(57)【要約】グリコーゲン生合成経路が破壊されるように改変された腸内細菌科の細菌、特にエシェリヒア属またはパントエア属に属する細菌を用いてＬ−アミノ酸を製造する方法を提供する。
2009515506.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコーゲン生合成経路が破壊されるように改変された腸内細菌科のＬ−アミノ酸生産細菌。
【請求項２】
前記グリコーゲン生合成経路がｇｌｇＢＸオペロン及び／又はｇｌｇＣＡＰオペロンの発現の減弱によって破壊された、請求項１に記載のＬ−アミノ酸生産細菌。
【請求項３】
前記グリコーゲン生合成経路がｇｌｇＢＸオペロン及び／又はｇｌｇＣＡＰオペロンの不活性化によって破壊された、請求項１に記載のＬ−アミノ酸生産細菌。
【請求項４】
前記ｇｌｇＢＸオペロン及び／又はｇｌｇＣＡＰオペロンの不活性化は、ｇｌｇＢ、ｇｌｇＸ、ｇｌｇＣ、ｇｌｇＡ、ｇｌｇＰ、及びその組み合わせからなる群から選択される遺伝子の欠失によって行われる、請求項３に記載のＬ−アミノ酸生産細菌。
【請求項５】
前記グリコーゲン生合成経路がｇｌｇＳ遺伝子発現の減弱によって破壊された、請求項１に記載のＬ−アミノ酸生産細菌。
【請求項６】
前記グリコーゲン生合成経路がｇｌｇＳ遺伝子の不活性化によって破壊された、請求項１に記載のＬ−アミノ酸生産細菌。
【請求項７】
エシェリヒア属に属する、請求項１に記載のＬ−アミノ酸生産細菌。
【請求項８】
パントエア属に属する、請求項１に記載のＬ−アミノ酸生産細菌。
【請求項９】
前記Ｌ−アミノ酸が芳香族Ｌ−アミノ酸及び非芳香族Ｌ−アミノ酸からなる群から選択される、請求項１に記載のＬ−アミノ酸生産細菌。
【請求項１０】
前記芳香族Ｌ−アミノ酸がＬ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、及びＬ−トリプトファンからなる群から選択される、請求項９に記載のＬ−アミノ酸生産細菌。
【請求項１１】
前記非芳香族Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−システイン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グリシン、Ｌ−セリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−アルギニンからなる群から選択される、請求項９に記載のＬ−アミノ酸生産細菌。
【請求項１２】
請求項１に記載の細菌を培地中で培養して前記Ｌ−アミノ酸を培地中に生成及び分泌させること、及び
培地から前記Ｌ−アミノ酸を回収すること
を含む、Ｌ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１３】
前記Ｌ−アミノ酸が芳香族Ｌ−アミノ酸及び非芳香族Ｌ−アミノ酸からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記芳香族Ｌ−アミノ酸がＬ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、及びＬ−トリプトファンからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記非芳香族Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−システイン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グリシン
、Ｌ−セリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−アルギニンからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、微生物産業、詳細には、グリコーゲン生合成経路が破壊された腸内細菌科の細菌を使用したＬ−アミノ酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
［背景技術］
グリコーゲンは、エシェリヒア・コリ及び多数の他の原核生物の主な貯蔵炭素形態の代表的な物質であり、エネルギーを維持するため、すばやく代謝される基質を提供する。エシェリヒア・コリ中のグリコーゲン蓄積は生育速度に反比例し、細胞が静止期に入った時に最も活発に起こる。３つの生合成酵素のレベルがこれらの条件下に対応して変化することから、酵素の生合成に関与する遺伝子調節がその制御の少なくとも一部を占めることが示唆される（Preiss, J., Annu. Rev. Microbiol. 38, 419-458 (1984)）。エシェリヒア・コリでは、グリコーゲン生合成経路に関与する構造遺伝子は、隣接する2つのオペロン、すなわちｇｌｇＢＸ及びｇｌｇＣＡＰにクラスター化されている。興味深いことに、グリコーゲン生合成遺伝子（ｇｌｇＣＡ）及び分解遺伝子（ｇｌｇＰ）は、共にクラスター中に存在しており、これはおそらくｉｎ  ｖｉｖｏでのこれらの系の調節を容易にするためと考えられる（Romeo, T., Gene. 70(2), 363-76 (1988)）。ｇｌｇＣ遺伝子は、グルコース−１−ホスフェートアデニリルトランスフェラーゼの構造遺伝子である。グルコース−１−ホスフェートアデニリルトランスフェラーゼの同義語は、ＡＤＰ−グルコースシンターゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、ＡＤＰ：ａ−Ｄ−グルコース−１−ホスフェートアデニリルトランスフェラーゼ、ＧｌｇＣタンパク質である。
【０００３】
グルコース−１−ホスフェートアデニリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．７．２７）は、真正細菌のグリコーゲン生合成経路におけるアロステリック酵素である。腸内細菌では、グルコース−１−ホスフェートアデニリルトランスフェラーゼは、解糖の中間体であるフルクトース１，６−ビホスフェートによって活性化され、ＡＭＰ、ＡＤＰ、及びＰiによって阻害される。この酵素は、グルコース−１−ホスフェート及びＡＴＰからのＡＤＰグルコース及びＰＰiの合成を触媒する。この反応は、細菌のグリコーゲン生合成における最初の、また、固有の反応である。
【０００４】
エシェリヒア・コリの炭素貯蔵調節系が炭水化物代謝及び細胞運動に関与する遺伝子の発現を調節することが知られている。ｇｌｇＣＡＰ転写産物へＣｓｒＡが結合すると、ｇｌｇＣＡＰのｍＲＮＡ分解が促進され、グリコーゲン代謝を阻害する。ＣｓｒＢのＲＮＡはＣｓｒＡと拮抗し、このタンパク質を捕捉することによりその機能を妨げる（Baker, C.S. 他, Mol. Microbiol., 44(6), 1599-610 (2002)）。
【０００５】
ｇｌｇＣＡＰオペロンは、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）及びｃＡＭＰ受容体タンパク質（ＣＲＰ）の正の調節下にある。アデニル酸シクラーゼ（ＥＣ４．６．１．１）をコードするｃｙａ遺伝子及びＣＲＰをコードするｃｒｐ遺伝子の両方は、至適なグリコーゲン合成に必要である（Fletterick, R.J.及びMadsen, N.B., Annu. Rev. Biochem., 49, 31-61 (1980)）。ＣＲＰは、ｇｌｇＣ遺伝子の上流に位置する部位に結合する。エシェリヒア・コリにおけるグリコーゲン生合成はまた、ｐｐＧｐｐによって正に調節され、ｇｌｇＣＡＰオペロンの転写を刺激する（Preiss. J.,及びRomeo, T., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 47, 299-329 (1994)）。
【０００６】
ミニＭｕランダム染色体ライブラリーの使用及びグリコーゲン過剰産生についてのスクリーニングにより、グリコーゲン合成に関与する新規の遺伝子（ｇｌｇＳ）が同定された（Hengge-Aronis, R.及びFischer, D., Mol Microbiol. 6, 14, 1877-86 (1992)）。エシェリヒア・コリタンパク質ＧｌｇＳは飢餓ストレスに応答して正に調節され、その過剰産生がグリコーゲン合成を刺激することが認められることも示された（Kozlov, G. 他, BMC
Biol., 2, 1, 10 (2004)）。
【０００７】
解糖生合成の最初の基質は、グルコース−６−Ｐから得られるグルコース−１−Ｐであり、その経路はグルコース−６−Ｐの解糖と競合する。しかし、現在、Ｌ−アミノ酸生産のためのｇｌｇＢＸオペロン及び／又はｇｌｇＣＡＰオペロンの不活性化又はｇｌｇＳ遺伝子の不活性化は報告されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、Ｌ−アミノ酸生産株の生産性の強化及びこれらの株を使用したＬ−アミノ酸の製造方法の提供を含む。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ｇｌｇＢＸオペロン及び／又はｇｌｇＣＡＰオペロンの不活性化によってＬ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−システイン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−プロリン、及びＬ−アルギニンなどのＬ−アミノ酸の生産を増強することができることを見出すことによって、上記目的が達成された。
【００１０】
本発明は、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−システイン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−プロリン、及びＬ−アルギニンなどのアミノ酸を生産する能力が増大した腸内細菌科の細菌を提供する。
【００１１】
