(57)【要約】  本発明は、増殖性疾患又はコンホメーション病の診断及び／又は予後予測及び／又は治療の効力の測定方法、あるいは対象における老化状態を証明する方法を開示する。その様な方法を実施するためのキットも開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖性疾患又はコンホメーション病の診断、及び／又は予後予測、及び／又は治療の効力の測定、あるいは対象における老化状態を証明する方法であって、
ａ）対象から血液サンプルを回収する工程；
ｂ）前記血液サンプルから血漿を分離して、末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）を単離する工程；
ｃ）前記血漿中のＨＤＬコレステロールレベルを測定する工程；
ｄ）ＰＢＭＣを培養し、適当な有効量の刺激剤を使用する刺激によって、それらの増殖を促進し、十分な量の培養ＰＢＭＣを得る工程；
ｅ）前記培養ＰＢＭＣから脂質画分を単離する工程；
ｆ）前記培養ＰＢＭＣの単離した脂質画分由来の遊離コレステロール及びエステル化コレステロールの量を測定する工程；
ｇ）前記培養ＰＢＭＣ中の細胞内コレステロールホメオスタシスに関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程、
並びに、任意に
ｈ）前記培養ＰＢＭＣ中の特定の増殖性疾患又はコンホメーション病の病理に関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；
並びに、任意に
ｉ）前記培養ＰＢＭＣ中の炎症性サイトカインの少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；
ｊ）工程ｃ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）、ｉ）の結果を、年齢にあった対照サンプルに由来する標準値と比較する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記増殖性疾患が、アテローム性動脈硬化症、血管形成後の再狭窄、血液新生物、固形腫瘍の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記血液新生物が、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、急性及び慢性白血病、赤白血病、骨髄腫、又は多血症の群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記固形腫瘍が、脳、頭頚、鼻咽頭、胸、肺、胃腸、結腸、腎臓、又は肝臓の腫瘍の群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記コンホメーション病が、プリオン関連疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、又は脊髄小脳変性症の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記プリオン関連疾患が、クロイツフェルトヤコブ病、新変異型クロイツフェルトヤコブ病、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、慢性消耗病、猫海綿状脳症の群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記刺激剤が分裂促進剤である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記分裂促進剤がフィトヘマグルチニン又はコンカナバリンＡである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程ｄからｊ）が、
ｄ’）前記対象から線維芽細胞を単離する工程；
ｅ’）単離した線維芽細胞を培養し、同調させ、任意に刺激して、十分な量の細胞を得る工程；
ｆ’）培養線維芽細胞から脂質画分を単離する工程；
ｇ’）前記単離した脂質画分又は前記培養線維芽細胞中の遊離コレステロール及びエステル化コレステロールの量を測定する工程；
ｈ’）前記培養線維芽細胞中の細胞内コレステロールホメオスタシスに関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又は翻訳されたタンパク質を検出する工程；
並びに、任意に
ｉ’）前記培養線維芽細胞中の特定の増殖性疾患又はコンホメーション病の病理に関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又は翻訳されたタンパク質を検出する工程；
並びに、任意に、
ｊ’）前記培養線維芽細胞中の炎症性サイトカインの少なくとも１つのｍＲＮＡ又は翻訳されたタンパク質を検出する工程；
ｋ’）工程ｃ）、ｇ’）、ｈ’）、ｉ’）、及びｊ’）の結果を、年齢にあった対照サンプルに由来する標準値と比較する工程
によって置換される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｅ’）の線維芽細胞を同調させる工程が血清枯渇によって実施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｅ’）の線維芽細胞を刺激する工程が、ウシ胎仔血清又は少なくとも１つのマイトジェンの添加によって実施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記マイトジェンがβ−ＦＧＦである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記エステル化コレステロールが、オイルレッドＯを使用する細胞染色によって測定される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞内コレステロールホメオスタシスに関与するｍＲＮＡ及び／又は翻訳されたタンパク質が、ＬＤＬ−Ｒ、ＨＭＧＣｏＡ−Ｒ、ＳＲＥＢＰ２、ＭＤＲ１、ＡＣＡＴ−１、カベオリン−１、ｎＣＥＨ、及びＡＢＣＡ１の群に含まれる、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記増殖性疾患及びコンホメーション病の病理に関与するｍＲＮＡ及び／又は翻訳されたタンパク質が、ＡＰＰ、ネプリライシン、β−セクレターゼ、ＰｒＰタンパク質、腫瘍抑制遺伝子、例えば、ｐ１６、ｐ５３、ＰＴＥＮ、並びに癌遺伝子、例えば、ｃＭｙｃ、サイクリンＤ１、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦ−Ｒ、及びＢｃｌ２の群に含まれる、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記炎症性サイトカインのｍＲＮＡ及び／又は翻訳されたタンパク質が、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、及びインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）の群から選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＡｐｏＥハプロタイプを測定する工程を更に含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
増殖性疾患又はコンホメーション病の治療の効果について薬剤をスクリーニングする方法であって、
ａ）罹患している対象から血液サンプルを回収する工程；
ｂ）前記血液サンプルから血漿を分離して、末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）を単離する工程；
ｃ）ＰＢＭＣを培養し、適当な有効量の刺激剤を使用する刺激によって、それらの増殖を促進し、十分な量の培養ＰＢＭＣを得る工程；
ｄ）適当な条件及び用量で各薬剤とともにＰＢＭＣをインキュベートする工程；
ｅ）前記培養ＰＢＭＣ中の細胞内コレステロールホメオスタシスに関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；
ｆ）前記培養ＰＢＭＣ中の特定の増殖性疾患又はコンホメーション病の病理に関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；
ｇ）前記培養ＰＢＭＣ中の炎症性サイトカインの少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；
ｈ）工程ｅ）、ｆ）、ｇ）の結果を、参照薬及び適当な対照と比較する工程
を含む、方法。
【請求項１９】
増殖性疾患又はコンホメーション病の治療の効果について薬剤をスクリーニングする方法であって、
ａ）対象から線維芽細胞を単離する工程；
ｂ）単離した線維芽細胞を培養し、同調させ、任意に刺激して、十分な量の細胞を得る工程；
ｃ）適当な条件及び用量で各薬剤とともに培養線維芽細胞をインキュベートする工程；
ｄ）前記培養線維芽細胞中の細胞内コレステロールホメオスタシスに関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又は翻訳されたタンパク質を検出する工程；
ｅ）前記培養線維芽細胞中の特定の増殖性疾患又はコンホメーション病の病理に関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又は翻訳されたタンパク質を検出する工程；
ｆ）前記培養線維芽細胞中の炎症性サイトカインの少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又は翻訳されたタンパク質を検出する工程；
ｇ）工程ｄ）、ｅ）、ｆ）の結果を、参照薬及び適当な対照と比較する工程
を含む、方法。
【請求項２０】
増殖性疾患又はコンホメーション病に罹患している対象の薬剤応答プロフィールを評価する方法であって、
ａ）罹患した対象から血液サンプルを回収する工程；
ｂ）前記血液サンプルから血漿を分離し、末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）を単離する工程；
ｃ）ＰＢＭＣを培養し、適当な有効量の刺激剤を使用する刺激によって、それらの増殖を促進し、十分な量の培養ＰＢＭＣを得る工程；
ｄ）適当な条件及び用量で各薬剤とともに培養ＰＢＭＣをインキュベートする工程；
ｅ）前記培養ＰＢＭＣ中の細胞内コレステロールホメオスタシスに関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程； 
ｆ）前記培養ＰＢＭＣ中の特定の増殖性疾患又はコンホメーション病の病理に関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程； 
ｇ）前記培養ＰＢＭＣ中の炎症性サイトカインの少なくとも１つのｍＲＮＡ又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；
ｈ）工程ｅ）、ｆ）、ｇ）の結果を、参照薬、適切な対照、及び試験した薬剤の間で比較する工程
を含む、方法。
【請求項２１】
増殖性疾患又はコンホメーション病に罹患している対象の薬剤応答プロフィールを評価する方法であって、
ａ）前記対象から線維芽細胞を単離する工程；
ｂ）単離した線維芽細胞を培養し、同調させ、任意に刺激して、十分な量の細胞を得る工程；
ｃ）適当な条件及び用量で各薬剤とともに培養線維芽細胞をインキュベートする工程；
ｄ）前記培養線維芽細胞中の細胞内コレステロールホメオスタシスに関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又は翻訳されたタンパク質を検出する工程； 
ｅ）前記培養線維芽細胞中の特定の増殖性疾患又はコンホメーション病の病理に関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又は翻訳されたタンパク質を検出する工程； 
ｆ）前記培養線維芽細胞中の炎症性サイトカインの少なくとも１つのｍＲＮＡ又は翻訳されたタンパク質を検出する工程；
ｇ）工程ｄ）、ｅ）、ｆ）の結果を、参照薬、適切な対照、及び試験した薬剤の間で比較する工程
を含む、方法。
【請求項２２】
オイルレッドＯで細胞染色する手段を含む、細胞中のエステル化コレステロールを測定するためのキット。
【請求項２３】
細胞内コレステロールホメオスタシスに関与する少なくとも１つのｍＲＮＡの検出のためのキットであって、
−  逆転写のための手段；
−  ＬＤＬ−Ｒ、ＨＭＧＣｏＡ−Ｒ、ＳＲＥＢＰ２、ＭＤＲ１、ＡＣＡＴ−１、カベオリン−１、ｎＣＥＨ、及びＡＢＣＡ１の群に含まれるｃＤＮＡ又はそのフラグメントの特異的な増幅のための手段；
−  検出手段
を含む、キット。
【請求項２４】
増殖性疾患又はコンホメーション病の病理に関与する少なくとも１つのｍＲＮＡの検出のためのキットであって、
−  逆転写のための手段；
