(57)【要約】  本発明は、蛍光性を有する磁性ナノ粒子、その製造方法及びその用途に関する。本発明による磁性ナノ粒子は、光学的性質及び磁気的性質を同時に有するので、様々なバイオ分野への適用が可能であり、シリカシェルを水溶性物質を利用して表面改質することによって、多様な化学官能基をナノ物質に導入することができ、これらを利用して細胞内への浸透力を増加または減少させることができるだけでなく、所望の特定の細胞だけに作用するように選択性を付与することができる。
2009508105.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁気物質を含むコアと、コアの外部に有機蛍光物質とを含み、表面改質されたシリカシェルで覆われた、そのサイズが１００ｎｍ以下で且つ水溶性である磁性ナノ粒子。
【請求項２】
前記磁性ナノ粒子は、コバルト、鉄、マンガン、亜鉛、ニッケル及び銅からなる群から選択された１種の金属酸化物を含むことを特徴とする請求項１に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項３】
前記有機蛍光物質は、ローダミンＢイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）であることを特徴とする請求項１に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項４】
前記シリカシェルは、電荷を帯びた物質で表面改質されたものであることを特徴とする請求項１に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項５】
前記電荷を帯びた物質は、イオン性官能基を有する有機シリコーン化合物であることを特徴とする請求項４に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項６】
前記イオン性官能基を有する有機シリコーン化合物は、（ＣＨ3Ｏ）3Ｓｉ−ＰＥＧ［（ＣＨ3Ｏ）3ＳｉＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6〜9ＣＨ3］、（ＣＨ3Ｏ）3Ｓｉ−ＰＭＰ［（ＣＨ3Ｏ）3ＳｉＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ2（ＯＣＨ3）Ｎａ］、（ＣＨ3Ｏ）3Ｓｉ−ＰＴＭＡ［（ＣＨ3Ｏ）3ＳｉＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｎ+（ＣＨ3）3Ｃｌ-］及び３−アミノプロピルトリエトキシシラン（3-aminopropyltriethoxysilane；ＡＰＳ）よりなる群から選択された１種であることを特徴とする請求項５に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項７】
前記磁性ナノ粒子は、細胞内に浸透し、外部磁場（０．３テスラ）によって０．５〜１ｍｍ／ｓｅｃの速度で移動することを特徴とする請求項１に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項８】
前記細胞は、真核細胞、ヒトの細胞、動物細胞、または植物細胞であることを特徴とする請求項７に記載の磁性ナノ粒子。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれかに記載の磁性ナノ粒子の表面改質されたシリカシェルの表面に陰電荷を帯びた遺伝子が結合されている遺伝子結合磁性ナノ粒子。
【請求項１０】
前記陰電荷を帯びた遺伝子は、プラスミドＤＮＡであることを特徴とする請求項９に記載の遺伝子結合磁性ナノ粒子。
【請求項１１】
前記プラスミドＤＮＡは、ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰであることを特徴とする請求項１０に記載の遺伝子結合磁性ナノ粒子。
【請求項１２】
請求項９に記載の遺伝子結合磁性ナノ粒子を含む遺伝子デリバリーシステム。
【請求項１３】
請求項１乃至８のいずれかに記載の磁性ナノ粒子の表面改質されたシリカシェルの表面に陰電荷を帯びた核酸が結合されている核酸結合磁性ナノ粒子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸結合磁性ナノ粒子を含む遺伝子デリバリーシステム。
【請求項１５】
請求項１乃至８のいずれかに記載の磁性ナノ粒子の表面改質されたシリカシェルの表面に抗体が結合されている抗体結合磁性ナノ粒子。
【請求項１６】
前記表面改質されたシリカシェルは、３−アミノプロピルトリエトキシシランによって表面改質されたものであることを特徴とする請求項１５に記載の抗体結合磁性ナノ粒子。
【請求項１７】
前記３−アミノプロピルトリエトキシシランのアミン基をマレイミドブチル酸で処理し、アミン基にマレイミド基を導入したことを特徴とする請求項１６に記載の抗体結合磁性ナノ粒子。
【請求項１８】
前記抗体は、２−メルカプトエチルアミン（2-mercaptoethylamine）と反応してチオール基を有することを特徴とする請求項１７に記載の抗体結合磁性ナノ粒子。
【請求項１９】
前記抗体は、白血病細胞に対してＣＤ−１０抗体または乳房癌細胞に対してＨｅｒ２Ab抗体であることを特徴とする請求項１８に記載の抗体結合磁性ナノ粒子。
【請求項２０】
請求項１５に記載の抗体結合磁性ナノ粒子を含む細胞染色剤。
【請求項２１】
１）水溶性磁性体ナノ粒子の表面をポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）高分子で処理し、エタノールに分散される形態に変換させた後、遠心分離する段階と、
２）前記１）段階で分離された高分子によって安定化された磁性ナノ粒子をシリカコーティングをするためにエタノールに分散させる段階と、
３）前記２）段階で製造した溶液に、有機蛍光物質を３−アミノプロピルトリエトキシシラン（3-aminopropyltriethoxysilane；ＡＰＳ）で処理した溶液とテトラエトキシシラン（tetraethoxysilane；ＴＥＯＳ）の溶液を添加し、ＮＨ4ＯＨを添加し、有機蛍光物質を含む磁性ナノ粒子の表面からシリカが形成されるように誘導する段階と、
４）前記３）段階で得た磁性ナノ粒子のシリカシェルの表面をシリコーン化合物で表面処理する段階と、を含む磁性ナノ粒子の製造方法。
【請求項２２】
１）陰電荷を帯びた遺伝子と陽電荷を帯びたＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＴＭＡをＨＥＰＥＳ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）］緩衝溶液に入れ、培養させる段階と、
２）前記１）段階で培養された溶液にＣａＣｌ2を入れ、２時間さらに培養させる段階と、３）前記２）段階で培養された溶液にＤＭＥＭを入れ、Ｃａ2+イオン濃度を４．５ｍＭに調整した後、４時間さらに培養させ、ＰＢＳ緩衝溶液で洗浄する段階と、を含む陰電荷を帯びた遺伝子結合磁性ナノ粒子の製造方法。