本発明の目的は、グリコーゲン生合成経路が破壊されるように改変された腸内細菌科のＬ−アミノ酸生産細菌を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、前記グリコーゲン生合成経路がｇｌｇＢＸオペロン及び／又はｇｌｇＣＡＰオペロンの発現の減弱によって破壊された、前記Ｌ−アミノ酸生産細菌を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、前記グリコーゲン生合成経路がｇｌｇＢＸオペロン及び／又はｇｌｇＣＡＰオペロンの不活性化によって破壊された、前記Ｌ−アミノ酸生産細菌を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、前記ｇｌｇＢＸオペロン及び／又はｇｌｇＣＡＰオペロンの不活性化が、ｇｌｇＢ、ｇｌｇＸ、ｇｌｇＣ、ｇｌｇＡ、ｇｌｇＰ、及びその組み合わせからなる群から選択される遺伝子の欠失によって行われる、前記Ｌ−アミノ酸生産細菌を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、前記グリコーゲン生合成経路がｇｌｇＳ遺伝子発現の減弱によって破壊された、前記Ｌ−アミノ酸生産細菌を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、前記グリコーゲン生合成経路がｇｌｇＳ遺伝子の不活性化によって破壊された、前記Ｌ−アミノ酸生産細菌を提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、エシェリヒア属に属する前記Ｌ−アミノ酸生産細菌を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、パントエア属に属する前記Ｌ−アミノ酸生産細菌を提供することである。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、前記Ｌ−アミノ酸が芳香族Ｌ−アミノ酸及び非芳香族Ｌ−アミノ酸からなる群から選択される、前記Ｌ−アミノ酸生産細菌を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、前記芳香族Ｌ−アミノ酸がＬ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、及びＬ−トリプトファンからなる群から選択される、前記Ｌ−アミノ酸生産細菌を提供することである。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、前記非芳香族Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−システイン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グリシン、Ｌ−セリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−アルギニンからなる群から選択される、前記Ｌ−アミノ酸生産細菌を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、前記細菌を培地中で培養して前記Ｌ−アミノ酸を培地中に生成及び分泌させること、及び培地から前記Ｌ−アミノ酸を回収することを含む、Ｌ−アミノ酸の製造方法を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、前記Ｌ−アミノ酸が芳香族Ｌ−アミノ酸及び非芳香族Ｌ−アミノ酸からなる群から選択される、前記方法を提供することである。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、前記芳香族Ｌ−アミノ酸がＬ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、及びＬ−トリプトファンからなる群から選択される、前記方法を提供することである。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、前記非芳香族Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−システイン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グリシン、Ｌ−セリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、及びＬ−アルギニンからなる群から選択される、前記方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
［好ましい実施形態の詳細な説明］
本発明を、以下に詳述する。
【００２７】
１．本発明の細菌
本発明の細菌は、グリコーゲン生合成経路が破壊されるように改変された腸内細菌科のＬ−アミノ酸生産細菌である。
【００２８】
本発明において、「Ｌ−アミノ酸生産細菌」とは、細菌を培地中で培養した場合にＬ−アミノ酸を培地中に生成及び分泌する能力を有する細菌を意味する。
【００２９】
また、「Ｌ−アミノ酸生産細菌」という用語は、本明細書中で使用される場合、エシェリヒア・コリＫ−１２株などのエシェリヒア・コリの野生株や親株よりも大量に、培地で
Ｌ−アミノ酸を生成し且つＬ−アミノ酸を蓄積させることができる細菌を意味する。またこの用語は、好ましくは微生物が培地で０．５ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の標的Ｌ−アミノ酸を蓄積させることができることを意味する。「Ｌ−アミノ酸」という用語は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン及びＬ−バリンを含む。
【００３０】
「芳香族Ｌ−アミノ酸」という用語は、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン及びＬ−トリプトファンを含む。「非芳香族Ｌ−アミノ酸」という用語は、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−システイン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グリシン、Ｌ−セリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン及びＬ−アルギニンを含む。Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−システイン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−プロリン及びＬ−アルギニンが特に好ましい。
【００３１】
腸内細菌科細菌には、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、クレブシエラ属、パントエア属、フォトラブダス属（Photorhabdus）、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、モルガネラ属、エルシニア属などに属する細菌が含まれる。詳細には、ＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information））データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3& keep=1&srchmode=1&unlock）で使用されている分類法にしたがって腸内細菌科に分類された細菌を使用することができる。エシェリヒア属又はパントエア属に属する細菌が好ましい。
【００３２】
「エシェリヒア属に属する細菌」という語句は、微生物学分野の当業者に既知の分類にしたがって、細菌がエシェリヒア属に分類されることを意味する。本発明で使用されるエシェリヒア属に属する細菌の例には、エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）が含まれるが、これに限定されない。
【００３３】
本発明で使用することができるエシェリヒア属細菌は、特に制限されないが、例えば、Neidhardt, F.C. 他. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208,表１)によって記載された細菌が本発明に含まれる。
【００３４】
「パントエア属細菌」という語句は、微生物学分野の当業者に既知の分類にしたがって、細菌がパントエア属に分類されることを意味する。エンテロバクター・アグロメランスのいくつかの種は、最近、１６Ｓ  ｒＲＮＡのヌクレオチド配列分析に基づいて、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、又はパントエア・ステウェアルチ（Pantoea stewartii）などに再分類されている（Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)）。このような株は、「パントエア属細菌」に含まれる。
【００３５】
「細菌がグリコーゲン生合成経路が破壊されるように改変された」という語句は、改変された細菌が非改変細菌と比較してグリコーゲンを合成する能力が減少しているか、又はグリコーゲンを合成及び蓄積することができないように細菌が改変されていることを意味する。グリコーゲン生合成経路の破壊を、グリコーゲン生合成に関与する酵素（ＧｌｇＢ、ＧｌｇＸ、ＧｌｇＣ、ＧｌｇＡ、ＧｌｇＰ、及びＧｌｇＳなど）をコードする遺伝子の
発現の減弱によって行うことができ、上記遺伝子の不活性化によって行うことが好ましい。
【００３６】
