(57)【要約】本発明は、ネコにおいてFel d1発現のレベルを決定するための方法に関し、この方法は、（ａ）ネコ由来サンプルにおいてFel d1遺伝子の１以上の多型位置の型を決める工程；および（ｂ）それによって、Fel d1発現のレベルを決定する工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネコにおいてFel d1発現のレベルを決定する方法であって、
（ａ）該ネコ由来サンプルにおいてFel d1遺伝子の１以上の多型位置の型を決める工程；および
（ｂ）それによって、該ネコのFel d1発現のレベルを決定する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記１以上の多型位置が、以下：
−  配列番号Xの２０９位における[T/C](チェーン1 SNP B);
−  配列番号Xの２４９位における[C/G](チェーン1 SNP C);
−  配列番号Yの８３３位における[A/G](チェーン2 SNP A);
−  配列番号Yの５７０位における[G/A] (チェーン2 SNP B);もしくは
−  配列番号Yの１６２０位における[C/T](チェーン2 SNP C);または
このような多型のいずれかと共に連鎖不平衡にある多型のいずれかである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
チェーン2 SNP AハプロタイプGGおよびチェーン2 SNP CハプロタイプTTは、高レベルのFel d1発現に関連し、チェーン2 SNP AハプロタイプAAおよびチェーン2 SNP CハプロタイプCCは、低レベルのFel d1発現に関連する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子ハロタイプCT＼CG＼GG＼GG＼TT、CT＼GG＼GG＼GG＼TT、CT＼CC＼AG＼AG＼CT、CC＼GG＼AG＼GG＼CT、CC＼GG＼GG＼GG＼CT、CC＼CG＼GG＼GG＼CC、CC＼CG＼AA＼AG＼CC、TT＼CC＼GG＼GG＼TTは、高レベルのFel d1発現に関連し、CC＼CG＼AG＼AG＼CCおよびCT＼CG＼AG＼GG＼CTは、低レベルのFel d1発現に関連する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）が、Fel d1のポリヌクレオチドまたはタンパク質を特異的結合因子と接触される工程、および該ポリヌクレオチドまたはタンパク質に該因子が結合するか否かを決定する工程を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記因子がポリヌクレオチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Fel d1遺伝子の１以上の多型位置において存在するヌクレオチドが、ゲル電気泳動の間の、Fel d1をコードするポリヌクレオチドまたはタンパク質の移動度を測定することによって検出される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３のいずれかに記載の多型配列を選択的に検出することができるプローブ、プライマーまたは抗体。
【請求項９】
Fel d1遺伝子の１以上の多型位置に存在するヌクレオチドを検出するための手段を含む、請求項１〜７のいずれかの方法を実施するためのキット。
【請求項１０】
請求項８に記載のプローブ、プライマーまたは抗体を含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
ネコについての医療勧告を提供する方法であって、
（ａ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法によって、該ネコのFel d1発現のレベルを決定する工程；および
（ｂ）該ネコの所有者または世話人に対して適切な医療勧告を提供し、必要に応じて、該ネコに対して該医療勧告を実施する工程
を含む、前記方法。
【請求項１２】
前記ネコが高レベルのFel d1発現を有し、前記医療勧告が、Fel d1レベルを低下させるために、該ネコを洗浄および／またはブラッシングすることについての指示を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ネコが高レベルのFel d1発現を有し、前記医療勧告が該ネコの不妊・去勢処置を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
Fel d1アレルギーに罹患しているか、またはFel d1アレルギーが疑われる個体に対して、ネコの適合性を決定する方法であって、
（ａ）請求項１〜７のいずれかに記載の方法によって該ネコのFel d1発現のレベルを決定する工程；および
（ｂ）そこから、該個体について該ネコの適合性を同定する工程
を含む、方法。
【請求項１５】
低レベルのFel d1発現が、Fel d1アレルギーに罹患している個体またはFel d1アレルギーが疑われる個体に対して適合性を示す、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Fel d1多型およびその多型とFel d1発現のレベルとの関連に関する情報を含むデータベース。
【請求項１７】
ネコにおいてFel d1発現のレベルを決定するための方法であって、
（ａ）該ネコのFel d1遺伝子中の１以上の多型位置において存在するヌクレオチドのデータをコンピュータシステムにインプットする工程；
（ｂ）該データをコンピュータデータベースと比較する工程であって、該データベースは、Fel d1多型およびその多型とFel d1発現のレベルとの関連に関する情報を含む、工程；ならびに
（ｃ）該ネコのFel d1発現のレベルを比較に基づいて決定する工程
を含む、前記方法。
【請求項１８】
前記Fel d1多型は請求項２に記載されたものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
コンピュータプログラムがコンピュータ上で実行されたときに請求項１７に記載の全ての工程を実施するためのプログラムコード手段を含む、コンピュータプログラム。
【請求項２０】
コンピュータプログラムプロダクトがコンピュータ上で実行されたときに請求項１７に記載の方法を実施するためのコンピュータ読み取り可能媒体上で保存されるプログラムコード手段を含む、コンピュータプログラムプロダクト。
【請求項２１】
搬送波上のプログラムコード手段を含むコンピュータプログラムプロダクトであって、コンピュータシステム上で実行されたとき、プログラムコード手段が、請求項１７に記載の方法を実施することを該コンピュータシステムに指示する、コンピュータプログラムプロダクト。
【請求項２２】
請求項１７に記載の方法を実施するためにアレンジされたコンピュータシステムであって、
（ａ）ネコのFel d1遺伝子中の１以上の多型位置において存在するヌクレオチドのデータを受容する手段；
（ｂ）Fel d1多型およびその多型とFel d1発現のレベルとの関連に関する情報を含むデータベースと、該データを比較するためのモジュール；および
（ｃ）該比較に基づいて、該ネコのFel d1発現のレベルを決定するための手段
を備える、コンピュータシステム。
【請求項２３】
単離されたポリヌクレオチドであって、
（ａ）請求項２に記載の１以上の多型位置において、配列番号１または配列番号３と異なる配列；
（ｂ）配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、および配列番号１３のいずれか１つ；
（ｃ）（ａ）または(ｂ)に記載の配列に対して相補的である配列、または遺伝コードの結果として、該配列に縮重する配列；または
（ｄ）請求項２に記載の１以上の多型位置において配列番号１もしくは配列番号３と異なり、かつ長さが少なくとも１０ヌクレオチドである、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のフラグメント
を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２４】
ポリペプチドであって、
（ａ）請求項２に記載の１以上の多型位置において配列番号２または配列番号４と異なる、請求項２３に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列；
（ｂ）配列番号６および配列番号１０のいずれか１つ；または
（ｃ）請求項２に記載の１以上の多型位置において配列番号２もしくは配列番号４と異なり、かつ長さが少なくとも１０アミノ酸である、（ａ）または（ｂ）のフラグメント
を含む、ポリペプチド。
【請求項２５】
低レベルまたは高レベルのFel d1発現を有する子孫を誕生させるためのネコを選択する方法であって、
−  候補の第１のネコにおいて請求項１〜７のいずれか１項に記載のFel d1発現のレベルを決定する工程；および、それによって、該候補の第１のネコが低レベルまたは高レベルのFel d1発現を有する子孫を誕生させるのに適しているか否かを決定する工程
を含み、該方法はさらに、必要に応じて、
−  該第１のネコと逆の性別の第２のネコにおいて請求項１〜７のいずれか１項に記載のFel d1発現のレベルを決定する工程；および低レベルまたは高レベルのFel d1発現を有する子孫を誕生させるために第１のネコと第２のネコとを交配する工程
を含む、方法。
【請求項２６】
低レベルのFel d1発現を有する子孫を誕生させるための請求項２５に記載の方法であって、必要に応じて、前記第１のネコがFel d1遺伝子において、低発現を生じさせる少なくとも１つの多型を有し、その多型は、前記第２のネコには存在しないものである、方法。
【請求項２７】
