(57)【要約】  本発明は、酵素による能動的な除染、例えば神経作用物質の解毒のための新規な酵素及び方法を提供する。ある特徴では、本発明は、非ヘムクロロペルオキシダーゼ（nhCPO）活性を有する酵素、並びにリグニンの漂白及び分解のための方法を提供する。本発明は、ポリペプチド、核酸、感染性ビヒクル、形質導入若しくは感染細胞又は植物及び/又はトランスジェニック植物、及びそれらを使用して、例えば自己防衛的農薬耐性及び/又は除草剤耐性細胞又は植物を提供する方法を提供し、ある特徴では、本発明のポリペプチドは、P-S又はP-F結合を加水分解するように作用し、アセチルコリンエステラーゼ又はブチリルコリンエステラーゼを解毒する。ある特徴では、本発明は、広域性、物質特異性酸化及び加水分解活性を提供し、同様にV剤、G剤及びH剤の酸化又は加水分解について次亜ハロゲン酸塩生成を提供し、さらに生物剤（炭疽芽胞を含む）の殺滅のための酸化物（例えば二酸化塩素）及び反応性ラジカルを生成する酵素混合物又は組成物を提供する。
2009517002.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49、配列番号:51、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、配列番号:67、配列番号:69、配列番号:71、配列番号:73、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:79、配列番号:81、配列番号:83、配列番号:85、配列番号:87、配列番号:89、配列番号:91、配列番号:93、配列番号:95、配列番号:97、配列番号:99、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:105、配列番号:107、配列番号:109、配列番号:111、配列番号:113、配列番号:115、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:121、配列番号:123、配列番号:125、配列番号:127、配列番号:129、配列番号:131、配列番号:133、配列番号:135、配列番号:137、配列番号:139、配列番号:141、配列番号:143、配列番号:145、配列番号:147、配列番号:149、配列番号:151、配列番号:153、配列番号:155、配列番号:157、配列番号:159、配列番号:161、配列番号:163、配列番号:165、配列番号:167、配列番号:169、配列番号:171、配列番号:173、配列番号:175、配列番号:177、配列番号:179、配列番号:181、配列番号:183、配列番号:185、配列番号:187、配列番号:189、配列番号:191又は配列番号:193と少なくとも約25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、又はそれより大きい残基の領域にわたって少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は完全な（100％）配列同一性を有する配列を含む単離、合成又は組換え核酸であって、
エステラーゼ活性、有機リン酸エステラーゼ活性、有機リン酸ヒドロラーゼ活性、カルボキシルエステラーゼ活性、ハロペルオキシダーゼ活性、クロロペルオキシダーゼ（CPO）活性、ヘム型（hCPO）又は非ヘムクロロペルオキシダーゼ（nhCPO）活性、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性、デハロゲナーゼ活性、オキシドレダクターゼ活性、プロリダーゼ活性、イミドジペプチダーゼ活性、及び/又は有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードするか、又は、配列番号:2から配列番号:194を含む、配列表中の偶数の配列番号のいずれかを含む配列を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体を生成することができるポリペプチド又はペプチドをコードし、
場合によって前記配列同一性が配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、又は目視精査によって決定される、前記単離、合成又は組換え核酸；
（b）配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49、配列番号:51、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、配列番号:67、配列番号:69、配列番号:71、配列番号:73、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:79、配列番号:81、配列番号:83、配列番号:85、配列番号:87、配列番号:89、配列番号:91、配列番号:93、配列番号:95、配列番号:97、配列番号:99、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:105、配列番号:107、配列番号:109、配列番号:111、配列番号:113、配列番号:115、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:121、配列番号:123、配列番号:125、配列番号:127、配列番号:129、配列番号:131、配列番号:133、配列番号:135、配列番号:137、配列番号:139、配列番号:141、配列番号:143、配列番号:145、配列番号:147、配列番号:149、配列番号:151、配列番号:153、配列番号:155、配列番号:157、配列番号:159、配列番号:161、配列番号:163、配列番号:165、配列番号:167、配列番号:169、配列番号:171、配列番号:173、配列番号:175、配列番号:177、配列番号:179、配列番号:181、配列番号:183、配列番号:185、配列番号:187、配列番号:189、配列番号:191又は配列番号:193を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む単離、合成又は組換え核酸であって、
エステラーゼ活性、有機リン酸エステラーゼ活性、有機リン酸ヒドロラーゼ活性、カルボキシルエステラーゼ活性、ハロペルオキシダーゼ活性、クロロペルオキシダーゼ（CPO）活性、ヘム型（hCPO）又は非ヘムクロロペルオキシダーゼ（nhCPO）活性、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性、デハロゲナーゼ活性、オキシドレダクターゼ活性、プロリダーゼ活性、イミドジペプチダーゼ活性、及び/又は有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードするか、又は、配列番号:2から配列番号:194を含む、配列リスト中の偶数の配列番号のいずれかを含む配列を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体を生成することができるポリペプチド又はペプチドをコードし、
前記ストリンジェントな条件が、約65℃の温度にて約15分間の0.2ｘSSC中での洗浄を含む洗浄工程を含み、
場合によって、少なくとも20、30、40、50、60、75、100、150、200、225、250、275、300、350、400、500、600、700、800、900、1000若しくはそれより大きい残基、又は完全長の遺伝子若しくは転写物である、前記単離、合成又は組換え核酸；
（c）配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50、配列番号:52、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66、配列番号:68、配列番号:70、配列番号:72、配列番号:74、配列番号:76、配列番号:78、配列番号:80、配列番号:82、配列番号:84、配列番号:86、配列番号:88、配列番号:90、配列番号:92、配列番号:94、配列番号:96、配列番号:98、配列番号:100、配列番号:102、配列番号:104、配列番号:106、配列番号:108、配列番号:110、配列番号:112、配列番号:114、配列番号:116、配列番号:118、配列番号:120、配列番号:122、配列番号:124、配列番号:126、配列番号:128、配列番号:130、配列番号:132、配列番号:134、配列番号:136、配列番号:138、配列番号:140、配列番号:142、配列番号:143、配列番号:146、配列番号:148、配列番号:150、配列番号:152、配列番号:154、配列番号:156、配列番号:158、配列番号:160、配列番号:162、配列番号:164、配列番号:166、配列番号:168、配列番号:170、配列番号:172、配列番号:174、配列番号:176、配列番号:178、配列番号:180、配列番号:182、配列番号:184、配列番号:186、配列番号:188、配列番号:190、配列番号:192又は配列番号:194の20、30、40、50、60、75、100、150、200、225、250、275、300、350、400又はそれより大きい残基に記載の配列を有するポリペプチド又はペプチドをコードする核酸配列を含む単離、合成又は組換え核酸であって、
エステラーゼ活性、有機リン酸エステラーゼ活性、有機リン酸ヒドロラーゼ活性、カルボキシルエステラーゼ活性、ハロペルオキシダーゼ活性、クロロペルオキシダーゼ（CPO）活性、ヘム型（hCPO）又は非ヘムクロロペルオキシダーゼ（nhCPO）活性、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性、デハロゲナーゼ活性、オキシドレダクターゼ活性、プロリダーゼ活性、イミドジペプチダーゼ活性、及び/又は有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードするか、又は、配列番号:2から配列番号:194を含む、配列リスト中の偶数の配列番号のいずれかを含む配列を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体を生成することができるポリペプチド又はペプチドをコードする、前記単離、合成又は組換え核酸；又は
（d）（a）、（b）又は（c）と相補的な核酸配列を含む、単離、合成又は組換え核酸。
【請求項２】
配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49、配列番号:51、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、配列番号:67、配列番号:69、配列番号:71、配列番号:73、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:79、配列番号:81、配列番号:83、配列番号:85、配列番号:87、配列番号:89、配列番号:91、配列番号:93、配列番号:95、配列番号:97、配列番号:99、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:105、配列番号:107、配列番号:109、配列番号:111、配列番号:113、配列番号:115、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:121、配列番号:123、配列番号:125、配列番号:127、配列番号:129、配列番号:131、配列番号:133、配列番号:135、配列番号:137、配列番号:139、配列番号:141、配列番号:143、配列番号:145、配列番号:147、配列番号:149、配列番号:151、配列番号:153、配列番号:155、配列番号:157、配列番号:159、配列番号:161、配列番号:163、配列番号:165、配列番号:167、配列番号:169、配列番号:171、配列番号:173、配列番号:175、配列番号:177、配列番号:179、配列番号:181、配列番号:183、配列番号:185、配列番号:187、配列番号:189、配列番号:191、又は配列番号:193に記載の配列を含む、請求項1に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項３】
配列比較アルゴリズムが、BLASTバージョン2.2.2アルゴリズムであり、ここでフィルタリング設定がblastall p blastp d“nr pataa” F Fに設定され、他の全てのオプションが規定値に設定される、請求項1に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項４】
酵素活性が解毒又は除染活性を含む、請求項1に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項５】
酵素活性がV剤の加水分解又は除染を含む、請求項1に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項６】
酵素活性がV剤の加水分解又は除染を含むか、又は酵素活性がハロペルオキシダーゼ活性、又はメチルホスホノフルオリデート若しくはチオリン酸エステルの加水分解を触媒する含む活性、又はその組合せを含む、請求項5に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項７】
ハロペルオキシダーゼ活性がクロロペルオキシダーゼ活性を含む、請求項6に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項８】
V剤が、VX(O-エチル-S-[2(ジイソプロピルアミノ)エチル]メチルホスホノチオエート又はメチルホスホノチオ酸) 、VE(O-エチル-S-[2-(ジエチルアミノ)エチル]エチルホスホノチオエート)、VG(O,O-ジエチル-S-[2-(ジエチルアミノ)エチル]ホスホロチオエート)、VM(O-エチル-S-[2-(ジエチルアミノ)エチル]メチルホスホノチオエート)、VR(ホスホノチオ酸)ソヴィエトV-ガス（ロシアVX）、テトリソ(O,O-ジイソプロピルS-(2-ジイソプロピルアミノエチル)ホスホロチオレート)、又はホスホリルチオコリン含有化合物を含む、請求項5に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項９】
V剤を加水分解又は除染する酵素が、配列番号:1、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:89、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:127、配列番号:151、配列番号:167、配列番号:171、配列番号:187、若しくは配列番号:191に記載の配列を有する核酸によってコードされるポリペプチド、又は配列番号:2、配列番号:76、配列番号:78、配列番号:90、配列番号:118、配列番号:120、配列番号:128、配列番号:152、配列番号:168、配列番号:172、配列番号:189若しくは配列番号:192に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項5に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項１０】
酵素活性がG剤の加水分解又は除染を含む、請求項1に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項１１】
G剤の加水分解又は除染を含む酵素活性が有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性を含む、請求項10に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項１２】
G剤が、タブン（GA）、サリン（メチルホスホノフルオリデート）（GB）、ソマン（GD）、シクロサリン（GF）又はその組合せを含む、請求項10に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項１３】
G剤を加水分解又は除染する酵素が、配列番号:73、配列番号:93、配列番号:95、配列番号:97、配列番号:99、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:105、配列番号:107、配列番号:109、配列番号:111、配列番号:113、配列番号:115、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:121、配列番号:123、配列番号:125、配列番号:127、配列番号:129、配列番号:131、配列番号:133、配列番号:135、配列番号:137、配列番号:139、配列番号:141、配列番号:143、配列番号:145、配列番号:147、配列番号:149、配列番号:151、配列番号:153、配列番号:155、配列番号:157、配列番号:159、配列番号:161、配列番号:163、配列番号:165、配列番号:167、配列番号:169、配列番号:171、配列番号:173、配列番号:175、配列番号:177、配列番号:179、配列番号:181、配列番号:183、配列番号:185、配列番号:187若しくは配列番号:191に記載の配列を有する核酸によってコードされるポリペプチド；又はプロリダーゼ活性若しくは有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性を有し、さらに配列番号:193に記載の配列を有する核酸によってコードされるか又は配列番号:194に記載の配列を有するポリペプチドを含む、請求項5に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項１４】
酵素活性がH剤の加水分解又は除染を含む、請求項1に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項１５】
H剤がクロロペルオキシダーゼ活性、デハロゲナーゼ活性又はその組合せを含む、請求項14に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項１６】
H剤が、マスタードガス、1 1'チオビス[2クロロエタン]ビス-(2-クロロエチル)スルフィド、ベータ,ベータ'ジクロロエチルスルフィド、2,2'ジクロロエチルスルフィド、ビス(ベータ-クロロエチル)スルフィド、1-クロロ-2(ベータ-クロロジエチルチオ)エタン、又はその組合せを含む、請求項14に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項１７】
H剤を加水分解又は除染する酵素が、クロロペルオキシダーゼをコードし、さらに配列番号:1、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65若しくは配列番号:67に記載の配列を有する核酸によってコードされるポリペプチドを含むか、又は前記酵素が配列番号:2、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66若しくは配列番号:68に記載のアミノ酸配列を含むか、又は
デハロゲナーゼをコードし、かつ配列番号:69若しくは配列番号:91に記載の配列を有する核酸によってコードされるポリペプチドを含むか、又は前記酵素が配列番号:70若しくは配列番号:92に記載のアミノ酸配列を有する、請求項14に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項１８】
酵素活性が生物剤の加水分解又は除染を含む、請求項1に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項１９】
酵素活性がクロロペルオキシダーゼ活性を含む、請求項18に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項２０】
生物剤がグラム陰性芽胞である、請求項18に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項２１】
グラム陰性芽胞が炭疽（又は炭疽菌（Bacillus anthracis））芽胞を含む、請求項20に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項２２】
生物剤を加水分解又は除染する酵素が、配列番号:1、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65若しくは配列番号:67に記載の配列を有する核酸によってコードされるポリペプチドを含むか、又は前記酵素が、配列番号:2、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66若しくは配列番号:68に記載のアミノ酸配列を有する、請求項18に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項２３】
酵素活性がP-F結合の加水分解又は除染を含む、請求項1に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項２４】
P-F結合の加水分解又は除染活性を有するポリペプチドが、配列番号:71、配列番号:73、配列番号:93、配列番号:95、配列番号:97、配列番号:99、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:105、配列番号:107、配列番号:109、配列番号:111、配列番号:113、配列番号:115、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:121、配列番号:123、配列番号:125、配列番号:127、配列番号:129、配列番号:131、配列番号:133、配列番号:135、配列番号:137、配列番号:139、配列番号:141、配列番号:143、配列番号:145、配列番号:147、配列番号:149、配列番号:151、配列番号:153、配列番号:155、配列番号:157、配列番号:159、配列番号:161、配列番号:163、配列番号:165、配列番号:167、配列番号:169、配列番号:171、配列番号:173、配列番号:175、配列番号:177、配列番号:179、配列番号:181、配列番号:183、配列番号:185、配列番号:187、配列番号:191若しくは配列番号:193に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:72、配列番号:74、配列番号:94、配列番号:96、配列番号:98、配列番号:100、配列番号:102、配列番号:104、配列番号:106、配列番号:108、配列番号:110、配列番号:112、配列番号:114、配列番号:116、配列番号:118、配列番号:120、配列番号:122、配列番号:124、配列番号:126、配列番号:128、配列番号:130、配列番号:132、配列番号:134、配列番号:136、配列番号:138、配列番号:140、配列番号:142、配列番号:144、配列番号:146、配列番号:148、配列番号:150、配列番号:152、配列番号:154、配列番号:156、配列番号:158、配列番号:160、配列番号:162、配列番号:164、配列番号:166、配列番号:168、配列番号:170、配列番号:172、配列番号:174、配列番号:176、配列番号:178、配列番号:180、配列番号:182、配列番号:184、配列番号:186、配列番号:188、配列番号:192若しくは配列番号:194に記載のアミノ酸配列を有する、請求項23に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項２５】
酵素活性がP-S結合の加水分解又は除染を含む、請求項1に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項２６】
P-S結合の加水分解又は除染活性を有するポリペプチドが、配列番号:1、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:89、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:127、配列番号:151、配列番号:167、配列番号:171、配列番号:187若しくは配列番号:191に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:2、配列番号:76、配列番号:78、配列番号:90、配列番号:118、配列番号:120、配列番号:128、配列番号:152、配列番号:168、配列番号:172、配列番号:188若しくは配列番号:192に記載のアミノ酸配列を有する、請求項25に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項２７】
酵素活性が有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性を含む、請求項1に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項２８】
有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性を有する酵素が、配列番号:193に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:194に記載のアミノ酸配列を有する、請求項27に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項２９】
酵素活性がアミノペプチダーゼ活性を含む、請求項1に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項３０】
アミノペプチダーゼ活性を有する酵素が、配列番号:189に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:190に記載のアミノ酸配列を有する、請求項27に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項３１】
酵素活性がカルボキシルエステラーゼ活性を含む、請求項1に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項３２】
カルボキシルエステラーゼ活性を有する酵素が、配列番号:73、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:79、配列番号:81、配列番号:83、配列番号:85、配列番号:87又は配列番号:89に記載の配列を有する核酸によってコードされる、請求項27に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項３３】
酵素活性がヘム型ペルオキシダーゼ活性を含む、請求項1に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項３４】
ヘム型ペルオキシダーゼ活性を有する酵素が、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49若しくは配列番号:51に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は前記酵素が、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50若しくは配列番号:52に記載の配列を有する、請求項33に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項３５】
酵素がヘム型クロロペルオキシダーゼ活性を有し、さらに配列番号:1に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:2に記載のアミノ酸配列を有する、請求項34に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項３６】
酵素活性が非ヘム型ペルオキシダーゼ活性を含む、請求項1に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項３７】
非ヘム型クロロペルオキシダーゼ活性を有する酵素が、配列番号:1、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、若しくは配列番号:67に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は前記酵素が、配列番号:2、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66、若しくは配列番号:68に記載のアミノ酸配列を有する、請求項37に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項３８】
酵素活性がデハロゲナーゼ活性を含む、請求項1に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項３９】
デハロゲナーゼ活性を有する酵素が、配列番号:69若しくは配列番号:91に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:70若しくは配列番号:92に記載のアミノ酸配列を有する、請求項38に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項４０】
酵素活性がジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性を含む、請求項1に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項４１】
ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性を有する酵素が、配列番号:71に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:72に記載のアミノ酸配列を有する、請求項38に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項４２】
酵素活性が有機リン酸エステラーゼ活性を含み、P-S又はP-F結合を加水分解し、さらにアセチルコリンエステラーゼ-又はブチリルコリンエステラーゼ-阻害物質を解毒することができる、請求項1に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項４３】
酵素活性がハロゲン化反応を含み、過酸化水素及び塩化物、臭化物又はヨウ化物から次亜ハロゲン酸塩を生成する、請求項1に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項４４】
酵素活性が過酸化水素から有機基質への酸素の転移を触媒することを含む、請求項1に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項４５】
酵素活性がリグニンの化学漂白を含む、請求項44に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項４６】
酵素活性が、パルプ又は紙の製造過程におけるリグニンの化学漂白を含む、請求項45に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項４７】
酵素活性が農薬、除草剤及び/又は殺虫剤の解毒を含む、請求項1に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項４８】
農薬が、デメトン-S、デメトン-S-メチル、デメトン-S-メチルスルホン、デメトン-メチル、パラチオン、フォスメト、カルボフェノチオン、ベノキサフォス、アジンフォス-メチル、アジンフォス-エチル、アミトン、アミジチオン、シアントエート、ジアリフォス、ジメトエート、ジオキサチオン、ジスルフォトン、エンドチオン、エチオン、エトエート-メチル、フォルモチオン、マラチオン、メルカルバム、オメトエート、オキシデプロフォス、オキシジスルフォトン、フェンカプトン、フォレート、フォサロン、プロチダチオン、プロトエート、ソファミド、チオメトン、ヴァミドチオン、メタミドフォス、又はその組合せを含む、請求項1に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項４９】
核酸が熱安定性又は耐熱性酵素又はタンパク質をコードする、請求項48に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項５０】
酵素又はタンパク質が、約37℃から約95℃、又は約55℃から約85℃、又は約70℃から約75℃、又は約70℃から約95℃、又は約90℃から約95℃の温度範囲を含む条件下で活性を維持するか、又は37℃より高く約95℃、55℃より高く約85℃、又は約70℃から約75℃、又は約90℃より高く約95℃までの温度範囲、又は約1℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約95℃の温度範囲を含む条件下で酵素活性を維持する、請求項49に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項５１】
酵素又はタンパク質が、37℃より高く約95℃まで、55℃より高く約85℃まで、90℃より高く約95℃までの範囲の温度に暴露した後、又は約1℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約95℃、約55℃から約85℃、約70℃から約75℃、又は約90℃から約95℃までの範囲の温度に暴露した後で活性を維持する、請求項49に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項５２】
ヒドロラーゼ活性、エステラーゼ活性、有機リン酸ヒドロラーゼ活性、有機リン酸エステラーゼ活性、カルボキシルエステラーゼ活性、ハロペルオキシダーゼ活性、ヘム型（hCPO）若しくは非ヘムクロロペルオキシダーゼ（nhCPO）活性、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性、デハロゲナーゼ活性、オキシドレダクターゼ活性、プロリダーゼ活性、イミドジペプチダーゼ活性、又は有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性を有するポリペプチドをコードする核酸を同定するための核酸プローブであって、
（a）請求項1に記載の配列、又は
（b）配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49、配列番号:51、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、配列番号:67、配列番号:69、配列番号:71、配列番号:73、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:79、配列番号:81、配列番号:83、配列番号:85、配列番号:87、配列番号:89、配列番号:91、配列番号:93、配列番号:95、配列番号:97、配列番号:99、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:105、配列番号:107、配列番号:109、配列番号:111、配列番号:113、配列番号:115、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:121、配列番号:123、配列番号:125、配列番号:127、配列番号:129、配列番号:131、配列番号:133、配列番号:135、配列番号:137、配列番号:139、配列番号:141、配列番号:143、配列番号:145、配列番号:147、配列番号:149、配列番号:151、配列番号:153、配列番号:155、配列番号:157、配列番号:159、配列番号:161、配列番号:163、配列番号:165、配列番号:167、配列番号:169、配列番号:171、配列番号:173、配列番号:175、配列番号:177、配列番号:179、配列番号:181、配列番号:183、配列番号:185、配列番号:187、配列番号:189、配列番号:191又は配列番号:193記載の配列、
の少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250又はそれより大きい連続する塩基を含む核酸の少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250又はそれより大きい連続する塩基を含み、
結合又はハイブリダイゼーションによって前記核酸を同定する、前記核酸プローブ。
【請求項５３】
プローブが、少なくとも約10から50、約20から60、約30から70、約40から80、約60から100、又は約50から150の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項49に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項５４】
酵素活性を有するポリペプチドをコードするか、又はタンパク質をコードする核酸を増幅する増幅プライマー対であって、前記プライマー対が、
（a）請求項1に記載の配列、若しくはその部分配列を含む核酸、又は
（b）配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49、配列番号:51、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、配列番号:67、配列番号:69、配列番号:71、配列番号:73、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:79、配列番号:81、配列番号:83、配列番号:85、配列番号:87、配列番号:89、配列番号:91、配列番号:93、配列番号:95、配列番号:97、配列番号:99、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:105、配列番号:107、配列番号:109、配列番号:111、配列番号:113、配列番号:115、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:121、配列番号:123、配列番号:125、配列番号:127、配列番号:129、配列番号:131、配列番号:133、配列番号:135、配列番号:137、配列番号:139、配列番号:141、配列番号:143、配列番号:145、配列番号:147、配列番号:149、配列番号:151、配列番号:153、配列番号:155、配列番号:157、配列番号:159、配列番号:161、配列番号:163、配列番号:165、配列番号:167、配列番号:169、配列番号:171、配列番号:173、配列番号:175、配列番号:177、配列番号:179、配列番号:181、配列番号:183、配列番号:185、配列番号:187、配列番号:189、配列番号:191又は配列番号:193の少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250又はそれより大きい連続する塩基を含む核酸を含む核酸、
を増幅することができ、前記増幅プライマー対のメンバーが、前記配列の少なくとも約10から50の連続する塩基、又は前記配列の約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40若しくはそれより大きい連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含む、前記増幅プライマー対。
【請求項５５】
増幅プライマー対が、ヒドロラーゼ活性、エステラーゼ活性、有機リン酸ヒドロラーゼ活性、有機リン酸エステラーゼ活性、カルボキシルエステラーゼ活性、ハロペルオキシダーゼ活性、ヘム型（hCPO）若しくは非ヘムクロロペルオキシダーゼ（nhCPO）活性、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性、デハロゲナーゼ活性、オキシドレダクターゼ活性、プロリダーゼ活性、イミドジペプチダーゼ活性、又は有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅する、請求項54に記載の増幅プライマー対。
【請求項５６】
（a）又は（b）の核酸の最初の（5'の）約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、42、33、34、35又はそれより大きい残基によって示される配列を有する第一のメンバー、及び前記第一のメンバーの相補鎖の最初の（5'の）約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、42、33、34、35又はそれより大きい残基によって示される配列を有する第二のメンバーを含む、請求項54に記載の増幅プライマー対。
【請求項５７】
請求項54〜56のいずれか１項に記載の増幅プライマー対を用いるポリヌクレオチドの増幅によって生成される、酵素コード核酸又はタンパク質コード核酸。
【請求項５８】
増幅がポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による、請求項57に記載の酵素コード核酸又はタンパク質コード核酸。
【請求項５９】
核酸が遺伝子ライブラリーの増幅によって生成され、さらに場合によって前記遺伝子ライブラリーが環境ライブラリーである、請求項57に記載の酵素コード核酸又はタンパク質コード核酸。
【請求項６０】
酵素活性を有するか、請求項57に記載の配列を有する核酸によってコードされる、単離、合成又は組換えポリペプチド。
【請求項６１】
請求項54〜56のいずれか１項に記載の増幅プライマー対を用いて鋳型核酸を増幅することを含む、酵素活性を有するポリペプチドをコードするか、又はタンパク質をコードする核酸を増幅する方法であって、前記増幅プライマー対が、請求項1に記載の核酸配列又はその部分配列を増幅させることができる、前記核酸の増幅方法。
【請求項６２】
請求項1又は57に記載の配列を含む核酸を含む発現カセット。
【請求項６３】
請求項1又は57に記載の配列を含む核酸を含むベクター。
【請求項６４】
請求項1又は57に記載の配列を含む核酸を含むクローニングビヒクルであって、前記クローニングビヒクルが、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージ又は人工染色体である、前記クローニングビヒクル。
【請求項６５】
ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター又はアデノ関連ウイルスベクターを含む、請求項64に記載のクローニングビヒクル。
【請求項６６】
請求項1又は57に記載の配列を含む、細菌人工染色体（BAC）、バクテリオファージP1-由来ベクター（PAC）、酵母人工染色体（YAC）、又は哺乳動物人工染色体（MAC）。
【請求項６７】
請求項1又は57に記載の配列を含む核酸、又は請求項62に記載の発現カセット、又は請求項64に記載のクローニングビヒクル、又は請求項66に記載の細菌人工染色体（BAC）、バクテリオファージP1-由来ベクター（PAC）、酵母人工染色体（YAC）若しくは哺乳動物人工染色体（MAC）を含む形質転換細胞。
【請求項６８】
細菌細胞、哺乳動物細胞、菌類細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は植物細胞である、請求項67に記載の形質転換細胞。
【請求項６９】
請求項1又は57に記載の配列を含む非ヒトトランスジェニック動物であって、場合によって前記動物がマウス、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ又はラットである、前記非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項７０】
請求項1又は57に記載の配列を含むトランスジェニック植物であって、場合によって前記植物が、トウモロコシ、ソルガム、ジャガイモ、トマト、コムギ、脂肪種子植物、ナタネ、ダイズ、イネ、オオムギ、牧草、又はタバコである、前記トランスジェニック植物。
【請求項７１】
請求項1又は57に記載の配列を含むトランスジェニック種子であって、場合によって前記種子が、トウモロコシの種子、コムギの穀粒、脂肪種子、ナタネ、ダイズ種子、ヤシ核、ヒマワリ種子、ゴマ種子、コメ、オオムギ、落花生、又はタバコ種子である、前記トランスジェニック種子。
【請求項７２】
請求項1若しくは57に記載の配列又はその部分配列に対して相補的であるか、又は前記配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、場合によって前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、約10から50、約20から60、約30から70、約40から80、又は約60から100塩基の間の長さを有する、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７３】
細胞内の酵素コードメッセージ又はタンパク質コードメッセージの翻訳を阻害する方法であって、前記方法が、請求項1又は57に記載の配列に対して相補的であるか、又は前記配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に投与するか、又は細胞内で発現させることを含む、前記メッセージの翻訳を阻害する方法。
【請求項７４】
請求項1又は57に記載の配列の部分配列を含む二本鎖阻害性RNA（RNAi）分子であって、
場合によって前記RNAiがsiRNA又はmiRNA分子であるか、又は、
場合によって前記RNAiが約11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又はそれより大きい長さの二本鎖ヌクレオチドであり、
場合によって前記RNAiがsiRNA又はmiRNA分子である、
前記二本鎖阻害性分子。
【請求項７５】
請求項74に記載の二本鎖阻害性RNA（RNAi）を細胞に投与するか、又は前記RNAiを細胞で発現させることを含む、酵素又はタンパク質の発現を阻害する方法。
【請求項７６】
（a）配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50、配列番号:52、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66、配列番号:68、配列番号:70、配列番号:72、配列番号:74、配列番号:76、配列番号:78、配列番号:80、配列番号:82、配列番号:84、配列番号:86、配列番号:88、配列番号:90、配列番号:92、配列番号:94、配列番号:96、配列番号:98、配列番号:100、配列番号:102、配列番号:104、配列番号:106、配列番号:108、配列番号:110、配列番号:112、配列番号:114、配列番号:116、配列番号:118、配列番号:120、配列番号:122、配列番号:124、配列番号:126、配列番号:128、配列番号:130、配列番号:132、配列番号:134、配列番号:136、配列番号:138、配列番号:140、配列番号:142、配列番号:143、配列番号:146、配列番号:148、配列番号:150、配列番号:152、配列番号:154、配列番号:156、配列番号:158、配列番号:160、配列番号:162、配列番号:164、配列番号:166、配列番号:168、配列番号:170、配列番号:172、配列番号:174、配列番号:176、配列番号:178、配列番号:180、配列番号:182、配列番号:184、配列番号:186、配列番号:188、配列番号:190、配列番号:192又は配列番号:194と少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、又はそれより大きい残基の領域にわたって、少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％若しくはそれより高い、又は完全な（100％）配列同一性を有する単離、合成又は組換えポリペプチドであって、場合によって前記配列同一性が配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、又は目視精査によって決定される、前記単離、合成又は組換えポリペプチド、
又は、（ii）請求項1に記載の核酸によってコードされる単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチドであって、
前記（i）又は（ii）のポリペプチド又はペプチドは、エステラーゼ活性、有機リン酸エステラーゼ活性、有機リン酸ヒドロラーゼ活性、カルボキシルエステラーゼ活性、ハロペルオキシダーゼ活性、クロロペルオキシダーゼ（CPO）活性、ヘム型（hCPO）又は非ヘムクロロペルオキシダーゼ（nhCPO）活性、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性、デハロゲナーゼ活性、オキシドレダクターゼ活性、プロリダーゼ活性、イミドジペプチダーゼ活性、及び/又は有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性を有するか、又は、配列番号:2から配列番号:194を含む配列リスト中の偶数の配列番号のいずれかを含む配列を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体を生成することができるポリペプチド又はペプチドをコードする、前記単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項７７】
配列比較アルゴリズムが、BLASTバージョン2.2.2アルゴリズムを含み、ここでフィルタリング設定がblastall p blastp d “nr pataa” F Fに設定され、他の全てのオプションが規定値に設定される、請求項1に記載の単離、合成又は組換え核酸。
【請求項７８】
酵素活性が解毒又は除染活性を含む、請求項76に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項７９】
酵素活性がV剤の加水分解又は除染を含む、請求項76に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項８０】
V剤の加水分解又は除染を含む酵素活性が、ハロペルオキシダーゼ活性、メチルホスホノフルオリデート若しくはチオリン酸エステルの加水分解の触媒を含む活性、又はその組合せを含む、請求項79に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項８１】
ハロペルオキシダーゼ活性がクロロペルオキシダーゼ活性を含む、請求項80に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項８２】
V剤が、VX(O-エチル-S-[2(ジイソプロピルアミノ)エチル]メチルホスホノチオエート又はメチルホスホノチオ酸) 、VE(O-エチル-S-[2-(ジエチルアミノ)エチル]エチルホスホノチオエート)、VG(O,O-ジエチル-S-[2-(ジエチルアミノ)エチル]ホスホロチオエート)、VM(O-エチル-S-[2-(ジエチルアミノ)エチル]メチルホスホノチオエート)、VR(ホスホノチオ酸)ソヴィエトV-ガス（ロシアVX）、テトリソ(O,O-ジイソプロピルS-(2-ジイソプロピルアミノエチル)ホスホロチオレート)、又はホスホリルチオコリン含有化合物を含む、請求項79に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項８３】
V剤を加水分解又は除染する酵素が、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:89、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:127、配列番号:151、配列番号:167、配列番号:171、配列番号:187、又は配列番号:191に記載の配列を有する核酸によってコードされるポリペプチドを含む、請求項79に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項８４】
酵素活性がG剤の加水分解又は除染を含む、請求項76に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項８５】
G剤の加水分解又は除染を含む酵素活性が有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性又はジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性を含む、請求項84に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項８６】
G剤が、タブン（GA）、サリン（メチルホスホノフルオリデート）（GB）、ソマン（GD）、シクロサリン（GF）又はその組合せを含む、請求項84に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項８７】
G剤を加水分解又は除染する酵素が、配列番号:71、配列番号:73、配列番号:93、配列番号:95、配列番号:97、配列番号:99、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:105、配列番号:107、配列番号:109、配列番号:111、配列番号:113、配列番号:115、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:121、配列番号:123、配列番号:125、配列番号:127、配列番号:129、配列番号:131、配列番号:133、配列番号:135、配列番号:137、配列番号:139、配列番号:141、配列番号:143、配列番号:145、配列番号:147、配列番号:149、配列番号:151、配列番号:153、配列番号:155、配列番号:157、配列番号:159、配列番号:161、配列番号:163、配列番号:165、配列番号:167、配列番号:169、配列番号:171、配列番号:173、配列番号:175、配列番号:177、配列番号:179、配列番号:181、配列番号:183、配列番号:185、配列番号:187又は配列番号:191に記載の配列を有する核酸によってコードされるるポリペプチドを含むか；又は配列番号:72、配列番号:74、配列番号:94、配列番号:96、配列番号:98、配列番号:100、配列番号:102、配列番号:104、配列番号:106、配列番号:108、配列番号:110、配列番号:112、配列番号:114、配列番号:116、配列番号:118、配列番号:120、配列番号:122、配列番号:124、配列番号:126、配列番号:128、配列番号:130、配列番号:132、配列番号:134、配列番号:136、配列番号:138、配列番号:140、配列番号:142、配列番号:144、配列番号:146、配列番号:148、配列番号:150、配列番号:152、配列番号:154、配列番号:156、配列番号:158、配列番号:160、配列番号:162、配列番号:164、配列番号:166、配列番号:168、配列番号:170、配列番号:172、配列番号:174、配列番号:176、配列番号:178、配列番号:180、配列番号:182、配列番号:184、配列番号:186、配列番号:188又は配列番号:192に記載のアミノ酸配列を有するか、又は
プロリダーゼ活性又は有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性を有しさらに配列番号:193に記載の配列を有する核酸によってコードされるポリペプチドを含むか、又は配列番号:194に記載の配列を有するか；又は配列番号:71に記載の核酸によってコードされるジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性有するポリペプチドを含むか、又は配列番号:72に記載のアミノ酸配列を有する、請求項84に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項８８】
酵素活性がH剤の加水分解又は除染を含む、請求項76に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項８９】
H剤がクロロペルオキシダーゼ活性、デハロゲナーゼ活性又はその組合せを含む、請求項88に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項９０】
H剤が、マスタードガス、1 1'チオビス[2クロロエタン]ビス-(2-クロロエチル)スルフィド、ベータ,ベータ'ジクロロエチルスルフィド、2,2'ジクロロエチルスルフィド、ビス(ベータ-クロロエチル)スルフィド、1-クロロ-2(ベータ-クロロジエチルチオ)エタン、又はその組合せを含む、請求項88に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項９１】
H剤を加水分解又は除染する酵素が、クロロペルオキシダーゼをコードし、さらに配列番号:1、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65又は配列番号:67に記載の配列を有する核酸によってコードされるポリペプチドを含むか、又は前記酵素が配列番号:2、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66又は配列番号:68に記載のアミノ酸配列を含むか、又は
デハロゲナーゼをコードし、さらに配列番号:69又は配列番号:91に記載の配列を有する核酸によってコードされるポリペプチドを含むか、又は前記酵素が配列番号:70又は配列番号:92に記載のアミノ酸配列を有する、請求項88に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項９２】
酵素活性が生物剤の加水分解又は除染を含む、請求項76に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項９３】
酵素活性がハロペルオキシダーゼ活性を含む、請求項92に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項９４】
ハロペルオキシダーゼ活性がクロロペルオキシダーゼ活性を含む、請求項93に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項９５】
生物剤がグラム陰性芽胞である、請求項92に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項９６】
グラム陰性芽胞が炭疽（又は炭疽菌（Bacillus anthracis））芽胞を含む、請求項94に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項９７】
生物剤を加水分解又は除染する酵素が、配列番号:1、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65又は配列番号:67に記載の配列を有する核酸によってコードされるポリペプチドを含むか、又は前記酵素が、それぞれ配列番号:2、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66又は配列番号:68に記載のアミノ酸配列を有する、請求項92に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項９８】
酵素活性がP-F結合の加水分解又は除染を含む、請求項76に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項９９】
P-F結合の加水分解又は除染活性を有するポリペプチドが、配列番号:73、配列番号:93、配列番号:95、配列番号:97、配列番号:99、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:105、配列番号:107、配列番号:109、配列番号:111、配列番号:113、配列番号:115、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:121、配列番号:123、配列番号:125、配列番号:127、配列番号:129、配列番号:131、配列番号:133、配列番号:135、配列番号:137、配列番号:139、配列番号:141、配列番号:143、配列番号:145、配列番号:147、配列番号:149、配列番号:151、配列番号:153、配列番号:155、配列番号:157、配列番号:159、配列番号:161、配列番号:163、配列番号:165、配列番号:167、配列番号:169、配列番号:171、配列番号:173、配列番号:175、配列番号:177、配列番号:179、配列番号:181、配列番号:183、配列番号:185、配列番号:187、配列番号:191又は配列番号:193に記載の配列を有する核酸によってコードされる、請求項98に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１００】
酵素活性がP-S結合の加水分解又は除染を含む、請求項76に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１０１】
P-S結合の加水分解又は除染活性を有するポリペプチドが、配列番号:1、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:89、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:127、配列番号:151、配列番号:167、配列番号:171、配列番号:187又は配列番号:191に記載の配列を有する核酸によってコードされる、請求項100に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１０２】
酵素活性が有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性を含む、請求項76に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１０３】
有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性を有する酵素が、配列番号:193に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:194に記載のアミノ酸配列を有する、請求項102に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１０４】
酵素活性がアミノペプチダーゼ活性を含む、請求項76に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１０５】
アミノペプチダーゼ活性を有する酵素が、配列番号:189に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:190に記載のアミノ酸配列を有する、請求項104に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１０６】
酵素活性がカルボキシルエステラーゼ活性を含む、請求項76に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１０７】
カルボキシルエステラーゼ活性を有する酵素が、配列番号:73、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:79、配列番号:81、配列番号:83、配列番号:85、配列番号:87又は配列番号:89に記載の配列を有する核酸によってコードされる、請求項106に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１０８】
酵素活性がヘム型ペルオキシダーゼ活性を含む、請求項76に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１０９】
ヘム型ペルオキシダーゼ活性を有する酵素が、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49又は配列番号:51に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は前記酵素が、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50又は配列番号:52に記載のアミノ酸配列を有する、請求項108に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１１０】
酵素がヘム型クロロペルオキシダーゼ活性を有し、さらに配列番号:1に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:2に記載のアミノ酸配列を有する、請求項109に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１１１】
酵素活性が非ヘム型ペルオキシダーゼ活性を含む、請求項76に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１１２】
非ヘム型クロロペルオキシダーゼ活性を有する酵素が、配列番号:1、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、又は配列番号:67に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は前記酵素が、配列番号:2、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66、又は配列番号:68に記載のアミノ酸配列を有する、請求項111に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１１３】
酵素活性がデハロゲナーゼ活性を含む、請求項76に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１１４】
デハロゲナーゼ活性を有する酵素が、配列番号:69又は配列番号:91に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:70又は配列番号:92に記載のアミノ酸配列を有する、請求項113に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１１５】
酵素活性がジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性を含む、請求項76に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１１６】
ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性を有する酵素が、配列番号:71に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:72に記載のアミノ酸配列を有する、請求項115に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１１７】
酵素活性が有機リン酸エステラーゼを含み、P-S又はP-F結合を加水分解し、さらにアセチルコリンエステラーゼ-又はブチリルコリンエステラーゼ-阻害物質を解毒することができる、請求項76に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１１８】
酵素活性がハロゲン化反応を含み、過酸化水素及び塩化物、臭化物又はヨウ化物から次亜ハロゲン酸塩を生成する、請求項76に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１１９】
酵素活性が過酸化水素から有機基質への酸素の転移を触媒することを含む、請求項76に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１２０】
酵素活性がリグニンの化学漂白を含む、請求項119に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１２１】
酵素活性が、パルプ又は紙の製造過程におけるリグニンの化学漂白を含む、請求項120に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１２２】
酵素活性が農薬、除草剤及び/又は殺虫剤の解毒を含む、請求項76に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１２３】
農薬が、デメトン-S、デメトン-S-メチル、デメトン-S-メチルスルホン、デメトン-メチル、パラチオン、フォスメト、カルボフェノチオン、ベノキサフォス、アジンフォス-メチル、アジンフォス-エチル、アミトン、アミジチオン、シアントエート、ジアリフォス、ジメトエート、ジオキサチオン、ジスルフォトン、エンドチオン、エチオン、エトエート-メチル、フォルモチオン、マラチオン、メルカルバム、オメトエート、オキシデプロフォス、オキシジスルフォトン、フェンカプトン、フォレート、フォサロン、プロチダチオン、プロトエート、ソファミド、チオメトン、ヴァミドチオン、メタミドフォス、又はその組合せを含む、請求項122に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１２４】
核酸が熱安定性若しくは耐熱性酵素又はタンパク質をコードする、請求項76から123のいずれか１項に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１２５】
ポリペプチドが、約37℃から約95℃、又は約55℃から約85℃、又は約70℃から約75℃、又は約70℃から約95℃、又は約90℃から約95℃の温度範囲を含む条件下で酵素活性を維持するか、又は37℃より高く約95℃、55℃より高く約85℃、又は約70℃から約75℃、又は90℃より高く約95℃の温度範囲、又は約1℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約95℃の温度範囲を含む条件下で酵素活性を維持する、請求項124に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１２６】
ポリペプチドが、37℃より高く約95℃、55℃より高く約85℃、90℃より高く約95℃の範囲の温度に暴露した後、又は約1℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約95℃、約55℃から約85℃、約70℃から約75℃、又は約90℃から約95℃の範囲の温度に暴露した後で活性を維持する、請求項124に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１２７】
請求項76に記載の配列を含み、さらにシグナル配列を欠く単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１２８】
請求項76に記載の配列を含み、さらに異種シグナル配列を有する単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１２９】
タンパク質1ミリグラム当たり約100から約1000ユニット、タンパク質1ミリグラム当たり約500から約750ユニット、タンパク質1ミリグラム当たり約500から約1200ユニット、又はタンパク質1ミリグラム当たり約750から約1000ユニットの範囲の約37℃の比活性を有する、請求項76に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１３０】
耐熱性が、高い温度に加熱後にヒドロラーゼの37℃の比活性の少なくとも半分の保持を含む、請求項124に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１３１】
ポリペプチドが少なくとも1つのグリコシル化部位を含み、場合によって前記グリコシル化がN-結合グリコシル化であり、場合によって前記ポリペプチドが、P. パストリス（P. pastoris）又はS. ポンベ（S. pombe）での発現後にグリコシル化される、請求項76に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１３２】
ポリペプチド又はペプチドが、約pH6.5、pH6.0、pH5.5、pH5.0、pH4.5又はpH4.0を含む条件下で酵素活性又は結合活性を維持する、請求項76に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１３３】
ポリペプチド又はペプチドが、約pH8.0、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10又はpH10.5を含む条件下で酵素活性又は結合活性を維持する、請求項76に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチド。
【請求項１３４】
請求項76に記載のポリペプチド又はペプチドを含むタンパク質調製物であって、前記タンパク質調製物が液体、固体又はゲルを含む、前記タンパク質調製物。
【請求項１３５】
請求項76に記載のポリペプチド又はペプチド及び第二のドメインを含むヘテロダイマーヘテロダイマーであって、場合によって前記第二のドメインがエピトープ又はタグである、前記ヘテロダイマー。
【請求項１３６】
第二のドメインがポリペプチドであり、へテロダイマーが融合タンパク質である、請求項135に記載のヘテロダイマー。
【請求項１３７】
請求項76に記載のポリペプチド又はペプチドを含むホモダイマー。
【請求項１３８】
固定されたポリペプチド又はペプチドであって、前記ポリペプチド又はペプチドが請求項76に記載の配列又はその部分配列を含む、前記固定ポリペプチド又はペプチド。
【請求項１３９】
ポリペプチド又はペプチドが、細胞、金属、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、グラファイト粒子、ビーズ、ゲル、プレート、アレイ、又はキャピラリー管上に固定される、請求項138に記載の固定ポリペプチド又はペプチド。
【請求項１４０】
請求項138又は139に記載の固定ポリペプチド又はペプチドを含むアレイ。
【請求項１４１】
固定された請求項1又は57に記載の核酸を含むアレイ。
【請求項１４２】
請求項76に記載のポリペプチド又はペプチドと特異的に結合する単離、合成又は組換え抗体であって、場合によって前記抗体がモノクローナル又はポリクローナル抗体である、前記単離、合成又は組換え抗体。
【請求項１４３】
請求項76に記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体を含むハイブリドーマ。
【請求項１４４】
以下の工程を含む、酵素活性を有するか又はタンパク質をコードするポリペプチドを単離又は同定する方法：（a）請求項142に記載の抗体を提供する工程；（b）ポリペプチドを含むサンプルを提供する工程；及び（c）工程（b）のサンプルを工程（a）の抗体と、前記抗体が前記ポリペプチドと特異的に結合することができる条件下で接触させ、それによって酵素活性を有するか又はタンパク質をコードするポリペプチドを単離又は同定する工程。
【請求項１４５】
請求項1又は57に記載の核酸又はその部分配列を、液性免疫応答を生じるために十分な量で非ヒト動物に投与し、それによって抗酵素抗体又は抗タンパク質抗体を生成することを含む、抗酵素抗体又は抗タンパク質抗体を生成する方法。
【請求項１４６】
請求項76に記載のポリペプチド又はペプチド又はその部分配列を、液性免疫応答を生じるために十分な量で非ヒト動物に投与し、それによって抗酵素抗体又は抗タンパク質抗体を生成することを含む、抗酵素抗体又は抗タンパク質抗体を生成する方法。
【請求項１４７】
以下の工程を含む、組換えポリペプチドを生成する方法：（a）プロモーターに機能可能に連結された核酸を提供する工程であって、前記核酸が請求項1又は57に記載の配列を含む前記工程；及び（b）工程（a）の核酸を前記ポリペプチドの発現を許容する条件下で発現させ、それによって組換えポリペプチドを生成する工程。
【請求項１４８】
さらに、工程（a）の核酸で宿主細胞を形質転換し、続いて工程（a）の核酸を発現させ、それによって組換えポリペプチドを生成する工程を含む、請求項147に記載の方法。
【請求項１４９】
以下の工程を含む、酵素活性を有するか又はタンパク質をコードするポリペプチドを同定する方法：（a）請求項76に記載のポリペプチドを提供する工程；（b）酵素基質を提供する工程；及び（c）前記ポリペプチドを工程（b）の基質と接触させ、基質の量の減少又は反応生成物の量の増加を検出する工程であって、基質の量の減少又は反応生成物の量の増加があれば、酵素活性を有するか又はタンパク質をコードするポリペプチドが検出されたとする、前記工程。
【請求項１５０】
以下の工程を含む、酵素又はタンパク質の基質を同定する方法：（a）請求項76に記載のポリペプチドを提供する工程；（b）テスト基質を提供する工程；及び（c）工程（a）のポリペプチドを工程（b）のテスト基質と接触させ、基質の量の減少又は反応生成物の量の増加を検出する工程であって、基質の量の減少又は反応生成物の量の増加があれば、前記テスト基質が酵素又はタンパク質の基質と同定される、前記工程。
【請求項１５１】
以下の工程を含む、テスト化合物がポリペプチドと特異的に結合するか否かを決定する方法：（a）核酸又は前記核酸を含むベクターを、前記核酸のポリペプチドへの翻訳を許容する条件下で発現させる工程であって、前記核酸が請求項1又は57に記載の配列を有する前記工程；（b）テスト化合物を提供する工程；（c）前記ポリペプチドを前記テスト化合物と接触させる工程；及び（d）工程（b）のテスト化合物が前記ポリペプチドと特異的に結合するか否かを決定する工程。
【請求項１５２】
以下の工程を含む、テスト化合物がポリペプチドと特異的に結合するか否かを決定する方法：（a）請求項76に記載のポリペプチドを提供する工程；（b）テスト化合物を提供する工程；（c）前記ポリペプチドを前記テスト化合物と接触させる工程；及び（d）工程（b）のテスト化合物が前記ポリペプチドと特異的に結合するか否かを決定する工程。
【請求項１５３】
以下の工程を含む、酵素活性の調節物質を同定する方法：（a）請求項76に記載のポリペプチドを提供する工程；（b）テスト化合物を提供する工程；（c）工程（a）のポリペプチドを工程（b）のテスト化合物と接触させ、酵素活性を測定する工程であって、テスト化合物の非存在下の酵素活性と比較して、テスト化合物の存在下で測定された酵素活性が変化すれば、前記テスト化合物が酵素活性を調節するという決定がなされる、前記工程。
【請求項１５４】
酵素基質を提供し、さらに基質量の減少若しくは反応生成物量の増加又は基質量の増加若しくは反応生成物量の減少を検出することによって酵素活性が測定され、場合によって、テスト化合物の非存在下での基質量又は反応生成物量と比較して、テスト化合物の存在下で基質量が減少又は反応生成物量が増加すれば、前記テスト化合物が酵素活性のアクチベーターと同定され、さらに場合によって、テスト化合物の非存在下での基質量又は反応生成物量と比較して、テスト化合物の存在下で基質量が増加又は反応生成物量が減少すれば、前記テスト化合物が酵素活性の阻害剤と同定される、請求項153に記載の方法。
【請求項１５５】
プロセッサー及びデータ保存装置を含むコンピュータシステムであって、前記データ保存装置にはポリペプチド配列又は核酸配列が保存され、前記ポリペプチド配列が請求項76に記載の配列を含み、ポリペプチドが請求項1又は請求項57に記載の核酸によってコードされる、前記コンピュータシステム。
【請求項１５６】
さらに配列比較アルゴリズム、及び少なくとも1つの参照配列が保存された保存装置を含み、場合によって前記配列比較アルゴリズムが多型性を表示するコンピュータプログラムを含み、さらに場合によって前記コンピュータシステムが、前記配列の1つ以上の特徴を同定するアイデンティファイアーを含む、請求項155に記載のコンピュータシステム。
【請求項１５７】
ポリペプチド配列又は核酸配列が保存されてあるコンピュータ読み出し可能媒体であって、前記ポリペプチド配列が請求項76に記載の配列を含み、ポリペプチドが請求項1又は請求項57に記載の核酸によってコードされる、前記コンピュータ読み出し可能媒体。
【請求項１５８】
以下の工程を含む、配列の特徴を同定する方法：（a）配列内の1つ以上の特徴を同定するコンピュータプログラムを用いて配列を読み取る工程であって、前記配列がポリペプチド配列又は核酸配列を含み、前記ポリペプチド配列が請求項76に記載の配列を含み、ポリペプチドが請求項1又は請求項57に記載の核酸によってコードされる、前記工程；及び、（b）前記コンピュータプログラムにより配列の1つ以上の特徴を同定する工程。
【請求項１５９】
（a）配列を比較するコンピュータプログラムを用いて第一の配列および第二の配列を読み取る工程であって、前記第一の配列がポリペプチド配列又は核酸配列を含み、前記ポリペプチド配列が請求項76に記載の配列を含み、ポリペプチドが請求項1又は請求項57に記載の核酸によってコードされる、前記工程；及び、（b）第一の配列と第二の配列間の相違を前記コンピュータプログラムにより決定する工程を含む、第一の配列を第二の配列と比較する方法であって、
場合によって、第一の配列と第二の配列間の相違を決定する前記工程がさらに多型性を同定する工程を含み、
場合によって、前記方法がさらに配列内の1つ以上の特徴を同定するアイデンティファイヤーの使用を含み、
場合によって、前記方法がさらにコンピュータプログラムを用いて第一の配列を読み取り、さらに配列内の1つ以上の特徴を同定する工程を含む、
前記第一の配列を第二の配列と比較する方法。
【請求項１６０】
（a）請求項54〜56のいずれか１項に記載の増幅プライマー対を提供する工程；（b）前記環境サンプルから核酸を単離するか、又は前記サンプル内の核酸がハイブリダイゼーションのために前記増幅プライマー対に接近することができるように前記環境サンプルを処理する工程；及び、（c）工程（b）の核酸を工程（a）の増幅プライマー対と一緒にして前記環境サンプルの核酸を増幅し、それによって環境サンプルから酵素活性を有するポリペプチドをコードするか、又はタンパク質をコードする核酸を単離または回収する工程を含む、環境サンプルから酵素活性を有するポリペプチドをコードするか又はタンパク質をコードする核酸を単離または回収する方法であって、
場合によって前記増幅プライマー配列対の各メンバーが、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、及び配列番号:1から配列番号:193の全ての奇数の配列番号を含む配列リストに開示された全核酸に記載の配列の少なくとも約10から50の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含む、前記核酸を単離または回収する方法。
【請求項１６１】
以下の工程を含む、環境サンプルから酵素活性を有するポリペプチドをコードするか又はタンパク質をコードする核酸を単離または回収する方法：（a）配列番号:1又は57に記載の配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチドプローブを提供する工程；（b）前記環境サンプルから核酸を単離するか、又は前記サンプル内の核酸が工程(a)のポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションのために接近できるように前記環境サンプルを処理する工程；（c）工程（b）の単離核酸又は処理された環境サンプルを工程(a)のポリヌクレオチドプローブと一緒にする工程；さらに（d）工程（a）のポリヌクレオチドプローブと特異的にハイブリダイズする核酸を単離し、それによって環境サンプルから酵素活性を有するポリペプチドをコードするか、又はタンパク質をコードする核酸を単離または回収する工程。
【請求項１６２】
環境サンプルが、水サンプル、液体サンプル、土壌サンプル、空気サンプル又は生物学的サンプルを含み、場合によって前記生物学的サンプルが、細菌細胞、原生動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、菌類細胞又は哺乳動物細胞に由来する、請求項160又は161に記載の方法。
【請求項１６３】
（a）請求項1又は57に記載の配列を含む鋳型核酸を提供する工程；（b）前記鋳型配列内の1つ以上のヌクレオチドの改変、欠失若しくは付加、又はその組合せを実施して前記鋳型核酸の変種を作出する工程を含む、酵素活性を有するポリペプチドをコードするか、タンパク質をコードする核酸の変種を作出する方法であって、前記方法が、場合によってさらに前記変種核酸を発現させて変種酵素ポリペプチド又は変種タンパク質ポリペプチドを生成する工程を含む、前記核酸の変種を作出する方法。
【請求項１６４】
改変、付加又は欠失が、エラー誘発PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）、合成連結再アッセンブリ（SLR）及びその組合せを含む方法により導入されるか、又は前記改変、付加または欠失が、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート-修飾DNA変異導入、ウラシル含有鋳型変異導入、ギャップ含有二重鎖変異導入、点ミスマッチ修復変異導入、修復欠損宿主株変異導入、化学変異導入、放射性変異導入、欠失変異導入、制限-選択変異導入、制限-精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸マルチマー生成、及びその組合せを含む方法によって導入される、請求項163に記載の方法。
【請求項１６５】
方法が、鋳型核酸によってコードされるポリペプチドの活性又は安定性とは変異した若しくは異なる活性又は変異した若しくは異なる安定性を有する酵素又はタンパク質が生じるまで反復され、
場合によって、前記変種酵素又はタンパク質ポリペプチドが耐熱性であり、高い温度に暴露された後ある程度の活性を維持するか、又は、前記変種酵素又はタンパク質ポリペプチドが、鋳型核酸によってコードされる酵素又はタンパク質と比較してグリコシル化が高められてあるか、又は、前記変種酵素又はタンパク質ポリペプチドが高温下で活性を有するが鋳型核酸によってコードされる酵素は高温下で活性を示さず、