「ｇｌｇＢＸオペロン及び／又はｇｌｇＣＡＰオペロン発現の減弱」又は「ｇｌｇＳ遺伝子の発現の減弱」という語句は、改変されたオペロン又は遺伝子が活性の低減した変異タンパク質をコードするような方法で標的オペロン又は遺伝子が改変されることを意味する。「ｇｌｇＢＸオペロン及び／又はｇｌｇＣＡＰオペロンの不活性化」又は「ｇｌｇＳ遺伝子の不活性化」という語句は、このような改変オペロン又は遺伝子が完全に不活性なタンパク質をコードすることを意味する。遺伝子の一部の欠失、遺伝子のリーディングフレームのシフト、ミスセンス／ナンセンス変異の導入、又は遺伝子の隣接領域の改変、例えば、プロモーター、エンハンサー、アテニュエーター、リボゾーム結合部位などの遺伝子の発現調節配列の改変によって、改変ＤＮＡ領域が遺伝子を天然に発現できないようにすることもできる。
【００３７】
遺伝子の発現レベルを、ノーザンブロッティング及び定量的ＲＴ−ＰＣＲなどの種々の既知の方法を使用した遺伝子からのｍＲＮＡの転写量の測定によって評価することができる。遺伝子によってコードされるタンパク質量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の免疫ブロッティングアッセイ（ウェスタンブロッティングアッセイ）などの既知の方法によって測定することができる。
【００３８】
ｇｌｇＣ遺伝子は、グルコース−１−ホスフェートアデニリルトランスフェラーゼ（同義語−Ｂ３４３０）をコードする。ｇｌｇＣ遺伝子（ｇｉ：１６１３１３０４、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．２中のヌクレオチド３５６６０５６〜３５６７３５１に相補的なヌクレオチド、配列番号１）は、エシェリヒア・コリＫ−１２株の染色体上のｇｌｇＡとｇｌｇＸとの間に存在する。ｇｌｇＣ遺伝子のヌクレオチド配列及びｇｌｇＣ遺伝子によってコードされるグルコース−１−ホスフェートアデニリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１及び配列番号２に示す。
【００３９】
ｇｌｇＡ遺伝子は、グリコーゲンシンターゼ（同義語−Ｂ３４２９）のサブユニットをコードする。ｇｌｇＡ遺伝子（ｇｉ：４９１７５９９０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．２のヌクレオチド３，５６６，０５６〜３，５６４，６２３）は、エシェリヒア・コリＫ−１２株の染色体上のｇｌｇＰ遺伝子とｇｌｇＣ遺伝子との間に存在する。ｇｌｇＡ遺伝子のヌクレオチド配列及びｇｌｇＡ遺伝子によってコードされるグリコーゲンシンターゼのサブユニットのアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１１及び配列番号１２に示す。
【００４０】
ｇｌｇＰ遺伝子は、グリコーゲンホスホリラーゼ／グリコーゲン−マルトテトラオースホスホリラーゼ（同義語−Ｂ３４２８、ＧｌｇＹ）のサブユニットをコードする。ｇｌｇＰ遺伝子（ｇｉ：４９１７５９９０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．２のヌクレオチド３，５６４，６０４〜３，５６２，１５７）は、エシェリヒア・コリＫ−１２株の染色体上のｙｚｇＬ遺伝子とｇｌｇＡ遺伝子との間に存在する。ｇｌｇＰ遺伝子のヌクレオチド配列及びｇｌｇＰ遺伝子によってコードされるグリコーゲンホスホリラーゼ／グリコーゲン−マルトテトラオースホスホリラーゼのサブユニットのアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１３及び配列番号１４に示す。
【００４１】
ｇｌｇＸ遺伝子は、グリコーゲンホスホリラーゼ制限デキストリンα−１，６−グルコヒドロラーゼ（同義語−Ｂ３４３１、ＧｌｙＸ）をコードする。ｇｌｇＸ遺伝子（ｇｉ：４９１７５９９０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．２のヌクレオチド３，５６９，３４２〜３，５６７，３６９）は、エシェリヒア・コリＫ−１２株の染色体上のｇｌｇＣ遺伝子とｇｌｇＢ遺伝子との間に存在する。ｇｌｇＸ遺伝子のヌクレ
オチド配列及びｇｌｇＸ遺伝子によってコードされるグリコーゲンホスホリラーゼ制限デキストリンα−１，６−グルコヒドロラーゼのアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１５及び配列番号１６に示す。
【００４２】
ｇｌｇＢ遺伝子は、グリコーゲン分枝酵素（同義語−Ｂ３４３２）をコードする。ｇｌｇＢ遺伝子（ｇｉ：４９１７５９９０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．２のヌクレオチド３，５７１，５２５〜３，５６９，３３９）は、エシェリヒア・コリＫ−１２株の染色体上のｇｌｇＸ遺伝子とａｓｄ遺伝子との間に存在する。ｇｌｇＢ遺伝子のヌクレオチド配列及びｇｌｇＢ遺伝子によってコードされるグリコーゲン分枝酵素のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１７及び配列番号１８に示す。
【００４３】
ｇｌｇＳ遺伝子は、グリコーゲン生合成のｒｐｏＳ依存性タンパク質（同義語−Ｂ３０４９）をコードする。ｇｌｇＳ遺伝子（ｇｉ：４９１７５９９０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．２のヌクレオチド３，１８９，９６１〜３，１８９，７６１）は、エシェリヒア・コリＫ−１２株の染色体上のｙｑｉＩ  ＯＲＦとｙｑｉＪ  ＯＲＦとの間に存在する。ｇｌｇＳ遺伝子のヌクレオチド配列及びｇｌｇＳ遺伝子によってコードされるグリコーゲン生合成のｒｐｏＳ依存性タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１９及び配列番号２０に示す。
【００４４】
腸内細菌科の属間又は株間でＤＮＡ配列がいくらか異なり得るので、染色体上の欠失すべきｇｌｇＣ遺伝子は、配列番号１に示す遺伝子に制限されず、配列番号１の相同遺伝子も含まれる。したがって、ｇｌｇＣ遺伝子によってコードされるタンパク質変異型（variant）は、不活性化前のグルコース−１−ホスフェートアデニリルトランスフェラーゼの活性が維持される限り、配列２に示すコードされた全アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上相同であってもよい。
【００４５】
さらに、ｇｌｇＣ遺伝子は、不活性化前の１−ホスフェートアデニリルトランスフェラーゼをコードする限り、ストリンジェントな条件下で配列番号１に示すヌクレオチド配列又はこのヌクレオチド配列から調製することができるプローブとハイブリッド形成する変異型であってもよい。「ストリンジェントな条件」には、特異的なハイブリッド（例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、及び最も好ましくは９５％以上相同なハイブリッド）が形成され、非特異的なハイブリッド（例えば、上記より低い相同性を有するハイブリッド）が形成されない条件が含まれる。例えば、ストリンジェントな条件の例は、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは６０℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに対応する塩濃度での１回、好ましくは２回又は３回の洗浄する条件である。プローブの長さを、ハイブリッド形成条件に応じて適切に選択することができ、通常、１００ｂｐ〜１ｋｂｐである。
【００４６】
ｇｌｇＣ遺伝子についての上記の類似の表現を、ｇｌｇＢＸオペロン及びｇｌｇＣＡＰオペロンの他の遺伝子の変異型に適用することができる。
【００４７】
ＵＶ照射もしくはニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）などの従来の方法を使用した変異誘発処理、部位特異的な変異誘発、相同組換えを使用した遺伝子破壊、及び／又は挿入−欠失変異誘発（Yu, D. 他., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 5978-83並びにDatsenko, K.A.及びWanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45）（「Ｒｅｄ駆動組み込み（Red-driven integration）」とも呼ばれる）などによって、遺伝子の不活性化を行うことができる。
【００４８】
ｇｌｇＣ遺伝子によってコードされるグルコース−１−ホスフェートアデニリルトランスフェラーゼの活性は、例えば、Haugen, T.H. 他 (J. Biol. Chem. 251 (24), 7880-5 (
1976))に記載の方法によって測定することができる。したがって、本発明の細菌中のグルコース−１−ホスフェートアデニリルトランスフェラーゼ活性の低減又は消失を、非改変の親細菌と比較することによって確認することができる。
【００４９】
ｇｌｇＡ遺伝子によってコードされるグリコーゲンシンターゼの活性は、例えば、Fox,
J. 他 (Methods Enzymol., 28, 539-544 (1972))に記載の方法によって測定することができる。したがって、本発明の細菌中のグリコーゲンシンターゼ活性の低減又は消失を、非改変の親細菌と比較することによって確認することができる。
【００５０】
ｇｌｇＰ遺伝子によってコードされるグリコーゲンホスホリラーゼ／グリコーゲン−マルトテトラオースホスホリラーゼの活性は、例えば、Graves, D.J.及びWang, J.H. (The Enzymes, 7 (第３版), 435-482 (1972))に記載の方法によって測定することができる。したがって、本発明の細菌中のグリコーゲンホスホリラーゼ／グリコーゲン−マルトテトラオースホスホリラーゼ活性の低減又は消失を、非改変の親細菌と比較することによって確認することができる。
【００５１】
ｇｌｇＸ遺伝子によってコードされるグリコーゲンホスホリラーゼ制限デキストリンα−１，６−グルコヒドロラーゼの活性は、例えば、Jeanningros, R. 他 (Biochim Biophys Acta, 438(1), 186-199 (1976))に記載の方法によって測定することができる。したがって、本発明の細菌中のグリコーゲンホスホリラーゼ制限デキストリンα−１，６−グルコヒドロラーゼ活性の低減又は消失を、非改変の親細菌と比較することによって確認することができる。
