(57)【要約】  本発明は、下記の構造：2009530445.tif 000011を有するアクリル化ヒアルロン酸製造物、及びそれを製造するプロセスに関する。
2009530445.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造：
【化１】
2009530445.tif 000010
を有するアクリル化ヒアルロン酸製造物。
【請求項２】
Ｒ1が、水素、メチル、塩素及びＣＯＣｌからなる群から選択され、Ｒ2が、水素、メチル、フェニル、塩素、２−クロロフェニル、ＣＯＣｌ及びＣＨ2ＣＯＣｌからなる群から選択され、Ｒ3が水素、メチル、塩素、４−ニトロフェニル、３−トリフルオロメチルフェニル及びスチリル部分からなる群から選択される、請求項１に記載のアクリル化ヒアルロン酸製造物。
【請求項３】
ａ）ｐＨが適切なｐＨで保たれた状態で、ヒアルロン酸を含む水性液体を用意する工程；
ｂ）塩化アクリロイル及び有機溶媒を含む有機液体を用意する工程；及び
ｃ）ｐＨが適切なｐＨで維持された状態で、（ｂ）の有機液体と（ａ）の水性液体とを混合する工程
を含むアクリル化ヒアルロン酸製造物を製造するプロセス。
【請求項４】
工程ｃ）における混合が撹拌によって達成される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
工程ａ）がｐＨ７〜１１で維持される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項６】
工程ａ）の水性液体がリン酸緩衝液を含む、請求項３に記載のプロセス。
【請求項７】
リン酸緩衝液が０．１モル濃度〜１モル濃度の量で存在する、請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
工程ｃ）がｐＨ７〜１１で維持される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項９】
工程ｃ）が、緩衝剤によってｐＨ７〜１１で維持される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項１０】
工程ｃ）が、ＮａＯＨの滴状（ｄｒｏｐ−ｗｉｓｅ）添加によってｐＨ７〜１１で維持される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項１１】
工程ｃ）が、緩衝剤の使用及び／又は希釈したＮａＯＨの滴状添加によってｐＨ７〜１１で維持される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項１２】
工程ｃ）がｐＨ７．５〜１０で維持される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項１３】
工程ｃ）が、緩衝剤によってｐＨ７．５〜１０で維持される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項１４】
工程ｃ）が、ＮａＯＨの滴状添加によってｐＨ７．５〜１０で維持される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項１５】
工程ｃ）が、緩衝剤の使用及び／又は希釈したＮａＯＨの滴状添加によってｐＨ７．５〜１０で維持される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項１６】
工程ｃ）がｐＨ８〜９で維持される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項１７】
工程ｃ）が、緩衝剤によってｐＨ８〜９で維持される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項１８】
工程ｃ）が、ＮａＯＨの滴状添加によってｐＨ８〜９で維持される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項１９】
工程ｃ）が、緩衝剤の使用及び／又は希釈したＮａＯＨの滴状添加によってｐＨ８〜９で維持される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項２０】
工程ａ）の最中、温度が０℃〜１５℃に保たれる、請求項３に記載のプロセス。
【請求項２１】
工程ｃ）の最中、温度が０℃〜５℃に保たれる、請求項３に記載のプロセス。
【請求項２２】
工程ａ）の水性液体のｐＨが、ＮａＯＨを滴状添加することによって調整される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項２３】
工程ａ）の水性液体のｐＨが、緩衝剤及び／又はＮａＯＨを滴状添加することによって調整される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項２４】
工程ｃ）のｐＨが、ＮａＯＨを滴状添加することによって調整される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項２５】
