(57)【要約】本明細書では、様々な膀胱癌の治療および方法を開示する。本開示は、膀胱癌を個別に標的とする治療を行うために、膀胱のヒト移行上皮癌におけるプロピレングリコール濃度および／またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノン酸化還元酵素−１（ＮＱＯ１）、チトクロームＰ４５０酸化還元酵素（Ｐ４５０Ｒ）およびグルコース輸送体（Ｇｌｕｔ−１）タンパク質発現を利用することができる。本発明には、薬学的製剤も含まれる。具体的に、本発明による一実施形態には、ＰＧ約３０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、ＰＧ約２０％ｖｏｌ／ｖｏｌおよびＰＧ約１０％ｖｏｌ／ｖｏｌからなる群から選択されたプロピレングリコール（ＰＧ）濃度の溶液中にＥＯ９を含む薬学的製剤が含まれる。
2009526085.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロピレングリコール（ＰＧ）約３０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、ＰＧ約２０％ｖｏｌ／ｖｏｌおよびＰＧ約１０％ｖｏｌ／ｖｏｌからなる群から選択されたＰＧ濃度の溶液中にＥＯ９を含む薬学的製剤。
【請求項２】
ＥＯ９濃度約３００μＭから約４００μＭの溶液を含む、請求項１に記載の薬学的製剤。
【請求項３】
ＥＯ９濃度約３４７μＭの溶液を含む、請求項１に記載の薬学的製剤。
【請求項４】
ＮａＨＣＯ３、ＥＤＴＡ、マンニトールおよび水をさらに含む、請求項１に記載の薬学的製剤。
【請求項５】
ＮａＨＣＯ３を約１０ｍｇ／ｍＬから約１２０ｍｇ／ｍＬ含む、請求項４に記載の薬学的製剤。
【請求項６】
ＮａＨＣＯ３を約１００ｍｇ／ｍＬ含む、請求項５に記載の薬学的製剤。
【請求項７】
ＮａＨＣＯ３を約５０ｍｇ／ｍＬ含む、請求項５に記載の薬学的製剤。
【請求項８】
マンニトールを約０．５ｍｇ／ｍＬから約３．０ｍｇ／ｍＬ含む、請求項４に記載の薬学的製剤。
【請求項９】
マンニトールを約０．６２５ｍｇ／ｍＬ含む、請求項８に記載の薬学的製剤。
【請求項１０】
マンニトールを約１．２５ｍｇ／ｍＬ含む、請求項８に記載の薬学的製剤。
【請求項１１】
ＥＤＴＡ、ＰＧおよび水を含む溶液中にＮａＨＣＯ３を約１００ｍｇ／ｍＬ、マンニトールを約０．６２５ｍｇ／ｍＬおよびＥＯ９を約０．１ｍｇ／ｍＬ含む、請求項１に記載の薬学的製剤。
【請求項１２】
ＰＧ、ＥＤＴＡおよび水を含む溶液中にＥＯ９、ＮａＨＣＯ３およびマンニトールを含む薬学的製剤であって、該ＰＧが、約６％から約１４％ｖｏｌ／ｖｏｌ、約１６％から約２４％ｖｏｌ／ｖｏｌ、および約２６％から約３４％ｖｏｌ／ｖｏｌからなる群から選択されたパーセント範囲で該溶液中に存在する薬学的製剤。
【請求項１３】
前記ＰＧが、約１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、約２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、および約３０％ｖｏｌ／ｖｏｌからなる群から選択されたパーセントで前記溶液中に存在する、請求項１２に記載の薬学的製剤。
【請求項１４】
ＥＯ９濃度約３４７μＭおよびＰＧ濃度約１０％ｖｏｌ／ｖｏｌの溶液を含む、請求項１２に記載の薬学的製剤。
【請求項１５】
ＥＯ９濃度約３４７μＭおよびＰＧ濃度約２０％ｖｏｌ／ｖｏｌの溶液を含む、請求項１２に記載の薬学的製剤。
【請求項１６】
ＥＯ９濃度約３４７μＭおよびＰＧ濃度約３０％ｖｏｌ／ｖｏｌの溶液を含む、請求項１２に記載の薬学的製剤。
【請求項１７】
ＮａＨＣＯ３を約１０ｍｇ／ｍＬから約１２０ｍｇ／ｍＬ含む、請求項１２に記載の薬学的製剤。
【請求項１８】
ＮａＨＣＯ３を約１００ｍｇ／ｍＬ含む、請求項１７に記載の薬学的製剤。
【請求項１９】
ＮａＨＣＯ３を約５０ｍｇ／ｍＬ含む、請求項１７に記載の薬学的製剤。
【請求項２０】
マンニトールを約０．５ｍｇ／ｍＬから約３．０ｍｇ／ｍＬ含む、請求項１２に記載の薬学的製剤。
【請求項２１】
マンニトールを約０．６２５ｍｇ／ｍＬ含む、請求項２０に記載の薬学的製剤。
【請求項２２】
マンニトールを約１．２５ｍｇ／ｍＬ含む、請求項２０に記載の薬学的製剤。
【請求項２３】
ＥＯ９濃度約３４７μＭ、ＰＧ濃度約１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、ＮａＨＣＯ３約１００．２５ｍｇ／ｍＬおよびマンニトール約０．６２５ｍｇ／ｍＬの溶液を含む、請求項１２に記載の薬学的製剤。
【請求項２４】
ＥＯ９濃度約３４７μＭ、ＰＧ濃度約３０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、ＮａＨＣＯ３約１００．２５ｍｇ／ｍＬおよびマンニトール約０．６２５ｍｇ／ｍＬの溶液を含む、請求項１２に記載の薬学的製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００６年２月９日に出願された米国仮特許出願第６０／７７１，６７８号の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ＥＯ９製剤を使用した膀胱癌の治療および方法に関する。本発明は、膀胱癌を個別に標的とする治療を行うために、膀胱のヒト移行上皮癌におけるプロピレングリコール濃度および／またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノン酸化還元酵素−１（ＮＱＯ１）、チトクロームＰ４５０酸化還元酵素（Ｐ４５０Ｒ）およびグルコース輸送体１（Ｇｌｕｔ−１）タンパク質発現を利用することができる。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
膀胱癌は、世界的に７番目に最も一般的な癌である。英国では男性における４番目に最も一般的な癌で、２０００年には１年で９０００の新たな症例が診断された（非特許文献１）。２００２年には、欧州では膀胱癌の症例は２８００００と推定され、２００４年には合衆国において６００００を上回る新たな症例が予測された。
【０００４】
膀胱癌の最も一般的な種類（約９０％）は、尿道系（尿管、膀胱および尿道）の内壁の細胞である尿路上皮から生じる移行上皮癌（ＴＣＣ）である。移行上皮癌（ＴＣＣ）は、表在性（ｐＴａおよびｐＴ１）または筋肉浸潤性（≧ｐＴ２）のいずれかに分類することができる。表在性ＴＣＣの治療は現在のところ、経尿道的切除（ＴＵＲＢＴ、すなわち、可視病巣全ての外科的切除）およびその後のアジュバント化学療法または免疫療法である。このような治療の有効性は、ＴＵＲＢＴ単独の場合と比較したとき、アジュバント化学療法後に認められる表在性腫瘍再発の有意な低下によって支持される（非特許文献２）。マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、エピルビシンおよびＢＣＧなどの薬剤が通常使用されるが、ＴＣＣに対してより強力かつ／または毒性の少ない薬剤を開発するか、有益と考えられる個体（または病理学的部分集団）の標的化治療の点から見て、現在の治療法をより良く使用することが必要であることが広く認められている。
【０００５】
マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）は、生体内還元性薬物として知られている化合物の種類に属する、天然に生じるキノンをベースにした抗悪性腫瘍薬である（非特許文献３）。一般的に、生体内還元性薬物は、細胞傷害性代謝物を生じるために代謝活性化を必要とするプロドラッグで、いずれも原理的に固形腫瘍の潅流の乏しい領域に存在する低酸素性細胞を除去するように設計されている。しかし、これらの薬物は、腫瘍の好気性部分も標的とすることができる。