さらに場合によって、前記方法が、鋳型核酸のコドン使用頻度とは変異したコドン使用頻度を示す酵素又はタンパク質コード配列が生じるまで反復され、又は前記方法が、鋳型核酸のメッセージ発現レベル又は安定性レベルより高い又は低いメッセージ発現レベル又は安定性レベルを有する酵素又はタンパク質遺伝子が生じるまで反復される、
請求項163に記載の方法。
【請求項１６６】
以下の工程を含む、酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸内のコドンを改変して宿主細胞におけるその発現を高める方法：（a）請求項1又は57に記載の配列を含む、酵素活性を有するポリペプチドをコードするか又はタンパク質をコードする核酸を提供する工程；及び、（b）工程（a）の核酸の非優先コドンまたは低優先コドンを同定し、前記コドンを置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする優先コドンまたは中立的に使用されるコドンに置換し、それによって核酸を改変して宿主細胞における前記の発現を増加させる工程であって、前記優先コドンは宿主細胞の遺伝子内のコード配列において高頻度で提示されるコドンであり、前記非優先コドンまたは前記低優先コドンとは宿主細胞の遺伝子内のコード配列において低頻度で提示されるコドンである、前記工程。
【請求項１６７】
以下の工程を含む、酵素活性を有するポリペプチドをコードするか又はタンパク質をコードする核酸内のコドンを改変する方法：（a）請求項1又は57に記載の配列を含む、酵素活性を有するポリペプチドをコードするか又はタンパク質をコードする核酸を提供する工程；及び（b）工程（a）の核酸のコドンを同定し、前記コドンを置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする異なるコドンで置換し、それによって酵素又はタンパク質をコードする核酸内のコドンを改変する工程。
【請求項１６８】
以下の工程を含む、酵素活性を有するポリペプチドをコードするか又はタンパク質をコードする核酸内のコドンを改変して、宿主細胞におけるその発現を高める方法：（a）請求項1又は57に記載の配列を含む、酵素活性を有するポリペプチドをコードするか又はタンパク質をコードする核酸を提供する工程；及び（b）工程（a）の核酸内の非優先コドンまたは低優先コドンを同定し、前記コドンを置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする優先コドンまたは中立的に使用されるコドンで置換し、それによって前記核酸を改変して宿主細胞におけるその発現を高める工程であって、前記優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において高頻度で提示されるコドンであり、前記非優先または前記低優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において低頻度で提示されるコドンである、前記工程。
【請求項１６９】
酵素活性を有するポリペプチドをコードするか又はタンパク質をコードする核酸内のコドンを改変して、宿主細胞におけるその発現を低下させる方法であって、前記方法が、（a）請求項1又は57に記載の配列を含む、酵素活性を有するポリペプチドをコードするか又はタンパク質をコードする核酸を提供する工程；及び（b）工程（a）の核酸内の少なくとも1つの優先コドンを同定し、前記コドンを置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする非優先コドンまたは低優先コドンで置換し、それによって前記核酸を改変して宿主細胞におけるその発現を低下させる工程であって、前記優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において高頻度で提示されるコドンであり、前記非優先または低優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において低頻度で提示されるコドンである前記工程を含み、さらに場合によって、前記宿主細胞が、細菌細胞、菌類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である、前記核酸内のコドンを改変する方法。
【請求項１７０】
以下の工程を含む、複数の改変された酵素若しくはタンパク質活性部位又は基質結合部位をコードする核酸のライブラリーを作成する方法であって、前記改変される活性部位又は基質結合部位が、第一の活性部位又は第一の基質結合部位をコードする配列を含む第一の核酸に由来する前記方法：
（a）第一の活性部位または第一の基質結合部位をコードする第一の核酸を提供する工程であって、前記第一の核酸配列が、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、及び配列番号:1から配列番号:193の全ての奇数の配列番号を含む配列リストに開示された全核酸に記載の配列、又はその部分配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含み、さらに前記核酸が酵素若しくはタンパク質活性部位又は酵素若しくはタンパク質基質結合部位をコードする、前記工程；
（b）前記第一の核酸内の複数の標的コドンにおいて天然に存在するアミノ酸変種をコードする一組の変異導入オリゴヌクレオチドを提供する工程；
（c）前記一組の変異導入オリゴヌクレオチドを用いて、変異を導入された各アミノ酸コドンの一連のアミノ酸変種をコードする一組の活性部位コード変種または基質結合部位コード変種核酸を生成し、それによって複数の改変酵素若しくはタンパク質活性部位又は基質結合部位をコードする核酸のライブラリーを作成する工程。
【請求項１７１】
最適化定方向進化システム、遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）、合成連結再アッセンブリ(SLR)、エラー誘発PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ及びその組合せを含む方法によって工程（a）の第一の核酸又は変種に変異を導入するか、又は組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート-修飾DNA変異導入、ウラシル含有鋳型変異導入、ギャップ含有二重鎖変異導入、点ミスマッチ修復変異導入、修復欠損宿主株変異導入、化学変異導入、放射性変異導入、欠失変異導入、制限-選択変異導入、制限-精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸マルチマー生成及びその組合せを含む方法によって工程（a）の第一の核酸又は変種に変異を導入することを含む、請求項170に記載の方法。
【請求項１７２】
以下の工程を含む小分子の製造方法：（a）小分子を合成または改変することができる複数の生合成酵素を提供する工程であって、前記酵素の1つが請求項1又は57に記載の配列を含む核酸によってコードされる酵素を含む、前記工程；（b）工程（a）の酵素の少なくとも１つに対する基質を提供する工程；及び（c）複数の生物触媒反応を促進する条件下で工程（b）の基質を前記酵素と反応させて一連の生物触媒反応により小分子を生成する工程。
【請求項１７３】
以下の工程を含む小分子の改変方法：
（a）酵素を提供する工程であって、前記酵素が、請求項76に記載のポリペプチド、又は請求項1又は57に記載の核酸配列を含む核酸によってコードされるポリペプチドを含む、前記工程；
（b）小分子を提供する工程；及び
（c）前記酵素によって触媒される酵素反応が促進される条件下で、工程（a）の酵素を工程（b）の小分子と反応させ、それによって小分子を酵素反応により改変する工程； 
さらに場合によって、工程（a）の酵素に対する複数の小分子基質の使用を含み、それによって前記酵素により触媒される少なくとも1つの酵素反応によって生成される改変小分子のライブラリーを作成する工程；
さらに場合によって、複数の追加される酵素を前記酵素による複数の生物触媒反応を促進する条件下で使用し、前記複数の酵素反応によって生成される改変小分子のライブラリーを作成する工程；
さらに場合によって、所望の活性を示す特定の小分子がライブラリー内に存在するか否かを決定するために、前記ライブラリーを試験する工程、
さらに場合によって、前記ライブラリーの試験工程が、所望の活性をもつ特定の改変小分子の有無について改変小分子の一部分を試験することによってライブラリー内の複数の改変小分子の前記一部分を生成するために用いられた生物触媒反応の1つ以外の全てを系統的に排除し、所望の活性をもつ特定の改変小分子を生成する少なくとも1つの特異的な生物触媒反応を同定する工程。
【請求項１７４】
（a）酵素を提供する工程であって、前記酵素が請求項76に記載のポリペプチド、又は請求項1又は57に記載の核酸配列を含む核酸によってコードされるポリペプチドを含む、前記工程；及び（b）工程（a）の配列から複数のアミノ酸残基を欠失させ、残余の部分配列を酵素活性について試験し、それによって酵素の機能的フラグメントを決定する工程、
を含む、酵素の機能的フラグメントを決定する方法であって、場合によって、前記酵素活性が、酵素基質を提供し、さらに前記基質の量の減少又は反応生成物の量の増加を検出することによって測定される、前記酵素の機能的フラグメントの決定方法。
【請求項１７５】
以下の工程を含む、リアルタイム代謝フラックス分析によって新規または改変表現型のための全細胞操作の方法：
（a）細胞の遺伝的構成を改変することによって改変細胞を作成する工程であって、前記遺伝的構成が請求項1又は57に記載の配列を含む核酸を細胞に導入することによって改変される、前記工程；
（b）前記改変細胞を培養して複数の改変細胞を生じる工程；
（c）工程（b）の細胞培養をリアルタイムでモニターすることによって前記細胞の少なくとも1つの代謝パラメーターを測定する工程；及び
（d）工程（c）のデータを分析して、前記測定パラメーターが同様な条件下における未改変細胞の対応する測定値と異なるか否かを決定し、それによって細胞の操作された表現型をリアルタイム代謝フラックス分析により同定する工程；
さらに場合によって、細胞の遺伝的構成が、細胞内の配列の欠失若しくは改変又は遺伝子発現のノックアウトを含む方法によって改変される工程；
さらに場合によって、新規に操作された表現型を含む細胞を選別する工程；
さらに場合によって、前記選別された細胞を培養し、それによって新規に操作された表現型を含む新規な細胞株を作成する工程。
【請求項１７６】
以下の（a）又は（b）の残基1から14、1から15、1から16、1から17、1から18、1から19、1から20、1から21、1から22、1から23、1から24、1から25、1から26、1から27、1から28、1から28、1から30、1から31、1から32、1から33、1から34、1から35、1から36、1から37、1から38、1から40、1から41、1から42、1から43または1から44、1から45、1から46、1から47に記載の配列から成る、又は本質的に前記配列から成る単離又は組換えシグナル配列（シグナルペプチド）：
（a）配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、及び配列番号:2から配列番号:194の全ての偶数の配列番号を含む配列リストに開示された全ポリペプチド；又は
（b）請求項1又は57に記載の配列。
【請求項１７７】
請求項176に記載の配列を有するシグナルペプチド（SP）を含む少なくとも第一のドメイン、及び異種ポリペプチド又はペプチドを含む少なくとも第二のドメインを含むキメラポリペプチドであって、前記異種ポリペプチド又はペプチドは前記シグナルペプチド（SP）と天然では付随せず、さらに場合によって前記異種ポリペプチド又はペプチドは酵素ではなく、さらに場合によって前記異種ポリペプチド又はペプチチドは、前記シグナルペプチド（SP）又は酵素触媒ドメイン（CD）のアミノ末端、カルボキシル末端、若しくはその両端に存在する、前記キメラポリペプチド。
【請求項１７８】
酵素ポリペプチドの耐熱性又は熱安定性を高める方法であって、前記方法が、請求項76に記載のポリペプチドの少なくとも30の連続するアミノ酸を含むポリペプチド又は請求1若しくは57に記載の核酸によってコードされるポリペプチドをグリコシル化し、それによって前記酵素の耐熱性又は熱安定性を高めることを含む、前記耐熱性又は熱安定性を高める方法。
【請求項１７９】
請求項1又は57に記載の核酸配列を含むベクターを発現させることを含む、細胞で組換え酵素を過剰発現させる方法であって、前記過剰発現が、高活性プロモーター、二シストロンベクターの使用によって、又は前記ベクターの遺伝子増幅によって達成される、前記組換え酵素を過剰発現させる方法。
【請求項１８０】
（a）請求項1又は57に記載の配列を含む異種核酸配列を細胞に導入し、それによって形質転換植物細胞を作出する工程及び（b）前記形質転換細胞からトランスジェニック植物を作出する工程を含む、トランスジェニック植物の作出方法であって、場合によって工程（a）がさらに、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーション又はマイクロインジェクションにより前記異種核酸配列を導入する工程を含み、場合によって工程（a）がさらに、DNA粒子ボンバードメントによって植物組織に直接前記異種核酸配列を導入するか、又はアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）宿主を用いて植物細胞DNAに前記異種核酸配列を導入することを含む、前記トランスジェニック植物を作出する方法。
【請求項１８１】
以下の工程を含む、植物細胞で異種核酸配列を発現させる方法：（a）プロモーターに機能可能に連結された異種核酸配列で植物細胞を形質転換する工程であって、前記異種核酸配列が請求項1又は57に記載の配列を含む、前記工程；（b）前記異種核酸配列が前記植物細胞で発現される条件下で前記植物を生長させる工程。
【請求項１８２】
以下の工程を含む、組成物中の化合物の量を減少させる方法：（a）酵素活性を有するか若しくは請求項76に記載のタンパク質をコードするポリペプチド又は請求項1若しくは57に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（b）前記化合物を含む組成物を提供する工程；及び（c）工程（a）のポリペプチドを工程（b）の組成物と、前記酵素が前記組成物中の化合物を加水分解、脱ハロゲン化、酸化、分解又はプロセッシングする条件下で接触させる工程。
【請求項１８３】
少なくとも1つの請求項76に記載のポリペプチド又は請求項1若しくは57に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含むセルロース含有化合物であって、場合によって前記セルロース含有化合物が、パルプ、紙、紙製品、木材、木材製品、又は紙若しくは木材廃棄物である、前記セルロース含有化合物。
【請求項１８４】
（a）請求項76に記載のクロロペルオキシダーゼ活性を有するポリペプチド、又は請求項1若しくは57に記載の核酸によってコードされるクロロペルオキシダーゼ活性を有するポリペプチドを提供する工程；
（b）リグニン又はセルロースを含む化合物を提供する工程；及び、
（c）前記ポリペプチドが酵素的に活性を示し、さらにリグニン又はセルロースが漂白される条件下で、前記化合物を前記ポリペプチドと接触させる工程を含む、
パルプ若しくは紙の製造過程においてリグニン又はセルロースを化学漂白する方法であって、
場合によって前記酵素活性がヘム型ペルオキシダーゼ活性を含み、さらに場合によって前記ヘム型ペルオキシダーゼ活性を有する酵素が、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49又は配列番号:51に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は前記酵素が、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50又は配列番号:52に記載のアミノ酸配列を有し、
さらに場合によって、前記酵素はヘム型クロロペルオキシダーゼ活性を有し、さらに配列番号:1に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は前記酵素は配列番号:2に記載のアミノ酸配列を有し、
場合によって、前記酵素活性は非ヘム型ペルオキシダーゼ活性を含み、さらに場合によって前記非ヘム型クロロペルオキシダーゼ活性を有する酵素は、配列番号:1、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、又は配列番号:67に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は前記酵素は、配列番号:2、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66、又は配列番号:68に記載のアミノ酸配列を有し、
さらに場合によって、前記セルロース又は親油性化合物はパルプ、紙、紙製品、木材、木材製品、又は紙若しくは木材廃棄物を含む、
前記リグニン又はセルロースの化学漂白方法。
【請求項１８５】
少なくとも1つの請求項76に記載のポリペプチド又は請求項1若しくは57に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む組成物であって、場合によって前記組成物が、食用デリバリー物質、注射可能な液体、錠剤、ゲル、リポソーム、ピル、カプセル、ゲルタブ、ローション、局所適用液体、座薬、散剤、凍結乾燥化合物、泡沫、乳液又はその組み合わせとして処方され、さらに場合によって、前記組成物が、少なくとも2つ又は3つの請求項76に記載のポリペプチド、又は請求項1若しくは57に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含み、場合によって前記組成物中の酵素が、約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％の濃度で存在するか、又は約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％w/vで存在する、前記組成物。
【請求項１８６】
請求項76に記載のポリペプチド又は請求項1若しくは57に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む医薬組成物であって、
場合によって、食用デリバリー物質、注射可能な液体、スプレー、錠剤、ゲル、リポソーム、カプセル、ゲルタブ、ヒドロゲル、ローション、局所適用液体、座薬、エーロゾル、散剤、凍結乾燥化合物、噴射剤、泡沫、乳液、ナノ構造物、インプラント又はその組合せとして処方され、
場合によって前記組成物中の酵素が、約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％の濃度で存在するか、又は約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％w/vで存在する、
前記医薬組成物。
【請求項１８７】
少なくとも1つの請求項76に記載のポリペプチド又は請求項1若しくは57に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含むナノ構造物であって、
場合によって前記ナノ構造物がナノチューブ又はナノファイバーを含み、
さらに場合によって前記組成物が、少なくとも2つ又は3つの請求項76に記載のポリペプチド又は請求項1若しくは57に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、
前記ナノ構造物。
【請求項１８８】
請求項76に記載の配列を有するか又は請求項1若しくは57に記載の核酸によってコードされる、凍結乾燥されたポリペプチド。
【請求項１８９】
少なくとも1つの請求項76に記載のポリペプチド又は請求項1若しくは57に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、除染、中和又は解毒用組成物であって、
場合によって前記除染又は解毒用組成物が、食用デリバリー物質、注射可能な液体、錠剤、ゲル、リポソーム、カプセル、ゲルタブ、ローション、局所適用液体、座薬、散剤、凍結乾燥化合物、泡沫、乳液、又はその組合せとして処方され、
場合によって前記組成物が、少なくとも2つ又は3つの請求項76に記載のポリペプチド又は請求項1若しくは57に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含み、場合によって前記組成物中の酵素が、約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％の濃度で存在するか、又は約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％w/vで存在する、
前記組成物。
【請求項１９０】
さらに界面活性剤、乳化剤、起泡剤又はその組合せを含む、請求項189に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項１９１】
組成物が農薬、除草剤及び/又は殺虫剤の解毒剤として処方される、請求項189に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項１９２】
組成物が神経ガス解毒剤として処方される、請求項189に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項１９３】
組成物がハロペルオキシダーゼ酵素を含む場合、前記組成物はまた亜ハロゲン酸塩成分を含み、さらに場合によって前記亜ハロゲン酸塩成分は亜塩素酸塩成分を含み、さらに場合によって前記亜塩素酸塩成分は亜塩素酸ナトリウム又は亜ヨウ素酸ナトリウムを含む、請求項189に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項１９４】
少なくとも1つの請求項76に記載のポリペプチド又は請求項1若しくは57に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む製品。
【請求項１９５】
製品がハロペルオキシダーゼ酵素を含むとき、前記組成物はまた亜ハロゲン酸塩成分を含み、場合によって前記亜ハロゲン酸塩成分は亜塩素酸塩成分を含み、さらに場合によって前記亜塩素酸塩成分は亜塩素酸ナトリウム又は亜ヨウ素酸ナトリウムを含む、請求項194に記載の製品。
【請求項１９６】
少なくとも1つの請求項76に記載のポリペプチド又は請求項1若しくは57に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む布、織物材料又は繊維であって、
場合によって、前記少なくとも1つのポリペプチドが、布、織物材料、又は繊維の表面に固定されるか、又は前記少なくとも1つのポリペプチドが、布、織物材料又は繊維のコーティング若しくは被覆の成分であるか、または布、織物材料、又は繊維中に埋め込まれるか若しくは塗りつけられた処方物であり、
場合によって前記組成物が、少なくとも2つ又は3つのポリペプチド又は請求項1若しくは57に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、
前記布、織物材料又は繊維。
【請求項１９７】
少なくとも2、3、4、5又は6つの異なる種類の酵素の混合物を含み、場合によって各種類の酵素が異なる毒性物質又は生物剤を解毒する、請求項189に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項１９８】
少なくも1つのデハロゲナーゼ、少なくとも1つのハロペルオキシダーゼ、及び少なくとも1つの有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）を含む、少なくとも3つの異なる種類の酵素の混合物を含み、場合によって前記ハロペルオキシダーゼがクロロペルオキシダーゼである、請求項197に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項１９９】
（a）デハロゲナーゼが、配列番号:69若しくは配列番号:91に記載の配列を有するポリペプチドであるか、又は配列番号:70若しくは配列番号:92に記載のアミノ酸配列を有するか、又は（b）クロロペルオキシダーゼが、配列番号:1に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:2に記載のアミノ酸配列を有するヘム型クロロペルオキシダーゼであるか、又は（c）ハロペルオキシダーゼが、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49若しくは配列番号:51に記載の配列を有する核酸によってコードされるヘム型ペルオキシダーゼであるか、又は前記酵素が、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50若しくは配列番号:52に記載のアミノ酸配列を有するか、又は（d）ハロペルオキシダーゼが、配列番号:1、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、若しくは配列番号:67に記載の配列を有する核酸によってコードされる非ヘム型クロロペルオキシダーゼであるか、又は前記酵素が、配列番号:2、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66若しくは配列番号:68に記載のアミノ酸配列を有するか、又は（e）前記有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）が、配列番号:193に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:194に記載の配列を有する、請求項198に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項２００】
少なくも1つのジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）又は有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）及び少なくとも1つのハロペルオキシダーゼを含み、さらに場合によって前記ハロペルオキシダーゼがクロロペルオキシダーゼである、請求項197に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項２０１】
ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）、有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）及びハロペルオキシダーゼを含む、請求項200に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項２０２】
DFPase及び/又はOPAAが、G剤の除染、中和又は解毒に用いられ、ハロペルオキシダーゼ又はクロロペルオキシダーゼ（CPO）が、V剤、H剤及び/又は生物剤の除染、中和又は解毒に用いられ、場合によって前記生物剤が細菌の芽胞である、請求項200に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項２０３】
さらにデハロゲナーゼを含む、請求項200に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項２０４】
さらにコリンエステラーゼを含む、請求項200に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項２０５】
ジイソプロピル-フルオロホスファターゼ（DFPase）活性が、配列番号:71に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:72に記載のアミノ酸配列を有する、請求項200に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項２０６】
ハロペルオキシダーゼがクロロペルオキシダーゼである、請求項200に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項２０７】
クロロペルオキシダーゼが、配列番号:1に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:2に記載のアミノ酸配列を有するヘム型クロロペルオキシダーゼであるか；又はハロペルオキシダーゼが、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49若しくは配列番号:51に記載の配列を有する核酸によってコードされるヘム型ペルオキシダーゼであるか、又は前記酵素が、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50若しくは配列番号:52に記載のアミノ酸配列を有するか；又はハロペルオキシダーゼが、配列番号:1、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、若しくは配列番号:67に記載の配列を有する核酸によってコードされる非ヘム型クロロペルオキシダーゼであるか、又は前記酵素が、配列番号:2、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66若しくは配列番号:68に記載のアミノ酸配列を有する、請求項206に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項２０８】
有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性が、配列番号:193に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:194に記載のアミノ酸配列を有する、請求項200に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項２０９】
少なくも1つのデハロゲナーゼ（DH）及び少なくとも1つのハロペルオキシダーゼを含む少なくとも2つの異なる種類の酵素の混合物を含み、場合によって前記ハロペルオキシダーゼがクロロペルオキシダーゼ（CPO）である、請求項197に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項２１０】
デハロゲナーゼ及びハロペルオキシダーゼがH剤の除染、中和又は解毒に用いられる、請求項209に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項２１１】
ハロペルオキシダーゼが、配列番号:1に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:2に記載のアミノ酸配列を有するヘム型クロロペルオキシダーゼであるか；又はハロペルオキシダーゼが、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49若しくは配列番号:51に記載の配列を有する核酸によってコードされるヘム型ペルオキシダーゼであるか、又は前記酵素が、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50若しくは配列番号:52に記載のアミノ酸配列を有するか；又はハロペルオキシダーゼが、配列番号:1、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、若しくは配列番号:67に記載の配列を有する核酸によってコードされる非ヘム型クロロペルオキシダーゼであるか、又は前記酵素が、配列番号:2、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66若しくは配列番号:68に記載のアミノ酸配列を有する、請求項209に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項２１２】
デハロゲナーゼが、配列番号:69若しくは配列番号:91に記載の配列を有するか、又は配列番号:70若しくは配列番号:92に記載のアミノ酸配列を有する、請求項209に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項２１３】
さらに、少なくとも1つのジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）、有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）及び/又はコリンエステラーゼを添加して、G剤を除染、中和又は解毒する、請求項209に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項２１４】
ジイソプロピル-フルオロホスファターゼが配列番号:71に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:72に記載のアミノ酸配列を有する、請求項213に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項２１５】
有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性が配列番号:193に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:194に記載のアミノ酸配列を有する、請求項213に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項２１６】
少なくも1つのデハロゲナーゼ（DH）酵素及び少なくとも1つの有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）を含む少なくとも2つの異なるクラスの酵素の混合物を含む、請求項197に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項２１７】
デハロゲナーゼを用いてH剤を除染、中和又は解毒し、さらに有機リン酸アンヒドロラーゼを用いてG剤を除染、中和又は解毒する、請求項216に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項２１８】
さらに少なくとも1つのハロペルオキシダーゼを含み、H剤の除染、中和又は解毒が強化される、請求項216に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項２１９】
さらにハロペルオキシダーゼを含む請求項216に記載の除染、中和又は解毒用組成物であって、場合によって前記組成物が亜ハロゲン酸塩成分も含み、場合によって前記亜ハロゲン酸塩成分が亜ヨウ素酸塩又は亜塩素酸塩成分を含み、さらに場合によって前記亜ヨウ素酸塩又は亜塩素酸塩成分が亜塩素酸ナトリウム若しくは亜ヨウ素酸ナトリウム又は等価の成分を含む、前記除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項２２０】
さらに少なくとも1つのジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）及び/又はコリンエステラーゼ酵素を含み、G剤のOPAA除染、中和又は解毒を補填する、請求項216に記載の除染、中和又は解毒用組成物。
【請求項２２１】
請求項189から193のいずれかの項又は請求項197から221のいずれかの項に記載の除染、中和又は解毒用組成物を含む起泡剤であって、場合によって前記起泡剤中の酵素が、約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％の濃度で存在するか、又は約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％w/vで存在する、前記起泡剤。
【請求項２２２】
請求項189から193のいずれかの項又は請求項197から221のいずれかの項に記載の除染、中和又は解毒用組成物を含む乳化剤又は界面活性剤であって、場合によって前記起泡剤又は界面活性剤中の酵素が、約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％の濃度で存在するか、又は約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％w/vで存在する、前記乳化剤又は界面活性剤。
【請求項２２３】
請求項189から193のいずれかの項又は請求項197から221のいずれかの項に記載の除染、中和又は解毒用組成物を含む塗料又はコーティングであって、場合によって前記塗料又はコーティング中の酵素が、約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％の濃度で存在するか、又は約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％w/vで存在する、前記塗料又はコーティング。
【請求項２２４】
請求項189から193のいずれかの項若しくは請求項197から221のいずれかの項に記載の除染、中和又は解毒用組成物、又は請求項186に記載の医薬組成物を適用又は投与することを含む、毒性物質を除染、中和又は解毒する方法。
【請求項２２５】
組成物が、食用デリバリー物質、注射可能な液体、錠剤、ゲル、リポソーム、カプセル、ゲルタブ、ローション、局所適用液体、座薬、散剤、凍結乾燥化合物、泡沫、乳液、又はその組合せとして処方される、請求項224に記載の方法。
【請求項２２６】
請求項189から193のいずれかの項若しくは請求項197から221のいずれかの項に記載の除染、中和又は解毒用組成物、又は請求項186に記載の医薬組成物を適用又は投与することを含む、V剤、H剤、G剤又は生物剤の毒性作用を防ぐ方法。
【請求項２２７】
請求項189から193のいずれかの項若しくは請求項197から221のいずれかの項に記載の除染、中和又は解毒用組成物、又は請求項186に記載の医薬組成物を含む、ガスマスク。
【請求項２２８】
請求項189から193のいずれかの項若しくは請求項197から221のいずれかの項に記載の除染、中和又は解毒用組成物、又は請求項186に記載の医薬組成物を含む、空気フィルター又は水フィルター。
【請求項２２９】
請求項189から193のいずれかの項若しくは請求項197から221のいずれかの項に記載の除染、中和又は解毒用組成物、又は請求項186に記載の医薬組成物を含む、農薬、除草剤、及び/又は殺虫剤の除染、中和又は解毒剤であって、
場合によって前記組成物中の酵素が、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％の濃度で存在するか、又は0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％w/vで存在する、
前記農薬、除草剤、及び/又は殺虫剤の除染、中和又は解毒剤。
【請求項２３０】
組成物が、P-S又はP-F結合を加水分解する有機リン酸エステラーゼを含む、請求項229に記載の農薬、除草剤、及び/又は殺虫剤の除染、中和又は解毒剤。
【請求項２３１】
有機リン酸エステラーゼが、アセチル-コリンエステラーゼ又はブチリルコリンエステラーゼの阻害物質として作用する、請求項230に記載の農薬、除草剤、及び/又は殺虫剤の除染、中和又は解毒剤。
【請求項２３２】
農薬が、デメトン-S、デメトン-S-メチル、デメトン-S-メチルスルホン、デメトン-メチル、パラチオン、フォスメト、カルボフェノチオン、ベノキサフォス、アジンフォス-メチル、アジンフォス-エチル、アミトン、アミジチオン、シアントエート、ジアリフォス、ジメトエート、ジオキサチオン、ジスルフォトン、エンドチオン、エチオン、エトエート-メチル、フォルモチオン、マラチオン、メルカルバム、オメトエート、オキシデプロフォス、オキシジスルフォトン、フェンカプトン、フォレート、フォサロン、プロチダチオン、プロトエート、ソファミド、チオメトン、ヴァミドチオン、メタミドフォス、又はその組合せを含む、請求項229に記載の農薬、除草剤、及び/又は殺虫剤の除染、中和又は解毒剤。
【請求項２３３】
組成物が、コーティング、塗料、泡沫、液体、ゲル、ローション、界面活性剤、散剤又は乳化剤として処方されるか、又は前記と一緒に処方される、請求項229に記載の農薬、除草剤、及び/又は殺虫剤の除染、中和又は解毒剤。
【請求項２３４】
請求項189から193のいずれかの項若しくは請求項197から221のいずれかの項に記載の除染、中和又は解毒用組成物、又は請求項186に記載の医薬組成物、又は請求項228から232のいずれかの項に記載の農薬の除染、中和若しくは解毒剤を適用又は投与することを含む、農薬、除草剤、及び/又は殺虫剤を除染、中和又は解毒する方法。
【請求項２３５】
請求項189から193のいずれかの項若しくは請求項197から221のいずれかの項に記載の除染、中和又は解毒用組成物、又は請求項186に記載の医薬組成物、又は請求項228から232のいずれかの項に記載の農薬の除染、中和若しくは解毒剤を適用又は投与することを含む、農薬、除草剤及び/又は殺虫剤の毒性作用を防ぐ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子及び細胞生物学並びに生化学に関する。ある特徴では、本発明は、酵素及び酵素による能動的な除染（例えば神経作用物質の解毒）のための方法を提供する。ある特徴では、本発明は、ヒドロラーゼ活性、エステラーゼ活性、例えば有機リン酸ヒドロラーゼ活性（例えば有機リン酸エステラーゼ活性）、又はカルボキシルエステラーゼ活性、ハロペルオキシダーゼ活性、例えばヘム型（hCPO）若しくは非ヘムクロロペルオキシダーゼ（nhCPO）活性、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性、デハロゲナーゼ活性、オキシドレダクターゼ活性、プロリダーゼ活性、イミドジペプチダーゼ活性、及び/又は有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性を有する酵素、並びに前記を製造及び使用する方法（種々の工業的応用、例えばリグニンの漂白及び分解を含む）を、前記の除染剤としての使用に加えて提供する。本発明は、ポリペプチド、核酸、感染性ビヒクル、及び前記を使用して自己防衛的農薬耐性細胞又は植物を作成する方法を提供する。ある特徴では、本発明は、V剤、G剤及びH剤の酸化又は加水分解に対し次亜ハロゲン酸塩（hypohalite）を生成すると同様に、広域スペクトルの、物質特異性酸化及び加水分解活性を提供し、さらに生物剤（炭疽芽胞を含む）を殺滅するために酸化物（例えば二酸化塩素）及び反応性ラジカルを生じる酵素混合物又は組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
産業的農業で用いられるほとんどの殺虫剤及び農薬はアセチル-又はブチリルコリンエステラーゼ阻害剤であり、阻害作用の決定的因子としてP-S又はP-F結合を有する。これらの分子は害虫に対して有毒であるが、前記が適用される植物にとってもまた有毒であり得る。
【発明の開示】
【０００３】
要旨
本発明は、新規なポリペプチド（例えば酵素、ペプチド及び抗体）及び酵素による能動的な（例えば毒素又は毒物の）除染で使用される方法を提供する。前記毒素及び毒物には合成物質、例えば神経ガス（例えばVX剤、マスタードガスなど）及び生物学的毒性物質、例えばバチルス（Bacillus）菌及び他の有毒な芽胞が含まれる。本発明は、新規なポリペプチド（例えば酵素及び触媒抗体（これら酵素（例えばオキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼなど）活性の熱安定形及び耐熱形を含む））（前記酵素は、ヒドロラーゼ活性、エステラーゼ活性、例えば有機リン酸ヒドロラーゼ活性（例えば有機リン酸エステラーゼ活性）又はカルボキシルエステラーゼ活性、ハロペルオキシダーゼ活性、例えばヘム型（hCPO）若しくは非ヘムクロロペルオキシダーゼ（nhCPO）活性、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性、デハロゲナーゼ活性、オキシドレダクターゼ活性、プロリダーゼ活性、イミドジペプチダーゼ活性、及び/又は有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性、及びその混合活性（例えば処方物として）を除染活性のために有する）、及びこれらポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ベクターを含む）、宿主細胞、トランスジェニック植物及び非ヒト動物、並びにこれらポリヌクレオチド及びポリペプチドを製造及び使用する方法を提供する。
【０００４】
本発明は、本発明の例示的核酸と少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、又はそれより大きい残基の領域にわたって少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％若しくはそれより高い、又は完全な（100％）配列同一性を有する核酸配列を含む単離、合成又は組換え核酸を提供し、ここで前記核酸は、少なくともヒドロラーゼ活性、エステラーゼ活性、例えばカルボキシルエステラーゼ活性、有機リン酸ヒドロラーゼ活性、ハロペルオキシダーゼ活性、例えばヘム型（hCPO）若しくは非ヘムクロロペルオキシダーゼ（nhCPO）活性、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性、デハロゲナーゼ活性、オキシドレダクターゼ活性、プロリダーゼ活性、イミドジペプチダーゼ活性、及び/又は有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性、及び/又は除染活性（例えば農薬、除草剤、殺虫剤、及び他の毒性物質）又は他の関連活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする。前記配列同一性は配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、又は目視精査によって決定される。本発明の例示的核酸には、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49、配列番号:51、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、配列番号:67、配列番号:69、配列番号:71、配列番号:73、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:79、配列番号:81、配列番号:83、配列番号:85、配列番号:87、配列番号:89、配列番号:91、配列番号:93、配列番号:95、配列番号:97、配列番号:99、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:105、配列番号:107、配列番号:109、配列番号:111、配列番号:113、配列番号:115、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:121、配列番号:123、配列番号:125、配列番号:127、配列番号:129、配列番号:131、配列番号:133、配列番号:135、配列番号:137、配列番号:139、配列番号:141、配列番号:143、配列番号:145、配列番号:147、配列番号:149、配列番号:151、配列番号:153、配列番号:155、配列番号:157、配列番号:159、配列番号:161、配列番号:163、配列番号:165、配列番号:167、配列番号:169、配列番号:171、配列番号:173、配列番号:175、配列番号:177、配列番号:179、配列番号:181、配列番号:183、配列番号:185、配列番号:187、配列番号:189、配列番号:191、及び配列番号:193に記載される核酸配列、及びその部分配列、例えば長さが少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500若しくはそれより長い残基、��は遺伝子若しくは転写物の完全長にわたる残基、及びその相補性配列を含む単離、合成又は組換え核酸が含まれる。
【０００５】
本発明の例示的核酸にはまた、本発明のポリペプチド（本発明の例示的配列、例えば配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10など、配列番号:194までの全ての偶数の配列番号に記載されるアミノ酸配列を含む）、及びその部分配列並びにその変種をコードする単離、合成又は組換え核酸が含まれる。また別の特徴では、前記ポリペプチドは、ヒドロラーゼ活性、エステラーゼ活性、例えば有機リン酸ヒドロラーゼ活性（例えば有機リン酸エステラーゼ活性）又はカルボキシルエステラーゼ活性、ハロペルオキシダーゼ活性、例えばヘム型（hCPO）若しくは非ヘムクロロペルオキシダーゼ（nhCPO）活性、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性、デハロゲナーゼ活性、オキシドレダクターゼ活性、プロリダーゼ活性、イミドジペプチダーゼ活性、及び/又は有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性、又は除染活性、又は他の関連活性を有する。
【０００６】
ある特徴では、本発明は、ポリペプチド（酵素、ペプチド及び抗体を含む）及び前記をコードする核酸を提供し、ここで前記ポリペプチドは、解毒、中和又は除染活性を含む少なくとも1つの酵素活性を有する。前記酵素活性は、V剤の加水分解又は除染を含むことができる。前記酵素活性はV剤の加水分解又は除染を含むことができるか、又は前記酵素活性は、ハロペルオキシダーゼ活性、又はメチルホスホノフルオリデート若しくはチオリン酸エステルの加水分解の触媒を含む活性、又はその組合せを含むことができる。前記ハロペルオキシダーゼ活性はクロロペルオキシダーゼ活性を含むことができる。本発明のポリペプチドによって解毒、中和及び/又は除染されるV剤は、VX(O-エチル-S-[2(ジイソプロピルアミノ)エチル]メチルホスホノチオエート又はメチルホスホノチオ酸) 、VE(O-エチル-S-[2(ジエチルアミノ)エチル]エチルホスホノチオエート)、VG(O,O-ジエチル-S-[2-(ジエチルアミノ)エチル]ホスホロチオエート)、VM(O-エチル-S-[2-(ジエチルアミノ)エチル]メチルホスホノチオエート)、VR(ホスホノチオ酸)ソヴィエトV-ガス（ロシアVX）、テトリソ(O,O-ジイソプロピルS-(2-ジイソプロピルアミノエチル)ホスホロチオレート)、又はホスホリルチオコリン含有化合物を含むことができる。V剤を加水分解又は除染する酵素は、配列番号:1、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:89、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:127、配列番号:151、配列番号:167、配列番号:171、配列番号:187、若しくは配列番号:191に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:2、配列番号:76、配列番号:78、配列番号:90、配列番号:118、配列番号:120、配列番号:128、配列番号:152、配列番号:168、配列番号:172、配列番号:189若しくは配列番号:192に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０００７】
ある特徴では、本発明は、ポリペプチド（酵素、ペプチド及び抗体を含む）及び前記をコードする核酸を提供し、ここで前記ポリペプチドは、G剤に対する解毒、中和又は除染活性を含む少なくとも1つの酵素活性を有する。例えば前記酵素活性はG剤の加水分解又は除染を含み、有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性を含むことができる。前記G剤は、タブン（GA）、サリン（メチルホスホノフルオリド酸）（GB）、ソマン（GD）、シクロサリン（GF）又はその組合せを含むことができる。G剤を加水分解又は除染する酵素は、配列番号:73、配列番号:93、配列番号:95、配列番号:97、配列番号:99、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:105、配列番号:107、配列番号:109、配列番号:111、配列番号:113、配列番号:115、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:121、配列番号:123、配列番号:125、配列番号:127、配列番号:129、配列番号:131、配列番号:133、配列番号:135、配列番号:137、配列番号:139、配列番号:141、配列番号:143、配列番号:145、配列番号:147、配列番号:149、配列番号:151、配列番号:153、配列番号:155、配列番号:157、配列番号:159、配列番号:161、配列番号:163、配列番号:165、配列番号:167、配列番号:169、配列番号:171、配列番号:173、配列番号:175、配列番号:177、配列番号:179、配列番号:181、配列番号:183、配列番号:185、配列番号:187若しくは配列番号:191に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:72、配列番号:74、配列番号:94、配列番号:96、配列番号:98、配列番号:100、配列番号:102、配列番号:104、配列番号:106、配列番号:108、配列番号:110、配列番号:112、配列番号:114、配列番号:116、配列番号:118、配列番号:120、配列番号:122、配列番号:124、配列番号:126、配列番号:128、配列番号:130、配列番号:132、配列番号:配列番号:134、配列番号:136、配列番号:138、配列番号:140、配列番号:142、配列番号:144、配列番号:146、配列番号:148、配列番号:150、配列番号:152、配列番号:154、配列番号:156、配列番号:158、配列番号:160、配列番号:162、配列番号:164、配列番号:166、配列番号:168、配列番号:170、配列番号:172、配列番号:174、配列番号:176、配列番号:178、配列番号:180、配列番号:182、配列番号:184、配列番号:186、配列番号:188、配列番号:192に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、又はプロリダーゼ活性若しくは有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性を有しかつ配列番号:193に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:194に記載の配列を有するポリペプチドを含むことができる。
【０００８】
ある特徴では、本発明は、ポリペプチド（酵素、ペプチド及び抗体を含む）及び前記をコードする核酸を提供し、ここで前記ポリペプチドは、H剤に対する解毒、中和又は除染活性を含む少なくとも1つの酵素活性を有し、例えば前記酵素活性はH剤の加水分解又は除染を含む。前記H剤は、クロロペルオキシダーゼ活性、デハロゲナーゼ活性又はその組合せを含むことができる。H剤は、マスタードガス、1 1'チオビス[2クロロエタン]ビス-(2-クロロエチル)スルフィド、ベータ,ベータ'ジクロロエチルスルフィド、2,2'ジクロロエチルスルフィド、ビス(ベータ-クロロエチル)スルフィド、1-クロロ-2(ベータ-クロロジエチルチオ)エタン、又はその組合せを含むことができる。H剤を加水分解又は除染する酵素は、クロロペルオキシダーゼをコードし、かつ配列番号:1、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65若しくは配列番号:67に記載の配列を有するか、又はデハロゲナーゼをコードし、かつ配列番号:69若しくは配列番号:91に記載の配列を有する核酸によってコードされるポリペプチドを含むことができる。又は前記酵素は配列番号:70若しくは配列番号:92に示す配列を有する。
【０００９】
ある特徴では、本発明は、ポリペプチド（酵素、ペプチド及び抗体を含む）及び前記をコードする核酸を提供し、ここで前記ポリペプチドは、生物剤に対する解毒、中和又は除染活性を含む少なくとも1つの酵素活性を有し、例えば前記酵素活性は生物剤の加水分解又は除染を含む。前記酵素活性はクロロペルオキシダーゼ活性を含むことができる。前記生物剤は、グラム陰性芽胞、例えばバチルス（Bacillus）菌の芽胞、例えば炭疽又は炭疽菌（Bacillus anthracis）芽胞であり得る。生物剤を加水分解、中和又は除染する酵素は、配列番号:1、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65又は配列番号:67に記載の配列を有する核酸によってコードされるポリペプチドを含むことができる。あるいは、前記酵素は配列番号:2、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66又は配列番号:68に記載のアミノ酸配列を有する。前記酵素活性はP-F結合の加水分解又は除染を含むことができる。P-F結合の加水分解、中和又は除染活性を有するポリペプチドは、配列番号:71、配列番号:73、配列番号:93、配列番号:95、配列番号:97、配列番号:99、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:105、配列番号:107、配列番号:109、配列番号:111、配列番号:113、配列番号:115、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:121、配列番号:123、配列番号:125、配列番号:127、配列番号:129、配列番号:131、配列番号:133、配列番号:135、配列番号:137、配列番号:139、配列番号:141、配列番号:143、配列番号:145、配列番号:147、配列番号:149、配列番号:151、配列番号:153、配列番号:155、配列番号:157、配列番号:159、配列番号:161、配列番号:163、配列番号:165、配列番号:167、配列番号:169、配列番号:171、配列番号:173、配列番号:175、配列番号:177、配列番号:179、配列番号:181、配列番号:183、配列番号:185、配列番号:187、配列番号:191若しくは配列番号:193に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:72、配列番号:74、配列番号:94、配列番号:96、配列番号:98、配列番号:100、配列番号:102、配列番号:104、配列番号:106、配列番号:108、配列番号:110、配列番号:112、配列番号:114、配列番号:116、配列番号:118、配列番号:120、配列番号:122、配列番号:124、配列番号:126、配列番号:128、配列番号:130、配列番号:132、配列番号:134、配列番号:136、配列番号:138、配列番号:140、配列番号:142、配列番号:144、配列番号:146、配列番号:148、配列番号:150、配列番号:152、配列番号:154、配列番号:156、配列番号:158、配列番号:160、配列番号:162、配列番号:164、配列番号:166、配列番号:168、配列番号:170、配列番号:172、配列番号:174、配列番号:176、配列番号:178、配列番号:180、配列番号:182、配列番号:184、配列番号:186、配列番号:188、配列番号:192若しくは配列番号:194に記載されるアミノ酸配列を有することができる。
【００１０】
ある特徴では、本発明のポリペプチド、又は本発明の方法の実施、又は本発明の処方物で用いられるポリペプチドの酵素活性は、P-S結合の加水分解又は除染を含む。P-S結合の加水分解、中和又は除染活性を有するポリペプチドは、配列番号:1、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:89、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:127、配列番号:151、配列番号:167、配列番号:171、配列番号:187若しくは配列番号:191に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:2、配列番号:76、配列番号:78、配列番号:90、配列番号:118、配列番号:120、配列番号:128、配列番号:152、配列番号:168、配列番号:172、配列番号:188若しくは配列番号:192に記載されるアミノ酸配列を有することができる。
ある特徴では、本発明のポリペプチド、又は本発明の方法の実施、又は本発明の処方物で用いられるポリペプチドの酵素活性は、有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性を含む。有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性を有する酵素は、配列番号:193に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:194に記載されるアミノ酸配列を有することができる。
ある特徴では、本発明のポリペプチド、又は本発明の方法の実施、又は本発明の処方物で用いられるポリペプチドの酵素活性はアミノペプチダーゼ活性を含む。アミノペプチダーゼ活性を有する酵素は、配列番号:189に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:190に記載されるアミノ酸配列を有することができる。
ある特徴では、本発明のポリペプチド、又は本発明の方法の実施若しくは本発明の処方物で用いられるポリペプチドの酵素活性はカルボキシルエステラーゼ活性を含む。カルボキシルエステラーゼ活性を有する酵素は、配列番号:73、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:79、配列番号:81、配列番号:83、配列番号:85、配列番号:87又は配列番号:89に記載の配列を有する核酸によってコードされ得る。
【００１１】
ある特徴では、本発明のポリペプチド、又は本発明の方法の実施、又は本発明の処方物で用いられるポリペプチドの酵素活性はヘム型ペルオキシダーゼ活性を含む。ヘム型ペルオキシダーゼ活性を有する酵素は、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49若しくは配列番号:51に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は前記酵素は、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50若しくは配列番号:52に記載の配列を有することができる。前記酵素は、ヘム型クロロペルオキシダーゼ活性有することができ、配列番号:1に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:2に記載のアミノ酸配列を有することができる。
ある特徴では、本発明のポリペプチド、又は本発明の方法の実施、又は本発明の処方物で用いられるポリペプチドの酵素活性は、非ヘム型ペルオキシダーゼ活性を含む。非ヘム型クロロペルオキシダーゼ活性を有する酵素は、配列番号:1、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、若しくは配列番号:67に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は前記酵素は、配列番号:2、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66、若しくは配列番号:68に記載のアミノ酸配列を有することができる。
【００１２】
ある特徴では、本発明のポリペプチド、又は本発明の方法の実施、又は本発明の処方物で用いられるポリペプチドの酵素活性はデハロゲナーゼ活性を含む。デハロゲナーゼ活性を有する酵素は、配列番号:69若しくは配列番号:91に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:70若しくは配列番号:92に記載のアミノ酸配列を有することができる。
ある特徴では、本発明のポリペプチド、又は本発明の方法の実施、又は本発明の処方物で用いられるポリペプチドの酵素活性はジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性を含む。ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性を有する酵素は、配列番号:71に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:72に記載されるアミノ酸配列を有することができる。
ある特徴では、本発明のポリペプチド、又は本発明の方法の実施、又は本発明の処方物で用いられるポリペプチドの酵素活性は有機リン酸エステラーゼ活性を含み、P-S又はP-F結合を加水分解し、アセチルコリンエステラーゼ-又はブチリルコリンエステラーゼ-阻害物質を解毒することができる。
【００１３】
ある特徴では、本発明のポリペプチド、又は本発明の方法の実施、又は本発明の処方物で用いられるポリペプチドの酵素活性はハロゲン化反応を含み、過酸化水素及び塩化物、臭化物又はヨウ化物から次亜ハロゲン酸塩を生成する。ある特徴では、前記酵素活性は、過酸化水素から有機基質への酸素の転移の触媒を含む。
ある特徴では、本発明のポリペプチド、又は本発明の方法の実施、又は本発明の処方物で用いられるポリペプチドの酵素活性はリグニンの化学的漂白を含む。前記酵素活性は、パルプの製造又は製紙工程におけるリグニンの化学漂白を含むことができる。
ある特徴では、本発明のポリペプチド、又は本発明の方法の実施、又は本発明の処方物で用いられるポリペプチドの酵素活性は、農薬、除草剤及び/又は殺虫剤の解毒を含む。前記農薬は、デメトン-S、デメトン-S-メチル、デメトン-S-メチルスルホン、デメトン-メチル、パラチオン、フォスメト、カルボフェノチオン、ベノキサフォス、アジンフォス-メチル、アジンフォス-エチル、アミトン、アミジチオン、シアントエート、ジアリフォス、ジメトエート、ジオキサチオン、ジスルフォトン、エンドチオン、エチオン、エトエート-メチル、フォルモチオン、マラチオン、メルカルバム、オメトエート、オキシデプロフォス、オキシジスルフォトン、フェンカプトン、フォレート、フォサロン、プロチダチオン、プロトエート、ソファミド、チオメトン、ヴァミドチオン、メタミドフォス、又はその組合せを含むことができる。
【００１４】
ある特徴では、本発明はまた、混合培養から誘導されるという共通の新規性を有する酵素コード核酸を提供する。本発明は、本発明の核酸を含む混合培養から単離される酵素コード核酸を提供し、前記核酸は、例えば、本発明の例示的核酸と少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、75、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、又はそれより大きい残基の領域にわたって少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％若しくはそれより高い、又は完全な（100％）配列同一性を有する核酸配列であり、ここで前記核酸は、酵素活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードし、前記配列同一性は配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、又は目視精査によって決定される。ある特徴では、本発明は、本発明の核酸を含む混合培養から単離される酵素コード核酸を提供する。
【００１５】
ある特徴では、本発明はまた、環境供給源、例えば混合環境供給源に由来するという共通の新規性を有する酵素コード核酸を提供する。ある特徴では、本発明は、核酸配列を含む環境供給源、例えば混合環境供給源から単離される酵素コード核酸を提供し、前記核酸配列は、本発明の例示的核酸と少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500又はそれより大きい残基の領域にわたって少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％若しくはそれより高い、又は完全な（100％）配列同一性を有する核酸配列を含み、ここで前記核酸は、酵素活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードし、前記配列同一性は配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、又は目視精査によって決定される。ある特徴では、本発明は、本発明の核酸を含む環境供給源、例えば混合環境供給源から単離される酵素コード核酸を提供する。
ある特徴では、前記配列比較アルゴリズムは、BLASTバージョン2.2.2アルゴリズムであり、ここでフィルタリング設定はblastall p blastp d “nr pataa” F Fに設定され、他の全てのオプションは規定値に設定される。
【００１６】
本発明のまた別の特徴は、本発明の核酸配列の少なくとも10の連続する塩基、前記と実質的に同一の配列、及び前記と相補的な配列を含む単離、合成又は組換え核酸である。
ある特徴では、前記単離、合成又は組換え核酸は酵素活性を有するポリペプチドをコードし、前記酵素活性は熱安定性である。前記ポリペプチドは、約37℃から約95℃、約55℃から約85℃、約70℃から約95℃、又は約90℃から約95℃の温度範囲を含む条件下で活性を維持することができる。
また別の特徴では、前記単離又は組換え核酸は、酵素活性、構造活性又は結合活性を有するポリペプチドをコードし、前記活性は耐熱性である。前記ポリペプチドは、37℃から約95℃の範囲の温度、又は55℃より高く約85℃までの範囲のいずれかの温度に暴露した後で活性を維持することができる。前記ポリペプチドは、約1℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約95℃、約55℃から約85℃、約70℃から約75℃、若しくは約90℃から約95℃又はそれより高い範囲の温度に暴露した後で活性を維持することができる。ある特徴では、前記ポリペプチドは、約pH4.5で90℃より高く約95℃までの範囲の温度に暴露した後で活性を維持する。
【００１７】
本発明は、本発明の核酸、例えば配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7など(配列リストに記載される奇数の配列番号の全て、すなわち配列番号:1から配列番号:193まで)に記載の配列（又はその相補鎖）（そのフラグメント若しくは部分配列及びその相補性配列を含む) を含む本発明の例示的核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単離、合成又は組み換え核酸を提供する。ある特徴では、前記核酸は、酵素活性、例えば除染活性（ヒドロラーゼ活性、エステラーゼ活性、例えば有機リン酸ヒドロラーゼ活性（例えば有機リン酸エステラーゼ活性）又はカルボキシルエステラーゼ活性、ハロペルオキシダーゼ活性、例えばヘム型（hCPO）若しくは非ヘムクロロペルオキシダーゼ（nhCPO）活性、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性、デハロゲナーゼ活性、オキシドレダクターゼ活性、プロリダーゼ活性、イミドジペプチダーゼ活性、及び/又は有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性を含む）を有するポリペプチドをコードする。前記核酸は、長さが少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500若しくはそれより大きい残基又は完全長の遺伝子若しくは転写物であり得る。ある特徴では、前記ストリンジェントな条件には、約65℃の温度で15分の0.2ｘSSC中での洗浄を含む洗浄工程が含まれる。
【００１８】
本発明は、核酸プローブ、例えば酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を同定するためのプローブを提供し、ここで前記プローブは、本発明の配列又はそのフラグメント若しくは部分配列の少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000若しくはそれより大きい連続する塩基を含み、前記プローブは結合又はハイブリダイゼーションによって前記核酸を同定する。前記プローブは、本発明の配列又はそのフラグメント若しくは部分配列を含む配列の少なくとも約10から50、約20から60、約30から70、約40から80、又は約60から100の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。前記プローブは、本発明の核酸配列又はその部分配列の少なくとも約10から50、約20から60、約30から70、約40から80、又は約60から100の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。
本発明は、酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅する増幅プライマー配列対を提供し、ここで、前記プライマー対は、本発明の配列又はそのフラグメント若しくは部分配列を含む核酸を増幅することができる。前記増幅プライマー配列対の一方又は各メンバーは、前記配列の少なくとも約10から50の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００１９】
本発明は、酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅する方法を提供し、前記方法は、本発明の核酸配列又はそのフラグメント若しくは部分配列を増幅することができる増幅プライマー配列対を用いて鋳型核酸を増幅する工程を含む。
本発明は、本発明の核酸又はその部分配列を含む発現カセットを提供する。ある特徴では、前記発現カセットは、プロモーターと機能可能に連結された前記核酸を含むことができる。前記プロモーターは、ウイルスプロモーターでも、細菌プロモーターでも、哺乳動物プロモーターでも、又は植物プロモーターでもよい。ある特徴では、前記植物プロモーターは、ジャガイモ、コメ、トウモロコシ、コムギ、タバコ、又はオオムギのプロモーターであり得る。構成的プロモーターはCaMV35Sを含むことができる。また別の特徴では、前記プロモーターは誘導性プロモーターでもよい。ある特徴では、前記プロモーターは、組織特異的プロモーター又は環境調節性若しくは発生調節性プロモーターであり得る。したがって、前記プロモーターは、例えば種子特異的、葉特異的、根特異的、茎特異的プロモーター又は器官脱離により誘導されるプロモーターであり得る。ある特徴では、発現カセットはさらに植物発現ベクター又は植物ウイルス発現ベクターを含むことができる。
本発明は、本発明の発現カセット（例えばベクター）又は本発明の核酸を含むクローニングビヒクルを提供する。前記クローニングビヒクルは、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージ又は人工染色体であり得る。前記ウイルスベクターはアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター又はアデノ関連ウイルスベクターを含むことができる。前記クローニングビヒクルは細菌人工染色体（BAC）、プラスミド、バクテリオファージP1-由来ベクター（PAC）、酵母人工染色体（YAC）、又は哺乳動物人工染色体（MAC）を含むことができる。
【００２０】
本発明は、本発明の核酸若しくは本発明の発現カセット（例えばベクター）、又は本発明のクローニングビヒクルを含む形質転換細胞を提供する。ある特徴では、前記形質転換細胞は、細菌細胞、哺乳動物細胞、菌類細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は植物細胞であろう。ある特徴では、前記植物細胞は、ジャガイモ、コムギ、コメ、トウモロコシ、タバコ、又はオオムギの細胞であり得る。
本発明は、本発明の核酸若しくは本発明の発現カセット（例えばベクター）を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する。ある特徴では、前記動物はマウスである。
本発明は、本発明の核酸若しくは本発明の発現カセット（例えばベクター）を含むトランスジェニック植物を提供する。前記トランスジェニック植物は、トウモロコシ、ジャガイモ、トマト、コムギ、脂肪種子植物、ナタネ、ダイズ、イネ、オオムギ又はタバコであり得る。
本発明は、本発明の核酸若しくは本発明の発現カセット（例えばベクター）を含むトランスジェニック種子を提供する。前記トランスジェニック種子は、コメ、トウモロコシの種子、コムギの穀粒、脂肪種子植物、ナタネ、ダイズ種子、ヤシの核、ヒマワリ種子、ゴマ種子、落花生、又はタバコ種子であり得る。
本発明は、本発明の核酸に対して相補的な核酸配列又は本発明の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、細胞内の酵素メッセージの翻訳を阻害する方法を提供する前記方法は、細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与するか、又は細胞内でアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現させることを含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明の核酸に対して相補的な核酸配列又は本発明の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含む。
【００２１】
本発明は、本発明の例示的ポリペプチド又はペプチドと少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550若しくはそれより大きい残基の領域にわたって、又は前記ポリペプチドの完全長にわたって少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％若しくはそれより高い、又は完全な（100％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離、合成又は組換えポリペプチドを提供し、前記配列同一性は配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、又は目視精査によって決定される。本発明の例示的ポリペプチド又はペプチド配列には、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50、配列番号:52、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66、配列番号:68、配列番号:70、配列番号:72、配列番号:74、配列番号:76、配列番号:78、配列番号:80、配列番号:82、配列番号:84、配列番号:86、配列番号:88、配列番号:90、配列番号:92、配列番号:94、配列番号:96、配列番号:98、配列番号:100、配列番号:102、配列番号:104、配列番号:106、配列番号:108、配列番号:110、配列番号:112、配列番号:114、配列番号:116、配列番号:118、配列番号:120、配列番号:122、配列番号:124、配列番号:126、配列番号:128、配列番号:130、配列番号:132、配列番号:134、配列番号:136、配列番号:138、配列番号:140、配列番号:142、配列番号:143、配列番号:146、配列番号:148、配列番号:150、配列番号:152、配列番号:154、配列番号:156、配列番号:158、配列番号:160、配列番号:162、配列番号:164、配列番号:166、配列番号:168、配列番号:170、配列番号:172、配列番号:174、配列番号:176、配列番号:178、配列番号:180、配列番号:182、配列番号:184、配列番号:186、配列番号:188、配列番号:190、配列番号:192及び配列番号:194、並びにその部分配列及びその変種、例えば長さが少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500若しくはそれより大きい残基又は酵素の完全長にわたる残基が含まれる。本発明の例示的ポリペプチド又はペプチド配列には、本発明の核酸によってコードされる配列が含まれる。本発明の例示的ポリペプチド又はペプチド配列には、本発明の抗体が特異的に結合するポリペプチド又はペプチドが含まれる。ある特徴では、本発明のポリペプチドは少なくとも1つの酵素活性を有する。ある特徴では、前記活性は領域選択性及び/又は化学選択性活性である。
【００２２】
本発明のまた別の特徴は、本発明のポリペプチド又はペプチド配列の少なくとも10の連続する塩基、前記と実質的に同一の配列、及び前記と相補的な配列を含む単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチドである。
ある特徴では前記酵素活性は熱安定性である。前記ポリペプチドは、約37℃から約95℃、約55℃から約85℃、約70℃から約95℃、又は約90℃から約95℃の温度範囲を含む条件下で活性を維持することができる。また別の特徴では前記酵素活性は耐熱性である。前記ポリペプチドは、約37℃から約95℃の範囲の温度、又は55℃より高く約85℃までの範囲の温度に暴露した後で活性を維持することができる。ある特徴では、前記ポリペプチドは、約pH4.5で90℃より高く約95℃までの範囲の温度に暴露した後で活性を維持する。
ある特徴では、前記単離、合成又は組換えポリペプチドは、シグナル配列を欠く本発明のポリペプチドを含むことができる。ある特徴では、前記単離又は組換えポリペプチドは、異種シグナル配列、例えば異種酵素のシグナル配列又は非酵素シグナル配列を含む本発明のポリペプチドを含むことができる。ある特徴では、本発明は、本発明のシグナル配列を含む第一のドメイン及び少なくとも第二のドメインを含むキメラタンパク質を提供する。前記タンパク質は融合タンパク質であり得る。前記第二のドメインは酵素を含むことができる。前記酵素は1つの酵素（例えば本発明の酵素又は別の酵素）であり得る。
【００２３】
ある特徴では、前記酵素活性は、タンパク質1ミリグラム当たり約100から約1000ユニットの範囲の約37℃の比活性を含む。別の特徴では、前記酵素活性は、タンパク質1ミリグラム当たり約500から約750ユニットの比活性を含む。或いは、前記酵素活性は、タンパク質1ミリグラム当たり約500から約1200ユニットの範囲の約37℃の比活性を含む。ある特徴では、前記酵素活性は、タンパク質1ミリグラム当たり約750から約1000ユニットの範囲での約37℃の比活性を含む。別の特徴では、前記耐熱性は、高い温度に加熱後に、37℃の比活性の少なくとも半分を保持することを含む。或いは、前記耐熱性は、高い温度に加熱後に、タンパク質1ミリグラム当たり約500から約1200ユニットの範囲の約37℃の比活性を保持することを含む。
本発明は、本発明の単離、合成又は組換えポリペプチドを提供し、ここで、前記ポリペプチドは少なくとも1つのグリコシル化部位を含む。ある特徴では、グリコシル化はN-結合グリコシル化である得る。ある特徴では、前記ポリペプチドは、P. パストリス（P. pastoris）又はS. ポンベ（S. pombe）で発現させるとグリコシル化され得る。
ある特徴では、前記ポリペプチドは、約pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5又はpH4を含む条件下で酵素活性を維持することができる。別の特徴では、前記ポリペプチドは、約pH7、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH10.5又はpH11を含む条件下で酵素活性を維持することができる。
【００２４】
本発明は、本発明のポリペプチドを含むタンパク質調製物を提供し、ここで、前記タンパク質調製物は液体、固体又はゲルを含む。
本発明は、本発明のポリペプチド及び第二のドメインを含むヘテロダイマーを提供する。ある特徴では、第二のドメインはポリペプチドであり、前記ヘテロダイマーは融合タンパク質であり得る。ある特徴では、第二のドメインはエピトープ又はタグでもよい。ある特徴では、本発明は、本発明のポリペプチドを含むホモダイマーを提供する。
本発明は、酵素活性を有する固定ポリペプチドを提供し、ここで前記ポリペプチドは、本発明のポリペプチド、本発明の核酸によってコードされるポリペプチド、又は本発明のポリペプチド及び第二のドメインを含むポリペプチドを含む。ある特徴では、前記ポリペプチドは、細胞、金属、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、グラファイト粒子、ビーズ、ゲル、プレート、アレイ又はキャピラリー管上に固定することができる。
本発明は、固定された本発明の核酸を含むアレイを提供する。本発明は、本発明の抗体を含むアレイを提供する。
本発明は、本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドと特異的に結合する単離、合成、又は組換え抗体を提供する。前記抗体はモノクローナルでもポリクローナル抗体でもよい。本発明は、本発明の抗体、例えば本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドと特異的に結合する抗体を含むハイブリドーマを提供する。
本発明は、本発明のポリペプチド、例えば本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む動物用の食物サプリメントを提供する。ある特徴では、前記食物サプリメント中のポリペプチドはグリコシル化され得る。本発明は、本発明のポリペプチド、例えば本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む食用酵素デリバリーマトリックスを提供する。ある特徴では、前記デリバリーマトリックスはペレットを含む。ある特徴では、前記ポリペプチドはグリコシル化することができる。ある特徴では、前記酵素活性は耐熱性である。別の特徴では、前記酵素活性は熱安定性である。
【００２５】
本発明は、以下の工程を含む酵素活性を有するポリペプチドを単離又は同定する方法を提供する：（a）本発明の抗体を提供する工程；（b）ポリペプチドを含むサンプルを提供する工程；及び（c）工程（b）のサンプルを工程（a）の抗体と、前記抗体が前記ポリペプチドと特異的に結合することができる条件下で接触させ、それによって酵素活性を有するポリペプチドを単離又は同定する工程。
