(57)【要約】  レバプラザンまたはその塩と、医薬的に許容可能な担体とを含む、胃腸管粘膜損傷の予防または治療用の組成物が提供される。該レバプラザンまたはその塩は、酸ポンプ拮抗剤として作用すると同時に、胃腸管粘膜の防御因子を増強させることによって、すぐれた胃腸管粘膜損傷の予防または治療効果を有する。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レバプラザンまたはその塩と、医薬的に許容可能な担体とを含む、胃腸管粘膜損傷の予防または治療用の組成物。
【請求項２】
前記レバプラザンの塩がレバプラザン塩酸塩であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
胃腸管粘膜に対する損傷を予防または治療するのに有効な量のレバプラザンまたはその医薬的に許容可能な塩と、医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を、胃腸管粘膜に対する損傷の予防または治療を必要とする人に投与することを含む、胃腸管粘膜に対する損傷の予防または治療の方法。
【請求項４】
胃腸管粘膜に対する薬物誘導性の損傷を予防または治療するのに有効な量のレバプラザンまたはその医薬的に許容可能な塩と、医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を、胃腸管粘膜に対する薬物誘導性の損傷の予防または治療を必要とする人に投与することを含む、胃腸管粘膜に対する薬物誘導性の損傷の予防または治療の方法。
【請求項５】
胃腸管粘膜に対するアルコール誘導性の損傷を予防または治療するのに有効な量のレバプラザンまたはその医薬的に許容可能な塩と、医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を、胃腸管粘膜に対するアルコール誘導性の損傷の予防または治療を必要とする人に投与することを含む、胃腸管粘膜に対するアルコール誘導性の損傷の予防または治療の方法。
【請求項６】
細胞保護的に（cytoprotectively）有効な量のレバプラザンまたはその医薬的に許容可能な塩と、医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤｓ）の投与前または同時に人に投与することを含む、非ステロイド性抗炎症剤を投与される人で、胃腸管粘膜の細胞保護（cytoprotection）を提供する方法。
【請求項７】
前記医薬的に許容可能な塩がレバプラザン塩酸塩であることを特徴とする請求項３から請求項６のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記有効な量が約１００ｍｇないし３００ｍｇ／１日であることを特徴とする請求項３から請求項６のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記有効な量が約１５０ｍｇないし２５０ｍｇ／１日であることを特徴とする請求項３から請求項６のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記有効な量が約２００ｍｇ／１日であることを特徴とする請求項３から請求項６のうちいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レバプラザンまたはその塩を含む胃腸管粘膜損傷の予防または治療用の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学名が５，６−ジメチル−２−（４−フルオロフェニルアミノ）−４−（１−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−２−イル）ピリミジンとして知られているレバプラザンは、下記化学式１で表示される化合物であり、酸付加塩（例えば、レバプラザン塩酸塩）として使われうる（国際特許公開第ＷＯ９６／０５１７７号パンフレット）。
【０００３】
【化１】
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レバプラザンまたはその塩は、胃壁細胞（gastric parietal cells）に存在するプロトンポンプ（Ｈ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅ）のＨ＋／Ｋ＋交換部位に可逆的に結合し、胃管腔（gastric lumen）内のＨ＋の分泌を競争的に抑制する。レバプラザンまたはその塩は、Ｈ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅの特定部位に結合し、Ｈ＋の輸送及び胃管腔への酸分泌を遮断することによって、胃内ｐＨ（intragastric ｐＨ）を上昇させる。オメプラゾールのような非可逆的プロトンポンプ阻害剤とは異なり、レバプラザンまたはその塩は、薬物の胃酸活性化（gastric  acid activation）またはプロトンポンプの胃酸分泌に影響を受けない。オメプラゾールのような非可逆的プロトンポンプ阻害剤との異なるメカニズムに基づいて、レバプラザンまたはその塩は、胃酸ポンプ拮抗剤（ＡＰＡ：Acid Pump Antagonist）として分類される。
【０００４】
