(57)【要約】  本発明は、宿主の血液中に脱落しない免疫グロブリン結合細胞表面決定基を特異的にターゲティングする方法、組成物及びワクチンを提供する。いくつかの場合では、免疫グロブリン結合細胞表面決定基が、様々なＢ細胞障害に関与する。本方法では、Ｂ細胞に対するＩＡＣＳＤターゲティングエレメントを投与する。本方法は、ＩＡＣＳＤをターゲティングする調製物を有効量投与することによる、Ｂ細胞関連障害を有する個体の治療を用いることができる。この組成物は、免疫グロブリン結合細胞表面決定基と結合する単離抗体を含む。また本発明は、免疫グロブリン結合細胞表面決定基に対して免疫感作するワクチンを含む。【選択図】  図１
2009536217.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体にターゲティング抗体又は抗体断片を有効量投与するステップを含む方法であって、ターゲティング抗体又は抗体フラグメントが、血液中に脱落しないか又は対応する分泌免疫グロブリン中に存在しないＢ細胞上の免疫グロブリン結合細胞表面決定基を特異的に認識する方法。
【請求項２】
前記抗体又は抗体フラグメントがヒト化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫グロブリン結合細胞表面決定基が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭから成る群から選択される免疫グロブリンアイソタイプと結合するペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫グロブリン結合細胞表面決定基が、配列番号１〜８のいずれかを含むペプチド又はその免疫原性フラグメント又は配列番号１〜８のいずれかに対して少なくとも９５％のアミノ酸の同一性を有する変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞傷害作用薬を治療有効量投与するステップをさらに含み、前記細胞傷害作用薬及び前記ターゲティング抗体又は抗体フラグメントを任意の順番で又は同時に投与することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞傷害作用薬及び前記ターゲティング抗体又は抗体フラグメントがコンジュゲートを形成する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞傷害作用薬が化学療法剤である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞傷害作用薬が放射性核種である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記個体がＢ細胞関連障害を有するか又は有することが疑われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ｂ細胞上の決定基を標的にする少なくとも１つの追加のターゲティング剤を投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの追加のターゲティング剤が、前記Ｂ細胞上のＣＤ２０エピトープを標的にする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
単離抗体又は抗体フラグメント及び細胞傷害作用薬を含む組成物であって、前記単離抗体又は抗原結合フラグメントが、宿主の血液中に脱落しないか又は対応する分泌免疫グロブリン中に存在しないＢ細胞上の免疫グロブリン結合細胞表面決定基と結合する組成物。
【請求項１３】
前記免疫グロブリン結合細胞表面決定基が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭから成る群から選択される免疫グロブリンアイソタイプと結合するペプチドである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記免疫グロブリン結合細胞表面決定基が、配列番号１〜８のいずれか１つ又はその免疫原性フラグメント又は配列番号１〜８のいずれか１つに対して少なくとも９５％のアミノ酸の同一性を有する変異体を含むペプチドである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記細胞傷害作用薬が化学療法剤である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記細胞傷害作用薬が放射性核種である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
前記抗体又は抗体フラグメントがヒト化されている、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１８】
前記Ｂ細胞上の決定基を標的にする少なくとも１つの追加のターゲティング剤をさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの追加のターゲティング剤が、前記Ｂ細胞上のＣＤ２０エピトープを標的にする、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
（ａ）試料中での、宿主の血液中に脱落しないか又は対応する分泌免疫グロブリン中に存在しない免疫グロブリン結合細胞表面決定基タンパク質の発現、又は、細胞中の免疫グロブリン結合細胞表面決定基核酸の発現を検出又は測定するステップであって、前記試料が、Ｂ細胞関連障害を有するか又は有することが疑われる個体に由来するステップと、
（ｂ）前記発現を標準物質と比較するステップであって、標準物質に対する前記免疫グロブリン結合細胞表面決定基タンパク質又は核酸の発現がＢ細胞障害と相関するステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
[0001]本発明は、配列番号１〜８によってコードされたＩＡＣＳＤを含むＢ細胞系統の細胞の全てのサブセットに限定された免疫グロブリン結合細胞表面決定基（ＩＡＣＳＤ）をターゲティングする組成物及び方法、並びに、癌、自己免疫疾患、臓器移植拒絶反応及びアレルギー性反応を含む、Ｂ細胞のサブセットに関連した多様な自然及び病的状態の治療及び診断におけるそれらの使用に関する。
【発明の背景】
【０００２】
[0002]定義された細胞決定基に選択的に結合する標的薬剤は、診断及び治療剤として首尾良く開発されている。腫瘍学及び自己免疫疾患において、これらの薬剤は多様な腫瘍のタイプ及び免疫疾患でその効果が立証され、いくつかの標的薬剤が臨床的設定での使用のために認可された。多くの場合、従来の医薬と比較して非特異的な相互作用を起こすことが少ないので、この新しいクラスの医薬は低毒性という利点を有する。Ｒｉｔｕｘａｎは、この新しいクラスの薬剤の典型的な例である。これらの標的薬剤のサブセットは、細胞表面決定基に結合し、細胞膜輸送に関連した耐性メカニズムを回避して、治療法の一部として免疫エフェクターメカニズムの補充又は腫瘍若しくは標的正常組織へ毒性部分を導き送達するためのビヒクルとして作用することを可能にする。
【０００３】
[0003]癌、免疫又はその他の疾患を治療するための標的薬剤による手法の実現可能性は、主として定義された標的決定基の相対的なユニークさに依存していた。一般に、成功のために必要な条件には、疾患病因に関与する細胞の有効なターゲティング、標的細胞へ毒性部分を特異的に送達する能力、標的分子の重要な機能的側面の阻害、及び、ある場合には、標的細胞に対する免疫応答の活性化が含まれる。また標的決定基は、腫瘍又は病理学的組織に対して絶対的に特異的であることが必要なことが一般的に認められてきた。残念なことに、腫瘍又は病理学的組織に本当に特異的であることが見出された細胞決定基の数は限られている。したがって、絶対的な「腫瘍又は病理学的組織」特異性に基づく標的薬剤はきわめてまれであるので、治療可能な疾患実体の数は制限され得る。反対に、ターゲティングする特異性のレベルを低下させることは、その非特異的な正常組織反応性が誘導する毒性によって、新しい薬剤の効果を低減する。したがって、「相対的な」特異性を有する薬剤は、効果と毒性間の最良のバランスを示し得る。
【０００４】
［0004]腫瘍又は病理学的組織に関する決定基を特異的にターゲティングすることにより、かなりの数の病状を治療することが実現可能でないため、標的薬剤を設計する新しい方法が求められている。本発明において、特異的にターゲティングする腫瘍又は病理学的組織決定基に代わるものとして、本発明者らは全ての特定のＢ細胞系統の細胞表面上の決定基に対する標的薬剤を設計する方法、及び、これらの標的薬剤に基づく病状を治療する方法を説明する。
【発明の開示】
【０００５】
[0005]本発明は、種々の疾患の治療のために、免疫細胞の「Ｂ細胞系統」のサブセットに対して絶対的な特異性を有する免疫グロブリン結合細胞表面決定基（ＩＡＣＳＤ）のファミリーを使用する方法及び組成物を提供する。より詳細には、本発明は、Ｂ細胞又は腫瘍性Ｂ細胞の表面で見いだされる定義されたタンパク質及びペプチド、並びに、多様なターゲティングエレメントに対する標的部位として前記タンパク質及びペプチドの配列をコードする核酸分子を利用するものである。このタンパク質及びペプチドは、限定されるものではないが、これらの前記タンパク質又はペプチドに対する結合に関して特異的に選択された特異的抗体、抗体に基づく構築物、ペプチド及び／又は薬剤が含まれるターゲティングエレメントを用いて、検出して標的にすることができる。ある場合には、表面ペプチドは、この核酸コードからの前記配列から予測された値に基づく約１５０，０００〜２００，０００の分子量を持つ。
【０００６】
［0006]宿主にターゲティングエレメントの有効量を投与することによって、哺乳動物（例えばヒト又はその他の個体、例えば霊長類、げっ歯類、ブタ、イヌ若しくはネコ）等のＢ細胞を有する個体を治療するために、ターゲティングエレメント及びターゲティングエレメントを含む組成物を用いることができる。
【０００７】
[0007]本発明はまた、単量体若しくは多量体型のこれら前記核酸分子又はタンパク質の使用、並びに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏでの診断又はスクリーニング及び治療法における、抗体、抗体に基づく構築物、特異的結合ペプチド又は特異的結合薬剤に関する。
【０００８】
[0008]本発明の特定のＩＡＳＣＤは、宿主の血液中に脱落せず、これは良好な薬剤ターゲティングのための決定基の重要な特徴である。血液中の循環標的分子は薬剤に結合でき、薬剤を肝臓又は腎臓等の代謝又は排出に向かう経路に転換する。分泌された標的決定基はまた、この決定基が細胞表面から脱落するため、最初は腫瘍を標的にした薬剤が血液に再放出される結果となる場合がある。
【０００９】
[0009]本発明の基礎をなすＩＡＳＣＤは、最も分化した形態であるリンパ腫及び白血病等の形質細胞新生物、並びに、多発性骨髄腫等の形質細胞異形成を含む全てのＢ細胞由来の新生物で発現している。ＩＡＳＣＤはＢ細胞分化を細分して、正常若しくは悪性のＢ細胞のサブセットそれぞれの調節又は殺傷に対して特異的なターゲティングを可能にするので、これらの決定基は現在承認済のＢ細胞腫瘍を標的にする薬剤よりさらに特異的である。現在リンパ腫の治療に承認された薬剤は、かなりのＢ細胞コンパートメント（例えば、ＣＤ２０を発現している細胞）と反応して、大量の正常細胞との反応及び／又は大量の正常細胞の溶解を生じる。完全なＢ細胞系統によるＩＡＳＣＤの発現は、Ｂ細胞悪性腫瘍又は自己免疫疾患に対するＢ細胞依存性免疫抑制において、これらの薬剤のより広範な使用を可能にする。しかし結果として、Ｂ細胞系統を細分するこれらのＩＡＳＣＤは、それぞれ標的治療用薬剤であり、これらは正常な細胞の少数のサブセットと反応性を有するであろう。さらに定義された特異性を有する薬剤が、正常組織溶解を低減するために必要とされている。
【００１０】
[0010]ＩＡＣＳＤに結合することにより誘導される生物学的効果には、限定されるものではないが、増殖阻害、細胞周期撹乱、成長促進、分化、老化、形態学的変化、アポトーシス、抗遊走、抗血管形成、新しいタンパク質合成の誘導、複合内在化（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）、エンドサイトーシス、タンパク質代謝、増殖因子遮断、薬剤感受性の増加、タンパク質合成阻害、免疫抑制の逆転、特異的免疫抑制、抗原提示、Ｔ細胞刺激、サイトカイン分泌、炎症の誘導、凝固の活性化、血栓症及び凝固因子の消耗、並びに、プロスタグランジン生合成が含まれる。
【００１１】
[0011]ここで定義されたＩＡＳＣＤは新しい診断用又は治療用薬剤の開発のために、さらに定義され限定された標的を与えるが、現在利用できる治療薬と組み合わせたその使用はまた、付加的又は相乗的組合せをもたらすことを可能にし、いまだ治療可能でないＢ細胞腫瘍のサブセットの良好な治療を可能にする。
【００１２】
[0012]特定の状況においてここで定義されたＩＡＳＣＤは、抗体又はその他の結合部分が細胞表面決定基に結合するとき、Ｂ細胞中へ内在化することを誘導し得る。この過程は、ターゲティング剤に結合したコファクターの細胞表面への特異的な送達を可能にし、次いでこれらの複合の内在化は、細胞中へコファクター侵入を引き起こすであろう。これらのコファクターには、治療、診断、画像化若しくはスクリーニング試薬としての使用のための、その他のタンパク質、核酸、炭水化物、薬剤又は放射性物質が含まれる。
【００１３】
[0013]ＩＡＳＣＤを検出し且つ結合する免疫グロブリンの開発は、標的Ｂ細胞の免疫介在性破壊を引き起こすであろう。これは他の抗体構築物について記載されたように、補体又は細胞に媒介された効果によって生じ得る。
【００１４】
[0014]前記核酸及びアミノ酸配列の相同性の欠如は、顕著な特異性及びその他のタンパク質との低い交叉反応性が、開発された試薬に対する低い毒性を可能にすることを示唆している。
【００１５】
[0015]本発明のいくつかの方法は、個体に作用薬を投与することを含む。この方法は、個体にターゲティングエレメントを含むターゲティング調製物を投与するステップを含み、このターゲティングエレメントは、宿主の血液中に脱落しないか又は対応する分泌Ｉｇ中に存在しないＢ細胞上の免疫グロブリン結合細胞表面決定基を標的にする。Ｂ細胞は、腫瘍性Ｂ細胞であり得る。いくつかの方法では、ターゲティングエレメントはターゲティング抗体又は抗体フラグメントを含み得、このターゲティング抗体又は抗体フラグメントは、個体の血液中に脱落しないか又は対応する分泌免疫グロブリン中に存在しないＢ細胞上の免疫グロブリン結合細胞表面決定基を特異的に認識する。このターゲティング抗体又は抗体フラグメントは、ヒト化することができる。典型的には、ターゲティングエレメントは、個体の血液中に脱落しないか又は対応する分泌Ｉｇ中に存在しないＢ細胞上の免疫グロブリン結合細胞表面決定基を特異的に認識する。この方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＢ細胞にターゲティングエレメントを投与するステップを含み得る。
【００１６】
[0016]いくつかの方法では、この免疫グロブリン結合細胞表面決定基は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭのいずれかを含む免疫グロブリンアイソタイプと関連したペプチドである。例えば、ＩＡＳＣＤは配列番号１〜８のいずれか１つを含むペプチドであり得る。免疫グロブリン結合細胞表面決定基はまた、このようなペプチドの免疫原性フラグメント又はこのペプチドに対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％のアミノ酸の同一性を有するその変異体であり得る。
【００１７】
[0017]いくつかの方法では、個体に、ターゲティング調製物を有する細胞傷害作用薬を治療有効量投与することができ、この細胞傷害作用薬及びターゲティングエレメントは、任意の順番で又は同時に投与することができる。細胞傷害作用薬及びターゲティングエレメントは、コンジュゲートを形成し得る。
【００１８】
[0018]いくつかの方法では、Ｂ細胞上の決定基を標的にする少なくとも１つの追加のターゲティング剤を投与することができる。Ｂ細胞上の決定基は、ＣＤ２０エピトープを含み得る。
【００１９】
[0019]本発明の組成物は、ターゲティング組成物を含む。ターゲティング組成物は、単離ターゲティング抗体、抗原結合フラグメント、又は抗体フラグメントを含み得、単離抗体又は抗原結合フラグメントは、宿主の血液中に脱落しないか又は対応する分泌Ｉｇ中に存在しないＢ細胞上の免疫グロブリン結合細胞表面決定基と結合する。この組成物は、化学療法剤又は放射性核種であり得る細胞傷害作用薬をさらに含み得る。抗体、抗原結合フラグメント又は抗体フラグメントは、細胞傷害作用薬と結合し得る。抗体、抗原結合フラグメント、又は抗体フラグメントは、免疫グロブリン結合細胞表面決定基と関連した１つ又は複数の機能を阻害し得る。
【００２０】
[0020]いくつかの組成物では、Ｂ細胞上の決定基を標的にする少なくとも１つの追加のターゲティング剤を投与することができる。Ｂ細胞上の決定基は、ＣＤ２０エピトープを含み得る。
【００２１】
[0021]いくつかの方法が、Ｂ細胞障害を診断することを含み得る。Ｂ細胞障害を診断する方法は、Ｂ細胞障害を有するか又は有する疑いのある個体から試料を得るステップと、試料中での、宿主の血液中に脱落しないか又は対応する分泌Ｉｇ中に存在しない細胞上の免疫グロブリン結合細胞表面決定基タンパク質の発現、又は、細胞中の免疫グロブリン結合細胞表面決定基核酸の発現を検出又は測定するステップと、この発現を標準物質と比較することとを含み得る。標準物質に対する免疫グロブリン結合細胞表面決定基タンパク質又は核酸の発現は、Ｂ細胞障害と相関し得る。
【００２２】
[0022]本発明のいくつかの実施形態は、ワクチンを含む。Ｂ細胞障害を治療するためのワクチンは、宿主の血液中に脱落しないか又は対応する分泌Ｉｇ中に存在しない免疫グロブリン結合細胞表面決定基を標的にするターゲティングエレメントを含むターゲティング調製物、及び、生理学的に許容可能なキャリアを含み得る。このワクチンは、アジュバント又は免疫賦活性の薬剤を含む生理学的に許容可能な担体をさらに含み得る。
【詳細な説明】
【００２３】
[0024]本発明は、ターゲティングエレメント、例えばＩＡＣＳＤ結合ポリペプチド、ＩＡＣＳＤをコードする核酸、抗ＩＡＣＳＤ抗体（これらのエレメントのいずれかのフラグメント又は操作された産物又は他の修飾体を含む）を用いる、免疫グロブリン結合細胞表面決定基（ＩＡＣＳＤ）を発現するＢ細胞の特異的なサブセットを標的にする方法に関する。ある実施形態では、これらのターゲティングエレメントはｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかでＢ細胞に投与されるであろう。本発明の対象のＩＡＣＳＤは、宿主の血液中を循環する免疫グロブリン上に存在しない細胞外決定基である。したがって、特異的にこれらのＩＡＣＳＤを標的にするターゲティングエレメントは、循環している免疫グロブリン分子に結合することなく、腫瘍細胞上の抗体に結合できる。
【００２４】
[0025]カテゴリーとして、ＩＡＣＳＤは一般にＢ細胞の特定のサブセットにより特異的に発現されるが、対応する分泌されたＩｇ上に見いだされないすべての免疫グロブリン関連ペプチドを包含する。ＩＡＣＳＤペプチドは、免疫グロブリンアイソタイプのあらゆるタイプと結合し得る。例えば、配列番号１〜８のペプチドは、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ｌｇＭ及びＩｇＤと関連したペプチドを包含する。本発明によるターゲティングのために有用なＩＡＣＳＤとしての特異的な配列の非限定例には以下のペプチドが含まれる。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
[0026]ある実施形態では、本発明は、ＩＡＣＳＤ発現Ｂ細胞と関連する疾患及び障害を診断及び治療する新しい手法を提供する。この手法は、個体にターゲティング調製物、例えばワクチン、抗原提示細胞、又は操作された構築物、ＩＡＣＳＤ結合ポリペプチド、配列番号１〜８をコードする核酸等のターゲティングエレメントを含む医薬組成物、及び／又は抗ＩＡＣＳＤ抗体を有効量、投与するステップを含む。多くの場合、ＩＡＣＳＤ発現Ｂ細胞の細胞膜上のＩＡＣＳＤのターゲティングは、このような細胞の増殖を阻害するか又は破壊し得る。一般にＩＡＣＳＤ発現Ｂ細胞の増殖を阻害するか又は破壊するための有効量は、細胞膜上のＩＡＣＳＤを標的にし、且つ、ＩＡＣＳＤ発現Ｂ細胞の増殖を阻害するか又は破壊するために必要なこのようなＩＡＣＳＤターゲティング調製物の量であるであろう。
【００２７】
