(57)【要約】  本発明は、ヘイズ生成能が低減された酒類を製造する醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などを提供する。より具体的には、本発明は、醸造酵母の細胞壁マンノプロテインであるCwp2pをコードするScCWP2遺伝子又は特にビール酵母に特徴的なnonScCwp2遺伝子の発現量を高めることによって、製品中のヘイズを低減させた酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。
2009508468.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(f) からなる群から選択される記載のポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の(g)〜(i) からなる群から選択される請求項１に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２のアミノ酸配列、あるいは配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、あるいは配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：１又の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
DNAである、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項1〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【請求項７】
請求項1〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項８】
以下の(j)〜(l) からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有するベクター。
(j)配列番号：4のアミノ酸配列又は配列番号：4のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(k) 配列番号：4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(l)配列番号：3の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のベクターが導入された酵母。
【請求項１０】
請求項７又は８に記載のベクターを導入することによって、ヘイズ生成能が低減された請求項９に記載の酵母。
【請求項１１】
請求項６に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、ヘイズ生成能が低減された請求項１０に記載の酵母。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
【請求項１３】
醸造する酒類が麦芽飲料である請求項１２に記載の酒類の製造方法。
【請求項１４】
醸造する酒類がワインである請求項１２に記載の酒類の製造方法。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
【請求項１６】
配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有する細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のヘイズ生成能について評価する方法。
【請求項１７】
被検酵母を培養し、配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有する細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のヘイズ生成能を評価する方法。
【請求項１８】
被検酵母を培養し、請求項６に記載のタンパク質を定量または配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有する細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子の発現量を測定し、目的とするヘイズ生成能に応じた前記タンパク質の生成量または前記遺伝子の発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
【請求項１９】
基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有する細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現している被検酵母を選択する、請求項１８に記載の酵母の選択方法。
【請求項２０】
基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における請求項６に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、請求項１８に記載の酵母の選択方法。
【請求項２１】
請求項９〜１１に記載の酵母および請求項１８〜２０に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、ヘイズ生成量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子及びその用途に関し、特に、ヘイズ生成能が低減された酒類を製造する醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母の細胞壁マンノプロテインであるCwp2pをコードするScCWP2遺伝子又は特にビール酵母に特徴的なnonScCwp2遺伝子の発現量を高めることによって、製品中のヘイズを低減させた酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
酒類には、糖類やでんぷん質を原料にし、酵母などの働きで、アルコール発酵により作られる、ワイン、ビール、清酒、ワイン等の醸造酒がある。
例えば、ビールは麦芽を主原料として糖化によって麦汁を得、この麦汁と酵母を用いて主発酵を行い、次いで若ビールを後発酵（貯酒）工程に付し、濾過、ビン詰め工程を経て製造される。このようにして製造されているビール等の醸造酒（特に色のうすいもの）は、製造されてから消費されるまでの間に濁りを生じないような、いわゆる「混濁安定性」が醸造酒の品質上きわめて重要な項目である。
【０００３】
例えばビール混濁の原因は、生物学的混濁と非生物学的混濁の２つに大別できる。生物学的混濁は、微生物の混入に起因するものである。非生物学的混濁は、ビールの成分自体の変性による混濁、例えば、タンパク質成分とポリフェノールの会合によって生じるヘイズタンパクと総称されるタンパク質成分の生成による（K. Asano et al., ASBC Journal 40:147-154, 1982；J.A.Delcour et al., MBAA Technical Quarterly, 25:62-66, 1988）。一般に、普通に生じうる混濁は、非生物学的混濁である。非生物学的混濁の原因物質や形成メカニズムは詳細には明らかにされていないが、近年では、酵母由来の細胞壁成分（マンノプロテイン等）と麦芽、ホップ由来の蛋白質成分やポリフェノールなどが結合して次第に大きな粒子が形成されていくと考えられている。
【０００４】
近年、酵母からのマンノプロテインの剥落の程度とビールのヘイズの高さに良い相関性があることを見出されている（F. Omura et al., 30th EBC Congress SUMMARIES PRESENTATIONS, 19, 2005）。Cwp2ｐは、細胞壁を構成する主要なマンノプロテインの一つであり、細胞壁の安定化や低pH時の抵抗性の役割を有している（M, Skrzypek et al., Curr Genet, 38, 191-201, 2000）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述したように、非生物学的混濁の原因物質や形成メカニズムは詳細には明らかにされていないが、このような非生物学的混濁を低減することが、醸造酒の品質管理上、強く求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母から細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子を同定・単離することに成功した。また、得られた遺伝子を酵母に導入し発現させた形質転換酵母を作製し、ヘイズ生成量が低減することを確認して、本発明を完成した。
