(57)【要約】  本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達を阻害するための、ヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストの使用方法、並びに、癌、細胞増殖性疾患及び血管新生、神経障害、並びに、育毛、神経幹細胞の分化、軟骨形成及び骨形成、肺サーファクタント生産、肺細胞内でのラメラ体の形成などのヘッジホッグシグナル伝達により影響を受ける他の状態を含む、ヘッジホッグシグナル伝達又はヘッジホッグの過剰発現に関連する障害の治療方法及び診断方法を提供する。
2009526752.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘッジホッグ（ｈｅｄｇｅｈｏｇ）シグナルが活性化した細胞を、有効量のヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストと接触させることを含む、細胞内のヘッジホッグシグナル伝達を阻害する方法。
【請求項２】
前記ヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストが、前記細胞の増殖阻害を生じさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストが、前記細胞の死を生じさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストが、ＲＮＡｉ分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストにそれぞれ阻害される、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫポリペプチドが、それぞれ図１Ａないし図１Ｉに示す配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストが、増殖阻害剤又は細胞毒性薬剤に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記増殖阻害剤又は細胞毒性薬剤が、メイタンシノイド、カリケアマイシン、抗生物質、放射性同位体、及び核酸分解酵素から成る群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
活性なヘッジホッグシグナル伝達経路を有する細胞を、有効量の有効量のヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストと接触させることを含む、活性なヘッジホッグシグナル伝達経路を有する細胞の増殖、成長、分化又は生存を阻害する方法。
【請求項１０】
前記細胞の増殖が良性である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞の増殖が癌性である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
癌細胞の増殖を阻害する方法であって、ここで、前記癌細胞の増殖が、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのヘッジホッグポリペプチドによる増殖増強効果に少なくとも部分的に依存しており、前記方法が、前記ヘッジホッグポリペプチドをヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２及びＴＴＫのアンタゴニストとそれぞれ接触させることで、前記ヘッジホッグポリペプチドの増殖増強効果を中和して、結果として前記癌細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項１３】
前記増殖が、完全に阻害される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞の死を誘導する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞のアポトーシスを誘導する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストが、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのＲＮＡｉ分子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストが、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのオリゴペプチド、有機低分子又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２及びＴＴＫのアンタゴニストが、メイタンシノイド、カリケアマイシン、抗生物質、放射性同位体、及び核酸分解酵素から成る群から選択される増殖阻害剤又は細胞毒性薬剤に結合している、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）前記哺乳動物から入手した組織又は細胞のテストサンプルと、（ｂ）同一の組織の由来又は種類の既知の正常な非癌性組織又は細胞のコントロールサンプル中のヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを比較することを含み、ここで、前記コントロールサンプルとの比較における、前記テストサンプル内でのＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫポリペプチドの高発現レベルが、前記テストサンプルを取り出した哺乳動物内の細胞増殖性疾患の存在の指標となる、細胞増殖性疾患の存在の診断方法。
【請求項２０】
ヘッジホッグシグナル伝達の発現又は活性の増大と関連する細胞増殖性疾患の治療又は予防の方法であって、このような治療を必要とする対象に治療上有効量のヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストを投与することを含む方法。
【請求項２１】
前記細胞増殖性疾患が、癌である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの適用が、ヘッジホッグシグナル伝達の阻害を生じさせる、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの適用が、細胞死を生じさせる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの適用が、アポトーシスを生じさせる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストが、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのＲＮＡｉ分子である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストが、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのオリゴペプチド、有機低分子又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記ヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストが、メイタンシノイド、カリケアマイシン、抗生物質、放射性同位体、及び核酸分解酵素から成る群から選択される増殖阻害剤又は細胞毒性薬剤に結合している、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物内の腫瘍の治療方法であって、ここで、前記腫瘍の増殖が、ヘッジホッグポリペプチドの増殖増強効果、及びＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫポリペプチドによる増殖増強効果の修飾に少なくとも部分的に依存している、細胞を含み、前記方法が、治療上有効量のヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストを前記哺乳動物に投与することで、ヘッジホッグポリペプチドによる増殖増強を中和して、腫瘍の効果的な治療をもたらす方法。
【請求項２９】
前記腫瘍が、ヘッジホッグシグナル伝達が活性な細胞を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ヘッジホッグアンタゴニストの適用が、前記ヘッジホッグシグナル伝達が活性な細胞の増殖阻害を生じさせる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ヘッジホッグアンタゴニストの適用が、前記ヘッジホッグシグナルを発現する細胞の死を生じさせる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ヘッジホッグアンタゴニストの適用が、アポトーシスを生じさせる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストが、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのＲＮＡｉ分子である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストが、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのオリゴペプチド、有機低分子又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのオリゴペプチド、有機低分子又はアンチセンスオリゴヌクレオチドが、増殖阻害剤又は細胞毒性薬剤に結合している、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記増殖阻害剤が、メイタンシノイド、カリケアマイシン、抗生物質、放射性同位体、及び核酸分解酵素から成る群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
癌細胞又は癌組織を、有効量のヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストと接触させることを含む、癌の治療方法。
【請求項３８】
血管新生を阻害すべき細胞又は組織を、有効量のヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストと接触させることを含む、血管新生の阻害方法。
【請求項３９】
未分化幹細胞を、有効量のヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストと接触させることを含む、培養中の未分化幹細胞の増殖、分化又は生存を調節する方法。
【請求項４０】
（ａ）神経疾患を患う患者、（ｂ）軟骨形成若しくは骨形成過程にある患者、又は毛髪の再生又は再成長過程にある患者の細胞を、治療上有効量のヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストと接触させることを含む、（ａ）神経疾患を患う患者、（ｂ）軟骨形成若しくは骨形成過程にある患者、又は毛髪の再生又は再成長過程にある患者の細胞の増殖、分化又は生存を調節する方法。
【請求項４１】
肺細胞を、サーファクタント生産を促進するのに有効な量のヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストと接触させることを含む、肺細胞内でのサーファクタント生産の促進方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、合衆国法典第３５巻１１９条（ｅ）に基づき、２００５年１２月２７日に出願された米国特許出願第６０／７５４，５１４号；２００５年１２月２７日に出願された米国特許出願第６０／７５４，４６４号；２００５年１２月２７日に出願された米国特許出願６０／７５４，５１６号；２００５年１２月２７日に出願された米国特許出願第６０／７５４，５５７号、及び２００６年２月２１日に出願された米国特許出願第６０／７７５，５２５号に係る優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ヘッジホッグ（ｈｅｄｇｅｈｏｇ）シグナル伝達を制御するための、ヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫ、及び該ヘッジホッグキナーゼに拮抗するアンタゴニストの新規な用途、並びにヘッジホッグシグナルに部分的に媒介され、又は起因する種々の生理的症状又は疾患におけるその治療用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
シグナル伝達分子であるヘッジホッグファミリーメンバーは、無脊椎動物及び脊椎動物の胚、胎児及び成体の発生において、多くの重要な短期的及び長期的なパターン形成過程を媒介する。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒでは、単一のヘッジホッグ遺伝子が、分節性成虫原基のパターン形成を制御する。対照的に脊椎動物では、ヘッジホッグ遺伝子ファミリーが、３種類全ての胚葉から生じる、例えば左右非対称性、ＣＮＳの発生、大節及び肢のパターン形成、軟骨形成、骨格形成及び精子成形を含む細胞及び組織の増殖、分化、移動及び生存の制御に関与している。
【０００４】
脊椎動物のヘッジホッグ遺伝子ファミリーとしては、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの単一のヘッジホッグ遺伝子（国際公開公報第９５／１８８５６号及び国際公開公報第９６／１７９２４号）の少なくとも４つのメンバー又はパラログが挙げられる。デザート（Ｄｅｓｅｒｔ）ヘッジホッグ（Ｄｈｈ）、ソニック（Ｓｏｎｉｃ）ヘッジホッグ（Ｓｈｈ）及びインディアン（Ｉｎｄｉａｎ）ヘッジホッグ（Ｉｈｈ）として知られる上記メンバーのうちの３つは、魚類、鳥類及び哺乳類を含む全ての脊椎動物内に存在することが明らかとなっている。Ｄｈｈは、マウス胚の発生の際、及びげっ歯類及びヒトの成体内の両方で、精巣内で主に発現し；Ｉｈｈは、胚形成過程での骨発生、及び成体内での骨形成に関与しており；そしてＳｈｈは、３種類全ての系統に由来する複数の胚及び成体の細胞腫に関与している。Ｓｈｈは、発生段階の脊椎動物胚の脊索及び底板内で高レベルで発現し、発生段階の肢、大節及び神経管の細胞運命を支配する。インビトロでの外植片アッセイ、並びにトランスジェニック動物内でのＳｈｈの異所発現により、Ｓｈｈは神経管のパターン形成において重要な役割を果たすことが示されている（Ｅｃｈｅｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３），Ｃｅｌｌ  ７５：１４１７−３０（１９９３）；Ｅｒｉｃｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８１：７４７−５６（１９９５）；Ｍａｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：３２２−２５（１９９５）；Ｈｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｕｒｏｎ  １９：１５−２６（１９９７）．）。ヘッジホッグシグナル伝達は、肢の発生（Ｋｒａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７５：１４３１−４４（１９９３）；Ｌａｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７９：１１６５−７３（１９９４））；大節の発生（Ｆａｎ  ａｎｄ  Ｔｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ，Ｃｅｌｌ  ７９：１１７５−８６（１９９４）；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７９：１１６５−７３（１９９４））、肺の発生（Ｂｅｌｌｕｓｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌ  １２４：５３−６３（１９９７））及び皮膚の発生（Ｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：８１７−２１（１９９７））にも関与している。同様に、Ｉｈｈ及びＤｈｈは、骨細胞、腸細胞及び胚芽細胞の発生に関与する（Ａｐｅｌｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７：８０１−８０４（１９９７）；Ｂｅｌｌｕｓｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｓｕｐｐｌ．１２４：５３−６３（１９９７）；Ｂｉｔｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：２９８−３０４（１９９６）；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２１：３１６３−７４（１９９５））。Ｉｈｈは、特に軟骨細胞の発生に関与しており（Ｖｏｒｔｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：６１３−２２（１９９６））、一方で、Ｄｈｈは精巣の発生において重要な役割を果たす。
【０００５】
ヘッジホッグシグナル伝達は、ヘッジホッグタンパク質（例えば、哺乳類ではＳｈｈ、Ｄｈｈ、Ｉｈｈであり、集約的に「Ｈｈ」）と、ヘッジホッグ受容体であるＰａｔｃｈｅｄ（Ｐｔｃｈ）及び補助受容体のＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）との相互作用により生じる。Ｐｔｃｈには、２種類の哺乳動物ホモログ、Ｐｔｃｈ−ｌ及びＰｔｃｈ−２（集約的に「Ｐｔｃｈ」）が存在し、これらはいずれも、ステロール感受性ドメインを含む１２回膜貫通型タンパク質である（Ｍｏｔｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ，ａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｌ８：１０４−１０６（１９９８），Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）９５（２３）：１３６３０−４０（１９９８））。ＨｈとＰｔｃｈとの相互作用により、シグナルカスケードが誘発され、結果的にＧｌｉファミリーのジンクフィンガー転写因子による転写制御が起こる。
【０００６】
ＨｈがＰｔｃｈに結合すると、７回膜貫通型Ｇ結合タンパク質であるＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）が放出され、次いで複雑な細胞内シグナル伝達経路が活性化される。その後、Ｓｍｏの活性化によりＣｏｓｔａｌ２（Ｃｏｓ２）、Ｆｕｓｅｄ（Ｆｕ）及びＦｕｓｅｄ（Ｓｕ（Ｆｕ））のサプレッサーを含む多分子複合体によるシグナル伝達が生じ、転写因子Ｇｌｉの核内輸送が起こる（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  １２：５７−６３（２００２）；Ｎｙｂａｋｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１２：５０３−５１１（２００２）；ｉ  Ａｌｔａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：２４−３３（２００２））。脊椎動物では、３種類のＧｌｉ転写因子が存在することが知られている：Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２及びＧｌｉ３。Ｇｌｉ１は、Ｈｈ−応答性細胞内で全般的に誘起されている転写活性化因子であるが、Ｇｌｉ２及びＧｌｉ３は、細胞の内部状態により転写の活性化因子又は抑制因子のいずれとしても作用し得る。Ｈｈシグナル伝達がないと、Ｇｌｉ３は完全長Ｇｌｉ３のＣ末端領域を欠く、より小さい核内転写抑制因子にプロセシングされる。Ｓｍｏが活性化されると、Ｇｌｉ３タンパク質の開裂が抑止され、転写−活性化機能を有する完全長型が生成する。Ｇｌｉ２はそのＣ末端切断型において抑制因子機能もコードするが、Ｇｌｉ２の形成はＨｈシグナル伝達の制御を受けないと考えられる（Ｓｔｅｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．１（２）：９（２００２））。
【０００７】
悪性腫瘍（癌）は、米国において、心疾患に次ぐ第２の主要死因である（Ｂｏｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｌ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．４３：７（１９９３））。癌は、増殖して腫瘤を生成する正常組織から生じる異常細胞、即ち新生物細胞の数の増加と、これら新生物の腫瘍細胞による隣接組織の浸潤と、最終的に血液又はリンパ系を通して局所リンパ節に広がり、また転移と称されるプロセスにより遠隔部位に広がる悪性細胞の発生とにより特徴付けられる。癌状態では、細胞は、正常細胞が成長しない条件下で増殖する。癌は様々な形態で表れ、種々の程度の感染度と病原力により特徴付けられる。
【０００８】
ヘッジホッグシグナル伝達は、様々な癌及び発癌現象に関連していると考えられている。発癌プロセスの一例は、血管新生である。現存する脈管構造から新たな血管を発生させる血管形成、及び小さな血管からより大きな幹となる血管への再構築である動脈形成は、いずれも成体組織内の血管成長において、生理的に重要な側面である（Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ  ａｎｄ  Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５３：２１７−３９（１９９１）；Ｆｏｌｋｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１６）：１０９３１−４（１９９２）；Ｂｅｃｋ  ａｎｄ  Ｄ’Ａｍｏｒｅ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１１（５）：３６５−７３（１９９７）；Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９３（５）：６６１−４（１９９８）；Ｂｕｓｃｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｃａｐｅｒ，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９０（３）：３３８−４２（２０００））。このような血管形成プロセスは、組織修復、創傷治癒、組織虚血からの回復、及び月経周期のような有益なプロセスにも要求される。しかしながら、このような血管形成成長プロセスは、新生物の増殖、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、乾癬、特定の形態の黄斑変性症病、及び特定の炎症性症状のような病的症状の発症にも必要とされる（Ｃｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７９：１−３８（２０００））。従って、血管成長の阻害により、細胞の増殖、成長、分化及び／又は生存を阻害することができる。Ｈｈ  は血管形成を促進することが示されているため、Ｈｈ  アンタゴニストは、抗血管形成特性を有すると期待される。
【０００９】
キナーゼは、もとんどの生物学的なシグナル伝達経路の中の重要な成分であり、ヘッジホッグシグナル伝達経路についても例外ではない。出願人は、本明細書中で、有効なシグナル伝達に必要とされる特定のキナーゼを同定した。結果として、これらのキナーゼを調節する分子は、シグナル伝達を調節することの他に、ヘッジホッグシグナル伝達が決定的な因子となる様々な症状及び／又は疾患を治療することが予想される。
【発明の開示】
【００１０】
最も広い意味において、本発明は、ヘッジホッグシグナルの全て又は一部を阻害するためのヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの使用方法を提供する。より直接的な意味では、この方法は、癌を含むヘッジホッグシグナルに関連する疾患を治療するためのヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの使用に関する。
【００１１】
１の態様では、本発明は、容器と、該容器内に含まれる組成物とを含む製品であって、ここで、該組成物は、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを含んでいてもよい製品に関する。具体的な局面では、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、以下のキナーゼのアンタゴニストである：ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２及びＴＴＫ。また、この製品は、更に、ヘッジホッグシグナルの過剰発現と関連する疾患の治療、診断上の検出、又はこの疾患の治療薬のスクリーニング方法におけるヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの使用ついて説明する、容器に添付されたラベル、又は、容器と共に含まれる添付文書を随意に含んでいてもよい。
【００１２】
別の態様では、本発明は、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストに反応性を示す状態の治療、診断上の検出、又はこの疾患の治療薬のスクリーニング方法において有用な薬物の調製のためのヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの使用に関する。具体的な局面では、ヘッジホッグキナーゼは、以下のキナーゼのアンタゴニストである：ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２及びＴＴＫ。
【００１３】
更に別の態様では、本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達が活性な細胞を、ヘッジホッグキナーゼポリペプチドに特異的に結合する、有効量のヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２及びＴＴＫのアンタゴニストと接触させることを含む、ヘッジホッグシグナル伝達の阻害方法に関する。具体的な局面では、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、ヘッジホッグキナーゼポリペプチドを発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する。別の具体的な局面では、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、アポトーシスを誘導する。更に別の態様では、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、細胞死を誘導する。更に具体的な局面では、ヘッジホッグシグナル伝達は、（ｉ）ヘッジホッグ機能獲得型表現型を示す細胞及び組織、並びに（ｉｉ）野生型ヘッジホッグ活性を有する細胞及び組織と関連する。更に具体的な局面では、本発明の方法は、ヘッジホッグシグナル伝達を示す細胞にインビトロで適用される。更に具体的な局面では、本発明の方法は、ヘッジホッグシグナル伝達を示す細胞にインビボで適用される。更に具体的な局面では、活性なヘッジホッグシグナル伝達経路を、Ｇｌｉ遺伝子（例：Ｇｌｉ１）の過剰発現又は核内移行により測定することができる。更に具体的な局面では、ヘッジホッグ遺伝子の過剰発現又は変異型若しくは機能不全型のヘッジホッグ遺伝子（例：ｐｔｃｈ−１、ｐｔｃｈ−２、Ｓｍｏ、Ｆｕ、Ｓｕ（Ｆｕ）等）の存在により、活性なヘッジホッグシグナル伝達経路を測定することができる。更に具体的な局面では、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、ＲＮＡｉ、オリゴペプチド又は有機分子である。更に具体的な局面では、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、例えば、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）又はカリケアマイシン等を含む毒素、抗生物質、放射性同位体、核酸分解酵素等の増殖阻害剤又は細胞毒性剤に結合されていてもよい。
【００１４】
更なる態様では、本発明は、活性なヘッジホッグシグナル伝達経路を有する細胞を、有効量のヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２及びＴＴＫのアンタゴニストと接触させることを含む、活性なヘッジホッグシグナル伝達経路を有する細胞の増殖、成長、分化又は生存を防ぐ方法に関する。具体的な局面では、この細胞増殖は、癌である。別の具体的な局面では、細胞増殖は、良性の過形成である。更に別の具体的な局面では、良性の過形成は、良性の前立腺肥大である。更なる具体的な局面では、活性なヘッジホッグシグナル伝達経路を、Ｇｌｉ遺伝子（例：Ｇｌｉ１）の過剰発現又は核内移行により測定することができる。更に具体的な局面では、ヘッジホッグ遺伝子の過剰発現又は変異型若しくは機能不全型のヘッジホッグ遺伝子（例：ｐｔｃｈ−１、ｐｔｃｈ−２、Ｓｍｏ、Ｆｕ、Ｓｕ（Ｆｕ）等）の存在により、活性なヘッジホッグシグナル伝達経路を測定することができる。
【００１５】
更なる態様では、本発明は、癌細胞の増殖を阻害する方法であって、ここで、前記癌細胞の増殖が、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのヘッジホッグポリペプチドによる増殖増強効果に少なくとも部分的に依存しており、前記方法が、前記ヘッジホッグポリペプチドをヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２及びＴＴＫのアンタゴニストとそれぞれ接触させることで、ヘッジホッグポリペプチドの増殖増強効果を中和して、結果として癌細胞の増殖を阻害する方法に関する。具体的な局面では、癌細胞の増殖は、完全に阻害される。別の具体的な局面では、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、癌細胞の細胞死を誘導する。更に別の具体的な局面では、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、アポトーシスを誘導する。更に具体的な局面では、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、ＲＮＡｉ分子、オリゴペプチド、有機低分子又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。更なる具体的な局面では、本発明の方法で用いられるヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、例えば、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）又はカリケアマイシン等を含む毒素、抗生物質、放射性同位体、核酸分解酵素等の増殖阻害剤又は細胞毒性剤に結合されていてもよい。
【００１６】
更なる態様では、本発明は、（ａ）前記哺乳動物から入手した組織又は細胞のテストサンプルと、（ｂ）同一の組織の由来又は種類の既知の正常な非癌性組織又は細胞のコントロールサンプル中のヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを比較することを含み、ここで、前記コントロールサンプルとの比較における、前記テストサンプル内でのＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫポリペプチドの高発現レベルが、前記テストサンプルを取り出した哺乳動物内の細胞増殖性疾患の存在の指標となる、細胞増殖性疾患の存在の診断方法に関する。具体的な局面では、細胞増殖性疾患は、癌である。具体的な局面では、ヘッジホッグキナーゼポリペプチドは、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２及びＴＴＫポリペプチドから成る群から選択される。
【００１７】
更なる態様では、本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達の発現又は活性の増大と関連する細胞増殖性疾患の治療又は予防の方法であって、このような治療を必要とする対象に治療上有効量のヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストを投与することを含む方法に関する。具体的な局面では、細胞増殖性疾患は、癌であり、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、ＲＮＡｉ分子、オリゴペプチド、有機分子又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の具体的な局面では、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの使用により、ヘッジホッグシグナル伝達が阻害される。更に別の具体的な局面では、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの使用により、細胞死が起こる。更なる具体的な局面では、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの使用により、アポトーシスが生じる。
【００１８】
更なる態様では、本発明は、哺乳動物内の腫瘍の治療方法であって、ここで、前記腫瘍の増殖が、ヘッジホッグシグナルによる増殖増強効果、又はＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２若しくはＴＴＫポリペプチドによる増殖増強効果の修飾に少なくとも部分的に依存している、細胞を含み、前記方法が、治療上有効量のヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストをそれぞれ前記哺乳動物に投与することで、ヘッジホッグシグナル伝達による増殖増強を中和して、腫瘍の効果的な治療をもたらす方法に関する。具体的な局面では、前記腫瘍は、ヘッジホッグシグナル伝達が活性な細胞を含む。別の具体的な局面では、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、ヘッジホッグシグナル伝達が活性な細胞の増殖を阻害する。更に別の具体的な局面では、細胞は、癌細胞である。更に具体的な局面では、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、活性なヘッジホッグシグナルを発現する細胞に細胞死を生じさせる。更に具体的な局面では、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、アポトーシスを生じさせる。更に具体的な局面では、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、ＲＮＡｉ、オリゴペプチド又は有機分子である。更に具体的な局面では、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、例えば、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）又はカリケアマイシン等を含む毒素、抗生物質、放射性同位体、核酸分解酵素等の増殖阻害剤又は細胞毒性剤に結合されていてもよい。
【００１９】
更なる態様では、本発明は、癌細胞又は癌組織を有効量のヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストと接触させることを含む、癌の治療方法に関する。具体的な局面では、癌は、前立腺癌（例：腺癌）、胆嚢癌、食道癌、唾液腺癌、胆道癌、胃腸癌、大腸癌、直腸癌、肛門癌、大腸及び直腸の癌、胃癌、小腸の癌、腎臓癌、腎臓関連癌、肝細胞癌、肝癌、肝臓癌、膵癌、泌尿生殖器の癌［子宮頸癌、子宮癌（例：子宮内膜癌）、卵巣癌、外陰部の癌、精巣癌、陰茎の癌、膣癌、尿道癌］である。別の具体的な局面では、癌は、骨格筋又は平滑筋の癌、胃腸の癌、大腸及び直腸の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、下垂体及び鼻咽腔の癌、皮膚癌、黒色腫、多発性骨髄腫、上皮の扁平上皮癌、頭頸部癌である。更なる別の具体的局面では、前記方法は、化学療法剤又はモノクローナル抗体の投与といった、従来からの抗癌治療と組み合される。更に具体的な局面では、前記癌は、神経系の癌である。更に具体的な局面では、癌は、悪性神経膠腫、膠芽腫、髄膜腫、髄芽細胞腫、神経外胚葉性腫瘍及び上衣細胞腫である。更に具体的な局面では、前記癌は、乳房組織と関連する。更なる局面では、癌は、下部腺管癌、下部小葉癌、分泌管内癌、髄様癌及び管状腺癌である。更なる具体的な局面では、前記癌は、肺組織と関連する。更なる局面では、前記癌は、腺癌、気管支肺胞癌、扁平上皮癌、小細胞癌、非小細胞癌及び腹膜癌である。更に具体的な局面では、本発明により治療可能な癌は、原発腫瘍と関連する転移である。
【００２０】
更なる態様では、本発明は、血管新生を阻害すべき細胞又は組織を、有効量のヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストと接触させることを含む、血管新生の阻害方法に関する。具体的な局面では、前記方法は、別の抗血管新生療法と組み合されてもよい。別の具体的な局面では、このような血管新生は、創傷治癒、排卵及び受精後の胞胚の着床の結果として生じる。更に別の具体的な局面では、このような血管新生は、正常な発毛、異所発毛、多毛症、網状瘢痕性紅斑性包毛嚢炎、ケロイド性毛包炎（ｋｅｌｏｉｄ  ｆｏｌｌｉｃｕｌｉｔｉｓ）及び偽性毛嚢炎を含む男性型多毛症又は毛包炎の発症時期に生じる。
【００２１】
更なる態様では、本発明は、未分化幹細胞を、有効量のヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストと接触させることを含む、培養中の未分化幹細胞の増殖、分化又は生存を調節する方法に関する。具体的な局面では、前記方法により、大脳内移植に使用するための最終分化した神経細胞へ幹細胞を分化させることができる。別の具体的な局面では、このような最終分化した神経細胞は、グリア細胞、シュワン細胞、クロム親和細胞、コリン作動性ニューロン、交感ニューロン又は副交感ニューロン、並びにペプチド作動性ニューロン及びセロトニン作動性ニューロンである。更に別の具体的な局面では、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、別の神経栄養因子と組み合わせて用いられる。
【００２２】
更なる態様では、本発明は、神経疾患を患う患者の細胞を、治療上有効量のヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストと接触させることを含む、神経疾患を患う患者の細胞の増殖、分化又は生存を調節する方法に関する。具体的な局面では、神経疾患は、以下の結果として生じる：（ｉ）外傷、化学傷害、血管損傷及び欠乏、脳卒中により生じる乏血、感染性／炎症性及び腫瘍誘導性の損傷を含む急性、亜急性又は慢性の神経系への傷害；（ｉｉ）アルツハイマー病を含む神経系の老化；（ｉｉｉ）パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症及び脊髄小脳変性症を含む神経系の慢性的な神経変性疾患；並びに（ｉｖ）多発性硬化症を含む神経系の又は神経作用性の慢性免疫疾患。
【００２３】
更なる態様では、本発明は、軟骨形成又は骨形成過程にある患者の細胞を、有効量のヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストと接触させることを含む、軟骨形成又は骨形成中の患者の細胞の増殖、分化又は生存を調節する方法に関する。具体的な局面では、軟骨形成又は骨形成は、ジアスロイダルジョイント（ｄｉａｔｈｒｏｉｄａｌ  ｊｏｉｎｔ）若しくは顎関節の軟骨の治療、又は軟骨移植及び人工器官を用いた治療における治療的介入において生じる。別の具体的な局面では、軟骨形成又は骨形成は、骨格組織の欠損における骨形成の治療計画において生じる。
【００２４】
更なる態様では、本発明は、毛髪の再生又は再成長過程にある患者の細胞を、有効量のヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストと接触させることを含む、毛髪の再生又は再成長中の患者の細胞の増殖、分化又は生存を調節する方法に関する。具体的な局面では、増殖、分化又は生存は、化学療法又は放射線療法後に起こる。
【００２５】
更なる態様では、本発明により、肺細胞を、サーファクタント生産を促進するのに有効な量のヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストと接触させることを含む、肺細胞内でのサーファクタント生産の促進方法が提供される。
【００２６】
更なる態様では、本発明により、肺細胞を、ラメラ体（ｌａｍｅｌｌａｔｅｄ  ｂｏｄｙ）形成を促進するのに有効な量のヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのアンタゴニストと接触させることを含む、肺細胞内でのラメラ体形成の促進方法が提供される。具体的な局面では、前記細胞は、早産児の肺組織内に存在する。
【００２７】
更なる態様では、本発明により、ヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２又はＴＴＫのポリペプチドを、標的分子の存在下及び非存在下の両方で前記ヘッジホッグキナーゼポリペプチドと相互作用するヘッジホッグシグナル成分（「キナーゲ基質」）と接触させること、及び標的分子の存在下及び非存在下において、これらの相互作用の進行度を比較することを含む、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストのスクリーニング方法が提供される。具体的な局面では、相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用により測定可能である。別の具体的な局面では、相互作用は、標的、ヘッジホッグキナーゼ又はキナーゼ基質を固体表面に結合させ、ここで、非固相化成分が、更に検出可能な標識を含むことにより、測定可能である。別の具体的な局面では、検出手段は、イムノアッセイ又はラジオアッセイである。更に別の具体的な局面では、標的分子は低分子である。更に具体的な局面では、ヘッジホッグキナーゼポチペプチドは、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２及びＴＴＫポリペプチドから成る群から選択される。
【００２８】
当業者であれば、本明細書を読むことで、本発明の更なる態様を自明なものとして把握するであろう。
【００２９】
発明の詳細な説明
Ｉ．概要
本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達で活性な特定のキナーゼの活性をアンタゴナイズすることにより、ヘッジホッグシグナル伝達により調節されるシグナル伝達経路（例えば、ヘッジホッグ、ｐａｔｃｈｅｄ、ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ｆｕｓｅｄ、ｆｕｓｅｄのサプレッサー等）を、少なくとも部分的に阻害可能であるという発見に関連する。
【００３０】
従って、ここに同定されるヘッジホッグキナーゼアンタゴニストが、ヘッジホッグシグナル伝達活性に干渉し、同様に正常な発達過程にある細胞や異常なヘッジホッグシグナル伝達を特徴とする疾患状態にある細胞といった、ヘッジホッグシグナル伝達の影響下にある細胞又は組織の運命を変更可能なことが具体的に意図されている。より具体的には、このようなヘッジホッグシグナル伝達は、（ｉ）野生型ヘッジホッグシグナル伝達として、又は（ｉｉ）ヘッジホッグ経路の活性化過剰の結果として生じる場合がある。ヘッジホッグ経路の活性化過剰により生じる疾患は、ヘッジホッグシグナル伝達構成成分に生じる変異又はヘッジホッグシグナル伝達構成成分の変異若しくは損傷の結果ではない不適切な活性化若しくは刺激が原因であると考えられる。従って、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを用いた治療が効果的にターゲットとなり得るように、ヘッジホッグ経路が過剰に活性化された細胞を同定する方法を有することが望ましい。当業者であれば、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストが、ヘッジホッグシグナル伝達の活性化過剰を特徴とする状態又は疾患の治療、並びにヘッジホッグ濃度の抑制により発生中の細胞の運命を変更することに適していることを直ちに理解するであろう。
【００３１】
ＩＩ．定義
「ヘッジホッグキナーゼポリペプチドＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫ」、又は「ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫポリペプチド」には、下記に示すように「ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫ天然配列ヘッジホッグキナーゼポリペプチド」及び「ヘッジホッグキナーゼポリペプチドＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫの変異体」が含まれる。
【００３２】
「天然配列のヘッジホッグキナーゼポリペプチドＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫ」は、天然由来の対応するヘッジホッグキナーゼポリペプチドＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。このような天然配列のヘッジホッグキナーゼポリペプチドは、自然界から単離可能であるか、又は遺伝子組換え手段若しくは合成手段により作製可能である。「天然配列のヘッジホッグキナーゼポリペプチドＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫ」という用語は、特に、このポリペプチドの天然の切断型、天然の変異型（例えば、選択的スプライシングを受けた型）及び天然の対立遺伝子多型を包含する。１の具体的な局面では、ここに開示する天然配列を有するヘッジホッグキナーゼポリペプチドは、図１及び３に示す配列に相当する成熟した又は完全長の天然配列を有するポリペプチドである。この配列は、本明細書において、一般的名称ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫによって具体的に参照され、マウス配列は、ＤＮＡ１８９８５６、ＤＮＡ２４５２６２、ＤＮＡ２４３２３８、ＤＮＡ３９５９１７と参照され、ヒト配列は、ＤＮＡ３７０６５２、ＤＮＡ３６４９８１、ＤＮＡ２６９８７８、ＤＮＡ３８０４３４と参照される。
【００３３】
「ヘッジホッグキナーゼポリペプチドＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫの変異体」は、好ましくは、本明細書に定義するこれらポリペプチドの活性型にあり、本明細書に定義する完全長天然配列ヘッジホッグキナーゼポリペプチドの配列及びシグナルペプチド、完全長天然配列のヘッジホッグキナーゼ活性と共通する断片、若しくはここに参照する完全長天然配列ヘッジホッグキナーゼポリペプチドのいずれかの別の断片を欠く変異型と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するヘッジホッグキナーゼポリペプチドＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫを意味する。このような変異体ポリペプチドには、例えば、完全長天然アミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端において、１又は２個以上のアミノ酸残基が付加されるか又は欠失したポリペプチドが含まれる。具体的な局面では、このような変異体ポリペプチドは、本明細書に定義する完全長天然配列ヘッジホッグキナーゼポリペプチドの配列及びシグナルペプチド、完全長天然配列のヘッジホッグキナーゼ活性と共通する断片、若しくはここに参照する完全長天然配列ヘッジホッグキナーゼポリペプチドのいずれかの別の断片を欠く変異型と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有し、これに代わる場合には、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する。具体的な局面では、このような変異体ポリペプチドは、対応する天然配列ポリペプチドと、その長さにおいて少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００以上のアミノ酸残基が異なる。これとは別に、このような変異体ポリペプチドは、天然ポリペプチド配列との比較において１個以下の保存的アミノ酸置換を有し、これに代わる場合には、対応する天然ポリペプチド配列との比較において２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個以下の保存的アミノ酸置換を有する。
【００３４】
ここに同定されるヘッジホッグキナーゼポリペプチド配列ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫに関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」とは、配列をアラインメントして必要であればギャップを導入して最大の配列同一性パーセンテージを達成した後に、配列同一性の一部として保存的置換を考慮しない場合の、特定のヘッジホッグキナーゼポリペプチド配列ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫのアミノ酸残基と同一な候補配列のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的機関から入手可能なコンピューターソフトウェアを用いて、当該技術分野の種々の方法により達成可能である。当業者であれば、比較される完全長配列に対する最大アラインメントを達成するのに必要なアルゴリズムを含む、アラインメント測定のための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、この目的において、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較用コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られるが、ＡＬＩＧＮ−２プログラムを提供するための完全なソースコードについては、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社が著作権を有しており、このコードは、米国著作権局（ワシントンＤ．Ｃ．、２０５５９）に利用者文書と共に申請され、米国著作権登録番号第ＴＸＵ５１００８７号として登録されている。よって、ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社（サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）を通じて公的に入手可能となっている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）  Ｖ４．０Ｄ上での使用のためにコンパイルする必要がある。全ての配列比較用パラメーターが、ＡＬＩＧＮ−２プログラムに設定されており、変更はできない。
【００３５】
「ヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫの変異体ポリヌクレオチド」又は「ヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫの変異体核酸配列」は、好ましくは、本明細書に定義するこれらポリペプチドの活性型のヘッジホッグキナーゼポリペプチドをコードし、本明細書に定義する完全長天然配列ヘッジホッグキナーゼポリペプチド配列、又は本明細書に定義する個々の完全長ヘッジホッグキナーゼポリペプチド配列の別の断片のいずれか（完全長ヘッジホッグキナーゼポリペプチドの完全コーディング配列の一部分のみを表す核酸にコードされる断片等）をコードするヌクレオチド酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子を意味する。通常、このような変異体ポリヌクレオチドは、本明細書に定義する個々の完全長天然配列ヘッジホッグキナーゼポリペプチド配列、又は個々の完全長ヘッジホッグキナーゼポリペプチド配列の別の断片のいずれかをコードする核酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有し、これに代わる場合には、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の核酸配列同一性を有する。天然ヌクレオチド配列は、このような変異体ポリヌクレオチドに包含されない。
【００３６】
通常は、このような変異体ポリヌクレオチドは、対応する天然配列ポリペプチドと、その長さにおいて少なくとも約５０ヌクレオチド異なっており、これに代わる場合は、変異体は、その長さにおいて、少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０又は１０００ヌクレオチド異なる。ここで、「約」という用語は、参照したヌクレオチドの配列に、この参照配列の１０％の長さをプラスマイナスしたものを意味する。
【００３７】
ここに同定されるヘッジホッグキナーゼポリペプチドＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫをコードする核酸配列に関する「核酸配列同一性パーセント（％）」とは、配列をアラインメントして必要であればギャップを導入して最大の配列同意性パーセンテージを達成した後に、目的のヘッジホッグキナーゼ核酸配列のヌクレオチドと同一な候補配列のヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。核酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的機関から入手可能なコンピューターソフトウェアを用いて、当該技術分野の種々の方法により達成可能である。しかしながら、この目的において、核酸配列同一性％の値は、配列比較用コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られるが、ＡＬＩＧＮ−２プログラムを提供するための完全なソースコードについては、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社が著作権を有しており、このコードは、米国著作権局（ワシントンＤ．Ｃ．、２０５５９）に利用者文書と共に申請され、米国著作権登録番号第ＴＸＵ５１００８７号として登録されている。よって、ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社（サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）を通じて公的に入手可能となっている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）  Ｖ４．０Ｄ上での使用のためにコンパイルする必要がある。全ての配列比較用パラメーターが、ＡＬＩＧＮ−２プログラムに設定されており、変更はできない。
【００３８】
核酸配列比較のためにＡＬＩＧＮ−２を用いる場合、任意の核酸配列Ｄへの、Ｄとの、若しくはＤに対する任意の核酸配列Ｃの核酸配列同一性％（別の表現では、任意の核酸配列Ｄへの、Ｄとの、若しくはＤに対して一定の核酸配列同一性％を有する又は含む任意の核酸配列Ｃと表わすこともできる）は、以下：
１００ｘフラクションＷ／Ｚ
のように計算される。
【００３９】
ここで、Ｗは、配列アラインメント用プログラムＡＬＩＧＮ−２により、このプラグラムのＣとＤのアラインメントにおいて同一のものとしてマッチングしたヌクレオチドのスコアの数であり、Ｚは、Ｄの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｃの長さに等しくない場合、Ｄに対するＣの核酸配列同一性％は、Ｃに対するＤの核酸配列同一性％と同じではなくなることを理解すべきである。核酸配列同一性％の計算の例として、表３と表４に、「参照ＤＮＡ（ＲＥＦ−ＤＮＡ）」と定義される核酸配列に対する、「比較ＤＮＡ（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ＤＮＡ）」と定義される核酸配列の核酸配列同一性％の計算方法が示されている。ここで、「参照ＤＮＡ」は、仮想上の目的ヘッジホッグキナーゼをコードする核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」は、目的の「参照ＤＮＡ」核酸分子と比較する対象となる核酸分子のヌクレオチド配列を表し、「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」のそれぞれは、別の仮想上のヌクレオチドを表す。他に具体的に記載されない限り、本明細書で用いる全ての核酸配列同一性％の値は、直ぐ上段のＡＬＩＧＮ−２コンピュータープログラムの使用において記載されるように得られる。
【００４０】
別の態様では、ヘッジホッグキナーゼ変異体ポリヌクレオチドは、ヘッジホッグキナーゼポリペプチドをコードする核酸分子であり、本明細書に定義する完全長ヘッジホッグキナーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件下で、ハイブリダイズすることができる。そのようは変異体ポリペプチドは、このような変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
【００４１】
「単離された」とは、本明細書に開示する種々のヘッジホッグキナーゼポリペプチドを記載する際に用いられる場合、そのポリペプチドの自然環境の構成成分から、同定され、分離及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境から混入した構成成分は、典型的には、ポリペプチドの診断又は治療用途に干渉する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質を含む場合がある。好ましい態様では、このようなポリペプチドは、（１）スピニングカップアミノ酸配列分析装置の使用により、Ｎ末端側又は内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度、又は（２）クマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた非還元的若しくは還元的条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで一様になる程度に、精製されることになる。その自然環境に由来するヘッジホッグキナーゼポリペプチドの少なくとも１の成分は存在しないことから、このようにして単離されたポリペプチドには、組換え細胞内にインサイチュで存在する対応ポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、このように単離されたポリペプチドは、少なくとも１段階の精製工程により調製されることになる。
【００４２】
「ヘッジホッグ」又は「ヘッジホッグポリペプチド」（Ｈｈ）という用語は、本明細書で用いられる場合、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのヘッジホッグのあらゆる哺乳動物ホモログ、即ち、ソニックヘッジホッグ（ｓＨｈ）、デザートヘッジホッグ（ｄＨｈ）又はインディアンヘッジホッグ（ＩＨｈ）のいずれかを一般名称として示す。この用語を用いてタンパク質又は核酸を記載する場合もある。
【００４３】
本明細書で用いる「ヘッジホッグシグナル経路」、「ヘッジホッグ経路」及び「ヘッジホッグシグナル伝達経路」という用語は、ヘッジホッグ及びそのレセプター（例えば、ｐａｔｃｈｅｄ、ｐａｔｃｈｅｄ−２）により媒介されるシグナルカスケード、及び遺伝子発現の変化や他のヘッジホッグ活性に典型的な表現型の変化を生じさせるものを、互換性をもって参照する。ヘッジホッグが存在しない場合であっても、下流の構成成分の活性化によってヘッジホッグ経路が活性化される場合がある（例えば、ヘッジホッグの不存在下であっても、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄの過剰発現又はＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ若しくはＰａｔｃｈｅｄの変異体のトランスフェクションにより、ヘッジホッグシグナルが恒常的に活性化される）。転写因子のＧｌｉファミリーは、しばしばヘッジホッグ経路活性化のマーカー又は指標として用いられる。
【００４４】
「Ｈｈシグナル構成成分」という用語は、Ｈｈシグナル経路に関与する遺伝子産物を指す。Ｈｈシグナル構成成分は、多くの場合、細胞又は組織内でのＨｈシグナルの伝達に有形的又は実質的に作用し、これによって下流遺伝子の発現レベル及び／又はヘッジホッグ経路の活性化と関連する他の表現径の変化に影響を及ぼす。
【００４５】
各Ｈｈシグナル構成成分は、その生物学的機能及び下流遺伝子の活性化又は発現の最終的な結果の作用にもよるが、正又は負の調節因子のいずれかに分類できる。正の調節因子は、Ｈｈシグナル伝達に性に作用する、即ち、Ｈｈが存在する場合に下流の生命現象を促進するＨｈシグナル構成成分である。負の調節因子は、Ｈｈシグナル伝達に負に作用する、即ち、Ｈｈが存在する場合に下流の生命現象を阻害するＨｈシグナル構成成分である。
【００４６】
「ヘッジホッグの機能獲得」という用語は、例えば、ヘッジホッグ経路の異常な活性化等、細胞をヘッジホッグタンパク質と接触させることに似た表現型を生じさせることになる、ヘッジホッグシグナル構成成分（例えば、ｐｔｃｈ、Ｓｍｏ、Ｆｕｓｅｄ、Ｓｕ（ｆｕ）、Ｃｏｓ−２等）の異常な修飾若しくは変異、又はこれらの遺伝子の発現レベルの低下（又は喪失）を指す。機能獲得には、ｐｔｃｈ遺伝子産物の転写活性化因子Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２及び／又はＧｌｉ３の発現レベルを調節する能力の喪失が含まれる場合がある。「ヘッジホッグの機能獲得」という用語は、これに限定される訳ではないが、ヘッジホッグ自体の修飾又は変異を含む、ヘッジホッグシグナル伝達経路のあらゆる時点での変更により生じる、類似の細胞表現型のいずれか（例えば、過剰な増殖を示す等）を指すものとして用いられることもある。例えば、ヘッジホッグシグナル経路の活性化に対して異常に高い増殖速度を示す腫瘍細胞は、ヘッジホッグがその細胞内で変異を有していない場合であっても、「ヘッジホッグの機能獲得」表現型を有することになる。
【００４７】
