(57)【要約】本発明は、神経変性病または神経筋病の治療のための治療薬として用いてよいヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を提供する。本発明は、式Ｉ：2009515887.tif 000042の化合物類を提供する。本発明はまた、これらの化合物を含む医薬品組成物および製品、ならびに神経変性病または神経筋病を治療する方法および予防する方法もしくは発症を遅れさせる方法を提供する。さらに、本発明は、新規なＨＤＡＣ阻害剤、ならびに該ＨＤＡＣ阻害剤の合成のための新規な方法も目的とする。
2009515887.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉａ
【化１】
2009515887.tif 000027
（式中、
ｎは、２から約１０であり、
Ｒ１は、アリールまたはヘテロアリールであり、
Ｒ２は、アリールまたはヘテロアリールであり、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリールまたは窒素保護基であり、
任意のアルキル、アリールまたはヘテロアリールは、置換されていないか、あるいはヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロ、アルキル、トリフルオロメチル、アルコキシ、アリール、カルボキシル、カルボキシエステル、カルボキサミドおよびＮＲｃＲｄまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選ばれた１から３の置換基で置換され、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立に、水素、アルキルまたはＣ（＝Ｏ）ＯＲｅであり、Ｒｅは、Ｈまたはアルキルであり、
Ｒ１がフェニルであり、ｎが３〜６のとき、Ｒ２は２−アミノフェニルでなく、
Ｒ１が２−アミノフェニルであり、ｎが３〜６のとき、Ｒ２はフェニルでない）
の化合物またはその塩。
【請求項２】
Ｒ１がフェニルのとき、Ｒ２は２−アミノフェニルでなく、Ｒ１が２−アミノフェニルのとき、Ｒ２はフェニルでない、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１は、アリールまたはヘテロアリールである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１は、フェニル、２−メチルフェニル、３−メチルフェニル、４−メチルフェニル、２−アミノフェニル、３−アミノフェニル、４−アミノフェニル、２−メトキシフェニル、３−メトキシフェニル、４−メトキシフェニル、２，４−ジメトキシフェニル、３，５−ジメトキシフェニル、３，４，５−トリメトキシフェニル、２，４−ジアミノフェニル、３，５−ジアミノフェニル、３，４，５−トリアミノフェニル、２−ピリジニル、３−キノリニルまたは８−キノリニルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ２は、アリールまたはヘテロアリールである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２は、フェニル、２−メチルフェニル、３−メチルフェニル、４−メチルフェニル、２−アミノフェニル、３−アミノフェニル、４−アミノフェニル、２−メトキシフェニル、３−メトキシフェニル、４−メトキシフェニル、２，４−ジメトキシフェニル、３，５−ジメトキシフェニル、３，４，５−トリメトキシフェニル、２，４−ジアミノフェニル、３，５−ジアミノフェニル、３，４，５−トリアミノフェニル、２−ピリジニル、３−キノリニルまたは８−キノリニルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１とＲ２とが同じであるか、あるいは同じでない、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
ＲａはＨであるか、ＲｂはＨであるか、あるいは両方がＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒａが窒素保護基であるか、Ｒｂが窒素保護基であるか、あるいは両方が窒素保護基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
ｎは３から６である、好ましくは、ｎは４または５である、より好ましくは、ｎは６である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ１は、２つのアミノ基または２つのメトキシ基で置換されている、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ２は、２つのアミノ基または２つのメトキシ基で置換されている、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
【化２】
2009515887.tif 000028
【化３】
2009515887.tif 000029
からなる群から選ばれた構造を有する、請求項１に記載の化合物、それらの塩基性化合物の塩、およびそれらの任意の組み合わせ。
【請求項１４】
塩形成部分は、鉱酸、有機酸、アルカリ塩基またはアルカリ土類塩基、アミンまたはアンモニアである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
式Ｉ
【化４】
2009515887.tif 000030
（式中、
ｎは２から約１０であり、
Ｒ１は、アリールまたはヘテロアリールであり、
Ｒ２は、アリールまたはヘテロアリールであり、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリールまたは窒素保護基であり、
任意のアルキル、アリールまたはヘテロアリールは、任意選択として、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロ、アルキル、トリフルオロメチル、アルコキシ、アリール、カルボキシル、カルボキシエステル、カルボキサミドおよびＮＲｃＲｄからなる群から選ばれた１から３の置換基で置換され、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立に、水素、アルキル、またはＣ（＝Ｏ）ＯＲｅであり、ＲｅはＨまたはアルキルである）
の化合物またはその塩を合成するための方法であって、
式Ｖ：
【化５】
2009515887.tif 000031
の化合物を一つ以上のカップリング剤および式ＶＩ：
Ｒ２−ＮＨ（Ｒｂ）  （ＶＩ）
の化合物と接触させて式Ｉの前記化合物を提供することを含む方法。
【請求項１６】
前記１つ以上のカップリング剤は、１−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）および１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記式Ｉの化合物は、１つ以上の塩基性化合物、好ましくはアルキルアミン、より好ましくはジイソプロピルエチルアミンの存在下で形成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記式Ｉの化合物は、溶媒系、好ましくはジメチルホルムアミドの存在下で形成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
好ましくは沈殿、ろ過、再結晶およびクロマトグラフィーの１つ以上によって前記式Ｉの化合物を精製することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
式ＩＩＩ：
【化６】
2009515887.tif 000032
の化合物を式ＩＶ：
Ｒ１−ＮＨ（Ｒａ）  （ＩＶ）
の化合物と接触させて前記式Ｖの化合物を提供することによって、前記式Ｖの化合物を形成することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記式ＩＩＩの化合物と前記式ＩＶの化合物とを溶媒系の存在下で接触させ、前記溶媒系は、好ましくは有機溶媒を含み、前記有機溶媒は、より好ましくはエーテル、テトラヒドロフランおよびジオキサンの１つ以上を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
式ＩＩ：
【化７】
2009515887.tif 000033
の化合物を脱水剤と接触させて前記式ＩＩＩの化合物を提供することによって前記式ＩＩＩの化合物を形成することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記脱水剤は、カルボン酸無水物、好ましくは無水酢酸を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記式ＩＩＩの化合物の前記形成を無水条件下で行う、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記式ＩＩの化合物と前記脱水剤とを加熱する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
式Ｉ：
【化８】
2009515887.tif 000034
（式中、
ｎは３から約１０であり、
Ｒ１は、アリールまたはヘテロアリールであり、
Ｒ２は、アリールまたはヘテロアリールであり、
ＲａおよびＲｂは、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリールまたは窒素保護基であり、
任意のアルキル、アリールまたはヘテロアリールは、任意選択として、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロ、アルキル、トリフルオロメチル、アルコキシ、アリール、カルボキシル、カルボキシエステル、カルボキサミドおよびＮＲｃＲｄからなる群から選ばれた１から３の置換基で置換され、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立に、水素、アルキルまたはＣ（＝Ｏ）ＯＲｅであり、ＲｅはＨまたはアルキルである）
の化合物を合成するための方法であって、
（ａ）式ＩＩ：
【化９】
2009515887.tif 000035
の化合物を脱水剤と接触させて式ＩＩＩ：
【化１０】
2009515887.tif 000036
の化合物を提供すること、
（ｂ）前記式ＩＩＩの化合物を式ＩＶ：
Ｒ１−ＮＨ（Ｒａ）        （ＩＶ）
の化合物と接触させて式Ｖ：
【化１１】
2009515887.tif 000037
の化合物を提供すること、
（ｃ）前記式Ｖの化合物を１つ以上のカップリング剤および式ＶＩ：
Ｒ２−ＮＨ（Ｒｂ）        （ＶＩ）
の化合物と接触させて前記式Ｉの化合物を提供すること
を含む方法。
【請求項２７】
式Ｉ：
【化１２】
2009515887.tif 000038
（式中、
ｎは２から約１０であり、
Ｒ１は、アリールまたはヘテロアリールであり、
Ｒ２は、アリールまたはヘテロアリールであり、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリールまたは窒素保護基であり、
任意のアルキル、アリールまたはヘテロアリールは、任意選択として、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロ、アルキル、トリフルオロメチル、アルコキシ、アリール、カルボキシル、カルボキシエステル、カルボキサミドおよびＮＲｃＲｄからなる群から選ばれた１から３の置換基で置換され、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立に、水素、アルキルまたはＣ（＝Ｏ）ＯＲｅであり、ＲｅはＨまたはアルキルである）
の化合物またはその塩を含み、薬学的に許容されるキャリアと組み合わされた医薬品組成物。
【請求項２８】
前記式Ｉの化合物のＲ１がフェニルのとき、Ｒ２は２−アミノフェニルでなく、Ｒ１が２−アミノフェニルのとき、Ｒ２はフェニルでない、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記組成物は、経口投与、非経口投与または静脈内投与に適している、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
前記組成物は、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤または持続放出調合物の形である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３１】
前記式Ｉの化合物は、細胞中のフラタキシンｍＲＮＡレベルを増加させるのに有効な量である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３２】
前記細胞は、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞、より好ましくはヒトリンパ球、ヒト心筋細胞またはヒト神経細胞である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３３】
パッケージング材料と前記パッケージング材料の中に含まれた前記式Ｉの化合物とを含む製品であって、前記パッケージング材料は、フリードライヒ運動失調症を治療するために前記式Ｉの化合物を用いてよい旨を表示するラベルを含み、式Ｉは、
【化１３】
2009515887.tif 000039
であり、
式中、
ｎは２から約１０であり、
Ｒ１は、アリールまたはヘテロアリールであり、
Ｒ２は、アリールまたはヘテロアリールであり、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリールまたは窒素保護基であり、
任意のアルキル、アリールまたはヘテロアリールは、任意選択として、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロ、アルキル、トリフルオロメチル、アルコキシ、アリール、カルボキシル、カルボキシエステル、カルボキサミドおよびＮＲｃＲｄからなる群から選ばれた１から３の置換基で置換され、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立に、水素、アルキルまたはＣ（＝Ｏ）ＯＲｅであり、ＲｅはＨまたはアルキルである、
またはその塩である製品。
【請求項３４】
哺乳類中の神経変性病または神経筋病を治療し、予防し、あるいは哺乳類中の神経変性病または神経筋病の前記発症を遅れさせる方法であって、前記哺乳類に、前記哺乳類中のヒストンアセチル化の前記レベルを変化させるのに有効な量の式Ｉの化合物を投与することを含み、式Ｉは、
【化１４】
2009515887.tif 000040
であり、
式中、
ｎは２から約１０であり、
Ｒ１は、アリールまたはヘテロアリールであり、
Ｒ２は、アリールまたはヘテロアリールであり、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリールまたは窒素保護基であり、
式中、任意のアルキル、アリールまたはヘテロアリールは、任意選択として、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロ、アルキル、トリフルオロメチル、アルコキシ、アリール、カルボキシル、カルボキシエステル、カルボキサミドおよびＮＲｃＲｄからなる群から選ばれた１から３の置換基で置換され、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立に、水素、アルキルまたはＣ（＝Ｏ）ＯＲｅであり、ＲｅはＨまたはアルキルである、
またはその塩である方法。
【請求項３５】
前記哺乳類が、神経変性病または神経筋病にかかっているか、または神経変性病または神経筋病にかかるおそれがあることを特定することをさらに含み、前記病は、好ましくは、ハンチントン病、脊髄小脳失調、フリードライヒ運動失調症、脆弱性Ｘ症候群、脊髄筋肉萎縮症、ケネディー病、脊髄および延髄筋肉萎縮症、筋緊張性異栄養症、筋萎縮性側索硬化症およびアルツハイマー病からなる群から選ばれる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
哺乳類のフリードライヒ運動失調症を治療し、予防し、あるいは哺乳類のフリードライヒ運動失調症の前記発症を遅れさせる方法であって、前記哺乳類に、前記哺乳類のフラキサチンｍＲＮＡを増加させるのに有効な量の式Ｉの化合物を投与することを含み、式Ｉは、
【化１５】
2009515887.tif 000041
であり、
式中、
ｎは２から約１０であり、
Ｒ１は、アリールまたはヘテロアリールであり、
Ｒ２は、アリールまたはヘテロアリールであり、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリールまたは窒素保護基であり、
任意のアルキル、アリールまたはヘテロアリールは、任意選択として、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロ、アルキル、トリフルオロメチル、アルコキシ、アリール、カルボキシル、カルボキシエステル、カルボキサミドおよびＮＲｃＲｄからなる群から選ばれた１から３の置換基で置換され、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立に、水素、アルキルまたはＣ（＝Ｏ）ＯＲｅであり、ＲｅはＨまたはアルキルである、
またはその塩である方法。
【請求項３７】
前記哺乳類は、ヒトである、請求項３４または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記化合物は、経口投与または非経口投与される、請求項３４または３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記哺乳類がフリードライヒ運動失調症にかかっているか、またはフリードライヒ運動失調症にかかるおそれがあることを特定することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記フラタキシン遺伝子のイントロン１中のＧＡＡ３塩基繰り返しの伸張の前記程度、前記哺乳類中のフラタキシンｍＲＮＡの前記レベル、または前記哺乳類中のフラタキシン蛋白質の前記レベルを測定することによって、フリードライヒ運動失調症にかかっているか、またはフリードライヒ運動失調症にかかるおそれがある前記哺乳類を特定する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４２】
前記式Ｉの化合物は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤である、請求項２７に記載の医薬品組成物。
【請求項４３】
前記式Ｉの化合物は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤である、請求項３４または３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、米国仮特許出願第６０／７３５，４８３号、２００５年１１月１１日出願；米国仮特許出願第６０／８３８，９０８号、２００６年８月１８日出願；および米国仮特許出願第６０／８２３．０５１号、２００６年８月２１日出願（これらは全て、本明細書中で参考として援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（政府資金援助）
本発明は、ＮＩＮＤＳ／ＮＩＨ契約番号Ｒ２１  ＮＳ０４８９８９およびＲ２１  ＮＳ０５５７８１の下の支援によって行われた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤と、治療法としてのＨＤＡＣ阻害剤の使用とに関する。
【背景技術】
【０００４】
（背景）
フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）は、白人の間で最も多い遺伝性運動失調症である（非特許文献１参照）。ＦＲＤＡの人にはフラタキシンをコードするｍＲＮＡが不足している。フラタキシンは、高度に保存された２１０アミノ酸残基の核コードミトコンドリア蛋白質であり、鉄のホメオスタシス、鉄−硫黄クラスターの貯蔵およびアコニターゼなどの提携蛋白質への移動に関与すると考えられている（非特許文献２、非特許文献３参照）。
【０００５】
フラタキシンが不足すると進行性脊髄小脳神経変性となり、その結果、歩行および手の動きの共調運動失調、言葉のもつれ、筋肉の脱力および感覚の喪失が表れ、神経外脊柱側彎症、心筋症および糖尿病を伴う。一般的に、最初に症状が表れてから１５年から２０年後に、患者は車椅子生活を余儀なくされ、その後の段階では身体の自由を完全に失う。ＦＲＤＡの人のほとんどは成年期の初めに心臓疾患で死亡する。ＦＲＤＡを治療するために、酸化防止剤および鉄キレート化剤を利用する方策が用いられてきたが、これらの方策は、この疾患の症状を治療するだけであり、原因、すなわちフラタキシン欠損を治療するわけではない。従って、ＦＲＤＡなどの神経学的状態の治療のために、フラタキシン蛋白質発現を回復させることができる分子を開発する必要がある。
【０００６】
さらに、ＦＲＤＡ患者の９８％に見いだされたＤＮＡの異常が、フラタキシン遺伝子の最初のイントロン中のＧＡＡ３塩基繰り返しの一定でない超伸長である（非特許文献４参照）。ゲノムＤＮＡ中の３塩基繰り返し伸長は、筋緊張性異栄養症、脊髄筋肉萎縮症、脆弱性エックス症候群、ハンチントン病、脊髄小脳運動失調症、筋萎縮性側索硬化症、ケネディー病、脊髄および延髄筋肉萎縮症およびアルツハイマー病を含むがそれらに限定されない、多数の他の神経変性疾患および神経筋疾患と関連している。３塩基繰り返し伸張は、遺伝子発現を変化させて疾患の原因となることがある。例えば、ハンチントン病、脊髄小脳運動失調症、脆弱性エックス症候群および筋緊張性異栄養症では、伸長した繰り返しが遺伝子抑制を招く。従って、神経系疾患において遺伝子の正常な機能を回復させることができる分子を開発する必要がある。
【非特許文献１】Ｐａｎｄｏｌｆｏ  （１９９９）  Ｓｅｍｉｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  １９：３１１
【非特許文献２】Ｂｕｌｔｅａｕら、（２００４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５：２４２、Ｓｅｚｎｅｃら、（２００５）  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １４：４６３
【非特許文献３】Ｃａｌａｂｒｅｓｅら、（２００５）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｓｃｉ．  ２３３：１４５
【非特許文献４】Ｃａｍｐｕｚａｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１：１４２３  （１９９６）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、ＦＲＤＡなどの神経系疾患を治療するために用いることができる小分子を提供する。本発明は、遺伝子の正常な機能を回復させる、例えば、フラタキシンｍＲＮＡの転写を回復させるのに有効な小分子阻害剤を提供する。本発明は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤とともにインキュベートされたＦＲＤＡ患者由来のリンパ球がアセチル化ヒストンのレベルの増加を示すという発見を含む。さらに、本発明には、ＨＤＡＣ阻害剤ＢＭＬ−２１０および他の新規なＨＤＡＣ阻害剤にはＦＲＤＡ患者由来のリンパ球内のフラタキシンｍＲＮＡを増加させる効果があるという発見が関わっている。従って、本発明は、ＨＤＡＣ阻害剤の医薬品組成物と、例えばフリードライヒ運動失調症などの慢性および急性神経系疾患のための治療法としての該医薬品組成物の使用とを目的とする。本発明は、新規なＨＤＡＣ阻害剤、ならびに該ＨＤＡＣ阻害剤の合成のための新規な方法も目的とする。
【０００８】
従って、一実施態様では、本発明は、式Ｉａ：
【０００９】
【化１６】
2009515887.tif 000003
式中、
ｎは、２から約１０であり、
Ｒ１は、アリールまたはヘテロアリールであり、
Ｒ２は、アリールまたはヘテロアリールであり、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリールまたは窒素保護基であり、
任意のアルキル、アリールまたはヘテロアリールは、任意選択として、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロ、アルキル、トリフルオロメチル、アルコキシ、アリール、カルボキシル、カルボキシエステル、カルボキサミドおよびＮＲｃＲｄからなる群から選ばれた１から３の置換基で置換され、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立に、水素、アルキルまたはＣ（＝Ｏ）ＯＲｅであり、Ｒｅは、Ｈまたはアルキルであり、カルボキシエステルのエステル基は、アルキル基である、
の化合物またはその塩を提供し、
Ｒ１がフェニル、ｎが３〜６のとき、Ｒ２は、２−アミノフェニルでなく、Ｒ１が２−アミノフェニル、ｎが３〜６のとき、Ｒ２は、フェニルでないものとする。
【００１０】
式Ｉａの化合物は、ＨＤＡＣ阻害剤である。
【００１１】
別の実施態様では、本発明は、式Ｉ：
【００１２】
【化１７】
2009515887.tif 000004
式中、
ｎは、２から約１０であり、
Ｒ１は、アリールまたはヘテロアリールであり、
Ｒ２は、アリールまたはヘテロアリールであり、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリールまたは窒素保護基であり、
任意のアルキル、アリールまたはヘテロアリールは、任意選択として、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロ、アルキル、トリフルオロメチル、アルコキシ、アリール、カルボキシル、カルボキシエステル、カルボキサミドおよびＮＲｃＲｄからなる群から選ばれた１から３の置換基で置換され、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立に、水素、アルキルまたはＣ（＝Ｏ）ＯＲｅであり、Ｒｅは、Ｈまたはアルキルであり、カルボキシエステルのエステル基は、アルキル基である、
の化合物またはその塩を合成するための方法を提供する。
【００１３】
本発明の方法によれば、式Ｉの化合物は、式Ｖ：
【００１４】
【化１８】
2009515887.tif 000005
の化合物を、１つ以上のカップリング剤および式ＶＩ：
Ｒ２−ＮＨ（Ｒｂ）                （ＶＩ）
の化合物と接触させ、式Ｉの化合物を提供することによって合成してよい。式Ｖの化合物は、式ＩＩＩ：
【００１５】
【化１９】
2009515887.tif 000006
の化合物を、式ＩＶ：
Ｒ１−ＮＨ（Ｒａ）                  （ＩＶ）
の化合物と接触させ、式Ｖの化合物を提供することによって合成してよい。式ＩＩＩの化合物は、式ＩＩ：
【００１６】
【化２０】
2009515887.tif 000007
の化合物を脱水剤と接触させ、式ＩＩＩの化合物を提供することによって合成してよい。
【００１７】
別の実施態様では、本発明は、薬学的に許容されるキャリアと組み合わされた式Ｉの化合物を含む医薬品組成物を提供する。本医薬品組成物は、経口投与に適するものであってよい。経口投与に適する医薬品組成物は、錠剤、カプセルまたはエリキシル剤の形であってよい。本医薬品組成物は、静脈内投与、腹腔内投与または皮下投与によるなど、非経口投与に適するものであってもよい。本医薬品組成物は、持続型放出性調合物の形であってもよい。
【００１８】
本医薬品組成物は、細胞中のフラタキシンｍＲＮＡレベルを増加させるのに有効な量の式Ｉの化合物を含んでよい。細胞は、哺乳類細胞であってよい。哺乳類細胞は、リンパ球、心筋細胞または神経細胞などのヒト細胞であってよい。
【００１９】
本発明は、フリードライヒ運動失調症を治療するために式Ｉの化合物を用いてよい旨を表示するラベルを有するパッケージング材料中に内包された式Ｉの化合物を含む製品も提供する。
【００２０】
