(57)【要約】  本発明は、主には異なる平均分子量と水溶液での異なるレオロジー性とを有するヒアルロン酸試料の二成分混合物に存するヒアルロン酸の組成に関する。結果である組成は、粘性と粘弾性の均衡で、独特のレオロジー性の挙動を示した。したがって、これらのヒアルロン酸の組成は、関節内投与又は軟性組織障害における関節外からの処置による関節疾患の処置に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩を形成した二つのヒアルロン酸試料からなる二成分混合物であって、水溶液中の濃度が１０ｍｇ／ｍｌで、かつ温度が２５℃での、前記二成分混合物のレオロジー性が、
流動粘性が１秒の剪断比率が、少なくとも５Ｐａ／秒であって、
動的なレオロジー上の粘弾性が、少なくとも７．５ＰａのＧ’と、１Ｈｚでは少なくとも７ＰａであるＧ”と、であって、
前記二つのヒアルロン酸の試料は、
ａ）第一の試料は平均分子量質量が１，０００，０００Ｄａ以下であり、
ｂ）第二の試料は平均分子量質量が１５，０００，０００Ｄａを上回る、
こと。
【請求項２】
水溶液中の濃度が１０ｍｇ／ｍｌで、かつ温度が２５℃での、前記二成分混合物のレオロジー性が、
流動粘性は１秒の剪断比率で５〜２５Ｐａ／秒からなる範囲の数値であり、
動的なレオロジーによる粘性Ｇ’は７．５〜３０Ｐａからなる範囲の数値であり、Ｇ”は１Ｈｚでは７〜２０Ｐａからなる範囲の数値である請求項１に係る二成分混合物。
【請求項３】
水溶液中の濃度が１０ｍｇ／ｍｌで、かつ温度が２５℃での、前記二成分混合物のレオロジー性が、
流動粘性は１秒の剪断比率で１０〜１５Ｐａ／秒からなる範囲の数値であり、
動的なレオロジーによる粘性Ｇ’は１０〜１５Ｐａからなる範囲であり、Ｇ”は１Ｈｚでは７〜１０Ｐａからなる範囲の数値である請求項２に係る二成分混合物。
【請求項４】
前記二つのヒアルロン酸試料は、
ａ）第一の試料は、平均分子量質量が３００，０００〜１，０００，０００Ｄａからなる範囲であり、
ｂ）第二の試料は、平均分子量質量が１，５００，０００〜６，０００，０００Ｄａである請求項１に係る二成分混合物。
【請求項５】
前記二つのヒアルロン酸試料は、
ａ）第一の試料は、平均分子量質量が５００，０００〜９００，０００Ｄａからなる範囲であり、
ｂ）第二の試料は、平均分子量質量が１，８００，０００〜３，５００，０００Ｄａからなる範囲である請求項４に係る二成分混合物。
【請求項６】
前記試料ａ）の塩を形成したヒアルロン酸と、前記試料ｂ）の塩を形成したヒアルロン酸とが、８０：２０〜２０：８０からなる範囲の質量比で存在する請求項１に係る二成分混合物。
【請求項７】
前記試料ａ）のヒアルロン酸と、前記試料ｂ）のヒアルロン酸とが、４０：６０〜６０：４０からなる範囲の質量比で存在する請求項６に係る二成分混合物。
【請求項８】
前記試料ａ）のヒアルロン酸と、前記試料ｂ）のヒアルロン酸とが、５０：５０の質量比で存在する請求項７に係る二成分混合物。
【請求項９】
塩を形成した二つのヒアルロン酸試料からなる二成分混合物であって、水溶液中の濃度が１０ｍｇ／ｍｌで、かつ温度が２５℃での、前記二成分混合物のレオロジー性が、  
流動粘性が１秒の剪断比率で５〜２５Ｐａ／秒からなる範囲の数値であり、
動的なレオロジーによる粘性Ｇ’が７．５〜３０Ｐａからなる範囲の数値であり、Ｇ”は１Ｈｚでは７〜２０Ｐａからなる範囲の数値であって、
前記二つのヒアルロン酸の試料は、
ａ）第一の試料は、平均分子量質量が３００，０００〜１，０００，０００Ｄａからなる範囲であり、
ｂ）第二の試料は、平均分子量質量が１，５００，０００〜６，０００，０００Ｄａからなる範囲であり、
前記二成分混合物は、前記試料ａ）の塩を形成したヒアルロン酸と、前記試料ｂ）の塩を形成したヒアルロン酸とを、８０：２０〜２０：８０からなる範囲の質量比で混合することによって得られる前記二成分混合物である、塩を形成した二つのヒアルロン酸試料からなる二成分混合物。
【請求項１０】
前記二つのヒアルロン酸の試料は、
ａ）第一の試料は、平均分子量質量が５００，０００〜９００，０００Ｄａからなる範囲であり、
ｂ）第二の試料は、平均分子量質量が１，８００，０００〜３，５０００，０００Ｄａからなる範囲である請求項９に係る二成分混合物。
【請求項１１】
前記試料ａ）のヒアルロン酸と、前記試料ｂ）のヒアルロン酸とが、４０：６０〜６０：４０からなる範囲の質量比で存在する請求項９に係る二成分混合物。
【請求項１２】
前記試料ａ）のヒアルロン酸と、前記試料ｂ）のヒアルロン酸とが、５０：５０の質量比で存在する請求項１１に係る二成分混合物。
【請求項１３】
適切な希釈液、賦形剤及び請求項１乃至１２のいずれかに係る塩を形成した二つのヒアルロン酸試料の二成分混合物で調合される医薬品の組成。
【請求項１４】
塩を形成した二つのヒアルロン酸試料の混合物は、その濃度が１０〜２０ｍｇ／ｍｌからなる範囲であること請求項１３に係る医薬品の組成。
【請求項１５】
関節内に適用する炎症性・外傷性の関節疾患の処置のための医薬品の組成の調剤のための前述の請求項１乃至１２のいずれかに係る塩を形成した二つのヒアルロン酸試料の二成分混合物の使用。
【請求項１６】
関節内に適用する関節鏡検査中でのアジュバント処置のための医薬品の組成の調剤のための前述の請求項１乃至１２のいずれかに係る塩を形成した二つのヒアルロン酸試料の二成分混合物の使用。
【請求項１７】
前述の炎症性・外傷性の関節疾患は、骨関節炎、関節症又は半月板の損傷を含む一群から選択される、請求項１５及び１６に係る塩を形成した二つのヒアルロン酸試料の二成分混合物の使用。
