(57)【要約】  組み換え宿主細胞内でプロセシングを受けた一次翻訳産物を用いて、タンパク質を発現させるのに有用である構築物及び方法を開示する。単一オープンリーディングフレーム（ｓＯＲＦ）を含む構築物を、複数のポリペプチドの発現を含めて、タンパク質発現用に記述する。一次翻訳産物（プロタンパク質又はポリタンパク質）は、複数の目的タンパク質サブユニット間にインフレームで挿入された、インテイン又はヘッジホッグファミリー自動プロセシングドメイン、その変種などのポリペプチドを含む。一次産物は、他のタンパク質分解性切断又はプロテアーゼ認識部位、複数のタンパク質サブユニットの少なくとも２個を分離する、シグナルペプチダーゼ用の認識配列を含むシグナルペプチドなどの切断配列も含み得る。挿入された自動プロセシングポリペプチド又は切断部位の配列は、別々の複数のタンパク質サブユニットの発現の効率を高めるように操作することができる。免疫グロブリンなどのタンパク質の効率的発現、分泌及び／又は多量体組立てを実施する独立した態様も開示する。ポリタンパク質が、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の各セグメント、又は抗原認識可能な断片を含む場合、一実施形態においては、選択可能な化学量論比は、重鎖セグメント１個当たりの軽鎖セグメントが少なくとも２コピーであり、その結果、適切に折り畳まれ、組み立てられた機能的抗体が作製される。免疫グロブリン軽鎖由来のものを含めて、修飾シグナルペプチドを記載する。
2009508470.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｓＯＲＦ挿入断片を含む１種類以上の組み換えタンパク質産物を産生するための発現ベクターであり、前記ｓＯＲＦ挿入断片が、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列と、第１のタンパク質切断部位をコードする第１の介在核酸配列と、及び第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列とを含み、前記第１のタンパク質切断部位をコードする前記介在核酸配列が前記第１の核酸配列と前記第２の核酸配列との間に作動可能に位置し、ならびに前記第１のタンパク質切断部位において切断可能であるｓＯＲＦポリペプチドを発現可能である、前記発現ベクター。
【請求項２】
前記第１のタンパク質切断部位が自己プロセシング切断部位を含む、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記自己プロセシング切断部位が、インテインセグメント又は修飾インテインセグメントを含み、修飾インテインセグメントは、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとの切断を可能にするが、完全な連結を可能にしない、請求項１又は２の発現ベクター。
【請求項４】
前記自己プロセシング切断部位が、ヘッジホッグセグメント又は修飾ヘッジホッグセグメントを含み、修飾ヘッジホッグセグメントが、前記第１のポリペプチドの前記第２のポリペプチドからの切断を可能にする、請求項１又は２の発現ベクター。
【請求項５】
第１のポリペプチドと第２のポリペプチドが多量体組立て可能である、請求項１から４のいずれかの発現ベクター。
【請求項６】
前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドの少なくとも一方が細胞外分泌可能である、請求項１から５のいずれかの発現ベクター。
【請求項７】
前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドの少なくとも一方がほ乳動物起源である、請求項１から６のいずれかの発現ベクター。
【請求項８】
前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドの少なくとも一方が免疫グロブリン重鎖又はその機能的断片を含む、請求項１から７のいずれかの発現ベクター。
【請求項９】
前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドの少なくとも一方が免疫グロブリン軽鎖又はその機能的断片を含む、請求項１から８のいずれかの発現ベクター。
【請求項１０】
前記第１のポリペプチドが免疫グロブリン重鎖又はその機能的断片を含み、前記第２のポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖又はその機能的断片を含み、前記第１のポリペプチドと第２のポリペプチドが任意の順序である、請求項１から９のいずれかの発現ベクター。
【請求項１１】
前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドが多量体組立てにおいて会合して、機能的抗体又は他の抗原認識分子を形成可能である、請求項１から１０のいずれかの発現ベクター。
【請求項１２】
前記第１のポリペプチドが前記第２のポリペプチドの上流にある、請求項１から１１のいずれかの発現ベクター。
【請求項１３】
前記第２のポリペプチドが前記第１のポリペプチドの上流にある、請求項１から１２のいずれかの発現ベクター。
【請求項１４】
第３のポリペプチドをコードする第３の核酸配列を更に含み、前記第３の核酸配列が前記第２の核酸配列の後に作動可能に位置し、及び前記第３の配列が独立に前記第１の核酸配列又は前記第２の核酸配列のどちらかと同じでも、異なっていてもよい、請求項１から１３のいずれかの発現ベクター。
【請求項１５】
前記第１、第２及び第３のポリペプチドの少なくとも２種類が多量体組立てにおいて会合可能である、請求項１４の発現ベクター。
【請求項１６】
第２のタンパク質切断部位をコードする第２の介在核酸配列を更に含み、前記第２の介在核酸配列が前記第１及び前記第２の核酸配列の後に作動可能に位置し、及び前記第２の介在配列が前記第１の介在核酸配列と同じでも、異なっていてもよい、請求項１から１５のいずれかの発現ベクター。
【請求項１７】
第３のポリペプチドをコードする第３の核酸配列と、及び第２のタンパク質切断部位をコードする第２の介在核酸配列とを更に含み、第２の介在核酸配列と第３の核酸配列がこの順で前記第２の核酸配列の後に作動可能に位置する、請求項１から１６のいずれかの発現ベクター。
【請求項１８】
前記第３の核酸配列が、免疫グロブリン重鎖、軽鎖、又はそれぞれにその機能的断片をコードする、請求項１から１７のいずれかの発現ベクター。
【請求項１９】
前記第３の核酸配列が、免疫グロブリン軽鎖又はその機能的断片をコードする、請求項１４から１８のいずれかの発現ベクター。
【請求項２０】
前記第３の核酸配列が、免疫グロブリン重鎖又はその機能的断片をコードする、請求項１４から１８のいずれかの発現ベクター。
【請求項２１】
第１のタンパク質切断部位をコードする前記第１の介在核酸配列が、シグナルペプチド切断部位又は修飾シグナルペプチド切断部位配列をコードするシグナルペプチド核酸を含む、請求項１から２０のいずれかの発現ベクター。
【請求項２２】
前記第１の核酸配列又は前記第２の核酸配列の前に作動可能に位置する、シグナルペプチド切断部位をコードするシグナルペプチド核酸配列を更に含む、請求項１から２１のいずれかの発現ベクター。
【請求項２３】
シグナルペプチド切断部位を各々独立にコードする２個のシグナルペプチド核酸配列を更に含み、一方のシグナルペプチド核酸配列が、前記第１のポリペプチドをコードする前記第１の核酸の前に作動可能に位置し、及びもう一方のシグナルペプチド核酸配列が、前記第２のポリペプチドをコードする前記第２の核酸の前に作動可能に位置する、請求項１から２２のいずれかの発現ベクター。
【請求項２４】
前記シグナルペプチド核酸配列が、免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド切断部位又は修飾免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド切断部位をコードする、請求項２１から２３のいずれかの発現ベクター。
【請求項２５】
シグナルペプチド核酸配列が修飾又は非修飾免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド切断部位をコードし、及び前記修飾部位が、前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、及び前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとの集合分子の少なくとも１つを切断し、その分泌を増大させることが可能であり、ならびに前記シグナルペプチド部位の存在下の分泌レベルが、前記シグナルペプチド部位の非存在下の分泌レベルの約１０％から約１００倍大きい、請求項２４の発現ベクター。
【請求項２６】
第１のタンパク質切断部位をコードする前記介在核酸配列が、パイロコッカス  ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）Ｐｈｏ  Ｐｏｌ  Ｉ配列、サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＶＭＡ配列、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）種Ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ６８０３  ＤｎａＥ配列、マイコバクテリウム  ゼノピ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｅｎｏｐｉ）ＧｙｒＡ配列、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）種ＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ａ型細菌インテイン様（ＢＩＬ）ドメイン及びＢ型ＢＩＬからなる群から選択されるインテイン又は修飾インテイン配列を含む、請求項１から３のいずれかの発現ベクター。
【請求項２７】
第１のタンパク質切断部位をコードする前記介在核酸配列が、ヘッジホッグファミリーメンバーのＣ末端自動プロセシング（ａｕｔｏ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）ドメインを含み、ヘッジホッグファミリーメンバーがショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、マウス、ヒト、又は他の昆虫若しくは動物種に由来する、請求項１、２及び４のいずれかの発現ベクター。
【請求項２８】
第１のタンパク質切断部位をコードする前記介在核酸配列が、線虫由来のｗａｒｔｈｏｇ、ｇｒｏｕｎｄｈｏｇ、若しくは他のホッグ（ｈｏｇ）含有遺伝子からのＣ末端自動プロセシングドメイン、又は襟鞭毛虫由来のＨｏｇｌｅｔドメインを含む、請求項１、２及び４のいずれかの発現ベクター。
【請求項２９】
前記第１及び前記第２のポリペプチドが、腫よう壊死因子α、エリスロポイエチン受容体、ＲＳＶ、ＥＬ／セレクチン、インターロイキン１、インターロイキン１２、インターロイキン１３、インターロイキン１８、インターロイキン２３、ＣＸＣＬ−１３、ＧＬＰ−１Ｒ及びアミロイドベータからなる群から選択される抗原との結合に対する抗原特異性を有する、機能的抗体又は他の抗原認識分子を含む、請求項１から２８のいずれかの発現ベクター。
【請求項３０】
第１及び第２のポリペプチドが、Ｄ２Ｅ７、ＡＢＴ−００７、ＡＢＴ−３２５、ＥＬ２４６又はＡＢＴ−８７４の抗体由来の１対の免疫グロブリン鎖を含む、請求項１から２８のいずれかの発現ベクター。
【請求項３１】
第１及び第２のポリペプチドが、Ｄ２Ｅ７、ＡＢＴ−００７、ＡＢＴ−３２５、ＥＬ２４６、ＡＢＴ−８７４又は他の抗体の類似のセグメントに由来する、免疫グロブリン重鎖又は免疫グロブリン軽鎖セグメントから各々独立に選択される、請求項１から２８のいずれかの発現ベクター。
【請求項３２】
前記ｓＯＲＦ挿入断片に対するプロモーター調節エレメントを更に含む、請求項１から３１のいずれかの発現ベクター。
【請求項３３】
前記プロモーター調節エレメントが誘導性又は構成的である、請求項３２に記載の発現ベクター。
【請求項３４】
前記プロモーター調節エレメントが組織特異的である、請求項３２に記載の発現ベクター。
【請求項３５】
前記プロモーターがアデノウイルス主要後期プロモーターを含む、請求項３２に記載の発現ベクター。
【請求項３６】
前記第１のタンパク質切断部位を切断可能であるプロテアーゼをコードする核酸を更に含む、請求項１から３５のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項３７】
プロテアーゼをコードする前記核酸が、前記ｓＯＲＦ挿入断片内に作動可能に位置し、前記発現ベクターが、プロテアーゼをコードする前記核酸と、前記第１の核酸と前記第２の核酸の少なくとも一方との間に位置する第２の切断部位をコードする追加の核酸を更に含む、請求項３６に記載の発現ベクター。
【請求項３８】
請求項１から３７のいずれかに記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３９】
原核細胞である、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
エシェリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項３９に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
真核細胞である、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項４２】
前記真核細胞が、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞及び真菌細胞からなる群から選択される、請求項４１に記載の宿主細胞。
【請求項４３】
前記真核細胞が、ほ乳動物細胞、トリ細胞及び昆虫細胞からなる群から選択される動物細胞である、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
ＣＨＯ細胞又はジヒドロ葉酸還元酵素欠乏ＣＨＯ細胞である、請求項４３に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
ＣＯＳ細胞である、請求項４３に記載の宿主細胞。
【請求項４６】
酵母細胞である、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４７】
前記酵母細胞がサッカロミセス  セレビシエである、請求項４６に記載の宿主細胞。
【請求項４８】
昆虫ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９細胞である、請求項４３に記載の宿主細胞。
【請求項４９】
ヒト胎児腎細胞である、請求項４３に記載の宿主細胞。
【請求項５０】
請求項３８に記載の宿主細胞を培地中で、ベクタータンパク質の発現に十分な条件下で培養することを含む、組み換えポリタンパク質又は複数のタンパク質を製造する方法。
【請求項５１】
前記ベクタータンパク質の回収及び／又は精製を更に含む、請求項５０の方法。
【請求項５２】
前記複数のタンパク質が多量体組立て可能である、請求項５０から５１のいずれかの方法。
【請求項５３】
組み換えポリタンパク質又は複数のタンパク質が、生物学的に機能的である、及び／又は治療効果のある、請求項５０から５２のいずれかの方法。
【請求項５４】
請求項３８に記載の宿主細胞を培地中で、免疫グロブリンタンパク質若しくはその機能的断片、組み立てられた抗体、又は他の抗原認識分子の製造に十分な条件下で培養することを含む、免疫グロブリンタンパク質若しくはその機能的断片、組み立てられた抗体、又は他の抗原認識分子を製造する方法。
【請求項５５】
請求項５０から５４のいずれかの方法によって製造されたタンパク質。
【請求項５６】
請求項５０から５５のいずれかの方法によって製造されたポリタンパク質。
【請求項５７】
請求項５０から５６のいずれかの方法によって製造された、組み立てられた免疫グロブリン、組み立てられた他の抗原認識分子、又は個々の免疫グロブリン鎖若しくはその機能的断片。
【請求項５８】
腫よう壊死因子α、エリスロポイエチン受容体、インターロイキン１８、ＥＬ／セレクチン又はインターロイキン１２との特異的抗原結合をもたらす能力がある、又はその一因となる能力がある、請求項５７に記載の免疫グロブリン、他の抗原認識分子、又は個々の免疫グロブリン鎖若しくはその機能的断片。
【請求項５９】
免疫グロブリンがＤ２Ｅ７である、又は機能的断片がＤ２Ｅ７の断片である、請求項５８に記載の免疫グロブリン又はその機能的断片。
【請求項６０】
請求項５５から５９のいずれかに記載のタンパク質と、薬剤として許容される担体とを含む、薬剤組成物。
【請求項６１】
前記第１のタンパク質切断部位が、細胞のプロテアーゼ切断部位、又はウイルスのプロテアーゼ切断部位を含む、請求項１又は２の発現ベクター。
【請求項６２】
前記第１のタンパク質切断部位が、フューリン；ＩＰＮＶのＶＰ４；タバコ  エッチ（ｔｏｂａｃｃｏ  ｅｔｃｈ）ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ；ライノウイルスの３Ｃプロテアーゼ；ＰＣ５／６プロテアーゼ；ＰＡＣＥプロテアーゼ、ＬＰＣ／ＰＣ７プロテアーゼ；エンテロキナーゼ；活性化第Ｘ因子プロテアーゼ；トロンビン；ｇｅｎｅｎａｓｅ  Ｉ；ＭＭＰプロテアーゼ；カブモザイクポティウイルスの核封入タンパク質ａ（Ｎ１ａ）；デング熱４型フラビウイルスのＮＳ２Ｂ／ＮＳ３、黄熱病ウイルスのＮＳ３プロテアーゼ；カリフラワーモザイクウイルスのＯＲＦ  Ｖ；ＫＥＸ２プロテアーゼ；ＣＢ２；又は２Ａによって認識される部位を含む、請求項１又は２に記載の発現ベクター。
【請求項６３】
前記第１のタンパク質切断部位が、ウイルス内部切断可能シグナルペプチド切断部位である、請求項１又は２の発現ベクター。
【請求項６４】
前記ウイルス内部切断可能シグナルペプチド切断部位が、Ｃ型インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ハンタウイルス、フラビウイルス又は風疹ウイルス由来の部位を含む、請求項６３の発現ベクター。
【請求項６５】
二重ハイブリッド系のタンパク質の発現方法であり、前記二重ハイブリッド系がベイト（ｂａｉｔ）タンパク質とプレイ（ｐｒｅｙ）タンパク質候補とを含み、ベイトタンパク質部分とプレイタンパク質候補部分とを含むポリタンパク質をコードする発現ベクターが導入された宿主細胞を用意する段階（前記各部分は自己プロセシング切断配列、シグナルペプチド配列又はプロテアーゼ切断部位によって分離されている）と、ポリタンパク質の発現、及びポリタンパク質の自己プロセシング又はプロテアーゼ切断が可能である条件下で宿主細胞を培養する段階とを含む、前記方法。
【請求項６６】
ポリタンパク質が三重ハイブリッド系の切断可能成分を更に含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
２Ａ配列を含まない、請求項１から３７及び６１から６４のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項６８】
前記第１のタンパク質切断部位が、ＦＭＤＶ  ２Ａ配列、又は他のピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルス、トリパノソーマ若しくはサーモトガ  マリチマ（Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）由来の２Ａ様ドメインを含む、請求項１又は２に記載の発現ベクター。
【請求項６９】
ポリタンパク質のコード配列を含む、組み換えタンパク質を発現するための発現ベクターであり、ポリタンパク質が少なくとも第１及び第２のタンパク質セグメントを含み、前記各タンパク質セグメントがその間のタンパク質切断部位によって分離されており、タンパク質切断部位が自己プロセシングペプチド切断配列、シグナルペプチド切断配列又はプロテアーゼ切断配列を含み、及び前記コード配列が宿主細胞中で発現可能であり、及び宿主細胞内で切断される、発現ベクター。
【請求項７０】
前記介在核酸配列がタグを更にコードする、請求項１から３７、６１から６４、６７及び６８のいずれかの発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、分子生物学であり、特に、組み換えタンパク質発現、並びに、特に組み換えポリタンパク質又はプレタンパク質の翻訳後プロセシングを含めた、発現及びプロセシングの領域に一般に関係する。
【背景技術】
【０００２】
診断ツール及び治療様式としての抗体の使用は、近年増加している。最初のＦＤＡ認可モノクローナル抗体ＯＫＴ３（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ）は、腎移植拒絶患者の治療に認可された。転移性乳癌患者の治療用ヒト化モノクローナル抗体であるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡの商標）は、１９９８年に認可された。多数の抗体療法が、種々の臨床発生段階において有望である。抗体技術の広範な臨床応用における１つの制約は、治療効力のために典型的には多量の抗体が必要であり、十分な製造に付随するコストが高いことである。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びＮＳＯ骨髄腫細胞は、抗体、他の生物学的治療薬などのグリコシル化ヒトタンパク質の商業規模製造に最も一般に使用されるほ乳動物細胞系である（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ  ａｎｄ  Ｇｌｏｖｅｒ  ２００１．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｄｅｖｅｌ．  ４：１７２−８５）。ほ乳動物細胞系の製造は、典型的には、バッチ発酵槽中で５−７日の培養で５０−２５０ｍｇ／Ｌ、又は流加発酵槽中で７−１２日で３００−６００ｍｇ／Ｌの収量である。非グリコシル化免疫グロブリンタンパク質は、酵母又はＥ．コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）中で首尾よく製造することができるが（例えば、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ  ＤＰ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．  ２０（２）：２５２−６４参照）、細菌発現系における成功は大部分が抗体断片を用いている（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ，  Ｄ．Ｐ．  ２００３．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｄｅｖｅｌ．  ２００３  ６：１８８−９６）。
【０００３】
複数の遺伝子セグメント又は遺伝子の発現の分野における重要な進展は、インテインの発見である（例えば、Ｈｉｒａｔａ，  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５：６７２６−６７３３；  Ｋａｎｅ，  ＰＭ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：，  ６５１−６５７；  Ｘｕ，  Ｍ−Ｑ  ａｎｄ  Ｐｅｒｌｅｒ，  ＦＢ，  １９９６，  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １５（１９）：５１４６−５１５３参照）。インテインは、遺伝子イントロンのタンパク質相当物と考えられ、タンパク質スプライシングを促進する。Ｓｎｅｌｌ  Ｋ．の米国特許第７０２６５２６号に記述されているように、タンパク質スプライシングは、前駆体タンパク質の内部領域（インテイン）が切り出され、タンパク質のフランキング領域（エクステイン）が連結されて成熟タンパク質を形成するプロセスである。このプロセスは、原核生物と真核生物の両方に由来する多数のタンパク質において観察される（Ｐｅｒｌｅｒ，  Ｆ．Ｂ．，  Ｘｕ，  Ｍ．Ｑ．，  Ｐａｕｌｕｓ，  Ｈ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９７，  １，  ２９２−２９９；  Ｐｅｒｌｅｒ，  Ｆ．Ｂ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９９，  ２７，  ３４６−３４７）。インテイン単位は、タンパク質スプライシングを触媒するのに必要な成分を含み、インテインの移動に関与するエンドヌクレアーゼドメインを含むことが多い（Ｐｅｒｌｅｒ，  Ｆ．Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９４，  ２２，  １１２７−１１２７）。
【０００４】
インテインに基づく系は、精製技術を創作し、発現遺伝子セグメントから新しい融合タンパク質を産生することに主に焦点が置かれているが、米国特許第７０２６５２６号は、植物において形質を積み重ねるための別々のタンパク質として、複数の遺伝子産物の発現のための修飾インテインを含むＤＮＡ構築物を報告している。しかし、いまだに欠如しているのは、機能的多量体タンパク質、細胞外分泌タンパク質、ほ乳動物タンパク質、又は真核生物宿主細胞中で産生されるタンパク質に組み立てられる別々のタンパク質の発現に、インテインに基づく系を首尾よく使用することができるという指摘である。免疫グロブリンがこれらのカテゴリーの全部に属することは注目に値する。
【０００５】
米国特許第７０２６５２６号の修飾インテイン手法を他の遺伝子又は目的に拡張することの困難さを増大させているのは、関与するインテイン系に関連がある所望のエクステイン遺伝子セグメントの寄与の潜在的重要性の認識である。Ｐａｕｌｕｓによれば、「実際、タンパク質スプライシングは、専らインテインによって触媒されても、エクステイン配列によって著しく影響され得る。この影響は、インテイン配列が外来コード配列間にインフレームで挿入されたキメラタンパク質スプライシング系の発現が、上流又は下流のスプライス部位における切断などのかなりの副反応をもたらすことが多いということによって現れる（Ｘｕ  Ｍ−Ｑ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｃｅｌｌ  ７５：１３７１−７７及びＳｈｉｎｇｌｅｄｅｃｋｅｒ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｇｅｎｅ  ２０７：１８７−９５）。これは、タンパク質スプライシングに最適な構造を副反応なしにとるインテインの能力が、特定のエクステインに関連して進化したことを示唆している。」。Ｐａｕｌｕｓ  Ｈ，  ２０００，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｕｔｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６９：４４７−９６を参照されたい。別の解説者によれば、「合理的設計によって望ましい特性及び活性をタンパク質に導入することは可能であるが、加工産物を効率的かつ実用的にするのに必要な微妙な変更は、我々の予測能力をいまだに超えていることが多い（Ｓｈａｏ，  Ｚ．  ａｎｄ  Ａｒｎｏｌｄ，  Ｆ．Ｈ．  １９９６．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ６，  ５１３−５１８）。．．．それでも、インテインに隣接する領域がスプライシング効率に影響することが見出され（Ｃｈｏｎｇ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２６，  ５１０９−５１１５；  Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈ，  Ｍ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２７，  １１０−１１４）、一部のタンパク質宿主はインテイン活性に不適合であり得る。高発現及び産物純度は重要な考慮事項ではあるが、最終産物が不活性である場合には実際的意味がない。」。Ａｍｉｔａｉ  Ｇ  ａｎｄ  Ｐｉｅｔｒｏｋｏｖｓｋｉ，  １９９９，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８５４−８５５を参照されたい。
【０００６】
したがって、好ましい結果が再連結のない切断である修飾インテイン系においては、所与のインテイン配列に関連した外来エクステインが存在すると、正確な切断、再連結の非存在、及び副反応の非存在の実際的な効率的組合せに影響を及ぼし得る。最終産物、例えば、免疫グロブリン及び他の生物学的治療薬として機能的活性を保持するある種のタンパク質の組み換え製造のための修飾インテイン手法の手直しは、革新のための難題であることは明らかである。
【０００７】
本発明では、この難題を、インテインに基づく系に対して取り上げただけでなく、ヘッジホッグドメインに関して有用である適用分野に対して先駆的に探究した。ヘッジホッグファミリーのタンパク質は、脊椎動物胚におけるパターニングに必須の細胞間シグナル伝達分子である。例えば、Ｍａｎｎ，  Ｒ．Ｋ．  ａｎｄ  Ｂｅａｃｈｙ，  Ｐ．Ａ．  （２０００）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  １５２９，  １８８−２０２；  Ｂｅａｃｈｙ，  ＰＡ，  （１９９７）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ  ６２：  １９１−２０４を参照されたい。未変性ヘッジホッグ前駆体タンパク質は、タンパク質スプライシングと類似した自動プロセシング（ａｕｔｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）反応によって、Ｃ末端断片（Ｈｈ−Ｃ）とＮ末端断片（Ｈｈ−Ｎ）に切断される。ヘッジホッグ系は、複数の別々のタンパク質セグメントの発現に適切な修飾系を含めた系を創造するために、実証されていない機会を提供するものである。
【０００８】
単一のベクターを用いた組み換えＤＮＡ技術によって完全長抗体／免疫グロブリン分子を発現させる以前の試みは、不十分な結果に終わり、典型的には、抗体／免疫グロブリン分子の重鎖と軽鎖の発現レベルがかなり異なり、より具体的には、第２の遺伝子の発現レベルが低かった。他の要因は、適切に組み立てられた多量体抗体又はその機能的断片の最適な産生のために、一方の鎖に比較して他方の鎖のより高い発現レベルを必要とし得る。したがって、１つの問題は、細胞内の重鎖と軽鎖の発現の最適に満たない化学量論であって、組み立てられた多量体抗体は全体的に低収率になる。Ｆａｎｇ等によれば、十分な生物学的機能を有する抗体を単一のベクターから高レベルで発現させるためには、重鎖と軽鎖を等モルで発現させる必要がある（Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：５８４−５９０、米国特許出願公開第２００４／０２６５９５５号Ａ１参照）。さらに、複数のポリペプチドを独立に発現するベクター系に依拠する従来の発現系は、プロモーター相互作用（例えば、プロモーター干渉）などの要因にかなり影響される。これらの相互作用は、遺伝子の効率的発現及び／又は発現鎖の組立てを損ない得るものであり、又は１種類を超えるベクターを使用する必要があり得る（例えば、米国特許第６３３１４１５号、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．参照）。複数のベクターを必要とすることは、一般に追加の操作が必要なことに加えて、個々のベクターの１種類以上が失われるなどの潜在的に面倒な事態のために不利である。
【０００９】
単一のベクターから２種類以上のコード配列を発現する能力を制限する他の要因としては、ベクター自体のパッケージング容量が挙げられる。例えば、適切なベクター／コード配列を考慮する際に、考慮すべき要因としては、ベクターのパッケージング容量（例えば、アデノ随伴ウイルスＡＡＶの場合は約４，５００ｂｐ）、ベクターによって移入された細胞又は器官による組み換えタンパク質のインビトロ／インビボでの発現期間（例えば、アデノウイルスベクターの場合は短期発現）、ウイルスベクターを使用する場合にはベクターによる効率的感染を支援する細胞タイプ、遺伝子産物の所望の発現レベルなどが挙げられる。アデノウイルス、ＡＡＶなどのウイルスベクターのパッケージングの制約に加えて、２種類以上の遺伝子産物の発現を制御する必要があることは、ベクターの構築、及び免疫グロブリン、その断片などのある種の遺伝子の発現系に関する選択肢を制限するものである。
【００１０】
２種類以上のタンパク質又はポリペプチド配列を単一のベクターから発現させる更なる手法においては、２種類以上のプロモーター又は単一のプロモーターと、目的コード配列間の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列とを使用して、個々のコード配列を発現させる。単一のベクター内の２種類のプロモーターを使用すると、プロモーター干渉のために、タンパク質発現が低くなり得る。２種類のコード配列をＩＲＥＳ配列によって分離すると、第２のコード配列の翻訳発現は、第１のコード配列の翻訳発現よりもかなり弱くなることが多い（Ｆｕｒｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：８６４−８７３）。米国特許出願公開第２００４／０２４１８２１号は、異種コード配列がウイルスポリタンパク質コード配列の下流に取り込まれ、ＩＲＥＳによって該コード配列から分離されているフラビウイルスベクターを記載している。セグメントがプロテアーゼ認識部位によって分離された融合タンパク質を含めて、核に固定されたベクターによる組み換え遺伝子発現戦略が、米国特許出願公開第２００５／００２６１３７号に記載されている。
【００１１】
単一オープンリーディングフレーム（ｓＯＲＦ）中のポリタンパク質の形のタンパク質の結鎖は、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）を含めて、多数の天然ウイルスの複製において認められる戦略である。翻訳後、ウイルスによってコードされたプロテイナーゼは、ポリタンパク質の迅速な分子内（ｃｉｓ）切断を媒介して、別個の成熟タンパク質産物を与える。口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）は、ピコルナウイルス科内の一群であり、約２２５ｋＤのポリタンパク質をコードする単一の長いオープンリーディングフレームを発現する。完全長翻訳産物は、キャプシドタンパク質前駆体（Ｐ１−２Ａ）とポリタンパク質２ＢＣ及びＰ３の複製ドメインとの間に存在する２Ａ領域のＣ末端において迅速な分子内（ｃｉｓ）切断を受ける。この切断は、リボソームのスタッター（ｓｔｕｔｔｅｒ）機構によって、２Ａ領域自体によって媒介される（Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１．  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：２７２７−２７３２）；Ｖａｋｈａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．  １９８７．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６１：３１９９−３２０７）。ＦＭＤＶ  ２Ａ領域によって切断活性を発現するための必須アミノ酸残基が特定された。２Ａ及び類似のドメインは、ピコルナウイルスファミリーのアフトウイルス科（ａｐｈｔｈｏｖｉｒｉｄａｅ）及びカルジオウイルス科（ｃａｒｄｉｏｖｉｒｉｄａｅ）からも特徴づけられた（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：１３−２１）。
【００１２】
タンパク質分解プロセシング技術を使用する更に別の試みにおいて、組み換えインスリン製造の初期の記述としては、例えば、欧州特許第０５５９４５号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及び欧州特許第０３７７２３号（Ｔｈｅ  Ｒｅｇｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が挙げられる。しかし、免疫グロブリンなどのはるかに大きく、より複雑な機能的タンパク質の組み換え発現を利用する状況において、かかる労力をかけ得ることは途方もない飛躍である。機能的抗体分子の例としては、４本以上の鎖（例えば、２本の免疫グロブリン重鎖と２本の軽鎖）の組立てを必要とするヘテロ多量体が挙げられる。
【００１３】
組み換えタンパク質を産生するための代替発現系及び／又は改善された発現系が依然として要求されている。ある特定の要求は、現在利用可能な技術に比べて優位性をもたらす、完全長免疫グロブリン及びその抗原結合性フラグメントの効率的及び／又は正確な発現の領域に反映されている。本発明は、インテイン、ヘッジホッグ自動プロセシングセグメント、自己触媒のウイルスプロテアーゼ、そのそれぞれの変形物などの種々の戦略を用いて、単一のベクター構築物を提供することによって、これらの要求に対処する。それとは別に、サブユニット（例えば、重鎖及び軽鎖又はその断片）の化学量論的関係を調節することによって、多量体（例えば、免疫グロブリン）の効率的組立ての要求に対処する。複数の実施形態においては、ｓＯＲＦ中の構築物は、対象となる酵素、免疫グロブリン、サイトカイン、ケモカイン、受容体、ホルモン、二重ハイブリッド系の各成分、他の多サブユニットタンパク質などの工業的又は生物学的に機能的なポリペプチドを発現させるための、自己プロセシングペプチド成分をコードする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、発現カセット、ベクター、組み換え宿主細胞を提供し、組み換えポリタンパク質及びプレタンパク質の組み換え発現、及び翻訳後プロセシングを含めた、プロセシングの方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
一実施形態においては、本発明は、ｓＯＲＦ挿入断片を含む１種類以上の組み換えタンパク質産物を産生するベクターを提供する。前記ｓＯＲＦ挿入断片は、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列と、第１のタンパク質切断部位をコードする介在核酸配列と、第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列とを含み、前記第１のタンパク質切断部位をコードする前記介在核酸配列は、前記第１の核酸配列と前記第２の核酸配列との間に作動可能に位置し、前記発現ベクターは、前記第１のタンパク質切断部位において切断可能であるｓＯＲＦポリペプチドを発現可能である。一実施形態においては、第１のタンパク質切断部位は、自己プロセシング切断部位を含む。一実施形態においては、自己プロセシング切断部位は、インテインセグメント又は修飾インテインセグメントを含み、修飾（又は非修飾）インテインセグメントは、発現された第１のポリペプチドと発現された第２のポリペプチドとの切断を可能にするが、両者を完全に連結することはできない。一実施形態においては、自己プロセシング切断部位は、ヘッジホッグセグメント又は修飾ヘッジホッグセグメントを含み、修飾（又は非修飾）ヘッジホッグセグメントは、発現された第１のポリペプチドと発現された第２のポリペプチドとの切断を可能にする。一実施形態においては、複数の別々のタンパク質（例えば、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、第３のポリペプチドなど）が発現される。一実施形態においては、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは、多量体組立て可能である。一実施形態においては、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドの少なくとも一方は、細胞外分泌可能である。一実施形態においては、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドの少なくとも一方は、ほ乳動物起源である。一実施形態においては、組み立てられた抗体を作製する、ベクター及び方法を提供する。
【００１６】
複数の実施形態においては、本発明は、複数の別々のタンパク質の組み換え発現のための構築物及び方法を提供する。特定の実施形態においては、タンパク質は細胞外分泌可能である。特定の実施形態においては、タンパク質はほ乳動物起源である。特定の実施形態においては、タンパク質は多量体組立て可能である。特定の実施形態においては、タンパク質は免疫グロブリンである。
【００１７】
一実施形態においては、（野生型、切断型又は改変形態の、インテイン、ショウジョウバエ、マウス、ヒト及び他の種由来のヘッジホッグのＣ末端自動プロセシングドメイン（Ｄａｓｓａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｖｏｌ．２０  Ｎｏ．１１  Ｎｏｖ，  ２００４，  ５３８−５４２；  Ｉｂｒａｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ａｃｔａ  １７６０  （２００６）  ３４７−３５５）。自動プロセシングポリペプチド配列は、タンパク質分解プロセシングに関連して、タンパク質分解性部位と称する場合もあることに注意されたい。シノラブディス  エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）などの線虫由来のｗａｒｔｈｏｇ、ｇｒｏｕｎｄｈｏｇ、若しくは他のホッグ（ｈｏｇ）含有遺伝子のＣ末端自動プロセシングドメイン（Ｓｎｅｌｌ  ＥＡ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｒ．  Ｓｏｃ．  Ｂ  （２００６）  ２７３，  ４０１−４０７；  Ａｓｐｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９９９，  ９：９０９−９２３）、又は襟鞭毛虫由来のＨｏｇｌｅｔ−Ｃ自動プロセシングドメイン（Ａｓｐｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９９９，  ９：９０９−９２３）を使用する。クロストリジウム  サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）などの細菌由来のものなどのＡ型細菌インテイン様（ＢＩＬ）ドメイン、及びロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）などの細菌由来のＢ型ＢＩＬドメイン（Ｄａｓｓａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．２７９，  Ｎｏ．３１，  Ｊｕｌｙ  ３０，  ３２００１−３２００７）を含めた）プロテアーゼ認識部位、切断可能なシグナルペプチド、又は自動プロセシングポリペプチド配列を、組み換えプレタンパク質配列に取り込むことによって、プロタンパク質の効率的発現及び切断が可能になり、生理活性部分が遊離し、又はポリタンパク質内で発現された所望のタンパク質が遊離する。この実施形態は、プロタンパク質の天然タンパク質分解プロセシング酵素の同時発現が不要である。或いは、特定の認識部位と同起源のプロテアーゼは、プロテアーゼがタンパク質分解によって遊離し得るように、プレタンパク質配列、その間のプロテアーゼ認識部位と同一の広がりを持って（ｃｏｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ）発現され得る。次いで、プレタンパク質の前駆体部分は、それに続くタンパク質分解性切断によって遊離し、プレタンパク質の活性部分が遊離する。更なる実施形態においては、操作された組み換えタンパク質の自己プロセシングが発現後に起こるように、２Ａ自己タンパク質分解プロセシングペプチド配列を成熟（生理活性）部分と前駆体タンパク質の間のプレタンパク質中に操作することができる。
【００１８】
本発明の別の実施形態においては、本発明は、少なくとも１個の重鎖領域と少なくとも１個の軽鎖領域とを含むポリタンパク質を組み換え発現させることによって、組み換え免疫グロブリン分子の効率的発現方法を提供する。前記領域は、１個以上のプロテアーゼ認識部位、シグナルペプチド、ポリペプチドの切断を媒介するが、連結を媒介しないインテイン配列、ヘッジホッグ配列、他のインテイン様若しくはヘッジホッグ様自動プロセシング配列、又はその変形物によって分離され、又はフランキングペプチドを翻訳中に分離する２Ａペプチドなどの配列によって、分離されている。更なる実施形態においては、プロテアーゼは、ポリタンパク質の残部からプロテアーゼ認識部位によって分離された、ポリタンパク質の一部として発現され得る。各プロテアーゼ認識部位は、同時に発現されるプロテアーゼと同起源である。次いで、タンパク質分解又はシグナルペプチダーゼの作用によって、プロテアーゼ及び他の個々のタンパク質が一次翻訳産物から遊離する。ポリタンパク質中のタンパク質サブユニットを分離する上記方法を併用して、所望の切断及びタンパク質発現を得ることもできる。
【００１９】
免疫グロブリン発現の実施形態の場合には、軽鎖コード領域が複製されることによって、軽鎖コード領域が重鎖コード領域と１：１で発現カセット及び／又は発現ベクター中に存在する場合よりも、完全免疫グロブリン分子の組立て及び／又は発現が改善される。本発明の状況において、重鎖及び軽鎖タンパク質は、天然の重鎖及び軽鎖の機能的断片であり得る（機能的断片は、当分野で周知のように、その相手の抗体鎖との結合能力を保持し、同族の抗原との結合能力も保持する。したがって、本発明は、軽鎖成分と重鎖成分のコード領域比が１：１である、又は１：１を超える、構築物及び方法を提供する。例えば、一実施形態においては、ＬＨ比は２：１であり、又は２：１を超え、他の実施形態においては、ＬＨ比は３：１、３：２、４：１であり、又は４：１を超える。
【００２０】
本発明の好ましい態様においては、軽鎖免疫グロブリンコード配列、又はその成分断片は、ポリタンパク質コード配列内で二重であり、重鎖及び軽鎖免疫グロブリンコード配列は、約２本の軽鎖と約１本の重鎖のモル比で存在し、１：１軽鎖：重鎖を超える比で発現される。軽鎖配列と重鎖配列は、ポリタンパク質中でプロテアーゼ切断部位、シグナル（又はリーダー）ペプチド、インテイン又は自己プロセシング部位によって連結されている。
【００２１】
プロテアーゼ（エンドプロテアーゼ）及びシグナルペプチダーゼ、並びにポリタンパク質翻訳産物内の生物活性タンパク質の各成分を分離させるのに有用である、プロテアーゼ（エンドプロテアーゼ）及びシグナルペプチダーゼの認識部位のアミノ酸配列、及びその認識配列としては、フューリン、ＲＸＲ／Ｋ−Ｒ（配列番号１）；ＩＰＮＶのＶＰ４、Ｓ／ＴＸＡ−Ｓ／ＡＧ（配列番号２）；タバコ  エッチ（ｔｏｂａｃｃｏ  ｅｔｃｈ）ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、ＥＸＸＹＸＱ−Ｇ（配列番号３）；ライノウイルスの３Ｃプロテアーゼ、ＬＥＶＬＦＱ−ＧＰ（配列番号４）；ＰＣ５／６プロテアーゼ；ＰＡＣＥプロテアーゼ、ＬＰＣ／ＰＣ７プロテアーゼ；エンテロキナーゼ、ＤＤＤＤＫ−Ｘ（配列番号５）；活性化第Ｘ因子プロテアーゼ、ＩＥ／ＤＧＲ−Ｘ（配列番号６）；トロンビン、ＬＶＰＲ−ＧＳ（配列番号７）；ｇｅｎｅｎａｓｅ  Ｉ、ＰＧＡＡＨ−Ｙ（配列番号８）；及びＭＭＰプロテアーゼ；カブモザイクポティウイルスの核封入タンパク質ａ（Ｎ１ａ）；デング熱４型（ＤＥＮ４）フラビウイルスのＮＳ２Ｂ／ＮＳ３、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）のＮＳ３プロテアーゼ；カリフラワーモザイクウイルスのＯＲＦ  Ｖ；及びＫＥＸ２プロテアーゼ、ＭＹＫＲ−ＥＡＤ（配列番号）などが挙げられるが、これらだけに限定されない。別の内部切断部位の選択肢はＣＢ２である。切断が起こる認識配列内の位置をハイフンで示す。
【００２２】
一実施形態においては、使用するシグナル配列は野生型であり、変異導入され、又は無作為に変異導入され、当分野で理解されている技術によるスクリーニングによって選択される。
【００２３】
発現カセットも本発明の上記範囲内である。ここで、特定のポリタンパク質又はプレタンパク質（プロタンパク質、ポリタンパク質）のコード配列は、転写調節配列、発現ベクター、及び発現ベクター又は発現カセットを含む組み換え宿主細胞に作動可能に結合している。
【００２４】
本発明は、単一のプロモーターの転写制御下にある重鎖及び軽鎖コード配列の発現に基づく、完全長免疫グロブリン又はその断片の発現系を提供する。ここで、重鎖と軽鎖の分離は、インテイン又は修飾インテイン（遊離タンパク質分子を切断するが、連結しない、又は抗体若しくは他のフランキングタンパク質配列は、タンパク質の連結を防止するように修飾し得る。）によって、又はショウジョウバエ、マウス、ヒト及び他の種由来のヘッジホッグのＣ末端自動プロセシングドメインによって、又はシノラブディス  エレガンスなどの線虫由来のｗａｒｔｈｏｇ、ｇｒｏｕｎｄｈｏｇ、及び他のホッグ（ｈｏｇ）含有遺伝子のＣ末端自動プロセシングドメイン、襟鞭毛虫由来のＨｏｇｌｅｔ−Ｃ自動プロセシングドメインによって、又はクロストリジウム  サーモセラムなどの細菌由来のものなどのＡ型細菌インテイン様（ＢＩＬ）ドメインによって、又はロドバクター  スフェロイデスなどの細菌由来のＢ型ＢＩＬドメインによって、媒介される。本発明に有用であるインテインとしては、サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＶＭＡ、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、当分野で公知の他のインテインなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。重鎖と軽鎖の分離は、自己プロセシング切断部位、例えば、２Ａ又は２Ａ様配列によっても媒介され得る。
【００２５】
一態様においては、本発明は、組み換え免疫グロブリンの発現用ベクターを提供する。このベクターは、免疫グロブリン分子又はその断片の第１の鎖のコード配列に作動可能に結合したプロモーターと、自己プロセシング切断部位をコードする配列と、免疫グロブリン分子又はその断片の第２の鎖のコード配列とを含む。自己プロセシング切断部位をコードする配列は、免疫グロブリン分子の第１の鎖のコード配列と免疫グロブリン分子の第２の鎖のコード配列との間に挿入されている。免疫グロブリン分子の第１の鎖又は第２の鎖は重鎖でも軽鎖でもよく、組み換え免疫グロブリンをコードする配列は完全長コード配列又はその断片であり得る。軽鎖に対応する第２の領域は、プロテアーゼ認識部位、シグナルペプチド、又は２Ａ部位などの自己プロセシング部位によって隣接領域から分離されている。正確なプロセシングを受けた抗体鎖が生成するように、各抗体鎖成分が適切なプロセシング部位、又はそれに関連した配列を有するという条件で、Ｌ鎖配列の２本のコピー及び１本のＨ鎖配列（又は各々の複数のコピー）が存在し得る。
【００２６】
ベクターは、完全長ポリペプチド、例えば免疫グロブリン分子又はその断片を発現可能な任意の組み換えベクター、とりわけ、例えばプラスミドベクター、特にほ乳動物細胞における遺伝子発現に適切なプラスミドベクター、昆虫細胞における発現用のバキュロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、増殖性アデノウイルスベクター、非増殖性（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）アデノウイルスベクター及びヘルパー依存型（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター又は非ウイルスベクター（プラスミド）であり得る。
【００２７】