別の実施態様では、本発明は、ヒトなどの哺乳類の神経変性病または神経筋病を治療し、予防し、または発症を遅れさせる方法を提供する。本方法は、該哺乳類に、該哺乳類中のヒストンアセチル化のレベルを変化させるのに有効な量の式Ｉの化合物を投与することを含む。式Ｉの化合物は、経口投与してよく、あるいは非経口投与してよい。本方法は、該哺乳類が神経変性病または神経筋病の患者であること、または患者になるおそれがあることを特定することも含んでよい。神経変性病は、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、フリードライヒ運動失調症、脆弱性Ｘ症候群、ケネディー病、脊髄萎縮症および延髄筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症およびアルツハイマー病であってよい。神経筋病は、脊髄筋肉萎縮症または筋緊張性異栄養症であってよい。従って、一態様では、本発明は、哺乳類におけるフリードライヒ運動失調症を治療し、予防し、または発症を遅れさせる方法を提供する。この方法は、該哺乳類に、該哺乳類中のフラタキシンｍＲＮＡを増加させるのに有効な量の式Ｉの化合物を投与することを含む。本方法は、該哺乳類がフリードライヒ運動失調症の患者であること、または患者になるおそれがあることを特定することを含んでよい。フリードライヒ運動失調症の患者であるかまたは患者になるおそれがある哺乳類は、フラタキシン遺伝子のイントロン１中のＧＡＡ３塩基繰り返しの長さ、伸長の程度または伸張の数を測定して特定してよい。フラタキシンｍＲＮＡまたは蛋白質のレベルを測定して該哺乳類を特定してもよい。
【００２１】
（定義）
特に異なる定義を示さない限り、以下の定義を用いる。ラジカル、置換基および範囲に関して下記に列挙する特定の値および好ましい値は、例を示すためのものでしかなく、それらのラジカルおよび置換基について、他の定義された値も、定義された範囲内の他の値も除外しない。アルキル、アルコキシ、アルケニルおよび類似基は、直鎖基および分岐基を指す。
【００２２】
本明細書中で参照される基「アルキル」は、任意選択として不飽和であり、任意選択として本明細書に記載される官能基で置換された直鎖または分岐炭化水素ラジカルを指す。アルキル基は、１から約２０の炭素原子を含んでよい。例えば、アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、３−ペンチル、ヘキシル、ヘプチルまたはオクチルであってよいが、本発明の範囲はそれらに限定されない。一実施態様では、アルキルは、好ましくは（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルである。別の実施態様では、アルキルは、好ましくは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルである。
【００２３】
アルキル基が不飽和の実施態様では、アルキル基は、アルケニル基である。アルケニル基は、例えば、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニル、７−オクテニルおよびそれらの分岐異性体であってよい。
【００２４】
本明細書中で参照される基「アルコキシ」は、酸素ラジカルで置換された、任意選択として置換された、アルキル基を指す。アルコキシは、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ペントキシ、２−ペントキシ、３−ペントキシまたはヘキシルオキシであってよい。
【００２５】
本明細書中で参照される「アリール」は、親の芳香環系の１つの炭素原子から１つの水素原子を除去して誘導される６〜１８の炭素原子の一価芳香族炭化水素ラジカルを指す。アリール基は、通常、６〜１０の炭素原子からなり、さらに、本明細書に記載される任意選択の置換基を有してよい。一般のアリール基は、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルおよび類似物から誘導されるラジカルを含むが、それらに限定されない。
【００２６】
本明細書中で参照される「ヘテロアリール」は、１つ、２つ、または３つの芳香環を含み、芳香環中に少なくとも１つ（通常１から約３）の窒素、酸素または硫黄原子を含む単環、２環または３環の環系を指す。ヘテロアリール基は、本明細書に記載される任意選択の置換基を有してよい。
【００２７】
ヘテロアリール基の例は、２Ｈ−ピロリル、３Ｈ−インドリル、４Ｈ−キノリジニル、アクリジニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、ベンゾチアゾリル、β−カルボリニル、カルバゾリル、クロメニル、シンノリニル、ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラニル、フラザニル、フリル、イミダゾリル、イミジゾリル、インダゾリル、インドリシニル、インドリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフチリジニル、オキサゾリル、ペリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナルサジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリルおよびキサンテニルを含むがそれらに限定されない。
【００２８】
一実施態様では、用語「ヘテロアリール」は、炭素と、非ペルオキシド酸素、硫黄およびＮ（Ｚ）から独立に選ばれた１つ、２つ、３つまたは４つのヘテロ原子とを含む５つまたは６つの環原子を含む単環芳香環を示す。ここで、Ｚは、存在しないか、またはＨ、Ｏ、アルキル、フェニルまたはベンジルである。別の実施態様では、ヘテロアリールは、ヘテロアリールから誘導された約８から１０の環原子のオルト縮合２環複素環、特にベンゾ誘導体、またはプロピレン、トリメチレンまたはテトラメチレンジラジカルをヘテロアリールに縮合して誘導したものを示す。
【００２９】
本明細書中で参照される「任意選択として」置換された基は、１つ以上の水素原子がそれぞれ独立に非水素置換基で置換される場合の基の置換を指す。任意選択として置換される基は、通常、１つから５つの置換基で置換される。他の実施態様では、任意選択として置換される基は、１つから３つの置換基で置換される。一般的な置換基は、−Ｘ、−Ｒ、−Ｏ−、＝Ｏ、−ＯＲ、−Ｓ−、−ＳＲ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｏ−、−Ｓ（＝Ｏ）２ＯＨ、−ＯＳ（＝Ｏ）２ＯＲ、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ、−ＮＲ２、−Ｎ＋Ｒ３、＝ＮＲ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ２、＝Ｎ２、−Ｎ３、ＮＣ（＝Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＲ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＮＲＲ、−Ｃ（ＮＲ）ＮＲＲ、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ−）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２を含むがそれらに限定されない。式中、各Ｘは、独立に、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）であり、各Ｒは、独立に、Ｈ、アルキル、アリール、複素環または保護基である。置換基が２つの結合によって（例えば、「二重結合」によって）基に結合しているとき、置換基によって２つの水素原子が置換されている。
【００３０】
１つ以上の置換基を含む上記の任意の基に関して、もちろん、そのような基は、立体的に実際的でない、および／または合成的に実現可能でないいかなる置換も置換パターンも含まないと理解される。さらに、本発明の化合物は、これらの化合物の置換によって生じるあらゆる立体化学異性体を含む。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「窒素保護基」は、窒素基に結合したとき、この基で望ましくない反応が起こることを防ぐために用いることができ、後の段階で通常の化学的または酵素的工程によって除去し、遊離の窒素（例えば、−ＮＨ−基または−Ｎ＝基）を復旧させることができる任意の基を指す。
【００３２】
本明細書に記載される化合物のヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基およびアミド基は、任意選択の保護基を含んでよい。適当な保護基は、当業者に既知である。参照によって本明細書に全体が組み込まれるＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１，  ＩＳＢＮ  ０−４７１−６２３０１−６）  に、本発明の化合物とともに用いることができる多数の保護基および対応する化学開裂反応が記載されている。この書物には、ヒドロキシル保護基、カルボン酸保護基およびアミド形成基が含まれている。特に、Ｃｈａｐｔｅｒ  １，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ：  Ａｎ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ，  ｐａｇｅｓ  １−２０、Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，  Ｈｙｄｒｏｘｙｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ，  ｐａｇｅｓ  ２１−９４、Ｃｈａｐｔｅｒ  ４，  Ｃａｒｂｏｘｙｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ，  ｐａｇｅｓ  １１８−１５４  および  Ｃｈａｐｔｅｒ  ５，  Ｃａｒｂｏｎｙｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ，  ｐａｇｅｓ  １５５−１８４を参照すること。参照によって本明細書に全体が組み込まれる  Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，  Ｐｈｉｌｉｐ  Ｊ．；  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  （Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９４）  も参照すること。下記の保護基の使用を説明する節で、本発明の化合物を合成する際に使用することができるいくつかの特定の保護基を考察する。
【００３３】
本明細書中で用いられる「塩基」は、プロトン受容体として作用する任意の分子、イオンまたは他の実体を指す。塩基は、非共有電子対を有する有機化合物またはイオンであってよい。一般的な塩基は、モノ、ジ、およびトリアルキル置換アミンを含む。塩基は、金属酸化物または金属水酸化物などの無機化合物またはイオンであってもよい。有機合成において用いられる塩基は、当業者に公知である。例えば、ｔｈｅ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  ２００３−２００４  （Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  ＷＩ）に多数の塩基が開示されている。
【００３４】
本明細書中で用いられる「溶媒」は、別の物質、例えば固体物質、半固体物質または液体を溶解することができる物質、通常は液体を指す。一般的な溶媒は、水および有機溶媒を含む。使用される反応条件下で、溶媒は、反応混合物中に存在するいかなる出発原料または試薬とも、有意な程度には、化学的に反応しない必要があることは当業者に自明である。
【００３５】
本明細書中で用いられる「溶媒系」は、１つ以上の溶媒を含む媒質を指す。溶媒系は、均一（相溶性の複数溶媒）であってよく、あるいは不均一（例えば、有機／水系）であってよい。
【００３６】
本明細書中で用いられる「還流」は、容器、例えばコンデンサを取り付けた容器中で液体溶媒系を沸騰させ、溶媒系の蒸気が連続的に凝縮して再び沸騰するようなプロセスを指す。
【００３７】
本明細書中で用いられる「精製」は、基質（例えば、結晶、非晶質固体、液体または油）から不純物を除去するプロセスを指す。適当な精製方法は、例えば、ろ過、洗浄、再結晶および乾燥、蒸留ならびにクロマトグラフィーを含む。
【００３８】
本明細書で用いられる用語「単離された」および「精製された」は、他の試薬を実質的に含まない、例えば、重量基準で少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の純度の物質を指す。
【００３９】
本明細書で用いられる「無水」は、約１０重量％より少ない水、約１重量％より少ない水、約０．５重量％より少ない水、約０．１重量％より少ない水、または約０．０１重量％より少ない水を含む物質を指す。無水条件は、約２重量％より少ない水、約１重量％より少ない水、約０．５重量％より少ない水、約０．１重量％より少ない水、または約０．０１重量％より少ない水を有する反応条件を指す。
【００４０】
本明細書で用いられる「接触させる」は、触れさせる、接触をさせる、またはすぐ近くに持って来る行為を指す。一般に、適当な溶媒系中に溶液を形成させることによって化合物を接触させる。
【００４１】
化合物、組成物およびその他の限定条件の詳細を記載するにあたって、本明細書に示される数値範囲は、本組成物中に機能としての結果をもたらす数量である。従って、一般に、範囲は、その範囲の特定の柔軟性を示す用語「約」とともに導入される。例えば、用語「約」は、示された数、あるいは範囲上限または下限から±整数１を指してよい。他の実施態様では、用語「約」は、示された数、あるいは範囲上限または下限から±整数２を指してよい。用語「約」は、示された数または数値範囲の±２０％を指してもよい。他の実施態様では、用語「約」は、示された数または数値範囲の±１０％、あるいは±５％を指してよい。さらに他の実施態様では、用語「約」は、±１％を指す。さらに他の実施態様では、用語「約」は、厳密に示された数または数値範囲を指す。
【００４２】
他の定義を示さない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解すると同じ意味を有する。適当な方法および物質を下記に記載するが、本明細書に記載する方法および物質と類似または同等な方法および物質を用いて本発明を実施してよい。本明細書で言及するすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照によって全体が組み込まれる。本明細書は、特定の用語の選ばれた定義を提供し、不一致がある場合、これらの定義が他の定義より優先する。さらに、物質、方法および実施例は、例を示すものでしかなく、限定を目的とするものではない。
【００４３】
以下の詳細な説明によって、ならびに請求項によって、本発明の他の特徴および利点を明らかにする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＦＲＤＡなどの神経学的病気を治療するのに用いることができる小分子を提供する。本発明には、ＦＲＤＡ患者由来のリンパ球が、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤とインキュベートすると、アセチル化ヒストンのレベルの増加を示すという発見が関与している。さらに、本発明には、ＨＤＡＣ阻害剤であるスベロイルアニリドオルトアミノアニリド（ＳＡＯＡ、ＢＭＬ−２１０）およびピメロイルアニリドオルトアミノアニリド（ＰＡＯＡ）、ならびにＳＡＯＡおよびＰＡＯＡの新規な誘導体にはＦＲＤＡ患者由来のリンパ球中のフラタキシンｍＲＮＡおよび蛋白質の発現を増加させる効果があるという発見が関与している。従って、本発明は、ＨＤＡＣ阻害剤の医薬品組成物と、例えばフリードライヒ運動失調症などの慢性および急性の神経疾患の治療法としての該医薬品組成物の使用とを提供する。本発明は、新規なＨＤＡＣ阻害剤、ならびに該阻害剤の合成のための新規な方法も提供する。
【００４５】
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤
ＦＲＤＡ患者の９８％に見いだされるＤＮＡ異常がフラタキシン遺伝子の最初のイントロン中のＧＡＡ３塩基繰り返しの一定でない超伸張であり、その結果、フラタキシン遺伝子の転写に欠損が生じる（Ｃａｍｐｕｚａｎｏら  （１９９６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１：１４２３−７参照）。ＦＲＤＡ患者には、フラタキシンｍＲＮＡが著しく欠損し、ＧＡＡ３塩基繰り返しが長くなるほど、フラタキシン欠損が重くなることもある。ＦＲＤＡは、典型的な３塩基繰り返し疾患である。すなわち、正常な対立遺伝子の繰り返しは６〜３４であるが、ＦＲＤＡ患者の対立遺伝子の繰り返しは６６〜１７００である。ＧＡＡ３塩基繰り返しが長くなるほど、発症が早くなり、疾患の重さが増大する。
【００４６】
本発明は、ＦＲＤＡなどの３塩基繰り返し伸張と関連する神経疾患において遺伝子機能を回復させることができるヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を提供する。例えば、本発明のＨＤＡＣは、ＦＲＤＡ患者由来のリンパ球中のフラタキシンｍＲＮＡおよび蛋白質を増加させることができる。「ヒストンデアセチラーゼ阻害剤」とは、１つ以上のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）と結合し、ヒストン、非ヒストン染色体蛋白質、およびその他の細胞蛋白質のアセチル化のレベルを調節する小分子である。本発明のＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＤＡＣと相互作用し、細胞標的のアセチル化のレベルを調節することができる。
【００４７】
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、アセチル化された標的蛋白質からのアセチル基の除去（脱アセチル化）を触媒するポリペプチドの特徴となる特性を有する任意のポリペプチドであってよい。ＨＤＡＣの特徴となる特性は、当分野で既知である。例えば、Ｆｉｎｎｉｎら  （１９９９）  Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：１８８を参照すること。従って、ＨＤＡＣは、ヌクレオソームを形成するヒストン、例えばＨ３、Ｈ４、Ｈ２ＡおよびＨ２ＢのＮ−末端に位置する保存されたリジン残基のε−アミノ基を脱アセチル化して遺伝子転写を抑制するポリペプチドであってよい。ＨＤＡＣは、ｐ５３、Ｅ２Ｆ、α−チューブリンおよびＭｙｏ  Ｄなどの他の蛋白質を脱アセチル化してもよい。Ａｎｎｅｍｉｅｋｅら  （２００３）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３７０：７３７を参照すること。ＨＤＡＣは、核に局所化してもよく、あるいは、核と細胞質との両方に見いだされるものであってもよい。
【００４８】
本発明のＨＤＡＣ阻害剤は、任意のＨＤＡＣと相互作用してよい。例えば、本発明のＨＤＡＣ阻害剤は、３つの既知のクラスのＨＤＡＣの１つに由来するＨＤＡＣと相互作用してよい。本発明のＨＤＡＣ阻害剤は、クラスＩまたはクラスＩＩのＨＤＡＣファミリーのＨＤＡＣと相互作用してよい。クラスＩのＨＤＡＣは、酵母転写制御因子ＲＰＤ３に最もよく似ているものである。クラスＩのＨＤＡＣの例は、ＨＤＡＣ１、２、３および８、ならびにアミノ酸配列がＨＤＡＣ１、２、３および８と４５％から９３％の同一性を示すデアセチラーゼドメインを有する任意のＨＤＡＣを含む。クラスＩＩのＨＤＡＣは、酵母ＨＤＡ１酵素に最もよく似ているものであり、クラスＩＩのＨＤＡＣの例は、ＨＤＡＣ４、５、６、７、９および１０を含む。本発明のＨＤＡＣ阻害剤は、酵母ＳＩＲ２蛋白質に最もよく似ているＨＤＡＣのＮＡＤ＋依存性ファミリーと相互作用してもよい。本発明のＨＤＡＣ阻害剤は、上記クラスの１つに属さないＨＤＡＣと相互作用してもよい。例えば、Ｇａｏら  （２００２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：２５７４８を参照すること。
【００４９】
本発明の小分子量ＨＤＡＣ阻害剤は、ＳＡＯＡおよびＰＡＯＡ、本明細書に記載されるＳＡＯＡおよびＰＡＯＡの誘導体、ならびにそれらの塩を含む。従って、本発明のＨＤＡＣ阻害剤は、式Ｉ：
【００５０】
【化２１】
2009515887.tif 000008
式中、
ｎは、２から約１０であり、
Ｒ１は、アリールまたはヘテロアリールであり、
Ｒ２は、アリールまたはヘテロアリールであり、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリールまたは窒素保護基であり、
任意のアルキル、アリールまたはヘテロアリールは、任意選択として、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロ、アルキル、トリフルオロメチル、アルコキシ、アリール、カルボキシル、カルボキシエステル、カルボキサミドおよびＮＲｃＲｄからなる群から選ばれた１から３の置換基で置換され、
ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立に、水素、アルキルまたはＣ（＝Ｏ）ＯＲｅであり、Ｒｅは、Ｈまたはアルキルであり、カルボキシエステルのエステル基は、アルキル基である、
の化合物またはその塩を含む。
【００５１】
式Ｉにおいて、アルキル置換基、アリール置換基またはヘテロアリール置換基は、カルボキシル、カルボキシエステルまたはカルボキサミド以外であってよい。
【００５２】
一実施態様では、Ｒ１は、アリールであってよい。別の実施態様では、Ｒ１は、ヘテロアリールであってよい。他の実施態様では、Ｒ１は、フェニル、２−アミノフェニル、３−アミノフェニル、４−アミノフェニル、２−メトキシフェニル、３−メトキシフェニルまたは４−メトキシフェニルであってよい。他の実施態様では、Ｒ１は、２−メチルフェニル、３−メチルフェニルまたは４−メチルフェニルであってよい。他の実施態様では、Ｒ１は、２，４−ジメトキシフェニル、３，５−ジメトキシフェニル、３，４，５−トリメトキシフェニル、２，４−ジアミノフェニル、３，５−ジアミノフェニルまたは３，４，５−トリアミノフェニルであってよい。さらに他の実施態様では、Ｒ１は、２−ピリジニル、３−キノリニルまたは８−キノリニルであってよい。
【００５３】
一実施態様では、Ｒ２は、アリールであってよい。別の実施態様では、Ｒ２は、ヘテロアリールであってよい。特定の実施態様では、Ｒ２は、フェニル、２−アミノフェニル、３−アミノフェニル、４−アミノフェニル、２−メトキシフェニル、３−メトキシフェニルまたは４−メトキシフェニルであってよい。他の実施態様では、Ｒ１は、２−メチルフェニル、３−メチルフェニルまたは４−メチルフェニルであってよい。他の実施態様では、Ｒ２は、２，４−ジメトキシフェニル、３，５−ジメトキシフェニル、３，４，５−トリメトキシフェニル、２，４−ジアミノフェニル、３，５−ジアミノフェニルまたは３，４，５−トリアミノフェニルであってよい。さらに別の実施態様では、Ｒ２は、２−ピリジニル、３−キノリニルまたは８−キノリニルであってよい。
【００５４】
実施態様によっては、Ｒ１とＲ２とは同じであってよい。他の実施態様では、Ｒ１とＲ２とは同じでない。
【００５５】
一実施態様では、Ｒａは、Ｈである。別の実施態様では、Ｒｂは、Ｈである。さらに別の実施態様では、Ｒａは、窒素保護基である。さらに別の実施態様では、Ｒｂは、窒素保護基であってよい。
【００５６】
一実施態様では、ｎは、約３から約６である。別の実施態様では、ｎは、５である。さらに別の実施態様では、ｎは、６である。
【００５７】
一実施態様では、Ｒ１は、１つ以上の置換基で置換されていてよい。Ｒ１は、１から約５、または１から約３の置換基で置換されていてよい。一実施態様では、Ｒ１は、２つのアミノ基で置換されていてよい。別の実施態様では、Ｒ１は、２つのメトキシ基で置換されていてよい。
【００５８】
一実施態様では、Ｒ２は、１つ以上の置換基で置換されていてよい。Ｒ２は、１から約５、または１から約３の置換基で置換されていてよい。一実施態様では、Ｒ２は、２つのアミノ基で置換されていてよい。別の実施態様では、Ｒ２は、２つのメトキシ基で置換されていてよい。
【００５９】
ＨＤＡＣ阻害剤の合成方法
本発明は、ＨＤＡＣ阻害剤の合成のための新規な方法も提供する。例えば、式Ｉの化合物は、式Ｖ：
【００６０】
【化２２】
2009515887.tif 000009
の化合物を、１つ以上のカップリング剤および式ＶＩ：
Ｒ２−ＮＨ（Ｒｂ）                （ＶＩ）
の化合物と接触させ、式Ｉの化合物を提供することによって、合成してよい。カップリング剤は、１−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）および１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）であってよい。式Ｖの化合物と式ＶＩの化合物とのカップリングは、１つ以上の塩基性化合物の存在下で行ってよい。適当な塩基性化合物または「塩基」は、アルキルアミンを含む。アルキルアミンは、トリアルキル置換アミン、例えばトリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンであってよい。２，６−ルチジンおよび２，４，６−コリジンなどの立体障害アミンも、本発明の特定の実施態様で用いてよい。
【００６１】
溶媒系の存在下で式Ｖの化合物と式ＶＩの化合物とのカップリングを行ってよい。一般的な溶媒系は、１成分溶媒または２成分以上の溶媒であってよい。溶媒系は、１つ以上の有機溶媒であってよい。２成分溶媒系は、互いに相溶性の２つの溶媒を含む。溶媒系は、式Ｉの化合物を生成するまで反応が進行するのを可能にする程度に式Ｖの化合物とＶＩの化合物とを溶解するとよい。適当な溶媒は、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、テトラヒドロピラン（ＴＨＦ）、１，４−ジオキサン、ジクロロメタンおよびその他の任意の適当な非プロトン溶媒を含む。
【００６２】
式Ｉの化合物を単離し、精製してよい。用いてよい精製技法は、沈殿、ろ過、再結晶、ならびにＧＣ、ＨＰＬＣ、逆相クロマトグラフィー、ゲルプレート、薄層クロマトグラフィーおよび類似技法を含むがそれらに限定されない他の形のクロマトグラフィーを含む。
【００６３】
本発明は、式ＩＩＩ：
【００６４】
【化２３】
2009515887.tif 000010
の化合物を、式ＩＶ：
Ｒ１−ＮＨ（Ｒａ）                （ＩＶ）
の化合物と接触させ、式Ｖの化合物を提供することによって式Ｖの化合物を合成する方法も提供する。溶媒系の存在下で式ＩＩＩの化合物と式ＩＶの化合物とを接触させてよい。溶媒系は、１つ以上の有機溶媒を含んでよい。適当な溶媒は、エーテル、テトラヒドロフランおよびジオキサンを含む。一実施態様では、溶媒は、テトラヒドロフランである。
【００６５】
本発明は、式ＩＩ：
【００６６】
【化２４】
2009515887.tif 000011
の化合物を脱水剤と接触させ、式ＩＩＩの化合物を提供することによって式ＩＩＩの化合物を合成する方法も提供する。脱水剤は、カルボン酸無水物であってよい。一実施態様では、カルボン酸無水物は、無水酢酸である。他のアルキルまたはアリールカルボン酸無水物もこの反応で使用してよい。一般に、無水条件下で式ＩＩＩの化合物の形成を行う。反応体、試薬および装置の適当な乾燥によって無水条件を実現してよい。式ＩＩの化合物と脱水剤とを加熱して式ＩＩＩの化合物の形成を促進してよい。反応の温度を、例えば、約３５℃、約４０℃、約５０℃、約７０℃または約１００℃に上げてよい。溶媒系が還流を実現する温度によって反応の温度を定めてもよい。そのような場合、反応は、使用する溶媒系の還流温度までであってよい。
【００６７】
式ＩＩの化合物から式Ｖの化合物を合成するための合成プロトコルの例を、下の図式１のように示すことができる。
【００６８】
【化２５】
2009515887.tif 000012
式ＩＩＩの化合物を単離し、精製してよい。あるいは、式ＩＩＩの化合物を精製しないでそのまま式Ｖの化合物に変換してよい。
【００６９】
式Ｖの化合物から式Ｉの化合物を合成するための合成プロトコルの例を、下の図式２のように示すことができる。
【００７０】
【化２６】
2009515887.tif 000013
これらの方法は、そのような合成の性質の例を示すことを意図し、利用可能な方法の範囲を限定するものではない。本発明のＨＤＡＣ阻害剤は、本明細書に記載のように合成してよく、あるいは、任意の他の当分野で既知の有機合成の利用可能な技法を用いて合成してもよい。本明細書に記載されていない多数の利用可能な技法が当分野では公知である。しかし、Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），  Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−６  ならびにＭａｒｃｈ，  Ｊ．，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３ｒｄ  Ｅｄ．  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８５）、およびＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ，  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ＆  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｉｎ  ９  Ｖｏｌｕｍｅｓ，  Ｂａｒｒｙ  Ｍ．  Ｔｒｏｓｔ，  Ｅｄ．−ｉｎ−Ｃｈｉｅｆ  （Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９３  ｐｒｉｎｔｉｎｇ）  に、既知の技法の多くが詳細に記載されている。