一方、胃腸管疾患は、攻撃因子（例えば、胃酸）が強くなったり、防御因子が弱くなる場合に発生する。オメプラゾールなどのプロトンポンプ阻害剤及びレバプラザンのような胃酸ポンプ拮抗剤は、いずれも攻撃因子、すなわち胃酸分泌を抑制する化合物であり、スクラルファート（sucralfate）、レバミピド（rebamipide）のような細胞保護剤（cytoprotective agent）は、防御因子を増強させる化合物である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、胃酸ポンプ拮抗剤であるレバプラザンまたはその塩を使用して、多様な臨床試験を行い、レバプラザンまたはその塩がプロトンポンプ抑制活性だけではなく、胃腸管で細胞保護活性を有するということを発見した。かような驚くべき発見は、レバプラザンまたはその塩が攻撃因子の胃酸分泌を抑制する効果だけではなく、防御因子を増強させる胃腸管粘膜の保護効果を同時に有するということを示唆する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
従って、本発明は、レバプラザンまたはその塩を含む胃腸管粘膜損傷の予防または治療用の組成物を提供する。
本発明は、レバプラザンまたはその塩と、医薬的に許容可能な担体とを含む、胃腸管粘膜損傷の予防または治療用の組成物を提供する。
本発明の一様態によって、胃腸管粘膜に対する損傷を予防または治療するのに有効な量のレバプラザンまたはその医薬的に許容可能な塩と、医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を、胃腸管粘膜に対する損傷の予防または治療を必要とする人に投与することを含む、胃腸管粘膜に対する損傷の予防または治療の方法が提供される。
【０００７】
本発明の他の様態によって、胃腸管粘膜に対する薬物誘導性の損傷を予防または治療するのに有効な量のレバプラザンまたはその医薬的に許容可能な塩と、医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を、胃腸管粘膜に対する薬物誘導性の損傷の予防または治療を必要とする人に投与することを含む、胃腸管粘膜に対する薬物誘導性の損傷の予防または治療の方法が提供される。
【０００８】
本発明のさらに他の様態によって、胃腸管粘膜に対するアルコール誘導性の損傷を予防または治療するのに有効な量のレバプラザンまたはその医薬的に許容可能な塩と、医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を、胃腸管粘膜に対するアルコール誘導性の損傷の予防または治療を必要とする人に投与することを含む、胃腸管粘膜に対するアルコール誘導性の損傷の予防または治療の方法が提供される。
【０００９】
本発明のさらに他の様態によって、細胞保護的に（cytoprotectively）有効な量のレバプラザンまたはその医薬的に許容可能な塩と、医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤｓ）の投与前または同時に人に投与することを含む、非ステロイド性抗炎症剤を投与される人で、胃腸管粘膜の細胞保護（cytoprotection）を提供する方法が提供される。本発明で使われるＮＳＡＩＤｓは、特別に制限されるものではなく、アスピリン、インドメタシン、ジクロフェナック、イブプロフェン、ナプロキセン、ピロキシカム、メフェナム酸、フルフェナム酸、フロクタフェニン、エテンザミド、サリチル酸ナトリウム、ジフルニサル、クロフェゾン、ケトフェニルブタゾン、フェニルブタゾン、アルクロフェナック、アルミノプロフェン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、プラノプロフェン、ロキソプロフェンナトリウム、塩酸チアラミド、クエン酸ペリソキサール、エモルファゾン、アセメタシン、マレイン酸プログルメタシン、ブコロームなどのように、広く使われるあらゆるＮＳＡＩＤｓを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本発明の前記特徴及び有利な点は、下記の添付図面を参照しつつ、本発明の例示的な具現例について詳細に叙述することによって、さらに明白になる。
【図１】ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）誘導胃腸管粘膜損傷による細胞死滅に対するレバプラザンの抑制効果についてのＭＴＴ分析結果を示すグラフである。
【図２】エタノール誘導胃腸管粘膜損傷による細胞死滅に対するレバプラザンの抑制効果についてのＭＴＴ分析結果を示すグラフである。
【図３Ａ】生体内（in  vivo）胃腸管損傷に対するレバプラザンの細胞保護効果（cytoprotective effect）を示すイメージである。
【図３Ｂ】生体内（in  vivo）胃腸管損傷に対するレバプラザンの細胞保護効果（cytoprotective effect）を示すイメージである。
【図４】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ誘導ＥＲＫ（Extracellular signal-Regulated Kinase）活性化に対するレバプラザンの阻害効果を示すウェスタンブロット・イメージである。
【図５】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ誘導ＮＦ−ｋＢ活性化に対するレバプラザンの阻害効果を示す電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ：Electrophoretic Mobility Shift Assay）結果である。
【図６】親血管新生成長因子の活性に対するすレバプラザンの効果を示すＲＴ−ＰＣＲ結果である。
【図７】熱衝撃蛋白質の活性に対するレバプラザンの効果を示すウェスタンブロット・イメージである。
【図８】インドメタシン投与前に、レバミピド、オメプラゾール及びレバプラザンを処理し、胃粘膜病変にかかわる予防効果を示す比較イメージである。