自己プロセシング切断部位としては、２Ａペプチド配列、例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）由来の２Ａ配列などが挙げられる。更に好ましい態様においては、ベクターは、免疫グロブリン分子又はその断片の第１の鎖のコード配列と、免疫グロブリン分子又はその断片の第２の鎖のコード配列との間に位置し（すなわち、２Ａ切断部位などの自己プロセシング切断部位配列に隣接し）、第２の軽鎖配列にも隣接する、追加のタンパク質分解性切断部位をコードする配列を含む。例示的一手法においては、追加のタンパク質分解性切断部位は、コンセンサス配列ＲＸＫ／Ｒ−Ｒ（配列番号１）を有するフューリン切断部位である。自己プロセシングペプチドを用いた組み換え免疫グロブリン発現用ベクターは、幾つかのプロモーターのいずれかを含み得る。ここで、プロモーターは、構成的、調節可能若しくは誘導性、細胞タイプ特異的、組織特異的又は種特異的である。ベクターは、免疫グロブリン鎖、プレタンパク質などのコード配列の１つ以上に対するシグナル配列をコードする配列を更に含み得る。
【００２８】
本発明は、免疫グロブリン（すなわち、抗体）の重鎖及び軽鎖をコードする配列、自己プロセシング切断部位をコードする配列を含むベクターであって、追加のタンパク質分解性切断部位をコードする配列を更に含み得、自己プロセシング部位又はプロテアーゼ認識配列によってコード配列の残部から同様に分離されたプロテアーゼコード領域を含んでいてもよいベクターに感染した、宿主細胞又は宿主細胞の安定なクローンを更に提供する。完全長組み換え免疫グロブリン又はその断片の産生におけるかかる細胞又はクローンの使用も本発明の範囲に含まれる。適切な宿主細胞としては、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞などの昆虫培養細胞、細菌を含む微生物、サッカロミセス  セレビシエ、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母細胞、トリコデルマ  リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｕｍ）、ペニシリン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種などの真菌、並びにチャイニーズハムスター卵巣（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１；ＣＨＯ  ＤＧ４４、Ｃｈａｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９８６，  Ｓｏｍ．  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｇｅｎｅｔ．  １２：５５５）、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ−２１、ＢＨＫ−５７０、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８５４４、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０３１４）、ＣＯＳ、マウス胚性（ＮＩＨ−３Ｔ３、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、Ｖｅｒａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８７として利用可能なアフリカミドリザル腎）、イヌ腎細胞（例えば、ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、ラット下垂体細胞（ＧＨ１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、ヒト胎児腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）を含めたある種のヒト細胞系などのほ乳動物細胞などが挙げられるが、これらだけに限定されない。ブタ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシを含めて、ただしこれらだけに限定されない種々のトランスジェニック動物系も同様に使用することができる。卵白中での発現用のヒヨコ系並びにトランスジェニックヒツジ、ヤギ及びウシ系は、とりわけ、乳中での発現用に知られている。植物細胞も宿主細胞として適切である。
【００２９】
関係する態様においては、本発明は、かかる細胞又はクローンによって産生される、組み換え免疫グロブリン分子又はその断片、及びこれらを製造する方法を提供する。ここで、免疫グロブリンは、自己プロセシング切断部位由来のアミノ酸、シグナルペプチド、インテイン、Ｃ末端自動プロセシングホッグ含有遺伝子、細菌インテイン様（ＢＩＬ）ドメイン、又はプロテアーゼ認識配列を含む。インテインを使用する場合には、好ましくは、２本の抗体鎖が一緒にスプライスされて単一のポリペプチド鎖を形成しないように、又は抗体ポリペプチドの末端がインテインによって一緒にスプライスできないようなものであるように、修飾されたインテインである。インテインは、ポリタンパク質一次翻訳産物のインテイン及び／又はジャンクション近位アミノ酸配列が、切断されてエクステインを遊離するが、これらのエクステインタンパク質の連結は生じないという条件で、インフレーム融合としてＮエクステインとＣエクステインとの間、例えば、免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖との間に位置する。
【００３０】
本発明は、第１の発現タンパク質部分と第２のタンパク質部分の間に位置するヘッジホッグタンパク質プロセシングドメインを用いた翻訳後タンパク質プロセシング戦略を更に提供する。ヘッジホッグタンパク質プロセシングドメイン（Ｈｈ−Ｃ）は、タンパク質切断のみが起こるように、コレステロール転移部分を欠失するように短縮されていてもよい。Ｈｈ−Ｃが完全に切り出されない場合に備えて、第２のタンパク質部分のＮ末端にシグナルペプチドドメインを包含させると、成熟した第２のタンパク質をＨｈ−Ｃ／第１のタンパク質部分からタンパク質分解によって分離し得る。ポリタンパク質が翻訳によって単一のメッセージから産生されるように、第１の発現タンパク質部分のコード配列と第２のタンパク質部分のコード配列の間に位置するヘッジホッグタンパク質プロセシングドメインを含むポリタンパク質をコードする配列を含む非天然組み換えＤＮＡ分子も、本発明のこの態様の範囲内である。
【００３１】
本発明の更に別の態様は、新規に合成されたフューリンタンパク質を小胞体腔に向けるペプチド領域の付加を特徴とする、修飾フューリンである。本明細書に記載のインテイン又は修飾インテイン戦略も包含する。
【００３２】
本発明の別の態様は、ポリタンパク質／自己プロセシング、インテインプロセシング、シグナルペプチド切断又はタンパク質分解性切断手法の二重ハイブリッド及び三重ハイブリッド（及び変種）技術への適用である。第１及び第２又は第１、第２及び第３のタンパク質は、適切な宿主細胞において単一の転写物からポリタンパク質として発現され、これらのタンパク質のコード配列は、自己プロセシング部位（例えば、２Ａ）、インテイン、シグナルペプチド又はプロテアーゼ認識部位によって分離されている。この戦略は、１種類を超えるベクターを用いた同時移入を不要にし、又は従来のように、各タンパク質を単一の転写物から発現させることによって同時移入を不要にする。本発明の結果、経済性、効率及びタンパク質発現が改善され、結合対候補は互いに近接して、結合相手と結合しやすくなると考えられる。特定の一実施形態においては、ポリタンパク質は、ベイト（ｂａｉｔ）タンパク質と、目的ベイトタンパク質と相互作用する１種類以上のプレイ（ｐｒｅｙ）タンパク質候補である、自己プロセシング、インテイン、シグナルペプチド又はプロテアーゼ認識配列及び挿入ｃＤＮＡ配列とを含む。このクローニング及び発現戦略を図８及び９に模式的に示す。
【００３３】
一実施形態においては、本発明は、構築物の５’末端にある単一のプロモーターと、別々のタンパク質をコードする２個以上のエクステイン配列、及び発現される最後のエクステイン配列を除いて、各エクステイン配列のカルボキシ末端コード部分と融合した１個以上のインテイン配列を含むインテイン含有単位と、最後のエクステインタンパク質コード配列に続くポリアデニル化シグナルを含む３’末端配列とを含む細胞中で、複数の遺伝子産物を発現させるためのＤＮＡ構築物を提供する。インテイン含有単位は、エクステインによってコードされたタンパク質に隣接する少なくとも１個のインテインを含む前駆体タンパク質として発現される。インテインの少なくとも１個は、エクステインの切り出しを触媒し得るものである。好ましくは、少なくとも１個のアミノ酸残基は、切り出されたエクステインがインテインによって連結されないように、インテイン含有単位中で置換されており、又はインテイン含有単位に付加している。特定の一実施形態においては、エクステイン配列の少なくとも２個が、タンパク質として発現した後に、多量体組立てにおいて会合可能である、構築物が形成される。一実施形態においては、少なくとも２個のエクステイン配列は、免疫グロブリン又は他の抗原認識分子をコードし得る。一実施形態においては、少なくとも１個のエクステイン配列は、タンパク質として発現した後に、細胞外分泌可能である。一実施形態においては、少なくとも１個のエクステイン配列は、ほ乳動物の遺伝子である。
【００３４】
複数の実施形態においては、本発明は、修飾又は非修飾インテインを用いた免疫グロブリン発現のための構築物及び方法を提供する。発現された免疫グロブリンセグメントは再連結／融合せず、それによって、組み立てられた抗体を複数のサブユニットから産生し得る。特定の一実施形態においては、修飾インテインは、Ｃエクステインの第１の位置にあるアミノ酸残基中に変化を含む。特定の一実施形態においては、インテインセグメント内の最後から２番目のアミノ酸に変化がある。
【００３５】
複数の実施形態においては、本発明は、任意の遺伝子又は遺伝子の組合せの発現のための構築物及び方法を提供する。特定の一実施形態においては、Ｃエクステインは修飾されている。更なる特定の一実施形態においては、Ｃエクステインは、シグナル配列を用いて修飾されている。別の特定の実施形態においては、末端Ｃエクステイン成分が欠如している。
【００３６】
複数の実施形態においては、本発明は、インテイン又はヘッジホッグ自動プロセシングドメインの後に位置する、免疫グロブリンの第２の鎖（重鎖又は軽鎖）、及び必要であれば第３の鎖に対する修飾シグナルペプチドを用いた、抗体遺伝子の発現のための構築物及び方法を提供する。一実施形態においては、セグメントの順序は以下のとおりである：第１の鎖−第１のインテイン又はヘッジホッグ−第１の修飾シグナルペプチド−第２の鎖−第２の修飾シグナルペプチド−第３の鎖（２本の鎖の場合、例えば、第３の鎖又は「第２の修飾シグナルペプチド−第３の鎖」セグメントは削除される。）。別の実施形態においては、第２のインテイン又はヘッジホッグセグメントは、第２の鎖の後に含まれる。特定の一実施形態においては、かかる修飾シグナルペプチドを使用すると、抗体分泌が増加する。一実施形態においては、使用したシグナルペプチドを修飾して疎水性を低下させる。一実施形態においては、シグナルペプチドは非修飾である。
【００３７】
複数の実施形態においては、ｓＯＲＦベクターは、一過性発現のために与えられる。他の実施形態においては、ｓＯＲＦベクターは、安定な発現系において与えられる。一実施形態においては、安定な宿主細胞は、当分野で理解されているように、例えば、形質移入及び他の技術によって、作製される。
【００３８】
腫よう壊死因子α（アルファ）に特異的である抗体を発現させるための多数の例示的構築物を本明細書に具体的に開示するが、構築物は、他のタンパク質をコードする配列の置換と同じ戦略によって容易に調製することができると理解される。特定の例としては、他の免疫グロブリン及び生物学的治療薬分子が挙げられる。更なる特定の例としては、Ｅ／Ｌセレクチン、インターロイキン１２、インターロイキン１８若しくはエリスロポイエチン受容体に特異的な抗体、又はアミノ酸配列及び／又はコード配列が当技術に利用可能である所望の特異性を有する任意の他の抗体が挙げられる。
【００３９】
一実施形態においては、本発明は、ｓＯＲＦ挿入断片を含む１種類以上の組み換えタンパク質産物を産生するベクターを提供する。前記ｓＯＲＦ挿入断片は、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列と、第１のタンパク質切断部位をコードする第１の介在核酸配列と、第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列とを含み、前記第１のタンパク質切断部位をコードする前記介在核酸配列は、前記第１の核酸配列と前記第２の核酸配列との間に作動可能に位置し、前記発現ベクターは、前記第１のタンパク質切断部位において切断可能であるｓＯＲＦポリペプチドを発現可能である。一実施形態においては、前記第１のタンパク質切断部位は、自己プロセシング切断部位を含む。
【００４０】
一実施形態においては、自己プロセシング切断部位は、インテインセグメント又は修飾インテインセグメントを含み、修飾インテインセグメントは、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとの切断を可能にするが、両者を完全に連結することはできない。一実施形態においては、自己プロセシング切断部位は、ヘッジホッグセグメント又は修飾ヘッジホッグセグメントを含み、修飾ヘッジホッグセグメントは、前記第１のポリペプチドを前記第２のポリペプチドから切断可能にする。一実施形態においては、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは、多量体組立て可能である。一実施形態においては、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドの少なくとも一方は、細胞外分泌可能である。一実施形態においては、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドの少なくとも一方は、ほ乳動物起源である。
【００４１】
一実施形態においては、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドの少なくとも一方は、免疫グロブリン重鎖又はその機能的断片を含む。一実施形態においては、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドの少なくとも一方は、免疫グロブリン軽鎖又はその機能的断片を含む。一実施形態においては、前記第１のポリペプチドは免疫グロブリン重鎖又はその機能的断片を含み、前記第２のポリペプチドは免疫グロブリン軽鎖又はその機能的断片を含み、前記第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは任意の順序である。一実施形態においては、前記第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは、多量体組立てにおいて会合して、機能的抗体又は他の抗原認識分子を形成可能である。
【００４２】
一実施形態においては、前記第１のポリペプチドは、前記第２のポリペプチドの上流にある。一実施形態においては、前記第２のポリペプチドは、前記第１のポリペプチドの上流にある。
【００４３】
一実施形態においては、発現ベクターは、第３のポリペプチドをコードする第３の核酸配列を更に含み、前記第３の核酸配列は前記第２の核酸配列の後に作動可能に位置し、前記第３の配列は独立に前記第１の核酸配列又は前記第２の核酸配列のどちらかと同じでも、異なっていてもよい。一実施形態においては、前記第１、第２及び第３のポリペプチドの少なくとも２種類は、多量体組立てにおいて会合可能である。
【００４４】
一実施形態においては、発現ベクターは、第２のタンパク質切断部位をコードする第２の介在核酸配列を更に含み、前記第２の介在核酸配列は前記第１及び前記第２の核酸配列の後に作動可能に位置し、前記第２の介在配列は前記第１の介在核酸配列と同じでも、異なっていてもよい。一実施形態においては、発現ベクターは、第３のポリペプチドをコードする第３の核酸配列と、第２のタンパク質切断部位をコードする第２の介在核酸配列とを更に含み、第２の介在核酸配列と第３の核酸配列はこの順で前記第２の核酸配列の後に作動可能に位置する。一実施形態においては、前記第３の核酸配列は、免疫グロブリン重鎖、軽鎖、又はそれぞれにその機能的断片をコードする。一実施形態においては、前記第３の核酸配列は、免疫グロブリン軽鎖又はその機能的断片をコードする。一実施形態においては、前記第３の核酸配列は、免疫グロブリン重鎖又はその機能的断片をコードする。
【００４５】
発現ベクターの一実施形態においては、第１のタンパク質切断部位をコードする前記第１の介在核酸配列は、シグナルペプチド切断部位又は修飾シグナルペプチド切断部位の配列をコードするシグナルペプチド核酸を含む。一実施形態においては、発現ベクターは、前記第１の核酸配列又は前記第２の核酸配列の前に作動可能に位置する、シグナルペプチド切断部位をコードするシグナルペプチド核酸配列を更に含む。
【００４６】
一実施形態においては、発現ベクターは、シグナルペプチド切断部位を各々独立にコードする２個のシグナルペプチド核酸配列を更に含み、一方のシグナルペプチド核酸配列は、前記第１のポリペプチドをコードする前記第１の核酸の前に作動可能に位置し、もう一方のシグナルペプチド核酸配列は、前記第２のポリペプチドをコードする前記第２の核酸の前に作動可能に位置する。複数の実施形態においては、２個のシグナルペプチド配列は、同じであり、又は異なる。
【００４７】
一実施形態においては、シグナルペプチド核酸配列は、免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド切断部位又は修飾免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド切断部位をコードする。一実施形態においては、シグナルペプチド核酸配列は、修飾又は非修飾免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド切断部位をコードし、前記修飾部位は、前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、及び前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとの集合分子の少なくとも１つを切断し、その分泌を増大させることが可能であり、前記シグナルペプチド部位の存在下の分泌レベルは、前記シグナルペプチド部位の非存在下の分泌レベルの約１０％から約１００倍大きい。
【００４８】
一実施形態においては、第１のタンパク質切断部位をコードする前記介在核酸配列は、パイロコッカス  ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）Ｐｈｏ  Ｐｏｌ  Ｉ配列、サッカロミセス  セレビシエＶＭＡ配列、シネコシスティス種Ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ６８０３  ＤｎａＥ配列、マイコバクテリウム  ゼノピ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｅｎｏｐｉ）ＧｙｒＡ配列、パイロコッカス種ＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ａ型細菌インテイン様（ＢＩＬ）ドメイン及びＢ型ＢＩＬからなる群から選択されるインテイン又は修飾インテイン配列を含む。
【００４９】
一実施形態においては、第１のタンパク質切断部位をコードする介在核酸配列は、ヘッジホッグファミリーメンバーのＣ末端自動プロセシングドメインを含み、ヘッジホッグファミリーメンバーは、ショウジョウバエ、マウス、ヒト、又は他の昆虫若しくは動物種に由来する。一実施形態においては、第１のタンパク質切断部位をコードする介在核酸配列は、線虫由来のｗａｒｔｈｏｇ、ｇｒｏｕｎｄｈｏｇ、又は他のホッグ含有遺伝子からのＣ末端自動プロセシングドメイン、又は襟鞭毛虫由来のＨｏｇｌｅｔドメインを含む。
【００５０】
一実施形態においては、第１及び前記第２のポリペプチドは、腫よう壊死因子α、エリスロポイエチン受容体、ＲＳＶ、ＥＬ／セレクチン、インターロイキン１、インターロイキン１２、インターロイキン１３、インターロイキン１８、インターロイキン２３、ＣＸＣＬ−１３、ＧＬＰ−１Ｒ及びアミロイドベータからなる群から選択される抗原との結合に対する抗原特異性を有する、機能的抗体又は他の抗原認識分子を含む。一実施形態においては、第１及び第２のポリペプチドは、Ｄ２Ｅ７、ＡＢＴ−００７、ＡＢＴ−３２５、ＥＬ２４６又はＡＢＴ−８７４の抗体由来の１対の免疫グロブリン鎖を含む。一実施形態においては、第１及び第２のポリペプチドは、Ｄ２Ｅ７、ＡＢＴ−００７、ＡＢＴ−３２５、ＥＬ２４６、ＡＢＴ−８７４又は他の抗体の類似のセグメントに由来する、免疫グロブリン重鎖又は免疫グロブリン軽鎖セグメントから各々独立に選択される。
【００５１】
一実施形態においては、ベクターは、前記ｓＯＲＦ挿入断片に対するプロモーター調節エレメントを更に含む。一実施形態においては、前記プロモーター調節エレメントは誘導性又は構成的である。一実施形態においては、前記プロモーター調節エレメントは組織特異的である。一実施形態においては、前記プロモーターは、アデノウイルス主要後期プロモーターを含む。
【００５２】
一実施形態においては、ベクターは、前記第１のタンパク質切断部位を切断可能であるプロテアーゼをコードする核酸を含む。一実施形態においては、プロテアーゼをコードする前記核酸は、前記ｓＯＲＦ挿入断片内に作動可能に位置し、前記発現ベクターは、プロテアーゼをコードする前記核酸と、前記第１の核酸と前記第２の核酸の少なくとも一方との間に位置する第２の切断部位をコードする追加の核酸を更に含む。
【００５３】
一実施形態においては、本発明は、本明細書に記載のベクターを含む宿主細胞を提供する。一実施形態においては、宿主細胞は原核細胞である。一実施形態においては、前記宿主細胞はエシェリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。一実施形態においては、前記宿主細胞は真核細胞である。一実施形態においては、前記真核細胞は、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞及び真菌細胞からなる群から選択される。一実施形態においては、前記真核細胞は、ほ乳動物細胞、トリ細胞及び昆虫細胞からなる群から選択される動物細胞である。好ましい実施形態においては、前記宿主細胞は、ＣＨＯ細胞又はジヒドロ葉酸還元酵素欠乏ＣＨＯ細胞である。一実施形態においては、前記宿主細胞はＣＯＳ細胞である。一実施形態においては、前記宿主細胞は酵母細胞である。一実施形態においては、前記酵母細胞はサッカロミセス  セレビシエである。一実施形態においては、前記宿主細胞は昆虫ヨトウガＳｆ９細胞である。一実施形態においては、前記宿主細胞はヒト胎児腎細胞である。
【００５４】
一実施形態においては、本発明は、宿主細胞を培地中で、ベクタータンパク質の発現に十分な条件下で培養することを含む、組み換えポリタンパク質又は複数のタンパク質を製造する方法を提供する。一実施形態においては、方法は、前記ベクタータンパク質の回収及び／又は精製を更に含む。一実施形態においては、前記複数のタンパク質は、多量体組立て可能である。一実施形態においては、組み換えポリタンパク質又は複数のタンパク質は、生物学的に機能的であり、及び／又は治療効果がある。
【００５５】
一実施形態においては、本発明は、請求項３８に記載の宿主細胞を培地中で、免疫グロブリンタンパク質若しくはその機能的断片、組み立てられた抗体、又は他の抗原認識分子の製造に十分な条件下で培養することを含む、免疫グロブリンタンパク質若しくはその機能的断片、組み立てられた抗体、又は他の抗原認識分子を製造する方法を提供する。
【００５６】
一実施形態においては、本発明は、本明細書の方法によって製造されるタンパク質又はポリタンパク質を提供する。一実施形態においては、本発明は、本明細書の方法によって製造される、組み立てられた免疫グロブリン、組み立てられた他の抗原認識分子、又は個々の免疫グロブリン鎖若しくはその機能的断片を提供する。一実施形態においては、免疫グロブリン、他の抗原認識分子、又は個々の免疫グロブリン鎖若しくはその機能的断片は、腫よう壊死因子α、エリスロポイエチン受容体、インターロイキン１８、ＥＬ／セレクチン又はインターロイキン１２との特異的抗原結合をもたらす能力があり、又はその一因となる能力がある。一実施形態においては、免疫グロブリンはＤ２Ｅ７であり、又は機能的断片はＤ２Ｅ７の断片である。
【００５７】
一実施形態においては、本発明は、タンパク質と薬剤として許容される担体とを含む、薬剤組成物又は医薬品を提供する。薬剤用の賦形剤及び担体は、当分野で理解されているように選択される。
【００５８】
一実施形態においては、本発明は、第１のタンパク質切断部位が、細胞のプロテアーゼ切断部位、又はウイルスのプロテアーゼ切断部位を含む、発現ベクターを提供する。一実施形態においては、前記第１のタンパク質切断部位は、フューリン；ＩＰＮＶのＶＰ４；タバコ  エッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ；ライノウイルスの３Ｃプロテアーゼ；ＰＣ５／６プロテアーゼ；ＰＡＣＥプロテアーゼ、ＬＰＣ／ＰＣ７プロテアーゼ；エンテロキナーゼ；活性化第Ｘ因子プロテアーゼ；トロンビン；ｇｅｎｅｎａｓｅ  Ｉ；ＭＭＰプロテアーゼ；カブモザイクポティウイルスの核封入タンパク質ａ（Ｎ１ａ）；デング熱４型フラビウイルスのＮＳ２Ｂ／ＮＳ３、黄熱病ウイルスのＮＳ３プロテアーゼ；カリフラワーモザイクウイルスのＯＲＦ  Ｖ；ＫＥＸ２プロテアーゼ；ＣＢ２；又は２Ａによって認識される部位を含む。一実施形態においては、前記第１のタンパク質切断部位は、ウイルスの内部切断可能なシグナルペプチド切断部位である。一実施形態においては、ウイルスの内部切断可能な前記シグナルペプチド切断部位は、インフルエンザＣウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ハンタウイルス、フラビウイルス又は風疹ウイルス由来の部位を含む。
【００５９】
一実施形態においては、本発明は、二重ハイブリッド系がベイトタンパク質とプレイタンパク質候補とを含み、ベイトタンパク質部分とプレイタンパク質候補部分とを含むポリタンパク質をコードする発現ベクターが導入された宿主細胞を用意する段階であって、前記各部分が自己プロセシング切断配列、シグナルペプチド配列又はプロテアーゼ切断部位によって分離されている段階と、ポリタンパク質の発現、及びポリタンパク質の自己プロセシング又はプロテアーゼ切断が可能である条件下で宿主細胞を培養する段階とを含む、二重ハイブリッド系のタンパク質の発現方法を提供する。一実施形態においては、ポリタンパク質は、三重ハイブリッド系の切断可能成分を更に含む。
【００６０】
一実施形態においては、発現ベクターは２Ａ配列を含まない。一実施形態においては、前記第１のタンパク質切断部位が、ＦＭＤＶ  ２Ａ配列、又は他のピコルナウイルス科、昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルス、トリパノソーマ若しくはサーモトガ  マリチマ（Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）由来の２Ａ様ドメインを含む、発現ベクターを提供する。
【００６１】
一実施形態においては、本発明は、ポリタンパク質のコード配列を含む、組み換えタンパク質を発現する発現ベクターを提供する。ポリタンパク質は、少なくとも第１及び第２のタンパク質セグメントを含み、前記各タンパク質セグメントは、その間のタンパク質切断部位によって分離されており、タンパク質切断部位は、自己プロセシングペプチド切断配列、シグナルペプチド切断配列又はプロテアーゼ切断配列を含み、前記コード配列は、宿主細胞中で発現可能であり、宿主細胞内で切断される。
【００６２】
一実施形態においては、本発明は、介在核酸配列がタグを更にコードする、発現ベクターを提供する。
【００６３】
本発明の他の態様、特徴及び利点は、添付図面と併せて、開示目的で示す、以下の本発明の説明から明らかである。
【００６４】
一般に、本明細書において使用する用語及び句は、当業者に公知の標準の教科書、学術雑誌及びコンテクストを参照することによって見出すことができる、その分野で認識されている意味を有する。本明細書に規定する定義は、本発明の状況においてその具体的な使用を明らかにするものである。
【００６５】
特定の理論に拘泥するものではないが、本発明に関係する基本原理又は機序の考え又は理解について本明細書で考察する。説明又は仮説の最終的な正確さにかかわらず、本発明の一実施形態が有効であり、有用であることを認識されたい。
（発明の詳細）
【００６６】
以下の説明及び非限定的例によって、本発明を更に理解することができる。
【００６７】
本発明は、酵素、ホルモン（例えば、インスリン）、サイトカイン、ケモカイン、受容体、抗体、他の分子などの構造タンパク質又は生物活性タンパク質の発現のための系、例えば、構築物及び方法を提供する。好ましくは、タンパク質は、インターロイキン、完全長免疫グロブリン、その断片、当分野で理解されている他の抗原認識分子などの免疫調節性タンパク質、又は他の生物学的治療薬分子である。かかるシステムの概要は、組み換え製造が、単一のプロモーターの転写制御下にある重鎖及び軽鎖コード配列の発現に基づき、単一の翻訳産物（ポリタンパク質）から別々の重鎖及び軽鎖への転化が、各フランキングペプチドをリボソームにおいて翻訳中に分離するインテイン、ホッグ含有自動プロセシングドメイン、２Ａ又は２Ａ様配列によって媒介され、又は成熟生物活性タンパク質の２本の鎖の間に位置する１個以上のプロテアーゼ認識配列におけるタンパク質分解プロセシングの結果である、免疫グロブリン分子の特定の状況におけるものである。
【００６８】
（インテインセグメント、ホッグドメイン、２Ａ若しくは２Ａ様又はプロテアーゼ認識部位及び各々に対するその変形物に関係していても、いなくても）介在部位は、切断部位と称し得る。複数の３個以上のタンパク質セグメントが発現される場合、かかる切断部位は、複数のセグメントの少なくとも任意の２個の間に位置し得、又は切断部位は、各セグメントの後に位置し得、最後のセグメントの後でもよいが、最後のセグメントの後ではないことが好ましい。複数の切断部位を使用する場合には、各々は、別の切断部位と同じでも、無関係でもよい。
【００６９】
一態様においては、本発明は、組み換え免疫グロブリンの発現用ベクターを提供する。このベクターは、免疫グロブリン分子又はその断片の第１の鎖のコード配列に作動可能に結合したプロモーターと、自己プロセシング又は他のタンパク質分解性切断部位をコードする配列と、免疫グロブリン分子又はその断片の第２の鎖のコード配列とを含む。自己プロセシング又は他のタンパク質分解性切断部位をコードする配列は、免疫グロブリン分子の第１の鎖のコード配列と免疫グロブリン分子の第２の鎖のコード配列との間に挿入され、免疫グロブリン軽鎖をコードする第３の領域も、自己プロセシング又は他のタンパク質分解性切断部位によってポリタンパク質の残部から分離されている。
【００７０】
一実施形態においては、免疫グロブリンポリタンパク質分子の第１の鎖又は第２の鎖は、重鎖でも軽鎖でもよい。組み換え免疫グロブリンセグメントをコードする配列は、完全長コード配列又はその断片であり得る。特定の実施形態においては、第２の軽鎖コード配列は、本発明の実施においてプロセシングを受けるポリタンパク質をコードする配列の一部でなければならない。すなわち、まとめると、２本の軽鎖と１本の重鎖を任意の順序で含む３個のセグメントがある。特定の実施形態においては、構築物は、これらの成分で、以下の順序で構成される：ａ）ＩｇＨ−ＩｇＬ、ｂ）ＩｇＬ−ＩｇＨ、ｃ）ＩｇＨ−ＩｇＬ−ＩｇＬ、ｄ）ＩｇＬ−ＩｇＨ−ＩｇＬ、ｅ）ＩｇＬ−ＩｇＬ−ＩｇＨ、ｆ）ＩｇＨ−ＩｇＨ−ＩｇＬ、ｇ）ＩｇＨ−ＩｇＬ−ＩｇＨ、及び／又はｈ）ＩｇＬ−ＩｇＨ−ＩｇＨ。一実施形態においては、ハイフンは、切断部位配列が位置する場所を示し得る。
【００７１】
或いは、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖コード配列は、その間のインテインコード配列にインフレームで融合している。インテインは、スプライシング活性を欠くように修飾され、又は重鎖及び軽鎖の末端は、スプライシングが好ましくは起きないように、若しくはスプライシングが低効率で起きて、スプライシングされていない抗体分子が優勢であるように、設計されている。また、修飾インテインは、軽い及び重い抗体ポリペプチドが、一次翻訳産物の介在インテイン部分から解放されるように、部位特異的タンパク質分解性切断活性が残留しているという条件で、（エンドヌクレアーゼ領域が以前に存在した）エンドヌクレアーゼ領域が存在しないように更に修飾し得る。軽い又は重い抗体ポリペプチドは、Ｎエクステインであり得、Ｃエクステインであり得る。
【００７２】
ベクターは、完全長ポリタンパク質を発現可能である任意の組み換えベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、増殖性アデノウイルスベクター、非増殖性アデノウイルスベクター及びヘルパー依存型アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター若しくは非ウイルスベクター（プラスミド）又は当分野で公知の任意の他のベクターであり得る。免疫グロブリン又は他のタンパク質が発現される宿主細胞に適切なベクターが好ましい。バキュロウイルスベクターは、昆虫細胞における遺伝子発現に利用可能である。多数のベクターが当分野で公知であり、多数のベクターが市販されており、又は当分野に容易に利用することができる。
【００７３】
切断部位
好ましい自己プロセシング切断部位としては、インテイン配列、修飾インテイン、ヘッジホッグ配列、他のホッグファミリー配列、２Ａ配列、例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）由来の２Ａ配列、各々に対するその変形物などが挙げられる。
【００７４】
その認識配列を２Ａ配列の代わりに使用し得るプロテアーゼとしては、上述したように、フューリン、トランスゴルジ網ではなく小胞体を標的とする修飾フューリン、ＩＰＮＶのＶＰ４、ＴＥＶプロテアーゼ、核局在化シグナル欠損ＴＥＶプロテアーゼ（ＴＥＶ  Ｎｌｓ−）、ライノウイルスの３Ｃプロテアーゼ、ＰＣ５／６プロテアーゼ、ＰＡＣＥプロテアーゼ、ＬＰＣ／ＰＣ７プロテアーゼ、エンテロキナーゼ、Ｘａプロテアーゼ、トロンビン、ｇｅｎｅｎａｓｅ  Ｉ、ＭＭＰプロテアーゼなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。本発明の実施において有用である他のエンドプロテアーゼは、カブモザイクポティウイルスの核封入タンパク質ａ（Ｎ１ａ）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２１：２４５−２４９）；デング熱４型（ＤＥＮ４）フラビウイルスのＮＳ２Ｂ／ＮＳ３（Ｆａｌｇｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７：２０３４−２０４２；  Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４．  Ａｒｃｈ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｓｕｐｐｌ．  ９：３５９−３６８）、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）のＮＳ３プロテアーゼ（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５：６０４２−６０５０）；カリフラワーモザイクウイルスのＯＲＦ  Ｖ（Ｔｏｒｒｕｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．  １９８９．  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ８：２８１９−２８２５）；その例がＰｓｐ−ＧＢＤ  Ｐｏｌインテイン（Ｘｕ，  Ｍ．Ｑ．  １９９６．  ＥＭＢＯ  １５：５１４６−５１５３）である、インテイン；その例がインフルエンザＣウイルスの内部切断可能シグナルペプチドである、内部切断可能シグナルペプチド（Ｐｅｋｏｓｚ  Ａ．  １９９２．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：３２３３−１３２３８）；及びＫＥＸ２プロテアーゼ、ＭＹＫＲ−ＥＡＤ（配列番号９）；ＫＥＸ２、及びＥＲを標的にした修飾ＫＥＸ２（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１０：８１１−８２２参照）を含めて、ただしこれらだけに限定されないプロテアーゼである。ＥＲを唯一の対象とする修飾ＫＥＸ２は、それぞれ表７Ａ及び７Ｂに示すコード配列及びアミノ酸配列を有し、ＫＥＸ２−ｓｏｌ−ＫＤＥＬと呼ばれる。サッカロミセス  セレビシエ由来のＫＥＸ２の一次アミノ酸配列は、膜結合ドメインを除去し、タンパク質のＣ末端においてＥＲターゲティング配列ＫＤＥＬを付加するように修飾された。適切な切断認識部位を含むポリタンパク質の切断に有用である他のヒトプロテアーゼとしては、米国特許出願公開第２００５／０１１２５６５号に記載のヒトプロテアーゼなどが挙げられる。キイロショウジョウバエ由来のソニックヘッジホッグタンパク質、特にそのプロセシングドメインは、ポリタンパク質一次翻訳産物からタンパク質を解放するのにも役立ち得る。
【００７５】
トランスゴルジ網（ＴＧＮ）ではなく小胞体（ＥＲ）を標的とする修飾フューリンプロテアーゼは、天然フューリンプロテアーゼ同様、本発明の範囲内である。Ｖｏｒｈｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５．  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １４：４９６１−４９７５は、フューリンのＥＥＤＥ（配列番号１０）部分（アミノ酸７７５−７７８）がＴＧＮに対するプロテアーゼのターゲティングに関与すると記述した（Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３２７：６２５−６３５）。Ｚｅｒａｎｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８：２４３１−２４３６は、タンパク質のＣ末端におけるＫＫＸＸを含めた、ＥＲ輸送シグナルを報告した。このように、修飾フューリンが開発され、フューリン切断活性を、ＴＧＮ及びその後の区画の代わりに、又はそれらに加えて、ＥＲ区画に向けるのに使用される。
【００７６】
更に別の態様においては、ベクターは、免疫グロブリン分子又はその断片の第１の鎖のコード配列と、免疫グロブリン分子の第２の鎖及び／又は第３の鎖（例えば、第１又は第２の鎖の複製）又はその断片のコード配列との間に位置する（すなわち、２Ａ切断部位であり得る、切断部位配列に隣接する）、追加の切断部位をコードする配列を含む。例示的一手法においては、追加のタンパク質分解性切断部位は、コンセンサス配列ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１）を有するフューリン切断部位である。
【００７７】
プロモーターを含む調節配列；宿主細胞
組み換え免疫グロブリン又は他のタンパク質の発現用ベクターは、当分野で公知である幾つかのプロモーターのいずれかを含み得る。ここで、プロモーターは、構成的、調節可能若しくは誘導性、細胞タイプ特異的、組織特異的又は種特異的である。更なる具体例としては、例えば、テトラサイクリン応答性プロモーターが挙げられる（Ｇｏｓｓｅｎ  Ｍ，  Ｂｕｊａｒｄ  Ｈ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９２，  １５；８９（１２）：５５４７−５１）。ベクターは、キメラ遺伝子が発現される宿主細胞に適応されるレプリコンであり、細菌細胞においても同様に機能的であるレプリコンを含むことも望ましく、有利には、分子生物学的操作に好都合な細胞であるエシェリキア  コリである。
【００７８】
遺伝子発現用宿主細胞は、動物細胞、特にほ乳動物細胞であり得、又は微生物細胞（細菌、酵母、真菌、ただし好ましくは真核生物）若しくは植物細胞であり得る。特に適切な宿主細胞としては、ヨトウガ細胞などの昆虫培養細胞、サッカロミセス  セレビシエ、ピキア  パストリスなどの酵母細胞、トリコデルマ  リーセイ、アスペルギルス、アウレオバシジウム、ペニシリン種などの真菌、及びＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎）、ＣＯＳ、２９３、３Ｔ３（マウス）、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル）細胞などのほ乳動物細胞などが挙げられる。ブタ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシを含めて、ただしこれらだけに限定されない種々のトランスジェニック動物系も同様に使用することができる。卵白中での発現用のヒヨコ系並びにトランスジェニックヒツジ、ヤギ及びウシ系は、とりわけ、乳中での発現用に知られている。バキュロウイルスベクター、特にＡｃＮＰＶベクターは、例えばポリヘドリンプロモーター、又は昆虫細胞系における他の強力なプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅ）の調節性制御下にあるｓＯＲＦの発現によって、本発明の単一のＯＲＦ抗体発現及び切断に使用することができる。かかるベクター及び細胞系は当分野で周知であり、市販されている。ほ乳動物細胞に使用されるプロモーターは、構成的（ヘルペスウイルスＴＫプロモーター、ＭｃＫｎｉｇｈｔ，  Ｃｅｌｌ  ３１：３５５，  １９８２；ＳＶ４０初期プロモーター、Ｂｅｎｏｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４，  １９８１  ラウス肉腫ウイルスプロモーター、Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７９：６７７７，  １９８２；サイトメガロウイルスプロモーター、Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  ４５：１０１，  １９８０；マウス乳癌ウイルスプロモーター、一般にＥｔｃｈｅｖｅｒｒｙ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｃｌｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ，  ｐｐ．１６２−１８１，  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９６参照）であり得、又は調節することができる（メタロチオネインプロモーター、例えば、Ｈａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １：２７３，  １９８２）。ベクターは、特定のほ乳動物細胞、特にレトロウイルス、ワクシニア及びアデノウイルスに感染するウイルスに基づくことができ、それらの誘導体は、当分野で公知であり、市販されている。プロモーターとしては、サイトメガロウイルス、アデノウイルス後期、ワクシニア７．５Ｋプロモーターなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。酵母及び真菌のベクター（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ，  Ｊ．Ｗ．  ａｎｄ  Ｌａｓｕｒｅ，  Ｌ．Ｌ．（ｅｄｓ．），  Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ，  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ中のＶａｎ  ｄｅｎ  Ｈａｎｄｅｌ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），  ３９７−４２８参照）及びプロモーターも周知であり、広範に利用可能である。エノラーゼは周知の構成的酵母プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼは周知の調節されたプロモーターである。
【００７９】
特定のプロモーター、転写終結配列、及び組織特異的配列をコードする配列などの他の任意の配列の選択は、その中での発現が望まれる細胞タイプによって主に決定される。細菌、酵母、真菌、ほ乳動物、昆虫、ヒヨコ又は他の動物細胞であり得る。
【００８０】
シグナル配列
ベクターに取り込まれる、切断、タンパク質分解性プロセシング又は自己プロセシングを受けるタンパク質のコード配列は、１個以上のシグナル配列をコードする１個以上の配列を更に含み得る。これらのコードされたシグナル配列は、ポリタンパク質内の１個以上の成熟セグメントと結合し得る。例えば、免疫グロブリン重鎖リーダー配列をコードする配列は、ポリタンパク質コード配列の残部とインフレームで作動可能に結合した、重鎖のコード配列に先行し得る。同様に、軽鎖リーダーペプチドコード配列又は他のリーダーペプチドコード配列は、免疫グロブリン軽鎖コード配列の一方又は両方とインフレームで結合し得る。リーダー配列鎖は、隣接鎖によって（２Ａなどの）自己プロセシング部位から分離され、又はプロテアーゼ認識配列をコードする配列によって分離され、適切な読み枠が維持される。
【００８１】
免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の化学量論
本明細書の多数の実施形態においては、免疫グロブリン／抗体軽鎖（ＩｇＬ）及び重鎖（ＩｇＨ）は、ベクターレベルで、又は発現された細胞内レベルで、宿主細胞内に約１：１（ＩｇＬ：ＩｇＨ）で存在する。本明細書等の組み換え手法は、重鎖と軽鎖の等モルの発現に依拠するが（例えば、米国特許出願公開第２００５／０００３４８２号Ａ１又は国際公開第２００４／１１３４９３号参照）、他の実施形態においては、本発明は、一次翻訳産物がポリタンパク質であるときに、軽鎖と重鎖のコード配列の比が２：１であり、鎖の自己プロセシング又はタンパク質分解プロセシングと同時発現される、方法、発現カセット及びベクターを提供する。複数の実施形態においては、比は約２：１又は２：１よりも大きいなど、１：１よりも大きい。特定の一実施形態においては、軽鎖コード配列は、１：１（ＩｇＬ：ＩｇＨ）を超える比で使用される。特定の実施形態においては、ＩｇＬ：ＩｇＨ比は２：１である。
【００８２】
本発明は、免疫グロブリン（すなわち、抗体）の重鎖及び１本又は少なくとも２本の軽鎖をコードする配列と、その間の自己プロセシング、プロテアーゼ認識部位、シグナルペプチドなどの切断部位をコードする配列とを含み、追加のタンパク質分解性切断部位をコードする配列を更に含み得る、ベクターで転換された、又はベクターに感染した、宿主細胞又は宿主細胞の安定なクローンを更に提供する。完全長組み換え免疫グロブリン若しくはその断片、又は複数のサブユニット（例えば、二連鎖（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ）若しくは多連鎖（ｍｕｌｔｉ−ｃｈａｉｎ）分子、又はプロタンパク質として天然に産生され、切断若しくはプロセシングされて、前駆体から誘導されるタンパク質及び活性部分を遊離するもの）を含む他の生物活性タンパク質の産生における、かかる細胞又はクローンの使用も本発明の範囲に含まれる。非限定的例としては、インスリン、インターロイキン１８、インターロイキン１、骨形成タンパク質４、骨形成タンパク質２、任意の他の二連鎖骨形成タンパク質、神経成長因子、レニン、キモトリプシン、トランスフォーミング成長因子β及びインターロイキン１βが挙げられる。
【００８３】
関係する態様においては、本発明は、かかる細胞又はクローンによって産生される、組み換え免疫グロブリン分子若しくはその断片又は他のタンパク質、並びにこれらを製造する方法、ベクター及び宿主細胞を提供する。免疫グロブリンは、（インテイン、ヘッジホッグドメインなどの）自己プロセシング切断部位、切断部位又はシグナルペプチド切断から誘導されるアミノ酸を含む。複数の実施形態においては、本発明は、本明細書に記載の１種類以上の構築物を含む宿主細胞を提供する。
【００８４】
本発明は、免疫グロブリン分子又はその断片の発現用の単一のベクター構築物、及び該ベクター構築物をインビトロ又はインビボで使用する方法を提供する。ベクターは、第１の免疫グロブリンコード配列と第２の免疫グロブリンコード配列の間、及び第２の免疫グロブリンコード配列と第３の免疫グロブリンコード配列の間に、自己プロセシング又は他のプロテアーゼ認識配列を有し、単一のプロモーター及び転写物を用いた機能的抗体分子の発現を可能にする。例示的なベクター構築物は、オープンリーディングフレーム間の自己プロセシング切断部位をコードする配列を含み、切断後に、自己プロセシング切断部位を含むアミノ酸を除去するための自己プロセシング切断部位に隣接する追加のタンパク質分解性切断部位を更に含み得る。ベクター構築物は、完全長生物活性免疫グロブリン又はその断片のインビトロ及びインビボでの産生の増加に関連する方法に有用である。少なくとも２本の異なる鎖を有する他の生物活性タンパク質も同じ戦略によって製造することができるが、一方の鎖のコード配列が他方の鎖のコード配列に対して１を超える比で存在する必要は必ずしもないと理解される。
【００８５】
特定の組成物及び方法を本明細書に例示するが、幾つかの代替の組成物及び方法のいずれでも本発明の実施に使用するのに適用可能であり、適切であると理解される。本発明のポリタンパク質発現カセット及びベクター、宿主細胞並びに方法の評価は、当分野で標準の手順によって実施し得ることも理解されたい。本発明の実施は、別段の記載がない限り、当業者の範囲内である、細胞生物学、（組み換え技術を含めた）分子生物学、微生物学、生化学及び免疫学の従来技術を使用する。かかる技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．  Ｇａｉｔ，  ｅｄ．，  １９８４）、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  ｅｄ．，  １９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．  Ｗｅｉｒ  ＆  Ｃ．Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，  ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．  Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｐ．  Ｃａｌｏｓ，  ｅｄｓ．，  １９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９９３）、ＰＣＲ：  Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９９４）及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９９１）などの文献に詳細に説明されている。これらの各々を参照により本明細書に明確に組込む。
【００８６】
別段の記載がない限り、本明細書において使用する全用語は、当業者に対するものと同じ意味を有する。本発明の実施は、当業者の知識の範囲内である、微生物学及び組み換えＤＮＡ技術の従来技術を使用する。
【００８７】
タンパク質に関連して本明細書において一般に使用する「修飾」という用語は、少なくとも１個のアミノ酸残基が基準分子において置換された、基準分子から除去された、又は基準分子に付加された、セグメントを指す。同様に、核酸に関連して、この用語は、少なくとも１個の核酸サブユニットが基準分子において置換された、基準分子から除去された、又は基準分子に付加された、セグメントを指す。
【００８８】
