(57)【要約】  抗走化性、抗血管形成、および抗腫瘍活性を有するアンギオスタチンペプチドフラグメント、それを含む薬学的組成物、ならびに炎症、結合組織変性、血管および新生物の状態の処置のためのその使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列ＨｉｓＡｓｎＡｒｇ（ＨＮＲ）を有する、単離された抗血管形成ペプチド。
【請求項２】
アミノ酸残基がＤ−もしくはＬ−立体配置を有するか、またはカルボキシル末端のアミド化、親油性の基、特に脂肪酸残基との結合、もしくは糖鎖形成によって化学的に修飾された、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
医薬として用いるための請求項１または２記載の抗血管形成ペプチド。
【請求項４】
請求項１〜２に記載のペプチドを含有する薬学的組成物。
【請求項５】
請求項１〜２に記載のペプチド、または請求項４記載の薬学的組成物の使用であって、慢性炎症、糖尿病、関節リウマチおよびアテローム性動脈硬化症を含む結合組織変性、原発性血管状態、特に黄斑変性のような目の障害、未成熟網膜症、角膜拒絶反応、血管性緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、心血管系および脳血管系状態、腫瘍、特に充実性腫瘍および白血病の予防または治療処置のための医薬を製造するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症、結合組織変性、血管および新生物の状態の処置のための医薬を製造するのに有用である、抗走化性、抗血管形成および抗腫瘍活性を有するアンギオスタチンペプチドフラグメントに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アンギオスタチン（ＡＳＴ）は、特殊な条件、たとえば充実性腫瘍のもとに体内で産生される抗血管形成性分子であり、その根底にある病理学的状態に対する恒常性維持の応答の表出である。それは、プラスミノーゲンのフラグメントとして産生され、内皮細胞その他の細胞標的におけるアポトーシスを誘導して（１）、原発性および転移性双方の腫瘍における血管の新形成ならびに成長を阻止する。アンギオスタチンで処置した動物では、毒性効果も耐性の発生も観察されていない。
【０００３】
この分子の特徴は、クリングルと呼ばれる官能性ドメインの存在である。アンギオスタチンおよびそのクリングルの特性は、多数の刊行物および特許出願、とりわけYou, W-K.らによるProtein Expression and Purification, 36 (2004)；米国特許願第２００４／００２４５９号明細書（US2004/002459）；米国特許第５８３７６８２号明細書（US5837682）；Bouma-Ter Stegee, J.C.A.らによるCritical Reviews in Eukaryotic Gene Expression, 11 (2001)に記載されている。その他の特許は、アンギオスタチンの配列の変種、およびそれを単離し、精製し、かつ合成によって製造する方法を開示している。たとえば米国特許第５８６１３７２号；第５６３９７２５号；第５７９２８４５号；第５８８５７９５号；第５８５４２０５号；第５８５４２２１号；第６０２４６８８号明細書を参照されたい。
【発明の開示】
【０００４】
発明の記載
アンギオスタチン分子の第３クリングルから一フラグメントを単離したところ、それは、好中球の走化性の阻害、内皮アポトーシスの誘導および血管形成阻害を再現すること、すなわちアンギオスタチン自体の代表的な効果が可能であった。
【０００５】
本発明の主題であるこのペプチドは、ＨＮＲなる配列（ＨｉｓＡｓｎＡｒｇ）を有していて、in vitroでの走化性アッセイ、マトリゲル（matrigel）スポンジを利用したin vivoでの血管形成アッセイ、および動物腫瘍モデルでこれを研究した。用いた手順は、「材料および方法」の項に記載されている。
【０００６】
図１−ａは、ヒト多形核球（ＰＭＮ）富裕化画分におけるＨＮＲの抗走化性活性を示している。グラフで観察できるとおり（棒「Ｘ」）、ペプチド活性は、アンギオスタチンおよびＩＬ−８双方に比して非常に高い（ｐ＜０．００４；マン・ホイトニー）。逆に、内皮ＨＵＶＥＣ（ＥＣ）および単核球上でアッセイしたとき、該ペプチドは、有意な活性を示さなかった。したがって、ＨＮＲの抗走化性作用は、ＰＭＮに対して極めて選択的である。
