(57)【要約】【課題】本発明は、ケヨノミの抽出物を含む肝臓疾患予防及び治療効果を有する薬剤学的組成物を提供するためのものである。【解決手段】本発明は、ケヨノミ（Lonicera caerulea L. var. edulis）の抽出物を含む肝臓疾患予防及び治療効果を有する薬剤学的組成物に関するものであって、上記組成物は肝炎、肝硬化、または脂肪肝などの疾患に対する予防及び治療効果を有する。【選択図】図５【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケヨノミ（Lonicera caerulea L. var. edulis）の抽出物を含む肝臓疾患予防及び治療効果を有することを特徴とする薬剤学的組成物。
【請求項２】
ケヨノミの実の抽出物であることを特徴とする請求項１記載の薬剤学的組成物。
【請求項３】
水、有機溶媒、またはこれらの混合溶媒を用いて抽出したことを特徴とする請求項１記載の薬剤学的組成物。
【請求項４】
肝炎、肝硬化、または脂肪肝の予防及び治療効果を有することを特徴とする請求項１記載の薬剤学的組成物。
【請求項５】
ケヨノミの抽出物が全組成物の０．０１乃至１００％重量比を有することを特徴とする請求項１記載の薬剤学的組成物。
【請求項６】
粉末、顆粒、錠剤、カプセル、または注射剤剤形で製造されることを特徴とする請求項１記載の薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケヨノミ（Lonicera caerulea L. var. edulis）の抽出物を含む肝臓疾患予防及び治療効果を有する薬剤学的組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、人体内の消化器系と全身循環系との間に位置して、外部から入ってきた毒性物質から全身を防禦し、生体外物質の代謝を担当する重要な機能を担当している。生体内に入ってきた生体外物質は、一旦、肝を通過するため、肝は栄養素の他にも多くの毒性物質に露出される危険が高いため、他の臓器より損傷を受ける可能性が高い。
【０００３】
肝臓疾患は、誘発原因に従ってアルコールなどの過剰服用による毒性肝臓疾患と、ウイルス感染によるウイルス性肝臓疾患がある。ウイルス性肝臓疾患は、Ｂ型、Ｃ型肝炎ウイルスなどの感染により発生し、最近は食べ物や医薬、漢方薬、アルコールなどによる毒性肝臓疾患が増加する趨勢にいる。肝臓疾患は自覚症状がよく表れないので、早期診断が困難であり、自覚症状が表れた場合には相当な肝損傷が起きた場合である。肝組織は他の組織に比べて回復機能が大きい組織ではあるが、既に肝細胞が変形された場合には回復が困難である。
【０００４】
慢性肝炎や肝硬変の治療は現在まで明確な治療剤が開発されていない。インターフェロンと核酸アナログ型であるラビビュディンが慢性肝炎の治療剤として使われているが、これら薬品は、ウイルスの活性抑制効能を発揮する薬剤であって、肝細胞の機能を回復させる薬剤ではない。今まで、肝細胞機能の回復剤として全世界に最も多く知られたものには、シリマリンがある。シリマリンは、薬用植物であるCarduus marianus Linne Silybum marianumの学名を有した薬草から抽出したものであって、紀元前から古代ギリシアを始めとして西方世界に重要な薬物として知られてきた。１９７０年代に大韓民国に肝臓治療剤として紹介された以後、この成分を主成分とする多くの薬剤が市販中にいる。シリマリンを主成分として含有する製剤の場合、既に臨床的に肝臓疾患治療に広く応用されているが、その主成分であるシリマリンは水に殆ど溶けない難溶性物質であって、経口投与時、体内吸水率が低いという短所を有する。現在シリマリン製剤は中毒性肝臓疾患、慢性肝炎、及び肝硬化などの肝臓疾患治療の補助療法に利用されているだけであり、したがって、肝細胞の機能を速かに回復させることができる薬剤の開発は相変わらず要求されている実状である。
【０００５】
天然物から有用な肝機能改善効果に対する研究としては、特許文献１では、肝機能維持及び改善に有用な発酵乳及びその製造方法に関して開示しており、特許文献２では、ケンポナシの実の抽出物を有効成分として含有する肝機能改善効果と宿酔改善効能を有する機能性食品組成物に関して開示しており、特許文献３では、エゾウコギの抽出物がコーティングされた機能性食品の用途に関して開示しており、特許文献４では、コミカンソウの抽出物を含むＢ型肝炎治療剤及びその製造方法に関して開示しており、特許文献５では、イヌヤクシソウの抽出物を含有したウイルス性肝臓疾患治療用組成物に関して開示する。
【０００６】
前述した既存の治療組成物の他にも、優れる肝臓疾患治療活性を有する物質を天然物から獲得しようとする研究の一環として、本発明者は、損傷された肝細胞株にケヨノミの抽出物を添加すると肝細胞の成長が促進され、これによって、損傷された肝機能が回復されることを肝機能の生化学的指標として使われるＧＯＴ、ＧＰＴ数値が格段に減少することと確認し、ケヨノミの抽出物を含む組成物が肝炎、肝硬化、または脂肪肝などの肝臓疾患に対する優れる予防及び治療効果を有することを明らかにすることで、本発明を完成した。