工程ｃ）のｐＨが、緩衝剤及び／又はＮａＯＨを滴状添加することによって調整される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項２６】
工程ｃ）における塩化アクリロイルの添加が、シリンジポンプの使用によって達成される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項２７】
回収工程をさらに含む、請求項３に記載のプロセス。
【請求項２８】
回収工程が沈殿工程を含む、請求項２７に記載のプロセス。
【請求項２９】
回収工程が、反応混合物のろ過工程及びろ過物の沈殿工程をさらに含む、請求項２７に記載のプロセス。
【請求項３０】
有機溶媒が、ジクロロメタン及びジエチルエーテルからなる群から選択される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項３１】
請求項１に記載のアクリル化ヒアルロン酸製造物を重合／架橋する方法であって、
ａ）請求項１に記載のアクリル化ヒアルロン酸製造物；
ｂ）過酸化物源；
ｃ）開始剤；
ｄ）酵素；及び
ｅ）溶媒
を組み合わせることを含む前記方法。
【請求項３２】
過酸化物源が、過酸化水素又はアルキル過酸化物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
酵素が、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ、大豆ペルオキシダーゼ、及びリグニン・ペルオキシダーゼから選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
アクリル化ヒアルロン酸製造物が、メタクリル酸エステル類、アクリル酸エステル類、アクリルアミド、スチレン、並びにアクリル酸及びその塩の１つである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
酵素が組換え酵素である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
酵素が好熱性酵素である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
酵素が中温性酵素である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
開始剤がベータ−ジカルボニル化合物又はベータ−ジケトンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
溶媒が、水若しくは有機溶媒、又はそれらの混合物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
不活性雰囲気下で組み合わせることを含む、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アクリル化ヒアルロン酸（ＨＡ）を製造するプロセス、その製造物及びそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、非硫酸化グリコサミノグリカン類に属する天然及び線状の糖質高分子である。ヒアルロン酸は、ベータ−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン及びベータ−１，４−グルクロン酸繰り返し二糖単位から構成され、分子量（ＭＷ）が最大６ＭＤａである。ＨＡは、ヒアリン軟骨、滑膜関節滑液、及び真皮と表皮の両方の皮膚組織に存在している。ＨＡは、脊椎動物の結合組織を含む自然組織、ヒトの臍帯、及びニワトリのトサカから抽出することができる。しかしながら、今日では、病原物質を移動させる潜在的なリスクを最小限にし、製造物の均一性、品質及び利用可能性を増加させるために、微生物学的な方法によってＨＡを調製することが好ましい（米国特許第６，９５１，７４３号；ＷＯ０３／０１７５９０２）。
【０００３】
生体におけるＨＡの多数の役割が同定されてきた。ＨＡは、皮膚、腱、筋肉及び軟骨などの多くの組織の細胞のための機械的支持体として、生物有機体において重要な役割を果たす。ＨＡは、組織の湿潤、及び潤滑などの主要な生物学的プロセスに関与している。また、接着、発生、細胞移動、癌、血管形成、及び創傷治癒などの多数の生理作用における役割を有すると考えられている。ＨＡの独特かつ生物学的な特性（粘弾性、生体適合性、生体分解性を含む）により、ＨＡは、化粧品、眼科、リウマチ科、薬物及び遺伝子送達、創傷治癒及び組織工学における広範囲な現在及び開発中の用途において採用されている。これらの用途のいくつかにおけるＨＡの使用は、ＨＡが室温で、即ち、約２０℃で水に溶解し、生体内ではヒアルロニダーゼによって急速に分解され、生体材料に加工することが困難であるといった事実によって制限されている。したがって、ＨＡの架橋は、ＨＡの物理学的及び機械的特性、並びにインビボでの滞留時間を改善するために取り込まれている。
【０００４】
