(57)【要約】【解決手段】  新規なワートマニン類似体及び哺乳類におけるＰＩ−３−キナーゼ活性の阻害におけるそれらの使用、並びに対象における癌及び腫瘍形成の治療又は予防について本明細書に記載する。好ましくは、ワートマニン類似体は、癌治療における他の化学療法薬と共に投与することが可能である。【選択図】      図１６Ｂ
2009500408.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を治療する方法であって、
以下の化学式を有する化合物の薬学的有効量と、化学療法薬とを対象に投与する工程を有するものであり、
【化１】
2009500408.tif 000019
ここで、
Ｙはヘテロ原子であり、更にＲ１又はＲ２は不飽和アルキル、非直線アルキル、又は置換アルキルである、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、
前記Ｒ１又はＲ２は二置換アルキルである。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記化学療法薬は、細胞障害剤及び抗腫瘍標的化剤から成る群より選択されるものである。
【請求項４】
請求項２記載の方法において、前記細胞障害剤は、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、及びシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）から成る群より選択されるものである。
【請求項５】
請求項２記載の方法において、前記抗腫瘍標的化剤は、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、及びベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）から成る群より選択されるものである。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、前記化合物は以下の化合物である。
【化２】
2009500408.tif 000020
【請求項６】
請求項１記載の方法において、前記化合物は以下の化合物である。
【化３】
2009500408.tif 000021
【請求項７】
請求項１記載の方法において、前記化合物は以下の化合物である。
【化４】
2009500408.tif 000022
【請求項８】
請求項１記載の方法において、前記化合物は経口投与されるものである。
【請求項９】
請求項１記載の方法において、前記化合物は静脈内投与されるものである。
【請求項１０】
請求項１記載の方法において、前記化合物はＰＸ−８６６であり、前記化学療法薬はゲフィチニブである。
【請求項１１】
請求項１記載の方法において、前記化合物はＰＸ−８６６であり、前記化学療法薬はベバシズマブである。
【請求項１２】
請求項１記載の方法において、前記化合物はＰＸ−８６７であり、前記化学療法薬はゲフィチニブである。
【請求項１３】
請求項１記載の方法において、前記化合物はＰＸ−８６７であり、前記化学療法薬はベバシズマブである。
【請求項１４】
前記請求項１の方法において、この方法は、さらに、
抗高血糖剤を投与する工程を有するものである。
【請求項１５】
以下の化学式の化合物と、化学療法薬とを有する組成物であって、
【化５】
2009500408.tif 000023
ここで、
Ｙはヘテロ原子であり、Ｒ１又はＲ２はそれぞれ不飽和アルキル、非直線アルキル、又は置換アルキルである、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、「ワートマニン類似体及びその使用」という名称で、２００４年７月９日付で提出された米国仮出願第６０／５８６，６８７号に対して優先権を主張しており、その全体は本明細書に組み込まれるものである。
発明の開示
【背景技術】
【０００２】
本発明はワートマニン類似体、及びＰＩ−３−キナーゼ活性を阻害し、更に特定の悪性腫瘍及び他の癌を治療するために、それらの誘導体を単独又は化学療法薬と組み合わせて使用する方法に関する。ワートマニンは、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ−３−キナーゼ）及び抗癌剤の強力な阻害剤として周知である。ワートマニンは、真菌アオカビワートマニンの培養液から単離される天然化合物であり、米国特許第５，４８０，９０６号明細書において示される基本構造を有するものである（前記引用はこの参照により本明細書に組み込まれる）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明の一観点によると、新規なワートマニン類似体、及び対象において癌を阻害する方法を提供するものであり、その方法はワートマニン類似体の薬学的有効量を対象に投与する工程を有するものである。
【０００４】
本発明の別の観点によると、ワートマニン類似体の有効量を投与することにより哺乳類のＰＩ−３−キナーゼ活性を阻害する方法が提供される。
【０００５】
本発明の別の観点によると、抗癌（抗腫瘍）剤としての前記化合物使用、及び薬学的に許容可能な担体、受容体、又は希釈剤と組み合わせた前記化合物を含む薬学製剤が提供される。
【０００６】
本発明の更なる観点によると、癌を治療するための化学療法薬と組み合わせたワートマニン類似体の使用が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本組成物及び方法を記載する前に、本発明が、記載される特定の工程、組成物、又は方法に限られず、変化することもあることが理解される。また、本記載において使用される専門用語は、特定の意味又は実施形態を説明する目的のみのものであり、添付の請求項のみによって限定される本発明の範囲を制限することを意図しないことが理解される。
【０００８】
その本明細書及び添付の請求項において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈で明確に別に示されていない限り、複数の言及を含む。従って、例えば、「繊維芽細胞」への言及は、１若しくはそれ以上の繊維芽細胞及び当業者に既知のその同等物に言及するなどである。他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者に一般的に理解される同一の意味を有する。本明細書において記載されるものと類似又は同等な任意の方法及び物質が本発明の実施形態の実践又は試験において使用される場合があるが、好ましい方法、装置、及び物質は以下に記載する。本明細書において記載する全公開物は、参照により全体が組み込まれる。本明細書は、本発明が先行技術の長所による開示に先立つ権利がないことの承認として解釈されるものではない。
【０００９】
本明細書に記載する使用方法は、既存の病気の治療における治療的使用及び予防的使用を意図する。本明細書において使用されるように、「約」という用語は、使用されている数値の±１０％を意味する。従って、約５０％は、４５％〜５５％の範囲を意味する。
【００１０】
治療手段と併せて使用する場合の「投与」は、全身に若しくは例えば直接標的細胞に又は標的細胞上に治療剤を投与するように局所的に投与すること、若しくは治療剤が標的とする組織に確実に影響を与えるように治療剤を患者に投与することを意味する。従って、本明細書において使用されるように、ワートマニン類似体と併せて使用する場合、「投与」という用語は、これに限定されないが、標的組織中又は標的組織上にワートマニン類似体を提供すること、治療薬が標的組織又は細胞に到達するように例えば静脈内注射により全身的に患者にワートマニン類似体を提供することを含む。組成物を「投与する」ことは、注射、局所的投与、経口投与により、若しくは他の方法単独で又は他の従来技術との組み合わせで達成される。そのような組み合わせ技術は、加熱、放射線照射、及び超音波を含む。
【００１１】
本明細書において使用されるように、「治療的な（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）」という用語は、患者の望ましくない状態又は病気を治療する、防止する、改善する、阻止する、又は向上させる薬剤を意味する。一部において、本発明の実施形態は、癌治療及び／又は癌症状の改善に関する。
【００１２】
組成物の「治療的有効量」又は「有効量」は、望まれる効果、すなわち、細胞の活性、遊走、又は増殖を抑制、阻害、又は逆転させるなど効果を達成するために、或いは癌を効果的に治療する若しくは癌の症状を改善するために算出された所定量である。本発明のワートマニン類似体の治療的有効量は、生理的に許容な賦形剤組成物において投与される場合、血漿又は血清における有効濃度若しくは標的組織における局所的有効濃度に到達するのに十分である一般的な量である。本発明の化合物の有効量は、治療中の患者が経験する腫瘍サイズ、全身腫瘍組織量、又は症状における改善により測定することが可能である。本発明の方法により予期される活性は、適切な医学的治療剤及び／又は予防的治療の両者を含む。治療的及び／又は予防的効果を得るために本発明に従って投与される化合物の特定の投与量は、例えば、投与化合物、投与経路、及び治療する病気など含む特定の周囲状況により、当然、決定されるであろう。
【００１３】
「抑制する」という用語は、症状を緩和し、疾病、状態、又は疾患を除去して症状の発現を防ぐための本発明の化合物の投与を含む。
【００１４】
本発明の一観点は、以下の一般的化学式のワートマニン類似体であり、
【００１５】
【化６】
2009500408.tif 000003
【００１６】
ここで、Ｙはヘテロ原子であり、更にＲ１又はＲ２は不飽和アルキル、非直線アルキル、若しくは置換アルキルであり、分枝鎖又は環状アルキルを含む。好ましくは、ワートマニン類似体は、図１６において示される化合物から成る群から選択される化学式と一致する。より好ましくは、Ｒ１又はＲ２は、ＰＸ−８６６及びＰＸ−８６７等の二置換アルキルである。
【００１７】
ワートマニンの生合成的な生成は当業者に既知であり、その類似体はワートマニンから合成される。米国特許第５，４８０，９０６号明細書において（これはこの参照により本明細書に完全に組み込まれる）、典型的な合成スキームが記載されている。一般的に、ワートマニンは、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓワートマニン及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍワートマニン、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｒｏｒｉｄｉｕｍ、並びにフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）等の以前に開示された多くの微生物のうちのいずれか１つの発酵により生成される。発酵後、ワートマニンは抽出され、既知の方法により精製される。好ましくはワートマニンは微生物合成され、発酵培養から実質的に精製された形態で単離される（そのような発酵培養の１つはＡ２４６０３．１として特定される）。