【００７１】
一般に、温度、反応時間、溶媒、後処理手順および類似事項などの反応条件は、当分野において特定の反応を行う際に普通のものである。引用文献の事例は、文献中の引用事項とともに、そのような条件の詳細な説明を含む。一般に、温度は約−１００℃から約２００℃とし、溶媒は必要な条件によって非プロトン性またはプロトン性とし、反応時間は１分から１０日とする。所望の変換を実現するために反応時間を調節する。反応の後処理は、粗生成物を提供する溶媒の除去、沈殿およびろ過、および／または任意の未反応試薬の不活性化とそれに続く水／有機層系の間の分配（抽出）ならびに生成物を含む層の分離を含んでよい。
【００７２】
保護基  用語「保護基」は、ヒドロキシル、窒素または他のヘテロ原子に結合されると、望ましくない反応がこの基で起こることを防ぎ、通常の化学または酵素による工程によって除去し、ヒドロキシル基を復旧させることができる任意の基を指してよい。使用される特定の除去可能な保護基は、それほど重要ではなく、好ましい除去可能なヒドロキシルおよび窒素保護基は、例えば、アリル、ベンジル、アセチル、クロロアセチル、チオベンジル、ベンジリジン、フェナシル、メチル、メトキシ、シリルエーテル類（例えば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔ−ブチル−ジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）またはｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）およびヒドロキシル基または窒素官能基上に化学的に導入することができ、後で生成物の性質と適合する温和な条件で化学的または酵素的方法のどちらかによって選択的に除去することができる任意のその他の基などの通常の置換基を含む。
【００７３】
適当なヒドロキシル保護基は、当業者に既知であり、参照によってともに本明細書に全体が組み込まれるＴ．Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；  Ｗｉｌｅｙ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８１（「Ｇｒｅｅｎｅ」）およびその中の引用文献、ならびにＫｏｃｉｅｎｓｋｉ，  Ｐｈｉｌｉｐ  Ｊ．；  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  （Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９４）にさらに詳細に開示されている。
【００７４】
保護基は、入手可能であり、普通に知られており、任意選択として合成手順、すなわち本発明の方法によって本化合物を合成する経路または方法において被保護基の副反応を防ぐために用いられる。ほとんどの場合、どの基を保護するか、いつ保護するか、どのような性質の化学保護基とするか、という決定は、保護する対象である反応の化学的性質（例えば酸性、塩基性、酸化性、還元性または他の条件）および意図する合成方針に依存する。
【００７５】
化合物が複数の保護基で置換されている場合、保護基は同じである必要はないし、通常は同じでない。一般に、保護基は、カルボキシル基、ヒドロキシル基、チオ基またはアミノ基などの官能基を保護し、従って副反応を防ぐか、または他の方法で合成の効率を促進するために用いられる。遊離の、脱保護された基を生じさせる脱保護の順序は、意図する合成の方針および遭遇する反応条件に依存し、担当者が定める任意の順序で実行してよい。
【００７６】
本発明の化合物のさまざまな官能基は、保護されていてよい。例えば、−ＯＨ基（ヒドロキシル、カルボン酸または他の官能基のどれか）用の保護基は、「エーテル形成基またはエステル形成基」を含む。エーテル形成基またはエステル形成基は、本明細書に示される合成図式において化学保護基として機能することができる。しかし、いくつかのヒドロキシル保護基およびチオ保護基は、当業者によって理解されるように、エーテル形成基でもエステル形成基でもない。いくつかは、例えば、下記で考察するアミドの考察に含まれる。
【００７７】
カルボン酸保護基、および他の酸用保護基についてもっと知りたい場合は、下記に示すグリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）を参照すること。そのような基は、例えば、エステル、アミド、ヒドラジドおよび類似物を含むがそれらに限定されない。
【００７８】
エーテル、エステルおよびアミド形成保護基
エステルおよびアミド形成基は、（１）カルボキシルエステル／アミド形成基と、（２）スルホネート、サルフェートおよびスルフィネートなどの硫黄エステル形成基とを含む。エステルを形成するその役割を見ると、通常、保護基は、例えば−ＣＯ２Ｈ基などであるがそれに限定されない任意の酸性の基に結合し、それによって、結果としてＣＯ２Ｒａとなる。ここでＲａは、本明細書に定義するとおりである。保護基の例は、以下を含む。
【００７９】
複素環またはアリールラジカル。これらの基は、任意選択として、多環であっても単環であってもよい。例は、フェニル、スピリル、２−および３−ピロリル、２−および３−チエニル、２−および４−イミダゾリル、２−、４−および５−オキサゾリル、３−および４−イソオキサゾリル、２−、４−および５−チアゾリル、３−、４−および５−イソチアゾリル、３−および４−ピラゾリル、１−、２−、３−および４−ピリジニルおよび１−、２−、４−および５−ピリミジニルを含む。
【００８０】
ハロ、Ｒａ、アルキレン−Ｏ−Ｒａ、アルコキシ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＨ、カルボキシ、カルボキシエステル、チオール、チオエステル、ハロアルキル（１〜６のハロゲン原子）、アルケニルまたはアルキニルで置換された複素環またはアリール。そのような基は、２−、３−および４−アルコキシフェニル（Ｃ１〜Ｃ１２アルキル）、２−、３−および４−メトキシフェニル、２−、３−および４−エトキシフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−および３，５−ジエトキシフェニル、２−および３−カルボエトキシ−４−ヒドロキシフェニル、２−および３−エトキシ−４−ヒドロキシフェニル、２−および３−エトキシ−５−ヒドロキシフェニル、２−および３−エトキシ−６−ヒドロキシフェニル、２−、３−および４−Ｏ−アセチルフェニル、２−、３−および４−ジメチルアミノフェニル、２−、３−および４−メチルメルカプトフェニル、２−、３−および４−ハロフェニル（２−、３−および４−フルオロフェニルならびに２−、３−および４−クロロフェニルを含む）、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−および３，５−ジメチルフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−および３，５−ビスカルボキシエチルフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−および３，５−ジメトキシフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−および３，５−ジハロフェニル（２，４−ジフルオロフェニルおよび３，５−ジフルオロフェニルを含む）、２−、３−および４−ハロアルキルフェニル（１から５のハロゲン原子、４−トリフルオロメチルフェニルを含むＣ１〜Ｃ１２アルキル）、２−、３−および４−シアノフェニル、２−、３−、および４−ニトロフェニル、２−、３−および４−ハロアルキルベンジル（１から５のハロゲン原子、４−トリフルオロメチルベンジル、２−、３−および４−トリクロロメチルフェニルならびに２−、３−および４−トリクロロメチルフェニルを含むＣ１〜Ｃ１２アルキル）、４−Ｎ−メチルピペリジニル、３−Ｎ−メチルピペリジニル、１−エチルピペラジニル、ベンジル、アルキルサリチルフェニル（２−、３−および４−エチルサリチルフェニルを含むＣ１〜Ｃ４アルキル）、２−，  ３−および４−アセチルフェニル、１，８−ジヒドロキシナフチル（−Ｃ１０Ｈ６−ＯＨ）およびアリールオキシエチル［Ｃ６〜Ｃ９アリール（フェノキシエチルを含む）］、２，２′−ジヒドロキシビフェニル、２−、３−および４−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノフェノール、−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、トリメトキシベンジル、トリエトキシベンジル、２−アルキルピリジニル（Ｃ１〜４アルキル）；２−カルボキシフェニルのＣ４〜Ｃ８エステル；アリール部分において３から５のハロゲン原子、またはハロゲン、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ（メトキシおよびエトキシを含む）、シアノ、ニトロ、−ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ１２ハロアルキル（１から６のハロゲン原子、−ＣＨ２ＣＣｌ３を含む）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（メチルおよびエチルを含む）、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニルまたはＣ２〜Ｃ１２アルキニルから選ばれた１から２の原子または基によって置換されたＣ１〜４アルキ���ン−Ｃ３〜Ｃ６アリール（ベンジル、−ＣＨ２−ピロリル、−ＣＨ２−チエニル、−ＣＨ２−イミダゾリル、−ＣＨ２−オキサゾリル、−ＣＨ２−イソオキサゾリル、−ＣＨ２−チアゾリル、−ＣＨ２−イソチアゾリル、−ＣＨ２−ピラゾリル、−ＣＨ２−ピリジニルおよび−ＣＨ２−ピリミジニルを含む）、；アルコキシエチル［−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３（メトキシエチル）を含むＣ１〜Ｃ６アルキル］；上記でアリールの場合に示した任意の基、特に−ＯＨ、によって置換されたアルキルまたは１から３のハロ原子によって置換されたアルキル（−ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２ＣＨ３、−（ＣＨ２）２ＣＨ３、−（ＣＨ２）３ＣＨ３、−（ＣＨ２）４ＣＨ３、−（ＣＨ２）５ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＣｌ３を含む）；２−Ｎ−モルホリノ−エチル；−Ｎ−２−プロピルモルホリノ、２，３−ジヒドロ−６−ヒドロキシインデン、セサモール、カテコールモノエステル、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）２、−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）（Ｒ１）、−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２（Ｒ１）、−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｒ１）−ＣＨ２（ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｒ１）、コレステリル、エノールピルベート（ＨＯ２Ｃ−Ｃ（＝ＣＨ２）−）およびグリセロールを含む。
【００８１】
保護基のさらに別の例は、エステル部分である。エステル部分は、例えば、本発明の化合物の酸素を介して−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＰＧ′に結合してよい。ここで、ＰＧ′は、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）２、−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）（Ｒ１）、−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２（Ｒ１）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５、３−コレステリル、３−ピリジル、Ｎ−エチルモルホリノ、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ６Ｈ５、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＣｌ３、−Ｃ６Ｈ５、−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２ＣＨ３、−ＮＨＲ１、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１０Ｈ１５、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（ＣＨ３）２および−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｒ１）−ＣＨ２−（ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｒ１）である。これらのエステルの多数は、遊離のヒドロキシル（または酸基）を有する本明細書の化合物をＤＭＦ（あるいはアセトニトリルまたはＮ−メチルピロリドンなどの他の溶媒）中で対応するハロゲン化物（クロリドまたはアシルクロリドおよび類似物）ならびにＮ，Ｎ−ジシクロヘキシル−Ｎ−モルホリンカルボキサミジン（またはＤＢＵ、トリエチルアミン、ＣｓＣＯ３、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンおよび類似物などの別の塩基）と反応させることによって合成してよい。カップリング試薬を用いて化合物と保護基とのカップリングを容易にしてよい。グリーンによって記載されている方法によって、または当業者に公知の他の方法によって、他のエステルを合成してよい。
【００８２】
保護基は、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＳＣＯＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣＯＮ（ＣＨ３）２、ジヒドロ−フラン−２−オン−５−イル、あるいはアルキル−またはアリール−アシルオキシアルキル基（酸基の酸素に結合している）など、官能基前駆体を形成する「二重エステル」も含む（米国特許第４，９６８，７８８号を参照すること）。別の例は、ピバロイルオキシメチル基である。有用な保護基のその他の例は、２−（アダマンチン−１−カルボキシレート）−エチル、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）ＯＣ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｃ１０Ｈ１５、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）ＯＣ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＨ（ＣＨ（ＣＨ３）２）ＯＣ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｃ６Ｈ１１、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｃ６Ｈ５、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｃ１０Ｈ１５、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）３および−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ６Ｈ５を含むアルキルアシルオキシメチルエステルおよびそれらの誘導体である。欧州特許第６３２０４８号には、本発明において使用するに適する他のエステルが記載されている。
【００８３】
１つ以上の酸性ヒドロキシルを保護してよい。２つ以上の酸性ヒドロキシルを保護する場合、同じ保護基または異なる保護基を使用してよく、例えば、エステルは異なっていてもよく、同じであってもよく、あるいはアミデートとエステルとを混用してもよい。
【００８４】
グリーンに記載されている一般的な窒素およびヒドロキシ保護基（１４〜１１８頁）は、置換メチルおよびアルキルエーテル、置換ベンジルエーテル、シリルエーテルと、スルホン酸エステル、カーボネート、サルフェートおよびスルホネートを含むエステルを含む。例えば、
・エーテルメチル、ｔ−ブチル、アリル）、
・置換メチルエーテル（メトキシメチル、メチルチオメチル、ｔ−ブチルチオメチル、（フェニルジメチルシリル）メトキシメチル、ベンジルオキシメチル、ｐ−メトキシベンジルオキシメチル、（４−メトキシフェノキシ）メチル、グアイヤコールメチル、ｔ−ブトキシメチル、４−ペンテニルオキシメチル、シロキシメチル、２−メトキシエトキシメチル、２，２，２−トリクロロエトキシメチル、ビス（２−クロロエトキシ）メチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、テトラヒドロピラニル、３−ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、１−メトキシシクロヘキシル、４−メトキシテトラヒドロピラニル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルＳ，Ｓ−ジオキシド、１−［（２−クロロ−４−メチル）フェニル］−４−メトキシピペリジン−４−イル、１，４−ジオキサ−２−イル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、２，３，３ａ，４，５，６，７，７ａ−オクタヒドロ−７，８，８−トリメチル−４，７−メタノベンゾフラン−２−イル）、
・置換エチルエーテル（１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、１−メチル−１−メトキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシ−２−フルオロエチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−トリメチルシリルエチル、２−（フェニルセレニル）エチル、
・ｐ−クロロフェニル、ｐ−メトキシフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル、
・置換ベンジルエーテル（ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−ハロベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ｐ−シアノベンジル、ｐ−フェニルベンジル、２−および４−ピコリル、３−メチル−２−ピコリルＮ−オキシド、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ′−ジニトロベンズヒドリル、５−ジベンゾスベリル、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル、ジ（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル、４−（４′−ブロモフェナシルオキシ）フェニルジフェニルメチル、４，４′，４″−トリス（４，５−ジクロロフタルイミドフェニル）メチル、４，４′，４″−トリス（レブリノイルオキシフェニ）メチル、４，４′，４″−トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル、３−（イミダゾール−１−イルメチル）ビス（４′，４″−ジメトキシフェニル）メチル、１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−１′−ピレニルメチル、９−アントリル、９−（９−フェニル）キサンテニル、９−（９−フェニル−１０−オキソ）アントリル、１，３−ベンゾジチオラン−２−イル、ベンゾイソチアゾリルＳ，Ｓ−ジオキシド）、
・シリルエーテル（シリルオキシ基）（トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、ジメチルイソプロピルシリル、ジエチルイソプロピルシリル、ジメチルヘキシルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリベンジルシリル、トリ−ｐ−キシリルシリル、トリフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル、ｔ−ブチルメトキシフェニルシリル）、
・エステル（ギ酸エステル、ベンゾイルギ酸エステル、酢酸エステル、クロロ酢酸エステル、ジクロロ酢酸エステル、トリクロロ酢酸エステル、トリフルオロ酢酸エステル、メトキシ酢酸エステル、トリフェニルメトキシ酢酸エステル、フェノキシ酢酸エステル、ｐ−クロロフェノキシ酢酸エステル、ｐ−ポリ−フェニル酢酸エステル、３−フェニルプロピオン酸エステル、４−オキソペンタン酸エステル（レブリン酸エステル）、４，４−（エチレンジチオ）ペンタン酸エステル、ピバル酸エステル、アダマンタン酸エステル、クロトン酸エステル、４−メトキシクロトン酸エステル、安息香酸エステル、ｐ−フェニル安息香酸エステル、２，４，６−トリメチル安息香酸エステル（メシト酸エステル）、
・炭酸エステル（メチル、９−フルオレニルメチル、エチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−（トリメチルシリル）エチル、２−（フェニルスルホニル）エチル、２−（トリフェニルホスホニオ）エチル、イソブチル、ビニル、アリル、ｐ−ニトロフェニル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、Ｓ−ベンジルチオ炭酸エステル、４−エトキシ−１−ナフチル、メチルジチオ炭酸エステル）、
・支援開裂する基（２−ヨード安息香酸エステル、４−アジド酪酸エステル、４−ニトロ−４−メチルペンタン酸エステル、ｏ−（ジブロモメチル）安息香酸エステル、２−ホルミルベンゼンスルホン酸エステル、２−（メチルチオメトキシ）エチル炭酸エステル、４−（メチルチオメトキシ）酪酸エステル、２−（メトキシチオメトキシメチル）安息香酸エステル）、その他の雑多なエステル（２，６−ジクロロ−４−メチルフェノキシ酢酸エステル、２，６−ジクロロ−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシ酢酸エステル、２，４−ビス（１，１−ジメチルプロピル）フェノキシ酢酸エステル、クロロジフェニル酢酸エステル、イソ酪酸エステル、モノコハク酸エステル、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテン酸エステル（チグロン酸エステル）、ｏ−（メトキシカルボニル）安息香酸エステル、ｐ−ポリ−安息香酸エステル、α−ナフトエ酸エステル、硝酸エステル、アルキルＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルホスホロジアミデート、ｎ−フェニルカルバメート、ホウ酸エステル、ジメチルホスフィノチオイル、２，４−ジニトロフェニルスルフェン酸エステル）、
・スルホン酸エステル（サルフェート、メタンスルホネート（メシレート）、ベンジルスルホネート、トシレート、トリフレート）。
【００８５】
本発明のＨＤＡＣ阻害剤の使用
本発明のＨＤＡＣ阻害剤は、さまざまな神経変性病または神経筋病に対して、予防法として用いてもよく、治療法として用いてもよい。より詳しくは、本発明のＨＤＡＣ阻害剤は、神経変性病または神経筋病の発症を遅れさせるかまたは予防するために用いてよく、同時に、神経変性病または神経筋病にかかっている哺乳類を治療するために用いてよい。神経変性病の非限定的な例は、脆弱エックス症候群、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、脊髄小脳失調、筋萎縮性側索硬化症、ケネディー病、脊髄および延髄筋肉萎縮症およびアルツハイマー病を含むがそれらに限定されない。神経筋病の非限定的な例は、脊髄筋肉萎縮症および筋緊張性異栄養症を含む。
【００８６】
ＨＤＡＣ阻害剤を投与してよい哺乳類、例えばヒトは、上記で考察した病気にかかっている哺乳類またはヒト、ならびに上記の病気にかかるおそれのある哺乳類またはヒトを含む。神経変性病にかかるおそれのある哺乳類は、例えば、最初に、（１）その個体のゲノム中の特定の核酸配列の繰り返しの長さ、程度または数、コアヒストンのアセチル化の度合い、あるいは特定のｍＲＮＡまたは蛋白質の発現レベルを測定し、次に、（２）それを正常な個体のものと比較することを含む多数の方法で特定してよい。神経変性病または神経筋病にかかるおそれのある個体は、特定の核酸配列の繰り返しの数、コアヒストンのアセチル化の度合い、または特定の遺伝子の発現が異常なものである。例えば、フリードライヒ運動失調症にかかるおそれのある哺乳類は、フラタキシン遺伝子の最初のイントロン中のＧＡＡ３塩基の繰り返しの長さ、程度または数を測定することによって特定してよい。上記の分析によって３４を超えるＧＡＡ３塩基の繰り返しがあることが分れば、例えば哺乳類に６６を超えるＧＡＡ３塩基の繰り返しがあれば、その哺乳類は、フリードライヒ運動失調症にかかるおそれがある。フリードライヒ運動失調症にかかるおそれのある哺乳類は、その哺乳類中のフラタキシンｍＲＮＡまたは発現された蛋白質のレベルを測定することによって特定してもよい。哺乳類は、フラタキシンｍＲＮＡまたは蛋白質のレベルが、例えば非感染同胞などの健康な個体中で通常観測されるレベルより低ければ、フリードライヒ運動失調症にかかるおそれがあると考えられる。
【００８７】
哺乳類に投与されるＨＤＡＣ阻害剤の量は、感染哺乳類中のヒストンアセチル化のレベル、あるいはｍＲＮＡまたは蛋白質発現のレベルを、非感染同胞などの健康な個体の通常のレベルに復帰させるのに適切な任意の量であってよい。投与されるＨＤＡＣ阻害剤の量は、有効投与量またはその適切な割り合いであってよい。そのような量は、年齢、体調、体の大きさ、体重、治療される病気、病気の重さ、および任意の並行治療を含む個々の患者のパラメータに依存する。例えば、神経変性病の発症を防ぐかまたは遅れさせるために必要な有効投与量の範囲は、治療対象の病気の進行を阻害するための有効投与量範囲より著しく低くてよい。適切な用量を決定する因子は、当業者に公知であり、常識的な実験によって対処してよい。例えば、物理化学的性質、毒物学的性質および薬物動態学的性質の測定は、標準的な化学的および生物学的アッセイを用いて、および化学技術、薬理学技術および毒物学技術において既知の数学的モデル技法の使用によって行ってよい。治療有用性および投薬計画は、そのような技法の結果から、および適切な薬物動態学的モデルおよび／または薬力学的モデルを用いて外挿によって求めてよい。患者に投与するＨＤＡＣ阻害剤の正確な量は、主治医の責任である。しかし、医学的理由、心理学的理由、または事実上任意の他の理由によって、患者が投与量または許容投与量を低くするよう主張することもある。
【００８８】
本発明のＨＤＡＣ阻害剤は、多数の方法によって投与してよい。例えば、本発明のＨＤＡＣ阻害剤は、経口投与、直腸投与、経皮投与によって、あるいは筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射または静脈内注射によって投与してよい。好ましくは、本阻害剤は、経口投与または注射によって投与する。他の経路は、直接髄液への髄腔内投与および標的細胞、標的細胞近傍、または標的細胞内の直接導入を含む。治療される病気およびその重さによって、投与の経路を決めてよい。
【００８９】
本発明のＨＤＡＣ阻害剤は、経口または注射によって、哺乳類のｋｇ体重あたり０．１から３０ｍｇ、好ましくは２から１５ｍｇ／ｋｇ哺乳類の体重の投与量で投与してよい。成人のヒトの投与量範囲は、一般に、８から２，４００ｍｇ／日、好ましくは３５から１，０５０ｍｇ／日である。本発明の特定のＨＤＡＣ阻害剤は長期作用性なので、最初の日に７０から２，４００ｍｇの初回投与量を投与し、次に、その後の日々は２０から１，２００ｍｇと投与量を少なくすると有利なことがある。本化合物の塩を投与する場合、投与する塩の量は、塩基を基準として計算する。
【００９０】
医薬品組成物
ＨＤＡＣ阻害剤は、そのまま、あるいは、好ましくは医薬品組成物として投与してよい。本発明の医薬品組成物は、適切なキャリアならびに他の有用な成分と組み合わされた適切な量のＨＤＡＣ阻害剤を含む。
【００９１】
