(57)【要約】  本発明は、過剰産生黄色ブドウ球菌株により産生される５型および８型莢膜多糖、ならびに該莢膜多糖を含む免疫原性組成物およびワクチンに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
過剰産生黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｔ８および／またはＴ５株のそれぞれ８型および／または５型莢膜多糖を含む免疫原性組成物。
【請求項２】
黄色ブドウ球菌ＣＹＬ１８９２株の５型莢膜多糖を含む、請求項１記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
黄色ブドウ球菌ＣＹＬ７７０株の８型莢膜多糖を含む、請求項１または２記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
キャリアータンパク質と結合している過剰産生黄色ブドウ球菌株のＴ８および／またはＴ５莢膜多糖を含む結合体を含む免疫原性組成物。
【請求項５】
結合体がＣＹＬ７７０株のＴ８莢膜多糖を含む、請求項４記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
結合体がＣＹＬ１８９２株のＴ５莢膜多糖を含む、請求項４記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
ＣＹＬ７７０株のＴ８莢膜多糖を含む結合体およびＣＹＬ１８９２株のＴ５莢膜多糖を含む結合体を含む、請求項４記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
キャリアー分子が緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）外毒素Ａである、請求項４〜７いずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
Ｔ５および／またはＴ８莢膜多糖が分画されている、請求項４〜８いずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
キャリアータンパク質と結合している過剰産生黄色ブドウ球菌株のＴ５またはＴ８莢膜多糖を含む結合体。
【請求項１１】
莢膜多糖が黄色ブドウ球菌ＣＹＬ１８９２株のＰＳ Ｔ５である、請求項１０記載の結合体。
【請求項１２】
多糖が黄色ブドウ球菌ＣＹＬ７７０株のＰＳ Ｔ８である、請求項１０記載の結合体。
【請求項１３】
キャリアー分子が緑膿菌外毒素Ａである、請求項１０〜１２いずれか１項記載の結合体。
【請求項１４】
ＰＳが分画されている、請求項１０〜１２いずれか１項記載の結合体。
【請求項１５】
黄色ブドウ球菌ＣＹＬ１８９２株から単離または精製されたＴ５莢膜多糖。
【請求項１６】
黄色ブドウ球菌感染症に対する免疫化のための免疫原性組成物の製造のための請求項１０〜１４いずれか１項記載の結合体の使用。
【請求項１７】
ａ）過剰産生黄色ブドウ球菌株を培養することからなる工程、
ｂ）このようにして製造された培養物を不活化することからなる工程、および
ｃ）上清からＴ５莢膜多糖を回収することからなる工程
を含む、Ｔ５莢膜多糖の製造方法。
【請求項１８】
過剰産生株がＣＹＬ１８９２株である、請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過剰産生黄色ブドウ球菌（S. aureus）株、特に、ＣＹＬ１８９２株およびＣＹＬ７７０株によって産生される５型および８型莢膜多糖、ならびに黄色ブドウ球菌血清型５および／または８株による感染症に対する免疫化のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
黄色ブドウ球菌株は、ペプチドグリカン壁およびおそらくその外表面と結合している多糖を含んでおり、この多糖は、莢膜またはグリコカリックスと称される多少厚みのある構造を形成する。これらの莢膜多糖は反復単位の構築により形成され、その構成成分および結合は定義されており、細菌種の特徴である。これらの反復単位は、エピトープ、および抗原性を決定する構造体を含有する。
【０００３】
黄色ブドウ球菌の臨床単離体の表面での血清学的に異なる莢膜多糖の発見により、研究されているこれらの株の病原性におけるそれらの役割が導き出された。黄色ブドウ球菌株の血清型検査により、血清型５および８が大部分のヒト感染症の原因であることが示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
黄色ブドウ球菌による感染症に対するワクチンの開発は、発生する合併症の重篤性および増加の一途をたどる現行抗生物質に対して耐性のある株の出現のために大きな利害関係を示している。黄色ブドウ球菌血清型５および血清型８（Ｔ５およびＴ８）株による感染症に対して防御するワクチンの開発は、８５〜９０％の黄色ブドウ球菌株による感染症に対して個体を防御することを可能にするであろう。
【０００５】
莢膜抗原に基づく黄色ブドウ球菌に対するワクチンの開発に対する重大な障害は、Ｔ５およびＴ８を発現する野生型株の生産性の低さであり、これは培養条件によって異なる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、驚くべきことに、莢膜多糖（ＰＳ）を多量に生産するように遺伝子改変された野生型黄色ブドウ球菌株が目的の多糖を製造するために有利に使用され得ることを実証した。
【０００７】
本発明者らは、実際に、莢膜ＰＳを過剰産生する株を得るように遺伝子組換えにより改変された黄色ブドウ球菌Ｔ５およびＴ８株が、野生型ＰＳとは異なるが野生型莢膜ＰＳに対する抗体を含む体液性応答を誘導する莢膜多糖を培養上清中で多量に産生する能力を有することを立証した。
【０００８】
したがって、本発明の主題は、過剰産生黄色ブドウ球菌Ｔ８および／またはＴ５株のそれぞれＴ８および／またはＴ５莢膜多糖を含む免疫原性組成物である。
【０００９】
特定の実施態様によると、該組成物は、黄色ブドウ球菌ＣＹＬ１８９２株のＴ５莢膜多糖を含む。
【００１０】
別の実施態様によると、該組成物は、黄色ブドウ球菌ＣＹＬ７７０株のＴ８莢膜多糖を含む。
【００１１】
特定の実施態様によると、該組成物は、黄色ブドウ球菌ＣＹＬ１８９２株のＴ５莢膜多糖および黄色ブドウ球菌ＣＹＬ７７０株のＴ８莢膜多糖を含む。
【００１２】
特定の実施態様によると、該免疫原性組成物は、キャリアータンパク質と結合している過剰産生黄色ブドウ球菌株のＴ８および／またはＴ５莢膜多糖を含む結合体を含む。
【００１３】
特定の実施態様によると、結合体は、ＣＹＬ７７０株のＴ８莢膜多糖を含む。
【００１４】
特定の実施態様によると、結合体は、ＣＹＬ１８９２株のＴ５莢膜多糖を含む。
【００１５】
特定の実施態様によると、免疫原性組成物は、ＣＹＬ７７０株のＴ８莢膜多糖を含む結合体およびＣＹＬ１８９２株のＴ５莢膜多糖を含む結合体を含む。
【００１６】
特定の実施態様によると、結合体は、分画された莢膜多糖を含む。
【００１７】
特定の実施態様によると、本発明の結合体のキャリアー分子は、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）外毒素Ａである。
【００１８】
別の態様によると、本発明は、キャリアータンパク質（有利には、緑膿菌外毒素Ａ）と結合している過剰産生黄色ブドウ球菌株のＴ８またはＴ５莢膜多糖を含む結合体に関する。一の実施態様によると、ＰＳは、分画されている。
【００１９】
特定の実施態様によると、結合体は、黄色ブドウ球菌ＣＹＬ１８９２株の莢膜多糖を含む。
【００２０】
別の実施態様によると、結合体は、黄色ブドウ球菌ＣＹＬ７７０株の莢膜多糖を含む。
【００２１】
該ＰＳは、好ましくは、結合する前に分画される。
【００２２】
別の態様によると、本発明は、黄色ブドウ球菌ＣＹＬ１８９２株の５型莢膜多糖に関する。この多糖は、有利には、単離または精製した形態である。
【００２３】
別の態様によると、本発明は、黄色ブドウ球菌感染症に対する免疫化のための免疫原性組成物の製造のための上記で定義した結合体の使用に関する。
【００２４】
別の態様によると、本発明は、
ａ）過剰産生黄色ブドウ球菌株を培養することからなる工程、
ｂ）このようにして製造された培養物を不活化することからなる工程、および
ｃ）上清からＴ５莢膜多糖を回収することからなる工程
を含む、Ｔ５莢膜多糖の製造方法に関する。
【００２５】
本発明の方法の特定の実施態様によると、過剰産生株はＣＹＬ１８９２株である。
【００２６】
以下の記載において、図１〜６を引用しながらより詳しく本発明を説明する。
【００２７】
「黄色ブドウ球菌株」なる用語は、Ｔ５および／またはＴ８多糖を含む莢膜または微小莢膜（microcapsule）を発現する任意の黄色ブドウ球菌株を意味することが意図される。非限定的な例として、Ｎｅｗｍａｎ（Ｔ５）株、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（Ｔ５）株、Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ（Ｔ５）株、Ｂｅｃｋｅｒ（Ｔ８）株およびＷｒｉｇｈｔ（Ｔ８）株を挙げることができる。本発明の関連において有利に使用される株は、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ株およびＢｅｃｋｅｒ株である。
【００２８】
本発明の関連において、「過剰産生株」なる用語は、２つの株を同じ培養条件下で培養した場合に、由来する親株よりも、培養上清中で単位容量あたり少なくとも１０倍多い、有利には少なくとも２０倍多い重量の莢膜多糖を産生するように遺伝子改変された黄色ブドウ球菌株を意味することが意図される。
【００２９】
産生される莢膜多糖の量は実施例１に記載されるようにＥＬＩＳＡ法によって決定され得る。
【００３０】
「遺伝子改変された」株は、ゲノムがその莢膜多糖産生能を増大させるように遺伝子操作により改変された黄色ブドウ球菌株である。適当な遺伝子改変の説明の一例として、ｃａｐ５またはｃａｐ８オペロンの主要プロモーターの、黄色ブドウ球菌Ｍ株のｃａｐ１オペロンの主要プロモーターのような別の株の強力な主要プロモーターとの相同的組換えによる置換による黄色ブドウ球菌株の改変を挙げることができる。相同的組換えによる遺伝子挿入の方法は、A. J. Link et alによる論文（J. of Bacteriology. Oct. 1997, p.6228-6237）に詳細に記載されており、過剰産生黄色ブドウ球菌株の生産へのその特定の利用は、T. T. Luong et alによる論文（Infection and Immunity, July 2002, p.3389-3395）に詳細に記載されている。かくして、使用され得る操作条件に関するさらなる詳細についてこれらの論文を参照することができる。この同方法は、Ｔ５莢膜多糖を過剰産生する組換え株を構築するためにも使用することができる。これを行うために、ある種のパラメーターを調整することが必要であり得、相同的組換えは出発株に応じて、多少容易に行われる。一例として、ｃａｐ５オペロンの主要プロモーターが黄色ブドウ球菌Ｍ株のｃａｐ１オペロンの主要プロモーターと相同的組換えによって置換された過剰産生Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＣＹＬ１８９２株は、以下の変更を導入したLuong et alの方法によって生産することができた：相同配列がＲｅｙｎｏｌｄｓ株の等価な相同配列と置換されており、プラスミドｐＣＬ５２.２が、温度感受性複製開始点を有しておりかつｃａｔマーカー（クロラムフェニコールに対する耐性を与えるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を含んでいるプラスミドｐＣＬ１０と置換された。つまり、Ｐｃａｐ１プロモーターを含む約２５０ｂｐのフラグメントと融合されたＲｅｙｎｏｌｄｓ株のｃａｐ５ ＯＲＦを含む約１ｋｂのＤＮＡフラグメントが、重複ＰＣＲ技法によって構築される。ｃａｐ５Ａ遺伝子の上流の配列を含む約１ｋｂのＤＮＡフラグメントが、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ株のゲノムからＰＣＲによって増幅される。次いで、２つのフラグメントが、熱感受性複製開始点を有しておりかつｃａｔマーカーを含んでいるｐＣＬ１０プラスミド中にクローン化され、その結果、Ｐｃａｐ５プロモーターがＰｃａｐ１プロモーターと置換される。次いで、このようにして構築されたプラスミドが、ＲＮ４２２０株中に電気穿孔され、次いで、バクテリオファージ５２を使用する形質導入によってＲｅｙｎｏｌｄｓ株へ導入される。次いで、該プラスミドの複製開始点の温度感受性は、その複製をブロックしつつ同時にクロラムフェニコールによる選択を適用することによって相同的組換えの促進を可能にする。