本発明は抗酵素抗体を生成する方法を提供し、前記方法は、本発明の核酸又は本発明のポリペプチド又はその部分配列を、液性免疫応答を生じるために十分な量で非ヒト動物に投与し、それによって抗酵素抗体を生成することを含む。本発明は、抗酵素免疫を誘導する方法を提供し、前記方法は、本発明の核酸又は本発明のポリペプチド又はその部分配列を、免疫応答を生じるために十分な量で非ヒト動物に投与することを含む。
本発明は、以下の工程を含む組換えポリペプチドを生成する方法を提供する：（a）プロモーターに機能可能に連結された本発明の核酸を提供する工程；及び（b）前記ポリペプチドの発現を許容する条件下で工程（a）の核酸を発現させ、それによって組換えポリペプチドを生成する工程。ある特徴では、前記方法はさらに、工程（a）の核酸で宿主細胞を形質転換し、続いて工程（a）の核酸を発現させ、それによって形質転換細胞内で組換えポリペプチドを生成する工程を含むことができる。
本発明は、以下の工程を含む酵素活性を有するポリペプチドを同定する方法を提供する：（a）本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（b）酵素基質を提供する工程；及び（c）工程（a）のポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種を工程（b）の基質と接触させ、基質の量の減少又は反応生成物の量の増加を検出する工程、ここで基質の量が減少又は反応生成物の量が増加すれば酵素活性を有するポリペプチドが検出されたとする。
【００２６】
本発明は、以下の工程を含む酵素の基質を同定する方法を提供する：（a）本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（b）テスト基質を提供する工程；及び（c）工程（a）のポリペプチドを工程（b）のテスト基質と接触させ、基質の量の減少又は反応生成物の量の増加を検出する工程、ここで基質の量が減少又は反応生成物の量が増加すれば前記テスト基質が酵素基質と同定される。
本発明は、以下の工程を含む、テスト化合物がポリペプチドと特異的に結合するか否かを決定する方法を提供する：（a）本発明の核酸を含む核酸又は前記核酸を含むベクターを、前記核酸のポリペプチドへの翻訳を許容する条件下で発現させる工程、又は本発明のポリペプチドを提供する工程；（b）テスト化合物を提供する工程；（c）前記ポリペプチドを前記テスト化合物と接触させる工程；及び（d）工程（b）のテスト化合物が前記ポリペプチドと特異的に結合するか否かを決定する工程。
本発明は、以下の工程を含む、酵素活性の調節物質を同定する方法を提供する：（a）本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（b）テスト化合物を提供する工程；（c）工程（a）のポリペプチドを工程（b）のテスト化合物と接触させ、酵素活性を測定する工程、ここでテスト化合物の非存在下の活性と比較してテスト化合物の存在下で測定された酵素活性が変化すれば、前記テスト化合物が酵素活性を調節するとして決定される。ある特徴では、前記酵素活性は、酵素基質を提供し、さらに基質量の減少若しくは反応生成物量の増加又は基質量の増加若しくは反応生成物量の減少を検出することによって測定することができる。テスト化合物の非存在下での基質量若しくは反応生成物量と比較してテスト化合物の存在下で基質量が減少若しくは反応生成物量が増加すれば、前記テスト化合物は酵素活性のアクチベーターとして同定される。テスト化合物の非存在下での基質量若しくは反応生成物量と比較してテスト化合物の存在下で基質量が増加若しくは反応生成物量が減少すれば、前記テスト化合物は酵素活性の阻害剤として同定される。
【００２７】
本発明は、プロセッサー及びデータ保存装置を含むコンピュータシステムを提供する。前記データ保存装置には本発明のポリペプチド配列（例えば本発明の核酸によってコードされるポリペプチド）又は本発明の核酸配列が保存されている。ある特徴では、前記コンピュータシステムはさらに配列比較アルゴリズム、及び少なくとも1つの参照配列が保存された保存装置を含むことができる。別の特徴では、前記配列比較アルゴリズムは多型性を表示するコンピュータプログラムを含む。ある特徴では、前記コンピュータシステムはさらに、前記配列における1つ以上の特徴を同定するアイデンティファイアーを含むことができる。本発明は、本発明のポリペプチド配列または本発明の核酸配列が保存されているコンピュータ読み出し可能媒体を提供する。本発明は、以下の工程を含む配列の特徴を同定する方法を提供する：（a）配列内の1つ以上の特徴を同定するコンピュータプログラムを用いて配列を読み取る工程（前記配列は本発明のポリペプチド配列又は核酸配列を含む）；及び、（b）前記コンピュータプログラムにより前記配列の1つ以上の特徴を同定する工程。本発明は、以下の工程を含む第一の配列と第二の配列を比較する方法を提供する：（a）配列を比較するコンピュータプログラムを用いて第一の配列および第二の配列を読み取る工程（前記第一の配列は本発明のポリペプチド配列又は核酸配列を含む）；及び、（b）第一の配列と第二の配列間の相違を前記コンピュータプログラムにより決定する工程。第一の配列と第二の配列間の相違を決定する工程はさらに多型性を同定する工程を含むことができる。ある特徴では、前記方法はさらに、配列内の1つ以上の特徴を同定するアイデンティファイヤーを含むことができる。別の特徴では、前記方法は、コンピュータプログラムを用いて第一の配列を読み取り、さらに前記配列内の1つ以上の特徴を同定する工程を含むことができる。
【００２８】
本発明は、以下の工程を含む、環境サンプルから酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離または回収する方法を提供する：（a）酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅するための増幅プライマー配列を提供する工程、ここで前記プライマー対は本発明の核酸を増幅することができる；（b）前記環境サンプルから核酸を単離するか、または前記サンプル内の核酸がハイブリダイゼーションのために前記増幅プライマー対に接近できるように前記環境サンプルを処理する工程；及び、（c）工程（b）の核酸を工程（a）の増幅プライマー対と一緒にして前記環境サンプルの核酸を増幅し、それによって環境サンプルから酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離または回収する工程。前記増幅プライマー配列対の一方又は各メンバーは、本発明の配列の少なくとも約10から50の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。
本発明は、以下の工程を含む環境サンプルから酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離または回収する方法を提供する：（a）本発明の核酸又はその部分配列を含むポリヌクレオチドプローブを提供する工程；（b）前記環境サンプルから核酸を単離するか、又は前記サンプル内の核酸がハイブリダイゼーションのために工程(a)のポリヌクレオチドに接近できるように前記環境サンプルを処理する工程；（c）工程（b）の単離核酸又は処理された環境サンプルを工程(a)のポリヌクレオチドプローブと一緒にする工程；さらに（d）工程（a）のポリヌクレオチドプローブと特異的にハイブリダイズする核酸を単離し、それによって環境サンプルから酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離または回収する工程。前記環境サンプルは水サンプル、液体サンプル、土壌サンプル、空気サンプル又は生物学的サンプルを含むことができる。ある特徴では、前記生物学的サンプルは、細菌細胞、原生動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、菌類細胞又は哺乳動物細胞に由来し得る。
【００２９】
本発明は、以下の工程を含む酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸の変種を作出する方法を提供する：（a）本発明の核酸を含む鋳型核酸を提供する工程；（b）前記鋳型の配列内の1つ以上のヌクレオチドの改変、欠失若しくは付加、又は前記の組合せを実施して前記鋳型核酸の変種を作出する工程。ある特徴では、前記方法はさらに、変種核酸を発現させて変種酵素ポリペプチドを生成することを含むことができる。前記改変、付加又は欠失は、エラー誘発PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）、合成連結再アッセンブリ（SLR）又はそれらの組合せを含む方法により導入することができる。別の特徴では、前記改変、付加または欠失は、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート-修飾DNA変異導入、ウラシル含有鋳型変異導入、ギャップ含有二重鎖変異導入、点ミスマッチ修復変異導入、修復欠損宿主株変異導入、化学変異導入、放射性変異導入、欠失変異導入、制限-選択変異導入、制限-精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸マルチマー生成、及びそれらの組合せによって導入することができる。
ある特徴では、前記方法は、鋳型核酸によってコードされるポリペプチドの活性または安定性とは変異した若しくは異なる活性又は変異した若しくは異なる安定性を有する酵素が得られるまで反復することができる。ある特徴では、前記変種酵素ポリペプチドは耐熱性であり、高い温度に暴露された後ある程度の活性を維持する。別の特徴では、前記変種酵素ポリペプチドは、鋳型核酸によってコードされる酵素と比較して高度にグリコシル化されている。或いは、前記変種酵素ポリペプチドは高温下で活性を有するが、鋳型核酸によってコードされる酵素は高温下で活性をもたない。ある特徴では、前記方法は、鋳型核酸のコドン使用頻度とは変異したコドン使用頻度を示す酵素コード配列が得られるまで反復することができる。別の特徴では、前記方法は、鋳型核酸のメッセージ発現レベル又は安定性レベルより高い又は低いメッセージ発現レベル又は安定性レベルを有する酵素遺伝子が得られるまで反復することができる。
【００３０】
本発明は、酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸内のコドンを改変して宿主細胞におけるその発現を高める方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：（a）酵素活性を有するポリペプチドをコードする本発明の核酸を提供する工程；及び、（b）工程（a）の核酸の非優先コドンまたは低優先コドンを同定し、前記コドンを置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする優先コドンまたは中立的に使用されるコドンに置換し、それによって核酸を改変して宿主細胞における前記の発現を増加させる工程（前記優先コドンとは宿主細胞の遺伝子内のコード配列において高頻度で提示されるコドンであり、前記非優先コドンまたは前記低優先コドンとは宿主細胞の遺伝子内のコード配列において低頻度で提示されるコドンである）。
本発明は、以下の工程を含む、酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸内のコドンを改変する方法を提供する：（a）本発明の核酸を提供する工程；及び、（b）工程（a）の核酸のコドンを同定し、前記コドンを置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする異なるコドンで置換し、それによって酵素をコードする核酸内のコドンを改変する工程。
本発明は、以下の工程を含む、酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸内のコドンを改変して宿主細胞におけるその発現を高める方法を提供する：（a）酵素ポリペプチドをコードする本発明の核酸を提供する工程；及び、（b）工程（a）の核酸内の非優先コドンまたは低優先コドンを同定し、前記コドンを置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする優先コドンまたは中立的に使用されるコドンで置換し、それによって前記核酸を改変して宿主細胞におけるその発現を高める工程（前記優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において高頻度で提示されるコドンであり、前記非優先または前記低優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において低頻度で提示されるコドンである）。
本発明は、以下の工程を含む、酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸内のコドンを改変して宿主細胞におけるその発現を低下させる方法を提供する：（a）本発明の核酸を提供する工程；及び（b）工程（a）の核酸内の少なくとも1つの優先コドンを同定し、前記コドンを置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする非優先コドンまたは低優先コドンで置換し、それによって前記核酸を改変して宿主細胞におけるその発現を低下させる工程（前記優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において高頻度で提示されるコドンであり、前記非優先または低優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において低頻度で提示されるコドンである）。ある特徴では、前記宿主細胞は細菌細胞、菌類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞または哺乳動物細胞であり得る。
【００３１】
本発明は、複数の改変された酵素活性部位又は基質結合部位をコードする核酸のライブラリーを作成する方法を提供する（前記改変活性部位または基質結合部位は、第一の活性部位または第一の基質結合部位をコードする配列を含む第一の核酸に由来する）。前記方法は以下の工程を含む：（a）第一の活性部位または第一の基質結合部位をコードする第一の核酸を提供する工程（前記第一の核酸配列は本発明の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含み、さらに前記核酸は酵素活性部位または酵素基質結合部位をコードする）；（b）前記第一の核酸内の複数の標的コドンにおいて天然に存在するアミノ酸変種をコードする一組の変異導入オリゴヌクレオチドを提供する工程；（c）前記一組の変異導入オリゴヌクレオチドを用いて、変異導入アミノ酸コドンの各々一連のアミノ酸変種をコードする一組の活性部位コード変種または基質結合部位コード変種核酸を生成し、それによって複数の改変酵素活性部位または基質結合部位をコードする核酸のライブラリーを作成する工程。ある特徴では、前記方法は、最適化定方向進化システム、遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）、合成連結再アッセンブリ(SLR)、エラー誘発PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ及びそれらの組合せを含む方法によって、工程（a）の第一の核酸に変異を導入することを含む。別の特徴では、前記方法は、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート-修飾DNA変異導入、ウラシル含有鋳型変異導入、ギャップ含有二重鎖変異導入、点ミスマッチ修復変異導入、修復欠損宿主株変異導入、化学変異導入、放射性変異導入、欠失変異導入、制限-選択変異導入、制限-精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸マルチマー生成及びそれらの組合せを含む方法によって、工程（a）の第一の核酸又は変種に変異を導入することを含む。
【００３２】
本発明は、以下の工程を含む小分子の製造方法を提供する：（a）小分子を合成または改変することができる複数の生合成酵素を提供する工程（前記酵素の1つは本発明の核酸によってコードされる酵素を含む）；（b）工程（a）の酵素の少なくとも１つに対する基質を提供する工程；及び（c）複数の生物触媒反応を促進する条件下で工程（b）の基質を前記酵素と反応させて一連の生物触媒反応により小分子を生成する工程。本発明は、以下の工程を含む小分子の改変方法を提供する：（a）酵素を提供する工程（前記酵素は本発明のポリペプチド、又は本発明の核酸若しくはその部分配列によってコードされるポリペプチドを含む）；（b）小分子を提供する工程；及び、（c）工程（a）の酵素を工程（b）の小分子と前記酵素によって触媒される酵素反応が促進される条件下で反応させ、それによって酵素反応により小分子を改変する工程。ある特徴では、前記方法は、工程（a）の酵素に対する複数の小分子基質を含むことができ、それによって前記酵素により触媒される少なくとも1つの酵素反応によって生成される改変小分子のライブラリーを作成する。ある特徴では、前記方法は、複数の酵素を前記酵素による複数の生物触媒反応を促進する条件下で追加し、前記複数の酵素反応によって生成される改変小分子のライブラリーを作成することを含むことができる。別の特徴では、前記方法はさらに、所望の活性を示す特定の小分子がライブラリー内に存在するか否かを決定するために、前記ライブラリーを試験する工程を含むことができる。前記ライブラリーの試験工程はさらに、所望の活性をもつ特定の改変小分子の有無について改変小分子の一部分を試験することによってライブラリー内の複数の改変小分子の前記一部分を生成するために用いられた生物触媒反応の1つ以外の全てを系統的に排除し、所望の活性をもつ特定の改変小分子を生成する少なくとも1つの特異的な生物触媒反応を同定する工程を含むことができる。
【００３３】
本発明は、以下の工程を含む酵素の機能的フラグメントを決定する方法を提供する：（a）酵素を提供する工程（前記酵素は本発明のポリペプチド又は本発明の核酸若しくはその部分配列によってコードされるポリペプチドを含む）；及び（b）工程（a）の配列から複数のアミノ酸残基を欠失させ、酵素活性について残りの部分配列を試験し、それによって酵素の機能的フラグメントを決定する工程。ある特徴では、前記酵素活性は、酵素基質を提供し、さらに前記基質の量の減少または反応生成物の量の増加を検出することによって測定される。
本発明は、リアルタイム代謝フラックス分析によって新規または改変表現型のための全細胞操作の方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：（a）細胞の遺伝的構成を改変することによって改変細胞を作成する工程（前記遺伝的構成は本発明の核酸を細胞に導入することによって改変される）；（b）前記改変細胞を培養して複数の改変細胞を生じる工程；（c）工程（b）の細胞培養をリアルタイムでモニターすることによって前記細胞の少なくとも1つの代謝パラメーターを測定する工程；及び、（d）工程（c）のデータを分析して、前記測定パラメーターが類似の条件下において未改変細胞の対応する測定値と異なるか否かを決定し、それによって細胞の操作された表現型をリアルタイム代謝フラックス分析により同定する工程。ある特徴では、細胞の遺伝的構成は、細胞内の配列の欠失若しくは改変又は遺伝子発現のノックアウトを含む方法によって改変することができる。ある特徴では、前記方法はさらに、新規に操作された表現型を含む細胞の選別を含むことができる。別の特徴では、前記方法は、選別された細胞を培養し、それによって新規に操作された表現型を含む新規な細胞株を作成することを含むことができる。
【００３４】
本発明は、酵素ポリペプチドの耐熱性または熱安定性を高める方法を提供する。前記方法は、酵素ポリペプチドをグリコシル化し（前記ポリペプチドは本発明のポリペプチド又は本発明の核酸配列によってコードされるポリペプチドの連続する少なくとも30のアミノ酸を含む）、それによって前記ポリペプチドの耐熱性または熱安定性を高めることを含む。ある特徴では、前記酵素活性は約37℃より高く約95℃までの範囲の温度で熱安定性又は耐熱性であり得る。
本発明は、細胞で組換えポリペプチドを過剰発現させる方法を提供する。前記方法は、本発明の核酸又は本発明の核酸配列（前記配列の同一性は配列比較アルゴリズムによる分析または目視精査によって決定される）を含むベクターを発現させることを含み、ここで前記過剰発現は、高活性プロモーターの使用、二シストロンベクターの使用によって、又は前記ベクターの遺伝子増幅によって達成される。
本発明は、本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む洗剤組成物を提供する（前記ポリペプチドは酵素活性を有する）。ある特徴では、前記酵素は非界面活性酵素であり得る。別の特徴では、前記酵素は界面活性酵素でもよい。
本発明は、以下の工程を含む対象物の洗浄方法を提供する：（a）酵素活性を有するポリペプチドを含む組成物を提供する工程（前記ポリペプチドは本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む）；（b）対象物を提供する工程；及び（c）工程（a）のポリペプチド及び（b）の対象物を、前記組成物が前記対象物を洗浄することができる条件下で接触させる工程。
【００３５】
本発明は以下の工程を含むトランスジェニック植物の作出方法を提供する：（a）異種核酸配列を細胞に導入し（前記異種核酸配列は本発明の核酸配列を含む）、それによって形質転換植物細胞を作出する工程；及び（b）前記形質転換細胞からトランスジェニック植物を作出する工程。ある特徴では、工程（a）はさらに、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーション又はマイクロインジェクションにより前記異種核酸配列を導入する皇帝を含むことができる。別の特徴では、工程（a）はさらに、DNA粒子ボンバードメントによって植物組織に直接前記異種核酸配列を導入する工程を含むことができる。或いは、工程（a）はさらに、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）宿主を用いて植物細胞DNAに前記異種核酸配列を導入することを含むことができる。ある特徴では、前記植物細胞はジャガイモ、トウモロコシ、コメ、コムギ、タバコまたはオオムギ細胞であり得る。
本発明は、以下の工程を含む、植物細胞で異種核酸配列を発現させる方法を提供する：（a）植物細胞をプロモーターに機能可能に連結された異種核酸配列で形質転換する工程（前記異種核酸配列は本発明の核酸を含む）；（b）前記異種核酸配列が前記植物細胞で発現される条件下で前記植物を生長させる工程。
【００３６】
本発明は、本発明のポリペプチドの部分配列を有するペプチドを含む又は前記ペプチドから成るシグナル配列を提供する。本発明は、本発明のシグナル配列を含む第一のドメイン及び少なくとも第二のドメインを含むキメラタンパク質を提供する。前記タンパク質は融合タンパク質である。前記第二のドメインは酵素を含むことができる。前記酵素はヒドロラーゼ及び/又はオキシドレダクターゼ、又は除染活性を有する酵素であり得る。
本発明は、以下の工程を含む、組成物中の化合物の量を減少させる方法を提供する：（a）本発明の酵素活性を有するか若しくは本発明のタンパク質をコードするポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（b）前記化合物を含む組成物を提供する工程；及び（c）工程（a）のポリペプチドを工程（b）の組成物と、前記酵素が前記組成物中の化合物を加水分解、脱ハロゲン化、酸化、分解又はプロセッシングする条件下で接触させる工程。
本発明は、本発明の少なくとも1つのポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含むセルロース含有化合物を提供し、さらに場合によって、前記セルロース含有化合物は、パルプ、紙、紙製品、木材、木材製品、又は紙若しくは木材廃棄物を含む。
【００３７】
本発明は、パルプ又は紙の製造過程においてリグニン又はセルロースを化学的に漂白する方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：（a）本発明のクロロペルオキシダーゼ活性を有するポリペプチド、又は本発明の核酸によってコードされるクロロペルオキシダーゼ活性を有するポリペプチドを提供する工程；（b）リグニン又はセルロースを含む化合物を提供する工程；及び（c）前記ポリペプチドが酵素的に活性を有し、かつリグニン又はセルロースが漂白される条件下で、前記化合物を前記ポリペプチドと接触させる工程。
ここで、場合によって前記酵素活性はヘム型ペルオキシダーゼ活性を含み、さらに場合によって前記ヘム型ペルオキシダーゼ活性を有する酵素は、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49若しくは配列番号:51に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は前記酵素は、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50若しくは配列番号:52に記載のアミノ酸配列を有し、さらに場合によって前記酵素はヘム型クロロペルオキシダーゼ活性を有し配列番号:1に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は前記酵素は配列番号:2に記載されるアミノ酸配列を有し、ここで場合によって、前記酵素活性は非ヘム型ペルオキシダーゼ活性を含み、さらに場合によって、前記非ヘム型クロロペルオキシダーゼ活性を有する酵素は、配列番号:1、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、配列番号:67に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は前記酵素は、配列番号:2、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66若しくは配列番号:68に記載のアミノ酸配列を有し、さらに場合によって、前記セルロース又は親油性化合物はパルプ、紙、紙製品、木材、木材製品、又は紙若しくは木材廃棄物を含む。
【００３８】
本発明は、少なくとも1つの本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む組成物を提供する。前記組成物は場合によって、食用デリバリー物質、注射可能な液体、座薬、散剤、凍結乾燥化合物、泡沫、乳液又はその組み合わせとして処方され、さらに場合によって、前記組成物は少なくとも2つ又は3つの本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含み、場合によって前記組成物中の酵素は約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％の濃度で存在するか、又は約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％w/vで存在する。
本発明は、本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は場合によって、食用デリバリー物質、注射可能な液体、スプレー、錠剤、ゲル、リポソーム、カプセル、ゲルタブ、ヒドロゲル、ローション、局所適用液体、座薬、エーロゾル、散剤、凍結乾燥化合物、噴射剤、泡沫、乳液、ナノ構造物、インプラント又はその組合せとして処方され、場合によって前記組成物中の酵素は約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％の濃度で存在するか、又は約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％w/vで存在する。
本発明は、少なくとも1つの本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含むナノ構造物（ナノチューブ、ナノインプラント）を提供する。前記ナノ構造物は場合によって、ナノチューブ又はナノファイバーを含む、さらに前記組成物は場合によって、少なくとも2つ又は3つの本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む。
本発明は、本発明の配列を有する又は本発明の核酸によってコードされる、凍結乾燥されたポリペプチドを提供する。ある特徴では、前記ポリペプチドは、約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％又はそれより高い濃度で凍結乾燥物中に存在する。
【００３９】
本発明は、少なくとも1つの本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む除染、中和又は解毒用組成物を提供する。前記除染又は解毒用組成物は、場合によって、食用デリバリー物質、注射可能な液体、錠剤、ゲル、リポソーム、カプセル、ゲルタブ、ローション、局所適用液体、座薬、散剤、凍結乾燥化合物、泡沫、乳液、又はその組合せとして処方され、前記組成物は場合によって、少なくとも2つ又は3つの本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含み、場合によって前記組成物中の酵素は、約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％の濃度で存在するか、又は約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％w/vで存在する。
ある特徴では、前記除染、中和又は解毒用組成物はさらに界面活性剤、乳化剤、起泡剤又はその組合せを含む。前記除染、中和又は解毒用組成物は農薬、除草剤及び/又は殺虫剤、神経ガス解毒剤などとして処方することができる。
ある特徴では、前記除染、中和又は解毒用組成物がハロペルオキシダーゼ酵素を含むとき、前記組成物はまた亜ハロゲン酸塩成分を含み、さらに場合によって前記亜ハロゲン酸塩成分は亜塩素酸塩成分を含み、さらに場合によって前記亜塩素酸塩成分は亜塩素酸ナトリウム又は亜ヨウ素酸ナトリウムを含む。
本発明は、少なくとも1つの本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む工業製品を提供する。前記工業製品はハロペルオキシダーゼ酵素を含むことができ、前記組成物はまた亜ハロゲン酸塩成分を含み、さらに場合によって前記亜ハロゲン酸塩成分は亜塩素酸塩成分を含み、さらに場合によって前記亜塩素酸塩成分は亜塩素酸ナトリウム又は亜ヨウ素酸ナトリウムを含む。
【００４０】
本発明は、少なくとも1つの本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む布、衣類、織物材料、糸及び/又は繊維を提供する。場合によって、前記少なくとも1つのポリペプチドは、布、織物材料、糸、又は繊維の表面に固定されるか、又は前記少なくとも1つのポリペプチドは、布、織物材料、糸、又は繊維のコーティング又は被覆成分であるか、または処方物は、布、織物材料、又は繊維中に埋め込まれるか又は塗りつけられる。場合によって前記組成物は、2つ又は3つの本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む。
ある特徴では、前記除染、中和又は解毒用組成物が少なくとも2、3、4、5又は6つの異なる種類の酵素の混合物を含むとき、場合によって各々の種類の酵素は異なる毒性物質又は生物剤を解毒する。例えば、ある特徴では、本発明の除染、中和又は解毒用組成物は、少なくも1つのデハロゲナーゼ、少なくとも1つのハロペルオキシダーゼ、及び少なくとも1つの有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）を含む、少なくとも3つの異なる種類の酵素の混合物を含み、場合によって前記ハロペルオキシダーゼはクロロペルオキシダーゼである。ある特徴では、前記デハロゲナーゼは、配列番号:69若しくは配列番号:91に記載の配列を有するポリペプチドであるか、又は配列番号:70若しくは配列番号:92に記載されるアミノ酸配列をそれぞれ有するか、又はクロロペルオキシダーゼは、配列番号:1に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:2に記載されるアミノ酸配列を有するヘム型クロロペルオキシダーゼであるか、又はハロペルオキシダーゼは、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49若しくは配列番号:51に記載の配列を有する核酸によってコードされるヘム型ペルオキシダーゼであるか、又は前記酵素は、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50若しくは配列番号:52に記載のアミノ酸配列を有するか、又はハロペルオキシダーゼは、配列番号:1、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、若しくは配列番号:67に記載の配列を有する核酸によってコードされる非ヘム型クロロペルオキシダーゼであるか、又は前記酵素は、配列番号:2、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66若しくは配列番号:68に記載のアミノ酸配列を有するか、又は前記有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）は配列番号:193に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:194に記載の配列を有する。
【００４１】
ある特徴では、前記除染、中和又は解毒用組成物は、少なくも1つのジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）又は有機燐酸アンヒドロラーゼ（OPAA）及び少なくとも1つのハロペルオキシダーゼを含む、少なくとも2つの異なる種類の酵素の混合物を含み、さらに場合によって前記ハロペルオキシダーゼはクロロペルオキシダーゼである。前記組成物は、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）、有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）及びハロペルオキシダーゼを含むことができる。DFPase及び/又はOPAAは、G剤の除染、中和又は解毒に用いることができ、ハロペルオキシダーゼ又はクロロペルオキシダーゼ（CPO）は、V剤、H剤及び/又は生物剤の除染、中和又は解毒に用いることができ、ここで前記生物剤は、場合によって細菌の芽胞である。ある特徴では、この除染、中和又は解毒用組成物はさらにデハロゲナーゼ及び/又はコリンエステラーゼを含む。ある特徴では、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性は、配列番号:71に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:72に記載されるアミノ酸配列を有する。ある特徴では、前記ハロペルオキシダーゼはクロロペルオキシダーゼである。ある特徴では、前記クロロペルオキシダーゼは、配列番号:1に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:2に記載されるアミノ酸配列を有するヘム型クロロペルオキシダーゼであるか、又はハロペルオキシダーゼは、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49若しくは配列番号:51に記載の配列を有する核酸によってコードされるヘム型ペルオキシダーゼであるか、又は前記酵素は、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50若しくは配列番号:52に記載のアミノ酸配列を有するか、又はハロペルオキシダーゼは、配列番号:1、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、若しくは配列番号:67に記載の配列を有する核酸によってコードされる非ヘム型クロロペルオキシダーゼであるか、又は前記酵素は、配列番号:2、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66若しくは配列番号:68に記載のアミノ酸配列を有する。
【００４２】
ある特徴では、有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性は、配列番号:193に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:194に記載されるアミノ酸配列を有する。
ある特徴では、前記除染、中和又は解毒用組成物は、少なくも1つのデハロゲナーゼ（DH）及び少なくとも1つのハロペルオキシダーゼを含む、少なくとも2つの異なる種類の酵素の混合物を含み、場合によって前記ハロペルオキシダーゼはクロロペルオキシダーゼ（CPO）である。前記デハロゲナーゼ及び/又はハロペルオキシダーゼは、H剤の除染、中和又は解毒に用いることができる。ある特徴では、前記ハロペルオキシダーゼは、配列番号:1に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:2に記載されるアミノ酸配列を有するヘム型クロロペルオキシダーゼであるか、又は前記ハロペルオキシダーゼは、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49若しくは配列番号:51に記載の配列を有する核酸によってコードされるヘム型ペルオキシダーゼであるか、又は前記酵素は、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50若しくは配列番号:52に記載のアミノ酸配列を有するか、又は前記ハロペルオキシダーゼは、配列番号:1、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、若しくは配列番号:67に記載の配列を有する核酸によってコードされる非ヘム型クロロペルオキシダーゼであるか、又は前記酵素は、配列番号:2、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66若しくは配列番号:68に記載のアミノ酸配列を有する。この処方物のある特徴では、前記デハロゲナーゼは、配列番号:69若しくは配列番号:91に記載の配列を有するか、又は配列番号:70若しくは配列番号:92に記載のアミノ酸配列を有する。
【００４３】
ある特徴では、この処方はさらに、少なくとも1つのジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）、又は有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）及び/又はコリンエステラーゼの添加を含み、G剤を除染、中和又は解毒する。前記ジイソプロピルフルオロホスファターゼは配列番号:71に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:72に記載されるアミノ酸配列を有することができる。前記有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性は配列番号:193に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:194に記載されるアミノ酸配列を有することができる。
本発明は、少なくも1つのデハロゲナーゼ（DH）酵素及び少なくとも1つの有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）を含む、少なくとも2つの異なる種類の酵素の混合物を含み除染、中和又は解毒用組成物を提供する。前記デハロゲナーゼを用いてH剤を除染、中和又は解毒することができ、有機リン酸アンヒドロラーゼを用いてG剤を除染、中和又は解毒することができる。この処方のある特徴では、前記組成物はさらに少なくとも1つのハロペルオキシダーゼを含み、H剤の除染、中和又は解毒を強化する。この処方のある特徴では、前記組成物はさらにハロペルオキシダーゼを含み、さらに場合によって前記組成物はまた亜ハロゲン酸塩成分を含むことができ、場合によって前記亜ハロゲン酸塩成分は亜ヨウ素酸塩又は亜塩素酸塩成分を含み、さらに場合によって前記亜ヨウ素酸塩又は亜塩素酸塩成分は亜塩素酸ナトリウム若しくは亜ヨウ素酸塩又は等価の成分を含む。この処方のある特徴では、前記組成物はさらに、少なくとも1つのジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）及び/又はコリンエステラーゼ酵素を含み、G剤のOPAAによる除染、中和又は解毒を補填する。
【００４４】
本発明は、本発明の除染、中和又は解毒用組成物を含む起泡剤を提供し、場合によって、前記起泡剤中の酵素は、約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％の濃度で存在するか、又は約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％w/vで存在する。
【００４５】
本発明は、本発明の除染、中和又は解毒用組成物を含む乳化剤又は界面活性剤を提供し、場合によって、前記乳化剤又は界面活性剤中の酵素は、約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％の濃度で存在するか、又は約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％w/vで存在する。
本発明は、本発明の除染、中和又は解毒用組成物を含む塗料又はコーティング（アンダーコート/下地、船体処理などを含む）を提供し、場合によって、前記塗料又はコーティング中の酵素は、約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％の濃度で存在するか、又は約0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％w/vで存在する。
本発明は、毒性物質の除染、中和又は解毒のための方法を提供する。前記方法は、本発明の除染、中和若しくは解毒用組成物又は本発明の医薬組成物を適用又は投与することを含む。この方法で用いられる組成物は、食用デリバリー物質、注射可能な液体、錠剤、ゲル、リポソーム、カプセル、ゲルタブ、ローション、局所適用液体、座薬、散剤、凍結乾燥化合物、泡沫、乳液、又はその組合せとして処方される。
本発明は、V剤、H剤、G剤又は生物剤の毒性作用を防ぐ方法を提供する。前記方法は、本発明の除染、中和若しくは解毒用組成物又は本発明の医薬組成物を適用又は投与することを含む。
本発明は、本発明の除染、中和若しくは解毒用組成物又は本発明の医薬組成物を含むガスマスク、空気又は水のフィルターなどを提供する。これらのフィルターは、例えば換気システム及び他の気流系、例えばビルディング上若しくはビルディング内、飛行機、船、車、トラック、列車、待避壕などに配置することができる。
【００４６】
本発明は、本発明の除染、中和若しくは解毒用組成物又は本発明の医薬組成物を含む農薬、除草剤、及び/又は殺虫剤の除染、中和又は解毒剤を提供し、場合によって、前記組成物中の酵素は、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％の濃度で存在するか、又は0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％若しくは25％w/vで存在する。
前記農薬、除草剤、及び/又は殺虫剤の除染、中和又は解毒剤は、P-S又はP-F結合を加水分解する有機リン酸エステラーゼを含むことができ、さらにある特徴では、前記有機リン酸エステラーゼは、アセチル-コリンエステラーゼ又はブチリルコリンエステラーゼの阻害物質として作用する。ある特徴では、前記農薬は、デメトン-S、デメトン-S-メチル、デメトン-S-メチルスルホン、デメトン-メチル、パラチオン、フォスメト、カルボフェノチオン、ベノキサフォス、アジンフォス-メチル、アジンフォス-エチル、アミトン、アミジチオン、シアントエート、ジアリフォス、ジメトエート、ジオキサチオン、ジスルフォトン、エンドチオン、エチオン、エトエート-メチル、フォルモチオン、マラチオン、メルカルバム、オメトエート、オキシデプロフォス、オキシジスルフォトン、フェンカプトン、フォレート、フォサロン、プロチダチオン、プロトエート、ソファミド、チオメトン、ヴァミドチオン、メタミドフォス、又は前記の組合せを含むことができる。前記農薬の除染、中和又は解毒剤は、コーティング、塗料、起泡剤、液体、ゲル、ローション、界面活性剤、散剤又は乳化剤として、又は前記と一緒に処方することができる。
本発明は、農薬-、除草剤-若しくは殺虫剤-含有組成物又は適用物の除染、中和又は解毒の方法、又は本発明の除染、中和若しくは解毒用組成物、又は本発明の農薬、除草剤、及び/又は殺虫剤の除染、中和又は解毒剤の投与方法を提供する。
本発明は、農薬、除草剤及び/又は殺虫剤の毒性作用を防ぐ方法を提供する。前記方法は、本発明の除染、中和若しくは解毒用組成物、又は本発明の医薬組成物、又は本発明の農薬除染、中和若しくは解毒剤を適用又は投与することを含む。
本発明の1つ以上の実施態様の詳細が添付の図面及び下記の説明で示される。本発明の他の特徴、目的及び利点は下記の説明及び添付の図面から、並びに特許請求の範囲から明瞭となろう。
全ての刊行物、特許、特許出願、GenBank配列は引用により本明細書に含まれる。
【００４７】
詳細な説明
本発明は、（酵素、ペプチド及び抗体を含む）ポリペプチド（前記はヒドロラーゼ活性、エステラーゼ活性、例えば有機リン酸ヒドロラーゼ活性（例えば有機リン酸エステラーゼ活性）又はカルボキシルエステラーゼ活性、ハロペルオキシダーゼ活性、例えばヘム型（hCPO）若しくは非ヘムクロロペルオキシダーゼ（nhCPO）活性、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性、デハロゲナーゼ活性、オキシドレダクターゼ活性、プロリダーゼ活性、イミドジペプチダーゼ活性、及び/又は有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性を有する）、これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにこれらポリヌクレオチド及びポリペプチドを製造及び使用する方法を提供する。ある特徴では、本発明は、本発明の酵素の混合物/処方物/組合せを提供し、さらにいくつかの特徴では、これらの混合物/処方物/組合せはまた、除染又は解毒活性（中和活性を含む）のための公知の酵素を含む。ある特徴では、本発明は、これらの活性を有するポリペプチド（例えば酵素、例えばヒドロラーゼ、デハロゲナーゼ、ハロペルオキシダーゼ、オキシドレダクターゼ活性、有機リン酸アンヒドロラーゼ、有機リン酸ヒドロラーゼなど）（熱安定性及び耐熱性酵素活性を有する酵素を含む）、及びこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、並びにこれらのポリヌクレオチド及びポリペプチドの製造及び使用を目的とする。
【００４８】
本発明のポリペプチドは、多様な医薬的、農業的及び工業的背景（能動的な除染を含む）で用いることができる。別の特徴では、本発明のポリペプチドを用いて、エナンチオマーとして純粋なキラル生成物が合成される。本発明のポリペプチドは、多様な医薬的、農業的及び工業的背景（能動的な除染を含む）で用いることができる。例えば、ある特徴では、本発明は、民生用、軍事用、及び/又は自国の安全保障の目的で、例えば毒素、例えば神経作用物質、例えばV剤（VX剤）、G剤（サリン、ソマン、シクロサリン）又はH剤（例えばマスタードガス）及び/又は生物剤（例えば炭疽芽胞）の除染又は解毒のためのポリペプチド（本発明の酵素、ペプチド及び抗体を含む）及び新規な酵素混合物/処方物/組合せ（本発明のポリペプチド、公知の酵素、又はその混合物を含む）を提供する。
本発明の酵素は高い選択性を有する触媒である。それらは、通常の合成化学では不可能な立体選択性、領域選択性、及び化学選択性を示す反応を触媒する能力を有し得る。本発明の酵素は万能であり得る。種々の特徴において、それらは有機溶媒中で機能し、極端なpH（例えば高pH及び低pH）、極端な温度（例えば高温及び低温）、極端な塩濃度レベル（例えば高塩濃度及び低塩濃度）で働き、さらにそれらの天然の生理学的な基質とは構造的に無関係な化合物との反応を触媒することができる。
【００４９】
核酸の作成及び操作
本発明は、本発明のポリペプチド（例えば酵素、ペプチド、抗体）をコードする核酸（発現カセット、例えば発現又はクローニングベクターを含む）を提供する。本発明はまた、本発明の核酸を用いて新規な酵素配列を発見する方法を含む。さらにまた、本発明の核酸を、例えば合成連結アッセンブリー、最適化定方向進化システム及び/又は飽和変異導入によって改変する方法が提供される。さらにまた、酵素の発現を阻害することができる核酸、例えば本発明の配列を有するアンチセンス又はRNAi（二本鎖“干渉性”RNA；miRNA又はiRNAを含む）が提供される。
本発明の核酸は、例えばcDNAライブラリーのクローニング及び発現、メッセージ又はゲノムDNAのPCRによる増幅などによって作成、単離及び/又は操作することができる。本発明の方法を実施する場合、本明細書で述べるように、相同な遺伝子を鋳型核酸の操作によって改変することができる。本発明は、当分野で公知の任意の方法又はプロトコル又は装置（前記は学術文献および特許文献に詳しく記載されている）を併用して実施することができる。
【００５０】
一般的技術：本発明の実施に用いられる核酸は、RNA、iRNA、アンチセンス核酸、cDNA、ゲノムDNA、ベクター、ウイルス又は前記のハイブリッドのいずれであっても、種々の供給源から単離、遺伝的に操作、増幅、及び/又は組換えにより発現/作成することができる。これらの核酸から作成された組換えポリペプチドは個々に単離またはクローニングし、所望の活性について試験することができる。任意の組換え発現系（細菌、哺乳動物、酵母、昆虫または植物細胞発現系を含む）を用いることができる。
あるいは、これら核酸は周知の化学的合成技術によってin vitroで合成することができる。前記技術は例えば以下に記載されている：Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (9179) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; US Patent No. 4,458,066。
核酸操作のための技術、例えばサブクローニング、プローブの標識（例えばクレノーポリメラーゼ、ニックトランスレーション、増幅を用いるランダムプライマー標識）、配列決定、ハイブリダイゼーションなどは学術文献および特許文献に詳しく記載されている。例えば以下を参照されたい：Sambrook, ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucleic Acids Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)。
【００５１】
本発明の方法の実施に用いられる核酸を入手および操作するために有用なまた別の手段は、ゲノムサンプルからのクローニング、および所望の場合には、例えばゲノムクローン若しくはcDNAクローンから単離又は増幅した挿入物のスクリーニングおよび再クローニングである。本発明の方法で用いられる核酸の供給源には、哺乳動物人工染色体（MAC）（例えば米国特許5,721,118号、同6,025,155号を参照されたい）、ヒト人工染色体（Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15:333-335）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、P1人工染色体（Woon (1998) Genomics 50:306-316）、P1誘導ベクター（PAC）（Kern (1997) Biotechniques 23:120-124）、コスミド、組換えイルス、ファージ又はプラスミドに含まれるゲノムライブラリー又はcDNAライブラリーが含まれる。
ある特徴では、本発明のポリペプチドをコードする核酸は、翻訳されたポリペプチド又はそのフラグメントの分泌を誘導することができるリーダー配列とともに適切な位相でアッセンブリングされる。
本発明は融合タンパク質及びそれらをコードする核酸を提供する。本発明のポリペプチドは異種ペプチド又はポリペプチド、例えば所望の特性（例えば安定性増強または精製の簡便化）を付与するN-末端識別ペプチドと融合させることができる。本発明のペプチド及びポリペプチドは又、例えばより強い免疫原性をもつペプチドを生成するため、組換えにより合成されたペプチドをより容易に単離するため、抗体及び抗体発現B細胞を同定および単離するためなどの目的のために、前記に結合した1つ以上の追加のドメインを有する融合タンパク質として合成及び発現させることができる。検出及び精製を容易にするドメインには、例えば金属キレートペプチド（例えばポリヒスチジン鎖およびヒスチジン-トリプトファンモジュール（固定化金属上での精製を可能にする）、プロテインAドメイン（固定化免疫グロブリン上での精製を可能にする）、およびFLAGS伸長/アフィニティー精製系（Immune Corp, Seatle WA）で利用されるドメインが含まれる。精製ドメイン及びモチーフ構成ペプチド又はポリペプチド間の切断可能リンカー配列（例えばXa因子またはエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego CA））の挿入は精製を容易にする。例えば、発現ベクターは、6つのヒスチジン残基とそれに続くチオレドキシン及びエンテロキナーゼ切断部位に連結されたエピトープコード核酸配列を含むことができる（例えば以下を参照されたい：Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414）。前記ヒスチジン残基は検出及び精製を容易にし、一方、エンテロキナーゼ切断部位は融合タンパク質の残りの部分からエピトープを精製するための手段を提供する。融合タンパク質をコードするベクターおよび融合タンパク質の利用に関する技術は学術文献および特許文献に詳しく記載されている（例えば以下を参照されたい：Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53）。
【００５２】
“単離”という用語は、物質がその本来の環境（例えば、物質が天然に存在する場合はその天然の環境）から取り出されることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然に出現するポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていないが、天然の系に一緒に存在する物質のいくつか又は全てから分離されている前記と同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分であってもよいし、及び/又はそのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは組成物の一部であってもよく、それでもなおそのようなベクター又は組成物はその天然の環境の一部分ではないという点で、単離されている。本明細書で用いられるように、単離された物質又は組成物はまた“精製”された組成物でもあり得る。すなわち、“精製”は絶対的純粋を要求せず、むしろ相対的な定義と考えられる。ライブラリーから得られる個々の核酸は電気泳動による均質度まで通常的に精製することができる。また別の特徴では、本発明は、ゲノムDNAから、又はライブラリー若しくは他の環境中の他の配列から少なくとも１桁、2桁、3桁、4桁、5桁又はそれより大きい桁まで精製された核酸を提供する。
“組換え”という用語は、その天然の環境では隣接しない“骨格”核酸に核酸が隣接することを意味し得る。ある特徴では、核酸は、“骨格分子”核酸の集団において核酸挿入物の数の5％以上に相当する。本発明の“骨格分子”には、例えば発現ベクター、自己複製核酸、ウイルス、組み込み核酸、及び、対象の核酸挿入物の維持又は操作に用いられる他のベクター又は核酸のような核酸が含まれる。ある特徴では、濃縮された核酸は、組換え骨格分子集団において核酸挿入物の数の15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％又はそれ以上に相当する。“組換え”ポリペプチド又はタンパク質は、組換えDNA技術によって生成された、例えば所望のポリペプチド又はタンパク質をコードする外因性DNA構築物によって形質転換された細胞から生成されたポリペプチド又はタンパク質を指す。“合成”ポリペプチド又はタンパク質は、下記でさらに詳細に述べるように化学的合成によって調製されたものである。
【００５３】
個々のポリペプチド又はタンパク質の“コード配列”又は前記を“コードする配列”は、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、ポリペプチド又はタンパク質に転写及び翻訳される核酸配列である。
“遺伝子”という用語には、転写生成物（例えばメッセージ）の産生に必要とされるDNAセグメントを含む核酸配列が含まれ、前記核酸配列は、続いて翻訳されてポリペプチド鎖を生じるか、又は遺伝子の転写、複製、若しくは安定性を調節する。遺伝子は、とりわけコード領域に先行又は後続する領域、例えばリーダー、トレーラー、プロモーター及びエンハンサーを、該当する場合には個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）と同様に含むことができる。
“核酸”または“核酸配列”という語句はオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又は前記のいずれかのフラグメント、ゲノム若しくは合成起源のDNA又はRNA（例えばmRNA、rRNA、tRNA、iRNA）（これらは一本鎖でも二本鎖でもよく、センスまたはアンチセンス鎖を表していてもよい）、ペプチド核酸（PNA）又は任意のDNA様若しくはRNA様物質（天然若しくは合成起源）（例えばRNAi（二本鎖“干渉”RNA）、リボヌクレオプロテイン（例えばiRNP）を含む）を含むことができる。前記用語は、核酸、すなわちオリゴヌクレオチド（天然のヌクレオチドの公知の類似体を含む）を包含する。前記用語はまた合成骨格をもつ核酸様構造物を包含する（例えば以下を参照されたい：Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156）。
“オリゴヌクレオチド”は一本鎖ポリデオキシヌクレオチド又は2本の相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかを含み、前記は化学的に合成することができる。そのような合成オリゴヌクレオチドは5'リン酸基をもたず、したがってキナーゼの存在下でATPを用いてリン酸基を付加されなければ別のオリゴヌクレオチドと連結されない。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸化されていないフラグメントとは連結される。
【００５４】
転写および翻訳制御配列：本発明は、RNA合成/発現を誘導または調節するために発現（例えば転写または翻訳）制御配列（例えばプロモーターまたはエンハンサー）に機能可能に連結された本発明の核酸（例えばDNA、iRNA）配列を提供する。前記発現制御配列は発現ベクター内に存在し得る。例示的な細菌プロモーターにはlacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダPR、PL及びtrpが含まれる。例示的な真核細胞プロモーターにはCMV極初期、HSVチミジンキナーゼ、初期及び後期SV40、レトロウイルスのLTR及びマウスのメタロチオネインIが含まれる。
プロモーター配列は、下記でさらに詳細に考察するとおり、前記プロモーターで転写を開始するRNAポリメラーゼがコード配列をmRNAへ転写するときには、コード配列に“機能可能に連結”されている。本明細書で用いられる“プロモーター”という用語には、細胞（例えば植物細胞）内でコード配列の転写を駆動させることができる全ての配列が含まれる。したがって、本発明の構築物で用いられるプロモーターには、遺伝子の転写のタイミング及び/又は速度の調節または調整に必要なcis-作動性転写制御エレメント及び調節配列が含まれる。例えば、プロモーターは、cis-作動性転写制御エレメント（エンハンサー、プロモーター、転写ターミネータ、複製起点、染色体組み込み配列、5'及び3’非翻訳領域又はイントロン配列が含まれ、転写調節に必要である）であり得る。これらのcis-作動性配列は、典型的にはタンパク質又は他の生物学的分子と相互作用して転写を実行する（転写のON、OFFの切り替え、調節または調整など）。“構成的”プロモーターは、大部分の環境条件下及び生育又は細胞分化の状態で持続的に発現を駆動するプロモーターである。“誘導性”または“調節性”プロモーターは環境条件又は生育条件の影響下で本発明の核酸の発現を誘導する。誘導性プロモーターによって転写に影響を与えることができる環境条件の例には、嫌気的条件、上昇温度、乾燥又は光の存在が含まれる。プロモーター配列は、下記でさらに詳細に考察するとおり、前記プロモーターで転写を開始するRNAポリメラーゼがコード配列をmRNAへ転写するときには、コード配列に“機能可能に連結”されている。
【００５５】
“組織特異的”プロモーターは、例えば植物又は動物の特定の細胞又は組織又は器官でのみ活性を有する転写制御エレメントである。組織特異的調節は、ある組織に特異的なタンパク質をコードする遺伝子の発現を担保するある種の固有の因子によって達成され得る。そのような因子は哺乳動物および植物に存在し、特定の組織を発達させることが知られている。“植物”という用語には植物体全体、植物の部分（例えば葉、茎、花、根など）、植物のプロトプラスト、種子及び植物細胞、並びに前記の子孫が含まれる。本発明の方法で用いることができる植物のクラスは、一般的には、形質転換技術を施しやすい高等植物のクラスと同じように広く、裸子植物と同様に被子植物（単子葉および双子葉植物）が含まれる。この語には多様な倍数性レベルを有する植物（倍数体、二倍体、半数体および半接合状態を含む）が含まれる。本明細書で用いられる“トランスジェニック植物”には、異種核酸配列（例えば本発明の核酸及び種々の組換え構築物、例えば発現カセット）が挿入された植物または植物細胞が含まれる。
細菌でポリペプチド発現させるために適切なプロモーターには、大腸菌のlac又はtrpプロモーター、lacIプロモーター、lacZプロモーター、T3プロモーター、T7プロモーター、gptプロモーター、ラムダPRプロモーター、ラムダPLプロモーター、糖分解酵素（例えば3-ホスホグリセレートキナーゼ（PGK））をコードするオペロン由来のプロモーター及び酸性ホスファターゼプロモーターが含まれる。真核細胞プロモーターには、CMV極初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、熱ショックプロモーター、初期および後期SV40プロモーター、レトロウイルスのLTR及びマウスのメタロチオネインIプロモーターが含まれる。原核細胞若しくは真核細胞又はそれらのウイルスで遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターもまた用いることができる。
【００５６】
組織特異的植物プロモーター：本発明は、組織特異的態様で発現させることができる、例えば組織特異的態様で本発明の酵素を発現させることができる発現カセットを提供する。本発明はまた、本発明の酵素を組織特異的態様で発現する植物または種子を提供する。前記組織特異性は、種子特異的、茎特異的、葉特異的、根特異的、果実特異的などであり得る。
ある特徴では、構成的プロモーター（例えばCaMV35Sプロモーター）を植物若しくは種子の特定の部分又は植物全体における発現に用いることができる。例えば、本発明の酵素の過剰発現のために、植物のいくつかの組織または全ての組織（例えば再生植物）で核酸の発現を誘導する植物プロモーターフラグメントを用いることができる。そのような “構成的”プロモーターは、ほとんどの環境条件下及び生育又は細胞分化状態で活性を示す。構成的プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35S転写開始領域、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のT-DNA由来1'-又は2'-プロモーター、及び当業者に公知の種々の植物遺伝子のその他の転写開始領域が含まれる。そのような遺伝子には、例えばアラビドプシス（Arabidopsis）のACT11（Huang (1996) Plant Mol. Biol. 33:125-139）；アラビドプシスのCat3（GenBank No. U43147、Zhong (1996) Mol. Gen. Genet. 251：196-203）；ブラシカ・ナプス（Brassica napus）のステアロイル-アシルキャリアタンパク質デサチュラーゼをコードする遺伝子（GenBank No. X74782、Solocombe (1994) Plant Physiol. 104:1167-1176）；トウモロコシのGPc1（GenBank No. X15596、Martinez (1989) J. Mol. Biol. 208:551-565）；トウモロコシのGpc2（GenBank No. U45855、Manjunath (1997) Plant Mol. Biol. 33:97-112）；米国特許4,962,028号、同5,633,440号に記載された植物プロモーターが含まれる。
本発明は、ウイルス由来の組織特異的または構成的プロモーターを用いる。これらには、例えばトバモウイルスのサブゲノムプロモーター（Kumagai (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1679-1683）；イネのツングロ杆状ウイルス（RTBV）（感染したイネの師部細胞でのみ複製し、強力な師部特異的レポータ遺伝子発現を駆動するプロモーターを有する）；キャッサバ葉脈モザイクウイルス（CVMV）プロモーター（維管束エレメント、葉の葉肉細胞および根の先端でもっとも強い活性を有する）（Verdaguer（1996） Plant Mol. Biol. 31:1129-1139）が含まれ得る。
あるいは、植物プロモーターは、特定の組織、器官または細胞タイプで酵素発現核酸の発現を誘導するか（すなわち組織特異的プロモーター）、又はそうでなければより厳密な環境若しくは生育制御下に置くか、または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。転写に影響を与えることができる環境条件の例には、嫌気性条件、上昇温度、光の存在、化学物質／ホルモンの散布が含まれる。例えば、本発明は、トウモロコシの乾燥誘導プロモーター（Busk (1997) 上掲書）；ジャガイモの低温、乾燥および高塩誘導プロモーター（Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33:897-909）を取り込んでいる。
【００５７】
組織特異的プロモーターは、その組織内の一定の時間枠内の生育段階内でのみ転写を促進することができる。例えば以下を参照されたい：Blazquez (1998) Plant Cell 10:791-800（アラビドプシスのLEAFY遺伝子のプロモーターの特性を明らかにする）。さらにまた例えば以下を参照されたい：Cardon (1997) Plant J 12:367-377（A.サリアナ（thaliana）の花の分裂組織同一性遺伝子AP1のプロモーター領域中の保存配列モチーフを認識する転写因子SPL3について記載している）；及びMandel (1995) Plant Molecular Biology, vol 29, pp995-1004（分裂組織プロモーターeIF4について記載している）。特定の組織のライフサイクルの全体を通して活性を有する組織特異的プロモーターを用いてもよい。ある特徴では、本発明の核酸は、主としてワタの繊維細胞でのみ活性を示すプロモーターに機能可能に連結される。ある特徴では、本発明の核酸は、例えば上掲書（Rinehart （1996））に記載されたように、主としてワタの繊維細胞の伸張期間に活性を示すプロモーターに機能可能に連結される。前記核酸は、ワタの繊維細胞で優先的に発現されるようにFbl2A遺伝子プロモーターに機能可能に連結することができる（上掲書）。さらに以下を参照されたい：John (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5769-5773；John et al., US Patent No. 5,608,148, 5,602,321（ワタの繊維特異的プロモーターおよびトランスジェニックな綿を構築する方法が記載されている）。根特異的プロモーターもまた本発明の核酸の発現に用いられる。根特異的プロモーターの例には、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターが含まれる（DeLisle (1990) Int. Rev. Cytol. 123:39-60）。本発明の核酸の発現に用いることができる他のプロモーターには、例えば胚珠特異的、胚特異的、内胚葉特異的、珠皮特異的、種子外皮特異的プロモーター、又はこれらのいくつかの組合せ；葉特異的プロモーター（例えば以下を参照されたい：Busk (1997) Plant J. 11:1285-1295、前記にはトウモロコシの葉特異的プロモーターが記載されている）；アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）のORF13プロモーター（根で高い活性を示す（上掲書（Hansen, 1997）を参照されたい））；トウモロコシの花粉特異的プロモーター（例えば以下を参照されたい：Guerrero (1990) Mol. Gen. Gnet. 224:161-168）；果実成熟時、葉の（前記より低頻度で花の）老化および離脱時に活性を示すトマトのプロモーター（例えば以下を参照されたい：Blume (1997) Plant J. 12:731-746）；ジャガイモのSK2遺伝子のめしべ特異的プロモーター（例えば以下を参照されたい：Ficker (1997) Plant Mol. Biol. 35:425-431）；エンドウマメのBlec4遺伝子（トランスジェニックアルファルファの栄養および生殖茎頂の表皮組織で活性を示し、活発に生長しているシュートまたは繊維の表皮層で外来遺伝子を発現させるために有用である）；珠皮特異的BEL1遺伝子（例えば以下を参照されたい：Reiser (1995) Cell 83:735-742, GenBank No. U39944）；及び/又は米国特許第5,589,583号（Klee）（分裂組織及び/又は急速に分裂している細胞で高レベルの転写を付与することができる植物プロモーターについて記載）のプロモーターが含まれる。
【００５８】
あるいは、植物ホルモン（例えばオーキシン）の暴露に際して誘導することができる植物プロモーターが本発明の核酸を発現させるために用いられる。例えば、本発明は以下を用いることができる：ダイズ（Glycine max L.）のオーキシン応答エレメントE1プロモーターフラグメント（AuxRE）（Liu (1997) Plant Physiol. 115:397-407）；オーキシン応答性アラビドプシスGST6プロモーター（サリチル酸及び過酸化水素にも反応性である）（Chen (1996) Plant J. 10:955-966）；タバコのオーキシン誘導性parCプロモーター（Sakai (1996) 37:906-913）；植物ビオチン応答エレメント（Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:933-937）；及びストレスホルモンアブシジン酸に応答するプロモーター（Sheen (1996) 274:1900-1902）。
本発明の核酸はまた、植物に適用可能な化学的試薬（例えば除草剤または抗生物質）の暴露に際して誘導することができる植物プロモーターに機能可能に連結することもできる。例えば、トウモロコシのIn2-2プロモーター（ベンゼンスルホンアミド除草剤の毒性緩和剤によって活性化される）を用いることができる（De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577）。種々の除草剤の毒性緩和剤の適用によって、根、排水組織、茎頂分裂組織での発現を含むそれぞれ別個の遺伝子発現パターンが誘導される。コード配列は、例えばテトラサイクリン誘導プロモーター（例えばアヴェナ・サティヴァL.（Avena sativa L.）（エンバク）のアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子（Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473）を含むタバコのトランスジェニック植物で開示された）、またはサリチル酸応答エレメント（Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324）の制御下に置くことができる。化学的に（例えばホルモンまたは殺虫剤によって）誘導されるプロモーター（すなわち野外でトランスジェニック植物に適用することができる化学物質に対し応答するプロモーター）を用いて、本発明のポリペプチドの発現を植物の生育の特定の段階で誘導することができる。したがって、本発明はまた、その宿主域が標的植物種（例えば、トウモロコシ、イネ、オオムギ、コムギ、ジャガイモまたはその他の作物）に限定される、作物の任意の生育段階で誘導可能な本発明のポリペプチドをコードする誘導性遺伝子を含むトランスジェニック植物を提供する。
【００５９】
組織特異的植物プロモーターは、標的組織以外の組織で機能可能に連結された配列の発現を駆動することができる。したがって、組織特異的プロモーターは、標的組織または細胞タイプで優先的に発現を駆動させることができるが、他の組織でもまた同様にある程度の発現を誘導することができる。
本発明の核酸はまた、化学的試薬に暴露されたときに誘導される植物プロモーターに機能可能に連結することができる。前記試薬には、例えば除草剤、合成オーキシン又は抗生物質が含まれ、これらはトランスジェニック植物に適用、例えば噴霧することができる。本発明の酵素生成核酸の誘導性発現によって、栽培者は最適のデンプン/糖比をもつ植物を選別することができる。植物の部分の生育をしたがって制御することができる。このようにして、本発明は、植物および植物の部分の収穫を促進する手段を提供する。例えば、種々の実施態様で、トウモロコシのIn2-2プロモーター（ベンゼンスルホンアミド除草剤の毒性緩和剤によって活性化される）が用いられる（De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577）。種々の除草剤の毒性緩和剤の適用によって、根、排水組織及び茎頂分裂組織での発現を含むそれぞれ別個の遺伝子発現パターンが誘導される。本発明のコード配列はまた、例えばテトラサイクリン誘導性プロモーター（例えばアヴェーナ・サティヴァL. （Avena sativa L.）（エンバク）のアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子（Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473）を含むタバコのトランスジェニック植物で開示された）、又はサリチル酸応答エレメント（Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324）の制御下にある。
適切なポリペプチド発現が所望される場合には、コード領域の3'末端のポリアデニル化領域が含まれるべきであろう。前記ポリアデニル化領域は、天然の遺伝子、種々の他の植物遺伝子、又はアグロバクテリウムのT-DNAの遺伝子に由来し得る。
【００６０】
発現ベクターおよびクローニングビヒクル：本発明は、本発明の核酸、例えば本発明の酵素及び抗体をコードする配列を含む発現ベクターおよびクローニングビヒクルを提供する。本発明の発現ベクターおよびクローニングビヒクルは、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスDNA（例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びSV40の誘導体）、P1系人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、および関心のある特定宿主（例えばバチルス、アスペルギルス及び酵母）に特異的な他の任意のベクターが含まれる。本発明のベクターには染色体配列、非染色体配列及び合成DNA配列が含まれる。多数の適切なベクターが当業者に知られており、市場で入手できる。例示的なベクターには以下が含まれる：細菌系：pQEベクター（Qiagen）、pBluescriptプラスミド、pNHベクター、ラムダ-ZAPベクター（Stratagene）、ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T（Pharmacia）；真核細胞系：pXT1、pSG5（Stratagene）、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40（Pharmacia）。しかしながら、他の任意のプラスミド又は他のベクターもまた、それらが宿主内で複製可能でさらに生存可能である限り用いることができる。低コピー数または高コピー数ベクターを本発明に関して用いることができる。
【００６１】
ある特徴では、“発現カセット”という用語は、構造遺伝子（すなわちタンパク質コード配列、例えば本発明の酵素）の発現に対して、そのような配列と適合する宿主内で影響を及ぼすことができるヌクレオチド配列を含む。発現カセットは、ポリペプチドコード配列（及び場合によって他の配列、例えば転写終了シグナル）と機能可能に連結された少なくとも1つのプロモーターを含む。発現の実施に必要な又は有用なさらに別の因子（例えばエンハンサー）もまた用いることができる。本明細書で用いられる“機能可能に連結される”とは、プロモーターがDNA配列の転写を仲介することができるように、DNA配列より上流でプロモーターに連結されることを意味する。したがって、発現カセットはまた、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、任意の形態の “裸のDNA” 組換えベクターなどを含む。“ベクター”は、細胞に感染させるか、トランスフェクトするか、一過性若しくは永久的に形質導入することができる核酸を含む。ベクターは、裸の核酸又はタンパク質若しくは脂質と複合体を形成した核酸でもよいことは理解されよう。ベクターは場合によって、ウイルス又は細菌の核酸及び/又はタンパク質及び/又は膜（例えば細胞膜、ウイルスの脂質エンベロープなど）を含む。ベクターには、DNAフラグメントが結合し複製できるようになったレプリコン（例えばRNAレプリコン、バクテリオファージ）が含まれるが、ただし前記に限定されない。したがって、ベクターには、自律的自己複製性環状若しくは直線状DNA又はRNA（例えばプラスミド、ウイルスなど、例えば米国特許出願第5,217,879号参照）が含まれ（ただし前記に限定されない）、さらに発現及び非発現プラスミドが含まれる。組換え微生物又は培養細胞が“発現ベクター”の宿主となっていると記述されている場合には、染色体外環状及び直鎖状DNA並びに宿主染色体に取り込まれたDNAの両方が含まれる。ベクターが宿主細胞により維持されている場合は、前記ベクターは自律性構造物として有糸分裂時に細胞によって安定的に複製されていても、又は宿主のゲノム内に取り込まれていてもよい。
【００６２】
発現ベクターは、プロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、及び転写終了因子を含むことができる。発現を増幅させるために、ベクターはまた適切な配列を含むことができる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終了配列及び5'フランキング非翻訳配列を含むことができる。いくつかの特徴では、SV40スプライシング及びポリアデニル化部位に由来するDNA配列を用いて、必要な非転写遺伝子エレメントを提供することができる。
ある特徴では、発現ベクターは1つ以上の選別可能なマーカー遺伝子を含み、前記ベクターを含む宿主細胞の選別を可能にする。そのような選別可能マーカーには、真核細胞培養に対してはジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子又はネオマイシン耐性を付与する遺伝子、大腸菌でテトラサイクリン又はアンピシリン耐性を付与する遺伝子、及びS.セレビシアエ（S. cerevisiae）のTRP1遺伝子が含まれる。プロモーター領域は、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（CAT）ベクター又は選別可能なマーカーを有する他のベクターを用いて、所望される任意の遺伝子から選別することができる。
真核細胞中でポリペプチド又はそのフラグメントを発現させるためのベクターはまた発現レベルを高めるためにエンハンサーを含むことができる。エンハンサーはDNAのcis-作動性エレメントであり、通常は長さが約10から約300bpであってプロモーターに作用してその転写を高める。その例には、複製起点の後期側100bpから270bpにあるSV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
DNA配列は多様な方法によってベクターに挿入することができる。一般的には、DNA配列は、適切な制限エンドヌクレアーゼによる挿入物およびベクターの消化に続いてベクター内の所望の位置に連結される。あるいは、挿入物とベクターの両方の平滑末端を連結することもできる。多様なクローニング技術が当業界で公知であり、例えばAusubel および Sambrookに記載されている。そのような技術および他の技術は当業者の技術範囲内であろう。
【００６３】
ベクターはプラスミド、ウイルス粒子またはファージの形態を有し得る。他のベクターには染色体配列、非染色体配列及び合成DNA配列、SV40の誘導体、細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNAの組合せに由来するベクター、ウイルスDNA、例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルスが含まれる。原核細胞および真核細胞宿主で使用できる多様なクローニングベクターおよび発現ベクターは例えばSambrookによって記載されている。
使用できる具体的な細菌ベクターには、以下の周知のクローニングベクターの遺伝的エレメントを含む市販のプラスミドが含まれる：pBR322（ATCC37017）、pKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden）、GEM1（Promega Biotec, Madison, WI, USA）、pQE70、pQE60、pQE-9（Qiagen）、pD10、psiX174、pBluescript IIKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（Stratagene）、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmacia）、pKK232-8およびpCM7。具体的な真核細胞ベクターには、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG（Stratagene）、pSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVL（Pharmacia）が含まれる。しかしながら他のベクターのいずれも宿主細胞内で複製可能で生存可能である限り使用することができる。
本発明の核酸は、発現カセット、ベクター又はウイルスで発現させることができ、さらに一過性又は安定的に植物細胞および種子で発現させることができる。ある例示的な一過性発現系はエピソーム発現系、例えばカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）のウイルスRNA（スーパーコイルDNAを含むエピソームミニ染色体の転写によって核内で生成される）を用いる（例えば以下を参照されたい：Covey (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1633-1637）。あるいは、コード配列（すなわち本発明の全配列又は部分配列）を植物宿主細胞ゲノムに挿入して宿主染色体DNAの一体化部分を形成することができる。センスまたはアンチセンス転写物を前記のようにして発現させることができる。本発明の核酸由来の配列（例えばプロモーターまたはコード領域）を含むベクターは、植物細胞または種子に選別可能な表現型を付与するマーカー遺伝子を含むことができる。例えば、前記マーカーは、殺菌物質耐性、特に抗生物質耐性（例えばカナマイシン、G418、ブレオマイシン、ヒグロマイシンに対する耐性）、又は除草剤耐性（例えばクロロスルフロンまたはバスタに対する耐性）をコードすることができる。
【００６４】
植物で核酸及びタンパク質を発現することができる発現ベクターは当業界において周知で、例えばアグロバクテリウム種、ジャガイモウイルスX（例えば以下を参照されたい：Angell (1997) EMBO J. 16:3675-3648）、タバコモザイクウイルス（例えば以下を参照されたい：Casper (1996) Gene 173:69-73）、トマトのブッシースタントウイルス（例えば以下を参照されたい：Hillman (1989) Virology 169:42-50）、タバコのエッチウイルス（例えば以下を参照されたい：Dolja (1997) Microbiol. Immunol. 37:471-476）、ビーンゴールデンモザイクウイルス（例えば、Morinaga(1993) Microbiol Immuol. 37:471-476を参照されたい）、カリフラワーモザイクウイルス（例えば以下を参照されたい：Cecchini (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:1094-1101）、トウモロコシAc/Ds転移因子（例えば以下を参照されたい：Rubin (1997) Mol. Cell. Biol. 17:6294-6302; Kunze (1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204:161-194）、及びトウモロコシサプレッサー‐ミューテータ（Spm）転移因子（例えば以下を参照されたい：Schlappi (1996) Plant Mol. Biol. 32:717-725）、並びに前記の誘導体由来のベクターが含まれよう。