−  ＡＰＰ、ネプリライシン、β−セクレターゼ、ＰｒＰタンパク質、腫瘍抑制遺伝子、例えば、ｐ１６、ｐ５３、ＰＴＥＮ、及び癌遺伝子、例えば、ｃＭｙｃ、サイクリンＤ１、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦ−Ｒ、及びＢｃｌ２の群に含まれるｃＤＮＡ又はそのフラグメントの特異的な増幅のための手段；
−  検出手段
を含む、キット。
【請求項２５】
炎症性サイトカインの少なくとも１つのｍＲＮＡを検出するためのキットであって、
−  逆転写のための手段；
−  サイトカイン：腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、及びインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）の群に含まれるｃＤＮＡ又はそのフラグメントの特異的な増幅のための手段；
−  検出手段
を含む、キット。
【請求項２６】
ＬＤＬ−Ｒ、ＨＭＧＣｏＡ−Ｒ、ＳＲＥＢＰ２、ＭＤＲ１、ＡＣＡＴ−１、カベオリン−１、ｎＣＥＨ、及びＡＢＣＡ１の群に含まれるタンパク質の１つに特異的な少なくとも１つのリガンドを含む、細胞内コレステロールホメオスタシスに関与する少なくとも１つのタンパク質の検出のためのキット。
【請求項２７】
アルツハイマー病のためのＡＰＰ、ネプリライシン、及びβ−セクレターゼ；プリオン病のためのＰｒＰタンパク質；血液新生物及び固形腫瘍のための腫瘍抑制遺伝子、例えば、ｐ１６、ｐ５３、ＰＴＥＮ、及び癌遺伝子、例えば、ｃＭｙｃ、サイクリンＤ１、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦ−Ｒ、及びＢｃｌ２の群に含まれるタンパク質の１つに特異的な少なくとも１つのリガンドを含む、増殖性疾患又はコンホメーション病の病理に関与する少なくとも１つのタンパク質の検出のためのキット。
【請求項２８】
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、及びインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）の群に含まれるが、それらに限らない、サイトカインの少なくとも１つのリガンドを含む、少なくとも１つの炎症性サイトカインの検出のためのキット。
【請求項２９】
請求項２２から２８に記載のキットの全てを含む、増殖性疾患又はコンホメーション病に罹患している対象を診断し、及び／又は予後予測し、及び／又は治療の効力を測定し、及び／又は治療の効果について薬剤をスクリーニングし、及び／又は薬剤応答プロフィールを評価するか、あるいは対象における老化状態の証明をする診断プラットフォーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト及び／又は他の動物における、コレステロールホメオスタシスの変化、老化過程、並びに増殖性疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症及び新生物）及び／又はコンホメーション病（例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）及びプリオン関連疾患）の発症の間の因果関係に対する研究に関する。
【０００２】
本発明として、上述の増殖性疾患及び／又はコンホメーション病に罹患しているか又はそれらの疾患を発症するリスクがある対象と健康な対象とを区別することを可能にする方法を開示する。
【０００３】
更に具体的には、本発明は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）又は皮膚線維芽細胞などの末梢細胞におけるコレステロール輸送及び代謝を評価するための方法を提供する。前記方法は、以下のパラメータ：
ｉ）鑑別診断のために使用され得る血清中の全コレステロール、ＨＤＬコレステロール、及びＬＤＬコレステロール；
ｉｉ）細胞膜中の遊離コレステロール（ＦＣ）及び細胞質中のエステル化コレステロール（ＥＣ）；
ｉｉｉ）コレステロールの代謝及び細胞内輸送に関与するタンパク質（ＳＲＥＢＰ２、ＬＤＬ−Ｒ、ＨＭＧ−ＣｏＡ−Ｒ、ＭＤＲ１−Ｐｇｐ、ＡＣＡＴ、ｎＣＥＨ、カベオリン−１、及びＡＢＣＡ−１）並びに関連するｍＲＮＡ；
ｉｖ）特定の増殖性疾患及び／又はコンホメーション病の病理に関与するタンパク質（ＡＰＰ、ネプリライシン（ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ）、β−セクレターゼ、ＰｒＰ、腫瘍抑制タンパク質、癌タンパク質）及び関連するｍＲＮＡ；
ｖ）炎症性サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−１α、ＩＦＮγ）及び関連するｍＲＮＡ
のレベルを測定することを目的とするｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを包含する。
【背景技術】
【０００４】
図１に示すように、細胞内コレステロールは、ｉ）ヒドロキシルメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼ（ＨＭＧＣｏＡ−Ｒ）の活性による小胞体（ＥＲ）における内因性の新たな合成（１）、及びｉｉ）まずＬＤＬ受容体（ａ）を介して吸収され、次いでリソソームにおいて加水分解処理されて酸コレステロールエステルヒドロラーゼ（ａＣＥＨ）（ｂ）の活性によって遊離コレステロール（ＦＣ）を産生する、循環低比重リポタンパク質（２）に由来する。
【０００５】
新たに合成されたＦＣの大半は、ラフト（ｃ）におけるコレステロールの生理的な代謝回転に関与し、及び／又はＥＲ及びゴルジ体における新しい膜ドメインの生合成に関与する。
【０００６】
細胞膜のＦＣがしきい値を超える場合には、過剰なＦＣは、多剤耐性（ＭＤＲ１）遺伝子によってコードされるＰ−糖タンパク質（ＭＤＲ１−Ｐｇｐ、はじめは腫瘍細胞からの細胞毒性薬のＡＴＰ依存性の放出を触媒する機能について開示された）（１−３）によって、急速にＥＲ（ｄ）に輸送される。次いで、ＥＲに存在する酵素であるアシルコエンザイムＡコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）（ｅ）が、ＦＣをコレステロールエステル（ＣＥ）に変換し、細胞質の小滴に保存される（４−６）。ＥＲにおいて新たに合成されたＦＣがＡＣＡＴの近傍にあるために効率的にエステル化に用いられ得るが、少ない割合のみが直接的にエステル化される。事実、全てのエステル化ＦＣは、細胞膜に由来する。
【０００７】
細胞がコレステロールを必要とする場合は、中性コレステロールエステルヒドロラーゼ（ｎＣＥＨ）という酵素（ｆ）によって、ＣＥが再びＦＣに再加水分解され、カベオリン−１によって細胞膜に再送達される。過剰な場合には、ＦＣは、カベオリン−１、ＡＴＰ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ，ｍｅｍｂｅｒ  １（ＡＢＣ−Ａ１）、及び血漿ＨＤＬ（ｇ）が関与するＥＲから細胞膜に通じる排出経路によって細胞から排出される（４−９）。
【０００８】
脂質ラフトにおけるコレステロールの役割
最近の研究によって、「均質流動モザイク」よりも「脂質ドメインのモザイク」と見なす、生物学的な膜を考察する新しい方法が導き出された。コレステロールは膜内に均一に分布しているわけではないが、コレステロールに乏しいドメイン及びコレステロールに富んだドメインに分布されるようである。後者では、飽和スフィンゴ脂質を含有するものが脂質ラフトと称され（１０）、細胞膜において自由に浮かび、幾つかのパッセンジャータンパク質を運ぶ。パッセンジャータンパク質がリガンドによって活性化される際に、脂質ラフトが融合して、多数の異なるタンパク質が集まった大きなプラットホームを形成し、シグナル伝達、プロセッシング、又は輸送などの特定の機能を実現する（１０、１１）。
【０００９】
ラフトパッセンジャータンパク質の例は、増殖因子受容体、シグナル伝達タンパク質（Ｐ２１Ｒａｓ）、ケモカイン受容体、ＭＨＣクラスタンパク質、抗原受容体、及びＡＤ及びプリオン関連疾患の各々に関与するアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）及び細胞性プリオンタンパク質（ＰｒＰｃ）などの未知機能の各種のタンパク質である。興味深いことに、これらのドメインに結合するコレステロールの量は、ラフトに存在するタンパク質の機能に対して興味深い効果を奏する。例えば、脂質ラフト中のコレステロールの低いレベルは、細胞増殖促進のための連続的な刺激を生じさせ（１２）、ＡＰＰ及び細胞性プリオンタンパク質ＰｒＰｃを誘導して、それらの対応する病理学的形態：アミロイド生成性のアミロイドベータペプチド及びスクレイピープリオンタンパク質（ＰｒＰｓｃ）の各々の産生を生じさせる病理学的プロセスを起こす（１３、１４）。
【００１０】
増殖性疾患におけるコレステロール輸送及び代謝
増殖性疾患におけるコレステロール輸送及び代謝に対する出願人の最初の研究は、ｉ）ラット膵腺房細胞癌及び腹水肝癌（１５、１６）；ｉｉ）ヒト充実性新生物及び血液浸生物（１７−２０）由来の組織生検；ｉｉｉ）各種のヒト及び動物の腫瘍に由来する細胞系（２１−２３）；並びにｉｖ）健康人及びアテローム性動脈硬化症患者に由来する血管組織（２４、２５）において実施した。
【００１１】
これらのｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいて、出願人は、細胞増殖速度が、ｉ）ＦＣエステル化を生じさせるＭＤＲ１−Ｐｇｐ及びＡＣＡＴ並びに関連するｍＲＮＡと正に相関し、ｉｉ）細胞内におけるＣＥの蓄積を生じさせるｎＣＥＨ及びカベオリン−１並びに関連するｍＲＮＡのレベルと負に相関することを実証している（表１）。
【００１２】
したがって、健康な対照と比較すると、上述の増殖性疾患に罹患した対象は、より低いＦＣレベル、有意に高いＣＥレベル、並びにより低いＨＤＬ−コレステロールレベルを有する。
【００１３】
【表１Ａ】
2009526991.tif 000002
【表１Ｂ】
2009526991.tif 000003
【００１４】
しかしながら、組織サンプルの分析に基づくその様な実験手法は、増殖性疾患又はコンホメーション病の診断及び／又は予後の容易かつ迅速な試験を作り出すことに容易に応用することができない。出願人は、本発明では、ＰＢＭＣ及び／又は線維芽細胞、好ましくはＰＢＭＣが、細胞内のコレステロールホメオスタシスに関与するｍＲＮＡ及び／又はタンパク質産物の同定を目的とするアッセイを実施するための良好な出発物質であることを開示する。
【００１５】
コンホメーション病におけるコレステロールの輸送及び代謝
増大するコンホメーション病として分類される神経変性疾患のうち、ＡＤ及びプリオン関連疾患（感染性海綿状脳症、ＴＳＥとしても知られている）は、非感染性及び感染性脳アミロイドーシスの各々のプロトタイプであると解されてよい（２５−２７）。
【００１６】
これらの疾患の原因論と発病機序とは明らかに異なるが、細胞内のＣＥの蓄積は、これらの病理プロセスとコレステロールホメオスタシスの変化の間の関連性を示す共通の顕著な特徴である。
【非特許文献１】Metherall, J.E., Li5 H., and Waugh, K. J Biol Chem 1996; 271, 2634-2640
【非特許文献２】Debry, P., Nash, E.A., Neklason, D.W., and Metherall, J.E. J Biol Chem 1997; 272, 1026-1031
【非特許文献３】Luker, G.D., Nilsson, K.R., Covey, D.F., and Piwnica-Worms, D. J Biol Chem 1999; 274, 6979-6991
【非特許文献４】Brown MS, Ho YK, Goldstein JL. J Biol Chem 1980; 255, 9344-52
【非特許文献５】Lange, Y., Ye, J., and Chin, J. J Biol Chem 1997; 272, 17018-17022
【非特許文献６】Lange, Y., and Steck, T. J Biol Chem 1994; 269, 29371-29374
【非特許文献７】Field, E.J., Born, E., Murthy, S., and Mathur, S.N. J Lipid Res 1998; 39, 1938-1950
【非特許文献８】Smart, E.J., Ying, Y., Donzel, D.C., and Anderson, R.G. J Biol Chem 1996; 271, 29427-29435
【非特許文献９】Fielding, P.E., and Fielding, CJ. Biochemistry 1995; 34, 14288-14292
【非特許文献１０】Kurzchalia, T.V., and Parton, R.G, Curr Op Cell Biol 1999; 11 , 424-431
【非特許文献１１】Simons K and Ehehalt R. J Clin Invest 2002; 110, 597-603.