本明細書では「インテイン」という用語は、インテイン自体の除去を促進し、エクステインとして知られるフランキングセグメントを連結する、タンパク質の内部セグメントを典型的には指す。インテインの多数の例が種々のタイプの生物体において認められ、構造的及び／又は機能的特徴を共有する場合もある。本発明は、存在が認められている、また、今後存在が認められ、又は発見される、インテイン及びその変種を広範に使用することができる。例えば、Ｇｏｇａｒｔｅｎ  ＪＰ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００２；５６：２６３−８７；  Ｐｅｒｌｅｒ，  Ｆ．Ｂ．（２００２），  ＩｎＢａｓｅ，  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０，  ３８３−３８４（また、インターネットによる、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｉｐｓｗｉｃｈ，  ＭＡ；  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂ／ｉｎｔｅｉｎｓ．ｈｔｍｌのウェブサイト；  Ａｍｉｔａｉ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００３，  ４７（１）：６１−７３；  Ｇｏｒｂａｌｅｎｙａ  ＡＥ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９８；２６（７）：  １７４１−１７４８．  Ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｉｎｔｅｉｎｓ）を参照されたい。タンパク質においては、インテイン含有単位又はインテインスプライシング単位は、構造的側面が切断、連結などの反応の一因となり得る、フランキングエクステインの一部を包含すると理解される。この用語は、「修飾インテイン」成分を含む、インテインに基づく系に関連したカテゴリーとしても理解される。
【００８９】
本明細書では「修飾インテイン」という用語は、切断又は切り出されたエクステインがインテインによって完全に連結されないように、少なくとも１個のアミノ酸残基が、インテインスプライシング単位において置換された、インテインスプライシング単位から除去された、又はインテインスプライシング単位に付加された、合成インテイン又は天然インテインを指す。
【００９０】
本明細書では「ヘッジホッグ」という用語は、自己タンパク質分解性機能をもたらす構造を有するメンバーを含む遺伝子ファミリー（及び対応するタンパク質セグメント）を指す。ファミリーメンバーとしては、例えば、ショウジョウバエ、マウス、ヒト及び他の種由来の類似体が挙げられる。また、「ヘッジホッグセグメント」という用語は、かかるファミリーメンバーだけを包含するものではなく、シノラブディス  エレガンスなどの線虫由来のｗａｒｔｈｏｇ、ｇｒｏｕｎｄｈｏｇ及び他のホッグ（ｈｏｇ）含有遺伝子の自動プロセシングドメイン、並びに襟鞭毛虫由来のＨｏｇｌｅｔ−Ｃ自動プロセシングドメインにも広範に関係する。例えば、Ｐｅｒｌｅｒ  ＦＢ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ａｕｔｏｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ：  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，  Ｃｅｌｌ．  １９９８，  ９２（１）：１−４；  Ｋｏｏｎｉｎ，  ＥＶ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｌｉｃｅ−ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ  ｉｎ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．  ２０（４）：  １４１−２；  Ｈａｌｌ  ＴＭ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ａｕｔｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ：  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ａｎｄ  ｓｅｌｆ−ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｃｅｌｌ  ９１（１）：  ８５−９７；  Ｓｎｅｌｌ  ＥＡ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｒ．  Ｓｏｃ．  Ｂ（２００６）  ２７３，  ４０１−４０７；  Ａｓｐｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９９９，  ９：９０９−９２３を参照されたい。ヘッジホッグセグメントの特定の例は、キイロショウジョウバエから得られるソニックヘッジホッグタンパク質である。この用語は、「修飾ヘッジホッグ」成分を含む、ヘッジホッグに基づく系に関連したカテゴリーとしても理解される。
【００９１】
「修飾ヘッジホッグ」セグメントという用語は、切断されたセグメントが完全に連結されないように、少なくとも１個のアミノ酸残基が、ヘッジホッグスプライシング単位において置換された、ヘッジホッグスプライシング単位から除去された、又はヘッジホッグスプライシング単位に付加された、合成ヘッジホッグセグメント又は天然ヘッジホッグセグメントを指す。
【００９２】
本明細書では「ベクター」という用語は、１個以上の異種又は組み換えＤＮＡ配列を含み、異なる宿主細胞間を移動するように設計された、プラスミド、ウイルス、他のビヒクルなどのＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指す。「発現ベクター」及び「遺伝子治療ベクター」という用語は、細胞における異種ＤＮＡ断片の取り込み及び発現に有効である任意のベクターを指す。クローニング又は発現ベクターは、追加のエレメントを含み得る。例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有することがあり、したがって２種類の生物体中で、例えば発現用のヒト細胞とクローニング及び増幅用の原核生物宿主中で、維持することができる。タンパク質又はポリペプチドの発現が、例えばウイルスベクター又は非ウイルスプラスミドベクターから得られるように、核酸を細胞に導入するのに有効である任意の適切なベクターを使用することができる。発現に有効な任意の細胞、例えば、昆虫細胞及び酵母、ほ乳動物細胞などの真核細胞は、本発明の実施に有用である。
【００９３】
「異種ＤＮＡ」及び「異種ＲＮＡ」という用語は、これらが存在する細胞又はゲノム若しくはベクターの一部に対して内因性（自然）ではないヌクレオチドを指す。一般に、異種ＤＮＡ又はＲＮＡは、形質導入、感染、移入、転換、電気穿孔法、遺伝子銃による転換などによって細胞に添加される。かかるヌクレオチドは、一般に、少なくとも１個のコード配列を含むが、コード配列は発現されなくてもよい。「異種ＤＮＡ」という用語は、「異種コード配列」又は「導入遺伝子」とも称し得る。
【００９４】
本明細書では「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、区別なく使用することができ、本発明の自己プロセシング切断部位含有ベクターを用いて発現される対象の「タンパク質」及び「ポリペプチド」を典型的には指す。かかる「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、以下に更に記述する研究、診断又は治療目的に有用である任意のタンパク質又はポリペプチドであり得る。本明細書では、ポリタンパク質は、２種類以上のポリペプチド産物を産生するプロセシング用のタンパク質である。
【００９５】
本明細書では「多量体」という用語は、集合して機能的タンパク質を形成する、２本以上の（「サブユニット」と称する場合もある）ポリペプチド鎖からなるタンパク質である。多量体は、２本（２量体）、３本（３量体）、４本（４量体）又は５本以上（例えば、５量体など）のペプチド鎖で構成され得る。多量体は、自己組織化によって生成し得るものであり、又は組立てを補助する触媒などの成分を必要とし得る。多量体は、同一のペプチド鎖のみで構成され（ホモ多量体）、又は２種類以上の異なるペプチド鎖で構成され得る（ヘテロ多量体）。かかる多量体は、構造的又は化学的に機能的であり得る。酵素、ホルモン、抗体、サイトカイン、ケモカイン及び受容体を含めて、ただしこれらだけに限定されない多数の多量体が当分野で知られ、使用されている。したがって、多量体は、生物学的（例えば、薬剤）にも、工業的（例えば、バイオプロセシング／生物生産）にも有用であり得る。
【００９６】
本明細書では「タグ」という用語は、挿入ベクターの１種類以上の発現産物の検出及び／又は精製を可能にするように機能し得る、発現ベクターに取り込むことができるペプチドを指す。かかるタグは当分野で周知であり、標識アビジン（例えば、光学的方法又は比色定量法によって検出することができる蛍光性マーカー又は酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出することができる、ビオチン部分のポリペプチドに対する放射性標識アミノ酸又は付加物（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）などが挙げられる。ＦＬＡＧ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、セルロース結合ドメイン、チオレドキシン、ＮｕｓＡ、ミスチン（ｍｉｓｔｉｎ）、キチン結合ドメイン、クチナーゼ、ＡＧＴ、ＧＦＰなどの親和性タグは、タンパク質発現及び精製系などに広く用いられている。ポリペプチドに対するタグの更なる非限定的例としては、ヒスチジンタグ、放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ又は１５３Ｓｍ）；蛍光タグ（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素タグ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；化学発光タグ；ビオチニル基；二次レポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体用結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される所定のポリペプチドエピトープ；及びガドリニウムキレートなどの磁性剤（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００９７】
本発明のウイルス性遺伝子治療ベクターに関連して本明細書で使用する「複製欠陥のある」という用語は、ウイルスベクターがそのゲノムを独立して更に複製することができず、含むことができないことを意味する。例えば、対象細胞がｒＡＡＶビリオンに感染したときには、異種遺伝子が感染細胞中で発現されるが、感染細胞がＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子並びに補助的な機能遺伝子を欠いているために、ｒＡＡＶを複製することができない。
【００９８】
本明細書では「レトロウイルス導入ベクター」とは、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含み、ベクターのパッケージングに必要なヌクレオチド配列を更に含む発現ベクターを指す。好ましくは、レトロウイルス導入ベクターは、細胞中で導入遺伝子が発現するのに必要な配列も含む。
【００９９】
本明細書では「パッケージング系」とは、組み換えウイルスのパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む１組のウイルス性構築物を指す。典型的には、パッケージング系の構築物は、パッケージング細胞に最終的に取り込まれる。
【０１００】
本明細書では「第二世代」レンチウイルスベクター系とは、アクセサリー遺伝子ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆが除去又は不活性化されたものなど、機能的アクセサリー遺伝子を欠くレンチウイルスパッケージング系を指す。例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １５：８７１−８７５を参照されたい。
【０１０１】
本明細書では「第三世代」レンチウイルスベクター系とは、第二世代ベクター系の諸特性を有し、ｔａｔ遺伝子が除去又は不活性化されたものなど、機能的ｔａｔ遺伝子を更に欠く、レンチウイルスパッケージング系を指す。典型的には、ｒｅｖをコードする遺伝子は、別の発現構築物で与えられる。例えば、Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：８４６３−８４７１を参照されたい。
【０１０２】
ウイルス又はウイルスベクターに関して本明細書で使用する「シュードタイプ化（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）」とは、未変性ウイルスエンベロープタンパク質を異種ウイルスエンベロープタンパク質又は機能的に改変されたウイルスエンベロープタンパク質で置換することを指す。
【０１０３】
組み換えＤＮＡ構築物又はベクターに関連して本明細書で使用する「作動可能に結合した」という用語は、組み換えＤＮＡ構築物又はベクターのヌクレオチド成分が、通常は共有結合していることを意味する。一般に、「作動可能に結合した」ＤＮＡ配列は、隣接し、また、分泌リーダーの場合には、同じ読み枠内で隣接する。しかし、エンハンサーは、発現が上方制御される配列と隣接する必要はない。この用語は、作動可能に位置する、と同じである。
【０１０４】
エンハンサー配列は、プロモーター依存性遺伝子の発現に影響を及ぼし、未変性遺伝子の５’又は３’領域に位置し得る。「エンハンサー」は、隣接遺伝子の転写を刺激又は阻害するシス作用エレメントである。転写を阻害するエンハンサーは「サイレンサー」とも称する。エンハンサーは、コード配列から、また、転写された領域の下流の位置から、数キロ塩基対（ｋｂ）までの距離にわたって、どちらの方向でも機能し得る（すなわち、コード配列と結合し得る。）。また、核マトリックス付着領域（Ｃｈｕｎｇ，  Ｃｅｌｌ，  １９９３，  Ａｕｇ  １３；７４（３）：５０５−１４，  Ｆｒｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００１，  １２：３４９−３５４，  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １０７，  ２００４，  ９５−１０５）など、インスレーター又はクロマチン開始（ｏｐｅｎｉｎｇ）配列は、安定に組み込まれた遺伝子カセットの転写を促進するのに使用し得る。
【０１０５】
本明細書では「遺伝子」又は「コード配列」という用語は、適切な調節配列に作動可能に結合したときに、ポリペプチドにインビトロ又はインビボで転写（ＤＮＡ）及び翻訳（ｍＲＮＡ）される核酸配列を意味する。遺伝子は、コード領域に先行する領域、及びコード領域に続く領域、例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）又は「リーダー」配列、及び３’ＵＴＲ又は「トレーラー」配列、並びに個々のコードセグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン）を含んでも、含まなくてもよい。
【０１０６】
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を誘導し、それによってＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列、すなわち、転写を誘導するのに十分な最小配列である。プロモーター及び対応するタンパク質又はポリペプチドの発現は、細胞型特異的、組織特異的又は種特異的であり得る。プロモーター配列に隣接していても、していなくてもよいエンハンサー配列も本発明の核酸構築物又はベクターに含まれる。
【０１０７】
本明細書において広範に使用する「転写調節配列」又は発現制御配列は、プロモーター配列、及び付随するコード配列の転写を、しばしば栄養又は環境のシグナルに応じて、変調又は調節する物理的に付随する配列を含む。これらの付随する配列は、組織又は細胞の特異的発現、環境シグナルに対する応答、転写を増加又は減少させるタンパク質の結合などを決定し得る。「調節可能プロモーター」は、その活性がシス又はトランス作用因子によって影響を受ける任意のプロモーターである（例えば、外部のシグナル又は薬剤によって活性化される誘導性プロモーター）。
【０１０８】
「構成的プロモーター」は、多数又は全部の組織／細胞型においてほとんどの場合にＲＮＡ生成を誘導する任意のプロモーター、例えば、ほ乳動物細胞においてクローン化ＤＮＡ挿入断片の構成的発現を促進するヒトＣＭＶ最初期エンハンサー／プロモーター領域である。
【０１０９】
「転写調節タンパク質」、「転写調節因子」及び「転写因子」という用語は、本明細書では区別なく使用され、ＤＮＡ応答エレメントに結合し、それによって関連遺伝子の発現を転写的に調節する核タンパク質を指す。転写調節タンパク質は、一般に、ＤＮＡ応答エレメントに直接結合するが、ＤＮＡとの結合は、ＤＮＡ応答エレメントと結合する、又はＤＮＡ応答エレメントに結合される、別のタンパク質との結合を介して間接的であり得る。
【０１１０】
本明細書では「配列内リボソーム進入部位」又は「ＩＲＥＳ」とは、シストロン（タンパク質コード化領域）の開始コドン（ＡＴＧなど）への直接の配列内リボソーム進入を促進し、それによって遺伝子のｃａｐ非依存的翻訳をもたらすエレメントを指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｒ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  １９９０．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １５：４７７−８３）及びＪａｃｋｓｏｎ  Ｒ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｋａｍｉｎｓｋｉ，  Ａ．  １９９５．  ＲＮＡ  １：９８５−１０００を参照されたい。本明細書に記載の例は、シストロンの開始コドンへの直接の配列内リボソーム進入を促進することができる、任意のＩＲＥＳエレメントの使用に関連する。本明細書では「ＩＲＥＳの翻訳調節下」とは、翻訳がＩＲＥＳと関連し、ｃａｐ非依存的に進行することを意味する。例えば、重鎖及び２個の軽鎖コード配列は、２本の鎖を分離するタンパク質分解性又は自己プロセシングの必要なしに、個々のコード配列を分離するＩＲＥＳを介して翻訳することができる。
【０１１１】
「自己プロセシング切断部位」又は「自己プロセシング切断配列」は、翻訳後又は同時翻訳プロセシング切断部位配列として本明細書では定義される。かかる「自己プロセシング切断」部位又は配列とは、２Ａ部位、配列若しくはドメイン、又は２Ａ様部位、配列若しくはドメインによって本明細書では例示される、ＤＮＡ又はアミノ酸配列を指す。本明細書では「自己プロセシングペプチド」は、翻訳後、自己プロセシング切断部位を含むタンパク質又はポリペプチドの迅速な分子内（ｃｉｓ）切断を媒介して、別個の成熟タンパク質又はポリペプチド産物を産生する、自己プロセシング切断部位又は配列をコードするＤＮＡ配列のペプチド発現産物として本明細書では定義される。
【０１１２】
本明細書では「追加のタンパク質分解性切断部位」という用語は、本発明の発現構築物に２Ａ又は２Ａ様配列などの自己プロセシング切断部位に隣接して取り込まれ、切断後に残留する追加のアミノ酸を自己プロセシング切断配列によって除去する手段を提供する、配列を指す。例示的な「追加のタンパク質分解性切断部位」は、本明細書に記載されており、コンセンサス配列ＲＸＫ／Ｒ−Ｒを含むフューリン切断部位が挙げられるが、これだけに限定されない。かかるフューリン切断部位は、フューリン、タンパク質分泌経路内の他のセリンプロテアーゼなどの内因性サブチリシン様プロテアーゼによって切断し得る。
【０１１３】
本明細書では「免疫グロブリン」及び「抗体」という用語は、目的の抗原決定基と結合可能であるＦａ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどの完全な分子及びその断片を指す。かかる「免疫グロブリン」及び「抗体」は、分子量約２３，０００ダルトンの２本の同一の軽いポリペプチド鎖、及び分子量５３，０００−７０，０００の２本の同一の重鎖で構成される。４本の鎖は、「Ｙ」配置でジスルフィド結合によって連結されている。重鎖は、ガンマ（ＩｇＧ）、ミュー（ＩｇＭ）、アルファ（ＩｇＡ）、デルタ（ＩｇＤ）又はイプシロン（ＩｇＥ）として分類され、所与の抗体のエフェクター機能を決定する、免疫グロブリンのクラス名称の基礎である。軽鎖は、カッパ又はラムダとして分類される。本明細書において「免疫グロブリン又はその断片」に言及するときには、かかる「その断片」が、免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片であり、特に完全な免疫グロブリンの結合親和性の少なくとも１０％の結合親和性でその同族リガンドと結合する免疫グロブリン断片であることを理解されたい。
【０１１４】
抗体のＦａｂ断片は、抗体分子の一価の抗原結合性フラグメントである。Ｆｖ断片は、軽鎖の可変領域と、２本の鎖として発現された、重鎖の可変領域とを含む、遺伝子操作された断片である。
【０１１５】
「ヒト化抗体」という用語は、抗体の本来の結合活性を依然として保持しながら、より厳密にヒト抗体に類似するために、非抗原結合領域において１個以上のアミノ酸が置換された、抗体分子を指す。例えば、米国特許第６，６０２，５０３号を参照されたい。
【０１１６】
本明細書では「抗原決定基」という用語は、特定の抗体と接触する分子の断片（すなわち、エピトープ）を指す。タンパク質又は糖タンパク質のタンパク質又はペプチド又は糖ペプチドの多数の領域は、タンパク質の所与の領域又は３次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘導し得る。これらの領域又は構造は、抗原決定基又はエピトープと称する。抗原決定基は、抗体との結合について、完全な抗原（すなわち、免疫応答の誘発に使用される免疫原）と競合し得る。
【０１１７】
本発明の組み換えタンパク質又はポリペプチドに関して、「断片」という用語は、対応する完全長タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列の全部ではないが、その一部と同じアミノ酸配列を有し、対応する完全長タンパク質又はポリペプチドの機能又は活性の少なくとも１つを保持する、ペプチド又はポリペプチドを意味する。断片は、好ましくは、完全長タンパク質又はポリペプチドの少なくとも２０−１００個の隣接アミノ酸残基を含む。
【０１１８】
本明細書では「投与すること」又は「導入すること」という用語は、（免疫グロブリンを含めた）タンパク質を、それを必要とするヒト又は動物に、当分野で公知の任意の経路によって送達することを意味する。薬剤担体及び製剤又は組成物も当分野で周知である。投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、経皮、粘膜、腫よう内、粘膜などが挙げられる。或いは、これらの用語は、細胞若しくは培養細胞、及び又は対象の細胞若しくは器官への組み換えタンパク質発現用ベクターの送達を指し得る。かかる投与すること又は導入することは、インビボ、インビトロ又は生体外で起こり得る。組み換えタンパク質又はポリペプチドの発現用ベクターは、移入（物理的手段（例えば、リン酸カルシウム移入、電気穿孔法、微量注入又はリポフェクション）による細胞への異種ＤＮＡの挿入を典型的には意味する。）、感染（感染体、すなわちウイルスを介した導入を典型的には指す。）、又は形質導入（細胞の安定なウイルス感染、又は一微生物から別の微生物へのウイルス性媒介物（例えば、バクテリオファージ）を介した遺伝物質の移動を典型的には意味する。）によって細胞に導入することができる。
【０１１９】
「形質転換」は、異種ＤＮＡを含む細菌、又は発癌遺伝子を発現し、したがって、連続成長状態に変換された細胞、例えば、腫よう細胞を指すのに典型的には使用される。細胞を「形質転換する」のに使用されるベクターは、プラスミド、ウイルス、他のビヒクルなどである。
【０１２０】
典型的には、細胞は、異種ＤＮＡ（すなわち、ベクター）を細胞に投与、導入又は挿入するための手段に応じて、「形質導入された」、「感染した」、「移入された」又は「転換された」と称される。「形質導入された」、「移入された」及び「転換された」という用語は、異種ＤＮＡの導入方法にかかわらず、本明細書では区別なく使用することができる。
【０１２１】
本明細書では、「安定に転換された」、「安定に移入された」及び「トランスジェニック」という用語は、ゲノムに組み込まれた非天然（異種）核酸配列を有する細胞を指す。安定な移入は、そのゲノムへの組み込みによって、又はエピソーム要素として、安定に複製する移入ＤＮＡを含む娘細胞の集団からなる細胞系又はクローンの樹立によって示される。「移入」は、安定でない、すなわち、一過性である場合もある。一過性移入の場合には、外因性又は異種ＤＮＡが発現されるが、導入された配列は、ゲノムには組み込まれず、又は宿主細胞は複製することができない。
【０１２２】
本明細書では「生体外投与」とは、一次細胞を対象から採取し、ベクターを細胞に投与して、形質導入された、感染した、又は移入された組み換え細胞を産生し、組み換え細胞を同じ又は異なる対象に再投与するプロセスを指す。
【０１２３】
「マルチシストロニック転写物」とは、１つを超えるタンパク質コード領域、又はシストロンを含む、ｍＲＮＡ分子を指す。２つのコード領域を含むｍＲＮＡを「バイシストロニック転写物」と表す。「５’の近位にある」コード領域又はシストロンは、その翻訳開始コドン（通常ＡＵＧ）がマルチシストロニックｍＲＮＡ分子の５’末端に最も近いコード領域である。「５’の遠位にある」コード領域又はシストロンは、その翻訳開始コドン（通常ＡＵＧ）がｍＲＮＡの５’末端に最も近い開始コドンではないものである。
【０１２４】
「５’の遠位にある」及び「下流の」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に隣接しないコード領域を指すのにも同じ意味で使われる。
【０１２５】
本明細書では「同時転写された」とは、２個（又は２個を超える）オープンリーディングフレーム、コード領域又はポリヌクレオチドが、プロモーターを含む単一の転写制御又は調節エレメントの転写制御下にあることを意味する。
【０１２６】
本明細書では「宿主細胞」という用語は、ベクターが形質導入された、ベクターに感染した、ベクターが移入された、又はベクターで転換された、細胞を指す。ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどであり得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で以前に使用された条件であり、当業者には明らかである。「宿主細胞」という用語は、形質導入された、感染した、移入された、又は転換された、最初の細胞及びその子孫を指すことを理解されたい。
【０１２７】
本明細書では「生物活性」及び「生物活性な」という用語は、培養細胞系、又はＥＬＩＳＡプレート中でのリガンド−受容体アッセイなどの無細胞系において、特定のタンパク質に起因する活性を指す。「免疫グロブリン」、「抗体」又はその断片の「生物活性」は、抗原決定基と結合し、それによって免疫機能を促進する能力を指す。ホルモン又はインターロイキンの「生物活性」は、当分野で公知である。
【０１２８】
本明細書では「腫よう」及び「癌」という用語は、正常な成長及び／又は発生の制御を少なくとも部分的に失った細胞を指す。例えば、腫よう又は癌細胞は、しばしば、接触阻止を一般に失い、浸潤性となり得、及び／又は転移能力を有する。
【０１２９】
抗体は、重鎖と軽鎖のヘテロ２量体である免疫グロブリンタンパク質である。典型的な抗体は、結合した、２本の重鎖と２本の軽鎖（又はその機能的断片）とを有する多量体である。抗体は、しばしばアイソタイプに応じて、２量体、３量体、４量体、５量体など、更なる重合体構造次数（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｏｒｄｅｒ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を有し得る。抗体は、ほ乳動物培養発現系において、単一のベクター又は２種類のベクターから、完全長で発現することが極めて困難であることが証明された。抗体の製造には幾つかの方法が現在使用されている。すなわち、「ポリクローナル」抗体を製造するための動物のインビボでの免疫化、モノクローナル抗体を製造するためのＢ細胞ハイブリドーマのインビトロでの細胞培養（参照により本明細書に組込む、Ｋｏｈｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  １９８８．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６：５１１；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８８）及び（例えば、参照により本明細書に組込むＣａｂｉｌｌｙ他、米国特許第６３３１４１５号に記載の）組み換えＤＮＡ技術である。
【０１３０】
免疫グロブリンポリペプチドの基本分子構造は、分子量約２３，０００ダルトンの２本の同一の軽鎖と、分子量５３，０００−７０，０００の２本の同一の重鎖とを含み、４本の鎖はジスルフィド結合によって「Ｙ」配置で連結されていることがよく知られている。アミノ酸配列は、Ｙの上端のＮ末端から各鎖の下端のＣ末端まで伸びる。Ｎ末端は、抗原結合の特異性を与える（約１００アミノ酸長の）可変領域である。
【０１３１】
本発明は、自然の配列（すなわち、抗原による刺激に応じて生成される配列）を有する完全長抗体及び抗体断片、単一の安定に折り畳まれたポリペプチド鎖中の重鎖と軽鎖の両方の抗原結合可変領域を結合させる単鎖抗体；（第２の重鎖のＦｃ領域と結合した重鎖／軽鎖２量体を含む）一価の抗体；免疫グロブリン分子の完全「Ｙ」領域を含む「Ｆａｂ断片」、すなわち、「Ｙ」の分枝、軽鎖若しくは重鎖単体又はその部分（すなわち、Ｆａｂ’として一般に知られる、１本の重鎖と１本の軽鎖の集合体）；２種類以上の異なる抗原に対して特異性を有する「ハイブリッド免疫グロブリン」（例えば、米国特許第６，６２３，９４０号などに記載のクアドローマ又は二重特異性抗体）；重鎖及び軽鎖が、異なる種又は特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ）由来の重鎖及び軽鎖を模倣した「複合（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）免疫グロブリン」；並びに重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列の各々の部分が２種類以上の種に由来する（すなわち、可変領域がネズミ抗体などの一出所に由来し、定常領域がヒト抗体などの別の出所に由来する）「キメラ抗体」を含めて、ただしこれらだけに限定されない、全タイプの免疫グロブリンを製造するための改善された方法を対象とする。
【０１３２】
本発明の組成物及び方法は、重鎖若しくは軽鎖が「ほ乳動物の」、「キメラの」ものであり、又はその効力を増大させるように修飾されている、免疫グロブリン又はその断片の製造に有用である。修飾抗体は、無修飾体の同じ生物活性を保持する、アミノ酸と核酸の両方の配列変種、及び活性が変化するように修飾された（すなわち、補体結合、膜との相互作用、及び他のエフェクター機能を改善する定常領域の変化、又は抗原結合特性を改善する可変領域の変化）、アミノ酸と核酸の両方の配列変種を含む。本発明の組成物及び方法は、触媒作用の免疫グロブリン又はその断片も更に含み得る。
【０１３３】
「変種」免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチド配列は、基準ポリペプチド配列から１個以上のアミノ酸が変化した「変種」免疫グロブリンアミノ酸配列をコードし得る。以下の同じ考察を、対象となる他の生物活性タンパク質配列（及びそのコード配列）に適用することができる。変種ポリヌクレオチド配列は、置換されたアミノ酸が、置換したアミノ酸と類似した構造的又は化学的性質を有する「保存的」置換を含む、変種アミノ酸配列をコードし得る。目的タンパク質の変種は、天然の配列のアミノ酸配列と実質的に同一（少なくとも約８０から９９％同一、及びこれらの間の全整数）であるアミノ酸配列を用いて作製することができ、機能的に等価な３次元構造を形成し、天然タンパク質の生物活性を保持すると理解される。ある種のアミノ酸置換が、タンパク質配列において、タンパク質の機能に影響を及ぼさずになされ得ることは、生物学分野では周知である。一般に、保存的アミノ酸置換、又は類似のアミノ酸の置換は、タンパク質機能に影響を及ぼさずに許容される。類似のアミノ酸は、サイズ及び／又は荷電特性が類似したアミノ酸であり得る。例えば、アスパラギン酸とグルタミン酸及びイソロイシンとバリンは、類似のアミノ酸対である。一アミノ酸を別のアミノ酸で置換することは、自然の二次及び三次構造の形成が、意図した以外には乱されないときに許容される。アミノ酸対間の類似度は、当分野では幾つかの方法で評価されている。例えば、参照により本明細書に組込む、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  １９７８．  Ｖｏｌｕｍｅ  ５，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２２，  ｐａｇｅｓ  ３４５−３５２は、アミノ酸類似度の尺度として使用することができるアミノ酸置換の度数分布表を記載している。Ｄａｙｈｏｆｆ等の度数分布表は、進化的に異なる種々の出所からの、同じ機能を有するタンパク質のアミノ酸配列の比較に基づく。
【０１３４】
開示されたヌクレオチド（及びアミノ酸）配列の置換変種、挿入変種及び欠失変種は、当分野で周知の方法によって容易に調製することができる。これらの変種は、本発明の具体的例示配列と実質的な配列同一性を有し、所望の機能性が保存される限り、具体的例示配列と同様に使用することができる。
【０１３５】
本明細書では、実質的な配列同一性とは、変種ポリヌクレオチド又はタンパク質が、変種が由来するポリヌクレオチド又はタンパク質と同じ能力で機能するのに十分な相同性（又は同一性）を指す。好ましくは、この配列同一性は、７０％又は８０％を超え、より好ましくは、この同一性は８５％を超え、又はこの同一性は９０％を超え、及び又は、これは９５％を超え、７０から１００％までの全整数である。機能が等価である、又は配列の機能を改善するように設計された、又は方法論的な利点を与える、置換変異、挿入変異及び欠失変異を行うことは当業者の技術範囲内に十分ある。任意の天然タンパク質を包含し得る、又は適格な従来技術項目を包含し得る実施形態／変形形態は、特許請求する本発明の範囲内にはないものとする。元の完全長配列の、生成した断片及び／又は変異体の幾つかが、完全長配列の所望の特性を保持することができるように、本発明のポリヌクレオチド配列を短縮及び／又は変異し得ることは当分野で周知である。より大きな核酸分子から断片を生成するのに適切である多種多様な制限酵素が周知である。また、Ｂａｌ３１エキソヌクレアーゼをＤＮＡの時間制御制限消化（ｔｉｍｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）に好都合に使用できることは周知である。例えば、参照により本明細書に組込む、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９８２．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐａｇｅｓ  １３５−１３９を参照されたい。Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９８３．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５８：１３００６−１３５１２も参照されたい。（「ｅｒａｓｅ−ａ−ｂａｓｅ」手順と一般に称される）Ｂａｌ３１エキソヌクレアーゼの使用によって、当業者は、対象の核酸の一端又は両端からヌクレオチドを除去して、対象のヌクレオチド配列と機能的に等価である広範な断片を生成することができる。当業者は、このようにして、すべて元のコード配列に沿った場所から、制御された種々の長さの数百の断片を作製することができる。当業者は、作製された断片の諸特性を常法に従って試験又はスクリーニングして、本明細書に教示する断片の有用性を決定することができる。完全長配列の変異配列、又はその断片は、部位特異的変異誘発によって容易に作製できることも周知である。例えば、参照により本明細書に組込む、Ｌａｒｉｏｎｏｖ，  Ｏ．Ａ．  ａｎｄ  Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，  Ｖ．Ｇ．  １９８２．  Ｇｅｎｅｔｉｋａ  １８：３４９−５９；  Ｓｈｏｒｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８１）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  １５：２６５−９４を参照されたい。当業者は、欠失型、挿入型又は置換型変異を常法に従って生じさせることができ、完全長野生型配列又はその断片の所望の特性を含む生成変異体、例えば、ホルモン、サイトカイン、抗原結合性又は他の生物活性を保持する生成変異体を特定することができる。
【０１３６】
それに加え、又はそれとは別に、変種ポリヌクレオチド配列は、置換されたアミノ酸が、置換したアミノ酸とは異なる構造的又は化学的性質を有する「非保存的」置換を含む、変種アミノ酸配列をコードし得る。変種免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドは、アミノ酸の挿入配列（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ）若しくは欠失配列（ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）又はその両方を含む変種アミノ酸配列もコードし得る。また、変種免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドは、基準ポリヌクレオチド配列と同じポリペプチドをコードし得るが、遺伝コードの縮重のために、基準ポリヌクレオチド配列と１個以上の塩基が異なるポリヌクレオチド配列を有する。
【０１３７】
本発明の組み換え免疫グロブリンに関して、「断片」という用語は、対応する完全長免疫グロブリンタンパク質のアミノ酸配列の全部ではないが、一部と同じであるアミノ酸配列を有し、対応する完全長タンパク質と本質的に同じ生物学的機能若しくは活性を保持する、又は対応する完全長タンパク質の機能若しくは活性の少なくとも１つを保持する、ポリペプチドを意味する。断片は、好ましくは、完全長免疫グロブリンの少なくとも２０−１００個の隣接アミノ酸残基を含み、好ましくは、完全長抗体と同じ抗原に結合する能力を保持する。
【０１３８】
本明細書では「配列同一性」という用語は、配列アラインメントプログラムを用いて整列させたときに、整列した２つ以上の配列における核酸又はアミノ酸配列同一性を意味する。「％相同性」という用語は、本明細書の「％同一性」という用語と本明細書では区別なく使用され、配列アラインメントプログラムを用いて整列させたときに、整列した２つ以上の配列間の核酸又はアミノ酸配列同一性のレベルを指す。例えば、本明細書では、８０％相同性は、規定のアルゴリズムによって求められる８０％配列同一性と同じものを意味し、したがって所与の配列の相同体は、所与の配列の長さにわたって８０％を超える配列同一性を有する。
【０１３９】
比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ．  １９８１．  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ．  １９７０．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ．  １９８８．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似度検索（ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）によって、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサイト（ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／参照）を通して公的に利用可能であるソフトウェアを用いた、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０．  Ｊ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０によって、又は目視検査（一般に、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，下記参照）によって、実施することができる。本発明では、比較のための最適な配列アラインメントは、最も好ましくは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ．  １９８１．  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２の局所的相同性アルゴリズムによって実施される。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７も参照されたい。
【０１４０】
２つ以上の核酸又はタンパク質配列に関連して、「同一の」又はパーセント「同一性」という用語は、最大一致で比較及び整列させたときに、本明細書に記載の配列比較アルゴリズムの１つ、例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、当分野で公知の他のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴを用いて測定して、又は目視検査によって測定して、同じである、又は同じアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを指定割合で含む、２つ以上の配列又は部分配列を指す。
【０１４１】
本発明によれば、自然の配列と８０、８５、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％（及び８０から１００までの全整数）又は９９％を超える配列同一性を有する、自己プロセシング切断ポリペプチド及びポリペプチド自体をコードする配列変種も包含する。少なくとも５、少なくとも１０、又は少なくとも１５単位のひと続きであるポリペプチドのアミノ酸断片、記載の同一性条件に従ってそれと相同である断片、及び少なくとも１５、少なくとも３０、又は少なくとも４５単位のひと続きである核酸配列の断片も包含する。
【０１４２】
核酸配列は、核酸配列と基準核酸配列が、中度から高度の厳密性のハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で特異的にハイブリッド形成する場合に、基準核酸配列と「選択的にハイブリッド可能」であるとみなされる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体又はプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づく。例えば、「最大厳密性」は、典型的には約Ｔｍ−５℃の（プローブのＴｍよりも５°低い）温度で生じ、「高度の厳密性」はＴｍよりも約５−１０°低い温度で生じ、「中間の厳密性」はプローブのＴｍよりも約１０−２０°低い温度で生じ、「低度の厳密性」はＴｍよりも約２０−２５°低い温度で生じる。機能的に、最大厳密性条件は、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性又はほぼ厳密な同一性を有する配列の特定に使用することができ、高度の厳密性の条件は、プローブと約８０％以上の配列同一性を有する配列の特定に使用される。
【０１４３】
中度及び高度の厳密性のハイブリダイゼーション条件は当分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ，  １９８９，  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ９  ａｎｄ  １１及びＡｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３参照。高度の厳密性の条件の例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハート液、０．５％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性担体ＤＮＡ中、約４２℃でのハイブリダイゼーションと、それに続く２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳによる室温での２回の洗浄と、０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳによる４２℃での追加の２回の洗浄とを含む。目的の天然タンパク質と同じ生物活性を有するポリペプチドをコードし、中度から高度の厳密性のハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド形成する２Ａ配列変種は、本発明の範囲内であるとみなされる。
【０１４４】
遺伝コードの縮重の結果として、同じ２Ａ若しくは２Ａ様ポリペプチド配列又は他のプロテアーゼ若しくはシグナルペプチダーゼ切断配列をコードする幾つかのコード配列が生成し得る。例えば、トリプレットＣＧＴはアミノ酸アルギニンをコードする。アルギニンは、代わりに、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＡＧＡ及びＡＧＧによってもコードされる。したがって、コード領域における同義コドンのかかる置換は、本発明に包含される配列変種の範囲内であることを理解されたい。
【０１４５】
かかる配列変種は、高度の厳密性の条件下で親配列とハイブリッド形成する場合も、しない場合もあることを更に理解されたい。これは、例えば、配列変種が、親ヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の各々に対して異なるコドンを含むときに起こり得る。それでも、かかる変種は、本発明によって具体的に企図され、包含される。
【０１４６】
治療様式としての抗体の潜在能力は、現在、現行技術の生産能力及び費用によって制限されている。免疫グロブリン（又は他のタンパク質）産生用の改善されたウイルス性又は非ウイルス性単一発現ベクターは、単一のベクターから２つ以上のコード配列、すなわち、二重特異性又は多重特異性を有する免疫グロブリン又は他のタンパク質の発現及び送達を促進する。本発明は、これらの制限に対処し、単鎖抗体、完全長抗体、抗体断片などの操作された抗体、２本鎖ホルモン、２本鎖サイトカイン、２本鎖ケモカイン、２本鎖受容体などを含めて、本明細書に詳述する、任意の免疫グロブリン（すなわち、抗体）若しくはその断片、他の複部構成（ｍｕｌｔｉｐａｒｔ）タンパク質又は結合タンパク質対に適用可能である。
【０１４７】
ＩＲＥＳ
配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントは、ピコルナウイルスｍＲＮＡ中で最初に発見された（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  １５：４７７−８３）及びＪａｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｍｉｎｓｋｉ．  １９９５．  ＲＮＡ  １：９８５−１０００）。当業者によって一般に使用されるＩＲＥＳの例としては、表Ｉに記載のもの、及び米国特許第６，６９２，７３６号に記載のものが挙げられる。当分野で公知である「ＩＲＥＳ」の例としては、ピコルナウイルスから入手可能なＩＲＥＳ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）、並びに、例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８：６１７８−６１９０）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）、インスリン様成長因子（ＩＧＦＩＩ）、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇ及び酵母転写因子ＴＦＩＩＤ及びＨＡＰ４、Ｎｏｖａｇｅｎから市販されている脳心筋炎（ｅｎｃｅｐｈｅｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ）ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｄｕｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ  ６６：１６０２−９）及びＶＥＧＦ  ＩＲＥＳ（Ｈｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８：６１７８−９０）など、ウイルス又は細胞のｍＲＮＡ源から入手可能なＩＲＥＳが挙げられるが、これらだけに限定されない。ＩＲＥＳは、カルジオウイルス、ライノウイルス、アフトウイルス、ＨＣＶ、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦｒＭＬＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）などの種々のウイルスにおいても報告されている。本明細書では「ＩＲＥＳ」は、ＩＲＥＳ配列の機能的変形物がシストロンの開始コドンへの直接の配列内リボソーム進入を促進し得る限り、該変形物を包含する。ＩＲＥＳは、ほ乳動物、ウイルス又は原生動物のものであり得る。
【０１４８】
ＩＲＥＳは、下流のシストロンの開始コドンへの直接の配列内リボソーム進入を促進し、ｃａｐ非依存的翻訳をもたらす。したがって、下流のシストロンの産物は、ポリタンパク質の切断も、モノシストロニックｍＲＮＡの生成も必要とせずに、バイシストロニック（又はマルチシストロニック）ｍＲＮＡから発現され得る。配列内リボソーム進入部位は、約４５０ヌクレオチド長であり、一次配列の中度の保存、及び二次構造の強固な保存を特徴とする。ＩＲＥＳの最も重要な一次配列の特徴は、その開始がＩＲＥＳの３’末端の約２５ヌクレオチド上流にあるピリミジンリッチ部位である。Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）を参照されたい。
【０１４９】
主要な３クラスのピコルナウイルスＩＲＥＳが特定され、特徴づけられた。すなわち、カルジオ及びアフトウイルスクラス（例えば、脳心筋炎ウイルス、Ｊａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０．  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ  ４：１５６０−１５７２）、エンテロ及びライノウイルスクラス（例えば、ポリオウイルス、Ｂｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３：３１４９−３１５７）、並びにＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）クラス、Ｇｌａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３．  Ｖｉｒｏｌ  １９３：８４２−８５２）である。最初の２クラスの場合、２つの一般的原理が適用される。第一に、ＩＲＥＳの４５０ヌクレオチド配列の大部分が、リボソーム結合及び翻訳開始に寄与する二次及び三次構造を特に維持する機能を果たす。第二に、リボソーム侵入部位は、ＩＲＥＳの３’末端において、保存されたオリゴピリミジン域（ｔｒａｃｔ）の約２５ヌクレオチド下流に位置するＡＵＧトリプレットである。翻訳は、リボソーム侵入部位（カルジオウイルス）において、又は次の下流のＡＵＧ（エンテロ／ライノウイルスクラス）において開始され得る。アフトウイルスにおいては両方の部位で開始される。ＨＣＶ、及びウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）などのペスチウイルスは、それぞれ、３４１ｎｔ及び３７０ｎｔ長５’−ＵＴＲを有する。これらの５’−ＵＴＲ断片は、類似のＲＮＡ二次構造を形成し、適度に効率的なＩＲＥＳ機能を有し得る（Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６：１４７６−１４８３；Ｆｒｏｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  ＲＮＡ  ４：１４１８−１４３５）。最近の研究によれば、フレンドマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）５’−ＵＴＲ及びラットレトロトランスポゾンウイルス様３０Ｓ（ＶＬ３０）配列は、レトロウイルス起源のＩＲＥＳ構造を含む（Ｔｏｒｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７：６０３−６１２）。