高レベルのFel d1発現を有する子孫を誕生させるための請求項２５に記載の方法であって、必要に応じて、前記第１のネコがFel d1遺伝子において、高発現を生じさせる少なくとも１つの多型を有し、その多型は、前記第２のネコには存在しないものである、方法。
【請求項２８】
Fel d1アレルギーに対して個体を脱感作するためのネコを選択する方法であって、
（ａ）請求項１〜７のいずれかに記載のFel d1発現のレベルを決定することによって、高レベルのFel d1発現を有するネコを選択する工程；および、必要に応じて
（ｂ）新生児または妊娠しているヒト個体に該ネコを提示する工程
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、高レベルまたは低レベルのアレルゲン産生を起こしやすい（susceptible to）ネコを同定するための方法、ならびに新規ポリヌクレオチドおよび新規ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
世界のヒト集団のおよそ１０％がネコに対してアレルギー体質であり、ぜん息患者の６７％までがネコアレルゲンに対して反応しやすい。ネコによって産生される主要なアレルゲンは、糖タンパク質Fel d1であり、このタンパク質は、ネコアレルギーに罹患している患者のうち９０〜９５％において反応を引き起こす。この３９ｋＤａタンパク質は、遺伝子FEL D1 AおよびFEL D1 Bによってコードされる２個のジスルフィド結合ペプチドから各々なる２個の１７ｋＤａサブユニットから形成されている。Fel d1タンパク質の主な供給源は皮脂腺であるが、唾液腺および肛門腺においても発現が検出される。Fel d1タンパク質の機能は現在知られていないが、フェロモン結合タンパク質であると考えられている。
【０００３】
Fel d1発現の制御についてはほとんど知られていない。解剖学的な部位に依存して皮膚産物は異なり、去勢されていない雄ネコの胸部の皮膚よりも顔面の皮膚でより多量のタンパク質が産生される。Fel d1産生は、不妊・去勢処置（neutering）の後に低下し、この低下は、テストステロン補足によって戻る場合がある。Fel d1は免疫原性が非常に高く、空気で運ばれる１００ｎｇ／ｍ3と同程度の低いレベルによって感作が引き起こされる可能性があるが、環境中のFel d1レベルを低下させると、ネコアレルギー罹患者の症状を弱めることが示されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明者らは、ネコの間でFel d1発現のレベルが顕著に異なり、最も高い発現レベルと最も低い発現レベルとの間に７倍を超える差があることを見出している。従って、より低いレベルのFel d1を産生するネコを同定することは、ネコアレルギー罹患者にとって好都合となり得る。従って、発明者らは、Fel d1の発現レベルが高いまたは低い可能性のあるネコを同定する方法を提供するために、ネコにおいてFel d1発現の遺伝的条件（genetic basis）を決定した。
【０００５】
従って、本発明は、ネコにおいてFel d1発現のレベルを決定する方法を提供し、その方法は、
（ａ）上記ネコ由来サンプルにおいてFel d1遺伝子の１以上の多型位置の型を決める工程；および
（ｂ）それによって、そのネコのFel d1発現のレベルを決定する工程
を含む。
【０００６】
本発明は、以下を提供する：
−  配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３のいずれかに記載の多型配列を選択的に検出することができるプローブ、プライマーまたは抗体；
−  Fel d1遺伝子の１以上の多型位置に存在するヌクレオチドを検出するための手段を含む、本発明の方法を実施するためのキット；
−  ネコについての医療勧告を提供する方法であって、
（ａ）本発明の方法によって、上記ネコのFel d1発現のレベルを決定する工程；および
（ｂ）そのネコの所有者または世話人に対して適切な医療勧告を提供し、必要に応じて、そのネコに対して医療勧告を実施する工程
を含む、方法；
−  Fel d1アレルギーに罹患しているか、またはFel d1アレルギーが疑われる個体に対して、ネコの適合性を決定する方法であって、
（ａ）請求項１〜７のいずれかに記載の方法によって上記ネコのFel d1発現のレベルを決定する工程；および
（ｂ）そこから、その個体についてそのネコの適合性を同定する工程
を含む、方法；
−  Fel d1多型およびその多型とFel d1発現のレベルとの関連に関する情報を含むデータベース；
−  ネコにおいてFel d1発現のレベルを決定するための方法であって、
（ａ）上記ネコのFel d1遺伝子中の１以上の多型位置において存在するヌクレオチドのデータをコンピュータシステムにインプットする工程；
（ｂ）上記データをコンピュータデータベースと比較する工程であって、そのデータベースは、Fel d1多型およびその多型とFel d1発現のレベルとの関連に関する情報を含む、工程；ならびに
（ｃ）上記ネコのFel d1発現のレベルを比較に基づいて決定する工程
を含む、方法；
−  コンピュータプログラムがコンピュータ上で実行されたときに本発明の方法の全ての工程を実施するためのプログラムコード手段を含む、コンピュータプログラム；
−  コンピュータプログラムプロダクトがコンピュータ上で実行されたときに本発明の方法を実施するためのコンピュータ読み取り可能媒体上で保存されるプログラムコード手段を含む、コンピュータプログラムプロダクト；
−  搬送波上のプログラムコード手段を含むコンピュータプログラムプロダクトであって、コンピュータシステム上で実行されたとき、プログラムコード手段が、本発明の方法を実施することを上記コンピュータシステムに指示する、コンピュータプログラムプロダクト；
−  本発明の方法を実施するためにアレンジされたコンピュータシステムであって、
（ａ）ネコのFel d1遺伝子中の１以上の多型位置において存在するヌクレオチドのデータを受容する手段；
（ｂ）Fel d1多型およびその多型とFel d1発現のレベルとの関連に関する情報を含むデータベースと、上記データを比較するためのモジュール；および
（ｃ）上記比較に基づいて、そのネコのFel d1発現のレベルを決定するための手段
を備える、コンピュータシステム；
−  単離されたポリヌクレオチドであって、
（ａ）本明細書に記載の１以上の多型位置において、配列番号１または配列番号３と異なる配列；
（ｂ）配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、および配列番号１３のいずれか１つ；
（ｃ）（ａ）または(ｂ)に記載の配列に対して相補的である配列、または遺伝コードの結果として、それらの配列に縮重する配列；または
（ｄ）本明細書に記載の１以上の多型位置において配列番号１もしくは配列番号３と異なり、かつ長さが少なくとも１０ヌクレオチドである、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のフラグメント
を含む、単離されたポリヌクレオチド；
−  ポリペプチドであって、
（ａ）本明細書に記載の１以上の多型位置において配列番号２または配列番号４と異なる、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる配列；
（ｂ）配列番号６および配列番号１０のいずれか１つ；または
（ｃ）本明細書に記載の１以上の多型位置において配列番号２もしくは配列番号４と異なり、かつ長さが少なくとも１０アミノ酸である、（ａ）または（ｂ）のフラグメント
を含む、ポリペプチド；
−  低レベルまたは高レベルのFel d1発現を有する子孫を誕生させるためのネコを選択する方法であって、
−  候補の第１のネコにおいて本発明に記載の方法によってFel d1発現のレベルを決定する工程；および、それによって、上記候補の第１のネコが低レベルまたは高レベルのFel d1発現を有する子孫を誕生させるのに適しているか否かを決定する工程
を含み、この方法はさらに、必要に応じて、
−  上記第１のネコと逆の性別の第２のネコにおいて本発明に記載の方法によってFel d1発現のレベルを決定する工程；および低レベルまたは高レベルのFel d1発現を有する子孫を誕生させるために第１のネコと第２のネコとを交配する工程
を含む、方法；ならびに
−  Fel d1アレルギーに対して個体を脱感作するためのネコを選択する方法であって、
（ａ）本発明の方法によってFel d1発現のレベルを決定することによって、高レベルのFel d1発現を有するネコを選択する工程；および、必要に応じて
（ｂ）新生児または妊娠しているヒト個体にそのネコを提示する工程
を含む、方法。
【０００７】
（配列の簡単な説明）
配列番号１は、Fel d1チェーン１のポリヌクレオチド配列を示す。配列番号２は、対応するポリペプチド配列を示す。
【０００８】
配列番号３は、Fel d1チェーン２のポリヌクレオチド配列を示す。配列番号４は、対応するポリペプチド配列を示す。
【０００９】
配列番号５および６は、Fel d1のチェーン１  ＳＮＰ  Ｂ変異体のポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を示す。
【００１０】
配列番号７および８は、Fel d1のチェーン１  ＳＮＰ  Ｃ変異体のポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を示す。
【００１１】
配列番号９および１０は、Fel d1のチェーン２  ＳＮＰ  Ａ変異体のポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を示す。
【００１２】
配列番号１１および１２は、Fel d1のチェーン２  ＳＮＰ  Ｂ変異体のポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を示す。
【００１３】