【００３１】
「ＣＹＬ７７０株」なる用語は、Luong and Lee（2002 Infect. Immun. 70: 3389-3395）に記載されているようにｃａｐ８オペロンのプロモーターが黄色ブドウ球菌Ｍ株のｃａｐ１オペロンの強力なプロモーターと置き換えられた野生型Ｂｅｃｋｅｒ株（ＣＩＰ１０３３１４）から得られる過剰産生黄色ブドウ球菌株を示す。
【００３２】
「ＣＹＬ１８９２株」なる用語は、上記改変を含むLuong and Lee（2002 Infect. Immun. 70: 3389-3395）により記載されている方法に従ってｃａｐ５オペロンのプロモーターが黄色ブドウ球菌Ｍ株のｃａｐ１オペロンの強力な構成プロモーターと置き換えられたＲｅｙｎｏｌｄｓ株（ＣＩＰ１０３３１３）から得られる過剰産生黄色ブドウ球菌株を示す。
【００３３】
本発明者らは、過剰産生黄色ブドウ球菌株、特に、ＣＹＬ７７０株およびＣＹＬ１８９２株が高い遺伝的安定性を示すことも立証した。「高い遺伝的安定性」なる用語は、実施例１に記載した試験によって測定されるように、莢膜を有する黄色ブドウ球菌株を培養するのに適している培養培地上で少なくとも２５継代後にそれらの過剰産生能を保存する該株の特性を意味することが意図される。
【００３４】
さらにまた、本発明者らは、過剰産生黄色ブドウ球菌株によって生産される莢膜多糖（以下、ｒＰＳと称する）が、対応する野生型株によって生産されるＰＳ（以下、ｗｔＰＳと称する）の物理化学的特徴とは異なる物理化学的特徴を示すことを示した。「ＰＳ８」および「ＰＳ Ｔ８」なる用語は、血清型８莢膜多糖を意味するために本発明の関連において差別せずに用いられる。同様に、「ＰＳ５」および「ＰＳ Ｔ５」なる用語は、血清型５莢膜多糖を意味するために本発明の関連において差別せずに用いられる。
【００３５】
ｒＰＳ Ｔ８多糖は、対応するｗｔＰＳよりも非常高い平均分子量を有する。すなわち、２５０ｋＤａ対１５０ｋＤａ。
【００３６】
ｒＰＳ Ｔ５多糖は、対応するｗｔＰＳよりも非常に高い平均分子量を有する。すなわち、１５０ｋＤａ対５０ｋＤａ。さらにまた、本発明者らは、ｒＰＳ Ｔ５は、細菌壁と結合したままであるｗｔＰＳ Ｔ５とは異なって、主として培養上清中に放出されることを示した。
【００３７】
本発明者らは、ｗｔＰＳのものとは異なるプラスチック表面への吸着特性を示すことも観察した。抗ＰＳ８ポリクローナル抗体は、Ｍ１培地中にて予め培養した種々のＴ８株（Ｂｅｃｋｅｒ、ＷｒｉｇｈｔおよびＣＹＬ７７０）の反復注射によってウサギにおいて産生された。これらの血清の抗ＰＳ８抗体力価は、吸着抗原として種々のＰＳ８（Ｂｅｃｋｅｒ株、Ｗｒｉｇｈｔ株またはＣＹＬ７７０株から精製した）を用いてＥＬＩＳＡによって評価された。結果は、Ｂｅｃｋｅｒ株から得られた抗ＰＳ８ポリクローナル血清が高い抗ＰＳ８抗体力価を示すことを示した。この力価は、Ｂｅｃｋｅｒ株のＰＳ８について評価されているかＷｒｉｇｈｔ株のＰＳ８について評価されているかに関わらず同様である。他方、後者をＣＹＬ７７０株から精製した吸着ＰＳ８について評価した場合には低い抗ＰＳ８力価が観察される。Ｗｒｉｇｈｔ株またはＣＹＬ７７０株から得られた血清について同じ結果が得られた。
【００３８】
種々の血清によるＣＹＬ７７０のＰＳ８の弱い認識が、このｒＰＳ８の、処理されたプラスチック製ＥＬＩＳＡプレートと結合する能力の低下に因るものであり、ＰＳ８自体の認識の差異に因るものではなかったことを立証するために、３つの血清を、ｒＥＰＡと結合したＣＹＬ７７０のｒＰＳ８に対してＥＬＩＳＡにより滴定した。吸着を大きく改良することは、キャリアータンパク質の存在にとって不可欠であった。これらの吸着条件下で、３種類のＴ８株から産生される抗ＰＳ８ポリクローナル血清は、お互いに比べても遜色のない、Ｂｅｃｋｅｒ株またはＷｒｉｇｈｔ株から精製されたＰＳ８について得られたものと同様の抗体力価をもって、ＣＹＬ７７０のｒＰＳ８を非常に強く認識する。
【００３９】
異なる免疫特性および抗原特性に反映される可能性のあるこれらのかなりの相違にもかかわらず、本発明者らは、特徴付けおよび免疫原性実験によって、ｒＰＳが、まず、C. Jones（Carbohydr. Res., 2005, 340, 1097-1006）によって記載されるようにそれらの特徴的な一次構造を保存すること、次に、ｗｔＰＳの免疫原性および抗原性を保存することを立証した。
【００４０】
本発明者らは、特に、種々の黄色ブドウ球菌８型株に対する抗ＣＹＬ７７０血清の交差反応性を評価した。これに関して、ＣＹＬ７７０株のホルマリン処理した全微生物の注射によりウサギ中にて過免疫血清を調製し、化学的に脱莢膜した自家微生物上に吸着させた。得られた結果は、抗ＣＹＬ７７０株血清が表面でｗｔＰＳ Ｔ８を示している野生型Ｂｅｃｋｅｒ株およびＷｒｉｇｈｔ株との交差反応性を示すことを示している。したがって、これらの結果は、免疫化方法で使用することができるＴ８莢膜多糖を多量に製造するために過剰産生ＣＹＬ７７０株を使用することが可能であることを立証している。
【００４１】
ｒＰＳは、
ａ）過剰産生黄色ブドウ球菌株、特に、ＣＹＬ１８９２株またはＣＹＬ７７０株を培養することからなる工程、
ｂ）このようにして製造された培養物を不活化することからなる工程、および
ｃ）培養上清からＴ５またはＴ８莢膜多糖を回収することからなる工程
を含む製造方法によって製造され得る。
【００４２】
工程（ａ）は、固体または液体培養培地上で行うことができる。これを行うために、莢膜を有する黄色ブドウ球菌株を培養するのに適していると文献に記載されているいずれもの培養培地を使用することができる。非限定的な例として、以下の培地を挙げることができる：ＴＳＢ（トリプティケースソイブロス（trypticase soy broth））；Poutrelが規定した培地（Poutrel et al., Clin Diagn Lab Immunol. 1995, 2(2): 166-71）；Ｃｏｌｕｍｂｉａブロス。続いて、誘導または非誘導培地に言及する。「誘導培地」なる用語は、ｃａｐ遺伝子座の誘導性主要プロモーターに対して間接的にまたは直接作用する成分（例えば、ＮａＣｌ、またはＣａＣｌ2およびＭｇＣｌ2のような別の塩）を含有する培養培地を意味することが意図される。したがって、誘導培地は、ｃａｐ遺伝子座に誘導性主要プロモーターを含んでいる黄色ブドウ球菌株における莢膜の生産を誘導する能力を有する培地である。逆に、非誘導培地は、このようなシグナルを含有しない培養培地である。
【００４３】
本発明の関連において、好ましくは、動物起源のタンパク質を含まない培地が使用される。
【００４４】
「動物起源のタンパク質」なる用語は、動物起源の材料から得られたタンパク質およびそれらから誘導される物質、例えば、動物タンパク質の化学的処理により誘導される誘導体を意味することが意図される。それはまた、これらの動物タンパク質の部分または全加水分解の生成物、例えば、ペプトン類、ポリペプチド類、ペプチド類、またはそれらから誘導されるアミノ酸を意味することが意図される。
【００４５】
培養工程は、接種材料を、例えば０.２の初期ＯＤ680nmで、培養培地に接種し、５〜１０％の濃度で場合によりＣＯ2を含有する雰囲気下で（Ｔ５株についてはＣＯ2を含有せず、Ｔ８株の使用の場合にはＣＯ2を含有する）、例えば約４８〜７２時間の間、３７℃でインキュベートすることにより行うことができる。培養容量は、必要に応じて変えることができる。４００ｍｌ〜２０リットルまたはそれ以上、例えば、３０リットル〜１００リットルの容量を使用することができる。好ましくは、酸素化が促進するように２０％（Ｖ／Ｖ）の培養培地容量対培養容器容量が維持される。多量の容量の場合は、酸素化は、培養の過程において確認され、酸素圧の調節および適当な撹拌によって調節される。
【００４６】
要求に応じて、培養工程は、バイオマスおよび生産される多糖の量を増加させるために、容量を増やしながらの連続培養を含むことができる。工程（ａ）から得られる培養物は、続いて不活化工程（ｂ）を受ける。
【００４７】
不活化工程は、培養物を２％（容量、最終濃度）の割合のフェノール／エタノール（１Ｖ／１Ｖ）混合物で処理し、次いで、例えばマグネチックバーを使用して、周囲温度で６時間〜４８時間（処理されるバイオマスに依存する）撹拌することにより行うことができる。不活化は、死亡率試験によって確認される。これを行うために、処理された培養物１００μｌをＣｏｌｕｍｂｉａ ２％ＮａＣｌ 寒天上にプレーティングし、並行して、処理された培養物１００μｌを、３０分の１のウマ血清を補充したトリプティケースソイブロス中に接種する。培養物を３７℃で４８時間インキュベートする（ブロスフラスコの栓はゆるめたままである）。生存している細菌の不在は、３７℃で２４時間インキュベートした後に増殖がないことに反映される。一旦培養物の死亡が確立されると、莢膜多糖を回収する。
【００４８】
過剰産生黄色ブドウ球菌株、特に、ＣＹＬ７７０株およびＣＹＬ１８９２株の場合、ｒＰＳ Ｔ８およびＴ５の大部分が培養上清中に放出される。したがって、ｒＰＳは、後者から直接単離され得る。これを行うために、不活化工程の終わりに、培地を遠心分離し、細胞ペレットを除去する。
【００４９】
次いで、培養上清に含有されるｒＰＳは、ＰＳを精製するための慣用技術によって精製され得る。種々の精製技術が文献に記載されており、本発明の関連において使用することができる。例えば、Lee J. C. et al. による論文1987; 55, 2191-2197またはFattom et al. による論文Infect. Immun. 1990; 58, 2367-2374を参照することができ、後者は、ＰＳのリゾスタフィンによる放出、ならびにＲＮＡｓｅ、ＤＮＡｓｅ、プロテアーゼ、分画されたエタノール沈殿、イオン交換およびモレキュラーシーブでの処理を含む方法を記載している。好ましくは、本発明の関連において、少なくとも７０％の純度を示すｒＰＳを製造する技術が使用される。
【００５０】
物理化学的分析および５００ＭＨｚでの一次元プロトン核磁気共鳴分析は、過剰産生株から精製されたｒＰＳ Ｔ８およびＴ５が、少なくとも７０％の純度および７０％より高いＯ−およびＮ−アセチル化度を有する、文献に記載された構造に従った構造を示すことを示す。残留物質は、最終生成物中に、タンパク質特性を有する残留物質５％（ｗ／ｗ）未満、残留核酸１％（ｗ／ｗ）未満、ならびに残留リポテイコ酸および残留テイコ酸５％（ｗ／ｗ）未満の割合で存在する。
【００５１】
得られた莢膜多糖の量は、実施例１に記載されるＥＬＩＳＡ技術によって評価され得る。
【００５２】
かくして、ＣＹＬ７７０株は、上清中に、親Ｂｅｃｋｅｒ株によって生産されるものよりも約８０倍多い量のｒＰＳ Ｔ８を生産することが示された。この生産性における利益は、培養培地中での連続継代後も安定を保つ。
【００５３】
さらにまた、本発明者らは、ＣＹＬ１８９２株が野生型親株よりも約５０倍多い、すなわち平均２００μｇ／ｍｌのｒＰＳ Ｔ５を生産することを示した。この生産性における利益は、本質的に、培養上清中で観察され、培養培地中での連続継代後も安定を保つ。さらにまた、ＣＹＬ１８９２株は、細胞ペレット中に野生型親株よりも７倍多いＴ５多糖を生産する。
【００５４】
一部のｒＰＳ Ｔ５は細菌壁に結合したままであるので、ｒＰＳ Ｔ５を回収することかになる工程はまた、細胞からｒＰＳ Ｔ５を抽出することからなるさらなる工程を含むことができる。これを行うために、種々の抽出技術が文献に記載されており、本発明の関連において使用され得る。例えば、これらの技術の詳細な説明のためにLee J. C.による論文Infect. Immun. 1993; 67: 1853-1858；Dassy B. et al.による論文Gen. Microbiol. 1991; 137: 1155-1162を参照することができる。
【００５５】
したがって、本発明のＰＳを生産する方法は、有利には、好ましくはＣＹＬ１８９２株から、ＰＳの細胞ペレットからの抽出により上清から直接、ｒＰＳ Ｔ５を生産するために使用され得る。したがって、本発明の方法により、数多くの細胞混入物（すなわち、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、テイコ酸）の除去の面倒な工程を簡単にすることが可能になる。
【００５６】
一の実施態様によると、本発明の主題はまた、ｒＰＳ莢膜多糖、特に、黄色ブドウ球菌ＣＹＬ１８９２株のｒＰＳ Ｔ５である。該多糖は、有利には、単離または精製された形態である。
【００５７】