【０１５０】
真核細胞においては、翻訳は、通常、リボソームによって、開始因子の制御下で、キャッピングされたｍＲＮＡ  ５’末端からスキャンして開始される。しかし、幾つかの細胞ｍＲＮＡは、ｃａｐ非依存的翻訳を媒介するＩＲＥＳ構造を有することが見出された（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｅｌｄｅ，  ｅｔ  ａｌ．  １９９９．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３１：８７−１０６）。ＩＲＥＳエレメントとしては、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１．  Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：９０−９４）、ショウジョウバエのアンテナペディアｍＲＮＡ（Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２．  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｄｅｖ  ６：１６４３−１６５３）、線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）（Ｖａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５：３５−４４）、血小板由来増殖因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：９３５６−９３６２）、インスリン様成長因子ＩＩ（Ｔｅｅｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １２６４：４０３−４０８）、及び翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇ（Ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：６２３−６２６）が挙げられるが、これらだけに限定されない。最近、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）がＩＲＥＳエレメントを有することも見出された（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８：３１１２−３１１９；Ｈｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．１８：６１７８−６１９０）。ＩＲＥＳ配列の更なる例としては、ピコルナウイルスＨＡＶ（Ｇｌａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９３：８４２−８５２）；ＥＭＣＶ（Ｊａｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｍｍｅｒ．  ４：１５６０−１５７２）；ポリオウイルス（Ｂｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３：３１４９−３１５７）；ＨＣＶ（Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６：１４７６−１４８３）；ペスチウイルスＢＶＤＶ（Ｆｒｏｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  ＲＮＡ．  ４：１４１８−１４３５）；リーシュマニアＬＲＶ−１（Ｍａｇａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５：４８８４−４８８９）；レトロウイルス：ＭｏＭＬＶ（Ｔｏｒｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７：６０３−６１２）．  ＶＬ３０、ハーベイマウス肉腫ウイルス、ＲＥＶ（Ｌｏｐｅｚ−Ｌａｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ８：１８５５−１８６５）が挙げられる。ＩＲＥＳは、当分野で公知である標準組み換え方法及び合成方法を用いて調製することができる。クローニングに都合がよいように、制限酵素切断部位を操作して、使用するＩＲＥＳ断片の末端に入れることができる。
【０１５１】
ウイルス又は非ウイルスベクターによって決まる単一の転写物から２種類以上のタンパク質を発現させるために、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を一般に使用して、第２、第３、第４のコード配列などを発現させる。２種類のコード配列をＩＲＥＳによって連結すると、第２のコード配列の翻訳発現レベルがかなり減少することが多い（Ｆｕｒｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：８６４−８７３）。実際、同じプロモーターに作動可能に結合した２つ以上のコード配列の転写を制御するためにＩＲＥＳを使用すると、第２、第３などのコード配列の発現レベルが、プロモーターに隣接するコード配列よりも低下し得る。また、ＩＲＥＳ配列は、ベクターの完全なパッケージングに影響を及ぼすのに十分な長さであり得る。例えば、ｅＣＭＶ  ＩＲＥＳは５０７塩基対の長さを有する。
【０１５２】
（一次翻訳産物として）ポリタンパク質の形のタンパク質の発現は、ピコルナウイルス科を含めて、ただしこれだけに限定されない、多数のウイルスの複製において採用される戦略である。翻訳後、ウイルスによってコードされた自己プロセシングペプチドは、ポリタンパク質の迅速な分子内（ｃｉｓ）切断を媒介して、別個の（成熟）タンパク質産物を与える。本発明は、単一のプロモーターを用いて、２種類以上のタンパク質又はポリペプチドコード配列の発現を促進する、（本明細書では２Ａペプチド配列によって例示される）自己プロセシングペプチド配列又は他のプロテアーゼ切断部位を含む組み換えタンパク質又はポリペプチド発現用ベクターが提供される点で、ＩＲＥＳの使用を上回る利点を提供する。２種類以上のタンパク質又はポリペプチドは、有利なモル比で発現される。免疫グロブリンの場合、ポリタンパク質は、各々の間でコードされた自己プロセシング部位又はプロテアーゼ認識部位を含む、１本の重鎖のコード配列と、１又は２本の軽鎖のコード配列とによってコードされる。
【０１５３】
インテイン含有構築物においては、２本の免疫グロブリン鎖間のインテインを含むインフレーム融合ポリタンパク質中で発現され、インテイン−免疫グロブリン鎖接合部における切断を可能にするが、２つの免疫グロブリンタンパク質を再連結しない適切な特徴を有する、重鎖及び軽鎖セグメントの各々のちょうど１個が存在し得る。別のインテイン含有構築物においては、第１及び／又は第２のセグメントから切断部位によって分離されていてもよい、１個以上の追加の免疫グロブリンセグメントが存在する。例えば、インテイン手法を用いて、１個の重鎖セグメントと１個の軽鎖セグメントとを発現させ、又は１本の重鎖と２本の軽鎖とを発現させる。
【０１５４】
上記「自己プロセシング切断部位」又は「自己プロセシング切断配列」とは、翻訳後、自己プロセシング切断部位を含むポリペプチドの迅速な分子内（ｃｉｓ）切断が起こり、別個の成熟タンパク質産物が産生する、ＤＮＡコード又はアミノ酸配列を指す。かかる「自己プロセシング切断部位」は、本明細書では２Ａ部位、配列若しくはドメイン又はインテインによって例示される、同時翻訳又は翻訳後プロセシング切断部位とも称し得る。２Ａ部位、配列又はドメインは、リボソームの活性を改変して、エステル結合の加水分解を促進し、それによって、分離した下流の翻訳産物の合成が進むように翻訳複合体からポリペプチドが遊離することによって、翻訳効果を示す（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，  ２００１）。或いは、２Ａ部位又はドメインは、それ自体のＣ末端をシスで切断して一次分解産物を産生することによって、「自動タンパク質分解」又は「切断」を示す（Ｆｕｒｌｅｒ  ａｎｄ  Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇ．  １９９０．  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４４：６０３−６２３）。シグナルペプチダーゼ切断部位を含めて、他のプロテアーゼ認識配列を、自己プロセシング部位の代わりに使用することができる。インテインは、ポリタンパク質においても有用である。
【０１５５】
インテイン
本明細書では、インテインは、Ｎエクステインによって一次発現産物のＮ末端方向に区切られ、また、Ｃエクステインによって一次発現産物のＣ末端方向に区切られる、発現されたタンパク質内のセグメントである。天然のインテインは、インテインの切り出し、並びにＮ及びＣエクステインの再結合（タンパク質連結）を媒介する。しかし、本発現産物に関連して、インテイン又はフランキングエクステインアミノ酸配列の一次配列は、タンパク質骨格がエクステインの非存在下で、又はエクステインの少量若しくは最小限の連結によって切断されるようなものであり、その結果、エクステインタンパク質は、結合して融合タンパク質を形成することなく、一次翻訳産物（ポリタンパク質）から遊離する。一次発現産物（任意のタンパク質分解性切断の前の、ｍＲＮＡによって合成されたタンパク質）のインテイン部分は、Ｎエクステイン／インテイン及びインテイン／Ｃエクステイン接合部におけるタンパク質分解性切断を媒介する。一般に、天然のインテインは、ＮエクステインとＣエクステインのスプライシングトゥゲザー（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｔｏｇｅｔｈｅｒ）（ペプチド結合の形成による連結）も媒介する。しかし、（抗体分子の重鎖と軽鎖によって具体的に例示される）２種類のポリペプチドを発現する目的に適用される本発明においては、タンパク質連結は起こらないことが好ましい。これは、天然にでも、変異によってでも連結活性を持たないインテインを組み入れることによって実施することができる。或いは、スプライシングは、スプライス部位における、又はスプライス部位に隣接する、アミノ酸を変化させて、遊離タンパク質の連結を防止する変異によって、阻止し得る。Ｘｕ  ａｎｄ  Ｐｅｒｌｅｒ，  １９９６，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １５：５１４６−５１５３を参照されたい。Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＣｙｓは、通常、Ｃエクステインの開始点（ｓｔａｒｔ）に存在する。
【０１５６】
インテインは、その遺伝子が他のタンパク質の遺伝子内にのみ存在するタンパク質クラスである。インテインは、エクステインと称するフランキング宿主遺伝子と一緒に、単一のｍＲＮＡとして転写され、単一のポリペプチドとして翻訳される。翻訳後、インテインは、自己触媒現象を開始してインテイン自体を除去し、フランキング宿主タンパク質セグメントを新しいポリペプチド結合と接合する。この反応は、インテインによってのみ触媒され、他の細胞タンパク質、補助因子及びＡＴＰを必要としない。インテインは、種々の単細胞生物中に存在し、サイズが異なる。多くのインテインは、ゲノム内での移動性の原因となるエンドヌクレアーゼドメインを含む。
【０１５７】
インテインによって媒介される反応は、バイオテクノロジーに使用され、特に精製、タンパク質チップ構築などのインビトロでの状況で、また、植物系統の改善に使用されている（Ｐｅｒｌｅｒ，  Ｆ．Ｂ．  ２００５．  ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ  ５７（７）：４６９−７６）。変異は、自然のインテインヌクレオチド配列に導入され、これらの変異体の一部は、諸特性が変化することが報告されている（Ｘｕ  ａｎｄ  Ｐｅｒｌｅｒ，  １９９６．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １５（９），  ５１４６−５１５３）。インテインに加えて、細菌インテイン様（ＢＩＬ）ドメイン及びヘッジホッグ（Ｈｏｇ）自動プロセシングドメイン、Ｈｏｇ／インテイン（ＨＩＮＴ）スーパーファミリーの他の２メンバーも、類似の機序によって翻訳後の自己プロセシングを触媒することが知られている（Ｄａｓｓａ  ｅｔ．  ａｌ．  ２００４．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９（３１）：３２００１−３２００７）。
【０１５８】
インテインは、特定の宿主タンパク質においてインフレームの挿入配列として存在する。自己スプライシング反応においては、インテインは、前駆体タンパク質からインテイン自体を切り出し、フランキング領域のエクステインは、結合して、宿主遺伝子機能を回復する。これらのエレメントは、ゲノム内の移動性の原因となるエンドヌクレアーゼ機能も含む。インテインは、ある範囲のサイズ（１３４から１６５０アミノ酸）で存在し、真正細菌、真核生物及び古細菌のゲノム中で特定された。モデルスプライシング／レポーター系を用いた実験によれば、エンドヌクレアーゼ、タンパク質切断及びタンパク質スプライシング機能は、分離し得る（Ｘｕ  ａｎｄ  Ｐｅｒｌｅｒ．  １９９６．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １５：５１４６−５１５３）。下記例は、パイロコッカス  ホリコシイＰｈｏ  Ｐｏｌ  Ｉ、サッカロミセス  セレビシエＶＭＡ及びシネコシスティス種由来のインテインを使用して、抗体の重鎖と軽鎖由来の配列を有する融合タンパク質を産生する。インテインのスプライシング能力を除去するように設計されたインテインの変異によって、自己切断を起こして、正確にコードされた抗体の重鎖と軽鎖を生成する単一のポリペプチドが産生される。この戦略は、他の多連鎖タンパク質、ホルモン又はサイトカインの発現に同様に使用することができ、その成熟、生物活性形態への前駆体タンパク質（プロタンパク質）のプロセシングに適合させることもできる。パイロコッカス  ホリコシイＰｈｏ  Ｐｏｌ  Ｉ、Ｓ．セレビシエＶＭＡ及びシネコシスティス種のインテインの使用を本明細書で具体的に例示したが、当分野で公知である他のインテインを、本発明のポリタンパク質発現ベクター及び方法に使用することができる。
【０１５９】
パイロコッカス  ホリコシイＰｈｏ  Ｐｏｌ  Ｉ、Ｓ．セレビシエＶＭＡ及びシネコシスティス種のインテインに加えて、多数の他のインテインが当分野で公知である（例えば、Ｐｅｒｌｅｒ，  Ｆ．Ｂ．  ２００２，  ＩｎＢａｓｅ，  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０（１）：３８３−３８４及びＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓウェブサイト、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｉｎｂａｓｅ／から利用可能であるＩｎｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙを参照されたい。）インテインは、酵母、マイコバクテリア、超好熱性古細菌などの広範囲の生物体において特定されている。ある種のインテインは、エンドヌクレアーゼ活性、並びに部位特異的なタンパク質切断及びスプライシング活性を有する。エンドヌクレアーゼ活性は、本発明の実施には不要である。エンドヌクレアーゼコード領域は、タンパク質切断活性が維持される限り、除去することができる。
【０１６０】
タンパク質スプライシングプロセスの機序は、詳細に研究されており（Ｃｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：２２１５９−２２１６８；Ｘｕ  ａｎｄ  Ｐｅｒｌｅｒ．  １９９６．  ＥＭＢＯ  Ｊ  １５：５１４６−５１５３）、保存されたアミノ酸がインテイン及びエクステインスプライシングポイントに見出された（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４．  ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：５５１７−５５２２）。本明細書に記載の構築物は、第１のコード配列の５’末端に融合したインテイン配列を含み、第２のコード配列は、インテインのＣ末端にインフレームで融合している。適切なインテイン配列は、タンパク質スプライシングエレメントを含むことが知られているタンパク質のいずれかから選択することができる。公知の全インテインを含むデータベースは、ワールドワイドウェブ上に見出すことができる（Ｐｅｒｌｅｒ，  Ｆ．Ｂ．  １９９９．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２７：３４６−３４７）。インテインコード配列は、第２のコード配列の３’末端から５’末端において（インフレームで）融合している。このタンパク質をある種の細胞小器官に向けるために、適切なペプチドシグナルをタンパク質のコード配列に融合させることができる。
【０１６１】
第２のエクステインコード配列の後に、同じ細胞中で複数のタンパク質を発現させるために、インテインコード配列−エクステインコード配列を所望の回数繰り返すことができる。複数のインテイン（ｍｕｌｔｉ−ｉｎｔｅｉｎ）を含む構築物の場合、異なる出所からのインテインエレメントを使用することが有用であり得る。発現される最後の遺伝子の配列の後に、転写終結配列が、有利にはポリアデニル化配列を含めて、所望のとおりに挿入される。ポリアデニル化配列と終結配列の順序は、当分野で理解されている順序とすることができる。一実施形態においては、ポリアデニル化配列は終結配列に先行し得る。
【０１６２】
修飾インテインスプライシング単位は、目的のかかる修飾インテインがインテインからエクステインの切り出しを触媒し得るが、エクステインの連結を触媒し得ないように設計された（例えば、米国特許第７０２６５２６号及び米国特許出願公開第２００２０１２９４００号参照）。パイロコッカス種ＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼにおけるＣ末端エクステイン接合部の変異誘発によって、エクステイン及びインテインの切断を誘導するが、それに続くエクステインの連結を阻止する改変スプライシングエレメントが生成した（Ｘｕ  ａｎｄ  Ｐｅｒｌｅｒ．  １９９６．  ＥＭＢＯ  Ｊ  １５：５１４６−５１５３）。セリン５３８からアラニン又はグリシン（ＳｅｒからＡｌａ又はＧｌｙ）への変異は、切断を誘導したが、連結を阻止した。かかる位置においては、ＳｅｒからＭｅｔ又はＳｅｒからＴｈｒによっても、別々のセグメントに切断され、少なくとも部分的に再連結されないポリタンパク質の発現が得られる。他のインテインスプライシング単位における等価な残基の変異は、インテインとのＣ末端エクステイン接合部におけるアミノ酸の相互的保存（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）のために、エクステインセグメントの連結も防止し得る。保存／相同性が低い場合には、例えば、Ｃエクステインの始めの幾つかの、例えば、約５個の残基、及び／又はインテインセグメントの最後の幾つかの残基が、系統的に変化し、所与のエクステインセグメント、特に本明細書に開示され、当分野で理解されているエクステインセグメントの切断を支援するが、スプライシングを支援しない能力についてスクリーニングされる。エンドヌクレアーゼドメインを含まないインテインが存在する。これらのインテインとしては、シネコシスティス種ｄｎａＥインテイン、マイコバクテリウム  ゼノピＧｙｒＡタンパク質などが挙げられる（Ｍａｇｎａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００４，  ４３，  １０２６５−１０２７６；Ｔｅｌｅｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７９：６３７８−６３８２）。他のインテインは、自然界に存在し、又はエンドヌクレアーゼ含有インテインをコードする配列からエンドヌクレアーゼコードドメインを除去することによって人工的に作製された（Ｃｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：１５５８７−１５５９０）。所望であれば、インテインは、マイコバクテリウム  ゼノピＧｙｒＡタンパク質由来のインテインなど、スプライシング機能を実施するのに必要な最少のアミノ酸からなるように最初に選択される（Ｔｅｌｅｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．上記）。別の実施形態においては、エンドヌクレアーゼドメインを除去するように修飾された、マイコバクテリウム  ゼノピＧｙｒＡタンパク質又はサッカロミセス  セレビシエＶＭＡインテイン由来のインテインなど、エンドヌクレアーゼ活性のないインテインが選択される（Ｃｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．上記）。
【０１６３】
インテインスプライシング単位を更に修飾すると、切断反応の反応速度が変わり得る。したがって、スプライシング単位の遺伝子配列を単に変更するだけでタンパク質投与量を制御することができる。
【０１６４】
一実施形態においては、Ｃ末端エクステインの第１の残基は、グリシン又はアラニンを含むように操作される（パイロコッカス種ＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼとのエクステイン連結を防止することが判明した修飾）（Ｘｕ  ａｎｄ  Ｐｅｒｌｅｒ．  １９９６．  ＥＭＢＯ  Ｊ  １５：  ５１４６−５１５３）。この実施形態においては、好ましいＣ末端エクステインタンパク質は、未変性アミノ酸配列中のＮ末端メチオニンの後にグリシン又はアラニン残基を自然に含む。インテインのＣ末端にエクステインのグリシン又はアラニンが融合すると、ポリタンパク質のプロセシング後に未変性アミノ酸配列が得られる。別の実施形態においては、人工グリシン又はアラニンは、自然の配列を改変することによって、又は追加のアミノ酸残基を自然の配列のＮ末端に付加することによって、Ｃ末端エクステイン中に位置する。この実施形態においては、タンパク質の未変性アミノ酸配列は、ポリタンパク質プロセシング後に１個のアミノ酸によって改変される。更なる実施形態においては、本発明に有用である他の修飾は、米国特許第７０２６５２６号に記載されている。
【０１６５】
パイロコッカス種ＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼインテインのＤＮＡ配列は、米国特許第７，０２６，５２６号の配列番号１である。Ｎ末端エクステイン接合部は、「ａａｃ」配列（配列番号１のヌクレオチド１−３）であり、アスパラギン残基をコードする。未変性ＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼ前駆体タンパク質中のスプライシング部位は、配列番号１中のヌクレオチド３及びヌクレオチド１６１４に続く。Ｃ末端エクステイン接合部は、セリン残基をコードする「ａｇｃ」配列（配列番号１のヌクレオチド１６１５−１６１７）である。Ｃ末端エクステインのセリンからアラニン又はグリシンへの変異によって、ポリタンパク質の切り出しを促進し得るが、エクステイン単位の連結を促進し得ない、修飾インテインスプライシングエレメントが形成される。
【０１６６】
マイコバクテリウム  ゼノピＧｙｒＡ最小インテインのＤＮＡ配列は、米国特許第７，０２６，５２６号の配列番号２である。Ｎ末端エクステイン接合部は、「ｔａｃ」配列（配列番号２のヌクレオチド１−３）であり、チロシン残基をコードする。前駆体タンパク質中のスプライシング部位は、配列番号２のヌクレオチド３及びヌクレオチド５９７に続く。Ｃ末端エクステイン接合部は、「ａｃｃ」配列（配列番号２のヌクレオチド５９８−６００）であり、トレオニン残基をコードする。Ｃ末端エクステインのトレオニンからアラニン又はグリシンへの変異によって、ポリタンパク質の切り出しを促進するが、エクステイン単位を連結しない、修飾インテインスプライシングエレメントが形成される。
【０１６７】
２Ａ系
本発明の２Ａプロテアーゼプロセシング実施形態に目を向けると、２Ａの活性は、ペプチド結合の形成を阻止する、コドン間のリボソームの読み飛ばしを必要とし得るが（ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００．  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１：１９２１−１９３１；  Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８２：１０１３−１０２５）、２Ａドメインは、むしろ自己融解酵素のように作用すると考えられる（Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９８９．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７３：３５−４５）。口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａコード領域を、発現ベクターにクローン化し、標的細胞に移入した研究によって、人工レポーターポリタンパク質のＦＭＤＶ  ２Ａ切断が広範囲の異種発現系（コムギ胚芽溶解物及びトランスジェニックタバコ（Ｈａｌｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第５，８４６，７６７号（１９９８）及びＨａｌｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９．  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １７：４５３−４５９）、Ｈｓ  ６８３ヒト神経こう腫細胞系（ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：１９８−２０８；以下「ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ  ＩＩ」と記述する。）、ウサギ網状赤血球溶解物及びヒトＨＴＫ−１４３細胞（Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３：９２８−９３３）及び昆虫細胞（Ｒｏｏｓｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０．  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１：１７０３−１７１１）において効率的であることが立証された。生物学的に関連する分子に対する、ＦＭＤＶ  ２Ａによって媒介される異種ポリタンパク質の切断が、ＩＬ−１２について示された（ｐ４０／ｐ３５ヘテロ２量体；Ｃｈａｐｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９．  Ｊ．  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．  １９：２３５−２４１）。移入されたＣＯＳ−７細胞において、ＦＭＤＶ  ２Ａは、ｐ４０−２Ａ−ｐ３５ポリタンパク質が、ＩＬ−１２に関連する活性を有する、生物学的に機能的なｐ４０及びｐ３５サブユニットに切断されるのを媒介した。
【０１６８】
ＦＭＤＶ  ２Ａ配列を、単独で、又は種々のＩＲＥＳ配列と一緒に、発現ベクターに取り込み、バイシストロニック、トリシストロニック及びテトラシストロニックベクターを構築した。動物において２Ａによって媒介される遺伝子発現の効率は、Ｆｕｒｌｅｒ（２００１）によって、ＦＭＤＶ  ２Ａ配列を介して連結された、αシヌクレインとＥＧＦＰ又はＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ−１）とＥＧＦＰをコードする組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いて実証された。ＥＧＦＰとαシヌクレインは、２Ａ配列を含むベクターから、対応するＩＲＥＳ系ベクターよりも実質的に高いレベルで発現されたが、ＳＯＤ−１は、同等又はわずかに高いレベルで発現された。
【０１６９】
自己プロセシング切断部位をコードするＤＮＡ配列は、エンテロ、ライノ、カルジオ、アフト又は口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）を含めて、ただしこれらだけに限定されない、ピコルナウイルスに由来するウイルス配列によって例示される。好ましい実施形態においては、自己プロセシング切断部位コード配列は、ＦＭＤＶに由来する。自己プロセシング切断部位としては、２Ａ、２Ａ様ドメインなどが挙げられるが、これらだけに限定されない（参照によりその全体を組込む、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８２：１０２７−１０４１）。
【０１７０】
或いは、プロテアーゼ認識部位を、自己プロセシング部位の代わりに用いることができる。適切なプロテアーゼ及び同族認識部位としては、フューリン、ＲＸＲ／Ｋ−Ｒ（配列番号１）；ＩＰＮＶのＶＰ４、Ｓ／ＴＸＡ−Ｓ／ＡＧ（配列番号２）；タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、ＥＸＸＹＸＱ−Ｇ（配列番号３）；ライノウイルスの３Ｃプロテアーゼ、ＬＥＶＬＦＱ−ＧＰ（配列番号４）；ＰＣ５／６プロテアーゼ；ＰＡＣＥプロテアーゼ、ＬＰＣ／ＰＣ７プロテアーゼ；エンテロキナーゼ、ＤＤＤＤＫ−Ｘ（配列番号５）；活性化第Ｘ因子プロテアーゼＩＥ／ＤＧＲ−Ｘ（配列番号６）；トロンビン、ＬＶＰＲ−ＧＳ（配列番号７）；ｇｅｎｅｎａｓｅ  Ｉ、ＰＧＡＡＨ−Ｙ（配列番号８）；及びＭＭＰプロテアーゼ；内部切断可能なシグナルペプチド（その例は、インフルエンザＣウイルスの内部切断可能シグナルペプチドである。）（Ｐｅｋｏｓｚ  Ａ．  １９９８．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：Ｉ１３２３３−１３２３８）（ＭＧＲＭＡＭＫＷＬＶＶＩＩＣＦＳＩＴＳＱＰＡＳＡ、配列番号１１）などが挙げられるが、これらだけに限定されない。プロテアーゼは、ポリタンパク質の一部としてトランス又はシスで与えられ得る。プロテアーゼは、同じ転写内でコードされ、例えば、自己プロセシング部位又はプロテアーゼ認識部位によって、一次翻訳産物の残部から分離される。
【０１７１】
より多くの抗体治療が臨床応用に認可されるようになるにつれ、これらの治療タンパク質を製造する方法がこの２０年間で着実に改善された（Ｗｕｒｍ，  ＦＭ，  ２００４，  ”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，”  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２２（１１）：１３９３）。しかし、更に効率的で信頼性の高い製造方法が工業界で望まれている。幾つかの望ましい特徴としては、培地へのより高レベルの抗体分泌、製造細胞系の遺伝的安定性の改善、細胞系のより大きな産生速度などが挙げられる。
【０１７２】
治療抗体のより効率的な製造方法の本発明者らの探索において、本発明者らは、単一オープンリーディングフレームから抗体の重鎖と軽鎖を発現させる方法を開発した。かかる一方法においては、インテインコード配列を用いて、単一オープンリーディングフレーム（ｓＯＲＦ）内の抗体の重鎖と軽鎖の各遺伝子を分離する。かかるｓＯＲＦ抗体発現技術によってもたらされる利点としては、重鎖と軽鎖の遺伝子量比を操作する能力、ＥＲ中で多サブユニットを組み立てるための重鎖と軽鎖のポリペプチドの近接、高効率タンパク質分泌の潜在能力などが挙げられる。
【０１７３】
ほ乳動物細胞中でモノクローナル抗体を発現する他の技術は、各々それ自体のプロモーター及び調節配列と一緒に、２つの別々のＯＲＦ中に重鎖と軽鎖の遺伝子を導入する必要がある。プロモーター干渉は、この方法に付随する懸念である。抗体の重鎖と軽鎖の各コード配列を発現細胞系に導入する代替法は、抗体の重鎖と軽鎖の各コード配列を分離する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用しなければならない。この方法は、ＩＲＥＳ配列の下流のコード配列を翻訳する効率が低いので、広範には用いられていない。最近、口蹄疫ウイルス（ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｖｉｒｕｓ）ペプチド（２Ａペプチド）をコードする配列を用いて、抗体の重鎖と軽鎖の各コード配列を分離する方法が記述された（Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３（５）：５８４−９０）。この方法では、抗体の重鎖と軽鎖及び２Ａペプチドを単一のｍＲＮＡとして転写する。しかし、抗体の重鎖と軽鎖の各ポリペプチドは、小胞体（ＥＲ）に入る前に切断される。また、２個の非天然アミノ酸が、重鎖と軽鎖の切断／分離後に、重鎖のＣ末端に残る。本発明のインテイン発現系は、基本的に異なる。本発明のインテイン発現系は、重鎖と軽鎖のポリペプチドが翻訳され、単一のポリタンパク質としてＥＲに導入される点で、２Ａ法とは異なる。有利なことに、非天然アミノ酸を成熟抗体分子に含める必要がない。
【０１７４】
以下の説明はすべて、以下の発現カセットを含む抗体産生ベクターに関連する：ｐ．ホリコシイＰｏｌ  Ｉインテイン−分泌シグナル−軽鎖−ポリＡなどのプロモーター−分泌シグナル−重鎖−ｗｔインテイン、ｐ．ホリコシイＰｏｌ  Ｉインテイン−軽鎖−ポリＡなどのプロモーター−分泌シグナル−重鎖−修飾インテイン、ｐ．ホリコシイＰｏｌ  Ｉインテイン−分泌シグナル−軽鎖−ポリＡなどのｐ．ホリコシイＰｏｌ  Ｉインテイン−分泌シグナル−軽鎖−Ｐｏｌ修飾インテインなどのプロモーター−分泌シグナル−重鎖−Ｐｏｌ修飾インテイン、ｐ．ホリコシイＰｏｌ  Ｉインテイン−修飾分泌シグナル−軽鎖−ポリＡなどのプロモーター−分泌シグナル−重鎖−ｗｔ又は修飾インテイン、Ｐ．ホリコシイＰｏｌ  Ｉインテイン−修飾分泌シグナル−重鎖−ポリＡなどのプロモーター−分泌シグナル−軽鎖−ｗｔ又は修飾インテイン、Ｐ．ホリコシイＰｏｌ  Ｉインテイン−修飾分泌シグナル−軽鎖−ポリＡなどのｐ．ホリコシイＰｏｌ  Ｉインテイン−修飾分泌シグナル−軽鎖−ｗｔ又は修飾インテインなどのプロモーター−分泌シグナル−重鎖−ｗｔ又は修飾インテイン、Ｐ．ホリコシイＰｏｌ  Ｉインテイン−フューリン切断部位−分泌シグナル−軽鎖−ポリＡなどのプロモーター−分泌シグナル−重鎖−フューリン切断部位−修飾インテイン及びＰ．ホリコシイＰｏｌ  Ｉインテイン−フューリン切断部位−軽鎖−ポリＡなどのＰ．ホリコシイＰｏｌ  Ｉインテイン−フューリン切断部位−軽鎖−フューリン切断部位−修飾インテインなどのプロモーター−重鎖−フューリン切断部位−修飾インテイン。更なる構築物においては、修飾Ｐｓｐ−ＧＢＤ  Ｐｏｌインテインを使用する。
【０１７５】
本明細書に具体的に例示するポリタンパク質は、Ｐ．ホリコシイＰｏｌ  Ｉインテインを使用する。Ｐ．ホリコシイＰｏｌ  Ｉインテインは、その前及び後でＤ２Ｅ７のそれぞれ重鎖及び軽鎖とインフレームで融合している。−１位にあるアミノ酸はリジンであり、＋１位にあるアミノ酸は、軽鎖シグナルペプチドの第１のアミノ酸であるメチオニンであった。＋１位のメチオニンを使用すると、本発明者らが後半のセクションで実証するように、スプライシング、重鎖と軽鎖の接合を廃することができる。スプライシングには、セリン、システイン、トレオニンなどの求核性アミノ酸残基が＋１位に必要であると理解される。ｗｔインテインに加えて、最後のアミノ酸のアスパラギン及び最後から２番目のヒスチジンを変える変異は、これらの変異として使用することができ、一般にスプライシングを廃し、Ｎ末端スプライシング接合部における切断を維持する（Ｍｉｌｌｓ，  ２００４；  Ｘｕ，  １９９６，  Ｃｈｏｎｇ，  １９９７）。或いは、インテインの第１のアミノ酸を変える変異を使用することもでき、かかる変異は、一般にスプライシングを廃し、Ｃ末端スプライシング接合部における切断を維持し、Ｎ末端スプライシング接合部における切断を廃し、又は弱まった切断を維持する（Ｎｉｃｈｏｌｓ，  ２００４；  Ｅｖａｎｓ，  １９９９及びＸｕ，  １９９６）。例えば、これは、「スプライシングを完全に遮断し、分枝中間体の形成を阻害し、両方のスプライス部位における切断をもたらす」ことが示された（Ｘｕ，  Ｍ．Ｑ．，  ＥＭＢＯ  ｖｏｌ．  １５：５１４６−５１５３）。
【０１７６】
別のポリペプチドにおいては、フューリン切断部位を含むと、接合部配列が変化し、続いて分泌中にフューリン切断による切り出しが起こる。インテインの野生型配列を表９に示す。パイロコッカス種ＧＢ−ＤのＤＮＡポリメラーゼＩにおいては、切断／スプライス部位は、ＲＱＲＡＩＫＩＬＡＮ／Ｓ（配列番号１３８）（Ｎ末端）及びＨＮ／ＳＹＹＧＹＹＧＹＡＫ（配列番号１３９）（Ｃ末端）である。望ましくは、エンドヌクレアーゼコード領域は、ＨｉｎｄＩＩＩ切断によって切り出される。切断、スプライシング及びエンドヌクレアーゼの各機能は互いに分離され、このエンドヌクレアーゼ領域は、小リンカーで置換されて、依然として切断及びスプライシング可能であるミニインテインを生成し得る（Ｔｅｌｅｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７９：６３７８−６３８２）。少なくとも１種類の酵母インテインは、ほ乳動物細胞において機能することが注目される（Ｍｏｏｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２５：１０５６１−１０５６９）。Ｄ２Ｅ７（免疫グロブリン）インテイン構築物のコード配列及びアミノ酸配列については表８Ａ及び８Ｂを参照されたい。表８Ｃは、Ｄ２Ｅ７インテイン構築物発現ベクターの完全ヌクレオチド配列である。修飾Ｐｓｐ  Ｐｏｌ  １インテインと融合した、Ｄ２Ｅ７の重鎖をコードする融合構築が記述されている（Ｈｕｍｉｒａ−アダリムマブの登録商標）。修飾Ｐｓｐ  Ｐｏｌ  １インテイン自体は、Ｄ２Ｅ７軽鎖のコード領域と融合している。軽鎖配列は、二重であり得、インテイン、シグナルペプチド又はプロテアーゼ切断部位によって、ポリタンパク質の残部から分離されている。この実施形態においては、重鎖分泌シグナルが成熟重鎖に先行する。インテインは、上述したように改変され、セリン１は、トレオニンに変化し、内部のＨｉｎｄ  ＩＩＩ断片が切り出されてエンドヌクレアーゼ活性が取り除かれている。インテインは、成熟Ｄ２Ｅ７軽鎖領域とインフレームで融合する。別の実施形態は、成熟軽鎖の５’側の軽鎖分泌シグナルを含む。Ｄ２Ｅ７インテイン構築物及び発現ベクターの略図については図１０及び１１を参照されたい。発現構築物及び完全発現ベクターのヌクレオチド配列並びにＤ２Ｅ７インテイン構築物のアミノ酸配列については表８Ａ−８Ｃを参照されたい。
【０１７７】
シグナルペプチド及びシグナルペプチダーゼ
タンパク質が膜へのタンパク質ターゲティングについての情報をそのアミノ酸配列中に含むというシグナル仮説は、３０年以上知られている。Ｍｉｌｓｔｅｉｎとその共同研究者は、骨髄腫細胞由来のＩｇＧの軽鎖が、より高い分子量で合成され、小胞体小胞（ミクロソーム）を翻訳系に添加したときに、その成熟型に転換されることを発見し、これらの結果に基づいて、ミクロソームが、アミノ末端伸長ペプチドを除去することによって前駆体タンパク質型を成熟型に転換するプロテアーゼを含む、モデルを提案した。シグナル仮説は、ミトコンドリア、葉緑体などの種々の細胞内膜に局在するタンパク質内に異なるターゲティング配列を含むようにすぐに拡張された。これらの異なるターゲティング配列は、搬出されたタンパク質から特異的シグナルペプチダーゼ（ＳＰａｓｅ）によって切断されることが後日見出された。
【０１７８】
細菌においてシグナルペプチドの切断に関与する少なくとも３種類の異なるＳＰａｓｅが存在する。ＳＰａｓｅ  Ｉは、ＳｅｃＹＥＧ経路又はｔｗｉｎ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（Ｔａｔ）経路によって搬出される非リポタンパク質基質を処理し得る。Ｓｅｃ経路によって搬出されるリポタンパク質は、ＳＰａｓｅ  ＩＩによって切断される。ＳＰａｓｅ  ＩＶは、ＩＩ型分泌装置の成分である、ＩＶ型ｐｒｅｐｉｌｉｎ及びｐｒｅｐｉｌｉｎ様タンパク質を切断する。
【０１７９】
真核生物においては、小胞体（ＥＲ）膜を標的とするタンパク質は、タンパク質を共翻訳的に、又は翻訳後に、Ｓｅｃ６１トランスロケーション装置に向けるシグナルペプチドによって媒介される。ＥＲシグナルペプチドは、その細菌的な対応物と類似した特徴を有する。ＥＲシグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼ複合体（ＳＰＣ）によってＥＲ腔に搬出された後、搬出されたタンパク質から切断される。タンパク質を真核細胞内の異なる場所に分別する各シグナルペプチドは、これらの細胞が多数の種々の膜状及び含水区画を含むので、異なるものでなければならない。ＥＲを標的とするタンパク質は、切断可能なシグナル配列を含むことが多い。驚くべきことに、多数の人工ペプチドがトランスロケーションシグナルとして機能し得る。最も重要な特徴は、あるしきい値を超えた疎水性であると考えられる。ＥＲシグナルペプチドは、ロイシン残基の含量が、細菌のシグナルペプチドよりも高い。シグナル認識粒子（ＳＲＰ）は、リボソームから出現した後に切断可能シグナルペプチドと結合する。ＳＲＰは、新生タンパク質をＥＲ膜に向けるのに必要である。ＥＲ腔へのタンパク質のトランスロケーション後、搬出されたタンパク質はＳＰＣによってプロセシングを受ける。別の実施形態は、真核細胞中に天然に存在するシグナル（リーダー）ペプチドプロセシング酵素を利用する。真核生物においては、小胞体（ＥＲ）膜を標的とするタンパク質は、タンパク質を共翻訳的に、又は翻訳後に、Ｓｅｃ６１トランスロケーション装置に向けるシグナルペプチドによって媒介される。ＥＲシグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼ複合体（ＳＰＣ）によってＥＲ腔に搬出された後、搬出されたタンパク質から切断される。公知のＥＲシグナルペプチドの大部分は、Ｎ末端で切断可能であり、又は内部で切断不可能である。最近、Ｃ型肝炎ウイルス、ハンタウイルス、フラビウイルス、風疹ウイルス及びインフルエンザＣウイルス中に見出されるポリタンパク質など、幾つかのウイルス性ポリタンパク質が、ＥＲ  ＳＰＣによって切断される可能性が最も高い内部シグナルペプチドを含むことが見出された。ウイルス性ポリタンパク質の成熟に関するこれらの研究によれば、ＳＰＣは、アミノ末端に位置するシグナルペプチドだけでなく、内部シグナルペプチドの後に位置するシグナルペプチドも切断し得る。
【０１８０】
プレセニリン型アスパラギン酸プロテアーゼシグナルペプチドペプチダーゼ（ＳＰＰ）は、その膜貫通領域内のシグナルペプチドを切断する。ＳＰＰは、ヒトにおけるシグナルペプチド由来のＨＬＡ−Ｅエピトープの生成に必須である。最近、Ｃ型肝炎ウイルス、ハンタウイルス、フラビウイルス、風疹ウイルス及びインフルエンザＣウイルス中に見出されるポリタンパク質など、幾つかのウイルス性ポリタンパク質が、ＥＲ  ＳＰＣによって切断される可能性が最も高い内部シグナルペプチドを含むことが見出された。したがって、予測されるシグナルペプチダーゼ基質特異性エレメントの変異誘発によって、ウイルス感染能（ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）を遮断し得る。ポリタンパク質の成熟に関するこれらの研究は、ＳＰＣが、アミノ末端に位置するシグナルペプチドだけでなく、内部シグナルペプチドの後に位置するシグナルペプチドも切断し得ることを示しているので、やはり極めて興味深い。シグナルペプチダーゼは当分野で周知である。例えば、Ｐａｅｔｚｅｌ  Ｍ．  ２００２．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  １０２（１２）：４５４９；  Ｐｅｋｏｓｚ  Ａ．  １９９８．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ９５：１３２３３−１３２３８；  Ｍａｒｉｕｓ  Ｋ．  ２００２．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  １０：７３５−７４４；  Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｋ．  ２００４．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：６３７０−６３８０，  Ｖｏｌ．  ７８；  Ｍａｒｔｏｇｌｉｏ  Ｂ．  ２００３．  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２：Ｒ２０１−Ｒ２０６及びＸｉａ  Ｗ．  ２００３．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １１６：２８３９−２８４４を参照されたい。
【０１８１】
小胞体（ＥＲ）膜を標的とするタンパク質は、タンパク質を共翻訳的に、又は翻訳後に、Ｓｅｃ６１トランスロケーション装置に向けるシグナルペプチドによって媒介される。ＥＲシグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼ複合体（ＳＰＣ）によってＥＲ腔に搬出された後、搬出されたタンパク質から切断される。公知のＥＲシグナルペプチドの大部分は、Ｎ末端で切断可能であり、又は内部で切断不可能である。最近、Ｃ型肝炎ウイルス、ハンタウイルス、フラビウイルス、風疹ウイルス及びインフルエンザＣウイルス中に見出されるポリタンパク質など、幾つかのウイルス性ポリタンパク質が、ＥＲ  ＳＰＣによって切断される可能性が最も高い内部シグナルペプチドを含むことが見出された。ウイルス性ポリタンパク質の成熟に関するこれらの研究によれば、ＳＰＣは、アミノ末端に位置するシグナルペプチドだけでなく、内部シグナルペプチドの後に位置するシグナルペプチドも切断し得る。
【０１８２】
本発明は、単一の転写物におけるポリペプチドの発現に内部切断可能シグナルペプチドを利用する。次いで、転写された単一のポリペプチドは、ＳＰＣによって切断されて、個々のペプチドが分離され、又は個々のペプチドがタンパク質に組み立てられる。本発明の方法は、転写された単一のポリペプチドにおける免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の発現、続いて切断、次いで成熟免疫グロブリンへの組立てに適用可能である。この技術は、ポリペプチドサイトカイン、成長因子、又は種々の他のタンパク質、例えば、転写された単一のポリペプチドにおけるＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１２ｐ３５、次いでＩＬ−１２への組立て、又は転写された単一のポリペプチドにおけるＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−２３ｐ１９、次いでＩＬ−２３への組立てに適用可能である。
【０１８３】
シグナルペプチダーゼ手法は、ほ乳動物発現ベクターに適用可能であり、前駆体又はポリタンパク質から機能的抗体、又はプロセシングを受けた他の産物が発現される。抗体の場合には、ベクターから重鎖と軽鎖の両方を含むポリタンパク質として産生され、重鎖と軽鎖の間の介在配列は、内部切断可能シグナルペプチドである。この内部切断可能シグナルペプチドは、ＥＲに存在するプロテアーゼ、主にシグナルペプチダーゼ、プレセニリン又はプレセニリン様プロテアーゼによって切断されて、重鎖と軽鎖が残され、折り畳まれ、組み立てられて、機能的分子を与え得るものであり、望ましくは分泌される。Ｃ型肝炎ウイルス由来の内部切断可能シグナルペプチドに加えて、ＥＲに存在するプロテアーゼによって切断され得る他の内部切断可能な配列は、置換することができる。同様に、本発明の実施は、シグナルペプチダーゼが切断を起こす宿主細胞に限定する必要はなく、プレセニリン、プレセニリン様プロテアーゼ、及びポリペプチドをプロセシングするための他のプロテアーゼを含めて、ただしこれらだけに限定されないプロテアーゼも含む。これらのプロテアーゼは、とりわけ、引用した論文に概説されている。
【０１８４】
また、本発明は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の発現に限定されず、単一の転写物において発現される他のポリペプチド及びポリタンパク質も含み、続いて内部シグナルペプチドが切断されて、各ペプチド又はタンパク質が遊離する。これらのタンパク質は、成熟産物中で一緒に組み立てられても、組み立てられなくてもよい。
【０１８５】
個々のポリペプチドが交互に存在する発現構築物、すなわち、「ペプチド１−内部切断可能シグナルペプチド−ペプチド２」又は「ペプチド２−内部切断可能シグナルペプチド−ペプチド１」も本発明の範囲内である。本発明は、「ペプチド１−内部切断可能シグナルペプチド−ペプチド２−内部切断可能シグナルペプチド−ペプチド３」など、内部切断可能シグナルペプチドによって連結された２種類を超えるペプチドの発現を更に含む。
【０１８６】
また、本発明は、Ｉ型とＩＩ型の両方の膜貫通タンパク質の発現に適用され、また、発現構築物を包囲する他のプロテアーゼ切断部位の付加に適用される。一例は、フューリン又はＰＣ５／６切断部位を免疫グロブリン重鎖の後に付加して、重鎖ペプチドのカルボキシル末端における追加のアミノ酸残基の切断を促進することである。例えば、「重鎖−フューリン切断部位−内部切断可能シグナルペプチド−軽鎖」である。本発明は、離れた、又は直列の、１個を超える内部切断可能シグナルペプチドも含む。例えば、「重鎖−フューリン切断部位−内部切断可能シグナルペプチド−内部切断可能シグナルペプチド−軽鎖」である。また、本発明は、「ＨＣシグナルペプチド−重鎖−フューリン切断部位−内部切断可能シグナルペプチド−ＬＣシグナルペプチド−軽鎖」など、重鎖及び軽鎖の自己シグナルペプチドが維持又は除去される状況も含む。
【０１８７】
以下の記述は、本明細書にその一部が記載されている抗体産生ベクターに関連する。ベクターの設計としては、以下が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１８８】
ベクター設計の表
【０１８９】
【表１】
2009508470.tif 000003
【０１９０】