すなわち本発明は、ビール酵母に特徴的に存在する細胞壁マンノプロテイン遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、該遺伝子の発現が調節された酵母を用いることによる製品中のヘイズの制御方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターが導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。
【０００７】
（１）以下の(a)〜(ｆ) からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d)配列番号：２のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(ｆ)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【０００８】
（２）以下の(g)〜(i) からなる群から選択される上記（１）に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２のアミノ酸配列、あるいは配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、あるいは配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【０００９】
（３）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）DNAである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【００１０】
（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（７a）以下の(x)〜(z)の構成要素を含む発現カセットを含む上記（７）に記載のベクター：
(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター
(y)該プロモーターにセンス方向で結合した、上記（１）〜（５）に記載のポリヌクレオチド；及び
(z)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
（８）以下の(j)〜(l) からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有するベクター。
(j)配列番号：4のアミノ酸配列又は配列番号：4のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(k) 配列番号：4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(l)配列番号：3の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【００１１】
（９）上記（７）又は（８）に記載のベクターが導入された酵母。
（１０）上記（７）又は（８）に記載のベクターを導入することによって、ヘイズ生成能が低減された上記(９)に記載の酵母。
（１１）上記（６）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、ヘイズ生成能が低減された上記（１０）に記載の酵母。
（１２）上記（９）〜（１１）のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
（１３）醸造する酒類が麦芽飲料である上記（１２）に記載の酒類の製造方法。
（１４）醸造する酒類がワインである上記（１２）に記載の酒類の製造方法。
（１５）上記（１２）〜（１４）のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
【００１２】
（１６）配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有する細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のヘイズ生成能について評価する方法。
（１６a）上記（１６）に記載の方法によって、ヘイズ生成能が低減された酵母を選別する方法。
（１６b）上記（１６a）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
（１７）被検酵母を培養し、配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有する細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のヘイズ生成能を評価する方法。
【００１３】
（１８）被検酵母を培養し、上記（６）に記載のタンパク質を定量または配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有する細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子の発現量を測定し、目的とするヘイズ生成能に応じた前記タンパク質量または前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（１８ａ）被検酵母を培養して、ヘイズ生成能を測定し、目的とするヘイズ生成能の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（１９）基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有する細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現している被検酵母を選択する、上記（１８）に記載の酵母の選択方法。
【００１４】
（２０）基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における上記（６）に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、上記（１８）に記載の酵母の選択方法。即ち、複数の酵母を培養して各酵母における上記（６）に記載のタンパク質を定量し、その中で該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、上記（１８）に記載の酵母の選択方法。
（２１）上記（９）〜（１１）に記載の酵母および上記（１８）〜（２０）に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、ヘイズ生成量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の形質転換酵母を用いる酒類の製造法によれば、細胞壁マンノプロテインにより酵母細胞壁構造が安定化されると考えられるため、ビール醸造および製品中のヘイズ量が低く抑えられた酒類を製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明者らは、酵母の細胞壁マンノプロテインを増大させることによって、酵母の細胞壁を安定化させることが可能であると考えた。このような着想に基づいて研究を重ね、特開2004-283169号公報に開示の方法で解読したビール酵母ゲノム情報を基に、ビール酵母特有の細胞壁マンノプロテインをコードするnonScCWP2遺伝子を単離・同定した。該遺伝子の塩基配列および該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号：１及び配列番号：2に示す。また、特開2004-283169号公報に開示の方法で解読したビール酵母ゲノム情報を基に、ビール酵母の細胞壁マンノプロテインをコードするScCWP2遺伝子を単離・同定した。該遺伝子の塩基配列および該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号：3及び配列番号：4に示す。また、ScCWP2はS. cerevisiaeのゲノムデータベース(http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/)からも取得できる。