「単離された」ヘッジホッグキナーゼポリペプチドをコードする核酸は、同定され、そして、このポリペプチドをコードする核酸の天然供給源と通常関連する少なくとも１つの付随する核酸分子から分離された核酸分子である。上記の単離された核酸分子のいずれも、この核酸分子が見出された天然状態での形態又は環境とは異なる状態にある。従って、このような核酸分子のいずれも、天然の細胞内に存在する状態の特定のポリペプチドをコードする核酸分子とは異なっている。
【００４８】
「調節配列」という用語は、特定の宿主生命体内での機能的に連結されたコーディング配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適した調節配列には、例えば、プロモーター、随意に、オペレーター配列、及びリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００４９】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係を持つように配置された場合に「機能的に連結される」ことになる。例えば、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列用のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合に、ポリペプチド用のＤＮＡと機能的に連結されていることになる；プロモーター又はエンハンサーは、コーディング配列の転写に作用する場合に、コーディング配列と機能的に連結されていることになる；又はリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合に、コーディング配列と機能的に連結されていることになる。一般的に、「機能的に連結している」とは、連結されるＤＮＡ配列が、隣接しており、分泌リーダー配列の場合には、隣接し、かつ翻訳可能な位相にある。しかしながら、エンハンサーは、隣接している必要はない。都合のよい制限部位にライゲーションすることで連結させることができる。このような制限部位が存在しない場合には、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドのアダプター又はリンカーが用いられる。
【００５０】
当業者であれば、ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」は、直ちに決定可能であり、一般的に、プローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に応じて経験に基づいて計算される。一般的に、より長いプローブでは、適切なアニーリングのためにより高い温度を要するが、より短いプローブでは、より低い温度を要する。ハイブリダイゼーションは、一般的に、変性ＤＮＡが、環境に相補鎖が存在する場合に、その融解温度を下回る温度で、再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間に高い相同性が所望される場合には、相対的に高い温度を用いることができる。結果として、より高い相対温度では、反応条件がよりストリンジェントなものとなり、より低い温度では、よりストリンジェントではなくなることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーについての更なる詳細と説明については、以下を参照：Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）。
【００５１】
本明細書に定義する「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェンシーの高い条件」とは、以下のものとして同定できる：（１）洗浄に低イオン強度と高温を用いること、例えば、５０℃での０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム；（２）ハイブリダイゼーション中に、ホルムアミド等の変性剤を用いること、例えば、４２℃での０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／５ＯｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ６．５）を含む５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム；又は（３）４２℃で、５０％のホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ  ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、及び１０％の硫酸デキストランを用いる溶液中での一晩のハイブリダイゼーション；（１）−（３）のそれぞれの後に、４２℃での０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の１０分間の第１回目洗浄、次いで、５５℃でのＥＤＴＡ含有０．１  ｘ  ＳＳＣから成る１０分間の高ストリンジェンシー洗浄を行う。
【００５２】
「中程度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されるように確認でき、上記の条件よりもストリンジェンシーの低い洗浄溶液とハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及びＳＤＳ％）の使用が含まれる。中程度にストリンジェントな条件の例としては、３７℃で、２０％のホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での一晩のインキュベーション、次いで、約３７−５０℃で、１ｘＳＳＣ中でのフィルターの洗浄が挙げられる。当業者であれば、プローブ長等の要素を適応させるために必要な、温度、イオン強度等を調製する方法を理解するであろう。
【００５３】
「エピトープでタグ化される」という用語は、本明細書で用いた場合、「タグポリペプチド」と融合したヘッジホッグキナーゼポリペプチド又はヘッジホッグキナーゼ結合剤を含むキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、抗体を作製可能なエピトープを提供できる程度に十分な残基数を有するが、融合するポリペプチドの活性に干渉しない程度に短いものとなる。タグポリペプチドは、このような抗体が他のエピトープと実質的に交差反応を起こさないように、十分に独特なものであることが好ましい。適切なタグポリペプチドは、一般的に、少なくとも６アミノ酸残基を有し、通常は、約８ないし５０アミノ酸残基（好ましくは、約１０ないし２０アミノ酸残基）を有する。
【００５４】
「活性を示す」又は「活性」は、本発明の目的においては、自然な又は天然のヘッジホッグキナーゼポリペプチドの生物活性及び／又は免疫活性を保持するヘッジホッグキナーゼポリペプチドの形態を指し、この場合、「生物」活性は、自然な又は天然のヘッジホッグキナーゼポリペプチドが有する抗原性エピトープに対する抗体の生産を促進する能力以外の、自然な又は天然のヘッジホッグキナーゼが生じる生物学的機能（阻害性又は促進性のいずれでもよい）を指し、「免疫」活性は、自然な又は天然のヘッジホッグキナーゼポリペプチドが有する抗原性エピトープに対する抗体の生産を促進する能力を指す。本明細書で用いる活性なヘッジホッグキナーゼポリペプチドは、神経膠腫において、神経膠腫を患っていない類似組織での発現と比べて、定性的又は定量的観点のいずれかにおいて、差次的に発現される抗原である。
【００５５】
「治療する」若しくは「治療」又は「緩和」は、両方とも治療的及び予防的又は防止的指標を指し、この場合、その目的は、疾患の進行を防止するか又は遅延（低下）させることにある。「診断する」とは、疾患又は腫瘍に特有の特徴を同定又は決定するプロセスを指す。診断プロセスは、病状又は疾患進行に応じて、病期分類又は腫瘍分類として表現される場合もある。
【００５６】
治療又は診断を要する対象には、既にヘッジホッグシグナル伝達に異常をきたした対象、並びにヘッジホッグシグナル伝達に異常をきたし易い対象又はヘッジホッグシグナル伝達異常を防止すべき対象が含まれる。対象又は哺乳動物は、本発明の方法に従って、治療用量のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを受容した後に、その患者が、以下の１つ以上に当てはまる観察及び／又は測定可能な低下又は不存在を示した場合に、ヘッジホッグシグナル伝達異常について「治療」が成功したことになる：腫瘍細胞数の減少又はこのような細胞の不存在；腫瘍サイズの低下；軟かい組織及び骨への癌の進展を含む、周辺器官への腫瘍細胞の浸潤の阻害（即ち、一定の範囲で遅延させることであり、好ましくは止めること）；腫瘍の転移の阻害（即ち、一定の範囲で遅延させることであり、好ましくは止めること）；腫瘍増殖の、一定の範囲での、阻害；及び／又は特定の癌に関連する１又は２種類以上の症状の、一定の範囲での軽減；病的状態及び死亡率を低下させて、クオリティオブライフの問題を改善すること。このようなヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、既存の癌細胞の増殖を防ぎ、そして／又は死滅できる程度において、細胞増殖抑制性及び／又は細胞毒性を示すものであってもよい。これらの兆候又は症状の軽減は、患者が感じ取れる場合もある。
【００５７】
治療の成功と疾患の改善を評価する上記のパラメーターは、医師になじみのあるルーチンな方法により直ちに測定可能である。癌治療の場合、効果は、例えば、無増悪期間（ｔｉｍｅ  ｔｏ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ：ＴＴＰ）の評価及び／又は奏功率（ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｒａｔｅ：ＲＲ）の測定により、評価できる。転移の場合は、病期分類とカルシウムレベル及び転移の範囲を測定するための他の酵素の試験とによって決定できる。ＣＴスキャンを行って、腫瘍又は癌の外側の領域の広がりを探ることもできる。予測、診断及び／又は治療のプロセスに関連する本明細書に記載の発明は、ヘッジホッグキナーゼの測定及び評価、並びにヘッジホッグの増幅及び発現を伴う。
【００５８】
癌の治療、症状の緩和又は診断の目的のための「哺乳動物」とは、哺乳動物に分類されるあらゆる動物を指し、ヒト、家畜動物及び牧羊動物、及び動物園の動物、スポーツ用動物又はペット動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、フェレット等が含まれる。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
【００５９】
１又は２種類以上の更なる治療剤との「組み合わせ」の投与には、同時（併用）の投与及びあらゆる順番での連続した投与が含まれる。
【００６０】
本明細書で用いる「担体」には、医薬的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤が含まれ、これらは、使用する用量と濃度においてこれらに曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性なものである。多くの場合、生理学的に許容可能な担体は、水性のｐＨ緩衝能を持つ溶液である。生理学的に許容可能な担体の例には、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルミン、ゼラチン、又はイムノグロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖、二糖及び他の糖質；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成用対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）等の非イオン性界面活性剤が含まれる。
【００６１】
「固相」又は「固相支持体」とは、ヘッジホッグキナーゼポリペプチド又は本発明のヘッジホッグキナーゼポリペプチドが接着又は結合可能な、非水性マトリックスを意味する。ここに包含される固相の例には、ガラス（例えば、コントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ））、多糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコンで部分的に又は全体的に構成される固相が含まれる。特定の態様では、状況にもよるが、固相は、アッセイ用プレート；別の場合には、精製用カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）の壁面を含んでいてもよい。また、この用語には、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されるような、分離した粒子からなる不連続な固相も含まれる。
【００６２】
「リポソーム」は、種々の脂質、リン脂質及び／又はサーファクタントから構成される小胞であり、薬物（ヘッジホッグキナーゼアンタゴニスト等）を哺乳動物に送達するのに有用である。リポソームの成分は、通常、２重層構造に配置されており、生体膜の脂質配置と類似している。
【００６３】
本明細書に定義する「低分子」又は「有機低分子」は、約５００ダルトン未満の分子量を有する。
【００６４】
ヘッジホッグキナーゼアンタゴニスト薬剤の「有効量」とは、ヘッジホッグシグナル伝達が活性な細胞内のヘッジホッグシグナル伝達を部分的又は全体的に阻害するのに十分な量をいう。これに代わる場合、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの有効量とは、ヘッジホッグを発現又は過剰発現している細胞の増殖率及び／又は生存率を低下させるのに十分な量である。「有効量」は、その目的において、経験的かつルーチン的に決定することができる。「治療上有効量」という用語は、対象又は哺乳動物内の疾患又は障害を「治療する」ために効果的なヘッジホッグキナーゼアンタゴニスト又は他の薬物を指す。ヘッジホッグシグナル伝達の場合、治療上有効量の薬物は、ヘッジホッグシグナル伝達の異常を正常な生理学的レベルにまで低下させるか又は回復させ；腫瘍サイズを低下させ；周辺組織又は器官への腫瘍細胞の浸潤を阻害し（即ち、一定の範囲で遅延させ、好ましくは止める）；腫瘍の転移を阻害し（即ち、一定の範囲で遅延させ、好ましくは止める）；腫瘍増殖を、一定の範囲で阻害し；そして／又は腫瘍又は癌に関連する１又は２種類以上の症状を一定の範囲で軽減させる。本明細書の「治療する」の定義を参照。このようなヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、既存の癌細胞の増殖を防ぎ、そして／又は死滅できる程度において、細胞増殖抑制性及び／又は細胞毒性を示すものであってもよい。
【００６５】
ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの「増殖阻害量」とは、細胞、特に癌細胞等の腫瘍の増殖を、インビトロ又はインビボのいずれかにおいて阻害可能な量である。腫瘍細胞の増殖を阻害する目的において、このような量は、経験に基づいてルーチン的に決定することができる。
【００６６】
ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの「細胞毒性量」とは、細胞、特に癌細胞等の腫瘍細胞の破壊を、インビトロ又はインビボのいずれかにおいて、細胞の破壊を生じさせることが可能な量をいう。腫瘍細胞の増殖を阻害する目的において、このような量は、経験に基づいてルーチン的に決定することができる。
【００６７】
「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられ、具体的には、例えば、抗ヘッジホッグキナーゼポリペプチドモノクローナル抗体（アンタゴニストと中和抗体を含む）、多重エピトープ（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）特異性を示す抗ヘッジホッグキナーゼポリペプチド抗体組成物、ポリクローナル抗体、１本鎖抗ヘッジホッグキナーゼ抗体、多重特異性抗体（例えば、２重特異性抗体）、及び所望の生物活性又は免疫活性を示す限りにおける、上記に列挙する全ての抗体の抗原結合断片（下記参照）が含まれる。「イムノグロブリン」（Ｉｇ）という用語は、ここにいう抗体と互換性をもって用いられる。
【００６８】
「単離された」抗体は、その抗体の自然環境の構成成分から、同定され、分離及び／又は回収された抗体を意味する。その自然環境から混入した構成成分は、その抗体の診断又は治療用途に干渉する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質を含む場合がある。好ましい態様では、このような抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法による測定で、抗体の９５重量％を超え、最も好ましくは９９重量％を超える程度、（２）スピニングカップアミノ酸配列分析装置の使用により、Ｎ末端側又は内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度、又は（３）クマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた非還元的若しくは還元的条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで一様になる程度に、精製されることになる。抗体の自然環境の少なくとも１の成分は存在しないことから、単離された抗体には、組換え細胞内にインサイチュで存在する抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は、少なくとも１段階の精製工程により調製されることになる。
【００６９】
本明細書で用いる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に一様な抗体の集団に由来する抗体を指し、即ち、集団を構成する個々の抗体が、同一であり、そして／又は同一のエピトープに結合するが、例外的に、モノクローナル抗体の製造過程において変異体が生じる可能性があり、このような変異体は、一般的に、少量で存在するに過ぎない。このようなモノクローナル抗体には、典型的に、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体が含まれ、この場合、標的結合ポリペプチド配列は、複数種類のポリペプチド配列からの単一標的に結合するポリペプチド配列の選択を含むプロセスにより入手された。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に一様な抗体の集団から得られたという抗体の特徴を表すものであり、特定の方法による抗体の製造を要するものと解釈されるものではない。
【００７０】
「キメラ」抗体（イムノグロブリン）は、所望の生物活性を示す限りにおいて、特定の種に由来する抗体又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同的な重鎖及び／又は軽鎖の一部を有しており、これらの鎖の残りの部分は、別の種に由来する抗体又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同的であり、またこのような抗体の断片も同様である（米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書で用いるヒト化抗体は、キメラ抗体のサブセットである。
【００７１】
非ヒト（例えば、マウス）由来の抗体の「ヒト化」型は、非ヒトイムノグロブリンに由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。殆どの部分において、ヒト化抗体は、ヒトイムノグロブリン（レシピエント又はアクセプター抗体）であるが、レシピエントの超可変領域の残基が、所望の特異性、親和性及び性能を有する、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト類人猿等の非ヒト種に由来する超可変領域の残基（ドナー抗体）によって置換されたヒトイムノグロブリンをいう。場合によっては、ヒトイムノグロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が、対応する非ヒト由来の残基で置換される。更にまた、ヒト化抗体には、レシピエント抗体又はドナー抗体に見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾を施すことによって、結合親和性等の抗体の性能が更に洗練される。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、これら可変領域では、非ヒトイムノグロブリンの超可変ループに対応する超可変ループの全部若しくは実質的に全部、及びＦＲ領域の全部若しくは実質的に全部が、ヒトイムノグロブリンのものであるが、ＦＲ領域には、結合親和性を向上させる１又は２つ以上のアミノ酸置換が含まれていてもよい。ＦＲ内でのこれらアミノ酸置換の数は、典型的には、Ｈ鎖で６個以下、そしてＬ鎖で３個以下となる。ヒト化抗体には、随意に、イムノグロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部が含まれていてもよく、これは典型的には、ヒトイムノグロブリンの定常領域である。更なる詳細については、以下を参照：Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）。
【００７２】
「抗体断片」は、完全な抗体の一部分、好ましくは、完全な抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2及びＦｖ断片；ジアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）；線抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］）；１本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００７３】
抗体のパパイン処理により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と残りの「Ｆｃ」断片（この名称は、直ちに結晶化する能力を反映している）が生み出される。Ｆａｂ断片は、全Ｌ鎖並びにＨ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）及び１の重鎖の第１定常ドメイン（ＣH１）から成る。各Ｆａｂ断片は、抗原結合という点において１価である、即ち、単一の抗原結合部位しか持たない。抗体のペプシン処理により、２価の抗原結合活性を有し、抗原との結合能を維持する、ジスルフィド結合で連結された２つのＦａｂ断片におおよそ対応する、単一の巨大なＦ（ａｂ’）2断片が生じる。Ｆａｂ’断片は、ＣH１領域のカルボキシ末端に、抗体のヒンジ領域に由来する１又は２つ以上のシステインを含む、追加的な２、３個の残基を有する点においてＦａｂ断片と異なっている。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を保持するＦａｂ’の称呼である。Ｆ（ａｂ’）2抗体断片は、もともとは、断片間にヒンジ部のシステインを有するＦａｂ’断片のペアとして作製された。抗体断片の化学的カップリングについては、他の方法も知られている。
【００７４】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識結合部位を含む最小の抗体断片である。この断片は、１の重鎖可変領域ドメインと１の軽鎖可変領域ドメインが、非共有結合によって強固に結合した２量体から成る。「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」の略称も持つ「１本鎖Ｆｖ」は、１本のポリペプチド鎖に連結されたＶH抗体ドメインとＶL抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶHドメインとＶLドメイン間に、ｓＦｖが抗原結合のために望ましい構造を取ることを可能にするポリペプチドリンカーを更に含む。ｓＦｖの総論については、以下を参照：Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  １９９５、下記。
【００７５】
「ヘッジホッグキナーゼアンタゴニスト」という用語には、ヘッジホッグシグナル伝達を弱めることを含む、本明細書に開示するヘッジホッグキナーゼポリペプチドＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫの生物活性を部分的若しくは完全にブロックするか、阻害するか、又は中和するあらゆる分子が含まれる。例としては、ヘッジホッグリガンド（例えば、Ｓｈｈ、Ｄｈｈ、Ｉｈｈ）が、ヘッジホッグレセプター（例えば、ｐｔｃｈ−１、ｐｔｃｈ−２、Ｓｍｏ）への結合によりヘッジホッグシグナル伝達を促進する能力をブロックすること、又はＧｌｉ転写因子若しくはヘッジホッグシグナル伝達経路の他の下流成分へのシグナルの伝達からＳｍｏをブロックすることが含まれる。適切なアンタゴニスト分子には、特に、アンタゴニスト抗体又はアンタゴニスト抗体断片、天然ヘッジホッグキナーゼポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、有機低分子、ＲＮＡｉ分子、ＲＮＡｉコンストラクト等が含まれる。特定の態様では、「ヘッジホッグキナーゼアンタゴニスト」は、ヘッジホッグキナーゼＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫに対するものである（例えば、抗ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫ抗体、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫ結合性オリゴペプチド、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫ用ＲＮＡｉ分子及びＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫ低分子）。ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの同定方法には、ポリペプチドを発現する細胞を含むこのようなポリペプチドを、このポリペプチドを発現する細胞を、アゴニスト候補又はアンタゴニスト分子と接触させることと、正常状態においてこのようなポリペプチドと関連する１又は２つ以上の生物活性の検出可能な変化を測定することが含まれていてもよい。
【００７６】
「ＲＮＡ干渉」又はＲＮＡｉは、１０ないし５０ヌクレオチドの長さを有するＲＮＡであり、鎖の一部分が十分な相補性を示す（例えば、標的遺伝子に対して少なくとも８０％の同一性を示す）標的遺伝子の発現を低下させる。ＲＮＡ干渉の方法は、転写後段階（例えば、翻訳）で生じる遺伝子発現の標的特異的な抑制（即ち、「ジーンサイレンシング」）を指し、Ｐ．Ｄ．Ｚａｍｏｒｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：１２６５（２００２）ａｎｄ  Ｈａｎｎａｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ４３１：３７１−３７８（２００４）に記載されるような、ＲＮＡ媒介性の遺伝子発現阻害の全ての転写後機構及び転写機構を含む。本明細書で用いる場合、ＲＮＡｉは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び／又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の形態の場合がある。
【００７７】
このようなＲＮＡｉ分子は、多くの場合、分離した相補的ＲＮＡ鎖又は部分的に相補的なＲＮＡ鎖の形態で発現される場合のある２本鎖ＲＮＡ複合体である。２本鎖ＲＮＡ複合体の設計方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、適切なｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡの設計と合成については、Ｓａｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３９：２１５−２２４（２００５）に見出すことができる。
【００７８】
「ＲＮＡコーディング領域」とは、２本鎖ＲＮＡ複合体等のＲＮＡ分子の合成において鋳型として機能可能な核酸である。好ましくは、ＲＮＡコーディング領域は、ＤＮＡ配列である。
【００７９】
「低分子干渉ＲＮＡ」又はｓｉＲＮＡは、１０ないし５０ヌクレオチドの長さを有する２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、第１鎖の一部分が十分な相補性を示す（例えば、標的遺伝子に対して少なくとも８０％の同一性を示す）標的遺伝子の発現を低下させる。ｓｉＲＮＡは、インターフェロン合成の増加、非特異的なタンパク質合成阻害及びしばしば、哺乳動物細胞内でのＲＮＡｉの使用と関連する細胞の自殺又は死滅を引き起こすＲＮＡ分解により特徴付けられる抗ウイルス反応を特に回避するように設計される。Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９（３）：１４４３−８．（２００２）。
【００８０】
「ヘアピン」という用語は、７−２０ヌクレオチドから成るループ型ＲＮＡ構造を指す。
【００８１】
「短鎖ヘアピンＲＮＡ」又はｓｈＲＮＡは、１０ないし５０ヌクレオチドの長さを有する１本鎖ＲＮＡであり、ＲＮＡ鎖の一部分が十分な相補性を示す（例えば、標的遺伝子に対して少なくとも８０％の同一性を示す）標的遺伝子の発現を低下させるヘアピンターンにより特徴付けられる。
【００８２】
「ステム−ループ」という用語は、短い非ペア形成型のループを末端に持つダブルへリックスを形成して、ロリポップ型（ｌｏｌｌｉｐｏｐ−ｓｈａｐｅｄ）構造を生じさせる、同一分子内の塩基対から成る２領域間のペア形成を指す。
【００８３】
「マイクロＲＮＡ」（従前はｓｔＲＮＡとして知られていた）は、約１０ないし７０ヌクレオチドの１本鎖ＲＮＡであり、最初に「ステム−ループ」構造を特徴とするｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとして転写され、次いで、ＲＮＡ誘導性スライシング複合体（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＲＩＳＣ）を通じた更なるプロセス後に成熟したｍｉＲＮＡへプロセッシングされる。
【００８４】
「ヘッジホッグキナーゼ結合オリゴペプチド」は、好ましくは、本明細書に記載するレセプター、リガンド又はシグナル構成成分をそれぞれ含む、ヘッジホッグキナーゼポリペプチドに好ましくは特異的に結合するオリゴペプチドである。このようなオリゴペプチドは、公知のオリゴペプチド合成方法によって化学的に合成可能であるか、又は遺伝子組み換え技術により調製及び精製可能である。このようなオリゴペプチドは、通常、少なくとも約５アミノ酸の長さを有し、これに代わる場合には、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００アミノ酸以上の長さを有する。このようなオリゴペプチドは、よく知られる技術を用いて、過度の実験を行うことなく同定できる。この点において、オリゴペプチドライブラリーからポリペプチド標的に特異的に結合可能なオリゴペプチドをスクリーニングする技術が、当該技術分野においてよく知られていることは、特筆すべきことである（例として以下を参照：米国特許第５，５５６，７６２号、同第５，７５０，３７３号、同第４，７０８，８７１号、同第４，８３３，０９２号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６８９号、同第５，６６３，１４３号；国際公開公報ＷＯ  ８４／０３５０６及び同ＷＯ８４／０３５６４；Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．．８１：３９９８−４００２（１９８４）；Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：１７８−１８２（１９８５）；Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．１３０−１４９（１９８６）；Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．．１０２：２５９−２７４（１９８７）；Ｓｃｈｏｏｆｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．．１４０：６１１−６１６（１９８８），Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８（１９９０）；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２（１９９１）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４（１９９１）；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８３６３（１９９１），及びＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２：６６８（１９９１））。
【００８５】
例えば、ヘッジホッグキナーゼ等の、対象となる標的抗原に「結合する」ヘッジホッグキナーゼアンタゴニスト（例えば、オリゴペプチド、ＲＮＡｉ分子、又は低分子）は、十分な親和性をもって標的に結合することから、抗原を発現する細胞又は組織のターゲッティングにおける診断薬剤、予後薬剤及び／又は治療薬剤として有用であり、他のタンパク質と有意に交差反応を起こすことがない。不所望のマーカーポリペプチドへの結合の程度は、蛍光活性セルソーティング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）解析又は放射性免疫沈降法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ：ＲＩＡ）等の通常の技術で測定すると、特定の所望の標的への結合の約１０％未満となる。
【００８６】
更に、特定のヘッジホッグキナーゼポリペプチド又は特定のヘッジホッグキナーゼポリペプチド標的上のエピトープへの「特異的結合」又はこれら「に特異的に結合する」又は「に特異的な」という用語は、非特異的相互作用とは検出可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、コントロール分子（通常、結合活性を有しない類似構造の分子である）の結合との比較における、ある分子の結合を測定することで評価することができる。例えば、特異的結合は、過剰量の非標識標的のような、標的と類似するコントロール分子との競合により決定することができる。この場合、標識された標的のプローブへの結合が、過剰量の非標識標的により競合的に阻害された場合に、特異的結合が示されることになる。１の態様では、このような用語は、ある分子が、実質的に他のいずれのポリペプチド又はポリペプチドのエピトープに結合することなく、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに結合するような結合を指す。別の表現では、このような用語は、標的に対して、少なくとも約１０-4Ｍ、１０-5Ｍ、１０-6Ｍ、１０-7Ｍ、１０-8Ｍ、１０-9Ｍ、１０-10Ｍ、１０-11Ｍ又は１０-12Ｍ以上のＫｄを示す分子により説明することができる。
【００８７】
「ヘッジホッグキナーゼポリペプチドを発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する」ヘッジホッグキナーゼアンタゴニスト、又はこのような分子の「増殖阻害」量は、ヘッジホッグキナーゼポリペプチドを発現する癌細胞の測定可能な増殖阻害を生じさせる量である。治療に用いるための好ましい組成物には、増殖阻害量にある、少なくとも１種類のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストが含まれ、腫瘍細胞の増殖を、適切なコントロールとの比較において、２０％超、好ましくは約２０％ないし約５０％、より好ましくは５０％超（例えば、約５０％ないし約１００％）阻害する。１の態様において、増殖阻害は、細胞培養中に約０．１ないし３０μｇ／ｍｌ又は約０．５ｎＭないし２００ｎＭの分子濃度で測定可能であり、この場合、腫瘍細胞を抗体に曝露してから１−１０日後に増殖阻害を測定する。インビボでの神経膠腫細胞の増殖阻害は、下記の実験実施例に記載されるような種々の方法によって測定できる。本段落の上部に記載するいずれの分子の量も、このような分子を体重１ｋｇ当たり約１μｇないし約１００ｍｇで投与した際に、抗体の第１回目の投与から約５日間ないし３月間以内、好ましくは約５日間ないし３０日間以内に腫瘍サイズ又は腫瘍細胞の増殖の低下が生じた場合には、インビボでの増殖阻害作用が示されたことになる。
【００８８】
「アポトーシスを誘導する」ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞の断片化、及び／又は膜小胞（アポトーシス体と呼ばれる）の形成により決定される腫瘍細胞のプログラム化された細胞死を引き起こすヘッジホッグキナーゼアンタゴニストである。前記細胞は、通常、ヘッジホッグポリペプチドを過剰発現する細胞である。アポトーシス関連の細胞現象の評価には種々の方法が利用可能である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の転座は、アネキシン結合により測定できる；ＤＮＡの断片化は、ＤＮＡのラダー化を通じて評価できる；そしてＤＮＡ断片化に伴う核／クロマチン凝縮は、低二倍体細胞の増加によって評価できる。好ましくは、アポトーシスを誘導する抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子は、アネキシン結合アッセイにおいて、非処理細胞に対して、約２ないし５０倍、好ましくは、約５ないし５０倍、最も好ましくは、約１０ないし５０倍のアネキシン結合を誘導するものである。
【００８９】
「細胞死を誘導する」ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、腫瘍又は癌の生細胞を、非生細胞にするヘッジホッグキナーゼアンタゴニストである。このような細胞は、ヘッジホッグシグナル伝達経路を発現する細胞、好ましくは、非疾患細胞と比較して過剰発現する細胞である。インビトロでの細胞死は、補体と免疫エフェクター細胞の不存在によって決定でき、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ）により誘導されル細胞死から区別される。従って、細胞死のアッセイは、熱失活させた血清（即ち、補体が存在しない）を用いて、免疫エフェクター細胞の不存在下で行うことができる。細胞死の誘導能は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：１−１１（１９９５））又は７ＡＡＤの取込みにより評価される膜完全性の喪失等、適切な技術により、非処理細胞に相対的なものとして評価することが可能である。具体的な局面では、細胞死を誘導するヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、ＢＴ４７４細胞でのＰＩ取込みアッセイにおいてＰＩ取込みを促進するヘッジホッグキナーゼアンタゴニストである。
【００９０】
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」という用語は、異常な細胞増殖と一定の関連性を持つ疾患を指す。ある態様では、細胞増殖性疾患は、癌である。
【００９１】
「腫瘍」とは、本明細書で用いる場合、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍性細胞の成長及び増殖、並びに全ての前癌細胞及び前癌組織並びに全ての癌細胞及び癌組織を指す。
【００９２】
「癌」及び「癌の」という用語は、典型的に非制御下の細胞増殖を特徴とする哺乳動物内の生理学的状態を指すか又は説明する。癌の例には、以下に限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病又はリンパ性悪性疾患が含まれる。
【００９３】
ヘッジホッグを「過剰発現する」か、又はヘッジホッグシグナル伝達が「過剰に活性化された」腫瘍は、細胞表面に著しく高いレベルのヘッジホッグを有する腫瘍であるか、又は同一種類の組織の非癌細胞と比べてヘッジホッグシグナル伝達が高レベルに活性化された腫瘍である。このような過剰発現は、遺伝子増幅の結果によるものか、又は転写若しくは翻訳の増大による可能性がある。細胞表面での濃度を増大させるか又は分泌させることになるヘッジホッグ発現の増大を測定する種々の診断用又は予後用アッセイには、抗ヘッジホッグリガンド抗体又は抗ヘッジホッグレセプター抗体を用いる免疫組織化学アッセイ、ＦＡＣＳ解析等がある。これに代わるものとしては、ヘッジホッグをコードする核酸又はヘッジホッグのｍＲＮＡのレベルは、例えば、ヘッジホッグをコードする核酸又はこれに相補的な核酸に対応する核酸プローブを用いた蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＦＩＳＨ、１９９８年１０月に公開されたＷＯ９８／４５４７９を参照）、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、又はリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）等のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術により、細胞内で測定可能である。これに代わるものとしては、ヘッジホッグ過剰発現は、例えば、抗体に基づくアッセイ等により、血清等の生体液中に流れる抗原を測定することで決定できる（例として以下を参照：１９９０年６月１２日発行の米国特許第４，９３３，２９４  号；１９９１年４月１８日公開の国際公開公報ＷＯ９１／０５２６４；１９９５年３月２８日発行の米国特許第５，４０１，６３８号；及び、Ｓｉａｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３２：７３−８０（１９９０））。これに代わるものとしては、ヘッジホッグ活性は、例えば、転写因子Ｇｌｉ１等、特定の下流レポーターの発現を測定することで評価できる。上記のアッセイの他にも、当業者は種々のインビボアッセイを利用できる。例えば、患者の体内の細胞を、例えば、放射性同位体等の検出可能な標識で随意に標識した抗体に暴露し、例えば、放射能を外部からスキャンするか、又は治療剤に暴露する前に患者から採取した生検体を分析すること等により、患者内の細胞への抗体の結合を評価することができる。
【００９４】
本明細書で用いられる「イムノアドヘシン（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）」という用語は、異種のタンパク質（「アドヘシン（ａｄｈｅｓｉｎ）」）の結合特異性を、イムノグロブリン定常ドメインのエフェクター機能と組み合わせた、抗体様分子を指す。その構造において、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識結合部位以外の所望の結合特異性を有する（即ち、「異種」である）アミノ酸配列と、イムノグロブリン定常ドメインの配列の融合体を含む。イムノアドヘシン分子のアドヘシン部分は、典型的には、少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接したアミノ酸配列である。イムノアドヘシンのイムノグロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭ等のあらゆるイムノグロブリンから入手可能である。
【００９５】
「標識」という用語は、本明細書で用いる場合には、「標識された」抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子を作製するように、抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子に直接又は間接的に結合される検出可能な化合物又は組成物を指す。標識は、それ自体で検出可能なものであってもよく（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）、又は、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変化を触媒するものであってもよい。
【００９６】
「細胞毒性剤」という用語は、本明細書で用いる場合、細胞の機能を阻害するか若しくは妨げるか、そして／又は細胞破壊を生じさせる物質を指す。この用語には、放射性同位体（例えば、Ａｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、核酸分解酵素等の酵素及びその断片、抗生物質、細菌、真菌、植物又は動物に由来する低分子毒素又は酵素活性を有する毒素のような毒素及びその断片及び／又は変異体、並びに下記に開示する種々の抗腫瘍剤又は抗癌剤が含まれることが意図されている。下記にその他の細胞毒性剤も記載する。殺腫瘍剤は、腫瘍細胞の破壊を生じさせる。
【００９７】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、ヒドロキシウレアタキサン（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａｔａｘａｎｅ）（パクリタキセル及びドキセタキセル）及び／又はアンスラサイクリン系抗生物質；チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド等のアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン等のスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）のようなアジリジン類；アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）及びトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン類（特にブラタシン及びブラタシノン）；Δ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトセシン、スコポレクチン、及び９−アミノカンプトセシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；テニポシド；クリプトフィシン類（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ  ｏｘｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード；ニトロソウレア類、例えばカルムスチン、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムヌスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）；抗生物質、例えばエネジン抗生物質（例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマＩＩ及びカリケアマイシンオメガＩＩ（例えばＡｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）参照）；ジネマイシン、例えばジネマイシンＡ；エスペラマイシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連の色素タンパク質エネジン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（例えばモルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えばメトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類縁体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類縁体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類縁体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスリジン；アンドロゲン類、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗アドレナル類、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補給剤、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトラキセート；デホファミン；デメコルシン；ジアジクオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルホルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド類、例えばマイタンシン及びアンサミトシン類；マイトグアゾン；ミトキサトロン；モピダンモル；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメト；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ユージーン、オレゴン州）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）；トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド類、例えばＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、プリンストン、ニュージャー��ー州）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）クレモフォール不含、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、ショーンバーグ、イリノイ州）及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、アントニー、仏国）；クロランブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類縁体、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボビン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノヴァントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド類、例えばレチノイン酸；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；上記のいずれかの医薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体；並びに上記物質の二種以上の組み合わせ、例えばＣＨＯＰ（即ちシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニソロンの複合療法の略称）及びＦＯＬＦＯＸ（即ち５−ＦＵ及びロイコボビンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））を用いた治療計画の略称等）が含まれる。
【００９８】
上記定義には、癌の増殖を促進可能なホルモンを制御し、低下させ、ブロックするか、又は阻害するように作用し、多くの場合、全身又は全体治療の態様にある、抗ホルモン剤も含まれる。抗ホルモン剤は、ホルモンそのものの場合もある。例としては、抗エストロゲン及び選択的エストロゲンレセプターモジュレーター（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ：ＳＥＲＭ）、例えば、タモキシフェン（例えばＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェン）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ：ＥＲＤ）；卵巣を抑制又はシャットダウンする機能を有する薬剤、例えば黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、例えばＬＵＰＲＯＮ（登録商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）酢酸ロイプロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン；他の抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド及びビカルタミド；及び副腎におけるエストロゲン生産を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲステロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタニー（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アラストロゾールが含まれる。更に又、化学療法剤のこのような定義には、ビスホスホネート類、例えばクロドロネート（例えばＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）又はＯＳＴＡＣ（登録商標））、ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標）エチドロネート、ＮＥ−５８０９５、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロネート、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロネート、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロネート又はＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）リセドロネート；並びにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類縁体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えばＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ及び上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）のような異常な細胞増殖に関与するとされるシグナル伝達経路内の遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド；ワクチン類、例えばＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン及び遺伝子治療用ワクチン類、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ラパチニブジトシレート（ＥｒｂＢ−２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ低分子阻害剤、別名ＧＷ５７２０１６）；及び上記のいずれかの医薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体が含まれる。
【００９９】
「増殖阻害剤」とは、本明細書で使用する場合は、細胞、特に、ヘッジホッグ経路が過剰に活性化した細胞の増殖を、インビトロ又はインビボで阻害する化合物又は組成物を指す。従って、増殖阻害剤とは、Ｓ期にあるヘッジホッグ発現細胞のパーセンテージを顕著に低下させる薬剤であってもよい。増殖阻害剤の例には、Ｇ１期停止及びＭ期停止を促進する薬剤など、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の場所で）ブロックする薬剤が含まれる。主なＭ期ブロッカーには、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン、並びにトキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド及びブレオマイシン等のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤が含まれる。Ｇ１期停止させるこれらの薬剤はＳ期停止にまで作用を及ぼすものがあり、例えば、タモシキフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル及びａｒａ−Ｃ等のＤＮＡアルキル化剤がある。更なる情報は、下記に見出すことができる：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ及びＩｓｒａｅｌ編集，第１章，表題「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ」Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ著．（ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ：フィラデルフィア、１９９５）、特に１３頁。タキサン又はヒドロキシウレアタキサン（パクリタキセル及びドセタキセル）は両方とも、イチイに由来する抗ガン剤である。セイヨウイチイに由来するドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成類似体である。これらの分子は、チューブリン２量体からの微小管の構築を促進し、脱重合を防ぐことで微小管を安定化させ、細胞の有糸分裂を阻害する。
【０１００】
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン系抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は（８Ｓ−シス）−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リキソ−ヘキサピラノシル）オキシ］−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−５，１２−ナフタセンジオンである。
【０１０１】
「添付文書」という用語は、市販の治療薬品のパッケージに通常含まれる使用説明書を指し、この使用説明書には、効能、使用法、投与量、投与法、禁忌及び／又はその治療薬品の使用に関する注意が含まれる。
【０１０２】
「腺癌」は、腺上皮から発生する悪性腫瘍である。
【０１０３】
「間葉細胞」は、線維芽細胞、ストローマ細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、軟骨細胞等の骨形成細胞、単球、マクロファージ、リンパ球、顆粒細胞のような造血系由来の細胞並びに脂肪細胞等の脂肪由来の細胞を含む、間葉系由来の細胞である。
【０１０４】
「血管新生」とは、血管の形成であり、組織灌流に益する新たな脈管構造の形成又は既存の脈管系の変更の両方が含まれる。これには、既存の血管から上皮細胞が伸び出して新たな血管を形成すること、又は既存の血管を再構築して、サイズ、成熟度、流動性の方向を変えることで組織の血液灌流を向上させることの両方が含まれる。後者のプロセスは、場合によってはより具体的に「アーテロジェネシス（ａｒｔｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）」と呼ばれることもあるが、ここに意図される定義には、両方のプロセスが包含される。血管新生は、多段階から成るプロセスであり、上皮細胞が病巣において分解して自身の基底膜中に浸潤し、間質ストローマを通って血管新生刺激に向かって移動し、移動の先端周囲で増殖し、血管を組織し、新たに合成された基底膜に再結合する。Ｆｏｌｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４３：１７５−２０３（１９８５）。
【０１０５】
「基底細胞癌」は、結節性−潰瘍性、表面性、色素沈着性、斑状強皮症、線維上皮腫及び母斑様症候群等、様々な癌皮膚組織の臨床態様及び組織学的態様を指す。
【０１０６】
「火傷」は、熱又は化学薬品への暴露により生じる皮膚の損傷である。
【０１０７】
「癌腫」は、身体の他の領域に転移する傾向のある上皮細胞由来の悪性増殖を指す。例としては、以下が含まれる：「基底細胞癌」−皮膚の上皮腫瘍であり、殆ど転移することはないが、局所的な浸潤と破壊を生じさせる可能性がある；「扁平上皮癌」−扁平上皮から生じる腫瘍であって立方細胞を有する；「癌肉腫」−癌組織と肉腫組織の両方を含む悪性腫瘍である；「腺嚢胞癌（ａｄｅｎｏｃｙｓｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」−多くの場合粘液を含む円形の腺様の空間又は嚢胞を含む、上皮細胞の層に縁取られた大きな上皮細胞塊を特徴とする腫瘍；「類表皮癌」−扁平上皮癌を参照；「鼻咽腔癌」−鼻の後方の空間を覆う上皮に生じる悪性腫瘍；「腎細胞癌」−種々の配置にある尿細管細胞から構成される腎実質内の腫瘍。更なる癌性の上皮増殖には、上皮に由来する良性の腫瘍であり、発生因子としてパピローマウイルスを有する「乳頭腫」；及び、神経溝が塞がる際の外胚葉因子の封入により形成される大脳の髄膜腫瘍「類表皮腫（ｅｐｉｄｅｒＭｏｌｄｏｍａ）」、が含まれる。
【０１０８】
「真皮（Ｃｏｒｉｕｍ）」又は「真皮（ｄｅｒｍｉｓ）」は、血管結合組織の密な床から成り、神経と感覚末端器官を含む、表皮の深部にある皮膚層を指す。毛根並びに皮脂腺及び汗腺は、表皮の構造であり、真皮内に深く包埋されている。
【０１０９】
「皮膚潰瘍（ｄｅｒｍａｌ  ｓｋｉｎ  ｕｌｃｅｒ）」とは、組織表面の喪失によって生じ、通常、炎症を伴う皮膚の損傷を指す。本発明の方法により治療可能な皮膚潰瘍には、褥瘡性潰瘍、糖尿病性潰瘍、静脈うっ滞性潰瘍及び動脈性潰瘍が含まれる。褥瘡性の創傷は、長時間皮膚に圧力を加えた結果生じる慢性的な潰瘍である。これらの種類の創傷は、褥瘡又はとこずれとも呼ばれる。静脈うっ滞性潰瘍は、血液又はその他の欠陥を持つ血管からの液体の停滞により生じる。動脈性潰瘍は、血流が乏しい動脈付近の領域の壊死を起こす皮膚を指す。
【０１１０】
「上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｉａ）」、「上皮の」及び「上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）」は、身体の内部表面及び外部表面（皮膚、粘膜及び漿液）を覆う細胞を指し、角膜、食道、表皮、及び毛包の上皮細胞等、上皮に由来する腺及び他の構造体も含まれる。他の代表的な上皮組織には、以下が含まれる：嗅上皮−鼻腔の嗅部を覆う多列上皮であり、嗅覚のレセプターを含む；腺上皮−分泌細胞から構成される上皮；扁平上皮−１又は２以上の細胞層を含む上皮であり、このうち最も表層にあるものは、平坦で、鱗状又は板状の細胞から構成される。上皮は、また、例えば、重層扁平上皮と円柱上皮の移行を示す組織等、収縮と拡張により大きな機械的変化を受ける中空器官を覆うことを特徴とするような移行上皮も指す場合がある。
【０１１１】