ある特徴では、発現ベクターは、2つの生物で（例えば、発現のために哺乳動物細胞または昆虫細胞で、クローニング及び増幅のために原核細胞で）維持され得るように2種の複製系を含むことができる。さらにまた、組込み発現ベクターについては、発現ベクターは宿主細胞ゲノムと相同な少なくとも1つの配列を含むことができる。この発現ベクターは、前記発現構築物にフランキングする2つの相同な配列を含むことができる。前記組込みベクターは、ベクター内の適切な挿入用相同配列を選択することによって宿主細胞内の特定の遺伝子座に誘導することができる。組込みベクターのための構築物は当業界で周知である。
本発明の発現ベクターはまた選別可能なマーカー遺伝子を含み、形質転換された細菌株の選別を可能にすることができる。前記遺伝子は、例えば細菌を薬剤（例えばアンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン及びテトラサイクリン）に耐性にする遺伝子である。選別可能マーカーにはまた、生合成遺伝子、例えばヒスチジン、トリプトファン及びロイシン生合成経路の遺伝子が含まれる。
【００６５】
宿主細胞及び形質転換細胞：本発明はまた、本発明の核酸配列、例えば本発明の酵素及び抗体をコードする配列又は本発明のベクターを含む形質転換細胞を提供する。宿主細胞は、当業者に周知の任意の宿主細胞であって、原核細胞、真核細胞、例えば細菌細胞、菌類細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は植物細胞が含まれ得る。本発明の酵素は任意の宿主細胞、例えば任意の細菌細胞、任意の酵母細胞、例えばピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）又はシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）で発現させることができる。例示的な細菌細胞には、大腸菌、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ストレプトミセス、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・セレウス(B.cereus)、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、又はバチルス属、ストレプトミセス属、及びスタフィロコッカス属の任意の種が含まれる。例示的な昆虫細胞には、ドロソフィラ（Drosophila）S2及びスポドプテラ（Spodoptera）Sf9が含まれる。例示的な動物細胞にはCHO、COS又はボウズ・メラノーマ、又は任意のマウス若しくはヒト細胞株が含まれる。適切な宿主を選択することは当業者の技術範囲内である。多様な高等植物種を形質転換する技術は周知で、技術文献及び学術文献に記載されている。例えば以下を参照されたい：Weising (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477；米国特許5,750,870号。
ベクターは、多様な任意の技術を用いて宿主細胞に導入することができる。前記技術には、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃またはTi仲介遺伝子伝達が含まれる。具体的な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン仲介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる（L. Davis, M. Dibner, I. Battey, Basic Methods in Molecular Biology, 1986）。
適切な場合には、操作された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選別、又は本発明の遺伝子の増幅に適切なように改変した通常の栄養培地で培養することができる。適切な宿主株を形質転換し、さらに適切な細胞密度に前記宿主株を増殖させた後、選択したプロモーターを適切な手段（例えば温度シフトまたは化学的誘導）によって誘導し、さらに追加の期間培養して所望のポリペプチド又はそのフラグメントを産生させることができる。
【００６６】
ある特徴では、本発明の核酸又はベクターはスクリーニングのために細胞に導入される。したがって前記核酸はその後の核酸の発現に適した態様で細胞に導入される。導入方法は、主として標的細胞タイプによって決定される。例示的な方法にはCaPO4沈殿、リポソーム融合、リポフェクション（例えばLIPOFECTINTM）、エレクトロポレーション、ウイルス感染などが含まれる。候補核酸は宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれるか（例えばレトロウイルス導入による）、又は細胞質に一過性もしくは安定的に存在することができる（すなわち慣例的なプラスミドの使用を介し、標準的な調節配列、選別マーカーなどを利用する）。多くの医薬的に重要なスクリーニングではヒトまたはモデル動物細胞標的が要求されるので、そのような標的をトランスフェクトすることができるレトロウイルスが好ましい。
細胞を遠心分離によって採集し、物理的又は化学的手段により破壊し、得られた粗抽出物を更なる精製のために維持することができる。タンパク質の発現に用いた微生物細胞は任意の一般的な方法によって破壊することができる。そのような方法には、凍結融解の繰り返し、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用が含まれる。そのような方法は当業者には周知である。発現されたポリペプチド又はそのフラグメントは、組換え細胞培養から以下を含む方法によって回収および精製することができる：硫安又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用によるクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィー。タンパク質の再折りたたみ工程は、ポリペプチドの立体構造の完成に際して必要に応じて用いることができる。所望の場合には、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を最終精製工程に用いることができる。
【００６７】
種々の哺乳動物細胞系もまた組換えタンパク質の発現に利用することができる。哺乳動物発現系の例には、サル腎線維芽細胞のCOS-7株、及び適合ベクターからタンパク質を発現させることができる他の細胞株、例えばC127、3T3、CHO、HeLa及びBHK細胞株が含まれる。
宿主細胞内の構築物を通常の態様で用い、組換え配列によってコードされる遺伝子生成物を産生させることができる。組換え体生産方法で用いられる宿主細胞に応じて、ベクターを含む宿主細胞により産生されるポリペプチドはグリコシル化されても、またグリコシル化されないてもよい。本発明のポリペプチドはまた最初のメチオニン残基を含んでいてもいなくてもよい。
無細胞翻訳系もまた本発明のポリペプチドの生産に使用することができる。無細胞翻訳系は、ポリペプチド又はそのフラグメントをコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含むDNA構築物から転写されたmRNAを用いることができる。いくつかの特徴では、前記DNA構築物は、in vitro転写反応の実施前に直線状化することができる。続いて適切な無細胞翻訳抽出物（例えばウサギ網状赤血球抽出物）とともに前記転写mRNAをインキュベートし、所望のポリペプチド又はそのフラグメントを生成する。
発現ベクターは1つ以上の選別可能な遺伝子を含み、形質転換された宿主細胞の選別用表現型特性（真核細胞の場合には例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性、大腸菌では例えばテトラサイクリン耐性又はアンピシリン耐性）を提供することができる。
【００６８】
核酸の増幅：本発明を実施するとき、本発明のポリペプチドをコードする核酸又は改変核酸は例えば増幅によって複製することができる。本発明は、酵素をコードする核酸を増幅するための増幅プライマー配列対を提供し、ここで前記プライマー対は、以下の例示的な配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49、配列番号:51、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、配列番号:67、配列番号:69、配列番号:71、配列番号:73、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:79、配列番号:81、配列番号:83、配列番号:85、配列番号:87、配列番号:89、配列番号:91、配列番号:93、配列番号:95、配列番号:97、配列番号:99、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:105、配列番号:107、配列番号:109、配列番号:111、配列番号:113、配列番号:115、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:121、配列番号:123、配列番号:125、配列番号:127、配列番号:129、配列番号:131、配列番号:133、配列番号:135、配列番号:137、配列番号:139、配列番号:141、配列番号:143、配列番号:145、配列番号:147、配列番号:149、配列番号:151、配列番号:153、配列番号:155、配列番号:157、配列番号:159、配列番号:161、配列番号:163、配列番号:165、配列番号:167、配列番号:169、配列番号:171、配列番号:173、配列番号:175、配列番号:177、配列番号:179、配列番号:181、配列番号:183、配列番号:185、配列番号:187、配列番号:189、配列番号:191及び配列番号:193を含む、本発明の核酸を増幅することができる。当業者は、これら配列の任意の部分又はその完全長のための増幅プライマー配列対を設計することができる。
【００６９】
増幅反応はまたサンプル中の核酸の量（例えば細胞サンプル中のメッセージの量）の定量、核酸の標識（例えば前記核酸をアレイまたはブロットに適用する）、核酸の検出、またはサンプル中の特定の核酸の量の定量に用いることができる。本発明のある特徴では、細胞又はcDNAライブラリーから単離したメッセージが増幅される。当業者は適切なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選択及び設計することができる。増幅方法はまた当業界で周知であり、例えば以下が含まれる：ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（例えば以下を参照されたい：PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, ed. Innis, Academic Press, NY (1990)；及びPCR Strategies (1995) ed. Innis, Academic Press, Inc., NY）、リガーゼ連鎖反応（LCR）（例えば以下を参照されたい：Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117）、転写増幅（例えば以下を参照されたい：Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173）、及びセルフサステイン配列複製（例えば以下を参照されたい：Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874）、Qベータレプリカーゼ増幅アッセイ（例えば以下を参照されたい：Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271）、自動Q-ベータレプリカーゼ増幅アッセイ（例えば以下を参照されたい：Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271）、及び他のRNAポリメラーゼ仲介技術（例えば以下を参照されたい：NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario）。さらにまた以下を参照されたい：Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316; Sambrook; Ausubel；米国特許4,683,195及び4,683,202号；Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564。
本発明はまた本発明の配列を含む増幅プライマー対を提供し、例えば、ここで前記プライマー対は、本発明の核酸の最初の（5'の）約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39若しくは40又はそれより大きい残基によって示される配列を有する第一のメンバー、及び前記第一のメンバーの相補鎖の最初の（5'の）約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39若しくは40又はそれより大きい残基によって示される配列を有する第二のメンバーを含む。
【００７０】
配列同一性の程度の決定
本発明は、本発明の例示的核酸（本発明の核酸と完全な（100％）配列同一性を有するものを含む）（例えば配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11など配列番号:193までの全ての奇数の配列番号に記載の配列を有する）と種々の配列同一性（例えば少なくとも50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％）を有する核酸；及び本発明のポリペプチド、例えば配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12などに記載の配列を有する例示的なポリペプチドと少なくとも50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％若しくはそれより高い、又は完全な（100％）配列同一性を有するポリペプチドを提供する。また別の特徴では、前記配列同一性は、少なくとも約5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、1000若しくはそれより大きい連続する残基の領域、又は前記核酸又はポリペプチドの完全長に及ぶことができる。配列同一性（相同性）の程度は、任意のコンピュータプログラム及び付属のパラメーター（本明細書に記載されたもの、例えばBLAST2.2.2又はFASTAヴァージョン3.0t78を含む）を規定値パラメーターとともに用いて決定することができる。
【００７１】
2つの核酸又はポリペプチドの関係で“実質的に同一”という語句は、下記で詳細に考察するように、最大一致のための比較及びアラインメントを実施し任意の公知の配列比較アルゴリズムの1つを用いるか又は目視精査により測定したとき、例えば少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％若しくはそれより高いヌクレオチド又はアミノ酸残基（配列）同一性を有する2つ以上の配列を指すことができる。また別の特徴では、本発明は、本発明の核酸（例えば本発明の例示的核酸）と、少なくとも約10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000残基の領域にわたって、又は核酸若しくはポリペプチドの約50残基から完全長の範囲の領域にわたって実質的同一性を有する核酸及びポリペプチド配列を提供する。
さらにまた、“実質的に同一”なアミノ酸配列は、1つ以上の保存的若しくは非保存的アミノ酸置換、欠失又は挿入によって参照配列と異なる配列である（特にそのような置換が分子の活性部位ではない部位で生じる場合、及び前記ポリペプチドがその機能的特性を本質的に維持していることを条件とする）。保存的アミノ酸置換は、例えばあるアミノ酸を同じクラスの別のアミノ酸で置換する（例えばある疎水性アミノ酸（例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン）で別の疎水性アミノ酸を置換、又は極性アミノ酸で別の極性アミノ酸を置換、例えばアルギニンでリジンを置換、グルタミン酸でアスパラギン酸を置換、又はグルタミンでアスパラギンを置換）。1つ以上のアミノ酸を例えば酵素から欠失させて、その生物学的活性を顕著に変更することなく、前記ポリペプチドの構造を改変させることができる。例えば、酵素活性に必要でないアミノ末端又はカルボキシル末端アミノ酸を除去することができる。
【００７２】
相同な配列にはまた、核酸配列内のチミンがウリジンに置換されているRNA配列が含まれる。相同な配列は本明細書に記載されている方法のいずれかを用いて入手できるが、前記はまたシークェンシングエラーの修正から得ることができる。本明細書に記載される核酸配列は、伝統的な一文字様式（例えば以下を参照されたい：Lubert Stryer, Biochemistry, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York）又は配列内のヌクレオチドの実体を記録する他の任意の様式で表現することができることは理解されよう。
本明細書で特定される種々の配列比較プログラムは本発明のこの特徴で使用される。タンパク質及び/又は核酸配列の同一性（相同性）は、当業界で公知の多様な配列比較アルゴリズムおよびプログラムのいずれかを用いて評価することができる。そのようなアルゴリズムおよびプログラムには、TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA及びCLUSTALWが含まれるが、ただしこれらに限定されない（Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448, 1988; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680, 1994; Higgins et al., Methods Enzymol. 266:383-402, 1996; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Altschul et al., Nature Genetics 3:266-272, 1993）。
相同性または同一性は配列分析ソフト（例えばジネティクスコンピュータグループ（Universty of Wisconsin Bitechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705）の配列分析ソフトウェアパッケージ）を用いて測定できる。そのようなソフトは、種々の欠失、置換及び他の改変に対して相同性の程度を判定することによって類似の配列を比較する。2つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関して“相同性”および“同一性”という用語は、比較ウィンドウ又は指定の領域上で、多数の配列比較アルゴリズムを使用するか又は手動アラインメント及び目視精査による測定にしたがって最大一致を求めて比較及びアラインメントを実施したとき、同じであるか、又は特定のパーセンテージの同じアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する2つ以上の配列または部分配列を指す。配列比較の場合、１つの配列は参照配列（例えば本発明の例示的核酸又はポリペプチド配列）として機能し、前記に対してテスト配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いるとき、テスト配列及び参照配列はコンピュータに入力され、必要な場合には部分配列同等物が指定され、さらに配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。規定値プログラムパラメーターを用いることができるが、また別のパラメーターを指定することもできる。続いて配列比較アルゴリズムは、前記プログラムパラメーターを基に参照配列に対するテスト配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００７３】
本明細書で用いられる“比較ウィンドウ”は、任意の連続残基数をもつセグメントに対する参照を含む。例えば、本発明のまた別の特徴では、本発明の例示的ポリペプチド又は核酸配列の20から完全長までの任意の範囲の連続残基が、同数の連続箇所をもつ参照配列と、前記2つの配列について最適にアラインメントが実施された後で比較される。参照配列が、本発明の例示的ポリペプチド又は核酸配列と必要な配列同一性を有するならば、例えばまた別の特徴では、本発明の例示的ポリペプチド又は核酸配列と50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％若しくはそれより高いか、又は完全な（100％）配列同一性を有するならば、前記配列は本発明の範囲内に存在する。また別の実施態様では、約20から600、約50から200、及び約100から150の範囲の部分配列が、同数の連続箇所をもつ参照配列と、前記2つの配列について最適にアラインメントが実施された後で比較される。比較のために参照配列でアラインメントを実施する方法は当業者に周知である。配列比較の最適アラインメントは、例えばSmith & Watermanの局所相同性アルゴリズム（Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)）によって、Needleman & Wunschの相同性アラインメントアルゴリズム（J. Mol. Biol. 48:443 (1970)）によって、Pearson & Lipmanの類似性検索方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)）によって、前記アルゴリズムのコンピュータによる実施によって（GAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）、または手動アラインメントと目視精査によって実施できる。相同性または同一性決定のための他のアルゴリズムには、BLASTプログラム（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information）の他に、ALIGN、AMAS（Analysis of Multiply Aligned Sequences）、AMPS（Protein Multiple Sequence Alignment）、ASSET（Aligned Segment Statistical Evaluation Tool）、BANDS、BESTSCOR、BIOSCAN（Biological Sequence Comparative Analysis Node）、BLIMPS（BLocks IMProved Searcher）、FASTA、Intervals & Points、BMB、CLUSTALV、CLUSTALW、CONSENSUS、LCONSENSUS、WCONSENSUS、Smith-Watermanアルゴリズム、DARWIN、ラスベガスアルゴリズム、FNAT（Forced Nucleotide Alignment Tool）、フレームアライン、フレームサーチ、DYNAMIC、FILTER、FSAP（Fristensky Sequence Analysis Package）、GAP（Global Alignment Program）、GENAL、GIBBS、GenQuest、ISSC（Sensitive Sequence Comparison）、LALIGN（Local Sequence Alignment）、LCP（Local Content Program）、MACAW（Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench）、MAP（Multiple Alignment Program）、MBLKP、MBLKN、PIMA（Pattern-Induced Multi-Sequence Alignment）、SAGA（Sequence Alignment by Genetic Algorithm）及びWHAT-IFが含まれる。前記のようなアラインメントプログラムはまたゲノムデータベースのスクリーニングに用いられ、実質的に同一の配列をもつポリヌクレオチド配列を同定することができる。多数のゲノムデータベースが利用可能で、例えばヒトゲノムの実質的部分がヒトゲノム配列決定プロジェクトの一部分として利用可能である（J. Roach, http://weber.u.Washington.edu/~roach/human_genome_progress2.html）（Gibbs, 1995）。いくつかのゲノム、例えばM. ジェニタリウム（genitalium）（Fraser et al., 1995）、M. ジャナスキイー（jannaschii）（Bult et al., 1996）、H. インフルエンザ（Fleischmann et al. 1995）、大腸菌（Blattner et al. 1997）、及び酵母（S. cerevisiae）（Mewes et al. 1997）、及びD.メラノガスター（melanogaster）（Adams et al., 2000）が既に配列決定されている。顕著な進展がモデル生物（例えばマウス、C. エレガンス及びアラビドプシス種（Arabidopsis sp））のゲノム配列決定で達成された。いくつかの機能的情報の注釈をもつゲノム情報を含むデータベースが種々の機関で維持されており、インターネットでアクセスすることができる。
【００７４】
BLAST、BLAST2.0及びBLAST2.2.2もまた本発明の実施に用いられる。前記は例えば以下に記載されている：Altschul (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402；Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410。BLAST分析を実施するソフトは、National Center for Biotechnology Informationから公開されている。このアルゴリズムは、問い合わせ配列で長さがWの短いワードを同定することによって高スコアをもつ配列対（HSP）をまず初めに同定することを必要とする。前記は、データベース配列中の同じ長さを持つワードとアラインメントを実施したとき、一致するか又はいくらかの正の値をもつ閾値スコアTにマッチするかその条件を満たす。Tは近傍ワードスコア閾値と称される（Altschul (1990)上掲書）。これらの最初の近傍ワードヒットはそれらを含むより長いHSPを見つけるための検索開始のシードとして機能する。前記ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加する限り各配列の両方向に沿って伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメーターM（一致残基対のための褒賞スコア、常に＞0）を用いて計算される。アミノ酸配列の場合は、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアが計算される。各方向のワードヒットの伸長は以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Xだけ下降したとき；累積スコアが、1つ以上の負のスコアを与える残基アラインメントの累積のために0以下になったとき；又はどちらかの配列の末端に達したとき。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXは前記アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、規定値として11のワード長（W）、10の期待値（E）、M=5、N=-4および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムは、3のワード長及び10の期待値（E）、及びBLOSUM62スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915）アラインメント（B）50、期待値（E）10、M=5、N=-4および両鎖の比較を用いる。BLASTアルゴリズムはまた2つの配列間の類似性の統計的分析を実施する（例えば以下を参照されたい：Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873）。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性測定の1つは最小合計確率（P(N)）であり、前記は2つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然によって生じる確率を提供する。例えば、テスト核酸と参照核酸の比較で最小合計確率が約0.2未満、好ましくは約0.01未満、もっとも好ましくは約0.001未満であるならば、核酸は参照配列と類似であると考えられる。ある特徴では、タンパク質及び核酸配列相同性はベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール（Basic Local Alignment Search Tool, “BLAST”）を用いて評価される。例えば、5つの特別なBLASTプログラムを用いて以下のタスクが実行される：（1）BLASTP及びBLAST3はアミノ酸の問い合わせ配列をタンパク質配列データベースと比較する；（2）BLASTNはヌクレオチドの問い合わせ配列をヌクレオチド配列データベースと比較する；（3）BLASTXは問い合わせヌクレオチド配列（その両方の鎖）の仮想的な6フレーム翻訳生成物をタンパク質配列データベースと比較する；（4）TBLASTNは問い合わせタンパク質配列（両方の鎖）を6つの読み枠の全てで翻訳されるヌクレオチド配列データベースと比較する；さらに（5）TBLASTXはヌクレオチド問い合わせ配列の6フレーム翻訳物をヌクレオチド配列データベースの6フレーム翻訳物と比較する。BLASTプログラムは類似のセグメントを同定することによって相同な配列を同定する。前記セグメントは本明細書では問い合わせアミノ酸または核酸配列とテスト配列間の“高スコアセグメントペア”と称され、前記は、好ましくはタンパク質又は核酸配列データベースから得られる。高スコアセグメントペアは、好ましくは、スコアリングマトリックス（その多くは当業界で公知である）によって同定される（すなわちアラインメントが実施される）。好ましくは、使用されるスコアリングマトリックスはBLOSUM62マトリックスである（Gonnet et al., Science 256:1443-1445 (1992); Henikoff and Henikoff, Proteins 17:49-61 (1993)）。好ましさは劣るが、PAM又はPAM250もまた用いることができる（例えば以下を参照されたい：Schwartz and Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation）。
【００７５】
本発明のある特徴では、核酸が本発明の範囲内に包含されるために必要条件の配列同一性を有するか否かを決定するために、NCBI BLAST 2.2.2プログラムが用いられ、規定値オプションはblastpである。BLAST 2.2.2プログラムには約38の設定オプションがある。本発明のこの例示的特徴では、フィルタリング設定規定値を除いて全ての規定値が用いられ（すなわちOFFに設定されるフィルタリングを除いて全てのパラメーターが規定値に設定される）、適度であれば“-F F”設定が用いられ、この設定はフィルタリングを不能にする。フィルタリング規定値の使用は、長さが短い配列のためにしばしばKarlin-Altschul違反を生じる。
本発明のこの例示的特徴で用いられる規定値は以下のとおりである：“低複雑度のためのフィルター：ON、ワードサイズ：3、マトリックス：Blosum62、ギャップコスト：存在：11、伸長：1”。他の規定値設定は以下のとおりである：低複雑度のためのフィルター：OFF、タンパク質の場合ワードサイズ：3、BLOSUM62マトリックス、ギャプ存在ペナルティーは-11、及びギャップ伸長ペナルティーは-1である。例示的なNCBI BLAST 2.2.2プログラム設定は下記の実施例１に示されている。“-W”オプションは規定値を0にすることに留意されたい。これは、設定されない場合は、ワードサイズの規定値をタンパク質の場合3に、ヌクレオチドの場合11にすることを意味する。
【００７６】
コンピュータシステムおよびコンピュータプログラム製品
配列同一性、構造相同性、モチーフなどをコンピュータシステムで決定および同定するために、コンピュータによって読み取りさらにアクセスすることができる任意の媒体上に本発明の配列を保存、記録し、さらに操作することができる。したがって、本発明は、本発明の核酸及びポリペプチド配列を記録または保存させたコンピュータ、コンピュータシステム、コンピュータ読み出し可能媒体、コンピュータプログラム製品などを提供する。本明細書で用いられる“記録”および“保存”という用語はコンピュータ媒体に情報を保存するプロセスを指す。当業者は、コンピュータ読み出し可能媒体に情報を記録するための任意の公知の方法を容易に利用して、本発明の1つ以上の核酸及び/又はポリペプチド配列を含む製品を製造することができる。本明細書で用いられる“コンピュータ”、“コンピュータプログラム”及び“プロセッサー”という用語は、これらのもっとも広い一般的な意味で用いられ、下記で詳細に述べるように、そのような装置の全てが含まれる。
本発明のまた別の特徴は、少なくとも1つの本発明の核酸及び/又はポリペプチド配列が記録されたコンピュータ読み出し可能媒体である。コンピュータ読み出し可能媒体には、磁気により読み出し可能な媒体、光学的に読み出し可能な媒体、電子的に読み出し可能な媒体及び磁気/光学媒体が含まれる。例えば前記コンピュータ読み出し可能媒体はハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、CD-ROM、多用途デジタルディスク（DVD）、ランダムアクセスメモリー（RAM）、又は読み出し専用メモリー（ROM）の他、当業者に公知の他のタイプの媒体であろう。
【００７７】
本発明の特徴には、システム（例えばインターネット使用システム）、特に、本明細書に記載されている配列情報を保存し、これを操作するコンピュータシステムが含まれる。コンピュータシステム（100）の一例が図１の組立て図に示されている。本明細書で用いられる“コンピュータシステム”は、本発明のヌクレオチド又はポリペプチド配列の分析に用いられるハードウェア構成部分、ソフトウェア構成部分及びデータ保存構成部分を指す。コンピュータシステム（100）は、配列データを処理し、これにアクセスし、さらに操作するプロセッサーを含む。プロセッサ（105）は周知のタイプの中央演算ユニットのいずれか、例えばインテル社（Intel Corporation）のペンチアムIII又はサン（Sun）、モトローラ（Motorola）、コンパック（Compaq）、AMD又はインターナショナル・ビジネス・マシーンズ（IBM）の同様なプロセッサーでもよい。コンピュータシステム（100）は汎用システムであり、プロセッサー（105）及び1つ以上のデータ保存用内部データ保存構成成分（110）、及び前記データ保存構成成分に保存されたデータを検索するための1つ以上のデータ検索装置を含む。従来の利用可能なコンピュータシステムのいずれも適切であることは当業者には理解されよう。
ある特徴では、コンピュータシステム（100）は、バス（メインメモリー（115）（好ましくはRAMとして提供されている）に連結されている）に連結されたプロセッサー（105）、及び1つ以上の内部データ保存装置（110）（例えばハードドライブ及び/又はそれにデータが記録されている他のコンピュータ読み出し可能媒体）を含む。コンピュータシステム（100）はさらに、内部データ保存装置（110）に保存されたデータを読み取るための1つ以上のデータ検索装置（118）を含む。前記データ検索装置（118）は、例えばフロッピー（登録商標）ディスクドライブ、コンパクトディスクドライブ、磁気テープドライブ、または遠隔データ保存システムに連結することができる（例えばインターネットを介して）モデムであろう。いくつかの実施態様では、内部データ保存装置（110）は取り外し可能なコンピュータ読み出し可能媒体、例えばフロッピー（登録商標）ディスク、コンパクトディスク、磁気テープなどで、制御ロジック及び/又はそれに記録されたデータを含んでいる。コンピュータシステム（100）は有利には、データ検索装置にいったん挿入されたデータ保存構成部分から前記制御ロジック及び/又はデータを読み出すための適切なソフトを含むか、または前記ソフトによってプログラムされる。コンピュータシステム（100）は、コンピュータのユーザーに出力結果を表示するために用いられるディスプレー（120）を含む。コンピュータシステム（100）は他のコンピュータシステム（125a−c）とネットワークまたは広域ネットワークで連結され、コンピュータシステム（100）への中央アクセスを提供することができることは留意されるべきであろう。本発明のヌクレオチド又はアミノ酸配列にアクセスし前記を処理するためのソフトは実行時にはメインメモリー（115）に存在し得る。いくつかの特徴では、コンピュータシステム（100）はさらに、本発明の核酸配列を比較するための配列比較アルゴリズムを含むことができる。前記アルゴリズム及び配列はコンピュータ読み出し可能媒体に保存することができる。“配列比較アルゴリズム”は、データ保存手段内に保存されている他のヌクレオチド配列及び/又は化合物とヌクレオチド配列を比較するためにコンピュータシステム（100）に（端末または遠隔端末から）提供される1つ以上のプログラムを指す。例えば、配列比較アルゴリズムは、コンピュータ読み出し可能媒体に保存されている本発明のヌクレオチド配列を、コンピュータ読み出し可能媒体に保存されている参照配列と比較し、相同性または構造モチーフを同定することができる。
【００７８】
上記のアルゴリズムとともに用いられるパラメーターは、調査される配列の長さ及び相同性の程度に応じて修正することができる。いくつかの特徴では、前記パラメーターは、ユーザーの指示がない場合アルゴリズムによって用いられる規定値パラメーターであってもよい。図2は、新規なヌクレオチド又はタンパク質配列を配列データベースと比較して、新規な配列とデータベース配列との間の相同性レベルを決定するためのプロセス（200）の1つの特徴を示す工程図である。前記データベースの配列は、コンピュータシステム（100）内に保存された個人的データベースでも、公的データベース（例えばインターネットを介して利用可能なGENBANK）でもよい。プロセス（200）は開始状態（201）で始まり、続いて、比較されるべき新規な配列がコンピュータシステム（100）内のメモリーに保存される状態（202）に移行する。上記で考察したように、前記メモリーは任意のタイプのメモリー（RAMまたは内部保存装置を含む）であり得る。続いてプロセス（200）は状態（204）に移行し、ここで配列データベースが分析および比較のために開かれる。続いてプロセス（200）は、データベースに保存されている第一の配列がコンピュータのメモリーに読み出される状態（206）に移行する。続いて比較が状態（210）で実施され、第一の配列が第二の配列と同じであるか否かが決定される。この工程は、新規な配列とデータベースの第一の配列との間の正確な比較の実施に限定されないことに留意することが重要である。2つのヌクレオチド配列又はタンパク質配列を（たとえそれらが同一ではなくても）比較する周知の方法を当業者は心得ている。例えばギャップを1つの配列に導入してこれら2つのテスト配列間の相同性レベルを高めることができる。比較時にギャップ又は他の特徴を配列に導入するか否かを制御するパラメーターは通常はコンピュータシステムのユーザーによって入力される。いったん2つの配列の比較が状態（210）で実施されたら、前記2つの配列が同じか否かの決定が決定の状態（210）で下される。もちろんのこと、“同じ”という用語は完全に同一である配列に限定されない。ユーザーによって入力された相同性パラメーター内に入る配列は、プロセス（200）で“同じ”と示される。2つの配列が同じであるという決定が下されたら、プロセス（200）は状態（214）に移行し、ここでデータベース由来の配列の名称がユーザーに表示される。前記状態はディスプレーされた名称の配列が入力した相同性の特徴を満たすことをユーザーに知らせる。保存配列の名称がいったんユーザーに表示されたら、プロセス（200）は、それ以上の配列がデータベースに存在するか否かの決定が下される決定状態（218）に移行する。それ以上データベースに配列が存在しない場合には、プロセス（200）は終了状態（220）で終了する。しかしながらデータベースにさらに配列が存在する場合は、プロセス（200）は状態（224）に移行し、前記状態でポインターは、データベースの次の配列に移動し前記新たな配列と比較することができる。このようにして、新たな配列はアラインメントを実施されデータベースの各配列と比較される。配列が相同でないという決定が決定状態（212）で下された場合、プロセス（200）は直ちに決定状態（218）に移行し、データベース内に比較されるべき他の配列が存在するか否かが決定されることは留意されよう。したがって、本発明のある特徴は、プロセッサー、本発明の核酸配列及び比較を実施するための配列コンペアラーが保存されているデータ保存装置を含むコンピュータシステムである。前記配列コンペアラーは、比較される配列間の相同性レベルを示すか又は構造モチーフを同定するか、又はこれら核酸コード及びポリペプチドコードと比較される配列内の構造モチーフを同定することができる。図3は、2つの配列が相同であるか否かを決定するコンピュータシステムのプロセス（250）のある実施態様を示す工程図である。プロセス（250）は開始状態（252）で開始し、続いて比較されるべき第一の配列がメモリーに保存される状態（254）に移行する。続いて比較されるべき第二の配列が状態（256）でメモリーに保存される。続いてプロセス（250）は状態（260）に移行し、前記状態（260）で第一の配列中の第一の記号が読み取られ、続いて状態（262）に移行し、前記状態（262）で第二の配列の第一の記号が読み取られる。前記配列がヌクレオチド配列の場合、前記記号は通常はA、T、C、G又はUのいずれかであることは理解されよう。前記配列がタンパク質配列の場合は、前記記号は一文字のアミノ酸コードであり、それによって第一および第二の配列は容易に比較され得る。続いて2つの記号が同じものであるか否かの決定が決定状態（264）で下される。それらが同じものである場合、プロセス（250）は状態（268）に移行し、前記状態（268）で第一および第二の配列の次の記号が読み取られる。続いて、前記次の記号が同じものであるか否かの決定が下される。それらが同じものである場合には、プロセス（250）は2つの記号が同じでなくなるまでこのループを繰り返す。次の2つの記号が同じでないという決定が下された場合、プロセス（250）は決定状態（274）に移行して、いずれかの配列に読み取られるべき記号がそれ以上存在するか否かが決定される。読み取られるべき記号がそれ以上存在しない場合は、プロセス（250）は状態（276）に移行し、第一および第二の配列間の相同性レベルがユーザーに表示される。相同性レベルは、第一の配列内の記号の総数のうち配列間で同じであった記号の割合を計算することによって決定される。したがって、第二の配列の各記号と最初の100ヌクレオチド配列内の各記号のアラインメントが達成された場合、相同性レベルは100％であろう。
【００７９】
あるいは、コンピュータプログラムは、本発明の配列と参照配列を比較して、それら配列が1つ以上の位置で異なるか否かを決定することができる。前記プログラムは、参照配列又は本発明の配列のいずれかの配列に対して挿入、欠失または置換されたヌクレオチドの長さまたはそれらの実体を記録することができる。コンピュータプログラムは、参照配列が本発明の配列に対して一ヌクレオチド多型性（SNP）を含むか否か、又は本発明の配列が公知の配列のSNPを含むか否かを決定するプログラムであってもよい。したがって、いくつかの特徴では、コンピュータプログラムはSNPを同定するプログラムである。前記方法は上記に述べたコンピュータシステムによって実施することができ、前記方法は図3に示されている。前記方法は、コンピュータプログラムを使用することにより本発明の配列及び参照配列を読み取り、さらにコンピュータプログラムにより相違を同定することによって実施することができる。
【００８０】
他の特徴では、前記コンピュータ使用システムは、本発明の核酸又はポリペプチド内の特徴を同定するアイデンティファイヤーを含む。“アイデンティファイヤー”は、核酸配列内のある種の特徴を同定する1つ以上のプログラムを指す。例えば、アイデンティファイヤーは、核酸配列内のオープンリーディングフレーム（ORF）を同定するプログラムを含むことができる。図4は、配列内の1つの特徴の存在を検出するためのアイデンティファイヤープロセス（300）のある特徴を示す工程図である。プロセス（300）は開始状態（302）で開始し、続いて状態（304）に移行し、前記状態（304）で特徴についてチェックされるべき第一の配列がコンピュータシステム（100）のメモリー（115）に保存される。プロセス（300）は続いて状態（306）に移行し、前記状態（306）で配列の特徴のデータベースが開かれる。そのようなデータベースは各特徴の属性リストを前記特徴の名称とともに含むであろう。例えば、特徴の名称は“開始コドン”であり、その属性は“ATG”であろう。別の例では、特徴の名称は“TAATAAボックス”であり、特徴の属性は“TAATAA”であろう。そのようなデータベースの例は、ウィスコンシン大学のGenetics Computer Groupによって作成されている。あるいは、前記特徴は構造的なポリペプチドモチーフ例えばアルファへリックス、ベータシート又は機能的ポリペプチドモチーフ、例えば酵素活性部位、ヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフ又は当業者に公知の他のモチーフであろう。特徴のデータベースが状態（306）で開かれると直ちにプロセス（300）は状態（308）に移行し、前記状態（308）で第一の特徴がデータベースから読み取られる。続いて第一の特徴の属性と第一の配列との比較が状態（310）で実施される。続いて、前記特徴の属性の比較が第一の配列内で見出されるか否かの決定が決定状態（316）で下される。前記属性が見出された場合、プロセス（300）は状態（318）に移行し、見出された特徴の名称が前記状態（318）でユーザーに表示される。続いてプロセス（300）は決定状態（320）に移行し、前記状態（320）でそれ以上の特徴がデータベースに存在するか否かの決定が下される。特徴がそれ以上存在しない場合は、プロセス（300）は終了状態（324）で終了する。しかしながら、それ以上の特徴がデータベースに存在する場合、プロセス（300）は状態（326）で次の配列特徴を読み取り、状態（310）に戻り、前記状態で次の特徴の属性が第一の配列に対して比較される。第一の配列で前記特徴の属性が決定状態（316）で見出されない場合、プロセス（300）は直接決定状態（320）に移行し、特徴がそれ以上データベースに存在するか否かを決定する。したがって、ある特徴では、本発明はオープンリーディングフレーム（ORF）を同定するコンピュータプログラムを提供する。
【００８１】
本発明のポリペプチド又は核酸配列は、種々のデータプロセッサプログラムで多様な様式で保存し操作することができる。例えば、配列は、ワードプロセッシングファイルのテキストとして（例えばマイクロソフトワード（WORD）又はワードパーフェクト（WORDPERFECT））、又は当業者に周知の多様なデータベースプログラムにおけるアスキー（ASCII）ファイルとして（例えばDB2、SYBASE、又はORACLE）保存することができる。さらに、多くのコンピュータプログラム及びデータベースを配列比較アルゴリズム、アイデンティファイヤー、又は本発明の核酸配列と比較されるべき参照ヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の供給源として用いることができる。本発明の実施に用いられるプログラム及びデータベースには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）： MacPattern（EMBL）、DiscoveryBase（Molecular Applications Group）、GeneMine （Molecular Applications Group）、Look（Molecular Applications Group）、MacLook（Molecular Applications Group）、BLASTおよびBLAST2（NCBI）、BLASTNおよびBLASTX（Alyschul et al. J. Mol. Biol. 215:403, 1990）、FASTA（Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444,1988）、FASTDB (Brutlag et al. Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990)、Catalyst（Molecular Simulations Inc.）、Catalyst/SHAPE（Molecular Simulations Inc.）、Cerius2.DBAccess（Molecular Simulations Inc.）、HypoGen（Molecular Simulations Inc.）、Insight II（Molecular Simulations Inc.）、Discover（Molecular Simulations Inc.）、CHARMｍ（Molecular Simulations Inc.）、Felix（Molecular Simulations Inc.）、DelPhi（Molecular Simulations Inc.）、QuanteMN（Molecular Simulations Inc.）、Homology（Molecular Simulations Inc.）、Modeler（Molecular Simulations Inc.）、ISIS（Molecular Simulations Inc.）、Quanta/Protein Design（Molecular Simulations Inc.）、WebLab（Molecular Simulations Inc.）、WebLab Diversity Explorer（Molecular Simulations Inc.）、Gene Explorer（Molecular Simulations Inc.）、SeqFold（Molecular Simulations Inc.）、MDL Available Chemicals Directoryデータベース、MDL Drug Data Reportデータベース、Comprehensive Medical Chemistryデータベース、Derwent's World Drug Indexデータベース、BioByteMasterFileデータベース、Genbankデータベース及びGenseqnデータベース。他の多くのプログラム及びデータベースも本発明の開示が提供される当業者には明白であろう。
上記のプログラムを用いて検出することができるモチーフには、ロイシンジッパー、ヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフ、グリコシル化部位、ユビキチン化部位、アルファヘリックス、ベータシート、コードされたタンパク質の分泌を誘導するシグナルペプチドをコードするシグナル配列、転写調節に関与する配列（例えばホメオボックス）、酸性ストレッチ、酵素活性部位、基質結合部位および酵素切断部位が含まれる。
【００８２】
核酸のハイブリダイゼーション
本発明は、本発明の核酸、例えば本発明の例示的な配列（例えば配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11など）、及びその部分配列（相補的配列を含む）又は本発明のポリペプチドをコードする核酸と種々のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離、合成又は組換え核酸を提供する。前記ストリンジェントな条件は、高度にストリンジェントな条件、中等度にストリンジェントな条件、軽度にストリンジェントな条件であり、本明細書に記載されている高ストリンジェンシー条件及び低ストリンジェンシー条件を含む。
“ハイブリダイゼーション”は、核酸鎖が相補的な鎖と塩基対形成によって結合する過程を指す。ハイブリダイゼーション反応は鋭敏で選択性があり、低い濃度でしか存在しないサンプルにおいてさえ問題の特定の配列を同定することができる。ストリンジェントな条件は、例えばプレハイブリダイゼーション溶液又はハイブリダイゼーション溶液中の塩若しくはホルムアミドの濃度によって、又はハイブリダイゼーション温度によって規定することができ、当業界では周知である。例えば、ストリンジェンシーは、下記で詳細に述べるように、塩濃度の減少、ホルムアミド濃度の増加、又はハイブリダイゼーション温度の上昇、ハイブリダイゼーション時間の変更によって高めることができる。また別の特徴では、本発明の核酸は、本明細書に示す種々の（例えば高度、中等度および低度）ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするその能力によって定義される。
また別の実施態様では、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるその能力によって定義される本発明の核酸は、本発明の核酸の約5残基から完全長の間であろう。例えばそれらは、長さが少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000又はそれより大きい残基であり得る。完全長より短い核酸もまた含まれる。これらの核酸は、例えばハイブリダイゼーションプローブ、標識プローブ、PCRオリゴヌクレオチドプローブ、iRNA、アンチセンス又は抗体結合ペプチド（エピトープ）をコードする配列、モチーフ、活性部位などとして有用であり得る。
【００８３】
ある特徴では、本発明の核酸は、約37℃から42℃で約50％のホルムアミドの条件を含む高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができるその能力によって定義される。ある特徴では、本発明の核酸は、約30℃から35℃で約35％から25％のホルムアミドの条件を含む低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができるその能力によって定義される。
あるいは、本発明の核酸は、約37℃から42℃で約50％ホルムアミドの条件を含む高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができるその能力によって定義される。ある特徴では、本発明の核酸は、約30℃から35℃で約35％から25％のホルムアミドを含む低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができるその能力によって定義される。
あるいは、本発明の核酸は、42℃、50％ホルムアミド、5ｘのSSPE、0.3％SDS及び反復配列ブロッキング核酸（例えばcot-1またはサケ精子DNA（例えば200n/mＬのせん断変性サケ精子DNA））の条件を含む高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができるその能力によって定義される。ある特徴では、本発明の核酸は、35℃の低温で約35％のホルムアミドを含む低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができるその能力によって定義される。
ハイブリダイゼーションの後、フィルターを50℃にて6XのSSC、0.5%のSDSで洗浄することができる。これらの条件は、25％を超えるホルムアミドで“中等度”の条件、25％より低いホルムアミドで“低度”の条件と考えられる。“中等度”のハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記のハイブリダイゼーションが30％のホルムアミド実施される場合である。“低ストリンジェンシー”の具体的な例は、上記のハイブリダイゼーションが10％のホルムアミド実施される場合である。
【００８４】
個々のストリンジェンシーレベルに対応する温度範囲は、問題の核酸のプリン対ピリミジン比を算出し、それにしたがって温度を調整することによってさらに狭めることができる。本発明の核酸はまた、Ausubel and Sambrookの成書に示されているように、高度、中等度又は低度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするそれらの能力によって定義される。上記の範囲および条件における多様な型は当業界で周知である。ハイブリダイゼーション条件は下記でさらに考察される。
上記の方法は、プローブ配列に対して相同性が低い核酸を同定するために改変することができる。例えば、検出可能なプローブに対して相同性が低い核酸を得るために、ストリンジェンシーが低い条件を用いることができる。例えば、約1MのNa+濃度を有するハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイゼーション温度を68℃から42℃まで5℃ずつ下げることができる。ハイブリダイゼーション後に、フィルターをハイブリダイゼーション温度で2XのSSC、0.5％SDSで洗浄することができる。前記の条件は、50℃より上で“中等度”の条件、50℃未満で“低度”の条件と考えられる。“中等度”のハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記のハイブリダイゼーションが55℃で実施される場合である。“低ストリンジェンシー”のハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記のハイブリダイゼーションが45℃で実施される場合である。
【００８５】
あるいは、ハイブリダイゼーションは、ホルムアミドを含む緩衝液（例えば6XのSSC）中で42℃の温度で実施することができる。この場合、ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアミドの濃度を50%から0%まで5%ずつ減少させ、プローブに対して相同性レベルの低いクローンを同定することができる。ハイブリダイゼーションの後でフィルターを6XのSSC、0.5％SDSにより50℃で洗浄することができる。これらの条件は、25％を超えるホルムアミドで“中等度”の条件、25％より低いホルムアミドで“低度”の条件と考えられる。“中等度の”ハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記のハイブリダイゼーションが30％のホルムアミドで実施されるときである。“低ストリンジェンシー”のハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記のハイブリダイゼーションが10％のホルムアミドで実施されるときである。
しかしながら、ハイブリダイゼーションの様式の選択は決定的なものではなく、ある核酸が本発明の範囲内に包含されるか否かを決定する条件を示すのは洗浄条件のストリンジェンシーである。本発明に包含される核酸を同定するために用いられる洗浄条件には例えば以下が含まれる：pH７で約0.02Mの塩濃度、及び少なくとも約50℃又は約55℃から約60℃；又は約0.15MのNaClの塩濃度で72℃、約15分；又は約0.2XのSSCの塩濃度で少なくとも約50℃又は約55℃から約60℃の温度で約15から約20分；又はハイブリダイゼーション複合体を、0.1％のSDSを含む約2XのSSCの塩濃度を有する溶液で室温にて15分2回洗浄し、続いて0.1％のSDSを含む約0.1XのSSCで68℃にて15分2回洗浄する；又は前記と同等な条件。SSC緩衝液および同等な条件に関してはSambrook, TijssenおよびAusubelの著書を参照されたい。
これらの方法は本発明の核酸の単離に用いることができる。
【００８６】
オリゴヌクレオチドプローブ及びそれらを使用する方法
本発明はまた、酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を同定する核酸プローブを提供する。ある特徴では、前記プローブは、本発明の核酸の連続する少なくとも10塩基を含む。あるいは、本発明のプローブは、本発明の核酸に記載の配列の少なくとも約5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、160、170、180、190、200若しくはそれより大きい、又は約10から50、約20から60、約30から70の連続する塩基であり得る。前記プローブは、結合及び/又はハイブリダイゼーションによって核酸を同定する。前記プローブは、例えばキャピラリーアレイを含む本発明のアレイ（下記の考察を参照されたい）で用いることができる。本発明のプローブはまた他の核酸又はポリペプチドの単離に用いることができる。
本発明のプローブを用いて、生物学的サンプル（例えば土壌サンプル）が、本発明の核酸配列（例えば酵素コード配列）を有する生物又は前記核酸が得られた生物を含むか否かを決定することができる。そのような方法では、前記核酸が単離された生物を潜在的に保有する生物学的サンプルを入手し、前記サンプルから核酸を得る。前記プローブがサンプル中に存在する相補的配列のいずれかと特異的にハイブリダイズすることができる条件下で、前記核酸を前記プローブと接触させる。必要な場合には、相補性配列を含まないコントロール配列と同様に、相補性配列を含むことが判明しているサンプルの相補性配列とプローブを接触させることによって、プローブが特異的にハイブリダイズすることができる条件を決定することができる。ハイブリダイゼーション条件（例えばハイブリダイゼーション緩衝液の塩濃度、ハイブリダイゼーション緩衝液のホルムアミド濃度又はハイブリダイゼーションの温度）を変化させて、前記プローブが相補性核酸と特異的にハイブリダイズすることができる条件を同定することができる（特異的ハイブリダイゼーションの条件に関しては考察を参照されたい）。
【００８７】
前記核酸が単離された生物をサンプルが含む場合には、プローブの特異的なハイブリダイゼーションが検出される。ハイブリダイゼーションは、プローブを検出可能な薬剤（例えば放射性同位元素、蛍光染料、又は検出可能な生成物の形成を触媒することができる酵素）で標識することによって検出することができる。標識プローブを用いてサンプル中の相補性核酸の存在を検出する多くの方法が当業者にはよく知られている。これらにはサザンブロット、ノーザンブロット、コロニーハイブリダイゼーション法及びドットブロットが含まれる。これらの各方法のプロトコルはAusubel and Sambrookの著書において提供される。
あるいは、2つ以上のプローブ（そのうちの少なくとも1つは核酸サンプルに存在する任意の相補性配列と特異的にハイブリダイズすることができる）を増幅反応で用いて、サンプルが本発明の核酸配列を含む生物（例えば前記核酸が単離された生物）を含むか否かを決定することができる。ある特徴では、前記プローブはオリゴヌクレオチドを含む。ある特徴では、前記増幅反応はPCR反応を含むことができる。PCRのプロトコルはAusubel and Sambrookの著書に記載されている（増幅反応に関しては考察を参照されたい）。そのような方法では、サンプル中の核酸をプローブと接触させ、増幅反応を実施し、さらに生成された一切の増幅生成物を検出する。増幅生成物は、反応生成物のゲル電気泳動を実施し、前記ゲルをインターカレーション試薬（例えば臭化エチジウム）で染色することによって検出することができる。あるいは1つ以上のプローブを放射性同位元素で標識し、ゲル電気泳動の後で放射性増幅生成物の存在をオートラジオグラフィーによって検出してもよい。
本発明の核酸配列の3'又は5'末端近くの配列に由来するプローブもまた染色体ウォーキング法で用いて、さらに別に例えばゲノム配列を含むクローンを同定することができる。そのような方法は、興味を有するさらに別のタンパク質をコードする遺伝子を前記宿主生物から単離することを可能にする。
【００８８】
ある特徴では、本発明の核酸配列をプローブとして用いて関連核酸を同定及び単離することができる。いくつかの特徴では、そのようにして同定される関連核酸は、本発明の核酸が最初に単離された生物以外の生物に由来するcDNA又はゲノムDNAであり得る。そのような方法では、プローブが特異的に関連配列とハイブリダイズすることができる条件下で、核酸サンプルを前記プローブと接触させる。続いて、関連生物に由来する核酸とプローブのハイブリダイゼーションが上記に記載した方法のいずれかを用いて検出される。
核酸のハイブリダイゼーション反応では、特定のレベルのストリンジェンシーを達成するために用いられる条件は、ハイブリダイズされる核酸にしたがって変動するであろう。例えば、核酸のハイブリダイズする領域の長さ、相補性の低度、ヌクレオチド配列組成（例えばGC対AT含量）、及び核酸タイプ（例えばRNA対DNA）は、ハイブリダイゼーション条件の選択に際して考慮され得る。さらにまた別の条件は、核酸の1つが、例えばフィルターに固定されるか否かということである。ハイブリダイゼーションは、低ストリンジェンシー、中等度ストリンジェンシー又は高ストリンジェンシーの条件下で実施することができる。核酸のハイブリダイゼーションの例として、固定された変性核酸を含むポリマーメンブレンを最初に45℃にて30分、0.9MのNaCl、50mMのNa2H2PO4（pH7.0）、5.0mMのNa2EDTA、0.5％のSDS、10ｘデンハルト溶液、及び0.5mg/mLポリリボアデニル酸から成る溶液中でプレハイブリダイズさせる。続いて約2ｘ107cpm（比活性4−9ｘ108cpm/μg）の32P末端標識オリゴヌクレオチドプローブを前記溶液に加える。12−16時間のインキュベーションの後で、前記メンブレンを室温（RT）にて30分、0.5％のSDSを含む1ｘのSET（150mMのNaCl、20mMトリス塩酸、pH7.8、1mMのNa2EDTA）で洗浄し、続いて前記オリゴヌクレオチドプローブのTm−10℃にて30分新しい1ｘSETで洗浄する。続いて、ハイブリダイゼーションシグナルの検出のためにこのメンブレンをオートラジオグラフフィルムに暴露する。
【００８９】
検出可能なプローブとハイブリダイズする核酸（例えばcDNAまたはゲノムDNA）を同定するために用いられるハイブリダイゼーションのストリンジェンシーレベルを変動させることによって、プローブに対して種々のレベルの相同性を有する核酸を同定および単離することができる。ストリンジェンシーは、プローブの融解温度より低い種々の温度でハイブリダイゼーションを実施することによって変動させることができる。融解温度（Tm）は、（所定のイオン強度およびpHの下で）標的配列の50％が完全に相補性のプローブとハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、個々のプローブのTmに等しいか又はそれより約5℃低くなるように選択される。プローブの融解温度は以下の等式を用いて計算できる。長さが14から70ヌクレオチドのプローブの場合、融解温度（Tm）は下記式を用いて計算される：Tm＝81.5＋16.6（log[Na+]）＋0.41（G+Cの割合）−（600/N）、式中Nはプローブの長さである。ハイブリダイゼーションがホルムアミド含有溶液中で実施される場合、融解温度は以下の等式を用いて計算できる：Tm＝81.5＋16.6（log[Na+]）＋0.41（G+Cの割合）−（0.63％ホルムアミド）−（600/N）、式中Nはプローブの長さである。プレハイブリダイゼーションは、6ｘのSSC、5ｘのデンハルト試薬、0.5％SDS、100μgの変性断片化サケ精子DNA、または6ｘのSSC、5ｘのデンハルト試薬、0.5％SDS、100μgの変性断片化サケ精子DNA、50％ホルムアミド中で実施することができる。SSC及びデンハルト溶液のための組成は例えばSambrookの著書に挙げられている。
ある特徴では、ハイブリダイゼーションは、検出可能プローブを上記に挙げたプレハイブリダイゼーション溶液に添加することによって実施される。プローブが二本鎖DNAを含む場合、ハイブリダイゼーション溶液に添加する前にそれを変性させる。前記プローブがそれと相補的若しくは相同な配列を含むcDNA又はゲノムDNAとハイブリダイズできるように十分な時間、前記ハイブリダイゼーション溶液とフィルターを接触させる。長さが200ヌクレオチドを超えるプローブの場合、ハイブリダイゼーションはTmより15−25℃下で実施できる。より短いプローブの場合（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）、ハイブリダイゼーションはTmより5−10℃下で実施できる。ある特徴では、6ｘのSSC中でのハイブリダイゼーションが約68℃で実施される。ある特徴では、50％ホルムアミド含有溶液中でのハイブリダイゼーションが約42℃で実施される。前述のハイブリダイゼーションはいずれも高ストリンジェンシー条件のものと考えられる。
【００９０】
ある特徴では、ハイブリダイゼーションの後、フィルターを洗浄して非特異的に結合した検出可能なプローブを一切除去することができる。フィルターの洗浄に用いられるストリンジェンシーはまた、ハイブリダイズされる核酸の性質、ハイブリダイズされる核酸の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列の組成（例えばGC対AT含有量）及び核酸のタイプ（例えばRNA対DNA）に応じて変動し得る。ストリンジェンシーがだんだんと高くなる洗浄条件の例は以下のとおりである：2ｘのSSC、0.1%のSDS、室温で15分（低ストリンジェンシー）；0.1ｘのSSC、0.5%のSDS、室温で30分から1時間（中等度ストリンジェンシー）；0.1ｘのSSC、0.5%のSDS、ハイブリダイゼーション温度から68℃で15から30分（高ストリンジェンシー）；及び0.15MのNaCl、72℃で15分（超高ストリンジェンシー）。最後の低ストリンジェンシー洗浄は、0.1ｘのSSCで室温で実施することができる。前述の例は、フィルターの洗浄で用いることができる1組の条件の単なる例示である。種々のストリンジェンシーの洗浄用レシピが多数存在することは当業者には知られていよう。
プローブとハイブリダイズした核酸はオートラジオグラフィー又は他の通常的な技術によって同定される。上記の方法は、プローブ配列に対して相同性が低い核酸を同定するために改変することができる。例えば、検出可能なプローブに対して相同性が低い核酸を得るために、ストリンジェンシーが低い条件を用いることができる。例えば、約1MのNa+濃度を有するハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイゼーション温度を68℃から42℃まで5℃ずつ下げることができる。ハイブリダイゼーション後に、フィルターをハイブリダイゼーション温度で2ｘのSSC、0.5％SDSで洗浄することができる。前記の条件は、50℃より上で“中等度”の条件、50℃未満で“低度”の条件と考えられる。“中等度”のハイブリダイゼーション条件の例は、上記のハイブリダイゼーションが55℃で実施される場合である。“低ストリンジェンシー”ハイブリダイゼーション条件の例は、上記のハイブリダイゼーションが45℃で実施される場合である。
【００９１】
あるいは、ハイブリダイゼーションは、例えばホルムアミドを含む緩衝液（例えば6ｘのSSC）中で42℃の温度で実施することができる。この場合、ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアミドの濃度を50%から0%まで5%ずつ減少させ、プローブに対して相同性レベルの低いクローンを同定することができる。ハイブリダイゼーションの後でフィルターを6ｘのSSC、0.5％SDSにより50℃で洗浄することができる。前記の条件は、25％を超えるホルムアミドで“中等度”の条件、25％より低いホルムアミドで“低度”の条件と考えられる。“中等度” のハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記のハイブリダイゼーションが30％のホルムアミドで実施されるときである。“低ストリンジェンシー”ハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記のハイブリダイゼーションが10％のホルムアミドで実施されるときである。
本発明のこれらのプローブ及び方法を用いて、本発明の核酸配列と少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又はそれより高い配列同一性を有する配列であって、少なくともその配列の約10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、又はそれより大きい連続する塩基を含む配列、又はそれらと相補的な配列を有する核酸を単離又は同定（例えばアレイを用いて）することができる。相同性は、本明細書で考察するとおりアラインメントアルゴリズムを用いて測定することができる。例えば、相同なポリヌクレオチドは、本明細書に記載したコード配列の1つの天然に存在する対立遺伝子座変種のコード配列を有することができる。そのような対立遺伝子座変種は、本発明の核酸と比較したとき1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有することができる。
さらにまた、本発明のプローブ及び方法を用いて、本発明のポリペプチドと少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又はそれより高い配列同一性（相同性）を有するポリペプチド配列であって、少なくともその配列の約5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、若しくは150、又はそれより大きい連続するアミノ酸を含むポリペプチド配列をコードする核酸を単離又は同定（例えばアレイを用いて）することができる。前記配列同一性は、配列アラインメントアルゴリズム、例えば規定値パラメータを用いるFASTAバージョン3.0t78アルゴリズム、又は本明細書に示す例示的設定を用いるBLAST2.2.2プログラムにより決定される。
【００９２】
酵素の発現阻害
本発明は、本発明の核酸配列（例えば酵素コード配列）と相補的な核酸（例えばアンチセンス配列）を提供する。アンチセンス配列は、酵素コード遺伝子の輸送、スプライシング又は転写を阻害することができる。前記阻害は、ゲノムDNA又はメッセンジャーRNAを標的とすることにより達成され得る。前記阻害は、本発明の配列を含むDNA（例えば阻害性リボザイム）又はRNA（例えば二本鎖iRNA、例えばsiRNA又はmiRNA）を用いて実施することができる。標的とされる核酸の転写又は機能は、例えばハイブリダイゼーション及び/又は切断によって阻害することができる。本発明は、酵素遺伝子及び/又はメッセージに結合することができるオリゴヌクレオチドを含む1組の阻害物質を提供する（いずれの事例でも酵素の生成又は機能が防止又は抑制される）。前記の結合は配列特異的ハイブリダイゼーションを介することができる。別の有用な阻害物質の種類には酵素メッセージの不活化又は切断をもたらすオリゴヌクレオチドが含まれる。前記オリゴヌクレオチドはそのような切断を惹起する酵素活性を有することができる（例えばリボザイム）。オリゴヌクレオチドは化学的に改変するか、または相補性核酸を切断することができる酵素若しくは組成物と結合させることができる。ある者は、多くのそのような種々のオリゴヌクレオチドのプールを所望の活性を有するオリゴヌクレオチドについてスクリーニングすることができる。
【００９３】
アンチセンスオリゴヌクレオチド：本発明は、mRNA又はゲノムDNAを標的とすることによって酵素活性を阻害することができる、酵素メッセージと結合する能力を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する方法は学術文献および特許文献に詳しく記載されており、当業者は本発明の新規な試薬を用いてそのような酵素オリゴヌクレオチドを設計することができる。例えば、有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングするためのジーンウォーキング／RNAマッピングプロトコルは当業界で周知である。例えば以下を参照されたい：Ho (2000) Methods Enzymol. 314:168-183。この文献はRNAマッピングアッセイを記載し、前記アッセイは標準的な分子技術を基にし、強力なアンチセンス配列選別のための簡単で信頼できる方法を提供する。さらにまた以下を参照されたい：Smith (2000) Eur. J. Phar. Sci. 11:191-198。
ある特徴では、組換えによって生成した核酸又は単離した天然に存在する核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いられる。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは任意の長さであってもよく、例えばまた別の特徴では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは約5から100、約10から80、約15から60、約18から40である。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖又は二本鎖RNAでもDNAでもよい。最適な長さは日常的なスクリーニングによって決定することができる。この潜在的課題に向け得る極めて多様な合成された天然に存在しないヌクレオチド及び核酸類似体が知られている。例えば、非イオン性骨格（例えばN-(2-アミノエチル)グリシンユニット）を含むペプチド核酸（PNA）を用いることができる。ホスホロチオエート結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた用いることができる（それらは以下に記載されている：WO97/03211；WO96/39154；Mata (1997) Toxicol. App. Pharmacol. 144:189-197；Antisense Therapeutics, ed. Agrawal (Humana Press, Totowa, N.J., 1996)）。本発明によって提供される合成DNA骨格類似体をもつアンチセンスオリゴヌクレオチドにはまた、上記で述べたようにホスホロ-ジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、3'-えぬカルバメート及びモルホリノカルバメート核酸が含まれる。
コンビナトリアルな化学的方法を用いて膨大な数のオリゴヌクレオチドを生成することができる。前記オリゴヌクレオチドは、任意の標的（例えば本発明のセンスおよびアンチセンス酵素配列）に対し適切な結合親和性および特異性を有する特定のオリゴヌクレオチドについて迅速にスクリーニングすることができる（例えば以下を参照されたい：Gold (1995) J. Biol. Chem. 270:13581-13584）。
【００９４】
阻害性リボザイム：本発明は、mRNAを標的にすることにより酵素活性を阻害することができる、酵素メッセージと結合することができるリボザイムを提供する。リボザイムを設計し、ターゲッティングのために酵素特異的アンチセンス配列を選別する方法は学術文献および特許文献に詳しく記載されており、当業者は本発明の新規な試薬を用いてそのようなリボザイムを設計することができる。リボザイムは、標的RNAを切断するRNAの酵素部分に極めて近傍に保持されているリボザイムの標的RNA結合部分を介して標的RNAと結合することによって機能する。したがって、リボザイムは、相補性塩基対形成により標的RNAを認識し、これと結合する。正確な部位にいったん結合したら、リボザイムは酵素として機能し標的RNAを切断し、これを不活化する。切断がコード配列内で発生すれば、そのような態様での標的RNAの切断は、コードされるタンパク質の合成を指令するその能力を破壊するであろう。リボザイムがそのRNA標的と結合し、これを切断した後、リボザイムは典型的には前記RNAから遊離し、したがって新たな標的と繰り返し結合し、さらにこれを切断することができる。
いくつかの環境下では、リボザイムの酵素的性質は他の技術、例えばアンチセンス技術に比べて有利であり得る（アンチセンス技術では、核酸分子は核酸標的に単に結合してその転写、翻訳又は別の分子との結合を妨げるだけである）。なぜならば、治療達成に必要なリボザイムの有効濃度はアンチセンスオリゴヌクレオチドのそれよりも低いからである。この潜在的な利点はリボザイムの酵素として機能する能力の結果である。したがって、ただ1つのリボザイム分子が多くの標的RNA分子を切断することができる。さらにまた、リボザイムは典型的には特異性が高い阻害因子であり、阻害の特異性は塩基対形成による結合メカニズムだけでなく、リボザイムが結合するRNAの発現を前記リボザイム分子が阻害するメカニズムにも依存している。すなわち、阻害はRNA標的の切断によって生じ、したがって特異性は非標的RNAの切断速度に対する標的RNAの切断速度の比と定義される。この切断メカニズムは塩基対形成に関与する要因に加えて更に種々の要因に依存する。したがって、リボザイム作用の特異性は、同じRNA部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド結合の特異性よりも高いであろう。
酵素リボザイムRNA分子はハンマーヘッドモチーフとして形成され得るが、前記はまたヘアピンモチーフ、肝炎デルタウイルスモチーフ、グループIイントロンモチーフ又はRNaseP様RNAモチーフ（RNAガイド配列と結合している）として形成することができる。そのようなハンマーヘッドモチーフの例はRossi（Aids Research and Human Retroviruses 8:183 (1992)）によって、ヘアピンモチーフの例はHampel（Biochmistry 28:4929 (1989)およびNuc. Acids Res. 18:299 (1992)）によって、肝炎デルタウイルスモチーフの例はPerrotta（Biochemistry 31:16 (1992)）によって、RNasePモチーフの例はGuerrier-Takada（Cell 35:849 (1983)）によって、さらにグループIイントロンの例はCech（US Pat. No. 4,987,071）によって記載されている。前記の特定のモチーフの記載はそれらに限定することを意図したものではなく、当業者は、本発明の酵素RNA分子は、標的遺伝子のRNA領域の1つ以上と相補的な固有の基質結合部位を有し、基質結合部位内またはその周辺にこの分子にRNA切断活性を付与するヌクレオチド配列を有することを理解していよう。
【００９５】
RNA干渉（RNAi）：ある特徴では本発明は、本発明の酵素配列を含むRNA阻害分子、いわゆる“RNAi”分子を提供する。RNAi（又はRNA干渉分子）には、転写を阻害する小型の干渉RNA（又はsiRNA）及び翻訳を阻害するミクロRNA（又はmiRNA）が含まれる。
RNAi分子は二本鎖RNA（dsRNA）分子を含む。RNAiは酵素遺伝子の発現を阻害することができる。ある特徴では、RNAiは、長さが約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又はそれより大きい二重鎖ヌクレオチドである。本発明はいずれの特定の作用メカニズムにも限定されないが、RNAiは細胞内に入り、類似または同一の配列を有する一本鎖RNA（ssRNA）（内因性mRNAを含む）の分解を引き起こす。細胞が二本鎖RNA（dsRNA）に暴露されるとき、相同な遺伝子に由来するmRNAは、RNA干渉（RNAi）と称される過程によって選択的に分解される。RNAiの背後にある可能な基本的メカニズムは、特定の遺伝子配列と一致する二本鎖RNA（dsRNA）の短い破片（短小干渉性RNAと称される）への分解である。前記短小干渉性RNAは、その配列と一致するmRNAの分解の引き金となる。ある特徴では、本発明の前記RNAiは遺伝子サイレンシング療法で用いられる（例えば以下を参照されたい：Shuey (2002) Drug Discov. Today 7:1040-1046）。ある特徴では、本発明は、本発明のRNAiを用いて選択的にRNAを分解する方法を提供する。前記方法はin vitro、ex vivo又はin vivoで実施することができる。ある特徴では、本発明のRNAi分子を用いて細胞、器官又は動物の機能低下変異を作出することができる。選択的にRNAを分解するためにRNAi分子を作成及び使用する方法は当業界では周知である。例えば以下を参照されたい：米国特許第6,506,559号、第6,511,824号、第6,515,109号および第6,489,127号。
【００９６】
核酸の改変
本発明は、本発明の核酸及びポリペプチド（例えば本発明の酵素、ペプチド又は抗体をコードする核酸）の変種を作成する方法を提供する。これらの方法を反復して実施するか、又は多様な組合せで用いて、鋳型核酸によってコードされる酵素又は抗体とは変異した若しくは異なる活性又は変異した若しくは異なる安定性を持つ酵素又は抗体を生成することができる。またこれらの方法を反復して実施するか、又は多様な組合せで用いて、例えば遺伝子/メッセージ発現、メッセージ翻訳又はメッセージ安定性における変種を生成することができる。別の特徴では、細胞の遺伝的構成は、例えば相同遺伝子のex vivo改変とそれに続く前記遺伝子の細胞への再挿入によって改変される。
“変種”という用語は、1つ以上の塩基対、コドン、イントロン、エキソンまたはアミノ酸残基で改変され、しかもなお（それぞれが）本発明の酵素の生物学的活性を維持する本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドを含むことができる。変種は、例えばエラー誘発PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、GSSM及びそれらの任意の組合せを含む手段のいずれかによって作成することができる。例えば野生型酵素とは異なるpH又は温度での活性を有する変種酵素を作成する技術が本明細書に含まれている。