【００１８】
ワートマニンの回収可能な量が生産されるまで、適切な培地において水中酸素条件下で株を培養することにより、ワートマニンが生成される。ワートマニンは、当業者に既知のさまざまな単離及び精製手順を使用して回収することが可能である。
【００１９】
培養株を増殖するために使用される培地は、多くの培地のいずれか１つであれば良い。しかしながら、生成、最適収量、及び生成物単離の簡便さにおける経済的理由から、大規模発酵において好ましい炭素源は、グルコース及び可溶性澱粉（トウモロコシ澱粉等）である。マルトース、リボース、キシロース、フラクトース、ガラクトース、マンノース、マンニトール、ジャガイモデキストリン、オレイン酸メチル、大豆油等の油等もまた、使用可能である。
【００２０】
好ましい窒素源は、酵素加水分解カゼイン及び綿実小麦粉であるが、ペプシン分解された乳汁、消化された大豆食、魚粉、コーンスティープリカー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）、酵母エキス、酸性加水分解カゼイン、牛肉エキス等もまた、使用可能である。
【００２１】
培養培地に組み入れることが可能な栄養源無機塩の中で、通常可溶な塩は、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ナトリウムイオン、アンモニウムイオン、塩化物イオン、炭酸イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、亜鉛イオン等を生成することができる。生物の成長及び発育のために必要な必須微量元素もまた、培地中に含まれるようにすべきである。そのような微量元素は、一般的に、生物が成長するための必要条件に十分な量において培地の他の置換基の不純物として存在する。
【００２２】
相当量のワートマニンを生成するためには、撹拌したバイオリアクター中の水中好気性発酵が好まれる。少量のワートマニンは、振盪培養により得ることが出来る。大型バイオリアクターを生物の芽胞形成と接種するのに一般的に関連する生成のタイムラグのため、栄養接種を使用することが好ましい。栄養接種は、少量の培地を芽胞形成または菌糸断片と摂取することにより調整され、新鮮且つ活発に成長する生物体の培地が得られる。栄養接種培地は、より大規模発酵のために使用されるものと同一でも良いが、他の培地もまた適切である。
【００２３】
前述の生成後、ワートマニンは、当業者において使用される方法によって発酵培地から回収され得る。Ａ２４６０３．１生物の発酵期間に生成されるワートマニンは、例えば、主に培養液中に発生する。
【００２４】
一般的に、ワートマニンはさまざまな技術によりバイオマスから回収することが可能である。好ましい技術は、セラミック濾過器により全発酵培養液を濾過することに関連する。濾液は、酢酸エチル等の有機溶媒で溶出し濃縮する。前記濃縮物は結晶化が起こるまでアルコール中に懸濁し、さらにその溶液を濾過し、洗浄し、更に乾燥させる。確認のために、結晶性物質を有機溶媒に溶解し、逆相シリカゲル吸収剤（Ｃ８又はＣ１８）上のクロマトグラフィーにかける。分画は、６０％アセトニトリルなどの有機溶媒−水溶液緩衝液で溶出される。
【００２５】
ワートマニンを更に操作することにより本発明の化合物に達する。特定のワートマニン類似体の合成を以下に示したが、当業者であれば当業者に一般的である他の合成スキームによって本発明に従った化合物を合成することが可能であり、本明細書において説明される合成スキームが限定的であると考慮されるべきではない。
【００２６】
特定の兆候を治療的処置するために、本発明のワートマニン類似体は、非経口、経皮、直腸、経鼻、局所的静脈投与、又は好ましくは経口投与のための単位投与量形態において、薬学的組成物として、或いは薬学的組成物と混ぜ合わせて処方することにより投与することが可能である。そのような薬学的組成物は、当業者に既知の方法で調製され、薬学的担体、及び本明細書を通して使用される用語「活性化合物」から成る群より選択される少なくとも１つの活性化合物を含み、前記「活性化合物」という用語は、前記化学式の化合物から成る化合物から選択される少なくとも１つの化合物又はそれらの薬学的に許容な塩に言及する。
【００２７】
化合物は、広範囲な投与量において有効であり、例えば、通常一日の投与量は、０．００１〜１０のｍｇ／ｋｇまでであり、より一般的には０．０１〜１ｍｇ／ｋｇである。しかしながら、投与される有効量が、治療される条件、投与される化合物の選択、及び選択された投与経路を含む適切な状況に合わせて、医者により決定されることが理解され、従って上記の投与量範囲は本発明の範囲を限定する意図ではない。
【００２８】
そのような組成物において、活性化合物は、「活性成分」として知られる。組成物を作る際に、活性成分は、カプセル、におい袋、紙、又は他のコンテナであっても良い担体と通常混合され、又は担体により希釈され、又は担体の中に包み込まれる。担体が希釈剤として役立つ場合、それは、活性成分のための媒体の賦形剤として作用する固体物質、半固体物質、又は液体物質である。このように、組成物は、錠剤、ピル、粉末、トローチ剤、カプセル、エリキシル剤、エマルション、溶液、シロップ、懸濁液、柔ゼラチンカプセル又は硬ゼラチン、注射可能な滅菌溶液、及びパック化滅菌粉末の形態であり得る。
【００２９】
適切な担体、賦形剤及び希釈剤のいくつかの実施例は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウムアルギン酸塩、カルシウムサリシレート、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、トラガカンタ、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、メチル−及びプロピルヒドロキシ安息香酸塩、滑石、ステアリン酸マグネシウム、水、及び鉱油を含む。製剤は加えて、平滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存料、甘味料、又は香料を含み得る。組成物は、当業者に既知の手順を使用することにより患者に投与後活性成分の即時、徐放性、又は遅延放出を提供する目的で調製される。
【００３０】
経口投与のために、化合物は担体及び希釈剤と混合され、錠剤に成型、又はゼラチンカプセルに封入することが可能である。前記混合物は選択的に１０％グルコース水溶液、等張食塩水、滅菌溶液等の液体中で溶解することが可能であり、静脈内又は注射により投与することが可能である。
【００３１】
「薬学的に許容可能な」とは、担体、希釈剤、又は賦形剤が製剤の他の成分と適合しなければならなく、その受容体に対して有害であってはならないことを意味する。
【００３２】
活性化合物を癌治療のために抑制量で局所的に送達することは、化合物を増殖部位に又はその近接位に投与する様々な技術によりなされ得る。局所的送達技術の例は限定することを意図しないが、利用可能な技術を例示する。それらの例は、局所的送達カテーテル、部位特異的担体、移植、直接注入、又は直接塗布を含む。カテーテルによる局所的送達によって、直接増殖部位に薬剤を投与することが可能である。
【００３３】
移植による局所的送達とは、薬剤を含むマトリックスを増殖病巣へ外科的配置することを表す。移植されたマトリックスは、拡散、化学反応、又は溶媒活性化剤により薬剤を放出する。
【００３４】
他の例は、ポリマーの腔内封着による薬剤の送達である。この技術は、ポリマー移植を内腔の内部表面に適用させるためにカテーテルを使用する。生分解性ポリマー移植に組み込まれた薬剤は、外科的部位において放出される。このような内容は、国際公報第ＷＯ９０／０１９６９号（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ，Ａｕｇ．２３，１９８９）に記載される。
【００３５】
移植による局所的送達の最後の例は、小胞又は微粒子の増殖部位への直接注入によるものである。これらの微粒子は、タンパク質、脂質、炭水化物、又は合成ポリマー等の物質から成るものであっても良い。これらの微粒子は、微粒子覆うコーテング剤として又は微粒子を介して組み込まれた薬剤を有する。微粒子を組み込んでいる送達系は、Ｌａｎｇｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９９０）及び  Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐ．Ｐｏｌｙ．Ｓｃｉ．，２６：８０９（１９８１）に記載される。
【００３６】
部位特異的担体による局所的送達とは、増殖部位に医薬品を導く担体に薬剤を接着することを表す。この送達技術の例は、タンパク質リガンド又は単クローン抗体等の担体の使用を含む。
【００３７】
直接塗布による局所的送達は、局所的塗布の使用を含む。直接塗布による局所的送達の例は、動脈腫瘍又は腫瘍の切除後残された部位への薬剤の塗布である。
【００３８】
ワートマニン類似体の製剤は当業者に周知であり発酵工程によるものである。製剤又は合成スキームに関する包括的な詳細に入るより、本発明は以下の一般化学式の合物を合成するためのそれらの一般的合成技術及び製剤技術を使用する当業者に依存しており、
【００３９】
【化７】
2009500408.tif 000004
【００４０】
ここにおいて、
Ｙはヘテロ原子であり、更にＲ１又はＲ２が不飽和アルキル、非直線アルキル、分枝鎖アルキル、置換アルキル、又は環状アルキルである。好ましくは、本発明は、図１６において示される化合物から成る群より選択される化合物に対応する化学式を有する。
【００４１】
ワートマニン類似体及びそれを含む薬学的組成物は、ＰＩ−３Ｋの阻害及び癌の治療及び／又は予防に役立つ可能性がある。
【００４２】
本発明の別の観点によると、癌の治療及び／又は予防における化学療法薬と組み合わせたワートマニン類似体の使用が提供される。ワートマニン類似体は、化学療法薬の投与の前、その最中、又はその後に投与される。化学療法薬は、細胞障害剤及び抗腫瘍標的化剤の両者を含む。例示的な細胞障害剤は、これに限定されるものではないが、ゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、及びシスプラチン（プラチノール（登録商標））を含む。例示的な抗腫瘍標的化剤は、これに限定されるものではないが、ゲフィチニブを（イレッサ（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、セツキシマブ（エルビタックス（登録商標））、及びベバシズマブ（アバスチン（登録商標））を含む。特定の実施形態において、薬学製剤は、ワートマニン類似体及び化学療法薬の組み合わせを含む。他の実施形態において、ワートマニン類似体及び化学療法薬は、他の薬剤の投与の前、実質的に同時、又は後のいずれかの時に別々に投与される。
【００４３】
本発明の別の観点において、以下の一般化学式のワートマニン類似体の治療的有効量を投与することによりＰＩ−３Ｋを阻害する方法が提供され、
【００４４】
【化８】