「上皮腺」は、表皮と結合しており、その通常の代謝上の要求とは関係のない物質を分泌又は排泄するように特化した細胞の凝集体を指す。例えば、「皮脂腺」は、油性の物質と皮脂を分泌する真皮内のホロクリン腺である。「汗腺」という用語は、汗を分泌する腺であり、真皮内又は皮下組織内に存在する。
【０１１２】
「表皮」は、皮膚の最も外側の保護的な、血管を有しない層を指す。
【０１１３】
「切除による創傷（ｅｘｃｉｓｉｏｎａｌ  ｗｏｕｎｄ）」には、皮膚の上皮層内（真皮又はこれより深くに広がる場合もある）の裂傷、擦過傷、切り傷、穿刺又は裂創が含まれ、外科的手術過程又は事故による皮膚の貫通により生じる。
【０１１４】
細胞の「増殖状態」とは、細胞の増殖速度及び／又は細胞の分化の状態を指す。「変化した増殖状態」とは、異常な増殖速度により特徴付けられる増殖状態であり、例えば、正常細胞に対して増加した又は低下した増殖速度を示す細胞等がある。
【０１１５】
「ヘッジホッグ」又は「ヘッジホッグペプチド」（Ｈｈ）という用語は、本明細書で用いる場合、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａのヘッジホッグの哺乳動物ホモログホモログ、即ち、ソニックヘッジホッグ（ｓＨｈ）、デザートヘッジホッグ（ｄＨｈ）又はインディアンヘッジホッグ（ＩＨｈ）のいずれかを一般名称として示す。この用語を用いてタンパク質又は核酸を記載する場合もある。
【０１１６】
本明細書で用いる「ヘッジホッグシグナル経路」、「ヘッジホッグ経路」及び「ヘッジホッグシグナル伝達経路」という用語は、ヘッジホッグ及びそのレセプター（例えば、ｐａｔｃｈｅｄ、ｐａｔｃｈｅｄ−２）により媒介されるシグナルカスケード、及び遺伝子発現の変化や他のヘッジホッグ活性に典型的な表現型の変化を生じさせるものを、互換性をもって参照する。ヘッジホッグが存在しない場合であっても、下流の構成成分の活性化によってヘッジホッグ経路が活性化される場合がある（例えば、ヘッジホッグの不存在下であっても、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄの過剰発現又はＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ若しくはＰａｔｃｈｅｄの変異体のトランスフェクションにより、活性なヘッジホッグシグナルが恒常的に活性化される）。転写因子のＧｌｉファミリーは、しばしばヘッジホッグ経路活性化のマーカー又は指標として用いられる。
【０１１７】
「ヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル構成成分」という用語は、Ｈｈシグナル経路に関与する遺伝子産物を指す。Ｈｈシグナル構成成分は、多くの場合、細胞又は組織内でのＨｈシグナルの伝達に有形的又は実質的に作用し、これによって下流遺伝子の発現レベル及び／又はヘッジホッグ経路の活性化と関連する他の表現型の変化に影響を及ぼす。各Ｈｈシグナル構成成分は、その生物学的機能及び下流遺伝子の活性化又は発現の最終的な結果の作用にもよるが、正又は負の調節因子のいずれかに分類できる。正の調節因子は、Ｈｈシグナル伝達に正に作用する、即ち、Ｈｈが存在する場合に下流の生命現象を促進するＨｈシグナル構成成分である。負の調節因子は、Ｈｈシグナル伝達に負に作用する、即ち、Ｈｈが存在する場合に下流の生命現象を阻害するＨｈシグナル構成成分である。
【０１１８】
「ヘッジホッグの機能獲得」という用語は、例えば、ヘッジホッグ経路の異常な活性化等、細胞をヘッジホッグタンパク質と接触させることに似た表現型を生じさせることになる、ヘッジホッグシグナル構成成分（例えば、ｐｔｃｈ、Ｓｍｏ、Ｆｕｓｅｄ、Ｓｕ（ｆｕ）、等）の異常な修飾若しくは変異、又はこれらの遺伝子の発現レベルの低下（又は喪失）を指す。機能獲得には、ｐｔｃｈ遺伝子産物の転写活性化因子Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２及び／又はＧｌｉ３の発現レベルを調節する能力の喪失が含まれる場合がある。「ヘッジホッグの機能獲得」という用語は、これに限定される訳ではないが、ヘッジホッグ自体の修飾又は変異を含む、ヘッジホッグシグナル伝達経路のあらゆる時点での変更のより生じる、類似の細胞表現型のいずれか（例えば、過剰な増殖を示す等）を指すものとして用いられることもある。例えば、ヘッジホッグシグナル経路の活性化に対して異常に高い増殖速度を示す腫瘍細胞は、ヘッジホッグがその細胞内で変異を有していない場合であっても、「ヘッジホッグの機能獲得」表現型を有することになる。
【０１１９】
「内部上皮組織」とは、皮膚の表皮層に類似する特徴を有する、身体内部の組織を指す（例えば、腸の内層等）。
【０１２０】
「角化症」とは、表皮の角質層の過形成を特徴とする、増殖性の皮膚疾患を指す。角化症疾患の例には、毛包性角化症、掌蹠角皮症、咽頭角化症、毛孔性角化症、及び光線性角化症が含まれる。
【０１２１】
「ラメラ体」は、サーファクタントを生産する肺細胞内に見られる細胞下構造を指す。ラメラ体は、肺のサーファクタント生合成の供給源と考えられている。
【０１２２】
本明細書で用いる「過剰発現」という用語は、組織の細胞内での遺伝子発現レベルであり、その組織の正常の発現レベルより高い遺伝子発現レベルを指す。
【０１２３】
「ｐａｔｃｈｅｄの機能喪失」という用語は、例えば、ヘッジホッグ経路の異常な活性化等、細胞をヘッジホッグタンパク質と接触させることに似た表現型を生じさせることになる、ｐａｔｃｈｅｄ遺伝子の異常な修飾若しくは変異、又はこの遺伝子の発現レベルの低下（又は喪失）を指す。機能喪失には、ｐｔｃｈ遺伝子産物の転写活性化因子Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２及び／又はＧｌｉ３の発現レベルを調節する能力の喪失が含まれる場合がある。
【０１２４】
「ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄの機能獲得」という用語は、例えば、ヘッジホッグ経路の異常な活性化等、ヘッジホッグでヘッジホッグ経路を活性化させることに似た表現型を生じさせることになる、Ｓｍｏ遺伝子への異常な修飾若しくは変異又はｐｔｃｈ遺伝子産物のＳｍｏに結合することでヘッジホッグシグナルを抑制する能力を指す。
【０１２５】
「増殖している」及び「増殖」という用語は、有糸分裂中の細胞を指す。
【０１２６】
「増殖性皮膚疾患」という用語は、皮膚組織の不所望の、又は異常な増殖により特徴づけられる皮膚のあらゆる疾患／障害を指す。このような状態は、典型的には表皮の増殖又は不完全な細胞分化により特徴付けられ、例えば、Ｘ染色体性魚鱗癬，乾癬，アトピー性皮膚炎，アレルギー性接触皮膚炎，表皮剥離性角質増殖症及び脂漏性皮膚炎が含まれる。例えば、表皮異形成とは、表皮の不完全な発育の形態である。別の例は、「表皮剥離」であり、皮下又は外傷部位でのブレブやブラの形成を伴う、表皮が緩んだ状態を指す。
【０１２７】
「乾癬」は、皮膚の調整機構に変更をきたす、慢性、再発性、炎症性、過剰増殖性の皮膚疾患である。特に、表皮増殖、皮膚の炎症反応、及びリンフォカインや炎症因子等の調節分子の発現に１次的及び２次的な変化を伴う損傷が形成される。乾癬性の皮膚は、表皮細胞の折り返しの増大、表皮の肥厚、異常な角化、真皮層への炎症細胞の浸潤、及び基底状態での細胞サイクルを増加させる表皮層への多形核白赤球（ｐｏｌｙｍｏｒｏｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）の浸潤を、その形態上の特徴とする。５種類の感染が存在し、それぞれ固有の兆候と症状を有する。最も一般的な種類の乾癬は、尋常性乾癬（ｐｌａｑｕｅ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）であり、主として、パッチ上の、銀白色の板状鱗屑で覆われた、めくれ上がって赤味がかった皮膚を特徴とし、ひじ、ひざ、腰部及び頭皮に現れる。他の種類は、（ｉ）皮膚上の、小さな赤い斑点を特徴とする滴状乾癬、（ｉｉ）赤い皮膚に囲まれた白色の膿疱を特徴とする膿疱性乾癬、（ｉｉｉ）皮膚のひだの部分に形成される、滑らかで赤色の損傷を特徴とする逆乾癬（ｉｎｖｅｒｓｅ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、（ｉｖ）広範囲の赤色で、強い痒みと疼痛を特徴とする、紅皮症乾癬（ｅｒｙｔｈｒｏｄｅｒｍｉｃ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、がある。
【０１２８】
「アトピー性皮膚炎」（ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ：ＡＤ）（湿疹）は、かゆみ、湿疹、損傷、乾燥症（乾燥肌）、及び皮膚の苔癬化（皮膚の肥厚と皮膚生産の増加）を特徴とする、原因不明のそう痒性疾患である。多くの患者において、ＡＤは、他のアトピー性疾患とも関連する（例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、じんま疹、食物に対する急性のアレルギー反応、ＩｇＥ生産の増加等）。また、ＡＤは、アレルギーを患う個体では、花粉、食物、動物のふけ又は毛、昆虫由来毒物及び植物毒素等のアレルゲンへの曝露によって、誘起される場合もある。
【０１２９】
「皮膚」は、真皮と上皮から成る、身体の外側の保護的被覆であり、汗腺及び皮脂腺並びに毛包構造を含んでいる。
【０１３０】
「小細胞癌」は、気管支の悪性の新生物を指す。このような腫瘍細胞は、内分泌様の特徴を有し、１又は２種類以上の広範囲のホルモン、特に、ボンベシンのような調節ペプチドを分泌する可能性がある。
【０１３１】
「尿生殖器の」とは、尿生殖路の器官及び組織を指し、とりわけ、前立腺、尿管、腎臓、及び膀胱が含まれる。「尿生殖器癌」とは、尿生殖器組織の癌である。
【０１３２】
【表１】
2009526752.tif 000003
【０１３３】
アミノ酸配列同一性％＝
（ＡＬＩＧＮ−２で測定した２種類のポリペプチド配列間で同一なものとしてマッチしたアミノ酸残基数）÷（参照ポリペプチドの全アミノ酸残基数）
＝５÷１５＝３３．３％
【０１３４】
【表２】
2009526752.tif 000004
【０１３５】
アミノ酸配列同一性％＝
（ＡＬＩＧＮ−２で測定した２種類のポリペプチド配列間で同一なものとしてマッチしたアミノ酸残基数）÷（参照ポリペプチドの全アミノ酸残基数）
＝５÷１０＝５０％
【０１３６】
【表３】
2009526752.tif 000005
【０１３７】
核酸配列同一性％＝
（ＡＬＩＧＮ−２で測定した２種類の核酸配列間で同一なものとしてマッチしたヌクレオチド数）÷（参照−ＤＮＡ核酸配列の全ヌクレオチド数）
＝６÷１４＝４２．９％
【０１３８】
【表４】
2009526752.tif 000006
【０１３９】
核酸配列同一性％  ＝
（ＡＬＩＧＮ−２で測定した２種類の核酸配列間で同一なものとしてマッチしたヌクレオチド数）÷（参照−ＤＮＡ核酸配列の全ヌクレオチド数）
＝４÷１２＝３３．３％
【０１４０】
ＩＩＩ．ヘッジホッグアンタゴニスト法
ヘッジホッグ（Ｈｈ）タンパク質は、細胞増殖を調節して発生時のパターンを形成する、長期又は短期作用型のモルフォゲンである。Ｏｇｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６７：８０５（２００４）；Ｈｕａｎｇｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３３：３（２００６）；Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６３（１１）：１２４９−１２６５（２００６）。哺乳動物には３種類のＨｈタンパク質が存在する：ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、デザートヘッジホッグ（Ｄｈｈ）、及びインディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ）。Ｈｈシグナル（図４ａ）を受容する細胞では、１２回膜貫通型レセプターのＰａｔｃｈｅｄ（Ｐｔｃｈ１）にＨｈリガンドが結合した際に、経路の活性化が開始され、それによって、Ｐａｔｃｈｅｄ  による阻害から、７回膜貫通型タンパク質のＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）が開放される。Ｈｕａｎｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ．，Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ，Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：１２９−１３３（１９９６）。Ｓｍｏの活性化により、下流のシグナル現象が起こり、ジンクフィンガー転写因子である神経膠腫関連（Ｇｌｉｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ：Ｇｌｉ）ファミリーが活性化される。Ｋａｓｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４２：４３７（２００６）。Ｈｈシグナルの不存在下では、プロテインキナーゼＡ（Ｐｋａ）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ｂ（Ｇｓｋ３ｂ）、及びカゼインキナーゼ１（Ｃｋ１）等のプロテインキナーゼにより、Ｇｌｉがリン酸化され、ＧｌｉのＮＨ２末端切断型へのプロテオソーム媒介性切断が起こり、ＮＨ２末端切断型がＨｈシグナルの標的遺伝子の発現のリプレッサーとして作用することになる。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：２３４９（２００６）；Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０８：８２３（２００２）；Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６：４３３１（１９９９）；Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１６：５４８（２００２）。Ｆｕｓｅｄのサプレッサー（Ｓｕｆｕ）は、細胞質内及び核内の両方で、Ｇｌｉに結合することで、この経路の別の負の調節物質として作用し、Ｈｈ標的遺伝子の活性化を防ぐ。Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：５４４２（２００２）；Ｋｏｇｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１：３１２（１９９９）；Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．９：１１１９（１９９９）；Ｐｅａｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１２：３２３（１９９９）。
【０１４１】
哺乳動物細胞では、どのようにしてＳｍｏからＧｌｉへＨｈシグナルが伝達されるのかが依然として解明されていない（図５Ａ）。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａでは、キナーゼのＦｕｓｅｄ（Ｆｕ）及びキネシン様分子のＣｏｓｔａｌ  ２（Ｃｏｓ２）が、ＳｍｏからＧｌｉのハエのホモログ、Ｃｕｂｉｔｕｓ  ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｕｓ（Ｃｉ）へシグナルを伝達するものと考えられている。Ｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２：１２６１（２００３）；Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：２７０９（２００３）；Ｒｕｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：９０７（２００３）；Ｏｇｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１３：１９９８（２００６）。しかしながら、哺乳動物においては、上記機構が、明確に保存されていない、なぜなら、Ｈｈシグナルの伝達において、Ｃｏｓ２とＦｕの哺乳動物オルソログは、いずれも必要とされないからである。Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２５：７０５４（２００５）；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２５：７０４２（２００５），Ｖａｒｊｏｓａｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  １０：１７７（２００６）。更にまた、シグナル伝達と、Ｆｕ及びＣｏｓ２への結合に必要なハエＳｍｏのカルボキシ末端尾部［Ｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，上記、Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，上記］は、哺乳動物のＳｍｏで保存されてはおらず、哺乳動物のＳｍｏは、新たな成分と相互作用することでＨｈシグナルを伝達することが示唆される。
【０１４２】
対象的に、最近の研究により、哺乳動物のＨｈシグナルは、非運動型の繊毛の存在を必要とすることが示されている。Ｈｕａｎｇｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２６：８３（２００６）；Ｈｕａｎｇｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１１３２５（２００５）；Ｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２８７：３７８（２００５）；Ｃｏｒｂｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３７：１０１８（２００５）；Ｈａｙｃｒａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ  １：ｅ５３（２００５）。マウスの遺伝学的研究により、順行性又は逆行性の鞭毛内輸送（ｉｎｔｒａｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ：ＩＦＴ）の多くの成分を破壊することにより、ＳｍｏとＧｌｉの間のＨｈシグナルに異常が起こるため、神経管のパターン形成と、四肢発生に欠陥が生じることが解明されている。Ｈｕａｎｇｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）、上記、Ｈｕａｎｇｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）、上記、Ｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．、上記。更にまた、Ｓｍｏ、Ｓｕｆｕ、及び３種類の全てのＧｌｉタンパク質を含む、この経路の数多くの成分が、Ｈｈシグナル伝達中に繊毛の先端部に発見されている。Ｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ，Ｃｏｒｂｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、上記、Ｈａｙｃｒａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．、上記、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３２：１６７９（２００３）。従って、繊毛は、哺乳動物におけるＨｈシグナル伝達の重要な媒体であると考えられる。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａでは、繊毛はＨｈシグナル伝達に必要ではないことから［Ａｖｉｄｏｒ−Ｒｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １１７：５２７（２００４）；Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１３：１６７９（２００３）］、ハエと哺乳動物間のＨｈ経路の相違の証拠が更に提供される。
【０１４３】
Ｈｈシグナル伝達が癌と関係することから、この経路において更なる薬物標的候補を同定することが重要である。哺乳動物のＨｈシグナルに関与する新規なキナーゼを見つけるため、我々は、Ｈｈシグナル（図５Ａ及び図５Ｃ）を反復するように設計された細胞に基づくアッセイにおいて、全てのキナーゼといくつかのキナーゼ調節タンパク質を含む、マウスｓｉＲＮＡキノームライブラリーをスクリーニングした。最初に、ハイスループットアッセイ（図５Ｃ）を開発して、Ｈｈシグナルの研究に従来からモデルとして用いられてきたマウスのＣ３Ｈ１０Ｔ１／２間葉系セルラインを用いてＨｈ経路の誘導をモニターした。上記セルラインは、ホタルルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡの発現を駆動する８個のＧｌｉ結合部位から成る、Ｈｈ誘導性のルシフェラーゼレポーターを安定に発現するよう遺伝子組み換えされており、Ｓ１２と呼ばれる。Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．１：１０（２００２）。Ｓｈｈの不存在下では、Ｓ１２細胞は、基底量のルシフェラーゼを生産する（図５Ｂ）。
【０１４４】
Ｓｈｈの添加により、Ｈｈ経路が活性化され、ルシフェラーゼ発現は、１５倍にまで増加する（図５Ｂ）。対照的に、Ｓｍｏに対するｓｉＲＮＡで処理し次いでＳｈｈで刺激した細胞は、ルシフェラーゼの蓄積が見られなかった（図５Ｂ）。
【０１４５】
血管新生
ヘッジホッグが血管新生を促進することが知られていることから、特に、血管新生に一定の強度のヘッジホッグシグナルが必要な場合には、ヘッジホッグ活性を阻害するヘッジホッグキナーゼアンタゴニストが、血管形成を阻害することが期待される。血管新生は、多くの疾患の基礎となっている。持続的な、非制御下の血管新生により、種々の疾患状態、腫瘍の転移及び内皮細胞の異常増殖が引き起こされる。血管新生プロセスの結果作り出された脈管構造は、これらの疾患に見られる病理学的損傷の証拠となる。
【０１４６】
血管新生と関連する疾患及び血管新生により生じる疾患には、以下が含まれる：腫瘍増殖、腫瘍転移又は内皮細胞の異常増殖、例えば、血管新生疾患、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、末熟児網膜症、角膜移植後拒絶反応、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズの過剰装着、アトピー性角膜炎、上輪部角膜炎、乾燥性角結膜炎、シェーグレン症候群、酒さ性ざ瘡、フィルクテヌローシス（ｐｈｙｌｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ）、梅毒、ミコバクテリア感染、脂質変性、化学薬品による火傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状ヘルペス感染、原虫感染症、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン辺縁変性、辺縁角質溶解（ｍａｒｇｉｎａｌ  ｋｅｒａｔｏｌｙｓｉｓ）、慢性関節リウマチ、全身性の狼瘡、多発性動脈炎、外傷、ヴェーゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、強膜炎、スティーヴェンズ−ジョンソン症候群、類天疱瘡、放射状角膜切開、角膜移植拒絶、慢性関節リウマチ、全身性の狼瘡、多発性動脈炎、外傷、ヴェーゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、強膜炎、スティーヴンズ‐ジョンソン症候群、類天疱瘡、放射状角膜切開、角膜移植拒絶、慢性関節リウマチ、変形性関節症、慢性炎症（例えば、潰瘍性大腸炎又はクローン病）、血管腫、オスラー−ウェーバー・ランデュ病、及び遺伝性出血性毛細血管拡張。
【０１４７】
血管新生は、癌において決定的な役割を果たす。栄養を供給して細胞排泄物を取り除く血液供給なくして、腫瘍は拡張することができない。血管新生が重要となる腫瘍には、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、骨肉腫等の固形腫瘍、及び聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫等の良性腫瘍が含まれる。血管新生因子は、複数種の固形腫瘍と関連があることが判明しており、血管新生を防ぐことで、これらの腫瘍の増殖と腫瘍の存在に起因する動物への結果的な損傷をくい止めることができる。血管新生は、白血病等の血液由来の腫瘍、及び、通常、貧血、血液凝固障害、並びにリンパ節、肝臓及び脾臓の腫脹を伴う、白血球の非抑制的増殖が起こっている骨髄の種々の急性又は慢性腫瘍疾患とも関連している。血管新生は、白血球様の腫瘍を生じる骨髄内での障害に関与していると考えられている。
【０１４８】
腫瘍の増殖に加え、血管新生は、転移においても重要である。初期において、血管新生は、腫瘍の脈管化において重要であり、癌細胞が血流内へ侵入して全身を循環することを可能にする。腫瘍細胞が原発部位を離脱して、第２の転移部位に定着した後には、その新たな腫瘍が増殖して拡張する前に血管新生が起こる必要がある。従って、血管新生を妨げることにより、腫瘍の転移が予防され、恐らく、新生物の増殖を原発部位に抑制することが可能になる。
【０１４９】
血管新生は、生殖や創傷治癒等の正常な生理学的プロセスにも関与している。血管新生は、排卵、並びに受精後の胞胚の着床において重要な工程である。血管新生の防止を利用することで、無月経を誘導し、排卵を遮断し、又は胞胚の着床を予防することができる。
【０１５０】
肺機能
本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、不適切な肺の表面張力から生じる呼吸窮迫症候群（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＲＤＳ）又は他の疾患の治療及び／又は予防に有用である。呼吸窮迫症候群は、肺胞内の不十分なサーファクタントによって生じる。脊椎動物の肺には、表面張力を肺膨張時に上昇させ、肺収縮時に低下させる脂質とタンパク質の複雑な混合物であるサーファクタントを含む。肺収縮時には、肺胞の崩壊を防ぐために面積力が無くなるようサーファクタントが減少する。崩壊せずに通気した肺胞は、呼息時に、血液と肺胞気間で絶え間なく酸素と二酸化炭素を輸送させ、これに続く吸息において膨張するためにより少ない力が必要とされる。膨張時には、肺胞の表面積が増加すると、肺サーファクタントは表面張力を上昇させる。拡張時の肺胞内で表面張力が上昇することにより、これらの気腔内での過膨張に対する抵抗が生まれ、吸い込んだ空気が比較的通気されていない肺胞へと向けられ、均一な肺通気が促進される。
【０１５１】
呼吸窮迫症候群は、特に未熟児において発症する。肺サーファクタントは、通常、胎児期の最後の６週になるまで、非常に低率で合成される。通常の妊娠期よりも６週を超えて早く生まれるヒト胎児では、不適切な量の肺サーファクタント及び不適切なサーファクタント合成速度をもって誕生するリスクが高い。より早く生まれた胎児では、サーファクタントの欠損がより重度になる傾向がある。重度のサーファクタント欠損では、生後数分又は数時間以内に呼吸不全に陥る可能性がある。サーファクタント欠損により、最大の吸息作用にもかかわらず、肺の拡張する能力が低下することから、進行性の肺胞崩壊（無気肺）が生じる。結果として、胎児の血液に到達する酸素の量が不十分なものとなる。ＲＤＳは、典型的には、サーファクタント生合成不全の結果として、成体においても生じる場合がある。
【０１５２】
未熟児の肺組織では、ヘッジホッグシグナル伝達の高い活性が示される。ヘッジホッグアンタゴニストを用いたこの経路の阻害により、ラメラ体の形成が増加し、サーファクタント生合成に関与する遺伝子の発現が上昇する。ラメラ体は、サーファクタント生合成に関連する細胞下構造を有する。以上の理由から、ヘッジホッグアンタゴニストを用いて未熟児を処置することにより、サーファクタント生合成が促進され、ＲＤＳが緩和されるはずである。成体のＲＤＡがヘッジホッグシグナルの活性化と関連する場合にも、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを用いた処置は有効となるであろう。
【０１５３】
ヘッジホッグシグナルの過活性により生じる疾患
本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、特に、罹患組織及び／又は細胞が高いヘッジホッグシグナル活性を示す疾患を対象としてもよい。ｇｌｉ−１、ｇｌｉ−２及びｇｌｉ−３を含むｇｌｉ遺伝子の発現のヘッジホッグシグナル伝達経路による活性化は、広範囲の組織及び疾患におけるヘッジホッグシグナルと最も一貫して関連している（しかしながら、ｇｌｉ−３は、比較的関連性が低い）。ｇｌｉ遺伝子には、ヘッジホッグシグナル伝達の完全な効果を発揮するのに必要な数多くの遺伝子の発現を活性化させる転写因子がコードされている。しかしながら、Ｇｌｉ−３転写因子は、ヘッジホッグエフェクター遺伝子のレプレッサーとしても作用する場合があり、従って、ｇｌｉ−３の発現は、ヘッジホッグシグナル伝達の効果を減少させる可能性がある。ｇｌｉ−３が、翻訳後の現象に応じて転写アクチベーター又は転写リプレッサーのいずれかとして作用することから、Ｇｌｉ−３タンパク質の（抑制型に対する）活性化型の検出方法が、ヘッジホッグ経路活性の信頼性のある測定法となることが期待される。ｇｌｉ−１遺伝子は、種々の癌、過形成及び未熟児の肺で強く発現しており、ヘッジホッグ経路の相対的な活性化のマーカーとして機能する。更に、高いｇｌｉ遺伝子発現を示す、未熟児の肺のような組織は、ヘッジホッグ阻害剤により強い影響を受ける。従って、ｇｌｉ遺伝子発現の検出が、ヘッジホッグアンタゴニストを用いた治療が特に有効な組織及び疾患を同定する強力な予測ツールとして使用可能であることが考えられる。
【０１５４】
好ましい態様では、ｇｌｉ−１の発現レベルは、転写物の直接的な検出又はタンパク質レベル若しくはタンパク質活性の検出のいずれかにより検出される。転写物については、主にｇｌｉ−１転写物又はこれから合成されるｃＤＮＡに対するハイブリダイゼーション又はプローブに基づく種々の技術を用いて検出可能である。良く知られる技術には、転写物のレベルでは、ノーザンブロッティング、逆転写酵素ＰＣＲ及びマイクロアレイ解析が含まれる。Ｇｌｉタンパク質レベルでの検出法には、ウェスタンブロッティング、免疫沈降法、２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（２Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ‐Ｇｌｉタンパク質の位置が決定できるよう、スタンダードと比較できることが好ましい）、及び質量分析法が含まれる。
【０１５５】
質量分析は、特定のサンプル中の多数の異なるタンパク質レベルのハイスループットな同定を可能にする、一連の精製工程が組み合されていてもよい。質量分析と２Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いることで、タンパク質分解、ユビキチン結合、リン酸化、脂質修飾等を含むタンパク質に対する転写後修飾を同定することも可能である。基質ＤＮＡへの結合又はインビトロでの標的プロモーターの転写活性化を解析することでＧｌｉ活性を評価することができる。ゲルシフトアッセイ、ＤＮＡフットプリンティングアッセイ及びＤＮＡ−タンパク質架橋アッセイの全ては、その使用により、ＤＮＡ上のＧｌｉ結合部位に結合可能なタンパク質の存在を評価できる方法である。Ｊ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ  ７７（６）：４５９−６８（１９９９）；Ｃｅｌｌ  １００（４）：４２３−３４（２０００）；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７（１９）：４９２３−４３０１（２０００）。
【０１５６】
特定の態様では、ｇｌｉ転写レベルを測定して、異常に高いｇｌｉレベルを示す疾患組織又は障害組織をヘッジホッグキナーゼアンタゴニストで処置する。別の態様では、ｇｌｉ発現レベルの測定が、治療される組織において行われていない場合であっても、治療される症状が、異常なヘッジホッグ経路の活性化と有意な相関関係を示すことが知られている。未熟児の肺組織、肺癌（例えば、腺癌、気管支肺胞腺癌、小細胞癌）、乳癌（例えば、下部腺管癌、下部小葉癌、管状腺癌）、前立腺癌（例えば、腺癌）及び、良性の前立腺過形成の全ては、一定の事例において、強力で高いｇｌｉ−１発現レベルを示す。従って、ｇｌｉ−１発現レベルは、これらのどの組織をヘッジホッグキナーゼアンタゴニストで治療すべきかを決定するための強力な診断デバイスとなる。更に、尿路上皮細胞の癌（例えば、膀胱癌、他の尿生殖器の癌）も、一定の事例において高いｇｌｉ−１レベルを示すことの確固たる関連証拠が存在する。例えば、染色体９ｑ２２におけるヘテロ接合の喪失が、膀胱癌に共通していることが知られている。Ｐｔｃｈ−１遺伝子は、上記部位に位置しており、ｐｔｃｈ−１の機能喪失は、恐らく、多くの他の多くの種類の癌においても、過剰増殖の部分的要因となっているであろう。従って、このようは癌は、高いｇｌｉ発現を示し、ヘッジホッグアンタゴニストを用いた治療に特に適している。
【０１５７】
ｐｔｃｈ−１とｐｔｃｈ−２の発現も、ヘッジホッグシグナル伝達経路によって活性化されるが、典型的には、ｇｌｉ遺伝子と同程度に活性化される訳ではなく、結果的に、ヘッジホッグ経路活性化のマーカーとしてはｇｌｉ遺伝子に劣ることになる。特定の組織では、ヘッジホッグ経路の活性が高くてもｐｔｃｈ−１又はｐｔｃｈ−２の片方のみが発現している。例えば、精巣の発達においては、ｄｅｓｅｒｔ  ヘッジホッグが重要な役割を果たし、ヘッジホッグ経路が活性されているが、ｐｔｃｈ−２のみが発現している。従って、これらの遺伝子は、単独では、ヘッジホッグ経路活性のマーカーとして信頼性がないが、両方の遺伝子の同時測定は、ヘッジホッグアンタゴニストで治療すべき組織に関するより有用な指標になると考えられる。
【０１５８】
ヘッジホッグ活性化の間、ｇｌｉが遍在的に発現されることから、あらゆるｇｌｉ過剰発現の程度が、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストが有効な治療薬であることの決定において有用となるはずである。好ましい態様では、ｇｌｉが、正常レベルより少なくとも２倍高いレベルで発現されるべきである。特に好ましい態様では、発現は、正常レベルより４倍、６倍、８倍又は１０倍高い。
【０１５９】
脊椎動物の分化した組織の秩序だった空間配置の形成におけるヘッジホッグシグナル伝達の幅広い関与を考慮するに、本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、インビトロ及びインビボの両方において異なる脊椎動物組織の配置を作り出すプロセス及び／又は維持するプロセスに用いることができる。任意の組織の種類の増殖又は分化に関して誘導的又は抗誘導的であるヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、上記の製剤のいずれにおいても適切であろう。
【０１６０】
神経細胞の培養
本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、更に、ヘッジホッグシグナルの低下が望まれる細胞培養技術に適用可能である。インビトロでの神経培養系は、神経発生の研究並びに、神経成長因子（ＮＧＦ）、繊毛栄養因子（ＣＮＴＦ）及び脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）等の神経栄養因子の同定の基礎となる欠くことのできないツールであることが証明されている。本発明の方法の１の使用法は、例えば、新たな神経及びグリアを作り出すための培養の使用といった、神経幹細胞の培養であってもよい。培養物中の神経幹細胞の増殖速度を変化させたり、そして／又は分化速度を変化させたり、又は特定の最終分化した神経細胞の培養の完全性を維持するために、これらの培養物をヘッジホッグキナーゼアンタゴニストと接触させることができる。代表的な態様では、対象方法を用いて特定の種類のニューロン（例えば、感覚ニューロン、運動ニューロン等）を培養することができる。このような神経培養物は、簡便なアッセイ系並びに治療用の移植可能細胞の供給源として用いることができる。
【０１６１】
本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、更に、中枢神経系の疾患の新たな治療法としての大脳内移植にも適用可能である。例えば、損傷を受けた脳組織を修復するための１つの方法では、動物胎児又は新生児由来細胞の、成体の脳への移植を伴う。Ｄｕｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１２３：２６５−２８９（１９８７）。種々の脳領域に由来する胎児ニューロンの、成体の脳への組み込みを成功させることが可能であり、このような移植片は、行動障害を軽減することができる。例えば、基底核へのドーパミン投射の損傷により誘導される運動障害は、胚性ドーパミン産性ニューロンの移植により防ぐことができる。新皮質の損傷後に悪化する複雑な認知機能は、胚性皮質細胞の移植により、部分的に回復させることができる。対象の方法を用いることで、培養内の増殖状態を調節するか、又は胎児組織、特に神経幹細胞が用いられる場合には、その幹細胞の分化の速度を変化させることができる。
【０１６２】
本発明に有用な幹細胞は、一般的に知られている。例えば、複数の神経堤細胞が同定されており、このうちの数種類は、多分化能を示し、恐らく特定の系統に入っていない神経堤細胞を代表するものと考えられ、残りの種類は、感覚ニューロン等、唯１種類の細胞のみを生み出すことが可能であり、恐らく特定の系統に入った前駆細胞を代表するものと考えられる。本発明の方法において、このような幹細胞の培養に用いられるヘッジホッグアンタゴニストの役割は、特定の系統に入っていない前駆細胞の分化を調節すること、又は特定の系統に入った前駆細胞の発生学的運命の更なる限定を調節すること、又は特定の系統に入った前駆細胞の発生学的運命の更なる限定を、最終分化したニューロン細胞になるように調節すること、になるであろう。例えば、本発明の方法をインビトロで用いて、神経堤細胞からグリア細胞、シュワン細胞、クロム親和細胞、コリン作動性ニューロン、交感ニューロン又は副交感ニューロン、並びにペプチド作動性ニューロン及びセロトニン作動性ニューロンへの分化を調節することができる。ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、単独、又は神経前駆細胞の特定の分化の運命をより重点的に促進するように作用する他の神経栄養因子との組合せで用いることができる。
【０１６３】
神経の増殖と分化の調節
本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを細胞培養物の移植と組み合わせて使用することに加え、本発明の別の局面は、中枢神経系と末梢神経系の両方のニューロン及び他の神経細胞の増殖状態を調節するためのヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの治療用途に関する。ヘッジホッグ経路の構成成分（例えば、ｐｔｃｈ、ヘッジホッグ、及びｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）が、神経系の発生過程及び恐らく成体の状態においても神経分化を調節しる能力は、特定の場合において、対象のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストが、正常細胞の維持、機能の発揮、及び老化に関する成体ニューロンの調節；化学的又は機械的な損傷を受けた細胞の修復と再生工程；並びに特定の病理学的状態における神経変性の治療を容易化することが期待できる。上記の見解に照らし、本発明では、特に、以下によって生じる神経学的状態の治療（例えば、予防、症状の軽減等）への対象方法の応用が意図されている：（ｉ）外傷、化学的損傷、血管の創傷及び血管（脳卒中により生じる虚血等）、並びに感染性／炎症性損傷及び腫瘍誘導性の損傷；（ｉｉ）パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症等の神経系の老化、並びに脊髄小脳変性症；並びに（ｉｖ）多発性硬化症を含む、神経系の、又は神経系を患う慢性の免疫疾患。
【０１６４】
適切な場合には、対象の方法を、中枢神経及び末梢神経の損傷の修復のための神経プロテーゼの製造に用いることができる。特に、つぶれた又は切断された軸索が、プロテーゼ装置の使用により管状となっていない場合、そのプロテーゼ装置にヘッジホッグアンタゴニストを添加して樹状突起の増殖速度と再生を調節することができる。代表的な神経誘導チャネルが、米国特許第５，０９２，８７１号及び同第４，９５５，８９２号に記載されている。
【０１６５】
別の態様では、中枢神経系で起こるであろう、新生物又は過形成の変態の治療に対象方法を用いることができる。例えば、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを利用して、このような変態した細胞に分裂終了又はアポトーシスを生じさせることもできる。従って、本発明の方法は、例えば、悪性の神経膠腫、髄膜腫、髄芽腫、神経外胚葉性腫瘍及び上衣細胞腫の治療の一部として用いることができる。
【０１６６】
神経癌
ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、悪性の髄芽腫及び他の原発性のＣＮＳの悪性の神経外胚葉性腫瘍の治療計画の一環として用いることができる。原発性脳腫瘍である髄芽腫は、子供に最も高頻度に発症する脳腫瘍である。髄芽腫は、後頭蓋窩に生じる原発性の神経外胚葉性腫瘍（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ  ｔｕｍｏｒ：ＰＮＥＴ）である。髄芽腫は、全ての小児脳腫瘍の約２５％を占める。組織学的には、これらは、通常、真性ロゼット（ｔｒｕｅ  ｒｏｓｅｔｔｅ）様に配置される小円形細胞の腫瘍であり、星状細胞、上衣細胞又はニューロンへの一定の分化を示す場合がある。ＰＮＥＴは、松果体（松果体芽細胞腫）及び大脳を含む、脳の他の領域に生じる可能性がある。テント上の領域に生じたＰＮＥＴは、一般的に、他の領域の生じたＰＮＥＴと比べて悪い予後を示す。
【０１６７】
髄芽腫／ＰＮＥＴは、切除後において、ＣＮＳのあらゆる場所で再発することが知られており、骨に転移する場合もある。従って、治療前評価には、「下がった転移（ｄｒｏｐｐｅｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）」の可能性を排除するため、脊髄を検査することも含まれる。この目的のため、ミエログラフィーがガドリニウム増幅性ＭＲＩに大きく取って代わられ、ルーチンなプロセスとして、手術後にＣＳＦサイトロジー（ＣＳＦ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ）が得られる。
【０１６８】
別の態様では、対象の方法は、上衣細胞腫の治療プログラムの一環として用いられる。上衣細胞腫は、子供の小児脳腫瘍の約１０％を占める。これらは、脳室の上衣層から生じる腫瘍であり、微視的には、ロゼット、環状構造及び脈管周囲ロゼットを形成している。上衣細胞腫を患う５１人の子供のＣＨＯＰシリーズにおいて、３／４が組織学的に良性であった。約３分の２が、第４心室の領域から生じていた。３分の１が、テント上の領域に発症していた。ＳＥＥＲデータ並びにＣＨＯＰから得たデータが示すように、発症のピークは、誕生から４歳の間である。年齢の中央値は、約５歳である。この疾患を患う子供の多くが、赤子であるため、多くの場合、集学的治療を必要とする。
【０１６９】
非神経細胞の培養
ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、非神経組織の製造及び維持に関する細胞培養並びに治療法で用いることができる。このような使用は、別の脊椎動物の器官発生経路、例えば、内皮のパターン形成及び、中胚葉及び内胚葉の分化の形態形成シグナルにおけるヘッジホッグシグナル構成要素（例えば、ｐｔｃｈ、ヘッジホッグ、ｓｍｏ等）の関与の結果意図されるものである。ヘッジホッグシグナル、特に、ｐｔｃ、ヘッジホッグ及びｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄは、消化管、肝臓、肺及び他の原始腸管由来の器官の形成に関与する幹細胞の発生の調節に関わっている。Ｓｈｈは、内胚葉から中胚葉への誘導性シグナルであり、腸管の形態形成に決定的に重要である。従って、例えば、本発明の方法のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、正常細胞の複数の分泌機能を示すことが可能な人工肝臓の発生及び維持の調節に用いることができる。代表的な態様では、対象方法を用いて、正常肝臓の機能を調節することができる。代表的な態様では、対象方法を用いて、消化管の幹細胞の増殖と分化を制御して、細胞外マトリックスの構成に使用可能な、又は生体適合性ポリマー内に封入可能な肝細胞培養物を形成し、移植可能な人工肝臓と体外人工肝臓の両方を形成することができる。
別の態様では、対象方法を治療に使用して、物理的、化学的又は病理学的な障害を受けたこのような器官を調節することができる。例えば、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを含む治療法を、部分的な肝臓摘出（ｈｅｐａｃｔｅｃｔｏｍｙ）の後の肝修復に使用することができる。
【０１７０】
別の態様では、対象方法を用いて、インビボ及びインビトロの両方において膵臓組織の増殖及び／又は分化を制御又は調節することができる。胚性腸管からの膵臓と小腸の発生は、腸管の内胚葉細胞と中胚葉細胞間の細胞間シグナルに依存する。特に、腸の中胚葉から平滑筋への分化は、隣接する内胚葉細胞からのシグナルに依存することが示唆されている。胚性後腸内の内胚葉からのシグナルの１つの媒体候補は、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）である。Ａｐｅｌｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７：８０１−４（１９９７）。Ｓｈｈ遺伝子は、膵芽（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｂｕｄ）の内胚葉を除く胚芽（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｂｕｄ）の内胚葉の至るところで発現しており、膵芽の内胚葉では、代わりに膵臓発生初期の必須の調節因子であるホメオドメインタンパク質Ｉｐｆ１／Ｐｄｘ１（インシュリンプロモーター因子１（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ  １）／膵臓十二指腸ホメオボックス１（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｎｄ  ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １））が高レベルで発現している。Ｉｐｆ１／Ｐｄｘ１を用いて、発生過程にある膵臓上皮内で選択的にＳｈｈを発現させている。Ｉｐｆ１／Ｐｄｘ１−Ｓｈｈトランスジェニックマウスの膵臓中胚葉は、平滑筋とカハル（膵臓の間葉や脾臓よりもむしろ腸に特徴的な細胞）の間質細胞へ発達した。Ａｐｅｌｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．、上記。更に、Ｓｈｈに曝露した膵臓の体外移植組織は、内皮由来のＳｈｈコントロールと同様の発現を示し、腸管の異なる領域において隣接する中胚葉の運命を経た。別の態様では、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを用いて、間葉系細胞及び中葉系組織由来の肝細胞を含む、非内胚葉系幹細胞由来の内胚葉組織の発生を変化させる。幹細胞を単離可能な代表的な中胚葉系組織には、骨格筋、心筋、腎臓、軟骨及び脂肪が含まれる。
【０１７１】
膵臓の状態／疾患
本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストが、治療上の利点を提供可能な種々の病理学的な細胞増殖及び分化に関する膵臓状態が存在する。より具体的には、このような治療上の利点は、異常なインシュリン発現の修正、又は膵臓細胞の分化の変更に関する。しかしながら、より一般的には、本発明は、膵臓細胞を対象ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストと接触させることによる、膵臓細胞の分化状態の促進及び／又は維持、生存率の向上及び／又は増殖に対する作用の方法に関する。例えば、本発明では、膵臓組織の秩序だった空間配置の形成におけるｐｔｃ、ヘッジホッグ及びｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄの明らかな関与に鑑み、対象方法が、インビトロ及びインビボの両方で、このような組織を作り出し、そして／又は維持する技術の一部として用いられることを意図している。例えば、ヘッジホッグシグナル伝達の調節は、β膵島細胞の発生及び維持、及び、恐らく消化管、脾臓、肺、尿生殖器官（例えば膀胱）、並びに原子腸管由来の他の器官等の非膵臓組織からのβ膵島細胞の発生及び維持も含む細胞培養と治療方法の両方に用いることができる。
【０１７２】
特定の態様では、本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、膵臓組織を患う過形成及び新生物疾患、特に、膵臓細胞の異常増殖を特徴とする過形成及び新生物疾患の治療に用いることができる。例えば、膵臓癌は、膵臓細胞の異常増殖を特徴としており、膵臓のインシュリン分泌能に変化をきたす可能性がある。例えば、肝臓癌等の、特定の膵臓の過形成は、β細胞の機能不全又は膵島細胞の量の減少に起因する低インスリン血症を生じさせる可能性がある。更にまた、異なる時点におけるヘッジホッグシグナル伝達特性の操作は、インビボ及びインビトロの両方で脾臓組織を再構築／修復するための戦略の一環として有用であろう。ある態様では、本発明は、膵臓組織の発生を制御するｐｔｃ、ヘッジホッグ及びｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄの明確な関与を利用する。別の態様では、対象のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを治療に用いて、物理的、化学的又は病理学的傷害後に膵臓を制御することができる。更に別の態様では、対象方法を細胞培養技術に応用することが可能であり、特に、対象方法を用いて、プロテーゼの膵臓組織装置の最初の統合を促進することができる。例えば、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの使用等により、膵臓組織の増殖と分化を操作することにより、培養組織の特徴をより慎重に制御するための手段を提供することができる。代表的な態様では、対象方法を用いて、例えば、米国特許第４，８９２，５３８号、同第５，１０６，６２７号、同第４，３９１，９０９号及び同第４３５３，８８８号に記載されるような封入装置に使用可能な、β膵島細胞を要するプロテーゼ装置の生産を増大させることも可能である。膵島の初期前駆細胞は、多能性であり、これらが現れた時点から明確に全ての膵島特異的遺伝子を共活性化させる。発生がすすむにつれて、インシュリン等の膵島特異的ホルモンの発現が、成熟した膵島細胞に特徴的な発現パターへと制限されていく。しかしながら、成熟膵島細胞の表現型は、培養において不安定であり、成熟したβ細胞においても胚の特徴が再出現することが観察される場合もある。対象のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを用いることにより、細胞の分化経路又は増殖指標を制御することができる。
【０１７３】
更にまた、膵臓組織の異なる段階における操作は、人工膵臓の移植と併せて用いることができる。例えば、組織分化に影響を及ぼすヘッジホッグ機能の操作は、移植片の生存能を維持するための手段として用いることができる。
【０１７４】
本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを用いて、例えば、気腫の治療のように、肺組織の再生を調節することができる。Ｓｈｈは、インビボで肺の間葉系細胞の増殖を調節することが報告されている。Ｂｅｌｌｕｓｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４：５３（１９９７）．
【０１７５】
細胞増殖性疾患、腫瘍及び癌
本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを用いて、肺癌及び肺腺癌、並びに肺上皮に関する他の増殖性疾患を治療することができる。ヒトの肺扁平上皮癌細胞と腺癌細胞内でＳｈｈが発現されていることが知られている。Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３８：６５８（１９９７）。Ｓｈｈの発現は、ヒトの胚扁平上皮がん組織においても検出されているが、同じ患者の正常な肺組織内では検出されていない。また、Ｓｈｈが癌細胞へのＢｒｄＵの取り込みを促進して、その細胞増殖を促進する一方で、抗Ｓｈｈ−Ｈがそのような増殖を阻害したことが観察された。これらの結果から、ｐｔｃ、ヘッジホッグ、及び／又はｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄが、このように編成した肺組織の細胞増殖に関与することが示されており、従って、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを用いることで、肺癌及び肺腺癌、並びに肺上皮に関する他の増殖性疾患を治療できることが示されている。
【０１７６】
本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを用いて、ヘッジホッグシグナルが腫瘍の存在又は病因と関連する腫瘍を治療することができる。このような腫瘍には、これらに限定される訳ではないが、以下が含まれる：ゴーリン症候群関連腫瘍（例えば、髄芽腫、髄膜腫等）、ｐｔｃノックアウトマウスに明らかな腫瘍（例えば、血管腫、横紋筋肉腫等）、ｇｌｉ−１増幅により生じる腫瘍（例えば、グリア芽細胞腫、肉腫等）、Ｓｍｏ機能不全により生じる腫瘍（例えば、基底細胞癌等）、ｐｔｃホモログのＴＲＣ８と関連する腫瘍（例えば、腎癌、甲状腺癌等）、Ｅｘｔ−１関連腫瘍（例えば、骨肉腫等）、Ｓｈｈ誘導性腫瘍（例えば、肺癌、軟骨肉腫等）、並びに、その他の腫瘍（例えば、乳癌、尿生殖器の癌（例えば、腎臓、膀胱、尿管、前立腺等）、副腎癌、胃腸の癌（例えば、胃、腸等）。
【０１７７】
本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを用いて、複数の形態の癌を治療することもできる。このような癌には、これらに限定される訳ではないが、以下が含まれる：前立腺癌、膀胱癌、胆道癌、肺癌（小細胞癌と非小細胞癌を含む）、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、乳癌、子宮頸癌、子宮内膜癌又は他の子宮癌、卵巣癌、精巣癌、陰茎の癌、膣癌、尿道の癌、胆嚢癌、食道癌、又は膵臓癌。更なる癌の種類には、骨格筋又は平滑筋の癌、胃癌、小腸の癌、唾液腺の癌、肛門の癌、直腸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、下垂体癌、及び鼻咽腔癌が含まれる。本発明のヘッジホッグアンタゴニストで治療可能な代表的な更なる癌の形態には、ヘッジホッグ発現細胞を含む癌が包含される。本発明のヘッジホッグアンタゴニストで治療可能な更なる代表的な癌の形態には、ｇｌｉ発現細胞を含む癌が包含される。ある態様において、癌は、ｐａｔｃｈｅｄ−１の変異によって特徴付けられることはない。
【０１７８】
骨格組織及び結合組織：
本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、インビトロでの、骨片形成幹細胞等からの骨格組織の発生、並びに骨格組織欠損のインビボでの処置に用いることができる。より具体的には、このようなヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを用いて、軟骨形成及び／又は骨形成を調節することができる。「骨格組織欠損」とは、骨又は結合組織の回復が望まれるいずれかの部位における骨又は他の骨格結合組織の欠損を意味しており、外科手術による処置、腫瘍の除去、潰瘍形成、移植、骨折、又は他の外相若しくは変性状態のいずれによって生じる欠損であるかは問われない。
【０１７９】
本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、例えば、退行性の摩耗により生じた軟骨組織の欠損又は損傷の回復等、結合組織に軟骨機能を回復させる方法に用いることができる。より具体的には、関節炎（変形性関節症及び慢性関節リウマチ）及び／又は外傷により生じる退行性の摩耗‐断裂した半月板組織の除去、半月板切除術、断裂した靭帯による関節の弛み、関節の整列不良、骨折等。このような修復方法は、形成外科又は再建手術並びに歯根膜手術のような軟骨マトリックスの再構築に用いることもできる。この修復方法は、例えば、半月板、靭帯又は軟骨の外科的修復の後に、先の処置の増強又は修正をするために適用することもできる。更にまた、この修復方法を、外傷後に十分早く適用した場合には、変性疾患の発症又は増悪を防ぐことができる。
【０１８０】
本発明のある態様においては、組織内に包埋された軟骨細胞の分化速度及び／又は増殖速度を調節することで結合組織内の軟骨修復反応を制御するため、修復方法は、増殖罹患した結合組織を、治療上有効量のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストで処置することを含む。関節軟骨、関節間軟骨（半月板）、肋軟骨（真肋と胸骨を繋ぐ）、靭帯及び腱等の結合組織は、特に対象方法を用いた再構築治療及び／又は再生治療における処置に適している。本明細書で用いる場合、再生治療には、変性が、明らかであり治療、並びに、変性がその初期段階にあるか又は切迫している組織の防止的又は予防的治療が含まれる。
【０１８１】
別の態様では、修復方法は、ヒザ、くるぶし、肘、臀部、こし、中手指節関節若しくはいずれかの手の指、足の指、又は顎関節等のジアースロイダル関節（Ｄｉａｒｔｈｒｏｉｄａｌ  ｊｏｉｎｔ）の軟骨の処置における治療的介入の一貫として用いることができる。治療は、関節の半月板、関節軟骨、又はその両方に関するものであってもよい。更に例示するならば、対象方法を用いて、外傷（例えば、スポーツによる損傷又は過剰な摩耗）又は変形性関節症の結果生じる可能性のある、ヒザの退行性疾患を治療することができる。対象アンタゴニストは、例えば、関節鏡ニードル等を用いて、関節内に注射として投与することができる。ある場合には、処置する組織との薬剤のより長時間に亘る規則的な接触を可能にするため、注射される薬剤は、ハイドロゲル又は上記に記載する徐放性媒体の形態にあってもよい。
【０１８２】
別の態様では、修復方法をプロテーゼ軟骨装置の製造の促進とその移植に応用することができる。治療法の改善に対する要求により、研究の対象が、コラーゲン‐グリコサミノグリカン鋳型を基礎とする新たな軟骨の創作（Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｄ．２５２：１２９（１９９０））、単離された軟骨細胞（Ｇｒａｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．７：２０８（１９８９）；Ｔａｋｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  ２：４４９（１９８７））及び天然ポリマー又は合成ポリマーに結合した軟骨細胞（Ｗａｌｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｔ．Ｓｕｒｇ．７１Ｂ：７４（１９８９）；Ｖａｃａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｓｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．８８：７５３（１９９１）；ｖｏｎ  Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２５：３２９（１９９１）；Ｆｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２７：１１（１９９３）；Ｕ．Ｓ．Ｐ．５，０４１，１３８）に向かって誘導された。例えば、軟骨細胞は、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、アガロースゲル、又はポリマー骨格の加水分解により時間を経て無害のモノマーへと分解される他のポリマーのようなポリマーから形成される生分解性、生体適合性の多孔性スキャフォールド又はマトリックス上での培養において増殖させることが可能である。マトリックスは、移植を行うまで、細胞が十分な栄養とガス交換をできるように設計されている。細胞は、移植される細胞にとって十分な細胞量と密度に達するまで、インビトロで培養することができる。マトリックスの１つの利点は、マトリックスは、その最終産物が、患者自身の罹患した生体部分（例えば、耳、鼻等）に近似するように、個別の基準に基づいて所望の形状に鋳造又は成形することが可能であり、又は、関節内への移植時において、操作が可能なフレキシブルマトリックスを用いることもできることである。
【０１８３】
更なる態様において、軟骨細胞の分化速度と培養内での肥大軟骨細胞の形成を管理するため、移植片を、その培養工程の特定の段階にヘッジホッグキナーゼアンタゴニストと接触させてもよい。
【０１８４】
更なる態様においては、移植したマトリックスを能動的に再構築して、その意図する機能により適したものにするために、移植した装置をヘッジホッグキナーゼアンタゴニストで処理する。先に記載したように、あらゆる人工的移植物は、マトリックスが移植された実際の機械的環境に適した設定で誘導されていないという欠点をもち合わせる。修復方法によりマトリックス中の軟骨細胞を制御する能力により、移植片が、その配置される予定の組織に類似する特性を獲得することが可能になる。
【０１８５】
ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、動物内の骨格組織が欠損した部位での骨の発生（骨形成）方法に用いることができる。ｉｎｄｉａｎ  ヘッジホッグは、最終的に骨芽細胞に置き換わる肥大軟骨細胞と特に関連があることから、本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの使用を通じで、ｉｎｄｉａｎ  ヘッジホッグ機能を調節することができる。例えば、本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの投与を、対象内の骨量減少速度の調節方法の一環として用いることができる。ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを含む製剤を用いて、例えば、骨形成の「モデル」の形成における軟骨内骨形成を制御することができる。