本発明のＨＤＡＣ阻害剤は、式Ｉの化合物を含み、当てはまる場合には、式Ｉの化合物の許容される塩を含む。許容される塩は、以下の酸、すなわち、任意選択として１から４のヒドロキシルで置換された１から２０の炭素原子のアルキル、アルケニル、アリール、アルキルアリールおよびアルケニルアリールのモノ−、ジ−およびトリカルボン酸；任意選択として１から４のヒドロキシルで置換された１から２０の炭素原子のアルキル、アルケニル、アリール、アルキルアリールおよびアルケニルアリールのモノ−、ジ−およびトリスルホン酸、および鉱酸から調製された塩を含むがそれらに限定されない。例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリシクリン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸およびベンゼンスルホン酸を含む。薬学的に許容される塩は、アミン塩、アンモニウム塩またはカルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩などのアルカリ金属またはアルカリ土類塩として調製してもよい。これらは、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩基から、またはアミン化合物から形成される。さらに、官能基の均等物として働く前述の化合物の類似体も均等物として、本発明の範囲内に含まれるものとする。
【００９２】
経口投与に適するＨＤＡＣ阻害剤の医薬品組成物は、（１）予め定められた量のＨＤＡＣ阻害剤をそれぞれ含むカプセル剤、カシェ剤、錠剤またはトローチ剤などの離散的な単位、（２）粉体または顆粒、（３）ボーラス、舐剤またはペースト、（４）水性液体または非水性液体中の溶液または懸濁液、あるいは（４）水中油液体エマルジョンまたは油中水液体エマルジョンの形であってよい。従って、口中の局所投与、例えば経頬投与または舌下投与に適する組成物は、トローチ剤を含む。非経口投与にする組成物は、水性および非水性無菌懸濁液または注射溶液を含む。直腸投与に適する組成物は、坐薬として投与してよい。
【００９３】
従って、固体または液体キャリアを用いてＨＤＡＣ阻害剤の医薬品組成物を調合してよい。固体または液体キャリアは、調合物の他の成分と適合し、服用者に有害でないものとする。医薬品組成物が錠剤形なら、ＨＤＡＣ阻害剤は、必要な圧縮特性を有するキャリアと適当な比率で混合され、所望の形状およびサイズに圧縮される。組成物が粉体形なら、キャリアは、微粉化された有効成分と混合された微粉化固体である。粉体および錠剤は、最大９９％の有効成分を含んでよい。適当な固体キャリアは、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂を含む。固体キャリアは、着香料、潤滑剤、可溶化剤、懸濁剤、充填材、滑走剤、圧縮補助剤、バインダまたは錠剤崩壊剤として機能することがある１つ以上の物質を含んでよい。適当なキャリアは、カプセル化材料であってもよい。
【００９４】
組成物が溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシルまたは加圧組成物なら、液体キャリアを用いてよい。この場合、ＨＤＡＣ阻害剤を、薬学的に許容される液体キャリア中に溶解または懸濁する。経口投与および非経口投与のための液体キャリアの適当な例は、（１）水、（２）アルコール、例えば一価アルコールおよびグリコールなどの多価アルコール、それらの誘導体、ならびに（３）油、例えば被分画椰子油および落花生油を含む。非経口投与の場合、キャリアは、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの油性エステルであってもよい。加圧組成物のための液体キャリアは、ハロゲン化炭化水素またはその他の薬学的に許容される推進体を含む。液体キャリアは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、甘味料、着香料、懸濁剤、増粘剤、着色剤、粘度調整剤、安定剤、浸透圧調節剤、カルボキシルメチルセルロースナトリウムなどのセルロース誘導体、抗酸化剤および静菌薬など、その他の適当な医薬品添加物を含んでよい。他のキャリアは、スクロース、アカシア、トラガカンタ、ゼラチンおよびグリセリンなど、トローチ剤を調合するために用いられるもの、ならびにカカオバターまたはポリエチレングリコールなど、坐薬を調合する際に用いられるものを含む。
【００９５】
本組成物が灌流または注射によって静脈内投与または腹膜内投与される場合、ＨＤＡＣ阻害剤の溶液は任意選択として、非毒性界面活性剤と混合して、水溶液として調製してよい。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチンおよびそれらの混合物および油の中で調製してもよい。通常の貯蔵および使用条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防ぐ防腐剤を含む。注射または灌流に適する組成物は、無菌注射用溶液または灌流可能溶液あるいは分散液を即座に調製するようになっている、任意選択としてリポソーム中にカプセル化された、有効成分を含む無菌水溶液または分散液、あるいは無菌粉体を含んでよい。いずれにしても、最終的な投薬形は、製造および貯蔵条件下で無菌、流動性および安定な必要がある。液体キャリアまたはビヒクルは、上記に記載した溶媒または液体分散媒であってよい。例えば、リポソームを形成させて、分散液の場合には必要な粒子サイズを保持して、または界面活性剤を用いて適切な流動性を保持してよい。微生物の作用の予防は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールおよび類似物によって実現してよい。多くの場合、等張剤、例えば砂糖、緩衝剤または塩化ナトリウムを含むと好ましい。吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に用いることによって、注射用組成物の吸収を長引かせてよい。必要に応じて、必要量のＨＤＡＣ阻害剤を適切な溶媒中に組み込み、次にろ過滅菌することによって、上記で列挙した他の成分のさまざまなものとともに無菌注射用溶液を調製する。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉体の場合、好ましい調製法は、真空乾燥技法および凍結乾燥技法である。これらの技法によって、ＨＤＡＣ阻害剤プラス既に無菌ろ過した溶液中に存在する任意の別の所望の成分の粉体を作り出す。
【００９６】
本発明の医薬品組成物は、単位投与形または多回投与形であってよく、あるいはＨＤＡＣ阻害剤の遅い放出または制御された放出を可能にする形であってよい。各単位投与形は、錠剤、カプセル剤、または、例えばパッケージ化粉体、バイアル、アンプル、事前充填注射器または液体を含むサシェなどのパッケージ化組成物の形であってよい。単位投与形は、適切な数のパッケージ形の任意のそのような組成物であってよい。多回投与形の医薬品組成物は、密封アンプルおよびバイアルなどの容器中にパッケージ化してよい。この場合、ＨＤＡＣ阻害剤は、使用の直前に無菌液体キャリアを加えるだけでよい凍結乾燥（疎液化）状態で保存してよい。さらに、迅速注射溶液および懸濁液は、既に記載した種類の無菌粉体、顆粒および錠剤から調製してよい。
【００９７】
以下の実施例中に本発明をさらに説明するが、これらの実施例は、請求項に記載されている本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００９８】
（実施例１  材料および方法）
細胞培養
ＦＲＤＡ患者由来のエプスタインバー（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ）ウイルス変換リンパ芽球細胞系統ＧＭ１５８５０（フラタキシン遺伝子中に６５０および１０３０のＧＡＡ繰り返しを有する対立遺伝子、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，  Ｃａｍｄｅｎ，  ＮＪから）、および非感染同胞由来のＧＭ１５８５１（正常な繰り返しの範囲）をＲＰＭＩ１６４０培地中で２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１５％のウシ胎仔血清とともに３７℃、５％ＣＯ２中で増殖させた。位相差顕微鏡法によって細胞の成長および形態、トリパンブルー排除法によって生存率を追跡した。ＨＤＡＣ阻害剤をＤＭＳＯに溶かし、表および図の註に示した濃度で、表示の回数、培地に加えた。培養培地中の最終ＤＭＳＯ濃度は、０．５％（体積／体積）を超えなかった。すべての対照試料は、化合物を含まない同濃度のＤＭＳＯで処理した。ＨＤＡＣ阻害剤の販売業者は、バルプロン酸（ＶＰＡ）がカルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）；トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、スベロイルビス−ヒドロキサム酸（ＳＢＨＡ）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）およびＢＭＬ−２１０がバイオ−モル（Ｂｉｏ−Ｍｏｌ）（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，  ＰＡ）であり、それぞれ、図に示した、販売業者報告のＩＣ５０値で試験した。
【００９９】
リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ
リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析は、フラタキシン遺伝子用の次のプライマー、すなわち５′−ＣＡＧＡＧＧＡＡＡＣＧＣＴＧＧＡＣＴＣＴ−３′および５′−ＡＧＣＣＡＧＡＴＴＴＧＣＴＴＧＴＴＴＧＧ−３′を用い、基本的にＣｈｕｍａら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３７：１９８−２０７（２００３）  に記載されているとおりに実行した。Ｐａｔｔｙｎら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１：１２２−３  （２００３）  に記載されているように、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの定量化によってＲＮＡを標準化し、すべての値をＧＡＰＤＨに対する相対値として表した。ｉＳｃｒｉｐｔ一段ＲＴ−ＰＣＲキットをＳＹＢＲグリーン（ＢｉｏＲａｄ）とともに用いて定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実行した。各ＲＮＡ試料について、３回の独立な定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験を統計解析した。図に示した誤差バーは、平均値の標準誤差を表している。
【０１００】
ウエスタンブロット分析
ＨＤＡＣ阻害剤で処理した細胞と処理していない細胞との蛋白質レベルを、ヒストンＨ３およびＨ４（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）への抗体、またはこれらの蛋白質のアセチル化体への抗体を用いるウェスタンブロッティングによって追跡した。Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから提供されたプロトコルに記載されていたように、酸抽出によってヒストンを精製した。ヒトフラタキシンへの抗体は、Ｍｉｔｏｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ）から、抗アクチン抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （ＣＡ）  から入手した。フラタキシンおよびアクチンのウェスタンブロットには全細胞抽出物を用いた。ＨＲＰ−共役二次抗体（Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ，  Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてブロットを探測した後、化学ルミネセンスによって信号を検出した。蛋白質の相対レベルを定量化するために、オートラジオグラム（Ｘ線フィルムの線形応答範囲内）をディジタル画像に変換し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて信号を定量した。
【０１０１】
クロマチン免疫沈降
既に記載したようにクロマチン免疫沈降を行った（Ｌｕｏら、Ｃｅｌｌ  ９２：４６３−７３  （１９９８）を参照。各免疫沈降実験の場合、２５〜５０μｇの全ＤＮＡに対応する量の溶解物を以下の抗体（それぞれＵｐｓａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手、表示したカタログナンバーを有する）、すなわち、抗−アセチル−ヒストンＨ３（０６−５９９）、抗−アセチル−ヒストンＨ４（０６−５９８）、抗−アセチル−ヒストンＨ３−Ｌｙｓ９（０７−３５２）、抗−アセチル−ヒストンＨ３−Ｌｙｓ１４（０７−３５３）、抗−アセチル−ヒストンＨ４−Ｌｙｓ５（０７−３２７）、抗−アセチル−ヒストンＨ４−Ｌｙｓ８（０７−３２８）、抗−アセチル−ヒストンＨ４−Ｌｙｓ１２（０７−５９５）、抗−アセチル−ヒストンＨ４−Ｌｙｓ１６（０７−３２９）の１つとインキュベートした。標準曲線法を用い、リアルタイムＰＣＲによって３試料測定法で試料を定量した。図に示した誤差バーは、平均値の標準誤差を表している。この測定に用いたプライマーは、フラタキシンプロモーター用が５′−ＣＣＣＣＡＣＡＴＡＣＣＣＡＡＣＴＧＣＴＧ−３′および５′−ＧＣＣＣＧＣＣＧＣＴＴＣＴＡＡＡＡＴＴＣ−３′、フラタキシン遺伝子のイントロン１中のＧＡＡ繰り返しの上流領域用が５′−ＧＡＡＡＣＣＣＡＡＡＧＡＡＴＧＧＣＴＧＴＧ−３′および５′−ＴＴＣＣＣＴＣＣＴＣＧＴＧＡＡＡＣＡＣＣ−３′、フラタキシン遺伝子のイントロン１中のＧＡＡ繰り返しの下流領域用が５′−ＣＴＧＧＡＡＡＡＡＴＡＧＧＣＡＡＧＴＧＴＧＧ−３′および５′−ＣＡＧＧＧＧＴＧＧＡＡＧＣＣＣＡＡＴＡＣ−３′、ＧＡＰＤＨ用が５′−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣＧ−３′および５′−ＡＴＡＣＣＣＡＡＧＧＧＡＧＣＣＡＣＡＣＣ−３′であった。
【０１０２】
ヒストンデアセチラーゼアッセイ
バイオモルのＡＫ５００キットを用いてヒストンデアセチラーゼ阻害剤のそれぞれをアッセイし、ＩＣ５０値を測定した。バイオモル社の記載のとおりに試料を処理し、９６ウェル蛍光プレートリーダーを用いて読み取った。カレイダグラフ（Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ）ソフトウェアを用いてデータの半対数プロットを解析し、ＩＣ５０値を求めた。
【０１０３】
ヒト被検者および一次リンパ球
フリードライヒ運動失調症研究協議会（Ｔｈｅ  Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ’ｓ  Ａｔａｘｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  （Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，  ＶＡ））が、感染した個人および兄弟または両親の家族の集団を募集して匿名の献血を受けた（適切なインフォームドコンセントの下、Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ＣｏｍｍｉｔｔｅｅおよびＮＩＮＤＳが承認したヒト被検者プロトコルに従って実施した）。ヘパリン化Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ管（＃３６４６８０，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に血液を採取し、製造業者の指示に従い、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて密度遠心分離によってリンパ球を単離した。株化細胞系統と同じ培養培地および状態にリンパ球を保持し、上記に記載したとおりにＨＤＡＣ阻害剤で処理した。１６時間後、細胞をＨＤＡＣ阻害剤で処理し、さらに４８時間インキュベーションした後、ＲＮＡを単離した。これらの培養条件下では、細胞数の増加は観測されなかった。
【０１０４】
（実施例２  新規な二段階手順によるビス−アミドＨＤＡＣ阻害剤の合成）
一般的な合成手順
ＨＤＡＣ阻害剤の合成のための出発原料として、アジピン酸１ａ（図式１、ｎ＝３）、ピメリン酸１ｂ（ｎ＝４）またはスベリン酸１ｃ（ｎ＝５）を用いた。合成の図式は、下に示したとおりである。
【０１０５】
【化２７】
2009515887.tif 000014
還流下、無水酢酸と反応させると、これらのジカルボン酸は、分子内閉環して化合物２ａ、２ｂおよび２ｃとなる。報告されている結果（Ｗｏｎｇら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２５：５５８６−７  （２００３））と異なり、これらの無水物を精製せず、さらに開環条件下でアニリンと反応させ、約９０％の収率で前駆体化合物３ａ、３ｂおよび３ｃとする。１−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）と１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）とを用いる強力なカップリング条件によって、変換率が高くなる結果、高速の反応と高い収率とが得られる。３３％（Ｗｏｎｇら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２５：５５８６−７  （２００３））と比較すると、４ｂの収率は、これらの条件を用いることによって６４％に増加した。４ｃ（ＢＭＬ−２１０に相当する）の収率は、５０〜６０％（総括）であった。表４に挙げた各化合物について同程度の収率を得た。
【０１０６】
薄層クロマトグラフィー、分析ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、１３Ｃ−および１Ｈ−ＮＭＲによってすべての化合物の純度および特定を検証した。ＮＭＲスペクトルは、バリアン（Ｖａｒｉａｎ）のマーキュリー（Ｍｅｒｃｕｒｙ）３００、またはブルーカー（Ｂｒｕｋｅｒ）のＤＲＸ−５００で記録した。１３Ｃスペクトルは、プロトンデカップリングを用いて測定した。テトラメチルシランを基準としてすべてのスペクトルを較正した。化合物によっては、ＨＰＬＣシステム（日立Ｌ−６２００Ａポンプ、Ｌ４２００可視紫外検出器、Ｄ−２５００クロマトインテグレーター、およびスペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）から購入したスペルコシル（Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ）ＰＬＣ−１８カラム（２５ｃｍ×２１．２ｍｍ、１２μｍ））を用いてさらに精製した。このＲＰ−ＨＰＬＣシステムでは、０〜６０分は１０％アセトニトリル／水／０．１％ＴＦＡ−１００％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ、次に６０〜７５分は１００％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ−１０％アセトニトリル／水／０．１％ＴＦＡを５ｍＬ／分の流速で流した。ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦスペクトルはすべてアプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のボイジャー（Ｖｏｙａｇｅｒ）システム１０８９で測定し、α−シアノヒドロキシケイ皮（ＣＨＣＡ）酸をマトリックスとして用いた。フラッシュカラムクロマトグラフィーには、ジェイティーベイカー（Ｊ．Ｔ．  Ｂａｋｅｒ）から購入したシリカゲル（６０〜２００メッシュ）を用いた。ＴＬＣプレートは、ジェイティーベイカー（Ｊ．Ｔ．  Ｂａｋｅｒ）から購入した（Ｓｉ２５０Ｆ）。
【０１０７】
略語  ＣＨＣＡ（シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）、ＤＣＭ（ジクロロメタン）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ）、ＭｅＯＨ（メタノール）、室温（ｒ．ｔ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）およびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）。
【０１０８】
各化合物の詳細な合成方法および分析データは以下のとおりである。前駆体化合物ＰＡＯＡ、ＳＡＯＡおよびさまざまな誘導体の構造式を以下の表１、２および３に示す。各化合物は、単独または本明細書に記載されている他の成分および手順と組み合わされて、本発明の実施態様となる。
【０１０９】
【表１】
2009515887.tif 000015
【０１１０】
【表２−１】
2009515887.tif 000016
【０１１１】
【表２−２】
2009515887.tif 000017
前駆体化合物の合成
化合物Ｐ１  ｔｅｒｔ−ブチル−２−アミノフェニルカルバメート
５０ｍＬのＤＭＦ中の１，２−フェニレンジアミン（９５０ｍｇ、１０．０ｍｍｏｌ）の溶液を５５℃で撹拌しながら、ＤＭＦ（２５ｍｌ）中のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（２．００ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。添加後、反応混合物を３時間撹拌した。真空下で溶媒を除去し、残留物を酢酸エチル（１５０ｍＬ）に取り込んだ。有機相を飽和ＮａＣｌ溶液（４０ｍＬ）で３回洗い、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を蒸発させた。残留物をクロロホルム／ｎ−ヘキサンから再結晶した。
【０１１２】
この反応によって、１．０３ｇ（４．９７ｍｍｏｌ、４９％）のＰ１を淡黄色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．４９（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ＝  １．５１  （ｓ，  ９Ｈ），  ６．３５  （ｍ，  １Ｈ），  ６．７２−６．７８  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．９８  （ｍ，  １Ｈ），  ７．２５  （ｍ，  １Ｈ）。
【０１１３】
化合物３ａ  ６−オキソ−６−（フェニルアミノ）ヘキサン酸
無水酢酸（１０ｍＬ）中のアジピン酸（５．００ｇ、３４．０ｍｍｏｌ）の溶液を１時間還流加熱した。室温に冷却した後、真空下で溶媒を除去した。粗生成物の黄色の油をそれ以上精製せず、次の段階に用いた。無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の無水物生成物の溶液を撹拌しながら、アニリン（３．００ｍＬ、２８．７ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間撹拌した後、溶媒を除去し、残留物を水／アセトニトリルから再結晶した。
【０１１４】
この反応によって２．２８ｇ（１０．３ｍｍｏｌ、３６％）の３ａを無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．４８（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝２２２．２（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値２２２．２）、２４４．２（２０、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値２４４．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−Ｄ６）：  δ  ＝  １．５０−１．６４  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．２１−２．３４  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．００−７．０７  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．０２  （ｍ，  ３Ｊ＝７．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．２８  （ｍ，  ３Ｊ＝７．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５９−７．６２  （ｍ，  ２Ｈ），  ９．９０  （ｓ，  １Ｈ）。
【０１１５】
化合物３ｂ  ７−オキソ−７−（フェニルアミノ）ヘプタン酸
無水酢酸（１０ｍＬ）中のピメリン酸（５．００ｇ、３１．２ｍｍｏｌ）の溶液を１時間還流加熱した。室温に冷却した後、真空下で溶媒を除去した。粗生成物の黄色の油をそれ以上精製せず、次の段階に用いた。
【０１１６】
無水物生成物の溶液を撹拌しながら、無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のアニリン（３．００ｍＬ、２８．７ｍｍｏｌ）を加えた。３０分間室温で撹拌した後、無色の固体が沈殿するまで反応混合物を水で希釈した。固体をろ過して集めた。水／アセトニトリルから再結晶して純粋な化合物を無色の固体として得た。
【０１１７】
この反応によって３．５２ｇ（１５．０ｍｍｏｌ、４８％）の３ａを無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．６８（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ９：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝２３６．３（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値２３６．１）、２５８．４（２０、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値２５８．１）、１Ｈ−ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−Ｄ６）：  δ  ＝  １．２８−１．３４  （ｍ，  ２Ｈ），  １．４９−１．６２  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５５−１．５８  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．２０  （ｔ，  ３Ｊ＝９．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．３０  （ｔ，  ３Ｊ＝９．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．００  （ｍ，  ３Ｊ＝７．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．２６−７．２９  （ｍ，  ３Ｊ＝７．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５７−７．５９  （ｍ，  ２Ｈ），  ９．８３  （ｓ，  １Ｈ）。
【０１１８】
化合物３ｂ２  ７−オキソ−７−（ピリジン−２−イルアミノ）ヘプタン酸
無水酢酸（１５ｍＬ）中のピメリン酸（３．００ｇ、１８．７ｍｍｏｌ）の溶液を１時間還流加熱した。室温に冷却した後、真空下で溶媒を除去した。粗生成物の黄色の油をそれ以上精製せず、次の段階に用いた。
【０１１９】
無水ＴＨＦ（５ｍＬ）中の無水物生成物の溶液を撹拌しながら、２−アミノピリジン（１．７５ｇ、１８．７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した後、真空下で溶媒を除去し、残留物を酢酸エチル（２００ｍＬ）でほぐした。有機相を水、飽和ＮａＣｌ溶液で洗い、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を除去した後、残留物を水／トリフルオロ酢酸（１：１００）から再結晶して無色の固体を得た。
【０１２０】
