミトコンドリア孔遷移および／またはカスパーゼ活性化への影響を通して、これらのアポトーシス誘導剤は、多剤耐性癌に対する細胞傷害効果を引き出すことが可能である。
【００４４】
好ましくは、本発明で使用するためのアポトーシス誘導剤は、天然源由来である（Ｐｅｓｓａｙｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｔｒｉｇｇｅｄ  ｂｙ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ”，“Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｄｒｕｇｓ”，ｅｄｓ．Ｒ．Ｇ．Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｇ．Ｆｅｕｅｒ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，２０００，ｐｐ．８６−１０８中）。例えば、ベツリン酸は、白樺の木（ベチュラ・アルバ）の外皮中に豊富に発見される物質である、ベツリン由来である。本発明において有用な典型的アポトーシス誘導剤は、タプシガルギン、アトラクチロシド、ベツリン酸、ＣＤ４３７、三酸化ヒ素、ロテノン、ピエリシジンＡ、およびロニダミンを含むが、それらに限定されない。
【００４５】
本発明との使用に適したアポトーシス誘導剤のその他の例は、デキサメタゾン、オリゴマイシンＢ、リン酸ヒドロキシクロロキン、ケルセチン、ビタミンＡ、ビタミンＤ２およびＤ３、クルクミン、カプサイシン、および亜鉛、鉛、銅、ニッケル、カドミウムなどの重金属、および化学療法薬を含むか、またはそれらに由来するが、それらに限定されない。
【００４６】
本発明の組成物は、経口投与形態（つまり、カプセル、ソフトゲル、および錠剤）、坐薬、吸入剤、点鼻および点眼薬、包帯、嗅粉末、注射剤、塗布薬、および局所製剤を含むが、それらに限定されない、任意の現在知られている投与の方法によって、癌細胞へ送達することができる。一実施形態では、該組成物は、ソフトゲルとして経口投与のために調製される。別の実施形態では、該組成物は、注射剤として静脈投与のために調製される。
【実施例】
【００４７】
（実施例１）
ＰＡＦＰ分離および精製
ＰＡＦＰは、ブタ胚の肝臓および血液、羊水、および胎盤から抽出した。抽出が行われる胎児期は、その生物活性（例えば、受容体結合）ならびにアポトーシス誘導剤に結合するその能力の両方に影響を及ぼし得る、ＰＡＦＰの変動翻訳後特性により、重要である。妊娠初期（３週間より前）または妊娠後期（１４週間以降）の胎児物質から抽出されるＰＡＦＰは、妊娠３週から１４週の胎児物質から抽出されるＰＡＦＰと比べると、異なってグリコシル化している（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２２：５１５−５２０、１９７８；Ｋｅｅｌ，Ｂ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ａｌｐｈａ１−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ”Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ｖｏｌ  ２，ｐｐ．２４−３１，１９８９中；Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉ，Ｇ．Ｊ．，Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２２６（５）：３７７−４０８、２００１；Ｐａｒｋｅｒ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，３８：１７７−１８３，２００４；Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉ，Ｇ．Ｊ．“Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ  ｏｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ”ｅｄ．Ｕｌｒｉｃｈ  Ｗｅｓｔｐｈａｌ，Ｓｔｅｒｏｉｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ＩＩ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ，Ｔｏｋｙｏ，１９８６，ｐｐ．３２０−３５６中）。グリコシル化の異なる状態は、ＨＡＦＰの結合特性に影響することが示されており、よって、ＰＡＦＰのグリコシル化が胚形成の期間に変化し、妊娠１４週後に流体の収率が有意に減少するため、胚からの流体の抽出のタイミングが重要である。理想的には、ブタ胎児物質は、胚形成の第３週から第１４週の間に採取し、抽出過程の対象とした。
【００４８】
抽出後、血液および羊水（以降「原料」）は、自然沈殿を発生させるために、１２から２４時間にわたって４〜１０℃で維持した。浮遊物を収集して異なる容器に移し、その後、５０ｋＤａ膜を使用した限外ろ過によって３〜５倍に濃縮した。限外ろ過の過程中、温度は１５℃を越えなかった。この濃縮ステップは、高収率のＰＡＦＰを結果としてもたらした。そしてブタノールを５％〜１０％の間の最終濃度にまで加えた；典型的にはブタノールの最終濃度は約８％であった。原料およびブタノールを２分間攪拌し、混合物をさらに１分間インキュベートさせ、上層非水相および下層水相への溶液の分離を可能にした。非結合ＰＡＦＰを含む上層非水相は、混合物から残留ブタノールを除去するために、保持して透析ろ過の対象とした。ＰＡＦＰを含む結果として生じた溶液は、難治性癌を治療する際に使用するためのアポトーシス誘導剤とのインビトロ結合の対象とした。
【００４９】
本発明のＰＡＦＰ抽出の方法は、増大し、さらに高濃縮された非結合ＰＡＦＰの産物を結果としてもたらすという点で、ＡＦＰ抽出の従来方法よりも有利である。非結合とは、内因性結合パートナーに結合していないＰＡＦＰを意味する。より高濃度の非結合ＰＡＦＰの結果として、関心のアポトーシス誘導剤に結合した増大した濃度のＰＡＦＰが達成可能である。
【００５０】
上記に詳述される方法によって抽出されるＰＡＦＰは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の対象とした（図２）。２つの主要タンパク質バンドは、クマシーゲル染色時に明白であった（図２、レーンＡおよびレーンＣ）。上方バンド（約７０ｋＤａ）はＰＡＦＰに対応し、下方バンド（約６７ｋＤａ）はアルブミンに対応する。
【００５１】
（実施例２）
ＰＡＦＰには、ＨＡＦＰと比べて同様の結合特性がある