【非特許文献１２】Wang P, Weng J, Anderson R.G.W. Science 2005 : 307. 1472 - 1476
【非特許文献１３】Simons M et al. Neurology 2001; 57, 1089-1093.
【非特許文献１４】Diomede L, Forloni G, Bugiani O, et al. Neurobiol Lipids 2002; 1, 8-14.
【非特許文献１５】Rao K.N., ottaρallyS.K,.Eskander E.D, Shinozuka H., Dessi S., Pani P. BrJ.Cancer 1986; 54: 305-310.
【非特許文献１６】S.Dessi, B.Batetta, C.Anchisi, P.Pani, P.Costelli, L.Tessitore, F.M.Baccino. BrJ.Cancer 1992; 66: 787-793.
【非特許文献１７】Dessi S., Batetta B., Pulisci D., Accogli P., Pani P., Broccia G.IntJ.Hematoll991; 54: 483-486.
【非特許文献１８】Dessi S., Batetta B., Pulisci D., Spano O., Cherchi R., Lanfranco G., Tessitore L., Costelli P., Baccino F.M., Anchisi C, Pani P. Oncology 1992; 49: 436-441
【非特許文献１９】Dessi S., Batetta B., Pulisci D., Spano O., Anchisi C, Tessitore L., Costelli P., Baccino F.M., Aroasio E., Pani P. Cancer 1994; 73: 253-258.
【非特許文献２０】Dessi S., Batetta B., Spano O., Sanna F., Tonello M., Giacchino M., Tessitore L., Costelli P., Baccino F.M., Madon E., Pani P. Clin.Sci 1995, 89: 505-510.
【非特許文献２１】Pani A, Batetta B., Putzolu M., . Sanna F, Spano O., Piras S., Mulas MF., Bonatesta RR, Amat di S.Filippo C, Vargiu L., Marceddu T., Sanna L., La Colla P., Dessi S. Cell MoI Life Science 2000; 57: 1094-1103.
【非特許文献２２】Dessi, S., Batetta, B., Pani, A., Spano, O., Sanna, F., Putzolu, M., Bonatesta, R., Piras, S., and Pani, P. Biochem J 1997; 321, 603-608
【非特許文献２３】Batetta, B., Pani, A., Putzolu, M., Sanna, F., Bonatesta, R.R., Piras, S., Spano, O., Mulas, M.F., and Dessi, S. Cell Prolif 1999; 32, 49-61
【非特許文献２４】Batetta, B., Mulas, M.F., Petruzzo, P., Putzolu, M., Bonatesta, R.R., Sanna, F., Cappai, A., Brotzu, G., and Dessi . S. Cell MoI Life Sci 2001; 58, 1113-1120
【非特許文献２５】Trzesniewska K., Brzyska, Elbaum D. Acta Neurobiol Exp 2004; 64, 41-52.
【非特許文献２６】Kaytor MD and Warren ST. J Biol Chem 1999; 37507-37510.
【非特許文献２７】Ferrer I, Blanco R, Caraiona M, et al. Acta Neuropathol 2001 ; 101 , 49-56.
【非特許文献２８】Selkoe, DJ. (2001). Physiol Rev 81, 741-766
【非特許文献２９】Aguzzi A, Heikenwalder M, Miele G. J Clin Invest 2004; 114, 153-160.
【非特許文献３０】Harper JD and Lansbury PT. Annu Rev Biochem 1997; 66, 385-407.
【非特許文献３１】Churcher I, Beher D. Curr Pharm Des. 2005; 11 , 3363-82.
【非特許文献３２】Racchi M, Mazzucchelli M, Lenzken SC, Porrello E, Lanni C, Govoni S. Chem Biol Interact. 2005;157-158:335-338.
【非特許文献３３】Pavlov OV, Bobryshev YuV, Balabanov YuV, Ashwell K. Neurotoxicol Teratol. 1995; 17, 31-9
【非特許文献３４】Puglielli, L., Konopka, G., Pack-Chung, E., Ingano, L.A., Berezovska, O., Hyman, B.T., Chang, T. Y., Tanzi, R.E., Kovacs, D.M. Nat Cell Biol 2001; 3, 905-912.
【非特許文献３５】Hutter-Paler, B.H. et al. Neuron 2004; 44, 237-238.
【非特許文献３６】Mulas M.F., Demuro G., Mulas C, Putzolu M., Cavallini G., Donati A., Bergamini E. and Dessi S. Mechanisms of Ageing and Development 2005, 126: 648-54.
【非特許文献３７】Nicolosi RJ, Wilson TA, Krause BR. Atherosclerosis. 1998;137(l):77-85.
【非特許文献３８】Insull W Jr, Koren M, Davignon J, Sprecher D, Schrott H, Keilson LM, Brown AS, Dujovne CA, Davidson MH, McLain R, Heinonen T. Atherosclerosis. 2001; 157, 137-44.
【非特許文献３９】Panyam J, Labhasetwar V. Advanced Drug Delivery Reviews. 2003; 55, 329-47.
【非特許文献４０】Pean JM, Menei P, Morel O, Montero-Menei CN, Benoit JP. Biomaterials. 2000; 21, 2097-101.
【非特許文献４１】Verdun, P.Couvreur, H.Vranckx, V.Lenaerts, M.Roland. J. Control. Release 1986; 3, 205-210.
【非特許文献４２】Muller B., Kreuter J.Int. J. Pharm. 1999; 178, 23-32
【非特許文献４３】Butcher J, Brown H. Lancet. 2004; 363, 1201-1208.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
未解決な課題
上述の全ての疾患は、発生率について深刻な割合に達した。しかしながら、ＡＤ及びプリオン関連疾患について、診断、治療、又は予防の確実な手段は、いまだ得られていない（２８−３０）。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、
ａ）疾患の要因である可能性がある細胞のフェノタイプを同定するために有用であり；
ｂ）兆候及び症状が完全に明らかになる前に、感度の良い試験を提供することによってＡＤ及びＴＳＥの疑いを早期に診断するために寄与し；
ｃ）ＡＤ患者の親族の中でＡＤを発症するリスクを評価するツールであり；
ｄ）各種のコンホメーション病及び増殖性疾患において変化するコレステロールの代謝に関与する複数の細胞内及び血漿のパラメータを試験し、次いで治療の有効性の指標として役立つ簡便な方法を提供する。
【００１９】
本発明は、ラフト結合タンパク質の機能に影響を与えるＣＥ代謝における変化によって特徴付けられる増殖性疾患及び／又はコンホメーション病に罹患しているか又はその発症リスクがある個体と臨床的に正常な個体とを区別することを可能にする。本発明は、増殖性疾患及び／又はコンホメーション病の診断、予防、治療、及び治療観察のための手段を提供する。
【００２０】
加えて、老化プロセス、増殖性疾患、又はコンホメーション病のための、現存するか又は新しい合成又は天然の化合物／有効成分の治療／予防における有用性を予測／確立するための手段を提供する。
【００２１】
いずれにしても、単独又は他の試験（すなわち、ＡｐｏＥハプロタイプ）との併用のいずれかで使用される際に、本発明の方法が、増殖性疾患、コンホメーション病、例えば、ＡＤ、又はプリオン関連疾患、例えば、ＴＳＥの存在、リスク、又は不在を正確に診断する可能性を改善する。
【００２２】
本発明は、血漿、皮膚線維芽細胞、及び／又はＰＢＭＣを使用することによって、上記の疾患の疑いがある個体又は上記の疾患を検出するための新規手法を含む。これらの手法は、血漿中の全コレステロール、ＨＤＬコレステロール、及びＬＤＬコレステロールレベルの評価、ＦＣ及びＣＥ量の評価、並びに非増殖末梢細胞及び増殖末梢細胞の双方におけるコレステロールの輸送及び代謝の指標の評価を含む。
【００２３】
疾患又は疾患のリスクの診断は、疑いがある場合における上記のパラメータの相対値を、適当に標準化した年齢にあわせた対照の相対値と比較することにより為される。
【００２４】
したがって、本発明の主題は、
ａ）対象から血液サンプルを回収する工程；
ｂ）血液サンプルから血漿を分離し、末梢血液リンパ球（ＰＢＭＣ）を単離する工程；
ｃ）血漿中のＨＤＬコレステロールレベルを測定する工程；
ｄ）ＰＢＭＣを培養し、適当な有効量の刺激剤で刺激することによってそれらの増殖を促進し、十分な量の培養ＰＢＭＣを得る工程；
ｅ）培養ＰＢＭＣから脂質画分を単離する工程；
ｆ）培養ＰＢＭＣの単離した脂質画分由来の遊離コレステロール及びエステル化コレステロールの量を測定する工程；
ｇ）培養ＰＢＭＣ中の細胞内コレステロールホメオスタシスに関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；
並びに、任意に
ｈ）培養ＰＢＭＣ中の特定の増殖性疾患又はコンホメーション病の病理に関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；
並びに、任意に
ｉ）培養ＰＢＭＣ中の炎症性サイトカインの少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；
