(57)【要約】  代謝経路を操作するための組成物及び方法をここに提供する。これらの方法は、潜在的経路タンパク質を細胞外発現する２以上の細胞を、反応物の存在下で組み合わせることを含む。複数の経路成分及び／又は所定の経路成分の複数の変異体を細胞外発現する細胞のライブラリーをも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の生成物を生成する経路を操作する方法であって、下記：
ｉ）２以上の細胞を、経路のための基質を含む反応混合物中で混合し、ここに、該細胞は、潜在的な経路成分を細胞外発現し；
ii）所望の生成物の生成について反応混合物をアッセイする
ことを含む当該方法。
【請求項２】
前記の細胞が、潜在的な経路成分を細胞表面で発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の細胞が、潜在的な経路成分を細胞外環境に分泌する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記の細胞が、原核細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記の細胞が、細菌細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記の細胞が、大腸菌である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記の細胞が、真核細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記の細胞が、酵母細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
３以上の細胞を、反応混合物中で混合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
複数の細胞を、反応混合物中で混合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
潜在的な経路成分の発現が、反応混合物中の適当な基質の存在に依存する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
潜在的な経路成分を発現する細胞の生存力又は増殖が、制御可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
潜在的な経路成分を発現する細胞の生存力又は増殖が、反応混合物中の成分の存在に依存する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
各細胞が、少なくとも一つの潜在的な経路成分を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも一の細胞が、少なくとも２つの潜在的経路成分を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
投入物質の生物分解のための経路を操作する方法であって、下記：
ｉ）２以上の細胞を、この経路による分解のための投入物質を含む反応混合物中で混合し、該細胞は、潜在的な経路成分を細胞外発現し；
ii）反応混合物を、投入物質の分解についてアッセイする
ことを含む当該方法。
【請求項１７】
反応混合物を、投入物質の消失についてアッセイする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
反応混合物を、分解生成物の生成についてアッセイする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
複数の潜在的経路成分を細胞外発現する複数の細胞を含むライブラリー。
【請求項２０】
前記の細胞が、前記の潜在的経路成分を細胞表面で発現する、請求項１９に記載のライブラリー。
【請求項２１】
前記の細胞が、前記の潜在的経路成分を細胞外環境へ分泌する、請求項１９に記載のライブラリー。
【請求項２２】
前記の複数の潜在的経路成分が、生物分解経路に含まれる酵素、又はその変異体を含む、請求項１９に記載のライブラリー。
【請求項２３】
前記の複数の潜在的経路成分が、生合成経路に含まれる酵素、又はその変異体を含む、請求項１９に記載のライブラリー。
【請求項２４】
前記の複数の潜在的経路成分が、少なくとも一種の代謝酵素又は異化酵素の２以上の変異体を含む、請求項１９に記載のライブラリー。
【請求項２５】
前記の複数の潜在的経路成分が、少なくとも一種の代謝酵素又は異化酵素の複数の変異体を含む、請求項２４に記載のライブラリー。
【請求項２６】
各細胞が、少なくとも一種の潜在的経路成分を発現する、請求項１９に記載のライブラリー。
【請求項２７】
少なくとも一の細胞が、少なくとも２種の潜在的経路成分を発現する、請求項１９に記載のライブラリー。
【請求項２８】
複数の細胞が、各々、少なくとも２種の潜在的経路成分を発現する、請求項２７に記載のライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００５年７月１２日に出願された米国暫定特許出願第６０／６９８，３３７号(この開示を、本明細書中に、参考としてそっくりそのまま援用する)の利益を請求するものである。
【背景技術】
【０００２】
天然物は、非常に多様な化学構造及び生物学的機能をカバーする。しかしながら、この天然の構造のプールが豊富なものであっても、それは生物学的に作ることのできる構造の小さな画分であり、この可能な機能的分子の本質的に無限のバンクは、生物学的デザインのための非常に魅力的な標的である。その上、多くの生物学的に活性な化合物は、それらの天然起源では極微量でしか見出されず、化学的に合成することは困難であるか不可能である。代謝工学の分野を駆動するものは、組換え細胞が生合成の工場として役立ち、おそらく新しい分子的多様性の源としてさえ役立ちうるという希望である(Bailey, J.E., Nature Biotech, 1999;17:616-618; Reynolds, K.A., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1998;95:12744-12746; Cane等、Biochemistry, 1999;38:1643-1651;及び、Lau等、Nature, 1994;370:389-391)。
【０００３】
生物学的系例えば細菌、酵母、カビ、藻類、及び植物などの宿主で合成される新しい改良された化合物を造り出す一つのストラテジーは、その化合物の生合成経路に関与する酵素の少なくとも一つを変えることである。しかしながら、合理的なタンパク質デザインにより酵素経路を改変することは、その経路の酵素の構造−機能関係の詳細な知識を必要とし、それは、この考えを非現実的なものとする。
【０００４】
コンビナトリアル生化学は、バイオテクノロジー及び生化学における鍵となる表現となりつつあるが、非常に限られた数の例が存在するだけである。コンビナトリアル生合成の威力は、例えば、新規なポリケチドの合成について示されている。ここに、ポリケチドシンターゼ(ＰＫＳ)のモジュール式コンポーネントの混合及びマッチングは、新規なポリケチドの生成へと導き且つそれらの構造及び機能への新たな機械論的洞察へと導いた(Carrera及びSanti, Curr. Opin. Biotechnol., 1998;9:403-411; Koshla等、Biotechnol. Bioeng., 1996;52:122-128; Xue及びSherman, Nature 2000;403:571-575, Tanget等、Science 2000;287:640-642)。
【０００５】
不幸にも、ポリケチドの生合成は、生合成経路のむしろ特殊な例を表している。カルボン酸誘導体間で繰り返されるＰＫＳモジュールにより触媒される縮合と対照的に、代謝経路は、通常、全く異なる反応を触媒する幾つかの酵素からなっている。従って、有機分子の多様性の創出は、ポリケチド生合成とは異なり、通常、代謝経路に関与する酵素の機能を変えること及び／又は種々の起源の酵素をテーラーメイドの経路において混合すること及びマッチングすることを必要とする。その上、ポリケチド生合成においてこれまで適用されたコンビナトリアル方法は、ＰＫＳ複合体の中位の変更に限られており、それは、ハイブリッドポリケチドを創出するための経験的な遺伝子融合アプローチ(例えば、ドメイン相互作用、置換又は付加)を含むが、この経路にとって外来の新規な機能の追加は含まれない。
【０００６】
新規な生合成経路から離れて、代謝工学にとって重要な応用は、生物分解経路を探究すること及び該経路を改良することである。有毒な廃棄物を破壊するバイオテクノロジー工程は、特に、廃棄化合物の混合物、高すぎる又は低すぎる濃度、阻害性又は毒性の化合物、生物利用可能性及び生物分解速度などの問題の挑戦を受けている。例えば、種々の化学置換基を有する芳香族化合物は、生体異物の重要なクラスを表している。これらの置換基は、しばしば、これらの化合物の低い生物利用可能性の原因である。それにもかかわらず、生体異物にさらされた微生物群は、しばしば、これらの化学物質に適合することができ、それらを不完全又は完全に代謝する微生物が単離されている。しかしながら、この芳香族生体異物及びある種の微生物の異化経路の酵素組成によっては、分解は、非常に遅いか又は、あまり代謝されてない元の生体異物より一層毒性でありうる中間体の蓄積へと導きうる。これは、特に、多くのニトロ化合物及びクロロ芳香族化合物に関して真実である(Pieper, D.H.等、Naturwissenschaften 1996;83:201-213, Fetzner, S., Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998;50:633-657)。新規な生物分解能を有する系統をデザインする代謝工学のアプローチは、主として、種々の系統に由来する経路モジュールを組み合わせ、そうしてハイブリッドの経路を造ることに基づいてきた(Lee, J-Y等、Appl. Environ. Microbiol. 1995;61:2211-2217, Panke, S.等、Appl. Environ. Microbiol. 1998;64:748-751, Reineke, W. Ann. Rev. Microbiol. 1998;52:287-331, Timmuis, K.N.等、Steffan, R.J.及びUntermann, R., Annu Rev Microbiol. 1994;48:525-557)。これは、デザインされた微生物の更なる生物分解能へと導いた。しかしながら、効果的な生物分解プロセスに必要とされる触媒の性質及び性能の改善は、殆ど達成されていない。
【０００７】
方向付けられた進化は、最近数年間で、酵素機能の変更のための強力なツールとなった(Kuchner及びArnold, TIBtech. 1997;15:523)。典型的には、ランダムな突然変異誘発及び／又は遺伝子のＤＮＡシャッフリングを創出したライブラリーの効率的スクリーニングと組み合わせることによって、試験管内で進化を模倣する。この技術は、比較的短時間で、バイオテクノロジー的応用への最適化された特性を有する新規な酵素変異体の生成へと導いた。例えば、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼが、野生型タンパク質より１５０倍活性な酵素(１５〜２０％ＤＭＦ中)を生成するための４回のランダム突然変異誘発及び２回の組換えにより進化された(Moore及びArnold, Nat. Biotechnol., 1996;14:458及びMoore等、J. Mol. Biol., 1997;272:336)。セファロスフォリナーゼ遺伝子のファミリーのＤＮＡシャッフリングは、モクサラクタマーゼ活性の５４０倍増へと導いた(Cramer等、Nature, 1998;391:288)。しかしながら、必要な合成又は分解の潜在能力を有する遺伝子を、天然から選択し、医学又は農業で利用される生物学的産物のための新規な経路に適合させてアセンブルすることができることは示されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、当分野には、組換え宿主において有用な化合物の生成を最適化するために、経路を再創出するストラテジーに対する要求がある。これは、特に、低い収量及びそのための低い利用可能性、及び／又は高い価格に悩まされている多段階の合成を必要とする複雑な化学化合物に関して真実である。元の化合物を超える改良された及び／又は新しい品質を有する新規な構造であって、それらの合成には新規な経路の開発を必要とする当該構造に対する更なる要求がある。特に、合成経路のライブラリーは、以前に特定の宿主で合成されたことのない又は全く合成されたことのない広範囲の化合物を、提供することができよう。当分野には、関心ある代謝産物を生成するための又は廃棄物を分解するための新規な及び改良された生物分解経路に対する要求もある。本発明は、当分野におけるこれらの及び他の要求を扱うものである。
【０００９】
伝統的な代謝工学的アプローチは、幾つかの限界を有する。第一に、新規な遺伝子及び／又は経路を細胞に導入することは、細胞内の代謝の流れを撹乱し、これは、その細胞の生存能力に影響を与えうる。第二に、代謝経路により生成された中間体は、細胞障害性でありえ、その場合、細胞死を生じ、経路工学を実施することができなくなる。最後に、経路工学は、経路内の多くの異なるタンパク質及び／又は任意所定のタンパク質の複数の変異体の試験のための組合わせを必要としえて、これは、構築して活性を試験する多数の可能な経路を生じる。これらの経路のすべての可能な変異体を含む細胞の構築は、非常に時間を浪費する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
我々は、今や、これらの多くの限界を扱う経路工学のための方法を開発した。特に、上記の問題を解決するための一つの可能な方法は、所望の変換を細胞の内部ではなく、細胞の外側で行なう触媒的工程を実施することである。これを行なうためには、必要な酵素を、細胞の外側へ移行させて、細胞の表面に提示させる(ファージディスプレー又は酵母ディスプレーのように)か又は媒質中に放出させなければならない。
【００１１】
上記の問題を除くことに加えて、このストラテジーは、幾つかの他の鍵となる利点を有する。第一に、種々の表面酵素を発現する細胞は、経路工学のための細胞の他の混合物と急速に組み合わされうる、交換可能な、再利用可能な成分を提供する。第二に、リアクター内のこの細胞の混合物は、外部から、細胞自体に影響を与えずに、制御することができる(経路を変化させることが宿主細胞に影響を及ぼす細胞内の代謝工学と異なる)。第三に、この細胞の混合物は、自立調節性でありうる。例えば、ＡをＢに変換する酵素をコードする遺伝子を有する細胞は、媒質中でＡの存在下でＡをＢに変換する酵素を急増又はアップレギュレートするように構築されうる。最後に、反応物、中間体、補助因子及び生成物を、細胞を溶解させ又は透過性にすることなく、必要に応じて、連続的に、媒質に加えること及び媒質から取り出すことができる。例えば、毒性の反応物、中間体又は生成物を、反応に加える量を制御することにより又は毒性成分が反応混合物中で組み立てられる場合にそれを取り出すことによって、これらの細胞にダメージを与えないレベルに維持することができる。更に、これらの酵素は細胞外で発現されるので、反応物の十分な細胞による取込みを達成することに関する心配がなく、細胞を透過性にして細胞取込みを増進させる必要がない。
【００１２】
ここに記載した方法は、経路工学に有用なタンパク質のライブラリーの細胞外での発現を与える細胞ライブラリーと共に利用することができる。そのライブラリーメンバーの種々の組合せを混合して、種々の経路を生成することができ、それは、その経路を発現する細胞を各事例において操作する(engineer)ことなく所望の生成物の生成について試験することができる。反応物を培養培地に与えて、該培養培地における中間体及び／又は生成物の生成をモニターすることができる。
【００１３】
一面において、この発明は、所望の生成物を生成する経路を操作する方法であって、(１)分泌され又は細胞膜へ輸送される少なくとも一つの潜在的生合成経路成分を各々発現する２種以上の細胞を混合し；(２)該混合物に、所望の生成物の前駆物質を加え；そして(３)該混合物中の経路成分に、反応混合物中の前駆物質を化学的に変化させて所望の生成物を生成させることを含む当該方法を提供する。
【００１４】
他の面において、この発明は、投入した物質の生物分解のための経路を操作する方法であって、(１) 分泌され又は細胞膜へ輸送される少なくとも一つの潜在的生物分解経路成分を各々発現する２種以上の細胞を混合し；(２) 該混合物に、分解のための投入物質を加え；そして(３) 該混合物中の経路成分に、投入物質を分解させることを含む当該方法を提供する。
【００１５】
一面において、この発明は、所望の生成物を生成する経路を操作する方法であって、(ｉ)この経路の基質を含む反応混合物中に２種以上の細胞を混合し；そして(ii)所望の生成物の生成について該反応混合物をアッセイすることを含む当該方法を提供する。
【００１６】
ある具体例において、これらの細胞は、潜在的な経路成分を細胞表面で発現しうる。他の具体例においては、これらの細胞は、潜在的な経路成分を細胞外環境に分泌しうる。