融合構築物の一具体例は、内部切断可能シグナルペプチドと融合したＤ２Ｅ７重鎖をコードする（Ｈｕｍｉｒａ／アダリムマブ）。内部切断可能シグナルペプチド自体は、Ｄ２Ｅ７軽鎖のコード領域と融合している。この実施形態においては、重鎖分泌シグナルが成熟重鎖に先行する。内部切断可能シグナルペプチド配列は、インフルエンザＣウイルスに由来する。フューリン切断部位は、重鎖のカルボキシ末端に含まれる。成熟抗体に対する感情（ａｆｆｅｃｔ）を最小化するために、重鎖の最後から３番目のアミノ残基をプロリンからアルギニンに変異させて、フューリン切断部位を作製した。別の実施形態は、成熟軽鎖の５’側の軽鎖分泌シグナルを含む。表９Ａ−９Ｃを参照されたい。インフルエンザＣウイルス由来の最小の内部切断可能シグナルペプチド配列（ＭＧＲＭＡＭＫＷＬＶＶＩＩＣＦＳＩＴＳＱＰＡＳＡ、配列番号１１）を例に使用する。より長い配列を使用して切断効率を高めることもできる。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ１２６１９６を参照されたい。同じアミノ酸配列をコードする種々のヌクレオチド配列を使用することもできる。
【０１９１】
本発明は、単一の転写物内でコードされたポリタンパク質内の１種類以上のポリペプチドの成熟のために、内部切断可能シグナルペプチドを更に利用することができる。次いで、転写された単一のポリペプチドは、ＳＰＣによって切断されて、個々のペプチドが分離され、又は個々のペプチドがタンパク質に組み立てられる。本発明は、転写された単一のポリペプチドにおいて免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を発現させ、次いで成熟免疫グロブリンに組み立てるのに適用可能である。本発明は、ポリペプチドサイトカイン、成長因子、又は種々の他のタンパク質、例えば、転写された単一のポリペプチドにおいてＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１２ｐ３５を発現させ、次いでＩＬ−１２に組み立てるのに、又は転写された単一のポリペプチドにおいてＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−２３ｐ１９を発現させ、次いでＩＬ−２３に組み立てるのに、適用可能である。
【０１９２】
本発明のベクター構築物のための２個以上の異種ＤＮＡ配列間の２Ａ配列又は他のプロテアーゼ若しくはシグナルペプチダーゼ切断（認識）部位の位置的なサブクローニングによって、単一の発現ベクターを介して２種類以上の遺伝子を送達及び発現させることができる。ＦＭＤＶ  ２Ａ配列、プロテアーゼ認識配列などの自己プロセシング切断部位は、単一のウイルスベクターから、例えば、抗体、ヘテロ２量体受容体又はヘテロ２量体タンパク質の個々の部分であり得る、２種類以上のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを発現及び送達させる独特の手段をもたらすことが好ましい。
【０１９３】
ＦＭＤＶ  ２Ａは、ＦＭＤＶゲノム中でそれ自体のＣ末端における単一の切断を誘導する機能を果たし、したがってシスで機能するポリタンパク質領域である。ＦＭＤＶ  ２Ａドメインは、約１９アミノ酸長（ＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、配列番号１２；ＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、配列番号１３；Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１．  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：２７２７−２７３２）であると一般に報告されているが、わずか１４アミノ酸残基（ＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、配列番号１４）のオリゴペプチドも、未変性ＦＭＤＶポリタンパク質プロセシングにおけるその役割と同様に、２Ａ  Ｃ末端における切断を媒介することが判明した。
【０１９４】
２Ａ配列の変形物は、ポリタンパク質の効率的プロセシングを媒介する能力について研究された（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）。２Ａ配列の相同体及び変種は、本発明の範囲内に含まれ、以下の配列、すなわち、ＱＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、配列番号１５；ＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰＦＦ、配列番号１６；ＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、配列番号１７；ＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、配列番号１８；ＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、配列番号１９；ＶＴＥＬＬＹＲＭＫＲＡＥＴＹＣＰＲＰＬＬＡＩＨＰＴＥＡＲＨＫＱＫＩＶＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、配列番号２０；ＬＬＡＩＨＰＴＥＡＲＨＫＱＫＩＶＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、配列番号１４１；ＥＡＲＨＫＱＫＩＶＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、配列番号１４２などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１９５】
２Ａ配列及びその変種は、自己プロセシング又は他の切断部位が存在することによってポリタンパク質の切断後に個々のタンパク質が適切なモル比及び／又は量で発現されるように、自己プロセシング切断部位又は他のプロテアーゼ切断部位を介して連結された、タンパク質又はポリペプチドのコード配列を含む任意の（プラスミド又はウイルス系）ベクターを含めて、自己プロセシングポリタンパク質を発現するベクターの作製に使用することができる。これらのタンパク質は、ベクター自体に対して異種でもよく、互いに異種でもよく、又は自己プロセシング切断部位、例えば、ＦＭＤＶに対して異種でもよく、したがって、本発明の実施に用いられる自己プロセシング切断部位は、切断機能を果たし、又は切断を媒介する能力において、自己プロセシング切断部位と同じ出所に由来する異種タンパク質とコード配列とを区別しない。
【０１９６】
一実施形態においては、本発明によるベクターに含まれるＦＭＤＶ  ２Ａ配列は、ＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１２）を含むアミノ酸残基をコードする。或いは、本発明によるベクターは、ピコルナウイルス、昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルス、トリパノソーマ反復配列又は細菌サーモトガ  マリチマ由来の２Ａ様ドメインを含めて、ただしこれらだけに限定されない、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８２：１０２７−１０４１に考察された他の２Ａ様領域のアミノ酸残基をコードし得る。
【０１９７】
本発明は、アミノ酸の１個以上に対して親ヌクレオチドのコドンとは異なるコドンを有する２Ａ又は２Ａ様ポリペプチドの核酸コード配列など、２Ａ又は２Ａ様ペプチド配列をコードする核酸配列変種の使用を企図する。かかる変種は、本発明によって具体的に企図され、包含される。２Ａペプチド及びポリペプチドの配列変種も同様に本発明の範囲に含まれる。同様に、シス又はトランスで供給されるプロテアーゼは、ポリタンパク質の領域間の同起源のプロテアーゼ認識（切断）部位を介してタンパク質分解プロセシングを媒介し得る。
【０１９８】
インテイン−抗体発現構築物を用いた更なる実験においては、本発明者らは、ほ乳動物（２９３Ｅ）細胞において、ＥＲ中で、抗体（Ｄ２Ｅ７）重鎖及び軽鎖アミノ酸配列に関連して、パイロコッカス  ホリコシイＰｏｌ  Ｉインテインによって媒介されるタンパク質スプライシング反応が起こり得ることを示した。このタイプの反応を単一オープンリーディングフレーム（ｓＯＲＦ）形式の抗体発現に用いるために、本発明者らは、ほ乳動物細胞（２９３Ｅ）において、ＥＲ中で、抗体重鎖及び抗体軽鎖のアミノ酸配列に関連して、２種類の構築物、ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ１ａａ−ｐ．ｈｏｒｉ及びｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ３ａａ−ｐ．ｈｏｒｉを用いて、この反応が起こり得ることを示した。表１１Ａ及び１２Ａを参照されたい。
【０１９９】
これらの構築物をＰＴＴ３ベクター骨格上で作製した。このベクターは、懸濁培養液中の移入された２９３Ｅ細胞（エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）核抗原１を発現する細胞）においてそのエピソーム増幅を可能にする、エプスタインバーウイルス複製開始点を有する（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，  ２００２，  ”Ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｇｒｏｗｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ２９３−ＥＢＮＡ１  ｃｅｌｌｓ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０（２）：Ｅ９）。各ベクターは、ＣＭＶプロモーターの調節制御下で転写的に発現される、１個のＯＲＦを含んだ。ＯＲＦにおいては、シグナルペプチド（ＳＰ）を各々有するＤ２Ｅ７の重鎖と軽鎖の間にＰ．ホリコシイＰｏｌＩインテインがインフレームで挿入された。ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ１ａａ−ｐ．ｈｏｒｉ及びｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ３ａａ−ｐ．ｈｏｒｉ構築物は、Ｄ２Ｅ７抗体の重鎖と軽鎖の各配列をインテイン配列から分離する、１個の自然のエクステインアミノ酸、又は３個の自然のエクステインアミノ酸をインテインのどちらかの側に含んだ。これらの構築物を一過性の移入によって２９３Ｅ細胞に導入した。培養上清と細胞ペレット試料の両方を分析した。
【０２００】
サイトゾル画分と細胞内膜画分の分離を可能にする条件下で細胞ペレット試料を溶解した。これらの画分の両方を、抗重鎖又は抗カッパ軽鎖抗体を用いたウエスタンブロット（ＷＢ）によって分析した。これらのブロット上で、本発明者らは、構築物のＯＲＦにおけるような３部構成（ｔｒｉ−ｐａｒｔｉｔｅ）体（１３０ｋＤａ）、スプライシング現象から誘導されるＨとＬの融合物（ｆｕｓｉｏｎ）（８０ｋＤａ）、抗体重鎖（５０ｋＤａ）、及び抗体軽鎖（２５ｋＤａ）に対応する４つのタンパク質種の発現を観測した。最初の２つのタンパク質種は抗重鎖と抗軽鎖の両方の抗体によって検出され、重鎖は抗重鎖抗体によってのみ検出され、軽鎖は抗軽鎖抗体によってのみ検出された。これらの構築物の両方において、重鎖と軽鎖の両方の抗体によって検出された８０ｋＤａのタンパク質種が存在することは、タンパク質スプライシング現象が起きたことを示している。また、４つのタンパク質種は全部、小胞体（ＥＲ）を含む、細胞内（ｓｕｂ−ｃｅｌｌｕｌａｒ）の膜画分中に主に存在した。これは、（ＯＲＦの最初にコードされた）重鎖シグナルペプチドがポリペプチド全体をＥＲに誘導し、そこでスプライシング反応が起きたことを示している。特定の理論に拘泥するつもりはないが、重鎖と軽鎖の遊離ポリペプチドは、不完全なスプライシングに起因する、Ｎ末端及びＣ末端スプライシング接合部における切断の結果である可能性が高いと考えられる。
【０２０１】
細胞ペレット試料を、全ＲＮＡ抽出、及び抗体重鎖プローブと抗体軽鎖プローブの両方を用いたノーザンブロット分析にも使用した。ノーザンブロット分析によって、これらのｓＯＲＦ構築物中に、重鎖プローブと軽鎖プローブの両方とハイブリッド形成した３部構成（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）ｍＲＮＡ（３．４ｋｂ）が出現したが、別々の重鎖又は軽鎖のｍＲＮＡは出現しなかった。これに対し、従来の手法を用いて、すなわち、２個のｐＴＴ３ベクターに保有された２個の別々のＯＲＦから抗体の重鎖と軽鎖を導入して、Ｄ２Ｅ７抗体を発現させた細胞ペレット試料においては、重鎖（１．４ｋｂ）及びＬ鎖（０．７ｋｂ）の各ｍＲＮＡが、それぞれ重鎖又は軽鎖プローブを用いて検出された。これらの対照細胞ペレットにおいては、３部構成ｍＲＮＡは検出されなかった。
【０２０２】
上記データは、単一のＯＲＦを含む構築物（Ｄ２Ｅ７重鎖−Ｐ．ホリコシイ（ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ）インテイン−Ｄ２Ｅ７軽鎖）を用いて、３種類のタンパク質全部を含む単一のｍＲＮＡが転写されたことを示している。この３部構成メッセージは、３部構成ポリペプチドに翻訳され、３部構成ポリタンパク質のＮ末端に存在する重鎖シグナルペプチドによって誘導されて、ＥＲに同時翻訳的に移入された。この構築物を用いて、インテインによって媒介されるタンパク質スプライシング反応がＥＲ内で起きた。これは、インテインによって媒介される反応を、抗体の発現、及び他の多サブユニット分泌タンパク質、すなわち、折り畳まれ、適切に翻訳後修飾されるために分泌経路を通過する必要があるタンパク質の発現に使用できることを示唆している。
【０２０３】
培養上清も分析した。ウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡによって、ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ１ａａ−ｐ．ｈｏｒｉ構築物の発現から分泌される抗体を検出することができる。これらの研究を以下でより詳細に考察する。分泌抗体発現量は、軽鎖シグナルペプチドをコードする配列内の点変異と変異の両方によって増加した。
【０２０４】
インテインによって媒介される連結を阻害するが、Ｎ末端又はＣ末端のスプライシング接合部における切断反応を維持するように設計された変異によって、抗体分泌レベルが増加した。
【０２０５】
抗体分泌の効率を増加させる目的で、３タイプの点変異を設計し、試験した。第１のタイプの変異は、Ｃ末端エクステインの第１セリン残基のコドンにおけるものであった。これらの構築物は、ＳｅｒからＭｅｔ（Ｓ＞Ｍ）への変化を含んだ（構築物ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉ、構築物Ｅ及び構築物Ａ）。第２のタイプの変異は、インテインの第１セリン残基のコーディングにおけるものであった。かかる構築物はＳｅｒからＴｈｒ（Ｓ＞Ｔ）への変化を含んだ（構築物Ｅ）。第３のタイプの変異は、インテインの最後から２番目のアミノ酸であるヒスチジン残基のコドンにおけるものであった。これらの構築物はＨｉｓからＡｌａ（Ｈ＞Ａ）への置換変異を含んだ（構築物Ａ及び構築物Ｂ）。これらの変異を単独で、又は組み合わせて、導入した。変異体構築物全部を、文献に記載の反応機構に従って、Ｎ又はＣ末端スプライシング接合部における切断を維持し、遊離したエクステインのスプライシングを減少させるように、又は両方、設計した。以下に概説するように、Ｄ２Ｅ７抗体の分泌は、幾つかのこれらの構築物を用いて実施される。
【０２０６】
一実験においては、これらの構築物を一過性移入によって２９３Ｅ細胞に導入し、７日後、培養した上清のＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ分析によって分析した。構築物ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ３ａａ−ｐ．ｈｏｒｉ、ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ１ａａ−ｐ．ｈｏｒｉ、ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉ、Ｅ、Ａ及びＢの抗体価は、それぞれ１７．０＋０．６、１１３．８＋２．６、２２５．８＋１０．０、９．３＋０．５、１６１．７＋４．４及び４８．２＋１．０ｎｇ／ｍｌ（平均＋ｓ．ｄ．）であった。
【０２０７】
これらの上清試料を変性条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでも分析し、ヒトＩｇＧ重鎖に対する抗体及びヒトカッパ軽鎖に対する抗体と一緒にブロットした。これらのウエスタンブロット上で、抗体重鎖（約５０ｋＤａ）及び抗体軽鎖（約２５ｋＤａ）は、構築物ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉ及び構築物Ａから生成した上清において明瞭に見られ、ＥＬＩＳＡによって測定したＩｇＧレベルの順位と一致した。
【０２０８】
これらの移入から得られた細胞ペレット試料もウエスタンブロット分析によって特徴づけられた。３部構成ポリペプチド（約１３０ｋＤａ）は、抗体重鎖（約５０ｋＤａ）及び軽鎖（約２５ｋＤａ）バンドと一緒に、上記の全構築物を含む細胞ペレットにおいて見られる。これらのうち、構築物ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉ及び構築物Ａは、最も強い重鎖及び軽鎖バンドを与えた。したがって、細胞内遊離重鎖及び軽鎖レベルと、組み立てられ、分泌された抗体との間に相関があると結論された。抗体の重鎖と軽鎖の融合物である、スプライスされた産物（約８０ｋＤａ）は、構築物ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ３ａａ−ｐ．ｈｏｒｉを用いて作製された細胞ペレット中に存在し、構築物ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ１ａａ−ｐ．ｈｏｒｉから作製された細胞ペレット中により少ない程度に存在した。これは、構築物ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉ及び構築物Ａ、Ｂ及びＥでは存在しなかった。これは、タンパク質スプライシングレベルが、抗体分泌効率と逆相関することを示している。これは、抗体構造についての一般的知識に基づいて、抗体の重鎖と軽鎖の連結が誤った折り畳みをもたらし、その結果、この誤った折り畳みが、誤って折り畳まれたタンパク質の分解に対する細胞機構のために、分泌を阻止するという予測と一致する。これらのブロット上の別のタンパク質種は、（軽鎖抗体によって認識されるが、重鎖抗体によっては認識されない）インテイン−軽鎖融合物（８０ｋＤａ）であった。この融合物は、更なる切断の非存在下で、Ｎ末端のスプライシング接合部における切断から生成した。このバンドは、本明細書に記載の構築物Ａ、Ｂ、Ｅ、ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ３ａａ−ｐ．ｈｏｒｉ、ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ１ａａ−ｐ．ｈｏｒｉにおいて存在し、構築物ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉ及び構築物Ｈにおいてほとんど存在しなかった。したがって、このタンパク質種の存在も、抗体分泌量と逆の関係にあった。最後に、インテインバンドは、これらの細胞溶解物においても、ＫＬＨと複合化した、Ｐ．ホリコシイペプチドに対して産生されたウサギポリクローナル抗血清を用いて検出された。
【０２０９】
本発明者らは、ｓＯＲＦ構築物ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉを用いて分泌されたＤ２Ｅ７抗体が、重鎖及び軽鎖の正確なＮ末端配列、正確な重鎖及び軽鎖分子量、並びに完全な分子量を有することを示した。
【０２１０】
ｓＯＲＦ構築物ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉの１つを用いて分泌されたＤ２Ｅ７抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、その重鎖とその軽鎖の両方のＮ末端配列に関して分析した。明確な結果は、重鎖のＮ末端ペプチド配列がＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ（配列番号２１）であり、軽鎖のＮ末端配列がＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ（配列番号２２）であったことを示している。したがって、この構築物を用いて、シグナルペプチダーゼｗ  ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳによって用いられる切断部位は、従来の２個のＯＲＦ／２種類のベクターの手法においてＤＥ２７抗体発現に使用された切断部位と同じである。
【０２１１】
これらのデータは、次世代の構築物の設計に重要な科学的見識を提供する。すなわち、ほ乳動物のＥＲペプチダーゼは、その提示には幾つかの明白な要件があるにしても、新規合成ポリタンパク質中のシグナルペプチドを認識し、正確に切断することができる（下記参照）。
【０２１２】
この精製抗体を、従来の製造方法によって製造されたＤ２Ｅ７と一緒に、質量分析法によって分析した。変性条件下では、ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉ構築物から産生されたＤ２Ｅ７軽鎖は、質量スペクトル上の単一ピークを与え、その分子量（ＭＷ）は２３４０８．８であった。一方、標準製造方法から作製されたＤ２Ｅ７軽鎖の分子量（ＭＷ）は２３４０９．７であり、よく一致した。また、変性条件下では、ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉ構築物から産生されたＤ２Ｅ７重鎖は、質量スペクトル上で１本の主ピークと２本の副ピークを与え、その分子量（ＭＷ）はそれぞれ５０６４０．６、５０７６８．２及び５０８０２．４であった。一方、標準製造方法から作製されたＤ２Ｅ７重鎖の分子量（ＭＷ）はそれぞれ５０６４１．７、５０７６８．６及び５０８０４．１であり、やはりよく一致した。３本のピークは、Ｄ２Ｅ７重鎖の標準変形物に対応する。
【０２１３】
ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉ構築物から産生されたこのＤ２Ｅ７抗体の自然条件下で完全な分子量（ＭＷ）も、本製造方法から作製されたＤ２Ｅ７抗体と一緒に、質量分析法によって測定した。ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉ構築物から産生されたＤ２Ｅ７抗体は、それぞれＭＷ１４８０９７．６、１４８２４６．９及び１４８４１３．１の３本のピークを有した。本製造方法から作製されたＤ２Ｅ７抗体もそれぞれＭＷ１４８０９６．０、１４８２５２．３及び１４８４１２．８の３本のピークを有した。
【０２１４】
これらのデータは、ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉ構築物から産生されたＤ２Ｅ７抗体が、変性条件と自然条件の両方で、従来の製造方法から作製されたＤ２Ｅ７抗体と同一サイズであることを明確に示した。従来の製造方法と比較して、完全に信頼のおけるアミノ酸配列を有する抗体を産生する能力は、本発明の抗体発現系の利点の１つである。例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２００５においてＦａｎｇらによって記述された２Ａ系を用いて、産生された抗体は、その重鎖のＣ末端に２個の余分な非天然アミノ酸を含んだ。これは、切断の性質上、回避することができない。
【０２１５】
本発明者らは、ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉ  ｓＯＲＦ構築物を用いて産生されたＤ２Ｅ７抗体が、ＴＮＦとの結合に対して、本製造方法から作製されたＤ２Ｅ７抗体と同じ親和性を有することも示した。バイオセンサーチップ全体にわたって固定化ヤギ抗ヒトＩｇＧを介して捕捉されたｒｈＴＮＦａ拮抗物質と、可溶性ｒｈＴＮＦａとの間の実時間の結合相互作用を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、製造者の指示及び標準手順に従って測定した。手短に述べると、ｒｈＴＮＦａ一定分量をＨＢＳ−ＥＰ（Ｂｉａｃｏｒｅ）緩衝剤で希釈し、１５０μｌ一定分量を固定化タンパク質マトリックス全体に流量２５ｍｌ／ｍｉｎで注入した。等濃度の分析物を無処置の基準表面全体に同時注入して、バルク屈折率バックグラウンドを減算するためのブランクのセンサーグラムとした。センサーチップ表面を、１０ｍＭグリシンの２５ｍｌ／ｍｉｎで５分間の２回の注入を含むサイクル間で再生した。次いで、得られた実験結合センサーグラムをＢＩＡ評価４．０．１ソフトウェアを用いて評価して、動力学的速度パラメータを求めた。各拮抗物質のデータセットを１：１ラングミュアモデルに適合させた。これらの試験では、適合を最大分析物結合能（ＲＵ）又はＲｍａｘ特性について局所的に選択しながら、結合及び解離データを全体的な適合分析（ｇｌｏｂａｌ  ｆｉｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）プロトコル下で分析した。この場合、ソフトウェアは、単一解離（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）定数（ｋｄ）、会合定数（ｋａ）及び親和性定数（Ｋｄ）を計算した。平衡解離定数はＫｄ＝ｋｄ／ｋａである。動力学的オン速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）、動力学的オフ速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）及び全体の親和性を、１−１００ｎＭの範囲の異なるＴＮＦα濃度を用いて求めた。構築物ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉから産生されたＤ２Ｅ７抗体の動力学的オン速度、動力学的オフ速度及び全体の親和性は、それぞれ１．６１Ｅ＋６（Ｍ−１ｓ−１）、５．６９Ｅ−５（ｓ−１）及び３．５４Ｅ−１１（Ｍ）であった。本製造方法によって製造されたＤ２Ｅ７抗体の動力学的オン速度、動力学的オフ速度及び全体の親和性は、それぞれ１．７３Ｅ＋６（Ｍ−１ｓ−１）、６．７２Ｅ−５（ｓ−１）及び３．８９Ｅ−１１（Ｍ）であった。Ｂｉａｃｏｒｅ分析によれば、このｓＯＲＦ構築物を用いて産生されたＤ２Ｅ７抗体は、ＴＮＦに対して、従来の製造方法によって製造されたＤ２Ｅ７抗体と類似の親和性を有する。
【０２１６】
シグナルペプチドの修飾
本発明者らは、ｓＯＲＦ構築物設計、Ｈｅａｖｙｃｈａｉｎ−ｉｎｔ−ＬｉｇｈｔＣｈａｉｎにおいて、軽鎖シグナルペプチド配列の疎水性を部位特異的変異誘発によって減少させると、抗体分泌レベルが約１０倍増加したことを示した。
【０２１７】
本発明者らは、Ｐ．ホリコシイインテイン配列後に、軽鎖シグナルペプチド配列が「ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＦＰＧＳＲＣ」（配列番号２３）から「ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧ  ＤＥＷＦＰＧＳＲＣ」（配列番号２４）に変化した構築物Ｈを設計した。上述した同じタイプの移入実験において、この構築物を発現した細胞の上清は、ＥＬＩＳＡ分析によって測定して２０４７＋１１６ｎｇ／ｍｌの抗体を含んだ。この抗体分泌レベルは、２Ａ技術を用いて記述したレベルと類似している（１．６μｇ／ｍｌ）。この上清のウエスタンブロット分析は、抗体重鎖及び抗体軽鎖に対応する強いバンドを示した。
【０２１８】
対照実験では、この同じ軽鎖シグナルペプチド変異を、この抗体を発現するベクターに（２種類の別々のベクター中の２個の別々のオープンリーディングフレームから抗体の重鎖と軽鎖を発現させる）従来手法によって導入した。この構築物においては、疎水性領域は、従来の構築物設計において、ＥＲ上のシグナル認識粒子（ＳＲＰ）複合体へのターゲティング、及びトランスロコンへの入口（ｅｎｔｒａｎｃｅ）の誘導に重要であるので、予想されたように、配列番号２４を与える配列番号２３の変化は、抗体分泌を消滅させた。これは、ｓＯＲＦ構築物の設計において、軽鎖シグナルペプチドがＥＲシグナルペプチダーゼによって認識及び切断され得るとしても、軽鎖シグナルペプチドのターゲティング機能が不必要であることを立証しており、ＯＲＦ全体が、ＯＲＦの始めの重鎖シグナルペプチドによって誘導されてＥＲに入るという仮説と一致する。
【０２１９】
ｓＯＲＦ構築物Ｈを用いて分泌されたＤ２Ｅ７抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、その軽鎖のＮ末端配列に関して分析した。軽鎖のＮ末端ペプチド配列は、非切断シグナルペプチドである（明確な）ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬ（配列番号２６）であった。文献は、ほ乳動物のＥＲシグナルペプチドのＨ領域が、（ＳＲＰ）複合体へのターゲティング、及びトランスロコンを介したトランスロケーションの誘導において主に機能することを示唆しているが、本発明者らのデータは、シグナルペプチドの疎水性（Ｈ）領域も、シグナルペプチダーゼによる認識及び切断にある役割を果たすことを示唆した。
【０２２０】
本発明者らは、ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉ構築物と構築物Ｈの両方を用いて分泌されたＤ２Ｅ７抗体が、細胞アッセイにおいて生物学的に活性であることを示した。構築物ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉ及び構築物Ｈを用いて産生されたＤ２Ｅ７抗体を精製し、ＴＮＦａによって誘発される細胞傷害性を中和する能力をＬ９２９細胞において試験した。このアッセイを本質的に米国特許第６０９０３８２号（その中の実施例４参照）に記載のように実施した。ヒト組み換えＴＮＦａは、ネズミＬ９２９細胞において細胞傷害性を生じ、このアッセイに使用された。Ｄ２Ｅ７、抗ＴＮＦａ抗体は、この細胞傷害性を中和し得るので、Ｌ９２９アッセイは、特定のＤ２Ｅ７抗体調製物の生物活性を評価するのに使用することができる細胞アッセイの１つである。このアッセイによって分析すると、ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉ構築物と構築物Ｈの両方から産生されたＤ２Ｅ７は、ＴＮＦａによって誘発される細胞傷害性を中和した。そのＩＣ５０値は、標準製造方法から作製されたＤ２Ｅ７によるＩＣ５０値と類似していた。
【０２２１】
本発明者らは、軽鎖シグナルペプチド領域の設計が異なる追加の構築物を検討した。高い抗体分泌効率を与える最適なｓＯＲＦ構築物設計を特定するために、本発明者らは、Ｃ末端スプライシング部位とそれに続くシグナルペプチドの周囲の領域を変化させた幾つかの追加の構築物を設計した。構築物Ｊは、Ｈ構築物の「ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＤＥ  ＷＦＰＧＳＲＣ」（配列番号２４）の代わりに、インテインの最後のＮに続く「ＭＤＭＲＶＰＡＱＷＦＰＧＳＲＣ」（配列番号２５）を決定し、更にこのシグナルペプチド内の疎水性領域を除去し、Ｃ末端領域及びシグナルペプチダーゼ切断部位を保持した。構築物Ｋは、インテインの最後のＮに直接続く成熟軽鎖配列の発現を誘導した。構築物Ｌは、切断部位の前の−１及び−２アミノ酸をシグナルペプチダーゼによって変化させた構築物ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉにおけるように、「ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＦＰＧＳＲＣ」（配列番号２３）の代わりに、インテインの最後のＮに続く「ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＦＰＧＳＧＧ」（配列番号２７）の発現を誘導した。
【０２２２】
一実験においては、これらの構築物を一過性移入によって２９３Ｅ細胞に導入し、７日後、培養した上清のＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ分析によって分析した。構築物Ｈ、Ｊ、Ｋ及びＬの抗体価は、それぞれ２３２８．５＋７９．９、１２８９．７＋１２９．６、１３９．３＋４．７及び６２５．０＋２０．６ｎｇ／ｍｌ（平均＋ｓ．ｄ．）であった。
【０２２３】
これらの移入から得られた細胞ペレット試料をウエスタンブロット分析によっても分析した。全構築物は、上記３部構成ポリペプチドバンド（約１３０ｋＤａ）、重鎖バンド（約５０ｋＤａ）及び軽鎖バンド（約２５ｋＤａ）を有し、（重鎖と軽鎖の両方の抗体によって認識される）検出可能なスプライス産物（８０ｋＤａ）を持たなかった。この構築物群のうち、構築物Ｋは、極少量の細胞内軽鎖のみを産生し、代わりにインテイン−軽鎖融合に対応するタンパク質種、Ｎ末端スプライス部位における一切断現象の産物を産生した点で、最も特徴的なウエスタンブロット（ＷＢ）パターンを示した。このタンパク質種は、この群の他の構築物では存在しなかった。構築物Ｋは、他の構築物とは２つの面で異なった。すなわち、構築物Ｋは、シグナルペプチダーゼによる切断部位を持たず、Ｃ末端エクステインの第１アミノ酸残基としてメチオニン又はセリンの代わりにアスパラギン酸を含んだ。これらの特徴の一方又は両方は、インテインと抗体軽鎖の間の領域における切断を防止し、抗体分泌を減少させ得た。
【０２２４】
ｓＯＲＦ構築物Ｊ及びＬを用いて分泌されたＤ２Ｅ７抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、その軽鎖のＮ末端配列を分析した。この分析によれば、構築物Ｊによって産生された軽鎖のＮ末端ペプチド配列は、非切断シグナルペプチドであるＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬであった。一方、構築物Ｌによって産生された軽鎖のＮ末端ペプチド配列は、正確なシグナルペプチド切断後の成熟軽鎖であるＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳであった。したがって、構築物Ｌは、構築物ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉよりも抗体分泌を増加させる設計であり（異なる一過性移入において０．６−１ｕｇ／ｍｌ）、その軽鎖は同時に正確なＮ末端配列を有した。
【０２２５】
本発明者らは、組み立てられた抗体をｓＯＲＦ構築物からインテインを用いて発現させる機構、及び抗体分泌レベルを更に増加させる方法を探索した。記述したｓＯＲＦ構築物の大部分を移入した細胞の細胞内試料は、プロセシングを受けない軽鎖とプロセシングを受けた軽鎖に対応する２つの抗体軽鎖種を含んだ。正の対照構築物又はｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉ構築物を移入した細胞においては、プロセシングを受けた軽鎖のみが分泌された。これは、結合した野生型軽鎖シグナルペプチドを有する、プロセシングを受けない軽鎖を組み立てることができず、分泌できないことを示している。これに対し、Ｈ及びＪ構築物から得られたプロセシングを受けない軽鎖は、組み立てることができ、分泌することができた。どちらも変異シグナルペプチドを含んだ。プロセシングを受けない形態とプロセシングを受けた形態の間の細胞内軽鎖ポリペプチド分布に見られるように、軽鎖シグナルペプチドプロセシングの程度は、構築物に応じて変わる。構築物ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉに比較して、構築物Ｌは、プロセシングを受けた軽鎖の量が増加した。これは、抗体分泌の増加につながった。
【０２２６】
上記実験データに基づいて、ｓＯＲＦ構築物から抗体分泌を増加させる一方法は、軽鎖シグナルペプチドのプロセシング効率を改善することである。これは、疎水性領域及び切断部位周囲領域における変異を系統的に試験することによって、また、長さの異なるシグナルペプチドを試験することによって実施される。これは、この提示（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）において効率的に切断することができるペプチド配列を酵母中でスクリーニングすることによって、また、ＣＨＯ細胞において類似のスクリーニングを実施することによって、実施することもできる。
【０２２７】
ｓＯＲＦ構築物からの抗体分泌レベルを増加させるのに使用することができる別の方法は、３部構成ｍＲＮＡの安定性を増加させるために、異なる５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を試験することである。というのは、これらのｍＲＮＡは、抗体の重鎖と軽鎖を別々にコードする従来のｍＲＮＡよりも大きいからである。
【０２２８】
ｓＯＲＦ構築物からの抗体分泌レベルを増加させる別の方法は、安定なＣＨＯ又はＮＳ０細胞系を作製し、選択し、ＤＨＦＲ又はＧＳを用いて増幅させて、組み換え遺伝子コピー数を増加させることである。抗体分泌レベルは、組み換え遺伝子の位置をエピソーム（一過性）からゲノム（安定な）に変更することによって独立に増加する。抗体分泌レベルは、コピー数を増加させることによって、及び／又は５’及び３’ＵＴＲ、プロモーター並びにエンハンサー配列を操作することによっても、増加する。ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）を発現するベクターをｄｈｆｒ欠損細胞系に移入する。ベクターコピー数の多い細胞系を、ｄｈｆｒの競合的阻害剤であるメトトレキセートを用いて選択する（Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｒ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  Ｐ．Ａ．  Ｊ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （１９８２）  １５９：６０１−６２１）。更に独立した選択肢として、グルタミンシンセターゼ選択マーカーと併せてサイトメガロウイルスプロモーターエンハンサーを保有する発現ベクターを用いて、発現を増加させる（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ，  Ｃ．Ｒ．  （１９９１）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２：１３８−１４５）。組み換え遺伝子コピー数の増加に加えて、ｓＯＲＦ構築物設計からのプロセシングに特に適している細胞系譜もこの方法において選択される。
【０２２９】
挿入配列を含む修飾インテインの使用
Ｄ２Ｅ７の重鎖と軽鎖の各ポリペプチドから分離された細胞内インテインタンパク質を追跡するために、本発明者らは、ｐＴＴ３−ＬｃｉｎｔＨＣ−ｐ．ｈｏｒｉと構築物Ｈの両方の構築物において、アミノ酸配列位置ＦＲＫＶＲ！ＲＧＲＧ（！は挿入部位、−ＨＴ１）及びＥＧＫＲ！ＩＰＥＦ（−ＨＴ２）にヒスチジンタグを導入した４構築物を作製した。Ｐ．ホリコシイインテイン中のこれらの２つの位置は、その３次元構造を維持し、したがってその機能を維持しつつ、挿入断片を許容し得るループであると仮定した。一実験においては、２９３Ｅ細胞の移入に続いて４日間インキュベートした後、培養上清のＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ分析によって分析した。構築物ｐＴＴ３−ＬｃｉｎｔＨＣ−ｐ．ｈｏｒｉ−ＨＴ１、ｐＴＴ３−ＬｃｉｎｔＨＣ−ｐ．ｈｏｒｉ−ＨＴ２、構築物Ｈ−ＨＴ１、構築物Ｈ−ＨＴ２及び構築物Ｈの抗体価は、それぞれ７８．３＋３．２、６７．３＋０．６、６６３．０＋１５．５、４０２．７＋５．５、７４７．０＋２２．５ｎｇ／ｍｌ（平均＋ｓ．ｄ．）であった。２つの位置の両方に挿入配列を含むＰ．ホリコシイインテインを使用すると、組み立てられた抗体が分泌された。特に、第１の位置に内部挿入タグを含むインテインを使用すると、挿入配列を含まないインテインを使用した場合と類似した抗体分泌レベルが得られた。
【０２３０】
上記データは、本発明のｓＯＲＦ構築物設計が、内部タグを含む修飾インテインの使用を含むことを示している。種々のタグが当分野で公知である。本発明のタグとしては、蛍光タグ、化学発光タグなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。かかる構築物を用いて、個々の細胞における蛍光検出によって、発現されたポリタンパク質の量をモニターすることができる。また、これらの細胞をＦＡＣＳによってタンパク質発現レベルに従って分別することができる。かかるタグの使用は、ＦＡＣＳ分析による高産生性細胞又は細胞系の選択を可能にするので、安定な細胞系産生において特に有用である。本発明に教示するように、完全長インテインは、フランキング抗体の重鎖と軽鎖から自己切断（ａｕｔｏ−ｃｌｅａｖｅｄ）された後、細胞溶解物中に観測された。これは、蛍光標識インテインの検出、及び安定な細胞系産生におけるその使用の基礎を提供するものである。タグは、タンパク質の精製に使用することもできる。
【０２３１】
上記データから、本発明者らは、Ｐ．ホリコシイＰｏｌ  Ｉインテインによって媒介されるタンパク質スプライシング反応が２９３Ｅ細胞において、ＥＲ中で、（Ｄ２Ｅ７によって具体的に例示される）抗体の重鎖及び軽鎖の各アミノ酸配列に関連して、起こり得ることを学んだ。Ｃ末端エクステインの第１のアミノ酸におけるＳ＞Ｍ、インテインの最後から２番目のアミノ酸におけるＨ＞Ａなどの点置換（ｐｏｉｎｔ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）変異によって、分泌抗体レベルが増加した。構築物Ｈ及びＪなどにおける軽鎖シグナルペプチドのＨ領域の疎水性を低下させると、抗体分泌レベルが更に増加した。軽鎖シグナルペプチドを欠く構築物における抗体分泌レベルは比較的低い。これは、Ｃ末端スプライシング接合部における切断効率が低いためであると考えられた。この切断の効率を増加させるために、２つの手法が使用される。第１の手法は、＋１位においてアスパラギン酸以外のアミノ酸を使用する。本明細書に記載の幾つかの構築物も、＋１位のメチオニンを使用し、Ｃ末端スプライシング接合部における切断が効率的であった。この切断の効率を増加させる第２の手法は、本開示に記載のものなどの異なるタイプの切断部位が後に続いてもよいリンカーを用いて、Ｃ末端切断部位と軽鎖球状構造との間隔を変えることである。
【０２３２】
Ｐ．ホリコシイインテイン及びＤＥ２７抗体を含む種々の構築物を記述し、試験したが、例えば抗体の重鎖と軽鎖の間に取り込まれた、（ヘッジホッグ及び関係するファミリーを含めて）他のインテイン及びインテイン様タンパク質を本発明のｓＯＲＦ設計に使用する。（２サブユニットタンパク質、及び２個を超えるサブユニットを有するタンパク質を含めて）他の複数サブユニットタンパク質を、抗体の重いタンパク質及び軽いタンパク質の代わりに同様に使用する。
【０２３３】
上記Ｐ．ホリコシイＰｏｌＩインテイン構築物に加えて、本発明者らは、Ｓｃｅ．ＶＭＡインテイン及びＳｓｐ．  ｄｎａＥミニインテインを用いて類似の構築物を設計した：ｐＴＴ３−Ｈｃ−ＶＭＡｉｎｔ−ＬＣ−０ａａ、ｐＴＴ３−Ｈｃ−ＶＭＡｉｎｔ−ＬＣ−１ａａ、ｐＴＴ３−Ｈｃ−ＶＭＡｉｎｔ−ＬＣ−３ａａ、ｐＴＴ３−Ｈｃ−Ｓｓｐ−ＧＡ−ｉｎｔ−ＬＣ−０ａａ、ｐＴＴ３−Ｈｃ−Ｓｓｐ−ＧＡ−ｉｎｔ−ＬＣ−１ａａ及びｐＴＴ３−Ｈｃ−Ｓｓｐ−ＧＡ−ｉｎｔ−ＬＣ−３ａａ。これらの構築物を２９３Ｅ細胞に移入し、上清及び細胞ペレット試料を分析した。
【０２３４】
一実験においては、２９３Ｅ細胞の移入に続いて７日間インキュベートした後、培養上清のＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ分析によって分析した。構築物ｐＴＴ３−Ｈｃ−ＶＭＡｉｎｔ−ＬＣ−０ａａ、ｐＴＴ３−Ｈｃ−ＶＭＡｉｎｔ−ＬＣ−１ａａ、ｐＴＴ３−Ｈｃ−ＶＭＡｉｎｔ−ＬＣ−３ａａ、ｐＴＴ３−ＨＣ−Ｓｓｐ−ＧＡ−ｉｎｔ−ＬＣ−０ａａ、ｐＴＴ３−ＨＣ−Ｓｓｐ−ＧＡ−ｉｎｔ−ＬＣ−１ａａ及びｐＴＴ３−ＨＣ−Ｓｓｐ−ＧＡ−ｉｎｔ−ＬＣ−３ａａの抗体価は、それぞれ９．０±３．５、１２．０±０．０、３９．７±１．２、９０．０±２．０、３８．７±１．５及び３２±２．６ｎｇ／ｍｌ（平均±ｓ．ｄ．）であった。
【０２３５】
これらの移入から得られた細胞ペレット試料をウエスタンブロット分析によっても分析した。３部構成ポリペプチドは、これらの試料の全部で観測された。また、重鎖ポリペプチドは、構築物ｐＴＴ３−Ｈｃ−ＶＭＡｉｎｔ−ＬＣ−０ａａ、ｐＴＴ３−ＨＣ−Ｓｓｐ−ＧＡ−ｉｎｔ−ＬＣ−０ａａ、ｐＴＴ３−ＨＣ−Ｓｓｐ−ＧＡ−ｉｎｔ−ＬＣ−１ａａ及びｐＴＴ３−ＨＣ−Ｓｓｐ−ＧＡ−ｉｎｔ−ＬＣ−３ａａで観測され、軽鎖ポリペプチドは、ｐＴＴ３−ＨＣ−Ｓｓｐ−ＧＡ−ｉｎｔ−ＬＣ−０ａａ、ｐＴＴ３−ＨＣ−Ｓｓｐ−ＧＡ−ｉｎｔ−ＬＣ−１ａａ及びｐＴＴ３−ＨＣ−Ｓｓｐ−ＧＡ−ｉｎｔ−ＬＣ−３ａａで観測された。
【０２３６】
これらの実験の結果によれば、タンパク質の１クラスとしてのインテインは、本発明者らが記述したｓＯＲＦタンパク質発現戦略に首尾よく使用することができる。また、インテインに加えて、細菌インテイン様（ＢＩＬ）ドメイン及びヘッジホッグ（Ｈｏｇ）自動プロセシングドメイン、Ｈｏｇ／インテイン（ＨＩＮＴ）スーパーファミリーの他の２メンバーを、本明細書に記載の構築物設計と類似した構築物設計に適用可能である。
【０２３７】
さらに、Ｐ．ホリコシイＰｏｌＩインテイン及びＳｃｅ．ＶＭＡインテインを含めて、多数のインテイン中に存在するエンドヌクレアーゼ領域は、本発明の遺伝子発現戦略に不用であるので、エンドヌクレアーゼドメインを除去し、小さなリンカーで置換して、「ミニインテイン」を作製することができる。
【０２３８】
これらの操作されたミニインテインも上記構築物設計に有用である。これらの操作されたミニインテインは、インテインコード領域がかなり小さいという利点があり、したがって目的ポリペプチドをコードする配列を拡大することができ、及び／又は組み換えＤＮＡ分子の取扱いをより容易にすることができる。
【０２３９】
２Ａ又は２Ａ様配列、プロテアーゼ認識配列などの自己プロセシングペプチドの使用に関連した１つの懸念は、１本以上のポリペプチド鎖のＣ又はＮ末端が、一次翻訳産物内の特定の鎖の切断位置及び相対位置に応じて、自己プロセシングペプチドから誘導されるアミノ酸、すなわち２Ａによって誘導されるアミノ酸残基、又はプロテアーゼ認識配列を含むことである。これらのアミノ酸残基は、宿主に対して「外来性」であり、組み換えタンパク質がインビボで発現されると、又は送達されると（すなわち、遺伝子療法に関連してウイルス若しくは非ウイルスベクターから発現され、又はインビトロで製造された組み換えタンパク質として投与されると）、免疫応答を誘発し得る。また、２Ａによって誘導されるアミノ酸残基、又はプロテアーゼ部位由来のアミノ酸残基は、除去しないと、産生細胞においてタンパク質分泌を妨害することがあり、及び／又はタンパク質高次構造を変えることがあり、発現レベルが最適未満となり、及び／又は組み換えタンパク質の生物活性が低下し得る。
【０２４０】
追加のタンパク質分解性切断部位が、切断後に残留した自己プロセシング切断部位由来のアミノ酸残基の除去手段として、ポリペプチドコード配列と自己プロセシング切断部位（すなわち、２Ａ配列）又は他のプロテアーゼ切断部位との間に設けられるように操作された遺伝子発現構築物を、本発明の実施に使用することができる。
【０２４１】
追加のタンパク質分解性切断部位の例は、フューリン、タンパク質分泌経路内の他のセリンプロテアーゼなどの内因性サブチリシン様プロテアーゼによって切断され得る、コンセンサス配列ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１）を有するフューリン切断部位である。米国特許出願公開第２００５／００４２７２１号によれば、第１のタンパク質のＮ末端の２Ａ残基は、第１のポリペプチドと２Ａ配列の間にフューリン切断部位ＲＡＫＲを導入することによって効率的に除去することができる。また、２Ａ配列と２Ａ部位に隣接するフューリン切断部位とを含むプラスミドを使用すると、２Ａ配列のみを含むプラスミドよりもタンパク質発現レベルが高くなることが判明した。この改善によって、２Ａ残基をタンパク質のＮ末端から除去したときに、より長い２Ａ配列、２Ａ様配列又は他の自己プロセシング配列を使用することができる点で更なる利点が提供される。２Ａ配列、２Ａ様配列などのかかるより長い自己プロセシング配列は、２種類以上のポリペプチドのより良好な等モル発現を単一のプロモーターを介して促進し得る。免疫グロブリン発現の更なる増加は、ポリタンパク質中に免疫グロブリン軽鎖コード配列が２回存在し、重鎖コード配列が１回しか存在しないときに得られる。
【０２４２】
十分なヒト特性を有する抗体又はその類似体を使用することが有利である。これらの試薬は、非ヒト種由来の抗体又は類似体によって誘発される、望ましくない免疫応答を回避する。自己プロセシングペプチドから誘導されるアミノ酸残基に対して起こり得る宿主免疫応答に対処するために、発現されたポリペプチド、すなわち抗体から自己プロセシングペプチド配列を除去するように、タンパク質分解性切断部位のコード配列を、第１のタンパク質のコード配列と自己プロセシングペプチドのコード配列との間に（当分野で公知である標準方法を用いて）挿入することができる。これは、インビボで使用される治療抗体又は診断抗体に特に有用である。
【０２４３】
組み換えＤＮＡ技術ベクターを用いて発現させることができる、当分野で公知である任意の追加のタンパク質分解性切断部位を、本発明の実施に使用することができる。ポリペプチド又はタンパク質コード配列と（２Ａ配列などの）自己プロセシング切断配列との間に挿入することができる、例示的な追加のタンパク質分解性切断部位としては、フューリン切断部位、ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１）；活性化第Ｘ因子切断部位、ＩＥ（Ｄ）ＧＲ（配列番号６）；シグナルペプチダーゼＩ切断部位、例えばＬＡＧＦＡＴＶＡＱＡ（配列番号２８）及びトロンビン切断部位、ＬＶＰＲＧＳ（配列番号７）が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０２４４】
１種類を超える成熟タンパク質を単一オープンリーディングフレームから発現させるＩＲＥＳ、フューリン、２Ａ及びインテイン手法の代替として、本発明は、ポリタンパク質内の第１のタンパク質部分と第２のタンパク質部分の間に位置するヘッジホッグタンパク質ドメインを用いたタンパク質プロセシングも規定する。本発明者らは、抗体の重鎖と軽鎖の各遺伝子を分離するために、ヘッジホッグ自動プロセシングドメインを有する抗体の重鎖と軽鎖を発現させる単一オープンリーディングフレームを設計した。かかるＯＲＦを保有する細胞においては、少なくとも１本の抗体重鎖、１本の抗体軽鎖及び１個のヘッジホッグ自動プロセシングドメインからなる単一のｍＲＮＡを転写し、使用して、対応するポリタンパク質を産生させる。翻訳後に、ヘッジホッグ自動プロセシングドメインは、抗体の重鎖と軽鎖の分離を媒介する。
【０２４５】
タンパク質のヘッジホッグファミリーは、種々の発生系においてモルフォゲンとして働く保存されたシグナル伝達分子を含み、広範囲のヒト疾患に関与する（Ｋａｌｄｅｒｏｎ，  Ｄ．  ２００５．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．  Ｄｅｃ；３３（Ｐｔ６）：１５０９−１２）。ヘッジホッグタンパク質は、２個の構造ドメインと、細胞シグナル伝達において機能するＮ末端ドメイン（Ｈｈ−Ｎ）と、これら２個のドメイン間を切断する翻訳後自動プロセシング現象を触媒するＣ末端ドメイン（Ｈｈ−Ｃ）とを有し、Ｎ末端ドメインのＣ末端にコレステロール部分を付加し、それによってシグナル伝達分子を活性化する。（Ｔｒａｃｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  Ｃｅｌｌ，  ９１，  ８５−９７）。
【０２４６】
かかるｓＯＲＦ抗体発現技術によってもたらされる利点としては、重鎖と軽鎖の遺伝子量比を操作する能力、ＥＲ中で多サブユニットを組み立てるための重鎖と軽鎖のポリペプチドの近接、高効率タンパク質分泌の潜在能力などが挙げられる。