【０００６】
キノンをベースにした生体還元性薬物の細胞傷害性選択性（すなわち、低酸素性と好気性腫瘍細胞の間）を測定する重要なパラメータは、プロドラッグを還元するために必要な特定の還元酵素の存在および活性化プロセスを逆行させる酸素分子の能力である（非特許文献４、非特許文献５）（但し、細胞死滅の決定における還元酵素および酸素分圧の相対的な役割は、問題となる化合物に応じて変化する（非特許文献４、非特許文献６））。ＭＭＣがＴＣＣ治療に通常使用されるという事実は、この疾患が生体還元活性化に必要な適切な生化学的機構を有しているだけでなく、この種類のその他の化合物もこの疾患の治療に有用であり得ることを示唆している。有用であり得る他の化合物の２つの例には、インドールキノン誘導体ＥＯ９およびアジリジニルベンゾキノンＲＨ１が含まれる（非特許文献７、非特許文献８）。
【０００７】
このように、キノンをベースにした生体還元性薬物が好気性または低酸素性細胞を除去する能力は、還元酵素の存在を含む腫瘍の酵素学と低酸素との間の複雑な関係によって主に決定される。酵素チトクロームＰ４５０還元酵素（Ｐ４５０Ｒ）およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノン酸化還元酵素−１（ＮＱＯ１）には細心の注意を払ったが、いくつかの還元酵素が生体還元性薬物の活性化に影響を及ぼした（非特許文献４、非特許文献６）。低酸素の測定に関して、グルコース輸送体１（Ｇｌｕｔ−１）または炭酸脱水素酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）などの内因性マーカーは、ピモニドゾールなどの外因性低酸素マーカーと相関することが示された（非特許文献９、非特許文献１０）。したがって、腫瘍の低酸素と膀胱の表在性および浸潤性移行上皮癌（ＴＣＣ）内における２種類の重要な還元酵素の発現との関係は極めて重要である。さらに、様々な浸透特性を備えた膀胱癌を治療する薬学的製剤を使用することは、表在性と筋肉浸潤性腫瘍を標的とするために必要である。本発明は、膀胱癌治療のこれらの側面に取り組む。
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＵＫ，  Ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  −  ＵＫ．  Ｌｏｎｄｏｎ，  ２００２．
【非特許文献２】Ｔｏｌｌｅｙ  ＤＡ，  Ｐａｒｍａｒ  ＭＫ，  Ｇｒｉｇｏｒ  ＫＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ  ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ  ｏｎ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎｅｗｌｙ  ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ：  ａ  ｆｕｒｔｈｅｒ  ｒｅｐｏｒｔ  ｗｉｔｈ  ７  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｆｏｌｌｏｗ  ｕｐ．  Ｊ  Ｕｒｏｌ  １９９６；１５５：１２３３−８．
【非特許文献３】Ｓａｒｔｏｒｅｌｌｉ  ＡＣ，  Ｈｏｄｎｉｃｋ  ＷＦ，  Ｂｅｌｃｏｕｒｔ  ＭＦ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ：  ａ  ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ｂｉｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ．  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｓ  １９９４；６：５０１−８．
【非特許文献４】Ｒｏｓｓ  Ｄ，  Ｂｅａｌｌ  ＨＤ，  Ｓｉｅｇｅｌ  Ｄ，  Ｔｒａｖｅｒ  ＲＤ，  Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ  ＤＬ．  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｂｉｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ｄｒｕｇ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９６；Ｓｕｐｐｌ  ２７：Ｓ１−８．
【非特許文献５】Ｗａｒｄｍａｎ  Ｐ，  Ｄｅｎｎｉｓ  ＭＦ，  Ｅｖｅｒｅｔｔ  ＳＡ，  Ｐａｔｅｌ  ＫＢ，  Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  ＭＲ，  Ｔｒａｃｙ  Ｍ．  Ｒａｄｉｃａｌｓ  ｆｒｏｍ  ｏｎｅ−ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｔｒｏ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，  ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｎ−ｏｘｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｑｕｉｎｏｎｅｓ：  ｔｈｅ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ，  ｂｉｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ｄｒｕｇｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｓｙｍｐ  １９９５；６１：１７１−９４．
【非特許文献６】Ｗｏｒｋｍａｎ  Ｐ，  Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  ＩＪ．  Ｔｈｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｉｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔ  Ｒｅｖ  １９９３；１２：７３−８２．
【非特許文献７】Ｐｕｒｉ  Ｒ，  Ｂａｓｕ  Ｓ，  Ｌｏａｄｍａｎ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ  ＥＯｑｕｉｎ  （ＥＯ９）  ａｇａｉｎｓｔ  ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ：  Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｒｅｓｕｌｔｓ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００３；９：６２４８Ｓ−９Ｓ．
【非特許文献８】Ｄａｎｓｏｎ  Ｓ，  Ｗａｒｄ  ＴＨ，  Ｂｕｔｌｅｒ  Ｊ，  Ｒａｎｓｏｎ  Ｍ．  ＤＴ−ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ：  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｖ  ２００４；３０：４３７−４９．
