(57)【要約】  本発明は、宿主細胞中でＢＭＰ−７ポリペプチドを発現する組換えベクター及び上記組換えベクターを含む医薬組成物に関する。本発明はまた、哺乳動物での、有利にはイヌ及びネコでの、本発明の組換えベクター及び医薬組成物の投与による、急性腎不全及び慢性腎不全両方の予防及び／又は処置のための方法も包含する。
2009515529.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターに作動的に連結された、ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換えプラスミドベクターであって、前記ＢＭＰ−７ポリペプチドが、プレプロＢＭＰ−７ポリペプチド、プロＢＭＰ−７ポリペプチド、及び成熟ＢＭＰ−７ポリペプチドからなる群から選択されるか、又は
前記ＢＭＰ−７ポリペプチドが、配列番号３並びにＢＭＰ−７活性を有するその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する組換えプラスミドベクター。
【請求項２】
ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号１、配列番号２、並びにＢＭＰ−７活性を有するポリペプチドをコードするその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択される請求項１に記載の組換えプラスミドベクター。
【請求項３】
ＢＭＰ−７ポリペプチドが、ＢＭＰ−７シグナル配列、ＩＧＦ−１シグナル配列、及びｔＰＡシグナル配列からなる群から選択されるシグナルペプチドを含むか、又は
前記シグナルペプチドが、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、並びにシグナルペプチド活性を有するペプチドをコードするその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるか、又は
前記シグナルペプチドが、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１２、並びにシグナルペプチド活性を有するその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組換えプラスミドベクター。
【請求項４】
プラスミドがpNB292であり、配列番号１０のヌクレオチド配列を有する、又は
プラスミドがVR1012プラスミドに挿入された、ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードする核酸配列を含む請求項１に記載の組換えプラスミドベクター。
【請求項５】
請求項１に記載の組換えプラスミドベクター及び、任意で少なくとも１つの薬学的に又は獣医学的に許容される担体、賦形剤、又は媒体を含む医薬組成物。
【請求項６】
腎不全に罹患している又はそれを発症する危険性がある哺乳動物被検体を処置する方法であって、プロモーターに作動的に連結された、ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードする核酸配列を含有する、治療上有効な量のプラスミドを前記哺乳動物被検体に投与することを含む方法。
【請求項７】
ＢＭＰ−７ポリペプチドが、プレプロＢＭＰ−７ポリペプチド、プロＢＭＰ−７ポリペプチド、及び成熟ＢＭＰ−７ポリペプチドからなる群から選択されるか、又は
ＢＭＰ−７ポリペプチドが、配列番号３並びにＢＭＰ−７活性を有するその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号１、配列番号２、並びにＢＭＰ−７活性を有するポリペプチドをコードするその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＢＭＰ−７ポリペプチドが、シグナルペプチドを含み、前記シグナルペプチドが、ＢＭＰ−７シグナル配列、ＩＧＦ−１シグナル配列、及びｔＰＡシグナル配列からなる群から選択されるか、又は
前記シグナルペプチドが、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１２、並びにシグナルペプチド活性を有するその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するか、又は
シグナルペプチドが、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、並びにシグナルペプチド活性を有するペプチドをコードするその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
プラスミドが、pNB292であり、配列番号１０のヌクレオチド配列を有するか、又は
プラスミドが、VR1012プラスミドに挿入された、ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
ＢＭＰ−７ポリペプチドが、哺乳動物被検体中でインビボで発現する請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物被検体が、ネコ科の動物及びイヌ科の動物からなる群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物被検体が、イヌ科の動物である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
腎不全を発症する危険性がある哺乳動物被検体において、腎不全の発症を予防する方法であって、プロモーターに作動的に連結された、ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードする核酸配列を含有する、予防的に有効な量のプラスミドベクターを前記哺乳動物被検体に投与することを含む方法。
【請求項１５】
ＢＭＰ−７ポリペプチドが、プレプロＢＭＰ−７ポリペプチド、プロＢＭＰ−７ポリペプチド、及び成熟ＢＭＰ−７ポリペプチドからなる群から選択されるか、又は
ＢＭＰ−７ポリペプチドが、配列番号３並びにＢＭＰ−７活性を有するその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号１、配列番号２、並びにＢＭＰ−７活性を有するポリペプチドをコードするその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ＢＭＰ−７ポリペプチドが、シグナルペプチドを含み、前記シグナルペプチドが、ＢＭＰ−７シグナル配列、ＩＧＦ−１シグナル配列、及びｔＰＡシグナル配列からなる群から選択されるか、又は
前記シグナルペプチドが、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、並びにシグナルペプチド活性を有するペプチドをコードするその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるか、又は
前記シグナルペプチドが、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１２、並びにシグナルペプチド活性を有するその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
プラスミドが、pNB292であり、配列番号１０のヌクレオチド配列を有するか、又は
プラスミドが、VR1012プラスミドに挿入された、ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードする核酸配列を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物被検体が、ネコ科の動物及びイヌ科の動物からなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物被検体が、イヌ科の動物である請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、本明細書に参照により組み込まれる、２００５年１１月１４日に提出された米国仮出願第６０／７３６，４５２号の優先権を主張する。
【０００２】
参照による組み込み
本明細書で引用される又は参照されるすべての文献（「本明細書で引用される文献」）及び本明細書で引用される文献で引用される又は参照されるすべての文献は、本明細書で又は参照により本明細書に組み込まれるあらゆる文献で言及されるあらゆる製品のためのあらゆるメーカーの使用説明書、説明書、製品仕様書、及び製品シートと共に、これによって本明細書に参照により組み込まれ、本発明の実施において利用されてもよい。
【０００３】
本発明は、組換えベクター、かかる組換えベクターを含む医薬組成物、及び哺乳動物における急性腎不全及び／又は慢性腎不全の予防及び／又は処置方法に関する。本発明はまた、宿主中で、タンパク質の骨形成タンパク質−１／骨形態形成タンパク質−７（ＯＰ−１／ＢＭＰ−７，Osteogenic Protein-1/Bone Morphogenetic Protein-7）ファミリーに属する生物活性ポリペプチドを発現することができるベクターにも関する。
【背景技術】
【０００４】
哺乳動物腎系は、血流からの異化老廃物の除去、並びに体内の体液と電解質とのバランスの維持両方で主たる役割を果たす。したがって、腎不全は、異化代謝産物及び他の毒素の蓄積並びに／又は電解質若しくは体液の著しいアンバランスの発生により、他の主要な器官系の不全並びに死につながる可能性がある、生命を脅かす状態である。一般的な事項として、腎不全は、「急性」又は「慢性」として分類される。以下に詳述されるように、急性腎不全及び慢性腎不全は、疾患と関連する腎臓の構造的な変性を遅延させる及び／又は逆戻りさせる適当な処置が存在しない、消耗性の生命を脅かす疾患である。
【０００５】
急性腎不全（ＡＲＦ，acute renal failure）は、腎機能の突然の衰退をもたらす、虚血性傷害又は毒性傷害により普通引き起こされる。腎臓は、それらの特有の解剖学的特色及び生理学的特色のために、虚血及び毒物に対して感受性が強い。他の器官と比較して、多量の腎血流（心拍出量の約２５％）が、血液由来の毒物の腎臓への送達の増加をもたらす。腎皮質は、腎皮質が、腎血流の９０％を受け取り、且つ多数の糸球体毛細血管による広大な内皮表面面積を有するので、毒物暴露に対してとりわけ感受性である。腎皮質内で、近位尿細管（Ｓ３セグメント又は「直部」）及びヘンレ係蹄の厚い上行腕の上皮細胞は、それらの溶質輸送機能及び高度な代謝率のために、虚血性で毒物誘発性の外傷により最も頻繁に影響を及ぼされる。水及び電解質が糸球体濾液から再吸収されるので、尿細管上皮細胞は、高濃度の毒物にますます暴露され得る。類似して、髄質では、対向流増幅系が毒物を濃縮し得る。尿細管上皮細胞により分泌された又は再吸収された毒物（ゲンタミシン等）は、これらの細胞内に高濃度で蓄積する可能性がある。最終的に、腎臓はまた、多くの薬剤及び毒物の生体内変化にも役割を演ずる。生体内変化は、普通、親化合物ほど毒性ではない代謝産物の形成をもたらす。しかしながら、場合により（エチレングリコールの、グリコール酸及びシュウ酸への酸化等）、代謝産物はより毒性となる。
【０００６】
ＡＲＦは、３つの異なる段階を有し、それらは、開始段階、維持段階、及び回復段階として類別される。開始段階の間に、腎臓傷害を低下させる治療手段（たとえば輸液療法）は、ＡＲＦの定着の発生を予防することができる。維持段階は、尿細管病変及びネフロン機能障害の定着により特徴づけられる。ＡＲＦの回復段階は、腎機能が、ネフロン修復及び代償性肥大以後に改善される場合に生じる。尿細管病変は、尿細管基底膜が無傷で、且つ生細胞が存在する場合、修復される可能性がある。そのうえ、残存しているネフロンの機能的及び形態的肥大は、場合により、ネフロン数の減少を適当に代償することができる。たとえ腎機能回復が不完全だとしても、適当な機能が、場合により再建される可能性がある。しかしながら、より共通して、尿細管損傷は、重篤で、且つ回復不能であり、かなりのパーセンテージの動物が、ＡＲＦの維持段階で死ぬ又は安楽死させられる。
【０００７】
過去数十年の間の、ＡＲＦの細胞病原論及び分子病原論を解くためのおびただしい努力にもかかわらず、現在利用可能な有効な処置はなく、死亡の発生率は、獣医学において非常に高度なままである。少なくとも２つの遡及研究が、イヌでのＡＲＦに関連する予後不良を立証した。医原性ＡＲＦの研究では、生存率は３８％であったのに対して、ＡＲＦのすべての種類の他の研究では、生存率は２４％であった。したがって、ＡＲＦの予防及び／又は処置の改善のためのまだ対処されていない医学的必要性がある。
【０００８】
慢性腎不全（ＣＲＦ，chronic renal failure）は、ネフロンの著しい、継続する損失による、糸球体濾過率（ＧＦＲ，glomerular filtration rate）の進行性で、持続性の、著しい低下として定義されてもよい。ＣＲＦは、慢性腎機能不全（つまり少なくとも５０〜６０％の腎機能での持続性の減少）が、ネフロン機能単位の著しい損失を引き起こした、腎組織に対するいくつかの傷害に起因したポイントから典型的に始まる。初めの傷害は、急性腎不全のエピソードに関連しなかった可能性がある。初めの傷害の性質に関係なく、ネフロンが進行的に失われ、且つＧＦＲが進行的に下降するにつれて、ＣＲＦは、徴候及び症状の「最終共通路」を顕在化させる。腎機能でのこの進行性の悪化は遅く、一見不可避であり、典型的にイヌ科及びネコ科の被検体では数ヶ月〜数年、ヒト患者では何十年に及ぶ。
【０００９】
初期のＣＲＦは、ＧＦＲが、正常なレベルの約３分の１（たとえば、平均的なヒト大人については３０〜４０ｍｌ／分）に低下した場合に、典型的に始まる。著しいネフロン損失の結果として及び少数のネフロンを用いて最大ＧＦＲを維持するための見かけ上の「試み」において、平均的な単一ネフロンＧＦＲ（ＳＮＧＦＲ，single nephron GFR）は、残りのネフロンの適応により、構造的レベル及び機能的レベルの両方で増加する。生検サンプルの顕微鏡検査により容易に検出可能なこの適応の１つの構造的な所見は、腎臓の糸球体及び尿細管の両方の「代償性肥大」であり、これは、それぞれの残りのネフロンにより、糸球体及び尿細管の文字どおりの拡大によりもたらされ得る、濾液の容量を実際に増加させるプロセスである。
【００１０】
集合管の肥大又は拡張の結果として、ＣＲＦを有する被検体の尿は、正常な直径の２〜６倍である円柱を含有することが多い（本明細書で「幅広円柱」又は「腎不全円柱」と言われる）。上記幅広円柱の存在は、ＣＲＦの診断を助ける。同時に、通常排出される溶質の吸収の減少又は分泌の増加等の残りのネフロンにおける機能的変化があり、これは、体内の他のところでのホルモン変化又はパラクリン変化に対する応答である可能性がある（たとえばカルシウム及びリン酸塩の血清レベルでの変化に応じて副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ，parathyroid hormone）のレベルが増加する）。
【００１１】
初期ＣＲＦでのこれらの適応は、ＧＦＲ又は腎機能の他のパラメーターを完全に修復することにおいて成功せず、実際、残りのネフロンを、損失の危険性の増加にさらす。たとえば、ＳＮＧＦＲの増加は、高血圧及び過灌流による、糸球体に対する機械的ストレスに関連する。有足細胞接合部の完全性の損失は、高分子に対する糸球体の透過性の増加又は糸球体嚢の「漏れやすさ」につながる。増殖性の影響はまた、メサンギウム細胞、上皮細胞、及び内皮細胞並びにコラーゲン及び他のマトリックスタンパク質の沈着の増加において観察される。糸球体及び尿細管の両方の硬化は、肥大したネフロンの他の共通の症状であり、糸球体中の凝固の危険性が増加する。特に、ＳＮＧＦＲを、その正常なレベルを超えて十分に押し上げることによる、残りのネフロンのこれらの適応は、水負荷、溶質負荷、又は酸負荷での急性変化に対して応答するための残りのネフロンの能力を実際に減少させ、したがって、さらなるネフロン損失の可能性を実際に増加させる。
【００１２】
ＣＲＦが進行し、ＧＦＲが、正常の１０％未満（つまりヒトで、約５〜１０ｍｌ／分）まで下降し続けると、被検体は、末期腎疾患（ＥＳＲＤ，end-stage renal disease）に入る。この段階の間に、残りのネフロンは、老廃物を適当に除去し、且つ体液バランス及び電解質バランスを維持することができず、多くの器官系、特に心血管系が衰え始める可能性がある急速な衰退につながる。このポイントで、患者が腎臓置換療法（つまり慢性血液透析、持続的腹膜透析、又は腎臓移植）を受けない限り、腎不全は急速に進行し、死に至るであろう。
【００１３】
ＣＲＦの管理は、窒素血症、栄養の不適当、低増殖性貧血、鉱質代謝障害、電解質異常、代謝性アシドーシス、タンパク尿、水代謝障害、全身性高血圧、及び特定の病因に関係なく、ＣＲＦの共通した収束的結末と考えられる間質性線維症を通した腎外傷の進行を含むが、これらに限定されない腎不全により誘発される同定可能な臨床的予後、代謝の予後、内分泌の予後、及び生化学的予後のすべてを寛解させるために行わなければならない。
【００１４】
おびただしい進歩が、最近の十年間の間、ＣＲＦのいくつかの臨床的予後、代謝の予後、内分泌の予後、及び生化学的予後に対処するために成されている一方で、臨床的に慢性の線維症の療法は、非常に難易度の高いままであり、したがって、腎疾患の長期的な医学的コントロールは、重要な、まだ対処されていない、治療上必要なもののままである。現在、腎疾患関連性の線維症の低下を目標とする最も進歩した療法は、レニン−アンギオテンシン系（ＲＡＳ，renin-angiotensin system）の活性の低下に焦点を合わせている。この戦略は、疾患発達を遅らせることが示されたけれども、その効力は、部分的なままであり、この戦略は、実験的状態及び臨床的状態における慢性線維症の進行を完全に停止させるわけではない。これは、おそらく、ＲＡＳ以外の多くの因子がＣＲＦ関連性の線維症の病原論の一因となるからである。