【００１７】
１．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、(a)配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(b)配列番号：２又は配列番号：４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
本発明で対象とするポリヌクレオチドは、上記のビール酵母由来の細胞壁マンノプロテインをコードするポリヌクレオチドに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号：２又は配列番号：４のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質（細胞壁を構成するマンノプロテイン）が挙げられる。
このようなタンパク質としては、配列番号：２又は配列番号：４のアミノ酸配列において、例えば、１〜100個、１〜90個、１〜80個、１〜70個、１〜60個、１〜50個、１〜40個、１〜39個、１〜38個、１〜37個、１〜36個、１〜35個、１〜34個、１〜33個、１〜32個、１〜31個、１〜30個、１〜29個、１〜28個、１〜27個、１〜26個、１〜25個、１〜24個、１〜23個、１〜22個、１〜21個、１〜20個、１〜19個、１〜18個、１〜17個、１〜16個、１〜15個、１〜14個、１〜13個、１〜12個、１〜11個、１〜10個、１〜9個、１〜8個、１〜7個、１〜6個（1〜数個）、１〜5個、１〜4個、１〜3個、１〜2個、１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号：２又は配列番号：４のアミノ酸配列と約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
なお、細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質であるか否かは、例えば、サンプルをSDS-電気泳動により分子量的に分離し、そのサンプルに対して、コンカナバリンAというレクチンがマンノプロテインのマンノース部分を認識し、これに結合する性質を利用して、アフィノブロッティング (Faye L and Chrispeels MJ, Anal Biochem, 1985)という手法を用いることにより、検出することができる。
【００１８】
また、本発明は、(e)配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(f)配列番号：２又は配列番号：４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。
【００１９】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号：２又は配列番号：４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、DNA）をいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。
【００２０】
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２１】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド（例えば、DNA）を検出することができる。
【００２２】
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２又は配列番号：４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
【００２３】
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Proc. Natl． Acad． Sci． USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90： 5873, 1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J Mol Biol 215： 403, 1990）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００２４】
２．本発明のタンパク質
本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(l)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：２又は配列番号：４のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質（本明細書中、単に「細胞壁マンノプロテイン」と称することもある）である。
このようなタンパク質としては、配列番号：２又は配列番号：４のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：２又は配列番号：４のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ細胞壁マンノプロテインとして機能するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
【００２５】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
【００２６】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸；  C群：アスパラギン、グルタミン；  D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸；  E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン；  F群：セリン、スレオニン、ホモセリン；  G群：フェニルアラニン、チロシン。
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００２７】
３．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(l)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）を含有する。また、本発明のベクターは、通常、(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター；(y)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記(a)〜(l)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）；及び(z)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。
【００２８】
酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（YEp型）、単コピー型（YCp型）、染色体組み込み型（YIp型）のいずれもが利用可能である。例えば、YEp型ベクターとしてはYEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983) 、YCp型ベクターとしてはYCp50 (M. D. Rose et al., gene, 60, 237, 1987) 、YIp型ベクターとしてはYIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USP, 76, 1035, 1979) が知られており、容易に入手することができる。
【００２９】
酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター／ターミネーターとしては、醸造用酵母中で機能するとともに、もろみ中の成分に影響を受けなければ、任意の組み合わせでよい。例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーターなどが利用可能である。これらの遺伝子はすでにクローニングされており、例えばM. F. Tuite et al., EMBO J., 1, 603 (1982) に詳細に記載されており、既知の方法により容易に入手することができる。
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992; Hussain et et al., gene, 101, 149, 1991）などが利用可能である。
【００３０】
上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス  パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母  清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。
【００３１】
酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
【００３２】
より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えばYEPD培地“Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117(1979)”等）で、OD600nmの値が1〜6となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約1〜2Mのアルカリ金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約３０℃で、約60分間静置した後、導入するDNA（約1〜20μg）とともに約30℃で、約60分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約4,000ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約20％〜50％となるように加える。約30℃で、約30分間静置した後、この細胞を約42℃で約5分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約30℃で約60分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。
【００３３】
その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第3版」、“Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY)”等を参照することができる。
【００３４】
４．本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類
上述した本発明のベクターを製造対象となる酒類の醸造に適した酵母に導入し、その酵母を用いることによって所望の酒類で、ヘイズ生成量が低減した酒類を製造することができる。また、下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母も同様に用いることができる。対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、発泡酒などのビールテイストドリンク、ワイン、清酒などが挙げられる。
【００３５】
これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明において得られた醸造酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と全く同一でよく、ヘイズ生成量を低減させた酒類を製造するためのコストを増加させることはない。つまり、本発明によれば、混濁安定性等に優れた酒類を、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。
【００３６】
５．本発明の酵母の評価方法
本発明は、配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有する細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のヘイズ生成能について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、ＷＯ０１／０４０５１４号公報、特開平８−２０５９００号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
【００３７】
まず、被検酵母のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)）。得られたゲノムを対象にして、細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子の塩基配列（好ましくは、ORF配列）に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマーまたはプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
【００３８】
遺伝子または特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、PCR 法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、10bp以上であり、15〜25bpであることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、300 〜2000bpが適当である。
【００３９】
PCR 法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度：90〜95℃、アニーリング温度：40〜60℃、伸長温度：60〜75℃、サイクル数：10回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のDNA 分子を含む大きさかどうかによって、その酵母のヘイズ生成能について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性能についてより正確に予測・評価することが可能である。
【００４０】
また、本発明においては、被検酵母を培養し、配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有する細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のヘイズ生成能を評価することもできる。なお、遺伝子の発現量の測定は、被検酵母を培養し、細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子の産物であるmRNA又はタンパク質を定量することによって可能である。mRNA又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。mRNAの定量は例えばノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、タンパク質の定量は例えばウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。なお、被検酵母を培養した際に得られる発酵液中のヘイズ量を測定することによって、その被検酵母における上記遺伝子の発現量を予測することも可能である。
【００４１】