アクリル化ＨＡは、酵素媒介の架橋を実行し、ハイドロゲルの形態で材料を製造するために用いることができる。架橋されたＨＡは、化粧品、生物医学的及び医薬的用途において用いることができる。ＨＡを架橋することによって、特定の用途のために特定の特性を有する化合物を設計することが可能になる。アクリル化ＨＡは、様々な用途のために生物活性なペプチドを導入するために、Ｍｉｃｈａｅｌ型付加によってさらに修飾可能な官能性反応基を与える。
【０００５】
ＨＡ上のアクリレート基は、メタクリル酸グリシジル−ＨＡ（ＧＭＨＡ）結合体の合成によって導入されている。ＧＭＨＡ誘導体は、組織修復及び創傷治癒を促進するＨＡ生体模倣的ハイドロゲルの調製に有用である。また、結合したメタクリレート基の量の増加は、架橋密度の増加、及び分解速度の減少と一致し、ヒトの大動脈内皮細胞の細胞適合性及び増殖へのわずか効果を与えることが分かってきた。ＧＭＨＡ誘導体は、過剰のトリメチルアミン及びテトラブチルアンモニウムブロミドの存在下で、蒸留水中の発酵誘導したＨＡ（分子量：約２×１０6）の１％ｗ／ｖ溶液を６、１０及び２０倍のモル濃度の過剰なメタクリル酸グリシジルとともに、一晩、室温で処理し、次に６０℃で１時間インキュベートすることによって調製されている。例えば、６倍のモル濃度の過剰なＧＭを有するＧＭＨＡは、１．０ｇのＨＡを１００ｍｌの蒸留水に溶解させることによって調製された。この溶液に、２．２ｍｌのトリエチルアミン、２．２ｍｌのメタクリル酸グリシジル、及び２．２ｇのテトラブチルアンモニウムブロミドを添加し、一晩撹拌後、６０℃で１時間インキュベートした。このプロセスによって、５％のメタクリル化が達成された。１０倍及び２０倍のモル濃度の過剰を用いて、７及び１１％のアクリル化が達成された（Ｌｅａｃｈ及びＳｃｈｍｉｄｔ，２００５，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２６，１２５−１３５；Ｙｏｎｅｓｅら，２００２，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５０，１３４１−１３４８；Ｓｃｈｍｉｄｔら，２００３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ８２（５），５７８−５８９）。
【０００６】
ＧＭＨＡ結合体はまた、ｐＨ１１．０の炭酸塩緩衝液中にＨＡを溶解させることによって調製されている。メタクリル酸グリシジルを上記溶液に添加し、混合物を室温で７日間撹拌した。得られた溶液のｐＨをＨＣｌで７．０に調整した。これをろ過し、凍結乾燥した（Ｙｏｎｅｓｅ，２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７３，１７３−１８１）。ＧＭＨＡ結合体は、アクリル酸ヒドロキシエチルを用いてさらに架橋し、ハイドロゲルを調製した。
【０００７】
また、ＨＡ上のアクリレート基は、ＨＡに存在するカルボキシル基の修飾によるＮ−３−アミノプロピルメタクリルアミド−ＨＡ結合体の合成によって導入されている。天然のＨＡと酵素的に分解されたＨＡの両方は、化学修飾に実質的に用いられた。ＨＡの両方は、アクリル化剤としてＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミドを用いることによって修飾された。アミノプロピル基は、他端でペンダント状のアクリル基を含むアミド結合の形成をもたらすカップリング剤としてＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣＩ）の存在下で、ＨＡのカルボキシル基と反応した。典型的な反応では、ＨＡは、蒸留水に溶解させた。この溶液に、ＥＤＣＩ、次にＮ−３−アミノプロピルメタクリルアミドを添加した。反応混合物は、ｐＨ６．５で２時間インキュベートし、続いて、ＥＤＣＩ及びＮ−３−アミノプロピルメタクリルアミドを連続して添加し、さらに、室温で２時間インキュベートした。溶液をろ過し、ＮａＣｌ、次に水に対して透析し、最後に凍結乾燥させて、メタクリル化ＨＡを得た。得られたアクリル化の程度は、およそ１０％であった（Ｔｉｒｅｌｌｉら，２００３，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４，８９３−９００；Ｋｉｍ及びＰａｒｋ  ２００２，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，８０，６９−７７）。
【０００８】
メタクリル化ヒアルロン酸（ＨＡＭＡ）は、ｐＨ８に調整された脱イオン水中の１％  ＨＡ溶液に無水メタクリル酸（約２０倍）を添加し、氷上で２４時間反応させることによって合成されている。修飾した多糖を沈殿させ、エタノールで洗浄し、無水メタクリル酸を除去した。このプロセスでは、最大１７％のメタクリル化が達成された。達成された低いメタクリル化％（１７％）は、無水メタクリル酸とＨＡヒドロキシルとの低い反応性に起因した（Ｓｍｅｄｓ及びＧｒｉｎｓｔａｆｆ  ２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４，１１５−１２１；Ｌａｎｇｅｒら，２００５，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，６，３８６−３９１）。