ｊ）工程ｃ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）、ｉ）の結果を、年齢にあった対照のサンプルに由来する標準値と比較する工程
を含む、増殖性疾患又はコンホメーション病の診断及び／又は予後予測及び／又は治療の効力の測定のための方法、あるいは対象における老化状態を証明するための方法である。
【００２５】
好ましくは、増殖性疾患は、アテローム性動脈硬化症、血管形成後の再狭窄、血液新生物、固形腫瘍の群から選択される。より好ましくは、血液新生物は、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、急性及び慢性白血病、赤白血病、骨髄腫、又は多血症の群から選択される。更により好ましくは、固形腫瘍は、脳、頭頚、鼻咽頭、胸、肺、胃腸、結腸、腎臓、又は肝臓の腫瘍の群から選択される。
【００２６】
更に好ましくは、コンホメーション病は、プリオン関連疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、又は脊髄小脳変性症の群から選択される。より好ましくは、プリオン関連疾患は、クロイツフェルトヤコブ病、新変異型クロイツフェルトヤコブ病、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、慢性消耗病、猫海綿状脳症の群から選択される。
【００２７】
好ましくは、刺激剤は分裂促進剤である。より好ましくは、分裂促進剤はフィトヘマグルチニン又はコンカナバリンＡである。
【００２８】
１つの実施態様では、上述の方法の工程ｄ）からｊ）を以下の工程：
ｄ’）対象から線維芽細胞を単離する工程；
ｅ’）単離した線維芽細胞を培養し、同調させ、任意に刺激して、十分な量の細胞を得る工程；
ｆ’）培養線維芽細胞から脂質画分を単離する
ｇ’）単離した脂質画分又は培養線維芽細胞中の遊離コレステロール及びエステル化コレステロールの量を測定する工程；
ｈ’）培養線維芽細胞中の細胞内コレステロールホメオスタシスに関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；
並びに、任意に
ｉ’）培養線維芽細胞中の特定の増殖性疾患又はコンホメーション病の病理に関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；
並びに、任意に
ｊ’）培養線維芽細胞中の炎症性サイトカインの少なくとも１つのｍＲＮＡ又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；
ｋ’）工程ｃ）、ｇ’）、ｈ’）、ｉ’）、及びｊ’）の結果を、年齢にあった対照サンプルに由来する標準値と比較する工程
に置換する。
【００２９】
好ましくは、ｅ’）の線維芽細胞を同調させる工程は、血清枯渇によって実施する。より好ましくは、ｅ’）の線維芽細胞を刺激する工程は、ウシ胎仔血清又は少なくとも１つのマイトジェンの添加によって実施する。好ましくは、マイトジェンはβ−ＦＧＦである。
【００３０】
更に好ましくは、エステル化コレステロールは、オイルレッドＯを用いた細胞染色によって測定する。
【００３１】
より好ましくは、細胞内コレステロールホメオスタシスに関与するｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質は、ＬＤＬ−Ｒ、ＨＭＧＣｏＡ−Ｒ、ＳＲＥＢＰ２、ＭＤＲ１、ＡＣＡＴ−１、カベオリン−１、ｎＣＥＨ、及びＡＢＣＡ１の群に含まれる。
【００３２】
好ましくは、増殖性疾患及びコンホメーション病の病理に関与するｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質は、ＡＰＰ、ネプリライシン、β−セクレターゼ；ＰｒＰタンパク質；癌抑制遺伝子、例えば、ｐ１６、ｐ５３、ＰＴＥＮ、並びに癌遺伝子、例えば、ｃＭｙｃ、サイクリンＤ１、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦ−Ｒ、及びＢｃｌ２の群に含まれる。
【００３３】
より好ましくは、炎症性サイトカインのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の群から選択される。
【００３４】
好ましくは、上述の方法は、ＡｐｏＥハプロタイプを測定する工程を更に含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明の１つの主題は、増殖性疾患又はコンホメーション病の治療効果について薬剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
ａ）罹患した対象から血液サンプルを回収する工程；
ｂ）血液サンプルから血漿を分離して、末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）を単離する工程；
ｃ）ＰＢＭＣを培養し、適当な有効量の刺激剤を使用する刺激によって、それらの増殖を促進し、十分な量の培養ＰＢＭＣを得る工程；
ｄ）適当な条件及び用量で各薬剤とともにＰＢＭＣをインキュベートする工程；
ｅ）培養ＰＢＭＣ中の細胞内コレステロールホメオスタシスに関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；
ｆ）培養ＰＢＭＣ中の特定の増殖性疾患又はコンホメーション病の病理に関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；
ｇ）培養ＰＢＭＣ中の炎症性サイトカインの少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；
ｈ）工程ｅ）、ｆ）、及びｇ）の結果を、参照薬及び適当な対照と比較する工程
を含む。
【００３６】
本発明の更なる１つの主題は、増殖性疾患又はコンホメーション病の治療の効果について薬剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
ａ）対象から線維芽細胞を単離する工程；
ｂ）単離した線維芽細胞を培養し、同調させ、任意に刺激して、十分な量の細胞を得る工程；
ｃ）適当な条件及び用量で各薬剤とともに、培養線維芽細胞をインキュベートする工程；
ｄ）培養線維芽細胞中の細胞内コレステロールホメオスタシスに関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；、
ｅ）培養線維芽細胞中の特定の増殖性疾患又はコンホメーション病の病理に関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；、
ｆ）培養線維芽細胞中の炎症性サイトカインの少なくとも１つのｍＲＮＡ又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；
ｇ）工程ｄ）、ｅ）、及びｆ）の結果を、参照薬及び適当な対照と比較する工程
を含む。
【００３７】
本発明の他の主題は、増殖性疾患又はコンホメーション病に罹患した患者の薬剤応答プロフィールを評価する方法であって、以下の工程：
ａ）罹患した対象から血液サンプルを回収する工程；
ｂ）血液サンプルから血漿を分離して、末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）を単離する工程；
ｃ）ＰＢＭＣを培養し、適当な有効量の刺激剤を使用する刺激によって、それらの増殖を促進し、十分な量の培養ＰＢＭＣを得る工程；
ｄ）適当な条件及び用量で各薬剤とともにＰＢＭＣをインキュベートする工程；
ｅ）培養ＰＢＭＣ中の細胞内コレステロールホメオスタシスに関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；
ｆ）培養ＰＢＭＣ中の特定の増殖性疾患又はコンホメーション病の病理に関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；
ｇ）培養ＰＢＭＣ中の炎症性サイトカインの少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；
ｈ）工程ｅ）、ｆ）、及びｇ）の結果を、参照薬、適当な対照、及び試験した対象の間で比較する
を含む。
【００３８】
本発明の更なる主題は、増殖性疾患又はコンホメーション病に罹患している患者の薬剤応答プロフィールを評価するための方法であって、以下の工程：
ａ）対象から線維芽細胞を単離する工程；
ｂ）単離した線維芽細胞を培養し、同調させ、任意に刺激して、十分な量の細胞を得る工程；
ｃ）適当な条件及び用量で各薬剤とともに、培養線維芽細胞をインキュベートする工程；
ｄ）培養線維芽細胞中の細胞内コレステロールホメオスタシスに関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；、
ｅ）培養線維芽細胞中の特定の増殖性疾患又はコンホメーション病の病理に関与する少なくとも１つのｍＲＮＡ及び／又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；、
ｆ）培養線維芽細胞中の炎症性サイトカインの少なくとも１つのｍＲＮＡ又はその翻訳されたタンパク質を検出する工程；
ｇ）工程ｄ）、ｅ）、及びｆ）の結果を、参照薬、適当な対照、及び試験した薬剤の間で比較する工程
を含む。
【００３９】
本発明の他の主題は、オイルレッドＯで細胞を染色するための手段を含む細胞中のエステル化コレステロールを測定するためのキットである。
【００４０】
本発明の更なる１つの主題は、
−  逆転写のための手段；
−  ＬＤＬ−Ｒ、ＨＭＧＣｏＡ−Ｒ、ＳＲＥＢＰ２、ＭＤＲ１、ＡＣＡＴ−１、カベオリン−１、ｎＣＥＨ、及びＡＢＣＡ１の群に含まれるｃＤＮＡ又はその断片の特異的な増幅のための手段；
−  検出手段
を含む細胞内コレステロールホメオスタシスに関与する少なくとも１つのｍＲＮＡの検出のためのキットである。
【００４１】
本発明の他の主題は、
−  逆転写のための手段；
−  ＡＰＰ、ネプリライシン、β−セクレターゼ、ＰｒＰタンパク質、腫瘍抑制遺伝子、例えば、ｐ１６、ｐ５３、ＰＴＥＮ、及び癌遺伝子、例えば、ｃＭｙｃ、サイクリンＤ１、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦ−Ｒ、及びＢｃｌ２の群に含まれるｃＤＮＡ又はその断片の特異的な増幅のための手段；
−  検出手段
を含む、増殖性疾患又はコンホメーション病の病理に関与する少なくとも１つのｍＲＮＡの検出のためのキットである
【００４２】
本発明の他の主題は、
−  逆転写のための手段；
−  サイトカイン：腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の群に含まれるｃＤＮＡ又はその断片の特異的な増幅のための手段；
−  検出手段
を含む、炎症性サイトカインの少なくとも１つのｍＲＮＡの検出のためのキットである。
【００４３】
本発明の他の主題は、ＬＤＬ−Ｒ、ＨＭＧＣｏＡ−Ｒ、ＳＲＥＢＰ２、ＭＤＲ１、ＡＣＡＴ−１、カベオリン−１、ｎＣＥＨ、及びＡＢＣＡ１の群に含まれるタンパク質の１つに特異的な少なくとも１つのリガンドを含む、細胞内コレステロールホメオスタシスに関与する少なくとも１つのタンパク質の検出のためのキットである。
【００４４】
