(57)【要約】  造血幹細胞の生着を促進するための方法であって、造血幹細胞と一緒に骨髄前駆細胞を投与することを包含する方法、ならびにそのための組成物が提供される。
2009526784.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における造血幹細胞移植片の生着の増強方法であって、造血幹細胞の生着を増強するのに有効な量で前記患者に骨髄前駆体（ＭＰ）細胞移植片を投与することを包含する方法。
【請求項２】
前記造血幹細胞移植片がサブオプティマル移植片である請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記サブオプティマル移植片が約5.0×106未満のＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）／患者体重1 kgを含む請求項２記載の方法。
【請求項４】
上記サブオプティマル移植片が約1.0×106未満のＣＤ３４＋ＨＳＣ／患者体重1 kgを含む請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記サブオプティマル移植片が末梢血または骨髄から得られる請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記サブオプティマル移植片が臍帯血（ＵＢＣ）から得られる請求項２記載の方法。
【請求項７】
前記サブオプティマル移植片が約4×107未満の有核細胞／患者体重1 kgを含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記サブオプティマル移植片が約4.0×105未満のＣＤ３４+細胞／患者体重1 kgを含む請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記サブオプティマル移植片が2未満の臍帯血単位由来のＨＳＣを含む請求項６記載の方法。
【請求項１０】
前記サブオプティマル移植片が単一臍帯血単位由来のＨＳＣを含む請求項６記載の方法。
【請求項１１】
前記ＭＰ細胞移植片および前記ＨＳＣ移植片が前記患者に関して同種異系である請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記同種異系移植片が前記患者に関してＭＨＣで少なくとも部分的不適化される請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記同種異系移植片が前記患者に関してＭＨＣで完全不適合化される請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記同種異系移植片が前記患者に関して1つまたは複数のＭＨＣ抗原で不適合化される請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
前記同種異系移植片が前記患者に関してＭＨＣで完全適性化される請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
前記骨髄前駆細胞移植片が前記造血幹細胞移植片と同時に投与される請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記骨髄前駆細胞移植片が前記造血幹細胞移植片の12時間以内に投与される請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記骨髄前駆細胞移植片が増殖骨髄前駆細胞を含む請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記増殖骨髄前駆細胞が同種異系骨髄前駆細胞の混合物である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記同種異系骨髄前駆細胞が造血幹細胞移植片に関してＭＨＣで少なくとも部分的不適合化される請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の引照
本出願は、U.S.S.N. 60/773,405（2006年2月14日提出）（この記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）の35 U.S.C. § 119(e)下での利益を主張する。
【０００２】
２．産業上の利用分野
本発明は、幹細胞療法改善のための方法および組成物、特に、サブオプティマル用量の造血幹細胞の生着を促進するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
３．発明の背景
造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、広範な多数の血液学的障害の処置の重要な構成成分である。一般的に、2種類のＨＳＣＴが存在する：即ち、自己由来および同種異系移植である。自己由来移植は、骨髄破壊的処置後のレシピエント自身の細胞の注入を包含する。自己由来細胞移植片は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の危険を最小限にし、そして合併症低減を生じる。同種異系移植は、典型的にはレシピエントのＭＨＣと適合性であるドナーを用いるドナー幹細胞の注入を包含する。しかしながら適合性非血縁ドナー（ＭＵＤ）移植片は、より強力な移植片対宿主反応にも関連し、したがってより高い死亡率を生じる。
【０００４】
造血幹細胞（ＨＳＣ）の3つの主要供給源が存在する：即ち、骨髄、末梢血および臍帯血である。臍帯血（ＵＣＢ）は、血縁および非血縁同種異系造血幹細胞移植のための、他の造血前駆細胞供給源（例えば骨髄および動員末梢血）のほかに取り得る実用的代替供給源である。しかしながら残念なことに、臍帯血は容易に入手可能で、そして移植片対宿主病のより低い発生率を示すにもかかわらず、それは生着遅延を特徴とする。
【０００５】
したがって、臍帯血から得られるＨＳＣを用いて血液学的障害を治療することは非常に有望である一方、造血性回復の速度の遅さが依然として大きな妨げとなっている（Laughlin, et al., N. Eng. J. Med. 351: 22; 2265-2275 (2004)）。凍結保存有核細胞（ＮＣ）用量は好中球回復の主要決定因子であり、そしてより高いＣＤ３４+細胞用量は非血縁ドナーＵＣＢ移植における生存率改善と関連する（Laughlin, et al.）。1.8×107ＮＣ／レシピエント体重1kg未満または1.7×105ＣＤ３４+細胞／kg未満の注入細胞用量を有するＵＣＢの成人レシピエントは、典型的には、より低い生着および生存を示す（Wagner et al., Blood. 100; 51, 1611-1618）。有核細胞用量が1.5×107 kgより低い場合、ＵＣＢに関して、特に不十分な結果が観察された（Grewal, et al. Blood, 101; 11; 4233-4244）。
【０００６】
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）不適合のレベルとＨＳＣＴにおける生存率との間には、十分に確立された関係も存在する。例えば、移植片が少なくとも1.7×105ＣＤ３４+細胞／kgを含有する場合、2以下のＨＬＡで本質的に異なるＵＣＢ移植片の受取りにおいて高確率の生存が認められる（Wagner et al.）。
【０００７】
その結果として、より高い細胞用量でのＵＣＢ移植片が成人患者における最適生着のために必要とされる、というコンセンサスが明らかになりつつある。一単位の臍帯血は、凍結時点で少なくとも2.0×107の有核細胞／kgを有し、そして、単独でまたはレシピエントと組合せて、ＨＬＡ、ＢまたはＤＲＢ１に関する適合性の2以下の不一致を示すべきである、ということを、Rocha等は示唆している（Rocha et al., N. Eng. J. Med. 351: 22; 2276-2285 (2004)）。最小許容可能注入ＵＣＢ移植片細胞用量は未だ意見の一致を見ていないが、約1.5×107有核細胞／kg〜約1.5×105ＣＤ３４+細胞の最小許容可能用量が示唆されている（Grewall et al., Wagner et al.）。
【０００８】
任意の事象においては、これらの量またはそれ以上のＵＣＧ細胞用量を用いる場合でさえ、生着の効率は依然として、骨髄または末梢血からのＨＳＣを用いる場合より有意に低い（Rocha et al., p. 2281 and Figure 1 A.）。さらに生着は、単一の不適合が存在する場合でさえ悪化することが示されている（Gluckman et al., Exp. Hematol. 32: 397-407 (2004)）。したがって、幹細胞移植の効能を改善するために、ＵＣＢから得られるＨＳＣの生着を増強することに依然として大きな関心が寄せられている。
【発明の開示】
【０００９】
４．発明の要約
本発明の開示に従って、幹細胞移植を改善するための方法、組成物およびキットが記載される。特に、造血幹細胞（ＨＳＣ）の生着を促進するための方法であって、ＨＳＣ移植片と一緒に移植患者に骨髄前駆細胞（ＭＰ）移植片を投与することを包含する方法が提供される。ＭＰ移植片は、ＨＳＣ移植片にとっておよび／または患者にとって自己由来であるかまたは同種異系であり、そしてさらに同種異系ＭＰ細胞の混合集団を含み得る。好ましい実施形態では、ＭＰ細胞は、投与前にin vitroで増幅される。
【００１０】
本明細書中で実証されるように、ＨＳＣを伴うＭＰの投与は、特に最適以下用量のＨＳＣを受容している被験者において特に、ＨＳＣの生着を劇的に増強し得る。したがって、一態様において、サブオプティマルＨＳＣ移植片の生着を増強するための方法であって、ＨＳＣ移植片と一緒に患者にＭＰ移植片を投与することを包含する方法が提供される。一般的に、最適ＨＳＣ用量投与は、ＨＳＣ移植片中の有核細胞（ＮＣ）および／またはＣＤ３４+細胞の数の、および／または患者およびＨＳＣ移植片間のＭＨＣでの不適合のレベルの一関数である。
【００１１】
一態様では、幹細胞移植を首尾よく達成するために、最適ＨＳＣ移植片は細胞／患者体重1kgの閾値数を要する。最適ＨＳＣ移植片は、一般的に少なくとも約1.0×106ＣＤ３４＋細胞／患者体重1kg、少なくとも約2.0×106ＣＤ３４＋細胞／患者体重1kg、好ましくは少なくとも約3.0×106ＣＤ３４＋細胞／患者体重1kg、さらに好ましくは約4.0×106ＣＤ３４＋細胞／患者体重1kg、最も好ましくは5.0×106ＣＤ３４＋細胞／患者体重1kgを含有する。
【００１２】