【図９】インドメタシンを投与した後の胃粘膜病変にかかわるレバプラザンの治療効果を示す比較イメージである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
レバプラザンは、ＷＯ９６／０５１７７パンフレット、ＷＯ９７／４２１８６パンフレット及び／またはＷＯ９８／１８７８４パンフレットで開示された方法で製造できる。レバプラザンの塩は、塩酸、硫酸、リン酸、及び硝酸のような無機酸の塩、及び酒石酸、フマル酸、クエン酸、メシル酸及び酢酸のような有機酸の塩でありうる。レバプラザン塩酸塩が望ましい。
【００１２】
本発明の組成物は、ラクトース、トウモロコシ澱粉のような賦形剤、ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、乳化剤、懸濁化剤、安定化剤、及び等張化剤などを含むことができる。必要な場合、甘味剤及び／または香味剤を加えることができる。
【００１３】
本発明の組成物は、経口投与したり、静脈内、腹腔内、皮下、直腸及び局所投与を含んだ非経口で投与できる。従って、本発明の組成物は、錠剤、カプセル剤、水性液剤または懸濁剤のような多様な形態で製剤化されうる。経口用錠剤の場合、一般的にラクトース、トウモロコシ澱粉のような賦形剤、及びステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤が加えられうる。経口投与用カプセル剤の場合、ラクトース及び／または乾燥トウモロコシ澱粉が希釈剤として使われうる。経口用水性懸濁剤が必要である場合、活性成分を乳化剤及び／または懸濁化剤と結合させることができる。所望の場合には、特定甘味剤及び／または芳香剤を加えることができる。筋肉内、腹腔内、皮下及び静脈内投与の場合、活性成分の滅菌溶液が一般的に製造され、溶液のｐＨを適切に調節して緩衝させねばならない。静脈内投与の場合、溶質の総濃度は、製剤に等張性が付与されるように調節されねばならない。本発明の組成物は、ｐＨが７．４である食塩水のような医薬的に許容される担体を含む水性液剤の形態でありうる。前記溶液は、局所大量注射（local bolus injection）で患者の筋肉内の血流に導入されうる。
【００１４】
レバプラザンまたはその塩は、胃腸管粘膜損傷の予防または治療を必要とする患者に、約５０ｍｇないし約４００ｍｇ／１日、望ましくは約１００ｍｇないし３００ｍｇ／１日、さらに望ましくは約１５０ｍｇないし２５０ｍｇ／１日、特に望ましくは約２００ｍｇ／１日の有効量で投与できる。もちろん、前記容量は、患者の年齢、体重、感受性、または症状によって変更されうる。
【実施例】
【００１５】
以下、本発明について、下記実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、下記実施例は説明のためのものであり、よって本発明がそれらに制限されるものではない。
【００１６】
実施例１．ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）誘導細胞死滅率の測定（ＭＴＴ分析−１）
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染に対するレバプラザンの細胞保護能（cytoprotective properties）を測定するために、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染前に胃粘膜細胞をレバプラザン及びレバミピドで前処理し、細胞死滅率を測定した。対照薬物として、細胞保護能を有すると知られているレバミピドを使用した。
【００１７】
人間の胃上皮細胞（ＡＧＳ細胞、ＫＣＬＢ ２１７３９）を９６ウェルプレートに５Ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌでシーディング（seeding）した後、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）の補充されたＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Grand Island，New York，米国）中で培養した。滅菌水に溶解させたレバプラザン及びレバミピドを最終濃度がそれぞれ５０μＭになるようにＡＧＳ細胞に添加し、前記細胞を３７℃で１６時間培養した。ＲＰＭＩ １６４０培地を除去するために、前記プレートを２４℃で３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４及び２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で３回洗浄した。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ（ＡＴＣＣ ４３５０４）菌液をＰＢＳに再懸濁させ、最終濃度が５×１０８ＣＦＵ／ｍｌになるようにＡＧＳ細胞に接種して共培養（coculture）した。３７℃で４８時間培養した後、培養物を２４℃で３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して培地（すなわち、ＲＰＭＩ １６４０）を除去し、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリムブロミド）分析方法で、生きている総細胞数を分析した。ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４及び２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）にＭＴＴ（Amresco，Ohio，米国）を溶解させて製造した１ｍｇ／ｍｌの ＭＴＴ溶液を、５０μｌ／ウェルになるように各ウェルに添加した後、３７℃で４時間培養した。２４℃で３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄み液を除去し、生きている細胞によって形成されるフォルマザン粒（formazan grains）を９９．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（関東化学、東京、日本）（５０μｌ／ウェル）に溶かした後、ＥＬＩＳＡリーダー（ＴＥＣＡＮ，Maennedorf，スイス）を使用し、５４０ｎｍで吸光度（optical intensity）を測定した。