本発明の更なる主題は、アルツハイマー病のためのＡＰＰ、ネプリライシン、及びβ−セクレターゼ；プリオン関連疾患のためのＰｒＰタンパク質；血液新生物及び固形癌のための腫瘍抑制遺伝子、例えば、ｐ１６、ｐ５３、ＰＴＥＮ、及び癌遺伝子、例えば、ｃＭｙｃ、サイクリンＤ１、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦ−Ｒ、及びＢｃｌ２の群に含まれるタンパク質の１つに特異的な少なくとも１つのリガンドを含む増殖性疾患又はコンホメーション病の病理に関与する少なくとも１つのタンパク質の検出のためのキットである。
【００４５】
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の群に含まれるが、それらに限らないサイトカインの少なくとも１つのリガンドを含む、少なくとも１つの炎症性サイトカインの検出のためのキットである。
【００４６】
本発明の他の主題は、増殖性疾患又はコンホメーション病に罹患した対象の診断、及び／又は予後予測、及び／又は治療の効力の測定、及び／又は治療効果についての薬剤のスクリーニング、及び／又は薬剤応答プロフィールの評価、あるいは対象の老化状態を証明する診断のプラットフォームであり、請求項２２から２８に記載の全てのキットを含む。
【００４７】
本発明では、増殖性疾患及びコンホメーション病は、表２に示す疾患を含むが、それらに限らない。
【００４８】
【表２Ａ】
2009526991.tif 000004
【表２Ｂ】
2009526991.tif 000005
【実施例】
【００４９】
本発明を、添付の図面を参照し、非限定的な実施例によって開示する。
【００５０】
原料及び方法
患者及び細胞の供給源
ＡＤ（又はＴＳＥ）の臨床診断をされた個体又はそのリスクを有する個体。ＡＤの臨床診断は、ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ基準によって為された。更なる測定は、ＭＭＳＥ
及びＤｅｍｅｎｔｉａ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ（ＤＳＲＳ）を含む。磁気共鳴画像法を含む標準的な実験を実施して、認識機能障害の他の原因を排除する。Ｒｅｉｓｂｅｒｇ Ｇｌｏｂａｌ Ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ Ｓｃａｌｅ（ＧＤＳ）を使用して、ＡＤ患者の認識機能障害の重度を示す。異常なＧＤＳレベルは、レベル３からであり、最大の悪性度はレベル７に相当する。認識衰退していない各種の年齢のＡＤ患者の一等親血縁者を、インフォームドコンセントの後に実験に採用する。認識衰退していない年齢にあった群の対照を、提携病院又は血液ドナーリスト（ＡＶＩＳ）から採用する。
【００５１】
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、末梢血サンプルから回収する。皮膚生検は、２％キシロカインで局所麻酔をした後、２ｍｍパンチによって対象の前腕上部から得る。
【００５２】
地域病因において診断された１８人の慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者（年齢は４５から６５歳）及び１２人の急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）患者（年齢は４０から６０歳）を採用する。１５人の健康な年齢があった対象も対照として採用する。１０人の患者（７人がＣＬＬであり、３人がＡＬＬである）をランダムに選択して、動態分析及び分子分析を実施した。病院の施設内倫理委員会の方針によって、実験を開始する前に、全ての患者及び健康な対照からインフォームドコンセントを得た。
【００５３】
各種の実験に参加した全ての対象は、血液又はパンチサンプル回収の前に、いずれの薬物治療も受けなかった。
【００５４】
睡眠
スクレイピーの疑いがあるＡＲＱ／ＡＲＱ遺伝子型を有する１０匹の自然にスクレイピーに罹ったＳａｒｄａ品種のヒツジ、並びにＡＲＱ／ＡＲＱ遺伝子型を有する１０匹の実験的なスクレイピー感染ヒツジ（全てＡＲＱ／ＡＲＱ＋と名付けた）を使用した。全てのヒツジは、末期的な疾患の臨床病期であった。ヒツジは、バルビツレート、続いて４ｍｌのエンブトラミド（ｅｍｂｕｔｒａｍｉｄｅ）及びヨウ化メベンゾニコ（ｍｅｂｅｎｚｏｎｉｃｏ−ｉｏｄｉｄｅ）（Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｒｏｕｓｓｅｌ  Ｖｅｔ．）を用いて安楽死させた。末梢血液サンプル及び皮膚生検を動物から回収した。脳を回収して、ウエスタンブロットによるＰｒＰＳｃ検出のための切片を得た。同じ操作を、１０匹のスクレイピー耐性ＡＲＲ／ＡＲＲ遺伝子型ヒツジ及び１０匹のＡＲＱ／ＡＲＱのスクレイピーに罹っていないヒツジ（ＡＲＱ／ＡＲＱ−）に実施した。
【００５５】
ＰＢＭＣ及び線維芽細胞の単離
ＰＢＭＣを、患者の末梢血液から回収し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配によって分離する。激しく洗浄した後に、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０に細胞を再懸濁し（１×１０６細胞／ｍｌ）、一晩インキュベートした。アッセイのために、２×１０５細胞／ｍｌの非接着細胞（リンパ球）を、ＰＨＡ（フィトヘマグルチニン、１０μｇ／ｍｌ、カタログ番号Ｌ８９０２、ＳＩＧＭＡ）を加えたＲＰＭＩ−１６４０ １０％ＦＣＳ中において３７℃でインキュベートする。トリパンブルー排除を用いて細胞を計数することによって一定時間経過後に生存率を評価する。細胞はインキュベートの各種の時点で回収した。
【００５６】
線維芽細胞単離のために、生検を６ウェルプレートで２時間に亘って平板培養する。接着させた２時間後に、各組織断片を覆う１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、及びファンギゾン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂ ＮＹ、ＵＳＡ）の数滴を添加する。翌日、組織断片を培養培地で覆って、加湿インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で維持する。２日毎に培地を交換する。５から６日後に、線維芽細胞は、断片の周囲（「細胞のかさ」）から増殖し始め、単層の紡錘状の細胞を形成する。４週間後に、線維芽細胞を、トリプシン処理（トリプシン−ＥＤＴＡ−０．０５％／０．０２％）を繰り返すことによって精製し、継代して、紡錘細胞の均一な集団を得る。精製した線維芽細胞をＰＢＳで２回洗浄して、遠心分離する。次いで、１×１０６の細胞を２５ｃｍ２培養フラスコに播種して、コンフルエントになるまで増殖させる。常に、細胞は「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」染色実験に使用するか又は１×１０７細胞／ｍｌの密度で冷凍保存培地を含有するバイアルに移す。すばやく凍結させた後に、長期保存のためにバイアルを液体窒素に移す。分析が必要な際には、冷凍保存した細胞を液体窒素から取り出して、上記のように培養する。
【００５７】
分析のために、皮膚線維芽細胞を６ウェルプレートに５０００細胞／ｃｍ２の密度で平板培養し、次いで、４８時間に亘って０．２％ＦＣＳを含むＭＥＭ１９９中においてインキュベートし、細胞を休止状態にする。各アッセイの前に、休止細胞を刺激し、ＦＣＳ（１０％）又はβ−ＦＧＦ（β−線維芽細胞増殖因子）などの強力なマイトジェンの添加によって同調して増殖させ、各種の薬剤の存在下又は非存在下において、１２、２４、４８、及び７２時間に亘ってインキュベートする。
【００５８】
全てのアッセイは、２回から４回の継代の間の線維芽細胞を用いて実施する。
【００５９】
３Ｈチミジン取り込み
細胞増殖は、３Ｈ−チミジン取り込みによって測定した。細胞は、培養の最後の６時間の間に３Ｈ−チミジン（２．５μＣｉ／ｍｌ）で標識し、図１０に示す時点で回収した。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、５％冷ＴＣＡで洗浄し、１Ｍ ＮａＯＨですすいだ。放射活性の量を、Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄをシンチレーション流体として使用してＢｅｃｈｍａｎβカウンター（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａ）によって測定した。細胞可溶化物の一定分量はタンパク質含有量について処理をした。いずれの毒素効果についても、トリパンブルー摂取によって排除した。
【００６０】
コレステロールエステル化
コレステロールエステル化は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合した［１−１４Ｃ］オレイン酸（Ｄｕｐｏｎｔ，ＮＥＮ ５５ ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を含有する培地において６時間に亘って細胞をインキュベートすることによって評価した。インキュベート後に、細胞をＰＢＳで洗浄して、脂質をアセトンで抽出した。脂質サブクラスは、ｎ−ヘプタン／イソプロピルエーテル／蟻酸（６０：４０：２、ｖ／ｖ／ｖ）を含有する溶液系をｋｉｅｓｅｇｅｌプレート上で薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分離した。コレステロールエステルのバンドは、隣に同時に流し、ヨウ素蒸気のもとで可視化した参照標準と比較することによって同定した。シンチレーションカウントのために、そのバンドを切り取って、１０ｍｌ Ｅｃｏｎｏｆｌｕｏｒ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）液体シンチレーション流体を含有するカウント用バイアルに直接加えた。
【００６１】
分子生物学的アッセイ
ＡＰＯＥのハプロタイプの分子学的特性決定を、末梢血液サンプルから得られたリンパ球から抽出したＤＮＡに対して実施した。ＤＮＡはＱｉＡｍｐ Ｂｌｏｏｄキットの手法（Ｑｕｉａｇｅｎ）によって精製し、プライマーセット及び標準的な実験条件を用いるＰＣＲによる増幅を実施する。
【００６２】
ＳＲＥＢＰ２、ＬＤＬ−Ｒ、ＨＭＧ−ＣｏＡ−Ｒ、ＭＤＲ１−Ｐｇｐ、ＡＣＡＴ−１、ｎＣＥＨ、カベオリン−１、ＡＢＣＡ−１、ＡＰＰ、ネプリライシン、β−セクレターゼ、ＰｒＰ、ｐ１６、ｐ５３、ＰＴＥＮ、ｃＭｙｃ、サイクリンＤ１、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦ−Ｒ、Ｂｃｌ２、ＴＮＦα、ＩＬ−１α、及びＩＦＮγついての相対的なｍＲＮＡ発現レベルの測定を、マクロアレイシステムによって確立された手法に従ってＴＲＩＺＯＬ試薬（ＧＩＢＣＯ）を用いて精製した全ＲＮＡサンプルに対して実施した。
【００６３】
マクロアレイの調製
マクロアレイは、Ｆａｓｔ Ｓｐｏｔｔｅｒ ｍａｃｒｏａｒｒａｙｅｒ（Ｄｒ，Ｃｈｉｐ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＤＲ．ＤｉＹ ｓｐｏｔｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒに懸濁した精製ＰＣＲ生成物をプリントすることによって調製した。プリントは、アミノシラン処理スライド（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製のＣＭＴ−ＧＡＰＳ（商標））上で実施する。プリント後、スライドを室温で乾燥させ、次いで、ＵＶＣ ５００架橋剤（Ｈｏｅｆｅｒ）でＵＶ架橋し、直ぐに使用するか又は室温で乾燥させて保存する。