【請求項１８】
軟性組織の障害での関節外処置のための医薬品の組成の調剤のための前述の請求項１乃至１２のいずれかに係る塩を形成した二つのヒアルロン酸試料の二成分混合物の使用。
【請求項１９】
前述の障害は、組織硬直、捻挫及び外傷を含む一群から選択される請求項１８に係る塩を形成した二つのヒアルロン酸試料の二成分混合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異なる平均分子量を有するヒアルロン酸試料から得られる二成分混合物と、その二成分混合物の関節疾患おける関節内、又は軟性組織障害における関節外への使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸はよく知られた高分子量の生体多糖類であり、グリコサミノグリカン類に属し、脊椎動物の全ての結合組織、関節の滑液及び軟骨並びに眼球の硝子体の主要な成分として高い頻度で存在し、種々の疾病の治療目的で広く用いられる。
【０００３】
自然界において、その分子量は１０，０００ｋＤａに達するが、試料として抽出され精製されたヒアルロン酸は通常は平均分子量によって同定されたとき、その試料は、分子量がある範囲の異なる重合体からなることが常であることが知られている。
【０００４】
すなわち、この生体高分子の試料は分子量に広がりがあるわけであり、そのためヒアルロン酸はどのような試料であっても分子量の多分散によって特徴づけられる。
【０００５】
ゆえに、特定できなくても、決定された平均分子量質量（又は平均分子量数）又は分子量の分布から試料がヒアルロン酸であることが必然であることがわかる。
【０００６】
又、ナトリウム塩の形成において、通常、ヒアルロン酸、又はヒアルロナン、又はヒアルロナン酸塩という用語は（以下、ＨＡと記す）、塩の形での外因性のヒアルロン酸であることを意味している。
【０００７】
その生物医学的な応用のために、動物を元としたもの、又は細菌性の煮汁から抽出されたこの生体高分子の多数にわたる試料が、創傷治癒、関節炎及び眼の外科的治療に長らく用いられてきており、これらの使用は生物学的役割及びその水溶液の非ニュートン力学的特性（例えば、粘性・構造上の粘弾性）に本質的に立脚している。
【０００８】
粘性・粘弾性の両特性は、ＨＡ試料の分子量の範囲、重合体の濃度に依存しているが、架橋反応の度合いのような他の技術的な特性も前述の分子量のようにレオロジー性に寄与し得る。
【０００９】
実際には、ＨＡのレオロジー性は、試料における技術的に異なる特徴の組合せに影響され又は帰趨されると考えられる。
【００１０】
にもかかわらず、高度な粘性・粘弾性が要求される、特に、例えば、滑液の補充目的でヒアルロン酸が使用される膝の関節炎では、その粘性・粘弾性が、高分子量のＨＡ試料を参照するための常識かつ慣例であるとされている。
【００１１】
実際には、滑液に内在するＨＡの第一の役割は、関節疾患の際に、その粘性・粘弾性によって関節に適切な機械的特性をもたらし、関節軟骨部の基盤の構造及び機能を保持するというものである。
【００１２】
例えば、骨関節炎は、関節軟骨の正常な分解と合成を不安定にさせる機械的、生物学的な事象の結果であり（Dieppe P. Osteoarthritis. Acta Orthop Scand Suppl. 1998; 281:2-5）、滑液に内在するＨＡの濃度と分子量の低下に影響され、膝のような関節の荷重負荷での痛みや機能喪失という特徴的な兆候を次々ともたらす（Balasz E.A., Denlinger S. L. Viscosupplementation: a new concept in the treatment of osteoarthritis. J Rheumatol 1993; 20 (Suppl 39):3-9）。
【００１３】
したがって、ＨＡ試料による関節における粘性付与と軟骨保護のため、適切な粘性・粘弾性と、平均分子量質量とは、直接関係し、痛みの緩和と関節の機能改善のために、滑液を特徴づける濃度と分子量を回復させる目的では、高い平均分子量質量が好ましい。
【００１４】
臨床治験での関節内のＨＡ調剤は、偽薬よりも痛みの緩和に効果的であり（Dahlberg L, Lohmander L.S., Ryd L. Intraarticular injections of hyaluronan in patients with cartilage abnormalities and knee pain. Arthritis Rheum 1994; 37:521-528; Dougados M., Nguyen M., Listrat V., Amor B. High molecular weight sodium hyaluronate (hyalectin) in osteoarthritis of the knee: a 1 -year placebo-controlled trial. Osteoarthritis Cartilage 1993; 1:97-103; Petrella R. J., DiSilvestro M. D., Hildebrand C. Effects of hyaluronate sodium on pain and physical functioning in osteoarthritis of the knee. Arch Intern Med 2002; 162:292-298; Karlsson