【００１５】
ネコ及びイヌでのＣＲＦの有病率は増加している。１９８０年に米国で調べられた１０００匹のネコ当たり、４匹が腎不全を年齢に関係なく有した。１９９０年までに、腎不全の報告された症例の数は、４倍になり、検査された１０００匹のネコ当たり、１６症例が同定された。年齢が１５歳より高いネコについては、腎不全の１５３症例が、１９９０年に１０００匹の検査当たり診断された。高齢のネコでの腎不全の有病率における増加は、持ち主により求められる獣医の医療における増加を及び疾患を検出するための獣医による一層の努力を反映している可能性がある。理由が何でも、これらの発見は、高年齢の動物でのＣＲＦの認識及び重要性が現れていることを強調する。伴侶動物におけるＣＲＦの最も頻繁な病因は、特発性慢性間質性腎炎、回復不能なＡＲＦ、家族性腎形成不全又は腎無形成、先天的多嚢胞性腎疾患、アミロイドーシス、糸球体腎炎、高カルシウム血症、両側水腎症、レプトスピラ症、腎盂腎炎、両側腎結石症、ファンコーニ様症候群、高血圧、腎リンパ肉腫を含むが、これらに限定されない。
【００１６】
ヒト医学では、１００万人当たり約６００人の患者が、慢性透析を、毎年、米国で、１年当たりの１人の患者当たり＄６０，０００〜＄８０，０００に近い平均コストで受けている。毎年の末期腎疾患の新しい症例のうちで、約２８〜３３％は、糖尿病性腎症（又は糖尿病性糸球体症又は糖尿病性腎肥大）によるものであり、２４〜２９％は、高血圧性腎硬化（又は高血圧性糸球体硬化症）によるものであり、１５〜２２％は、糸球体腎炎によるものである。すべての慢性ヒト透析患者についての５年間の生存率は、約４０％であるが、６５歳を超える患者については、その率は約２０％まで落ちる。したがって、米国のみで、ほぼ２００，０００人のヒト患者が、慢性透析に依存性になる原因となり、毎年何万人もの早死をもたらす、腎機能の進行性の損失を予防するための処置について、必要性が残っている。
【００１７】
向腎性特性を呈し、尿細管修復及び腎機能の回復を促進する特定の形態形成因子及び／又は成長因子が最近同定されたという事実の観点から、これらの分子のいくつかは、ＡＲＦ及び／又はＣＲＦの予防及び／又は処置のための治療剤として使用される潜在力を有し得たと考えられる。１つの上記作用物質は、骨形態形成タンパク質−７（ＢＭＰ−７、又は骨形成タンパク質−１、ＯＰ−１）であり、これは、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β，Transforming Growth Factor-β）スーパーファミリーのメンバーである。ＢＭＰ−７は、アクチビン受容体Ｉ型及びII型に結合するが、ＴＧＦ−β受容体Ｉ型、II型、及びIII型には結合しない。単量体ＢＭＰ−７は、１７〜１９ｋＤａの分子量を有し、異所性骨形成を誘発するその能力により、当初同定された。ＢＭＰ−７ポリペプチドは、約３５〜３６ｋＤａの見かけ上の分子量を有するホモ二量体として分泌される。最近、ＢＭＰ−７は、腎発生の間の主な形態形成因子であることが示された。ＢＭＰ−７の腎発現は、成熟腎臓において、とりわけ髄質の集合管において継続する。腎尿細管はまた、ＢＭＰ−７受容体を発現する。ＡＲＦ及びＣＲＦの動物モデルでは、ＢＭＰ−７の腎発現は、著しくダウンレギュレートされ、組換えＢＭＰ−７タンパク質の投与は、腎臓回復、より軽い間質性炎に関連する効果、及びプログラム細胞死を速めることが報告された。
【００１８】
しかしながら、ＢＭＰ−７は、インビボでの半減期が短いので（約３０分間）、精製タンパク質の注射の後での循環中での外来性タンパク質の持続レベルの維持は、複数回の短い間隔の投与を必要とし、非常に深刻な実践的な難題を作り出している。上記複数回注射療法のコストは、獣医学において適用可能となるには高すぎる。遺伝子送達は、様々な疾患処置のために、タンパク質療法に対する代替としてうまく促進されてきたけれども、インビボでのＢＭＰ−７ポリペプチド発現を通したＡＲＦ及び／又はＣＲＦの予防及び／又は処置のためのその適用可能性は、今まで提唱されておらず、その考えられる有効性は、不確かなままである。実に、低分子量のＢＭＰ−７ホモ二量体（つまり約３５ｋＤａ）は、理論上、急速な糸球体濾過を可能にするであろう。インビボで発現したＢＭＰ−７のレベルが治療上有効な血漿濃度に達することができるかどうかは、既存の文献から予測し、決定することができない。インビボで発現したＢＭＰタンパク質の評価をさらに複雑にすることには、結果は、処置動物の免疫状態に依存して可変的であり、免疫適格動物及び免疫不適格動物の間での著しい差異を有する可能性がある。したがって、総合的に全体として考えると、文献は、インビボで発現したＢＭＰ−７のレベルが治療上有用な血漿濃度に達することができるかどうかは教示していない。
【００１９】
本出願におけるあらゆる文献の引証又は検証は、上記文献が本発明に対する先行技術として利用可能であるとみなされるものではなく、且つこれを承認するものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、急性腎不全又は慢性腎不全に罹患している又はその危険性がある哺乳動物被検体の予防及び処置の方法、並びに上記方法において使用するための組換えベクター及び医薬組成物を対象とする。本発明の方法、ベクター、及び組成物は、死亡率及び／又は罹病率を低下させ、腎不全を特徴づける、腎機能の進行性の損失を予防、阻害、遅延、又は緩和するのに有用である。本発明の方法、組換えベクター、及び組成物が有用な被検体は、急性腎不全又は慢性腎不全に既にかかっている被検体、腎臓置換療法を既に受けたことのある被検体、及び機能的ネフロン単位の進行性の損失に関連する、腎機能の急性又は進行性の損失に罹患していることが当然予想されるあらゆる被検体を含むが、これらに限定されない。特定の被検体が腎疾患の危険性があるかどうか、及び／又は被検体が本発明の方法及び／又は組成物から利益を得る可能性があるかどうかは、関連する医学又は獣医学の技術における熟練者がルーチン的に成すことができる決定である。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
一実施形態では、本発明は、プレプロＢＭＰ−７遺伝子、プロＢＭＰ−７遺伝子、又は成熟ＢＭＰ−７遺伝子を含有し、宿主で発現するベクターに関する。プレプロＢＭＰ−７ポリペプチド、プロＢＭＰ−７ポリペプチド、又は成熟ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードするＢＭＰ−７遺伝子は、哺乳動物から由来するものであってもよい。好ましい実施形態では、発現ベクターは、イヌ科プレプロＢＭＰ−７、イヌ科プロＢＭＰ−７、又はイヌ科成熟ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーター及び任意選択でエンハンサーに作動的に連結させてもよい。
【００２２】
有利な実施形態では、本発明は、イヌ科プロＢＭＰ−７ポリペプチドを含有し、且つ発現するベクターに関し、イヌ科プロＢＭＰ−７ポリペプチドは、Ｎ末端の「プレ」ペプチドが削除され、異なる起源からのペプチドシグナル配列が、イヌ科プロＢＭＰ−７ポリペプチドに融合される。有利には、そのペプチドシグナル配列は、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）ペプチドシグナル配列又は組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）ペプチドシグナル配列であってもよい。他の実施形態では、発現ベクターは、イヌ科成熟ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよく、上述のポリペプチドは、ＢＭＰ−７、ＩＧＦ−１、又はｔＰＡからのペプチドシグナル配列に融合される。
【００２３】
他の実施形態では、本発明は、プレプロＢＭＰ−７ポリペプチド、プロＢＭＰ−７ポリペプチド、又は成熟ＢＭＰ−７ポリペプチドを発現するベクター及び薬学的に又は獣医学的に許容し得る担体、賦形剤、又は媒体を含む医薬組成物に関する。特定の実施形態では、医薬組成物は、ベクターの宿主細胞中への形質移入又は形質導入の効力を改善するための物質を含んでいてもよい。
【００２４】
他の実施形態では、本発明は、哺乳動物にＢＭＰ−７ポリペプチドを送達する方法に関し、この方法は、プレプロＢＭＰ−７ポリペプチド、プロＢＭＰ−７ポリペプチド、又は成熟ＢＭＰ−７ポリペプチドをインビボで発現することができるベクターを注射することを含んでいてもよい。有利な実施形態では、動物宿主は、イヌ又はネコであってもよい。本発明は、哺乳動物を、慢性腎不全又は急性腎不全について予防する及び／又は処置するための上記ベクターの使用に関する。本発明の医薬組成物は、筋肉内経路又は皮下経路を含むが、これらに限定されない投与のあらゆる適した経路により投与されてもよい。特定の実施形態では、ベクターは、宿主に、無針注射器を使用して又は電気的導入を使用して投与されてもよい。
【００２５】
他の実施形態では、本発明は、血清クレアチニン濃度の増加及び／又は血清尿素窒素濃度の増加を呈する哺乳動物を処置するための、本発明による医薬組成物の使用に関する。有利には、ネコは、血漿クレアチニン濃度が１．９ｍｇ／ｄｌよりも高い場合に及び／又は血漿尿素窒素濃度が３５ｍｇ／ｄｌよりも高い場合に処置されてもよい。有利には、イヌは、血漿クレアチニン濃度が１．６ｍｇ／ｄｌよりも高い場合に及び／又は血漿尿素窒素濃度が３０ｍｇ／ｄｌよりも高い場合に処置されてもよい。
【００２６】
本開示並びに特に請求項及び／又は段落で、「含む（comprises）」、「含まれた（comprised）」、「含む（comprising）」等のような用語は、米国特許法での意味に帰する意味を有することができ、たとえば、それらの用語は、「含む（includes）」、「含まれた（included）」、「含む（including）」等を意味することができる。「本質的に〜から成る（consisting essentially of）」及び「本質的に〜から成る（consists essentially of）」等の用語は、米国特許法での用語に基づく意味を有し、たとえば、それらの用語は、明確に記載されていない要素を考慮に入れるが、先行技術に見い出される又は本発明の基本的な若しくは新規な特徴に影響を及ぼす要素を除外することに留意されたい。
【００２７】
これらの実施形態及び他の実施形態は、以下の発明を実施するための最良の形態に記載され又はそれから明白であり、且つそれにより包含される。
【００２８】
実施例として与えられるが、本発明を記載される特定の実施形態にもっぱら限定するよう意図されない以下の詳述される記載は、添付の図面により最も理解されてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の方法及び組成物は、腎不全の予防的処置に使用することができる。用語「予防」、「予防法」、「予防的処置」、並びに「予防処置」は、それらの用語が腎不全に関係するように並びにそれらの用語が本明細書並びにヒト医学及び獣医学の分野で使用されるように、健常な動物、又は腎不全とは無関係な疾患に罹患している、急性腎不全の危険性があると考えられる動物のいずれかの処置に関係する。ネコ及びイヌにおける急性腎不全についての主な危険因子は、ショック及び／又は血液量減少（たとえば出血、低血圧ショック、敗血症性ショック、麻酔遷延若しくは深麻酔、血液量減少、熱射病、外傷、熱傷、又は利尿剤乱用）、全身性疾患（たとえば膵炎、腹膜炎、肝不全、播種性血管内凝固症候群、副腎不全、又は脈管炎）、虚血（たとえば血栓塞栓性閉塞又は悪性高血圧により引き起こされた虚血）、感染症（たとえばレプトスピラ症、腎盂腎炎、ネコ科感染性腹膜炎、ボレリア症、リーシュマニア症、バベシア症、敗血症、又は敗血症性塞栓）、全身性腎疾患（たとえば多臓器不全、糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、腎静脈血栓症、尿流閉塞、溶血性尿毒症症候群、ヘム色素尿症−クラッシュ症候群、又は赤血球増加）、高齢、先天的腎疾患及び／又は遺伝的腎疾患、並びに腎細胞毒素（たとえばアミノグリコシド、アンホテリシンＢ、シスプラチン、アドリアマイシン、非ステロイド性抗炎症薬、利尿薬、ＩＬ−２、又はアロプリノール）に対する暴露、新形成（たとえばリンパ腫）、高カルシウム血症、外傷（たとえば剥離）、悪性高血圧、シュウ酸塩腎症その他等の他のいろいろな因子を含むが、これらに限定されない。
【００３０】
一般的に予防的目的のための処置は、急性腎不全に関する１つ又は複数の前述の危険因子に健常な動物を暴露する数週間内（理想的には６〜８日に）に行われる。その代わりに、急性腎不全に関連する危険因子が同定された病気の動物においては、処置は、腎臓代謝並びに／又は腎臓組織の構造及び構成に対する、危険因子である原発性疾患のあらゆるマイナスの影響を制限するために、できるだけ迅速に行われてもよい。
【００３１】
予防的処置の他に、本発明の方法及び組成物はまた、腎不全の治療処置に使用することもできる。用語「療法」又は「治療処置」は、それらの用語が腎不全に関係するように並びにそれらの用語が本明細書及び獣医学の分野で使用されるように、処置すること、又は急性腎不全に既に罹患している若しくはそれから回復している（つまり回復段階にある）動物の処置又は遅らせることを目指した処置を支援すること及び／又は速めること、並びに／又は慢性腎不全を有する若しくはその危険性があると診断された動物における病変発達を逆戻りさせることに関係する。療法の重要な目的は、ＡＲＦ発症以後のＣＲＦに移行する危険性を低下させることである。本明細書においては、被検体が、機能的ネフロン単位の進行性の損失に関連する、腎機能の進行性の損失に罹患することが合理的に予想される場合に、ＣＲＦに罹患する又はＣＲＦを発症する危険性があると表現される。特定の被検体がＣＲＦに罹患しているかどうか又はＣＲＦを発症する危険性があるかどうかは、関連する獣医学の技術又は医学の技術における熟練者により容易に決定することができる。
【００３２】
イヌにおける慢性腎不全についての主な危険因子は、特発性慢性間質性腎炎、回復不能なＡＲＦ、家族性腎形成不全、又は腎無形成（危険性が高い品種は、ノルウェジアンエルクハウンド、ラサアプソ、サモエード、コッカースパニエル、ドーベルマンピンシャー、スタンダードプードル、及びゴールデンレトリーバーを含む）、先天的多嚢胞性腎疾患（たとえばケアンテリア）、アミロイドーシス、糸球体腎炎、高カルシウム血症、両側水腎症、レプトスピラ症、腎盂腎炎、両側腎結石症、ファンコーニ様症候群、並びに高血圧を含むが、これらに限定されない。
【００３３】
ネコにおける慢性腎不全についての主な危険因子は、特発性慢性間質性腎炎、回復不能なＡＲＦ、腎リンパ肉腫、多嚢胞性腎疾患（たとえばペルシアネコにおける家族性のもの）、糸球体腎炎、両側水腎症、アミロイドーシス、腎盂腎炎、高カルシウム血症、及び両側腎結石症を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
ＣＲＦを罹患する又はＣＲＦを発症する危険性がある又は腎臓置換療法を必要とする可能性があるヒト被検体は、末期腎疾患、慢性糖尿病腎症、高血圧性腎硬化、慢性糸球体腎炎、遺伝性腎炎、及び／又は腎形成異常を有する被検体、糸球体肥大、尿細管肥大、慢性糸球体硬化症、及び／又は慢性尿細管間質硬化を示す生検を受けたことのある被検体、腎臓線維症の存在を示す超音波、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャン、又は他の非侵入性の検査を受けたことのある被検体、尿沈渣中に異常な数の幅広円柱を有する被検体、被検体について予想されるＧＦＲの、慢性的に５０％未満、より詳細には約４０％、３０％、又は２０％未満の糸球体濾過率（「ＧＦＲ」）を有する被検体、健常被検体そうでなければ類似する被検体が有する機能的ネフロン単位の数の約５０％未満、より詳細には約４０％、３０％、又は２０％未満の数の機能的ネフロン単位を有する被検体、単一の腎臓のみを有する被検体、並びに腎臓移植片レシピエントである被検体を含むが、これらに限定されない。
【００３５】
「糸球体濾過率」又は「ＧＦＲ」は、血清タンパク質が結合せず、糸球体を介して自由に濾過され、腎尿細管により分泌されも再吸収されもしない血漿由来物質である「マーカー」物質の尿中へのクリアランスの率に比例する。したがって、本明細書に使用されるように、ＧＦＲは、好ましくは、以下の方程式により定義される：
【００３６】
【数１】
2009515529.tif 000003
【００３７】
式中、Ｕｃｏｎｃは、マーカー物質の尿濃度であり、Ｐｃｏｎｃは、マーカー物質の血漿濃度であり、Ｖは、ｍｌ／分の尿流率である。任意選択で、ＧＦＲは、体表面積に合わせて補正することができる。したがって、ＧＦＲ値は、単位をｍｌ／分／１．７３ｍ２」とみなされてもよい。ＧＦＲ測定のための好ましいマーカー物質は、イヌリンである、しかしながら、この物質の濃度を測定する際の困難さのために、クレアチニンが、臨床設定におけるＧＦＲ測定のためのマーカーとして典型的に使用される。
【００３８】
「予想ＧＦＲ」又は「ＧＦＲｅｘｐ」の推定値は、被検体の年齢、体重、性別、体表面積、及び筋系の程度並びに血液試験により決定されるいくつかのマーカー化合物（たとえばクレアチニン）の血漿濃度の考慮に基づいて提供されてもよい。したがって、例として、予想ＧＦＲは、以下のように推定されてもよい：
【００３９】
【数２】
2009515529.tif 000004
【００４０】
