(57)【要約】  本発明は、ＡＴＩＩＩタンパク質が活性種が豊富な未修飾低分子量ヘパリンとのインキュベーションによって最初に活性化されていること、およびＡＴＩＩＩタンパク質が含水樹脂１ｍｌにつきタンパク質約２ｍｇ未満の比率で樹脂に共有結合されていることを特徴とする、固体支持体に結合されているＡＴＩＩＩタンパク質を含むアフィニティークロマトグラフィーカラムに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．ＡＴＩＩＩタンパク質は、野生型タンパク質またはこの変異体であること、
ｂ．ＡＴＩＩＩタンパク質は、活性種が豊富な未修飾低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）とのインキュベーションによって、最初に活性化されていること、
ｃ．ＡＴＩＩＩタンパク質は、含水樹脂１ｍｌにつきタンパク質約２ｍｇ未満の比率で、樹脂に共有結合されている
ことを特徴とする、固体支持体に結合されているアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）タンパク質を含むアフィニティークロマトグラフィーカラム。
【請求項２】
ＬＭＷＨに存在するＡＴＩＩＩ−結合部位の量とＡＴＩＩＩ分子の量との比率が、約５から約１５の間であることを特徴とする、請求項１に記載のカラム。
【請求項３】
比率が約１０であることを特徴とする、請求項２に記載のカラム。
【請求項４】
ＬＭＷＨがｅｎｏｘａｐａｒｉｎｅ（登録商標）であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載のカラム。
【請求項５】
ＡＴＩＩＩ／樹脂比が、樹脂１ｍｌにつきタンパク質０．５から１．５ｍｇの間であることを特徴とする、請求項１に記載のカラム。
【請求項６】
ＡＴＩＩＩに対して親和性を有する種と親和性を有さない種とを含むサンプルにおいて、
ａ．前記サンプルを請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィーカラムに（前記カラムは適切な生理食塩緩衝液中で、最初に平衡化しておく）導入すること、
ｂ．適切な生理食塩洗浄緩衝液を用いて、特異的に保持されていない種を前記カラムから洗浄すること、および
ｃ．適切な生理食塩溶出緩衝液を用いて、特異的に保持されている種を前記カラムから溶出すること
を含む、ＡＴＩＩＩに対して親和性を有する種を精製するための方法。
【請求項７】
種がオリゴ糖であることを特徴とする、請求項６に記載の、ＡＴＩＩＩに対して親和性を有する種を精製するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固体支持体に結合されているＡＴＩＩＩタンパク質を含むアフィニティークロマトグラフィーカラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリンは、動物由来の硫酸化ムコ多糖の混合物であり、特に有用な抗凝固性を有する、グリコサミノグリカン類の生物活性剤である。ヘパリンは、サイズの非常に不均質な、直鎖状の硫酸化多糖鎖から構成されている。ヘパリンの平均重量は、約１５０００Ｄａである（由来：ブタ粘液）。
【０００３】
低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）および極低分子量ヘパリン（ＶＬＭＷＨ）は、長いヘパリン多糖鎖をより短い低分子量鎖に開裂することよって調製される。したがって、「ＬＭＷＨ」および「ＶＬＭＷＨ」という用語は、「ＬＭＷＨ」および「ＶＬＭＷＨ」の分子量が、それぞれ３０００から６５００Ｄａの間および１５００から３０００Ｄａの間である鎖を意味することを意図する。
【０００４】
アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）（Ｃｈａｎｄｒａ他，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：１８４５〜１８４８）は、凝固を抑制するセリンプロテアーゼに対して弱い阻害活性を有する特定のセルピンである。この作用は、ＡＴＩＩＩと結合してＡＴＩＩＩを活性化させるヘパリンの存在下で、明らかに増大する。特に、ヘパリンへの結合は、このタンパク質における一連の構造変化を引き起こし、ついには標的のセリンプロテアーゼとの相互作用に極めて有利な構造を取ることになる。ＡＴＩＩＩが活性化された構造である場合、ヘパリンの分子または構造変化を開始した誘導体の分子との相互作用は明らかに強化される。
【０００５】
ヘパリンとＡＴＩＩＩとの間の相互作用は、特定の五糖配列に起因する。多糖鎖の３分の１のみが、ＡＴＩＩＩとの安定した相互作用を可能にする特定の配列を有する。したがって、ヘパリンの製剤および誘導体は、ＡＴＩＩＩに対する親和性に関して不均質である。オリゴ糖の群をＡＴＩＩＩに対して親和性を有する種において豊富にすることができることは重要であり、このように量を豊富にすることによって、この群の抗凝固活性を著しく増大させることができる。
【０００６】
ヘパリン親和性画分とヘパリン非親和性画分とを分離するためのＡＴＩＩＩアフィニティークロマトグラフィーの方法は、Ｈｏｏｋ他（１９７６，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，６６：９０〜９３）に記載されている。他の方法は公表されているが、Ｈｏｏｋ他の方法の要点を繰り返している（Ｈｏｐｗｏｏｄ他，１９７６，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，６９：５１〜５４；Ｄｅｎｔｏｎ他，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｌ．，１１８：３８８〜３９１；Ｐｉｘｌｅｙ＆Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ，１９８２，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，２６：１２９〜１３３）。この方法によると、ＡＴＩＩＩは、アセチル化ヘパリンの存在下でＣＮＢｒ−活性化セファロースＢ樹脂上にグラフトされている。ヘパリンを使用する目的は、ＡＴＩＩＩのヘパリン結合部位のレベルで、いずれのグラフトも起こらないようにすることである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この技術には２つの重大な限界がある。
【０００８】
まず第一に、ＡＴＩＩＩを結合させるために使用されるヘパリンは、アセチル化ヘパリンであり、これはヘキサミンＮＨ２残基と競合する危険性を避けるためである。ヘパリンをアセチル化すると、結合部位に関しては、この親和性がかなり減少し、ひいてはこの保護力がかなり減少してしまうので、親和性を有する種を結合させることができるＡＴＩＩＩ分子の数が減少することに反映される。
【０００９】
第二に、使用されるＡＴＩＩＩの濃度（含水樹脂１ｍｌ当たりタンパク質約７ｍｇ）を考慮すると、ＡＴＩＩＩに対して親和性を有する種の精製中に、ＡＴＩＩＩに結合することができる多糖分子間の立体障害という高い危険性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の主題は、
ａ．ＡＴＩＩＩタンパク質が、野生型タンパク質またはこの変異体であること、
ｂ．ＡＴＩＩＩタンパク質が、活性種が豊富な未修飾低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）とのインキュベーションによって、最初に活性化されていること、
