(57)【要約】ガンの治療ならびに転移ガンの治療および予防を目的とした薬学的組成物を調製するための、４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンまたはそのエナンチオマーのあらゆる組み合わせ、もしくはそのエナンチオマーの一つの利用法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガンの治療ならびに転移ガンの治療および予防を目的とした薬学的組成物を調製するための、４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、またはそのエナンチオマーのあらゆる組み合わせ、あるいはそのエナンチオマーの一つの利用法。
【請求項２】
薬学的組成物がさらに少なくとも一つのアルカロイドを含有することを特徴とする、請求項１に記載の利用法。
【請求項３】
アルカロイドがビンカ・アルカロイドであることを特徴とする、請求項２に記載の利用法。
【請求項４】
ビンカ・アルカロイドが、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、酒石酸ビノレルビンまたはそれらの混合物で構成されるグループから選択され、好ましくはビンクリスチンおよび／またはビンブラスチンであることを特徴とする、請求項３に記載の利用法。
【請求項５】
前記ガン、あるいは前記転移ガンが、前立腺ガン、骨肉腫、肺ガン、非小細胞肺ガン、乳ガン、子宮粘膜ガンまたは結腸ガン、慢性または急性白血病、小児充実性腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膵臓ガン、皮膚ガン、皮膚黒色腫または眼内黒色腫、頭部ガンまたは頸部ガン、子宮ガン、卵巣ガン、婦人科ガン、ホジキン病、骨ガン、直腸ガン、肛門部ガン、胃ガン、食道ガン、小腸ガン、内分泌系ガン、骨髄肉腫、尿道ガン、陰茎ガン、膀胱ガン、腎臓ガン、尿管ガン、小児悪性腫瘍および中枢神経系腫瘍で構成されるグループから選択されるガンに由来するものであることを特徴とする、請求項１〜請求項４のいずれか一つに記載の利用法。
【請求項６】
前記ガンが乳ガンであること、または、前記転移ガンが乳ガンに起因するものであることを特徴とする、請求項５に記載の利用法。
【請求項７】
前記ガンが白血病であることを特徴とする、請求項５に記載の利用法。
【請求項８】
薬学的組成物が、経口経路、静脈内経路、腸内経路、非経口経路、筋肉内経路、鼻腔内経路、皮下経路または舌下経路によって投与されることを特徴とする、請求項１〜請求項７のいずれか一つに記載の利用法。
【請求項９】
同時利用、別々での利用または抗ガン療法における時間の中での長期的な利用のための併用製品としての、４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、または、そのエナンチオマーの少なくとも一つ、あるいは、そのエナンチオマーのあらゆる組み合わせと、少なくとも一つのアルカロイドを含む産物。
【請求項１０】
アルカロイドがビンカ・アルカロイドであることを特徴とする請求項９に記載の産物。
【請求項１１】
ビンカ・アルカロイドが、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、酒石酸ビノレルビンまたはそれらの混合物で構成されるグループから選択され、好ましくはビンクリスチンおよび／またはビンブラスチンであることを特徴とする、請求項１０に記載の産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガンの治療ならびに転移ガンの治療および予防を目的とする薬学的組成物を調製するための、４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、または、そのエナンチオマーの一つ、あるいは、そのエナンチオマーのあらゆる組み合わせの利用法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ここ２０年の間にガンの新たな年間症例数は著しく増加している。したがって、ガンの治療は公衆衛生における正真正銘の問題である。ガンのタイプがどのようなものであっても、一般的には、補助治療であっても化学療法による治療が推奨される。したがって、常に、化学療法に対する新しい分子を開発していく必要性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンおよびそのエナンチオマー、あるいはそのエナンチオマーのあらゆる組み合わせを研究し、これらの化合物が多くのタイプのガン細胞に対する抗増殖活性を有すること、そして、該化合物をガンの予防または治療に利用できることを示した。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
したがって、本発明は、ガンの治療ならびに転移ガンの治療および予防を目的とする薬学的組成物を調製するための、４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、または、（（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、（１Ｓ，４Ｒ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、（１Ｒ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンおよび（１Ｒ，４Ｒ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン）から選択されるエナンチオマーの一つ、あるいは、これらエナンチオマーのあらゆる組み合わせの利用法に関するものである。
【０００５】
ガンまたは転移ガンの治療とは、本発明では本質的に、ある化合物が正常細胞にほとんど達することなく、腫瘍細胞を選択的に破壊する能力を意味するものであり、この選択性は患者の状態および治療されるガンのタイプに応じて変化しうるものとする。
【０００６】
後の実施例で確認するように、本発明による化合物は腫瘍細胞を破壊する際だった能力を有している。多くの異なるガンのタイプに由来する腫瘍細胞に作用するこれらの化合物の能力に関して、その結果は非常に驚くべきものであることが明らかになった。
【０００７】
本発明によると、前記ガンまたは前記転移ガンは、前立腺ガン、骨肉腫、肺ガン、非小細胞肺ガン、乳ガン、子宮粘膜ガンまたは結腸ガン、慢性または急性白血病、小児充実性腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膵臓ガン、皮膚ガン、皮膚黒色腫または眼内黒色腫、頭部ガンおよび頸部ガン、子宮ガン、卵巣ガン、婦人科ガン、ホジキン病、骨ガン、直腸ガン、肛門部ガン、胃ガン、食道ガン、小腸ガン、内分泌系ガン、骨髄肉腫、尿道ガン、陰茎ガン、膀胱ガン、腎臓ガン、尿管ガン、小児悪性腫瘍および中枢神経系の腫瘍、特に脳腫瘍で構成されるグループから選択されるガンに由来するものである。
【０００８】
好ましくは、前記ガンまたは前記転移ガンは乳ガンに起因するものである。また好ましくは、前記ガンは白血病である。
【０００９】
さらに、本発明者らは、少なくとも一つのアルカロイド、好ましくはビンカ・アルカロイド、たとえばビンクリスチンまたはビンブラスチンと組み合わせて投与された４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンまたはそのエナンチオマーの一つ、あるいはそのエナンチオマーのあらゆる組み合わせが、腫瘍細胞に対する特異的な細胞毒性の相乗作用を有していることを示した。
【００１０】
したがって、本発明のもう一つの特徴は、ガンの治療ならびに転移ガンの治療および予防を目的とする薬学的組成物を調製するための、４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンまたはそのエナンチオマーの一つ、あるいはそのエナンチオマーのあらゆる組み合わせと、少なくとも一つのアルカロイドの利用法に関するものである。好ましくは、アルカロイドはビンカ・アルカロイドである。より好ましくは、ビンカ・アルカロイドは、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよび酒石酸ビノレルビンで構成されるグループから選択され、好ましくはビンクリスチンおよび／またはビンブラスチンである。
【００１１】