J., Sjogren L. S., Lohmander L.S. Comparison of two hyaluronan drugs and placebo in patients with knee osteoarthritis: a controlled, randomized, double-blind, parallel-design multi-center study. Rheumatology (Oxford) 2002; 41:1240-1248）、その効果は関節内の糖質コルチコイドに匹敵するか、又はそれを上回るものである（Mamlin L. A, Melfi CA. , Parchman M. L, et al. Management of osteoarthritis of the knee by primary care physicians. Arch. Fam. Med. 1998; 7:563-567）。
【００１５】
ＨＡの調剤は関節内の糖質コルチコイド注射よりもゆっくりと行うことで痛みが緩和されるが、その効果はより長く継続すると考えられる（Adams M.E., Atkinson M.H., Lussier A.J. et al. The role of viscosupplementation with hylan GF-20 (Synvisc) in the treatment of osteoarthritis of the knee: a Canadian multi-centre trial comparing hylan GF-20 alone, hylan GF-20 with nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) and NSAIDs alone. Osteoarthrits Cartilage 1995; 3:213-226）。
【００１６】
同様に、関節内のＨＡは、経口の抗炎症性調剤に匹敵する疼痛緩和の効果を有する（Adams M. E. et al. 1995 ref. cit.）。
【００１７】
いくつかのＨＡ調剤は、現在、それを投与し、その効果を主張する世界中の臨床医によって、それぞれの信念に基づく方法、ＨＡの分子量（５００，０００〜６×１０６）で広く利用されている。
【００１８】
特に、与えられた選択肢についていかなる判断基準もなく、特異的な製品が患者に投与されたとはいえ、これらの製品に見られる有効性に違いがあるかどうかが明らかでない（Lo G.H., LaValley M., McAlindon T., Felson D. T. Intra-articular hyaluronic acid in treatment of knee osteoarthritis: a meta-analysis. JAMA 2003; 290:3115-21）。
【００１９】
その上、成人において、骨関節炎で、症状の重大さ及び症状の形質に応じて粘弾性の変異を生じさせる内在性ＨＡの組成の違いが記述されている（Balasz and Denlinger, 1993 ref. cit.）。Balaszの論文から見積もられる分子量の変動は５〜２００万である。
【００２０】
平均分子量が相対的に低いＨＡによる関節疾患の処置は、外来性ＨＡ分子が、コラーゲンの繊維網におそらくは補足され吸着されるとする文献が言及している事実によって、好ましいとされている（Balasz E.A., Bloom G.D., Swann D.A. Federation Proceedings 1966, 25, 1813-1816）。
【００２１】
関節の軟骨における表面層の微細構造とグリカンの含有量の関係において、関節の軟骨表面に対する粘液補充の投与によるこの生体高分子の吸着は、コラーゲン分子が存在するために、静電的な相互作用によっても除外され得ない。
【００２２】
したがって、特に、相対的に高濃度な状態で、軟骨表面での、低分子量質量又は相対的に低い分子量質量を有するＨＡ試料が備える界面層内のＨＡ分子の拡散及び重合体の吸着は考慮すべき事項であり、低分子量質量又は相対的に低い分子量質量が、高い平均分子量質量よりも好ましいとされる。
【００２３】
一方で、軟骨と滑液中のヒアルロン酸の存在は、内在性ヒアルロン酸の二つの生物学的な役割を浮き彫りにしており、一つは軟骨の細胞外基質における構造上の組織化でのその生物学的な役割に関係するものであり、一つは滑液内の物理的特性に関係するもので、後者の側面を考慮すると、関節疾患の治療のために最良なＨＡ試料の選択は、多糖類の実験データが大量に存在するにもかかわらず思ったよりも容易ではないという問題がある。
【００２４】
実際には、膝の動的な挙動では、必要な粘稠性に均衡した最適な分子量での弾力的な組成が要求される。例えば、滑液を通じた高周波数による負荷は、より高い粘稠性に比して弾性係数が高いヒアルロン酸の動的な変動によって、ヒアルロン酸に対する負荷が低周波数の場合に、分散される（Balasz and Delinger, 1993 ref. cit）。
【００２５】
与えられたＨＡ製品が、低、中又は高分子量の範囲に典型的に限定されている間は、滑液の弾性係数、粘稠係数を参照し、骨関節炎が激しい関節への要求に倣った組成の補充をするためのいかなる製品も決められない。
【００２６】
その上、粘性と粘弾性は、関節疾患の粘液補充治療で有用であると認められている。しかし、関節疾患の処置に適しているとされる平均分子量質量は予測不可能であることから、ＨＡの同一の試料は、粘液補充目的に適合したこれらの特性を共に備える必要はない。