【０００９】
ＨＡをアクリル化する既知の方法は、多大な時間を必要とし、複雑であり、ＨＡのアクリル化のより単純なプロセスが当該技術分野において必要である。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明は、アクリル化ヒアルロン酸を製造する方法に関し、該方法は、下記：
（ａ）ヒアルロン酸を含む、ｐＨが７〜１１である水性液体を用意する工程；
（ｂ）アクリルクロリド（ａｃｒｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）及び塩化メチレン／ジエチルエーテルを含む有機液体を用意する工程；及び
（ｃ）ｐＨが７〜１１で維持された状態で、（ｂ）の有機液体と（ａ）の水性液体とを混合する工程
を含む。
【００１１】
本発明はまた、下記の構造を有するアクリル化ヒアルロン酸製造物に関する。
【００１２】
【化１】
2009530445.tif 000003
【００１３】
使用されるアクリル化試薬が非常に高い反応性であるために、本発明のプロセスは非常に迅速であり、それにより従来の反応時間を減少させる。達成されるアルキル化％は、本発明のプロセスを用いると非常に高い。単純であり、しかも迅速なプロセスを用いることにより、＞９０％のアルキル化が、今日までに報告されている複雑なプロセスの使用による１７％と比較しても、非常に短い反応時間（１〜２時間）で得られる。さらに、本発明のプロセスにおいて得られる副生物は非常に少なく、報告されているプロトコールと比較しても容易に取り除くことができる。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、アクリル化ヒアルロン酸を製造するプロセスに関し、該プロセスは、下記：ａ）ｐＨが７〜１１で保たれた状態で、ヒアルロン酸を含む水性溶液を用意する工程；ｂ）塩化アクリロイル及び有機溶媒を含む有機溶液を用意する工程；及び、ｃ）ｐＨが７〜１１で維持された状態で、（ｂ）の有機液体と（ａ）の水性液体とを混合する工程を含む。
【００１５】
本発明の方法では、ＨＡは、制御可能にアクリル化及び架橋され、創傷治癒、組織工学的足場における様々な用途のための広範囲な特性、及び広範囲な他の生物医学的用途を有する高水和性かつ分解性ハイドロゲルを形成することができる。
【００１６】
ＨＡのナトリウム塩の構造式は、下記に示される：
【００１７】
【化２】
2009530445.tif 000004
【００１８】
「ヒアルロン酸」は、本明細書においては、交互にベータ−１，４−及びベータ−１，３グリコシド結合によって互いに連結されたＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びグルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）の繰り返し二糖単位から構成される非硫酸化グリコサミノグリカンとして定義され、それは、天然では、細胞表面、脊椎動物の結合組織の塩基性細胞外物質、関節の滑液、眼の眼球内液（ｅｎｄｏｂｕｌｂａｒ  ｆｌｕｉｄ）、ヒトの臍帯、及びオンドリのトサカに存在している。また、ヒアルロン酸は、ヒアルロナン、ヒアルロン酸塩、又はＨＡとして知られている。ヒアルロナン及びヒアルロン酸なる用語は、本明細書において互換可能に用いられる。
【００１９】
用語「ヒアルロン酸」は、様々な分子量を有するＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びＤ−グルクロン酸の一群の多糖、又はさらにその分解した画分を包含する。
【００２０】
本発明は、相間移動触媒及びカップリング剤の使用を避けたＨＡをアクリル化する簡便なプロセスを記載している。本発明による解決すべき課題は、簡便かつ迅速なプロセスにおいて、架橋されたＨＡを基礎としたハイドロゲルを製造するために、アクリル化ヒアルロン酸中間体をどのように製造するかである。
【００２１】
本発明に用いられるＨＡは、脊椎動物の結合組織を含む自然組織、ヒトの臍帯、及びニワトリのトサカ由来のＨＡを含む任意の利用可能なＨＡであってもよい。特定の態様では、ヒアルロン酸またはその塩は、グラム陽性菌又は宿主細胞によって、より好ましくはバシラス属の細菌によって、組換え的に製造される。別の態様では、ＨＡは、ストレプトコッカス細胞から得られる。
【００２２】
