(57)【要約】  本発明は、医薬、公衆衛生、ワクチンおよび医薬製剤の分野に関する。本発明は、ニコチン担体結合体、ならびに非還元二糖類および非イオン性界面活性剤を含む安定化剤を含んで成る組成物製剤を提供する。組成物製剤は、室温での長期保存に安定である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）：
（ａ）ウイルス様粒子；および
（ｂ）少なくとも１個のニコチン分子、ここで、当該少なくとも１個のニコチン分子は前記ウイルス様粒子と結合配列によって共有結合しており、当該結合配列はエステル官能基を含む；
を含んで成る少なくとも１個のニコチン−ウイルス様粒子結合体、および
（ｉｉ）：
（ｃ）少なくとも１種の非還元二糖類、ここで前記非還元二糖類の濃度は、凍結乾燥前の製剤中濃度において、０．５％から１５％（ｗ／ｖ）である；
（ｄ）少なくとも１種の非イオン性界面活性剤、ここで当該非イオン性界面活性剤の濃度は、凍結乾燥前の製剤中濃度において０．０００５％から０．１％（ｗ／ｖ）である；
を含む安定化剤組成物を含んで成る凍結乾燥製剤であって、当該安定化剤組成物は凍結乾燥前に５．４から６．６のｐＨ値を有している、製剤。
【請求項２】
非還元二糖類がショ糖またはトレハロースである、請求項１の凍結乾燥製剤。
【請求項３】
非還元二糖類がトレハロースである、請求項１または２の凍結乾燥製剤。
【請求項４】
少なくとも１種の非還元二糖類の濃度が凍結乾燥前の製剤中濃度において３％から１２％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは少なくとも１種の非還元二糖類の濃度が凍結乾燥前の製剤中濃度において１０％（ｗ／ｖ）である、請求項１〜３のいずれかの凍結乾燥製剤。
【請求項５】
安定化剤組成物がさらに充填剤を含む、請求項１〜４のいずれかの凍結乾燥製剤。
【請求項６】
非還元二糖類および充填剤の濃度が凍結乾燥前の製剤中濃度において０．５％から１５％（ｗ／ｖ）である；ただし非還元二糖類の濃度が凍結乾燥前の製剤中濃度において少なくとも０．５％（ｗ／ｖ）である、請求項５の凍結乾燥製剤。
【請求項７】
充填剤がマンニトールである、請求項５または６の凍結乾燥製剤。
【請求項８】
非イオン性界面活性剤の濃度が、凍結乾燥前の製剤中濃度において０．００２５％から０．０１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）である、請求項１〜７のいずれかの凍結乾燥製剤。
【請求項９】
非イオン性界面活性剤がポリソルベート２０である、請求項１〜８のいずれかの凍結乾燥製剤。
【請求項１０】
ウイルス様粒子がＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子であり、好ましくはウイルス様粒子がＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス様粒子である、請求項１〜９のいずれかの凍結乾燥製剤。
【請求項１１】
結合配列がＡ−ＣＨ２ＯＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯ−Ｂ（ここで、Ａはニコチン分子を意味し、Ｂはウイルス様粒子を意味する）から成る、請求項１〜１０のいずれかの凍結乾燥製剤。
【請求項１２】
結合配列がニコチン分子の３’位置と共有結合している、請求項１１の凍結乾燥製剤。
【請求項１３】
安定化剤組成物がさらに、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、およびヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌから選択される緩衝化剤を含む、好ましくは安定化剤組成物がさらに、ヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌである緩衝化剤を含む、請求項１〜１２のいずれかの凍結乾燥製剤。
【請求項１４】
（ｉ）：
（ａ）ＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス様粒子；および
（ｂ）少なくとも１個のニコチン分子、ここで少なくとも１個のニコチン分子は前記ウイルス様粒子と結合配列によって共有結合しており、当該結合配列はＡ−ＣＨ２ＯＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯ−Ｂ（ここで、Ａはニコチン分子を意味し、ＢはＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス様粒子を意味する）から成り、当該結合配列はニコチン分子の３’位置と共有結合している；
を含む少なくとも１個のニコチン−ウイルス様粒子結合体；および
（ｉｉ）：
（ｃ）１種の非還元二糖類、ここで当該非還元二糖類はトレハロースであり、トレハロースの濃度は凍結乾燥前の製剤中濃度において１０％（ｗ／ｖ）である；
（ｄ）１種の非イオン性界面活性剤、ここで当該非イオン性界面活性剤はポリソルベート２０であり、そしてポリソルベート２０の濃度は凍結乾燥前の製剤中濃度において０．００５％（ｗ／ｖ）である；
を含む安定化剤組成物を含んで成る凍結乾燥製剤であって、当該安定化剤組成物は凍結乾燥前に６．２のｐＨ値を有している、製剤。
【請求項１５】
（ｉ）：
（ａ）ＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス様粒子；および
（ｂ）少なくとも１個のニコチン分子、ここで少なくとも１個のニコチン分子は前記ウイルス様粒子と結合配列によって共有結合しており、当該結合配列はＡ−ＣＨ２ＯＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯ−Ｂ（ここで、Ａはニコチン分子を意味し、ＢはＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス様粒子を意味する）から成り、当該結合配列はニコチン分子の３’位置と共有結合している；
を含む少なくとも１個のニコチン−ウイルス様粒子結合体；および
（ｉｉ）：
（ｃ）１種の非還元二糖類、ここで当該非還元二糖類はトレハロースであり、トレハロースの濃度は凍結乾燥前の製剤中濃度において１０％（ｗ／ｖ）である；
（ｄ）１種の非イオン性界面活性剤、ここで当該非イオン性界面活性剤はポリソルベート２０であり、そしてポリソルベート２０の濃度は凍結乾燥前の製剤中濃度において０．００５％（ｗ／ｖ）である；
（ｅ）１種の緩衝化剤、ここで当該緩衝化剤はヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌであり、当該ヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌの濃度は２０ｍＭである；
を含む安定化剤組成物を含んで成る凍結乾燥製剤であって、当該安定化剤組成物は凍結乾燥前に６．２のｐＨ値を有している、製剤。
【請求項１６】
凍結乾燥製剤が室温で少なくとも１５週間、好ましくは少なくとも２５週間安定である、請求項１〜１５のいずれかの凍結乾燥製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、医薬、ワクチンおよび医薬製剤の分野に関する。本発明は、ニコチン−ウイルス様粒子結合体および安定化剤を含む製剤であって、当該安定化剤が非還元二糖類および非イオン性界面活性剤を含んで成る製剤を提供する。凍結乾燥製剤は室温での長期保存後に安定である。
【背景技術】
【０００２】
関連技術
ニコチン中毒の処置または予防のためのワクチンは、近年国民の注意を集めている。これらのワクチンは典型的には、ニコチンが低分子量有機化合物でありそれ自体が免疫応答を導くことができないため、担体と共有結合したニコチン分子を含む。さらに、ニコチンが担体に結合するのに適した官能基を有していないため、ニコチン分子に結合配列を導入することが典型的には必要である。様々なワクチンの開発が近年報告されており、例えばＵＳ５’８７６’７２７、ＵＳ６’２３２’０８２、ＵＳ６’６５６’４６９およびＵＳ６’９３２’９７１である。記載されている結合体は、担体の性質を変化させるだけでなく、結合配列および結合配列をニコチンに導入する部位の性質も変化させる。
【０００３】
ＵＳ６’９３２’９７１は、ニコチン分子とウイルス様粒子（ＶＬＰ）の、エステル官能基を含む結合配列によるカップリングを開示しており、これは整序反復ニコチン−担体結合体を形成し、高力価のニコチン特異的抗体の産生を導く。同じ著者らが近年、ニコチン分子がエステル官能基を有する結合配列によって共有結合しているＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス様粒子を含むワクチンが、ヒトの筋炎に有効であり得ることを示した（Maurer et al., Eur. J. Immun. 2005 35:2031-40）。
【０００４】
安定であり、化学的および／または物理的崩壊を最小にするかまたは回避するワクチン組成物の必要性は、かかる要求を満たす製剤の開発の必要性を暗示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
発明の要約
本発明者らは、驚くべきことに、ウイルス様粒子と少なくとも１個のカルボン酸エステル官能基を含む結合配列によって共有結合しているニコチン分子を含むニコチン−ウイルス様粒子結合体を安定化する凍結乾燥製剤を見出した。さらにまた、本発明者らは、驚くべきことに、この凍結乾燥製剤が室温で、または加速温度（４０℃）でさえも、長期保存にわたって安定であることを見出した。さらに、本発明の凍結乾燥製剤は、それに含まれる賦形剤が最小数であるため、簡単で経済的な安定化剤組成物を含む。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって１つの局面において、本発明は、（ｉ）：（ａ）ウイルス様粒子；および（ｂ）少なくとも１個のニコチン分子、ここで少なくとも１個のニコチン分子は前記ウイルス様粒子と結合配列によって共有結合しており、当該結合配列はエステル官能基を含む；を含む少なくとも１個のニコチン−ウイルス様粒子結合体と、（ｉｉ）：（ｃ）少なくとも１種の非還元二糖類、ここで、当該非還元二糖類の濃度は凍結乾燥前の製剤中濃度において０．５％から１５％（ｗ／ｖ）である；（ｄ）少なくとも１種の非イオン性界面活性剤、ここで、当該非イオン性界面活性剤の濃度は凍結乾燥前の製剤中濃度において０．０００５％から０．１％（ｗ／ｖ）である；を含む安定化剤組成物を含んで成る凍結乾燥製剤であって、前記安定化剤組成物は凍結乾燥前に５．４から６．６のｐＨ値を有する、製剤を提供する。