【特許文献１】大韓民国特許登録第８０７５９号
【特許文献２】大韓民国特許公開第２００３−００２７６１５
【特許文献３】大韓民国特許公開第２００３−００１１８１８号
【特許文献４】大韓民国特許公開第２００３−００６３３０８号
【特許文献５】大韓民国特許公開第２００４−００１８７３３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ケヨノミの抽出物を含む肝臓疾患予防及び治療効果を有する薬剤学的組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一実施形態において、本発明は、ケヨノミの抽出物を含む肝臓疾患予防及び治療効果を有する薬剤学的組成物に関するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、ケヨノミの抽出物を含む組成物は、毒性などの副作用がない、かつ優れる肝機能回復及び成長回復能を有するので、肝臓疾患の予防及び治療に効果的に利用されることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明における用語“抽出物（extract）”は、天然物から分離された活性成分を意味し、ここでは、ケヨノミから分離された物質であって、肝細胞成長促進効果を有する。抽出物は、水、有機溶媒、またはこれらの混合溶媒を利用する抽出過程で獲得することができ、抽出液、これの乾燥粉末、またはこれを利用して剤形化された全ての形態を含む。
【００１１】
本発明における用語“ケヨノミ（Lonicera caerulea L. var. edulis）”とは、天然、雑種、または変種ケヨノミの全ての器官、例えば、根、枝、幹、葉、花、及び実を全て含む意味であるが、好ましくは、ケヨノミの実である。ケヨノミ（Lonicera caerulea L. var. edulis）は、茜目スイカズラ科の双子葉植物であって、高さが１．５ｍに達する落葉潅木であり、枝がたくさん分かれて、小さな枝の節に盾形態の苞葉があり、木の幹の中の部分は白色である。葉は対向して生え、披針形または楕円形であり、両端が鋭くないとか尖っており、歯がないし、縁部及び表面に短い毛が生え、後面に絨毛が多い。花は概して花柄が短くて、葉わきの下に吊り下がり、花冠は漏斗形で、黄白色であり、夏に咲く。うてなは５個に分かれて、花冠は黄白色で、円筒状鐘形であり、長さ１．２〜１．５ｃｍであり、毛が若干ある。雄蕊は雌蕊台より短くて、毛がないし、子房は２つが合わせられ、実は楕円形またはほぼ円形であり、７〜８月に紫黒色に熟れ、白粉で覆われる。シベリア、サハリン、中国北部、チベット、北朝鮮等に分布している冷帯性植物である。本発明の以前にケヨノミの肝細胞の成長促進及びこれによる肝機能改善効果を調べたことはなかった。
【００１２】
肝機能改善効果は、組成物の投与により損傷された肝細胞で細胞成長が促進される度合と肝酵素数値、即ちＡＳＴ（Aspartate Aminotransferase：ＧＯＴ）とＡＬＴ（Alanine Aminotransferase：ＧＰＴ）にて客観的に評価することができる。ＡＬＴとＡＳＴは、肝細胞にある酵素であって、肝細胞が損傷または破壊されると、流出されて血中濃度が増加することになるので、ＡＬＴとＡＳＴ数値は、肝細胞損傷による肝疾患の生化学的指標として使われる。
【００１３】
本発明の具体的な実施形態において、エチルアルコールにより損傷された人の肝細胞であるＨｅｐＧ２細胞株にケヨノミの抽出物を添加し、肝細胞成長促進度合をケヨノミの抽出物を添加しない対照群と比較した結果、濃度比例的に成長を促進させた。ケヨノミの抽出物を０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で添加すると約２７％、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で添加すると約５４％の細胞成長が促進された。また、肝機能改善の可否をＡＬＴとＡＳＴ量の測定により観察した結果、ＨｅｐＧ２細胞株でケヨノミの抽出物の投与によりＡＬＴ、ＡＳＴ数値が減少し、延いては、急性肝炎を誘発させたマウスにケヨノミの抽出物を投与すると、ＡＬＴ、ＡＳＴ数値は、既存の薬剤であるシリマリンを投与した場合より２５％以上回復能が優れることと表れた。上記の結果は、本発明のケヨノミの抽出物の優れる肝細胞成長促進による肝機能改善効果を有し、延いては、肝疾患治療活性を有することを立証するものである。
【００１４】
本発明における用語“肝臓疾患”は、肝機能の低下を誘発する全ての疾患を意味し、ウイルス（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、または、Ｅ型ウイルス）、アルコール、薬物（結核薬、アスピリン、抗生剤、麻酔剤、高血圧治療剤、経口避妊剤等）、先天的代謝異常などにより誘発される。肝臓疾患の具体的な例としては、肝炎、肝硬化、及び脂肪肝などがある。肝炎は慢性及び急性肝炎を全て含む。