[0027]本発明のさらなる実施形態は、一般にＢ細胞障害を治療するのに用いられる治療剤及びアジュバント剤を有するＩＡＣＳＤ調製物を投与することにより、ＩＡＣＳＤ発現Ｂ細胞と関連する疾患を治療及び管理するのに用いられる治療剤及び補助剤の効果を促進する。例えば、腫瘍性疾患の治療に有用な化学療法剤及び抗増殖性薬剤及び免疫抑制のために用いられる薬剤には、以下の薬剤を含むアルキル化剤を含み得る：メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン及びクロラムブシル等のナイトロジェンマスタード；カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、及びセムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）等のニトロソウレア；トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオリンアミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン）等のエチレンイミン／メチルメラミン；ブスルファン等のアルキルスルホナート；ダカルバジン（ＤＴＩＣ）等のトリアジン；メトトレキセート及びトリメトレキサート等の葉酸アナログ、５−フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２’−ジフルオロデオキシシチジン等のピリミジンアナログ、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２’−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、フルダラビンホスフェート、及び２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ）等のプリンアナログを含む代謝拮抗剤；パクリタキセル、ビンブラスチン（ＶＬＢ）を含むビンカアルカロイド、ビンクリスチン、及びビノレルビン、タキソテール、エストラムスチン、及びエストラムスチンホスフェート等の細胞分裂阻害剤を含む天然産物；エトポシド及びテニポシド等のエピポドフィロトキシン；アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｍｏｍｙｃｉｎ）、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ、及びアクチノマイシン等の抗生物質；Ｌ−アスパラギナーゼ等の酵素；インターフェロンアルファ、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦ等の生物学的応答調節物質；シスプラチン及びカルボプラチン等のプラチナ配位化合物、ミトキサントロン等のアントラセンジオン、ヒドロキシウレア、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）及びプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体等の置換ウレア、ミトーテン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）及びアミノグルテチミド等の副腎皮質抑制剤を含む種々の薬剤；プレドニソン及び等価物、デキサメサゾン等の副腎皮質ステロイドアンタゴニスト、及びアントラサイクリンを含むホルモン及びアンタゴニスト、及びプロテアソームインヒビター及びサリドマイド又は抗血管新生剤。
【００２８】
[0028]さらにＢ細胞障害の管理に用いられる補助的療法は、例えばＸ線増感剤、グロブリンやベータ−ガラクトシダーゼ等の異種性タンパク質と抗原の結合、又は免疫感作中のアジュバントの包含を含む。
【００２９】
[0029]ある場合には、標的反応をもたらすレベルを達成するために一部の治療剤に高用量が必要となる。しかしまたこれらの高用量は、用量関連副作用の頻度が高いことと関連し得る。対照的に、ＩＡＣＳＤ発現Ｂ細胞を特異的に標的にする本発明の方法とＢ細胞関連障害を治療するのに一般に用いられる薬剤の併用法は、このような薬剤の比較的低用量の使用を可能にし、このことは、従来の治療剤の長期投与と一般に関連する有害な副作用の頻度の低減をもたらし得る。したがって、本発明の方法の別の適用は、ＩＡＣＳＤ発現Ｂ細胞と関連する疾患の従来の治療に関連する有害な副作用を低減することである。
【００３０】
定義
[0030]本明細書中で使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン及び免疫グロブリン（例えばＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭとＩｇＥ）のいかなる抗原結合部分、すなわち、特異的に抗原と結合（「免疫反応する」）する抗原結合部位を含むポリペプチドを意味する。抗体は、少なくとも１つのジスルフィド結合により相互に連結した少なくとも１つの重（Ｈ）鎖及び少なくとも１つの軽（Ｌ）鎖を含むことができる。「ＶＨ」という用語は、抗体のＨ鎖可変領域を意味する。「ＶＬ」という用語は、抗体のＬ鎖可変領域を意味する。例示的な実施形態において、「抗体」という用語は、具体的にはモノクローナル及びポリクローナル抗体を包含する。「ポリクローナル抗体」とは、１つの抗原又は複数の抗原で免疫された動物の血清に由来した抗体を意味する。「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ細胞の単一クローンにより生産された抗体を意味する。モノクローナル抗体を作製するための技術には、限定されるものではないが、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５  ４９７を参照のこと）；トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２を参照のこと）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５  Ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、ｐｐ．７７  ９６を参照のこと）及びファージディスプレイが含まれる。
【００３１】
[0031]核酸の「フラグメント」という用語は、少なくとも約５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約９ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約１１ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約１７ヌクレオチドであるヌクレオチド残基の配列を意味する。このフラグメントは、好ましくは約１００ヌクレオチド未満、好ましくは約７５ヌクレオチド未満、より好ましくは約１００ヌクレオチド未満、より好ましくは約５０ヌクレオチド未満、最も好ましくは３０ヌクレオチド未満である。ある実施形態では、このフラグメントをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、種々のハイブリダイゼーション法又はマイクロアレイ法に用いて、ｍＲＮＡ又はＤＮＡ分子の同一又は関連した部分を同定又は増幅することができる。フラグメント又はセグメントは、本発明のそれぞれのポリヌクレオチド配列をユニークに同定し得る。ある実施形態では、このフラグメントは、実質的にＩＡＣＳＤの部分と同様な配列を含む。一般に実質的に同様とは、少なくとも８５％、好ましくは９５％を超える配列類似性を共有する配列を含む。
【００３２】
[0032]ポリペプチド「フラグメント」とは、少なくとも約５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約７個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約９個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約１３個かそれ以上アミノ酸のアミノ酸残基の連続である。このペプチドは、好ましくは約３５個のアミノ酸未満、より好ましくは３２個のアミノ酸未満である。多くの実施形態において、このペプチドは約５個から約３５個のアミノ酸である。活性を有するためには、すべてのポリペプチドは、生物学的及び／又は免疫学的活性を示すために十分な長さを有しなければならない。「免疫原性」という用語は、適切な動物又は細胞において特異的な免疫応答を誘導し且つ特異的抗体と結合するための、自然、組換え又は合成ＩＡＣＳＤ様ペプチド、又はそれらの任意のペプチドの能力を意味する。
【００３３】
[0033]「変異体」（又は「アナログ」）という用語は、例えば組換えＤＮＡ技術を用いて操作されたアミノ酸の挿入、欠失及び置換により自然のポリペプチドと異なる任意のポリペプチドを意味する。所望の活性を損なわずにどのアミノ酸残基が置換、添加又は除去され得るかを決定する方法は、相同のペプチドの配列と特定のポリペプチドの配列を比較すること及び高い相同性部位（保存された部位）で起こったアミノ酸配列変化の数を最小化することにより、又はアミノ酸をコンセンサス配列で置換することにより見いだされ得る。ある実施形態では、ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントは、天然のポリペプチドに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％のアミノ酸の同一性を有する変異体を含む。一致した位置の数をもたらす同一性のパーセンテージは、両方の配列において同一のアミノ酸残基が生じる位置の数を測定することにより算出される。配列を整列させ、同一性のパーセンテージを算出するためのアルゴリズムは、当分野において良く知られている（例えばＢＬＡＳＴ）。
【００３４】
[0034]或いは、これらの同じ又は類似したポリペプチドをコードする組み換え型の変異体が、遺伝コードの「重複」を使用することにより合成又は選択され得る。種々の制限酵素認識部位を生じるサイレント変異等の種々のコドン置換を、プラスミド若しくはウイルスベクター中へのクローニング、又は、特定の原核生物若しくは真核生物系における発現を最適化するために導入できる。リガンド結合、親和性、鎖間親和性、若しくは分解／代謝率のような特性を変えるためのポリヌクレオチド配列における突然変異は、ポリペプチドの任意の部分の特性を変更するためにポリペプチドに加えられたポリペプチド又は他のペプチドのドメイン中に反映され得る。
【００３５】
ＩＡＣＳＤの免疫ターゲティング
[0035]また免疫ターゲティングは、操作された産物、結合するペプチド若しくは抗体、抗体フラグメント等の免疫系の成分、又は、標的に対する免疫系の感作された細胞の投与を含み得る。抗ＣＤ２０及び抗ＣＤ２２抗体は、適切な抗体の２つの例である。抗体フラグメント又は抗体を用いる癌細胞を免疫ターゲティングする方法は、当分野において良く知られている。例えば米国特許第６，３０６，３９３号は、Ｂ細胞悪性腫瘍の免疫療法における抗ＣＤ２２抗体の使用を記載し、米国特許第６，３２９，５０３号は、蛇行性膜貫通抗原を発現する細胞の免疫ターゲティングを記載する。
【００３６】
[0036]ＩＡＣＳＤ抗体（場合によっては細胞傷害作用薬に結合された、ヒト化若しくはヒトモノクローナル抗体又はそれらのフラグメント若しくは他の修飾体を含む）は、抗体がＢ細胞により発現されたＩＡＣＳＤに結合し、且つ、細胞の破壊を媒介し及び／又は細胞の増殖を阻害するように個体に導入され得る。この開示を限定するものではないが、このような抗体が治療効果を発揮することができるメカニズムには、補体介在性細胞溶解、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）、ＩＡＣＳＤの生理的機能を調節すること、結合若しくはシグナル伝達経路を阻害すること、腫瘍細胞分化を調節すること、腫瘍血管新生因子プロフィールを変更すること、免疫を促進する若しくは腫瘍を抑制するサイトカイン及び増殖因子の分泌を調節すること、細胞接着を調節すること、及び／又は、アポトーシスを誘導することが含まれ得る。また放射性リガンド又はサイトゾル毒素等の毒性薬剤又は治療剤に結合されたＩＡＣＳＤ抗体を、ＩＡＣＳＤを有するＢ細胞に毒性剤又は治療剤を直接に送達するために治療的に使うことができる。
【００３７】
[0037]ある実施形態では、ＩＡＣＳＤ抗体を、臓器移植を受ける患者又は関節炎等の自己免疫の疾患を有する患者で免疫系を抑制するために用いることができる。健全な免疫細胞は、これらの抗体により標的にされ、細胞死及びその系からの排除に導かれ、したがってＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ又はＩｇＥの産生を特異的に阻害することにより免疫系を抑制するであろう。
【００３８】
[0038]抗ＩＡＣＳＤ抗体治療はＢ細胞系統のサブセットの癌の全ての病期に有用であり得るが、抗体治療は進行性又は転移性癌で特に適切であり得る。抗体治療を用いる治療は、１つ又は複数の化学療法を受けた患者に対して示され得るが、化学療法、放射線又は外科療法と抗体治療方法の併用は、化学療法治療を受けていない患者においてより好適であり得る。さらに抗体治療はまた、特に化学療法剤の毒性にあまり良好に耐えられない患者において、同時併用の化学療法の低減した用量の使用を可能にすることができる。さらにまた抗ＩＡＣＳＤ抗体を用いる化学療法剤に対して耐性の腫瘍を有する癌患者の治療は、組合せによりこれらの化学療法剤に対する感受性及び応答を誘導する可能性がある。
【００３９】
[0039]抗ＩＡＣＳＤ免疫ターゲティングの前に、好ましは腫瘍組織の免疫組織化学的評価、定量的ＩＡＣＳＤ画像化、定量ＲＴ−ＰＣＲ、又は、ＩＡＣＳＤ発現の存在及び程度を確実に示すことでできるその他の技術を用いて、患者を腫瘍細胞によるＩＡＣＳＤ発現の存在及びレベルについて評価することができる。例えば、血液又はバイオプシー試料を、ＩＡＣＳＤ発現Ｂ細胞の存在を測定するか又は試料中の細胞表面上のＩＡＣＳＤ発現の程度を測定する免疫組織化学的な方法によって評価することができる。腫瘍組織の免疫組織化学的分析方法は、当該分野で一般的に周知である。
【００４０】
[0040]癌治療に有用な抗ＩＡＣＳＤ抗体は、腫瘍に対して強力な免疫応答を開始でき及び直接的に細胞障害できる抗ＩＡＣＳＤ抗体を含む。この点に関して、抗ＩＡＣＳＤ  ｍＡｂは補体介在性又はＡＤＣＣメカニズムのどちらかによって腫瘍細胞溶解を誘発でき、この両方はエフェクター細胞Ｆｃ受容体部位又は補体タンパク質との相互作用のために免疫グロブリン分子の完全なＦｃ部分を必要とする。さらに腫瘍増殖に対して直接的な生物学的効果を及ぼす抗ＩＡＣＳＤ抗体は、本発明の実施において有用である。このような直接に細胞障害性抗体が作用し得る潜在的メカニズムには、細胞増殖の阻害、細胞分化の調節、腫瘍血管新生因子プロフィールの調節、及び、アポトーシスの誘導が含まれる。特定の抗ＩＡＣＳＤ抗体が抗腫瘍効果を及ぼすメカニズムを、当技術で一般的に知られているように、ＡＤＣＣ、ＡＤＭＭＣ、補体介在性細胞溶解等を測定するように設計された種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて評価することができる。
【００４１】
[0041]特定の抗ＩＡＣＳＤ抗体の抗腫瘍活性、又は抗ＩＡＣＳＤ抗体の組合せを、適切な動物モデルを用いてｉｎ  ｖｉｖｏ評価することができる。例えば、ヒトリンパ腫細胞が、ヌードマウス又はＳＣＩＤ  マウス等の免疫不全動物に導入される異種のリンパ腫癌モデルを、評価のために使用できる。腫瘍形成、腫瘍退縮又は転移等の阻害を評価するアッセイを用いて有効性を予測することができる。
【００４２】
[0042]マウス又は他の非ヒトモノクローナル抗体、ヒト／マウスキメラｍＡｂの使用は、これらは腫瘍への抗体の送達には有効でないため、一般に好ましくないことに留意されたい。さらにこれらの非ヒトモノクローナル抗体は、一部の患者で中等度から強度の免疫応答を誘導することがある。最も重篤な場合には、このような免疫応答は免疫複合体の大量形成を導く可能性があり、場合によっては腎不全等の組織損傷を生じ得る。したがって、本発明の治療法の実施において使われる好ましいモノクローナル抗体は、完全にヒト又はヒト化され高い親和性で特異的に標的ＩＡＣＳＤ抗原に結合するが、患者において抗原性が低いか又は抗原性を示さないモノクローナル抗体である。
【００４３】
[0043]本発明の方法は、単一の抗ＩＡＣＳＤモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、及び、異なるｍＡｂの組合せ又は「カクテル」の投与を意図する。ＩＡＣＳＤに結合する２つ又はそれ以上のモノクローナル抗体は、単一の抗体と比べて改善された効果を提供し得る。或いは異なる抗原を結合する抗体と抗ＩＡＣＳＤ抗体との組合せは、単一の抗体と比べて改善された効果を提供し得る。このようなｍＡｂカクテルは、これらが異なるエフェクターメカニズムを利用するか、又は、免疫エフェクター機能に依存するｍＡｂと細胞障害性ｍＡｂを直接に組み合わせたｍＡｂを含むので、特定の利点を有し得る。このようなｍＡｂの組合せは、相乗的治療効果を示し得る。さらに抗ＩＡＣＳＤ  ｍＡｂの投与と、種々の化学療法剤、アンドロゲンブロッカー、及び免疫のモジュレーター（例えばＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ）を含むがこれに限定されない他の治療剤とを組み合わせることができる。抗ＩＡＣＳＤ  ｍＡｂは、その「裸の」又は複合していない形態で投与され得るか、又は、これらに結合された治療剤を有し得る。さらに二重特異性抗体を使用できる。このような抗体は、ＩＡＣＳＤに特異的な１つの抗原の結合ドメイン及び別の抗原（例えばＣＤ２０等）に特異的な他の抗原の結合ドメインを有する。最後にＦａｂ  ＩＡＣＳＤ抗体又はこれらの抗体のフラグメント（他のタンパク質配列又は毒素に結合したフラグメントを含む）もまた、治療剤として使用できる。
【００４４】
１．抗ＩＡＣＳＤ抗体
[0044]特異的にＩＡＣＳＤを結合する抗体は、ＩＡＣＳＤを発現するＢ細胞のサブセットの免疫ターゲティング、並びに、障害に含まれるＢ細胞のサブセットがＩＡＣＳＤを発現する疾患又は障害の診断のための組成物及び方法において有用である。ＩＡＣＳＤを発現するＢ細胞のサブセットの例には、プラズマ細胞及びプラズマ細胞系統の細胞が含まれる。このような抗体は、モノクローナル及びポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、二機能性／二重特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、並びに、特異的にＩＡＣＳＤを認識するＣＤＲ及び／又は抗原結合配列を含む化合物を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体を含む。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ、並びに、操作された構築物を含む抗体フラグメントも有用である。
【００４５】
[0045]抗体及び抗体フラグメントに関して、「特異的である」又は「特異的に認識する」という用語は、抗体の可変領域がＩＡＣＳＤを認識して結合する（すなわち、ポリペプチドファミリーで見いだされる配列同一性、相同性又は類似性にもかかわらず、可変領域が他の類似したポリペプチドからＩＡＣＳＤを識別することができる）ことを示す。ほとんどのその他の抗原と比べ抗体が好ましくその抗原に結合する場合、抗体は抗原又は抗原のエピトープを「特異的に認識する」。典型的には特異的な結合は、抗体結合部位と標的外の分子間よりも抗体結合部位と標的抗原間で強い結合を生じる。特異的な結合に関して、その同族の抗原に対する抗体結合部位の親和定数は、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、好ましくは少なくとも１０１０、又はさらに好ましく少なくとも１０１１リットル／モルであり得る。抗ＩＡＣＳＤ抗体の結合特異性を測定することができるスクリーニングアッセイは、当該技術分野で周知であり日常的に実施される。どのようにして抗体の結合特異性を測定するかの例については、Ｃｈａｐｔｅｒ  ６、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８８）を参照のこと。
【００４６】
[0046]動物を免疫してＩＡＣＳＤと特異的に反応するポリクローナル及びモノクローナル抗体を得るために、ＩＡＣＳＤ結合ポリペプチドを用いることができる。このような抗体は、免疫原として完全なタンパク質か又はこれらのフラグメントを用いて得ることができる。ペプチド免疫原はさらにカルボキシル末端にシステイン残基を含むことができ、ペプチド免疫原はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のハプテンに結合され得る。このようなペプチドを合成する方法は、以前に記載されている（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５、２１４９〜２１５４（１９６３）；Ｋｒｓｔｅｎａｎｓｋｙら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１１：１０（１９８７））。所望の抗体を産生することができるポリクローナル及びモノクローナル抗体並びにハイブリドーマを調製するための技術も、すでに開示されている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８４）；Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：１〜２１（１９９０）；ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７（１９７５））、ｔｈｅ  ｔｒｉｏｍａ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅら、ｉｎ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、ｐｐ．７７〜９６（１９８５））。