宿主細胞は、ヒアルロン酸の組換え的な製造に適した任意のバシラス細胞であってもよい。バシラス宿主細胞は、野生型バシラス細胞又はその突然変異体であってもよい。本発明の実施に有用なバシラス細胞には、限定されないが、バシラス・アガラデルヘンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｅｒｈｅｎｓ）、バシラス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシラス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バシラス・サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バシラス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バシラス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バシラス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バシラス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バシラス・リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシラス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バシラス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及びバシラス・ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞が含まれる。組換え発現に特に適合した変異体のバシラス・サブチリス細胞は、ＷＯ９８／２２５９８に記載されている。被嚢性でないバシラス細胞は、本発明に特に有用である。
【００２３】
好ましい態様では、バシラス宿主細胞は、バシラス・アミロリクエファシエンス、バシラス・クラウシイ、バシラス・レンツス、バシラス・リチェニホルミス、バシラス・ステアロサーモフィルス又はバシラス・サブチリス細胞である。より好ましい態様では、バシラス細胞は、バシラス・アミロリクエファシエンス細胞である。別のより好ましい態様では、バシラス細胞は、バシラス・クラウシイ細胞である。別のより好ましい態様では、バシラス細胞は、バシラス・レンツス細胞である。別のより好ましい態様では、バシラス細胞は、バシラス・リチェニホルミス細胞である。別のより好ましい態様では、バシラス細胞は、バシラス・サブチリス細胞である。最も好ましい態様では、バシラス宿主細胞は、バシラス・サブチリスＡ１６４Δ５細胞（米国特許第５，８９１，７０１号を参照されたい）又はバシラス・サブチリス１６８Δ４である。
【００２４】
ヒアルロン酸の平均分子量は、当該技術分野において標準的な方法、例えば、Ｕｅｎｏら，１９８８，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３６，４９７１−４９７５；Ｗｙａｔｔ，１９９３，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ２７２，１−４０；及び、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１９９９，“Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＤＡＷＮ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”及び“ＤＡＷＮ  ＥＯＳ  Ｍａｎｕａｌ”Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａに記載されている方法を用いて決定することができる。
【００２５】
好ましい態様では、本発明のヒアルロン酸、又はその塩は、分子量が約１０，０００〜約１０，０００，０００Ｄａである。より好ましい態様では、分子量は約２５，０００〜約５，０００，０００Ｄａである。最も好ましい態様では、ヒアルロン酸は、分子量が約５０，０００〜約３，０００，０００Ｄａである。
【００２６】
本発明のプロセスでは、使用される塩化アクリロイルは、任意の利用可能な塩化アクリロイルであってもよい。
【００２７】
塩化アクリロイルは、下記の構造：
【００２８】
【化３】
2009530445.tif 000005
【００２９】
（式中、特定の態様では、Ｒ1は、水素、メチル、塩素及びＣＯＣｌからなる群から選択され、Ｒ2は、水素、メチル、フェニル、塩素、２−クロロフェニル、ＣＯＣｌ及びＣＨ2ＣＯＣｌからなる群から選択され、Ｒ3は、水素、メチル、塩素、４−ニトロフェニル、３−トリフルオロメチルフェニル及びスチリル部分からなる群から選択される）
を有する。
【００３０】
２−プロペノイルクロリド又はアクリル酸クロリドとしても知られている塩化アクリロイルは、刺激臭を伴う透明な淡黄色の可燃性液体である。それは、化合物の酸塩化物群に属し、したがって、アクリル酸の誘導体である。この化合物は、酸塩化物の共通の反応を与える：水と激しく反応し、アクリル酸が生じる。アルコールとの反応は、エステルの形成をもたらし、アミンとの反応は、アミドを生じさせる。塩化アクリロイルは、他の化合物にアクリル部分を導入するために、有機合成では最も一般的に採用されている。また、アクリレート単量体及び重合体の調製において広く用いられている。
【００３１】