この推定値は、表面積、筋系の程度、又は体脂肪のパーセンテージのような因子を考慮に入れない。それでもなお、血漿クレアチニンレベルをマーカーとして使用して、この式は、ＧＦＲを推定する安価な手段としてヒト男性に利用されてきた。クレアチニンは横紋筋により産生されるので、ヒト女性被検体の予想ＧＦＲは、筋量における予想される差異の説明となる０．８５を掛けた同じ方程式により推定される（Lemann et al., 1990 Am. J. Kidney Dis. 16(3); 236-243を参照されたい）。
【００４１】
有形要素の存在についての尿沈渣の顕微鏡検査は、尿分析における標準的な手順である。尿中に存在する可能性のある有形要素の中には、遠位曲尿細管又は集合管の管腔のモールド又は「円柱」に典型的に相当する凝集した物質の円柱状の塊がある。健常なヒトでは、上記円柱の直径は、典型的に１５〜２５μｍである。しかしながら、ＣＲＦを有する被検体では、尿細管の肥大が、正常な円柱の直径の２〜６倍であり、均質でろう様の外観（waxy appearance）を有することが多い円柱の存在をもたらす可能性がある。これらは、「幅広円柱(broad casts)」又は「腎不全円柱(renal failure casts)」と称される。本明細書に使用されるように、用語「幅広円柱」は、直径が被検体について正常の２〜６倍又はヒト円柱について約３０〜１５０μｍである尿沈渣円柱について言及するために使用される。
【００４２】
臨床的指標に関して本明細書に使用されるように、用語「急性」は、発症が、傷害又は危険因子に対する暴露の数時間又は数日内に急速に典型的に生じる腎病理について言うために使用される。
【００４３】
臨床的指標に関して本明細書に使用されるように、用語「慢性」は、少なくとも３か月、より好ましくは少なくとも６か月の期間持続することを意味する。したがって、たとえば、５０％のＧＦＲｅｘｐより下の測定ＧＦＲを慢性的に有する被検体は、少なくとも３か月、より好ましくは少なくとも６か月隔てられた少なくとも２回の測定で、ＧＦＲが測定され、ＧＦＲｅｘｐが５０％より下であることがわかった及びＧＦＲが介在期間の間に実質的に（たとえば１０％）高かったと考えるのに医学的に正当な理由がない被検体である。幅広円柱の存在等の異常腎機能の他の指示物の存在が、少なくとも３か月、より好ましくは少なくとも６か月隔てられた少なくとも２回の測定で持続した場合、上記指示物は、同様に、慢性と評され得る。
【００４４】
表１は、ＡＲＦ及びＣＲＦを区別するのに有用である可能性のあるパラメーターについて、すべてではないが、いくつかを記載するものである。
【００４５】
【表１】
2009515529.tif 000005
【００４６】
本発明は、ＢＭＰ−７ポリペプチドをインビボで発現することができるベクターを含む医薬組成物を活用する、腎不全のための療法及び予防的処置並びに血漿ＢＭＰ−７濃度の増加の持続を誘発し、それによって上皮細胞上のＴＧＦ−β経路の活性化を低下させる方法及び組成物を提供する。ＴＧＦ−β活性化は、数ある中で、Ｓｍａｄ２因子及びＳｍａｄ３因子のリン酸化及びそれらの核内輸入を引き起こし、上皮間葉移行の促進及び間葉上皮移行の抑制をもたらし、線維症についての主なトリガーとして作用する。ＢＭＰ−７は、成人腎臓で発現するけれども、その発現は腎不全に直面して頻繁にダウンレギュレートされている。したがって、外来性インビボ産生ＢＭＰ−７は、ＢＭＰ−７のレベルを正常な生理的レベルまで修復するのを援助し、尿細管間質腎炎及びＣＲＦに関連する線維症のコントロール及び後退をもたらし得る。
【００４７】
本明細書に使用されるように、本発明による医薬組成物は、組成物のその量の投与が、ＡＲＦ又はＣＲＦを罹患している哺乳動物被検体での疾患の臨床的徴候又は測定可能なマーカーの著しい改善を引き起こすのに十分な場合、「治療上の効力」を有する又は「治療上有効である」と表現される。本明細書に使用されるように、本発明による医薬組成物は、組成物のその量の投与が、被検体でのＡＲＦの発生を予防するのに十分な場合、「予防効力」を有する又は「予防的に有効である」と表現される。用語「治療上有効な」はまた、より一般的な意味で、ＡＲＦ若しくはＣＲＦを罹患している哺乳動物被検体での疾患の臨床的徴候若しくは測定可能なマーカーの著しい改善を引き起こすのに十分である又は被検体でのＡＲＦの発生を予防するのに十分である組成物の量について言うために本明細書に使用されてもよい。
【００４８】
被検体のＡＲＦ又はＣＲＦの状態を調べるのに有用で、医学の及び獣医学の文献において並びに当業者によく知られている、腎機能の測定可能なマーカーは、血液尿素窒素又は「ＢＵＮ，blood urea nitrogen」レベル（静的測定及びＢＵＮレベルにおける増加率又は減少率の測定の両方）、血清クレアチニンレベル（静的測定及び血清クレアチニンレベルにおける増加率又は減少率の測定の両方）、ＢＵＮ／クレアチニン比の測定（ＢＵＮ／クレアチニン比の変化率の測定の静的測定）、クレアチニンについての尿／血漿比、尿素についての尿／血漿比、糸球体濾過率（ＧＦＲ）、ナトリウム（Ｎａ＋）の血清濃度、尿浸透圧、日々の尿量その他を含むが、これらに限定されない（たとえばBrenner and Lazarus (1994), in Harrison's principles of Internal medicine, 13th edition, Isselbacher et al. eds, McGraw Hill Text, NY; Luke and Strom (1994), in Internal Medicine, 4th Edition, J. H. Stein, ed., Mosby-Year Book, Inc. St Louisを参照されたい）。上述のうち、クレアチニン及び／若しくは尿素の血漿濃度又はＢＵＮの測定値は、腎機能の、特に重要で有用な読み取り値となる。
【００４９】
血清クレアチニン濃度についての正常値は、イヌでは、約０．５〜約１．６ｍｇ／デシリットル（「ｄｌ，decilitre」）、ネコでは約０．５〜約１．９ｍｇ／ｄｌの範囲にある。血清クレアチニンレベルの正常な生理的な範囲の上限は、イヌよりもネコでわずかに高い。食餌を除き、血清クレアチニン濃度の生理的な値に影響を及ぼす因子は、よく理解されていない。タンパク質が豊富な食餌は、一時的に高クレアチン血症の原因となる潜在力を有することが知られている。たとえば、健常なイヌが市販の飼料を与えられた場合、血清クレアチニン濃度におけるおよそ２５％の増加が、６〜９時間の期間にわたって生じ得る。クレアチン血症の微量の変動の関係は、判断するのが困難であり、クレアチニンレベルの２つの連続的な測定の間の関係のある最も小さな変動は、正常値から３５μｍｏｌ／ｌの濃度の変化と考えられる。
【００５０】
空腹時のイヌ及びネコでのＢＵＮレベルについての正常な生理的な範囲の上限は、イヌでは約８．８〜約２５．９ｍｇ／ｄｌ、ネコでは約１５．４〜約３１．２ｍｇ／ｄｌの範囲にあり、正常範囲の上限は、イヌよりもネコでわずかに高い。ＢＵＮレベルは、クレアチニンレベルと同様に、食餌により影響を及ぼされる。ＢＵＮレベルにおける変動につながり得る他の因子は、長期的なグルココルチコイド処置及び／又は肝細胞不全を含む。
【００５１】
血清クレアチニンレベル及び／又はＢＵＮレベルの、それらの正常な生理的な範囲を上回るあらゆる著しい増加は、腎臓が排泄物及び異化代謝産物を排除する能力の低下の徴候である（つまり排出不全）。
【００５２】
本発明の方法及び組成物の効力の実験的実証（たとえばＢＭＰ−７又はＢＭＰ−７の機能的均等物を用いた遺伝子療法に有用な方法及び組成物）は、たとえば、本発明の方法及び組成物を使用して処置した動物が、プラセボ処置動物と比較して、たとえば毒物（たとえばＨｇＣｌ２）又は腎虚血（たとえば両側腎動脈閉塞）を誘発する手技等のトリガー又は危険因子に暴露された場合に、血漿クレアチニン及び／又はＢＵＮの上昇の著しい低下を呈することを実証することにより、種々の方法で実行することにより実行することができる。
【００５３】
同様に、組織読み取り値は、本発明の方法及び組成物の効力を実証するために使用することができる。適した組織の読み取りの例は、腎臓の皮質の実質内の及び度合いがより少ないが腎臓の髄質の実質内の、尿細管間質腎炎の病変（「ＴＩＮ，tubulo-interstitial nephritic」病変）の定量化を含む。尿細管間質腎炎（ＴＩＮ）に関連する間質性腎線維症は、広範囲の多様な病因を有する腎臓障害の共通の最終経路であることが十分に立証される。腎機能の悪化は、多くの形態の腎疾患における及び同様に数匹の実験動物モデルにおける尿細管間質病変の度合いにより主として決定される。したがって、ＴＩＮ線維症の発達を遅らせる又は逆戻りさせることができる方法又は組成物は、疾患修飾機構を通して（つまり腎臓組織の構造要素の分解及び崩壊の制限により）、すべての腎臓障害のためになる潜在力を有する。本発明のＢＭＰ−７遺伝子療法の方法及び組成物の効力の実験的実証は、片側尿管閉鎖モデル又は「ＵＵＯ，unilateral ureteral obstruction」モデルを使用して評価されたように、ＢＭＰ−７処置動物が、コントロールよりも、腎臓での尿細管間質病変を著しく低下させたという観察から実証することができる。ＵＵＯモデルは、進行性尿細管萎縮及び間質コラーゲン蓄積に関連する腎線維症の慢性的な進行について、十分に確立された動物モデルである。ＵＵＯモデルは、当技術分野でよく知られており（たとえばR. Chevalier et al., Kidney Int. 2000, 57, 882-890を参照されたい、その内容は、これによって参照によりそれらの全体が組み込まれる）、片側尿管閉鎖手技は、当業者により容易に実行することができる。ＵＵＯモデルは、非常に深刻な尿細管間質病理及び軽微糸球体病変に典型的に関連し、本発明の方法及び組成物の効力を実証するための、たとえば、ＢＭＰ−７又はＢＭＰ−７の機能的均等物のインビボでの発現に基づいた本明細書に開示される遺伝子療法戦略の効力を実証するための関係がある有用な実験モデルである。このモデルを使用すると、腎皮質でのＴＩＮの評価は、固定組織の従来のヘマトキシリンエオジン（若しくは「Ｈ＆Ｅ，hematoxylin and eosin」）染色及び／又はコラーゲン特異的マッソントリクローム染色を使用して決定することができる。病変の特徴づけは、尿細管拡張、上皮萎縮、並びに筋線維芽細胞活性化及びマトリックス沈着を有する間質増大の度合いに基づく。さらなる調査は、たとえば、組織での間葉への上皮の移行（又は「ＥＭＴ，epithelial to mesenchyme transition」）のレベルを特徴づけ、定量化するための、α−平滑筋アクチン（「α−ＳＭＡ，α-smooth muscle actin」）特異性抗体を使用した免疫組織化学技術及び組織形態計測技術に基づくものとすることができる。相補的な免疫組織化学分析はまた、コラーゲンＩ又はフィブロネクチンに特異的な抗体を用いて実行することができる。細胞浸潤の定量化は、病変を特徴づけるために使用することができるさらなる読み取りとなる。後者の免疫組織化学分析は、たとえば、マクロファージに特異的な抗ＥＤ−１又は抗ｍａｃ−１抗体を使用して行うことができる。総合的に、上述の読み取りの結果は、病変についての評点を提供するために使用することができる。
【００５４】
上記の他に、腎臓疾患及び／又は腎臓機能を研究するためのあらゆる他の適した方法又は読み取りはまた、あらゆる他の適した動物モデルを含み、本発明の方法及び組成物の効力を実証するために及び上記組成物のどれくらいの量が又は投与のどのようなモードが治療上又は予防的に有効であるかを決定するために使用することができる。
【００５５】
一態様では、本発明は、宿主中で、インビボで、骨形態形成タンパク質−７（ＢＭＰ−７）ポリペプチド又はその変異体若しくは断片を発現することができるベクターに関する。本明細書に使用されるように、「ＢＭＰ−７ポリペプチド」は、プレプロＢＭＰ−７ポリペプチド、プロＢＭＰ−７ポリペプチド、又は成熟ＢＭＰ−７ポリペプチドについて言うために使用されてもよく、プロＢＭＰ−７ポリペプチド及び成熟ＢＭＰ−７ポリペプチドは、ＢＭＰ−７シグナルペプチド、ＩＧＦ−１シグナルペプチド、又はｔＰＡシグナルペプチドに融合されてもよい。本発明のＢＭＰ−７ポリペプチドは、好ましくはイヌ科起源のものである。一実施形態では、ベクターは、プレプロＢＭＰ−７、プロＢＭＰ−７、又は成熟ＢＭＰ−７のヌクレオチド配列又は遺伝子を含有し、それを宿主中で発現する。プレプロＢＭＰ−７ポリペプチド、プロＢＭＰ−７ポリペプチド、又は成熟ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又は遺伝子は、哺乳動物、たとえばネコ又はイヌに由来する。好ましい実施形態では、ＢＭＰ−７ヌクレオチド配列又は遺伝子は、イヌに由来する。
【００５６】
ＢＭＰ−７はまた、骨形成タンパク質−１又は「ＯＰ−１」としても知られており、形質転換成長因子−βスーパーファミリー又は「ＴＧＦ−β」スーパーファミリーのメンバーである。これは、プロタンパク質をプロセシングしてカルボキシ末端成熟タンパク質が得られる分泌タンパク質である。成熟タンパク質内には、配列番号３のアミノ酸３３０〜アミノ酸４３０にわたるドメインを定義する、７つのシステイン残基の保存パターンがある。タンパク質の活性形態は、ジスルフィド結合したホモ二量体である。その成熟した天然の形態では、自然発生ＢＭＰ−７は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，SDS-polyacrylamide gel electrophoresis」）により決定されるように、約３０〜３６ｋＤａの見かけ上の分子量を有するグリコシル化二量体である。還元されると、３０ｋＤａタンパク質は、約１６ｋＤａ及び１８ｋＤａの見かけ上の分子量を有する２つのグリコシル化ポリペプチドサブユニットを生じる。非グリコシル化タンパク質は、約２７ｋＤａの見かけ上の分子量を有する。還元されると、２７ｋＤａ非グリコシル化タンパク質は、約１４ｋＤａ及び１６ｋＤａの分子量を有する２つの非グリコシル化ポリペプチド鎖を生じる。
【００５７】
典型的に、自然発生ＢＭＰ−７タンパク質は、前駆物質として翻訳され、Ｎ末端シグナルペプチド配列、「プロ」ドメイン、及び「成熟」タンパク質ドメインを有する。シグナルペプチドは、２９残基長であり、翻訳の際に、Von Heijne (1986), Nucleic Acid Research, 14; 4683-4691の方法を使用して予測することができる開裂部位で急速に開裂される。「プロ」ドメインは、ヒト、イヌ科、ブタ、及びウシのＢＭＰ−７では２６４残基、マウスＢＭＰ−７では２６３残基を有する。プロドメインは、開裂されて、１３９残基の「成熟」Ｃ末端ドメインが得られ、このドメインは、１０２残基の保存された７つのシステインＣ末端ドメインを含む。本明細書で言われるように、ＢＭＰ−７ポリペプチドの「プロ形態」は、１対のポリペプチドを含むタンパク質のことを言い、それぞれ、ＢＭＰ−７ポリペプチドの成熟ドメインに、共有結合的又は非共有結合的に関連するプロドメインを含む。プロ形態は、培養哺乳動物細胞から分泌された第一の形態であると思われる。タンパク質の「成熟形態」は、共有結合的にも非共有結合的にもプロドメインに関連しない成熟Ｃ末端ドメインを言う。
【００５８】
本明細書に使用されるように、用語「プレプロＢＭＰ−７」、「プロＢＭＰ−７」、「成熟ＢＭＰ−７」、及び「ＢＭＰ−７は、明細書及び添付の配列一覧で示される特定のポリペプチド及び配列について言うだけではなく、誘導体、突然変異体、相同体、オルソログ、対立遺伝子変異体、対立遺伝子多形体、多形変異体、系統発生的対応物を含むが、これらに限定されない、これらのタンパク質の知られている自然発生変異体のいずれか又はすべて及び誘導体、突然変異体、断片、融合タンパク質その他を含むが、これらに限定されない、これらのタンパク質のいずれか又はすべての非自然発生変異体についても言う。本明細書に使用されるように、用語「変異体」は、すべての上記自然発生変異体及び非自然発生変異体を包含する。特に、本発明は、ＡＲＦ及びＣＲＦを含む腎疾患の治療処置又は予防処置に有用である特色を保持する並びに／又はＢＭＰ−７活性を保持するすべての上記変異体を包含する。
【００５９】
これらの機能的に等価な変異体、誘導体、及び断片その他は、ＢＭＰ−７活性を保持する能力を示す。機能的等価物は、本明細書に使用されるように、以下の２つの基準のいずれかを満たす、あらゆるＢＭＰ−７の変異体、誘導体、断片その他について言う（ａ）それらは、かなりのレベルのアミノ酸配列相同性を、本明細書に記載されるＢＭＰ−７のタンパク質配列と有する若しくはかなりのレベルのヌクレオチド配列相同性を、本明細書に記載されるＢＭＰ−７のタンパク質配列と有するヌクレオチドによりコードされる；又は（ｂ）それらは、げっ歯類での腎不全の以下の実験モデルの少なくとも１つで、プラセボ処置群と比較した処置群で、統計的に異なる応答を提供する能力を有する：（ｉ）毒物誘発性モデル又は虚血誘発性腎不全モデル、血漿クレアチニン又はＢＵＮの上昇の低下が、コントロール／プラセボ群と比較した処置群で予想される；（ii）腎不全のＵＵＯモデル、病変評点の低下が、コントロール／プラセボ群と比較した処置群で予想される。
【００６０】