さらに、被検酵母を培養して、配列番号：１又は３の塩基配列を有する本発明の遺伝子の発現量を測定し、目的とするヘイズ生成能に応じた遺伝子発現量の酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。また、基準酵母および被検酵母を培養し、各酵母における前記遺伝子発現量を測定し、基準酵母と被検酵母の前記遺伝子発現量を比較して、所望の酵母を選択してもよい。具体的には、例えば、基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有する細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現している被検酵母を選択することによって所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。
あるいは、被検酵母を培養して、ヘイズ生成能の低い酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な被検酵母を選択することができる。
【００４２】
これらの場合、被検酵母または基準酵母としては、例えば、上述した本発明のベクターを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（DNA）の発現が増加された酵母、上述した本発明の蛋白質の発現が増加された酵母、突然変異処理が施された酵母、自然変異した酵母などが使用され得る。ヘイズの定量は、例えば、P. W. Galesら：J. Am. Soc. Brew. Chem. 58, 101-107 (2000)）に記載の方法によって行うことができる。突然変異処理は、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法など、いかなる方法を用いてもよい（例えば、大嶋泰治編著、生物化学実験法39  酵母分子遺伝学実験法、ｐ67-75、学会出版センターなど参照）。
【００４３】
なお、基準酵母、被検酵母として使用され得る酵母は、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス  パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母  清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。基準酵母、被検酵母は、上記酵母から任意の組み合わせで選択しても良い。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例によって本発明の詳細を述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４５】
実施例1：細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子（nonScCWP2）のクローニング
特開2004-283169号公報に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母に特有の新規細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子nonScCWP2を見出した（配列番号：１）。得られた塩基配列情報を基に、nonScCWP2全長遺伝子を増幅するためのプライマーnonScCWP2_for（配列番号：５）／nonScCWP2_rv（配列番号：６）を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス  パストリアヌス  バイヘンステファン34/70株（「W34/70株」と略記することがある）の染色体DNAを鋳型としたPCRによってnonScCWP2の全長遺伝子を含むDNA断片（約0.3kb）を取得した。
上記のようにして得られたnonScCWP2遺伝子断片を、TAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。nonScCWP2遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。
【００４６】
実施例２：ビール試醸中のnonScCWP2遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス  パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度      12.69％
麦汁容量            70L
麦汁溶存酸素濃度    8.6ppm
発酵温度            15℃
酵母投入量          12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図１）、外観エキス濃度（図２）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。nonScCWP2遺伝子の発現パターンを図３に示す。この結果より、通常のビール発酵においてnonScCWP2遺伝子が発現していることが確認できた。
【００４７】
実施例３：nonScCWP2遺伝子の高発現株の作製
実施例１に記載のnonScCWP2/pCR2.1-TOPOを制限酵素SacIおよびNotI消化し、タンパク質コード領域全長を含むDNA断片を調製する。この断片を制限酵素SacIおよびNotI処理したpYCGPYNotに連結させ、nonScCWP2高発現ベクターnonScCWP2/pYCGPYNotを構築する。pYCGPYNotはYCp型の酵母発現ベクターであり、導入された遺伝子はピルビン酸キナーゼ遺伝子PYK1のプロモーターによって高発現される。酵母での選択マーカーとしてジェネチシン耐性遺伝子G418rを、また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Amprを含んでいる。
上述の方法で作製したnonScCWP2高発現ベクターを用い、特開平07-303475に記載された方法でサッカロマイセス  パストリアヌス  バイヘンステファン34/70株を形質転換した。ジェネチシン300mg/Lを含むYPD平板培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）で形質転換体を選択した。
【００４８】
実施例４：ビール試験醸造におけるヘイズ生成量の解析
親株ならびに実施例3で得られたnonScCWP2高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行った。
麦汁エキス濃度    11.85%
麦汁容量          2L
麦汁溶存酸素濃度  約 8 ppm
発酵温度          15℃一定
酵母投入量        10 g 湿酵母菌体 / 2L麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（OD660）、エキス消費量の経時変化を調べた。醪中のヘイズの定量は、もろみを5,000rpm、10分の遠心をすることによって、浮遊酵母を沈殿させ、遠心上清を回収し、このサンプルを珪藻土濾過およびヘイズ測定に供した。上述したサンプルをポアサイズ50μmの金属製メッシュに乗せた珪藻土を用いて濾過した。濾過後、ヘイズを生じやすい環境にするため24時間氷水（0℃）で保持した。サンプルのヘイズをヘイズメーター（シグリスト社製、シグリスト光電計 KTL30）を用いて測定し、この値をT-haze（全混濁量）とした。また、28℃で冷凝固物を可溶化して測定した値をP-Haze(永続混濁量)、T-HazeとP-Hazeの差分を冷凝固物によるHaze値、C-Haze（冷凝固物混濁量）とした。単位はHelmを用いて表現できる（1 Helm＝０．1 FTU(Formazin Turbidity Unit)）（文献；P. W. Galesら：J. Am. Soc. Brew. Chem. 58, 101-107 (2000)）。得られた結果を表１に示す。
【００４９】
【表１】
2009508468.tif 000003
【００５０】
表１より、T-Haze生成量は親株の64Helmに対してnonScCWP2高発現株では41Helmであった。また、P-Haze量は親株の46Helmに対してnonScCWP2高発現株では31Helm、C-Haze量は親株の18Helmに対してnonScCWP2高発現株では10Helmであった。これらの結果より、nonScCWP2高発現によってHaze量が約34-45%減少することが明らかとなった。またこのとき、親株と破壊株の間で、増殖速度およびエキス消費速度にはほとんど差がみられなかった。