【００１８】
前記ＭＴＴ分析結果は、図１の通りである。図１から分かるように、４８時間Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染によって、有意性ある胃粘膜細胞の損傷（cytotoxicity）が誘導された。しかし、レバミピドとレバプラザンとを前処理したとき、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉによる胃粘膜細胞の損傷が有意性あるように減少した。かような結果は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ誘導細胞損傷に対し、レバプラザンがレバミピドと同等以上の細胞保護効果（cytoprotective effect）を有するということを示している。
【００１９】
実施例２．エタノール誘導細胞死滅率の測定（ＭＴＴ分析−２）
ラットの胃粘膜細胞（ＲＧＭ−１，理研セルバンク、日本）を９６ウェルプレートに５Ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌでシーディング（seeding）した後、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）の補充されたＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Grand Island，New York，米国）で培養した。滅菌水に溶解させたレバプラザン及びレバミピドを最終濃度が５０μＭになるようにＲＧＭ−１細胞に添加し、前記細胞を３７℃で１６時間培養した。ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地を除去するために、前記プレートを２４℃で３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４及び２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で３回洗浄した。エタノール含有培地（１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び１０％ＦＢＳが補充された２００ｍＭエタノール含有ＤＭＥＭ−Ｆ１２）を前記細胞に加え、細胞を３７℃で１６時間培養した。培養後、培養物を２４℃で３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して培地を除去し、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリムブロミド）分析方法で生きている総細胞数を分析した。ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４及び２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）にＭＴＴ（Amresco，Ohio，米国）を溶解させて製造した１ｍｇ／ｍｌの ＭＴＴ溶液を、５０μｌ／ウェルになるように各ウェルに添加した後、３７℃で４時間培養した。２４℃で３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄み液を除去し、生きている細胞によって形成されるフォルマザン粒（formazan grains）を９９．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（関東化学、東京、日本）（５０μｌ／ウェル）に溶かした後、ＥＬＩＳＡリーダー（ＴＥＣＡＮ，Maennedorf，スイス）を使用し、５４０ｎｍで吸光度（optical intensity）を測定した。
【００２０】
前記ＭＴＴ分析結果は、図２の通りである。図２から分かるように、エタノール単独処理群では、有意性ある胃粘膜細胞の損傷（cytotoxicity）が誘導された。一方、レバミピド／レバプラザン−エタノール処理群では、胃粘膜細胞の損傷が有意性あるように減少した。かような結果は、レバプラザンがレバミピドに比べて同等以上の細胞保護効果（cytoprotective effect）を有するということを示している。
【００２１】
実施例３．生体内の胃腸管損傷に対するレバプラザンの保護効果評価
６週齢のＳＰＦ（Specific-Pathogen-Free）スプラグドーレイ系雄性ラット（Charles River、東京、日本）を試験に使用した。商業的で市販されている滅菌されたペレット飼料（Biogenomics Ｃｏ．、ソウル、韓国）と滅菌された水とを自由に与え、１２時間ずつ昼夜を調節して清浄室（air-conditioned biohazard room）で飼育した。ラットをインドメタシン単独処理群、レバプラザン−インドメタシン処理群、エタノール単独処理群及びレバプラザン−エタノール処理群の４群に分けた。ラットを２４時間絶食させ、インドメタシン（４０ｍｇ／ｋｇ、１２時間）または純粋なエタノール（６ｍｌ／ｋｇ、１時間）に露出させる前に、オロ・ガストリック管（oro-gastric tube）を介して、０．５％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）に懸濁させた１０ｍｇ／ｋｇのレバプラザンを投与した。