【非特許文献９】Ｈｏｓｋｉｎ  ＰＪ，  Ｓｉｂｔａｉｎ  Ａ，  Ｄａｌｅｙ  ＦＭ，  Ｗｉｌｓｏｎ  ＧＤ．  ＧＬＵＴ１  ａｎｄ  ＣＡＩＸ  ａｓ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ：  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｗｉｔｈ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ＡＲＣＯＮ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００３；８９：１２９０−７．
【非特許文献１０】Ａｉｒｌｅｙ  ＲＥ，  Ｌｏｎｃａｓｔｅｒ  Ｊ，  Ｒａｌｅｉｇｈ  ＪＡ，  ｅｔ  ａｌ．  ＧＬＵＴ−１  ａｎｄ  ＣＡＩＸ  ａｓ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｒｖｉｘ：  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｐｉｍｏｎｉｄａｚｏｌｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００３；１０４：８５−９１．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
（発明の趣旨）
表在性腫瘍と筋肉浸潤性腫瘍で認められた低レベルの浸潤性腫瘍の間には、ＮＱＯ１発現の有意な差が見出された。対照的に、Ｐ４５０ＲおよびＧｌｕｔ−１は、（特に、Ｇｌｕｔ−１の場合）腫瘍病期と共に発現が増加するが、ＴＣＣの全病期および悪性度で発現した。さらに、Ｇｌｕｔ−１発現は、Ｇ３腫瘍で著しく増加する一方、ＮＱＯ１は低レベルで存在した。これらの結果は、表在性と浸潤性膀胱ＴＣＣとの間には、ＮＱＯ１およびＧｌｕｔ−１発現の著しい差が存在することを示している。さらに、異なる浸透特性を備えたキノンをベースにした生体還元性薬物の薬学的製剤が見出された。
【０００９】
単一の薬剤による治療が表在性疾患に適切である一方、筋肉浸潤性疾患には、低酸素部分を標的とするキノンおよび好気性部分を除去するその他の療法を使用した併用治療が望ましいという点において、これらの結果は、キノンをベースにした生体還元性薬物に対して治療的に重要な意味を持つ。さらに、浸透特性が低い薬学的製剤は、表在性膀胱癌を治療するときに選択することができ、浸透特性が高い薬学的製剤は、筋肉浸潤が多い膀胱癌を治療するときに選択することができる。これらのことを考え合わせると、本発明のこれらの態様は、個々の疾患プロファイルの固有特性に対して癌治療を調整するのを可能にし、膀胱癌の治療において重要な進歩をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
具体的に、本発明の一実施形態には、腫瘍内の少なくとも１種の酵素レベルを測定することおよび少なくとも１種の酵素レベルに基づいた治療を選択することを含む膀胱癌の治療方法であって、キノンをベースにした生体還元性薬物を単独で、または別の治療法と組み合わせて投与することを含む方法が含まれる。
【００１１】
別の実施形態では、酵素は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノン酸化還元酵素−１（ＮＱＯ１）およびＮＡＤＰＨチトクロームＰ４５０還元酵素（Ｐ４５０Ｒ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、酵素は、ＮＱＯ１であり、治療には、キノンをベースにした生体還元性薬物の単独投与が含まれる。別の特定の実施形態では、酵素は、ＮＱＯ１であり、治療には、別の治療法と組み合わせたキノンをベースにした生体還元性薬物の投与が含まれる。別の特定の実施形態では、酵素は、Ｐ４５０Ｒであり、治療には、キノンをベースにした生体還元性薬物の単独投与が含まれる。さらに別の特定の実施形態では、酵素は、Ｐ４５０Ｒであり、治療には、別の治療法と組み合わせたキノンをベースにした生体還元性薬物の投与が含まれる。本発明の他の実施形態では、酵素は、ＮＱＯ１およびＰ４５０Ｒであり、治療には、キノンをベースにした生体還元性薬物の単独投与が含まれる。さらに別の実施形態では、酵素は、ＮＱＯ１およびＰ４５０Ｒであり、治療には、別の治療法と組み合わせたキノンをベースにした生体還元性薬物の投与が含まれる。
【００１２】
本発明の一実施形態はさらに、腫瘍内の低酸素のレベルを測定し、少なくとも１種の酵素レベルおよび低酸素レベルに基づいた治療法を選択することを含む。具体的な実施形態では、低酸素レベルは、グルコース輸送体１（Ｇｌｕｔ−１）および／または炭酸脱水素酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）を測定することによって測定される。
【００１３】
本発明の特定の実施形態には、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノン酸化還元酵素−１（ＮＱＯ１）のレベル、ＮＡＤＰＨチトクロームＰ４５０還元酵素（Ｐ４５０Ｒ）のレベル、およびグルコース輸送体１（Ｇｌｕｔ−１）のレベルからなる群から選択された測定値に基づいた治療法を選択することを含む膀胱癌の治療方法であって、キノンをベースにした生体還元性薬物を単独で、または別の治療薬と組み合わせて投与することを含む方法が含まれる。この特定の実施形態の様々な態様では、測定値はＮＱＯ１またはＰ４５０Ｒであることができ、治療には、キノンをベースにした生体還元性薬物の単独投与が含まれる；測定値はＮＱＯ１またはＰ４５０Ｒであることができ、治療には別の治療法と組み合わせたキノンをベースにした生体還元性薬物の投与が含まれる；測定値はＮＱＯ１およびＰ４５０Ｒであることができ、治療にはキノンをベースにした生体還元性薬物の単独投与が含まれる；測定値はＮＱＯ１およびＰ４５０Ｒであることができ、治療には別の治療法と組み合わせたキノンをベースにした生体還元性薬物の投与が含まれる；あるいは、測定値はＮＱＯ１、Ｐ４５０ＲおよびＧｌｕｔ−１であることができ、治療にはキノンをベースにした生体還元性薬物の単独投与または別の治療薬と組み合わせた投与が含まれる。
【００１４】
本発明の一実施形態では、本発明には、前記腫瘍が表在性であった場合に認められるよりも前記ＮＱＯ１レベルは低く、前記Ｇｌｕｔ−１レベルは高いという理由に基づいて、腫瘍内のＮＱＯ１およびＧｌｕｔ−１のレベルを測定し、別の治療法と組み合わせたキノンをベースにした生体還元性薬物を含む併用療法を選択することを含む浸潤性膀胱癌の治療方法が含まれる。
【００１５】
本発明の別の実施形態では、本発明には、前記患者の膀胱癌内のＮＱＯ１およびＧｌｕｔ−１の発現レベルに基づいた膀胱癌の適切な治療のために患者を階層化する方法であって、前記患者の膀胱癌内のＮＱＯ１およびＧｌｕｔ−１の発現レベルを測定し、前記患者がＮＱＯ１レベルの高い表在性膀胱癌を有するならば、単一の薬剤療法として生体還元性薬物を投与するか、または前記患者が、ＮＱＯ１レベルが低く、Ｇｌｕｔ−１レベルが高い浸潤性膀胱癌を有するならば、照射療法または別の化学療法薬と組み合わせて生体還元性薬物を使用する併用療法を施すことを含む方法が含まれる。
【００１６】
本発明の特定の実施形態では、別の治療法は、照射療法および／または少なくとも１種の化学療法薬の投与である。
【００１７】
様々な実施形態では、特に有用なキノンをベースにした生体還元性薬物は、マイトマイシンＣ、インドールキノン誘導体ＥＯ９、アジリジニルベンゾキノン（ＲＨ１）およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００１８】
本発明には、薬学的製剤も含まれる。具体的に、本発明による一実施形態には、ＰＧ約３０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、ＰＧ約２０％ｖｏｌ／ｖｏｌおよびＰＧ約１０％ｖｏｌ／ｖｏｌからなる群から選択されたプロピレングリコール（ＰＧ）濃度の溶液中にＥＯ９を含む薬学的製剤が含まれる。ＥＯ９濃度は、約３００μＭから約４００μＭの範囲で存在することができる。具体的な実施形態では、調製物は、ＥＯ９濃度約３４７μＭの溶液を含む。