【０１８６】
精子形成及び男性避妊
本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを用いて、精子形成を調節することができる。ヘッジホッグタンパク質、特にＤｈｈは、精巣の生殖細胞の分化及び／又は増加及び維持に関与することが示されている。Ｄｈｈ発現は、Ｓｒｙ（精巣決定遺伝子）の活性化の直後にセルトーリ細胞前駆細胞内で開始され、成人になるまで精巣内で持続する。Ｄｈｈ−ｎｕｌｌ変異体を持つオスのマウスは、生存は可能であるが、成熟精子が全く存在しないため、生殖能を有しない。異なる遺伝的背景にある発生過程の精巣の研究により、Ｄｈｈは、精子形成の初期段階及び後期段階の両方を調節していることが示されている。Ｂｉｔｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６（３）：２９８−３０４（１９９６）。好ましい態様では、本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを、避妊薬として用いることができる。
【０１８７】
上皮組織
本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、上皮組織を侵す疾患の治療（予防を含む）にも用いることができる。一般的に、このような治療には、治療する上皮組織の増殖状態を変化させるのに効果的な量のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを投与することが含まれる。投与方法と投与計画は、治療すべき上皮細胞（例えば、皮膚、粘膜、腺等）に応じて変更されることになる。具体的な局面では、この方法を用いて、上皮由来組織のＳｈｈ誘導性分化の誘導を制御し、そして／又は増殖を阻害することができる。従って、本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、上皮組織に関する過形成及び／又は新生物状態の治療方法に用いることができる。
【０１８８】
（ｉ）創傷治癒
本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、創傷治癒を促進する方法に用いることができる。具体的には、「創傷治癒を促進する」とは、治療を行わない場合の同様の創傷の治癒との比比較における、治療の適用の結果としての、より効果的な創傷治癒を意味する。「創傷治癒を促進する」とは、方法が、とりわけ、ケラチノサイトの増殖及び／又は成長を制御すること、又は創傷が、より少ない瘢痕化、より少ない創傷収縮、より少ないコラーゲン沈着及びより多くの表面積で治癒することを意味する場合もある。特定の場合においては、「創傷治癒を促進する」とは、特定の創傷治癒方法を本発明の方法と一緒に用いた場合に、成功率（例えば、皮膚移植片の取込み率等）が向上することを意味する場合もある。
【０１８９】
再建手術技術における目覚ましい進歩にもかかわらず、瘢痕化は、治癒した皮膚の正常機能の再獲得及び見た目において大きな障害となる場合がある。このことは、特に、手や顔のケロイド又は過形成性瘢痕のような病理学的瘢痕が、機能的障害や物理的変形を生じる場合に事実となる。最も過酷な状況では、このような瘢痕化は、心理社会的な苦痛及び経済的窮乏を伴う生活を突如として引き起こす場合がある。創傷治癒には、止血、炎症、増殖及び再構築の段階が含まれる。増殖段階は、線維芽細胞並びに内皮及び上皮細胞の増加を伴う。創傷の閉鎖を管理し、そして／又は瘢痕組織の形成を最小化するため、本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを適用することにより、創傷内及び創傷周囲の上皮細胞の増殖を調節することができる。
【０１９０】
また、本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを用いて、例えば、放射線療法及び／又は化学療法によって生じるような口腔内、口腔傍及び粘膜の潰瘍を治療することもできる。このような潰瘍は、通常、化学療法又は放射線療法から数日以内に発症する。多くの場合、治療を欠くと、損傷部位周辺の炎症組織の増加を招き、表面上皮の連続性が喪失することになる。上皮の完全性が喪失した結果として、身体は、潜在的な２次的感染に晒されることになる。このような潰瘍が消化管中に増加した場合、日常的な食物や水の摂取が苦痛となり、下痢及びその悪化因子を伴うことになる。本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、損傷を受けた上皮の異常な増殖と分化を低下させ、それによって、これに続く炎症現象の重症度を低下させる助けをすることにより、このような潰瘍の治療法となり得る。
【０１９１】
（ｉｉ）角膜とレンズの修復
水晶体嚢外摘出術の術後合併症を防ぐため、本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを用いて、レンズ上皮細胞の増殖を阻害することができる。白内障は、難治性の目の疾患であり、多くの研究が行われている。しかしながら、現状においては、この疾患の治療効果は、主として外科的手術よって得られるのみである。白内障の手術は、長い期間に亘って適用されており、種々の手術法が試みられてきた。水晶体嚢外摘出術は、白内障の除去するための選択法となった。嚢内摘出に対する上記技術の主な医療上の利点は、嚢胞様黄斑浮腫（ａｐｈａｋｉｃ  ｃｙｓｔｏｉｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｅｄｅｍａ）と網膜剥離の発生率が低いことである。嚢外摘出は、現在、殆どの事例において選択されるレンズと考えられる、後眼房型眼内レンズの移植にも必要である。
【０１９２】
しかしながら、水晶体嚢外摘出の不都合な点は、しばしば後発白内障とも呼ばれる後房レンズの不透明化の発生率が高いことであり、３年間の手術において５０％以下の事例で生じる可能性がある。後発白内障は、嚢外レンズ摘出後に残存する赤道及び前眼房レンズ（ｅｑｕａｔｏｒｉａｌ  ａｎｄ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃａｐｓｕｌｅ  ｌｅｎｓ）の上皮細胞の増殖により生じる。これらの細胞は、増殖することで、Ｓｏｍｍｅｒｌｉｎｇ環（Ｓｏｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｒｉｎｇ）を生じさせ、後眼房に沈着して生じる線維芽細胞と共に、後眼房の不透明化を生じさせ、視覚に干渉することになる。したがって、このような後発白内障は予防することが好ましい。このような「後発」又は２次的な白内障形成を阻害するため、対象方法は、残存するレンズ上皮細胞の増殖阻害手段を提供する。例えば、レンズ除去後に目の前眼房に、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニスト製剤を含む溶液を点眼することにより、これらの細胞を静止状態に留まるように誘導することができる。更にまた、この溶液は、目の前眼房に点眼した場合に、最小の有効投与量を提供して、一定の特異性をもって被膜下上皮の増殖を阻害するように浸透圧を平衡化させることもできる。
【０１９３】
本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、例えば、眼球表面の上皮増殖低下又は平坦細胞癌のような眼球上皮疾患等、角膜上皮細胞の増殖により特徴づけられる角膜疾患（ｃｏｒｎｅｏｐａｔｈｙ）の治療にも用いることができる。ヘッジホッグタンパク質は、脊椎動物網膜内での有糸分裂誘発と光受容体分化を調節することが証明されており（Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：６２７７（１９９７））、Ｉｈｈは、網膜前駆細胞の増殖及び光受容体の分化を促進する色素上皮由来の候補因子である。同様にして、周産期のマウスの網膜細胞の培養を、Ｓｈｈタンパク質のアミノ末端断片で処理すると、杆状光受容体においてブロモデオキシウリジンを取り込む細胞、アマクリン細胞及びミュラーグリア細胞の割合が増加することが、Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４：３６３（１９９７）に示されている。このことは、Ｓｈｈが網膜前駆細胞の増殖を促進することを示しており、本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストが、このようなＳｈｈ媒介性増殖を調節することが期待されることを意味している。従って、本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを網膜細胞の族職性疾患の治療に用いて、光受容体分化を制御することが可能である。
【０１９４】
（ｉｉｉ）発毛
本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを用いて発毛を調節することも可能である。毛は、主として、頑強で不溶性のタンパク質であるケラチンから構成されている。個々の毛は円柱状の長幹と毛根を含み、皮膚のフラスコ状の凹みである小胞に含まれている。小胞の底部には、乳頭と呼ばれる指状の突起物が含まれ、乳頭は、そこから毛が成長する結合組織から成り、この結合組織を通じて血管から細胞に栄養が供給される。長幹は、皮膚表面から外に向かって伸びる部分であり、毛根は、既に記載したように、毛の埋め込まれる部分である。毛根の基底部は、乳頭上に存在する毛球へと広がる。毛が作られる細胞は、小胞の毛球内で増殖する：これらは、細胞が小胞内で増殖するにつれて、繊維の形態で押し出される。毛の「成長」とは、分裂細胞による毛の繊維の形成と伸長を指す。
【０１９５】
当該技術分野においてよく知られるように、通常の毛の周期は、３段階に分けられる：成長期、退行期及び休止期である。活性期（成長期）には、真皮乳頭の表皮幹細胞の分裂が早い。娘細胞は上に向かって移動し、分化して、その毛の同心円層を形成する。移行期の退行期は、小胞内の幹細胞の有糸分裂の休止を特徴とする。休止段階は、休止期として知られており、毛は、頭皮の下で成長する新たに出現する毛が、小胞から休止期の長幹を押し出すまで、数週間も頭皮内に留まっている。上記のモデルから、毛細胞に分化する分裂幹細胞のプールが大きい程、より発毛が生じることが明らかとなった。従って、これらの幹細胞の増殖を増強又は阻害することにより、それぞれ発毛を増加又は低下させる方法を実施することができる。
【０１９６】
ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、切るか、剃るか、又は脱毛による除去に代わり、又はこれらとの組合せで、ヒトの毛の増殖を低下させる方法に用いることができる。例えば、本発明の方法は、多毛症等の、異常に迅速又は重度の発毛を特徴とする毛髪病の治療に用いることができる。代表的な態様では、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを用いて、異常な毛深さを特徴とする障害である男性型多毛症を管理することができる。また、対象の方法は、脱毛効果の期間を延長する方法も提供することができる。
【０１９７】
更にまた、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは多くの場合上皮細胞に対して、細胞毒性というよりはむしろ細胞増殖抑制性であるため、このような薬剤を用いて、例えば、放射線誘導性の死といった効力のために細胞周期のＳ期への細胞進行を要する細胞毒性薬剤から毛包細胞を保護することができる。ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストで処理することで、例えば、細胞のＳ期への進入を防ぐことにより、毛包細胞を静止状態にさせ、それによって、毛包細胞の有糸分裂のカタストロフィー又はプログラム化された細胞死を防ぐことによる保護が提供される。例えば、既に毛髪を喪失した、化学療法又は放射線療法を受けている患者に、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを用いることもできる。このような治療中の細胞周期の進行を阻害することにより、対象治療は、一方で、静止状態の不存在による細胞死プログラムの活性化を生じる可能性のある、死から毛包細胞を保護することができる。ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの治療が完了した後には、本発明の方法を取り除き、それに付随して毛包細胞増殖の阻害を解くこともできる。
【０１９８】
本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、脱毛性毛包炎、網状痕跡性紅斑性毛嚢包炎又はケロイド性毛包炎（ｋｅｌｏｉｄ  ｆｏｌｌｉｃｕｌｉｔｉｓ）等の毛包炎の治療に用いることができる。例えば、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの美容用製剤を偽性毛嚢炎（髭剃りに伴って、首の顎下領域に最もよく発生する慢性疾患であり、紅斑様の丘疹と包埋された毛を含む膿疱から成る病変を特徴とする）の治療において局所的に適用することもできる。
【０１９９】
本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、ヒトの毛髪の成長の調節方法に用いることができる。Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４：８５５−８６４（１９９９）では、新生児の皮膚内でのＳｈｈ活性の上方制御は、静止中の毛包を成長期に進入させ、続いて発毛を生じさせるように誘導する生物スイッチとして機能することが報告されている。Ｓａｔｏらは、アデノウイルスベクターＡｄＳｈｈを用いて、マウスＳｈｈ  ｃＤＮＡを生後１９日目のＣ５７ＢＬ／６マウスの皮膚に導入している。処理した皮膚では、Ｓｈｈ、Ｐａｔｃｈｅｄ及びＧｌｉ−１のｍＲＮＡ発現の増加が示された。ＡｄＳｈｈを受容したマウスでは、毛包のサイズとメラニン形成が増加し、毛髪特異的なケラチンｇｈＨｂ−１とメラニン合成関連チロシナーゼのｍＲＮＡが蓄積していたことから、成長期への加速が確認された（コントロールでは確認されなかった）。最後に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＡｄＳｈｈを皮膚に投与した領域において、処置から数週間後に、新たな育毛発生の顕著な促進を示したが、コントロールベクターで処理した領域又は非処理領域では示さなかった。６月後、ＡｄＳｈｈ処置した皮膚は、正常な毛と正常な皮膚の形態を示した。従って、本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、Ｓｈｈ誘導性の発毛の制御又は調節に有用であろう。
【０２００】
（ｉｖ）過剰な上皮増殖
本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、過形成状態（例えば、角化症）及び高い増殖速度を特徴とする表皮の腫瘍状態（例えば、扁平細胞癌）の治療方法に用いることができる。また、対象方法は、皮膚を患う自己免疫疾患の治療、特に、乾癬又はアトピー性皮膚炎等の、表皮の病的な増殖及び／又は角質化を伴う皮膚病の治療にも用いることができる。局所的な皮膚の異常増殖を特徴とする通常の皮膚病（例えば、乾癬、扁平細胞癌、光線性角化症等）も、本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの適用により治療できることが期待される。
【０２０１】
ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの製剤は、皮膚細胞の異常増殖を生じさせる角質化と関連した皮膚病の治療に適しており、このような疾患は、炎症性成分又は非炎症性成分を特徴とする場合がある。静止状態又は分化を促進する本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを用いて、皮膚、粘膜又は舌等の種々の形態の乾癬を治療することができる。上記のように、乾癬は、典型的には、顕著な増殖活性と、「再生」経路に沿った分化を示す表皮ケラチノサイトを特徴とする。本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを用いた治療を用いて、病理学的な表皮活性を逆転させることが可能であり、また、この疾患の持続的寛解の基礎を提供することができる。
【０２０２】
角化性病変を特徴とする他の種々の疾患も、本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを用いた治療の候補である。例えば、光線性角化症は、太陽光に曝されて、照射された皮膚上に生じる、表層の炎症性の前悪性腫瘍である。現行の治療には、切除と冷凍外科手術が含まれる。これらの治療は、苦痛を伴うが、美容上許容不可能な瘢痕を作り出す場合がある。従って、光線性角化症等の角化症の治療には、損傷部位の表皮細胞／類表皮細胞の過剰増殖を阻害するのに十分な量のヘッジホッグアンタゴニスト組成物を適用することが含まれる。
【０２０３】
（ｖ）アクネ
アクネは、本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストにより治療可能な更なる別の皮膚病を代表する。１０代及び若い成人に最も頻繁に生じる多因性疾患である尋常性ざ瘡は、顔及び体幹上半部の炎症性損傷及び非炎症性損傷の出現を特徴とする。尋常性ざ瘡に生じる基本的な欠陥は、過活性な皮脂腺の管の角質化過剰である。角質化過剰により、皮膚と小胞の微生物の正常な移動がブロックされ、その際に細菌のＰｒｏｐｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、並びに酵母のＰｉｔｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｏｖａｌｅによるリパーゼの放出が促進される。ヘッジホッグキナーゼアンタゴニスト、特に局所用製剤を用いた治療は、例えば、角質化過剰等、損傷を形成するに至る管の移行特徴を防ぐためにも有用であろう。ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを含む治療計画には、更に、抗生物質、レチノイド及び抗男性ホルモン等が含まれていてもよい。
【０２０４】
（ｖｉ）皮膚炎及び他の皮膚病
本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、種々の形態の皮膚炎の治療方法に用いることもできる。皮膚炎は、そう痒性、紅斑性、落屑性で、疱疹を伴い、湿潤性で、亀裂を有するか又は表面が硬い、境界があいまいな損傷を指す記述的用語である。これらの損傷は、広範囲な種々の要因のいずれによっても生じる。最も一般的な種類の皮膚炎は、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎及びおむつ皮膚炎である。例えば、脂漏性皮膚炎は、慢性の、通常そう痒性の皮膚炎であり、種々の領域、特に過剰量の乾燥板状鱗屑の落屑を伴う頭皮に、紅斑性、乾燥、湿潤、又は油脂性の板状鱗屑と黄色く表面が硬いパッチを伴う。対象方法のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、多くの場合慢性であり、通常は湿疹様の皮膚炎である、うっ血性皮膚炎の治療にも用いることができる。光線性皮膚炎は、例えば太陽光線、紫外線、又はＸ線若しくはγ腺照射等の光線照射への曝露に起因する皮膚炎である。本発明によれば、対象の方法を、上皮細胞の望ましくない増殖によって生じた皮膚炎の特定の症状の治療及び／又は予防に用いることができる。これら種々の形態の皮膚炎の治療には、局所的及び全身性のコルチコステロイド、止痒剤及び抗生物質が含まれる。
【０２０５】
対象方法により治療可能な更なる疾患は、ダニ症等、人間以外に特異的な疾患である。
【０２０６】
非標準的なヘッジホッグシグナル
本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを用いて、Ｐａｔｃｈｅｄ−Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄレセプター複合体及びＧｌｉ転写因子から独立した非標準的なＳｈｈ経路の活性を調節することができる。最近の報告、Ｊａｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２６１（２）：５２０−５３６（２００３）には、Ｓｈｈを基質（細胞外マトリックス）に固定するか又はトランスフェクション後に神経上皮細胞により生産された場合、神経板体外移植組織は、分散できず、代わりに小型構造体を形成したことが記載されている。Ｓｈｈにより生じる神経上皮細胞の接着能力の変化は、表面のβ１−インテグリンの不活性化とＮ−角へリン媒介性細胞接着の増加の組み合わせによるものと考えられる。固定化されたＳｈｈは、可溶性のＳｈｈと同じ強さで、神経上皮細胞の運動ニューロン及び底板細胞への分化を促進したことから、このような固定Ｓｈｈ媒介性の接着は、既知の（可溶性の）Ｓｈｈ媒介性の誘導機能、有し分裂促進機能、及び栄養機能に抵触又は干渉することはない。神経管の形態発生における接着特性のＳｈｈによる調節は、迅速で可逆性であり、古典的なＰａｔｃｈｅｄ−Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ−Ｇｌｉシグナル伝達を伴うことなく、Ｓｈｈ媒介性の細胞分化から独立しており、識別可能であることが証明されている。Ｓｈｈに誘導される神経上皮細胞の接着特性の変更は、その分化促進作用に起因すると考えることはできないが、今まで説明されていなかった、この組織内でのＳｈｈの新たな機能が解明されたことになる。従って、本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを用いて、Ｐｔｃｈ、Ｓｍｏ、Ｆｕ、Ｓｕ（Ｆｕ）及び／又はＧｌｉから独立した非標準的なヘッジホッグ経路を制御することができる。より具体的には、このようなヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを、好ましくは特定の発生段階において、神経組織又は他の適用可能な組織内での上記機能を混乱させる方法に用いることができる。
【０２０７】
ＩＶ．本発明の組成物及び方法
Ａ．抗ヘッジホッグキナーゼ抗体
ある態様において、本発明は、抗ヘッジホッグキナーゼ抗体の使用を提供するが、抗ヘッジホッグキナーゼ抗体は、ここにおいて、腫瘍又は癌の重症度の判定及び／又は疾病経過の予測において、治療剤、診断剤及び／又は予後剤として有用であろう。このような目的のために使用可能な代表的な抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、２重特異性抗体、及びヘテロ結合抗体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）が含まれる。「抗体」という用語には、場合によっては、抗原結合断片も含まれる。ヘッジホッグキナーゼは、ヘッジホッグシグナル伝達の細胞内成分であるから、本発明の方法では、内部移行抗体（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、又は抗体の細胞内送達用の技術を用いることが好ましい。
【０２０８】
１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、適切な抗原及びアジュバンドを複数回皮下（ｓｃ）注射又は腹腔内（ｉｐ）注射することにより動物内で惹起することが好ましい。適切な抗原を、免疫化する種にとって免疫原性のタンパク質に結合させることが有用な場合もある（特に合成ペプチドを用いる場合）。例えば、抗原は、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介した結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ2、又はＲ1Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここでＲ及びＲ１は異なるアルキル基である）等の二機能性薬剤又は誘導体化剤を用いて、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシ由来チログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに結合させることが可能である。
【０２０９】
動物は、１００μｇ又は５μｇ（それぞれ、ウサギ又はマウス用）のタンパク質又は複合体を３当量のＦｒｅｕｎｄ’ｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔと配合して、この溶液を複数部位に非内注射することにより抗原、免疫原性複合体又は誘導体で免疫する。１ヶ月後に、動物に、最初の量の１／５ないし１／１０の量のＦｒｅｕｎｄ’ｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ中のペプチド又は複合体を、複数部位に皮下注射することにより、ブーストする。７日ないし１４日後に、動物を出血させ、抗体的適用に血清をアッセイする。動物は、滴定がプラトーに達するまでブーストする。複合体は、タンパク質融合体として組換え細胞培養で作製することもできる。また、ミョウバン等の凝集剤を適切に用いることで、免疫反応が促進される。
【０２１０】
２．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製可能であり、又は組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によっても作製可能である。
【０２１１】
ハイブリドーマ法では、マウス又はハムスター等の他の適切な宿主動物を上記のように免疫して、免疫に用いたタンパク質に特異的に結合する抗体を作る若しくは作ることが可能なリンパ球を誘起する。これに代わり、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。免疫後、リンパ球を単離して、ポリエチレングリコール等の適切な融合剤を用いてミエローマセルラインと融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【０２１２】
このように調製したハイブリドーマ細胞を播種して適切な培養培地中で増殖させるが、この培地には、融合していない親ミエローマ細胞（融合パートナーとも呼ばれる）の増殖又は生存を阻害する１又は２種類以上の物質が含まれていることが好ましい。例えば、親ミエローマ細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマの選択用培養培地には、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる物質である、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンが含まれることになる（ＨＡＴ培地）。
【０２１３】
好ましい融合パートナーとしてのミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体生産を助け、そして、非融合親細胞に対して選択的な選択培地に対する感受性を有するミエローマ細胞である。好ましいミエローマセルラインは、ＳａＩｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）から入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍から誘導されたセルライン等のマウスミエローマライン、及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（マナサス、バージニア州、米国）から入手可能なＳＰ−２及びＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞等の誘導体等がある。また、ヒトモノクローナル抗体の作製については、ヒトミエローマセルライン及びマウス−ヒトヘテロミエローマセルラインが記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；及びＢｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０２１４】
ハイブリドーマ細胞を増殖させた培養培地を、その抗原に対するモノクローナル抗体の生産についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により生産されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法、又は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）若しくは酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ結合アッセイにより測定する。
【０２１５】
３．ヒト抗体及びヒト化抗体
本発明の実施に有用な抗ヘッジホッグキナーゼ抗体には、更にヒト化抗体又はヒト抗体が含まれる場合がある。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化型は、キメラ型のイムノグロブリン、イムノグロブリン鎖又はその断片であり（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2又は抗体のその他の抗原結合性部分配列）、これらには、非ヒトイムノグロブリン由来の最小限度の配列が含まれる。ヒト化抗体には、ヒトイムノグロブリン（レシピエント抗体）が含まれ、レシピエントの相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）由来の残基が、マウス、ラット又はウサギ等、所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置換されている。場合によっては、ヒトイムノグロブリンのＦｖフレームワークの残基が、対応する非ヒト由来の残基で置換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体又は移入されたＣＤＲ若しくはフレームワークの配列に見出されない残基を含んでいてもよい。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、これら可変領域では、非ヒトイムノグロブリンに対応するＣＤＲ領域の全部若しくは実質的に全部、及びＦＲ領域の全部若しくは実質的に全部が、ヒトイムノグロブリンのコンセンサス配列である。
ヒト化抗体には、好ましくは、イムノグロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部が含まれ、これは典型的には、ヒトイムノグロブリンの定常領域である［Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及び  Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）］。
【０２１６】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野においてよく知られている。一般的には、ヒト化抗体では、非ヒトの供給源から１又は２個以上のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「輸入」残基と呼ばれ、典型的には「輸入」可変ドメインに由来する。ヒト化は、基本的にはＷｉｎｔｅｒ及びその同僚の方法［Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］に従って、ヒト抗体の対応配列をげっ歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列で置換することにより行うことができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、完全なヒト可変ドメインよりも十分に小さい領域が、非ヒト種由来の対応配列で置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、一定のＣＤＲ残基と、場合によっては一定のＦＲ残基とが、げっ歯類抗体内の類似部位に由来する残基で置換された、ヒト抗体である。
【０２１７】
ヒト抗体の作製に用いるヒト可変領域ドメイン（軽鎖及び重鎖の両方の）の選択は、そのヒト抗体についてヒトの治療用途が意図されている場合には、抗原性とＨＡＭＡ反応（ヒト抗マウス抗体（ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＨＡＭＡ））を低下させるためにも非常に重要である。いわゆる「ベストフィット（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）」法に従えば、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の完全なライブラリーに対してスクリーニングされる。マウスのＶドメイン配列に最も近似するヒトＶドメイン配列が同定され、その中のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）が、ヒト化抗体に受容された（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。別の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列から得られた特定のフレームワーク領域が用いられる。同様のフレームワークを複数の異なるヒト化抗体に用いることができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３））。
【０２１８】
これに代わり、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３［１９９０］）を用いて、免疫を行っていないドナー由来のイムノグロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を作ることができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ  １３又はｆｄ等の糸状バクテリオファージのメジャーコートタンパク質遺伝子又はマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれかに、機能的関連性を持たせてクローニングし、このファージ粒子の表面上に機能的な抗体断片としてディスプレイさせる。糸状粒子にはファージゲノムの１本鎖ＤＮＡコピーが含まれていることから、抗体の機能特性に基づく選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子が選択されることになる。従って、ファージは、Ｂ細胞のいくつかの特性を模倣することになる。ファージディスプレイは、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３）に総説される種々の様式で行うことができる。ファージディスプレイにはＶ遺伝子セグメントの複数の供給源を用いることができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫したマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さくランダムなコンビナトリアルライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫していないヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーを構築することが可能であり、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１），ｏｒ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）に記載される技術に基本的に従えば、抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体を単離することができる。他に、米国特許第５，５６５，３３２号及び同第５，５７３，９０５号を参照。上記で議論したように、ヒト抗体は、インビトロで活性化させたＢ細胞によって作り出すこともできる（米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号を参照）。
【０２１９】
４．抗体断片
特定の状況においては、抗体全体よりも抗体断片を用いる方が有利となる。より小さいサイズの断片であれば、対応する完全長分子と同様の抗原結合特異性を維持しながらも、迅速なクリアランスが可能であり、固形腫瘍への接近が向上する場合もある。
【０２２０】
抗体断片の作製には種々の技術が開発されてきた。古典的には、これらの断片は完全な抗体のタンパク分解処理によって得られていた（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）；及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照）。しかしながら、現在では、これらの断片は、組換え宿主細胞から直接作り出すことができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びｓｃＦｖ抗体断片は全て大腸菌によって発現させて分泌させることが可能であるから、これらの断片を大量に容易に作製することができる。抗体断片は、上記で議論した抗体ファージライブラリーから単離することができる。これに代わり、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を、大腸菌から直接回収して、化学的にカップリングさせることでＦ（ａｂ’）2断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別の方法によれば、Ｆ（ａｂ’）2断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含む、インビボでの半減期が増加したＦａｂ断片及び  Ｆ（ａｂ’）2断片が、米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体断片を作製するための他の技法は、当業者にとって明らかであろう。別の態様では、選択される抗体は、１本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開公報ＷＯ  ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照。ＦＶ及びｓＦｖは、定常領域を欠く完全な結合部位を有する唯一の種である；従って、これらはインビボでの使用において、非特異的結合を低下させることに適している。ｓＦｖのアミノ末端又はカルボキシ末端にエフェクタータンパク質を融合させるために、ｓＦｖ融合タンパク質を構築することもできる。上記の「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編集）を参照。例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるように、抗体断片は「線形抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」であってもよい。このような線形抗体断片は、単一特異性又は２重特異性のものであってもよい。
【０２２１】
５．免疫複合体
本発明は、化学療法剤、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物若しくは動物由来の酵素活性を持つ毒素、又はその断片）、又は放射性同位体（即ち、放射性複合体（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ））等の細胞毒性薬物と結合した抗体を含む免疫複合体にも関係する。
【０２２２】
ａ．化学療法剤
このような免疫複合体の作製に有用な化学療法剤が上記に記載されている。使用可能な酵素活性を示す毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、リストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテセネス（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）が含まれる。放射性物質結合抗体の作製用の種々の放射性核酸が利用可能である。例としては、212Ｂｉ、131Ｉ、131Ｉｎ、90Ｙ、及び186Ｒｅが含まれる。Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオレン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ：ＩＴ）、イミドエステルの２機能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド類（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート類（トリエン２，６−ジイソシアネート等）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）等の種々の２機能性タンパク質結合剤を用いて、抗体と細胞毒性薬剤の複合体が作られる。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製できる。炭素１４で標識した１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に放射性核酸を結合させるための代表的なキレート剤である。国際公開公報ＷＯ  ９４／１１０２６を参照。
【０２２３】
抗体と、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、トリコセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｎｅ）及びＣＣ  １０６５並びにこれらの毒素の毒性活性を示す誘導体といった、１又は２種類以上の低分子毒素との複合体も、ここで意図されている。
【０２２４】
ｂ．マイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）及びメイタンシノイド
１の好ましい態様において、本発明の抗ヘッジホッグキナーゼ抗体（完全長又はその断片）は、１又は２個以上のメイタンシノイド分子と結合している。
【０２２５】
メイタンシノイドは、有糸分裂阻害剤であり、チューブリンの重合を阻害することで作用する。マイタンシンは、最初に、東アフリカの低木Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａから単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。これに続き、特定の微生物も、マイタンシノール（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｌ）及びＣ−３マイタンシノールエステル（Ｃ−３  ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｌ  ｅｓｔｅｒ）等のメイタンシノイドを生産することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成マイタンシノール並びにその誘導体及び類似体は、例えば、以下に開示されている：米国特許第４，１３７，２３０号；同第４，２４８，８７０号；同第４，２５６，７４６号；同第４，２６０，６０８号；同第４，２６５，８１４号；同第４，２９４，７５７号；同第４，３０７，０１６号；同第４，３０８，２６８号；同第４，３０８，２６９号；同第４，３０９，４２８号；同第４，３１３，９４６号；同第４，３１５，９２９号；同第４，３１７，８２１号；同第４，３２２，３４８号；同第４，３３１，５９８号；同第４，３６１，６５０号；同第４，３６４，８６６号；同第４，４２４，２１９号；同第４，４５０，２５４号；同第４，３６２，６６３号；及び同第４，３７１，５３３号（これらの開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる）。
【０２２６】
治療指数を向上させる試みにおいて、マイスタンシン及びマイスタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体に結合された。メイタンシノイド含有免疫複合体とその治療用途が、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号、及び欧州特許ＥＰ  ０  ４２５  ２３５  Ｂ１に開示されており、これらの開示は、参照より本明細書に明示的に組み込まれる。Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３（１９９６）には、ヒト大腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合したＤＭ１という名称のメイタンシノイドを含む免疫複合体が開示されている。この複合体は、培養した大腸癌細胞に対して高い毒性を示すことが判明し、インビボでの腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）には、メイタンシノイドが、ヒト大腸癌セルライン上の抗原に結合するマウス抗体Ａ７又は別のＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子に結合するマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１にジスルフィドリンカーを介して結合された、免疫複合体が記載されている。ＴＡ．１−メイタンシノイド複合体の細胞毒性を、細胞１個当たり、３  ｘ  １０5個のＨＥＲ−２表面抗原を発現するヒト乳癌セルラインＳＫ−ＢＲ−３に対してインビトロで試験している。薬物複合体は、遊離のメイタンシノイド薬物と同程度の細胞毒性を達成したが、その細胞毒性は、抗体分子１個当たりのメイタンシノイド分子数を増加することで、高めることが可能であった。Ａ７−メイタンシノイド複合体は、マウスにおいて低い全身細胞毒性を示した。
【０２２７】
抗ヘッジホッグキナーゼ抗体−メイタンシノイド（例えば、抗ＧＹＫ抗体−メイタンシノイド、抗ＮＥＫ１抗体−メイタンシノイド、抗ＴＴＫ抗体メイタンシノイド、抗ＴＴＢＫ１抗体メイタンシノイド等）、これらの抗原結合断片又はオリゴペプチドを含むヘッジホッグキナーゼ−メイタンシノイドは、抗体、断片又はオリゴペプチドをメイタンシノイド分子に化学的に結合させることで、抗体、断片若しくはオリゴペプチド又はメイタンシノイド分子のいずれの生物活性も有意に損なうことなく、調製することができる。
【０２２８】
抗体分子１個当たり平均で３−４個のメイタンシノイド分子の結合が、抗体の機能又は可溶性に負の影響を与えることなく、効果的に標的細胞の細胞毒性を高めることが示されているが、抗体１個当たりに１分子の毒素であっても、裸の抗体を使用する場合と比較して細胞毒性を高めることが予測される。メイタンシノイドは、当該技術分野でよく知られており、既知の技術で合成するか、又は天然供給源から単離することが可能である。適切なメイタンシノイドは、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、並びに本明細書の上記で参照する他の特許文献及び非特許文献に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、マイタンシノール、並びにマイタンシノール分子の芳香環又他の部位が修飾された、例えば、種々のマイタンシノールエステル等のマイタンシノール類似体である。
【０２２９】
抗体−メイタンシノイド複合体又は抗体断片−メイタンシノイド複合体を作製するための数多くの結合基が当該技術分野で知られており、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号又は欧州特許第０  ４２５  ２３５  Ｂ１号、及びＣｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）に開示する結合基が含まれる。結合基には、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸反応性基、光反応性基、ペプチダーゼ反応性基、又はエステラーゼ反応性基が含まれるが、上記に同定される特許に開示されるように、ジスルフィド基及びチオエーテル基が好ましい。
【０２３０】
抗体又は抗体断片とメイタンシノイドの複合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオレン（ＩＴ）、イミドエステルの２機能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド類（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート類（トルエン２，６−ジイソシアネート等）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）等の種々の２機能性タンパク質結合剤を用いて作ることができる。ジスルフィド結合の提供に、特に好ましい結合剤には、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７［１９７８］）及びＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）が含まれる。
【０２３１】
リンカーは、その結合の種類に応じて、メイタンシノイド分子の種々の部位に結合させることができる。例えば、エステル結合は、通常のカップリング技術によりヒドロキシル基との反応により形成できる。反応は、ヒドロキシル基を有するＣ−３部位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４部位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５部位、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０部位で起こってもよい。好ましい態様では、結合は、マイタンシノール又はマイタンシノール類似体のＣ−３部位に形成される。
【０２３２】
ｃ．カリケアマイシン
対象となる別の免疫複合体は、１又は２個以上のカリケアマイシン分子に結合した抗ヘッジホッグキナーゼ抗体、ヘッジホッグキナーゼ結合抗体断片、又はヘッジホッグキナーゼオリゴペプチドを含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、ピコモル濃度未満で２本鎖ＤＮＡを切断することができる。カリケアマイシンファミリーの複合体の調製については、米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、同第５，８７７，２９６（全て、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ社に付与された）を参照。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、これらに限定されるものではないが、以下が含まれる：γ1I、α2I、α3I、Ｎ−アセチル−γ1I、ＰＳＡＧ及びθ1I（Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２（１９９３）、Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８（１９９８）及び上記のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ社の米国特許）。抗体を結合可能な別の抗腫瘍薬剤は、抗葉酸剤であるＱＦＡである。カリケアマイシンとＱＦＡは両方とも、細胞内作用部位を有し、容易に原形質膜を横切ることはない。従って、抗体により媒介される内部移行を通じたこれらの薬剤の細胞内取り込みは、これらの薬剤の細胞毒性作用を大幅に増大させる。
【０２３３】
ｄ．その他の細胞毒性薬剤
本発明の抗ヘッジホッグキナーゼアンタゴニスト（抗体、抗原結合断片、オリゴペプチド）に結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｉｃｉｎ）、ビンクリスチン及び５−フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号、同第５，７７０，７１０号に記載されるＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として集約的に知られる薬剤ファミリー並びにエスペラマイシン（米国特許第５，８７７，２９６号）が含まれる。
【０２３４】
使用可能な酵素活性を示す毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、リストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテセネス（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日に公開された国際公開公報ＷＯ  ９３／２１２３２を参照。
【０２３５】
本発明では、抗体と核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼ又はデオキシリボヌクレアーゼ：ＤＮａｓｅ等のＤＮＡエンドヌクレアーセ等）との間に形成される免疫複合体が意図されている。
【０２３６】
選択的な腫瘍の破壊のため、抗体は高い放射活性を示す原子を含んでいてもよい。放射性物質結合抗ヘッジホッグキナーゼ抗体の作製のために、種々の放射性同位体が利用可能である。例としては、Ａｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32、Ｐｂ212及びＬｕの放射性同位体が含まれる。複合体を診断に用いる場合には、複合体には、例えばｔｃ99m  ｏｒ  Ｉ123等のシンチグラフィー検査用放射性原子、又はヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−ＩＩＩ、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄といった、核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像（磁気共鳴画像法、ＭＲＩとしても知られる）用のスピンラベルが含まれていてもよい。
【０２３７】
放射性標識又は他の標識は、既知の方法で複合体に取り込ませることができる。例えば、ペプチドは、生合成可能であるか、又は、例えば、水素の代わりにフッ素−１９を含む適切なアミノ酸前駆体を用いたアミノ酸化学合成により合成可能である。ｔｃ99m又はＩ123、Ｒｅ186、Ｒｅ188及びＩｎ111等の標識は、ペプチドのシステイン残基を介して付加できる。イットリウム−９０は、リジン残基を介して付加できる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７）を用いて、ヨウ素−１２３を取り込むことができる。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｏｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）には、他の方法が詳細に記載されている。
【０２３８】
抗体と細胞毒性薬剤の複合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオレン（ＩＴ）、イミドエステルの２機能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド類（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン等）、ジイソシアネート類（トリエン２，６−ジイソシアネート等）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）等の種々の２機能性タンパク質結合剤を用いて作ることができる。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製できる。炭素１４で標識した１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に放射性核酸を結合させるための代表的なキレート剤である。国際公開公報ＷＯ  ９４／１１０２６を参照。リンカーは、細胞内での細胞毒性薬剤の解離を容易化する「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸反応性リンカー、ペプチダーゼ反応性リンカー、光反応性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー等（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を用いることができる。
【０２３９】
また、これに代わり、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニスト（例えば、抗体、抗原結合断片、オリゴペプチド）と細胞毒性薬剤を含む融合タンパク質又はキメラ分子は、例えば、組換え技術又はペプチド合成により作製できる。ＤＮＡの長さには、相複合体の互に隣り合うか、又は複合体の所望の特性を壊さないリンカーペプチドをコードする領域によって分離された２つの部分をコードするそれぞれの領域が含まれていてもよい。
【０２４０】
更なる別の態様では、抗体は、腫瘍プレターゲッティングに用いるための「レセプター」（例えば、ストレプトアビジン）に結合していてもよく、この場合、抗体−レセプター複合体を患者に投与し、その後、排出剤を用いて循環系から結合しなかった複合体を除去し、次いで、細胞毒性薬剤（例えば、放射性ヌクレオチド）に結合した「リガンド」（例えば、アビジン）を投与することになる。
【０２４１】
Ｂ．ヘッジホッグキナーゼ結合性オリゴペプチド
本発明のヘッジホッグキナーゼ結合性オリゴペプチド又はヘッジホッグキナーゼオリゴペプチドは、好ましくは、特異的に、本明細書に記載するヘッジホッグキナーゼポリペプチドに結合するオリゴペプチドである。ヘッジホッグキナーゼ結合性オリゴペプチドは、既知のオリゴペプチド合成方法により化学合成可能であるか、又は組換え技術を用いて調製及び精製可能である。ヘッジホッグキナーゼオリゴペプチドは、通常、少なくとも約５アミノ酸の長さを有し、これに代わる場合には、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００アミノ酸以上の長さを有し、この場合、このような結合可能なオリゴペプチドは、好ましくは特異的に本明細書に記載するヘッジホッグキナーゼポリペプチドに結合可能である。ヘッジホッグキナーゼオリゴペプチドは、よく知られる技術を用いて、過度の実験を行うことなく同定できる。この点において、オリゴペプチドライブラリーから、ポリペプチド標的に特異的に結合可能なオリゴペプチドをスクリーニングする技術が、当該技術分野においてよく知られていることは、特筆すべきことである（例として以下を参照：米国特許第５，５５６，７６２号、同第５，７５０，３７３号、同第４，７０８，８７１号、同第４，８３３，０９２号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６８９号、同第５，６６３，１４３号；国際公開公報ＷＯ  ８４／０３５０６及び同ＷＯ８４／０３５６４；Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：３９９８−４００２（１９８４）；Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：１７８−１８２（１９８５）；Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，１３０−１４９（１９８６）；Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１０２：２５９−２７４（１９８７）；Ｓｃｈｏｏｆｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：６１１−６１６（１９８８）、Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ��．ＵＳＡ，８８：８３６３、及びＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：６６８）。
【０２４２】
この点において、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイが、最もよく知られる技術の１つであり、広範囲なオリゴペプチドライブラリーをスクリーニングして、標的ポリペプチドと特異的に結合可能なメンバーをそのライブラリーから同定することができる。ファージディスプレイは、変異体ポリペプチドが、バクテリオファージ粒子の表面上にコートタンパク質との融合タンパク質としてディスプレイされる技術である（Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６）。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化したタンパク質変異体（又はランダムにクローニングしたｃＤＮＡ）の広範囲なライブラリーを、標的分子に高い親和性で結合する配列に従って迅速に、かつ効果的にソーティングできるという事実にある。ファージ上へのペプチドライブラリー（Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８７：６３７８）又はタンパク質ライブラリー（Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１  ；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８３６３）のディスプレイは、特異的結合特性を持つポリペプチド又はオリゴペプチドを目的とした、数百万種類のポリペプチド又はオリゴペプチドのスクリーニングに用いられてきた（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：６６８）。ランダムな変異体のファージライブラリーのソーティングは、多数の変異体を構築して増殖するためのストラテジー、標的レセプターを用いたアフィニティー精製の工程、及び結合濃縮の結果の評価手段を必要とする。米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６８９号及び同第５，６６３，１４３号。
【０２４３】
殆どのファージディスプレイ法では、繊維状ファージが用いられてきたが、ラムダ形ファージディスプレイ系（ｌａｍｂｄｏｉｄ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｓｙｓｔｅｍ）（ＷＯ  ９５／３４６８３；Ｕ．Ｓ．５，６２７，０２４）、Ｔ４ファージディスプレイ系（Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２１５：４３９（１９９８）；Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．５８（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ＆  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６５（１１）：４７７０−４７７７（１９９７）：Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９５（２）：３０３−３１１（１９９７）：Ｒｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，５：１８３３（１９９６）；Ｅｆｉｍｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ，１０：１７３（１９９５））及びＴ７ファージディスプレイ系（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１７：２２８−２５７（１９９３）；米国特許第５，７６６，９０５号）も知られている。