したがって一態様では、本発明の方法は、一般的に約5.0×106ＣＤ３４＋細胞／患者体重1kg未満、さらに特定的には約4.0×106ＣＤ３４＋細胞／患者体重1kg未満、好ましくは約3.0×106ＣＤ３４＋細胞／患者体重1kg未満、さらに好ましくは約2.0×106ＣＤ３４＋細胞／患者体重1kg未満、または最も好ましくは約1.0×106ＣＤ３４＋細胞／患者体重1kg未満を含むサブオプティマルＨＳＣ移植片と一緒にＭＰ移植片を用いる。
【００１３】
いくつかの実施形態では、サブオプティマル移植片は、骨髄または末梢血から得られる。一実施形態では、サブオプティマル移植片は、注入のために約5×108有核細胞／患者体重1kg未満、さらに好ましくは4.5または4.0×108有核細胞／患者体重1kg未満、および最も好ましくは約4.1×108有核細胞／患者体重1kg未満を含む。代替的一実施形態では、サブオプティマル移植片は、注入のために約6×106ＣＤ３４+細胞／患者体重1kg未満、さらに好ましくは約4.5〜5.5×106ＣＤ３４+細胞／患者体重1kg未満、および最も好ましくは約5.0×106ＣＤ３４+細胞／患者体重1kg未満を包含し得る。
【００１４】
いくつかの実施形態では、サブオプティマル移植片は、臍帯血から得られる。一実施形態では、サブオプティマル移植片は、2より少ない臍帯血単位から得られる、さらに好ましくは単一臍帯血単位から得られるＨＳＣを含む。別の実施形態では、サブオプティマル移植片は、注入のために約4×107有核細胞／患者体重1kg未満、さらに好ましくは3.0×107有核細胞／患者体重1kg未満、および最も好ましくは約3.5×107有核細胞／患者体重1kg未満を含む。代替的一実施形態では、サブオプティマル移植片は、約5×105ＣＤ３４+細胞／患者体重1kg未満、さらに好ましくは約3.5〜4.5×105ＣＤ３４+細胞／患者体重1kg未満、および最も好ましくは約4.0×105ＣＤ３４+細胞／患者体重1kg未満を包含し得る。
【００１５】
別の態様では、サブオプティマル移植片は、患者表現型と比較して、1つより多くのＭＨＣ不適合を有するＨＳＣを含む。
【００１６】
幹細胞移植を改善するための組成物も提供される。一態様では、組成物は、造血幹細胞および骨髄前駆細胞の自己由来または同種異系混合物を含む。一実施形態では、ＭＰ細胞は、ＨＳＣとの組合せ前に増幅される。本発明の方法に従ってＭＰおよびＨＳＣを単離し、増幅し、保存し、そして投与するためのキットも提供される。
５．添付の図面の簡単な説明
【００１７】
図面は例証目的だけのためであって、如何なる点でも本発明の教示の範囲を限定するものではない、と当業者は理解する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
６．本発明の詳細な説明
６．１  定義
本発明の開示に関して、本明細書中の記載で用いられる技術および科学用語は、特に別記しない限り、当業者により一般に理解される意味を有する。したがって以下の用語は、以下の意味を有するよう意図される：
【００１９】
「同種異系の」とは、同一種の成員に由来すること、同一種の成員に起源を有すること、あるいは同一種の成員であることを指し、この場合、成員は遺伝的血縁であるか、あるいは遺伝的非血縁であるが、しかし遺伝的に類似する。「同種異系移植片」とは、ドナーからレシピエントへの細胞または器官の移入を指し、この場合、レシピエントはドナーと同一種である。
【００２０】
「自己由来の」とは、同一被験者または患者に由来すること、または同一被験者または患者に起源を有することを指す。「自己由来移植片」とは、被験者自身の細胞または器官の収集物および再移植片を指す。
【００２１】
「委任骨髄前駆細胞」または「骨髄前駆細胞」または「ＭＰ」とは、骨髄細胞系列の最終分化細胞のいずれかに最後には発達し得るが、しかし典型的にはリンパ細胞系列の細胞に分化しない多能性または単能性前駆細胞を指す。それゆえ、「骨髄前駆細胞」は、骨髄細胞系列中の任意の前駆細胞を指す。骨髄細胞系列の委任前駆細胞は本明細書中で示されるような少能性ＣＭＰ、ＧＭＰおよびＭＥＰを含むが、しかし、単能性赤血球前駆細胞、巨核球前駆細胞、顆粒球前駆細胞およびマクロファージ前駆細胞も包含する。骨髄前駆細胞の異なる細胞集団は、それらの分化能力ならびに特徴的な一組の細胞マーカーの存在により、他の細胞と区別可能である。
【００２２】
「共通骨髄前駆細胞」または「ＣＭＰ」とは、顆粒球／単球（ＧＭＰ）前駆細胞ならびに巨核球／赤血球（ＭＥＰ）前駆細胞を生じるその能力により特性化される細胞を指す。これらの前駆細胞は、限定または非自己複製能力を有するが、しかし骨髄系樹状細胞、骨髄系赤血球系細胞、赤血球系細胞、巨核球、顆粒球／マクロファージ、顆粒球およびマクロファージ細胞を生じ得る。
【００２３】
「コンジェニック」とは、同一種の成員に由来すること、同一種の成員に起源を有すること、あるいは同一種の成員であることを指し、この場合、成員は、小遺伝子領域、典型的には単一遺伝子座（即ち単一遺伝子）を除いて、遺伝子的に同一である。「コンジェニック移植片」とは、ドナーまたはレシピエントからの細胞または器官の移入を指し、この場合、レシピエントは、単一遺伝子座を除いてドナーと遺伝子的に同一である。
【００２４】
「増幅」または「増幅される」とは、細胞の情況では、同一であり得るし、そうでない場合もある細胞の初期集団からの単数または複数の特徴的細胞型の数の増大を指す。増幅のために用いられる初期細胞は、増幅から生成される細胞と同一である必要はない。例えば増幅細胞は、ex-vivoまたはin vitro増殖ならびに細胞の初期集団の分化により産生され得る。この用語に含まれるのは、細胞の分化能力を特性化するために用いられる限界希釈検定である。
【００２５】
「機能的な」とは、細胞の情況では、単数または複数の限定機能検定により同定されるような特定細胞型と関連した一定の機能または活性を実施し得る細胞あるいはそれを保持する細胞を指す。例えば「機能的ＧＭＰ細胞」は、顆粒球およびマクロファージに最後は分化し得る前駆細胞であって、この場合、最終的分化細胞は顆粒球およびマクロファージとして機能する。
【００２６】
「移植片対宿主応答」または「ＧＶＨ」または「ＧＶＨＤ」は、異なるＭＨＣクラスのリンパ球が宿主中に導入されて、宿主に対するリンパ球の反応を生じる場合に起きる細胞性応答を指す。
【００２７】
「顆粒球／マクロファージ前駆細胞」または「ＧＭＰ」は、共通骨髄前駆細胞由来の、そして顆粒球およびマクロファージ細胞を生じるが、しかし典型的には骨髄系系列の赤血球系細胞または巨核球を生じないその能力により特性化される細胞を指す。
【００２８】
「単離される」とは、天然のものであれ、合成されたものであれ、その自然状態でそれが関連する少なくとも1つの他の生成物、化合物または組成物から分離される生成物、化合物または組成物を指す。
【００２９】
「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」は、造血系のすべての細胞型、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、リンパ系樹状細胞、骨髄系樹状細胞、顆粒球、マクロファージ、巨核球および赤血球系細胞に最後に分化し得るクローン原性自己複製多能性細胞を指す。造血系の他の細胞に関する場合、ＨＳＣは典型的には、特徴的一組の細胞マーカーの存在により限定される。
【００３０】
「マーカー表現型分類」とは、その表現型（例えば分化状態および／または細胞型）を確定するための細胞上のマーカーまたは抗原の同定を指す。これは、細胞上に存在する抗原を認識する抗体を用いる免疫表現型分類により実行され得る。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得るが、しかし一般的には他の細胞マーカーとの最小交差反応性を有するよう選択される。ある種の細胞分化または細胞表面マーカーは、細胞が由来する動物種に独特であるが、一方、他の細胞マーカーは種間で共通である、と理解されるべきである。種間の等価細胞型を限定するこれらのマーカーは、構造（例えばアミノ酸配列）における種差が存在する場合でも、同一マーカー同定を提供する。細胞マーカーとしては、ある種の情況においては細胞分化（ＣＤ）マーカーとも呼ばれる細胞表面分子、および遺伝子発現マーカーが挙げられる。遺伝子発現マーカーは、細胞型または分化状態を示す発現遺伝子の組である。一部は、遺伝子発現プロフィールは細胞表面マーカーを反映するが、しかしそれらは非細胞表面分子を含み得る。
【００３１】
「巨核球／赤血球前駆細胞」または「ＭＥＰ」とは、共通骨髄系前駆細胞由来の、そして赤血球および巨核球を生じるがしかし典型的には顆粒球、マクロファージまたは骨髄系樹状細胞を生じないその能力により特性化される細胞を指す。
【００３２】
「不適合同種異系の」とは、典型的には当業界で用いられる標準検定、例えば限定数のＭＨＣ抗原の血清学的分析または分子分析により確定されるような非同一主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原（即ちタンパク質）を有する同一種に由来すること、それに起源を有すること、またはその成員であることを指す。「一部不適合」とは、成員間で、典型的にはドナーおよびレシピエント間で試験されたＭＨＣ抗原の部分的適合を指す。例えば「半不適合」とは、試験されたＭＨＣ抗原の50％が2つの成員間で異なるＭＨＣ抗原を示すことを指す。「全」または「完全」不適合とは、試験されたすべてのＭＨＣ抗原が2つの成員間で異なっていることを指す。
【００３３】
「骨髄破壊的」または「骨髄破壊」とは、典型的には細胞傷害性作因または放射線への曝露による造血系の損傷または破壊を指す。骨髄破壊は、造血系を破壊する高用量の細胞傷害性作因または全身放射線照射によりもたらされる完全骨髄破壊を包含する。それは、非骨髄破壊的状態調節により引き起こされる完全未満の骨髄破壊状態も包含する。したがって非骨髄破壊的状態調節は、被験者の造血系を完全に破壊しない処置である。
【００３４】
「自己複製」とは、分裂し、そして親細胞の同一（例えば自己複製的）特質を有する少なくとも1つの娘細胞を生成する細胞の能力を指す。二次娘細胞は、特定の分化経路に委ねられ得る。例えば自己複製性造血幹細胞は分裂して、骨髄系またはリンパ系経路における分化に委ねられ得る1つの娘幹細胞ともう1つの娘細胞を生じる。方向付けされた前駆細胞は典型的には自己複製能力を失っており、そして細胞分裂時に、さらに分化された（即ち制限された）表現型を表示する2つの娘細胞を生じる。
【００３５】
「ソーティング」とは、それが細胞に関する場合、物理的特質あるいはマーカーの存在に基づいた細胞の分離（例えば側方散乱（ＳＳＣ）および前方散乱（ＦＳＣ）を用いるソーティング、あるいは標識化抗体を用いる蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ））、あるいは細胞マーカーの存在に基づいた細胞の分析、例えばソーティングを伴わないＦＡＣＳを指す。
【００３６】