【請求項２３】
１）有機蛍光物質を含む磁性ナノ粒子の表面をＳｉ−ＰＥＧ／３−アミノプロピルトリエトキシシラン（3-aminopropyltriethoxysilane；ＡＰＳ）で同時に処理する段階と、２）前記１）段階で得た磁性ナノ粒子にマレイミドブチル酸を反応させて、磁性ナノ粒子のシリカシェルの表面にあるアミン基にマレイミド基（maleimide；ＭａＩ）を導入する段階と、３）抗体に２−メルカプトエチルアミン（2-mercaptoethylamine）を反応させてチオール基を有する抗体を形成する段階と、４）前記２）段階で得た磁性ナノ粒子のシリカシェルの表面にあるマレイミド基に前記３）段階で得た抗体を結合する段階と、を含む抗体結合磁性ナノ粒子の製造方法。
【請求項２４】
請求項１乃至８のいずれかに記載の磁性ナノ粒子を利用して蛍光分析とＭＲＩ分析が同時に可能な分析試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光性を有する磁性ナノ粒子、その製造方法及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
磁気物質は、診断及びバイオセンサーを含む通常の生物学的適用において重要である。したがって、ナノ粒子を利用した細胞染色（bio-imaging）、細胞分離（cell separation）、生体内ドラッグデリバリー（drug delivery）及び遺伝子デリバリー(gene delivery)は、最近に主要研究対象になってきた。特に、発光性量子ドット（quantum dot）ナノ粒子を利用して細胞内に量子ドットを浸透させて（uptake）、量子ドットから発散される蛍光を外部で測定する研究を始めとしてナノ粒子を利用したバイオ分野へのアプローチは、最近多く研究されている［米国特許第６，１９４，２１３号：Barbera-Guillem Emilio, ‘Lipophilic, Functionalized Nanocrystals and Their Use for Fluorescene Labeling of Membranes’；米国特許第６，３０６，６１０号：Bawendi Moungi G., Mikulec Frederic V., Sundar Vikram C. ‘Biological applications of quantum dots’］。
【０００３】
しかし、量子ドットをはじめとする大部分のナノ粒子は、カドミウム、亜鉛、コバルトなど重金属からなっていて、バイオ分野への応用性を増大させるためには、合成されたナノ粒子の表面を生体に適合するように（biocompatible）処理しなければならない。例えば、生体に無毒性を示すと知られているシリカやポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような無機、有機化合物を、合成されたナノ粒子の表面に導入することによって、ナノ粒子の親水性程度を増加させることができるだけでなく、これにより、生体内流れ時間（circulation time）を増加させることができるなど、最近になってこのような研究が急速に進められているShuming Nie et al., ‘In vivo Cancer Targeting And Imaging With Semiconductor Quantum Dots’ Nat. Biotechnol., 2004(22), 969］。
【０００４】
しかし、このような量子ドットを合成する技術は、非常に複雑で且つ難しい条件を経なければならないし、表面処理過程を通じた全体収率が非常に低いという問題点を有している。最近、量子ドットの表面に特定の癌細胞の結合が可能なように抗体を導入させて癌細胞を認識する研究が進められたが、この研究の最大の難点の１つである量子ドットから発生する光を検出して位置を確認する方法は、生体外（in vitro）研究だけに対して意味を有し、生体内（in vivo）の研究に対しては限界がある。その理由は、量子ドットから発散される光が生体組職を貫いて検出されにくいからである［Mark Stroh et al., ‘Zooming In and Out With Quantum Dots’ Nat. Biotechnol., 2004(22), 959］。
【０００５】
これを克服するための他のアプローチとして、磁性を有するナノ粒子に対して研究し始めた。これは、磁性を有するナノ粒子を生体内に導入すれば、磁性体が有する磁気的性質を磁気共鳴装置（ＭＲＩ）のような外部の強い磁場によって検出することが容易であるからである［米国特許第５，５６５，２１５号、Gref; Ruxandra et al., ‘Biodegradable Injectable Particles for Imaging’］。
【０００６】
したがって、最近、国内外の研究者らは、磁気的性質を示すナノ粒子を合成し、これをバイオ分野に適合するようにシリカシェルを導入するなど量子ドットを利用したバイオ分野へのアプローチに対する問題点を克服するための努力をしてある。しかし、このような外部の強い磁場を利用する方法は、反対に細胞研究のような生体外（in vitro）研究に対しては適用することが容易ではない問題点を有している。
【０００７】
既存の磁気的性質を利用するさらに他の分野は、３００ナノメートルから数マイクロメータサイズの高分子塊りの中にいくつかの磁性ナノ粒子を含ませる形態（プリンの形態）の物質が利用されてきた。この物質の表面にバンコマイシン（Vancomycine）のような化合物を導入し、特定のバクテリアを認識して外部の磁場によって分離することができる可能性を提示した。しかし、有機高分子の場合、生体内（in vivo）毒性を有しており、形成された全体のサイズがあまり大きいため、血管を通じた流れに適合しないので、生体内（in vivo）研究に対する問題点が提示されている。
【０００８】
また、有機高分子シェルからなるこのような物質は、所望の表面で処理するために、非常に複雑な合成過程が先行されなければならないので、その適用に対する限界点が存在する。すなわち、生体内（in vivo）ドラッグデリバリーや遺伝子デリバリーのような応用性を有するためには、合成された物質のサイズと表面処理可能性がどれほど容易であるかが非常に重要な要素である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、蛍光性を有する磁性ナノ粒子を提供することにある。また、本発明の他の目的は、蛍光性を有する磁性ナノ粒子と陰電荷を帯びた遺伝子または核酸が結合されている磁性ナノ粒子、及びこれを含む遺伝子デリバリーシステムを提供することにある。
【００１０】
