(57)【要約】本発明は、ヒトおよびマウスのＶＣＡＭ−１の両方ともに特異的に結合するモノクローナル抗体、これらの製造方法、これらを含む診断または治療用組成物、およびこれらを用いた診断または治療方法に関する。また、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトおよびマウスＶＣＡＭ−１に特異的に結合する最初の組み換えモノクローナル抗体であり、ヒトおよびマウス内皮細胞だけでなく、ラット骨格筋および豚内皮細胞で発現されたＶＣＡＭ−１にも強い親和力を示し、白血球と活性化された内皮細胞との相互作用を強く阻害する。したがって、本発明に係るモノクローナル抗体は、ＶＣＡＭ−１によって媒介された、内皮細胞への白血球の接着を効果的に阻害してＶＣＡＭ−１関連疾患、特に炎症性疾患および癌を効果的に治療することができる。
2009536641.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトおよびマウス血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）の両方ともに特異的に結合する、モノクローナル抗体。
【請求項２】
さらに、内皮細胞および骨格筋細胞で発現するヒト、マウス、ラットおよび豚ＶＣＡＭ−１を特異的に結合することを特徴とする、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
白血球と活性化された内皮細胞との相互作用を阻害することを特徴とする、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体は組み換えモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
配列番号５で定義される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号６で定義される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７で定義される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変部位を含むことを特徴とする、請求項４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
配列番号１で定義される軽鎖アミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項５に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
配列番号８で定義される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９または配列番号１１で定義される重鎖ＣＤＲ２；および配列番号１０または配列番号１２で定義される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変部位を含むことを特徴とする、請求項４〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
配列番号２で定義される重鎖アミノ酸配列、配列番号３で定義される重鎖アミノ酸配列、および配列番号４で定義されるアミノ酸配列よりなる群から選ばれるいずれか一つの重鎖アミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
前記モノクローナル抗体はヒト化されたことを特徴とする、請求項４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
配列番号１３で定義される軽鎖アミノ酸配列、および配列番号１４または１５で定義される重鎖アミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項９に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
配列番号５で定義される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号６で定義される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号７で定義される軽鎖ＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域。
【請求項１２】
配列番号１または１３で定義される軽鎖アミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の軽鎖可変領域。
【請求項１３】
配列番号８で定義される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９または配列番号１１で定義される重鎖ＣＤＲ２；および配列番号１０または配列番号１２で定義される重鎖ＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域。
【請求項１４】
配列番号２で定義される重鎖アミノ酸配列、配列番号３で定義される重鎖アミノ酸配列、配列番号４で定義される重鎖アミノ酸配列、配列番号１４で定義される重鎖アミノ酸配列、および配列番号１５で定義される重鎖アミノ酸配列よりなる群から選ばれる重鎖アミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の重鎖可変領域。
【請求項１５】
下記の段階を含む、請求項１のモノクローナル抗体を製造する方法：
（ａ）哺乳類動物内に組み換えヒトＶＣＡＭ−１／Ｆｃを免疫させる段階、
（ｂ）免疫化された哺乳類動物の抗体力価を検出する段階、
（ｃ）免疫化された哺乳類動物からポリクローナル抗体を精製する段階、
（ｄ）非ヒト哺乳類動物／ヒトキメラ抗体ライブラリーを構築する段階、および
（ｅ）抗体ライブラリーから、抗ＶＣＡＭ−１に特異的な抗体を選別する段階。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか１項のモノクローナル抗体および薬学的に許容される担体を含む、ＶＣＡＭ−１によって媒介される疾患の診断用組成物。
【請求項１７】
ＶＣＡＭ−１によって媒介される疾患は炎症性疾患または癌であることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
炎症性疾患は、関節炎、多発性硬化症、大腸疾患、喘息、動脈硬化、心筋梗塞および臓器移植拒否よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか１項のモノクローナル抗体および薬学的に許容される担体を含む、ＶＣＡＭ−１によって媒介される疾患の治療用組成物。
【請求項２０】
ＶＣＡＭ−１によって媒介される疾患は炎症性疾患または癌であることを特徴とする、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
炎症性疾患は、関節炎、多発性硬化症、大腸疾患、喘息、動脈硬化、心筋梗塞および臓器移植拒否よりなる群から選ばれる、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１のモノクローナル抗体または請求項１６の診断用組成物を用いて、ＶＣＡＭ−１によって媒介される疾患を診断する方法。
【請求項２３】
ＶＣＡＭ−１によって媒介される疾患は炎症性疾患または癌であることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
炎症性疾患は、多発性硬化症、大腸疾患、喘息、動脈硬化、心筋梗塞および臓器移植拒否よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１のモノクローナル抗体または請求項１９の治療用組成物を投与することを含む、ＶＣＡＭ−１によって媒介される疾患を治療する方法。
【請求項２６】
ＶＣＡＭ−１によって媒介される疾患は炎症性疾患または癌であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