ビンカ・アルカロイドとは、本発明では、ニチニチソウ（Ｖｉｎｃａ  Ｒｏｓｅａ）属である、ツルニチソウのアルカロイドおよび化学的修飾によって得られるその誘導体を意味するものである。該アルカロイドは、それらが重合化を阻害する、核分裂の紡錘体のチューブリンを標的としている。このチューブリンは神経線維も構成しているため、ビンカ・アルカロイドは神経毒性、特に感覚神経の毒性を有しており、抑鬱傾向を誘発する。
【００１２】
本発明のもう一つの特徴は、同時利用、別々での利用、または抗ガン療法における時間の中での長期利用のための併用製品としての、４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンまたはそのエナンチオマーの一つ、あるいはそのエナンチオマーのあらゆる組み合わせと、少なくとも一つのアルカロイドを含んだ産物に関するものである。
【００１３】
好ましくは、選択されるアルカロイドはビンカ・アルカロイドである。より好ましくは、ビンカ・アルカロイドは、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよび酒石酸ビノレルビンで構成されるグループから選択され、好ましくはビンクリスチンおよび／またはビンブラスチンである。
【００１４】
本発明による薬学的組成物および／または併用製品は、経口経路、静脈内経路、腸内経路、非経口経路、筋肉内経路、鼻腔内経路、皮下経路、舌下経路または局所経路によって投与することができる。一般的には、経口経路を利用することが好まれる。特に腫瘍の治療のような、注射が不可能な場合である。注目すべきことに、本発明者らは、本発明の製品が、今日患者に対して利用可能な多くの抗腫瘍製品とは異なり、経口投与によって効果的となりうることを証明している（Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｍｃ  Ｇｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｅｄｉｔｏｒ）。
【００１５】
日々の用量は病気の状態だけではなく、治療されるガンの状態、その段階および進行を考慮することが必要である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下の実施例は例示としてのみ言及し、本明細書の教示内容を限定するものとして捉えることはできないものである。
【００１７】
図１：Ｕ９３７白血病タイプの細胞増殖の阻害に対する、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンクリスチンの組み合わせによる相乗効果の研究。
【００１８】
図２：Ｕ９３７白血病タイプの細胞増殖の阻害に対する、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンブラスチンの組み合わせによる相乗効果の研究。
【００１９】
図３：ＭＤＡ−ＭＢ２３１タイプの乳ガンの細胞増殖の阻害に対する、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンクリスチンの組み合わせによる相乗効果の研究。
【００２０】
図４：ＭＤＡ−ＭＢ２３１タイプの乳ガンの細胞増殖の阻害に対する、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンブラスチンの組み合わせによる相乗効果の研究。
【００２１】
図５：腹腔内経路によってシス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンを長期投与した後の、ＳＣＩＤマウスに導入した平均量の腫瘍の治療における進展。
【００２２】
図６：腹腔内経路によって（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンを長期投与した後の、ＳＣＩＤマウスに導入した平均量の腫瘍の治療における進展。
【００２３】
実施例
「シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン」とは、二つのエナンチオマー、（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンおよび（１Ｒ，４Ｒ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンのラセミ混合物を意味する。
【００２４】
「トランス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン」とは、二つのエナンチオマー、（１Ｓ，４Ｒ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンおよび（１Ｒ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンのラセミ混合物を意味する。
【００２５】
「シス／トランス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン」とは、四つの前記エナンチオマーのラセミ混合物を意味する。
【００２６】
実施例１〜実施例３
これらの実施例において、本発明者らは、予想に反することに、起源が多様な腫瘍細胞株に対する、４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとそのエナンチオマーあるいはそのエナンチオマーのあらゆる組み合わせの抗腫瘍効果を証明している。
【実施例１】
【００２７】
Ｕ９３７白血病タイプの細胞に対するＣＩ50の判定
以下で説明する方法を、Ｕ９３７細胞に対する次の化合物のＣＩ50の値を判定するために適用した。該化合物とは、
−シス／トランス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、
−シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、
−トランス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、
−（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、
−（１Ｓ，４Ｒ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、
−（１Ｒ，４Ｒ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、
−（１Ｒ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、
である。
【００２８】
ＣＩ50の値を以下の表（表１）にまとめている。
【００２９】
【表１】
2009501193.tif 000002
【００３０】
これらの結果は、４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、そのエナンチオマーの組み合わせおよびすべてのエナンチオマーが、Ｕ９３７白血病タイプの細胞増殖を阻害する特性、したがって抗腫瘍活性を有していることを示している。４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、そのエナンチオマーの組み合わせおよびすべてのエナンチオマーの抗腫瘍活性は、得られたＣＩ50の値がすべて３μＭと１２μＭの間に含まれている点で等価である。したがって、４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンのエナンチオマーのあらゆる組み合わせは、Ｕ９３７白血病タイプの細胞増殖を阻害する特性、したがって抗腫瘍活性を有している。
【実施例２】
【００３１】
ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳ガンの細胞に対するＣＩ50の判定
以下で説明する方法を、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞に対する次の化合物のＣＩ50の値を判定するために適用した。該化合物とは、
−シス／トランス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、
−シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、
−トランス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、