また、本発明のさらに他の目的は、蛍光性を有する磁性ナノ粒子と陰電荷を帯びた核酸が結合されている磁性ナノ粒子、及びこれを含む遺伝子デリバリーシステムを提供することにある。また、本発明のさらに他の目的は、蛍光性を有する磁性ナノ粒子と抗体が結合されている磁性ナノ粒子、及びこれを含む細胞染色剤を提供することにある。また、本発明のさらに他の目的は、前記磁性ナノ粒子の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち、本発明者らは、前記問題点を克服し、生体内及び生体外に共に適用可能な磁性ナノ粒子について研究したところ、生体適合性のためにシリカシェルをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に改質した磁性ナノ粒子を合成し、発表した。［Tae-Jong Yoon et al., ‘Multifunctional Nanoparticles Possesing a Magnetic Motor Effect for Drug or Gene Delivery’ Angew. Chem. In. Ed. 2005(44), 1068〜1071］。しかし、前記ＰＥＧには、電荷がないので、ＤＮＡのように電荷を帯びた生体分子の結合などに困難があった。
【００１２】
したがって、本発明者らは、有機蛍光物質を含み、シリカシェルで覆われた磁性ナノ粒子の表面を電荷を有する物質に改質する方法について研究したところ、有機蛍光物質を含み、表面が電荷を有する物質で表面改質されたシリカで覆われた磁性ナノ粒子を合成するようになり、このような磁性ナノ粒子が細胞内に投入される場合、外部の磁場によって位置確認及び調節が可能であると同時に、容易に蛍光を検出することによって、生体内及び生体外の研究に共に効率的に適用が可能であることを確認し、本発明を完成した。
【００１３】
本発明は、磁気物質を含むコアと、コアの外部に有機蛍光物質とを含み、表面改質されたシリカシェルで覆われた、そのサイズが１００ｎｍ以下で且つ水溶性である磁性ナノ粒子を提供する。
【００１４】
また、本発明は、前記磁性ナノ粒子と陰電荷を帯びた遺伝子または核酸が結合されている磁性ナノ粒子、及びこれを含む遺伝子デリバリーシステムを提供する。
【００１５】
また、本発明は、蛍光性を有する磁性ナノ粒子と陰電荷を帯びた核酸が結合されている磁性ナノ粒子、及びこれを含む遺伝子デリバリーシステムを提供する。
【００１６】
また、本発明は、前記磁性ナノ粒子と抗体が結合されている磁性ナノ粒子、及びこれを含む細胞染色剤を提供する。また、本発明は、前記磁性ナノ粒子の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明による磁性ナノ粒子は、光学的性質及び磁気的性質を同時に有し、バイオ分野への適用が可能であり、高い親水性と簡単な化学的表面処理技術を通じて多様な化合物を利用して化学官能基をナノ物質に導入することができ、これらを利用して細胞内浸透力を増加または減少させることができる。
【００１８】
また、これらのうち陽電荷を帯びるナノ物質を利用してプラスミドＤＮＡを細胞内に移動させて遺伝子デリバリーシステムとして有用に利用することができ、表面処理技法を利用して特定の細胞に選択的に結合、認知することができる技術に基づいて細胞染色に有用に利用することができる。また、選択的に認知された細胞を外部の強い磁場によって細胞を分離、精製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明について詳しく説明する。本発明の磁性ナノ粒子は、粒子内部に磁気物質を含み、コア外部に有機蛍光物質を含む電荷を帯びた物質で表面改質された非磁気シリカシェルで覆われているので、光学的性質及び磁気的性質を同時に有し、バイオ分野への適用が可能である。
【００２０】
本発明による磁性ナノ粒子は、
１）水溶性磁性体ナノ粒子の表面をポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）で処理し、エタノールに分散される形態に変換させた後、遠心分離する段階と、
２）前記１）段階で分離された高分子によって安定化された磁性ナノ粒子をシリカコーティングをするためにエタノールに分散させる段階と、
３）前記２）段階で製造した溶液に、有機蛍光物質を３−アミノプロピルトリエトキシシラン（3-aminopropyltriethoxysilane；ＡＰＳ）で処理した溶液とテトラエトキシシラン（tetraethoxysilane；ＴＥＯＳ）の溶液を添加し、ＮＨ4ＯＨを添加し、有機蛍光物質を含む磁性ナノ粒子表面からシリカが形成されるように誘導する段階と、
４）前記３）段階で得た磁性ナノ粒子のシリカシェルの表面をシリコーン化合物で表面処理する段階とを含んで製造されることができる。
【００２１】
本発明による磁性ナノ粒子の製造方法を段階別に詳しく説明すれば次の通りである。
前記１）段階で、水溶性磁性体ナノ粒子は、湿式、乾燥または真空方法など公知の方法によって製造されることができる。例えば、粉砕する大きい物質、溶液から沈殿、 共沈殿、マイクロエマルジョン、ポリオール、有機前駆体の高温分解、溶液技術、エアロゾール／気泡方法、スプレイ熱分解、プラズマ原子化、及びレーザ熱分解方法を含むが、これらに限らない。本発明において、水溶性磁性体ナノ粒子は、共沈殿法（coprecipitation）によって製造して使用することができる。前記水溶性磁性体ナノ粒子は、コバルトと鉄酸化物からなり、マンガン、亜鉛、ニッケル、銅などの遷移金属酸化物を含むことができる。
【００２２】
前記３）段階で、有機蛍光物質は、ローダミンＢイソチオシアネート（Rhodamine B isothiocyanate、ＲＩＴＣ）またはフルオレセインイソチオシアネート（fluoresceine isothiocyanate、ＦＩＴＣ）が好ましく、これらに限らず、現存する有機蛍光物質を化学的に変形させてすべて含むことができる。例えば、アレクサフルオロ（Alexa Fluor）、ローダミンレッド−Ｘ（Rhodamine Red-X）、テキサスレッド（Texas Red）、テトラメチルローダミン（Tetramethylrhodamine）、カスケードブルー（Cascade Blue）、ＤＡＰＩ、クマリン類（coumarine）、ルシファーイエロー（Lucifer Yellow）、ダンシルアミンデ（Dansylaminde）などが挙げられる。
【００２３】
本発明において、シリカの原料であるＴＥＯＳの量が増加するほど磁性ナノ粒子のシリカシェルが厚くなる。したがって、ＴＥＯＳの量を調節することによって、磁性ナノ粒子のサイズを調節することができる。
【００２４】