【０００７】
他の局面において、本発明は、本発明の凍結乾燥製剤の製造方法を提供する。
【０００８】
さらに他の局面において、本発明は、生理的に許容される溶液または滅菌水、好ましくは注射用水（ＷＦＩ）に溶解および／または懸濁させた本発明の凍結乾燥製剤を含む、再構成製剤を提供する。さらに好ましい態様において、再構成製剤はさらにアジュバントを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】製剤
【図２】結果
【図３】安定性試験
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
特に定義がない限り、本明細書において使用されている全ての技術および化学的用語は、本発明の属する技術分野における当業者が通常理解する通りの意味を有する。
【００１１】
アジュバント：「アジュバント」なる用語は、本明細書において使用するとき、免疫応答の非特異的刺激物質、または本発明のワクチンおよび医薬組成物それぞれと組み合わせたときより上昇した免疫応答を提供する、デポを宿主中に形成することができる物質を意味する。様々なアジュバントを用いることができる。例えば、完全および不完全フロインドアジュバント、水酸化アルミニウムおよび修飾ムラミールジペプチドが含まれる。さらなるアジュバントは、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性剤、例えばリソレシチン、プルロニック（pluronic）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油マルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよび潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ（bacille Calmette Guerin）およびCorynebacterium parvumである。かかるアジュバントは、当業者に既知でもある。本発明の組成物と共に投与し得るさらなるアジュバントにはこれらに限定されないが、モノホスホリル脂質免疫調節剤、ＡｄｊｕＶａｘ  １００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩（Ａｌｕｍ）、ＭＦ−５９、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７、ＯＭ−２９４、およびＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術が含まれる。アジュバントはまた、これらの物質の混合物を含む。ＶＬＰは一般的にアジュバントとして記載される。しかし、本発明の文脈で使用する「アジュバント」なる用語は、本発明の製剤に使用されるＶＬＰであるアジュバントではなく、むしろ当該ＶＬＰに加えて用いされるアジュバントを意味する。
【００１２】
被覆タンパク質：「被覆タンパク質」なる用語および相互交換可能に使用される「カプシドタンパク質」なる用語は、本明細書において、ウイルス性タンパク質、好ましくはウイルス、好ましくはウイルスカプシドまたはＶＬＰに導入することができるＲＮＡバクテリオファージの天然カプシドのサブユニットを意味する。
【００１３】
凍結乾燥前の製剤：「凍結乾燥前の製剤」なる用語は、凍結乾燥手段に、典型的かつ好ましくは２４時間以内に、さらに典型的かつ好ましくは８時間以内、およびより典型的かつ好ましくは２から４時間以内に凍結乾燥プロセスに供される本発明の液体製剤を意味する。「凍結乾燥プロセス」および「フリーズドライプロセス」は相互交換可能なように本明細書において使用され、類義語であると考えるべきである。
【００１４】
凍結乾燥製剤：「凍結乾燥製剤」なる用語は、液体製剤の凍結乾燥プロセスによって得るまたは入手可能な組成物を意味する。典型的かつ好ましくは、これは５％未満、好ましくは３％未満の水分含有量を有する固体組成物である。好ましくは、「凍結乾燥製剤」なる用語は、本発明の凍結乾燥製剤の製造プロセスによって得るまたは入手可能である組成物を意味する。
【００１５】
再構成製剤：「再構成製剤」なる用語は、生理的に許容される溶液に凍結乾燥製剤を溶解および／または懸濁させた液体製剤を意味する。
【００１６】
結合配列：「結合配列」なる用語は、本明細書において使用するとき、ニコチン分子をウイルス様粒子と共有結合させる分子構造を意味する。
【００１７】
室温：「室温」なる用語は、本明細書において使用するとき、１５から３０℃、好ましくは２０から２７℃、より好ましくは２５℃を意味する。
【００１８】
安定：「安定」なる用語は、本明細書において使用するとき、ニコチン−ＶＬＰ結合体を含む、好ましくはＲＮＡバクテリオファージＱβ結合体のニコチン−ＶＬＰを含む、およびさらに好ましくはＮｉｃ−Ｑβを含む本発明の凍結乾燥製剤の状態が、１５週以下、好ましくは２０週以下、より好ましくは２５週以下の室温または加速温度（４０℃）での貯蔵において、（ｉ）遊離ニコチンおよびニコチン誘導体の総量が、製剤中のニコチンの総量の７％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは３％未満、より好ましくは２％未満である；および（ｉｉ）ニコチン−ＶＬＰオリゴマーおよび凝集体の合計量、好ましくはＲＮＡバクテリオファージＱβのニコチン−ＶＬＰオリゴマーおよび凝集体の合計、好ましくはＮｉｃ−Ｑβオリゴマーおよび凝集体の合計が、凍結乾燥前の製剤におけるニコチン−ＶＬＰオリゴマーおよび凝集体の合計量、好ましくはＲＮＡバクテリオファージＱβのニコチン−ＶＬＰオリゴマーおよび凝集体の合計、好ましくはＮｉｃ−Ｑβオリゴマーおよび凝集体の合計と比較して、１０％以上、好ましくは７％以上、より好ましくは４％以上増加していないことを意味する。貯蔵後のニコチン−ＶＬＰオリゴマーおよび凝集体の合計量を凍結乾燥前の製剤中のニコチン−ＶＬＰオリゴマーおよび凝集体の合計量から引いて、本発明において使用するとき、増加率を得る。例えば、凍結乾燥前の製剤において１％  Ｎｉｃ−Ｑβオリゴマーおよび凝集体が存在し、本発明の凍結乾燥および１５週間貯蔵後に再構成製剤において４％  Ｎｉｃ−Ｑβオリゴマーおよび凝集体が存在するとき、増加率は３％である。「遊離ニコチンおよびニコチン誘導体」なる用語は、本明細書において使用するとき、本発明のウイルス様粒子に共有結合していないニコチンおよびニコチン誘導体を意味する。ニコチンならびに遊離ニコチンまたはニコチン誘導体の総量を測定する方法は、好ましくは本明細書の実施例１に記載のＲＰ−ＨＰＬＣアッセイである。ニコチン−ＶＬＰオリゴマーおよび凝集体の合計量、好ましくはＲＮＡバクテリオファージＱβのニコチン−ＶＬＰオリゴマーおよび凝集体の合計、好ましくはＮｉｃ−Ｑβオリゴマーおよび凝集体の合計を測定する方法は、好ましくは本明細書の実施例１に記載の非対称フロー場流動分画（asymmetrical flow field flow fractionation、ＡＦ４）であり、ニコチン−ＶＬＰオリゴマーおよびダイマーより、好ましくはＲＮＡバクテリオファージＱβのニコチン−ＶＬＰオリゴマーおよびダイマーより、好ましくはＮｉｃ−Ｑβオリゴマーおよびダイマーより大きな粒子を含む分画を計算において組み合わせる。
【００１９】
オリゴマー：「ニコチン−ＶＬＰオリゴマー」、「ＲＮＡバクテリオファージＱβのニコチン−ＶＬＰオリゴマー」および「Ｎｉｃ−Ｑβオリゴマー」なる用語に使用されるように、「オリゴマー」なる用語は、少なくとも３個、１０個までのＶＬＰまたはＱβのＶＬＰの凝集体をそれぞれ意味する。
【００２０】
凝集体：「ニコチン−ＶＬＰ凝集体」、「ＲＮＡバクテリオファージＱβのニコチン−ＶＬＰ凝集体」および「Ｎｉｃ−Ｑβ凝集体」なる用語に使用されるように、「凝集体」なる用語は、少なくとも１０個のＶＬＰまたはＱβのＶＬＰの凝集体をそれぞれ意味する。
【００２１】
ウイルス粒子：「ウイルス粒子」なる用語は、本明細書において使用するとき、ウイルスの形態学的形態を意味する。いくつかのウイルスタイプにおいて、これはタンパク質カプシドに囲まれたゲノムを含み；さらなる構造（例えばエンベロープ、テールなど）を有するものもある。
【００２２】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、本明細書において使用するとき、非複製性または非感染性、好ましくは非複製性かつ非感染性ウイルス粒子を意味するか、または非複製性または非感染性、好ましくは非複製性かつ非感染性のウイルス粒子類似構造、好ましくはウイルスのカプシドを意味する。「非複製性」なる用語は、本明細書において使用するとき、ＶＬＰに含まれるゲノムが複製不可能であることを意味する。「非感染性」なる用語は、本明細書において使用するとき、宿主細胞に侵入することができないことを意味する。好ましくは本発明のウイルス様粒子は、ウイルスゲノムまたはゲノム機能の全てまたは一部を欠くため、非複製性および／または非感染性である。１つの態様において、ウイルス様粒子はウイルスゲノムが物理的または化学的に不活性化されているウイルス粒子である。典型的かつより好ましくは、ウイルス様粒子はウイルスゲノムの複製および感染コンポーネントの全てまたは一部を欠く。本発明のウイルス様粒子は、それらのゲノムとは異なる核酸を含んでいてもよい。典型的かつ好ましい本発明のウイルス様粒子の態様は、対応するウイルス、バクテリオファージ、好ましくはＲＮＡファージのウイルス性カプシドのようなウイルス性カプシドである。「ウイルス性カプシド」または「カプシド」なる用語は、ウイルス性タンパク質サブユニットからなる巨大集合分子を意味する。典型的には、６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０および３６０以上のウイルス性タンパク質サブユニットが存在する。典型的かつ好ましくは、これらのサブユニットの相互作用は、固有の反復構造を有する、典型的には球形または管形であるウイルス性カプシドまたはウイルス性カプシド様構造の形成を導く。例えば、ＲＮＡファージまたはＨＢｃＡｇｓのカプシドは、正２０面体対称球形を有する。「カプシド様構造」なる用語は、本明細書において使用するとき、形態学的に上記定義の意味においてカプシドに類似するが、十分な整序および反復度を維持しながらも典型的な対称集合体とは異なる、ウイルス性タンパク質サブユニットからなる巨大集合分子を意味する。ウイルス粒子とウイルス様粒子の１つの共通する特徴は、そのサブユニットの高い整序および反復配列である。