2009500408.tif 000005
【００４５】
ここにおいて、
Ｙはヘテロ原子であり、更にＲ１又はＲ２は分枝鎖アルキル又は環状アルキルを含む不飽和アルキル、非直線アルキル、置換されたアルキルである。好ましくは、前記ワートマニン類似体は、図１６において示される化合物からなる群より選択される化学式と一致する。より好ましくは、Ｒ１又はＲ２は、二置換アルキルである。一実施形態において、前記ワートマニン類似体はＰＸ−８６６及びＰＸ−８６７である。前記ワートマニン類似体は、化学療法薬の投与の前、実質的に同時、又は後に投与される。
【００４６】
本発明の別の観点において、以下の一般化学式のワートマニン類似体の治療的有効量を投与することによりＰＩ−３Ｋを阻害する方法が提供され、
【００４７】
【化９】
2009500408.tif 000006
【００４８】
ここにおいて、
Ｙはヘテロ原子であり、更にＲ１又はＲ２は分枝鎖アルキル又は環状アルキルを含む不飽和のアルキル、非直線アルキル、置換されたアルキルである。好ましくは、前記ワートマニン類似体のＲ１又はＲ２は二置換アルキルであり、化学療法薬は、ゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、及びシスプラチン（プラチノール（登録商標））から成る群から選択されるものである。例示的な抗腫瘍標的化剤は、これに限定されるものではないが、ゲフィチニブを（イレッサ（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、セツキシマブ（エルビタックス（登録商標））、及びベバシズマブ（アバスチン（登録商標））を含む。より好まれる実施形態において、前記方法はＰＸ−８６６及びゲフィチニブを投与することを含む。また別の実施形態において、前記方法はＰＸ−８６７及びゲフィチニブを投与することを含む。前記ワートマニン類似体は、化学療法薬の投与の前、実質的に同時に、又はその後に投与することが可能である。
【００４９】
本発明の別の観点において、以下の一般化学式のワートマニン類似体の治療的有効量を投与することにより癌を治療又は予防する方法が提供され、
【００５０】
【化１０】
2009500408.tif 000007
【００５１】
ここにおいて、
Ｙはヘテロ原子であり、更にＲ１又はＲ２は分枝鎖アルキル又は環状アルキルを含む不飽和アルキル、非直線アルキル、置換アルキルである。好ましくは、前記ワートマニン類似体は、図１６において示される化合物からなる群より選択される化学式と一致する。より好ましくは、Ｒ１又はＲ２は二置換アルキルである。一実施形態において、前記ワートマニン類似体はＰＸ−８６６及びＰＸ−８６７である。前記ワートマニン類似体は、化学療法薬の投与の前、実質的に同時、又は後に投与することが可能である。
【００５２】
本発明の別の観点において、以下の一般化学式のワートマニン類似体の治療的有効量を他の化学療法薬との組み合わせで投与することにより癌を治療又は予防する方法が提供され、
【００５３】
【化１１】
2009500408.tif 000008
【００５４】
ここにおいて、
Ｙはヘテロ原子、更にＲ１又はＲ２は分枝鎖アルキル又は環状アルキルを含む不飽和アルキル、非直線アルキル、置換アルキルである。好ましくは、ワートマニン類似体のＲ１又はＲ２は二置換アルキルであり、化学療法薬は、ゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、及びシスプラチン（プラチノール（登録商標））から成るグループから選択される。例示的な抗腫瘍標的化剤は、これに限定されるものではないが、ゲフィチニブを（イレッサ（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、セツキシマブ（エルビタックス（登録商標））、及びベバシズマブ（アバスチン（登録商標））を含む。より好ましい実施形態において、前記方法は、ＰＸ−８６６及びゲフィチニブの投与を含む。別のより好ましい実施形態において、前記方法は、ＰＸ−８６７及びゲフィチニブの投与を含む。前記ワートマニン類似体は、前記化学療法薬の投与前、実質的に同時に、又はその後に投与することが可能である。
【００５５】
更なる実施形態において、ワートマニン類似体の活性代謝産物を含む化合物及びその使用方法が提供される。好ましい実施形態において、前記活性代謝産物は、ワートマニン類似体のカルボニル還元物、及ぶカルボニル還元脱アセチル化物から成る群より選択されるものである。より好ましい実施形態において、前記活性代謝産物は、カルボニル還元ＰＸ−８６６及びカルボニル還元脱アセチル化ＰＸ−８６６から成る群より選択されるものである。
【００５６】
増大した細胞生存は癌細胞の基本的特性であり、癌治療の効果を制限する。多くの癌における増大した細胞生存の重要なメカニズムは、受容体及び発癌性タンパク質チロシンキナーゼにより活性化されるホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼ）／Ａｋｔ（タンパク質キナーゼＢ）情報伝達系により媒介される。８種類の哺乳類のＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼは、３つの主なクラスに分類される。分類ＩのＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼのリン酸化メンブレンＰｔｄＩｎｓは、そのプレクストリン相同（ｐＨ）ドメインに結合することにより細胞質セリン／トレオニンキナーゼＡｋｔを入れるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を与える。細胞膜に関連したＡｋｔは、細胞膜に関連したホスホイノシチド依存性キナーゼ−１（ＰＤＫ１）によるＳｅｒ４７３リン酸化及び不十分に特徴づけられた第２のＰＤＫ２によるＴｈｒ３０８リン酸化により活性化される。活性化されたＡｋｔは、原形質膜から脱離し、細胞質及び核に移動し、そこにおいて一連の標的をリン酸化して死滅遺伝子（ｄｅａｔｈ  ｇｅｎｅｓ）の発現を防ぎ、細胞生存を誘導する。ＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼ活性は、人間の小細胞肺癌、卵巣癌、頭頸部癌、泌尿器癌、大腸癌、及び子宮頸部癌において増加される。腫瘍抑制タンパク質ＰＴＥＮ（ホスファターゼ及びテンシンホモログが欠失した第１０番染色体上）、二重特異性チロシン−トレオニン／ＰｔｄＩｎｓ−３−ホスファターゼは、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の蓄積を防ぎ、及びＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼ情報伝達（９）を減らす。ＰＴＥＮは、進行前立腺癌、進行子宮体癌、進行腎臓癌、進行グリア癌、進行メラノーマ、進行小細胞肺癌を含むヒトのさまざまな癌において突然変異化している又は欠失している。ＰＸ−８６６は、ゲフィチニブ抗腫瘍活性を強化する。プロテインキナーゼファミリーは、受容体タンパク質チロシンキナーゼがその中においてしばしば癌治療の標的になる８００より多くのヒトメンバーを有する。その細胞外ドメインへのリガンド結合により活性化される際に３つの他のファミリーメンバーＥｒｂＢ−２（ＨＥＲ２）、ＥｒｂＢ−３（ＨＥＲ３）、及びＥｒｂＢ−４（ＨＥＲ４）の任意とホモ２量体化又はヘテロ２量体化し、細胞質のＣ末端チロシン残基の自動リン酸化を引き起こす上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１、ＨＥＲ１）をそれらは、含む。これらのリン酸化は、ラス癌遺伝子−ＭＥＫ  ＭＡＰＫ経路、ＳＴＡＴ経路、及びＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼ／Ａｋｔ生存経路を含む情報伝達経路の活性化を導くシグナルトランスデューサを入れる。ＥＧＦＲは、それが腫瘍進行に重要な役割を果たすと考えられている広範囲のヒトの癌において増幅される又は過剰発現する。非小細胞癌において、ＥＧＦＲ発現は、減少した患者生存と相関する。ＥＧＦＲ単クローン抗体と同様数多くの小分子ＥＧＦＲキナーゼの阻害剤は、開発中である又は臨床使用のために承認される。ゲフィチニブ（ＺＤ  １８３９イレッサ（登録商標））は、再発したｎｓｃ肺癌患者に投与される際に１０〜２０％の応答率を示しており、他の２０〜３０％の患者においてその疾病を安定化させた。しかしながら、未治療のｎｓｃ肺癌患者においてゲフィチニブの化学療法への添加は、全体の生存率、進行時間、応答率に関し、何ら効果がなかった。全てではないが、単一ゲフィチニブ剤に応答する大多数のｎｓｃ肺癌患者は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインの未知機能の重大な体細胞突然変異を含む。しかしながら、ＥＧＦＲ受容体突然変異体を持たないｎｓｃ肺癌患者でゲフィチニブ及び他のＥＧＦＲ阻害剤から利点を得る患者もまた存在する。さらに、ＥＧＦＲの突然変異を活性化することは、ヒトの結腸直腸癌及び神経膠芽腫において稀であるが、これらの腫瘍は、ＥＧＦＲ阻害剤に応答する。最近の研究により、ゲフィチニブが細胞増殖を阻害しＥｒｂＢ−３発現を伴うｎｓｃ肺癌細胞系においてＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼ情報伝達を下方制御するようにＰＸ−８６６は、ゲフィチニブ抗腫瘍活性を強化するということが示された。これは、ＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼがＥｒｂＢ−３にカップリングし、野生型又はＥＧＦＲ受容体突然変異体の一方及びＥｒｂＢ−３を有するｎｓｃ肺癌細胞系においてのみＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼ／Ａｋｔ情報伝達活性化を導く故である。ゲフィチニブは、ＥｒｂＢ−３へのＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼの結合を阻害し、このようにこれらの細胞系においてＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼ／Ａｋｔ活性化を防ぐことが可能である。ゲフィチニブへの応答を決定する際に働くＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼの中心的役割は、ＥｒｂＢ−３を発現しない抗ｎｓｃ肺癌腫瘍においてＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼの阻害剤がゲフィチニブの抗腫瘍活性を増す方法を提供する可能性があることを示唆する。ＰＸ−８６６は、現在臨床前の試行開発段階にあるＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼの新しい阻害剤である。ＥｒｂＢ−３を発現せず、ゲフィチニブに耐性がある活性Ｎｒａｓ突然変異体を有するＡ−５４９ヒトｎｓｃ肺癌細胞系が使用された。Ａ−５４９腫瘍異種移植片において、ゲフィチニブがＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼ／Ａｋｔ情報伝達を阻害せず、ＰＸ−８６６の静脈内（ｉｖ）又は経口（ｐｏ）投与がゲフィチニブの抗腫瘍活性を顕著に強化したことが見出された。ＰＸ−８６６の長期投与の毒性は、それがインスリン感受性の減少に関連した血糖値を増すことを示す。