本発明のｒＰＳ Ｔ５およびＴ８は、例えば、操作条件の完全な記載について参照することができる米国特許第６,０４５,８０５号に記載される方法に従って、分画または脱重合され得る。本発明の関連において、「分画する」および「脱重合する」なる用語は、区別なく使用される。これらの分画されたｒＰＳを、以下、ｒＰＳｆと称する。本発明のｒＰＳ Ｔ５およびＴ８は、有利には、有利には１０〜１２０ｋＤａの範囲内、特に３０〜７０ｋＤａの範囲内の平均分子量を示すｒＰＳｆ、例えば、平均分子量５０ｋＤａのｒＰＳｆが得られるまで分画または脱重合される。
【００５８】
したがって、一の実施態様によると、本発明の主題はまた、ｒＰＳｆ莢膜多糖、特に、ｒＰＳｆ Ｔ５、有利には、黄色ブドウ球菌ＣＹＬ１８９２株のｒＰＳｆ Ｔ５である。該ｒＰＳｆ多糖は、有利には、単離または精製された形態である。
【００５９】
本発明はまた、黄色ブドウ球菌Ｔ５および／またはＴ８株による感染症の治療または予防のための免疫原性組成物およびワクチンを製造するための、過剰産生黄色ブドウ球菌株（有利には、ＣＹＬ１８９２株およびＣＹＬ７７０株）により産生されるｒＰＳ Ｔ５およびＴ８莢膜多糖の使用に関する。
【００６０】
ｒＰＳ莢膜多糖は、補体の存在下での食細胞によるそれらを担持する細菌の破壊を媒介することができる抗体の産生を誘導する。
【００６１】
したがって、一の実施態様によると、本発明は、過剰産生黄色ブドウ球菌株（有利には、ＣＹＬ７７０株またはＣＹＬ１８９２株）のｒＰＳ Ｔ８および／またはＴ５を含む免疫原性組成物またはワクチン組成物に関する。
【００６２】
本発明はまた、黄色ブドウ球菌感染症の予防用および／または治療用の免疫原性組成物の製造またはワクチン組成物の製造のための過剰産生ブドウ球菌株（有利には、ＣＹＬ７７０株またはＣＹＬ１８９２株）のｒＰＳ Ｔ８および／またはＴ５の使用に関する。特に、該免疫原性組成物またはワクチン組成物は、投与を受ける個体において黄色ブドウ球菌Ｔ８および／またはＴ５株に対する体液性応答を誘導することができる。
【００６３】
特定の実施態様によると、該組成物は、ｒＰＳ Ｔ８およびＴ５を含む。かかる免疫原性組成物またはワクチン組成物は、投与を受ける個体において、感染性黄色ブドウ球菌株の圧倒的多数を代表する黄色ブドウ球菌Ｔ５およびＴ８株に対する免疫応答を誘導することができるので、特に有利である。
【００６４】
本発明の免疫原性組成物またはワクチン組成物は、感染個体において感染と戦うために、または、入院する個体または外科手術手技を受けなければならない個体のような感染の恐れのある個体において感染を予防するために使用することができる。
【００６５】
本発明の免疫原性組成物またはワクチン組成物が、２歳未満の小児用、または高齢（６０歳を超える）の個体のような弱い免疫防御を示している個体用である場合、本発明のｒＰＳは、好ましくは、結合形態で使用される。
【００６６】
したがって、別の実施態様によると、本発明は、ｒＰＳ−キャリアータンパク質結合体に関する。
【００６７】
「キャリアータンパク質」なる用語は、莢膜多糖に対する免疫応答の誘導においてＴ細胞とＢ細胞との間の細胞協力を可能にし、かくして、能動免疫についてであってもボランティアに対して調製された高力価抗血清を使用する受動免疫についてであっても免疫原性を向上させるタンパク質を意味する。キャリアータンパク質は、好ましくは、非毒性および非反応性であるタンパク質である。使用することができるキャリアータンパク質の非限定的な例としては、組換えまたは不活化細菌毒素、例えば、緑膿菌外毒素Ａ、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドまたは百日咳トキソイド、ブドウ球菌トキソイドもしくは外毒素、またはイー・コリ（E. coli）熱不安定性毒素（ＬＴ）または志賀毒素（ＳＴ）が挙げられる。細菌の外膜タンパク質、例えば、外膜複合体ｃ（ＯＭＰｃ）、ポリン、トランフェリン結合タンパク質、または肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓａＡ）もまた使用され得る。他のさらなるタンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニンまたはツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）をキャリアータンパク質として使用することができる。
【００６８】
それらの高い分子量のために、ｒＰＳ Ｔ５およびＴ８多糖は、好ましくは、例えば使用すべき操作条件の記載について参照することができる米国特許第６,０４５,８０５号に記載されている方法に従って、キャリアー分子と結合する前に「分画」または「脱重合」される。非分画ｒＰＳは、低い累積的結合および精製収率をもたらし、それらのサイズが大きいために濾過滅菌の実施がより困難になり得る結合体を生じる。脱重合または分画したｒＰＳは、本明細書において、以下、ｒＰＳｆと称する。
【００６９】
本発明のｒＰＳは、１０〜１２０ｋＤａ、特に３０〜７０ｋＤａ、例えば５０ｋＤａの平均分子量を示すｒＰＳｆが得られるまで脱重合または分画され得る。例えば、ＣＹＬ１８９２株のｒＰＳ Ｔ５は、有利には３０〜７０ｋＤａの範囲、例えば５０ｋＤａの平均分子量を有するｒＰＳｆが得られるまで脱重合または分画され、ＣＹＬ７７０株のｒＰＳ Ｔ８は、有利には３０〜７０ｋＤａの範囲、例えば、５０ｋＤａの平均分子量を有するｒＰＳｆが得られるまで脱重合または分画される。
【００７０】
その後、多糖を、共有結合によるキャリアータンパク質との結合の前に官能化させる。該官能化は、種々の方法に従って行うことができる。例えば、多糖の活性化カルボキシレート基をアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）またはシスタミンで官能化させることができ、次いで、該部分アミド化多糖とキャリアータンパク質のカルボキシレート基とのカルボジイミド媒介反応によって、該多糖をキャリアータンパク質と結合させることができる。また、多糖のヒドロキシル基を臭化シアンまたはテトラフルオロホウ酸１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジウムを使用して活性化することができ、次いで、該多糖をKohn et al. 1993 FEBS Lett. 154: 209: 210に記載されている方法に従ってＡＤＨで官能化させることができる。次いで、官能化多糖をエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＡＣ）の存在下でキャリアータンパク質と（例えば、残基ＧＬＵ５５３を欠失させた組換え緑膿菌エキソプロテインＡ（本明細書中ではｒＥＰＡなる用語の下に言及される））と結合させる。次いで、反応しなかった多糖から結合体を分取するためにサイズ排除クロマトグラフィーを使用することができる。官能化および結合の活性化工程は、多糖の反復単位の化学構造を損なわない。
【００７１】
したがって、一の態様によると、本発明は、キャリアータンパク質（好ましくは、ＥｘｏＡ解毒ｒＥＰＡ）と結合した、有利にはそれぞれＣＹＬ７７０株およびＣＹＬ１８９２株の、ＰＳｆ Ｔ８および／またはＴ５を含む結合体に関する。
【００７２】
別の態様によると、本発明はまた、キャリアータンパク質（好ましくは、ＥｘｏＡ解毒ｒＥＰＡ）と結合した、有利にはそれぞれＣＹＬ７７０株およびＣＹＬ１８９２株の、ｒＰＳｆ Ｔ８および／またはＴ５を含む結合体に関する。
【００７３】
特定の実施態様によると、本発明は、上記定義の結合体、特に、ＰＳｆ Ｔ８およびＴ５結合体またはｒＰＳ Ｔ８およびＴ５結合体を含む混合物であって、該ＰＳが、有利には解毒ＥｘｏＡと同一またはそれに相当する、同一または異なるキャリアータンパク質と結合されているところの混合物に関する。
【００７４】
本発明の結合体は、免疫原性組成物またはワクチン組成物、特に黄色ブドウ球菌感染症の予防用および／または処置用のワクチン組成物の製造のために使用することができる。したがって、本発明はまた、上記で定義した結合体またはその混合物を含む免疫原性組成物またはワクチン組成物に関する。
【００７５】
本発明の組成物は、インビボでの体液性応答を誘導するのに有用、特に黄色ブドウ球菌Ｔ５またはＴ８株に対する抗体または抗血清を製造するのに有用、または感染した個体において感染症と戦うのに、または入院している個体もしくは外科手術手技を受けなければならない個体のような感染の恐れのある個体において感染症を予防するのに有用である。
【００７６】
したがって、本発明の主題はまた、当業者に周知の抗血清およびポリクローナルまたはモノクローナル抗体を得るための慣用技術によって行われ得る抗体および抗血清の調製、ならびにこのようにして製造される指向性抗体および抗血清である。
【００７７】
本発明の免疫原性組成物またはワクチン組成物は、当業者に知られているいずれかの常法によって製造され得る。通常、本発明の抗原は、医薬上許容される賦形剤と混合される。「医薬上許容される賦形剤」なる用語は、ヒトに投与することができる組成物の調製において慣用的に使用される、いずれもの賦形剤、充填剤、希釈剤、ビヒクル、保存剤などを意味することが意図される。一般に、これらの物質は、選択される医薬剤形および投与経路に応じて、そして、標準的な製薬業務に従って、選択される。例えば、当該技術分野におけるレファレンス・マニュアルを構成するRemington's Pharmaceutical Sciencesを参照することができる。
【００７８】
本発明の組成物はまた、アジュバントを含有することができる。ワクチン分野で慣用的に使用されるいずれかの医薬上許容されるアジュバントまたはアジュバント混合物をこの目的のために使用することができる。好適なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩、ＤＣ−ＣｈｏｌおよびＴｏｌｌアゴニストが挙げられる。
【００７９】
さらなる態様によると、本発明は、黄色ブドウ球菌感染症に対して個体を免疫化する方法であって、該個体に上記本発明の免疫原性組成物またはワクチン組成物の免疫学的に有効な量を投与することを含む方法に関する。
【００８０】
「個体」なる用語は、黄色ブドウ球菌感染症の恐れのある個体、例えば、入院しているかまたは外科手術手技を受けなければならない個体を意味することが意図される。
【００８１】
本発明の組成物は、非経口経路（静脈内、筋肉内、皮下など）のようなワクチン分野で通常使用されるいずれかの慣用経路によって投与され得る。本発明の関連において、注射用組成物については、好ましくは筋肉内投与が用いられる。かかる投与は、有利には、大腿部または腕の筋肉において行われ得る。本発明の組成物はまた、経口投与され得る。鼻粘膜、膣粘膜または直腸粘膜を介する投与もまた本発明に関連して推奨され得る。該投与は、１回投与量または反復投与量の投与によって行われ得る。ワクチン投与量は、０.１ｍｌ〜２ｍｌの容量、好ましくは０.５ｍｌの容量で調製され得る。免疫学的に有効な量は、免疫化個体において、黄色ブドウ球菌株をオプソニン化して感染個体の食細胞によるその除去を促進する能力を有する抗体を含む体液性応答を誘導する能力を有する量である。該組成物は、有利には、黄色ブドウ球菌感染症の恐れが増加する期間の開始の少なくとも１０〜１４日前に投与され得る。
【００８２】
図面および以下の実施例により本発明を説明するが、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００８３】
以下の実施例で使用する培養培地の組成は下記表１に規定するとおりである。該培地は、構成成分を表に示した順序で混合することによって調製した。
【００８４】
【表１】
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【００８５】
実施例１：  ＣＹＬ１８９２ ５型株の特徴付け
ＣＹＬ１８９２株の凍結材料がChia Y. Lee博士（アメリカ合衆国、Arkansas University Medical Center）から提供された。それは、原凍結材料である。
【００８６】
凍結材料の調製
２種類の凍結材料を調製した。凍結材料（Ａ）は、Ｃｏｌｕｍｂｉａ培地での増幅により原凍結材料から直接得られ、該培地と同様に動物起源の材料を含有する。第二の凍結材料（Ｂ）は、動物起源の材料を含まない培地でのクローニングおよび反復継代により原凍結材料から得られた。
【００８７】
ＴＳＢ（トリプティケースソイブロス）培地における前培養物を、初期凍結材料１００μｌを使用して接種し、振盪しながら３７℃で１８時間置く。次いで、培養物４００ｍｌを、該前培養物を使用して接種する。振盪しながら３７℃で５時間後、０.２２μｍで濾過したグリセロール５０ｍｌに培養物２００ｍｌを加える。凍結材料を１００μｌの試験管１００本および１ｍｌの試験管１００本に分配し、次いで、−８０℃で貯蔵する。