以前の研究は、ＰＡＦＰがＨＡＦＰと比べて同様の生物学的特性を保有するかどうかを扱っていなかった。上記に詳述されている方法によって抽出されるＰＡＦＰは、上記に詳述されている方法から得られる抽出物中のＰＡＦＰの存在を検出するために、２つの異なる免疫酵素キットを使用して分析した。ＰＡＦＰサンプルは、ヒト血清および羊水から分離されたＡＦＰと比較した。最初は、サンプルは、ＨＡＦＰに対するモノクローナル抗体を組み込む、膜ＥＩＡアルファフェトプロテイン検査（カタログ番号４１０−１、ＩＮＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）の対象とした。ＰＡＦＰは、ヒトＡＦＰサンプルと比べて、ＥＩＡアルファフェトプロテイン検査キットとの反応を引き起こさず、ＰＡＦＰ対ヒトＡＦＰの化学構造の潜在的差異を示唆した。そして、ＨＡＦＰに対するポリクローナル抗体を組み込む第２の検査キット（カタログ番号Ｔ−８４５６、ＡＦＰ-ＥＩＡ−ＢＥＳＴ−Ｓｔｒｉｐ、Ｖｅｃｔｏｒ−ＢＥＳＴ、Ｎｏｖｏｓｉｂｉｒｓｋ、Ｒｕｓｓｉａ）を使用して抽出物中のＰＡＦＰの存在を分析した。ヒトＡＦＰに対して樹立された抗体と反応するＰＡＦＰの能力を示す、陽性反応が発生した。免疫学的検定研究の結果は、ＰＡＦＰはＨＡＦＰに対する抗体による認識が可能であることを示唆し、ＰＡＦＰがＨＡＦＰと構造的に同様であることを示唆する。
【００５２】
ＨＡＦＰ自体がアポトーシスを誘導することが可能であることは、以前に実証されている。腫瘍細胞死の誘導は、低用量（＜２００ｍｇ／ｍＬ）ではなく、高生理学的用量のＡＦＰ（＞２５０ｍｇ／ｍＬ）で示された（Ｄｕｄｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６６：１−１３，１９９９）。また、研究は、ＨＡＦＰが様々な疎水性および親水性化合物に結合することが可能であることを示している（Ｈｉｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３１；１８９−１９１，１９８５）。しかし、ＰＡＦＰが同様にアポトーシスまたはその他の下流生物学的反応を誘導する可能性があるかどうか、そしてＨＡＦＰと比べて、ＰＡＦＰのアミノ酸配列の違いにより（８２％アミノ酸類似）、ＰＡＦＰはＨＡＦＰと同様に様々な薬剤に結合することが可能であるかどうかは不明であった（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３３：４６８−４８５，２００２）。
【００５３】
マウス癌モデルにおいて行われた研究は、アポトーシス誘導剤（例えば、アトラクチロシド、タプシガルギン、およびベツリン酸）を癌細胞に送達し、結果として全身腫瘍組織量を低減するＰＡＦＰの能力を実証した（実施例４および６参照）。これらの結果は、ＰＡＦＰと結合したアポトーシス誘導剤が癌予防効果を引き出すことが分かったヒト研究において、結果として再現された。共に、データは、ＰＡＦＰがヒトおよびマウス両方のＡＦＰ受容体によって認識されることを示唆している。
【００５４】
（実施例３ａ）
ＰＡＦＰおよびアポトーシス誘導剤のインビトロ結合
上記に詳述されている抽出手順より得られたＰＡＦＰを、アポトーシス誘導剤と１分間組み合わせ、１０〜１５℃でさらに１０分間インキュベートさせた。より長いインキュベーション期間が容認可能であるが、インキュベーション時間の延長は、ＰＡＦＰに結合された薬剤の量に関して、有意な利益を提供しなかった。そして、小分子、および例えば、原料の採取中の以前の抽出ステップにおいて生理的緩衝剤として使用される塩といったその他の不純物を取り除くために、ＰＡＦＰ−アポトーシス誘導剤混合物を、５０ｋＤａ膜および透析ろ過を使用した限外ろ過のステップの対象とした。限外ろ過のステップはさらに、残っている非結合アポトーシス誘導剤の排除を支援した。未透過物は、後のステップで有用なＰＡＦＰ−アポトーシス誘導剤混合物を含んだ。
【００５５】
最終的なろ過のステップは、結果として生じる溶液をろ過殺菌するために、０．２２ミクロン膜を使用して行った。混合物中に残ったアルブミンは、本発明の組成物の有効性に干渉しない。
【００５６】
結果として生じる溶液は、完全に凍結するまで、−４５℃で急速冷凍した。そしてＰＡＦＰ−アポトーシス誘導剤組成物を、層が完全に乾燥するまで、凍結乾燥機を使用して乾燥した。そして凍結乾燥したＰＡＦＰ−アポトーシス誘導剤組成物は微粒子に磨砕し、粉末の温度が３５℃を越えないことを確実にした。組成物を様々な製剤または送達システムに組み込むことを容易にするために、８０メッシュ以下の粉末を得た。粉末中のＰＡＦＰの正確な量は、ＨＰＬＣまたはＰＡＡＧ電気泳動データを使用して算出することが可能である。
【００５７】
（実施例３ｂ−ＰＡＦＦ−アトラクチロシド）
１：１モル比のＰＡＦＰ：アトラクチロシドを達成するために、３５ｇ／Ｌの最終総タンパク質濃度、および約２１ｇ／ＬのＰＡＦＰを有する１リットルのＰＡＦＰ未透過物を、５０ｍＬの水に溶解した２５０ｍｇのアトラクチロシド（ＭＷ＝８０３）と組み合わせた。該溶液は４〜１５℃で１０分間混合させ、そして２〜３容積の水で限外ろ過および透析ろ過した。１リットルの最終溶液を凍結乾燥の対象とし、ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物を生成した。
【００５８】
（実施例３ｃ−ＰＡＦＦ−タプシガルギン）
１：１モル比のＰＡＦＰ：タプシガルギンを達成するために、８ｇ／Ｌの最終総タンパク質濃度、および約１．７ｇ／ＬのＰＡＦＰを有する半リットルのＰＡＦＰ未透過物を、１０ｍＬのアルコールに溶解した１０ｍｇのタプシガルギン（ＭＷ＝６０５）へ滴下により加えた。該溶液を１５〜２５℃で３０分間混合させ、そして２〜５容積の水で限外ろ過および透析ろ過した。２００ミリリットルの最終溶液を凍結乾燥の対象とし、ＰＡＦＰ−タプシガルギン組成物を生成した。
【００５９】
（実施例３ｄ−ＰＡＦＰ−ベツリン酸）
１：１モル比のＰＡＦＰ：ベツリン酸を達成するために、２０ｇ／Ｌの最終総タンパク質濃度、および約１４ｇ／ＬのＰＡＦＰを有する２リットルのＰＡＦＰ未透過物を、１００ｍＬのＤＭＳＯに溶解した５００ｍｇのベツリン酸（ＭＷ＝４５６）と組み合わせた。該溶液は２５〜３７℃で１０分間混合させ、そして透析ろ過の対象とした。１リットルの最終溶液を凍結乾燥の対象とし、ＰＡＦＰ−ベツリン酸組成物を生成した。
【００６０】
（実施例４）
インビボマウス白血病モデル：ＰＡＦＰ＋アポトーシス誘導剤は、腫瘍細胞接種の２４日後のマウスにおける腫瘍細胞を殺滅する。
ＤＢＡ２系のマウスに、以前ＡＦＰ受容体を発現することが示された２０，０００個のＰ−３８８マウス白血病細胞を体の側面に皮下接種した（Ｓｅｖｅｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｏｋｌ．Ａｃａｄ．Ｎａｕｋ，３６６（４）：５６１−５６４，１９９９；Ｍｏｒｏ−Ｖｉｄａｌ，Ｒ．，Ｃｕｒｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，ｗｗｗ．ｂｉｏｃｕｒｅｘ．ｃｏｍ）。全ての動物は接種後に生存した。１０匹ずつのマウスを、下記の毎日の治療のうちの１つの対象とした。
１−製剤Ａ（ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物）
２−製剤Ｔ（ＰＡＦＰ−タプシガルギン組成物）
３−製剤Ｓ（脾臓抽出物）
４−製剤Ａ＋Ｓ
５−製剤Ｔ＋Ｓ
６−対照油
７−対照水
【００６１】
１０匹のマウスから成る各群は、Ｐ−３８８細胞接種の翌日である第２日より始まる、油送達媒体中の指示された治療の０．２ｍＬの１日経口用量を服用した。該動物は、接種後第２４日に腫瘍成長について評価した。結果を表２にまとめる。