本発明の特定の態様では、塩化アクリロイルは、塩化アクリロイル、塩化メタクリロイル、塩化クロトニル、塩化シンナモイル、塩化フマリル、塩化イタコニル、塩化３，３−ジメチルアクリロイル、塩化トリクロロアクリロイル、塩化２−クロロシンナモイル、塩化トランス−４−ニトロシンナモイル、塩化トランス−３−（トリフルオロメチル）シンナモイル、塩化トランス−３−（トリフルオロメチル）シンナモイル及び塩化シンナミリデンマロニルからなる群から選択される。
【００３２】
本発明の方法では、ＨＡは、下記に示される反応に従って、塩化アクリロイルと反応させる：
【００３３】
【化４】
2009530445.tif 000006
【００３４】
式中、Ｒ1は、水素、メチル、塩素及びＣＯＣｌからなる群から選択され、Ｒ2は、水素、メチル、フェニル、塩素、２−クロロフェニル、ＣＯＣｌ及びＣＨ2ＣＯＣｌからなる群から選択され、Ｒ3は、水素、メチル、塩素、４−ニトロフェニル、３−トリフルオロメチルフェニル及びスチリル部分からなる群から選択される。
【００３５】
本発明の特定の態様では、ａ）の水性液体は、下記のように調製される：ＨＡを水、特に脱イオン水に溶解させ、ＨＡを含む水性液体を形成する。ＨＡを含む前記水性液体に水酸化ナトリウムを滴状（ｄｒｏｐ−ｗｉｓｅ）添加する。ＨＡの水酸基が脱プロトン化することが重要である。水性液体を低温で一時期放置し、水酸基の水酸化物イオンへの転換を確実にする。
【００３６】
本発明の特定の態様では、水性液体の温度は、ＨＡの溶解後、約０℃〜５℃まで下げ、反応中は０℃〜１５℃に保つ。本発明のより具体的な態様では、水性液体の温度は、反応中は０℃〜５℃に保たれる。
【００３７】
本発明の特定の態様では、ｐＨは、このプロセスの第１工程中、７〜１１で維持される。本発明のより具体的な態様では、ｐＨは、８〜１０で保たれる。本発明の最も具体的ｎ態様では、ｐＨは、８．５〜９．５で保たれる。ｐＨは、緩衝剤によって、及び／又は希釈した水酸化ナトリウムの添加によって維持される。
【００３８】
有機液体は、塩化アクリロイルと低沸点の非混和性溶媒とを混合することによって調製される。この低沸点の非混和性溶媒は、ジエチルエーテル及びジクロロメタンからなる群から選択されてもよい。
【００３９】
アクリル化は、主に、溶液のｐＨに依存する。特定の態様では、塩化アクリロイルは、ＨＡ溶液に滴状添加される。ある種のアクリル酸は、ｐＨが下がることで形成され、即ち、ｐＨを上げるための塩基を添加することが必要である。特定の態様では、ｐＨは、緩衝剤の使用及び／又はＮａＯＨ、好ましくは１Ｎ〜５ＮのＮａＯＨの添加によって、７〜１１で維持される。本発明の特定の態様では、ｐＨは、反応中、７．５〜１０で保たれる。本発明のより具体的な態様では、ｐＨは、反応中、７．５〜９．５で維持される。最も具体的な発明では、ｐＨは、８〜９で維持される。
【００４０】
本反応の最適ｐＨは、８〜９．５である。塩化アクリロイルの添加中にｐＨを安定に維持することは困難であり、それは、塩化アクリロイルと水との比較的に急速な反応により、ｐＨ変化が非常に早く、アクリル酸を形成してしまうためである。
【００４１】
ＨＡと塩化アクリロイルとの反応中にｐＨを８〜９．５に維持することができるようにするため、シリンジポンプを用いた塩化アクリロイルの添加により、問題が解決され、５００〜１０００μＬ／時で塩化アクリロイルの添加を維持できることが見出された。シリンジポンプの使用により、より少量の塩化アクリロイルが添加され、したがって、ｐＨは、容易に維持することができる。このようにして、特定の態様では、シリンジポンプは、ｐＨを安定に維持するために用いられる。
【００４２】
モル濃度ベースでのＨＡと塩化アクリロイルの比は、好ましくは、１：１０〜１：６０である。好ましい態様では、２５ｍｌの脱イオン水中の５０ｍｇのＨＡ（０．１２５ｍｍｏｌ）は、約１：１２の比で、１２０マイクロリットルの塩化アクリロイル（１．４８ｍｍｏｌ）で処理され、ＨＡの１７％アクリル化が得られた。別の好ましい態様では、同濃度のＨＡ（０．１２５ｍｍｏｌ）は、約１：２５の比で、より多量の塩化アクリロイル（２５０マイクロリットル、３．０７ｍｍｏｌ）で処理され、ＨＡの３４％アクリル化が得られた。より好ましい態様では、０．１２５ｍｍｏｌのＨＡは、約１：５０の比で、５００マイクロリットルの塩化アクリロイル（６．１５ｍｍｏｌ）で処理され、ＨＡの９０％アクリル化が得られた。
【００４３】
塩化アクリロイルの完全なアクリル化後、この溶液反応混合物を撹拌し、完全な反応を確実にする。
【００４４】
反応が終了後、アクリル化ＨＡ製造物は、エタノール、アセトン、メタノール又はイソプロピルアルコールのような過剰の有機溶媒を添加して沈殿させる。誘導体化した製造物の精製のために、遠心分離し、エタノール、メタノール又はアセトンなどの溶媒で洗浄する。この製造物は透析され、実質的に純粋なアクリル化ＨＡ製造物が得られる。
【００４５】
アクリル化ＨＡは、例えば、凍結乾燥又は噴霧乾燥によって乾燥粉末に調合されてもよい。
【００４６】
また、本発明は、下記の構造を有するアクリル化ＨＡに関する：
【００４７】
【化５】
2009530445.tif 000007
【００４８】