前記４）段階で、シリカシェルの表面改質に使われるシリコーン化合物は、電荷を帯びた物質、すなわちイオン性官能基を有する有機シリコーン化合物が好ましい。例えば、（ＣＨ3Ｏ）3Ｓｉ−官能基が導入されたイオン性化合物、水溶性化合物または薬物など特定の機能性化合物が含まれることができる。具体的に、（ＣＨ3Ｏ）3Ｓｉ−ＰＥＧ［（ＣＨ3Ｏ）3ＳｉＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6〜9ＣＨ3］、（ＣＨ3Ｏ）3Ｓｉ−ＰＭＰ［（ＣＨ3Ｏ）3ＳｉＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ2（ＯＣＨ3）Ｎａ］、（ＣＨ3Ｏ）3Ｓｉ−ＰＴＭＡ［（ＣＨ3Ｏ）3ＳｉＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｎ+（ＣＨ3）3Ｃｌ-］及び３−アミノプロピルトリエトキシシラン（3-aminopropyltriethoxysilane；ＡＰＳ）よりなる群から選択された１種を含むが、これらに限らず、すべてのシリコーン化合物を含むことができる。
【００２５】
本発明による磁性ナノ粒子は、すべての細胞［乳房癌細胞（ＭＣＦ−７）、肺癌細胞（Ａ５４９）、肺正常細胞（ＮＬ２０）］に対して毒性を示さない。本発明による磁性ナノ粒子が細胞内に侵透した後、細胞が外部磁場に露出された時、磁性ナノ粒子の数は、細胞毒性を起こすには十分ではないが、磁気粒子の数が磁気運動をする細胞を提供するには十分な磁気粒子を含む。前記細胞は、真核細胞、ヒトの細胞、動物細胞、または植物細胞であり得る。前記磁気粒子は、約１００ｎｍ以下、特に約３０〜８０ｎｍの平均粒子サイズを有することができる。前記ナノ磁気粒子が浸透された細胞は、外部磁場（約０．３テスラ）によって０．５〜１ｍｍ／ｓｅｃの速度で移動し、外部磁場の強さと移動速度は、これに限定されない。
【００２６】
一方、本発明による有機蛍光物質を含み、電荷を帯びた物質で表面改質されたシリカシェルで覆われた磁性ナノ粒子は、表面改質されたシリカシェルの表面に陰電荷を帯びた遺伝子または核酸、または抗体など多様な物質を結合させることによって、多様な用途に使用されることができる。一例として、本発明による磁性ナノ粒子の表面改質されたシリカシェルの表面に、陽電荷を帯びたＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＴＭＡは、陰電荷を帯びた遺伝子と結合が可能である。
【００２７】
前記陰電荷を帯びた遺伝子と結合した磁性ナノ粒子は、
１）陰電荷を帯びた遺伝子と陽電荷を帯びたＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＴＭＡをＨＥＰＥＳ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）］緩衝溶液に入れ、培養させる段階と、
２）前記１）段階で培養された溶液にＣａＣｌ2を入れ、２時間さらに培養させる段階と、
３）前記２）段階で培養された溶液にダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を入れ、Ｃａ2+イオン濃度を４．５ｍＭに調整した後、４時間さらに培養させ、ＰＢＳ緩衝溶液で洗浄する段階とを含んで製造されることができる。
【００２８】
上記のように、陰電荷を帯びた遺伝子と結合した磁性ナノ粒子｛プラスミドＤＮＡ−［ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＴＭＡ］｝が細胞に入ると、細胞膜を通過することによって、陰電荷を帯びた遺伝子を伝達した後、分離され、細胞質内に磁性ナノ粒子として残るようになる（赤色蛍光）。また、伝達されたＤＮＡによって青色タンパク質が細胞質で合成されることを確認することができる（図８参照）。
【００２９】
前記陰電荷を帯びた遺伝子は、プラスミドＤＮＡ、具体的にｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰであることが好ましいが、これに限らず、多様な遺伝子の結合が可能である。
【００３０】
本発明による磁性ナノ粒子は、陰電荷を帯びた遺伝子以外に陰電荷を帯びた核酸と結合することもできる。したがって、本発明による磁性ナノ粒子は、陰電荷を帯びた遺伝子または核酸と結合することによって、遺伝子デリバリーシステムとして有用に使用されることができる。また、本発明による磁性ナノ粒子の表面改質されたシリカシェルの表面に抗体を導入し、特定の細胞に選択的に結合することができ、これを外部磁場によって動きを誘導して分離することができる。
【００３１】
前記抗体結合磁性ナノ粒子は、
１）有機蛍光物質を含む磁性ナノ粒子の表面をＳｉ−ＰＥＧ／３−アミノプロピルトリエトキシシラン（3-aminopropyltriethoxysilane；ＡＰＳ）で同時に処理する段階と、
２）前記１）段階で得た磁性ナノ粒子にマレイミドブチル酸を反応させて磁性ナノ粒子のシリカシェルの表面にあるアミン基にマレイミド基（maleimide；ＭａＩ）を導入する段階と、
３）抗体に２−メルカプトエチルアミン（2-mercaptoethylamine）を反応させてチオール基を有する抗体を形成する段階と、
４）前記２）段階で得た磁性ナノ粒子のシリカシェルの表面にあるマレイミド基に前記３）段階で得た抗体を結合する段階とを含んで製造されることがある。
【００３２】
前記４）段階で使用された抗体としては、白血病細胞に対してＣＤ−１０抗体または乳房癌細胞に対してＨｅｒ２Ab抗体を含むが、これらに限らず、幹細胞など多様な細胞の抗体を含むことができる。したがって、本発明による磁性ナノ粒子は、抗体と結合することによって、細胞染色剤として有用に使用されることができる。
【００３３】
また、本発明による磁性ナノ粒子は、マウスの腹腔内に投与した後、マウスの肝で黒色磁性信号として観察される。したがって、本発明による磁性ナノ粒子は、細胞染色、細胞分離、生体内ドラッグデリバリーまたは遺伝子デリバリーに有用に利用することができる。また、本発明による磁性ナノ粒子は、蛍光分析とＭＲＩ分析が同時に可能な分析試薬として利用することもできる。
【実施例】
【００３４】
（実施例１）本発明による磁性ナノ粒子の製造
１．有機蛍光物質を含み、シリカシェルで覆われた磁性ナノ粒子の製造
コバルトフェライト磁性ナノ粒子（２０ｍｇ／ｍＬ）水溶液３４．７ｍＬをポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）水溶液０．６５ｍＬ（濃度は２５．６ｇ／Ｌ）に添加し、常温で一晩撹拌した。ポリビニルピロリドンで安定化された磁性ナノ粒子溶液に水／アセトン＝１／１０比率の溶液を添加し、４０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離した。上澄液を除去し、沈殿されたナノ粒子は、エタノール１０ｍＬにさらに分散させた。
【００３５】