【０２４４】
基礎的なファージディスプレイ概念の多くの他の改良及び変更が開発されてきた。これらの改良により、ディスプレイ系の、選択された標的分子への結合のためにペプチドライブラリーをスクリーニングする能力と、機能タンパク質をディスプレイして所望の特性に基づいてそれらのタンパク質をスクリーニングする能力が向上される。ファージディスプレイ反応用のコンビナトリアル反応装置が開発されており（国際公開公報ＷＯ９８／１４２７７）ファージディスプレイライブラリーを用いて生体分子の相互作用が解析されて制御され（国際公開公報ＷＯ  ９８／２０１６９；同ＷＯ  ９８／２０１５９）、そして束縛されたへリックスペプチド（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）の特性が解析されて制御されている（国際公開公報ＷＯ９８／２００３６）。国際公開公報ＷＯ９７／３５１９６には、ファージライブラリーを、アフィニティーリガンドがその中で標的分子に結合する１の溶液と、その中ではアフィニティーリガンドが標的分子と結合しない第２の溶液と接触させて、選択的に結合したリガンドを単離する、アフィニティーリガンドの単離方法が記載されている。国際公開公報ＷＯ９７／４６２５１には、アフィニティー精製した抗体を有するランダムファージディスプレイライブラリをバイオパニングして、次いで結合したファージを単離し、その後、マイクロプレートウェルを用いたマイクロパニング法により高い親和力で結合するファージを単離する方法が記載されている。アフィニティータグとしてのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓタンパク質Ａの使用も、報告されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，９：１８７）。国際公開公報ＷＯ  ９７／４７３１４には、ファージディスプレイライブラリーであってもよいコンビナトリアルライブラリーを用いて酵素の特異性を区別するための基質のサブトラクションライブラリーの使用が記載されている。ファージディスプレイを用いて、界面活性剤での使用に適した酵素を選択する方法が、国際公開公報ＷＯ９７／０９４４６に開示されている。特異的結合性を示すタンパク質の更なる選択方法が、米国特許第５，４９８，５３８号、同第５，４３２，０１８号、及び国際公開公報ＷＯ９８／１５８３３に記載されている。
【０２４５】
ペプチドライブラリーの作製方法及びこれらのライブラリーのスクリーニング方法も、米国特許第５，７２３，２８６号、同第５，４３２，０１８号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，４９８，５３０号、同第５，７７０，４３４号、同第５，７３４，０１８号、同第５，６９８，４２６号、同第５，７６３，１９２号及び同第５，７２３，３２３号に開示されている。
【０２４６】
Ｃ．ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストのスクリーニング
本発明の方法で使用するヘッジホッグキナーゼアンタゴニスト（ポリペプチド、抗体、ポリペプチド、オリゴペプチド、ＲＮＡｉ分子、ＲＮＡｉコンストラクト、リボザイム及び有機分子）を作製するための技法が上記に記載されている。所望により、特定の生物学的特徴に基づいて、更に抗体（及びその抗原結合断片）、オリゴペプチド又は他の有機分子を選択してもよい。
【０２４７】
本発明で使用可能な種々のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの増殖阻害効果は、例えば、内在的に又はヘッジホッグキナーゼ遺伝子のトランスフェクション後にヘッジホッグキナーゼポリペプチドを発現する細胞を用いる等、当該技術分野で既知の方法により評価することができる。例えば、ヘッジホッグキナーゼをコードする核酸とトランスフェクトした適切な腫瘍セルライン及び腫瘍細胞を、種々の濃度にある本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストで数日間（例えば、２−７日間）処理して、クリスタルバイオレット若しくはＭＴＴで染色するか、又は他の比色アッセイにより分析してもよい。別の方法では、このようなヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの存在下又は非存在下で細胞を処理して、3Ｈ−チミジンの取り込みを比較することで増殖率を測定する。処理した後に、細胞を回収して、ＤＮＡに取り込まれた放射能の量をシンチレーションカウンターで定量する。適切なポジティブコントロールとしては、選択したセルラインを、そのセルラインの増殖を阻害することが分かっている増殖阻害抗体で処理することが挙げられる。インビボでの腫瘍細胞の増殖阻害は、当該技術分野で知られる種々の方法で決定可能である。好ましくは、腫瘍細胞は、ヘッジホッグポリペプチドを過剰発現する腫瘍細胞である。好ましくは、このようなヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、ある態様において、約０．５ないし３０μｇ／ｍｌの抗体濃度において、インビトロ又はインビボで、ヘッジホッグ発現腫瘍細胞の細胞増殖を、処理してない腫瘍細胞と比べて、約２５−１００％、より好ましくは、約３０−１００％、そして更により好ましくは、約５０−１００％又は７０−１００％阻害する。
【０２４８】
増殖阻害は、細胞培養中に約０．５ないし３０μｇ／ｍｌ又は約０．５  ｎＭないし２００  ｎＭのヘッジホッグキナーゼアンタゴニスト濃度で測定可能であり、この場合、腫瘍細胞をアンタゴニストに曝露してから１−１０日後に増殖阻害を測定する。アンタゴニストについては、アンタゴニスト及び／又はアゴニストを体重１ｋｇ当たり約１μｇないし約１００ｍｇで投与した際に、抗体の第１回目の投与から約５日間ないし３月間以内、好ましくは約５日間ないし３０日間以内に腫瘍サイズ又は腫瘍細胞増殖の低下が生じた場合には、インビボでの増殖阻害作用が示されたことになる。
【０２４９】
細胞死を促進するヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを選択するため、例えば、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー又は７ＡＡＤ等の取込みによって示される膜完全性の喪失をコントロールの比較によって評価してもよい。ＰＩ取込みアッセイは、補体と免疫エフェクター細胞の不存在下で行うことができる。ヘッジホッグキナーゼポリペプチドを発現する腫瘍細胞を、培地のみ、又は適切なヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを含む培地とインキュベートする。細胞は３日間インキュベートする。それぞれの処理の後、細胞を洗浄し、細胞凝集塊を取り除くため、３５ｍＭストレーナーキャップが取り付けられた１２ｘ７５チューブ内に一定分量を注入する（各チューブに１ｍｌ、処理グループ毎に３チューブ）。次いで、チューブにＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を添加する。サンプルは、ＦＡＣＳＣＡＮ（登録商標）フローサイトメーターとＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ（登録商標）ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて解析してもよい。次に、ＰＩ取込みにより測定される、統計的に有意なレベルの細胞死を誘導するヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを選択できる。
【０２５０】
ヘッジホッグキナーゼポリペプチド上のエピトープに結合する抗ヘッジホッグキナーゼ抗体をスクリーニングするため、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されるようなルーチンなクロスブロッキングアッセイ（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｓｓａｙ）を行うことができる。このアッセイを用いて、テスト抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子が、既知の抗ヘッジホッグキナーゼ抗体と同じ部位又はエピトープに結合するかどうかを決定できる。これに代わり、又はこれに加えて、当該技術分野で公知の方法により、エピトープマッピングを行うことも可能である。例えば、抗体配列に、アラニンスキャニング等により突然変異を誘発することで、接触残基を同定できる。変異抗体については、最初にポリクローナルとの結合をテストすることで、適切なフォールディングが確かめられる。別の方法では、ヘッジホッグキナーゼポリペプチドの異なる領域に対応するペプチドを、テスト抗体と共に、又はテスト抗体及び特定されたエピトープ若しくは既知のエピトープを有する抗体と共に、競合アッセイに用いることができる。
【０２５１】
Ｄ．ヘッジホッグキナーゼポリペプチド変異体
本明細書に記載するヘッジホッグキナーゼポリペプチドに加え、本発明で用いるための、このような分子の変異体を調製できることが意図されている。このような変異体は、適切なヌクレオチドの変更をコードするＤＮＡに導入するか、そして／又は所望の抗体又はポリペプチドを合成することにより、調製可能である。当業者であれば、アミノ酸の変化により、グリコシル化部位の数又は位置の変化や、膜への固定の特性の変化のように、これらの分子の翻訳後プロセスが変化する場合があることを理解するであろう。
【０２５２】
例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に説明される保存的変異又は非保存的変異用の技術及びガイドラインのいずれかを用いてアミノ酸配列の変異を作製できる。変異は、天然配列と比較してアミノ酸配列に変化を生じさせるアミノ酸配列をコードする１又は２個以上のコドンの置換、欠失又は挿入であってもよい。変異は、随意に、少なくとも１つのアミノ酸を、対象のアミノ酸配列の１又は２個以上のドメイン中の他のアミノ酸のいずれかで置換したものであってもよい。所望の活性に悪影響を及ぼさずに、いずれのアミノ酸残基を挿入、置換又は欠失できるかを決定するための手引きは、対象のアミノ酸配列を相同的な既知のタンパク質分子と比較して、相同性の高い領域内に生じているアミノ酸配列の変化の数を最小化することで、見つけ出すことが可能である。アミノ酸の置換は、例えば、ロイシンのセリンによる置換等、１のアミノ酸を類似する構造特性及び／又は化学特性を有する別のアミノ酸で置換した結果、即ち、保存的アミノ酸置換であってもよい。挿入又は欠失は、随意に、約１ないし５アミノ酸の範囲内であってもよい。許容される変異は、その配列にアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に生じさせ、完全長配列又は成熟した天然配列が示す活性について得られた変異体を試験することで決定できる。
【０２５３】
種々のヘッジホッグキナーゼポリペプチドの断片も、ここに提供される。このような断片は、例えば、完全長の天然抗体又はタンパク質と比較した場合に、そのＮ末端又はＣ末端で切断されていてもよく、又は、配列内部の残基が欠けていてもよい。所望の生物活性に不可欠ではないアミノ酸残基を欠くこのような断片も、開示される方法に有用である。
【０２５４】
上記のペプチド断片は、数多くの古典的技術のいずれによっても調製できる。所望のペプチド断片は、化学合成することもできる。これに代わる方法では、例えば、特別なアミノ酸残基で特定される部位でタンパク質を切断することが知られている酵素でそのタンパク質を処理するか、又は適切な制限酵素でＤＮＡを処理して所望の断片を単離する等の酵素処理によって、このような断片を作製することを伴う。更に別の適切な技術では、所望の断片をコードするＤＮＡ断片を単離してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅することを伴う。ＤＮＡ断片の所望の末端を定義するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにおいて、５’プライマー及び３’プライマーとして用いられる。好ましくは、このような断片は、対応する完全長分子と少なくとも１種類の生物活性及び／又は免疫活性を共有する。
【０２５５】
特定の態様において、目的の保存的置換を、表５の好ましい置換という表題の下に示す。このような置換が生物活性に変化を生じさせる場合には、所望の変異体を同定するために、表５の代表的な置換と称されるか、又はアミノ酸のクラスに関して下記に更に記載される、より実質的な変化を導入して生成物をスクリーニングする。
【０２５６】
【表５】
2009526752.tif 000007
【０２５７】
ヘッジホッグキナーゼ変異体ポリペプチドの機能同一性又は免疫学的同一性における実質的な変更は、（ａ）置換した領域内のポリペプチド骨格の構造、例えば、シート構造やへリックス構造等、（ｂ）その分子の標的部位における電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の大きさの維持に対する、これらポリペプチドの効果を有意に変化させる置換を選択することで、達成される。天然の残基は、側鎖の共通する特性に基づいてグループ分けされる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、ＶａＩ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性で疎水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ａｓｎ；Ｇｌｎ
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０２５８】
非保存的置換は、上記のクラスのメンバーを別のクラスのメンバーと変えることを伴う。このように置換された残基も、保存的置換部位、又は、より好ましくは、残存（保存されていない）部位に導入することができる。
【０２５９】
オリゴヌクレオチド媒介性（部位特異的）変異導入、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ変異導入のような、当該技術分野で公知の方法を用いて、変異を作り出すことができる。部位特異的変異導入［Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８７）］、カセット式変異導入（ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）［Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３４：３１５（１９８５）］、制限部位選択的変異導入（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）［Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ，３１７：４１５（１９８６）］又は他の既知の技術をクローニングしたＤＮＡに対して行うことで、ヘッジホッグキナーゼ分子を作製できる。
【０２６０】
スキャニングアミノ酸解析（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて、隣接する配列に沿った１又は２個以上のアミノ酸を同定することもできる。スキャニングアミノ酸の中でも、比較的小さく、中性のアミノ酸が好ましい。このようなアミノ酸には、アラニン、グリシン、セリン及びシステインが含まれる。アラニンは、β炭素を超えた側鎖を持たず、変異体の主鎖のコンフォメーションを変化させにくいことから、上記のアミノ酸グループの中でも、アラニンが、典型的に好ましいスキャニングアミノ酸である［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）］。また、アラニンは最も高頻度に存在するアミノ酸であることからも、典型的に好ましい。更にまた、アラニンは、埋め込まれた部位と露出される部位の両方において、頻繁に見出される［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１（１９７６）］。アラニンの置換により、十分な量の変異体が得られない場合には、アイソテリック（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）なアミノ酸を用いることができる。
【０２６１】
ヘッジホッグキナーゼ変異体ポリペプチド特有の構造維持に関与していないいずれかのシステイン残基をセリンで置換することで、この分子の酸化に対する安定性を向上させ、異常な架橋形成を防ぐことができる。また反対に、システイン結合をこのような分子に加えて、安定性を向上させることもできる（特に、抗体がＦｖ断片等の抗体断片である場合）。
【０２６２】
特に好ましい種類の置換変異体には、結合領域の１又は２個以上の残基の置換が含まれる。例えば、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストが抗ヘッジホッグキナーゼ抗体である場合、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の超可変領域残基。一般的に、更なる開発のために選択される結果物としての変異体では、これらが作り出される元となる親抗体と比べて、生物学的特性が向上されることになる。このような置換変異体を作り出す簡便な方法には、ファージディスプレイを用いたアフィニティーの成熟が含まれる。簡潔に言うと、複数の超可変領域部位（例えば、６−７個の部位）に変異を導入して、各部位において全ての考えられるアミノ酸置換を生じさせる。このようにして作り出された変異体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子に内包されるＭ１３の遺伝子ＩＩＩの産物との融合体として、１価の態様でディスプレイされる。ファージディスプレイされた変異体を、本明細書に開示するように、その生物活性（例えば、結合親和力等）についてスクリーニングする。修飾を施すための候補の超可変領域部位を同定するため、アラニンスキャニング変異導入を行って、抗原結合に大きく関与する超可変領域の残基を同定することもできる。これに代わり、又はこれに加えて、抗体と標的ポリペプチド間の接触点を同定するために抗原抗体複合体の結晶構造解析を行うことも有益となるであろう。このような接触残基及び隣接残基は、ここに詳述する技術による置換の候補である。このような変異体を作製したならば、変異体のパネルをここに記載するスクリーニングに付して、１又は２種類以上の適切なアッセイで優れた特性を示した抗体を更なる開発のために選択できる。
【０２６３】
ヘッジホッグキナーゼ変異体ポリペプチドのアミノ酸配列変異をコードする核酸分子は、当該技術分野で知られる種々の方法により調製される。これらの方法には、以下に限定されるものではないが、天然配列若しくは事前に調製した変異体の、天然供給源からの単離（天然アミノ酸配列の変異体の場合）又はオリゴヌクレオチド媒介性の（又は部位特異的）変異導入、ＰＣＲ変異導入及びカセット式変異導入による調製が含まれる。
【０２６４】
Ｅ．ヘッジホッグポリペプチドの調製
以下の記載は、主に、このような抗体、ポリペプチド、オリゴペプチドの核酸を含むベクターで形質転換又はトランスフェクトした細胞を培養することによるヘッジホッグポリペプチドの製造に関する。上記セレクションの目的に限り、「ヘッジホッグポリペプチド」という用語には、ヘッジホッグシグナル伝達構成成分、並びに特定のヘッジホッグキナーゼアンタゴニスト（即ち、組換え技術で簡便に調製可能な抗体、ポリペプチド、オリゴペプチド）が含まれるべきである。言うまでもないが、当該技術分野でよく知られる別の方法を用いて、このような抗体、ポリペプチド及びオリゴペプチドを調製することもできる。例えば、適切なアミノ酸配列、又はその一部は、固相法を用いた直接的なペプチド合成により作り出すことができる［例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ（１９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４（１９６３）を参照］。手作業による技法を用いるか又は自動化によって、インビトロでのタンパク質合成を行うこともできる。自動合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（フォスターシティー、カリフォルニア州）を製造元の使用説明書に従って用いることで達成できる。このような抗体、ポリペプチド及びオリゴペプチドの種々の部分を別々に化学合成して、化学的又は酵素的方法により組み合せることで、所望の産物を作り出すことも可能である。
【０２６５】
１．ヘッジホッグポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
ヘッジホッグポリペプチドをコードするＤＮＡは、かかる抗体、ポリペプチド又はオリゴペプチドｍＲＮＡを有し、それを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製したｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。従って、かかるポリペプチドをコードするＤＮＡは、ヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー、又は既知の合成手順（例えば、自動核酸合成）により便利に得ることができる。
【０２６６】
ライブラリーは、目的の遺伝子又はそれにコードされたタンパク質を同定するように設計されたプローブ（少なくとも約２０ないし８０塩基から成るオリゴヌクレオチド等）を用いてスクリーニングすることができる。選択されたプローブを用いたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されたような、標準的な手順を使用して実施することができる。或いは、ＰＣＲ方法論を用いてもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，上記：Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５））。
【０２６７】
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング技術は、当該技術分野において周知である。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、偽陽性を最低限に抑えるのに十分な長さと十分な明確性を有するべきである。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー中のＤＮＡへのハイブリダイゼーションによって検出することができるよう、標識されていることが好ましい。標識の方法は当該技術分野において周知であり、32Ｐ等の放射性標識で標識されたＡＴＰ、ビオチン化又は酵素標識等の使用が挙げられる。中程度のストリンジェント条件及び高ストリンジェント条件を含むハイブリダイゼーション条件はＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，上記に提示されている。
【０２６８】
かかるライブラリースクリーニング方法で同定された配列を比較し、ＧｅｎＢａｎｋのような公的データベース又は他の民間配列データベースに寄託され、これから入手可能な他の既知の配列とアラインメントをとることができる。分子の特定の領域内又は完全長配列間の配列同一性（アミノ酸又はヌクレオチドレベルでの）は、当該技術分野において既知の方法及び本明細書に記載する方法を使用して決定できる。
【０２６９】
タンパク質をコードする配列を有する核酸は、最初に本明細書に開示された推定アミノ酸配列を使用して、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングし、必要に応じて、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，に記載されたような従来のプライマー伸長手順を使用して、ｃＤＮＡに逆転写されていない可能性のあるｍＲＮＡの前駆体及びプロセシング中間体を検出することにより入手できる。
【０２７０】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞は、本明細書に記載したヘッジホッグポリペプチド生成用発現又はクローニングベクターでトランスフェクト又は形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切なように改変された従来の栄養培地で培養する。培地、温度、ｐＨ等のような培養条件は、過度の実験をすることなく当業者が選択することができる。一般に、細胞培養の産出能を最大化するための原理、プロトコル、及び実用技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ，ｅｄ．（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１）及び上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，に見い出すことができる。
【０２７１】
真核細胞のトランスフェクション方法及び原核細胞の形質転換方法は当業者に既知であり、例えば、ＣａＣｌ2、ＣａＰＯ4、リポソーム媒介性及びエレクトロポレーション等がある。使用する宿主細胞に応じて、形質転換は、かかる細胞に適切な標準的技術を使用して実施される。上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，に記載されたような塩化カルシウムを使用するカルシウム処理又はエレクトロポレーションは、一般に原核生物に用いられる。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの感染は、Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２３：３１５（１９８３）及び１９８９年６月２９日発行の国際公開第８９／０５８５９号に記載されているように、特定の植物細胞の形質転換に用いられる。かかる細胞壁のない哺乳類細胞に対しては、Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７（１９７８）のリン酸カルシウム沈殿法を用いることができる。哺乳類細胞宿主系のトランスフェクションの全般的局面は、米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母への形質転換は、典型的には、Ｖａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔ，１３０：９４６（１９７７）及びＨｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７６：３８２９（１９７９）の方法に従って実施される。しかしながら、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷細胞と細菌性プロトプラストとの融合、又は、例えばポリブレン、ポリオルニチン等のポリカチオン類のようなＤＮＡを細胞に導入する他の方法を用いてもよい。哺乳類細胞を形質転換する種々の技術については、Ｋｅｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：５２７−５３７（１９９０）及びＭａｎｓｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８−３５２（１９８８）を参照。
【０２７２】
本明細書でベクター内のＤＮＡをクローニングする又は発現させるために好適な宿主細胞としては、原核生物、酵母、又は高等真核細胞が挙げられる。好適な原核生物としては、グラム陰性菌又はグラム陽性菌のような真正細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ．のような腸内細菌が揚げられるが、これらに限定されない。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ｓｔｒａｉｎｍＭ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）及びＫ５  ７７２（ＡＴＣＣ  ５３，６３５）のような、種々のＥ．ｃｏｌｉ．株が公的に入手可能である。他の好適な原核生物宿主細胞としては、例えばＥ．ｃｏｌｉ．等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ等のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えばＳｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ等のＳｅｒｒａｔｉａ、及びＳｈｉｇｅｌｌａ、並びにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日発行の旧東独国特許第２６６，７１０号に開示されているＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ４１Ｐ）のようなＢａｃｉｌｌｉ、例えばＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ等のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。これらの例は、制限というよりむしろ説明のための例である。株Ｗ３１１０は、組み換えＤＮＡ産物発酵のための一般的な宿主株であるため、特に好ましい宿主又は親宿主（ｐａｒｅｎｔ  ｈｏｓｔ）である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０を改変して、宿主に対して内因性のタンパク質をコードする遺伝子に遺伝的変異をもたらしてよく、かかる宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有するＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株１Ａ２、完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有するＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株９Ｅ４、完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−  ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎr  を有するＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ  ５５，２４４）、完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎr  を有するＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株３７Ｄ６、非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ  欠失変異を有する株３７Ｄ６であるＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株４０Ｂ４、及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４，９４６，７８３号に開示されたペリプラズムプロテアーゼ変異体を有するＥ．ｃｏｌｉ株が挙げられる。或いは、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応等のインビトロでのクローニング方法が好適である。
【０２７３】
完全長抗体、抗体断片、及び抗体融合タンパク質は、特に、治療抗体が細胞毒性薬（例えば、毒素）に結合され、その免疫複合体自体が腫瘍細胞の破壊に有効性を示す場合のような、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能を必要としない場合には、細菌内で生成することができる。完全長抗体は循環中の半減期が長い。Ｅ．ｃｏｌｉ内での生産はより速く、より費用効率が高い。細菌内の抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、発現及び分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）及びシグナル配列について記載した、米国特許第５，６４８，２３７号（Ｃａｒｔｅｒら）、同第５，７８９，１９９号（ＪｏＩｙら）及び同第５，８４０，５２３号（Ｓｉｍｍｏｎｓら）を参照。これらの特許は本明細書に参照することにより組み込まれたものとする。発現後、抗体は可溶性画分中のＥ．ｃｏｌｉ．細胞ペーストから単離され、例えば、アイソタイプに応じてＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ又はＧカラムを通して精製することができる。最終精製は好適な細胞（例えばＣＨＯ細胞）内で発現した抗体を精製する方法と類似の方法で実施することができる。
【０２７４】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母のような真核微生物も、ヘッジホッグポリペプチドをコードするベクター用の好適なクローニング又は発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、一般的に使用される下等真核宿主微生物である。他には、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ（Ｂｅａｃｈ  ａｎｄ  Ｎｕｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２９０：１４０［１９８１］；１９８５年５月２日発行の欧州特許第１３９，３８３号）；例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（ＭＷ９８−８Ｃ，ＣＢＳ６８３，ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４（２）：７３７−７４２［１９８３］）、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ  ３６，９０６；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０））、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ及びＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；のようなＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（米国特許第４，９４３，５２９号、Ｆｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１））；ｙａｒｒｏｗｉａ（欧州特許第４０２，２２６号）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（欧州特許第１８３，０７０号；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８：２６５−２７８  ［１９８８］）；Ｃａｎｄｉｄａ；；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（欧州特許第２４４，２３４号）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（Ｃａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：５２５９−５２６３［１９７９］）；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（１９９０年１０月３１日発行の欧州特許第３９４，５３８号）のようなＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ；並びに、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、  Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ（１９９１年１月１０日発行の国際公開第９１／００３５７号）及びＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｂａｌｌａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１２：２８４−２８９［１９８３］；Ｔｉｌｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２６：２０５−２２１  ［１９８３］；Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：１４７０−１４７４［１９８４］）、Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ｋｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｈｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：４７５−４７９  ［１９８５］）のようなＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主のような糸状菌が挙げられる。メチロトローフ酵母は本明細書で好適であり、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、及びＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａから成る属から選択される、メタノール上で成育可能な酵母が挙げられるが、これらに限定されない。代表的なこの分類の酵母である具体的な種の一覧は、Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ，Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ，２６９（１９８２）に見ることができる。
【０２７５】
グリコシル化されたヘッジホッグキナーゼポリペプチド生成物の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物由来である。無脊椎動物細胞の例としては、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９のような昆虫細胞、並びに、ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト及びタバコの細胞培養のような植物細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株及び変異株並びにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（キャタピラ（登録商標））、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（カ）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（カ）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのような宿主由来の、対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株は、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１変異体及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株等、公的に入手可能であり、かかるウイルスは、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、本発明に従ってここに述べるウイルスとして使用することができる。
【０２７６】
しかしながら、脊椎動物細胞への関心が最も高く、培養（組織培養）での脊椎動物細胞の増殖は常法となっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚性腎臓系統（懸濁培養で増殖させるためにサブクローニングされた２９３又は２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶｌ  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺癌（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌系統（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０２７７】
宿主細胞は、ヘッジホッグポリペプチド生成物のために上記発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変された従来の栄養培地で培養される。
【０２７８】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
それぞれのヘッジホッグポリペプチドをコードする核酸（例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）を、複製可能なクローニング（ＤＮＡの増幅）ベクター又は発現ベクターに挿入してよい。種々のベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子又はファージの形態であってよい。適切な核酸配列を、種々の手順によりベクターに挿入することができる。一般に、ＤＮＡは、当該技術分野において既知の技術を使用して、適切な制限酵素部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、１又は２種類以上のシグナル配列、複製開始点、１又は２種類以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター及び転写終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。１又は２種類以上のこれらの成分を含有する好適なベクターの構築には、当業者に既知の標準的なライゲーション技術を使用する。
【０２７９】
ヘッジホッグポリペプチドは、直接生成するだけでなく、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても、組み換えで生成することができ、これはシグナル配列又は成熟タンパク質若しくはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドであってよい。一般に、シグナル配列はベクター成分であってよく、又はベクターに挿入される成熟配列をコードするＤＮＡの一部であってもよい。シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、又は熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌については、シグナル配列は、例えば、インベルターゼリーダー、α因子リーダー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ及び  Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓのα因子リーダーを含む、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている）又は酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日発行の欧州特許第３６２，１７９号）又は１９９０年１１月１５日発行の国際公開第９０／１３６４６号に記載されたシグナルであってよい。哺乳類細胞の発現では、同一種又は近縁種の分泌されたポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の分泌を支配する哺乳類シグナル配列を用いてよい。
【０２８０】
発現及びクローニングベクターはともに、ベクターを１又は２種類以上の選択された宿主細胞内で複製可能にする核酸配列を含有する。かかる配列は、種々の細菌、酵母及びウイルスで周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開始点は大部分のグラム陰性菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に好適であり、種々のウイルス開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳類細胞のクローニングベクターに有用である。
【０２８１】
発現ベクター及びクローニングベクターは、典型的に、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有する。典型的な選択遺伝子は、（ａ）例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート若しくはテトラサイクリン等の抗生物質又は他の毒素に対する耐性を与えるタンパク質、（ｂ）栄養要求性欠損を補完するタンパク質、又は（ｃ）例えばＢａｃｉｌｌｉのＤ−アラニン・ラセマーゼをコードする遺伝子等の複合培地から入手できない必須栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０２８２】
哺乳類細胞に好適な選択マーカーの例は、ＤＨＦＲ又はチミジンキナーゼのような、所望のタンパク質をコードする核酸を取り込む能力のある細胞を同定できるものである。野生型ＤＨＦＲが使用される場合、適切な宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０）に記載されたように調製及び増殖した、ＤＨＦＲ活性の欠損したＣＨＯ細胞株である。酵母での使用に好適な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０：１５７（１９８０）］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えばＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６又は  ＰＥＰ４−１［Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）］等の、トリプトファン中で増殖する能力の欠損した酵母の変異株に対するマーカーを提供する。
【０２８３】
発現及びクローニングベクターは、通常、直接ｍＲＮＡを合成するために、所望のアミノ酸配列をコードする核酸配列に機能的に連結したプロモーターを含有する。種々の潜在宿主細胞により認識されるプロモーターは周知である。原核生物宿主とともに使用するのに好適なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７５：６１５（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４（１９７９））、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）；欧州特許第３６，７７６号）及びｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーター（ｄｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１−２５（１９８３））が挙げられる。細菌系で使用するプロモーターもまた、所望のタンパク質配列をコードするＤＮＡに機能的に連結したＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有する。
【０２８４】
酵母宿主とともに使用するのに好適なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：２０７３（１９８０））又はエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヒキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのような他の糖分解酵素（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．，７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７：４９００（１９７８））のプロモーターが挙げられる。
【０２８５】
他の酵母プロモーターは、転写が増殖条件により制御されるという利点も有する誘導性プロモーターであるが、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、並びにマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域である。酵母での発現に使用するのに好適なベクター及びプロモーターは、さらに欧州特許第７３，６５７号に記載されている。
【０２８６】
哺乳類宿主細胞でのＤＮＡ転写は、例えば、以下のようなプロモーターが、宿主細胞系に適合する場合には、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日発行の英国特許（ＵＫ）第２，２１１，５０４号）、アデノウイルス（アデノウイルス２のような）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、例えば、アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター等の異種哺乳類プロモーター、並びにヒートショックプロモーターにより制御される。
【０２８７】
ｈｅｄｇｈｏｇポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクターに挿入されたエンハンサー配列により増加させることができる。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用性ＤＮＡ因子であり、通常約１０ないし３００ｂｐであって、プロモーターに作用してその転写を増加させる。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインシュリン）由来の多くのエンハンサー配列が、現在知られている。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられる。例としては、複製開始点（１００ないし２７０ｂｐ）の後方（ｌａｔｅ  ｓｉｄｅ）にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後方にあるポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、ベクターの、前述のアミノ酸配列のコーディング配列の５‘又は３’側に挿入してよいが、好ましくはプロモーターの５‘側に位置する。
【０２８８】
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞）で使用される発現ベクターもまた、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化のために必要な配列を含有する。かかる配列は、真核生物又はウイルスＤＮＡ又はｃＤＮＡの５‘非翻訳領域及び時に３’非翻訳領域から一般的に入手可能である。これらの領域は、本章に記載した抗体、ポリペプチド、又はオリゴペプチドをそれぞれコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内でポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチド断片を含有する。
【０２８９】
さらに他の方法では、組み換え脊椎動物細胞培養内でのそれぞれの抗体、ポリペプチド又はオリゴペプチドの合成に適応させるのに好適なベクター並びに宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９３：６２０−６２５（１９８１）；Ｍａｎｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：４０−４６（１９７９）；欧州特許第１１７，０６０号；及び欧州特許第１１７，０５８号に記載されている。
【０２９０】
４．宿主細胞の培養
ヘッジホッグポリペプチドの生成に用いる宿主細胞は、種々の培地で培養してよい。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（（ＭＥＭ），（Ｓｉｇｍａ））、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）のような市販の培地は、宿主細胞の培養に好適である。さらに、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、  Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号若しくは同第５，１２２，４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；同第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０，９８５号に記載された培地のいずれかを、宿主細胞用培養培地として使用してもよい。これらの培地はいずれも、必要に応じて、ホルモン並びに／又は他の増殖因子（インシュリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子のような）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸のような）、バッファ（ＨＥＰＥＳのような）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンのような）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬剤のような）、微量元素（通常、最終濃度マイクロモル単位で存在する無機化合物として定義される）、及びグルコース若しくは等価エネルギー源を追加してよい。任意の他の必要な追加物もまた、当業者に既知の適切な濃度で含んでもよい。温度、ｐＨ等のような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に以前から用いられているものであり、当業者には明らかである。
【０２９１】
５．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、例えば、本明細書で提供した配列に基づいた適切に標識したプローブを用いる、従来のサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量化するためのノーザンブロッティング（Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５（１９８０））、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、又はインサイチュハイブリダイゼーションにより、直接サンプル中で測定することができる。或いは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ−タンパク質二本鎖を含む、特定の二本鎖を認識することができる抗体を使用してもよい。抗体は、順に、標識され、表面上で二本鎖が形成されるように、表面に二本鎖が結合した箇所でアッセイが実施され、二本鎖に結合した抗体の存在が検出され得る。
【０２９２】
或いは、細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色のような免疫学的方法及び細胞培養又は体液のアッセイにより、遺伝子産物の発現を直接定量化することにより遺伝子発現を測定できる。免疫組織化学的染色及び／又は試料液のアッセイに有用な抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれかであってよく、いずれの哺乳動物内で調製してよい。便利なことに、本方法に好適な抗体は、天然配列ポリペプチド又はオリゴペプチドに対して調製でき、ＤＮＡと融合し、かかるポリペプチド又はオリゴペプチドの特定の抗体エピトープをコードする外来配列に対して調製できる。
【０２９３】
６．タンパク質精製
ヘッジホッグポリペプチドは、培養培地又は宿主細胞溶解物から回収することができる。膜結合型である場合は、好適な界面活性溶液（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）を用いて、又は酵素的切断により膜から放出させることができる。前述の発現に使用する細胞は、凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破砕、又は細胞溶解剤のような種々の物理的又は化学的手段により破壊することができる。
【０２９４】
組み換え細胞タンパク質又はポリペプチドから前述のポリペプチドを精製することが望ましい場合がある。以下の手順は、代表的な好適な精製手順である：イオン交換カラムによる分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はＤＥＡＥのような陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー；等電点電気泳動；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫安沈澱；例えばＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を用いたゲル濾過；ＩｇＧのような夾雑物を除去するためのＰｒｏｔｅｉｎ  Ａセファロースカラム；及び所望の分子のエピトープタグを付けた形態を結合させる金属キレートカラム。タンパク質精製の種々の方法を使用してよく、かかる方法は当該技術分野において既知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｖｍｏｌｏｇｙ，１８２（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）に記載されている。選択された精製法は、例えば、使用する生成工程及び請求項に係る方法で生成した特定の抗体、ポリペプチド又はオリゴペプチドの性質に依る。
【０２９５】
組み換え技術を用いる場合、ヘッジホッグポリペプチドは細胞内、細胞膜周辺腔で生成されるか、又は培地に直接分泌される場合がある。かかる分子が細胞内で生成される場合、第一段階として、微粒子片、宿主細胞又は溶解断片のいずれかが、例えば遠心分離又は限外濾過により除去される。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３−１６７（１９９２）には、Ｅ．ｃｏｌｉ．の細胞膜周辺腔に分泌された抗体を単離する手順が記載されている。簡潔にいえば、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフッ化フェニルメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間にわたって解凍する。細胞片は遠心分離により除去できる。抗体が培地に分泌される場合、かかる発現系から得られる上清は、一般に、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置等の市販のタンパク質濃縮フィルターを用いて最初に濃縮される。前述の工程のいずれかにＰＭＳＦのようなプロテアーゼ阻害剤を含み、タンパク質分解を阻害してよく、抗生物質を含んで外来性夾雑物の増殖を阻止してもよい。
【０２９６】
精製は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティクロマトグラフィーを用いて行ってよく、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティリガンドとしてのＰｒｏｔｅｉｎ  Ａの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依る。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａを用いて、ヒトγ１、γ２又はγ４Ｈ鎖を基礎とする抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇは、マウスのアイソタイプ全て及びヒトγ３に推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７−１５７５（１９８６））。アフィニティリガンドが結合するマトリクスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリクスも利用可能である。制御された多孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定なマトリクスにより、アガロースにより達成し得るよりも、流速を早く且つ処理時間を短くすることが可能になる。抗体がＣH３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、フィリップスバーグ、ニュージャージー州）が精製に有用である。イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカによるクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）によるクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム等）によるクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫安沈澱のような他のタンパク質精製技術もまた、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０２９７】
任意の予備精製段階に続いて、目的の抗体及び夾雑物を含む混合物を、ｐＨ約２．５ないし４．５の溶出バッファを用いた低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、好ましくは低塩濃度（例えば約０ないし０．２５Ｍ塩）にて実施する。
【０２９８】
Ｆ．治療用製剤