【００５２】
ｇｌｇＢ遺伝子によってコードされるグリコーゲン分枝酵素の活性は、例えば、Illingworth, B.B.及びBrown, D.H. (Methods Enzymol., 8, 395-403 (1966))に記載の方法によって測定することができる。したがって、本発明の細菌中のグリコーゲン分枝酵素活性の低減又は消失を、非改変の親細菌と比較することによって確認することができる。
【００５３】
ｇｌｇＳ遺伝子によってコードされるグリコーゲン生合成のｒｐｏＳ依存性タンパク質の活性は、例えば、Hengge-Aronis, R及びFischer, D. (Mol. Microbiol., 6, 14, 1877-1886 (1992))に記載のグリコーゲン合成を阻害するｇｌｇＳ−ヌル変異の相補性によって検出することができる。したがって、本発明の細菌中のグリコーゲン生合成のｒｐｏＳ依存性タンパク質活性の低減又は消失を、非改変の親細菌と比較することによって確認することができる。
【００５４】
プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化及びライゲーション、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択などの方法は、当業者に既知の一般的な方法であり得る。これらの方法は、例えば、Sambrook, J.、 Fritsch, E.F.、及びManiatis, T.著 "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されている。
【００５５】
Ｌ−アミノ酸生産細菌
本発明の、ｇｌｇＢＸオペロン及び／又はｇｌｇＣＡＰオペロン又はｇｌｇＳ遺伝子が不活性化するように改変された細菌として、芳香族又は非芳香族のＬ−アミノ酸のいずれかを生産することができる細菌を使用することができる。
【００５６】
本発明の細菌は、本来的にＬ−アミノ酸を生産する能力を有する細菌中でｇｌｇＢＸオペロン及び／又はｇｌｇＣＡＰオペロン又はｇｌｇＳ遺伝子を不活性化するによって得ることができる。あるいは、本発明の細菌は、不活性化されたｇｌｇＢＸ及び／又はｇｌｇＣＡＰオペロン又はｇｌｇＳ遺伝子を既に有する細菌にＬ−アミノ酸を生産する能力を付
与することによって得ることができる。
【００５７】
Ｌ−スレオニン生産菌
Ｌ−スレオニン生産菌の親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５８】
TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性を有し、また、ilvA遺伝子にリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異型thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異型thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で寄託されている。
【００５９】
好ましくは、本発明の細菌は、さらに、下記の遺伝子の１種以上の発現が増大するように改変される。
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子
ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子
スレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子
推定トランスメンブランタンパク質をコードするrhtA遺伝子
アスパラギン酸−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするasd遺伝子
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）をコードするaspC遺伝子
【００６０】
Escherichia coliのアスパルトキナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子が知られている(塩基番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12株の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子が知られている(塩基番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12株の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子が知られている(塩基番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E.
coli K-12株の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。
【００６１】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産E. coli VKPM B-3996株に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。
【００６２】
rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, 塩基番号764〜1651, GenBank
accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている(rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性)。また、rhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual
Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。
【００６３】
E. coliのasd遺伝子は既に知られており(塩基番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いてPCRにより得ることができる(White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【００６４】
また、E. coliのaspC遺伝子も既に知られており(塩基番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。
【００６５】
Ｌ−リジン生産菌
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン(AEC)、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びEscherichia coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００６６】
WC196株が、Escherichia coliのＬ−リジン生産菌として使用できる。この菌株は、Escherichia coli K-12株に由来するW3110株にAEC耐性を付与することにより育種された。同株は、Escherichia coli AJ13069株と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。
【００６７】
L-リジン生産菌の親株の例としては、Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大している株も挙げられる。Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子(dapA)、アスパルトキナーゼ遺伝子(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ddh) (米国特許第6,040,160号)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(ppc)、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(asd)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB)及びアスルターゼ遺伝子(aspA) (EP 1253195 A)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
Ｌ−リジン生産菌の親株の例としては、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ(米国特許第5,827,698号)が挙げられる。
【００６９】
Ｌ−システイン生産菌
Ｌ−システイン生産菌の親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (JP11155571A2)、cysB遺伝子によりコードされる正のシステインレギュレーターの活性が上昇したE. coli W3110 (WO0127307A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７０】
Ｌ−ロイシン生産菌
Ｌ−ロイシン生産菌の親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号)またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE.coli株(JP 62-34397 B及びJP 8-70879 A)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (JP 8-70879 A)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７１】
