(57)【要約】本発明は、生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方を処理する方法に関する。該方法は、内側相と外側相とを備えた流体小滴を提供することを含む。外側相は内側相とは混和せず、外側相は内側相を取り囲んでいる。内側相は、生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方を含む。流体小滴は、磁気的に誘引性の物質をさらに含んでなる。該方法は、少なくとも１つの表面であって、流体小滴を該表面と接触させた際に流体小滴が元の状態のままであるような、テクスチャと、流体小滴の内側相の流体に対する濡れ性とを有する表面を、提供することをさらに含む。該方法は、この少なくとも１つの表面の上に流体小滴を配置することをさらに含む。該方法はまた、流体小滴中の生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方に対して処理を行なうことを含む。
2009526970.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方を処理する方法であって、
内側相および外側相からなる流体小滴を提供する工程であって、
外側相は内側相とは混和しないことと、外側相は内側相を取り囲んでいることと、
内側相は前記生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方を含むことと、内側相は外側相によって環境から遮蔽されていることと、
前記流体小滴は磁気的に誘引性の物質を含むことと
を特徴とする工程と、
少なくとも１つの表面を提供する工程であって、該表面は、流体小滴を該表面と接触させた際に該流体小滴が元の状態のままであるような、テクスチャと、流体小滴の内側相の流体に対する濡れ性と、を有することを特徴とする工程と、
前記少なくとも１つの表面の上に前記流体小滴を配置する工程と、
前記流体小滴中の生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方に対して処理を行なう工程と
からなる方法。
【請求項２】
前記流体小滴の外側相は薄膜として内側相を取り囲んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記流体小滴の内側相の流体は液体である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記流体小滴の内側相の流体は液体であり、かつ前記流体小滴の外側相の流体は液体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
磁気的に誘引性の物質は、少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子、磁性流体、鉄含有性の細菌、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの表面に対する前記流体小滴の位置を制御する工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの表面に対する前記流体小滴の位置を制御する工程は、流体小滴を磁場または電磁場に曝露することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの表面に対する前記流体小滴の位置を制御する工程は、磁場または電磁場を変化させることにより流体小滴を移動させること、前記少なくとも１つの表面を移動させること、およびこれらの組み合わせからなる群のうちの１つをさらに含む、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項９】
磁場を変化させることは、少なくとも１つの磁石の位置を変化させることからなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
流体小滴の内側相の流体に対する、前記少なくとも１つの表面の濡れ性は、流体小滴の内側相の流体で構成される流体小滴の、前記少なくとも１つの表面との界面における前進接触角θが、約５０度以上であることによって特徴づけられる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの表面は、ほぼ平面の基材、凹形の基材、凸形の基材、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
流体小滴の内側相の流体は極性の液体であり、かつ少なくとも１つの表面は無極性の表面である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
無極性の表面は、シリコーン、プラスチック、表面が修飾されたシリコン酸化物、表面が修飾されたシリコン水素化物、表面が修飾された紙、表面が修飾されたガラス、表面が修飾された石英、表面が修飾された雲母、表面が修飾された金属、表面が修飾された金属酸化物、表面が修飾されたセラミック、ならびにこれらの任意の複合材からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
流体小滴の内側相の流体は無極性の液体であり、かつ少なくとも１つの表面は極性の表面である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
流体小滴を提供する工程は、
第１の流体を提供することと、
第１の流体とは混和しない第２の流体を提供することと、
第２の流体上に第１の流体の小滴を分注することによって、内側相および外側相からなる流体小滴を形成することと、第１の流体が内側相を形成し、該内側相は外側相を形成している第２の流体に囲まれていることと、
からなる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の流体は最初に提供される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第１の流体、第２の流体および試料が同時に提供される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
流体小滴を提供する工程は、
内側相および外側相からなる流体小滴またはその一部を、外側相を形成している第２の流体中から回収することによって、内側相を囲んでいる外側相を薄膜として備えた流体小滴を形成することをさらに含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
流体小滴の内側相は極性の液体であり、かつ流体小滴の外側相は無極性の液体である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
流体小滴の内側相は親水性の液体であり、かつ流体小滴の外側相は疎水性の液体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
内側相の流体は、水、酸化ジュウテリウム、酸化トリチウム、アルコール、有機酸、無機酸、有機酸のエステル、無機酸のエステル、エーテル、アミン、アミド、ニトリル、ケトン、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、二酸化炭素、ジメチルスルホン、ジメチルスルホキシド、チオール、ジスルフィド、および極性のイオン性液体からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
外側相の流体は、鉱油、シリコーンオイル、天然オイル、ペルフルオロ化された炭素の液体、部分的にハロゲン化された炭素の液体、アルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物、二硫化炭素、および無極性のイオン性液体からなる群から選択される、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子は、反磁性の粒子、強磁性の粒子、常磁性の粒子、および超常磁性の粒子からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子は、生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方に含まれていることが疑われる標的物質に結合することができるリガンドを含んでいる、請求項５または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記リガンドは、生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方に含まれていることが疑われる標的物質に選択的に結合することができる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記リガンドは、少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子の表面に固定化される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記リガンドは、クラウンエーテル、ペプチド、抗体、リポカリンファミリーのポリペプチドをベースとした突然変異タンパク質、アンキリンスカフォールドもしくはクリスタリンスカフォールドをベースとしたタンパク質、アビマー、グルボディ、レクチン、核酸、プロテインＡ、プロテインＧ、酵素、金属原子、カーボンナノチューブ、カーボンナノフォーム、染料、ストレプトアビジン、アミロース、マルトース、セルロース、キチン、細胞外マトリクス、グルタチオン、カルモデュリン、ゼラチン、ポリミキシン、ヘパリン、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、リジン、アルギニン、ベンズアミジン、およびアルモシリケートからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの表面の領域を、温度の変化、磁場、電場、電磁場、圧力、波長、周波数、振幅、化学物質濃度、および化学組成からなる群から選択される条件に曝露する工程をさらに含み、かつ、
少なくとも１つの表面に対する流体小滴の位置を制御する工程は、前記条件に曝露されている少なくとも１つの表面の領域内へと流体小滴を移動させることを含んでなる、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
互いに向かい合っている少なくとも２つの表面を提供する工程であって、該表面は、流体小滴を該表面と接触させた際に該流体小滴が元の状態のままであるような、テクスチャと、流体小滴の内側相の流体に対する濡れ性とを有することを特徴とする工程をさらに含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
流体小滴の位置を制御する工程は、磁場または電磁場を用いるか、少なくとも１つの表面を移動するかのうち少なくともいずれかにより、前記少なくとも２つの表面の間で流体小滴を移動させることを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方に対して処理を行なう工程は、流体小滴をさらなる流体小滴と融合させる工程、流体小滴の内部を混合する工程、流体小滴を別の流体小滴で濾過する工程、および流体小滴を少なくとも２つの娘流体小滴に分割する工程からなる群から選択される工程を含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方は、試料中に含まれていることが疑われる標的物質の物理的検出、化学反応、生化学反応、細胞の溶解、生物もしくは生物の一部からの分子の抽出、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される処理を施される、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
物理的検出は、分光学的、光化学的、測光学的、蛍光分析的、放射線学的、電気的、音響学的、電気化学的、比色分析的、干渉分析的、回折分析的、および熱力学的な検出からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
化学反応は、化学合成、化学分解、酵素的合成、酵素的分解、化学修飾、酵素的修飾、結合分子との相互作用、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
酵素的合成は、タンパク質合成、核酸合成、ペプチド合成、薬剤化合物の合成、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
試料は、土壌試料、大気試料、環境試料、細胞培養試料、骨髄試料、降雨試料、放射性降下物試料、宇宙空間試料、大気圏外試料、下水試料、地下水試料、剥離試料、考古学的試料、食物試料、血液試料、血清試料、血漿試料、尿試料、糞便試料、精液試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、鼻咽頭洗浄試料、痰試料、口腔スワブ試料、咽頭スワブ試料、鼻腔スワブ試料、気管支肺胞洗浄試料、気管支分泌物試料、乳汁試料、羊水試料、生検試料、爪試料、毛髪試料、皮膚試料、がん試料、腫瘍試料、組織試料、細胞試料、細胞溶解物試料、ウイルス培養試料、法医学的試料、感染症試料、院内感染症試料、生産物試料、薬物調製物試料、生体分子生産物試料、タンパク質調製物試料、脂質調製物試料、炭水化物調製物試料、ヌクレオチドの溶液、ポリヌクレオチドの溶液、核酸の溶液、ペプチドの溶液、ポリペプチドの溶液、アミノ酸の溶液、タンパク質の溶液、合成ポリマーの溶液、生化学的組成物の溶液、有機化学的組成物の溶液、無機化学的組成物の溶液、脂質の溶液、炭水化物の溶液、コンビナトリアルケミストリーの生成物の溶液、薬物候補分子の溶液、薬物分子の溶液、薬物代謝産物の溶液、細胞の懸濁物、ウイルスの懸濁物、微生物の懸濁物、金属の懸濁物、金属合金の懸濁物、金属イオンの溶液、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
内側相と外側相、および少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子を含んでなる、流体小滴であって、
外側相は内側相とは混和しないことと、外側相は内側相を取り囲んでいることと、
内側相は外側相によって環境から遮蔽されていることと、
磁気的に誘引性の粒子は、生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方に含まれていることが疑われる標的物質に結合することができるリガンドを含んでいることと
を特徴とする流体小滴。
【請求項３８】
流体小滴の外側相は薄膜として内側相を取り囲んでいる、請求項３７に記載の流体小滴。
【請求項３９】
流体小滴の内側相の流体は液体である、請求項３７または請求項３８に記載の流体小滴。
【請求項４０】
流体小滴の内側相の流体は液体であり、かつ流体小滴の外側相の流体は液体である、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の流体小滴。
【請求項４１】
流体小滴の内側相は極性の液体であり、かつ流体小滴の外側相は無極性の液体である、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の流体小滴。
【請求項４２】
流体小滴の内側相は親水性の液体であり、流体小滴の外側相は疎水性の液体である、請求項４１に記載の流体小滴。
【請求項４３】
内側相の流体は、水、酸化ジュウテリウム、酸化トリチウム、アルコール、有機酸、無機酸、有機酸のエステル、無機酸のエステル、エーテル、アミン、アミド、ニトリル、ケトン、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、二酸化炭素、ジメチルスルホン、ジメチルスルホキシド、チオール、ジスルフィド、および極性のイオン性液体からなる群から選択される、請求項４１に記載の流体小滴。
【請求項４４】
外側相の流体は、鉱油、シリコーンオイル、天然オイル、ペルフルオロ化された炭素の液体、部分的にハロゲン化された炭素の液体、アルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物、二硫化炭素、および無極性のイオン性液体からなる群から選択される、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の流体小滴。
【請求項４５】
少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子は、反磁性の粒子、強磁性の粒子、常磁性の粒子、および超常磁性の粒子からなる群から選択される、請求項３７〜４４のいずれか１項に記載の流体小滴。
【請求項４６】
リガンドは、少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子の表面に固定化されている、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の流体小滴。
【請求項４７】
リガンドは、クラウンエーテル、ペプチド、抗体、リポカリンファミリーのポリペプチドをベースとした突然変異タンパク質、アンキリンスカフォールドもしくはクリスタリンスカフォールドをベースとしたタンパク質、アビマー、グルボディ、レクチン、核酸、プロテインＡ、プロテインＧ、酵素、金属原子、カーボンナノチューブ、カーボンナノフォーム、染料、ストレプトアビジン、アミロース、マルトース、セルロース、キチン、細胞外マトリクス、グルタチオン、カルモデュリン、ゼラチン、ポリミキシン、ヘパリン、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、リジン、アルギニン、ベンズアミジン、およびアルモシリケートからなる群から選択される、請求項４６に記載の流体小滴。
【請求項４８】
内側相、外側相および少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子を含んでなる流体小滴を形成する方法であって、前記方法は、
第１の流体を提供する工程と、
第１の流体とは混和しない第２の流体を提供する工程と、
第１の流体と第２の流体とを接触させることにより、内側相と外側相とを備えた流体小滴を形成する工程であって、第１の流体は内側相を形成し、該内側相は外側相を形成する第２の流体に囲まれていることを特徴とする工程と、
少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子を提供する工程と、
少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子を流体小滴の中に配置する工程であって、磁気的に誘引性の粒子は、生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方に含まれていることが疑われる標的物質に結合することができるリガンドを含むことを特徴とする工程と
からなる方法。
【請求項４９】
第１の流体は最初に提供される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
第１の流体および第２の流体が同時に提供される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子が第１の流体中に配置されてから、第１の流体の小滴が第２の流体の中に分注される、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
第１の流体と第２の流体との接触は、第２の流体上に第１の流体の小滴を分注することを含む、請求項４８〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流体小滴中の生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれかを処理する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学、薬学および生物工学の分野におけるデバイスの小型化は、液体の流量を制御しかつ多くの化学反応および生物学的反応の実施を可能にする微少流体デバイスの開発をもたらした。しかしながら、そのようなデバイスは、マイクロセパレータまたはマイクロフィルタのような適切な微小部品の欠如から、従来の汎用化学実験の規模を単一のマイクロチップ上まで縮小することは可能にしていない。更に、そのようなデバイスは混合要件を満たさないことが多い。したがって、オープンウェル型、典型的にはマルチウェル型のプレートは、自動化された混合デバイスおよび洗浄デバイスと組み合わせて使用されることが多い。しかしながら、そのような設計のウェルではさらなる小型化に際しての課題が大きくなり、その主な問題のうちの１つが蒸発である。
【０００３】