炎症性疾患は多発性硬化症、大腸疾患、喘息、動脈硬化、心筋梗塞および臓器移植拒否よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１のモノクローナル抗体を用いて、ＶＣＡＭ−１によって媒介された内細胞への白血球の接着を阻害させる方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、血管細胞接着分子−１（vascular cell adhesion molecule-1、以下「ＶＣＡＭ−１」という）に特異的に結合するモノクローナル抗体に関する。具体的には、本発明は、ヒトおよびマウスのＶＣＡＭ−１の両方ともに特異的に結合するモノクローナル抗体、これらの製造方法、これらを含む診断または治療用組成物、およびこれらを用いた診断または治療方法に関する。また、本発明は、ＶＣＡＭ−１によって媒介された、内皮細胞への白血球の接着を阻害させる方法に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
細胞接着分子（ＣＡＭｓ）は、循環する血液から炎症反応の起る内皮へまでの白血球の補充において重要である。
【０００３】
細胞外反応に対する反応における能動的応答者(responder)として、内皮細胞はＥ−およびＰ−セレクチンおよび細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）−１、−２および−３を含む免疫グロブリンスーパーファミリーの一員、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）−１などの多様なＣＡＭを発現し、これらは白血球内で発現する炭水化物リガンドおよびインテグリンと反応する。よって、炎症反応における白血球の蓄積を媒介するＣＡＭの核心役割のため、ＣＡＭの遮断は炎症性障害において治療学的調整のための展望のある戦略になるだろうと思われる。
【０００４】
ＣＡＭの中でも、ＶＣＡＭ−１およびＣＤ１０６が優勢に発現され、これらは脂質多糖（ＬＰＳ）、インターロイキン−１、インターフェロン−γ、または腫瘍怪死因子α（ＴＮＦ−α）による活性化状態で内皮細胞上に誘導的に発現される。ＶＣＡＭ−１は、炎症および免疫拒否において活性化された白血球上で発現されるＶＬＡ−４(Very late antigen-4)およびα４β１インテグリンと結合して内皮細胞と単核球およびＴ細胞を含む白血球間の相互作用を引き起こす重要な役割を果たす。現在、炎症性疾患における治療学的調整に対するターゲットとしてＶＣＡＭ−１−ＶＬＡ−４相互作用への関心が高まっている。例えば、インテグリンα４β１およびＴＲ１４０３５の小さいペプチド拮抗剤およびα４インテグリン抗体であるＴｙｓａｂｒｉまたはＮａｔａｌｉｚｕｍａｂは、炎症性腸疾患、多発性硬化症および喘息の改善に有効である。ＴＲ１４０３５およびＮａｔａｌｉｚｕｍａｂは現在、それぞれ臨床２相および３相段階にある。しかも、最近増加する証拠によれば、ＶＣＡＭ−１は癌の進行に密接に関連している。具体的に、第一に、可溶性ＶＣＡＭ−１は多様な癌の診断に対するマーカーとして見なされる。第二に、腫瘍の周囲で発現されるＶＣＡＭ−１は、腫瘍新血管新生(neovascularization)のための骨髄由来の前駆細胞の回帰を促進する重要な役割を担当する。第三に、ＶＣＡＭ−１は転移の際に重要な段階である循環する腫瘍細胞の血管遊出において重要である。第四に、免疫抵抗性が非常に高い癌細胞株におけるＶＣＡＭ−１の下方制御は腫瘍免疫浸透を減少させるものと明らかになった。このような観点から、癌の治療において抗接着薬物の診断および治療に対する必要は増加しつつある。
【０００５】
〔発明の開示〕
〔技術的課題〕
ＶＣＡＭ−１−ＶＡＬ−４の相互作用に対する最近の関心にも拘らず、ＶＣＡＭ−１を中和させる抗体の開発は盛んには研究されていない。マウスＶＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体であるＭ／Ｋ−２．７が最近開発され、コラーゲン誘導関節炎マウスモデルにおいて関節炎を減少させる効果を示したが、前記抗体の有用性は臨床適用のためにさらに検証されなければならない。これまで、抗接着分子療法の最も臨床的な試みはヒト化モノクローナル抗体を使用したことであった。このような観点から、前臨床および臨床の研究のためにマウスおよびヒトＶＣＡＭ−１に特異的に結合し、ヒト化抗体への転換が可能なモノクローナル抗体の開発が切実に求められている。
【０００６】
〔技術的解決方法〕
最近の研究において、本発明者は、最初、合成抗体ライブラリーからウサギの重鎖（ＶH）および軽鎖（ＶL）可変ドメインとヒト重鎖（ＣH1）および軽鎖（ＣL）不変ドメインを含むヒトおよびマウスＶＣＡＭ−１に特異的なウサギ／ヒトキメラ化モノクローナル抗体を製造した。このような抗体は、内皮細胞および骨格筋細胞などの多様な細胞で発現するヒト、マウス、ラットおよび豚ＶＣＡＭ−１を特異的に認識する。しかも、このような抗体は、Ｕ９３７単核球(promonocytic leukocyte)と活性化された内皮細胞との相互作用を遮断する強い活性を持つ。ついに、本発明者は、マウスＶＣＡＭ−１に由来した配列を有するＶＣＡＭ−１特異的な抗体に対するエピトープ部分を確認した。要するに、このような本研究はヒトおよびマウスＶＣＡＭ−１の両方ともに特異的な効果的治療用モノクローナル抗体を提供する。
【０００７】
〔図面の簡単な説明〕
本発明は次の詳細な説明からさらに十分に理解されるであろう。添付図面は説明のために提供されるものに過ぎず、本発明を限定するものではない。
【０００８】
図１ａ〜図１ｃはヒトおよびマウスＶＣＡＭ−１に特異的な抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂクローンの精製および特性描写(characterization)を示すもので、図１ａは０．２μｇの抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂに対するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色結果であって、２５ｋＤａの分子量を持つ抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂを矢印によって示した。図１ｂは９６ウェルプレートにコートさせた組み換えヒトおよびマウスＶＣＡＭ−１／Ｆｃキメラを免疫前血清、免疫血清および精製された抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂそれぞれを用いて検出した結果を示すものである。図１ｃは相異なる量の組み換えヒトおよびマウスＶＣＡＭ−１／Ｆｃキメラをゲルにロードし、抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂを用いて免疫ブロットした結果である。
【０００９】
図２は抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂクローンの重鎖および軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。選択されたＦａｂクローンをＤＮＡシーケンシングした後、特定された重鎖（ＶH）および軽鎖（ＶL）可変領域の配列を図示のように示した。ＦＲは構造領域(framework region)、ＣＤＲは相補性決定領域(complementarity-determining region)を意味する。また、抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂクローンに由来したヒト化抗体を示した。
【００１０】
図３は抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂによって多様な細胞類型で発現された天然型ＶＣＡＭ−１を検出した結果を示すもので、ｈＴＮＦαまたはＨ2Ｏ2の存在（実線）または非存在（破線）の下に培養されたＨＵＶＥＣ、ＭＥＣ、ＰＡＥＣおよびＬ６骨格筋細胞を抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂを用いてフローサイトメトリーした結果である。精製されたＶＣＡＭ−１特異的多血清(polysera)を陽性対照群として使用した。現れた結果は少なくとも３回の別個の実験から得られた平均結果である。