配列番号１３および１４は、Fel d1のチェーン２  ＳＮＰ  Ｃ変異体のポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を示す。
【００１４】
配列番号１５〜２９は、プライマー配列を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
主なネコアレルゲンFel d1は、２種の別個の鎖から構成され、その各々は、多くのエキソンからなる。チェーン１（Chain 1）は、102-150位(エキソン1)、197-257位(エキソン2)、411-600位(エキソン3)および1702-1731位(エキソン4)にエキソン配列を含む。チェーン２は、215-275位(エキソン1)および791-948位(エキソン2)にエキソン配列を含む。
【００１６】
本発明は、（代表的には、Fel d1タンパク質をコードする配列中の）多型の検出によってFel d1を高産生または低産生する可能性のあるネコを同定することができる。好ましくは、このような多型は、野生型のチェーン１配列（配列番号１）に関して以下の位置のいずれか１つにあるか、または以下の位置のいずれか１つにおける多型と共に連鎖不平衡にある：
−  ２０９位における[T/C](チェーン1 SNP B)；または
−  ２４９位における[C/G](チェーン1 SNP C)；
あるいは、野生型のチェーン２配列（配列番号３）に関して以下の位置のいずれか１つにあるか、または以下の位置のいずれか１つにおける多型と共に連鎖不平衡にある：
−  ８３３位における[A/G](チェーン2 SNP A)；
−  ５７０位における[G/A](チェーン2 SNP B)；または
−  １６２０位における[C/T](チェーン2 SNP C)。
各場合において、第１のヌクレオチドは、公知の（野生型）Fel d1遺伝子配列のヌクレオチドをさし、第２のヌクレオチドは、ＳＮＰヌクレオチドをさす。
【００１７】
これらのＳＮＰのうちの２つは、コードされたタンパク質中で検出することができるコーディング変化を生じさせる。チェーン1 SNP B（２０９位におけるＴからＣへの変化）は、ロイシン（Ｌ）をコードするＴＴＧから、セリン（Ｓ）をコードするＴＣＧへのコード変化を生じさせる。チェーン2 SNP A（８３３位におけるＡからＧへの変化）は、アスパラギン（Ｎ）をコードするＡＡＴから、セリン（Ｓ）をコードするＡＧＴへのコーディング変化を生じさせる。これらの多型性ポリペプチド配列は、配列番号６（チェーン1 SNP B）および配列番号１０（チェーン2 SNP A）に記載される。
【００１８】
本発明の１つの実施形態において、チェーン2 SNP AハプロタイプGGおよびチェーン2 SNP CハプロタイプTTは、高レベルのFel d1発現に関連し、それに対して、チェーン2 SNP AハプロタイプAAおよびチェーン2 SNP CハプロタイプCCは、低レベルのFel d1発現に関連する。さらなる実施形態において、チェーン1 SNP Bおよびチェーン1 SNP Cの遺伝子ハプロタイプＣＣは、高レベルのFel d1発現に関連し、TT/GGは、低レベルのFel d1発現に関連する。
【００１９】
全ての５つのＳＮＰのハロタイプは、「チェーン１  ＳＮＰ  Ｂ／チェーン１  ＳＮＰ  Ｃ／チェーン２  ＳＮＰ  Ａ／チェーン２  ＳＮＰ  Ｂ／チェーン２  ＳＮＰ  Ｃ」の形態で発現され得る。従って、本発明の別の実施形態において、Fel d1遺伝子ハロタイプCT＼CG＼GG＼GG＼TT、CT＼GG＼GG＼GG＼TT、CT＼CC＼AG＼AG＼CT、CC＼GG＼AG＼GG＼CT、CC＼GG＼GG＼GG＼CT、CC＼CG＼GG＼GG＼CC、CC＼CG＼AA＼AG＼CC、TT＼CC＼GG＼GG＼TTは、アレルゲンのレベルが顕著に高いことに関連し、そしてCC＼CG＼AG＼AG＼CCおよびCT＼CG＼AG＼GG＼CTは、アレルゲンのレベルが顕著に低いことに関連する。
【００２０】
ある集団のなかで互いに連鎖不平衡である多型は、同じ染色体上で一緒に見出される傾向がある。代表的には、一方は、少なくとも３０％の確率（例えば、少なくとも４０％、５０％、７０％または９０％の確率）で見出され、他方は、その集団のなかの個体の特定の染色体上で見出される。従って、機能的な多型ではないが、機能的な多型と共に連鎖不平衡にある多型が、機能的な多型の存在を示すマーカーとして作用することができる。本明細書で言及される多型のいずれかと共に連鎖不平衡にある多型は、代表的には、その多型の５００ｋｂ内にあり、好ましくは、その多型の４００ｋｂ、２００ｋｂ、１００ｋｂ、５０ｋｂ、１０ｋｂ、５ｋｂもしくは１ｋｂ内にある。検出される多型は、代表的には、Fel d1の高発現または低発現のもととなる機能変異であるが、機能変異と共に連鎖不平衡にある多型であってもよい。
【００２１】
ネコのFel d1発現のレベルは、ネコの毛で検出可能なFel d1ポリペプチドの量と同等であり得る。用語「高レベルのFel d1発現」とは、平均値または中央値の平均を超えるFel d1発現またはFel d1産物のレベルを記載するために使用することができ、「低レベルのFel d1発現」とは、平均値または中央値の平均よりも少ないFel d1発現またはFel d1産物のレベルを記載するために使用することができる。例えば、高レベルのFel d1発現は、２５ｍｇの毛につき５０００ｍＵ（例えば、２５ｍｇの毛につき６０００〜１６０００ｍＵ、７０００〜１４０００ｍＵ、例えば、約１０００ｍＵ）を超えるネコの毛サンプルから抽出されるFel d1の量に対応することができる。低レベルのFel d1発現は、２５ｍｇの毛につき５０００ｍＵ未満（例えば、２５ｍｇの毛につき１０００〜４０００ｍＵ、２０００〜３０００ｍＵ、特に、約４０００ｍＵ）のネコの毛サンプルから抽出されるFel d1の量に対応することができる。ネコの毛で検出可能なFel d1の量は、任意の適切な手段によって測定することができる。
【００２２】
（医療勧告および所有者についての適合性）
本発明の方法を使用して、一旦ネコのFel d1発現のレベルが予測されると、そのネコについて適切な医療勧告をネコの所有者または世話人に提供することが可能になる。特に、そのネコにおいて検出されたＳＮＰ配列が、高レベルのFel d1発現を示す場合、その所有者または世話人に、Fel d1のレベルを低下させるための方法を教示する、または示すことが可能である。例えば、この医療勧告は、Fel d1レベルを低下させるためにネコを洗浄および／またはブラッシングするための指示を含み得る。また、テストステロンは、Fel d1産生の増加を引き起こすことが知られている。従って、この医療勧告は、もし既に行われていない場合は、ネコの不妊・去勢処置または卵巣除去を含む場合がある。一旦、この医療勧告がネコの所有者または世話人に提供されると、その医療勧告を必要に応じて実施することができる。
【００２３】
ネコでのFel d1発現レベルを使用して、Fel d1アレルギーに罹患している個体またはそれが疑われる個体のために、そのネコの適合性を決定することもできる。特に、高レベルのFel d1発現を起こしやすい猫が、本発明に従ってFel d1遺伝子中の多型位置の型を決定することによって決定された場合、Fel d1アレルギーに罹患している個体またはそれが疑われる個体には不適切であり、低レベルのFel d1発現が予測されるネコのほうがより適している。従って、様々なネコを試験して、個体にとって最も適切であるネコを決定することが可能である。試験することができるネコの数は、少なくとも１匹、好ましくは２匹、または少なくとも５匹、または少なくとも１０匹である。
【００２４】
（低いFel d1発現または高いFel d1発現を有するネコの選択）
本発明において、低レベルまたは高レベルのFel d1発現を有する子孫を誕生させるネコを選択することが可能である。一旦、候補の第１のネコのFel d1発現のレベルが本発明の方法を使用して予測されると、その候補の第１のネコが低レベルまたは高レベルのFel d1発現を有する子孫を誕生させるのに適しているかどうかを決定することができる。第１のネコと逆の性別の第２のネコにおいて、本発明の方法を使用してFel d1発現のレベルを決定し、そして第１のネコと第２のネコとを交配することによって、低レベルまたは高レベルのFel d1発現を有する子孫を誕生させることが可能である。
【００２５】
このようにして、低レベルまたは高レベルのFel d1発現を示す子孫が産まれる。１つの実施形態において、低レベルのFel d1発現を有する子孫は、低発現を引き起こすFel d1遺伝子中の少なくとも１つの多型の遺伝的形質に起因して産まれる。低発現を引き起こす少なくとも２、３、４または５以上の多型が遺伝される場合もある。従って、第１のネコは、低Fel d1発現を引き起こすFel d1遺伝子中の多型であって、第２のネコには存在しない少なくとも１つの多型を有することができる。同様に、高レベルのFel d1発現を有する子孫の誕生を達成するために、この第１のネコは、高Fel d1発現を引き起こすFel d1遺伝子中の多型であって、第２のネコには存在しない少なくとも１つの多型を有することができる。
【００２６】
本発明はまた、Fel d1アレルギーに対して個体を脱感作するためのネコを選択する方法もする。脱感作の結果として、ネコアレルゲンに対して耐性を増加させ、ぜん息を起こりにくくすることができる。ヒト胎児の発達および乳児期の間、免疫系はアレルゲンに対して脱感作され得る。従って、本発明によると、本発明の方法を使用してFel d1発現のレベルを決定することによって、高レベルのFel d1発現を有するネコを選択することができる。次いで、高レベルのFel d1発現を有するネコを、新生児のヒト個体または妊娠したヒト個体に提示することができる。このように、代表的には、少なくとも２日間、１週間または１ヶ月の間、その個体の存在下にネコを配置する（例えば、その個体の５メートルまたは１０メートル以内）。この期間は、連続的であってもよいし、非連続的であってもよい。上記ネコは、妊娠の任意の段階（９週〜、１８週〜、または２７週〜誕生まで）で妊娠しているヒト個体に提供することができる。上記ネコは、妊娠の第３トリメスターの間（妊娠の２８週〜誕生まで）に提示することができる。高レベルのFel d1発現を有するネコは、ヒト個体が乳児期である間（例えば、誕生から２歳まで、誕生から１８ヶ月まで、誕生から１２ヶ月まで、または誕生から６ヶ月まで）、その個体に提示することができる。