ｃ．ＡＴＩＩＩタンパク質が、含水樹脂１ｍｌにつきタンパク質約２ｍｇ未満の比率で、樹脂に共有結合されていることを特徴とする、固体支持体に結合されているアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）タンパク質を含むアフィニティークロマトグラフィーカラムである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
「未修飾ＬＭＷＨ」という用語は、調製後に化学修飾または酵素修飾を受けておらず、特に、アセチル化されていないＬＭＷＨを意味することを意図する。「活性種が豊富なＬＭＷＨ」という表現は、ＡＴＩＩＩに対して親和性を有するオリゴ糖が豊富なＬＭＷＨを意味することを意図する。
【００１２】
本発明によると、「樹脂」という用語は、この上にＡＴＩＩＩがグラフトされる、化学的に不活性な高分子支持体を意味することを意図する。これらの支持体には、とりわけ、および限定されない意味で、アガロースビーズ、ポリアクリルアミド−アガロースビーズ、多孔質ガラスビーズ、ポリビニルビーズまたはポリメタクリレートビーズが含まれ、これらの支持体の上に、製造業者の指示または当業者によく知られている方法、特に、臭化シアンとのグラフト法およびヒドラジンとのグラフト法などの方法に従って、ＡＴＩＩＩがグラフトされる。予備活性化樹脂を使用してもよいことは、明らかに理解される。
【００１３】
本発明の極めて特に有利な実施形態によると、使用される樹脂はセファロースであり、使用されるグラフト法は臭化シアングラフト法である。
【００１４】
本発明によるアフィニティークロマトグラフィーカラムは、２つの利点を有する。
【００１５】
まず第一に、ＡＴＩＩＩの結合部位を保護するために未修飾ＬＭＷＨを使用すると、該タンパク質を活性化された構造に固定することができる。この構造において、ＡＴＩＩＩは、親和性を有する種に関して、事前活性化なしで１級アミンに結合されたＡＴＩＩＩよりも極めて一層高くさらに選択的な親和性を発揮する。
【００１６】
第二に、ＡＴＩＩＩを低濃度にすると、親和性を有する種間の立体障害がなく、これらの種との相互作用が可能になる。本発明のこの特性は、本発明が大きいサイズの種を分離する予定である場合には、特に有利である。
【００１７】
すべてのＡＴＩＩＩ分子を活性化するために、親和性を有する種が豊富な未修飾ＬＭＷＨの飽和量を使用することが好ましい。
【００１８】
本発明の有利な実施形態によると、ＬＭＷＨに存在するＡＴＩＩＩ−結合部位の量とＡＴＩＩＩ分子の量との比率は、約５から約１５の間である。より具体的には、本発明の主題は、この比率が約１０であることを特徴とする、上記定義のアフィニティークロマトグラフィーカラムである。
【００１９】
本発明の主題は、極めて具体的には、ＡＴＩＩＩ結合部位を保護するためのＬＭＷＨとしてｅｎｏｘａｐａｒｉｎｅ（登録商標）を使用することを特徴とする、アフィニティークロマトグラフィーカラムである。
【００２０】
上記説明のように、本発明はまた、樹脂上にグラフト可能なタンパク質の濃度を調節することによって、ＡＴＩＩＩにより接近し易くなるという利点を有する。
【００２１】
他の有利な実施形態によると、本発明の主題は、ＡＴＩＩＩ／樹脂比が、樹脂１ｍｌにつきタンパク質約０．５から約１．５ｍｇの間であることを特徴とする、アフィニティークロマトグラフィーカラムである。例えば、臭化シアン−活性化セファロースＢ樹脂（Ｓｉｇｍａ）については、この比率は乾燥樹脂１ｇにつきタンパク質約１．７５ｍｇから５．２５ｍｇの範囲に相当する（供給業者のデータによると、乾燥樹脂１ｇから含水後の樹脂約３．５ｍｌが生じる）。
【００２２】
したがって、本発明によるアフィニティークロマトグラフィーカラムは、先行技術において記載されているカラムに比べて、より優れた能力およびより優れた選択性を有する。
【００２３】
ＡＴＩＩＩに対して親和性を有する種を、親和性を有する種と親和性を有さない種との混合物から精製することが望ましい状況が発生する。「ＡＴＩＩＩに対して親和性を有する種」という表現は、ＡＴＩＩＩに特異的に結合することができる任意の分子を意味することを意図する。例えば、親和性を有する種において、ヘパリンオリゴ糖の群を豊富にすることは望ましい場合がある。例えば、ＡＴＩＩＩに対するポリクローナル抗体の溶液の滴定濃度を増加させることは有利である場合もある。