【００４７】
[0047]抗体を産生できる任意の動物を、ＩＡＣＳＤペプチド又はポリペプチドを用いて免疫することができる。免疫する方法には、ポリペプチドの皮下又は腹腔内注射が含まれる。免疫に用いるＩＡＣＳＤペプチド又はポリペプチドの量は、免疫する動物、ペプチドの抗原性及び注射の部位に依存する。免疫原として用いるＩＡＣＳＤペプチド又はポリペプチドは、修飾され得るか又はタンパク質の抗原性を増加させるためにアジュバント中で投与され得る。タンパク質の抗原性を増加させる方法は当分野において良く知られており、限定されるものではないが、異種のタンパク質（グロブリン又はβ−ガラクトシダーゼ等）と抗原を結合させること又は免疫の間にアジュバントの包含を介する異種のタンパク質と抗原を結合させることが含まれる。
【００４８】
[0048]ある実施形態では、抗体は当分野で知られているファージディスプレイ方法を用いて、ＩＡＣＳＤに対して作製されるであろう。ファージディスプレイを用いて抗体を作製すること説明する参照文献の例には、Ｈｕｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ  ９８（５）：２６８２〜２６８７（２００１）及びＬｉｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５：１０６３〜１０７３（２００２）が含まれる。動物モデルを介する従来の抗体産生と比較してファージ技術を用いる利点は、特定の動物において一部のＩＡＣＳＤペプチドが免疫原性を持たない場合があり、ファージディスプレイ技術は、次いで「ヒト」抗体に操作できるペプチド−ペプチド結合相互作用に対する明確な洞察を可能にすることである。
【００４９】
[0049]モノクローナル抗体用の、免疫した動物由来の脾臓細胞を摘出し、ＳＰ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞等のミエローマ細胞と融合してモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞にすることができる。当分野で周知の多くの方法のいずれか１つを用いて、所望の特性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定することができる。これらの方法には、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析又はラジオイムノアッセイを用いてハイブリドーマをスクリーニングすることが含まれる（Ｌｕｔｚら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１７５：１０９〜１２４（１９８８））。所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローニングし、当分野で知られている手法を用いてクラス及びサブクラスを決定する（Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ａ．Ｍ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８４））。単鎖抗体の産生について記載された技術を、ＩＡＣＳＤに対する単鎖抗体を産生するために適用することができる。一般に単鎖抗体のための技術が、米国特許第４，９４６，７７８号に示されている。
【００５０】
[0050]ポリクローナル抗体用に、抗体を含む抗血清を免疫した動物から分離し、上記の手法の１つを用いて所望の特異性を有する抗体の存在についてスクリーニングする。
【００５１】
[0051]げっ歯類由来の抗体は、ヒトに投与した場合この抗体に対する強い免疫応答を誘発する傾向があり、げっ歯類以外の抗体を用いることが有利であり得る。投与された抗体に対して強い免疫応答をもたらさない抗体を産生する方法が、当分野において良く知られている。例えば抗ＩＡＣＳＤ抗体は、非ヒト霊長類の抗体とすることができる。このような抗体をヒヒで作製する方法が国際公開第９１／１１４６５号パンフレット及びＬｏｓｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：３１０〜３１４（１９９０）で開示されている。
【００５２】
[0052]１つの実施形態では、抗ＩＡＣＳＤ抗体はヒト化モノクローナル抗体である。「ヒト化抗体」（ＨｕＡｂ）という用語は、非ヒト抗体由来のＣＤＲを有するヒト骨格と実質上同一（すなわち、少なくとも８５％）の骨格領域を有し、いずれの定常領域がヒト免疫グロブリン定常領域に対して少なくとも約８５％、９０％、好ましくは約９５％のポリペプチド配列同一性を有するキメラ抗体を意味する。例えばＰＣＴ国際公開第９０／０７８６１号パンフレット及び欧州特許第０４５１２１６号パンフレットを参照のこと。このようなＨｕＡｂの全ての部分は、おそらくはＣＤＲ以外は１つ又は複数の天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。ヒト化抗体を作製する方法は、以前に記載されている。（米国特許第５，９９７，８６７号及び第５，９８５，２７９号、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）；Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５〜４２８９（１９９２）；Ｓａｎｄｈｕ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７〜４６２（１９９２）；及びＳｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４〜２８５７（１９９３））。抗体のヒト化は、可変領域のヒト骨格にマウスＣＤＲ（抗原結合に関与する）の遺伝的移植を含むＣＤＲ移植により実施できる。ＣＤＲペプチド（「最小の認識単位」）は、所望の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することにより得ることができる。このような遺伝子は、例えばポリメラーゼ連鎖反応を用いて抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することにより調製される。この手法は、Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：１０６（１９９１）；Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ，ｐｐ．１６６〜１７９  ｉｎ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｒｉｔｔｅｒら編、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；及びＷａｒｄら、ｐｐ．１３７〜１８５  ｉｎ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｂｉｒｃｈら編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．（１９９５）に詳細に記載されている。マウスＣＤＲを含むヒト化抗体は、ヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニックマウスにより産生される。このようなマウスに由来するハイブリドーマは、大量のヒト化モノクローナル抗体を分泌するであろう。トランスジェニックマウスからヒト化抗体を得る方法は、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３〜２１（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）、及びＴａｙｌｏｒら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）に記載されている。
【００５３】
[0053]本発明はまた、抗ＩＡＣＳＤ抗体フラグメントの使用を含む。抗体フラグメントは、抗体のタンパク質加水分解により又はフラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌での発現により調製することができる。抗体フラグメントは、完全な抗体のペプシン又はパパイン消化によって得ることができる。例えば抗体フラグメントは、ペプシンを用いる抗体の酵素切断によって作製し、Ｆ（ａｂ’）２と表すフラグメントを提供することができる。このフラグメントは、チオール還元剤を用いてさらに切断することができ、場合によってはスルフヒドリル基の保護基がジスルフィド結合の切断から生じてＦａｂ’１価フラグメントを生成する。或いはペプシンを用いる酵素切断は、直接に２つの１価のＦａｂフラグメント及びＦｃフラグメントを生成する。これらの方法は、米国特許第４，０３６，９４５号及び第４，３３１，６４７号、Ｎｉｓｏｎｏｆｆら、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０（１９６０）；Ｐｏｒｔｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９（１９５９）、及びＥｄｅｌｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１：４２２（１９６７）に以前に記載されている。１価のＬ−Ｈ鎖フラグメントを形成するＨ鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、又は、他の酵素的、化学的若しくは遺伝的技術等の抗体を切断する他の方法も、フラグメントが完全な抗体により認識される抗原に結合するかぎりは用いることができる。例えば、Ｆｖフラグメントは非共有結合性であり得るＶＨ及びＶＬ鎖の結合を含む。或いは分子間ジスルフィド結合又はグルタールアルデヒド等の化学物質による架橋結合によって可変鎖を結合できる。
【００５４】
[0054]１つの実施形態では、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによって結合されたＶＨ及びＶＬ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって結合されたＶＨ及びＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、これは次いで大腸菌等の宿主細胞に導入される。組み換え型の宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖｓを作製する方法は、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｗｈｉｔｌｏｗら、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：９７（１９９１）；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３（１９８８）；及びＰａｃｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１（１９９３）に以前に記載されている。
【００５５】
[0055]本発明は、さらに検出可能的に標識された形態で上記の抗体を提供する。抗体は、放射性同位元素、親和性標識（例えばビオチン、アビジン等）、酵素的標識（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、蛍光標識（例えばＦＩＴＣ又はローダミン等）、常磁性原子等で検出可能に標識することもできる。このような標識化を達成するための手法は、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５（１９７０）；Ｂａｙｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８（１９７９）；Ｅｎｇｖａｌら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９（１９７２）；及びＧｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５（１９７６）に以前に詳細に開示されている。標識された抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、及びｉｎ  ｓｉｔｕアッセイで用いて、ＩＡＣＳＤが発現されるＢ細胞を同定することができる。
【００５６】
２．抗ＩＡＣＳＤ抗体コンジュゲート
[0056]本発明は、「裸の」抗ＩＡＣＳＤ抗体の使用、並びに、免疫コンジュゲートの使用を意図する。免疫コンジュゲートは、抗体成分に細胞傷害作用薬等の治療剤を間接的に結合することによって調製することができる。例えば毒性部分には、アブリン、リシン、モデッシン、ビスクミン（ｖｉｓｃｕｍｉｎ）、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモリディン（ｍｏｍｏｒｉｄｉｎ）、トリコサンチン、オオムギ毒素等の植物毒素；ジフテリアトキシン、シュードモナス・エンドトキシン及びエキソトキシン、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ等の細菌毒素；α−サルシン、レストリクトシン等の真菌毒素；細胞外膵臓ＲＮアーゼ等の細胞障害性ＲＮアーゼ；ＤＮアーゼＩ；カリケアマイシン、並びに、３２Ｐ、６７Ｃｕ、７７Ａｓ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１２１Ｓｎ、１３１Ｉ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９４Ｉｒ、及び１９９Ａｕ等の放射性同位元素が含まれる。例えば、ヒトでＢ細胞性リンパ腫に対するイットリウム９０結合抗ＣＤ２０抗体を用いる臨床試験が進行中である（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８（Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ９１〜Ｓ９５（２００１））。
【００５７】
[0057]治療剤に結合のための一般的な技術は、米国特許第６，３０６，３９３号及び第５，０５７，３１３号、Ｓｈｉｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４１：８３２〜８３９（１９８８）；及びＳｈｉｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：１１０１〜１１０６（１９９０）に以前に記載されている。一般的な方法は、酸化された炭水化物部分を有する抗体成分を、少なくとも１つの遊離アミン官能基を有し、且つ、複数の薬剤、毒素、キレート剤、ボロンアデンド（ｂｏｒｏｎ  ａｄｄｅｎｄ）又は他の治療剤がロードされた担体ポリマーと反応させることを含む。この反応は、開始のシッフ塩基（イミン）結合を生じ、この結合は第二アミンに還元して最終的なコンジュゲートを形成することにより安定化することが可能である。
【００５８】
[0058]担体ポリマーは、他の実質的に同等のポリマー担体も使用可能であるが、少なくとも５０個のアミノ酸残基を有するアミノデキストラン又はポリペプチドであることが好ましい。最終的な免疫コンジュゲートは、治療に使用するために投与を容易にし、且つ、効果的なターゲティングのために、哺乳動物の血清等の水溶液に可溶性を有することが好ましい。したがって担体ポリマー上の官能基を可溶化することは、最終的な免疫コンジュゲートの血清溶解性を高めるであろう。特にアミノデキストランが好ましい。
【００５９】
[0059]アミノデキストラン担体を有する免疫コンジュゲートを調製する過程は、典型的にはデキストランポリマー、好的には約１０，０００〜１００，００の平均分子量のデキストランを用いて開始される。デキストランを酸化剤と反応させて、その炭水化物環部分の制御された酸化を行い、アルデヒド基を生成する。この酸化は通常の手順に従い、ＮａＩＯ４等の解糖化学試薬で簡便に達成される。次いで酸化デキストランを、ポリアミン、好ましくはジアミン、より好ましくはモノ又はポリヒドロキシジアミンと反応させる。適切なアミンには、エチレンジアミン、プロピレンジアミン又は他の同様のポリメチレンジアミン類、ジエチレントリアミン若しくは同様のポリアミン類、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン、又は他の同様のヒドロキシル化ジアミン若しくはポリアミン類等が含まれる。デキストランのアルデヒド基に対して過剰のアミンが、確実にアルデヒド官能基をシッフ塩基基に実質的に完全に変換するために用いられる。ＮａＢＨ４、ＮａＢＨ３ＣＮ等の還元剤が、得られたシッフ塩基中間体の還元安定化を達成するために用いられる。通常のサイズ分別カラム又は限外濾過メンブレンを通過させて架橋結合したデキストランを除去することにより、得られた付加物を精製することができる。アミン官能基を導入するデキストランを誘導体化する他の通常の方法、例えば臭化シアンと反応させ、次いでジアミンと反応させる方法も用いることができる。
【００６０】
[0060]次いでアミノデキストランを、ロードしようとする特定の薬剤の誘導体、毒素、キレート剤、免疫修飾物質、ボロンアデンド又は他の治療剤と反応させて中間体付加物を形成する。これらの治療剤は、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又はこれらの水溶性変種を用いて、通常の方法によって調製された活性化された形態であり、好ましくはカルボキシル活性化誘導体である。或いは、ヨウシュヤマゴボウの抗ウイルスタンパク質又はリシンＡ鎖等のポリペプチド毒素は、グルタールアルデヒド縮合により又はタンパク質上の活性化されたカルボキシル基とアミノデキストラン上のアミンとを反応させることにより、アミノデキストランに結合することができる。
【００６１】
[0061]放射性金属又は磁気共鳴エンハンサーに対するキレート剤は、当分野では周知である。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の誘導体及びジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）がその典型である。これらのキレート剤は、典型的には側面鎖上に基を有しており、これによりキレート剤を担体に結合させることができる。このような基には、例えばベンジルイソチオシアネートが含まれ、これによってＤＴＰＡ又はＥＤＴＡが担体のアミン基に結合することができる。或いは、キレート剤上のカルボキシル基又はアミン基を、周知の手段で活性化又は事前の誘導体化後に結合することにより担体に結合することができる。
【００６２】
[0062]通常の方法によって、カルボラン等のボロンアデンドを抗体成分に結合させることができる。例えば、当該技術分野において周知のように、カルボランはペンダント側鎖のカルボキシル官能基を用いて調製することができる。このようなカルボランの担体への結合、例えばアミノデキストランへの結合は、カルボランのカルボキシル基を活性化し、担体のアミンを縮合させて中間コンジュゲートを生成することにより達成することができる。次いで以下に記述されるように、このような中間コンジュゲートを抗体成分に結合させて、治療上有用な免疫コンジュゲートを生成する。
【００６３】
[0063]ポリペプチド担体をアミノデキストランの代わりに用いることができるが、ポリペプチド担体は鎖中に少なくとも５０個のアミノ酸残基、好ましくは１００〜５０００個のアミノ酸残基を有しなければならない。少なくともいくつかのアミノ酸は、リシン残基又はグルタミン酸又はアスパラギン酸残基であるべきである。リシン残基のペンダントアミン並びにグルタミン及びアスパラギン酸のペンダントカルボキシレートは、薬剤、毒素、免疫修飾物質、キレート剤、ボロンアデンド又は他の治療剤の結合に好都合である。適切なポリペプチド担体の例には、得られたロード担体及び免疫コンジュゲートに所望の溶解特性を与えるための、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、これらのコポリマー、並びに、これらのアミノ酸及びその他、例えばセリンの混合ポリマーが含まれる。
【００６４】