【００１７】
ある具体例において、これらの細胞は、原核細胞例えば細菌細胞、又は真核細胞例えば酵母細胞であってよい。典型的具体例において、これらの細胞は、大腸菌であってよい。
【００１８】
ある具体例において、３種以上の細胞を、反応混合物中で混合することができる。他の具体例においては、複数の細胞を、反応混合物中で混合することができる。
【００１９】
ある具体例において、潜在的経路成分の発現は、反応混合物中の適当な基質の存在に依存する。他の具体例においては、潜在的経路成分を発現する細胞の生存能力又は増殖は、調節可能である。例えば、潜在的経路成分を発現する細胞の生存能力又は増殖は、反応混合物中のある成分の存在に依存しうる。
【００２０】
ある具体例において、各細胞は、少なくとも一種の潜在的経路成分を発現することができる。他の具体例においては、少なくとも一種の細胞は、少なくとも２つの潜在的経路成分を発現する。
【００２１】
他の面において、この発明は、投入物質の生物分解のための経路を操作する方法であって、(ｉ)２種以上の細胞を、該経路による分解のための投入物質を含む反応混合物中で混合し、該細胞は、潜在的経路成分を細胞外で発現し；そして(ii)反応混合物を、投入物質の分解についてアッセイすることを含む当該方法を提供する。
【００２２】
ある具体例において、この反応混合物を、投入物質の消失についてアッセイすることができる。他の具体例においては、この反応混合物を、分解生成物の生成についてアッセイすることができる。
【００２３】
他の面において、この発明は、複数の潜在的経路成分を細胞外で発現する複数の細胞を含むライブラリーを提供する。ある具体例において、このライブラリーの細胞は、該潜在的経路成分を細胞表面で発現する。他の具体例においては、このライブラリーの細胞は、該潜在的経路成分を細胞外環境中に分泌する。ある具体例において、複数の潜在的経路成分が、生物分解経路に関与する酵素又はその変異体を含む。他の具体例においては、複数の潜在的経路成分は、生合成経路に関与する酵素又はその変異体を含む。ある具体例において、複数の潜在的経路成分は、少なくとも一つの代謝又は異化酵素の２種以上の変異体を含む。他の具体例においては、複数の潜在的経路成分が、少なくとも一つの代謝又は異化酵素の複数の変異体を含む。ある具体例において、各細胞は、少なくとも一つの潜在的経路成分を発現する。他の具体例において、少なくとも一つの細胞は、少なくとも２つの潜在的経路成分を発現する。他の具体例においては、複数の細胞が、各々、少なくとも２つの潜在的経路成分を発現する。
添付の請求の範囲を、この節に、参考として組み込む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
１．定義
ここで用いる場合、次の用語及び語句は、下記の意味を有する。別途規定しない限り、ここで用いたすべての技術的及び科学的用語は、当業者に普通に理解されているものと同じ意味を有する。
【００２５】
単数形は、文脈上明らかに違う場合を除いて、複数形を含む。
【００２６】
用語「含む」は、包含的な、開いた意味、更なる要素を含むことができる意味で用いられる。
【００２７】
用語「〜を含む」は、「〜を含むが、それ(ら)に限られない」ことを意味する。「〜を含む」と「〜を含むが、それ(ら)に限られない」は、交換可能に用いられる。
【００２８】
用語「代謝経路」は、２以上の一連の酵素反応であって、一の酵素反応の生成物が次の酵素反応の基質になる当該一連の酵素反応を指す。代謝経路の各段階においては、中間体化合物が形成されて、次の段階の基質として利用される。これらの化合物は、「代謝中間体」と呼ばれうる。これらの各段階の生成物は又、「代謝産物」とも呼ばれる。
【００２９】
ここで用いる場合、用語「トランスフェクション」は、核酸例えば発現ベクターのレシピエント細胞への導入を意味し、ウイルス又はウイルスベクターに関して一般に用いられる「感染する」などの用語を含むことを意図している。用語「トランスフェクション」は、一般に、ここでは、核酸を用いるトランスフェクションが核酸のウイルス送達による場合に用いられる。用語「トランスフォーメーション」は、外来分子例えばＤＮＡを細胞に導入するための任意の方法を指す。リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介のトランスフェクション、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈降法、レトロウイルス送達法、エレクトロポレーション、自然のトランスフォーメーション、及びバイオリスティックトランスフォーメーションは、まさしく、当業者に公知の、利用することのできる幾らかの方法である。
【００３０】
上記のタンパク質の細胞外発現のための構築物を、宿主細胞内に、当分野で公知の任意の方法によって導入することができる。ポリヌクレオチドの真核又は原核細胞への導入のための任意の手段を、ここに記載した組成物及び方法に従って利用することができる。適当な方法には、例えば、直接的な注射針によるマイクロインジェクション、トランスフェクション、エレクトロポレーション、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ヘルペスウイルス及び他のウイルスのパッケージング及び送達システム、ポリアミドアミンデンドリマー、リポソーム、並びに遺伝子銃を用いて送達されるＤＮＡコートされた微小投射体(バイオリスティックデバイスと呼ばれる)又は狭いビームのレーザー(レーザーポレーション)を利用する一層最近の技術が含まれる。一具体例において、核酸構築物は、コロイド分散系との複合体で送達することができる。コロイド系には、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、並びに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベースのシステムが含まれる。この発明の典型的なコロイド系は、脂質複合体化又はリポソーム配合されたＤＮＡである。例えば、Canonico等、Am J Respir Cell Mol Biol 10:24-29, 1994; Tsan等、Am J Physiol 268(6 Pt 1): 1052-6(1995); Alton等、Nat Genet. 5:135-142, 1993及びCarson等による米国特許第５，６７９，６４７号を参照されたい。
【００３１】
２．生体触媒工学的方法及び組成物
一具体例において、この発明は、生合成(例えば、代謝)経路又は生物分解(例えば、生体矯正、異化)経路をデザインするための方法を提供する。これらの方法は、タンパク質を細胞外で発現する細胞を、経路の基質を含む反応混合物の存在下で、混合することを含む。これらの方法は、潜在的経路成分(例えば、代謝酵素、異化酵素、及びそれらの変異体など)の様々な組合せの迅速な試験を、単一細胞内で、経路の構築を必要とせずに可能にする。所望の生成物、又は投入物質の分解は、細胞外で、反応混合物中で、それらの細胞により細胞外に供給された潜在的経路成分により行われる。所望の生成物の上首尾の合成、又は投入物の分解は、反応混合物中の、投入物の減少、中間体の生成又は最終生成物の生成を測定することによりモニターすることができる。
【００３２】
ある具体例において、これらの方法は、複数の異なる潜在的経路成分を発現する複数の細胞を単一反応混合物中で混合することを含む。例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０の又は一層多くの、細胞外で潜在的経路成分を発現する細胞を、単一反応混合物中で混合することができる。ある具体例において、これらの潜在的経路成分は、公知の生合成及び／又は生物分解経路に含まれることが知られた酵素であってよい。他の具体例においては、これらの潜在的経路成分は、生合成又は生物分解経路に含まれることが知られていないが、代謝又は異化経路において有用でありうる活性を有しうるタンパク質であってよい。更に別の具体例においては、これらの潜在的経路成分は、前述の何れかの変異体である。かかる変異体は、ランダム突然変異誘発によって生成することができ又は、例えば、変化した基質特異性、増大した酵素活性、一層大きい安定性などを有する酵素活性の生成のための合理的デザインによって生成することができる。
【００３３】
様々な具体例において、反応混合物は、潜在的経路成分の任意の組合せを含むことができる。例えば、反応混合物は、公知の経路に由来する２以上の経路成分を、通常その経路に含まれないタンパク質と組み合わせて含むことができる。他の具体例において、反応混合物は、典型的には同じ経路で見出されない２以上の公知の経路に由来する経路成分の混合物を含むことができる。かかる成分は、通常種々の生物体において見出される経路又は同一生物体で見出される２以上の経路からのものであってよい。更に別の具体例においては、経路のデザインのための反応混合物は、通常公知の生合成又は生物分解経路に含まれないタンパク質である２以上の潜在的経路成分を含むことができる。他の具体例において、この反応混合物は、公知の経路成分又は他の関心あるタンパク質の一種以上の変異体を含むことができる。前述したものの様々な組合せも又、本願において企図される。
【００３４】
ここに記載の方法によれば、経路の開発のための反応混合は、細胞の成長及び／又はインキュベーションが可能な任意の容器中で実施することができる。例えば、反応混合物は、バイオリアクター、細胞培養用のフラスコ又はプレート、マルチウェルプレート(例えば、９６、３８４、１０５６ウェルのミクロ滴定プレートなど)、ファーメンターなどであってよい。典型的な具体例において、反応混合を、反応物(例えば、基質、生物分解のための投入物質、栄養分など)の追加及び／又は中間体及び又は生成物の取り出しが可能なミクロ流体工学用デバイスにおいて実施することができる。ミクロ流体工学用デバイスの利用は、有毒化合物を含みうる反応を実施する場合に、混合物中の有毒物質の量を制御すること(例えば、毒性生成物を、それが生成される際に反応から取り出すことができ、それ故、それは、細胞にダメージを与えるのに十分なだけの高レベルに蓄積しないか又は毒性の投入物は、細胞にダメージを与えうるレベルを超えるまで濃度を上げる必要がなく、反応混合物にゆっくりと加えることができるなど)が可能なので、特に有用である。反応混合物における栄養分の投入及び取出しの制御に加えて、ミクロ流体工学的デバイスを利用して、酵素を細胞外で発現する細胞を反応混合物に加え又は該混合物から取出すことができる。例えば、ミクロ流体工学的デバイスを利用して、反応混合物における酵素比を、例えば第一の酵素を発現する細胞の量を、反応混合物中に存在する第二の酵素を発現する細胞の量に対して制御することによって制御することができる。これは、反応の速度又は生成される生成物の量の制御において有用でありうる。その上、ミクロ流体工学的デバイスは、その後、細胞外で酵素を発現する細胞を反応混合物に加えるために利用することができる。例えば、もし酵素１がＡをＢに変換し、酵素２がＢをＣに変換して、酵素３がＣをＤに変換するならば、ミクロ流体工学的デバイスを、酵素１、２及び３を細胞外で発現する細胞を反応混合物に加えるタイミングを制御するために利用することができる。これらの細胞を、次いで、この反応に、この混合物中で適当な酵素の基質が組み立てられる際に加えることができ(例えば、Ｂが混合物中で組み立てられる場合は、酵素２を発現する細胞を加える)及び／又はこの混合物から該混合物中で酵素反応の生成物が組み立てられる際に取り出すことができる(例えば、Ｃが混合物中で組み立てられる場合は、酵素２を発現する細胞を取り出す)。ある具体例において、代謝又は異化経路を、細胞の組合せを利用して、連続的に行なうことができ、ここに、異なる酵素を発現する細胞は、決して同じ反応容器に一緒に混ぜない。例えば、ミクロ流体工学用デバイスを利用して、基質Ａを、酵素１を細胞外で発現する細胞と混合することができる。この反応の生成物Ｂを、次いで、このデバイスにより、ＢをＣに変換する酵素２を細胞外で発現する細胞を含む他の反応容器に取り出す。かかる技術は、異なる細胞型の間での競合、例えば単一の反応混合物中での一の細胞型の他と比較しての過剰増殖(これは、不明瞭な結果を生じうる)を回避するのに役立つ。ここに記載した組成物及び方法に従って利用されうるミクロ流体工学用デバイスの例には、例えば、米国特許公開第２００５／００８９９９号及び２００６／０１４１６０７号に記載されたデバイスが含まれる。
【００３５】
他の具体例において、この発明は、酵素を細胞外に発現する少なくとも一種の細胞を含む組成物を提供する。他の具体例において、この組成物は、各々細胞外に異なる酵素を発現する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０種の又は一層多くの細胞を含みうる。他の具体例において、この発明は、少なくとも２種の異なる酵素を同じ細胞上で又は該細胞から細胞外発現する少なくとも一種の細胞を含む組成物を提供する。他の具体例において、この組成物は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０種の又は一層多くの異なる酵素を同じ細胞上で又は該細胞から細胞外発現する少なくとも一種の細胞を含みうる。他の具体例において、この組成物は、各々、２種以上の異なる酵素を細胞外発現する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０種の又は一層多くの細胞を含みうる。個々の細胞が一種より多くの酵素を細胞外発現する場合には、酵素の任意の組合せを利用することができる。ある具体例において、酵素の組合せを、一般に一の経路中で一緒に見出される個々の細胞と共同して利用することは望ましいであろう。例えば、多くの異なるコンテキストにおいて利用することのできる柔軟な試薬の創出は、幾つかの異なる代謝及び／又は異化経路の共通の成分である２種の酵素を一緒に対合させることによって造ることができる。この細胞外発現は、細胞の表面での発現(例えば、表面ディスプレー)又は酵素の細胞外環境への分泌であってよい。ある具体例において、この酵素の発現は、誘導性プロモーター又は抑制可能なプロモーターによって制御することができる。典型的な酵素には、例えば、代謝酵素又は異化酵素例えば以下に記載したようなものが含まれる。ある具体例において、これらの組成物は、反応器、チューブ、ファーメンター、培養フラスコ、ミクロ滴定プレート、又は他の細胞生長若しくはインキュベーション用容器に含ませることができる。
【００３６】
典型的具体例において、この発明は、アモルファジエンの生成のための代謝経路を細胞外発現する少なくとも一種の細胞及びその適当な基質を含む組成物を提供する(例えば、Martin等、Nature Biotech. 21:796-802(2003)参照)。一具体例において、この組成物は、アモルファジエン代謝経路において、各々異なる酵素を発現する複数の細胞を含む。他においては、アモルファジエン合成に必須。
【００３７】
更に別の具体例において、この発明は、潜在的経路成分を細胞外発現する細胞のライブラリーを提供する。ある具体例において、これらのライブラリーは、公知の生合成又は生物分解経路からの複数の酵素、代謝又は異化経路に含まれていることが知られていない複数のタンパク質、前述の何れかの変異体、及びこれらの様々な組合せを含むことができる。これらのライブラリーは、例えば、ミクロ滴定プレート中に与えることができ、その場合、各ウェルは、異なるタンパク質を例えば細胞表面で又は細胞からの分泌により細胞外発現している細胞に相当する。これらのライブラリーは貯蔵することができ、これらのライブラリーからの成分にアクセスして、様々な経路の組合せをアッセイするために、種々の組合せを形成するために利用することができる。一具体例において、このライブラリーは、所与の経路における最大活性につきアッセイすることのできる所与の酵素の複数の変異体を含むことができる。
【００３８】
ある具体例において、これらの細胞を、潜在的経路成分の発現が調節可能であるように、例えば、発現が、インデューサーの添加(又は、リプレッサーの除去)に際して制御されうるように組み立てることができる。典型的具体例において、この潜在的経路成分の発現は、反応混合物中の経路成分が作用する基質の存在に依存しうる。例えば、ＡからＢの変換を触媒する酵素の発現は、媒質中のＡの存在下で誘導することができる。かかる経路成分の発現は、この発明の方法によって、誘導を引き起こす化合物の添加又は生合成経路の過程における該化合物の自然組み立てによって誘導することができる(例えば、このインデューサーは、所望の生成物を生じる生合成過程において生成される中間体であってよい)。典型的具体例において、遺伝子発現を制御する方法は、例えば米国特許公開第２００５／００５３９５１号に記載されたようなリボスイッチの利用に基づくものであってよい。
【００３９】