【００１９】
本発明による薬学的製剤はさらに、ＮａＨＣＯ３、ＥＤＴＡ、マンニトールおよび水を含むことができる。一実施形態では、この調製物は、ＮａＨＣＯ３を約１０ｍｇ／ｍＬから約１２０ｍｇ／ｍＬ含む。具体的な実施形態では、この調製物は、ＮａＨＣＯ３を約１００ｍｇ／ｍＬまたは約１００．２５ｍｇ／ｍＬ含む。別の具体的な実施形態では、この調製物は、ＮａＨＣＯ３を約５０ｍｇ／ｍＬまたはＮａＨＣＯ３約５０．１２５ｍｇ／ｍＬ含む。別の実施形態では、この調製物は、マンニトールを約０．５ｍｇ／ｍＬから約３．０ｍｇ／ｍＬ含む。具体的な実施形態では、この調製物は、マンニトールを約０．６２５ｍｇ／ｍＬ含む。別の具体的な実施形態では、この調製物は、マンニトールを１．２５ｍｇ／ｍＬ含む。別の具体的な実施形態では、この調製物は、ＥＤＴＡ、ＰＧおよび水を含む溶液中にＮａＨＣＯ３を約１００ｍｇ／ｍＬ、マンニトールを約０．６２５ｍｇ／ｍＬおよびＥＯ９を約０．１ｍｇ／ｍＬ含む。
【００２０】
本発明による一実施形態は、ＰＧ、ＥＤＴＡおよび水を含む溶液中にＥＯ９、ＮａＨＣＯ３およびマンニトールを含む薬学的製剤であって、ＰＧが約６％から約１４％ｖｏｌ／ｖｏｌ、約１６％から約２４％ｖｏｌ／ｖｏｌ、および約２６％から約３４％ｖｏｌ／ｖｏｌからなる群から選択されたパーセント範囲で溶液中に存在する薬学的製剤を含む。別の実施形態では、ＰＧは、約１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、約２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、および約３０％ｖｏｌ／ｖｏｌからなる群から選択されたパーセントで溶液中に存在する。別の実施形態では、調製物は、ＥＯ９濃度約３４７μＭおよびＰＧ濃度約１０％ｖｏｌ／ｖｏｌの溶液を含む。さらに別の実施形態では、調製物は、ＥＯ９濃度約３４７μＭおよびＰＧ濃度約２０％ｖｏｌ／ｖｏｌの溶液を含む。他の実施形態では、調製物は、ＥＯ９濃度約３４７μＭおよびＰＧ濃度約３０％ｖｏｌ／ｖｏｌの溶液を含む。これらの記載された本発明の実施形態は、ＮａＨＣＯ３を約１０ｍｇ／ｍＬから約１２０ｍｇ／ｍＬ含むことができ、特定の一実施形態では、ＮａＨＣＯ３を約１００、約１００．２５または約５０．１２５ｍｇ／ｍＬ含むだろう。これらの記載された本発明の実施形態はまた、マンニトールを約０．５ｍｇ／ｍＬから約３．０ｍｇ／ｍＬ含むことができ、特定の一実施形態では、マンニトールを約０．６２５または約１．２５ｍｇ／ｍＬ含むだろう。
【００２１】
本発明の一実施形態は、ＥＯ９濃度約３４７μＭ、ＰＧ濃度約１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、ＮａＨＣＯ３約１００．２５ｍｇ／ＭＬおよびマンニトール約０．６２５ｍｇ／ｍＬである溶液を含む薬学的製剤を含むことができる。別の実施形態は、ＥＯ９濃度約３４７μＭ、ＰＧ濃度約３０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、ＮａＨＣＯ３約１００．２５ｍｇ／ｍＬおよびマンニトール約０．６２５ｍｇ／ｍＬである溶液を含む薬学的製剤を含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（発明の詳細な発明）
キノンをベースにした生体還元性薬物は、酵素活性化後に細胞毒性種を生じるプロドラッグである。酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノン酸化還元酵素−１（ＮＱＯ１、ＤＴジアホラーゼ（ＤＴＤ）とも呼ばれる）、２電子還元酵素は、好気条件下で、キノンをベースにした生体還元性薬物の活性化において顕著な役割を果たす。キノンをベースにした生体還元性薬物はまた、ＮＱＯ１活性が低い細胞を含む低酸素条件下で細胞毒性である。チトクロームＰ４５０還元酵素などの１電子還元酵素は、低酸素条件下で、キノンをベースにした生体還元性薬物の活性化において顕著な役割を果たすことができる。前記に基づいて、これらの還元酵素のレベルおよび低酸素状態は、様々なキノンをベースにした生体還元性薬物を使用することの妥当性を含む様々な癌療法の妥当性を示すことができる。したがって、本発明では、様々な悪性度および病期のＴＣＣにおける前記の還元酵素レベルおよび低酸素状態を評価した。
【００２３】
膀胱癌の治療の改善はまた、様々な浸透特性を備えたキノンをベースにした生体還元性薬物を含む薬学的製剤の提供に基づいてもたらすことができる。例えば、浸透特性の低い薬学的製剤では、治療が最も必要とされる膀胱の表面のより近くに薬剤が保持されるので、表在性膀胱癌を治療するときに使用すると有益であろう。反対に、浸透特性の高い薬学的製剤では、症例において治療が最も必要とされる膀胱のより深い層に薬剤が浸透するので、筋肉浸潤性の高い膀胱癌を治療するときに有益であろう。これらのことを考え合わせると、本発明の様々な態様は、個体の疾患プロファイルの固有特性に対して癌治療を調整するのを可能にし、膀胱癌の治療において重要な進歩をもたらす。
【００２４】
アパジクオン（ｐｒｏｐ．ＩＮＮ、ＵＳＡＮ）は、ＥＯ９またはＮＳＣ−３８２４５９（３−ヒドロキシメチル−５−アジリジニル−１−メチル−２−（１Ｈ−インドール−４，７−ジオン）−プロペノールとして知られており、構造式、
【００２５】
【化１】
2009526085.tif 000003
を有し、完全合成された生体還元性アルキル化インドロキノンである。ＥＯ９活性化の基本的機構は、その他のインドロキノンと類似であると考えられており、１個または２個の電子を輸送する細胞酵素による還元、セミキノンおよびヒドロキノンの形成のそれぞれが関与する。好気性条件下でのセミキノンの酸化は、活性酸素種（ＲＯＳ）を形成することによってＤＮＡ鎖切断を引き起こし、細胞死の原因となり得る酸化還元サイクルを生じる。セミキノン／ヒドロキノンは、特に低酸素条件下で、ＤＮＡおよびその他の高分子をアルキル化し、架橋し、細胞死を引き起こすことができる。ＥＯ９は、本発明で使用するのに適したキノンをベースにした１生体還元性薬物の非限定的例である。
【実施例】
【００２６】
（実施例１）
Ｉ．材料および方法
Ａ．ヒト組織
ヒト膀胱移行上皮癌のホルマリン固定パラフィン包埋標本（ｎ＝５２）を、最初に医学研究審議会規則に則って地方研究および倫理委員会（ＬＲＥＣ）の承諾を得た後、本研究に使用した。秘密を保持するために患者の詳細は全て伏せ、実験は全てＬＲＥＣが策定した指針に従って実施した。本研究に使用した腫瘍は、ヒト膀胱ＴＣＣの表在性病期（１９ｐＴａ、１９ｐＴ１）および筋肉浸潤性病期（１４≧ｐＴ２）両方の全悪性度（悪性度１が１１種、悪性度２が２６種、悪性度３が１５種）を表した。腫瘍塊は全て組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）の作製およびその後の免疫組織化学分析のために使用した。
【００２７】
Ｂ．組織マイクロアレイ作製