【００２７】
（多型の検出）
本発明による多型の検出は、ネコのFel d1のポリヌクレオチドまたはタンパク質を、Fel d1多型について特異的な結合因子と接触させ、その結合因子が上記ポリヌクレオチドまたはタンパク質に結合するか否かを決定することを含む場合がある。ここで上記因子が結合することは、多型が存在することを示し、そして上記因子が結合しないことは、多型が存在しないことを示す。
【００２８】
この方法は、一般的に、ネコ由来のサンプルに対してインビトロで行われる。上記サンプルは、代表的には、ネコの体液および／または細胞を含み、例えば、口内スワブ液などのスワブを使用して得ることができる。このサンプルは、血液、尿、唾液、皮膚、頬の細胞または毛根のサンプルでよい。このサンプルは、代表的には、上記方法が行われる前に処理される（例えば、ＤＮＡ抽出が行われる場合がある）。サンプル中のポリヌクレオチドまたはタンパク質は、物理的に、もしくは例えば、適切な酵素を使用して化学的に、切断することができる。１つの実施形態において、例えば、多型を検出する前のクローニングもしくはＰＣＲベースの方法の使用によって、サンプル中のポリヌクレオチドの一部がコピーまたは増幅される。
【００２９】
本発明において、いずれの１以上の方法も、ネコにおいて１以上のFel d1多型の存否を決定する工程を含むことができる。上記多型は、そのネコのポリヌクレオチドまたはタンパク質中の多型配列の存在を直接的に決定することによって、代表的には検出される。このようなポリヌクレオチドは、代表的には、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡである。この多型は、以下に言及される方法などの任意の適切な方法によって検出することができる。
【００３０】
特異的な結合因子とは、多型を有するタンパク質もしくはポリペプチドには選択的または高親和性で結合するが、他のポリペプチドもしくはタンパク質には結合しないか、または低い親和性でしか結合しない因子である。この特異的結合因子は、プローブであってもよいし、プライマーであってもよい。上記プローブは、タンパク質（例えば、抗体）でもオリゴヌクレオチドでもよい。上記プローブは、標識されていてもよいし、間接的に標識可能であってもよい。ポリヌクレオチドまたはタンパク質に対するプローブの結合を使用して、プローブまたはポリヌクレオチドもしくはタンパク質のいずれかを固定することができる。
【００３１】
一般的に上記方法においては、Fel d1多型は、ネコの多型性のFel d1ポリペプチドまたはタンパク質への上記因子の結合を決定することによって検出することができる。しかし、１つの実施形態において、その因子は、例えば、変異位置に隣接するヌクレオチドまたはアミノ酸に結合することによって対応する野生型配列にも結合することができるが、野生型配列への結合の様式は、多型を含むポリヌクレオチドまたはタンパク質の結合とは検出可能に異なる。
【００３２】
上記方法は、２種のオリゴヌクレオチドプローブが使用されるオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイをベースにすることができる。これらのプローブは、多型を含むポリヌクレオチド上の隣接領域に結合し、これによって、結合の後に適切なリガーゼ酵素によって２つのプローブを一緒にライゲーションすることが可能になる。しかし、これらのプローブのうちの１つの中にシグナルミスマッチが存在すると、結合およびライゲーションが分断される場合がある。従って、多型を含むポリヌクレオチドとライゲーションしたプローブが存在し、それ故、ライゲーション産物の検出を使用して、多型の存在を決定することができる。
【００３３】
１つの実施形態において、上記プローブは、ヘテロ二本鎖分析ベースの系（heteroduplex analysis based system）で使用される。このような系において、プローブが多型を含むポリヌクレオチド配列に結合する場合、そのプローブは、多型が存在し、それ故に二重鎖構造が形成されない部位においてヘテロ二本鎖を形成する。このようなヘテロ二本鎖構造は、一本鎖または二重鎖に特異的な酵素を使用することによって検出することができる。代表的には、このプローブはＲＮＡプローブであり、ヘテロ二本鎖領域はＲＮＡａｓｅ  Ｈを使用して切断され、そして多型は、その切断産物を検出することによって検出される。
【００３４】
この方法は、蛍光化学切断ミスマッチ分析（fluorescent chemical cleavage mismatch analysis）に基づくことができ、例えば、PCR Methods and Applications 3, 268-71 (1994)およびProc. Natl. Acad. Sci. 85, 4397-4401 (1998)に記載されている。
【００３５】
１つの実施形態において、ＰＣＲプライマーが多型を含むポリヌクレオチドに結合する場合にのみＰＣＲ反応をプライムするＰＣＲプライマーが使用され（例えば、配列特異的ＰＣＲ系）、ＰＣＲ産物を検出することによってその多型の存在を決定することができる。好ましくは、上記多型に相補的なプライマーの領域は、プライマーの３’末端にあるか、または３’末端の近くにある。多型の存在は、蛍光色素およびクエンチング剤ベースのＰＣＲアッセイ（例えば、Taqman PCR検出系）を使用して決定することができる。
【００３６】
特異的結合因子は、多型配列によってコードされるアミノ酸配列に特異的に結合することができる。例えば、上記因子は、抗体または抗体フラグメントであってもよい。この検出方法は、ＥＬＩＳＡ系をベースにしたものであってよい。この方法は、ＲＦＬＰベースの系であってよい。ポリヌクレオチド中に多型が存在することによって、制限酵素によって認識される制限部位が作製または破壊される場合、この方法を使用することができる。
【００３７】
多型の存在は、多型の存在による、ゲル電気泳動の間のポリヌクレオチドまたはタンパク質の移動度の変化に基づいて決定することができる。ポリヌクレオチドの場合において、一本鎖立体構造多型（ＳＳＣＰ）または変性勾配ゲル電気泳動（ＤＤＧＥ）分析を使用することができる。多型を検出する別の方法において、多型領域を含むポリヌクレオチドは、多型を含む領域にわたって配列決定され、多型の存在が決定される。
【００３８】
多型の存在は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって検出することができる。特に、多型は、二重ハイブリダイゼーションプローブ系によって検出することができる。この方法は、互いに近くに位置決めされ、目的の標的ポリヌクレオチドの内部セグメント（internal segment）に相補的である２つのオリゴヌクレオチドプローブ（この２つのプローブの各々は、蛍光物質で標識される）を使用することを含む。１つのプローブ上の蛍光物質（ドナー）の放射波長が、第二のプローブ上の蛍光物質（アクセプター）の励起波長と重なるように、任意の適切な蛍光標識または色素を蛍光物質として使用することができる。代表的なドナー蛍光物質は、フルオレセイン（FAM）であり、代表的なアクセプター蛍光物質としては、Texas red、ローダミン、LC-640、LC-705およびcyanine 5 (Cy5)が挙げられる。
【００３９】
蛍光共鳴エネルギー移動が起こるために、２つの蛍光物質は、両方のプローブが標的に対してハイブリダイゼーションする際に接近するようになる必要がある。ドナー蛍光物質が適切な波長の光で励起される場合、その放射スペクトルエネルギーは、蛍光を生じさせるアクセプタープローブ上の蛍光物質に移される。従って、ドナー蛍光物質に対して適切な波長で励起する間に、この波長の光を検出すると、２個のプローブ上の蛍光物質がハイブリダイゼーションすること、そしてこれらの物質が近くに接近することが示される。上流（５’）に位置するプローブはその３’末端で標識され、下流（３’）に位置するプローブはその５’末端で標識されるように、各プローブは、一方の末端において蛍光物質によって標識することができる。標的配列に結合したとき、それら２つのプローブの間の間隔は、１〜２０ヌクレオチド、好ましくは１〜１７ヌクレオチド、より好ましくは１〜１０ヌクレオチド（例えば、１個、２個、４個、６個、８個または１０個のヌクレオチド間隔）であり得る。
【００４０】
これら２つのうちの第１のプローブは、多型に隣接する遺伝子の保存配列に結合するように設計することができ、第２のプローブは、１以上の多型を含む領域に結合するように設計することができる。第２のプローブによって標的とされる遺伝子の配列内の多型は、結果として生じる塩基のミスマッチによって引き起こされる融点の変化を測定することによって検出することができる。融点の変化の程度は、ヌクレオチド多型に関与する数および塩基型に依存する。
【００４１】
（ポリヌクレオチド）
本発明はまた、Fel d1多型配列を含むポリヌクレオチドも提供する。Fel d1多型配列は、代表的に、以下の多型位置の１以上において、野生型Fel d1チェーン１配列（配列番号１）と異なり：
−  ２０９位における[T/C](チェーン1 SNP B);もしくは
−  ２４９位における[C/G](チェーン1 SNP C);または
野生型Fel d1チェーン２ポリヌクレオチド配列（配列番号３）に関して以下の位置のいずれかにおいて異なる：
−  ８３３位における[A/G](チェーン2 SNP A);
−  ５７０位における[G/A](チェーン2 SNP B);もしくは