[0064]中間コンジュゲートと抗体成分との結合は、抗体成分の炭水化物部分を酸化し、得られたアルデヒド（及びケトン）のカルボニルを、薬剤、毒素、キレート剤、免疫修飾物質、ボロンアデンド又は他の治療剤をロードした後に担体に残るアミン基と反応させることにより達成される。或いは、治療剤をロードした後に中間コンジュゲートに導入されたアミン基を介して、中間コンジュゲートを酸化した抗体成分に結合させることができる。酸化は、例えばＮａＩＯ４若しくは他の解糖試薬を用いて化学的に、又は、例えばノイラミニダーゼ及びガラクトースオキシダーゼを用いて酵素的に都合よく達成される。アミノデキストラン担体の場合には、典型的にはアミノデキストランの全てのアミンが治療剤のロードに用いられるわけではない。アミノデキストランの残余のアミンは、酸化された抗体成分に縮合してシッフ塩基付加物を形成し、このシッフ塩基付加物は、次いで通常ホウ化水素還元剤を用いて還元的に安定化される。
【００６５】
[0065]本発明による他の免疫コンジュゲートの生成に、類似の手順が用いられる。ロードしたポリペプチド担体は、抗体成分の酸化された炭水化物部分との縮合のための残余の遊離リシン残基を有するのが好ましい。必要ならば、ポリペプチド担体のカルボキシルを、例えばＤＣＣで活性化して過剰のジアミンと反応させることにより、アミンに変換することができる。
【００６６】
[0066]Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００でのサイズクロマトグラフィー、又は、１つ若しくは複数のＩＡＣＳＤエピトープを用いるアフィニティークロマトグラフィー等の通常の技術を用いて、最終的な免疫コンジュゲートを精製することができる。
【００６７】
[0067]或いは抗体成分を治療剤と直接に結合することにより、免疫コンジュゲートを調製することができる。一般的な手順は、治療剤を酸化された抗体成分に直接に結合させることを除いて、間接的結合方法に類似している。他の治療剤を、本明細書に記載されたキレート剤の代わりに用いることが可能であることが理解されよう。当業者であれば、過度の実験を行なうことなく結合スキームを案出することができるであろう。
【００６８】
[0068]結合スキームの例としては、ジスルフィド結合形成を介して還元された抗体成分のヒンジ領域に治療剤を結合することができる。例えば、ペプチドを抗体成分に結合するために用いる単一のシステイン残基と共に、破傷風トキソイドペプチドを構築することができる。或いは、Ｙｕら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５６：２４４（１９９４）に示されたように、このようなペプチドをＮ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオネート（ＳＰＤＰ）等のヘテロ二機能性架橋剤を用いて、抗体成分に結合することができる。このような結合のための一般的な技術を示す他の文献は、Ｗｏｎｇ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓら、ｐｐ．１８７〜２３０  ｉｎ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｂｉｒｃｈら編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９５）；及びＰｒｉｃｅ、ｐｐ．６０〜８４  ｉｎ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｅｄｓ．Ｒｉｔｔｅｒら編、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）に以前に記載されている。
【００６９】
[0069]上記のように、抗体のＦｃ領域の炭水化物部分を、治療剤を結合するために用いることができる。しかし、抗体フラグメントが免疫コンジュゲートの抗体成分として用いられる場合は、Ｆｃ領域はなくてもよい。それにもかかわらず、炭水化物部分を抗体又は抗体フラグメントのＬ鎖可変領域に導入することは可能である。次いで作製された炭水化物部分を、治療剤と結合するために用いる。
【００７０】
[0070]この結合方法の可能の多くの変法が、当分野で知られている。例えば、血液、リンパ若しくは他の細胞外液中で、完全な抗体又はそれらの抗原結合フラグメントの半減期を延長するために、ポリエチレングリコールを結合するために炭水化物部分を用いることができる。さらに、治療剤を炭水化物部分及び遊離スルフヒドリル基に結合することにより、「二価の免疫コンジュゲート」を構築することが可能である。このような遊離スルフヒドリル基は、抗体成分のヒンジ領域に位置することができる。
【００７１】
３．抗ＩＡＣＳＤ抗体融合タンパク質
[0071]抗体に結合される治療剤がタンパク質である場合は、本発明は、１つ又は複数の抗ＩＡＣＳＤ抗体部分及び免疫修飾物質又は毒素部分を含む融合タンパク質の使用を意図する。抗体融合タンパク質を作製する方法は、米国特許第６，３０６，３９３号に以前に記載されている。例えば、インターロイキン−２部分を含む抗体融合タンパク質は、Ｂｏｌｅｔｉら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．６：９４５（１９９５）、Ｎｉｃｏｌｅｔら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：１６１（１９９５）、Ｂｅｃｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８２６（１９９６）、Ｈａｎｋら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２：１９５１（１９９６）及びＨｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：４９９８（１９９６））に以前に開示されている。さらに、Ｙａｎｇら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：１２９（１９９５）は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント及び腫瘍壊死因子アルファ部分を含む融合タンパク質を記載する。
【００７２】
[0072]組換え分子が、１つ又は複数の抗体成分及び毒素又は化学療法剤を含む抗体−毒素融合タンパク質を作製する方法も、当分野で知られている。例えば、抗体−シュードモナスエキソトキシンＡ融合タンパク質が、Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：３９４（１９８９）；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８６１６（１９９１）；Ｂａｔｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５８６７（１９９２）；Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３０５４（１９９３）；Ｗｅｌｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．６０：１３７（１９９５）；Ｆｏｍｉｎａｙａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１  ：１０５６０（１９９６）；Ｋｕａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：２８７２（１９９６）；及びＳｃｈｍｉｄｔら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．６５：５３８（１９９６）に記載されている。同様に、ジフテリアトキシン部分を含む抗体−毒素融合タンパク質が、Ｋｒｅｉｔｍａｎら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ７：５５３（１９９３）；Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：５３０２（１９９３）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２８０３７（１９９５）；及びＶａｌｌｅｒａら、Ｂｌｏｏｄ  ８８：２３４２（１９９６）に記載されている。Ｄｅｏｎａｒａｉｎら、（Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  １：１７７（１９９５））は、ＲＮアーゼ部分を有する抗体−毒素融合タンパク質を記載しているが、Ｌｉｎａｒｄｏｕら、（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４〜２５：２４３（１９９４））は、ＤＮアーゼＩ成分を含む抗体−毒素融合タンパク質を作製した。当該技術分野で、ゲロニン及びブドウ球菌エンテロトキシン−Ａが、抗体−毒素融合タンパク質における毒素部分として用いられてきた（Ｗａｎｇら、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２０９ｔｈ  ＡＣＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、Ａｎａｈｅｉｍ、Ｃａｌｉｆ．、Ａｐｒ．２〜６、１９９５、Ｐａｒｔ  １、ＢＩＯＴ００５；Ｄｏｈｌｓｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８９４５（１９９４））。
【００７３】
Ａ．ＩＡＣＳＤワクチンを用いるターゲティング
[0073]本発明の１つの実施形態は、ＩＡＣＳＤに対して免疫系を刺激し、したがってＩＡＣＳＤ発現Ｂ細胞を標的にするＩＡＣＳＤ結合ポリペプチドを含むワクチンを提供する。特異的に免疫グロブリン結合細胞表面決定基を標的にするワクチンの使用は、抗癌療法の細胞性免疫及び体液性免疫を生成するためのワクチンでの周知の腫瘍抗原の使用に類似しているだろう。例えば、１つのタイプの腫瘍特異性ワクチンは、軽度悪性ろ胞性リンパ腫を有する患者への注射のために、腫瘍細胞から分離し、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合し、アジュバントと混合した精製イディオタイプタンパク質を用いる（Ｈｓｕら、Ｂｌｏｏｄ  ８９：３１２９〜３１３５１９９７））。同様の方法で、Ｂ細胞から分離された精製ＩＡＣＳＤタンパク質を、ワクチン製剤で用いることができよう。当分野で知られている腫瘍特異性ワクチンの別の例には、悪性Ｂ細胞、特にリンパ腫、慢性リンパ性白血病及び多発性骨髄腫に対する免疫応答を誘導する方法を記載する米国特許第６，３１２，７１８号に記載されたワクチンが含まれる。米国特許第６，３１２，７１８号に記載された方法は、（１）少なくとも１つのＢ細胞悪性腫瘍関連抗原、（２）ＩＬ−２単独、又は、少なくとも１つの他のサイトカイン若しくはケモカインとの組合せ、及び、（３）少なくとも１つの脂質分子を有するリポソームを含むワクチンを用いる。同様の方法を、ＩＡＣＳＤに対するワクチン接種に用いることができる。典型的には、ＩＡＣＳＤに対するワクチン接種の方法は、フラグメント、アナログ及び／又は変異体であり得るＩＡＣＳＤ結合ポリペプチドを用いる。
【００７４】
[0074]別の例として、抗原提示細胞の一種である樹状細胞を細胞ワクチンに用いることができ、ここで樹状細胞は患者から分離され、ＩＡＣＳＤ抗原と共培養され、次いで細胞ワクチンとして再注入される（Ｈｓｕら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：５２〜５８（１９９６））。
【００７５】
Ｂ．ＩＡＣＳＤをコードする核酸を用いるターゲティング
１．核酸の直接送達
[0075]ある実施形態では、組み換え型のベクター中でＩＡＣＳＤをコードする核酸、又は、これらのフラグメント、アナログ若しくは変異体をコードする核酸が用いられる。免疫応答を生じさせるための核酸の使用は、当分野で知られている。例えば、免疫応答を裸のＤＮＡの注射により誘導することができる。例えば、マウスに注射される場合、腫瘍イディオタイプタンパク質、例えばＢ細胞性リンパ腫由来のイディオタイプタンパク質のＬ鎖及びＨ鎖の両方をコードする双シストロン性ｍＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡは、防御的な抗腫瘍反応を生じることができる（Ｓｉｎｇｈら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１４００〜１４１１（２００２））。ＩＡＣＳＤのウイルスベクターは、特に細胞へのＩＡＣＳＤをコードする核酸の送達に有用である。ベクターの例には、インフルエンザ由来ベクター、アデノウィルス、ワクシニア、単純ヘルペスウィルス、鶏痘、小胞性口内炎ウイルス、カナリア痘ウイルス、ポリオウィルス、アデノ随伴ウイルス、並びに、レンチウイルス及びシンドビスウィルスが含まれる。当然ながら、非ウイルスベクター、例えばリポソーム又は裸のＤＮＡもまた、細胞へのＩＡＣＳＤをコードする核酸の送達に有用である。
【００７６】
[0076]化学療法若しくは放射線等の他のタイプの治療剤又は治療法と、免疫反応を生じさせる核酸の使用との組合せも意図される。
【００７７】
２．細胞におけるＩＡＣＳＤをコードする核酸の発現
[0077]ある実施形態では、ＩＡＣＳＤ結合ポリペプチド（フラグメント、アナログ又は変異体を含む）をコードする核酸を含むベクターが、樹状細胞又はマクロファージ等の細胞に導入される。抗原提示細胞に発現されると、ＩＡＣＳＤ抗原がＩＡＣＳＤに対する免疫応答を誘発するＴ細胞に提示される。このような方法は、当分野で知られている。腫瘍特異抗原を用いる同様の方法の使用の一例については、米国特許第６，３００，０９０号を参照のこと。ＩＡＣＳＤをコードするベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗原提示細胞に導入され得る。或いはｅｘ  ｖｉｖｏで、ＩＡＣＳＤ結合ポリペプチド又はＩＡＣＳＤ結合ポリペプチドをコードする核酸を用いて、抗原提示細胞にロードし、次いでＩＡＣＳＤに対する免疫応答を誘発するために患者に導入できる。或いはｅｘ  ｖｉｖｏで、ＩＡＣＳＤ抗原を提示する細胞を、抗ＩＡＣＳＤ細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の増殖を刺激するために用いた後、刺激されたＣＴＬを患者に導入する。腫瘍特異抗原を用いるこの代替法の例は、米国特許第６，３０６，３８８号に示されている。上記のように、このタイプの治療と他のタイプの治療剤又は化学療法若しくは放射線等の治療とを組み合わせることも意図される。
【００７８】
抗ＩＡＣＳＤ免疫ターゲティングが適用できる疾患
[0078]１つの態様において、本発明は疾患又は障害に関連するＢ細胞のサブセットがＩＡＣＳＤを発現する疾患及び病状の治療に有用な試薬と方法を提供する。これらの疾患は、癌、及び、過形成、乾癬、接触皮膚炎、免疫性障害等の他の高増殖性病態、及び、不妊症を含む場合がある。疾病又は症状に関連するＢ細胞のサブセットがＩＡＣＳＤを発現するかどうかは、本明細書に記載する診断法を用いて測定することができる。
【００７９】
[0079] 患者がＩＡＣＳＤ免疫療法に応答するか否かを測定するために、疾患を有する細胞、組織又は体液（血液、リンパ液等）におけるＩＡＣＳＤをコードするｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルの定量を用いることができる。ＩＡＣＳＤをコードするｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を検出して定量化する方法は、当分野において良く知られている標準的な核酸及びタンパク質の検出と定量化技術を使用し、この方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ（１９８９）又はＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されている。そしてこれら両方の全体をここに引用により援用する。ｍＲＮＡの検出及び定量のための標準的な方法には、標識したＩＡＣＳＤリボプローブを用いるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロット及びＩＡＣＳＤポリヌクレオチドプローブを用いる関連技術、ＩＡＣＳＤに特異的なプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ分析、並びに、鎖ＤＮＡ溶液ハイブリダイゼーションアッセイ等の他の増幅検出法、転写媒介増幅、オリゴ、ｃＤＮＡ等のマイクロアレイ産物、並びに、モノクローナル抗体、並びに、リアルタイムＰＣＲが含まれる。ＩＡＣＳＤタンパク質の検出及び定量化のための標準的な方法には、ウエスタンブロット分析、免疫細胞化学、並びに、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫定量法（ＲＩＡ）及び特異的酵素免疫定量法（ＥＩＡ）を含む種々の免疫学的検定法が含まれる。例えばＩＡＣＳＤに特異的な免疫磁気ビーズ又はビオチン化ＩＡＣＳＤ抗体を用いるフローサイトメトリーを用いて、ＩＡＣＳＤ発現について、末梢血液細胞もまた分析することができる。
【００８０】
[0080]１つの実施形態では、疾患又は障害は、Ｂ細胞依存性の癌である。米国の主要な死亡原因である癌により、毎年５０万人以上が死亡している。人口の高齢化によって、癌による死亡数が著しく増加すると見込まれている。癌は一般的な用語であって様々なタイプの悪性新生物を包含し、そのほとんどが周辺の組織に侵入していくつかの部位に転移し得、除去しようとしても再発しやすく且つ適切に治療しなければ患者の死亡を引き起こしやすい。癌は年齢、臓器を問わずあらゆる組織に発生し得る。ひとたび癌の診断が下されれば、治療の決定が最優先事項であり、有効な療法は原発腫瘍及びその転移に主眼が置かれている。様々なタイプの癌治療が、癌患者の生存期間及びＱＯＬを向上するために開発されている。癌治療の進歩には、新たな細胞傷害作用薬、並びに、新たな外科及び放射線療法技術が含まれる。しかし多くのこれらの治療は、かなり心身への障害となり、治療の失敗はよくある事のままとなる。このような欠点が、癌研究者及び介護者を癌治療の新しい効果的な方法の開発に駆り立てている。
【００８１】
[0081]本発明の方法により治療可能な癌は、好ましくは哺乳動物で生じる。例えば哺乳動物には、ヒト及びその他の霊長類、並びに、イヌ及びネコ等のペット又は愛玩動物、ラット、マウス及びウサギ等の実験動物、並びに、ウマ、ブタ、ヒツジ及びウシ等の家畜が含まれる。
【００８２】
[0082]腫瘍又は新生物には、細胞の増殖が無制御で進行性である組織細胞の増殖が含まれる。一部のこのような増殖は良性であるが、他のものは「悪性」と名付けられ、生物の死に導くことがある。悪性新生物又は「癌」は、進行性の細胞増殖を示すことに加えて、これらは周辺の組織に浸潤し且つ転移する可能性があるという点で良性の増殖から区別される。さらに悪性新生物は、お互い及びその周辺組織に比べて、分化のより大きな喪失（より大きな「脱分化」）及びその秩序のより大きな喪失を示すという点で特徴づけられる。この特性は、一般に「退形成」と呼ばれる。
【００８３】
[0083]本発明は、特定のタイプの実験的に定義された癌の治療に関してここに特に示される。これら例示の治療において、標準的な最高水準のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏモデルが用いられた。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの治療法において有効であると期待できる薬剤を同定するために用いることができる。しかし本発明の方法は、これらの腫瘍タイプの治療に限定されないで、任意のＢ細胞由来の癌に拡張されることは理解できよう。実施例で示すように、ＩＡＣＳＤは一次Ｂ細胞のサブセット及びＢ細胞関連障害で発現する。白血病は、末梢血液、脾臓、リンパ節、そして最後に他の組織に伝播する前に、最初は骨髄中での無制御なＢ細胞増殖から生じ得る。無制御なＢ細胞増殖は、リンパ節中でも生じ、次いで血液及び骨髄へ広がるリンパ腫の発生を生じ得る。Ｂ細胞のサブセット上のＩＡＣＳＤの免疫ターゲティングは、世界保健機構（ＷＨＯ）により列挙された悪性腫瘍：前駆Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫、慢性リンパ球性白血病／リンパ腫、前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫／白血病、辺縁層リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、多発性骨髄腫、／プラズマ細胞腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ｍａｌｔ型リンパ腫）、単球様節性辺縁帯リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、並びに、バーキットリンパ腫及び白血病を含むが、これに限定されるものではなく、Ｂ細胞悪性腫瘍、白血病、リンパ腫並びにミエローマの治療に有用である。本発明により治療され得る他のＢ細胞関連悪性腫瘍には、皮膚Ｂ細胞性リンパ腫、原発濾胞性皮膚Ｂ細胞性リンパ腫、Ｂ系列急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ芽球性白血病、原発甲状腺リンパ腫、血管内悪性リンパ腫症、脾臓リンパ腫、ホジキン病、及び移植組織内血管親和性大細胞型リンパ腫（ｉｎｔｒａｇｒａｆｔ  ａｎｇｉｏｔｒｏｐｉｃ  ｌａｒｇｅ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）が含まれる。