【０００７】
ＡＳＴは、ＡＴＰ合成酵素の不活性化によって内皮のアポトーシスを誘導することが知られている。そのため、ＨＵＶＥＣに対するＨＮＲのアポトーシス促進作用（pro-apoptotic action）を試験した。図１は、２．５μg/mlのペプチドＨＮＲによる処理の８時間後の遊離ヌクレオソームの有意な増加を示している。一方、ＰＭＮまたはＰＢＭＣのいずれを用いたときも、有意な結果は、全く得られなかった。したがって、ＨＮＲによるアポトーシスの誘導は、内皮細胞について選択的である。
【０００８】
抗血管形成活性を、図２−ａに示す。マウスで誘導される血管形成は、ＨＮＲによって強く阻害される（ｐ＜０．０２）が、アンギオスタチンよりやや低い程度であった。実験完了後に、スポンジの組織学的制御も実施して、細胞性、血管形成の程度、およびその形態学を確認した（図２−ｂ）。細胞性、サンプルの血管化、およびマトリゲルスポンジ中のヘモグロビン測定によって得られた結果は、完全に整合した（図２−ｂ）。
【０００９】
最後に、ヌードマウスのカポジ肉腫（ＫＳ）細胞移植片モデルにおいて、ＨＮＲペプチドが腫瘍成長を妨げる能力を調べた。細胞接種後４日ごとの該ペプチドの腹腔内投与は、腫瘍の成長を、培地のみに比して減速することが観察された（ｐ＜０．０２；マン・ホイトニー、図３、曲線ＨＮＲ）。実験終点での腫瘍の重量は、この結果を確認した。
【００１０】
治療に用いるには、ペプチドＨＮＲを、薬学的に許容され得る賦形剤および／または担体と組み合わせるのが好ましい。更なる態様では、本発明は、ペプチドＨＮＲを含有する薬学的組成物であって、経口または非経口投与、特に皮下、静脈内、筋内、直腸、目、鼻、局所、子宮内もしくは膣経路による投与に適した薬学的組成物に関する。該組成物は、固体、たとえばカプセル剤、錠剤または顆粒剤；液体、たとえば液剤、懸濁剤、シロップ剤、滴剤、チンキ剤、噴霧剤またはエアゾル；半固体、たとえばクリーム剤、軟膏またはゲルであることができる。該ペプチドの投与量は、処置しようとする疾患または障害の重篤度はもとより、対象者の年齢および体重または投与経路のような要因に左右されることになる。原則として、ヒトまたは動物の処置には、０．０１〜２５０mg/kg、好ましくは０．１〜１００mg/kgにわたるペプチドの量が用いられることになる。
【００１１】
本発明のペプチドおよびその薬学的組成物は、慢性炎症、糖尿病、関節リウマチおよびアテローム性動脈硬化症を含む結合組織変性、原発性血管状態、特に黄斑変性のような目の障害、未成熟網膜症、角膜拒絶反応、血管性緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、心血管系および脳血管系状態、腫瘍、特に充実性腫瘍および白血病の予防または治療処置に用いることができる。
【００１２】
アンギオスタチンと比較すると、本発明のペプチドは、より安定であり、生物学的利用能が高く、すべての標的組織に到達し、高純度（細菌性混入物の不在）および低原価で製造するのが容易である。
【００１３】
ＨＮＲペプチドは、確立された手順［Stuart & Young, 1984, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chemical Co.；Tam et al., Am. Soc., 1983, 105: 6442；Merrifield, 1979, The Peptides, Gross and Meihofer eds. NY Academic Press, 1-284］に従って、溶液中でか、固相でか、または自動化された合成装置を用いて合成することができる。あるいは、該ペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって製造してもよい［Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CSH Press, CSH, NY, 1982またはAusbel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987］。ＨＮＲなる配列内のアミノ酸残基は、ＤもしくはＬの立体配置をなしてもよいか、あるいはたとえばカルボキシル末端のアミド化、親油性の基（すなわち脂肪酸残基）との結合、糖鎖形成、または他の分子との連結によって、ペプチド活性の様相もしくは生物学的利用能を改善するよう化学的に修飾することができる。