ある具体例において、潜在的経路成分を細胞外発現する細胞は、該細胞の成長、増殖及び／又は生存能力が調節可能であるように操作することができる。例えば、細胞の成長、増殖及び／又は生存能力は、外因性因子の、反応混合物への添加により及び／又は因子の反応混合物からの除去によって制御することができる。反応混合物に加え又は該混合物から除去しうる因子の例には、栄養要求性細胞型(又は、部分的栄養要求性細胞型)の成長に必要な栄養分、細胞の生存能力又は増殖に必要な遺伝子をアップレギュレート又はダウンレギュレートする(例えば、成長又は細胞分裂に必要な遺伝子をアップレギュレートし又は阻害性若しくは毒性遺伝子をダウンレギュレートする)化合物、毒性因子などが含まれる。ある具体例において、細胞を、それらの成長、増殖及び／又は生存能力が、代謝又は異化経路の中間体に依存するように操作することができる(例えば、上記のリボスイッチの利用により)。反応混合物中の酵素を細胞外発現する細胞の成長、増殖及び／又は生存能力を制御することにより、この混合物中の酵素の比率を制御することができる。この型の制御は、種々の細胞型の間の競合を防止し及び一の細胞型が反応混合物中に広まること及び潜在的にこの代謝若しくは異化経路の機能化と干渉することを防止するのを助成することができる。例えば、酵素１(Ａ→Ｂ)、酵素２(Ｂ→Ｃ)及び酵素３(Ｃ→Ｄ)を含む経路において、反応混合物中でＢの適当なレベルが確立された場合にのみ酵素２を発現する細胞の増殖をアップレギュレートすることは望ましいことであろう。同様に、Ｃの所望のレベルが反応混合物中で達成されたときに酵素２を発現する細胞の増殖を止めるかダウンレギュレートすることは望ましいことであろう。
【００４０】
３．細胞外でのタンパク質発現
様々な具体例において、ここに記載した方法及び組成物は、関心あるタンパク質の細胞外発現を利用する。細胞外発現は、表面ディスプレー(例えば、細胞の表面上に提示され又は係留されたタンパク質)並びに細胞からのタンパク質の分泌の両方を含む。タンパク質の細胞外発現は、様々な細胞又は生物体において達成することができ、該細胞又は生物体には、原核生物、真核生物及びウイルス(バクテリオファージを含む)が含まれる。細胞外タンパク質発現の方法は、例えば、Kostakioti等、J. Bacteriology 187:4306-4314(2005); 米国特許公開第２００４／０１４６９７６号、２００４／００７６９７６号；２００４／０１４６９７６号；２００４／０００５５３９号；２００３／０１０４６０４号；２００４／０１７１０６５号；２００５／０１１８６８５号；２００５／０１２４０４２号；２００５／００１９８５７号；２００４／０１２６８４７号；２００４／０１１５７９０号；２００４／０１１５７７５号；２００３／０１８０９３７号；及び米国特許第５，５１６，６３７号に記載されている。
【００４１】
タンパク質の表面発現のための典型的な宿主細胞又は生物体には、例えば、細菌栄養細胞、細菌胞子及び細菌ＤＮＡウイルスが含まれる。真核細胞は、宿主細胞として利用することができるが、細菌より一層長い分裂時間及び一層厳しい栄養要求性を有する。それらは又、細菌細胞より一層虚弱であり、それ故、ダメージを与えずに操作するのが一層困難である。真核ウイルスは、バクテリオファージの代わりに利用することができるであろうが、真核細胞中で増殖しなければならず、それ故、上記の増幅の問題の幾つかに遭遇するであろう。
【００４２】
宿主細胞が細菌細胞又はペリプラスムでアセンブルされるファージである場合には、これらのディスプレー手段は、２つの成分を有する。第一の成分は、初期発現生成物を細胞(パッケージがファージである場合の宿主細胞)の内膜に向かわせる分泌シグナルである。この分泌シグナルは、シグナルペプチドにより開裂されて、プロセッシングを受けた、成熟した、潜在的結合タンパク質を生成する。第二の成分は、外表面輸送シグナルであり、これは、宿主に、プロセッシングを受けたタンパク質を外表面にアセンブルするように指示する。好ましくは、この外表面輸送シグナルは、宿主生物体につきネイティブな表面タンパク質に由来する。
【００４３】
細胞外発現のためのタンパク質は、ハイブリッド遺伝子から発現させることができる。例えば、ハイブリッド遺伝子は、関心あるタンパク質をコードするＤＮＡを、シグナル配列(例えば、細菌のｐｈｏＡ若しくはｂｌａ遺伝子のシグナル配列又はＭ１３ファージ遺伝子ＩＩＩのシグナル配列)及び繊維状ファージ(例えば、Ｍ１３)のコートタンパク質(例えば、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩのタンパク質)をコードするＤＮＡに操作可能に結合させて含むことができる。この発現生成物は、宿主細胞の内膜(脂質二重層)まで輸送され、そこで、シグナルペプチドが開裂されてプロセッシングを受けたハイブリッドタンパク質が遊離される。このハイブリッドタンパク質のコートタンパク質様成分のＣ末端は、脂質二重層に捕捉され、それで、このハイブリッドタンパク質はペリプラスム空隙へ漏出しない。(これは、野生型コートタンパク質に典型的である。)新生ファージ粒子の一本鎖ＤＮＡは、ペリプラスム空隙へと通過する際に、野生型コートタンパク質とハイブリッドタンパク質の両方を脂質二重層から集める。このハイブリッドタンパク質は、こうして、繊維状ファージの表面鞘内にパッケージされて、潜在的結合ドメインがその表面に曝されて残る。
【００４４】
宿主生物体が細菌胞子又はファージ(その外被は、細胞内でアセンブルされる)である場合には、発現生成物を宿主の細菌細胞の内膜へ向かわせる分泌シグナルは、必要でない。これらの場合には、ディスプレー手段は、外表面輸送シグナル(典型的には、胞子又はファージの外被タンパク質の誘導体)だけである。
【００４５】
ある具体例において、ウイルスを、表面ディスプレーのための宿主生物体として利用することができる。このウイルスは、好ましくは、２〜１０ｋｂ塩基対のゲノムサイズのＤＮＡウイルス例えば繊維状(Ｆｆ)ファージＭ１３、ｆｄ、及びｆ１；ＩｎｃＮ特異的ファージＩｋｅ及びＩｆ１；ＩｎｃＰ特異的シュードモナス・アエルギノサファージＰｆ１及びＰｆ３；及びキサントモナス・オリゼファージＸｆ(但し、これらに限られない)である。
【００４６】
宿主生物体がＭ１３である場合には、遺伝子ＩＩＩの及び遺伝子ＶＩＩＩのタンパク質は、宿主の表面での所望のタンパク質の発現を標的とするための融合タンパク質として大いに好適である。遺伝子ＶＩ、ＶＩＩ及びＩＸからのタンパク質も又、利用することができる。宿主生物体がＰｆ３である場合には、Ｐｆ３の成熟外被タンパク質との融合タンパク質を、表面発現のために利用することができる。
【００４７】
所望のタンパク質の表面ディスプレーのための他のビヒクルは、それを遺伝子ＩＩＩの部分又は全部を含むのキメラ遺伝子のドメインとして発現することによる。この遺伝子は、Ｍ１３のマイナー外被タンパク質の一つをコードする。遺伝子ＶＩ、ＶＩＩ及びＩＸも又、マイナー外被タンパク質をコードする。これらのマイナータンパク質の各々は、ビリオン当たり約５コピーで存在し、形態形成又は感染と関係している。対照的に、主外被タンパク質は、ビリオン当たり２５００コピーより多数で存在している。遺伝子ＶＩ、ＶＩＩ及びＩＸのタンパク質は、ビリオンの端に存在し；これらの３種類のタンパク質は、翻訳後にプロセッシングを受けない。バクテリオファージφＸ１７４を宿主として利用する場合には、表面ディスプレーは、成熟ビリオンの外側に存在するφＸ１７４の３つの遺伝子産物：Ｆ(キャプシッド)、Ｇ(主要スパイクタンパク質、ビリオン当たり６０コピー)及びＨ(マイナースパイクタンパク質、ビリオン当たり１２コピー)の融合物を利用して達成することができる。
【００４８】
タンパク質の表面ディスプレーのための宿主として利用することのできる典型的な細菌細胞には、例えば、サルモネラ・ティフィムリウム、バチルス・ズブチリス、シュードモナス・アエルギノサ、ビブリオ・コレラ、クレブシュラ・ニューモニア、ネイセリア・メニンギチディス、バクテロイド・ノドサス、モラクセラ・ボビス、及び特に大腸菌が含まれる。大腸菌を宿主として利用する場合には、所望のタンパク質の表面ディスプレーを、次のタンパク質(又はその断片)の少なくとも一つとの融合物を作成することによって行なうことができる：ＬａｍＢ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＦ、ＰｈｏＥ、ＢｔｕＢ、ＦｅｐＡ、ＦｈｕＡ、ＩｕｔＡ、ＦｅｃＡ、ＦｈｕＥ及びピリン。大腸菌のＬａｍＢは、Ｓ．ティフィムリウム、Ｖ．コレラ及びＫ．ニューモニアにおいて、機能的形態で発現されており、これは、所望のタンパク質を、これらの宿主細胞において、大腸菌ＬａｍＢとの融合物として表面発現させる。Ｋ．ニューモニアにおいて、ＬａｍＢと類似するマルトポリンを表面発現に利用することができ、Ｐ．アエルギノサにおいて、Ｄ１タンパク質(ＬａｍＢの同族体)を利用することができる。Ｎ．ゴノロエアの表面でのディスプレーのためには、プロテインＩＡへの融合物を利用することができる。
【００４９】
細菌胞子は、宿主生物体として望ましい特性を有している。胞子は、栄養細菌細胞又はファージより遥かに化学及び物理的因子に対して耐性である。バチルス属の細菌は、熱、放射線、脱水及び毒性化学薬品によるダメージに対して極めて耐性である内生胞子を形成する。クロストリジウム属の細菌も又、非常に永続的な内生胞子を形成するが、クロストリジウム属の細菌は、偏性嫌気性菌であって、培養するのに不便である。所望のタンパク質は、ｃｏｔＣ若しくはｃｏｔＤ又はこれらの断片との融合物を作成することにより、Ｂ．ズブチリスの表面に提示されうる。
【００５０】
ペプチド及びタンパク質を細菌及びバクテリオファージの表面に提示するために、多くの方法が工夫されてきた。細菌における異質タンパク質の表面ディスプレーは、様々な目的例えば生細菌ワクチン送達システムの生成のために実行されてきた(例えば、Georgiou等、米国特許第５，３４８，８６７号；Huang等、米国特許第５，５１６，６３７号；Stahl及びUhlen, Trends Biotechnol. 15:185(1995)参照)。細菌表面ディスプレーは、細菌外膜タンパク質、脂質タンパク質、線毛タンパク質及び鞭毛タンパク質に由来するキメラ遺伝子を利用して達成されてきた。外来ペプチド及びタンパク質のバクテリオファージでのディスプレーは、抗原の生成、ペプチドリガンドの同定、酵素基質部位のマッピング、高親和性抗体の単離、及びタンパク質の所望の進化のための強力なツールとなった(例えば、Phizicky及びFields, Microbiol. Rev. 59:94(1995); Kay等、Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press 1996); Lowman, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:401(1997)を参照されたい)。
【００５１】
異質タンパク質の真核細胞における細胞表面ディスプレーのための方法は、記載されている(例えば、Boder及びWittrup, Nature Biotechnol. 15:553(1997)参照)。例えば、Boder及びWittrupは、サッカロミセス・セレビシエをディスプレー粒子として利用するライブラリースクリーニングシステムを記載している。この酵母表面でのディスプレー方法は、２つのサブユニットＡｇａ１及びＡｇａ２よりなるアルファ−アグルチニン酵母粘着性レセプターを利用する。このＡｇａ１サブユニットは、細胞壁にベータグルカン共有結合を介して係留され、Ａｇａ２は、ジスルフィド結合によりＡｇａ１に結合される。このアプローチにおいては、Ａｇａ１と外来ポリペプチドをＡｇａ２のＣ末端に含むＡｇａ２の融合タンパク質とを発現する組換え酵母が生成される。Ａｇａ１とこの融合タンパク質は、酵母細胞の分泌経路内で会合して、ディスプレー足場としての細胞表面で発現される。
【００５２】
真核生物系における様々なアプローチが、関心あるポリペプチドと、融合タンパク質を細胞膜に係留するためのアンカータンパク質由来の膜貫通ドメインとを含む融合タンパク質を生成することにより、表面ディスプレーを達成している。真核細胞においては、大部分の分泌タンパク質及び膜結合タンパク質は、翻訳と同時に小胞体膜を横切って移動する(Wicker及びLodish, Science 230:400(1985)；Verner及びSchatz, Science 241:1307(1988)；Hartmann等、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:5786(1989)；Matlack等、Cell 92:381(1998))。この同時移行過程の第一段階において、新生ポリペプチドのＮ末端の疎水性セグメント(「シグナル配列」と呼ばれる)は、シグナル認識粒子によって認識され、このシグナル認識粒子と膜レセプターとの間の相互作用によって小胞体膜を標的とする。このシグナル配列が小胞体膜に入り、続く新生ポリペプチドが小胞体膜中の翻訳装置を通過し始める。分泌タンパク質又はＩ型膜タンパク質のシグナル配列は、小胞体の内腔側でシグナルペプチダーゼによって開裂され、移行鎖から切り出される。分泌タンパク質鎖の残りは、小胞体内腔に放出される。Ｉ型膜タンパク質は、通常「膜貫通ドメイン」と呼ばれる第二の疎水性セグメントによって膜中に係留される。Ｉ型膜タンパク質のＣ末端は、この細胞のサイトゾル中に局在しているが、Ｎ末端は、細胞表面に提示される。
【００５３】
対照的に、あるタンパク質は、開裂されないシグナル配列、「シグナルアンカー配列」を有し、これは、膜貫通セグメントとして役立つ。シグナルアンカーＩ型タンパク質は、サイトゾルに局在するＣ末端を有し、これは、Ｉ型膜タンパク質と類似しているが、シグナルアンカーＩＩ型タンパク質は、サイトゾルに局在するＮ末端を有する。
【００５４】
幾つかの昆虫細胞系は、外来アミノ酸配列と膜貫通ドメインを含む融合タンパク質を発現するために工夫されてきた。一つの系において、発現ベクターは、異質タンパク質の、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス主要エンベロープ糖タンパク質ｇｐ６４のアミノ末端への融合を与えるようにデザインされた(Mottershead等、Biochem. Biophys. Res. Commun. 238:717(1997))。Ｇｐ６４、Ｉ型一体化膜タンパク質は、バキュロウイルス粒子の表面に提示される異質アミノ酸配列に対するアンカーとして機能する(Monsma及びBlissard, J. Virol. 69:2583(1995))。一層最近、Ernst等、Nucl. Acids Res. 26:1718(1998)は、エピトープライブラリーの生成のためのバキュロウイルス表面ディスプレー系を記載した。この場合には、特定のエピトープをコードするヌクレオチド配列を、インフルエンザウイルスヘマグルチニン遺伝子に挿入した。インフルエンザウイルスヘマグルチニン様ｇｐ６４は、Ｉ型一体化膜タンパク質であり、外来アミノ酸配列のための膜アンカーを提供する(例えば、Lamb及びKrug, 「Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication」Fundamental Virology, 第三版、606-647頁(Lippincott-Raven Publishers 1996)参照)。
【００５５】
ｐＤｉｓｐｌａｙ(商標)は、ポリペプチドを哺乳動物細胞表面に提示するために用いることのできる市販のベクター(INVITROGEN Corp.; カリフォルニア、Carlsbad)の一例である。このベクターにおいては、マルチクローニング部位が、２つの同定可能なペプチド、ヘマグルチニンＡ及びｍｙｃエピトープをコードする配列の間に存在している。このベクターは又、マウス免疫グロブリンカッパー鎖に由来するＮ末端シグナルペプチド、及び血小板由来成長因子のＩ型膜貫通ドメイン(Ｃ末端に位置する)をコードする配列をも含んでいる。この方法においては、関心あるタンパク質は、トランスフェクトされた細胞により、膜貫通ドメインによりＣ末端で原形質膜に係留された細胞外融合タンパク質として発現される。
【００５６】
ある具体例において、ここに記載の方法及び組成物は、宿主細胞から分泌されるタンパク質と共に利用することができる。様々な宿主細胞、例えば細菌などの原核細胞及び酵母などの真核細胞を、細胞外環境へ分泌されるタンパク質を生成するために利用することができる。
【００５７】
細胞質からの分泌のためのタンパク質は、リーダーペプチドとして知られる、一般に１５〜３０アミノ酸のＮ末端ペプチド伸長により合成される。このリーダーペプチドは、タンパク質分解により成熟タンパク質から、細胞質外への輸出と同時に又はその直後に除かれる。
【００５８】
最近の発見は、グラム陰性細菌において現実に４つのタンパク質輸出経路(Stuart及びNeupert, Nature, 406:575-577, 2000)：一般的分泌(Ｓｅｃ)経路(Danese及びSilhavy, Annu.Rev.Genet., 32:59-94, 1998；Pugsley, Microbiol.Rev., 57:50-108, 1993)、シグナル認識粒子(ＳＲＰ)依存性経路(Meyer等、Nature, 297:647-650, 1982)、最近発見されたＹｉｄＣ依存性経路(Samuelson等、Nature, 406:637-641, 2000)及びツイン−アルギニントランスロケーション(Ｔａｔ)システム(Berks, Mol.Micrbiol., 22:393-404, 1996)があることを確立した。これらの経路の最初の３つにつき、ポリペプチドは、膜を、「スレッディング」機構(即ち、折り畳まれてないポリペプチドの、タンパク質ＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ及びＳｅｃＧにより形成された細孔様構造へのインサート)により横切り、該膜を、ＡＴＰの加水分解を必要とする過程により、押されて横切る(Schatz及びDobberstein, Science, 271:1519-1526, 1996)。