“飽和変異導入”（又は“遺伝子部位飽和変異導入”（“GSSM”と略す）と称される）という用語は、下記に詳細に述べるように、縮退オリゴヌクレオチドプライマーを用いて点変異をポリヌクレオチドに導入する方法を含む。“最適化定方向進化システム”又は“最適化定方向進化”という用語は、関連する核酸配列（例えば関連遺伝子）のフラグメントを再アッセンブリングする方法を含み、下記で詳細に説明される。“合成連結再アッセンブリ”又は“SLR”という用語、非確率論的様式でオリゴヌクレオチドフラグメントを連結する方法を含み、下記で詳細に説明される。
【００９７】
本発明の核酸は任意の手段、例えばランダム若しくは確率論的な方法、又は非確率論的な若しくは“定方向進化”的な方法によって改変できる（例えば米国特許6,361,974号を参照されたい）。遺伝子のランダム変異導入の方法は当業界で周知である（例えば以下を参照されたい：US特許5,830,696号）。例えば変異原を用いて遺伝子をランダムに変異させることができる。変異原には、例えば紫外線若しくはガンマ線照射、又は化学的変異原、例えばマイトマイシン、亜硝酸、光活性化ソラレンが含まれ、単独又は併用して組換えにより修復されやすいDNA断裂が導入される。他の化学的変異原には、例えば、重亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはギ酸が含まれる。その他の変異原は、ヌクレオチド前駆体の類似物質、例えばニトロソグアニジン、5-ブロモウラシル、2-アミノプリンまたはアクリジンである。これらの薬剤はPCR反応にヌクレオチド前駆体の代わりに添加され、それによって前記配列を変異させることができる。インターカレーション薬剤（例えばプロフラビン、アクリフラビン、キナクリンなど）もまた用いることができる。
分子生物学の任意の技術、例えばランダムPCR変異導入（例えば以下を参照されたい：Rice (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5467-5471）、又はコンビナトリアルマルチカセット変異導入（combinatorial multiple cassette mutagenesis）（例えば以下を参照されたい：Crameri (1995) Biotechniques 18:194-196）を用いることができる。あるいは、核酸（例えば遺伝子）をランダムにまたは“確率論的に”断片化した後で再アッセンブリングすることもできる（例えば以下を参照されたい：米国特許第6,291,242号；同6,287,862号；同6,287,861号；同5,955,358号；同5,830,721号；同5,824,514号；同5,811,238号；同5,605,793号）。また別の特徴では、改変、付加又は欠失は、エラー誘発PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）、合成連結再アッセンブリ（SLR）、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート-修飾DNAによる変異導入、ウラシル含有鋳型による変異導入、ギャップ含有二重鎖による変異導入、点ミスマッチ修復による変異導入、修復欠損宿主株による変異導入、化学的変異導入、放射能発生による変異導入、欠失による変異導入、制限-選別変異導入、制限-精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸マルチマーの生成及び/又はこれらの組合せ並びに他の方法によって導入される。
【００９８】
以下の文献は、本発明の方法に取り入れることができる多様な反復組換え手順及び/又は方法を記載している：Stemmer (1999) “Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties”, Tiumor Tageting 4:1-4; Ness (1999) NatureBiotechnology 17:893-896; Chang (1999) “Evolution of a cytokine using DNA family shuffling”, Nature Biotechnology 17:793-797; Minshull (1999) “Protein evolution by molecular breeding”, Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290; Christians (1999) “Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling”, Nature Biotechnology 17:259-264; Crameri (1998) “DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution”, Nature 391:288-291; Crameri (1997) “Molecular evolution of an arsenate dtoxification pathway by DNA shuffling”, Nature Biotechnology 15:436-438; Zhang (1997) “Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screenig”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Patten et al. (1997) “Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines”, Current Opinion in Biotechnology 8:724-733; Crameri et al. (1996) “Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling”, Nature Medicine 2:100-103; Crameri et al. (1996) “Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling”, Nature Biotechnology 14:315-319; Gates et al. (1996) “Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor ‘headpiece dimer’” Journal of Molecular Biology 255:373-386; Stemmer (1996) “Sexual PCR and Assembly PCR” In: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York. pp.447-457; Crameri and Stemmer (1995) “Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes” BioTechniques 18:194-195; Stemmer et al. (1995) “Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides” Gene, 164:49-53; Stemmer (1995) “The Evolution of Molecular Computation” Science 270: 1510; Stemmer (1995) “Searching Sequence Space” Bio/Technology 13:549-553; Stemmer (1994) “Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling” Nature 370:389-391; およびStemmer (1994) “DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751。
【００９９】
多様性を作出する変異導入方法には例えば以下が含まれる：部位特異的変異導入(Ling et al. (1997) “Approaches to DNA mutagenesis: an overview” Anal Biochem. 254(2): 157-178; Dale et al. (1996) “Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method” Methods Mol. Biol. 57:369-374; Smith (1985) “In vitro mutagenesis” Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein & Shortle (1985) “Strategies and applications of in vitro mutagenesis” Science 229:1193-1201; Carter (1986) “Site-directed mutagenesis” Biochem. J. 237:1-7; および Kunkel (1987) “The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis” in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin))；ウラシル含有鋳型を用いる変異導入 (Kunkel (1985) “Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) “Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection” Methods in Enzymol. 154, 367-382;およびBass et al. (1988) “Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities” Science 242:240-245)；オリゴヌクレオチド誘導変異導入（Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller & Smith (1982) “Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment” Nucleic Acids Res. 10:6487-6500; Zoller & Smith (1983) “Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors” Methods in Enzymol. 100:468-500; および Zoller & Smith (1987) “Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template” Methods in Enzymol. 154:329-350)；ホスホロチオエート改変DNA変異導入(Taylor et al. (1985) “The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA” Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764; Taylor et al. (1985) “The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA” Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye (1986) “Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis” Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698; Sayers et al. (1988) “Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis” Nucl. Acids Res. 16:791-802;およびSayers et al. (1988) “Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide” Nucl. Acids Res. 16: 803-814)；ギャップをもつ二重鎖DNAを用いる変異導入(Kramer et al. (1984) “The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction” Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer & Fritz (1987) Methods in Enzymol. “Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA” 154:350-367; Kramer et al. (1988) “Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations” Nucl. Acids Res. 16: 7207; およびFritz et al. (1988) “Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro” Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999)。
【０１００】
本発明方法で用いることができるさらに別のプロトコルには以下が含まれる：点ミスマッチ修復(Kramer (1984) “Point Mismatch Repair” Cell 38:879-887)、修復欠損宿主株を用いる変異導入(Carter et al. (1985) “Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors” Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443; and Carter (1987) “Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors” Methods in Enzymol. 154: 382-403)、欠失変異導入(Eghtedarzadeh (1986) “Use of oligonucleotides to generate large deletions” Nucl. Acids Res. 14: 5115), restriction-selection and restriction-selection and restriction-purification (Wells et al. (1986) “Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin” Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423)、全遺伝子合成による変異導入(Nambiar et al. (1984) “Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein” Science 223: 1299-1301; Sakamar and Khorana (1988) “Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin)” Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells et al. (1985) “Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites” Gene 34:315-323;およびGrundstrom et al. (1985) “Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale shot-gun' gene synthesis” Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316)、二本鎖開裂修復(Mandecki (1986); Arnold (1993) “Protein engineering for unusual environments” Current Opinion in Biotechnology 4:450-455. “Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181)。上記の方法の多くに関する更なる詳細は”Enzymology”（Volume 154）で見出すことができる。この文献にはまた種々の変異導入方法に関する問題を解決するための有用な管理手段に関する記述がある。
【０１０１】
本発明の方法で用いることができるさらに別のプロトコルは以下に記載されている：U.S. Pat. No. 5,605,793（Stemmer, Feb. 25, 1997, “Methods for In Vitro Recombination）；U.S. Pat. No. 5,811,238 (Stemmer et al.,Sep. 22, 1998, “Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination”)；U.S. Pat. No. 5,830,721（Stemmer et al., Nov. 3, 1998, “DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”）；U.S. Pat. No. 5,834,252（Stemmer, et al., Nov. 10, 1998, “End-Complementary Polymerase Reaction”）；U.S. Pat. No. 5,837,458（Minshull, et al., Nov. 17, 1998, “Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering”）；WO 95/22625（Stemmer and Crameri, “Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”）；WO 96/33207（Stemmer and Lipschutz, “End Complementary Polymerase Chain Reaction”）；WO 97/20078（Stemmer and Crameri, “Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination”）；WO 97/35966（Minshull and Stemmer, “Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering”）；WO 99/41402（Punnonen et al. “Targeting of Genetic Vaccine Vectors”）；WO 99/41383（Punnonen et al. “Antigen Library Immunization”）；WO 99/41369（Punnonen et al. “Genetic Vaccine Vector Engineering”）； WO 99/41368（Punnonen et al. “Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines”）；EP 752008（Stemmer and Crameri, “DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”）；EP 0932670（Stemmer “Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination”）；WO 99/23107（Stemmer et al., “Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling”）；WO 99/21979（Apt et al., “Human Papillomavirus Vectors”）；WO 98/31837（del Cardayre et al. “Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination”）；WO 98/27230（Patten and Stemmer, “Methods and Compositions for Polypeptide Engineering”）；WO 98/27230（Stemmer et al., “Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection”）；WO 00/00632, “Methods for Generating Highly Diverse Libraries”；WO 00/09679, “Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences”；WO 98/42832（Arnold et al., “Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers”）；WO 99/29902（Arnold et al., “Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences”）；WO 98/41653（Vind, “An in Vitro Method for Construction of a DNA Library”）；WO 98/41622（Borchert et al., “Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling"）；及びWO 98/42727（Pati and Zarling, “Sequence Alterations using Homologous Recombination”）
【０１０２】
本発明の実施に用いることができるプロトコル（種々の多様性を作出する方法に関する詳細を提供する）は例えば以下に記載されている：米国特許出願（USSN）09/407,800, “SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES”（Patten et al.,1999年9月28日出願）；”EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION”（del Cardayre et al., 米国特許6,379,964号）；”OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION”（Crameri et al., 米国特許6,319,714号; 6,368,861号; 6,376,246号; 6,423,542号; 6,426,224号及びPCT/US00/01203）；“USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING”（Welch et al., 米国特許6,436,675号）；”METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS”（Selifonov et al., 2000年1月18日出願、PCT/US00/01202） 及び、例えば “METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS”（Selifonov et al., 2000年7月18日出願、U.S. Ser. No. 09/618,579）；”METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS”（Selifonov and Stemmer, 2000年1月18日出願PCT/US00/01138）；及び “SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION”（Affholter, 2000年9月6日出願、U.S. Ser. No. 09/656,549)；および米国特許6,177,263号；同6,153,410号。 
非確率論的又は“定方向進化”方法には、例えば“飽和変異導入”、遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）、合成連結再アッセンブリ（SLR）又は前記の組合せが含まれ、前記を用いて本発明の核酸を改変し、新規な又は変異した特性（例えば強酸又は強アルカリ条件下、高温又は低温条件下などでの活性）を有する酵素が作出される。改変された核酸によってコードされるポリペプチドは、タンパク質分解活性又は他の活性について試験する前に活性についてスクリーニングすることができる。任意の試験様式またはプロトコルを、例えばキャピラリーアレイ台を利用して用いることができる。例えば米国特許第6,361,974号、同6,280,926号、同5,939,250号を参照されたい。
【０１０３】
飽和変異導入（又はGSSM）：本発明のある特徴では、非確率論的遺伝子改変である“定方向進化プロセス”を用いて、新規な又は変異した特性を有する酵素が作出される。この方法の変型は、“遺伝子部位飽和変異導入”（”Gene Site Saturation MutagenesisTM”）、“部位飽和変異導入”、“飽和変異導入”又は単に“GSSMTM”と称されている。前記は、他の変異導入プロセスと併用して用いることができる。例えば米国特許6,171,820号、同238,884号を参照されたい。したがって、本発明は、本明細書並びに米国特許6,171,820号及び同238,884号に記載されているように、遺伝子部位飽和変異導入（又はGSSM）を用いて酵素を生成する方法を提供する。
ある特徴では、GSSMは鋳型ポリヌクレオチド及び複数のオリゴヌクレオチドを提供することを含む。この場合、各オリゴヌクレオチドは鋳型ポリヌクレオチドに対して相同な配列（それによって前記鋳型ポリヌクレオチドの特定の配列を標的とする）及び相同な遺伝子の変種である配列を含み、前記鋳型ポリヌクレオチドを前記オリゴヌクレオチドとともに複製することによって非確率的配列変種を含む子孫ポリヌクレオチドを生じ、それによって相同な遺伝子配列変種を含むポリヌクレオチドを作出する。
ある特徴では、縮退N,N,G/T配列を含むコドンプライマーを用いてポリヌクレオチドに点変異を導入し、各アミノ酸で（例えば改変の標的となる酵素活性部位又はリガンド結合部位のアミノ酸残基で）単一のアミノ酸置換の全範囲が出現する一組の子孫ポリペプチドを生成する。これらのオリゴヌクレオチドは、連続する第一の相同配列、縮退N,N,G/T配列及び場合によって第二の相同な配列を含むことができる。そのようなオリゴヌクレオチドを使用することによって得られる下流の子孫翻訳生成物は、N,N,G/T配列の縮退は20の全てのアミノ酸のためのコドンを含むので前記ポリペプチドに沿って各アミノ酸の位置で可能な全てのアミノ酸変化を含む。ある特徴では、１つのそのような縮退オリゴヌクレオチド（例えば１つに縮退N,N,G/Tカセットを含む）が、親のポリヌクレオチド鋳型中の本来のコドンの各々を全範囲のコドン置換に付すために用いられる。また別の特徴では、親のポリヌクレオチド鋳型中の少なくとも2つの本来のコドンを全範囲のコドン置換に付すために少なくとも2つの縮退カセットが（同じヌクレオチドまたは別個のヌクレオチドで）用いられる。例えば2つ以上のN,N,G/T配列を1つのオリゴヌクレオチド内に取り込み、2つ以上の部位でアミノ酸置換を導入することができる。この複数のN,N,G/T配列は連続していてもよいし、または1つ以上のさらに別のヌクレオチド配列によって分離されてあってもよい。別の特徴では、付加および欠失の導入に役立つオリゴヌクレオチドを単独またはN,N,G/T配列を含むコドンとともに用いて、アミノ酸付加、欠失及び/又は置換の任意の組合せまたは並べ換えが導入される。
【０１０４】
ある特徴では、2つ以上の連続するアミノ酸位の同時変異が、連続するN,N,G/Tトリプレット（すなわち縮退(N,N,G/T)ｎ配列）を含むオリゴヌクレオチドを用いて実施される。別の特徴では、N,N,G/T配列よりも縮退度の小さい縮退カセットが用いられる。例えば、いくつかの事例では、ただ1つのＮ（Ｎは前記トリプレットの第一、第二または第三番目の位置に存在できる）を含む縮退トリプレット配列を（オリゴヌクレオチドで）用いることができる。任意の組合せ及びその並べ換えを含む他のいずれの塩基もトリプレットの残りの2つの位置で用いることができる。あるいはいくつかの事例で縮退N,Ｎ,Ｎ,トリプレット配列を（例えばオリゴヌクレオチドで）用いることができる。
ある特徴では、縮退トリプレット（例えばN,N,G/Tトリプレット）の使用によって、ポリペプチドのそれぞれ全てのアミノ酸の位置について可能な天然アミノ酸の全範囲の（合計20アミノ酸）系統的で容易な生成が可能になる（別の特徴では、前記方法はまた、各アミノ酸残基、コドン、位置について可能な全置換よりも少ない置換の生成も含む）。例えば、100アミノ酸のポリペプチドの場合、2000個の別個の種（すなわち各位置につき20個の可能なアミノ酸ｘ100ヶ所のアミノ酸）が生成され得る。縮退N,N,G/Tトリプレットを含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドセットを使用することによって、32個の個々の配列が20個の可能な天然のアミノ酸を全てコードすることができる。したがって、親のポリヌクレオチド配列が少なくとも1つの前記のようなオリゴヌクレオチドを用いて飽和変異導入に付される反応容器では、20個の別個のポリペプチドをコードする32個のそれぞれ別個の子孫ポリヌクレオチドが生成される。対照的に、部位特異的変異導入では非縮退オリゴヌクレオチドを使用したとき、各反応容器につきただ1つの子孫ポリペプチド生成物が生じるだけである。場合によって非縮退オリゴヌクレオチドを開示の縮退プライマーと組み合わせて用いてもよい。例えば、非縮退オリゴヌクレオチドを用いて対象のポリヌクレオチドで特定の点変異を生成することができる。これは、特定のサイレント点変異、対応するアミノ酸変化をもたらす点変異、並びに停止コドンの生成及び対応するポリペプチドフラグメントの発現を生じさせる点変異を生成する1つの手段を提供する。
【０１０５】
ある特徴では、各飽和変異導入反応容器は、親のポリヌクレオチドで変異を導入されるコドンの位置に一致するある具体的なアミノ酸の箇所に20個全ての天然アミノ酸が提示されるように、少なくとも20の子孫ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドを含む（他の特徴では20個未満の天然の組合せが用いられる）。各飽和変異導入反応容器から生成される32倍の縮退子孫ポリペプチドをクローン増幅に付し（例えば適切な宿主（例えば大腸菌宿主）に例えば発現ベクターを用いてクローニングする）、さらに発現スクリーニングに付すことができる。スクリーニングにより好ましい特性の変化を提示させることによって個々の子孫ポリペプチドが同定されたとき（親のポリペプチドと比較したとき例えばアルカリ性又は酸性条件下でタンパク質分解活性が増加）、前記子孫ポリペプチドを配列決定し、その中に含まれる対応する好ましいアミノ酸置換を同定することができる。
ある特徴では、本明細書に開示したように、親のポリペプチドのそれぞれ全てのアミノ酸位置に飽和変異導入を用いて変異を導入するとき、好ましいアミノ酸変化が2つ以上のアミノ酸位置で同定できることがある。これら好ましいアミノ酸置換の全てまたは一部分の組合せを含む1つ以上の新規な子孫分子を生成することができる。例えば、2つの具体的な好ましいアミノ酸変化がポリペプチドの3つのアミノ酸の箇所の各々で同定されるならば、この入れ替えは各位置かつ3つの位置で3つの可能性（最初のアミノ酸から変化のないもの及び2つの好ましい変化のそれぞれ）を含む。したがって、3ｘ3ｘ3、又は合計27の可能性が存在し、これらは以前に調べられた7つ−6つの単一点変異（すなわち3つの位置の各々で2つ）及びいずれの位置においても変化のないものを含む。
さらに別の特徴では、位置飽和変異導入は、配列を変化させるためのまた別の確率的又は非確率的手段、例えば合成連結再アッセンブリー（下記参照）、シャッフリング、キメラ化、組換え及び他の変異導入方法、並びに突然変異誘発剤と一緒に用いることができる。本発明は任意の突然変異導入方法の使用を提供する。前記方法は反復態様で用いられる飽和変異導入を含む。
【０１０６】
合成連結再アッセンブリ（SLR）：本発明は、“合成連結再アッセンブリ”、又は簡潔に“SLR”、“定方向進化プロセス”と称される、新規なまたは変異した特性を有する酵素及び抗体を生成する非確率論的遺伝子改変系を提供する。SLRは、オリゴヌクレオチドフラグメントを非確率論的に一緒に連結する方法である。この方法は、核酸構築ブロックがランダムにシャッフル、連結、又はキメラ化されるのではなく、非確率論的にアッセンブリングされるという点で確率的オリゴヌクレオチドシャッフリングとは異なる。例えば以下を参照されたい：米国特許6,773,900号、6,740,506号、6,713,282号、6,635,449号、6,605,449号、6,537,776号。
ある特徴では、SLRは以下の工程を含む：（a）鋳型ポリヌクレオチドを提供する工程（前記鋳型ポリヌクレオチドは相同な遺伝子をコードする配列を含む）；（b）複数の構築ブロックポリヌクレオチドを提供する工程（前記構築ブロックポリヌクレオチドは鋳型ポリヌクレオチドとあらかじめ定められた配列で交差再アッセンブリングを生じるように設計され、構築ブロックポリヌクレオチドは前記相同な遺伝子の変種である配列及び前記変種配列にフランキングする前記鋳型ポリヌクレオチドと相同な配列を含む）；（c）前記構築ブロックポリヌクレオチドが前記鋳型ポリヌクレオチドと交差再アッセンブリングして相同な遺伝子配列変種を含むポリヌクレオチドを生成できるように、構築ブロックポリヌクレオチドを鋳型ポリヌクレオチドと一緒にする工程。
SLRは、再編成されるポリヌクレオチド間に高レベルの相同性が存在することを必要としない。したがって、本方法を用いて、10100を超える種々のキメラを含む子孫分子のライブラリー（又はセット）を非確率論的に作成することができる。SLRを用いて101000を超える種々の子孫キメラを含むライブラリーを作成することができる。したがって、本発明の特徴は、設計によって選択される全体的アッセンブリ順序を作り上げ完成されたキメラ核酸分子セットを製造する非確率論的方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：互いに適合する連結可能な有用な末端を有する複数の特別な核酸構築ブロックを設計にしたがって作成する工程、及び、設計した全体的アッセンブリ順序が達成されるように前記核酸構築ブロックをアッセンブリングする工程。
【０１０７】
アッセンブリングされる互いに適合する核酸構築ブロックの末端は、これらが前記構築ブロックをあらかじめ定めた順序で結合させることができるならば、このタイプの指定されたアッセンブリに対して“有用”であると考えられる。したがって、前記核酸構築ブロックが結合される全体的アッセンブリ順序は、連結させることができる末端の設計によって特定される。2つ以上のアッセンブリ工程が用いられる場合、核酸構築ブロックが結合される全体的アッセンブリ順序は、前記アッセンブリ工程の一連の順序によって特定される。ある特徴では、アニーリングされた構築片が酵素（例えばリガーゼ（例えばT4DNAリガーゼ））で処理され、前記構築片の共有結合が達成される。
ある特徴では、オリゴヌクレオチド構築ブロックの設計は、祖先核酸配列鋳型セットを分析することによって得られる（祖先核酸配列は完成したキメラポリヌクレオチドの子孫セットを製造する基礎として機能する）。したがって、これら親のオリゴヌクレオチド鋳型は、変異（例えばシャッフリングまたはキメラ化）を導入しようとする核酸構築ブロックの設計に役立つ配列情報源として機能する。この方法のある特徴では、複数の親核酸鋳型の配列でアラインメントを実施して1つ以上の境界点が選択される。前記境界点は相同領域に位置し、1つ以上のヌクレオチドを含むことができる。これらの境界点は好ましくは少なくとも2つの祖先鋳型によって共有される。それによって前記境界点は、親ポリヌクレオチドの再編成のために作製されるオリゴヌクレオチド構築ブロックの境界線を引くために用いることができる。祖先分子中で同定され選別される境界点は、完成キメラ子孫分子のアッセンブリにおける潜在的キメラ形成点として機能する。境界点は、少なくとも2つの親ポリヌクレオチド配列によって共有される相同領域（少なくとも1つの相同なヌクレオチド塩基を含む）であり得る。あるいは、境界点は、親ポリヌクレオチド配列の少なくとも半分によって共有される相同領域であるか、または親ポリヌクレオチド配列の少なくとも2/3によって共有される相同領域であり得る。さらに好ましくは、有用な境界点は、親ポリヌクレオチド配列の少なくとも3/4によって共有される相同領域であるか、または境界点は親ポリヌクレオチド配列のほぼ全てによって共有され得る。ある特徴では、境界点は、親ポリヌクレオチド配列の全部によって共有される相同領域である。
【０１０８】
ある特徴では、連結再アッセンブリ工程は、子孫キメラポリヌクレオチドの網羅的ライブラリーを作成するために徹底的に実施される。換言すれば、全ての可能な順番で組み合わされた核酸構築ブロックが、完成キメラ核酸分子セットに提示される。同時に、別の特徴では、各組合せにおけるアッセンブリ順序（すなわち完成したキメラ核酸の各々の配列の5'から3'方向における各構築ブロックのアッセンブリの順番）は上記に記載したように設計にしたがう（または非確率論的である）。本発明の非確率論的な性質のために、望ましくない副生成物の可能性は極めて低くなる。
別の特徴では、前記連結再アッセンブリ方法は系統的に実施される。例えば、前記方法は、系統的に区画化された子孫分子のライブラリーを作製するために実施され、前記区画化ライブラリーは、系統的に（例えば1つずつ）スクリーニングすることができる区画を有する。換言すれば、本発明は、連続工程によるアッセンブリング反応の選択的および慎重な使用と併せて特定の核酸構築ブロックを選択的および慎重に使用することによって、特定の子孫生成物セットがいくつかの反応容器の各々で生成される仕組みの達成を提供する。前記によって系統的な調査およびスクリーニング方法の実施が可能になる。したがって、これらの方法は、潜在的に膨大な数の子孫分子をより小さなグループで系統的に調査することを可能にする。特に祖先分子間で低レベルの相同性しか存在しないときに、高度に柔軟性を有し、しかも網羅的で系統的な態様でのキメラ化の実施を可能にするその能力のために、これらの方法は膨大な数の子孫分子を含むライブラリー（またはセット）の生成を提供する。本発明の連結再アッセンブリの非確率論的性質のために、生成される子孫分子は好ましくは、設計にしたがって選択された全体的なアッセンブリ順序を有する完成されたキメラ核酸分子のライブラリーを含む。飽和変異導入及び最適化された定方向進化方法もまた種々の子孫分子種の生成に用いることができる。本発明は、境界点、核酸構築ブロックのサイズ及び数並びに結合の設計の選択に関して選択と制御の自由を提供することは理解されよう。さらにまた、分子間相同性の要求は、本発明を実施し易くするために大きく緩和されることもまた理解されよう。実際、境界点は殆ど又は全く分子間相同性がない領域でも選択できる。例えば、コドンの揺らぎのために（すなわちコドンの縮退のために）、対応する祖先鋳型で本来コードされるアミノ酸を変更することなく核酸中にヌクレオチド置換を導入することができる。あるいは、コドンを変更して本来のアミノ酸のコードを変更してもよい。本発明は、分子間相同性を有する境界点の出現傾向を高めるために、したがって構築ブロック間で達成される結合数を高めるために（生成される子孫キメラ分子数の増加を可能にする）、前記のような置換の核酸構築ブロックへの導入を提供する。
【０１０９】
また別の特徴では、構築ブロックが作成される工程の合成的な性質によって、in vitro過程（例えば変異導入により）またはin vivo過程（例えば宿主生物の遺伝子スプライシング能を利用することにより）で場合によって後で除去することが可能なヌクレオチド（例えば1つ以上のヌクレオチドで、例えばコドン又はイントロン又は調節配列であろう）を設計または導入することが可能になる。多くの事例で、有用な境界点を創出できるという潜在的な利点以外にも他の多くの理由からこれらヌクレオチドの導入はまた望ましいものであり得ることは理解されよう。
ある特徴では、核酸構築ブロックを用いてイントロンが導入される。したがって、機能的なイントロンが、本明細書に記載の方法にしたがって作成された人工遺伝子に導入される。前記人工的に導入されたイントロンは、天然に存在するイントロンが遺伝子スプライシングで機能的に作用する態様で遺伝子スプライシングのために大いに宿主細胞で機能し得る。
【０１１０】
最適化定方向進化系：本発明は、新規なまたは変異した特性をもつ酵素又は抗体を作り出すために、“最適化定方向進化システム”と称される非確率論的遺伝子改変系を提供する。最適化定方向進化は、組換えを介して核酸の分子的誘導進化を可能にする、還元的再組合せ、組換え及び選別の反復サイクルの使用を誘導する。最適化定方向進化は、進化させたキメラ配列の大集団の作出を可能にする。この場合、前記作出集団には予め定められた数の交差事象を含む配列がきわめて豊富に存在する。
交差事象は、一方の親の変種から別の親の変種へ配列のシフトが生じるキメラ配列内の点である。そのような点は通常は2つの親に由来するオリゴヌクレオチドが一緒に連結されて単一の配列を形成する結合部に存在する。本方法は、最終的なキメラ配列集団が選択した数の交差事象を豊富に含むことができるようにオリゴヌクレオチド配列の正確な濃度の計算を可能にする。これによって、予め定められた数の交差事象を含むキメラ変種の選択に対してより大きな制御が提供される。
さらにまた、本方法は、他の系と比較して膨大な量の可能なタンパク質変種スペースの探索のための簡便な手段を提供する。以前には、反応中に例えば1013個のキメラ分子が生成された場合、そのような膨大な数の変種の特定の活性についてテストすることは極めて困難であろう。さらにまた、子孫集団の顕著な部分が、特定の活性のレベルが増加している可能性が少ないタンパク質を生じる非常に大きな数の交差事象を含むであろう。本方法を用いることによって、キメラ分子集団は特定の数の交差事象を含む変種を豊富に含むことができる。したがって、反応中になお1013個のキメラ分子が生成されても、更なる分析のために選別される分子の各々は、例えば3つの交差事象だけを含む可能性が高くなる。生成された子孫集団が予め定めた数の交差事象を持つように偏らせることができるので、キメラ分子間の機能的変種に対する境界が減少する。これによって、最初の親のポリヌクレオチドに由来するどのオリゴヌクレオチドが特定の属性に影響を及ぼすために必要かを計算するときにより操作しやすい数の変数が提供される。
キメラ子孫ポリヌクレオチドを作成する1つの方法は、それぞれの親の配列のフラグメントまたは部分に対応するオリゴヌクレオチドを作成することである。各オリゴヌクレオチドは、ある特徴では、固有の重複領域を含み、その結果、前記オリゴヌクレオチドを一緒に混合することによって、各オリゴヌクレオチドフラグメントが正しい順番でアッセンブリングされた新規な変種が生成される。本発明のこれらの方法を実施するためのまた別のプロトコルは、米国特許6,773,900号、6,740,506号、6,713,282号、6,635,449号、6,605,449号、6,537,776号、6,361,974号で見出すことができよう。
【０１１１】
各親変種のために作出されるオリゴヌクレオチドの数は、最終的に作製されるキメラ分子で生じる交差の総数と関係がある。例えば、3つの親のヌクレオチド配列変種が提供され、連結反応を経て、例えば高温でより高い活性をもつキメラ変種を見つけることができるであろう。1つの例として、50個のオリゴヌクレオチド配列を含むセットを各親変種のそれぞれの部分に対応して作成することができる。したがって、連結アッセンブリ工程の間に、キメラ配列の各々の中に50個までの交差事象が存在することができよう。生成されたキメラポリヌクレオチドの各々が交互に各親変種由来のオリゴヌクレオチドを含む確率は非常に低い。各オリゴヌクレオチドフラグメントが連結反応で同じモル濃度で存在するならば、いくつかの位置で同じ親に由来するオリゴヌクレオチドが互いに並んで連結され、したがって交差事象を生じない可能性がある。各親に由来する各オリゴヌクレオチドの濃度がこの例のいずれの連結工程でも一定に保たれるならば、同じ親変種に由来するオリゴヌクレオチドがキメラ配列内で連結され、交差を生じないチャンスは1/3（3つの親と仮定した）である。
したがって、親変種セットの数、各変種に対応するオリゴヌクレオチドの数、及び連結反応の各工程における各変種の濃度が与えられたならば、確率濃度関数（probability density function (PDF)）を決定して連結反応の各工程で生じる可能性がある交差事象をもつ集団を予測することができる。PDFの決定の根拠となる統計学および数学は以下に記載される。これらの方法を用いることによって、前記の確率濃度関数を決定することができ、したがって個々の連結反応から生じる予め定めた数の交差事象のためにキメラ子孫集団の濃度を高めることができる。さらにまた、交差事象の標的数は予め定めることができ、続いて、予め定めた交差事象数に集中する確率濃度関数をもたらす連結反応の各工程における各親オリゴヌクレオチドの出発量を算出するために前記系をプログラミングすることができる。これらの方法は、組換えによりポリペプチドをコードする核酸の定方向分子進化を可能にする還元的再組合せ、組換え及び選別の反復サイクルの使用を誘導する。前記の系は進化したキメラ配列の大集団の作製を可能にし、前記作製された集団は、予め定めた数の交差事象を含む配列が顕著に濃縮されている。交差事象は、一方の親変種からもう一方の親変種へ配列のシフトが生じるキメラ配列中の点である。そのような点は通常は2つの親に由来するオリゴヌクレオチドが一緒に連結されて単一の配列を形成する結合部に存在する。前記方法は、最終的なキメラ配列集団が選択した数の交差事象に富むことができるようにオリゴヌクレオチド配列の正確な濃度の計算を可能にする。これによって、予め定めた数の交差事象を含むキメラ変種の選択に対してより大きな制御が提供される。
【０１１２】
交差事象の決定：本発明の特徴は、所望の交差事象の確立濃度関数（PDF）、再アッセンブリングされる親遺伝子の数および再アッセンブリでのフラグメント数を入力としての受け取るシステムおよびソフトを含む。このプログラムの出力は、再アッセンブリングされた遺伝子を作成するためのレシピの決定に用いることができる“フラグメントPDF”及びこれら遺伝子の交差PDFの見積もりである。本明細書に記載されるプロセッシングは好ましくは、MATLABTM（The Mathworks, Natick, Massachusetts）、プログラミング言語及びテクニカルコンピューティングのための開発環境で実施される。
【０１１３】
反復工程：本発明の実施に際して、これらの工程は何度も繰り返すことができる。例えば、変異した酵素又は抗体表現型をもたらすある核酸（または所定の核酸）が同定、再単離、再改変され、さらに活性について再試験される。この工程は、所望の表現型が生じるまで何度も繰り返すことができる。例えば、完全な生化学的同化作用または異化作用経路（タンパク質分解活性を含む）を細胞内に高度な操作により生成することができる。
同様に、特定のオリゴヌクレオチドが所望の属性（例えば新規な酵素表現型）について全く影響を与えないと決定されたならば、除去される配列を含むより大きな親オリゴヌクレオチドを合成することによって前記オリゴヌクレオチドは変化し得るものとして除去することができる。配列をより大きな配列内に取り込むことによって一切の交差事象が防止されるので、子孫ポリヌクレオチド中にはこの配列の変型はもはや全く存在しないであろう。どのオリゴヌクレオチドが所望の属性と最も関係があり、どのオリゴヌクレオチドが無関係であるかを決定するこの反復実施は、特定の属性または活性を提供する可能性があるタンパク質の全てについてより効率的な探索を可能にする。
【０１１４】
in vivoシャッフリング：分子のin vivoシャッフリングは、本発明のポリペプチド（例えば抗体、酵素など）の変種を提供する本発明の方法で使用される。in vivoシャッフリングは、マルチマーを再結合させる細胞の天然の特性を利用して実施することができる。in vivo組換えは分子の多様性をもたらす主要な天然の経路を提供してきたが、一方遺伝子組み換えは以下を含む比較的複雑な過程のままである：1）相同性の認識；2）鎖の切断、鎖の侵襲、および組換えキアズマの生成をもたらす代謝工程；及び最後に3）別個の再結合分子へのキアズマの解離。キアズマの形成は相同配列の認識を必要とする。
ある特徴では、本発明は、少なくとも第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドからハイブリッドポリヌクレオチドを製造する方法を提供する。本発明を用い、少なくとも1つの部分的な配列相同性領域を共有する少なくとも第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドを適切な宿主細胞に導入することによってハイブリッドヌクレオチドを生成することができる。前記の部分的な配列相同性領域は、ハイブリッドポリヌクレオチドを生じる配列認識をもたらす過程を促進する。本明細書で用いられる“ハイブリッドポリヌクレオチド”という用語は、本発明の方法により得られる、少なくとも2つの原型ポリヌクレオチド配列由来の配列を含む任意のヌクレオチド配列である。そのようなハイブリッドポリヌクレオチドは、DNA分子間の配列統合を促進する分子間組換え事象により生じ得る。さらにまた、そのようなハイブリッドポリヌクレオチドは、DNA分子内のヌクレオチド配列を変異させるために反復配列を利用する分子内還元的再組合せプロセスから生成され得る。
【０１１５】
配列変種の作成：本発明はまた、本発明の核酸並びに酵素及び抗体配列の変種を作成する方法、並びに本発明の核酸及びポリペプチドを用いて酵素を単離する方法を提供する。ある特徴では、本発明は本発明のタンパク質コード配列の変種を提供する。前記は、任意の手段（例えばランダム若しくは確率的方法、又は非確率的若しくは上記に記載した“定方向進化”方法を含む）によって変異させることができる。
前記単離変種は天然に存在するものでもよい。変種はまたin vitroで生成することもできる。変種は遺伝子工学技術、例えば部位特異的変異導入、化学的ランダム変異導入、エキソヌクレアーゼIII欠失方法及び標準的クローニング技術を用いて生成することができる。あるいは、そのような変種、フラグメント、類似体又は誘導体は化学的合成又は改変方法を用いて生成することができる。変種を作製する他の方法もまた当業者にはよく知られていよう。前記には、天然の単離物から得られた核酸配列を改変して、それらの工業的又は実験室での利用価値を高める特徴をもつポリペプチドをコードする核酸を生成する方法が含まれる。そのような方法では、天然の単離物から得られた配列に対して1つ以上のヌクレオチドの相違を有する多数の変種配列が生成され、特徴が決定される。これらのヌクレオチドの相違は、天然の単離物の核酸によってコードされるポリペプチドに対してアミノ酸変化をもたらすことができる。
【０１１６】
例えば、変種はエラー誘発PCRを用いて作成することができる。エラー誘発PCRでは、PCRは、DNAポリメラーゼの複写信頼性が低く、高率の点変異がPCR全長にわたって得られるような条件下で実施される。エラー誘発PCRは例えば以下に記載されている：D.W. Leung et al., Technique, 1:11-15 (1989); R.C. Caldwell & G.F. Joyce, PCR Methods Applic. 2:28-33 (1992)。簡単に記せば、前記の方法では、変異を導入される核酸は、PCRプライマー、反応緩衝液、MgCl2、MnCl2、Taqポリメラーゼ及び適切な濃度のdNTPと混合され、PCR生成物の全長にわたって高率の点変異が達成される。例えば、前記反応は、20fmoleの突然変異を導入されるべき核酸、30pmoleの各PCRプライマー、反応緩衝液（50mMのKCL、10mMのトリス（pH8.3）及び0.01％のゼラチンを含む）、7mMのMgCl2、0.5mMのMnCl2、5単位のTaqポリメラーゼ、0.2mMのdGTP、0.2mMのdATP、1mMのdCTPおよび1mMのdTTPを用いて実施される。PCRでは、94℃1分、45℃1分及び72℃1分の30サイクルが実施される。しかしながら、これらのパラメーターは適宜変動させることができることは理解されよう。変異導入核酸は適切なベクターでクローニングされ、前記変異導入核酸によってコードされたポリペプチドの活性が評価される。
変種はまた、任意のクローニングされた関心のあるDNAで位置特異的変異を生じるオリゴヌクレオチド誘導変異導入を用いて生成することができる。オリゴヌクレオチド変異導入は例えば以下に記載されている：Reidhaar-Olson (1988) Science 241:53-57。簡単に記せば、そのような方法では、クローン化DNAに導入されるべき1つ以上の変異をもつ複数の二本鎖オリゴヌクレオチドが合成され、変異を導入される前記クローン化DNAに挿入される。変異導入DNAを含むクローンを回収し、それらがコードするポリペプチドの活性を評価する。
【０１１７】
変種を生成するまた別の方法はアッセンブリPCRである。アッセンブリPCRでは、小さなDNAフラグメント混合物からPCR生成物をアッセンブリングすることが必要である。多数の様々なPCR反応が同じバイアル中で平行して生じ、1つの反応の生成物が別の反応の生成物をプライミングする。アッセンブリPCRは例えば米国特許第5,965,408号に記載されている。
変種を生成するまた別の方法はセクシュアルPCR変異導入である。セクシュアルPCR変異導入では、配列相同性によるDNA分子のランダムなフラグメント化とそれに続くPCR反応におけるプライマーの伸長による交差の固定の結果として、強制された相同組換えが、相違しているが高度の相関性を有するDNA配列をもつDNA分子間でin vitroで生じる。セクシュアルPCR変異導入は例えば以下に記載されている：Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751。簡単に記せば、前記の方法では、組換えられるべき複数の核酸をDNaseで消化して平均サイズが50−200ヌクレオチドのフラグメントが生成される。所望の平均サイズをもつフラグメントを精製し、PCR混合物に再懸濁する。PCRは、前記核酸フラグメント間の組換えが促進される条件下で実施される。PCRは、例えば以下によって実施できる:前記精製フラグメントを10−30ng/μLの濃度で溶液（0.2Mの各dNTP、2.2mMのMgCl2、50mMのKCl、10mMのトリス塩酸（pH9.0）及び0.1％トリトンX-100）に再懸濁する。100μLの反応混合物につき2.5単位のTaqポリメラーゼを添加し、PCRを以下の方式を用いて実施する：94℃60秒、94℃30秒、50−55℃30秒、72℃30秒（30-45回）及び72℃で5分。しかしながら前記パラメーターは適宜変動させることができることは理解されよう。いくつかの特徴では、オリゴヌクレオチドをPCR反応に含ませることができる。他の特徴では、DNAポリメラーゼIのクレノーフラグメントをPCR反応の最初のセットで用い、Taqポリメラーゼをその後のPCR反応セットで用いることができる。組換え配列を単離し、それらがコードするポリペプチドの活性を評価する。
【０１１８】
変種はまたin vivo変異導入によって生成することができる。いくつかの特徴では、細菌株（例えば大腸菌株）で関心のある配列を増殖させることによって、関心のある配列中でランダム変異が生成される。前記大腸菌株はDNA修復経路の1つ以上の変異を含む。そのような“ミューテーター”株は野生型の親よりも高いランダム変異率を有する。これらの株の1つでDNAを増殖させることによって、最終的にはDNA内部にランダム変異が生成されるであろう。in vivo変異導入に使用するために適したミューテーター株は例えばPCT公開広報WO91/16427に記載されている。
変種はまたカセット変異導入を用いて生成することができる。カセット変異導入では、二本鎖DNA分子の小さな領域が、天然の配列とは異なる合成オリゴヌクレオチド“カセット”で置き換えられる。前記オリゴヌクレオチドはしばしば完全に及び/又は部分的に任意抽出された天然の配列を含む。
再帰的アンサンブル変異導入もまた変種の生成に用いることができる。再帰的アンサンブル変異導入は、表現型が関連性をもつ変異体の多様化集団（そのメンバーはアミノ酸配列が異なる）を生成するために開発されたタンパク質工学（タンパク質変異導入）のためのアルゴリズムである。前記方法はフィードバックメカニズムを用いて、コンビナトリアルカセット変異導入（combinatorial cassette mutagenesis）の連続一巡工程を制御する。再帰的アンサンブル変異導入は例えば以下に記載されている：Arkin (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815。
【０１１９】
いくつかの特徴では、変種はエクスポネンンシャルアンサンブル変異導入を用いて生成される。エクスポネンンシャルアンサンブル変異導入は、高い割合の固有で機能的な変異体を含むコンビナトリアルなライブラリーを生成する方法である。前記変異導入では、残基の小グループが並行して任意抽出され、機能的タンパク質を生じるアミノ酸がそれぞれ変異された位置で同定される。エクスポネンンシャルアンサンブル変異導入は例えば以下に記載されている：Delagrave (1993) Biotechnology Res. 11:1548-1552。ランダム変異導入および部位特異的変異導入は例えば以下に記載されている：Arnold (1993) Current Opinion in Biotechnology 4:450-455。
いくつかの特徴では変種はシャッフリングの方法によって生成される。前記では、別個のポリペプチドをコードする複数の核酸部分が融合され、例えば米国特許第5,965,408号及び同第5,939,250号に記載されたようにキメラポリペプチドをコードするキメラ核酸配列が生成される。
本発明はまた本発明のポリペプチドの変種を提供し、前記変種は、1つ以上のアミノ酸残基（例えば例示的ポリペプチド、例えば配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8などのアミノ酸残基）が保存的又は非保存的アミノ酸残基（例えば保存的アミノ酸残基）で置換されてあり、そのような置換アミノ酸残基は遺伝暗号によってコードされるものでも、そうでないものでもよい。保存的置換は、同様な特徴を有する別のアミノ酸によってポリペプチド内のあるアミノ酸が置換されるものである。したがって、本発明のポリペプチドは、本発明の配列（例えば本発明の例示的配列、例えば例えば配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8など）の保存的置換を有するポリペプチドを含む。前記置換は以下を含む（ただしこれらに限定されない）：脂肪族アミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン）の別の脂肪族アミノ酸による置換；セリンのスレオニンによる置換またはその逆；酸性残基（例えばアスパラギン酸及びグルタミン酸）の別の酸性残基による置換；アミド基をもつ残基（例えばアスパラギン及びグルタミン）の別のアミド基をもつ残基による置換；塩基性残基（例えばリジン及びアルギニン）の別の塩基性残基による交換；及び芳香族残基（例えばフェニルアラニン、チロシン）の別の芳香族残基による置換。他の変種は、本発明のポリペプチドの1つ以上のアミノ酸残基が置換基を含む変種である。
本発明の範囲内の他の変種は、前記ポリペプチドが別の化合物、例えば前記ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えばポリエチレングリコール）と結合しているものである。本発明の範囲内のさらに別の変種は、さらに追加のアミノ酸が前記ポリペプチドに融合されているものである。前記追加されるアミノ酸は例えばリーダー配列、分泌配列、プロプロテイン配列又は前記ポリペプチドの精製、濃縮又は安定化を促進する配列である。いくつかの特徴では、本発明のポリペプチドの変種、フラグメント、誘導体およびその類似体は、例示的ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性、例えばタンパク質分解活性を保持している。他の特徴では、前記変種、フラグメント、誘導体又は類似体は、プロプロテイン部分の切断によって活性化され活性なポリペプチド生成することができるようにプロプロテインを含む。
【０１２０】
宿主細胞における高レベルのタンパク質発現を達成するためのコドンの最適化：本発明は、酵素コード核酸を改変してコドン使用頻度を改変する方法を提供する。ある特徴では、本発明は、酵素をコードする核酸のコドンを改変して宿主細胞（例えば細菌、昆虫、哺乳動物、酵母又は植物細胞）におけるその発現を増加又は減少させる方法を提供する。本発明はまた、宿主細胞におけるその発現を高めるために改変された酵素をコードする核酸、そのように改変された酵素、及び前記改変酵素を製造する方法を提供する。前記方法は、“非優先”又は“低優先”コドンを酵素コード核酸中で同定し、さらにこれら非優先又は低優先コドンの1つ以上を、前記コドンと同じアミノ酸をコードする“優先コドン”で置き換えることを含み、核酸内の少なくとも1つの非優先または低優先コドンが同じアミノ酸をコードする優先コドンによって置き換えられいる。優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において高頻度に提示されるコドンであり、非優先又は低優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において低頻度で提示されるコドンである。
本発明の核酸、発現カセット及びベクターの発現のための宿主細胞には細菌、酵母、菌類、植物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞が含まれる。したがって、本発明はこれら全ての細胞でコドン使用頻度を最適化する方法、コドン改変核酸およびコドン改変核酸によって生成されるポリペプチドを提供する。例示的な宿主細胞には、グラム陰性細菌（例えば大腸菌）；グラム陽性細菌、例えば任意のバチルス属（例えばB.セレウス（cereus）又は枯草菌（B. subutilis））又はストレプトミセス属、ラクトバチルス・ガッセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・クレモリス（Lactococcus cremoris）が含まれる。例示的な宿主細胞にはまた真核生物、例えば種々の酵母、例えばサッカロミセス種（サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）を含む）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）及びクルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、アスペルギルス・ニゲル、並びに哺乳動物細胞及び哺乳動物細胞株、並びに昆虫細胞及び昆虫細胞株が含まれる。したがって、本発明はまた前記生物および種での発現のために最適化された核酸及びポリペプチドを含む。
例えば、細菌細胞から単離された酵素をコードする核酸のコドンは、前記酵素が由来した細菌とは異なる細菌細胞、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞で前記核酸が最適に発現できるように改変される。コドンを最適化する方法は当業界において周知で、例えば以下を参照されたい：米国特許5,795,737号；Baca (2000) Int. J. Parasitol. 30:113-118；Hale (1998) Protein Expr. Purif. 12:185-188；Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253。さらにまた以下を参照されたい：Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253（マウス系におけるコドンの最適化を記載）；Outchkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24:18-24（酵母におけるコドンの最適化を記載）；Feng (2000) Biochemistry 39:15339-15409（大腸菌におけるコドンの最適化を記載）；Humphreys (2000) Protein Expr. Purif. 20:252-264（大腸菌における分泌に影響するコドン使用頻度の最適化を記載）。
【０１２１】
非ヒトトランスジェニック動物
本発明は、本発明の核酸、ポリペプチド（例えば本発明の酵素又は抗体）、発現カセット、ベクター、トランスフェクトされた又は形質転換された細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する。前記トランスジェニック非ヒト動物は、例えば本発明の核酸又はポリペプチドを異種又は組換え配列として含むヤギ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、乳牛、ラット及びマウスであり得る。これらの動物は、例えば酵素活性を調べるin vivoモデルとして、または酵素活性を変化させる薬剤をin vivoでスクリーニングするモデルとして用いることができる。非ヒトトランスジェニック動物で発現されるポリペプチドのコード配列は、構成的であるように、又は組織特異的、生育特異的若しくは誘導性調節因子の制御下にあるように設計することができる。非ヒトトランスジェニック動物は当業界で公知の任意の方法を用いて設計および作出することができる。例えば以下を参照されたい：米国特許6,211,428号；6,187,992号；6,156,952号；6,118,044号；6,111,166号；6,107,541号；5,959,171号；5,922,854号；5,892,070号；5,880,327号；5,891,698号5,639,940号5,573,933号；5,387,742号；5,087,571号（形質転換細胞及び卵並びにトランスジェニックマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ及びウシの作成及び使用について記載されている）。さらにまた例えば以下を参照されたい：Pollock (1999) J. Immunol. Methods 231:147-157（トランスジェニック乳牛のミルク中の組換えタンパク質の製造について記載）；Baguisi (1999) Nat. Biotechnol. 17:456-461（トランスジェニックヤギの作成を示す）。米国特許第6,211,428号は、DNA配列を含む核酸構築物をその脳で発現する非ヒトトランスジェニック哺乳動物の作製および使用について記載している。米国特許第5,387,742号は、クローン化組換え又は合成DNA配列の受精マウス卵への注入、前記注入卵の偽妊娠雌への移植及び、アルツハイマー病関連タンパク質をその細胞が発現するトランスジェニックマウスの妊娠期間満了までの発生について記載している。米国特許第6,187,992号は、そのゲノムがアミロイド前駆体（APP）をコードする遺伝子の破壊を含むトランスジェニックマウスの作成及び使用を記載している。
“ノックアウト動物”もまた本発明の方法の実施に用いることができる。例えば、ある特徴では、本発明のトランスジェニック又は改変動物は“ノックアウト動物”、例えば内因性遺伝子を発現しないように操作された“ノックアウトマウス”を含み、前記は、本発明の酵素を発現する遺伝子、または本発明の酵素を含む融合タンパク質で置き換えられている。上記に記載したように、機能的ノックアウトもまた本発明のアンチセンス配列、例えば二本鎖RNAi分子を用いて作成することができる
【０１２２】
トランスジェニック植物および種子
本発明は、本発明の核酸、ポリペプチド(例えば酵素又は抗体）、発現カセット若しくはベクター、又はトランスフェクト若しくは形質転換された細胞を含むトランスジェニック植物及び種子を提供する。前記トランスジェニック植物は双子葉植物または単子葉植物であろう。本発明はまた前記トランスジェニック植物及び種子の製造方法並びに使用方法を提供する。本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物または植物細胞は当業界で公知の任意の方法にしたがって構築することができる。例えば米国特許第6,309,872号を参照されたい。
本発明の核酸および発現構築物は任意の手段によって植物細胞に導入できる。例えば、核酸または発現構築物は所望の植物宿主のゲノムに導入することができるが、また前記核酸又は発現構築物はエピソームであってもよい。所望の植物のゲノム中への導入は、宿主の酵素産生が内因性の転写又は翻訳制御エレメントによって調節できるようなものであり得る。本発明はまた、例えば相同組換えによる遺伝子配列の挿入によって内因性遺伝子の発現が破壊された“ノックアウト植物”を提供する。“ノックアウト”植物を作出する手段は当業界で周知であり、例えば以下を参照されたい：Strepp (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4368-4373；Miao (1995) Plant J. 7:359-365。下記のトランスジェニック植物についての考察を参照されたい。
ある特徴では、トランスジェニック植物製造の第一の工程は、植物細胞での発現のための発現構築物を作成することを必要とする。これらの技術は当業界では公知である。これらにはプロモーターの選別およびクローニング、リボソームのmRNAへの効率的な結合を促進するためのコード配列及び適切な遺伝子ターミネーター配列の選別が含まれる。例示的な構成的プロモーターの1つはカリフラワーモザイクウイルスに由来するCaMV35Sであり、これは一般的に植物で高度な発現をもたらす。他のプロモーターはより特異的であり、植物の内部環境または外部環境の合図に反応する。例示的な光誘導性プロモーターは、主要な葉緑素a/b結合タンパク質をコードするcab遺伝子に由来するプロモーターである。
【０１２３】
ある特徴では、核酸は改変されて植物細胞でのより強い発現が達成される。例えば、本発明の配列は植物で認められるA-Tヌクレオチド対の割合と比較して高いA-Tヌクレオチド対をもつ可能性が高い（植物のいくつかはG-Cヌクレオチド対を好む）。したがって、コード配列内のA-Tヌクレオチドを、アミノ酸配列を顕著に変化させることなくG-Cヌクレオチドに置換して、植物細胞における遺伝子生成物の産生を高めることができる。
選別可能なマーカー遺伝子を遺伝子構築物に付加し、トランスジーンを組み込むことに成功した植物細胞又は組織を同定することができる。これは、植物細胞での遺伝子の取り込み及び発現の達成が稀な事象であり、標的組織又は細胞のわずかな割合で生じるだけであるので必要であろう。選別可能なマーカー遺伝子は、通常は植物にとって有毒である物質（例えば抗生物質又は除草剤）に対して耐性を提供するタンパク質をコードする。前記適切な抗生物質又は除草剤を含む培地で増殖させたとき、選別可能なマーカー遺伝子を組み込んだ植物細胞だけが生存するであろう。他の挿入遺伝子の場合のように、マーカー遺伝子もまた適切な機能のためにプロモーター及びターミネーター配列を必要とする。
ある特徴では、トランスジェニック植物又は種子の作成は、本発明の配列及び場合によってマーカー遺伝子の標的発現構築物（例えばプラスミド、ファージ）への取り込みをプロモーター及びターミネーター配列の適切な配置とともに含む。これは、適切な方法により改変遺伝子を前記植物に移すことを必要とするであろう。例えば、構築物は、植物細胞のゲノムDNAに、例えば植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーション及びマイクロインジェクションのような技術を用いて直接導入することができる。または、構築物は弾道的方法（例えばDNA粒子ボンバードメント）を用いて植物組織に直接導入することもできる。例えば以下を参照されたい：Christou (1997) Plant Mol. Biol. 35:197-203；Pawlowski (1996) Mol. Biotechnol. 6:17-30；Klein (1987) Nature 327:70-73；Takumi (1997) Genes Genet. Syst. 72:63-69（トランスジーンのコムギへの導入のための粒子ボンバードメントの使用を考察する）；およびAdam (1997)（上掲書）（YACの植物細胞への導入のための粒子ボンバードメントの使用について記載）。例えばRinehart (1997)（上掲書）は粒子ボンバードメントを用いてトランスジェニックな綿を作出した。粒子を加速する装置は米国特許第5,015,580号に記載されており、さらにBioRad（Biolistics）PDS-2000粒子加速装置が市販されている。さらに以下もまた参照されたい：米国特許第5,608,148号（John）；および米国特許第5,681,730号（Ellis）（裸子植物の粒子仲介形質転換を記載している）。
【０１２４】
ある特徴では、プロトプラストを固定し、核酸（例えば発現構築物）を注入することができる。プロトプラストから植物を再生させることは穀類では容易ではないが、マメ類では体細胞の胚形成を用いてプロトプラスト由来カルスから植物の再生が可能である。遺伝子銃技術を用いて器官を形成した組織を裸のDNAで形質転換することができる。この場合、DNAはタングステンの微小発射体上（細胞のサイズの1/100）に被覆されて発射される。前記発射体はDNAを細胞および細胞内小器官の奥深くに運ぶ。続いて形質転換組織を再生のために誘導する（通常は体細胞胚形成による）。この技術はいくつかの穀類種（トウモロコシおよびイネを含む）で成功した。
核酸、例えば発現構築物は組換えウイルスを用いて植物細胞に導入することもできる。植物細胞はウイルスベクター、例えばタバコモザイクウイルス由来ベクターを用いて形質転換することができる（Rouwendal (1997) Plant Mol. Biol. 33:989-999）。以下を参照されたい：“Use of viral replicons for the expression of genes in plants”, Mol. Biotechnol. 5:209-221。
あるいは、核酸（例えば発現構築物）を適切なT-DNAフランキング領域と結合させて、一般的なアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）宿主ベクターに導入することができる。アグロバクテリウム・ツメファシエンスのビルレンス機能は、細胞が前記細菌に感染したとき植物細胞DNAに前記構築物および隣接するマーカーの挿入を誘導するであろう。アグロバクテリウム・ツメファシエンス仲介形質転換技術（バイナリーベクターの無毒化および使用を含む）は学術文献に詳しく記載されている。例えば以下を参照されたい：Horsch (1984) Science 233:496-498；Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803；Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed. (Springer-Verlag, Berlin 1995)。アグロバクテリウム・ツメファシエンスの細胞中のDNAは細菌の染色体および、Ti（腫瘍誘導；tumor-inducing）プラスミドとして知られている別の構造物中に含まれている。Tiプラスミドは、T-DNA（約20kbの長さ）と称される一続きのDNA（感染過程で植物細胞に移される）および一連のvir（virulence、ビルレンス）遺伝子（関連過程を誘導する）を含む。アグロバクテリウム・ツメファシエンスは創傷からのみ植物に感染する。植物の根または茎が傷を受けたとき、植物はある種の化学的シグナルを発し、それに応答してアグロバクテリウム・ツメファシエンスのvir遺伝子は活性化され、TiプラスミドのT-DNAの植物染色体への移転に必要な一連の事象を誘導する。続いてT-DNAは創傷から植物細胞に進入する。１つの推測は、T-DNAは、植物DNAが複製または転写されるまで待機し、続いて自身を裸の植物DNAに挿入するということである。アグロバクテリウム・ツメファシエンスをトランスジーンベクターとして使用するために、T-DNAの腫瘍誘導部分を除去し、一方T-DNAボーダー領域およびvir遺伝子は維持する必要がある。続いてトランスジーンをT-DNAボーダー領域間に挿入する（この場合、トランスジーンは植物細胞に移入し、植物染色体に組み込まれる）。
【０１２５】
本発明は、本発明の核酸を用いる単子葉植物（重要な穀類を含む）の形質転換を提供する（Hiei (1997) Plant Mol. Biol. 35:205-218）。さらにまた、例えば以下を参照されたい：Horsch (1984) Science 233:496；Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803; Thykjaer (1997) 上掲書；Park (1996) Plant Mol. Biol. 32:1135-1148（ゲノムDNAへのT-DNAの組み込みについて考察する）。さらにまた以下を参照されたい：米国特許第5,712,135号（D'Halluin）（穀類または他の単子葉植物の細胞内で機能を有する遺伝子を含むDNAの安定な組み込みのための方法を開示する）。
ある特徴では、第三の工程は、取り込まれた標的遺伝子を次の世代に伝達することができる植物体の選別および再生を含むことができる。そのような再生技術は、組織培養の増触培地での一定の表現型の操作を必要とし、典型的には所望のヌクレオチド配列と一緒に導入された有毒物質及び/又は除草剤マーカーを必要とする。培養プロトプラストから植物を再生することについては以下に記載されている：Evans et al., Protoplast Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp.124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; Binding, Regenration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985。再生はまた植物カルス、外植片、器官またはその部分からも得ることができる。そのような再生技術は一般的には以下に記載されている：Klee (1987) Ann. Rev. of Phys. 38:467-486。トランスジェニック組織（例えば未熟胚）から植物体を得るために、前記胚を栄養およびホルモンを含む一連の培養液中で環境制御条件下（組織培養として公知の方法）で増殖させることができる。いったん植物体が生成され種子が生じたら、子孫の評価が開始される。
発現カセットがトランスジェニック植物に安定的に取り込まれた後、前記カセットは有性交配によって他の植物に導入することができる。交配される種に応じて、多くの標準的育種技術のいずれも用いることができる。本発明の核酸のトランスジーン発現は表現型の変化を生じるので、本発明の組換え核酸を含む植物を第二の植物と有性交配して最終生成物を得ることができる。したがって、本発明の種子は、本発明の2つのトランスジェニック植物間の交配、または本発明の植物と他の植物間の交配から誘導することができる。所望の効果（例え本発明のポリペプチドを発現させて開花の態様が変化した植物を作製する）は、両方の親植物が本発明のポリペプチドを発現するときに強化される。所望の効果は将来の植物世代に標準的な繁殖手段によって伝えることができる。
【０１２６】
本発明の核酸およびポリペプチドは任意の植物または種子で発現又は挿入される。本発明のトランスジェニック植物は双子葉植物でも単子葉植物でもよい。本発明のトランスジェニック単子葉植物の例は、牧草、例えばメドーグラス（meadow grass（ブルーグラス、Poa））、飼い葉用草類、例えばウシノケグサ（festuca）、ロリウム（lolium）、温帯性イネ科草本、例えばアグロスチス（Agrostis）及び穀類、例えばコムギ、エンバク、ライムギ、オオムギ、コメ、ソルガムおよびトウモロコシ（コーン）である。本発明のトランスジェニック双子葉植物の例は、タバコ、豆類（例えばルピナス）、ジャガイモ、サトウダイコン、エンドウマメ、インゲンマメ及びダイズ、並びに十字架植物（Brassicaceae科）、例えばカリフラワー、ナタネ、および近縁のモデル植物のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）である。したがって、本発明のトランスジェニック植物および種子には以下の属に由来する種を含む（ただしこれらに限定されない）広範囲の植物が含まれる：アナカルジウム（Anacardium）、アラキス（Arachis）、アスパラガス、アトロパ（Atropa）、アベナ（Avena）、ブラシッカ（Brassica）、シトラス、シトラルス（Citrullus）、カプシクム（Capsicum）、カルサムス（Carthamus）、ココス（Cocos）、コフェア（Coffea）、ククミス（Cucumis）、ククルビタ（Cuurbita）、ダウクス（Daucus）、エレイス（Elaris）、フラガリア（Fragaria）、グリシン（Glycine）、ゴッシピウム（Gossypium）、ヘリアンサス（Helianthus）、ヘテロカリス（Heterocallis）、ホルデウム（Hordeum）、ヒオシアムス（Hyoscyamus）、ラクツカ（Lactuca）、リヌム（Linum）、ロリウム（Lolium）、ルピナス、リコペルシコン（Lycopersicon）、マルス（Malus）、マニホット（Manihot）、マジョラナ（Majorana）、メディカゴ（Medicago）、ニコチアナ、オレア（Olea）、オリザ（Oryza）、パニエウム（Panieum）、パニセツム（Panisetum）、ペルセア（Persea）、ファセオルス（Phaseolus）、ピスタキア（Pistachia）、ピスム（Pisum）、ピルス（Pyrus）、プルヌス（Prunus）、ラファヌス（Raphanus）、リシヌス（Ricinus）、セカレ（Secale）、セネシオ（Senecio）、シナピス（Sinapis）、ソラナム（Solanum）、ソルガム（Sorghum）、テオブロムス（Theobromus）、トリゴネラ（Trigonella）、トリチクム（Triticum）、ビシア（Vicia）、ビチス（Vitis）、ビグナ（Vigna）、およびゼア（Zea）。
また別の実施態様では、本発明の核酸は、繊維細胞を含む植物（綿、シルクコットンツリー（Kapok、Ceiba pentandra）、ヤナギ（desert willow）、クレオソートブッシュ、ウィンターファット、バルサ、カラムシ、ケナフ、アサ、ロゼレ（roselle）、ジュート、サイザル・アバカ（sisal abaca）およびアマを含む）で発現される。また別の実施態様では、本発明のトランスジェニック植物はゴシピウム（Gossypium）属のメンバー（一切のゴシピウム種のメンバー、例えばG.アルボレウム（arboreum）; G. ヘルバセウム（herbaceum）; G. バルバデンス（barbadense）; G. ヒルスタム（hirsutum）を含む）であり得る。
【０１２７】
本発明はまた、大量の本発明のポリペプチド（例えば抗体、酵素）を製造するために用いることができるトランスジェニック植物を提供する。例えば以下を参照されたい：Palmgren (1997) Trends Genet. 13:348; Chong (1997) Transgenic Res. 6:289-296（オーキシン誘導性二方向性マンノピンシンターゼ（mas1',2'）プロモーターを用い、アグロバクテリウム・ツメファシエンス仲介リーフディスク形質転換法により母乳タンパク質のベータカゼインのトランスジェニックなジャガイモによる生産を記載）。
公知の方法を用いて、当業者は、形質導入植物でトランスジーンのmRNAまたはタンパク質の増減を検出することによって本発明の植物をスクリーニングすることができる。mRNAの検出および定量手段は当業界で周知である。
ある特徴では、本発明のトランスジェニック植物は、油を含む天然の植物の形質転換によって生産される。続いて、遺伝的に形質転換した本発明の植物を有性生殖により再生し、本発明のトランスジェニック種子を製造する。これらの種子を用いてトランスジェニック植物の子孫を得ることができる。
【０１２８】
ポリペプチド及びペプチド
本発明は、本発明の例示的な配列、例えば配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50、配列番号:52、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66、配列番号:68、配列番号:70、配列番号:72、配列番号:74、配列番号:76、配列番号:78、配列番号:80、配列番号:82、配列番号:84、配列番号:86、配列番号:88、配列番号:90、配列番号:92、配列番号:94、配列番号:96、配列番号:98、配列番号:100、配列番号:102、配列番号:104、配列番号:106、配列番号:108、配列番号:110、配列番号:112、配列番号:114、配列番号:116、配列番号:118、配列番号:120、配列番号:122、配列番号:124、配列番号:126、配列番号:128、配列番号:130、配列番号:132、配列番号:134、配列番号:136、配列番号:138、配列番号:140、配列番号:142、配列番号:143、配列番号:146、配列番号:148、配列番号:150、配列番号:152、配列番号:154、配列番号:156、配列番号:158、配列番号:160、配列番号:162、配列番号:164、配列番号:166、配列番号:168、配列番号:170、配列番号:172、配列番号:174、配列番号:176、配列番号:178、配列番号:180、配列番号:182、配列番号:184、配列番号:186、配列番号:188、配列番号:190、配列番号:192及び配列番号:194に対して配列同一性（例えば少なくとも約51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％若しくは99％、又は完全な配列同一性）を有する単離、合成又は組換えポリペプチドを提供する。上記で考察したように、前記同一性はポリペプチドの完全長に及ぶことが可能であるが、また前記同一性は、少なくとも50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700又はそれより大きい残基の領域に及ぶものでもよい。ある特徴では、本発明は、本発明の配列の部分配列のみをを含むポリペプチドを提供し、例示的配列は、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700又はそれより大きい残基であり得る。