【０２４７】
Ｈｈ−Ｃタンパク質ドメインは、ＥＲ中での自動プロセシング反応を触媒して、下記単一オープンリーディングフレーム構築物設計において、抗体重鎖ポリペプチドとＨｈ−Ｃポリペプチドの間を翻訳後に切断するのに使用することができる。
【０２４８】
タンパク質のヘッジホッグファミリーは、Ｎ末端シグナル伝達ドメイン及びＣ末端自動プロセシングドメインを有する。そのＣ末端自動プロセシングドメインは、それ自体をＮ末端ドメインから切断し、そのＣ末端にコレステロール部分を２段階反応機序によって付加する（Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２７４  （５２８５）：２５５−９）。コレステロールに加えて、ＤＴＴ、グルタチオンなどの他の求核剤も自動プロセシングを刺激する（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６６，  １５２８−１５３７）。切断反応はＣ末端自動プロセシングドメインによって触媒されるので、ヘッジホッグタンパク質のＮ末端シグナル伝達ドメインを抗体の重鎖又は軽鎖のポリペプチドで置換したときも類似の切断反応が起こる。この反応は、単一オープンリーディングフレームによってコードされたポリタンパク質に含まれる抗体の重鎖と軽鎖を分離するのに使用することができる。
【０２４９】
まず、抗体発現を一過性発現系において試験する。このために、構築物をＰＴＴ３ベクター骨格上に作製する。このベクターは、懸濁培養中の移入された２９３Ｅ細胞（エプスタインバーウイルス核抗原１を発現する細胞）においてそのエピソーム増幅を可能にするＥＢＶ複製開始点を有する（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）。各ベクターは、ＣＭＶプロモーターによって駆動される、単一オープンリーディングフレームを有する。一構築物設計ｐＴＴ３−ＨＣ−Ｈｈ−Ｃ２５−ＬＣにおいては、キイロショウジョウバエに由来するソニックヘッジホッグタンパク質のＣ末端ドメイン全体を、その各々がシグナルペプチド（ＳＰ）を有するＤ２Ｅ７の重鎖と軽鎖の間にインフレームで挿入した。これらの構築物を一過性の移入によって２９３Ｅ細胞に導入する。培養上清と細胞ペレット試料の両方を分析する。
【０２５０】
サイトゾル画分と細胞内膜画分の分離を可能にする条件下で細胞ペレット試料を溶解する。これらの画分の両方を、抗重鎖又は抗カッパ軽鎖抗体を用いた免疫ブロット技術によって分析する。これらのブロット上で、観察されるタンパク質種としては、ポリタンパク質（ＨＣ−Ｈｈ−Ｃ２５−ＬＣ）、Ｈｈ−Ｃ２５−ＬＣ、別々の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）などが挙げられる。後者の３つのタンパク質種の存在によって、自動プロセシング反応が起きたことが確認される。遊離の重鎖は、Ｈｈ−Ｃタンパク質ドメインによって触媒される切断から生成し、遊離の軽鎖ポリペプチドは、シグナルペプチダーゼによる切断の結果である。小胞体（ＥＲ）を含む細胞内の膜画分中のタンパク質種の分離（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）は、本発明者らのＯＲＦの始めの重鎖シグナルペプチドがＯＲＦ全体をＥＲ中に誘導し、そこで切断反応が起こることを示唆している。
【０２５１】
これらの細胞ペレット試料を、全ＲＮＡ抽出、及び抗体重鎖特異的プローブと抗体軽鎖特異的プローブの両方を用いたノーザンブロット分析に供する。これらのノーザンブロット上で、重鎖プローブと軽鎖プローブの両方とハイブリッド形成する３部構成ｍＲＮＡが観察されることによって、構築物設計のｓＯＲＦ性が確認される。これに対し、従来の手法を用いて、すなわち、２個のｐＴＴ３ベクターに保有された２個の別々のＯＲＦから抗体の重鎖と軽鎖を導入して、Ｄ２Ｅ７抗体を発現させた細胞ペレット試料においては、重鎖（１．４ｋｂ）及びＬ鎖（０．７ｋｂ）の各ｍＲＮＡが、それぞれ重鎖又は軽鎖プローブを用いて検出された。
【０２５２】
これらの実験は、単一のＯＲＦを含む構築物（Ｄ２Ｅ７重鎖−Ｈｈ−Ｃ２５−Ｄ２Ｅ７軽鎖）を用いて、３種類のタンパク質全部を含む単一のｍＲＮＡが転写されることを示している。この３部構成メッセージは、３部構成ポリペプチドに翻訳され、ＯＲＦの始めに存在する重鎖シグナルペプチドによって誘導されて、ＥＲに同時翻訳的に移入される。これは、Ｈｈ−Ｃタンパク質ドメインが、抗体の発現、並びに他の多サブユニット分泌タンパク質、及び／又は折り畳まれ、適切に翻訳後修飾されるために分泌経路を通過する必要がある他のタンパク質の発現に有用であることを示している。
【０２５３】
細胞ペレットに加えて、本明細書で考察するように、培養上清の分泌抗体をウエスタンブロットとＥＬＩＳＡの両方を用いて分析する。除去されたｈｈ−Ｃ２５を用いた構築物を試験して、ポリタンパク質プロセシング及び抗体分泌レベルの効率を比較することができる。
【０２５４】
Ｈｈ−Ｃ２５タンパク質ドメインからＣ末端６３アミノ酸を除去すると、タンパク質プロセシングを触媒し得るが、コレステロール付加を触媒し得ないタンパク質ドメインＨｈ−Ｃ１７が生成することが判明した。Ｈｈ−Ｃ１７は、組み換えタンパク質として十分に発現し、その結晶構造が決定された（Ｔｒａｃｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．上記）。したがって、別の構築物設計ｐＴＴ３−ＨＣ−Ｃ１７−ＬＣにおいては、この切断型タンパク質ドメインをＤ２Ｅ７抗体の重鎖と軽鎖の間に挿入した。
【０２５５】
本発明者らが本明細書で詳述するのと類似した構築物設計において試験した、ヘッジホッグタンパク質とインテインの相同性アラインメントにおいては、最後の８アミノ酸は、最後に予測されたβシート二次構造を超えた延長部分（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）であり、自動プロセシング効率に寄与する場合もあれば、寄与しない場合もある。したがって、追加の構築物ｐＴＴ３−ＨＣ−Ｃ１７ｓｃ−ＬＣも試験する。
【０２５６】
これらの構築物を一過性移入によって２９３Ｅ細胞に導入し、７日後、培養上清のＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ分析によって分析することができる。ｐＴＴ３−ＨＣ−Ｃ２５−ＬＣ、ｐＴＴ３−ＨＣ−Ｃ１７−ＬＣ、ｐＴＴ３−ＨＣ−Ｃ１７ｓｃ−ＬＣ及びｐＴＴ３−ＨＣ−Ｃ１７ｈｎ−ＬＣの抗体価は、それぞれ０．０３８、０．０４２、０．０４０及び０．０４６ｕｇ／ｍｌである。
【０２５７】
これらの上清試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（変性条件）でも分析し、ヒトＩｇＧ重鎖に特異的な抗体及びヒトカッパ軽鎖に特異的な抗体と一緒にブロットする。これらのウエスタンブロット上で、抗体重鎖（約５０ｋＤａ）及び抗体軽鎖（約２５ｋＤａ）タンパク質を観測することができ、これらはＥＬＩＳＡによって測定されたＩｇＧレベルと相関し得る。
【０２５８】
これらの移入から得られた細胞ペレット試料もウエスタンブロット分析によって分析する。４つの上記タンパク質種の存在及び比重を異なる構築物間で比較して、構築物設計の各々によってもたらされるタンパク質プロセシング効率を求めることができる。
【０２５９】
別のクラスの自己プロセシングタンパク質、インテインにおいては、最後の２個のアミノ酸はＨｉｓＡｓｎである傾向にある。インテインによって触媒されるタンパク質スプライシングプロセスにおいては、ＡｓｎはＨｉｓによって補助されて環化し、その結果、インテインとそのＣ末端フランキングポリペプチドの間のペプチド結合が切断される。インテインに対して、ヘッジホッグ自動プロセシングタンパク質は、天然にＣ末端フランキングポリペプチドを持たず、保存されたＡｓｎをポリペプチドのこの位置に持たない。一構築物設計ｐＴＴ３−ＨＣ−Ｃ１７ｈｎ−ＬＣにおいては、本発明者らはＨｉｓ−Ａｓｎをこの位置に導入して、Ｓｅｒ−Ｃｙｓを置換した。理論に拘泥するつもりはないが、この位置における操作された切断部位によって、この特定の構築物設計におけるヘッジホッグ自動プロセシングタンパク質と抗体軽鎖の分離がより効率的になる。抗体分泌効率を上述したように試験する。
【０２６０】
ヘッジホッグ自動プロセシングタンパク質を含むｓＯＲＦ構築物によって産生される抗体を特徴づける。上記ｓＯＲＦ構築物を用いて分泌されたＤ２Ｅ７抗体を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、その重鎖とその軽鎖の両方のＮ末端配列を分析する。これらの精製抗体を、標準製造方法から作製されたＤ２Ｅ７と一緒に、変性条件下で、上記のように質量分析法によって分析する。質量分析法を用いて、これらの構築物から産生されたＤ２Ｅ７抗体の自然条件下での完全な分子量（ＭＷ）を、本製造方法から作製されたＤ２Ｅ７抗体と一緒に、求める。
【０２６１】
Ｄ２Ｅ７抗体とヒトＴＮＦαの結合を上記Ｂｉａｃｏｒｅを用いて分析する。動力学的オン速度、動力学的オフ速度及び全体の親和性を、１−１００ｎＭの範囲の異なるＴＮＦα濃度を用いて求める。
【０２６２】
本発明は、２種類以上のポリペプチド又はタンパク質のコード配列と自己プロセシング切断配列とを含む構築物を細胞に導入するための種々のベクターのいずれかの使用を企図する。遺伝子発現ベクターの多数の例が当分野で公知であり、それらはウイルス起源の場合もあれば、非ウイルス起源の場合もある。本発明の実施に使用することができる非ウイルス遺伝子送達方法としては、プラスミド、リポソーム、核酸／リポソーム複合体、陽イオン性脂質などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０２６３】
ウイルスベクター
ウイルスベクター及び他のベクターは、効率的に細胞を形質導入し、それ自体のＤＮＡを宿主細胞中に導入する。組み換えウイルスベクターを作製する際に、非必須遺伝子は、目的タンパク質又はポリペプチドをコードする発現可能な配列で置換される。例示的ベクターとしては、（レンチウイルスベクターを含めた）レトロウイルスベクター、その増殖性、非増殖性及びヘルパー依存型を含めたアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、サルウイルス４０（ＳＶ−４０）ベクター、ウシ乳頭腫ベクター、エプスタインバーベクター、ヘルペスベクター、ワクシニアベクター、モロニーマウス白血病ベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳癌ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクター、非ウイルス性プラスミドなどのウイルスベクター及び非ウイルスベクターが挙げられるが、これらだけに限定されない。バキュロウイルスベクターは周知であり、昆虫細胞における発現に適切である。ほ乳動物細胞又は他の真核細胞における発現に適切であるおびただしい量のベクターが当分野で周知であり、多数市販されている。商業供給源としては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯなどが挙げられる。多数のベクター配列がＧｅｎＢａｎｋを通して利用可能であり、ベクターに関する追加の情報は、インターネット上でＲｉｋｅｎ  ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒを介して利用可能である。
【０２６４】
ベクターは、複製開始点を典型的には含み、ベクターを特定し、選択することができる「マーカー」又は「選択マーカー」機能を更に含んでも、含まなくてもよい。任意の選択マーカーを使用することができるが、組み換えベクター用の選択マーカーは当分野で一般に公知であり、適切な選択マーカーを宿主細胞に応じて選択する。抗生物質又は他の毒素に対する耐性を与えるタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子の例としては、アンピシリン、メトトレキセート、テトラサイクリン、ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９８２．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ．  １：３２７−４１）、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９８０．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：１４２２−７）、ピューロマイシン、ゼオマイシン、ハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９８５．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ５：４１０−３）、ジヒドロ葉酸還元酵素、グルタミンシンセターゼ及びＧ４１８が挙げられるが、これらだけに限定されない。当業者には理解されるように、発現ベクターは、典型的には、複製開始点、発現すべきコード配列に作動可能に結合したプロモーター、並びにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写ターミネーター配列を、発現されるコード配列に応じて適宜含む。
【０２６５】
ベクター又は他のＤＮＡ配列を「組み換え」と称するのは、典型的には作動可能に結合されていないＤＮＡ配列の作動可能な結合が天然から単離され、又は天然に存在することを単に認めるものである。調節（発現及び／又は制御）配列は、発現及び／又は制御配列が転写及び、適宜、核酸配列の翻訳を調節するときに、核酸コード配列に作用可能に結合している。したがって、発現及び／又は制御配列は、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、コード配列の５’側の開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル及び終止コドンを含む。
【０２６６】
アデノウイルス遺伝子治療ベクターは、強い一過性発現、優れた力価、並びに分裂細胞及び非分裂細胞をインビボで形質導入する能力を示すことが知られている（Ｈｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００．  Ａｄｖ  ｉｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ５５：４７９−５０５）。本発明の組み換えＡｄベクターは、ベクターを非複製性（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）Ａｄビリオンに取り込まれるようにするパッケージング部位と、２種類以上の目的ポリペプチド又はタンパク質、例えば、目的免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖のコード配列と、自己プロセシング切断部位を単独で、又は追加のタンパク質分解性切断部位と組み合わせて、コードする配列とを含む。感染性ビリオンへの取り込みに必要又は有用な他のエレメントとしては、５’及び３’Ａｄ  ＩＴＲ、Ｅ２遺伝子、Ｅ４遺伝子部分、並びに場合によってはＥ３遺伝子などが挙げられる。
【０２６７】
組み換えＡｄベクターに封入された非複製性Ａｄビリオンは、当分野で公知である標準技術によって、Ａｄパッケージング細胞及びパッケージング技術を用いて作製される。これらの方法の例を、例えば、米国特許第５，８７２，００５号に見出すことができる。２種類以上の目的ポリペプチド又はタンパク質のコード配列は、一般に、アデノウイルス中の除去されたウイルスゲノムＥ３領域に挿入される。本発明の実施に用いるのに好ましいアデノウイルスベクターは、１種類以上の野生型Ａｄ遺伝子産物、例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４を発現しない。好ましい実施形態は、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４及び場合によってはＥ３遺伝子領域の機能を補完するパッケージング細胞系と一緒に典型的には使用されるビリオンである。例えば、米国特許第５，８７２，００５号、同５，９９４，１０６号、同６，１３３，０２８号及び同６，１２７，１７５号を参照されたい。
【０２６８】
したがって、本明細書では「アデノウイルス」及び「アデノウイルス粒子」とは、特段の記載がない限り、ウイルス自体又はその誘導体を指し、全血清型及び下位分類並びに天然体と組み換え体の両方を包含する。かかるアデノウイルスは、野生型でもよく、又は当分野で公知である、若しくは本明細書に開示する種々の方法で修飾されていてもよい。かかる修飾としては、感染性ウイルスを作製するために粒子中にパッケージされたアデノウイルスゲノムに対する修飾などが挙げられる。かかる修飾としては、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３又はＥ４コード領域の１個以上の欠失など、当分野で公知である欠失が挙げられる。例示的なパッケージング及び産生細胞は、２９３、Ａ５４９又はＨｅＬａ細胞に由来する。アデノウイルスベクターは、当分野で公知である標準技術によって精製され、処方される。
【０２６９】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、染色体を組み込むことによって細胞に潜在的に感染し得るヘルパー依存型（ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）ヒトパルボウイルスである。染色体に組み込むその能力及びその非病原性のために、ＡＡＶは、ヒト遺伝子治療ベクターとして重要な可能性を有する。本発明の実施に用いるために、ｒＡＡＶビリオンは、当業者に公知である標準方法によって製造することができ、転写方向に作用可能に結合した成分として、転写開始及び終結配列を含めた制御配列並びに目的コード配列を含むように構築される。より具体的には、本発明の組み換えＡＡＶベクターは、ベクターを非複製性（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）ＡＡＶビリオンに取り込まれるようにするパッケージング部位と、２種類以上の目的ポリペプチド又はタンパク質、例えば、目的免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖のコード配列と、自己プロセシング切断部位を単独で、又は１個以上の追加のタンパク質分解性切断部位と組み合わせて、コードする配列とを含む。本発明の実施に用いるＡＡＶベクターは、転写方向に作用可能に結合した成分として、転写開始及び終結配列を含めた制御配列も含むように構築される。これらの成分の５’及び３’末端は、機能的ＡＡＶ  ＩＴＲ配列に隣接する。「機能的ＡＡＶ  ＩＴＲ配列」とは、ＩＴＲ配列がＡＡＶビリオンの救出、複製及びパッケージング用として機能することを意味する。
【０２７０】
組み換えＡＡＶベクターは、選択された組み換えポリペプチド又はタンパク質産物の標的細胞における発現及び産生を誘導し得ることも特徴とする。したがって、この組み換えベクターは、キャプシド形成に、また、組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの感染に対する物理的構造に必須であるＡＡＶ配列の少なくとも全部を含む。したがって、発現ベクター用ＡＡＶ  ＩＴＲは、（例えば、Ｋｏｔｉｎ．  １９９４．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ５：７９３−８０１に記載の）野生型ヌクレオチド配列を含む必要がなく、ヌクレオチドの挿入、欠失若しくは置換によって改変することができ、又は幾つかのＡＡＶ血清型のいずれからも誘導することができる。一般に、ＡＡＶベクターは、当分野で公知であるアデノ随伴ウイルス血清型から誘導される任意のベクターであり得る。
【０２７１】
典型的には、ＡＡＶ発現ベクターを産生細胞に導入し、続いてＡＡＶヘルパー構築物を導入する。ヘルパー構築物は、産生細胞中で発現可能であるＡＡＶコード領域を含み、ＡＡＶベクターにはないＡＡＶヘルパー機能を補完する。ヘルパー構築物は、参照により本明細書に組込む米国特許第６，５４８，２８６号に記載のように、典型的には、ｐ５に続く開始コドンをＡＴＧからＡＣＧに変異させることによって、大きいＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８）の発現を下方制御するように設計し得る。これに続いて、ヘルパーウイルス及び／又は追加のベクターを産生細胞に導入する。ヘルパーウイルス及び／又は追加のベクターは、効率的ｒＡＡＶウイルス産生を支援し得る補助的機能を提供する。次いで、産生細胞を培養して、ｒＡＡＶを産生する。これらの段階を標準方法によって実施する。本発明の組み換えＡＡＶベクターに封入された非複製性ＡＡＶビリオンは、当分野で公知である標準技術によって、ＡＡＶパッケージング細胞及びパッケージング技術を用いて作製される。これらの方法の例を、例えば、参照によりその全体を本明細書に組込む米国特許第５，４３６，１４６号、同５，７５３，５００号、同６，０４０，１８３号、同６，０９３，５７０号及び同６，５４８，２８６号に見出すことができる。パッケージング用の更なる組成物及び方法は、やはり参照によりその全体を本明細書に組込むＷａｎｇ他（米国特許出願公開第２００２／０１６８３４２号）に記載されており、当業者の知識の範囲内の技術を含む。
【０２７２】
本発明の実施において、ｒＡＡＶ又は他のベクター発現ベクタービリオン（ｖｅｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｖｉｒｉｏｎ）を産生する宿主細胞としては、ほ乳動物細胞、昆虫細胞、微生物、酵母などが挙げられる。宿主細胞は、ＡＡＶ（又は他の）ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子が宿主細胞中に安定に維持されたパッケージング細胞、又はＡＡＶベクターゲノムが安定に維持され、パッケージされた産生細胞でもあり得る。例示的なパッケージング及び産生細胞は、２９３、Ａ５４９又はＨｅＬａ細胞に由来する。ＡＡＶは、当分野で公知である標準技術によって精製され、処方される。（ベクターに応じた）追加の適切な宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ  ＤＸ  Ｂ１１、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞などのＣＨＯジヒドロ葉酸還元酵素欠損変種（例えば、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ．  １９８０．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７７：４２１６−４２２０参照）、ＰｅｒＣ．６細胞（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．  １９：１６３−１６８）、Ｓｐ／２０マウス骨髄腫細胞（Ｃｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５４：２４４８−２４５５）などが挙げられる。
【０２７３】
レトロウイルス（Ｒｅｔｒｉｏｖｉｒａｌ）ベクター
レトロウイルスベクターも遺伝子送達用の一般的ツールである（Ｍｉｌｌｅｒ．  １９９２．  Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０）。レトロウイルスベクター、より具体的にはレンチウイルスベクターを本発明の実施に使用することができる。したがって、本明細書では「レトロウイルス」又は「レトロウイルスベクター」という用語は、それぞれ「レンチウイルス」及び「レンチウイルスベクター」を含むものとする。レトロウイルスベクターが試験され、目的遺伝子を広範囲の標的細胞のゲノムに安定に導入するための適切な送達ビヒクルであることが判明した。レトロウイルスベクターは、再配列されていない単一コピー導入遺伝子を細胞中に送達することができるので、遺伝子を細胞に移送するのに適している。また、レトロウイルスは、レトロウイルスのエンベロープ糖タンパク質が宿主細胞上の特異的細胞表面受容体と結合することによって宿主細胞に入る。その結果、コードされた未変性エンベロープタンパク質が、未変性エンベロープタンパク質とは異なる細胞特異性を有する（例えば、未変性エンベロープタンパク質と比較して、異なる細胞表面受容体に結合する）異種エンベロープタンパク質で置換されたシュードタイプレトロウイルスベクターも本発明の実施に有用であり得る。１個以上の標的タンパク質コード配列をコードするレトロウイルスベクターを特定の標的細胞に送達させる能力は、本発明の実施に望ましい。
【０２７４】
本発明は、例えば、１個以上の導入遺伝子配列を含むレトロウイルス導入ベクター、１個以上のパッケージングエレメントを含むレトロウイルスパッケージングベクターなどのレトロウイルスベクターを提供する。特に、本発明は、シュードタイプレトロウイルス産生用の異種エンベロープタンパク質又は機能的に修飾されたエンベロープタンパク質をコードするシュードタイプレトロウイルスベクターを提供する。
【０２７５】
本発明のレトロウイルスベクターのコア配列は、例えば、Ｂ、Ｃ及びＤ型レトロウイルス並びにスプマウイルス及びレンチウイルスを含めて、多種多様なレトロウイルスから容易に誘導し得る（ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８５参照）。本発明の組成物及び方法に使用するのに適切なレトロウイルスの例としては、レンチウイルスが挙げられるが、これだけに限定されない。本発明の組成物及び方法に使用するのに適切な他のレトロウイルスとしては、トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞増殖巣誘導（Ｍｉｎｋ−Ｃｅｌｌ  Ｆｏｃｕｓ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ）ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、ラウス肉腫ウイルスなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。特に好ましいマウス白血病ウイルスとしては、４０７０Ａ及び１５０４Ａ（Ｈａｒｔｌｅｙ  ａｎｄ  Ｒｏｗｅ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  １９：１９−２５）、エーベルソン（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ＶＲ−９９９）、フレンド（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ＶＲ−２４５）、グラッフィ、グロス（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ＶＲ−５９０）、キルスタイン（Ｋｉｒｓｔｅｎｉ）  ハーベイ肉腫ウイルス及びラウシャー（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ＶＲ−９９８）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ＶＲ−１９０）などが挙げられる。かかるレトロウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）などの寄託所又はコレクションから容易に得ることができ、又は一般に利用可能な技術によって公知の出所から単離することができる。他のレトロウイルスは、商業的に利用可能である。
【０２７６】
本発明のレトロウイルスベクター配列は、レンチウイルスから誘導することができる。好ましいレンチウイルスは、ヒト免疫不全症ウイルス、例えば、１型又は２型（すなわち、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２。ここで、ＨＩＶ−１は、リンパ節症関連ウイルス３（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）関連ウイルス（ＡＲＶ）と以前は呼ばれていた。）、又はＡＩＤＳ若しくはＡＩＤＳ様疾患と結びつけられ、また、関連づけられたＨＩＶ−１若しくはＨＩＶ−２に関係する別のウイルスである。他のレンチウイルスとしては、ヒツジビスナ／マエディウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシレンチウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）などが挙げられる。
【０２７７】
レトロウイルスの適切な属及び系統は、当分野で周知である（例えば、参照により本明細書に組込む、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｂ．Ｎ．  Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓを参照されたい。例えば、表１を含めて、Ｃｈａｐｔｅｒ  ５８，  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：  Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ｐａｇｅｓ  １７６８−１７７１を参照されたい。）。レトロウイルスを産生する産生細胞及び産生細胞系を生成するレトロウイルスパッケージング系、及びかかるパッケージング系を作製する方法も、当分野で公知である。
【０２７８】
典型的なパッケージング系は、少なくとも２種類のパッケージングベクター、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ、又はｇａｇとｐｏｌ遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列を含む第１のパッケージングベクターと、異種又は機能修飾エンベロープ遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列を含む第２のパッケージングベクターとを含む。レトロウイルスエレメントは、ＨＩＶなどのレンチウイルスから誘導することができる。ベクターは、機能的ｔａｔ遺伝子及び／又は機能的アクセサリー遺伝子（ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｎｅｆ）を欠き得る。パッケージング系は、ｒｅｖ遺伝子を含むヌクレオチド配列を有する第３のパッケージングベクターを更に含み得る。パッケージング系は、第１、第２及び場合によっては第３のヌクレオチド配列を含むパッケージング細胞の形で提供され得る。
【０２７９】
本発明は、種々の発現系、特に真核細胞、有利にはほ乳動物細胞を用いた発現系に適用可能である。未変性タンパク質をグリコシル化する場合には、発現系は、未変性様のグリコシル化を発現タンパク質にもたらす発現系であることが好ましい。
【０２８０】
レンチウイルスは、ｅｎｖ遺伝子によってコードされるエンベロープ糖タンパク質ＳＵ（ｇｐ１２０）及びＴＭ（ｇｐ４１）、ｇａｇ遺伝子によってコードされるＣＡ（ｐ２４）、ＭＡ（ｐ１７）及びＮＣ（ｐ７−１１）並びにｐｏｌ遺伝子によってコードされるＲＴ、ＰＲ及びＩＮを含めて、幾つかの構造的なビリオンタンパク質を共有する。ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２は、ウイルスＲＮＡの合成及びプロセシング並びに他の複製機能の調節に関与する、アクセサリータンパク質及び他のタンパク質を含む。アクセサリータンパク質は、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ／ｖｐｘ及びｎｅｆ遺伝子によってコードされ、組み換え系から除外する（又は不活性化する）ことができる。また、ｔａｔ及びｒｅｖは、例えば、変異又は欠失によって、除外又は不活性化し得る。
【０２８１】
第１世代のレンチウイルスベクターパッケージング系は、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖに対して別々のパッケージング構築物をもたらし、安全上の理由で、異種又は機能修飾エンベロープタンパク質を典型的には使用する。第２世代レンチウイルスベクター系においては、アクセサリー遺伝子ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆが欠失又は不活性化されている。第３世代レンチウイルスベクター系は、ｔａｔ遺伝子が（例えば、変異によって）欠失又は不活性化されたベクター系である。
【０２８２】
ｔａｔによって通常もたらされる転写調節の補償は、ヒトサイトメガロウイルス最初期（ＨＣＡＡＶ−ＩＥ）エンハンサー／プロモーターなどの強力な構成的プロモーターを使用することによってもたらされ得る。他のプロモーター／エンハンサーは、当分野で理解されているように、構成的プロモーター活性の強度、標的組織に対する特異性（例えば、肝臓特異的プロモーター）、又は所望の発現制御に関係した他の因子に基づいて選択することができる。例えば、一部の実施形態においては、ｔｅｔなどの誘導性プロモーターを用いて発現を制御することが望ましい。典型的な第３世代レンチウイルスベクター系は、４種類のプラスミド、すなわち、ｇａｇｐｏｌ、ｒｅｖ、エンベロープ及び導入ベクターに対して各々１種類を必要とするように、ｒｅｖをコードする遺伝子は、別々の発現構築物上に設けることができる。使用するパッケージング系の世代にかかわらず、ｇａｇ及びｐｏｌを単一の構築物上又は別々の構築物上に設けることができる。
【０２８３】
典型的には、パッケージングベクターは、パッケージング細胞中に含まれ、移入、形質導入又は感染によって細胞に導入される。移入、形質導入又は感染方法は当業者に周知である。本発明のレトロウイルス導入ベクターは、移入、形質導入又は感染によってパッケージング細胞系に導入して、産生細胞又は細胞系を産生することができる。本発明のパッケージングベクターは、例えば、リン酸カルシウム移入、リポフェクション又は電気穿孔法を含めた標準方法によって、ヒト細胞又は細胞系に導入することができる。一部の実施形態においては、パッケージングベクターをｎｅｏなどの優性選択マーカー、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、グルタミンシンセターゼ又はＡＤＡと一緒に細胞に導入し、続いて適切な薬物の存在下で選択し、クローンを単離する。選択マーカー遺伝子は、パッケージングベクターによってコードされる遺伝子に物理的に連結し得る。
【０２８４】
適切なパッケージング細胞によってパッケージング機能が発現されるように構成された安定な細胞系が知られている。例えば、米国特許第５，６８６，２７９号及びＯｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９３：１１４００−１１４０６を参照されたい。これらは、パッケージング細胞を記載している。安定な細胞系産生の更なる記述は、Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２（１１）：８４６３−８４７１及びＺｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：９８７３−９８８０に見出すことができる。
【０２８５】
Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １５：８７１−７５は、ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を含むｐｏｌの３’側の配列が除去されたレンチウイルスパッケージングプラスミドを教示している。構築物は、ｔａｔ及びｒｅｖ配列を含み、３’ＬＴＲはポリＡ配列で置換されている。５’ＬＴＲ及びｐｓｉ配列は、誘導性プロモーターなどの別のプロモーターで置換されている。例えば、ＣＭＶプロモーター又はその誘導体を使用することができる。
【０２８６】
パッケージングベクターは、パッケージング機能に加えて、レンチウイルスタンパク質の発現を促進し、安全性を向上させる変化を含み得る。例えば、ｇａｇの上流にあるＨＩＶ配列を全部除去することができる。また、エンベロープの下流にある配列を除去することができる。さらに、ＲＮＡのスプライシング及び翻訳を促進するようにベクターを改変する段階を設けることができる。
【０２８７】
場合によっては、Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．上記に記載のパッケージング系などの条件付きの（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ）パッケージング系を使用する。例えばＺｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：９８７３−９８８０によって記述されたように、ＨＩＶ−１長末端反復（ＬＴＲ）を欠失させることによってベクターのバイオセーフティを改善する自己不活型ベクター（ＳＩＮ）の使用も好ましい。テトラサイクリン誘導性ＬＴＲなどを介して、誘導性ベクターを使用することもできる。
【０２８８】
プロモーター
本発明のベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型プロモーター、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＭＯＭＬＶ  ＬＴＲ、ＰＧＫプロモーターなどの構成的プロモーター；ｍＴＴＲ、ＴＫ、ＨＢＶ、ｈＡＡＴ、調節可能又は誘導性プロモーターを含めた、組織又は細胞タイプ特異的プロモーター、エンハンサーなどを含めて、ただしこれらだけに限定されない異種制御配列を典型的には含む。
【０２８９】
有用なプロモーターとしては、ＬＳＰプロモーター（Ｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ．  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ８Ｓ２：２３−３０）、ＥＦ１−アルファプロモーター（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０．  Ｇｅｎｅ  ９１（２）：２１７−２３）及びＧｕｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ３（９）：  ８０２−１０）などが挙げられる。最も好ましいプロモーターとしては、伸長因子１−アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルス前初期遺伝子（ＣＭＶ）プロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（１ＳＰ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーターなどが挙げられる。本発明の実施に有用である有利なプロモーターは、アデノウイルス主要後期プロモーターである（Ｂｅｒｋｎｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ．  １９８５．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：８４１−８５７）。アデノウイルス主要後期プロモーターを使用した、具体的に例示する発現ベクターの配列を以下に示す。これらのプロモーター及び多数の追加のプロモーターの配列は当分野で公知である。関連する配列は、公的データベースから容易に入手することができ、本発明の実施に用いるベクターに取り込むことができる。
【０２９０】
本発明の実施における特定の好ましいプロモーターは、アデノウイルス主要後期プロモーターである。発現カセットは、５’から３’方向に、アデノウイルス主要後期プロモーター、目的タンパク質又は目的タンパク質鎖の第１のコード配列に作動可能な３部構成リーダー配列、自己プロセシング配列又はプロテアーゼ切断配列をコードする配列、目的タンパク質又はタンパク質鎖の第２のコード配列を含むことができ、自己プロセシング配列又はプロテアーゼ切断配列をコードする配列を含んでいてもよく、続いて目的タンパク質又はタンパク質鎖の第３のコード配列を含むことができる。翻訳がポリタンパク質コード配列内で終結しないように、これらのコード配列の全部が同じ読み枠中で共有結合している。タンパク質合成中、又はポリペプチドの合成完了後に、自己プロセシング又はタンパク質分解プロセシングによって、ポリタンパク質が適切なタンパク質鎖又はタンパク質に切断される。免疫グロブリン合成の場合には、軽鎖のコード配列は、ポリタンパク質コード配列内に２回存在する。有利には、リーダー配列コード領域は、タンパク質又はタンパク質鎖配列と連結され得る。シグナルペプチダーゼによるプロセシングは、プロセシング部位の下流にあるタンパク質のＮ末端におけるある残留アミノ酸残基を除去する更なる利点を有し得る。免疫グロブリン重鎖成分は、Ｍｅｔ、タンパク質開始メチオニン；ＨＣ、重鎖；ＬＣ、軽鎖、ＳＰＰＣ、自己プロセシング又はプロテアーゼ切断部位である。免疫グロブリン合成用発現構築物としては、以下のものなどが挙げられる：Ｍｅｔ−プロテアーゼ−ＳＰＰＣ−ＨＣリーダー配列−ＨＣ−ＳＰＰＣ−ＬＣリーダー配列−ＬＣ−ＳＰＰＣ−ＬＣリーダー配列−ＬＣ、Ｍｅｔ−プロテアーゼ−ＳＰＰＣ−ＬＣリーダー配列−ＬＣ−ＳＰＰＣ−ＬＣリーダー配列−ＬＣ−ＳＰＰＣ−ＨＣリーダー配列−ＨＣ、Ｍｅｔ−プロテアーゼ−ＳＰＰＣ−ＬＣリーダー配列−ＬＣ−ＳＰＰＣ−ＨＣリーダー配列−ＨＣ−ＳＰＰＣ−ＬＣリーダー配列−ＬＣ、ＨＣリーダー配列−ＨＣ−ＳＰＰＣ−ＬＣリーダー配列−ＬＣ−ＳＰＰＣ−ＬＣリーダー配列−ＬＣ、ＬＣリーダー配列−ＬＣ−ＳＰＰＣ−ＨＣリーダー配列−ＨＣ−ＳＰＰＣ−ＬＣリーダー配列−ＬＣ、ＬＣリーダー配列−ＬＣ−ＳＰＰＣ−ＬＣリーダー配列−ＬＣ−ＳＰＰＣ−ＨＣリーダー配列−ＨＣ、Ｍｅｔ−プロテアーゼ−ＳＰＰＣ−ＨＣリーダー−ＨＣ−ＳＰＰＣ−ＬＣリーダー−ＬＣ。
【０２９１】
具体的に例示するポリタンパク質コード配列（産物Ｍｅｔ−ＨＣリーダー−ＨＣ−操作されたフューリン部位−ＴＥＶ切断部位−ＴＥＶ  Ｎｉａプロテアーゼ−ＴＥＶ切断部位−ＬＣリーダー−ＬＣを図１に模式的に示す。この構築物の発現用発現ベクターを図２に示す。抗ＴＮＦα（Ｄ２Ｅ７）は、そのＨＣ及びＬＣ配列に対する例示的な抗体である。ＬＣリーダー配列は、治療抗体の産生に不要な場合もある。ＳＰＰＳはＴＥＶプロテアーゼ認識部位であり、ＴＥＶ部位の５’側にコードされたフューリン部位がある。ＴＥＶ切断後のフューリン切断によって、「正確な」Ｃ末端リジン残基を重鎖に回復させる。Ｄ２Ｅ７−ＴＥＶ発現ベクターの完全なＤＮＡ配列を表１に示す。
【０２９２】
ＬＣのタンデム反復をコードし、２Ａプロテアーゼ配列を切断部位として用いて切断された、具体的に例示するＤ２Ｅ７ポリタンパク質発現構築物（Ｄ２Ｅ７−Ｌｃ−ＬＣ−ＨＣ）を設計した。Ｄ２Ｅ７軽鎖Ｃ末端を、フューリン切断部位を付加するように修飾した。これは、（一般に）最後から２番目のアミノ酸におけるＧｌｕからＡｒｇへの変化、及びＣ末端へのリジンの付加をもたらす。２個のＬＣ配列をＨＣの５’側に配置することによって、２個のＬＣコピーは同じアミノ酸配列を維持する。発現ベクターの完全ヌクレオチド配列を表６Ｃに示す。ポリタンパク質のアミノ酸配列及びコード配列をそれぞれ表６Ｂ及び６Ａに示す。配列番号２９−３１も参照されたい。模式的な発現ベクターマップを図７に示す。
【０２９３】
具体的に例示する別のポリタンパク質（及びそのコード配列）は、ＡＢＴ−００７−ＴＥＶのものである。それぞれ表２Ｂ及び２Ａを参照されたい。配列番号３３及び３２を参照されたい。この組み換え抗体は、エリスロポイエチン受容体（ＥｐｏＲ）に特異的に結合する。操作されたＡＢＴ−００７−ＴＥＶポリタンパク質をコードする発現ベクターの完全配列を表２Ｃに示す（配列番号３５。配列番号３４も参照されたい。ベクターの略図を図３に示す。
【０２９４】
具体的に例示する追加のポリタンパク質及びそのコード配列は、ＡＢＴ−８７４−ＴＥＶのものである。それぞれ表３Ｂ及び３Ａを参照されたい。この抗体は、インターロイキン１２に特異的に結合する。発現ベクターの略図を図４に示す。配列番号３５−３７も参照されたい。
【０２９５】
具体的に例示する更に別のポリタンパク質（及びそのコード配列）はＥＬ２４６−ＧＧ−ＴＥＶのものである。表４Ｂ及び４Ａを参照されたい。その中でコードされる抗体は、Ｅ／Ｌセレクチンに特異的に結合する。発現ベクターを図５に模式的に示す。配列番号３８−４０も参照されたい。
【０２９６】
ＡＢＴ−３２５−ＴＥＶは、インターロイキン１８に対する結合特異性を有する、操作された抗体である。ポリタンパク質のコード配列及びアミノ酸配列をそれぞれ表５Ａ及び５Ｂに示す。完全な発現ベクター配列を表５Ｃに示す。その合成用の発現ベクターを図６に示す。配列番号４１−４３も参照されたい。
【０２９７】
核局在化シグナル（ＮＬＳ）を除去したＴＥＶプロテアーゼも提供する（ＴＥＶ  ＮＬＳ−）。ＴＥＶ又はＴＥＶ（ＮＬＳ−）プロテアーゼは、分離したベクター又は分離した転写物の一部として細胞中で過渡的に、又は安定に発現させることもできる。ＴＥＶ（ＮＬＳ−）タンパク質は、ＥＲアンカー配列を含めることによって、又は小さなリボソーム結合タンパク質と融合させることによって、以前のＮＬＳ部分において、それぞれＥＲ又はリボソームに固定され得る。
【０２９８】
本願は、合成中の、又は合成後の細胞における、前駆体タンパク質及びポリタンパク質のタンパク質分解性切断の考察を含むが、ポリタンパク質及び前駆体タンパク質（プロタンパク質）は、これらのタンパク質の収集後に適切なプロテアーゼを用いてインビトロで実施できると理解される。
【０２９９】
本発明の範囲内で、特定の発現された抗体（免疫グロブリン）としては、とりわけ、腫よう壊死因子に特異的に結合する抗体（ＨＵＭＩＲＡ／Ｄ２Ｅ７（Ａｂｂｏｔｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｂｅｒｍｕｄａのアダリムマブの商標）に対応する、及び／又は由来する、操作された抗体）、インターロイキン１２（ＡＢＴ−８７４に由来する、操作された抗体）、インターロイキン１８（ＡＢＴ−３２５に由来する、操作された抗体）、組み換えエリスロポイエチン受容体（ＡＢＴ−００７に由来する、操作された抗体）、インターロイキン１８（ＡＢＴ−３２５に由来する、操作された抗体）、Ｅ／Ｌセレクチン（ＥＬ２４６−ＧＧに由来する、操作された抗体）などが挙げられる。操作されたポリタンパク質のコード配列及びアミノ酸配列を表１−５に示す。本発明に適切である更なる抗体としては、例えば、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（インフリキシマブ）、Ｒｉｔｕｘａｎ／Ｍａｂｔｈｅｒａ（リツキシマブ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツヅマブ）、Ａｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ）、Ｓｙｎａｇｉｓ（パリビズマブ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）、Ｒｅｏｐｒｏ（アブシキシマブ）、Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ３（ムロモナブ−ＣＤ３）、Ｚｅｎａｐａｘ（ダクリズマブ）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（バシリキシマブ）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（ゲムツズマブ）、Ｃａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（イブリツモマブ）、Ｘｏｌａｉｒ（オマリズマブ）、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ）及びＲａｐｔｉｖａ（エファリツマブ）が挙げられる。ここで、一般に、商標−商品名の後に括弧内のそれぞれの一般名が続く。追加の適切なタンパク質としては、例えば、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、エタネルセプト、ダーベポエチンアルファ、フィルグラスチム、インターフェロンベータ１ａ、インターフェロンベータ１ｂ、インターフェロンアルファ−２ｂ、インスリングラルギン、ソマトロピン、テリパラタイド、ホリトロピンアルファ、ドルナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、イミグルセラーゼ、ネシリチド、レノグラスチム及びフォンウィルブランド因子の１種類以上が挙げられる。ここで、１個以上の一般名称は、製品の１個以上の商標−商品名に各々対応し得る。他の抗体及びタンパク質は、当分野で理解されているように、本発明に適切である。
【０３００】
本発明は、目的とする２種類以上のポリペプチド、タンパク質又はプロタンパク質のコード配列の制御された発現も企図する。遺伝子調節系は、特定の遺伝子の調節された発現に有用である。例示的一手法においては、遺伝子調節系又はスイッチは、リガンド結合ドメイン、転写活性化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを有するキメラ転写因子を含む。これらのドメインは、実質的に任意の出所から得ることができ、新規タンパク質を得るための幾つかの方法のいずれにおいても組み合わせることができる。調節可能な遺伝子系は、キメラ転写因子と相互作用するＤＮＡ応答エレメントも含む。この転写調節エレメントは、調節すべき遺伝子に隣接する。
【０３０１】
本発明の実施に使用することができる例示的転写調節系としては、例えば、ショウジョウバエエクジソン系（Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９３：３３４６）、カイコエクジソン系（Ｓｕｈｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９５：７９９９）、ＲＵ４８６を誘導物質として使用するＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ（Ｖａｌｅｎｔｉｓ、Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、ＴＸの商標）合成プロゲステロン受容体系（Ｏｓｔｅｒｗａｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８（２２）：１２５９６−６０１）；テトラサイクリン（Ｔｃ）又は類似体、例えばドキシサイクリンなどの小分子を使用して標的の転写を調節（オン又はオフ）する、Ｔｅｔ及びＲｅｖＴｅｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（テトラサイクリンによって調節される発現系、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡの商標）（Ｋｎｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３２（４）：７９６、７９８、８００）；各々が転写活性化因子又はＤＮＡ結合タンパク質と連結された２種類の細胞内分子を一緒に運ぶ小分子の使用に基づく、ＡＲＩＡＤ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｒｉａｄ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）が挙げられる。これらの成分が一緒になると、目的遺伝子の転写が活性化される。Ａｒｉａｄは、ホモ２量体化に基づく系、及びヘテロ２量体化に基づく系を有する（Ｒｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  ２（９）：１０２８−１０３２；Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：８８−９１）。
【０３０２】
自己プロセシング又はプロテアーゼによって切断された組み換えポリペプチドの形の抗体若しくはその断片、他の異種タンパク質又はプロタンパク質をコードする核酸配列を含む本発明の発現ベクター構築物は、外来、治療又は導入遺伝子を細胞、例えば、体細胞に送達するために、又はベクターによって形質導入された細胞による組み換えポリペプチドの産生において、インビトロで、生体外で、又は生体内で細胞に導入することができる。