【００６４】
標識ｃＤＮＡの調製（各々２つの０．５ｍｌエッペンドルフチューブ）
ポリＡ ＲＮＡ（サンプル又は対象のいずれか）  ２μｇ
オリゴ−（ｄＴ）プライマー（１８−２０ｍｅｒ）  １μｇ／μｌ  ２μｌ
ＤＥＰＣ処理水（１０μｌまで）  Ｘμｌ
を１０分間に亘って７０℃に加熱及び氷上で冷却する；
ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄリアクションミックスの調製
５×ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄバッファー  ６μｌ
ｄＮＴＰミックス（各々１０ｍＭ）  １．５μｌ
ＤＴＴ（０．１Ｍ）  ３μｌ
ＲＮアーゼ ｏｕｔ  １μｌ
ＤＥＰＣ処理水（３０μｌまで）  １８．５μｌ；
変性ｍＲＮＡを含有する各チューブに
Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄリアクションミックス  １５μｌ
Ｃｙ３又はＣｙ５ ｄＵＴＰ １ｍＭ  ３μｌ
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ）  ２μｌ
を添加する。反応物を混合して、チューブをアルミホイルで包み、２時間に亘って４２℃でインキュベートする。次いで、チューブをパルススピンして、１．５μｌのＥＤＴＡを添加して反応を停止させる。
【００６５】
プローブクローニング
標識試薬をフィルターカラム（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ（商標）Ｇ−５０、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にのせて、製造業者によって提供されたプロトコルに従って洗浄する。溶出したプローブを清浄なチューブに回収し、ホイルで包み、直ぐに使用しない場合には−２０℃で保存する。
【００６６】
アレイハイブリダイゼーション
等容量（１０μｌ）の２つのプローブを０．５ｍｌエッペンドルフチューブ中において混合し、次いで、
ＣＯＴ１ ＤＮＡ（２０μｇ／μｌ）  １μｌ
Ｐｏｌｙ Ａ ＲＮＡ（２０μｇ／μｌ）  １μｌ
を添加する。
【００６７】
プローブは、３分に亘って９５℃で加熱することによって変性し、次いで、等容量のハイブリダイゼーションバッファー（１０×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、０．２％ＳＤＳ）と混合する。
【００６８】
使用する直前に、４２℃で３０分間に亘ってＰｒｅ−ｈｙｂバッファー（５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、及び１％ＢＳＡ）を用いてＣｏｐｌｉｎ ｊａｒ中でスライドをプレハイブリダイズする。
【００６９】
スライドをろ過したＭｉｌｌｉ−Ｑ水に浸け、次いで、イソプロパノールに浸けて、室温で乾燥させる。３０μｌのプローブミックスをマクロアレイにオーバーレイして、２２×６０ｍｍ疎水性カバースリップで覆う。スライドをハイブリダイゼーションチャンバーにセットし、次いで、蓋をして密封し、４２℃の水浴において、暗所で１６から２０時間に亘ってインキュベートする。ハイブリダイゼーション後に、スライドをペトリ皿に置いて、４２％で洗浄バッファー（１×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ）に沈めた。カバースリップをゆっくりと持ち上げて取り除き、スライドをストリンジェンシーバッファー（０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ）に沈め、次いで、ストリンジェンシーバッファーで洗浄する。洗浄後、スライドを室温で乾燥させ、直ぐにＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）４０００Ｂ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｃａｎｎｅｒでスキャンして、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏソフトウェアで分析する。発現の相対レベルは、標準化し且つバックグラウンドを差し引いて、赤：緑のシグナル比で算出する。
【００７０】
【表３Ａ】
2009526991.tif 000006
【表３Ｂ】
2009526991.tif 000007
【表３Ｃ】
2009526991.tif 000008
【００７１】
マーカーの評価は、Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅによって確立された基準に従って遂行し、（ｉ）感度（疾患を有する患者の実質的な割合を同定するためのバイオマーカーの能力を意味する）；（ｉｉ）特異性（通常の老化、認識障害及び認知症の他の原因からＡＤを区別するための試験の能力を意味する）；（ｉｉｉ）（陽性又は陰性の）予測値（陽性／陰性試験を用いて、検死解剖で疾患を有するか又は有さないことが実質的に判明するヒトの割合を表わす）を評価するために価値がある。
【００７２】
血漿脂質試験
ヘパリン化した血漿試料を一晩絶食させた後に脂質試験のために回収し、同日に分析する。全コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）、及びリン脂質（ＰＬ）レベルは、酵素を用いて測定する（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｄｉａｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。高密度脂質タンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）は、塩化マグネシウム及び硫酸デキストランによる粒子を含有するアポリポタンパク質Ｂ（Ａｐｏ−Ｂ）の沈殿後に測定する。
【００７３】
細胞内脂質含有量
脂質細胞含有量の測定のために、単離した培養ＰＢＭＣ及び皮膚線維芽細胞から冷アセトンを用いて抽出した中性脂質を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分離した。遊離コレステロール（ＦＣ）、コレステロールエステル（ＣＥ）、トリグリセリド（ＴＧ）、及びリン脂質（ＰＨ）の重量は、酵素を用いた標準アッセイ方法によって測定する。
【００７４】
中性脂質染色
中性脂質染色のために、単離したＰＢＭＣ及び皮膚線維芽細胞を上述のように培養する。異なる時間でインキュベートして、細胞をＰＢＳで三回洗浄し、１０％ホルマリンに浸けることによって固定化した。細胞をイソプロピルアルコール（６０％）で処理し、洗浄して、次いで、核及び細胞内中性脂質小滴を、マイヤーヘマトキシリン溶液及びオイルレッドＯの各々を用いて染色する。次いで、染色した細胞を試験し、光学顕微鏡下で撮影した。脂質結合ＯＲＯは、Ｓｃｉｏｎ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ １．６３ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐｒｏｇｒａｍ）又は脂質のクロロホルム／メタノール（２：１）抽出後及び５２０ｎｍにおけるＯＤの読み取りの各々によって無傷細胞又は細胞抽出物において定量する。
【００７５】
結果
新生物及びアテローム性動脈硬化症の細胞におけるコレステロールホメオスタシスの変化
表４は、急性及び慢性リンパ性白血病（各々、ＡＬＬ及びＣＬＬ）の初代細胞における脂質含有量、並びに診断時のＣＬＬ患者（１８人の患者、４５から６５歳）又はＡＬＬ患者（１２人の患者４０から６０歳）に由来する血清の脂質プロフィールを示す。年齢にあった健康な対象（ｎ＝１５）を対照として用いた。出願人は、構成的コレステロールエステルレベルは、対照よりも白血病細胞において高いことを見出した。ＦＣ：ＣＥモル比（ＣＬＬでは１．１及びＡＬＬでは０．８５であり、対照では３．６）における大きな低減が、白血病細胞においても認められた。他の細胞性脂質のパラメータにおける顕著な変化は認められなかった。ＨＤＬ−Ｃは、年齢にあった健康な対照と比較して、白血病患者において有意に低減（ｐ＜０．０５）した。全血清コレステロール（ＴＣ）ＬＤＬ−Ｃ、ＴＧ、及びＰＬレベルは、対照と腫瘍患者との間の有意な差はなかったが、低コレステロール血症及び高トリグリセリド血症の傾向が、後者の群には認められた（データ示さず）。
【００７６】
【表４】
2009526991.tif 000009
【００７７】
これらの結果は、脂質含有量、主に細胞性コレステロールエステル及び血漿ＨＤＬ−Ｃのレベルにおける変化が、増殖性疾患を特定することが可能なプロフィールを表わすという概念を支持するものである。
【００７８】
これらの結果を補強するために、出願人は、オイルレッドＯ染色法を用いて、正常なリンパ球及び白血病ＰＢＭＣにおける細胞質脂質含有量を分析した。
【００７９】
図３Ａで示すように、０時点においては、白血病ＰＢＭＣのみが確実に染色され（矢印で示す細胞における赤い領域の存在によって示される）、ＰＨＡ刺激の２４時間及び４８時間後では、対照細胞も同様に確実に染色される。染色強度は、コレステロールエステルの量と比例する。図３Ａは、脂質蓄積は、考えられる全ての時点において対照細胞よりも白血病細胞において多い。示される結果は、７人の異なる患者及び７人の対照の試料を表わす。さらに、ＡＣＡＴ−１ ｍＲＮＡレベルはより高かったが、中性コレステロールエステルヒドロラーゼ（ｎＣＥＨ）及びＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡレベルは、健康な対照と比較して白血病患者に由来するＰＢＭＣにおいてより低かった（図３Ｂ）。
【００８０】
同様の結果が、健康な対照に由来する単核球と比較して、アテローム性動脈硬化症患者に由来するマイトジェンで誘導して増殖しているＰＢＭＣにおいて得られた（図４）。
【００８１】
ＡＤ患者の皮膚線維芽細胞におけるコレステロールホメオスタシスの変化
コレステロールの細胞輸送及び代謝に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ試験（図５及び図５Ｂｉｓ）は、ＡＤ患者に由来する皮膚線維芽細胞が、健康なドナー由来の線維芽細胞と比較すると、コレステロールをエステル化し、蓄積する増大した能力を有する事を明らかにする。さらに、出願人は、健康な対照と比較すると、同じＡＤ患者に由来する線維芽細胞におけるｎＣＥＨ、カベオリン−１、及びＡＢＣＡ１のｍＲＮＡのより低いレベルとともに、ＭＤＲ１−Ｐｇｐ及びＡＣＡＴ−１のｍＲＮＡのより高い細胞内レベルを見出した（図５Ｂｉｓ Ａ）。これは、ＡＣＡＴにおける増大及びカベオリン１タンパク質レベルにおける低減を伴った（図５ Ｂｉｓ Ｂ）。ＡＰＯＥ対照ハプロタイプは図５Ｂｉｓの表に示す。
【００８２】
ＡＤ患者のＰＢＭＣにおけるコレステロールホメオスタシスの変化