【００２３】
ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子：本明細書において使用するとき、「ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子」なる用語は、ＲＮＡバクテリオファージの被覆タンパク質、その変異体またはフラグメントを含む、またはこのましくは本質的にそれから成る、またはそれから成るウイルス様粒子を意味する。さらに、ＲＮＡバクテリオファージの構造に類似しており、非複製性および／または非感染性であり、そして少なくともＲＮＡバクテリオファージの複製機構をコードする遺伝子を欠き、そして典型的には宿主へのウイルス接着または侵入に関与するタンパク質をコードする遺伝子も欠く、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である。しかし、この定義は、上記遺伝子がなお存在するが、不活性であり、ＲＮＡファージの非複製性および／または非感染性ウイルス様粒子を導くＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子を含むべきである。好ましいＲＮＡバクテリオファージ由来ＶＬＰは、正２０面体対称を示し、１８０個のサブユニットから成る。本発明の開示において、「サブユニット」または「モノマー」なる用語は、相互交換可能なように、そして同等に使用される。ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子を非複製性および／または非感染性とするのに好ましい方法は、物理的、化学的不活性化、例えばＵＶ照射、ホルムアルデヒド処理により、典型的かつ好ましくは遺伝子操作による。
【００２４】
１、ａ、またはａｎ：「１」、「ａ」、または「ａｎ」なる用語は、本明細書で使用されるとき、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を、特に記載がない限り意味する。
【００２５】
１つの局面において本発明は、（ｉ）：（ａ）ウイルス様粒子；および（ｂ）少なくとも１個のニコチン分子、ここで少なくとも１個のニコチン分子は前記ウイルス様粒子と結合配列によって共有結合しており、当該結合配列はエステル官能基を含む；を含む少なくとも１個のニコチン−ウイルス様粒子結合体と、（ｉｉ）：（ｃ）少なくとも１種、好ましくは１種の非還元二糖類、ここで、当該非還元二糖類の濃度は凍結乾燥前の製剤中濃度において０．５％から１５％（ｗ／ｖ）である；（ｄ）少なくとも１種、好ましくは１種の非イオン性界面活性剤、ここで、当該非イオン性界面活性剤の濃度は凍結乾燥前の製剤中濃度において０．０００５％から０．１％（ｗ／ｖ）である；を含む安定化剤組成物を含んで成る凍結乾燥製剤であって、前記安定化剤組成物は凍結乾燥前に５．４から６．６のｐＨ値を有する、製剤を提供する。当業者に理解されるように、タンパク質組成物の凍結乾燥は通常、より安定な生成物をもたらし、したがってより長い保存寿命を有する。さらにまた、凍結乾燥製剤はニコチン−ＶＬＰ結合体に存在するエステル官能基の上昇した安定性およびＲＮＡ成分の上昇した安定性を有する。
【００２６】
あるいは他の局面において、本発明は（ｉ）：（ａ）ウイルス様粒子；および（ｂ）少なくとも１個のニコチン分子、ここで少なくとも１個のニコチン分子は前記ウイルス様粒子と結合配列によって共有結合しており、当該結合配列はエステル官能基を含む；を含む少なくとも１個のニコチン−ウイルス様粒子結合体と、（ｉｉ）：（ｃ）少なくとも１種、好ましくは１種の非還元二糖類、ここで、当該非還元二糖類の濃度は当該製剤中濃度において０．５％から１５％（ｗ／ｖ）である；（ｄ）少なくとも１種、好ましくは１種の非イオン性界面活性剤、ここで、当該非イオン性界面活性剤の濃度は当該製剤中濃度において０．０００５％から０．１％（ｗ／ｖ）である；を含む安定化剤組成物を含んで成る液体製剤であって、前記安定化剤組成物は５．４から６．６のｐＨ値を有する、製剤を提供する。さらにまた、本発明は、前記液体製剤を凍結させる工程および前記液体製剤を乾燥させる工程を含む凍結乾燥方法によって入手可能な製剤を提供する。
【００２７】
他の局面において、本発明は、（ｉ）：（ａ）ウイルス様粒子；および（ｂ）少なくとも１個のニコチン分子、ここで少なくとも１個のニコチン分子はＶＬＰと結合配列によって共有結合しており、当該結合配列はエステル官能基を含む；を含む少なくとも１個のニコチン−ウイルス様粒子結合体と、（ｉｉ）：（ｃ）少なくとも１種、好ましくは１種の非イオン性界面活性剤、ここで、当該非イオン性界面活性剤の濃度は当該製剤中濃度において０．０００５％から０．１％（ｗ／ｖ）である；を含むまたはそれから成る安定化剤組成物を含んで成る液体製剤であって、前記安定化剤組成物は５．４から６．６のｐＨ値を有する、製剤を提供する。
【００２８】
１つの好ましい態様において、本発明の液体または凍結乾燥製剤は、１種のみの炭水化物、好ましくは１種のみの糖を含み、当該糖は好ましくは非還元二糖類である。１つの好ましい態様において、本発明の液体または凍結乾燥製剤は、さらなるアミノ酸を含まない。これは、さらなるアミノ酸を製剤に加えないことを意味する。しかし、当該製剤は、ウイルス様粒子の崩壊のために微量のアミノ酸を含み得る。
【００２９】
１つの好ましい態様において、本発明の液体または凍結乾燥製剤はウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンを含まない。さらなる好ましい態様において、本発明の製剤はあらゆる種類の血清タンパク質を含まない。血清を除外することによって、タンパク質血清汚染を有利に回避する。
【００３０】
１つの好ましい態様において、本発明の液体または凍結乾燥製剤、とりわけ本発明の凍結乾燥製剤は、塩化ナトリウムを含まない。ＮａＣｌを除外することによって、製剤の不必要に高い浸透圧を回避することができる。さらにまた、塩の除外によってさらに、凍結乾燥中のタンパク質安定性に対する有害作用の可能性を排除する。
【００３１】
１つの好ましい態様において、少なくとも１種、好ましくは１種の非還元二糖類は、ショ糖またはトレハロースである。１つのさらに好ましい態様において、非還元二糖類はトレハロースである。
【００３２】
１つの好ましい態様において、少なくとも１種、好ましくは１種の非還元二糖類の濃度は、液体製剤中の濃度において、または凍結乾燥製剤においては凍結乾燥前の製剤中濃度において、３％から１５％（ｗ／ｖ）、好ましくは５％から１２％（ｗ／ｖ）、好ましくは５％から１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは７．５％から１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１０％（ｗ／ｖ）である。特に明示的な記載がない限り、本明細書に記載のトレハロースの濃度は、トレハロース２水和物（２Ｈ２Ｏ）の濃度を意味する。トレハロース２水和物の濃度と無水トレハロースの濃度の変換は当業者に一般に知られている。例えば、１０％  トレハロース２水和物は９％  無水トレハロースに等しい。
【００３３】
１つの好ましい態様において、本発明の液体または凍結乾燥製剤の安定化剤組成物は、さらに少なくとも１種、好ましくは１種の充填剤を含む。１つのさらに好ましい態様において、非還元二糖類および充填剤の総濃度は、液体製剤中の濃度において、または凍結乾燥製剤においては凍結乾燥前の製剤中濃度において、０．５％から１５％（ｗ／ｖ）であるが、ただし非還元二糖類の濃度は少なくとも０．５％（ｗ／ｖ）、好ましくは少なくとも１％（ｗ／ｖ）である。１つのさらに好ましい態様において、前記少なくとも１種、好ましくは１種の非還元二糖類および前記少なくとも１種、好ましくは１種の充填剤の総濃度は、液体製剤中の濃度において、または凍結乾燥製剤においては凍結乾燥前の製剤中濃度において、３％から１０％、好ましくは３％から８％（ｗ／ｖ）、好ましくは３％から７％、好ましくは４．５％から７％、より好ましくは４．５％から６％（ｗ／ｖ）である。
【００３４】
１つの好ましい態様において、前記少なくとも１種、好ましくは１種の非還元二糖類および少なくとも１種、好ましくは１種の充填剤は、凍結乾燥前の製剤において、３％から１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは４．５％から７％（ｗ／ｖ）であり、非還元二糖類の濃度は少なくとも１％（ｗ／ｖ）である。好ましくは、製剤の浸透圧は２５０から３５０ｍｏｓｍ／Ｋｇ、より好ましくは約３００ｍｏｓｍ／Ｋｇである。
【００３５】
１つの好ましい態様において、少なくとも１種、好ましくは１種の非還元二糖類および少なくとも１種、好ましくは１種の充填剤の総濃度は、凍結乾燥前の製剤において、３％から１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは４．５％から７％（ｗ／ｖ）であり、充填剤の濃度は少なくとも１％（ｗ／ｖ）である。好ましくは製剤の浸透圧は２５０から３５０ｍｏｓｍ／Ｋｇ、より好ましくは約３００ｍｏｓｍ／Ｋｇである。
【００３６】
１つの好ましい態様において、少なくとも１種、好ましくは１種の非還元二糖類および少なくとも１種、好ましくは１種の充填剤の総濃度は、凍結乾燥前の製剤において、３％から１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは４．５％から７％（ｗ／ｖ）であり、充填剤の濃度は少なくとも１％（ｗ／ｖ）であり、非還元二糖類の濃度は少なくとも１％（ｗ／ｖ）である。好ましくは製剤の浸透圧は２５０から３５０ｍｏｓｍ／Ｋｇ、より好ましくは約３００ｍｏｓｍ／Ｋｇである。
【００３７】