小滴の操作は近年、分離し取り扱う体積をピコリットル／フェムトリットル範囲まで下げる可能性があるためにかなりの関心を集めてきた（例えば特許文献１を参照）。いくつかのラボ・オン・チップ（ＬＯＣ）、マイクロ総合分析システム（μＴＡＳ）、および生物学的微小電気機械システム（ＢｉｏＭＥＭＳ）が、表面上の小滴の移動、融合／混合、分割、加熱などのために開発されており、例えば電気的濡れ性制御（ｅｌｅｃｔｒｏｗｅｔｔｉｎｇ−ｏｎ−ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ：ＥＷＯＤ）［非特許文献１］、表面弾性波（ＳＡＷ）［非特許文献２］、誘電泳動［非特許文献３］、および局所的非対称環境［非特許文献４］などである。しかしながら、これらの方法は連続的な生物学的処理を行なうために最も重要な作業、すなわち出発物質または反応生成物のうち少なくともいずれか一方を粗製混合物または複合混合物から分離／精製／単離する能力を欠いている。そのような分離を可能にするために、小滴を用いるシステムの一部として固相を導入する必要がある。
【特許文献１】国際公開公報第２００４／０３０８２０号パンフレット
【非特許文献１】ポラック、Ｍ．Ｇ．（Ｐｏｌｌａｃｋ，Ｍ．Ｇ．）ら、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．（２０００），７７，１７２５−１７２６
【非特許文献２】ウィクスフォース、Ａ．（Ｗｉｘｆｏｒｔｈ，Ａ．）ら、ｍｓｔｎｅｗｓ（２００２），５，４２−４３
【非特許文献３】キャスコイン、Ｐ．Ｒ．Ｃ．（Ｃａｓｃｏｙｎｅ，Ｐ．Ｒ．Ｃ．）ら、Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ（２００４），４，２９９−３０９
【非特許文献４】ダニエル、Ｓ．（Ｄａｎｉｅｌ，Ｓ．）ら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ（２００５），２１，４２４０−４２２８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明は、化学的試料または生物学的試料のうちの少なくともいずれか一方を処理する方法であって、上記に議論した不都合を回避する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１つの態様では、本発明は、生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方を処理する方法を提供する。該方法は流体小滴を提供することを含む。該流体小滴は内側相および外側相を備えている。外側相は内側相とは混和しない。外側相は内側相を取り囲んでいる。内側相は生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方を含む。内側相は外側相によって環境から遮蔽されている。流体小滴は磁気的に誘引性の物質を更に含む。該方法は、少なくとも１つの表面を提供することも含む。該表面は、流体小滴を該表面と接触させた際に流体小滴が元の状態のままであるような、テクスチャと、流体小滴の内側相の流体に対する濡れ性とを有する。該方法は、少なくとも１つの表面の上に流体小滴を配置することをさらに含む。該方法はさらに、流体小滴中の生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方に対して処理を行なうことを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、流体小滴を磁場または電磁場に曝露することにより、少なくとも１つの表面に対する流体小滴の位置を制御することをさらに含む。
【０００６】
さらなる態様では、本発明は流体小滴を提供する。該流体小滴は、内側相と外側相、および少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子を含む。流体小滴の外側相は流体小滴の内側相とは混和しない。流体小滴の外側相は内側相を取り囲んでいる。流体小滴の内側相は外側相によって環境から遮蔽されている。少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子は、生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方に結合することができるリガンドを含む。
【０００７】
さらに別の態様では、本発明は、流体小滴を形成する方法を提供する。流体小滴は、内側相、外側相および少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子を含む。該方法は、第１の流体を提供することと、第１の流体とは混和しない第２の流体を提供することとを含む。該方法は、第１の流体と第２の流体とを接触させることにより内側相と外側相とを備えた流体小滴を形成することをさらに含む。第１の流体は内側相を形成し、該内側相は外側相を形成する第２の流体に囲まれている。該方法は、少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子を提供することをさらに含む。磁気的に誘引性の粒子は、生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方に結合することができるリガンドを含む。該方法は、少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子を流体小滴の中に配置することをさらに含む。
【０００８】
本発明は、詳細な説明を参照し、非限定的な実施例および添付の図面と併せて考慮すれば、一層よく理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方を処理する方法を提供する。該方法は、任意の処理、特に、微小化された規模において流体中で実施可能な処理に適している（以下を参照のこと）。
【００１０】
試料は任意の起原のものであってよい。試料は例えば、限定するものではないが、ヒト、動物、植物、細菌、ウイルス、胞子、菌類、または原生動物由来のものでもよいし、合成物もしくは生物起原の有機もしくは無機物質に由来するものでもよい。従って、限定するものではないが、土壌試料、大気試料、環境試料、細胞培養試料、骨髄試料、降雨試料、放射性降下物試料、下水試料、地下水試料、剥離試料、考古学的試料、食物試料、血液試料、血清試料、血漿試料、尿試料、糞便試料、精液試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、鼻咽頭洗浄試料、痰試料、口腔スワブ試料、咽頭スワブ試料、鼻腔スワブ試料、気管支肺胞洗浄試料、気管支分泌物試料、乳汁試料、羊水試料、生検試料、がん試料、腫瘍試料、組織試料、細胞試料、細胞培養試料、細胞溶解物試料、ウイルス培養試料、爪試料、毛髪試料、皮膚試料、法医学的試料、感染症試料、院内感染症試料、生産物試料、薬物調製物試料、生体分子生産物試料、タンパク質調製物試料、脂質調製物試料、炭水化物調製物試料、宇宙空間試料、大気圏外試料あるいはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される試料のうち任意のものを、本方法で処理可能である。望ましい場合には、それぞれの試料をある程度まで前処理しておいてもよい。説明に役立つ例として、組織試料が、消化、均質化または遠心分離処理されてから本発明のデバイスと共に使用される場合が考えられる。該試料は更に、溶液のような流体の形態で準備されていてもよい。例としては、限定するものではないが、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、ポリペプチド、アミノ酸、タンパク質、合成ポリマー、生化学的組成物、有機化学的組成物、無機化学的組成物、金属、脂質、炭水化物、コンビナトリアルケミストリーの生成物、薬物候補分子、薬物分子、薬物代謝産物、またはこれらの任意の組み合わせの、溶液またはスラリーが挙げられる。さらなる例としては、限定するものではないが、金属の懸濁物、金属合金の懸濁物、および金属イオンの溶液あるいはこれらの任意の組み合わせ、ならびに細胞、ウイルス、微生物、病原体、放射性化合物またはこれらの任意の組み合わせの懸濁物が挙げられる。当然ながら、試料には前述の例の任意の組み合わせも更に含まれうる。
【００１１】
必然ではないが多くの場合、試料は標的物質またはその前駆物質を含むことになるか、あるいは含むことが予想されることになる。そのような実施形態について、いくつかの実例によって説明することとする：標的物質は、例えば試料に添加または包含された細胞または分子であってよく、精製または富化された形態で得られることが望ましい場合もある。別の例として、標的物質は、前駆物質化合物から化学処理により入手可能であることが既知であるかまたは理論的に説明できる化合物であってもよい。この場合、試料は例えばそのような前駆物質化合物の溶液を含みうる。さらなる例として、細胞培養培地に汚染が疑われる場合がある。この場合、汚染物質のタイプを識別するために本発明の方法を使用可能である。
【００１２】
標的物質またはその前駆物質はこのように任意の性質のものであってよい。例としては、限定するものではないが、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、ポリペプチド、アミノ酸、タンパク質、合成ポリマー、生化学的組成物、糖タンパク質、放射性化合物、高分子電解質、ポリカチオン、ポリカタニオン（ｐｏｌｙｃａｔａｎｉｏｎ）、病原体、有機化学的組成物、無機化学的組成物、脂質、炭水化物、コンビナトリアルケミストリーの生成物、薬物候補分子、薬物分子、薬物代謝産物、細胞、ウイルス、微生物またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。標的物質が例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである実施形態では、標的物質は親和性タグを含む場合がある。親和性タグの例には、限定するものではないが、ビオチン、ジニトロフェノールまたはジゴキシゲニンが挙げられる。標的物質がタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである場合、親和性タグのさらなる例として、限定するものではないが、オリゴヒスチジン（ペンタヒスチジンもしくはヘキサヒスチジンのタグなど）、ポリヒスチジン、米国特許出願第２００３／００８３４７４号、米国特許第５，５０６，１２１号または同第６，１０３，４９３号明細書に記載のＳＴＲＥＰ−ＴＡＧＳ（登録商標）のようなストレプトアビジン結合タグ、免疫グロブリンドメイン、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）、カルモデュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ＦＬＡＧペプチド（例えば配列Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙのもの）、Ｔ７エピトープ（Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄの配列Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ＡｓｐのＨＳＶエピトープ、配列Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓの水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エピトープ、配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａのヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープ、および配列Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕの転写因子ｃ−ｍｙｃの「ｍｙｃ」エピトープが挙げられる。標的物質が核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである場合、親和性タグは更にオリゴヌクレオチドタグであってもよい。そのようなオリゴヌクレオチドタグは、例えば、相補的配列により固定化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるために使用されうる。それぞれの親和性タグは標的物質の内部にあってもよいし、標的物質の任意の部分に取り付けられてもよい。説明に役立つ例として、親和性タグは、前述のタンパク質例のうち任意のもののアミノ末端またはカルボキシ末端に、機能可能なように融合されてもよい。
【００１３】
本発明の方法では、生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方は、液体の小滴のような流体小滴に含まれている。説明に役立つ例として、試料はそのような流体小滴の内側相に含まれる場合がある（以下参照）。試料は任意の手段によって流体小滴内に配置可能である（以下参照）。
【００１４】
本発明の方法は流体小滴を提供することを含む。さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載されるような流体小滴に関するものでもある。下記において明らかになるように、本明細書に記載されるような流体小滴は、自己組織化する仮想反応チャンバとして機能する。流体小滴は任意の所望の体積のものであってよい。流体小滴は例えば、約１ｐｌ〜約１ｍｌの範囲の体積、約０．１ｎｌ〜約５００μｌの範囲の体積、あるいは約１００ｎｌ〜１００μｌの範囲の体積を有することができる。１ｍｌを越える体積の小滴を空気中で取り扱うには、一部の実施形態では、小滴の環境をさらに適合させる必要がある。この点に関して、当業者は、体積の大きい（例えば２ｍｌなどの）小滴を使用する場合、それぞれの小滴が表面と接触する際に分割してより小さな小滴になるかもしれないことに気づくであろう。本発明の方法を実行する際にそのような分割が望ましくない場合、選択された流体の小滴に適した体積を実験的に容易に決定することができる。
【００１５】
流体小滴は磁気的に誘引性の物質を含む。典型的には、流体小滴の１相のみ、すなわち流体小滴の外側相または内側相のいずれかが、磁気的に誘引性の物質を含有する。説明に役立つ例として、一部の実施形態では、強磁性流体のような磁性流体が流体小滴に含められる場合がある。強磁性流体は、例えば、サブドメインの磁気的に誘引性の粒子が液体担体中にコロイド懸濁液となっている形態で、Ｆｅｒｒｏｔｅｃ（米国ニューハンプシャー州ナシュア所在）から市販されている。それぞれの強磁性流体は、例えば無極性の液体をベースとして流体小滴の外側相を形成してもよい。この場合、内側相は例えば水性溶液である。説明に役立つさらなる例として、鉄含有性の細菌が流体小滴の相に含められる場合がある。多くの細菌種が、該細菌の代謝に必要であるため鉄を含んでいる。髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）および淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）を含む数多くが、例えばトランスフェリンまたはラクトフェリンのうち少なくともいずれかの鉄取り込みシステムを有している。そのような細菌は、ある一定の実施形態においてのみ、本発明の方法での使用に十分な鉄を含みうる。他の細菌は鉄を還元または酸化し、よって多くの鉄を含有する。説明に役立つ（嫌気性）鉄還元細菌の例は、ゲオバクター・メタリレデューセンス（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）である。この細菌は一般に、液体小滴の内側相であれ外側相であれ、水相に含めることができる。例えば流体小滴の外側相が無極性の液体であるように選択される場合、上記細菌は一般に、それぞれの流体小滴の内側相に含められることになろう（下記も参照）。それぞれの細菌は、例えば組換え発現技術によって、例えば標的物質を誘引することができる表面タンパク質を含むこともできる。
【００１６】
説明に役立つさらに別の例として、磁気的に誘引性の粒子が流体小滴に含められる場合もある。そのような粒子は標的物質を誘引することができてもよい。一部の実施形態では、該磁性粒子は、標的物質に対する特異的親和性で官能化されて、標的物質を捕捉し、従って結合手段として作用することができる（以下を参照）。
【００１７】
便宜的に、磁気的に誘引性の粒子を本明細書では「磁性粒子」または「磁性ビーズ」と呼ぶ。磁性粒子は、反磁性、強磁性、常磁性、または超常磁性の物質を含みうる。超常磁性物質は、誘起磁場を伴って磁場に応答するが永久磁化は生じない。酸化鉄をベースとする磁性粒子は、例えば、Ｄｙｎａｌ  ＢｉｏｔｅｃｈからＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）として、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃから磁性マイクロビーズ（ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ）として、ＣＰＧ  Ｉｎｃ．から磁性多孔質ガラスビーズとして、ならびに様々な他の供給元、例えばごく少数を挙げればＲｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＢＩＯＣＬＯＮ、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．、ｍｉｃｒｏｍｏｄ、ＡＭＢＩＯＮ、Ｍｅｒｃｋ、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、またはＮｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．などから市販されている。超常磁性のＣｏおよびＦｅＣｏをベースとした磁性ナノ粒子、ならびに強磁性のＣｏナノ結晶については、例えばヒュッテン、Ａ．（Ｈｕｅｔｔｅｎ，Ａ）ら（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００４），１１２，４７−６３）によって説明されている。
【００１８】
磁性ビーズは、化学吸着（例えば共有結合）または物理吸着（例えば静電引力）によって標的物質を誘引する機能を果たすように設計されてもよい。そのような実施形態で使用される磁性粒子は、タンパク質、ペプチド、核酸および他の化合物を例えば吸着／脱着することを可能にするある種の物質に対する親和性を備えた表面を、提供することができる。例としては、限定するものではないが、物理的手段、例えば、πスタッキング、双極子−双極子、誘導双極子−双極子、ファンデルワールス、反対電荷、またはＨ結合形成による誘引、例えば、抗体と抗原との結合引力、および標的物質への結合活性を有するリガンドと標的との間（例えば、リガンドと金属との間）で形成される親和性引力が挙げられる。説明に役立つ２つのさらなる例として、物理化学的結合（例えば、金とチオールとの間の物理化学的結合）、または、幾何学的手段（例えばサイズ排除）を利用することもできる。同一またはいくつかの磁性粒子の異なる領域が、標的物質を誘引または「捕捉」するように設計されてもよい。
【００１９】
いくつかの実施形態では、磁性粒子は、生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方に含まれていることが疑われるかまたは知られている標的物質に結合することができるリガンドを含んでいる。そのようなリガンドは一部の実施形態において、そのような標的物質、例えば、限定するものではないが、イオン、ポリイオン、金属、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質（該タンパク質の合成アナログを含む）、細菌細胞、胞子、ウイルス、低分子量の有機分子、あるいは無機化合物に、選択的に結合することができる。それぞれのリガンドを、少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子の表面に固定化することができる。図５は、磁性粒子上に固定化されたリガンドに結合している標的物質の例を概略的に示している。この標的物質は、細胞表面マーカー（例えばＣＤ４５／１５）を担持している白血球である。磁性粒子は、γ−Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４およびポリメチルメタクリレート・グラフト型ポリスチロールを含み、該磁性粒子上に固定化されているのは、細胞表面マーカーに対する抗体（例えば抗ＣＤ４５／１５）である。図１５は、標識された標的物質（蛍光抗体）の磁性粒子への結合を示している。
【００２０】