【００１５】
本発明における用語“予防”とは、組成物の投与により肝機能低下を抑制または遅延させる全ての行為を意味する。本発明における用語“治療”とは、組成物の投与により肝機能及び成長が回復されるとか、有益に変更する全ての行為を意味する。
【００１６】
本発明の組成物投与により、肝炎、肝硬化、及び脂肪肝などの疾患のみならず、これにより誘発される症状（symptom）または合併症（complication）を予防及び治療することができる。例えば、ケヨノミの抽出物により予防及び治療できる肝疾患症状には、疲労、嘔吐、食欲減退、腹痛、黄疸などを含み、合併症には、むくみ、腹水、胃腸官出血、食道静脈瘤出血、肝性脳症（肝性昏睡）などを含む。
【００１７】
本発明におけるケヨノミの抽出物は、水、有機溶媒、またはこれらの混合溶媒を使用して抽出する方法により製造される。抽出した液は直ちに使用したり、または濃縮及び／または乾燥して使用することができる。
【００１８】
有機溶媒を使用して抽出する場合、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレン、アセトン、ヘキサン、エーテル、クロロホルム、エチルアセテート、ブチルアセテートジクロロメタン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルサルフォキサイド（ＤＭＳＯ）、１、３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、またはこれらの混合溶媒である有機溶媒を使用して、生薬の有効成分が破壊されないとか、最小化された条件で、室温または加温して抽出することができる。抽出する有機溶媒に従い、薬剤の有効成分の抽出度合と損失度合とが差が出ることがあるので、適した有機溶媒を選択して使用するようにする。抽出方法は特別に制限されず、例えば冷浸抽出、超音波抽出、還流抽出などがある。
【００１９】
上記溶媒抽出物は、浮遊する固体粒子を除去するために、抽出物を濾過させる段階をさらに含むことができる。綿、ナイロンなどを利用して粒子を濾過したり、限外濾過、冷凍濾過法、遠心分離法などを使用することができるが、これに制限されるものではない。
【００２０】
抽出液の濃縮には、減圧濃縮、逆滲透圧濃縮などの方法が使われることができる。濃縮後の乾燥段階は、凍結乾燥、真空乾燥、熱風乾燥、噴霧乾燥、減圧乾燥、泡沫乾燥、高周波乾燥、赤外線乾燥などを含むが、これに制限されるものではない。場合によって、最終乾燥された抽出物を粉砕する工程をさらに含むことができる。
【００２１】
また、上記抽出物は追加の分画工程を遂行することができる。例えば、上記抽出物を蒸溜水に懸濁させて、非極性有機溶媒、例えば、核酸、エテロ、ジクロロメタン、クロロホルム、エチルアセテート、またはこれらの混合溶媒で非極性溶媒可溶層を抽出、分離して収得するようにし、これを濃縮及び／または乾燥して使用することができる。
【００２２】
一つの具体的な実施形態において、本発明のケヨノミの抽出物は、ケヨノミ、より好ましくは、木の実の乾燥重量（ｋｇ）の５倍乃至２５倍、好ましくは７倍乃至１５倍の水、Ｃ１乃至Ｃ４の低級アルコール、またはこれらの混合溶媒、好ましくは水または水とエチルアルコールの混合溶媒で、２０乃至１００℃、好ましくは６０乃至１００℃の抽出温度で０．５時間乃至２日、好ましくは１時間乃至１日間、熱水抽出、冷浸抽出、超音波抽出、還流抽出、好ましくは還流抽出方法により、１回乃至５回、好ましくは２回乃至３回連続抽出して収得した。また、上記抽出物を濾紙で濾過し、濾液を回転真空濃縮器で２０乃至１００℃、好ましくは５０乃至７０℃で減圧濃縮した後に乾燥し、粉末形態の本発明のケヨノミの抽出物を製造した。粉末形態のケヨノミの抽出物は、そのまま使われるとか、溶媒に一定濃度で溶解させて使われることができる。
【００２３】
上記のケヨノミの抽出物は天然物から獲得した成分を有効成分に含有するので、安全で、毒性、副作用、及び耐性をもたらさないので、長期間の服用が可能であるという長所を有する。実際に、マウス急性実験結果、毒性を誘発しないことと究められた。また、上記組成物は人間だけでなく肝臓疾患が発生できる牛、馬、羊、豚、ヤギ、駱駝、レイヨウ、犬などの家畜に使われることができる。 
上記ケヨノミの抽出物は、肝臓疾患予防及び治療用薬学組成物の総重量に対し、０．０１乃至１００重量％、より好ましくは１乃至８０重量％で含む。また、上記組成物は薬効は増加させるものではないが、薬剤組成物に通常使われて、臭い、味、視覚などを向上させることができる追加成分を含むことができる。また、上記組成物は、ビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｃ、Ｅ、ニアシン、カルニチン、ベタイン、葉酸パントテン酸、ビオチン、亜鉛、鉄、カルシウム、クロム、マグネシウム、これらの混合物などの無機、及び有機添加物を追加に含むことができる。また、上記組成物は単独使用したり、既存に使用されていた肝臓疾患に治療活性を有する物質を追加に含むことができる。