【００８８】
種バッチＡおよびＢの凍結材料の調製
予備凍結材料の調製
非誘導培地Ｍ０上にてクローニング工程が行われる。原ＣＹＬ１８９２株のアリコート１００μｌを使用して非誘導培地Ｍ０上にて単離が行われる。この単離により２つのコロニーを収穫し、ヌクレアーゼ不含Ｈ2Ｏの５０μｌに溶解し、次いで、単離コロニーとして再度接種する。三継代後、ペトリ皿あたりコロニー１つを溶解し、次いで、層として接種する（ＰＣＲによる対照を行うために、並行して１つのコロニー溶解容量を採取する）。次いで、このようにして得られた層を、液体誘導培地Ｍ０（５０ｍｌ）の５時間培養物を接種するために使用する。培養の終わりに、６８０ｎｍでの光学密度を測定し、次いで、体系化され０.２２μｍで濾過したグリセロール１０ｍｌに培養物４０ｍｌを加える。４５×１ｍｌに分配が行われ、−８０℃で貯蔵が行われる。
【００８９】
凍結材料Ｂの培養および冷凍
原凍結材料中に存在する可能性のある動物起源の全ての成分を除去するために段階希釈液を調製する。非誘導培地Ｍ０を継代に使用する。
【００９０】
寒天培地上での最初の継代の前に、出発の予備凍結材料Ｂを１００分の１に希釈する。次いで、各継代（継代２〜４）間で段階希釈（１０-5）を行う。合計４回の寒天培地上での継代を全希釈係数１０-17で行う。液体誘導培地Ｍ０ ４００ｍｌの培養物を接種するために、行われた最終希釈に対応する層を使用する。振盪しながら３７℃で５時間培養した後、対数期の終わりに培養を停止させる。ＯＤ680nm測定は、増殖キネティクスの至るところで行われる。次いで、培養物にグリセロールを２０％の最終濃度で補給し、次いで、試験管中へ最終分配するまで氷中に維持されるＳｃｈｏｔｔフラスコ６個に分配する。分配は、Ｎｕｎｃ試験管中に１ｍｌずつ、１５ｍｌのＦａｌｃｏｎ試験管中に５ｍｌずつ行われる。次いで、アンプルを−８０℃に置く。
【００９１】
実行される管理
生存率
以下のプロトコルに従って、冷凍前に、凍結材料Ｂの分配時に各分配フラスコについて計数を行う：
・１０-9希釈まで、凍結材料のＰＢＳ中段階１０倍希釈、
・Ｃｏｌｕｍｂｉａ 寒天 ２％ＮａＣｌを含有する２４×２４Ｎｕｎｃペトリ皿上に１０-3〜１０-9の希釈液２５μｌの６滴を置くこと、
・３７℃で１８時間のインキュベーション、
・最も可読な希釈範囲におけるコロニーの計数および分配フラスコについての平均値の算出。
【００９２】
次いで、以下の計画に従って、各分配フラスコに対応するいくつかの凍結材料について同計数技術に従って生存率管理を行った：Ｄ＋１１日、Ｄ＋１ヶ月、Ｄ＋３ヶ月、Ｄ＋６ヶ月、Ｄ＋１年。
【００９３】
同一性
ＡｐｉＳｔａｐｈ（登録商標）システムの生化学試験およびリゾスタフィン耐性試験によって凍結材料を使用して同一性を立証する。これらの試験は、製造者によって提供される使用説明書に従って、Ｃｏｌｕｍｂｉａ 寒天 ２％ＮａＣｌ上３７℃での１８時間培養物を使用して行われた。
【００９４】
さらにまた、Ｃｏｌｕｍｂｉａ 寒天 ２％ＮａＣｌ上での単離を使用してＴ５／Ｔ８マルチプレックスＰＣＲ増幅による莢膜分類を行う。Ｒｅｙｎｏｌｄｓ株およびＢｅｃｋｅｒ株をＴ５およびＴ８増幅についての対照として使用する。
【００９５】
オリゴヌクリオチドＰｐａ１ＮｃｏｌおよびＰｐａ１ｒを使用するｃａｐ１遺伝子安定性についてのＰＣＲ試験（Luong et al. in Infect. Immun. 2002; 70(7): 3389-95により記載されている）もまた行う：Ｃｏｌｕｍｂｉａ 寒天 ２％ＮａＣｌ上で単離を行い、３７℃で２４時間インキュベートする。次いで、コロニーを回収して、Ｃｏｌｕｍｂｉａ 寒天 ２％ＮａＣｌ上で２回目の継代を行う。このようにして４回の連続継代を行う。コロニーからのＤＮＡを抽出して、ｃａｐ１プロモーターの存在をＰＣＲにより立証する。ＣＹＬ７７０株をｃａｐ１プロモーターの増幅についての対照として使用する。
【００９６】
Ｔ５およびＴ８株の莢膜多糖の同一性の立証は、当業者に周知の慣用方法によって製造された、Pasteur Instituteによって提供されるハイブリドーマから得られた特異的モノクローナル抗ＰＳ５（ＩｇＭ）クローンＪ１および抗ＰＳ８（ＩｇＧ１）クローンＫ８−２４抗体を使用してスライドグラス上での凝集アッセイによって行われる。スライドグラス上での凝集反応は、ＯＤ680nm＝５に調整した細菌懸濁液５０μｌを使用して行われた。
【００９７】
ＥＬＩＳＡによる生産性の評価
生産性試験
液体誘導培地Ｍ０における前培養物を、試験しようとする凍結材料を使用して接種する。次いで、誘導培地Ｍ１中４００ｍｌの培養物を接種し、振盪しながら３７℃で７２時間置く。培養の終わりに、培養物５０ｍｌを取り出し、＋４℃にて３５００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。その後、莢膜多糖を抽出し、次いで、ＥＬＩＳＡによってアッセイする。
【００９８】
安定性試験
培地Ｍ１中での連続培養を行って、１０００リットルの発酵槽中で得ることができるものと同様に多くの世代を得る。これについて、Ｍ１の１０ｍｌに凍結材料Ｂのアンプルを接種し、次いで、３７℃で１６時間培養した後、ＯＤ＝０.２で培地Ｍ１の１０ｍｌに接種し、３７℃でそれぞれ４時間、４時間、１６時間、４時間、４時間、１６時間、４時間および４時間培養することにより８回連続培養を行う。最後の培養物を使用して、１５０μｌを寒天誘導培地Ｍ０に接種して、３７℃で１６時間、前培養を行い、次いで、Ｍ１の４００ｍｌにＯＤ＝０.２で接種し、３７℃で７２時間培養する。培地Ｍ１での最後の継代の終わりに、生産性測定を上記のように行い、同一培養条件下で参照凍結材料について得られた生産性と比較する。
【００９９】
オートクレーブ抽出および試料の調製
培養の終わりに、懸濁液を＋４℃にて３５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、培養上清を分取し、＋４℃で貯蔵する。２回連続オートクレーブサイクルによりペレットを抽出する。各サイクルは、ＰＢＳ ５ｍｌにペレットを溶解すること、次いで、１２１℃で６０分間のオートクレーブサイクルからなる。オートクレーブしたペレットについて、Ｃｏｌｕｍｂｉａ 寒天 ２％ＮａＣｌへの接種により死亡率試験を行う。その後、このオートクレーブしたペレットを＋４℃にて２５０００×ｇで３０分間遠心分離し、抽出物（上清）を回収し、次いで、＋４℃で貯蔵する。次いで、該ペレットをＰＢＳ ５ｍｌに再溶解し、２回目のオートクレーブサイクルを開始する。２回目のサイクルの終わりに、２つの抽出物を合わせる。抽出物および培養上清を３７℃で１時間プロテイナーゼＫ（５０μｇ／ｍｌ）で処理し、次いで、８０℃で３０分間インキュベートすることによりプロテイナーゼＫを不活化する。次いで、処理した培養上清について死亡率試験を行う。
【０１００】
ＰＳ５ ＥＬＩＳＡアッセイ
プロテイナーゼＫで処理した試料（オートクレーブ処理後に得られた抽出物および／または処理した培養上清）をサンドイッチＥＬＩＳＡによりアッセイする。二重滴定により、データの信頼性を確実にすることができる。原理は、２つの抗体間で抗原（ＰＳ５）を捕獲して、それを定量化することからなる。いずれもの干渉を回避するため、そしてできる限り正確な測定値を得るために、２つの抗体のうち１つは、完全に特異的でなければならない（吸着で使用される抗ＰＳ５モノクローナル抗体）。次いで、吸着したウサギポリクローナル血清を検出抗体として使用する。ペルオキシダーゼと結合した二次抗体は可視化を可能にするであろう。ＥＬＩＳＡの間、精製ＰＳ５を様々な濃度で使用して標準曲線を作成して抗原を定量化する。対照も導入する；それは、濃度が既知であり、物理化学的測定により７８μｇ／ｍｌであることが確立されている精製ＰＳ５である。最終工程において、発色基質、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を加える。後者をペルオキシダーゼにより分解して青色の生成物を得る。暗所にて２０℃で１５分間インキュベートした後、酸を加え、反応を停止させ、青色の生成物を黄色に変える。４５０ｎｍで光学密度を測定する。それは、結合した抗体の量に比例する。
【０１０１】
結果
ＣＹＬ１８９２凍結材料Ａ
１１日間冷凍した後、ＣＹＬ１８９２計数結果は安定である。４回連続継代を行った。合計１６個の異なるコロニーを抽出し、ＰＣＲにより分析した。継代ごとに試験したコロニーは全て明らかに５型ｃａｐ遺伝子座を有しており、ｃａｐ１プロモーターの存在もまた全てのコロニーについて示された。
【０１０２】
ＣＹＬ１８９２凍結材料Ｂ
１１日間冷凍した後、ＣＹＬ１８９２計数結果は安定である（平均２.３×１０9ＣＦＵ／ｍｌ）。
【０１０３】
Ａｐｉ系
製造者の使用説明書に従って生化学的特性の分析に従って黄色ブドウ球菌の正確な同定が得られる。
【０１０４】
ＰＣＲプロフィール
様々なクローニング工程の間、予備凍結材料の遺伝的安定性をモニターした。約５００ｂｐのｃａｐ５および２００ｂｐのｃａｐ１プロモーターの特異的増幅の存在に注目する。試験した１０個のコロニーは、凍結材料Ｂを生産するための培養物の接種のために使用した予備凍結材料Ｂから得られる。ｃａｐ５遺伝子座およびｃａｐ１プロモーターの遺伝的安定性が観察される。
【０１０５】
ＣＹＬ１８９２凍結材料Ｂ由来の２０個の単離コロニーを試験した。約５００ｂｐおよび２００ｂｐの増幅は、ｃａｐ５遺伝子座およびｃａｐ１プロモーターの遺伝的安定性を説明する。
【０１０６】
凝集アッセイ
抗ＰＳ５モノクローナル抗体による凝集のみが観察される。
【０１０７】
ＣＹＬ１８９２凍結材料ＡおよびＢの生産性（図１）
参考凍結材料および野生型株凍結材料を並行して用いて生産性測定を数回行った。組換え株に関して、野生型株について２種類の凍結材料を調製した。Ｃｏｌｕｍｂｉａ ブロス ２％ＮａＣｌ中にて研究室にてわずかな回数の継代によって、原株からＲｅｙｎｏｌｄｓ凍結材料Ａを得た。この凍結材料Ａは、動物起源の材料を含有する。培地Ｍ０上での原株の連続継代によって、動物起源の材料を含まない第２の凍結材料（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ凍結材料Ｂ）得た。非誘導培地Ｍ０において継代を受けた後、液体誘導培地Ｍ０においてＲｅｙｎｏｌｄｓ凍結材料Ｂを調製した。
【０１０８】
組換えＣＹＬ１８９２株は、上清中においてペレット中よりも平均３.５倍多いＰＳ５を生産することが観察される。このようにして製造された合計量は、液体誘導培地Ｍ１において培養した後、野生型Ｒｅｙｎｏｌｄｓ株と比べてＰＳ５が約１０倍多い（それぞれ、３００μｇ／ｍｌおよび３０μｇ／ｍｌ）。この差異は上清中で非常に有意である。ＣＹＬ１８９２株については野生型Ｒｅｙｎｏｌｄｓ株と比べて約５０倍多いＰＳ５生産が観察される。この差異は、ペレットに関してはそれほど大きくはない。実際、ＣＹＬ１８９２株についてはＲｅｙｎｏｌｄｓ株と比べて２倍のＰＳ５生産性差異が観察される。ＣＹＬ１８９２凍結材料Ｂが凍結材料Ａと比べて等量のＰＳ５を生産することに注目する。
【０１０９】
ＣＹＬ１８９２凍結材料ＡおよびＢの安定性（図１）
培地Ｍ１上での安定性試験後（約４０世代が実現）、生産性測定を行った。培地Ｍ１中での数回の継代後にペレットおよび上清中で観察された生産性は、凍結材料Ａに関してはＣＹＬ１８９２凍結材料Ｂについて継代なしで観察されるものと同等である。野生型Ｒｅｙｎｏｌｄｓ株の凍結材料Ｂについては２０〜５０％の生産性減少が観察される。
【０１１０】
組換え黄色ブドウ球菌５型株ＣＹＬ１８９２の特徴付けにより、野生型Ｒｅｙｎｏｌｄｓ株の使用と比べて莢膜多糖生産性の増加が得られることを観察することができた。驚くべきことに、培養上清中にて生産性差異が本質的に観察され（約５０×、すなわち、平均２００μｇ／ｍｌ）、誘導培地における連続継代後でも安定した状態を保つ。これらの結果は、この組換え株を生産するために使用される構築物が安定であることを示している。したがって、凍結材料ＡおよびＢは、均質集団から調製された。
【０１１１】
実施例２：  ＣＹＬ１８９２株によって生産された５型莢膜多糖およびＣＹＬ７７０株によって生産された８型莢膜多糖の特徴付け
下記分析によって、それぞれＣＹＬ７７０株およびＣＹＬ１８９２株から単離および精製されたｒＰＳ Ｔ８およびＴ５を特徴付けた。
【０１１２】