図６及び図７において報告するデータは、皮膚線維芽細胞における上述のようなコレステロールエステル代謝及び輸送における変化が、ＡＤ患者及びその親族から単離したＰＢＭＣにも存在することを明らかにする。特に、図７Ｂで示すように、ＡＤ患者（６５％）に由来するＰＢＭＣの大半は、３と４との間のＯＲＯ陽性の値を有し、約８０％の対照が０の値を有したが、大半のＡＤの親族は１と２の間であった。これらのデータは、ＡＤ患者に由来する細胞において、図７Ａで示す低レベルのＨＤＬ−Ｃによって証明されるＦＣ排出の低減及び細胞質におけるＣＥ蓄積をもたらすコレステロール代謝における不均衡が存在し、かつ、図８Ａ、Ｂ、Ｃにおいて示すｎＣＥＨ、Ｃａｖ−１、及びＡＢＣＡ−１ ｍＲＮＡの発現レベルの低減が存在することをさらに示す。
【００８３】
スクレイピーに感染したヒツジのＰＢＭＣ及び皮膚線維芽細胞におけるコレステロールホメオスタシスの変化
同様の相関が、スクレイピー耐性遺伝子型（ＡＲＲ／ＡＲＲ）を有する対照の非感染動物と比較すると、スクレイピーに感染しやすい遺伝子型ＡＲＱ／ＡＲＱ（ＡＲＱ／ＡＲＱ＋及びＡＲＱ／ＡＲＱ−）を有するスクレイピーに感染したヒツジ及びスクレイピーに感染していないヒツジに由来する脳組織（図９Ｂ）、血漿（図９Ａ）、及び皮膚線維芽細胞（図１０、１１）においても認められた。事実、スクレイピーに感染しやすい遺伝子型のヒツジでは、スクレイピー耐性遺伝子型の動物と比較して、コレステロールエステル化速度（図１０Ｂ）及び細胞内ＣＥ含有量（図１１）は有意に高く、血漿ＨＤＬコレステロールは低かった（図９Ａ）。重要なことに、他の細胞システムにおいて出願人により発見されたように、スクレイピーに感染しやすい遺伝子型の皮膚線維芽細胞において認められたＣＥレベルの増大は、増殖速度の増大と相関していた（図１０Ａ）。
【００８４】
結論として、高い細胞内ＣＥレベルの存在及びそれによる低い細胞膜ＦＣの存在は、コンホメーション病における構造が異常なタンパク質の形成及び沈着を含む、幾つかの疾患（図２Ａ、Ｂ、Ｃ）に罹りやすくする細胞の表現型を示す（図２Ｃ）。本実施例の結果は、細胞内ＣＥ蓄積をＡＣＡＴインヒビターで阻害することが、ＡＤの細胞モデルにおけるβアミロイドペプチドの精製を妨げ（３４）、ＡＤのマウスモデルにおける脳のアミロイド斑の形成を強力に阻害する（３５）ことを示す最近の実験によって支持される。
【００８５】
加えて、出願人は、上述のパラメータの幾つかが老化現象と相関することも既に示している（３６）。事実、ラットモデルを使用して、出願人は、動物の年齢増加として、ＭＤＲ１−Ｐｇｐ及びＡＣＡＴ ｍＲＮＡのレベルが幾つかの器官（肝臓、脳、心臓、腎臓、動脈）において有意に増大する。対照的に、ｎＣＥＨ及びカベオリン−１のｍＲＮＡの発現レベルは年齢と共に有意に減少し、低レベルの循環するＨＤＬコレステロールとともに、細胞内ＣＥ蓄積及び細胞膜ＦＣのレベルの低減を生じさせる（３６）。本実施例の結果は、上述の相関がＰＢＭＣ及び皮膚線維芽細胞においても認めることができ、上述の加齢に伴う疾患を発症するリスクの迅速な評価を可能にすることを示す。
【００８６】
末梢血液サンプルにおける細胞質ＣＥの蓄積量を測定するためのキットの例は、ＯＲＯ染色法を利用し、
ａ）以下の手法によって全血サンプルからＰＢＭＣを単離する手段：
−  ２ｍｌの全血をＰＢＳで１：１に希釈する。
−  １５ｍｌ遠心管中において、希釈したサンプルを２ｍｌのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐの上に層にする。
−  ２２００ｒｐｍで１５分間に亘って遠心管を遠心分離する。
−  単核球を含有する輪をパスツールピペットで回収し、ＲＰＭＩ １６４０で洗浄する。
−  細胞を３−５ｍｌのＨａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）に再懸濁し、計数する。
ｂ）以下の手段に従う、ＣＲＯ染色による細胞質ＣＥの検出のための手段：
−  １×１０６の細胞の一定分量を丸底ホウケイ酸ガラス管に移し、１０％ホルマリンで３０分間に亘って固定化し、５００ｒｐｍで遠心分離した。
−  細胞ペレットを再懸濁し、１ｍｌのＯＲＯ（イソプロピルアルコール中で１：２００ ｖ／ｖ）で１０分間に亘って室温で連続的に攪拌しながら染色する。
−  過剰なＯＲＯ染色は廃棄し、細胞をＭａｙｅｒ’ｓ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎで対比染色する。
−  染色した細胞の一定分量（１０μｌ）をガラススライドに置いて、光学顕微鏡によって視察して、撮影する。
ｃ）以下の手法に従って、脂質結合ＯＲＯの分光学的に定量するための手段：
−  残存する細胞を、三倍容量のクロロホルム／メタノール（２：１ ｖ／ｖ）の混合物で処理し、ボルテックスして細胞の脂質を抽出する。
−  次いで、その管を１０分間に亘って５００ｒｐｍ、室温で遠心分離して、回収するクロロホルム相を分離し、石英キュベットに移す。
−  次いで、クロロホルム相の光学吸収を５２０ｎｍで測定する（ＯＲＯの最大光学吸収）。
−  吸光度の値は、検量線に対してプロットして、細胞の数あたりのＯＲＯのｍｍｏｌとして表わす。
を含んで良い。
【００８７】
細胞内コレステロールホメオスタシスに関与する少なくとも１つのｍＲＮＡの相対定量のためのキットの例は、ｃＤＮＡ又はその断片からｍＲＮＡへの特定の逆増幅のための手段を含んでよい。
【００８８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の反応試薬ミックスの例は、
−  ＭｇＣｌ２（２ｍＭ）
−  標的ｃＤＮＡ（１０μＬ）
−  ジゴキシゲニン−１１−２’−デオキシ−ウリジン−５’−トリホスフェート（ＤＩＧ）（８μＭ）
−  フォワードプライマー及びリバースプライマー（表３に記載した配列ＡＣＡＴ、ＭＤＲ１、ｎＣＥＨ、カベオリン−１、又はＡＢＣＡ１を含むが、それらに限らない）（０．１５μＭ）及びプライマー標準β−アクチン（０．１５μＭ）
−  ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Ｔａｑポリメラーゼ：１．２５Ｕ）
−  １×ＰＣＲバッファーＩＩ（５００ｍＭ ＫＣｌ；１００ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．３）
−  Ｈ２Ｏ（一定用量まで）
−  ＰＣＲ産物の精製のための手段
を含む。
【００８９】
ＰＣＲ産物は、フィルターカラム（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ（商標）Ｇ−５０、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にのせて、製造業者によって提供されたプロトコルに従って洗浄する。溶出した増幅産物を清浄なチューブに回数して、直ぐに使用しない場合には‐２０℃で保存する。
【００９０】
マクロアレイの調製：
マクロアレイは、Ｆａｓｔ Ｓｐｏｔｔｅｒ ｍａｃｒｏａｒｒａｙｅｒを使用して、ＤＲ．ＤｉＹスポッティングバッファーに懸濁した精製したＰＣＲ産物をプリントすることによって調製する。プリントは、アミノシラン処理スライド（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製のＣＭＴ−ＧＡＰＳ（商標））に実施する。プリント後、スライドを室温にして、次いで、ＵＶＣ５００ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ（Ｈｏｅｆｅｒ）を使用してＵＶ架橋し、直ぐに使用するか又は室温で乾燥させて保存する。
【００９１】
標識ＤＮＡの調製（各々２つの別々の０．５ｍｌエッペンドルフチューブ）
ＰｏｌｙＡ ＲＮＡ（サンプル又は対照のいずれかに由来する）  ２μｇ
オリゴ−（ｄＴ）プライマー（１８−２０ｍｅｒ）１μｇ／μｌ  ２μｌ
ＤＥＰＣ処理水（１０μｌまで）  Ｘμｌ
１０分間に亘って７０℃で加熱し、氷上で冷却する。
【００９２】
ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ反応ミックスの調製
５×ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄバッファー  ６μｌ
ｄＮＴＰミックス（各々１０ｍＭ）  １．５μｌ
ＤＴＴ（０．１Ｍ）  ３μｌ
ＲＮアーゼ ｏｕｔ  １μｌ
ＤＥＰＣ処理水（３０μｌまで）  １８．５μｌ
【００９３】
変性ｍＲＮＡを含有する各々のチューブに
ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ反応ミックス  １５μｌ
Ｃｙ３又はＣｙ５ ｄＵＴＰ １ｍＭ  ３μｌ
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ）
を添加する。
【００９４】
反応物を混合し、チューブをアルミホイルで包み、４２℃で２時間に亘ってインキュベートする。次いで、チューブをパルススピンして、１．５μｌのＥＤＴＡを添加して、反応を停止させる。
【００９５】
標識プローブの洗浄
標識反応は、フィルターカラム（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ（商標）Ｇ−５０、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にのせて、製造業者によって提供されたプロトコルに従って洗浄する。
【００９６】
溶出したプローブは清浄なチューブに回収して、ホイルで包み、直ぐに使用しない場合は−２０℃で保存する。
【００９７】
アレイハイブリダイゼーション
等容量（１０μｌ）の２つのプローブを、０．５ｍｌエッペンドルフチューブ内で混合し、次いで、
ＣＯＴ１ ＤＮＡ（２０μｇ／μｌ）  １μｌ
ｐｏｌｙＡ ＲＮＡ（２０μｇ／μｌ）  １μｌ
を添加する。
【００９８】
プローブは、３分間に亘って９５℃で加熱することによって変性させ、次いで、等容量のハイブリダイゼーションバッファー（１０×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、０．２％ＳＤＳ）と混合する。
【００９９】
使用の直前に、４２℃で３０分間に亘ってＰｒｅ−ｈｙｂバッファー（５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、及び１％ＢＳＡ）を用いて、スライドをＣｏｐｌｉｎ ｊａｒ中でプレハイブリダイズさせる。
【０１００】
スライドを濾過したＭｉｌｌｉ−Ｑ水に浸け、次いで、イソプロパノールに浸け、室温で乾燥させる。
【０１０１】
３０μｌのプローブミックスをマクロアレイにオーバーレイして、２２×６０ｍｍ疎水性カバースリップで覆う。
【０１０２】
スライドをハイブリダイゼーションチャンバーにセットし、次いで、フタで密封して、４２℃の水浴に置き、暗所で１６から２０時間に亘ってインキュベートする。
【０１０３】
ハイブリダイゼーションスライドをペトリ皿に置いた後に、４２％で洗浄バッファー（１×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ）に浸ける。
【０１０４】
カバースリップをゆっくりと持ち上げて、取り除き、スライドを浸け、次いで、ストリンジェンシーバッファー（０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ）で洗浄する。
【０１０５】
ハイブリダイズしたマクロアレイの分析及び定量