それぞれのリガンドは例えば炭化水素系（重合体を含む）であってよく、また窒素基、リン基、硫黄基、カーベン（ｃａｒｂｅｎ）基、ハロゲン基または擬ハロゲン基を含むことができる。リガンドは、アルコール、有機酸、無機酸、アミン、ホスフィン、チオール、ジスルフィド、アルカン、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、単糖類、オリゴ糖類、または多糖類であってよい。さらなる例として、リガンドはまた、カチオン、アニオン、ポリカチオン、ポリアニオン、ポリカチオン、電解質、多価電解質、カーボンナノチューブ、カーボンナノフォーム、シリカ粒子、ガラス粒子、またはアルモシリケート（ａｌｕｍｏｓｉｌｉｃａｔｅ）であってもよい。一般に、そのようなリガンドは標的物質に対してその他の物質に対するよりも高い親和性を有する。それぞれのリガンドの例には、限定するものではないが、クラウンエーテル、抗体、抗体フラグメントおよび抗体様の機能を備えたタンパク質性の結合分子が挙げられる。（組換え）抗体フラグメントの例は、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディまたはドメイン抗体（ホールト、ＬＪ（Ｈｏｌｔ，ＬＪ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（１１），２００３，４８４−４９０）である。抗体様の機能を備えたタンパク質性の結合分子の一例は、リポカリンファミリーのポリペプチドをベースとした突然変異タンパク質である。例えば、ベステ（Ｂｅｓｔｅ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，１９９９，１８９８−１９０３および国際公開公報第９９／１６８７３号、同第００／７５３０８号、同第０３／０２９４７１号、同第０３／０２９４６２号、同第０３／０２９４６３号、同第２００５／０１９２５４号、同第２００５／０１９２５５号あるいは同第２００５／０１９２５６号パンフレットを参照されたい。これらの参照文献に記載のリポカリン、例えばビリン結合タンパク質、ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ヒトのアポリポタンパク質Ｄ、ヒトの涙リポカリン、またはグリコデリンなどは、ハプテンとして知られる選択された小さなタンパク質領域と結合するように修飾可能な、天然のリガンド結合部位を有している。さらなるタンパク性結合分子の別の非限定的な例は、いわゆるグルボディ（ｇｌｕｂｏｄｙ）（国際公開公報第９６／２３８７９号パンフレットを参照）、アンキリンスカフォールド（Ｈｒｙｎｉｅｗｉｃｚ−Ｊａｎｋｏｗｓｋａ，Ａら，Ｆｏｌｉａ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｂｉｏｌ．４０，２００２，２３９−２４９）もしくはクリスタリンスカフォールド（国際公開公報第０１／０４１４４号パンフレット）をベースとしたタンパク質、Ｓｋｅｒｒａ，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１３，２０００，１６７−１８７に記載のタンパク質、およびアビマーである。アビマー（ａｖｉｍｅｒ）は、いくつかの細胞表面受容体において連なった多重ドメインとして生じるいわゆるＡドメインを含んでいる（シルバマン、Ｊ．（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｊ）ら、（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，１５５６−１５６１）。適切なリガンドのさらなる例に��、限定するものではないが、分子インプリント構造物、細胞外マトリクス、レクチン、プロテインＡ、プロテインＧ、金属、金属イオン、ニトリロトリ酢酸誘導体（ＮＴＡ）、ＲＧＤモチーフ、デキストラン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、多価電解質、レドックス重合体、糖タンパク質、アプタマー、酵素、染料、ストレプトアビジン、アミロース、マルトース、セルロース、キチン、グルタチオン、カルモデュリン、ゼラチン、ポリミキシン、ヘパリン、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、リジン、アルギニン、ベンズアミジン、ポリＵ、あるいはオリゴｄＴが挙げられる。コンカナバリンＡのようなレクチンは多糖類およびグリコシル化タンパク質に結合することが知られている。説明に役立つ染料の例は、Ｃｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ  Ｆ３Ｇ−Ａ（ＣＢ）またはＲｅｄ  ＨＥ−３Ｂのようなトリアジン染料であり、該染料はＮＡＤＨ依存性の酵素に特異的に結合する。Ｇｒｅｅｎ  Ａは、ＣｏＡタンパク質、ヒト血清アルブミンおよびデヒドロゲナーゼに結合する。染料である７−アミノアクチノマイシンＤおよび４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールはＤＮＡに結合する。Ｎｉ、Ｃｄ、Ｚｎ、Ｃｏ、またはＣｕのような金属のカチオンは、典型的には、親和性タグ、例えば、ヘキサヒスチジンタグまたはＨｉｓ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓタグ（ＭＡＴタグ）のようなオリゴヒスチジン含有配列、ヘキサペプチドのＨｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ（カドミウムに結合）、およびＮ−メタクリロイル−（Ｌ）−システインメチルエステルとの結合のために使用される。さらに、磁性粒子は、標的物質の任意もしくは一定の形態、種類などに対する該支持体の親和性をさらに増大させる改質剤でコーティングされてもよい。
【００２１】
いくつかの実施形態では、標的物質は、（所望されない）他の物質の中に存在することが疑われるかまたは知られている分子であって、前記他の物質から抽出される必要がある。生物、生物の一部または胚からの分子の抽出は、例えば、所望の分子を生物またはその一部から流体中へと移行しやすくする化合物の使用を含む。生物の一部からの分子の抽出について説明に役立つ例は、細胞膜中に（全体的または部分的に）組み込まれたタンパク質の抽出である。そのようなタンパク質は、さらに処理するために水溶液中に移行させることが望ましいことが多い。そのようなタンパク質の水溶液中への移行を促進する化合物は、界面活性剤である。それぞれの細胞膜を、界面活性剤を添加した水溶液と接触させると、一般に膜タンパク質が抽出されることになる。
【００２２】
磁性粒子が使用される場合、該磁性粒子は同時に標的物質の担体として作用してもよいし、あるいはその代替例として、該磁性粒子自体がセンサ技術におけるタグまたは増幅器として作用してもよい。例としては、限定するものではないが、巨大磁気抵抗（ＧＭＲ）［Ｃｈｉｒｉａｃ，Ｈら、（２００５）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｇｎｅｔｉｓｍ  ａｎｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，２９３，６７１−６７６］、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、増強表面プラズモン共鳴（ｅＳＰＲ）、および二次元キャピラリー電気泳動法が挙げられる。説明に役立つ例として、標的物質は、本発明による流体小滴中の様々な磁性粒子上に固定化されたリガンドと結合可能なものであってよい。固定相に結合したものであれ、溶液中であれ、その他の場合であれ、さらなる親和性リガンドを用いて、標的物質を、該標的物質に結合した磁性粒子とともに分離することができる。磁性粒子が磁場に曝露される場合、磁性粒子は双極場を生じる。この双極場は双極子センサによって検出することができる。センサのインピーダンスの振幅を定量することによって、標的物質の量を定量することができる。
【００２３】
流体小滴はさらに内側相と外側相とを備えている。外側相は内側相を取り囲んでいる。いくつかの実施形態では、外側相は内側相を収容するバルク相である。他の実施形態では、外側相は薄膜として内側相を取り囲んでいる。外側相の流体は液体でも気体でもよい。内側相の流体は典型的には液体である。
【００２４】
外側相が薄膜である実施形態では、外側相の体積は一般に、内側相の体積の数分の１の大きさから数倍の大きさの範囲にある。内側相の外側相に対する体積比は、例えば約１０００：１〜約１：１０００の範囲、例えば約１０：１〜約１：１０の範囲で選択されうる。例として、室温で一つ以上の液体小滴を用いる適用については、内側相の外側相に対する体積比を高く、例えば比率を約１０００：１として選択することが望ましい場合がある。約１００℃の範囲で一つ以上の液体小滴を用いる適用については、内側相の外側相に対する体積比を低く、例えば比率を約１：１０００として選択することが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、更にそれぞれの薄膜が均一の厚さである。他の実施形態では、薄膜は錐体のような不規則な変化を含んでいる。不規則に変化するそれぞれの境界面は、例えば、水と、オクチル置換ヘキサフルオロホスフェートのような一部のイオン性液体との間の境界面に関して知られている。
【００２５】
外側相は内側相とは混和しない。典型的には、外側相の流体は内側相の流体とは混和しない。流体が、（ａ）他方の相と混和せず、その結果２つの別個の相が生じうるとともに、（ｂ）該流体が所望の処理の実施を妨げないかぎり、任意の流体をそれぞれの相に使用することができる。説明に役立つ２つの不混和性気体の例は、ヘリウムと二酸化炭素であり、これらの気体は、温度が該二成分混合物の臨界点未満で圧力が純粋な液体二酸化炭素の蒸気圧より上である限り、一般に広範な組成範囲にわたって混和しない２つの相を形成する。処理は、典型的には内側相において行われる（以下も参照のこと）。したがって、選択される流体は任意の特性のものであってよい。相が液体または気体であるように選択される場合、その相は例えばそれぞれ極性または無極性の液体または気体であってよい。液体は、溶解度および他の液体との混和性のような特性を表すために極性および無極性の液体に分類される。極性の液体は一般に、電子密度が不均等に分布した分子を含んでいる。同じ分類は気体にも適用されうる。分子の極性はその比誘電率またはその双極子モーメントによって反映される。極性分子は一般に、プロトン性分子およびプロトン性でない（または非プロトン性）分子にさらに分類される。したがって、極性プロトン性分子を非常に多く含んでいる流体（例えば液体）は、極性プロトン性流体と呼ぶことができる。極性非プロトン性分子を非常に多く含んでいる流体（例えば液体）は、極性非プロトン性流体と呼ぶことができる。プロトン性分子は、該分子が例えば水またはアルコール中に溶解されると酸性水素になりうる水素原子を含んでいる。非プロトン性分子はそのような水素原子を含んでいない。
【００２６】
無極性の液体の例には、限定するものではないが、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、四塩化炭素、二硫化炭素、ジオキサン、ジエチルエーテル、またはジイソプロピルエーテルが挙げられる。二極性の非プロトン性液体の例は、メチルエチルケトン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、エチレングリコールモノブチルエーテル、ピリジン、メチルイソブチルケトン、アセトン、シクロヘキサノン、酢酸エチル、イソ酪酸イソブチル、ジ酢酸エチレングリコール、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ニトロメタン、アセトニトリル、Ｎ−メチルピロリドン、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、およびジメチルスルホキシドである。極性のプロトン性液体の例は、水、メタノール、イソプロパノール、第三ブチルアルコール、ギ酸、塩酸、硫酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、ジメチルアルシン酸［（ＣＨ３）２ＡｓＯ（ＯＨ）］、アセトニトリル、フェノールまたはクロロフェノールである。イオン性液体は一般に、有機カチオンおよび有機または無機のいずれかのアニオンを有する。イオン性液体（例については以下を参照）の極性は、大部分は関連するアニオンによって決まることが知られている。例えばハロゲン化物、擬ハロゲン化物、ＢＦ４−、硫酸メチル、ＮＯ３−、またはＣｌＯ４−は極性の液体であり、ヘキサフルオロホスフェート、ＡｓＦ６−、ビス（ペルフルオロアルキル）イミド、および［Ｃ４Ｆ６ＳＯ３］−は無極性の液体である。各々の相が２以上の流体を含むこともできる。例えば、２以上の液体が内側相または外側相に使用される場合、選択される液体混合物は小滴のそれぞれの他方の相と分離した相を形成することが依然として可能であり、該２以上の液体は一般に選択された比率において互いに混和性である。説明に役立つ例として、アンモニア（極性の気体）は水（極性の液体）に容易に溶けるので、これらの２つの流体は共通の相に含めることができる。
【００２７】
不混和性の２つの相は、例えば、親水性の液体（以下参照）のような極性の流体が一方の相について選択され、疎水性の液体のような無極性の流体が他方の相について選択される場合に得られる。説明に役立つ例として、無極性の気体である二酸化炭素（ＣＯ２）は、極性の液体である水には溶けない（極微量を除く）。しかしながら、一定の状況下、例えば加圧下では、二酸化炭素は水に溶解する場合もある（例えば炭酸飲料）。いくつかの実施形態では、内側相の流体が極性の液体で、流体小滴の外側相の流体が無極性の液体であってもよい。適切な極性の液体には、限定するものではないが、水、酸化ジュウテリウム、酸化トリチウム、アルコール、有機酸（その塩を含む）、無機酸（その塩を含む）、有機酸のエステル、無機酸のエステル、エーテル、アミン（その塩を含む）、アミド、ニトリル、ケトン、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、二酸化炭素、ジメチルスルホン、ジメチルスルホキシド、チオール、ジスルフィド、および極性のイオン性液体が挙げられる。適切な無極性の液体には、限定するものではないが、鉱油、シリコーンオイル、天然オイル、ペルフルオロ化された炭素の液体、部分的にハロゲン化（例えばフッ素化）された炭素の液体、アルカン、アルケン、アルキン、シクロアルカン、芳香族化合物、二硫化炭素、および無極性のイオン性液体が挙げられる。
【００２８】
説明に役立つ例として、流体小滴の内側相の流体が親水性の液体で、流体小滴の外側相の流体が疎水性の液体である場合がある。親水性の（「水を好む」）液体は、親油性（「脂肪を好む」）とも呼ばれ、水分子とともに双極子−双極子相互作用を形成して水中に溶けることができる分子を含んでいる。親水性の（「水を嫌う」）液体は、疎油性とも呼ばれ、水から分離する傾向がある。親水性の液体の例には、限定するものではないが、水、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、テトラヒドロフラン、ピリジン、クロロホルム、エチレングリコールモノブチルエーテル、ピリジン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ギ酸、ホルムアミド、および極性のイオン性液体が挙げられる。極性のイオン性液体の例には、限定するものではないが、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、Ｎ−ブチル−４−メチルピリジニウムテトラフルオロボレート、１，３−ジアルキルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１，３−ジアルキルイミダゾリウムヘキサフルオロボレート、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムビス（ペンタフルオロエチル）ホスフィネート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラキス（３，５−ビス（トリフルオロメチルフェニル）ボレート、テトラブチルアンモニウムビス（トリフルオロメチル）イミド、エチル−３−メチルイミダゾリウムトリフルオロメタンスルホネート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムメチルスルフェート、１−ｎ−ブチル−３−メチルイミダゾリウム（［ｂｍｉｍ］）オクチルスルフェート、および１−ｎ−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレートが挙げられる。無極性の液体の例には、限定するものではないが、鉱油、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、二硫化炭素、ジオキサン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチルプロピルケトン、メチルイソアミルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、イソ酪酸イソブチル、ジ酢酸エチレングリコール、および無極性のイオン性液体が挙げられる。無極性のイオン性液体の例には、限定するものではないが、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムビス［（トリフルオロメチル）−スルホニル］アミドビス（トリフリル）アミド、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムビス［（トリフルオロメチル）−スルホニル］アミド・トリフルオロアセテート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムビス−（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムビス［オキサラト（２−）］ボレート、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムトリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスフェート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート、トリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスフェート、トリヘキシル−（テトラデシル）ホスホニウム、Ｎ”−エチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルグアニジニウム、１−ブチル−１−メチルピロリジニウムトリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスフェート、１−ブチル−１−メチルピロリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミドおよび１−ｎ−ブチル−３−メチルイミダゾリウムが挙げられる。
【００２９】
流体小滴の相は、さらなる物質を、例えばその相の中に溶解、乳化、または懸濁させた状態で含んでいてもよい。説明に役立つ例として、水相が使用される場合、該水相は１以上のバッファー化合物を含んでいてもよい。数多くのバッファー化合物が当分野で使用されており、本明細書に記載の様々な処理を行なうために使用することができる。バッファーの例としては、限定するものではないが、リン酸塩、炭酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、バルビツール酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、フタル酸塩、マレイン酸塩、カコジル酸塩、ホウ酸塩、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノ−エタンスルホン酸塩（（ＡＣＥＳ）とも呼ばれる）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳとも呼ばれる）の塩、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳとも呼ばれる）の塩、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳとも呼ばれる）の塩、（２−［トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ］−１−エタンスルホン酸（ＴＥＳとも呼ばれる）の塩、２−シクロヘキシルアミノ−エタンスルホン酸（ＣＨＥＳとも呼ばれる）の塩ならびにＮ−（２−アセトアミド）−イミノジアセテート（ＡＤＡとも呼ばれる）の溶液が挙げられる。これらの塩においては任意の対イオンを使用することができ；アンモニウム、ナトリウムおよびカリウムを説明に役立つ例として挙げることができる。バッファーのさらなる例としては、限定するものではないがいくつかを挙げれば、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、エチルアミン、トリエチルアミン、グリシン、グリシルグリシン、ヒスチジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳとも呼ばれる）、ビス−（２−ヒドロキシエチル）−イミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン（ＢＩＳ−ＴＲＩＳとも呼ばれる）、ならびにＮ−［トリス（ヒドロキシメチル）−メチル］−グリシン（ＴＲＩＣＩＮＥとも呼ばれる）が含まれる。バッファーは、そのようなバッファー化合物の水溶液でもよいし適切な極性有機溶媒中の溶液でもよい。説明に役立つ例として、バッファーが固体形態で、例えば凍結乾燥された形態で配されてもよい。そのような場合、該固体バッファー（例えば粉末）は、融合または混合のうち少なくともいずれかにより、例えば超音波による支援または実施のもとに、水相中に溶解されてもよい。そのような場合、使用されるそれぞれの水相の体積は、例えば、所望の最終的なバッファー濃度が得られるように用いることができる。