精製ｒＰＳ５および精製ｒＰＳ８の一次元プロトン磁気共鳴分析は、これらの多糖が既に公表されているもの（C Jones. Carbohydr. Res. 2005, 340, 1097-1106）と同一の一次構造を有することを示した。加えて、この分析により、ｒＰＳ５が７０％を超えるＮ−およびＯ−アセチル化度を有することを直接示すことができる。８型多糖について、ＮＭＲ試験管に直接加えたＮａＯＤを使用する抗原の脱Ｏ−アセチル化後に行った同分析は、Ｎ−およびＯ−アセチル化度が７０％を超えることを示した。ｒＰＳ５およびｒＰＳ８については、黄色ブドウ球菌から生じ得るグリコシド性質の未確認のまたは確認された不純物（例えば、ペプチドグリカン、テイコ酸、リポテイコ酸、および抗原３３６）がＮＭＲ分析によって検出された。それぞれＣＹＬ７７０株およびＣＹＬ１８９２株から精製されたｒＰＳ８およびｒＰＳ５のＮＭＲスペクトルを図５および６に示す。
【０１１３】
オンライン検出器として光散乱検出器、粘度計および屈折計を使用して、立体排除高速クロマトグラフィー処理を行った。この分析により、それぞれ２５０ｋＤａおよび１５０ｋＤａのｒＰＳ８およびｒＰＳ５の平均分子量を評価することができた。これらの分子量値は、同一培養条件下にて同一培地で培養し、細胞ペレットから精製した黄色ブドウ球菌Ｂｅｃｋｅｒ株（８型）またはＲｅｙｎｏｌｄｓ株（５型）から精製した莢膜多糖のものよりも高い（それぞれ１５０ｋＤａおよび５０ｋＤａの推定された平均分子量）。
【０１１４】
実施例３  化学的に脱莢膜した微生物上に吸着した抗ＣＹＬ７７０ポリクローナル血清の調製および種々の黄色ブドウ球菌８型株に対するその交差反応性の評価
誘導培地Ｍ１において組換え８型株ＣＹＬ７７０の培養物を調製した。この培養物由来の微生物をホルマリン処理して、文献（Karakawa et al., 1985 J Clin Microbiol 22: 445-447）に記載される原理に従ってウサギにおける免疫化プロトコルに使用した。得られた過免疫血清は、８型莢膜多糖に対して特異的な抗体を含有するが、種々の株間で共通し得る他のエピトープに対する抗体も含有する。したがって、この血清を、化学的に脱莢膜させられた自家株の１０11ＣＦＵを含有するペレット上に数回吸着させて、８型莢膜多糖に対して特異的ではない抗体を除去した。このようにして得られた試薬を、誘導培地Ｍ１における組換えＣＹＬ７７０株の培養物由来の微生物についてプロテインＡを介する抗体の非特異的結合を回避するためにトリプシン処理された全微生物上での凝集技術によって評価した。次いで、様々なレベルの莢膜多糖誘導を有する固体および液体培養物由来の８型野生株（ＢｅｃｋｅｒおよびＷｒｉｇｈｔ）のトリプシン処理した全微生物について同条件下で抗ＣＹＬ７７０血清を試験した。
【０１１５】
免疫化についてＣＹＬ７７０微生物の調製
液体誘導培地Ｍ０（９ｍｌ）にＣＹＬ７７０凍結材料Ａのアンプル（１ｍｌ）を接種することによりエルレンマイヤーフラスコ中にて前培養物を調製する。前培養物を×１００振盪しながら３７℃で１８時間〜２０時間置く。次いで、ＣＹＬ７７０株を、液体誘導Ｍ０中にて調製した前培養物を使用してＯＤ680nm＝０.２で接種することにより、エルレンマイヤーフラスコ中のＭ１（１００ｍｌ）中にて培養する。次いで、エルレンマイヤーフラスコを×１００振盪しながら３７℃で４８時間置く。次いで、培養物を遠心分離し、ペレットをＰＢＳ ２０ｍｌに溶解し（貯蔵溶液）、ＯＤ680nmを測定する。
【０１１６】
形成前に計数を行うために、一定量の貯蔵溶液を取り出す。２４ウェルプレートにてＣＹＬ７７０貯蔵溶液の試料から１０-1〜１０-9の１０倍希釈液を調製する。各希釈液２５μｌの６滴をＣｏｌｕｍｂｉａ寒天２％ＮａＣｌ上に接種し、３７℃で１８時間〜２０時間インキュベートする。ＣＦＵの計数が可能な希釈液でＣＦＵを計数し、下記式に従ってＣＦＵ／ｍｌの数（Ｘ）を決定する：Ｘ＝(１滴あたりのＣＦＵの平均値×４０)／希釈度。等量ＯＤ／ＣＦＵ（Ｙ）の決定は以下のとおり行われる：ＯＤ680nm＝１について、Ｙ＝(Ｘ／ＯＤ680nm貯蔵溶液)。
【０１１７】
Karakawa et al., 1985 J Clin Microbiol 22: 445-447に記載されているプロトコルに従って、ＣＹＬ７７０貯蔵溶液をＰＢＳ−３％ホルマリンで希釈してＯＤ680nm＝１.２の懸濁液８０ｍｌを得ることによってホルマリン固定を１５分間行う。１５時間処理した後、ＴＳＢ ９ｍｌ中に接種して振盪（×１００）しながら３７℃で１８〜２０時間置いたホルマリン処理懸濁液１ｍｌを増幅させ、次いで、死亡率試験のためにＣｏｌｕｍｂｉａ寒天２％ＮａＣｌ上に増幅した培養物１５０μｌを一層として広げることにより接種し、３７℃で１８〜２０時間インキュベートすることによって、死亡率試験を行う。
【０１１８】
次いで、ホルマリン処理した微生物を、ホルマリン除去のために１×濃リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、ｐＨ７で３回連続洗浄し、＋４℃にて３５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し（２×４０ｍｌ）、２×４０ｍｌで洗浄し、＋４℃にて３５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、２×３０ｍｌで洗浄し、＋４℃にて３５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、２×２０ｍｌで洗浄し（プール）、＋４℃にて３５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、該微生物をＰＢＳに溶解する。このようにして処理した微生物懸濁液を＋４℃で貯蔵することができる。
【０１１９】
ホルマリン処理した微生物を調整し、５ｍｌ滅菌フラスコ中に４ｍｌを分注する。ホルマリン処理した微生物の懸濁液の調整は、所望の微生物濃度と同等のＯＤ680nm値に関して行う：
６×１０7ＣＦＵ／ｍｌで２×４ｍｌ（注射ｄ2＋ｄ4）
１.２×１０8ＣＦＵ／ｍｌで４×４ｍｌ（注射ｄ0＋ｄ7＋ｄ9＋ｄ11）
１.８×１０8ＣＦＵ／ｍｌで３×４ｍｌ（注射ｄ14＋ｄ16＋ｄ18）
２.４×１０8ＣＦＵ／ｍｌで３×４ｍｌ（注射ｄ21＋ｄ23＋ｄ25）
【０１２０】
滅菌状態で栓を差し込み、次いで、ペンチを用いてフラスコに嵌め込んだ。該懸濁液を＋４℃で１週間貯蔵する。
【０１２１】
吸着のための化学的に脱莢膜した微生物の調製
ＣＹＬ７７０株の凍結材料Ａ（１ｍｌ）のアンプルを使用して、Ｃｏｌｕｍｂｉａ培地５０ｍｌの前培養物を接種し、振盪しながら３７℃で１８時間インキュベートする。前培養物を使用して、Ｃｏｌｕｍｂｉａ培地の４００ｍｌの培養物を初期ＯＤ680nm ０.２で接種し、振盪しながら３７℃で２４時間インキュベートする。次いで、培養物を＋４℃にて３５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を除去する。次いで、ペレットをＰＢＳ ８ｍｌに溶解し、ＯＤ測定を行う：ＯＤ680nm＝１７８。
【０１２２】
莢膜多糖を取り出すために微生物に与えるべき化学的処理は、Karakawa et al.（1985 Karakawa et al., 1985 J Clin Microbiol 22: 445-447）に記載されていた。以下の処理を２重に行う：ＯＤ＝１７８の細菌懸濁液４ｍｌを２５０ｍｌのガラス製Ｓｃｈｏｔｔフラスコに移し、０.２Ｍグリシン、０.１４Ｍ ＨＣｌ、ｐＨ２の３０ｍｌを加え、該混合物を正確に１００℃で（水浴）２０分間インキュベートする。懸濁液を５０ｍｌのＦａｌｃｏｎ試験管に移し、＋４℃にて３５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を除去する。ペレットをＰＢＳ ４０ｍｌで３回洗浄する。次いで、ペレットをＰＢＳ ３０ｍｌに溶解してプールし、ＯＤ測定を行って、合計１０11ＣＦＵを有するように試験管１本あたりに分配される容量を決定する。＋４℃にて３５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を除去した後、使用するまで乾燥ペレットを−２０℃で貯蔵する。
【０１２３】
化学的に脱莢膜した微生物上への血清の吸着
吸着プロトコルために抗ＣＹＬ７７０ポリクローナル血清２ｍｌを使用した。１０11ＣＦＵの細菌ペレットにより、血清２ｍｌについて１回の吸着サイクルを行うことができる。合計５回の吸着サイクルを行った；各サイクルは、以下のように構成されていた：化学的に脱莢膜した微生物のペレット上に脱補体抗ＣＹＬ７７０血清２ｍｌを置き、ゆっくりと再懸濁させ、１日中または一夜＋４℃で試験管用回転装置上に置き、＋４℃にて３５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、吸着血清を回収し、化学的に脱莢膜した微生物のさらなるペレット上に血清を置き、該プロトコルを繰り返す。５回目のサイクルの後、吸着血清を回収し、０.２２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ膜で濾過し、次いで、スライドグラス上での凝集アッセイによって評価するまで＋４℃で貯蔵する。
【０１２４】
吸着血清についての凝集アッセイ
種々の固体および液体培地上での黄色ブドウ球菌８型株（Ｂｅｃｋｅｒ、ＷｒｉｇｈｔおよびＣＹＬ７７０）の培養物由来のトリプシン処理微生物について、化学的に脱莢膜した微生物上に吸着した抗ＣＹＬ７７０ポリクローナル血清についてのスライドグラス上での凝集アッセイを行った。黄色ブドウ球菌５型Ｒｅｙｎｏｌｄｓ株のＰＳを誘導しない固体培地中の培養物を対照として試験した。
【０１２５】
トリプシン処理微生物を調製するために、寒天固体誘導培地Ｍ０（８型株について）およびＣｏｌｕｍｂｉａ培地２％ＮａＣｌ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ株について）中の培養物を以下の方法で調製した：Ｂｅｃｋｅｒ株、Ｗｒｉｇｈｔ株およびＲｅｙｎｏｌｄｓ株の凍結材料１００μｌにＰＢＳ ９００μｌを加え、ペトリ皿上に細菌懸濁液１５０μｌを一層として広げ、３７℃（Ｂｅｃｋｅｒ株については３７℃＋５％ＣＯ2）で１８時間インキュベートする。次いで、層をＰＢＳに溶解し、懸濁液をＯＤ680nm＝５に調整する。
【０１２６】
ＢｅｃｋｅｒおよびＷｒｉｇｈｔ ８型株については、ＴＳＢ培地および寒天誘導Ｍ０中の固体前培養物からそれぞれＴＳＢ培地および培地Ｍ１中の液体培養物５０ｍｌを調製した。固体培養物が上記のように凍結材料から直接接種された。固体培養物の層をＰＢＳに再懸濁し、初期ＯＤ680nm ０.２の液体培養物を接種するために使用した。
【０１２７】
組換えＣＹＬ７７０株については、培地Ｍ１中５０ｍｌの液体培養物を調製した。液体誘導培地Ｍ０中の前培養物１０ｍｌが凍結材料１ｍｌを用いて直接接種された。振盪しながら３７℃で１８時間インキュベートした後、培養培地Ｍ１が液体前培養物を使用して初期ＯＤ680nm ０.２で接種された。液体培養物を振盪しながら３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間培養した後、ＯＤ680nmを測定し、培養物を＋４℃にて３５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。ペレットを、懸濁液をＯＤ680nm＝５に調整するのに必要な量のＰＢＳに溶解した。
【０１２８】
ＯＤ680nm＝５に調整した固体および液体培養物由来細菌懸濁液をトリプシンで処理して、いずれもの邪魔な微量のプロテインＡを除去する。これに関して、細菌懸濁液のアリコート５ｍｌに５０ｍｇ／ｍｌのトリプシン１００μｌを加え、該混合物を回転装置上で３７℃にて１時間インキュベートし、次いで、＋４℃にて３５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。該ペレットをＰＢＳ ５ｍｌで３回洗浄し、懸濁液をＯＤ680nm＝５に調整するのに必要な量のＰＢＳに溶解した。該懸濁液は、使用するまで＋４℃で貯蔵される。
【０１２９】
ＯＤ680nm＝５の新鮮なトリプシン処理微生物５０μｌを用いて凝集アッセイを行った。該微生物をスライドグラス上に広げて、凝集することが意図される境界を定めたガラスの輪の外側に広がることなくその輪を完全に覆った。微生物対照は、まず、微生物の懸濁液５０μｌを用いて調製され、その上にＰＢＳ ５μｌを置く。対照は、５分間接触させた後の凝集の不在下で立証される。化学的に脱莢膜した微生物上に吸着した抗ＣＹＬ７７０ポリクローナル血清５μｌを凝集アッセイに使用した。３つのウェルにおいてスライドグラス上に血清を置いた後、該スライドグラスをＫａｈｎミラー（凹面鏡）上で手動により円運動で揺り動かした。この工程は、第１のウェルに血清を加えてから計時した。
【０１３０】
結果