【００２４】
したがって、本発明によるアフィニティークロマトグラフィーカラムは、ＡＴＩＩＩに対して親和性を有する種を混合物から精製するために使用することができる。したがって、本発明の主題はまた、ＡＴＩＩＩに対して親和性を有する種と親和性を有さない種とを含むサンプルにおいて、ＡＴＩＩＩに対して親和性を有する種を精製するための方法であり、前記方法は、
ａ．前記サンプルをＡＴＩＩＩタンパク質用のアフィニティークロマトグラフィーカラムに導入し、前記カラムは適切な生理食塩緩衝液中で、最初に平衡化しておくこと、
ｂ．適切な生理食塩洗浄緩衝液を用いて、明確には保持されていない種を前記カラムから洗浄すること、および
ｃ．適切な生理食塩溶出緩衝液を使用して、明確に保持されている種を前記カラムから溶出することを含む。
【００２５】
特に、極めて特に有利な実施形態によると、本発明による方法を用いて精製される、親和性を有する種は、ヘパリンおよびこれらの誘導体からなるオリゴ糖である。
【００２６】
多様な種の溶出は、例えば、分光光度計を使用して、それぞれの画分についての吸光度を測定することによって追跡することができる。使用される波長は、精製種の性質に適したものである。例えば、オリゴ糖を精製する場合、使用される波長は２３２ｎｍであり、タンパク質を精製する場合、使用される波長は２８０ｎｍである。
【００２７】
次いで、当業者によく知られている方法に従って、溶出画分の組成を分析することができる。したがって、分析される画分がオリゴ糖を含む場合、当業者は先行技術において記載されている分析方法、例えば、および限定されない意味で、キャピラリー電気泳動法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光光度法、高速液体クロマトグラフィーを使用してよい。当業者は、Ｘａ因子阻害アッセイなどの生物学的アッセイを使用することも可能である。
【００２８】
実施例
以下の実施例により、本発明を例示するが、これらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
カラムの調製および使用
１．カラムの調製
ＡＴＩＩＩの１０ｍｇを水２ｍｌに還元して注入可能な試料とし、続いてこれをカップリング緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝８）１８ｍｌ中に溶かして０．５ｍｇ／ｍｌ（８．６μＭ）の最終濃度とする。ｅｎｏｘａｐａｒｉｎｅ（登録商標）３４．４ｍｇを溶液に加え、１．４ｍｇ／ｍｌ（２１５μＭ）の最終濃度とする。
【００３０】
この溶液と、製造業者の指示に従って調製されたＣＮＢｒ−活性化セファロースＢ樹脂（Ｓｉｇｍａ）とを１：２の比率で混合し、次いで冷却状態で一晩穏やかに攪拌する。続いて溶液全体をブロッキング緩衝液（体積対体積）中に移し、１６時間攪拌する。
【００３１】
この樹脂を、２個のピストンを備えた温度自動調節式のＸＫ１６カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に注ぎ込む。静かに注いだ後、これを、ブロッキング緩衝液と洗浄緩衝液とを交互に繰り返すことによって、４回から５回洗浄する。
【００３２】
この洗浄後、ＡＴＩＩＩと複合したｅｎｏｘａｐａｒｉｎｅ（登録商標）分子を除去するために、カラムを１０Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．４；３Ｍ  ＮａＣｌで完全にすすぐ。
最後に、カラムを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．４；０．４Ｍ  ＮａＣｌで平衡化する。
【００３３】