本発明に従って使用されるヘッジホッグキナーゼアンタゴニスト（「治療薬」）の治療剤形は、任意の医薬的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００））を含む、所望の純度の治療薬を混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、保存用に調製することができる。許容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、使用される投薬量及び濃度で受容者に対して無毒性であり、アセテート、トリス、ホスフェート、シトレート及び他の有機酸類のようなバッファ；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル若しくはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールのような）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリジンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；トレハロース及び塩化ナトリウムのような等張化剤（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）；スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトールのような糖類；ポリソルベートのような界面活性剤；ナトリウムのような塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；並びに／又はＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を含む。抗体は、５ないし２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０ないし１００ｍｇ／ｍｌの濃度の抗体を含むことが好ましい。
【０２９９】
本明細書で製剤はまた、必要に応じて、治療される特定の兆候のための複数の活性化合物を含有してよく、好ましくは、それらは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する。例えば、前述の治療薬に加えて、製剤に、例えば第二のかかる治療薬、又は神経膠腫の増殖に影響を与える増殖因子のような他の幾つかの標的に対する抗体等の追加的な抗体を含んでよい。或いは又はさらに、組成物は、化学療法剤、細胞毒性薬剤、サイトカイン、増殖阻害剤、抗ホルモン薬、及び／又は心保護剤をさらに含んでよい。かかる分子は、意図する目的のために有効な量で組み合わされて好適に存在する。
【０３００】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術により、又は例えばそれぞれコロイド・ドラッグ・デリバリー・システム（例えば、リポソーム、アルブミン微細球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションにおけるヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル等の界面重合により、調製されたマイクロカプセルに封入してよい。かかる技術は、上記のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，に開示されている。
【０３０１】
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、フィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形態にある。徐放性マトリクスの例としては、ポリエステル類、ヒドロゲル類（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド類（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγＬ−グルタミン酸エチルのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能な微粒子）のような分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０３０２】
インビボ投与に用いるための製剤は無菌でなければならない。これは無菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【０３０３】
Ｇ．ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストによる診断及び治療
腫瘍又は癌中のヘッジホッグキナーゼ発現を測定するために、種々の診断アッセイが利用可能である。一態様では、ヘッジホッグポリペプチドの過剰発現及び／又はポリペプチドの過剰発現を免疫組織化学（ＩＨＣ）により分析することができる。腫瘍生検由来のパラフィン包埋組織切片をＩＨＣアッセイに供し、以下のようにヘッジホッグキナーゼポリペプチド染色強度基準を定めることができる。
スコア０  −  染色が観察されない、又は１０％未満の腫瘍細胞で膜染色が観察される。
スコア１＋  −  １０％以上の腫瘍細胞でかすかな／かろうじて知覚可能な膜染色が検出される。細胞は、その膜の一部のみ染色されている。
スコア２＋  −  １０％以上の腫瘍細胞で、弱〜中程度の完全な膜染色が観察される。
スコア３＋  −  １０％以上の腫瘍細胞で、中〜強程度の完全な膜染色が観察される。
【０３０４】
ヘッジホッグキナーゼ発現スコアが０又は１＋である腫瘍は、それぞれ、ヘッジホッグキナーゼが過剰発現していないと特徴付けることができ、一方ヘッジホッグキナーゼ発現スコアが２＋又は３＋である腫瘍は、それぞれ、ヘッジホッグキナーゼが過剰発現していると特徴付けることができる。
【０３０５】
或いは又はさらに、ＩＮＦＯＲＭ（登録商標）（Ｖｅｎｔａｎａ，Ａｒｉｚｏｎａにより販売）又はＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（登録商標）（ヴィシス、イリノイ州）のようなＦＩＳＨアッセイを、ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した腫瘍組織に対して実施し、腫瘍におけるヘッジホッグキナーゼの過剰発現の程度（もし過剰発現しているとすれば）を測定することができる。
【０３０６】
ヘッジホッグキナーゼの過剰発現又は増幅は、例えば、検出する分子に結合し、検出可能な標識（例えば、放射性同位元素又は蛍光標識）でタグ付けされた分子（抗体、オリゴペプチド、有機分子、ＲＮＡｉ、ＲＮＡｉコンストラクト、アンチセンスオリゴヌクレオチドのような）を投与し、患者に対して標識の位置を外部からスキャニングすることによる、インビボ診断アッセイを用いて評価することができる。
【０３０７】
現在、癌の進行度に応じて、癌治療は、癌組織を除去する手術、放射線治療、及び化学療法のうち１種類の治療又はその組み合わせを含む。ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの投与を含む治療は、特に、化学療法の毒性及び副作用に対する耐性のあまりない高齢患者及び放射線治療の有用性に限界のある転移性疾患において望ましい場合がある。本発明の方法の腫瘍を標的とするヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを用いて、疾患の初期診断時又は再発時に、ヘッジホッグキナーゼが過剰発現している癌を軽くすることもできる。治療への応用については、かかるヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを、他の従来の薬剤の適用及び／若しくは例えばホルモン、抗血管新生、又は放射性標識化合物等の神経膠腫の治療方法の前若しくは後に併用してよく、又は手術、寒冷療法、放射線治療及び／若しくは化学療法と併用してよい。ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（ドセタキセル）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）（パクリタキセル（ｐａｌｉｃｔａｘｅｌ））、エストラムスチン及びミトキサントロンのような化学療法薬は、癌治療、特にグッドリスク患者に用いられる。
【０３０８】
具体的には、パクリタキセル（ｐａｌｉｃｔａｘｅｌ）及び修飾された誘導体（例えば欧州特許第０６００５１７号を参照）との併用療法が検討される。前述の抗体、ポリペプチド、オリゴペプチド又は有機分子は、化学療法薬の治療的に有効な投薬量で投与される。別の態様では、かかる抗体、ポリペプチド、オリゴペプチド又は有機分子は、化学療法と併用して投与され、例えばパクリタキセル等の化学療法薬の活性及び効果を増強する。Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ）には、種々の癌の治療に用いられているこれらの薬剤の投薬量が開示されている。治療的に有効なこれらの前述の化学療法薬の投与計画及び投薬量は、治療される具体的な癌、疾患の程度及び当該技術分野の医師によく知られている他の要因に応じて、医師が決定することができる。
【０３０９】
一特定の態様では、細胞毒性薬に結合された、かかるヘッジホッグキナーゼを含む免疫複合体が患者に投与される。好ましくは、かかる免疫複合体は細胞内部に取り込まれ、その結果、結合する癌細胞の死滅における免疫複合体の治療効果が向上する。好ましい態様では、細胞毒性薬は癌細胞内の核酸を標的とするか又はそれに干渉する。かかる細胞毒性薬の例は、上述のとおりであり、メイタンシノイド、カリケアマイシン、リボヌクレアーゼ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼが挙げられる。
【０３１０】
前述のヘッジホッグキナーゼアンタゴニスト又はその毒素複合体は、例えばボーラス投与等の静脈内投与のような既知の方法に従って、又は長期間にわたる持続注入により、頭蓋内、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）、関節内、くも膜下腔内、静脈内、動脈内、皮下、口腔内、局所若しくは吸入経路により、ヒト患者に投与される。
【０３１１】
他の治療計画を、前述のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの投与と組み合わせてよい。併用投与としては、別々の製剤又は単一治療用製剤を用いる同時投与、いずれかの順序での連続投与が挙げられ、両方（又は全て）の活性剤がその生物活性を同時に発揮する期間が存在することが好ましい。かかる併用療法が相乗的治療効果をもたらすことが好ましい。
【０３１２】
別の態様では、本発明の療法的治療方法は、異なる化学療法薬のカクテルの同時投与を含む、１又は２種類以上の上記ヘッジホッグキナーゼアンタゴニスト及び１又は２種類以上の化学療法薬又は増殖阻害剤の併用投与を含む。化学療法薬の例は、既に提供されている。かかる化学療法薬の製剤及び用量スケジュールは、メーカーの取扱説明書に従って使用するか又は熟練した開業医により経験的に決定してもよい。かかる化学療法の製剤及び投与計画はまた、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｅｄ．，Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９２）にも記載されている。
【０３１３】
疾患の予防及び治療では、投薬量及び投与方式は、既知の基準に従って医師により選択される。ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの適切な投薬量は、治療する疾患の種類、疾患の重症度及び経過、投与が予防目的か治療目的のいずれの場合でも、患者の病歴及び応答（を含む）薬歴、主治医の裁量に依る。前述のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、患者に一度に又は治療期間にわたって好適に投与してよい。投与は、静脈内点滴又は皮下注射により行ってよい。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば１又は２回以上の分割投与又は連続点滴のいずれであれ、約１μｇ／ｋｇないし約５０ｍｇ／ｋｇ／体重（例えば、約０．１ないし１５ｍｇ／ｋｇ／投与）のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストが、患者への投与の初期候補投薬量となるであろう。投与計画は、かかるヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷量の投与、それに続く約２ｍｇ／ｋｇの週１回の維持量の投与を含んでよい。しかしながら、他の投与計画が有用な場合もある。典型的な１日の投薬量は、上述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ以上であってよい。条件に依って、数日間又はそれ以上にわたる反復投与の場合、病徴が所望のレベルに抑制されるまで治療を持続する。この治療の進行は、従来の方法及びアッセイ並びに医師又は他の当業者に既知の基準に基づいて容易にモニターできる。
【０３１４】
患者への抗体タンパク質の投与とは別に、本出願は遺伝子治療による抗体の投与も考慮する。かかるヘッジホッグキナーゼポリペプチドアンタゴニストをコードする核酸の投与は、「治療上有効量の抗体投与」という表現に包含される。細胞内抗体を産生する遺伝子治療の使用に関しては、例えば１９９６年５月１４日発行の国際特許公開第９６／０７３２１号を参照。
【０３１５】
患者の細胞内にかかる核酸（所望によりベクターに含有された）を入れる、２つの主なインビボ及びエキソビボでのアプローチが存在する。インビボ送達の場合、核酸は患者の、通常抗体が必要な部位に直接注入される。エキソビボ治療の場合、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、改変された細胞を患者に直接又は例えば患者に移植される多孔質膜内に封入して投与する（例えば、米国特許第４，８９２，５３８号及び同第５，２８３，１８７号を参照）。核酸を生存細胞に導入するために利用可能な種々の技術が存在する。その技術は、核酸が、培養細胞にインビトロで導入されるか、又はインビボで目的の宿主の細胞に導入されるかに依って変化する。核酸をインビトロで哺乳類細胞に転移させるのに好適な技術としては、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法等が挙げられる。遺伝子のエキソビボ送達に一般的に用いられるベクターはレトロウイルスベクターである。
【０３１６】
現在好ましいインビボ核酸転移技術としては、ウイルスベクター（アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ随伴ウイルスのような）及び脂質系（遺伝子の脂質媒介制導入に有用な脂質は、例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ−Ｃｈｏｌである）を用いた  トランスフェクションが挙げられる。現在既知の遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコルの総説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３（１９９２）を参照。また国際公開第９３／２５６７３号及びそれに引用された参考文献を参照。
【０３１７】
Ｈ．製品及びキット
治療へ応用する場合、製品は容器と、ヘッジホッグシグナル伝達の全体又は一部を阻害するか、又はヘッジホッグシグナル経路の活性化によりもたらされる疾病又は状態の治療のための使用を指示する、容器上の又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器としては、例えば瓶、バイアル、シリンジ等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックのような種々の材料から形成してよい。容器は、癌の状況を治療するのに有効な組成物を保持し、無菌アクセスポートを有してよい（例えば、容器は、静脈注射用溶液袋又は皮下注射針により貫通可能な栓を有するバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１種類の有効成分はヘッジホッグキナーゼアンタゴニストである。ラベル又は添付文書は、組成物が神経膠腫治療のために用いられることを示す。ラベル又は添付文書は、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストを投与するための指示書をさらに含む。さらに、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー液、及びデキストロース溶液のような、医薬的に許容可能なバッファを含む第二の容器をさらに含んでよい。それは、他のバッファ、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含んでよい。
【０３１８】
例えばヘッジホッグキナーゼ発現細胞死滅アッセイ、細胞からのヘッジホッグキナーゼの精製又は免疫沈降等の種々の他の目的に有用なキットもまた提供され得る。ヘッジホッグキナーゼポリペプチドの単離及び精製のために、キットは、それぞれビーズ（例えばセファロースビーズ）に結合したヘッジホッグキナーゼ結合剤を含有してよい。例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロット等の、ヘッジホッグキナーゼポリペプチドをインビトロで検出及び定量するための、かかる分子を含有するキットも提供できる。製品と同様に、キットは、容器と、容器上の又は容器に付随したラベル又は添付文書を含む。容器は、本発明に使用できる、かかるヘッジホッグキナーゼ結合抗体、オリゴペプチド、ＲＮＡｉ、Ｒｎａｉコンストラクト又は有機分子のうち少なくとも１種類を含む組成物を保持する。例えば希釈剤及びバッファ等を収容し、抗体を制御する追加の容器を含んでよい。ラベル又は添付文書は、組成物の説明書並びに目的とするインビトロ又は診断的使用のための指示書を提供してよい。
【０３１９】
Ｉ．ヘッジホッグキナーゼをコードする核酸のセンス及びアンチセンス
ヘッジホッグキナーゼを阻害し、それ故ヘッジホッグシグナル伝達を活性化又は増幅することが予想される分子としては、アンチセンス又はオリゴヌクレオチドのようなヘッジホッグキナーゼをコードする核酸断片が挙げられ、これは標的ヘッジホッグキナーゼｍＲＮＡ（センス）又は標的ヘッジホッグキナーゼＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合することができる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含む。本発明によるアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、それぞれのヘッジホッグキナーゼＤＮＡのコード領域の断片を含む。任意のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいたアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：２６５９，１９８８）及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８，１９８８）に記載されている。
【０３２０】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合によって、二本鎖の分解促進、転写若しくは翻訳の中途終止を含む、幾つかの手段のうち１つ、又は他の手段により標的配列の転写又は翻訳をブロックする二本鎖が形成される。かかる方法は、本発明に含まれる。従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてヘッジホッグシグナル伝達の阻害又は減衰の一因となり得る、ヘッジホッグキナーゼタンパク質の発現をブロックすることができる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾された糖−リン酸ジエステル骨格（又は、国際公開第９１／０６６２９号に記載されたもののような他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、かかる糖結合は内因性ヌクレアーゼに対して耐性がある。耐性糖結合を有するかかるオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが（即ち、酵素的分解に抵抗できる）、標的ヌクレオチド配列に結合することができる配列特異性は保持する。
【０３２１】
本発明に従って用いられるアンチセンス化合物は、周知の固相合成技術を通して簡便に且つルーチン的に作製することができる。かかる合成のための装置は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（フォスターシティー、カリフォルニア州）を含む幾つかの供給メーカーにより販売されている。当該技術分野において既知のかかる合成のための任意の他の手段を代替的又は追加的に用いてよい。類似の技術を用いて、ホスホロチオネート及びアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチドを調製することは周知である。本発明の化合物はまた、摂取、分配及び／又は吸収を補助するために、他の分子、分子構造又は例えばリポソーム、レセプター標的分子、経口、直腸、局所用又は他の製剤のような化合物の混合物と混合、封入、結合、又は別の方法で一体にしてよい。かかる摂取、分配及び／又は吸収補助剤の調製を教示した特許としては、米国特許第５，１０８，９２１号、同第５，３５４，８４４号、同第５，４１６，０１６号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５２１，２９１号、同第５，５４３，１５８号、同第５，５４７，９３２号、同第５，５８３，０２０号、同第５，５９１，７２１号、同第４，４２６，３３０号、同第４，５３４，８９９号、同第５，０１３，５５６号、同第５，１０８，９２１号、同第５，２１３，８０４号、同第５，２２７，１７０号、同第５，２６４，２２１号、同第５，３５６，６３３号、同第５，３９５，６１９号、同第５，４１６，０１６号、同第５，４１７，９７８号、同第５，４６２，８５４号、同第５，４６９，８５４号、同第５，５１２，２９５号、同第５，５２７，５２８号、同第５，５３４，２５９号、同第５，５４３，１５２号、同第５，５５６，９４８号、同第５，５８０，５７５号及び同第５，５９５，７５６号が挙げられるが、これらに限定されない。これらは各々参照することにより本明細書に組み込まれたものとする。
【０３２２】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例としては、国際公開第９０／１００４８号に記載されたもののような有機分子、及びポリ−（Ｌ−リジン）のような標的核酸配列のためのオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる他の分子に共有結合したオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらに、エリプチシン及びアルキル化剤のような挿入剤又は金属錯体を、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させて、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの、標的ヌクレオチド配列への結合特異性を変更できる。
【０３２３】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ4媒介性のＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転移方法により、又はＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスのような遺伝子転移ベクターを使用することにより、標的核酸配列を含有する細胞に導入してよい。好ましい手順では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、好適なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含有する細胞は、インビボ又はエキソビボのいずれかで組み換えレトロウイルスベクターと接触する。好適なレトロウイルスベクターとしては、マウスレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶ由来のもの、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶ由来のレトロウイルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと呼ばれるダブルコピーベクター（国際公開第９０／１３６４１号を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２４】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、国際公開第９１／０４７５３号に記載されたように、リガンド結合分子と複合体を形成することにより、標的核酸配列を含有する細胞に導入してよい。好適なリガンド結合分子としては、細胞表面レセプター、増殖因子、他のサイトカイン又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、リガンド結合分子の結合は、実質的に、リガンド結合分子がその対応する分子若しくはレセプターと結合する、又はセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその複合体の細胞への侵入のブロックする能力を干渉しない。
【０３２５】
或いは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開第９０／１０４４８号に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により、標的核酸配列を含有する細胞へ導入してよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、内因性リパーゼにより細胞内で分離されることが好ましい。
【０３２６】
アンチセンス又はセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、一般に、少なくとも約５ヌクレオチドの長さ、或いは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、又は１０００ヌクレオチドの長さであって、この状況において「約」という用語は、基準となる長さの±１０％の長さの基準ヌクレオチド配列を意味する。
【０３２７】
Ｊ．他のｈｅｄｅｇｈｏｇキナーゼアンタゴニスト
別の態様では、ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストはリボザイムであってよい。リボザイムは、ｍＲＮＡのような一本鎖核酸を開裂することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡであって、相補的領域を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチドの形態である（リボザイムに関する総説としては、例えば、Ｏｈｋａｗａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １１８：２５１−２５８；Ｓｉｇｕｒｄｓｓｏｎ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ．Ｆ．（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １３：２８６−２８９；Ｒｏｓｓｉ，Ｊ．Ｊ．（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：３０１−３０６；Ｋｉｅｈｎｔｏｐｆ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７３：６５−７１を参照）。ヒトヘッジホッグキナーゼｍＲＮＡに対して特異性を有するリボザイムは、ヒトヘッジホッグキナーゼｃＤＮＡの核酸配列に基づいて設計することができる。例えば、ＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａＬ−１９ＩＶＳＲＮＡの誘導体は、活性部位の塩基配列がヒトヘッジホッグキナーゼｍＲＮＡ内で開裂される塩基配列に対して相補的であるように構築できる。例えば、米国特許第４，９８７，０７１号及び同第５，１１６，７４２号（ともにＣｅｃｈら）を参照。或いは、ヒトヘッジホッグキナーゼｍＲＮＡを用いて、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択してよい。例えば、Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ．Ｊ．Ｗ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８を参照。
【０３２８】
細胞内のヒトヘッジホッグキナーゼの発現及び／又は活性を阻害するために使用できる別の種類の阻害剤は、ヒトヘッジホッグキナーゼタンパク質に特異的な細胞内抗体である。細胞内のタンパク質の機能を阻害する細胞内抗体の使用は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２６３８−２６４６；Ｂｉｏｃｃａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＥＭＢＯ  Ｊ．９：１０１−１０８；Ｗｅｒｇｅ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２７４：１９３−１９８；Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：７４２７−７４２８；Ｍａｒａｓｃｏ，Ｗ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：７８８９−７８９３；Ｂｉｏｃｃａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：３９６−３９９；Ｃｈｅｎ，Ｓ−Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：５９５−６０１；Ｄｕａｎ，Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５０７５−５０７９；Ｃｈｅｎ，Ｓ−Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５９３２−５９３６；Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９：２３９３１−２３９３６；Ｂｅｅｒｌｉ．Ｒ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４：６６６−６７２；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：１５４２−１５５１；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：３１３７−３１４１；Ｍａｒａｓｃｏらによる国際公開第９４／０２６１０号；及びＤｕａｎ  らによる国際公開第９５／０３８３２号を参照）。
【０３２９】
細胞内抗体を用いてタンパク質活性を阻害するために、ベクターを細胞に導入する際、抗体鎖が細胞の細胞内区画で機能的抗体として発現するような形態の抗体鎖をコードする組み換え発現ベクターを調製する。本発明の阻害方法によるヒトヘッジホッグキナーゼ活性の阻害では、ヒトヘッジホッグキナーゼタンパク質に特異的に結合する細胞内抗体は、細胞の細胞質で発現する。細胞内抗体発現ベクターを調製するために、例えばヒトヘッジホッグキナーゼ等の目的の標的タンパク質に対して特異的な抗体鎖をコードする抗体のＬ鎖及びＨ鎖ｃＤＮＡを、典型的にはヒトヘッジホッグキナーゼタンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマから単離する。ハイブリドーマ分泌抗ヒトヘッジホッグキナーゼモノクローナル抗体、又は組み換え抗ヒトヘッジホッグキナーゼモノクローナル抗体は、上記のように調製することができる。ヒトヘッジホッグキナーゼタンパク質対して特異的なモノクローナル抗体を同定した後に（例えばハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体又はコンビナトリアルライブラリー由来の組み換え抗体のいずれか）、モノクローナル抗体のＬ鎖及びＨ鎖をコードするＤＮＡを標準的な分子生物学的技術により単離する。ハイブリドーマ由来抗体の場合、Ｌ鎖及びＨ鎖ｃＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより得ることができる。ファージディスプレイライブラリー由来のような、組み換え抗体の場合、Ｌ鎖及びＨ鎖をコードするｃＤＮＡは、ライブラリースクリーニング工程中に単離されたディスプレイパッケージ（例えばファージ）から回収することができる。それからＰＣＲプライマー又はｃＤＮＡ（ＣＤＮＡ）ライブラリープローブが調製できる、抗体のＬ鎖及びＨ鎖遺伝子の核酸配列は、当該技術分野において既知である。例えば、かかる配列の多くが、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２及び「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベースに開示されている。
【０３３０】
抗体のＬ鎖及びＨ鎖配列は、入手後に標準的な技術を用いて組み換え発現ベクターにクローニングされる。Ｌ鎖及びＨ鎖を細胞質で発現させるために、Ｌ鎖及びＨ鎖の疎水性リーダーをコードするヌクレオチド配列は除去される。細胞内抗体発現ベクターは、幾つかの異なる形態のうち１種類の細胞内抗体をコードすることができる。例えば、一態様では、完全長抗体が細胞内で発現するように、ベクターは完全長Ｌ鎖及びＨ鎖をコードする。別の態様では、Ｆａｂフラグメントが細胞内で発現するように、ベクターはＨ鎖のＶＨ／ＣＨ１領域のみを除いた完全長Ｌ鎖をコードする。最も好ましい態様では、ベクターは１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードし、この抗体内では、Ｌ鎖及びＨ鎖の可変領域は可動性ペプチドリンカー（例えば（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3）と結合しているため、抗体は、単鎖分子として発現する。細胞内のヒトヘッジホッグキナーゼキナーゼ活性を阻害するために、抗ヒトヘッジホッグキナーゼ細胞内抗体をコードする発現ベクター（ｓｅｃｔｏｒ）を、上文で論じたように、標準的なトランスフェクション方法により細胞に導入する。
【０３３１】
本発明のヘッジホッグキナーゼアンタゴニストのさらに別の形態は、ヒトヘッジホッグキナーゼの阻害形態であり、本明細書ではドミナントネガティブ阻害剤とも呼ばれる。ヘッジホッグキナーゼタンパク質は、特にヘッジホッグシグナル伝達成分標的分子のリン酸化状態を調節することにより、ヘッジホッグシグナル伝達成分標的分子の活性を調節することが知られている。酵素活性を有する分子の活性を阻害する１つの手段は、標的分子と相互作用する能力を有するが、酵素的活性の欠損したドミナントネガティブ阻害剤を使用することである。標的分子と相互作用することにより、かかるドミナントネガティブ阻害剤は、標的分子の活性化を阻害することができる。この過程は、細胞間情報伝達分子の酵素活性を制御する手段として自然界で起こる場合がある。
【０３３２】
従って、本発明の阻害剤は、他のタンパク質と相互作用する能力を有するが、酵素活性の欠損したヒトヘッジホッグキナーゼタンパク質の形態であってよい。このヒトヘッジホッグキナーゼタンパク質のドミナントネガティブ形態は、例えば、キナーゼコンセンサス配列が変化しているヒトヘッジホッグキナーゼの変異型であってよい。かかるドミナントネガティブヒトヘッジホッグキナーゼタンパク質は、ヒトヘッジホッグキナーゼタンパク質をコードする組み換え発現ベクターを用いて細胞内で発現することができ、標準的なトランスフェクション方法により細胞に導入される。変異型ＤＮＡは、組み換え発現ベクターに挿入され、次いで細胞に導入され、酵素活性の欠損した変異型ヒトヘッジホッグキナーゼの発現を可能にする。
【０３３３】
ヒトヘッジホッグキナーゼタンパク質の活性を阻害するために使用可能な他の阻害剤は、ヒトヘッジホッグキナーゼ活性を直接阻害するか、又はヒトヘッジホッグキナーゼと標的分子の間の相互作用を阻害する化学物質である。かかる化合物は、上文で詳細に記載したように、かかる化合物を選択するスクリーニングアッセイを用いて同定できる。
【０３３４】
Ｋ．ヘッジホッグキナーゼアンタゴニストの同定に用いるスクリーニングアッセイ
アッセイは、当該技術分野においてよく特徴付けられた生化学的スクリーニングアッセイ、セルベースアッセイ、及びキナーゼアッセイ等の種々の形式で実施することができる。
【０３３５】
アンタゴニストのためのアッセイは全て、一般に、本明細書においては、２つの成分が相互作用する条件下で、十分な時間をかけて、薬剤候補とヘッジホッグキナーゼポリペプチド（以下において、「標的分子」と呼ぶ）を接触させることを必要とする。
【０３３６】
結合アッセイでは、相互作用は候補化合物と標的分子が結合することであり、形成した複合体は反応混合物中で単離又は検出できる。特定の態様では、本明細書で同定された遺伝子によりコードされた標的分子又は薬剤候補は、例えばマイクロタイタープレート等の固相上に、共有又は非共有結合により固定化される。非共有結合は一般に、固体表面を標的分子の溶液でコーティングし、乾燥させることにより達成される。或いは、固定化される標的分子に対して特異的な、例えばモノクローナル抗体等の固定化抗体を用いて、それを固体表面に固着させてよい。アッセイは、検出可能な標識で標識されている場合がある非固定化成分を、例えば固着した成分を含有するコーティングされた表面等の固定化成分に添加することにより実施される。反応が完了した際、未反応成分は、例えば、洗浄等により除去され、固体表面に固着した複合体が検出される。最初に非固定化成分が検出可能な標識を保有する場合、表面上に固定化された標識の検出は、複合体形成が起こったことを示す。最初に非固定化成分が標識を保有しない場合、複合は、例えば固定化複合体に特異的に結合する標識された抗体を用いることにより、検出できる。
【０３３７】
候補化合物が、本明細書で同定された遺伝子によりコードされる特定の標的分子と相互作用するが結合しない場合、ポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための周知の方法によりアッセイできる。かかるアッセイとしては、例えば架橋、免疫共沈降、及び密度勾配カラム（ｇｒａｄｉｅｎｔｓ  ｃｏｌｕｍｎ）又はクロマトグラフカラムを通じた同時精製のような、伝統的なアプローチが挙げられる。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Ｃｈｅｖｒａｙ  ａｎｄ  Ｎａｔｈａｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５７８９−５７９３（１９９１）に開示されたように、Ｆｉｅｌｄｓ及び共同研究者により記載された（Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｓｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３４０：２４５−２４６（１９８９）；Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：９５７８−９５８２（１９９１））酵母ベースの遺伝子系を用いることによりモニターできる。酵母ＧＡＬ４のような、２つの物理的に分離したモジュラードメインから成る多くの転写活性化因子は、一方がＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方が転写活性化ドメインとして機能する。前述の刊行物に記載された酵母発現系（一般に「ツー・ハイブリッド系」と呼ばれる）はこの特性を活用し、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと融合し、他方では候補活性化タンパク質が活性化ドメインと融合した、２つのハイブリッドタンパク質を用いる。ＧＡＬ４により活性化されるプロモーターの制御下でのＧＡＬｌ−／ｌａｃＺレポーター遺伝子の発現は、タンパク質−タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用しているポリペプチドを含有するコロニーは、β−ガラクトシダーゼに対する発色性基質で検出される。ツー・ハイブリッド技術を用いて２つの特異的タンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ（商標））が、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販されている。この系はまた、特異的タンパク質相互作用に関与するタンパク質ドメインの位置を決定し、並びにこれらの相互作用にとって重大であるアミノ酸残基を特定することにも拡大適用できる。
【０３３８】
本明細書で同定された標的分子をコードする遺伝子の相互作用に干渉する化合物及び他の細胞内又は細胞外成分は、以下のように試験することができる。通常、遺伝子産物と細胞内又は細胞外成分を含有する反応混合物を、これら２つの産物が相互作用及び結合できる条件下及び時間で調製する。候補化合物の、結合を阻害する能力を試験するために、試験化合物の非存在下及び存在下で反応を行う。さらに、プラセボを第三の反応混合物に添加し、ポジティブコントロールとして機能させてよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分間の結合（複合体形成）は、上述のようにモニターする。コントロール反応において複合体が形成されるが、試験化合物を含有する反応混合物では形成されないことは、試験化合物が、試験化合物とその反応相手との相互作用を干渉していることを示す。
【０３３９】
好適な薬剤候補をアッセイするために、標的分子を、特定の活性（例えばヘッジホッグシグナル伝達活性化又は阻害）についてスクリーニングされる化合物とともに細胞に添加してよく、化合物の、標的分子の存在下で目的の活性を阻害する能力は、試験化合物が標的分子のアンタゴニストであることを示す。或いは、アンタゴニストは、標的分子と、膜結合標的分子又は組み換えレセプターを有する、可能性のあるアンタゴニストとを、競合的阻害アッセイに適切な条件下で組み合わせることにより検出できる。標的分子は、レセプターに結合する標的分子の数を用いて可能性のあるアンタゴニストの有効性を測定できるように、放射能等により標識してよい。レセプターをコードする遺伝子は、例えば、リガンドパニング及びＦＡＣＳソーティング等の、当業者に既知の多数の方法により同定することができる。Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎ．，１（２）：Ｃｈａｐｔｅｒ  ５（１９９１）。発現クローニングを使用することが好ましく、この場合、ポリアデニル化ＲＮＡが、標的分子に対して応答性を示す細胞から調製され、このＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーは２つのプールに分割され、ＣＯＳ細胞又は標的分子に対して応答性を示さない他の細胞をトランスフェクトするために用いられる。スライドガラス上で増殖したトランスフェクトされた細胞を、標識した標的分子に曝露する。標的分子は、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段により標識してよい。固定及びインキュベートした後、スライドガラスをオートラジオグラフィー分析に供する。ポジティブプールを同定し、サブプールを調製し、相互作用を生じるサブ・プーリング及び再スクリーニング過程を用いて再トランスフェクトし、最終的に推定上のレセプターをコードする単一クローンを得る。
【０３４０】
レセプター同定の代替アプローチとして、標識した標的分子を、細胞膜又はレセプター分子を発現する抽出製剤と光親和性結合させてよい。架橋物質は、ＰＡＧＥ及びＸ線フィルムへの曝露により分解される。レセプターを含有する、標識された複合体は切除し、ペプチド断片に分解し、タンパク質マイクロシーケンシングシーケンシングに供してよい。マイクロシーケンシングにより得られるアミノ酸配列を用いて、一連の変性オリゴヌクレオチドプローブを設計し、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、推定上のレセプターをコードする遺伝子を同定することができる。
【０３４１】
アンタゴニストのための別のアッセイでは、活性ヘッジホッグシグナル伝達を発現する哺乳類細胞を、候補化合物の存在下で、標識された標的分子とともにインキュベートしてよい。次いで、化合物の、かかるヘッジホッグシグナル伝達を増強する又はブロックする能力を測定できる（例えば、下流のＧｌｉ活性化レベルを測定することにより）。
【０３４２】
可能性のあるアンタゴニストのより具体的な例としては、標的分子と免疫グロビンの融合物に結合するオリゴヌクレオチド及び、特に、ポリ及びモノクローナル抗体並びに抗体断片、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、並びにかかる抗体又は断片のキメラ又はヒト化型が挙げられるが、これらに限定されない抗体、並びにヒト抗体及び抗体断片が挙げられる。或いは、可能性のあるアンタゴニストは、近縁タンパク質、例えば、レセプターを認識するが影響を与えず、それにより標的分子の作用を競合的に阻害することができる標的分子の変異型であってよい。
【０３４３】
別の可能性のあるヘッジホッグキナーゼアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡコンストラクトであって、例えばＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、標的となるｍＲＮＡにハイブリダイズすることによりｍＲＮＡの転写を直接ブロックし、タンパク質翻訳を阻止する。
【０３４４】
さらなる可能性のあるヘッジホッグキナーゼアンタゴニストとしては、活性部位、レセプター結合部位又はヘッジホッグキナーゼポリペプチドの増殖因子若しくは他の関連する結合部位に結合し、それによりヘッジホッグキナーゼポリペプチドの正常な生物活性をブロックする小分子が挙げられる。小分子の例としては、小ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチジル有機又は無機化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４５】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的開裂を触媒することのできる酵素ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへ配列特異的にハイブリダイズし、続いてヌクレオチド鎖を切断することにより作用する。可能性のあるＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術により同定できる。さらなる詳細は、例えばＲｏｓｓｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：４６９−４７１（１９９４）及び国際公開第９７／３３５５１号（１９９７年９月１８日発行）を参照。
【０３４６】
転写阻害のために用いられる三重らせん形成における核酸分子は一本鎖であり且つデオキシヌクレオチドから構成されるべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合則を介して三重らせん形成を促進するように設計され、これは一般に二本鎖のうち一本の鎖上に相当な長さのプリン又はピリミジンを必要とする。さらなる詳細は、例えば国際公開第９７／３３５５１号（上記）を参照。
【０３４７】
これらの小分子は、本明細書の上文で論じた任意の１又は２種類以上のスクリーニングアッセイ及び／又は当業者に周知の任意の他のスクリーニング技術により同定できる。
【０３４８】
スクリーニング方法をエキソビボアッセイとして実施する場合、標的分子（例えばヘッジホッグキナーゼ）は実質的に精製されたポリペプチドであってよい。キナーゼ基質（例えばＭＢＰ、Ｇｌｉ）は実質的に精製された基質であり、アッセイはキナーゼにより触媒された実質的に精製されたリン酸源との反応でリン酸化される。リン酸化の程度は、反応中のリン酸化された基質の量を測定することにより決定される。アッセイ中に測定されたリン酸化反応が自己リン酸化である場合のキナーゼ自体を含む、種々の可能性のある基質を用いてよい。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）；酵母タンパク質基質；合成ペプチド基質及びポリマー基質のような標準的なタンパク質基質を含む、外来性基質を用いてもよい。これらのうち、ＭＢＰ及び他の標準的なタンパク質基質が好ましいと考えられる（実施例１０を参照）。しかしながら、それはキナーゼに対する親和性、反応速度論の最小摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）、単一又は同種の反応部位の保有、取扱及び反応後の回収の容易さ、強いシグナル生成の可能性、並びに試験化合物に対する耐性又は不活性の点で優れている他の基質を同定してもよい。
【０３４９】
本発明の前述のエキソビボアッセイにおけるリン酸化された基質の量の測定は、イムノアッセイ、ラジオアッセイ、又は他の周知の方法を用いて実施してよい。イムノアッセイ測定では、反応中に形成されたリン酸化部分に特異的な抗体（ヤギ又はマウスの抗ホスホセリン／スレオニン抗体のような）を用いてよい。周知のＥＬＩＳＡ技術を用いると、ホスホセリン／スレオニン抗体複合体は、測定可能なシグナルを発することができる標識（例えば、蛍光又は放射性標識）に結合したさらなる抗体により検出される。さらに、マイクロタイタープレートにおけるＥＬＩＳＡ型アッセイを用いて、精製された基質を試験することができる。Ｐｅｒａｌｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８５：７１−７８（１９９２）；Ｓｃｈｒａａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１１：２３３−２３９（１９９３）；Ｃｌｅａｖｌａｎｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９０：２４９−２５３（１９９０）；Ｆａｒｌｅｙ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０３：１５１−１５７（１９９２）及びＬｏｚａｒｏ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：２５７−２６１（１９９１）。
【０３５０】
例えば、検出スキームは、キナーゼ反応中の基質の減少を測定することができる。最初に、リン酸供給源を32Ｐ又は33Ｐのような同位体で放射性標識し、反応中に基質に組み込まれた放射性標識の量を測定することにより、基質のリン酸化の量を測定することができる。検出は、（ａ）フィルター若しくはマイクロタイターウェル表面に吸着させ後の、βカウンタを用いる市販のシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）含有プレート及びビーズ、又は（ｂ）シンチレーション近接アッセイビーズ若しくはシンチラントプレートに結合させた後の測光手段により達成できる。Ｗｅｅｒｎｉｎｋ  ａｎｄ  Ｋｉｊｋｅｎ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３１：４９，１９９６；Ｂｒａｕｎｗａｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３４：２３（１９９６）；Ｋｅｎｔｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３４８８（１９９６）及びＲｕｓｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００：９８（１９９１）。
【０３５１】
非特異的結合又は好ましくは特異的結合により、基質が固体指示表面に結合することが好ましい。かかる結合により、シグナル検出の前に、取り込まれていない、標識されたリン酸供給源（アデノシン三リン酸のような）からリン酸化された基質を分離することが可能になる。一態様では、Ｎｕｎｃ（商標）高タンパク質結合プレート（Ｈａｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：６９５（１９９６））又はＷａｌｌａｃ  ＳｃｉｎｔｉＳｔｒｉｐ（商標）プレート（Ｂｒａｕｎｗａｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３４：２３（１９９６）の使用を通して、基質を反応前に物理的に固定化してよい。基質はまた、例えばＰ８１ホスホセルロース（塩基性ペプチドの場合）、ＰＥＩ／酸性モリブデン酸樹脂又はＤＥＡＥ上での捕捉することにより、又はＷｈａｔｍａｎ（商標）３Ｍペーパー上へのＴＣＡ沈殿により、反応後固定化してもよい（Ｔｉｇａｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３２５：２８９（１９９６）；Ｍｏｒａｗｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５０；１７（１９９６）；Ｂｕｄｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｎｏｓｙ  ３３：２７（１９９５）及びＣａｓｎｅｌｌｉｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．２００：１１５（１９９１））。さらに別の可能性は、支持体に結合しているグルタチオン及びストレプトアビジン（それぞれＧＳＴ及びビオチンの場合）のような結合パートナーを結合することによるか、又は同様に支持体に結合したタグに特異的な抗体を介した、支持表面への基質の結合である。
【０３５２】
上記の方法に好ましい、さらなる検出方法を開発してよい。特に、ハイスループットスクリーニングと共に用いる場合、かかる方法は良好な感度及び特異性、広い線形部分の範囲（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｌｉｎｅａｒ  ｒａｎｇｅ）、低バッククラウンドシグナル、最低限のばらつき、他の試薬との適合性、並びに自動処理システムとの適合性を示すことが予想される。
【０３５３】
本発明の治療のインビボでの有効性は、種々のげっ歯類モデルで化学的に誘導された腫瘍に対して研究することができる。インビトロ細胞培養で増殖した腫瘍細胞株を、例えばマウス等の実験用げっ歯類に、例えば皮下経路等の注射により導入できる。実験動物内での腫瘍の化学的誘導技術は、当該技術分野において既知である。
【０３５４】
Ｌ．ＲＮＡｉの調製
「ＲＮＡコード領域」は、二本鎖ＲＮＡ複合体のようなＲＮＡ分子の合成用テンプレートとして機能し得る核酸である。好ましくは、ＲＮＡコード領域はＤＮＡ配列である。
【０３５５】
ＲＮＡコード領域は、特定の遺伝子の発現を下方制御することができる二本鎖ＲＮＡ複合体（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）をコードすることが好ましい。ある態様では、二本鎖ＲＮＡ複合体は、ステムループ又はいわゆる「ヘアピン」構造を有するＲＮＡ分子の形態で発現する。本明細書で使用する時、「ヘアピン」構造はｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを含む。ある態様では、二本鎖ＲＮＡ複合体は、別々の相補的又は部分的に相補的なＲＮＡ鎖の形態で発現する。
【０３５６】
例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ等の二本鎖ＲＮＡ複合体を設計する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、有効なｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡの設計について記載したリソース及び引用は、Ｓａｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３９：２１５−２２４（２００５）に見られる。二本鎖ＲＮＡ複合体の配列は、天然起源であってよく、又は合成であってもよいことを理解されたい。例えば、実施例１３には、天然起源のマイクロＲＮＡの骨格に埋め込まれた合成二本鎖部分を含むハイブリッドｍｉＲＮＡが開示されている。
【０３５７】
下方制御される遺伝子領域に対応する二本鎖領域を含むＲＮＡ複合体は、細胞内で発現する。ＲＮＡ二本鎖領域のうち一本の鎖の配列は、下方制御の標的となるコード領域の配列と実質的に同一（典型的には、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一）である。二本鎖領域の他の鎖（互換的に「ＲＮＡ二本鎖領域」と呼ばれる）は、下方制御の標的となるコード領域の配列に対して相補的又は部分的に相補的である（典型的には、標的となるコード領域の相補鎖と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である）。二本鎖領域は２つの別々のＲＮＡ鎖により、又はヘアピン構造を有する一本鎖ＲＮＡの自己相補的部分により形成できることを理解されたい。二本鎖領域は、一般に、長さ少なくとも約１５ヌクレオチド、ある態様では長さ約１５ないし約３０ヌクレオチドである。しかしながら、著しく長い二本鎖領域を幾つかの生物で有効に使用することができる。より好ましい態様では、二本鎖領域は、長さ約１９ないし２２ヌクレオチドである。二本鎖領域は、この領域全体にわたって標的ヌクレオチド配列と同一であることが好ましい。
【０３５８】
下方制御されるコード領域が、高度に保存された遺伝子ファミリー内にある場合、ＲＮＡ二本鎖領域の配列は、所望の遺伝子のみを標的とするために、配列比較を補助として用いて選択してよい。他方、生物内に相同な遺伝子のファミリー間で十分な同一性がある場合、二本鎖分子は、複数の遺伝子を同時に下方制御するよう設計することができる。
【０３５９】
ある態様では、コンストラクト内の一本鎖ＲＮＡコード領域は、センス領域、ループ領域及びアンチセンス領域を含む自己相補的ヘアピンＲＮＡの発現のためのテンプレートとして機能する。センス及びアンチセンス領域は、各々約１５ないし約３０ヌクレオチドの長さであることが好ましい。ループ領域は、好ましくは約２ないし約１５ヌクレオチド、より好ましくは約４ないし約９ヌクレオチドの長さである。発現に続いて、センス及びアンチセンス領域は二本鎖を形成する。
【０３６０】
別の態様では、ベクターは２つのＲＮＡコード領域を含む。第一コード領域は、第一ＲＮＡの発現用テンプレートであり、第二コード領域は第二ＲＮＡの発現用テンプレートである。発現後、第一及び第二ＲＮＡは二本鎖を形成する。レトロウイルスコンストラクトもまた、第一ＲＮＡコード領域に機能的に結合した第一ＰｏｌＩＩＩプロモーターと、第二ＲＮＡコード領域に機能的に結合した第二ＰｏｌＩＩＩプロモーターを含むことが好ましい。
【０３６１】
特定の態様では、本発明のベクターは、異なる標的遺伝子の発現を阻害する１を超えるＲＮＡコード領域の形成に十分な核酸配列を包含し得ることを理解されたい。この態様では、異なる標的遺伝子の同時阻害は、本発明の単一ベクターにより達成することができる。同時に発現する可能性のある様々なＲＮＡ複合体転写産物の数は、ベクターのパッケージング容量（ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）によってのみ制限され（ウイルスベクターが使用される場合）、以下に記載するプロモーターのいずれかを含む、隣接するプロモーターは、干渉を除く又は最小限に抑え、複数の標的遺伝子を有効に同時阻害できるように選択され得る。例えば２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、又は１０以上の隣接するプロモーターの複数のＲＮＡコンストラクト転写産物の阻害により、ユーザーが、幾つかのコード領域（例えば、遺伝子）が同時に標的とされ、複雑な遺伝系の操作及び解明を可能にする場合のみ生じる、所望の表現型を発生させることが可能になる。
【０３６２】
以下の実施例は、説明目的のためだけに提供され、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０３６３】
本明細書で引用した特許及び文献参照は全て、その全文が参照することにより組み込まれたものとする。
【実施例】
【０３６４】
実施例
本実施例で参照する市販の試薬は、特に記載のない限り、製造元の使用説明書に従って用いた。以下の実施例中と明細書を通してＡＴＣＣ受託番号により同定される細胞の供給源は、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（マナサス、バージニア州）である。
【０３６５】
実施例１：キナーゼｓｉＲＮＡスクリーニングによりヘッジホッグシグナル伝達の調節因子が同定される
【０３６６】
【表６】
2009526752.tif 000008
【０３６７】
方法：
セルライン
ＲＮＡｉで用いたＳ１２細胞は、Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．１：１０（２００２）に記載されるＨｈ−ルシフェラーゼレポーターと安定に融合したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（ＡＴＣＣ）から誘導された細胞であり、ＡＴＣＣガイドラインに沿って維持される。Ｈｈ候補の特異性の決定に用いたＳＶ４０細胞は、ルシフェラーゼ発現を駆動するＳＶ４０プロモーターと安定に融合したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から誘導された細胞である。
【０３６８】
ｓｉＲＮＡライブラリーとコントロール
３２４８種類のｓｉＲＮＡを含むマウス由来ｓｉＲＮＡキナーゼライブラリーをＤｈａｒｍａｃｏｎ社から購入した。ライブラリーには、全て既知のマウスキナーゼ及びキナーゼ調節タンパク質から成る８１２種類の遺伝子と、各遺伝子につき４種類の固有のｓｉＲＮＡが含まれていた。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ非ターゲッティングｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｄ００１２１０−０１）をネガティブコントロールとして使用し、Ｓｍｏ  ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｍ−０４１０２６）をポジティブコントロールとして使用した。
【０３６９】
ヘッジホッグ調節因子のハイスループットｓｉＲＮＡスクリーニング