１つの好ましい態様において、非還元二糖類はトレハロースであり、充填剤はマンニトールである。
【００３８】
極めて好ましい態様において、少なくとも１種、好ましくは１種の非還元二糖類および少なくとも１種、好ましくは１種の充填剤の総濃度は凍結乾燥前の製剤において５．０から６．５％（ｗ／ｖ）である。さらに好ましい態様において、充填剤と非還元二糖類の比は３．５：１から４：５：１、好ましくは４：１である。さらに好ましい態様において、非還元二糖類はトレハロースであり、充填剤はマンニトールである。極めて好ましい態様において、凍結乾燥前の製剤において、トレハロースの濃度は１．１％（ｗ／ｖ）であり、マンニトールの濃度は４．４％（ｗ／ｖ）である。
【００３９】
１つの好ましい態様において、充填剤はマンニトールまたはグリシンである。さらに好ましい態様において、充填剤はマンニトールである。充填剤、好ましくはマンニトールを含めることによって、安定なケーキ構造を得て、凍結乾燥プロセスにおける１次乾燥温度をより高くすることができ、これは製造コストの減少に有利である。
【００４０】
１つの好ましい態様において、安定化剤組成物のｐＨは５．４から６．６、好ましくは５．６から６．４、好ましくは５．８から６．４、好ましくは６．０から６．４、好ましくは６．２である。さらに好ましい態様において、ｐＨは５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５および６．６である。
【００４１】
１つの好ましい態様において、非イオン性界面活性剤は液体製剤中、または凍結乾燥製剤においては凍結乾燥前の製剤中濃度において、０．００２５％から０．０２％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００２５％−０．０１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）である。
【００４２】
１つの好ましい態様において、非イオン性界面活性剤はポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。１つの好ましい態様において、非イオン性界面活性剤はポリソルベート２０である。
【００４３】
ウイルス様粒子は、整序および反復構造を有する既知のあらゆるウイルスであり得る。例示的ＤＮＡまたはＲＮＡウイルス、ＶＬＰの製造に使用することができる被覆タンパク質またはカプシドタンパク質は、ＷＯ２００４／００９１２４の２５頁１０−２１行、２６頁１１−２８行および２８頁４行から３１頁４行に記載されている。これらの開示を出典明示により本明細書の一部とする。
【００４４】
さらに好ましい態様において、ウイルス様粒子は下記群から選択されるウイルスのものである：ａ）ＲＮＡバクテリオファージ；ｂ）バクテリオファージ；ｃ）Ｂ型肝炎ウイルス、好ましくはそのカプシドタンパク質（Ulrich, et al., Virus Res. 50:141-182 (1998)）またはその表面タンパク質（ＷＯ９２／１１２９１）；ｄ）はしかウイルス（Warnes, et al., Gene 160:173-178 (1995)）；ｅ）シンドビウイルス；ｆ）ロタウイルス（ＵＳ５，０７１，６５１およびＵＳ５，３７４，４２６）；ｇ）口蹄疫（Twomey, et al., Vaccine 13:1603 1610, (1995)）；ｈ）ノーウォークウイルス（Jiang, X., et al., Science 250:1580 1583 (1990)；Matsui, S.M., et al., J. Clin. Invest. 87:1456 1461 (1991)）；ｉ）アルファウイルス；ｊ）レトロウイルス、好ましくはそのＧＡＧタンパク質（ＷＯ９６／３０５２３）；ｋ）レトロトランスポゾンＴｙ、好ましくはタンパク質ｐ１；ｌ）ヒトパピローマウイルス（ＷＯ９８／１５６３１）；ｍ）ポリオーマウイルス；ｎ）タバコモザイクウイルス；ｏ）ササゲモザイクウイルス；およびｐ）Flock House ウイルス；ｑ）ササゲクロロティックモトル（cowpea chlorotic mottle）ウイルス；およびｒ）アルファルファモザイクウイルス。ササゲクロロティックモトルウイルス、アルファルファモザイクウイルスおよびササゲモザイクウイルスのＶＬＰの製造方法は、ＵＳ２００５／０２６０７５８およびＷＯ０５０６７４７８に記載されている。
【００４５】
１つの好ましい態様において、ウイルス様粒子はＲＮＡバクテリオファージのものである。好ましい態様において、ＲＮＡ−バクテリオファージは下記群から選択される：ａ）バクテリオファージＱβ；ｂ）バクテリオファージＲ１７；ｃ）バクテリオファージｆｒ；ｄ）バクテリオファージＧＡ；ｅ）バクテリオファージＳＰ；ｆ）バクテリオファージＭＳ２；ｇ）バクテリオファージＭ１１；ｈ）バクテリオファージＭＸ１；ｉ）バクテリオファージＮＬ９５；ｋ）バクテリオファージｆ２；ｌ）バクテリオファージＰＰ７およびｍ）バクテリオファージＡＰ２０５。１つの好ましい態様において、ウイルス様粒子はＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス様粒子である。ＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰ、とりわけバクテリオファージＱβのＶＬＰおよびＶＬＰバクテリオファージＡＰ２０５の製造方法は、ＷＯ０４００９１２４の３７−４７頁および実施例１および２１に記載されている。
【００４６】
１つの好ましい態様において、ウイルス様粒子はＲＮＡバクテリオファージＱβのものである。さらに好ましい態様において、ウイルス様粒子はＥ．  ｃｏｌｉ．で組換え的に発現しているＲＮＡバクテリオファージＱβのものである。
【００４７】
１つの好ましい態様において、ニコチン−ＶＬＰ結合体は、液体製剤中、または凍結乾燥製剤においては凍結乾燥前の製剤中濃度において、０．１ｍｇ／ｍｌから２．５ｍｇ／ｍｌである。１つの好ましい態様において、ニコチン−ＶＬＰ結合体は、液体製剤中、または凍結乾燥製剤においては凍結乾燥前の製剤中濃度において、０．２ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌである。他の好ましい本発明の態様において、ニコチン−ＶＬＰ結合体の液体製剤中濃度は、典型的かつ好ましくは凍結乾燥前の製剤の濃度において、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌまたは２ｍｇ／ｍｌである。さらに他の好ましい本発明の態様において、ニコチン−ＶＬＰ結合体の液体製剤中濃度は、典型的かつ好ましくは凍結乾燥前の製剤の濃度において、０．２ｍｇ／ｍｌまたは０．６ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２ｍｇ／ｍｌである。
【００４８】
ニコチン分子が担体と共有結合するカルボン酸エステル官能基を含む様々な結合配列がＵＳ５８７６７２７、ＵＳ６６５６４６９およびＵＳ６９３２９７１に記載されている。これらの具体的な教示を、出典明示により本明細書の一部とする。本発明に有用でありエステル官能基を含む結合配列は、例えばＵＳ５８７６７２７の１７欄に記載のＣＪ２、ＣＪ２．１、ＣＪ２．２、ＣＪ２．３、ＣＪ４、ＣＪ４．１、ＣＪ５、ＣＪ５．１、ＣＪ８、ＣＪ８．１、ＣＪ９およびＣＪ１１である。
【００４９】
本発明の１つの好ましい態様において結合配列はＡ−Ｘ−ＣＯ（Ｏ）−Ｙ−Ｚ−Ｂ（ここで、Ａはニコチン分子を意味し、そしてＢはウイルス様粒子を意味し、Ｘ＝（ＣＨ２）ｍ（ｍ＝１−４）を意味し、Ｙ＝（ＣＨ２）ｎ（ｍ＝１−８）を意味し、Ｚ＝Ｃ（Ｏ）を意味する）を含む。
【００５０】
極めて好ましい態様において、結合配列はＣＨ２ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯ（ここで、ｎ＝１−８、好ましくはｎ＝１−４、好ましくはｎ＝１または２、より好ましくはｎ＝２）を含む、本質的にそれから成る、またはそれから成る。極めて好ましい態様において、結合配列はＡ−ＣＨ２ＯＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯ−Ｂ（ここで、Ａはニコチン分子を意味し、Ｂはウイルス様粒子を意味する）から成る。
【００５１】
結合配列はニコチン分子のピリジンまたはピロリジン環のいずれかと共有結合し得る。その例は、とりわけＵＳ  ５８７６７２７、ＵＳ６６５６４６９およびＵＳ６９３２９７１に記載されている。極めて好ましい態様において、結合配列はニコチン分子の３’位置と共有結合している。
【００５２】
共有結合で結合したニコチン分子の全体は、すなわち全てのニコチン分子が（Ｒ）−立体配置を有し、または全てのニコチン分子が天然に生じる（Ｓ）−立体配置を有して、同じ絶対立体配置で存在するか、またはそれらは任意の混合物で存在するかの何れかである。好ましくは、ニコチン分子は（Ｒ）−立体配置と天然に生じる（Ｓ）−立体配置の両方の、およそ等しいまたは等しい混合物が存在するように共有結合する。極めて好ましい態様において、本発明の製剤含まれるニコチン−ＶＬＰ結合体は、ニコチン分子またはニコチン誘導体のラセミ混合物を用いて、典型的かつ好ましくは、本発明のニコチン−ウイルス様粒子結合体を導くウイルス様粒子とカップリング反応のための、それと共有結合した結合配列を有するニコチン分子を含むニコチン分子またはニコチン誘導体のラセミ混合物を用いて、入手可能であるか、または得る。
【００５３】
１つの好ましい態様において、ニコチン−ＶＬＰ結合体、好ましくはＲＮＡバクテリオファージＱβのニコチン−ＶＬＰ、好ましくはＮｉｃＱβを、出発物質Ｏ−スクシニル−３’−ヒドロキシメチル−ニコチンおよび出発物質ＱβのＶＬＰから製造する。
【００５４】
１つの好ましい態様において、安定化剤組成物は、コハク酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ、トリエタノールアミン、トリシン、ビシン、ヒスチジン、アスパラギン酸塩、グリシン酸塩、グルタミン酸塩、リシン、フタル酸塩、ギ酸塩、アラニン、フェニルアラニン、アルギニンおよびプロリンのような緩衝化剤を含む。
【００５５】