【００２７】
靱帯のような軟性組織の障害についても、粘性と粘弾性の正しい均衡が必要であることから、これらの場合においても同様な問題が生じる。
【００２８】
したがって、分子量、特に処置のための物性を参照して最も適切なヒアルロン酸の種類が何であるかの問題は、なお公然の課題であり、ヒアルロン酸の調剤が、そのヒアルロン酸の平均分子量質量とは独立して、正しい粘性と適切な粘弾性を備えるとする要求は、なお未解決である。
【非特許文献１】Dieppe P. Osteoarthritis. Acta Orthop Scand Suppl. 1998; 281:2-5
【非特許文献２】Balasz E.A., Denlinger S. L. Viscosupplementation: a new concept in the treatment of osteoarthritis. J Rheumatol 1993; 20 (Suppl 39):3-9
【非特許文献３】Dahlberg L, Lohmander L.S., Ryd L. Intraarticular injections of hyaluronan in patients with cartilage abnormalities and knee pain. Arthritis Rheum 1994; 37:521-528
【非特許文献４】Dougados M., Nguyen M., Listrat V., Amor B. High molecular weight sodium hyaluronate (hyalectin) in osteoarthritis of the knee: a 1 -year placebo-controlled trial. Osteoarthritis Cartilage 1993; 1:97-103
【非特許文献５】Petrella R. J., DiSilvestro M. D., Hildebrand C. Effects of hyaluronate sodium on pain and physical functioning in osteoarthritis of the knee. Arch Intern Med 2002; 162:292-298
【非特許文献６】Karlsson J., Sjogren L. S., Lohmander L.S. Comparison of two hyaluronan drugs and placebo in patients with knee osteoarthritis: a controlled, randomized, double-blind, parallel-design multi-center study. Rheumatology (Oxford) 2002; 41:1240-1248
【非特許文献７】Mamlin L. A, Melfi CA. , Parchman M. L, et al. Management of osteoarthritis of the knee by primary care physicians. Arch. Fam. Med. 1998; 7:563-567
【非特許文献８】Adams M.E., Atkinson M.H., Lussier A.J. et al. The role of viscosupplementation with hylan GF-20 (Synvisc) in the treatment of osteoarthritis of the knee: a Canadian multi-centre trial comparing hylan GF-20 alone, hylan GF-20 with nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) and NSAIDs alone. Osteoarthrits Cartilage 1995; 3:213-226
【非特許文献９】Lo G.H., La Valley M., McAlindon T., Felson D. T. Intra-articular hyaluronic acid in treatment of knee osteoarthritis: a meta-analysis. JAMA 2003; 290:3115-21
【非特許文献１０】Balasz E.A., Bloom G.D., Swann D.A. Federation Proceedings 1966, 25, 1813-1816
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
本発明は、粘性・粘弾性に関連した異なる特性及び主には異なる分子量の前述のＨＡ試料を備え、並びに使用、特に関節疾患の処置のための粘性係数と粘弾性係数の適切な均衡が実証された前述のＨＡ混合物を備えたヒアルロン酸の試料の二成分混合物を供給するものである。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
したがって、本発明の第一の目的は、塩を形成した二つのヒアルロン酸試料からなる二成分混合物であって、水溶液中の濃度が１０ｍｇ／ｍｌで、かつ温度が２５℃での、前記二成分混合物のレオロジー性が、  
流動粘性が１秒の剪断比率が、少なくとも５Ｐａ／秒であって、