この反応によって１．１２ｇ（４．７６ｍｍｏｌ、２５％）の３ｂ２を無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．１２（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝２３７．０（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値２３７．１）、１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ｍｅｔｈａｎｏｌ−Ｄ４）：  δ  ＝  １．４１−１．５０  （ｍ，  ２Ｈ），  １．６０−１．８１  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．３１  （ｔ，  ３Ｊ＝７．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．５６  （ｔ，  ３Ｊ＝７．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４５  （ｍ，  １Ｈ），  ７．６４  （ｍ，  １Ｈ），  ８．２１−８．２８  （ｍ，  １Ｈ），  ８．３２−８．３５  （ｍ，  １Ｈ）。
【０１２１】
化合物３ｂ３  ７−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）フェニルアミノ）−７−オキソヘプタン酸
５ｍＬの無水酢酸中のピメリン酸（１６０ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を１時間還流させた。溶媒を除去して乾固させた。残留物を１０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中で希釈し、５ｍＬの乾燥ＴＨＦ中のＰ１（２００ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を一夜撹拌した後、水で希釈した。結果として得られた無色の固体をろ過して集め、エタノールから再結晶した。
【０１２２】
この反応によって２７５ｍｇ（０．７８ミリモル、８２％）の３ｂ３を無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．２３（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、１Ｈ−ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ＝  １．５０  （ｓ，  ９Ｈ），  １．３７−１．４２  （ｍ，  ２Ｈ），  １．６７−１．７２  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．３１−２．３４  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．００−７．０７  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．１３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．３６  （ｍ，  １Ｈ），  ８．２５  （ｂｒ．  ｓ，  １Ｈ）。
【０１２３】
化合物３ｃ  ８−オキソ−８−（フェニルアミノ）オクタン酸
無水酢酸（１０ｍＬ）中のスベリン酸（５．００ｇ、２８．７ｍｍｏｌ）の溶液を１時間還流加熱した。室温に冷却した後、真空下で溶媒を除去した。粗生成物の黄色の油をそれ以上精製せず、次の段階に用いた。
【０１２４】
無水物生成物の溶液を撹拌しながら、無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のアニリン（３．００ｍＬ、２８．７ｍｍｏｌ）を加えた。３０分間室温で撹拌した後、無色の固体が沈殿するまで反応混合物を水で希釈した。固体をろ過して集めた。水／アセトニトリルから再結晶して純粋な化合物を無色の固体として得た。
【０１２５】
この反応によって２．７４ｇ（１１．０ｍｍｏｌ、３９％）の３ｃを無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．５２（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ９：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝２５０．２（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値２５０．１）、２７２．３（２６、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値２７２．１）、１Ｈ−ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−Ｄ６）：  δ  ＝  １．２７−１．３２  （ｍ，  ４Ｈ），  １．４６−１．５０  （ｍ，  ２Ｈ），  １．５５−１．５８  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．１８  （ｔ，  ３Ｊ＝７．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．２８  （ｔ，  ３Ｊ＝７．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．９９  （ｍ，  ３Ｊ＝７．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．２５−７．２８  （ｍ，  ３Ｊ＝７．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５６−７．５８  （ｍ，  ３Ｊ＝７．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ９．８２  （ｍ，  １Ｈ），  １１．９  （ｓ，  １Ｈ）。
【０１２６】
阻害剤の合成
化合物４ａ  Ｎ１−（２−アミノフェニル）−Ｎ７−フェニルヘキサンジアミド
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の３ａ（８８ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６８μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌しながら、ＤＭＦ（５ｍｌ）中のＰ１（８６ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を一夜撹拌した後、無色の固体が沈殿するまで水を加えた。ろ過して固体を集め、水／アセトニトリルから再結晶した。固体を乾燥させ、ＤＣＭ／ＴＦＡ（１０ｍｌ、１：１）を加え、この溶液を室温で２時間撹拌した。真空下で溶媒を除去し、残留物を凍結乾燥させた。この反応によって７２ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ、４３％）の４ａを無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．６９（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３１２．３（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３１２．２）、３３４．４（２、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３３４．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−Ｄ６）：  δ  ＝  １．６０−１．６７  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．３２−２．４０  （ｍ，  ４Ｈ），  ６．９０−７．１２  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．２３−７．３０  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．５８−７．６０  （ｍ，  ２Ｈ），  ９．５９  （ｓ，  １Ｈ），  ９．９１  （ｓ，  １Ｈ）。
【０１２７】
化合物４ｂ  Ｎ１−（２−アミノフェニル）−Ｎ７−フェニルヘプタンジアミド
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の１，２−フェニレンジアミン（４３２ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌しながら冷却し、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物３ｂ（９４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６８μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を一夜撹拌した後、無色の固体が沈殿するまで水を加えた。ろ過して固体を集め、水／エタノールから再結晶した。調製規模のＲＰ−ＨＰＬＣによって生成物をさらに精製する。
【０１２８】
この反応によって６０ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ、４３％）の４ｂを無色の固体として得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝３２分、ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．４６（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３２６．２（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３２６．２）、３４８．２（４０、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３４８．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−Ｄ６）：  δ  ＝  １．３４−１．３８  （ｍ，  ２Ｈ），  １．５８−１．６９  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．２９−２．３９  （ｍ，  ４Ｈ），  ６．９５−７．１５  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．２３−７．３０  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．５４−７．６０  （ｍ，  ２Ｈ），  ９．６８  （ｓ，  １Ｈ），  ９．８９  （ｓ，  １Ｈ）．
化合物４ｃ  Ｎ１−（２−アミノフェニル）−Ｎ８−フェニルオクタンジアミド
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の１，２−フェニレンジアミン（４３２ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌しながら冷却し、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物３ｃ（１００ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６８μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を一夜撹拌した後、無色の固体が沈殿するまで水を加えた。ろ過して固体を集め、水／エタノールから再結晶した。
【０１２９】
この反応によって６０ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ、４３％）の４ｃを無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．６３（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ９：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３４０．２（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３４０．２）、３６２．２（１５、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３６２．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−Ｄ６）：  δ  ＝  １．３１−１．３２  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５６−１．６２  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．２６−２．３１  （ｍ，  ４Ｈ），  ６．９５−７．１５  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．２２−７．２９  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．５３−７．６１  （ｍ，  ２Ｈ），  ９．６８  （ｓ，  １Ｈ），  ９．８９  （ｓ，  １Ｈ）。
【０１３０】
化合物５ｂ  Ｎ１−フェニル−Ｎ７−フェニルヘプタンジアミド
ＤＭＦ（３ｍＬ）中のアニリン（３７ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌しながら冷却し、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物３ｂ（９４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６８μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を一夜撹拌した後、無色の固体が沈殿するまで反応混合物に水を加えた。ろ過して組成生物を集め、水／エタノールから再結晶した。
【０１３１】
この反応によって５２ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ、４２％）の５ｂを無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．４６（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３１１．１（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３１１．２）、３３３．１（９０、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３３３．３）、１Ｈ−ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−Ｄ６）：  δ  ＝  １．３２−１．３５  （ｍ，  ２Ｈ），  １．５９−１．６４  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．３１  （ｔ，  ３Ｊ＝７．３  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ７．００  （ｍ，  ３Ｊ＝７．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．２７  （ｍ，  ３Ｊ＝７．３  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ７．５７−７．５９  （ｍ，  ４Ｈ），  ９．８６  （ｓ，  ２Ｈ）。
【０１３２】
化合物６ｂ  Ｎ１−（３−アミノフェニル）−Ｎ７−フェニルヘプタンジアミド
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の１，３−フェニレンジアミン（４３２ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌しながら冷却し、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物３ｂ（９４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６８μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を一夜撹拌した後、真空下で溶媒を除去した。残留物を酢酸エチル／水でほぐした。二相を分液し、水相を酢酸エチル（５０ｍＬ）で２回抽出した。有機相を合わせ、飽和ＮａＣｌ溶液で１回洗い、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を蒸発させた後、残留物をフラッシュクロマトグラフィーによってさらに精製した。
【０１３３】
この反応によって２４ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ、１５％）の６ｂを無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．６１（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ９：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３２６．３（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３２６．２）、３４８．４（５、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３４８．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−Ｄ６）：  δ  ＝  １．２４−１．３２  （ｍ，  ２Ｈ），  １．５０−１．６０  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．２４  （ｔ，  ３Ｊ＝７．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．２５  （ｔ，  ３Ｊ＝７．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．６８  （ｍ，  １Ｈ），  ６．９４  （ｍ，  １Ｈ），  ７．１１−７．２３  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．５０−７．５３  （ｍ，  ３Ｈ），  ９．８１  （ｓ，  １Ｈ），  ９．９２  （ｓ，  １Ｈ）。
【０１３４】
化合物６ｃ  Ｎ１−（３−アミノフェニル）−Ｎ８−フェニルオクタンジアミド
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の１，３−フェニレンジアミン（４３２ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌しながら冷却し、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物３ｃ（１００ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６８μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を一夜撹拌した後、無色の固体が沈殿するまで水を加えた。ろ過して固体を集め、水／エタノールから再結晶した。生成物をＲＰ−ＨＰＬＣによってさらに精製した。
【０１３５】
この反応によって５２ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ、３８％）の６ｃを無色の固体として得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝３６分、ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．６６（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ９：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３４０．３（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３４０．２）、３６２．３（３０、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３６２．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−Ｄ６）：  δ  ＝  １．３２−１．３３  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５１−１．６５  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．２６−２．３１  （ｍ，  ４Ｈ），  ６．６０  （ｍ，  １Ｈ），  ６．９８−７．０６  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．１１−７．１７  （ｍ，  １Ｈ），  ７．２３−７．３０  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４１  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５６−７．５９  （ｍ，  ２Ｈ），  ９．８６  （ｓ，  １Ｈ），  ９．８７  （ｓ，  １Ｈ）。
【０１３６】
化合物７ｂ  Ｎ１−（４−アミノフェニル）−Ｎ７−フェニルヘプタンジアミド
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の１，４−フェニレンジアミン（４３２ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌しながら冷却し、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物３ｂ（９４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６８μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を一夜撹拌した後、真空下で溶媒を除去した。残留物を酢酸エチル／水でほぐした。二相を分液し、水相を酢酸エチル（５０ｍＬ）で２回抽出した。有機相を合わせ、飽和ＮａＣｌ溶液で１回洗い、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を蒸発させた後、残留物を水／アセトニトリルから再結晶した。この化合物をさらにＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【０１３７】
この反応によって２５ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ、１５％）の７ｂを無色の固体として得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝３０分、ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．３８（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ９：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３２６．４（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３２６．２）、３４８．３（５０、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３４８．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−Ｄ６）：  δ  ＝  １．２７−１．３７  （ｍ，  ２Ｈ），  １．５６−１．６６  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．２４  （ｍ，  ４Ｈ），  ６．９８−７．０３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．１２−７．１７  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．２４−７．２９  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５６−７．６３  （ｍ，  ４Ｈ），  ９．８７  （ｓ，  １Ｈ），  ９．９８  （ｓ，  １Ｈ）。
【０１３８】
化合物７ｃ  Ｎ１−（４−アミノフェニル）−Ｎ８−フェニルオクタンジアミド
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の１，４−フェニレンジアミン（４３２ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌しながら冷却し、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物３ｃ（１００ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６８μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を一夜撹拌した後、真空下で溶媒を除去し、スラリーを水と酢酸エチルとの間で分配した。二相を分液し、水相を酢酸エチル（２０ｍＬ）でさらに２回抽出した。次に、水相を真空下で濃縮し、無色の固体が沈殿するまでアセトニトリル／水（１：４）で処理した。ろ過して生成物を単離し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【０１３９】
この反応によって２５ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ、１６％）の７ｃを無色の固体として得た。Ｒｔ＝３１分、ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．６６（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ９：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３４０．５（８０、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３４０．２）、３６２．４（１５、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３６２．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−Ｄ６）：  δ  ＝  １．２５−１．３９  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５４−１．６７  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．２７  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．００−７．０９  （ｍ，  １Ｈ），  ７．１４−７．２０  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．２８−７．３４  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５４−７．６５  （ｍ，  ４Ｈ），  ９．７８  （ｓ，  １Ｈ），  ９．９５  （ｓ，  １Ｈ）。
【０１４０】
化合物８ｂ  Ｎ１−フェニル−Ｎ７−（ピリジン−２−イル）ヘプタンジアミド
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物３ｂ（９４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６８μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を冷却し、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の２−アミノピリジン（４０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。一夜撹拌した後、無色の固体が沈殿するまで反応混合物に水を加えた。ろ過して生成物を集め、水／アセトニトリルから再結晶した。
【０１４１】