【００８４】
[0084]自己免疫疾患は、自己抗体産生及び細胞性免疫を生じる機能亢進性Ｂ細胞活性を伴う場合がある。自己抗体を産生する細胞の発生又はこのような細胞の増殖の阻害は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、強皮症、多発動脈炎、アミロイドーシス、シェーグレン症候群、混合性結合組織病、免疫性溶血性貧血、免疫性血小板減少症、免疫性凝固障害、免疫性血球減少症、多発性筋炎、皮膚炎（ｄｅｒｍａｔｏｓｉｔｉｓ）、免疫性不妊症、真正糖尿病、糸球体腎炎、重症筋無力症、多発性硬化症、免疫性脱髄疾患、慢性活動性肝炎、免疫性炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、薬剤誘導自己免疫性疾患、壊死性血管系疾患、多形性紅斑、水疱性皮膚疾患、湿疹、アトピー性皮膚炎、じんま疹、血管性浮腫、結節性紅斑、アテローム性動脈硬化関連疾患、移植拒絶反応、薬物反応、輸血反応、移植片対宿主病、グレーブス病、喘息、クリオグロブリン血症、原発硬化性胆管炎、悪性貧血、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、過粘稠度症候群、マクログロブリン血症、寒冷凝集性溶血性貧血、起源未定のモノクローナル高ガンマグロブリン血症、斑状皮膚萎縮及びＰＯＥＭＳ症候群（多発性神経炎、臓器巨大症、内分泌障害、Ｍ成分、皮膚変化）、結合織病、嚢胞性線維症、自己免疫性肺炎症、乾癬、ギラン−バレー症候群、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性炎症性眼疾患、グッドパスチャー病、ラスマッセン脳炎、疱疹状皮膚炎、胸腺腫、自己免疫性多腺性症候群タイプ１、原発性及び続発性膜性糸球体腎炎、癌関連網膜症、自己免疫性肝炎タイプ１、腎臓の関与を有する混合性クリオグロブリン血症、類嚢胞黄斑水腫、子宮内膜症、多発性神経炎（高ＩｇＭ免疫不全症候群を含む）、脱髄疾患、血管腫症、並びに、モノクローナル高ガンマグロブリン血症を含むがこれに限定されない、自己免疫疾患における自己抗体レベルの減少に治療的に有効であり得る。
【００８５】
[0085]Ｂ細胞障害がＩｇＭと関連する場合、本発明による抗ＩＡＣＳＤ抗体は、Ｂ細胞の細胞表面上のＩｇＭ由来のペプチドを認識し得るが、分泌されたＩｇＭ又は個体の血液中に脱落するＩｇＭは認識し得ない。したがって抗体は、疾患を伴うＢ細胞の特異的なサブセットを標的にする。限定されることを望まないが、以下の疾患がＩｇＭと関連していた。すなわち、Ｂ細胞白血病及びリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫を含む非ホジキンリンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、慢性リンパ性白血病、前リンパ球性白血病、辺縁層リンパ腫、ヘアリーセル白血病、ＭＡＬＴリンパ腫、単球様節性辺縁帯リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小細胞型リンパ腫、混合性細胞リンパ腫、大細胞型リンパ腫、プラズマ細胞腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、バーキットリンパ腫及び白血病、濾胞性皮膚Ｂ細胞性リンパ腫、Ｂ系列急性リンパ芽球性白血病、ホジキン病、ＩｇＭ多発性神経炎（高ＩｇＭ免疫不全症候群を含む）、腎臓の関与を有する混合性クリオグロブリン血症、移植片対宿主病、過粘稠度症候群、マクログロブリン血症、並びに、寒冷凝集性溶血性貧血である。したがって、これらの疾患を有するか又は有する疑いのある個体は、膜結合ＩｇＭ由来のペプチドに特異的な抗ＩＡＣＳＤ抗体を用いる標的治療から利益を得るであろう。
【００８６】
[0086]Ｂ細胞障害がＩｇＧと関連する場合、本発明による抗ＩＡＣＳＤ抗体は、Ｂ細胞の細胞表面上のＩｇＧ由来のペプチドを認識し得るが、分泌されたＩｇＧ又は個体の血液中に脱落するＩｇＧは認識し得ない。したがって抗体は、疾患と関連するＢ細胞の特異的なサブセットを標的にする。限定されることを望まないが、以下の疾患はＩｇＧと関連していた。すなわち、自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、強皮症、多発動脈炎、アミロイドーシス、及びシェーグレン症候群、混合性結合疾患、免疫性溶血性貧血、免疫性血小板減少症、免疫性凝固障害、免疫性血球減少症、多発性筋炎、ダーマトサイシス、免疫性受胎能、真正糖尿病、糸球体腎炎、重症筋無力症、多発性硬化症、免疫性脱髄疾患、慢性活動性肝炎、免疫性炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、薬剤誘導自己免疫性疾患、壊死性血管系疾患、多形性紅斑、水疱性皮膚疾患、湿疹、アトピー性皮膚炎、じんま疹、血管性浮腫、結節性紅斑、アテローム性動脈硬関連疾患、移植拒絶反応、薬物反応、輸血反応、移植片対宿主病、グレーブス病、喘息、クリオグロブリン血症、原発硬化性胆管炎、悪性貧血、過粘稠度症候群、寒冷凝集性溶血性貧血、起源未定のモノクローナル高ガンマグロブリン血症、ＰＯＥＭＳ症候群（多発性神経炎、臓器巨大症、内分泌障害、Ｍ成分、皮膚変化）、結合組織疾患、嚢胞性線維症、自己免疫性肺炎症、乾癬、ギラン‐バレー症候群、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性炎症性眼疾患、グッドパスチャー病、ラスマッセン脳炎、疱疹状皮膚炎、胸腺腫、自己免疫性多腺性症候群タイプ１、原発性及び続発性膜性糸球体腎炎、癌関連網膜症、自己免疫性肝炎タイプ１、腎臓の関与を有する混合性クリオグロブリン血症、類嚢胞黄斑水腫、子宮内膜症、脱髄疾患、血管腫症、並びに、モノクローナル高ガンマグロブリン血症である。したがって、これらの疾患を有するか又は有する疑いのある個体は、膜結合ＩｇＧ由来のペプチドに特異的な抗ＩＡＣＳＤ抗体を用いる標的治療から利益を得るであろう。
【００８７】
[0087]Ｂ細胞障害がＩｇＥと関連する場合、本発明による抗ＩＡＣＳＤ抗体は、Ｂ細胞の細胞表面上のＩｇＥ由来のペプチドを認識し得るが、分泌されたＩｇＥ又は個体の血液中に脱落するＩｇＥは認識し得ない。したがって抗体は、疾患と関連するＢ細胞の特異的なサブセットを標的にする。限定されることを望まないが、以下の疾患がＩｇＥと関連していた。すなわち、急性アレルギー性反応、アナフィラキシー反応、水疱性皮膚疾患、湿疹、アトピー性皮膚炎、じんま疹、血管性浮腫、結節性紅斑、真正糖尿病、薬物反応、乾癬、喘息、花粉症アレルギー性鼻炎、及びモノクローナル高ガンマグロブリン血症である。したがって、これらの疾患を有するか又は有する疑いのある個体は、膜結合ＩｇＥ由来のペプチドに特異的な抗ＩＡＣＳＤ抗体を用いる標的治療から利益を得るであろう。
【００８８】
[0088]Ｂ細胞障害がＩｇＡと関連する場合、本発明による抗ＩＡＣＳＤ抗体は、Ｂ細胞の細胞表面上のＩｇＡ由来のペプチドを認識し得るが、分泌されたＩｇＡ又は個体の血液中に脱落するＩｇＡは認識し得ない。したがって抗体は、疾患と関連するＢ細胞の特異的なサブセットを標的にする。限定されることを望まないが、以下の疾患は、ＩｇＡと関連していた。すなわち、アミロイドーシス、糸球体腎炎、慢性活動性肝炎、免疫性炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、薬剤誘導自己免疫性疾患、多形性紅斑、水疱性皮膚疾患、湿疹、アトピー性皮膚炎、じんま疹、血管性浮腫、結節性紅斑、自己免疫性肺炎症、乾癬、原発性及び続発性膜性糸球体腎炎、過粘稠度症候群、及び、モノクローナル高ガンマグロブリン血症である。したがって、これらの疾患を有するか又は有する疑いのある個体は、膜結合ＩｇＡ由来のペプチドに特異的な抗ＩＡＣＳＤ抗体を用いる標的治療から利益を得るであろう。
【００８９】
投与
[0089]本発明の方法の実行において使用される抗ＩＡＣＳＤ抗体を、所望の送達方法に適切な担体を含む医薬組成物に製剤化することができる。適切な担体は、抗ＩＡＣＳＤ抗体と組み合わせた場合、抗体機能を保持し、対象の免疫系に対して非反応性である任意の物質を含む。例としては、限定するものではないが無菌のリン酸緩衝食塩水、静菌水等の多くの標準的な製薬担体のいずれかが挙げられる。
【００９０】
[0090]抗ＩＡＣＳＤ抗体製剤を、疾患を有する部位に抗体を送達できる任意の経路を介して投与することができる。潜在的に有効な投与経路には、限定されるものではないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内等が含まれる。好ましい投与の経路は、静脈注射である。静脈内注射用の好ましい製剤は、保存静菌水、無菌非保存水の溶液中の抗ＩＡＣＳＤ抗体及び／又は注射用（ＵＳＰ）の０．９％無菌塩化ナトリウムを含むポリ塩化ビニル又はポリエチレンバッグ中に希釈した抗ＩＡＣＳＤ抗体を含む。抗ＩＡＣＳＤ抗体調製物は、好ましくは真空下で凍結乾燥して無菌の散剤として保存し、次いで例えばベンジルアルコール保存剤を含む静菌水中又は注射に先立ち無菌水中で再構成され得る。
【００９１】
[0091]治療は、一般に典型的には約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で静脈内注射（ＩＶ）等の許容可能な投与経路を介して、抗ＩＡＣＳＤ抗体調製物を繰り返し投与することを含むであろう。しかし０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲の他の例示的な用量も意図される。１週あたり１０〜５００のｍｇ  ｍＡｂの範囲の用量が有効で、耐容性は良好であり得る。非限定的な例として、Ｂ細胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び再発した緩徐進行型リンパ腫の治療に用いられるキメラＣＤ２０抗体であるリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）（Ｒｉｔｕｘａｎ（商標））を、典型的には週に１回、４〜８用量として静脈注入により３７５ｍｇ／ｍ２で投与する。複数のコースが所望され、又は必要となることがある。したがって、Ｒｉｔｕｘａｎ（商標）に対する有効投与量は、５０〜５００ｍｇ／ｍ２であろう。同様の投与量の範囲が、本発明の抗体調製物に対して予測される。用い得る投与計画の他の例は、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂで用いられた投与計画である。トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））の臨床経験に基づく、約４ｍｇ／ｋｇ患者体重静注の初回負荷投与量に引き続く、週１回の約２ｍｇ／ｋｇの静注投与を用いるＨＥＲ２（ヒト上皮細胞増殖因子２）陽性の転移性乳癌の治療に用いられたヒト化モノクローナル抗体は適切である。同様にこの投与計画を、本発明の抗ＩＡＣＳＤ  ｍＡｂ調製物で使用できる。初回負荷投与量は、９０分又はそれより長い時間の注入で投与されるのが好ましい。初回量に十分に耐えられたならば、周期的維持用量を、３０分又はそれより長い時間の注入で投与することができる。しかし当分野で知られているように、様々な要素が特定の場合における理想的な用量投薬計画に影響を与えるだろう。このような要素には、例えば用いた抗体の結合親和性及び半減期、患者におけるＩＡＣＳＤ発現の程度、所望の恒常的な抗体濃度レベル、治療の回数、並びに、本発明の治療方法と組み合わせて用いられた化学療法剤の影響を含み得る。
【００９２】
[0092]治療は、放射性同位元素に結合した抗ＩＡＣＳＤ抗体を含むこともできる。非限定的な例として、放射性同位元素標識−抗癌胎児性抗原（抗ＣＥＡ）モノクローナル抗体を用いる研究は、３０〜８０ｍＣｉ／ｍ２で２〜３注入の腫瘍退縮に関する用量ガイドラインを提供する（Ｂｅｈｒら、Ｃｌｉｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５（１０  Ｓｕｐｐｌ．）：３２３２ｓ〜３２４２ｓ（１９９９）；Ｊｕｗｅｉｄら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３９：３４〜４２（１９９８））。
【００９３】
[0093]或いは、ＩＡＣＳＤをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトした樹状細胞を、Ｔ細胞に媒介される応答を刺激するためのワクチンとして使用できる。例えば、前立腺特異抗原ｍＲＮＡでトランスフェクトした樹状細胞を用いる研究は、１０７細胞の皮内注射と同時の２〜６週間の１×１０７〜５×１０７細胞の３サイクルの静脈内投与が、適切な投与計画を提供し得ることを示唆する（Ｈｅｉｓｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：４０９〜４１７（２００２）；ＨａｄｚａｎｔｏｎｉｓとＯ’Ｎｅｉｌｌ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１：１１〜２２（１９９９））。１×１０５〜１×１０９又は１×１０６〜１×１０８細胞の間の他の例示的な用量も意図される。
【００９４】
[0094]ＩＡＣＳＤをコードするプラスミドを用いる裸のＤＮＡワクチンは、免疫応答を誘導できる。直接皮膚及び筋肉への注射による裸のＤＮＡの投与は、有害な免疫反応の発現及び挿入突然変異の危険性等のウイルスベクターの使用で直面する制約を伴わない（Ｈｅｎｇｇｅら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１６：９７９（２００１））。研究は筋肉組織へ外来性ｃＤＮＡの直接的注射が、強い免疫応答及び防御免疫を生じることを示した。物理的（遺伝子銃、電気穿孔法）及び化学的（陽イオン脂質又はポリマー）な手法も、プラスミドＤＮＡによる遺伝子導入の効率及び標的細胞特異性を高めるために開発された。プラスミドＤＮＡは、さらにエアゾール送達により肺に投与できる。裸又は脂質で被覆したプラスミドＤＮＡの直接的な注射による遺伝子治療が、癌、後天性免疫不全症候群、嚢胞性線維症、脳血管疾患、及び高血圧症等の疾患の予防、治療及び治癒のために構想される。非限定的な例として、ＨＩＶ−１  ＤＮＡワクチン用量増加研究は、適切な治療として３０〜３００μｇ／用量の投与を示している（Ｗｅｂｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０：８００）。さらにまた発現が用量依存的で、１５０μｇの注射されたＤＮＡに対して最大である場合、大脳内にマウス脳中に注射された裸のＤＮＡは、リポータータンパク質の発現を与える（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：４０５〜４１１（１９９６））。それにもかかわらず、ＤＮＡは裸の形態である必要はない。プラスミドのＤＮＡであっても良い。例えば、１マイクログラムのベータ−ガラクトシダーゼプラスミドを含むナノ球の筋肉内注射後のマウスでの遺伝子発現は、同量の裸のＤＮＡ又はＬｉｐｏｆｅｃｔａｒｍｉｎｅと複合体形成したＤＮＡを用いる注射後に観察されるよりも、より大きくさらに長期にわたる（Ｔｒｕｏｎｇら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：１７０９〜１７１７（１９９８））。インシュリンの治療供給源を提供する方法としての骨格筋へのプラスミド媒介遺伝子導入の研究において、マウスのフューリン（ｆｕｒｉｎ）ｃＤＮＡトランスジーン及びラットプロインシュリンｃＤＮＡを含む４つのプラスミド構築物を、雄Ｂａｌｂ／ｃマウスの腓筋に注射した。ここで大部分の構築物に対する至適用量は１００マイクログラムプラスミドＤＮＡであった（Ｋｏｎら、Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．１：１８６〜１９４（１９９９））。上記で述べた用量は、裸のＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡのいずれかで使用し得る。さらに１〜１０００μｇ／用量又は１０〜５００μｇ／用量の例示的な用量も意図される。
【００９５】
１．ＩＡＣＳＤターゲティング組成物
[0095]ＩＡＣＳＤ発現するＢ細胞を標的にするための組成物は、本発明の範囲内に包含される。例えば、このような組成物は、薬剤学的に許容し得る薬剤と混合した、本明細書中に記載する治療的若しくは予防的に有効量の抗体又はこれらのフラグメント、変異体、誘導体若しくは融合物を含み得る。典型的には、ＩＡＣＳＤターゲティングエレメントは、動物に投与するために十分に精製されるであろう。
【００９６】
[0096]医薬組成物は、ｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、清澄度、色、等張性、臭味、無菌性、安定性、溶解若しくは放出速度、組成物の吸着若しくは浸透等を改変、維持又は保存するための製剤材料を含み得る。適切な製剤材料には、限定されるものではないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン等）、抗菌薬、抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム等）、緩衝液（ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス−塩酸、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸等）、増量剤（マンニトール又はグリシン等）、キレート剤［エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等]、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン等）、充填剤、単糖類、二糖類及び他の糖質（グルコース、マンノース、又はデキストリン等）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等）、着色剤、香味剤及び希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドン等）、低分子量ポリペプチド、塩成形対イオン（ナトリウム等）、保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素等）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール等）、糖アルコール（マンニトール又はソルビトール等）、懸濁剤、界面活性剤又は湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０等のポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール等）、安定性増強剤（スクロース又はソルビトール）、張度強化剤（アルカリ金属ハロゲン化物等（好ましくナトリウム又は塩化カリウム、マンニトール、ソルビトール））、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤及び／又は医薬補助剤が含まれる。全てのこれらの製剤材料は、一般に当分野では周知である。
【００９７】
[0097]最適な医薬組成物が、例えば意図される投与経路、送達形式及び所望の用量に応じて、当業者によって決定されるであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、（１９９０）を参照のこと。このような組成物は、ＩＡＣＳＤターゲティングエレメントの物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏでの放出速度、及びｉｎ  ｖｉｖｏでのクリアランス速度に影響を及ぼし得る。
【００９８】
[0098]医薬組成物中の主なビヒクル又は担体は、事実上、水性であっても非水性であってもよい。例えば、適当なビヒクル又は担体は、非経口投与用の組成物中で一般に用いられる他の物質でおそらく補足される注射用水、生理的食塩水又は人工脳脊髄液であり得る。血清アルブミンと混合された中性緩衝食塩水又は生理食塩水は、さらに典型的なビヒクルである。他の典型的な医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝溶液又は約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、これらはさらにソルビトール又はこれらの適切な代替物を含み得る。本発明の１つの実施形態では、ＩＡＣＳＤターゲティングエレメント組成物は、凍結乾燥ケーク（ｃａｋｅ）又は水性溶液の形態の任意の製剤物質と、所望の純度を有する選択された組成物とを混合することにより保存用に調製され得る。さらに結合剤産物は、スクロースのような適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として製剤化され得る。