【００５９】
対照的に、タンパク質は、部分的又はおそらく完全に折り畳まれたコンホメーションで、膜を横切るＴａｔ経路から輸出された。細菌のＴａｔシステムは、植物の葉緑体チラコイド膜の「ΔｐＨ依存性」タンパク質輸入経路と密接に関係している(Settles等、Science, 278:1467-1470, 1997)。Ｔａｔ経路を通しての輸出は、ＡＴＰ加水分解を必要とせず、ＳｅｃＹ／Ｅ／Ｇ細孔の通過を含まない。殆どの事例で、この経路の天然の基質は、ＦｅＳセンター又はモリブロプテリンなどのある範囲の補助因子を得るために、細胞質で折り畳まらなければならないタンパク質である。しかしながら、補助因子を含まないが、任意の他の経路により輸出されるように余りに早く又は余りに固く折り畳まるタンパク質は、細胞質から、Ｔａｔ特異的リーダーペプチドと融合することによって分泌されうる(Berks, Mol.Microbiol., 22:393-404, 1996；Berks等、Mol.Microbiol., 35:260-274, 2000)。
【００６０】
膜タンパク質ＴａｔＡ、ＴａｔＢ及びＴａｔＣは、大腸菌におけるＴａｔトランスロカーゼの必須成分である(Sargent等、EMBO J., 17:3640-3650, 1998；Weiner等、Cell, 93:93-101、1998)。加えて、ＴａｔＡ同族体ＴａｔＥも又、必須ではないが、トランスロケーションにおいて役割を有しえて、他の因子の関与を、除外できない。ＴａｔＡ、ＴａｔＢ及びＴａｔＥは、すべて一体化膜タンパク質であり、細胞質に面するＣ末端ドメインで一度内膜に及ぶと予言されたものである。ＴａｔＡ及びＢタンパク質は、シングル−スパンタンパク質であると予想されているが、ＴａｔＣタンパク質は、６回膜貫通セグメントを有しており、トランスロケーションチャンネル及びプレタンパク質のレセプターとして機能すると提案されている(Berks等、Mol.Microbiol., 35:260-274, 2000；Bogsch等、J.Biol.Chem., 273:18003-18006, 1998；Chanal等、Mol.Microbiol., 30:674-676, 1998)。ＴａｔＢ又はＣの突然変異誘発は、輸出を完全に破壊する(Bogsch等、J.Biol.Chem., 273:18003-18006, 1998；Sargent等、EMBO J., 17:3640-3650, 1998；Weiner等、Cell, 93:93-101, 1998)。可溶化大腸菌膜から精製されたＴａｔ複合体は、ＴａｔＡＢＣだけを含んだ(Bolhuis等、J.Biol.Chem., 276:20213-20219, 2001)。このトランスロケーション複合体のイン・ビトロでの再構成は、ＴａｔＡＢＣの最小必要物及び無傷の膜ポテンシャルを示した(Yahr及びWickner, EMBO J., 20:2472-2479, 2001)。
【００６１】
リーダーペプチドの選択(従って、特定のタンパク質の輸出に利用される経路の選択)は、正しく折り畳まれた機能性タンパク質が生成されるかどうかを決定しうる(Bowden及びGeorgiou, J.Biol.Chem., 265:16760-16766, 1990；Thomas等、Mol.Microbiol., 39:47-53, 2001)。Feilmeier等(2000)は、グリーン蛍光タンパク質(ＧＦＰ)のＳｅｃ特異的リーダーペプチド又はマルトース結合タンパク質(ＭＢＰも又、Ｓｅｃ経路から輸出される)への融合が、グリーン蛍光タンパク質とＭＢＰ−ＧＦＰのペリプラスムへの輸出を生じることを示した(Feilmeier等、J.Bacteriol., 182:4068-4076, 2000)。しかしながら、ペリプラスム中のグリーン蛍光タンパク質は、非蛍光性であり、これは、この分泌されたタンパク質が不正確に折り畳まれており、それ故に、そのグリーン蛍光タンパク質の発色団が形成されえなかったことを示している。Ｓｅｃ経路から輸出されたタンパク質は、折り畳まれてない形態で膜を横切るので、細菌の分泌コンパートメント(ペリプラスム空隙)における環境が、グリーン蛍光タンパク質の折り畳みに適してないと結論された(Feilmeier等、J.Bacteriol., 182:4068-4076, 2000)。対照的に、Ｔａｔ特異的リーダーペプチドのグリーン蛍光タンパク質への融合は、蛍光性グリーン蛍光タンパク質のペリプラスム空隙における蓄積を生じた。この場合には、Ｔａｔ−ＧＰＦプロペプチドが最初に細胞質において折り畳まることができ、次いで、完全に折り畳まれたタンパク質としてペリプラスム空隙に輸出される(Santini等、J.Biol.Chem., 276:8159-8164, 2001；Thomas等、Mol.Microbiol., 39:47-53, 2001)。しかしながら、ＴｏｒＡ以外のリーダーペプチドを異質タンパク質の大腸菌のペリプラスム空隙への輸出のために利用することができるという証拠はない。
【００６２】
このタンパク質の折り畳みが起きる細胞コンパートメントは、生物学的に活性なタンパク質の収率に劇的な効果を有しうる。細菌細胞質は、多数のタンパク質折り畳みの付随因子例えばシャペロンを含んでおり、その新たに合成されたポリペプチドの折り畳みを促進する機能及び能力はＡＴＰ加水分解により制御される。対照的に、細菌のペリプラスムは、比較的少ないシャペロンを含み、ＡＴＰがそのコンパートメントに存在するという証拠はない。従って、多くのタンパク質は、該ペリプラスムにおいて折り畳まることができず、細胞質環境内でのみネイティブな状態に到達することができる。折り畳まれたタンパク質の細胞質からの分泌を可能にする唯一知られた方法は、Ｔａｔ特異的リーダーペプチドへの融合によるものである。しかしながら、このＴａｔ輸出システムによるタンパク質フラックスは、一層広く利用されているＳｅｃ経路より有意に低い。従って、Ｔａｔ経路から輸出されるタンパク質の蓄積及び定常状態の収率は、低い。
【００６３】
一具体例において、タンパク質は、ｓｅｃ依存性又はｔａｔ経路により細菌細胞から分泌される。その第一の経路は、ｓｅｃ依存性経路である。この経路は、よく特性決定されており、多くの推定のシグナル配列が、記載されてきた。すべてのｓｅｃ依存性シグナルペプチドは、本発明に包含されるべきであるということが意図される。特定の実施例には、ＡｍｙＬ及びＡｐｒＥ配列が含まれるが、これらに限られない。ＡｍｙＬ配列は、アルファ−アミラーゼのシグナル配列を指し、ＡｐｒＥは、ＡｐｒＥシグナルペプチド配列を指す(ＡｐｒＥは、Ｂ．ズブチリスのズブチリシン(アルカリプロテアーゼとも呼ばれる)である)。第二の経路は、ツインアルギニントランスロケーション又はＴａｔ経路である。同様に、すべてのｔａｔ依存性シグナルペプチドは、本発明に包含されるべきであるということが意図される。特定の実施例には、ｐｈｏＤ及びｌｉｐＡ配列が含まれるが、これらに限られない。
【００６４】
他の具体例において、真核細胞からのタンパク質分泌は、ここに記載した方法に従って利用することができる。典型的具体例において、タンパク質を、酵母細胞から分泌することができる。酵母のシグナルペプチド配列は、公知の天然のシグナル配列、又はシグナルペプチドの機能に悪影響を与えないその変異体であってよい。本発明に適したシグナルペプチドの例には、アルファ因子のシグナル配列(例えば、米国特許第５，６０２，０３４号；Brake等(1984) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:4642-4646参照)；インベルターゼ(ＷＯ８４／０１１５３)；ＰＨＯ５(ＤＫ３６１４／８３)；ＹＡＰ３(酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３；ＰＣＴ公開Ｎｏ．９５／０２０５９)；及びＢＡＲ１(ＰＣＴ公開Ｎｏ．８７／０２６７０)が含まれるが、これらに限られない。或は、シグナルペプチド配列は、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリーから当分野で利用可能なハイブリダイゼーションプローブ技術(Sambrook等(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク、Plainview)参照)を利用して決定することができ、又は合成により誘導することさえできる(例えば、ＷＯ９２／１１３７８参照)。
【００６５】
ＥＲに入る間、このシグナルペプチドは、この前駆体ポリペプチドからプロセッシング部位で開裂される。このプロセッシング部位は、イン・ビボで酵母のタンパク質分解酵素により認識される任意のペプチド配列を含むことができる。このプロセッシング部位は、シグナルペプチドの天然のプロセッシング部位であってよい。一層好ましくは、天然のプロセッシング部位は、好適なプロセッシング部位となるように改変され、又は合成により誘導される。「好適なプロセッシング部位」とは、イン・ビボで、酵母のタンパク質分解酵素により、天然の部位より一層効率的に開裂されるプロセッシング部位を意図している。好適なプロセッシング部位の例には、二つの塩基性ペプチド、特に、２つの塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇの任意の組合せ即ちＬｙｓ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ又はＡｒｇ−Ａｒｇ、最も好ましくは、Ｌｙｓ−Ａｒｇが含まれるが、これらに限られない。これらの部位は、サッカロミセス・セレビシエのＫＥＸ２遺伝子によりコードされるエンドペプチダーゼ(Fuller等、Microbiology 1986:273-278参照)又は他の酵母種の同等のプロテアーゼ(Julius等参(1983) Cell 32:839-852照)により開裂される。ＫＥＸ２エンドペプチダーゼが関心ある成熟異種タンパク質のペプチド配列内のある部位を開裂するという事象において、他の好適なプロセッシング部位は、関心あるペプチド配列が無傷のままでいるように利用されうる(例えば、Sambrook等(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク、Plainview)参照)。
【００６６】
機能的シグナルペプチド配列は、異質タンパク質の酵母細胞からの細胞外分泌をもたらすのに必須である。加えて、ハイブリッド前駆体ポリペプチドは、この分泌過程を更に容易にするための酵母分泌タンパク質の分泌リーダーペプチド配列を含むことができる。存在する場合、このリーダーペプチド配列は、一般に、シグナルペプチド配列プロセッシング部位の直ぐ３’側に位置している。「分泌リーダーペプチド配列」(ＬＰ)とは、前駆体ポリペプチド例えば分泌すべき成熟異質タンパク質を含むハイブリッド前駆体ポリペプチドの、細胞膜を横切る細胞壁領域及び/又は清澄媒質への分泌ための、ＥＲからゴルジ装置への及びそこから分泌小胞への移動を指示するペプチドを意図している。このリーダーペプチド配列は、酵母宿主細胞にとってネイティブであっても異質であってもよいが、一層好ましくは、宿主細胞にとってネイティブである。
【００６７】
本発明のリーダーペプチド配列は、シグナルペプチド配列起源として役立った同じ酵母の分泌タンパク質についての天然の配列、異なる酵母の分泌タンパク質についての天然の配列、又は合成の配列であってよく(例えば、ＷＯ９２／１１３７８参照)、又はそのリーダーペプチドの機能に悪影響を与えない任意の変異体であってよい。
【００６８】
この発明の目的につき、リーダーペプチド配列(存在する場合)は、好ましくは、同じ酵母の、シグナルペプチド配列の起源として役立った分泌タンパク質に由来し、一層好ましくは、アルファ因子タンパク質に由来する。前駆体アルファ因子タンパク質をコードする幾つかの遺伝子がクローン化されて、それらの組み合わされたシグナル−リーダーペプチド配列が同定されている。例えば、Singh等(1983) Nucleic Acids Res. 11:4049-4063；Kurjan等、米国特許第４，５４６，０８２号；米国特許第５，０１０，１８２号(本明細書中に、参考として援用する)を参照されたい。アルファ因子のシグナル−リーダーペプチド配列は、異質タンパク質を酵母で発現させるために利用されてきた。例えば、Elliott等(1983) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:7080-7084；Bitter等(1984) Proc.Natl.Acad.Sci. 81:5330-5334；Smith等(1985) Science 229:1219-1229；及び米国特許第４，８４９，４０７号及び５，２１９，７５９号(参考として、本明細書中に援用する)を参照されたい。
【００６９】
アルファ因子(約１３残基長の、オリゴペプチド交配フェロモン)は、約１００〜２００残基長の、一層典型的には約１２０〜１６０残基長の一層大きい前駆体ポリペプチドから生成される。この前駆体ポリペプチドは、約１９〜２３(一層典型的には２０〜２２残基)のシグナル配列、約６０残基のリーダー配列、及び典型的には成熟フェロモン配列の２〜６の直列反復を含む。このシグナルペプチド配列及び完全長アルファ因子リーダーペプチド配列を利用することができるが、この発明にとって一層好ましくは、切り詰められたアルファ因子リーダーペプチド配列がシグナルペプチドと共に用いられる(両エレメントがこのハイブリッド前駆体分子中に存在する場合)。
【００７０】
「切り詰められた」アルファ因子リーダーペプチド配列とは、約２０〜６０アミノ酸残基長の、好ましくは約２５〜５０残基長の、一層好ましくは約３０〜４０残基長の、完全長アルファ因子リーダーペプチド配列の部分を意図している。切り詰められたアルファ因子リーダー配列の、異質タンパク質の分泌を酵母において指示するための利用方法は、当分野で公知である。詳しくは、米国特許第５，６０２，０３４号を参照されたい。ハイブリッド前駆体ポリペプチド配列が切り詰められたアルファ因子リーダーペプチドを含む場合には、完全長リーダーの欠失は、好ましくは、Ｃ末端からであり、少なくとも一つのグリコシル化部位(−Ａｓｎ−Ｙ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ−、ここに、Ｙは、任意のアミノ酸残基である)を切り詰められたペプチド配列中に維持するような仕方で行なう。このグリコシル化部位は、分泌を促進するために維持され、その改変は、当分野の技能の範囲内にある(詳しくは、ＷＯ８９／０２４６３を参照されたい)。
【００７１】
このハイブリッド前駆体ポリペプチドがリーダーペプチド配列例えばアルファ因子のリーダー配列を含む場合には、リーダーペプチド配列の３’末端に隣接してプロセッシング部位があるであろう。このプロセッシング部位は、酵母宿主細胞にとってネイティブなタンパク質分解酵素がその酵母分泌リーダーペプチド配列を、関心ある成熟異質タンパク質のネイティブなＮ末端プロペプチド配列(存在する場合)の５’末端から、又は関心ある成熟異質タンパク質のペプチド配列の５’末端から開裂することを可能にする。このプロセッシング部位は、イン・ビボで、関心ある成熟異質タンパク質が正確にプロセッシングを受けることができるように、酵母のタンパク質分解酵素により認識される任意のペプチド配列を含むことができる。このプロセッシング部位のペプチド配列は、このリーダーペプチド配列のネイティブなプロセッシング部位の天然のペプチド配列であってよい。一層好ましくは、天然のプロセッシング部位は、上記のように、好適なプロセッシング部位となるように改変され、又は該プロセッシング部位は、合成により誘導される。
【００７２】
４．バイオレメディエーションのための代謝経路の操作
現代産業は、多くの汚染物質を生成し、環境は、最早、それに対する無限の吸収装置と考えることはできない。天然の微生物は、自然界で見出されない多くのもの(例えば、生体異物)を含む数千種類の有機化合物を代謝することができる。バイオレメディエーション(微生物の、人間の作り出した廃棄物の生物分解のための意図的利用)は、新生の技術であり、伝統的な処理方法を超えるコスト的及び実際的利点を提供するものである。このバイオレメディエーションの成功は、汚染物質を無毒化又は無機物化することのできる生物体の利用可能性に依存している。特定の汚染物質を分解することのできる微生物は、遺伝子工学及び反復的配列組換えにより生成することができる。
【００７３】
バイオレメディエーションは、汚染制御の面であるが、一層有用な長期のアプローチは、産業廃棄物が環境に注がれる前の防止の一つである。産業廃棄物流の、それらが含む汚染物質を分解することのできる微生物への曝露は、これらの汚染物質の無毒化又は無機物化を、廃棄物流が環境に入る前に生じる。組換え生物体の放出の問題は、それらを、産業排液パイプに適合させたバイオリアクター内に含ませることにより回避することができる。このアプローチは又、用いる微生物混合物を、生成される特定の廃棄物を最も分解するように調節することを可能にする。最後に、この方法は、多くの実験室の微生物が直面している外部世界への適応及び競合の扱いの問題を回避する。
【００７４】