である。
【００３２】
ＣＩ50の値は以下の表（表２）にまとめている。
【００３３】
【表２】
2009501193.tif 000003
【００３４】
これらの結果は、４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンと、そのエナンチオマーの組み合わせが、ＭＤＡ−ＭＢ２３１タイプの乳ガン細胞の増殖を阻害する特性、したがって抗腫瘍活性を有していることを示している。４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンおよびそのエナンチオマーの組み合わせの抗腫瘍活性は、得られたＣＩ50の値がすべて４μＭと７μＭの間に含まれている点で等価である。したがって、４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンのすべてのエナンチオマーと、これらエナンチオマーのあらゆる組み合わせも、ＭＤＡ−ＭＢ２３１タイプの乳ガン細胞の増殖を阻害する特性、したがって抗腫瘍活性を有している。
【実施例３】
【００３５】
３０の腫瘍細胞株に対する（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンのＣＩ50の判定
以下で説明する方法を、乳ガン、結腸ガン、肺ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、膵臓ガン、皮膚ガン、脳腫瘍および血液ガンから派生した３０の細胞株に対する（１Ｓ，４Ｓ）−４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンのＣＩ50の値を判定するために適用した。
【００３６】
表３は、血液ガンおよび非常に多様な充実性腫瘍に由来する、異なる３０の腫瘍株に対する、（１Ｓ，４Ｓ）−４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンのＣＩ50の値をまとめている。
【００３７】
この実施例において、本発明者らは、予想に反することに、（１Ｓ，４Ｓ）−４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンが広範囲の抗腫瘍活性を有し、試験したガン全体に由来する腫瘍細胞の増殖を阻害する能力をもっていることを証明している。
【００３８】
【表３】
2009501193.tif 000004
【００３９】
実施例４〜実施例９
これらの実施例において、本発明者らは、予想に反することに、４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンおよびそのエナンチオマーとビンカ・アルカロイドとの相乗的な抗腫瘍効果を証明している。
【実施例４】
【００４０】
Ｕ９３７白血病タイプの細胞増殖の阻害に対する、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンクリスチンの組み合わせによる相乗効果の研究
Ｕ９３７白血病タイプの細胞増殖の阻害に対する、二つの製品の組み合わせによる相乗効果を評価するために、以下で説明する方法を次の化合物を用いて適用した。該化合物とは、
−シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、
−ビンクリスチン、
である。
【００４１】
シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンを試験するために選択した最終的な６つの濃度は、２５、１３、６．３、３．１および１．６マイクロモル（μＭ）である。ビンクリスチンを試験するために選択した最終的な６つの濃度は、４０００、１０００、２５０、６３および１６ピコモル（ｐＭ）である。
【００４２】
Ｕ９３７細胞を、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンクリスチンの濃縮物によるさまざまな組み合わせを用いてインキュベートすることにより、二つの化合物の抗増殖効果の間に相乗効果が存在することが明らかになった。
【００４３】
結果は図１に示している。
【００４４】
ビンクリスチン（２５０ｐＭ）とシス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン（３．１μＭ）の組み合わせによる抗増殖活性（７３％の増殖阻害率）は、最も活性の高い薬剤単独の効果（２５０ｐＭのビンクリスチンについて２１％の阻害）を明らかに上回っている。さらに、この組み合わせで観察された抗増殖効果は、「Ｂｌｉｓｓ」加算性に対する超過について計算したプラスの値（＋４９）を考慮すると、二つの製品の別々の効果を単純に加算したものではないことは明らかである。
【００４５】
結論としては、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンクリスチンのこの組み合わせによる相乗効果は存在する。
【実施例５】
【００４６】
Ｕ９３７白血病タイプの細胞増殖の阻害に対するシス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンブラスチンの組み合わせによる相乗効果の研究
Ｕ９３７白血病タイプの細胞増殖の阻害に対する二つの製品の組み合わせによる相乗効果を評価するために、以下で説明する方法を次の化合物を用いて適用した。該化合物とは、
−シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、
−ビンブラスチン、
である。
【００４７】
シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンを試験するために選択された最終的な６つの濃度は２５、１３、６．３、３．１および１．６マイクロモル（μＭ）である。ビンブラスチンを試験するために選択された最終的な６つの濃度は、４０００、１０００、２５０、６３および１６ピコモル（ｐＭ）である。
【００４８】
Ｕ９３７細胞を、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンブラスチンの濃縮物のさまざまな組み合わせを用いてインキュベートすることにより、二つの化合物の抗増殖効果の間に相乗効果が存在することが明らかになった。
【００４９】
結果は図２に示している。
【００５０】
ビンブラスチン（２５０ｐＭ）とシス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン（３．１μＭ）の組み合わせによる抗増殖効果（５４％の増殖阻害率）は、最も活性の高い薬剤単独の効果（２５０ｐＭのビンブラスチンについて１９％の阻害）を明らかに上回っている。さらに、この組み合わせで観察された抗増殖効果は、「Ｂｌｉｓｓ」加算性に対する超過について計算したプラスの値（＋３１）を考慮すると、二つの製品の別々の効果を単純に加算したものではないことは明らかである。結論として、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンブラスチンのこの組み合わせによる相乗効果は存在する。
【実施例６】
【００５１】
Ｕ９３７白血病タイプの細胞増殖の阻害に対する、（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンクリスチンの組み合わせによる相乗効果の研究
Ｕ９３７白血病タイプの細胞増殖の阻害に対する二つの製品の組み合わせによる相乗効果を評価するために、以下で説明する方法を次の化合物を用いて適用した。該化合物とは、
−（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、
−ビンクリスチン、
である。
【００５２】
Ｕ９３７細胞を、（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンクリスチンの濃縮物のさまざまな組み合わせを用いてインキュベートすることにより、二つの化合物の抗増殖効果の間に相乗効果が存在することが明らかになった。（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン（３．１μＭ）とビンクリスチンの組み合わせで観察された抗増殖効果は、「Ｂｌｉｓｓ」加算性に対する超過について計算したプラスの値（＋８）を考慮すると、二つの製品の別々の効果を単純に加算したものではないことは明らかである。結論として、（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンクリスチンのこの組み合わせによる相乗効果は存在する。