１つの好ましい態様において、緩衝化剤は、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌ、酢酸ナトリウム、コハク酸ナトリウムから選択される。さらに好ましい態様において、緩衝化剤の濃度は液体製剤中濃度において、または凍結乾燥製剤においては凍結乾燥前の製剤中濃度において、１０−２０ｍＭである。さらに好ましい態様において、緩衝化剤はリン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム、好ましくはリン酸ナトリウムである。１つの好ましい態様において、緩衝化剤はヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌである。１つの好ましい態様において、緩衝化剤は酢酸ナトリウムである。１つの好ましい態様において、緩衝化剤はコハク酸ナトリウムである。
【００５６】
１つの好ましい態様において、本発明の液体または凍結乾燥製剤はさらに、０から９０ｍＭ、好ましくは０から６０ｍＭ、より好ましくは０から３０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。第１に、塩化ナトリウムを含有せしめることによって、液体製剤が安定化され、本発明の液体または凍結乾燥製剤の浸透圧を調節する。
【００５７】
さらに極めて好ましい態様において、本発明は、（ｉ）：（ａ）ウイルス様粒子；および（ｂ）少なくとも１個のニコチン分子、ここで少なくとも１個のニコチン分子は前記ウイルス様粒子と結合配列によって共有結合しており、当該結合配列はエステル官能基を含む；を含む少なくとも１個のニコチン−ウイルス様粒子結合体；および（ｉｉ）：（ｃ）少なくとも１種、好ましくは１種の非還元二糖類、ここで、当該非還元二糖類の濃度は凍結乾燥前の製剤中濃度において０．５％から１５％（ｗ／ｖ）、好ましくは３％から１２％（ｗ／ｖ）である；（ｄ）少なくとも１種、好ましくは１種の非イオン性界面活性剤、ここで、当該非イオン性界面活性剤の濃度は凍結乾燥前の製剤中濃度において０．０００５％から０．１％（ｗ／ｖ）である；（ｅ）１種の緩衝化剤、ここで当該緩衝化剤はリン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、コハク酸ナトリウムおよびヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌから選択される；（ｆ）所望により、凍結乾燥前の製剤中濃度において０−３０ｍＭのＮａＣｌを含む安定化剤組成物を含んで成る、本質的にそれらから成るまたはそれらから成る凍結乾燥製剤であって、前記安定化剤組成物は凍結乾燥前に５．４から６．６のｐＨ値を有する、製剤を提供する。
【００５８】
別の好ましい態様において、本発明は、（ｉ）：（ａ）ウイルス様粒子；および（ｂ）少なくとも１個のニコチン分子、ここで少なくとも１個のニコチン分子は前記ウイルス様粒子と結合配列によって共有結合しており、当該結合配列はエステル官能基を含む；を含む少なくとも１個のニコチン−ウイルス様粒子結合体；および（ｉｉ）：（ｃ）少なくとも１種、好ましくは１種の非還元二糖類、ここで、当該非還元二糖類の濃度は凍結乾燥前の製剤中濃度において０．５％から１５％（ｗ／ｖ）である；（ｄ）少なくとも１種、好ましくは１種の充填剤、ここで、前記非還元二糖類と当該充填剤の総濃度は凍結乾燥前の製剤中濃度において、０．５％から１５％（ｗ／ｖ）である；ただし、前記非還元二糖類の濃度は少なくとも０．５％（ｗ／ｖ）である；（ｅ）少なくとも１種、好ましくは１種の非イオン性界面活性剤、ここで、当該非イオン性界面活性剤の濃度は凍結乾燥前の製剤中濃度において０．０００５％から０．１％（ｗ／ｖ）である；（ｆ）１種の緩衝化剤、ここで当該緩衝化剤はリン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、コハク酸ナトリウムおよびヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌから選択される；（ｇ）所望により、凍結乾燥前の製剤中濃度において０−３０ｍＭのＮａＣｌを含む安定化剤組成物を含んで成る、本質的にそれらから成るまたはそれらから成る凍結乾燥製剤であって、前記安定化剤組成物は凍結乾燥前に５．４から６．６のｐＨ値を有する、製剤を提供する。
【００５９】
極めて好ましい態様において、本発明は、（ｉ）：（ａ）ウイルス様粒子、好ましくはＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス様粒子、ここで、当該結合体の濃度は、凍結乾燥前の製剤中濃度において好ましくは０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌである；および（ｂ）少なくとも１個のニコチン分子、ここで少なくとも１個のニコチン分子は前記ウイルス様粒子、好ましくはＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス様粒子と結合配列によって共有結合しており、当該結合配列はエステル官能基を含む；を含む少なくとも１個のニコチン−ウイルス様粒子結合体、好ましくは少なくとも１個のＲＮＡバクテリオファージのニコチン−ウイルス様粒子、好ましくは少なくとも１個のＲＮＡバクテリオファージＱβ結合体のニコチン−ウイルス様粒子、より好ましくはＮｉｃＱβ結合体；および（ｉｉ）：（ｃ）少なくとも１種、好ましくは１種の非還元二糖類、好ましくはトレハロース、ここで、当該非還元二糖類の濃度は凍結乾燥前の製剤中濃度において５％から１２％、好ましくは１０％（ｗ／ｖ）である；（ｄ）少なくとも１種、好ましくは１種の非イオン性界面活性剤、好ましくはポリソルベート２０、ここで、当該非イオン性界面活性剤の濃度は凍結乾燥前の製剤中濃度において０．０００５％から０．１％、好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）である；（ｅ）１種の緩衝化剤、ここで当該緩衝化剤はリン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、コハク酸ナトリウムおよびヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌから選択され、より好ましくはヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌである；を含む安定化剤組成物を含んで成る、本質的にそれらから成るまたはそれらから成る凍結乾燥製剤であって、前記安定化剤組成物は凍結乾燥前に５．６から６．２のｐＨ値を有する、製剤を提供する。
【００６０】
本発明は、（ｉ）：（ａ）ＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス様粒子；および（ｂ）少なくとも１個のニコチン分子、ここで少なくとも１個のニコチン分子は前記ウイルス様粒子と結合配列によって共有結合しており、当該結合配列はＡ−ＣＨ２ＯＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯ−Ｂ（ここで、Ａはニコチン分子を意味し、ＢはＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス様粒子を意味する）から成り、結合配列がニコチン分子の３’位置と共有結合している；を含む少なくとも１個のニコチン−ウイルス様粒子結合体；および（ｉｉ）：（ｃ）１種の非還元二糖類、ここで当該非還元二糖類はトレハロースであり、ここでトレハロースの濃度は凍結乾燥前の製剤中濃度において１０％（ｗ／ｖ）である；（ｄ）１種の非イオン性界面活性剤、ここで当該非イオン性界面活性剤はポリソルベート２０であり、ここで、ポリソルベート２０の濃度は凍結乾燥前の製剤中濃度において０．００５％（ｗ／ｖ）である；を含む安定化剤組成物を含んで成る、またはそれらから成る凍結乾燥製剤であって、前記安定化剤組成物は凍結乾燥前に６．２のｐＨ値を有する、製剤を提供する。
【００６１】
本発明は、（ｉ）：（ａ）ＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス様粒子；および（ｂ）少なくとも１個のニコチン分子、ここで少なくとも１個のニコチン分子は前記ウイルス様粒子と結合配列によって共有結合しており、当該結合配列はＡ−ＣＨ２ＯＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯ−Ｂ（ここで、Ａはニコチン分子を意味し、ＢはＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス様粒子を意味する）から成り、結合配列がニコチン分子の３’位置と共有結合している；を含む少なくとも１個のニコチン−ウイルス様粒子結合体；および（ｉｉ）：（ｃ）１種の非還元二糖類、ここで当該非還元二糖類はトレハロースであり、ここでトレハロースの濃度は凍結乾燥前の製剤中濃度において１０％（ｗ／ｖ）である；（ｄ）１種の非イオン性界面活性剤、ここで当該非イオン性界面活性剤はポリソルベート２０であり、ここで、ポリソルベート２０の濃度は凍結乾燥前の製剤中濃度において０．００５％（ｗ／ｖ）である；（ｅ）１種の緩衝化剤、ここで当該緩衝化剤はリン酸ナトリウムまたはヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌであり、当該リン酸ナトリウムまたはヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌの濃度は２０ｍＭである；から本質的に成るか、またはから成る安定化剤組成物を含んで成る、またはそれらから成る凍結乾燥製剤であって、前記安定化剤組成物は凍結乾燥前に６．２のｐＨ値を有する、製剤を提供する。
【００６２】