【００１１】
図４ａおよび図４ｂは白血球と内皮細胞間の相互作用における抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂの中和効果を示すもので、図４ａは４００μｍ Ｈ2Ｏ2で処理されたＰＡＥＣを抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂまたは抗ＶＣＡＭ−１ ＩｇＧの存在（太い線）または非存在（細い線）の下で培養し、ＣＳＦＥ標識付きＵ９３７細胞を用いて接着アッセイ(adhesion assay)した結果であって、内皮細胞に結合したＵ９３７の量をフローサイトメトリーによって検出した。破線はＨ2Ｏ2非存在状態で培養した不活性化ＰＡＥＣ内皮細胞に対するＵ９３７の基本的な結合のために示すために使用した。図４ｂは内皮細胞に結合したＣＦＳＥ標識付きＵ９３７の百分率数値を垂直棒で示したもので、現れた結果は同様に行われた２回の別個の実験から得られた平均±Ｓ．Ｄを示す。
【００１２】
〔発明を実施するための最善の様態〕
上述した課題を解決するための本発明の一つの様態として、本発明は、ヒトおよびマウス血管接着細胞分子−１（以下、ＶＣＡＭ−１という）の両方ともに特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。
【００１３】
本願で使用される用語「抗体」は、免疫学的に特定の抗原と反応する免疫グロブリン分子を含み、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を全て含む。また、前記用語は、キメラ性抗体（例えば、ヒト化免疫抗体）および異種結合抗体（例えば、両特異性抗体）などの遺伝工学によって生産された形態を含む。また、用語「抗体」は、抗原結合能力を持つ断片、例えばＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびｒＩｇＧを含む、抗体の抗原結合形態を含む。また、前記用語は、組み換え単一鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を示し、二価または両特異性分子、ジアバディ(diabody)、トリアバディ(triabody)およびテトラバディ(tetrabody)を含む。二価および両特異性分子は、例えばＫｏｓｔｅｌｎｙ等(1992, J. Immunol. 148:15467)、ＰａｃｋおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ(1992, Biochemistty 31:1579)、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ等(1993, supra)、Ｇｒｕｂｅｒ等(1994, J. Immunol.:5368)、Ｚｈｕ等(1997, Protein Sci. 6:781)、Ｈｕ等(1996, Cancer Res. 56:3055)、Ａｄａｍｓ等(1993, Cancer Res. 53:4026)およびＭｃＣａｒｔｎｅｙ等(1995, Protein Eng. 8:301)に記述されている。
【００１４】
また、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同一の抗体集団から得た単一分子組成の抗体分子を指す。このようなモノクローナル抗体は、特定のエピトープに対して単一結合特異性および新和度を示す。
【００１５】
典型的に、免疫グロブリンは、重鎖および軽鎖を有し、それぞれの重鎖および軽鎖は不変部位および可変部位（前記部位は「ドメイン」として知られている）を含有する。軽鎖および重鎖の可変部位は「相補性決定領域」（complementarity-determining resion、以下「ＣＤＲ」という）と呼ばれる３つの多変可能な領域および４つの「構造領域(framework region)」を含む。前記ＣＤＲは主に抗原のエピトープに結合する役割を果たす。それぞれの鎖のＣＤＲは典型的にＮ末端から始まって順次ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれるし、特定のＣＤＲが位置している鎖によって識別される。
【００１６】
好適な一様態において、本発明のモノクローナル抗体は、配列番号５で定義される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号６で定義されるＣＤＲ２；および配列番号７で定義されるＣＤＲ３を含む軽鎖可変部位を含むモノクローナル抗体である。さらに好ましくは、配列番号１で定義される軽鎖アミノ酸配列を含むモノクローナル抗体である。
【００１７】
また、好適な一様態において、本発明のモノクローナル抗体は、配列番号８で定義される重鎖ＣＤＲ１；配列番号９または配列番号１１で定義される重鎖ＣＤＲ２；および配列番号１０または配列番号１２で定義される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変部位を含むモノクローナル抗体である。さらに好ましくは、配列番号２、配列番号３および配列番号４で定義される重鎖アミノ酸配列番号のいずれか一つを含むモノクローナル抗体である。
【００１８】
また、本発明のモノクローナル抗体は、前記軽鎖可変部位および前記重鎖可変部位を全て含むモノクローナル抗体であってもよい。
【００１９】
一方、本発明のモノクローナル抗体は、前記相補性決定領域（ＣＤＲ）に公知の治療用抗体の構造領域（ＦＲ）を接合させて製造することができる。好ましくは、前記構造領域は図２に開示されたアミノ酸配列を有する。
【００２０】
好適な別の様態において、本発明に係るモノクローナル抗体は、ヒトに対するより適切な治療のためにヒト化できる。さらに好ましくは、前記ヒト化モノクローナル抗体は、配列番号１３で定義される軽鎖アミノ酸配列および／または配列番号１４または配列番号１５で定義される重鎖アミノ酸配列を含むモノクローナル抗体である。
【００２１】
用語「ヒト化抗体」とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む免疫グロブリン分子であって、受血者のＣＤＲからの残基が、好適な特異性、親和力および収容力を持つマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（供血者の抗体）のＣＤＲからの残基で代替されるヒト免疫グロブリン（受血者の抗体）を含む。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒと共同研究者(Jones et al., Nature 321:522-525(1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327(1988))の方法によって、非ヒト種のＣＤＲ配列を、相応するヒト抗体の配列で置換することにより必須的に行われ得る。ヒト化抗体は、通常、ヒトの治療に用いられるが、３つ以上の潜在的な利点を持つ。第一に、これはヒト免疫体系とより良好に相互作用し、例えば補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）によって目的細胞をより効率よく破壊する。第二に、ヒト免疫体系は前記抗体を外来の者と認識しなければならない。第三に、さらに少ない量、より少ない頻度の薬物を投与したときにもヒト循環系内半減期が天然発生抗体と類似であろう。
【００２２】
ＷＯ９３／１４２２０には、ＶＣＡＭ−１の４番目の免疫グロブリンドメインを認識するモノクローナル抗体が開示されており、このような抗体がヒトＶＣＡＭ−１に対して効果があることを示した。ところが、本発明のモノクローナル抗体は、前述したように、ヒト、マウスおよび豚内皮細胞やラット骨格筋細胞などの多様な細胞類型で発現するＶＣＡＭ−１と結合する新規のモノクローナル抗体であり、ＷＯ９３／１４２００に開示されたモノクローナル抗体とはそのエピトープも異なる。
【００２３】