−  １６２０位における[C/T](チェーン2 SNP C)。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、１以上の多型位置において配列番号１および配列番号３と異なる配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１もしくは配列番号１３の配列、またはそのフラグメントを含む。上記ポリペプチドは、代表的には、少なくとも１０塩基長、１５塩基長、２０塩基長、３０塩基長、５０塩基長、１００塩基長、２００塩基長、または５００塩基長であり、例えば、少なくとも（または最大で）１ｋｂ、１０ｋｂ、１００ｋｂ、１０００ｋｂまたはそれ以上の長さである。このポリヌクレオチドは、代表的に、多型の（５’または３’に対して）一方または両側に隣接するヌクレオチドを含み、例えば、全体または各サイドで少なくとも２個、５個、１０個、１５個、またはそれ以上の隣接するヌクレオチドを含む。代表的には、上記ポリヌクレオチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３のポリヌクレオチド配列と、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％、さらにより好ましくは少なくとも９９．９％同一である。このような数の置換および／または挿入および／または欠失および／またはパーセンテージの同一性は、そのポリヌクレオチドの全長にわたって、または全体もしくは各サイドで５０個、３０個、１５個、１０個またはそれ以下の隣接するヌクレオチドにわたって行うことができる。
【００４３】
上記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡでもＤＮＡでもよく、それらとしては、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはｃＤＮＡが挙げられる。上記ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。このポリヌクレオチドは、合成ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを含むことができる（例えば、メチルホスホン酸骨格およびホスホロチオエート骨格、またはその分子の３’末端および／もしくは５’末端におけるアクリジンもしくはポリリジン鎖の付加）。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチドは、（例えば、ＰＣＲのための）プライマーまたはプローブとして使用することができる。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、露出した標識を有することができる。適切な標識としては、放射性同位体（例えば、32Ｐまたは35Ｓ）、蛍光標識、酵素標識または他のタンパク質標識（例えば、ビオチン）が挙げられる。
【００４５】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含み、かつ本発明のポリペプチドを発現することが可能な発現ベクターも提供する。このようなベクターはまた、適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサーおよび他のエレメント（例えば、必要な場合、タンパク質発現を可能にするための正確な配向で位置決めされたポリアデニル化シグナル）も含むことができる。従って、ベクター中のコーディング配列は、そのようなエレメントに作動可能に連結されて、そのコーディング配列の発現を（代表的には、細胞中で）提供する。用語「作動可能に連結する」とは、記載された構成要素が、意図された様式で機能することが可能になるような関係に並置されるこという。
【００４６】
上記ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルスまたはファージのベクターであり得る。代表的には、このベクターは、複製のための起点を有する。このベクターは、１以上の選択可能なマーカー遺伝子を含むことができ、それらは、例えば、細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子であり、真菌ベクターの場合には耐性遺伝子である。ベクターは、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを産生するためにインビトロで使用することができるし、または宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）をトランスフェクトもしくは形質転換するために使用することができる。これらのベクターは、例えば、遺伝子療法において、インビボで使用するために適合させてもよい。
【００４７】
プロモーターおよび他の発現調節シグナルを選択して、発現が設計される宿主細胞と適合性を持たせることができる。例えば、酵母プロモーターとしては、S. cerevisiae GAL4およびADHプロモーター、S. pombe nmt1およびadh プロモーターが挙げられる。哺乳動物プロモーターとしては、カドミウムなどの重金属に応答して誘導することができるメタロチオネシンプロモーターが挙げられる。SV40 large T抗原プロモーターまたはアデノウイルスプロモータなどのウイルスプロモーターも使用することができる。哺乳動物プロモーター（例えば、βアクチンプロモーター）を使用してもよい。組織特異的なプロモーターが特に好ましい。例えば、モロニーマウス白血病ウイルスの長い末端反復（MMLV LTR）、ラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター、SV40プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)IEプロモーター、アデノウイルス、HSVプロモーター(例えば、HSV IEプロモーター)またはHPVプロモーター、特にHPV上流調節領域(URR)などのウイルスプロモーターも使用することができる。
【００４８】
上記ベクターは、真核細胞ゲノム配列（好ましくは哺乳動物ゲノム配列）またはウイルスゲノム配列に相同な配列を含むポリヌクレオチドを生じさせる、ポリヌクレオチドに隣接する配列をさらに含むことができる。これにより、本発明のポリヌクレオチドを、相同組換えによって真核細胞またはウイルスのゲノムに導入することができる。特に、ウイルス配列によって隣接される発現カセットを含むプラスミドベクターを使用して、本発明のポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に送達するのに適切なウイルスベクターを調製することができる。適切なウイルスベクターの他の例としては、単純ヘルペスウイルスベクター、ならびにレンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびＨＰＶウイルスを含むレトロウイルスが挙げられる。これらのウイルスを用いた遺伝子移入技術は、当該分野で公知である。例えば、レトロウイルスベクターを使用して、そのポリヌクレオチドを宿主ゲノムに安定に組み込むことができる。一方、複製欠損アデノウイルスは、エピソームの状態のままであり、従って一過性の発現を可能にする。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドは、Fel d1多型に選択的に結合し得るプローブまたはプライマーとして使用することができる。好ましくは、上記プローブまたはプライマーは、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３のポリヌクレオチド配列に選択的に結合することができる。このプローブまたはプライマーは、より好ましくは、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３のいずれか１つの核酸配列のフラグメントを含む。従って、本発明は、本発明に従う方法で使用するためのプローブまたはプライマー（このプローブまたはプライマーは、Fel d1多型の存在を選択的に検出することができる）を提供する。好ましくは、上記プローブは、単離核酸または組換え核酸である。このプローブは、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３のポリヌクレオチド配列に対応していてもよいし、またはこれらのアンチセンスであってもよい。このプローブをポリヌクレオチドアレイなどのアレイ上に固定化することができる。このようなプライマー、プローブおよび他のフラグメントは、好ましくは、少なくとも１０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長、または少なくとも２０ヌクレオチド長であり、例えば、少なくとも２５ヌクレオチド長、少なくとも３０ヌクレオチド長、または少なくとも４０ヌクレオチド長である。これらは、代表的には、最大で４０ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、６０ヌクレオチド長、７０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、または１５０ヌクレオチド長である。プローブおよびフラグメントは、１５０ヌクレオチド長を超えるものであってもよく、例えば、最大で２００ヌクレオチド長、３００ヌクレオチド長、４００ヌクレオチド長、５００ヌクレオチド長、６００ヌクレオチド長、７００ヌクレオチド長であり、または本発明の全長のポリヌクレオチド配列の最大で数個（例えば、５個または１０個）短いヌクレオチド長であってもよい。
【００５０】
（相同体）