【００５７】
使用される方法及び物質を図示している本発明及び実施例は、以下の非制限実施例の参照により更に理解される。
【実施例１】
【００５８】
酢酸４−ジアリルアミノメチレン−６−ヒドロキシ−１−α−メトキシメチル−１０β，１３β−ジメチル−３，７，１７−トリオキソ−１，３，４，７，１０，１１β，１２，１３，１４α，１５，１６，１７−ドデカヒドロ−２−オキサ−シクロペンタ［α］フェナントレン−１１−イル−エステル（ｄｊｍ２−１６６）。
【００５９】
【化１２】
2009500408.tif 000009
【００６０】
新たに調製したＣＨ２Ｃｌ２中の０．２Ｍジアリルアミン原液（１３８μＬ，２７．５μｍｏｌ））を、ＣＨ２Ｃｌ２（１２５μＬ）中のワートマニン溶液（１０．７ｍｇ，２５．０μｍｏｌ）に添加した。その反応混合物を室温で１時間撹拌した。溶媒及び過剰アミンを真空中で除去し、ＳｉＯ２（ヘキサン／酢酸エチル，１：９）のクロマトグラフィーを用いて生成物を精製することにより、オレンジ油としてｄｊｍ２−１６６（９．０ｍｇ，１７μｍｏｌ，６８％）が得られた：［α］Ｄ＝６３０（ｃ０．００１５，ＣＨ２Ｃｌ２，２３Ｃ）；ＩＲ（ＫＢｒ）３３９１，１７４３，１６９５，１６８５，１６２２，１５６９，１２２２，１１１１，１１００ｃｍ−１；１ＨＮＭＲ  δ  ８．２０（ｓ，１Ｈ），６．８１（ｓ，１Ｈ），６．０６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４，４．８Ｈｚ），５．８５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），５．６２（ｂｒ，１Ｈ），５．４４〜５．０４（ｍ，４Ｈ），４．４８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２，１．９Ｈｚ），４．０５〜３．６０（ｍ，４Ｈ），３．２６（ｓ，３Ｈ），３．２７〜３．２０（ｍ，１Ｈ），３．１６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．９，７．２Ｈｚ），３．００〜２．９０（ｍ，２Ｈ），２．５９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１９．４，８．６Ｈｚ），２．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．４，７．７Ｈｚ），２．３５〜２．０７（ｍ，２Ｈ），２．０７（ｓ，３Ｈ），１．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．４，４．７Ｈｚ），１．５４（ｓ，３Ｈ），０．８６（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ  δ２１７．０，１７８．５，１６９．６，１６４．８，１５６．３，１５１．５，１３９．０，１３６．９，１３２．２，１３１．３，１２７．７（２Ｃ），１１９．２，８９．０，８１．９，７３．１，６７．６，５９．１，５０．９（２Ｃ），４８．９，４２．３，４２．２，３７．５，３６．０，２４．６，２２．２，２０．８，１６．１；ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ（ｒｅｌ．強度）５２５（Ｍ＋，１１），４６６（１７），３９１（１５），３５０（１４），３２３（１３），２６６（１７），２３９（１７），６０（１００）；ＨＲＭＳ（ＥＩ）Ｃ２９Ｈ３５ＮＯ８の計算値は５２５．２３６３であり、実測値は５２５．２３８６であった。
【実施例２】
【００６１】
酢酸６−ヒドロキシ−１α−メトキシメチル−１０β，１３β−ジメチル−３，７，１７−トリオキソ−４−ピロリジン−１−イル−メチレン−１，３，４，７，１０，１１β，１２，１３，１４α，１５，１６，１７−ドデカヒドロ−２−オキサ−シクロペンタ［α］フェナントレン−１１−イル（ｄｊｍ２−１６７）。
【００６２】
【化１３】
2009500408.tif 000010
【００６３】
ＣＨ２Ｃｌ２中のピロリジン（７．０μＬ，８４μｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（２００μＬ）中のワートマニン溶液（３０．０ｍｇ，７０．０μｍｏｌ）に添加した。その反応混合物を室温で１時間撹拌した。溶媒及び過剰チオールを真空中で除去し、ＳｉＯ２（ヘキサン／酢酸エチル  ９：１，結果１：１）のクロマトグラフィーによって生成物を精製することにより、オレンジ油としてｄｊｍ２−１６７（３０．０ｍｇ，６０．６μｍｏｌ，８６％）が得られた。：［α］Ｄ−３９０（ｃ０．００７３，ＣＨ２Ｃｌ２，２３Ｃ）；ＩＲ（ＫＢｒ）３３３７，１７４０，１６８４，１６１７，１５７０，１２６１，１２２１，１０９９，１０１８ｃｍ．ｓｕｐ．−１；．ｓｕｐ．１Ｈ  ＮＭＲ  δ８．２９（ｓ，１Ｈ），６．７２（ｓ，１Ｈ），６．０７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，４．８Ｈｚ），４．４７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０，１．９Ｈｚ），３．８０〜３．７０（ｍ，２Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．２５〜３．１４（ｍ，２Ｈ），３．０２〜２．９０（ｍ，２Ｈ），２．６９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），２．５８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１９．１，８．４Ｈｚ），２．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．６，７．８Ｈｚ），２．３２〜２．０８（ｍ，２Ｈ），２．０６（ｓ，３Ｈ），１．９９〜１．９５（ｍ，５Ｈ），１．８４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．５，４．２Ｈｚ），１．５６（ｓ，３Ｈ），０．８６（ｓ，３Ｈ）；．ｓｕｐ．１３Ｃ  ＮＭＲ  δ  ２１７．５，１７８．９，１６９．９，１６４．９，１５３．９，１５１．３，１３７．６，１３７．１，１２９．２，８９．４，８２．１，７３．３，６７．７，５９．３，５５．２，４９．２（２Ｃ），４２．６，４２．４，３７．８，３６．３，２５．６（２Ｃ），２４．５，２２．４，２１．０，１６．３；ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ（ｒｅｌ．強度）４９９（Ｍ．ｓｕｐ．＋，１），４３９（２），３６５（７），１６７（３５），１４９（１００）；ＨＲＭＳ（ＥＩ）Ｃ２７Ｈ３３ＮＯ８の計算値は４９９．２２０６であり、実測値は１９６であった。
【実施例３】
【００６４】
酢酸４−［（ベンジルメチルアミノ）メチレン］−６−ヒドロキシ−１α−メトキシメチル−１０β，１３β−ジメチル−３，７，１７−トリオキソ−１，３，４，７，１０，１１β，１２，１３，１４α，１５，１６，１７−ドデカヒドロ−２−オキサ−シクロペンタ［α］フェナントレン−１１−イル−エステル（ｄｊｍ２−１８１）。
【００６５】
【化１４】
2009500408.tif 000011
【００６６】
新たに調製したＣＨ２Ｃｌ２中の０．２ＭのＮ−メチルベンジルアミン溶液（１８５μＬ、３７．０μｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（１２５μＬ）中のワートマニン溶液（１０．７ｍｇ、２５．０μｍｏｌ）に添加した。その反応混合物を室温で２時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、ＳｉＯ２（ヘキサン／酢酸エチル、１：９）のクロマトグラフィーによって前記生成物を精製することにより、オレンジ油としてｄｊｍ２−１８１（１３．３ｍｇ、２４．２μｍｏｌ、９７％）が得られた：［α］Ｄ−８３５（ｃ０．００１４，ＣＨ２Ｃｌ２，２３Ｃ）；ＩＲ（ｎｅａｔ）１７４２，１６８５，１６１８，１５８９，１５７５，１２２４ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ  δ８．３６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．３６〜７．２７（ｍ，５Ｈ），６．６０（ｂｓ  ｓ，１Ｈ），６．１０〜６．００（ｍ，１Ｈ），４．６８〜４．６３（ｍ，１Ｈ），４．５３〜４．４７（ｍ，２Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．２５〜３．１１（ｍ，２Ｈ），２．９９〜２．８４（ｍ，２Ｈ），２．７１（ｂｒ，２Ｈ），２．５５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１９．５，８．９Ｈｚ），２．３８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．４，７．６Ｈｚ），２．３２〜２．０５（ｍ，２Ｈ），２．０５（ｓ，３Ｈ），１．８５（ｂｓ  ｓ，１Ｈ），１．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．５，４．７Ｈｚ），１．５２（ｓ，３Ｈ），０．８２（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ  δ２１７．３，１７８．９，１６９．９，１６４．７，１５８．３，１５１．７，１３８．８，１３７．１，１３４．９，１２９．０（３Ｃ），１２８．６，１２８．１（２Ｃ），８８．７，８２．２，７３．４，６７．９，６４．３，５９．４，４９．１，４２．７，４２．５，３７．８（２Ｃ），３６．３，２５．２，２２．５，２１．１，１６．３；ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ（ｒｅｌ．強度）５４９（Ｍ＋，１４），４８９（３７），４１５（１５），１２０（２３），９１（１００）；ＨＲＭＳ（ＥＩ）Ｃ３１Ｈ３５ＮＯ８の計算値は５４９．２３６３であり、実測値は５４９．２３４０であった。
【実施例４】
【００６７】
様々なワートマニン類似体の薬力学を試験した。特に、ＰＸ−８６６、ＰＸ−８６７、及びＰＸ−８８１の投薬効果を、ＨＴ−２９異種移植片リン光体−Ａｋｔの阻害の下で測定した。図１Ａは、前記ワートマニン類似体の投薬量が増加するにつれて阻害が増加したことを図示している。ＰＸ−８６６は、最も大きい阻害活性を呈するように見えた。また、時間経過に伴うＰＸ−８６６の阻害活性への投与経路の効果を測定した。腹腔内、静脈内、及び経口でＰＸ−８６６を投与した。図１Ｂに示すように、特に、ＰＸ−８６６の経口製剤は、より長期間に亘って、より一貫した阻害を提供するように見えた。