なお、この実施例で得られた結果を、図４及び図５にも示す。図４は、この実施例のビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。図５は、この実施例のビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【００５１】
実施例５：細胞壁マンノプロテインをコードする遺伝子（ScCWP2）のクローニング
ScCWP2全長遺伝子を増幅するためのプライマーScCWP2_for（配列番号：７）／ScCWP2_rv（配列番号：８）を設計し、S. cerevisiae X2180-1Aの染色体ＤＮＡを鋳型としたPCRによってScCWP2の全長遺伝子を含むＤＮＡ断片（約0.3kb）を取得した。
上記のようにして得られたScCWP2遺伝子断片を、それぞれTAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。ScCWP2遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。
【００５２】
実施例６：ビール試醸中のScCWP2遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス  パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度      12.69％
麦汁容量            70L
麦汁溶存酸素濃度    8.6ppm
発酵温度            15℃
酵母投入量          12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図４）、外観エキス濃度（図５）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。ScCWP2遺伝子の発現パターンを図６に示す。この結果より、通常のビール発酵においてScCWP2遺伝子が発現していることが確認できた。
【００５３】
実施例７： ScCWP2遺伝子の高発現株の作製
実施例5に記載のプラスミドTOPO/ScCWP2から、制限酵素XhoIおよびBamHI処理によってScCWP2遺伝子を含む約0.7 kbのDNA断片を調製した。これを制限酵素XhoIおよびBamHI処理したpUP3GLP2に連結させ、ScCWP2高発現ベクターpUP-ScCWP2を構築した。酵母発現ベクターpUP3GLP2は、相同組換え部位としてオロチジン5リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子URA3を含むYIp型（染色体組み込み型）ベクターであり、導入された遺伝子はグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子TDH3のプロモーター／ターミネーターによって高発現される。酵母での選択マーカーとして、ガラクトキナーゼ遺伝子GAL1のプロモーター／ターミネーターの制御下に薬剤耐性遺伝子YAP1が組み込まれており、ガラクトースを含む培地で発現が誘導される。また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Amprを含んでいる。
上述の方法で作製したnonScCWP2高発現ベクターを用い、特開平07-303475に記載された方法でWeihenstephan Nr.164株を形質転換した。セルレニン1.0mg/Lを含むYPGal平板培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%ガラクトース、2%寒天）でセルレニン耐性株を選択した。
【００５４】
実施例８：ビール試験醸造におけるヘイズ生成量の解析
親株ならびに実施例7で得られたScCWP2高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行った。
麦汁エキス濃度    11.85%
麦汁容量          2L
麦汁溶存酸素濃度  約 8ppm 
発酵温度          15℃一定
酵母投入量        10 g 湿酵母菌体 / 2L麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（OD660）、エキス消費量の経時変化を調べた。醪中のヘイズの定量は、もろみを5,000rpm、10分の遠心をすることによって、浮遊酵母を沈殿させ、遠心上清を回収し、このサンプルを珪藻土濾過およびヘイズ測定に供した。上述したサンプルをポアサイズ50μmの金属製メッシュに乗せた珪藻土を用いて濾過した。濾過後、ヘイズを生じやすい環境にするため24時間氷水（0℃）で保持した。サンプルのヘイズをヘイズメーター（シグリスト社製、シグリスト光電計 KTL30）を用いて測定し、この値をT-haze（全混濁量）とした。また、28℃で冷凝固物を可溶化して測定した値をP-Haze(永続混濁量)、T-HazeとP-Hazeの差分を冷凝固物によるHaze値、C-Haze（冷凝固物混濁量）とした。単位はHelmを用いて表現できる（1 Helm＝０．1 FTU(Formazin Turbidity Unit)）（文献；P. W. Galesら：J. Am. Soc. Brew. Chem. 58, 101-107 (2000)）。得られた結果を表２に示す。
【００５５】
【表２】
2009508468.tif 000004
【００５６】
表２より、T-Haze生成量は親株の33Helmに対してScCWP2高発現株では24Helmであった。また、P-Haze量は親株の23Helmに対してScCWP2高発現株では18Helm、C-Haze量は親株の10Helmに対してScCWP2高発現株では7Helmであった。これらの結果より、ScCWP2高発現によってHaze量が約22-33%減少することが明らかとなった。またこのとき、親株と破壊株の間で、増殖速度およびエキス消費速度にはほとんど差がみられなかった。
また、この実施例で得られた結果を図７及び図８にも示す。図７は、この実施例のビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。図８は、この実施例のビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の酒類製造法によれば、ビール醸造および製品中のヘイズ量が低く抑えられるため、ヘイズ量の低減された酒類を製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は実施例２でのビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図２】図２は実施例２でのビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図３】図３は実施例２でのビール試験醸造中の酵母におけるnonScCWP2遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【図４】図４はこの実施例のビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図５】図５はこの実施例のビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図６】図６は実施例６でのビール試験醸造中の酵母におけるScCWP2遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【図７】図７はこの実施例のビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図８】図８はこの実施例のビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【配列表フリーテキスト】
【００５９】
［配列番号：５］  プライマー
［配列番号：６］  プライマー
［配列番号：７］  プライマー
［配列番号：８］  プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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