【００２２】
インドメタシンを投与した群に属するラットの胃を摘出し、胃粘膜の病変程度を観察した（図３Ａ）。図３Ａから分かるように、インドメタシン単独処理群では、胃粘膜に出血性病変の増加が肉眼で観察された。しかし、レバプラザン投与後にインドメタシンで処理したレバプラザン−インドメタシン処理群では、インドメタシン誘導胃粘膜の損傷（gastric injury）が完全に抑制された。また、エタノール処理群に属するラットの胃を摘出し、胃粘膜の病変程度を観察した（図３Ｂ）。図３Ｂから分かるように、エタノール単独処理群でも、胃粘膜に出血性病変の明確な増加が肉眼で観察された。しかし、レバプラザン投与後にエタノールを投与したレバプラザン−エタノール処理群では、エタノール誘導胃粘膜の損傷（gastric injury）が完全に抑制された。かような結果は、レバプラザン前処理が非ステロイド性抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）（例えば、インドメタシン）やエタノール誘導性胃粘膜の病変を有意性あるように減少させることによって、優秀な胃腸管粘膜の細胞保護効果を達成するということを示している。
【００２３】
実施例４．Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ媒介細胞毒性を誘導するＥＲＫ（Extracellular signal-Regulated Kinase）の活性評価
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ誘導細胞毒性は、ＭＡＰＫ（Mitogen-Activated Protein Kinase）を活性化させることによって、細胞死滅（apoptosis）を誘導する。従って、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染は、ＭＡＰＫの３つの主要亜科（subfamily）のうちの一つであるＥＲＫのリン酸化を増大させる。
【００２４】
人間の胃上皮細胞（ＡＧＳ細胞、ＫＣＬＢ ２１７３９）を培養皿に２Ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／１００ｍｍ２でシーディング（seeding）した後、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）の補充されたＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Grand Island，New York，米国）で培養した。滅菌水に溶解させたレバプラザンを最終濃度が５及び２５μＭになるようにＡＧＳ細胞に添加し、前記細胞を３７℃で１６時間培養した。ＲＰＭＩ １６４０培地を除去した後、前記細胞をＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４及び２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で３回洗浄した。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ（ＡＴＣＣ ４３５０４）菌液をＰＢＳに再懸濁させ、最終濃度が５×１０８ＣＦＵ／ｍｌになるようにＡＧＳ細胞に接種して共培養（coculture）した。３７℃で３０分間培養した後、細胞を溶解緩衝液（Lysis buffer）（２０ｍＭ Tris−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Triton Ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ及びプロテアーゼ阻害物質カクテル（protease inhibitor cocktail）（Roche，Mannheim，ドイツ）に再懸濁させた。懸濁液をＢＩＯＲＵＰＴＯＲ（Cosmo Bio，江東区，東京）を使用して超音波破砕（約１０秒、４回）し、４℃で１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上澄み液を蛋白質抽出物として使用し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動した後、semidry transfer system（Hoeffer Pharmacia Biotech，サンフランシスコ，ＣＡ，米国）を使用し、ＰＶＤＦ膜（Millipore，マサチューセッツ，米国）に転移させた。一次抗体と蛋白質との非特異的な結合を遮断するために、ＰＶＤＦ膜を５％スキムミルク（Difco，Livonia ＭＩ，米国）を含有するブロッキング緩衝液（blocking buffer）（ＴＢＳＴ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．１％Tween ２０（ｖ／ｖ））で２３℃で１時間ブロッキングした。ＰＶＤＦ膜をｐ−ＥＲＫまたはＥＲＫに対する一次抗体の１：１，０００希釈液（２００ｎｇ／ｍｌ）と共に４℃で１５時間培養した。ＰＶＤＦ膜をＨＲＰ（horseradish peroxidase）共役（conjugated）二次抗体（Santa Cruz Biotech，カリフォルニア，米国）の１：２，０００希釈液（１００ｎｇ／ｍｌ）と共に２３℃で１時間培養した。免疫複合体（immunocomplex）をＥＣＬ（enhanced chemiluminescence）検出キット（detection kit）（Amersham-Pharmacia Biotec, Buckinghamshire, UK）を使用して確認した。