これに、有機蛍光物質であるローダミンＢイソチオシアネート（Rhodamine B isothiocyanate、ＲＩＴＣ）またはフルオレセインイソチオシアネート（fluoresceineisothiocyanate、ＦＩＴＣ）を３−アミノプロピルトリエトキシシラン（3-aminopropyltriethoxysilane；ＡＰＳ）で処理した溶液と、テトラエトキシシラン（tetraethoxysilane；ＴＥＯＳ）を０．０４／０．３のモル比率でエタノールに溶解したものを添加した。ＮＨ3が３０重量％含まれたＮＨ4ＯＨを０．８６ｍＬ添加し、磁性ナノ粒子表面からシリカが形成されるように誘導した。有機蛍光物質が含まれたシリカシェルで覆われた磁性ナノ粒子を高速遠心分離器を利用して１８、０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、沈殿をエタノールと水で洗浄することによって、精製した。形成された物質は、水またはアルコールによく分散された。
【００３６】
有機蛍光物質を含むシリカシェルで覆われた磁性ナノ粒子（ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣまたはＦＩＴＣ）の製造過程を図１に示し、シリカシェルで覆われた磁性ナノ粒子（ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣまたはＦＩＴＣ）の透過電子顕微鏡の写真を図２に示す。
【００３７】
図２に示されたように、磁性ナノ粒子のサイズは、シリカの原料であるＴＥＯＳの量が増加するほど磁性ナノ粒子のサイズが増加した。したがって、ＴＥＯＳの量を調節することによって、磁性ナノ粒子のシェル厚さを調節することができることが分かる。
【００３８】
２．有機蛍光物質を含み、電荷を帯びた物質で表面改質されたシリカシェルで  覆われた磁性ナノ粒子の製造
上記１で製造した磁性ナノ粒子（ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ））４５ｍｇをエタノール１０ｍＬに分散させ、各シリコーン化合物０．０２ｍｍｏｌ［（ＣＨ3Ｏ）3Ｓｉ−ＰＥＧ、（ＣＨ3Ｏ）3ＳｉＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6〜9ＣＨ3は１２５ｍｇ；（ＣＨ3Ｏ）3Ｓｉ−ＰＭＰ、（ＣＨ3Ｏ）3ＳｉＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＰＯ2（ＯＣＨ3）Ｎａは２３８ｍｇ；（ＣＨ3Ｏ）3Ｓｉ−ＰＴＭＡ、（ＣＨ3Ｏ）3ＳｉＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｎ+（ＣＨ3）3Ｃｌ-は２５７ｍｇ］を入れ、ＮＨ4ＯＨを利用してｐＨを１２に調整した。
【００３９】
３時間６０℃で強く撹拌した。溶液を高速遠心分離機を利用して１８、０００ｒｐｍで３０分間回転させて、表面処理されたナノ粒子を沈殿させた。濾液には、過量のシリコーン化合物が残るようになる。沈殿されたナノ粒子をエタノールと水を利用して３回洗浄し、精製及び分離した。製造されたナノ粒子は、水に対して非常に高い安定性を示した。
【００４０】
本発明による磁性ナノ粒子の表面を多様なシリコーン化合物で化学的処理する過程を図３に示し、本発明による磁性ナノ粒子の多様な表面処理によって全体ナノ粒子の表面電荷が変わったことを測定したゼータ電位（zeta-potential）を図４に示す。
【００４１】
図３及び図４に示されたように、ＭＮＰ＠ＳｉＯ（ＲＩＴＣ）［Ａ線］は、表面処理されないもので、電荷は、−１６．８ｍＶの値を示し、（ＣＨ3Ｏ3）Ｓｉ−ＰＥＧで表面処理されたＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＥＧ［Ｂ線］の電荷は、２．４ｍＶの値を示し、（ＣＨ3Ｏ）3Ｓｉ−ＰＭＰで表面処理されたＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＭＰ［Ｃ線］の電荷は、−５０ｍＶの値を示し、（ＣＨ3Ｏ）3Ｓｉ−ＰＴＭＡで表面処理されたＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＴＭＡ［Ｄ線］の電荷は、＋３５．７ｍＶを示した。
【００４２】
（実験例１）本発明による磁性ナノ粒子の細胞浸透率比較
本発明による磁性ナノ粒子の細胞内浸透率を調べるために、下記のような実験を行った。
【００４３】
乳房癌細胞（ＭＣＦ−７）は、ＡＴＣＣ（American type culture collection）から購入した。前記乳房癌細胞を１０％牛胎児血清（Fetal Bovine Serum；ＦＢＳ）４０μＬ、前記実施例１で製造した表面処理されない磁性ナノ粒子［ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）及びシリコーンで表面処理された磁性ナノ粒子［ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＥＧ、ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＭＰ、またはＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＴＭＡ］２ｍｇ／ｍＬが含まれたダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium、ＤＭＥＭ）で培養させた。すべての細胞は、ラップ−テック（Ｌａｂ−Ｔｅｋ）ガラスチャンバスライドで培養させ、共焦点レーザー蛍光顕微鏡（Confocal Laser Scanning Microscope；ＣＬＳＭ）で観察した。
【００４４】
表面処理されない磁性ナノ粒子［ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）］及びシリコーンで表面処理された磁性ナノ粒子［ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＥＧ、ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＭＰまたはＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＴＭＡ］を同一の量及び同一の条件で乳房癌細胞に注入した時、細胞に浸透される程度を図５に示し、ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＥＧとＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＭＰを同一の量及び同一の条件で乳房癌細胞に注入した時、細胞に浸透される程度を図６に示す。
【００４５】
図５に示されたように、シリコーンで表面処理された磁性ナノ粒子は、同一の量を同一の条件で細胞に注入した時、細胞に浸透される程度は、ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＥＧ＞ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＴＭＡ≒ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）＞ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＭＰの順に磁性ナノ粒子がさらに多く浸透された。