【００９９】
[0099]医薬組成物は、非経口送達について選択することができる。或いは組成物は、例えば経口的な消化管を介する吸入又は送達について選択し得る。このような薬剤学的に許容し得る組成物の調製物は、当分野の技術の範囲内である。一般に製剤成分は投与部位で許容し得る濃度で存在する。例えば、緩衝液は生理的ｐＨで又は僅かに低いｐＨで、典型的にはｐＨ約５〜約８の範囲内で組成物を維持するために使用される。非経口投与が意図されるとき、本発明に使用する治療的組成物は、発熱物質を含まない薬剤学的に許容し得るビヒクル中にＩＡＣＳＤターゲティングエレメント含む、非経口的に許容し得る水溶液形態であり得る。非経口注射に特に適しているビヒクルは、適切に保存された無菌等張溶液としてＩＡＣＳＤターゲティングエレメントが製剤化される無菌蒸留水である。さらに別の調製物は、産物の制御された若しくは遅延放出を与える注射可能なマイクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸）、ビーズ、又はリポソーム等の物質と共に、所望の分子の製剤を含むことができ、これらは次いでデポー注射剤として送達され得る。またヒアルロン酸を使用することができ、これは循環中での維持の持続化を促進する効果を有し得る。所望の分子への導入のための他の適当な方法には、移植可能な薬剤送達装置が含まれる。
【０１００】
[0100]他の態様では、非経口投与のための適切な医薬製剤を、好ましくはハンクス液、リンガー溶液、又は生理緩衝食塩水等の生理学的に適合性の緩衝液に入れて製剤化され得る。水性注射懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストラン等の懸濁液の粘度を増加させる物質を含み得る。さらに活性化合物の懸濁液は、適切な油状注射懸濁液として調製され得る。適切な親油性溶媒又は親油性ビヒクルとしては、ゴマ油等の脂肪油、又は、オレイン酸エチル、トリグリセリド若しくはリポソーム等の合成脂肪酸エステルが含まれる。非脂質ポリカチオンアミノポリマーも送達に用いられ得る。必要に応じて、懸濁液は、この化合物の溶解度を増大させて、非常に濃縮された溶液の調製を可能にする適切な安定剤又は薬剤も含み得る。
【０１０１】
[0101]さらに別の実施形態では、医薬組成物を吸入用に製剤化され得る。例えば、ＩＡＣＳＤターゲティングエレメントを、吸入用の乾燥粉末として製剤化できる。またポリペプチド又は核酸分子吸入溶液は、エアゾール送達用の噴射剤を用いて製剤化できる。別の実施形態においては、溶液は噴霧化され得る。さらに肺への投与が、化学修飾をほどこしたタンパク質の肺への送達を記載するＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号に記載されている。
【０１０２】
[0102]特定の製剤は、経口的に投与され得ることも意図される。本発明の１つの実施形態では、この方法で投与されるＩＡＣＳＤターゲティングエレメントは、錠剤及びカプセル剤等の固形剤形の配合に通常使用される担体を使用して、又は、使用しないで製剤化することかできる。例えば、カプセル剤は、生物学的利用能が最大になり全身循環前の分解が最小になる消化管内の部位で製剤の活性部分を放出するよう設計し得る。結合物質分子の吸収を促進するために、別の薬剤を含有させることができる。希釈剤、風味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤及び結合剤も使用できる。
【０１０３】
[0103]経口投与用の医薬組成物も、経口投与のために適切な用量で、当分野では周知である薬剤学的に許容し得る担体を用いて調製することができる。このような担体は、この医薬組成物を患者による摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液等として製剤化されることを可能にする。
【０１０４】
[0104]経口投与するための医薬品は、活性化合物と固形の賦形剤を組み合わせ、錠剤又は糖衣剤コアを得るために得られた顆粒剤の混合物（必要に応じて、粉砕後）を加工処理することにより得ることができる。所望であれば、適切な補助剤を加えることができる。適切な賦形剤には、以下のものを含有する炭水化物又はタンパク質充填剤が含まれる：ラクトース、スクロース、マンニトール及びソルビトールを含む糖質等；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ又は他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース；アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム質；並びに、ゼラチン及びコラーゲン等のタンパク質。必要であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、及びアルギン酸又はアルギン酸ナトリウム又はこれらの塩等の崩壊剤又は可溶化剤が加えられ得る。
【０１０５】
[0105]糖衣剤コアは、濃縮した糖溶液等の適切なコーティングと組み合わせて使用でき、溶液はアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、及び適切な有機溶媒又は混合溶媒も含み得る。製品の識別のために又は活性化合物の量、すなわち供与量を特徴づけるために、染料又は色素を錠剤又は糖衣剤皮に加えることができる。
【０１０６】
[0106]経口で使用され得る医薬品はまた、ゼラチンでできているプッシュフィットカプセル及びゼラチンでできている柔らかい密封されたカプセル、並びに、グリセロール又はソルビトール等の錠皮を含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトース若しくはデンプン等の充填剤又は結合剤、タルク若しくはステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、及び、必要に応じて安定剤と混合された活性成分を含むことができる。柔らかいカプセル剤では、ＩＡＣＳＤターゲティングエレメントは、安定剤の有無にかかわらず、脂肪油、液体、若しくは液体ポリエチレングリコール等の適切な液体に溶解又は懸濁され得る。
【０１０７】
[0107]他の医薬組成物は、錠剤の製造に適した無毒性の賦形剤との混合物中に、有効量のＩＡＣＳＤターゲティングエレメントを含み得る。無菌水又は他の適当なビヒクルの中に錠剤を溶解することにより、単位投与形の液剤を調製することができる。これらの医薬組成物のための適切な賦形剤には、限定されるものではないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム若しくは重炭酸塩、ラクトース又はリン酸カルシウム等の不活性希釈剤；或いはデンプン、ゼラチン又はアラビアゴム等の結合剤；或いはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルク等の潤滑剤が含まれる。
【０１０８】
[0108]持続又は制御送達製剤中にＩＡＣＳＤターゲティングエレメントを含む製剤を含む別の医薬組成物が、当業者には明らかであろう。また他の様々な持続又は制御送達手段、例えばリポソーム担体、生体内分解性微小粒子又は多孔質ビーズ及びデポー注射剤を製剤化するための技術は当業者に公知である。例えば医薬組成物の送達における多孔性ポリマー微小粒子の制御された放出を記載するＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照のこと。持続性調製物の別の例には、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスが含まれる。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸、Ｌ−グルタミン酸コポリマー及びガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、エチレン酢酸ビニル、又はポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含むことができる。また、持続性組成物はリポソームを含み、これは当分野で知られているいくつかの方法のいずれかにより調製できる。例えば、リポソームを対象とする詳細な文献についてはＥｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８２：３６８８〜３６９２（１９８５）；ＥＰ  ３６，６７６；ＥＰ  ８８，０４６；ＥＰ  １４３，９４９を参照のこと。
【０１０９】
[0109]一般に、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される医薬組成物は、無菌でなくてはならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過により達成できる。組成物が凍結乾燥されている場合、この方法を用いる滅菌を、凍結乾燥及び再構成の前か又は後のいずれかで実施できる。非経口投与用の組成物を、凍結乾燥した形態又は溶液で保存できる。さらに非経口組成物は、一般に無菌のアクセスポート、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルを備えた容器に入れることができる。
【０１１０】
[0110]一旦医薬組成物を製剤化したら、それを溶液、懸濁液、ゲル剤、乳濁液、固体、又は、脱水若しくは凍結乾燥した粉末として無菌バイアル中で保存することができる。そのような製剤は、すぐに使用できる形態で保存できるし、又は投与前に再構成を要する形態（例えば、凍結乾燥形態）で保存できる。
【０１１１】
[0111]特定の実施形態では、本発明は単回投与単位を作製するためのキットに関する。このキットは、それぞれ乾燥ＩＡＣＳＤターゲティングエレメントを有する第１の容器及び水性製剤を有する第２の容器の両方を含むことができる。一個の空室及び複数の空室を有する前充填した注射器（例えば、液体注射器）を含むキットも、本発明の範囲内に含まれる。
【０１１２】
２．用量
[0112]例えば、用いられる医薬組成物の有効量は、治療状況及び目的に依存するであろう。当業者は、したがって、治療の適切な用量レベルは一部には、送達される分子、ＩＡＣＳＤターゲティングエレメントが用いられる適応症、投与経路、並びに、大きさ（体重、体表面又は臓器大きさ）及び患者の病態（年齢及び健康状態）に応じて変わることを理解するであろう。したがって、医師は用量をタイターし、最適な治療効果を得るために投与経路を変更し得る。典型的な用量は、上記の要素に依存して約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇかそれ以上までの範囲であり得る。特定の実施形態においては、用量は、０．１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲、又は０．０１ｍｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの範囲、又は１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲、又は５ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。他の実施形態では、放射免疫療法のための用量は、１回量当たり１０ｍＣｉから１００ｍＣｉ、１回の注射若しくは注入当たり約１×１０７から５×１０７細胞又は１×１０５から１×１０９細胞又は１×１０６から１×１０８細胞、或いは上記の要素に依存して、１回量当たり３０μｇから３００μｇ又は１回量当たり１〜１０００μｇ又は１０〜５００μｇの裸のＤＮＡの範囲であり得る。
【０１１３】
[0113]任意の化合物について治療的有効量は、初めに細胞培養アッセイ又はマウス、ラット、ウサギ、イヌ若しくはブタ等の動物モデルで推定することができる。また動物モデルも、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために使用し得る。次いでこのような情報を用いて、ヒトにおける効果的な用量及び投与経路を決定することができる。
【０１１４】
[0114]正確な用量は、治療を必要とする対象に関連した要素を考慮して決定されるであろう。用量及び投与は、十分なレベルの活性化合物を提供するために又は所望の効果を維持するために調整される。考慮に入れ得る要素には、疾患状態の重篤度、対象の健康状態、年齢、体重、並びに、対象の性別、投与の時間及び頻度、併用する薬剤（複数可）、反応感受性、並びに、治療に対する応答が含まれる。長時間作用性の医薬組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス速度に応じて、３〜４日毎に、１週間毎に、又は、２週間毎に投与され得る。
【０１１５】
[0115]投薬頻度は、使用された製剤中のＩＡＣＳＤターゲティングエレメントの薬物動態学的パラメータに左右されるであろう。典型的には組成物は、所望の効果を達成する用量に達するまで投与される。したがって組成物を、単回投与として又は経時的な複数回投与（同じか又は異なる濃度／用量での）として又は連続注入として投与することができる。さらに適切な用量の改良が、日常的に行なわれる。適切な用量は、適切な用量反応データを用いることにより確認することができる。
【０１１６】
３．投与経路
[0116]医薬組成物の投与経路は、周知の方法、例えば経口的に、注射により静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼球内、動脈内、門脈内、病巣内経路、骨髄内、髄こう内、心室内、経皮、胸膜腔内、皮下、鼻腔内、経腸的、局所、舌下、尿道、膣に、若しくは直腸手段による、持続性放出方式による若しくは埋め込み装置による、又は一般に体のいずれの部位の任意の体液を含むことができる滲出液を有する任意の区画への注射による方法に従う。所望の場合には、組成物は、ボーラス注射によって又は連続的に注入によって、又は、埋め込み装置によって投与され得る。
【０１１７】
[0117]これとは別に、又はこれに加えて、ＩＡＣＳＤターゲティングエレメントが吸収若しくは封入された膜、スポンジ、又は、他の適切な物質の埋め込みによって局所的に組成物を投与することができる。埋め込み装置を使用する場合、任意の適切な組織又は臓器にこの装置を挿入することができ、拡散、徐放性ボーラス、又は、連続投与を介してＩＡＣＳＤターゲティングエレメントを送達することができる。
【０１１８】
[0118]ある場合には、ｅｘ  ｖｉｖｏの方法で、医薬組成物を使用するのが望ましいこともある。このような場合、患者から摘出された細胞、組織又は臓器は、医薬組成物に暴露され、その後細胞、組織及び／又は臓器は患者へ移植し戻される。
【０１１９】
[0119]場合によっては、ＩＡＣＳＤターゲティングエレメントを、ポリペプチドを発現し分泌するために遺伝子操作した特定の細胞を移植することにより送達することができる。このような細胞は、動物又はヒト細胞であり得、アンティロガス（ａｎｔｉｌｏｇｏｕｓ）、異種性、又はゼノゼニイ（ｘｅｎｏｇｅｎｙ）であり得る。必要に応じて、細胞は不死化され得る。免疫応答の機会を減らすために、細胞を封入して周辺組織への浸潤を回避し得る。カプセル材料は、典型的には生体適合性で半透過性の高分子封入物又は膜であり、これらはタンパク質産物（複数可）の放出を許容するが、患者の免疫性系による又は周辺組織からの他の有害因子による細胞の破壊を防ぐものである。
【０１２０】
併用療法
[0120]本発明のＩＡＣＳＤターゲティング剤は、他の治療剤と組み合わせて利用できる。これらの他の治療法は、例えば放射線治療、化学療法剤及び他の増殖因子を含む。
【０１２１】
[0121]１つの実施形態では、抗ＩＡＣＳＤ抗体が、放射線増感剤として用いられる。このような実施形態では、抗ＩＡＣＳＤ抗体は放射線増感剤に結合される。本明細書中で用いられる「放射線増感剤」という用語は、放射線で増感する細胞の電磁放射線に対する感受性を増大する及び／又は電磁放射線によって治療可能な疾患の治療を促進するために治療的有効量で投与される分子として、好ましくは低分子量の分子として定義される。電磁放射線によって治療可能な疾患には、新形成疾患、良性の及び悪性腫瘍、並びに、癌細胞が含まれる。
【０１２２】
[0122]本明細書で用いる「電磁放射線」及び「放射線」という用語には、限定されるものではないが、１０−２０から１００メートルの波長を有する放射が含まれる。本発明の好ましい実施形態では、ガンマ線（１０２０〜１０−１３ｍ）、Ｘ線（１０−１２〜１０−９ｍ）、紫外線（１０ｎｍ〜４００ｎｍ）、可視光線（４００ｎｍ〜７００ｎｍ）、赤外線（７００ｎｍ〜１．０ｍｍ）、及び、マイクロ波放射（１ｍｍ〜３０ｃｍ）の電磁放射線を用いる。
【０１２３】
[0123]放射線増感剤は、電磁放射線の毒性作用に対する癌細胞の感受性を増加させることが知られている。現在多くの癌治療プロトコルは、Ｘ線の電磁放射により活性化される放射線増感剤を使用する。Ｘ線で活性化される放射線増感剤の例には、限定されるものではないが、メトロニダゾル、ミソニダゾール、デスメチルミソニダゾール、ピモニダゾール（ｐｉｍｏｎｉｄａｚｏｌｅ）、エタニダゾール（ｅｔａｎｉｄａｚｏｌｅ）、ニモラゾール（ｎｉｍｏｒａｚｏｌｅ）、マイトマイシンＣ、ＲＳＵ１０６９、ＳＲ４２３３、ＥＯ０９、ＲＢ６１４５、ニコチンアミド、５−ブロモデオキシウリジン（ＢＵｄＲ）、５−ヨードデオキシウリジン（ＩＵｄＲ）、ブロモデオキシシチジン、フルオロデオキシウリジン（ＦＵｄＲ）、ヒドロキシウレア、シスプラチン、並びに、これらの治療的に有効なアナログ及び誘導体が含まれる。
【０１２４】
[0124]癌の光力学的治療（ＰＤＴ）では、増感剤の放射アクティベーターとして可視光線を使用する。光力学性放射線増感剤の例には、限定されるものではないが、ヘマトポルフィリン誘導体、フォトフリン（Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ）（登録商標）、ベンゾポルフィリン誘導体、ＮＰｅ６、スズエチオポルフィリン（ＳｎＥＴ２）、フェオフォルビド−ａ、バクテリオクロロフィル−ａ、ナフタロシアニン、フタロシアニン、亜鉛フタロシアニン、並びに、これらの治療的に有効なアナログ及び誘導体が含まれる。
【０１２５】
[0125]化学療法治療には、抗悪性腫瘍剤、例えば、以下の薬剤を含むアルキル化剤を含むものを使用することができる：例えばメクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン及びクロラムブシル等のナイトロジェンマスタード；カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、及びセムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）等のニトロソウレア；トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオリンアミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン）等のエチレンイミン／メチルメラミン；ブスルファン等のアルキルスルホナート；ダカルバジン（ＤＴＩＣ）等のトリアジン；メトトレキセート及びトリメトレキサート等の葉酸アナログ、５−フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２’−ジフルオロデオキシシチジン等のピリミジンアナログ、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２’−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、フルダラビンホスフェート、及びクロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ）等のプリンアナログを含む代謝拮抗剤；パクリタキセル等の細胞分裂阻害剤、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、及びビノレルビンを含むビンカアルカロイド、タキソテール、エストラムスチン、及びエストラムスチンホスフェートを含む天然物；エトポシドとテニポシド等のエピポドフィロトキシン；アクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ、及びアクチノマイシン等の抗生物質；Ｌ−アスパラギナーゼ等の酵素；インターフェロンアルファ、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦ等の生体応答調節剤；シスプラチン及びカルボプラチン等のプラチナ配位化合物、ミトキサントロン等のアントラセンジオン、ヒドロキシウレア等の置換ウレア、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）及びプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、ミトーテン（ｏ、ｐ’−ＤＤＤ）及びアミノグルテチミド等の副腎皮質抑制剤を含む種々の物質；プレドニソン及び等価物、デキサメサゾン、及びアンスラサイクリン等の副腎皮質ステロイド拮抗剤を含むホルモン、並びに、アンタゴニスト。