【００６２】
【表２】
2009515909.tif 000004
【００６３】
マウスの側面に皮下接種され、指示されるように接種後第１日より始まって毎日治療された、Ｐ−３８８リンパ性白血病細胞株の増殖を図３に示す。
【００６４】
結果：
１．  群１（ＰＡＦＰ−アトラクチロシド）および群２（ＰＡＦＰ−タプシガルギン）の動物における腫瘍の成長は、接種後第２４日における対照群６（油）と比べて、平均でそれぞれ７９％および５３％抑制された。接種後第２２日では、腫瘍の成長は対照群７（水）と比べて、平均でそれぞれ８５％および７９％抑制された。
２．  生存率は、１０匹の各群内の動物の５０％（例えば５匹）が生存していた時に測定した。ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物を投与された群１の動物における５０％生存率（第３０日）は、対照として水を投与した動物（群７）の生存率（第２１日）と比べて、１．４倍増加した。ＰＡＦＰ−タプシガルギン組成物を投与された群２の動物における５０％生存率（第２７日）は、対照動物と比べて、１．２８倍増加した（図４）。
３．  接種後３８日、ＰＡＦＰ−アトラクチロシド（「製剤Ａ」）の毎日の治療を受けている１０匹のマウスのうち３匹がなお生存しており、ＰＡＦＰ−タプシガルギン（「製剤Ｔ」）を投与されている１０匹のマウスのうち１匹がなお生存していた（図４）。水対照群内の全てのマウスが第２４日までに死亡した一方で、油対照群内の全てのマウスは第２５日までに死亡した。
４．  「製剤Ａ」の毎日の治療を受けている、接種後３８日になお生存していた３匹のマウスのうち１匹において、腫瘍の緩解が認められた（表３）。
【００６５】
【表３】
2009515909.tif 000005
【００６６】
同様の腫瘍成長の緩解は、ＡＦＰをそれが共有接合される抗生エスペラマイシンＡ１に対する送達媒体として使用して、Ｓｅｖｅｒｉｎらによって実証された（Ｓｅｖｅｒｉｎ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｏｋｌ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ．３６６（４）：５６１−４，１９９９）。
【００６７】
結論：
１．  それぞれＰＡＦＰ−アトラクチロシドおよびＰＡＦＰ−タプシガルギンから成る「製剤Ａ」および「製剤Ｔ」は、実証された濃度で、腫瘍成長を抑制した。
２．  アポトーシス誘導剤であるＰＡＦＰと結合したアトラクチロシドおよびタプシガルギンの投与は、白血病のマウスモデルにおいて生存を延長した。
【００６８】
（実施例５）
インビボデータ−腫瘍：ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物は、ヒトにおける腫瘍細胞を殺滅する
各医師によって癌の進行においてＩＶ期として分類された８名の患者は、１ヶ月にわたって毎日、カプセル形態（２〜６カプセル）のＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の経口用量を投与された。そしてこれらの患者の進展を、さらに４ヶ月にわたって各医師によって追跡した。患者自身は、生活の質の向上を報告した。これらの患者において行われたＣＴスキャンによると、ＰＡＦＰ−アトラクチロシド治療を受けている者は、原発腫瘍の成長率の減少、症例によっては原発腫瘍のサイズの減少、ならびに転移の程度の減少を経験した。初期ヒト研究の結論は次のとおりである：
【００６９】
１．  ２〜６カプセルの１日用量におけるＰＡＦＰ−アトラクチロシド製品（でんぷんおよび油送達媒体中）の経口摂取は、安全であり、治療の経過中の最小限の副作用と関連することが分かった。
２．  原発および転移性腫瘍サイズならびに転移部位の痛みの減少は、ＰＡＦＰ−アトラクチロシド製品の具体的な制癌作用を確定した。
３．  身体活動性および一般的な健康の患者が説明した向上によって測定された、生活の質の顕著な改善は、ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与を、単独またはその他の薬剤との組み合わせいずれかで受けた患者において、認められた。
４．  データは、原発および転移性両方の腫瘤において認められた減少によって判定されるように、ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物を投与された患者における用量依存反応を示した。
５．  ＰＡＦＰ−アトラクチロシドの投与は、用量を増加させるにつれて、まれにしか急性免疫反応（体温の上昇、腫瘍／転移の部位における局所疼痛）を伴わない。
６．  ＰＡＦＰアトラクチロシド組成物の投与に応じたＩＶ期癌患者における全身腫瘍組織量の減少は、組成物が経口投与可能であることを示唆した。
【００７０】
（実施例６）
インビボデータ−白血病：インビトロで第１のアポトーシス誘導剤と、第２のアポトーシス誘導剤とに可逆的に結合する外因性ＰＡＦＰを備える組成物は、マウスにおける腫瘍細胞を殺滅する
毎日の治療は、
１−対照水
２−対照油
３−インビトロで第１のアポトーシス誘導剤（ベツリン酸）に結合したＰＡＦＰ（ＰＡＦＰ−ベツリン酸組成物）
４−付加的な非結合ベツリン酸と組み合わせた、インビトロで第１のアポトーシス誘導剤（ベツリン酸）に結合したＰＡＦＰ（ＰＡＦＰ−ベツリン酸組成物）
から成った。
【００７１】
マウスは、第１日に２０，０００個のＰ−３８８マウス白血病細胞を接種され、第２日に０．２ｍＬの水（１）または油（２）の対照治療、または０．２ｍＬ用量の試験製剤３または４といった、１日経口用量を投与された。実験は、各治療群に１０匹のマウスを含むように設計された。図５は、１日経口用量の水（１）、油（２）、ＰＡＦＰ結合ベツリン酸（３）、または付加的な非結合ベツリン酸と組み合わされたＰＡＦＰ結合ベツリン酸（４）のうちの１つを投与されている動物における、時間の関数としてのＰ−３８８白血病細胞の増殖のグラフを示し、この場合、後半２つの製剤のそれぞれは、０．２ｍＬの油中に懸濁される。
【００７２】
群４の治療は、過剰なベツリン酸をＤＭＳＯ中に０．５ｍｇ／ｍＬとして溶解し、そして２μＬ（１μｇ）のこの溶液を０．２ｍＬのＰＡＦＰ結合ベツリン酸製剤に加えることによって調製した。ＰＡＦＰ結合ベツリン酸が腫瘍細胞に送達されると、ＰＡＦＰは細胞外に再循環されることが仮定されており、Ｉ１２５標識ＡＦＰが新生リンパ細胞系によって取り込まれ、細胞から実質的に分解されずに解放されることを実証したインビトロ研究の結果に基づいて、腫瘍細胞への後の送達のために腫瘍内微小環境において、外因性ＰＡＦＰが過剰ベツリン酸と結合することを可能にする（Ｔｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７（１）：１１０−１１７，１９９１）。
【００７３】