この反応によって、８０ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ、６４％）の８ｂを無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．４９（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３１２．３（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３１２．２）、３３４．３（１８、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３３４．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−Ｄ６）：  δ  ＝  １．２９−１．３８  （ｍ，  ２Ｈ），  １．５９−１．６４  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．３０  （ｔ，  ３Ｊ＝７．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．４３  （ｔ，  ３Ｊ＝７．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．００  （ｍ，  ３Ｊ＝７．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．１７  （ｍ，  １Ｈ）  ７．２４−７．２９  （ｍ，  ３Ｊ＝７．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５６−７．５９  （ｍ，  ３Ｊ＝７．８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．８５−７．９８  （ｍ，  ２Ｈ），  ８．３０  （ｍ，  １Ｈ），  ９．８６  （ｓ，  １Ｈ），  １０．８  （ｓ，  １Ｈ）。
【０１４２】
化合物８ｃ  Ｎ１−フェニル−Ｎ８−（ピリジン−２−イル）オクタンジアミド
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物３ｃ（１００ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６８μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を冷却し、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の２−アミノピリジン（４０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。一夜撹拌した後、無色の固体が沈殿するまで反応混合物に水を加えた。ろ過して生成物を集め、水／アセトニトリルから再結晶した。
【０１４３】
この反応によって、２３ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ、１８％）の８ｃを無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．２５（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ９：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３２６．１（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３２６．２）、３４８．１（１８、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３４８．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ｍｅｔｈａｎｏｌ−Ｄ４）：  δ  ＝  １．３９−１．４６  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５９−１．７８  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．２８  （ｔ，  ３Ｊ＝７．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．５４  （ｔ，  ３Ｊ＝７．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．０６  （ｍ，  １Ｈ），  ７．２５−７．３０  （ｍ，  ２Ｈ）  ７．４２−７．４７  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５１−７．５４  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．６０  （ｍ，  １Ｈ），  ８．２３  （ｍ，  １Ｈ），  ８．３１  （ｍ，  １Ｈ）。
【０１４４】
化合物９ｂ  Ｎ１−（２−メトキシフェニル）−Ｎ７−フェニルヘプタンジアミド
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物３ｂ（９４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６８μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を冷却し、ＤＭＦ（３ｍＬ）中の２−メトキシアニリン（５０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。一夜撹拌した後、無色の固体が沈殿するまで反応混合物に水を加えた。ろ過して粗生成物を集め、水／アセトニトリルから再結晶した。
【０１４５】
この反応によって、９５ｍｇ（０．２８ｍｍｏｌ、７０％）の９ｂを無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．２７（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３４１．４（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３４１．２）、３６３．４（３５、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３６３．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−Ｄ６）：  δ  ＝  １．２９−１．３８  （ｍ，  ２Ｈ），  １．５５−１．６７  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．３０  （ｔ，  ３Ｊ＝７．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．３８  （ｔ，  ３Ｊ＝７．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．８０  （ｓ，  ３Ｈ），  ６．８５  （ｍ，  １Ｈ），  ６．９８−７．０７  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．２５−７．３０  （ｍ，  ３Ｊ＝７．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５８−７．６０  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．９３  （ｍ，  １Ｈ），  ９．０３  （ｓ，  １Ｈ），  ９．８６  （ｓ，  １Ｈ）。
【０１４６】
化合物９ｃ  Ｎ１−（２−メトキシフェニル）−Ｎ８−フェニルオクタンジアミド
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物３ｃ（１００ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６８μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を冷却し、ＤＭＦ（３ｍＬ）中の２−メトキシアニリン（５０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。一夜撹拌した後、無色の固体が沈殿するまで反応混合物に水を加えた。ろ過して粗生成物を集め、水／アセトニトリルから再結晶した。
【０１４７】
この反応によって、５８ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ、４１％）の９ｃを無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．６１（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ９：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３５５．４（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３５５．２）、３７７．３（１８、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３７７．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−Ｄ６）：  δ  ＝  １．３０−１．３６  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５０−１．６８  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．３０−２．３９  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．８１  （ｓ，  ３Ｈ），  ６．８８  （ｍ，  １Ｈ），  ６．９０−７．１０  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．２６−７．３０  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５８−７．６１  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．９３  （ｍ，  １Ｈ），  ９．０１  （ｓ，  １Ｈ），  ９．８６  （ｓ，  １Ｈ）。
【０１４８】
化合物１０ｂ  Ｎ１−（４−メトキシフェニル）−Ｎ７−フェニルヘプタンジアミド
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物３ｂ（９４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６８μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を冷却し、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の４−メトキシアニリン（５０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。一夜撹拌した後、無色の固体が沈殿するまで反応混合物に水を加えた。ろ過して粗生成物を集め、水／アセトニトリルから再結晶した。
【０１４９】
この反応によって、６３ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ、４６％）の１０ｂを無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．３８（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３４１．４（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３４１．２）、３６３．５（１５、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３６３．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−Ｄ６）：  δ  ＝  １．２５−１．４２  （ｍ，  ２Ｈ），  １．５５−１．７３  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．２７−２．３２  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．７０  （ｓ，  ３Ｈ），  ６．８４−６．８６  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．０１  （ｍ，  １Ｈ），  ７．２５−７．３０  （ｍ， ２Ｈ），  ７．４８−７．６０  （ｍ，  ４Ｈ），  ９．７２  （ｓ，  １Ｈ），  ９．８６  （ｓ，  １Ｈ）。
【０１５０】
化合物１１ｂ  Ｎ１−フェニル−Ｎ７−（キノリン−８−イル）ヘプタンジアミド
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物３ｂ（９５ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６８μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌しながら冷却し、３ｍＬのＤＭＦ中の８−アミノキノリン（５８ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を一夜撹拌した後、無色の固体が沈殿するまで反応混合物を水で希釈した。ろ過して固体を集め、水で洗い、水／アセトニントリルから再結晶した。
【０１５１】
この反応によって、３４ｍｇ（０．１０ｍｍｏｌ、２５％）の１１ｂを無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．４７（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３６２．８（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３６２．２）、３８４．８（１０、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３８４．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−Ｄ６）：  δ  ＝  １．３６−１．４４  （ｍ，  ２Ｈ），  １．５９−１．７３  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．３２  （ｔ，  ３Ｊ＝７．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．５９  （ｔ，  ３Ｊ＝７．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．００  （ｍ，  １Ｈ），  ７．２３−７．２９  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５４−７．６８  （ｍ，  ５Ｈ），  ８．４１  （ｍ，  １Ｈ），  ８．６２  （ｍ，  １Ｈ），  ８．９２  （ｍ，  １Ｈ），  ９．８６  （ｓ，  １Ｈ），  １０．０１  （ｓ，  １Ｈ）。
【０１５２】
化合物１２ｂ  Ｎ１−フェニル−Ｎ７−（キノリン−３−イル）ヘプタンジアミド
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物３ｂ（９５ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６８μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌しながら冷却し、３ｍＬのＤＭＦ中の３−アミノキノリン（５８ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を一夜撹拌した後、無色の固体が沈殿するまで反応混合物を水で希釈した。ろ過して固体を集め、水で洗い、水／アセトニントリルから再結晶した。
【０１５３】
この反応によって、４７ｍｇ（０．１３ｍｍｏｌ、３２％）の１２ｂを無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．４７（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３６２．７（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３６２．２）、３８４．８（２０、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３８４．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−Ｄ６）：  δ  ＝  １．３５−１．４５  （ｍ，  ２Ｈ），  １．６１−１．７５  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．３４  （ｔ，  ３Ｊ＝７．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．４５  （ｔ，  ３Ｊ＝７．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．０２  （ｍ，  １Ｈ），  ７．２５−７．３０  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５８−７．６１  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．６７  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７６  （ｍ，  １Ｈ），  ８．０２−８．０５  （ｍ，  ２Ｈ），  ８．８８  （ｍ，  １Ｈ），  ９．１０  （ｍ，  １Ｈ），  ９．８９  （ｓ，  １Ｈ），  １０．６０  （ｓ，  １Ｈ）。
【０１５４】
化合物１３ｂ  Ｎ１−（２−アミノフェニル）−Ｎ７−（ピリジン−２−イル）ヘプタンジアミド
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の１，２−フェニレンジアミン（４３２ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌しながら冷却し、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物３ｂ２（９５ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６８μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を一夜撹拌した後、溶媒を除去し、残留物をそのままフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール  ８０：１〜４０：１）で精製した。
【０１５５】
この反応によって、８６ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ、６７％）の１３ｂを無色の油として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．３７（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３２７．４（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３２７．２）、３４９．５（５、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３４９．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−Ｄ６）：  δ  ＝  １．２４−１．３８  （ｍ，  ２Ｈ），  １．５５−１．７３  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．１８−２．３５  （ｍ，  ４Ｈ），  ６．８４−６．９５  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．２８−７．４０  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．６５  （ｍ，  １Ｈ），  ８．２５  （ｍ，  １Ｈ），  ８．３４  （ｍ，  １Ｈ），  ９．７２  （ｓ，  １Ｈ），  １０．３６  （ｓ，  １Ｈ）。
【０１５６】
化合物１４ｂ  Ｎ１−（３−メトキシフェニル）−Ｎ７−フェニルヘプタンジアミド
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物３ｂ（９５ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６８μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を冷却し、ＤＭＦ（３ｍＬ）中の３−メトキシアニリン（５０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を一夜撹拌した後、真空下で溶媒を除去し、残留物を酢酸エチル／水（１５０ｍＬ／２０ｍＬ）でほぐした。二相を分液し、有機相を飽和ＮａＣｌ溶液で２回洗い、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を蒸発させた。残留物をカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール  ２０：１）で精製した。
【０１５７】
この反応によって、８４ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ、６２％）の１４ｂを無色の油として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．３２（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ９：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３４１．２（６０、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３４１．２）、３６３．２（７０、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３６３．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ＝  １．３８−１．４２  （ｍ，  ２Ｈ），  １．６９−１．７２  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．３１−２．３５  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．７４  （ｓ，  ３Ｈ），  ６．６３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．００  （ｍ，  １Ｈ），  ７．０６  （ｍ，  １Ｈ），  ７．１０  （ｍ，  １Ｈ），  ７．１５  （ｍ，  １Ｈ），  ７．２４−７．２７  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３０−７．５１  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．８２−７．８６  （ｍ，  ２Ｈ）。
【０１５８】
化合物１５ｂ  Ｎ１−（２，４−ジメトキシフェニル）−Ｎ７−フェニルヘプタンジアミド
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物３ｂ（９５ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６８μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を冷却し、ＤＭＦ（３ｍＬ）中の２，４−ジメトキシアニリン（４８ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を一夜撹拌した後、無色の固体が沈殿するまで反応混合物を水で希釈した。ろ過して固体を集め、水で洗い、水／アセトニトリルから再結晶した。
【０１５９】
この反応によって、９７ｍｇ（０．２６ｍｍｏｌ、６５％）の１５ｂを無色の油として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．３６（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ９：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３７１．５（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３７１．２）、３９３．５（５０、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３９３．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ＝  １．４２−１．４８  （ｍ，  ２Ｈ），  １．７３−１．７９  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．３４−２．４０  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．７７  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．８２  （ｓ，  ３Ｈ），  ６．４２−６．４６  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．０６  （ｍ，  １Ｈ），  ７．２６−７．２９  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５１−７．５６  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．７０  （ｍ，  １Ｈ），  ８．１６  （ｍ，  １Ｈ）。
【０１６０】
化合物１６ｂ  Ｎ１，Ｎ７−ビス（２−アミノフェニル）ヘプタンジアミド
ＤＭＦ（３ｍＬ）中のＰ１（８２ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌しながら冷却し、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物３ｂ３（１４０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６８μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を一夜撹拌した後、溶媒を除去し、残留物を酢酸エチル／水（１５０ｍＬ、２：１）でほぐした。二相を分液し、有機相を冷却した５％クエン酸（２０ｍＬ）で２回、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２０ｍＬ）で２回、飽和ＮａＣｌ溶液（２０ｍＬ）で２回洗い、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を蒸発させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ４０：１）で精製した。
【０１６１】
この反応によって、１８６ｍｇ（０．３４ｍｇ、８６％）の無色の固体を得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．２１（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）。
【０１６２】
ＤＣＭ／ＴＦＡ（５ｍＬ、３：２）の混合物を加え、室温で２時間撹拌してＢｏｃ保護基を開裂させた。溶媒を除去した後、生成物を凍結乾燥した。必要なら、生成物をさらに調製規模ＨＰＬＣによって精製してよい。
【０１６３】
この反応によって１８５ｍｇ（０．３２ｍｍｏｌ、８０％）の無色の固体を得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝２７．０分、ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．０５（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３４１．２（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３４１．２）、３６３．２（２０、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３６３．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−Ｄ６）：  δ  ＝  １．３８−１．４５  （ｍ，  ２Ｈ），  １．６３−１．７１  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．３９−２．４３  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．１８−７．３４  （ｍ，  ８Ｈ），  ９．５９−９．８５  （ｂｒ．  ｓ，  ４Ｈ），  ９．９７  （ｓ，  ２Ｈ）。