本発明の細菌は、L-ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、L-ロイシンによるフィードバック阻害を受けないイソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表されるleuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明の細菌は、細菌の細胞からL-アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。
【００７２】
Ｌ−ヒスチジン生産菌
Ｌ−ヒスチジン生産菌の親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116〜B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７３】
L-ヒスチジン生産菌の親株の例としては、L-ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。L-ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の例としては、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、ホスホリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、ホスホリボシル-ATPピロホスホヒドロラーゼ遺伝子(hisIE)、ホスホリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールホスフェートアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。
【００７４】
hisG及びhisBHAFIにコードされるL-ヒスチジン生合成系酵素はL-ヒスチジンにより阻害
されることが知られており、従って、L-ヒスチジン生産能は、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。
【００７５】
L-ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、L-ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (JP 56-005099 A)、アミノ酸輸送の遺伝子であるrhtを導入したE.coli株(EP1016710A)、スルファグアニディン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。
【００７６】
Ｌ−グルタミン酸生産菌
Ｌ−グルタミン酸生産菌の親株の例としては、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するL-イソロイシン及びL-スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入により導入された。この結果、L-イソロイシン要求性株VL334thrC+ (VKPM B-8961) が得られた。この株はL-グルタミン酸を生産することができる。
【００７７】
L-グルタミン酸生産菌の親株の例としては、L-グルタミン酸生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株が挙げられるがこれらに限定されない。L-グルタミン酸生合成系酵素をコードする遺伝子の例としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、グルタミンシンテターゼ遺伝子、グルタミン酸シンテターゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子、クエン酸シンターゼ遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、ピルビン酸キナーゼ遺伝子、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子、エノラーゼ遺伝子、ホスホグリセロムターゼ遺伝子、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子、トリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝子、フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、グルコースホスフェートイソメラーゼ遺伝子などが挙げられる。
【００７８】
クエン酸シンテターゼ遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、及び／またはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、EP1078989A、EP955368A及びEP952221Aに開示されたものが挙げられる。
【００７９】
L-グルタミン酸生産細菌の親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。このような酵素の例としては、イソクエン酸リアーゼ、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ、ホスホトランスアデチラーゼ、アセテートキナーゼ、アデトヒドロキシ酸シンターゼ、アセトラクテートシンターゼ、フォルメートアセチルトランスフェラーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼなどが挙げられる。α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌、及び、それらの取得方法は米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号に記載されている。
具体例としては下記のものが挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損している。
【００８０】
L-グルタミン酸生産菌の他の例としては、エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有するものが挙げられる。これらの株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを欠損していてもよく、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第5.908,768号)、さらにL-グルタミン酸分解能が低下したFFRM P-12379(米国特許第5,393,671号); AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号)などが挙げられる。
【００８１】
L-グルタミン酸生産菌の例としては、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられ、上記のようにして得ることができる。このような株の例としては、パントエア・アナナティス AJ13356(米国特許第6,331,419号)がある。パントエア・アナナティス AJ13356は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6615が付与されている。パントエア・アナナティス AJ13356は、αKGDH-E1サブユニット遺伝子(sucA)の破壊によりα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損している。この株は、単離された時には、エンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランス AJ13356として寄託された。しかし、16S rRNAの塩基配列などに基づき、パントエア・アナナティスに再分類されている。AJ13356は、上記寄託機関にエンテロバクター・アグロメランスとして寄託されているが、本明細書では、パントエア・アナナティスとして記載する。
【００８２】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌の親株の例としては、E.coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)、変異型pheA34遺伝子を保持するE.coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E.coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。また、親株として、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE.
coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424
B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するL-フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【００８３】
Ｌ−トリプトファン生産菌
Ｌ−トリプトファン生産菌の親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニル酸シンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、ホスホエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８４】