野生状態で、微生物は、それらが汚染物質を競合のない栄養源として資化することを可能にする新たな異化活性を進化させてきた。しかしながら、環境に低濃度で存在する汚染物質は、異化酵素の進化に十分好都合な刺激を与えることができない。かかる生物分解経路の自然進化及び古典的技術による微生物の幾つかの操作の総説は、Ramos等、BioTechnology 12:1349-1355 (1994)を参照されたい。
【００７５】
それ故、バイオレメディエーションのための異化酵素又は経路の生成は、特定の遺伝子の生物体間での意図的トランスファー(Wackett等、Nature 368:627-629 (1994))、特定の異化能力を有する細菌間での強制的交配(Brenner等、Biodegradation 5:359-377 (1994))、又はケモスタットにおける長期の選択に依存してきた。幾らかの研究者は、自然の遺伝的機構による進化をケモスタット選択において様々な異化経路を有する微生物を含有させることにより促進させることを試みた(Kellogg等 Science 214:1133-1135 (1981)；Chakrabarty American Society of Micro. Biol. News 62:130-137 (1996))。この領域における努力の総説は、Cameron等、Applied Biochem. Biotech. 38:105-140 (1993)を参照されたい。
【００７６】
バイオレメディエーションのための生物体の改良における現在の努力は、労働集約的なアプローチを採っており、該アプローチでは、ネイティブな及び異質のプロモーターからの転写効率、調節サーキット及び翻訳効率並びにタンパク質の安定性及び活性の改善を含む多くのパラメーターが、独立に最適化される(Timmis等、Ann.Rev.Microbiol. 48:525-527 (1994))。
【００７７】
ここに記載した方法は、天然の微生物と異なり且つ／又はそれより優れたバイオレメディエーションの能力を有する微生物の迅速な開発を可能にする。酵素の組合せ、活性及び特異性を、ここに記載した方法により、同時に又は順次的に変えることができる。例えば、基質に作用する増大した速度を有する異化酵素を迅速にアッセイすることができる。代謝経路における律速段階の知識が求められなくても、経路における律速タンパク質を、増大した発現及び／又は活性を有するように開発することができ、物質を誘導する条件を排除することができ、そして新規な反応を触媒する酵素を開発することができる。
【００７８】
新規な分解経路は、ここに記載した方法を利用して開発することができる。例えば、この発明の方法は、新規なバイオレメディエーションの経路を生成することのできる種々の酵素の組合せの迅速な試験を可能にする。加えて、これらの方法は、バイオレメディエーションの経路における酵素の特異性及び／又は効率の迅速な最適化を可能にする。酵素を、新規な触媒機能を有するように最適化する場合、その機能は、構成的に又は新たな基質に応答して発現されうる。酵素機能の最適化は、タンパク質の構造及び調節エレメント(調節タンパク質の構造を含む)の両方の改変を含みうる。新規な基質を栄養源として効率的に利用することのできるタンパク質変異体の選択は、酵素及びその調節の両方をタンパク質構造又はオペロン調節の何れの詳細な分析も行なわずに最適化することを確実にするのに十分である。
【００７９】
バイオレメディエーションのための化学的標的の幾つかの例には、ベンゼン、キシレン及びトルエン、カンフル、ナフタレン、ハロゲン化炭化水素、ポリ塩化ビフェニル(ＰＣＢ)、トリクロルエチレン、農薬例えばペンタクロロフェニル(ＰＣＰ)、及び除草剤例えばアトラジンが含まれるが、これらに限られない。
【００８０】
Ａ．芳香族炭化水素
芳香族炭化水素の例には、ベンゼン、キシレン、トルエン、ビフェニル多環式芳香族炭化水素例えばピレン及びナフタレンが含まれるが、これらに限られない。これらの化合物は、カテコール中間体を経て代謝される。カテコールのシュードモナス・プチダによる分解は、ＣａｔＲ調節タンパク質に作用するシス，シス−ムコネートによる異化オペロンの誘導を必要とする。そのＣａｔＲタンパク質のための結合部位は、Ｇ−Ｎ11−Ａであるが、アクチベーター(ＣａｔＲは、そのメンバー)のＬｙｓＲクラスに対する最適配列は、Ｔ−Ｎ11−Ａである。ＣａｔＲ結合部位におけるＧからＴへの突然変異は、カテコール代謝遺伝子の発現を増大させる(Chakrabarty, American Society of Microbiology News 62:130-137 (1996))。これは、異化経路の発現の制御が、特定の生体異物の代謝のために最適化されないことを示している。それは又、繰り返すオペロンの配列の組換えとその後のより一層標的化合物を分解することのできる細菌の選択から予想されるタイプの変異体の一例でもある。
【００８１】
出発材料の例として、ジオキシゲナーゼは、芳香族化合物が異化される多くの経路に必要とされている。たとえジオキシゲナーゼ配列における小さな差異であっても、基質特異性における有意の差異へと導きうる(Furukawa等、J.Bact. 175:5224-5232 (1993)；Erickson等、App.Environ.Micro. 59:3858-3862 (1993))。２つの「親」酵素に由来する配列を利用して作られたハイブリッド酵素は、それらの親の中間的である異化活性を有しえて(Erickson, 前出)、又は何れの親よりも特定の反応について一層優れていることが実際にありうる(Furukawa等、J.Bact.176:2121-2123 (1994))。これらの事例の一つにおいては、位置指定突然変異誘発が、ハイブリッド配列を有する単一ポリペプチドを生成するために利用され(Erickson, 前出)；他方においては、４サブユニットの酵素が、２つの異なるジオキシゲナーゼの各々に由来する２つのサブユニットを発現させることにより生成された(Furukawa, 前出)。それ故、ジオキシゲナーゼをコードする一種以上の遺伝子に由来する配列を、ここに記載の方法によるバイオレメディエーション経路の開発に利用して、新規な特異性を有する酵素を生成することができる。加えて、この異化経路の他の特徴を、関心ある活性に関する代謝経路を最適化するためのこれらの技術を同時に又は順次的に利用して開発することができる。
【００８２】
Ｂ．ハロゲン化炭化水素
多量のハロゲン化炭化水素が、毎年、溶媒及び殺生物剤としての利用のために生成される。これらは、米国だけで、５００万トンを超える１，２−ジクロロエタン及びビニルクロリド(ＰＶＣ生産に使われる)の両方を含む。これらの化合物は、原則として、種々の微生物からの遺伝子を組み合わせることによりハロゲン化芳香族異化経路を構築することができるが、単一の生物体における過程によっては、非常に非生物分解性である。ここに記載した方法は、種々の酵素の組合せの迅速な試験並びにタンパク質変異体の最適化基質特異性及び／又は新規な異化経路を開発する効率についての試験を可能にする。
【００８３】
ここに記載した方法について可能な出発物質の例として、Wackett等(Nature 368:627-629 (1994))は、古典的な技術により、２つのマルチコンポーネントオキシゲナーゼをコードする７つの遺伝子が組み合わされた組換えシュードモナス株が、ポリハロゲン化化合物を順次的還元及び酸化技術により代謝して無毒の生成物を生成することのできる単一の宿主を生成することを示した。これらの及び／又は関連する物質を、ここに記載した技術にかけて、生物分解経路を開発して最適化することができる。
【００８４】
トリクロロエチレンは、重大な地下水汚染物質である。それは、微生物により、補助代謝経路(cometabolic way)において分解される(即ち、エネルギー又は栄養素は得られない)。その酵素は、異なる化合物により誘導されなければならない(例えば、シュードモナス・セパシアは、トルエン−４−モノオキシゲナーゼを利用し、これは、トリクロロエチレンを破壊するためには、トルエンによる誘導を必要とする)。その上、この分解経路は、酵素を不活性化しうる高度に反応性のエポキシドの形成を含む(Timmis等、Ann. Rev. Microbiol. 48:525-557 (1994))。ここに記載した方法を利用して、エポキシドによる不活性化を受けにくい酵素変異体を開発することができる。ある具体例において、エポキシドに一層感受性でない酵素の同定は、細胞外酵素発現を有する細胞を、増大する濃度のトリクロロエチレンの存在下でアッセイすることにより達成することができる。
【００８５】
Ｃ．ポリ塩化ビフェニル(ＰＣＢ)及び多環式芳香族炭化水素(ＰＡＨ)
ＰＣＢ及びＰＡＨは、多くのスーパーファンドにおいて主たる汚染物質である構造的に関連する化合物のファミリーである。一層広い基質特異性を有する酵素をコードするプラスミドで形質転換した細菌が、商業的に利用されてきた。現実には、一層大きいＰＡＨ又は一層塩化されたＰＣＢを分解する公知の経路は、単一宿主内では生成されていない。実際、しばしば、嫌気性細菌と好気性細菌の共同が、完全な代謝に必要とされる。
【００８６】
従って、バイオレメディエーション経路の開発のための出発物質の起源には、ＰＡＨ分解性異化酵素(Sanseverino等、Applied Environ. Micro. 59:1931-1937 (1993)；Simon等、Gene 127:31-37 (1993)；Zylstra等、Annals of the NY Acad. Sci. 721:386-398 (1994))、ビフェニル及びＰＣＢ代謝酵素(Hayase等、J. Bacteriol. 172:1160-1164 (1990)；Furukawa等、Gene 98:21-28 (1992)；Hofer等、Gene 144:9-16 (1994))をコードする遺伝子が含まれる。これらの酵素及びその変異体は、ここに記載した方法において利用して、新奇な生物分解経路を開発することができる。
【００８７】
ＰＣＢ経路における基質特異性は、主として、初期ジオキシゲネーション反応に関与する酵素から生じ、これらの酵素における突然変異によって有意に変化しうる(Erickson等、Applied Environ. Micro. 59:3858-38662 (1993)；Furukawa等、J. Bact. 175:5224-5232 (1993))。ＰＡＨ及びＰＣＢの無機物化は、下流の経路が最初の反応の生成物を代謝することができることを必要とする(Biodegradation 5:359-377 (1994))。これらのここに与えた方法は、ＰＣＢ又はＰＡＨを分解することのできる酵素経路及び／又は酵素変異体の開発を可能にする。
【００８８】
Ｄ．除草剤
除草剤を分解するための新規な異化経路の開発を、アトラジンに関して例示することができる。アトラジン[２−クロロ−４−(エチルアミノ)−６−(イソプロピルアミノ)−１，３，５−トリアジン]は、中程度に分解されにくい除草剤であり、地中及び表面水において、ＥＰＡにより健康に関して勧告すべきレベルとされた３ｐｐｂを超える濃度で頻繁に検出される。アトラジンは、シュードモナス種によって、ゆっくり代謝されうる(Mandelbaum等、Appl. Environ. Micro. 61:1451-1457 (1995))。シュードモナスによるアトラジン代謝の最初の２段階を触媒する酵素は、遺伝子ＡｔｚＡ及びＡｔｚＢによりコードされる(de Souza等、Appl. Environ. Micro. 61:3373-3378 (1995))。これらの遺伝子は、６．８ｋｂの断片にて、ｐＵＣ１８(ＡｔｚＡＢ−ｐＵＣ)中にクローン化されている。このプラスミドを有する大腸菌は、アトラジンを遥かに可溶性の代謝産物に変換する。
【００８９】
Ｅ．重金属の無毒化
細菌は、商業的に、硫砒鉄鉱金鉱石の採鉱により生成した砒酸塩廃液の無毒化に利用されている。採鉱流出液と並んで、産業廃水は、しばしば、重金属(例えば、電子部品及びプラスチックの製造で用いられるもの)で汚染されている。従って、単に、他のバイオレメディエーション機能を実施できるためには、微生物は、水銀、砒素塩、クロム酸塩、カドミウム、銀などを含む存在する重金属レベルに耐性でなければならない。
【００９０】
強い選択圧は、毒性化合物を一層毒性の低いものに代謝する能力である。重金属は、主として、タンパク質を変性させることにより有毒である(Ford等、Bioextraction and Biodeterioration of Metals, p. 1-23)。重金属汚染の無毒化は、その金属の溶解度又はバイオアベイラビリティーを変えること、その酸化還元状態を変えること(例えば、塩化第二水銀は、遥かに揮発性の元素水銀への還元により無毒化される)及び固定化細菌又は植物による金属の生体間蓄積によることさえも含む多くの方法で実施することができる。金属の十分高濃度の蓄積は、金属を再利用することを可能にし；精錬は、生物体の有機部分を焼きはらい、あとに再利用可能な蓄積した金属を残す。幾つかの重金属(砒酸塩、カドミウム、コバルト、クロム、銅、水銀、ニッケル、鉛、銀、及び亜鉛)に対する耐性は、スタフィロコッカス及びシュードモナスを含む幾つかの種でコードされるプラスミドである(Silver等、Environ. Health Perspect. 102:107-113 (1994)；Ji等、J. Ind. Micro. 14:61-75 (1995))。これらの遺伝子は又、重金属耐性を他の種(例えば、大腸菌)にも与える。ここに記載した方法を利用して、微生物の重金属耐性を増大させる経路及び／又は酵素変異体を開発すること並びに細胞が重金属を蓄積する程度を高めることができる。
【００９１】
Ｆ．微生物による採鉱
「バイオリーチング」は、微生物が、不溶性の金属鉱床(通常、金属の硫化物又は酸化物)を可溶性の金属硫酸塩に変換する方法である。バイオリーチングは、硫砒鉄鉱の採鉱において商業的に重要であるが、廃棄物からの金属及び酸の無毒化及び回収における更なる潜在的能力を有している。バイオリーチングの可能な天然の細菌は、Rawlings及びSilver(Bio/Technology 13:773-778 (1995))により総説されている。これらの細菌は、典型的には、それらの成長のための好適温度によってグループに分けられる。一層重要な中温菌は、チオバチルス及びレプトスピリルム種である。中位の好熱菌には、スルホバチルス種が含まれる。極端な好熱菌には、スルホロブス種が含まれる。これらの生物体の多くは、商業的産業環境で成長させるのが困難であり、それらの異化能力を、シュードモナス、ロドコッカス、Ｔ．フェロオキシダンス又は大腸菌などの他の生物体への移行及び該生物体での最適化に関して魅力的な候補にしている。Ｔ．フェロオキシダンスの少なくとも一つの株については、遺伝子システムを利用することができ、その遺伝物質をプラスミドにおいて操作することを可能にする。
【００９２】
ここに記載した方法は、新規な異化経路を開発し及び／又は経路内の少なくとも一の酵素の異化能力例えば金属を不溶性から可溶性の塩に変換する能力を最適化するために利用することができる。加えて、特定の鉱石の浸出速度は、例えば、鉱石濃縮物における毒性化合物に対する増大した耐性、ある基質に対する増大した特異性、異なる基質を栄養源として利用する能力などの結果として改善することができる。
【００９３】
Ｇ．油の脱硫
化石燃料中の硫黄の存在は、パイプライン、ポンプ輸送及び精製装置の腐食、並びに燃焼機関の時期尚早の故障と相関してきた。硫黄は又、化石燃料の精製に用いられる多くの触媒の力を減少させる。硫黄の燃焼生成物の大気中への放出は、酸性雨として知られている。
【００９４】
微生物による脱硫は、魅力あるバイオレメディエーション応用である。化石燃料中に見出される硫黄化合物のクラスの代表的化合物であるジベンゾチオフェン(ＤＢＴ)を異化することのできる幾つかの細菌が報告されている。米国特許第５，３５６，８０１号は、生体触媒により油の脱硫を触媒することのできるロドコッカス・ロドクロウスに由来するＤＮＡ分子のクローニングを開示している。Denomeなど(Gene 175:6890-6901 (1995))は、ジベンゾチオフェンをも分解する上部ナフタレン異化経路をコードするシュードモナスに由来する９．８ｋｂのＤＮＡ断片のクローニングを開示している。類似の機能を実行する他の遺伝子も同定されている(米国特許第５，３５６，８０１号に開示されている)。
【００９５】
これらの酵素の活性は、現在、商業的に価値を有するには低すぎるが、この経路は、ここに記載した方法を利用して効率を増大させることができる。関心ある遺伝子の所望の特性は、ジベンゾチオフェンを脱硫するそれらの能力である。ある具体例において、選択は、好ましくは、この経路を細菌に栄養素を与える経路と結合することにより達成される。従って、例えば、ジベンゾチオフェンの脱硫は、ヒドロキシビフェニルの生成を生じる。これは、炭素及びエネルギーを与えるビフェニル異化経路の基質である。それ故、経路の開発は、ジベンゾチオフェン経路の成分をビフェニル異化経路の成分と組み合わせることを包含する。増大したジベンゾチオフェン脱硫は、宿主細胞の増大した栄養素利用可能性及び増大した成長速度を生じるであろう。個々の経路の成分の最適化の後に、これらの脱硫酵素は、ビフェニル分解酵素から容易に分離することができる。後者は、目的が、油のエネルギー含有量を減じることなく脱硫することであるので、最終経路において望ましくない。
【００９６】
Ｈ．有機ニトロ化合物