さらに極めて好ましい態様において、本発明は、（ｉ）：（ａ）ウイルス様粒子；および（ｂ）少なくとも１個のニコチン分子、ここで少なくとも１個のニコチン分子は前記ウイルス様粒子と結合配列によって共有結合しており、当該結合配列はエステル官能基を含む；を含む少なくとも１個のニコチン−ウイルス様粒子結合体；および（ｉｉ）：（ｃ）少なくとも１種、好ましくは１種の非還元二糖類、ここで、当該非還元二糖類の濃度は凍結乾燥前の製剤中濃度において５％から１５％（ｗ／ｖ）、好ましくは１０％（ｗ／ｖ）である；（ｄ）少なくとも１種、好ましくは１種の非イオン性界面活性剤、ここで、当該非イオン性界面活性剤の濃度は凍結乾燥前の製剤中濃度において０．０００５％から０．１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００５％である；（ｅ）１種の緩衝化剤、ここで当該緩衝化剤はリン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、コハク酸ナトリウムおよびヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌから選択される；（ｆ）所望により、凍結乾燥前の製剤中濃度において０−３０ｍＭのＮａＣｌを含む安定化剤組成物を含んで成る、本質的にそれらから成るまたはそれらから成る凍結乾燥製剤であって、前記安定化剤組成物は凍結乾燥前に６．０から６．４、好ましくは６．２のｐＨ値を有する、製剤を提供する。
【００６３】
１つの好ましい態様において、本発明の凍結乾燥製剤は、少なくとも１５週間、好ましくは少なくとも２５週間、室温で、または加速温度（４０℃）でさえも、安定である。
【００６４】
１つの局面において、本発明は、生理的に許容される溶液または滅菌水、好ましくは注射用水に溶解および／または懸濁させた本発明の凍結乾燥組成物を含む再構成製剤を提供する。他の好ましい態様において、溶液はＮａＣｌ溶液である。好ましくは、再構成製剤は生理的に許容される浸透圧値を有する。
【００６５】
１つの好ましい態様において、再構成製剤はさらにアジュバントを含む。さらに好ましい態様において、アジュバントは水酸化アルミニウム水和ゲルまたはリン酸アルミニウム水和ゲルである。
【００６６】
１つの局面において、本発明は、（ｉ）棚温度を−３５℃以下、好ましくは−３８℃以下、好ましくは−４０℃以下、好ましくは−４５℃以下、好ましくは−５０以下に低下させて凍結乾燥前の製剤を凍結させる工程；（ｉｉ）−４５℃から−１５℃、好ましくは−４０℃から−２０℃、好ましくは−３５℃から−２５℃の棚温度で、チャンバー圧０．２ｍｂａｒ以下で製剤を一次乾燥させる工程；（ｉｉｉ）１０℃から４０℃、好ましくは１０℃から３０℃の棚温度で、チャンバー圧０．２ｍｂａｒ以下で製剤を二次乾燥させる工程を含む、本発明の凍結乾燥前の製剤の製造方法を提供する。当該方法は所望により、−３０℃から−１５℃、好ましくは−２０℃の棚温度で、（ｉｉ）の後に、チャンバー圧０．２ｍｂａｒ以下で製剤を乾燥させる工程を含む。
【００６７】
１つの好ましい態様において、一次および二次乾燥中のチャンバー圧は、０．００５ｍｂａｒから０．２ｍｂａｒ、好ましくは０．０２０ｍｂａｒから０．２ｍｂａｒ、好ましくは０．０３から０．１ｍｂａｒ、好ましくは０．０４０から０．０５ｍｂａｒである。
【００６８】
他の好ましい態様において、棚温度の低下を、０．１℃から１．０℃／分、好ましくは０．５℃から１．０℃／分の速度で行う。
【００６９】
１つの好ましい態様において、本発明の方法は：（ｉ）棚温度を−４０℃以下、好ましくは−５０℃以下に低下させて凍結乾燥前の製剤を凍結させる工程；（ｉｉ）−３５℃の棚温度で、少なくとも１０時間、好ましくは２０時間、チャンバー圧０．２ｍｂａｒ以下で製剤を一次乾燥させる工程；（ｉｉｉ）１０℃から３０℃の棚温度で、チャンバー圧０．２ｍｂａｒ以下で製剤を二次乾燥させる工程を含む。当該方法は所望により、−２０℃の棚温度で、（ｉｉ）の後に、チャンバー圧０．２ｍｂａｒ以下で製剤を乾燥させる工程を含む。
【００７０】
１つの好ましい態様において、本発明は：（ｉ）棚温度を−４０℃以下、好ましくは−５０℃に低下させて凍結乾燥前の製剤を凍結させる工程；（ｉｉ）−３５℃の棚温度で、好ましくは２５時間、チャンバー圧０．２ｍｂａｒ以下で製剤を一次乾燥させる工程；棚温度を上昇させ、−２０℃の棚温度で、好ましくは１０時間、チャンバー圧０．２ｍｂａｒ以下；好ましくは０．０４５ｍｂａｒで製剤を乾燥させる工程；（ｉｉｉ）２０℃の棚温度で、チャンバー圧０．２ｍｂａｒ以下で製剤を二次乾燥させる工程を含んで成る本発明の凍結乾燥製剤の製造方法を提供する。当該方法は所望により、−２０℃の棚温度で、（ｉｉ）の後に、チャンバー圧０．２ｍｂａｒ以下、好ましくは０．０４５ｍｂａｒで製剤を乾燥させる工程を含む。
【００７１】
１つの好ましい態様において、本発明の方法は、好ましくは−１０から−２０℃で、典型的には２から５時間、本発明に記載の凍結方法の１つによって製剤を凍結させた後、さらなるアニーリング工程を含む。かかるアニーリング工程は、好ましくは本発明の安定化組成物が少なくとも１種の充填剤、例えばマンニトールまたはグリシンを含むときに用いる。
【００７２】
他の好ましい態様において、本発明は、（ｉ）棚温度を−４０℃以下、好ましくは−５０℃に低下させて凍結乾燥前の製剤を凍結させる工程；（ｉｉ）所望により−１５℃でアニーリングさせる工程；（ｉｉｉ）−１５℃の棚温度で、好ましくは２０時間製剤を一次乾燥させる工程；（ｉｖ）４０℃の棚温度で、チャンバー圧０．２ｍｂａｒ以下、好ましくは０．００７ｍｂａｒで製剤を二次乾燥させる工程を含んで成る本発明の凍結乾燥製剤の製造方法を提供する。
【実施例１】
【００７３】
実施例
実施例１
材料および方法
「ＮｉｃＱβ」  −  「ＮｉｃＱβ」なる用語は、本明細書において使用するとき、（ａ）ＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス様粒子；および（ｂ）少なくとも１個のニコチン分子、ここで、当該少なくとも１個のニコチン分子は前記ウイルス様粒子と結合配列によって共有結合しており、当該結合配列はＡ−ＣＨ２ＯＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯ−Ｂ（ここで、Ａはニコチン分子を意味し、ＢはＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス様粒子を意味する）から成り、結合配列がニコチン分子の３’位置と共有結合している；を含む少なくとも１個のニコチン−ウイルス様粒子結合体を意味するべきである。ＮｉｃＱβを、ＵＳ６’９３２’９７１の実施例１に記載通りに製造した。ＮｉｃＱβ薬剤物質を室温で解凍した。
凍結乾燥プロトコル
【表１】
2009536936.tif 000002
【表２】
2009536936.tif 000003
【００７４】
凍結乾燥物の再構成
当業者に知られているとおり、下記分析のいくつかは凍結乾燥物を水溶液にする必要がある。したがって、凍結乾燥物を滅菌濾過水、典型的かつ好ましくは、凍結乾燥前の製剤の総体積に調節する体積の滅菌濾過水で再構成した。実施例の方法によって、凍結乾燥プロセス前の製剤がバイアルあたり０．７ｍｌであるとき、凍結乾燥プロセスから得られる好ましく形成されるケーキを、かかる体積の滅菌水、例えば最終組成物が０．７ｍｌから成るように再構成する。
【００７５】
ＶＬＰ凝集体を測定するための非対称フロー場流動分画（ＡＦ４）測定
ＡＦ４測定を、３５０μｍスペーサー、Eclipse2分離システムを備えたWyatt分離チャンネル（Wyatt Technology Corporation）、Agilent 1100 G1310Aアイソクラティックポンプ、Agilent 1100 G1379A脱気機、Agilent 1100 G1329A オートサンプラー、Agilent 1100 G1330Bオートサンプラー用サーモスタット、Agilent 1100 G1365B MWD 検出器、Agilent 1100 G1362A RI検出器およびWyatt DAWN EOS MALS検出器を用いて行った。
【００７６】
チャンネル流速は１．５ｍｌ／分であった。クロス流速は１８分間２．０ｍｌ／分、続いて１５分間０．１５ｍｌ／に減少させ、５分間０．１５ｍｌ／分で行った。最終工程においてクロス流速は５分間０．０ｍｌ／分であった。
【００７７】
ＶＬＰの濃度を、２６０ｎｍでＭＷＤ検出器で測定した。Wyatt DAWN EOS MALS検出器を、ＶＬＰ種の流体力学径および分子量を測定するために用いた。液体製剤および再構成凍結乾燥物（上記の通り水で再構成した）由来のＶＬＰ  約２０μｇの量を、ＡＦ４にそれぞれ注入した。
【００７８】
ガラス転移温度を測定するための示差走査熱量計（ＤＳＣ）測定
ＤＳＣ測定を、Netzsch Differential Scanning Calorimeter 204 Phoenixで行った。典型的には、１から２５ｍｇのサンプルをアルミニウムパンに秤量した。パンをアルミニウムのフタで、汎用密封加圧器（closure press）を用いて固く封した。参照パンは空のままとし、同じ方法で調製した。パンを測定セルに置いた。セルを窒素でフラッシュした。サンプルを、１０℃／分の加熱速度で測定した。
【００７９】
凍結乾燥物のガラス転移温度（Ｔｇ）を、シングルＤＳＣスキャンによって測定した。
【００８０】
水含有分析
凍結乾燥物の水分含量測定を、電量分析Karl Fischer滴定装置で、ヘッドスペースオーブン（Analytic Jena AG）で行った。凍結乾燥物を２Ｒガラスバイアル中そのままで、ヘッドスペース温度８０℃で測定した。サンプルをオーブンチャンバー内で少なくとも５分間加熱した。
【００８１】
製剤の均質性を測定するための動的光散乱（ＤＬＳ）測定
動的光散乱測定を、Malvern Zetasizer Nano ZS 装置で行った。液体製剤または再構成凍結乾燥物（上記の通り再構成した）０．５から１．０ｍｌをＵＶマイクロキュベットプラスチブランド（Plastibrand）にピペットで入れ、バリデーションしたLMU Munich 標準プロトコル（SOPタンパク質＿ｍ＿９９％）を用いて測定した。多分散度指数（ＰＩ）、主ＮｉｃＱｂピークの割合、ならびに体積変換および強度モデルを適用した主たるピークサイズを計算した。
【００８２】
粒子汚染およびＶＬＰ凝集体を測定するための光遮断測定
光遮断測定を、PAMAS SVSS-C装置で行った。システムを製剤の一部、続いて０．１−０．３ｍｌの液体製剤または再構成凍結乾燥物でフラッシュし、粒子汚染について評価した。溶液を測定セルに吸引し、１ｍｌあたりで計算した１、１０および２５μｍより大きな粒子の量を測定した。
【００８３】
ＳＥ−ＨＰＬＣ−ＲＮＡインテグリティー