ベツリン酸（ＢＡ）は、悪性黒色腫を治療するために使用されている（米国特許出願公報第２００３／０１８６９４５号）が、大量のＢＡが必要とされる（毎日０．２ｍｇ〜５００ｍｇ）。ＰＡＦＰは、１：２のモル比でＢＡと混合され、その場合、組成物は、担体の役割を果たす０．２ｍＬの油内の０．６ｍｇのヒト用の量で存在している。重量比では、ベツリン酸は０．００８ｍｇの１日用量で存在している。ＰＡＦＰと複合している場合、ベツリン酸はマイクログラム濃度でヒトにおいて有効であることが分かっている。Ｂｏｉｋ（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２００１）は、ヒト用量（グラム／ｋｇ）＝マウス用量（ｍｇ／ｋｇ）／１０４という、ヒト用量から同等のマウス経口用量を算出するための方程式を提供している。７５ｋｇのヒト体重および０．０２ｋｇのマウス体重は、０．０００６ｇ（ヒト用量）×１０４＝マウス用量（ｍｇ／ｋｇ）＝０．０６２４ｍｇ／ｋｇをもたらす。０．０２ｋｇのマウスに対しては、用量は０．０６２４ｍｇ／ｋｇ×０．０２ｋｇ＝０．０１２４８ｍｇまたは１２μｇとして算出することが可能である。ヒト用量からマウス用量を算出するための係数は、６００μｇ（ヒト１日用量）／１２μｇ（マウス１日用量）＝５０である。過剰な第２のアポトーシス誘導剤が用量に含まれる場合、この第２のアポトーシス誘導剤は後に、油懸濁形態で、第１の複合体（ＰＡＦＰ／第１のアポトーシス誘導剤）の既に調製された油懸濁に加えられる。例えば、典型的なマウス用量は、０．０５ｍＬの油と混ぜられ、０．２ｍＬの最終量の油まで、油中で溶解された０．１５ｍｇのベツリン酸と組み合わせられた、乾燥形態の７μｇのＰＡＦＰ−ベツリン酸複合体から成る。
【００７４】
過剰なベツリン酸がないＰＡＦＰ結合ベツリン酸を投与されている動物（群３）における腫瘍容積の、過剰なベツリン酸と組み合わせてＰＡＦＰ結合ベツリン酸を投与されている動物（群４）における腫瘍容積との比較は、後者の治療が腫瘍容積の減少を結果としてもたらしたことを示す。結果は、過剰な非結合ベツリン酸とのＰＡＦＰ結合ベツリン酸の組み合わせにおける、治療的利益の追加を示唆している。データは、悪性新生物を治療するために、ＰＡＦＰに結合することが可能であるアポトーシス誘導剤を使用することが可能であり、その細胞は、１）アポトーシス誘導剤と結合したＰＡＦＰの腫瘍細胞への送達、および２）インビボでＰＡＦＰに結合して治療成績を向上することが可能である第２のアポトーシス誘導剤の結果的な送達により、ＡＦＰ受容体を発現することを、さらに示唆している。
【００７５】
結果は、ＰＡＦＰ結合ベツリン酸製剤中の過剰な非結合ベツリン酸の含有は、ＰＡＦＰ結合ベツリン酸単独よりも、腫瘍成長を低減させるのに効果的であることを実証している。さらに、データは、本発明の組成中に第２のアポトーシス誘導剤を使用する際の治療的利点を示唆している。
【００７６】
（実施例７）
インビボデータ−腫瘍：インビトロで第１の化合物と、第２の化合物とに可逆的に結合する外因性ＰＡＦＰを備える組成物は、ヒト患者における固形腫瘍型の癌を殺滅するために使用される。
転移を伴う、または伴わない固形腫瘍がある５名の患者（女性４名および男性１名）における予備結果：
患者＃１：女性、５７歳、局所的乳癌
患者＃２：女性、６３歳、骨に転移した乳癌
患者＃３：女性、４４歳、卵巣・乳癌
患者＃４：女性、６０歳、リンパ節への転移を伴う乳癌
患者＃５：男性、５８歳、精巣癌
【００７７】
本研究の目的は、手術不可能、既存の治療に対して難治性、または術後再発として分類される固形型癌の患者における、ＰＡＦＰ−ベツリン酸組成物に対する奏功を評価することであった。
【００７８】
患者は、朝に１つおよび就寝前に１つ、空腹時に２つのソフトゲルという１日投与量を服用した。各ソフトゲルは、ＰＡＦＰ−ベツリン酸製品（つまり、インビトロで外因性ＰＡＦＰに可逆的に結合するベツリン酸）、および過剰なベツリン酸（つまり、ＰＡＦＰに結合されない付加的なベツリン酸）から成っていた。ＰＡＦＰ−ベツリン酸製品は、１ソフトゲルにつき３００μｇのＰＡＦＰおよび６μｇのベツリン酸という単一単位用量で提供した。過剰な、または付加的なベツリン酸は、１ソフトゲルにつき１５０μｇで存在していた。
【００７９】
予備結果は、５名の患者中４名が、癌の進行率の減少、および痛みの軽減、エネルギーレベルの向上、および食欲の増進という患者報告によって判定されるような全体的により良い生活の質を実証したことを示した。患者は、ソフトゲルによる治療に関わる副作用を報告しなかった。
【００８０】
（実施例８）
インビボデータ−ヒト患者における転移性腫瘍容積の減少
本研究の目的は、固形腫瘍の治療における、ＰＡＦＰ−アトラクチロシド複合体の治療的利益を評価することであった。ソフトゲルは、転移性疾患の患者において空腹時に、朝に１つおよび就寝前に１つ、経口で毎日２カプセル投与した。
【００８１】
１３名の患者を評価した。１２名の患者が結腸癌、１名の患者が乳癌と診断されていた。各患者は、少なくとも１部位に転移性疾患を呈した。７名の患者が女性で６名が男性であり、それぞれ年齢は４５歳から６５歳であった。
【００８２】
各患者は、４から８週間にわたって毎日、２カプセル（１カプセルにつき０．３ｍｇのＰＡＦＰ＋０．００６ｍｇのアトラクチロシド）の投与量で、ＰＡＦＰ結合アポトーシス誘導剤（ＣＰＡという名）を投与された。コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）（Ｓｉｅｍｅｎｓ、１６層）スキャンを治療の前後に行った。
【００８３】
下記は該研究の結果である。ＣＴスキャンデータに基づき、患者奏功を次のうちの１つとして分類した：
完全：  明白な転移なし
部分的：少なくとも１つの転移が消滅したか、または大きさが減少した
安定：  安定化についての世界保健機関標準内の転移成長（２５％未満の成長）。
進行：  転移の大きさの増加（２５％以上）または健康状態の悪化のいずれか。
中断：  副作用が治療の中断につながった。
【００８４】
患者データの概要を表４に提供する。治療の前後にとられたＣＴスキャンを、各々が治療の完全奏功を実証した患者Ｐ．およびＰ．Ｎ．Ｇ．について図６および７に提供する。
【００８５】
【表４】
2009515909.tif 000006
【００８６】
完全な患者情報は次のとおりである：
【００８７】
患者：Ｐ．
性別：男。年齢：５６歳。
臨床診断：結腸癌（Ｔ２  Ｎ０  Ｍ０）、腺癌（２００５年１月２１日よりＢ−１２３２５６−６８）
以前の治療：手術（腫瘍切除）−２００５年１月１５日
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与の前：
２００６年５月−進行：１肝転移（Ｍｔｓ）（１３×１５ｍｍ）（２００６年５月１５日からのＣＴ）
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与：２００６年５月５日〜２００６年７月１５日
治療の結果：    肝Ｍｔｓなし（２００６年８月２日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝８０％
副作用：なし
結論：完全奏功。転移は消滅した。
患者Ｐ．については、治療の前（左）および後（右）にとられたＣＴスキャン（図６）の比較は、転移（矢印）が治療後にもはや明瞭ではないことを示す。
【００８８】
患者：Ｐ．Ｎ．Ｇ．
性別：男。年齢：６２歳。
臨床診断：結腸癌（Ｔ２  Ｎ０  Ｍ０）。腺癌（２００５年１月９日よりＯ−１０４５−４８）。