動的なレオロジー性である粘弾性が、少なくとも７．５ＰａのＧ’と、１Ｈｚでは少なくとも７ＰａであるＧ”と、であって、
前述の二つのヒアルロン酸の試料は、
ａ）第一の試料は平均分子量質量が１，０００，０００Ｄａ以下であり、
ｂ）第二の試料は平均分子量質量が１，５００，０００Ｄａを上回る、
ということである。
【発明の効果】
【００３１】
本発明に係るヒアルロン酸の二成分混合物の試料は、滑液の弾性の回復及び生物学的な潤滑に適し、更には、本発明の目的である炎症性・外傷性の関節疾患の処置又は関節検査鏡での関節内処置及び軟性組織障害の関節外部の処置によるアジュバントとしての用途を提供することにある。
【００３２】
以下に明らかにする詳細な説明により、本発明の特色及び有利な点と共にこれら及び他の目的が理解されるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
［発明の詳細な説明］
以下の説明と、本発明の目的を限定するものではない図解された最適な実施例とによって、本発明の特徴と有利な点を明確にする。本発明の分野と考えられる技術に熟達した者であれば、実施例と同様に本発明の更なる実施又は適応は、直ちに明らかなものである。
【００３４】
本発明は、前述の混合物に係るＨＡ試料に一つには生物学的な潤滑特性を、第二に滑液に弾性を与えるヒアルロン酸の二成分混合物によって、関節疾患治療用に係る既存のヒアルロン酸調剤の欠点を克服し得るものである。
【００３５】
前述のように、ＨＡの試料は、５００，０００〜６×１０６Ｄａの分子量を備え、関節疾患における粘液補充治療で、長い間その粘性・粘弾性が利用されている。
【００３６】
しかしながら、関節の潤滑に寄与する粘稠性と、その動的挙動のための粘弾性との間の適切な均衡は、適切な挙動として実現されていない。
【００３７】
実際には、低分子量のＨＡの試料は有力な粘性挙動を示すとしても、高分子量のＨＡの試料は有力な粘弾性挙動を示すことはよく知られている。
【００３８】
重合体の濃度、架橋反応の程度のような、その他の技術的な特徴が、前述の分子量と同様にレオロジー性の向上に寄与し得る。
【００３９】
出願人は、異なる平均分量質量及び水溶液中で異なる粘性／粘弾性の特性を備える二つのＨＡ試料の混合し、結果生じたＨＡの二成分混合物が、生物学的な潤滑に必須な粘性及び関節の動的挙動に必須の粘弾性の特性であって、関節疾患治療又は軟性組織疾患での粘液補充に適した粘性係数と粘弾性係数との均衡を備えることを見出した。
【００４０】
したがって、本発明に係るヒアルロン酸二成分混合物の医薬品等級での組成は、関節炎・外的障害における関節内処置又は軟性組織疾患における関節外の処置に特に有用であり、上述の粘性と粘弾性の問題を解決し、製品中の粘性及び粘弾性の挙動に係る適切な特性を備えるものである。
【００４１】
本発明の目的を実現するには、ヒアルロン酸の混合物は２５℃の水溶液で、１０ｍｇ／ｍｌの濃度を備える二成分混合物である：
流動粘性が１秒の剪断比率で少なくとも５Ｐａ／秒で、
動的なレオロジーによる粘性Ｇ’が少なくとも７．５Ｐａで、Ｇ”は１Ｈｚでは少なくとも７Ｐａであること。
【００４２】
及び好ましくは、
流動粘性は１秒の剪断比率で５〜２５Ｐａ／秒からなる範囲の数値であり、
動的なレオロジーによる粘性Ｇ’は７．５〜３０Ｐａからなる範囲の数値であり、Ｇ”は１Ｈｚでは７〜２０Ｐａからなる範囲の数値であること。
【００４３】
更に好ましくは、２５℃で、濃度１０ｍｇ／ｍｌの二成分混合物のレオロジー性は：
流動粘性は１秒の剪断比率で１０〜１５Ｐａ／秒からなる範囲の数値であり、
動的なレオロジーによる粘性Ｇ’は１０〜１５Ｐａからなる範囲であり、Ｇ”は１Ｈｚでは７〜１０Ｐａからなる範囲の数値であること。
【００４４】
本発明の一実施例において、ＨＡ二成分混合物は、異なる平均分子量質量を備えるヒアルロン酸の試料から得られる。特に、ＨＡの試料は、より低い平均分子量質量を備え、１，０００，０００Ｄａ（ＬＭＨＡ）以下の平均分子量質量を持つものであって、好ましくは、平均分子量質量が３００，０００〜１，０００，０００Ｄａからなる範囲であり、更に好ましくは、５００，０００〜９００，０００Ｄａである。
【００４５】
一般に、この範囲の分子量では、ヒアルロン酸試料はそれぞれ、０．１秒−１で粘性は１Ｐａ.ｓ辺りであり、弾性係数Ｇ’は、１ＨｚでのＧ”よりも低い〜１Ｐａである。
【００４６】
ＨＡの第二の試料は、高い平均分子量質量を備え、１，５００，０００Ｄａ（ＨＭＨＡ）を下回らない平均分子量質量を持つものであって、好ましくは、平均分子量質量が１，５００，０００〜６，０００，０００Ｄａからなる範囲であり、更に好ましくは、１，８００，０００〜３，５００，０００Ｄａである。
【００４７】
一般に、この範囲の分子量では、ヒアルロン酸試料はそれぞれ、０．３１秒−１で粘性は７０Ｐａ.ｓ以上であり、粘弾性係数Ｇ’は、６５Ｐａよりも大きい。
【００４８】
ＨＡ二成分混合物は、流動粘性及び本発明の目的に叶う動的なレオロジーによる粘弾性に関するレオロジー性を備え、前述の最適な比率でのＨＡの二つの試料から得られるものである。
【００４９】
本発明の好ましい一実施例は、塩の試料を形成した二つのヒアルロン酸からなる二成分混合物であり、２５℃で、水溶液での濃度が１０ｍｇ／ｍｌである上述の二成分混合物のレオロジー性である：
流動粘性は１秒の剪断比率で５〜２５Ｐａ／秒からなる範囲の数値であり、
動的なレオロジーによる粘性Ｇ’は７．５〜３０Ｐａからなる範囲の数値であり、Ｇ”は１Ｈｚでは７〜２０Ｐａからなる範囲の数値であること。