このような本発明のモノクローナル抗体は、ヒト、マウスおよび豚内皮細胞やラット骨格筋細胞などの多様な細胞類型で発現されるＶＣＡＭ−１と強い親和性を持つため、ＶＣＡＭ−１に対する抗原認識を有用に使用することが可能な任意の適用で使用でき、特に、活性化された内皮細胞に対する白血球の結合を効果的に阻害させるので、炎症性障害などのＶＣＡＭ−１関連疾患に対する効果的な診断および治療方法を提供することができる。
【００２４】
したがって、ヒトおよびマウスのＶＣＡＭ−１の両方ともに特異的に結合する本発明のヒトモノクローナル抗体は、単独でまたは通常の薬学的に許容される担体と共に炎症性障害などのＶＣＡＭ−１関連疾患に対する診断および治療用薬学的組成物の形で使用可能である。
【００２５】
また、本発明のモノクローナル抗体は、多様な目的のために他の抗体、生物学的活性を持つ製剤または物質と共に使用できる。例えば、本発明のモノクローナル抗体は、内皮細胞で発現するＶＣＡＭ−１によって特定付けられる疾患の治療で４Ｂ９または他の抗ＶＣＡＭ−１抗体と共に使用できる。また、本発明のモノクローナル抗体は、炎症反応で現れる内皮細胞受容体（例えば、ＥＬＡＭ１やＩＣＡＭ１など）を認識する抗体と併用して使用できるうえ、公知の炎症性疾患抑制薬物とも併用して使用できる。
【００２６】
別の様態として、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列を持つＣＤＲ１；配列番号６のアミノ酸配列を持つＣＤＲ２；および配列番号７のアミノ酸配列を持つＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域に関する。好ましくは、前記軽鎖可変領域は配列番号１または配列番号１３で定義される軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００２７】
別の様態として、本発明は、配列番号８のアミノ酸配列を持つＣＤＲ１；配列番号９または１１のアミノ酸配列を持つＣＤＲ２；および配列番号１０または１２のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域に関する。好ましくは、前記重鎖可変領域は配列番号２、３、４、１４および１５で定義される重鎖アミノ酸配列のいずれか一つを含む。
【００２８】
別の様態として、本発明は、ヒトおよびマウスＶＣＡＭ−１の両方ともに特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法に関する
本発明のモノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体製造技術で容易に製造できる。例えば、モノクローナル抗体を製造する方法は、免疫された動物から得たＢリンパ球を用いてハイブリドーマを製造することにより行われてもよく(Koeher and Milsteinm, 1976, Nature, 256:495)、ファージディスプレイ技術を用いて行われてもよいが、これに限定されない。
【００２９】
ファージディスプレイ技術を用いた抗体ライブラリーは、ハイブリドーマを製作せず、直ちにＢリンパ球から抗体遺伝子を得てファージの表面に抗体を発現させる方法である。ファージディスプレイ技術を用いると、Ｂ細胞の不滅化(immortalization)によってモノクローナル抗体を生成することに関連した既存の多くの難しさが克服できる。
【００３０】
一般なファージディスプレイ技術は、１）ファージの外皮タンパク質ｐIII（またはｐIV）のＮ末端に該当する遺伝子部位に無作為配列のオリゴヌクレオチドを挿入する段階、２）天然型の外皮タンパク質の一部と前記無作為配列のオリゴヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの融合タンパク質を発現させる段階、３）前記オリゴヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと結合することが可能な受容体物質を処理する段階、４）受容体に結合したペプチド−ファージ粒子を低いｐＨまたは結合競争力のある分子を用いて溶出させる段階、５）パンニング(panning)によって溶出されたファージを宿主細胞内で増幅させる段階、６）所望の量を得るために前記方法を繰り返し行う段階、および７）パンニングによって選別されたファージクローンのＤＮＡ配列から活性のあるペプチドの配列を決定する段階から構成される。
【００３１】
好適な一様態として、本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、ファージディスプレイ技術を用いて行われることができ、下記の段階を含む：
（ａ）哺乳類動物内に組み換えヒトＶＣＡＭ−１／Ｆｃを免疫させる段階、
（ｂ）免疫化された哺乳類動物の抗体力価を検出する段階、
（ｃ）免疫化された哺乳類動物からポリクローナル抗体を精製する段階、
（ｄ）非ヒト哺乳類動物／ヒトキメラ抗体ライブラリーを構築する段階、および
（ｅ）抗体ライブラリーから、抗ＶＣＡＭ−１に特異的な抗体を選別する段階。
【００３２】
当業者は、公知のファージディスプレイ技術、例えばＢａｒｂａｓ等(METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2:119, 1991 and J. Virol. 2001, Jul;75(14):6692-9)およびＷｉｎｔｅｒ等(Ann. Rev. Immunol. 12:433,1994)の論文などに公知になった方法を参考し、前記本発明の製造方法の各段階を容易に行うことができる。
【００３３】
具体的に、（ａ）哺乳類動物内に組み換えヒトＶＣＡＭ−１／Ｆｃを免疫させる方法は、当業界に公知になっている任意の動物の免疫化方法で行うことができる。例えば、文献[Harlow and Lane, Antibodies:A Laboratory Mannual, New York:Cold Spring Harber Press(1990)]を参照する。ヒト以外の動物、例えばマウス、ラット、羊、ヤギ、豚、牛および馬の免疫化方法は、当業界によく知られている。好ましくは、ＶＣＡＭ−１／Ｆｃ抗原は免疫反応の促進のためにアジュバントと共に投与される。このようなアジュバントは、完全または不完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）を含む。
【００３４】
（ｂ）免疫化された哺乳類動物の抗体力価を検出する方法であって、当業者は公知の力価測定法、例えば酵素結合免疫分析法（enzyme-linked immunoassay、ＥＬＩＳＡ）または放射性免疫分析法（radioimmunoassay、ＲＩＡ）を使用することができるが、これに限定されない。好ましくはＥＬＩＳＡを用いて行われる。
【００３５】
（ｃ）免疫化された哺乳類動物からポリクローナル抗体を精製する方法としては、多様に知られている分離および精製技術を使用することができる。このような分離技術はタンパク質Ａ−セファロース(Sepharose)を用いた親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー(size-exclusion chromatography)およびイオン交換クロマトグラフィーを含む(Coligan at pages 2.7.1-2.7.12 and pages 2.9.1-2.9.3. およびBaines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL.10, pages 79-104(The Humana Press, Inc. 1992参照)。
【００３６】
（ｄ）非ヒト哺乳類動物／ヒトキメラ抗体ライブラリーを構築する方法および（ｅ）抗体ライブラリーから抗ＶＣＡＭ−１に特異的な抗体を選別する方法は、前述した一般なファージディスプレイ法によって容易に行われ得る。
【００３７】
前記段階で抗体ライブラリーを構築するために使用できるファージは、例えばフィラメント性ファージ(filamentous phage)であって、ｆｄ、Ｍ１３、ｆ１、Ｉｆ１、Ｉｋｅ、Ｚｊ／Ｚ、Ｆｆ、Ｘｆ、Ｐｆ１またはＰｆ３ファージがあるが、これに限定されない。また、前記フィラメント性ファージの表面上における異種遺伝子の発現のために使用できるベクターには、例えばｆＵＳＥ５、ｆＡＦＦ１、ｆｄ−ＣＡＴ１またはｆｄｔｅｔＤＯＧなどのファージベクター、またはｐＨＥＮ１、ｐＣｏｍｂ３、ｐＣｏｍｂ８またはｐＳＥＸなどのファージミドベクターがあるが、これに限定されない。好ましくはｐＣｏｍｂ３Ｘファージミドベクターである。