培地Ｍ１中にてＣＹＬ７７０株を４８時間培養し、次いで、ホルマリンで固定する。直接死亡率および増幅後の死亡率を立証する。次いで、懸濁液を所望の濃度（表２）に調整し、滅菌フラスコ中に分配する。次いで、該フラスコに栓をし、文献（Karakawa et al., 1985 J Clin Microbiol 22: 445-447）に記載されているプロトコルに従って免疫化に使用する。
【０１３１】
【表２】
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【０１３２】
製造するとすぐに、血清を化学的に脱莢膜した自家微生物上に吸着させ、次いで、スライドグラス上での凝集により８型株に対して評価する（表３）。
【０１３３】
【表３】
2009531398.tif 000004
【０１３４】
凝集アッセイは、以下の方法読み取られた：
＋＋＋＋    ０〜３０秒で完全な凝集が観察された
＋＋＋      ３０秒〜１分で完全な凝集が観察された
＋＋        １〜３分で完全な凝集が観察された
＋          ３〜５分で完全な凝集が観察された
＋／−      非常に遅く、１０分で完全な凝集が観察された
−          凝集は観察されなかった
【０１３５】
吸着抗ＣＹＬ７７０血清についてＢｅｃｋｅｒ株（ＴＳＢ培地における場合を除く）、Ｗｒｉｇｈｔ株およびＣＹＬ７７０株の凝集が観察される。さらにまた、この血清は、Ｃｏｌｕｍｂｉａ寒天２％ＮａＣｌ参照培地中で培養した対照Ｒｅｙｎｏｌｄｓ微生物（５型）およびＰＳ８を誘導しないＴＳＢ培地中で培養したＢｅｃｋｅｒ微生物を凝集させず、したがって、その特異性を立証する。
【０１３６】
吸着抗ＣＹＬ７７０血清は、微生物が８型莢膜を担持している場合には該微生物をさらに急速に凝集する。抗ＰＳ８モノクローナル抗体（Ｍａｂ−ＰＳ８）について同凝集プロフィールが観察される。
【０１３７】
したがって、吸着抗ＣＹＬ７７０血清は、試験した３つの株が莢膜誘導条件下に置かれている場合にはこれらの株に関する認識の差異を示さなかった。該凝集は莢膜抗原の存在に関係しているので、これらの種々の株によって産生される８型莢膜多糖間の差異は注目されるべきではない。
【０１３８】
したがって、このようにして製造された吸着抗ＣＹＬ７７０血清は、８型莢膜を示している野生型微生物に対する交差反応性を可能にすると考えられる。
【０１３９】
実施例４：  ＣＹＬ７７０株を使用するウサギにおける抗ＰＳ８ポリクローナル抗体の発生
ＣＹＬ７７０株によって生産されるＰＳ８の性質を特徴付けるために、基礎としてKarakawaおよび研究仲間によって以前に記載されたプロトコル（Karakawa et al., 1985; J. Clin. Microbiol., 22: 445-447）を使用して、培地Ｍ１中で培養されたＣＹＬ７７０株の不活化全微生物でウサギを免疫化することによって抗ＰＳ８ポリクローナル抗体を生じさせた。
【０１４０】
免疫化プロトコル
注射：  体重２.５ｋｇの雌性ニュージーランド白ウサギ（ESD - Charles River Laboratories、フランス国St Germain-sur-l'Arbresle）３羽に、培地Ｍ１中にて培養したＣＹＬ７７０株の不活化全微生物を様々な濃度で４週間、週３回注射し、ＰＢＳに対して透析する。最初の注射（Ｄ０）は、敗血症性ショックを回避するように上肢帯にて皮下に施す。その後の注射は全て、耳の辺縁静脈において静脈内に施す。各注射に使用される濃度および容量を以下に記載する。
【０１４１】
【表４】
2009531398.tif 000005
【０１４２】
免疫前動物からの血液試料：  １回目の免疫化（Ｄ−１）の前に、キシロカインで局所麻酔した各ウサギについて耳の正中動脈から血液５〜１０ｍｌをＶａｃｕｔａｉｎｅｒTM試験管に回収した。該試料を周囲温度（２０〜２２℃）で３時間〜４時間滲出させ、１５００ｇで４℃にて２０分間遠心分離する。
【０１４３】
全採血により採取された血液試料：  １回目の注射の２８日後、全身麻酔下で心臓穿刺により全ての動物から試料を採取する。動物１匹あたり血液５０ｍｌ〜８０ｍｌを採取し、５０ｍｌの滅菌ＦａｌｃｏｎTM試験管に回収する。
使用するまで全ての血清を−２０℃で保存する。
【０１４４】
【表５】
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【０１４５】
抗ＰＳ８抗体応答の分析
ＥＬＩＳＡアッセイによってポリクローナルウサギ血清をＰＳ８に対する特異性について評価する。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（平底マイクロプレート；Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｐ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ；Nunc；デンマーク国Roskilde）を、１×ＰＢＳ、ｐＨ７.２（１００μｌ／ウェル）中の１μｇ／ｍｌの精製ＰＳ８の存在下、周囲温度（２０〜２２℃）で一夜インキュベートする。該プレートを、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｍ９６Ｖ自動プレート洗浄器を使用してウェルあたり３００μｌのＰＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で４回洗浄し、次いで、２５０μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ／１％ＢＳＡを用いて３７℃で１時間飽和させる。次いで、該プレートを上記方法に従って４回洗浄する。プレート上に種々の濃度の被験血清の各々をウェルあたり１００μｌ置く；マルチチャネルピペットを用いて、プレート内にてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ／１％ＢＳＡで連続３倍希釈液を調製する（カラム希釈）。プレートを３７℃で１時間３０分インキュベートし、次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄する。
【０１４６】
ＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ結合体（BirminghamのSouthern Biochemicals Inc.）をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ／１％ＢＳＡで１２０００分の１に希釈し、ウェルあたり１００μｌの結合体溶液を加える。該プレートを３７℃で１時間３０分インキュベートし、次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄する。可視化のために、ウェルあたり１００μｌの即時使用可能なＴＭＢ基質溶液（ＴＥＢＵ Bio-laboratories）を加え、該プレートを暗所にて周囲温度（２０〜２２℃）で１５分間インキュベートする。ウェルあたり１００μｌの１Ｍ Ｈ3ＰＯ4を加えることによって、ペルオキシダーゼによる酵素反応を停止させる。各ウェルの光学密度（ＯＤ）を、自動プレートリーダー（Ｖｅｒｓａｍａｘ）を使用して４５０ｎｍで測定する。ＯＤ測定値からバックグラウンドノイズ（４つのブランクウェルについての平均値）を差し引く。
【０１４７】
ポリクローナル抗体の特異的抗ＰＳ８力価は、参照血清と比べて、４５０ｎｍで２つのウェルについて観察された希釈度の逆数の相加平均に対応する。
【０１４８】
【表６】
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【０１４９】
実施例５：  結合体の製造
５．１  −  ８型結合体の製造（ＳＴＡＰＨ８−ｒＥＰＡ）
ＣＹＬ７７０株から精製した８型多糖の脱重合
結合前に、米国特許第６,０４５,８０５号に記載された原理に従って、ＣＹＬ７７０株から精製したｒＰＳ８抗原を脱重合する。ｒＰＳ８抗原を２ｍｇ／ｍｌで調製する。周囲温度で、この溶液２０ｍｌに２００ｍＭアスコルビン酸１１０μｌ、２０ｍＭ ＣｕＳＯ4 １１μｌおよび２０ｍＭ ＦｅＳＯ4 １１μｌを加える。周囲温度で８０分間撹拌しながら該反応を続ける。ｐＨ７.０の２Ｍ ＴＲＩＳ溶液２ｍｌを加えることによって脱重合反応を停止させる。水に対して透析することにより脱重合反応物を取り出し、次いで、該脱重合ｒＰＳ８を凍結乾燥させる。ＨＰＳＥＣ／ＬＳ／ＲＩ／Ｖｉｓｃ分析により、脱重合ｒＰＳ８の平均分子量は、５０ｋＤａ付近であると見積もられた。
【０１５０】
抗原活性化
抗原（ＣＹＬ７７０株から精製した多糖について脱重合された）４０ｍｇを８ｍｌの２００ｍＭ ＮａＣｌおよび１２５ｍＭアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）に溶解した。ｐＨを４.９に調整し、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＡＣ）を最終濃度２５ｍＭで加える。周囲温度で９０分間続いた活性化の進行の間、希ＨＣｌ溶液を加えることによってｐＨを常に４.９に調整する。ｐＨの中和により反応を停止させる。次いで、活性抗原を５００ｍＭ ＮａＣｌに対して透析し、次いで、水に対して透析する。次いで、活性化および透析した抗原を凍結乾燥させる。機能化パーセンテージは、Ｂｅｃｋｅｒ株から精製した多糖およびＣＹＬ７７０株から精製および脱重合した多糖についてそれぞれ３.７および４.３（ｗ／ｗ）であると見積もられた。
【０１５１】
抗原結合
１００ｍＭ ＮａＣｌおよび５０ｍＭ ＥＤＡＣ中に活性抗原（ＣＹＬ７７０株から精製された抗原について脱重合された）２０ｍｇおよびキャリアータンパク質（組換えエキソプロテインＡΔ５５３、すなわち、ｒＥＰＡ）１０または２０ｍｇを含有する１０ｍｌの溶液を調製した。４℃で９０分間続いた結合の進行の間、希ＨＣｌ溶液を加えることによってｐＨを常に５.６に調整する。反応の終わりに、ｐＨを中和する。次いで、結合抗原を２００ｍＭ ＮａＣｌに対して透析し、次いで、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７.２中の２００ｍＭ ＮａＣｌで平衡させたＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｃｌ−４Ｂカラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製する。結合体を含有しており（２１０ｎｍおよび２８０ｎｍでの光吸収によって検出される）、主にカラムのデッドボリュームで溶離されるフラクションを合わせた。
【０１５２】
結合抗原の特徴付け
精製後、結合した多糖およびタンパク質の量は、多糖（Ｈｅｓｔｒｉｎの方法（Hestrin S. 1949. J. Biol. Chem. 180: 249-261）に従ってＯ−アセチルの定量化により測定された）対タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Anal. Biochem. 1976 72, 248-254）に従ってタンパク質の定量化により測定された）の重量比として見積もられた。非結合抗原および遊離キャリアータンパク質のレベルは、キャピラリー電気泳動法により測定された。結合体のサイズは、ＨＰＳＥＣ／ＬＳ／ＲＩ／Ｖｉｓｃにより見積もられた。
【０１５３】
５．２  −  ５型結合体（ＳＴＡＰＨ５−ｒＥＰＡ）の製造
ＣＹＬ１８９２株から精製した５型多糖の脱重合
結合前に、米国特許第６,０４５,８０５号に記載された原理に従って、ＣＹＬ１８９２株から精製したｒＰＳ５抗原を脱重合する。ｒＰＳ５抗原を２ｍｇ／ｍｌで調製する。周囲温度で、この溶液２０ｍｌに２００ｍＭアスコルビン酸５５μｌ、２０ｍＭ ＣｕＳＯ4 ５.５μｌおよび２０ｍＭ ＦｅＳＯ4 ５.５μｌを加える。周囲温度で８０分間撹拌しながら該反応を続ける。ｐＨ７.０の２Ｍ ＴＲＩＳ溶液２ｍｌを加えることによって脱重合反応を停止させる。水に対して透析することにより脱重合反応物を取り出し、次いで、該脱重合ｒＰＳ５を凍結乾燥させる。ＨＰＳＥＣ／ＬＳ／ＲＩ／Ｖｉｓｃ分析により、脱重合ｒＰＳ５の平均分子量は、５０ｋＤａ付近であると見積もられた。
【０１５４】
抗原活性化