「実質的に純粋な細胞集団」とは、特定細胞マーカー特質を有し、ならびに総細胞集団を作り上げている細胞の少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約75〜80％、さらに好ましくは少なくとも約85〜90％、最も好ましくは少なくとも約95％である分化能力を有する細胞の集団を指す。したがって「実質的に純粋な細胞集団」とは、指示検定条件下で、特定マーカー特質および分化能力を表示しない約50％より少ない、好ましくは約20〜25％より少ない、さらに好ましくは約10〜15％より少ない、最も好ましくは約5％より少ない細胞を含有する細胞の集団を指す。
【００３７】
「被験者」または「患者」は互換的に用いられ、そして指示された場合を除いて、哺乳類、例えばヒトおよび非ヒト霊長類、ならびにウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ブタおよびその他の哺乳類種を指す。
【００３８】
「同種同系の」とは、特に抗原または免疫学的反応に関して、遺伝子的に同一である同一種に由来すること、それに起源を有すること、またはその成員であることを指す。これらは、適合ＭＨＣ型を有する一卵性双生児を含む。したがって「同種同系移植片」とは、ドナーからドナーと遺伝子的に同一であるレシピエントへの細胞または器官の移入を指す。
【００３９】
「異種の」とは、異なる種、例えばヒトと齧歯類、ヒトとブタ、ヒトとチンパンジー等に由来すること、それに起源を有すること、またはその成員であることを指す。「異種移植片」とは、ドナーからドナーのものとは異なる種であるレシピエントへの細胞または器官の移入を指す。
【００４０】
６．２  造血幹細胞移植片の生着増強
本発明の開示は、幹細胞生着を促進するための方法、組成物およびキットを記載する。一態様では、それを必要とする患者におけるＨＳＣの生着を増強するための方法であって、患者に（ＭＰ）細胞を投与することを包含する方法が提供される。本明細書中で初めて実証されたように、ＭＰ細胞はＨＳＣの生着を増強し、それにより、特にＨＳＣ移植片が細胞数および／またはＨＬＡ不適合に関して最適以下である場合、ＨＳＣ移植片を受容している移植患者の生存を改善する。
【００４１】
造血幹細胞は自己複製可能な多能性幹細胞であり、そして許容状態下で造血系のすべての細胞型を生じるそれらの能力により特性化される。ＨＳＣ自己複製とは、分裂し、同一自己複製およびＨＳＣの分化能力を有する少なくとも1つの娘細胞を生じる；即ち、細胞分裂は付加的ＨＳＣを生じる。自己複製は、造血系の補充のための非分化幹細胞の連続的供給源を提供する。ＨＳＣを同定するために有用なマーカー表現型は、当業界で一般的に既知のものである。ヒトＨＳＣに関しては、細胞マーカー表現型としては、好ましくは、ＣＤ３４+ＣＤ３８-ＣＤ９０（Ｔｈｙ１）+Ｌｉｎ-が挙げられる。マウスＨＳＣに関しては、例示的マーカー表現型は、Ｓｃａ-１+ＣＤ９０+（例えばSpangrude, G.J. et al., Science 1: 661-673 (1998)参照）またはｃ-ｋｉｔ+ＴｈｙloＬｉｎ-Ｓｃａ-１+（例えばUchida, N. et al., J. Clin. Invest. 101(5): 961-966 (1998)参照）である。代替的ＨＳＣマーカー、例えばアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Storms et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. 96: 9118-23 (1999)参照）、ＡＣ１３３（Yin et al., Blood 90: 5002-12 (1997)参照）およびＣＤ１５０（ＳＬＡＭ）（Kiel Cell 2005, 121(7) 1109-21参照）も有益な用途を見出し得る。
【００４２】
ＨＳＣは、方向付けされたリンパ系または骨髄系前駆（ＭＰ）細胞を生じる。本明細書中で用いる場合、方向付けされた骨髄系前駆細胞とは、骨髄系列の最終分化細胞のいずれかに分化し得る細胞集団を指す。骨髄系前駆細胞に包含されるのは、限定または非自己複製能力により特性化されるがしかし細胞分裂して顆粒球／マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）ならびに巨核球／赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）を生成し得る細胞集団である共通骨髄系前駆細胞（ＣＭＰ）である。非自己複製細胞とは、細胞分裂を受けて娘細胞を生じ、この何れもが親細胞型の分化能力を有さないが、しかしその代わりに分化娘細胞を生じる細胞を指す。ＣＭＰを同定するために有用なマーカー表現型としては、当業界で一般に既知のものが挙げられる。ネズミ起源のＣＭＰ細胞に関しては、細胞集団は、マーカー表現型ｃ-ｋｉｔhigh（ＣＤ１１７）ＣＤ１６lowＣＤ３４lowＳｃａ-１negＬｉｎnegにより特性化され、そしてさらに、マーカー表現型ＦｃγＲloＩＬ-７Ｒαneg（ＣＤ１２７）により特性化される。ネズミＣＭＰ細胞集団は、Ｂ２２０、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、Ｔｅｒ１１９、Ｇｒ-１およびＭａｃ-１を含むマーカーの発現の非存在によっても特性化される。ヒト起源のＣＭＰ細胞に関しては、細胞集団はＣＤ３４+ＣＤ３８+により特性化され、そしてさらに、マーカー表現型ＣＤ１２３+（ＩＬ‐３Ｒα）ＣＤ４５ＲＡnegにより特性化される。ヒトＣＭＰ細胞集団は、細胞マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６およびＣＤ２３５ａの非存在によっても特性化される。種々の骨髄系前駆細胞に関するマーカー表現型の説明は、例えば米国特許第6,465,247号および第6,761,883号；Akashi, Nature 404: 193-197 (2000)ならびにManz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(18): 11872-7 (2002)（これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
【００４３】
骨髄系列のもう一つの方向付けられた前駆細胞は、顆粒球／マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）である。この前駆細胞集団の細胞は、顆粒球（例えば好塩基球、好酸球および好中球）およびマクロファージを生じるそれらの能力により特性化される。他の方向付けられた前駆細胞と同様に、ＧＭＰは自己複製能力を欠く。ネズミＧＭＰは、マーカー表現型ｃ-ｋｉｔhi（ＣＤ１１７）Ｓｃａ-１negＦｃγＲhi（ＣＤ１６）ＩＬ‐７ＲγnegＣＤ３４posにより特性化される。ネズミＧＭＰはさらにまた、マーカーＢ２２０、Ｔｅｒ１１９、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、Ｇｒ-１、Ｍａｃ-１およびＣＤ９０の発現を欠く。ヒトＧＭＰは、マーカー表現型ＣＤ３４+ＣＤ３８+ＣＤ１２３＋ＣＤ４５ＲＡ+により特性化される。ヒトＧＭＰ細胞集団は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６およびＣＤ２３５ａの非存在によっても特性化される。
【００４４】
ＣＭＰ由来である巨核球／赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）は、方向付けられた巨核球前駆細胞および赤血球前駆細胞に分化するそれらの能力により特性化される。成熟巨核球は、トロンボポイエチンにより調節される発生プロセスである血小板形成のための前駆体である多倍数体細胞である。赤血球系細胞は、エリスロポイエチンにより調節されるプロセスにより方向付けられた赤血球前駆細胞から形成され、そして最終的には成熟赤血球に分化する。ネズミＭＥＰは、細胞マーカー表現型ｃ-ｋｉｔhiおよびＩＬ‐７Ｒnegにより特性化され、そしてさらに、マーカー表現型ＦｃＲloおよびＣＤ３４lowにより特性化される。ネズミＭＥＰ細胞集団は、Ｂ２２０、Ｔｅｒ１１９、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、Ｇｒ-１およびＣＤ９０の非存在によっても特性化される。マウスＭＥＰに関する別の例示的マーカー表現型は、ｃ-ｋｉｔhighＳｃａ-１negＬｉｎneg/lowＣＤ１６lowＣＤ３４lowである。ヒトＭＥＰは、マーカー表現型ＣＤ３４+ＣＤ３８+ＣＤ１２３negＣＤ４５ＲＡnegにより特性化される。ヒトＭＥＰ細胞集団は、マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６およびＣＤ２３５ａの非存在によっても特性化される。
【００４５】
骨髄系列におけるさらなる限定前駆細胞は、顆粒球前駆体、マクロファージ前駆体、巨核球前駆体および赤血球前駆体である。顆粒球前駆細胞は、最終分化顆粒球、例えば好酸球、好塩基球、好中球に分化し得るそれらの能力により特性かされる。ＧＰは、典型的には、骨髄系列の他の細胞に分化しない。巨核球前駆細胞（ＭＫＰ）に関しては、これらの細胞は、最終分化巨核球に分化するが、しかし一般的には骨髄系列の他の細胞に分化しないそれらの能力により特性化される（例えばWO 2004/024875参照）。
【００４６】
ＨＳＣおよびＭＰ細胞は、種々の供給源、例えば骨髄、末梢血、臍帯血から、ならびに造血および骨髄前駆細胞を保有することが既知のその他の供給源、例えば肝臓、特に胎児肝臓から得られる。末梢血および臍帯血は、ＨＳＣおよびＭＰ細胞の富供給源である。細胞は、当業界で既知のそして一般に実行される方法を用いて得られる。例えば骨髄細胞を調製するための方法は、Sutherland et al., Bone Marrow Processing and Purging: A Practical Guide (Gee, A.P. ed.), CRC Press Inc. (1991)に記載されている。ＨＳＣおよびＭＰ細胞は、適切な増幅および分化技法を用いて、始原幹細胞供給源、例えば胚性幹細胞（Thomson et al., Science 282: 1145 (1998)）および生殖細胞（Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726 (1998)）からも得られる。
【００４７】
ＨＳＣおよびＭＰ細胞は、本明細書中で一般的に記載されるように、造血系を有する任意の動物種から得られる。好ましくは適切な動物は、哺乳類、例えば齧歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、霊長類（例えばヒト）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