式中、Ｒ1は、水素、メチル、塩素及びＣＯＣｌからなる群から選択され、Ｒ2は、水素、メチル、フェニル、塩素、２−クロロフェニル、ＣＯＣｌ及びＣＨ2ＣＯＣｌからなる群から選択され、Ｒ3は、水素、メチル、塩素、４−ニトロフェニル、３−トリフルオロメチルフェニル及びスチリル部分からなる群から選択される。
【００４９】
特定の態様では、本発明は、下記の構造を有するアクリル化ＨＡを開示する。
【００５０】
【化６】
2009530445.tif 000008
【００５１】
アクリル化ＨＡ製造物は、プロトンＮＭＲによって特徴付けることができる。アクリル化％は、アクリレートのプロトン５．６６ｐｐｍ（１Ｈ）からヒアルロン酸のＮ−アセチルのプロトン（複数）（−ＮＨＣＯＣＨ3、３Ｈ、２．０ｐｐｍ）までの積算値により決定される。
【００５２】
アクリル化ＨＡを用いて、酵素媒介の架橋を実行し、ハイドロゲルの形態で材料を製造することができる。
【００５３】
酵素媒介の架橋／重合の例：
ペルオキシダーゼ（セイヨウワサビ）を酵素触媒として用いて、分子内又は分子間のアクリル官能基の重合／架橋を仲介した。
【００５４】
ペルオキシダーゼ及びラッカーゼの酵素分類は、ＨＡグリシジルアクリレート及びＨＡ−アクリレートの上述した架橋反応を触媒することができる。
【００５５】
化学的に修飾したＨＡポリマーの酵素的な架橋反応は、代替の化学的方法と比較して穏やかであり、環境的に扱いやすい。
【００５６】
これまでに、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、メタクリル酸メチルのフリーラジカル重合を媒介することが報告されている（Ｋａｌｒａ，Ｂ．；Ｇｒｏｓｓ，Ｒ．Ａ．；Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４，１７４−１７８）。この反応は、周囲温度で、水中で実行することができる。一例として、水性媒体で行われたアクリル酸ナトリウムのＨＲＰ媒介の重合により、２４時間以内に、Ｍｗが約１１９ＫＤａであるポリ（アクリル酸ナトリウム）が最大８８％の収率で得られた。
【００５７】
特定の態様では、酵素は、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ、大豆ペルオキシダーゼ、及びリグニン・ペルオキシダーゼの１つである。
【００５８】
特定の態様では、酵素は、組換え酵素である。
特定の態様では、酵素は、好熱性酵素である。
特定の態様では、酵素は、中温性酵素である。
【００５９】
本発明の特定の態様では、本発明のアクリル化ヒアルロン酸製造物の重合／架橋の方法は、下記：
ａ）請求項１のアクリル化ヒアルロン酸製造物；
ｂ）過酸化物源；
ｃ）開始剤；
ｄ）酵素；及び
ｅ）溶媒
を組み合わせることを含む。
【００６０】
本発明に有用な過酸化物源は、酸素−酸素結合を有する任意の化合物、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化アルカリ及びアルカリ土類金属、過酸化モノ及びジアルキル、過酸化水素ｂｉｓ−ＴＭＳエーテル、有機及び無機過酸、又は過酸化水素であってもよい。反応条件化で酸素−酸素結合を有する化合物を生じさせる試薬はまた、この用語が本明細書中で使用されるとき、過酸化物源である。過酸化水素は、副生物として水だけを生じるので好ましい。
【００６１】
本発明の特定の態様では、過酸化物源は、過酸化水素又は過酸化アルキルであってもよい。
【００６２】
本発明の特定の態様では、アクリル化ヒアルロン酸製造物は、メタクリル酸エステル類、アクリル酸エステル類、アクリルアミド、スチレン、並びにアクリル酸及びその塩の１つである。
【００６３】
本発明の特定の態様では、開始剤は、ベータ−ジカルボニル化合物又はベータ−ジケトンである。
【００６４】
特定の態様では、溶媒は、水若しくは有機溶媒、又はそれらの混合物である。
特定の態様では、重合／架橋は、不活性雰囲気下でなされる。
【実施例】
【００６５】
実施例１
高分子量のヒアルロン酸（７００，０００〜１，０００，０００ダルトン、５０ｍｇ）を脱イオン水（２５ｍｌ）に溶解した。温度を０℃まで下げた。
【００６６】
上記の溶液に、０．３３Ｎ  ＮａＯＨを１滴添加した。ｐＨは、５．４から９．５に変化した。溶液をこのｐＨで３０分間撹拌した。等量の塩化アクリロイル（１００〜５００μＬ）及びジクロロメタン（１００〜５００ｍｌ）の混合物を調製した。ヒアルロン酸反応混合物に１時間かけてこれを１滴ずつ添加した。塩化アクリロイルを滴下して添加中に、１Ｎ〜５ＮのＮａＯＨの滴状添加によってｐＨを８〜９で維持した。
【００６７】
塩化アクリロイルの添加が完了後、この溶液をさらに１時間撹拌した。反応の初めから終わりまで、低温（０〜５℃）が維持された。これをろ過した。大過剰の冷メタノール（５００ｍｌ〜１０００ｍｌ）を用いてろ過物を沈殿させ、エタノールで洗浄した。遠心分離、透析、及び凍結乾燥させた。
【００６８】
実施例２