有機ニトロ化合物は、爆薬、染料、薬物、ポリマー及び抗菌剤として利用される。これらの化合物の生物分解は、通常、ニトロレダクターゼ(広い特異性の酵素のファミリー)により触媒される硝酸塩原子団の還元によって起きる。有機ニトロ化合物の部分的還元は、しばしば、元より一層毒性の化合物の形成を生じる(Hassan等、1979 Arch Bioch Biop. 196:385-395)。ニトロレダクターゼの最適化は、標的化合物(その例には、ニトロトルエン及びにトロベンゼンが含まれるが、これらに限られない)に一層特異的で且つそれらを一層完全に還元する(従って、無毒化する)ことのできる酵素を生成しうる。ニトロレダクターゼは、爆発的に汚染された土壌から単離した細菌例えばモルガネラ・モルガニ及びエンテロバクター・クロアカ(Bryant等、1991, J. Biol Chem. 266:4126-4130)から分離することができる。酵素又は経路の好適選択方法は、関心ある有機ニトロ化合物に対する増大した抵抗性を探すことである。何故なら、それは、その酵素が、元の化合物の任意の毒性の部分的還元生成物を還元することもできることを示すからである。
【００９７】
５．別基質を利用する化学合成のための代謝経路の操作
代謝工学を利用して、産業上有用な化学物質を生成する経路及び／又は宿主細胞が、人間の作り出した産業廃棄物を含む他の又は一層豊富な栄養源を利用して成長することを可能にする経路を開発することができる。
【００９８】
ここに記載の方法による経路開発のための出発物質は、典型的には、基質の利用又はその輸送のための遺伝子である。関心ある栄養源の例には、ラクトース、ホエー、ガラクトース、マンニトール、キシラン、セロビオース、セルロース及びスクロースが含まれるが、これらに限られない。それ故、エタノール、トリプトファン、ラムノリピッド界面活性剤、キサンタンガム及びポリヒドロキシアルカノエートを含む(これらに限られない)化合物の一層安価な生産が可能となる。かかる基質の望ましい標的基質としての総説は、Cameron等(Appl. Biochem. Biotechnol. 38105-140 (1993))を参照されたい。
【００９９】
ここに記載した経路開発方法は、ネイティブな宿主又は異種宿主の、関心ある基質を利用する能力、一層効率的な輸送系を進化させる能力、ある種の基質に対する特異性を増大又は変更させる能力などを最適化するために利用することができる。
【０１００】
６．生合成のための代謝経路の操作
代謝工学を利用して、生物体を、抗生物質、ビタミン、アミノ酸例えばフェニルアラニン及び芳香族アミノ酸、エタノール、ブタノール、ポリマー例えばキサンタンガム及び細菌セルロース、ペプチド及び脂質を含む事実上任意の代謝中間体の生成を最適化するように変えることができる。かかる化合物を宿主が容易に生成することができる場合には、ここに記載した経路開発方法を利用して、所望の代謝中間体の生成を最適化することができ、これは、酵素の基質特異性及びターンオーバー数の増加、代謝フラックスを有毒な基質又は中間体を減らすように変えること、宿主の毒性化合物などへの抵抗性を増大させること、遺伝子の発現／活性の誘導の必要性を減らし又は変えること、代謝に必要な酵素の生成を増大させることなどの事項を含む。
【０１０１】
代謝酵素は又、水以外の溶媒中での改善された活性のために開発することもできる。これは、化学合成における中間体がしばしばブロッキング基によって保護され、該基は、その化合物の水性溶媒中での溶解度に劇的な影響を与えるので有用である。多くの化合物を、純粋化学的反応と酵素に触媒される反応との組合せによって生成することができる。酵素反応を殆ど不溶性の基質に対して実施することは明らかに非常に非効率的であり、それ故、他の溶媒において活性である酵素のアベイラビリティーは、非常に有用なものとなる。かかるスキームの一例は、ロラカルベフ合成における中間体から保護基を除去するパラ−ニトロベンジルエステラーゼの進化である(Moore, J.C.及びArnold, F.H. Nature Biotechnology 14:458-467 (1996))。
【０１０２】
加えて、殆ど任意の代謝経路の収率を増大させることができる(宿主生物体にとって全く内因性の遺伝子又は全面的若しくは部分的に異種の遺伝子の何れからなるものであっても)。一経路における酵素の発現レベルの最適化は、単に発現を最大にすることよりも一層複雑である。幾つかの事例では、酵素の発現を調節した方が、構成的発現よりも、細胞成長に有利であり、従って、フェニルアラニン(Backman等、Ann. NY Acad. Sci. 589:16-24 (1990))及び２−ケト−Ｌ−グルコン酸(Anderson等、米国特許第５，０３２，５１４号)の生産で見られたように収率について有利でありうる。
【０１０３】
Ａ．抗生物質
天然の小型分子である抗生物質の範囲には、ペプチド、ペプチドラクトン、チオペプチド、ベータ−ラクタム、糖タンパク質、ランチビオティックス、ミクロシン、ポリケチド誘導体抗生物質(アントラサイクリン、テトラサイクリン、マクロライド、アベルメクチン、ポリエーテル及びアンサミシン)、クロラムフェニコール、アミノグリコシド、アミノシクリトール、ポリオキシン、アグロシン及びイソプレのイドが含まれるが、これらに限られない。
【０１０４】
ここに記載した経路開発方法を利用して、新規な薬物の合成を促進し、又は既存の抗生物質の生合成を改善するための少なくとも３つの方法がある。
【０１０５】
第一に、抗生物質合成酵素を、取込みを改善する抗生物質前駆体として利用される化合物のエントリー及び機能を変化させる人工的側鎖前駆体の組込みを与える輸送系と一緒に開発することができる。例えば、ペニシリンＶは、ペニシリウムに人工的な側鎖前駆体のフェノキシ酢酸を与えることにより生成され、ＬＹ１４６０３２は、ストレプトミセス・ロゼオスポルスにデカン酸を与えることにより生成される(Hopwood, Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 324:549-562 (1989))。乏しい前駆体取込み及び合成酵素による乏しい組込みは、しばしば、所望の生成物の非効率的形成へと導く。これらの２つの系の経路開発は、所望の生成物の収率を増大させることができる。
【０１０６】
その上、酵素変異体を様々な他の酵素と一緒に試験することができて、生物学的活性について試験することのできるコンビナトリアルアプローチを採用することができる。この具体例において、これらの方法は、細胞外タンパク質及び媒質中に与えられる潜在的抗生物質前駆体(例えば、側鎖類似体)を発現する種々の細胞を含む反応物を含む。新しい側鎖を組み込んで効果的な抗生物質を生成することのできる細胞の組合せを選択することができる。
【０１０７】
第二に、様々な生物体に由来する抗生物質合成遺伝子の新規な組合せを、経路開発中に、組み合わせ且つ／又は最適化することができる。新規な酵素の組合せは、代謝産物を新規な特性を有する新しい化合物に変換することができる。伝統的方法を利用して、外来遺伝子の抗生物質合成宿主への導入は、既に、新規なハイブリッド抗生物質の生成を生じている。例には、メダデロジンが含まれる。ジヒドログラナチロジン(dihydrogranatirhodin)、６−デオキシエリスロマイシンＡ、イソバレリルスピラマイシン及び他のハイブリッドマクロライド(Cameron等、Appl.Biochem.Biotechnol. Biochem. Biotechnol. 38:105-140 (1993))。ここに記載した経路開発方法は、様々な酵素の組合せのタンパク質レベルを最適化し、その酵素を安定化し、そして酵素の新規な基質に対する活性を増大させるために利用することができる。
【０１０８】
第三に、二次代謝に関与する酵素の基質特異性を、それが、新規な化合物に作用してそれを改変するように又はその活性を変化させてその正常基質の位置と異なるサブセットに作用するように変えることができる。ここに記載した経路開発方法を利用して、酵素の基質特異性を例えば酵素の様々な変異体を作成して試験することにより変えることができる。その上、新規な抗生物質を生成するためのストラテジーとして個々の酵素の変異体を試験することに加えて、全経路の新規な組合せを例えば酵素比を変えることにより試験することは、代謝フラックスを変えて、増大した抗生物質合成のみならず、種々の抗生物質の合成をも生じる。これは、外来宿主における同じクラスターからの種々の遺伝子の発現は、異なる生成物の形成へと導くという観察から演繹することができる(Hutchinson等(1991) Ann NY Acad Sci, 646:78-93の８０頁参照)。従って、既存の抗生物質合成経路の最適化を利用して、新規な抗生物質を、その経路内の酵素の割合又は基質特性を改変することによって生成することができる。
【０１０９】
加えて、抗生物質は又、イン・ビトロで、精製した酵素の前駆体に対する作用によって生成することもできる。例えば、イソペニシリンＮシンターゼは、多くのその正常基質(ｄ−(Ｌ−ａ−アミノアジピル)−Ｌ−システイニル−Ｄ−バリン)の類似体の環化を触媒する(Hutchinson, Med. Res. Rev. 8:557-567(1988))。これらの生成物の多くは、抗生物質として活性である。広範な基質類似体を、二次代謝産物合成酵素による取込みについて、反応の初期効率の懸念なしで試験することができる。次いで、ここに記載の経路開発方法を利用して、有望な新しい基質との反応速度を増大させることができる。
【０１１０】
従って、所望の抗生物質を生成するための公知の経路は、その抗生物質の生成を最大にするように、ここに記載の経路開発方法によって進化させることができる。加えて、新規な抗生物質を、個々の酵素の操作により又はここに記載のような新規な酵素の組合わせによって開発することができる。抗生物質生成のための遺伝子は、所望の経路の開発後に、好適な宿主に移すことができる。基質フラックスの増進を含む二次代謝産物生成の増大(速度制限酵素の速度を増すこと、負の制御エレメントの抑制又はアクチベーターの過剰発現による経路の制限解除及び調節された酵素のフィードバック無反応性の統制解除されたタンパク質への変異によるフィードバック制御の軽減による)は、ここに記載した方法を利用して、関連遺伝子クラスターの発現を支配する調節機構の網羅的分析なしで達成することができる。
【０１１１】
新規な経路及び／又は酵素の発現のために選択した宿主は、好ましくは、生成した抗生物質に耐性であるが、幾つかの場合には、生成方法は、生成された抗生物質の量が、商業的に有意であってしかも宿主に致死的である場合には、宿主細胞を犠牲にするようにデザインすることができる。同様に、バイオリアクターを、生育媒質が連続的に補充されるようにデザインし、それにより生成された抗生物質を「引き出す」こと及びこれらの生産細胞を助命することができる。好ましくは、耐性の機構は、生成された抗生物質の分解でない。
【０１１２】
増大した抗生物質発現についての多くのスクリーニング方法は、当分野で公知であり、自身の生成した抗生物質に一層耐性の生物体のスクリーニングを含んでいる。これは、抗生物質合成の発現と抗生物質耐性遺伝子との間の結合により生じうる(Chater, BioTechnology 8:115-121(1990))。他のスクリーニング方法は、レポーター遺伝子(例えば、シュードモナスＴＯＬプラスミド由来のｘｙｌＥ)を抗生物質産生遺伝子と融合することである。次いで、抗生物質合成遺伝子の発現を、レポーター(例えば、ｘｙｌＥは、カテコールジオキシゲナーゼをコードしており、これは、コロニーにカテコールを噴霧した場合に黄色の粘性セミアルデヒドを生成する)の発現を探すことにより測定することができる(Zukowski等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:1101-1105 (1983))。
【０１１３】
広範なクローン化された抗生物質遺伝子は、ここに記載した経路開発方法のための豊富な出発材料を提供する。例えば、抗生物質非生産性のストレプトミセス・リビダンスにおいてセファマイシンＣ合成を指示する遺伝子が、ストレプトミセス・カトレアからクローン化されている(Chen等、Bio/Technology 6:1222-1224(1988))。ペニシリン生合成のためのクラスター化された遺伝子(δ−(Ｌ−α−アミノアジピル)−Ｌ−システイニル−Ｄ−バリンシンテターゼ；イソペニシリンＮシンテターゼ及びアシル補酵素Ａ：６−アミノペニシラン酸アシルトランスフェラーゼ)が、ペニシリウム・クリソゲナムからクローン化されている。これらの遺伝子のニューロスポラ・クラッサ及びアスペルギルス・ニガーへのトランスファーは、活性なペニシリンＶの合成を生じる(Smith等、Bio/Technology 8:39-41(1990))。セファロスポリンＣ、ペニシリンＧ及びＶ並びにセファマイシンＣの生合成に関与するクローン化された遺伝子の総説は、Piepersberg, Crit.Rev.Biotechnol.14:251-285(1994)を参照されたい。抗生物質産生遺伝子のクローン化されたクラスターの総説は、Chater BioTechnology 8:115-121(1990)を参照されたい。工業用産生株にトランスファーされた抗生物質産生遺伝子又は遺伝子の過剰発現の他の例は、チロシン、セファマイシンＣ、セファロスポリンＣ、ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体(抗腫瘍剤及び抗菌剤)、ドキソルビシン、スピラマイシン及び他のマクロライド抗生物質を含み、Cameron等、Appl.Biochem.Biotechnol. 38:105-140 (1993)に総説されている。
【０１１４】
Ｂ．抗生物質の化学合成に取って代わる生合成
幾つかの抗生物質は、現在、生物学的に生成された出発化合物の化学的改変により製造されている。所望の分子の完全な生合成は、必要な酵素活性及び基質特異性を有する酵素の欠乏のため、現在、実際的でない。例えば、７−アミノデアセトオキシセファロスポラン酸(７−ＡＤＣＡ)は、半合成セファロスポリンの前駆体である。７−ＡＤＣＡは、化学的環伸張によりペニシリンＶから作成され、その後、酵素によるフェノキシアセタール基の脱アシル化が行われる。セファロスポリンＶは、原則として、ペニシリンＶから、ペニシリンＮエキスパンダーゼを利用して、生物学的に生成することができるが、ペニシリンＶは、如何なる公知のエキスパンダーゼによっても基質として利用されない。ここに記載した経路開発方法を利用して、ペニシリンＶを基質として利用する酵素変異体を同定することができる。同様に、セファロスポリン又はセファマイシンを基質として受け入れるペニシリントランスアシラーゼの変異体を開発することができる。
【０１１５】
更に別の具体例において、大腸菌で発現されるペニシリンアミダーゼは、ペニシリンＧ産生において鍵となる酵素である。この酵素は、前駆体ペプチドから生成されて、媒質中に代謝されえない糖が存在しない限り、不溶性の凝集物としてペリプラスムに蓄積する傾向がある(Scherrer等、Appl.Microbiol.Biotechnol. 42:85-91 (1994))。この酵素の変異体の、ここに記載した方法を利用する開発は、数倍良好な酵素の生成を可能にして、一層高レベルの活性酵素発現へと導く。
【０１１６】
更に別の例においては、アガロースに共有結合されたペニシリンＧアシラーゼが、ペニシリンＧ誘導体の合成において利用される。この酵素は、増大された活性、長命及び／又は熱安定性について、化学的改変により安定化することができる(Fernandez-Lafuente等、Enzyme Microb.Technol.14:489-495 (1992))。ここに記載した方法を利用して、増大した熱安定性を有する酵素を開発することができ、それにより、かかる酵素の化学的改変の必要性を回避することができる。熱安定性についての選択は、ここに記載した反応を一層高温で実施することにより行なうことができる。一般に、熱安定性は、酵素の一般的安定性の増進における優れた第一ステップである。突然変異誘発と選択は又、酵素を非水性溶媒中での機能に適合させるために利用することもできる(Arnold Curr Opin Biotechnol, 4:450-455 (1993)；Chen等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:5618-5622 (1993))。
【０１１７】
Ｃ．ポリケチド
ポリケチドは、抗生物質例えばテトラサイクリン及びエリスロマイシン、抗癌剤例えばダウノマイシン、免疫抑制剤例えばＦＫ５０６及びラパマイシン及び獣医学用製品例えばモネシン及びアバメクチンを包含する。ポリケチドシンターゼ(ＰＫＳ)は、鎖長、鎖組立てユニットの選択及び天然のポリケチドにおける莫大な変異を生成する還元サイクルを制御する多機能酵素である。ポリケチドは、「エキステンダユニット」(脂肪酸アシルＣｏＡ基)の適当な開始ユニット(例は、アセテート、クマレート、プロピオネート及びマロナミドである)への順次的移行により組み立てられる。ＰＫＳは、縮合反応数及びエキステンダー原子団の種類を決定し、ポリケチド前駆体を折り畳んで環化することもできる。ＰＫＳは、特異的β−ケト基を還元して、その結果生成したβ−ヒドロキシルを脱水して二重結合を形成することができる。利用する組立てブロックの性質又は数、β−ケト基が還元される場所、還元の程度及び可能な環化の異なる位置の改変は、種々の最終生成物の形成を生じる。ポリケチド探索は、現在、改変及びインヒビター研究、新規なポリケチド生成物へと導くであろう酵素の合理的改変のための基礎を定める位置指定突然変異誘発及び３−Ｄ構造解明に集まっている。