本発明により包含される変異体、誘導体その他の例証として、本明細書に開示されるヌクレオチド配列と全く同じではないが、ヌクレオチド配列での変化が、コードされたアミノ酸配列を変化させない又はアミノ酸残基の保存的な置換、１つ又は少数のアミノ酸の欠失又は付加、コードされたポリペプチドの特性に著しく影響を及ぼさないアミノ酸類似体によるアミノ酸残基の置換その他をもたらす、ヌクレオチド配列によりコードされるＢＭＰ−７変異体、誘導体その他を含むが、これらに限定されない。保存的なアミノ酸置換の例は、グリシン／アラニン置換、バリン／イソロイシン／ロイシン置換、アスパラギン／グルタミン置換、アスパラギン酸／グルタミン酸置換、セリン／トレオニン／メチオニン置換、リシン／アルギニン置換、及びフェニルアラニン／チロシン／トリプトファン置換を含む。上記のような機能的ＢＭＰ−７誘導体をもたらす他の種類の置換体、変形物、付加体、欠失体、及び誘導体もまた本発明により包含され、当業者は、上記変異体又は誘導体の作製、同定、又は選択する方法及びそれらの変異体又は誘導体のＢＭＰ−７活性について試験する方法を容易に知るであろう。当業者は、潜在スプライス部位の除去により、開始コドンの前にＫｏｚａｋコンセンサス配列を導入することで、コドン使用頻度を適応させることにより、発現を改善するためにコドン使用頻度又はその組合せを変化させることにより、本発明のＢＭＰ−７ポリペプチドの発現を最適化してもよい。
【００６１】
他の実施形態では、本発明は、配列番号３の残基１〜４３１と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の相同性又は同一性を有するイヌ科プレプロＢＭＰ−７ポリペプチド変異体を含む。
【００６２】
他の実施形態では、本発明は、配列番号３の残基２９３〜残基４３１と少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、又は少なくとも９９％の相同性又は同一性を有するイヌ科成熟ＢＭＰ−７ポリペプチド変異体を含む。
【００６３】
本発明の目的のために、配列の同一性又は相同性は、配列ギャップを最小にしながら、重複及び同一性を最大にするように整列させて、配列を比較することにより決定される。特に、配列同一性は、多くの数学アルゴリズムのいずれかを使用して決定されてもよい。２つの配列の比較のために使用される数学アルゴリズムの非限定的な例は、Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 5873-5877におけるように修正されたKarlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87, 2264-2268のアルゴリズムである。
【００６４】
配列の比較のために使用される数学アルゴリズムの他の例は、Myers & Miller, CABIOS 1988,4, 11-17のアルゴリズムである。上記アルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）の中に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを活用すると、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティー、及び４のギャップペナルティーを使用することができる。局所的な配列の類似性の領域の同定及びアラインメントのためのさらに他の有用なアルゴリズムは、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 2444-2448に記載されるＦＡＳＴＡアルゴリズムである。
【００６５】
本発明による使用について有利なのは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ（ワシントン大学ＢＬＡＳＴ，Washington University BLAST）バージョン２．０ソフトウェアである。いくつかのＵＮＩＸ（登録商標）プラットフォームのためのＷＵ−ＢＬＡＳＴバージョン２．０実行可能プログラムは、ftp://blast.wustl.edu/blast/executablesからダウンロードすることができる。このプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴバージョン１．４に基づき、これは、同様に、パブリックドメインＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴバージョン１．４に基づく（Altschul & Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods in Enzymology 266, 460-480；Altschul et al., Journal of Molecular Biology 1990, 215, 403-410；Gish & States, Nature Genetics, 1993, 3: 266-272；Karlin & Altschul, 1993,Proc, Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5877、これらのすべてが参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６６】
一般に、アミノ酸配列の比較は、構造が知られているポリペプチドのアミノ酸配列を、構造が知られていないポリペプチドのアミノ酸配列と整列させることにより達成される。次いで、配列中のアミノ酸は比較され、相同であるアミノ酸の群は、共に一まとめにされる。この方法は、ポリペプチドの保存領域を検出し、アミノ酸挿入及び欠失の説明となる。アミノ酸配列の間の相同性は、市販で入手可能なアルゴリズムの使用により決定することができる（上記の相同性の記載もまた参照されたい）。他の本明細書で言及されたアルゴリズムの他に、言及はまた、National Center for Biotechnology Informationにより提供されるＢＬＡＳＴ、ギャップＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムについても成される。これらのプログラムは、当技術分野で、この目的のために広範に使用され、２つのアミノ酸配列の相同領域を整列させることができる。
【００６７】
スーツ中のすべての検索プログラムで、ギャップアラインメントルーチンはデータベース検索自体と一体化している。ギャッピングは、所望の場合、止めることができる。長さ１のギャップについてのデフォルトペナルティー（Ｑ）は、タンパク質及びＢＬＡＳＴＰについてはＱ＝９及びＢＬＡＳＴＮについてはＱ＝１０であるが、任意の整数に変化させてもよい。ギャップを拡大するためのデフォルトの残基ごとのペナルティー（Ｒ）は、タンパク質及びＢＬＡＳＴＰについてはＲ＝２及びＢＬＡＳＴＮについてはＲ＝１０であるが、任意の整数に変化させてもよい。Ｑ及びＲについての値の任意の組合せは、配列ギャップを最小にしながら重複及び同一性を最大にするよう配列を整列させるために使用することができる。デフォルトアミノ酸比較マトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２であるが、ＰＡＭ等の他のアミノ酸比較マトリックスを活用することができる。
【００６８】
好ましい実施形態では、本発明は、イヌ科プレプロＢＭＰ−７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有し、且つ発現する、より好ましくは、配列番号１のヌクレオチド１〜１２９６を含有し、且つ発現するベクターを提供する。好ましくは、このベクターは、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現する。
【００６９】
一実施形態では、ペプチドシグナル（プレペプチド）配列は、位置（１）のＭｅｔ残基から位置（２９）のＡｌａ残基まで及び、アミノ酸残基の番号付けは、配列番号３として同定されたプレプロＢＭＰ−７配列の番号付けとする。シグナルペプチドの開裂は、Ａｌａ（２９）残基の後に生じてもよい。プレＢＭＰ−７ペプチドの開裂の後に、プロＢＭＰ−７ポリペプチドは、配列Arg-X-X-Arg（２９２）の後で二番目に開裂され、成熟ＢＭＰ−７ポリペプチドにつながる。
【００７０】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ポリペプチド断片」は、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーについて言及するために区別なく本明細書に使用される。
【００７１】
ある種の実施形態では、発現ベクターは、イヌ科成熟ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリペプチドは、イヌ科ＢＭＰ−７シグナルペプチドである又はそれを含む又はそれに由来するペプチドシグナル配列に融合される。他の実施形態では、シグナルペプチド配列は、他のＢＭＰ−７シグナルペプチドである又はそれを含む又はそれに由来してもよい。
【００７２】
本発明は、さらに、プロＢＭＰ−７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有し、且つ発現するベクターに関し、プレＢＭＰ−７シグナルペプチドが削除され、異なる起源からのペプチドシグナル配列がプロＢＭＰ−７ポリペプチドに融合される。たとえば、ある種の実施形態では、そのペプチドシグナル配列は、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−１）ペプチドシグナル配列又は組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）ペプチドシグナル配列であってもよい。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドによりコードされるプロＢＭＰ−７は、イヌ科プロＢＭＰ−７ポリペプチドである。有利には、プロＢＭＰ−７は、配列番号１のヌクレオチド８８〜１２９６である又はそれを含む又はそれに由来する及び配列番号３のアミノ酸残基３０〜４３１に対応するアミノ酸配列をコードする又は含むポリヌクレオチドヌクレオチドによりコードされる。他の好ましい実施形態では、配列番号２に対応するコドン最適化イヌ科ヌクレオチド配列が使用される。
【００７３】
シグナルペプチドがＩＧＦ−１シグナルペプチドに由来する実施形態では、ペプチドシグナルは、ウマＩＧＦ−１ペプチドシグナルである又はそれを含む又はそれに由来し、好ましくは、ペプチドシグナルは、配列番号９のアミノ酸残基１〜２５により定義され、配列番号８のヌクレオチド１〜７５によりコードされることが好ましい。代わりの実施形態では、ＩＧＦ−１ペプチドシグナルは、イヌ科ＩＧＦ−１ペプチドシグナルであってもよく又はそれを含んでいてもよく又はそれに由来してもよく、好ましくは、配列番号１２のアミノ酸残基１〜２５により定義され、配列番号１１のヌクレオチド１〜７５によりコードされるイヌ科ＩＧＦ−１ペプチドシグナルである又はそれを含む又はそれに由来する。
【００７４】
他の実施形態では、ペプチドシグナルは、ヒトｔＰＡシグナルペプチド等のｔＰＡペプチドシグナルであってもよい又はそれを含んでいてもよい又はそれに由来してもよい。好ましい実施形態では、使用されるｔＰＡシグナルペプチドは、配列番号５のヒトｔＰＡシグナルペプチド配列のアミノ酸残基１〜２３であり又はそれを含み又はそれに由来し、配列番号４のヌクレオチド１〜６９によりコードされる。代替実施形態では、配列番号７のアミノ酸残基１〜２８であり又はそれを含み又はそれに由来し、配列番号６のヌクレオチド１〜８４によりコードされるヒトｔＰＡシグナルペプチドが、使用されてもよい。
【００７５】
本発明の有利な実施形態によれば、発現ベクターは、配列番号５、７、９、又は１２によるＩＧＦ１又はｔＰＡのシグナルペプチドをコードし、シグナルペプチドが削除されたプレプロＢＭＰ−７ポリペプチドに融合されたポリヌクレオチドを含む（残基３０〜残基４３１に対応する）。本発明の他の実施形態によれば、発現ベクターは、成熟ＢＭＰ−７に融合された、ＩＧＦ１又はｔＰＡのシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む（残基２９３〜残基４３１に対応する）。所望の配列を含むポリヌクレオチドは、適した発現ベクターに挿入することができ、ベクターは、同様に、複製及び増幅のための適した宿主細胞、たとえば大腸菌（E. coli）中に導入することができる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本発明は、イヌ科プレプロＢＭＰ−７、イヌ科プロＢＭＰ−７、イヌ科成熟ＢＭＰ−７、又はその変異体若しくは断片を発現することができるベクターを包含する。成熟ＢＭＰ−７又はプロＢＭＰ−７については、ペプチドシグナルをインフレームでコードするヌクレオチド配列は、細胞外培地中へのＢＭＰ−７の分泌を促進するために、ペプチドをコードするヌクレオチド配列に隣接して先行することが好ましい。シグナル配列は、プレプロＢＭＰ−７からの本来の配列又は分泌タンパク質からのペプチドシグナル、たとえば組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質（ｔＰＡ）、特にヒトｔＰＡからのシグナルペプチド（S. Friezner Degen et al J. Biol. Chem. 1996, 261, 6972-6985;R. Rickles et al J. Biol. Chem. 1988, 263, 1563-1569;D. Berg. et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991, 179, 1289-1296）、又はインスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、特にウマ科ＩＧＦ１（K. Otte et al. Gen. Comp. Endocrinol. 1996, 102(1),11-15）、イヌ科ＩＧＦ１（P. Delafontaine et al. Gene 1993, 130, 305-306）、ネコ科ＩＧＦ１（国際公開第０３／０２２８８６）、ウシＩＧＦ１（S. Lien et al. Mamm. Genome 2000, 11(10), 877-882）、ブタＩＧＦ１（M. Muller et al. Nucleic Acids Res. 1990, 18(2), 364）、ニワトリＩＧＦ１（Y. Kajimoto et al. Mol. Endocrinol. 1989, 3(12), 1907-1913）、シチメンチョウＩＧＦ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０７４９８０）からのシグナルペプチドとすることができる。ＩＧＦ１からのシグナルペプチドは、本来のものであってもよく又は最適化されてもよく、特に、潜在スプライス部位を除去することにより及び／又はコドン使用頻度を適応させることにより最適化されてもよい。
【００７７】
本明細書に使用されるように、用語「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドについて言うために使用され、このヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含有する。
【００７８】
本発明は、プロモーター要素に操作可能に連結され、エンハンサーにさらに連結されていてもよいＢＭＰ−７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有し、且つ発現するベクターをさらに包含する。有利な実施形態では、プロモーターは、好ましくはヒト由来ＣＭＶ又はネズミ由来ＣＭＶからの、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ，cytomegalovirus）前初期遺伝子のプロモーターである。他の実施形態では、エンハンサー及び／又はプロモーターは、当技術分野で知られており、本発明のベクター中でのＢＭＰ−７の発現に適したプロモーターの中から選択されてもよい。多くの上記プロモーターは、当技術分野で知られており、適したプロモーターは、当業者により容易に選択することができる。たとえば、様々な細胞特異的プロモーター及び／又は組織特異的プロモーター（たとえば筋肉、内皮細胞、肝臓、体細胞、及び幹細胞に特異的なプロモーター）並びに様々なウイルスプロモーター及びウイルスエンハンサー並びに各動物種について同質遺伝子的に特異的なＢＭＰ−７プロモーター等のＢＭＰ−７プロモーターがある。たとえば、一実施形態では、イヌ科ＢＭＰ−７がイヌ科筋細胞中で発現されることになる場合、イヌ科筋細胞に特異的なエンハンサー及び／又はプロモーターは、イヌ科ＢＭＰ−７の発現を所望の適用に最適化させるために使用されてもよい。筋特異的プロモーター及び筋特異的エンハンサーの例は記載されており、当業者に知られている（たとえばLi et al., Gene Ther. 1999 Dec, 6(12),2005-11、Li et al., Nat Biotechnol. 1999 Mar, 17(3), 241-5、及び Loirat et al., Virology. 1999, Jul 20,260(1), 74-83を参照されたい、これらの開示は、参照によりそれらの全体が組み込まれる）。
【００７９】
本発明で利用されてもよいプロモーター及びエンハンサーは、ラウス肉腫ウイルス（Rous sarcoma virus）のＬＴＲ、ＨＳＶ−１のＴＫ遺伝子、ＳＶ４０の初期プロモーター又は後期プロモーター、アデノウイルス（adenovirus）の主要後期プロモーター（ＭＬＰ，major late promoter）、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、α−１抗トリプシン遺伝子、アルブミン遺伝子、コラーゲナーゼ遺伝子、エラスターゼＩ遺伝子、β−アクチン遺伝子、β−グロビン遺伝子、γ−グロビン遺伝子、α−フェトプロテイン遺伝子、並びに筋クレアチンキナーゼ遺伝子のプロモーター及びエンハンサーを含むが、これらに限定されない。