抗原（ＣＹＬ１８９２株から精製された多糖について脱重合された）４０ｍｇを８ｍｌの２００ｍＭ ＮａＣｌおよび５０ｍＭアジピン酸ジヒドラジト（ＡＤＨ）に溶解した。ｐＨを４.９に調整し、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＡＣ）を最終濃度１０ｍＭで加える。周囲温度で４５分間続いた活性化の進行の間、希ＨＣｌ溶液を加えることによってｐＨを常に４.９に調整する。ｐＨの中和により反応を停止させる。次いで、活性抗原を５００ｍＭ ＮａＣｌに対して透析し、次いで、水に対して透析する。次いで、活性化および透析した抗原を凍結乾燥させる。機能化パーセンテージは、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ株から精製した多糖およびＣＹＬ１８９２株から精製および脱重合した多糖についてそれぞれ１.２５および０.９（ｗ／ｗ）であると見積もられた。
【０１５５】
抗原結合
１００ｍＭ ＮａＣｌおよび５０ｍＭ ＥＤＡＣ中に活性抗原（ＣＹＬ１８９２株から精製された抗原について脱重合された）２０ｍｇおよびキャリアータンパク質（組換えエキソプロテインＡ、ｒＥＰＡ）４０ｍｇを含有する１０ｍｌの溶液を調製した。４℃で９０分間続いた結合の進行の間、希ＨＣｌ溶液を加えることによってｐＨを常に５.６に調整する。反応の終わりにｐＨを中和する。次いで、結合抗原を２００ｍＭ ＮａＣｌに対して透析し、次いで、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７.２中の２００ｍＭ ＮａＣｌで平衡させたＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｃｌ−４Ｂカラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製する。結合体を含有しており（２１０ｎｍおよび２８０ｎｍで光吸収により検出される）、主にカラムのデッドボリュームで溶離されるフラクションを合わせた。
【０１５６】
結合抗原の特徴付け
精製後、結合した多糖およびタンパク質の量は、多糖（Ｈｅｓｔｒｉｎの方法（Hestrin S. 1949. J. Biol. Chem. 180: 249-261）に従ってＯ−アセチルの定量化により測定された）対タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Anal. Biochem. 1976 72, 248-254）に従ってタンパク質の定量化により測定された）の重量比として見積もられた。非結合抗原および遊離キャリアータンパク質のレベルは、キャピラリー電気泳動法により測定された。結合体のサイズは、ＨＰＳＥＣ／ＬＳ／ＲＩ／Ｖｉｓｃにより見積もられた。
【０１５７】
実施例６：  マウスにおける８型結合体（ＰＳ Ｔ８−ｒＥＰＡ）の免疫原性の評価
Ｂｅｃｋｅｒ８型株から精製したＰＳ８を使用するＰＳ Ｔ８−ｒＥＰＡ結合体の種々のバッチが本発明者らによって得られた。これらの８型結合体の免疫原性は、抗ＰＳ８体液性応答（ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＧのサブクラス）のＥＬＩＳＡ分析により、種々の近交系または非近交系マウス系において立証することができた。用量−効果実験もまたこの種の動物モデルについて行われた。
【０１５８】
組換えＣＹＬ７７０株から精製したＰＳ８を使用して得られたｒＰＳｆＴ８−ｒＥＰＡ結合体によって誘導される免疫原性を立証するために、Ｂｅｃｋｅｒ原（野生型株）を有する８型結合体について完成されたものと同様の種類の動物試験および免疫学的分析が開発され、設定された。
【０１５９】
免疫化プロトコル
注射：  体重２０〜２２ｇの雌性ＯＦ１マウス（非近交系）（ESD - Charles River Laboratories、フランス国St Germain-sur-l'Arbresle）に、培地Ｍ１中にて培養したＣＹＬ７７０株に由来するＰＳ８を用いて得られた種々の濃度のＰＳ Ｔ８−ｒＥＰＡ結合体を、Ｄ０（感作）、次いで、１回目の注射の３週間後（Ｄ２１）に、上肢帯にて皮下注射する。各注射に使用される濃度および容量を以下に記載する。
【０１６０】
【表７】
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【０１６１】
Ｐｒｏｔ／ＰＳは、精製後の最終比率を表す。それは、精製ＰＳ８多糖の割合に対する組換えタンパク質の割合を重量／重量として示す。
【０１６２】
中間血液試料：  感作（初回刺激）（Ｄ０）前、次いで、Ｄ２１の各マウスの増幅（追加免疫）前に、免疫前動物において後眼窩洞から血液を約５００μｌ採取し、ＶａｃｕｔａｉｎｅｒTM試験管に回収する。中間試料の採取において、８ｍｇ／ｍｌのケタミンおよび１.６ｍｇ／ｍｌのキシラジンの混合物の０.２ｍｌ／マウスの腹腔内注射によりマウスを麻酔する。
【０１６３】
全採血により採取された最終血液試料：  増幅から１５日後のＤ３５に全身麻酔下で全ての動物から全採血する。動物１匹あたり血液１ｍｌ〜１.５ｍｌを採取し、ＶａｃｕｔａｉｎｅｒTM試験管に回収する。
【０１６４】
血液試料を凝固させ、周囲温度（２０〜２２℃）で３時間滲出させ、次いで、６０００ｇで４℃にて３分間遠心分離し、次いで、Ｎｕｎｃ １ｍｌコニカル試験管中に移し、使用するまで血清を−２０℃で保存する。
【０１６５】
抗体応答の分析
吸着（「コーティング」）のために抗原としてＢｅｃｋｅｒ Ｔ８株から精製した特徴付けられたＰＳ８を１.５μｇ／ｍｌの濃度で使用してＥＬＩＳＡアッセイによって抗ＰＳ８体液性応答（アッセイ内で決定された免疫化用量についての、Ｄ０、Ｄ２１およびＤ３５での抗ＰＳ８ ＩｇＧおよびＩｇＭ力価、ならびにＤ０およびＤ３５での抗ＰＳ８ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３力価）を評価する。
【０１６６】
「野生型」株から精製したｗｔＰＳ８に対してｒＰＳｆＴ８−ｒＥＰＡ結合体（原ＣＹＬ７７０）によって生じる抗体応答を評価するために、組換えＳＹＬ７７０株から精製したものではなくてＢｅｃｋｅｒ株から精製したＰＳ８が吸着のために選ばれた。ＰＳ８特異的血清の全てを以下の方法に従って自動ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｚｙｍａｒｋロボット）によって分析する。
【０１６７】
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｍ１２９Ｂ、Dynex）を、１×ＰＢＳ、ｐＨ７.２（１００μｌ／ウェル）中のＢｅｃｋｅｒ株から精製したＰＳ８の１μｇ／ｍｌの存在下、周囲温度（２０〜２２℃）で一夜インキュベートする。該プレートを、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｍ９６Ｖ自動プレート洗浄器を使用してウェルあたり３００μｌのＰＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で４回洗浄し、次いで、２５０μｌ／ウェルのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／１％ＢＳＡを用いて３７℃で１時間飽和させる。プレートを上記方法に従って４回洗浄する。プレート上に種々の濃度の被験血清の各々をウェルあたり１００μｌ置く。プレート内にてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ／１％ＢＳＡで連続２倍希釈液を調製する（オンライン希釈）。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄する。
【０１６８】
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ／１％ＢＳＡでＩｇのクラスに従って適当な濃度に希釈した抗マウスＩｇ結合体をウェルあたり１００μｌ加え、該プレートを３７℃で１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄する。可視化のために、ウェルあたりＴＭＢ溶液１００μｌを加え、該プレートを暗所にて周囲温度（２０〜２２℃）で２０分間インキュベートする。ウェルあたり１００μｌの１Ｎ ＨＣｌを加えることによりペルオキシターゼによる酵素反応を停止させる。各ウェルの光学密度（ＯＤ）を、自動プレートリーダー（Labsystem）を使用して４５０ｎｍ〜６３０ｎｍで測定する。ＯＤ測定値からバックグラウンドノイズ（４つのブランクウェルについての平均値）を差し引く。
【０１６９】
各プレート上に存在する標準血清によって得られる基準曲線と比べて値が０.２〜３の範囲であるＯＤについてＣｏｄＵｎｉｔソフトウェアを使用して抗ＰＳ８力価を算出する。任意のＥＬＩＳＡ単位で表されるこの標準のＩｇ力価は、いくつかの測定値の累積について予め決定され、ＯＤ450nm＝１についての希釈度の逆数の相加平均に対応する。このＥＬＩＳＡの検出閾値は、１０ＥＬＩＳＡ単位（１ｌｏｇ10）で評価される。各血清の力価はｌｏｇ10で表される。
【０１７０】
結果
抗ＰＳ８ ＩｇＭ力価
図２に示される結果は、免疫前動物の全てにおいて有意であるが非特異的な抗ＰＳ８応答が観察されることを示している（２Ｌｏｇよりも大きい力価）。感作後（Ｄ２１）、４つの結合体グループについて特異的な抗ＰＳ８ ＩｇＭ応答の著しい増大が見られ（約＋２Ｌｏｇ）、これら４つのグループの間で差異はない。非結合ＰＳ８を投与されたグループについては、グループＡ（Ｂｅｃｋｅｒ ＰＳ８＋ｒＥＰＡ、非結合）について約１Ｌｏｇ、グループＧ（ＣＹＬ７７０からの天然ＰＳ８＋ｒＥＰＡ、非結合）について約１.５Ｌｏｇの抗ＰＳ８ ＩｇＭ力価の著しい増加が見られる。グループＢ（ＣＹＬ７７０からの分画されたＰＳ８＋ｒＥＰＡ、非結合）については、抗ＰＳ８ ＩｇＭ力価の増大は見られない。Ｄ３５には、考慮されるグループに関わらずＩｇＭ応答の有意な増幅効果はない。
【０１７１】
抗ＰＳ８総ＩｇＧ力価
図３に示される結果は、免疫前動物において非特異的抗ＰＳ８ ＩｇＧ応答が全くまたはあまり観察されないことを示している（＜１.３Ｌｏｇ）。
【０１７２】
感作後（Ｄ２１）、４つの結合体グループについて非常に強い特異的抗ＰＳ８ ＩｇＧ応答が見られ（＞＋２.３Ｌｏｇ）、応答平均は３.５Ｌｏｇ〜４.１Ｌｏｇである。感作後の４つの結合体グループの間に差異は見られない。この抗ＰＳ８応答は、非結合ＰＳを注射したグループにおいて得られたものよりも明らかに大きい。しかしながら、グループＡ（Ｂｅｃｋｅｒ ＰＳ８＋ｒＥＰＡ、非結合）およびグループＧ（ＣＹＬ７７０からの天然ＰＳ８＋ｒＥＰＡ、非結合）について約１Ｌｏｇの、Ｄ２１の抗ＰＳ８ ＩｇＧ力価の増加が注目され得る。グループＢ（ＣＹＬ７７０からの分画されたＰＳ８＋ｒＥＰＡ、非結合）について抗ＰＳ８ ＩｇＧ力価の増加は見られない。
【０１７３】
Ｄ３５では、考慮されるグループに関わらず、４つの結合体グループについてのみ有意な増幅効果が見られる（＞＋０.６Ｌｏｇ）。抗ＰＳ８応答平均は、４.１Ｌｏｇ〜４.９Ｌｏｇである。応答平均を考慮した場合、Ｂｅｃｋｅｒに由来する結合体とＣＹＬ７７０に由来する結合体との間に有意な差異はない。しかしながら、Ｂｅｃｋｅｒ野生型株から精製したＰＳ８について評価される、ＣＹＬ７７０株に由来する結合体を用いて得られた抗ＰＳ８応答は、同一グループ内でより均一であると考えられる。
【０１７４】
Ｄ３５で測定された抗ＰＳ８ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇ３サブクラスの力価
図４は、免疫前動物においては非特異的抗ＰＳ８応答が観察されないことを示している（＜１.２Ｌｏｇ）。
【０１７５】
ＩｇＧ１について、４つの結合体グループについては非常に強い特異的抗ＰＳ８応答が観察されるが、一方、種々のタイプの非結合多糖を投与された３つのグループについては応答が検出されない。Ｂｅｃｋｅｒ結合体とＣＹＬ７７０結合体との間の応答平均に有意な差異はないが、２つのＣＹＬ７７０結合体を用いて得られた応答は同一グループ内でより均一であると考えられる。
【０１７６】
ＩｇＧ２ａについて、４つの結合体グループについては応答はわずかしか増大しないが（２.５Ｌｏｇ〜２.８Ｌｏｇ）、非結合ＰＳで免疫されたグループを用いて得られた応答に比べると有意である。
【０１７７】
ＩｇＧ３について、４つの結合体バッチについて、ＩｇＧ２ａ応答に比べて著しいＩｇＧ３応答が見られる。種々の結合体間で有意な差異は見られない。非結合ＰＳを投与されたグループは、いかなる抗ＰＳ８ ＩｇＧ３応答も示さない。
【０１７８】
これらの結果は、Ｂｅｃｋｅｒ「野生型」株または組換えＣＹＬ７７０株に由来する精製ＰＳ８から得られたＰＳ８−ｒＥＰＡ結合体が、単独で注射された精製多糖と比べて、ＯＦ１マウスモデルにおいて強い特異的抗ＰＳ８抗体応答を誘導することを示している。これら４つの結合体バッチについては有意な増幅効果も見られる。この応答は、Ｂｅｃｋｅｒ「野生型」株から精製したＰＳ８について評価される。抗体応答平均の観点から、ＰＳ８の起源に関わらず、種々の結合体バッチ間で有意な差異は見られない。しかしながら、ＣＹＬ７７０に由来する結合体を用いて得られる抗ＰＳ８総ＩｇＧおよびＩｇＧ１応答は、同一グループ内でより均一であると考えられる。