【００６８】
インビボでのＰＸ−８６６の静脈内、腹腔内、及び経口投与の薬物動態学を測定したものを図２に図示する。前述に基づくと、ＰＸ−８６６の半減期は約１６時間であると思われる。
【００６９】
下記の経口投与でのＰＸ−８６６の代謝を観察した。以下に図示されるように、通常、ＰＸ−８６６はカルボニル還元物に代謝され、カルボニル還元物は脱アセチル化代謝産物に代謝される。
【００７０】
【化１５】
2009500408.tif 000012
【００７１】
図３に示すように、最も多い成分はＰＸ−８６６であり、続いてカルボニル還元代謝産物、更にカルボニル還元物、脱アセチル化代謝産物である。しかし、投与の約４０分後、カルボニル還元されたＰＸ−８６６は、更にカルボニル還元され、脱アセチル化された代謝産物に代謝されたように見えた。前述に基づくと、主要な代謝産物のＴ１／２は、少なくとも約３時間である。
【実施例５】
【００７２】
ＮＣＩヒト腫瘍細胞株パネルにおいて、ワートマニン類似体の活性を測定した。具体的には、ワートマニン、ＰＸ−８８９、ＰＸ−８６８、ＰＸ−８６６、及びＰＸ−８８１の活性を、白血病、ＮＳＣ肺、大腸、ＣＮＳ、メラノーマ、卵巣、腎臓、前立腺、及び乳癌細胞株においてＩＣ５０で測定した。結果は図４に図示した。
【実施例６】
【００７３】
ＨＴ−２９大腸癌細胞のホスホ−Ａｋｔの阻害を、ＰＸ−８６６及びＰＸ−８６７を投与することによってパーセントコントロールで測定した。結果は図５に図示した。
【実施例７】
【００７４】
ワートマニン類似体の抗腫瘍活性を測定した。下記の表１に示すように、前記類似体はインビボにおいて、腫瘍由来の卵巣、大腸、及び肺に対する抗腫瘍活性を示した。
【００７５】
【表１】
2009500408.tif 000013
【実施例８】
【００７６】
図６に示すように、放射線を単独で、ＰＸ−８６６を単独で、若しくは放射線と組み合わせての抗腫瘍活性を、マウスのＯｖＣａｒ−３ヒト卵巣異種移植片において測定した。５日間に亘って毎日放射線を照射し、５日間毎日に亘る８及び１２．５ｍｇ／ｋｇのＰＸ−８６６の腹腔内投与、若しくは放射線との組み合わせとを比較した。結果は腫瘍体積の平均で測定した。
【実施例９】
【００７７】
様々な細胞毒性薬の抗腫瘍活性を単独若しくはＰＸ−８６６と組み合わせて測定した。細胞毒性剤には、ゲムシタビン、タキソール、及びシスプラチンが含まれていた。下記の表２に示すように、ＰＸ−８６６は、膵臓、卵巣、肺、及び大腸癌細胞株における前記細胞毒性剤を単独で処理したときの腫瘍成長阻害及び成長遅延に対するパーセントを著しく増加させた。
【００７８】
【表２】
2009500408.tif 000014
【実施例１０】
【００７９】
材料及び方法
化合物
ＰＸ−８６６（酢酸（１Ｓ，４Ｅ，１０Ｒ，１１Ｒ，１３Ｓ，１４Ｒ）−［４−ジアリルアミノメチレン−６−ヒドロキシ−１−メトキシメチル−１０，１３−ジメチル−３，７，１７−トリオキソ−１，３，４，７，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−ドデカヒドロ−２−オキサ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１１−イル−エステル）を前述したように合成した（２１）。マウスへの静脈内投与では、ＰＸ−８６６を０．９％ＮａＣｌ中の５％エタノールに１０ｍｇ／ｍｌで溶解し、経口投与では、水中の５％エタノールに５ｍｇ／ｍｌで溶解した。ゲフィチニブをＡｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ（英国，Ｍａｃｃｌｅｓｆｉｅｌｄ）から入手し、経口投与のために水中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０に７．５ｍｇ／ｍｌで懸濁した。ウサギから精製した抗ホスホＳｅｒ４７３−Ａｋｔ抗体、抗Ａｋｔ抗体、抗ホスホＴｙｒ１０８６−ＥＧＦ受容体抗体、及び抗ＥＧＦＲ抗体をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（マサチューセッツ州，Ｂｅｖｅｒｌｙ）から入手した。ヒト組換えｐ１１０α／ｐ８５α、ｐ１１０β／ｐ８５α、ｐ１２０γ、及びｐ１１０δ／ｐ８５α  ＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼをＵｐｓｔａｔｅ（バージニア州，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ）から入手した。塩酸メトホルミンをＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（カリフォルニア州，Ｇａｒｄｅｎａ）から、塩酸ピオグリタゾン及び組換えヒトインスリンをＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）から入手した。
【００８０】
細胞
Ａ−５４９非小細胞肺癌細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（メリーランド州，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）から入手した。前記細胞を、１０％ウシ胎児血清（ｆｂｓ）を追加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において３７℃、加湿９５％空気、５％ＣＯ２で培養した。全細胞株を、ＰＣＲ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，インディアナ州，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）を使用して、マイコプラズマがなくなるように試験した。
【００８１】
ＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼの測定
組換えウシｐ１１０α／ｐ８５α及び組換えヒトｐ１１０β／ｐ８５α、ｐ１２０γ、及びｐ１１０δ／ｐ８５αを阻害するＰＸ−８６６の能力を、Ｓｔｉｒｄｉｖａｎｔらが報告したようにＰｔｄＩｎｓの［３２Ｐ］（−ＡＴＰ依存リン酸化によって測定した（２２）。前述したように、細胞性ＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼの阻害を、ウェスタンブロッティングで測定される総Ａｋｔに対するホスホＳｅｒ４７３−Ａｋｔの割合として測定した。
【００８２】
抗腫瘍研究
対数細胞成長において、およそ１０７個のＡ−５４９ｎｓｃ肺癌細胞を、重症複合免疫不全（ｓｃｉｄ）マウスの脇腹に、０．２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水で皮下注射した。前記腫瘍が１００若しくは６００ｍｍ３に達したときに、前記マウスを、平均とほぼ等しい腫瘍体積を有する８匹の集団に階層にし、薬剤投与を始めた。投薬は、７５ｍｇ／ｋｇのゲフィチニブを経口投与で、４、９、若しくは１２ｍｇ／ｋｇのＰＸ−８６６を静脈内投与で、１、２．５、及び３ｍｇ／ｋｇのＰＸ−８６６を静脈内投与で、若しくはゲフィチニブ投与の４時間前にＰＸ−８６６を、１日おきに行った。動物の体重を毎週測定し、腫瘍直径を週に２回、電子キャリパーで直角（ｄショート及びｄロング）に測定し、腫瘍体積を計算式、体積＝（ｄショート）２×（ｄロング））２によって算出した。腫瘍が２，０００ｍｍ３若しくはそれ以上に達したとき、或いは壊死したときに、前記動物を安楽死させた。
【００８３】
薬力学的研究
１０７個のＡ−５４９ｎｓｃ肺癌細胞を雄のｓｃｉｄマウスの脇腹に皮下注射し、およそ３００ｍｍ３まで成長させることができた。マウスに、１２ｍｇ／ｋｇのＰＸ−８６６を静脈内投与で、３ｍｇ／ｋｇのＰＸ−８６６を経口投与で、また７５ｇ／ｋｇのゲフィチニブを静脈内投与で、５日間に亘って１日おきに投与した。腫瘍を最後の投薬の２４時間後に除去し、すぐに液体窒素で凍結させた。アッセイのために、前記腫瘍を５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ノニデットＰ４０、及び０．２５％デオキシコール酸ナトリウムで均質化し、抗ホスホＳｅｒ４７３−Ａｋｔ及び抗Ａｋｔ抗体を使用してウェスタンブロッティングを行った。腫瘍Ａｋｔ活性を、総Ａｋｔに対するホスホ−Ｓｅｒ４７３−Ａｋｔの割合として表した。
【００８４】
毒性研究
雄のｓｃｉｄマウスに、１０ｍｇ／ｋｇのＰＸ−８６６を静脈内投与で、若しくは３及び１．５ｍｇ／ｋｇのＰＸ−８６６を経口投与で１日おきに１４投薬分投与した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、３ｍｇ／ｋｇのＰＸ−８６６を経口投与で１日おきに１５投薬分投与した。最後の投薬から２４時間後に前記マウスを殺し、体重、血液リンパ球、好中球、赤血球、血小板数、血清グルコース、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、及びアミノアラニントランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の変化を測定した。
【００８５】
糖耐性研究
雌のＣ５７８１／６マウスを一晩絶食させ、１回量のＤ（＋）グルコース（１ｍｇ／ｋｇ）を０．１ｇ／ｍｌ溶液として経口で投与した。０、１０、２０、３０、６０、９０、１２０、及び１８０分の血液を採取し、血漿グルコース濃度曲線下面積（ＡＵＣ０〜１８０分）を得るために、血漿グルコースを血糖キット（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ミズーリ州，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ）を使用して測定した。マウスに、１回量として１０ｍｇ／ｋｇのＰＸ−８６６を経口投与し、４時間後にグルコースを投与し、若しくは３ｍｇ／ｋｇのＰＸ−８６６を経口で１日おきに２０投薬分投与し、最後の投薬から２４時間後及び８日後にグルコースを投与した。２５０ｍｇ／ｋｇのメトホルミンを５日間毎日経口投与し（２４）、前記グルコース投与前に１０ｍｇ／ｋｇのピオグリタゾンを腹腔内投与で７日間毎日投与した（２５）。０．０７５μｇ／ｋｇのヒト組換えインスリンを、グルコース投与と同時に腹腔内投与で投与した（２６）。
【００８６】
骨髄コロニー形成