【００２４】
上記組成物は、薬学的に許容可能な担体を含み、人体または獣医用に剤形化されることができる。目的に従い、薬剤学的分野で、通常的な経口用、非経口用、局所投与用等に適合した多様な形態の製剤で剤形化されることができる。粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤などの経口投与のための固形製剤には、結合剤、滑澤剤、崩解剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができる。経口用液状製剤には、懸濁剤、内溶液剤、油剤、及びシロップ剤などが該当されるが、よく使われる単純希釈剤である水及びリキッドパラフィンの以外に湿潤剤、甘味剤、芳香剤、及び保存剤などを含むことができる。注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して使用することができる。このような組成物は、単位−容量（１回分）または多重−容量（数回分）容器、例えば、封入されたアンプル及びバイアルに提示されることができ、使用直前に滅菌性液状担体、例えば、注射用数の付加のみを要求する凍結−乾燥条件下に貯蔵することができる。即席の注射溶剤及び懸濁剤は滅菌性酸剤、顆粒剤、及び錠剤から製造することができる。
【００２５】
更に他の一実施形態において、本発明は、ケヨノミの抽出物を含む組成物を患者に投与して肝臓疾患を予防及び治療する方法に関するものである。  
本発明における用語、“患者”は、肝機能が低下または損傷された疾患、例えば、肝炎、肝硬化、または脂肪肝などの疾患を有する人間と、馬、羊、豚、ヤギ、駱駝、レイヨウ、犬などの動物を意味し、本発明の組成物の投与により症状が好転されることができる。本発明のケヨノミの抽出物を含む組成物を患者に投与することで、前述した疾患を効果的に予防及び治療することができる。本発明の組成物を既存の肝臓疾患治療剤と並行して投与することができる。
【００２６】
本発明における用語“投与”は、如何なる適切な方法により患者に所定の物質を導入することを意味し、本発明の組成物の投与経路は、目的組織に到達できる限り、如何なる一般的な経路を通じて経口または非経口投与されることができる。また、組成物は活性物質が標的細胞へ移動できる任意の装置により投与されることができる。
【００２７】
本発明の組成物は薬剤学的に有効な量で投与する。
【００２８】
本発明における用語“薬剤学的に有効な量”は、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険割合で、疾患を治療することに十分な量を意味し、有効容量水準は患者の性別、年齢、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路、及び排出割合、治療期間、同時に使われる薬物を含んだ要素、及びその他の医学分野によく知られた要素に従って決まることができる。本発明の組成物は個別治療剤で投与したり、他の治療剤と併用して投与されることができ、従来の治療剤とは順次的または同時に投与されることができる。単一または多重投与されることができる。上記の要素を全て考慮して、副作用無しで、最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、当業者により容易に決まることができる。本発明の製造方法に従って製造された抽出物の投与方法は、経口投与、または静脈投与が好ましく、一般的にその有効容量は、経口投与の場合には普通の成人を基準に１回に１乃至２０ｍｇ／ｋｇが好ましくて、静脈投与の場合には１乃至２０ｍｇ／ｋｇが好ましい。特定の患者に対する投与容量水準は、性別、年齢、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、薬剤混合、及び疾患の重症度に従って変化されることができる。
【００２９】
以下、本発明を実施形態及び実験例により詳細に説明する。
【００３０】
但し、下記の実施形態は、本発明を例示するものであり、本発明の内容が下記の実施形態に限定されるものではない。
【００３１】
実施形態１：ケヨノミの実の抽出物の製造
（１−１）水溶媒を利用した熱水抽出法
中国の延辺地域及び白頭山で直接収穫した野生ケヨノミの実を乾燥させて実験に使用した。粉砕した状態のケヨノミの実１００ｇを１リットルの蒸溜水に加えてよく撹拌した後、９０乃至９５℃を維持する抽出温度で３時間の間還流抽出した後、濾液を分離したし、５５〜６５℃で生薬抽出物を減圧濃縮した後、凍結乾燥させて生薬組成物粉末エキス２１．２ｇを得た。
【００３２】
（１−２）水−アルコールの混合溶媒を利用した熱水抽出法