【００３８】
また、増幅のための組み換えファージの成功的な再感染のために要求される野生型外皮タンパク質を提供するために使用できるヘルパーファージには、例えばＭ１３Ｋ０７またはＶＳＣＭ１３などがあるが、これに限定されない。好ましくはＶＳＣＭ１３である。
【００３９】
具体的な一実施例において、本発明者は、本発明に係るヒトおよびマウスＶＣＡＭ−１の両方ともに特異的な組み換え抗体を製造するために、まず、組み換えマウスＶＣＡＭ−Ｆｃキメラをウサギで免疫させた。免疫化過程を通じて収集されたウサギ血清の酵素免疫アッセイは、全てのウサギが抗原に対して増加した抗体力価を持っていることを示した（データを表示せず）。５回の促進注射の後、総ＲＮＡを免疫化ウサギの脾臓および骨髄から分離し、ｃＤＮＡ合成を行った。３段階のＰＣＲを用いて、ウサギ／ヒトキメラ抗体ライブラリーを製造し、ファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｘでクローニングした。これは独立した形質転換体５．７×１０9の複雑度(complexity)を示した。
【００４０】
免疫化マウスＶＣＡＭ−１の６回のバイオパンニングの後、２０クローンを無作為に選別し、ヘルパーファージ(helper phage)を感染させた後、ファージ酵素免疫アッセイでヒトおよびマウスＶＣＡＭ−１の両方ともに対するそれらの反応性を検査した。選別された２０クローンのうち３クローンは、ヒトおよびマウスＶＣＡＭ−１の両方ともに対する強い反応性を示した。
【００４１】
このような３つのクローンを以後のＤＮＡシーケンシングによって分析した。３クローンは非常に同様のヌクレオチド配列を持っており、その配列を図２に示した。
【００４２】
抗ＶＣＡＭ−１キメラＦａｂのヒトにおける免疫生成を予防するために、本発明者は、公知の治療用ヒト化抗体の可変部位の構造領域上に抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂの６つのＣＤＲを接合させてヒト化抗体を製造しようとした。デザインされた配列は図２に示した。
【００４３】
その後、選別されたＶＣＡＭ−１特異的Ｆａｂの生化学的および機能的特性  化のために、大腸菌(E.coli)における過発現および抗ＨＡ親和性カラムクロマトグラフィーによる精製の後、０．３ｍｇの抗ＶＣＡＭ−１特異的なＦａｂを１Ｌの振とう培養液(shaking culture)から最終的に収得した。その純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色を用いて確認した（図１Ａ）。酵素免疫アッセイ実験は、精製された抗体が特異的にヒトおよびマウスＶＣＡＭ−１に結合することを示す。免疫前血清および免疫血清は、実験セット内で陰性対照群および陽性対照群として用いられた（図１Ｂ）。しかも、ヒトおよびマウスＶＣＡＭ−１の両方ともに対する抗体の特異性を証明するために、精製された組み換えヒトおよびマウスＶＣＡＭ−１／Ｆｃキメラを、精製された抗ＶＣＡＭ−Ｆａｂを用いてウエスタンブロットした。その結果は、精製されたＶＣＡＭ−１ Ｆａｂが成功的にヒトおよびマウスＶＣＡＭ−１／Ｆｃキメラそれぞれと反応することを示す（図１Ｃ）。このような発見は、前記ＶＣＡＭ−１−ＦａｂがヒトおよびマウスＶＣＡＭ−１の両方ともに特異性を持っているという明白な証拠を提供する。
【００４４】
また、本発明者は、天然型ＶＣＡＭ−１に対するそれの反応性を調べるために、ＶＣＡＭ−１特異的Ｆａｂをフローサイトメトリーによって分析した。選別されたＦａｂが、ｈ−ＴＮＦαで刺激されたＨＵＶＥＣ、Ｈ2Ｏ2で活性化された豚およびマウス内皮細胞内で発現されたＶＣＡＭ−１に結合することを見出した。また、このようなＦａｂがラット骨格筋細胞内で基本的に発現されたＶＣＡＭ−１と反応することを証明した（図３）。白血球と活性化された内皮細胞との相互作用がＶＣＡＭ−１によって媒介されるため、本発明者は選別されたＦａｂがこのような相互作用を阻害することができるか否かを実験した。このような目的のために、本発明者は、選別されたＦａｂを用いた培養の後、ＣＦＳＥ標識付きＵ９３７ヒト前単核白血球(promonocytic leukocyte)、およびｈＴＮＦαまたはＨ2Ｏ2で刺激されたヒト、マウスおよび豚内皮細胞を用いて接着アッセイを行った。得られた結果によって、本発明に係るモノクローナル抗体はヒト単核球と３類型の活性化内皮細胞間の相互作用の効果的な阻害作用を示すことが分かった（図４）。
【００４５】
別の様態として、本発明は、ヒトおよびマウスＶＣＡＭ−１の両方ともに特異的に結合するモノクローナル抗体を含有する、ＶＡＭ−１の発現有無または発現程度に関連した疾患またはＶＣＡＭ−１によって媒介される疾患に対する診断用組成物、およびこれを用いた前記疾患の診断方法に関する。
【００４６】
例えば、本発明のヒト化モノクローナル抗体を生物学的試料と反応させ、抗原−抗体複合体の形成を検出することにより、ＶＣＡＭ−１タンパク質を検出することができる。
【００４７】
本明細書で使用された用語「生物学的試料」としては、組織、細胞、全血、血清、血漿、組織剖検試料（脳、皮膚、リンパ節、脊髄など）、細胞培養上澄液、破裂された真核細胞および細菌発現系などを挙げることができるが、これに限定されない。これらの生物学的試料を操作している状態あるいは操作していない状態で本発明の抗体と反応させてＶＣＡＭ−１タンパク質の存在、炎症性疾患または癌の有無を確認することができる。
【００４８】
本明細書で使用された用語「抗原−抗体複合体」とは、試料中のＶＣＡＭ−１タンパク質抗原とこれを認知する本発明に係るモノクローナル抗体の結合物を意味し、このような抗原−抗体複合体の形成においては、比色法(colormetric method)、電気化学法(electrochemical method)、蛍光法(fluorimeric method)、発光法(luminometry)、粒子計数法(particle counting method)、肉眼測定法(visual assessment)、および閃光計数法(scintillation counting method)よりなる群から選ばれる任意の方法で検出することができる。ところが、必ずしもこれらに限定されるものではなく、多様な応用と適用が可能である。
【００４９】
本発明では、抗原−抗体複合体を検出するためのもので、いろいろの標識体を使用することができる。
【００５０】
具体的な例としては、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子、および放射性同位元素よりなる群から選択でき、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００５１】
検出標識体として使用される酵素にはアセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ホースラディシュベルオキシダーゼ、β−ラタマーゼなどがあり、蛍光物にはフルオレセイン、Ｅｕ3＋、Ｅｕ3＋キレートまたはクリプタートなどがあり、リガンドにはビオチン誘導体などがあり、発光物にはアクリジニウムエステル、イソルミノール誘導体などがあり、微小粒子にはコロイド金、着色されたラテックスなどがあり、放射性同位元素には５７Ｃｏ、３Ｈ、１２５Ｉ、１２５Ｉ−ボントンハンター試薬などがある。
【００５２】
好ましくは、抗原−抗体複合体を酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いて検出することができる。酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）は、固体支持体に付着した抗原を認知する標識付き抗体を用いる直接的ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗原を認知する抗体と抗原の複合体における捕獲抗体を認知する標識付き二次抗体を用いる間接的ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体における抗原を認知する標識付き別の抗体を用いる直接的サンドイッチＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体における抗原を認知する別の抗体と反応させた後、この抗体を認知する標識付き２次抗体を用いる間接的サンドイッチＥＬＩＳＡなどの多様なＥＬＩＳＡ方法を含む。前記モノクローナル抗体は、検出標識を持つことができ、検出標識を持たない場合はこれらのモノクローナル抗体を捕獲することができ、検出標識を持つ別の抗体を処理して確認することができる。