【００５０】
及び、上述のヒアルロン酸試料は、
ａ）第一の試料は、平均分子量質量が３００，０００〜１，０００，０００Ｄａからなる範囲であり、
ｂ）第二の試料は、平均分子量質量が１，５００，０００〜６，０００，０００Ｄａであり、
試料ａ）の塩を形成したヒアルロン酸と、試料ｂ）の塩を形成したヒアルロン酸とが、８０：２０〜２０：８０からなる範囲の質量比で存在する。
【００５１】
試料ａ）のヒアルロン酸及び試料ｂ）のヒアルロン酸での他の好ましい質量比は、４０：６０〜６０：４０からなる範囲であり、更に好ましくは５０：５０の質量比である。
【００５２】
本発明の目的のために、ＨＡ試料は二成分混合物の調剤として使用されることが好ましいが、線状のヒアルロン酸でなければならないということではなく、塩についてはアルカリ金属の塩でよく、好ましくはＮａ又はＫである。
【００５３】
関節炎・外傷性疾患での関節内処置又は軟性組織での関節外の処置のために、本発明に係るヒアルロン酸二成分混合物の組成は、希釈剤及び予想される使用に適した賦形剤と混合することで、医薬品等級での組成たり得、ヒアルロン酸が１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度となるように緩衝され溶解されることが好ましい。  
【００５４】
好ましい実施例では、ヒアルロン酸の濃度は１０ｍｇ／ｍｌ又は２０ｍｇ／ｍｌである。希釈溶液は、適切なモル浸透圧濃度で、生理的なｐＨで緩衝されていることが好ましい。
【００５５】
以下の実験部分では、商業的に入手可能な選択されたＨＡ試料と、二成分混合物（ｐａｒｔＡ）及び骨関節炎患者の臨床研究で、同様に商業的に入手可能であって規定の問題に適用できるＨＡ医薬品（ｐａｒｔＢ）と、の物性上の特徴（例：レオロジー）が一致している。
【００５６】
実験で実証された本発明に係るヒアルロン酸の混合物のレオロジー性の挙動を特徴付け、評価するために、応力に対する反応が決定され、弾性の寄与は、脈動（ｒａｄ／ｓ）又は振動（Ｈｚ）（ω）の作用に係る粘性の寄与として同時に測定される。
【００５７】
実際には、内因性の粘性は、剪断比率がゼロで重合体の濃度がゼロで得られ、与えられた溶媒、温度での内因性の粘性と分子量（Ｍａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋの関係  ＮａＣｌ ０．１５ＭのＨＡでの［η］（ｍＬ／ｇ）＝ ０．０３３６Ｍ 079 ）との間に存在する経験的な関連性はよく知られている。
【００５８】
その上、溶液の粘度は、この内因性粘度と低剪断比率での重合体の濃度に直接依存している。（これら二つの要素に依存している）与えられた決定的な重合体の濃度を超えると、分子鎖が重複し、流動実験では非ニュートン的な挙動を示す。
【００５９】
したがって、重合体溶液、特にヒアルロン酸溶液を評価するための最も重要な技術的特徴は、重合溶液を特徴づける粘弾性である（粘弾性は、線状の状態が認められるときに、振動又は脈動を応力として溶液に加える動的なレオロジーの実験によって計測される）。
【００６０】
［実験］
［ＰＡＲＴ Ａ：ＨＡ二成分混合物のレオロジー性の挙動］
［物質と製法］
研究のため、ヒアルロン酸の異なる試料を適用する：ＡＲＤ社が製造したＡＲＤ試料（ロットＮｏ ０３１６７）であって、メーカーが主張する分子量が１０６程度のもの（試料１）；ジェンザイム社が製造したＨｙｌｕＭｅｄ試料（ロットＮｏ ６９０１１３）であって、メーカーが主張する分子量が２．５９×１０６のもの（試料２）；分枝ＨＡを２０％、直鎖ＨＡを８０％含有するＨｙｌａｎ ＧＦ２０又はＳｙｎｖｉｓｃ（ジェンザイム社）であって、メーカーが主張する分子量が６×１０６のもの（試料３）；細菌起源の直鎖ＨＡであるＳｕｐｌａｓｙｎ（Ｂｉｏｎｉｃｈｅ社）であって、メーカーが主張する分子量が（分子量  ５００，０００〜１，０００，０００Ｄａ）のもの（試料４）；ＡＲＤとＨｙｌｕＭｅｄの各試料を２０／８０で混合したもの（試料５）；６０／４０で混合したもの（試料６）；Ｈｙｌａｎ ＧＦ２０又はＳｙｎｖｉｓｃとＳｕｐｌａｓｙｎとを５０：５０で混合したもの（試料７）。
【００６１】
ＨＡ試料の粘性は、メーカーによって明らかにされておらず、その計測は温度、溶媒、剪断比率の諸条件で決定される。
【００６２】
２５℃の０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液での濃度１０ｍｇ／ｍｌのこれらの試料において、平面プレートと円錐プレートとを備えるＴＡインスツルメント社のレオメータによってレオロジー性の挙動を分析した；円錐は直径４ｃｍ、角度は３．５９度である。この装置は以下の計測が可能である：（１）流動性試験（秒−１で表現された剪断比率からＰａ・秒での粘度を決定する）及び（２）動的試験、Ｐａで表現された貯蔵係数（Ｇ’）、損失係数（Ｇ”）を計測する。
【００６３】
変形の振動の作用として（ω、単位はＨｚ）；Ｇ’は（固体的な特性である）応力存在下での溶液の弾性的挙動を表すもので、Ｇ”は粘性的な特性に係る。
【００６４】
粘弾性的な液体の場合、低振動ではＧ”＞Ｇ’であるが、ω０でＧ’とＧ”は交差し、高振動ではＧ”よりもＧ’の方が大きくなる。
【００６５】
複合粘度｜η＊｜（単位Ｐａ・秒）も同様に計算され、Ｇ’とＧ”を結びつける。
【００６６】