【０３０３】
宿主細胞及びベクターの送達
本発明のベクター構築物は、当分野で公知である標準方法によって、インビトロで、又は生体外で、適切な細胞に導入することができる。かかる技術としては、例えば、リン酸カルシウムを用いた移入、培養細胞への微量注入（Ｃａｐｅｃｃｈｉ．  １９８０．  Ｃｅｌｌ  ２２：４７９−４８８）、電気穿孔法（Ｓｈｉｇｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  １９８８．  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：７４２−７５１）、リポソームによって媒介される遺伝子移入（Ｍａｎｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９８８．  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：６８２−６９０）、脂質によって媒介される形質導入（Ｆｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９８７．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７）、及び高速微粒子銃を用いた核酸送達（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９８７．  Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３）が挙げられる。
【０３０４】
インビトロ又は生体外で発現させるために、機能的タンパク質産物の発現に有効な任意の細胞を使用することができる。タンパク質発現に用いられる細胞及び細胞系の多数の例が当分野で知られている。例えば、原核細胞及び昆虫細胞を発現に使用することができる。また、酵母などの真核微生物も使用することができる。原核生物系、昆虫系及び酵母系における組み換えタンパク質の発現は、当分野で一般に公知であり、本発明の組成物及び方法を用いて、抗体又は他のタンパク質の発現に適合させることができる。
【０３０５】
発現に有用である細胞の例としては、線維芽細胞などのほ乳動物細胞、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウシの各細胞などの非ヒトほ乳動物由来の細胞、昆虫細胞などが更に挙げられる。ほ乳動物細胞の具体例としては、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ  ＤＸ  Ｂ１１細胞、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞、ＰｅｒＣ．６細胞、Ｓｐ２／０細胞、２９３細胞、ＮＳＯ細胞、３Ｔ３線維芽細胞、Ｗ１３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＰＧ２細胞及びＭＤＣＫ細胞が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０３０６】
宿主細胞は、プロモーターを誘導するために、形質転換体を選択するために、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、適宜改変された、従来の栄養培地中で培養される。ほ乳動物宿主細胞は、種々の培地中で培養することができる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｓｉｇｍａ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販培地は、典型的には宿主細胞の培養に適切である。所与の培地は、一般に、（インスリン、トランスフェリン、上皮成長因子などの）ホルモン及び／又は他の成長因子、（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩などの）塩、（ＨＥＰＥＳなどの）緩衝剤、（アデノシン、チミジンなどの）ヌクレオシド、抗生物質、微量元素並びにグルコース又は等価なエネルギー源が必要に応じて補充されている。任意の他の必要な補助剤も、当業者に周知のように、適切な濃度で含めることができる。温度、ｐＨなどの特定の細胞系に適切な培養条件は、当分野で一般に公知である。多数の細胞系の培養に対する培養条件は、例えば、（インターネット上で「ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ＳｅａｒｃｈＣａｔａｌｏｇｓ／ＡｌｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ．ｃｆｍ」から利用可能なＡＴＣＣカタログにおいて、又は供給業者によって指示されるように、示唆される。
【０３０７】
発現ベクターは、種々の経路（例えば、皮内、静脈内、腫よう内、脳中に、門脈内、腹腔内、筋肉内、膀腔中になど）によって、インビボで投与して、自己プロセシング切断配列を介して接続された複数の遺伝子を送達して、動物モデル又はヒト対象において２種類以上のタンパク質又はポリペプチドを発現させ得る。投与経路に応じて、治療タンパク質は、その効果を局所的（脳又は膀腔中）又は全身的（他の投与経路）に引き出す。オープンリーディングフレームの５’側にある組織特異的プロモーターを使用すると、オープンリーディングフレーム全体によってコードされるタンパク質又はポリペプチドの組織特異的発現がもたらされる。
【０３０８】
導入遺伝子を保有する組み換え発現ベクターを標的細胞にインビトロで、生体外で、又はインビボで導入する種々の方法が既に記述されており、当分野で周知である。本発明は、２種類以上の目的タンパク質又はポリペプチドのコード配列を含む組み換えベクターに標的細胞を感染させ、標的細胞中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることによる、治療方法、ワクチン及び癌療法を提供する。
【０３０９】
例えば、本発明の組み換えベクターのインビボでの送達は、脳、肝臓、血管、筋肉、心臓、肺及び皮膚を含めて、ただしこれらだけに限定されない多種多様な器官タイプを標的とすることができる。
【０３１０】
生体外の遺伝子移入の場合には、標的細胞を宿主から取り出し、本発明の組み換えベクター及び当分野で周知の方法を用いて実験室で遺伝子改変する。
【０３１１】
本発明の組み換えベクターは、上記方法を含めて、ただしこれらだけに限定されない従来の投与方法によって投与することができる。本発明の組み換えベクターは、溶液及び懸濁液、微小胞、リポソーム並びに注射用又は注入用溶液を含めて、ただしこれらだけに限定されない種々の処方とすることができる。好ましい形式は、投与方法及び治療用途に応じて決まる。
【０３１２】
免疫グロブリン又は他の生物活性タンパク質のインビボでの産生における本発明の組み換え発現ベクター構築物の利点は、患者における単一のベクターの長期投与及び持続性の抗体発現、十分な生物活性を有する抗体又はその断片（又は他の生物活性タンパク質）のインビボでの発現、並びにヒト細胞において産生される抗体の自然な翻訳後修飾を含む。望ましくは、発現されたタンパク質は、免疫応答が誘発されないように、天然タンパク質と同一、又は十分に同一である。発現されたタンパク質は、前記タンパク質を必要とする患者において、複数の機会に投与され、又は連続して発現される。
【０３１３】
本発明の組み換えベクター構築物は、療法又は研究に用いられる組み換え抗体及び他の生物活性タンパク質のインビトロでの産生にも有用である。組み換えタンパク質産生方法は、当分野で周知であり、本明細書に記載の自己プロセシング切断部位又は他のプロテアーゼ切断部位を含むベクター構築物を用いた組み換え抗体の発現に利用することができる。
【０３１４】
一態様においては、本発明は、上記のものなどの発現ベクターを細胞に導入して、移入された細胞を得ることによって、組み換え免疫グロブリン又はその断片を製造する方法を提供する。この発現ベクターは、５’から３’方向に、免疫グロブリン重鎖及び２本の軽鎖又はその断片のコード配列に作動可能に結合したプロモーター、前記鎖の各々の間の２Ａ若しくは２Ａ様配列又はプロテアーゼ切断部位などの自己プロセシング配列を含む。免疫グロブリン重鎖のコード配列、又は免疫グロブリン軽鎖のコード配列は、所与のベクター構築物において２Ａ配列の５’側（すなわち、第１）にあり得ると理解される。或いは、プロテアーゼ切断部位と同起源であるプロテアーゼを、ポリタンパク質の残部から自己プロセシングを受け、又は別個の（又は同じ）プロテアーゼによってタンパク質分解切断されるように、ポリタンパク質の一部として発現させることができる。（二重又は三重ハイブリッド系から得られたタンパク質など）他の多連鎖タンパク質又は他のタンパク質は、やはり正確な大きさの自己プロセシング部位又はプロテアーゼ認識部位が挿入された関連コード配列を置換することによって、プロセシングを受けた活性型で発現され得る。別々のタンパク質が産生される。
【０３１５】
二重（及び他の）ハイブリッド系手法を用いて、タンパク質複合体の公知（ｋｎｏｗ）リガンド又はサブユニットに対するまだ認知されていない結合相手について、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。この系の適切な変形物を用いて、公知複合体において結合を阻害する、結合と競合する、又は結合を乱す、タンパク質又はサブユニットを特定することもできる。二重（及び他の）ハイブリッド系は、種々の科学的研究に適用されてきたが、これらのシステムは、偽陽性又は偽陰性の結果の重要性頻度（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）のために不十分であり得る。これらの偽シグナルは、少なくとも一部の例では、結合相手タンパク質候補又は分裂（ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ）タンパク質候補に対する「ベイト」タンパク質の相対発現の不均衡に起因した。本発明の戦略の更なる利点は、わずか１種類のプラスミドが宿主細胞に移入され、又は転換され、バイナリーベクター二重ハイブリッドスキームにおける２つの選択ではなく、単一の選択のみがこのプラスミドに必要である点である。この手法は、三重ハイブリッド系にも適用することができる。二重ハイブリッド系の考察については、Ｔｏｂｙ  ａｎｄ  Ｇｏｌｅｍｉｓ．  ２００１．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：２０１−２１７；  Ｖｉｄａｌ  ａｎｄ  Ｌｅｇｒａｉｎ．  １９９９．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２７：９１９−９２９；  Ｄｒｅｅｓ，  Ｂ．  １９９９．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ３：６４−７０及びＦｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｓｏｎｇ．  １９８９．  Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６を参照されたい。図９は、ベイト及びプレイタンパク質（又はプレイタンパク質候補）に対するポリタンパク質／自己プロセシング又はプロテアーゼ切断発現戦略の略図である。図８は、この手法を用いたベイト及びプレイタンパク質産生用の発現カセットを含むベクターを示す。ベクター発現カセットは、２Ａペプチドの翻訳後に自己プロセシングを受ける、ＧＡＬ４：：ベイト：：２Ａペプチド融合物としてベイトタンパク質を最初に翻訳するように構成されている。第２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＮＦカッパＢ：：ライブラリー融合タンパク質である。ベイトタンパク質をＭＣＳ１中に操作するには、２Ａ自己プロセシングペプチド配列中にインフレームで翻訳する必要がある。下流ＭＣＳ２における発現ライブラリーの操作は、さほど重要ではない。
【０３１６】
本明細書の戦略は、タンパク質分解性切断によって成熟活性型にプロセシングを受けるプロ体（ｐｒｏ−ｆｏｒｍ）として発現されるタンパク質の発現に同様に適合させることができ、したがって組み換え発現のための組成物及び方法をもたらす。かかるタンパク質の例としては、とりわけ、インターロイキン１及び１８（ＩＬ−１及びＩＬ−１８）インスリンが挙げられるが、これらだけに限定されない。ＩＬ−１及びＩＬ−１８は、炎症細胞の細胞質において産生される。これらの分子は、伝統的分泌シグナルを欠き、生物活性型として分泌されるためにはプロテアーゼによって切断されなければならない。ＩＬ−１は、インターロイキン変換酵素（ＩＣＥ）によって成熟型にプロセシングされる。プロＩＬ−１８は、カスパーゼによって成熟ＩＬ−１８に転化される。これらの組み換え型分子の産生は困難である。というのは、宿主として頻繁に使用される細胞は、これらのタンパク質の生物活性成熟型を産生するのに必要なプロテアーゼを発現しないからである。プロドメインのないこれらのサイトカインの発現は、不活性分子及び／又は低レベルの産生をもたらす。本発明は、潜在的に有毒なプロテアーゼを目的タンパク質と同時に発現させる必要なしに、操作された自己プロセシング部位（例えば、２Ａ配列）、又はプロドメインと成熟ポリペプチドのアミノ酸との間に挿入されたプロテアーゼ切断部位を含む一次翻訳産物を提供する。
【０３１７】
関係する態様においては、本発明は、上記のものなどの発現ベクターを細胞に導入することによって、組み換え免疫グロブリン又はその断片を製造する方法を提供する。この発現ベクターは、第１と第２の各免疫グロブリンコード配列の間に追加のタンパク質分解性切断部位を更に含む。好ましい追加のタンパク質分解性切断部位は、コンセンサス配列ＲＸＫ／Ｒ−Ｒ（配列番号１）を有するフューリン切断部位である。考察については、米国特許出願公開第２００５／０００３４８２号Ａ１を参照されたい。
【０３１８】
本発明の例示的一態様においては、細胞へのベクターの導入又は投与の後に、以下の段階の１つ以上が続く：移入された細胞を、細胞を選択し、ポリタンパク質又はプロタンパク質を発現させる条件下で、培養する段階と、免疫グロブリン若しくはその断片又は他のタンパク質の発現を測定する段階と、免疫グロブリン若しくはその断片又は他のタンパク質を収集する段階。
【０３１９】
本発明の別の態様は、目的とする組み換え免疫グロブリン若しくはその断片又は他のタンパク質を発現させるための細胞を提供する。この細胞は、２本以上の免疫グロブリン鎖若しくはその断片又は他のプロタンパク質若しくはタンパク質の発現のための発現ベクター、免疫グロブリン又は他の鎖又はその断片の第１のコード配列に作動可能に結合したプロモーター、自己プロセシング配列又は２Ａ若しくは２Ａ様配列、プロテアーゼ認識部位などの他の切断コード配列、及び免疫グロブリン又は他の鎖又はその断片の第２のコード配列を含む。自己プロセシング切断配列又はプロテアーゼ認識部位コード配列は、第１と第２の各コード配列の間に挿入されている。関係する一態様においては、細胞は、上記発現ベクターを含み、この発現ベクターは、第１と第２の各免疫グロブリンの間の追加のタンパク質分解性切断部位又は他の目的コード配列を更に含む。好ましい追加のタンパク質分解性切断部位は、コンセンサス配列ＲＸＲ／Ｋ−Ｒ（配列番号１）を有するフューリン切断部位である。
【０３２０】
本明細書では「免疫グロブリン分子又はその断片の第１の鎖のコード配列」とは、抗体又は免疫グロブリンの軽鎖又は重鎖、又はその断片を含めて、ただしこれらだけに限定されないタンパク質分子をコードする核酸配列を指す。
【０３２１】
本明細書では「免疫グロブリン分子又はその断片の第２の鎖のコード配列」とは、抗体又は免疫グロブリンの軽鎖又は重鎖、又はその断片を含めて、ただしこれらだけに限定されないタンパク質分子をコードする核酸配列を指す。本発明の一態様においては、重鎖コード配列の１コピー当たり免疫グロブリン軽鎖コード配列が２コピー存在するときに、改善された発現が結果として生ずると理解される。
【０３２２】
抗体又は免疫グロブリン又はその断片に対して第１又は第２の鎖をコードする配列としては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＡに由来する重鎖又はその断片などが挙げられる。概して、抗体又は免疫グロブリン又はその断片に対して鎖をコードする配列としては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＡに由来する軽鎖又はその断片も挙げられる。抗体分子全体の遺伝子並びにその修飾型又は誘導型としては、例えば、Ｆａｂ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）及びＦ（ａｂ’）２のような他の抗原認識分子断片が挙げられる。抗体及び断片は、動物由来であり、ヒト−マウスキメラであり、ヒト化であり、Ｄｅｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ（商標）（Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ  Ｌｔｄ）によって改変され、Ｆｃ受容体に対する親和性を変えるように改変され、又は完全なヒトであり得る。抗体又は他の組み換えタンパク質は、それが投与されるヒト又は動物において免疫応答を誘発しないことが望ましい。
【０３２３】
抗体は、二重特異性であり得る。抗体としては、二抗体（ｄｉａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、クアドローマ、ミニ抗体、ＳｃＢｓ抗体、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ抗体などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０３２４】
抗体自体の産生及び回収は、当分野で周知である種々の方法によって実施することができる（Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．  １９８８．  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。他の目的タンパク質は、当分野で周知の方法に従って、収集及び／又は精製及び／又は使用される。
【０３２５】
本発明の実施においては、組み換えＤＮＡ技術を用いた抗体又はその変種（類似体）の製造は、宿主細胞の増殖、及びコード配列の発現に適切な培養条件下で修飾組み換え宿主細胞を培養することによって実施することができる。発現の成功をモニターするために、抗原に対する抗体レベルをＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどの標準技術によってモニターすることができる。抗体は、当分野で公知である標準技術によって培養上清から回収される。これらの抗体の精製体は、言うまでもなく、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬカラムを用いて、又は特定の抗原に対する、さらには特異性が望まれる抗原の特定のエピトープに対する、アフィニティークロマトグラフィーを含めて、ただしこれらだけに限定されない標準精製技術によって容易に調製することができる。抗体は、硫酸アンモニア（ａｍｍｏｎｉａ  ｓｕｌｆａｔｅ）沈殿、サイズ限定（ｓｉｚｅ−ｌｉｍｉｔｅｄ）膜ろ過などの他の技術と併せて、イオン交換カラム、サイズ排除カラムなどの従来のクロマトグラフィーによって精製することもできる。発現系がシグナルペプチドを含むように設計された場合、生成した抗体は、培地又は上清中に分泌される。しかし、細胞内での産生も可能である。
【０３２６】
ヒトＩｇ部位（ｌｏｃｉ）を用いて操作されたマウス由来の抗原特異的完全ヒトモノクローナル抗体の製造及び選択は、既に記述されている（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３１：３３−４２；  Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６：  ５６１−５６６；  Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｖｏｌ．７：１３−２１）。
【０３２７】
治療用モノクローナル抗体の高レベル発現がトランスジェニックヤギの乳中で得られ、抗原結合レベルが、従来の細胞培養技術を用いて製造されたモノクローナル抗体の抗原結合レベルと同じであることが判明した。この方法は、ヒト治療タンパク質をその乳中で発現させることを可能にする遺伝情報を保有したトランスジェニック動物の乳中でのヒト治療タンパク質の発生に基づく。これらの組み換えタンパク質は、産生された後、標準技術によって乳から効率的に精製することができる。例えば、Ｐｏｌｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ２３１：１４７−１５７及びＹｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  Ｒｅｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４９（６）：６０９−６１０を参照されたい。トランスジェニック動物由来の動物乳、卵白、血液、尿、精しょう及びカイコの繭は、組み換えタンパク質の工業規模での製造のための源として可能性があることが示された（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ  Ｌ  Ｍ．  ２００２．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １３：６２５−６２９；  Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ，  ２１（８）：３６４−７０及びＧｕｒａ  Ｔ．  ２００２．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１７：５８４−５８６０。本発明は、本発明の自己プロセシング切断部位をコードするベクター及び／又はプロテアーゼ認識部位ベクターを用いた、組み換え抗体又は変種（類似体）又はその目的とする他のタンパク質の発現のためのトランスジェニック動物発現系の使用を企図する。
【０３２８】
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染、遺伝子銃形質転換、プロトプラスト形質転換などによって形質転換された、ジャガイモ、トマト、タバコ、コメ及び他の植物を含めて、ただしこれらだけに限定されない植物における組み換えタンパク質の製造も、首尾よく実証された。トランスジェニックタバコの種子中での組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦ発現、及び植物における単鎖抗体を含めた抗体の発現が示された。例えば、Ｓｔｒｅａｆｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｈｏｗａｒｄ．  ２００３．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．  ３３：４７９−９３；  Ｓｃｈｉｌｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３．  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ６０：４３３Ａ５；  Ｐｏｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．  ４０：４５−７４及びＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２７８：９５−１０４を参照されたい。本発明は、本発明のプロテアーゼ切断部位又は自己プロセシング切断部位をコードするベクターを用いた、目的とする組み換え免疫グロブリン若しくはその断片又は他のタンパク質の発現のためのトランスジェニック植物発現系の使用を企図する。
【０３２９】
昆虫細胞と併せたバキュロウイルスベクター発現系も、組み換えタンパク質製造用の実行可能なプラットフォームとして普及しつつある。バキュロウイルスベクター発現系は、ほ乳動物細胞培養に比べて、培養の容易さ、高い発現レベルなどの利点をもたらすと報告されている。例えば、Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ６：５−１１及びＩｋｏｎｏｍｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３．  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ６２：１−２０を参照されたい。本発明は、本発明の自己プロセシング切断部位をコードするベクターを用いた、組み換え免疫グロブリン又はその断片の発現用のバキュロウイルスベクター発現系の使用を更に企図する。バキュロウイルスベクター及び適切な宿主細胞は、当分野で周知であり、市販されている。
【０３３０】
酵母系も、本発明の自己プロセシング切断部位をコードするベクターを用いて、二重又は三重ハイブリッド系を含めて、目的とする組み換え免疫グロブリン若しくはその断片又は他のタンパク質の発現に使用することができる。例えば、参照により本明細書に組込む、米国特許第５，６４３，７４５号を参照されたい。
【０３３１】
自己プロセシングペプチドのコード配列を単独で、又はタンパク質分解性切断部位の追加のコード配列と組み合わせて含む、本発明の発現カセット及びベクター及び組み換え宿主細胞は、任意のタンパク質発現系において、二重及び三重ハイブリッド系の組み換え免疫グロブリン又はその断片、プロタンパク質、生物活性タンパク質及びタンパク質成分の発現に有用であると理解される。その幾つかは、当分野で公知であり、その例は本明細書に記載されている。当業者は、本発明のベクターを任意のタンパク質発現系用に容易に適合させることができる。
【０３３２】
化合物、構築物又は組成物を特許請求するときには、本明細書に開示する参考文献に教示されているものを含めて、当分野で公知である化合物、構築物及び組成物は含まれないことを理解すべきである。マーカッシュ群又は他の群を本明細書において使用するときには、群の個々のメンバー全部、並びに群内から可能である、全部の組合せ及び部分組合せ（ｓｕｂｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が開示に個々に含まれるものとする。
【実施例１】
【０３３３】
インテインによって媒介されたプロセシングによる免疫グロブリンの発現
抗体分子の効率的発現戦略は、インテインが重鎖と軽鎖の間に位置し、成分タンパク質がＮ末端とＣ末端の各タンパク質の連結なしに遊離されるように、インテイン配列及び／又は接合部配列が修飾された、ポリタンパク質発現による。かかる構築物内では、機能的切断配列がポリタンパク質内の各免疫グロブリン由来のタンパク質の分離を促進するように設けられている限り、関連する重鎖及び軽鎖の各々の１コピーが存在し得、又は軽鎖は二重であり得、又は重鎖と軽鎖の両方の複数のコピーがあり得る。インテイン戦略は１回を超えて使用することができ、又は異なるタンパク質分解プロセシング配列又は酵素は、免疫グロブリン由来のタンパク質の少なくとも一方の末端に位置し得る。
【０３３４】
パイロコッカス  ホリコシイ由来のインテインは、上で手短に述べたように、構築物に取り込まれ、正確にプロセシングを受けた、十分に機能的であるＤ２Ｅ７抗体を首尾よく産生することが示された。試験した追加のインテインは、サッカロミセス  セレビシエ及びシネコシスティス種Ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ６８０３由来のものであり、分泌抗体を産生することがＥＬＩＳＡによって示された。
【０３３５】
パイロコッカス  ホリコシイＰｈｏ  Ｐｏｌ  ＩインテインのＰＣＲ増幅及びサブクローニング：
ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用い、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｈｉ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて、以下のオリゴヌクレオチドをｐ．ホリコシイＰｈｏ  Ｐｏｌ  Ｉインテイン（ＮＣＢＩ／タンパク質アクセッション＃Ｏ５９６１０、ＤＮＡポリメラーゼＩ  ＤＮＡ配列全体のＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃は、Ｐ．ホリコシイのゲノム配列全体から取られた、ＢＡ０００００１．２：１６８６３６１．．１６９００６８である。）の増幅に使用した。ゲノムＤＮＡをＡＴＣＣから購入した。
Ｐ．ホリコシイｉｎｔ−５’  
【０３３６】
【化１】
2009508470.tif 000004
【０３３７】
ＰＣＲを以下のプログラムによって実施した。
【０３３８】
【表２】
2009508470.tif 000005
【０３３９】
ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングし、挿入断片の配列を決定し、正確であることを確認した。この時点で、プリントアウトエラーのために、インテインの３’末端から欠損した配列のあることがわかった。次いで、それに続くＰＣＲ反応中に欠損配列を埋めて、インテインをＤ２Ｅ７の重鎖及び軽鎖に連結した。
【０３４０】
Ｄ２Ｅ７重鎖−インテイン−Ｄ２Ｅ７軽鎖の融合物を作製するために、オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。ＰＣＲ産物をそれに続くＰＣＲ反応においてプライマーとして使用することができるようにプライマーを設計した。
【０３４１】
【表３】
2009508470.tif 000006
成分を説明するための配列用コード：
重鎖配列（太字の赤色）−軽鎖配列（下線）−Ｐ．ホリコシイインテイン配列（普通のＡｒｉａｌ）−Ｐ．ホリコシイエクステイン配列（太字の下線を引いた青色）ＳｒｆＩ認識配列ＧＣＣＣＧＧＧＣ（二重下線）緑色
ＢａｍＨＩ認識配列ＧＧＡＴＣＣ（紫色の破線の下線）
終止コドン、ＴＣＡ（Ｔｉｍｅｓ  Ｎｅｗ  Ｒｏｍａｎ、オリーブ）
コザック
【０３４２】
Ｄ２Ｅ７重鎖−インテイン−Ｄ２Ｅ７軽鎖融合物のＰＣＲ増幅及び組立て：上で産生されたｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｐ．ホリコシイインテインクローンをテンプレートとして用い、プライマーＰ．ホリコシイｉｎｔ−５’及び改訂Ｐ．ｈｏｒｉ−３’を用いて、ＰＣＲを実施して適切な３’末端をインテインに回復させた。使用したポリメラーゼは、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑを用いて起こるＡテーリングを回避するためにＰｆｕＩ  ＤＮＡポリメラーゼであった。
【０３４３】
ＰＣＲを以下のプログラムによって実施した。
【０３４４】
【表４】
2009508470.tif 000007
【０３４５】
ＰＣＲ増幅産物をＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）によってゲル精製した。この産物を次の反応セットにおいてテンプレートとして用いた。
【０３４６】
３セットのＰＣＲ反応を実施して、インテインコード配列の５’及び３’側に異なる数のエクステイン残基を含むインテインコード配列を作製した。エクステインコドンは、このインテインが天然にその一部であるＰ．ホリコシイ中の未変性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に由来する。プライマーを以下のように使用した：セット１は、０個のエクステイン配列を導入し（ＨＣ−インテイン−５’及び改訂ＬＣ−インテイン−３’）、セット２は１個のアミノ酸（３塩基対）をインテインの両末端に導入し（ＨＣ−インテイン（１ａａ）−５’及び改訂ＬＣ−インテイン（１ａａ）−３’）、セット３は、３個のアミノ酸（９塩基対）をインテインの両末端に導入する（ＨＣ−インテイン（３ａａ）−５’及び改訂ＬＣ−インテイン（３ａａ）−３’）。
【０３４７】
ＰＣＲプログラムは上記と同じであった。ＰＣＲ産物をＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）によってゲル精製した。これらの産物を次の反応セットにおいてプライマーとして用いた。
【０３４８】
３セットのＰＣＲ反応を実施して、間に０、１又は３個のエクステインアミノ酸を有する、Ｄ２Ｅ７重鎖とインテインの融合物を作製した。反応のテンプレートはＤ２Ｅ７重鎖ＤＮＡである。上記ＰＣＲ産物をそれぞれ３’プライマーとして用い、ＨＣ−ＳｒｆＩ−５’を全反応における５’プライマーとして用いた。ＰｆｕＩ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。
【０３４９】
ＰＣＲを以下のプログラムによって実施した。
【０３５０】
【表５】
2009508470.tif 000008
【０３５１】
ＰＣＲ産物をＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）によってゲル精製した。この生成物を次の反応セットにおいてプライマーとして用いた。
【０３５２】
３セットのＰＣＲ反応を実施して、間に０、１又は３個のエクステインアミノ酸を有する、Ｄ２Ｅ７重鎖−インテインとＤ２Ｅ７軽鎖の融合物を作製した。反応のテンプレートはＤ２Ｅ７軽鎖ＤＮＡである。直前に記載のＰＣＲ産物をそれぞれ５’プライマーとして用い、ＬＣ−ＢａｍＨＩ−３’を全反応における３’プライマーとして用いた。ＰｆｕＩ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。
【０３５３】
ＰＣＲを以下のプログラムによって実施した。
【０３５４】
【表６】
2009508470.tif 000009
【０３５５】
産生されたＰＣＲ産物は、ゲル上で泳動させると、拡散して、まばらになった。これらの反応物（ｒｅａｃｔｉｏｎ）をＰＣＲの最終回にテンプレートとして直接使用した。ＨＣ−ＳｒｆＩ−５’及びＬＣ−ＢａｍＨＩ−３’をプライマーとして用いた。ＰｆｕＩ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。上記と同じＰＣＲプログラムを使用した。ＰＣＲ産物をＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）によってゲル精製した。
【０３５６】
Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、上記精製ＰＣＲ産物をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。クローンの配列を決定して、構築物が予想した核酸配列を有することを確認した。正確なクローンが各産物タイプに対して存在した。Ｄ２Ｅ７重鎖−インテイン−Ｄ２Ｅ７軽鎖カセットをｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯからＳｒｆＩ及びＮｏｔＩを用いて切り出し、同じ酵素で制限切断（ｒｅｓｔｒｉｃｔ）されたｐＴＴ３にサブクローニングし、ゲル精製した。
【０３５７】
Ｄ２Ｅ７重鎖−インテイン−Ｄ２Ｅ７軽鎖に対する３種類の発現構築物を、Ｐ．ホリコシイインテインを利用して設計した：ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉ（プラスミドマップについては図１４参照）、ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ１ａａ−ｐ．ｈｏｒｉ及びｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ３ａａ−ｐ．ｈｏｒｉ。
【０３５８】
表１０Ａ．  ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉのヌクレオチド配列（配列番号６２）
【０３５９】
【化２】
2009508470.tif 000010
2009508470.tif 000011
2009508470.tif 000012
2009508470.tif 000013
【０３６０】
表１０Ｂ．  ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ−ｐ．ｈｏｒｉにおけるオープンリーディングフレームのアミノ酸配列（配列番号６３）
【０３６１】
【化３】
2009508470.tif 000014
配列のテキスト／フォントシンボルコード：
ｐＴＴ３ベクター−重鎖−インテイン−軽鎖
【０３６２】
以下の２個の構築物では、上記構築物との唯一の違いは、Ｐ．ホリコシイ（下線）に固有のエクステイン配列を含むことである。示した配列は、Ｄ２Ｅ７重鎖コード領域の末端（赤色で示した最後の９塩基対）からＤ２Ｅ７軽鎖コード領域の５’末端（分離線（ｓｅｐａｒａｔｅ  ｌｉｎｅ）上のピンク色で示した最初の９塩基対）までである。
【０３６３】
表１１Ａ．  ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ１ａａ−ｐ．ｈｏｒｉ部分コード配列（配列番号６４）
【０３６４】
【化４】
2009508470.tif 000015
【０３６５】
表１１Ｂ．  重鎖の上流の４個のアミノ酸、及びインテインの下流の４個のアミノ酸を示すｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ１ａａ−ｐ．ｈｏｒｉ部分アミノ酸配列（配列番号６５）
【０３６６】
【化５】
2009508470.tif 000016
重鎖３’配列−インテイン−エクステイン−軽鎖５’配列
【０３６７】
表１２Ａ．  ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ３ａａ−ｐ．ｈｏｒｉ部分コード配列（配列番号６６）
【０３６８】
【化６】
2009508470.tif 000017
2009508470.tif 000018
【０３６９】
表１２Ｂ．  インテイン及びフランキング配列を示すｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ３ａａ−ｐ．ｈｏｒｉ部分アミノ酸配列（配列番号６７）
【０３７０】
【化７】
2009508470.tif 000019
重鎖３’配列−インテイン−エクステイン−軽鎖５’配列
【０３７１】
構築物Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ及びＬに用いたプライマーは、以下のものであった。
【０３７２】
【化８】
2009508470.tif 000020
2009508470.tif 000021
【０３７３】
構築物Ａを調製するために、プラスミドｐＴＴ３  ＨＣ−ｉｎｔ−ＬＣ  Ｐ．ｈｏｒｉをテンプレート２として用い、重複ＤＮＡ断片を、それぞれ変異誘発プライマーＹＫＦ１とプライマーＹＫＲ３及び変異誘発プライマーＹＫＲ１とプライマーＹＫＦ３を用いて増幅させた。上記２個のＰＣＲ断片の混合物をテンプレートとして用い、プライマーＹＫＦ３とＹＫＲ３を用いて、上記２個の断片を連結するＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅によって作製した。次いで、このＰＣＲ断片を制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉで切断し、同じ制限酵素で切断したｐＴＴ３  ＨＣ−ｉｎｔ−ＬＣ  Ｐ．ｈｏｒｉにクローン化した。
【０３７４】
変異誘発プライマーＹＫＦ２とＹＫＲ２をＹＫＦ１とＹＫＲ１の代わりに用い、プラスミドｐＴＴ３  ＨＣ−ｉｎｔ−ＬＣ−１ａａ  Ｐ．ｈｏｒｉをプラスミドｐＴＴ３  ＨＣ−ｉｎｔ−ＬＣ  Ｐ．ｈｏｒｉの代わりにＰＣＲテンプレートとして用い、ｐＴＴ３  ＨＣ−ｉｎｔ−ＬＣ  Ｐ．ｈｏｒｉベクターをクローニング用骨格として用いた以外は、構築物Ａと同様にして構築物Ｂを作製した。
【０３７５】
構築物Ｅを調製するために、プラスミドｐＴＴ３  ＨＣ−ｉｎｔ−ＬＣ−１ａａ  Ｐ．ｈｏｒｉをテンプレートとして用い、プライマーＹＫＦ４及び変異誘発プライマーＹＫＲ４を用いて、ＤＮＡ断片を増幅した。このＰＣＲ断片をＳａｃ  ＩＩ及びＭｆｅ  Ｉによって切断し、同じ制限酵素で切断したｐＴＴ３  ＨＣ−ｉｎｔ−ＬＣ  Ｐ．ｈｏｒｉにクローン化した。
【０３７６】
構築物Ｈの場合、ｐＴＴ３  ＨＣ−ｉｎｔ−ＬＣ  Ｐ．ｈｏｒｉをテンプレート２として用いた。変異誘発プライマーＹＫＦ５及びプライマーＹＫＲ３を一方の断片に用い、プライマーＦ３及び変異誘発プライマーＲ５を他方の断片に用いて、重複断片を増幅した。ＰＣＲ増幅の２回目を上記２断片をテンプレートとして用い、プライマーＹＫＦ３及びＹＫＲ３を用いて実施した。この断片を制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉで消化し、同じ酵素で切断したｐＴＴ３  ＨＣ−ｉｎｔ−ＬＣ  Ｐ．ｈｏｒｉにクローン化した。
【０３７７】
構築物Ｊの場合、ｐＴＴ３  ＨＣ−ｉｎｔ−ＬＣ  Ｐ．ｈｏｒｉをテンプレート２として用いた。変異誘発プライマーＹＫＦ１３及びプライマーＹＫＲ３を一方の断片に用い、プライマーＦ３及び変異誘発プライマーＲ１３を他方の断片に用いて、重複断片を増幅した。ＰＣＲ増幅の２回目を上記２断片をテンプレートとして用い、プライマーＹＫＦ３及びＹＫＲ３を用いて実施した。この断片を制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉで切断し、同じ酵素で切断したｐＴＴ３  ＨＣ−ｉｎｔ−ＬＣ  Ｐ．ｈｏｒｉにクローン化した。
【０３７８】
構築物Ｋの場合、ｐＴＴ３  ＨＣ−ｉｎｔ−ＬＣ  Ｐ．ｈｏｒｉは、テンプレート２として役立った。変異誘発プライマーＹＫＦ１４及びプライマーＹＫＲ３を一方の断片に用い、プライマーＦ３及び変異誘発プライマーＲ１４を他方の断片に用いて、重複断片を増幅した。ＰＣＲ増幅の２回目を上記２断片をテンプレートとして用い、プライマーＹＫＦ３及びＹＫＲ３を用いて実施した。この断片を制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉで消化し、同じ酵素で切断したｐＴＴ３  ＨＣ−ｉｎｔ−ＬＣ  Ｐ．ｈｏｒｉにクローン化した。
【０３７９】
構築物Ｌの場合、ｐＴＴ３  ＨＣ−ｉｎｔ−ＬＣ  Ｐ．ｈｏｒｉをテンプレート２として用いた。変異誘発プライマーＹＫＦ１５及びプライマーＹＫＲ３を一方の断片に用い、プライマーＦ３及び変異誘発プライマーＲ１５を他方の断片に用いて、重複断片を増幅した。ＰＣＲ増幅の２回目を上記２断片をテンプレートとして用い、プライマーＹＫＦ３及びＹＫＲ３を用いて実施した。この断片を制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉで消化し、同じ酵素で切断したｐＴＴ３  ＨＣ−ｉｎｔ−ＬＣ  Ｐ．ｈｏｒｉにクローン化した。
【０３８０】
全構築物のヌクレオチド配列を確認した。全構築物は、Ｄ２Ｅ７重鎖の（ＰＧＫをコードする）最後のコドンとＤ２Ｅ７軽鎖成熟配列の（ＤＩＱをコードする）第１のコドンとの間の配列を除いて、ｐＴＴ３  ＨＣ−ｉｎｔ−ＬＣ  Ｐ．ｈｏｒｉと同じ配列を有する。ｗｔ又は変異体軽鎖シグナル配列と併せてｗｔ又は変異体インテインを含む、この領域内の配列を、下記全構築物に対して示す。
【０３８１】
表１３Ａ．  構築物Ａの部分コード配列（配列番号９８）
【０３８２】
【化９】
2009508470.tif 000022
2009508470.tif 000023
【０３８３】
表１３Ｂ．  構築物Ａにおけるインテイン及びフランキング配列を示す部分アミノ酸配列（配列番号９９）
【０３８４】
【化１０】
2009508470.tif 000024
【０３８５】
表１４Ａ．  構築物Ｂにおける部分コード配列（配列番号１００）
【０３８６】
【化１１】
2009508470.tif 000025
【０３８７】
表１４Ｂ．  構築物Ｂにおける部分アミノ酸配列（配列番号１０１）
【０３８８】
【化１２】
2009508470.tif 000026
【０３８９】
表１５Ａ．  構築物Ｅにおける部分コード配列（配列番号１０２）
【０３９０】
【化１３】
2009508470.tif 000027
【０３９１】
表１５Ｂ．  構築物Ｅにおける部分アミノ酸配列（配列番号１０３）
【０３９２】
【化１４】
2009508470.tif 000028
【０３９３】
表１６Ａ．  構築物Ｈにおける部分コード配列（配列番号１０４）
【０３９４】
【化１５】
2009508470.tif 000029
2009508470.tif 000030
【０３９５】
表１６Ｂ．  構築物Ｈにおける部分アミノ酸配列（配列番号１０５）
【０３９６】
【化１６】
2009508470.tif 000031
【０３９７】
表１７Ａ．  構築物Ｊにおける部分コード配列（配列番号１０６）
【０３９８】
【化１７】
2009508470.tif 000032
【０３９９】
表１７Ｂ．  構築物Ｊにおける部分アミノ酸配列（配列番号１０７）
【０４００】
【化１８】
2009508470.tif 000033
【０４０１】
表１８Ａ．  構築物Ｋにおける部分コード配列（配列番号１０８）
【０４０２】
【化１９】
2009508470.tif 000034
【０４０３】
表１８Ｂ．  構築物Ｋにおける部分アミノ酸配列（配列番号１０９）
【０４０４】
【化２０】
2009508470.tif 000035
【０４０５】
表１９Ａ．  構築物Ｌにおける部分コード配列（配列番号１１０）
【０４０６】
【化２１】
2009508470.tif 000036
2009508470.tif 000037
【０４０７】
表１９Ｂ．  構築物Ｌにおける部分アミノ酸配列（配列番号１１１）
【０４０８】
【化２２】
2009508470.tif 000038
重鎖３’配列−インテイン＋軽鎖シグナルペプチド配列−軽鎖成熟配列
【０４０９】
ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用い、Ｐｆｕ−Ｉ  Ｈｉ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた、サッカロミセス  セレビシエＶＭＡインテイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＡＢ０９３４９９）の増幅に以下のオリゴヌクレオチドを使用した。Ｙｅａｓｔ−Ｇｅｎｏ−ＤＮＡ−Ｔｅｍｐｌａｔｅキット（Ｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．  ＃７８６−１３４）を用いてサッカロミセス  セレビシエの培養からゲノムＤＮＡを調製した。
【０４１０】
【化２３】
2009508470.tif 000039
【０４１１】
ＰＣＲを以下のプログラムによって実施した。
【０４１２】
【表７】
2009508470.tif 000040
【０４１３】
ＰＣＲ産物をテンプレートとして用い、以下のプライマー対を用いて、Ｐ．ホリコシイインテイン構築物に関して、インテインの０ａａ、１ａａ又は３ａａバージョンを作製した。Ｐｆｕ−Ｉ  Ｈｉ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた。
【０４１４】
【化２４】
2009508470.tif 000041
【０４１５】
ＰＣＲを上記と同じプログラムによって実施した。各反応タイプから得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングし、各タイプの挿入断片の配列を決定し、正確であることを確認した。
【０４１６】
Ｅ．コリ中のｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ  ｐ．ホリコシイ構築物中への相同組み換えを介してＤ２Ｅ７重鎖−インテイン−Ｄ２Ｅ７軽鎖の融合物を作製するために、オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。ＰＣＲによって作製された（ｐＴＴ３ベクター、重鎖及び軽鎖領域を含むが、Ｐ．ホリコシイインテインを含まない）ベクターとＶＭＡインテイン挿入断片との間の４０塩基対オーバーハングを操作することによって、連結の利点なしに、２個のＤＮＡを混合し、Ｅ．コリに転換して、０ａａ、１ａａ及び３ａａバージョンのｐＴＴ３−ＨＣ−ＶＭＡｉｎｔ−ＬＣ中への２個の断片のＥ．コリ相同組み換えを起こし得る。
【０４１７】
ＶＭＡ相同組み換えプライマー：
【０４１８】
【化２５】
2009508470.tif 000042
【０４１９】
ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ相同組み換えプライマー：
【０４２０】
【化２６】
2009508470.tif 000043
【０４２１】
インテインのＰＣＲを以下のプログラムで実施した：Ｐｆｕ−Ｉ  Ｈｉ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。
【０４２２】
【表８】
2009508470.tif 000044
【０４２３】
ベクターのＰＣＲを以下のプログラムで実施した：Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｈｉ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
【０４２４】
【表９】
2009508470.tif 000045
【０４２５】
ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣへのＶＭＡインテインの相同組み換えを実施するために、以下の戦略を用いた。ＰＣＲ産物をゲル精製し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて各々を溶出緩衝剤５０μｌ中に溶出させた。ベクターＰＣＲ産物３μｌをエッペンドルフ管中で混合し、所望のＶＭＡインテインＰＣＲ産物３μｌを添加した（別個の管中の０ａａ、１ａａ又は３ａａ）。各混合物をＥ．コリ中に転換し、次いで細胞をＬＢ＋アンピシリンプレートに蒔き、３７Ｃで終夜インキュベートした。コロニーを培養物２ｍｌに増殖させた。プラスミドＤＮＡをＷｉｚａｒｄ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化及びアガロースゲル電気泳動によって分析した。正確な制限パターンを生成したクローンをＤＮＡ配列に関して分析した。
【０４２６】
Ｓ．セレビシエＶＭＡインテインを利用した、Ｄ２Ｅ７重鎖−インテイン−Ｄ２Ｅ７軽鎖に対する３個の発現構築物を作製した：ｐＴＴ３−Ｈｃ−ＶＭＡｉｎｔ−ＬＣ−０ａａ、ｐＴＴ３−Ｈｃ−ＶＭＡｉｎｔ−ＬＣ−１ａａ及びｐＴＴ３−Ｈｃ−ＶＭＡｉｎｔ−ＬＣ−３ａａ。図１５のプラスミドマップも参照されたい。
【０４２７】
表２０．  プラスミドｐＴＴ３−Ｄ２Ｅ７重鎖−インテイン−Ｄ２Ｅ７軽鎖全体の配列（配列番号１２４）
【０４２８】
【化２７】
2009508470.tif 000046
2009508470.tif 000047
2009508470.tif 000048
ｐＴＴ３ベクター−重鎖−インテイン−軽鎖
【０４２９】
以下の構築物では、上記構築物との唯一の違いは、（青色で示した）Ｓ．セレビシエに固有のエクステイン配列を含むことである。示した配列は、Ｄ２Ｅ７重鎖コード領域の末端（赤色で示した最後の９塩基対）からＤ２Ｅ７軽鎖コード領域の５’末端（ピンク色で示した最初の９塩基対）までである。
【０４３０】
表２１．  ｐＴＴ３−ＨＣ−ＶＭＡｉｎｔ−ＬＣ−１ａａにおける部分コード配列（配列番号１２５）
【０４３１】
【化２８】
2009508470.tif 000049
2009508470.tif 000050
重鎖３’配列−インテイン−エクステイン−軽鎖５’配列
【０４３２】
表２２．  ｐＴＴ３−ＨＣ−ＶＭＡｉｎｔ−ＬＣ−３ａａ（配列番号１２６）
【０４３３】
【化２９】
2009508470.tif 000051
重鎖３’配列−インテイン−エクステイン−軽鎖５’配列
【０４３４】