【００５３】
別の様態として、本発明は、ヒトおよびマウスＶＣＡＭ−１の両方ともに特異的に結合するモノクローナル抗体および薬学的に許容される担体または賦形剤を含有するＶＣＡＭ−１の過発現またはＶＣＡＭ−１に媒介される疾患の予防または治療用薬学的組成物、およびこれを用いて前記疾患を治療する方法に関する。前記疾患は好ましく炎症性疾患または癌である。
【００５４】
本発明の抗体組成物は、薬学的に有効な量で単一投与または多重投与できる。抗体組成物は、液剤、酸剤、エアロゾール、カプセル剤、腸溶コーティング錠剤またはカプセル剤または座剤の形で投与することができる。投与経路は、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下内投与、内皮投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与などを含むが、これに限定されない。ところが、経口投与の際に、ペプチドは消化されるため、経口用組成物は活性薬剤をコートし、あるいは胃における分解から保護されるように剤形化されなければならない。また、製薬組成物は活性物質が標的細胞に移動することが可能な任意の装置によって投与できる。
【００５５】
本発明の抗体組成物は、薬学的に有効な量で投与する。「薬学的に有効な量」とは、医学的治療または予防に適用できる合理的な恵み／危険の比で疾患の治療または予防に十分な量を意味する。
【００５６】
有効用量水準は、疾患の重証度、薬物の活性、患者の年齢、体重、健康、性別、患者の薬物に対する敏感度、使用された本発明の組成物の投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、使用された本発明の組成物と配合または同時使用される薬物を含む要素、およびその他医学分野によく知られている要素によって決定できる。また、本発明の抗体組成物は、個別治療剤として投与し、あるいは他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次または同時に投与することができる。
【００５７】
本発明の薬学的組成物を薬学的に有効な量で投与する場合、ＶＣＡＭ−１と強い親和性を持つ本発明のモノクローナル抗体が内皮細胞に発現されたＶＣＡＭ−１に特異的に結合することによりＶＣＡＭ−１を中和させ、前記内皮細胞に白血球が接着されることを阻害することにより、ＶＣＡＭ−１関連疾患を治療することができる。好ましいＶＣＡＭ−１関連疾患は、炎症性疾患または癌であり、さらに好ましくは、前記炎症性疾患は関節炎、多発性硬化症、大腸疾患、喘息、動脈硬化、心筋梗塞、臓器移植拒否である。
【００５８】
本明細書で引用された文献は、その全部が参考文献として含まれる。また、当該技術分野の熟練者は通常の実験によって、ここで、特に記述した本発明の特定の様態の数多くの同等なものがあることを認識または確認することができる。このような同等なものは本請求項の範囲に含まれる。
【００５９】
以下、実施例によって本発明を詳細に説明する。これらの実施例は本発明を例示するもので、本発明を限定するものではない。
【００６０】
〔発明の様態〕
〔実施例〕
１．物質
組み換えヒトおよびマウスＶＣＡＭ−１／Ｆｃキメラは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入した。拡張された高充実度(high fidelity)ＰＣＲシステムおよびＨＲＰコンジュゲート抗インフルエンザＡウィルスヘマグルチニン（ＨＡ）抗体（３Ｆ１０）は、Ｒｏｃｈｅ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のものを使用した。ＴＭＢ溶液はＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）のものを使用した。５，６−カルボキシ−フルオレセインスクシニミジルエステル（ＣＳＦＥ）およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識付きヤギ抗ウサギ二次抗体は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから得た。改善された化学発光物質(enhanced chemiluminiscence)およびＨＲＰコンジュゲート抗ウサギＩｇＧ抗体は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。アプロチニン、ロイペプチン(leupeptin)、パラホルムアルデヒド、ヒトＴＮＦα（ｈＴＮＦα）および過酸化水素はＳｉｇｍａのものを使用した。ヒト胎児静脈上皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびＥＧＭ−２ブレットキット(EGM-2 bullet kit)はＣａｍｂｒｅｘから購入した。ヤギ抗ヒトＦａｂポリクローナル抗体はＢｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸ）のものを使用した。フェニシリン／ストレプトマイシン、胎児牛血清、ＲＰＭＩ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍおよびＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地は、ライフテクノロジーから購入した（Ｇａｕｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）。豚大動脈上皮細胞株（ＰＡＥＣ）は、Ｃｕ−ｒｉｅ Ａｈｎ博士（ソウル大学校、韓国）から提供を受けた。ＳＶ４０形質転換マウス上皮膵臓島細胞株ＭＳ−１（ＭＩＬＥ ＳＥＶＥＮ１）は、Ｐａｎｎ−Ｇｈｉｌｌ Ｓｕｈ博士から提供を受けた（浦項工大、韓国）。Ｌ６ラット骨格筋細胞はＳａｎｇ−Ｃｈｕｌ Ｐａｒｋ博士から提供を受けた（ソウル大学校、韓国）。
【００６１】
２．細胞培養
ＰＡＥＣ、ＭＥＣおよびＬ６筋肉細胞は、１０％（ｖ／ｖ）の胎児牛血清および１％（ｖ／ｖ）フェニシリン／ストレプトマイシンそれぞれを追加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ培地内で維持された。ＨＵＶＥＣは製造社の案内に従ってＥＧＭ−２で維持された。Ｕ９３７ヒト単核球(promonocytic leukocyte)細胞株は、１０％（ｖ／ｖ）胎児牛血清および１％（ｖ／ｖ）フェニシリン／ストレプトマイシンを追加したＲＰＭＩ内で培養させた。全ての細胞は、３７℃で二酸化炭素が調節された（５％） 湿潤状態の培養器内で培養した。
【００６２】
３．ヒトＶＣＡＭ−１／Ｆｃキメラの免疫化
２．５μｇの組み換えヒトＶＣＡＭ−１／Ｆｃキメラは、２ｍＬのＰＢＳで混合させ、３０分間３７℃で前培養したＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳアジュバントを用いて乳化させた。免疫化されたウサギの抗体力価は、２次抗体としてＨＲＰコンジュゲート抗ウサギＩｇＧ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によって決定した。３週間の注射間隔をもって５回の促進注射を行った後、免疫化されたウサギからのポリクローナル血清をタンパク質Ａセファローズビードを用いて精製した。
【００６３】
４．ウサギ／ヒトキメラ抗体ライブラリーの構築