上記実施形態１−１のように、粉砕されたケヨノミの実１００ｇに１リットルの２５％エチルアルコールを加えてよく撹拌した後、熱を加えて８０乃至９０℃を維持する抽出温度で３時間の間還流抽出した後、濾液を分離したし、５５〜６５℃で生薬抽出物を減圧濃縮した後、凍結乾燥させて生薬組成物粉末エックス１９．５ｇを得た。
【００３３】
実施形態２：ケヨノミの実の抽出物による肝細胞株の成長に及ぼす影響測定
ＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに細胞数が１×１０４個になるように入れて、小児胎児血清（fetal bovine serum）が１０％含まれた細胞培養液で１６時間培養した。９６ウェルプレートを生理食塩水で洗浄し、０、０．１２５ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ／ｍｌの濃度で新たな細胞培養液にケヨノミの実の抽出物を希釈した溶液を各ウェルに加えた。４８時間を培養した後、各ウェルにある細胞数をＳＲＢ方法により測定した。 
４８時間後、９６ウェルプレートでケヨノミの実の抽出物が含まれた培養液を除去し、生理食塩水で９６ウェルプレートを洗浄し、７０％アセトンで各ウェルの細胞を２０分間固定した。固定された細胞は乾燥させた後、ＳＲＢ溶液で３０分間染色させ、染色されない溶液は１％酢酸溶液で５回洗浄した。洗浄が終わると、また乾燥させ、１０ｍＭ ｔｒｉｓ溶液を加えて、細胞たんぱく質と結合されたＳＲＢを溶解させ、分光測定器で５６２ｎｍでの吸光度を測定した。結果は、ケヨノミの実の抽出物を処理しないウェルを対照群にして、ケヨノミの実の抽出物を処理した各ウェルの吸光度を比較して百分率で表示した（図１）。この結果から見ると、ケヨノミの実の抽出物は、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度まではケヨノミの実の抽出物を処理しないウェルと比較して細胞数が等しいか、若干増加するか、細胞の成長に影響が殆どないことを見せている。
【００３４】
実施形態３．エチルアルコールが肝細胞株の成長に及ぼす影響測定
ＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに細胞数が１×１０４個になるように入れて、小児胎児血清（fetal bovine serum）が１０％含まれた細胞培養液で６時間培養した。９６ウェルプレートを生理食塩水で洗浄し、エチルアルコールを０、０．５、１．０、１．５、２．０％（ｖ／ｖ）の濃度になるように細胞培養液に希釈し、ＨｅｐＧ２が培養されている９６ウェルプレートの各ウェルに投与した。２４時間の間、エチルアルコールで細胞損傷を誘導した後、エチルアルコールが含まれた培養液を除去し、新たな培養液を加え、４８時間を培養した後、各ウェルにある細胞数をＳＲＢ方法により測定した。
【００３５】
培養液を除去し、生理食塩水で９６ウェルプレートを洗浄し、７０％アセトンで各ウェルの細胞を２０分間固定した。固定された細胞は乾燥させた後、ＳＲＢ溶液で３０分間染色させ、染色されない溶液は１％酢酸溶液で５回洗浄した。洗浄が終わると、また乾燥させ、１０ｍＭ ｔｒｉｓ溶液を加えて細胞たんぱく質と結合されたＳＲＢを溶解させ、分光測定器で５６２ｎｍでの吸光度を測定した。結果は、エチルアルコールを処理しないウェルを対照群にしてエチルアルコールを処理した各ウェルの吸光度を比較して百分率で表示した（図２）。この結果から見ると、ケヨノミの実の抽出物は、１％の濃度までは、むしろエチルアルコールが細胞成長を促進したが、１．５％以上の濃度ではエチルアルコールにより細胞数が減少することが分かった。
【００３６】
実施形態４：エチルアルコールによる細胞成長が抑制誘導された細胞におけるケヨノミの実の抽出物の投与による成長回復能測定
ＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに細胞数が１×１０４個になるように入れて、小児胎児血清（fetal bovine serum）が１０％含まれた細胞培養液で１６時間培養した。９６ウェルプレートを生理食塩水で洗浄し、エチルアルコールを１．５％（ｖ／ｖ）の濃度になるように細胞培養液に希釈し、ＨｅｐＧ２が培養されている９６ウェルプレートの各ウェルに投与した。２４時間の間、エチルアルコールで細胞損傷を誘導した後、エチルアルコールが含まれた培養液を除去し、０ｍｇ、０．１２５ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ／ｍｌの濃度で新たな細胞培養液にケヨノミの実の抽出物を希釈した溶液を各ウェルに加えた。４８時間を培養した後、培養液を除去し、生理食塩水で９６ウェルプレートを洗浄し、７０％アセトンで各ウェルの細胞を２０分間固定した。固定された細胞は乾燥させた後、ＳＲＢ溶液で３０分間染色させ、染色されない溶液は１％酢酸溶液で５回洗浄した。洗浄が終わると、また乾燥させ、１０ｍＭ ｔｒｉｓ溶液を加えて細胞たんぱく質と結合されたＳＲＢを溶解させ、分光測定器で５６２ｎｍでの吸光度を測定した。結果は、エチルアルコールとケヨノミの実の抽出物を処理しないウェルを対照群にして、エチルアルコールのみを処理したウェルでの吸光度とエチルアルコールを処理した各ウェルでケヨノミの実の抽出物を加えたウェルでの吸光度とを比較測定した（図３）。