【００８０】
一般に、真核細胞で機能的な強力なプロモーターを利用することが有利である。好ましい強力なプロモーターは、ヒト又はマウス起源の又はラット若しくはモルモット等の他の起源を有していてもよい前初期サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ，immediate early cytomegalovirus promoter）である。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、実際のプロモーター部を含むことができ、このプロモーター部は、エンハンサー部に関連していてもよく又はしていなくてもよい。参照は、欧州特許出願公開第２６０１４８号、欧州特許出願公開第３２３５９７号、米国特許第５，１６８，０６２号、第５，３８５，８３９号、及び第４，９６８，６１５号、並びにＰＣＴ出願国際公開第８７／０３９０５号について成すことができる。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、有利にはヒトＣＭＶ−ＩＥ（Boshart M. et al., Cell., 1985, 41, 521-530）又はネズミＣＭＶ−ＩＥである。
【００８１】
より一般的な用語では、プロモーターは、ウイルス起源又は細胞起源のいずれかを有する。本発明の実施において有用に利用されてもよいＣＭＶ−ＩＥ以外の強力なウイルスプロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの初期／後期プロモーター又はラウス肉腫ウイルスのＬＴＲプロモーターである。本発明の実施において有用に利用されてもよい強力な細胞プロモーターは、たとえばデスミンプロモーター（Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18, 2337-2344）又はアクチンプロモーター（Miyazaki J. et al., Gene, 1989, 79, 269-277）等の、細胞骨格の遺伝子のプロモーターである。
【００８２】
これらのプロモーターの機能的細断片、つまり適当な促進活性を維持しているプロモーターの部分、たとえば、ＰＣＴ出願国際公開第９８／００１６６号又は米国特許第６，１５６，５６７号による切断ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、本発明の範囲内に含まれ、本発明の実施において使用することができる。本発明の実施におけるプロモーターは、適当な促進活性を維持し、したがってプロモーターとして機能する、完全長プロモーターの誘導体及び細断片を結果的に含み、好ましくは、誘導体又は細断片が由来する実際のプロモーター又は完全長プロモーターの活性に実質的に類似する、たとえば、米国特許第６，１５６，５６７号の切断ＣＭＶ−ＩＥプロモーターの活性に、完全長ＣＭＶ−ＩＥプロモーターの活性に類している活性を促進する。したがって、本発明の実施におけるＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、完全長プロモーターのプロモーター部分及び／又は完全長プロモーターのエンハンサー部分並びに誘導体及び細断片を含む又はそれらから本質的に成る又はそれらから成ることができる。
【００８３】
好ましくは、プラスミドは、他の発現コントロール要素を含む。安定化配列（複数可）、たとえば、イントロン配列（複数可）、好ましくはｈＣＭＶ−ＩＥの第１のイントロン（ＰＣＴ出願国際公開第８９／０１０３６号）、ウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンII（van Ooyen et al., Science, 1979, 206, 337-344）を組み込むことは特に有利である。ポックスウイルス（poxvirus）以外のプラスミド及びウイルスベクターについてのポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙＡ）に関して、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）遺伝子のポリ（Ａ）シグナル（米国特許第５，１２２，４５８号を参照されたい）又はウサギβ−グロビン遺伝子のポリ（Ａ）シグナル又はＳＶ４０ウイルスのポリ（Ａ）シグナルをさらに使用することができる。
【００８４】
用語「ベクター」は、本明細書に使用されるように、標的細胞にインビボ等で送達されることになる異種ポリヌクレオチドを含む、組換えＤＮＡ又は組換えＲＮＡのプラスミド又はウイルスについて言う。異種ポリヌクレオチドは、療法の目的のための所望の配列を含んでいてもよく、発現カセットの形態をしていてもよい。本明細書に使用されるように、「ベクター」は、最終の標的細胞又は被検体中で複製することができる必要はない。
【００８５】
本明細書に使用される用語「組換え」は、半合成又は合成起源のポリヌクレオチドを意味し、このポリヌクレオチドは、自然界で生じない又は他のポリヌクレオチドに、自然界で見い出されない配置で連結される。
【００８６】
用語「異種」は、本明細書に使用されるように、それが並んでいる実体の残りと遺伝子的に別々の実体に由来することを意味する。たとえば、ポリヌクレオチドは、遺伝子工学技術により、異なる源に由来するプラスミド又はベクター中に配置されてもよく、したがって、異種ポリヌクレオチドとなる。したがって、その本来のコード配列から除去され、本来の配列以外のコード配列に作動的に連結されたプロモーターは、異種プロモーターである。
【００８７】
本発明のポリヌクレオチドは、同じ転写単位内の付加的なコード配列、プロモーター等のコントロール要素、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、同じ又は異なるプロモーターのコントロール下の付加的な転写単位、宿主細胞のクローニング、発現、相同組換え、及び形質転換を可能にする配列、並びに本発明の実施形態を提供するのに望ましい可能性のある任意の同様の構築物等の付加的な配列を含んでいてもよい。
【００８８】
イヌ科ＢＭＰ−７の発現のための要素は、発明のベクター中に有利に存在する。最小限の様式では、これは、開始コドン（ATG）、停止コドン、及びプロモーターを含み、それらから本質的に成り、又はそれらから成り、さらに、プラスミド及びある種のウイルスベクター、たとえばポックスウイルス以外のウイルスベクター等のある種のベクターのためのポリアデニル化配列を含んでいてもよい、それらから本質的に成っていてもよい、又はそれらから成っていてもよい。ポリヌクレオチドが、ポリペプチド断片、たとえばイヌ科ＢＭＰ−７をベクター中で有利にコードする場合、ATGは、リーディングフレームの５’に配置され、停止コドンは３’に配置される。エンハンサー配列、イントロン等の安定化配列、及びタンパク質の分泌を可能にするシグナル配列等の、発現をコントロールするための他の要素が存在していてもよい。インビボでの、本発明の遺伝子の遺伝子産物の発現のためのベクター又は組換え体又はプラスミドを作製する及び／又は投与する方法は、任意の所望の方法、たとえば、以下の中で開示される又は以下の中で引用される文献の中で開示される方法に似た方法とすることができる：米国特許第４，６０３，１１２号；第４，７６９，３３０号；第４，３９４，４４８号；第４，７２２，８４８号；第４，７４５，０５１号；第４，７６９，３３１号；第４，９４５，０５０号；第５，４９４，８０７号；第５，５１４，３７５号；第５，７４４，１４０号；第５，７４４，１４１号；第５，７５６，１０３号；第５，７６２，９３８号；第５，７６６，５９９号；第５，９９０，０９１号；第５，１７４，９９３号；第５，５０５，９４１号；第５，３３８，６８３号；第５，４９４，８０７号；第５，５９１，６３９号；第５，５８９，４６６号；第５，６７７，１７８号；第５，５９１，４３９号；第５，５５２，１４３号；第５，５８０，８５９号；第６，１３０，０６６号；第６，００４，７７７号；第６，１３０，０６６号；第６，４９７，８８３号；第６，４６４，９８４号；第６，４５１，７７０号；第６，３９１，３１４号；第６，３８７，３７６号；第６，３７６，４７３号；第６，３６８，６０３号；第６，３４８，１９６号；第６，３０６，４００号；第６，２２８，８４６号；第６，２２１，３６２号；第６，２１７，８８３号；第６，２０７，１６６号；第６，２０７，１６５号；第６，１５９，４７７号；第６，１５３，１９９号；第６，０９０，３９３号；第６，０７４，６４９号；第６，０４５，８０３号；第６，０３３，６７０号；第６，４８５，７２９号；第６，１０３，５２６号；第６，２２４，８８２号；第６，３１２，６８２号；第６，３４８，４５０号及び；第６，３１２，６８３号；１９８６年１０月１６日に提出された米国特許出願第９２０，１９７号；国際公開第９０／０１５４３号；国際公開第９１／１１５２５号；国際公開第９４／１６７１６号；国際公開第９６／３９４９１号；国際公開第９８／３３５１０号；欧州特許第２６５７８５号；欧州特許第０３７０５７３号；Andreansky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93: 11313-11318；Ballay et al., EMBO J. 1993; 4: 3861-65；Felgner et al., J. Biol. Chem. 1994; 269, 2550-2561；Frolov et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 1996, 93, 11371-11377��Graham, Tibtech 1990, 8, 85-87；Grunhaus et al., Sem. Virol. 1992, 3, 237-52；Ju et al., Diabetologia 1998, 41, 736-739；Kitson et al., J. Virol. 1991, 65, 3068-3075；McClements et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 11414-11420；Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 11341-11348；Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 11349-11353；Pennock et al., Mol. Cell. Biol. 1984,4,399-406；Richardson (Ed), Methods in Molecular Biology 1995, 39, "Baculovirns Expression Protocols," Humana Press Inc.；Smith et al, (1983) Mol. Cell. Biol. 1983, 3, 2156-2165；Robertson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 11334-11340；Robinson et al., Sem. Immunol. 1997, 9, 271；並びにRoizman, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 1996, 93, 11307-11312。したがって、本発明におけるベクターは、ポックスウイルス（たとえばワクシニアウイルス（vaccinia virus）、トリポックスウイルス（avipox virus）、カナリアポックスウイルス（canarypox virus）、鶏痘ウイルス（fowlpox virus）、アライグマポックスウイルス（raccoonpox virus）、豚痘ウイルス（swinepox virus）等）、アデノウイルス（たとえばヒトアデノウイルス、イヌ科アデノウイルス）、ヘルペスウイルス（herpesvirus）（たとえばイヌ科ヘルペスウイルス）、バキュロウイルス（baculovirus）、レトロウイルス（retrovirus）等のような任意の適した組換えウイルス又はウイルスベクターとすることができる（本明細書に参照により組み込まれた文献中のもの）；又はベクターはプラスミドとすることができる。参考文献により本明細書に引用され、組み込まれるベクターは、本発明の実施において有用なベクターの例を提供するだけではない。
【００８９】
本発明の一実施形態によれば、発現ベクターは、ウイルスベクター、特にインビボ発現ベクターである。有利な実施形態では、発現ベクターは、アデノウイルスベクターである。有利には、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス５型（ｈＡｄ５）ベクターであるＥ１欠失及び／又はＥ３欠失アデノウイルスである。
【００９０】
特定の一実施形態では、ウイルスベクターは、ポックスウイルス、たとえばワクシニアウイルス若しくは弱毒化ワクシニアウイルス（たとえば、ニワトリ胚線維芽細胞上での、アンカラワクチン株の５７０回を超える継代の後に得られたＭＶＡ、修飾アンカラ株；Stickl & Hochstein-Mintzel, Munch. Med. Wschr., 1971, 113, 1149-1153；Sutter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992, 89, 10847-10851を参照されたい；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１５０８として利用可能；又はＮＹＶＡＣ、米国特許第５，４９４，８０７号を参照されたい、たとえば米国特許第５，４９４，８０７号実施例１〜６以下参照、この特許は、ＮＹＶＡＣ及びコペンハーゲン株ワクシニアウイルスゲノムからさらにＯＲＦが欠失し、異種コード核酸分子がこの組換え体の部位に挿入されたＮＹＶＡＣの変形物の構築について並びにマッチしたプロモーターの使用についても論じている；国際公開第９６／４０２４１号もまた参照されたい）、トリポックスウイルス若しくは弱毒化トリポックスウイルス（たとえばカナリアポックス、鶏痘、鳩痘（dovepox）、鳩痘（pigeonpox）、ウズラ痘、ＡＬＶＡＣ、又はＴＲＯＶＡＣ；たとえば、米国特許第５，５０５，９４１号、第５，４９４，８０７号を参照されたい）、豚痘ウイルス、アライグマポックスウイルス、ラクダ痘ウイルス（camelpox virus）、又は粘液腫症ウイルス（myxomatosis virus）である。
【００９１】
本発明の他の実施形態によれば、ポックスウイルスベクターは、カナリアポックスウイルスベクター又は鶏痘ウイルスベクターであり、有利には、弱毒化カナリアポックスウイルス又は鶏痘ウイルスである。これに関しては、カナリアポックスは、アクセス番号ＶＲ−１１１でＡＴＣＣから利用可能である。弱毒化カナリアポックスウイルスは、米国特許第５，７５６，１０３号（ＡＬＶＡＣ）及びＰＣＴ出願国際公開第０１／０５９３４号に記載される。多数の鶏痘ウイルスワクチン接種株もまた利用可能である、たとえば、MERIAL社により販売されるＤＩＦＴＯＳＥＣ  ＣＴ株及びINTERVET社により販売されるＮＯＢＩＬＩＳ  ＶＡＲＩＯＬＥワクチン；弱毒化鶏痘株ＴＲＯＶＡＣに関係する米国特許第５，７６６，５９９号もまた参照されたい。
【００９２】
その組換え体を生成するための方法及びその組換え体を投与する方法についての情報については、当業者は、本明細書に引用される文献及びＰＣＴ出願国際公開第９０／１２８８２号を参照することができ、たとえば、ワクシニアウイルスに関しては、米国特許第４，７６９，３３０号、第４，７２２，８４８号、第４，６０３，１１２号、第５，１１０，５８７号、第５，４９４，８０７号、及び第５，７６２，９３８号がとりわけ言及され；鶏痘に関しては、米国特許第５，１７４，９９３号、第５，５０５，９４１号、及び米国特許第５，７６６，５９９号がとりわけ言及され；カナリアポックスに関しては、米国特許第５，７５６，１０３号がとりわけ言及され；豚痘に関しては、米国特許第５，３８２，４２５号がとりわけ言及され；アライグマポックスに関しては、ＰＣＴ出願国際公開第００／０３０３０号がとりわけ言及される。
【００９３】