以前の治療：手術（腫瘍切除、左）−２００５年８月
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与の前：
２００６年５月−進行；１肝臓Ｍｔｓ：７×１０ｍｍ（２００６年５月２０日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝９０％
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与：２００６年６月１０日〜２００６年７月２２日
治療の結果：肝Ｍｔｓなし（２００６年８月１６日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝９０％
副作用：なし
結論：完全奏功。転移（７×１０ｍｍ）は消滅した。
患者Ｐ．Ｎ．Ｇ．については、治療の前（左）および後（右）にとられたＣＴスキャン（図７）の比較は、転移（矢印）が治療後にもはや明瞭ではないことを示す。
【００８９】
患者：Ａ．Ｎ．Ａ．
性別：女。年齢：４８歳。
臨床診断：結腸癌（Ｔ３ａ  Ｎ１  Ｍ１）、転移：１（肝臓）、腺癌（２００５年９月２５日よりＢ−１１６７−７５）。
以前の治療：手術なし、化学療法（Ｅｌｏｘａｔｉｎ、Ａｌｉｍｔａ）、２００５年１０月〜２００６年２月、腫瘍成長の安定化
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与の前：
２００６年５月−進行：肝臓Ｍｔｓ（左葉）：２５×２７ｍｍ（２００６年５月２８日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝８０％
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与：２００６年６月１０日〜２００６年８月１２日
治療の結果：肝臓Ｍｔｓ（左葉）：１６×１１ｍｍ（２００６年８月２１日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝９０％
副作用：なし
結論：部分的奏功：転移縮小。
ＣＴスキャンは、１日２回投与量のＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物を投与された患者の肝臓における結腸癌転移の大きさの７３％（２５×２７＝６７５、１６×１１＝１７６、６７５−１７６＝４９９、４９９／６７５＝７３．９％）縮小を示す。
【００９０】
患者：Ａ．Ｎ．Ｐ．
性別：女、年齢：６３歳
臨床診断：結腸癌（Ｔ３  Ｎ０  Ｍ０）、腺癌（２００５年１月１４日よりＯ−１１１７−２９）。
以前の治療：手術（片側結腸切除術、右）−２００４年１２月
２００５年８月−進行。化学療法−Ｅｌｏｘａｔｉｏｎ、Ｘｅｌｏｄａ、５−ＦＵ；部分的奏功
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与の前：
２００６年５月−進行、Ｒｅｔｚｉｄｉｖ：３肝臓Ｍｔｓ：２１×２８ｍｍ、２７×２９ｍｍ、１０×１２ｍｍ（２００６年５月１７日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝７０−８０％
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与：２００６年６月５日〜２００６年７月３０日
治療の結果：２肝臓Ｍｔｓ：２１×２８ｍｍ、２７×２９ｍｍ（２００６年８月８日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝９０％
副作用：なし
結論：部分的奏功：肝転移のうちの１つ（１０×１２ｍｍ）の消滅。
【００９１】
患者：Ｓ．Ｖ．Ａ．
性別：女。年齢：４５歳
臨床診断：結腸癌（Ｔ２  Ｎ１  Ｍ０）。腺癌（２００５年３月２５日よりＯ−１１３５−４２）。
以前の治療：手術（片側結腸切除術、左）−２００５年３月
２００６年５月−対症療法
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与の前：
２００６年４月−進行：３肝臓Ｍｔｓ：４５×６５ｍｍ、２６×４２ｍｍ、および７×９ｍｍ（２００６年４月２６日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝８０％
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与：２００６年６月２９日〜２００６年７月２４日
治療の結果：２肝臓Ｍｔｓ：４２×５５ｍｍおよび２６×４２ｍｍ（２００６年８月３日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝９０％
副作用：なし
結論：部分的奏功：１転移は消去（７×９ｍｍ）し、２転移は安定化した。
【００９２】
患者：Ｚ．Ｔ．Ｐ
性別：女。年齢：４９歳
臨床診断：乳癌（Ｔ３ｂ  Ｎ１  Ｍ０）
以前の治療：手術（乳腺切除術）−２００４年１２月、放射線治療（リンパ節の部位）
Ｔａｘｏｔｅｒｅによる治療、安定
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与の前：
２００６年７月−進行。１肝臓Ｍｔｓ：６７×６９ｍｍ（２００６年７月１８日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝９０％
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与：２００６年８月５日〜２００６年９月２日
治療の結果：１肝臓Ｍｔｓ：６８×６６ｍｍ（２００６年８月３０日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝９０％
副作用：なし
結論：安定化。
【００９３】
患者：Ｇ．Ｎ．Ｋ．
性別：女、年齢：６２歳
臨床診断：結腸癌（Ｔ２  Ｎ０  Ｍ０）、腺癌（２００５年６月１４日よりＯ−１０８６−９２）
以前の治療：手術（腫瘍切除、右）−２００５年６月
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与の前：
２００６年６月−進行：２肝臓Ｍｔｓ：８×６ｍｍおよび６×６ｍｍ（２００６年１０月６日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝９０％
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与：２００６年７月１日〜２００６年９月２日
治療の結果：２肝臓Ｍｔｓ：８×６ｍｍおよび６×６ｍｍ（２００６年９月１５日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝９０％
副作用：なし
結論：安定化。
【００９４】
患者：Ｐ．Ａ．Ｇ．
性別：男。年齢：６５歳
臨床診断：結腸癌（Ｔ２  Ｎ０  Ｍ０）。腺癌（２００５年９月２５日よりＯ−１２５６−６５）。
以前の治療：外科手術−２００５年９月。２００５年１２月−進行：肝臓内のＭｔｓ
５コースの化学療法：５−ＦＵ。
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与の前：