いくつかの実施形態では、増幅幹細胞集団が用いられ得る。幹細胞は、サイトカインの混合物を含む別個の培地組成物中で増幅され得る。増幅幹細胞集団は、細胞起源の任意のメカニズムまたは理論により解釈または限定されるべきでなく、そして培養中で増殖される細胞ならびにＣＤ３４抗原の発現において増大する細胞、あるいはその組合せを含み得る。幹細胞発現技法は、当業界で既知である（例えば米国特許第6,326,198号、米国特許第6,338,942号、米国特許第6,335,195号）（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）。
【００４９】
いくつかの実施形態では、増幅ＭＰ集団が用いられ得る。ＭＰは、サイトカインの混合物を含む別個の培地組成物中で増幅され得る。増幅ＭＰ集団は、細胞起源の任意のメカニズムまたは理論により解釈または限定されるべきでなく、そして培養中で増殖される細胞ならびにＣＤ３４抗原の発現において増大する細胞、あるいはその組合せを含み得る。ＭＰ発現技法は、当業界で既知である（例えば同時係属中米国特許出願第11/259,592号（表題「Methods of Expanding Myeloid Cell Populations and Uses Thereof」）および米国特許第6,967,029号）（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）。
【００５０】
本発明は、自己由来または同種異系ＨＳＣ移植片に適用可能である。したがって一実施形態では、本発明の方法は、ＭＰ細胞を投与することによる自己由来ＨＳＣ移植片の生着増強を提供するが、この場合、ＭＰ細胞は、本明細書中で実証されるように、ＨＳＣ移植片または患者に関して自己由来または同種異系であり得る。他の実施形態では、本発明の方法は、ＭＰ細胞を投与することによる同種異系ＨＳＣ移植片の生着増強を提供するが、この場合、ＭＰ細胞は、本明細書中で実証されるように、ＨＳＣ移植片または宿主に関して自己由来または同種異系であり得る。したがって、本発明の方法に用いられるＨＳＣおよびＭＰ細胞がＨＳＣ移植片のＭＨＣにならびに移植片レシピエントに関して完全適合、部分不適合同種異系および／または完全不適合同種異系細胞であり、そして血縁ドナー（通常は同一親対立遺伝子を有する同胞）または非血縁ドナーからであり得る、と本発明は確定した。
【００５１】
ＨＳＣおよびＭＰ細胞は、実質的に純粋な細胞集団を得るために、さらなる選択および精製（陽性および陰性選択方法の両方を含み得る）にも付され得る。一態様では、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）（フローサイトメトリーとも呼ばれる）は、異なる細胞集団を分類し、分析するために用いられる。ＨＳＣまたはＭＰ細胞集団に特異的な細胞マーカーを有する細胞は、細胞マーカーを結合する抗体または典型的には抗体の混合物でタグづけされる。異なるマーカーに向けられる各抗体は、検出可能分子、特に他の抗体とカップリングされた他の蛍光染料から弁別され得る蛍光染料と接合される。タグ化または「染色」細胞の流れは、検出される細胞から蛍光色素および発光スペクトルを引き出す光源を通過させられて、特定の標識化抗体の存在を確定する。異なる蛍光色素の同時検出（当業界では、多色蛍光細胞選別とも呼ばれる）により、異なる組の細胞マーカーを表示する細胞が同定され、集団中の他の細胞から単離され得る。他のＦＡＣＳパラメーター、例えば側方散乱（ＳＳＣ）、前方散乱（ＦＳＣ）および生体染料染色（例えばヨウ化プロピジウムを用いる）（例として挙げられるが、これらに限定されない）は、サイズおよび成育可能性に基づいた細胞の選択を可能にする。ＨＳＣおよび前駆細胞のＦＡＣＳソーティングおよび分析は、とりわけ、米国特許第5,137,809号；第5,750,397号；第5,840,580号；第6,465,249号；Manz, M.G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 11872-11877 (2002)；およびAkashi, K. et al., Nature 404 (6774): 193-197 (2000)に記載されている。蛍光活性化細胞ソーティングに関する一般ガイダンスは、例えばShapiro, H.M., Practical Flow Cytometry, 4th Ed., Wiley-Liss (2003)およびOrmerod, M.G., Flow Cytometry: A Practical Approach, 3rd Ed., Oxford University Press (2000)に記載されている。
【００５２】
細胞の精製は、本明細書中に記載される方法の組合せも包含する、と理解されるべきである。典型的組合せは、望ましくない細胞および細胞材料の大部分を除去するのに有効である初期手順、例えば白血球泳動法を包含する。第二ステップとしては、基質に結合される抗体に関する免疫吸着による1つまたは複数の前駆細胞集団に共通のマーカーを発現する細胞の単離を包含し得る。例えば抗ＣＤ３４抗体を含有する磁気ビーズは、ＣＤ３４抗原を一般的に発現するＨＳＣ、ＣＭＰおよびＧＭＰ細胞を結合し、捕捉し得る。高分解能の異なる細胞型を提供する付加的ステップ、例えば一組の特定細胞マーカーに対する抗体を用いるＦＡＣＳソーティングは、所望の細胞の実質的に純粋な集団を得るために用いられ得る。別の組合せは、抗ＣＤ３４抗体と結合された磁気ビーズを用いる初期分離と、その後のＦＡＣＳを用いる付加的回数の精製を包含し得る。
【００５３】
治療作用を達成するために必要とされる細胞の量は、特定の目的のために慣用的手順に従って経験的に確定される。一般的に、治療目的のために細胞を投与するために、細胞は、薬理学的有効用量で投与される。「薬理学的有効量」または「薬理学的有効用量」とは、特に被験者の生着または生存のための、所望の生理学的作用を生じるのに十分な量、または所望の結果を達成し得る量である。治療的利益は、改善が実現されるか否かにかかわらず、基礎を成す疾患または障害の進行を止めることまたは遅くすることも包含する。上記のような薬理学的有効用量は、以下でさらに記載されるように、細胞と組合せて用いられる治療化合物にも当てはまる。
【００５４】
幹細胞移植片は、患者の年齢、体重および健康状態、適応症の性質および重症度の一関数として変わり得る。ＨＳＣに関する適切な投与量範囲は、これらの考慮事項によって変わる。
【００５５】
幹細胞移植を成功させるためには、最適ＨＳＣ移植片は閾値数の細胞／患者体重1 kgを要する。発表済みデータおよび近年の臨床試験からの結論によれば、最適ＨＳＣ移植片は、一般的に少なくとも約1.0×106ＣＤ３４＋細胞／患者体重1kg、少なくとも約2.0×106ＣＤ３４＋細胞／患者体重1kg、好ましくは少なくとも約3.0×106ＣＤ３４＋細胞／患者体重1kg、さらに好ましくは約4.0×106ＣＤ３４＋細胞／患者体重1kg、最も好ましくは5.0×106ＣＤ３４＋細胞／患者体重1kgを含有すべきである（例えばOlivieri, A. et al. (1998) Haematologica, 83: 329-337；Mavroudis, D. et al. (1996) Blood, Vo. 88, No. 8 (October 15); pp 3223-3229；Singhal, S. et al. (2000) Bone Marrow Transplantation, 26, 489-96；Bittencourt, H. et al. (2002) Blood, Vol. 99, No.8 (April 15); 2726-2733参照）。
【００５６】
好ましい態様では、本発明の方法および組成物は、当業界で既知の方法により確定した場合に、最適未満のＨＳＣ用量、例えば中央値未満の治療利益を生じる用量を有する移植片を用いる用途を見出す。いくつかの実施形態では、ＭＰ細胞の投与は、サブオプティマル用量の造血幹細胞の生着を増強する。いくつかの実施形態では、被験者の生存は、サブオプティマル用量の造血幹細胞と一緒にＭＰ細胞を投与することにより増大され得る。このような方法では、サブオプティマル移植片と一緒に患者にＭＰを投与すると、処置の有効性における全体的改善を生じる。
【００５７】
したがって一態様では、本発明の方法は、一般的に約5.0×106ＣＤ３４＋細胞／患者体重1kg未満、さらに特定的には約4.0×106ＣＤ３４＋細胞／患者体重1kg未満、好ましくは約3.0×106ＣＤ３４＋細胞／患者体重1kg未満、さらに好ましくは約2.0×106ＣＤ３４＋細胞／患者体重1kg未満、または最も好ましくは約1.0×106ＣＤ３４＋細胞／患者体重1kg未満を含むサブオプティマルＨＳＣ移植片と一緒にＭＰ移植片を用いる。
【００５８】
臍帯血単位は、単一胎盤および臍帯から収集される血液である。臍帯血単位中の有核細胞の数は、変化する。さらに、臍帯血単位中の有核細胞の数は、凍結および解凍後により少なくなり得る。したがってＨＳＣを投与するに際しては、有核細胞数が当該単位の解凍の前に測定されるか、後に測定されるかに留意することは得るところが大きい。いくつかの実施形態では、サブオプティマル移植片は、2未満の臍帯血単位を含む。いくつかの実施形態では、サブオプティマル移植片は単一臍帯血単位を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、サブオプティマル移植片は、患者に投与される有核細胞（ＮＣ）／患者体重1 kgの一関数である。一実施形態では、注入のための最低以下のＵＣＢ移植片は、約4×107有核細胞／患者体重1kgである。一実施形態では、サブオプティマルＵＣＢ移植片は、3.0×107有核細胞／患者体重1kg未満、好ましくは約3.5×107有核細胞／患者体重1kg未満である。一実施形態では、注入のためのサブオプティマルＵＣＢ移植片は、約2または2.5×107有核細胞／患者体重1 kgである。
【００６０】
骨髄または末梢血供給源からの最適ＨＳＣ移植片に関する閾値細胞数は、一般的にＵＣＢ移植片に関するものより大きいおよその大きさである。一実施形態では、これらの供給源からの注入のためのサブオプティマル移植片は、約5×108有核細胞／患者体重1kgである。一実施形態では、サブオプティマル移植片は、4または4.5×108有核細胞／患者体重1kg未満、好ましくは約4.1×108有核細胞／患者体重1kg未満である。一実施形態では、サブオプティマル移植片は、約3.5×108有核細胞／患者体重1kg未満である。
【００６１】