発現ベクターが、ワクシニアウイルスである場合、発現されることになる１つ又は複数のポリヌクレオチドのための１つ又は複数の挿入部位は、有利には、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子又は挿入部位、ヘマグルチニン（ＨＡ，hemagglutinin）遺伝子又は挿入部位、Ａ型の封入体（ＡＴＩ，inclusion body of the A type）をコードする領域である；本明細書に引用される文献、とりわけワクシニアウイルスに関係する文献もまた参照されたい。カナリアポックスの場合には、有利には、１つ又は複数の挿入部位は、ＯＲＦ（複数可）Ｃ３、Ｃ５、及び／又はＣ６である；本明細書に引用される文献、とりわけカナリアポックスウイルスに関係する文献もまた参照されたい。鶏痘の場合には、有利には、１つ又は複数の挿入部位は、ＯＲＦ  Ｆ７及び／又はＦ８である；本明細書に引用される文献、とりわけ鶏痘ウイルスに関係する文献もまた参照されたい。ＭＶＡウイルスのための１つ又は複数の挿入部位は、有利には、Carroll M. W. et al., Vaccine, 1997, 15 (4), 387-394；Stittelaar K. J. et al., J. Virol. 2000, 74 (9),4236-4243；Sutter G. et al., 1994, Vaccine, 12 (11), 1032-1040を含むが、これらに限定されない様々な刊行物におけるようなものとし、これに関しては、完全なＭＶＡゲノムは、当業者が他の挿入部位又は他のプロモーターを使用することができるようにするAntoine G., Virology, 1998, 244, 365-396に記載されることにも留意されたい。有利には、発現されることになるポリヌクレオチドは、特異的ポックスウイルスプロモーター、たとえば、とりわけ、ワクシニアプロモーター７．５ｋＤａ（Cochran et al., J. Virology, 1985, 54, 30-35）、ワクシニアプロモーターＩ３Ｌ（Riviere et al., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434）、ワクシニアプロモーターＨＡ（Shida, Virology, 1986,150,451-457）、牛痘プロモーターＡＴＩ（Funahashi et al., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47）、ワクシニアプロモーターＨ６（Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6, 504-508；Guo P. et al. J. Virol., 1989, 63, 4189-4198；Perkus M. et al., J. Virol., 1989, 63, 3829-3836）のコントロールの下で挿入される。
【００９４】
特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス（ＨＡＶ，human adenovirus）又はイヌ科アデノウイルス（ＣＡＶ，canine adenovirus）等のアデノウイルスである。
【００９５】
一実施形態では、ウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス、不可欠なゲノムのＥ１領域、アクセッション番号Ｍ７３２６０の下でＧｅｎｂａｎｋで及び参考刊行物J. Chroboczek et al Virol. 1992, 186, 280-285で開示されるｈＡｄ５の配列を参照するところによる特に約ヌクレオチド４５９〜約ヌクレオチド３５１０における欠失により複製することができなくされた特に血清型５アデノウイルスである。欠失アデノウイルスは、Ｅ１発現２９３細胞中で（F. Graham et al J. Gen. Virol. 1977, 36, 59-72）又はＰＥＲ細胞、特にＰＥＲ．Ｃ６細胞中で増殖する（F. Falloux et al Human Gene Therapy 1998, 9, 1909-1917）。ヒトアデノウイルスは、Ｅ３領域において、特に、約ヌクレオチド２８５９２〜約ヌクレオチド３０４７０において欠失させることができる。Ｅ１領域における欠失は、Ｅ３領域における欠失と組み合わせて行うことができる（たとえばJ. Shriver et al. Nature, 2002, 415, 331-335, F. Graham et al Methods in Molecular Biology Vo1.7: Gene Transfer and Expression Protocols Edited by E. Murray, The Human Press Inc, 1991, p 109-128；Y. Dan et al Proc. Natl. Acad. Sci. 1997, 94, 2587-2592；米国特許第6,133,028号；米国特許第6,692,956号；S. Tripathy et al Proc. Natl. Acad. Sci. 1994, 91, 11557-11561；B. Tapnell Adv. Drug Deliv. Rev. 1993, 12, 185-199；X. Danthinne et al Gene Thrapy 2000, 7, 1707-1714；K. Berkner Bio Techniques 1988, 6, 616-629；K. Berkner et al Nucl. Acid Res. 1983, 11, 6003-6020；C. Chavier et al J, Virol. 1996, 70,4805-4810を参照されたい）。挿入部位は、最終的な、Ｅ１領域及び／又はＥ３領域の部分的な又は完全な欠失の後のＥ１座及び／又はＥ３座（領域）とすることができる。有利には、発現ベクターがアデノウイルスである場合、発現されることになるポリヌクレオチドは、強力なプロモーター、好ましくは、M. Boshart et al Cell 1985, 41, 521-530におけるサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥプロモーター）、特に、約ヌクレオチド−７３４〜約ヌクレオチド＋７のエンハンサー／プロモーター領域又はPROMEGA Corp社製のｐＣＩベクターからのエンハンサー／プロモーター領域等の、真核細胞において機能的なプロモーターのコントロールの下に挿入される。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、有利には、ネズミ又はヒト由来である。延長因子１αのプロモーターもまた使用することができる。特定の一実施形態では、筋特異的プロモーターが使用することができる（X. Li et al Nat. Biotechnol. 1999, 17, 241-245）。強力なプロモーターはまた、プラスミドベクターに関しても本明細書に論じられる。一実施形態では、スプライシング配列は、エンハンサー／プロモーター領域の下流に位置させることができる。たとえば、ＣＭＶ−ＩＥ遺伝子から単離されたイントロン１（R. Stenberg at al J. Virol. 1984, 49, 190）、ウサギβ−グロビン遺伝子若しくはヒトβ−グロビン遺伝子から単離されたイントロン、特に、β−グロビン遺伝子からのイントロン２、免疫グロブリン遺伝子から単離されたイントロン、ＳＶ４０初期遺伝子からのスプライシング配列、又はマウス免疫グロブリンアクセプター配列に融合されたヒトβ−グロビンドナー配列を含む、Promega Corp.社製のｐＣＩベクターから単離されたキメライントロン配列（アクセッション番号ＣＶＵ４７１２０の下のＧｅｎｂａｎｋにおける約ヌクレオチド８９０〜約ヌクレオチド１０２２）。ポリ（Ａ）配列及び終結配列、たとえば、ウシ成長ホルモン遺伝子ポリアデニル化シグナル、特に、アクセッション番号ＢＯＶＢＭＰ−７の下のＧｅｎｂａｎｋにおける約ヌクレオチド２３３９〜約ヌクレオチド２５５０、ウサギβ−グロビン遺伝子ポリアデニル化シグナル、又はＳＶ４０後期遺伝子ポリアデニル化シグナルは、発現されることになるポリヌクレオチドの下流に挿入することができる。
【００９６】
他の実施形態では、ウイルスベクターは、イヌ科アデノウイルス、特にＣＡＶ−２である（たとえばL. Fischer et al. Vaccine, 2002, 20, 3485-3497；米国特許第５，５２９，７８０号；米国特許第５，６８８，９２０号；ＰＣＴ出願国際公開第９５／１４１０２号を参照されたい）。ＣＡＶについては、挿入部位は、Ｅ３領域並びに／又はＥ４領域及び右側のＩＴＲ領域の間に位置する領域とすることができる（米国特許第６，０９０，３９３号；米国特許第６，１５６，５６７号を参照されたい）。一実施形態では、インサートは、サイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥプロモーター）又はヒトアデノウイルスベクターについて既に記載されたプロモーター等のプロモーターのコントロール下とする。ポリ（Ａ）配列及び終結配列、たとえばウシ成長ホルモン遺伝子ポリアデニル化シグナル又はウサギβ−グロビン遺伝子ポリアデニル化シグナルは、発現されることになるポリヌクレオチドの下流に挿入することができる。
【００９７】
他の特定の実施形態では、ウイルスベクターは、イヌ科ヘルペスウイルス（ＣＨＶ，canine herpesvirus）又はネコ科ヘルペスウイルス（ＦＨＶ，feline herpesvirus）等のヘルペスウイルスである。ＣＨＶについては、挿入部位は、特に、チミジンキナーゼ遺伝子、ＯＲＦ３、又はＵＬ４３  ＯＲＦ中としてもよい（米国特許第６，１５９，４７７号を参照されたい）。一実施形態では、発現されることになるポリヌクレオチドは、真核細胞において機能的なプロモーター、有利には、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター（ネズミ又はヒト）のコントロールの下に挿入される。特定の一実施形態では、低酸素により調節されるプロモーター、たとえばK. Boast et al Human Gene Therapy 1999, 13, 2197-2208)に記載されるプロモーターＨＲＥが使用することができる。ポリ（Ａ）配列及び終結配列、たとえばウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル又はウサギβ−グロビン遺伝子ポリアデニル化シグナルは、発現されることになるポリヌクレオチドの下流に挿入することができる。
【００９８】
本発明の他の実施形態によれば、発現ベクターは、プラスミドベクター又はＤＮＡプラスミドベクター、特にインビボ発現ベクターである。特定の、非限定的な実施例では、pVR1020又はpVR1012プラスミド（VICAL Inc.社製;Luke C. et al., Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91-97；Hartikka J. et al., Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217）は、ポリヌクレオチド配列の挿入のためのベクターとして活用することができる。pVR1020プラスミドは、pVR1012に由来し、ヒトｔＰＡシグナル配列を含有する。一実施形態では、ヒトｔＰＡシグナルは、アクセッション番号ＨＵＭＴＰＡ１４の下のＧｅｎｂａｎｋにおけるアミノ酸Ｍｅｔ（１）〜アミノ酸Ｓｅｒ（２３）又はＡｌａ（２８）を含む。他の特定の非限定的な実施例では、ポリヌクレオチド配列の挿入のためのベクターとして活用されるプラスミドは、アクセッション番号Ｕ２８０７０の下のＧｅｎｂａｎｋにおけるアミノ酸Ｍｅｔ（２４）〜アミノ酸Ａｌａ（４８）のウマ科ＩＧＦ１のシグナルペプチド配列を含有することができる。
【００９９】
用語プラスミドは、本発明によるポリヌクレオチド及び所望の宿主又は標的の１つ又は複数の細胞におけるそのインビボ発現のために必要な要素を含むあらゆるＤＮＡ転写単位を包含し、これに関しては、スーパーコイルプラスミド、非スーパーコイルプラスミド、環状プラスミド、及び線状形態が本発明の範囲内にあることが意図されることに留意されたい。各プラスミドは、プレプロＢＭＰ−７、プロＢＭＰ−７、又は成熟ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの他に、プロモーターに操作可能に連結された又はプロモーターのコントロール下の又はプロモーターに依存した好ましくはイヌ科起源からのＢＭＰ−７ポリペプチド、変異体、類似体、又は断片を含む又はそれを含有する又はそれから本質的に成る。
【０１００】
本発明はまた、適切な又は適した条件下のインビボで又は適した宿主細胞中で発現するベクターを含む医薬組成物にも関する。医薬組成物は、１つ又は複数のベクター、たとえば、ＢＭＰ−７シグナルペプチド、ＩＧＦ−１シグナルペプチド、又はｔＰＡシグナルペプチドに融合されていてもよいＢＭＰ−７ポリペプチドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド含み、それらから本質的に成り、又はそれらから成り、且つそれらを発現するインビボ発現ベクター等の発現ベクターを、薬学的に又は獣医学的に許容し得る担体、賦形剤、又は媒体中で含む、それらから本質的に成る、又はそれらから成ることができる。有利には、ベクターは、ＢＭＰ−７シグナルペプチド、ＩＧＦ−１シグナルペプチド、又はｔＰＡシグナルペプチドに融合されていてもよいイヌ科ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを、薬学的に又は獣医学的に許容し得る担体、賦形剤、又は媒体中で含有し、それらから本質的に成り、又はそれらから成り、且つそれらを発現する。したがって、本発明の一実施形態によれば、組成物中の他の１つ又は複数のベクターは、イヌ科ＢＭＰ−７ポリペプチド以外の１つ又は複数の他のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードし、且つ適切な環境下で発現するポリヌクレオチドを含む。
【０１０１】
組成物は、イヌ科ＢＭＰ−７ペプチド又は融合タンパク質をコードし、有利にはインビボで、有利には発現するポリヌクレオチドを含有する、それらから本質的に成る、又はそれらから成る１つ又は複数のベクターを含有する。
【０１０２】
有利な実施形態では、本発明は、標的細胞におけるＢＭＰ−７ポリペプチドの送達及び発現のための、製剤の治療上有効な量の投与を提供する。治療上有効な量の決定は、当業者にとってルーチン的な実験作業である。一実施形態では、製剤は、ＢＭＰ−７ポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び薬学的に又は獣医学的に許容し得る担体、媒体、又は賦形剤を含む。有利な実施形態では、薬学的に又は獣医学的に許容し得る担体、媒体、又は賦形剤は、形質移入を促進する及び／又はベクターの保護を改善する。
【０１０３】
薬学的に又は獣医学的に許容し得る担体又は媒体又は賦形剤は、当業者によく知られている。たとえば、薬学的に又は獣医学的に許容し得る担体又は媒体又は賦形剤は、水又は０．９％ＮａＣｌ（たとえば生理食塩水）溶液又はリン酸緩衝液とすることができる。本発明の方法のために使用することができる、他の薬学的に又は獣医学的に許容し得る担体又は媒体又は賦形剤は、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）又はポリビニルピロリドンを含むが、これらに限定されない。薬学的に又は獣医学的に許容し得る担体又は媒体又は賦形剤は、ベクターの投与を促進する、発現のレベルを増加させる、又は発現の持続期間を増加させる任意の化合物又は化合物の組合せであってもよい。用量及び投薬量は、一般的な記載において本明細書に論じられ、さらに、当技術分野における知識と共に解釈される本開示から、いかなる必要以上の実験作業も伴わないで当業者により決定することができる。
【０１０４】
有利に、しかし排他的ではなく、プラスミドに適した、第四級アンモニウム塩を含有する陽イオン性脂質は、有利には以下の式を有する陽イオン性脂質である：
【０１０５】
【化１】
2009515529.tif 000006
【０１０６】
式中、Ｒ１は、１２〜１８個の炭素原子を有する飽和又は不飽和直鎖脂肪族ラジカルであり、Ｒ２は、２つ又は３つの炭素原子を含有する他の脂肪族ラジカルであり、Ｘは、アミン基又はヒドロキシル基であり、たとえばＤＭＲＩＥである。他の実施形態では、陽イオン性脂質は、中性脂質、たとえばＤＯＰＥに関連し得る。
【０１０７】
これらの陽イオン性脂質の中で、ＤＭＲＩＥ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシロキシ）−１−プロパンアンモニウム；ＰＣＴ出願国際公開第９６／３４１０９号）が好まれ、この陽イオン性脂質は、中性脂質に、有利にはＤＯＰＥ（ジオレオイル−ホスファチジル−エタノールアミン（dioleoyl-phosphatidyl-ethanol amine）；Behr J. P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389）に、有利に関連し、ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥを形成することができる。
【０１０８】
有利には、賦形剤を有するプラスミド混合物は、即席で、有利には調製物の投与と同時に、又は調製物の投与直前に形成され、たとえば投与の直前又は投与より前に、プラスミド−賦形剤混合物は、有利には、混合物が複合体を形成するよう、投与より前に、たとえば、投与より前の約３０分等の、投与より前の約１０分及び約６０分の間の十分な時間を与えるよう形成される。ＤＯＰＥが存在する場合、ＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥモル比は、有利には約９５：約５〜約５：約９５、より有利には約１：約１、たとえば１：１である。ＤＭＲＩＥ又はＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥアジュバント：プラスミド重量比は、約１０：約１及び約１：約５等の約５０：約１及び約１：約１０の間、有利には、約１：約１及び約１：約２、たとえば１：１及び１：２とすることができる。
【０１０９】
特定の実施形態では、医薬組成物は、直接インビボで投与され、コード化産物は、ベクターにより宿主中で発現する。ＢＭＰ−７ポリペプチド、有利にはイヌ科ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードするベクターをインビボで送達するための方法（たとえば、米国特許第６，４２３，６９３号；欧州特許公開第１０５２２８６号、欧州特許公開第１２０５５５１号、米国特許出願第２００４／００５７９４１号、ＰＣＴ出願国際公開第９９０５３００号、及びDraghia-Akli et al., Mol Ther. 2002 Dec, 6(6), 830-6；これらの開示は、参照によりそれらの全体が組み込まれる）は、本発明のＢＭＰ−７ポリペプチドをイヌ又はネコに送達するために修正することができる。本明細書に記載されるＢＭＰ−７をコードし、且つ発現するベクターのインビボ送達は、上述の参照が教示された当業者により達成することができる。