組織マイクロアレイ作製（ＴＭＡ）は、ヒト膀胱ＴＣＣの様々な悪性度（Ｇ１〜Ｇ３）および様々な病期（ｐＴａ、ｐＴ１、≧ｐＴ２）を表すために、パラフィン包埋塊から作製した。組織マイクロアレイ作製（ＴＭＡ）は、本明細書に参考として援用したＢｕｂｅｎｄｏｒｆ他（１１）の変法を使用したＢｅｅｃｈｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓマイクロアレイ装置（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して実施した。簡単に説明すると、各パラフィン包埋ドナー塊の切片をヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、顕微鏡で調べ、関心のある組織が含まれた領域を蝋塊上に示した。円柱状のコア（６００μＭ）をこれらの代表的領域からパンチ生検し、レシピエント塊に移した。各親塊に関する典型的なデータを入手するために、組織のサンプリングには各腫瘍塊から４個のコアを使用した。患者２６人を表す全部で１０８個のコア試料をＴＭＡ塊毎に含め、２個のＴＭＡ塊を作製した。厚さ５μＭの切片をレシピエントＴＭＡ塊から切断し、テープ輸送方法を使用してスライドガラスに乗せた（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｄｉｃｓ、ＵＳＡ）。組織化学および試料強度の検証のためのＨ＆Ｅ染色を、最初に実施し、その後は各マイクロアレイ塊を１０回切断する毎に実施した。その後、ＴＭＡスライドは、免疫組織化学分析を行った。
【００２８】
Ｃ．抗体
使用した抗体には、ＮＱＯ１に対するマウスモノクローナル抗体（ＵＳＡ、デンバー、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＣｅｎｔｅｒのＳｉｅｇｅｌ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓ博士から恵与された）、Ｐ４５０Ｒに特異的なヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）、Ｋｉ６７に対するマウスモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＫ）およびグルコース輸送体−１に特異的なウサギポリクローナル抗体（ＧＬＵＴ−１、Ｄａｋｏ、ＵＫ）が含まれる。
【００２９】
Ｄ．免疫組織化学
ＮＱＯ１、Ｐ４５０Ｒ、ＧＬＵＴ−１およびＫｉ６７の免疫学的局在は、既に記載され（９、１０、１２、１３）、当業者によって理解されているように、免疫組織化学分析によって評価した。簡単に説明すると、抗原回収後、非特異的イムノグロブリン結合をブロックし、ＴＭＡを適切な第１抗体と共にインキュベートし、ＴＢＳＴＭ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、５％脱脂粉乳）で１：１に希釈した抗ＮＱＯ１抗体で約６０分間インキュベートし、ＰＢＳで１：１００に希釈したＰ４５０Ｒで約９０分間インキュベートし、ＰＢＳで１：２５に希釈した抗Ｇｌｕｔ−１抗体で約９０分間インキュベートするか、またはＰＢＳで１：１００に希釈した抗Ｋｉ６７抗体で４℃で一晩インキュベートした。対照は、第１抗体の代わりに通常のＩｇＧを使用して実施した。免疫学的局在は、適切なビオチン化第２抗体（１：２００に希釈、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ．、ＵＳＡ）を使用し、その後Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ．、ＵＳＡ）を使用してシグナル増幅し、３，３′−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ．、ＵＳＡ）で視覚化して実施した。その後、切片はハリスヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、洗浄して、ＤＰＸ封入剤（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）に封入した。
【００３０】
Ｅ．免疫組織化学染色の半定量的分析
陽性の免疫染色は、３人の独立した観察者によって半定量的に記録された。ＮＱＯ１およびＰ４５０Ｒは、腫瘍内の細胞質に局在していた。染色の強度および分布に基づいて、各腫瘍コアの上皮画分のスコアは、０（染色無し）から４（染色強度最大）に割り当てた。平均スコア強度は、独立した観察者の結果からＴＭＡの各コアおよび各腫瘍について計算した。臨床病理学パラメータとのいかなる関係および相関のためにも結果を比較した。
【００３１】
各ＴＭＡコアにおけるＧｌｕｔ−１陽性のレベルを分析して、膜染色を示す腫瘍細胞のおよその割合を表す０から４のスコアに割り当てた（０＝染色無し、１＝０〜５％陽性、２＝５〜１５％陽性、３＝１５〜３０％陽性、４＝＞３０％陽性）。平均スコア強度は、独立した観察者の結果から各コアおよびＴＭＡの各腫瘍について計算した。臨床病理学パラメータとのいかなる関係および相関のためにも結果を比較した。
【００３２】
腫瘍細胞におけるＫｉ６７陽性核の割合は、本明細書に参考として援用したSantos他（１３、１４）によって報告されたように、核コアおよび腫瘍について４０倍に拡大して計算した。コア当たり全部で細胞２００個および腫瘍当たり細胞８００個が計数され、陽性の割合が計算された。スコアリングは、２人の観察者が独立して実施した。臨床病理学パラメータとのいかなる関係および相関のためにも結果を比較した。
【００３３】
Ｆ．統計学的分析
ＮＱＯ１およびＰ４５０Ｒの発現は、以下の臨床病理学的パラメータ、腫瘍病期、腫瘍悪性度、腫瘍低酸素性（Ｇｌｕｔ−１発現）および増殖性と比較した。統計学的分析は、ＳＰＳＳソフトウェアパッケージ、バージョン１１．０（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を使用して行った。免疫組織化学研究において、発現は通常分散しないので、各部類の平均発現値を四分位数範囲の中央値として記録した。独立変数の間の差は、マンホイットニーのＵ検定によって決定した。両側分析において、０．０５未満のＰの値は、有意と見なされる。
【００３４】
ＩＩ．結果
Ａ．ＮＱＯ１タンパク質レベル、腫瘍病期および悪性度の間の関係
ＮＱＯ１は、全病理学的悪性度および病期の膀胱癌の上皮の細胞質に局在しており、ＮＱＯ１の発現は腫瘍間で異なった（図１、表１）。多くの場合、ＮＱＯ１の不均一な発現パターンが同一腫瘍内で観察され、同一試料内にＮＱＯ１発現の高い領域および低い領域が存在した（データは示さず）。ＮＱＯ１の発現レベルは様々な病期の間で変化するが、全病理学的病期（ｐＴａ、ｐＴ１、≧ｐＴ２）の腫瘍で発現した（表１）。表在性腫瘍（ｐＴａ＋ｐＴ１）と筋肉浸潤性腫瘍（≧ｐＴ２）との間にはＮＱＯ１発現の有意な差が認められ、筋肉浸潤性腫瘍では発現は有意に低かった（Ｐ＝０．０２）。腫瘍の浸潤能力に対するＮＱＯ１発現の反比例関係はさらに、非浸潤性（ｐＴａ）と浸潤性（ｐＴ１＋≧ｐＴ２）腫瘍との間に認められる発現の有意差（Ｐ＝０．０３）によって強調された。全病理学的悪性度のＴＣＣでＮＱＯ１は発現した（表１）。ＮＱＯ１の発現は、悪性度１または悪性度３のいずれと比較しても悪性度２の腫瘍で有意に高かった（表１）。高度に分化した（悪性度１）腫瘍と分化の不十分な（悪性度３）腫瘍との間には有意差は認められなかった（表１）。
【００３５】
Ｂ．Ｐ４５０Ｒタンパク質発現と腫瘍病期および悪性度との間の関係
試験した腫瘍全てが、検出可能なレベルのＰ４５０Ｒを細胞質に局在して発現した。ＮＱＯ１とは対照的に、Ｐ４５０Ｒ発現は一般的に腫瘍内で均一であった。典型的な免疫染色を図１に示す。Ｐ４５０Ｒは、ＴＣＣの全病期で発現した（表１）。Ｐ４５０Ｒのレベルは、表在性（ｐＴａ＋ｐＴ１）腫瘍と比較して筋肉浸潤性腫瘍（≧ｐＴ２）で有意に高かった（Ｐ＜０．０１）。ＮＱＯ１とは対照的に、Ｐ４５０Ｒの発現は、悪化する腫瘍病期と正の関係を示すが、浸潤性（ｐＴ１＋≧ｐＴ２）および非浸潤性（ｐＴａ）腫瘍の間に有意差が認められないことから明らかなように、腫瘍の浸潤潜在性とは関係がない（表１）。ＴＣＣの病理学的悪性度全てにおいてＰ４５０Ｒが発現していた（表１）。正の関係がＰ４５０Ｒレベルと悪化する腫瘍悪性度の間に認められた（表１）。
【００３６】