ＤｈａｒｍａｃｏｎライブラリーをＤｈａｒｍａｃｏｎ  ｓｉＲＮＡバッガーに溶解し、０．５μＭの濃度で娘プレートに分注して、−８０℃で保存した。続いて、娘プレートをトランスフェクションの日に解凍し、各ｓｉＲＮＡのうち７μｌを、７μｌのＯｐｔｉｍｅｍ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ）を含む新たな９６ウェルプレートに移した。０．３μｌのＤｈａｒｍａｆｅｃｔ試薬＃３と１３．７μｌのＯｐｔｉｍｅｎ（登録商標）から成る混合物をｓｉＲＮＡに添加し、２０分間インキュベートした。Ｓ１２細胞を１１０００細胞／ウェルの密度で播種した。トランスフェクションから６４時間後に２００  ｎｇ／ｍｌのオクチル修飾Ｓｏｎｉｃ  ヘッジホッグ（Ｏ−Ｓｈｈ，Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，上記）を細胞に添加した。２４時間後にＳｔｅａｄｙ  Ｌｉｔｅ（登録商標）を製造元の使用説明書に従って用いてルシフェラーゼ基質を添加し、Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ（登録商標）ルミノメーターを用いて数値を測定した。アッセイは、終濃度２５  ｎＭのｓｉＲＮＡを含む各条件（−／＋  ２００ｎｇ／ｍｌのＯ−Ｓｈｈ）について、３つの重複する系で行った。ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたプレートの別のセットを残し、細胞生存率を測定（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ）するために製造元の説明書に従って用いた。ｓｉＲＮＡスクリーニングを行う前に、使用するトランスフェクション用試薬の種類、播種する細胞数、及びｓｉＲＮＡの濃度を含む、９６ウェルのフォーマットで用いる複数のパラメーターについて最適化を行った。例えば、Ｓ１２細胞はコンフルエントな時にＨｈに対して最大の反応性を示すが、我々は、ｓｉＲＮＡトランスフェクション時に約８０％のコンフルエンシーで細胞を播種すると、最大のＨｈ反応性が得られることを見出した。最適化を行った後、０．６１のＺスコア計算値により、我々のアッセイがロバストであることが示された（図８Ａ）。
【０３７０】
データ解析
ルシフェラーゼ測定値を自然対数（ＬＮ）値に変換し、参照用プレート（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ非ターゲッティングコントロール、Ｄ００１２１０−０１）に対して正規化した。３つの正規化した値を平均化し、「ヘッジホッグ処理」から「非ヘッジホッグ処理」を引いたスコアを各ｓｉＲＮＡについて計算した。遺伝子は、対応遺伝子に対する１又は２個以上のｓｉＲＮＡが、ライブラリーの全ｓｉＲＮＡの平均値から標準偏差の１．５倍以上逸脱した場合に、潜在的なヒットとして考慮した。
【０３７１】
ｑＲＴ−ＰＣＲ
ノックダウンされた転写物を測定するため（スクリーニングと同じ条件）、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの８８時間後にＳ１２から、又はｓｉＲＮＡで６４時間トランスフェクショトしたＳ１２細胞からＲＮＡを回収して、次いでＨｈで２４時間刺激して、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＨｈ標的遺伝子（Ｇｌｉ１及びＰｔｃｈ１）に対する効果を測定した。次いで、精製時にサンプルをＤｎａｓｅ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）処理に付して、ゲノムＤＮＡ混入物を除去した。リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲアッセイには、１００  ｎｇ／ウェルのトータルＲＮＡを鋳型として用い、ワンステップｑＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた。プローブは、５’−ＦＡＭレポーターと３’−Ｔａｍｒａクエンチャーから構成されていた。目的遺伝子（Ｇｌｉ−１、Ｐｔｃｈ１及びＲｐｌ１９（コントロール）の発現については、ＳＤＳ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、カリフォルニア州）を用いて２つの重複するウェルをアッセイした。転写物の相対存在量は、２−Ｃｔ法を用いてＲＰＬ  １９濃度に対して正規化した。ｍＲＮＡノックダウンと相関する表現型において、我々は、ＣＴ値が４０であったことから我々のセルラインでは１種類の遺伝子が発現していなかったことを見出した。同一のｑＲＴプローブセットでも精巣ｍＲＮＡを用いた場合には２３のＣＴ値が得られたことから、このことはｑＲＴプローブセットが原因ではなかった。
【０３７２】
解析は、ＳＤＳソフトウェア（バージョン１．７；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。
【０３７３】
【表７】
2009526752.tif 000009
【０３７４】
エピスタシス実験
ＧＬＩ１及びＳＭＯ２の過剰発現実験は、１００ｎＭのｓｉＲＮＡプールとＤｈａｒｍａｆｅｃｔ  ＃３トランスフェクション用試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を用いて、６ウェルのフォーマットにて、３つの重複する系で行った。２４時間後、細胞をトリプシン処理して、１２ウェルプレート上に再播種した。次の日（ｓｉＲＮＡトランスフェクションから約４８時間後）、Ｇｅｎｅ  Ｊｕｉｃｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、細胞を４００ｎｇのベクターコントロール、ＳＭＯＭ２、又はＧＬＩ１、２００ｎｇのＨｈ−ルシフェラーゼ、及び１００ｎｇのＴＫ−Ｒｅｎｉｌｌａでトランスフェクトした。６時間後に培地を交換した。更に４８時間後、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造元の説明書に従って用いて、ルシフェラーゼの値を測定した。Ｒｅｎｉｌｌａ値も測定して、プラスミドのトランスフェクション効率に対して正規化した。実験は、３つの系で重複して行った。
【０３７５】
２重ｓｉＲＮＡ実験では、細胞を９６ウェルフォーマットにて、５０  ｎＭの候補ｓｉＲＮＡ（１００  ｎＭの終濃度の全ｓｉＲＮＡ）及びＤｈａｒｍａｆｅｃｔ  ＃４トランスフェクション用試薬と共に５０  ｎＭのＧｌｉ３  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ  ＃４トランスフェクション用試薬は、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ  ＃３よりも僅かに細胞に対する毒性が高かったが、Ｇｌｉ３  ｓｉＲＮＡで処理した細胞のＨｈ活性レベルに示されるように、トランスフェクション効率は、ずっと高かったことが見出された（Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ  ＃３で２倍のＧｌｉ３  ＨＨ経路の誘起であり、これに対してＤｈａｒｍａｆｅｃｔ  ＃４では５倍の誘起であった）。８８時間後、ルシフェラーゼアッセイは先に記載したように、Ｓｔｅａｄｙ  Ｌｉｔｅ（登録商標）を用いて行った。実験は、３つの系で重複して行った。
【０３７６】
繊毛実験
リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＳｕｐｅｒ（Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ）又はｐＳｕｐｅｒ−ｓｈＮＥＫ１をマウス由来のＩＭＣＤ３（ＡＴＣＣ）細胞にトランスフェクトし、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む培地でセレクションを行った。３週間後、安定にトランスフェクトした細胞の残りのプールを回収して、ＬａｂＴｅｋ  ２ウェルチャンバースライド上に播種し、７日間増殖させた。細胞を、４％のホルムアルデヒド中で、室温にて１０分間固定し、１０％のロバ血清と０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＴｒｉｓ緩衝食塩水でブロッキングした。抗アセチル化チューブリン抗体（１：５０００）を５０分間インキュベートし、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳで洗浄した。Ｃｙ３結合抗マウス２次抗体を用いて、アセチル化チューブリンを可視化した。核の対比染色のため、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むＶｅｃｔｏｒｓｈｉｅｌｄマウント培地にマウントした。繊毛を標識したＩＭＣＤ３細胞を、６３Ｘ、０．９−ＮＡ水浸対物レンズ及びＣｈａｍｅｌｅｏｎ  ｍｕｌｔｉ−ｐｈｏｔｏｎ  Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ（６５０−９５０ｎＭ）並びにＡｒ（４８８−ｎｍ）及び２つのＨｅ／Ｎｅ（５４３−ｎｍ及び６３３−ｎｍ）レーザーを具備したアップライトレーザースキャン共焦点顕微鏡を用いて、０．５μｍの厚さで、ｚ方向の高さに約１５−１８μｍを表す光学断面を作製した。繊毛を有する細胞のカウントには、各実験においてｎ＝３００となるよう、３つの系で独立して実験を行った。
【０３７７】
結果：
ＲＮＡｉスクリーニングを行うため、８１２種類の遺伝子をターゲッティングし、遺伝子１種類当たり４種類のｓｉＲＮＡから成る、全部で３２４８種類の異なるｓｉＲＮＡを含むキノームｓｉＲＮＡライブラリー（図５Ｃ）を用いた。ｓｉＲＮＡトランスフェクションから６４時間後に、細菌に発現させて精製したＳｏｎｉｃ  ヘッジホッグ（Ｓｈｈ）を培地に添加して、Ｈｈ経路を誘起した。ルシフェラーゼ活性のアッセイは、更に２４時間後に行った。スクリーニングは、各処理（Ｓｈｈ含有又はＳｈｈ不含）について３つの重複する系で行い、そして、並行スクリーニングを行って２０％を超える細胞をスクリーニングから除外して細胞生存率を測定した。
【０３７８】
データを解析するため、生データを自然対数（ＬＮ）に変換し、次いで、同一プレート内の平均化された非ターゲッティングコントロールｓｉＲＮＡに対して正規化した（各実験プレート上に３つの重複する系）。正規化したデータの解析により、ｒ＝  ０．７１−０．８２の範囲で反復試験管の相関係数が示され、このアッセイが高い再現性を有することが示された（図５Ｄ）。どのｓｉＲＮＡがＨｈ経路の誘起に影響したのかを決定するため、各ｓｉＲＮＡについて、３つの重複系の平均値からの「Ｈｈ処理」及び「非Ｈｈ処理」の差を測定した（図５Ｅ）。ライブラリー中の全ｓｉＲＮＡの平均値から標準偏差の１．５倍逸脱したスコアを示す２又は３種類以上の独立したｓｉＲＮＡを含む遺伝子のみを、潜在的なヒットとみなした。この選別基準を用いて、更なるキャラクタリゼーションのために３０種類のキナーゼを選択した。
【０３７９】
３０種類のヒットを確認するため、この３０種類のヒットをターゲッティングする４種類のｓｉＲＮＡをそれぞれ用いたＨｈ−ルシフェラーゼアッセイを繰り返すことで、３０種類の遺伝子のうち２９種類に対する同一のｓｉＲＮＡが、再現性をもってＨｈシグナル伝達を低下させることができることを見出した（データは非表示）。第２に、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、Ｈｈ−ルシフェラーゼレポーターノックダウンが、２９種類の遺伝子をターゲッティングする４種類のｓｉＲＮＡのそれぞれのｍＲＮＡノックダウンと相関性を示すかどうかを決定した（図６Ａ）。２９種類の遺伝子のうち、Ｓ１２細胞内で１種類の遺伝子の発現を検出できなかったため、Ｈｈ−ルシフェラーゼレポーターとｍＲＮＡのノックダウンについては、残りの２８種類のみに相関性を認めることができた。驚くべきことに、４種類のｓｉＲＮＡのうち２種類のみがＨｈシグナルを低下させた遺伝子（図６Ａ、「２ヒット」区分）の多くは、Ｈｈ−ルシフェラーゼレポーターとｍＲＮＡノックダウンの間に相関性が認められず、この区分にあるヒットの大部分が、偽陽性であったことが示唆される。実際に、「２ヒット」区分の１９種類の遺伝子のうち、たったの２種類のみ（約１１％）が、Ｈｈ−ルシフェラーゼレポーターと転写物のノックダウンに相関関係を示した。反対に、少なくとも３種類のｓｉＲＮＡがＨｈシグナルを低下させた遺伝子（図６Ａ、「＞３ヒット」区分）では、Ｈｈ−ルシフェラーゼレポーターとｍＲＮＡのノックダウンに高い相関性が示された。この区分においては、９種類の遺伝子のうち９種類（１００％）が、Ｈｈ−ルシフェラーゼレポーター活性と転写物のノックダウンの間に相関関係を示した（図６Ａ、「＞３ヒット」区分）。従って、３又は４種類のｓｉＲＮＡ／遺伝子と比べて、２種類のｓｉＲＮＡ／遺伝子では、やはり有意な偽陽性率（８９％）が観察される。
【０３８０】
ｓｉＲＮＡが有意なオフターゲット効果を有することを示す報告数の増加は、ハウスループットなＲＮＡｉスクリーニングにより得られたデータに対する懐疑を生じさせ、いずれのヒットも確認するための２次的なアッセイの必要性が強調された。我々は、表現型を転写物のノックダウンと相関させることで大部分の偽陽性は排除されたものと考えたが、Ｈｈシグナルに対する効果が、遺伝子特異的ノックダウン又はオフターゲット効果のいずれによるものであったのかを更に評価することを望んだ。ＲＩＳＣ複合体内へのセンス鎖の取込みと翻訳阻害によって生じるオフターゲット遺伝子又は非特異的標的を有するアンチセンス鎖の類似性により生じる「マイクロＲＮＡ効果」。Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３３：４５２７（２００５）；Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  １２：１１９７（２００６）；Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：１９９（２００６）；Ｆｅｄｏｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  １２：１１８８（２００６）。
【０３８１】
ｓｉＲＮＡをプールすることで、オンターゲットによるサイレンシングを維持しつつ、有意にオフターゲット効果を低下させることが実証されている。Ｆｅｄｏｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、上記。オンターゲットジーンサイレンシングにより生じた表現型と、オフターゲットジーンサイレンシングにより生じた表現型を区別するため、４種類の元々の各ｓｉＲＮＡ又は各ヒットに対応するｓｉＲＮＡを再合成してプールし、Ｈｈ−ルシフェラーゼアッセイを繰り返した。図６Ｂに示すように、１１ヒット中の９つが、Ｈｈシグナルを必要とした。Ｈｈ−ルシフェラーゼシグナルの有意な低下にも関わらず、個々のｓｉＲＮＡに優劣がない場合には、プールしたｓｉＲＮＡを用いた転写物のノックダウンは同等のものであったことから、このアッセイで再現性を示さなかった２つのヒット（Ｐａｋ６及びＳｃｙｌ１）は、恐らく偽陽性であると考えられる（図６Ａと図６Ｂを比較）。
【０３８２】
実施例１の表には、キナーゼスクリーニングにより得た我々の９つのヒットが確認されたことが示されている。次に、我々は、恒常的プロモーターＳＶ４０からのルシフェラーゼ発現（ＳＶ−４０ルシフェラーゼ）を低下させる能力について、プールした対応するｓｉＲＮＡをテストすることにより、この９種類の遺伝子が、Ｈｈシグナルに特異的に必要とされているが、恐らく一般的な細胞生存率又は転写に影響することがないことを探索し、決定した。図２Ｃに示すように、ヒットのいずれもＳＶ４０−ルシフェラーゼレポーターに対する有意な効果を示さなかったことから、９つのヒットが全て、恐らく排他的ではないにしろ、特異的にＨｈシグナルに必要とされることが示唆された（図６Ｃ）。また、我々は、候補の遺伝子がＨｈシグナルに必須である場合には、これらは、内在性のＨｈ−標的遺伝子であるＧｌｉ１及びＰｔｃｈ１の活性化にも必要とされるであろうと論理付けた。Ｈｈリガンドで刺激した場合、Ｓｍｏ  ｓｉＲＮＡで処理した細胞は、コントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞のレベルの約２０％までしかＧｌｉ１及びＰｔｃｈ１を誘起することが出来なかった（図６Ｄ）。Ｓｍｏ  ｓｉＲＮＡで処理した細胞と同様に、９種類の候補全てをターゲッティングするｓｉＲＮＡは、Ｈｈ誘導性のＧｌｉ１及びＰｔｃｈ１の活性化を劇的に低下させた（図６Ｄ）。従って、これらの候補は、Ｈｈシグナル伝達と内在性のＨｈ標的遺伝子の活性化に必要とされている。
【０３８３】
Ｈｈ経路内における候補の位置を定めるため、この経路の既知の正の制御因子であるヒトＳＭＯ若しくはＧＬＩ１、又はＨｈ経路の既知の負の制御因子であるＧｌｉ３に対するｓｉＲＮＡのいずれかを過剰発現するコンストラクトを用いてエピスタシス実験を行った。ＳＭＯは、ＨｈからＧＬＩ１転写因子にシグナルを中継するために必要であり、ＳＭＯＭ２（Ｗ５３５Ｌ）をコードするヒトＳＭＯ内の変異は、Ｈｈ経路を恒常的に活性化させることになる［Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：９０（１９９８）］。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞では、ＳＭＯＭ２のトランスフェクションにより、リガンドに非依存的に、Ｈｈ経路を活性化することが可能である。Ｍｕｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．９：７６（１９９９）。我々は、候補遺伝子がＳｍｏの上流で作用する場合、標的遺伝子のサイレンシングは、ＳＭＯＭ２媒介性のＨｈ経路活性化に作用することはないであろうと論理付けした。反対に、ヒットがＳｍｏの下流に作用した場合には、それらの発現のサイレンシングは、ＳＭＯＭ２媒介性のＨｈ経路活性化を妨げるであろう。これらのヒットがＳｍｏの上流又は下流で作用するのかを評価するため、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を我々の候補ｓｉＲＮＡで形質転換して、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後４８時間に、細胞をヒトＳＭＯＭ２のコントロールベクター、Ｈｈ−ルシフェラーゼレポーター及びｒｅｎｉｌｌａレポーターでトランスフェクトして、プラスミドトランスフェクション効率を正規化した。ポジティブコントロールとして、細胞を非ターゲッティングｓｉＲＮＡ及びＳｍｏ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたが、これらの両ｓｉＲＮＡは、ＳＭＯＭ２のＨｈ経路を活性化させる能力に影響を与えないはずである（図７Ａ）。ＳＭＯＭ２の過剰発現により、ＣＳＮＫ１Ａ１、Ｇｙｋ、Ｈｅｋ１及びＴｔｋをターゲッティングするｓｉＲＮＡで処理した細胞内でＨｈ経路を活性化することができ、これらの遺伝子は、恐らくＳｍｏの上流で、又はＳｍｏと並行して作用することが示唆された（図７Ａ及び７Ｄ）。対照的に、ＳＭＯＭ２の過剰発現は、ＣＤＣ２Ｌ１、ＰＬＫ１、Ｐｒｋａｒ１ａ、Ｐｒｋｒａ及びＴｔｂｋ２をターゲッティングするｓｉＲＮＡで処理した細胞内で、Ｈｈ経路を活性化できないか、又は部分的にのみ活性化することができ、これらの遺伝子は、恐らくＳｍｏの上流で作用することが示唆された（図７Ａ及び７Ｂ）。
【０３８４】
Ｇｌｉ１過剰発現も、リガンド非依存的にＨｈ経路を活性化させるのに十分であるが、Ｓｍｏの下流で作用する。Ｇｌｉ１に相対的なヒットの位置を定めるため、上記のエピスタシスアッセイを繰り返したが、ヒトＳＭＯＭ２をＧＬＩ１で置き換えた。いずれのｓｉＲＮＡもＧＬＩ１によるＨｈ経路の活性化を低下させることができず、Ｇｌｉ１は、恐らく我々の９つのヒットの上流で作用することが示された（図７Ｂ及び図７Ｄ）。
【０３８５】
Ｇｌｉ１とは対照的に、ＧＨ３は、主としてＨｈ経路のリプレッサーとして作用し、Ｇｌｉ３  ｓｉＲＮＡで処理したレポーター細胞は、リガンド非依存的なＨｈ−ルシフェラーゼ活性の増加を示す（図５Ａ）。Ｇｌｉ３に相対的な位置を定めるため、Ｇｌｉ３をターゲッティングするｓｉＲＮＡと各候補遺伝子で細胞をトランスフェクトした。コントロール細胞との比較において、Ｇｌｉ３  ｓｉＲＮＡで処理した細胞は、Ｈｈ−ルシフェラーゼアッセイで測定したところ、５倍のＨｈ活性化の増大を示す。Ｇｌｉ３とＳｍｏのｓｉＲＮＡの両方で処理した細胞は、Ｇｌｉ３と同様に経路を活性化させ、Ｇｌｉ３の上流で作用するＳｍｏと一致していた（図７Ｃ）。Ｇｌｉ３を９つのヒットに対応する各ｓｉＲＮＡと組み合わせた場合、Ｈｈ経路のＧｌｉ３依存的活性化の低下は観察されなかった（図７Ｃ）。従って、９つの候補の全ては、Ｇｌｉ３の上流で作用するものと考えられる（図７Ｄ）。ヒットがＨｈ経路のどこで作用するのかをまとめたものを、図７Ｄに示す。
【０３８６】
ここ数年において、繊毛内の鞭毛内輸送（ｉｎｔｒａｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ：ＩＦＴ）がＨｈシグナル伝達に決定的なものであることが示されてきた。Ｈｕａｎｇｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）、上記；Ｈｕａｎｇｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）、上記；Ｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．上記、Ｃｏｒｂｉｔ  ｅｔ  ａｌ．、上記、Ｈａｙｃｒａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．、上記。ＮＥＫ１は、キナーゼのＮＩＭＡファミリーに属し、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ及びＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｍａｓ内に存在し、繊毛機能に必要とされるＮＩＭＡ関連キナーゼである。Ｍａｈｊｏｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １５：５１７２（２００４），Ｗｌｏｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １７：２７９９（２００６）。ヒトＮＥＫ１は、腎臓の繊毛損傷により生じると考えられる症候群である多発性嚢胞腎疾患（ＰＫＤ）に関与すると考えられている。Ｕｐａｄｈｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：２１７（２０００）。ＮＥＫ１は、また、中心体に位置すると報告されており［Ｍａｈｊｏｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１６：３４８５（２００５）］、ＩＦＴ順行性モータータンパク質であるＫｉｆ３ａと相互作用することが示されている［Ｓｕｒｐｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：１５３６９（２００３）］。我々は、ＲＮＡｉスクリーニングでＮＥＫ１を単離したことから、ＮＥＫ１が繊毛輸送及び／又は繊毛構造において主な機能を有するかもしれないと考えた。この疑問に取り組むため、マウスＩＭＣＤ３細胞（インビトロで繊毛形成することが実証されている）が、ＮＥＫ１に対する低分子ヘアピンＲＮＡｉ（ｓｈＲＮＡ）を安定して発現するように、遺伝子組替えを行った。約４０％の細胞が繊毛を発達させたコントロール細胞とは対照的に、ＮＥＫ１  ｓｈＲＮＡを発現するＩＭＣＤ３細胞は、繊毛形成の劇的な低下を示し、約１％の細胞が繊毛を発達させただけであった。図７Ｅ及び８Ｂ。従って、我々は、哺乳動物由来のＮＥＫ１は、その繊毛発生における役割を通じてＨｈシグナルに影響を及ぼすことを提示した。
【０３８７】
我々の知る限り、これは、表現型をＲＮＡｉスクリーニングから単離した全ての第１候補の転写物ノックダウンと相関させることを試みた最初のＲＮＡｉスクリーニングである。ＲＮＡｉスクリーニングにおける高い偽陽性率に対する関心を高める近年の数多くの論文を考慮するに［Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：７７７（２００６）、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４４３：３５９（２００６）］、我々は、上記実証工程は、必要であり、恐らく殆どの偽陽性を排除するものと考えた。驚くべきことに、ＲＮＡｉスクリーニングのスタンダードとして提唱されていた２種類の独立したｓｉＲＮＡの同定においても、数多くの偽陽性が生じた。我々の経験上、３個以上の独立したｓｉＲＮＡが同定された場合にはヒットが確認されるパーセンテージが高くなるので、これを追跡研究用のヒットの選択における選択基準として用いるべきである。しかしながら、任意の遺伝子ヒットにおいて表現型とｍＲＮＡノックダウン間に相関関係が存在しないことが、必ず偽陽性として考慮されねばならないと結論付けることはできない。
【０３８８】
我々のスクリーニングで確認した９つのヒットのうち、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１及びＰＲＫＡＲ１Ａは、ハエでも保存されている。ＰＲＫＡＲ１Ａは、ハエ及び脊椎動物内の既知のＨｈシグナル阻害剤であるＰｋａを負に制御すると考えられている。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）、上記、Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）、上記；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：２８３８（１９９９）；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７７：１９８８９（２００２）。エピスタシス実験により、ＰＲＫＡＲ１ＡがＳｍｏの下流に位置することが判明し、Ｈｈシグナルの不存在下でのＧｌｉタンパク質のリン酸化と制御におけるＰＲＫＡＲ１Ａ及びＰｋａの役割と一致することになった。また、我々のスクリーニングによりＣＳＮＫ１Ａ１（ＣＫ１α）が、Ｈｈシグナルにおいて正の役割を果たすことが確認された。ハエにおいては、ＣＳＮＫ１Ａ１は、Ｈｈの不存在下でＣｉ（Ｇｌｉのハエホモログ）のリン酸化を通じて負に調節する役割［Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、上記；Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ．９：８１９（２００５）；Ｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：２０３９（２００３）］と、Ｈｈシグナルの存在下でのＳｍｏのリン酸化を通じた性の役割の両方を果たすことが先に証明されている。Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１０４５（２００４）；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１７９００（２００４）；Ａｐｉｏｎｉｓｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：８６（２００５）。我々のスクリーニングにおいてＣＳＮＫ１Ａ１が同定されたことにより、ＣＳＮＫ１Ａ１が哺乳動物のＨｈシグナル伝達においても正の役割を果たす可能性が示唆される。哺乳動物のＳｍｏは、推定上のＣｓｎｋ１ａリン酸化部位のいずれも有していないので、ＣＳＮＫ１Ａ１は、Ｈｈ活性化に必要な他の成分に対して作用するものと考えられる。ＣＳＮＫ１Ａ１の哺乳動物Ｈｈシグナル伝達における正の役割を指示するものとして、我々のエピスタシス実験において、ＣＳＮＫ１Ａ１は、Ｓｍｏの上流か、又は同程度の位置にあるものと確認された。最後に、ＣＤＣ２Ｌ１は、ＰｉｔｓｌｒｅのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａオルソログであり、最近、ハエのＨｈ調節因子を同定するための全ゲノムのＲＮＡｉスクリーニングで発見されたものである。Ｎｙｂａｋｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３７：１３２３（２００５）。我々は、Ｐｉｔｓｌｒｅの哺乳動物ホモログ（Ｃｄｃ２Ｌ１）を単離したことから、このタンパク質は、恐らくＨｈシグナル伝達において保存されてはいるが未知の役割を果たすものであろう。
【０３８９】
我々のスクリーニングでは、Ｇｙｋ１、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１、Ｐｒｋｒａ、Ｔｔｂｋ２及びＴｔｋを含む、Ｈｈ経路内での６種類の新規と思われるキナーゼが単離された。興味深いことに、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１及びＴｔｋを含むこれらの多くは中心体に位置しており、細胞周期を調節するものと考えられる。複数のモデルにより、これらの特異的な中心体遺伝子が、どのようにしてＨｈシグナル伝達に作用するのかが説明されるであろう。第１の可能性としては、これらの中心体成分に対するｓｉＲＮＡが、生存能の細胞増殖に影響を与え、それによってＨｈシグナル伝達に間接的に作用する可能性が挙げられる。しかしながら、ヒットのいずれについても、ＡＴＰアッセイで判別したところ、細胞の生存能に顕著な効果を示しておらず、ＳＶ４０−ルシフェラーゼレポーターに対しても作用を示していないことから、恐らく上記の可能性は事実と異なっている。更に、ＦＡＣｓ解析をおこなったところ、ＮＥＫ１及びＴｔｋのｓｉＲＮＡで処理した細胞は、細胞周期に異常を示さず、ＰＬＫ１  ｓｉＲＮＡで処理した細胞は、僅かな細胞周期の異常を示しただけであった（データ非表示）。更にまた、これらの細胞周期調節因子は、有糸分裂にも必要とされると考えられるが、我々のアッセイでは、大部分の細胞がＧ１停止にある８０％のコンフルエンシーにある細胞を用いたため、有糸分裂のみにおいて機能する遺伝子は、我々のスクリーニングで単離することができなかった。このことをサポートするに、我々は、ライブラリーに存在する数多くの多様な細胞中期調節因子を単離することはなかった。
【０３９０】
別の可能性としては、これらの特異的な中心体遺伝子が、繊毛形成のような、中心体の別の機能に作用することが挙げられる。実際に、Ｎｅｋ１に関しては、これが事実であった。ＰＬＫ１とＴｔｋが、繊毛発生に特異的な役割を果たす可能性もある。興味深いことに、最近になってＣｅｎｅｘｉｎ（Ｏｄｆ２）が、ＰＬＫ１の中心体へのターゲッティングに必要とされることが証明されたことから、ＰＬＫ１は、Ｃｅｎｅｘｉｎとの相互作用を介して繊毛発生と関連付けられている。Ｓｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２６：８３１６−  ８３３５（２００６）。さらにまた、Ｃｅｎｅｘｉｎを欠くマウスの解析では、Ｃｅｎｅｘｉｎが一次繊毛の発生に不可欠であるが、他の細胞周期関連中心体機能にには不可欠でないことが示されている。Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：５１７（２００５）。従って、ＣｅｎｅｘｉｎはＰＬＫ１との相互作用を介して繊毛形成に対する作用を発揮し、繊毛形成におけるＰＬＫ１の特異的な役割は、有糸分裂の調節における役割とは異なる形で存在していてもよい。
【０３９１】
第３の可能性としては、これらのキナーゼが、Ｈｈ経路の成分を直接リン酸化することである。実際に、Ｓｍｏ、Ｓｕｆｕ、並びにＧｌｉ−２、Ｇｌｉ−２及びＧｌｉ−３の配列解析により、ＰＬＫ１に重要な結果をもたらす複数のリン酸化部位の候補が同定され、少なくともこのキナーゼが直接Ｈｈ成分をリン酸化するであろうことが示唆される。
【０３９２】
我々の確認されたヒットの分析に基づき、我々のスクリーニングで同定されたヘッジホッグキナーゼについて以下の機能が同定されたと推測した：
【０３９３】
【表８】
2009526752.tif 000010
【０３９４】
実施例２：癌又は腫瘍中のヘッジホッグキナーゼポリペプチドの上方制御を検出するためのマイクロアレイ解析
多くの場合数千種類の遺伝子配列を含む核酸マイクロアレイは、疾患組織とその正常な同等物との比較において、差次的に発現される遺伝子の同定に有用である。核酸マイクロアレイを用いる際には、試験組織サンプル及びコントロール組織サンプルからの試験ｍＲＮＡサンプル及びコントロールｍＲＮＡサンプルを逆転写して標識することでｃＤＮＡプローブを作製する。次にｃＤＮＡプローブを、固相支持体に固相化された核酸のアレイにハイブリダイズさせる。アレイは、アレイの各メンバーの配列と位置が分かるように配置されている。例えば、特定の疾患状態で発現することが知られている遺伝子の選択物を、固相支持体上にアレイすることもできる。特定のアレイメンバーを有する標識プローブがハイブリダイズした場合には、このプローブが由来するサンプルで、その遺伝子が発現されていることを示す。試験サンプル（疾患組織）由来のプローブのハイブリダイゼーションシグナルが、コントロールサンプル（正常組織）由来のプローブのハイブリダイゼーションよりも強い場合、疾患組織内で発現される遺伝子又は遺伝子群が同定されたことになる。この結果は、疾患組織内で過剰発現されるタンパク質は、疾患状態の存在の診断マーカーとして有用なだけでなく、その疾患状態の処置のための、治療標的としても有用であることを示している。
【０３９５】
核酸のハイブリダイゼーション方法及びマイクロアレイ技術は、当該技術分野においてよく知られている。本実施例では、ハイブリダイゼーション及びプローブ用の核酸の具体的調整、スライド、並びにハイブリダイゼーション条件は、全て２００１年３月３０日に提出された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／１０４８２号に詳細に記載されており、この出願の記載は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３９６】
実施例３：ヘッジホッグキナーゼｍＲＮＡ発現の定量的解析
本アッセイにおいて、５’ヌクレアーゼアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）等）及びリアルタイム定量的ＰＣＲ（例えば、ＡＢＩ  Ｐｒｉｚｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ事業部、フォスターシティー、カリフォルニア州））を用いて、癌性の神経膠腫に、他の癌腫又は正常な非癌性組織と比べて、有意に過剰発現する遺伝子を見つける。５’ヌクレアーゼアッセイは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素の５’エキソヌクレアーゼ活性を利用して、リアルタイムで遺伝子発現をモニターする蛍光ＰＣＲを基礎とする技術である。２種類のオリゴヌクレオチドプライマー（その配列は、目的の遺伝子又はＥＳＴ配列に基づく）を用いて、ＰＣＲ反応に典型的な増幅産物を作り出す。第３のオリゴヌクレオチド、又はプライマーは、これら２種類のＰＣＲプライマー間に位置するヌクレオチド配列を検出するように設計される。プローブは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素によっても伸長することはできず、レポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素で標識されている。レポーター色素からのレーザー誘起されたいずれの放出も、レポーター色素とクエンチャー色素がプローブ上に存在することで相互に近く位置する場合には、クエンチャー色素によってクエンチングされている。ＰＣＲ増幅反応時に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素が、鋳型依存的にプローブを切断する。生じるプローブ断片は溶液中で解離して、レポーター色素から放出されるシグナルは、第２のフルオロフォアによるクエンチング効果から解放される。新しい分子が合成される度に１分子のレポーター色素が遊離することになり、クエンチングされていないレポーター色素の検出により、データの定量的な解釈の基礎が提供される。当該技術分野においては、このアッセイはよく知られており、２種類の異なるヒト組織サンプル間の遺伝子発現の差を定量的に同定するためにルーチン的に使用されている。例えば、以下を参照：Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：４１３−４１７（１９９２）；Ｌｉｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，４：３５７−３６２（１９９５）；Ｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：９８６−９９４（１９９６）；Ｐｅｎｎｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（２５）：１４７１７−１４７２２（１９９８）；Ｐｉｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９６（６７１２）：６９９−７０３（１９９８）及びＢｉｅｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７８：６６１−６６６（１９９８）。
【０３９７】
５’ヌクレアーゼ処理は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００ＴＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ等のリアルタイム定量的ＰＣＲ装置上で行う。このシステムは、サーマルサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ及びコンピューターから構成される。このシステムは、サーマルサイクラー上の９６ウェルフォーマット中でサンプルを増幅させる。増幅期間中、レーザーで誘起された蛍光シグナルは、９６ウェル全てについて、光ファイバーケーブルを通じてリアルタイムに回収され、ＣＣＤで検出される。このシステムには、装置の運転用とデータの解析用のソフトウェアが含まれる。
【０３９８】
スクリーニング用の開始材料は、種々の癌組織から単離されたｍＲＮＡである。ｍＲＮＡは、例えば、蛍光定量的に、正確に定量される。ネガティブコントロールとしては、テストする癌組織と同一組織種の種々の正常組織からＲＮＡを単離する。多くの場合、腫瘍サンプルは、同一組織種の「マッチした（ｍａｔｃｈｅｄ）」正常サンプルと直接比較される。即ち、腫瘍サンプルと正常サンプルは、同一の個体から得られることを意味する。
【０３９９】
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、最初にＣｔ、又は閾値サイクル数として表示される。これは、レポーターシグナルが、蛍光のバックグラウンドレベルを上回るまで蓄積したサイクル数として定義される。ΔＣｔ値は、癌のｍＲＮＡの結果を正常なヒトｍＲＮＡの結果と比較する際に、核酸サンプル中の特定の標的配列の開始時における相対的なコピー数の定量的測定値として用いられる。１Ｃｔ単位は、１ＰＣＲサイクル又は正常に対して約２倍の相対的増加に相当することから、２単位は４倍の相対的増加に相当し、３単位は８倍の相対的増加に相当する等、２種類以上の異なる組織間のｍＲＮＡ発現の相対的倍数増加を定量的に測定することが可能である。上記の点に関しては、このアッセイが、ヒト腫瘍組織における、正常コントロールと比較して少なくとも２倍のｍＲＮＡ発現の増加を再現性をもって検出するのに十分な技術的感度を有することが当該技術分野において十分に認められている。
【０４００】
実施例４：インサイチュハイブリダイゼーション
インサイチュハイブリダイゼーションは、細胞又は組織試料中の核酸配列の検出及び位置決定のための強力で多様性に富む技術である。例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の解析、ウイルス感染の同定及び位置決定、特定のｍＲＮＡ合成における変化の追跡、及び染色体マッピングの補助において有用であろう。
【０４０１】
インサイチュハイブリダイゼーションは、ＰＣＲで作製した33Ｐ−標識リボプローブを用いて、Ｌｕ  ａｎｄ  Ｇｉｌｌｅｔｔ，Ｃｅｌｌ  Ｖｉｓｉｏｎ  １：１６９−１７６（１９９４）によるプロトコルを最適化したバージョンに従って行う。簡潔に言うと、ホルマリン固定してパラフィン包埋したヒト組織を切片にして、脱パラフィンして、プロテイナーゼＫ（２０  ｇ／ｍｌ）中にて３１℃で１５分間かけて除タンパクし、更に上記のＬｕ  ａｎｄ  Ｇｉｌｌｅｔｔに記載されるようにインサイチュハイブリダイゼーション用に加工する。［33−Ｐ］  ＵＴＰ標識したアンチセンスリボプローブをＰＣＲ産物から作製して、５５℃で一晩かけてバイブリダイズさせる。スライドを、Ｋｏｄａｋ  ＮＴＢ２  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｃｋ  ｅｍｕｌｓｉｏｎに浸して、４週間露光させる。
【０４０２】
33Ｐ−リボプローブ合成
６．０μｌ（１２５  ｍＣｉ）の33Ｐ−ＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢＦ  １００２、ＳＡ＜２０００  Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を高速真空乾燥させた。乾燥した33Ｐ−ＵＴＰを含む各チューブに、以下の成分を添加した。
２．０μｌ  ５ｘ  転写バッファー
１．０μｌ  ＤＴＴ（１０ＯｍＭ）
２．０μｌ  ＮＴＰミックス（２．５ｍＭ：１０μ；各１０ｍＭのＧＴＰ、ＣＴＰ及びＡＴＰ  ＋  １０μｌのＨ2Ｏ）
１．０μｌ  ＵＴＰ（５０μＭ）
１．０μｌ  Ｒｎａｓｉｎ
１．０μｌ  ＤＮＡ鋳型（１μｇ）
１．０μｌ  Ｈ2Ｏ
１．０μｌ  ＲＮＡポリメラーゼ（通常、ＰＣＲ産物Ｔ３  ＝  ＡＳ、Ｔ７  ＝  Ｓ）
【０４０３】
チューブを３７℃で１時間インキュベートする。１．０μｌのＲＱ１  ＤＮａｓｅを添加し、次いで３７℃で１５分間インキュベートする。９０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．６）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ８．０））を添加し、混合物をＤＥ８１ペーパー上にピペットする。残った溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ−  ５０限外濾過ユニットに注入し、プログラム１０を用いてスピンする（６分間）。ろ過ユニットを第２チューブ上に反転して装着し、プログラム２を用いてスピンする（３分間）。最後の回収スピンの後、１００μｌのＴＥを添加する。１μｌの最終産物をＤＥ８１上にピペットし、６ｍｌのＢｉｏｆｌｕｏｒ  ＩＩの中でカウントする。
【０４０４】
プローブはＴＢＥ／尿素ゲル上で泳動させる。１−３μｌのプローブ又は５μｌのＲＮＡ  Ｍｒｋ  ＩＩＩを３μｌのローディングバッファーに添加する、９５℃ヒートブロック上で３分間加熱した後、プローブを直ちに氷上に静置する。ゲルのウェルを洗い流し、サンプルをローディングして、１８０−２５０ボルトで４５分間泳動する。ゲルをサランラップで包み、‐７０℃の冷凍庫にて増感スクリーンと共にＸＡＲフィルムに１時間ないし一晩暴露させる。
【０４０５】
33Ｐ−ハイブリダイゼーション
Ａ．凍結切片の事前処理
スライドを冷凍庫から取り出してアルミニウム製トレー上において、室温で５分間かけて解凍する。トレーを５５℃のインキュベーター内に５分間静置して、濃度を低下させる。スライドは、ドラフト内において氷上にて４％ホルムアルデヒド中で１０分間かけて固定し、０．５  ｘ  ＳＳＣで、室温で５分間かけて洗浄する（２５ｍｌ  ２０ｘＳＳＣ＋９７５ｍｌ  ＳＱ  Ｈ2Ｏ）。０．５μｇ／ｍｌ  のプロテイナーゼＫ中で３７℃で１０分間かけて脱タンパクした後（２５０ｍｌの事前に暖めたＲＮａｓｅ不含ＲＮＡｓｅバッファー中に１２．５μｌの１０ｍｇ／ｍｌストック）、切片を０．５ｘＳＳＣ中で室温で１０分間かけて洗浄する。切片は、７０％、９５％、１００％エタノール中で、各２分間かけて脱水する。
【０４０６】
Ｂ．パラフィン包埋した切片の事前処理
切片を脱パラフィンしてＳＱ  Ｈ2Ｏ中に静置し、２ｘＳＳＣで、室温にて各５分間かけて２回リンスする。切片を、２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅ不含ＲＮＡｓｅバッファー中に５００μｌの１０ｍｇ／ｍｌ；３７℃、１５分間）−ヒト胚又は８ｘプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲｎａｓｅバッファー中に１００μｌ、３７℃、３０分間）−ホルマリン組織中で除タンパクする。これに続く０．５ｘＳＳＣ中でのリンスと脱水は、上記のように行う。
【０４０７】
Ｃ．プレハイブリダイゼーション
切片は、Ｂｏｘバッファー（４ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド）で飽和した濾紙で覆ったプラスチック製のボックス中に並べる。
【０４０８】
Ｄ．ハイブリダイゼーション
１．０ｘ１０6ｃｐｍのプローブと切片１枚当たり１．０μｌのｔＲＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌストック）を９５℃で３分間加熱する。切片を氷上で冷却し、切片１枚当たり４８μｌのハイブリダイゼーションバッファーを添加する。ボルテックス撹拌した後、５０μｌの33Ｐミックスをスライド上の５０μｌプレハイブリダイゼーションに添加する。切片を５５℃で一晩インキュベートする。
【０４０９】
Ｅ．洗浄
洗浄は、室温で１０分間かけて、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡを用いて２回行い（４００ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌの０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ、Ｖf＝４Ｌ）、続いて３７℃で３０分間かけてＲＮａｓｅＡ処理する（２５０ｍｌのＲｎａｓｅバッファー中に５００μｌの１０ｍｇ／ｍｌ＝２０μｇ／ｍｌ）。切片を、室温で１０分間かけて、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡを用いて２回洗浄する。ストリンジェントな洗浄条件は、以下のようなものであってもよい：５５℃で２時間、０．１ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌのＥＤＴＡ、Ｖf＝４Ｌ）。
【０４１０】
Ｆ．オリゴヌクレオチド
本明細書に開示する種々のＤＮＡ配列に対してインサイチュ解析を行う。これらの解析に用いるオリゴヌクレオチドは、添付する図面に示す核酸に相補的なもの（又はその相補物）を入手する。
【０４１１】
実施例５：ヘッジホッグキナーゼに結合する抗体の調製
モノクロナール抗体の産生技術は当該分野で公知であり、例えば上記のＧｏｄｉｎｇに記載されている。  使用できる免疫原としては、精製ヘッジホッグキナーゼポリペプチド、ヘッジホッグキナーゼポリペプチドを含む融合タンパク質、及び細胞表面上で組換えヘッジホッグキナーゼポリペプチドを発現する細胞が挙げられる。免疫原は、当業者であれば過度の実験を行なわずとも選定することができる。
【０４１２】
Ｂａｌｂ／ｃのようなマウスを、Ｆｒｅｕｎｄ完全アジュバント中に乳化した上記免疫原で免疫し、１〜１００マイクログラムの量を皮下又は腹腔内に注射する。あるいは、該免疫原を、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ハミルトン、モンタナ州）中に乳化し、動物の後足蹠に注射する。次いで、免疫したマウスに、選択したアジュバント中に乳化した追加の免疫原で１０〜１２日間ブーストする。その後、該マウスは、更なる免疫注射により数週間かけてブーストしてもよい。血清サンプルは、抗ヘッジホッグキナーゼ抗体を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイ試験用に、マウス眼窩後部の出血により定期的に採取してもよい。
【０４１３】
適切な抗体価を検出した後、抗体が「陽性」な動物に、ヘッジホッグキナーゼポリペプチドの最後の静脈内注射を注入することができる。３〜４日後、該マウスを屠殺し、その脾臓細胞を回収する。次いで、ＡＴＣＣ、Ｎｏ．ＣＲＬ  １５９７より入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．ｌ等の選択したマウスミエローマ細胞に、該脾臓細胞を融合させる（３５％ポリエチレングリコールを使用）。融合により、ハイブリドーマ細胞が作り出され、次いでこのハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）を含む９６ウェルの組織培養プレートに播種して、非融合細胞、ミエローマハイブリッド及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害することができる。
【０４１４】
ＥＬＩＳＡによって、ヘッジホッグキナーゼに対する反応性について、前記ハイブリドーマ細胞のスクリーニングを行う。ヘッジホッグキナーゼに対する所望のモノクロナール抗体を分泌する「陽性」のハイブリドーマ細胞の決定方法は、当該分野の技術範囲内である。
【０４１５】
陽性のハイブリドーマ細胞を、Ｂａｌｂ／ｃ同系マウスの腹腔内に注入し、抗ヘッジホッグキナーゼモノクロナール抗体を含む腹水を生成させることができる。あるいは、該ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトル中で増殖させることができる。腹水中で生産されたモノクロナール抗体の精製は、硫安沈殿とこれに続くゲル排除クロマトグラフィーにより達成できる。あるいは、抗体のＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ又はＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇへの結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーも採用できる。
【０４１６】
実施例６：ヘッジホッグキナーゼに結合する毒素結合抗体の調製
癌の治療における、細胞毒性薬剤又は細胞増殖抑制剤、即ち、腫瘍細胞を死滅させるか阻害する薬剤の局所的送達用の抗体‐薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ＡＤＣ）、即ち、免疫複合体の使用は（Ｐａｙｎｅ（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：２０７−２１２；Ｓｙｒｉｇｏｓ  ａｎｄ  Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：６０５−６１４；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１−１７２；米国特許第４，９７５，２７８号）、これらの非結合型薬物の全身投与により、排除しようとする腫瘍細胞のみならず、正常な細胞にまで許容不可能なレベルの毒性を生じる可能性がある場合に、腫瘍への薬剤部分のターゲッティング送達及び腫瘍部位における細胞内蓄積を可能にする（Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｌａｎｃｅｔ（Ｍａｒ．１５，１９８６）ｐｐ．６０３−０５；Ｔｈｏｒｐｅ，（１９８５）“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６）。それによって、最小の毒性を持つ最大の効果が探索される。ＡＤＣを設計して洗練する尽力は、薬物結合特性及び薬物放出特性並びにモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の選択性に集中していた。これらの戦略においては、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方が有用であることが報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２１：１８３−８７）。これらの方法で用いられる薬剤には、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキセート及びビンデシンが含まれる（Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）上記）。抗体‐毒素複合体で用いられる毒素には、ジフテリア毒素等の細菌性毒素、リシン等の植物性毒素、ゲルダナマイシン等の低分子毒素（Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１；Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：１０２５−１０２８；Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｉｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１）、メイタンシノイド類（欧州特許第１３９１２１３号；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３）、及びカリケアマイシン（Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２８：Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２）が含まれる。
【０４１７】
精製した抗体に毒素を結合させることによる抗体‐薬物複合体を作製するための技術は、当該技術分野においてよく知られており、ルーチン的に用いられている。例えば、毒素ＤＭ１への精製したモノクローナル抗体の結合は、以下のように達成できる。精製した抗体をＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエートで誘導体化してジチオピリジル基を導入する。ＮａＣｌ（５０ｍＭ）とＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含む４４．７ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．５）中の抗体をＳＰＰ（２．３ｍｌエタノール中の５．３モル当量）で処理する。アルゴン下で周囲温度にて９０分間インキュベートした後、反応混合物を、３５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５４ｍＭのＮａＣｌ及び２ｍＭのＥＤＴＡで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５を通してゲルろ過する。次いで、抗体含有区分をプールしてアッセイする。抗体‐ＳＰＰ−Ｐｙ（３３７．０ｍｇ：開離可能な２−チオピリジン基を有する）を上記の３５ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）で希釈して終濃度を２．５ｍｇ／ｍｌにする。次いで、３．０ｍＭのジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、最終反応混合物中に３％ｖ／ｖ）中のＤＭ１（１．７当量、１６．１モル）を抗体溶液に添加する。反応は、アルゴン下にて周囲温度で２０時間進行させる。反応物を、３５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５４ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．５）で平衡化させたＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００ゲルろ過カラム（５．０ｃｍ×９０．０ｃｍ、１．７７Ｌ）にローディングする。流速は、５．０ｍｌ／分とし、６５個の分画（各２０．０ｍｌ）を回収する。分画をプールしてアッセイするが、この場合、２５２ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより、抗体分子（ｐ’）１つ当たりに結合したＤＭ１薬物分子の数が決定される。
【０４１８】
例示のためではあるが、毒素ＤＭ１への精製したモノクローナル抗体の結合は、以下のようにして達成できる。精製したモノクローナル抗体を（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）で誘導体化して、ＳＭＣＣリンカーを導入する。５ＯｍＭのリン酸カリウム／５０ｍＭの塩化ナトリウム／２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）中に２０ｍｇ／ｍｌで存在する抗体を、７．５モル当量のＳＭＣＣ（ＤＭＳＯ中に２０ｍＭ、６．７ｍｇ／ｍｌ）で処理する。アルゴン下で周囲温度にて２時間撹拌した後、反応混合物を５ＯｍＭのリン酸カリウム／５０ｍＭの塩化ナトリウム／２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５を通してろ過する。抗体含有分画をプールしてアッセイする。次いで、抗体‐ＳＭＣＣをリン酸カリウム／５０ｍＭの塩化ナトリウム／２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）で希釈してＤＭ１（５  ＳＭＣＣ／抗体の場合には１．７当量、７．３７ｍｇ／ｍｌ）の１０ｍＭジメチルアセトアミド溶液と反応させる。反応物をアルゴン下で、周囲温度にて１６．５時間撹拌する。結合反応混合物を、ｐＨ  ６．５の１ｘＰＢＳで、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５ゲルろ過カラム（１．５ｘ４．９ｃｍ）を通してろ過する。次いで、２５２ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより、ＤＭ１／抗体比（ｐ）を測定する。
【０４１９】
細胞毒性薬剤は、典型的には、抗体の多数のリジン残基を通じて抗体に結合されてきた。目的の抗体に存在するか又は組み込まれたチオール基を通じた結合が達成されている。例えば、システイン残基を遺伝子工学的技術によりタンパク質内に導入して、リガンド用の共有結合部位が形成されている（Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１３：９６４４−９６５０；Ｂｅｒｎｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｉｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１２６−１３２；Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １：２４７−２５５；Ｔｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：４８６２−４８６７；Ｋａｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．７６：２０７−２１４；Ｃｈｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８（１５）：８４８０−８４８４；米国特許第６，２４８，５６４号）。目的の抗体内に遊離したシステイン残基が存在するならば、毒素はその部位に結合することができる。例えば、薬物リンカー用試薬である、ＤＭＳＯに溶解したマレイミドカプロイルモノメチルアウリスタチンＥ（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ−ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ  ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  Ｅ：ＭＭＡＥ）、即ち、ＭＣ−ＭＭＡＥ、マレイミドカプロイルモノメチルアウリスタチンＦ（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ−ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ  ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  Ｆ：ＭＭＡＦ）、即ち、ＭＣ−ＭＭＡＦ、ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ又はＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦをアセトニトリル及び水に既知の濃度で希釈し、冷却したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のシステイン誘導体化抗体に添加する。約１時間後、過剰量のマレイミドを添加して反応をクエンチングし、抗体のあらゆる未反応チオール基をキャップする。反応混合物を遠心限外濾過により濃縮し、毒素が結合した抗体を精製してＰＢＳ中にてＧ２５樹脂を通して溶離することで脱塩し、無菌状態で０．２ｍフィルターを通してろ過し、そして保存用に凍結する。
【０４２０】
更にまた、選択した抗体の遊離システインをビスマレイミド試薬ＢＭ（ＰＥＯ）４（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）により修飾し、抗体表面上の未反応のマレイミド基を解離させることもできる。上記は、ＢＭ（ＰＥＯ）４を５０％エタノール／水混合物に１０ｍＭの濃度にまで溶解して、約１．６ｍｇ／ｍｌ（１０マイクロモル／リットル）の濃度でリン酸緩衝食塩水中に抗体を含む溶液に１０倍のモル過剰量で添加し、１時間反応させることにより達成できる。過剰量のＢＭ（ＰＥＯ）４は、１５０ｍＭのＮａＣｌと３０ｍＭのクエン酸のバッファー（ｐＨ６）中のゲルろ過により取り除く。約１０倍モル過剰量のＤＭ１をジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）に溶解し、抗体‐ＢＭＰＥＯ中間体に添加する。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて薬物部分の試薬を溶解してもよい。反応混合物は、一晩反応させ、その後、ゲルろ過又はＰＢＳ中での透析により未反応の薬物を取り除く。ＰＢＳを溶媒とするＳ２００カラム上でのゲルろ過を用いて、高分子量の凝集体を取り除くことで、精製された抗体‐ＢＭＰＥＯ−ＤＭ１複合体が得られる。
【０４２１】
実施例７‐インビトロでの細胞死滅アッセイ
活性なヘッジホッグシグナル伝達経路を発現する哺乳動物は、標準的な発現ベクターとクローニング技術を用いることで得られる。これに代わり、活性にヘッジホッグシグナル伝達経路を発現する多くの腫瘍セルラインが例えば、ＡＴＣＣ等の公的機関を通じて入手可能であり、標準的なＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳ解析を用いてルーチン的に同定可能である。次いで、抗ヘッジホッグ経路ポリペプチドモノクローナル抗体（及びその毒素結合誘導体）をアッセイで用いて、その抗体が、活性なヘッジホッグシグナル伝達経路を発現する細胞をインビトロで死滅させる能力を測定することができる。
【０４２２】