【００２５】
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染細胞の非処理群及びレバプラザン処理群のｐ−ＥＲＫに対するウェスタンブロット結果は、図４の通りである。図４から分かるように、レバプラザンは、ＥＲＫの活性化に対して有意性ある濃度依存的な阻害効果を示す。
【００２６】
実施例５．Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染と関連したＮＦ−ｋＢ転写因子の活性評価（Electrophoretic Mobility Shift Assay 、ＥＭＳＡ）
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染と関連していると知られているレドックス感受性（Redox-sensitive）転写因子であるＮＦ−ｋＢ（nuclear factor−kappa Ｂ）のＤＮＡ結合活性をＥＭＳＡで測定した。対照薬物として、細胞保護能を有すると知られているレバミピド（５０μＭ）を使用し、試験薬物としてレバプラザン（２５μＭ）を使用した。
【００２７】
人間の胃上皮細胞（ＡＧＳ細胞、ＫＣＬＢ ２１７３９）を培養皿に２Ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／１００ｍｍ２でシーディング（seeding）した後、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）の補充されたＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Grand Island，New York，米国）で培養した。滅菌水に溶解させたレバプラザン及びレバミピドを最終濃度がそれぞれ２５μＭ及び５０μＭになるようにＡＧＳ細胞に添加し、前記細胞を３７℃で１６時間培養した。培地を除去した後、前記細胞をＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４及び２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で２回洗浄した。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ（ＡＴＣＣ ４３５０４）菌液をＰＢＳに再懸濁させ、最終濃度が５×１０８ＣＦＵ／ｍｌになるようにＡＧＳ細胞に接種して３７℃で１時間共培養（coculture）した。ＥＭＳＡのための核分画（nuclear fraction）をＮＥ−ＰＥＲ NuclearとCytoplasmic Extraction Kit（Pierce、Rockford、ＩＬ、米国）を使用して準備した。ＥＭＳＡのために使われたＮＦ−ｋＢの二重鎖オリゴヌクレオチド配列は、５'−ＡＧＴ ＴＧＡ ＧＧＧ ＧＡＣ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＧＧ  Ｃ−３'であり、前記オリゴヌクレオチドは、Biotin 3'End DNA標識キット（Labeling Kit）（Pierce、Rockford、ＩＬ，米国）で標識した。ＥＭＳＡは、Light Shift Chemiluminescent ＥＭＳＡ Kit（Pierce、Rockford、ＩＬ、米国）を使用して行った。
【００２８】
ＥＭＳＡを利用してＮＦ−ｋＢのＤＮＡ結合活性を評価した結果は、図５の通りである。かような結果は、レバプラザン前処理によって、ＮＦ−ｋＢの活性が有意性あるように抑制されることによって、レバミピドに比べて同等以上の細胞保護効果を達成するということを示す。
【００２９】
実施例６．細胞保護作用（cytoprotection）に関与する蛋白質の発現量測定（ＲＴ−ＰＣＲ）
レバプラザンの細胞保護効果を評価するために、ＮＳＡＩＤｓに属するスリンダク１００μＭをラット細胞に加えた後、親血管新生成長因子であるＶＥＧＦ（Vascular Endothelial Growth Factor）、インタールキン−８（ＩＬ−８）及びＣＯＸ−２（シクロオキシゲナーゼ−２）の発現量を測定した。対照薬物として細胞保護能を有すると知られているレバミピド（５０μＭ）を使用し、試験薬物としてレバプラザン（２５μＭ）を使用した。
【００３０】
ラットの胃粘膜細胞（ＲＧＭ−１、理研セルバンク）を培養皿に２Ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／１００ｍｍ２にシーディング（seeding）した後、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１０％ＦＢＳ（Fetal  Bovine   Serum）の補充されたＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Grand Island，New York，米国）で培養した。滅菌水に溶解させたレバプラザン及びレバミピドを最終濃度がそれぞれ２５μＭ及び５０μＭになるようにＲＧＭ−１細胞に添加し、前記細胞を３７℃で１６時間培養した。培地を除去した後、前記細胞をＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４及び２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で３回洗浄した。スリンダクのＤＭＳＯ溶液を最終濃度が１００μＭになるように前記細胞に添加し、３７℃で８時間培養した。