Ｃ．Ｇｌｕｔ−１と腫瘍病期および悪性度との間の関係
Ｇｌｕｔ−１タンパク質の発現は、個々の腫瘍標本内および個々の患者試料間の両方で不均一であった。典型的な免疫染色と腫瘍病期および悪性度との関係は、図１および表１にそれぞれ表してある。Ｇｌｕｔ−１のレベルは、≧ｐＴ２腫瘍（ｐＴａ腫瘍に対して、Ｐ＝０．０５）および悪性度３腫瘍（悪性度１［Ｐ＝０．０３］および悪性度２［Ｐ＜０．０１］腫瘍の両方に対して）で有意に高かったが、Ｇｌｕｔ−１タンパク質は、試験した病期および悪性度の全てにおいて発現していた。さらに、非浸潤性（ｐＴａ）および浸潤性（ｐＴ１＋≧ｐＴ２）腫瘍の間には統計学有意差（Ｐ＝０．０２）が存在しており、浸潤性疾患は高いＧｌｕｔ−１タンパク質発現、したがって高い低酸素レベルに関係していることが示唆される。
【００３７】
Ｄ．Ｋｉ６７、腫瘍病期、腫瘍悪性度および酵素の間の関係
Ｋｉ６７抗原の発現レベルを腫瘍増殖指数の指標として使用した（表１）。予測通り、悪化する腫瘍悪性度（低下する分化度）と増殖指数の間には有意な関係が認められた（Ｐ＜０．０１）。腫瘍増殖性と腫瘍浸潤能力（ｐＴａ対ｐＴ１＋≧ｐＴ２）の間には関係が認められなかった。対照的に、おそらく筋肉浸潤性と高い腫瘍悪性度との間の関係の結果として、腫瘍増殖性は、表在性腫瘍（ｐＴａ＋ｐＴ１［Ｐ＜０．０１］）に対して筋肉浸潤性腫瘍（≧ｐＴ２）において有意に高かった。興味深いことに、有意な関係が、腫瘍増殖指数とＧｌｕｔ−１発現（Ｐ＝０．０１）およびＰ４５０Ｒ発現（Ｐ＜０．０１）の両方の間に認められたが、ＮＱＯ１発現には認められなかった。
【００３８】
この研究の結果は、膀胱ＴＣＣの病期および悪性度に伴うＧｌｕｔ−１タンパク質レベルの変化によって測定されたように、重要な酵素のタンパク質発現がキノンをベースにした化合物の生体還元活性化および低酸素の存在に関係していることを示している。最も注目すべき所見は、ＮＱＯ１タンパク質発現が腫瘍病期の悪化につれて有意に減少するという事実である（表１）。腫瘍悪性度に関しては、Ｇ３腫瘍ではＧ２（Ｇ１ではない）腫瘍よりもＮＱＯ１レベルが低いことも証明された。これらの発見は、ＮＱＯ１ｍＲＮＡ発現と悪化する腫瘍病期との間の反比例関係（１５）を報告した、既に公表された研究と一致した。Ｇｌｕｔ−１と類似して、腫瘍悪性度（Ｇ１およびＧ２をそれぞれＧ３腫瘍と比較したとき、Ｐ＝０．０３および＜０．０１）および腫瘍病期（ｐＴａ腫瘍を≧ｐＴ２腫瘍と比較したとき、Ｐ＝０．０５）と共にタンパク質発現が増加することは、以前の報告（１６）と一致する。筋肉浸潤性ＴＣＣと比較して表在性においてＰ４５０ＲｍＲＮＡレベルが高いことを示す既に公表された報告（１５）とは対照的に、この研究では、Ｐ４５０Ｒタンパク質レベルは、筋肉浸潤性（ｐＴａ＋ｐＴ１と比較して≧ｐＴ２）疾患において有意に高かった（Ｐ＜０．０１）。さらに、Ｐ４５０Ｒタンパク質発現は、腫瘍悪性度の悪化（分化の低下）と正の相関を示す（表１）。興味深いことに、おそらく、Ｐ４５０Ｒ、Ｋｉ６７と悪化する腫瘍悪性度（分化の低下）との間の強い関係の結果として、Ｐ４５０Ｒ発現はまた、増殖指数と強い正の相関を示した（Ｐ＜０．０１）。それにもかかわらず、高い増殖指数が膀胱癌の予後不良と関連があることが示されたので（１７、１８）、Ｐ４５０Ｒに関係した生体還元療法を評価するとき、このことは留意しなければならない。要約すると、免疫組織化学によるタンパク質発現の分析によって、Ｇｌｕｔ−１発現によって示されたように、低酸素は悪化する腫瘍病期、悪性度および腫瘍浸潤性に関係することが示唆される。腫瘍酵素学に関しては、この研究によって、ＮＱＯ１レベルは腫瘍病期の悪化（および浸潤能力）に応じて有意に減少し、一方、Ｐ４５０Ｒレベルは腫瘍悪性度および浸潤潜在性と共に増加することが示された。
【００３９】
これらの結果は、膀胱ＴＣＣの治療におけるキノンをベースにした生体還元性薬物を使用した有望な治療戦略に重要な意味を持つ。前臨床モデルにおいて、ＭＭＣ、ＥＯ９およびＲＨ１に対する細胞応答はＮＱＯ１レベルだけでなく、腫瘍低酸素のレベルにも左右されることを示す確実な証拠がある。ＭＭＣに関して、好気性条件下での細胞応答の決定におけるＮＱＯ１の役割には議論の余地が残されているが、低酸素条件下では活性の著しい増強が、ＮＱＯ１活性が低い、または活性がない細胞においてのみ認められる（１９）。ＥＯ９およびＲＨ１の場合、同様の結果が低酸素条件下で得られ、活性の顕著な増強がＮＱＯ１の低い細胞でのみ認められた（２０、２１）。しかし、好気性条件下では、ＮＱＯ１活性と化学感受性の間には良好な相関が存在し、酸素の存在下では、ＮＱＯ１はＥＯ９およびＲＨ１の活性化に主要な役割を果たすことを示唆している（２２、２３）。これらの所見を説明する機構的根拠は明らかではないが（２４）、低酸素条件下では、Ｐ４５０Ｒなどの１電子還元酵素が生体還元活性化プロセスにより大きな影響力を及ぼす役割を担うと考えられる（２５）。これらの結果に基づくと、ＥＯ９およびＲＨ１などの化合物は、ＮＱＯ１が豊富な腫瘍の好気性画分（ＭＭＣも同様であるが、程度は低い）、またはＮＱＯ１が欠如した、Ｐ４５０Ｒなどの１電子還元酵素が存在すると考えられる腫瘍の低酸素画分を標的とするのであろう。したがって、ＮＱＯ１の豊富な腫瘍の場合、好気的画分を標的とする単一の薬剤として、ＥＯ９およびＲＨ１などの化合物を使用することが適しているであろう。顕著な低酸素画分を有し、ＮＱＯ１が欠如した腫瘍では、これらの薬剤は、放射線療法または好気性画分を標的とするその他の化学療法薬と組み合わせて使用すべきである。この研究の結果は、この後者の戦略は、膀胱のより進行したＴＣＣ（すなわち、≧ｐＴ２）またはより侵襲的な疾患（すなわち、悪性度の３腫瘍）の場合、これらは一般的にＮＱＯ１タンパク質の発現が低く（おそらく、Ｐ４５０Ｒの発現が多く）、低酸素領域を多く含有するので、有効であり得ることを示唆している。この特定の場合において、ＮＱＯ１および低酸素マーカーの分析はこの研究の設計には組み込まれていなかったが、興味深いことに、放射線化学療法（根治的放射線療法と併用したマイトマイシンＣおよび５フルオロウラシル）を使用して筋肉浸潤性膀胱癌において強力な結果が得られた（２６）。より広範な状況では、この研究およびその他の研究において、表在性および筋肉浸潤性膀胱ＴＣＣの両方が低酸素領域を多く有することが示されたことによって、これらの腫瘍がその他の生体還元性薬物または低酸素媒介治療を評価するための魅力的な候補であることが示唆される。
【００４０】
要するに、この研究の結果は、キノンをベースにした化合物の生体還元活性化および低酸素の存在に関係している重要な酵素のタンパク質発現が、膀胱ＴＣＣの腫瘍病期および悪性度に応じて変化することを示した。これらの結果は、これらの腫瘍（すなわち、≧ｐＴ２およびＧ３腫瘍）が、低酸素画分を標的とするキノン（例えば、ＭＭＣ、ＥＯ９およびＲＨ１）を照射または細胞の好気性画分を標的とするその他の化学療法と組み合わせて使用する放射線化学療法計画の良好な候補であることを示している。これらの原理に基づいて、図１を振り返ってみると、症例Ａ（ｐＴ２Ｇ３）は低いＮＱＯ１、高いＰ４５０Ｒおよび高いＧｌｕｔ−１レベルを示し、したがってキノンを使用した放射線化学療法の良好な候補であろう。症例Ｂ（ｐＴａＧ１）は、ＮＱＯ１が高く、Ｐ４５０Ｒが低く、Ｇｌｕｔ−１は中程度で、それ自体キノンをベースにした化学療法によく応答するはずである。ＮＱＯ１が中程度で、Ｐ４５０Ｒも中程度で、Ｇｌｕｔ−１も中程度である症例Ｃ（ｐＴ１Ｇ２）はまた、キノンをベースにした化学療法によく応答することが予測されるであろう。特に、患者間に存在する（特にＮＱＯ１の）著しい不均一性を考慮すると、これらのマーカーについて個々の患者の腫瘍をプロファイルすることは依然として重要である。
【００４１】