【００３０】
流体小滴の相に含まれる物質のさらなる例としては、限定するものではないが、化学的処理もしくは生物学的処理を実行するための試薬、触媒および反応物が挙げられる。説明に役立つ例として、細胞またはタンパク質を元の状態に維持するために塩類、支持体または界面活性剤が添加される場合がある。説明に役立つ別の例として、例えば生物を極微量の他の有毒な塩から保護するため、あるいは化学反応の収率を増大させるために、キレート化合物が必要な場合がある。説明に役立つさらなる例として、タンパク質、ＲＮＡまたはＤＮＡを完全な状態で維持するために、プロテアーゼ、ＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅの阻害剤が添加される場合がある。流体小滴の相に添加される可能性のある、さらに別の例としては、磁気的に誘引性の粒子が挙げられる（上記参照）。
【００３１】
流体小滴の内側相は外側相によって環境から遮蔽される。このように外側相は、例えば障壁として、または密封材として作用することができる。用語「環境」とは、任意の流体または固体の物質、例えば（任意の所望の密度もしくは圧力の）気体、または液体であって、内側相、外側相、または流体小滴が配置される表面の一部ではないものを指す。説明に役立つ例として、外側相は、内側相が周囲の空気中へと蒸発するのを防止または低減することができる。さらなる例として、外側相は、接触または拡散などの点で障壁を提供することができる。外側相は、例えば砂または塵の粒子のような固体物質との接触、あるいは流体小滴の内側相と混和可能と思われる流体との接触を防止することができる。小滴の外側相は、ある波長の電磁放射のようなエネルギーを内側相に到達させることもできる。外側相は、流体小滴が配置される表面を、流体小滴の内側相の成分による汚染から防御する際に役立つ場合もある。更に、外側相は、体液（例えば血液、痰など）のような試料の、無極性の表面（例えばＰＴＦＥ）上での移動を可能にすることもある。いくつかの実施形態では、外側相はまた、流体小滴が全体としては非無菌条件下で取り扱われるか非無菌状態に曝露される場合でも、内側相の無菌性を維持することが可能である。外側相はさらに、同様の極性（例えば同様の疎水性）を有する２つの相を備えた別の流体小滴との接触および融合を可能にすることもできる。一例として、外側相が疎水性の液体で、内側相が親水性の液体である場合に、外側相は、別の流体小滴の親水性の外側相であってかつ親水性の内側相を取り囲む外側相と、融合することができるかもしれない。そのような場合、この２つの典型的な小滴は自発的に融合するかもしれない。
【００３２】
流体小滴は任意の手段によって提供されうる。流体小滴の形成には、内側相の流体を提供すること、外側相の流体を提供すること、および試料を提供することが含まれる。本発明において使用されるように、２つの相を備えた流体小滴は自己組織化システムであり、その形成は表面エネルギーによって駆動される。従って、内側相もしくは外側相、または試料は、最初に提供されてもよいし、第２工程または最終工程で提供されてもよい。別例として、内側相、外側相、または試料のうち任意の１つ以上（または一部）が同時に提供されてもよい。説明に役立つ例として、流体小滴の形成には、第１の流体を提供することと、第１の流体とは混和しない第２の流体を提供することとが含まれる。流体小滴の形成にはさらに、第２の流体上に第１の流体の一定分量（例えば小滴）を分注することによって、第２の流体に囲まれた第１の流体の流体小滴を１つ以上形成し、その結果として内側相と外側相とを備えた１つ以上の流体小滴を形成することが含まれうる。一部の実施形態では、流体小滴の形成には、前記第１の流体の小滴またはその一部分を、外側相を形成している第２の流体の中から回収することをさらに含みうる。この場合、薄膜として内側相を囲んでいる外側相を備えた小滴が形成されうる。一部の実施形態では、第１の流体の流体小滴が第２の流体中で形成されることにより、当初は大きな小滴が形成される可能性がある。これらの実施形態では、その後、この当初の大きな小滴から数個の小さな小滴を回収することができる。流体小滴が自己組織化システムであることから、一般に、最初の量をそれぞれに分割するために追加の手段は必要ない。
【００３３】
この点で、本発明は、上記に定義されるような流体小滴を形成する方法にも関する。該方法は、先に述べたように流体小滴を形成すること、すなわち、互いに混和しない２つの流体を提供し、第１の流体および第２の流体を接触させることによって、第１の流体が第２の流体に囲まれた流体小滴を形成すること（上述）を含む。該方法の１つの実施形態では、第１および第２の流体を接触させることは、第１の流体の小滴を第２の流体の中へ分注することを含んでいる。いくつかの実施形態では、該方法はさらに、第２の流体から第１の流体の小滴を回収することによって、内側相および外側相を備え、外側相が薄膜として内側相を囲んでいる流体小滴を形成することを含みうる。上記第１の流体は内側相を形成し、第２の流体は外側相を形成する。該方法は、標的物質に結合可能なリガンドを含んだ少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子（上述）を提供することをさらに含んでいる。該方法はさらに、少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子を、流体小滴の内側相を形成する第１の流体中に配置することを含んでいる。上記に示すように、流体小滴は自己組織化システムであるため、少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子はこの方法の任意の時点で第１または第２の流体中に配置されうる。例えば、磁性粒子が小滴中、例えば第１の流体中に配置されてから、第１の流体の小滴が第２の流体中に分注されてもよい。
【００３４】
上述のように、小滴の内側相は、該小滴が載っているかまたは配置されるように意図されている少なくとも１つの表面に含まれている物質と、直接接触することができる。そのような物質の、説明に役立つ２つの例は、固体表面または流体表面である。少なくとも１つの表面は、流体小滴を該表面と接触させた際に該流体小滴が元の状態を維持するようなテクスチャ（例えば粗さ及びうねり）である限り、いかなる形状および幾何構造を有していてもよい。説明に役立つ例として、表面と接触する流体小滴が元の状態を維持するのを可能にするのに十分低い、流体小滴内側相の流体に対する粗さを備えた表面を提供することが、一般に必要とされるであろう。用語「元の状態」とは、２つの相を備えた定義どおりの小滴が存在することを指す。従って流体小滴は、該流体小滴が例えば所望の範囲に塗布されるか、または別の小滴と融合される際に、元の状態を維持するものと理解される。少なくとも１つの表面は、例えば、曲線的な凹形または凸形（図１Ｄおよび１Ｅ参照）でもよいし、これらの組み合わせ（図４Ｃ）でもよい。１つの実施形態では、少なくとも１つの表面はほぼ平面である（例えば図１Ａ−１Ｃを参照）。別の実施形態では、少なくとも１つの表面は円筒の形態を有し、その表面に沿って小滴が回転することができる。
【００３５】
本発明の方法は、例えば上述のような少なくとも１つの表面を提供することを含んでいる。いくつかの実施形態では、２以上の表面、例えば２つ、３つ、４つなどの表面が提供される。１つの実施形態では、少なくとも２つの表面が互いに向かい合っている。表面は、流体小滴が該表面と接触しても元の状態を維持するような、流体小滴の内側相の流体に対する濡れ性を有する限り、任意の材料のものであってよい。２以上の表面、例えば互いに向かい合っている２つの表面が提供される１つの実施形態では、それぞれの表面は全て、流体小滴が該表面と接触しても元の状態を維持するようなテクスチャおよび内側相の流体に対する濡れ性を有している。
【００３６】
例えば、流体小滴の内側相が水性の流体のような極性液体である場合、少なくとも１つの表面は無極性であってよい。１つの実施形態では、流体小滴の内側相は水性の流体（例えば水）であり、少なくとも１つの表面は無極性である。いくつかの実施形態においてそれぞれの無極性表面は、シリコーン（表面が修飾されたシリコーンを含む）、プラスチックなどのポリマー（バイオポリマーまたは合成ポリマー、例えば部分的にフッ素化されたポリマー、ペルフルオロ化されたポリマー、および表面が修飾されたポリマーを含む）、表面が修飾されたシリコン酸化物、表面が修飾されたシリコン水素化物、表面が修飾された紙、表面が修飾されたガラス（例えば表面が修飾されたパイレックスガラス）、表面が修飾された石英、表面が修飾された雲母（ｇｌｉｍｍｅｒ）、表面が修飾された金属、表面が修飾された合金、表面が修飾された金属酸化物、表面が修飾されたセラミック、ならびにこれらの任意の複合材からなる群から選択可能である。説明に役立つさらなる例として、流体小滴の内側相は親水性で、少なくとも１つの表面は疎水性または疎油性であってよい。説明に役立つさらに別の例として、流体小滴の内側相は無極性で、少なくとも１つの表面は極性であってもよい。
【００３７】
表面の修飾は、典型的には固体表面の特性を変更するために為される処置によって得られる。そのような処置には、物理的手段、例えば機械的、熱的、もしくは電気的手段、化学的手段、または電気化学的手段のような、様々な手段が含まれうる。一例として、プラスチック材料の表面を、希硫酸、クロム酸、過マンガン酸カリウム溶液、または希硝酸を用いた処置によって親水性にすることができる。別の例として、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）表面を、酸素もしくは空気プラズマを用いた酸化によって親水性にすることもできる。キム（Ｋｉｍ）ら（２００３  ＥＣＩ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈｅａｔ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  Ｆｏｕｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｅａｎｉｎｇ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［２００３］，Ｖｏｌ．ＲＰｌ，１０７−１１４）が述べたように、ポリメチルメタクリレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンテレフタレートおよびポリカーボネートのような疎水性ポリマーの表面を、反応性気体の存在下でのイオン照射によって親水性にすることもできる。シリコンはＨ２Ｏ／Ｈ２Ｏ２／ＮＨ４ＯＨに浸漬することにより親水性にすることができる。更に、任意の疎水性表面の表面特性を、親水性の自己集合型単分子層、親水性ポリマーで被覆することにより、または界面活性剤処理もしくはポリマー前駆物質によるプラズマ処理により、親水性を高めることができる。
【００３８】
本発明による方法を、分析法もしくは調製法（下記も参照）のような別の方法と組み合わせることになっている場合、そのような追加の方法および本発明による方法の両方を実施することを可能にする、または実施するのに有利な表面を提供することが望ましいかもしれない。そのような追加の方法を実施する際、またはその前に、流体小滴の２つの相の完全性が影響を受けるかまたは低下する場合がある。その結果、流体小滴の内側相の中にある物質が、もう一方の流体相に曝露され、かつ表面と接触する可能性がある。本発明において使用される流体小滴に適した様々な内側相および外側相を利用できることにより、コーティングなどの化学的表面処理の選択に融通性を与えることができる。したがって、本発明の方法およびその後の方法の両方において同じ表面を使用できることが多い。
【００３９】
説明に役立つ例として、例えば本発明において使用される流体小滴中に含まれるにせよ含まれないにせよ、例えば磁性粒子を対象として、電気泳動分離または等電点電気泳動を実施することが望ましいかもしれない。例えば、選択された方法によって検出可能な存在するあらゆる物質との相互作用が最小限である表面を提供することが望ましいかもしれない。例えば、電磁場を適用して単離タンパク質の純度を分析すること（電気泳動法など）が望まれる場合、分析結果はタンパク質と著しく相互作用する表面によって歪められる可能性がある。タンパク質相互作用が最小の適切な表面コーティング剤に関する、説明に役立つ２つの例は、極性ポリマーであるポリ−Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミドおよびポリ（エチレングリコール）を終端とする終了したアルキルトリクロロシランである。同様に、等電点電気泳動に使用されるデバイスの表面の特性が、収束過程および移動過程の両方において狭い分離ゾーンを得る効率に影響することが知られている。等電点電気泳動においてｐＨ勾配を使用して高度な分離を達成するために使用可能な表面処理の例には、限定するものではないが、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、またはフルオロカーボンによるコーティングのような、極性の高いポリマーによるコーティングが挙げられる。
【００４０】
化学的表面処理の例には、限定するものではないが、ヘキサメチルジシラザン、２−ヒドロキシ−４−（３−トリエトキシ−シリルプロポキシ）ジフェニルケトン、３−トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物、２−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］トリメトキシシラン、（ヘプタデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロデシル）トリエトキシシラン、（トリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチル）トリエトキシシラン、（ヘプタデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロデシル）トリクロロシラン、（トリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチル）トリクロロシラン、メタクロイルオキシメチルトリス（トリメチルシロキシ）シラン、ＰｌｕｓＯｎｅ（登録商標）Ｒｅｐｅｌ−Ｓｉｌａｎｅ  ＥＳ（オクタメチルシクロオクタシランに溶解されたジメチルジクロロシランの２％溶液、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＳＩＧＭＡＣｏｔｅ（登録商標）（ヘプタン中の塩素化有機ポリシロキサン）、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、オクタデシルシラン、オクタデシルトリメトキシシラン、エポキシプロポキシプロピルトリメトキシシラン、２−（ジフェニルホスフィノ）エチルトリエトキシシラン、ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピル−トリエトキシシラン、アミノブチルトリエトキシシラン、（３−アクリルオキシプロピル）トリメトキシシラン、トリメチルクロロシラン、ジメチルジクロロシラン、プロピルトリクロロシラン、テトラエトキシシラン、グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、３−（２，３−エポキシプロポキシル）プロピルトリメトキシシラン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、γ−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、ポリ（メタクリル酸メチル）もしくはポリメタクリレートコポリマー、ウレタン、ポリウレタン、フルオロポリアクリレート、テフロン（登録商標）ＡＦ１６００、２４００および２２００、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリ（メトキシポリエチレングリコールメタクリレート）、ポリ（ジメチルアクリルアミド）、ポリＮ−アクロイル−アミノエトキシエタノール（ＡＡＥＥ）、ベンゾフェノンおよびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）−Ｆ−６８がグラフトされたポリアクリルアミド（リ（Ｌｉ）ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２００５，２６，１８００−１８０６）、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］（ＰＨＰＭＡ）、α−ホスホリルコリン−ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ウンデシル  オリゴＤＭＡＡｍ−オリゴ−ＳＴｂｌｏｃｋコオリゴマー（例えばマツダ、Ｔ（Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔ）ら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，（２００３），２４，４５１７−４５２７）、ポリ（３，４−エポキシ−１−ブテン）、３，４−エポキシ−シクロヘキシルメチルメタクリレート、２，２−ビス［４−（２，３−エポキシプロポキシ）フェニル］プロパン、３，４−エポキシ−シクロヘキシルメチルアクリレート、（３’，４’−エポキシシクロヘキシルメチル）−３，４−エポキシシクロヘキシルカルボキシレート、ジ−（３，４−エポキシシクロヘキシルメチル）アジペート、ＵＣＯＮ（米国コネティカット州ノーウォーク所在のＡｎａｌａｂｓ）のような、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのコポリマー、ビスフェノールＡ（２，２−ビス−（ｐ−（２，３−エポキシプロポキシ）フェニル）プロパン）、２，３−エポキシ−１−プロパノール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、デキストラン、ドデシルジメチル（３−スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド（Ｃ１２Ｎ３ＳＯ３）のような界面活性剤、ヘキサデシルジメチル（３−スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド（Ｃ１６Ｎ３ＳＯ３）、ならびにココ（アミドプロピル）ヒドロキシルジメチルスルホベタイン（ＲＣＯＮＨ（ＣＨ２）３Ｎ＋（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＳＯ３−、Ｒ＝Ｃ８−Ｃ１８）、例えばＳｕｐｅｌｃｏａｔ  ＰＳ２（米国ペンシルベニア州ベルフォンテ所在のＳｕｐｅｌｃｏ）のようなポリマー界面活性剤など、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、あるいはヒドロキシプロピルメチルセルロース、に曝露すること、または前記物質と反応させることが挙げられる。ポリマーを用いたコーティングは、例えば、化学蒸着によって、あるいは米国特許出願第２００５／０２４９８８２号明細書に開示されているような、二官能性試薬に表面を曝露した後の表面上での重合作用によって、実行することができる。後者の場合、表面とポリマーコーティング剤との間に安定な共有結合が生じる。例えば、表面に起伏があるか、マイクロ腔もしくはナノ腔が含まれる実施形態において、この技術を選択することが望ましいかもしれない。
【００４１】