いくつかの実施形態では、サブオプティマル移植片は、患者に投与されるＣＤ３４+細胞の数の一関数である。一実施形態では、注入のためのサブオプティマルＵＣＢ移植片は、約5×105ＣＤ３４+細胞／患者体重1kg未満である。一実施形態では、注入のためのサブオプティマルＵＣＢ移植片は、約3.5〜4.5×105ＣＤ３４+細胞／患者体重1kg未満、好ましくは約4×105ＣＤ３４+細胞／患者体重1kg未満である。一実施形態では、注入のためのサブオプティマルＵＣＢ移植片は、約3×105ＣＤ３４+細胞／患者体重1kg未満である。
【００６２】
骨髄または末梢血供給源からの最適ＨＳＣ移植片に関する閾値細胞数は、一般的にＵＣＢ移植片に関するものより大きいおよその大きさである。一実施形態ではこれらの供給源からの注入のためのサブオプティマル移植片は、約5×106ＣＤ３４+細胞／患者体重1kg未満である。一実施形態では、注入のためのサブオプティマル移植片は、約4×106ＣＤ３４+細胞／患者体重1kg未満、好ましくは約3×106ＣＤ３４+細胞／患者体重1kg未満である。一実施形態では、注入のためのサブオプティマル移植片は、約2または1×106ＣＤ３４+細胞／患者体重1kg未満である。
【００６３】
いくつかの実施形態では、サブオプティマル移植片はＭＨＣでの不適合の関数であり、例えばサブオプティマル移植片は、一部または全部不適合同系異種ドナーからであり得る。いくつかの実施形態では、サブオプティマル移植片は、患者に関してＭＨＣ遺伝子座で少なくとも一部不適合である。一実施形態では、サブオプティマル移植片は、1つまたは複数の抗原に関して不適合である。一実施形態では、サブオプティマル移植片は、少なくとも2つの抗原に関してＭＨＣで不適合である。抗原は、同一ＭＨＣ遺伝子座内または異なるＭＨＣ遺伝子座内であり得る。
【００６４】
ＭＨＣ不適合の程度の確定は、当業界で既知でありそして用いられる標準試験を使用する。例えば移植生物学において重要であると確認されたヒトにおけるＭＨＣ遺伝子の少なくとも6つの主要部類が存在する。ＨＬＡ-Ａ、ＨＬＡ-Ｂ、ＨＬＡ-ＣはＨＬＡクラスＩタンパク質をコードするが、一方、ＨＬＡ-ＤＲ、ＨＬＡ-ＤＱおよびＨＬＡ-ＤＰはＨＬＡクラスＩＩタンパク質をコードする。これらの各群内の遺伝子は、ヒト集団中に見出される多数のＨＬＡ対立遺伝子または変異体において反映されるように、高多型性であり、そして個体間のこれらの群における差は、移植細胞に対する免疫応答の強度に関連する。ＭＨＣ適合の程度を確定するための標準方法は、ＨＬＡ-ＢおよびＨＬＡ-ＤＲ、またはＨＬＡ-Ａ、ＨＬＡ-ＢおよびＨＬＡ-ＤＲ群内の対立遺伝子を検査する。したがって試験は、それぞれ2または3つのＨＬＡ群内の少なくとも4、好ましくは少なくとも6つのＭＨＣ抗原から成る。
【００６５】
血清学的ＭＨＣ試験において、各ＨＬＡ抗原型に対して向けられる抗体は一被験者（例えばドナー）からの細胞と反応させられて、抗体と反応するある種のＭＨＣ抗原の存在または非存在を確定する。これは、多の被験者（例えばレシピエント）の反応性プロフィールと比較される。抗体とＭＨＣとの反応は、典型的には、抗体を細胞とともにインキュベートし、次に補体を付加して、細胞溶解を誘導する（即ちリンパ球傷害性試験）ことにより確定される。反応は検査され、反応において溶解された細胞の量により等級分けされる（Mickelson, E. and Petersdorf, E.W., Hematopoietic Cell Transplantation, Thomas, E.D. eds., pg 28-37, Blackwell Scientific, Malden, MA (1999)）。その他の細胞ベースの検定としては、標識化抗体を用いるフローサイトメトリーまたは酵素結合免疫検定（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。
【００６６】
ＭＨＣ型を確定するための分子方法は、一般的に、合成プローブおよび／またはプライマーを用いて、ＨＬＡタンパク質をコードする特定遺伝子配列を検出する。合成オリゴヌクレオチドは、特定のＨＬＡ型と関連した制限断片長多型を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いられ得る（Vaughn, R.W., Methods in Molecular Biology: MHC Protocols 210: 45-60 (2002)）。あるいはプライマーは、直接ＤＮＡシーケンシング、制限断片多型分析（ＲＦＬＰ）、あるいは一連の配列特異的オリゴヌクレオチドプライマー（ＳＳＯＰ）によりさらに検査され得る（Petersdorf, E.W. et al., Blood 92(10): 3515-20 (1998)；Morishima, Y. et al., Blood 99(11): 4200-6 (2002)；およびMiddleton, D. and Williams, F., Methods in Molecular Biology: MHC Protocols 210: 67-112 (2002)）。
【００６７】
サブオプティマル移植片は上記のように確定されるが、しかし本発明の開示は、このような測定基準に限定されない。代替的測定基準は、当業者に既知である。例えばサブオプティマル移植片は、例えば収集され、解凍され、または投与されるコロニー形成細胞の数、顆粒球-マクロファージコロニー形成細胞の数、バースト形成単位-赤血球系細胞の数、あるいはコロニー形成単位-顆粒球赤血球系単球マクロファージ細胞の数により確定し得る。
【００６８】
一般的に、治療目的のためにＭＰ細胞を投与するために、細胞は薬理学的有効用量で投与される。「薬理学的有効量」または「薬理学的有効用量」とは、特に障害または疾患状態を治療するために、例えば障害または疾患の1つまたは複数の症候または症状発現を低減するかまたは排除するために、所望の生理学的作用を生じるのに十分な量、または所望の結果を達成し得る量である。治療的利益は、改善が実現されるか否かにかかわらず、基礎を成す疾患または障害の進行を止めることまたは遅くすることも包含する。
【００６９】
治療作用を達成するために必要とされるＭＰ細胞の量は、特定の目的のために慣用的手順に従って経験的に確定され得る。ＭＰ細胞の量は、患者の年齢、体重および健康状態、適応症の性質および重症度の一関数として広範に変わり得る。さらに、投与されるＭＰ細胞の量は幹細胞移植片に伴って変わり得るが、しかし概して、ＭＰ細胞の量は、ＨＳＣ生着を増強する量で投与される。いくつかの実施形態では、ＭＰ細胞の量は、患者生存を増大する量で投与される。
【００７０】
いくつかの実施形態では、注入されるＭＰ細胞の数は、約1×105〜約1×109細胞／体重1 kg、さらに好ましくは約1×106〜約1×108細胞／kg、最も好ましくは約1×107細胞／kg、または必要な場合はそれ以上であり得る。
【００７１】
患者への細胞の移植は、当業界で一般的に用いられる方法により成し遂げられる。投与の好ましい方法は、静脈内注入である。上記のように、輸注される細胞の数は、性別、年齢、体重、疾患または障害の種類、障害の段階、細胞集団中の所望の細胞のパーセンテージ（例えば細胞集団の純度）、ならびに治療利益を生じるために必要とされる細胞数といったような因子を考慮に入れる。
【００７２】
細胞は、1回の注入で、あるいは治療作用を生じるのに十分な限定時間に亘っての連続注入により、投与され得る。処置が連続注入を包含する場合、異なる集団の細胞が注入され得る。製薬上許容可能な担体は、以下でさらに説明されるように、患者への細胞の注入のために用いられ得る。これらは典型的には、例えば緩衝生理食塩水（例えばリン酸塩緩衝生理食塩水）または非補足基本細胞培地、あるいは当業界で既知の培地を含み得る。いくつかの実施形態では、ＭＰ細胞は、幹細胞移植と同時に、その後または前に、用いられ得る。
【００７３】
骨髄系前駆細胞を投与する造血幹細胞移植片の生着の増強方法は、種々の障害の処置のために用いられ得る。いくつかの実施形態では、障害は、疾患または骨髄破壊的処置により引き起こされる造血の不足に関する。本明細書中で用いる場合、「処置」とは、治療的または予防的処置、あるいは疾患、障害または望ましくない状態に関する抑制的測定を指す。処置は、疾患症候の開始前および／または臨床的症状発現または疾患または症状の発現の後に、適切な形態で被験者細胞を投与して、疾患重症度を低減し、疾患進行を止め、または疾患を排除することを包含する。疾患の防止としては、好ましくは障害に対する感受性増大を示す被験者における、障害または疾患の症候の開始の延長または遅延が挙げられる。
【００７４】
本開示はさらに、固形器官、細胞または組織移植の分野における造血幹細胞移植片の生着を増強するためのＭＰ細胞の使用を提供する。例として本開示はさらに、心臓、肺、肝臓、腎臓、島細胞、皮膚、内分泌器官または膵臓の移植における造血幹細胞移植片の生着を増強するためのＭＰ細胞の使用を提供するが、これらに限定されない。
【００７５】
６．３  補助的処置
種々の補助的処置は、本明細書中に記載される方法とともに用いられ得る。一態様では、補助的処置としては、特に、抗真菌剤、抗細菌剤および抗ウイルス剤が挙げられる。
【００７６】
一態様では、補助的投与剤は、抗真菌剤である。真菌感染は、骨髄破壊療法およびＨＳＣＴを受けたことのある患者においては有意の問題である。生着遅延を示すレシピエントおよびＧＶＨＤを発症する患者は、典型的には真菌感染に対して高い危険に曝されている。真菌感染の型は変更され、そして例としては特に、カンジダ症（例えばカンジダ・クルセイcandida krusei、カンジダ・グラブラタcandida glabrata、カンジダ・アルビカンスcandida albicans、カンジダ・トロピカリスcandida tropicalisによる）、アスペルギルス症（例えばアスペルギルス・フミガツスaspergillus fumigatus、アスペルギルス・フラブスaspergillus flavusによる）、ムコール菌症（例えばリゾビウム・アリズスrhizobium arrhizus、アブシジア・コリムビフェラabsidia corymbifera、リゾムコール・プシルスrhizomucor pusillusによる）、クリプトコッカス症、ヒストプラズマ・カプスラーツム、コクシジオイデス・イミチスが挙げられる。
【００７７】
補助的投与のための抗真菌剤は、一般的には全身用抗真菌剤である。この型の有用な一抗真菌剤は、ポリエンマクロライド系抗生物質の群からのアンフォテリシンＢである。アンフォテリシンＢは、例えばデオキシシクロレートとの複合体として；コレステリル・スルフェートを含有するコロイド懸濁液中で；そしてダイズ・レシチン、コレステロールおよびジステアロイルホスファチジルグリセロールから作製されるリポソーム中に封入された種々の処方物中に、当業界で既知のその他の処方物中に利用可能である。
【００７８】