培養された細胞を２３℃で３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離して回収した後、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Life technologies，ミラノ，イタリア）を使用して細胞から総ＲＮＡを分離した。総ＲＮＡ２μｇと１０ｐｍｏｌ／ｏｌｉｇ ｄＴ １μに、滅菌したRNase-free waterを入れ、総３４μｌの反応溶液を得た。反応溶液を６５℃で５分間培養した後、５Ｘ逆転写緩衝液１０μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ ５μｌ、及びＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（reverse transcriptase）１μｌを添加した。反応溶液を３７℃で１時間培養してｃＤＮＡ（Promega，Madison，ＷＩ）を合成し、前記ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲは、Premix Ex Taq kit（寶酒造，千葉、日本）を使用し、下記特定プライマーをもって行った。
【００３１】
VEGF, 5'-TGCACCCACGACAGAAGGGGA-3'及び5'-TCACCGCCTTGGCTTGTCACAT-3';
IL-8, 5'-GAAGATAGATTGCCCGA-3'及び5'-CATAGCCTCTCACACATTTC-3';
COX-2, 5'-ATCTGTGTGGGTACAAATTTG-3'及び5'-GTCTCTCATCTGCAATAATGTG-3';
GAPDH, 5'-TGAAGGTCGGTGTCAACGGATTTGTC-3'及び
5'-CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC-3'。前記の通り、ＧＡＰＤＨは陽性対照群として使用した。ＰＣＲ反応は、次の通り行った：９４℃で１分間、ついで６０℃（ＶＥＧＦ）、４５℃（ＩＬ−８）、４８℃（ＣＯＸ−２）、５５℃（ＧＡＰＤＨ）で１分間、そして７２℃で１分間、総３５サイクル（ＶＥＧＦ、ＩＬ−８及びＣＯＸ−２）または２８サイクル（ＧＡＰＤＥ）。ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲル上で分離（resolve）した後、１０ｍｇ／ｍｌの臭化エチジウムで染色した。
【００３２】
レバミピド−スリンダク処理群及びレバプラザン−スリンダク処理群において、ＩＬ−８、ＶＥＧＦ及びＣＯＸ−２の発現量は、図６の通りである。図６から分かるように、レバプラザン−スリンダク処理群で、ＩＬ−８、ＶＥＧＦ及びＣＯＸ−２の発現量がレバミピド−スリンダク処理群に比べてさらに高かった。ＮＳＡＩＤ誘導胃粘膜損傷のメカニズムのうちの一つが、胃粘膜再生及び虚血の原因になるＶＥＧＦ、ＩＬ−８、及びＣＯＸ−２の減少と関連すると知られている。従って、レバプラザン−スリンダク処理群でのＩＬ−８、ＶＥＧＦ及びＣＯＸ−２の発現量増加を示す図６の結果は、レバプラザンがすぐれた胃腸管粘膜の細胞保護効果（cytoprotective effect）を有するということを示す。
【００３３】
実施例７．熱・衝撃蛋白質の活性評価（ウェスタンブロッティング）
熱・衝撃蛋白質（heat-shock protein）であるＨＯ−１、ＨＳＰ２７及びＨＳＰ７０の発現を測定するために、細胞を５、１０、及び２５μＭの濃度のレバプラザンで前処理し、ＮＳＡＩＤであるインドメタシン（０．５μＭ）で処理した。
【００３４】
ラットの胃粘膜細胞（ＲＧＭ−１、理研セルバンク、日本）を培養皿に２Ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／１００ｍｍ２にシーディング（seeding）した後、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１０％ＦＢＳ（Fetal  Bovine   Serum）の補充されたＤＭＥＭ−Ｆ１２（Gibco ＢＲＬ，Grand Island，New York，米国）で培養した。ＲＧＭ−１細胞をレバプラザン（５、１０及び２５μＭ）で前処理して３７℃で１６時間培養した。培地を除去し、ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４及び２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で３回洗浄した。インドメタシン滅菌水溶液を最終濃度が０．５μＭになるように前記細胞に添加し、細胞を３７℃で１６時間培養した。培養後、細胞を溶解緩衝液（Lysis buffer）（２０ｍＭ Tris−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Triton Ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及びプロテアーゼ阻害物質カクテル（protease inhibitor cocktail）（Roche，Mannheim，ドイツ））に再懸濁させた。前記懸濁液をＢＩＯＲＵＰＴＯＲ（Cosmo Bio，江東区，東京）を使用して超音波破砕（約１０秒、４回）し、４℃で１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上澄み液を蛋白質抽出物として使用し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動した後、semidry transfer system（Hoeffer Pharmacia Biotech，サンフランシスコ，ＣＡ，米国）を使用し、ＰＶＤＦ膜（Millipore，マサチューセッツ，米国）に転移させた。