【０１６４】
化合物２２ａ  Ｎ１−フェニル−Ｎ７−フェニルヘキサンジアミド
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の３ａ（８８ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６８μＬ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌し、ＤＭＦ（５ｍＬ）中のアニリン（３７ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を一夜撹拌した後、無色の固体が沈殿するまで水を加えた。ろ過して粗生成物を集め、水／エタノールから再結晶した。
【０１６５】
この反応によって、６４ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ、５４％）の２２ａを無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．３５（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝２９７．４（８０、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値２９７．２）、３１９．４（２０、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３１９．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−Ｄ６）：  δ  ＝  １．６０−１．６７  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．３３−２．４１  （ｍ，  ４Ｈ），  ６．９９−７．０３  （ｍ，  ３Ｊ＝７．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．２６−７．３０  （ｍ，  ３Ｊ＝７．６  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ７．５８−７．６０  （ｍ，  ３Ｊ＝７．６  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ９．８８  （ｓ，  ２Ｈ）。
【０１６６】
追加の前駆体の合成
化合物Ｐ２  ｔｅｒｔ−ブチル−４−アミノフェニルカーバメート
５０ｍＬのＤＭＦ中の１，４−フェニレンジアミン（１．０８ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液を５５℃で撹拌しながら、ＤＭＦ（２５ｍＬ）中のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（２．０ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。添加後、反応混合物を２時間撹拌した。真空下で溶媒を除去し、残留物を酢酸エチル（１５０ｍＬ）に取り込んだ。有機相を５％クエン酸で３回、飽和炭酸水素ナトリウムで３回、飽和ＮａＣｌ溶液（４０ｍＬ）で３回洗った。次に、有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を蒸発させた。残留物を酢酸エチルから再結晶した。
【０１６７】
この反応によって１．３５ｇ（６．５０ｍｍｏｌ、６５％）のＰ２を無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．３９（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、１Ｈ−ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  １．５０  （ｓ，  ９Ｈ），  ３．５０  （ｂｒ．  ｓ，  ２Ｈ），  ６．３３  （ｂｒ．  ｓ，  １Ｈ），  ６．６０−６．６４  （ＡＡ’ＢＢ’，  ２Ｈ），  ７．１１−７．１３  （ＡＡ’ＢＢ’，  ２Ｈ）．    １３Ｃ−ＮＭＲ  （１２８  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ２８．４，  ８０．０，  １１５．６，  １１６．７，  １２０．９，  １２９．７，  １５３．３。
【０１６８】
化合物Ｐ３  ７−（４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）フェニルアミノ）−７−オキソヘプタン酸
１０ｍＬの無水酢酸中のピメリン酸（２００ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を３０分間還流させた。溶媒を除去して乾固させた。残留物を５ｍＬの乾燥ＴＨＦ中で希釈した後、５ｍＬの乾燥ＴＨＦ中のＰ２（２０８ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を一夜撹拌した後、溶媒を蒸発させた。残留物を１００ｍＬの酢酸エチルに取り込んだ後、５０ｍＬの水で２回、飽和ＮａＣｌで２回洗った。ＭｇＳＯ４上で溶媒を乾燥させた後、溶媒を蒸発させた。粗残留物を、シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ４０：１）によって精製した。
【０１６９】
この反応によって１４０ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ、４０％）のＰ３を無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．１４（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３５１．３（１５、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３５１．２）、３７３．４（１００、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３７３．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  Ｄ６−ＤＭＳＯ）：  δ  １．２４−１．２９  （ｍ，  ４Ｈ），  １．４５  （ｓ，  ９Ｈ），  １．４７−１．５３  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．２１−２．２６  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３３  （ＡＡ’ＢＢ’，  ２Ｈ），  ７．４４  （ＡＡ’ＢＢ’，  ２Ｈ），  ９．２０  （ｓ，  １Ｈ），  ９．７０  （ｓ，  １Ｈ）。
【０１７０】
化合物８０ｂ  ７−オキソ−７−（２−メトキシフェニルアミノ）ヘプタン酸
無水酢酸（１０ｍＬ）中のピメリン酸（５．００ｇ、３１．２ｍｍｏｌ）の溶液を１時間加熱還流した。室温に冷却した後、真空下で溶媒を除去した。粗生成物の黄色の油をそれ以上精製せずに、次の段階に用いた。無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の生成物無水物の溶液を撹拌し、ｏ−アニシジン（２．１０ｍＬ、２８．７ｍｍｏｌ）を加えた。ｒ．ｔ．で３０分間撹拌した後、無色の固体が沈殿するまで反応混合物を水で希釈した。ろ過して固体を集めた。水／アセトニトリルから再結晶して純粋な化合物を無色の固体として得た。
【０１７１】
この反応によって１．８６ｇ（７．０２ｍｍｏｌ、２５％）の８０ｂを無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．２１（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝２６６．３（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値２６６．１）、２８８．４（２４、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値２８８．１）、１Ｈ−ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  Ｄ４−ＭｅＯＨ）：  δ  １．３１−１．３６  （ｍ，  ２Ｈ），  １．５８−１．６４  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．２８−２．４１  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．８６  （ｓ，  ３Ｈ），  ６．９１−７．０２  （ｍ，  １Ｈ），  ７．０７−７．１２  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．９４  （ｍ，  １Ｈ）。
【０１７２】
化合物１００ｂ  ７−オキソ−７−（ｏ−トリルアミノ）ヘプタン酸
無水酢酸（１０ｍＬ）中のピメリン酸（２．５０ｇ、１６．４ｍｍｏｌ）の溶液を還流下で２０分間加熱した。室温に冷却後、真空下で溶媒を除去した。粗生成物の黄色の油をそれ以上精製せずに、次の段階に用いた。無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の生成物無水物の溶液を撹拌し、ｏ−トルイジン（１．７７ｍＬ、１６．０ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間撹拌した後、無色の固体が沈殿するまで反応混合物を水で希釈した。ろ過して固体を集めた。水／エタノールから再結晶して純粋な化合物を無色の固体として得た。
【０１７３】
この反応によって１．２６ｇ（５．１ｍｍｏｌ、３１％）の１００ｂを無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．１６（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝２５０．３（７３、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値２５０．１）、２７２．４（５６、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値２７２．１）、１Ｈ−ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  Ｄ４−ＭｅＯＨ）：  δ  １．４１−１．４９  （ｍ，  ２Ｈ），  １．６４−１．８１  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．２３  （ｓ，  ３Ｈ）  ２．３０  （ｄ，  ３Ｊ＝７．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．４１  （ｄ，  ３Ｊ＝７．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．３２  （ｓ，  ３Ｈ），  ７．０１−７．１８  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．２１−７．２３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．２５−７．２９  （ｍ，  １Ｈ）。
【０１７４】
化合物１０１ｂ  ７−オキソ−７−（ｐ−トリルアミノ）ヘプタン酸
合成方法は、ｏ−トルイジンの代わりにｐ−トルイジンを用いた点を除けば、１００ｂの合成方法と同じであった。
【０１７５】
この反応によって１．５６ｇ（６．３ｍｍｏｌ、３８％）の１０１ｂを無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．１７（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝２５０．３（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値２５０．１）、２７２．４（２４、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値２７２．１）、１Ｈ−ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  Ｄ４−ＭｅＯＨ）：  δ  １．４２−１．５０  （ｍ，  ２Ｈ），  １．６３−１．７９  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．３５  （ｓ，  ３Ｈ）  ２．３１  （ｄ，  ３Ｊ＝７．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．４３  （ｄ，  ３Ｊ＝７．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．３２  （ｓ，  ３Ｈ），  ７．０９−７．１２  （ＡＡ’ＢＢ’，  ２Ｈ），  ７．４８−７．５１  （ＡＡ’ＢＢ’，  ２Ｈ）。
【０１７６】
追加の阻害剤の合成
【０１７７】
【表３】
2009515887.tif 000018
化合物８１ｂ  Ｎ１−（２−アミノフェニル）−Ｎ７−（２−メトキシフェニル）ヘプタンジアミド
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の１，２−フェニレンジアミン（１．５０ｇ、１４．０ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌しながら冷却し、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の８０ｂ（１．８６ｇ、７．００ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１．３３ｇ、７．００ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１．０７１ｇ、７．００ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した後、溶媒を除去し、残留物を１５０ｍＬの酢酸エチルに取り込み、２０ｍＬの５％クエン酸で２回、２０ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウムで２回、飽和ＮａＣｌで２回洗った。ＭｇＳＯ４上で乾燥させた後、溶媒を蒸発させ、粗生成物を水／エタノールから再結晶した。
【０１７８】
この反応によって１．３６６ｇ（３．８５ｍｍｏｌ、５５％）の８１ｂを黄色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．５３（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３５６．０（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３５６．２）、３７８．０（２０、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３７８．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  Ｄ４−ＭｅＯＨ）：  δ  １．４６−１．５３  （ｍ，  ２Ｈ），  １．７１−１．８０  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．４１−２．４７  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．８５  （ｓ，  ３Ｈ），  ６．６７−６．７２  （ｍ，  １Ｈ），  ６．８２−６．９２  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．９７−７．０２  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．０３−７．１０  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．９０  （ｍ，  １Ｈ）。
【０１７９】
化合物８２ｂ  Ｎ１−（４−アミノフェニル）−Ｎ７−（２−メトキシフェニル）ヘプタンジアミド
ＤＭＦ（５ｍＬ）中のＰ３（１００ｍｇ、２８６μｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（５５ｍｇ、２８６μｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（４４ｍｇ、２８６μｍｏｌ）の溶液を冷却し、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の２−メトキシアニリン（３３μＬ、２８６μｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。３時間撹拌した後、真空下で溶媒を除去し、残留物を１０ｍＬのＤＣＭ／ＴＦＡでほぐし、室温で２時間撹拌した。溶媒を除去し、残留物をアセトニトリル／水から再結晶した。
【０１８０】
この反応によって５５ｍｇ（１５４μｍｏｌ、５４％）の８２ｂを黄色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．２６（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、ＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝２８分、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３５６．３（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３５６．２）、３７８．２（２８、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３７８．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  Ｄ６−ＤＭＳＯ）：  δ  １．３０−１．３５  （ｍ，  ２Ｈ），  １５８−１．６４  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．２９−２．３９  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．８０  （ｓ，  ３Ｈ），  ６．８５−６．８８  （ｍ，  １Ｈ），  ７．００−７．０６  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．１４  （ＡＡ’ＢＢ’，  ２Ｈ），  ７．６２  （ＡＡ’ＢＢ’，  ２Ｈ），  ７．９０  （ｍ，  １Ｈ），  ９．００  （ｓ，  １Ｈ），  ９．９７  （ｓ，  １Ｈ）。
【０１８１】
化合物１０２ｂ  Ｎ１−（２−アミノフェニル）−Ｎ７−ｏ−トリルヘプタンジアミド
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の１，２−フェニレンジアミン（４３０ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌しながら冷却し、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の１００ｂ（２００ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１５２ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１２１ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した後、白色の固体が沈殿するまで水を加えた。ろ過して固体を集め、エタノール／水から再結晶した。
【０１８２】
この反応によって１８６ｇ（０．５５ｍｍｏｌ、６９％）の１０２ｂを無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．２１（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３４０．４（９５、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３４０．２）、３６２．４（４３、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３６２．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  Ｄ６−ＤＭＳＯ）：  δ  １．３７−１．４２  （ｍ，  ２Ｈ），  １．５９−１．６５  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．３２−２．３６  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．３２  （ｓ，  ３Ｈ），  ４．８０  （ｂｒ．  ｓ，  ２Ｈ），  ６．４９−６．５５  （ｍ，  １Ｈ），  ６．７０−６．７２  （ｍ，  １Ｈ），  ６．８７−６．８９  （ｍ，  １Ｈ），  ７．０６−７．１９  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．３５−７．３７  （ｍ，  １Ｈ），  ９．０８  （ｓ，  １Ｈ），  ９．２２  （ｓ，  １Ｈ）。
【０１８３】
化合物１０６ｂ  Ｎ１−（２−アミノフェニル）−Ｎ７−ｐ−トリルヘプタンジアミド
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の１，２−フェニレンジアミン（１．６２ｍｇ、１５．０ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌しながら冷却し、ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の１０１ｂ（７５０ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（５７３ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（４６０ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した後、白色の固体が沈殿するまで水を加えた。ろ過して固体を集め、エタノール／水から再結晶した。
【０１８４】
この反応によって７４２ｍｇ（２．１９ｍｍｏｌ、７３％）の１０１ｂを無色の固体として得た。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．５３（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ２０：１）、ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＣＨＣＡ）  ｍ／ｚ（％）＝３４０．３（１００、［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値３４０．２）、３６２．４（２４、［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値３６２．２）、１Ｈ−ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  Ｄ６−ＤＭＳＯ）：  δ  １．３３−１．３６  （ｍ，  ２Ｈ），  １．６０−１．６５  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．２５−２．３３  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．３５  （ｓ，  ３Ｈ），  ４．８０  （ｂｒ．  ｓ，  ２Ｈ），  ６．５０−６．５４  （ｍ，  １Ｈ），  ６．７０−６．７２  （ｍ，  １Ｈ），  ６．８７−６．９０  （ｍ，  １Ｈ），  ７．０７−７．０９  （ＡＡ’ＢＢ’，  ２Ｈ），  ７．１３−７．１６  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４５−７．４７  （ＡＡ’ＢＢ’，  ２Ｈ），  ９．０５  （ｓ，  １Ｈ），  ９．７６  （ｓ，  １Ｈ）。
【０１８５】
（実施例３  活性フラタキシン対立遺伝子および抑制フラタキシン対立遺伝子のヒストン組成物）
ヒストン改変がＦＲＤＡにおける遺伝子抑制に関与しているかを評価するために、アセチル化形のヒストンＨ３およびＨ４に対する抗体を用いるクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）によって、ＦＲＤＡ患者から誘導されたエプスタインバーウイルス変換リンパ球細胞系統（系統ＧＭ１５８５０、フラタキシン遺伝子中に６５０および１０３０のＧＡＡ・ＴＴＣ繰り返しのある対立遺伝子、ＮＩＧＭＳ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，  Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｃａｍｄｅｎ，  ＮＪから入手）中のフラタキシン遺伝子のヒストンアセチル化状態を測定した。比較のため、この患者の正常な同胞からの同様な細胞系統（系統ＧＭ１５８５１、正常範囲の繰り返し）を用いた。予想したとおり、このＦＲＤＡ患者由来の細胞系統のフラタキシンｍＲＮＡのレベルは、定量的リアルタイム／逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ、下記参照）によって測定すると、非感染同胞由来の細胞系統と比較して著しく低い（１３±６％、２０回の測定からの範囲（Ｂｕｒｎｅｔｔら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  １０３：１１４９７−５０２  （２００６）））。このＣｈＩＰ実験では、フラタキシン遺伝子の最初のイントロン中のＧＡＡ・ＴＴＣ繰り返しの上流または下流のクロマチン領域、ならびにプロモーター要素を調べるプライマーを用い、免疫沈降したＤＮＡのレベルはリアルタイムＰＣＲ（図１Ａ）によって定量した。２つの細胞系統の間でグリセルアルデヒド−３−ホスホデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡの発現に差がなかったので、ＧＡＰＤＨをこのＣｈＩＰ実験における回収率の標準として用いた。ＧＭ１５８５１細胞系統中の活性フラタキシン対立遺伝子のコード領域は、ＧＭ１５８５０のＦＲＤＡ細胞系統中の不活性対立遺伝子と比較すると、Ｈ３−Ｋ９、Ｈ３−Ｋ１４、Ｈ４−Ｋ５、Ｈ４−Ｋ８、Ｈ４−Ｋ１２およびＨ４−Ｋ１６でアセチル化されたヒストンが多く、ＧＭ１５８５０のＦＲＤＡ細胞系統中の不活性対立遺伝子にはこれらのヒストン改変が明らかに少ない。これらの２つの細胞系統中のフラタキシンプロモーター上には、ヒストンアセチル化のレベルの有意差は見いだされなかった。さらに、モノ−、ジ−およびトリメチル化されたＨ３−Ｋ９に対する抗体を用いて、Ｈ３−Ｋ９のメチル化状態を調べた。ＦＲＤＡ細胞系統のＨ３−Ｋ９は、正常細胞系統と比較すると高度にトリメチル化されている（図１Ｂ）。アセチル化不足とともに、Ｈ３−Ｋ９のトリメチル化は、ヘテロクロマチンの特徴である（Ｅｌｇｉｎ  ＆  Ｇｒｅｗａｌ，  Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  １３：Ｒ８９５−８  （２００３））。従って、不活性フラタキシン対立遺伝子のコード領域内のヒストンの合成後改変状態は、ＦＲＤＡ中の遺伝子抑制の原因としてのクロマチン媒介機構（Ｓａｖｅｌｉｅｖら、Ｎａｔｕｒｅ  ４２２：９０９−１３  （２００３））と矛盾しない。
【０１８６】
（実施例４  フラタキシン遺伝子発現に対するヒストンデアセチラーゼ阻害剤の効果）
伸長ＧＡＡ・ＴＴＣフラタキシン対立遺伝子における遺伝子抑制がヒストン脱アセチル化およびヘテロクロマチン形成に起因する可能性をさらに評価するために、アセチル化形のヒストンＨ３およびＨ４に対する抗体を用いて、ＦＲＤＡと正常なリンパ球細胞系統とにおけるヒストンアセチル化とフラタキシン転写とのレベルに対する一連の市販ＨＤＡＣ阻害剤の効果を測定した。試験した阻害剤は、ヒドロキサム酸トリコスタチンＡ、スベロイルビス−ヒドロキサム酸（ＳＢＨＡ）およびスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）；ベンゾアミド型ＳＡＨＡ誘導体ＢＭＬ−２１０（Ｗｏｎｇら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２５：５５８６−７  （２００３））；および小型カルボキシラートバルプロン酸を含んでいた。ＳＡＨＡ、ＰＡＯＡ（化合物４ｂ）およびＳＡＯＡ（化合物４ｃ、ＢＭＬ−２１０）の構造を下：