滑液の粘弾性の回復のためには、ω０が０．５Ｈｚより低い溶液を調合する必要がある（この０．５Ｈｚは、Ｂａｌａｚｓ論文に記載された歩行時の振動に一致する（Balazs E.A., Gibbs D.A. "The rheological properties and function of hyaluronic acid. In Chemistry and molecular biology of the intracellular matrix",, edit. Balazs E.A., Academic press, London and NY, 1970 , 1241-1254））。
【００６７】
三つの検出器（屈折計、Ｗｙａｔｔ ＭＡＬＬＳ光散乱計、粘度計）を備えた分子排斥クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ ＧＰＣＶ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２０００）を使用して、較正なしで、平均分子量質量と全分子量の分布とを決定するが、これは我々の所見において分子量の決定に妥当な技術であるに過ぎない。
【００６８】
試料は溶出剤液０．１Ｍ ＮａＮＯ３での濃度０．５ｇ／Ｌに調整され、１０８マイクロリットルの注射前に、多孔質膜（孔径が０．２マイクロメーター）を通じて濾過される。
【００６９】
重合体全体の濃度を１０ｇ／Ｌに保ったまま、それぞれのＨＡ試料の混合量を調整することにより、異なる混合物を調整できる。ＨＭＨＡを導入することで、ω０の数値は相対的に低下し、臨界値である０．５Ｈｚになる；ＬＭＨＡは、注射時のＨＡの総量を保つことを許容するが、ＨＡが豊富な界面層の形成される軟骨でのよりよい相互作用を支援する。
【００７０】
得られた結果は、ＡＲＤ社とジェンザイム社との試料及びそれらの二成分混合物に係る表１並びに以下に述べる臨床治験で用いられるＳｙｎｖｉｓｃ社とＳｕｐｌａｓｙｎ社との試料及びそれらの混合物に係る表２の通りである。
【００７１】
【表１】
2009536625.tif 000002
【００７２】
同様の結果を図１、図２に示す。図１では、ＡＲＤ社の試料がわずかに添加されたとき、ジェンザイム社の試料の粘弾性が大きく向上することが見られる。Ｇ’、Ｇ”の転移での振動ω０は、ＡＤＲ社の試料では非常に高い位置にあるが（３．７Ｈｚ＞ジェンザイム社の０．０６４Ｈｚ）、係数の数値はＧ’＝２０Ｐａで同値である。
【００７３】
図２では、剪断比率の作用としての複合粘度が同一の溶液に与えられている；粘弾性に関係する溶液において、剪断比率が増加と共に正常に減少することを示している。
【００７４】
【表２】
2009536625.tif 000003
【００７５】
同様の結果を図３〜５に示す。図３では、１０ｇ／Ｌでの最初の溶液と５０／５０％の混合物での動的係数が与えられている。Ｓｙｎｖｉｓｃ社の試料は、表中の周波数の全領域において弾性的である；Ｓｕｐｌａｓｙｎ社の試料は、相対的に低い分子量、係数で交差する点がないことに関係して、主として粘性的である。
【００７６】
５０／５０％の混合物は、非常に興味深い挙動を示し、歩行時の振動である０．５Ｈｚよりも更に低いω０＝０．０７５Ｈｚでの交差を伴う振動の幅広い領域で主として弾性的である。
【００７７】
図４及び図５では、複合粘度｜η＊｜及び粘度ηが剪断比率の作用として示されている。Ｓｐｌａｓｙｎ社の試料は、相対的に低分子量なため、ニュートン力学に基づく平坦部分を示す。
【００７８】
［ＰＡＲＴ Ｂ：膝の骨関節炎患者の関節内でのヒアルロン酸（二成分）混合物］
現在、有効性に明確な差がないまま用いられている低分子量から高分子量の範囲に属するいくつかの製品に関する本発明に係るＨＡ混合物の長所を確立する目的で、膝の骨関節炎患者での臨床学的研究について記す。
【００７９】
［方法］
膝の骨関節炎の管理を参照する２３人の患者で（７．４±４．１年症状が持続していて、年齢が６８±８歳）、関節内ヒアルロン酸治療を受けたことがない者でなく、視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）上で痛みのスケールが＞４５ｍｍを示すことから注入手段を経験した者であって、片側の膝のＸ線検査の確認でグレード１〜３の骨関節炎である者で、かつ分子量の範囲が単一又は二つあるような関節内ヒアルロン酸治療に同意した者であって不規則ながら成果が見込まれるものとして、１２週間の研究のために単純盲検の博物学的な群として登録された者である。
【００８０】
患者は、３週間以上にわたって、一つはＳｕｐｌａｓｙｎ社の試料（１０ｍｇ／ｍｌ；２ｍｌ／１注射、分子量が５００，０００〜１，０００，０００Ｄａ、以下に低分子量であることが確認されているもの）、Ｓｙｎｖｉｓｃ社の試料（８ｍｇ±２／１ｍＬ；２ｍｌ／１注射、分子量が６００万Ｄａ、以下に高分子量であることが確認されているもの）、又はＳｕｐｌａｓｙｎ社とＳｙｎｖｉｓｃ社の試料を混合したもの（１５ｍｇ／１．５ｍＬ＋１２ｍｇ±３／１．５ｍｌ；３ｍｌ／１注射、以下にＬ−ＨＭＷとして確認されているもの）の三種類の関節内注射を受けることを基本として、不規則に選択された者である。
【００８１】
患者は、随伴する薬物療法又は理学療法を受けるかは随意である。
【００８２】
患者は、休息と歩行のＶＡＳ痛み（当初のもので有効性が可変なもの）、分類上の世界的に認められている満足度に関する五段階の評価数値の収集、不利な現象の記録、各調査で随伴して受けられる治療の態様、及び最後の注射後１週間で基礎的な評価を完了する。
【００８３】
患者は、１２週間での不利な現象も含む反復した測定についての報告を受けた。
【００８４】
［結果］