【実施例７】
【００５３】
Ｕ９３７白血病タイプの細胞増殖の阻害に対する、（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンブラスチンの組み合わせによる相乗効果の研究
Ｕ９３７白血病タイプの細胞増殖の阻害に対する二つの製品の組み合わせによる相乗効果を評価するため、以下で説明する方法を次の化合物を用いて適用した。該化合物とは、
−（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、
−ビンブラスチン、
である。
【００５４】
Ｕ９３７細胞を、（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンブラスチンの濃縮物のさまざまな組み合わせを用いてインキュベートすることで、二つの化合物の抗増殖効果の間に相乗効果が存在することが明らかになった。（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン（３．１μＭ）とビンブラスチンの組み合わせで観察された抗増殖効果は、「Ｂｌｉｓｓ」加算性に対する超過について計算したプラスの値（＋５）を考慮すると、二つの製品の別々の効果を単純に加算したものではないことは明らかである。結論としては、（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンブラスチンのこの組み合わせによる相乗効果は存在する。
【実施例８】
【００５５】
ＭＤＡ−ＭＢ２３１タイプの乳ガンの細胞増殖の阻害に対する、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンクリスチンの組み合わせによる相乗効果の研究
ＭＤＡ−ＭＢ２３１タイプの乳ガンの細胞増殖の阻害に対する二つの製品の組み合わせによる相乗効果を評価するために、以下で説明する方法を次の化合物を用いて適用した。該化合物とは、
−シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、
−ビンクリスチン、
である。
【００５６】
シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンを試験するために選択した最終的な６つの濃度は、２５、１３、６．３、３．１および１．６マイクロモル（μＭ）である。ビンクリスチンを試験するために選択した最終的な６つの濃度は、４０００、１０００、２５０、６３および１６ピコモル（ｐＭ）である。
【００５７】
ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンクリスチンの濃縮物のさまざまな組み合わせを用いてインキュベートすることで、二つの化合物の抗増殖効果の間に相乗効果が存在することが明らかになった。
【００５８】
結果は図３に示している。
【００５９】
ビンクリスチン（１０００ｐＭ）とシス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン（３．１μＭ）の組み合わせによる抗増殖活性（５９％の増殖阻害率）は、最も活性の高い薬剤単独の効果（１０００ｐＭのビンクリスチンについて２５％の阻害）を明らかに上回っている。さらに、この組み合わせで観察された抗増殖効果は、「Ｂｌｉｓｓ」加算性に対する超過について計算したプラスの値（＋２８）を考慮すると、二つの製品の別々の効果を単純に加算したものではないことは明らかである。結論としては、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンクリスチンによるこの組み合わせの相乗効果は存在する。
【実施例９】
【００６０】
ＭＤＡ−ＭＢ２３１タイプの乳ガンの細胞増殖の阻害に対する、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンブラスチンの組み合わせによる相乗効果の研究
Ｕ９３７白血病タイプの細胞増殖の阻害に対する二つの製品の組み合わせによる相乗効果を評価するために、以下で説明する方法を次の化合物を用いて適用した。該化合物とは、
−シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、
−ビンブラスチン、
である。
【００６１】
シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンを試験するために選択した最終的な６つの濃度は、２５、１３、６．３、３．１および１．６マイクロモル（μＭ）である。ビンブラスチンを試験するために選択した最終的な６つの濃度は、４０００、１０００、２５０、６３および１６ピコモル（ｐＭ）である。
【００６２】
ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンブラスチンの濃縮物のさまざまな組み合わせを用いてインキュベートすることで、二つの化合物の抗増殖効果の間に相乗効果が存在することが明らかになった。
【００６３】
結果は図４に示している。
【００６４】
ビンブラスチン（１０００ｐＭ）とシス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン（１．６μＭ）の組み合わせによる抗増殖活性（６１％の増殖阻害率）は、最も活性の高い薬剤単独の効果（１０００ｐＭのビンブラスチンについては３３％の阻害）をはっきり上回っている。さらに、この組み合わせで観察された抗増殖効果は、「Ｂｌｉｓｓ」加算性に対する超過について計算したプラスの値（＋２７）を考慮すると、二つの製品別々の効果を単純に加算したものでないことは明らかである。結論としては、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンブラスチンのこの組み合わせによる相乗効果は存在する。
【００６５】
同様に、ビンブラスチン（１０００ｐＭ）とシス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン（３．１μＭ）の組み合わせによる抗増殖活性（８７％の増殖阻害率）は、最も活性の高い薬剤単独の効果（１０００ｐＭのビンブラスチンについて３３％の阻害）をはっきりと上回っている。さらに、この組み合わせで観察された抗増殖効果は、「Ｂｌｉｓｓ」加算性に対する超過について計算したプラスの値（＋４７）を考慮すると、二つの製品別々の効果を単純に加算したものではないことは明らかである。結論としては、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンブラスチンのこの組み合わせによる相乗効果は存在する。
【００６６】
実施例１０および実施例１１
これらの実施例において、本発明者らは、予想に反することに、腫瘍を保持した動物に投与された４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとそのエナンチオマーの抗腫瘍効果を証明している。
【実施例１０】
【００６７】
腹腔内経路によって長期投与した後の、マウスにおけるシス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンの抗腫瘍効果の研究
この実施例において、本発明者らは、以下で説明する方法を適用し、マウスにおけるシス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンの抗腫瘍効果を試験した。この効果を試験するため、本発明者らは、事前に腫瘍細胞を移植したマウスに、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンを投与した。本発明者らは、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンで処理した動物における腫瘍の増加を、処理していない、または試験物質の賦形剤のみで処理した対照の動物における腫瘍の増加と比較した。注目すべきことに、本発明者らは、腹腔内経路によるシス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンの投与によって、処理したマウスにおける腫瘍の増加が顕著に鈍化することを示すことに成功した。
【００６８】