【０１２６】
[0126]増殖因子を用いる併用療法は、サイトカイン、リンフォカイン、増殖因子、又はＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子及びエリスロポエチン等の他の造血因子との組合せを含むことができる。他の組成物は、既知のアンギオポエチン、例えば血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含むことができる。増殖因子は、アンギオゲニン、骨形態形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質−２、骨形態形成タンパク質−３、骨形態形成タンパク質−４、骨形態形成タンパク質−５、骨形態形成タンパク質−６、骨形態形成タンパク質−７、骨形態形成タンパク質−８、骨形態形成タンパク質−９、骨形態形成タンパク質−１０、骨形態形成タンパク質−１１、骨形態形成タンパク質−１２、骨形態形成タンパク質−１３、骨形態形成タンパク質−１４、骨形態形成タンパク質−１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子受容体、サイトカイン誘発好中球走化因子１、サイトカイン誘発好中球、化学走性因子２、サイトカイン誘発好中球化学走性因子２、血管内皮細胞増殖因子、エンドセリン１、上皮細胞増殖因子、上皮由来好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子４、線維芽細胞増殖因子５、線維芽細胞増殖因子６、線維芽細胞増殖因子７、線維芽細胞増殖因子８、線維芽細胞増殖因子８ｂ、線維芽細胞増殖因子８ｃ、線維芽細胞増殖因子９、線維芽細胞増殖因子１０、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞系由来ニュートロフィックファクター受容体１、グリア細胞系由来ニュートロフィックファクター受容体２、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、インシュリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体、神経増殖因子、神経増殖因子受容体、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子２、血小板由来血管内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子Ａ鎖、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＡＢ、血小板由来増殖因子Ｂ鎖、血小板由来増殖因子ＢＢ、血小板由来増殖因子受容体、血小板由来増殖因子受容体、プレＢ細胞増殖刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子受容体、トランスフォーミング増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、トランスフォーミング増殖因子１、トランスフォーミング増殖因子１．２、トランスフォーミング増殖因子２、トランスフォーミング増殖因子３、トランスフォーミング増殖因子５、潜在型トランスフォーミング増殖因子１、トランスフォーミング増殖因子結合タンパク質Ｉ、トランスフォーミング増殖因子結合タンパク質ＩＩ、トランスフォーミング増殖因子結合タンパク質ＩＩＩ、腫瘍壊死因子受容体タイプＩ、腫瘍壊死因子受容体タイプＩＩ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーター受容体、血管内皮増殖因子、並びに、キメラタンパク質及びこれらの生物学的に又は免疫学的に活性なフラグメントが含まれる。
【０１２７】
[0127]本発明は、放射線、化学療法剤又は増殖因子と別々に、経時的に又は同時にＩＡＣＳＤターゲティング剤を投与することを意図する。同様に、放射線、化学療法剤又は増殖因子は、任意の順番で又は同時に、又は上記のようにコンジュゲートとしてＩＡＣＳＤターゲティング剤と共に投与される。
【０１２８】
ＩＡＣＳＤの診断上の使用
１．ＩＡＣＳＤ発現状態を測定するためのアッセイ
[0128]個体におけるＩＡＣＳＤ発現パターンの状態の測定は、癌の診断に用いることができ、適切な治療選択を定めるのに有用な予後情報を提供し得る。同様にＩＡＣＳＤの発現状態は、特定の病期段階に対する感受性、進行及び／又は腫瘍の攻撃性を予測するために有用な情報を提供し得る。本発明はＩＡＣＳＤ発現状態を測定し、ＩＡＣＳＤを発現する癌を診断する方法及びアッセイを提供する。
【０１２９】
[0129]１つの態様において、本発明は試験細胞若しくは組織若しくは体液試料における、ＩＡＣＳＤをコードするｍＲＮＡ又はタンパク質発現を検出することを含む、個体における癌の存在を測定するのに有用なアッセイを提供する。１つの実施形態では、ＩＡＣＳＤをコードするｍＲＮＡの存在が、リンパ腫の組織試料で評価される。有意なＩＡＣＳＤ発現が存在することは、リンパ腫がＩＡＣＳＤ免疫ターゲティングに対して感受性であるどうかを示すために有用であり得る。関連する実施形態では、ＩＡＣＳＤの発現状態を核酸レベルでよりもむしろタンパク質レベルで測定することができる。例えば、このような方法又はアッセイは、試験組織試料中の細胞により発現するＩＡＣＳＤのレベルを測定することと、こうして測定されたレベルと対応する正常な試料中で発現するＩＡＣＳＤのレベルを比較することとを含むであろう。１つの実施形態では、ＩＡＣＳＤの存在は、例えば免疫組織化学的方法を用いて評価される。ＩＡＣＳＤ発現を検出することができる抗ＩＡＣＳＤ抗体は、この目的のために当分野では周知である種々のアッセイ形式で用いられ得る。
【０１３０】
[0130]Ｂ細胞のサブセットを含む末梢血液は、ＩＡＣＳＤ発現を検出するためにＲＴ−ＰＣＲを用いて、リンパ腫及び白血病を含む癌細胞の存在について都合良くアッセイされ得る。ＲＴ−ＰＣＲで増幅可能なＩＡＣＳＤをコードするｍＲＮＡの存在は、１つのこのタイプの癌の存在の指標を提供する。Ｒａｃｉｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：４５８９〜４５９４（１９９８）に示されるような、血液中の癌細胞を検出し、特徴を明確にする高感度アッセイを使用することができる。このアッセイは、免疫磁気濃縮と多パラメータのフローサイトメトリー分析及び免疫組織化学的分析とを組み合わせており、血液中の癌細胞の検出について非常に感度が高く、１ｍｌの末梢血液中の１個の上皮細胞を検出することができるとの報告がある。
【０１３１】
[0131]本発明の関連態様は、個体で増殖中の癌に対する感受性を予測することに関する。１つの実施形態では、癌に対する感受性を予測する方法は、組織試料中でＩＡＣＳＤをコードするｍＲＮＡ又はＩＡＣＳＤを検出することを含み、その存在は癌に対する感受性を示し、存在するＩＡＣＳＤをコードするｍＲＮＡ発現の程度は、感受性の程度と比例している。
【０１３２】
[0132]本発明のさらに他の関連態様は、腫瘍攻撃性を評価する方法に関する。１つの実施形態では、腫瘍の攻撃性を測定する方法は、腫瘍試料中のＢ細胞サブセットにより発現されるＡＣＳＤをコードするｍＲＮＡ又はＩＡＣＳＤタンパク質のレベルを測定することと、こうして測定されたレベルと、同じ個体若しくは正常な組織参照試料から採取された対応する正常組織で発現されるＩＡＣＳＤをコードするｍＲＮＡ又はＩＡＣＳＤタンパク質のレベルとを比較することとを含み、腫瘍試料中のＩＡＣＳＤをコードするｍＲＮＡ又はＩＡＣＳＤタンパク質発現の相対的な程度は攻撃性の程度を示す。
【０１３３】
[0133]ＩＡＣＳＤをコードするｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を検出し定量化する方法を、本明細書に記載し、当分野では周知である標準的な核酸及びタンパク質の検出及び定量化技術を用いる。ＩＡＣＳＤをコードするｍＲＮＡの検出及び定量化のための標準的方法には、標識したＩＡＣＳＤをコードするリボプローブを用いるｉｎ  ｓｉｔｕのハイブリダイゼーション、ノーザンブロット及びＩＡＣＳＤをコードするポリヌクレオチドプローブを用いる関連技術、ＩＡＣＳＤをコードするポリヌクレオチドに特異的なプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ分析、並びに、他の増幅タイプの検出法、例えば分枝ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡ、及び種々のタイプのマイクロアレイ製品、例えばオリゴ、ｃＤＮＡ及びモノクローナル抗体が含まれる。特定の実施形態では、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、ＩＡＣＳＤをコードするｍＲＮＡを検出し定量化するために用いることができる。タンパク質を検出し、定量化する標準的方法を用いることができる。特定の実施形態では、野生型ＩＡＣＳＤと特異的に反応するポリクローナル又はモノクローナル抗体を、生検組織の免疫組織化学的なアッセイに使用することができる。
【０１３４】
２．医療用画像化
[0134]抗ＩＡＣＳＤ抗体及びこれらのフラグメントは、ＩＡＣＳＤを発現する部位の医療用画像化に有用である。このような方法は、６７Ｃｕ、９０Ｙ、２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ及び２１２Ｂｉを含む放射性同位元素等の標識剤又は画像化剤の化学的結合、薬剤学的に許容し得る担体中の標識した抗体及びフラグメントの対象への投与、並びに、標的部位でｉｎ  ｖｉｖｏにおける標識した抗体及びフラグメントの画像化を含む。放射性同位元素で識別した抗ＩＡＣＳＤ抗体又はこれらのフラグメントは、リンパ腫若しくは白血病等のＩＡＣＳＤを発現する癌のｉｎ  ｖｉｖｏにおける画像化に、特に有用であり得る。このような抗体は、外部画像化又はバイオプシー又は局在する放射能の検出のいずれかによる、ＩＡＣＳＤ発現する癌の転移を検出する高感度の方法を提供し得る。
【０１３５】
[0135]本開示を考慮すれば、当業者は、多くの他の実施例及び実施例の変形が本発明の範囲内で行なうことができることを理解するであろう。したがって本発明のより広い態様は、下記の実施例の開示に限定されるものではないことを意図する。
【実施例】
【０１３６】
実施例１−ＩｇＭ関連Ｂ細胞障害に対するＩＡＣＳＤ特異的抗体の産生
[0136]この実施例では、膜結合ＩｇＭに対応するＩＡＣＳＤに特異的なモノクローナル抗体を作製した。６つの免疫原を用いた。すなわち、（１）ＡＴＣＣ細胞系、ＣＲＬ−２２６１（Ｂ細胞リンパ球性リンパ腫／白血病細胞）；（２）ＣＲＬ細胞のＮＰ−４０溶解物；（３）膜ＩｇＭ免疫親和性富化ＣＲＬ細胞溶解物；（４）ＫＬＨ−ペプチド；（５）ＧＳＴ−ペプチド；（６）ＭＡＰ−ペプチド。ペプチドＥＧＥＶＳＡＤＥＥＧＦＥＮ（配列番号７）（「ペプチド」としてこの実施例では示した）を、ＫＬＨ−、ＧＳＴ−、及びＭＡＰに結合した。膜ＩｇＭに対するこの配列の特異性は、ＧｅｎＢａｎｋの全てのヒトタンパク質に対するペプチドを検索することにより確認した。
【０１３７】
[0137]１０２個のマウス脾細胞／ｓｐ２０細胞の融合で、ペプチドと反応するモノクローナル抗体を産生する２８個のクローンが生じた。免疫原１〜４を用いる融合では、標的ペプチドに特異的なモノクローナル抗体を生じなかった。しかし免疫原としてＧＳＴ−ペプチドを用いる融合では、１５個の陽性のハイブリドーマクローンを産生し（表２）、免疫原としてＭＡＰ−ペプチドを用いる融合では、１３個のクローンを産生した（表３）。これらの２８個クローンは、標的ペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生することが判明した。
【０１３８】
【表２】
2009536217.tif 000004
【０１３９】
【表３】
2009536217.tif 000005
【０１４０】
[0138]膜ＩｇＭに対する抗体の特異性を確かめるために、５つの基準を確立した。すなわち、（１）抗体は、免疫原上のペプチド（ＧＳＴ−ペプチド又はＭＡＰ−ペプチド）と反応しなければならない；（２）抗体は、ＫＬＨ−ペプチド構築物上のペプチドに結合しなければならない；（３）抗体は、ＥＬＩＳＡによりＣＲＬ−２２６１細胞由来の膜ＩｇＭの天然のタンパク質上のペプチドと結合しなければならない；（４）抗体は、ＫＬＨ−ペプチド又はＣＲＬ細胞由来の膜ＩｇＭを用いる阻害アッセイで示すように、ヒト血清タンパクと反応してはならない；及び（５）抗体は、ＥＬＩＳＡで血清ＩｇＭと反応してはならない。このスクリーニング計画に対する理論的根拠は、血清ＩｇＭを含むヒト血清タンパク質に結合するモノクローナル抗体を除去し、特異的にＩＡＣＳＤと結合する全てのモノクローナル抗体を収集することであった。
【０１４１】
[0139]このスクリーニングの結果を、表２及び表３に示す。第１に、ハイブリドーマ選択過程の一部として、ＧＳＴ−ペプチド又はＭＡＰ−ペプチドに対するスクリーニングを行った。この免疫原に結合するこれらのクローンのみを、スクリーニングで次に進める。したがって、さらなるスクリーニングのために選択された全て２８個のクローンは、ＧＳＴ−ペプチド又はＭＡＰ−ペプチド結合のいずれかに対して陽性であった（データは示さず）。第２に、特異的なモノクローナル抗体の反応性を、ＫＬＨ−ペプチド構築物上のペプチドに対する抗体の結合をアッセイすることにより調べた。最初に同定された２８個のクローンが、ＫＬＨ−ペプチド構築物上のペプチドへの結合を示した（表２及び表３、第４列）。第３に、特異的モノクローナル抗体の反応性を、天然のＩｇＭタンパク質に対するこの抗体の結合をアッセイすることにより調べた。膜ＩｇＭはＣＲＬ−２２６１細胞に由来し、結合はＥＬＩＳＡによりアッセイした。全ての２８個のクローンは、ＣＲＬ細胞由来の天然ＩｇＭへの結合を示した（表２及び表３、第３列）。第４に、正常ヒト血清を用い、ＫＬＨ−ペプチド又はＣＲＬ細胞由来の免疫吸着した膜ＩｇＭへの抗体の結合を阻止する阻害アッセイにより、抗体を血清タンパクとの反応性について試験した。大部分のクローン（２８のうち２３）は、ヒト血清に反応性を示さなかった（表２及び表３、第５列）。残りの７個のクローンについては、反応性を測定しなかった（ＮＤ）。最後に、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＩｇＭ由来の免疫吸着した血清を用いて、モノクローナル抗体クローンは、標的ペプチドを有していない血清ＩｇＭと反応しないことが示された（データは示さず）。
【０１４２】
[0140]ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞に対する抗ＩＡＣＳＤ抗体の特異性を、蛍光顕微鏡を用いて分析した。クローンＧＲＩ−ＳＷ−Ｍ−４由来のフルオレセイン（ＦＩＴＣ）結合抗体を調製した。この抗体を、ＣＲＬ−２２６１細胞の調製物に添加した。蛍光染色試験で、通常、膜ＩｇＭの反応性は、強度が「弱い」と記載されるが、これらの抗体は、蛍光染色により不均一なパターンで弱から中程度の反応性を示した（図１）。したがって抗ＩＡＣＳＤ抗体は、無傷の細胞で膜結合ＩｇＭに特異的に結合することが示された。
【０１４３】
実施例２−ＩＡＣＳＤ特異的抗体の細胞増殖阻害及び細胞障害性効果
[0141]ＭＴＴアッセイを、ＣＲＬ−２２６１細胞における抗ＩＡＣＳＤ抗体の増殖阻害及び細胞障害性効果を測定するために用いた。ＭＴＴは、ミトコンドリアで紫色のホルマザンに還元されるＹｅｌｌｏｗ  ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド、テトラゾール）色素を用いる比色定量アッセイである。ＣＲＬ−２２６１細胞を計数して、４８，０００細胞／ウェルに調整した。各試料を、４組反復して試験した。以下の試料をアッセイした。すなわち、（１）１０μｌのモノクローナルの上清を８つのウェルに添加した；（２）１０μｌの標準培地を４つの「−  Ｒｉｔｕｘａｎ」ウェルに添加した；（３）１０μｌの１００μｇ／ｍｌ  Ｒｉｔｕｘａｎ溶液（標準培地中）を、「＋  Ｒｉｔｕｘａｎ」とラベル付した４つのウェルに添加した；（４）上清を有していない対照系列；及び（５）ＳＰ２０の上清を有する対照系列である。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養した。インキュベーション後に、１０μｌのＭＴＴ溶液を各ウェルに添加し、プレートを２時間インキュベーターに戻した。１００μｌの停止液を加えて反応を停止した。プレートを暗所で２時間、室温でインキュベートした後、吸光度を６５０ｎｍでの読み取り値から５６０ｎｍの読み取り値を引いて読み取った。
【０１４４】
[0142]この結果を表４に示す。同じ試料を含む全てのウェルの平均吸光度が示されている。Ｒｉｍｘａｎで処置した試料は、典型的には軽度の増殖阻害及び細胞障害性を示した。しかし、クローンの上清８９−７１は、Ｒｉｔｕｘａｎの存在下及び非存在下で有意な細胞障害性効果を有した。
【０１４５】
【表４】
2009536217.tif 000006
【０１４６】
[0143]この結果は、抗体の結合だけで細胞障害性効果を生じるのに十分であり、直接に細胞を殺し得ることを示している。理論に拘泥するものではないが、一部の抗体は、膜ＩｇＭに結合する他の膜タンパク質との結合に関して競合し得ると考えられる。モノクローナル抗体の親和性がこれらの他のタンパク質よりも大きい親和性を示してＩｇＭに結合する場合、膜ＩｇＭは内在化される。細胞は分化するようにプログラムされるが、悪性細胞は死滅する。この過程は、８９−７１モノクローナルが直接細胞を殺すことができる理由を説明し得る。親和性が低い抗体は、やはり標的に結合はするが、他のタンパク質に対して効果的に競合しない。このような抗体が、直接的な細胞障害性効果を有することは期待できないであろう。
【０１４７】
実施例３−ＩＡＣＳＤ特異的抗体の産生
[0144]ヒト化モノクローナル抗体は、ＣＤＲ−ＩｇＧ１ヒトフレームワーク操作（ＣＤＲ移植）、又はキメラ化、又は特異的にＩＡＣＳＤに結合するペプチドを同定するファージディスプレイ技術の使用のいずれかにより作製される。商業ベンダーから入手したファージペプチドライブラリ（Ｍ１３、ｆ１、又はｆｄ株）を、ＩＡＣＳＤペプチドに結合するそれらの能力に関してスクリーニングする。これらのライブラリは、ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（Ｂｅｖｅｒｌｙ  ＭＡ）の「ＰｈＤ」ライブラリ又はファージがファージの表面上にｓｃＦｖ領域発現する抗体ライブラリの様なランダムなペプチド配列を含み得る。スクリーニングステップは、合成ペプチド、ＩＡＣＳＤを含む精製した膜免疫グロブリン又はＩＡＣＳＤを発現する細胞系で実施されるであろう。ファージをスクリーニングする方法は、当分野において良く知られている。総説に関しては、Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｂａｒｂａｓら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、（２００１）、ＡｚｚａｚｙとＨｉｇｈｓｍｉｔｈ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：４２５（２００２）、Ｓｉｅｇｅｌ、Ｔｒａｎｓｆｕｓ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｌ  ９：１５（２００２）、Ｂａｃａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２＃１６  １０６７８（１９９７）、Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら、Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２１：４９（２００２）を参照のこと。
【０１４８】
[0145]結合することが見出されたファージは増幅され、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＩＡＣＳＤを結合するそれらの能力に関して試験されるであろう。ＥＬＩＳＡに基づく方法は当分野において良く知られており、ＥＬＩＳＡ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｃｒｏｗｔｈｅｒ、Ｊ．、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５、及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ．（１９９４）に記載されている。ＩＡＣＳＤに対して強い結合を示す個々のファージは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）Ｂｉｇ  Ｄｙｅ配列決定キットを用いて配列決定されるであろう。
【０１４９】