【００１４】
図面の説明
図１−ａ  多形核球での走化性。移動したＰＭＮ細胞を計数し（ｙ軸）、その数を、デンシトメトリー法によって確認した（図示せず）。ＳＦＭ＝無血清培地；ＩＬ−８＝走化性因子として用いたインターロイキン８。
図１−ｂ  ＨＵＶＥＣで誘導されるアポトーシス。処置の８時間後に、遊離ヌクレオソームを調べた。ＡＳＴ＝アンギオスタチン；Ｖｉｎｃ＝ビンクリスチン（２５mM：正の対照）；ＣＴＬ＝非処置細胞（ブランク）。ＨＮＲ２．５および５は、２．５および５μg/mlのＨＮＲ濃度を表す。
図２−ａ  in vivoでの血管形成。マトリゲルペレット中のヘモグロビン含量を、血管形成の指標として横軸に報告した。ＶＴＨ＝血管形成促進剤として用いたＶｅｇｆ、ＴＮＦ、ヘパリン；ＡＳＴ＝アンギオスタチン；Ｘ＝ＨＮＲ。
図２−ｂ  マトリゲルスポンジの組織学的分析。図は、ヘマトキシリン−エオシンで染色した切片を示す。化学的誘引物質のＶＴＨのみ（ＶＴＨのＣＴＲＬ）と比較すると、ＨＮＲサンプルでは血管の欠如、および乏しい細胞浸潤物を観察することができる。
図３  腫瘍成長の阻害。実験は、２５日目に終了した。ＣＴＲＬ−ペプチドは、配列ＡｌａＳｅｒＡｌａを有する対照ペプチドである。ＰＢＳ＝ＰＢＳ＋賦形剤として用いた０．１％ＢＳＡ。
【００１５】
材料および方法
腫瘍の阻害
ＣＤ１系ヌードマウスを３群に分け、一群には、ＰＢＳ−ＢＳＡ１００μl中マウス１匹あたり５０μgのＨＮＲペプチド（Calbiochem, La Jolla, CA）を腹腔内注射し、対照群には、賦形剤を、第三の群には、ランダム配列のペプチド５０μgを注射した。ＡＳＴは、隔日に、ＨＮＲは、４日ごとに注射した。０日目に、ＫＳ  ＩＭＭ細胞5,000,000個を注射した。３１日目に、マウスを殺処分した。
【００１６】
カリパスで測定した体積を、式：
π／６ｘ長さｘ幅
を用いて算出した。
【００１７】
マトリゲルスポンジアッセイ
Ｃ５７ｂｌ系マウスにおけるマトリゲルスポンジによる血管形成アッセイを、（３）に記載されたとおりに、ＶＴＨまたはＫＳ細胞上清を走化性因子として用いて実施した。
【００１８】
ペプチド配列
ペプチド：ＨＮＲ
対照ペプチド（図２−ａにおける「ランダム」）：ＡｌａＳｅｒＡｌａ
【００１９】
マトリゲルスポンジの組織化学
動物から取り出した後、ペレットを、４％ＰＡＦ中で固定し、パラフィン包埋した。４μmの切片を、ヘマトキシリン−エオシンの標準的手順で染色した。
【００２０】
走化性−アポトーシス
このアッセイは、（４）に記載されたような４８穴チャンバー内で実施した。アポトーシスアッセイは、細胞死検出キット（Cell Death Detection Kit；Roche）を用い、製造者の指示に従って実施した。
【００２１】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１−ａ】多形核球での走化性を示す。
【図１−ｂ】ＨＵＶＥＣで誘導されるアポトーシスを示す。
【図２−ａ】in vivoでの血管形成を示す。
【図２−ｂ】マトリゲルスポンジの組織学的分析を示す。
【図３】腫瘍成長の阻害を示す。
【図１−ａ】
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【図１−ｂ】
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【図２−ａ】
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【図３】
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【図２−ｂ】
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【国際調査報告】
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