別の抗真菌剤は、フルシトシン（フッ化ピリミジン系薬剤）である。真菌によるフルシトシンの脱アミノ化は、５-フルオロウラシル、代謝拮抗剤およびＤＮＡ合成阻害剤を生じる。フルシトシンは典型的には、クリプトコッカスおよびカンジダ症菌の感染症のために用いられる。単独で用いられるがしかし、フリシトシンは一般的に、アンフォテリシンＢと組合せて用いられる。
【００７９】
イミダゾールおよびトリアゾールは、アゾールベースの抗真菌剤の広範な一クラスを代表する。イミダゾールおよびトリアゾールは、ステロール１４-α-デメチラーゼを阻害して、エルゴステロールの生合成損傷ならびに細胞膜ベースの活性、例えば電子運搬の崩壊を引き起こす、と考えられる。アゾールベースの抗真菌剤は、ある型のカンジダ症菌、例えばカンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタおよびカンジダ・ネオフォルマンスcandida neoformansに対して有効である。全身投与に適した例示的アゾール抗真菌剤としては、特に、ケトコンザオール、イトラカナゾール、フルコナゾール、エコナゾール、ボリコナゾールおよびテルカノゾールが挙げられる。
【００８０】
真菌感染のほかに、好中球減少症患者は、種々の細菌性病原体による感染に感受性である。骨髄破壊レジメンおよびＨＳＣＴを受けている患者は、グラム陽性細菌（例えば連鎖球菌streptococcusおよび黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureus）およびグラム陰性細菌（例えば大腸菌E. coliおよび緑膿菌Pseudomonas aeruginosa）の両方による高率の細菌感染を有する。敗血症は、一般的出来事である。さらに生着遅延、ならびに封入細菌、例えば肺炎球菌streptococcus pneumoniaeまたはインフルエンザ菌haemophilus influenzaに対する免疫応答の回復損傷は、ＧＶＨＤを有する移植片レシピエントに関する罹患率を増大する。
【００８１】
補助的抗細菌療法は、特定細菌病原体に適した任意の既知の抗生物質を使用し得る。これらの例としては、広範囲の抗生物質ならびにより多くの標的化抗細菌性化合物の両方が挙げられる。増幅骨髄細胞に適切な種々のクラスの抗細菌剤としては、例えばキノロンおよびフルオロキノロン、β-ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド、テトラサイクリン、マクロライド、ならびにその種々のcogenerが挙げられるが、これらに限定されない。例示的キノロン化合物としては、シプロフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシン、ロメフロキサシンおよびモキシフロキサシンが挙げられる。例示的β-ラクタム系抗生物質としては、ペニシリン（例えばペニシリンＧ、ペニシリンＶ）、アンピシリン、カルベニシリン、メチシリン、カルバペネムおよびセファロスポリン（例えばセファロシン、セファマンドール、セファクロル、セフォニシド、セフォテタン、セファトキシム、セフタジジム、セフチゾキシム、セフェピム）が挙げられる。例示的アミノグリコシドとしては、ネオマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシンおよびネチルミシンが挙げられる。例示的マクロライドとしては、エリスロマイシン、クラリスロマイシンおよびアジスロマイシンが挙げられる。その他の抗生物質は、当業者に明らかである。
【００８２】
ウイルス感染も、骨髄破壊患者およびＨＳＣＴにおいては問題である。一般的に、ウイルス感染の危険増大は、骨髄破壊療法によりもたらされる損傷細胞媒介免疫性に起因する。これらの感染の多くは、血清陽性患者においてまたは血清陽性ドナーの細胞中に存在する潜伏ウイルスの再活性化から生じる。一般に遭遇するウイルスとしては、特に、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヘルペスウイルス-６、エプスタイン・バーウイルス；アデノウイルス等が挙げられる。細胞注入に付加するものとして、選択される抗ウイルス化合物は、患者が遭遇するウイルスに適したものである。有用な抗ウイルス化合物としては、例えばアシクロビル、シドフォビル、ガンシクロビル、イドクスウリジン、ペンシクロビル、バルガンシクロビル、バラシクロビル、ビダラビン、アマンタジン、リマンタジン、ザナミビル、フォミビルセン、イミキモドおよびリバビリンが挙げられるが、これらに限定されない。レトロウイルスに対して向けられる治療薬としては、特に、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例えばジドブジン、ジダノシン、スタブジン、ザルシタビン、ラミビヅジン）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例えばネビラピン、エファビレンズ、デルビルジン）、ならびにプロテアーゼ阻害剤（例えばサキニビル、インジナビル、リトナビル、ネルフィナビル、アンプレナビルおよびロピナビル）が挙げられる。
【００８３】
抗真菌剤、抗細菌剤および抗ウイルス剤は、感染の発生を低減するための予防薬として、あるいは疾患の出現時に用いられ得る。予防薬は、免疫抑制患者に共通の真菌感染のために、そして血清陽性患者または血清陽性移植患者におけるウイルス感染のために、特に指示される。したがって治療目的のための実施形態は、ＨＳＣ、ＭＰ細胞ならびに抗真菌、抗細菌または抗ウイルス化合物の組合せを包含する。
【００８４】
さらなる一実施形態では、補助的投与剤は、最終分化骨髄細胞、特に顆粒球、マクロファージ、巨核球および赤血球系細胞の分化および動員を増強するサイトカインまたは増殖因子である。顆粒球発達を増強するために、サイトカインＣ-ＣＳＦおよびＧＭ-ＣＳＦが用いられ得る。Ｇ-ＣＳＦは、ＨＳＣＴにおける好中球の生着および産生を加速するのに有効である。別の実施形態では、サイトカインまたは増殖因子は、トロンボポイエチンである。ＴＰＯの投与は、移植前駆細胞の生着を増強し、そして巨核球および血小板の発達を促進する（Fox, N et al., J. Invest. 110: 389-394 (2002)；Akahori, H. et al., Stem Cells 14(6): 678-689 (1996)）。
【００８５】
種々のビヒクルおよび賦形剤ならびに投与経路が、当業者に明らかであるように、補助療法のために用いられ得る。代表的処方技法は、特に、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed., Mack Publishing Co., Easton, , PA (1995)およびHandbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed, Kibbe, A.H. ed., Washington DC, American Pharmaceutical Association (2000)（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に教示されている。
【００８６】
製剤組成物は、一般的に、製薬上許容可能な担体、ならびに薬理学的有効量の化合物あるいはその混合物またはその適切な塩を含む。製剤組成物は、粉末、顆粒、溶液、懸濁液、エーロゾル、固体、ピル、錠剤、カプセル、ゲル、局所用クリーム、座薬、経皮パッチおよび当業界で既知のその他の処方物として処方され得る。
【００８７】
本明細書中で用いる場合、「製薬上許容可能な担体」は、製剤組成物を処方するに際して、当業者に既知の標準製薬上許容可能担体のうちのいずれかを含む。したがって製薬上許容可能な塩としてまたは接合体として存在するような化合物は、それ自体、製薬上許容可能な希釈剤中の、例えば生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、水性エタノール中の、あるいはグルコース、マンニトール、デキストラン、プロピレングリコール、油（例えば植物油、動物油、合成油等）、微晶質セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸カルシウム、ゼラチン、ポリソルベート８０等の溶液中の処方物として、あるいは適切な賦形剤中の固体処方物として、調製され得る。
【００８８】
製剤組成物はしばしば、1つまたは複数の緩衝剤（例えば中性緩衝生理食塩水またはリン酸塩緩衝生理食塩水）、炭水化物（例えばグルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール等）、静菌剤、キレート化剤、例えばＥＤＴＡまたはグルタチオン、処方物をレシピエントの血液と等張、低張または弱低張性にさせる溶質、沈殿防止剤、増粘剤、防腐剤、風味剤、甘味剤および着色化合物を適切な場合はさらに含む。
【００８９】
当業者に既知の任意の適切な担体が組成物中に用いられ得るが、しかし担体の種類は典型的には、投与方式によって変わる。治療用組成物は、任意の適切な投与方法、例えば経口、鼻、粘膜、直腸、膣、局所、静脈内、腹腔内、皮内、皮下および筋肉内投与のために処方され得る。
【００９０】
本明細書中に記載される製剤組成物は、単位用量または多用量容器中、例えば密封アンプルまたはバイアル中で提供される。このような容器は、典型的には、使用するまで処方物の滅菌性および安定性を保存するような方法で密封される。概して、処方物は、上記のような油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液として貯蔵され得る。代替的には、製剤組成物は、凍結-乾燥状態で貯蔵され、使用直前に滅菌液体担体の付加のみを要し得る。
【００９１】
宿主に投与される量は、何が投与されているか、投与の目的（例えば予防または治療）、宿主の状態、投与方法、投与回数、投与間の間隔等によって変わる。これらは当業者により経験的に確定され、そして治療的応答の程度に関して調整され得る。適切な用量を確定するに際して考慮すべき因子としては、被験者のサイズおよび重量、被験者の年齢および性別、症候の重症度、疾患の段階、作用物質の送達の方法、作用物質の半減期、作用物質の効力が挙げられるが、これらに限定されない。考慮すべき疾患の段階としては、疾患が急性であるか、慢性であるか、再発または寛解期、ならびに疾患の進行性が挙げられる。
【００９２】
治療的有効量に関する投与量および投与回数を確定することは、当業者の技術の範囲内である。例えば初期有効用量は、細胞培養またはその他のin vitro検定から概算され得る。用量は次に、動物モデルで処方されて、循環濃度または組織濃度、例えば細胞培養検定により確定されるようなＩＣ50の濃度を生じる。
【００９３】
６．４  キット