【０１１０】
有利には、本発明による医薬組成物及び／又は製剤は、本明細書に論じられる治療的応答を得るための、有効な含量の１つ又は複数の発現ベクターを含み又はそれらから本質的に成り又はそれらから成り、有効な含量は、本明細書に組み込まれる文献及び当技術分野における知識を含めて、本開示から、必要以上の実験作業を伴わないで決定することができる。
【０１１１】
プラスミドベクターをベースにした治療組成物及び／又は医薬組成物の場合には、用量は、大まかに言えば、ＢＭＰ−７ポリペプチドを発現するプラスミドの約１μｇ〜約２０００μｇ、有利には約５０μｇ〜約１０００μｇ、より有利には約１００μｇ〜約８００μｇを含む、それから本質的に成る、又はそれから成る。プラスミドベクターをベースにした医薬組成物が電気的導入を用いて投与される場合、プラスミドの用量は、一般に、約０．１μｇ及び１ｍｇの間、有利には約１μｇ及び１００μｇの間、有利には約２μｇ及び５０μｇの間となる。
【０１１２】
有利な実施形態では、本発明によるプラスミドベクター（複数可）を含む医薬組成物は、宿主細胞によるベクターの取り込みを改善するために、好ましくは、電気的導入を用いた筋肉内経路により投与される。電気的導入の、選択的な又は組合せの特色は、以下のとおりである：（１）単又は両極性電界、好ましくは単極；（２）１０〜２５０Ｖ／ｃｍ、好ましくは５０〜２００Ｖ／ｃｍで変動する電界；（３）１０〜５０ミリ秒、好ましくは１５〜２５ミリ秒の電気パルス持続期間；（４）１０〜９９０ミリ秒、好ましくは５０〜２５０ミリ秒で変動する、パルスの間の間隔；（５）１〜５０Ｈｚ、好ましくは４〜２０Ｈｚ、最も好ましくは６〜１０Ｈｚで変動する周波数；（６）１〜１５、好ましくは４〜１０で変動するパルス数；（７）処置の持続期間は、０．１及び５秒の間、好ましくは０．５及び２．５秒の間、最も好ましくは０．７５及び１．５秒の間で変動するであろう；（８）電極は、侵襲性又は非侵襲性とすることができる；（９）１回の処置当たりの電気的導入の数は、１及び１０の間、好ましくは１及び５の間、最も好ましくは１及び２の間で構成されるであろう、そして処置の頻度は、ＢＭＰ−７ポリペプチドが誘発された血漿濃度に基づいて確立されるであろう；（１０）電気的導入は、麻酔又は鎮静作用を伴って又は伴わないで適用することができる。電気的導入はまた、腎臓に対して直接実行することができる。
【０１１３】
プラスミドベクター（複数可）又はアデノウイルスベクター（複数可）を含む医薬組成物は、その代わりに、超音波穿通により投与することができる：（１）条件は、超音波暴露により誘発される剪断を回避するために定義される；プラスミド（複数可）は、ポリマーにより、好ましくは陽イオン性ポリマーにより保護することができる；（２）心エコー検査で使用される市販の造影剤（たとえばＰＥＳＤＡペルフルオロカーボン又はOptison）は、音響キャビテーション機構（又は他のもの）に基づいて、効力を改善するために使用することができる；（３）投与の経路は、好ましくは、腎臓のような内臓を標的とするのに興味がある筋肉内又は血管内（動脈内）とする；（４）診断上のパルス超音波は、連続波システムよりも好都合である；（５）効力は、プラスミド（複数可）が陽イオン化ゼラチンと複合体を形成する場合に高められる。
【０１１４】
その代わりに、最小限の組織損傷でインビボ遺伝子送達を高めるために、医薬組成物はまた、フェムト秒赤外レーザー（ＬＢＧＴ技術）を使用して投与することもできる。
【０１１５】
医薬組成物はまた血管送達により投与することもできる。薬力学に基づくプラスミドＤＮＡ遺伝子送達方法は、短期間内の多容量のＤＮＡ溶液の注射の後でのレシピエント動物における血液循環の流体力学の変化に基づく。門脈内又は肝臓内静脈注射を通した裸のＤＮＡの送達は、高度なレベルの遺伝子発現をもたらすことが実証された。哺乳動物腎臓中での特異的発現は、下大静脈（ＩＶＣ，inferior vena cava）への直接注射の後で達成することができる。この手技によると、腎臓中での発現は、他の器官よりも１０〜１０００倍高かった。
【０１１６】
投薬量は、約０．１及び約２ｍｌの間、有利には約０．２及び約１ｍｌの間とすることができる。これらの用量及び投薬量は、イヌ科の動物並びにウマ科の動物及びネコ科の動物等の他の哺乳動物標的種の処置のために適している。
【０１１７】
治療組成物及び／又は医薬組成物は、１用量当たり、約１０４〜約１０１１個、有利には約１０５〜約１０１０個、より有利には約１０６〜約１０９個の、ＢＭＰ−７ポリペプチドを発現する組換えアデノウイルスのウイルス粒子を含有する。ポックスウイルスをベースにした治療組成物及び／又は医薬組成物の場合には、用量は、約１０２ｐｆｕ及び約１０９ｐｆｕの間とすることができる。医薬組成物は、１用量当たり、約１０５〜１０９、有利には約１０６〜１０８ｐｆｕの、ＢＭＰ−７ポリペプチドを発現するポックスウイルス組換え体又はヘルペスウイルス組換え体を含有する。
【０１１８】
哺乳動物である標的種のための組成物の投薬量、たとえばウイルスベクターをベースにしたイヌ科組成物、たとえば非ポックスウイルスウイルスベクターベースの組成物の投薬量は、一般に約０．１及び約２．０ｍｌの間、好ましくは約０．１及び約１．０ｍｌの間、より好ましくは約０．５ｍｌ及び約１．０ｍｌの間である。
【０１１９】
本発明は、本発明によって作製された、効果的な量の治療組成物の、動物に対する少なくとも１回の投与を企図する。動物は、オス、メス、妊娠中のメス、及び新生仔であってもよい。この投与は、筋肉内（ＩＭ，intramuscular）、皮下（ＳＣ，subcutaneous）、血管内（ＩＶ，intravascular）、又は腎内注射を含むが、これらに限定されない様々な経路を介するものとすることができる。腎臓に達するための代替経路は、腎動脈、腎被膜下スペース中への注射、尿管からの逆行性注射、又は実質注射である。
【０１２０】
本発明による治療組成物はまた、無針装置により（たとえば、Pigjet、Biojector、又はVitajet装置（BIOJECT社製、オレゴン、米国）を用いて）投与することもできる。プラスミド組成物を投与するための他のアプローチは、電気的導入を使用することである（たとえば、S. Tollefsen et al. Vaccine, 2002, 20, 3370-3378；S. Tollefsen et al. Scand. J. Immunol., 2003, 57, 229-238；S. Babiuk et al., Vaccine, 2002, 20, 3399-3408；ＰＣＴ出願国際公開第９９／０１１５８号を参照されたい）。有利な実施形態では、動物は哺乳動物である。より有利な実施形態では、哺乳動物は、イヌ又はネコである。
【０１２１】
本発明の組成物の投与に関する、本明細書の本開示は、例として提供され、本発明は、記載される特定の例に限定されないことが当業者により理解されたい。本明細書の本開示から及び当技術分野における知識から、当業者は、投与の数、投与経路、及び本発明の組成物の各投与のために使用されることになる用量を、いかなる必要以上の実験作業も伴わないで決定することができる。
【０１２２】
好ましい実施形態では、本発明は、ＡＲＦ又はＣＲＦの処置及び／又は予防のための、イヌ科プレプロＢＭＰ−７、イヌ科プロＢＭＰ−７、イヌ科ＢＭＰ−７成熟ポリペプチド、又はその変異体、誘導体、若しくは断片をコードし、且つ発現することができるウイルスベクター又はプラスミドベクターを含む組成物及び組成物の使用に関する。しかしながら、本発明の他の実施形態では、本明細書に開示される方法並びに組成物は、他の腎臓の状態、障害、及び疾患、食欲不振症、体重減少、脱水、うつ病、嘔吐、多尿症、並びに／又は多渇症を含むがこれらに限定されない他の疾患並びに状態を処置する並びに／又は予防するために使用されてもよい。
【０１２３】
好ましい実施形態では、本発明は、それらの血清クレアチニン濃度における増加及び／若しくはそれらのＢＵＮ濃度における増加又はそれらの尿比重における増加を示す哺乳動物を処置するための本発明による医薬組成物の使用に関する。
【０１２４】
有利には、ネコは、血漿クレアチニン濃度が１．９ｍｇ／ｄｌよりも高い場合に及び／又は血漿尿素窒素濃度が３５ｍｇ／ｄｌよりも高い場合に処置される。有利には、イヌは、血漿クレアチニン濃度が１．６ｍｇ／ｄｌよりも高い場合に及び／又は血漿尿素窒素濃度が３０ｍｇ／ｄｌよりも高い場合に処置される。
【０１２５】
本発明は、以下の非限定的な実施例としてさらに記載される。
【実施例１】
【０１２６】
プラスミドpNB292の構築
コドン最適化イヌ科ＢＭＰ７オープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）は、１２９６ｂｐから成り、４３１個のアミノ酸ポリペプチド（配列番号２）をコードする。配列番号３のポリペプチド配列をコードし、特有のSalI及びXbaI制限部位が側面に並ぶコドン最適化ｃＤＮＡを、重複するオリゴヌクレオチドから合成し、ハイブリダイゼーションにより集め、pCR-Scriptベクター（Invitrogen社製）中にクローン化し、プラスミドpPCR-Script050876（図１）を生成した。
【０１２７】
所望のＯＲＦに対応するＤＮＡ断片を、SalI消化及びXbaI消化を使用して切り取り、pVR1012プラスミド中にさらにクローン化し（J. Hartikka et al. Human Gene Therapy 1996, 7, 1205-1217）、コドン最適化イヌ科ＢＭＰ−７の発現がサイトメガロウイルス前初期（ＣＭＶ  ＩＥ）プロモーター／エンハンサーにより駆動されるpNB292プラスミド（図２）を生成した。pNB292プラスミドのヌクレオチド配列は、配列番号１０のヌクレオチド配列である。pNB292プラスミドをDH5α大腸菌細菌に形質転換し、続いて、メーカーが推奨する市販のキット（QIAGEN社製）を使用して精製した。最終プラスミド濃度を、ＴＥ緩衝液中２ｍｇ／ｍｌとした。
【０１２８】
pNB292プラスミドによりコードされたポリペプチドの一過性インビトロ発現を確認し、Lipofectamin 2000（INViTROGEN社製）を使用して、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の形質移入の後に観察した。直径６ｃｍのプレート中で９０％コンフルエンスのＣＨＯ−Ｋ１細胞を、メーカーの使用説明書に従って、５μｇプラスミド及び１０μｌリポフェクタミンを用いてそれぞれ形質移入した。形質移入の後、細胞を、１％ウシ胎仔血清を含有するMEM-glutamax培地中で２４数時間培養した。ガラスカバースリップ上の成長した細胞を、ＰＢＳで洗浄し、さらなる固定及び透過処理のために、冷アセトン中で１０分間インキュベートし、もう一度ＰＢＳ中で洗浄した。組換えタンパク質産生を、間接免疫蛍光法により、抗ヒトＢＭＰ７ポリクローナル血清（ABCAM社製、ケンブリッジ  英国）を使用して分析した。免疫化学的方法により、pBN292によりコードされたプレプロＢＭＰ−７ポリペプチドがＣＨＯ−Ｋ１細胞中で発現することを確認した。
【実施例２】
【０１２９】
ＢＭＰ−７プラスミドに基づく遺伝子療法の治療効果：
ＢＭＰ−７遺伝子療法が慢性腎不全の実験的片側尿管閉鎖（ＵＵＯ）モデルの発達に関連する尿細管間質病変の強度を低下させる能力を実証するために、研究をラットにおいて行った。
【０１３０】
研究の開始に体重が約２００ｇの２０匹のオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、IFFACREDO社（ラルブレール、フランス）から購入した。部屋の最高及び最低の両温度並びに湿度測定を毎日記録した。目標の温度及び湿度測定の範囲をそれぞれ２０〜２４℃及び２０〜７０％とした。光は、自動タイマーを使用して、１２時間明及び１２時間暗のサイクルで当てた。健常なラットのみを研究に含めた。ラットを、それぞれ５匹の動物の４群に無作為に割り付けた（群１〜４）。
【０１３１】
片側尿管閉鎖（ＵＵＯ）を、確立された手技を使用して、群２、３、及び４からのラットに対して実行した（R. Chevalier et al., Kidney Int. 2000, 57, 882-890）。手短に言えば、ラットに、チレタミン−ゾラゼパムの筋肉内注射により麻酔をかけた（ZOLETIL（登録商標）100−２０〜５０ｍｇ／ｋｇ−VIRBAC社製、フランス）。腹部を刈って、毛をなくし、腹側の皮膚をプロビドンヨードでこすって洗った。皮膚及び腹部内層の中央の切開を実行した。左尿管を露出し、２本の５．０絹縫合糸を用い、互いに約５ｍｍ離して管を締めることにより閉塞した。腹部内層及び皮膚の縫合は蚕糸を使用して実行した（装飾用の絹糸０、ETHICON社製、フランス）。群２のラットに偽手術を施した、つまり、これらの動物については、外科的にそれらの尿管を露出し、処理したが、結紮しなかった。群１のラットは、コントロールとして保ち、外科手術は実行しなかった。
【０１３２】
コントロール導入遺伝子ＳＥＡＰを発現するプラスミドgWIZ-SEAP（登録商標）を、GTS Inc.社（サンディエゴ、米国）から購入し、プラセボとして使用した。pNB292プラスミドを実施例１に従って構築した。最終プラスミド濃度をＴＥ緩衝液中２ｍｇ／ｍｌとした。
【０１３３】
個々の動物を外科手術より２日前（Ｄ−２）及び外科手術の５日後（Ｄ＋５）に処置し、外科手術の日をＤ０とした。３０Ｕ／１００μｌの１００μｌのヒアルロニダーゼを用いた筋肉内前処置を、各標的筋に対して、プラスミドの注射の２時間前に実行した。続いて、ラットに麻酔をかけ（チレタミン−ゾラゼパムの筋肉内注射により：ZOLETIL（登録商標）100−２０〜５０ｍｇ／ｋｇ−VIRBAC社製、フランス）、プラスミド溶液の２分の１用量（つまり２００μＬ）を、Ｄ−２に各脛側頭方筋領域に、Ｄ＋５に各半膜様筋領域に、筋肉内（ＩＭ）注射により投与した。２００μｌの各注射は、２分の１の用量のプラスミド、つまり４００μｇに対応した。プラスミドを注射した各ラットは、処置１日当たり、合計量が８００μｇのＤＮＡを受けた。以下の表により、注射したプラスミドの容量及び質量を要約する。
【０１３４】
【表２】
2009515529.tif 000007
【０１３５】
各群に投与した特定のプラスミド組成物を表３に明記する。
【０１３６】
【表３】
2009515529.tif 000008
【０１３７】
プラスミド筋肉内送達の後の５分以内に、電気的導入（ＥＴ，electrotransfer）を、注射した各筋に、皮膚及び電極の間の導電性ゲルの存在下で、非侵襲性プラーク電極（それぞれ約０．８ｃｍ２）を使用し適用した。電極間距離は、約０．８ｃｍと測定された。各２０ミリ秒の一連の８電気パルスを、８Ｈｚの周波数で１．３秒間にわたり適用した。印加電圧は、１７５Ｖ／ｃｍの電界を目標に、１４０Ｖとした。
【０１３８】
すべてのラットを、外科手術の１３日後（Ｄ＋１３）に安楽死させた。２分の１のそれぞれの左の腎臓を病理組織学的分析のために１０％緩衝ホルマリン中で固定した。固定化の後、各サンプルを、アルコール溶液中で濃度を増加させて脱水し、イソパラフィンＨ中できれいにし、パラフィン中に包埋した。包埋サンプルを、ミクロトーム（MICROM（登録商標）、フランス）を使用して、５μｍ切片にした。１つの部位当たり４枚の切片を用意し、ヘマトキシリン−エオシン−サフラニン（「ＨＥＳ，Hematoxylin-Eosin-Safranin」）及びマッソントリクロームを用いて染色した。組織学的切片は、×２、×４、×１０、×２５、及び×４０対物レンズを取り付けた顕微鏡（ECLIPSE E600）を使用して観察した。上皮萎縮を有する尿細管拡張及びマトリックス沈着を有する間質増大により特徴づけられる腎形態学的外傷を、０（非存在）、１（軽度）、２（中程度）、３（局部）、及び４（重篤）の尺度に基づく盲検法で採点した。全体の平均点及び各評点の頻度を、個々の値に基づいて算出し、この値は、１匹のラット当たり１０か所の域について、１群当たり６匹のラットについて決定した。
【０１３９】
プラスミド発現ＢＭＰ−７は、間質性腎線維症を、片側尿管閉鎖（ＵＵＯ）の１３日後に減弱させることが見い出された。
【０１４０】
図３は、コントロール対処置群における病変評点の頻度のヒストグラムを提供する。腎組織の変性は、非閉鎖コントロール群１の５匹のラットのいずれにおいても観察することができず、すべてのラットは、「０」と評点をつけられた完全に正常な腎臓構造を維持していた。対照的に、閉鎖したが、非処置のコントロール群２の５匹のラットのうちの４匹のラットが、評点が４の重篤な病変を有した。この群のたった１匹のラットが、評点を３と採点され、実験モデルの重症度を実証した。ＳＥＡＰ処置群（群４）の４匹のラットのうちの４匹すべてもまた、評点を４と採点された重篤な病変を示し、したがって、関係のない導入遺伝子で処置したこの群での誘発の重症度が確認された。対照的に、ＢＭＰ−７処置群３（群３）の５匹のラットのうちの４匹が３の病変点を有し、この群の１匹のラットのみが、４と評点をつけられた重篤な病変を有した。したがって、未処置コントロール群（群２）における８０％及びプラセボ処置群（群４）における１００％と比較して、ＢＭＰ−７処置群での重篤な（評点４）病変の割合は２０％であった（図４）。
【０１４１】
このデータは、尿細管間質腎炎の非常に重篤な実験モデルにおける、ＢＭＰ−７のプラスミドに基づく遺伝子療法の治療効果を明確に実証する。
【０１４２】
本発明は、以下の番号付けした項によりさらに記載される：
【０１４３】