【００３７】
１．５％エチルアルコールの濃度ではエチルアルコールを投与しないウェルに比べて吸光度割合が２２％減少したが、ケヨノミの実の抽出物をエチルアルコールを投与したウェルに処理すると、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度まではケヨノミの実の抽出物の濃度増加に比例して吸光度も増加した。したがって、ケヨノミの実の抽出物を処理したウェルでは、エチルアルコールによる損傷から細胞成長が回復していることが分かる。
【００３８】
したがって、エチルアルコールにより細胞損傷が誘導された細胞において、ケヨノミの実の抽出物の投与により細胞成長が回復した度合を数式１により求めて表１に表した。
【００３９】
【数１】
2009500446.tif 000002
【００４０】
【表１】
2009500446.tif 000003
【００４１】
表１の結果において、エチルアルコール投与（１．５％の濃度条件）により細胞損傷が誘導された細胞において、ケヨノミの実の抽出物の濃度０．１２５ｍｇ／ｍｌでは２０．４５±７．７２％、０．２５ｍｇ／ｍｌ濃度では２７．１４±８．１４％、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度では５４．７７±３．３７％の損傷された細胞が回復した。したがって、肝細胞損傷でケヨノミの実の抽出物は肝細胞成長を促進することで、肝組織の機能を回復させる薬剤として作用することが分かった。
【００４２】
実施形態５：エチルアルコールの投与により損傷された肝細胞株でケヨノミの実の抽出物による肝機能回復
人の肝細胞の一種であるＨｅｐ３Ｂ細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに２×１０４個で入れて、１２時間の間培養して細胞をプレートの底に付着させた後、培養上清液を除去し、燐酸緩衝溶液で洗浄した。新たな培養液にエチルアルコールを加えてエチルアルコールの最終濃度が５％になるようにした培養液を各ウェルに入れて、１２時間培養して細胞の損傷を誘導した。各ウェルで培養液を除去し、ケヨノミの実の抽出物を含んだ培養液（０．３ｍｇ／ｍｌ）と含まない培養液を各々エチルアルコールを加えて細胞の損傷を誘導したウェルに加えた。エチルアルコールを加えたウェルと加えないウェルでのＡＬＴ、ＡＳＴを測定するために、日本Array社からSPOTCHEMTM II stripを購入して本実験に使用した。SPOTCHEMTM II stripは、ＡＬＴ（ＧＯＴ）、ＡＳＴ（ＧＰＴ）、blood urea nitrogen、glucose total cholesterol、total bilirubinの量を１つのストリップ（strip）で全て測定可能である。このストリップでは、ＡＬＴとＡＳＴの量を測定する部分が米色のゾーンとなっているが、試料内にＡＬＴとＡＳＴ量が増加すると、濃厚な青色に変わることになる。４８時間が過ぎた後、各ウェルの培養上清液を取ってSPOTCHEMTM II stripに落として発色を確認した（図４）。
【００４３】
図４において、対照群はＨｅｐ３Ｂ細胞にエチルアルコールとケヨノミの実の抽出物も全て処理しないウェルの培養液による発色結果である。血清内にある微量のＡＬＴ、ＡＳＴにより、米色から浅い青色に変わった。しかしながら、エチルアルコールを５％の濃度で投与したウェルの培養液では、色の変化が濃厚な青色に表れて、ＡＳＴとＡＬＴ活性が急激に増加したことと表れた。浅い青色を表した対照群のＡＬＴ、ＡＳＴ値と類似している。エチルアルコールで細胞損傷を誘導した後、ケヨノミの実の抽出物（０．３ｍｇ／ｍｌ）を処理した結果は、ケヨノミの実の抽出物（０．３ｍｇ／ｍｌのみを加えた結果のように、浅い青色に発色されてエチルアルコールを処理し、ケヨノミの実の抽出物を処理しないウェルの培養液と比較する時、ＡＬＴ、ＡＳＴ値が減少したことが分かる。
【００４４】
実施形態６：毒性試験
上記実施形態１で製造した熱水抽出物または熱水酒精混合抽出物を蒸溜水に溶解し、これをマウス（群当たり１０頭）に各々５００ｍｇ／ｋｇを投与した後、７日間観察したが、死亡するマウスがないことから見て、細胞毒性はないことと表れた。
【００４５】
実施形態７：急性肝炎誘発マウスにおけるケヨノミの実の抽出物の投与効果