本明細書中に記載される方法は、ＨＳＣ生着を増強するためのキットにより促進され得る。キットは、細胞、例えばＨＳＣ、ＭＰ（これらに限定されない）、例えば増幅および／または単離細胞、および／または補助的療法用化合物、ＨＳＣおよびＭＰを単離または増幅するための手段、患者に細胞を投与するための手段、あるいはその任意の組合せを含有し得る。キットは、製薬上許容可能な担体、生理学的に許容可能な担体、使用説明書、容器、投与のための器、抗体のいずれかまたはすべて、あるいはその任意の組合せを任意に包含し得る。標識は、典型的にはキットに添付し、そして書かれているかまたは記録された任意の構成要素（これは電子的またはコンピューター読取り可能形態（例えばディスク、光学ディスク、メモリーチップまたはテープ）であり得る）を含み、使用説明書またはキット内容物の使用のためのその他の情報を提供する。
【実施例】
【００９４】
７．実施例
本発明の教示の態様は、以下の実施例を考慮に入れてさらに理解され得るが、これらは如何なる点でも本発明の教示の範囲を限定するよう意図されるべきでない。
【００９５】
７．１  実施例１：実験方法
マウスからのＨＳＣまたはＭＰの調製    マウス骨髄細胞を得るために、動物を安楽死させて、大腿骨／脛骨を取り出し、筋肉を取り除く。乳鉢と乳棒を用いて、骨を押し潰してパルプ状にして、骨髄をナイロンスクリーンを通して濾過し、次に1200 RPMで5分間遠心分離する。細胞を、氷上で3〜4分間、1 mlのＡＣＫ溶液（0.3 MＮＨ4Ｃｌ、0.2 MＫＨＣＯ3、MiliQ濾過水）中に再懸濁し、次に、試験管に染色媒質（2％ＦＣＳおよび2 mMＥＤＴＡ、w/oカルシウム、w/oマグネシウム、w/oフェノールレッドを含有するハンクス緩衝生理食塩水）を充填することにより洗浄する。細胞を遠心分離し、濾過し、染色媒質中に再懸濁して、マウスＩｇＧ（1 mg/mlストックの1:50希釈液、Sigma, St. Louis, MO）を付加する。細胞を氷上で10〜15分間インキュベートして、次に染色媒質中の100 μl／マウスの最終容積中に10 μl／マウスの容積でＣＤ１１７マイクロビーズ（Miltenyi Biotech, Auburn CA）と混合する。細胞を、氷上で25分間インキュベートする。細胞を洗浄し、最終容積〜1 ml／マウスで染色媒質中に再懸濁して、ナイロンスクリーンを通して濾過する。posseld設定を用いて、メーカーの指示に従って、AMAC（Miltenyi, Auburn, CA）を用いて、細胞を濃化する。濃化後、適切な濃度で付加される以下の指示接合抗体（eBioscience, San Diego, CA）とともに染色媒質中に約1×108細胞／mlで細胞を再懸濁する：Ｓｃａ-１アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ｃ-ｋｉｔＲ-フィコエリトリン-シアニン７タンデム（ＰＥ-Ｃｙ７）、Ｔｈｙ-１．１フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、系統（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、Ｂ２２０、ｍａｃ-１、Ｇｒ-１およびＴｅｒ１１９）Ｒ-フィコエリトリン（ＰＥ）。細胞を氷上で25分間インキュベートし、洗浄し、遠心分離し、そして染色媒質中に再懸濁する。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を付加して、死細胞を除外する。マウスＫＴＬＳ-ＨＳＣ、ｃ-ｋｉｔhighＴｈｙlowＳｃａ-１pos系統negまたはマウスＭＰｃ-ｋｉｔhighＴｈｙnegＳｃａ-１neg系統neg/lowをＦＡＣＳにより単離する。
【００９６】
細胞培養および増幅    Ｌｉｎneg/lowＫＴＬＳ-ＨＳＣをＡＫＲマウス（Ｈ２Ｋｋ）から類別し、サイトカインおよび増殖因子組合せｃ-ＫｉｔＬ、ＦＬ、ＴＰＯおよびＩＬ‐６を含有する500 μl／ウエルの無血清培地（X-Vivo 15基本培地（Cambrex Bioscience, MD）；ペンストレップ（100×）、グルタマックス（100×）、２-メルカプトエタノール（5×10-5 M）、ｃ-ＫｉｔＬ（50 ng/ml）、ＦＬ（30 ng/ml）、ＴＰＯ（5 ng/ml）およびＩＬ‐６（10 ng/ml））（Biosource, Camarillo, CAおよびR & D Systems, Minneapolis, MN）中でプレート化する。細胞を、24ウエルプレート中で約10,000細胞／ウエルでプレート化する。細胞を7日間培養して、ＭＰｃ（培養由来ＭＰ）を得る。細胞を2日目に500 μl／ウエルで育てて、4日目に、培地の半分を新鮮な培地と取り替える。5日目に、1 mlの新鮮な培地を付加しながら細胞を6ウエルプレートに移す。7日目に、培養細胞を収集し、3つの小アリコートを分析のために取り出す。
【００９７】
増幅細胞集団中のマウスＨＳＣに関する染色：  細胞を各ウエルから取り出し、洗浄し、次に対応する円錐形ＦＡＣＳ管に移して、血球計により計数する。細胞を1100 rpmで5分間遠心分離し、上清を除去する。50 μlの遮断抗体（ラットＩｇＧおよびマウスＩｇＧ 1:50）を付加し、10分間インキュベートして、その後、適切な濃度の以下の抗体（eBioscience, San Diego, CA）を用いて、50〜100 μlの抗体溶液を付加する：Ｓｃａ-１アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｔｈｙ-１．１フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ｃ-ｋｉｔ・フィコエリトリン-シアニン７タンデム（ＰＥ-Ｃｙ７）、Ｂ２２０、Ｍａｃ-１、ＧＲ-１  Ｒ-フィコエリトリン（ＰＥ）。氷上で25分間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、遠心分離し、そしてＰＩを含有する染色培地中に再懸濁する。細胞を、ＦＡＣＳによりＨＳＣに関して分析する。
【００９８】
培養増幅細胞集団中の骨髄前駆体に関する染色：  上記のＨＳＣ細胞の染色のために実行したのと同じ方法で、細胞を調製する。50 μlの遮断抗体（ラットＩｇＧおよびマウスＩｇＧ 1:50）とともにインキュベート後、50〜100 μlの系統-ビオチン（Ｔｅｒ１１９、Ｇｒ-１、Ｂ２２０）を各試験管に付加し、その後、氷上に20分間置く。細胞を2〜3 mlのＳＭで洗浄し、遠心分離して、次に50〜100 μlの以下の抗体溶液中に適切な濃度で再懸濁する：ストレプトアビジン・カスケードブルー（Molecular Probes, Eugene, OR）、ｃ-ｋｉｔ・フィコエリトリン-シアニン７タンデム（ＰＥ-Ｃｙ７）、Ｓｃａ-１アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＣＤ３４フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、２．４Ｇ２（ＦｃγＲ）Ｒ-フィコエリトリン（eBioscience, San Diego, CA）。細胞を、ＦＡＣＳによりＭＰ（ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＭＥＰ）に関して分析する。
【００９９】
成熟前駆細胞サブセットに関する培養増幅細胞の染色：  上記と同様に、細胞を処理する。遮断抗体とともにインキュベート後、細胞を、50〜100 μlの以下の抗体溶液中に再懸濁する：ＣＤ３フィコエリトリン-シアニン７タンデム（ＰＥ-Ｃｙ７）、Ｂ２２０パシフィックブルー、Ｇｒ-１  Ｒ-フィコエリトリン（ＰＥ）およびＭａｃ-１アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（eBioscience, San Diego, CA）。氷上で25分間インキュベーション後、細胞を上記と同様にＦＡＣＳ分析に関して処理する。
【０１００】
ドナー細胞の存在に関する再構成マウスのスクリーニング    ドナー細胞集団に関するＨＳＣおよび／またはＭＰを移植されたマウスのスクリーニングを、室温でＰＢＳ中の0.5 mMＥＤＴＡ0.5 ml中の約10〜15滴の血液を収集することにより実行する。ＰＢＳ中の2％デキストラン-５００  1 mlを付加し、37℃で30〜45分間インキュベートする。ほとんどの赤血球が沈殿する。その結果生じた上清を新しい試験管に移して、細胞を遠心分離（5分、1000 rpm）により収集し、残りの赤血球を、氷上で5〜6分間、1.0 mlの1×ＡＣＫ（0.3 MＮＨ4Ｃｌ、0.2 MＫＨＣＯ3、MiliQ濾過水）で溶解する。この後、洗浄し、1200 rpmで5分間遠心分離する。ペレットが依然として赤色である場合、洗浄ステップを反復する。氷上で10〜15分間、50 μl／試験管でのラットＩｇＧおよびマウスＩｇＧ（各々、1:50）で細胞を遮断する。ビオチニル化Ｍａｃ-１およびＧＲ-１（eBioscience, San Diego, CA）を適切な濃度で付加し、暗所で20分間、氷上でインキュベートする。細胞を洗浄し、1200 rpmで5分間遠心分離する。以下の抗体を、合成またはＭＵＤ移植片（Ｃ５７Ｂ６／Ｋａ、ＣＤ４５．１；Ｃ５７Ｂ１６／Ｋａ  ＣＤ４５．２または１２９）ストレプトアビジン・カスケードブルー（Molecular Probes, Eugene, OR）、ＣＤ４５．１アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＣＤ４５．２フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｂ２２０  Ｒ-フィコエリトリン  シアニンタンデム（ＰＥ-Ｃｙ７）およびＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８Ｒ-フィコエリトリン（ＰＥ）（eBioscience, San Diego, CA）に関して、適切な濃度で付加する。以下の抗体を、同種異系移植片（Ｃ５７Ｂ６／Ｋａ、Ｈ２Ｋｂ；Ｂａｌｂ／ｂ、Ｈ２Ｋｄ）ストレプトアビジン・カスケードブルー（Molecular Probes, Eugene, OR）、ＣＤ３アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｈ２Ｋｂフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｂ２２０  Ｒ-フィコエリトリン  シアニンタンデム（ＰＥ-Ｃｙ７）およびＨ２Ｋｄ  Ｒ-フィコエリトリン（ＰＥ）（eBioscience, San Diego, CA）に関して、適切な濃度で付加する。以下の抗体を、培養同種異系ＭＰ（Ｃ５７Ｂ６／Ｋａ、ＣＤ４５．１；１２９、ＣＤ４５．２；ＡＫＲ、Ｈ２Ｋｋ）ＣＤ４５．２ビオチン（eBioscience, San Diego, CA）を伴うＭＵＤ移植片に関して、適切な濃度で付加する。洗浄後、以下の抗体を適切な濃度で付加する：ストレプトアビジンＲ-フィコエリトリン・タンデム（ＰＥ-Ｃｙ５）、ＣＤ４５．１アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｈ２Ｋｋフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｍａｃ-１およびＧｒ-１  Ｒ-フィコエリトリン・シアニンタンデム（ＰＥ-Ｃｙ７）、Ｂ２２０パシフィックブルーおよびＣＤ３  Ｒ-フィコエリトリン（ＰＥ）（eBioscience, San Diego, CA）。氷上での25分間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、遠心分離し、そしてＰＩを含有するＳＭ中に再懸濁する。細胞を、ＦＡＣＳにより分析する。