粒子をＴＲＩ−Ｒｅａｇｅｎｔ（フェノールとグアニジンチオシアネートの一相溶液中混合物、ＲＮアーゼ活性を阻害する）中でホモジナイズし、ＲＮＡを１−ブロモ−３−クロロプロパン（ＢＣＰ）−Phase Separation Reagentで抽出した。抽出したＲＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、ペレットをエタノールで洗浄した。ＲＮＡをＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏに溶解させ、ＨＰＬＣで分析した（Ａ２６０ｎｍアイソクラティック溶出でモニタリング）。抽出したＲＮＡの保持時間を、同じシリーズのｔＲＮＡ標準分析と比較して測定した。
【００８４】
ＲＰ−ＨＰＬＣ−遊離ニコチン
溶解性ニコチン誘導体ヒドロキシメチル−ニコチン（エステル結合の加水分解による）およびスクシニル−ヒドロキシメチル−ニコチン（アミド結合の分解による）をＮｉｃＱβから、スピンフィルターで濾過して分離した。流水式をＲＰ−ＨＰＬＣ（ニコチンおよびニコチン誘導体のＡ２６０ｎｍ−吸収波長）によって分析した。ニコチン誘導体の濃度を、平衡して行ったニコチン標準曲線の回帰から計算した。遊離ニコチンの値を、全ニコチンの割合で得た。
【００８５】
ＲＰ−ＨＰＬＣ−総ニコチン
Ｑβタンパク質と共有結合しているニコチン部分を、４０℃、ｐＨ＞１１で３時間インキュベーションして定量的に切断し、その後タンパク質を沈殿させた。加水分解生成物であるヒドロキシメチル−ニコチンは上清に留まり、それをＲＰ−ＨＰＬＣ（Ａ２６０ｎｍ）によって、ニコチン標準曲線を用いて、同じクロモフォアの加水分解生成物およびニコチン割合として定量した。
【００８６】
ＳＥ−ＨＰＬＣ−ＶＬＰ完全性
ＳＥ−ＨＰＬＣは１つのサンプル中の異なる化合物をそれらのサイズに従って分離する分析方法である。したがって、大きなＱβ粒子をより小さい分子、例えばＱβ被覆タンパク質モノマーまたは核酸フラグメントから分離することができ、したがって、当該方法を用いてＶＬＰの完全性を確認した。かかる方法を用いて、薬剤物質の重度も確認した。対照としてＶＬＰ標準を、同じシリーズにおいて当該サンプルで分析した。検出を２６０ｎｍで行った。生成物の不純物は、タンパク質凝集体、小さな切断生成物および／または核酸である。全てのこれらの生成物の不純物をＳＥ−ＨＰＬＣによって検出したところ、これは生成物ピークからこれらの不純物を分離することができることが示された。検出のために、波長２６０ｎｍを用いた。
【００８７】
濁度測定
液体サンプル溶液の濁度を、実験室的濁度計（2100 AN, HACH company）を用いて測定した。濁度測定を、透過光とサンプル溶液中の粒子によって散乱される光の比率を測定する比濁度計によって行った。装置を、定義済みのサンプルセル中のフォルマジン（formazin）濁度標準懸濁液を用いてキャリブレーションした。小試験管内サンプル体積１−５ｍｌを測定するため、ユーザー定義のキャリブレーション曲線を、０−２００ＮＴＵの範囲で確立した。サンプル１ｍｌを、ガラスによって引き起こされる散乱作用を減少させるためにシリコンオイルを適用した使い捨てガラス試験管で測定した。
【００８８】
ＶＩＳ−透過率測定
透過率測定を、２本ビームＵＶ／Visible Spectrophotometer UV1（Thermo Spectronic）で行った。液体製剤０．５から１．０ｍｌをＵＶマイクロキュベットPlastibrandにピペットで入れた。６００ｎｍで透過率を測定した。
【実施例２】
【００８９】
実施例２
ＮｉｃＱβの安定性に対するｐＨの影響
ＮｉｃＱβの安定性を、４．６から８．２の範囲の１０種類の異なるｐＨで分析した。バルクウェア（bulkware）のｐＨを、０．１Ｎ  ＮａＯＨ溶液または０．１Ｎ  Ｈ３ＰＯ４溶液を用いて調節した。全サンプルを、水を用いて１ｍｇ／ｍｌ  ＮｉｃＱβの濃度に希釈した。サンプルを室温で１４日まで貯蔵した。結果を表３に示す。
【表３】
2009536936.tif 000004
【００９０】
ＮｉｃＱβの化学的安定性を、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥ−ＨＰＬＣ法を用いて調査した。ＮｉｃＱβの化学的不安定性によって、ＶＬＰがＱβタンパク質のモノマーもしくはマルチマーに崩壊し、および／またはニコチンとＱβのＶＬＰに分離する。
【００９１】
遊離ニコチン誘導体の含量が、ｐＨ値の増加と共に増加した。ｐＨ４．６から６．２では、わずかな遊離ニコチン誘導体の増加のみが検出された。ｐＨ６．２以上では、遊離ニコチン誘導体の量が貯蔵時間にわたって急速に増加した。さらに、ＶＬＰ完全性は、ｐＨ値の増加によって負に影響された。７．４に等しいかそれ以上のｐＨで、Ｑβカプシドの完全性は、ＳＥ−ＨＰＬＣで測定したとき、７日後に劇的に減少した。ｐＨ７．０で、室温で７日後のＮｉｃＱβの相対含量は約９６％であったが、ｐＨ７．４では約９１％であった。
【００９２】
ＮｉｃＱβの物理的安定性を、光遮断、ＤＬＳおよびＶＩＳ−透過率測定によって調査した。Ｎｉｃ−Ｑβの物理的安定性：「物理的安定性」なる用語は、本明細書において使用するとき、ＱβのＶＬＰの凝集を意味する。３つの分析法全てで、ＮｉｃＱβが５．８以下のｐＨ値で凝集する傾向があることが示された。ＤＬＳ測定では、ｐＨ５．８以下で、主たるピークの割合が減少したが、ＶＬＰおよびオリゴマーを含むピークの増加および多分散度（ＰＩ）が増加したことが示された。光遮断およびＶＩＳ−透過率測定によって得られた結果によって、ｐＨの減少によってＮｉｃＱβが凝集する傾向があることを確認された。
【実施例３】
【００９３】
実施例３
凍結解凍ストレス条件の、ＮｉｃＱβの安定性に対する影響
ＮｉｃＱβの総計３６個の異なる製剤を凍結／解凍サイクルに供した。サンプルを−８０℃で凍結させ、２０℃から２５℃で解凍した。この凍結／解凍サイクルを５回反復した。凍結／解凍サイクルの前および後に、製剤をＤＬＳ測定および光遮断測定によって測定した。
【００９４】
トレハロースおよびポリソルベート２０添加の影響  −  製剤に０．２ｍｇ／ｍｌ  ＮｉｃＱβ、０または１０％トレハロース、ｐＨ＝６．４、３０ｍＭ  ＮａＣｌを、０．００５％ポリソルベート２０有りまたは無しで含めた。トレハロース含有ポリソルベート無しの製剤で得られたＤＬＳ測定結果は、主たるピークのわずかな減少およびＰＩの増加を示した。したがって、トレハロースはＮｉｃＱβの凝集レベルのわずかな増加をもたらした。しかし、この効果はポリソルベート２０の添加によって予防された。光遮断結果はＤＬＳ測定を支持した。ポリソルベートを含まない製剤における＞１μｍ粒子の数と比較して、顕著に低い数の＞１μｍ粒子が凍結／解凍サイクル後のポリソルベート含有製剤において検出された。
【００９５】
異なるＮａＣｌ濃度およびポリソルベート２０添加の影響  −  製剤に０．２ｍｇ／ｍｌ  ＮｉｃＱβ、１０％  トレハロース、ｐＨ＝６．４、様々な濃度のＮａＣｌを、０．００５％  ポリソルベート２０有りまたは無しで含めた。ＤＬＳ測定結果は、凍結／解凍サイクル後のＮｉｃＱβの凝集レベルにＮａＣｌが影響を有していることが示された。溶液のＰＩは凍結／解凍サイクル後、ＮａＣｌ濃度の増加と共に増加した。したがって、ＮｉｃＱβの物理的安定性は、ＮａＣｌ濃度の増加によって顕著に減少された。しかし、ポリソルベート２０の添加によって、この物理的不安定性は９０ｍＭ以下のＮａＣｌ濃度について補償することができた。これらの結果は、光遮断測定によって支持された。凍結／解凍後、ポリソルベートを含まない製剤は、１μｍ以上の粒子の顕著な増加が示され、これは凝集体の量が多いことを示している。ポリソルベート２０の添加によって、ほぼ１μｍ以上の粒子が検出されないように、凝集が予防された。
【００９６】
異なるｐＨおよびポリソルベート２０添加の影響  −  ５．４から７．２の範囲のｐＨの、ポリソルベート２０を含むか含まない製剤の安定性に対する影響を調査した。製剤に０．２ｍｇ／ｍｌ  ＮｉｃＱβ、１０％  トレハロース、様々なｐＨ、ＮａＣｌ  ３０ｍＭ、０．００５％  ポリソルベート２０有りまたは無しで含めた。結果は、実施例２に記載のｐＨ安定性試験の知見を支持した。製剤溶液の製造中に既に、体積変換モデルを用いたＤＬＳ測定によって検出したとき、主たるＮｉｃＱβピークの割合がｐＨの減少と共に減少した。ポリソルベート２０の添加によって、試験したｐＨ値６．４および７．２でＮｉｃＱβの凝集が予防された。さらにまた、ポリソルベート２０の添加によって、ｐＨ５．４でのＮｉｃＱβの凝集が減少した。ＤＬＳ測定に加えて、光遮断測定によって得られた結果はこれらの知見を支持した。このｐＨ試験のコースにおいてＤＬＳ測定結果および光遮断測定によって得られた上記観察は、ＮａＣｌ濃度３０、６０、９０および１５０ｍＭで一致した。
【実施例４】
【００９７】
実施例４
凍結乾燥中のＮｉｃＱβの安定性に対する様々な組成物の影響
ＮｉｃＱβを室温で解凍した。様々なＮｉｃＱβ、トレハロース、ポリソルベート、ＮａＣｌ濃度および様々なバッファー系を含む様々な製剤（図１に示す）を、ＮｉｃＱβを賦形剤原液にピペッティングして製造した。溶液をＩＫＡ  マグネチックスターラーで５−１０分間攪拌した。最終薬剤溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍメンブランフィルター）、凍結乾燥した。
【００９８】
簡単に説明すると、薬剤溶液を滅菌２Ｒガラスバイアルに充填した。製剤Ｆ２９ＲＬ、Ｆ４８ＲＬおよびＦ４９ＲＬから、０．７ｍｌ／バイアルを充填した。他の製剤については、０．６ｍｌ／バイアルを充填した。ポリジメチルシロキサンおよびＥＴＦＥ（エチレンテトラフルオロエチレン）被覆凍結乾燥ストッパー（West Pharmaceutical Services）をバイアルに置いた。バイアルをChrist Epsilon 2-12 D凍結乾燥装置（Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH）の凍結乾燥チャンバーに移した。棚温度を０．５℃から１．０℃／分で−４０℃に低下させ、−４０℃未満に３時間保った。チャンバー圧を０．０４５ｍｂａｒに低下させ、棚を−３５℃に１℃／分で加温し、２０時間保った。その後、棚温度を−２０℃に、０．１℃／分で上昇させ、１０時間保った。その後、棚温度を２０℃に０．５℃／分で上昇させ、１０時間保った。凍結乾燥チャンバーを濾過乾燥窒素で８００ｍｂａｒに通気し、バイアルを凍結乾燥チャンバー内で封した。バイアルをチャンバーから取り出し、Flip-Off（登録商標）シールで密封した。凍結乾燥後、安定な凍結乾燥物が得られ、十分なケーキ構造が得られた。