更に、少なくとも１つの表面は、様々な表面特性の領域を提供してもよい。極性（例えば、親水性）の液体である流体小滴内側相の上記の例において、表面の一部の領域が例えば他の領域よりも低極性（例えば、疎水性）であってもよいし、一部の領域がより高極性（例えば、親水性）であってもよい。説明に役立つ例として、高極性の表面領域は、ハイブリダイゼーション用のＤＮＡアレイ上に小滴を拡げるために必要とされる場合がある。少なくとも１つの表面の任意の部分について、個別の極性または無極性の表面特性を提供するように処置することもできる。例えば、固体表面を個々に処置することができる。
【００４２】
液体のような流体に対する表面の濡れ性を定義する通常の方法は、一般に平滑かつ均質で、典型的には空気のような気体に囲まれている水平面上での、熱平衡状態における該流体の小滴との間の接触角（濡れ角とも呼ばれる）である。この点で、当業者は、表面の粗さが増大すると一般的には接触角が増大するという事実に気づくであろう。
【００４３】
表面および流体の種類によって、小滴は図１に例証するように様々な形状を有しうる。図１はさらに、図中の流体小滴の内側相のそれぞれの接触角θを示している。この接触角は一般に、対象とするそれぞれの相（例えば本発明で使用される流体小滴の内側相および外側相）ごとに個々に測定される（以下参照）。いくつかの実施形態では、内側相と外側相とを備えた流体小滴に対する表面の濡れ性を、特に外側相がバルク相である場合に、同じ方法で測定できるかもしれない。しかしながら、各相の接触角を別々に測定するほうが便利である。接触角θは、小滴の界面と水平面との間の角度によって与えられる。そのような接触角θは、用いた表面の界面張力に依存する熱力学的変数である。接触角は、小滴内の分子が相互に誘引することによる力と、該小滴の分子が表面の分子に対し誘引または反発することによる力とのバランスを反映している。
【００４４】
最も一般に用いられている接触角の測定技術は、図１に示すような内側相に類似した単一相の構成における、いわゆる静滴法もしくは液滴法である。測定には通常、接触角がプラトーに達するまで流体小滴を連続的に追加することを伴う。それぞれのプラトーでの値は前進接触角と呼ばれる。この点であまり意味がないと見なされるその上の値は、いわゆる後退接触角である。後退接触角は、等体積の流体小滴を該小滴から連続的に引っ込めながら接触角を直ちに連続的にモニターすることで、前進接触角の実験を継続することによって得られる。接触角を測定する別の手段には、ウィルヘルミプレート法、キャプティブエアバブル（Ｃａｐｔｉｖｅ  Ａｉｒ  Ｂｕｂｂｌｅ）法、毛管上昇法、および液滴滑落法（Ｔｉｌｔｅｄ−ｄｒｏｐ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）が挙げられる。
【００４５】
接触角θがゼロであれば濡れ性であり、接触角θが約０〜約９０、特に約４５度未満の範囲の値であれば一般に流体小滴が拡がる。接触角θが約９０より大きければ、該流体は固体表面から離れてビーズ状になるか縮まる傾向にあることを示している（例えば図１Ｃ参照）。既に上記に示したように、接触角は一般に単一相の流体について測定される。従って、流体小滴の内側相および外側相の接触角は、一般的には別々に測定される。いくつかの実施形態では、本発明で使用される少なくとも１つの表面は、流体小滴の内側相の流体に対して、それぞれの流体から成る単一相の流体小滴が該表面上に配置された時に約５０度以上の前進接触角θを特徴とすることができるような濡れ性を有するものである。したがって、該表面の濡れ性は、上記に定義された流体小滴の内側相で構成される流体小滴の界面における、少なくとも１つの表面との前進接触角θが、約５０度以上であることによって特徴づけられる。いくつかの実施形態では、本発明で使用される少なくとも１つの表面は、流体小滴の外側相の流体に対して、外側相の流体のみで構成される流体小滴がそれぞれの流体小滴の界面において少なくとも１つの表面とともに約５０度以上の前進接触角θをなすことによって特徴づけられるような濡れ性を有するものである。いくつかの実施形態では、本発明で使用される少なくとも１つの表面は、流体小滴全体に対して、前記流体小滴の界面における少なくとも１つの表面との前進接触角θが約５０度以上であることによって特徴づけられるような低い濡れ性を有するものである。
【００４６】
いくつかの実施形態では、表面（例えば固体表面）はさらに、流体小滴の内側相または外側相の流体に対して不活性である。そのような実施形態は、デバイスを何度も再使用することを可能にする。ほとんどの侵食性媒体に対して不活性な材料の、説明に役立つ例は、フルオロエチレンプロピレン（ＦＥＰ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＦＴＥ、テフロン（登録商標））、エチレン−テトラフルオロエチレン（ＥＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン−ペルフルオロ−メチルビニルエーテル（ＭＦＡ）、ビニリデンフルオリド−ヘキサフルオロプロピレンコポリマー、テトラフルオロエチレン−ヘキサフルオロプロピレンコポリマー、ビニリデンフルオリド−ヘキサフルオロプロピレン−テトラフルオロエチレンターポリマー、ペルフルオロメチルビニルエーテル−テトラフルオロエチレンコポリマー、ペルフルオロアルコキシコポリマー（ＰＦＡ）、ポリ（ビニルフルオリド）、ポリクロロトリフルオロエチレン、フルオロシリコーン、またはフルオロホスファゼンのようなフルオロポリマーである。
【００４７】
加えて、特にそれぞれの相が液相である場合には、流体小滴の内側相または外側相は、イオン性または非イオン性の界面活性剤、例えばペルフルオロカーボン系界面活性剤を含んでもよい。一般に界面活性剤は、適用可能な場合、接触線領域近傍の固体と液体および液体と液体および液体と蒸気の境界面に主として吸着する。説明に役立つ例として、流体小滴の内側相に含まれた試料と表面との非特異的相互作用を低減するために界面活性剤を使用することが望ましい場合がある。半ば親水性で半ば親油性である多数の界面活性剤が当分野で使用されており、例えばアルキルベンゼンスルホネート、アルキルフェノキシポリエトキシエタノール、アルキルグルコシド、第二級および第三級アミンであって例えばジエタノールアミン、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）１００およびトリエタノールアミン、または例えばＺＯＮＹＬ（登録商標）ＦＳＯ−１００（ＤｕＰｏｎｔ）のようなフッ素系界面活性剤である。
【００４８】
本発明の方法は、少なくとも１つの表面上に流体小滴を配置することも含んでいる。流体小滴は任意の手段で配置可能である。一例として、ディスペンサが提供されてもよい。ディスペンサは、所望の大きさの流体小滴を提供かつ配置するために任意の適切なデバイスもしくは機構を使用するものでよい。例としては、限定するものではないが、圧電気式ピペッタ、シリンジポンプ式ピペッタ、蠕動ポンプ、タッチオフ式分注、圧力式分注、インクジェット式分注（シリンジソレノイド式分注を含む）、ピン転写が挙げられる（総説としてＲｏｓｅ，Ｄ、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ（１９９９），４，４１１−４１９を参照のこと）。流体小滴の配置はまた、該流体小滴中に含まれる磁気的に誘引性の物質の特性に依存する場合もあるし、該特性に支援される場合もある。従って、磁場、電磁場、電場または静電場が使用されてもよい。説明に役立つ例として、磁場、電磁場または電場の影響下で、例えば誘電泳動によってキャピラリーからマグネット・プラグが注入されてもよい。一実施形態においては、ディスペンサの使用により、表面には触れないようにして流体小滴が該表面上に配置されうる。さらに別の実施形態では、流体小滴は、接触式分注により表面上に直接分注されることもある。望ましい場合は、例えば米国特許出願第２００３／０２０９５６０号明細書に開示されるようなカメラで分注量が計測されてもよい。
【００４９】
図７、１６および１８は、本発明で使用されるような、表面上の流体小滴の実例を示している。表面は、該表面上に流体小滴を分注する前、分注時または分注後に、地面に対して任意の方向を向いていてよい。ほぼ平坦な表面が提供され、流体小滴が空気のような気体中で取り扱われる実施形態においては、それぞれの表面の上面に流体小滴を配置することが便宜上望ましいかもしれない。同様に、そのような場合において、特に流体小滴の位置を磁場によって決定しその後磁場を終了することが望ましい場合、流体小滴の位置制御を支援するためにそれぞれの表面をほぼ水平位に維持することが望ましいかもしれない。そのような場合には、流体小滴は一般に、図３Ａおよび図３Ｂに示すようにそれぞれの表面の下方または上方で取り扱われる。凹形または凸形の表面が提供され、流体小滴が空気のような気体中で取り扱われる実施形態では、便宜上例えば、重力作用の方向に対してくぼみの最頂位置または底位置に流体小滴を配置することが望ましいかもしれない。
【００５０】
本発明の方法は典型的にはそれ以上の機械部品を必要としないので、本発明は頑健な微少流体システムを利用している。本発明の方法は典型的にはバルブが必要ないので、死容積も生じない。従って、本発明の方法は、ナノリットルスケール以下（上記）のサンプル体積を、物質の損失を伴わずに処理するのに十分適している。
【００５１】
典型的には、本発明の方法は、流体小滴の位置を、特に少なくとも１つの表面に対して制御することを含んでいる。この位置は、例えば凹形表面（図１Ｅ参照）のような幾何学的手段によって制御可能である。流体小滴の位置を制御する別の手段には機械力が挙げられる。そのような機械力は例えば、流体小滴を、別の表面、例えばピペットチップの表面と接触させることにより加えることができる。流体小滴の位置を制御するさらなる手段には、Ｇｕｔｔｅｎｂｅｒｇ，Ｚ．ら、Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ（２００５）５，３０８−３１７に開示されるような音響波の適用がある。流体小滴の位置を制御するさらに別の手段には、例えば少なくとも１つの表面の、温度勾配の適用が含まれる。それぞれの温度勾配は、例えばＩＲレーザによって得ることができる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの表面に対する前記流体小滴の位置を制御する本発明の方法は、流体小滴を磁場または電磁場に曝露することをさらに含んでいる。これにより磁性粒子に力が作用し、小滴全体が磁性粒子のいかなる動きにも従うことを強いられるようになる。その結果として流体小滴の位置を制御することができる。いくつかの実施形態では均一磁場または均一電磁場が適用されるが、他の実施形態では、磁場または電磁場は本発明の方法の間に変更される。いくつかの実施形態では、流体小滴の位置制御には、表面を、例えば均一磁場または均一電磁場の下で移動させることを含んでいる。その結果として、該表面に対する流体小滴の位置を変更することができる。いくつかの実施形態では、流体小滴の位置を制御するいくつかの手段が組み合わされる場合もある（さらなる例については以下も参照のこと）。いくつかの実施形態では、流体小滴が磁場または電磁場によってひとたび位置決定されたら処理が行われるだけである。これらの実施形態のうちの１つでは、流体小滴が所望の位置に配置された後で磁場または電磁場が打ち切られる。説明に役立つ例として、少なくとも１つの表面の領域は、温度の変化、磁場（の変化）、電場（静電場を含む）（の変化）、電磁場（の変化）、圧力の変化、波長（の変化）、周波数（の変化）、振幅（の変化）、化学物質濃度（の変化）、および化学組成（気体流量など）（の変化）のような条件に曝露されるかもしれない。そのような場合、流体小滴の位置制御は、少なくとも１つの表面の、この条件に曝露されている領域内へと流体小滴を移動させることを含みうる。
【００５３】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、電場／磁場に小滴を曝露することは、小滴を反発することを含んでいる。上記およびその他の実施形態では、電場／磁場に小滴を曝露することは、小滴を誘引することを含んでいる。磁場または電場によって小滴を誘引または反発することは、例えば棒磁石、電磁石、アレイ状の棒磁石もしくは電磁石、またはこれらの任意の組み合わせを用いて達成される。１つ以上の流体小滴を移動させるために、個々の磁石を移動させてもよい。アレイの１以上の磁石の誘引力または反発力を、流体小滴の位置を制御するために変更することもできる。
【００５４】
上記に定義されるような少なくとも２つの表面が提供されるいくつかの実施形態では、流体小滴が１つの表面から別の表面へと移されて、該表面の間で移動されてもよい。そのような実施形態では、流体小滴の位置制御は、磁場または電磁場を用いて２つの表面の間で流体小滴を移動させることを含みうる。
【００５５】
本発明の方法は、流体小滴中の生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれかに処理を施すことをさらに含んでいる。流体小滴中で行なうことができる任意の処理を施すことが可能である。実施可能な処理の例には、限定するものではないが、試料に含まれることが疑われるかまたは既知である標的物質の物理的検出、化学反応、細胞の溶解、生物もしくは生物の一部からの分子の抽出、生物からの分子の放出、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。物理的検出の例には、限定するものではないが、分光学的、光化学的、測光学的、蛍光分析的、放射線学的、音響学的、電気化学的、比色分析的、回折分析的、干渉分析的、偏光解析的、および熱力学的な検出があり、また例えば光活性標識、蛍光標識、放射性標識もしくは酵素標識の使用が含まれる。分光学的方法の説明に役立つ２つの例は、ラマン顕微鏡法および干渉性反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡法である。後者の技術は、例えば対象とする特定の分子を選択的に画像化するのに適している。化学反応の例には、限定するものではないが、化学合成、化学分解、酵素的合成、酵素的分解、化学修飾、酵素的修飾、結合分子との相互作用、ならびにこれらの任意の組み合わせが挙げられる。酵素的合成の例には、限定するものではないが、タンパク質合成、核酸合成、ペプチド合成、薬剤化合物の合成、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。本発明の方法は例えば、任意の生化学的変換またはアッセイ方式、例えば酵母ツーハイブリッドシステム、小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランスフェクション、ライゲーションなどと併用可能である。
【００５６】
処理の実施には、エネルギー、例えば、開始または触媒すべき処理のためのエネルギーへの曝露が含まれうる。適用されうるエネルギーの例には、限定するものではないが、赤外線照射、マイクロ波照射または光分解のエネルギーが挙げられる。説明に役立つ例として、流体小滴を備えた表面は、薄膜型の冷却器／加熱器上に置かれたバイオチップであってもよい。従って、温度上昇によって駆動されるかまたは温度低下を必要とする化学合成は、例えば小滴の環境の温度をそれぞれ調節することにより行なわれる。別の例として、４〜１００℃に温度制御された生化学反応を行なうこともできる。したがって、温度感受性の生体試料を、例えば保存することもできる。さらなる例には、限定するものではないが、細胞の単離（図９参照）、細胞のインキュベーション、細胞の溶解（図６）、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応（図１０、１２）、およびパイロシーケンシング（図１３）が挙げられる。パイロシーケンシングはリアルタイムの核酸塩基配列決定技術であり、核酸重合反応の際に放出されるピロホスフェートの検出に基づくものである（概説としては例えばＲｏｎａｇｈｉ，Ｍ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００１），１１，３−１１を参照のこと）。更に、種々の光学検出系、例えばフォトダイオード（ＰＤ）、光電子増倍管（ＰＭＴ）、光子計数モジュール（ＰＣＭ）、分光計、および電荷結合素子（ＣＣＤ）を実装することにより、これらの生化学反応を並列かつリアルタイムでモニターすることが可能となる。
【００５７】
説明に役立つ例として、病原体、細菌、ウイルスまたはＤＮＡ配列を、本発明を使用して疾病状態の識別のために検出することもできる。検出可能な疾病には、限定するものではないが、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、Ａ型、Ｂ型およびＣ型肝炎、ＨＩＶ／エイズ、デング熱、豚コレラ、口蹄疫、トリインフルエンザ、炭疽、サルモネラ、マラリア、ポリオ、結核およびインフルエンザのような感染症；出生前に（例えば染色体異常の検出により）検出可能な先天的な状態、例えば鎌状赤血球貧血、心房中隔欠損症のような心奇形、大動脈弁上狭窄、心筋症、ダウン症候群、内反足、多指症、合指症、指の萎縮、裂手症および裂足症などが挙げられる。本方法はまた、がんの検出およびスクリーニング、例えばＤＮＡタグを用いた動物の血統の識別、または血中の物質の検出および分析（例えばドーピング）に適している。
【００５８】
他の実施形態では、本発明の方法は、医薬品のような１つ以上の薬剤化合物の、検出、反応（生細胞またはその一部分との結合反応を含む）、合成あるいはこれらの任意の組み合わせのために使用されてもよい。薬剤化合物のような化合物の合成は、例えば誘導体化されたビーズ上での固相反応として実施可能である。薬剤化合物は、例えばライブラリの形式で使用されてもよい。そのようなライブラリの例は、モデル化合物として化学合成された様々な有機小分子、または数多くの配列バリアントを含んでいる核酸分子の集合物である。一例として、そのようなライブラリの各化合物が１つの小滴中に配置されてもよい。そのような小滴は、当業者によく知られた市販の機械によって自動で提供されうる。本発明の方法は、例えば薬物スクリーニングに、または尿試料もしくは血液試料中に存在する薬物の測定に使用されうる。
【００５９】
さらなる例として、細胞培養培地に汚染が疑われる場合がある（上述）。この場合、汚染物質の種類を識別し、この目的のために本発明のデバイスを使用することが望ましい場合がある。そのような実施形態において、磁気的に誘引性の物質は、例えば、該汚染物質との親和性、または該汚染物質との親和性を有する他の物質との親和性を備えたリガンドを担持している磁気的に誘引性の粒子であってよい。
【００６０】
試料中の副産物または望ましくない物質のような物質を除去することが望ましい実施形態では、処理は洗浄処理または洗浄工程を含む処理であってもよい。処理はまた、流体小滴を少なくとも２つの娘流体小滴へと分割することを含んでもよい。説明に役立つ例として、核酸が細胞から抽出されて、磁性粒子に付着したリガンドと結合される一方で、細胞残屑および試薬が廃棄される場合がある。図４Ａは、別の追加の流体小滴を用いて流体小滴を洗浄する工程の例を示している。この別の流体小滴も、２以上の流体相を含んでいてよい。この流体小滴は、２つの相と磁性物質と試料とを含んでいる流体小滴と同じ表面上に提供されてもよいし、別の表面上に提供されてもよい（図４Ｂ）。該流体小滴に向かって、２つの相と磁性物質と試料とを含んでいる流体小滴が移動される（図４Ａ（Ｉ））。図４Ａの矢印は、永久磁石の現在位置を示している。２つの流体小滴が融合し（図４Ａ（２））、１つの大きな流体小滴を形成する（図４Ａ（３））。完全な混合および洗浄を確実にするために、例えば流体小滴全体を上昇させることなく小滴内の磁性粒子を持ち上げるのに十分な弱い磁力を加えてもよい。一方の側に磁性粒子をさらに移動させることによって（図４Ａ（４））、小滴の分割が開始される（図４Ａ（５））。磁性粒子／外側相の比率、反応する流体小滴の体積比率、流体小滴の生化学的組成、表面の形態、表面の化学的性質、および（電）磁場の傾斜の強さは、対応する流体小滴が移動するか、融合するか、「洗浄」されるか、分割するかに影響する。これらの操作中、死容積はゼロである、すなわち、ナノリットルの体積が処理されても物質は失われない。望ましい場合には、さらなる機能ユニット、例えば混合を支援または達成するための圧電アクチュエータを、本発明の方法に容易に実装することもできる。
【００６１】
小滴の内側相は、任意の流体（例えば溶剤、酸または塩基）が（ａ）内側相をほぼ元の状態に維持すること、および（ｂ）磁性粒子の磁石への誘引性を維持することを可能にする限り、該流体を用いて洗浄または交換することが可能である（例えば図１８参照）。外側相が内側相を取り囲む薄膜を形成する実施形態（上述）においては、外側相が薄膜としての状態を損なわないように維持することが更に望ましいかもしれない。標的物質を結合するために、磁性粒子に付着したリガンドが使用される実施形態では、そのような流体は、リガンドが元の状態のままでありかつ所望の標的物質に結合することを可能にするものであることが更に望ましいかもしれない。処理を実施する前、実施中または実施後の任意の時点で、流体小滴の混合は、例えば流体小滴を超音波に曝露することにより実行されうる。小滴は自己組織化システムに基づいているので、そのような混合は小滴の完全性には影響せず、むしろ小滴内の相の内部に物質を均等に分布させるのを支援する。