【０１８７】
【化２８】
2009515887.tif 000019
に示す。
【０１８８】
図２Ａの結果によると、ＨＤＡＣ阻害剤はすべて、ＨＤＡＣ阻害のＩＣ５０の報告値で用いたとき、ＦＲＤＡ細胞系統中の全アセチル化ヒストンのレベルを増加させた。環状ペプチド阻害剤も試験したが、リンパ球細胞に対して細胞毒性が高いことが分ったので、それ以上検討しなかった。ｑＲＴ−ＰＣＲによって、ＦＲＤＡ細胞系統中のフラタキシンｍＲＮＡレベルに対する各ＨＤＡＣ阻害剤の効果（ＩＣ５０値で）も試験したが、ＢＭＬ−２１０がフラタキシンｍＲＮＡのレベルを約２倍に増加させただけであった（図２Ｂ）。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルは、ＨＤＡＣ阻害剤によって変化しなかったので、すべてのｑＲＴ−ＰＣＲ実験において正規化に用いた。ＨＤＡＣ阻害に必要な濃度範囲（１から５μＭ）にわたって、ＢＭＬ−２１０は、リンパ球細胞系統に対して細胞毒（トリパンブルー除外で測定）でなく、細胞成長速度にあまり影響しない。構造的に関連する化合物ＳＡＨＡにはフラタキシン転写に対する効果がなく、ＳＢＨＡには負の効果（５０％減少）があったが、両方の化合物ともＢＭＬ−２１０より有効なＨＤＡＣ阻害剤であった（図２Ａ）。
【０１８９】
（実施例５  ＨＤＡＣ阻害剤の評価）
ＢＭＬ−２１０の活性を最適化するために、簡便な２段階プロトコル（実施例２参照）によって、化合物４ｃ（Ｎ１−（２−アミノフェニル）−Ｎ８−フェニルオクタンジアミド、Ｗｏｎｇら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２５：５５８６−７  （２００３））および一連の関連類似体（表４参照）を合成した。２つの環系の間のリンカー部分の長さ（４、５および６のメチレン）、環の性質（フェニル、ピリジン、キノリン）および環置換基の種類および位置（メチルおよびメトキシ基等、表４）を調べるように誘導体を設計した。
【０１９０】
【表４】
2009515887.tif 000020
ｑＲＴ−ＰＣＲによって、ＦＲＤＡ細胞系統中のフラタキシンｍＲＮＡレベルに対するこれらの化合物の効果を試験し、ＨｅＬａ核抽出物中のＨＤＡＣ阻害剤としての活性を試験した（表４）。ＩＣ５０値は、これらの化合物の一般的なＨＤＡＣ阻害活性を表し、１４μＭ（化合物１６ｂ）から＞１０００μＭ（化合物１４ｂ、表４）の範囲にある。ＦＲＤＡリンパ球細胞からの抽出物に対して、これらの化合物のいくつかで同じＩＣ５０値を得た（表には示していない）。転写の活性化について、これらの化合物のそれぞれを培地中５μＭの濃度で９６時間試験した。重要な点であり、ＳＡＨＡおよびＴＳＡなどの普通のＨＤＡＣ阻害剤と対照的な点は、これらの化合物のどれもリンパ球細胞系統の生存率に影響を及ぼさなかった（転写活性化に必要な濃度で）ことである。リンカー部分に６つ（４ｃおよび誘導体）または４つ（４ａ）のメチレン基を有する化合物は、対応するピメロイルアニリド誘導体（４ｂ、Ｎ１−（２−アミノフェニル）−Ｎ７−フェニルヘプタンジアミド（Ｗｏｎｇら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２５：５５８６−７  （２００３））および誘導体、表４）より効力が低い転写活性化剤であり、フラタキシンｍＲＮＡのレベルを増加させるには、オルト−およびパラ−位をアミノ−またはメトキシ−で置換するのがもっとも効果がある。ピメロイルアニリドのキノリン誘導体（化合物１１ｂおよび１２ｂ）も高活性である。対称形ジアミノ化合物１６ｂ、Ｎ１，Ｎ７−ビス（２−アミノフェニル）ヘプタンジアミドは、ＦＲＤＡ細胞系統において最も効果がある化合物である（フラタキシンｍＲＮＡは５μＭで３．１倍の増加、１０μＭで３．５倍の増加）。ＨｅＬａ核抽出物ＨＤＡＣ阻害アッセイにおいて、４ｃが８７μＭ、４ｂが７８μＭのＩＣ５０であるのに対して、１６ｂは１４μＭのＩＣ５０値を示す。全ＨＤＡＣ阻害活性と生細胞中のフラタキシン遺伝子の転写を活性化する化合物の能力との間に明らかな相関はない。これらの知見は、普通のクラスＩおよびＩＩのＨＤＡＣ阻害剤はフラタキシン転写に対して効果がないという観察（図２Ｂ）と一致する。核抽出物は、多くの異なる多蛋白質複合体中にいくつかのＨＤＡＣ酵素を含むので、標準的なＨＤＡＣ阻害アッセイは、これらの酵素活性のすべての和となる全体的な阻害活性の指標を提供するにすぎない。一般的なＨＤＡＣアッセイは、フラタキシン遺伝子を抑制することに関与している真の標的酵素のＩＣ５０を反映しないことを示すものとしてこれらの結果を解釈する。
【０１９１】
（実施例６  ＨＤＡＣ阻害剤はフラタキシン蛋白質レベルを増加させる）
病原性のフラタキシン対立遺伝子の一次転写物は、長いＧＡＡ繰り返しのＲＮＡ配列を含むので、これらのＲＮＡは正しく処理されず、ＨＤＡＣ阻害剤で処理してもフラタキシン蛋白質の増加が観測されないことがあり得る。ＨＤＡＣ阻害剤が、処理されたリンパ球細胞中のフラタキシン蛋白質のレベルを増加させたかを試験するために、全細胞蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥと、抗フラタキシンまたは抗アクチン抗体を用いるウェスタンブロッティングとに付した（図３）。５μＭの４ｃ（ＢＭＬ−２１０）で約３倍のフラタキシン蛋白質の増加を観測し、２．５μＭの４ｂで同様なＦＲＤＡ細胞中のフラタキシン蛋白質の増加を観測した。これらのフラタキシン蛋白質の増加は、培養細胞中のフラタキシンｍＲＮＡの観測された増加以上である（表４）。
【０１９２】
（実施例７  ＨＤＡＣ阻害剤はＦＲＤＡ患者由来の一次リンパ球中のフラタキシンｍＲＮＡを増加させる）
ヒト疾患におけるフラタキシン蛋白質の欠乏は、非増殖性細胞型（神経細胞および心筋細胞）に影響を及ぼす。これらのヒト細胞を実験用に入手するのは簡単でないが、一次リンパ球はドナー血液から入手することができ、サイトカインで処理していないリンパ球は、本発明者らの実験条件下で培養しても分裂しない。従って、ＦＲＤＡ患者およびキャリアまたはこれらの患者の正常な同胞から入手した一次リンパ球中のフラタキシンｍＲＮＡレベルに対するＨＤＡＣ阻害剤の効果を試験した（承認されたヒト被検者プロトコルに従い、適切なインフォームドコンセントを遵守した）。フィコール勾配遠心分離によってリンパ球を単離し、細胞を培養物中で１６時間インキュベートした後、２．５または５μＭの４ｂまたは４ｃを培養培地に加えた。さらに４８時間培養した後、細胞を集め、ＲＮＡを精製した。この時間では、ＨＤＡＣ阻害剤は、株化細胞と同様に一次リンパ球の生存率に影響しなかった。感染者Ｓ由来のリンパ球のフラタキシンｍＲＮＡのレベルは、該感染者の相同正常同胞Ａ由来のリンパ球と比較すると３３±２％であった（図４Ａ）。どちらの化合物も、どちらの被検者由来の細胞中のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡのレベルには影響を及ぼさなかったが、４ｂおよび４ｃを有する培養物中で２日間インキュベーションすると、感染者由来のリンパ球中のフラタキシンｍＲＮＡ合成が顕著に刺激された（図４Ａ）。ＦＲＤＡリンパ球中のフラタキシンｍＲＮＡの相対レベルは、５μＭの４ｃで１．８倍（８０％増加）、５μＭの４ｂで２．３倍増加した（１３０％増加）。非感染同胞由来のリンパ球中で４ｂの効果は小さかった（３８％増加）が、これらの細胞中のフラタキシンｍＲＮＡに対して４ｃには正の効果がなかった。重要な点は、４ｂが感染者由来のリンパ球中のフラタキシンｍＲＮＡレベルを非感染者由来のリンパ球中のものの〜８０％に増加させた点である。
【０１９３】
次に、株化細胞で見分けた活性の最も高い５つのＨＤＡＣ阻害剤の、ヘテロ接合キャリア（被検者Ｃ、フラタキシンｍＲＮＡを１００％に規格化）およびＦＲＤＡ患者ＡＣ由来の一次リンパ球における転写活性を比較した（図４Ｂ）。この場合にも、４ｂは、キャリアＣおよび感染者ＡＣから入手した細胞中のフラタキシンｍＲＮＡレベルを増加させる上で活性が高く、ＦＲＤＡリンパ球中のフラタキシンｍＲＮＡレベルを無処理キャリアのリンパ球中に見いだされるものの〜１６０％にした。化合物１３ｂおよび１６ｂも活性があり、ＦＲＤＡリンパ球中のフラタキシンｍＲＮＡレベルを非感染キャリア由来のリンパ球中に見いだされるレベルにした。株化ＦＲＤＡ細胞系統（表４）と異なり、化合物７ｂおよび８ｃは、一次リンパ球中では比較的非活性であった。同じく、１６ｂの活性が最も高い株化細胞での結果と対照的に、一次リンパ球中で４ｂが最も活性の高い化合物であったので、その後の検討では４ｂを調べた。次に、２名の同胞のＦＲＤＡ患者ＪおよびＭ、ならびにキャリアの親族Ｄ（キャリアリンパ球中のフラタキシンｍＲＮＡレベルを１００％に規格化、図４Ｃ）由来のリンパ球中のフラタキシンｍＲＮＡレベルに対する４ｂの濃度を増大させる効果を試験した。４ｂは、試験したリンパ球ポピュレーションのそれぞれにおいて、フラタキシンｍＲＮＡのレベルを増加させ、ＦＲＤＡ患者リンパ球中のフラタキシンｍＲＮＡのレベルは、少なくともキャリアのレベルへ増加した。注目すべきことに、キャリア中のフラタキシンｍＲＮＡはほとんど２倍になり、不活性なフラタキシン対立遺伝子がほとんど完全に再活性化されたことを示唆した。さまざまなドナー由来の一次リンパ球中に４ｂを加えると、フラタキシンｍＲＮＡの倍数増加の差異が観測される（図４Ａ〜Ｃを比較）が、この化合物は、１２の家系のすべてから入手したＦＲＤＡおよびキャリアのリンパ球中のフラタキシンｍＲＮＡを確実に増加させ、それぞれの場合に、ＦＲＤＡリンパ球中のフラタキシンｍＲＮＡレベルは、大体、キャリア親族由来の未処理リンパ球のレベルへ増加した。従って、治療として有用なフラタキシンｍＲＮＡの増加を表す遺伝子活性化のレベルを実現した。ＦＲＤＡ細胞系統中より一次リンパ球中の方がＨＤＡＣ阻害剤の効果が大きい点に注意する。この差異は、ＦＲＤＡ細胞系統中で観測したフラタキシン遺伝子の抑制の方が強かったことに関連している可能性がある。
【０１９４】
（実施例８  ＨＤＡＣ阻害剤はフラタキシン遺伝子に直接作用する）
ＨＤＡＣ阻害剤がフラタキシン遺伝子のヒストンアセチル化状態に直接作用するか評価するために、ＦＲＤＡ細胞をＨＤＡＣ阻害剤４ｂで処理（５μＭで９６時間）した後、ＣｈＩＰ実験を行い、ＧＡＡ繰り返しの直ぐ上流のクロマチン領域上のヒストンアセチル化を分析した。細胞の収量が不十分であったため、ドナー血液由来のリンパ球を用いてこの実験を行うことはできなかった。ヒストンアセチル化において、ＧＡＡ繰り返しの直ぐ上流の領域が２つの細胞系統の間で最も明白な差異を示した（図１Ａ）ので、このプローブを用いてＣｈＩＰアッセイを行った。これらの細胞に４ｂを用いると、フラタキシン転写（表４）ならびにＨ３−Ｋ１４、Ｈ４−Ｋ５およびＨ４−Ｋ１２のアセチル化（図５Ａ）に約２．５から３倍の同程度の増加が観測される。Ｈ３−Ｋ９、Ｈ４−Ｋ８またはＨ４−Ｋ１６では、アセチル化の顕著な変化は観測されない。フラタキシン遺伝子におけるヒストンアセチル化に対する４ｂの効果の特異性を示すために、フラタキシン転写に効果のなかった（図２Ｂ）２つの普通のＨＤＡＣ阻害剤（ＴＳＡおよびＳＡＨＡ）でＦＲＤＡ細胞を処理した後、同様なＣｈＩＰ実験を行った。ＦＲＤＡ細胞をこれらの化合物とともに９６時間インキュベートした後、フラタキシン遺伝子中のＧＡＡ繰り返しの直ぐ上流の領域を探測したところ、ヒストンアセチル化に対する顕著な効果は観測されなかった（図５Ｂ）。これらのデータは、４ｂがフラタキシン遺伝子と関連する未特定のＨＤＡＣ酵素（単数または複数）を直接阻害し、従って、結果として関連するヒストンアセチルトランスフェラーゼの作用によってアセチル化ヒストンのレベルを増加させ、最終的にフラタキシン転写の増加に至ることを示唆している。
【０１９５】
（実施例９  追加の選ばれたＨＤＡＣ阻害剤）
以下の追加のＨＤＡＣ阻害剤を合成し、上記に記載したと同じように試験した。
【０１９６】
・ＫＪ−８１ｂ  Ｎ１−（２−アミノフェニル）−Ｎ７−（２−メトキシフェニル）ヘプタンジアミド
・ＫＪ−８２ｂ  Ｎ１−（４−アミノフェニル）−Ｎ７−（２−メトキシフェニル）ヘプタンジアミド
・ＫＪ−１０２ｂ  Ｎ１−（２−アミノフェニル）−Ｎ７−ｏ−トリルヘプタンジアミド
・ＫＪ−１０６ｂ  Ｎ１−（２−アミノフェニル）−Ｎ７−ｐ−トリルヘプタンジアミド
これらの化合物の構造式およびヒストンデアセチラーゼ阻害のＩＣ５０を表５にまとめる。
【０１９７】
【表５】
2009515887.tif 000021
（参考文献）
背景の説明用にこれらの参考文献を提供する。
【０１９８】
【化２９】
2009515887.tif 000022
【０１９９】
【化３０】
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【０２００】
【化３１】
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【０２０１】
【化３２】
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【０２０２】
【化３３】
2009515887.tif 000026
（他の実施態様）
本明細書中で参照または言及したすべての特許および刊行物は、本発明の関連分野の当業者の技術レベルを示し、そのような被参照特許または刊行物はそれぞれ、それぞれが参照によって個別に全体として組み込まれたか、または本明細書中に全体が示されたと同じ程度に、参照によって組み込まれる。原出願人らは、任意のそのような被引用特許または刊行物からの任意のおよびすべての参照物および情報を本明細書中に物理的に組み込む権利を留保する。
【０２０３】
本明細書中に記載した特定の方法および組成物は、好ましい実施態様を表わし、例を示すものであり、本発明の範囲に対する限定ではない。他の事物、態様および実施態様は、本明細書を考慮すれば当業者に想到され、請求項の範囲によって定義される本発明の技術思想の範囲内に包含される。本発明の範囲および技術思想から逸脱することなく、さまざまな置き換えおよび変更を本明細書に開示した本発明に施すことができることは、当業者に自明である。本明細書に説明のために例を記載した本発明は、本明細書に必須であるとして特に開示されていない任意の単数または複数の要素、あるいは単数または複数の限定条件なしに、適切に実行することができる。本明細書に説明として例を記載した方法およびプロセスは、工程の順序を変えて実行してよく、これらの方法およびプロセスは、本明細書または請求項に示す工程の順序に必ずしも制限されない。本明細書および添付の請求項中で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、状況によって明白に異なる場合を除いて、複数の参照を含む。従って、例えば、「抗体」を参照する場合、複数のそのような抗体（例えば、複数抗体の溶液または一連の抗体調製物）を含む、等々である。いかなる状況においても、本特許は、本明細書に特に開示した特定の実施例または実施態様あるいは方法に限定されると解釈してはならない。いかなる状況においても、本特許は、審査官または米国特許および商標庁の任意の他の係官によってなされるいかなる声明によっても限定されると解釈してはならないが、そのような声明が特になさ、原出願人らによる回答書面中に明示的に示された意見および留保を伴わない場合は、この限りでない。
【０２０４】
使用してきた用語および表現は、説明用語として用いたものであり、限定用語として用いたものではなく、そのような用語および表現の使用にあたって示し、記載した特徴、あるいはその一部のいかなる均等物も排除するものではないが、請求項に記載されている本発明の範囲内でさまざまな変更形が可能であると認識される。従って、好ましい実施態様および任意選択の特徴によって本発明を具体的に開示してきたが、本明細書に開示した概念の変更形および変化形は、当業者によって再構成され得ること、およびそのような変更形および変化形は添付の請求項によって定義される本発明の範囲に属すると考えられると理解される。
【０２０５】
本明細書においては、本発明を広義に、属のレベルで説明してきた。属開示の範囲内に分類されるもっと狭い種および亜属の分類のそれぞれも、本発明の一部を形成する。これは、任意の対象事物を、その事物が本明細書に具体的に挙げられているか否かにかかわらずある属から除外する旨の但し書きまたは否定的限定が付く本発明の属の記載を含む。
【０２０６】
以下の請求項の中に、他の実施態様がある。さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群によって記載されている場合、それによって、本発明がマーカッシュ群の任意の個々の構成員、あるいは構成員の部分群によっても記載されることは、当業者に自明である。
【０２０７】
詳細な説明とともに本発明を説明してきたが、以上の説明は、例を示すものであり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の範囲は、添付の請求項の範囲によって定義される。以下の請求項の範囲内に、他の態様、利点および変更形がある。
【図面の簡単な説明】
【０２０８】
【図１−Ａ】図１は、フラタキシン遺伝子クロマチン上のヒストン改変の例を示す棒グラフである。（Ａ）アセチル化形のヒトのヒストンＨ３およびＨ４（図に示したリジン残基の位置でアセチル化）に対する抗体を用いて、ＦＲＤＡ細胞系統（ＧＭ１５８５０）および正常細胞系統（ＧＭ１５８５１）のクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）実験を行った。フラタキシンプロモーター（Ｐｒｏ）、フラタキシン遺伝子の最初のイントロン中のＧＡＡ繰り返しの直ぐ上流の領域（Ｕｐ）および下流の領域（Ｄｏｗｎ）のプライマー対を用いた。リアルタイムＰＣＲで測定した相対回収率をＧＡＰＤＨと対比した相対値で表し、各抗体についてＵｐのＧＡＡ領域上の回収率を１００の値に設定している。誤差バーは、２〜３回の独立した免疫沈降のｓ．ｅ．ｍ．（標準測定誤差）であり、各免疫沈降は、３回の測定結果によって定量化した。（Ｂ）ＦＲＤＡ細胞系統と正常細胞系統との両方について、Ｋ９の位置でモノメチル化、ジメチル化およびトリメチル化形のヒストンＨ３に対する抗体を用いて、ＧＡＡ繰り返しの上流の領域のＣｈＩＰを行った。回収率は、ＧＡＰＤＨのパーセントとして表してある。
【図１−Ｂ】図１は、フラタキシン遺伝子クロマチン上のヒストン改変の例を示す棒グラフである。（Ａ）アセチル化形のヒトのヒストンＨ３およびＨ４（図に示したリジン残基の位置でアセチル化）に対する抗体を用いて、ＦＲＤＡ細胞系統（ＧＭ１５８５０）および正常細胞系統（ＧＭ１５８５１）のクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）実験を行った。フラタキシンプロモーター（Ｐｒｏ）、フラタキシン遺伝子の最初のイントロン中のＧＡＡ繰り返しの直ぐ上流の領域（Ｕｐ）および下流の領域（Ｄｏｗｎ）のプライマー対を用いた。リアルタイムＰＣＲで測定した相対回収率をＧＡＰＤＨと対比した相対値で表し、各抗体についてＵｐのＧＡＡ領域上の回収率を１００の値に設定している。誤差バーは、２〜３回の独立した免疫沈降のｓ．ｅ．ｍ．（標準測定誤差）であり、各免疫沈降は、３回の測定結果によって定量化した。（Ｂ）ＦＲＤＡ細胞系統と正常細胞系統との両方について、Ｋ９の位置でモノメチル化、ジメチル化およびトリメチル化形のヒストンＨ３に対する抗体を用いて、ＧＡＡ繰り返しの上流の領域のＣｈＩＰを行った。回収率は、ＧＡＰＤＨのパーセントとして表してある。
【図２−Ａ】図２は、ＦＲＤＡ細胞中のアセチル化およびフラタキシンｍＲＮＡに対するヒストンデアセチラーゼ阻害剤の効果の例を示す棒グラフである。（Ａ）ＦＲＤＡリンパ球細胞系統（１５８５０Ｂ）中のＨ３およびＨ４アセチル化のレベルに対するヒストンデアセチラーゼ阻害剤の効果。細胞は無処理のままか、または図に示した化合物で１２時間処理したものを、酸可溶性核蛋白質の単離、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および全ヒストンＨ４／Ｈ３またはアセチル化Ｈ４／Ｈ３に対する抗体を用いるウェスタンブロッティングに付した。全Ｈ４またはＨ３に対するＡｃＨ４またはＡｃＨ３の正規化された比の倍数変化を棒グラフに示す。（Ｂ）定量的ＲＴ−ＰＣＲによってフラタキシンｍＲＮＡレベルを測定した。すべての値は、ＨＤＡＣ阻害剤の影響を受けなかったＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルに規格化してある。市販品の販売業者が報告した、図に示したＩＣ５０値で、ＨＤＡＣ阻害剤のそれぞれを試験した。誤差バーは、ｓ．ｅ．ｍ．である。
【図２−Ｂ】図２は、ＦＲＤＡ細胞中のアセチル化およびフラタキシンｍＲＮＡに対するヒストンデアセチラーゼ阻害剤の効果の例を示す棒グラフである。（Ａ）ＦＲＤＡリンパ球細胞系統（１５８５０Ｂ）中のＨ３およびＨ４アセチル化のレベルに対するヒストンデアセチラーゼ阻害剤の効果。細胞は無処理のままか、または図に示した化合物で１２時間処理したものを、酸可溶性核蛋白質の単離、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および全ヒストンＨ４／Ｈ３またはアセチル化Ｈ４／Ｈ３に対する抗体を用いるウェスタンブロッティングに付した。全Ｈ４またはＨ３に対するＡｃＨ４またはＡｃＨ３の正規化された比の倍数変化を棒グラフに示す。（Ｂ）定量的ＲＴ−ＰＣＲによってフラタキシンｍＲＮＡレベルを測定した。すべての値は、ＨＤＡＣ阻害剤の影響を受けなかったＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルに規格化してある。市販品の販売業者が報告した、図に示したＩＣ５０値で、ＨＤＡＣ阻害剤のそれぞれを試験した。誤差バーは、ｓ．ｅ．ｍ．である。
【図３】図３は、ＨＤＡＣ阻害剤がＦＲＤＡリンパ球細胞系統中のフラタキシン蛋白質を増加させることを示すオートラジオグラムである。細胞を、図に示した濃度のＨＤＡＣ阻害剤と４日間インキュベートした後、ヒトのフラタキシンまたはアクチンに対する抗体を用いてウェスタンブロット分析した。全細胞抽出蛋白質の均等量を各レーンに載せた。無処理の対照細胞（図では「Ｃｔｒｌ」としてある）と比較したフラタキシン蛋白質の倍数変化は、対アクチンシグナルで規格化すると、１．６（２．５μＭの４ｃ／ＢＭＬ−２１０）、３．４（５μＭの４ｃ）、および３．５（２．５μＭの４ｂ）である。
【図４−Ａ】図４は、ＨＤＡＣ阻害剤がＦＲＤＡ患者由来の一次リンパ球中のフラタキシンｍＲＮＡを増加させることを示す棒グラフである。非感染者Ａ（正常な繰り返しの範囲）と、彼／彼女のＦＲＤＡ同胞（９０６および８８のＧＡＡ繰り返しを含むフラタキシン対立遺伝子を有する感染者Ｓ）とからのリンパ球（Ａ）中、キャリアＣと感染者ＡＣ（８０１および５９７の繰り返し）とからのリンパ球（Ｂ）中、ならびにキャリアＤと、感染者Ｊ（５５０および５３０の繰り返し）およびＭ（１０３０および６５０の繰り返し）とからのリンパ球（Ｃ）中のフラタキシンｍＲＮＡのレベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲによってＧＡＰＤＨのそれとの相対値として測定した。図に示した濃度のＨＤＡＣ阻害剤を細胞培養培地中に含ませ、４８時間の時点でのフラタキシンおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを測定した。データは、非感染者（ａでは正常者、ｂおよびｃではキャリア、＝１００％とする）由来のリンパ球中に見いだされるフラタキシンのｍＲＮＡレベルに対して規格化してある。３つの独立した測定値の平均および標準偏差を示してある。
【図４−Ｂ】図４は、ＨＤＡＣ阻害剤がＦＲＤＡ患者由来の一次リンパ球中のフラタキシンｍＲＮＡを増加させることを示す棒グラフである。非感染者Ａ（正常な繰り返しの範囲）と、彼／彼女のＦＲＤＡ同胞（９０６および８８のＧＡＡ繰り返しを含むフラタキシン対立遺伝子を有する感染者Ｓ）とからのリンパ球（Ａ）中、キャリアＣと感染者ＡＣ（８０１および５９７の繰り返し）とからのリンパ球（Ｂ）中、ならびにキャリアＤと、感染者Ｊ（５５０および５３０の繰り返し）およびＭ（１０３０および６５０の繰り返し）とからのリンパ球（Ｃ）中のフラタキシンｍＲＮＡのレベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲによってＧＡＰＤＨのそれとの相対値として測定した。図に示した濃度のＨＤＡＣ阻害剤を細胞培養培地中に含ませ、４８時間の時点でのフラタキシンおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを測定した。データは、非感染者（ａでは正常者、ｂおよびｃではキャリア、＝１００％とする）由来のリンパ球中に見いだされるフラタキシンのｍＲＮＡレベルに対して規格化してある。３つの独立した測定値の平均および標準偏差を示してある。
【図４−Ｃ】図４は、ＨＤＡＣ阻害剤がＦＲＤＡ患者由来の一次リンパ球中のフラタキシンｍＲＮＡを増加させることを示す棒グラフである。非感染者Ａ（正常な繰り返しの範囲）と、彼／彼女のＦＲＤＡ同胞（９０６および８８のＧＡＡ繰り返しを含むフラタキシン対立遺伝子を有する感染者Ｓ）とからのリンパ球（Ａ）中、キャリアＣと感染者ＡＣ（８０１および５９７の繰り返し）とからのリンパ球（Ｂ）中、ならびにキャリアＤと、感染者Ｊ（５５０および５３０の繰り返し）およびＭ（１０３０および６５０の繰り返し）とからのリンパ球（Ｃ）中のフラタキシンｍＲＮＡのレベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲによってＧＡＰＤＨのそれとの相対値として測定した。図に示した濃度のＨＤＡＣ阻害剤を細胞培養培地中に含ませ、４８時間の時点でのフラタキシンおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを測定した。データは、非感染者（ａでは正常者、ｂおよびｃではキャリア、＝１００％とする）由来のリンパ球中に見いだされるフラタキシンのｍＲＮＡレベルに対して規格化してある。３つの独立した測定値の平均および標準偏差を示してある。
【図５−Ａ】図５は、フラタキシン遺伝子におけるヒストンアセチル化に対するＨＤＡＣ阻害剤の効果の例を示す棒グラフである。（Ａ）ＨＤＡＣ阻害剤４ｂは、フラタキシン遺伝子上の特定のＨ３およびＨ４リジンの位置のヒストンアセチル化を増加させる。ＦＲＤＡ細胞を４ｂで処理した（５μＭで９６時間）後、図に示した抗体を用いてＣｈＩＰを行い、ＧＡＡ繰り返しの上流領域用のプライマーでＰＣＲを行った。無処理の細胞系統と４ｂで処理したＦＲＤＡ細胞との両方のデータを示してある。回収率は、ＧＡＰＤＨのパーセントとして表し、すべての値は、ＧＭ１５８５１細胞の値に対して規格化してある。（Ｂ）ＳＡＨＡおよびＴＳＡは、フラタキシン遺伝子上のヒストンアセチル化に影響を及ぼさない。ＦＲＤＡ細胞を２．５μＭのＳＡＨＡまたは０．１μＭのＴＳＡと９６時間インキュベートし、（Ａ）におけるように処理してＣｈＩＰを行った。回収率は、ＧＡＰＤＨに対して規格化し、無処理ＧＭ１５８５０細胞に対する相対値で表してある。誤差バーは、ｓ．ｅ．ｍ．である。
【図５−Ｂ】図５は、フラタキシン遺伝子におけるヒストンアセチル化に対するＨＤＡＣ阻害剤の効果の例を示す棒グラフである。（Ａ）ＨＤＡＣ阻害剤４ｂは、フラタキシン遺伝子上の特定のＨ３およびＨ４リジンの位置のヒストンアセチル化を増加させる。ＦＲＤＡ細胞を４ｂで処理した（５μＭで９６時間）後、図に示した抗体を用いてＣｈＩＰを行い、ＧＡＡ繰り返しの上流領域用のプライマーでＰＣＲを行った。無処理の細胞系統と４ｂで処理したＦＲＤＡ細胞との両方のデータを示してある。回収率は、ＧＡＰＤＨのパーセントとして表し、すべての値は、ＧＭ１５８５１細胞の値に対して規格化してある。（Ｂ）ＳＡＨＡおよびＴＳＡは、フラタキシン遺伝子上のヒストンアセチル化に影響を及ぼさない。ＦＲＤＡ細胞を２．５μＭのＳＡＨＡまたは０．１μＭのＴＳＡと９６時間インキュベートし、（Ａ）におけるように処理してＣｈＩＰを行った。回収率は、ＧＡＰＤＨに対して規格化し、無処理ＧＭ１５８５０細胞に対する相対値で表してある。誤差バーは、ｓ．ｅ．ｍ．である。
【図１−Ａ】
2009515887.tif 000043
【図１−Ｂ】
2009515887.tif 000044
【図２−Ａ】
2009515887.tif 000045
【図２−Ｂ】
2009515887.tif 000046
【図３】
2009515887.tif 000047
【図４−Ａ】
2009515887.tif 000048
【図４−Ｂ】
2009515887.tif 000049
【図４−Ｃ】
2009515887.tif 000050
【図５−Ａ】
2009515887.tif 000051
【図５−Ｂ】
2009515887.tif 000052
【国際調査報告】
2009515887.tif 000053
2009515887.tif 000054
2009515887.tif 000055
2009515887.tif 000056
2009515887.tif 000057