【０１２９】
また別の特徴では、本発明は、サイズがポリペプチド（例えば酵素）の約5から完全長の範囲のポリペプチド（ペプチド、フラグメント）を提供し、例示的なサイズは、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700又はそれより大きい残基、例えば本発明の例示的酵素の連続する残基である。本発明のペプチドは、例えば標識プローブ、抗原、耐性付与源、モチーフ、酵素活性部位として有用であり得る。本発明のポリペプチドはまた、本発明の酵素と結合することができる抗体を含む。
ある特徴では、本発明は、ヒドロラーゼ活性、エステラーゼ活性、例えば有機リン酸ヒドロラーゼ活性（例えば有機リン酸エステラーゼ活性）、又はカルボキシルエステラーゼ活性、ハロペルオキシダーゼ活性、例えばヘム型（hCPO）若しくは非ヘムクロロペルオキシダーゼ（nhCPO）活性、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性、デハロゲナーゼ活性、オキシドレダクターゼ活性、プロリダーゼ活性、イミドジペプチダーゼ活性、及び/又は有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性の少なくとも1つを有する酵素を提供する。ある特徴では、本発明は、除染活性を有する酵素を提供する。ある特徴では、本発明は、非ヘムクロロペルオキシダーゼ（nhCPO）活性を有する酵素を提供する。本発明は、これら酵素を製造する方法及び前記を使用する方法、例えば除染、リグニンの漂白及び分解などの方法を提供する。
【０１３０】
以下の図表には、本発明の例示的核酸及びポリペプチドの選択した特徴（活性プロフィル（酵素活性）を含む）が記載されている（例示的配列の公開データベースの配列に対する配列同一性比較を含む）。列挙した例示的酵素の活性は、公開データベースに対するこの配列同一性比較を基準にして決定した。本図表に記載した例示的配列は、2つのデータベースセットに対してBLAST検索（下記に詳細に記載）が施された。第一のデータベースセットはNCBI（National Center for Biotechnology Information）から入手できる。これらデータベースに対する全ての検索結果は、“NR情報”、“NRアクセッションコード”、“NR E値”又は“NR生物名”と表記した欄に記載されている。“NR”は、NCBIにより維持されている非重複ヌクレオチドデータベースを指す。このデータベースは、GenBank、最新GenBank、及び最新FMBLの複合データベースである。“NR情報”欄の記入は、任意のあるNCBI記録における情報範囲を指し、配列の詳細、例えば供給源生物、遺伝子の名称/タンパク質の名称、配列の機能に関する何らかの説明を含む。“NRアクセッションコード”欄の記入は、配列記録に付与された固有のアイデンティファイヤーを指す。“NR E値”欄の記入は、期待値（Expect value、E値）を指し、問合わせ配列（本発明の配列）とデータベース配列との間で見出されたアラインメントスコアと同様なアラインメントスコアが、本BLAST検索で実施されたものと同じ数のランダム配列間の比較で見出される確率を示す。“NR生物名”欄の記入は、最近縁BLASTヒットと同定された配列の供給源生物を指す。
【０１３１】
第二のデータベースセットは、ひとまとめにしてGENESEQTMデータベースとして知られている。前記は、Thomson Derwent（Philadelphia, PA）から入手できる。このデータベースに対する検索の結果は全て“Geneseqタンパク質情報”、“Geneseqタンパク質アクセッションコード”、“Geneseqタンパク質E値”、“Geneseq DNA情報”、“Geneseq DNAアクセッションコード”又は“Geneseq DNA E値”と表記した欄に記載されている。これらの欄で見出される情報は、上記に記載したNRで見出される情報と対応し得るが、ただし前記は、NCBIデータベースの代わりにGENESEQTMデータベースに対するBLAST検索から得られている点を除く。さらにまた、この表は、“予想されるEC番号”欄を含む。EC番号は、International Union of Biochemistry and Molecular Biology（IUBMB）の酵素命名委員会によって作成された標準化酵素命名方式にしたがって酵素のタイプに割り当てられた番号である。“予想EC番号”欄の結果は、Kegg（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）データベースに対するBLAST検索によって決定される。最高BLASTマッチがe-6に等しいか又はe-6未満のE値を有するならば、前記最高マッチに割り当てられるEC番号が表に記入される。最高ヒットのEC番号を、本発明の配列のEC番号の指標として用いることができる。“問合わせDNAの長さ”及び“問合わせタンパク質の長さ”欄は、NCBI又はGeneseqデータベースのどちらかに対して検索又は問合わせを実施した本発明の配列のヌクレオチドの数又はアミノ酸の数をそれぞれ指す。“Geneseq又はNR DNAの長さ”及び“Geneseq又はNRタンパク質の長さ”欄は、BLAST検索で最高マッチを示した配列のヌクレオチドの数又はアミノ酸の数をそれぞれ指す。前記の欄で提供される結果は、NCBIデータベース又はGENESEQTMデータベースのどちらかでより小さいE値を応答した検索から得られる。“GENESEQTM又はNR％IDタンパク質”及び“GENESEQTM又はNR％ID DNA”欄は、本発明の配列と最高BLASTマッチを示した配列との間の配列同一性パーセントを指す。前記の欄で提供される結果は、NCBIデータベース又はGENESEQTMデータベースのどちらかでより小さいE値を応答した検索から得られる。
例えば、この図表の理解を容易にするために、配列番号:2に記載の配列を有するポリペプチド（配列番号:1によってコードされる）は、とりわけ公開データベースに対する配列同一性比較を基準にすれば、[ソリバクター・ウシタツス（Solibacter usitatus）Ellin6076]Zi|67865127|gp|EAM60129.1|エステラーゼ[ソリバクター・ウシタツスEllin6076]との類似性に基づくエステラーゼ活性を有する。
【０１３２】
【表１】
2009517002.tif 000003
【０１３３】
【表２】
2009517002.tif 000004
【０１３４】
【表３】
2009517002.tif 000005
【０１３５】
【表４】
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【０１３６】
【表５】
2009517002.tif 000007
【０１３７】
【表６】
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【０１３８】
【表７】
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【０１３９】
【表８】
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【０１４０】
【表９】
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【０１４１】
【表１０】
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【０１４２】
【表１１】
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【０１４３】
【表１２】
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【０１４４】
【表１３】
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【０１４５】
【表１４】
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【０１４６】
【表１５】
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【０１４７】
【表１６】
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【０１４８】
【表１７】
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【０１４９】
【表１８】
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【０１５０】
【表１９−１】
2009517002.tif 000021
【０１５１】
【表１９−２】
2009517002.tif 000022
【０１５２】
また別の特徴では、配列番号:190はアミノペプチダーゼ及び/又はメタロペプチダーゼ活性を有し；配列番号:192はP-F及びP-S結合/V,G剤に対抗する酵素活性を有し、及び/又はVXを加水分解により分解することができ；配列番号:194はOPAA活性を有する。
“アミノ酸”又は“アミノ酸配列”にはオリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列、又はこれらのフラグメント、部分若しくはサブユニット、さらに天然に存在する分子及び合成分子が含まれる。“ポリペプチド”及び“タンパク質”という用語は、ペプチド結合又は改変ペプチド結合によって互いに結合したアミノ酸、すなわちペプチドイソステアーを含み、20個の遺伝子によってコードされるアミノ酸以外の改変アミノ酸を含むことができる。“ポリペプチド”という用語はまたペプチド及びポリペプチドフラグメント、モチーフなどを含む。前記用語はまたグリコシル化されたポリペプチドも含む。本発明のペプチド及びポリペプチドにはまた、下記でさらに詳細に記載されるように全ての“模倣体”および“ペプチド模倣体”が含まれる。
ある特徴では、本発明は、ポリペプチド、核酸、感染性ビヒクル（例えば本発明の有機リン酸エステラーゼ核酸を含むウイルス、ファージ）、形質導入若しくは感染細胞又は植物及び/又はトランスジェニック植物、並びにそれらを使用する方法を提供し、例えば自己防衛的農薬耐性細胞又は植物を提供し、この場合、ある特徴では、本発明のポリペプチドは、P-S又はP-F結合を加水分解し、アセチルコリンエステラーゼ-又はブチリルコリンエステラーゼ-阻害剤を解毒するように作用する。
本発明のポリペプチドは活性又は不活性型の酵素を含む。例えば、本発明のポリペプチドは、例えばプロタンパク質プロセッシング酵素（例えば“活性な”成熟タンパク質を生成するプロタンパク質コンバターゼ）による“成熟”前、又はプレプロ配列のプロセッシング前のプロタンパク質を含む。本発明のポリペプチドは、その他の理由のために、例えば翻訳後プロセッシング事象による“活性化”前、例えばエンド-若しくはエキソ-ペプチダーゼ又はプロテイナーゼ作用前、リン酸化事象、アミド化、グリコシル化若しくは硫酸化、ダイマー化事象などの前の不活性な酵素を含む。“プレプロ”ドメイン配列及びシグナル配列を同定する方法は当業界で周知である（例えば以下を参照されたい：Van de Ven (1993) Crit. Rev. Oncog. 4(2):115-136）。例えば、プレプロ配列を同定するために、タンパク質を細胞外間隙から精製し、N-末端タンパク質配列を決定し、未処理形と比較する。
【０１５３】
本発明のポリペプチドには全ての活性形が含まれ、前記は本発明の活性な部分配列、例えば酵素の触媒ドメイン又は活性部位を含む。ある特徴では、本発明は下記に示す触媒ドメイン又は活性部位を提供する。ある特徴では、本発明は、データベース、例えばPfam又は等価物を使用することにより予想される活性部位ドメインを含む、又は前記ドメインから成るペプチド又はポリペプチドを提供する。Pfamは、多くの一般的なタンパク質ファミリーをカバーする多数の配列アラインメント及び隠れマルコフ（Markov）モデルの大収集物である（Pfamタンパク質ファミリーデータベース：A. Bateman, E. Birney, L. Cerruti, R. Durbin, L. Etwiller, S.R. Eddy, S. Griffiths-Jones, K.L. Howe, M. Marshall, and E.L.L. Sonnhammer, Nucleic Acids Research, 30(1):276-280, 2002）。
本発明には、シグナル配列及び/又はプレプロ配列をもつポリペプチド又はもたないポリペプチドが含まれる。本発明には、異種シグナル配列及び/又はプレプロ配列をもつポリペプチドが含まれる。前記プレプロ配列（異種プレプロドメインとして用いられる本発明の配列を含む）は、前記タンパク質のアミノ末端又はカルボキシ末端に存在することができる。本発明にはまた、本発明の配列を含む単離又は組換えシグナル配列、プレプロ配列及び触媒ドメイン（例えば“活性部位”）が含まれる。
本発明のポリペプチド及びペプチドは天然の供給源から単離してペプチドでも、合成又は組換えによって生成されるペプチドでもよい。ペプチド及びタンパク質は組換えによってin vitro又はin vivoで発現することができる。本発明のペプチド及びポリペプチドは当業界で公知の任意の方法を用いて生成及び単離することができる。本発明のポリペプチド及びペプチドはまた、全体または部分を当業界で周知の化学的方法を用いて合成することもできる。例えば以下を参照されたい：Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223；Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232；A.K. Banga, Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA。例えばペプチド合成は種々の固相技術を用いて実施でき（例えば以下を参照されたい：Roberge (1995) Science 269:202；Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13）、さらにABI431Aペプチド合成装置（Perkin Elmer）を製造業者によって提供される指示にしたがって用いて、自動合成を実施することができる。
【０１５４】
本発明のペプチド及びポリペプチドはまたグリコシル化することができる。グリコシル化は化学的または細胞の生合成メカニズムによって翻訳後に行われ得る（後者は公知のグリコシル化モチーフの使用を含む）。前記グリコシル化モチーフは前記配列にとって天然であってもよいが、またはペプチドとして付加しても、核酸コード配列として付加してもよい。前記グリコシル化はO-結合でもN-結合でもよい。
本発明のペプチド及びポリペプチド（上記で定義された）は、全ての“模倣体”及び“ペプチド模倣体”形を含む。“模倣体”及び“ペプチド模倣体”という用語は、実質的に本発明のポリペプチドと同じ構造及び/又は機能的特徴を有する合成化学物質を指す。前記模倣体は完全に合成された非天然アミノ酸類似体で構成されているか、または部分的に天然のペプチドアミノ酸及び部分的に非天然のアミノ酸類似体のキメラ分子である。前記模倣体はまた任意の量の天然アミノ酸の保存的置換を含むことができるが、ただしそのような置換が前記模倣体の構造及び/又は活性を実質的に変化させない場合に限られる。保存的変種である本発明のポリペプチドに関しては、日常的な実験によって模倣体が本発明の範囲内に包含されるものであるか否か、すなわちその構造及び/又は機能が実質的に改変されていないかどうかが決定されるであろう。したがって、ある特徴では、模倣体組成物は、前記が酵素活性をもつならば本発明の範囲内に包含される。
【０１５５】
本発明のポリペプチド模倣体組成物は任意の組合せの非天然成分を含むことができる。また別の特徴では、本発明の模倣体組成物は以下の3つの構造基の1つ又は全てを含む：a）天然のアミド結合（“ペプチド結合”）以外の残基結合基；b）天然に存在するアミノ酸残基の代わりに非天然残基；c）二次構造模倣を誘導する（すなわち二次構造、例えばベータターン、ガンマターン、ベータシート、アルファヘリックス構造などを誘導又は安定化させる）残基。例えば本発明のポリペプチドは、その残基の全て又はいくつかが天然のペプチド結合以外の化学的手段によって結合されるとき模倣体と特徴付けることができる。個々のペプチド模倣体残基は、ペプチド結合、他の化学的結合、又はカップリング手段、例えばグルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能基性マレイミド、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）又はN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）によって結合される。通常のアミド結合（“ペプチド結合”）の代用となり得る結合基には例えば以下が含まれる：ケトメチレン（例えば-C(=O)-NH-の代わりに-C(O=)-CH2-）、アミノメチレン（CH2-NH）、エチレン、オレフィン（CH=CH）、エーテル（CH2-O）、チオエーテル（CH2-S）、テトラゾール（CN4-）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド又はエステル（例えば以下を参照されたい：Spatola (1983) Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol.7, pp267-357, “Peptide Backbone Modifications”, Marcell Dekker, NY）。
【０１５６】
本発明のポリペプチドはまた、天然に存在するアミノ酸残基の代わりに全て又はいくつかの非天然の残基が含まれることによって模倣体と特徴付けられる。非天然残基は学術文献及び特許文献に詳しく記載されている。天然のアミノ酸残基の模倣体として有用な例示的な非天然組成物のいくつか及び基準は以下で述べる。芳香族アミノ酸の模倣体は、例えば以下によって置き換えることによって生成することができる：D-又はL-ナフチルアラニン；D-又はL-フェニルグリシン；D-又はL-2チエネイルアラニン；D-又はL-1、-2,3-、又は4-ピレネイルアラニン；D-又はL-3チエネイルアラニン；D-又はL-（2-ピリジニル）-アラニン；D-又はL-(3-ピリジニル)-アラニン；D-又はL-(2-ピラジニル)-アラニン；D-又はL-(4-イソプロピル)-フェニルグリシン；D-(トリフルオロメチル)-フェニルグリシン；D-(トリフルオロメチル)-フェニルアラニン；D-p-フルオロ-フェニルアラニン；D-またはL-p-ビフェニルフェニルアラニン；D-又はL-p-メトキシ-ビフェニルフェニルアラニン；D-またはL-2-インドール(アルキル)アラニン；及びD-またはL-アルキルアラニン（前記アルキルはメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、iso-ブチル、sec-イソチル、イソペンチル又は非酸性アミノ酸で置換できるがまた置換されてなくてもよい）。非天然アミノ酸の芳香環には、例えばチアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンゾイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリルおよびピリジル芳香環が含まれる。
【０１５７】
酸性アミノ酸の模倣体は、例えば陰性荷電を維持している非カルボキシレートアミノ酸、（ホスホノ）アラニン、硫酸スレオニンによって置換することにより生成できる。カルボキシル側鎖基（例えばアスパルチルまたはグルタミル）はまた、カルボジイミド（R'-N-C-N-R'）、例えば1-シクロヘキシル-3(2-モルホリニル-(4-エチル)カルボジイミド又は1-エチル-3(4-アゾニア-4,4-ジメソールペンチル)カルボジイミドとの反応によって選択的に改変することができる。アスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基もまた、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギン残基およびグルタミン残基に変換することができる。塩基性アミノ酸の模倣体は、（リジン及びアルギニンの他に）アミノ酸オルニチン、シトルリン又は（グアニジノ）-酢酸又は(グアニジノ)アルキル-酢酸（アルキルは上記で定義されたとおり）による置換によって生成することができる。ニトリル誘導体（例えばCOOHの代わりにCN-部分を含む）でアスパラギンまたはグルタミンを置換することができる。アスパラギンおよびグルタミン残基は、対応するアスパラギン酸またはグルタミン酸残基に脱アミノ化することができる。アルギニン残基模倣体は、アルギニン残基を例えば1つまたは2つ以上の通常の試薬（例えばフェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロ-ヘキサンジオン又はニンヒドリンを含む）と、好ましくはアルカリ性条件下で反応させることによって生成することができる。チロシン残基模倣体はチロシン残基を例えば芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンと反応させることによって生成することができる。N-アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを用いてO-アセチルチロシル種及び3-ニトロ誘導体をそれぞれ形成することができる。システイン残基模倣体は、システイニル残基を例えばアルファ-ハロアセテート（例えば2-クロロ酢酸またはクロロアセトアミド）および対応するアミンと反応させてカルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生成することによって達成できる。システイン残基模倣体はまた、システイン残基を例えばブロモ-トリフルオロアセトン、アルファ-ブロモ-ベータ-(5-イミドゾイル)プロピオン酸；クロロアセチルホスフェート、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド；メチル2-ピリジルジスルフィド；p-クロロ水銀ベンゾエート；2-クロロ水銀-4-ニトロフェノール；又はクロロ-7-ニトロベンゾ-オキサ-1,3-ジアゾールと反応させることによって生成することができる。リジン模倣体は、リジン残基をコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させることによって（さらにアミノ末端残基を変化させることによって）生成することができる。リジン及び他のアルファ-アミノ含有残基模倣体はまた、イミドエステル、例えばメチルピコリンイミデート、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロハイドライド、トリニトロ-ベンゼンスルホン酸、O-メチルイソウレア、2,4-ペンタンジオンとの反応、及びグキオキシレートとのトランスアミダーゼ触媒反応によって生成することができる。メチオニンの模倣体は、例えばメチオニンスルホキシドとの反応によって生成することができる。プロリンの模倣体には、例えばピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、3-���は4-ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリン、3-又は4-メチルプロリン又は3,3-ジメチルプロリンが含まれる。ヒスチジン残基模倣体はヒスチジルを例えばジエチルプロカーボネート又はパラ-ブロモフェナシルブロミドと反応させることによって生成することができる。他の模倣体には、例えばプロリン及びリジンのヒドロキシル化；セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化；リジン、アルギニン及びヒスチジンのアルファ-アミノ基のメチル化；N-末端アミンのアセチル化；主鎖アミド残基のメチル化又はN-メチルアミノ酸による置換；またはC-末端カルボキシル基のアミド化によって生成することができるものが含まれる。
【０１５８】
本発明のポリペプチドの残基、例えばアミノ酸はまた反対のキラリティーをもつアミノ酸（又はペプチド模倣体残基)によって置換することができる。したがって、L型構造で天然に存在するいずれのアミノ酸（前記化学物質の構造に応じてRまたはSとも呼ぶことができる）も、同じ化学構造型であるが反対のキラリティーのアミノ酸又はペプチド模倣体（D-アミノ酸と称されるが、またR-又はS-型とも称される）で置換することができる。
本発明はまた本発明のポリペプチドを、天然の過程(例えば翻訳後プロセッシング、例えばリン酸化、アセチル化など）又は化学的改変技術のどちらかによって改変する方法、及び生成された改変ポリペプチドを提供する。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチド内のいずれの場所でも生じ得る。あるポリペプチドで同じタイプの改変が同じ程度または種々の程度でいくつかの部位で存在し得ることは理解されよう。さらにまた与えられたポリペプチドが多くのタイプの改変を含むこともできる。改変には以下が含まれる：アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合による付加、ヘム成分の共有結合による付加、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合による付加、脂質又は脂質誘導体の共有結合による付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合による付加、架橋環形成、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストリエーション、酸化、PEG化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、及びタンパク質へのトランスファーRNA仲介アミノ酸付加、例えばアルギニル化。例えば以下を参照されたい：T.E. Creighton, Proteins-Structure and Molecular Properties 2nd Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C.  Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 (1983)。
【０１５９】
固相ペプチド化学合成法もまた本発明のポリペプチド又はフラグメントの合成に用いることができる。前記の方法は1960年代初頭より当業界で公知であり（R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963；さらにまた以下を参照されたい：J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Snthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., pp.11-12）、さらに最近は市販の実験室ペプチド設計および合成キット（Canbridge Research Biochemicals）として用いられている。そのような市販の実験室キットは一般的にはH.M. Geysenら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3998 (1984)）の教示を利用し、多数の“ロッド”または“ピン”（これらは全て一枚のプレートにつながっている）の先端でペプチドを合成させる。前記のような系を利用するときは、ロッドまたはピンを含むプレートはさかさまにされ、対応するウェルまたはレザーバーの第二のプレートに挿入される。前記ウェルまたはレザーバーは適切なアミノ酸をピンまたはロッドの先端に結合または固着させるために溶液を含んでいる。そのような工程（すなわちロッドまたはピンの先端をさかさまにして適切な溶液に挿入する工程）を繰り返すことによって、アミノ酸は所望のペプチドに構築される。さらにまた、多数のFMOCペプチド合成系が利用可能である。例えば、ポリペプチド又はフラグメントのアッセンブリーはアプライドバイオシステムズ社のモデル431A（商標）自動ペプチド合成装置を用いて固相上で実施できる。前記のような装置は、直接合成又は一連のフラグメント（前記フラグメントは他の公知の技術を用いて結合させることができる）の合成によって本発明のペプチドの容易な入手を提供する。
【０１６０】
本発明の酵素
本発明は、新規な酵素、例えば本発明の例示的ポリペプチド、例えば配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8など（配列番号:2から配列番号:194までの全ての偶数の配列）に記載の配列を有するタンパク質と少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％若しくは99％、又は完全な（100％）配列同一性を含むタンパク質、それらと結合する抗体、並びにそれらを製造及び使用する方法を提供する。本発明のポリペプチドは酵素活性を有することができる。
また別の特徴では、本発明の酵素は、本明細書に記載の酵素又はその活性と比較して改変された又は新規な活性を有することができる。例えば、本発明は、シグナル配列を含む又はシグナル配列を含まない酵素、及びシグナル配列そのものを含む。本発明は、固定された酵素、抗酵素抗体及びそのフラグメントを含む。本発明は、酵素活性を阻害するタンパク質、例えば酵素の活性部位と結合する抗体を提供する。本発明は、本発明の酵素を含むホモダイマー及びヘテロ複合体、例えば融合タンパク質、ヘテロダイマーなどを含む。本発明は、高い及び低い温度並びにpH（例えば酸性及び塩基性水性条件）の広い範囲にわたって活性を有する酵素を含む。
ある特徴では、変化した（より高い又は低い）Kcat/Kmを有する酵素を作出する方法を提供する。ある特徴では、部位特異的変異導入を用いて、また別の基質特異性を有するまた別の酵素が作出される。前記は、例えば前記酵素の基質結合領域又は活性部位を再設計することによって達成することができる。ある特徴では、本発明の酵素は、通常の又は極端でない生物に由来する酵素と比較して、高温（例えば80℃から85℃から90℃から95℃）でより安定である。
本発明の種々のタンパク質は多様な条件下で酵素活性を有する。本発明は、温度、酸化剤及びpH条件に対して種々の触媒効率を有する酵素の製造方法を提供する。これらの方法では例えば部位特異的変異導入及び/又はランダム変異導入の技術を用いることができる。ある特徴では、定方向進化を用いてまた別の特異性及び安定性をもつ酵素を生産することができる。
【０１６１】
本発明のタンパク質は、酵素の調節物質（例えば活性化物質又は阻害物質）を同定する本発明の方法で用いられる。簡単に記せば、テストサンプル（例えば化合物、例えばペプチドライブラリー又はコンビナトリアルライブラリー、ブロス、抽出物など）を酵素アッセイに添加し、それらの調節能力（例えば阻害、活性化、基質切断能力）を決定する。これらの阻害物質は、望ましくない異性体形成を低下又は防止するために工業的に又は研究で用いることができる。本発明の方法を用いて見出された調節物質を用いて、酵素の活性スペクトルを変化（低下又は増大）させることができる。
本発明はまた、本発明の核酸、ポリペプチド及び抗体を用いて酵素を発見する方法を提供する。ある特徴では、ラムダファージライブラリーを酵素発現による発見のためにスクリーニングする。ある特徴では、本発明は、スクリーニングにラムダファージライブラリーを用い、毒性クローンの検出、基質への接近の改良、宿主操作の必要性の削減、ライブラリーの大量切り出しにより生じる一切の偏向の可能性の回避、及び低濃度クローンの増殖促進を可能にする。ラムダファージライブラリーのスクリーニングは液相でも固相でもできる。ある特徴では、本発明は液相でのスクリーニングを提供する。前記は、固相に比して、アッセイ条件におけるより大きな融通性、さらに付加される基質融通性、弱いクローに対するより高い感度、及び自動化の容易さを提供する。
本発明は、本発明のタンパク質及び核酸を用いる、自動機械による自動化を含むスクリーニング方法を提供する。前記は、短時間で（例えば1日当たり）何千もの生触媒反応及びスクリーニングアッセイの遂行を可能にするとともに、高レベルの正確性及び再現性を担保する（下記のアレイに関する考察を参照されたい）。結果として、誘導化合物ライブラリーは週単位で作成され得る。
本発明は、天然に存在しない酵素であって、非天然酵素と比較して種々の酵素活性、安定性、基質特異性、pHプロフィル及び/又は性能特性をもつ酵素を含む。これらの酵素は天然には見出されないアミノ酸配列を有する。これら酵素は、前駆体酵素の複数のアミノ酸残基を種々のアミノ酸残基で置換することによって誘導され得る。前駆体酵素は天然に存在する酵素でも組換え酵素でもよい。ある特徴では、前記酵素変種は、天然に存在する任意のL-アミノ酸の指定のアミノ酸残基箇所における置換を含む。
【０１６２】
酵素のシグナル配列、プレプロ及び触媒ドメイン：
本発明は、シグナル配列（例えばシグナルペプチド（SP））、プレプロドメイン及び触媒ドメイン（CD）を提供する。本発明のSP、プレプロドメイン及び/又はCDは単離若しくは組換えペプチドでもよく、または融合タンパク質の部分（例えばキメラタンパク質の異種ドメイン）であってもよい。本発明は、これらの触媒ドメイン（CD）、プレプロドメイン及びシグナル配列（SP、例えば本発明のペプチドのアミノ末端残基を含む／残基から成る配列を有するペプチド）をコードする核酸を提供する。ある特徴では、本発明は、本発明のペプチドの残基1から12、1から13、1から14、1から15、1から16、1から17、1から18、1から19、1から20、1から21、1から22、1から23、1から24、1から25、1から26、1から27、1から28、1から28、1から30、1から31、1から32、1から33、1から34、1から35、1から36、1から37、1から38、1から39、1から40、1から41、1から42、1から43、1から44（又はより長いペプチド）に記載の配列を含む／配列から成るペプチドを含むシグナル配列を提供する。
例えばある特徴では、例示的シグナル配列は以下から成る（又は以下を含む）：
配列番号:104については：MKKLFAGFVLFISFYSHA；
配列番号:106については：MQSAASILALALALLAGGVWL；
配列番号:108については：MRKKLVRLLAWIAGLCLLGLVLLVAAFWAPSRSV；
配列番号:114については：MNRLSLVLLSLLLPAAAAA；
配列番号:118については：MKRIATAVFLLHAMTSVAVCA；
配列番号:142については：MRLFFLFGLFAVLLLDSINATA；
配列番号:150については：MLRTLYLILVLMGLFPLSSTVMA；
配列番号:154については：MNKRSLRKCLSAVGVVAILFSVQQVLA；
配列番号:158については：MATMMRGASKLLAGMALAVSALTATGEAFA；
配列番号:188については：MKHYVIALTTAFLLYTALPATA；
配列番号:76については：MSSALFRLMLVAVVLVGSGLVRA；
配列番号:78については：MNAFWNRLAGATLMLALMSTAWA；
配列番号:84については：MNAFWNRLAGATLMLALMSTAWA；
配列番号:90については：MVIYRQLLAGILSLSLSLAALA；
配列番号:94については：MMKPLIAVLALLWACQDPGFTQA；
配列番号:96については：MNTSLCAAALAAWVLMPTAMA
【０１６３】
本発明の酵素シグナル配列（SP）、CD及び/又はプレプロ配列は単離ペプチドであっても、または別の酵素若しくは非酵素ポリペプチドと結合した配列（例えば融合（キメラ）タンパク質として）であってもよい。ある特徴では、本発明は、本発明の酵素シグナル配列を含むポリペプチドを提供する。ある特徴では、本発明の酵素シグナル配列SP、CD及び/又はプレプロを含むポリペプチドは、本発明の酵素にとって異種の配列を含む（例えば、本発明のSP、CD及び/又はプレプロ並びに別の酵素又は非酵素タンパク質由来の配列を含む融合タンパク質）。ある特徴では、本発明は、異種SP、CD及び/又はプレプロ配列を有する本発明の酵素（例えば酵母のシグナル配列を有する配列）を提供する。本発明のタンパク質は、異種SP及び/又はプレプロをベクター（例えばpPICシリーズベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA））中に含むことができる。
ある特徴では、本発明のSP、CD及び/又はプレプロ配列は、新規な酵素ポリペプチドの同定に続いて同定される。タンパク質が分類されそれらの適切な細胞内の存在場所に輸送される経路はしばしばタンパク質ターゲッティング経路と称される。これらのターゲッティング系の全てでもっとも重要な構成要素の1つは、新たに合成されたペプチドのアミノ末端に存在する短いアミノ酸配列（シグナル配列と称される）である。このシグナル配列はタンパク質をその適切な細胞内の存在場所に誘導し、輸送中または前記タンパク質がその最終的な行き先に到達したときに除去される。ほとんどのリゾチームタンパク質、膜タンパク質又は分泌タンパク質はアミノ末端シグナル配列を有し、前記配列は小胞体管腔内への輸送のために前記タンパク質に目印を付ける。シグナル配列の長さは13から45又はそれより大きいアミノ酸残基まで変動し得る。シグナル配列を認識する種々の方法が当業者に知られている。例えば、ある特徴では、新規な酵素シグナルペプチドがシグナルP（SignalP）と称される方法によって同定される。シグナルPは合体神経ネットワークを用い、前記はシグナルペプチド及びそれらの切断部位の両方を認識する（Nielsen et al., “Identification of prokariotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites”, Protein Engineering, vol.10, no.1, p.1-6） 。
【０１６４】
いくつかの特徴では、本発明の酵素は、SP及び/又はプレプロ配列、及び/又は触媒ドメインを持たないことがあり得ることは理解されよう。ある特徴では、本発明は、SP、CD及び/又はプレプロドメインの全て又は一部分を欠くポリペプチド（例えば酵素）を提供する。ある特徴では、本発明は、ある酵素に由来するシグナル配列（SP）、CD及び/又はプレプロをコードする核酸が別の酵素の核酸配列に機能可能に連結された核酸を提供し、また場合によって非酵素タンパク質のシグナル配列（SP）及び/又はプレプロドメインが所望されてもよい。
本発明はまた、本発明のシグナル配列（SP）、プレプロドメイン及び/又は触媒ドメイン（CD）並びに異種の配列を含む単離又は組換えポリペプチドを提供する。前記異種配列は、SP、プレプロドメイン及び/又はCDと天然には結合していない配列である。SP、プレプロドメイン及び/又はCDが天然には結合していない配列は、SP、プレプロドメイン及び/又はCDのアミノ末端、カルボキシ末端、及び/又はSP及び/又はCDの両末端に存在し得る。ある特徴では、本発明は、本発明のシグナル配列（SP）、プレプロドメイン及び/又は触媒ドメイン（CD）を含むポリペプチドを含む（または前記から成る）単離又は組換えポリペプチドを提供するが、ただし前記ポリペプチドはそれが天然に結合しているいずれの配列（例えば酵素配列）とも結合していないことを条件とする。同様にある特徴では、本発明は、これらのポリペプチドをコードする単離又は組換え核酸を提供する。したがって、ある特徴では、本発明の単離又は組換え核酸は、本発明のシグナル配列（SP）、プレプロドメイン及び/又は触媒ドメイン（CD）並びに異種配列（すなわち本発明のシグナル配列（SP）、プレプロドメイン及び/又は触媒ドメイン（CD）と天然には結合していない配列）のコード配列を含む。前記異種配列は、SP、プレプロドメイン及び/又はCDコード配列の3'端、5'端及び/又はその両端に存在することができる。
【０１６５】
本発明は、本発明の酵素（例えばシグナル配列、プレプロ配列）のN-末端又はC-末端部分配列と他のポリペプチド、活性なタンパク質又はタンパク質フラグメントの融合を提供する。本発明の酵素の生産はまた、タンパク質分解切断事象（内因性又は外因性プロテアーゼ活性、例えばトリプシンの使用）によって後で活性化される不活性な融合タンパク質として前記酵素を発現させることによっても達成することができる（前記切断事象は、融合タンパク質パートナー及び成熟酵素、例えば本発明の酵素の分離をもたらす）。ある特徴では、本発明の融合タンパク質は、以下のエレメントを含む単一のオープンリーディングフレームをコードするハイブリッドヌクレオチド構築物から発現される：融合タンパク質のためのヌクレオチド配列、リンカー配列（2つの可撓性の低いタンパク質ドメインを結合させる可撓性のアミノ酸配列をコードする）、プロテアーゼ切断認識部位、及び成熟酵素（例えば本発明の任意の酵素）配列。また別の特徴では、融合タンパク質は、ペクテートリアーゼ配列、キシラナーゼ配列、ホスファチジン酸ホスファターゼ配列、又は別の配列、例えば対象の宿主系で過剰発言されることが以前に示されている配列を含むことができる。いずれの宿主系（例えば大腸菌、ピキア・パストリス）も用いることができる（上記の考察を参照されたい）。キメラヌクレオチド構築物中のヌクレオチド配列の編成は、各融合構築物を用いて達成されるタンパク質発現レベルを基準にして決定することができる。ある特徴では、ヌクレオチド構築物の5'末端から構築物の3'プライム方向で、前記ヌクレオチド配列は以下のようにアッセンブリングされる：シグナル配列/融合タンパク質/リンカー配列/プロテアーゼ切断認識部位/成熟酵素（例えば本発明の任意の酵素）、又はシグナル配列/プロ配列/成熟酵素/リンカー配列/融合タンパク質。不活性な融合タンパク質としての酵素（例えば本発明の任意の酵素）の発現は、酵素配列の全体的発現を改善し、活性酵素の過剰発現に付随する潜在的毒性のいずれも減少させ、及び/又は使用前の酵素の保存期間を増加させることができる（酵素は、融合タンパク質例えばペクテートリアーゼが酵素、例えばヒドロラーゼ又はオキドレダクターゼ又は除染活性を有する酵素から分離されるまで不活性だからである）。
様々な特徴で、本発明は、融合タンパク質として発現される本発明の酵素の活性化のための特別な処方物を提供する。ある特徴では、最初に不活性な融合タンパク質として発現される前記酵素活性の活性化は、タンパク質分解活性、又はアミノ末端若しくはカルボキシ末端ペプチダーゼと併用される潜在的タンパク質分解活性を用いて達成される。
【０１６６】
グリコシル化：本発明のペプチド及びポリペプチド（例えば酵素、抗体）はグリコシル化することができる。例えばある特徴では、前記は少なくとも1つのグリコシル化部位、例えばN-結合又はO-結合グリコシル化を含むことができる。ある特徴では、前記ポリペプチドは、P.パストリス又はS.ポンベで発現させるとグリコシル化され得る。前記グリコシル化は、翻訳後に化学的に又は細胞の生合成メカニズムにより付加することができ、後者は公知のグリコシル化モチーフの使用を含むことができる。前記モチーフは、配列にとって本来のものであっても、又はペプチドとして付加、若しくは核酸コード配列において付加されてもよい。
【０１６７】
ハイブリッド酵素及びペプチドライブラリー
ある特徴では、本発明は、本発明の配列を含む、ハイブリッド酵素及び融合タンパク質（ペプチドライブラリーを含む）を提供する。本発明のペプチドライブラリーを用いて、標的のペプチド調節物質（例えば活性化物質又は阻害物質）を単離することができる。本発明のペプチドライブラリーを用いて、標的の正式な結合パートナー、例えばリガンド、例えばサイトカイン、ホルモンなどを同定することができる。
ある特徴では、本発明の融合タンパク質（例えばペプチド部分）は構造的に安定化され（直鎖状ペプチドと比較して）、標的に対してより高い結合親和性を可能にする。本発明は、本発明の酵素と他のペプチド（公知及び任意のペプチドを含む）の融合を提供する。それらは、酵素の構造が顕著にはかく乱されない態様で、さらに前記ペプチドが代謝的にまたは構造的構成的に安定化されるような態様で融合させることができる。これによって、細胞内でのその存在及び量を容易にモニターできるペプチドライブラリーの作成が可能になる。
本発明のアミノ酸配列変種は、前記変種の予め定めた性質、天然に存在する形態（例えば酵素配列の対立遺伝子変動または種間変動）とそれらを区別する特徴によって特徴付けられる。ある特徴では、本発明の変種は、天然に存在する類似体と同じ定性的生物学的活性を示す。あるいは、前記変種は改変された特徴を有するものについて選別することができる。ある特徴では、アミノ酸配列の変化を導入する部位または領域が予め決定されるが、変異それ自体は予め決定される必要はない。例えば、ある部位における変種の成果を最適にするために、ランダム変異導入を標的コドン又は領域で実施し、所望の活性の最適な組合せについて発現酵素変種をスクリーニングすることができる。既知の配列を有するDNAの予め定めた部位に置換変異を導入する技術は周知であり、例えば本明細書ではM13プライマー変異導入及びPCR変異導入が考察される。変異体のスクリーニングは、例えばタンパク質分解アッセイを用いて実施できる。また別の特徴では、アミノ酸置換は単一残基でもよい。挿入は約1から20アミノ酸の規模でもよいが、ただしはるかに大きな挿入も実施することができる。欠失は約1から約20、30、40、50、60、70残基又はそれを超える範囲でもよい。最適な特性を有する最終的な誘導体を得るために、置換、欠失、挿入又は前記の任意の組合せを用いることができる。一般的には、これらの変更は数アミノ酸に対して実施し、分子の改変を最小限にとどめる。しかしながら、ある種の環境ではもっと大きな変更も容認され得る。
【０１６８】
本発明は、そのポリペプチド骨格構造、二次又は三次構造（例えばアルファ-ヘリックス又はベータ-シート構造）が改変された酵素を提供する。ある特徴では、電荷または疎水性が改変されている。ある特徴では、側鎖の嵩が改変されている。保存性が低い置換を選択することによって、機能または免疫学的同一性に実質的な変更がもたらされる。例えば、以下に対してより顕著な影響を与える置換を実施することができる：改変領域のポリペプチド骨格構造（例えばアルファ-ヘリックス又はベータ-シート構造）；分子の荷電または疎水性部分（活性部位に存在していてもよい）；又は側鎖。本発明は、本発明のポリペプチドに以下のような置換を提供する：（ａ）疎水性残基（例えばセリル又はスレオニル）で親水性残基（例えばロイシル、イソロイシル、バリル又はアラニル）を置換する（または前者を後者で置換する）；（b）システイン又はプロリンで他の任意の残基を置換する（または前者を後者で置換する）；（ｃ）陽性荷電側鎖をもつ残基（例えばリジル、アルギニルまたはヒスチジル）で陰性荷電残基（例えばグルタミル又はアスパルチル）を置換する（または前者を後者で置換する）；または（ｄ）嵩の大きな側鎖をもつ残基（例えばフェニルアラニン）で側鎖をもたない残基（例えばグリシン）を置換する（または前者を後者で置換する）。前記変種は同じ定性的生物学的活性（例えば酵素活性）を示し得るが、変種を選別して酵素の性状を必要とされるように改変することができる。
【０１６９】
ある特徴では、本発明の酵素は、エピトープ若しくは精製タグ、シグナル配列又は他の融合配列などを含む。ある特徴では、本発明の酵素を任意のペプチドと融合させて、融合ポリペプチドを形成することができる。本明細書では“融合”又は“機能可能に連結”とは、任意のペプチド及び酵素が、前記酵素構造の安定性の破壊を最小限にとどめる（例えば前記が酵素活性を維持する）ことができる態様で一緒に結合されることを意味する。融合ポリペプチド（または融合ポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチド）はさらに別の成分（複数のループに存在する複数のペプチドを含む）も同様に含むことができる。
ある特徴では、ペプチド（例えば酵素部分配列）及びそれらをコードする核酸はランダム化される。ランダム化は完全なランダム化であっても、またはランダム化が、例えばヌクレオチド/残基頻度において全体的にもしくは位置毎に偏っていてもよい。“ランダム化された”とは各核酸及びペプチドがそれぞれ本質的に任意のヌクレオチド及びアミノ酸から成ることを意味する。ある特徴では、ペプチドを生じる核酸は化学的に合成することができ、したがって、任意の位置に任意のヌクレオチドを取り込むことができる。したがって、核酸が発現されペプチドを生成するとき、任意の位置に任意のアミノ酸残基が取り込まれ得る。合成プロセスは、ランダム化された核酸が生成されるように設計して、核酸の全長にわたって可能な組合せの全て又は大半の形成を可能にし、したがってランダム化された核酸ライブラリーの形成を可能にすることができる。前記ライブラリーは、ランダム化された発現生成物の十分に構造的に多様な集団を提供し、所望の反応を示す1つ以上の細胞を提供するために確率的に十分な範囲の細胞反応に影響を与えることができる。したがって、本発明は、ライブラリーメンバーの少なくとも1つがいくつかの分子、タンパク質または他の因子に対する親和性を与える構造を有することができるように十分に大きな相互作用ライブラリーを提供する。
【０１７０】
スクリーニングの方法論及び“オンライン”モニター装置
本発明の方法の実施に際して、多様な装置および方法論を本発明のポリペプチド及び核酸と併せて用いて、例えば酵素活性についてポリペプチドをスクリーニングし、例えば酵素活性の潜在的活性化物質又は阻害物質として化合物をスクリーニングし（例えば潜在的な薬剤スクリーニングのために）、本発明のポリペプチドと結合する抗体について、本発明の核酸とハイブリダイズする核酸について、本発明のポリペプチドを発現する細胞ついてスクリーニングすることなどが可能である。例えば米国特許6,337,187号を参照されたい。
【０１７１】
キャピラリーアレイ：キャピラリーアレイ、例えばGIGAMATRIXTM（Diversa Corporation, San Diego, CA）を本発明の方法で用いることができる。本発明の核酸又はポリペプチドをアレイ（キャピラリーアレイを含む）に固定又は適用することができる。アレイを用いて、組成物（例えば小分子、抗体、核酸など）のライブラリーを、本発明の核酸又はポリペプチドとの結合能力又は前記の活性の調節能力についてスクリーニング又はモニターすることができる。キャピラリーアレイは、サンプルを保持及びスクリーニングすることを目的とするまた別の系を提供する。例えば、サンプルスクリーニング装置は、隣り合うキャピラリーのアレイを形成する複数のキャピラリーを含み、この場合各キャピラリーは、ルーメンを仕切る、サンプル保持用の少なくとも1つの壁を含む。前記装置はさらにアレイ中の隣り合うキャピラリー間に配置される間質材及び前記間質材中に形成された1つ以上の参照認証を含む。サンプルのスクリーニングを目的とするキャピラリー（この場合キャピラリーはキャピラリーアレイ内で束ねらことができるようにしつらえてある）は、サンプルを保持するためのルーメンを仕切る第一の壁及びフィルタリング物質（サンプルの励起のためにルーメンに提供される励起エネルギーのフィルタリングを目的とする）で形成された第二の壁を含むことができる。
ポリペプチド又は核酸（例えばリガンド又は基質）は、キャピラリーアレイの1つのキャピラリーの少なくとも一部分の第一の成分に導入することができる。キャピラリーアレイの各キャピラリーは、前記第一の成分を保持するためにルーメンを仕切る少なくとも1つの壁を含むことができる。気泡をキャピラリー中の第一の成分に導入することができる。第二の成分をキャピラリーに導入することができるが、この場合、第二の成分は気泡によって前記第一の成分から分離されている。対象サンプルを検出可能な粒子で標識された第一の液体としてキャピラリーアレイの1本のキャピラリーに導入することができるが、この場合キャピラリーアレイの各キャピラリーは、第一の液体及び検出可能な粒子を保持するためにルーメンを仕切る少なくとも1つの壁を含み、さらに前記少なくとも1つの壁は前記検出可能な粒子と結合させるための結合物質で被覆されている。本方法はさらに、第一の液体をキャピラリー管から除去し（この場合結合した検出可能粒子はキャピラリー内に維持される）、さらに第二の液体をキャピラリー管に導入する工程を含む。
キャピラリーアレイは複数の個々のキャピラリーを含み、前記個々のキャピラリーはルーメンを仕切る少なくとも1つの外壁を含む。前記キャピラリーの外壁は融合した1つ以上の壁であってもよい。同様に、前記の壁は、それが液体又はサンプルを保持するルーメンを形成する限り、円筒形、四角、六角形又は他の任意の幾何学的形状であってよい。キャピラリーアレイのキャピラリーは極めて近接して一緒に保持され平面構造を形成することができる。キャピラリーは、溶融により（例えばキャピラリーがガラスで製造されている場合）、接着剤により、結合により、又は側面を留め金で留めることにより一緒に束ねることができる。キャピラリーアレイは多数の個々のキャピラリー（100から4,000,000本の範囲のキャピラリー）で形成することができる。キャピラリーアレイは、約100,000又はそれより多いキャピラリーが一緒に束ねられたマイクロタイタープレートを形成することができる。
【０１７２】
アレイ又は“バイオチップ”：本発明の核酸またはポリペプチド（酵素、ペプチド又は抗体を含む）はアレイに固定又は塗布することができる。アレイを用いて、（例えば小分子、抗体、核酸などの）組成物ライブラリーを、本発明の核酸又はポリペプチドと結合するその能力又は前記の活性を調節するその能力についてスクリーニング又はモニターすることができる。例えば本発明のある特徴では、モニターされるパラメーターは酵素遺伝子の転写物の発現である。細胞の1つ以上又は全ての転写物が、細胞の転写物又は細胞の転写物の代表的な核酸若しくは細胞の転写物と相補的な核酸を含むサンプルのハイブリダイゼーションによって、又はアレイ若しくは“バイオチップ”上に固定された核酸とのハイブリダイゼーションによって測定することができる。マイクロチップ上の核酸“アレイ”を用いることによって、細胞の転写物のいくつか又は全てを同時に定量することができる。あるいは、ゲノム核酸を含むアレイはまた、本発明の方法によって作出した新規に操作された株の遺伝子型の決定に用いることができる。“ポリペプチドアレイ”はまた、複数のタンパク質の同時定量に用いることができる。本発明は公知の任意の“アレイ”（“マイクロアレイ”又は“核酸アレイ”又は“ポリペプチドアレイ”又は“抗体アレイ”又は“バイオチップ”又はその変型ともいう）を用いて実施することができる。アレイは一般的には複数の“スポット”又は“標的エレメント”であり、各標的エレメントは規定量の1つ以上の生物学的分子、例えばオリゴヌクレオチドを含み、それらはサンプル分子（例えばmRNA転写物）と特異的に結合させるために基質表面の規定領域に固定されている。
本明細書で用いられる、“アレイ”又は“マイクロアレイ”又は“バイオチップ”又は“チップ”という用語は複数の標的エレメントであり、下記でさらに詳細に考察するように、各標的エレメントは、基質表面の規定領域に固定された規定量の1つ以上のポリペプチド（抗体を含む）又は核酸を含む。
【０１７３】
ある特徴では、前記酵素は固定された形態で用いられる。任意の固定方法を用いることができ、例えば不活性な支持体、例えばジエチルアミノエチル-セルロース、多孔性ガラス、キチン又は細胞上での固定である。本発明の酵素を発現する細胞を、例えばグルタルアルデヒドによる架橋によって基質表面に固定することができる。
本発明の方法の実施に際して、任意の公知のアレイ及び/又はアレイの製造および使用方法を、全体的に若しくは部分的に又はその変型を取り入れることができる。それらは例えば以下に記載されているようなものである：米国特許第6,277,628号；第6,277,489号；第6,261,776号；第6,258,606号；第6,054,270号；第6.048,695号；第6,045,996号；第6,022,963号；第6,013,440号；第5,965,452号；第5,959,098号；第5,856,174号；第5,830,645号；第5,770,456号；第5,632,957号；第5,556,752号；第5,143,854号；第5,807,522号；第5,800,992号；第5,744,305号；第5,700,637号；第5,556,752号；第5,434,049号。さらにまた例えば以下を参照されたい：WO99/51773；WO99/09217；WO97/46313；WO96/17958。さらにまた例えば以下を参照されたい：Johnston (1998) Curr. Biol. 8:R171-R174；Schummer (1997) Biotechniques 23:1087-1092；Kern (1997) Biotechniques 23:120-124；Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes＆ Cancer 20:399-407；Bowtell (1999) Nature Genetis Supp. 21:25-32。さらにまた以下を参照されたい：米国特許出願公開広報第20010018642号；同第20010019827号；同第20010016322号；同第20010014449号；同第20010014448号；同第20010012537号；同第20010008765号。
【０１７４】
抗体及び抗体使用スクリーニング方法
本発明は、本発明の酵素と特異的に結合する単離、合成又は組換え抗体を提供する。これらの抗体を用いて、本発明の酵素又は関連するポリペプチドを単離、同定又は定量することができる。これらの抗体を用いて本発明の範囲内に包含される他のポリペプチド又は他の関連する酵素を単離することができる。本発明はまた、本発明のポリペプチドの酵素活性を有する抗体又は “抗体様”構造物（下記で考察する）、例えばハロペルオキシダーゼ活性（例えばクロロペルオキシダーゼ活性）、デハロゲナーゼ活性、オキシドレダクターゼ活性、及び/又はプロリダーゼ若しくはイミドジペプチダーゼ活性を有する本発明の交代又は“抗体様”構造物を提供する。
“抗体”という用語には、１つの免疫グロブリン遺伝子若しくは複数の免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントから誘導されたか、前記にならって作製されたか、又は前記によって実質的にコードされたペプチド又はポリペプチドであって、抗原又はエピトープに特異的に結合することができるものが含まれる。例えば以下を参照されたい：Fundamental Immunology, Third Edition, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)；Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175:267-273；Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97。抗体という用語は、抗原に結合する能力を保持する抗原結合部分、すなわち“抗原結合部位”（例えばフラグメント、部分配列、相補性決定領域（CDR））を含み、（i）Fabフラグメント（VL、VH、CL及びCH1ドメインから成る一価のフラグメント）；（ii）F(ab')2フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結された2つのFabフラグメントを含む二価フラグメント）；（iii）VH及びCH1ドメインから成るFdフラグメント；（iv）抗体の単腕のVLおよびVHドメインから成るFvフラグメント；（v）dAbフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）（VHドメインから成る）；及び（vi）単離された相補性決定領域（CDR）が含まれる。単鎖抗体もまた関連する場合には“抗体”という用語に含まれる。したがって、本発明は抗体を提供し、前記は、本発明の酵素と特異的に結合する抗原結合部位及び単鎖抗体を含む。
【０１７５】
前記抗体は、免疫沈澱、染色、イムノアフィニティーカラムなどで用いることができる。所望の場合は、特異的な抗原をコードする核酸配列を、免疫とそれに続くポリペプチド又は核酸の単離、増幅又はクローニング及び本発明のアレイ上へのポリペプチドの固定によって作成することができる。あるいは、本発明の方法を用いて、改変されるべき細胞により産生される抗体の構造を改変することができる。例えば抗体の親和性を強化または低下させることができる。さらにまた、抗体を生成又は改変する能力は本発明の方法により細胞を操作して付与した表現型であり得る。
免疫誘導、抗体（ポリクローナル及びモノクローナル）の作成及び単離の方法は当業者には公知で、さらに学術文献および特許文献に記載されている。例えば以下を参照されたい：Coligan, Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene, NY (1991); Stites (eds.) Basic and Clinical Immunology (7th ed.) Lang Medical Publications, Los Altos, CA (“Stites”); Goding, Monoclonal Antibodies: Priciples and Practice (2nd ed.) Academic Press, New York, NY (1986); Kohler (1975) Nature 256:495; Harlow (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York。抗体はまた、動物を用いる従来のin vivo方法以外でも、in vitroで例えば組換え抗体結合部位発現ファージディスプレーライブラリーを用いて作製することができる。例えば以下を参照されたい：Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15:62-70; Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45。
ポリペプチド又はペプチドを用いて、本発明のポリペプチド又はペプチドと特異的に結合する抗体を作成することができる。得られた抗体をイムノアフィニティークロマトグラフィー方法で用いて、前記ポリペプチドを単離又は精製するか、または前記ポリペプチドが生物学的サンプルに存在するか否かを決定することができる。そのような方法では、本発明のポリペプチドの1つと特異的に結合することができる抗体と、タンパク質調製物（例えば抽出物）又は生物学的サンプルを接触させる。
イムノアフィニティーの方法では、前記抗体を固体支持体（例えばビーズまたは他のカラムマトリックス）に付着させる。抗体が本発明のポリペプチドの1つと特異的に結合する条件下で、前記タンパク質調製物を前記抗体と接触させる。洗浄して非特異的に結合したタンパク質を除去した後、特異的に結合したポリペプチドを溶出させる。
【０１７６】
生物学的サンプル中のタンパク質の前記抗体との結合能力は、当業者に周知の多様な方法のいずれかを用いて決定できる。例えば、結合は抗体を検出可能な標識（例えば蛍光物質、酵素標識又は放射性同位元素）で標識することによって決定できる。あるいは、抗体とサンプルとの結合は、前記のような検出可能な標識をその上に保持する二次抗体を用いて検出してもよい。具体的なアッセイにはELISAアッセイ、サンドイッチアッセイ、放射能免疫アッセイ及びウェスタンブロットが含まれる。
本発明のポリペプチドに対して作成されるポリクローナル抗体は、動物に前記ポリペプチドを直接注射することによって、または非ヒト動物に前記ポリペプチドを投与することによって得ることができる。そのようにして得られた抗体は前記ポリペプチド自体と結合するであろう。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえも完全な天然のポリペプチドと結合することができる抗体の作成に用いることができる。続いて前記のような抗体を用いて、そのようなポリペプチドを発現している細胞から前記ポリペプチドを単離することができる。
モノクローナル抗体の調製の場合、持続的細胞株培養によって生成される抗体を提供するいずれの技術も用いることができる。その例にはハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術及びEBV-ハイブリドーマ技術が含まれる（例えば以下を参照されたい：Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975）。
単鎖抗体の作成のために記載された技術（例えば米国特許第4,946,778号を参照されたい）を利用して、本発明のポリペプチドに対する単鎖抗体を生成することができる。あるいは、トランスジェニックマウスを用いて、これらポリペプチド又はそのフラグメントに対するヒト化抗体を発現させることができる。
本発明のポリペプチドに対して作成された抗体を他の生物およびサンプルに由来する類似のポリペプチドのスクリーニングに用いることができる。そのような技術では、前記生物由来のポリペプチドを抗体と接触させ、前記抗体と特異的に結合するポリペプチドが検出される。上記に記載したいずれの方法も抗体結合の検出に用いることができる。
【０１７７】
固定化ポリペプチド
ある特徴では、ポリペプチド（本発明のペプチド、酵素及び抗体を含む）は固定化形態として用いられる。固定化した本発明のペプチド、酵素及び抗体を、例えば除染のために用いることができる。いずれの固定化方法も支持形態（例えばアレイ、ビーズ、キャピラリー支持体など）も、上記に記載したように用いことができる。ある特徴では、ペプチド/酵素/抗体の固定化は、不活性支持体、例えばジエチルアミノエチル-セルロース、多孔性ガラス、キチン又は細胞上で実施することができる。
あるいは、本発明のペプチド、酵素及び抗体を発現する細胞を、例えばグルタルアルデヒドによる架橋によって基質表面に固定することができる。界面活性剤（例えばポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル又はポリグリセロール脂肪酸エステル）とともに、乾燥した多孔性粒状疎水性支持体に結合させた酵素を含む、本発明の固定化酵素を調製することができる。前記支持体は、脂肪族オレフィンポリマー、例えばポリエチレン又はポリプロピレン、スチレンのホモ-若しくはコポリマー又は前記の混合物、又は前処理無機支持体でもよい。これら支持体を疎水性にするために、前記支持体は、脂肪族オレフィンポリマー、酸化ポリマー、前記ポリマーの混合物、又は前処理無機支持体から選択される。この前処理は、有機シリコン化合物によるシラン化を含むことができる。無機材料はシリカ、アルミナ、ガラス又はセラミックであり得る。支持体は、ポリスチレンから、スチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンのコポリマーから、又はアクリレート（メタクリレート）由来コポリマーから作成することができる。例えば米国特許5,773,266号を参照されたい。
【０１７８】
キット
本発明は、組成物（例えば本発明の核酸、発現カセット、ベクター、細胞、トランスジェニック種子又は植物若しくは植物部分、及び/又はポリペプチド（例えばペプチド、酵素又は抗体））を含むキットを提供する。前記キットはまた、本発明の除染、中和又は解毒用組成物を含むことができる。前記キットはまた、本明細書に記載したような、本発明の方法論の利用及び本発明の使用について、例えば本発明の工業的、軍事的、自国の安全保障的使用についてのプロトコルを教示/周知させる指示物を含むことができる。
【０１７９】
代謝パラメーターの測定
本発明の方法は、細胞の遺伝的構成を改変することによって、新規な表現型を有する新規な細胞株を開発するために、全細胞進化又は全細胞操作を提供し、この場合、前記遺伝的構成は、本発明の酵素、例えば本発明の酵素コード核酸の細胞への導入によって改変される。新規な表現型を検出するために、改変細胞の少なくとも1つの代謝パラメーターを“リアルタイム”又は“オンライン”時間枠でモニターする。ある特徴では、複数の細胞（例えば細胞培養）が“リアルタイム”又は“オンライン”でモニターされる。ある特徴では、複数の代謝パラメーターが“リアルタイム”又は“オンライン”でモニターされる。代謝パラメーターは本発明の蛍光ポリペプチド（例えば蛍光部分を含む本発明の酵素）を用いてモニターできる。
代謝フラックス分析（MFA）は公知の生化学的フレームワークを基にしている。質量保存の法則及び細胞内代謝に関する擬似定常状態仮説（pseudo-steady state hypothesis, PSSH）に基づいて線形独立代謝行列が構築される。本発明の方法の実施に際して、以下を含む代謝ネットワークが確立される：
−全ての経路の基質、生成物および中間代謝物の実体；
−前記経路の代謝物を変換する全ての化学反応、前記経路の反応の化学量論の実体；
−前記反応を触媒する全ての酵素、前記酵素反応のカイネティクスの実体；
−経路の成分間の調節的相互反応、例えばアロステリック相互反応、酵素-酵素相互反応など；
−酵素の細胞内区画局在性又は前記酵素の他のいずれかの超分子的構成；及び
−代謝物、酵素またはエフェクター分子の何らかの濃度勾配又はそれらの移動に対する拡散障壁の存在。
ある株について前記代謝ネットワークがいったん確立されたら、オンラインメタボロームデータが利用可能ならば行列認識によって数学的提示を導入し、細胞内代謝フラックスを見積もることができる。代謝表現型は細胞内の完全な代謝ネットワークの変化を必要とする。代謝表現型は、環境条件、遺伝的調節、発育状態および遺伝子型などに対応する経路の利用変化に左右される。本発明の方法のある特徴では、オンラインMFA計算の後で、細胞の動的態様、それらの表現型及び他の特性が前記経路の利用を精査することによって分析される。例えば、酵母の発酵時にグルコースの供給が増加し、酸素が減少する場合、呼吸経路の利用は低下及び/又は停止し、発酵経路の利用が優先的になるであろう。細胞培養の生理的状態の制御は前記経路分析の後で可能になるであろう。本発明の方法は、基質供給、温度、誘発物質の使用などをどのように変化させるか、細胞の生理的条件を制御して所望の方向にどのように誘導するかを決定することによって発酵の操作方法の決定に役立てることができる。本発明の方法の実施に際して、MFAの結果はまた、代謝の操作又は遺伝子シャッフリングなどのための実験及びプロトコルの設計のために転写物データ及びタンパク質データと比較することができる。
本発明の方法の実施では、任意の改変表現型又は新規な表現型（細胞の新規な又は改善された性状を含む）を付与しこれを検出することができる。代謝又は増殖のいずれの特徴もモニターすることができる。
【０１８０】
mRNA転写物発現のモニタリング：本発明のある特徴では、操作される表現型は、細胞内でのmRNA転写物の発現の増加若しくは減少、又は新規転写物の生成を含む。この発現増加又は低下は、本発明の酵素コード核酸の使用によって追跡することができる。mRNA転写物（又はメッセージ）はまた、当業界で公知の任意の方法（例えばノザンブロット、定量的増幅反応、アレイへのハイブリダイゼーションなどを含む）によって検出及び定量することができる。定量的増幅反応は、例えば定量的PCR（例えば定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（又はRT-PCR）を含む）；定量的リアルタイムRT-PCR（又は“リアルタイムカイネティックRT-PCR”）を含む（例えば以下を参照されたい：Kreuzer (2000) Br. J. Haematol. 114:313-318; Xia (2001) Transplantation 72:907-914）。
本発明のある特徴では、操作される表現型は、相同遺伝子の発現をノックアウトすることによって作出される。前記遺伝子のコード配列又は1つ以上の転写制御エレメント（例えばプロモータ又はエンハンサー）をノックアウトすることができる。したがって転写物の発現は完全に排除されるか、または単に減少させることができる。
本発明のある特徴では、操作される表現型は相同遺伝子の発現の増加を含む。前記は、負の制御エレメント（cis-又はtrans-で作用する転写調節エレメントを含む）のノックアウト、または正の制御エレメントの変異導入によって実施できる。細胞の1つ以上又は全ての転写物は、細胞の転写物、又は細胞の転写物に典型的若しくは前記と相補的な核酸を含むサンプルのハイブリダイゼーションによって、又はアレイ上に固定された核酸とのハイブリダイゼーションによって測定することができる。
【０１８１】
ポリペプチド、ペプチドおよびアミノ酸の発現のモニタリング：本発明のある特徴では、操作される表現型は、細胞内でのポリペプチドの発現の増加若しくは低下、又は新規なポリペプチドの生成を含む。前記の発現増加又は低下は、本発明の酵素又は抗体の使用によって追跡することができる。ポリペプチド、ペプチド及びアミノ酸はまた、当業界で公知の任意の方法（例えば核磁気共鳴（NMR）、分光光度法、ラジオグラフィー（タンパク質放射能標識）、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、高拡散クロマトグラフィー、多様な免疫学的方法、例えば免疫沈澱、免疫拡散、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（RIA）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、免疫蛍光アッセイ、ゲル電気泳動（例えばSDS-PAGE）、抗体による染色、蛍光活性化細胞分類装置（FACS）、熱分解質量分析法、フーリエ変換赤外線分光分析、ラマン分光分析、GC-MS、並びにLC-エレクトロスプレー及びcap-LC-タンデム-エレクトロスプレー質量分析などを含む）によって検出および定量することができる。新規な生物活性はまた、米国特許第6,057,103号に記載された方法又はその変法を用いてスクリーニングできる。さらにまた以下で詳細に考察するように、細胞のポリペプチドの1つ以上、またはその全てをタンパク質アレイを用いて測定することができる。
【０１８２】
工業的及び医学的応用
本発明は、本発明のポリペプチド（酵素、ペプチド、抗体を含む）、例えばヒドロラーゼ活性、エステラーゼ活性、例えば有機リン酸ヒドロラーゼ活性（例えば有機リン酸エステラーゼ活性）、又はカルボキシルエステラーゼ活性、ハロペルオキシダーゼ活性、例えばヘム型（hCPO）若しくは非ヘムクロロペルオキシダーゼ（nhCPO）活性、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性、デハロゲナーゼ活性、オキシドレダクターゼ活性、プロリダーゼ活性、イミドジペプチダーゼ活性、及び/又は有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）活性を有するポリペプチド（除染活性をもつ他の酵素を含む）について、本明細書に記載されるように、例えば毒素又は毒物の除染のために（例えば神経作用物質の解毒又は生物剤の解毒又は中和（例えば炭疽及びその芽胞に対し）を含む）、多くの工業的使用及び医学的利用を提供する。したがって、また別の特徴では、本発明は、例えば毒素、例えば神経作用ガス、例えばV剤（VX剤）、G剤（サリン、ソマン、シクロサリン）又はH剤（例えばマスタードガス）及び/又は生物剤を、民事的、軍事的及び/又は自国の安全保障の目的のために除染する組成物及び方法を提供する。
【０１８３】
非ヘムクロロペルオキシダーゼ（nhCPO）：
本発明は、クロロペルオキシダーゼ活性（非ヘムクロロペルオキシダーゼ（nhCPO）又はヘム型クロロペルオキシダーゼ活性を含む）を有するポリペプチドを、例えばリグニン又は他の天然の産物の漂白及び分解のために提供する。
ある特徴では、これらの酵素は次亜ハロゲン酸塩形成、酸素転移及びパーヒドロリシス(perhydrolysis)の作用メカニズムを有する。通常又は高処理アッセイを用いて酵素の活性を決定することができる。例えば酵素が本発明のヘム又は非ヘムCPOであるか否か、例えばポリペプチドが、例えば以下の文献に記載されたように本発明の範囲内に包含されるか否かを決定することができる：Pelletier (1995) Biochim Biophys Acta 1250:149-157（非ヘムクロロペルオキシダーゼによるハロゲン化アッセイを記載）；Hofmann (1998) J Mol Biol 279:889-900（非ヘムクロロペルオキシダーゼの構造を記載）；Picard (1997) Angew Chem Int Ed Engl 36:1196-1199（非ヘムクロロペルオキシダーゼにより過酸化水素（H2O2）を活性化して過酢酸の生成を決定するアッセイを記載）；Pelletier (1994) Microbiology 140:509-516（非ヘムクロロペルオキシダーゼのクローニングを記載）。
非ヘムクロロペルオキシダーゼに対し相同性を有する酵素をコードする遺伝子配列が環境DNAライブラリーから発見された。前記配列には、配列番号:76（例えば配列番号:75によってコードされる）、配列番号:78（配列番号:77によってコードされる）及び配列番号:86（配列番号:85によってコードされる）に記載の配列を有する例示的ポリペプチドが含まれる。これらの酵素は金属補助因子をもたないが、セリンヒドロラーゼモチーフ（Gly-x-Ser-x-Gly）を利用してハロゲン化反応を生じて過酸化水素及び塩化物、臭化物又はヨウ化物から次亜ハロゲン酸塩を生成する。このメカニズムによって生じる求電子物質は有機基質をハロゲン化することができる。前記酵素はまた、過酸化水素から有機基質への酸素の転移を触媒することができる。パルプ及び紙製品中のリグニンの化学的漂白は次亜ハロゲン酸塩を大過剰で使用し、莫大な製造コスト及び不要副産物除去コストをもたらす。これらの新規な酵素は、紙製造工程で触媒的及び局所的に作用して次亜ハロゲン酸塩を形成し、高価で環境的負荷の高い化学的次亜ハロゲン酸塩発生の代用となりえる。
【０１８４】
これら新規な酵素はまた、O,O-ジイソプロピルS-(2-ジイソプロピルアミノメチル)ホスホロチオレート（テトリソ（Tetriso））を分解することが示され、本発明のアッセイで代用基質として用いられた。
本発明のnhCPOはブチリルコリンエステラーゼの解毒を目指して鋭意努力の結果発見され、これらの酵素は前記物質のP-S結合を加水分解することによる阻害剤である。環境ライブラリーヒットに由来する179個の候補酵素が、10μMのテトリソに対する分解活性を基準にしてより大きな収集物（20,000クローン）から選別された。前記アッセイは、ブチリルコリンエステラーゼ（BChE）に対するテトリソ阻害活性を基準にし、検出試薬としてレゾルフィンブチレートを使用する。レゾルフィンブチレートのBchEによる酵素的加水分解は、蛍光発光によって検出されるレゾルフィン陰イオンを生成する。酵素ヒットは、テトリソ分解活性を含む宿主培養で検出される蛍光発光強度を基準にしてスクリーニングされた。P-F結合の加水分解活性を有する、3つの別個の酵素（配列番号:76（例えば配列番号:75によってコードされる）、配列番号:78（配列番号:77によってコードされる）及び配列番号:86（配列番号:85によってコードされる）に記載の配列を有する例示的ポリペプチド）が最終的に同定された。これらの酵素の配列は、nhCPO酵素ファミリーと相同であることが判明した。
【０１８５】
自己防衛的農薬耐性作物植物：
ある特徴では、本発明は、2つのクラスの有機リン酸エステラーゼに分けることができる活性を有する本発明のポリペプチド（酵素、ペプチド、抗体を含む）を提供する。前記は、ある特徴ではアセチルコリンエステラーゼ-又はブチリルコリンエステラーゼ-阻害物質（例えば農薬として利用される阻害物質）をP-S又はP-F結合を加水分解することによって迅速に解毒する。それらをコードする核酸（ベクター並びにこれら有機リン酸エステラーゼコード核酸を含むトランスジェニック細胞及び植物を含む）もまた提供される。ある特徴では、本発明は、これらの酵素配列を（例えば作物植物で）発現することができるトランスジェニック細胞及び植物（及び種子）を提供して、自己防衛的農薬耐性植物、例えば自己防衛的農薬耐性作物植物を提供する。ある特徴では、本発明のトランスジェニック細胞及び植物系は、農薬使用条件下で細胞又は植物（例えば作物）の旺盛な成長及び発育を維持するために植物又は細胞防衛を提供する。本発明の有機リン酸エステラーゼ活性を有するポリペプチドはまた直接細胞又は植物に適用してもよいが、或いは核酸、ベクター又は感染体そのもの（例えばファージ、ウイルス、菌類など）を用いて細胞、植物又は作物を感染させるか若しくは前記に形質導入して、有機リン酸エステラーゼの細胞内、植物内又は作物内発現を達成し、それによって自己防衛的農薬耐性細胞、植物又は作物を生じることができる。ある特徴では、このような発現（たとえばベクター、ウイルス、菌類などからの発現）は誘導性である。ある特徴では、前記発現は構成的である。したがって、本発明は、ポリペプチド、核酸、感染性ビヒクル（例えば本発明の有機リン酸エステラーゼコード核酸を含むウイルス、ファージ）、形質導入若しくは感染細胞又は植物及び/又はトランスジェニック植物、並びにそれらを使用する方法、例えば自己防衛的農薬耐性細胞又は植物を提供する方法を提供する。本発明はいずれの特定の作用メカニズムにも限定されないが、本発明の有機リン酸エステラーゼは、アセチルコリンエステラーゼ又はブチリルコリンエステラーゼの阻害物質中のP-S又はP-E結合を加水分解するために作用することができる。したがって、ある特徴では、本発明の組成物及び方法を用いて、農薬阻害剤を解毒することができる。ある特徴では、農薬とは対照的に、本発明の組成物及び方法は、それらは本質的に農薬を解毒するので、それらが適用される植物に対して毒性をもたない。
ある特徴では、本発明の組成物及び方法は以下の農薬、並びにその類似体及び等価物を解毒するために用いられる：デメトン-S、デメトン-S-メチル、デメトン-S-メチルスルホン、デメトン-メチル、パラチオン、フォスメト、カルボフェノチオン、ベノキサフォス、アジンフォス-メチル、アジンフォス-エチル、アミトン、アミジチオン、シアントエート、ジアリフォス、ジメトエート、ジオキサチオン、ジスルフォトン、エンドチオン、エチオン、エトエート-メチル、フォルモチオン、マラチオン、メルカルバム、オメトエート、オキシデプロフォス、オキシジスルフォトン、フェンカプトン、フォレート、フォサロン、プロチダチオン、プロトエート、ソファミド、チオメトン、ヴァミドチオン、及び/又はメタミドフォス。
【０１８６】
毒性物質の除染、中和及び解毒：
ある特徴では、本発明は、民事、軍事及び/又は国土の安全保障の目的のために、ポリペプチド（本発明の酵素、ペプチド、抗体を含む）及び酵素の新規な混合物/処方物/組合せ物（本発明のポリペプチド、公知の酵素又はその混合物を含む）を、例えば毒素（例えば神経作用物質、例えばV剤（VX剤）、G剤（サリン、ソマン、シクロサリン、タブン）又はH剤（例えばマスタードガス）及び/又は生物剤（例えば炭疽）の除染、中和又は解毒のために提供する。H剤（マスタード）及び持続的な神経作用物質VXは、容易に酸化反応を受ける硫黄分子を含み、したがって、本発明は、硫黄含有毒素、例えばH剤（例えばマスタードガス）の酸化を触媒するポリペプチド及び方法を提供する。V剤（例えばVX）及びG剤（G神経作用物質）は、加水分解され得るリン基を含み、したがって、本発明は、リン含有毒素、例えばVXの酸化を触媒するポリペプチド及び方法を提供する。
本発明の除染、中和又は解毒組成物（例えば本発明の酵素混合物/処方物/組合せ物）及び方法を実施するために用いられる酵素（本明細書に記載した、V剤、H剤、G剤及び生物剤の除染、中和又は解毒のための例示的組合せを含む）はまた、ヒドロラーゼ、例えばエステラーゼ（例えばコリンエステラーゼ）、有機リン酸ヒドロラーゼ（例えば有機リン酸エステラーゼ）、カルボキシルエステラーゼ、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ及びオキシドレダクターゼの使用を、既に記載したハロペルオキシダーゼ、例えばヘム型（hCPO）又は非ヘムクロロペルオキシダーゼ、デハロゲナーゼ、プロリダーゼ、イミドペプチダーゼ及び有機リン酸アンヒドロラーゼの使用に加えて含む。
本発明の組成物及び/又は方法の実施によって除染、中和及び/又は解毒できる毒性物質には以下が含まれる：
【０１８７】
【化１】
2009517002.tif 000023
【０１８８】
V剤：
ある特徴では、本発明は、酵素（例えばハロペルオキシダーゼ（クロロペルオキシダーゼ（CPO）を含む））、及び酵素の混合物/処方物//組合せを、V剤、例えばVX、ソヴィエトVガス（ロシアVX）、テトリソ又は関連化合物（下記の表を参照）（例えば任意のホスホリルチオコリン化合物）の除染、中和又は解毒のために提供する。ハロペルオキシダーゼ、例えばCPOは全てのVX立体異性体を酸化によって分解する。
本発明のクロロペルオキシダーゼ並びに本発明の除染、中和又は解毒処方物及び方法の実施に用いられる酵素の活性はまた、メチルホスホノフルオリデート及び/又はチオリン酸エステルの加水分解の触媒（触媒能力）を含む活性を含むことができる。本発明の組成物（例えば酵素の混合物/処方物/組合せ）及び/又は方法は、以下に対して用いることができる：
本発明の組成物及び方法によって除染されるV剤シリーズ
2009517002.tif 000024
【０１８９】
VXはまた、化学名メチルホスホノチオ酸、S-[2-[ビス(1-メチルエチル)アミノ]エチル]-O-エチルエステルの名称で呼ばれ、分子式C11H26NO2PS及び式量267.37、CAS登録番号50782-69-9を有する。VRは、“油状”コンシステンシーをもつ液体の有機リン酸神経作用物質で、純粋な場合は無色であり、O-イソブチルS-(2-ジエチルアミノエチル)メチルホスホチオエート；O-イソブチルS-(2-ジエチルアミノエチル)メチルチオホスホネート；O-イソブチルS-(N,N-ジエチルアミノエチル)メチルホスホノチオエート；ロシアV-ガス；ロシアVX、RVXとも呼ばれる。テトリソ（Tetriso）（前記はまた本発明の酵素によって解毒される）はVX類似体であり、化学名O,O-ジイソプロピルS-(2-ジイソプロピルアミノエチル)ホスホロチオレートを有する。