【０１７９】
実施例７：  マウスにおける５型結合体（ＰＳ Ｔ５−ｒＥＰＡ）の免疫原性の評価
Ｒｅｙｎｏｌｄｓ５型株から精製したＰＳ５または組換え黄色ブドウ球菌株ＣＹＬ１８９２から精製したｒＰＳ５を用いて、種々のＰＳ Ｔ５−ｒＥＰＡ結合体バッチを得た。
【０１８０】
これらの５型結合体の免疫原性は、マウスにおいて抗ＰＳ５抗体応答のＥＬＩＳＡ分析（ＩｇＭおよび総ＩｇＧ）によって立証することができた。誘導された特異的抗体応答と比較するために、各結合体は、２.５μｇ／マウス／注射の至適免疫化用量（上記用量−効果実験で定義した）で注射された。
【０１８１】
免疫化プロトコル
注射：  体重２０〜２２ｇの雌性ＯＦ１（非近交系）マウス（ESD - Charles River Laboratories、フランス国St Germain-sur-l'Arbresle）に、培地Ｍ１にて培養したＲｅｙｎｏｌｄｓ株に由来する精製ＰＳ５またはＣＹＬ１８９２株に由来する精製ｒＰＳ５ｆから得られるＰＳ Ｔ５−ｒＥＰＡ結合体の２.５μｇ／マウス／注射を、Ｄ０（感作）、次いで、この１回目の注射の３週間後（Ｄ２１）に、上肢帯にて皮下注射した。
【０１８２】
【表８】
2009531398.tif 000009
【０１８３】
【表９】
2009531398.tif 000010
【０１８４】
中間血液試料：  ：後眼窩洞から血液を約２００μｌ採取し、ＶａｃｕｔａｉｎｅｒTM試験管に回収した。これらの試料は、感作前の免疫前動物からＤ０に、そして、個々のマウスについての「追加免疫」の前のＤ２１に採取された。中間試料の採取において、８ｍｇ／ｍｌのケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎｅ）および１.６ｍｇ／ｍｌのキシラジン（Ｒｏｕｍｐｕｎ）の混合物０.２ｍｌ／マウスの腹腔内注射によりマウスを麻酔した。
【０１８５】
全採血により採取された最終血液試料：  追加免疫の日から１５日後のＤ３５に全身麻酔下で全ての動物から頚部切開により全採血する。動物１匹あたり血液１ｍｌ〜１.５ｍｌを採取し、ＶａｃｕｔａｉｎｅｒTM試験管に回収した。
【０１８６】
血液試料を凝固させ、２０〜２２℃で３時間滲出させ、次いで、６０００ｇで３分間遠心分離し、次いで、Ｎｕｎｃ １ｍｌコニカル試験管中に移す。血清は、使用するまで−２０℃で保存する。
【０１８７】
抗体応答の分析
吸着（「コーティング」）のための抗原としてＲｅｙｎｏｌｄｓ５型株から精製したｓＰＳ５を１μｇ／ｍｌの濃度で使用して自動ＥＬＩＳＡアッセイによって抗ＰＳ５体液性応答（Ｄ０、Ｄ２１およびＤ３５での抗ＰＳ５ ＩｇＭおよびＩｇＧ力価）を評価する。
【０１８８】
ｒＰＳ５ｆＴ５−ｒＥＰＡ結合体（原ＣＹＬ１８９２）が野生型黄色ブドウ球菌株から精製したｓＰＳ５を特異的に認識する能力を有する抗体応答を誘導することができるかを評価するために、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ株から精製したｓＰＳ５がコーティングのために選ばれた。ＰＳ５特異的血清の全てを以下の方法に従って自動ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｚｙｍａｒｋ自動装置）によって分析する。
【０１８９】
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｍ１２９Ｂ、Dynex）を、１×ＰＢＳ、ｐＨ７.２（１００μｌ／ウェル）中の１μｇ／ｍｌのＲｅｙｎｏｌｄｓ株から精製したｓＰＳ５の存在下、周囲温度（２０〜２２℃）で一夜インキュベートする。該プレートを、自動プレート洗浄器（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｍ９６Ｖ洗浄器）を使用して３００μｌ／ウェルのＰＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で４回洗浄し、次いで、２５０μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ／１％ＢＳＡを用いて３７℃で１時間飽和させる。プレートを上記方法に従って４回洗浄する。ウェルあたり１００μｌの各血清をプレート上に置く。プレート上でＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ／１％ＢＳＡで血清の連続２倍希釈を実行する（オンライン希釈）。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄する。
【０１９０】
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ／１％ＢＳＡでＩｇクラスに従って適当な濃度に希釈した抗マウスＩｇ結合体の１００μｌ／ウェルを加え、該プレートを３７℃で１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄する。可視化のために、ウェルあたり１００μｌのＴＭＢ溶液を加え、該プレートを暗所にて周囲温度（２０〜２２℃）で２０分間インキュベートする。ウェルあたり１００μｌの１Ｎ ＨＣｌを加えることによりペルオキシダーゼによる酵素反応を停止させる。各ウェルの光学密度（ＯＤ）を、自動プレートリーダー（Labsystem）を使用して４５０ｎｍ〜６３０ｎｍで測定する。ＯＤ測定値からバックグラウンドノイズ（４つのブランクウェルについての平均値）を差し引く。
【０１９１】
各プレート上に存在する標準血清によって得られる基準曲線と比べて値が０.２〜３の範囲であるＯＤについてＣｏｄＵｎｉｔソフトウェアを使用して抗ＰＳ５力価を算出する。任意のＥＬＩＳＡ単位で表されるこの標準のＩｇ力価は、いくつかの測定値の累積について予め決定され、ＯＤ450nm＝１についての希釈度の逆数の相加平均に対応する。このＥＬＩＳＡの検出閾値は、１０ＥＬＩＳＡ単位（１ｌｏｇ10）で評価される。各血清の力価はｌｏｇ10で表される。
【０１９２】
結果：  抗ＰＳ５ ＩｇＭ力価
図７（ａ）に示される結果は、免疫前動物の全てにおいて有意であるが非特異的な抗ＰＳ５応答が観察されることを示している（力価の平均値約１.８Ｌｏｇ±０.２Ｌｏｇ）。
【０１９３】
ｒＥＰＡと結合していない精製ＰＳ５またはｒＰＳ５を注射されたマウスは、Ｄ２１（−０.７Ｌｏｇ）およびＤ３５（−１.２Ｌｏｇ）で、結合体を注射したマウスよりも弱い抗ＰＳ５ ＩｇＭ応答を示す。
【０１９４】
Ｄ２１およびＤ３５で４つの結合体について特異的かつ有意な応答が見られ、得られた平均力価値は、それぞれ、３.２Ｌｏｇ±０.２Ｌｏｇおよび４Ｌｏｇ±０.２である。
【０１９５】
Ｄ２１およびＤ３５で抗ＰＳ５ ＩｇＭ応答について種々の結合体間で有意な差異は示されなかった；それらは、したがって、ＰＳ５−ｒＥＰＡ結合体の免疫原性と同様の免疫原性を示す。さらにまた、ｒＰＳ５−ｒＥＰＡ結合体によって誘導されるＩｇＭは、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ株のような５型野生株から精製したＰＳ５を特異的に認識することができる。
【０１９６】
抗ＰＳ５ ＩｇＧ力価
図７（ｂ）に示される結果は、免疫前動物において抗ＰＳ５ ＩｇＧ応答が全く観察されないことを示している（平均力価＜１.３Ｌｏｇ；検出閾値）。
【０１９７】
Ｄ２１に、１つの結合体または他の結合体を注射したマウスのグループについて有意な抗ＰＳ５ ＩｇＧ応答が見られ、評価された平均力価値は、約３.２Ｌｏｇ±０.２Ｌｏｇである。Ｄ３５に、１つの結合体または他の結合体を注射したマウスのグループの全てについて非常に強い「追加免疫」効果が見られ、評価された平均力価値は、約５Ｌｏｇ±０.２Ｌｏｇである。
【０１９８】
さらにまた、Ｄ２１およびＤ３５に、４つの結合体の間で特異的な差異は示されなかった；したがって、ｒＰＳ５−ｒＥＰＡ結合体は、ＰＳ５−ｒＥＰＡ結合体の免疫原性と同様の免疫原性を示す。加えて、ｒＰＳ５−ｒＥＰＡ結合体により誘導されるＩｇＧは、ＰＳ５−ｒＥＰＡ結合体により誘導される特異的ＩｇＧと同様に、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ株のような５型野生株から精製したＰＳ５を特異的に認識することができる。
【０１９９】
初回刺激後および追加免疫後、マウスにおいてｒＰＳ５−ｒＥＰＡ結合体（バッチ１４および１５）で誘導された抗ＰＳ５ ＩｇＭおよびＩｇＧ応答は、ＰＳ５−ｒＥＰＡ結合体（バッチ１１および７）で誘導されるものと非常に類似している。さらにまた、これらの実験は、ｒＰＳ５−ｒＥＰＡ結合体が黄色ブドウ球菌のＲｅｙｎｏｌｄｓ株のような野生型株から精製したＰＳ５を強く認識し、ＰＳ５−ｒＥＰＡ結合体によって誘導される抗ＰＳ５抗体について観察されたものと同様のこの抗原に対する親和性を有する高力価の抗ＰＳ５抗体を誘導することができることを立証することができた。
【図面の簡単な説明】
【０２００】
【図１】図１は、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ株または組換えＣＹＬ１８９２株についてのペレットまたは培養上清中で測定した５型莢膜多糖（ＰＳ５）の量を表す。
【図２】図２は、ＣＹＬ７７０株またはＢｅｃｋｅｒ株から調製したＰＳ Ｔ８−ｒＥＰＡ結合体で免疫化したマウスにおいて誘導された抗ＰＳ８ ＩｇＭ力価を表す。力価の値（ヒストグラム）は、希釈度の逆数の平均値のＬｏｇによって表される。グループの各々について、各血清（ｎ＝１０）の個々の力価が記号で表される。免疫前動物（Ｄ−１）において測定した非特異的応答も表される。
【図３】図３は、ＣＹＬ７７０株またはＢｅｃｋｅｒ株から調製したＰＳ Ｔ８−ｒＥＰＡ結合体で免疫化したマウスにおいて誘導された抗ＰＳ８総合ＩｇＧ力価を表す。力価の値（ヒストグラム）は、希釈度の逆数の平均値のＬｏｇによって表される。グループの各々について、各血清（ｎ＝１０）の個々の力価が記号で表される。免疫前動物（Ｄ−１）において測定した非特異的応答も表される。
【図４】図４は、ＣＹＬ７７０株またはＢｅｃｋｅｒ株から調製したＰＳ Ｔ８−ｒＥＰＡ結合体で免疫化したマウスにおいてＤ３５に測定した抗ＰＳ８ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３サブクラスの力価を表す。力価の値（ヒストグラム）は、希釈度の逆数の平均値のＬｏｇによって表される。グループの各々について、各血清（ｎ＝１０）の個々の力価が記号で表される。免疫前動物（Ｄ−１）において測定した非特異的応答も表される。
【図５】図５（ａ）および図５（ｂ）は、それぞれ、ＣＹＬ７７０株の上清から精製したｒＰＳ８多糖およびＢｅｃｋｅｒ株の培養物の細胞ペレットから精製したｗｔＰＳ８の５００ＭＨｚでの一次元プロトンＮＭＲ分析によって得られたスペクトルを表す。これらのＮＭＲ分析は、Ｂｒｕｋｅｒ ＤＲＸ ５００分光計およびプローブ：ＢＢ−１Ｈ−Ｄ ＸＹＺ ＧＲＤ ５ｍｍを使用して行った。試料を１.２ｍｇ／ｍｌの濃度でＤ2Ｏに溶解した。該分析は、以下の条件下で行った：分析温度：３４３°Ｋ（７０℃）；緩和時間：２秒；スキャニング数＝５１２。各ＰＳ８について、スペクトルは、天然（Ｏ−アセチル化）形態、およびC. Jones（C. Jones. Carbohydr. Res. 2005, 340, 1097-1106）によって記載されているアルカリ処理によって得られる脱Ｏ−アセチル化形態について測定した。
【図６】図６（ａ）および図６（ｂ）は、それぞれ、ＣＹＬ１８９２株の培養上清から精製したｒＰＳ５多糖およびＲｅｙｎｏｌｄｓ株の培養物の細胞ペレットから精製したｓＰＳ５の５００ＭＨｚでの一次元プロトンＮＭＲ分析によって得られたスペクトルを表す。これらのＮＭＲ分析は、Ｂｒｕｋｅｒ ＤＲＸ ５００分光計およびプローブ：ＢＢ−１Ｈ−Ｄ ＸＹＺ ＧＲＤ ５ｍｍを使用して行った。試料を１.２ｍｇ／ｍｌの濃度でＤ2Ｏに溶解した。該分析は、以下の条件下で行った：分析温度３４３°Ｋ（７０℃）；緩和時間：２秒；スキャニング数＝５１２。
【図７】図７（ａ）および図７（ｂ）は、それぞれ、ＰＳ５−ｒＥＰＡおよびｒＰＳ５−ｒＥＰＡ結合体によってマウスにおいて誘導された抗ＰＳ５ ＩｇＭおよびＩｇＧ応答の評価および比較を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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