ポリヌクレオチド配列またはタンパク質配列の相同体をここで言及する。このような相同体は、代表的には、例えば、少なくとも１５個、２０個、３０個、１００個を超えて連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の領域にわたって、少なくとも７０％の相同性を有し、好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性を有する。この相同性は、ヌクレオチドまたはアミノ酸の同定に基づいて計算することができる（「ハードホモロジー」といわれる場合がある）。
【００５１】
例えば、UWGCGパッケージは、相同性を計算するために使用することができるBESTFITプログラムを提供する（例えば、デフォルトセッティングの際に使用される）（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395）。PILEUPアルゴリズムおよびBLASTアルゴリズムは、例えば、Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10に記載のように、相同性配列またはラインアップ配列（line up sequence）を計算するために使用することができる（代表的にはデフォルテセッティングの際に、等しい配列または対応する配列を同定する、など）。
【００５２】
BLAST分析を行うためのソフトフェアは、National Center for Biotechnology Information（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通じて公に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列の同じ長さのワードと整列させたときに、いくつかの陽性と評価される閾値スコア（positive-valued threshold score）Tとマッチする、またはこれを満たすクエリー配列中の短いワードの長さWを同定することによって、ハイスコアリング配列ペア（HSP）をまず同定することを含む。Tは、近接ワードスコア閾値（neighbourhood word score threshold）といわれる（Altschul et al, 前述）。これらの初期近接ワードヒットは、それらを含むHSPを見出すためのサーチを開始するためのシードとして作用する。このワードヒットは、累積アルゴリズムスコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方の方向に広がる。各方向でのワードヒットの広がりは、以下の場合、停止される：累積アルゴリズムスコアが、その最大到達値（maximum achieved value）から量X低下する場合；１以上の陰性と評価される残基アルゴリズム（negative-scoring residue alignment）の蓄積に起因して、累積スコアが０以下になる場合；または、いずれかの配列の末端に到達する場合。BLASTアルゴリズムのパラメータW、TおよびXは、整列の感度とスピードを決定する。BLASTプログラムは、１１のワード長(W)、５０のBLOSUM62スコアリングマトリックス(Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919を参照のこと)整列(B)、１０の期待値(E)、M=5、N=4、および両方のストランドの比較をデフォルテとして使用する。
【００５３】
BLASTアルゴリズムは、２つの配列の間で類似性の統計分析を行う。例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787を参照のこと。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定値は、最小合計確率（smallest sum probability）（P(N)）であり、これは、２つのポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間のマッチが偶然起こる確率の指標を提供する。例えば、第１の配列の第２の配列に対する比較において最小合計確率が約１未満である場合、好ましくは約０．１未満である場合、より好ましくは約０．０１未満である場合、最も好ましくは約０．００１未満である場合、その配列は、別の配列に類似していると考えられる。
【００５４】
相同配列は、代表的には、少なくとも１個、２個、５個、１０個、２０個またはそれ以上の変異によって異なり、それらの変異は、ヌクレオチドもしくはアミノ酸の置換、欠失、または挿入であり得る。これらの変異は、計算する相同性に関して、上記に言及した領域のいずれかにわたって測定することができる。タンパク質の場合には、上記置換は、好ましくは保存的置換である。これらは、以下の表によって規定される。第２カラムの同じブロック中のアミノ酸と、好ましくは第３カラムの同じ行にあるアミノ酸とを、互いに置換することができる：
【００５５】
【化１】
2009500010.tif 000002
【００５６】
より短いポリペプチド配列もまた、本発明の範囲内である。例えば、本発明のポリペプチド配列のフラグメントは、代表的には、アミノ酸の長さで、少なくとも１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１５０、または２００である。本発明のポリペプチドは、化学的に改変されてもよく、例えば、翻訳後に改変されていてもよい。上記ポリペプチドは、グリコシル化されていてもよく、また改変されたアミノ酸残基を含んでいてもよい。このような改変ポリペプチドは、本発明の用語「ポリペプチド」の範囲内に含まれる。
【００５７】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または抗体は、単離された形態で存在してもよいし、実質的に精製された形態で存在してもよい。これらは、意図された使用に干渉しないキャリアまたは希釈剤と混合することができ、それらは依然として実質的に単離されたものと考えられる。それらは、実質的に精製された形態であってもよく、この場合、タンパク質、ポリヌクレオチド、細胞または調製物の乾燥重量の少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９８％または９９％）を一般的に含む。
【００５８】
ポリヌクレオチドおよびタンパク質に関する上記の特性のいずれも、本明細書で言及される他のポリペプチドおよびタンパク質（例えば、本発明のスクリーニングの局面および治療局面で使用されるポリペプチドおよびタンパク質）の特性であってよいことが理解される。特に、そのような特性は、上記に言及された長さ、改変およびベクターのうちのいずれかの形態であり得る。
【００５９】
（検出抗体）
本発明はまた、本発明の多型性ポリペプチドに特異的である検出抗体も提供する。本発明の多型性ポリペプチドは、１以上の多型位置において配列番号２または配列番号４の配列と異なるポリペプチドである。好ましくは、このようなポリペプチドは、２０９位においてT→C変化を有するヌクレオチド（Fel d1チェーン1 SNP B）および／または８３３位においてA→G変化を有するポリヌクレオチド（Fel d1チェーン2 SNP A）によってコードされる。これらの多型は、ポリペプチド中で検出可能なコーディング変化を生じる。より好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号６もしくは配列番号１０の配列からなる、またはこれらの配列を含む。
【００６０】
検出抗体は、１つのFel d1多型について特異的であるが、他のいずれのFel d1多型にも結合しない抗体である。本発明の検出抗体は、例えば、精製、単離またはスクリーニングの方法（免疫沈降技術を含む）において有用である。
【００６１】
本発明のポリペプチドの特異的エピトープに対して、抗体を惹起することができる。抗体または他の化合物は、選択的または高い親和性でそれらが特異的であるタンパク質には結合するが、他のポリペプチドには実質的に結合しないか、または低い親和性でしか結合しない場合、ポリペプチドに「特異的に結合する」。抗体の特異的結合能力を決定するための競合結合アッセイまたは免疫放射分析アッセイについての種々のプロトコルは、当該分野で周知である（例えば、をMaddox et al, J. Exp. Med. 158, 1211-1226, 1993を参照のこと）。このような免疫アッセイは、代表的に、特異的タンパク質とその抗体との間の複合体を形成させること、および複合体形成を測定することを含む。
【００６２】
本発明の目的のために、用語「抗体」は、そうではないことが明記されない限り、本発明のポリペプチドに結合するフラグメントを含む。このようなフラグメントとしては、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメントおよびＦ（ａｂ’）2フラグメント、ならびに一本鎖抗体が挙げられる。さらに、上記抗体およびそのフラグメントは、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、またはヒト化抗体であってもよい。
【００６３】
生物学的サンプル中（例えば、本明細書において言及された何らかのそのようなサンプル）で本発明のポリペプチドを検出するための方法において、抗体を使用することができる。この方法は、以下の工程を含む：
Ｉ      本発明の抗体を提供する工程；
ＩＩ    抗原−抗体複合体が形成され得る条件下において、上記抗体を生物学的サンプルとインキュベートする工程；および
ＩＩＩ  上記抗体を含む抗体−抗原複合体が形成されたか否かを決定する工程。
【００６４】