屠殺後、マウスの骨髄を各々の大腿骨から抽出し、赤血球を０．２％の低張ＮａＣｌで溶解させ、続いて１．６％の高張ＮａＣｌを添加した。Ｉｓｃｏｖｅの最小必須培地、１５％ｆｂｓ、１％ウシ血清アルブミン、１０μｇ／ｍｌ組換えヒトインスリン、２００μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０ｎｇ／ｍｌ  ｒｍ幹細胞因子、１０ｎｇ／ｍｌ組換えマウスインターロイキン−３、１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトインターロイキン−６、及び３ｕｎｉｔｓ／ｍｌ組換えエリスロポエチンに１％メチルセルロースを含む１ｍｌのＭｅｔｈｏｃｕｌｔ（商標）ＧＦ  Ｍ３４３４（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，カナダ、ブリティッシュコロンビア州、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ）に、およそ２０，０００の細胞を蒔いた。細胞を３重に蒔き、記録する前に１４日間、湿潤環境で３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。コロニー（>４０セル／コロニー）若しくはクラスタ（３〜４０細胞）を記録し、コロニー−形成ユニット顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）；バースト−形成ユニット−赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）、コロニー形成ユニット顆粒球マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）の成長を、標準的な基準を用いて算定した。単一細胞のバックグラウンドレベルで定性的観察を行った。
【００８７】
結果
ＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼ阻害
組換えＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼを阻害するＰＸ−８６６の能力をワートマニンによる阻害と比較して表３に示した。ＰＸ−８６６及びワートマニンは、ｐ１１０α、ｐ１２０γ、及びｐ１１０δの強力な阻害剤であるが、ＰＸ−８６６はｐ１１０βの弱い阻害剤である点でワートマニンとは異なる。
【００８８】
【表３】
2009500408.tif 000015
【００８９】
細胞培養研究
ＰＸ−８６６は、２５ｎＭのＩＣ５０で、１０％ｆｂｓを含む培地中のＡ−５４９ヒト乳癌細胞のホスホ−Ａｋｔを阻害した。ゲフィチニブは、２４時間血清飢餓にされ、２５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで刺激され、１０％ｆｂｓを有する培地中にはない細胞中のホスホ−Ａｋｔのみを阻害した。これは、ＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼ経路が、ＥＧＦに加えて、血清中の成育因子によって刺激されることを示唆する。細胞増殖阻害研究は、Ａ−５４９細胞が１．１μＭのＩＣ５０を有するゲフィチニブによる増殖阻害に耐性であるという過去の報告を裏付けた。  最高１００ｎＭの濃度のＰＸ−８６６は、ゲフィチニブによる増殖阻害を高めなかった。
【００９０】
インビボでの抗腫瘍の研究
１００ｍｍ３のＡ−５４９ヒトｎｓｃ肺癌異種移植片を有するマウスに、１日おきに７５ｍｇ／ｋｇのゲフィチニブを経口投与すると、投薬期間の最後に、５１％のＴ／Ｃを有する異種移植片成長が阻害された（図７）。ＰＸ−８６６は、静脈内投与で与えられるよりも経口投与で与えられたときに抗腫瘍剤としておよそ４倍強力であり、投薬量は適宜調整された（表４）。雌のｓｃｉｄマウスの脇腹の皮下に、１０７個のＡ−５４９ヒトｎｓｃ肺癌細胞を埋め込んだ。１４投薬分の１日おきの薬物療法が始まる前に、腫瘍を１００ｍｍ３の平均体積まで成長させた。抗腫瘍活性を、投薬期間の最後に処理腫瘍／コントロール腫瘍（Ｔ／Ｃ％）の％体積として表した。各々のグループには８匹のマウスがおり、全ての相違はｐ<０．０１であった。
【００９１】
【表４】
2009500408.tif 000016
【００９２】
１００ｍｍ３のＡ−５４９腫瘍異種移植片を有するマウスに単独で投与するときに、ＰＸ−８６６は、９ｍｇ／ｋｇの静脈内投与では３１％のＴ／Ｃ、２．５ｍｇ／ｋｇの経口投与では４１％のＴ／Ｃを有する腫瘍成長を阻害した。予備研究は、ゲフィチニブとスケジュールを交互に組み合わせたＰＸ−８６６が、ゲフィチニブの２４時間後よりむしろ４時間後に投与したときにより活性化すると示した（図示せず）。ゲフィチニブの４時間前にＰＸ−８６６を投与するとき、その組み合わせは、９ｍｇ／ｋｇのＰＸ−８６６を静脈内投与したときは２２％のＴ／Ｃを、２．５ｍｇ／ｋｇのＰＸ−８６６を経口投与したときは１８％のＴ／Ｃを与えた。腫瘍成長は、ＰＸ−８６６の処理期間の最初の半分は定常期を保持し、その後、前記期間の終わりに向かってゆっくり増加し始めた（図７）。増加した組み合わせの抗腫瘍活性はまた、非常に大きな６００ｍｍ３のＡ−５４９腫瘍異種移植片にも見られた（図７Ｂ）。
【００９３】
腫瘍ＥＧＦＲ及びＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼ情報伝達の阻害
Ａ−５４９腫瘍異種移植片を有するマウスへ、１日おきに５日間、７５ｍｇ／ｋｇのゲフィチニブを経口投与すると、腫瘍ホスホ−ＥＧＦＲを４３％阻害したが、腫瘍ホスホ−Ａｋｔには顕著な効果を奏さなかった（図８）。１日おきに５日間、１２ｍｇ／ｋｇの静脈内投与、若しくは３ｍｇ／ｋｇのＰＸ−８６６の経口投与は、腫瘍ホスホ−ＥＧＦＲに顕著な効果を有さなかったが、腫瘍ホスホ−Ａｋｔをそれぞれ５１％及び４８％阻害した。ゲフィチニブ及びＰＸ−８６６の組み合わせは、腫瘍ホスホ−ＥＧＦＲ及び腫瘍ホスホ−Ａｋｔの両者を阻害した。同様の効果は、図９に図示するように、第２の研究にも見られた。このように、Ａ−５４９腫瘍異種移植片において、ＥＧＦＲ及びＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼ経路は、個別に機能し、それぞれゲフィチニブ及びＰＸ−８６６によって選択的に阻害されるように思われる。
【００９４】
長期間のＰＸ−８６６投与の毒性
ｓｃｉｄマウスに対する長期間のＰＸ−８６６投与の毒性を表５に要約した。値は、１グループにつき４匹のマウスの平均±ＳＥのものである。
【００９５】
【表５】
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【００９６】
４週間に亘る静脈内投与での１０ｍｇ／ｋｇ、及び経口投与での３ｍｇ／ｋｇのＰＸ−８６６処理は、体重の増加を減少させ、コントロール体重増加のそれぞれ８３％及び２８％まで減少させた（ｐ  ０．０５）。主に、増加した好中球数に起因して、ＰＸ−８６６の経口投与に続いて白血球数の顕著な増加があった。体重、血漿グルコース、及び血球数の全ての変化は、処理停止後９日で正常値に戻った。体重の減少及び血糖の増加は、ｓｃｉｄマウスを使用した２つの追加の研究において裏付けられたが、血球数の増加はこれらの研究ではあまり顕著ではなかった（図示せず）。
【００９７】
ＰＸ−８６６及び糖耐性
ＰＸ−８６６による血漿グルコースの増加の機構の更なる見識を得るために、絶食Ｃ５７Ｂｌ／６マウスへの１ｇグルコース／ｋｇの経口投与に続いて、インスリンレベル及び糖耐性について研究を行った（図１０）。１回量として１０ｍｇ／ｋｇのＰＸ−８６６の経口投与によって、最高５時間の血漿インスリンレベルの増加が生じた。ＰＸ−８６６はまた、前記マウスにおいて糖耐性を減少させ、特にグルコース投与の１時間後の時点で、血漿グルコースの増加を導き、その時点では、血漿グルコースが非処理マウスでは減少していたが、ＰＸ−８６６処理マウスでは増加していた。全ての糖耐性研究のＡＵＣ０〜１８０分の結果を以下の表６に示した。値は、１グループにつき４匹のマウスの平均±ＳＥである。
【００９８】
【表６】
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【００９９】
高用量でのインスリン処理は、ＰＸ−８６６によって生じる血漿グルコースの増加を克服し、コントロール及びＰＸ−８６６処理マウスの両者においてグルコースＡＵＣ０〜１８０分を顕著に減少させた。血糖降下薬メトホルミンは、ＰＸ−８６６による血糖の増加に効果を有さなかったが、血糖降下チアゾリジンジオン薬ピオグリタゾンは、ほぼ完全に前記増加を抑止した（図１０及び表６）。１日おきに１５投薬分の、９ｍｇ／ｋｇのＰＸ−８６６の静脈内投与での長期に亘る処理は、非絶食時のグルコースレベル（±Ｓ．Ｅ．、ｎ＝４）をコントロールマウスでの１３３．７±１６ｍｇ／ｄｌからＰＸ−８６６処理マウスでの２６９．４±２７．８ｍｇ／ｄｌ（ｐ<０．０５）まで増加させた。前記処理はまた、ＰＸ−８６６の最後の投薬から２４時間後、血漿グルコースＡＵＣ０〜１８０分を増加させたが、これは最後の投薬から８日後にコントロール値に戻った（表４）。ピオグリタゾンは、長期に亘るＰＸ−８６６処理の最後の投薬から２４時間後に、グルコースＡＵＣ０〜１２０分をコントロールと著しく異ならない値まで顕著に減少させた（表４）。
【０１００】
ＰＸ−８６６及び増加した好中球
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに３ｍｇ／ｋｇのＰＸ−８６６を１日おきに１５投薬分、経口投与するとき、コントロールマウスでの１．２±０．３Ｋ／μｌからＰＸ−８６６処理マウスでの３．７±１．８Ｋ／μｌまでの好中球数（±Ｓ．Ｅ．、ｎ＝４）の顕著な増加があったが、他のいかなる血液成分には顕著な変化はなかった。骨髄コロニー形成ユニットは、赤血球系統ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、ＢＦＵ−Ｅ、若しくはＣＦＵ−Ｅでは顕著な変化を示さず、骨髄ＣＦＵ−ＧＭ（±Ｓ．Ｅ．、ｎ＝４）では、コントロールマウスでの蒔かれた６０，０００骨髄細胞につき３８８±５２コロニーからＰＸ−８６６処理マウスでの１６８±５９コロニー（ｐ<０．０５）へ、小さいが顕著な減少を示した。同時に、ＰＸ−８６６処理マウスからの培養物において、個々の白血球数の増加があり、細胞接着が変化したことを示唆した。
【０１０１】
考察