【０１１８】
McDaniel等(Science 262:1546-1550 (1995))は、組換えＰＫＳの効率的構築及び発現のためのストレプトミセス宿主ベクター系を開発した。Hutchinson (BioTechnology 12:375-308 (1994))は、特異的生合成遺伝子の狙いを定めた突然変異を総説して、微生物単離株を、公知の薬理学的に活性な薬剤に関連する遺伝子についてのＤＮＡハイブリダイゼーションによりスクリーニングして、新規な代謝産物及び多量の従来品を与えるようにすることができることを示唆した。特に、該総説は、ポリケチド合成及びアミノグリコシド及びオリゴペプチド抗生物質への経路に集中している。
【０１１９】
ここに記載した経路開発方法を利用して、新規なポリケチドを生成する新規な経路及び／又は改変された酵素を生成することができる。プラスミド上のＰＫＳ遺伝子の利用可能性及び大腸菌−ストレプトミセスシャトルベクター(Wehmeier Gene 165:149-150 (1995))の存在は、ここに記載した経路開発方法を容易にする。抗生物質産生性生物体の選択のための技術は、更に、ここに記載したように実施することができる。加えて、幾つかの具体例において、特に望ましいポリケチド活性又は化合物のスクリーニングを利用することができる。
【０１２０】
Ｄ．イソプレノイド
イソプレノイドは、セスキテルペンシンターゼによるファルネシルピロホスフェートの環化から生じる。イソプレノイドの変化は、その主鎖ではなく環化の制御により生成される。イソプレノイドシンターゼ遺伝子のクローン化された例には、フサリウム・スプロロトリキオイデスからのトリコジエンシンターゼ、ストレプトミセスからのペンタレンシンターゼ、ペニシリウム・ロケフォチからのアリストロケンシンターゼ、及びＮ．タバクムからのエピ−アリストロケンシンターゼが含まれる(Cane, D.E. (1995) 「Genetics and Biochemistry of Antibiotics Production」(Vining, L.C.及びStuttard, C.編)(Butterworth-Heinemann刊)の633-655頁、イソプレノイド抗生物質)。ここに記載した経路開発方法を利用して、これらの酵素の異種宿主(例えば、植物及び工業用微生物株)における発現及び作られた環化生成物を変化させる酵素の改変の両方に有用なセスキテルペンシンターゼの変異体を生成することができる。多数のイソプレノイドが、抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗真菌剤、除草剤、殺虫剤又は細胞増殖抑制剤として活性である。従って、抗細菌剤及び抗真菌剤イソプレノイドは、インジケーター細胞型システムの利用につきスクリーニングすることができ、又はそれらの、宿主細胞に対するウイルスの攻撃に対する耐性を与える能力によってスクリーニングすることができる。
【０１２１】
Ｅ．生物活性なペプチド誘導体
生物活性なリボソームによらずに合成されたペプチドの例には、抗生物質のシクロスポリン、ペプスタチン、アクチノマイシン、グラミシジン、デプシペプチド、バンコマイシンなどが含まれる。これらのペプチド誘導体は、リボソームではなく、複合酵素により合成される。再び、かかるリボソームによらずに合成されたペプチド抗生物質の収率を増大させることは、今まで、生合成の「ボトルネック」の遺伝子の同定及び特異的酵素の過剰発現により為されてきた(例えば、「Genetics and Biochemistry of Antibiotic Production」(Vining, L.C.及びStuttard, C.編)(Butterworth-Heinemann刊)の133-135頁参照)。ここに記載した経路開発方法を利用して、既存の生物活性なリボソームによらずに作られたペプチドの収率を、新規な酵素の組合せを同定することにより及び／又は最適化された活性若しくは特異性を有する酵素を開発することによって改善することができる。ポリケチドシンターゼと同様に、ペプチドシンターゼは、活性化された組立てブロック(この場合アミノ酸)間の縮合反応及びその後のそれらの組縦ブロックの修飾を触媒するモジュール式の多機能酵素である(Kleinkauf, H.及びvon Dohren, H. Eur.J.Biochem. 236:335-351 (1996)参照)。従って、ポリケチドシンターゼと同様に、ここに記載した方法を利用して、酵素上の各結合部により認識されるアミノ酸に対する改変された特異性及び、これらのアミノ酸を改変して新規な抗生物質活性を有する化合物を生成する部位に対する変化した活性又は基質特異性を有するペプチドシンターゼ変異体を同定することができる。
【０１２２】
他のペプチド抗生物質は、リボソームにより作られてから翻訳後修飾される。このタイプの抗生物質の例は、ランチバイオティクス(グラム陽性細菌例えばスタフィロコッカス、ストレプトミセス、バチルス及びアクチノプラネスにより生成される)及びミクロシン(腸内細菌科により生成される)である。元のペプチドの改変は、セリン及びスレオニンの脱水、デヒドロアミノ酸のシステインとの縮合(ランチバイオティクスの場合)、又は単純なＮ又はＣ末端ブロッキング(ミクロシンの場合)を含む。リボソームにより作られた抗生物質に関して、ペプチドをコードする配列及び改変酵素の両方を、ここに記載した方法を利用して、濃度比を変えて試験することができる。再び、これは、抗生物質合成の増大したレベル及び、改変酵素(及びリボソームにより合成されたペプチド自身の配列)のレベルの変調による新規な抗生物質の両方へ導く。
【０１２３】
Ｆ．ポリマー
生物分解性プラスチックポリヒドロキシブタレート(ＰＨＢ)及び多糖類キサンタンガムの生成を含む生体高分子を生成するための代謝工学の幾つかの例が報告されている。総説としては、Cameron等、Applied Biochem.Biotech. 38:105-140 (1993)を参照されたい。これらの経路のための遺伝子は、クローン化されて、それらをここに記載した経路開発方法のための優秀な候補としている。
【０１２４】
経路開発のための出発物質の例には、ポリヒドロキシアルカノエート(ＰＨＡ)例えばポリヒドロキシブチレート(ＰＨＢ)を細胞内でストレスに応じてエネルギー貯蔵物質として生成するアルカリゲネス、ズーグロエア、リゾビウム、バチルス及びアゾバクターなどの細菌由来の遺伝子が含まれるが、これらに限られない。アセトアセチルＣｏＡのＰＨＢへの変換を触媒する酵素をコードするアルカリゲネス・ユートロフスからの遺伝子は、大腸菌及び植物のアラビドプシス・サリアナにトランスファーされた(Poirier等、Science 256:520-523 (1992))。これらの遺伝子の２つ(ｐｈｂＢ及びｐｈｂＣ、それぞれ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ及びＰＨＢシンターゼをコードする)は、アラビドプシスにおけるＰＨＢの生成を与える。このプラスチックを生成する植物は、おそらく、新しい代謝経路と植物の元々の代謝との間の有害な相互作用(即ち、メバロン酸経路からの基質の涸渇)のために、発育が阻害される。改良された植物におけるＰＨＢの生産が、この経路の酵素の、色素体などのオルガネラへの局在化により試みられてきた。他のストラテジー例えば組織特異性、発現のタイミング及び細胞局在性の調節は、植物におけるＰＨＢの悪影響を解決することが示唆されてきた。ここに記載した経路開発方法を利用して、かかる異種遺伝子並びに特異的なクローン化相互作用経路(例えば、メバロン酸)を改変すること及びＰＨＢ合成を工業用微生物株において最適化して例えば生育条件におけるストレス要求(例えば、窒素制限)を除去することができる。
【０１２５】
加えて、微生物ポリエステルが、更なるモノマーがポリマーに組み込まれる、異なる細菌によって作られる(Peoples等、Novel Biodegradable Microbial Polymers (E A Dawes編)の191-202頁(1990))。ここに記載した経路開発方法は、異なる特性の様々なポリマー(モノマーサブユニット比の変化を含む)の生産を与えるであろう。ここに記載した方法によって合成を操作することのできる他のポリマーは、セルロースである。セルロースの生合成のための遺伝子は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスからクローン化されている(Matthysse, A.G.等、J.Bacteriol. 177:1069-1075 (1995))。この生合成経路の経路開発は、セルロースの合成を増大させるために、又は別の糖がこのポリマーに組み込まれる変異体を生成するために利用することができよう。
【０１２６】
Ｇ．カロテノイド
カロテノイドは、全イソプレノイド生合成経路において、細菌、カビ及び植物により生成される６００を超えるテルペノイドのファミリーである(総説としては、Armstrong, J.Bact. 176:4795-4802 (1994)を参照されたい)。これらの色素は、生物体を、光酸化ダメージから防護し並びに抗腫瘍剤、遊離基を除去する抗酸化剤及び免疫応答のエンハンサーとして機能する。加えて、それらは、養殖魚類及び甲殻類の着色に商業的に利用される。カロテノイドの例には、ミクソバクトン、スフェロイデン、スフェロイデノン、ルテイン、アスタキサンチン、ビオラキサンチン、４−ケトルレン、ミクソキサントロフィル、エキネノン、リコピン、ゼアキサンチン及びそのモノ及びジグルコシド、アルファ−、ベータ−、ガンマ−及びデルタ−カロテン、ベータ−クリプトキサンチンモノグルコシド及びネオキサンチンが含まれるがこれらに限られない。
【０１２７】
カロテノイド合成は、比較的少数のクラスター化遺伝子により触媒される：ミクソコッカス・キサンタスに由来する１２ｋｂのＤＮＡ内の１１の異なる遺伝子(Botella等、Eur.J.Biochem. 233:238-248 (1995))及びロドバクター・スファエロイデスに由来する９ｋｂのＤＮＡ中の８遺伝子(Lang等、J.Bact. 177:2064-2073 (1995))。幾つかの微生物例えばサーマス・サーモフィルスにおいて、これらの遺伝子は、プラスミドに運ばれる(Tabata等、FEBS Letts 341:251-255 (1994))。
【０１２８】
幾つかのカロテノイド遺伝子の異種生物体へのトランスファーは、発現を生じる。例えば、エルウィナ・ウレドボラ及びヘマトコッカス・プルビアリス由来の遺伝子は、一緒に大腸菌内で機能する(Kajiwara等、Plant Mol.Biol. 29:343-352 (1995))。Ｅ．ヘルビコラ遺伝子は、Ｒ．スファエロイデス中で機能する(Hunter等、J.Bact. 176:3692-3697 (1994))。しかしながら、幾つかの他の遺伝子は機能しない；例えば、Ｒ．カプスラタス遺伝子は、大腸菌においてカロテノイド合成を指示しない(Marrs, J.Bact. 146:1003-1012 (1981))。
【０１２９】
ここに記載した方法を用いて、少なくとも一つの、触媒活性を最適化したカロテノイド合成遺伝子の変異体を開発することができる。カロテノイドは有彩色であるので、ミクロ滴定プレートにおいて又は成長培地においてさえ比色アッセイを利用して変異体のスクリーニングを行なうことができる。
【０１３０】
カロテノイドの活性を増大させることに加えて、カロテノイド生合成経路は、関与する酵素がそれらが触媒する反応型に特異的であるがそれらが改変する基質には特異的でないようなので、多様なカロテノイドを生成する潜在能力を有する。例えば、海洋性細菌アグロバクテリウム・アウランティアカムに由来する２つの酵素(ＣｒｔＷ及びＣｒｔＺ)は、６つの異なるケトカロテノイドをベータ−カロテンから合成する(Misawa等、J.Bact. 177:6576-6584 (1995))。この緩い基質特異性は、基質の多様性が、更に一層大きい生成物の多様性に変換されうることを意味する。カロテノイド遺伝子の新規な組合せは、光合成複合体において、新規且つ機能的なカロテノイドタンパク質複合体へと導きうる(Hunter等、J.Bact. 176:3692-3697 (1994))。
【０１３１】
新規な化合物を同定する他の方法は、標準的な分析技術例えば質量スペクトル分析、核磁気共鳴、高性能液体クロマトグラフィーなどを利用することである。組換え体微生物をプールすることができ、それらのプールからの抽出物又は培養上清をアッセイすることができる。次いで、如何なる陽性のプールをも細分して、単一陽性が同定されるまでこの手順を繰り返すことができる(同胞選択)。
【０１３２】
Ｈ．インジゴの生合成
多くの染料即ち色彩を与えるための薬剤は、有意の市場を有する専門化学薬品である。例えば、インジゴは、現在、化学的に合成されている。しかしながら、９つの遺伝子が大腸菌において組み合わされて、グルコースからトリプトファン／インドール経路を経てのインジゴの合成を与える(Murdock等、BioTechnology 11:381-386 (1993))。インジゴ合成を最適化するために、次の幾つかの操作が行われた：９つの遺伝子のクローニング、発酵培地の改変及び、幾つかの酵素の反応速度及び触媒活性を増大させるための２つのオペロンにおける位置指定した改変。それにもかかわらず、細菌により生成されたインジゴは、現在、経済的提供品ではない。ここに記載した経路開発方法を利用して、インジゴ合成経路及び／又は酵素触媒活性を最適化して増大したインジゴ生成へと導き、それにより、この経路を商業的に存立可能なものとしてインジゴ製造の環境への影響を低減することができよう。増大したインジゴ生産についてのスクリーニングは、ミクロ滴定プレート中での培養物の比色アッセイにより行なうことができる。
【０１３３】
Ｉ．アミノ酸
特定の商業的に重要なアミノ酸には、フェニルアラニン、グルタミン酸一ナトリウム、グリシン、リジン、スレオニン、トリプトファン及びメチオニンが含まれるが、これらに限られない。Backman等(Ann. NY Acad. Sci. 589:16-24 (1990))は、生物体の選択、生合成能力の最適化、及び発酵及び回収プロセスの開発をカバーする組織的なダウンストリーム戦略による、大腸菌における増大されたフェニルアラニンの生成を開示した。
【０１３４】
Simpson等(Biochem Soc Trans, 23:381-387 (1995))に記載されたように、アミノ酸生産の分野での現在の研究は、巨大分子の細部におけるこれらの経路の調節を理解することに集中している。ここに記載した経路開発方法は、アミノ酸の合成及び分泌のための経路の最適化並びにセラチア・マルセセンス、バチルス及びクロストリジウム・ブレビバクテリウム群などの生物体からの調節用ホスホエノールピルベート分岐点における酵素の最適化を可能にする。ある具体例において、増進された生産についてのスクリーニングは、所望のアミノ酸に特異的である当分野で周知の化学試験を利用するものであってよい。アミノ酸合成についてのスクリーニング／選択は又、問題のアミノ酸を自身で合成することのできない栄養要求性レポーター細胞を利用することによっても実施することができる。
【０１３５】
Ｊ．ビタミンＣの合成
Ｌ−アスコルビン酸(ビタミンＣ)は、１９８４年において３５，０００トンを超える世界的生産を有する商業的に重要なビタミンである。最近、グルコースを２，５−ケト−グルコン酸に変換することのできる細菌及びＬ−アスコルビン酸の前駆体である２−ケト−Ｌ−イドン酸を生成する細菌が操作されたが、殆どのビタミンＣは、現在、ライヒシュタイン法により、化学的に製造されている(Boudrant, Enzyme Microb. Technol. 12:322-329 (1990))。
【０１３６】
細菌におけるこれらの酵素的工程の効率は、現在、低いものである。ここに記載した経路開発技術を利用すれば、新規な経路及び／又は酵素をデザインして、ハイブリッドのＬ−アスコルビン酸合成経路の最適化を生じて、商業的に存立可能なビタミンＣの生合成を生じることができる。
【０１３７】
Ｋ．テルペノイド
テルペノイドは、天然物の最大のファミリー及び化学的に最も多様化した群を構成している。驚くべき数の２３，０００の異なるテルペノイド化合物が記載されており、毎年、数百の新しい構造が同定され続けている(Connolly及びHill, Dictionary of Terpenoids, Chapman & Hall, London, 1991)。テルペノイドの構造の大きな多様性は、生物系におけるテルペノイドの重要性及び機能の多様性を反映している。テルペノイドは、ホルモン(例えば、ジベレリン)、光合成色素(フィトール、カロテノイド)、抗酸化剤(例えば、カロテノイド)、電子キャリアー(例えば、ユビキノン)、多糖類のアセンブリのメディエーター(ポリプレニルジホスフェート)として及び膜成分(ステロール、ホパノイド)として役立つ。モノテルペンは、一般的な芳香剤であり香味料である。多くのセスキテルペン及びジテルペンは、防御剤、視覚色素、抗腫瘍薬、及びシグナル変換成分として機能する。植物において、これらのモノテルペノイド(１０炭素主鎖)は、必須油の成分として知られており、それらが存在する植物の特徴的な香りの原因であって、多様な構造型が、調味料及び香水として利用される。加えて、これらの化合物の多くは、生物学的活性を有し、様々な病気の治療に伝統的に用いられてきた植物及び草本植物中の治療上活性な成分の多くは、テルペノイドである。例には、アルテミシニン(熱病及びマラリアの治療に利用されるヨモギから単離されたセスキテルペン)；タキソール(最も有効な抗癌剤の一つであるイチイから単離されたジテルペン)、及びフォルスコリン(血圧を下げ、心臓作用性を有するインド薬用植物から単離されたジテルペン)が含まれる。様々なテルペノイドが、抗細菌性及び抗真菌性を有し又は、例えばある種のカビから単離されたトリコエテセンセスキテルペンのような強力な細胞毒である。重要なテルペノイドの農作物由来の化学物質は、例えば、殺虫性ピレスリン(モノテルペン)及びアザドラキチン(トリテルペノイド)である。テルペノイドの医薬及び農芸化学的特性の総説としては、Dewick(Medicinal Natural Products, John Wiley & Sons, New York, 1998)を参照されたい。テルペノイドの驚くべき化学的な多様性及び機能的多様性の両者は、それらを、経済的価値のある多様な化合物の発見のための天然物の最も有望なクラスにしている(Sacchettini及びPoulter, Science 1997; 277:1788-1790)。