本発明の抗体は、任意の適切な方法によって生成することができる。抗体を調製して特徴付けするための手段は、当該分野で周知である。例えば、Harlow and Lane (1988) "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照のこと。例えば、抗体は、ポリペプチド全体またはそのフラグメント（例えば、その抗原性エピトープ（以下、「免疫原」））に対して宿主動物で抗体を惹起させることによって生成することができる。このフラグメントは、本明細書において言及されるフラグメントのうちいずれのものであってもよい（例えば、少なくとも１０アミノ酸長または少なくとも１５アミノ酸長）。
【００６５】
ポリクローナル抗体を生成するための方法は、適切な宿主動物（例えば、実験動物）を免疫原で免疫する工程、およびその動物の血清から免疫グロブリンを単離する工程を含む。従って、動物に免疫原を接種し、その後、その動物から血液を回収してＩｇＧフラクションを精製することができる。モノクローナル抗体を生成するための方法は、所望の抗体を産生する細胞を不死化する工程を含む。ハイブリドーマ細胞は、接種された実験動物由来の脾臓細胞を腫瘍細胞と融合することによって生成することができる（Kohler and Milstein (1975) Nature 256, 495-497）。
【００６６】
所望の抗体を産生する不死化細胞は、慣習的な手順によって選択することができる。ハイブリドーマは、培養して増殖させてもよいし、同種宿主または免疫不全宿主に、腹水を形成するため腹腔内注射してもよいし、もしくは血流に注射してもよい。ヒト抗体は、ヒトリンパ球をインビトロで免疫し、その後、エプスタイン−バーウイルスでそのリンパ球を形質転換することによって調製することができる。
【００６７】
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方の生成に対して、適切な実験動物は、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ニワトリ、ヒツジまたはウマである。所望の場合には、上記免疫原は、例えば、一つのアミノ酸残基の側鎖を介して、その免疫原が適切なキャリアにカップリングした結合体として投与することができる。このキャリア分子は、代表的には、生理学的に受容可能なキャリアである。得られた抗体は、単離することができ、所望の場合には、精製することができる。
【００６８】
（検出キット）
本発明はまた、ネコにおいて１以上のFel d1多型の型を決定するための手段を含むキットを提供する。特に、このような手段としては、多型を検出する、または多型の検出を助けることができる、本明細書において定義された特異的な結合因子、プローブ、プライマー、プライマーペアもしくはプライマーの組合せ、または抗体（抗体フラグメントを含む）を挙げることができる。プライマーまたはプライマーペアもしくはプライマーの組合せは、本明細書で考察されるような、検出されるべきFel d1多型を含むポリヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅のみを生じさせる配列特異的プライマーであり得る。上記キットはまた、多型が存在しないことを検出することができる特異的結合因子、プローブ、プライマー、プライマーペアもしくはプライマーの組合せ、または抗体を含むことができる。このキットは、緩衝剤または水溶液をさらに含むことができる。
【００６９】
このキットは、上記に言及された方法の実施形態のうちのいずれかを行うことができる１以上の他の試薬または器具をさらに含むことができる。このような試薬または器具は、以下のものの１つ以上を含み得る：多型に対する作用因子の結合を検出する手段、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）、ポリヌクレオチド上で作用し得る酵素（代表的には、ポリメラーゼ、制限酵素、リガーゼ、ＲＮＡｓｅ  Ｈまたはポリヌクレオチドに標識を接着することができる酵素）、酵素試薬のための適切な緩衝剤または水溶液、本明細書で考察される多型に隣接する領域に結合するＰＣＲプライマー、ポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロール、ゲル電気泳動装置、サンプルからＤＮＡを単離する手段、個体からサンプルを得るための手段、例えば、スワブもしくは針を備える道具、または検出反応を行うことができるウェルを備える支持体。上記キットは、例えば、本発明の特異的結合因子（好ましくはプローブ）を含むポリヌクレオチドアレイなどのアレイであってもよいし、またはそのようなアレイを備えていてもよい。上記キットは、代表的には、そのキットを使用するための指示のセットを備えている。
【００７０】
（バイオインフォマティクス）
Fel d1多型の配列は、例えば、コンピュータデータベースに電気的フォーマットとして保存することができる。従って、本発明は、Fel d1多型配列に関する情報を含むデータベースを提供する。このデータベースは、多型に関する情報（例えば、多型とFel d1タンパク質の発現との関係）をさらに含むことができる。
【００７１】
本明細書に記載されるデータベースは、あるネコの高レベルまたは低レベルのFel d1発現の起こしやすさを決定するために使用することができる。このような決定は、電気的手段によって（例えば、ＰＣなどのコンピュータシステムを使用することによって）行うことができる。代表的には、この決定は、ネコからの遺伝的データをコンピュータシステムにインプットする工程；その遺伝的データをFel d1多型に関する情報を含むデータベースと比較する工程；および、この比較をもとに、そのネコの高レベルまたは低レベルのFel d1発現の起こしやすさを決定する工程によって行うことができる。
【００７２】
本発明はまた、プログラムがコンピュータ上で実行されたとき、本発明の方法の全ての工程を行うためのプログラムコード手段を備えるコンピュータープログラムを提供する。また、上記プログラムがコンピュータ上で実行されたとき、本発明の方法を行うための、コンピュータ読み取り可能媒体に保存されたプログラムコード手段を備えるコンピュータプログラムプロダクトも提供される。コンピュータシステム上で実行されたとき、そのコンピュータシステムに本発明の方法を行うよう指示する、搬送波上のプログラムコード手段を含むコンピュータプログラムプロダクトも、さらに提供される。
【００７３】
図６に説明されるように、本発明は、本発明に従う方法を行うようにアレンジされた機器も提供する。この機器は、代表的に、ＰＣなどのコンピュータシステムを備える。１つの実施形態において、このコンピュータシステムは以下を備える：ネコからの遺伝的データを受容するための手段２０；Fel d1多型に関する情報を含むデータベース１０と上記データを比較するためのモジュール３０；および、その比較をもとにして、そのネコのFel d1発現レベルを決定するための手段４０。
【００７４】
本発明は、以下の実施例によって説明される。
【実施例１】
【００７５】
材料および方法
（サンプル）
ルーチンな毛づくろいの間に、多くのネコから毛をプールすることによって、６ｇの毛サンプルを収集した。５０匹の家庭で飼われた短毛のネコから、週２回（連続４週間）ブラッシングすることによって毛サンプルを得た。ネコは全て、不妊・去勢処置または卵巣摘出されていた。全５０匹のネコの詳細は表１に提供する。各ネコは、それぞれの櫛でブラッシングし、その櫛は、使用しないときはシールしたバッグの中に保管した。アッセイの前、毛サンプルは、シールしたバッグ中に室温で保管されていた。
【００７６】
（ネコ毛  Fel d1の抽出）
ネコ毛からFel d1を回収するために使用する方法は、Carayol (2000)によって使用された方法に基づき改変を加えた。特に、抽出緩衝液は、0.05% v/v Tween 20を含有するリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）であり、これを毛サンプルに分配して１５分間ボルテックスで混合した。１５ｍｌ遠心チューブまたは５０ｍｌ遠心チューブのどちらかで抽出を行った。液体の表面に浮き上がった毛は全て表面の下に押し込み、そのチューブを１６〜２４時間の間４℃でインキュベートした。次いで、この毛−ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎミックスを遠心分離した（１９００ｇ、１５分間、４℃）。上清のサンプルを回収して、アッセイするまで−２０℃で保管した。
【００７７】
【表１】
2009500010.tif 000003
【００７８】
（ウエスタンブロッティング）
ネコ毛の抽出物に存在するタンパク質をポリアクリルアミドゲル上で分離し、その抽出物に存在するFel d1を標準的なプロトコルを用いたウエスタンブロッティングによって検出した。
【００７９】
（Fel d1  ELISA）
Indoor Biotechnologies Fel d1 ELISA kit (cat. no. EL-FD1, Indoor Biotechnologies, Cardiff, UK)を使用して、Fel d1 ELISAを行った。サンプル体積を５０μｌまで減らしたこと、および比色分析色素としてテトラメチルベンジジン（Sigma, Poole, UK）を使用したことを除いて、製造業者の指示に従った。40 mU/mlと0.3125 mU/mlとの間に希釈したFel d1標準液から、標準曲線を作成した。アッセイの前に、抽出緩衝液に毛サンプルを希釈した。Molecular Devices Versamax tuneable microplate reader (Molecular Devices, Wokingham, UK)を使用してデータを収集し、SoftMax Pro softwareを使用してデータを分析した。ネコ毛２５ｍｇあたり抽出された最終的な値（ｍＵ  Fel d1）を得るために、毛サンプルの希釈について、および抽出プロセスの間に使用した毛  対  ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎの異なる比について、結果を調節した。例えば、１ｍｌ／１０ｍｇ毛で抽出し、１／１００希釈でアッセイしたサンプルから得た値は、２５０倍（１００×２．５）して使用した最終値を得た。