急性肝炎を誘発させたマウスにおいて、ケヨノミの実の抽出物の投与による肝機能回復能を分析しようと次のような実験を行った。マウス（ＩＣＲ種）４０頭を各群当たり１０頭ずつ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの４群に分けた。Ａ群は、何らの薬剤を投与しなかったし、Ｂ群はオリーブオイルのみを食べさせた群であり、Ｃ群はシグマ社で購入したシリマリンをオリーブオイルに２０ｍｇ／ｍｌになるように溶かして、マウス１頭当たり１００ｕｌを３日間口腔投与したし、Ｄ群は、実施形態１で得たケヨノミの実の抽出物を５００ｍｇ／ｍｌになるように蒸溜水に溶かし、この溶液をマウス１頭当たり１００ｕｌを３日間口腔投与した。薬剤を投与する期間の間は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ群とも餌料を投与せず、水だけを供給した。四塩化炭素をオリーブオイルに１％になるように混合した後、１００ｕｌをＢ、Ｃ、Ｄ群のマウスの腹腔に注射した。そして、１８時間が過ぎた後、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ群のマウスから採血してマウス血液内のＡＳＴ、ＡＬＴの活性を実施形態５のような方法により測定し、各群の平均ＡＳＴ、ＡＬＴの活性値を比較した。この結果で、四塩化炭素を注入しないＡ群のＡＳＴ、ＡＬＴ平均活性値は、２３ユニット、３７ユニットであったし、四塩化炭素のみを注入したＢ群は、ＡＳＴ、ＡＬＴの数値が１，０２３ユニットと１，１２９ユニットであって、急性肝炎が誘発された現象を表した。一方、シリマリンを事前に服用させたＣ群のＡＳＴ、ＡＬＴ数値は、３３７ユニット、４４６ユニットであり、ケヨノミの抽出物を事前に服用させたＤ群のＡＳＴ、ＡＬＴ平均活性値は、１０７ユニット、１３０ユニットであって、ケヨノミの抽出物のＡＳＴ、ＡＬＴ値がシリマリンを投与したマウスに比べて平均２３０ユニット、２０７ユニットが各々減少した。ＡＳＴ、ＡＬＴ回復割合から見ると、シリマリンの肝機能回復能は６３．８％であったし、ケヨノミの実の抽出物の肝機能回復能は８９．０％であって、ケヨノミの実の抽出物が２５％以上回復能が優れることと表れた。
【００４６】
実施形態８：急性肝炎誘発マウスにおけるケヨノミの実の抽出物とシリマリンの組織化学的結果比較
実施形態７において、各実験群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄにおいて、ＡＳＴ、ＡＬＴの平均値を表したマウスの肝組織に対し、組織化学的な分析を行った。各群のマウスから肝組織を切片した後、１０％ホルマリンに固定したし、各々異なる濃度のエチルアルコールに浸して脱水過程を遂行したし、最終的にパラフィンに包埋した。パラフィン包埋組織は４−５ｕｍに切片してスライドガラスに接着させた後、ヘマタキシリンとエオシンで染色して光学顕微鏡で観察した（図５）。四塩化炭素を注入したマウスの肝組織では怪死が起きてヘマタキシリンとエオシンに染色されない部分がたくさん散在してあるが（図５−Ａ）、シリマリンとケヨノミの抽出物を投与し、四塩化炭素を注入したマウスの肝組織は（図５−Ｂ、図５−Ｃ）正常肝組織（図５−Ｄ）と比較して見て、怪死反応が殆ど起こらなかったことを見ることができる。特に、ケヨノミの抽出物を投与したマウスとシリマリンを投与したマウスの肝組織を比較して見ると、ケヨノミの抽出物を投与したマウスでシリマリンより怪死細胞がより少ないことを確認することができた。
【００４７】
実施形態９．ケヨノミの実の抽出物による肝機能回復効果臨床実験
平素に、肝炎症状を持っている３人の志願者を対象にして、実施形態１で製造したケヨノミの実の抽出物（１ｇ）を１０日または２０日間毎日２回服用するようにし、肝細胞内にある酵素であるＡＬＴとＡＳＴを調べた。試験に参加した３人とも１０日または２０日服用後、肝数値が減少したことを報告した。
【００４８】
志願者１：男、４０才
服用前症状：８年前からＢ型肝炎で難儀した。
【００４９】
服用後：１０日間服用後、ＡＳＴ３２から１１．１、ＡＬＴ７３から１４．３に減少した。
【００５０】
以後、服用しない状態で２０日後、ＡＳＴ１０．３、ＡＬＴ１０．６に減少した。
【００５１】
志願者２：男、３５才
服用前症状：肝臓疾患を病んでいたし、身体検査する度に肝数値が高かった。
【００５２】
服用後：２０日間服用後、ＡＳＴ５３から２．２５、ＡＬＴ９６から３５に減少した。
【００５３】
以後、服用しない状態で６０日後、ＡＳＴ２．２５、ＡＬＴ５．７５に減少した。
【００５４】
志願者３：女、３５才
服用前症状：家中の者が皆肝炎患者である
服用後：２０日間服用後、ＡＳＴ６９から２６、ＡＬＴ７２から２９に減少した。
【００５５】
実施形態１０：医薬品組成物の製造
製造例１−粉末及びカプセル剤の製造
上記実施形態１で得た熱水抽出物１００ｍｇをラクトース１４．８ｍｇ、結晶性セルロース３ｍｇ、マグネシウムステアレート０．２ｍｇと共に混ぜた。混合物を適当な装置を使用してＮｏ．５ゼラチンカプセルに詰めた。
【００５６】
常時粉末及びカプセル剤の構成成分は次の通りである。
【００５７】
有効成分                  １００ｍｇ
ラクトース                １４．８ｍｇ