実験プロトコルは、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２００１の方法に若干の変更を加えて行った。簡略に、ｃＤＮＡの一番目の鎖は、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライミングを用いたＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｐｒｅａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いた組み換えヒトＶＣＡＭ−１／Ｆｃキメラ−免疫化されたウサギ脾臓および骨髄の全長ＲＮＡから合成された。ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂライブラリーを構築するために、３段階のＰＣＲを用いてＰＣＲを行った。第１のＰＣＲを用いて、ウサギＶL（軽鎖可変部位）およびＶH（重鎖可変部位）をウサギｃＤＮＡおよびヒトＦａｂを含むｐＣｏｍｂ３Ｘ発現ベクターに由来したヒトＣLおよびＣH1から増幅させた。その後、第２のＰＣＲを用いて、ウサギ／ヒトキメラ軽鎖および重鎖をそれぞれ、ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｓｉｏｎ ＰＣＲを用いてウサギＶLとヒトＣKを結合させ、ウサギＶHとヒトＣH1を結合させて製造した。その結果として生成された、ライブラリーを暗号化するＦａｂをＳｆｉ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて消化させ、ファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｘ内に結合させ、１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含むＳＢ培地で培養された大腸菌(E.coli)菌株ＥＲ２７３８細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）内に形質転換させた。培養液はその後に３０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを付加した後、３７℃の振とう器で１時間培養した。ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（＞１×１０12ｐｆｕ／ｍＬ）および７０μｇ／ｍＬのカナマイシンを培養液に付加し、一晩３７℃で培養した。１５分間５０００ｒｐｍで遠心分離を行った後、収集した上澄液を８ｇのＰＥＧ−８０００および６ｇの塩化ナトリウムを仕込んで３０分間氷上で培養し、しかる後に、２０分間９０００ｒｐｍで遠心分離した。ファージペレットは３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．０２％ ＮａＮ3ＭＦ含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で再懸濁した。
【００６４】
５．抗体ライブラリーからの抗ＶＣＡＭ−１特異的な抗体の選別
総６回のパンニングを行った。マイクロタイタープレート(micro titer plate)内で一晩４℃で組み換えマウスＶＣＡＭ−１／Ｆｃキメラ２．５μｇのコーティングの後、５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＴＢＳを３７℃で２時間非特異的な結合を遮断するために培養し、その後３（ｖ／ｖ）％ＢＳＡ含有ＴＢＳ内で５０μＬの組み換えファージを２時間３７℃で培養した。非特異的ファージは０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳを用いて洗浄して除去した。結合したファージはｐＨ２．２の０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＨＣｌを用いて抽出し、ｐＨ９．１の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで中和させた。抽出物はＥＲ２７３９を対数的に成長させるために使用し、ファージミドライブラリーを抱く前記ＥＲ２７３８を一晩増幅させるために、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３を用いてファージミドを成長させた。ファージ製造物は、前述したように精製し、ＰＥＧおよび塩化ナトリウムを付加することにより濃縮させた。この全体的な選別過程を６回繰り返し行い、洗浄段階を１番目で１回、２番目、３番目および４番目でそれぞれ３回、５番目で６回、そして６番目で１０回に増加させた。
【００６５】
６．抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂの過発現および精製
０．５μｇのファージミドＤＮＡをＨＢ２１４１大腸菌内で形質転換させ、前記細胞を３７℃で絶え間なく振とうしながら、５０ｍｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ培地内で成長させた。６００ｎｍで光学的濃度が０．６に達するとき、前記細胞を３０℃で一晩成長させた。１５０００×ｇで３０分間遠心分離した後、収集された上澄液をＬａｂｓｃａｌｅ ＴＦＦ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて濃縮させ、しかる後に、タンパク質Ａセファロースにコンジュゲートされた抗ヘマグルチニン（ＨＡ）抗体を用いて培養させた。ｐＨ８．２の５０ｍＭナトリウムを含む緩衝液を用いて洗浄した後、前記ＦａｂをｐＨ２．２の０．１Ｍグリシンを用いて抽出し、その分画を生理学的ｐＨに合わせるために直ちにｐＨ９．２の１Ｍ Ｔｒｉｓを用いて中和させた。４℃で一晩ＰＢＳで透析した後、サンプルの濃度を２８０ｎｍにおける光学的濃度を測定することにより計算した。Ｆａｂの純度はクマシーブリリアントブルー染色を用いて検出した。
【００６６】
７．免疫ブロットの分析
Ｂｒａｄｆｏｒｄ溶液を用いてアッセイした後、タンパク質をＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液内で９５℃で５分間沸かして変性させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、ウェットトランスファーシステム(wet transfer system)（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたエレクトロブロッティングによってニトロセルロース膜に移動させた。５％（ｗ／ｖ）スキムミルクパウダーを含むＴＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）内で遮断させた後、その膜をそれぞれのモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて培養させ、しかる後に、必要に応じて、ホースラディシュペルオキシダーゼで結合した抗マウスまたは抗ウサギ免疫グロブリンＧを用いて別の培養を行った。検出は、改善された化学発光キット(enhanced chemiluminiscence kit)を用いて製造社の説明に従って行った。別の１次抗体を用いて再探針するために、膜をストリッピングバッファ（６２．５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．０、１００ｍＭ２−メルカプトエタノール［２−ＭＥ］および２％ＳＤＳ）内で３０分間５０℃で培養し、洗浄した後、追加的な研究のために使用した。
【００６７】
８．ＥＬＩＳＡ
ＰＢＳに溶解させた組み換えヒトおよびマウスＶＣＡＭ−１／Ｆｃキメラを２μｇ／ｍＬの濃度でマイクロプレートのそれぞれのウェルで一晩４℃で培養させた。ＰＢＳを用いて簡単に洗浄した後、前記プレートをＰＢＳで３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを用いて遮断させ、多血清（１：２０００）を用いて１時間３７℃で培養させ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを用いて３回以上洗浄した。プレートに結合したＦａｂの量は、抗ＨＡ ｍＡｂ ３Ｆ１０（Ｒｏｃｈｅ）コンジュゲートされたホースラディシュペルオキシダーゼの適用によって検出した。光学的濃度は３０分間３７℃でＡＢＴＳ基質溶液（２，２’−アジノ−ビス−１３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．）を用いて培養した後、マイクロタイターリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）によって４０５ｎｍで測定した。競争的ＥＬＩＳＡのために、ＶＣＡＭ−１ペプチドは、抗体コーティングの後、１時間３７℃でマイクロタイター内で培養した。以後の過程は前述と同様である。