患者は３グループ［ＬＭＷ＝９；ＨＭＷ＝６；Ｌ−ＨＭＷ＝８］の一つに不作為に分類された。人的統計の基準、骨関節炎の症状の程度、低分子若しくは高分子の製品の以前における使用、又は効能の基準で、グループ間での差は認められなかった。
【００８５】
二つの観察対象（ＬＭＷ；Ｌ−ＨＭＷ）は研究に関連しない理由によって脱落した。４週間と１２週間で、疼痛及び局所的な腫れに限定した不利な現象ではいかなるグループにも差は認められなかった（全体で＜１．３％）。
【００８６】
４週間と１２週間ではそれぞれ、全てのグループにおいて、歩行時のＶＡＳ痛みが変化し、処置前から有意に改善された：ＬＭＷ（８１．３％、ｐ＜０．００１；６３．６％、ｐ＜０．００１）；ＨＭＷ（７８．１％、ｐ＜０．００１；５９．１％、ｐ＜０．００１）及びＬ−ＨＭＷ（５０／５０混合）（８３．９％、ｐ＜０．００１；７９．６％、ｐ＜０．００１）。
【００８７】
Ｌ−ＨＭＷグループの患者は４週間１２週間のいずれにおいても、互いに差が生じなかった他のグループと比較して、目に見えるほどの大幅な改善が見られた（ｐ＜０．００７）。
【００８８】
同様に、休息時のＶＡＳ痛みは、全３グループで、４週間と１２週間で処置開始前から目に見えて改善されたが、グループ間で有意な差は認められなかった。
【００８９】
４週間での同時に行われる治療の態様はグループ間で差はなかったが、意義深いことに、１２週間では、よりＬＭＷであるグループの患者で他の２グループに比して随伴して受けられる治療の利用が顕著であった（ｐ＜０．０５）。
【００９０】
１２週間での、世界的に認められている満足度では、Ｌ−ＨＭＷのグループが他のグループに対して目立って高かった（ｐ＜０．００５）。
【００９１】
［結び］
低分子量、高分子量又は低分子量と高分子量とを併用したヒアルロン酸の関節内注射は、いずれも膝の骨関節炎における休息時のみならず歩行時の疼痛の改善に非常に効果的であった。低分子量と高分子量を併用したＬ−ＨＭＷグループの患者には、歩行時及び活動時での著しい改善が見られ、患者の処置に対する満足度は高く、１２週間での随伴的な処置の回数はより少なかったことから、分子量をある範囲で混合したヒアルロン酸は、特に病状が悪化した骨関節炎の患者にとって有効であると思われる。
【００９２】
したがって、本発明に係るＨＡ二成分混合物は、半月板の損傷を含む多様な兆候での関節鏡検査中のアジュバント処置と同じく、骨関節炎、関節症を含む一群から選択された関節の特異な病理所見、特に外傷性・炎症性の関節疾患の治療のための関節内投与、に有効であるとみられる。
【００９３】
本発明に係るＨＡ混合物のもう一つの応用は、靱帯のような軟部の障害であって、組織硬直、捻挫及び外傷といった上述の障害における関節外からの処置である。
【００９４】
ＨＡ二成分混合物は、滑液への粘液補充及び軟骨組織の保護目的での使用により、既知の予測可能な医薬品の使用又はこの分野の専門家にとって既知であるような新たなものとして、賦形剤、分散剤及び希釈液を組み合わせた医薬品的な組成で、関節内を介した投与が可能となる。
【００９５】
一の実施例における本発明に係る混合物は、生理的に等張性な水溶液、好ましくは生理食塩水に溶解し得るもので、非電解質の等張性水溶液であっても例外ではない。
【００９６】
薬用量は、患者の状態（年齢、体重、一般の健康状態）と同様に、病理学上の重症度に依存する。実証目的では、本発明による混合物の薬用量の範囲は、概ね１０ｍｇ／１ｍｌと２０ｍｇ／１ｍｌの間であり、１回当たり又は週毎に２〜６ｍＬ注射することで１〜３週間の期間内に反復投与するものであるが、これらに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】平均分子量質量が低いヒアルロン酸（ＬＭＨＡ  ○、●）、平均分子量質量が高いヒアルロン酸（ＨＭＨＡ  □、■）及びＬＭＨＡとＨＭＨＡとの質量比が８０：２０の混合物（◆、◇）の動的なレオロジーＧ’／Ｇ”を示す図である。Ｇ’＝Ｇ”となる遷移は低周波数に移行し、ＨＭＨＡが存在するＬＭＨＡ溶液の弾性的な挙動は増大することが分かる。
【図２】平均分子量質量が低いヒアルロン酸（ＬＭＨＡ  □）、平均分子量質量が高いヒアルロン酸（ＨＭＨＡ  ■）、ＬＭＨＡとＨＭＨＡとの質量比が８０：２０の混合物（◇）及び６０：４０の混合物（◆）の振動での機能における、複合的な粘性体の混合物の組成の影響を示す図である。
【図３】平均分子量質量が低いヒアルロン酸（ＬＭＨＡ  ○、●）、平均分子量質量が高いヒアルロン酸（ＨＭＨＡ  □、■）及びＬＭＨＡとＨＭＨＡとの質量比が５０：５０の混合物（◆、◇）の動的なレオロジーＧ’／Ｇ”を示す図である。Ｇ’＝Ｇ”となる遷移は、低周波数で出現し、ＨＭＨＡが添加されたＬＭＨＡ溶液の弾性的な挙動は増大することが分かる。
【図４】平均分子量質量が低いヒアルロン酸（ＬＭＨＡ  □）、平均分子量質量が高いヒアルロン酸（ＨＭＨＡ  ■）及びＬＭＨＡとＨＭＨＡとの質量比が５０：５０の混合物（◇）の振動での機能における、複合的な粘性体の混合物の組成の影響を示す図である。
【図５】平均分子量質量が低いヒアルロン酸（ＬＭＨＡ  ○）、平均分子量質量が高いヒアルロン酸（ＨＭＨＡ  ●）及びＬＭＨＡとＨＭＨＡとの質量比が５０：５０の混合物（□）の剪断比率に対する流動粘性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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