高分子量のヒアルロン酸（７００，０００〜１，０００，０００ダルトン、５０ｍｇ）は、ｐＨ８．０の０．２５〜２．０Ｍリン酸緩衝液（２５ｍｌ）中に溶解させた。温度を０℃まで下げた。溶液をこのｐＨで３０分間撹拌した。等量の塩化アクリロイル（１００〜５００μＬ）及びジクロロメタン（１００〜５００ｍｌ）の混合物は、ヒアルロン酸の混合物に１時間かけて１滴ずつ添加された。塩化アクリロイルの添加が完了後、この溶液をさらに１時間撹拌した。反応の初めから終わりまで、低温（０〜５℃）が維持された。得られた製造物をろ過した。大過剰の冷メタノール（５００ｍｌ〜１０００ｍｌ）を用いてろ過物を沈殿させ、エタノールで洗浄した。遠心分離、透析、及び凍結乾燥させた。
【００６９】
実施例３
高分子量のヒアルロン酸（７００，０００〜１，０００，０００ダルトン、５０ｍｇ）を脱イオン水（２５ｍｌ）に溶解した。温度を０℃まで下げた。
【００７０】
上記の溶液に、０．３３Ｎ  ＮａＯＨを１滴添加した。ｐＨは、５．４から９．５に変化した。溶液をこのｐＨで３０分間撹拌した。塩化アクリロイル（１００〜５００μＬ）をシリンジポンプを用いて滴下して添加した。塩化アクリロイルの添加速度は、５００〜２０００μＬ／時間であった。１Ｎ〜５ＮのＮａＯＨの滴状添加によってｐＨを８〜９で維持した。
【００７１】
塩化アクリロイルの添加が完了後、この溶液をさらに１時間撹拌した。反応の初めから終わりまで、低温（０〜５℃）が維持された。反応混合物をろ過した。大過剰の冷メタノール（５００ｍｌ〜１０００ｍｌ）を用いてろ過物を沈殿させ、エタノールで洗浄した。遠心分離、透析、及び凍結乾燥させた。
【００７２】
上記プロセスを用いて、種々のアクリル化率を有する様々なアクリル化ヒアルロン酸は、アクリル化に用いた塩化アクリロイルの量を変化させて処理することによって得られた。アクリル化％は、２．０２（３Ｈ、−ＮＨＣＯＣＨ3）及び５．６（１Ｈ、下記に示されるように誘導されたアクリル部分のＨAプロトン）のシグナルを比較することによって計算された。
【００７３】
【化７】
2009530445.tif 000009
【００７４】
一例として、脱イオン水２５ｍｌ中の５０ｍｇのＨＡ（０．１２５ｍｍｏｌ）を塩化アクリロイル（１．４８ｍｍｏｌ）の１２０マイクロリットルで処理し、アクリル化１７％が得られた。同濃度のＨＡ（０．１２５ｍｍｏｌ）を用いて、より多量の塩化アクリロイル（２５０マイクロリットル、３．０７ｍｍｏｌ）を用いた処理により、アクリル化３４％が得られた。より高いアクリル化を達成するために、ＨＡ（０．１２５ｍｍｏｌ）が、５００マイクロリットルの塩化アクリロイル（６．１５ｍｍｏｌ）で処理され、ヒアルロン酸の９０％アクリル化が得られた。これは、いずれかのカップリング剤を用いることなしに達成された最大のアクリル化％である。より高いアクリル化％は、塩化アクリロイルとＨＡの最初のヒドロキシルの高い反応性により達成される。修飾された製造物の収率は、＞９０％である。
【００７５】
実施例４
1Ｈ  ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ−３００）を用いて、アクリル化ヒアルロン酸（Ｄ2Ｏ中）の最終の官能性及び純度を測定した。試料は2Ｈ2Ｏ中にあり、４．７９ｐｐｍの2ＨＯＨピークを基準線として用いた。アクリル化ヒアルロン酸のプロトン−ＮＭＲは、別々のアクリルピーク（５．６６ｐｐｍ、１Ｈ、及び６．０４ｐｐｍ、２Ｈ）を示した。５．６６ｐｐｍのピークは、二重の二重（１１Ｈｚ及び２Ｈｚ）のようである。カルボニル基に隣接するＨXプロトンに結合した二重結合を横切るＨAのシスカップリングにより、（１１Ｈｚ）のカップリング定数が得られる。また、プロトンＨMに二重に（ｇｅｍｉｎａｌｌｙ）カップルし、２Ｈｚのカップリング定数を得る。ＨM及びＨXプロトン６．０４ｐｐｍであるようである。１７Ｈｚ及び１３Ｈｚのカップリング定数は、ＨXからＨMの（トランスに）横切る二重結合のカップリング、及びＨXからＨA（シスに）横切る二重結合のカップリングにより観察される。同様に、ＨＭプロトンは、ＨXプロトンに対する二重結合を（トランスに）横切ってカップルし、１７Ｈｚのカップリング定数が得られる。ＨM及びＨXプロトンは、同領域（６．０４ｐｐｍ）に見られ、低いΔｖ／Ｊ比により、全てのカップリング定数を解析することはできない。修飾の程度は、ヒアルロン酸のＮ−アセチルプロトン（−ＮＨＣＯＣＨ3、３Ｈ、２．０ｐｐｍ）に対するアクリレートの相対的な積分から決定した。
【００７６】
本明細書中に記載され、請求される発明は、これらの局面が発明のいくつかの局面の例示として意図されるため、本明細書に開示されている特定の局面による範囲に限定されるべきではない。任意の均等な局面は、本発明の範囲内にあることが意図される。実際に、本明細書に示され、記載されているものに加えて、本発明の様々な修飾は、前述の説明から当業者に明確となる。このような修飾はまた、添付された特許請求の範囲に含まれることが意図される。不一致である場合、定義を含む本開示が調節する。
【００７７】
種々の参考文献が本明細書に引用され、それらの開示は、全体として参照により援用される。
【国際調査報告】
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