洗浄後、スライドを室温Ｔで乾燥させ、ＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標） ４０００Ｂ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｃａｎｎｅｒで直ぐにスキャンして、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏソフトウェアで分析する。
【０１０６】
発現の相対レベルは、標準化し且つバックグラウンドを差し引いて、赤：緑のシグナル比で算出する。
（参考文献）
2009526991.tif 000010
2009526991.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】細胞内コレステロールホメオスタシス：細胞内コレステロールは、ｉ）ＨＭＧＣｏＡ−レダクターゼ（ＨＭＧＣｏＡ−Ｒ）の活性による小胞体（ＥＲ）における内因性の新しい合成（１）；ｉｉ）まずＬＤＬ受容体（ａ）を介して吸収され、次いでリソソームにおいて加水分解処理されて酸コレステロールエステルヒドロラーゼ（ａＣＥＨ）（ｂ）の活性によって遊離コレステロール（ＦＣ）を産生する、循環低比重リポタンパク質（２）に由来する。新しく合成されたＦＣ又はリソソームで放出されたＬＤＬ結合ＦＣの大半は、細胞表面カベオラに直ぐに現れ、そこから細胞機能（ｃ）のために使用されてよい。細胞膜ＦＣがしきい値を超える場合には、過剰なＦＣが、多剤耐性（ＭＤＲ１）遺伝子によってコードされるＰ−糖タンパク質（ＭＤＲ１−Ｐｇｐ）によって直ぐにＥＲ（ｄ）に輸送される。次いで、ＥＲに存在する酵素であるアシル補酵素Ａコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）（ｅ）が、ＦＣをコレステロールエステル（ＣＥ）に変換し、細胞質の小滴に保存される。細胞がコレステロールを必要とする場合は、酵素である中性コレステロールエステルヒドロラーゼ（ｎＣＥＨ）（ｆ）によって、ＣＥがＦＣに再加水分解され、カベオリン−１によって細胞膜に輸送される。過剰な場合は、ＦＣは、カベオリン−１、ＡＢＣＡ１受容体、及び血漿ＨＤＬ（ｇ）が関与するＥＲから細胞膜に通じる排出経路によって細胞から排出される。
【図２Ａ】病的状態におけるコレステロールホメオスタシスの変化：コレステロールホメオスタシスに変化、例えば、過剰なコレステロール合成及び取り込みが生じた際は、より多くのコレステロールがＭＤＲ１−ＰｇｐによってＥＲへと輸送される。ＥＲにおけるコレステロール過剰は、ＡＣＡＴ酵素の活性化を生じさせ、次いで、コレステロールをエステル化させる。コレステロールエステル（ＣＥ）は、次いで、脂質小滴として細胞質に蓄積し、泡様細胞が形成される（スキーム２Ａ、Ｂ、及びＣ）。一方で、エステル形態のコレステロールの過剰な蓄積は、コレステロールプールを低減させ、排出のためにカベオリン−１によって細胞膜（ラフト）に輸送される。これは、ＡＢＣＡ−１受容体を介するコレステロール排出の低減を生じさせ、かくして、血漿におけるＨＤＬ−コレステロールレベル（スキーム２、Ａ、Ｂ、及びＣ）を低下させる。ラフトにおけるＦＣのレベルの低下は、膜シグナル伝達、タンパク質及び脂質プロセシング及び輸送におけるラフトタンパク質の機能の連続的な活性化を生じさせ、かくして、アテローム性動脈硬化症（図２、スキームＡ）、腫瘍（図２、スキームＢ）、並びにＡＤ及びプリオン関連（ＴＳＥ）疾患（図２ｂｉｓ、スキームＣ）を含む各種の病的過程を引き起こす可能性がある。コレステロール代謝／輸送の調節因子を用いた処理は、細胞内コレステロールホメオスタシスが再確立することにより正常なラフトタンパク質の機能を回復させる（図２ｂｉｓ、スキームＤ）。
【図２Ｂ】（図２Ｂｉｓ）病的状態におけるコレステロールホメオスタシスの変化：コレステロールホメオスタシスに変化、例えば、過剰なコレステロール合成及び取り込みが生じた際は、より多くのコレステロールがＭＤＲ１−ＰｇｐによってＥＲへと輸送される。ＥＲにおけるコレステロール過剰は、ＡＣＡＴ酵素の活性化を生じさせ、次いで、コレステロールをエステル化させる。コレステロールエステル（ＣＥ）は、次いで、脂質小滴として細胞質に蓄積し、泡様細胞が形成される（スキーム２Ａ、Ｂ、及びＣ）。一方で、エステル形態のコレステロールの過剰な蓄積は、コレステロールプールを低減させ、排出のためにカベオリン−１によって細胞膜（ラフト）に輸送される。これは、ＡＢＣＡ−１受容体を介するコレステロール排出の低減を生じさせ、かくして、血漿におけるＨＤＬ−コレステロールレベル（スキーム２、Ａ、Ｂ、及びＣ）を低下させる。ラフトにおけるＦＣのレベルの低下は、膜シグナル伝達、タンパク質及び脂質プロセシング及び輸送におけるラフトタンパク質の機能の連続的な活性化を生じさせ、かくして、アテローム性動脈硬化症（図２、スキームＡ）、腫瘍（図２、スキームＢ）、並びにＡＤ及びプリオン関連（ＴＳＥ）疾患（図２ｂｉｓ、スキームＣ）を含む各種の病的過程を引き起こす可能性がある。コレステロール代謝／輸送の調節因子を用いた処理は、細胞内コレステロールホメオスタシスが再確立することにより正常なラフトタンパク質の機能を回復させる（図２ｂｉｓ、スキームＤ）。
【図３】慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する患者に由来するＰＢＭＣ中のコレステロール代謝及び輸送に関与する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベル及び中性脂質含有量：Ａ）ＰＨＡ刺激の表示された時間後にＯＲＯ法（矢印によって示す、原料及び方法の欄を参照のこと）によって中性脂質含有量について染色されたＣＬＬ患者に由来するＰＢＭＣ及び健康な個体（対照）に由来するＰＢＭＣ。Ｂ）ＲＴ−ＰＣＲ（原料及び方法の欄を参照のこと）による、ＣＬＬ患者（Ｐ１及びＰ２）に由来するＰＢＭＣ及び健康な個体（Ｃ１及びＣ２）に由来するＰＢＭＣ中の表示された遺伝子のｍＲＮＡレベル。β−アクチンを内部標準として使用した。
【図４】アテローム斑を有する患者に由来するＰＢＭＣ中の中性脂質含有量：ＰＨＡ刺激後の表示された時間でＯＲＯ法によって中性脂質含有量について染色されたアテローム性動脈硬化症患者に由来するＰＢＭＣ及び健康な個体（対照１及び２）に由来するＰＢＭＣ。
【図５Ａ】ＡＤ患者（ＡＤ）に由来する皮膚線維芽細胞中の中性脂質含有量：ＡＤ患者に由来する皮膚線維芽細胞及び健康な対照の個体に由来する皮膚線維芽細胞を、血清刺激の０（Ａ１、Ｂ１）、２４（Ａ２、Ｂ２）、及び４８（Ａ３、Ｂ３）時間後にＯＲＯ法によって中性脂質含有量について染色した。
【図５Ｂ】（図５Ｂｉｓ）ＡＤ患者（ＡＤ）に由来する皮膚線維芽細胞中のコレステロール代謝及び輸送に関与する遺伝子のｍＲＮＡ及びタンパク質：パネルＡは、ＡＤ患者（ＡＤ）、それらの親族（Ｒｅｌ）、及び対照の健康なドナー（Ｃ）由来の皮膚線維芽細胞におけるＡｐｏＥ遺伝子型（表）、並びにＡＣＡＴ−１、ｎＣＥＨ、ＡＢＣＡ−１、ＭＤＲ１、カベオリン−１、ＬＤＬ−Ｒ、及びβ−アクチン遺伝子のｍＲＮＡレベルを示す。パネルＢは、ＡＤ、それらの親族、及び対照に由来する皮膚線維芽細胞におけるカベオリン−１及びＡＣＡＴ−１のウエスタンブロット分析を示す。
【図６】ＡＤ患者、それらの親族、及び対照に由来するＰＢＭＣ中の脂質小滴：ＰＨＡ刺激の０（Ａ１、Ｂ１、Ｃ１）、２４（Ａ２、Ｂ２、Ｃ２）、及び４８（Ａ３、Ｂ３、Ｃ３）時間後にＯＲＯ法によって中性脂質を染色したＡＤ患者由来のＰＢＭＣ（Ａ１−Ａ３）、それらの親族由来のＰＢＭＣ（Ｂ１−Ｂ３）、及び健康な個体由来のＰＢＭＣ（Ｃ１−Ｃ３、対照群）。
【図７】ＡＤ患者、それらの親族、及び対照に由来する血漿中のＨＤＬコレステロールレベル及びＰＢＭＣ中の中性脂質含有量：Ａ）血清中のＨＣＬ−Ｃレベルは、酵素的方法（原料及び方法の欄を参照のこと）によって測定することによってｍｇ／ｄｌで表わされる５つの区分（０−２０，２１−３０、３１−４０、４１−５０、＞５０ｍｇ／ｄｌ）の増大値に階層化した。Ｂ）ＯＲＯで染色したＰＢＭＣ中の細胞内中性脂質を、２つの異なる方法によって脂質に結合した赤色の強度に基づいて定量した。その程度は、強度の測定に基づいて、１（０）、２（＋）、３（＋＋）、３（＋＋＋）、及び４（＋＋＋＋）という５つの種類に類別する。
【図８】アルツハイマー病患者、それらの親族、及び対照に由来するＰＢＭＣ中のコレステロール代謝及び輸送に関与する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベル：Ａ）ｎＣＥＨ、Ｂ）Ｃａｖ−１、Ｃ）ＡＢＣＡ１．オートラジオグラムの定量を、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＮＩＨ）によってデンシトメトリー分析によって得た。値は、ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンの発現レベルに対して標準化し、５つの種類（０かから５）の増大値に階層化した（原料及び方法の欄を参照のこと）。
【図９】スクレイピーに天然又は実験的に感染している（ＡＲＱ／ＡＲＱ＋）か又は感染していない（ＡＲＱ／ＡＲＱ−）スクレイピーに感染しやすい（ＡＲＱ／ＡＲＱ）遺伝子型を有するヒツジ、並びにスクレイピー耐性（ＡＲＲ／ＡＲＲ）遺伝子型を有するヒツジに由来するＡ）血漿サンプルにおける脂質プロフィール及びＢ）脳組織におけるコレステロール含有量。スチューデントのｔ試験、*Ｐ＜０．０５ ｖｓ ＡＲＲ／ＡＲＲ。
【図１０】スクレイピーに感染している（ＡＲＱ／ＡＲＱ＋）か又は感染していない（ＡＲＱ／ＡＲＱ−）スクレイピーに感染しやすい（ＡＲＱ／ＡＲＱ）遺伝子型を有するヒツジ、並びにスクレイピー耐性（ＡＲＲ／ＡＲＲ）遺伝子型を有するヒツジに由来するＦＣＳ刺激皮膚線維芽細胞における細胞増殖及びコレステロールエステル化。Ａ）ＤＮＡへのチミジン取り込み。Ｂ）ＣＥへの１４Ｃオレエート取り込み。スチューデントのｔ試験、*Ｐ＜０．０５ ｖｓ ＡＲＲ／ＡＲＲ。
【図１１】スクレイピーに感染している（ＡＲＱ／ＡＲＱ＋）か又は感染していない（ＡＲＱ／ＡＲＱ−）スクレイピーに感染しやすい（ＡＲＱ／ＡＲＱ）遺伝子型を有するヒツジ、並びにスクレイピー耐性（ＡＲＲ／ＡＲＲ）遺伝子型を有するヒツジに由来するＦＣＳ刺激皮膚線維芽細胞における中性脂質含有量。皮膚線維芽細胞中の細胞内中性脂質をＯＲＯで染色し、脂質に結合した赤色の強度に基づく方法によって定量した。
【図１】
2009526991.tif 000012
【図２Ａ】
2009526991.tif 000013
【図２Ｂ】
2009526991.tif 000014
【図３】
2009526991.tif 000015
【図４】
2009526991.tif 000016
【図５Ａ】
2009526991.tif 000017
【図５Ｂ】
2009526991.tif 000018
【図６】
2009526991.tif 000019
【図７】
2009526991.tif 000020
【図８】
2009526991.tif 000021
【図９】
2009526991.tif 000022
【図１０】
2009526991.tif 000023
【図１１】
2009526991.tif 000024
【配列表】
2009526991000001.app
【国際調査報告】
2009526991.tif 000025
2009526991.tif 000026
2009526991.tif 000027
2009526991.tif 000028
2009526991.tif 000029
2009526991.tif 000030
2009526991.tif 000031
2009526991.tif 000032