【００６２】
洗浄のような、物質の移行を実施可能であることにより、複雑な処理の実施が可能となる。所望の標的物質を、磁性粒子上に固定化されたリガンドに結合させることができるので、流体（例えば液体）の添加、除去、交換が実施可能であることから任意の段階または工程において任意の物質（例えばペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、有機小分子、金属イオンなど（上述））の単離が可能となり、かつ複雑な生化学的変換を次々と実行することができる（図４）。更に、流体小滴の体積を数桁の規模で変更することができる。従って、本発明の方法は、技術上の分断を伴わずに巨視的な世界と微視的な世界との間の接点を提供する。
【００６３】
望ましい場合は、ゲル濾過、限外濾過または透析のような当分野で良く知られた技術による体積の縮小によって、試料中の標的物質の濃度を増大させることも可能である。本発明の方法で使用されるような小さい体積を、特に高濃度の標的物質と併用することにより、絶対数の少ない生体分子のバイオセンシングが可能となる。
【００６４】
説明に役立つ更なる非限定的な例として、本発明の方法を使用してサンドイッチ型の酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実行することができる。このアッセイの用途および性能は当業者に良く知られている。結合工程、洗浄工程および検出工程に必要な試薬のうち少なくとも１つ以上をそれぞれ含んでいるいくつかの流体小滴を組み合わせることによって、試料中の標的物質の存在についてアッセイすることが可能である。上述のように、捕捉試薬は磁気ビーズに連結されてもよい。特定の実施形態では、捕捉試薬は、対象とする抗原を標的とする抗体である。より具体的には、該抗体は、ＨＩＶウイルス中、およびこのＨＩＶウイルスを含むことが疑われる血液試料または血清試料の中に存在する抗原を標的とするものでよい。抗原の検出は、比色分析または分光分析のうち少なくともいずれか一方によりモニターすることができる。これは、プローブ上に捕捉された基質の溶出後に行われてもよいし、あるいは溶出工程によらずデバイス自体の中で行われてもよい。
【００６５】
図６は、ポリメラーゼ連鎖反応のための本発明の方法の使用を例示している。温度調節は薄膜型加熱器および温度センサによって達成することができる。モジュール１は、リガンドで修飾された超常磁性粒子のマトリックスを表わす。上記リガンドは、様々な細胞表面マーカーに対する受容体である。このようにして、対象とするいかなる細胞も、体液または組織から上述のように分離することが可能である。ランセットを用いた指穿刺によって、少量のヒト毛細血管全血を得ることができる。この少量の血液をモジュール２上に置く。その後、白血球の細胞表面マーカーと、磁性粒子上に固定化されたリガンドとの結合によって、白血球を単離することができる（上記参照、さらに図５および図７も参照されたい）。図８は、磁性粒子上に固定化されたリガンドに結合した白血球の例を拡大して示している。白血球は、モジュール３の４つの薄膜型加熱器のうちの１つの上で、熱により溶解させることができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、試料を３種の異なる温度域に誘導して時計回りに実施される（図６のモジュール３参照）。図１７は、本発明の方法を使用して測定された温度プロファイルを示す。図１１は、本発明の方法によって得られたＰＣＲ生成物が、当分野で使用される従来法で得られた生成物と品質に差がないことを実証している。時空間の転換を使用することにより、試料の多重化が可能となる。ストレプトアビジンでコーティングされた超常磁性粒子に結合可能な、ビオチン化されたＰＣＲ生成物を生成させることもできる。この増幅生成物を、モジュール４上で化学的に変性させ、パイロシーケンシング（ＰＳＱ）用のシーケンスプライマーとアニーリングさせることが可能であり、パイロシーケンシングは、塩基Ｇ、Ａ、ＴおよびＣを含む４つの異なるＶＲＣを通って試料を移動させることにより、モジュール５上で時計回りに実施することができる。図１３は、それぞれの分析の例を示している。時空間の転換を使用することにより、試料の多重化が可能となる。望ましい場合は、パイロシーケンシングの後で試料を再びマトリックス状としてモジュール６上に保存することができる。別例として、試料をさらに処理することもできる。
【００６６】
流体小滴中の生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方を処理するさらに別の例は、流体小滴の内部の混合である。用語「混合」は、受動的混合（すなわち拡散によるもの）、外部エネルギーもしくは外力の適用などによる能動的混合、ならびにこれらの組み合わせを指す。静止状態または移動中の小滴内での能動的混合は、例えば超常磁性粒子を撹拌することを含んでいてもよい。そのような撹拌は、例えば小滴が曝露されている磁場もしくは電磁場を変化させることにより達成されうる。さらに該撹拌は、それぞれの表面を移動させることで一定の磁場もしくは電磁場における小滴の相対位置を変更すること（上述）により達成される場合もある。能動的混合のさらに別の手段は超音波を利用するものであり、添付の実施例において例証される。
【００６７】
流体小滴中の生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方を処理するさらに別の例は、図１８に示すように、流体小滴を別の流体小滴によって濾過することである。そのような濾過は、典型的には、標的物質が固定化された官能化超常磁性粒子を含んでいる小さな小滴を、より大きな流体小滴を通って移動させることで行なわれる。この方法で、望ましくない成分、例えば副産物、不純物、基質、試薬、溶媒もしくは溶媒成分、塩類、酵素、廃棄物、またはバッファーを、より大きな小滴の中で希釈することができる。大きな小滴の外へと磁性粒子をさらに移動させると、標的物質が固定化されている超常磁性粒子だけが基本的に大きな小滴から取り除かれ、望ましくない物質のほとんどが後に残される。該システムの自己組織化する性質により、外側相またはその一部も同様に大きな小滴から取り出される。薄膜の形態の外側相の場合、外側相の薄い膜が例えば残りの少量の内側相を囲むことができる。このように、磁気ビーズによって固定化されていない物質を流体小滴から十分に取り除くことが可能である（実施例および図２０参照）。根底にある精製作用は、親和性クロマトグラフィで知られる機構に似ており、該機構においては、標的物質が、固定相を形成する官能化されたカラム材料によって保持され、移動相を形成する洗浄溶液で数回すすぎ／洗浄される。親和性クロマトグラフィとは対照的に、本発明の方法では、洗浄溶液が固定相であり、官能化された材料が移動相である。更に注目すべきことは、本発明の方法を使用すると死容積が生じないことである。更に、親和性クロマトグラフィとは対照的に、本発明の方法はナノリットル体積中に標的物質を溶出させることができる。上記の利点は、バイオセンシングのような適用において、例えば高濃度の標的物質がごく小さな体積中に存在する場合、または高速の反応速度論を分析することになっている場合に重大である。
【００６８】
本発明の方法のどの部分も、手作業でも自動化された方法でも実施可能である。化合物、流体および試薬の自動分注、自動インキュベータ、およびプレートリーダなどの高機能蛍光読取り装置は、既に当分野において十分確立されている。一般には、そのような機器を直接本発明の装置と共に使用することができる。必要な場合は、そのような機器または本発明の装置のうちいずれかの特定の用途への適合が、当業者によって容易に行なわれる。
【００６９】
リアルタイム検出から、サイクル数として表現された反応時間に対する蛍光シグナルを示す増幅プロットが提供されうる（図１６を参照）。ベースラインより上の蛍光の増大は、増幅生成物の蓄積の検出を示している。一定の蛍光閾値をベースラインより上に設定する場合、蛍光シグナルはある時点でこの閾値を通過する。時間がサイクル数で表現されるので、いわゆる閾値サイクル数（または値）またはＣｔ値が得られる。この数が小さいほど、増幅プロット中にあるそれぞれの蛍光曲線がより左寄りになり、かつ増幅がより速くなる。この数が大きいほど、増幅が遅くなり、かつ非特異的なバックグラウンドの反応からの識別がしにくくなる。本発明の方法を使用して得られた蛍光シグナルの実例を図１０に示す。
【００７０】
本発明の方法は、例えば表面プラズモン共鳴、共振ミラー、反射測定干渉（ｒｅｆｌｅｃｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）、巨大磁気抵抗、質量分析、楕円偏光法、等電点電気泳動、クロマトグラフィ法、電気クロマトグラフィ、界面動電クロマトグラフィおよび電気泳動法のような分析法および調製法と併用可能である。電気泳動法の例は、例えば無担体電気泳動（ＦＦＥ）、パルスフィールドゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、キャピラリーゾーン電気泳動法またはキャピラリーゲル電気泳動法である。例えば荷電タンパク質による磁性粒子の表面固定化は、電気泳動度を数倍まで変化させることが知られている。そのような方法との併用には共通の工程または共通のデバイスが含まれうる。例として、タンパク質の分離がマイクロチップ上で、例えば等電点電気泳動によって行なわれる場合がある。続いて、対象とする（タンパク質のような）物質を含むことが知られているかまたは疑われている分離媒体（例えば両性電解質の水溶液）の試料を、例えば本発明の流体小滴の内側相として使用することができる。ゲルの分離媒体の場合には、対象とする物質を抽出する必要があるかもしれない。本発明で使用される流体小滴の内側相および外側相に適した流体の種類が豊富であることから、通常は、等電点電気泳動用の表面としての使用に十分適した表面材料の選択が可能である。結果として、望ましい場合には両方の方法について共通の表面を使用することができる。クロマトグラフィ法の例には、例えばゲル濾過、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィまたは疎水性電荷誘導クロマトグラフィ（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｃｈａｒｇｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）がある。説明に役立つ例として、それぞれの分析法または調製法は、本発明の方法を使用した試料の処理の前に行なわれてもよいし、処理後に行なわれてもよい。
【００７１】
本発明が容易に理解され、実践的効果を生むように、ここで特定の実施形態について以下の非限定的な実施例を用いて説明することにする。
【実施例】
【００７２】
小滴の操作
自家製の電磁石アレイであって、両面テープ（３Ｍ）でアナログ式アラーム時計（Ｃｉｔｉｚｅｎ）のハンドルに固定されたＭ１２１９−Ｘネオジム鉄ホウ素系ディスク状永久磁石（Ａｓｓｅｍｔｅｃｈ）（図１８ａ参照）、または静止しているネオジム鉄ホウ素系ディスク状永久磁石（Ｆａｒｎｅｌｌ）に対し相対移動され、操作棒もしくはＬａｂＶＩＥＷ８ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって制御されるＡ  ＰｒｏＳｃａｎＩＩモータ駆動式ステージシステム（Ｐｒｉｏｒ）を、超常磁性粒子を含んでいる流体小滴を操作するために使用した（図１９参照）。
【００７３】
流体小滴には極性の内側液体相および無極性の外側液体相を含めた。内側相は水性で、バッファー、試薬および超常磁性粒子を含むものとした（以下参照）。限外濾過した鉱油（Ｆｌｕｋａ）を、内側相を囲む薄膜の形態の外側相を形成する不混和性液体として使用した。室温（ｒｔ）での適用については、水性の相と不混和性の相との体積比を１０：１としたが、高温を要する適用、例えばパイロシーケンシング（ＰＳＱ）、逆転写（ＲＴ）、細胞の溶解、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）については、体積比を１：５とした。
【００７４】
微少流体の操作には、小滴の融合、混合、洗浄／濾過および分割が含まれた。小滴内の混合は、磁場／電磁場の変化による超常磁性粒子の撹拌を用いて、あるいは超音波による音響学的キャビテーション／ストリーミングによって行った。場合によっては両方の混合技術を組み合わせた。
【００７５】
超音波を発生させるためには、自家製の増幅器を装備した３３２５０Ａ  ８０ＭＨｚの駆動波形発生装置（ｆｕｎｃｔｉｏｎ／ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｗａｖｅｆｏｒｍ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）、およびチタン酸鉛ジルコニウム（ＰＺＴ）ディスク（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）がエポキシ系接着剤（Ａｌｔｅｃｏ）で基材に接着されたものを使用した。実験に応じて様々なｋＨｚ域の波形により迅速で効率的な混合が提供された。ＰＣＲ溶液を除いて、すべての小滴、すなわち血液、官能化した超常磁性粒子、鉱油、キャッピング溶液、洗浄溶液、基質などを実験の初めに表面上に配置し、超常磁性粒子を含んでいる小滴を、これらの小滴と連続的に融合、混合、洗浄／濾過、および分割した。
【００７６】
図１８は、官能化した超常磁性粒子を使用した新鮮なヒト毛細血管全血からの白血球の単離についての次の実施例に関して、移動、融合、洗浄／濾過、および分割を示している（以下参照）。白血球はその細胞膜上にＣＤ１５およびＣＤ４５抗原（細胞表面マーカー）を発現するので、抗ＣＤ１５および抗ＣＤ４５抗体でコーティングした超常磁性粒子を用いた免疫反応によって白血球を選択的に取り出すことができる。図１８Ａ：両面テープ（３Ｍ）でアナログ式アラーム時計（Ｃｉｔｉｚｅｎ）のハンドルに固定されたＭ１２１９−１ネオジム鉄ホウ素系ディスク状永久磁石（Ａｓｓｅｍｔｅｃｈ）を使用して、官能化された超常磁性粒子を含んでいる小滴（１）であって前記磁石の上方のテフロンＡＦ（ＤｕＰｏｎｔ）でコーティングされたスライドガラス（２４×６０ｍｍ、厚さ〜１８０μｍ、ｖｆｍ（ＴＭ）ＣｏｖｅｒＳｌｉｐｓ、ＣｅｌｌＰａｔｈ）上に配置された小滴を、移動、融合、洗浄／濾過、および分割する。より良く視認できるように、以降の図では時計とガラス基板との間に白色の紙を置く。図１８Ｂ：１００ｎｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＣＤ１５およびＣＤ４５（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含んでいる小滴（２６）は、１００ｎｌの新鮮なヒト毛細血管全血を含んでいる小滴（２７）に向かって移動され、融合される（図１８Ｃ、１８Ｄ）。２つの小滴の融合後、この一体化した小滴（２８）は、１０μｌの洗浄溶液（０．０１Ｍ  ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ）を含んでいる小滴（２９）に向かって移動される（図１８Ｅおよび図１８Ｆ）；このインキュベーション工程の間に、官能化された粒子上に白血球が固定化され、それに従って、移動している超常磁性粒子の撹拌が活発な混合を支援する。さらに、この目的のインキュベーション時間を短くするために、超音波による音響学的ストリーミングを使用することができる。注目すべきことは、多くの適用に関して、高い振幅での音響学的キャビテーションは該方法が白血球の破裂／溶解をもたらすので、回避することが望ましいことである。融合（図１８Ｇ）の後、固定化された白血球は洗浄／濾過される。用語「洗浄」／「濾過」は、白血球が固定化された官能化超常磁性粒子を、洗浄溶液を含んだより大きな小滴を通って移動させることを指す（図１８Ｈ、図１８Ｉ）。そのようにすると、固定化された白血球を含む超常磁性粒子だけが、自己組織化による外側相の不混和性液体の薄膜とともに、大きな小滴を通過する（図１８Ｊ）。大きな小滴に含められた他のすべての物質、例えば不純物、例えば赤血球、バッファー、塩類、ＥＤＴＡ（抗凝血剤の役割を果たす）、ヘパリン、ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅなどは、大きな小滴中に残る。赤血球の存在により、洗浄溶液の色が赤くなる（残っている小滴の暗変色を参照）。同時に、大きな小滴を通過する不純物、最終的には白血球が固定化された官能化超常磁性粒子のスラリーの一部は、希釈される。そのため、希釈係数は相互作用する小滴の体積比率に依存し：例えば、白血球が固定化された官能化超常磁性粒子の０．１μｌの小滴が、１０μｌの洗浄溶液によって３回洗浄される場合、スラリー内に残っている不純物は１００万倍に希釈される［（１：１００）３］。その後、白血���が固定化された官能化超常磁性粒子は洗浄溶液（２９）から離れ（図１８Ｊ）、第２の洗浄工程のために別の洗浄溶液（３０）に向かって移動される（図１８Ｋ、図１８Ｌ）。洗浄を増強するために、白血球が固定化された官能化超常磁性粒子を洗浄溶液内で前後に数回移動させ（図１８Ｍ〜図１８Ｕ）、その後洗浄溶液から離れるようにする（図１８Ｖ、図１８Ｗ）。最終的に、精製された白血球は下流の適用（例えばＲＴ−ＰＣＲ）への準備ができている。赤血球（血液の主成分であり、ＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅの混入により下流の適用の妨げとなる）を除去するためのある洗浄溶液の濾過効率を、ノイバウェル（Ｎｅｕｂａｕｅｒ）血球計を使用して赤血球を数えることにより評価したところ（図２０Ａ、図２０Ｂ）、〜１０００００倍であり、すなわち各１０μｌの２つの洗浄溶液の組み合わせにより最大１ｍｌの試料中のすべての赤血球が除去される（１ｍｌの試料中の赤血球の絶対数は５×１０９個である）。
【００７７】
熱管理
自家製作の温度調節モジュールは、白金（Ｐｔ）薄膜型加熱器および温度センサ、ならびに特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）制御装置からなるものとした（図１７参照）。別例として、ＰＣＲ実験（光学的検出なし）は、Ｓｌｉｄｅ  Ｇｒｉｄｄｌｅ（登録商標）アダプタ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を装備したＰＣＴ−２００（登録商標）ペルチェ式サーマルサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で実施した。熱管理の設定は、当分野で使用される他のデバイス、例えばグッテンバーグ、Ｚ．（Ｇｕｔｔｅｎｂｅｒｇ，Ｚ．）ら（上述）によって開示されているものなどと同様である。制御装置／ソフトウェアを備えた市販の注文仕様のＰＣＲチップについて、本発明の方法での使用に適していることが見出された。一部の試験においては、Ａｄｖａｌｙｔｉｘ（ドイツ連邦共和国ブルンサール（Ｂｒｕｎｎｔｈａｌ）所在、ｗｗｗ．ａｄｖａｌｙｔｉｘ．ｃｏｍ）、およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｈｉｇｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｅ．Ｖ．（ドイツ連邦共和国イェーナ（Ｊｅｎａ）所在）のＰＣＲチップを使用した。
【００７８】
光学的検出
蛍光は、Ｘ−Ｃｉｔｅ（登録商標）１２０蛍光照射システム（ＥＸＦＯ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＨＥ３８  ＦＩＴＣフィルタセット（Ｚｅｉｓｓ）、５７８４−２０光電増倍管（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）を装備したＡｘｉｏｔｅｃｈ  ｖａｒｉｏ蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）によって検出し、ＴＤＳ５００５４Ｂデジタルホスファオシロスコープ（Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ）で製造業者の指示に従って記録した。
【００７９】
生物発光の検出については、代わりにＨ７４２１−４０光子計数モジュール（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）を使用した。
表面の修飾