膜タンパク質をコードするyddG遺伝子はL−アミノ酸の生合成経路には関与しないものの、微生物においてその野生型対立遺伝子が多コピーで増幅されたときにL-フェニルアラニンおよびいくつかのL-アミノ酸アナログに対する耐性を微生物に付与することが過去に明らかにされている。さらに、WO 03/044192では、yddG遺伝子の付加的なコピーがL-フェニルアラニンまたはL−トリプトファンの生産株の細胞に導入されたときに、これらのL-アミノ酸の生産が向上することが開示されている。したがって、L−トリプトファン生産菌はさらに、yddG遺伝子のオープンリーディングフレームの発現が増強するように改変されることが好ましい。
【００８５】
L-トリプトファン生産菌の親株の例としては、アンスラニレートシンターゼ、ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（serA）、及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる酵素の活性の一種以上が増大した株も挙げられる。アンスラニレートシンターゼ及びホスホグリセレートデヒドロゲナーゼは共にL-トリプトファン及びL-セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アンスラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、E. coli SV164に、フィードバック阻害が解除されたホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)を導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。
【００８６】
L-トリプトファン生産菌の親株の例としては、脱感作型アンスラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(JP 57-71397 A, JP 62-244382 A, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、L-トリプトファン生産能を、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることにより付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpBによりコードされるα及びβサブユニットからなる。
【００８７】
Ｌ−プロリン生産菌
Ｌ−プロリン生産菌の親株の例としては、ilvA遺伝子が欠損し、L-プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明の細菌は、L-プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大することにより改良されていてもよい。L-プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、L-プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタミン酸キナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が挙げられる。さらに、本発明の細菌は、細菌の細胞からL-アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が増大することにより改良されていてもよい。このような遺伝子としては、b2682 遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP1239041 A2)が挙げられる。
【００８８】
L-プロリン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などのE. coli 株が挙げられる。
【００８９】
Ｌ−アルギニン生産菌
Ｌ−アルギニン生産菌の親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタミン酸シンターゼを保持するその誘導体株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン
生産株(特開昭57-5693)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９０】
L-アルギニン生産菌の親株の例としては、L-アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。L-アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルホスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルリン酸シンターゼ遺伝子が挙げられる。
【００９１】
本発明の方法
本発明の方法は、培地で本発明の細菌を培養してＬ−アミノ酸を当該培地に生成、分泌させる工程、及び当該培地からＬ−アミノ酸を回収する工程を含むＬ−アミノ酸の製造方法である。
【００９２】
本発明において、培地等からのＬ−アミノ酸の培養、回収、及び精製は、Ｌ−アミノ酸を微生物によって製造する従来の発酵方法に従って行うことができる。
【００９３】
炭素源、窒素源、ミネラル、および必要に応じて微生物が生育のために必要とする適量の栄養素が含まれていれば、培地は合成培地又は天然培地のいずれであってもよい。炭素源としては、グルコース、スクロース、及びキシロース等の炭水化物、並びに様々な有機酸が挙げられる。選択された微生物の資化の態様に応じて、エタノール及びグリセロール等のアルコールを使用してもよい。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム等の様々なアンモニウム塩、アミン類等の他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物、及び消化された発酵性微生物等の天然の窒素源を使用することができる。ミネラルとしては、一リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等を使用することができる。ビタミンとしては、チアミン、酵母エキス等を使用することができる。
【００９４】
培養は、振盪または通気下での撹拌等の好気条件下で、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３８℃の温度で、行うことが好ましい。培地のｐＨは通常、５〜９であり、好ましくは６．５〜７．２である。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、様々な酸、様々な塩基、及び緩衝液で調整することができる。通常、１〜５日間の培養により培地中に標的Ｌ−アミノ酸が蓄積する。
【００９５】
培養後、遠心分離又は膜濾過によって、細胞等の固体を液体培地から除去し、イオン交換法、濃縮法、及び／又は結晶化法によって、標的Ｌ−アミノ酸を回収及び精製することができる。
【００９６】
［実施例］
本発明を、以下の非限定的な実施例を参照して以下により具体的に説明することができる。
【実施例１】
【００９７】
不活性化ｇｌｇＣ遺伝子を有する株の構築
１．ｇｌｇＣ遺伝子の欠失
ｇｌｇＣ遺伝子が欠失した株を、「Ｒｅｄ駆動組み込み」と呼ばれる、Datsenko, K.A.及びWanner, B.L., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645)によって
最初に開発された方法によって構築することができる。この手順によれば、ｇｌｇＣ遺伝子と鋳型プラスミド中の抗生物質耐性を付与する遺伝子に隣接する領域との両方に相補的なＰＣＲプライマーｇｌｇＣＬ（配列番号３）及びｇｌｇＣＲ（配列番号４）を構築することができる。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４(NBL Gene Sciences Ltd., UK) (ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号Ｘ０６４０３)をＰＣＲにおける鋳型として使用することができる。ＰＣＲ条件は以下であり得る：９５℃で３分間の変性ステップ；最初の２サイクルのプロフィール：９５℃で１分間、５０℃で３０秒間、７２℃で４０秒間；最後の２５サイクルのプロフィール：９５℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、７２℃で４０秒間；最終ステップ：７２℃で５分間。
【００９８】
１０９３ｂｐのＰＣＲ産物（図１）を得て、アガロースゲルで精製し、これを温度感受性複製するプラスミドｐＫＤ４６を含むエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ  ７００９２６）のエレクトロポレーションのために使用することができる。プラスミドｐＫＤ４６（Datsenko, K.A.及びWanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45）は、λファージ(ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０２４５９)の２，１５４ヌクレオチド（３１０８８〜３３２４１）のＤＮＡフラグメントを含み、アラビノース誘導性ＰaraBプロモーターの調節下で、λＲｅｄ相同組換え系（γ、β、エキソ遺伝子）の遺伝子を含む。プラスミドｐＫＤ４６は、ＭＧ１６５５株の染色体へのＰＣＲ産物の組み込みに必要である。
【００９９】