【０１３８】
様々な酵素経路は、様々なテルペノイド例えばモノテルペノイド、セスキテルペノイド(１５炭素主鎖)、ジテルペノイド(２０炭素主鎖)、及びテトラテルペノイド(４０炭素主鎖)の形成へと導く。モノテルペンには、３つの主要なグループ；非環式テルペン例えばゲラニオール、一環式種例えばテルピネオール、及び２環式種例えばカンフル及びツジョンがある。
【０１３９】
これらのテルペン、カロテノイド及びステロイドの生合成経路は、すべて、２つのアセチル−ＣｏＡ分子の、酵素アセチル−ＣｏＡチオラーゼにより触媒される縮合から始まる。第二段階は、酵素ヒドロキシグルタリル−ＳＣｏＡ(ＨＧＭ−ＳＣｏＡ)シンターゼにより触媒される。その生成物のＨＭＧ−ＣｏＡは、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼにより還元されて、メバロン酸を生成する。このメバロン酸は、リン酸化されて、ＭＶＡ−５ピロホスフェートを生成し、これは、カルボキシル化されて、イソペンテニルピロホスフェート(ＩＰＰ)を生成する。イソプレノイドの生合成において最初に付したステップにおいて、直鎖状の１０炭素(Ｃ１０)のゲラニルジホスフェート(ＧＤＰ)分子は、ｇ２つのＣ５イソプレンユニットのヘッド・トゥー・テイル縮合(１’−４付加)により形成される；ＩＰＰ及びその異性体；ジメチルアリルジホスフェート(ＤＭＡＰＰ)。ＧＤＰ、すべてのテルペノイドの前駆体；ゲラニルジホスフェートは、その後、鎖伸張及び／環化を受けうる。
【０１４０】
６．スクリーニング技術
所望の又は新規な生成物の同定及び／又は検出のためのスクリーニング技術は、一般に、上に記載してある。加えて、スクリーニングは、選択マーカーの発現の検出により行なうことができ、該マーカーは、幾つかの遺伝的状況において、それを発現している細胞を生存させるが他の細胞は死滅する(又は、その逆)。スクリーニングマーカーには、例えば、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、及びグリーン蛍光タンパク質が含まれる。スクリーニングは、コロニーサイズ、ハロ形成などの生育の様相を観察することによっても行なうことができる。加えて、所望の化合物例えば治療用薬物又は「デザイナー化学薬品」の生成についてのスクリーニングを、細胞生成物のレセプター又はリガンドへの結合を固体支持体又はカラムにて観察することにより達成することができる。かかるスクリーニングは、更に、ＥＬＩＳＡにおけるように、抗体への結合により達成することができる。幾つかの事例においては、スクリーニング方法は、好ましくは、適当な数の反応のスクリーニングを可能にするように自動化される。自動化スクリーニング装置の幾つかの例には、蛍光活性化セルソーティング、特にアガロース中に固定化された細胞に関する該セルソーティング(Powell等、Bio/Technology 8:333-337 (1990)；Weaver等、Methods 2:234-247 (1991)参照)、自動化ＥＬＩＳＡアッセイなどが含まれる。選択マーカーには、例えば、薬物、毒素耐性、又は栄養合成遺伝子が含まれる。選択は又、基質を無毒化する能力を有する宿主を選択するための毒性基質上での生育、新規な栄養源を利用する能力を有する宿主を選択するための当該栄養源での生育、栄養源を利用する能力に基づく培養における競合的生育などの技術によっても行なうことができる。
【０１４１】
抗生物質生成についてのスクリーニングは、一般に、Hopwood(Phil Trans R. Soc. Lond B324:549-562 (1989))に記載されている。Omura(Microbio.Rev. 50:259-279 (1986))及びNisbet(Ann Rep. Med. Chem. 21:149-157 (1986))は、抗微生物剤についてのスクリーニングを開示しており、高感度細菌による、ベータ−ラクタマーゼ及びＤ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼ阻害、ベータ−ラクタマーゼ誘導、色素産生基質の検出及びモノクローナル抗体スクリーニングが含まれている。抗生物質標的は又、高スループットスクリーニングにおいてスクリーニング標的としても利用することができる。抗真菌剤は、典型的には、カビの成長の阻止によりスクリーニングされる。薬剤は、酵素及び色素生産性基質を含むプレートを利用して、又は自動化レセプターアッセイにより、酵素インヒビターとして同定することができる。加水分解酵素(例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ)は、基質を寒天プレート中に含有させて加水分解による透明域を評価することにより、又は比色インジケーターを利用することによってスクリーニングすることができる(Steele等、Ann.Rev.Microbiol. 45:89-106 (1991))。これは、酵素作用の効果を検出するための着色の利用と結合することができる(セルロース及びヘミセルロースの分解の程度を検出するためのコンゴーレッドなど)。例えば、リパーゼ及びエステラーゼを、ウンベリフェリルに結合させた種々の長さの脂肪酸を利用してスクリーニングすることができる。リパーゼ又はエステラーゼの作用は、このタグを脂肪酸から除去して、ウンベリフェリルの蛍光の消光を生じる。これらの酵素は、ミクロ滴定プレート中で、ロボット装置によりスクリーニングすることができる。
【０１４２】
効率的スクリーニング技術は、ここに記載の方法を利用する新規な経路の効率的開発を与えるために必要である。好ましくは、酵素経路により生成される化合物のための適当なスクリーニング技術が、関心ある特性についての迅速且つ高感度のスクリーニングを可能にする。視覚的(比色)アッセイは、この点において最適であり、適当な光吸収特性を有する化合物に容易に適用される。その上、薬物開発におけるコンビナトリアル化学及び指示された酵素進化の成功は、ますます洗練されたスクリーニング技術の開発に拍車をかけた。これには、例えば、高スループットＨＰＬＣ−ＭＳ分析(自動注入及び迅速な試料分析のために、スクリーニング用ロボットが、ＨＰＬＣ−ＭＳシステムに結合されている)が含まれる。これらの技術は、事実上任意の所望の可能物の、高スループットの検出及び定量を可能にする。ＨＰＬＣ−ＭＳ、ＴＬＣ及び、プレートリーダーを利用するミクロ滴定プレートのスクリーニングを利用して、吸着特性において僅かな差異しか示さない新規なカロテノイドを同定することができる。指示された酵素進化のためのスクリーニング及び選択技術は、ここに記載した方法における利用に適合させることができ、総説されている(Zhao, H.及びArnold, F., Curr.Opin.Struct.Biol. 1997; 7:480-485；Hilvert, D.及びKast, P., Curr.Opin.Struct.Biol. 1997; 7:470-479)。
【０１４３】
テルペノイドは、如何なる光吸収特性も蛍光特性も有していないので、テルペンの生合成の分析は、放射性標識された基質及び放射性−ＧＣ／ＨＰＬＣの利用又はＧＣ／ＨＰＬＣ−ＭＳに依存している。放射性ＧＣ及びＧＣ−ＭＳの両者は、テルペンの分析のために文献に記載された主要な方法である。しかしながら、ＨＰＬＣ−ＭＳも又、特に１５以上の炭素原子を有する低揮発性又は不揮発性テルペノイドについて利用されてきた(Bohlmann等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998;95:4126-4133；Corey等、Proc. Natl. Acad.Sci.USA 1994;91:2211-2215；Thomas等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999;96:4698-4703)。それ故、テルペノイドの分析及び定量のためのＨＰＬＣ−ＭＳ法を開発することができる。ＧＣ−ＭＳは、公知のテルペノイドの生合成の日常的分析に利用することができる。ＨＰＬＣ及びＧＣの両分析のために、文献に記載された方法を、現実の分析的要求及び既存の装置に適合させることができる。テルペノイドの抽出及びＧＣ／ＬＣ−ＭＳのための試料調製の方法は、好ましくは、公開された資料に基づいて開発される。特に強調すべきことは、高スループットの試料分析に適合させることのできる少しのステップしか必要としない方法を開発することである。その上、公知のテルペンを、公開された方法によるＧＣ／ＬＣ−ＭＳ分析のための標準として単離することができる。豊富な公開されたテルペノイド質量スペクトル及びＮＩＳＴデータベースに寄託されたものも又、テルペノイドの同定に動員することができる。幾つかの場合に、高分解能ＮＭＲ及び質量スペクトル分析による構造の同定は、必要となりうる。
【０１４４】
カロテノイドはそれらの発色団により特定の吸収特性を示すので、新規なカロテノイドは、酵素改変がその発色団に影響を与えた場合、それらの変化した吸収特性によって識別することができる。新規なカロテノイドの合成のために変化した分光測光的特性に基づくスクリーニングを容易にするために、例えば脱飽和、酸化又は環化によって発色団に影響を与える生合成酵素を、経路開発のために選択する。カロテノイド分析の詳細な方法は、Britton等(Carotenoids: 第１Ａ巻：Isolation and Analysis, Basel: Birkhuser Verlag (1998))；及びBritton等、(Carotenoids: 第１Ｂ巻：Isolation and Analysis, Basel:Birkhuser Verlag (1998))中に見出される。
【０１４５】
フラボノイドは、それらの発色団によって特定の吸収特性を示すので、新規なフラボノイドは、酵素改変がその発色団に影響を与える場合には、それらの変化した光吸収特性によって識別することができる。新規なフラボノイドの合成についての変化した分光測光的特性に基づくスクリーニングを容易にするためには、生合成酵素を、発色団に、例えば脱飽和、酸化又は環化によって影響を与える経路開発のために選択する。これらのフラボノイド構造の他の改変は、例えばＬＣ−ＭＳ技術によって検出することができる。
【０１４６】
テトラピロールは、特徴的な光吸収スペクトルを示すだけでなく、蛍光特性も異なっている。テトラピロール環系の殆どの、酸化、金属キレート化又は側鎖の改変による改変は、この環系の異なる非局在化状態を生じ、そうして、その蛍光及び光吸収特性に影響を与える。それ故、光吸収及び蛍光は、テトラピロール分析(ＨＰＬＣ及びＮＭＲを伴う)及びスクリーニングのための仮想的ツールとして役立つ。
【０１４７】
新規なテトラピロールの合成のための任意の生合成酵素の改変前に、各テトラピロール(プレコリン−２、プレコリン−３、コプロポルフィリノゲンＩＩＩ、プロトポルフィリノゲンＩＸ、プロトポリフィリン及びプロトヘムＩＸ)の吸収及び蛍光特性は、改変すべき酵素の基質として役立ち、分析して、公開された特性と比較することができる。加えて、分離のための抽出方法及びＨＰＬＣ法を、文献の方法に基づいて確立することができる。
【０１４８】
本発明の方法の実施は、別途示さない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学、工学、ロボット工学、光学、コンピューターソフトウェア及び統合の慣用の技術を利用する。これらの技術及び手順は、一般に、当分野で慣用の方法及び当業者の技能内にある様々な一般的参考文献に従って行われる。かかる技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 第二版、Sambrook, Fritsch及びManiatis編(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989)；DNA Cloning, 第I及びII巻(D.N. Glover編、1985)；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait等、1984)；Mullis等 米国特許第４，６８３，１９５号；Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames及びS.J. Higgins編、1984)；Transcription And Translation (B.D. Hames及びS.J. Higgins編、1984)；Culture Of Animal Cell(R.I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；学術論文、Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H. Miller及びM.P. Calos編、1987, Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology, 第154巻及び155巻(Wu等編)、Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer及びWalker編、Academic Press, London, 1987)；Handbook Of Experimental Immunology, 第I-IV巻(D.M. Weir及びC.C. Blackwell編、1986)；Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)；Lakowicz, J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York: Plenum Press (1983), 及びLakowicz, J.R. Emerging Applications of Fluorescence Spectroscopy to Cellular Imaging： Lifetime Imaging, Metal-ligand Probes,Multi-photon Excitation and Light Quenching, Scanning Microsc. 補遺第10巻 (1996) 213-24頁、(蛍光技術に関して)、Optics Guide 5 Melles Griot.RTM. Irvine カリフォルニア、(一般的光学技術に関して)、Optical Waveguide Theory, Snyder及びLove, Chapman & Hall刊、及びFiber Optics Devices and Systems (Peter Cheo) Prentice-Hall刊(ファイバーオプチック理論及び材料に関して)を参照されたい。
【０１４９】
同等物
本発明は、他のものの内で、代謝工学のための組成物及び方法を提供する。主題の発明の特定の具体例を論じてきたが、上記の詳細な説明は、説明のためのものであって、制限するためのものではない。この明細書を概観すれば、この発明の多くの変形が、当業者には明らかとなろう。この発明の全範囲は、同等物の全範囲と共に請求の範囲を参照し、かかる変形物と共に詳細な説明を参照して決定されるべきである。
【０１５０】
参考文献の組込み
本願で言及したすべての刊行物及び特許(以下に列記したものを含む)を、個々の刊行物又は特許が、特に、個別に、援用するように指示されたかのように、参考として、そっくりそのまま、本明細書中に援用する。矛盾がある場合には、本願は、本願における任意の定義を含めて、調整する。
【０１５１】
公的データベース例えばThe Institute for Genomic Research （TIGR) (www.tigr.org) 及び／又は the National Center for Biotechnology Information （NCBI) （www.ncbi.nlm.nih.gov） により維持されているデータベースにおけるエントリーに対応する受入れ番号を参照する如何なるポリヌクレオチド及びポリペプチド配列をも、やはり、そっくりそのまま、参考として援用する。
【国際調査報告】
2009501522.tif 000002
2009501522.tif 000003
2009501522.tif 000004
2009501522.tif 000005