疎水性であると同時に疎油性の表面は、ガラス（Ｓｃｈｏｔｔ）またはシリコン（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｓｅｎｓｅ）の基材を、（ヘプタデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロデシル）トリエトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ）を用いて１５Ｅオーブン（Ｙｉｅｌｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）中にて１５０℃および０．５ｍｂａｒ（５０Ｐａ）で２時間化学蒸着（ＣＶＤ）するか、あるいはガラス、シリコンもしくはポリマーの基材（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）をテフロン（登録商標）ＡＦ（ＤｕＰｏｎｔ）のＦＣ−７０（３Ｍ）中１％溶液でスピンコーティングすることにより得た。ＯＣＡ３０接触角測定器（ＤａｔａＰｙｓｉｓｃｓ）によって測定された、水および鉱油（Ｆｌｕｋａ）との静的接触角は、それぞれ＞１１０°および＞７０°であった。
【００８０】
次の順序の、ヒト全血からの白血球（ＷＢＣ）の単離、ＷＢＣの細胞溶解、ＰＣＲ、およびＰＳＱを、ユーザの介入なしで連続的に実施した（図６）。
白血球の単離
０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）／１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｒｏｔｈ）中に２００μｇ／μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ１５およびＣＤ４５（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の１：１懸濁液０．１μｌを含んでいる小滴を、新鮮なヒト毛細血管全血１５μｌを含んでいる小滴と融合させ、混合し、室温で１０分間インキュベートし、１０μｌの０．０１Ｍ  ＰＢＳ／１％ＢＳＡを含んでいる２つの小滴および１０μｌのＰＣＲ混合物を含んでいる１つの小滴の中で連続的に洗浄した（図７）。超常磁性粒子上に取り付けられた白血球（ＷＢＣ）は、この時点で細胞の溶解に対する準備が完了した。
【００８１】
単離されたＷＢＣの数を数えるために、超常磁性粒子を含んでいる小滴を、０．０１Ｍ  ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中の４％パラホルムアルデヒド（Ｒｏｔｈ）溶液１０μｌを含んでいる小滴と融合させ（以下参照）、混合し（以下参照）、４℃で３０分間インキュベートし、１０μｌの０．０１Ｍ  ＰＢＳ／１％ＢＳＡを含んでいる３つの小滴の中で連続的に洗浄した。ＷＢＣの固定の後、超常磁性粒子を含んでいる小滴を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｖｅｃｔｏｒ）を含むＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）包埋剤１μｌを含んでいる小滴と融合させ、混合し、４℃で一晩インキュベートした。最後に、ＤＡＰＩ染色されたＷＢＣを、グリッドサイズ５００×５００μｍの高解像度プリントされたポリマー箔（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ）で覆い、ＢＸ５１システム顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）に配置し、ＤＰ７０デジタルカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で撮影し、グレースケールに変換し（図８）、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ＿Ｖ６．１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）のソフトウェア支援により計数した（図９）。
【００８２】
細胞の溶解
ＷＢＣの単離の後、超常磁性粒子を含んでいる小滴を、ＰＣＲ混合物１μｌを含んでいる小滴と融合させ、混合し、９５℃で５分間インキュベートした。ＷＢＣを熱で溶解した後、ＰＣＲ混合物を含んでいる小滴から超常磁性粒子を取り除いた。放出されたゲノムＤＮＡはここでＰＣＲの準備が完了していた。
【００８３】
ＰＣＲ
ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を標的として使用したので増幅産物の長さは２０８ｂｐであった（Ｍａｘｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）。ビオチン−ＣＴＣ  ＡＴＴ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＴＡＴ  ＧＡＣ  ＡＡＣ  ＧＡ（配列番号１）およびＧＴＣ  ＴＡＣ  ＡＴＧ  ＧＣＡ  ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＡＧＧ  ＡＧ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｌａｂｓ、配列番号２）を、それぞれ順方向および逆方向プライマーとして使用した。シングルＰＣＲ混合物は、Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｃｏｒｅキット（ＱＩＡＧＥＮ）に基づいて調製して５０μｌのストック溶液とし、組成は以下のとおり、すなわち２３．０μｌのピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ）処理済みＨ２Ｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０．０μｌの５×Ｑ溶液、５．０μｌの５×ＰＣＲバッファー、５．０μｌの１０％ＢＳＡ、１．０μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μｌの１：１００  ＳＹＢＲグリーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、それぞれ２．５０μｌの１０μＭ順方向および逆方向プライマー、および０．５μｌの５ｕ／μｌ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとした。この特定のＰＣＲについては、上述のように単離した〜１４００個のＷＢＣを鋳型として使用した。
【００８４】
熱サイクル条件は以下のとおり、すなわち９５℃で１分、５８℃で１分、７２℃で１分および８０℃で１５秒、を４５サイクルとした。この８０℃区間における蛍光強度の平均値を取り出して、リアルタイムでＰＣＲを観察した（図１０）。融解曲線分析については、試料を１分間で６５℃に冷却し、その後傾きを０．０１Ｋ／ｓとして温度を連続的に上昇させて９５℃とした（図１１）。最後に、ＰＣＲ生成物を、２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してキャピラリー電気泳動によって解析した（図１２）。ＰＣＲの完了後、ビオチン化されたＰＣＲ生成物は、ＰＳＱの準備ができていた。
【００８５】
ＰＳＱ
ＰＳＱについては、消耗品を含む５×９６  ＰＳＱ（登録商標）９６  ＭＡ  Ｐｙｒｏ  Ｇｏｌｄ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（Ｂｉｏｔａｇｅ）を使用した。ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＴＧＴ  ＧＡＧ  ＧＡＧ（配列番号３）がシーケンスプライマーの役割を果たした。２×結合バッファー中に３００μｇ／μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（登録商標）ストレプトアビジン懸濁液１μｌを含んでいる小滴を、ＰＣＲ混合物を含んでいる小滴と融合し（上述）、混合し、６５℃で１５分間インキュベートした。ビオチン化されたＰＣＲ生成物の固定化の後、超常磁性粒子を含む小滴を、１×変性溶液１０μｌを含んでいる小滴と融合させ、混合し、室温で１分間インキュベートし、１×洗浄バッファー１０μｌを含む２つの小滴中で連続的に洗浄した。別例として、２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを９５℃で１分間熱変性させることもできる。ｄｓＤＮＡの変性後、超常磁性粒子を含む小滴を、１×アニーリングバッファー中０．３μＭのシーケンスプライマー溶液１μｌを含んでいる小滴と融合させ、混合し、８０℃で２分間インキュベートし、室温まで冷却した。超常磁性粒子上に取り付けられた１本鎖（ｓｓ）ＤＮＡはこの時点でＰＳＱの準備ができていた。
【００８６】
超常磁性粒子上へのｓｓＤＮＡの固定化を確認するために、超常磁性粒子を含む小滴を５０μｌの１×アニーリングバッファー中に懸濁させ、市販のＰＳＱ（登録商標）９６ＭＡシステム（Ｂｉｏｔａｇｅ）で配列を決定した（図１３）。
【００８７】
最後に、超常磁性粒子を含む小滴を、２．５μｌのｄＧＴＰ溶液を含んでいる小滴と融合させ、混合し、次いで酵素および基質の１：１混合溶液１０μｌを含んでいる小滴と融合させた（図１４）。
【００８８】
タンパク質（緑色蛍光タンパク質）の親和性精製
この実施例は、本発明の方法を使用してどのようにタンパク質を精製することができるかを示す。
【００８９】
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよびストレプトアビジン修飾された磁性アガロースビーズ（ＱＩＡＧＥＮ、４％（ｗ／ｖ）懸濁物相当）を含む水性の内側相１μｌと、限外濾過した鉱油（Ｆｌｕｋａ）の外側相とを含んでいる流体小滴を、該タグ付きアガロースビーズを０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後で調製することができる。上記バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中にビオチン化された組換え緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む粗製細菌溶解物（大腸菌）を１μｌ含んでいる小滴を、磁性アガロースビーズを含んでいる上記小滴と融合させることができる。得られた小滴を、室温で４５分間インキュベートすることができる。その後、該小滴を、１０μｌのバッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）を含んでいる３つの小滴中で連続的に洗浄することができる。得られた１μｌの小滴中の精製ＧＦＰの溶出は、上記バッファー中に１０ｍＭのビオチンを含んでいる２５μｌの小滴と融合させることと、超音波への曝露で混合することにより実施可能であり、その後磁性アガロースビーズを除去した。定量は、例えばレイン（Ｌａｙｎｅ）による２８０ｎｍおよび２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収の比率のような任意の標準的な方法により、対照標準小滴中で例えばブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の呈色反応を行なうことにより、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し続いて染色することにより、あるいは既知濃度のＧＦＰ対照溶液を用いた蛍光検出により、実施することができる。
【００９０】
酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
０．１Ｍの２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ）中のカルボキシ官能化超常磁性粒子の懸濁液１μｌを含んでいる小滴を、０．１ＭのＭＥＳ中の０．２Ｍ  Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ）溶液および０．０２Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（ＡｌｆａＡｅｓａｒ）を１０μｌ含んでいる小滴と融合させ（上述）、混合し、室温で１分間インキュベートし、１０μｌの０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含んでいる１つの小滴中で洗浄した。カルボキシ基を活性化した後、超常磁性粒子を含んでいる小滴を、０．０１ＭのＰＢＳ中１μｇ／μｌ溶液のフルオレセイン（ＦＩＴＣ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（分子全体）（Ｇｔ×Ｍｓ  ＩｇＧ  ＦＩＴＣ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１μｌを含んでいる小滴と融合させ、混合し、室温で１分間インキュベートし、１０μｌの０．０１Ｍ  ＰＢＳを含む１つの小滴中で洗浄した。Ｇｔ×Ｍｓ  ＩｇＧ  ＦＩＴＣとのカップリング後（図１５）、超常磁性粒子を含む小滴を、１０μｌの０．１Ｍ  ２−アミノエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む小滴と融合させ、混合し、室温で１分間インキュベートし、１０μｌの０．０１Ｍ  ＰＢＳ／１％ＢＳＡを含む３つの小滴中で連続的に洗浄した。残りのスクシンイミドエステル基をキャッピングした後、超常磁性粒子を含む小滴を、０．０１Ｍ  ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中１μｇ／μｌ溶液のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ウサギ抗ヤギＩｇＧ  Ｆｃ（Ｒｂｔ×Ｇｔ  ＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）１μｌを含んでいる小滴と融合させ、混合し、室温で１分間インキュベートし、１０μｌの０．０１Ｍ  ＰＢＳ／１％ＢＳＡまたは１０μｌの０．０１Ｍ  ＰＢＳ／０．０５％トゥイーン２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む５つの小滴中で連続的に洗浄した。Ｇｔ×Ｍｓ  ＩｇＧ  ＦＩＴＣおよびＲｂｔ×Ｇｔ  ＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰの免疫反応後に、超常磁性粒子を含む小滴を、ペルオキシダーゼ基質溶液ＡおよびＢ（Ｂｅｔｈｙｌ）の１：１溶液１０μｌを含んでいる小滴と融合させ、混合し、１〜１０分間インキュベートし、分割した（図１６参照）。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】平面（Ａ、Ｂ、Ｃ）、凸面（Ｄ）、および凹面（Ｅ）である表面（５）上の小滴の様々な接触角θを概略的に示す図。小滴は内側相（２）および外側相（３）を含んでいる。
【図２】表面（５）上における接触角θの大きい小滴を側面図（Ａ）および平面図（Ｂ）として示す図。小滴は内側相（２）および外側相（３）を含んでいる。小滴はさらに磁気的に誘引性の粒子（１）も含んでいる。
【図３Ａ】官能化された磁気的に誘引性の粒子（８）を含んでいる、内側相（２）および外側相（３）からなる小滴を示す側面図。表面（５）より下方の小滴の位置は、永久磁石（２０）によって、表面（５）に相対した位置に制御される。
【図３Ｂ】表面（５）の上面の、内側相（２）、外側相（３）および磁気的に誘引性の粒子（８）からなる小滴（６）を示す図。
【図３Ｃ】電磁石（７）上の、図３Ａまたは３Ｂに示すような小滴（６）を示す図。電磁石（７）は、それぞれ上方または下方から見たアレイ状電磁石を構成する部材である。
【図４】小滴（６）の中の試料を第２の小滴（１６）によって洗浄する工程（図１８も参照のこと）を示す平面図（Ａ）ならびに側面図（Ｂ）。側面図（Ｂ）は、表面（５）の下の磁石（２０）を示している。洗浄工程に用いられる第２の小滴は、磁性粒子（１）および内側相（２）および外側相（３）を含んでいる流体小滴が位置している表面（５）とは異なる表面に位置していてもよい（Ｃ）。
【図５】試料からの標的物質の単離を概略的に示す図。表面抗原（１１）を担持している白血球（１０）に、磁気的に誘引性の粒子（１）に接続された抗体（９）が結合する。
【図６】本発明の方法を使用した血液小滴試料の遺伝子分析を示す図。白血球は、小滴中の官能化された磁気的に誘引性の粒子（１）と結合し、単離され、洗浄され、薄膜センサ（１５）によって制御された薄膜型加熱器（１４）によって加熱溶解され、逆転写（ＲＴ）され、続いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびパイロシーケンシング（ＰＳＱ）で処理される。矢印は試料が移動する方向を示す。
【図７】０．１μｌの新鮮なヒト毛細血管全血から開始して、該血液を抗ＣＤ１５およびＣＤ４５で官能化した超常磁性粒子（２１）のスラリーと混合し、室温で１０分間インキュベートする、白血球（ＷＢＣ）の単離を示す図。ＰＢＳ／１％ＢＳＡで２回洗浄した後、ＷＢＣは下流の適用への準備ができている。
【図８】洗浄後の、ＤｙｎａｂｅａｄｓＣＤ１５およびＣＤ４５の上に固定化されたＤＡＰＩ染色済みの白血球（２２）を示す図。
【図９】一滴のヒト血液（黒四角）、および１００ｎｌ（黒丸）から単離された白血球の絶対数（左の縦座標軸）および相対収率（右の縦座標軸）を示す図。１００ｎｌの血液については、単離白血球の相対収率は１０分後において８５％である。
【図１０】リアルタイム検出による小滴中でのＲＴ−ＰＣＲの増幅分析を示す図。
【図１１】得られたＰＣＲ生成物の融解曲線分析を示す図。１つのピーク（ＴＭ＝８７．６℃、ＭＪ  ＲｅｓｅａｒｃｈのＯｐｔｉｃｏｎ２サーモサイクラーを使用して得られた値：ＴＭ＝８４．６℃）が、ＰＣＲ生成物が１つであり副生成物がほとんどないことを示している。
【図１２】増幅されたｃＤＮＡフラグメント（図１０）のキャピラリー電気泳動による同定を示す図。約１４００個の白血球（黒四角）または陰性（鋳型なしの）対照（ＮＴＣ  黒丸、灰色）を伴った１００ｎｌのＣＤ４５／１５、１μｌのＰＣＲ混合物および５μｌの鉱油を使用し、該試料から２０８ｂｐのＰＣＲ生成物が得られた（収率２０．５ｎｇ／μｌ）。１：１５ｂｐのマーカー、２：プライマー二量体、３：６００ｂｐのマーカー。
【図１３】ＰＣＲ生成物（ｃｄｓＤＮＡ＝２０．５ｎｇ／μｌ）の流動相パイロシーケンシングによって得られたパイログラム分析を示す図。
【図１４】本発明の方法を使用して小滴に基づいたパイロシーケンシングによって得られた、最初の３塩基部位のパイログラム分析を示す図。
【図１５】ｍｉｃｒｏｍｅｒ（登録商標）−Ｍ超常磁性粒子（ｍｉｃｒｏｍｏｄ）上に共有結合で連結された、表面に結合したフルオレセイン（ＦＩＴＣ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（分子全体）を示す図。
【図１６】基質溶液Ａ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）およびＢ（過酸化水素）を含んでいる小滴（２３）の無色の溶液が、Ｇｔ×Ｍｓ  ＩｇＧ  ＦＩＴＣ／Ｒｂｔ×Ｇｔ  ＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰでコーティングされた超常磁性粒子と反応した後に暗色に変化する（青みを帯びる／緑色を帯びる、２４）ことを示す図。反応を止めるために、超常磁性粒子（２５）が反応液から取り除かれる。
【図１７】本発明の方法を使用したＰＣＲの際の温度／時間プロファイルを示す図。チップの熱質量が低いので（約０．５ｇ）、迅速な加熱・冷却速度（±２０〜５０Ｋ／ｓ）を実行することができる。
【図１８】流体小滴中の生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方を処理するさらなる例であって、流体小滴を移動させ、流体小滴をさらなる流体小滴と融合させ、該流体小滴の内部を混合し、該流体小滴を別の流体小滴によって洗浄し、流体小滴を娘流体小滴に分割することを含む例を示す図（詳細には実施例参照）。
【図１９】本発明の方法において流体小滴を操作するための、ｘ、ｙ−ステージを使用する装置例を示す図。テープで固定された、テフロンＡＦ（アモルファスのフルオロポリマー）でコーティングしたスライドガラスを、ｘ、ｙ、ｚ−ステージ上に配置された（詳細にはＢ）静止している永久磁石に相対的に移動させる（Ａ）。
【図２０】超常磁性粒子に結合した白血球の最初の洗浄によって得られた洗浄溶液（Ａ）、およびその後のさらなる洗浄によって得られた追加の洗浄溶液（Ｂ）の内容物を示す図。追加の洗浄溶液は赤血球をほとんど含んでいない。単一の小滴により赤血球を除去する洗浄効率が約５ケタであることが示されている。