２．親和性を有するｅｎｏｘａｐａｒｉｎｅ（登録商標）種のアフィニティークロマトグラフィーによる分離
ｅｎｏｘａｐａｒｉｎｅ（登録商標）を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．４；０．４Ｍ  ＮａＣｌに１ｍｇ／ｍｌで溶かした溶液をカラムに注入する。該カラムを同緩衝液で完全に洗浄し、次いで１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．４；３Ｍ  ＮａＣｌで溶出を行う。
【００３４】
親和性を有する種の挙動は、ダイオードアレイＵＶ検出器（ＨＰ１１００）を用いて、画分の吸光度を２３２ｎｍで測定することによって追跡する。図１に示すように、親和性を有する種は、明確にカラム上に保持され、３Ｍ  ＮａＣｌの存在下のみで溶出される。
【実施例２】
【００３５】
他のアフィニティークロマトグラフィーカラムとの比較
１．能力
保護剤以外は同一のグラフトプロトコルで、２本のカラムを調製する。
【００３６】
カラム１：グラフト中にｅｎｏｘａｐａｒｉｎｅ（登録商標）４０ｍｇを用いた保護
カラム２：グラフト中にヘパリン１２０ｍｇを用いた保護
保護に使用する量の相違は、平均分子量の相違（約３．４の比率）によって正当化される。
【００３７】
カラムの能力を決定するために、国際出願ＷＯ０２／０８２９５の実施例７に記載されているように調製されたＬＭＷＨ４００μｇを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．４；０．２Ｍ  ＮａＣｌに溶かして各カラムに注入し、流速０．５ｍｌ／分で流出させる。３Ｍ  ＮａＣｌで溶出を行う。
【００３８】
多様な多糖種の分離は、ダイオードアレイＵＶ検出器（ＨＰ１１００）を用いて、画分の吸光度を２３２ｎｍで測定することによって追跡する。
【００３９】
２本のカラム上で分離が見られるが、分離プロフィールは異なる（図２）。特に、カラム２（保護：ヘパリン）では、保持されない種のピークがかなり尾を引いている。さらに、カラム２（保護：ヘパリン）での溶出量は、カラム１（保護：ｅｎｏｘａｐａｒｉｎｅ（登録商標））での溶出量に比べて低いように思われる。
【００４０】
この定性的な結果を定量的に証明するために、範囲の積分を用いて、保持される種の百分率を算出する。これは、ＨＰ  Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ（登録商標）ソフトウェア上で下記式、すなわち、保持される種％＝溶出ピークの面積／（保持されない種のピークの面積＋保持される種のピークの面積）に従って行われる。
【００４１】
使用したＬＭＷＨの六糖画分中、親和性を有する種の百分率が２２〜２４％と推定されることを承知の上で、注入量を変化させることによって能力の近似的定量を行った。そこで、能力は、２２〜２４％というこの百分率が溶出時に得られるような、注入ＬＭＷＨの最大量に相当する。
このようにして、カラム１（保護：ｅｎｏｘａｐａｒｉｎｅ（登録商標））の能力は１１５．８μｇであり、カラム２（保護：ヘパリン）の能力は６４μｇであることが見い出された。
【００４２】
選択性
本明細書において、「選択性」という用語は、分離中に、親和性を有する多糖種と親和性を有さない多糖種とを区別する、樹脂の能力と定義される。
【００４３】
これらの分析を行うために、先に決定した能力に満たない量で、ＬＭＷＨの注入を行った。
ａ．カラム１（保護：ｅｎｏｘａｐａｒｉｎｅ（登録商標））
ＬＭＷＨの４２７μｇを数回注入した後、親和性を有する画分および親和性を有さない画分を合わせ、ＣＴＡ−ＳＡＸ  ＨＰＬＣ（ＭＯＵＲＩＥＲ他，２００４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３３２：２９９〜３１３）を用いて分析した。得られる親和性を有する画分は、この画分が親和性を有さない種を全く含まないという点、およびこの画分が親和性を有するすべての六糖を示すという点において、純粋であり、完全である。親和性を有さない画分は、補完的な方法で、親和性を有する種から完全に除去される。