特に本発明を考慮した場合、細胞表面上に安定してヘッジホッグキナーゼポリペプチドを発現するＰＣ３−誘導セルライン（以下においてＰＣ３−ｇＤ−ＭＤＰと呼ぶ）を、標準的な技術を用いて組換え操作し、ＰＣ３−ｇＤ−ＭＤＰ細胞によるヘッジホッグキナーゼポリペプチドの発現を、標準的なＦＡＣＳセルソーティング、ＥＬＩＳＡ及び免疫組織化学分析により確認することができる。ＭＭＡＥ結合抗ヘッジホッグキナーゼモノクローナル抗体が、個々のヘッジホッグキナーゼ発現細胞を死滅させる能力は、以下のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＴＢ２８８；Ｍｅｎｄｏｚａ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：５４８５−５４８８）を用いたインビトロでの細胞死滅アッセイにより測定できる：
【０４２３】
１．増殖培地中に約１０4個の細胞（ＰＣ３−ｇＤ−ＭＤＰ細胞又はヘッジホッグキナーゼを発現しないトランスフェクトされていないＰＣ３細胞のいずれか）を含む５０μｌの細胞培養のアリコートを、９６ウェルの不透明な壁面を有するプレートの各ウェルに注入する。追加のコントロール用ウェルは、５０μｌの細胞を含まない増殖培地を含むように設ける。
【０４２４】
２．ヘッジホッグキナーゼ‐ＭＭＡＥ結合抗体又はヘッジホッグキナーゼに結合しないＭＭＡＥ結合コントロールモノクローナル抗体を各ウェルに５０μｌの用量で、０．０００１ないし１００μｇ／ｍｌの範囲の種々の濃度で添加して、プレートを３７℃、５％  ＣＯ2で３ないし５日間インキュベートする。
【０４２５】
３．約３０分間かけてプレートを室温に平衡化させる。
４．各ウェルに存在する細胞培養培地の用量に等しい量のＰｒｏｍｅｇａ社製  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを添加してプレートを楕円軌道シェーカー上で２分間シェークすることで細胞溶解を促進する。
【０４２６】
５．プレートを室温で１０分間インキュベートして、発光シグナルを安定させる。
６．発光を、Ｔｒｏｐｉｘ  Ｗｉｎｇｌｏｗ  Ｐｒｏｇｒａｍを具備したルミノメーターで記録し、ＲＬＵ  ＝  相対発光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｕｎｉｔ）として報告する。
【０４２７】
上記のアッセイにより得られる結果は、ヘッジホッグキナーゼ‐ＭＭＡＥ抗体が、抗体依存的に対応するヘッジホッグキナーゼポリペプチドを発現する細胞の死滅を誘導可能であることを示す可能性がある。即ち、ヘッジホッグキナーゼ‐ＭＭＡＥ又はＭＭＡＥ‐結合コントロールのいずれも、１μｇ／ｍｌ以下の抗体濃度では、トランスフェクトされていないＰＣ３細胞の有意な死滅を誘導できない。１μｇ／ｍｌを超える抗体濃度では、トランスフェクトされていないＰＣ３の細胞死の量は、抗体非依存的に抗体濃度と共に直線的に増加する場合がある。従って、１μｇ／ｍｌを超える抗体濃度でのトランスフェクトされていないＰＣ３細胞の死滅は、反応混合物中に存在するＭＭＡＥレベルの増加による非特異的な結果であり、用いた抗体の結合特異性の機能に基づくものではないことが明らかとなる。
【０４２８】
しかしながら、安定してヘッジホッグキナーゼポリペプチドを発現するＰＣ３−ｇＤ−ＭＤＰ細胞に関しては、抗体がトランスフェクトされていないＰＣ３細胞を死滅させる能力と同様にＭＭＡＥ結合コントロールが細胞死を誘導する一方で、ヘッジホッグキナーゼ‐ＭＭＡＥは、この濃度よりも有意に低い抗体濃度（例えば、僅か０．００１μｇ／ｍｌ）で有意に細胞死を誘導する。実際に、１μｇ／ｍｌの抗体濃度（非ヘッジホッグキナーゼ特異的ＭＭＡＥ結合コントロール抗体が有意な細胞死滅を示さない濃度）において、ＰＣ３−ｇＤ−ＭＤＰ細胞の大部分がヘッジホッグキナーゼ‐ＭＭＡＥによって死滅する。このようなデータは、それ自体が、ヘッジホッグキナーゼ特異的モノクローナル抗体が、細胞の表面上に発現された状態のヘッジホッグキナーゼポリペプチドに結合し、結合した細胞の死滅を誘導可能であることを証明するものである。
【０４２９】
実施例８：インビボでの腫瘍細胞死滅アッセイ
毒素が結合した、又は結合していない抗ヘッジホッグキナーゼポリペプチドモノクローナル抗体のインビボで腫瘍細胞の死滅を誘導する能力の効果を試験するため、以下のプロトコルを用いることができる。
【０４３０】
無胸腺ヌードマウスのグループに、５ｘ１０6個のヘッジホッグキナーゼポリペプチド発現腫瘍促進性細胞を、腹側部において皮下接種させる。腫瘍が１００−２００ｍＭ3の平均腫瘍体積に達した時点で、マウスを均等に５つのグループに分け、以下の処置を行う：
グループ１  −  週に１度のＰＢＳコントロール媒体の投与を４週間行う；
グループ２  −  週に１度の非特異的なコントロール抗体の１ｍｇ／ｋｇ  での投与を４週間行う；
グループ３  −  週に１度の非特異的なコントロール抗体の３ｍｇ／ｋｇ  での投与を４週間行う；
グループ４  −  週に１度の特異的な抗ヘッジホッグキナーゼポリペプチド抗体の１ｍｇ／ｋｇ  での投与を４週間行う；
グループ５  −  週に１度の特異的な抗ヘッジホッグキナーゼポリペプチド抗体の３ｍｇ／ｋｇ  での投与を４週間行う。
次いで、定期的な間隔を開けて各処理グループのマウス内の平均腫瘍体積を測定して抗体の効果を測定することができる。
【０４３１】
実施例９：ハイブリダイゼーションプローブとしてのヘッジホッグキナーゼの使用
以下の方法では、ヘッジホッグキナーゼポリペプチドをコードするヌクレオチドのハイブリダイゼーションプローブとしての使用、即ち、哺乳動物内の腫瘍の存在の診断用の使用について記載する。
【０４３２】
本明細書に開示する完全長又は成熟ヘッジホッグキナーゼポリペプチドのコーディング配列を含むＤＮＡをプローブとして用いて、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリー又はヒト組織ゲノムライブラリー内の相同的ＤＮＡ（ヘッジホッグキナーゼの天然変異体をコードするＤＮＡ等）のスクリーニングを行うことも可能である。
【０４３３】
いずれかのライブラリーＤＮＡを含むフィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄は、以下の高ストリンジェンシー条件下で行う。フィルターに対する放射性標識ヘッジホッグキナーゼ誘導プローブのハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、５ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ  ６．８、２ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液及び１０％硫酸デキストランの溶液中にて、４２℃で２０時間かけて行う。フィルターの洗浄は、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳの水溶液中で４２℃で行う。
【０４３４】
次いで、当該技術分野で公知の標準的技術を用いて、完全長天然配列のヘッジホッグキナーゼポリペプチドをコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡを同定できる。
【０４３５】
実施例１０：Ｅ．ｃｏｌｉ中でのヘッジホッグキナーゼの発現
本実施例では、Ｅ．ｃｏｌｉ中での組換え発現によるヘッジホッグキナーゼの非グリコシル化型の調製を例示する。
【０４３６】
先のヘッジホッグキナーゼポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列は、最初に、選択したＰＣＲプライマーを用いて増幅させる。プライマーには、制限酵素部位が含まれているべきであり、これらの制限酵素部位は、選択した発現ベクターの制限酵素部位に対応する。種々の発現ベクターを用いることができる。適切なベクターの例としてはｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ由来；Ｂｏｌｉｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２：９５（１９７７）参照）が挙げられ、このベクターにはアンピシリン耐性遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子が含まれる。ベクターを制限酵素処理して脱リン酸化する。次いで、ＰＣＲ増幅した配列をベクター内にライゲーションする。ベクターには、抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリＨｉｓリーダー配列（最初の６個のＳＴＩＩコドン、ポリＨｉｓ配列及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ヘッジホッグキナーゼコード領域、λ転写ターミネーター、及びａｒｇＵ遺伝子をコードする配列が含まれていることが好ましい。
【０４３７】
次いで、ライゲーション用混合物を用いて、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載される方法により、選択したＥ．ｃｏｌｉ種を形質転換する。形質転換体は、ＬＢプレート上で増殖する能力により同定し、次いで、抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素解析及びＤＮＡシーケンシングにより確認することができる。
【０４３８】
選択したクローンは、抗生物質を補充したＬＢブロス等の液体培地中で一晩増殖させることができる。次いで、一晩培養したものを用いて、より大きなスケールの培養に播種してもよい。次いで、細胞を所望の吸光度にまで増殖させるが、この間に発現プロモーターは活性化されている。
【０４３９】
細胞を更に数時間培養した後、遠心により細胞を回収できる。遠心により得られた細胞ペレットは、当該技術分野で公知の種々の薬剤を用いて溶解でき、次いで、溶解されたヘッジホッグキナーゼポリペプチドは、タンパク質の強固な結合を可能にする条件下で、金属キレート化カラムを用いて精製することができる。
【０４４０】
先のヘッジホッグキナーゼ配列は、以下の方法を用いることにより、ポリＨｉｓタグ化型でＥ．ｃｏｌｉ内で発現させることができる。ヘッジホッグキナーゼをコードするＤＮＡ配列は、最初に、選択したＰＣＲプライマーを用いて増幅させる。プライマーには、選択した発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位と効率的で信頼性のある翻訳開始、迅速な金属キレート化カラム上での精製及びエンテロキナーゼによるタンパク質分解による取り出しを可能にする他の有用な配列が含まれる。次いで、ＰＣＲ増幅したポリＨｉｓタグ化配列を発現ベクター内にライゲーションし、これを用いて５２（Ｗ３１１０  ｆｕｈＡ（ｔｏｎＡ）ｌｏｎ  ｇａｌＥ  ｒｐｏＨｔｓ（ｈｔｐＲｔｓ）ｃｌｐＰ（ｌａｃＩｑ））株を基礎とするＥ．ｃｏｌｉ宿主に形質転換する。形質転換体は、最初、Ｏ．Ｄ．６００の３‐５に達するまで、５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ上で３０℃にて撹拌と共に増殖させる。次いで、培養物をＣＲＡＰ培地（３．５７ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．７１ｇのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６  ｇのＤｉｆｃｏ酵母抽出物、５００  ｍＬの水中に５．３６ｇのＳｈｅｆｆｉｅｌｄ  ｈｙｃａｓｅ  ＳＦ、並びに１１０ｍＭのＭＰＯＳ（ｐＨ７．３）、０．５５％（ｗ／ｖ）のグルコース及び７ｍＭのＭｇＳＯ4を混合することにより調製）中に５０−１００倍希釈し、撹拌と共に３０℃で約２０−３０時間増殖させる。サンプルを取り出して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により発現を確認し、大量の培養物を遠心して細胞をペレット化する。細胞ペレットは、精製とリフォールディングまで凍結させる。
【０４４１】
０．５ないし１Ｌの発酵物由来のＥ．ｃｏｌｉペースト（６−１０ｇのペレット）を１０当量（ｗ／ｖ）の７Ｍグアニジン、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８）に再懸濁する。固体の亜硫酸ナトリウムとテトラチオン酸ナトリウムを添加して、終濃度をそれぞれ０．１Ｍと０．０２Ｍにして、この溶液を４０℃で一晩撹拌する。この工程により、全てのシステイン残基がスルフィトライゼーション（ｓｕｌｆｉｔｏｌｉｚａｔｉｏｎ）によりブロックされた変性タンパク質が生じる。溶液をＢｅｃｋｍａｎ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｉｆｕｇｅにて４０，０００  ｒｐｍで３０分間遠心する。上清を、３‐５当量の金属キレートカラム用バッファー（６Ｍのグアニジン、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４）で希釈し、０．２２ミクロンフィルターを通してろ過して透明にする。透明になった抽出物を、金属キレートカラム用バッファーで平衡化した５ｍｌのＱｉａｇｅｎ  Ｎｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムにローディングする。５０ｍＭのイミダゾール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｕｔｒｏｌグレード）を含む追加のバッファー（ｐＨ７．４）でカラムを洗浄する。このタンパク質を、２５０ｍＭのイミダゾールを含むバッファーで溶離させる。所望のタンパク質を含む分画をプールして４℃で保存する。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した消衰係数を用いて２８０ｎｍの吸光度により評価する。
【０４４２】
タンパク質は、新たに調製した以下から成るリフォールディング用バッファー内にサンプルをゆっくりと希釈することによりリフォールドさせる：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．６）、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２．５Ｍ尿素、５ｍＭシステイン、２０ｍＭグリシン及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ。リフォールディング用量は、タンパク質の終濃度が５０ないし１００マイクログラム／ｍｌになるように選択する。リフォールディング溶液を４℃にて１２−３６時間緩やかに撹拌する。ＴＦＡの添加によりリフォールディング反応をクエンチングして、終濃度を０．４％（約ｐＨ３）にする。タンパク質を更に精製する前に、溶液を０．２２ミクロンフィルターに通してろ過し、アセトニトリルを添加して２−１０％の終濃度にする。０．１％  ＴＦＡの移動バッファーを用いたＰｏｒｏｓ  Ｒ１／Ｈ逆相カラム上でリフォールドしたタンパク質のクロマトグラフィーを行い、１０ないし８０％のアセトニトリル勾配を用いて溶離する。Ａ２８０吸光を示す分画のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分析し、一様なリフォールドしたタンパク質を含む分画をプールする。殆どのタンパク質について正しくリフォールドした種は、逆相樹脂との相互作用から保護された疎水性内部を有することで最もコンパクトな状態にあることから、一般的に、最も低いアセトニトリル濃度で溶離する。凝集した種は、通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離する。誤ってフォールディングされた形態のタンパク質を所望の形態のタンパク質から分離することに加え、逆相工程は、サンプルからエンドトキシンをも取り除く。
【０４４３】
所望のフォールドしたタンパク質を含む分画をプールし、この溶液に向けた緩やかな窒素の流れを用いてアセトニトリルを取り除く。タンパク質は、透析により、又は製剤用バッファーで平衡化したＧ２５  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）樹脂を用いたゲルろ過と無菌濾過により、０．１４Ｍ塩化ナトリウム及び４％マンニトールを含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ６．８）中に製剤する。
【０４４４】
実施例１１：哺乳動物細胞内でのヘッジホッグキナーゼポリペプチドの発現
本実施例では、哺乳動物細胞中での組換え発現によるヘッジホッグキナーゼの潜在的にグリコシル化された型の調製を例示する。
【０４４５】
ベクターｐＲＫ５（１９８９年３月１５日に公開された欧州特許第ＥＰ  ３０７，２４７号を参照）を発現ベクターとして用いる。随意に、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載されるライゲーション方法を用いて、本明細書に記載するヘッジホッグキナーゼポリペプチドをコードするＤＮＡを、このようなＤＮＡの挿入を可能にする選択した制限酵素を用いてｐＲＫ５内にライゲーションしてもよい。生じるベクターをＨＫ−ＤＮＡと呼ぶ。
【０４４６】
ある態様では、選択される宿主細胞は２９３細胞であってもよい。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １５７３）は、組織培養プレート内で、ウシ胎児血清と、随意に栄養成分及び／又は抗生物質とを補充したＤＭＥＭ等の培地中でコンフルエントになるまで増殖させる。約１０μｇのｐＲＫ５−ＨＫ  ＤＮＡを、約１μｇのＶＡ  ＲＮＡ［Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３１：５４３（１９８２）］をコードするＤＮＡと混合し、５００μｌの１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ  ＣａＣｌ2に溶解する。この混合物に５００μｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＮａＰＯ4を滴下により添加し、２５℃で１０分間かけて沈殿を形成させる。沈殿物を再懸濁して２９３細胞に添加し、３７℃で約４時間かけて沈降させる。培養培地をアスピレーションにより除去し、２  ｍｌの２０％グリセロールＰＢＳ溶液を３０秒間かけて添加する。次いで、２９３細胞を無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加して、細胞を約５日間インキュベートする。
【０４４７】
トランスフェクションから約２４時間後に培養培地を取り除いて、培養培地（単体）又は２００μＣｉ／ｍｌの35Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌの35Ｓ−メチオニンを含む培養培地と交換する。１２時間インキュベートした後に、コンディションドメディウムを回収し、スピンフィルター上で濃縮して、１５％のＳＤＳゲル上にローディングする。加工したゲルを乾燥させて、選択した時間フィルムに曝露して、ヘッジホッグキナーゼポリペプチドの存在を明らかにする。トランスフェクトした細胞を含む培養物は、（無血清培地中で）更にインキュベートしてもよく、その培地を選択したバイオアッセイにおいてテストする。
【０４４８】
これに代わる技術では、ヘッジホッグキナーゼポリペプチドをコードするＤＮＡを、Ｓｏｍｐａｒｙｒａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２：７５７５（１９８１）に記載される硫酸デキストラン法を用いて２９３細胞内に一過的に導入することもできる。２９３細胞を、スピナーフラスコ内で最大濃度にまで増殖させ、７００μｇのｐＲＫ５−ＨＫ  ＤＮＡを添加する。最初に細胞を遠心によりスピナーフラスコから濃縮してＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートする。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μｇ／ｍｌのウシ由来インシュリン及び０．１μｇ／ｍｌのウシ由来トランスフェリンを含むスピナーフラスコ内へ再び導入する。約４日後にコンディションドメディウムを遠心してろ過することで細胞とデブリを除去する。次いで、発現したヘッジホッグキナーゼを含むサンプルを、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等のあらゆる選択した方法で濃縮して精製することができる。
【０４４９】
別の態様では、ヘッジホッグキナーゼポリペプチドは、ＣＨＯ細胞内で発現できる。ｐＲＫ５−ＨＫは、ＣａＰＯ4又はＤＥＡＥ−デキストラン等の公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞内にトランスフェクトできる。上記のように、細胞培養をインキュベートして、培地を培養培地（単体）又は35Ｓ−メチオニン等の放射性標識を含む培地と交換することができる。ヘッジホッグキナーゼの存在を決定した後に、培養培地を無血清培地と交換してもよい。培養物は、好ましくは、約６日間インキュベートして、次いで、コンディションドメディウムを回収する。次いで、発現したヘッジホッグキナーゼを含むサンプルを、あらゆる選択した方法で濃縮して精製することができる。
【０４５０】
エピトープタグ化したヘッジホッグキナーゼポリペプチドを、宿主ＣＨＯ細胞内で発現させてもよい。ヘッジホッグキナーゼ部分をコードする配列を、ｐＲＫ５ベクター以外のベクターでサブクローニングしてもよい。サブクローニング用インサートをＰＣＲに付して、ポリＨｉｓタグ等の所望のエピトープとフレームを合わせてバキュロウイルス発現ベクター内へ融合させてもよい。次いで、このポリＨｉｓタグ化ヘッジホッグキナーゼインサートを、安定なクローンの選択用のＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０駆動性ベクター内へサブクローニングできる。最後にＣＨＯ細胞を、このＳＶ４０駆動性ベクターで（上記のように）トランスフェクトできる。発現を確認するため、上記のように標識を行ってもよい。次いで、発現されたポリＨｉｓタグ化ヘッジホッグキナーゼを含む培養培地を、Ｎｉ2+−キレートアフィニティークロマトグラフィー等の所望の方法により、濃縮して精製できる。
【０４５１】
ヘッジホッグキナーゼポリペプチドは、一過性の発現過程でＣＨＯ及び／又はＣＯＳ細胞内で発現させてもよく、又は別の安定な発現過程によりＣＨＯ細胞内で発現させてもよい。
【０４５２】
ＣＨＯ細胞内での安定な発現は、以下の方法により達成される。タンパク質は、個々のタンパク質の溶解型（例えば、細胞外ドメイン）のコーディング配列が、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１定常領域に融合しているか、そして／又はポリＨｉｓタグ化した形態にある、ＩｇＧ構築物（イムノアドヘシン）として発現される。
【０４５３】
ＰＣＲ増幅後、個々のＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ  ３．１６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７）に記載される標準的な技法を用いてＣＨＯ発現ベクター内にサブクローニングする。ＣＨＯ発現ベクターは、ｃＤＮＡの簡便なシャトリングを可能にするような、目的のＤＮＡの５’側と３’側に適合性のある制限酵素部位を有するように構築する。ＣＨＯ細胞内での発現に用いられるベクターは、Ｌｕｃａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：９（１７７４−１７７９（１９９６）にも記載されており、目的ｃＤＮＡとジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＨＦＲ）の発現を駆動するためにＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現により、トランスフェクション後のプラスミドの安定な維持のためのセレクションが可能になる。
【０４５４】
市販のトランスフェクション用試薬ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）（Ｑｕｉａｇｅｎ）、ＤＯＳＰＥＲ（登録商標）又はＦＵＧＥＮＥ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、１２マイクログラムの所望のプラスミドＤＮＡを、約１０００万個のＣＨＯ細胞内に導入する。細胞は、上記のＬｕｃａｓ  ｅｔ  ａｌ．に記載されるように増殖させる。更なる増殖と生産のため、下記のように、約３ｘ１０7個の細胞をアンプル内で凍結させる。
【０４５５】
プラスミドＤＮＡを含むアンプルをウォーターバス内に静置して融解し、ボルテックスで混和する。内容物を、１０  ｍＬの培地を含む遠心チューブ内にピペットし、１０００  ｒｐｍで５分間遠心する。上清をアスピレートし、細胞を１０ｍＬの選択用培地（５％の０．２μｍ  ｄｉａｆｉｌｔｅｒを通したウシ胎児血清を含む０．２μｍフィルターを通したＰＳ２０）に再懸濁する。次いで、細胞を、９０ｍＬの選択用培地を含む１００  ｍＬスピナー内に分注する。１−２日後、１５０  ｍＬの選択用増殖培地を充填した２５０  ｍＬスピナー内に細胞を移し、３７℃でインキュベートする。更に２−３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬ及び２０００ｍＬのスピナーに３ｘ１０5細胞／ｍＬを播種する。細胞用培地を遠心によって新鮮な培地に交換し、生産用培地中に再懸濁する。いかなる適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、１９９２年６月１６日に発行された米国特許第５，１２２，４６９号に記載される生産用培地を実際に用いてもよい。３Ｌの生産用スピナーに１．２  ｘ  １０6細胞／ｍＬを播種する。０日目に、細胞数ｐＨを決定する。１日目に、スピナーをサンプリングし、フィルターを通した空気の散布を開始する。２日目に、スピナーをサンプリングして、温度を３３℃に変更し、３０ｍＬの５００ｇ／Ｌグルコースと０．６ｍＬの１０％泡止め剤（例えば、３５％のポリジメチルシロキサンエマルジョン、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３６５医療用グレードエマルジョン等）を添加する。生産を通して、ｐＨは、約７．２に維持するために必要なように調節する。１０日後、又は生存率が７０％未満に低下した時点で、細胞培養物を遠心により回収して、０．２２μｍフィルターを通してろ過する。ろ液は、４℃で保存するか、又は、精製するために直ちにカラム上にローディングする。
【０４５６】
ポリＨｉｓタグ化した構築物については、タンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製する。精製前に、イミダゾールを５ｍＭの濃度になるようにコンディションドメディウムに添加する。４−５ｍｌ／分の流速で、０．３ＭのＮａＣｌと５ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．４）で平衡化した６  ｍｌ  Ｎｉ−ＮＴＡカラム上にコンディションドメディウムをポンプで注入する。ローディング後に、カラムを追加量の平衡化バッファーで洗浄し、０．２５Ｍのイミダゾールを含む平衡化バッファーでタンパク質を溶離する。高度に精製されたタンパク質は、次いで、２５ｍｌ  Ｇ２５  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いて、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ及び４％マンニトールを含む保存用バッファー（ｐＨ６．８）内に脱塩し、−８０℃で保存する。
【０４５７】
以下のように、イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）構築物をコンディションドメディウムから精製する。コンディションドメディウムを、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．８）で平衡化した５ｍｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上にポンプで注入する。ローディング後に、平衡化バッファーでカラムを十分に洗浄して、その後に、１００ｍＭのクエン酸（ｐＨ３．５）で溶離する。溶離したタンパク質は、２７５μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ９）を含むチューブ内に１ｍｌの分画を回収することで、直ちに中和する。高度に精製されたタンパク質は、次いで、ポリＨｉｓタグ化タンパク質のために、上記のように保存用バッファー内に脱塩する。均一性は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルとエドマン分解によるＮ末端アミノ酸シーケンシングにより評価する。
【０４５８】
実施例１２：酵母内でのヘッジホッグキナーゼの発現
以下の方法では、酵母内でのヘッジホッグキナーゼポリペプチドの組換え発現について記載する。
【０４５９】
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからの先のヘッジホッグキナーゼ配列の細胞内生産又は分泌のために酵母発現ベクターを構築する。このようなヘッジホッグキナーゼ配列及びプロモーターをコードするＤＮＡを、ヘッジホッグキナーゼの細胞内発現を支配する選択したプラスミド内の適切な制限酵素部位に挿入する。分泌のために、このようなヘッジホッグキナーゼ配列をコードするＤＮＡを、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、負のヘッジホッグキナーゼシグナルペプチド若しくは他の哺乳動物シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、又は、例えば、酵母α因子若しくはインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、及びヘッジホッグキナーゼ発現用のリンカー配列（必要であれば）と共に、選択したプラスミドにクローニングすることができる。
【０４６０】
次いで、酵母株ＡＢ１１０等の酵母細胞を上記の発現ベクターで形質転換し、選択した発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母の上清を、１０％のトリクロロ酢酸を用いて沈殿形成させてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、その後、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色液を用いてゲルを染色することで分析できる。
【０４６１】
次いで、遠心により発酵培地から酵母細胞を取り出して、選択したカートリッジ式フィルターを用いて培地を濃縮することにより、組換えヘッジホッグキナーゼを単離して精製することができる。所望のカラムクロマトグラフィー用樹脂を用いてヘッジホッグキナーゼを含む濃縮物を更に精製してもよい。
【０４６２】
実施例１３：バキュロウイルス感染させた昆虫細胞内でのヘッジホッグキナーゼの発現
以下の方法では、バキュロウイルス感染させた昆虫細胞内でのヘッジホッグキナーゼポリペプチドの組換え発現について記載する。
【０４６３】
先のヘッジホッグキナーゼ配列をコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させる。このようなエピトープタグには、ポリＨｉｓタグやイムノグロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域の様な）が含まれる。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）等の市販のプラスミドから誘導したプラスミドを含む、種々のプラスミドを用いることができる。簡潔に言うと、先のヘッジホッグキナーゼ配列をコードする配列又はこのようなコーディング配列の所望の部分をコードする配列、例えば、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外にある場合には成熟したタンパク質をコードする配列等を、５’領域及び３’領域に相補的なプライマーを用いてＰＣＲによって増幅させる。この５’プライマーには、（選択した）制限酵素部位が隣接して組み込まれていてもよい。次いで、ＰＣＲ産物を、これらの選択した制限酵素で処理して、発現ベクター内にサブクローニングする。
【０４６４】
組換えバキュロウイルスは、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販されている）を用いてＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）内へ、上記のプラスミドとＢＡＣＵＬＯＧＯＬＤ（商標）ウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を共にトランスフェクトすることにより作り出される。２８℃で４−５日間インキュベートした後に、放出されたウイルスを回収して、更なる増幅に用いる。ウイルス感染とタンパク質発現は、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｏｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）に記載されるように行う。
【０４６５】
次いで、発現されたポリＨｉｓタグ化ヘッジホッグキナーゼポリペプチドは、例えば、以下のようにＮｉ2+−キレートアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。組換えウイルスで感染させたＳｆ９細胞から、Ｒｕｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：１７５−１７９（１９９３）に記載されるように抽出物を調製する。簡潔に言うと、Ｓｆ９細胞を洗浄して、音波破砕用バッファー（２５ｍＬ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）；１２．５ｍＭｍｇＣｌ2；０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％ＮＰ−４０；０．４Ｍ  ＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２０秒間かけて２回音波破砕を行う。音波粉砕物を遠心により透明にし、上清をローディングバッファー（５０ｍＭのリン酸、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール（ｐＨ  ７．８））で５０倍に希釈して、０．４５μｍフィルターを通してろ過する。Ｎｉ2+−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎから市販されている）は、５ｍＬの総容積で調製し、２５  ｍＬの水で洗浄して、２５ｍＬのローディングバッファーで平衡化する。ろ過した細胞抽出物を、毎分０．５ｍＬでカラム上にローディングする。分画回収を開始した点であるＡ280のベースラインまでカラムをローディングバッファーで洗浄する。次に、カラムを２次洗浄バッファー（５０ｍＭのリン酸；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール（ｐＨ６．０））で洗浄して、非特異的に結合したタンパク質を溶離させる。再度Ａ280のベースラインまで達した後、２次洗浄バッファー中の０ないし５００ｍＭのイミダゾール勾配でカラムを展開する。１ｍＬの分画を回収して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリオスファターゼに結合したＮｉ2+−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたウェスタンブロットにより分析する。溶離したＨｉｓ10タグ化したヘッジホッグキナーゼポリペプチドを含む分画をプールし、ローディングバッファーに対して透析する。
【０４６６】
これに代わり、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ又はＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラムクロマトグラフィー等の既知のクロマトグラフィー技術を用いて、ＩｇＧタグ化（又はＦｃタグ化）したヘッジホッグキナーゼポリペプチドの精製を行うことができる。
【０４６７】
実施例１４：特異的抗体を用いたヘッジホッグキナーゼポリペプチドの精製
天然又は組換え体のヘッジホッグキナーゼポリペプチドは、タンパク質精製の技術分野における種々の標準的技術で精製することができる。例えば、先のヘッジホッグキナーゼ配列のプロポリペプチド、成熟ポリペプチド又はプレポリペプチド変異体は、このような配列に特異的なイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。一般的に、イムノアフィニティーカラムは、抗ヘッジホッグキナーゼ抗体を活性化されたクロマトグラフィー用樹脂に共有結合することにより構築する。
【０４６８】
ポリクローナルイムノグロブリンは、硫酸アンモニウムを用いた沈殿形成によるか、又は固定化したＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）上での精製により、免疫血清から調製する。同様に、モノクローナル抗体も、硫安沈殿又は固定化したＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ上でのクロマトグラフィーにより、マウスの腹水から調製する。部分的に精製したイムノグロブリンを、ＣｎＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）等のクロマトグラフィー用樹脂に共有結合させる。抗体を樹脂に結合させ、樹脂をブロッキングして、誘導体樹脂を製造元の使用説明書に従って洗浄する。
【０４６９】
このようなイムノアフィニティーカラムは、溶解型にある先のヘッジホッグキナーゼ配列を含む細胞から分画を調製する、この配列の精製において利用される。上記の調製物は、完全な細胞の可溶化若しくは界面活性剤の添加により差次的遠心を介して得られた細胞成分分画の可溶化、又は当該技術分野でよく知られる別の方法により得られる。これに代わり、シグナル配列を含む可溶性ヘッジホッグキナーゼポリペプチドを、細胞を増殖させた培地中に、有用な量で分泌させてもよい。
【０４７０】
可溶性ヘッジホッグキナーゼポリペプチド含有調製物をイムノアフィニティーカラムに通し、このような配列の優先的吸着を可能にする条件（例えば、界面活性剤の存在下での高イオン強度バッファー等）下でカラムを洗浄する。次いで、抗体／基質間の結合を分裂させる条件（例えば、約ｐＨ２−３等の低ｐＨバッファー、又は高濃度の、尿素若しくはチオシアネートイオン等のカオトロープ）下でカラムを溶離し、それぞれのヘッジホッグキナーゼポリペプチドを回収する。
【図面の簡単な説明】
【０４７１】
【図１Ａ−Ｃ】図１のＡ−Ｃは、マウスのＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ天然配列ヘッジホッグキナーゼポリペプチド（配列番号１−３）の誘導アミノ酸配列をそれぞれ示す。
【図１Ｄ−Ｆ】図１のＤ−Ｆは、マウスのＮＥＫ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ天然配列ヘッジホッグキナーゼポリペプチド（配列番号４−６）の誘導アミノ酸配列をそれぞれ示す。
【図１Ｇ−Ｉ】図１のＧ−Ｉは、マウスのＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２、ＴＴＫ天然配列ヘッジホッグキナーゼポリペプチド（配列番号７−９）の誘導アミノ酸配列をそれぞれ示す。
【図２Ａ】図２のＡは、マウスのＣＤＣ２Ｌ１天然配列ヘッジホッグキナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。ヌクレオチド配列の配列番号１０は、本明細書においてＤＮＡ１８８７８６と定義されるクローンであり、固有の遺伝子同定番号ＵＮＱ７１０９を付した。
【図２Ｂ−Ｃ】図２のＢ−Ｃは、マウスのＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ天然配列ヘッジホッグキナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列をそれぞれ示す。ヌクレオチド配列の配列番号１１−１２は、それぞれ、本明細書においてＤＮＡ１８８６２４、ＤＮＡ１８９８５６と定義されるクローンであり、それぞれ、固有の遺伝子同定番号ＵＮＱ３２８９、ＵＮＱ７６４０を付した。
【図２Ｄ】図２のＤは、マウスのＮＥＫ１天然配列ヘッジホッグキナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。ヌクレオチド配列の配列番号１３は、本明細書においてＤＮＡ２４５２６２と定義されるクローンであり、固有の遺伝子同定番号ＵＮＱ１０５５３を付した。
【図２Ｅ】図２のＥは、マウスのＰＬＫ１天然配列ヘッジホッグキナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。ヌクレオチド配列の配列番号１４は、本明細書においてＤＮＡ２３８０６０と定義されるクローンであり、固有の遺伝子同定番号ＵＮＱ３３６８を付した。
【図２Ｆ−Ｇ】図２のＦ−Ｇは、マウスのＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ天然配列ヘッジホッグキナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列をそれぞれ示す。ヌクレオチド配列の配列番号１５−１６は、それぞれ、本明細書においてＤＮＡ２４５３３８、ＤＮＡ３９０２３４と定義されるクローンであり、それぞれ、固有の遺伝子同定番号ＵＮＱ１１０１、ＵＮＱ１４５３５を付した。
【図２Ｈ】図２のＨは、マウスのＴＴＢＫ２天然配列ヘッジホッグキナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。ヌクレオチド配列の配列番号１７は、本明細書においてＤＮＡ３９５９１７と定義されるクローンであり、固有の遺伝子同定番号ＵＮＱ２９３０８を付した。
【図２Ｉ】図２のＩは、マウスのＴＴＫ天然配列ヘッジホッグキナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。ヌクレオチド配列の配列番号１８は、本明細書においてＤＮＡ２４３２３８と定義されるクローンであり、固有の遺伝子同定番号ＵＮＱ１３７６２を付した。
【図３Ａ−Ｂ】図３のＡ−Ｂは、ヒトのＣＤＣ２Ｌ１、ＣＳＮＫ１Ａ１天然配列ヘッジホッグキナーゼポリペプチド（配列番号１９−２０）の誘導アミノ酸配列をそれぞれ示す。
【図３Ｃ−Ｅ】図３のＣ−Ｅは、ヒトのＧＹＫ、ＮＥＫ１、ＰＬＫ１天然配列ヘッジホッグキナーゼポリペプチド（配列番号２１−２３）の誘導アミノ酸配列をそれぞれ示す。
【図３Ｆ−Ｈ】図３のＦ−Ｈは、ヒトのＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ、ＴＴＢＫ２天然配列ヘッジホッグキナーゼポリペプチド（配列番号２４−２６）の誘導アミノ酸配列をそれぞれ示す。
【図３Ｉ】図３のＩは、ヒトのＴＴＫ天然配列ヘッジホッグキナーゼポリペプチド（配列番号２７）の誘導アミノ酸配列を示す。
【図４Ａ】図４のＡは、ヒトのＣＤＣ２Ｌ１天然配列ヘッジホッグキナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。ヌクレオチド配列の配列番号２８は、本明細書においてＤＮＡ３６３０６６と定義されるクローンであり、固有の遺伝子同定番号ＵＮＱ７１０９を付した。
【図４Ｂ−Ｃ】図４のＢ−Ｃは、ヒトのＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ天然配列ヘッジホッグキナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列をそれぞれ示す。ヌクレオチド配列の配列番号２９−３０は、それぞれ、本明細書においてＤＮＡ２５４２５６、ＤＮＡ３７０６５２と定義されるクローンであり、それぞれ、固有の遺伝子同定番号ＵＮＱ３２８９、ＵＮＱ７６４０を付した。
【図４Ｄ】図４のＤは、ヒトのＮＥＫ１天然配列ヘッジホッグキナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。ヌクレオチド配列の配列番号３１は、本明細書においてＤＮＡ３６４９８１と定義されるクローンであり、固有の遺伝子同定番号ＵＮＱ１０５５３を付した。
【図４Ｅ】図４のＥは、ヒトのＰＬＫ１天然配列ヘッジホッグキナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。ヌクレオチド配列の配列番号３２は、本明細書においてＤＮＡ２２７４９７と定義されるクローンであり、固有の遺伝子同定番号ＵＮＱ３３６８を付した。
【図４Ｆ−Ｇ】図４のＦ−Ｇは、ヒトのＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ天然配列ヘッジホッグキナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列をそれぞれ示す。ヌクレオチド配列の配列番号３３−３４は、それぞれ、本明細書においてＤＮＡ３５７１０３、ＤＮＡ３５４０３８と定義されるクローンであり、それぞれ、固有の遺伝子同定番号ＵＮＱ１１０１、ＵＮＱ１４５３５を付した。
【図４Ｈ】図４のＨは、ヒトのＴＴＢＫ２天然配列ヘッジホッグキナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。ヌクレオチド配列の配列番号３５は、本明細書においてＤＮＡ３８０４３４と定義されるクローンであり、固有の遺伝子同定番号ＵＮＱ２９３０８を付した。
【図４Ｉ】図４のＩは、ヒトのＴＴＫ天然配列ヘッジホッグキナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。ヌクレオチド配列の配列番号３６は、本明細書においてＤＮＡ２６９８７８と定義されるクローンであり、固有の遺伝子同定番号ＵＮＱ１３７６２を付した。
【図５Ａ−Ｂ】図５Ａは、ルシフェラーゼレポーターアッセイにおけるヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化の模式図を示す。刺激を受けていない細胞では、Ｐａｔｃｈｅｄ（Ｐｔｃｈ１）がＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）を阻害する。ヘッジホッグ（Ｈｈ）の結合によって、阻害から解放されて活性化されたＳｍｏがシグナル伝達経路を誘導し、転写因子Ｇｌｉ１及びＧｌｉ２を活性化させ、ヘッジホッグの標的遺伝子が活性化されることになる。ルシフェラーゼアッセイでは、ルシフェラーゼレポーター（９ＸＧｌｉＢＳ−ルシフェラーゼ）に９個のＧｌｉ１／２結合部位を融合させ、そしてマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞内へ導入した。従って、９ＸＧｌｉＢＳ−ルシフェラーゼレポーターは、ヘッジホッグ経路誘起の信頼性のある指標として機能する。図５Ｂは、Ｓ１２細胞（９ＸＧｌｉＢＳ−ルシフェラーゼレポーターを安定して発現するマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞）を示しており、ルシフェラーゼ誘起により測定したところ、非ターゲッティングコントロールｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、細胞のヘッジホッグに対する応答能に影響を与えていない。対照的に、Ｓｍｏを標的とするｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞では、細胞のヘッジホッグ刺激に対する応答能が妨げられている。Ｓ１２細胞にｓＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクションから６６時間後に、２００ｎｇ／ｍｌの組換えオクチル修飾ソニックヘッジホッグ（Ｏ−Ｓｈｈ）で処理した。Ｓｍｏタンパク質のレベル（内部のパネル）は、ＳｍｏのＣＯＯＨ尾部を検出する抗体（１４Ａ５）を用いてモニターした。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ヘッジホッグｓｉＲＮＡキノームスクリーニングの画面レイアウトを示す。全てマウスキナーゼとキナーゼ調節タンパク質から成る８１２種類の遺伝子をターゲッティングする３２４８種類のｓｉＲＮＡ（４ｓｉＲＮＡ／標的）。トランスフェクション用試薬をプレートに添加して、２０分間インキュベートした。次いで、Ｓ１２細胞を１１，０００細胞／ウェルで播種した。トランスフェクションの６６時間後に２００ｎｇ／ｍｌのＯ−Ｓｈｈを添加して、ヘッジホッグ経路を誘起した。２４時間後にルシフェラーゼ生産量を測定した。
【図５Ｄ】図５Ｄは、キノームｓｉＲＮＡスクリーニングのグラフ解析である。レプリコン間の相関係数（ｒ値）は、ｓｉＲＮＡスクリーニングが再現性を示したことを表す。個々のプレートからのスコアは、非処理細胞及びＨｈ処理細胞の両方のレプリコンプレートに対してプロットした。
【図５Ｅ】図５Ｅは、個々のスクリーニングからの分散図である。ルシフェラーゼの生データを、自然対数（ＬＮ）に変換した。別々のプレート間で比較を行うため、ＬＮ値を、各プレート上の非ターゲッティングｓｉＲＮＡの平均値に対して正規化した。次いで、正規化した値をプレートレプリコン間で平均化して、「Ｈｈ」処理から「非Ｈｈ」処理を引いたスコアを、個々のｓｉＲＮＡについて計算した。Ｈｈ」処理から「非Ｈｈ」処理を引いたスコアをＹ軸方向にプロットし、対応する３２４８種類のｓｉＲＮＡをＸ軸にプロットした分散図が示されている。ライブラリーの全ｓｉＲＮＡの平均値から標準偏差の１．５倍以上逸脱したスコアを有するｓｉＲＮＡは、潜在的なヒットとして考慮した。
【図６Ａ−１】図６Ａ−１は、Ｈｈ−ルシフェラーゼとｍＲＮＡノックダウンの相関関係に基づくヒットの確認である。潜在的ヒットを確認するため、各対応遺伝子の４つの全てのｓｉＲＮＡを、Ｈｈ−ルシフェラーゼアッセイで再テストした。非ターゲッティングｓｉＲＮＡをネガティブコントロールとして用いた。菱形の点を有する線は、Ｓｈｈで刺激した後のＨｈ−ルシフェラーゼ値（非ターゲッティングｓｉＲＮＡ処理細胞のパーセンテージ）を表す。四角の点を有する線は、遺伝子特異的プライマーと参照としてＲｐ１１９を用いたｑＲＴ−ＰＣＲで測定した、対応するｍＲＮＡノックダウン（非ターゲッティングｓｉＲＮＡ処理細胞のパーセンテージ）を表す。上部のパネルは、４種類のｓｉＲＮＡのうち、２種類がＨｈシグナル伝達に影響したことが判明した「２ヒット」区分であり、下部のパネルは、少なくとも３種類のｓｉＲＮＡが、Ｈｈシグナル伝達に影響したことが判明した「＞３ヒット」区分である。明るいグレーの輪郭を有する四角は、４種類全ての対応ｓｉＲＮＡが、Ｈｈ−ルシフェラーゼとｍＲＮＡノックダウン間に相関関係を示した遺伝子である。
【図６Ａ−２】図６Ａ−２は、Ｈｈ−ルシフェラーゼとｍＲＮＡノックダウンの相関関係に基づくヒットの確認である。潜在的ヒットを確認するため、各対応遺伝子の４つの全てのｓｉＲＮＡを、Ｈｈ−ルシフェラーゼアッセイで再テストした。非ターゲッティングｓｉＲＮＡをネガティブコントロールとして用いた。菱形の点を有する線は、Ｓｈｈで刺激した後のＨｈ−ルシフェラーゼ値（非ターゲッティングｓｉＲＮＡ処理細胞のパーセンテージ）を表す。四角の点を有する線は、遺伝子特異的プライマーと参照としてＲｐ１１９を用いたｑＲＴ−ＰＣＲで測定した、対応するｍＲＮＡノックダウン（非ターゲッティングｓｉＲＮＡ処理細胞のパーセンテージ）を表す。上部のパネルは、４種類のｓｉＲＮＡのうち、２種類がＨｈシグナル伝達に影響したことが判明した「２ヒット」区分であり、下部のパネルは、少なくとも３種類のｓｉＲＮＡが、Ｈｈシグナル伝達に影響したことが判明した「＞３ヒット」区分である。明るいグレーの輪郭を有する四角は、４種類全ての対応ｓｉＲＮＡが、Ｈｈ−ルシフェラーゼとｍＲＮＡノックダウン間に相関関係を示した遺伝子である。
【図６Ａ−３】図６Ａ−３は、Ｈｈ−ルシフェラーゼとｍＲＮＡノックダウンの相関関係に基づくヒットの確認である。潜在的ヒットを確認するため、各対応遺伝子の４つの全てのｓｉＲＮＡを、Ｈｈ−ルシフェラーゼアッセイで再テストした。非ターゲッティングｓｉＲＮＡをネガティブコントロールとして用いた。菱形の点を有する線は、Ｓｈｈで刺激した後のＨｈ−ルシフェラーゼ値（非ターゲッティングｓｉＲＮＡ処理細胞のパーセンテージ）を表す。四角の点を有する線は、遺伝子特異的プライマーと参照としてＲｐ１１９を用いたｑＲＴ−ＰＣＲで測定した、対応するｍＲＮＡノックダウン（非ターゲッティングｓｉＲＮＡ処理細胞のパーセンテージ）を表す。上部のパネルは、４種類のｓｉＲＮＡのうち、２種類がＨｈシグナル伝達に影響したことが判明した「２ヒット」区分であり、下部のパネルは、少なくとも３種類のｓｉＲＮＡが、Ｈｈシグナル伝達に影響したことが判明した「＞３ヒット」区分である。明るいグレーの輪郭を有する四角は、４種類全ての対応ｓｉＲＮＡが、Ｈｈ−ルシフェラーゼとｍＲＮＡノックダウン間に相関関係を示した遺伝子である。
【図６Ａ−４】図６Ａ−４は、Ｈｈ−ルシフェラーゼとｍＲＮＡノックダウンの相関関係に基づくヒットの確認である。潜在的ヒットを確認するため、各対応遺伝子の４つの全てのｓｉＲＮＡを、Ｈｈ−ルシフェラーゼアッセイで再テストした。非ターゲッティングｓｉＲＮＡをネガティブコントロールとして用いた。菱形の点を有する線は、Ｓｈｈで刺激した後のＨｈ−ルシフェラーゼ値（非ターゲッティングｓｉＲＮＡ処理細胞のパーセンテージ）を表す。四角の点を有する線は、遺伝子特異的プライマーと参照としてＲｐ１１９を用いたｑＲＴ−ＰＣＲで測定した、対応するｍＲＮＡノックダウン（非ターゲッティングｓｉＲＮＡ処理細胞のパーセンテージ）を表す。上部のパネルは、４種類のｓｉＲＮＡのうち、２種類がＨｈシグナル伝達に影響したことが判明した「２ヒット」区分であり、下部のパネルは、少なくとも３種類のｓｉＲＮＡが、Ｈｈシグナル伝達に影響したことが判明した「＞３ヒット」区分である。明るいグレーの輪郭を有する四角は、４種類全ての対応ｓｉＲＮＡが、Ｈｈ−ルシフェラーゼとｍＲＮＡノックダウン間に相関関係を示した遺伝子である。
【図６Ａ−５】図６Ａ−５は、Ｈｈ−ルシフェラーゼとｍＲＮＡノックダウンの相関関係に基づくヒットの確認である。潜在的ヒットを確認するため、各対応遺伝子の４つの全てのｓｉＲＮＡを、Ｈｈ−ルシフェラーゼアッセイで再テストした。非ターゲッティングｓｉＲＮＡをネガティブコントロールとして用いた。菱形の点を有する線は、Ｓｈｈで刺激した後のＨｈ−ルシフェラーゼ値（非ターゲッティングｓｉＲＮＡ処理細胞のパーセンテージ）を表す。四角の点を有する線は、遺伝子特異的プライマーと参照としてＲｐ１１９を用いたｑＲＴ−ＰＣＲで測定した、対応するｍＲＮＡノックダウン（非ターゲッティングｓｉＲＮＡ処理細胞のパーセンテージ）を表す。上部のパネルは、４種類のｓｉＲＮＡのうち、２種類がＨｈシグナル伝達に影響したことが判明した「２ヒット」区分であり、下部のパネルは、少なくとも３種類のｓｉＲＮＡが、Ｈｈシグナル伝達に影響したことが判明した「＞３ヒット」区分である。明るいグレーの輪郭を有する四角は、４種類全ての対応ｓｉＲＮＡが、Ｈｈ−ルシフェラーゼとｍＲＮＡノックダウン間に相関関係を示した遺伝子である。
【図６Ａ−６】図６Ａ−６は、Ｈｈ−ルシフェラーゼとｍＲＮＡノックダウンの相関関係に基づくヒットの確認である。潜在的ヒットを確認するため、各対応遺伝子の４つの全てのｓｉＲＮＡを、Ｈｈ−ルシフェラーゼアッセイで再テストした。非ターゲッティングｓｉＲＮＡをネガティブコントロールとして用いた。菱形の点を有する線は、Ｓｈｈで刺激した後のＨｈ−ルシフェラーゼ値（非ターゲッティングｓｉＲＮＡ処理細胞のパーセンテージ）を表す。四角の点を有する線は、遺伝子特異的プライマーと参照としてＲｐ１１９を用いたｑＲＴ−ＰＣＲで測定した、対応するｍＲＮＡノックダウン（非ターゲッティングｓｉＲＮＡ処理細胞のパーセンテージ）を表す。上部のパネルは、４種類のｓｉＲＮＡのうち、２種類がＨｈシグナル伝達に影響したことが判明した「２ヒット」区分であり、下部のパネルは、少なくとも３種類のｓｉＲＮＡが、Ｈｈシグナル伝達に影響したことが判明した「＞３ヒット」区分である。明るいグレーの輪郭を有する四角は、４種類全ての対応ｓｉＲＮＡが、Ｈｈ−ルシフェラーゼとｍＲＮＡノックダウン間に相関関係を示した遺伝子である。
【図６Ａ−７】図６Ａ−７は、Ｈｈ−ルシフェラーゼとｍＲＮＡノックダウンの相関関係に基づくヒットの確認である。潜在的ヒットを確認するため、各対応遺伝子の４つの全てのｓｉＲＮＡを、Ｈｈ−ルシフェラーゼアッセイで再テストした。非ターゲッティングｓｉＲＮＡをネガティブコントロールとして用いた。菱形の点を有する線は、Ｓｈｈで刺激した後のＨｈ−ルシフェラーゼ値（非ターゲッティングｓｉＲＮＡ処理細胞のパーセンテージ）を表す。四角の点を有する線は、遺伝子特異的プライマーと参照としてＲｐ１１９を用いたｑＲＴ−ＰＣＲで測定した、対応するｍＲＮＡノックダウン（非ターゲッティングｓｉＲＮＡ処理細胞のパーセンテージ）を表す。上部のパネルは、４種類のｓｉＲＮＡのうち、２種類がＨｈシグナル伝達に影響したことが判明した「２ヒット」区分であり、下部のパネルは、少なくとも３種類のｓｉＲＮＡが、Ｈｈシグナル伝達に影響したことが判明した「＞３ヒット」区分である。明るいグレーの輪郭を有する四角は、４種類全ての対応ｓｉＲＮＡが、Ｈｈ−ルシフェラーゼとｍＲＮＡノックダウン間に相関関係を示した遺伝子である。
【図６Ｂ−Ｃ】図６Ｂは、ヒットの候補が、Ｈｈシグナル伝達に特異的であることを示す棒グラフである。ｓｉＲＮＡプールを用いたＳ１２細胞のトランスフェクションは、殆どの候補遺伝子（Ｐａｋ６とＳｃｙｌ１を除く）は、ｍＲＮＡノックダウンのレベルを維持したままＨｈ−ルシフェラーゼを低下させることを示す。図６Ｃは、ｓｉＲＮＡのプールが、ＳＶ４０−ルシフェラーゼに影響することなく、候補遺伝子はＨｈシグナル伝達に特異的なことが示唆されることを示す棒グラフである。
【図６Ｄ】図６Ｄは、候補遺伝子が、内在性Ｈｈ−標的遺伝子Ｇｌｉ１及びＰｔｃｈ１の活性化に影響することを示す、ｑＲＴ−ＰＣＲ解析による棒グラフである。
【図７Ａ−Ｂ】図７Ａは、ＳＭＯＭ２（恒常的に活性なＳｍｏ変異体）の発現と共に、９種類の候補遺伝子をターゲッティングするｓｉＲＮＡのプールで処理した細胞のエピスタシス実験であり、４種類の遺伝子がＳｍｏの上流で作用し、５種類がＳｍｏの下流で作用することが示されている。３回の独立した実験の平均値と標準偏差（ＳＤ）が示されている。図７Ｂは、Ｇｌｉ１の発現と共に、９種類の候補遺伝子をターゲッティングするｓｉＲＮＡのプールで処理した細胞のエピスタシス実験であり、全てのヒットがＧｌｉ１の上流で作用することが示されている。３回の独立した実験の平均値と標準偏差（ＳＤ）が示されている。
【図７Ｃ−Ｄ】図７Ｃは、候補遺伝子とＧｌｉ３を用いた２重ｄｉＲＮＡ実験によるエピスタシス解析であり、９種類全ての候補がＧｌｉ３の上流で作用することが示されている。３回の独立した実験の平均値と標準偏差（ＳＤ）が示されている。図７Ｄは、９種類の各キナーゼ候補について考えられる、哺乳動物のＨｈ経路での作用の概要を示す図式モデルである。ＣＳＮＫ１Ａ１、ＧＹＫ、ＮＥＫ１及びＴＴＫは、Ｓｍｏの上流で作用すると考えられ、ＣＤＣ２Ｌ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＲＡ及びＴＴＢＫ２は、Ｓｍｏの下流で作用すると考えられる。全ての候補は、Ｇｌｉ転写因子の上流で作用する。
【図７Ｅ】図７Ｅは、抗アセチル化チューブリン抗体で染色して繊毛を視覚化し（赤色）又はＤＡＰＩで核を視覚化した（青色）、コントロールのｓｈＲＮＡ（下部のパネル）又はＮＥＫ１のｓｈＲＮＡ（上部のパネル）を発現する安定にトランスフェクトされたマウスＩＭＣＤ３細胞のプールの写真である。細胞の頂端部から得られた２ないし４μｍの光学的断面を、表示用に２次元で表題を付けて示す。
【図８Ａ−Ｂ】図８Ａは、０．６１のＺ因子計算値の表示であり、ＲＮＡｉアッセイがロバストネスを有していたことが示されている。スクリーニング用にＺ因子を計算するため、非ターゲッティングｓｉＲＮＡ又はＳｍｏ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞の平均値と標準偏差を計算した。Ｚ因子の計算は、以下の式：Ｚ因子＝１−［３（σp＋σn）／｜μp−μn｜］を用いて評価した。図８Ｂは、ＮＥＫ１が、繊毛形成に関与することを示す。コントロールのｓｈＲＮＡ又はＮＥＫ１のｓｈＲＮＡを発現する安定にトランスフェクトされたマウスＩＭＣＤ３細胞を、抗アセチル化チューブリン抗体で染色して繊毛を視覚化した。グラフは、ＮＥＫ１のｓｈＲＮＡで処理した細胞のコントロール中の、一時繊毛を有する細胞のパーセンテージを表す。エラーバーは、３回の独立したカウントの平均値を表しており、ｎ＝３００であった。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞内での、ｐＳｕｐｅｒ又はｐＳｕｐｅｒ−ＮＥＫ１とのＶ５タグ化ＮＥＫ１発現コンストラクトの共発現を示す。ｐＳｕｐｅｒ−ＮＥＫ１は、ｐＳｕｐｅｒ単独との比較において、ＮＥＫ１−Ｖ５タンパク質の発現を阻害可能である。
【図１Ａ−Ｃ】
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【図１Ｄ−Ｆ】
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【図１Ｇ−Ｉ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ−Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｅ】
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【図３Ｆ−Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ−Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ−Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ−１】
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【図６Ａ−２】
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【図６Ａ−３】
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【図６Ａ−４】
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【図６Ａ−５】
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【図６Ａ−６】
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【図６Ａ−７】
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【図６Ｂ−Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図７Ｃ−Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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