エレクトロコンピテント細胞を、以下のように調製することができる。アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）を添加したＬＢ培地中にて３０℃で生育させたエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の一晩培養物を、次いで、アンピシリン及びＬ−アラビノース（１ｍＭ）を含む５ｍｌのＳＯＢ培地（Sambrook 他, 著"Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）で１００倍に希釈することができる。得られた培養物を、通気しながら３０℃でＯＤ600が約０．６になるまで生育させ、次いで、１００倍濃縮し、氷冷脱イオンＨ2Ｏでの３回の洗浄によってエレクトロコンピテントにすることができる。７０μｌの細胞及び約１００ｎｇのＰＣＲ産物を使用して、エレクトロポレーションを行うことができる。エレクトロポレーション後の細胞を、１ｍｌのＳＯＣ培地（Sambrook 他, 著"Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）で３７℃で２．５時間インキュベートし、その後にＬ−寒天上に平坂播種し、３７℃で生育させ、ＣｍR組換え体を選抜した。次いで、ｐＫＤ４６プラスミドを取り除くために、４２℃のＣｍを含むＬ−寒天上で２回継代し、得られたコロニーを、アンピシリン感受性について試験することができる。
【０１００】
２．ＰＣＲによるｇｌｇＣ遺伝子欠失の同定
ｇｌｇＣ遺伝子が欠失し、Ｃｍ耐性遺伝子で標識された変異体を、ＰＣＲによって同定することができる。遺伝子座特異的プライマーｇｌｇＣ１（配列番号５）及びｇｌｇＣ２（配列番号６）を、同定のためにＰＣＲで使用することができる。ＰＣＲ同定の条件は以下であり得る：９４℃で３分間の変性のステップ；３０サイクルのプロフィール：９４℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、７２℃で１分間；最終ステップ：７２℃で７分間。鋳型にＭＧ１６５５ｇｌｇＣ+親株を使用した反応で得ることができるＰＣＲ産物は、１４７１ｂｐ長のはずである。鋳型に変異体ＭＧ１６５５ΔｇｌｇＣ::ｃａｔ株を使用した反応で得ることができるＰＣＲ産物は、１１９７ｂｐ長のはずである（図２）。
【実施例２】
【０１０１】
エシェリヒア・コリＶＬ３３４ｔｈｒＣ+−ΔｇｌｇＣによるＬ−グルタミン酸の生産
エシェリヒア・コリの−グルタミン酸生産株ＶＬ３３４ｔｈｒＣ+（ＥＰ１１７２４３３）の染色体中のｇｌｇＣ遺伝子を通常の既知の方法（例えば、ＭＧ１６５５ΔｇｌｇＣ
：：ｃａｔ株からのＰ１形質導入）によって欠失させ、ＶＬ３３４ｔｈｒＣ+−ΔｇｌｇＣを得ることができる。ＶＬ３３４ｔｈｒＣ+株は、２００４年１２月６日にロシア国立微生物受託機関（Russian National Collection of Industrial Microorganisms）(ＶＫＰＭ) (Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1)にてアクセッション番号ＶＫＰＭ  Ｂ−８９６１で寄託され、その後、２００４年１２月８日にブダペスト条約の下での寄託に移管されている。
【０１０２】
ＶＬ３３４ｔｈｒＣ+及びＶＬ３３４ｔｈｒＣ+−ΔｇｌｇＣの両株を、Ｌ−寒天プレート上にて３７℃で１８〜２４時間生育させることができる。次いで、１ループの細胞を、２ｍｌの発酵培地を含む試験管に移すことができる。発酵培地（ｐＨ７．２）は、グルコース（６０ｇ／ｌ）、硫酸アンモニウム（２５ｇ／ｌ）、ＫＨ2ＰＯ4（２ｇ／ｌ）、ＭｇＳＯ4（１ｇ／ｌ）、チアミン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、Ｌ−イソロイシン（７０μｇ／ｍｌ）、及びＣａＣＯ3（２５ｇ／ｌ）を含むべきである。グルコース及びＣａＣＯ3を、別々に滅菌すべきである。振盪しながら３０℃で３日間培養することができる。培養後、Ｌ−グルタミン酸の生成量を、ペーパークロマトグラフィ（液相の組成：ブタノール−酢酸−水＝４：１：１）及びその後のニンヒドリン（１％アセトン溶液）による染色ならびに０．５％ＣｄＣｌ2を含む５０％エタノールでのこの化合物のさらなる溶出によって測定することができる。
【実施例３】
【０１０３】
エシェリヒア・コリ７０２ｉｌｖＡ−ΔｇｌｇＣによるＬ−プロリンの生産
エシェリヒア・コリＬ−プロリン生産株７０２ｉｌｖＡ（ＶＫＰＭ  Ｂ−８０１２、ロシア特許出願第２０００１２４２９５号、欧州特許第１１７２４３３号）の染色体中のｇｌｇＣ遺伝子を上記の通常な既知の方法によって欠失させ、７０２ｉｌｖＡ−ΔｇｌｇＣ株を得ることができる。７０２ｉｌｖＡ株は、２０００年７月１８日にロシア国立微生物受託機関(ＶＫＰＭ) (Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1)にてアクセッション番号ＶＫＰＭ  Ｂ−８０１２で寄託されている。
【０１０４】
７０２ｉｌｖＡ及び７０２ｉｌｖＡ−ΔｇｌｇＣの両エシェリヒア・コリ株を、Ｌ−寒天プレート上にて３７℃で１８〜２４時間生育させることができる。次いで、これらの株を、上記と同一の条件下で培養することができる。
【実施例４】
【０１０５】
エシェリヒア・コリ２３７−ΔｇｌｇＣによるＬ−アルギニンの生産
エシェリヒア・コリＬ−アルギニン生産株２３７（ＶＫＰＭ  Ｂ−７９２５）の染色体中のｇｌｇＣ遺伝子を上記の通常の既知の方法によって欠失させ、２３７−ΔｇｌｇＣ株を得ることができる。２３７株は、２０００年４月１０日にロシア国立微生物受託機関(ＶＫＰＭ)(Russia, 113545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1)にてアクセッション番号ＶＫＰＭ  Ｂ−７９２５で寄託され、次いで２００１年５月１８日にブダペスト条約の下での寄託に移管されている。
【０１０６】
２３７及び２３７−ΔｇｌｇＣの両エシェリヒア・コリ株を、Ｌ−寒天プレート上にて３７℃で１８〜２４時間生育させることができる。次いで、これらの株を、上記と同一の条件下で培養することができる。
【実施例５】
【０１０７】
エシェリヒア・コリ５７−ΔｇｌｇＣによるＬ−ロイシンの生産
エシェリヒア・コリＬ−ロイシン生産株５７（ＶＫＰＭ  Ｂ−７３８６、米国特許第６，１２４，１２１号）の染色体中のｇｌｇＣ遺伝子を上記の通常の既知の方法によって欠失させ、５７−ｐＭＷ−ΔｇｌｇＣを得ることができる。５７株は、１９９７年５月１９
日にロシア国立微生物受託機関(ＶＫＰＭ) (Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1)にてアクセッション番号ＶＫＰＭ  Ｂ−７３８６で寄託されている。
【０１０８】
５７及び５７−ΔｇｌｇＣの両エシェリヒア・コリ株を、Ｌ−寒天プレート上にて３７℃で１８〜２４時間生育させることができる。次いで、これらの株を、培地にイソロイシンを加えることなく上記と同一の条件下で培養することができる。
【実施例６】
【０１０９】
エシェリヒア・コリＪＭ１５（ｙｄｅＤ）−ΔｇｌｇＣによるＬ−システインの生産
エシェリヒア・コリＬ−システイン生産株ＪＭ１５（ｙｄｅＤ）の染色体中のｇｌｇＣ遺伝子を、上記の通常の既知の方法によって欠失させ、ＪＭ１５（ｙｄｅＤ）−ΔｇｌｇＣ株を得ることができる。
【０１１０】
エシェリヒア・コリＪＭ１５の誘導体であるエシェリヒア・コリＪＭ１５（ｙｄｅＤ）（米国特許第６，２１８，１６８号）を、膜タンパク質をコードし、且ついかなるＬ−アミノ酸の生合成経路にも関与しないｙｄｅＤ遺伝子を有するＤＮＡ（米国特許第５，９７２，６６３号）で形質転換することができる。
【０１１１】
Ｌ−システイン生産の評価のための発酵条件は、米国特許第６，２１８，１６８号の実施例６に詳述されている。
【実施例７】
【０１１２】
エシェリヒア・コリＢ−３９９６−ΔｇｌｇＣによるＬ−スレオニンの生産
エシェリヒア・コリＬ−スレオニン生産株Ｂ−３９９６（ＶＫＰＭ  Ｂ−３９９６）の染色体中のｇｌｇＣ遺伝子を上記の通常の既知の方法によって欠失させ、Ｂ−３９９６−ΔｇｌｇＣ株を得ることができる。
【０１１３】
Ｂ−３９９６及びＢ−３９９６−ΔｇｌｇＣの両エシェリヒア・コリ株を、Ｌ−寒天プレート上にて３７℃で１８〜２４時間生育させることができる。次いで、これらの株を、上記と同一の条件下で培養することができる。
【実施例８】
【０１１４】
エシェリヒア・コリＡＪ１１４４２−ΔｇｌｇＣによるＬ−リジンの生産
エシェリヒア・コリＬ−リジン生産株ＡＪ１１４４２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５４３、ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１８５）の染色体中のｇｌｇＣ遺伝子を上記の通常の既知の方法によって欠失させ、ＡＪ１１４４２−ΔｇｌｇＣ株を得ることができる。ＡＪ１１４４２株は、１９８１年５月１日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託され、アクセッション番号ＦＥＲＭ  Ｐ−５０８４が付与された。次いで、１９８７年１０月２９日に、ブダペスト条約の定めるところにしたがって、国際寄託機関に移管され、アクセッション番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５４３が付与された。
【０１１５】
ＡＪ１１４４２及びＡＪ１１４４２−ΔｇｌｇＣの両エシェリヒア・コリ株を、Ｌ−寒天プレート上にて３７℃で１８〜２４時間生育させることができる。次いで、これらの株を、上記と同一の条件下で培養することができる。
【実施例９】
【０１１６】
エシェリヒア・コリＡＪ１２７３９−ΔｇｌｇＣによるＬ−フェニルアラニンの生産
エシェリヒア・コリＬ−フェニルアラニン生産株ＡＪ１２７３９(ｔｙｒＡ：：Ｔｎ１０、ｔｙｒＲ) (ＶＫＰＭ  Ｂ−８１９７)の染色体中のｇｌｇＣ遺伝子を上記の通常の既
知の方法によって欠失させ、ＡＪ１２７３９−ΔｇｌｇＣ株を得ることができる。ＡＪ１２７３９株は、２００１年１１月６日にロシア国立微生物受託機関(ＶＫＰＭ)(Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1)にてアクセッション番号ＶＫＰＭ  Ｂ−８１９７で寄託されている。