【図２１】パイロシーケンシングのメカニズムを示す図。
【図１Ａ】
2009526970.tif 000003
【図１Ｂ】
2009526970.tif 000004
【図１Ｃ】
2009526970.tif 000005
【図１Ｄ】
2009526970.tif 000006
【図１Ｅ】
2009526970.tif 000007
【図２Ａ】
2009526970.tif 000008
【図２Ｂ】
2009526970.tif 000009
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2009526970.tif 000011
【図３Ｃ】
2009526970.tif 000012
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2009526970.tif 000020
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図１８Ｈ】
2009526970.tif 000036
【図１８Ｉ】
2009526970.tif 000037
【図１８Ｊ】
2009526970.tif 000038
【図１８Ｋ】
2009526970.tif 000039
【図１８Ｌ】
2009526970.tif 000040
【図１８Ｍ】
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【図１８Ｎ】
2009526970.tif 000042
【図１８Ｏ】
2009526970.tif 000043
【図１８Ｐ】
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【図１８Ｑ】
2009526970.tif 000045
【図１８Ｒ】
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【図１８Ｓ】
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【図１８Ｔ】
2009526970.tif 000048
【図１８Ｕ】
2009526970.tif 000049
【図１８Ｖ】
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【図１８Ｗ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年12月8日(2006.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方を処理する方法であって、
内側相および外側相からなる流体小滴を提供する工程であって、
外側相は内側相とは混和しないことと、外側相は薄膜として内側相を取り囲んでいることと、
内側相は前記生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方を含むことと、内側相は外側相によって環境から遮蔽されていることと、
前記流体小滴は磁気的に誘引性の物質を含むことと
を特徴とする工程と、
少なくとも１つの表面を提供する工程であって、該表面は、流体小滴を該表面と接触させた際に該流体小滴が元の状態のままであるような、テクスチャと、流体小滴の内側相の流体に対する濡れ性と、を有することを特徴とする工程と、
前記少なくとも１つの表面の上に前記流体小滴を配置する工程と、
流体小滴を磁場または電磁場に曝露して、それにより前記少なくとも１つの表面に対する前記流体小滴の位置を制御する工程と、
前記流体小滴中の生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方に対して処理を行なう工程と
からなる方法。
【請求項２】
前記流体小滴の内側相の流体は液体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記流体小滴の内側相の流体は液体であり、かつ前記流体小滴の外側相の流体は液体である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
磁気的に誘引性の物質は、少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子、磁性流体、鉄含有性の細菌、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの表面に対する前記流体小滴の位置を制御する工程は、磁場または電磁場を変化させることにより流体小滴を移動させること、前記少なくとも１つの表面を移動させること、およびこれらの組み合わせからなる群のうちの１つをさらに含む、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
磁場を変化させることは、少なくとも１つの磁石の位置を変化させることからなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
流体小滴の内側相の流体に対する、前記少なくとも１つの表面の濡れ性は、流体小滴の内側相の流体で構成される流体小滴の、前記少なくとも１つの表面との界面における前進接触角θが、約５０度以上であることによって特徴づけられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの表面は、ほぼ平面の基材、凹形の基材、凸形の基材、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
流体小滴の内側相は前記表面に含まれる物質と直接接触している、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
流体小滴の内側相の流体は極性の液体であり、かつ少なくとも１つの表面は無極性の表面である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
無極性の表面は、シリコーン、プラスチック、表面が修飾されたシリコン酸化物、表面が修飾されたシリコン水素化物、表面が修飾された紙、表面が修飾されたガラス、表面が修飾された石英、表面が修飾された雲母、表面が修飾された金属、表面が修飾された金属酸化物、表面が修飾されたセラミック、ならびにこれらの任意の複合材からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
流体小滴の内側相の流体は無極性の液体であり、かつ少なくとも１つの表面は極性の表面である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
流体小滴を提供する工程は、
第１の流体を提供することと、
第１の流体とは混和しない第２の流体を提供することと、
第２の流体上に第１の流体の小滴を分注することによって、内側相および外側相からなる流体小滴を形成することと、第１の流体が内側相を形成し、該内側相は外側相を形成している第２の流体に囲まれていることと、
からなる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の流体は最初に提供される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
第１の流体、第２の流体および試料が同時に提供される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
流体小滴を提供する工程は、
内側相および外側相からなる流体小滴またはその一部を、外側相を形成している第２の流体中から回収することによって、内側相を囲んでいる外側相を薄膜として備えた流体小滴を形成することをさらに含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
流体小滴の内側相は極性の液体であり、かつ流体小滴の外側相は無極性の液体である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
流体小滴の内側相は親水性の液体であり、かつ流体小滴の外側相は疎水性の液体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
内側相の流体は、水、酸化ジュウテリウム、酸化トリチウム、アルコール、有機酸、無機酸、有機酸のエステル、無機酸のエステル、エーテル、アミン、アミド、ニトリル、ケトン、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、二酸化炭素、ジメチルスルホン、ジメチルスルホキシド、チオール、ジスルフィド、および極性のイオン性液体からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
外側相の流体は、鉱油、シリコーンオイル、天然オイル、ペルフルオロ化された炭素の液体、部分的にハロゲン化された炭素の液体、アルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物、二硫化炭素、および無極性のイオン性液体からなる群から選択される、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子は、反磁性の粒子、強磁性の粒子、常磁性の粒子、および超常磁性の粒子からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子は、生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方に含まれていることが疑われる標的物質に結合することができるリガンドを含んでいる、請求項４または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記リガンドは、生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方に含まれていることが疑われる標的物質に選択的に結合することができる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記リガンドは、少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子の表面に固定化される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記リガンドは、クラウンエーテル、ペプチド、抗体、リポカリンファミリーのポリペプチドをベースとした突然変異タンパク質、アンキリンスカフォールドもしくはクリスタリンスカフォールドをベースとしたタンパク質、アビマー、グルボディ、レクチン、核酸、プロテインＡ、プロテインＧ、酵素、金属原子、カーボンナノチューブ、カーボンナノフォーム、染料、ストレプトアビジン、アミロース、マルトース、セルロース、キチン、細胞外マトリクス、グルタチオン、カルモデュリン、ゼラチン、ポリミキシン、ヘパリン、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、リジン、アルギニン、ベンズアミジン、およびアルモシリケートからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの表面の領域を、温度の変化、磁場、電場、電磁場、圧力、波長、周波数、振幅、化学物質濃度、および化学組成からなる群から選択される条件に曝露する工程をさらに含み、かつ、
少なくとも１つの表面に対する流体小滴の位置を制御する工程は、前記条件に曝露されている少なくとも１つの表面の領域内へと流体小滴を移動させることを含んでなる、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
互いに向かい合っている少なくとも２つの表面を提供する工程であって、該表面は、流体小滴を該表面と接触させた際に該流体小滴が元の状態のままであるような、テクスチャと、流体小滴の内側相の流体に対する濡れ性とを有することを特徴とする工程をさらに含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
流体小滴の位置を制御する工程は、磁場または電磁場を用いるか、少なくとも１つの表面を移動するかのうち少なくともいずれかにより、前記少なくとも２つの表面の間で流体小滴を移動させることを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方に対して処理を行なう工程は、流体小滴をさらなる流体小滴と融合させる工程、流体小滴の内部を混合する工程、流体小滴を別の流体小滴で濾過する工程、および流体小滴を少なくとも２つの娘流体小滴に分割する工程からなる群から選択される工程を含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方は、試料中に含まれていることが疑われる標的物質の物理的検出、化学反応、生化学反応、細胞の溶解、生物もしくは生物の一部からの分子の抽出、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される処理を施される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
物理的検出は、分光学的、光化学的、測光学的、蛍光分析的、放射線学的、電気的、音響学的、電気化学的、比色分析的、干渉分析的、回折分析的、および熱力学的な検出からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
化学反応は、化学合成、化学分解、酵素的合成、酵素的分解、化学修飾、酵素的修飾、結合分子との相互作用、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
酵素的合成は、タンパク質合成、核酸合成、ペプチド合成、薬剤化合物の合成、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
試料は、土壌試料、大気試料、環境試料、細胞培養試料、骨髄試料、降雨試料、放射性降下物試料、宇宙空間試料、大気圏外試料、下水試料、地下水試料、剥離試料、考古学的試料、食物試料、血液試料、血清試料、血漿試料、尿試料、糞便試料、精液試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、鼻咽頭洗浄試料、痰試料、口腔スワブ試料、咽頭スワブ試料、鼻腔スワブ試料、気管支肺胞洗浄試料、気管支分泌物試料、乳汁試料、羊水試料、生検試料、爪試料、毛髪試料、皮膚試料、がん試料、腫瘍試料、組織試料、細胞試料、細胞溶解物試料、ウイルス培養試料、法医学的試料、感染症試料、院内感染症試料、生産物試料、薬物調製物試料、生体分子生産物試料、タンパク質調製物試料、脂質調製物試料、炭水化物調製物試料、ヌクレオチドの溶液、ポリヌクレオチドの溶液、核酸の溶液、ペプチドの溶液、ポリペプチドの溶液、アミノ酸の溶液、タンパク質の溶液、合成ポリマーの溶液、生化学的組成物の溶液、有機化学的組成物の溶液、無機化学的組成物の溶液、脂質の溶液、炭水化物の溶液、コンビナトリアルケミストリーの生成物の溶液、薬物候補分子の溶液、薬物分子の溶液、薬物代謝産物の溶液、細胞の懸濁物、ウイルスの懸濁物、微生物の懸濁物、金属の懸濁物、金属合金の懸濁物、金属イオンの溶液、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
内側相と外側相、および少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子を含んでなる、流体小滴であって、
外側相は内側相とは混和しないことと、外側相は薄膜として内側相を取り囲んでいることと、
内側相は外側相によって環境から遮蔽されていることと、
磁気的に誘引性の粒子は、生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方に含まれていることが疑われる標的物質に結合することができるリガンドを含んでいることと
を特徴とする流体小滴。
【請求項３６】
流体小滴の内側相の流体は液体である、請求項３５に記載の流体小滴。
【請求項３７】
流体小滴の内側相の流体は液体であり、かつ流体小滴の外側相の流体は液体である、請求項３５又は３６に記載の流体小滴。
【請求項３８】
流体小滴の内側相は極性の液体であり、かつ流体小滴の外側相は無極性の液体である、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の流体小滴。
【請求項３９】
流体小滴の内側相は親水性の液体であり、流体小滴の外側相は疎水性の液体である、請求項３８に記載の流体小滴。
【請求項４０】
内側相の流体は、水、酸化ジュウテリウム、酸化トリチウム、アルコール、有機酸、無機酸、有機酸のエステル、無機酸のエステル、エーテル、アミン、アミド、ニトリル、ケトン、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、二酸化炭素、ジメチルスルホン、ジメチルスルホキシド、チオール、ジスルフィド、および極性のイオン性液体からなる群から選択される、請求項３８に記載の流体小滴。
【請求項４１】
外側相の流体は、鉱油、シリコーンオイル、天然オイル、ペルフルオロ化された炭素の液体、部分的にハロゲン化された炭素の液体、アルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物、二硫化炭素、および無極性のイオン性液体からなる群から選択される、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の流体小滴。
【請求項４２】
少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子は、反磁性の粒子、強磁性の粒子、常磁性の粒子、および超常磁性の粒子からなる群から選択される、請求項３５〜４１のいずれか１項に記載の流体小滴。
【請求項４３】
リガンドは、少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子の表面に固定化されている、請求項３５〜４２のいずれか１項に記載の流体小滴。
【請求項４４】
リガンドは、クラウンエーテル、ペプチド、抗体、リポカリンファミリーのポリペプチドをベースとした突然変異タンパク質、アンキリンスカフォールドもしくはクリスタリンスカフォールドをベースとしたタンパク質、アビマー、グルボディ、レクチン、核酸、プロテインＡ、プロテインＧ、酵素、金属原子、カーボンナノチューブ、カーボンナノフォーム、染料、ストレプトアビジン、アミロース、マルトース、セルロース、キチン、細胞外マトリクス、グルタチオン、カルモデュリン、ゼラチン、ポリミキシン、ヘパリン、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、リジン、アルギニン、ベンズアミジン、およびアルモシリケートからなる群から選択される、請求項４３に記載の流体小滴。
【請求項４５】
内側相、外側相および少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子を含んでなる流体小滴を形成する方法であって、前記方法は、
第１の流体を提供する工程と、
第１の流体とは混和しない第２の流体を提供する工程と、
第１の流体と第２の流体とを接触させることにより、内側相と外側相とを備えた流体小滴を形成する工程であって、第１の流体は内側相を形成し、該内側相は外側相を形成する第２の流体に囲まれていることを特徴とする工程と、
少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子を提供する工程と、
少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子を流体小滴の中に配置する工程であって、磁気的に誘引性の粒子は、生物学的試料または化学的試料のうちの少なくともいずれか一方に含まれていることが疑われる標的物質に結合することができるリガンドを含むことを特徴とする工程と
からなる方法。
【請求項４６】
第１の流体は最初に提供される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
第１の流体および第２の流体が同時に提供される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
少なくとも１つの磁気的に誘引性の粒子が第１の流体中に配置されてから、第１の流体の小滴が第２の流体の中に分注される、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
第１の流体と第２の流体との接触は、第２の流体上に第１の流体の小滴を分注することを含む、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2009526970.tif 000057
2009526970.tif 000058
2009526970.tif 000059