本発明者らは、皮下腫瘍を保持し、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンで処理したマウスにおける腫瘍の平均サイズを分析し、該平均サイズを、これらの腫瘍を保持し、試験物質の賦形剤のみで治療した「対照」のマウスのサイズと保持する腫瘍の平均量と比較した。
【００６９】
図５は、治療初日からの経過時間（日単位）に応じて、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンで処理（腹腔内経路による５０ｍｇ／ｋｇ）したマウスが保持する皮下腫瘍の平均サイズ（ｍｍ3単位）を、賦形剤で処理したマウスが保持する腫瘍の平均量との比較で示している。
【００７０】
本発明の化合物で処理したマウスの腫瘍量は、処理していないマウスの腫瘍量をはっきり下回っており、このことは、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンの明らかな抗腫瘍効果を示している。
【実施例１１】
【００７１】
腹腔内経路による長期投与後の、マウスにおける（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンの抗腫瘍効果の研究
この実施例では、本発明者らは、以下で説明する方法を適用して、マウスにおける（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンの抗腫瘍効果を試験した。この効果を試験するために、本発明者らは、事前に腫瘍細胞を移植したマウスに（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンを投与した。本発明者らは、（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンで処理した動物における腫瘍の増加を、処理していない、または試験物質の賦形剤のみで処理した対照の動物における腫瘍の増加と比較した。注目すべきことに、本発明者らは、腹腔内経路による（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンの投与によって、処理したマウスでの腫瘍の増加が顕著に鈍化することを示すことに成功した。
【００７２】
本発明者らは、皮下腫瘍を保持し、（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンで処理したマウスにおける腫瘍の平均サイズを分析し、該平均サイズを、これらの腫瘍を保持し、試験物質の賦形剤のみで処理した「対照」のマウスのサイズと比較した。
【００７３】
図６は、治療初日からの経過時間（日単位）に応じて、（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンで処理した（腹腔内経路により１５ｍｇ／ｋｇを一日二回）マウスが保持する皮下腫瘍の平均量（ｍｍ3単位）を、賦形剤で処理したマウスが保持する腫瘍の平均量との比較で示している。
【００７４】
本発明の化合物で処理したマウスの腫瘍量は、処理していないマウスの腫瘍量をはっきり下回っており、このことは、（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンの明らかな抗腫瘍効果を示している。
【００７５】
実施例１２および実施例１３
これらの実施例において、本発明者らは、注目すべきことに、４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンおよびそのエナンチオマーが経口経路による治療利用に固有の特性を有していることを証明している。
【実施例１２】
【００７６】
マウスにおける（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンの薬物動態パラメータ（半減期、生物学的利用能）の研究
齧歯動物（マウスＣＤ１）において、薬物動態の研究を（１Ｓ，４Ｓ）−４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンを用いて行った。この化合物は、静脈内経路によって１ｍｇ／ｋｇの用量を、経口経路によって５、１０、そして２０ｍｇ／ｋｇの用量を動物に投与した。マウスの血中を流れる（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンの割合は、質量分析計に接続した液体クロマトグラフィにより、静脈内経路による投与後の５分から４８０分の間に含まれるさまざまな時点で、経口経路による投与後の１５分から１４４０分の間に含まれるさまざまな時点で測定した。これらの測定により、処理した動物における（１Ｓ，４Ｓ）−４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンの顕著な循環量を示すことが可能となった。
【００７７】
マウスにおける（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンの薬物動態パラメータの結果は、以下の表４ａおよび表４ｂに示している。
【００７８】
【表４ａ】
2009501193.tif 000005
【００７９】
【表４ｂ】
2009501193.tif 000006
【００８０】
これらの表において、
−Ｔ１／２＝排出半減期、
−ＡＵＣａｌｌ＝投与の瞬間（ｔ＝０）から最後の観察時までの曲線区域、
−ＡＵＣＩＮＦ＝投与の瞬間（ｔ＝０）から無限に外挿した曲線ゾーン
−Ｔｍａｘ＝観察された最大濃度の時点、
−Ｃｍａｘ＝時点に対応した濃度
−総クリアランス、
である。
【００８１】
さらに、（１Ｓ，４Ｓ）−４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンの経口経路による投与時と静脈内経路による投与時に得られた曲線領域（ＡＵＣ）の比率によって生体利用能の係数を測定することが可能となり、該係数の濃度にしたがった値は２４％と３０％の間に含まれる。
【００８２】
これらの実験は、（１Ｓ，４Ｓ）−４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンが経口経路によって投与されたとき、この化合物のかなりの用量が高い生物学的利用能の係数で循環部に見つかったことを示しており、したがって、このことは該化合物が経口経路による治療に適合化されていることを証明している。
【実施例１３】
【００８３】
経口経路による長期投与後の、マウスにおける（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンの抗腫瘍効果の研究
この実施例では、本発明者らは、以下で説明する方法を適用し、マウスにおける（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンの抗腫瘍効果を試験した。この効果を試験するために、本発明者らは、事前に腫瘍細胞を移植したマウスに、（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンを投与した。発明者らは、（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンで処理した動物における腫瘍の増加を、処理していない、または試験物質の賦形剤のみで処理した対照の動物における腫瘍の増加と比較した。注目すべきことに、本発明者らは、経口経路による（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンの投与によって、処理されたマウスでは腫瘍の増加が顕著に鈍化することを示すことに成功した。
【００８４】
表５は、治療の初日からの経過時間に応じた（日単位）、（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンで処理した（一日８０ｍｇ／ｋｇの経口経路による投与）ＳＣＩＤマウスが保持する皮下腫瘍の平均量（ｍｍ3単位）と、同じ日における賦形剤で処理したマウスが保持する腫瘍の平均量を示している。日付Ｊ１５およびＪ１８はそれぞれ、治療初日から１５日目と１８日目に対応している。
【００８５】
以下の表５は、経口経路による（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンの長期投与後の、ＳＣＩＤマウスに移植された腫瘍の平均量を示している。
【００８６】
【表５】
2009501193.tif 000007
【００８７】
本発明の化合物で処理したマウスが保持する腫瘍の平均量は、賦形剤で処理したマウスが保持する腫瘍の平均量を大きく下回っている（半分に近い）。