【０１１７】
ＡＪ１２７３９及びＡＪ１２７３９−ΔｇｌｇＣの両エシェリヒア・コリ株を、Ｌ−寒天プレート上にて３７℃で１８〜２４時間生育させることができる。次いで、これらの株を、上記と同一の条件下で培養することができる。
【実施例１０】
【０１１８】
不活性化されたｇｌｇＢＸオペロン及びｇｌｇＣＡＰオペロンを含む株の構築
１．ｇｌｇＢＸオペロン及びｇｌｇＣＡＰオペロンの欠失
ｇｌｇＢＸオペロン及びｇｌｇＣＡＰオペロンが欠失した株を、「Ｒｅｄ駆動組み込み」と呼ばれる、Datsenko, K.A.及びWanner, B.L., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,
97(12), 6640-6645)によって最初に開発された方法にしたがって構築した。この手順にしたがって、ｇｌｇＢＸオペロン及びｇｌｇＣＡＰオペロンに隣接する領域と鋳型プラスミド中の抗生物質耐性を付与する遺伝子との両方に相補的なＰＣＲプライマーｇｌｇＢＸＣＡＰＬ（配列番号７）及びｇｌｇＢＸＣＡＰＲ（配列番号８）を構築した。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４(NBL Gene Sciences Ltd., UK) (ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号Ｘ０６４０３)を、ＰＣＲにおける鋳型として使用した。ＰＣＲ条件は実施例１に詳述している。
【０１１９】
実施例１に記載のように、アガロースゲルで精製した１１５２ｂｐのＰＣＲ産物を、温度感受性複製するプラスミドｐＫＤ４６を含むエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ  ７００９２６）のエレクトロポレーションのために使用した。
【０１２０】
２．ＰＣＲによるｇｌｇＢＸオペロン及びｇｌｇＣＡＰオペロンの欠失の同定
ｇｌｇＢＸオペロン及びｇｌｇＣＡＰオペロンが欠失し、Ｃｍ耐性遺伝子で標識された変異体を、ＰＣＲによって同定した。遺伝子座特異的なプライマーｇｌｇＢＸＣＡＰ１（配列番号９）及びｇｌｇＢＸＣＡＰ２（配列番号１０）を、同定のためにＰＣＲで使用した。ＰＣＲ同定の条件は、実施例１に記載している。鋳型にＭＧ１６５５ｇｌｇＢＸＣＡＰ+親株を使用した反応で得られたＰＣＲ産物は、９４２５ｂｐ長であった。鋳型に変異株ＭＧ１６５５ΔｇｌｇＢＸＣＡＰ::ｃａｔを使用した反応で得られたＰＣＲ産物は、１２０８ｂｐ長であった（図３）。
【実施例１１】
【０１２１】
エシェリヒア・コリＢ−３９９６−ΔｇｌｇＢＸＣＡＰ株によるＬ−スレオニンの生産
スレオニン生産に対するｇｌｇＢＸオペロン及びｇｌｇＣＡＰオペロンの不活性化の効果を試験するために、上記エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｇｌｇＢＸＣＡＰ：：ｃａｔ株の染色体由来のＤＮＡフラグメントを、Ｐ１形質導入によってスレオニン生産エシェリヒア・コリＢ−３９９６株に移入した（Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY）。
【０１２２】
Ｂ−３９９６及びＢ−３９９６−ΔｇｌｇＢＸＣＡＰの両エシェリヒア・コリ株を、Ｌ−寒天プレート上にて３７℃で１８〜２４時間生育させた。種培養物を得るために、株を、回転式振盪培養機（２５０ｒｐｍ）において、４％グルコースを補充した２ｍｌのＬ−ブロスを含む２０×２００ｍｍ試験管中にて３２℃で１８時間生育させた。次いで、発酵培地に、０．２１ｍｌ（１０％）の種培養物を接種した。２ｍｌの発酵用最少培地を含む２０×２００ｍｍの試験管中で発酵した。細胞を、２５０ｒｐｍで振盪しながら３２℃で６５時間生育させた。
【０１２３】
培養後、培地中のＬ−スレオニンの蓄積量を、以下の移動相を使用したペーパークロマトグラフィによって測定した：ブタノール−酢酸−水＝４：１：１（ｖ／ｖ）。ニンヒドリンのアセトン溶液（２％）を、視覚化試薬として使用した。Ｌ−スレオニンを含むスポットを切り出し、Ｌ−スレオニンを、０．５％のＣｄＣｌ2水溶液で溶出し、Ｌ−スレオニン量を、分光光度法で５４０ｎｍで評価した。１０個の独立した試験管発酵の結果を、表１に示す。
【０１２４】
発酵培地の組成（ｇ／ｌ）を以下に示した。
グルコース               ８０．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4           ２２．０
ＮａＣｌ                  ０．８
ＫＨ2ＰＯ4                ２．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ        ０．８
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ        ０．０２
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ        ０．０２
塩酸チアミン              ０．０００２
酵母抽出物                １．０
ＣａＣＯ3               ３０．０
【０１２５】
グルコース及び硫酸マグネシウムは、別々に滅菌した。ＣａＣＯ3は、１８０℃で２時間乾熱滅菌した。ｐＨは、７．０に調整した。滅菌後、培地に抗生物質を添加した。
【０１２６】
表１から認められるように、Ｂ−３９９６−ΔｇｌｇＢＸＣＡＰにより、Ｂ−３９９６と比較して、より大量のＬ−スレオニンが蓄積した。
【実施例１２】
【０１２７】
エシェリヒア・コリＷＣ１９６−ΔｇｌｇＢＸＣＡＰ株によるＬ−リジンの生産
Ｌ−リジン生産に対するｇｌｇＢＸオペロン及びｇｌｇＣＡＰオペロンの不活性化の効果を試験するために、上記エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｇｌｇＢＸＣＡＰ::ｃａｔ株の染色体由来のＤＮＡフラグメントを、Ｐ１形質導入によってリジン生産エシェリヒア・コリＷＣ１９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２５２）に移入した（Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY）。
【０１２８】
種培養物を得るために、ＷＣ１９６及びＷＣ１９６−ΔｇｌｇＢＸＣＡＰの両エシェリヒア・コリ株を、回転式振盪培養機（２５０ｒｐｍ）において、下記の発酵培地と比較して２倍に希釈した２ｍｌの培地を含む２０×２００ｍｍ試験管中にて３２℃で１８時間生育させた。次いで、発酵培地に、０．２１ｍｌ（１０％）の種培養物を接種した。２ｍｌの発酵用最少培地を含む２０×２００ｍｍの試験管中で発酵した。細胞を、２５０ｒｐｍで振盪しながら３２℃で２４時間生育させた。
【０１２９】
培養後、培地中のＬ−リジンの蓄積量を、以下の移動相を使用したペーパークロマトグラフィによって測定した：ブタノール−酢酸−水＝４：１：１（ｖ／ｖ）。ニンヒドリンのアセトン溶液（２％）を、視覚化試薬として使用した。Ｌ−リジンを含むスポットを切り出し、Ｌ−リジンを、０．５％のＣｄＣｌ2水溶液で溶出し、Ｌ−リジン量を、分光光度法で５４０ｎｍで評価した。１０個の独立した試験管発酵の結果を、表２に示す。
【０１３０】
発酵培地の組成（ｇ／ｌ）を以下に示した。
グルコース              ４０．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4          ２４．０
ＫＨ2ＰＯ4                １．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ        １．０
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ        ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ        ０．０１
酵母抽出物                ２．０
ＣａＣＯ3               ３０．０
【０１３１】
グルコース、リン酸カリウム及び硫酸マグネシウムは、別々に滅菌した。ＣａＣＯ3は、１８０℃で２時間乾熱滅菌した。ｐＨは、７．０に調整した。
【０１３２】
表２から認められるように、ＷＣ１９６−ΔｇｌｇＢＸＣＡＰにより、ＷＣ１９６と比較して、より大量のＬ−リジンが蓄積した。
【０１３３】
本発明をその好ましい実施形態に関して詳述しているが、本発明の範囲を逸脱することなく種々の変更を行うことができ、等価物を使用することができることが当業者に明らかであろう。本明細書中で引用した全ての参考文献は、本出願の一部として参照として援用される。
【０１３４】
【表１】
2009515506.tif 000003
【０１３５】
【表２】
2009515506.tif 000004
【産業上の利用の可能性】
【０１３６】
本発明によれば、腸内細菌科の細菌による芳香族Ｌ−アミノ酸又は非芳香族Ｌ−アミノ酸の生産を増強することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】ｃａｔ遺伝子の増幅で使用したプラスミドｐＡＣＹＣ１８４上のプライマーｇｌｇＣＬ及びｇｌｇＣＲの相対的位置を示す図である。
【図２】不活性化されたｇｌｇＣ遺伝子を含む染色体ＤＮＡフラグメントの構築を示す図である。
【図３】不活性化されたｇｌｇＢＸ及びｇｌｇＣＡＰオペロンを含む染色体ＤＮＡフラグメントの構築を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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