【００８０】
結果
（異なるFel d1レベルが異なるネコで検出され得る）
Fel d1産生に関してネコをランク付けするために、各ネコ由来の８個の毛サンプルを合わせて４つのプールとした。それぞれ行った４週間の毛づくろいの各々からの毛を含んだ。各サンプルを三重でアッセイし、各毛抽出物についての値を得るために、３重の値それぞれについて平均値を計算した。こうして各ネコから４つのFel d1値（毛サンプリングが行われた４週の各々からの値）を得た。これら４つの値を使用して平均値を計算し、特定のネコによるFel d1産生の指標を得た。結果を図１〜４に示す。
【００８１】
各ネコについて分析した４つのサンプルの間の変動の程度にもかかわらず、個々のネコの間の変動は十分なもので、Fel d1産生に関してネコをランク付けすることが可能であった（図１）。変動の程度は、最も低く産生するネコと最も高く産生するネコとの間で７倍を超えていた。測定されたFel d1の量およびネコの年齢または性別との間の明確な関係は、決定されなかった（図２および図３）。雄ネコは、平均して雌ネコよりも多くのFel d1を産生したが、両方の性別においてFel d1産生の範囲は広く、この差は有意ではなかった。本研究で使用される全ての雄ネコは去勢されているので、テストステロンによって引き起こされるFel d1産生の増加は寄与因子ではない。また、サンプルは、全て１１月の間の４週にわたって収集されたので、季節の変化または夏の高温の影響は、これらの実験において検出されない。
【００８２】
Fel d1産生と一部の毛の色との間には、相関がある可能性があった（図４）。例えば、全てのタビー色（tabby coloured）のネコは、全体の平均を下回る量のFel d1を産生し、茶色および白色のネコの大部分は、全体の平均を上回るFel d1を産生した。暗色（dark coloured）のネコは多くのFel d1を産生することが示唆されるが、このことは、争点となっており、これらの結果においては、一般的に黒色のネコは全体の平均よりも少ない量のFel d1を産生した。しかし、毛の色とFel d1産生との間の関連は、統計学的に有意なものではなかった。
【００８３】
これらの結果から、ネコの毛のFel d1の量は、異なるネコの間で変動することが示される。この変動は、年齢、性別または毛の色に関連していないので、得られた結果は、これらの変動が遺伝的条件を有する可能性のあることを示唆する。
【実施例２】
【００８４】
材料および方法
（ＳＮＰの同定）
一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するために、Fel d1遺伝子を再び配列決定した。プライマー配列を以下の表２に示す。
【００８５】
【表２】
2009500010.tif 000004
【００８６】
（ＳＮＰの分析）
Fel d1ＳＮＰとアレルゲン発現のレベルとの間に関連が存在するか否かを調査するために、実施例１でアレルゲンレベルについて試験した４９匹のネコの各ＳＮＰに存在するヌクレオチドを決定した。最初に、各ＳＮＰ変量の効果を、一変量ＡＮＯＶＡを使用して別々に分析した。以下の表３は、各ＳＮＰに関連する観察された平均アレルゲンレベルおよび試験のｐ値を示す。
【００８７】
【表３】
2009500010.tif 000005
【００８８】
これらの結果は、独立して、チェーン2 SNP Cがアレルゲンレベルと有意に関係し、ＴＴが最も高いレベルであり、ＣＣが最も低いレベルであることを示す。チェーン２  ＳＮＰ  Ａもまた、最も高いアレルゲンレベルに関係するＧＧおよび最も低いアレルゲンレベルに関係するＡＡと、有意な関係を有する。他のＳＮＰは、有意であるには程遠く、ｐ値は０．３１７と０．７７０との間である。
【００８９】
しかし、これらのＳＮＰの一部は、他の作用をマスク／反映するものである可能性がある。従って、（順位）「段階的」分析を行った。この分析は、加算し、同時にモデル１から変数を取り出す（take out）：（そのｐ値が、一度加算されて、０．０５未満である限り）各工程において、「最も有意な」未使用変数を加算する、または（そのｐ値が０．０５を超える限り）「最も有意でない」使用変数を取り出す。従って、この最終モデルは、アレルゲンレベルを予測するためのＳＮＰの「最良の」組合せを含むはずである。この事象において、この最終モデルは、チェーン1 SNP B、チェーン1 SNP Cおよびチェーン2 SNP Cのみを含み、統計学的変数の年齢および性別が含まれるか否かという問題は残ったままだった。この最終モデルは、４２％のＲ−ｓｑを有していた。このことは、アレルゲンレベルの変動の４２％は、チェーン1 SNP B、チェーン1 SNP Cおよびチェーン2 SNP Cの結果であると考えられ、これらのＳＮＰの全ては非常に大きな意義があった（ｐ値は、チェーン2 SNP Cおよびチェーン1 SNP Bについて0.000、そしてチェーン1 SNP Cについて0.041）ことを意味する。
【００９０】
チェーン2 SNP Aはそのままで有意であったが、チェーン2 SNP Cがこのモデルに置く場合では有意ではなかったということも興味深い（チェーン2 SNP Aのｐ値は、これらがある場合、0.006から0.30に増加した）。このことから、これら２つのＳＮＰの値は互いに強く関係している可能性が高いことが示唆される（すなわち、分類別の方法（categorical way）で「相関する」）。カイ二乗検定によってこのことは確認されると考えられる（ｐ値＝0.000）。
【００９１】
（ハプロタイプの分析）
このデータデットにおいて、９個のハプロタイプが存在する。各々は以下の形態で表すことができる：
「チェーン1 SNP B / チェーン1 SNP C / チェーン2 SNP A /チェーン2 SNP B /チェーン 2 SNP C」（以下の表４に示す）
【００９２】
【表４】
2009500010.tif 000006
【００９３】
線形モデルを使用して、ハプロタイプのいずれかがアレルゲンレベルに有意に関係するか否かを見出した。ハプロタイプはアレルゲンレベルに有意に関連し（ｐ値＝０．００２）、そのモデルが６１％のＲ−ｓｑ値を有することが見出された。年齢も性別もアレルゲンレベルに有意には関係していなかったが、年齢はかなり類似していた（それぞれ、ｐ値＝0.103および0.267）。有意な差の体系非常に複雑であり、以下の表５において表している。「同等群」のメンバー資格は、「＊＊＊＊」記号によって示される（有意な差がその間にないハプロタイプの群である）。従って、２つのハプロタイプが有意に異なる場合、４つの群のカラムのうち両方について「＊＊＊＊」記号を含むものはない。
【００９４】
【表５】
2009500010.tif 000007
【００９５】
これらの結果は、最も高いレベルのアレルゲンが、ハプロタイプCT＼CG＼GG＼GG＼TT、CT＼GG＼GG＼GG＼TT、CT＼CC＼AG＼AG＼CT、CC＼GG＼AG＼GG＼CT、CC＼GG＼GG＼GG＼CT、CC＼CG＼GG＼GG＼CC、CC＼CG＼AA＼AG＼CC、TT＼CC＼GG＼GG＼TTに関連することを示す。最も低いレベルのアレルゲンは、CC＼CG＼AG＼AG＼CCおよびCT＼CG＼AG＼GG＼CTに対して見出された。
【００９６】
（結論）
本発明者らは、高レベルおよび低レベルのネコアレルゲン産生に関連するネコFel d1遺伝子中の単一のＳＮＰおよびＳＮＰハロタイプを見出した。従って、これらにＳＮＰを検出すると、Fel d1アレルゲンを高産生または低産生する可能性のあるネコを同定することが可能になり、適切な医療勧告を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、５０匹のネコからの毛サンプルから抽出したFel d1レベルの比較を示す。各ネコについての４サンプルの平均値を示す。エラーバーは、これらの４つの値の標準誤差を表す。黒い横線は、全ての５０匹のネコからの結果から得た平均値を示す。濃い灰色の影付きの４つの値は、４つのサンプルのうち少なくとも１つがＥＬＩＳＡの標準範囲からはずれたネコから得たものである。
【図２】図２は、誕生日に関して、全ての５０匹のネコによるFel d1産生について得られた最終値を示す。エラーバーは、各ネコについての４サンプルの間の標準誤差を表す。実線の横線は、全ての５０匹のネコからの値の全体の平均を表す。
【図３】図３は、Fel d1産生に対する性別の効果を示す。雌ネコについての値（薄い灰色、左側）および雄ネコについての値（濃い灰色、右側）を分ける。エラーバーは、各ネコからの４サンプルの間の標準誤差を表す。短い横線は、全ての雌ネコ（左）または全ての雄ネコ（右）からの平均値を表す。長い横線（黒）は、全ての５０匹のネコからの全体の平均値を表す。
【図４】図４は、５０匹の猫の各々から抽出したFel d1の値をそれぞれの毛の色に対してプロットして示す。エラーバーは、各ネコからの４サンプルの間の標準誤差を表す。実線の横線は、全ての５０匹のネコからの全体の平均値を表す。
【図５】図５は、Fel d1 チェーン1配列におけるエキソンおよびＳＮＰの位置を示す。
【図６】図６は、Fel d1 チェーン2配列におけるエキソンおよびＳＮＰの位置を示す。
【図７】図７は、ＳＮＰ位置（囲んだ残基）、エキソン位置（太字）およびプライマー配列（下線）を含むFel d1 チェーン1配列を示す。
【図８】図８は、ＳＮＰ位置（囲んだ残基）、エキソン位置（太字）およびプライマー配列（下線）を含むFel d1 チェーン2配列を示す。
【図９】図９は、本発明を実施するためにアレンジされた機能的構成要素の実施形態を図式的に説明する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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