本明細書で使用したように、患者の適切な治療を決定するために酵素レベルを使用するとき、その酵素の「高」レベル対「低」レベルは、関連する腫瘍の関心のある酵素のレベルを同一患者のその他の腫瘍、別の患者の腫瘍および／または標準的腫瘍細胞系または当業者に公知のその他の利用可能な参考点と比較することによって確定することができる。したがって、「高」および「低」レベルは、治療医または特定の患者の腫瘍酵素レベルの測定および／または定量に関与するその他の研究室、実験者もしくは医療関係者によって決定することができる。
【００４２】
（実施例２）
Ｉ．材料および方法
Ａ．装置および一般的な測定原理
図２に示したように、説明した実験で使用した装置には、２４ウェル培養プレートの１ウェルに挿入されたトランスウェル挿入物（Ｃｏｓｔａｒ）が含まれた。この挿入物の底面の膜はコラーゲンでコーティングされており、したがって、上室と下室の間ならびに細胞が結合し増殖する表面との間の両方に障壁が形成された。この研究で使用した細胞系は、細胞間に緊密な結合を形成し、それによって薬剤が通過しなければならない連続的な「障壁」を形成する能力のために、選択されたＤＬＤ−１ヒト結腸腺癌細胞であった。薬物浸透を評価するために、薬物を上室に添加し、下室中の薬物濃度を一連の時間間隔で測定した。
【００４３】
Ｂ．細胞培養条件
ＤＬＤ−１細胞は、通常、１０％牛胎児血清、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（５０ＩＵ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ）を補給し、ＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ）で緩衝化したＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。ＤＬＤ−１細胞（培地２００μｌで２．５×１０５個）を上室に添加し、静置して、３７℃でＣＯ２の豊富な（５％）雰囲気中で約３時間膜に結合させた。一旦細胞が結合したら、トランスウェルを２４ウェルプレートの１ウェルに挿入し、培地６００μｌを下室に添加した。次に、この装置を３７℃で４日間インキュベートし、上室と下室両方の培地は毎日交換した。以前の研究に基づくと、４日間培養した後の多細胞層の厚さは約５０μｍである。各アッセイについて、組織化学的実験ならびに厚さおよび強度の正確な測定のために３個のトランスウェルを取り出した（詳細は以下を参照）。
【００４４】
Ｃ．薬剤溶液の調製
以下の溶液は、以下に説明し、図３にまとめて示したように調製した。
【００４５】
１．溶液１：０．１％ＤＭＳＯに溶かしたＥＯ９（３４７μＭ）
固形ＥＯ９を１００％ＤＭＳＯに溶解し、３４７ｍＭの保存溶液を作製した。保存溶液１０μｌを完全ＲＰＭＩ培地（フェノールレッドを含まない）１０ｍｌに添加した。ＥＯ９が沈殿する可能性を防ぐために、この培地へのＥＯ９保存溶液の添加は継続的に振盪しながら行った。ＥＯ９の最終濃度は３４７μＭで、４ｍｇ／４０ｍｌに等しかった。
【００４６】
２．溶液２：１０％ＰＧに溶かしたＥＯ９（３４７μＭ）
炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）２００ミリグラムをＥＤＴＡ溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ、０．５Ｍ保存溶液、Ｓｉｇｍａから新たに調製した）４ｍｌに溶解した。次に、この溶液をＰＧ溶液（ＰＧ２ｍｌ＋Ｈ２Ｏ４ｍｌ）６ｍｌと混合し、２０％ＰＧを含有する最終量１０ｍｌを作製した。この溶液をＥＯ９（２ｍｇ）、炭酸水素ナトリウム（５ｍｇ）およびマンニトール（１２．５ｍｇ）を含有する汎用試験管２０ｍｌに添加した。ＥＯ９が完全に溶解するまで（約５〜６時間）、この溶液を継続的に振盪しながら３７℃でインキュベートした。次に、この溶液を水で１：１に希釈して、１０％ＰＧ溶液を得た。
【００４７】
３．溶液３：２０％ＰＧに溶かしたＥＯ９（３４７μＭ）
炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）２００ミリグラムをＥＤＴＡ溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ、０．５Ｍ保存溶液、Ｓｉｇｍａから新たに調製した）４ｍｌに溶解した。次に、この溶液をＰＧ溶液（ＰＧ４ｍｌ＋Ｈ２Ｏ２ｍｌ）６ｍｌと混合し、４０％ＰＧを含有する最終量１０ｍｌを作製した。この溶液をＥＯ９（２ｍｇ）、炭酸水素ナトリウム（５ｍｇ）およびマンニトール（１２．５ｍｇ）を含有する汎用試験管２０ｍｌに添加した。ＥＯ９が完全に溶解するまで（約３〜４時間）、この溶液を継続的に振盪しながら３７℃でインキュベートした。次に、この溶液を水で１：１に希釈して、２０％ＰＧ溶液を得た。
【００４８】
４．溶液４：３０％ＰＧに溶かしたＥＯ９（３４７μＭ）
炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）２００ミリグラムをＥＤＴＡ溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ、０．５Ｍ保存溶液、Ｓｉｇｍａから新たに調製した）４ｍｌに溶解した。次に、この溶液をＰＧ（ＰＧ６ｍｌ＋Ｈ２Ｏ０ｍｌ）６ｍｌと混合し、６０％ＰＧを含有する最終量１０ｍｌを作製した。この溶液をＥＯ９（２ｍｇ）、炭酸水素ナトリウム（５ｍｇ）およびマンニトール（１２．５ｍｇ）を含有する汎用試験管２０ｍｌに添加した。ＥＯ９が完全に溶解するまで（約２時間）、この溶液を継続的に振盪しながら３７℃でインキュベートした。次に、この溶液を水で１：１に希釈して、３０％ＰＧ溶液を得た。
【００４９】
Ｄ．薬物投与
全操作を通じて、使用した培地は、フェノールレッドを含まない培地を使用した事実以外は前述した通りであった（フェノールレッドは、クロマトグラムでＥＯ９と非常に近接して溶出する）。ＥＯ９をｔ＝０時に容量１００μｌで上室に添加し、下室には培地６００μｌを含めた（継続的に撹拌）。３７℃で１０分間インキュベートした後、トランスウェルを取り出し、新鮮な培地６００μｌを含有する２４ウェルプレートの新しいウェルに入れた。上室の薬物溶液を除去し、新鮮な薬物溶液１００μｌに代えた（すなわち、上室の濃度は一定濃度に維持した）。この全操作を１０分間隔で１時間の全期間中繰り返した。
【００５０】
Ｅ．抽出操作
ＥＯ９は、ＩｓｏｌｕｔｅＣ１８ＳＰＥカートリッジを使用してすぐに抽出された。カートリッジにメタノール１ｍｌを最初に注入し、次に脱イオン水１ｍｌで洗浄し、その後試料（５００μｌ）を添加した。脱イオン水１ｍｌでさらに洗浄した後、ＥＯ９をメタノール３００μｌで溶出した。試料を真空下で乾燥し（室温で、ロータリーエバポレーターを用いる）、分析が必要になるまで−２０℃で保存するか、すぐに分析するために移動相（以下参照）で復元した。
【００５１】
Ｆ．ＨＰＬＣ分析
ＥＯ９のクロマトグラフィー分析は、本明細書に参考として援用したPhillipsら（BritishJournal of Cancer、６５巻（３）、３５９〜６４頁、１９９２年）に記載された通りに実施した。簡単に説明すると、Ｈｉｃｈｒｏｍ  ＲＰＢカラム（２５ｃｍ×４．６ｍｍ  ｉｄ、Ｈｉｃｈｒｏｍ  Ｌｔｄ、ＵＫ）を分離のために使用した。Ｍａｓｓｌｙｎｘ３．４ソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｌｔｄ）を備えたＷａｔｅｒｓ９９６フォトダイオードアレイ検出器（λｉ＝２８０ｎｍ）を関心のあるピークの分光分析のために使用した。移動相は、１Ｍリン酸緩衝液（１％）、メタノール（４２％）およびＨＰＬＣ等級の水（５７％）から構成された。流速は、自動試料採取装置も組み込んだＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９０（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）クォータナリポンプクロマトグラフィーシステムを使用して、１．２ｍｌ分−１に設定した。検出限界は１０ｎｇ／ｍｌ（３４．７ｎＭ）であった。