【００８８】
したがって、経口経路によって投与された（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンは動物において抗腫瘍効果を有している。
【実施例１４】
【００８９】
マウスにおける（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンの脳浸入の研究
神経系の腫瘍に対する抗腫瘍活性は、血液脳関門を越えることができない能力、したがって脳に浸入できない能力のために制限されることが多い。
【００９０】
表３に指示したように、（１Ｓ，４Ｓ）−４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンは膠芽細胞腫から派生した腫瘍株に対してインビトロで活性である。興味深いことに、以下に報告する実験は、（１Ｓ，４Ｓ）−４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンがかなり血液脳関門を通過する能力を有することを証明しており、このことは、この化合物が脳腫瘍の治療に非常に有効であることを示している。
【００９１】
（１Ｓ，４Ｓ）−４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンを、１ｍｇ／ｋｇの割合で静脈内経路によってマウスＣＤ１の群に注射した。血中および脳内の（１Ｓ，４Ｓ）−４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンのレベルを質量分析計に接続した液体クロマトグラフィによって分析した。
【００９２】
この、マウスにおける（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンの脳浸入の研究の結果は、以下の表６に示している。
【００９３】
【表６】
2009501193.tif 000008
【００９４】
これらの実験は、脳内における（１Ｓ，４Ｓ）−４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンの濃度が血漿中よりも高いことと、脳と血液の間におけるこの化合物の比率が時間（分析した間隔）とともに増加することを証明しており、したがってこの化合物が脳に蓄積される能力を示している。
【００９５】
したがって、（１Ｓ，４Ｓ）−４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンは脳腫瘍の治療について大きな利点を有している。
【００９６】
材料と方法
Ｉ．Ｕ９３７白血病タイプの細胞に対するＣＩ50を判定するための方法
試験すべき化合物は濃度１×１０-2ＭのＤＭＳＯ（１００％）で溶液にし（原液）、細胞培養液の完全培地（ＲＰＭＩ１６４０  Ｃａｍｂｒｅｘ＋１０％のＦＢＳ＋１％のＬ−グルタミン＋４０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン）を用いた連続希釈法により、８つの異なる濃度の８つのサンプルを調製した。各サンプルについて、希釈液の量は、選択される最終的な濃度Ｃxの二倍の濃度が得られるように調節した。たとえば、１×１０-4Ｍ、５×１０-5Ｍ、２．５×１０-5Ｍ、１．３×１０-5Ｍ、６．３×１０-6Ｍ、３．１×１０-6Ｍ、１．６×１０-6Ｍおよび７．８×１０-7Ｍは、最終的な８つの濃度の標準的な範囲である。同時に、８つの対照サンプルを、細胞培養液の同じ培地（ＲＰＭＩ１６４０  Ｃａｍｂｒｅｘ＋１０％のＦＢＳ＋１％のＬ−グルタミン＋４０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン）を用いてＤＭＳＯ溶液（１００％）を連続希釈することで調製し、選択される希釈液の量が、試験すべき化合物のサンプルの調製に用いた量と厳密に同一となるようにした。
【００９７】
９６ウェルの白色不透明のプレート（ｆｌｕｏｒｏｎｕｎｃ  ９６Ｆ  Ｎｕｎｃｌｏｎ  Ｄｅｌｔａ）に、ＲＭＰＩ１６４０  Ｃａｂｒｅｘ＋１０％のＦＢＳ＋１％のＬ−グルタミン＋４０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンの培地における、２．５×１０4の細胞／ｍｌの濃度にある１００μＬのＵ９３７細胞懸濁液を各ウェルに置き、ウェルあたり２５００細胞とした。Ｃxの２倍の濃度にある１００μＬのサンプルを加え（ウェルごとに一つのサンプル）、培地を均質化した。空気下（５％のＣＯ2、９０〜９５％の湿度）における３７℃、１４４時間にわたるインキュベーションの後、培養液における細胞の生存率の定量化は、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって提供されている発光分析試験器ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）を用い、提供者の指示にしたがってＡＴＰレベルの観点から行った。各ウェルでの発光は計数器ＶＩＣＴＯＲ2（Ｗａｌｌａｃ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて測定した。
【００９８】
試験すべき化合物の最終的な濃度Ｃxのそれぞれについて、以下の式を適用することで細胞増殖の阻害率（％Ｉｎｈ．（Ｃx））を得た。
【００９９】
［式１］
2009501193.tif 000009
【０１００】
該式において、
−Ｌｕｍ．（ｅｃｈ．Ｃｏｍｐｏｓｅ  Ｃx）＝最終的な濃度Ｃxにおける試験すべきサンプルの３つのウェルにおける発光測定の平均、
−Ｌｕｍ．（ｅｃｈ．Ｃｏｎｔｒｏｌｅ  Ｃx）＝対応する対照サンプルの３つのウェルにおける発光測定の平均、
−Ｌｕｍ．（ｂｌａｎｃ）＝２００μＬの細胞培養液の培地（ＲＰＭＩ１６４０  Ｃａｍｂｒｅｘ＋１０％のＦＢＳ＋１％のＬ−グルタミン＋４０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン）のみを含む８つのウェルにおける発光測定の平均、
である。
【０１０１】
ＣＩ50は、細胞増殖の５０％の阻害を得るために必要な化合物の濃度であり、これらの値は、片対数曲線からソフトウェアＸＬｆｉｔ３（ＩＤ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｌｔｄ．，ＵＫ）を用いて計算した。
【０１０２】
ＩＩ．ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳ガンの細胞に対するＣＩ50を判定するための方法
試験すべき化合物を濃度１×１０-2ＭのＤＭＳＯ（１００％）で溶液にし（原液）、細胞培養液の完全培地（Ｅ−ＭＥＭ  Ｃａｍｂｒｅｘ＋１０％のＦＢＳ＋１％の非必須アミノ酸＋１％のＮａｐｙｒｕｖａｔｅ＋１％のＬ−グルタミン＋４０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン）を用いた連続希釈法により、異なる８つの濃度の８つのサンプルを調製した。各サンプルについて、希釈液の量は、選択される最終的な濃度Ｃxの二倍の濃度が得られるように調整した。たとえば、１×１０-4Ｍ、５×１０-5Ｍ、２．５×１０-5Ｍ、１．３×１０-5Ｍ、６．３×１０-6Ｍ、３．１×１０-6Ｍ、１．６×１０-6Ｍおよび７．８×１０-7Ｍが８つの最終的な濃度の標準範囲である。同時に、８つの対照サンプルを、細胞培養液の同一の培地（Ｅ−ＭＥＭ  Ｃａｍｂｒｅｘ＋１０％のＦＢＳ＋１％の非必須アミノ酸＋１％のＮａｐｙｒｕｖａｔｅ＋１％のＬ−グルタミン＋４０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン）によってＤＭＳＯ溶液（１００％）を希釈することで調製し、選択される希釈液の量は、試験すべき化合物のサンプルを調整するために用いた量と厳密に同一となるようにした。
【０１０３】