２００６年６月−進行：２肝臓Ｍｔｓ：３２×２４ｍｍおよび３２×２６ｍｍ（２００６年６月１４日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝９０％
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与：２００６年６月１９日〜２００６年８月１３日
治療の結果：２肝臓Ｍｔｓ：３２×２４ｍｍおよび３２×２６ｍｍ（２００６年８月２２日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝９０％
副作用：なし
結論：安定化
【００９５】
患者：Ｂ．Ｌ．Ｎ．
性別：女、年齢：５７歳
臨床診断：結腸癌（Ｔ３ｂ  Ｎ０  Ｍ０）、腺癌（２００６年１月１４日よりＯ−１２４５−６１）
以前の治療：手術（腫瘍切除、右）−２００５年１２月
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与の前：
２００６年６月−進行：肝臓Ｍｔｓ：１８×１２ｍｍ（２００６年６月１９日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝９０％
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与：２００６年７月２日〜２００６年８月２７日
治療の結果：肝臓Ｍｔｓ：２２×１８ｍｍ（２００６年９月４日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝９０％
副作用：なし
結論：進行。転移が２５％以上増加した。
【００９６】
患者：Ｋ．Ａ．Ｒ．
性別：男。年齢：５２歳
臨床診断：結腸癌（Ｔ３ｂ  Ｎ１  Ｍ１−Ｈｅｐ．）、腺癌（Ｂ−１１８９−９６）
以前の治療：手術なし。化学療法−Ｅｌｏｘａｔｉｏｎ（２００５年１２月〜２００６年２月）安定化
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与の前：
２００６年６月−進行：１肝臓Ｍｔｓ：１１８×８５ｍｍ（２００６年６月１９日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝６０〜７０％
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与：２００６年６月２６日〜２００６年８月２７日
治療の結果：１肝臓Ｍｔｓ：１１８×８５ｍｍ（２００６年６月１９日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝４０〜５０％
夜に体温が上がる。歩行不可。
副作用：嘔吐、悪心
結論：臨床的進行。転移−非動的（安定化）
【００９７】
患者：Ｋ．Ｖ．Ｉ．
性別：男、年齢：４８歳
臨床診断：結腸癌（Ｔ３ｂ  Ｎ１  Ｍ１−Ｈｅｐ．）。腺癌（Ｂ−１２４５−５０）
以前の治療：手術なし。化学療法−Ｅｌｏｘａｔｉｏｎ（２００５年１０月〜１１月）。部分的奏功
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与の前：
２００６年５月−進行：１肝臓Ｍｔｓ：１９×９ｍｍ（２００６年５月１６日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝９０％
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与：２００６年６月５日〜２００６年７月３０日
治療の結果：１肝臓Ｍｔｓ：２８×３２ｍｍ（２００６年８月８日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝９０％
副作用：なし
結論：進行。
【００９８】
患者：Ｐ．Ａ．Ｖ．
性別：男。年齢：６５歳
臨床診断：結腸癌（Ｔ３ａ  Ｎ０  Ｍ０）。腺癌（２００５年２月１２日よりＯ−１２１２−３４）。
以前の治療：手術（腫瘍切除）−２００５年２月
２００５年１０月−進行；肝臓内のＭｔｓ
２００５年１０月〜１１月−化学療法（Ｅｌｏｘａｔｉｏｎ）−部分的奏功
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与の前：
２００６年６月−進行：２肝臓Ｍｔｓ：７×８ｍｍおよび５×６ｍｍ（２００６年６月６日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝９０％
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与：２００６年６月５日〜２００６年８月６日
治療の結果：２肝臓Ｍｔｓ：１２×９ｍｍおよび６×８ｍｍ（２００６年８月７日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝９０％
副作用：なし。
結論：進行。
【００９９】
患者：Ｒ．Ｄ．Ｐ．
性別：女。年齢：６２歳
臨床診断：結腸癌（Ｔ２  Ｎ１  Ｍ０）。腺癌（２００４年９月２９日よりＯ−１１８７−４８）。
以前の治療：手術（腫瘍切除、左）−２００４年９月
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与の前：
２００６年５月−進行：２肝臓Ｍｔｓ：６５×８５ｍｍおよび４６×２２ｍｍ、融合傾向（２００６年５月１４日からのＣＴ）
生活の質（カルノフスキー指数）＝９０％
ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物の投与：２００６年６月
治療の結果：判定されず
副作用：嘔吐、悪心；制吐薬によって抑制されず
結論：治療は副作用（嘔吐、悪心）のために中断された。
【０１００】
本研究で治療されている進行癌を考慮すると、１日用量のＣＰＡを投与された１３名の患者の結果は、６１％（８／１３）が奏功を実証したことを示す。奏功とは、転移性腫瘤が治療後に検出不可能であった（１５％、２／１３）、少なくとも１つの転移性腫瘤が消去またはサイズが縮小した（２３％、３／１３）、または転移成長において進行が認められなかった（安定化、２３％、３／１３）、のうちのいずれかを意味する。
【０１０１】
４名の患者が疾患の進行を経験し（３１％）、および１名（８％）は副作用（嘔吐、悪心）により研究から排除された。主要治験責任医師は、副作用が治療に直接関連していたかどうかを判定することができず、肝臓内の初期転移の大きさ（６５×８５ｍｍおよび４６×２２ｍｍ、融合傾向）が影響を及ぼした可能性を示唆している。
【０１０２】
製品の摂取に直接相関していた可能性がない嘔吐の１症例を除いて、重篤な副作用は報告されなかった。
【０１０３】
患者Ａ．Ｎ．Ａ．およびＡ．Ｎ．Ｐ．には、それぞれＥｌｏｘａｔｉｎ／ＡｌｉｍｔａおよびＥｌｏｘａｔｉｎ／Ｘｅｌｏｄａ／５−ＦＵによる治療後に発生した多剤耐性転移があった。ＰＡＦＰ−アトラクチロシド組成物治療の後、これらの患者は転移性腫瘍サイズの縮小を実証した。これらのデータは、インビボで多剤耐性を克服するＰＡＦＰ−アトラクチロシド複合体の能力を支持する。
【０１０４】