ゲフィチニブによる増殖阻害に対するｎｓｃ肺癌細胞株の感受性は、ＥＧＦに刺激されたＥＧＦＲの自己リン酸化の阻害、細胞表面ＥＧＦＲの発現低下、ＥＲＫ１／２の発現低下、及びＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼ／Ａｋｔ情報伝達の阻害と関連する。ＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼ／Ａｋｔ経路は、癌細胞生存のための重要な経路である。Ｏｎｏ等による研究において、ゲフィチニブは、ホスホ−Ａｋｔレベルを測定することによって、ほとんど全てのｎｓｃ肺癌細胞株においてＥＧＦ起因性ＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼ／Ａｋｔ情報伝達を阻害したが、数株（３／１１）だけが、血清刺激増殖条件下でホスホ−Ａｋｔの阻害を示した。これらの結果は、ＥＧＦ以外の多くのｎｓｃ肺癌細胞株因子がＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼ／Ａｋｔ情報伝達の活性化に関与することを示唆する。この表現型を有する腫瘍細胞は、ＥＧＦＲインヒビターの細胞増殖抑制性活性、及び／若しくは細胞毒性活性に、限定的な反応を示す可能性がある。最近、Ｅｎｇｅｌｍａｎ等は、ＥｒｂＢ−３がＥＧＦＲ情報伝達をＰｔｄｉｎｓ−３−キナーゼ／Ａｋｔの活性化とつなげること、及びゲフィチニブが、野生型若しくは変異体のどちらかのＥＧＦＲとＥｒｂＢ−３とを発現しているｎｓｃ肺癌細胞株においてのみ、ホスホ−Ａｋｔ及び細胞増殖を阻害することを報告した。しかし、強制的にＥｒｂＢ−３を発現させると、ゲフィチニブ感受性のｎｓｃ肺癌細胞が生み出されず、これはＥＧＦＲ以外の経路がＥｒｂＢ−３不完全細胞においてＰｔｄｉｎｓ−３−キナーゼ／Ａｋｔ情報伝達を活性化するに違いないことを示唆している。ＥｒｂＢ受容体ファミリーの他の因子はまた、ＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼを活性化し、癌の表現型を促進するために、ＥｒｂＢ−３と結びつける可能性がある。我々は、ＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼの阻害が、ゲフィチニブ耐性ｎｓｃ肺癌細胞株においてゲフィチニブの抗腫瘍活性を強化するための合理的な戦略を提供できると推論した。
【０１０２】
本研究では、ゲフィチニブに対して最も耐性のあるｎｓｃ肺癌株の中で、ＥｒｂＢ−３を発現していないＡ−５４９ｎｓｃ肺癌細胞株を選択した。ＰＴＥＮ欠失はまた、恐らくＰｔｄｉｎｓ−３−キナーゼ／Ａｋｔ情報伝達の構成的な活性化を通して、細胞をゲフィチニブ増殖阻害に対して耐性にすることができる。しかし、ＰＴＥＮの遺伝的異常は、肺癌及びＡ−５４９細胞において比較的まれであり、大部分のｎｓｃ肺癌細胞株と同様に、野生型ＰＴＥＮと構成的ではないホスホ−Ａｋｔの活性レベルとを有する。ＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼを阻害するために、我々は、腫瘍ホスホ−Ａｋｔを下方制御すること、及び静脈内若しくは経口のどちらかで投与されるときに、多くのヒト腫瘍異種移植片モデルにおいて抗腫瘍活性を呈することを示しているＰＸ−８６６を使用した。
【０１０３】
静脈内若しくは経口のどちらかで投与されたＰＸ−８６６が、ゲフィチニブと同程度に効果的にｓｃｉｄマウスのＡ−５４９ｎｓｃ肺腫瘍異種移植片の成長を阻害したことが判明した。５０％前後の腫瘍Ｔ／Ｃを与える、長期間に亘る投与をするときに、両者の薬剤は最も活性的に見えた。しかし、ゲフィチニブと共にＰＸ−８６６を投与したとき、処理の前半の間は、Ａ−５４９腫瘍成長は定常状態を保っているように見え、処理の後半の間は僅かに増加したように見えた。これは、１００ｍｍ３の腫瘍と大きく進行した６００ｍｍ３の腫瘍との両者で見られた。ゲフィチニブは、Ａ−５４９腫瘍異種移植片のホスホ−Ａｋｔを阻害できなかった。Ａ−５４９細胞培養試験において、ゲフィチニブはまた、血清刺激増殖条件下ではホスホ−Ａｋｔ細胞を阻害せず、ＥＧＦに刺激された無血清のＡ−５４９細胞においてのみ抑制的であった。対照的に、ＰＸ−８６６は、血清刺激増殖条件下、及びＡ−５４９ヒト腫瘍異種移植片において、Ａ−５４９細胞のホスホ−Ａｋｔを阻害した。ゲフィチニブは、Ａ−５４９ヒト腫瘍異種移植片においてホスホ−ＥＧＦＲを阻害したが、ＰＸ−８６６は阻害しなかった。このように、ＰＸ−８６６は、非常に大きなＡ−５４９腫瘍異種移植片に対してさえゲフィチニブの抗腫瘍活性を強化し、処理の初期段階において完全な腫瘍成長調節を与えた。腫瘍成長の阻害は、ＰＸ−８６６によるＰｔｄｉｎｓ−３−キナーゼ／Ａｋｔ情報伝達の阻害と関連し、またゲフィチニブ単独では観察されなかった。
【０１０４】
過去の研究は、臨床開発に限られた可能性を有する、比較的に有毒かつ非特異的ＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼインヒビターである静脈内投与されたＬＹ２９４００２が、野生型と活性化ＥＧＦＲに由来する変異腫瘍とで共発現する６〜１００ｍｍ３の小さなＵ８７：）ＥＧＦＲヒトグリオーマ細胞異種移植片に対して、ゲフィチニブの抗腫瘍活性を強化すると報告している。この研究において、ゲフィチニブもＬＹ２９４００２も単独では抗腫瘍活性を示さなかった。
【０１０５】
ＰＸ−８６６の長期投与の主な毒性は、高血糖症であり、薬剤投与を停止したときに逆転する糖耐性を減少させた。成長シグナルがＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼｐ１１０αによって中継されると同時に、インスリンシグナルは、ＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼアイソフォームｐ１１０βだけでなくｐ１１０αによっても中継される。ＰＸ−８６６は、ワートマニンより強力なＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼｐ１１０αインヒビターであるが、ＰＸ−８６６は、ＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼｐ１１０βのインヒビターの弱いインヒビターである点でワートマニンとは異なる。マウスに対してＰＸ−８６６を急性投与すると、血漿インスリンレベルが増加したと同時に、糖耐性が減少し、これはインスリン感受性の減少を示唆している。これは、著しい高血糖症、高インスリン血、及び血糖を低下させるインスリンの損なわれた能力を含むＡｋｔ２アイソフォームを欠くマウスの表現型に類似する。本研究において、インスリンを大量投与することによって、ＰＸ−８６６により引き起こされる血糖の増加を克服することができた。第２型糖尿病の高血糖症の治療のために広く使用される薬物であるメトホルミンは、脂肪酸酸化を増加させるために、またトリグリセリド合成、肝性グルコース産生、及びグルコース利用を減少させるために、ＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼの下流のＡＭＰ−活性タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）を刺激することによって血糖を低下させる。ＡＭＰＫは、原形質膜へのグルコース輸送担体４（ＧＬＵＴ−４）の移動によるグルコース取込みの刺激を媒介する。ＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼ等の薬剤、若しくはグルコース利用を悪化させるＡｋｔインヒビターと一緒に使用する場合、メトホルミン等のＡＭＰＫアクチベーターが腫瘍細胞の生存を強化する可能性があることが示唆されている。メトホルミンは、ＰＸ−８６６によって生じる減少した糖耐性に影響しないことがわかった。活性インスリン受容体へのＣｂｌプロトオンコジーンの補充によって媒介される並列の経路はまた、インスリンによるグルコースの取込みを増加させる点に留意する必要がある。
【０１０６】
メトホルミンとは対照的に、チアゾリジンジオン高血糖性薬物ピオグリタゾンは、糖耐性への急性及び慢性のＰＸ−８６６投与の抑制効果を逆転させた。脂肪組織に高レベルで存在するペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−γ（ＰＰＡＲγ）転写因子のリガンドとして作用することによって、チアゾリジンジオンは、身体のインスリンの代謝効果の感受性を増加させる。ＰＰＡＲγはまた、腫瘍細胞の分化を誘発し、ピオグリタゾンによるＰＰＡＲγ活性化は、ｓｃｉｄマウスのＡ−５４９ｎｓｃ肺腫瘍異種移植片の成長を阻害すると報告されている。ＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼによるインスリン情報伝達の全詳細、及びメトホルミン及びピオグリタゾン等のグルコース低下薬物の効果が依然として不明である一方で、ＰＸ−８６６によるＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼ阻害によって生じる高血糖症が、インスリンとＰＸ−８６６の臨床用途に重要であるピオグリタゾンとに応答するように思われた。ｐ１１０α及びｐ１１０βの両者を阻害するワートマニンとは異なり、ｐ１１０βと相対的なｐ１１０αのインヒビターとしてのＰＸ−８６６の選択性はまた、ＰＸ−８６６のより明白な成長阻害効果と、ＰＸ−８６６起因性高血糖症を逆転するインスリン及びピオグリタゾンの能力とを説明できる可能性がある。
【０１０７】
ＰＸ−８６６投与の他の薬理効果は、循環好中球の増加に加えて、骨髄ＣＦＵ−ＧＭコロニー形成の減少である。ＰＸ−８６６によって誘導されるＣＦＵ−ＧＭの減少は、ｐ８５α−／−ノックアウトマウスのマクロファージ由来の骨髄において観察される顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）感受性の減少と一致する。ＰＸ−８６６による循環好中球の増加は、末梢循環への前駆細胞の流動の増加を反映している可能性があり、おそらくｐ８５α−／−ノックアウトマウスにおいて見られるような細胞接着の減少と関連している。
【０１０８】
要約すると、ｐ１１０βと対比するｐ１１０αの選択性を示すＰｔｄｉｎｓ−３−キナーゼインヒビターＰＸ−８６６は、治療の初期段階での実質的に完全な腫瘍成長調節を有する大きなＡ−５４９ｎｓｃ肺癌異種移植片に対してさえＥＧＦＲインヒビターゲフィチニブの抗腫瘍活性を強化するように見える。ＰＸ−８６６のこの治療効果は、ゲフィチニブ単独では見られない腫瘍Ａｋｔリン酸化の阻害と関連していた。慢性的なＰＸ−８６６の主な毒性は、減少したインスリン感受性に起因した糖耐性の可逆的減少を有する標的−関連高血糖症であった。減少した糖耐性は、ＡＭＰＫインヒビターであるメトホルミンに反応しないが、インスリン及びＰＰＡＲγアクチベーターであるピオグリタゾンによって逆転した。長期間に亘るＰＸ−８６６によっても、明らかに血管流動に起因する好中球数の増加が生じた。従って、ＰｔｄＩｎｓ−３−キナーゼ／Ａｋｔ情報伝達の阻害によるＰＸ−８６６は、ＥＧＦＲインヒビターによる治療に応答しないｎｓｃ肺癌を有する患者においてのゲフィチニブ等のＥＧＦＲインヒビターに対する応答を増加する際に臨床的有用性を有する可能性がある。
【実施例１１】
【０１０９】
ＰＸ−８６６及びゲフィチニブの投与の効果の更なる研究を下に図示した。本実施例では、高投与量でのＰＸ−８６６及びゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））の組み合わせの効果を図示した。図１１に示すように、Ａ５４９小細胞肺異種移植片において、ＰＸ−８６６をイレッサ（登録商標）投与より４時間前に（図１１Ａを参照）、ゲフィチニブ投与の２４時間後に（図１１Ｂを参照）投与した。加えて、図１２に示すように、Ａ−５４９小細胞肺異種移植片において、ＰＸ−８６６をゲフィチニブと実質的に同時に投与した。
【０１１０】