【０１０１】
培養由来ＭＰの凍結：  細胞を、2000万細胞／mlの濃度で凍結する。85％ＦＣＳおよび15％ＤＭＳＯを含有する凍結培地を調製する。培養由来ＭＰ細胞を計数し、洗浄する。1100 RPMで遠心分離する。細胞ペレットを1000万細胞／mlで再懸濁する。試験管を静かに混合しながら、等容積のＤＭＳＯ凍結培地を、徐々に1滴ずつ付加する。凍結バイアル中に細胞を1 ml／バイアルに分取する。細胞を、−80℃で一晩凍結する。翌日、長期間貯蔵のためにバイアルを液体窒素に移す。
【０１０２】
７．２  実施例２：サブオプティマル用量のＨＳＣと関連した生存を増大するための精製骨髄前駆細胞の使用
レシピエントマウスの100％において放射線防護を提供するためにＨＳＣが不適切数で提供された場合にＭＰが生存を改善し得るか否かを確定するために、これらの試験を設計した。これらの試験は、ＭＰが、同種同系（図３）、適合非血縁ドナー（ＭＵＤ）（図４）、または完全不適合同種異系設定（図５）での精製ＨＳＣ移植後の回復を増大し得るか否かを調べた。これらの試験において、各試験に関するＨＳＣおよびＭＰは、同一ドナーに由来した。
【０１０３】
ＨＳＣをマウス骨髄（ＢＭ）から調製し、ＬｉｎnegＫＴＬＳ-ＨＳＣを、Ｃ５７Ｂｌ／６  ＫＡマウス（Ｈ-２ｂ、ＣＤ９０．１、ＣＤ４５．２）から類別した。図１は、Ｃ５７Ｂ６／Ｋａ（Ｔｈｙ-１．１、ＣＤ４５．２）からのＫＴＬＳ  ＨＳＣに関するソートゲートを示す。全骨髄およびｃ-ｋｉｔ濃化後の両方に関して、ゲーティング・プロフィールを示す。このゲーティング戦略により類別されたＨＳＣを、移植実験に用いた。
【０１０４】
ＭＰをマウス骨髄（ＢＭ）から調製し、Ｃ５７Ｂｌ／６  ＫＡマウス（Ｈ-２ｂ、ＣＤ９０．１、ＣＤ４５．２）から類別した。図２は、Ｃ５７Ｂ６／Ｋａ（Ｔｈｙ-１．１、ＣＤ４５．２）からのＭＰに関するソートゲートを示す。全骨髄およびｃ-ｋｉｔ濃化後の両方に関して、ゲーティング・プロフィールを示す。このゲーティング戦略により類別されたＭＰを、移植実験に用いた。
【０１０５】
0日目に、分割線量放射線照射（総計9〜11 Gy、セシウム源）を用いて、宿主マウスＣ５７Ｂ１／Ｋａ（Ｈ-２ｂ、ＣＤ９０．１、ＣＤ４５．１）、１２９（Ｈ-２ｂ、ＣＤ４５．２）またはＢａｌｂ／ｃ（Ｈ-２ｄ、ＣＤ４５．２）を致死的照射した。類別ＨＳＣおよびＭＰを所望の用量で併合し、レシピエント動物中に眼窩後方注射により注入した。生存およびドナー・キメラ現象に関して、動物をモニタリングした。
【０１０６】
図３は、同種同系移植片モデルにおける生存データを示す。50のＫＴＬＳ  Ｃ５７Ｂ６／Ｋａ（Ｔｈｙ-１．１、ＣＤ４５．２）ＨＳＣを、単独で、または100,000のＣ５７Ｂ６／Ｋａ（Ｔｈｙ-１．１、ＣＤ４５．２）ＭＰと組合せて、Ｃ５７Ｂ６／Ｋａ（Ｔｈｙ-１．１、ＣＤ４５．１）宿主中に移植した。図３は、ＨＳＣ移植片へのＭＰの付加が生存を改善したことを示す。
【０１０７】
図４は、同種異系（適合非血縁ドナー）移植片モデルにおける生存データを示す。100（図４Ａ）または250（図４Ｂ）ＫＴＬＳ  Ｃ５７Ｂ６／Ｋａ（Ｔｈｙ-１．１、ＣＤ４５．２、Ｈ２ｂ）ＨＳＣを、単独で、または200,000のＣ５７Ｂ６／Ｋａ（Ｔｈｙ-１．１、ＣＤ４５．２、Ｈ２ｂ）ＭＰと組合せて、１２９（ＣＤ４５．１、Ｈ２ｂ）宿主中に移植した。図４は、ＨＳＣ移植片へのＭＰの付加が、100および250の幹細胞用量の両方で、生存を改善したことを示す。
【０１０８】
図５は、同種異系（完全不適合）移植片モデルにおける生存データを示す。500（図５Ａ）または2000（図５Ｂ）ＫＴＬＳ  Ｃ５７Ｂ６／Ｋａ（Ｔｈｙ-１．１、ＣＤ４５．２、Ｈ２ｂ）ＨＳＣを、単独で、または200,000のＣ５７Ｂ６／Ｋａ（Ｔｈｙ-１．１、ＣＤ４５．２、Ｈ２ｂ）ＭＰと組合せて、Ｂａｌｂ／ｃ（ＣＤ４５．１、Ｈ２ｄ）宿主中に移植した。図５は、ＨＳＣ移植片へのＭＰの付加が、500および2000の幹細胞用量の両方で、生存を改善したことを示す。
【０１０９】
図６は、3つの移植片モデル（同種同系、適合非血縁ドナーおよび不適合同種異系）に関する生存およびキメラ現象データを要約する。
【０１１０】
3つのモデル（同種同系、ＭＵＤおよび不適合同種異系）すべてにおいて、サブオプティマル用量のＨＳＣと組合せたＭＰの含入は、ＨＳＣ単独を上回って生存を改善した。
【０１１１】
７．３  実施例３：サブオプティマル用量のＨＳＣと関連した生存を増大するための同種異系培養由来骨髄前駆細胞の使用
ＨＳＣ用量が放射線防護を提供するために必要とされる用量より低い場合に、同種異系培養由来ＭＰの含入が適合非血縁ドナー（ＭＵＤ）ＨＳＣ移植後の生存率を改善し得たか否かを確定するために、この試験を設計した。
【０１１２】
ＨＳＣをマウス骨髄（ＢＭ）から調製し、Ｌｉｎneg/lowＫＴＬＳ-ＨＳＣを、ＡＫＲマウス（Ｈ-２ｋ、ＣＤ９０．１、ＣＤ４５．２）から類別した。ｃ-ＫｉｔＬ、ＦＬ、ＴＰＯおよびＩＬ‐６を補足した無血清培地中で、類別細胞をプレート化した。細胞を7日間培養した。培養期間後、細胞を採取し、ＭＰ（ＣＭＰ／ＧＭＰ／ＭＥＰ）およびＨＳＣ含量に関して分析して、凍結した。図８は、ＡＫＲ（Ｔｈｙ-１．１、ＣＤ４５．２、Ｈ２ｋ）培養誘導ＭＰの分析を示す。
【０１１３】
移植当日に、ＬｉｎnegＫＴＬＳ-ＨＳＣを、Ｃ５７Ｂ１／Ｋａ（Ｈ-２ｂ、ＣＤ９０．１、ＣＤ４５．１）マウスから類別した（図７）。ＡＫＲ  ＫＴＬＳ  ＨＳＣを類別し、記載されたように7日間培養した。この培養期間後、細胞を分析し、凍結した。移植のための細胞用量は、培養中のｃ-ｋｉｔ+細胞の数に基づいて算定する。
【０１１４】
0日目に、分割線量放射線照射（総計11.5 Gy、セシウム源）を用いて、宿主マウス１２９（Ｈ-２ｂ、ＣＤ９０．２、ＣＤ４５．２）を致死的照射した。培養細胞を凍結し、成育可能性に関してＦＡＣＳにより再分析し、そしてＭＰ（ＣＭＰ／ＧＭＰ／ＭＥＰ）およびＨＳＣ含量に関して分析した。総細胞数ならびにＨＳＣおよびＭＰ細胞数を、ソーティング分析から算定する。マウスへの注入のために用いられる細胞は、染色されない。培養由来ＭＰを所望数のＨＳＣと併合して、眼窩後方注射により状態調節宿主中に移植した。
【０１１５】
図９は、適合非血縁ドナーＫＴＬＳ  ＨＳＣが完全不適合同種異系培養由来ＭＰと同時移植された移植モデルにおける生存データを示す。100のＫＴＬＳ  Ｃ５７Ｂ６／Ｋａ（Ｔｈｙ-１．１、ＣＤ４５．１、Ｈ２ｂ）ＨＳＣを、単独で、または500,000のｃ-ｋｉｔ+ＡＫＲ（Ｔｈｙ-１．１、ＣＤ４５．２、Ｈ２ｋ）培養由来ＭＰ（ＭＰｃ）と組合せて、１２９（ＣＤ４５．２、Ｈ２ｄ）宿主中に移植した。ＨＳＣ移植片へのＭＰｃの付加は、生存を改善した。併合移植片からの生存は、同一用量のＨＳＣまたはＭＰｃ単独を移植するより大きい。
【０１１６】
このモデルにおいて、同種異系（ＭＵＤ）ＨＳＣおよび第三者同種異系培養由来ＭＰの併合移植片は、ＨＳＣまたはＭＰ単独を上回って生存を増強する（図９）。
【０１１７】
図１０は、ＭＨＣ適合非血縁ドナーＨＳＣが２名のＭＨＣ不適合ドナー由来のＭＰｃと同時移植された移植モデルにおける生存データを示す。50の同種異系ＨＳＣ（Ｂａｌｂ／ｂ、Ｈ-２ｂ）を、単独で、あるいは1,000,000または2,000,000のプール化同種異系培養由来ＭＰ（ＦＶＢ、Ｈ-２ｑ；ＡＫＲ、Ｈ２ｋ）と組合せて、致死照射宿主（Ｃ５７Ｂ１／Ｋａ、Ｈ-２ｂ）中に移植した。ＨＳＣ移植片へのＭＰｃの付加は、ＨＳＣ単独と比較して、生存を改善した。ＨＳＣおよびＭＰｃの併合移植片は、ＨＳＣまたはＭＰｃ移植単独と比較して、生存を改善した。
【０１１８】
本発明の特定実施形態の前記記載は、例証および説明の目的のために提示されてきた。それらは、網羅的であるよう、あるいは開示された正確な形態に本発明を限定するよう意図されないし、そして上記の教示にかんがみて、多数の修正および変更が可能であることは明らかである。本発明の原理ならびにその実際的適用を最良に説明するために、それにより、意図された特定用途に適している場合、本発明をならびに種々の修正を伴う種々の実施形態を最良に利用するために、実施形態を選択し、記載した。
【０１１９】
本明細書中で引用される特許、特許出願、出版物および参考文献はすべて、各々の個々の出版物または特許出願が特定的にそして個別に参照により援用されることが示されたのと同程度に、これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１Ａ−Ｂ】Ｃ５７Ｂ６／Ｋａ（Ｔｈｙ-１．１、ＣＤ４５．２）からのＫＴＬＳ  ＨＳＣに関するソートゲートを示す。
【図２Ａ−Ｂ】Ｃ５７Ｂ６／Ｋａ（Ｔｈｙ-１．１、ＣＤ４５．２）からのＭＰに関するソートゲートを示す。
【図３】同種同系移植片モデルにおける生存データを示す。
【図４Ａ−Ｂ】同種異系（適合非血縁ドナー）移植片モデルにおける生存データを示す。
【図５Ａ−Ｂ】同種異系（完全不適合）移植片モデルにおける生存データを示す。
【図６】3つの移植片モデル（同種同系、適合非血縁ドナーおよび不適合同種異系）に関する生存およびキメラ現象データを要約する。
【図７Ａ−Ｂ】実施例３で用いられるＫＴＬＳ  Ｃ５７Ｂ６／Ｋａ（Ｔｈｙ-１．１、ＣＤ４５．１、Ｈ２ｂ）ＨＳＣを精製するために用いられるソーティングを示す。
【図８Ａ−Ｂ】ＡＫＲ（Ｔｈｙ-１．１、ＣＤ４５．２、Ｈ２ｋ）培養誘導ＭＰの分析を示す。
【図９】適合非血縁ドナーＫＴＬＳ  ＨＳＣが完全不適合同種異系培養由来ＭＰと同時移植された移植モデルにおける生存データを示す。
【図１０】ＭＨＣ適合非血縁ドナーＨＳＣが２名のＭＨＣ不適合ドナー由来のＭＰｃと同時移植された移植モデルにおける生存データを示す。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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