結晶性セルロース          ３ｍｇ
マグネシウムステアレート  ０．２ｍｇ
製造例２−注射液剤の製造
上記実施形態１で得た熱水抽出物１００ｍｇを含有する注射液剤は、次のような方法により製造した。
【００５８】
上記実施形態１で得た熱水抽出物１００ｍｇ、塩化ナトリウム６００ｍｇ、及びアスコルビン酸１００ｍｇを蒸溜水に溶解させて１００ｍｌを作った。この溶液を瓶に入れて、１２０℃で３０分間加熱して滅菌させた。
【００５９】
上記注射液剤の構成成分は次の通りである。
【００６０】
有効成分            １０００ｍｇ
塩化ナトリウム      ６０００ｍｇ
アスコルビン酸      １０００ｍｇ
蒸溜水              定量
製造例３−酸剤の製造
大韓薬典製剤総則のうち、酸剤の製造方法に従い下記の成分含有量で製造する。
【００６１】
１）１包の中
有効成分抽出物（乾燥粉末）  １００ミリグラム
乳糖                        １００ミリグラム
タルク                      １０ミリグラム
２）１包の中
有効成分の水溶成分画    １００ミリグラム
乳糖                    １００ミリグラム
タルク                  １０ミリグラム
製造例４−錠剤の製造
大韓薬典製剤総則のうち、錠剤の製造方法に従い下記の成分含有量で製造する。
【００６２】
１）１錠の中
有効成分抽出物（乾燥粉末）  １００ミリグラム
とうもろこし澱粉            １００ミリグラム
乳糖                        １００ミリグラム
ステアリン酸マグネシウム    ２ミリグラム
２）１錠の中
有効成分の水溶成分画        １００ミリグラム
とうもろこし澱粉            １００ミリグラム
乳糖                        １００ミリグラム
ステアリン酸マグネシウム    ２ミリグラム
製造例５−カプセル剤の製造
大韓薬典製剤総則のうち、 カプセル剤の製造方法に従い下記の成分含有量で製造する。
【００６３】
１）１カプセルの中
有効成分抽出物（乾燥粉末）  １００ミリグラム
とうもろこし澱粉            １００ミリグラム
乳糖                        １００ミリグラム
ステアリン酸マグネシウム    ２ミリグラム
２）１カプセルの中
有効成分の水溶成分画        １００ミリグラム
とうもろこし澱粉            １００ミリグラム
乳糖                        １００ミリグラム
ステアリン酸マグネシウム    ２ミリグラム
製造例６−注射剤の製造
大韓薬典製剤総則のうち、注射剤の製造方法に従い下記の成分含有量で製造する。
【００６４】
１）１アンプルの中（２ｍｌ）
有効成分抽出物（乾燥粉末）  ５０ミリグラム
注射用滅菌蒸溜水            適量
ｐＨ調節剤                  適量
２）１アンプルの中（２ｍｌ）
有効成分の水溶成分画        ５０ミリグラム
注射用滅菌蒸溜水            適量
ｐＨ調節剤                  適量
製造例７−液剤の製造
大韓薬典製剤総則のうち、液製剤の製造方法に従い下記の成分含有量で製造する。
【００６５】
１）１００ｍｌの中
有効成分抽出物（乾燥粉末）  １ミリグラム
異性化糖                    １０グラム
マンニトール                ５グラム
精製水                      適量
２）１００ｍｌの中
有効成分の水溶成分画        １００ミリグラム
異性化糖                    １０グラム
マンニトール                ５グラム
精製水                      適量
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ＨｅｐＧ２細胞におけるケヨノミの実の抽出物の投与による細胞成長に及ぼす影響を分析した結果である。
【図２】ＨｅｐＧ２細胞におけるエチルアルコールの投与による細胞成長に及ぼす影響を分析した結果である。
【図３】エチルアルコールとケヨノミの実の抽出物を処理しないウェルを対照群にしてエチルアルコールのみを処理したウェルでの吸光度とエチルアルコールを処理した各ウェルにおいて、ケヨノミの実の抽出物を加えたウェルでの吸光度とを比較測定した結果である。
【図４】SPOTCHEMTM II strip上でケヨノミの実の抽出物の投与による肝機能回復現象を説明した結果である。
【図５】急性肝炎誘発マウスにおいて、ケヨノミの実の抽出物とシリマリン投与の効果を組織化学的分析で説明した結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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