【００６８】
９．ヒト、マウスおよび豚内皮細胞におけるＨ2Ｏ2およびｈＴＮＦαの処理
ＰＡＥＣおよびＭＥＣに対して、４００μＭのＨ2Ｏ2を、細胞内でＶＣＡＭ−１の最大発現を検出するために２４時間処理した。ＨＵＶＥＣに対しては２０ｎｇ／ｍＬのｈＴＮＦαを２４時間処理した。
【００６９】
１０．フローサイトメトリー
全ての細胞は、６０ｍｍの皿内で３×１０5細胞／ウェルの濃度で塗抹し、Ｈ2Ｏ2およびｈＴＮＦαでそれぞれ処理した。その後、細胞をトリプシン化した。１５００ｒｐｍで５分間簡略に遠心分離した後、そのペレットを１×ＰＢＳで洗浄し、１×ＰＢＳ内に１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む遮断バッファおよび最終濃度が５０μｇ／ｍＬに調整された遮断バッファ内に５０μＬの抗ＶＣＡＭ−１特異的なＦａｂを５０分間３７℃で細胞と共に培養した。５分間２０００ｒｐｍで遠心分離した後、前記細胞を１４０μＬの遮断バッファを用いて洗浄し、ＦＩＴＣ標識付き抗ヒトＦａｂ抗体（１：１００）を３０分間３７℃で培養させた。簡略に遠心分離した後、そのペレットを１４０μＬの遮断バッファを用いて洗浄し、その後、ＰＢＳに入っている２％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド３００μＬを用いて再懸濁した。ＶＣＡＭ−１の発現はフローサイトメーターによって分析した（Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）。
【００７０】
１１．ＣＦＳＥ標識
Ｕ９３７細胞を収穫した後、その細胞をＨＢＳＳを用いて２回洗浄した。洗浄された細胞（１×１０7細胞）を５分間暗い状態で、氷上で最終濃度が２．５μＭ ＣＦＳＥに調整されるようにＤＭＳＯ内のＣＦＳＥ溶液を用いて培養させた。標識（ラベリング）過程のクエンチング(quenching)のために、１／１０体積の胎児牛血清を付加し、１分間徐々に混合した。簡略な遠心分離の後、その細胞を再懸濁させ、使用前に計数した。
【００７１】
１２．細胞接着および中和アッセイ
白血球接着アッセイは若干修正して行った。要するに、６０ｍｍの皿に塗抹された３×１０5個の内皮細胞を、図示のように、Ｈ2Ｏ2およびｈＴＮＦαで刺激した後、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄させた。Ｕ９３７単核球を用いてＣＦＳＥ標識を行った後、図示のように標識された細胞を３７℃で１時間Ｈ2Ｏ2およびｈＴＮＦα刺激内皮細胞で培養させ、しかる後に、結合していない細胞を、０．２ｍＭ ＣａＣｌ2および０．１ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む１×ＰＢＳで５回洗浄した。最終細胞をトリプシン化させた後、ＦＡＣＳ分析を行った。中和アッセイのために、一日間Ｈ2Ｏ2およびｈＴＮＦαで刺激した内皮細胞を、図示のように、ＣＦＳＥ標識Ｕ９３７の追加前に３７℃で１時間抗ＶＣＡＭ−１ポリクローナル抗体または抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂを用いて培養させた。
【００７２】
〔産業上の利用可能性〕
本発明に係るモノクローナル抗体は、ヒトおよびマウスＶＣＡＭ−１に特異的に結合する最初の組み換えモノクローナル抗体であって、ヒトおよびマウス内皮細胞だけでなく、ラット骨格筋および豚内皮細胞で発現されたＶＣＡＭ−１にも強い親和力を示し、白血球と活性化された内皮細胞との相互作用を強く阻害する。したがって、本発明に係るモノクローナル抗体は、ＶＣＡＭ−１によって媒介された、内皮細胞への白血球の接着を効果的に阻害することにより、ＶＣＡＭ−１関連疾患、特に炎症性疾患を効果的に治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１ａ〜図１ｃはヒトおよびマウスＶＣＡＭ−１に特異的な抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂクローンの精製および特性描写(characterization)を示すもので、図１ａは０．２μｇの抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂに対するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色結果であって、２５ｋＤａの分子量を持つ抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂを矢印によって示した。図１ｂは９６ウェルプレートにコートさせた組み換えヒトおよびマウスＶＣＡＭ−１／Ｆｃキメラを免疫前血清、免疫血清および精製された抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂそれぞれを用いて検出した結果を示すものである。図１ｃは相異なる量の組み換えヒトおよびマウスＶＣＡＭ−１／Ｆｃキメラをゲルにロードし、抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂを用いて免疫ブロットした結果である。
【図２】図２は抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂクローンの重鎖および軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。選択されたＦａｂクローンをＤＮＡシーケンシングした後、特定された重鎖（ＶH）および軽鎖（ＶL）可変領域の配列を図示のように示した。ＦＲは構造領域(framework region)、ＣＤＲは相補性決定領域(complementarity-determining region)を意味する。また、抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂクローンに由来したヒト化抗体を示した。
【図３】図３は抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂによって多様な細胞類型で発現された天然型ＶＣＡＭ−１を検出した結果を示すもので、ｈＴＮＦαまたはＨ2Ｏ2の存在（実線）または非存在（破線）の下に培養されたＨＵＶＥＣ、ＭＥＣ、ＰＡＥＣおよびＬ６骨格筋細胞を抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂを用いてフローサイトメトリーした結果である。精製されたＶＣＡＭ−１特異的多血清(polysera)を陽性対照群として使用した。現れた結果は少なくとも３回の別個の実験から得られた平均結果である。
【図４】図４ａおよび図４ｂは白血球と内皮細胞間の相互作用における抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂの中和効果を示すもので、図４ａは４００μｍ Ｈ2Ｏ2で処理されたＰＡＥＣを抗ＶＣＡＭ−１ Ｆａｂまたは抗ＶＣＡＭ−１ ＩｇＧの存在（太い線）または非存在（細い線）の下で培養し、ＣＳＦＥ標識付きＵ９３７細胞を用いて接着アッセイ(adhesion assay)した結果であって、内皮細胞に結合したＵ９３７の量をフローサイトメトリーによって検出した。破線はＨ2Ｏ2非存在状態で培養した不活性化ＰＡＥＣ内皮細胞に対するＵ９３７の基本的な結合のために示すために使用した。図４ｂは内皮細胞に結合したＣＦＳＥ標識付きＵ９３７の百分率数値を垂直棒で示したもので、現れた結果は同様に行われた２回の別個の実験から得られた平均±Ｓ．Ｄを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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