【００４６】
また、図６に示されたように、Ａ〜Ｄは、ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＥＧに関する写真であり、Ｅ〜Ｈは、ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＭＰに関する写真である。ＡとＥは、赤色蛍光写真であり、ＢとＦは、光学顕微鏡写真であり、ＣとＧは、核染色を確認するＤＡＰＩモードの蛍光写真であり、ＤとＦは、それぞれＡ〜Ｃ、Ｅ〜Ｇの写真を重ねた写真である。（ＣＨ3Ｏ）3Ｓｉ−ＰＥＧで表面処理された磁性ナノ粒子は、中性的な電気的特徴を有するので、細胞に侵透した時、細胞質に不規則的に位置しているが、（ＣＨ3Ｏ）3Ｓｉ−ＰＭＰで表面処理された磁性ナノ粒子は、陰イオン性を有するので、核膜の周辺に存在している。
【００４７】
すなわち、本発明による有機蛍光物質を含み、電荷を帯びた物質で表面改質されたシリカシェルで覆われた磁性ナノ粒子は、その改質成分によって細胞内の位置を異なるので、本発明による磁性ナノ粒子の表面電荷を利用すれば、細胞内の位置変化を誘導することができる。
【００４８】
（実験例２）細胞毒性実験（ＭＴＴ  ａｓｓａｙ）
本発明による磁性ナノ粒子の細胞毒性を調べるために、下記のような実験を行った。
【００４９】
乳房癌細胞（ＭＣＦ−７）、肺癌細胞（Ａ５４９）、肺正常細胞（ＮＬ２０）は、ＡＴＣＣ（American type culture collection）から購入した。ＭＣＦ−７細胞は、１０％牛胎児血清（Fetal Bovine Serum；ＦＢＳ）４０μＬと本発明によるナノ粒子２ｍｇ／ｍＬが含まれたダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium、ＤＭＥＭ）で培養させ、Ａ５４９細胞とＮＬ２０細胞は、同一の条件下にＲＰＭＩ（１０％牛胎児血清、２ｍＭＬ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１×不必須アミノ酸、５ｍＭ２−メルカプトエタノール含有）で培養させた。全ての細胞は、ラップ−テック（Lab-Tek）ガラスチャンバスライドで培養させ、共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察を容易にした。
【００５０】
各細胞は、９６−ウェル容器で培養させ、培養が終わる頃、各ウェルに５０μＬのＭＴＴ［３−（４、５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２、５−ジフェニルテルトラゾリウムブロミド］をリン酸緩衝溶液［ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ（０．２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ＝７．２）］に添加し、最後濃度を０．４ｍｇ／ｍＬにした。これを５％ＣＯ2の環境で３７℃で４時間さらに培養させた。培養培地を用心深くピペットで除去し、生きている細胞のミトコンドリアの細胞呼吸から形成される脱水素酵素（dehydrogenase）によって形成されるホルマザン結晶（formazan crystal）を１５０μＬのＤＭＳＯに溶解した。これを１０分程度撹拌器で撹拌させ、４９０ｎｍと６２０ｎｍで吸光度を測定した。
【００５１】
結果を図７に示した。図７に示されたように、本発明による磁性ナノ粒子は、全ての細胞［乳房癌細胞（ＭＣＦ−７）、肺癌細胞（Ａ５４９）、肺正常細胞（ＮＬ２０）］に対して毒性を示さなかった。
【００５２】
（実施例２）プラスミドＤＮＡが結合されたＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＴＭＡの製造
プラスミドＤＮＡ遺伝子は、ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＥＰを利用した。プラスミドＤＮＡとＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＴＭＡを３０μＬのＨＥＰＥＳ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ｀−（２−エタンスルホン酸）］緩衝溶液（ｐＨ−７．４）に入れ、２つの混成体を２時間４℃で培養させ、１００ｍＭ  ＣａＣｌ2  ３０μＬを添加した。この溶液を２時間さらに培養させ、２４−ウェルプレートに移した。
【００５３】
これに０．６ｍＬのＤＭＥＭを入れ、Ｃａ2+イオン濃度を４．５ｍＭに調整した。３７℃で４時間さらに培養させた後、ＤＮＡが結合されたナノ粒子をＰＢＳ緩衝溶液で洗浄した。細胞にＤＮＡが結合されたナノ粒子を入れ、遺伝子伝達信号を観察した。
【００５４】
本発明による磁性ナノ粒子表面を（ＣＨ3Ｏ）3Ｓｉ−ＰＴＭＡで処理して得られたＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＴＭＡをプラスミドＤＮＡと結合して遺伝子デリバリーシステムとして利用する過程を図８に示し、プラスミドＤＮＡが結合されたＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＴＭＡを利用して遺伝子デリバリーに利用されてトランスフェクションを起こした細胞を共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察した写真を図９に示す。
【００５５】
図８に示されたように、プラスミドＤＮＡ遺伝子ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰが結合された陽電荷性ナノ粒子（ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＴＭＡ）は、細胞に入ると、細胞膜を通過した後、プラスミドＤＮＡから分離され、細胞質内に磁性ナノ粒子が残るようになり（赤色蛍光）、結果的に細胞内にプラスミドＤＮＡを伝達するようになる。このように伝達されたＤＮＡによって青色タンパク質が細胞内で合成された。
【００５６】
図９に示されたように、Ａは青色蛍光写真であり、Ｂは光学顕微鏡写真であり、Ｃは赤色蛍光写真であり、Ｄはすべての写真を重ねたもので、赤色点線は、ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＴＭＡに該当し、青色は、ＤＮＡトランスフェクションによってＧＦＰ蛍光が細胞質で現われる様子である。
【００５７】
したがって、本発明による磁性ナノ粒子は、プラスミドＤＮＡ遺伝子と結合することによって、遺伝子デリバリーシステムとして有用に利用することができる。
【００５８】