前述のものは、本発明の特定の側面の具体例である。その変更および変形物を含む、その他多くの実施形態も可能であり、本願に記載の本発明を再考することによって当業者にとっては明白となる。したがって、全ての適切な変更、変形物、および同等物を用いてもよく、そのような変更、変形物、および同等物は、本願で説明されるような本発明の範囲内および添付請求項の範囲内であることを目的としている。
【０１０５】
[参考文献]
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Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（１３）：１０４２−５３，２０００．
Ｄｅｃａｕｄｉｎ  Ｄ，Ｇｅｌｅｙ  Ｓ，Ｈｉｒｓｃｈ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｃｌ−２  ａｎｄ  Ｂｃｌ−ＸＬ  ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｅｃｅｄｉｎｇ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９７；５７：６２−６７．
Ｄｕｄｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｕｓｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ａ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ＣＤ９５，ＴＮＦＲ１  ａｎｄ  ＴＮＲＦ２  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ−３−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６６：１−１３，１９９９．
Ｅｖａｎ，Ｇ．Ｉ．ａｎｄ  Ｖｏｕｓｄｅｎ，Ｋ．Ｈ．，Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：３４２−３４８，２００１．
Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｎ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＡＦＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６５：１１４０−１１４５，２０００．
Ｆｉｓｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ．Ｃｅｌｌ  ７８：５３９−５４２，１９９４．
Ｆｕｌｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ａｎｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ａｐｏｐｔｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｂｙ  ｂｅｔｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８：２７３（５１）：３３９４２−８，１９９８．
Ｇｅｒｍａｎｎ  ＵＡ．，Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−ａ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３２Ａ：９２７−９４４，１９９６．
Ｈｉｒａｎｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＡＦＰ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３１，１８９−１９１，１９８５．
Ｋｅｅｌ，Ｂ．Ａ．，Ｃｈｏ，Ｓ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＡＦＰ  ｃｈａｒｇｅ  ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｂｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ，Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉ  ＧＩ，Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ＨＩ，ｅｄｓ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ａｌｐｈａ１−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｌ  ２，２４−３１，１９８９．
Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）ｇｅｎｅ  ｔｏ  ｓｗｉｎｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ８．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｎｉｍａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３３：４６８−４８５，２００２．
Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｇ．，Ｚａｍｚａｍｉ，Ｎ．，Ｓｕｓｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １８：４４−５１，１９９７．
Ｌａｂｏｒｄａ，Ｊ．，Ｎａｖａｌ，Ｊ．，Ａｌｌｏｕｃｈｅ，Ｍ．，Ｃａｌｖｏ，Ｍ．，Ｇｅｏｒｇｏｕｌｉａｓ，Ｖ．，Ｍｉｓｈａｌ，Ｚ．，Ｕｒｉｅｌ．Ｊ．，Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ＡＦＰ  ｂｙ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４０：３１４−３１８，１９８７．
Ｌｅｈｎｅｒｔ  Ｍ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ：ａ  ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌ  ｐｒｏｂｌｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３２Ａ：９１２−９２０，１９９６．
Ｌｕｔｓｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌｐｈａ  Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１（６）：３６７−３７４，２０００．
Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ，Ｐ．，Ｃａｓｔｅｄｏ，Ｍ．，Ｓｕｓｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｚａｍｚａｍｉ，Ｎ．，Ｈｉｒｓｃｈ，Ｔ．，Ｍａｃｈｏ，Ａ．，Ｈａｅｆｆｎｅｒ，Ａ．，Ｈｉｒｓｃｈ，Ｆ．，Ｇｅｕｓｋｅｎｓ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｇ．Ｊ．，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４，１１５５−１１６０，１９９６．
Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉ，Ｇ．Ｊ．，Ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ  ｏｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｕｌｒｉｃｈ  Ｗｅｓｔｐｈａｌ，Ｓｔｅｒｏｉｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ＩＩ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ，Ｔｏｋｙｏ，１９８６，３２０−３５６．
Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ａｎｔｉｕｔｅｒｏｔｒｏｐｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．７（１）：１９−３６，１９８６．
Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉ，Ｇ．Ｊ．，Ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｔｏ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ，ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２２６（５）：３７７−４０８，２００１．
Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉ，Ｇ．Ｊ．，Ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ＡＦＰ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｌｐｈａ−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，ｅｄ．Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉ  Ｇ．Ｉ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５．
Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｉ  ＧＩ，Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ＨＩ，ｅｄｓ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ａｌｐｈａ１−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｌ  １，１９８７；ｖｏｌ  ２，１９８９．
Ｍｏｒｉｎａｇａ，Ｔ，Ｓａｋａｉ，Ｍ，Ｗｅｇｍａｎｎ，ＴＧ，Ｔａｍａｏｋｉ，Ｔ．，Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｍＲＮＡ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８３  Ａｕｇ；８０（１５）：４６０４−８．
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Ｍｏｒｏ−Ｖｉｄａｌ，Ｒ．，Ｔｈｅ  ＡＦＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ａ  ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，Ｃｕｒｅｘ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，ｗｗｗ．ｂｉｏｃｕｒｅｘ．ｃｏｍ．
Ｍｏｓｋａｌｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ａ  ｎｅｗ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏ  ｏｖｅｒｃｏｍｅ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．２１（１２）：７９３−９１９９７，１９９７．
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Ｍｅｄ．，１８３：１５３３−１５４４，１９９６．
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】化学療法薬の対象となる癌細胞における、カスパーゼ媒介アポトーシス経路の概略図。
【図２】ＡＦＰ濃縮物単独（レーン「Ｃ」）、アトラクチロシドに結合したＡＦＰ濃縮物（レーン「Ａ」）、および標準分子量マーカーのゲル電気泳動。レーン「Ｂ」は別の実験用に廃棄されている。
【図３】ＰＡＦＰアポトーシス誘導剤組成物による治療後の白血病のマウスモデルにおいて、日数で測定された時間の関数としてｃｍ３で測定された腫瘍容積。Ｐ−３８８白血病細胞は、ＤＢＡ２マウスに皮下注射した。接種後１日の動物は、１．製剤Ａ（ＰＡＦＰ-アトラクチロシド（Ａ））、２．製剤Ｔ（ＰＡＦＰ-タプシガルギン（Ｔ））、３．製剤Ｓ（脾臓抽出物（Ｓ））、４．製剤Ａ＋Ｓ、５．製剤Ｔ＋Ｓ、６．対照油、または７．対照水のうちの１つにより、毎日治療した。
【図４】Ｐ−３８８白血病細胞の皮下注射、および１．製剤Ａ（ＰＡＦＰ-アトラクチロシド（Ａ））、２．製剤Ｔ（ＰＡＦＰ-タプシガルギン（Ｔ））、３．製剤Ｓ（脾臓抽出物（Ｓ））、４．製剤Ａ＋Ｓ、５．製剤Ｔ＋Ｓ、６．対照油、または７．対照水のうちの１つによる、接種後１日のその後の毎日の治療の後の、ＤＢＡ２マウスにおける生存率。
【図５】ＤＢＡ２マウスへのＰ−３８８白血病細胞の皮下注射、および１．対照（水）、２．対照（油）、３．ＰＡＦＰ−ベツリン酸、４．ＰＡＦＰ−ベツリン酸および追加非結合ベツリン酸のうちの１つによる、接種後１日のその後の毎日の治療の後の、日数で測定された時間の関数としてｃｍ３で測定された腫瘍容積。
【図６】肝移転の消去を示す、結腸の転移性腺癌がある癌患者Ｐ．における、ＰＡＦＰ−アトラクチロシド経口カプセル治療の８週間前（左）および後（右）のＣＴスキャンの比較。
【図７】肝移転の消去を示す、結腸の転移性腺癌がある癌患者Ｐ．Ｎ．Ｇ．における、ＰＡＦＰ−アトラクチロシド経口カプセル治療の６週間前（左）および後（右）のＣＴスキャンの比較。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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