神経作用物質の毒性は典型的には2つの方法、LCt50及びLD50で表される。LCt50は、蒸気形の吸入毒性を指す。“Ct”は、個体が暴露される時間（分で測定）を掛けた空気中の蒸気又はエーロゾルの濃度（mg/m3として測定）を指す。10mg.分/m3で、VXは神経作用物質で最大の毒性を示す（表2参照）。VXはまた神経作用物質でもっとも揮発性が低い。この特性によってVXは経皮的及び皮膚ルートで危険である。対照的に、G剤は皮膚に浸透するのではなく揮発しやすい。要約すれば下記のとおりである：
神経作用物質の毒性及び半減期
2009517002.tif 000025
【０１９０】
本発明の除染、解毒（中和）方法（V剤の除染/解毒/中和を含む）は、当業界で公知の任意の除染、解毒（中和）プロトコルと併用して実施できる。前記公知のプロトコルは例えば以下に記載されているようなものである：Yang (1999) Chemical detoxification of nerve agent VX, Acc Chem Res 32:109-115；Szafraniec (1990) On the Stoichiometry of Phosphonothiolate Ester Hydrolysis, CRDEC-TR-212, July 1990, AD-A250773；Epstein (1974) The kinetics and mechanisms of hydrolysis of phosphonothiolates, Phosphorus, 4:157-163；Ketelaar (1956) Metal-catalyzed hydrolysis of thiophosphoric esters, Nature 177:392-393；Albizo et al. Hydrolysis of GD and VX, in Proceedengs, Army Science Conference (16th), Vol 1, 25-27 October 1988, pp.33-37, AD-A203101；Yang (1993) Perhydrolysis of nerve agent VX, J Org Chem 58:6964-6965；Yang (1992) Decontamination of chemical warfare agents, Chem Rev 92:1729-1743；Yang (1990) Oxidative detoxification of phosphonothiolates, J Am Chem Soc 112(18):6621-6627。
例えばある特徴では、本発明は、V剤の除染、中和又は解毒のために、少なくとも1つのハロペルオキシダーゼ及び/又はプロリダーゼ、イミドペプチダーゼ及び/又は有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）の混合物/処方物//組合せを提供する。
ある特徴では、前記プロリダーゼは、配列番号:193に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、または配列番号:194に記載されるアミノ酸配列を有する。
ある特徴では、前記ハロペルオキシダーゼはヘム型ペルオキシダーゼ活性であり、ヘム型ペルオキシダーゼ活性を有する酵素は、例えば配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49、配列番号:51に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、または、前記酵素は、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50若しくは配列番号:52に記載のアミノ酸配列を有する。前記酵素は、配列番号:1に記載の配列を有する核酸によってコードされるヘム型クロロペルオキシダーゼ活性であってもよく、または前記酵素は配列番号:2に記載されるアミノ酸配列を有していてもよい。
【０１９１】
ある特徴では、前記酵素活性は非ヘム型ペルオキシダーゼ活性を含み、例えば前記非ヘム型クロロペルオキシダーゼ活性を有する酵素は、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65若しくは配列番号:67に記載の配列を有する核酸によってコードされてもよく、または前記酵素は、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66若しくは配列番号:68に記載のアミノ酸配列を有する。
ある特徴では、公知の任意のプロリダーゼ、イミドジペプチダーゼ及び/又は有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）を本発明の任意の酵素（本発明のプロリダーゼ、イミドジペプチダーゼ及び/又は有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）又はハロペルオキシダーゼを含む）（例えば米国特許6,080,566号、5,928,927号、6,524,834号、6,469,145号、6,838,277号を参照されたい）と併用して用いることができる。ある特徴では、公知の任意のハロペルオキシダーゼ（例えばクロロペルオキシダーゼ）（例えば米国特許6,251,386号を参照されたい）を本発明の任意の酵素（本発明のプロリダーゼ、イミドジペプチダーゼ及び/又は有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）又はハロペルオキシダーゼを含む）と併用して用いることができる。
別の特徴では、ヒドロラーゼ、例えばエステラーゼ、例えばコリンエステラーゼ、有機リン酸ヒドロラーゼ、例えば有機リン酸エステラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ及びオキシドレダクターゼ（公知の酵素又は前記活性を有する本発明のポリペプチドを含む）がまた、V剤、例えばVX、ソヴィエトV-ガス（ロシアVX）、テトリソ又は関連化合物（例えば任意のホスホリルチオコリン化合物）の除染、中和又は解毒のために本発明の組成物及び方法で用いられ得る。
【０１９２】
H剤：
ある特徴では、本発明は、酵素（例えばハロペルオキシダーゼ（クロロペルオキシダーゼ）及び/又はデハロゲナーゼ及び類似の活性を有する酵素を含む））及び酵素の混合物/処方物/組合せ（ハロペルオキシダーゼ及び/又はデハロゲナーゼ活性を有する本発明のポリペプチド、及び/又は公知のハロペルオキシダーゼ及びデハロゲナーゼを含む）を、H剤、例えばマスタードガス（ある形態では、式1,1'チオビス[2クロロエタン]ビス-(2-クロロエチル)スルフィド；又はベータ,ベータ'ジクロロエチルスルフィド、また2,2'ジクロロエチルスルフィドとしても知られている；又はビス(ベータ-クロロエチル)スルフィド；又は1-クロロ-2-(ベータ-クロロジエチルチオ)エタンを有する）、又は硫黄マスタード、又は“イェロークロスリキッド”の除染又は解毒（中和を含む）のために提供する。
例えば、ある特徴では、本発明は、H剤の除染、中和又は解毒のために、少なくとも1つのハロペルオキシダーゼ及び/又はデハロゲナーゼの混合物/処方物/組合せを提供する。ある特徴では、前記デハロゲナーゼは配列番号:70（例えば配列番号:69によってコードされる）及び/又は配列番号:92（例えば配列番号:91によってコードされる）に記載の配列を有する。本発明は特定のいずれの作用メカニズムによっても制限されないが、ある特徴では、本発明のデハロゲナーゼ、及び本発明の除染/中和/解毒組成物（例えば処方物）及び方法の実施に用いられるデハロゲナーゼは、H剤（例えばマスタードガス）の脱塩素化によって機能する。
ある特徴では、前記ハロペルオキシダーゼはヘム型ペルオキシダーゼ活性であり、例えばヘム型ペルオキシダーゼ活性を有する酵素は、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49若しくは配列番号:51に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は前記酵素は、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50若しくは配列番号:52に記載のアミノ酸配列を有する。前記酵素は、配列番号:1に記載の配列を有する核酸によってコードされるヘム型クロロペルオキシダーゼ活性であってもよく、又は前記酵素は配列番号:2に記載されるアミノ酸配列を有していてもよい。
【０１９３】
ある特徴では、前記酵素活性は非ヘム型ペルオキシダーゼ活性を含み、例えば前記非ヘム型クロロペルオキシダーゼ活性を有する酵素は、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、若しくは配列番号:67に記載の配列を有する核酸によってコードされてもよく、又は前記酵素は、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66、若しくは配列番号:68に記載のアミノ酸配列を有する。
ある特徴では、任意の公知のデハロゲナーゼは、本発明の任意の酵素（本発明のデハロゲナーゼ又はハロペルオキシダーゼを含む）と併用して用いることができる。ある特徴では、任意の公知のハロペルオキシダーゼ（例えばクロロペルオキシダーゼ）（米国特許6,251,386号参照）は、本発明の任意の酵素（本発明のデハロゲナーゼ又はハロペルオキシダーゼを含む）と併用して用いることができる。
別の特徴では、ヒドロラーゼ、例えばエステラーゼ、例えばコリンエステラーゼ、有機リン酸ヒドロラーゼ、例えば有機リン酸エステラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ及びオキシドレダクターゼ（公知の酵素又はこの活性を有する本発明のポリペプチドを含む）はまた、H剤の除染、中和又は解毒のために、本発明の組成物及び方法で併用して用いることができる。
【０１９４】
G剤：
ある特徴では、本発明は、酵素（例えばプロリダーゼ、有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）及び類似の活性を有する酵素）、及び酵素の混合物/処方物/組合せ物（プロリダーゼ及び/又はOPAA活性を有する本発明のポリペプチド、及び/又は公知のプロリダーゼ又はOPAAを含む）を、G剤（有機リン酸神経作用物質）、例えばタブン（GA）サリン（GB）、ソマン（GD）及びシクロサリン（GF）（上記もまた参照されたい）の除染又中和又は解毒（中和を含む）のために提供する。ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性を有するポリペプチド（例えば配列番号:71に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、又は配列番号:72に記載されるアミノ酸配列を有する）もまた、G剤の除染/中和/解毒のために本発明の組成物（例えば酵素の混合物/処方物//組合せ）及び方法で用いることができる。
ある特徴では、本発明のプロリダーゼ及び有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）又は本発明の実施に用いられる公知のプロリダーゼ及び/又はOPAAは、有機亜リン酸（organophosphorous）化合物ソマンの加水分解を触媒し、さらにまたある特徴では、ジペプチドGly-Proの加水分解を触媒する。
サリン（GB）は、化学名メチルホスホノフルオリド酸(1-メチルエチル)エステルを有し、分子式C4H10FO2P及び式量140.09を有する。そのCAS（Chemical Abstracts Service）登録番号は107-44-8である。
サリン及び他のG剤は、塩基性溶液（例えばNa2CO3、NaOH、又はKOH1）中で急速に加水分解される。GBは25ECでpH11において0.5分の半減期を有する。本発明は、G剤の加水分解について公知の手段を併用して実施することができる（前記公知の手段には例えば以下が含まれる：GB加水分解用の公知の触媒、例えば次亜塩素酸塩陰イオン（OCl-）、いくつかの金属イオン及びそれらの複合体（Cu2+、UO2+2、ZrO+2、MoO2+2、Th+4）及びヨードソ安息香酸誘導体）。本発明のプロトコルに取り入れることができる、前記化学反応による除染系には以下が含まれる：
・種々のタイプの漂白剤（NaOCl-又はCa(OCl-)2）を含む固体、粉末及び溶液；
・DS2（2％NaOH、70％ジエチレントリアミン、28％エチレングリコールモノメチルエーテル）；
・水、フェノール、エタノール及びアンモニアに溶解したNAOHで湿らせたタオル。
【０１９５】
本発明は、G剤の加水分解について公知の手段を併用して実施することができる。前記手段には以下に記載されたものが含まれる：Yang (1992) Decontamination of chemical warfare agents, Chem Rev 92:1729-1743；Gustafson (1962).....chelate-catalyzed hydrolysis of isopropyl methylphosphonofluoridate (Sarin) J Am Chem Soc 84:2309-2316；Hammond (1989) Hydrolysis of toxic organophosphorus compounds by o-iodosobenzoic acid and its derivatives, J Am Chem Soc 111:7860-7866。
G-シリーズの神経作用物質は、多数の共通の物理的及び化学的特性を共有する。室温では、G-シリーズの神経作用物質は揮発性液体であり、そのために液状の神経作用物質との皮膚接触又は神経作用物質の蒸気の吸入による暴露は極めて危険となる。GBは、これらの物質でもっとも揮発性であり、水と同じ速度で蒸発する。GDはその次に揮発性である。散布装置又は爆薬の爆破により神経作用物質がエーロゾル化され得る。神経作用物質の蒸気は空気より重く、そのために低地又は地下シェルターの人々にとって特に有害となる。GB及びGDは無色であるが、GAは無色から褐色である。GBは無臭であるが、GA及びGDは果実臭がある。
別の特徴では、ヒドロラーゼ、例えばエステラーゼ、例えばコリンエステラーゼ、有機リン酸ヒドロラーゼ、例えば有機リン酸エステラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ及びオキシドレダクターゼ（この活性を有する公知の酵素及び本発明のポリペプチドを含む）もまた、G剤の除染/中和/解毒のための本発明の組成物（例えば酵素の混合物/処方物/組合せ）及び方法で用いることができる。
【０１９６】
生物剤：
ある特徴では、本発明は、酵素（例えばハロペルオキシダーゼ（クロロペルオキシダーゼ、デハロゲナーゼ、プロリダーゼ、有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）及び類似の活性を有する酵素を含む）、及び酵素の混合物/処方物/組合せ（類似の活性を有する本発明のポリペプチドを含む）を、生物剤（例えば生物学的兵器（天然に存在する生物剤、例えば細菌（例えば炭疽菌（Bacillus anthracis））の芽胞及び毒素を含む）の除染又解毒（中和を含む）のために提供する。
本発明の実施によって中和、軽減、隔離又は殺滅される有毒な生物剤には、例えば炭疽菌の芽胞、炭疽を引き起こす細菌が含まれる。炭疽菌の芽胞は乾燥、極寒及び他の激烈な条件下で数十年にわたって生存し、いったん動物及び人間宿主の体内に入ればほぼ瞬時に発芽し感染して前記を殺滅することができる。
炭疽芽胞は慣習的な飲料水消毒方法では生存して水道管の内側表面にそれら自身を付着させることができるので、本発明の組成物を用いて、水道水中への炭疽の放出という稀な事象において水処理施設を消毒することができる。高濃度の塩素は炭疽の死滅に有効である。5mg/L（飲料水が濁っている期間中に処理系によって用いられ得る濃度）では、97％の芽胞が1時間後に死滅する。10mg/L（高度に塩素添加されたスィミングプールと類似の濃度）では、99.99％が死滅するが、前記塩素濃度は飲料用水としては高すぎる。
例えば、ある特徴では、本発明は、少なくとも1つのハロペルオキシダーゼの混合物/処方物/組合せを、生物剤（例えば細菌（例えば炭疽菌）の芽胞及び毒素）の除染、中和又解毒のために提供する。ある特徴では、前記ハロペルオキシダーゼはヘム型ペルオキシダーゼ活性を有し、例えばヘム型ペルオキシダーゼ活性を有する酵素は、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49、若しくは配列番号:51に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、または、前記酵素は、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50若しくは配列番号:52に記載のアミノ酸配列を有する。前記酵素は、配列番号:1に記載の配列を有する核酸によってコードされるヘム型クロロペルオキシダーゼ活性であってもよく、または前記酵素は配列番号:2に記載されるアミノ酸配列を有していてもよい。
【０１９７】
ある特徴では、前記酵素活性は非ヘム型ペルオキシダーゼ活性を含み、例えば前記非ヘム型クロロペルオキシダーゼ活性を有する酵素は、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65若しくは配列番号:67に記載の配列を有する核酸によってコードされてもよく、または前記酵素は、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66若しくは配列番号:68に記載のアミノ酸配列を有する。
ある特徴では、任意の公知のハロペルオキシダーゼ（例えばクロロペルオキシダーゼ）（例えば米国特許6,251,386号参照）を本発明の任意の酵素（本発明のハロペルオキシダーゼを含む）と併用して用いることができる。
別の特徴では、ヒドロラーゼ、例えばエステラーゼ、例えばコリンエステラーゼ、有機リン酸ヒドロラーゼ、例えば有機リン酸エステラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ及びオキシドレダクターゼ（公知の酵素又はこの活性を有する本発明のポリペプチドを含む）もまた、生物剤（例えば細菌（例えば炭疽菌）の芽胞及び毒素）の除染、中和又は解毒のために、本発明の組成物及び方法で用いることができる。
ある特徴では、少なくとも1つのハロペルオキシダーゼを含む本発明の混合物/処方物/組合せはまた、亜ハロゲン酸塩成分（例えば亜ハロゲン酸塩成分を含む溶液）、例えば亜塩素酸塩成分（例えば亜塩素酸ナトリウム又は亜ヨウ素酸ナトリウム）を含む亜ハロゲン酸塩成分を含む（前記は、ハロペルオキシダーゼ、例えばCPOを、生物学的試薬のためであろうと又は他の毒性物質のためであろうと除染試薬として使用することを含む本発明の全ての特徴のまた別の実施態様である）。ある特徴では、前記酵素及び亜塩素酸塩成分はClO2（二酸化塩素）を形成する。
【０１９８】
処方物及び装置：
本発明のポリペプチド（例えば酵素、ペプチド、抗体）、及び/又は本発明の組合せ物/混合物/処方物は、本発明の除染、解毒（中和）方法の実施で所望の効果を達成するために処方することができる。所望の効果は、治療的（例えば解毒、中和及び/又は除染作用）又は予防的（防止的）効果であり得る。ある特徴では、本発明のポリペプチドは、乳化剤、安定化剤、起泡剤、界面活性剤、泡沫、噴射剤、リポソーム、ナノ構造物などとともに処方されるか、又は適切な化合物とともに処方して乳剤を生成することができる。
本発明の除染、解毒（中和）方法の実施において、及び本発明のポリペプチド（例えば酵素、ペプチド、抗体）の適用において、任意の公知の適用装置を用いることができる。例えば任意の噴霧装置又は泡沫形成装置（例えば皮膚の局所的塗布のため）、又は本発明の酵素若しくは処方物/組合せ物/混合物の直接吸引のための任意の吸入装置又はネブライザー、例えば米国特許出願公開公報20060039870に記載された吸入装置又はネブライザーの使用である。
任意の肺デリバリー装置、例えば吸入装置（例えば乾燥散剤吸入装置）又はネブライザー（前記は当業界で周知である）を用いることができる。肺デリバリー装置は周知で、活性物質（化合物、抗体、ポリペプチド及びタンパク質を含む）をデリバリーすることによって肺臓及び肺システムで局部効果を提供する。肺デリバリー装置は、肺上皮の大きな表面積により活性物質のより高い生体利用性を提供し、より低用量及びより少ない副作用を可能にする。さらにまた、肺デリバリー装置は、コスト効率性を有し、使用が容易で、かつ非侵襲性である。
ある特徴では、本発明を実施するための肺デリバリー装置は吸入によって始動させることができる。前記は活性物質（例えば本発明の酵素又は組合せ処方物）を吸入時に自動的に分配することができる。本発明の酵素又は組合せ処方物を含むエーロゾル容器を用いることができる。ある特徴では、これらの装置は噴射剤の使用を含むことができる。
【０１９９】
本発明の実施に用いられる装置（例えば肺デリバリー又は局所デリバリー用）は、複数の計測用量を管理された態様で投与することができ、対象者の皮膚、口、気管支道、肺上皮への制御された一定用量の投薬を可能にする。本発明の実施に用いられる装置は、一定体積の活性物質を発射するために噴射剤を利用することによって機能し得る。前記活性物質は対象者に吸着及び/又は吸入される。
本発明の処方物及び/又は本発明の実施に用いられる装置は界面活性剤を含み、“活性作用因子”（例えば本発明の酵素又は組合せ処方物）の凝集を防ぐことができる。“活性作用因子”は溶液に溶解又は懸濁することができる。本発明の実施に用いられる装置は、同時吸入（肺:吸入装置の場合）又は表面適用（皮膚又は口へのデリバリー装置の場合）のため、及び活性物質の活性化のために噴射剤を利用することができる。ある特徴では、保持用チャンバー（例えばスペーサー）を用いて、エーロゾル化された“活性作用因子”を貯蔵し、同時の活性化及び吸入の必要性を排除する。ある特徴では、本発明の実施に用いられる装置は、活性物質の一定の計測用量を提供し、一定の投薬を可能にする。
本発明の実施での使用に適した肺デリバリー装置の例は、例えば米国特許5,290,539号、6,615,826号、4,349,945号、6,460,537号、6,029,661号、5,672,581号、5,586,550号、5,511,540号、米国特許出願公開公報20060039870号に記載されている。
別の特徴では、ネブライザーを用いて、“活性作用因子”、例えば本発明の酵素又は組合せ処方物を含む組成物がデリバーされる。ネブライザーは、霧状物を発生させることによって、すなわち溶液状態の本発明の組成物をネブライズ又は霧状化することによって機能し得る（前記霧状物が対象者に吸入される）。活性作用因子は溶液に溶解又は懸濁することができる。微小滴は当業界で公知の任意の方法（ファン、振動成分、又は超音波装置の使用を含む）によって生成することができる。ネブライザーは、本発明の実施に用いられる吸入装置及び動力供給式推進装置よりも“穏やか”であり、吸入装置を使用できない個体（例えば幼児、小児及び重症又は重度能力低下個体）に適切であり得る。ネブライザーの例は例えば米国特許6,029,661号、6,748,945号、6,530,370号、6,598,602号、6,009,869号に記載されている。
【０２００】
本発明の実施に用いられる装置（例えば肺デリバリー又は局所デリバリー用）は、対象者が“飲みこむ”（口に投与される）か又は吸入する乾燥粉末を提供することができる。乾燥粉末を分配するために、当業界で公知の任意の方法（空気システム、動力供給式ファン、機械的推進力（例えば容器の圧縮）を含む）を用いて活性作用因子を噴射することができる。例示的装置は、対象者による吸入時に簡単に操作することができる。ある特徴では、活性作用因子は噴射剤と混合される。別の特徴では、混合は行われず、したがってより大きな活性作用因子のペイロードがデリバーされる（例えば米国特許6,029,661号を参照されたい）。
ある特徴では、本発明の実施に用いられる装置は、例えば皮膚適用、口内投与又は肺への吸入のために本発明の液体又は乾燥粉末処方物のエーロゾルを発生させ、さらにある特徴では、噴射剤が使用される。任意の噴射剤を用いることができ、前記は、例えばクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン又はヒドロカーボンである（トリフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、及び1,1,1,2-テトラフルオロエタン又はその組合せを含む）（例えば米国特許5,672,581号に記載された噴射剤組成物を参照されたい）。
本発明はまた、皮膚、口内及び/又は肺投与のための、当業界で公知の任意の方法を包含する。前記は例えば皮内又は局所投与、気管内吸入、通気又は挿管によるデリバリーである。本発明はまた、本発明の処方物の溶液、粉末又は霧状物による口中へのデリバリー、又は注射筒、管または類似の装置による皮膚上若しくは皮内へのデリバリーを含むことができる。
本発明はまた、組成物、例えば本発明の酵素又は組合せ処方物を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、本発明の酵素又は組合せ処方物を1つ以上の医薬的又は生理学的に許容可能な担体、稀釈剤、又は賦形剤とともに含むことができる。医薬組成物はまた、緩衝剤（例えば中性緩衝食塩水又はリン酸緩衝食塩水、PBS）、炭水化物（例えばグルコース、マンノース、シュクロース又はデキストロース）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド又はアミノ酸（例えばグリシン）、抗酸化剤、キレート剤（例えばEDTA）又はグルタチオン、アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）及び/又は保存料を含むことができる。
【０２０１】
本発明はまた、局所適用、口内投与及び/又は霧状化のために、凍結乾燥物、乾燥粉末、溶液、懸濁物又はスラリーとして処方された組成物（例えば医薬組成物）を提供する。ある特徴では、粒子が噴射剤中に懸濁又は溶解される。適切な乾燥粉末は、非晶質活性作用因子、結晶活性作用因子、並びに非晶質及び結晶活性作用因子の両者の混合物を含むことができる。乾燥粉末活性作用因子は肺胞への侵入を防止するために選択した粒子サイズ、例えば直径約0.01μmから約4μm、又は3μm未満、又は約0.5μmから約1μm、又は約1μmを有することができる。ある特徴では、乾燥粉末活性作用因子は、約10質量％未満、約5質量％未満、又は約3質量％未満の水分含有量を有する。ある特徴では、本発明の凍結乾燥化合物（ただ1つの酵素又は酵素の組合せを含む）は、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％又はそれより多い酵素を含む（前記で構成される）。
本発明の酵素又は本発明の酵素処方物/混合物/組合せのデリバリーにおいて用いられる乾燥粉末は、実質的に非晶質粉末を生じる条件下で噴霧乾燥によって製造することができる。本発明の酵素又は本発明の酵素処方物/混合物/組合せは、生理学的に許容可能な水性緩衝液（例えば約pH2からpH9のpH範囲のクエン酸緩衝液）に溶解することができる。本発明の酵素又は本発明の酵素処方物/混合物/組合せは、0.01質量％から1質量％、例えば約0.1%から0.2％の濃度で溶解することができる。
ある特徴では、本発明の溶液を噴霧乾燥させ、ある特徴では、実質的に非晶質粉末が、例えば通常の噴霧乾燥装置で生成される。前記装置は、例えば市場の供給業者、例えばNiro A/S（デンマーク）、Buchi（スイス）などから入手できる。これらの噴霧乾燥粉末、例えば非晶質粉末は、本発明の酵素又は本発明の酵素処方物/混合物/組合せを、非晶質構造を生じる条件下で凍結乾燥、真空乾燥、又は蒸発乾燥させることによって調製することができる。ある特徴では、本発明のこの処方物を磨り潰すか又は製粉機で砕いて所望のサイズ範囲内の粒子が製造される。
【０２０２】
本発明の酵素又は本発明の酵素処方物/混合物/組合せはまた結晶形であってもよい。結晶乾燥粉末は結晶活性物質塊を磨り潰すか又はジェットミルで粉砕して調製することができる。
本発明の酵素又は本発明の酵素処方物/混合物/組合せはまた、粉末分散装置を含み、活性物質のより効率的で再生可能なデリバリーを提供し、本発明の処方物の取り扱い特性を改善することができる。本発明の処方物で用いられる例示的賦形剤には、炭水化物、例えば単糖類（例えばフラクトース、ガラクトース、グルコース、D-マンノース、ソルボースなど）；二糖類（例えばラクトース、トレハロース、セロビオースなど）；シクロデキストリン（例えば2-ヒドロキシプロピル-.ベータ.-シクロデキストリン）；及び多糖類（例えばラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなど）；アミノ酸（例えばグリシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、リジンなど）；有機酸及び塩基から調製された有機塩類（例えばクエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、グルコン酸マグネシウム、グルコン酸ナトリウム、塩酸トロメタミンなど）；ペプチド及びタンパク質（例えばアスパルテーム、ヒト血清アルブミン、ゼラチンなど）；及びアルジトール（例えばマンニトール、キシリトールなど）が含まれる。本発明の組成物はまた、当業界で周知の目的のために、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、マルトデキストリン、グリシン、クエン酸ナトリウム、ヒト血清アルブミン及びマンニトールを含むことができる。
ある特徴では、投与されるべき本発明の酵素又は本発明の酵素処方物/混合物/組合せの量は、所望の結果を達成するために治療的に又は予防的に有効な量をデリバーするために必要な量であり、また別の特徴では、症状の部分的緩和のみか症状の完全な停止にかかわらない。実際には、処方物の量又はタイプは、用いられる本発明の酵素又は本発明の酵素処方物/混合物/組合せ；症状の重篤度；対象者の体重；所望される治療的効果；有毒物質暴露の性質及び量にしたがって大きく変動するであろう。ある特徴では、本発明の酵素又は本発明の酵素処方物/混合物/組合せ（例えば本発明の医薬組成物を含む）は1回以上の投薬でデリバーされる。
【０２０３】
上記に記したように、本発明の酵素又は本発明の酵素処方物/混合物/組合せ（例えば本発明の医薬組成物を含む）は、エーロゾル形でデリバーされる。ある特徴では、本発明の液体エーロゾル処方物は、本発明の化合物及び分散剤を生理学的に許容可能な稀釈剤中に含む。ある特徴では、乾燥粉末エーロゾル処方物は、本発明の酵素又は本発明の酵素処方物/混合物/組合せ及び分散剤の微細に分割された固体形である。
上記に記したように、本発明の酵素又は本発明の酵素処方物/混合物/組合せ（例えば本発明の医薬組成物を含む）は、溶液中に懸濁、分散又は溶解することができ、前記溶液は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリンエステル及び前記の適切な混合物を含む溶媒又は液状分散媒体を含む。適切な流動性は、リポソームの生成、分散物の場合には適切な粒子サイズの投入、又は界面活性剤の添加によって維持することができる。
上記に記したように、本発明の酵素又は本発明の酵素処方物/混合物/組合せ物（例えば本発明の医薬組成物を含む）はさらに、抗菌及び/又は抗カビ剤、例えば抗生物質、抗体、核酸又は化学物質、例えばパラベン、クロロブタノール、又はソルビン酸を含む。
ある特徴では、本発明の組成物はさらに等張物質、例えば糖、緩衝剤及び塩化ナトリウムを含み、体液（例えば血液）の浸透圧と類似の浸透圧を担保する。
本発明の酵素又は本発明の酵素処方物/混合物/組合せはまた滅菌溶液の形態であってもよい。これは、適切な溶媒及び/又は賦形剤（上記を参照されたい）を用い、続いて無菌的ろ過によって調製することができる。無菌的粉末の場合には無菌的な注射可能溶液の調製に使用するために適切である。また別の調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥を含み、前記方法によって、本発明の酵素又は本発明の処方物/混合物、及びその後の無菌的溶液調製のために所望される賦形剤の粉末性混合物が提供される。
【０２０４】
本発明の酵素又は本発明の酵素処方物/混合物/組合せはまた、解毒又は除染されるべき汚染表面に適合するように（または予防的/防止的適用のために）適切に処方することができる。前記は、例えば皮膚、粘膜、眼、口、鼻道、肺などに適合する処方及び/又は調剤である。いくつかの特徴では、本発明の酵素又は本発明の酵素処方物/混合物/組合せはまた、それらを適用することができる無生物に適合するように、本発明の組成物及び/又は方法の実施時（例えばそれらを適用するとき）に処方されるか、またはそれらは、本明細書に記載した任意の適用装置又は任意の製品（例えばガスマスク、空気若しくは水のフィルター、布片、織物材料若しくは繊維、レンズ、木材、鋼、ガラス、ポリマーなど）の一部である。
本発明の酵素又は本発明の酵素処方物/混合物/組合せはまた、適切な適時放出処方物、例えばピル、ゲルタブ、ナノ構造物、ヒドロゲル、カプセル、リポソーム（例えば摂取用）、移植（例えば皮下又は皮内）、局所適用（例えばゲルとして）、座薬又は注射（例えばIV、非経口など）として適切なように処方することができる。前記経時放出は、治療用（中和、解毒又は除染目的を含む）でも、又は予防目的（例えば中和、解毒又は除染のためであるが暴露を予測する）でもよい。
本発明の酵素又は本発明の酵素処方物/混合物/組合せはまた、いずれの生物又は無生物にも適切なように処方することができる。例えば、本発明の組成物及び/又は方法は、人間又は動物（家畜（例えば愛玩動物、動物園又は農場の動物）、実験動物又は野生動物（哺乳動物、爬虫類、魚類または鳥類などを含む））で実施することができる。
本発明の酵素、又は本発明の酵素処方物/混合物/組合せはまた、適切な調剤（例えば錠剤、ゲル、リポソーム、ピル、散剤、エーロゾル、カプセル、ゲルタブ、ヒドロゲル、ローション、注射可能処方物、ナノ構造物など）で処方することができ、投与期間及び頻度は、患者の状態、患者の疾患のタイプ及び重篤度、並びに投与方法のような要件によって決定される。適切な投薬量及び治療レジーメンは治療及び/又は予防利益（暴露された個体の症状又は損傷の緩和）を提供することができる。適切な投薬量を決定するための種々の考察が下記成書の最新版に記載されている：Remington's Pharmaceutical Sciences, Maack Publishing Co, Easton PA (“Remington's”)（例えばRemington, The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, by University of the Sciences in Philadelphia, Editor）
【０２０５】
適切な投薬量は、実験モデル及び/又は臨床試験を用いて、例えば有効な治療を提供するために十分である最小の投薬量を用いて決定することができる。健康診断、画像調査、又は治療又は予防処置を施した症状に対する適切なアッセイ（前記は当業者にはよく知られている）を用いて、患者を治療的有効性についてモニターすることができる。用量の調節はモニター所見に基づいて実施することができる。例えば、神経作用物質に暴露された個体に本発明の組成物を投与し、症状の停止をモニターして適切な投薬のタイミング及び量を決定する。
他の特徴では、毒素又は物質の存在を調べるサンプル採取のための装置を用いて、本発明の組成物又は方法をいつ用いるべきかを決定し、又は本発明の組成物又は方法の有効性を決定することができる。例えば、化学兵器VXを検出する装置（米国特許出願公開公報20040161856号に開示）を本発明の実施過程で用いることができる。
本発明の酵素又は本発明の酵素処方物/混合物/組合せはまた、炭疽の除染/中和溶液として、例えば表面物質の除染溶液として使用するために処方することができる。ある特徴では、本発明の炭疽除染溶液は、泡沫、スプレー、霧状物、フォッグ又はスチームによって適用される。ある特徴では、本発明の組成物は、紫外線照射の使用によって増強される。
ある特徴では、本発明の除染/中和溶液/処方物/混合物（例えばV剤、G剤、H剤及び/又は生物剤（例えば炭疽）又は農薬用）は、軍事防衛用途で、また別には任意の民事的利用のために（建造物、郵便局、換気ダクト、カーペット、衣類及び電子機器の除染（毒素の中和を含む）を含む）用いられる。ある特徴では、本発明の除染/中和溶液は、消防用泡沫との適合性のために処方され得る。
本発明はまた、任意のV剤、G剤、H剤及び/又は生物剤及び/又は農薬、除草剤、殺虫剤から、機器、衣類、建造物、艦船、飛行機、トラック、車、列車、コンテナなどの任意の部分の除染及び/又は中和するために本発明の除染/中和溶液/処方物/混合物を含む機器を提供する。ある特徴では、本発明は、任意の対象物に適用することができる本発明の除染/中和溶液/処方物/混合物を含むコーティング及び塗料を提供するので、本発明はまた、本発明の酵素又は本発明の溶液/処方物/混合物を含む機器、衣類、建造物、艦船、飛行機、トラック、車、列車、コンテナなどの任意の部分を提供する。
【０２０６】
本発明の例示的溶液/処方物/混合物：
本発明は、種々の種類の酵素混合物を含む除染/中和溶液/処方物/混合物を提供し、これら酵素は、本発明の酵素でも、又は本発明の酵素及び公知の酵素でも、又は公知酵素の新規な組合せでもよい。ある特徴では、本発明は、1つ、2つ、3つ又は4つ以上の本発明の酵素、又は本発明の酵素及び公知の酵素、又は公知酵素の新規な組合せを含む除染/中和溶液/処方物/混合物を提供する。これら酵素組合せ溶液/処方物/混合物は、生物剤（例えば細菌（例えば炭疽菌）の芽胞及び毒素）の除染、中和又は解毒のために、本発明の方法及び製品で用いることができる。
【０２０７】
本発明の例示的三種酵素組合せ：
ある特徴では、本発明の例示的除染/中和溶液/処方物/混合物は、各々が異なるクラス（デハロゲナーゼ、ハロペルオキシダーゼ、例えばクロロペルオキシダーゼ及び有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）又はプロリダーゼ）の（少なくとも）3つの酵素の混合物を含む。
ある特徴では、デハロゲナーゼは配列番号:69又は配列番号:91に記載の配列を有するポリペプチドであるか、または配列番号:70又は配列番号:92に記載のアミノ酸配列を有する。
ある特徴では、前記ハロペルオキシダーゼはクロロペルオキシダーゼであり、ある実施態様では、前記クロロペルオキシダーゼはヘム型クロロペルオキシダーゼ、例えば配列番号:1に記載の配列を有する核酸によってコードされるポリペプチド、又は配列番号:2に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ある特徴では、前記ハロペルオキシダーゼは、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49若しくは配列番号:51に記載の配列を有する核酸によってコードされるヘム型ペルオキシダーゼであるか、又は前記酵素は、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50若しくは配列番号:52に記載のアミノ酸配列を有する。ある特徴では、前記ハロペルオキシダーゼは、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、若しくは配列番号:67に記載の配列を有する核酸によってコードされる非ヘム型クロロペルオキシダーゼであるか、又は前記酵素は、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66若しくは配列番号:68に記載のアミノ酸配列を有する。
【０２０８】
ある特徴では、前記有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）は、配列番号:193に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、または配列番号:194に記載の配列を有する。前記DFPaseは、配列番号:71に記載の配列を有する核酸によってコードされてもよく、または配列番号:72に記載されるアミノ酸配列を有する。
ある特徴では、この組合せ物/混合物/処方物は、少なくとも1つのジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）をさらに含む。あるいは、前記DFPaseはOPAA/プロリダーゼ酵素と互換的である（後者の代用として用いることができる）。
別の特徴では、また別の酵素を前記例示的“3種組合せ”に添加することができる。前記は、例えばヒドロラーゼ、例えばエステラーゼ、例えばコリンエステラーゼ、有機リン酸ヒドロラーゼ、例えば有機リン酸エステラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ及びオキシドレダクターゼ（公知の酵素又はこれらの活性のいずれかの活性を有する本発明のポリペプチドを含む）である。
ある特徴では、本発明の前記“3種組合せ”のデハロゲナーゼ、ハロペルオキシダーゼ（例えばクロロペルオキシダーゼ）及び有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）溶液/処方物/混合物は使用者にとって利点を有する。なぜならば、以下のようにこの組成物は1度の適用で多数の有毒物質を解毒するからである：デハロゲナーゼ−H剤（例えばマスタードガス；ハロペルオキシダーゼ−V剤（例えばVXガス）及び生物剤（例えばバチルスの芽胞）；OPAA−G剤（例えばサリン）。したがって、本発明の“多種組合せ”酵素混合物（“3種組合せ”を含む）は、初めに有害/有毒物質を同定する必要がなく個々人（例えば現場の兵士）が効果的に用いることができる。
ある特徴では、本発明の“多種組合せ”酵素混合物がハロペルオキシダーゼ酵素を含むとき、前記組成物はまた亜ハロゲン酸塩成分、例えば亜ヨウ素酸塩または亜塩素酸塩成分、例えば亜塩素酸ナトリウム又は亜ヨウ素酸ナトリウム又は等価の成分を含む。
【０２０９】
本発明の例示的二種酵素組合せ：
CPO及びDFPase/OPAA：ある特徴では、本発明の例示的除染/中和溶液/処方物/混合物は、各々が異なる種類の（少なくとも）2つの酵素の混合物を含む。上記で考察した、本発明の酵素の“三種組合せ”の場合のように、これらの“本発明の二種酵素組合せ”は、1度の適用で複数の有毒物質を解毒、中和又は除染することができる。
例えば、ある特徴では、“本発明の二種酵素組合せ”は、少なくとも1つのジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）又は有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）又はプロリダーゼ、及び少なくとも1つのハロペルオキシダーゼ（例えばクロロペルオキシダーゼ又はCPO）を含む。ある実施態様は、3つの酵素の全て（ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）、有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）又はプロリダーゼ及びハロペルオキシダーゼCPO）の使用を含む。上記に記したように、DFPase及び/又はOPAA又はプロリダーゼを用いて、G剤が除染、中和又は解毒される。ハロペルオキシダーゼ（例えばCPO）を用いて、V剤、H剤及び/又は生物剤（例えば炭疽）が除染、中和又は解毒される。
ある特徴では、H剤（例えばマスタードガス）に対する効果を追加するために（例えばH剤に対するCPOの効果を補強するために）、デハロゲナーゼがまたこの本発明の除染/中和溶液/処方物/混合物が添加される。
ある特徴では、G剤に対する効果を追加するために（例えばG剤に対するOPAA又はプロリダーゼ及び/又はDFPaseの効果を補強するために）、コリンエステラーゼがまたこの本発明の除染/中和溶液/処方物/混合物が添加される。
ある特徴では、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性を有するポリペプチドは、配列番号:71に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、または配列番号:72に記載されるアミノ酸配列を有する。この例示的な“本発明の二種酵素組合せ”で用いることができる例示的なハロペルオキシダーゼは、本発明のデハロゲナーゼ/ハロペルオキシダーゼ/OPAAの“三種組合せ”溶液/処方物/混合物について上記で考察したものと同じである。ある特徴では、有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）又はプロリダーゼ活性を有する酵素は、配列番号:193に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、または配列番号:194に記載されるアミノ酸配列を有する。
ある特徴では、ハロペルオキシダーゼ酵素を含む本発明の酵素混合物の場合のように、前記組成物はまた、亜ハロゲン酸塩成分、例えば亜ヨウ素酸塩又は亜塩素酸塩成分、例えば亜塩素酸ナトリウム又は亜ヨウ素酸ナトリウム又は等価の成分を含むことができる。
【０２１０】
DH及びCPO：ある特徴では、本発明の例示的除染/中和溶液/処方物/混合物は、（少なくとも）2つの酵素、少なくとも1つのデハロゲナーゼ（DH）酵素及び少なくとも1つのハロペルオキシダーゼ（例えばクロロペルオキシダーゼ又はCPO）の混合物を含む。上記に記したように、デハロゲナーゼ及びハロペルオキシダーゼは、H剤を除染、中和又は解毒するために使用される。
この例示的な“本発明の二種酵素組合せ”で用いることができる例示的なハロペルオキシダーゼは、本発明のデハロゲナーゼ/ハロペルオキシダーゼ/OPAAの“三種組合せ”溶液/処方物/混合物について上記で考察したものと同じである。例示的なデハロゲナーゼは、配列番号:69又は配列番号:91に記載の配列を有するか、または配列番号:70または配列番号:92に記載のアミノ酸配列を有する。
ある特徴では、少なくとも1つのジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）、有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）又はプロリダーゼ及び/又はコリンエステラーゼ（または2つ若しくは3つ全て）がまたDH及びCPO混合物に添加され、G剤もまた除染、中和又は解毒される。用いることができる例示的なDFPase、OPAA又はプロリダーゼ及び/又はコリンエステラーゼ酵素は、本明細書に記載した他の処方物で用いられるものと同じである。例えば、ある特徴では、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）活性は、配列番号:71に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、または配列番号:72に記載されるアミノ酸配列を有する。ある特徴では、有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）又はプロリダーゼ活性を有する酵素は、配列番号:193に記載の配列を有する核酸によってコードされるか、または配列番号:194に記載されるアミノ酸配列を有する。
ある特徴では、ハロペルオキシダーゼ酵素を含む本発明の任意の酵素混合物の場合のように、前記組成物はまた、亜ハロゲン酸塩成分、例えば亜ヨウ素酸塩又は亜塩素酸塩成分、例えば亜塩素酸ナトリウム又は亜ヨウ素酸ナトリウム又は等価の成分を含むことができる。
【０２１１】
DH及びOPAA：ある特徴では、本発明の例示的除染/中和溶液/処方物/混合物は、（少なくとも）2つの酵素、少なくとも1つのデハロゲナーゼ（DH）酵素及び少なくとも1つの有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）又はプロリダーゼの混合物を含む。上記に記したように、デハロゲナーゼ（及びハロペルオキシダーゼ）は、H剤（例えばマスタードガス）を除染、中和又は解毒するために使用され、有機リン酸アンヒドロラーゼはG剤（例えばサリン）を除染、中和、解毒するために使用される。
ある特徴では、本発明のこの例示的混合物はまたH剤の除染、中和、解毒の増強のため少なくとも1つのハロペルオキシダーゼを含むことができ、。ハロペルオキシダーゼ酵素を含む本発明の任意の酵素混合物の場合のように、前記組成物はまた、亜ハロゲン酸塩成分、例えば亜ヨウ素酸塩又は亜塩素酸塩成分、例えば亜塩素酸ナトリウム又は亜ヨウ素酸ナトリウム又は等価の成分を含むことができる。
ある特徴では、本発明のこの例示的混合物はまたOPAA又はプロリダーゼのG剤の除染、中和、解毒を補強するために少なくとも1つのジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）及び/又はコリンエステラーゼを含むことができる。
【０２１２】
本発明の酵素組合せの例示的処方物：
本発明の酵素組合せは、個々に処方するか、又は1つ以上の処方物をまとめて処方することができる。例えば、本発明のこれら除染、中和、解毒組合せ物で用いられる酵素は、任意の態様で（例えば本明細書に記載するように）、例えば摂取可能なデリバリー物質として、注射可能液体、スプレー、錠剤、ピル、ゲル、ヒドロゲル、リポソーム、カプセル、ゲルタブ、ローション、局所適用液体、座薬、エーロゾル、粉末、凍結乾燥化合物、噴射剤、泡沫、乳液、ナノ構造物又はその組合せとして、個々に又はひとまとめにして処方することができる。
ある特徴では、本発明の凍結乾燥化合物（1つのみ又は組合せ酵素を含む）は、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％又はそれより多い酵素を含む（酵素で構成される）。
【０２１３】
症状の判定−本発明の実施
本発明の除染、解毒（中和）方法の実施で、及び本発明のポリペプチド（例えば酵素、ペプチド、抗体）又は本発明の組合せ/混合物/処方物の適用で、標準的な臨床的/医学的判定を用いて、本発明の組成物若しくは方法の使用時期、又は本発明の組成物若しくは方法の有効性を決定することができる。例えば、多くの神経作用物質の場合、臨床的徴候及び症状は、コリン作動性ニコチン様及びムスカリン様レセプターにおける過剰刺激と関係を有する。中枢作用は、N-メチル-D-アスパルテート作動系及びGABA作働系によると同様に、コリン作動性レセプターによっても仲介されえる。神経作用物質の臨床的作用の要旨は以下のとおりである：
2009517002.tif 000026
【０２１４】
眼：眼に対する神経作用物質のもっとも一般的な作用は結膜充血及び瞳孔収縮（縮瞳として知られている）である。患者は眼の痛み、視野のぼやけ及び視野の濁りを訴える。前記は、作用物質と眼の直接接触からもっとも発生し易い。縮瞳は長期間にわたって持続し、片側だけでも起り得る。重度の縮瞳は視野のぼやけの愁訴となる。毛様体攣縮もまた眼の痛みを引き起こし得る。VXに暴露された患者は縮瞳を示さないかもしれない。これは、G剤と異なり、眼は通常VXに直接暴露されないためである可能性が高い。縮瞳はVX暴露の後期の徴候であり得る。
鼻：鼻漏は蒸気暴露後にもっとも一般的であるが、他の経路による暴露でも観察され得る。
肺：短縮呼吸は重要な愁訴である。患者は、胸部の圧迫感、呼吸困難又は息切れを訴え、無呼吸を提示する場合もある。気管支収縮及び過剰な気管支分泌は、これら作用物質による重大な致命的症状をもたらす。重度の暴露の場合、中枢性呼吸抑圧及び呼吸筋の完全な麻痺により死に至る可能性がある。神経作用物質中毒で、呼吸不全は主要な死因である。
骨格筋：線維束収縮は、これら作用物質による中毒のもっとも特異的で識別可能な徴候である。初期暴露時に、前記作用物質は局在するが、続いて拡散して全筋系の普遍的関与を引き起こし得る（重度の暴露後に）。ミオクロヌス単収縮（攣縮）が見られる。最終的には筋肉の疲労及び弛緩性麻痺が続く。
皮膚：少量の液体に暴露された場合、線維束収縮とともに局所の発汗が見られる。より大量の暴露により全身の発汗が見られる。
胃腸管：腹部の疼痛性痙攣が見られる。大量暴露の場合には、悪心、嘔吐、及び下痢が顕著である。
心臓：患者は徐脈又は頻脈のいずれかを提示し得る。心拍は、アドレナリン作動性刺激（頻脈をもたらす）又は副交感神経緊張（迷走神経刺激を解して徐脈をもたらす）の優位性に左右される。心拍は神経作用物質による中毒の非確定的徴候である。心臓の律動における多くの障害が、有機リン酸及び神経作用物質中毒後に報告されている。心臓ブロック及び未熟な心室収縮を観察することができる。報告されているもっとも懸念される2つの不整脈にはトルサード・ド・ポワント及び心室細動が含まれる。
中枢神経系：神経作用物質に対する少量の暴露は、行動の変化、例えば不安、精神運動の抑うつ、知的障害、異常夢を引き起こし得る。神経作用物質の大量暴露は、意識低下及び発作をもたらす。ほとんどの徴候及び症状は、コリン作動性レセプターの過剰な活性化及びそれに続く疲労に関連する。幾人かの著者らは、軽度、中等度及び重度の毒性に暴露を分類した。各暴露に付随する徴候及び症状の要旨は以下のとおりである：
【０２１５】
2009517002.tif 000027
ある特徴では、本発明は、酵素（例えばハロペルオキシダーゼ（クロロペルオキシダーゼを含む）及び/又はデハロゲナーゼ）及び酵素の混合物/処方物/組合せを、H剤（例えばマスタードガス）の除染又は解毒（中和を含む）のために提供する。マスタードガスによる急性中毒の判定では、マスタードガスの蒸気又は液体に対する暴露の影響は、典型的には数時間遅い。前記遅滞は液体の汚染の場合にはより短い。マスタードガス蒸気又は液体への暴露後最初の1時間では、徴候又は症状は通常発生しないが、悪心、吐き気、嘔吐、及び眼の痛みがときに報告されている。
致死量を超える濃度に対する暴露は、暴露後1時間以内に痙攣、昏睡及び死亡をもたらし得る。悪心、疲労、頭痛、強い眼の痛みを伴う眼の炎症、流涙、眼瞼痙攣、羞明及び鼻漏、その後に続く顔面及び首の紅潮、喉の痛み、並びに脈拍及び呼吸数の増加が、暴露後2から6時間で発生する。暴露後6から24時間で上記の症状は全般的に重篤度を増し、皮膚の炎症を伴い、続いてもっとも温度の高い領域（例えば性器会陰部領域、臀部、腋窩及び大腿の内側）に水疱が形成される。次の24時間に、症状は全般的に悪化し、水疱はさらに顕著になり、咳が出現する。粘液、膿及び壊死性脱落組織が咳とともに吐き出され得る。皮膚の激しいかゆみ及び皮膚の色素沈着増加が出現する。暴露後4日には、血球数は貧血及び好中球減少症を示す。全般的には、暴露の2から3日後の初期白血球溶解後に重篤な中毒患者で白血球減少症が続く。
マスタード汚染食物又は汚染水の摂取後数時間で、以下の徴候及び症状が発生する：悪心、嘔吐、腹痛、血液性嘔吐及び下痢、重篤な中毒ではショック及び虚脱を伴う。重篤な中毒を示す患者は、呼吸系合併症及び敗血症ショックのために暴露後2週間の間に死亡することがある。
【０２１６】
本発明の酵素の活性：
以下の本発明の例示的酵素はP-F結合を加水分解する（図表の解読のために：例えば、配列番号102に記載の配列を有するポリペプチドは、例えば配列番号:101などによってコードされる）：
2009517002.tif 000028
以下の本発明の例示的酵素はP-S結合を加水分解する（図表の解読のために：例えば、配列番号76に記載の配列を有するポリペプチドは、例えば配列番号:79などによってコードされる）：
配列番号
75, 76
77, 78
89, 90
以下の本発明の例示的酵素はP-S及びP-F結合の両結合を加水分解する（図表の解読のために：例えば、配列番号118に記載の配列を有するポリペプチドは、例えば配列番号:117などによってコードされる）：
配列番号
117, 118
119, 120
127, 128
151, 152
167, 168
171, 172
187, 188
【０２１７】
以下の本発明の例示的酵素は、除染（作物植物の保護を含むが、ただしこれに限定されない）及び/又は神経作用物質の解毒のために用いることができる（図表の解読のために：例えば、配列番号118に記載の配列を有するポリペプチドは、例えば配列番号:117などによってコードされる。前記は、P-F及びP-S結合及び/又はG、V剤に対し活性な酵素を含む）：
配列番号      作物植物保護/神経作用物質解毒
117, 118      P-F及びP-S結合/G, V剤に対して活性な酵素
119, 120      P-F及びP-S結合/G, V剤に対して活性な酵素
127, 128      P-F及びP-S結合/G, V剤に対して活性な酵素
151, 152      P-F及びP-S結合/G, V剤に対して活性な酵素
167, 168      P-F及びP-S結合/G, V剤に対して活性な酵素
171, 172      P-F及びP-S結合/G, V剤に対して活性な酵素
187, 188      P-F及びP-S結合/G, V剤に対して活性な酵素
101, 102      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
103, 104      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
105, 107      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
107, 108      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
109, 110      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
111, 112      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
113, 114      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
115, 116      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
121, 122      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
123, 124      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
125, 126      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
129, 130      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
131, 132      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
133, 134      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
135, 136      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
137, 138      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
139, 140      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
141, 142      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
143, 144      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
145, 146      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
147, 148      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
149, 150      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
153, 154      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
155, 156      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
157, 158      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
159, 160      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
161, 162      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
163, 164      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
165, 166      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
169, 170      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
173, 174      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
175, 176      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
177, 178      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
179, 180      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
181, 182      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
183, 184      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
185, 186      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
73, 74       P-F結合/G剤に対して活性な酵素
93, 94       P-F結合/G剤に対して活性な酵素
95, 96       P-F結合/G剤に対して活性な酵素
97, 98       P-F結合/G剤に対して活性な酵素
99, 100      P-F結合/G剤に対して活性な酵素
75, 76       P-S結合/V剤に対して活性な酵素
77, 78       P-S結合/V剤に対して活性な酵素
89, 90       P-S結合/V剤に対して活性な酵素
以下の実施例は説明のために提供され、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【０２１８】
実施例
実施例1：本発明のオキシドレダクターゼ及びヒドロラーゼの例示的混合物
本発明は、オキシドレダクターゼ、デハロゲナーゼ及びヒドロラーゼ（例えばハロペルオキシダーゼを含む）の多様な混合物/組合せ/処方物を提供し、これらは本発明の酵素を含むことができ、さらにまた本発明の（新規な）酵素及び公知の酵素の混合物を含むことができるが、また公知の酵素のみを用いる新規な混合物/組合せであってもよい。種々の特徴では、これらの混合物/組合せ/処方物は、所望の使用について、例えば除染又は脱リグニン化について最適の性能を提供することができる。ある特徴では、オキシドレダクターゼ及びヒドロラーゼ酵素混合物が提供され、この混合物は広域スペクトルのG-、H-、V-化学兵器物質及び生物学的兵器物質除染のためにブレンドされる。
まとめ：本発明は、広域スペクトルの、物質特異的酸化及び加水分解活性とともに、V剤、G剤及びH剤の酸化又は加水分解に対して次亜ハロゲン酸塩（生物剤（炭疽芽胞を含む）を殺滅する酸化物（例えば二酸化塩素及び反応性ラジカル）を生成する）の生成を提供する酵素混合物/処方物/組合せ組成物を提供する。本発明の例示的処方物/混合物は特に以下を含む：
（1）ペルオキシダーゼ、例えばクロロペルオキシダーゼ（CPO）のようなハロペルオキシダーゼ（これらはV-及びH剤（例えばマスタードガス）を加水分解（例えば非ヘムCPO）するか、又は酸化する）；及び
（2）デハロゲナーゼ（これらは酸化されたマスタードH剤を脱塩素化する）。
ある特徴では、前記混合物/処方物/組合せ組成物はさらに第三の酵素を含む：
（3）ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）又は等価の酵素（これらはG剤を加水分解する）。
また別の実施態様では、混合物/処方物/組合せ組成物は、（1）ペルオキシダーゼ酵素及び（3）ジイソプロピルホスファターゼ酵素を含む。
【０２１９】
これらの例示的混合物/処方物/組合せ中の酵素は以下を含むことができる：
（1）ペルオキシダーゼ（ハロペルオキシダーゼ（HPO）、例えばクロロペルオキシダーゼ、例えばヘム型CPOを含む）：これらの配列又はそれらの類似体：
−カリダリオミセス・フマゴ（Calidariomyces fumago）クロロペルオキシダーゼ（CPO）、配列番号:2（例えば配列番号:1によってコードされる）に記載の配列を有する。
−配列番号:3（例えば配列番号:3によってコードされる）に記載の配列を有するヘム型ペルオキシダーゼ。
−クロロペルオキシダーゼ（CPO）(ヘム型ペルオキシダーゼを含む)：前記は、本発明の配列、例えば配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25と少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％若しくはそれより高い、又は完全な（100％）配列同一性を有する配列によってコードされるか、又は配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24又は配列番号:26と少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％若しくはそれより高い、又は完全な（100％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
−ペルオキシダーゼ（PO）：前記は、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49、配列番号:51と少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％若しくはそれより高い、又は完全な（100％）配列同一性を有する配列によってコードされるか、又は配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50、配列番号:52と少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％若しくはそれより高い、又は完全な（100％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
−非ヘムクロロペルオキシダーゼ（CPO）：前記は、本発明の配列、例えば配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65若しくは配列番号:67と少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％若しくはそれより高い、又は完全な（100％）配列同一性を有する配列によってコードされるか、又は配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64配列番号:66若しくは配列番号:68と少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％若しくはそれより高い、又は完全な（100％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
（2）その活性が酸化されたマスタードH剤を脱塩素化することを含むデハロゲナーゼ、例えば、配列番号:69と少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％若しくはそれより高い、又は完全な（100％）配列同一性を有する核酸配列によってコードされるか、又は配列番号:70と少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％若しくはそれより高い、又は完全な（100％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含むデハロゲナーゼ。
（3）その活性がG剤を加水分解することを含むジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase）、例えば配列番号:71（例えば米国特許6,524,834号を参照）と少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％若しくはそれより高い、又は完全な（100％）配列同一性を有する核酸配列によってコードされるか、又は配列番号:72（例えば米国特許6,524,834号を参照）と少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％若しくはそれより高い、又は完全な（100％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含むDFPase。
【０２２０】
アッセイ：
本発明はまた、酵素が本発明の範囲内に包含されるために必須の活性を有するか否か、例えば、本発明の処方物/混合物/組合せ中の酵素であるために必須の活性を有するか否かを決定するための例示的アッセイを提供する。
VX剤又はVX代用物質のCPOによる除染のためのアッセイ
VX剤の分解の経時的変化：
１．環境ライブラリー溶解物を2回蒸留水（DDW）でそれらの凍結乾燥前の体積にそれぞれ再構成した。自動機械によるアッセイの全工程を防御フード内で実施した。
２．分解/反応96ウェルプレート：前記溶解懸濁物から190μLアリコットのサンプルを3組ずつ取り出し、さらに10μMのVXを10μL添加した（VXの最終濃度は1μM）。1つのウェルには200μLの溶解物のみが含まれVXは添加せず（AChE/溶解物のE0コントロール）、さらに、1つのウェルには200μLのDDWを加えた（maxEo AChEコントロール）。“空の”宿主（非形質導入宿主）を3組、宿主コントロールとして用いた。第二のコントロールは3組のDDW中のVXであった（最大AChE阻害“EI”コントロール）。結局、各反応プレートで22の溶解物を試験した。
３．冷水稀釈プレート：VX分解活性は、各時間間隔におけるVXの残留阻害活性を、SUNRISETM（Tecan, Research Park, NC）光吸収読取装置を用いエルマン（Ellman）法によって測定した。5分以内でのヒトAChEの95％阻害に要求されるVXのアッセイプレートにおける最終濃度は10nMであった。特定の時間間隔で、反応プレートの各ウェルから10μLを反応停止のために90μLの冷DDWに採取した。冷却希釈直後に、前記の水稀釈プレートから20μLをエルマンアッセイプレートに移した。
４．エルマンアッセイプレート：アッセイプレートにおける各ウェルの総体積は200μLである。稀釈プレートの20μLをエルマンアッセイプレートの130μLのDTNB（DTNBの最終濃度は0.32mM）に加え、続いて20μLのHuAChE（最終AChE活性は0.03u/mL）を添加する。アッセイプレートを読取装置内で5分間25℃にてインキュベートする。5分のインキュベーションに続いて、30μLのATCを添加する（最終濃度は112.5μM）。
マジェラン（Magellan）プログラムを用いて、読取装置のOD/分をλ＝405nmで1.5分測定する。最終勾配を最初の30秒を除いて（勾配のノイズが多いため）算出する。
５．エルマンアッセイ用ストック溶液は以下のとおりである：
・DNTB（Sigma）（0.5mM）は50mMのホスフェート（pH＝7.5）に溶解する。
・ヒトAChE（0.3u/mL）は、0.05％のBSA及び1mMのEDTAを含む50mMのホスフェート（pH＝7.5）に溶解する。
・ATC（ヨウ化アセチル-チオコリン、Sigma）（0.75mM）はDDWに溶解する。
【０２２１】
マスタード又はマスタード代用物のCPOによる除染のためのアッセイ
添付したプロトコルに関するJ. Appl. Toxicol.を参照されたい。
除染でデハロゲナーゼを使用する場合のアッセイ
イオン選択性電極を用いる、O,O-ジイソプロピルS-(2-ジイソプロピルアミノエチル)ホスホロチオレート（テトリソ）分解時の塩化物モニタリング。
材料：
−アキュメット（Acumet）クロリドガラス本体、二重連結部、BNCコネクター付きイオン選択性電極（Fisher Scientific, Pittsburgh, PA）
−アキュメットリサーチAR25デュアルチャネルpH/イオンメータ（Fisher Scientific）
−塩化物の標準物（注記：予想されるCl-生成レベルよりも高い標準物を選択すること。0.100MのCl-標準物で良好な成果が得られる）。
−Cl-電極参照溶液（1Mの硝酸カリウム、電極とともに送られたもの）
−9-ピンシリアルポート付きコンピュータ
−RS-232 9-ピンオス-メス型シリアルケーブル
−WINWEDGETM（Adept Scientific）（又は他の類似のシリアルコミュニケーションプログラム）
−マイクロソフトEXCELTM（又は他の類似のスプレッドシートプログラム）
−スタープレート
プロトコル：
１．Cl-標準物の連続稀釈物を作成する
・このブランドの電極は一般的に100ppm（2.85mM）未満のCl-濃度には応答が鈍い。稀釈を選択するときはこのことに注意すること。
・少なくとも3つの標準物を使用すること。
・最低濃度は最高濃度よりも少なくとも1桁低くなければならない。
２．電極本体に参照溶液を添加する
３．Cl-電極をpH/イオンメータの背側のBNCポートにつなぐ
４．RS-232ケーブルをメータとコンピュータにつなぐ
５．メータを基準化する
・“イオン”モードを選択する
・メータスクリーン上で“Std”を押して、基準化モードに入る。
・最低濃度のCl-標準物を攪拌プレート上に置き、Cl-電極を溶液中に浸す。シグナルを10分間採取し、完全に安定化させる（mV値の振れを可能なかぎり停止させることが重要である）。
・メータ上の“Std”を再び押して標準を設定する。しばらくしてプロンプトが表示されたら標準物の濃度を入力する。
・その他の標準物についてもこれらの工程を繰り返す。各濃度について表示されたmＶ値を記録し、スプレッドシートに入力する。log[標準濃度]の関数としてmV値をプロットする。最適一致線の勾配は-53から-60の間であるはずである。勾配がこの範囲から外れたら再度目盛り補正を実施する。
６．電極をテトリソ溶液に浸す。溶液中にクロロペルオキシダーゼ（CPO）を添加しないでｔ＝0点を表示させ、最初のCl-レベルをモニターする。CPOをサンプルに添加したときに読み取りを開始する。
７．実験が終了した後、電極を溶液から取り出す。短時間保持する場合は、電極は対象の一般的範囲内にある標準物中で保持されるべきである。
除染でDFPaseを使用する場合のアッセイ：
VX又はVX代用物のCPOによる除染のためのアッセイと同様である。
参考文献：
Acta Crystallogr. D Biol Crystallogr. 2002 Oct; 58(Pt 10 Pt 1):1757-9
Biochim Biophys Acta. 2001 Apr 7; 1546(2):312-24
Biochem J. 2001 Feb 1;353(Pt 3):579-89
Protein Expr. Purif. 2001 Feb;21(1):210-9
Chem Bio Interac. 1993 June;87(1-3):17-24
J Appl Toxicol. 2003 Jul-Aug;23(4)225-33
【０２２２】
実施例2：酵素による能動的除染
本発明は、新規なオキシドレダクターゼ、デハロゲナーゼ及びヒドロラーゼを提供し、前記には本発明の酵素の混合物/組合せ/処方物が含まれる（前記混合物は本発明の酵素及び/又は公知の酵素を含むことができる）。本実施例は、環境ライブラリーから本発明のVX/テトリソ（O,O-ジイソプロピルS-(2-ジイソプロピルアミノエチル)ホスホロチオレート）分解酵素の発見について記載する。
（1）環境ライブラリーから新規な酵素の異種発現：
今や我々は、アフィニティー精製を用いて、VX及びテトリソを分解することが示された3つの新規な酵素の各々を精製している（＞20mg）。前記酵素の各々を凍結乾燥した。
−活性試験：811サンプル（異なる437の酵素）をG及びV剤に対する活性について試験した。精製酵素をVXに対するそれらの活性について詳細に性状を調べた。
−アッセイの開発：G剤を分解する（例えばDFPase活性を有する）酵素を同定するためのアッセイを開発した。フッ化物イオンに特異的な電極を、そのネルンスト応答をチェックすることによって開発した（ネルンスト応答は、ある活性範囲又は濃度範囲の間で“局所的”な熱動力学平衡にしたがってイオン選択性電極が応答するときに発生する）。このプローブを用いて、代用G剤活性についてDFPase、精製有機リンヒドロラーゼ（OPH）及び精製酵素を比較した。最適化された他のアッセイは、G及びV剤の解毒をアセチルコリンエステラーゼに対し試験するエルマンアッセイ（コリンエステラーゼ（ChE）活性を測定するために一般的に用いられるアッセイ）である。
−精製タンパク質の特性決定：基質としてテトリソ及びVXを用いて識別された3つの精製解毒ヒットを0.4mg/mLでDFP（1mM）及びテトリソ（10μM及び10mM）とともにインキュベートした。アッセイは、DFPに関して陽性コントロール（DFPase）及び陰性コントロール（煮沸DFPase）の環境で有効に機能し、これらの酵素のいずれもこの代用G剤に対して活性を全く示さなかった。しかしながら、このコントロールは我々の従来のエルマンアッセイプロトコルではテトリソについては機能しなかった。
（2）菌類供給源からCPOの発見：
−配列による発見：残りの10個の完全長クローンをサブクローニングし、さらに完全長を作成する。
（3）宿主細胞の大腸菌/ピキア（Pichia）及びサッカロミセス（Saccharomyces）におけるカリダリオミセス・フマゴのクロロペルオキシダーゼの異種発現：
−C.フマゴのクロロペルオキシダーゼをサブクローニングし、サッカロミセスで試験した。図5に示したように、ウェスタンブロッティングではタンパク質は検出されなかった。図5は、種々のピキア及びサッカロミセス形質転換体の抗CPO抗体ウェスタンブロットで、宿主細胞におけるCPO発現レベルが示されている。興味深いことに、ピキアではバンドが観察されるが、全く活性が検出されない。
【０２２３】
（4）C.ヘテロストロフス（heterostrophus）におけるC.フマゴの異種発現の最適化：
−C.ヘテロストロフスにおけるC.フマゴの最適化された異種発現は、この宿主では3から4mg/mL のCPO発現である。
（5）CPO不活性化についての検討：
−プロテオミクス研究による支持：分析のために調製したサンプルが目指した時点を超えて進行したかもしれないという懸念があったので（例えばサンプル融解中に）、我々は、酸化剤NaClO2の作用を中和するために還元剤による停止方法を探した。CPOのNaClO2処理過程で設定した時点の直後にTCEP及び亜硫酸ナトリウムを過剰に用いた。完全なテトリソの分解がCPOの不活化の前に観察され（したがって、おそらくこれらのメカニズムは無関係である）、CPOの不活化の更なる解析が不要になった。
（6）テトリソの大規模な除染についての検討：
−一連の実験を設計して1質量％のテトリソの除染に必要なクロロペルオキシダーゼの量を決定した。クロロペルオキシダーゼ触媒酸化反応を力学的にモニターした。以下のパラメーターをモニターした：
ClO2-：チオ硫酸ナトリウムによるヨウ素滴定（ClO2は干渉を回避するために散布される）。
ClO2：DPD酸化の分光分析
テトリソ濃度：GC-MS；pH；Cl-：ISEプローブ
テトリソは、濃亜塩素酸ナトリウム中（酵素無し）で図6Aに示すように徐々に分解される。図6Cに示すように、亜塩素酸塩濃度は10から15分後に急速に低下し、これは、図6Dに示すようにClO2の生成と一致する。二酸化塩素が生成されると同時に、（図6Bに示すように）劇的なpHの低下が発生し、塩化物が消費される。本発明のこれらの例示的な方法を種々の量のクロロペルオキシダーゼの存在下で実施することができる。
（7）デハロゲナーゼ及びDFPase活性に対する種々の緩衝剤の影響：
−デハロゲナーゼは臭化物プローブを用いてアッセイし、DFPaseはフッ化物プローブを用いてアッセイした（異なる緩衝剤を利用することによる酵素性能への影響を決定するために各酵素は種々の緩衝剤中に存在する）。
−デハロゲナーゼ：図7に示すように、ジブロモメタンのデハロゲナーゼ触媒加水分解による臭化物イオンの生成を、種々の緩衝剤における酵素濃度の関数としてアッセイした。速度は臭化物選択性電極を用いてモニターした。この実験の結果（データは図7に提示）は、デハロゲナーゼはpH7.5でそれより低いpH値に比べ最高の性能を有するが、全体的なpH範囲内で劇的な変化はないことを示している。さらにまた使用した種々の緩衝剤の間でほとんど相違は存在しない。
−DFPase：同じ実験（デハロゲナーゼについて図7に示したように）をDFPaseに関して実施した（図8に示されている）。図8に示すように、DFP（3mM）のDFPase触媒加水分解によるフッ化物生成速度を、種々の緩衝剤中のDFPase濃度の関数としてアッセイした。速度はフッ化物選択性電極を用いて測定した。結果はデハロゲナーゼについて観察された結果と非常に類似している。速度は高いpHでより速いが、DFPase活性の劇的な変化はこのpH範囲内では観察されず、緩衝剤間で観察される顕著な変化はない。
【０２２４】
（8）pH変化に対抗する種々の緩衝剤の影響：
−酸性pH変化に対抗する種々の緩衝剤の性能をアッセイした。前記の実験を考慮して、少なくとも前記のような条件下では、除染反応を通して6.5より高いpHが維持されねばならない。良好な緩衝剤の望ましい属性は以下のとおりであろう：
ａ）自己緩衝のために用いられる固体成分
ｂ）所望範囲の1pH単位内のpKa
ｃ）安価
ｄ）単位質量当たりの高い性能
これら望ましい属性を試し強調するために、以下の実験を設定した。対応する緩衝溶液は300mM及び種々のpHで調製した。滴定装置を用い、0.1MのHClを一定時間にわたって添加し、その間pHをモニターした。結果を図9に示す。図9では、標準化した0.1MのHClで滴定した後でpH変化に対抗する種々の緩衝剤の性能をアッセイした。各緩衝剤は3つの出発pH6.5、7及び7.5で試験した。
pH範囲内の相対的強度＝
リン酸緩衝剤-クエン酸緩衝剤＞Hepes＞リン酸緩衝剤＞Tris
緩衝剤の調製に必要な質量＝
Tris＜リン酸緩衝剤-クエン酸緩衝剤＜リン酸緩衝剤＜Hepes
(37)              (41)              (42)            (72)
相対的コスト
Tris＜リン酸緩衝剤＜リン酸緩衝剤-クエン酸緩衝剤＜Hepes
全体的優位性＝
リン酸緩衝剤-クエン酸緩衝剤＞リン酸緩衝剤＞Hepes＞Tris
【０２２５】
（9）腐食検査：
種々の軍事特化塗料に対する除染溶液の影響を調べることを目的とする標準化方法を試験した。全体的なプロトコルは軍事用プロトコルに基づいて指示され、前記プロトコルでは種々の等級の硬さを有する鉛筆を用いて、スクラッチ又は彫りきずに対するペイントコーティングの抵抗性が計測される。
この軍用プロトコルは検査で実施されるべき方法は指定するが、検査で用いられるべき推奨乾燥被覆厚（dft）に対するガイドラインは提供されていない。いくつか検査プレートを塗装した後、最初に用いたコーティングは厚すぎ（〜10ミル（１ミル＝0.001”））、各コーティングの乾燥に時間の延長を必要とした。この時点で、この検査ラウンドで用いられるべき各タイプの塗料について仕様書が見つかった。これらの書類を調べることによって、使用される塗料タイプのための推奨dftの範囲は1から4ミルであることが明らかになった。
この情報を用いて、また別の検査パネルシリーズをMIL-24441エポキシポリアミド緑色プライマー（非揮発性有機化合物（VOC）コンプライアント、2層コート、エポキシポリアミド系、浸漬作業用に及び環境性攻撃からの表面保護のための処方）を用いて5湿潤ミル（約2.5乾燥ミル）で被覆した。最初のコーティングはまだらであったが、エナメルの最上部層を塗布する前に、プライマーコートを更に被覆して均等な塗装を達成しなければならない。
追加実験：1つ（又は2つ）のさらに追加のプライマーコートが検査プレートに塗布されるであろう。最後のプライマー被覆の5から6時間後に、エナメルの最上部層を塗布し、一方、最終プライマー被覆はなおべとついている。エナメル被覆プレートを60℃のオーブンに約2日間入れてキュアリングを促進する。この時点でサンディア泡沫（化学物質及び生物剤を迅速に中和する除染処方）（Sandia Corporation, a Lockheed Martin Company, for the United States Department of Energy）、300mMのNaClO2、及び1000ppmのClO2が前記プレートに適用され、鉛筆検査法を用いて塗料の硬さに対する影響が試験されるであろう。
【０２２６】
（10）化学的加水分解によるVX分解のカイネティクス：
−環境ライブラリー溶解物のスクリーニングにより9つのVX分解ヒットが得られた。クローンを濃縮し、タンパク質を発現させて精製した。ライブラリーの自動スクリーニングは酸化補助基質（例えばNaClO2又はH2O2）を一切添加せずに実施したので、これらのライブラリーのVX分解ヒットは酵素的加水分解から生じ得る。予備的な配列分析によって、ある種の公知のヒドロラーゼとの相同性が明らかになった。
新規に発見されたヒドロラーゼによる予想される酵素的加水分解の最大速度を判定するために、VXの化学的加水分解速度を種々のNaOH濃度で測定した。図10及び11（下記の考察を参照されたい）は、それぞれ10μM又は0.5mMのVXを用い、種々のNaOH濃度における経時的VX分解を示している。VX分解速度は、エルマン法を用いて残留するAChE阻害を追跡することによって決定した。0.01NのNaOHでは、10μM及び5mMのVXは22時間後にそれぞれ11％及び13％が分解された。
模式図1は、VX加水分解における種々の可能な経路を表している。基本的加水分解の第一段階はリン原子上での水酸基イオンの攻撃であり、五配位リン中間体（I）を生成する：
【０２２７】
2009517002.tif 000029
模式図１：五配位リン中間体