（実施例３）ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＦＩＴＣ）−ＰＥＧ／ＡＰＳ−ＭａＩ物質の製造
前記実施例１の２で磁性ナノ粒子（ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ））を（ＣＨ3Ｏ）3Ｓｉ−ＰＥＧ化合物で処理する時、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（3-aminopropyltriethoxysilane；ＡＰＳ）を一緒に入れて処理することを除いて、前記実施例１と同一の方法にしてＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＦＩＴＣ）−ＰＥＧ／ＡＰＳを製造した。
【００５９】
前記ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＦＩＴＣ）−ＰＥＧ／ＡＰＳを無水ＤＭＦに溶解した溶液［３６．５ｍＬ；Ｓｉ−ＰＥＧ／ＡＰＳ＝５／１（モル比率）、２２．９ｍｇ／ｍＬ、ここでアミンの濃度は６．５ｍｍｏｌ／ｇ］をマレイミドブチル酸（maleimidobutyric acid）（０．９６ｇ、１．４ｍｍｏｌ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（benzotriazol-1-yl-oxy-tris(pyrrolidino)phosphonium  hexafluorophosphate、ＰｙＢＯＰ）（０．４３ｇ、０．８２６ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（N-Hydroxybenzotriazole、ＨＯＢｔ）（０．１９ｇ、１．４ｍｍｏｌ）が溶解されている無水ＤＭＦに入れた。次に、精製されたジイソプロピルエチルアミン（diisopropylethylamine）（０．２ｍＬ）を入れ、常温で２０時間撹拌させた。反応物をエッペンドルフ（Eppendorf）チューブに移し、それぞれＤＭＦで数回洗浄した。ナノ粒子を０．８ｍＬのＤＭＦにさらに分散させ、光を遮断させた後、常温で貯蔵した。
【００６０】
磁性ナノ粒子の表面を（ＣＨ3Ｏ）3Ｓｉ−ＰＥＧとＡＰＳで同時に処理し、磁性ナノ粒子表面のアミン基にマレイミド基を導入した後、これに特定細胞認知用抗体を導入する過程を図１０に示す。
【００６１】
（実施例４）本発明による磁性ナノ粒子に抗体生体分子を導入する過程及び細胞染色実験
ＰＢＳ緩衝溶液に溶解されている（ＣＤ−１０またはＨｅｒ２Ab）抗体溶液（２００ｕｇ／ｍＬ）をＥＤＴＡ溶液（１０μＬ、０．５Ｍ）であらかじめ処理しておいた。これに５００μＬのＰＢＳに溶解されている２−メルカプトエチルアミン（2-mercaptoethylamine）溶液（５μＬ、０．７７９ｍｍｏｌ）を添加し、３７℃で９０分間培養した。
【００６２】
この工程を通じて、抗体を半分に切り、これをセファデックスＧ−２５を利用して精製し、前記実施例３で製造されたＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＦＩＴＣ）−ＰＥＧ／ＡＰＳ−ＭａＩ（０．８ｍＬ、２２．９ｍｇ／ｍＬ    ＰＢＳ）に入れ、３７℃で２０時間培養した。抗体が結合されたナノ粒子を１３、０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して沈殿を誘導し、濾液を除去した後、ＰＢＳ  １ｍＬを加え、再分散させて４℃で保管した。
【００６３】
抗体が結合された磁性ナノ粒子を利用して細胞染色に利用されている様子を共焦点蛍光顕微鏡で観察した結果を図１１に示す。また、抗体が結合された磁性ナノ粒子が白血病細胞と肺癌細胞に対して細胞染色に利用されている様子を共焦点蛍光顕微鏡で観察した結果を図１２に示す。
【００６４】
図１１に示されているように、細胞内に浸透させた物質は、赤色蛍光を有するＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）であり、細胞膜に結合された物質は、青色蛍光を有するＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＦＩＴＣ）−Ｈｅｒ２Abである。Ａは、青色蛍光写真であり、Ｂは、光学顕微鏡写真であり、Ｃは、赤色蛍光写真であり、Ｄは、すべての写真を重ねたものである。
【００６５】
図１２に示されたように、ＣＤ−１０抗体は、白血病細胞（ＳＰ２／Ｏ）膜には選択的に結合したが（Ａ〜Ｃ）、肺癌細胞に対しては結合しなかった（Ｄ〜Ｆ）。
【００６６】
（実施例５）本発明による磁性ナノ粒子のマウスの腹腔内投与実験（ｉｎ  ｖｉｖｏ実験）
本発明による磁性ナノ粒子の生体内作用を調べるために、下記のような実験を行った。
【００６７】
実験に使用した動物は、４週齢の特定病原体不在（specifi cpathogens free）環境で育てたＩＣＲ雄性マウス１２匹を温度２２±３℃、湿度５５±１０％、照明１２Ｌ／１２Ｄの動物室内で飼育した。マウスは、実験に使用される前に１週間程度順化させた。実験動物用飼料（（株）第一製糖、マウス用）及び飲水は、滅菌した後に供給し、自由摂取させた。
【００６８】
本発明によるＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）をマウスに腹腔注射を通じて注入し、１５分間隔でＭＲＩを通じて観察した。対照群としては、ナノ粒子を注入しないものを使用した。
【００６９】
結果を図１４に示す。図１４に示されたように、投入された磁性ナノ粒子は、マウスの肝で黒色磁性信号として観察された。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明による磁性ナノ粒子は、光学的性質及び磁気的性質を同時に有し、バイオ分野への適用が可能であり、高い親水性と簡単な化学的表面処理技術を通じて多様な化合物を利用して化学官能基をナノ物質に導入することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、有機蛍光物質を含み、シリカシェルで覆われた磁性ナノ粒子（ＭＮＰ＠Ｓｉｏ2（ＲＩＴＣまたはＦＩＴＣ）の製造過程を示す図である。
【図２】図２は、有機蛍光物質を含み、シリカシェルで覆われた磁性ナノ粒子（ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣまたはＦＩＴＣ）を透過電子顕微鏡で観察した図である。
【図３】図３は、本発明による磁性ナノ粒子（ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ））の表面を多様なシリコーン化合物で化学的処理する過程を示す図である。