【００４４】
構造解析を確証するために、カラム１（保護：ｅｎｏｘａｐａｒｉｎｅ（登録商標））で分離された、親和性を有する画分および親和性を有さない画分の、抗−Ｘａ活性を測定した。
【００４５】
親和性を有する画分の抗−Ｘａ活性は、８１８±１０ＩＵ／ｍｇに等しい。比較のために、六糖ΔＵＡ−（１→４）α−ＧＩｃＮＡｃ（６Ｓ）−（１→４）β−ＧＩｃＡ−（１→４）α−ＧＩｃＮＳ（ＮＳ，３，６Ｓ）−（１→４）β−ＩｄＡ２Ｓ−（１→４）α−ＧＩｃＮＳ（ＮＳ，６Ｓ）の活性は、約６５０〜７００ＩＵ／ｍｇである。これに反して、親和性を有さない画分における抗−Ｘａ活性を検出することは完全に不可能であった。
【００４６】
したがって、画分に関して行った生物学的分析は、構造解析と完全に一致している。
ｂ．カラム２（保護：ヘパリン）
カラム２（保護：ヘパリン）について、同様の検討を行った。先に決定した能力の観点からすると、この樹脂の機能を最大限に活用するために、注入量をやはりもっと少なく（６０μｇ）した。
【００４７】
親和性を有する画分は、カラム１（保護：ｅｎｏｘａｐａｒｉｎｅ（登録商標））で得られた画分ほど純粋ではない。親和性を有さない六糖の存在が実際に見られ、特に、ΔＵＡ２Ｓ−（１→４）α−ＧＩｃＮＳ（ＮＳ，６Ｓ）−（１→４）β−ＩｄＡ２Ｓ−（１→４）α−ＧＩｃＮＳ（ＮＳ，６Ｓ）−（１→４）β−ＩｄＡ２Ｓ−（１→４）α−ＧＩｃＮＳ（ＮＳ，６Ｓ）またはΔＵＡ２Ｓ−（１→４）α−ＧＩｃＮＳ（ＮＳ，６Ｓ）−（１→４）β−ＩｄＡ２Ｓ−（１→４）α−ＧＩｃＮＳ（ＮＳ，６Ｓ）−（１→４）β−ＧＩｃＡ−（１→４）α−ＧＩｃＮＳ（ＮＳ，６Ｓ）などの、高度に硫酸化された六糖の存在が、僅かではない量で見られる。
【００４８】
さらに、親和性を有する種は、親和性を有さない画分中に見い出され、特に、親和性を有する主な種、すなわちΔＵＡ−（１→４）α−ＧＩｃＮＡｃ（６Ｓ）−（１→４）β−ＧＩｃＡ−（１→４）α−ＧＩｃＮＳ（ＮＳ，３，６Ｓ）−（１→４）β−ＩｄＡ２Ｓ−（１→４）α−ＧＩｃＮＳ（ＮＳ，６Ｓ）が見い出される。
【００４９】
親和性を有する画分および親和性を有さない画分の、抗−Ｘａ活性の滴定濃度は、構造解析を裏づけるものである。実際に、親和性を有する画分は、僅か５６５±４５ＩＵ／ｍｇしか抗−Ｘａ活性を示さない。その上、約１５ＩＵ／ｍｇという僅かではない残余の活性が、親和性を有さない画分中に見い出される。この活性は、親和性を有さない画分中に存在する、親和性を有する残余の種の反映であり、このことは構造解析中に証明されている。
【００５０】
したがって、カラム１（ｅｎｏｘａｐａｒｉｎｅ（登録商標））の選択性は、カラム２（ヘパリン）の選択性に比べて優れていることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ＡＴＩＩＩアフィニティークロマトグラフィー上でのｅｎｏｘａｐａｒｉｎｅ（登録商標）の分離を示すクロマトグラムである。
【図２】ＡＴＩＩＩアフィニティークロマトグラフィー上でのｅｎｏｘａｐａｒｉｎｅ（登録商標）の分離を示すクロマトグラムである。曲線１はカラム１（ｅｎｏｘａｐａｒｉｎｅ（登録商標）保護）上へのＬＭＷＨの注入、曲線２はカラム１（ｅｎｏｘａｐａｒｉｎｅ（登録商標）保護）上への緩衝液の注入、曲線３はカラム２（ヘパリン保護）上へのＬＭＷＨの注入、曲線４はカラム２（ヘパリン保護）上への緩衝液の注入を示す。
【図１】
2009503483.tif 000002
【図２】
2009503483.tif 000003
【国際調査報告】
2009503483.tif 000004
2009503483.tif 000005
2009503483.tif 000006
2009503483.tif 000007
2009503483.tif 000008
2009503483.tif 000009