一次抗体と蛋白質との非特異的結合を遮断するために、ＰＶＤＦ膜を５％スキムミルク（Difco，Ｌｉｖｏｎｉａ ＭＩ，米国）を含有するブロッキング緩衝液（blocking buffer）（ＴＢＳＴ：１０ｍＭ Tris−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０（ｖ／ｖ））で２３℃で１時間ブロッキング（blocking）した。前記ＰＶＤＦ膜をＨＯ−１、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０またはａ−チューブリン（ＴＵ−０２）に対する一次抗体の１：１，０００希釈液（２００ｎｇ／ｍｌ）と共に、４℃で１５時間培養した。前記ＰＶＤＦ膜は、ＨＲＰ（horseradish peroxidase）共役された（conjugated）二次抗体（Santa Cruz Biotech，カリフォルニア，米国）の１：２，０００希釈液（１００ｎｇ／ｍｌ）と共に、２３℃で１時間培養した。免疫複合体（immunocomplex）をＥＣＬ（Enhanced ChemiLuminescence）検出キット（detection kit）（Amersham-Pharmacia Biotec, Buckinghamshire, UK）を使用して確認した（図７参照）。
図７から、レバプラザンは、熱・衝撃蛋白質の発現を刺激することによって、細胞保護効果を示すということが分かる。
【００３５】
実施例８．ＮＳＡＩＤ誘導性の胃病変（ＮＳＡＩＤ−induced gastropathy）に対するレバプラザンの予防効果の評価
６週齢のＳＰＦ（Specific-Pathogen-Free）スプラグドーレイ系雄性ラット（Charles River，東京）を試験に使用した。商業的で市販されている滅菌されたペレット飼料（Biogenomics Ｃｏ．，ソウル、韓国）と滅菌された水とを自由に与え、１２時間ずつ昼夜を調節して清浄室（air-conditioned biohazard room）で飼育した。ラットを２４時間絶食させ、インドメタシン（４０ｍｇ／ｋｇ、１２時間）に露出させる前に、オロ・ガストリック管（oro-gastric tube）を介して０．５％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）に懸濁させた５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇのレバプラザン、３０ｍｇ／ｋｇのレバミピド、及び５ｍｇ／ｋｇのオメプラゾールを投与した。リン酸緩衝食塩水（phosphate-buffered saline）をラットの胃腔（gastric lumen）内に注入して胃を膨脹させた。大きい湾曲（greater curvature）に沿って切開し、胃（stomachs）を開き、胃粘膜病変の総面積を計算して病変の平均サイズを得た。
対照群及び試験群の胃粘膜病変にかかわる予防効果を比較した結果は、図８の通りである。図８から分かるように、対照群、オメプラゾール前処理群及びレバミピド前処理群では、出血性病変が観察される一方、レバプラザン前処理群では、出血性病変はほとんど観察されなかった。かような結果は、レバプラザンが胃粘膜病変に対してすぐれた予防効果を有するということを示す。
【００３６】
実施例９．ＮＳＡＩＤ誘導性胃病変（ＮＳＡＩＤ−induced gastropathy）に対するレバプラザンの治療効果の評価
６週齢のＳＰＦ（Specific-Pathogen-Free）スプラグドーレイ系雄性ラット（Charles River，東京）を試験に使用した。商業的で市販されている滅菌されたペレット飼料（Biogenomics Ｃｏ．，ソウル、韓国）と滅菌された水とを自由に与え、１２時間ずつ昼夜を調節して清浄室（air-conditioned biohazard room）で飼育した。ラットを２４時間絶食させ、オロ・ガストリック管（oro-gastric tube）を介してインドメタシンの０．５％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）溶液１ｍｌ（４０ｍｇ／ｋｇ）で 処理した。インドメタシン処理８時間後、０．５％ＣＭＣに溶解させたレバプラザン溶液１ｍｌ（５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）でそれぞれ１時間ラットを処理し、実施例８と同じ方法で胃病変程度を測定した。
【００３７】
インドメタシン単独処理群とインドメタシン−レバプラザン処理群とでの胃粘膜病変に対する治療効果を比較した結果は、図９の通りである。図９から分かるように、インドメタシン−レバプラザン投与群では、胃粘膜出血性病変が顕著に改善され、エロージョン（erosion）及び潰瘍の数も減少した。かような結果は、レバプラザンが胃粘膜病変に対してすぐれた治療効果を有するということを示す。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
前記の通り、レバプラザンまたはその塩は、酸ポンプ拮抗剤として作用すると同時に、胃腸管粘膜の防御因子を増強させることによって、すぐれた胃腸管粘膜損傷の予防または治療効果を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３−Ａ】
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【図３−Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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