【図４】図４は、本発明による磁性ナノ粒子（ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）の多様な表面処理によって全体ナノ粒子の表面電荷が変わったことを測定したゼータ電位（zeta-potential）を示す図である。（Ａは、表面処理されないもので、ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）、Ｂは、（ＣＨ3Ｏ）3Ｓｉ−ＰＥＧで表面処理されたＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＥＧ、Ｃは（ＣＨ3Ｏ）3Ｓｉ−ＰＭＰで表面処理されたＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＭＰ、Ｄは（ＣＨ3Ｏ）3Ｓｉ−ＰＴＭＡで表面処理されたＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＴＭＡを示す）
【図５】図５は、ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＥＧ、ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＴＭＡ、ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）及びＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＭＰの乳房癌細胞に対する浸透率を共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察した図である。
【図６】図６は、ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＥＧとＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＭＰを同一の量及び同一の条件で乳房癌細胞に注入した時、ナノ粒子の細胞内位置を共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察した図である。（Ａ〜Ｄは、ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＥＧに関する写真であり、Ｅ〜Ｈは、ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＭＰに関する写真である。ＡとＥは、赤色蛍光写真であり、ＢとＦは、光学顕微鏡写真であり、ＣとＧは、核染色を確認するＤＡＰＩモードの蛍光写真であり、ＤとＦは、それぞれＡ〜Ｃ、Ｅ〜Ｇの写真を重ねた写真である）
【図７】図７は、ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）、ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＥＧ、ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＭＰ、及びＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＴＭＡを乳房癌細胞（ＭＣＦ−７）、肺癌細胞（Ａ５４９）及び肺正常細胞（ＮＬ２０）に処理して細胞毒性検査（ＭＴＴ実験）をした結果を示す図である。
【図８】図８は、ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＴＭＡをプラスミドＤＮＡと結合させて遺伝子デリバリーシステムとして利用する過程を示す図である。
【図９】図９は、プラスミドＤＮＡが結合されたＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）−ＰＴＭＡを利用して遺伝子デリバリー後トランスフェクション（transfection）を起こした細胞を共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察した図である。（Ａは、青色蛍光写真であり、Ｂは、光学顕微鏡写真であり、Ｃは、赤色蛍光写真であり、Ｄは、すべての写真を重ねたものである）
【図１０】図１０は、ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＦＩＴＣ）の表面を（ＣＨ3Ｏ）3Ｓｉ−ＰＥＧと３−アミノプロピルトリエトキシシラン（3-aminopropyltriethoxysilane：ＡＰＳ）で同時に処理し、前記表面のアミン基にマレイミド（maleimide）基を導入した後、これに特定の細胞認知用抗体を導入する過程を示す図である。
【図１１】図１１は、抗体が結合されたＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＦＩＴＣ）−ＰＥＧ／ＡＰＳ−ＭａＩが細胞染色に利用されている様子を共焦点蛍光顕微鏡で観察した図である。［Ａは青色蛍光写真であり、Ｂは光学顕微鏡写真であり、Ｃは赤色蛍光写真であり、Ｄはすべての写真を重ねたものである。細胞内浸透された物質は、赤色蛍光を有するＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）であり、細胞膜に結合された物質は、青色蛍光を有するＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＦＩＴＣ）−ＰＥＧ／ＡＰＳ−ＭａＩ−Ｈｅｒ２Ab（以下、ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＦＩＴＣ）−Ｈｅｒ２Abという）である］
【図１２】図１２は、白血病細胞（ＳＰ２／Ｏ）膜に選択的に結合が可能なＣＤ−１０抗体を青色ナノ粒子に導入したＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＦＩＴＣ）−ＣＤ１０Abであり、Ａ〜Ｃのように、白血病細胞（ＳＰ２／Ｏ）の細胞壁に選択的に結合し、Ｄ−Ｆのように、肺癌細胞（Ａ５４９）に対しては結合しない選択性を示す図である。
【図１３】図１３は、ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＦＩＴＣ）−ＣＤ１０Abが白血病細胞の細胞壁に選択的に認知された後、外部磁場によって引き込まれることを光学顕微鏡で観察した図である。（Ａは外部に磁場を加えない状態であり、Ｂは赤色点線部分に外部磁場を加えて細胞を特定の位置に移動させたものである）
【図１４】図１４は、ＭＮＰ＠ＳｉＯ2（ＲＩＴＣ）をマウスに腹腔注射を通じて注入し、一定の時間間隔でＭＲＩを通じて観察した図である。（対照群は、合成された磁性ナノ粒子を注入しないものであり、残りは、合成された磁性ナノ粒子を注入したマウスから１５分、３０分、１時間、１日及び３日後に観察した写真である）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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