１．腎不全に罹患している又はそれを発症する危険性がある哺乳動物被検体を処置する方法であって、プロモーターに作動的に連結された、ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードする核酸配列を含有する、治療上有効な量のプラスミドを上述の哺乳動物被検体に投与することを含み、ＢＭＰ−７ポリペプチドが、哺乳動物被検体中でインビボで発現する方法。
【０１４４】
２．哺乳動物被検体がネコ及びイヌからなる群から選択される、項１に記載の方法。
【０１４５】
３．哺乳動物被検体がイヌである、項１に記載の方法。
【０１４６】
４．哺乳動物被検体がネコである、項１に記載の方法。
【０１４７】
５．哺乳動物被検体が、急性腎不全に罹患している又はその危険性がある項１に記載の方法。
【０１４８】
６．哺乳動物被検体が、慢性腎不全に罹患している又はその危険性がある項１に記載の方法。
【０１４９】
７．ＢＭＰ−７ポリペプチドが、プレプロＢＭＰ−７ポリペプチド、プロＢＭＰ−７ポリペプチド、及び成熟ＢＭＰ−７ポリペプチドからなる群から選択される、項１に記載の方法。
【０１５０】
８．ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号１、配列番号２、並びにＢＭＰ−７活性を有するポリペプチドをコードするその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択される、項１に記載の方法。
【０１５１】
９．ＢＭＰ−７ポリペプチドが、配列番号３並びにＢＭＰ−７活性を有するその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、項１に記載の方法。
【０１５２】
１０．ＢＭＰ−７ポリペプチドが、シグナルペプチドを含む、項１に記載の方法。
【０１５３】
１１．シグナルペプチドが、ＢＭＰ−７シグナル配列、ＩＧＦ−１シグナル配列、及びｔＰＡシグナル配列からなる群から選択される、項１０に記載の方法。
【０１５４】
１２．シグナルペプチドが、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、並びにシグナルペプチド活性を有するペプチドをコードするその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる、項１０に記載の方法。
【０１５５】
１３．シグナルペプチドが、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１２、並びにシグナルペプチド活性を有するその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、項１０に記載の方法。
【０１５６】
１４．プロモーターが、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＳＶ−１  ＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、α−１抗トリプシン遺伝子プロモーター、アルブミン遺伝子プロモーター、コラーゲナーゼ遺伝子プロモーター、エラスターゼＩ遺伝子プロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター、β−グロビン遺伝子プロモーター、γ−グロビン遺伝子プロモーター、α−フェトプロテイン遺伝子プロモーター、及び筋クレアチンキナーゼ遺伝子プロモーターからなる群から選択される、項１に記載の方法。
【０１５７】
１５．プラスミドが、pNB292であり、配列番号１０のヌクレオチド配列を有する、項１に記載の方法。
【０１５８】
１６．プラスミドが、VR1012プラスミドに挿入された、ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードする核酸配列を含む項１に記載の方法。
【０１５９】
１７．腎不全に罹患している又はそれを発症する危険性があるイヌ科の動物を処置する方法であって、プロモーターに作動的に連結されたＢＭＰ−７ポリペプチドをコードする核酸配列を含有する治療上有効な量のプラスミドを前記イヌ科の動物に投与することを含む方法。
【０１６０】
１８．イヌ科の動物が、急性腎不全に罹患している又はその危険性がある、項１７に記載の方法。
【０１６１】
１９．イヌ科の動物が、慢性腎不全に罹患している又はその危険性がある、項１７に記載の方法。
【０１６２】
２０．ＢＭＰ−７ポリペプチドが、プレプロＢＭＰ−７ポリペプチド、プロＢＭＰ−７ポリペプチド、及び成熟ＢＭＰ−７ポリペプチドからなる群から選択される、項１７に記載の方法。
【０１６３】
２１．ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号１、配列番号２、並びにＢＭＰ−７活性を有するポリペプチドをコードするその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択される、項１７に記載の方法。
【０１６４】
２２．ＢＭＰ−７ポリペプチドが、配列番号３並びにＢＭＰ−７活性を有するその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、項１７に記載の方法。
【０１６５】
２３．ＢＭＰ−７ポリペプチドが、シグナルペプチドを含む、項１７に記載の方法。
【０１６６】
２４．シグナルペプチドが、ＢＭＰ−７シグナル配列、ＩＧＦ−１シグナル配列、及びｔＰＡシグナル配列からなる群から選択される、項２３に記載の方法。
【０１６７】
２５．シグナルペプチドが、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、並びにシグナルペプチド活性を有するペプチドをコードするその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる、項２３に記載の方法。
【０１６８】
２６．シグナルペプチドが、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１２、並びにシグナルペプチド活性を有するその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、項２３に記載の方法。
【０１６９】
２７．プロモーターが、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＳＶ−１  ＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、α−１抗トリプシン遺伝子プロモーター、アルブミン遺伝子プロモーター、コラーゲナーゼ遺伝子プロモーター、エラスターゼＩ遺伝子プロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター、β−グロビン遺伝子プロモーター、γ−グロビン遺伝子プロモーター、α−フェトプロテイン遺伝子プロモーター、及び筋クレアチンキナーゼ遺伝子プロモーターからなる群から選択される、項１７に記載の方法。
【０１７０】
２８．プラスミドが、pNB292であり、配列番号１０のヌクレオチド配列を有する、項１７に記載の方法。
【０１７１】
２９．プラスミドが、VR1012プラスミドに挿入された、ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、項１７に記載の方法。
【０１７２】
３０．腎不全の発生を、その危険性がある哺乳動物被検体において予防する方法であって、プロモーターに作動的に連結されたＢＭＰ−７ポリペプチドをコードする核酸配列を含有する予防的に有効な量のプラスミドベクターを前記哺乳動物被検体に投与することを含む方法。
【０１７３】
３１．哺乳動物被検体が、急性腎不全の危険性がある、項３０に記載の方法。
【０１７４】
３２．哺乳動物被検体が、慢性腎不全の危険性がある、項３０に記載の方法。
【０１７５】
３３．ＢＭＰ−７ポリペプチドが、プレプロＢＭＰ−７ポリペプチド、プロＢＭＰ−７ポリペプチド、及び成熟ＢＭＰ−７ポリペプチドからなる群から選択される、項３０に記載の方法。
【０１７６】
３４．ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号１、配列番号２、並びにＢＭＰ−７活性を有するポリペプチドをコードするその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択される、項３０に記載の方法。
【０１７７】
３５．ＢＭＰ−７ポリペプチドが、配列番号３並びにＢＭＰ−７活性を有するその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、項３０に記載の方法。
【０１７８】
３６．ＢＭＰ−７ポリペプチドが、シグナルペプチドを含む、項３０に記載の方法。
【０１７９】
３７．シグナルペプチドが、ＢＭＰ−７シグナル配列、ＩＧＦ−１シグナル配列、及びｔＰＡシグナル配列からなる群から選択される、項３０に記載の方法。
【０１８０】
３８．シグナルペプチドが、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、並びにシグナルペプチド活性を有するペプチドをコードするその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる、項３７に記載の方法。
【０１８１】
３９．シグナルペプチドが、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１２、並びにシグナルペプチド活性を有するその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、項３７に記載の方法。
【０１８２】
４０．プロモーターが、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＳＶ−１  ＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、α−１抗トリプシン遺伝子プロモーター、アルブミン遺伝子プロモーター、コラーゲナーゼ遺伝子プロモーター、エラスターゼＩ遺伝子プロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター、β−グロビン遺伝子プロモーター、γ−グロビン遺伝子プロモーター、α−フェトプロテイン遺伝子プロモーター、及び筋クレアチンキナーゼ遺伝子プロモーターからなる群から選択される、項３０に記載の方法。
【０１８３】
４１．プラスミドが、pNB292であり、配列番号１０のヌクレオチド配列を有する、項３０に記載の方法。
【０１８４】
４２．プラスミドが、VR1012プラスミドに挿入された、ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、項３０に記載の方法。
【０１８５】
４３．プロモーターに作動的に連結された、ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換えプラスミドベクター。
【０１８６】
４４．ＢＭＰ−７ポリペプチドが、プレプロＢＭＰ−７ポリペプチド、プロＢＭＰ−７ポリペプチド、及び成熟ＢＭＰ−７ポリペプチドからなる群から選択される、項４３に記載の組換えプラスミドベクター。
【０１８７】
４５．ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号１、配列番号２、並びにＢＭＰ−７活性を有するポリペプチドをコードするその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択される、項４３に記載の組換えプラスミドベクター。
【０１８８】
４６．ＢＭＰ−７ポリペプチドが、配列番号３並びにＢＭＰ−７活性を有するその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、項４３に記載の組換えプラスミドベクター。
【０１８９】
４７．ＢＭＰ−７ポリペプチドが、シグナルペプチドを含む、項４３に記載の組換えプラスミドベクター。
【０１９０】
４８．シグナルペプチドが、ＢＭＰ−７シグナル配列、ＩＧＦ−１シグナル配列、及びｔＰＡシグナル配列からなる群から選択される、項４７に記載の組換えプラスミドベクター。
【０１９１】
４９．シグナルペプチドが、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、並びにシグナルペプチド活性を有するペプチドをコードするその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる、項４７に記載の組換えプラスミドベクター。
【０１９２】
５０．シグナルペプチドが、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１２、並びにシグナルペプチド活性を有するその断片、変異体、誘導体、及びホモログからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、項４７に記載の方法。
【０１９３】
５１．プロモーターが、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＳＶ−１  ＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、α−１抗トリプシン遺伝子プロモーター、アルブミン遺伝子プロモーター、コラーゲナーゼ遺伝子プロモーター、エラスターゼＩ遺伝子プロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター、β−グロビン遺伝子プロモーター、γ−グロビン遺伝子プロモーター、α−フェトプロテイン遺伝子プロモーター、及び筋クレアチンキナーゼ遺伝子プロモーターからなる群から選択される、項４３に記載の方法。
【０１９４】
５２．プラスミドが、pNB292であり、配列番号１０のヌクレオチド配列を有する、項４３に記載の組換えプラスミドベクター。
【０１９５】
５３．プラスミドが、VR1012プラスミドに挿入された、ＢＭＰ−７ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、項４３に記載の組換えプラスミドベクター。
【０１９６】
５４．項４３〜５３のいずれかに記載の組換えプラスミドベクター及び少なくとも１つの薬学的に又は獣医学的に許容される担体、賦形剤、又は媒体を含む医薬組成物。
【０１９７】
このように、本発明の好ましい実施形態を詳細に記載したが、上述の項により定義された本発明は、その多くの明らかな変形物が、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、可能性として考えられるように、上述の記載で説明される特定の細部に限定されるものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１】050876pPCR-Scriptプラスミドマップ及びイヌ科ＢＭＰ−７のコードされたオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を表す図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列である。
【図２】pNB292プラスミドマップ及びイヌ科ＢＭＰ−７のコードされたＯＲＦを表す図である。コードされたＯＲＦのヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列、コードされたＯＲＦのアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列である。
【図３】コントロールラット及びＢＭＰ−７を発現するプラスミドで処置したラットにおける、ある種の評点を有する腎臓病変の頻度を示すヒストグラムを提供する図である。
【図４】コントロールラット及びＢＭＰ−７を発現するプラスミドで処置したラットにおける、重篤な病変の頻度を示すヒストグラムを提供する図である。
【０１９９】
配列表も本出願の一部として含まれる：配列番号１は、イヌ科プレプロＢＭＰ−７ポリペプチドのヌクレオチド配列であり、配列番号２は、イヌ科プレプロＢＭＰ−７ポリペプチドのコドン最適化ヌクレオチド配列であり、配列番号３は、イヌ科プレプロＢＭＰ−７ポリペプチドのアミノ酸配列であり、配列番号４は、ｔＰＡからの短いシグナルペプチドのヌクレオチド配列であり（２３個のアミノ酸）、配列番号５は、ｔＰＡからの短いシグナルペプチドのアミノ酸配列であり（２３個のアミノ酸）、配列番号６は、ｔＰＡからの長いシグナルペプチドのヌクレオチド配列であり（２８個のアミノ酸）、配列番号７は、ｔＰＡからの長いシグナルペプチドのアミノ酸配列であり（２８個のアミノ酸）、配列番号８は、ウマ科ＩＧＦ−１シグナルペプチドのヌクレオチド配列であり、配列番号９は、ウマ科ＩＧＦ−１シグナルペプチドのアミノ酸配列であり、配列番号１０は、pBN292プラスミドのヌクレオチド配列であり、配列番号１１は、イヌ科ＩＧＦ−１シグナルペプチドのヌクレオチド配列であり、配列番号１２は、イヌ科ＩＧＦ−１シグナルペプチドのアミノ酸配列である。
【図１】
2009515529.tif 000009
【図２】
2009515529.tif 000010
【図３】
2009515529.tif 000011
【図４】
2009515529.tif 000012
【配列表】
2009515529000001.app
【国際調査報告】
2009515529.tif 000013
2009515529.tif 000014
2009515529.tif 000015
2009515529.tif 000016
2009515529.tif 000017