白色不透明の９６ウェルのプレート（ｆｌｕｏｒｏｎｕｎｃ  ９６Ｆ  Ｎｕｎｃｌｏｎ  Ｄｅｌｔａ）において、Ｅ−ＭＥＭ  Ｃａｍｂｒｅｘ＋１０％のＦＢＳ＋１％の非必須アミノ酸＋１％のＮａｐｙｒｕｖａｔｅ＋１％のＬ−グルタミン＋４０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンの培地中にある、濃度が１．２５×１０-4細胞／ｍｌであるＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の１００μＬの懸濁液を各ウェルに置き、ウェルあたり２５００細胞となるようにした。Ｃxの二倍の濃度である１００μＬのサンプルを加え（ウェルあたり一つのサンプル）、培地を均質化した。空気下における（５％のＣＯ2、９０〜９５％の湿度）３７℃での１４４時間にわたるインキュベーションの後、培養液における細胞生存率の定量化を、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって提供されている発光分析試験器ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）を用いて、提供者の指示にしたがってＡＴＰレベルの観点から行った。各ウェルにおける発光は、計数器ＶＩＣＴＯＲ2１４２０（Ｗａｌｌａｃ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて測定した。
【０１０４】
試験すべき化合物の最終的な濃度Ｃxのそれぞれについて、細胞増殖の阻害率（％Ｉｎｈ．（Ｃx））は以下の式を適用して得た。
【０１０５】
［式２］
2009501193.tif 000010
【０１０６】
該式において、
−Ｌｕｍ．（ｅｃｈ．Ｃｏｍｐｏｓｅ  Ｃx）＝最終的な濃度Ｃxにある試験すべきサンプルの３つのウェルにおける発光測定の平均、
−Ｌｕｍ．（ｅｃｈ．Ｃｏｎｔｒｏｌｅ  Ｃx）＝対応する対照サンプルの３つのウェルにおける発光測定の平均、
−Ｌｕｍ．（ｂｌａｎｃ）＝細胞培養液の２００μＬの培地（Ｅ−ＭＥＭ  Ｃａｍｂｒｅｘ＋１０％のＦＢＳ＋１％の非必須アミノ酸＋１％のＮａｐｙｒｕｖａｔｅ＋１％のＬ−グルタミン＋４０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン）のみを含む８つのウェルにおける発光測定の平均、
である。
【０１０７】
ＣＩ50は細胞増殖の５０％の阻害を得るために必要な化合物の濃度であり、これらの値は、片対数曲線からソフトウェアＸＬｆｉｔ３（ＩＤ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ．，ＵＫ）を用いて計算した。
【０１０８】
ＩＩＩ．Ｕ９３７白血病タイプの細胞増殖の阻害に対する二つの製品ＡおよびＢの組み合わせによる相乗効果を評価するための方法
各製品を濃度１×１０-2ＭのＤＭＳＯ（１００％）で溶液にし（原液）、各製品について、細胞培養液の完全培地（ＲＰＭＩ１６４０  Ｃａｍｂｒｅｘ＋１０％のＦＢＳ＋１％のＬ−グルタミン＋４０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン）を用いた連続希釈法によって、異なる６つの濃度にある６つのサンプルを調製した。各サンプルについて、希釈液の量は、選択される最終的な濃度の四倍の濃度が得られるように調節した。
【０１０９】
完全培地において２．５×１０4細胞／ｍｌの細胞懸濁液を調製し、３６×１００μｌのこの溶液（２５００細胞／ウェル）を、白色不透明の９６ウェルのプレート（ｆｌｕｏｒｏｎｕｎｃ  ９６Ｆ  Ｎｕｎｃｌｏｎ  Ｄｅｌｔａ）の３６ウェルに分配した。１００μｌの細胞懸濁液を含んだ各ウェルに、４倍に濃縮した５０μＬの製品Ａのサンプルと、４倍に濃縮した５０μＬの製品Ｂを加えることで、２００μＬの最終的な量を得た。
【０１１０】
製品Ａの各サンプル（６つの濃度Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６）を製品Ｂの各サンプル（６つの濃度Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６）と組み合わせた。濃度Ａ６とＢ６はそれぞれ製品Ａと製品Ｂのゼロ濃度に対応する。
【０１１１】
したがって、Ａ６／Ｂ６の組み合わせは、薬品もＤＭＳＯもないウェルに対応し、該ウェルは細胞増加の基準の役割を果たす。
【０１１２】
３６ウェルの内容は次のように概略的に示すことができる。
【表７】
2009501193.tif 000011
【０１１３】
空気下（５％のＣＯ2、９０〜９５％の湿度）における３７℃での１４４時間にわたるインキュベーションの後、培養液中の細胞生存率の定量化を、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって提供されている発光分析試験器ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）を用い、提供者の指示にしたがってＡＴＰレベルの観点から行った。各ウェルでの発光は、計数器ＶＩＣＴＯＲ2１４２０（Ｗａｌｌａｃ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて測定した。
【０１１４】
Ａｎ／Ｂｍの各組み合わせについて、細胞増殖の阻害率（％Ｉｎｈ．（Ａｎ／Ｂｍ））を以下の式を適用して得た。
【０１１５】
［式３］
2009501193.tif 000012
【０１１６】
該式において、
−Ｌｕｍ．Ｍ（Ａｎ／Ｂｍ）＝サンプルＡｎとＢｍの組み合わせを含んだ二つのウェルにおける発光測定の平均、
−Ｌｕｍ．Ｍ（Ａ６／Ｂ６）＝サンプルＡ６およびＢ６の組み合わせを含んだ二つのウェルにおける発光測定の平均、
−Ｌｕｍ．（ｂｌａｎｃ）＝２００μＬの細胞培養液の培地（ＲＰＭＩ１６４０  Ｃａｍｂｒｅｘ＋１０％のＦＢＳ＋１％のＬ−グルタミン＋４０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン）のみを含んだ６ウェルにおける発光測定の平均、
である。
【０１１７】
Ａｎ／Ｂｍの各組み合わせについて、最も活性の高い薬剤単独と比較した超過部分（Ｅaslpa（Ａｎ／Ｂｍ））は、
−％Ｉｎｈ．（Ａｎ／Ｂｍ）≧％Ｉｎｈ．（Ａ６／Ｂｍ）であれば、Ｅaslpa（Ａｎ／Ｂｍ）＝％Ｉｎｈ．（Ａｎ／Ｂｍ）−％Ｉｎｈ．（Ａｎ／Ｂ６）、
−％Ｉｎｈ．（Ａｎ／Ｂｍ）＜％Ｉｎｈ．（Ａ６／Ｂｍ）であれば、Ｅaslpa（Ａｎ／Ｂｍ）＝％Ｉｎｈ．（Ａｎ／Ｂｍ）−％Ｉｎｈ．（Ａ６／Ｂｍ）、
という式を適用して計算した。
【０１１８】
最後に、相乗効果の加算を区別するために、Ａｎ／Ｂｍの各組み合わせに対する阻害率を「Ｂｌｉｓｓ」加算性に対する超過として表した。「Ｂｌｉｓｓ」モデルは、
Ｃ＝Ａ＋Ｂ−ＡＢ、ＡおよびＢは０から１の間の分数で表される、
という式にしたがって、データＡとＢの効果を有する二つの活性剤について、組み合わせた答えＣを予測するものである。
【０１１９】
ＩＶ．ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳ガンの細胞増殖の阻害に対する二つの製品の相乗効果を評価するための方法
ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳ガン細胞について利用した方法は、細胞懸濁液の濃度を除いて、Ｕ９３７白血病タイプの細胞について利用した方法と同じである（Ｕ９３７に対する２．５×１０4細胞／ｍｌの代わりに、ＭＤＡ−ＭＢ２３１については１．２５×１０4細胞／ｍｌ）。完全培地の組成も変更した。すなわち、Ｅ−ＭＥＭ  Ｃａｍｂｒｅｘ＋１０％のＦＢＳ＋１％の非必須アミノ酸＋１％のＮａｐｙｒｕｖａｔｅ＋１％のＬ−グルタミン＋４０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンである。
【０１２０】
Ｖ．異なるタイプのガンに由来する細胞株に対するＣＩ50を判定するための方法
細胞は、５％のＣＯ2を含む空気の中、３７℃で、試験する化合物を含有した１０％の子牛胎児の血清を追加した２００μｌの最終的な量の培養培地でインキュベートにかけた。
【０１２１】
腫瘍細胞は９６時間にわたり、１０の最終的な濃度（１×１０-4から４×１０-10Ｍの範囲）の試験した化合物を用いてインキュベートにかけた。最終的な濃縮物のそれぞれを４通りで試験した。対照の細胞は試験した化合物の賦形剤で処理した。
【０１２２】
処理期間の後、抗増殖活性をＭＴＳテトラゾリウム塩（３−（４，５）−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、Ｂａｌｔｒｏｐ  Ｊ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９１，１：６１１−６１４）を用いた比色分析テストによって評価した。
【０１２３】