【０２２８】
続いて、3つの可能な結合切断経路が存在する。第一に、P-S結合が切断され、メチルエチルホスホン酸及びN,N-ジイソプロピルアミノエタンチオールを生成し、VXの完全な解毒に至る：
【０２２９】
2009517002.tif 000030
【０２３０】
第二に、エトキシドが追い出されて有毒な化合物（いわゆる“EA2192”）が生じる：
【０２３１】
2009517002.tif 000031
【０２３２】
VXはまた、炭素原子からのチオホスホネート陰イオンの転移により加水分解されその解毒に至る：
【０２３３】
2009517002.tif 000032
【０２３４】
VXの加水分解生成物の性質は、主として媒体のpHに左右される。10より高いpHでは、唯一の生成物は遊離チオール及びメチルエチルホスホン酸である（例えば以下の文献を参照されたい：Epstein (1974) The Kinetics and mechanisms of hydrolysis of phosphonothiolates in dilute aqueous solution, Phosphorus 4:157-163）。実際、測定した全てのNaOH濃度において（48時間しか加水分解を追跡しなかった0.01NのNaOHを除く）、AChE阻害アッセイによって測定したとき、図10及び11に示すように、VXの完全な解毒が得られた。これらのKobs値は、精製酵素を用いて得られるカイネティクス値のための参照枠として有用である。
【０２３５】
図10に示すデータについて、NaOHによるVXの経時的分解は以下のとおりである（VX 10μM、25℃）：
2009517002.tif 000033
【０２３６】
図11に示すデータについて、NaOHによるVXの経時的分解は以下のとおりである（VX 5mM、25℃）：
2009517002.tif 000034
【０２３７】
（11）蛍光基質を用いる例示的スクリーニングアッセイ：
最適な蛍光基質を見つけるための実験を始め、さらにVX又はGF分解活性について環境ライブラリーをスクリーニングする条件についての実験もまた始めた。調べた蛍光基質：レゾルフィンブチレート（RB）、レゾルフィンアセテート（RA）及び7-アセトキシ-N-メチルキノリニウムイオダイド（AMQI）。図12は、基質としてRB又はブチルチオコリン（BTC）を用いたとき、VX及びGFによるBchE阻害の濃度依存を表している（ウマ血清BchE（Sigma）（2.5U/mL）の5分阻害、96ウェルプレートで0.2mLの総体積）。BChE活性は、基質としてRB（75μM）を用い時間による相対的蛍光単位（RFU/分）で測定するか、又は基質としてBTC及びチオール試薬としてDNTBを用い（エルマン法）412nmでのOD/分の勾配にしたがって測定した。
図12では、データは、VX及びGF濃度に対するBChE活性の依存性を示している。VX又はGFによるBChE阻害の濃度依存曲線（基質としてRB（蛍光）又はBTC（吸収）を用いて得られた）は、実質的には同一であった。AChEはBChEよりも低濃度のGF及びVXによって阻害されるので（約又はほぼ10から20倍低いIC50値をもつ）、適切な蛍光基質を用いることによりAChE阻害に関してVX及びGF濃度のより広いダイナミックな範囲が更なる実験によって示されるであろう。
【０２３８】
（10）弱毒化炭疽菌芽胞の除染：
本発明はまた、生物剤（例えば生物学的兵器、例えば炭疽芽胞）の除染のための組成物及び方法を提供する。総体積1mLのCPO/NaClO2の2つの異なる混合物を試験した：CPOは、NaClO2（25mM）を含むリン酸緩衝液（50mM、pH7.5）に各投与当たり2又は10単位で繰り返し（5回）添加した。CPOにより発生する酸化ラジカル濃度は、図13に示すように、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（DPD）によって10分間隔で60分まで測定した（DPDアッセイについては以下を参照されたい：Liem (2002) Clin Biochem 35(3):181-187）。図13は、DPDアッセイによって測定したCPO生成酸化ラジカル濃度を示す実験を示している。
このデータは、CPO-生成酸化ラジカルレベルは、それぞれ個々の混合物内で少なくとも60分間安定に維持されていたことを示している（10又は2CPO単位の5回の反復添加からそれぞれ12±1.5又は1.9±0.3ppm、図14を参照されたい、図14は、CPO生成酸化ラジカルによる弱毒炭疽菌芽胞不活化の有効性を示す実験を示している、TS＝チオスルフェート）。
これらの発見によって、我々は、弱毒化炭疽菌芽胞を不活化するCPO-生成酸化ラジカル（5ｘ10単位混合物による）の有効性を試験することにした。芽胞を1mLのCPO/NaClO2混合物に添加し、60分のインキュベーション後に生存率を決定した（図10参照）。我々のデータは、RT（ほぼ20℃）で60分以内に達成される効率的な除染（少なくとも6log低下）を示している。さらにまた、NaClO2（25mM）はそれだけでは芽胞の生存率に影響を与えず、さらに芽胞の接種前に混合物に50mMのチオ硫酸ナトリウムを添加することにより芽胞の不活化が阻止された（図14参照）。これらの結果を基に、我々はCPO-生成酸化ラジカルのCt値を決定するであろう。
【０２３９】
実施例3：酵素による能動的除染
本実施例は、環境ライブラリーからVX-/テトリソ-分解酵素の発見、及び新規な環境ヒットの異種発現について述べる。VXスクリーニングで示されたヒットを完全に配列決定し、3つの新規な遺伝子を同定し、適切な大腸菌発現プラスミドでサブクローニングし、さらに宿主及び配列を確認した、クローンは培養及び精製のためにHisタグを付加した。
環境ライブラリーヒットのVX分解についての反復確認
さらに結果の確証を得るために、40の環境ライブラリーサンプルをスクリーニングした。これら40の溶解物を、VX及びテトリソに対する分解活性について試験した。環境ライブラリー溶解物によるVX及びテトリソの経時的分解を自動操作システムで実施した。
図15は、環境ライブラリーサンプルによるVX（1μM）の分解のカイネティクスを示すデータである。VX分解カイネティクスの時間間隔は、図15A及び15Bに示されている。図16A及び16Bは、これら環境ライブラリーサンプルによるテトリソ（20μM）分解カイネティクスを示すデータである。両者のためのサンプルは、85時間（4d）まで7から8回の特定の時間間隔で分解混合物から採取した。
このスクリーニング過程によって検出されたVX分解ライブラリーヒットは以下のとおりである：配列番号:76（例えば配列番号:75によってコードされる）、配列番号:78（例えば配列番号:77によってコードされる）、配列番号:80（例えば配列番号:79によってコードされる）（図15A、“プレート1”）、配列番号:82（例えば配列番号:81によってコードされる）、配列番号:84（例えば配列番号:83によってコードされる）及び配列番号:74（例えば配列番号:73によってコードされる）（図15B、“プレート2”）、さらに程度がかなり低いサンプルとして配列番号:86（例えば配列番号:85によってコードされる）、配列番号:88（例えば配列番号:87によってコードされる）及び配列番号:90（例えば配列番号:89によってコードされる）（図15B、“プレート2”）は20から25％の分解を引き起こしただけである。
【０２４０】
後者の3つのVXヒット（配列番号:86（例えば配列番号:85によってコードされる）、配列番号:88（例えば配列番号:87によってコードされる）及び配列番号:90（例えば配列番号:89によってコードされる）のみが、テトリソの顕著な分解を引き起こす溶解物であった（図16、プレート2）。他の6つのVXライブラリーヒットはテトリソ分解自動スクリーニングアッセイでは検出されなかった。40の反復環境サンプルから発見された9つ全てのヒットが手動のカイネティクス測定によって確認された。
図17は、コントロール（発現タンパク質を全く含まない細胞溶解物）と比較した9つ全てのVX環境ヒットによるVX分解カイネティクス（手動で実施）を示すデータである。もっとも迅速なVX分解速度は、サンプル、配列番号:84（例えば配列番号:83によってコードされる）＞配列番号:80（例えば配列番号:79によってコードされる）＞配列番号:76（例えば配列番号:75によってコードされる）及び配列番号:74（例えば配列番号:73によってコードされる）に関して得られ、t1/2値はそれぞれ12、19及び23時間であった。他の3つのヒットは、配列番号:78（例えば配列番号:77によってコードされる）＞配列番号:82（例えば配列番号:81によってコードされる）＞配列番号:74（例えば配列番号:73によってコードされる）及び配列番号:74（例えば配列番号:73によってコードされる）であり、t1/2値はそれぞれ48、59及び71時間であった。
以前のカイネティクスの測定では、連続的な降順は少しばかり異なり、これはおそらく粗溶解物中の酵素の固有の安定性の相違を示しているのであろうということは特筆しなければならない。興味深いことには、テトリソヒットの配列番号:86（例えば配列番号:85によってコードされる）、配列番号:88（例えば配列番号:87によってコードされる）、及び配列番号:90（例えば配列番号:89によってコードされる）（前記はまたVXに対しては限定的な分解活性を示す）は同じアミノ酸配列を有することが見出された。他の6つのVXヒットは2つの別個の配列を示した。
【０２４１】
2009517002.tif 000035
*テトリソライブラリーヒット
図17では、環境ライブラリーヒットによるVXの経時的酵素分解が1μMのVXで25℃にてコントロール細胞溶解物を用い手動で実施された。
【０２４２】
２．菌類供給源からCPOの発見
酵素：部分的に精製した菌類のヘムCPOの3バッチをVXについてアッセイした。部分的に凍結乾燥したサンプルをそれらの本来の体積に水で再構成し、続いて最初の2つのサンプルについては16.6、第三のサンプルについては3.33の稀釈率で稀釈した。これらのサンプルのいずれも、0.025MのNaClO2とともに7日間インキュベートした後でVX（10μM）に対して分解活性を示さなかった。
配列による発見：オーバーラップPCRによる方法を用いて2つの完全長菌類遺伝子からイントロンを除去し、さらに前記遺伝子を適切な発現宿主でサブクローニングする。同じ縮退PCRアプローチを用いて、10の新規なペルオキシダーゼの部分配列を見つけ、4つの完全長の遺伝子を続いて単離した。オーバーラップPCRによる方法を用いてこれら遺伝子のイントロンを除去することができる。
３．大腸菌、ピキア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）でのC.フマゴCPOの異種発現
C.フマゴのクロロペルオキシダーゼ（CPO）（配列番号:2）をコードする核酸（配列番号:1）をサッカロミセスでサブクローニングし、活性について、さらに例えばウェスタンブロッティングを用いて細胞内で生成される何らかのタンパク質が存在するか否かを試験することができる。さらにまた、最初のピキア構築物を再度操作し、それらの天然のシグナル配列をあらためて付加した（これは、この宿主での発現を達成することができるか否かを調べるためである）。大腸菌及びピキアで作成した最初の構築物のウェスタンブロットによって、これら異種宿主で生成されるタンパク質は存在しないこと、及びこれはMCDアッセイを用いて活性が検出されなかったこととと一致する。
【０２４３】
４．C.ヘテロストロフスでのC.フマゴの異種発現の最適化
C.フマゴCPO（配列番号:2）に対する抗体を用いて、我々はウェスタンブロットによる酵素の検出を最適化して、形質転換体を検出した。図18（種々のサンプルの抗C.フマゴCPOイムノブロット）に示すように、3から4mg/mLのクロロペルオキシダーゼがC.ヘテロストロフスで生成されている。この発現レベルはGSSM実験のためには十分ではないので、CPO発現レベルを改善するまた別のアプローチが用いられるであろう。
５．CPO不活化の検討
ラジカルトラップ試験：この実験は、CPOの安定性が、潜在的不活性化能をもつラジカルを吸収する化合物の添加によって改善されるか否かを決定するために実施した。不活性化能をもつ最少量のNaClO2（0.5mM）（この量はCPO（1μM）を用いてプロテオミクスグループによって以前に決定された）を用い最初のスクリーニング実験のために、9つの化合物を水性系（100mMまで）での十分な可溶性について試験した（陽性コントロール（NaClO2無添加）及び陰性コントロール（NaClO2のみ添加）を含む）。
9つの化合物のうち、4つのみ（POBN、DBNBS、DMPO及びサリチル酸ナトリウム）がさらに前に進むために十分な可溶性を有していた。続いて、NaClO2を添加後１分、10分、60分及び24時間でドライアイス/アセトンで適量を瞬間凍結することにより経時的変化を調べた。これらのサンプルをSDS-PAGE分析用調製物中で凍結乾燥した。陽性コントロール（非不活性化CPO）との比較に基づき、ラジカルトラップのCPOのMWサイズを保存する能力は以下のように等級付けされる：
DBNBS＞DMPO＞POBN＞サリチル酸ナトリウム
サンプルはプロテオミクスによって解析されるであろう。
脱グリコシル化：C.フマゴのクロロペルオキシダーゼ（CPO）（配列番号:2）のための条件を天然の条件下で調べ、この酵素の脱グリコシル化形がどのように良好に機能するかを精査した（脱グリコシル化形の酵素活性を調べるため）。これは、タンパク質をグリコシル化することができない異種発現方法（例えば原核細胞発現系）の使用を評価するために実施した。数日にわたって採取したそれぞれの時点におけるSDS-PAGE解析を基に、一組の成功条件を特定した。この方法を再現性について試験し、SDS-PAGE、MS解析及びモノクロロジメドンアッセイ（CPOのための塩素化活性アッセイ）によってチェックすることができる。
【０２４４】
クロロペルオキシダーゼの亜塩素酸ナトリウムへの暴露（プロテオミクス解析）： NaClO2のCPO（25mM、モル比25,000：1）への暴露が決定された。プロテオミクスプロファイリングを処理又は未処理CPOについて実施した。処理CPOをNaOCl2に1：1000の割合で暴露した。マトリックス支援レーザー脱離飛行時間型質量分析（Matrix Assisted Laser Desorption Time of Flight Mass Spectrometry）（MALDI-TOFMS）解析を（C.フマゴのクロロペルオキシダーゼの）各サンプルについて実施し、図19A及び19Bに示すように各サンプル間で消失及び出現するピークを観察した。いくつかの事例では、質量マッピングはピークのいくつかについて配列の決定を可能にした。しかしながら、図19A及び19Bでは、豊富さに変化があったピークの配列は決定することができなかった。
四重極子飛行時間質量分析装置結合エレクトロスプレーイオン化（Electrospray ionization coupled with a quadruple time of flight mass spectrometry（ESI-QTOFMS）instrument）を用いてタンデム質量分析を実施し、未処理サンプルと処理サンプル間で図20Aに示したように豊富さに変化があったCPOのペプチド配列を決定した。消失したピークを未処理サンプルのタンデム質量分析のために選別し、それらの配列を図20Bに示すように決定した。
MALDI-TOF及びESI-QTOFの両分析で、未処理サンプルの多数のピークが処理サンプルで消失するのが観察された。改変（例えば酸化又は塩素化）が発生すれば、シグナルが種々の質量で出現し完全には消失しないはずである。以前のゲル分析から、架橋が起こっているかもしれないと理論づけられる。この理論によって、質量スペクトル内の多くのシグナルがなぜ未処理サンプルと比較して処理サンプルで存在しないのかを説明できる可能性がある。消失したペプチドのいくつかはタンパク質の三次元構造マップを作成すると、図21に示すように分子の外側に存在する。したがって、架橋が生じた可能性があると考えられる。
【０２４５】
６．テトリソの大規模除染の検討
VX類似体のテトリソ（40mM）の除染に必要なクロロペルオキシダーゼの量を調べた。テトリソを完全に除染し二酸化塩素の生成を防止するためには、図22に示すように、ほぼ1200U/mLのクロロペルオキシダーゼが溶液中に存在しなければならないことが判明した。亜塩素酸塩消費、二酸化塩素生成及び残留酵素活性を除染の間モニターすることができる。図22では、320mMの亜塩素酸塩及び300mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）中の種々の濃度のCPOによるテトリソ分解が示されている。
７．他の例示的酵素
本発明は、本発明の酵素の活性を確認し、さらにあるポリペプチドが本発明の特許請求の範囲内に包含されるために必須の活性を有するか否かを決定するためのアッセイを提供する。ある例示的アッセイは、デハロゲナーゼ活性をアッセイするために臭化物プローブを用いる（ジブロモエタンを使用する）。図23及び24に示すように、多数の緩衝液及びpHが、クロロペルオキシダーゼ、デハロゲナーゼ及びDFPaseの最適活性/安定性についてスクリーニングされるであろう。図23は、ジブロモメタン（飽和溶液）のデハロゲナーゼ触媒加水分解による臭化物イオンの生成を種々の緩衝液における酵素濃度の関数として示している。速度は臭化物選択性電極を用いてモニターした。図24は、DFP（3mM）のDFPase触媒加水分解によって生成されるフッ化物の割合を種々の緩衝液中のDFPase濃度の関数として示している。速度はフッ化物選択性電極を用いて測定した。高濃度の亜塩素酸塩、二酸化塩素との適合性を有する物質、及び本発明の除染処方物のより高活性型（高濃度の酵素及び亜塩素酸塩）もまた用いることができる。
【０２４６】
実施例4：酵素による能動的除染
本発明は、デハロゲナーゼ活性（例えばハロアルカンデハロゲナーゼ活性）を有するポリペプチド、及びデハロゲナーゼ活性についてアッセイする方法、例えばハロアルカンデハロゲナーゼ活性及びハロアルカンデハロゲナーゼを発見する方法を提供する。ある特徴では、これらの酵素は硫黄マスタード（HD）の除染に用いることができる。
Ｉ．酵素の発見及び特性決定：
本実施例は、硫黄マスタード（HD）を除染する酵素の発見、精製及び性状決定を目的とする例示的方法について述べる。
・13のハロアルカンデハロゲナーゼを生成し、部分的精製を実施した。代用基質を用いて前記の酵素を活性について試験し、それらのうちの2つを硫黄マスタードについて試験した。一方の酵素が他方の酵素より優れており（配列番号:70、配列番号:69によってコードされる）、1グラムを超えるこの酵素を均質に精製し、処方実験に用いた。
VX分解用新規酵素の発見及び単離：
・環境DNAライブラリーのスクリーニング：高処理自動スクリーニングを考案し、代用基質テトリソを用いて実施した。有機リンヒドロラーゼ（OPH）をサブクローニングし、このアッセイで陽性コントロールとして用いた。3.5ヶ月にわたって、地球上の種々の生態学的適所を含む合計12の環境ライブラリー（100万個のクローンを含む）をスクリーニングした。予備スクリーニングで、活性を有するように思われる179クローンを同定した。これらのクローンの各々を増殖させ、溶解物を調製し、細胞ODについて正規化した。これらのサンプルをVXで直接検査した。9クローンがVX（IIBR）に対して顕著な活性を示すことが判明した。続いてこれらのクローンの配列を決定し、3つが無比のものと同定された。3つの酵素の全てがアルファベータヒドロラーゼスーパーファミリーに属している。これらの遺伝子は、現在更なる特性決定のためにサブクローニングされつつある。
・新規な菌類単離体からクロロペルオキシダーゼの単離：我々は、500を超える新規な菌類の単離体を増殖させ、クロロペルオキシダーゼ活性についてアッセイし、22単離体が活性を示した。これらの単離体のうち5つを増殖させ、それらのペルオキシダーゼ酵素を部分精製した。これらの酵素をVX分解活性について試験している。
・新規なヘム含有クロロペルオキシダーゼの配列ベースの発見：C.フマゴ由来の公知のヘムクロロペルオキシダーゼ及び公開されている他の菌類ゲノムから同定された相同な遺伝子を用い、2つの縮退PCRプライマーを設計し、上記に記載したクロロペルオキシダーゼ活性についてスクリーニングした同じ菌類単離体から類似の遺伝子を引き出すために用いた。2つの完全長の配列を回収し、8つの部分配列を同定した。
・ラッカーゼの単離及び特性決定：ラッカーゼはVXに対していくらかの活性を有する。8つのラッカーゼ酵素を増殖させ部分精製し、VXに対する活性について試験している。
・バナジウムクロロペルオキシダーゼ：このクラスの酵素は以前にVXに対して活性を示すことが示された。先ず初めに、この酵素をクルブラリア・イナエクァリス（Curvularia inaequalis）の野生型培養から部分的に精製し、得られた酵素を活性について試験した。クルブラリア・イナエクァリスの遺伝子をコクリオボルス・ヘテロストロフス（Cochliobolus heterostrophus）菌類宿主でサブクローニングし過剰発現させた。前記の部分的精製酵素を活性について試験した。さらにまた、新規なバナジウムペルオキシダーゼをC.ヘテロストロフスのゲノムから同定した。野生型生物から前記酵素を精製する試みは、この酵素とともに多糖類が一緒に単離されたために成功しなかった。
C.フマゴCPOの異種発現：
・糸状菌での発現：3つの異なるプロモーターを用いて、C.フマゴのクロロペルオキシダーゼの遺伝子を菌類宿主C.ヘテロストロフスでサブクローニングした。種々のプロモーター及び増殖培地の組合せを用いて過剰発現のために最適な条件を決定することができる。
・大腸菌/ピキア/サッカロミセス：菌類発現系に加えて、本発明は、大腸菌、ピキア、及びサッカロミセス発現系を提供する。種々の構築物＋／−シグナル配列を大腸菌、ピキア及びサッカロミセスでサブクローニングした。トランスフェクトしたこれらの細胞（例えば本発明の構築物を含む細胞（本発明の酵素を発現する細胞を含む））を現在増殖させ、クロロペルオキシダーゼ活性について試験している。
・CPOのプロテオミクス解析：市販のC.フマゴCPO（配列番号:2、例えば配列番号:1によってコードされる）を用いて、なぜCPOが時間の経過にしたがってVX及びNaClO2の存在下でその活性を失ったのかを確認するための実験を実施した。多くの異なる生化学的及びプロテオミクス的技術を用いた（ラジカルトラップを用いるいくつかの実験を含む）。今日までに、我々は、前記酵素はNaClO2の存在下にあるときは架橋するらしいことを示した。特定のアミノ酸における酸化又は他の改変がCPOに生じているかもしれない。この酵素の脱グリコシル化は、その後のプロテオミクス的解析を容易にするかもしれない。さらに種々の消化条件の試験もまた、その後の（酵素をもっともよくカバーする）質量分析によるプロテオミクス解析を促進するであろう。
【０２４７】
II．代用物質の除染及び処方物：
DFPase及びG剤の分解：
・クロロペルオキシダーゼと併用してDFPaseを用いるために、前記は、亜塩素酸ナトリウム及び二酸化塩素の存在下で活性を維持しなければならない。DFPase（2.5mg/mL）を亜塩素酸ナトリウム（0−100mM）又は二酸化塩素（0−100ppm）とともにインキュベートするとき、インキュベーションの30分後に顕著な活性（＞30％）が維持される。
・二酸化塩素はDFPを分解しない。DFPaseは、100ppmのClO2の存在下で2.5mMのDFPを分解するが、活性の低下を取り戻すためにDFPaseの濃度の増加が要求される。
・加水分解される物質1モル毎に2モルの酸が生成されるので、重要な物質の完全な分解を担保するために緩衝剤を必要とする。
・DFPaseは、有意義な緩衝剤が存在し、pHの低下を防止するかぎり、1質量％のDFPの分解に有効である。200mMの炭酸アンモニウム緩衝液はpH変化の防止に有効であり、8U/mLのDFPaseによって1質量％のDFPが20分で完全に分解される。
・DFPaseは、100mMまでの亜塩素酸ナトリウムの存在下で1質量％のDFPの除染に有効であった。100mMの亜塩素酸ナトリウムとともに50U/mLのクロロペルオキシダーゼを添加しても完全なDFP分解を妨害しなかった。
クロロペルオキシダーゼ及び酸化的除染
・二酸化塩素は、クロロペルオキシダーゼ及びセイヨウワサビペルオキシダーゼの両者を失活させ、前記の失活は、前記酵素のソーレー吸収帯の減少と関連している。
・0.5mMのテトリソは、25mMの亜塩素酸ナトリウムを加えた50U/mLのクロロペルオキシダーゼによってpH7.0で効率的に分解される。このような条件下では、14ppmのClO2のみが溶液中に検出される。二酸化塩素を用いて類似の分解を達成するためには、過剰のClO2が要求される。
・実験によって、亜塩素酸ナトリウムの存在下でクロロペルオキシダーゼにより2-CEESがそのスルホキシドへ迅速に分解されることが示された。
・109個の枯草菌（B． subtilis）栄養細胞は、亜塩素酸ナトリウムとともに50U/mLのセイヨウワサビペルオキシダーゼ又は50U/mLのクロロペルオキシダーゼによりpH7.5で30分暴露後に完全に不活化される。
・枯草菌の芽胞は、25mMの亜塩素酸ナトリウムとともにpH7.5でクロロペルオキシダーゼ及びセイヨウワサビペルオキシダーゼに暴露後に不活化されるが、完全な不活化には酵素の反復添加が必要である。
・我々は、25mMの亜塩素酸ナトリウムの添加後のクロロペルオキシダーゼ及びセイヨウワサビペルオキシダーゼの安定性を、0.5mMのテトリソの存在下及び非存在下で測定した。これらの条件下での50U/mLの酵素の半減期は、クロロペルオキシダーゼについては約3分、セイヨウワサビペルオキシダーゼについては約1分である。
・多数の溶液添加物（スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、PEI、ギアイコール、アスコルビン酸、ABTS、マンニトール及びDMSO）を、除染中のクロロペルオキシダーゼの安定性を改善するそれらの能力について調べた。調べた前記安定化剤のいずれも酵素の安定化の改善に有効ではなかった。
・クロロペルオキシダーゼ安定性の改善及びテトリソの除染の増加のための技術として、亜塩素酸塩の制御添加を検討した。クロロペルオキシダーゼの半減期は改善されたが、テトリソの分解速度は低下し、テトリソターンオーバーの顕著な改善は観察されなかった。
・160mMの亜塩素酸塩及び960U/mLのクロロペルオキシダーゼ（300mM、pH7のリン酸緩衝液）を用いて、我々は25mMのテトリソを10分でほぼ除染することができた。
・50U/mLのクロロペルオキシダーゼの二酸化塩素溶液（ほぼ60ppm）への添加は、二酸化塩素の大きな減少（ほぼ80％）をもたらす。等価重量のBSAの添加は二酸化塩素濃度に殆ど変化をもたらさない。
【０２４８】
腐食実験
二酸化塩素（340又は800ppm）と酵素的除染処方物（DFPase、クロロペルオキシダーゼ、25mM亜塩素酸ナトリウム）とを比較する腐食実験は、酵素的除染は金属に対して腐食性が少ないことを示した。図25はこれらの実験の結果で、種々の濃度の炭酸アンモニウム緩衝液（50−300mM）中での1質量％のDFPのDFPase（8U/mL）による分解を示している。
クロロペルオキシダーゼと酸化的除染
図26は、クロロペルオキシダーゼと酸化的除染に関する実験を示す。この実験では、二酸化塩素の添加時にクロロペルオキシダーゼについてソーレー吸収帯に変化があった。図26では、ソーレーバンド（398nm）は二酸化塩素の添加時に消失する。酵素活性の低下もまたソーレー帯の消失と一致した。図27は、50mMのリン酸緩衝液（pH7.0）中での二酸化塩素及び亜塩素酸ナトリウムによるテトリソの分解を示す実験で、20分後に50％を超えるテトリソが分解される。図28は、50mMリン酸緩衝液（pH7.0）中でのクロロペルオキシダーゼ/NaClO2/ClO2によるテトリソの分解を示す実験を示している。図29は、亜塩素酸ナトリウム及びクロロペルオキシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼを用いた二重酸化による暴露後1時間の枯草菌Niger変種株の不活化を示す実験を示している。全ての実験は50mMのリン酸緩衝液（pH7.5）中で実施された。図30は、亜塩素酸ナトリウム及びクロロペルオキシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼを用いた二重酸化による暴露後1時間の枯草菌Niger変種株芽胞の不活化を示す実験を示している。酵素は、50単位として1回接種で添加されるか（1ｘ50）又は5回添加された（5ｘ10）。全ての実験は50mMのリン酸緩衝液（pH7.5）中で実施された。図31は、緩衝液中で、25mMのNaClO2中で、0.5MのテトリソとともにNaClO2中で、さらに0.25mMのNaClO2中でのクロロペルオキシダーゼの安定性を示す実験を示している。サンプルを周期的に取り出し、MCDを用いてアッセイした。図32は、緩衝液中で、25mMのNaClO2中で、0.5MのテトリソとともにNaClO2中で、さらに0.25mMのNaClO2中でのセイヨウワサビペルオキシダーゼの安定性を示す実験を示している。サンプルを周期的に取り出し、ギアイコール及びH2O2を用いてアッセイした。図33は、80mMのNaClO2を含む300mMのリン酸緩衝液（pH7.0）中で480U/mLのCPOによるテトリソの分解を示す実験を示している。実験の最後には利用可能な亜塩素酸塩はなく、pHはわずか0.15単位だけ変化した。コントロールについては、pHの変化はなく、10mMの亜塩素酸塩は1時間後に消失した。図34は、160mMのNaClO2（酵素なし）を含む300mMのリン酸緩衝液（pH7.0）によるテトリソの分解を示す実験を示している。ほぼ60mMのNaClO2が1時間後に消失し、pHはほぼ0.3変化した。図35は、160mMのNaClO2を含む300mMのリン酸緩衝液（pH7.0）中で960U/mLのCPOによるテトリソの分解を示す実験を示している。1時間終了時のpH変化はほぼ0.3から0.4であり、極めてわずかの亜塩素酸塩が1時間の終了時に存在していた。図36は、50U/mLのCPOの添加時のClO2吸収の低下を示す実験を示している。BSAの添加は吸収の変化をほとんど生じなかった。図37は、CPO（50U/mL）又は等価重量のBSAの添加時のClO2分解のカイネティクスを示す実験を示している。
【０２４９】
金属に対する腐食実験
本発明は、本発明のハロペルオキシダーゼ（例えばクロロペルオキシダーゼ）及び亜塩素酸塩成分（例えば亜塩素酸ナトリウム）又は等価物（例えば亜ヨウ素酸ナトリウムが等価であろう）を含む処方物（例えば混合溶液）を提供する。ある特徴では、これらの処方物は液体であり、有毒な暴露事象の前、最中及び/又は後に除染として適用される。別の特徴では、これらの処方物は、表面（例えば衣類、布地、金属（例えば鋼物質）、エラストマー、プラスチック、合金など）にコーティングとして塗布するか、又は噴霧することができる。前記酵素成分及び亜塩素酸塩成分（例えば亜塩素酸ナトリウム）又は等価物成分は1つの処方物として又は混合した同時適用物として一緒に適用することができるが、またはそれらは別々に（任意の順序で）適用することができる。二酸化塩素はこの除染反応によって生成される。鋼系物質を用いるこれらの実験（下記で詳細に述べる）は、本発明のこの特徴を実施することによって生成する二酸化塩素量は、前記を適用し得る鋼物質に対して非腐食性であることを明快に示している。
本発明はいずれの特定の作用メカニズムにも限定されないが、クロロペルオキシダーゼの除染作用の仮説的作用メカニズムは、亜塩素酸ナトリウム（又は等価物）を二酸化塩素（又は等価物）に変換することであり、この二酸化塩素（又は等価物）は効率的な除染物質である。補足すれば、前記酵素は多くの酸化種を生成することができるが、それらは未だ性状が決定されていない。
いくつかの通常的な除染プロトコルでは二酸化塩素を単独で用い除染し、これらの通常的な適用では、二酸化塩素は概して相対的に高い濃度で用いられる（ほぼ300から787ppmでこれは金属及び他の表面に対して腐食性である）。実際、相対的に高い濃度の300ppmでさえVX擬似物質を効率的には分解しない。本発明の実施によって二酸化塩素が酵素的に生成されるとき、効率的に除染するために要求される二酸化塩素の濃度ははるかに低くてもよく、例えばある特徴ではほぼ100ppmである。したがって、これらの実験では、我々は、低濃度の二酸化塩素（酵素により生成される条件を模倣する）と高濃度（通常の除染で使用される）を、特に種々の金属に対するそれらの腐食作用を比較する。
【０２５０】
図38及び52は、本発明のハロペルオキシダーゼ酵素及び亜塩素酸塩成分を含む、本発明の除染組成物及び方法を実施する（使用する）場合の鋼に対する非腐食性作用を示す実験（下記で詳細に述べる）を示している。例えば、図38は、酵素使用除染溶液（左パネル）及び340ppm二酸化塩素（右パネル）によりブルーテンパーを施したバネ鋼の2枚の写真を示す。この実験は、この例示的酵素使用除染溶液では腐食は生じないことを示している（さらにまた上記の図25に関する考察も参照されたい）。
図52は、これらハロペルオキシダーゼ/亜塩素酸塩成分除染(decon)処方物を実施及び使用するときに“通常”生成される二酸化塩素レベルに暴露した110炭素鋼の4枚の写真を示している。この実験もまた本発明のこれらの組成物の非腐食性作用を示している。図52に示すように、本発明の例示的除染処方物によって生成される量と等価の二酸化塩素濃度に暴露する前（上段左の写真）も暴露した後（上段右の写真）も炭素鋼は顕著な（すなわち目に見える）腐食徴候を全く示さなかった。対照的に、顕著な（すなわち目に見える）腐食が、本発明のこの例示的除染処方物（上段の2枚の写真の作成に使用）を用いることによって生成される量より3倍高い二酸化塩素濃度に暴露した鋼サンプルで観察された（暴露前は下段左の写真であり、暴露後は下段右の写真である）。
前記例示した鋼材料の他に、エラストマー、金属及び合金も、本発明の除染処方物による浸漬検査及び本発明の例示的除染処方物が実施時に生成する二酸化塩素濃度への暴露の両検査を合格した。対照的に、いくつかの金属は、二酸化塩素噴霧で用いられる濃度より低いか又は等価の酸化物質濃度に暴露したとき不合格であった。
本発明は、布地及び衣類上又はその内部、又はプラスチック上又はその内部などにプライマー及びコーティングとして使用される、本発明のハロペルオキシダーゼ酵素（例えばクロロペルオキシダーゼ）及び亜塩素酸塩成分（例えば亜塩素酸ナトリウム）又は等価物（例えば亜ヨウ素酸ナトリウムが等価であろう）の処方物を含む。
【０２５１】
金属及び合金の腐食性検査のためのプロトコル（データは図38及び52）
以下のタイプの金属及び合金を使用する：304、316及び321ステンレス鋼；110炭素鋼；ニッケル鋼；ブルーバネ鋼；銅；硬-及び軟-焼戻しアルミニウム。種々の溶液（二酸化塩素の100、300及び787ppmの比較）の腐食性を下記に記載するように試験した。使用した溶液はいずれも脱イオン水での二酸化塩素稀釈物であった。
100ppmの二酸化塩素：
これは、クロロペルオキシダーゼ/亜塩素酸ナトリウム除染によるVX-擬似物質の分解時に生成される二酸化塩素の濃度である。VX擬似物質が存在しないとき、ほぼ50ppmの二酸化塩素が生成される。
300ppmの二酸化塩素、787ppmの二酸化塩素：
これらの濃度は、除染で用いられる二酸化塩素の濃度とほぼ等価であるか又は前記より低い。我々は、300ppmの二酸化塩素（我々の実験室で合成）は1%w/vのVX擬似物質を30分では分解しないことを見出した。
試験はASTM（American Society for Tsting and Materials）法G31-72（1995）、金属の実験室浸漬検査（Laboratory Immersion Corrosion Testing of Metals）を用いて実施した。使用したその他の方法は、金属及び合金に対する変化を視覚的に観察するためのASTMF502-93であった。
金属及び合金を切断して均一の腐食試験片を作成し、ノギスを用いてそれらの面積をチェックした。前記試験片を洗浄し乾燥させた。重さを3回測定し、平均を算出した。各試験片を100mL広口ビンに入れ、試験溶液に浸漬した。ビンに封をし、サンプルをほぼ24時間前記溶液中に放置した。試験片を溶液から取り出し、水洗いし、風乾した。腐食の外観を写真で記録した。腐食生成物をやわらかいブラシで除去した。前記試験片を再度3回秤量し、平均を算出した。
腐食率を決定するために、質量減少、暴露時間（時間）、試験片の面積及び密度を用いて腐食率（ミル/年）を決定した。
以下の等式を用いた：腐食率＝(K x Ｗ)/(A x T x D)
式中、Kは定数（ミル/年では＝3.45ｘ106）であり、Aはcm2で表した面積、Tは時間で表した暴露時間、Wはグラムで表した質量減少、Dは密度（g/cm3）である。
この式は腐食の速度は均一であると仮定する。腐食はNACE（National Association of Corrosion Engineers）標準TM0169-2000を用いて分類した。
下記の表は、100、300及び787ppmの二酸化塩素溶液の比較を示す。データは、110炭素鋼は787ppmによって激しく腐食されるが、300ppmでは腐食は前記より少なく、100ppmではもっとも少ない。他の金属の結果、例えばブルーバネ鋼の結果も同様である。
【０２５２】
100ppmのClO2−短時間浸漬
2009517002.tif 000036
暴露時間（時間）18.75；定数（mpy）、3.45E+06；厚さ（cm）、0.00508
【０２５３】
300ppmのClO2
2009517002.tif 000037
暴露時間（時間）19.25；定数（mpy）、3.45E+06；厚さ（cm）、0.00508
【０２５４】
787ppmのClO2
2009517002.tif 000038
暴露時間（時間）16.00；定数（mpy）、3.45E+06；厚さ（cm）、0.00508
【０２５５】
クロロペルオキシダーゼ：亜塩素酸ナトリウム比は重要である（いくつかの事例では我々が除染することができるVX擬似物質の量のためであるが、ほとんどの場合には我々が生成する二酸化塩素の量のためである）。本発明のいくつかの特徴の実施で、完全な除染をもたらし、一方で100ppm以下の二酸化塩素を生成する、本発明の酵素と基質（例えば亜塩素酸塩成分、例えば亜塩素酸ナトリウム）の比を設計することが望ましい。ある特徴では、二酸化塩素が、生物剤（例えば芽胞、例えば炭疽又は炭疽菌芽胞）の除染の目的のためにもっぱら生成される。したがって、少なくともこの特徴（生物剤、例えば芽胞の除染）では、本明細書に開示されるV剤（例えばVXなど）の除染のために本発明のまた別の特徴で生成される二酸化塩素と同じ多くの量を生成することは要求されない。
本発明はいずれの特定の作用メカニズムにも限定されないが、ある特徴では、二酸化塩素それ自体はVX擬似物質を除染しない。我々は合成した二酸化塩素（酵素生成二酸化塩素とは反対に）を用いて実験を実施し、300ppmでさえも1%w/vのVX擬似物質を30分では除染しないことを見出した。実際、注目し得る分解は認められなかった。我々は、VX擬似物質を実際に除染しているものは短命の酸化種であると考えている。本発明の酵素、処方物及び方法がそのような効率的に除染する（短命でないとしたら）酸化種を生成することができることを実験が明快に示したことで充分なので、我々はどの種がこの除染をもたらしているのかを単離も決定もしていない。
【０２５６】
III．生物剤の実験：
硫黄マスタード（HD）の除染についての酵素の評価：
以下の実施例は、ポリペプチドが本発明の範囲内に包含されるために必須の活性を有するか否かを決定するために用いることができる例示的なアッセイについて述べる。以下の実施例はまた、本発明の例示的酵素の同定及び特性決定について述べる。
14の新規なデハロゲナーゼ（DHG）クローンを、硫黄マスタード（HD）及び硫黄マスタード-スルホキシド（HD-SO）の分解カイネティクスについて試験した。例示的デハロゲナーゼ（DHG）配列番号:70（例えば配列番号:69によってコードされる）をコードするDHGクローンは、硫黄マスタード（HD）の分解に顕著な活性を示した：例示的配列番号:70（例えば配列番号:69によってコードされる）による硫黄マスタード（HD）（50μM）分解のｔ1/2は、図39に示すように1分未満（25℃、pH7.5）である。図39は、デハロゲナーゼ（DHG）配列番号:70（図ではBD2036）（例えば配列番号:69によってコードされる）及び配列番号:92（図ではBD2037）（配列番号:91によってコードされる）による硫黄マスタードの分解を示している（硫黄マスタード（HD）50μM、DHG 2mg/mL、50mMリン酸塩、pH7.5、30℃、各時間間隔につきｎ＝3）：
【０２５７】
2009517002.tif 000039
【０２５８】
この分解速度は、緩衝液中での硫黄マスタード（HD）の加水分解速度よりも少なくとも10倍速く、さらにデハロゲナーゼ（DHG）（図40）及び硫黄マスタード（HD）濃度（図41）に左右される。図40は、種々のDHG濃度での例示的配列番号:70による酵素的分解後の硫黄マスタードの残留パーセントを示すデータを示している（50μMのHD、配列番号:70、2分、50mMのリン酸塩、pH7.5、30℃、上記の表は、各DHG濃度について3回実施した2組のデータセットを含む）：
【０２５９】
2009517002.tif 000040
【０２６０】
図41は、種々のDHG濃度での例示的配列番号:70による酵素的分解後の硫黄マスタードの残留パーセントを示すデータを示している（DHG 2mg/mL、2分、リン酸塩、pH7.5、30℃）：
【０２６１】
2009517002.tif 000041
【０２６２】
例示的配列番号:70による顕著な硫黄マスタード（HD）の酵素的分解（45％又は50％）が低温でも（0−2℃）1から3分で得られ、DHの酵素的脱塩素化の低い活性化エネルギーが示唆された。硫黄マスタード（HD）分解は、また別のHD部分（50μM）を用い配列番号:70の同じバッチを再使用した後でも得られ（図39）、HD-誘発不活化に対するDHGの抵抗性を示唆した。
プロピレングリコール（1,2-ジヒドロキシプロパン、PG）及びポリエチレングリコール-400（PEG-400）のDHG触媒HD分解（2分のインキュベーション）に対する影響を調べた。2％又は5％のPEG-400は、緩衝液と比較して硫黄マスタード（HD）の酵素的分解レベルに変化を与えない：図42に示すように、PEG0％、2％及び5％ではそれぞれ74％、76％及び72％が分解された。10％のPEG-400は、硫黄マスタード（HD）の酵素的分解レベルを約10％低下させ65％にした。これらの結果は、HDの溶解及び除染に対するPEG-400の、特に高濃度での適合性を示唆している。図42は、ポリエチレングリコール-400（PEG-400）とともに例示的配列番号:70による硫黄マスタード（HD）の分解をを示すデータを示している（2mg/mLのデハロゲナーゼ（DHG）濃度、2分、50mMのリン酸塩を含む緩衝液（pH7.5）、25℃）。
【０２６３】
HDの共働的酵素分解：硫黄マスタード（HD）の例示的デハロゲナーゼ（DHG）配列番号:70（2mg/mL）による分解をCPO/NaClO2の非存在下又は存在下で調べた（注記：前記はHD及びVX分解のための例示的酵素/基質混合物である）。図43は、CPO/NaClO2は硫黄マスタード（HD）のほぼ完全な（＞99％）分解を1分以内に引き起こすことを示すデータを示している。しかしながら、DHGの存在下では、CPO/NaClO2はより低いHD分解をもたらした（残留HD18％）。図43は、例示的配列番号:70及びCPO＋NaClO2によるHD分解の時間依存性を示すデータを示している（50μMのHD、2mg/mLのDHG、10U/mLのCPO（ｘ5）、0.5MのNaClO2、リン酸塩pH7.5、25℃）。
さらにまた、CPO/NaClO2によって又はデハロゲナーゼ（DHG）と併用したCPO/NaClO2の存在下で、図44に示すように、HDの完全な分解が3分でもたらされた。一定の時間間隔（2分）でのHD分解の比較は、我々のカイネティクスデータを裏付けた。図44は、DHG、CPO/NaClO2、NaClO2、及び併用混合物DHG＋CPO/NaClO2による分解後の残留HDレベルを示している。CPO/NaClO2は2分以内に完全なHDの分解をもたらす。DHG単独又はCPO/NaClO2と併用したDHGの存在下では、2分以内のHDの分解はそれぞれ90％及び80％である（図44）。図44では、例示的配列番号:70及びCPO＋NaClO2によるHDの分解は、50μMのHD、2mg/mLのDHG、10U/mLのCPO（ｘ5）、0.5MのNaClO2、リン酸塩（pH7.5）、25℃で2分以内であった。
例示的デハロゲナーゼ（DHG）配列番号:70はまた、HD-SO（CPOを用いるHDの酸化生成物）のためのもっとも活性の高い加水分解酵素であった。図45は、例示的DHG配列番号:70（2mg/mL）の非存在下又は存在下で40分、60分及び180分で得られる残留HD-SOレベルを示している。DHGの存在下における残留HD-SO濃度は、緩衝液中でインキュベートされた場合の71−77％の残留HD-SOと比較して40分以内に8％である（図45）。したがって、DHGは、HD-SO（相対的になお有毒である）を完全に解毒するのでCPOに加えてHD除染に必須である。図45は、例示的配列番号:70によるHD-SOの経時的酵素分解を示している（100μMのHD-SO、2mg/mLのリン酸塩（pH7.5）、25℃）。1MのNaClの存在下での酢酸エチルによる緩衝液からのHD-SOの抽出によってHD-SOの90％の回収が提供される。
【０２６４】
HDの酵素的分解生成物の同定及び安定性
チオジグリコール（TDG）が、硫黄マスタード（HD）の主要なデハロゲナーゼ（DHG）加水分解生成物としてGC/MSによって同定され、実質的に完全なHDの解毒が示唆された。GC/MSによって同定されたHDの酵素的酸化生成物（HD-スルホキシド及びHD-スルホン）を合成し、それらの加水分解安定性の実験のために、さらにHDの酵素的過酸化生成物の同定のための参照化合物として使用した。
1H-NMRによって同定された硫黄マスタード（HD）の加水分解生成物はモノクロロ-モノヒドロキシ-HD及びチオジグリコール（TDG）であり、HD-SOについてはモノクロロ-エチルビニルスルホキシドであり、HD-SO2についてはモノクロロ-エチルビニルスルホン及びジビニルスルホンである。HD、HD-SO2及びHD-SO加水分解について1H-NMRによって判定した半減期（t1/2）はそれぞれ10分、250分及び1,222時間である（50mMのリン酸塩、pH7.5、25℃）。
高処理スクリーニング（HTS）自動操作系を用いるVX分解酵素用アッセイ条件の開発：96ウェルプレートアレイでのシミュレーション分解によって自動操作系の診断機能の有効性確認を実施した。VX（10-9−10-8M）によるAChE阻害のカイネティクスを、オンライン96ウェルプレート光学読取装置と連結した前記自動操作系を用いて測定した。カイネティクスの結果によって、手動で得た以前のデータが確認された。
短時間（15秒−10分）及び長時間（10−20分）分解カイネティクス実験を、C.フマゴのクロロペルオキシダーゼ（CPO）（配列番号:2）（NaClO2、pH7.5）を用いてVXで実施し、ソフトの制御及びハードの相互反応性能について調べた。結果は手動で得たものを完全に確認した。
DNAライブラリーの高処理スクリーニング（HTS）は、非毒性のVX代用物質としてテトリソを用いて実施されたので、VXと比較したその分解速度を調べることが重要であった。VXと比較してテトリソに対するC.フマゴCPOの酵素的分解活性を測定した。CPOによるVX分解速度はテトリソのそれと非常に類似していた（それぞれKobs＝0.15及び0.14/分；0.1mMのホスホロチオレート、40U/mLのCPO、0.025MのNaClO2、pH7.5，25℃）。したがって、原則としてテトリソをVX代用物質として新規な過酸化反応用酵素の探索に用いることが可能であった。
0.1、0.5及び1U/mLのCPOによって触媒されるVX分解カイネティクスを、自動操作系を用い2つのVX濃度（1及び10μM）で測定した（図8）。これらの実験の前に、一定のCPO活性を用い種々のNaClO2濃度（0.01−0.1M）で、VX分解カイネティクスを測定した。これらの実験によって、低CPO活性に対して適切なNaClO2濃度の選択が可能になった。図46は、低活性レベルのC.フマゴのクロロペルオキシダーゼ（CPO）（配列番号:2）によるVXの経時的分解を示す。図46A：VX＝10μM、NaClO2＝0.03M；図46B：VX＝1μM、NaClO2＝0.02M、リン酸塩=50mM、pH7.5、25℃。
【０２６５】
2009517002.tif 000042
【０２６６】
新規酵素のVX除染についての評価
天然のC.イナエクァリスのVaCPO：80μLのVaCPO（0.2mg/mL）のただ1回の添加によって、5ｘ20μLのVaCPOで得られる分解速度（ｔ1/2＝15分）（0.5MのNaCl、0.5mMのUPER、pH2.75、50mMの酒石酸塩）と類似の分解速度（ｔ1/2＝13分）が提供された。VXの分解は、補助基質としてNaClO2（0.01−0.1M）をpH7.5で用いてもVaCPOでは得られなかった。
組換えC.イナエクァリスVaCPO：組換えC.イナエクァリスVaCPOのサンプルをC.ヘテロストロフスで発現させた。このサンプルは、モノクロロデメドン（MDM）塩素化アッセイで測定したとき16.2Uの総活性を含んでいた。データは、組換えC.イナエクァリスVaCPOの存在下ではVX又はテトリソのいずれの分解も実質的に存在しないことを示した。
組換え菌類ラッカーゼ：我々は、以前に、ヒラタケ（プレウロツス・オストレアツス）（Pleurotus ostreatus）のラッカーゼは、補助基質としてABTSの存在下で緩衝液（リン酸塩、pH7.4）中に溶解した大気酸素を用いてVXを分解できることを記載した（Amitai et al. FEBS Lett 1998）。2つの組換え菌類ラッカーゼ（フェノールオキシダーゼ）サンプルを用いた。ラッカーゼで得られた分解速度は、クロロペルオキシダーゼで得られた分解速度に比して極めて遅かった。
環境ライブラリー蛍光ヒット：環境ライブラリーヒットに由来する179酵素を、10μMのテトリソ（VXの代用物質）の分解活性を基準に大きな収集物（20,000クローン）から選別した。合計して10の宿主コントロールと179の蛍光ヒットが、VX分解活性について自動操作系によりIIBRでスクリーニングされた。全サンプルを6から8日間毎日モニターした。
図47は、（179サンプルのうち）24の溶解物サンプルを含む代表的な1枚の96ウェルプレートにより特定の時間間隔で測定したVX分解カイネティクスを示している。179の環境サンプルのうち以下の9ヒットが有意な分解活性をVXに対して示した（いずれも手動のカイネティクス実験で確認した）：配列番号:74（例えば配列番号:73によってコードされる）；配列番号:76（例えば配列番号:75によってコードされる）；配列番号:78（例えば配列番号:77によってコードされる）；配列番号:80（例えば配列番号:79によってコードされる）；配列番号:82（例えば配列番号:81によってコードされる）；配列番号:84（例えば配列番号:83によってコードされる）；配列番号:86（例えば配列番号:85によってコードされる）；配列番号:88（例えば配列番号:87によってコードされる）；配列番号:90（例えば配列番号:89によってコードされる）。図47は、環境ライブラリー溶解物によるテトリソの経時的分解を示す（8枚のうち1枚の代表的96ウェルプレートで20μMのテトリソ（25℃）を用い高処理HTS自動操作系によって測定）。
さらに179溶解物の全てを、自動操作系を用いてテトリソ分解についても試験した。図48は、自動操作スクリーニングアッセイでは3つのテトリソヒットが発見されただけであることを示すデータを提示している。これらは、サンプル番号配列番号:86（例えば配列番号:85によってコードされる）；配列番号:88（例えば配列番号:87によってコードされる）；配列番号:90（例えば配列番号:89によってコードされる）である。他の6つのVXヒットはテトリソアッセイでは検出されなかった。これらの結果は、テトリソは常にVX代用物質として機能するわけではないことを示唆している（特にヒドロラーゼについては）。全ライブラリーヒットについての全てのVX及びテトリソ分解カイネティクスのまとめはそれぞれ図49及び図50に記載されている。
図49Aに示した環境ヒットによるVX及びテトリソ分解のまとめ：溶解物（1μMのVX、25℃）による経時的酵素分解：
【０２６７】
2009517002.tif 000043
図49Bは、溶解物（20μMのテトリソ、25℃）によるテトリソの経時的酵素分解を示す。
【０２６８】
ヒドロラーゼのG剤除染についての評価
DFP及びGFに対するDFPase活性：組換えロリゴ・ブルガリス（Loligo vulgaris）のDFPase（rec. squid DFPase）をDFP及びシクロヘキシルサリン（GF）に対して評価した。2つの異なるDFPバッチを名目的等価活性で評価した：1．DFPase（Biocatalysis, USA）；2．DFPase（Roche Diagnostics）。これらの酵素は、GF分解に対して類似の活性を示す。Roche DiagnosticsのDFPaseはDFPに対してより活性が高いようである（下記の表を参照されたい）。両DFPaseバッチによるDFP及びGF分解速度は、DFP及びGF濃度に反比例し、これは下記の表に要約される：
【０２６９】
2009517002.tif 000044
(1)A=Biocatalytics（USA）のDFPase；G＝MOD（ドイツ）のDFPase
DFPaseによる0.1mMのGFの分解速度は、DFP分解速度と比較して約2桁遅いことを特記することは適切であろう（上記の表を参照されたい）。
【０２７０】
濃緩衝液中のCPOによるVXの分解及びDFPaseによるDFPの酵素的加水分解：相対的に高濃度（50mM）のDFPのDFPase誘発酵素的加水分解は、0.2Mの炭酸アンモニウム（AC）緩衝液中でpH＝8にて完了まで進行する。したがって、0.2MのACを用いてCPOによるVX分解カイネティクスを評価することは重要である。図51は、CPO/ NaClO2によるVXの酸化は、0.2Mのリン酸塩中でのDFPaseによるGFP（シクロヘキシルサリン）及びDFPの加水分解（データは示されていない）と同様に比較的迅速な速度で完了まで進行するが、一方、0.2MのAC中でのVX分解は遅く、（たとえCPOの反復添加後であっても）不完全であることを示している（図51参照）。したがって、濃リン酸緩衝液（0.2M）が、両酵素（すなわちDFPase及びCPO）に関してAC緩衝液よりも適合性が高い。
【０２７１】
実施例5：本発明の有機リン酸エステラーゼの発見方法
本発明は、P-S又はP-F結合の加水分解によって農薬、除草剤及び/又は殺虫剤を迅速に解毒する有機リン酸エステラーゼを提供する。以下の実施例は、ポリペプチドが有機リン酸エステラーゼ活性を有するか否か、さらに例えば農薬、除草剤及び/又は殺虫剤を迅速に解毒することができるか否か、及び本発明の範囲内に包含されるか否かを決定するために用いることができるアッセイについて述べる。
予備アッセイ：切り出した増幅ライブラリーをLB/Kan50を含むバイオアッセイトレーにスプレッディングし、CPS群に適した濃度に一晩増殖させた。1週間につき1ライブラリーの速度で十分な数のトレーを作成し、1日につき100の予めバーコード標識した黒色384-ウェルプレートを満たすコロニーを採取した。前記プレートを一晩37℃でインキュベートした。次の日、これらの“母”プレートをピンツールで複製し保存用“娘”プレート（再び前バーコード標識しさらに50μLのLB/Kan50を添加した）を得た。テトリソ（Cel-Lytic中の50μM溶液の10μL；最終濃度はほぼ10μM）を各母プレートに分注した。母プレートの10番目毎に宿主のみの陽性コントロールがA1-A2-B1-B2コーナーに含まれてあり、前記は毒素を含まず、プレートの各検査時の参照蛍光シグナルとして用いられた。これらのプレートをロボリッド（robolid）（Corning, 308）で蓋をし、袋（Ziploc）に入れて湿潤インキュベーターに37℃で6日間静置した。保存娘プレートをグリセロール（50％溶液の10μL）で処理し、-20℃で保存した。
アッセイ：プレートは100バッチずつ毎日自動機械でアッセイした。プレートを自動回転コンベヤーに載せ、コンベヤーでブチトリルコリンエステラーゼ（20U/mL溶液の10μL）添加に続く振盪が実施され、一切の残留未分解テトリソによってコリンエテラーゼが不活化される。さらに、レゾルフィンブチレート（0.25mM溶液の10μL）の添加に続いて振盪及びエンドポイント視覚化（λex560nm；λem610nm）を実施した。下流での廃棄物処理を簡単にするために、視覚化後にプレートをさらに漂白剤（10μL）で処理した。
データ解析：酵素カイネティクス解析ソフトプログラムを用いて全データを調べた。バックグラウンドより１シグマ大きいシグナルは全てブレークアウトのために先へ進めた。
ブレークアウト：全てのヒットを画線培養し、個々のコロニーを3組ずつ黒色384-ウェルプレートに手動で接種し、自動アッセイによって再現性を確認した。このアッセイによってシグナルを再現したヒットを、生物剤VXに対する後の試験のための粗溶解物として凍結乾燥させた。
【０２７２】
実施例6：弱毒化炭疽菌芽胞の除染
本発明は、生物剤（例えばバチルスの芽胞、例えば炭疽菌芽胞）を除染、解毒及び/又は中和する組成物（例えば酵素及び処方物）及び方法を提供する。本実施例は、本発明の組成物及び方法、特に本発明の例示的クロロペルオキシダーゼ（CPO）配列番号:2の、細菌芽胞の除染における有効性を、例示的モデル系（芽胞殺滅アッセイ）として弱毒炭疽菌芽胞を用いて示す。
1mLの体積中でクロロペルオキシダーゼ（CPO）（配列番号:2）による芽胞除染を判定する基本的な標準アッセイを規定した。このアッセイは、CPO-生成酸化ラジカルの調製のために予め作成した（プリメード）混合物を用い、その中に芽胞が添加される。我々は、プリメード混合物のもっとも有効な組成物は以下であると決定した：50mMのリン酸緩衝液、100mMのNaClO2及び10U/mLのCPO。この芽胞殺滅アッセイで100mMのリン酸緩衝液を使用することの適切性を調べた。CPO酵素による芽胞除染の有効性試験をこの芽胞殺滅アッセイで実施することができる。
200mMのリン酸緩衝液は、炭疽菌の除染用CPO/ NaClO2混合物で使用するには不適切であることが判明したので中間のリン酸緩衝液濃度（100mM）を使用することの適切性を調べた。100mMのリン酸緩衝液中での酸化ラジカル生成の条件を最適化するために、種々のCPO量（10から500U/mL）を100mM又は50mMのNaClO2と組み合わせて試験した。前記の結果は、100mMのリン酸緩衝液を含む全ての混合物で、それらの対応する50mMコントロールと比較したとき、CPO生成酸化ラジカルの収量が少ないことを示している。
NaClO2濃度は、100mMのリン酸緩衝液を含む混合物で酸化ラジカルの生成に中心的な役割を果たすことが判明した。50mMのNaClO2及び10U/mLのCPOを含む混合物では、非常に低レベルのCPO生成酸化ラジカルが得られた（3ppmから3.5ppm）。より高いCPO濃度（50から250U/mL）はCPO生成酸化ラジカルレベルをわずかに高めただけだった（3から7ppm）。100mMのリン酸緩衝液を100mMのNaClO2と組み合わせたとき、酸化ラジカル生成が改善（8.7から10ppm）されたが、対応する50mMのリン酸緩衝液コントロール（12−13ppm）よりはなお顕著に低かった。さらにまた、CPO生成酸化ラジカルレベル（9から11.5ppm）は、100mMのリン酸緩衝液及び100mMのNaClO2を含む混合物のCPO濃度（10−500単位/mL）では基本的には影響されないことが判明した。
100mMのリン酸緩衝液中のCPOによる酸化ラジカル生成効率は50mMのリン酸緩衝液を含む混合物と比較して低かったが、我々は、100mMのリン酸緩衝液、100mMのNaClO2及び種々のCPO濃度（10、50、100、250又は500単位/mL）を含む混合物による芽胞除染の有効性を試験することにした。弱毒化炭疽菌芽胞を各混合物（9−13ppmのCPO生成酸化ラジカルを含む）に添加し、200−800（分ｘmg/mL）の間のCt値を得るために20−40分インキュベートした。CPO生成酸化ラジカルの芽胞殺滅活性は、400−800（分ｘmg/mL）の間のCt値で顕著に損なわれた（この値は、50mMのリン酸緩衝液による標準的芽胞殺滅アッセイでは6 logの除染に有効であることが以前に示された）。さらにまた、100mMのリン酸緩衝液を含む混合物で再生されたCPO生成酸化ラジカルは、同じCtレベルでCPO濃度が50単位/mLよりも増加したときそれらの芽胞殺滅活性を失ってしまうように思われる。
【０２７３】
50mM又は100mMのリン酸緩衝液混合物を用いたとき、同様なCt値が芽胞除染有効性に驚くべき相違をもたらすという我々の観察は、我々に、前記現象は、より強力な緩衝液環境下におけるラジカルのより脆弱な安定性に起因するのか否かを究明させた。前記の目的のために、CPO生成酸化ラジカルのストックを、50mMのリン酸緩衝液、100mMのNaClO2及び10CPO単位/mLを含む混合物で形成し、続いて50又は150mMのリン酸緩衝液に稀釈し（1：1、v/v）、それぞれ50又は100mMの最終リン酸塩濃度を得た。弱毒炭疽菌芽胞を各混合物に添加し60分間インキュベートして、50mMのストック溶液については1320−1740のCt値を、さらに50及び100mMの最終リン酸塩濃度についてはそれぞれ570−660又は515−700のCt値を得た。これらの結果は、最初のストック溶液の場合と同様に、両処理（50及び100mMの最終リン酸塩濃度）でも接種芽胞の完全な除染（少なくとも生存率において6 log低下）を示している。これらの発見は、100mMのリン酸緩衝液は、CPO生成酸化ラジカルが50mMリン酸緩衝液で形成された後、前記ラジカルの芽胞殺滅活性に干渉しないことを示唆している。したがって、100mMのリン酸緩衝液で調製された酸化ラジカルが芽胞殺滅能力を持たないことは、より高いリン酸塩濃度でのラジカル形成の妨害と関連があるのかもしれない。
本発明の例示的CPO（配列番号:2）を130単位/mLの溶液として調製し、予備的な適合性検査を実施した。CPOを200単位/mLのストック溶液に稀釈し、前記を1mL体積の一連の標準的芽胞殺滅アッセイで用いた（50mMのリン酸緩衝液、100mMのNaClO2及び10単位/mLのCPO）。コントロールとして、市販のCPO（Sigma）を用いた。両酵素は類似量のCPO生成ラジカルを生じ（10−11ppm）、60分のインキュベーション後（Ct＝600−660）に接種した芽胞の完全な除染を達成した（生存率が少なくとも6 log低下）。これらの実験は、本発明のCPOは全ての試薬と適合し得ること、及び芽胞殺滅アッセイで用い得ることを暗示している。
図53は、例示的CPO（配列番号:2）は、モデル系として弱毒化炭疽菌芽胞を用いて、細菌芽胞の除染に有効であることを示す例示的実験を示している。前記データは、CPO生成ClO2（二酸化塩素）による弱毒化炭疽菌芽胞の不活化の有効性を示している。図53に提示したデータによって示されるように、例示的CPO（配列番号:2）は8桁の濃度範囲にわたって炭疽芽胞を完全に殺滅した。
【０２７４】
実施例7：OPAA酵素によるG剤の除染
本発明は、G剤、例えばソマン、サリン、シクロサリンを除染、解毒及び/又は中和する組成物（例えば酵素及び処方物）及び方法を提供する。ある特徴では、本発明の組成物及び方法は、有機リン酸アンヒドロラーゼ（OPAA）（例えば本発明の例示的ポリペプチド配列番号:194（前記はOPAA活性を示す））をG剤の除染、解毒及び/又は中和のために用いる。本実施例は、G剤ソマン（GD）の本発明の例示的OPA（配列番号:194）による除染を示す。
例示的OPAA（配列番号:194）は50mLのリアクター中でソマン（GD1%w/v）を除染した。50mLの並列リアクターを1%w/vのGDの除染に用いた。精製OPAA（100mg/mL、2mg/mLの配列番号:194）を含む又は含まない総体積50mLの0.2Mのビストリスプロパン（pH7.2）にGD（0.5g）を溶解した。反応は、2つの125mL並列3首ガラス製反応フラスコで実施した。前記フラスコには、機械的攪拌棒（w/テフロン（登録商標）ウィング）、デジタル温度計及び使い捨ての1mL注射筒に連結したポリプロピレンサンプリングチューブが備えられてあった。前記反応フラスコは、反応フラスコの外部ガラスジャケットを循環するプラスチックチューブに連結した恒温水槽ユニットを用いることによって一定温度（20℃から22℃）に維持された。攪拌速度は300rpmから340rpmで、サンプルは特定した時間間隔で採取された。各サンプルを直ちに冷DDWで10-3、10-5及び10-6Mに稀釈した。前記稀釈サンプルをAChE阻害アッセイ及びGC/FPDによって解析した。サンプルをメチルt-ブチルエーテル（MTBE/水1：1）でGC分析の前に抽出した。要約すれば、1つのリアクターはOPAAを含む緩衝液に溶解したGD1%w/vを含み、他方のリアクターは緩衝液のみ（0.25MのBTP、0.5MのNaCl、1mMのMnCl2）のGD溶液を含んでいた。サンプルは使い捨て注射筒を用いて反応混合物から抜きとった。温度は恒温ユニットによって管理し、全除染プロセスを通して測定した（21±1℃）。
OPAA（2mg/mL）によるGD（1%w/v）の経時的解毒は、AChE残留阻害アッセイを用いて実施した。GDは最初の8分以内に＞99.9％が解毒されることが観察された（図2、ｔ1/2＝1.7分）。さらに、GDの酵素的及び非酵素的加水分解を通してpHは一定（7−7.5）であることもまた観察された（緩衝液：0.25Mのビストリスプロパン、pH7.2）。GD解毒レベルは強化分解で測定した。GDによるAChEの阻害は、1%w/v反応混合物から採取したGDの3つの異なる稀釈物で測定した（前記稀釈物は、10-8、10-7及び10-5MのAChE未加水分解GDの最終濃度を提供した）。
【０２７５】
2009517002.tif 000045
【０２７６】
このアプローチに基づいて、我々は、15分以内及び20分以内に、それぞれ99.99％及び99.999％のGDの解毒を示すことができた（50mLリアクターで種々の開始濃度のGD溶液のサンプル採取によるOPPAのGD（1%w/v）解毒の解析）：
【０２７７】
2009517002.tif 000046
【０２７８】
AChE阻害アッセイによって測定された非常に高レベルのGD解毒（＞99.99％）は、無毒なP(+)C(+)及びP(+)C(-)ジアステレオマー異性体の分解も同様に示した。GC解析は、全ての異性体が8−15分で既に分解されていることを示した。50mLリアクターで得られたGD解毒速度は、GD（1%w/v）を含む0.5mLの反応体積で得られるものよりも速く、さらに最終分解レベルも高かった。酵素的分解時のGDのGC解析は、AChE阻害アッセイから得られた結果を確認した。GD分解カイネティクスはGCによって解析し、GDは、5分以内、8分以内及び15分以内にそれぞれ99％、99.5％及び99.6％が分解された。コントロールの緩衝液反応では、GD濃度の初期低下は、この初期時の低いGD分散から生じるのであろう。
GDのGC解析クロマトグラフィー図から、GDのピークは本質的にGDの4つのジアステレオマーを表す4つの成分で構成されることが観察される。ピークのショルダーのいくつかは、加水分解時に他のものより速く消失する。
図54は、上記で考察したように、OPAA（2mg/mL）によるGD（1%w/v）の経時的解毒の、AChE残留阻害アッセイを用いたデータを示す：
【０２７９】
2009517002.tif 000047
【０２８０】
図55は、上記で考察したように、OPAA（2mg/mL）によるGD（1%w/v）の経時的解毒のガスクロマトグラフィー解析のデータを示す：
2009517002.tif 000048
【０２８１】
実施例8：デハロゲナーゼ酵素によるH剤の除染
本発明は、H剤、例えばマスタードガス（HD）を除染、解毒及び/又は中和する組成物（例えば酵素及び処方物）及び方法を提供する。ある特徴では、本発明の組成物及び方法は、デハロゲナーゼ（DH）（例えば本発明の例示的ポリペプチド配列番号:70（前記はデハロゲナーゼ活性を有する））をH剤（例えばHD）の除染、解毒及び/又は中和のために用いる。本実施例は、H剤のマスタードガス（HD）の本発明の例示的デハロゲナーゼ、配列番号:70による除染を示す。
本実験は、本発明の例示的ポリペプチド配列番号:70による50mLリアクターでのHD（1%w/v）の酵素的分解を示す。HD（1%w/v）の配列番号:70（30mg/mL）による50mLリアクターでの経時的分解を実施した。前記タンパク質（30mg/mL）を含まない、デハロゲナーゼの同じ発現系に由来する膜の存在下での反応も並行して実施した。実験の設定は、50mLリアクターでのGDの加水分解について上記（実施例7を参照されたい）に記載した設定と同一であった。サンプル（0.5mL）を特定した時間間隔で反応容器から取り出し、同体積の冷イソオクタンで直ちに抽出した。15,000rpmで1.5分間遠心することによる相分離に続いて、イソオクタン溶液をさらに10-3、10-4及び10-5Mの微量の非加水分解HDに稀釈した。これらのサンプルを用いて実施したGC解析の結果は低い抽出収量を示している（ほぼ10から20％）。我々は、この抽出レベルは、酵素的及び非酵素的反応調製物の両方の細胞溶解物の類似性に基づいて、酵素的及び非酵素的反応の両反応で同様であったと仮定した。HDは、陰性コントロール反応でのほぼ40％と比較して、例示的デハロゲナーゼ配列番号:70によって15分以内に98.6から99.2％分解された（下記のデータ表を参照されたい）。これらの結果は小反応体積（0.5mL）で得られた結果と類似していた。反応で小体積（0.5mL）を用いたときのイソオクタンによる抽出収量は、全反応体積（0.5mL）をサンプル採取しそれを等体積のイソオクタンで抽出したので顕著に高かった（一方全体積のほんの1％が50mLリアクター由来のサンプルである）。
【０２８２】
2009517002.tif 000049
1これらの値は、10倍高いHD濃度（1mMの非加水分解HD）をもつイソオクタン溶液から得られた。
2これらの値は、5倍高いHD濃度（0.5mMの非加水分解HD）をもつイソオクタン溶液から得られた。
3検出不能（最初のサンプルの5 x 10-8Mよりも低い）。
【０２８３】
また別の実験（50mLリアクターでの本発明の配列番号:70の例示的デハロゲナーゼによるHDの経時的分解）を実施した。この反応は、陰性コントロール又は配列番号:70（30mg/mL）とともに、10％PEG400を含む50mLのリン酸塩溶液（0.2M；pH7.5）中の0.5gのHDを用いて21±1℃で実施した。サンプル（0.5mL）をリアクターから採取し、0.5mLのイソオクタンで抽出した。相分離（15,000rpm、1.5分）に続いて、GCカラムに注入する前にイソオクタン溶液を0.1mMの非加水分解HDに稀釈した。0.1mMのHDに稀釈したサンプルは、0.25％という残留HD（99.75％分解）の検出限界を提供することができた。このように、初期HD濃度0.5及び1mMでは、それぞれ99.95％及び99.975％分解が検出される。図56は、これらの実験から得られた以下のデータを示している（ここでは配列番号:70は“DHG5137”と称され、陰性コントロールは“NEG5123”である）：
【０２８４】
2009517002.tif 000050
【０２８５】
例示的配列番号:70（30mg/mL）によるHD（2％w/v）の分解速度を0.2Mのリン酸塩溶液（pH7.5）中の10％PEG400の存在下で調べた。反応混合物の総体積は0.5mL（3回実施）であった。0.5mLの体積の各反応混合物は、各時間間隔（0.5、5、15、30及び60分）で、0.5mL及び0.35mLのイソオクタンの2回の連続添加によって完全に抽出された。GCへの注入前にイソオクタンでさらに稀釈したHD反応サンプル（非加水分解HD濃度は10-5M）について、定量的GC/PFPD解析を実施した。データは、15分及び30分でそれぞれ例示的配列番号:70（30mg/mL）によるHDの75％及び76％分解を示している。対照的に、陰性コントロールによるHD分解は同じ時間間隔で24％及び39％であった。HDは、（陰性コントロールの44％と比較して）わずか60分後に97％が分解した。
【０２８６】
2009517002.tif 000051
【０２８７】
例示的配列番号:70による2%w/vのHDの経時的分解（磁石攪拌を用いる0.5mLの反応体積、30mg/mLの配列番号:70、30mg/mLの陰性コントロール、0.2Mのリン酸塩（pH7.4）、10％v/vのPEG400、25℃）；3組ずつのサンプル（0.5mLの反応混合物）を0.5＋0.35mLのイソオクタンによって2回抽出し、GC/PFPD解析の前に公称0.125Mから10-5MのHD濃度に稀釈した。
【０２８８】
実施例9：CPO酵素によるV剤の除染
本発明は、V剤、例えばVXガスを除染、解毒及び/又は中和する組成物（例えば酵素及び処方物）及び方法を提供する。ある特徴では、本発明の組成物及び方法は、クロロペルオキシダーゼ（例えば本発明の配列番号:2の例示的ポリペプチド（前記はデハロゲナーゼ活性を有する））をV剤（例えばVX）の除染、解毒及び/又は中和のために用いる。本実施例は、V剤、VXの本発明の例示的クロロペルオキシダーゼ、配列番号:2による除染を示す。
VXの経時的除染は、1％VXw/vを用い、本発明の配列番号:2の例示的クロロペルオキシダーゼ（1700U/mL）、NaClO2（0.4M）、リン酸塩（0.3M、pH7.0）を25℃で用いて実施した。データは、図57（時間の関数として％VX解毒を示す）及び図58（pH及び時間）に示され、以下のように要約される：
2009517002.tif 000052
本発明の多数の実施例を述べてきた。それにもかかわらず、多様な改変が本発明の意図及び範囲を外れることなく為し得ることは理解されよう。したがって、他の実施態様も以下の特許請求の範囲内に包含される。
以下の図面は本発明の特徴の例示であり、特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を限定しようとするものではない。種々の図面中の同じ参照記号は同じ要素を表示する。
【図面の簡単な説明】
【０２８９】
【図１】コンピュータシステムのブロック図である。
【図２】新規なヌクレオチド又はタンパク質配列をデータベース配列と比較して、前記新規配列とデータベース配列間の相同性レベルを決定するためのプロセスの一特徴を示すフローチャートである。
【図３】2つの配列が相同であるか否かを決定するためのコンピュータプロセスの一特徴を示すフローチャートである。
【図４】配列内の特徴の存在を検出するためのアイデンティファイアープロセス300の一特徴を示すフローチャートである。
【図５】実施例2で詳細に考察するように、ピキア（Pichia）及びサッカロミセス（Saccharomyces）形質転換体の抗CPO抗体ウェスタンブロットの例示である。
【図６】実施例2で詳細に考察するように、濃亜塩素酸ナトリウム中でのテトリソ分解実験（酵素なし）のデータを示し、図6Aは時間に対してテトリソレベルを示し、図6Cは時間に対して亜塩素酸塩濃度を示し、図6Dは時間に対してClO2生成を示し、図6Bは時間に対してpHを示している。
【図７】実施例2で詳細に考察するように、種々の緩衝液中の酵素濃度の関数としてアッセイした、ジブロモメタンのデハロゲナーゼ触媒加水分解によるヨウ化物イオンの生成実験のデータを示す。
【図８】実施例2で詳細に考察するように、DFPのDFPase触媒加水分解によるフッ化物の生成速度を、種々の緩衝液中のDFPase濃度の関数として示す実験のデータである。
【図９】実施例2で詳細に考察するように、滴定後の酸によるpH変化に対する種々の緩衝液の性能を示す実験のデータである。
【図１０】実施例2で詳細に考察するように、種々のNaOH濃度で測定したVXの化学的加水分解速度（すなわちそれぞれ10mM又は0.5mMのVXを使用）を示す実験のデータである。
【図１１】図１０に同じ
【図１２】実施例2で詳細に考察するように、基質としてRB又はブチルチオコリン（BTC）を用いた、VX及びGFによるBChE阻害の濃度依存を示す実験のデータである。
【図１３】実施例2で詳細に考察するとおり、DPDアッセイにより決定したCPO-生成酸化ラジカル濃度を示す実験である。
【図１４】実施例2で詳細に考察するように、CPO生成酸化ラジカルによる弱毒化炭疽菌（B. anthracis）芽胞の不活化の有効性を示す実験である。
【図１５Ａ】実施例3で詳細に考察するように、VX分解のカイネティクスを環境ライブラリーサンプルによって表したデータを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ａに同じ。
【図１６Ａ】実施例3で詳細に考察するように、テトリソ分解のカイネティクスをこれら環境ライブラリーサンプルによって表したデータを示す。
【図１６Ｂ】図１６Ａに同じ。
【図１７】実施例3で詳細に考察するように、VX分解のカイネティクスをコントロールと比較した9つのVX環境ヒットの全てによって表したデータを示す。
【図１８】実施例3で詳細に考察するように、サッカロミセスでサブクローニングした、C.フマゴ（C. fumago）のクロロペルオキシダーゼ（配列番号:2）をコードする核酸（配列番号:1）の種々のサンプルにおける抗C. フマゴCPOイムノブロットを示す。
【図１９Ａ】実施例3で詳細に考察するように、C.フマゴのクロロペルオキシダーゼ（配列番号:2）で実施した、マトリックス支援レーザー脱離飛行時間型質量分析（MALDI-TOFMS）解析を示す。
【図１９Ｂ】図１９Ａに同じ。
【図２０Ａ】図20Aは、実施例3で詳細に考察するように、タンデムマススペクトロメトリーを実施して、C.フマゴのクロロペルオキシダーゼのペプチド配列（前記は図20Aに示すように未処理サンプルと処理サンプル間で豊富さに変化があった）を決定するための四重極子飛行時間質量分析（quadrupole time of flight mass spectrometry）装置連結エレクトロスプレーイオン化（ESI-QTOFMS）を示し、さらに、消失したピークを未処理サンプルにおけるタンデムマススペクトロメトリーのために選択し、それらの配列を図20Bに示したように決定した。
【図２０Ｂ】図２０Ａに同じ。
【図２１】実施例3で詳細に考察するように、四重極子飛行時間質量分析連結エレクトロスプレーイオン化（ESI-QTOFMS）を用いて得られた、CPO三次元構造にマッピングされたペプチドは分子の外側に存在した。
【図２２】実施例3で詳細に考察するように、320mMの亜塩素酸塩及び300mMのリン酸ナトリウム緩衝液中での種々の濃度のCPOによるテトリソ分解を示すデータである。
【図２３】実施例3で詳細に考察するように、種々の緩衝液における酵素濃度の関数として、ジブロモエタンのデハロゲナーゼ触媒加水分解による臭化物イオンの生成を示す。
【図２４】実施例3で詳細に考察するように、種々の緩衝液におけるDFPase濃度の関数として、DFPのDFPase触媒加水分解によるフッ化物生成速度を示す。
【図２５】実施例4で詳細に考察するように、二酸化塩素を例示的酵素系除染処方物（DFPase、クロロペルオキシダーゼ、25mM亜塩素酸ナトリウム）と比較した腐食実験であり、前記酵素系除染剤は金属に対して腐食性が少ないことを示す。
【図２６】実施例4で詳細に考察するように、クロロペルオキシダーゼ及び酸化性除染に関する実験を示す。
【図２７】実施例4で詳細に考察するように、二酸化塩素及び亜塩素酸ナトリウムによるテトリソの分解に関する実験を示す。
【図２８】実施例4で詳細に考察するように、クロロペルオキシダーゼ、NaClO2及びClO2によるテトリソの分解に関する実験を示す。
【図２９】実施例4で詳細に考察するように、亜塩素酸ナトリウム及び二重酸化よる枯草菌（B. subtilis）変種ニゲル（Niger）の不活化に関する実験を示す。
【図３０】実施例4で詳細に考察するように、クロロペルオキシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼを用いた、亜塩素酸ナトリウム及び二重酸化よる枯草菌変種ニゲルの芽胞の不活化を示す実験を示す。
【図３１】実施例4で詳細に考察するように、緩衝液、NaClO2、テトリソを含むNaClO2、及びClO2中のクロロペルオキシダーゼの安定性を示す実験を示す。
【図３２】実施例4で詳細に考察するように、緩衝液、NaClO2、テトリソを含むNaClO2、及びClO2中のセイヨウワサビペルオキシダーゼの安定性を示す実験を示す。
【図３３】実施例4で詳細に考察するように、NaClO2を含むリン酸緩衝液中のCPOによるテトリソの分解を示す実験を示す。
【図３４】実施例4で詳細に考察するように、NaClO2を含むリン酸緩衝液によるテトリソの分解を示す実験を示す。
【図３５】実施例4で詳細に考察するように、CPO（160mMリン酸緩衝液）によるテトリソの分解を示す実験を示す。
【図３６】実施例4で詳細に考察するように、CPO添加時のClO2吸収の低下を示す実験を示す。
【図３７】実施例4で詳細に考察するように、CPO又は等価重量のBSA添加時のClO2分解のカイネティクスを示す実験を示す。
【図３８】実施例4で詳細に考察するように、酵素系除染溶液（左パネル）及び340ppmの二酸化塩素（右パネル）により青色強化（blue-tmpered）バネ鋼の2枚の写真を示す。
【図３９】実施例4で詳細に考察するように、本発明の配列番号:70の例示的酵素による硫黄マスタード（HD）のt1/2を示す実験を示す。
【図４０】実施例4で詳細に考察するように、種々の酵素濃度（DHG）における例示的な配列番号:70による酵素的分解後の硫黄マスタード（HD）の残留パーセントを示すデータである。
【図４１】実施例4で詳細に考察するように、種々の硫黄マスタード（HD）濃度での例示的な配列番号:70による酵素的分解後の硫黄マスタード（HD）の残留パーセントを示すデータである。
【図４２】実施例4で詳細に考察するように、ポリエチレングリコール-400（PEG-400）を用いた、例示的な配列番号:70による硫黄マスタード（HD）の分解を示すデータである。
【図４３】実施例4で詳細に考察するように、CPO/NaClO2は1分以内に＞99％の硫黄マスタード（HD）の分解をもたらすことを示すデータ、及び例示的な配列番号:70によるHD分解の時間依存性を示すデータである。
【図４４】実施例4で詳細に考察するように、種々の条件及び時間における例示的な配列番号:70によるHDの分解を示すデータである。
【図４５】実施例4で詳細に考察するように、例示的デハロゲナーゼ（DHG）配列番号:70はHD-SOの分解について有効な加水分解酵素であることを示すデータを示し、さらに種々の条件及び時間における例示的な配列番号:70によるHD-SOの酵素的分解のタイムコースを示す。
【図４６】実施例4で詳細に考察するように、低活性レベルでのC.フマゴのクロロペルオキシダーゼ（CPO）（配列番号:2）によるVX分解のタイムコースを示し、図46Aは、VX 10μM、NaClO2 0.03Mで得られたデータであり、図46Bは、VX 1μM、NaClO2 0.02M、リン酸塩50mM、pH7.5、25℃で得られたデータである。
【図４７】実施例4で詳細に考察するように、特定の時間間隔で溶解物サンプルを含む96ウェルプレートで測定したVX分解のカイネティクスを示す。
【図４８】実施例4で詳細に考察するように、自動スクリーニングアッセイによって見出された“テトリソヒット”（テトリソを加水分解する酵素）を示すデータである。
【図４９】実施例4で詳細に考察するように、自動スクリーニングアッセイによって見出された全てのライブラリー“ヒット”についての全VX及びテトリソ分解カイネティクスデータのまとめである。
【図５０】図４９に同じ。
【図５１】実施例4で詳細に考察するように、CPO/NaClO2によるVX酸化、同様にDFPase（0.2Mリン酸塩）によるGF（シクロヘキシルサリン）DFP加水分解は、比較的迅速な速度で完了し、一方、0.2MのAC中でのVX分解の速度は遅く不完全であることを示すデータの要旨を示す。
【図５２】実施例4で詳細に考察するように、本発明のハロペルオキシダーゼ/亜塩素酸塩成分除染処方物を用いた場合に“通常”得られる、いくつかの二酸化塩素レベルに暴露された炭素鋼の写真を示す。
【図５３】実施例4で詳細に考察するように、本発明の例示的CPOは細菌芽胞の除染に有効であることを示す例示的実験を示す。
【図５４】実施例7で詳細に考察するとおり、本発明の例示的OPAA酵素を用いたタイムコース解毒実験のデータを示す。
【図５５】実施例7で詳細に考察するように、図54に示すタイムコース解毒実験のガスクロマトグラフィーのデータを示す。
【図５６】実施例8で詳細に考察するように、本発明の例示的デハロゲナーゼを用いたHDのタイムコース解毒実験のデータを示す。
【図５７】実施例9で詳細に考察するように、本発明の例示的CPO酵素を用いたVXのタイムコース解毒実験のデータを示す。
【図５８】図５７に同じ。
【図１】
2009517002.tif 000053
【図２】
2009517002.tif 000054
【図３】
2009517002.tif 000055
【図４】
2009517002.tif 000056
【図７】
2009517002.tif 000057
【図８】
2009517002.tif 000058
【図９】
2009517002.tif 000059
【図１０】
2009517002.tif 000060
【図１１】
2009517002.tif 000061
【図１２】
2009517002.tif 000062
【図１３】
2009517002.tif 000063
【図１４】
2009517002.tif 000064
【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
2009517002.tif 000066
【図１６Ａ】
2009517002.tif 000067
【図１６Ｂ】
2009517002.tif 000068
【図１７】
2009517002.tif 000069
【図１９Ｂ】
2009517002.tif 000070
【図２０Ａ】
2009517002.tif 000071
【図２０Ｂ】
2009517002.tif 000072
【図２１】
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【図２２】
2009517002.tif 000074
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５】
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【図６】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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