【００５２】
Ｇ．組織学
各実験について、対照１種および実験終了時に２種の３種のトランスウェル挿入物を集めた。各トランスウェルを１０％ホルマリンで１時間固定した後、７０％エタノールに移し、一晩保存した。清潔な外科用メスを使用して、膜をプラスティック挿入物から注意深く脱離し、当業者に公知の標準的方法を使用してパラフィンワックスに包埋するために処理した。Ｌｅｉｔｚ回転式ミクロトーンを使用して標本を剪断し（５μｍ）、タンパク質をコーティングしたスライドガラスに乗せ、当業者に公知の標準的方法をまた使用して、ヘマトキシリンおよびエオジンを使用して染色した。多細胞層の厚さは、ステージマイクロメータを使用して目盛りを付けた目盛り付き接眼レンズを使用して測定した。各箇所について５個の測定値を得て、試料当たり３箇所を測定した。
【００５３】
ＩＩ．結果
Ａ．典型的クロマトグラム
図４は、ＷＶ１４内部標準を加えた盲検試料のクロマトグラムを示した図である（滞留時間＝１１．０５９分）。６．８７０分のピークは、混入ピークである。図５は、ＲＰＭＩ１６４０培地に溶かしたＥＯ９標準物（１μｇ／ｍｌ（図５Ａ）および２０ｎｇ／ｍｌ（図５Ｂ））を示す。図５Ａに示したように、ＥＯ９ピークは８．０２９分、ＷＶ１４ピークは１３．０２３分に溶出する（７．２９２分のピークは前述した混入ピークである）。滞留時間は、研究室の温度の変動によって変化し得るが、相対的滞留時間は一定に保持されることに注意されたい。図５Ｂは、検出限界を示す。図６は、０．１％ＤＭＳＯ（図６Ａ）、３０％ＰＧ（図６Ｂ）、２０％ＰＧ（図６Ｃ）および１０％ＰＧ（図６Ｄ）に溶かしたＥＯ９標準物のクロマトグラムを示した図である。
【００５４】
Ｂ．検量線
検量線は、各ＥＯ９調製物について作成し、その結果を図７に表す。検量線は再現性があり、各検量線の勾配には図７に例示したようにわずかな差が認められた。差の理由は明らかではないが、異なる調製物間の抽出効率のわずかな差を反映している可能性がある。ＥＯ９の抽出効率は、０．１％ＤＭＳＯ溶液で９２．３％、１０％ＰＧ溶液で８１．７％、２０％ＰＧ溶液で７９．９％および３０％ＰＧ溶液で８１．１％であった。変動のため、検量線は実施した実験毎に作成した。明らかな分解産物はクロマトグラムのいずれにも認められなかった。
【００５５】
Ｃ．薬剤浸透
図８に認めることができるように、ＰＧの濃度が増加するにつれて、ＥＯ９の多細胞層浸透速度は減少する。０．１％ＤＭＳＯに溶かしたＥＯ９に関して、速度式は、予測通りに、上室の濃度がおおよそ一定値に維持されるとき直線である。試験した２種類の最高のＰＧ濃度では、速度式は完全な直線ではなく、時間が経つにつれて速度が徐々に増加することには意味がない。この影響はおそらく、ＰＧによって引き起こされた多細胞層の厚さの変化を反映しているのであろう（図９参照）。明らかな代謝物および分解産物は評価時点のいずれにおいても認められなかった。
【００５６】
図９は、ＤＬＤ−１多細胞層のＥＯ９の浸透を調べるための組織学的分析の結果を示している。薬物で処理していない部分の厚さは、５６．０１±３．６３μｍであった。０．１％ＤＭＳＯに溶かしたＥＯ９による処理の１時間後、多細胞層の厚さは、薬物で処理していない標本と有意差がなかった（５８．８０±２．５０μｍ）。しかし、３０％ＰＧに溶かしたＥＯ９で処理した後、多細胞層の厚さは２９．０１±１．７８μｍに有意に減少した。層内には見たところ著しい形態学的変化もあり、その最も明らかなのは層自体内の「分断」または「溝」の出現であった。ＰＧに溶かしたＥＯ９を使用した実験を通して得られた所見は、上室は予測よりも多くの流体を含有することであった。例えば、３０％、２０％および１０％のＰＧに溶かしたＥＯ９と共に１０分間インキュベートした後、上室から回収された容量はそれぞれ、１０６±３、１０７±３および１０５±２μｌであった（０．１％ＤＭＳＯに溶かしたＥＯ９に１時間曝露した後、回収された容量は９８±２μｌであった）。これらの容量は近似しているだけでなく（ギルソンピペットを使用して回収できるものに基づいている）、ＰＧ薬学的製剤（特に３０％ＰＧ）に溶解したＥＯ９を使用すると上室内の培地の容量が変化することを示していることを強調すべきである。組織学的写真は、対照およびＥＯ９（０．１％ＤＭＳＯ）処理標本では細胞が基底膜に緊密に接触しているが、３０％ＰＧに溶かしたＥＯ９で処理した多細胞層では多細胞層と膜自体の間には小さいが明確な隔たりがあることを示していることも注目に値する。
【００５７】
（参考文献）
【００５８】
【化２】
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【００５９】
【化３】
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【００６０】
【化４】
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表１．膀胱のヒトＴＣＣにおけるＮＱＯ１、Ｐ４５０Ｒ、ＧＬＵＴ−１およびＫｉ６７のタンパク質発現
ＮＱＯ１、Ｐ４５０ＲおよびＧＬＵＴ−１のデータは、２人の観察者のスコア中央値（±四分位数範囲）で表す。増殖指数のデータは、２人の観察者の平均スコア±Ｓ．Ｅで表す。標本は、ＮＱＯ１、Ｐ４５０ＲおよびＧＬＵＴ−１については０から４の間で採点し、増殖指数は「材料および方法」で記載されたように％ｋｉ６７陽性として計算した。
【００６１】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、膀胱の移行上皮癌の患者３人におけるＮＱＯ１、Ｐ４５０ＲおよびＧｌｕｔ−１の免疫組織化学的分析を示した図である。
【図２】図２は、多細胞層の薬剤浸透を研究するために使用した装置を示した図である。
【図３】図３は、薬剤溶液調製の概略図である。
【図４】図４は、内部標準として、ＷＶ１４を加えた盲検試料のクロマトグラムを示した図である。
【図５Ａ】図５Ａは、ＲＰＭＩ１６４０培地中のＥＯ９標準物のクロマトグラムを示した図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＲＰＭＩ１６４０培地中のＥＯ９標準物のクロマトグラムを示した図である。
【図６Ａ】図６Ａは、ＤＭＳＯ０．１％（６Ａ）に溶かしたＥＯ９標準物のクロマトグラムを示した図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、プロピレングリコール３０％（ＰＧ、６Ｂ）に溶かしたＥＯ９標準物のクロマトグラムを示した図である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＰＧ２０％（６Ｃ）に溶かしたＥＯ９標準物のクロマトグラムを示した図である。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ＰＧ１０％（６Ｄ）に溶かしたＥＯ９標準物のクロマトグラムを示した図である。
【図７】図７は、ＤＭＳＯ０．１％および様々なＰＧ濃度（３０％、２０％、１０％）におけるＥＯ９の検量線を示した図である。
【図８】図８は、様々なＰＧ濃度におけるＥＯ９のＤＬＤ−１多細胞層への浸透を示した図である。
【図９】図９は、染色したＤＬＤ−１多細胞層の断面を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年9月25日(2008.9.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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