細胞処理の最後に、０．２２μｍのＭＴＳ（２０ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、Ｒｅｆ  Ｇ１１１１、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）と、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸塩で緩衝した生理食塩溶液中（ＤＰＢＳ，Ｒｅｆ  １７−５１３Ｆ，Ｃａｍｂｒｅｘ）のＰＭＳ（０．９２ｍｇ／ｍｌで１ｍｌ、Ｒｅｆ  Ｐ９６２５，Ｓｉｇｍａ）で新しく濾過した４０μｌの溶液を各ウェルに加えた。培養プレートを３７℃で２時間にわたってインキュベートした。各ウェルの吸収は、他項マーカー計数器、ＶＩＣＴＯＲ3（登録商標）１４２０（Ｗａｌｌａｃ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて４９０ｎｍで測定した。吸収の値は４つの実験測定による平均に相当する。
【０１２４】
試験すべき化合物の最終的な濃度Ｃxのそれぞれについて、細胞増殖の阻害率（％Ｉｎｈ．（Ｃx））を以下の式を適用して得た。
【０１２５】
［式４］
2009501193.tif 000013
【０１２６】
該式において、
−Ａｂｓ．Ｃｏｍｐｏｓｅ（Ｃx）＝最終的な濃度Ｃxにある試験すべきサンプルの４つのウェルにおける吸収測定の平均、
−Ａｂｓ．Ｃｏｎｔｒｏｌ＝４つの対照ウェル（化合物なし）における吸収測定の平均、
である。
【０１２７】
ＣＩ50は、細胞増殖の５０％の阻害を得るために必要な化合物の濃度であり、これらの値は、片対数曲線からソフトウェアＸＬｆｉｔ３（ＩＤ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ．，ＵＫ）を用いて計算した。
【０１２８】
ＶＩ．試験した化合物のインビボでの抗腫瘍効果を判定するための方法
腫瘍誘導
２００μｌという量のＲＰＭＩ培養液の培地で生育可能なＵ９３７細胞を、ＳＣＩＤマウスの右脇腹に皮下注射した。細胞の注射は、γ線源（１．８Ｇｙ、Ｃｏ60、ＩＮＲＡ  ＢＲＥＴＥＮＩＥＲＥ，Ｄｉｊｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて体全体を完全に照射した２４時間後に行った。
【０１２９】
処理計画
処理は、腫瘍がおよそ５０ｍｍ3である平均体積に達したときに開始した。マウスは、各グループの腫瘍体積の平均が他のグループと統計的に異ならないように（多変量解析）、１０頭のマウスのグループにランダムに振り分けた。
【０１３０】
試験化合物の各用量について、製品の適切な量をＴｗｅｅｎ−２０（Ｒｅｆ  Ｐ７９４９，Ｓｉｇｍａ）で懸濁液にした。次に、懸濁液を、試験化合物の所望の濃度と、１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０の最終的な濃度に達するように水で希釈した。
【０１３１】
マウスに、賦形剤（１％のＴｗｅｅｎ−２０（ｖ／ｖ））または選択した処理計画にしたがった用量の試験化合物を（一日１回または一日２回、３０日間）、繰り返し腹腔内注射（ＩＰ）した。経口経路による処理については、製品および賦形剤を強制経口投与した。
【０１３２】
腫瘍体積の判定
腫瘍の長さおよび幅は、週に２回、キャリパーを用いて測定し、腫瘍の体積は、
腫瘍体積＝（幅2×長さ）／２、
という式によって算出した。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】Ｕ９３７白血病タイプの細胞増殖の阻害に対する、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンクリスチンの組み合わせによる相乗効果を表す図。
【図２】Ｕ９３７白血病タイプの細胞増殖の阻害に対する、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンブラスチンの組み合わせによる相乗効果を表す図。
【図３】ＭＤＡ−ＭＢ２３１タイプの乳ガンの細胞増殖の阻害に対する、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンクリスチンの組み合わせによる相乗効果を表す図。
【図４】ＭＤＡ−ＭＢ２３１タイプの乳ガンの細胞増殖の阻害に対する、シス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンとビンブラスチンの組み合わせによる相乗効果を表す図。
【図５】腹腔内経路によってシス４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンを長期投与した後の、ＳＣＩＤマウスに導入した平均量の腫瘍の治療における進展を表す図。
【図６】腹腔内経路によって（１Ｓ，４Ｓ）４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミンを長期投与した後の、ＳＣＩＤマウスに導入した平均量の腫瘍の治療における進展を表す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月3日(2007.5.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガンの治療ならびに転移ガンの治療および予防を目的とした薬学的組成物を調製するための、唯一の活性成分としての、または少なくとも一つのアルカロイドと組み合わせる、４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、またはそのエナンチオマーのあらゆる組み合わせ、あるいはそのエナンチオマーの一つの利用法。
【請求項２】
アルカロイドがビンカ・アルカロイドであることを特徴とする、請求項１に記載の利用法。
【請求項３】
ビンカ・アルカロイドが、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、酒石酸ビノレルビンまたはそれらの混合物で構成されるグループから選択され、好ましくはビンクリスチンおよび／またはビンブラスチンであることを特徴とする、請求項２に記載の利用法。
【請求項４】
前記ガン、あるいは前記転移ガンが、前立腺ガン、骨肉腫、肺ガン、非小細胞肺ガン、乳ガン、子宮粘膜ガンまたは結腸ガン、慢性または急性白血病、小児充実性腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膵臓ガン、皮膚ガン、皮膚黒色腫または眼内黒色腫、頭部ガンまたは頸部ガン、子宮ガン、卵巣ガン、婦人科ガン、ホジキン病、骨ガン、直腸ガン、肛門部ガン、胃ガン、食道ガン、小腸ガン、内分泌系ガン、骨髄肉腫、尿道ガン、陰茎ガン、膀胱ガン、腎臓ガン、尿管ガン、小児悪性腫瘍および中枢神経系腫瘍で構成されるグループから選択されるガンに由来するものであることを特徴とする、請求項１〜請求項３のいずれか一つに記載の利用法。
【請求項５】
前記ガンが乳ガンであること、または、前記転移ガンが乳ガンに起因するものであることを特徴とする、請求項４に記載の利用法。
【請求項６】
前記ガンが白血病であることを特徴とする、請求項４に記載の利用法。
【請求項７】
薬学的組成物が、経口経路、静脈内経路、腸内経路、非経口経路、筋肉内経路、鼻腔内経路、皮下経路または舌下経路によって投与されることを特徴とする、請求項１〜請求項６のいずれか一つに記載の利用法。
【請求項８】
同時利用、別々での利用または抗ガン療法における時間の中での長期的な利用のための併用製品としての、４−（３，４−ジクロロ−フェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアミン、または、そのエナンチオマーの少なくとも一つ、あるいは、そのエナンチオマーのあらゆる組み合わせと、少なくとも一つのアルカロイドを含む産物。
【請求項９】
アルカロイドがビンカ・アルカロイドであることを特徴とする請求項８に記載の産物。
【請求項１０】
ビンカ・アルカロイドが、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、酒石酸ビノレルビンまたはそれらの混合物で構成されるグループから選択され、好ましくはビンクリスチンおよび／またはビンブラスチンであることを特徴とする、請求項９に記載の産物。
【国際調査報告】
2009501193.tif 000020
2009501193.tif 000021
2009501193.tif 000022
2009501193.tif 000023
2009501193.tif 000024
2009501193.tif 000025