シネコシスティス種Ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ６８０３  ＤｎａＥインテイン：合成、ＰＣＲ増幅及びクローニング
シネコシスティス種Ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ６８０３  ＤｎａＥインテインは、天然に分裂したインテインである（ＮＣＢＩアクセッション＃Ｓ７６９５８及びＳ７５３２８）。本発明者らは、このインテインのＮ末端半分とＣ末端半分を、統合的に合成することによって１個のオープンリーディングフレームとして連結した。所望のタンパク質配列のコード配列を、ＣＨＯ細胞中での発現用にコドン最適化した（ｗｗｗ．ｇｅｎｅａｒｔ．ｃｏｍ）。得られたヌクレオチド配列を表２３に示す。
【０４３５】
表２３．  Ｓｓｐ−Ｄｉ（モンゴルキヌゲネズミ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）における発現用に最適化されたコード配列）（配列番号１２７及び１２８も参照）
【０４３６】
【化３０】
2009508470.tif 000052
【０４３７】
上記合成ＤＮＡをテンプレートとして用い、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｈｉ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた、シネコシスティス種Ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ６８０３  ＤｎａＥインテインの増幅に以下のオリゴヌクレオチドを使用した。Ｓ．セレビシエＶＭＡインテインを用いて実施したように、これらのプライマーは、ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣベクターへのＰＣＲ産物の相同組み換え用配列と同様に、エクステイン配列も導入して、０ａａ、１ａａ及び３ａａバージョンを作製する：
【０４３８】
【化３１】
2009508470.tif 000053
【０４３９】
ＰＣＲを以下のプログラムによって実施した。
【０４４０】
【表１０】
2009508470.tif 000054
【０４４１】
ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣへの、コドンが最適化されたシネコシスティス種Ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ６８０３  ＤｎａＥインテインの相同組み換えを得るために、以下の戦略を用いた。ＰＣＲ産物をゲル精製し、各々を溶出緩衝剤Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）５０ｕｌ中に溶出させた。（ＶＭＡインテインを用いた相同組み換えに使用したのと同じ）ベクターＰＣＲ産物２μｌをエッペンドルフ管中で所望のシネコシスティス種Ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ６８０３  ＤｎａＥインテインＰＣＲ産物（別個の管中の０ａａ、１ａａ又は３ａａ）２μｌと混合した。次いで、核酸をＥ．コリに転換し、ＬＢ＋アンピシリンプレートに蒔き、次いで３７℃で終夜インキュベートした。コロニーを培養物２ｍｌに増殖させ、Ｗｉｚａｒｄ  ｐｒｅｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＤＮＡの準備をし、制限エンドヌクレアーゼ消化及びアガロースゲル電気泳動によって分析した。正確な制限パターンを生成するクローンをＤＮＡ配列に関して分析して、所望の配列が存在することを確認する。
【０４４２】
シネコシスティス種Ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ６８０３  ＤｎａＥインテインを利用して、Ｄ２Ｅ７重鎖−インテイン−Ｄ２Ｅ７軽鎖に対する３個の発現構築物を設計した：ｐＴＴ３−Ｈｃ−Ｓｓｐ−ＧＡ−ｉｎｔ−ＬＣ−０ａａ（図１６のプラスミドマップ参照）、ｐＴＴ３−Ｈｃ−Ｓｓｐ−ＧＡ−ｉｎｔ−ＬＣ−１ａａ及びｐＴＴ３−Ｈｃ−Ｓｓｐ−ＧＡ−ｉｎｔ−ＬＣ−３ａａ。
【０４４３】
表２４．  プラスミドｐＴＴ３−Ｄ２Ｅ７重鎖−Ｓｓｐ−ＧＡ−インテイン−Ｄ２Ｅ７軽鎖全体の配列（配列番号１３５）
【０４４４】
【化３２】
2009508470.tif 000055
2009508470.tif 000056
2009508470.tif 000057
ｐＴＴ３ベクター−重鎖−インテイン−軽鎖
【０４４５】
以下の構築物では、上記構築物との唯一の違いは、（青色で示した）シネコシスティス種Ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ６８０３に固有のエクステイン配列を含むことである。示した配列は、Ｄ２Ｅ７重鎖コード領域の末端（赤色で示した最後の９塩基対）からＤ２Ｅ７軽鎖コード領域の５’末端（ピンク色で示した最初の９塩基対）までである。
【０４４６】
表２５．  ｐＴＴ３−ＨＣ−Ｓｓｐ−ＧＡ−ｉｎｔ−ＬＣ−１ａａ、コード配列の関連部分（配列番号１３６）
【０４４７】
【化３３】
2009508470.tif 000058
2009508470.tif 000059
ｐＴＴ３ベクター−重鎖−インテイン−軽鎖
【０４４８】
表２６．  ｐＴＴ３−ＨＣ−Ｓｓｐ−ＧＡ−ｉｎｔ−ＬＣ−３ａａ  −  コード配列の関連部分（配列番号１３７）
【０４４９】
【化３４】
2009508470.tif 000060
ｐＴＴ３ベクター−重鎖−インテイン−軽鎖
【０４５０】
また、表８Ａ−８Ｃは、変異（セリンからトレオニンへ）パイロコッカスＳｓｐ．ＧＢＤ  Ｐｏｌインテインを用いた、Ｄ２Ｅ７インテイン融合タンパク質、発現ベクター及びコード配列の関連配列である。
【０４５１】
表８Ａ．  Ｄ２Ｅ７インテイン融合タンパク質のコード配列（配列番号４８）
【０４５２】
【化３５】
2009508470.tif 000061
2009508470.tif 000062
【０４５３】
表８Ｂ．  Ｄ２Ｅ７インテイン融合構築物のアミノ酸配列（配列番号４９）
【０４５４】
【化３６】
2009508470.tif 000063
【０４５５】
表８Ｃ．  Ｄ２Ｅ７インテイン融合構築物の発現ベクターの完全ヌクレオチド配列（配列番号５０）
【０４５６】
【化３７】
2009508470.tif 000064
2009508470.tif 000065
2009508470.tif 000066
2009508470.tif 000067
【０４５７】
表９．  フランキング配列情報の限られた未変性Ｐｓｐ−ＧＢＤ  Ｐｏｌインテイン配列のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．  ＡＡＡ６７１３２．１）（配列番号５１）
【０４５８】
【化３８】
2009508470.tif 000068
／はスプライス部位であり、下線を引いたアミノ酸はインテイン配列であり、残りはエクステイン配列情報である。
【実施例２】
【０４５９】
免疫グロブリンポリタンパク質配列並びにキイロショウジョウバエヘッジホッグ自動プロセシングドメイン、Ｃ１７及びＣ２５配列を有するベクターの構築
抗体分子の効率的発現の更なる戦略は、ヘッジホッグドメインが重鎖と軽鎖の間に位置し、コレステロールがＮ末端タンパク質に付加せずに成分タンパク質が遊離されるように、ヘッジホッグドメイン配列及び／又は接合部配列が修飾された、ポリタンパク質発現である。かかる構築物内では、機能的切断配列がポリタンパク質内の各免疫グロブリン由来のタンパク質の分離を促進するように設けられている限り、関連する重鎖及び軽鎖の各々の１コピーが存在し得、又は軽鎖は複製されて、少なくとも２本の軽鎖を与え得、又は重鎖と軽鎖の両方の複数のコピーがあり得る。特定の切断部位戦略（例えば、ヘッジホッグドメイン）は１回を超えて使用することができ、又は複数の切断部位に対して、各々が独立であり得る。したがって、異なるタンパク質分解プロセシング配列又は酵素は、免疫グロブリン又は免疫グロブリン由来のタンパク質の少なくとも１個の末端に関して位置し得る。
【０４６０】
ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用い、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｈｉ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた、キイロショウジョウバエヘッジホッグＣ末端自動プロセシングドメイン（Ｈｈ−Ｃ）、配列Ｈｈ−Ｃ１７、Ｈｈ−Ｃ１７切断物（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）（及び変異を有するもの）及びＨｈ−Ｃ２５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃Ｌ０２７９３．１）の増幅に以下のオリゴヌクレオチドを使用した。ゲノムＤＮＡをショウジョウバエＤ．Ｍｅｌ−２細胞の凍結バイアル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．＃１０８３１−０１４）から調製した。
【０４６１】
【化３９】
2009508470.tif 000069
【０４６２】
ＰＣＲを以下のプログラムによって実施した。
【０４６３】
【表１１】
2009508470.tif 000070
【０４６４】
Ｅ．コリ中のｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ  ｐ．ホリコシイ構築物中への相同組み換えを介してＤ２Ｅ７重鎖−Ｈｈ−Ｃ−Ｄ２Ｅ７軽鎖の融合物を作製するために、オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。ＰＣＲによって作製された（ｐＴＴ３ベクター、重鎖及び軽鎖領域を含むが、Ｐ．ホリコシイインテインを含まない）ベクターとＨｈ−Ｃドメイン挿入断片との間の４０塩基対オーバーハングを操作することによって、連結の利点なしに、２個のＤＮＡ断片を混合し、Ｅ．コリに転換して、（最初のＰＣＲ産物が指示する種々のバージョンの）ｐＴＴ３−ＨＣ−Ｈｈ−Ｃ−ＬＣへの２個の断片のＥ．コリ相同組み換えを起こし得る。
【０４６５】
Ｈｈ−Ｃドメイン相同組み換えプライマー：
【０４６６】
【化４０】
2009508470.tif 000071
【０４６７】
ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣ相同組み換えプライマー：
【０４６８】
【化４１】
2009508470.tif 000072
【０４６９】
Ｈｈ−ＣドメインのＰＣＲを以下のプログラムで実施した：Ｐｆｕ−Ｉ  Ｈｉ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。
【０４７０】
【表１２】
2009508470.tif 000073
【０４７１】
ベクターのＰＣＲを以下のプログラムで実施した：Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｈｉ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
【０４７２】
【表１３】
2009508470.tif 000074
【０４７３】
ｐＴＴ３−ＨｃｉｎｔＬＣへのＨｈ−Ｃドメインの相同組み換えを実施するために、以下の戦略を用いた。ＰＣＲ産物をゲル精製し、各々を溶出緩衝剤（Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット、Ｑｉａｇｅｎ）５０μｌ中に溶出させた。ベクターＰＣＲ産物３μｌをエッペンドルフ管中で所望のＨｉｎｔドメインＰＣＲ産物（種々のバージョン）３μｌと混合した。ＰＣＲ増幅産物をＥ．コリに転換し、ＬＢ＋アンピシリンプレートに蒔き、３７℃で終夜インキュベートした。コロニーを培養物２ｍｌに増殖させ、Ｗｉｚａｒｄ  ｐｒｅｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ試料を制限エンドヌクレアーゼ消化及びアガロースゲル電気泳動によって分析した。正確な制限パターンを生成したクローンをＤＮＡ配列に関して分析して、所望の配列が作製されたことを確認した。
【０４７４】
キイロショウジョウバエヘッジホッグＣ末端自動プロセシングドメインを利用した、Ｄ２Ｅ７重鎖−Ｈｈ−Ｃ−Ｄ２Ｅ７軽鎖発現に対する５個の発現構築物を設計した：ｐＴＴ３−ＨＣ−Ｈｈ−Ｃ１７−ＬＣ、ｐＴＴ３−ＨＣ−Ｈｈ−Ｃ１７−ＳＣ−ＬＣ、ＰＴＴ３−ＨＣ−Ｈｈ−Ｃ１７−ＨＮ−ＬＣ及びｐＴＴ３−ＨＣ−Ｈｈ−Ｃ２５−ＬＣ。
【０４７５】
表２７．  プラスミドｐＴＴ３−Ｄ２Ｅ７重鎖−Ｈｈ−Ｃ１７−Ｄ２Ｅ７軽鎖全体の配列（配列番号１５５）
【０４７６】
【化４２】
2009508470.tif 000075
2009508470.tif 000076
2009508470.tif 000077
ｐＴＴ３ベクター−重鎖−Ｈｈ−Ｃ１７−軽鎖
【０４７７】
以下の構築物においては、上記構築物との唯一の違いは、Ｃ１７領域の切り詰めであり、その結果、コレステロール転移活性（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）が除去される。示した配列は、Ｄ２Ｅ７重鎖コード領域の末端（ＨＣコード配列の最後の９塩基対、表の第１行）からＤ２Ｅ７軽鎖コード領域の５’末端（ＬＣコード配列の最初の９塩基対、表の最終行）までである。
【０４７８】
表２８．  プラスミドｐＴＴ３−ＨＣ−Ｃ１７−ｓｃ−ＬＣの部分コード配列（配列番号１５６）
【０４７９】
【化４３】
2009508470.tif 000078
重鎖３’配列−Ｈｈ−Ｃ１７−軽鎖５’配列
【０４８０】
以下の構築物においては、上記構築物ｐＴＴ３−ＨＣ−Ｃ１７−ｓｃ−ＬＣとの唯一の違いは、ヘッジホッグＣ１７領域中の最後の２個のアミノ酸のＳＣからＨＮへの変異（下線）である。示した配列は、Ｄ２Ｅ７重鎖コード領域の末端（ＨＣコード配列の最後の９塩基対、表の第１行）からＤ２Ｅ７軽鎖コード領域の５’末端（表の最終行）までである。
【０４８１】
表２９．  プラスミドｐＴＴ３−ＨＣ−Ｃ１７−ｈｎ−ＬＣの部分コード配列（配列番号１５７）
【０４８２】
【化４４】
2009508470.tif 000079
重鎖３’配列−Ｈｈ−Ｃ１７−変異−軽鎖５’配列
【０４８３】
以下の構築物においては、Ｃ１７ではなく、Ｈｉｎｔドメインの完全Ｃ２５領域を使用する。示した配列は、Ｄ２Ｅ７重鎖コード領域の末端（ＨＣコード配列の最後の９塩基対、表の第１行）からＤ２Ｅ７軽鎖コード領域の５’末端（ＬＣコード配列の最初の９塩基対、表の最終行）までである。
【０４８４】
表２９Ｂ．  ｐＴＴ３−ＨＣ−Ｃ２５−Ｈｉｎｔ−ＬＣ由来の部分コード配列（配列番号１５８）
【０４８５】
【化４５】
2009508470.tif 000080
［重鎖３’配列−Ｈｈ−Ｃ２５ドメイン−軽鎖５’配列］
【０４８６】
（配列番号１４０）
Ｈｈ−Ｃ２５及び関係する構築物のアミノ酸配列（下向きの矢印は切断部位を示す；↓：Ｈｈ−Ｃ１７  ↓：Ｈｈ−Ｃ１７ｓｃ）：
【０４８７】
【化４６】
2009508470.tif 000081
【実施例３】
【０４８８】
タンパク質分解プロセシング用のＴＥＶ認識配列を用いた抗体発現
目的抗体を含む、免疫グロブリン重鎖と軽鎖の各配列セグメント間のＴＥＶ認識配列を用いて、構築物及び発現ベクターを作製して、腫よう壊死因子α、インターロイキン１２、インターロイキン１８及びエリスロポイエチン受容体に特異的な抗体の発現を誘導する。好ましくは、構築物は、インフレームリーダー配列が先行する目的抗体重鎖の転写を誘導する、アデノウイルス主要後期プロモーター及びサイトメガロウイルスエンハンサーを含む発現ベクターを含む。重鎖コード配列は、インフレームフューリン切断部位及びＴＥＶ認識配列（Ｅ−Ｐ−Ｖ−Ｙ−Ｆ−Ｑ−Ｇ）、続いて核局在化領域欠損ＴＥＶプロテアーゼのコード領域（Ｃｅｒｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ．３６：２３９）、続いて第２のＴＥＶ認識配列と連結される。第２のＴＥＶ認識配列は、目的抗体軽鎖のコード領域と連結された抗体軽鎖のリーダー配列、及び終止コドンにインフレームで連結される。コード領域にはポリアデニル化シグナルが続く。関連する配列を以下に示す。
【０４８９】
表１．  Ｄ２Ｅ７（Ｈｕｍｉｒａ／アダリムマブ）ＴＥＶ発現ベクター完全ＤＮＡ配列（配列番号４４）
【０４９０】
【化４７】
2009508470.tif 000082
2009508470.tif 000083
2009508470.tif 000084
2009508470.tif 000085
【０４９１】
表２Ａ．  ＡＢＴ−００７  ＴＥＶ構築物：ポリタンパク質のコード配列（配列番号３２）
【０４９２】
【化４８】
2009508470.tif 000086
【０４９３】
表２Ｂ．  ＡＢＴ−００７  ＴＥＶポリタンパク質アミノ酸配列（配列番号３３）
【０４９４】
【化４９】
2009508470.tif 000087
2009508470.tif 000088
【０４９５】
表２Ｃ．  完全ＡＢＴ−００７  ＴＥＶ構築物発現ベクター配列（配列番号３４）
【０４９６】
【化５０】
2009508470.tif 000089
2009508470.tif 000090
2009508470.tif 000091
【０４９７】
表３Ａ．  ＡＢＴ−８７４（Ｊ６９５）ＴＥＶポリタンパク質のコード配列（配列番号３５）
【０４９８】
【化５１】
2009508470.tif 000092
【０４９９】
表３Ｂ．  ＡＢＴ−８７４（Ｊ６９５）ＴＥＶポリタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３６）
【０５００】
【化５２】
2009508470.tif 000093
【０５０１】
表３Ｃ．  ＡＢＴ−８７４（Ｊ６９５）ＴＥＶ発現ベクターの完全ヌクレオチド配列（配列番号３７）
【０５０２】
【化５３】
2009508470.tif 000094
2009508470.tif 000095
2009508470.tif 000096
【０５０３】
表４Ａ．  ＥＬ２４６  ＧＧ（抗Ｅ／Ｌセレクチン）ＴＥＶポリタンパク質をコードする核酸配列（配列番号３８）
【０５０４】
【化５４】
2009508470.tif 000097
2009508470.tif 000098
【０５０５】
表４Ｂ．  ＥＬ２４６  ＧＧ（抗Ｅ／Ｌセレクチン）ＴＥＶポリタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３９）
【０５０６】
【化５５】
2009508470.tif 000099
【０５０７】
表４Ｃ．  ＥＬ２４６  ＧＧ（抗Ｅ／Ｌセレクチン）ＴＥＶポリタンパク質発現ベクターの完全ヌクレオチド配列（配列番号４０）
【０５０８】
【化５６】
2009508470.tif 000100
2009508470.tif 000101
2009508470.tif 000102
【０５０９】
表５Ａ．  ＡＢＴ−３２５  ＴＥＶポリタンパク質のコード配列（配列番号４１）
【０５１０】
【化５７】
2009508470.tif 000103
2009508470.tif 000104
【０５１１】
表５Ｂ．  ＡＢＴ−３２５  ＴＥＶポリタンパク質アミノ酸配列（配列番号４２）
【０５１２】
【化５８】
2009508470.tif 000105
【０５１３】
表５Ｃ．  完全ＡＢＴ−３２５  ＴＥＶポリタンパク質発現ベクターのヌクレオチド配列（配列番号４３）
【０５１４】
【化５９】
2009508470.tif 000106
2009508470.tif 000107
2009508470.tif 000108
【０５１５】
表６Ａ．  Ｄ２Ｅ７  ＬＣ−ＬＣ−ＨＣポリタンパク質構築物のコード配列（配列番号２９）
【０５１６】
【化６０】
2009508470.tif 000109
2009508470.tif 000110
【０５１７】
表６Ｂ．  Ｄ２Ｅ７  ＬＣ−ＬＣ−ＨＣポリタンパク質アミノ酸配列（配列番号３０）
【０５１８】
【化６１】
2009508470.tif 000111
【０５１９】
表６Ｃ．  Ｄ２Ｅ７  ＬＣ−ＬＣ−ＨＣポリタンパク質発現ベクターＤＮＡ配列の完全ヌクレオチド配列（配列番号３１）
【化６２】
2009508470.tif 000112
2009508470.tif 000113
2009508470.tif 000114
2009508470.tif 000115
【実施例４】
【０５２０】
内部切断可能シグナルペプチド構築物を有するポリタンパク質としての抗体の発現
更なる実施形態は、抗体発現のためのコード配列、発現ベクター及び方法で構成される。一次発現構築物は、内部切断可能シグナルペプチドを有するポリタンパク質を含み、発現とそれに続く切断によって、多連鎖（例えば、二連鎖）抗体分子が形成される。
【０５２１】
表７Ａ．  Ｄ２Ｅ７内部切断可能シグナルペプチド構築物のコード配列（配列番号４５）
【０５２２】
【化６３】
2009508470.tif 000116
【０５２３】
表７Ｂ．  Ｄ２Ｅ７内部切断可能シグナルペプチドポリタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４６）
【０５２４】
【化６４】
2009508470.tif 000117
【０５２５】
表７Ｃ．  完全Ｄ２Ｅ７内部切断可能シグナルペプチドポリタンパク質発現ベクターＤＮＡ配列（配列番号４７）
【０５２６】
【化６５】
2009508470.tif 000118
2009508470.tif 000119
2009508470.tif 000120
【０５２７】
材料及び方法：
記述した構築物を２９３−６Ｅ細胞に以下のように移入する。使用した細胞は、指数増殖期のＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞（０．８から１．５×１０６細胞／ｍｌ）である。この細胞は、３０回未満継代培養された。培養物を新しい増殖培地に３又は４日おきに濃度３×１０５細胞／ｍｌまで接種する。増殖培地は、ジェネテシン（Ｇ４１８）２５ｕｇ／ｍｌ（ＧＩＢＣＯ（商標）Ｃａｔ．  Ｎｏ．１０１３１−０２７）及び０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（界面活性剤、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｃａｔ．  Ｎｏ．２４０４０−０３２）を補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ（商標）Ｃａｔ．  Ｎｏ．１２３３８−０１８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）である。移入培地は、最終濃度１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｌ（ＧＩＢＣＯ（商標）Ｃａｔ．  Ｎｏ．１５６３０−０８０）を含むＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ（商標）Ｃａｔ．  Ｎｏ．１２３３８−０１８）である。移入のために、最適なベクターＤＮＡを添加して、最適化実験に基づいて変化する濃度１μｇ（重鎖＋軽鎖）／ｍｌとする。ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）、線状、２５ｋＤａ、１ｍｇ／ｍｌ無菌原液、ｐＨ７．０（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）を移入媒介物質としてＤＮＡ：ＰＥＩ比１：２で添加する。使用した栄養補給（Ｆｅｅｄｉｎｇ）培地は、Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｎ１  Ｍｅｄｉｕｍ（ＴｅｋｎｉＳｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．  Ｔｅｌ＃１−８００−２６７−９７９９から入手可能なＯｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ  Ｆｒａｎｃｅ製ＴＮ１粉末、Ｃａｔ  Ｎｏ．１９５５４）である。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ中５％ｗ／ｖ原液を添加して最終濃度０．５％にする。標準実験室装置を一般に使用する。Ｃｅｄｅｘ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用する（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ、Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０５２８】
各小規模移入を１２５ｍｌ三角フラスコ中で以下のように実施する。新しい培地２０ｍｌ一定分量に生細胞１×１０６細胞／ｍｌを接種する。（注：より大きい体積の場合、培養物は容器の公称容量の２０−２５％、例えば５００ｍｌフラスコ中培養物１００ｍｌとすべきである）。次いで、培養物を５％ＣＯ２の加湿雰囲気で回転速度１３０ｒｐｍで３７℃インキュベーター中に置く。
【０５２９】
ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体調製物を、移入培地を水浴で３７℃に加温し、凍結ＰＥＩ原液及び（−２０℃で貯蔵した）ＤＮＡ溶液を室温で解凍することによって調製する。使用するＤＮＡ及びＰＥＩの各量は、移入される培養物の総体積に基づく。ＤＮＡ／ＰＥＩ複合体２．５ｍｌ及びＴｎ１  ２．５ｍｌを含む培養物２０ｍｌは、合計ＤＮＡ  ２５μｇ及びＰＥＩ  ５０μｇを要する。（例えば、１０個の移入物用の）ＤＮＡ：ＰＥＩ複合体は、最適なＤＮＡベクターを含有する溶液を添加した管Ａに、移入培地１２．５ｍｌを最終濃度１０μｇ／ｍｌまで混合することによって形成される。ＰＥＩに対して移入培地１２．５ｍｌを添加する（２０μｇ／ｍｌ、最終濃度）。ＰＥＩ混合物を約１０秒間ボルテックス撹拌して混合した後、ＤＮＡ溶液と混合する。ＰＥＩとＤＮＡの各混合物を組み合わせた後、組合せを１０秒間ボルテックス撹拌して混合する。次いで、混合物を室温で１５分間（ただし、２０分間以下）静置する。ＤＮＡ：ＰＥＩ複合体溶液２．５ｍｌをＨＥＫ−６Ｅ細胞２０ｍｌに添加する。移入から約２０から２４時間後に、５％ＴＮ１補助剤を各フラスコに最終濃度０．５％まで添加する。
【０５３０】
細胞密度及び生存度を４日目及び７日目に求める。細胞ペレットを、ウエスタン分析及びノーザンブロット分析用に培養物２ｍｌ一定分量から収集する）。ペレットを分析まで−８０℃で凍結する。移入から７日後に細胞を１０００ｒｐｍ（１０ｍｉｎ）の遠心分離によって収集し、プレフィルター紙及びＣｏｒｎｉｎｇ  ０．２２μｍ  ＣＡ  Ｆｉｌｔｅｒシステムによって上清をろ過する。上清試料も分析、例えばＥＬＩＳＡアッセイに使用するまで８０℃で貯蔵する。
【０５３１】
ノーザンブロット分析の場合、過渡的に移入された２９３−６Ｅ細胞から全ＲＮＡを以下のように単離する。凍結細胞ペレットを氷上で解凍する。ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ  Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ｃａｔ．＃７４１０４）を用いて、製造者の指示に従って精製する。
【０５３２】
ホルムアルデヒド／アガロースゲル調製は以下のとおりである。アガロース（Ａｍｂｉｏｎ、ｃａｔ．＃９０４０）２グラムを蒸留水１６１．３ｍｌ中で煮沸する。１Ｍ  ＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホン酸）ＰＨ７．０  ４ｍｌ、１Ｍ  ＮａＯＡｃ  １ｍｌ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ０．４ｍｌを添加し、混合物を６０℃に冷却する。次いで、３７％ホルムアルデヒド（Ｊ．Ｔ．  Ｂａｋｅｒ、ｃａｔ＃２１０６−０１）３３．３ｍｌを添加し、溶融アガロース溶液を静かに混合する。ゲルを注ぎ、換気フード中で凝固させる。
【０５３３】
１Ｍ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０  ３０ｍｌ、１Ｍ  ＮａＯＡｃ  ７ｍｌ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ３ｍｌ及び１．５までのＤＥＰＣ（ジエチルピロカルボナート）処理ｄＨ２Ｏを混合することによって、泳動緩衝剤を調製する。
【０５３４】
ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  ｌｏａｄ  ｄｙｅ（Ａｍｂｉｏｎ、ｃａｔ．＃８５５２）３部をＲＮＡ  １部と混合することによってＲＮＡ試料を調製する。１レーン当たりＲＮＡ  ３から５μｇを泳動させる。使用したＲＮＡ分子量マーカーは、０．５−１０Ｋｂ  ＲＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．＃１５６２３−２００）からである。試料を６５℃で５分間加熱して変性し、氷冷する。次いで、１０μｇ／μｌ臭化エチジウム（Ｐｉｅｒｃｅ、ｃａｔ．＃１７８９８）０．５μｌを各試料に添加する。各試料を短時間遠心分離して液体をペレットにする。
【０５３５】
ゲル電気泳動を以下のように実施する。ホルムアルデヒド／アガロースゲルを泳動緩衝剤で覆い、試料を載せ、次いで１５０Ｖで２時間換気フード中で泳動させる。バンドを紫外線透視法によって検査し、永久記録用に写真を撮影する。
【０５３６】
ＤＥＰＣで処理したｄＨ２Ｏの幾つかの変化物（ｃｈａｎｇｅ）にゲルを５分間浸漬して、ホルムアルデヒドを除去することによって、キャピラリートランスファーを実施する。次いで、ゲルを５０ｍＭ  ＮａＯＨ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ中に室温で２０分間浸漬して、二本鎖ＲＮＡを更に変性させる。ゲルを、ＤＥＰＣで処理したｄＨ２Ｏで１回リンスし、次いで、２０×ＳＳＣ（ＮａＣｌ  １７５．３ｇ；クエン酸ナトリウム８８．２ｇ；１０Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨ約７．０へ、１Ｌに調節した体積）に室温で２０分間浸漬して中和する。Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ＃ＲＰＮ３０３Ｂ）を浸漬し、ゲルと同じサイズに切断し、ＤＥＰＣで処理したｄＨ２Ｏで湿らせる。３Ｍろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  ｃａｔ＃３０３０９１７）をゲル及び膜と同じサイズに切断する。上部に組み立てられる層を通してろ紙が２０×ＳＳＣを毛管作用によって吸い取るように、２０×ＳＳＣ貯蔵器上の固体担体に３Ｍろ紙の層を配置することによって、移行系を組み立てる。この毛管作用体（ｗｉｃｋ）、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜、サイズに切断した３Ｍろ紙３枚、及びＧｅｌ  Ｂｌｏｔ  Ｐａｐｅｒ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ、ｃａｔ．＃１０４２７９２０）の厚い積層物の上にゲルを置く。平坦な支持体を積層物の上に置き、必要に応じて荷重（通常、１リットルビンの水）を加えて、効率的キャピラリートランスファーを確かなものにする。プラスチックラップを使用して、空気にさらされる貯蔵器を覆って蒸発を防止する。室温で終夜移行させる。次いで、移行系を分解し、ブロットを６×ＳＳＣに浸漬して、アガロースを除去する。膜を風乾し、ＵＶに曝露してブロットを架橋する。
【０５３７】
ＤＮＡプローブテンプレートは、Ｄ２Ｅ７の重鎖及び軽鎖のコード領域である。所望のテンプレート１００ｎｇを、ＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓキット（アルカリホスファターゼ標識系、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．＃ＲＰＮ３６８０）を用いて製造者の指示に従ってアルカリリン酸塩で標識する。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション段階を、標識の場合と同じキットを用いて実施した（ハイブリダイゼーション緩衝剤を含む。）。膜をハイブリダイゼーションオーブン中で６５℃で少なくとも１時間プレハイブリダイズする。プローブを煮沸し、プレハイブリダイゼーション緩衝剤／ブロットに直接添加する。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションオーブン中で６５℃で終夜起きた。ハイブリダイゼーション溶液をデカントし、膜を２×ＳＳＣで短時間洗浄してハイブリダイゼーション溶液を除去し、次いで２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃で各１５分間２回洗浄し、最後に０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃で各１５分間２回洗浄した。膜上のバンドを可視化するために、化学発光を用いた。ブロットにＣＤＰ−Ｓｔａｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（１，２−ジオキセタン基質からのフォトープ（ｐｈｏｔｏｐｅ）のアルカリホスファターゼ依存的生成、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．＃ＲＰＮ３６８２）を室温で５分間塗布する。過剰の試薬をブロットから抜き取り、次いでブロットをプラスチック保護シートで包んだ。ブロットをＫｏｄａｋ  Ｂｉｏｍａｘ  ＭＲフィルム（Ｘ線フィルム、Ｋｏｄａｋ、ｃａｔ．＃８９５２８５５）に曝露し、１０秒から最高１０分間開始した。フィルムをＫｏｄａｋ  Ｍ３５Ａ  Ｘ−ＯＭＡＴ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ｘ線現像機／現像処理機）によって現像した。
【０５３８】
ウエスタンブロット用細胞ペレット試料を以下のように調製した。細胞内抗体発現の分析のために、細胞をＮＰ  ４０溶解緩衝剤（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０（オクチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル））、５ｍＭ  ＢＭＥ及びプロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩ）で溶解し、氷上で１０分間インキュベートした。膜及び不溶性タンパク質の各画分を、微量遠心機を用いて遠心分離によって１６，０００ｒｐｍで３０分間収集する。可溶細胞内又はサイトゾル画分と呼ばれる上清をゲル分析に使用し、ＤＴＴを含むＳＤＳローディングバッファーを添加した。ペレットを等体積の溶解緩衝剤で懸濁させ、ＤＴＴを含むＳＤＳゲルローディングバッファーを添加した。培養上清試料をウエスタンブロット用に以下のように調製した。培養上清をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（限外ろ過装置、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって、ＭＷカットオフ３０，０００ダルトンで濃縮し、又はウエスタンブロットに直接使用した。免疫ブロット（ウエスタン分析）のために、試料をＮＵＰＡＧＥ  ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ポリアクリルアミド）ゲルによって分離し、ＰＶＤＦ膜に標準方法によって移した。膜をブロッキング溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）及び５％粉乳を含むＰＢＳ）中で１時間インキュベートし、洗浄し、ＰＢＳＴ緩衝剤で１：１０００希釈してＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｄｅｎｍａｒｋ）製ポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＧ／ＨＲＰ又はポリクローナルウサギ抗ヒトカッパ軽鎖／ＨＲＰと一緒にインキュベートし、次いでＰＢＳＴを３回変えて室温で再度洗浄した。ＧＥ／Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）製ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（化学発光及び化学蛍光検出）Ｓｙｓｔｅｍを検出に使用した。
【０５３９】
ＥＬＩＳＡアッセイを、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）製ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＵＮＬＢ及びヤギ抗ヒトＩｇＧ／ＨＲＰ、ブロッティング緩衝剤として２％乳のＰＢＳ溶液、基質としてＫ−Ｂｌｕｅ（３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン及び過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、Ｎｅｏｇｅｎ、Ｌａｎｓｉｎｇ、ＭＩ）を用いて、標準方法によって実施した。プレートをＳｐｅｃｔｒａｍａｘマイクロプレートリーダーによって主波長６５０ｎＭ及び基準波長４９０ｎｍで読み取った。
【０５４０】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）製Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ａｇａｒｏｓｅビーズ、Ｐｉｅｒｃｅ製Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｕｒｅ（Ａ）ＩｇＧ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ、洗浄緩衝剤としてＰＢＳ、ｐＨ７．４、及び（１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９．５で中和した）溶出緩衝剤として０．１Ｍ酢酸／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．５を用いて、標準方法によって分泌抗体を親和性精製した。
【０５４１】
完全な分子量の測定  構築物ｐＴＴ３  ＨＣ−ｉｎｔ−ＬＣ  Ｐ．ｈｏｒｉから産生されたＤ２Ｅ７試料の完全な分子量をＬＣ−ＭＳによって分析した。タンパク質マイクロトラップ（Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，  Ｉｎｃ．  ｃａｔ．  ００４／２５１０９／０３）を備えた１１００キャピラリーＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳＮ  ＤＥ  １４９００６５９）を用いて、試料を脱塩し、Ｑ  Ｓｔａｒ  Ｐｕｌｓａｒ  ｉ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＳＮ  Ｋ１８２０２０２）に導入した。試料を溶出させるために、緩衝剤Ａ（０．０８％ＦＡ、０．０２％ＴＦＡのＨＰＬＣ水溶液）と緩衝剤Ｂ（０．０８％ＦＡと０．０２％ＴＦＡのアセトニトリル溶液）を用いて、流量５０μＬ／ｍｉｎで１５分間勾配をかけた。
【０５４２】
軽鎖及び重鎖の分子量の測定  構築物ｐＴＴ３  ＨＣ−ｉｎｔ−ＬＣ  Ｐ．ｈｏｒｉから産生された未変性Ｄ２Ｅ７試料をＬＣ−ＭＳによって分析した。軽鎖と重鎖を連結するジスルフィド結合を２０ｍＭ  ＤＴＴ中で３７℃で３０分間還元した。ＰＬＲＰ−Ｓカラム（Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，  Ｉｎｃ．  ８μｍ、４０００Å、１．０×１５０ｍｍ、Ｐ／Ｎ  ９０１−００９１１−００）を備えた１１００キャピラリーＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳＮ  ＤＥ  １４９００６５９）を用いて、軽鎖を重鎖から分離し、それらをＱ  Ｓｔａｒ  Ｐｕｌｓａｒ  ｉ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＳＮ  Ｋ１８２０２０２）に導入した。カラムを６０℃で加熱した。緩衝剤Ａ（０．０８％ＦＡ、０．０２％ＴＦＡのＨＰＬＣ水溶液）と緩衝剤Ｂ（０．０８％ＦＡと０．０２％ＴＦＡのアセトニトリル溶液）を用いたＨＰＬＣ勾配を、流量５０μＬ／ｍｉｎで６０分間流して試料を溶出させた。
【０５４３】
制限エンドヌクレアーゼをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から入手した。クローニングに使用した特注のオリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ及びＥ．コリ系統をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から入手した。プロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩをＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から入手した。Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）製品をＤＮＡ単離及び精製に使用した。
【０５４４】
参照及び変形物による組込みに関する記載
本願を通して言及する全参考文献、例えば、発行若しくは登録された特許又は等価物、特許出願公報、未公開特許出願を含めた特許文献、及び非特許文献又は他の原資料を、参照により個々に本明細書に組込むかのごとく、参照によりその全体を本明細書に組込む。万一、引用した参考文献と本願の開示に不一致が生じた場合には、本明細書の開示を優先する。本明細書の一部の参考文献は、情報、例えば、出発材料、追加の出発材料、追加の試薬、追加の合成方法、追加の分析方法、追加の生体材料、追加の細胞、及び本発明の追加の使用の各出所に関する詳細を提供するために、参照により本明細書に組込まれる。
【０５４５】
本明細書で言及する全部の特許及び刊行物は、本発明が関係する当業者の技術レベルを示している。本明細書で引用する参考文献は、その刊行日又は出願日の時点における最新技術を示し得るものであり、この情報は、適格な従来技術内である特定の実施形態を排除するために、必要に応じて、本明細書で使用できるものとする。例えば、組成物を本明細書で特許請求するときには、本明細書で引用する参考文献において授権的に開示する化合物を含めて、本出願人の発明に関連した適格な従来技術として公知であり、利用可能である化合物は、本明細書の組成物クレームに含まれないものであることを理解すべきである。
【０５４６】
本明細書の添付物を、明細書及び／又は図面の一部として参照により組込む。
【０５４７】
本明細書では「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」又は「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、言明した特徴、整数、段階又は成分の存在を明示すると解釈すべきであるが、１つ以上の他の特徴、整数、段階、成分又はこれらの群の存在又は追加を除外するものではない。したがって、本明細書では、含むことは、含めて（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）、有する、又はを特徴とすると同義であり、包括的又はオープンエンド（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）である。本明細書では、「からなる」は、特許請求の範囲に明示されていないあらゆる要素、段階、成分などを排除する。本明細書では、「から本質的になる」は、（例えば、活性成分に関係して）特許請求の範囲の基本的及び新規の特性に物質的に影響を及ぼさない材料又は段階を排除しない。本明細書の各場合において、「含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という用語のいずれも、それ以外の２つの用語のどちらかで置換し得るものであり、それによって、必ずしも同一の広がりを持つとは限らない、別々の実施形態及び／又は範囲を開示し得る。本明細書に説明的に記述された本発明は、本明細書に具体的に開示しない任意の要素又は制約の非存在下で適切に実施し得る。
【０５４８】
範囲、例えば、温度範囲、時間範囲、組成若しくは濃度範囲、又は他の値の範囲などを本明細書で開示するときにはいつでも、全部の中間範囲及び部分範囲（ｓｕｂｒａｎｇｅ）、並びに所与の範囲に含まれる個々の値全部が開示に含まれるものとする。本発明は、図面に示す任意の実施形態、又は明細書に例示する任意の実施形態を含めて、開示する実施形態に限定されるべきではない。これらの実施形態は、例又は説明として示すものであって、限定的なものではない。本明細書の記載に含まれる任意の部分範囲、又は範囲若しくは部分範囲内の個々の値は、特許請求の範囲から除外し得ることを理解されたい。
【０５４９】
本発明を、種々の特定の、及び／又は好ましい、実施形態及び技術に関連して記述した。しかし、多数の変形及び改変が、本発明の精神及び範囲内でなされ得ることを理解すべきである。本明細書に具体的に記載したもの以外の組成物、方法、装置、装置部品、材料、手順及び技術を、過度の実験を行うことなく、本明細書に大まかに開示する本発明の実施に使用できることは当業者には明らかである。これは、具体的に例示したもの以外の、例えば、出発材料、生体材料、試薬、合成方法、精製方法、分析法、アッセイ方法及び生物学的方法に拡張することができる。本明細書に記載の上述のもの（例えば、組成物、方法、装置、装置部品、材料、手順及び技術など）の当分野で公知である全部の機能的等価物は、本発明に包含されるものとする。使用した用語及び表現は、説明の用語として使用され、限定的な用語ではない。かかる用語及び表現の使用において、示した、また、記述した特徴又はその部分の任意の等価物を除外することを意図したものではない。そうではなく、種々の改変が、特許請求する本発明の範囲内で可能であることを認識されたい。したがって、本発明を実施形態、好ましい実施形態、及び必須でない特徴によって具体的に開示したが、本明細書で開示する概念の改変及び変形が当業者によってなされ得るものであり、かかる改変及び変形は、添付の特許請求の範囲に規定された本発明の範囲内とみなされることを理解すべきである。
【０５５０】
追加の参考文献
米国特許第６２５８５６２号、米国特許第６０９０３８２号；米国特許第６４５５２７５号；欧州特許第１０８０２０６号Ｂ１；国際公開第９９６０１３５号；米国特許第５９１２１６７号；米国特許第５１６２６０１号；国際公開第１９９５２１２４９号Ａ１；米国特許第５１４９７８３号；米国特許第５９５５０７２号；米国特許第５５３２１４２号；米国特許出願公開第２００４０２２４３９１号；米国特許第６５３７８０６号；米国特許第５８４６７６７号；米国特許出願公開第２００３００９９９３２号；国際公開第９９５８６６３号；米国特許出願公開第２００３０１５７６４１号；米国特許出願公開第２００３０４８３０６号Ａ２；米国特許第６１１４１４６号；米国特許第６０６０２７３号；米国特許第５９２５５６５号；米国特許出願公開第２００４０２４１８２１号；国際公開第２００３１０００２１号Ａ２；国際公開第２００３１０００２２号Ａ２；米国特許出願公開第２００４０２６５９５５号；米国特許出願公開第２００５０００３４８２号；米国特許出願公開第２００５００４２７２１号；国際公開第２００５０１７１４９号；国際公開第２００４１１３４９３号；米国特許出願公開第２００５０１３６０３５号；国際公開第２００４１０８８９３号；米国特許第６６９２７３６号；米国特許出願公開第２００５０１４７９６２号；米国特許第６３３１４１５号；米国特許第６６３２６３７号；米国特許出願公開第２００４００６３１８６号；米国特許第７０２６５２６号；米国特許第６３６５３７７号；国際公開第２００５１２３９１５号；米国特許第５６６５５６７号；国際公開第９７４１２４１号Ａ１；欧州特許第０７０１６１６号Ｂ１；米国特許出願公開第２００６００１０５０６号；国際公開第２００６０４８４５９号；米国特許第６８５２５１０号；国際公開第２００５０７２１２９号；米国特許第５６４８２５４号；米国特許第６９０８７５１号；米国特許出願公開第２００５０２２１４２９号；国際公開第２００５０７１０８８号；国際公開第２００５１０８５８５号；国際公開第２００５０８５４５６号；米国特許第７０２９８７６号；米国特許第６６３８７６２号；米国特許第６５４４７８０号；米国特許第５５１９１６４号；国際公開第２００３０３１６３０号；米国特許第６２９４３５３号；国際公開第２００５０４７５１２号；米国特許第７０５２９０５号；米国特許第７０１８８３３号；米国特許出願公開第２００２００３４８１４号；米国特許出願公開第２００４０１２６８８３号；米国特許出願公開第２００５０００２９０７号；米国特許出願公開第２００５０１１２０９５号；米国特許出願公開第２００５０２１４２５８号；欧州特許第０５９８０２９号。
【０５５１】
Ｍａｔｈｙｓ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｇｅｎｅ  ２３１（１−２）：１−１３，  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｅｌｆ−ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｍｉｎｉ−ｉｎｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ａｕｔｏｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｎ−  ａｎｄ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ：  ｆａｃｉｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇａｔｉｏｎ．
【図面の簡単な説明】
【０５５２】
【図１】好ましい安定なｓＯＲＦ発現ベクター構築物を示す図である。
【図２】（自動プロセシング部位であり得る）第２のタンパク質切断部位をコードする追加の（第２の）介在核酸、及び第３のポリペプチドをコードする第３の核酸配列を更に含む、好ましい安定なｓＯＲＦ発現ベクター構築物を示す図である。かかるベクターは、２種類を超えるポリペプチドを発現可能である。
【図３】好ましい一過性ｓＯＲＦ発現ベクター構築物（例えば、ｐＴＴ３−ＨＣ−Ｓｓｐ−ＧＡ−ｉｎｔ−ＬＣ−０ａａ）を示す図である。
【図４】二重ハイブリッド系用の２Ａセグメントを含む発現ベクターを示す図である。ベクター発現カセットは、２Ａペプチドの翻訳後に自己プロセシングを受ける、ＧＡＬ４：：ベイト：：２Ａペプチド融合物としてベイトタンパク質を最初に翻訳するように構成されている。第２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＮＦカッパＢ：：ライブラリー融合タンパク質である。
【図５】図４のプラスミド（２Ａ切断を含む２−ハイブリッド系）の発現領域の拡大線状図である。
【図６】免疫グロブリン発現用のインテインに基づくｓＯＲＦベクターを示す図である。
【図７】抗体などの組立て（ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ）多量体分子の発現のために選択された点変異を含む幾つかのｓＯＲＦ構築物を示す図である。
【図８】変化したシグナルペプチド、例えば、修飾免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチドを含むｓＯＲＦ構築物を示す図である。
【図９】ヘッジホッグ自動プロセシングドメインを用いたｓＯＲＦ構築物を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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