また、ＨＴ−２９大腸癌においてのゲフィチニブを伴うＰＸ−８６６の抗腫瘍活性も測定した。図１３に示すように、ＰＸ−８６６はゲフィチニブの抗腫瘍効果を増加させた。７５ｍｇ／ｋｇのゲフィチニブを単独で経口投与し、２ｍｇ／ｋｇのＰＸ−８６６を単独で経口で、若しくはゲフィチニブ投与の４時間前に投与した。
【実施例１２】
【０１１１】
ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））を伴うＰＸ−８６６の投与の抗腫瘍効果を測定した。ＰＸ−８６６を、単独で、３日ごとに静脈内又は経口で、投薬を変化させて投与し、若しくはベバシズマブと組み合わせて投与した。図１４に示すように、複合治療は、ベバシズマブの抗腫瘍活性を顕著に増加させた。
【実施例１３】
【０１１２】
図１５に、単独で若しくはゲフィチニブとの組み合わせでの、マウス皮膚におけるリン光体−ＡｋｔのＰＸ−８６６阻害を表した。
【０１１３】
本明細書に記載された実施例及び実施形態は、説明の目的のみに用いられ、またその観点からの様々な改良若しくは変更は、当業者に示唆されるものであり、本出願と添付の特許請求の範囲との精神及び範囲内に含まれると理解される。本明細書において引用された全ての公報、特許、及び特許出願は、全ての目的のために、引用することによりその全体が本明細書に組み込まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
本発明の本質及び利点をより十分に理解するために、添付した図面と関連した付属する図面との関連で以下の詳細記載に添付されなければならない。
【図１Ａ】図１Ａは、本発明のワートマニン類似体によるＨＴ−２９の異種移植片ホスホ−Ａｋｔのパーセントコントロールの投与量依存性のグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明のワートマニン類似体ＰＸ−８６６によるＨＴ−２９の異種移植片リン光体−Ａｋｔのパーセントコントロールの経路依存性のグラフである。
【図２】図２は、静脈、腹膜内、及び経口投与後のマウス血漿中のＰＸ−８６６（ｎｇ／ｍｌ）の濃度のグラフである。
【図３】図３は、マウス血漿のＰＸ−８６６及び代謝物の濃度（ｎｇ／ｍｌ）のグラフである。
【図４】図４は、ＩＣ５０により測定されるＮＣＩヒト腫瘍細胞系パネルにおける本発明のワートマニン類似体の活性を示したものである。
【図５】図５は、本発明のワートマニン類似体によるＨＴ−２９の大腸癌細胞ホスホ−Ａｋｔの阻害を示したグラフである。
【図６】図６は、ＯｖＣａｒ−３ヒト卵巣異種移植片におけるＰＸ−８６６、本発明のワートマニン類似体を単独又は放射線照射との組み合わせで処理した後の平均腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフである。
【図７】図７は、ＰＸ−８６６によるゲフィチニブの抗腫瘍活性の増強を図示したグラフである。
【図８】図８は、Ａ−５４９非小細胞肺癌異種移植片におけるゲフィチニブ及びＰＸ−８６６によるＥＧＦＲ及び蛍光体−Ａｋｔの阻害を図示した棒グラフである。
【図９】図９は、ＰＸ−８６６を単独で（静脈内又は経口的）又はゲフィチニブを単独で投与したＡ５４９肺癌異種移植片におけるホスホＡｋｔ及びホスホ−ＥＧＦＲパーセントコントロールの棒グラフである。
【図１０】図１０は、血漿インスリン及びグルコース耐性に関するＰＸ−８６６の効果を示したグラフである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、Ａ５４９小細胞肺臓異種移植片におけるＰＸ−８６６、本発明のワートマニン類似体、及び４時間後のイレッサで処理した後の平均腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフである。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、Ａ５４９小細胞肺臓異種移植片におけるＰＸ−８６６、本発明のワートマニン類似体、イレッサ（Ｉｒｅｓｓａ）との組み合わせで処理した後の平均腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフである。
【図１２】図１２は、Ａ５４９ヒト肺腫瘍異種移植片におけるＰＸ−８６６、本発明のワートマニン類似体を単独で、又はイレッサの投与前に処理した後の平均腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフである。
【図１３】図１３は、ＨＴ−２９大腸癌細胞におけるＰＸ−８６６、本発明のワートマニン類似体を単独で、又はイレッサの投与前に処理した後の平均腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフである。
【図１４】図１４は、Ａ５４９ヒト肺臓異種移植片におけるＰＸ−８６６、本発明のワートマニン類似体を単独で又はイレッサの投与前に処理した後の平均腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフである。
【図１５】図１５は、ＰＸ−８６６、イレッサ、又はその組み合わせを投与した後のマウス皮膚におけるｐＡｋｔ−陽性の毛嚢のパーセントを示した棒グラフである。
【図１６Ａ】図１６は、本発明のワートマニン類似体である。
【図１６Ｂ】図１６は、本発明のワートマニン類似体である。
【図１Ａ】
2009500408.tif 000024
【図１Ｂ】
2009500408.tif 000025
【図２】
2009500408.tif 000026
【図３】
2009500408.tif 000027
【図４】
2009500408.tif 000028
【図５】
2009500408.tif 000029
【図６】
2009500408.tif 000030
【図７】
2009500408.tif 000031
【図８】
2009500408.tif 000032
【図９】
2009500408.tif 000033
【図１０】
2009500408.tif 000034
【図１１Ａ】
2009500408.tif 000035
【図１１Ｂ】
2009500408.tif 000036
【図１２】
2009500408.tif 000037
【図１３】
2009500408.tif 000038
【図１４】
2009500408.tif 000039
【図１５】
2009500408.tif 000040
【図１６Ａ】
2009500408.tif 000041
【図１６Ｂ】
2009500408.tif 000042
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月17日(2007.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を治療する方法であって、
以下の化学式を有する化合物の薬学的有効量と、化学療法薬とを対象に投与する工程を有するものであり、
【化１】
2009500408.tif 000043
ここで、
Ｙはヘテロ原子であり、更にＲ１又はＲ２は不飽和アルキル、非直線アルキル、又は置換アルキルである、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、
前記Ｒ１又はＲ２は二置換アルキルである。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記化学療法薬は、細胞障害剤及び抗腫瘍標的化剤から成る群より選択されるものである。
【請求項４】
請求項２記載の方法において、前記細胞障害剤は、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、及びシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）から成る群より選択されるものである。
【請求項５】
請求項２記載の方法において、前記抗腫瘍標的化剤は、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、及びベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）から成る群より選択されるものである。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、前記化合物は以下の化合物である。
【化２】
2009500408.tif 000044
【請求項７】
請求項１記載の方法において、前記化合物は以下の化合物である。
【化３】
2009500408.tif 000045
【請求項８】
請求項１記載の方法において、前記化合物は以下の化合物である。
【化４】
2009500408.tif 000046
【請求項９】
請求項１記載の方法において、前記化合物は経口投与されるものである。
【請求項１０】
請求項１記載の方法において、前記化合物は静脈内投与されるものである。
【請求項１１】
請求項１記載の方法において、前記化合物はＰＸ−８６６であり、前記化学療法薬はゲフィチニブである。
【請求項１２】
請求項１記載の方法において、前記化合物はＰＸ−８６６であり、前記化学療法薬はベバシズマブである。
【請求項１３】
請求項１記載の方法において、前記化合物はＰＸ−８６７であり、前記化学療法薬はゲフィチニブである。
【請求項１４】
請求項１記載の方法において、前記化合物はＰＸ−８６７であり、前記化学療法薬はベバシズマブである。
【請求項１５】
前記請求項１の方法において、この方法は、さらに、
抗高血糖剤を投与する工程を有するものである。
【請求項１６】
以下の化学式の化合物と、化学療法薬とを有する組成物であって、
【化５】
2009500408.tif 000047
ここで、
Ｙはヘテロ原子であり、Ｒ１又はＲ２はそれぞれ不飽和アルキル、非直線アルキル、又は置換アルキルである、組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成20年7月11日(2008.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
本発明はワートマニン類似体、及びＰＩ−３−キナーゼ活性を阻害し、更に特定の悪性腫瘍及び他の癌を治療するために、それらの誘導体を単独又は化学療法薬と組み合わせて使用する方法に関する。ワートマニンは、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ−３−キナーゼ）及び抗癌剤の強力な阻害剤として周知である。ワートマニンは、真菌アオカビワートマニンの培養液から単離される天然化合物であり、米国特許第５，４８０，９０６号明細書において示される基本構造を有するものである（前記引用はこの参照により本明細書に組み込まれる）。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
【特許文献１】米国特許第６，７０３，４１４号明細書
【特許文献２】米国特許第３，６６８，２２２号明細書
【国際調査報告】
2009500408.tif 000048