[0146]次いでこのペプチドは、当分野で公知であり、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ．（１９９８）に記載され、当分野で周知の標準的なクローニング技術を用いて、相補性決定領域（ＣＤＲ）、Ｐｏｐｋｏｖ、Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２９１：１３７（２００４）と呼ばれる分子の領域内のヒト抗体構築物中にクローニングされるであろう。
【０１５０】
実施例４−ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗体依存性細胞障害性アッセイ
[0147]抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導するＩＡＣＳＤ特異的抗体の能力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することができる。ＡＤＣＣは、ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６非放射性細胞障害性アッセイ（Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ）、並びに、エフェクター及び標的細胞を用いて実施する。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又は中性親和性多形核白血球（ＰＭＮ）は、このアッセイで用いるエフェクター細胞の２つの例である。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配遠心分離により健常なヒトドナーから分離され、ＰＭＮは不連続パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）勾配（７０％及び６２％）による遠心分離後、残存する赤血球を除去するために低張溶解により精製される。ＲＡ１  Ｂ細胞性リンパ腫細胞又はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）ＣＲＬ  ２２６１リンパ腫細胞（例えば）を、標的細胞として用いる。
【０１５１】
[0148]ＲＡ１細胞を、２％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、２×１０４細胞／ウェルで９６ウェルＶ−底部マイクロタイタープレートに播種する。ＩＡＣＳＤ特異的抗体を１μｇ／ｍｌで３組ずつそれぞれのウェルに添加し、種々のエフェクター細胞：標的細胞比率（例えば１２．５：１〜５０：１）でエフェクター細胞を添加する。プレートを、３７℃で４時間インキュベートする。上清を採取し、乳酸デヒドロゲナーゼの放出を測定して製造業者のプロトコルを用いて特異的溶解パーセントを算出する。
【０１５２】
実施例５−毒素結合ＩＡＣＳＤ特異的抗体
[0149]ＩＡＣＳＤに対する抗体を毒素に結合し、癌の動物モデルにおけるこのようなコンジュゲートの効果を評価する。カリチアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎ）及びカルボプラチン等の化学療法剤、又はリシン毒素等の毒性ペプチドがこの手法で用いられる。抗体−毒素コンジュゲートが、抗原を有する細胞に対して細胞傷害作用薬を特異的にターゲティングするために用いられる。抗体−毒素は、これらの抗原を有する細胞に結合し、受容体依存性エンドサイトーシスにより内在化され、次いで標的細胞を破壊する。この場合、抗体−毒素コンジュゲートはＢ細胞性リンパ腫等のＩＡＣＳＤ発現する細胞を標的にし、腫瘍に細胞傷害作用薬を送達して腫瘍細胞の死を引き起こす。
【０１５３】
[0150]抗体に結合し得る毒素のこのような１つの例は、カルボプラチンである。この毒素が抗体に結合されるメカニズムは、Ｏｔａら、Ａｓｉａ−Ｏｃｅａｎｉａ  Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎａｅｃｏｌ．１９：４４９〜４５７（１９９３）に記載されている。例えば種々の濃度の結合抗体、培地単独、カルボプラチン単独、又は抗体単独と共に、ＩＡＣＳＤを発現する標的細胞（ＲＡ１  Ｂ細胞性リンパ腫細胞系等の）をインキュベートすることによりｉｎ  ｖｉｔｒｏでカルボプラチン結合ＩＡＣＳＤ特異的抗体の細胞障害性を評価する。抗体−毒素コンジュゲートは、ＩＡＣＳＤ抗原を有する細胞を特異的に標的にして殺傷するが、抗原を有していない細胞、又は培地単独、カルボプラチン単独若しくは抗体単独で処置した細胞は細胞障害性を示さない。
【０１５４】
[0151]カルボプラチン結合ＩＡＣＳＤ特異的抗体の抗腫瘍効果は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるマウス腫瘍モデルで示される。５〜６週齢の胸腺欠損ヌードマウスに、皮下又は静脈注射により腫瘍を移植する。ＩＡＣＳＤ−カルボプラチン複合体又は非特異的抗体−カルボプラチン複合体でマウスを処置する。ＩＡＣＳＤ抗原を有するマウスの腫瘍異種移植片が標的にされ、ＩＡＣＳＤ−カルボプラチン複合体により結合される。これは、腫瘍壊死、腫瘍収縮、及び処置したマウスの生存期間の延長によって立証されるように腫瘍細胞致死を引き起こす。
【０１５５】
[0152]当該技術分野において知られている方法を用いて、その他の毒素がＩＡＣＳＤ特異的抗体に結合される。ヒト臨床試験における毒素結合抗体の例には、カリチアマイシン毒素と結合されたＡＭＬのＣＤ３３抗原に対する抗体であるＣＭＡ−６７６が存在する。
【０１５６】
実施例６−ＩＡＣＳＤ特異的抗体を用いる放射−免疫療法
[0153]動物モデルを用いて、リンパ腫、血液学的悪性腫瘍及び固形腫瘍を治療するための放射−免疫療法での放射性核種の送達における、ベクターとしてのＩＡＣＳＤに対する特異的抗体の効果を評価する。ヒト腫瘍を、癌性Ｂ細胞系又は腫瘍細胞を皮下に注射して、５〜６週齢の胸腺欠損ヌードマウスで増殖させる。腫瘍を有する動物に、放射性同位元素標識抗ＩＡＣＳＤ抗体（例えば、３０〜４０μＣｉ１３１Ｉで標識された）を静脈内注射する。腫瘍大きさを、注射前及び注射後に定期的に（すなわち毎週）測定し、治療を受けていないマウスの腫瘍と比較する。抗腫瘍効力を、算出した平均腫瘍線量及び誘導された成長遅延の程度を対応させることによって算定する。腫瘍及び臓器組織学を調べるために、動物を頚椎脱臼により殺処分して剖検を行なう。臓器を１０％ホルマリンで固定してパラフィンに包埋し、薄い切片にする。切片をヘマトキシリンエオジンで染色する。
【０１５７】
実施例７−ＩＡＣＳＤ特異的抗体を用いる免疫療法
[0154]モノクローナル抗体を用いる抗体に基づく免疫療法のための標的として、動物モデルを用いてＩＡＣＳＤ特異的抗体の効果を評価する。ヒトミエローマ細胞を、ナチュラルキラー細胞を根絶した５〜６週齢のヌードマウスの尾静脈に注射する。腫瘍増殖阻止におけるＩＡＣＳＤ特異的抗体の能力を評価するために、マウスにＩＡＣＳＤ特異的抗体を、それぞれ腫瘍接種後１日又は１５日のいずれかで腹腔内注射し、引き続いて週に１回又は２回、１日用量２０μｇ又は１００μｇのいずれかを腹腔内注射した。ヒトＩｇＧのレベル（ヒト腫瘍細胞により生じる免疫反応から）を、ＥＬＩＳＡによりマウス血清で測定する。
【０１５８】
[0155]ミエローマ細胞の増殖に及ぼすＩＡＣＳＤ特異的抗体の効果を、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで調べる。細胞を１００μｌ／ウェル中、１×１０５細胞／ｍｌで９６ウェルプレートで培養し、種々の量のＩＡＣＳＤ抗体又は対照ＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌまでの）と共に２４時間インキュベートする。細胞を０．５μＣｉの３Ｈ−チミジン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）と共に１８時間インキュベートし、オートマチック細胞ハーベスター（Ｐａｃｋａｒｄ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、Ｃｏｎｎ．）を用いてガラスフィルター上へ採取する。取り込まれた放射活性を、液体シンチレーションカウンターを用いて測定する。
【０１５９】
[0156]抗ＩＡＣＳＤモノクローナル抗体の細胞障害性を、５１Ｃｒ放出アッセイを用いて、ミエローマ細胞に及ぼす補体の効果により調べる。ミエローマ細胞を、３７℃で１時間、０．１ｍＣｉの５１Ｃｒ−クロム酸ナトリウムで標識する。５１Ｃｒ標識細胞を、種々の濃度の抗ＩＡＣＳＤモノクローナル抗体又は対照ＩｇＧと共に、氷上で３０分間インキュベートする。非結合抗体を、培地で洗浄して除去する。細胞を９６ウェルプレートに分配し、幼齢ウサギ補体の階段希釈と共に３７℃で２時間インキュベートする。上清を各ウェルから採取し、放出された５１Ｃｒの量を、ガンマカウンターを用いて測定する。５１Ｃｒの自発的放出は、培地単独で細胞をインキュベートして測定するが、最大の５１Ｃｒ放出は、１％ＮＰ−４０で細胞を処理して形質膜を破壊することにより測定する。パーセント細胞障害性は、最大及び自発的５１Ｃｒ放出の差よって実験的及び自発的５１Ｃｒ放出の差を除することにより測定する。
【０１６０】
[0157]抗ＩＡＣＳＤモノクローナル抗体に対する抗体依存細胞媒介細胞障害性（ＡＤＣＣ）は、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを用いて測定する。ＳＣＩＤマウス由来の脾臓単核細胞をエフェクター細胞として用いて、組み換え型インターロイキン−２（例えば）と共に、又はなしで６日間培養する。５１Ｃｒ標識した標的ミエローマ細胞（１×１０４細胞）を、種々の濃度の抗ＩＡＣＳＤモノクローナル抗体又は対照ＩｇＧと共に９６ウェルプレートに入れる。エフェクター細胞を、種々のエフェクター対標的比（１２．５：１〜５０：１）でウェルに添加する。４時間後に、培養上清を除去してガンマカウンターでカウントする。細胞溶解のパーセンテージを、上記のように測定する。
【０１６１】
実施例８−免疫抑制剤としてのＩＡＣＳＤ特異的抗体
[0158]動物モデルを用いて、ＩＡＣＳＤ特異的抗体がＩＡＣＳＤ受容体を介するシグナル伝達を遮断して、自己免疫疾患、例えば関節炎若しくは他の炎症性疾患又は臓器移植の拒絶反応を抑制する効果を評価する。免疫抑制作用は、ウマ赤血球（ＨＲＢＣ）をマウスに注射し、ＨＲＢＣ特異的抗体のレベルをアッセイすることにより試験する。動物を５群に分け、この３群には１０日間、抗ＩＡＣＳＤ抗体を注射し、２群には処置をしない。実験群のうちの２群及び１対照群に、５〜１０×１０７  ＨＲＢＣを含むアール平衡塩類溶液（ＥＢＳＳ）又はＥＢＳＳ単独のいずれかを注射する。抗ＩＡＣＳＤ抗体処置を１群については連続するが、他の群は抗体処置しない。６日後に、全ての動物を後眼窩穿刺により採血した後、頚椎脱臼及び脾臓の切除を行った。脾細胞懸濁液を調製し、分析のために遠心分離により血清を取り出す。
【０１６２】
[0159]免疫抑制作用を、ＨＲＢＣ特異的抗体を産生するＢ細胞の数によって測定する。Ｉｇアイソタイプ（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２等）は、ＩｓｏＤｅｔｅｃｔ（商標）アイソタイピングキットを用いて決定する（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）。一旦Ｉｇアイソタイプが判明すると、ＨＲＢＣに対するマウスの抗体を、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定する。９６ウェルプレートをＨＲＢＣでのコートし、動物から分離した抗ＨＲＢＣ抗体を含む血清と共にインキュベートする。このプレートを、アルカリホスファターゼで標識した二次抗体と共にインキュベートし、発色を基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェートを用いて、４０５ｎｍでマイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定する。
【０１６３】
[0160]Ｔ及びＢ細胞アクティベーターコンカナバリンＡ、並びに、リポ多糖それぞれに応答したリンパ球の増殖を測定する。マウスを、７日間抗ＩＡＣＳＤ抗体治療を受ける１群と対照としての１群の２群にランダムに分ける。治療終了後、動物を頚椎脱臼により殺処分し、脾臓を摘出して上記のように脾細胞懸濁液を調製する。ｅｘ  ｖｉｖｏの試験については、同数の脾細胞を用いるが、ｉｎ  ｖｉｖｏの試験については、試験開始時に抗ＩＡＣＳＤ抗体を培地に添加する。また上記の３Ｈ−チミジン取り込みアッセイを用いて、細胞増殖をアッセイする。
【０１６４】
実施例９−ＩＡＣＳＤペプチドフラグメントに応答するサイトカイン分泌
[0161]Ｉｇドメイン等のＩＡＣＳＤタンパク質のフラグメントの活性を評価するために、サイトカイン分泌を刺激するために、並びに、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び骨髄細胞での免疫応答を刺激するためにアッセイを実施する。このような免疫応答を、免疫系を刺激して腫瘍細胞の殺傷又は増殖抑制を認識及び／又は媒介するために用いることができる。同様に、この免疫刺激を、細菌又はウイルス感染を標的にするために用いることができる。或いは、ＩＡＣＳＤ受容体を介する活性化を阻害するＩＡＣＳＤのフラグメントを、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞及び骨髄細胞における免疫刺激を阻害するために用い得る。
【０１６５】
[0162]ＩＡＣＳＤのフラグメントを含む融合タンパク質、例えばＩｇドメインは、ＣＤ３３リーダーペプチドの後ろにヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したＩＡＣＳＤドメインを哺乳動物発現ベクターに挿入することによって作製され、これは例えば、ＮＳ−１細胞に安定にトランスフェクトされる。融合タンパク質は、培養上清に分泌され、これはインターフェロンγ分泌アッセイ等のサイトカインアッセイのために採取される。
【０１６６】
[0163]ＰＢＭＣは、最適用量以下の可溶性ＣＤ３濃度及び種々の濃度の精製した可溶性の抗ＩＡＣＳＤモノクローナル抗体又は対照ＩｇＧで活性化される。ＩＡＣＳＤ−Ｉｇサイトカインアッセイについては、抗ヒトＦｃ  Ｉｇを、５又は２０μｇ／ｍｌで９６ウェルプレートに結合し、一夜４℃でインキュベートする。過剰の抗体を除去し、ＩＡＣＳＤ−Ｉｇ又は対照Ｉｇのいずれかを２０〜５０μｇ／ｍｌで添加して室温で４時間インキュベートする。種々の濃度で細胞及び抗ＣＤ３を添加する前に、過剰な融合タンパク質を除去するためにプレートを洗浄する。上清を培養の４８時間後に採取し、製造者が推奨するように、インターフェロンγレベルを、一次及びビオチン化二次抗ヒトインターフェロンγ抗体を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定する。
【０１６７】
実施例１０−ＩＡＣＳＤ発現を検出するためのＩＡＣＳＤ特異的抗体を用いる診断法
[0164]（正常又は疾患を有する）組織試料におけるＩＡＣＳＤの発現を、抗ＩＡＣＳＤ抗体を用いて検出する。試料を、標準的技術を用いて１０％ホルマリンで組織を固定し、パラフィンに包埋し、切片にして免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析のために調製する。ＩＡＣＳＤ特異的抗体を用いて切片を染色した後、二次ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体と共にインキュベーションして切片を染色し、ＨＲＰ酵素反応産物により可視化する。
【０１６８】
[0165]血液試料中の細胞表面のＩＡＣＳＤの発現を、フローサイトメトリーにより検出する。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的技術を用いて血液試料から分離する。細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、ＩＡＣＳＤ特異的ポリクローナル抗体と共に氷上で３０分間インキュベートする。細胞を穏やかにペレット化し、ＰＢＳで洗浄し、蛍光抗ウサギ抗体と共に氷上で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、細胞を穏やかにペレット化し、氷冷したＰＢＳで洗浄し、０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳに再懸濁して分析まで氷上で保存する。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）及びＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、試料を分析する。機器設定は、ＦＡＣＳ−ブライトキャリブレーションビーズ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて決定する。
【０１６９】
[0166]１２３Ｉ等の放射性核種に結合したＩＡＣＳＤ特異的抗体を用い、腫瘍を標的にするために患者に注射した後、Ｘ線又は磁気共鳴画像によって、ＩＡＣＳＤを発現する腫瘍を画像化する。
【０１７０】
実施例１１−ＩＡＣＳＤ特異的抗体を用いる腫瘍画像化
[0167]ＩＡＣＳＤ特異的抗体を、ｉｎ  ｖｉｖｏでＩＡＣＳＤを発現する細胞の画像化のために用いる。６週齢の胸腺欠損ヌードマウスを、セシウムソースからの４００ラドで照射する。３日後、照射されたマウスの大腿の皮下に、４×１０７  ＲＡ１細胞及び４×１０６のヒト胎児肺繊維芽細胞フィーダー細胞を接種する。腫瘍が直径約１ｃｍに達したときに、マウスに１００μＣｉ／１０μｇの１３１Ｉ標識したＩＡＣＳＤ特異的抗体を含む接種物を静注する。注射後１日、３日及び５日目に、マウスを０．８ｍｇナトリウムペントバルビタールの皮下注射で麻酔する。次いで固定したマウスを腹臥位にして、Ｎｕｃｌｅａｒ  ＭＡＸ  Ｐｌｕｓ画像分析ソフトウェアパッケージ（ＭＥＤＸ  Ｉｎｃ．；Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ、Ｉｌｌ．）を用いて、５，０００〜１０，０００のカウントを記録するよう設定されたピンホールコリメータを備えたＳｐｅｃｔｒｕｍ  ９１カメラ（Ｒａｙｔｈｅｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｅｌｒｏｓｅ  Ｐａｒｋ、Ｉｌｌ．）で画像化する。
【０１７１】
[0168]当業者であれば、特に説明の記載を提供することに関するいずれか及び全て目的のために、本明細書において開示される全範囲は、いずれか及び全ての可能な部分的な範囲、並びに、それらの部分的な範囲の組合せもまた包含することは理解されるであろう。任意の列挙した範囲は、同じ範囲は少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、１０分の１等に十分に記載し且つ分解することができると容易に認識さ得る。非限定的な例として、本明細書中に記載の各範囲は、下部３分の１、中部３分の１及び上部３分の１等に容易に分解され得る。また当業者であれば、「〜まで」、「少なくとも」、「〜より大きい」、「〜未満」、「〜を超える」等のような全ての言語は、上記のように次いで下位の範囲に分解され得る範囲を列挙し且つ表す数を含むことは理解されるであろう。同様に、本明細書において開示される全ての比率もまた、より広い比率の範囲内にある全ての下位の比率を含んでいる。
【０１７２】
[0169]また当業者は、メンバーが共通の方法で、例えばマーカッシュグループでグループ化される場合、特定の実施形態は全体として列挙した完全なグループばかりでなく、グループの各メンバーを個々に及び主要なグループの全ての可能なサブグループもまた包含することを容易に認識するであろう。したがって全ての目的のために、特定の実施形態は、主要なグループばかりでなく、１つ又は複数のグループメンバーを欠く主要なグループも包含する。個々の実施形態はまた、１つ又はそれ以上のいずれかのグループメンバーの明白な排除を意図している。
【０１７３】
[0170]本明細書において開示する全ての参考文献、特許及び刊行物は、ここに特に参考文献として引用した。特に明記しない限り、詞「ａ」、又は、「ａｎ」は、「１つ又はそれ以上」を意味する。
【０１７４】
[0171]好ましい実施形態が説明され且つ記述されているが、本明細書中に記載する広義の観点では本発明を逸脱することなく、当業者により変更及び修飾を実施できることを理解されたい。本発明のより広い態様は、以下の請求の範囲に定義される。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】本発明による抗ＩＡＣＳＤ抗体とＢ細胞の相互作用を示すデータを示す図である。パネルＡは、細胞が抗体に結合した蛍光色素を照射している図である。パネルＢは、同じ細胞のホワイトフィールド図（ｗｈｉｔｅｆｉｅｌｄ  ｖｉｅｗ）である。
【図１】
2009536217.tif 000007
【配列表】
2009536217000001.app
【国際調査報告】
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