【００９９】
結果を図２に示す。様々なＮｉｃ−Ｑｂ（０．２ｍｇ／ｍｌから２．０ｍｇ／ｍｌについて試験した）、トレハロース（５％から１０％について試験した）、ポリソルベート（０．００５から０．０１％について試験した）、ＮａＣｌ濃度（０から６０ｍＭ）を含む凍結乾燥前の製剤からの凍結乾燥物は、全て１％未満の水分含量であった。上記製剤のＮｉｃＱβ−オリゴマーおよびＮｉｃＱβ−凝集体の量は、ＡＦ４で分析したとき、凍結乾燥前製剤と比較して凍結乾燥後に１％以上増加しなかった。ＤＬＳ測定はこれらの製剤が典型的に、体積変換モデルを用いて測定したときそれぞれ０．２以下の多分散度（ＰＩ）を有し、主たるＮｉｃＱβピークの割合が９８．５％以上であることを示した。行った分析測定によって、これら上記の製剤は０．２０ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌの濃度においてＮｉｃＱｂを安定化することができるという結論が導かれた。
【０１００】
ポリソルベート２０を含まないＦ２２ＲＬは、多分散度（ＰＩ）値約０．３５を有した。さらにまた、ＮｉｃＱβ−オリゴマーおよびＮｉｃＱβ−凝集体の合計量が、凍結乾燥前と比較して約５．５％増加した。これらの結果は、非イオン性界面活性剤がＶＬＰ凝集の予防に必要であることを示した。
【０１０１】
Ｆ０８ＲＬ、Ｆ３９ＲＬ、Ｆ３７ＲＬ、Ｆ３８ＲＬは、３０ｍＭ、６０ｍＭ、９０ｍＭおよび１５０ｍＭの塩化ナトリウムをそれぞれ含む。ポリソルベート２０の存在によって、ＮｉｃＱβの物理的安定性に対するＮａＣｌ（６０ｍＭ以下の濃度）の影響を補償するが（Ｆ０８ＲＬおよびＦ３９ＲＬは凍結乾燥後、ＮｉｃＱβオリゴマーおよびＮｉｃＱβ凝集体の量の実質的な増加を有さなかった）、ＮｉｃＱβオリゴマーとＮｉｃＱβ凝集体の合計量が凍結乾燥後２．８および３．５％増加したように、ポリソルベート２０の存在によっては、９０ｍＭ以上のＮａＣｌ濃度のＮａＣｌ効果を一部のみ補償した。さらにまた、９０ｍＭ以上のＮａＣｌの存在によって、４００ｍｏｓｍ／ｋｇ以上の浸透圧値となった。
【実施例５】
【０１０２】
実施例５
凍結乾燥中のＮｉｃＱβ安定化剤としてのマンニトール／トレハロース組成物の試験
【表４】
2009536936.tif 000005
４種の製剤（図１のＦ３０ＲＬ、Ｆ３２ＲＬ、Ｆ４２ＲＬ、Ｆ５４ＲＬ）を、実質的に実施例４に記載の通りに製造した。バイアルの充填体積は０．６ｍｌであった。製剤Ｆ３０ＲＬ、Ｆ３２ＲＬおよびＦ４２ＲＬを簡単に、以下の条件で凍結乾燥した：棚温度を１．０℃／分で−５０℃に低下させ、−５０℃に３時間保った。チャンバー圧を０．０４５ｍｂａｒに低下させ、棚を−１５℃に、０．１５℃／分で加温し、２０時間保った。あるいは、製剤Ｆ４２ＲＬおよびＦ５４ＲＬを、−１５℃で２時間アニーリング工程を行う以外は同じ凍結乾燥プロセスを適用して、凍結乾燥した。続いて、チャンバー圧を０．００７ｍｂａｒに低下させ、棚を４０℃に、０．１５℃／分で加温して、さらに１０時間保った。凍結乾燥チャンバーを濾過乾燥窒素で８００ｍｂａｒに通気し、バイアルを凍結乾燥チャンバー内で封した。バイアルをチャンバーから取り出し、Flip-Off（登録商標）シールで密封した。
【０１０３】
結果を一部図２に示した。凍結乾燥後、安定な凍結乾燥物を得て、十分なケーキ構造が得られた。３種の凍結乾燥製剤の水分含量は典型的には０．３％未満であった。製剤の浸透圧は典型的には、２５０から３４０［ｍｏｓｍ／ｋｇ］の範囲であった。浸透圧はトレハロースおよびマンニトール濃度の上昇と共に上昇した。
【０１０４】
アニーリング工程を適用せずに製造した製剤Ｆ３０ＲＬ、Ｆ３２ＲＬおよびＦ４２ＲＬのマンニトール分画は、アモルファスまたは部分的にアモルファスであった。アニーリング工程を適用して製造した製剤Ｆ４２ＲＬおよびＦ５４ＲＬのマンニトール分画は、凍結乾燥後、結晶であった。
【０１０５】
製剤Ｆ３０ＲＬ、Ｆ３２ＲＬおよびＦ４２ＲＬは、ＡＦ４測定で分析したとき、凍結乾燥後、ＮｉｃＱβオリゴマーとＮｉｃＱβ凝集体の合計量の顕著な明白な増加は見られなかった。ＤＬＳ測定によって体積変換モデルを用いて測定したとき、３製剤が多分散度（ＰＩ）０．２未満を有し、主たるＮｉｃＱβピークの割合が典型的には９９％以上であることが示された。製剤Ｆ５４ＲＬについては、凍結乾燥後、ＮｉｃＱβオリゴマーとＮｉｃＱβ凝集体の合計量の増加がＡＦ４によって測定された。
【０１０６】
光遮断測定によって、再構成凍結乾燥物の粒子汚染が典型的には、１ｍｌあたり１００個以下の＞１０μｍ粒子であり、＞１μｍ粒子の数は典型的には１ｍｌあたり２０００粒子以下であることが示された。これらの結果によって、トレハロースとマンニトールのような充填剤の混合物が凍結乾燥中のＮｉｃＱβを安定化し得ることが示された。
【実施例６】
【０１０７】
実施例６
凍結乾燥ＮｉｃＱβ製剤の安定性試験
５種の製剤Ｆ４２ＲＬ、Ｆ３５ＲＬ、Ｆ１０ＲＬ、Ｆ１６ＲＬおよびＦ５４ＲＬを、実施例４および５と実質的に同様に製造した。バイアルの充填体積は０．６ｍｌであった。
【０１０８】
トレハロースのみを含む製剤（Ｆ３５ＲＬ、Ｆ１０ＲＬ、Ｆ１６ＲＬ）を下記条件で凍結乾燥した：棚温度を１．０℃／分で−５０℃に低下させ、−５０℃で３時間保った。チャンバー圧を０．０４５ｍｂａｒに減少させ、棚を−３５℃に１℃／分で加温し、２５時間保った。続いて、棚温度を−２０℃に０．１℃／分で上昇させ、１０時間保った。続いて、棚温度を２０℃に、０．５℃／分で上昇させ、１０時間保った。
【０１０９】
トレハロースとマンニトールのいずれもを含む製剤（Ｆ４２ＲＬ）を、下記条件で凍結乾燥した：棚温度を１．０℃／分で−５０℃に低下させ、−５０℃で３時間保った。チャンバー圧を０．０４５ｍｂａｒに減少させ、棚を−１５℃に０．１５℃／分で加温し、２５時間保った。続いて、チャンバー圧を０．００７ｍｂａｒに減少させ、棚温度を４０℃に、０．１５℃／分で上昇させ、１０時間保った。
【０１１０】
マンニトールのみを含む製剤（Ｆ５４ＲＬ）を、下記条件で凍結乾燥した：棚温度を１．０℃／分で−５０℃に低下させ、−５０℃で２時間保った。−１５℃でアニーリング工程を２時間適用した。棚温度を−５０℃に低下させ、−５０℃で２時間保った。チャンバー圧を０．０４５ｍｂａｒに減少させ、棚を−１５℃に０．１５℃／分で加温し、２０時間保った。続いて、チャンバー圧を０．００７ｍｂａｒに減少させ、棚温度を４０℃に、０．１５℃／分で上昇させ、１０時間保った。
【０１１１】
凍結乾燥後、安定な凍結乾燥物を全ての凍結乾燥製剤について得て、十分なケーキ構造が得られた。
【０１１２】
サンプルを２〜８℃、２５および４０℃で、２５週まで貯蔵した。分析結果を一部図３に示した。全てのトレハロースまたはトレハロース／マンニトール利用製剤の凍結乾燥物のケーキ構造は、貯蔵の間、加速温度でさえも安定であった。このことは、すべての保存条件および時点で観察された。マンニトールを含まない凍結乾燥物のガラス転移温度は典型的には、６０℃から１１０℃の範囲であり、貯蔵の間顕著に変化しなかった。製剤の浸透圧は、３００から３５０［ｍｏｓｍ／ｋｇ］の範囲であった。
【０１１３】
凍結乾燥製剤の初期水分含量は、１．０％以下であった。２−８℃および２５℃で貯蔵した凍結乾燥物の水分含量は、２５週間の貯蔵を通じて、０．５％未満の水分含量の増加と安定であった。４０℃で貯蔵した凍結乾燥物は、水分含量がわずかに増加した；貯蔵後の水分含量は典型的には、貯蔵前の約１％と比較して、１．７％以下であった。
【０１１４】
ＮｉｃＱβオリゴマーとＮｉｃＱβ凝集体の合計量は、ＡＦ４測定で分析したとき、凍結乾燥後、トレハロースまたはトレハロース／マンニトール利用製剤において増加しなかった。ＡＦ４で分析したとき、凍結乾燥前製剤と比較して、貯蔵後、３％未満のわずかな増加が観察された。マンニトール利用製剤は、ＮｉｃＱβオリゴマーとＮｉｃＱβ凝集体の合計量の明白な増加が示された。
【０１１５】
光遮断測定によって、貯蔵後の再構成凍結乾燥物の粒子汚染が典型的には、全製剤、貯蔵条件および時点を通じて１ｍｌあたり５００個以下の＞１０μｍ粒子であることが示された。
【０１１６】
ＤＬＳ測定は、４つのトレハロースまたはトレハロース／マンニトール利用製剤に由来する貯蔵後再構成凍結乾燥物が典型的に、体積変換モデルを用いて測定したときそれぞれ０．２以下の多分散度（ＰＩ）を有し、主たるＮｉｃＱβピークの割合が９８．５％以上であることを示した。このことは、全ての製剤、貯蔵条件および時点について観察された。製剤Ｆ５４ＲＬは４０℃６週間の貯蔵によって、多分散度が０．２４に上昇した。
【０１１７】
ＩＥＦ、ＳＥ−ＨＰＬＣ（ＲＮＡインテグリティー）、ＲＰ−ＨＰＬＣ（総ニコチン）、Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＲＮＡ含有量）、濁度およびＬＤＳ−Ｐａｇｅ測定は、全てのトレハロースおよびトレハロース／マンニトール利用製剤の顕著な変化を、全ての貯蔵条件および時点について示さなかった。組換え的に生産されたＱβのウイルス様粒子は典型的には、宿主ＲＮＡ分子を含み、これは通常ウイルス様粒子の内部空間（inner space）に存在する。
【０１１８】
遊離ニコチン誘導体の含有量は、全てのトレハロースまたはトレハロース／マンニトール利用製剤、全ての貯蔵条件および時点について、典型的に、ＲＰ−ＨＰＬＣ測定で測定したとき、総結合ニコチンの１．５％以下であった。遊離ニコチン誘導体の量は、製剤Ｆ５４ＲＬにおいて、４０℃で６週間貯蔵によって４．２％まで増加した。
【０１１９】
ＳＥ−ＨＰＬＣ（ＶＬＰ完全性）測定によって、ＮｉｃＱβの相対含量が全てのトレハロースまたはトレハロース／マンニトール利用製剤、時点および貯蔵条件を通じて９７％以上であることが示された。ＮｉｃＱβの相対含量は、製剤Ｆ５４ＲＬにおいて、４０℃で６週間貯蔵によって９３％に減少した。
【０１２０】
行った分析測定によって、全てのトレハロースまたはトレハロース／マンニトール利用製剤は凍結乾燥および続く貯蔵（４０℃の加速温度でさえ）中の、のＮｉｃＱβを安定化することができるという結論が導かれた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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