(57)【要約】  本発明は異常ＨＤＬの検出用新規アッセイを提供する。前記アッセイはアテローム性動脈硬化症又は炎症反応を特徴とする他の病変の良好な診断法及び／又は予後診断法である。所定態様では、前記方法はヘム関連ＨＤＬ会合蛋白質（例えばハプトグロビン、ヘモペキシン等）の測定、及び／又は血漿／血清のＨＤＬ及び非リポ蛋白質画分間のＨＤＬ会合蛋白質の相対分布の測定、及び／又は向炎症性ＨＤＬの一酸化窒素消費能の測定、及び／又はＨＤＬのＬＤＬ凝集抑制能の測定を含む。【選択図】図２８Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における向炎症性ＨＤＬの検出又は定量方法であって、
前記哺乳動物に由来し、ＨＤＬを含有する生体サンプルを準備する段階と；
ｍ／ｚ比が約９．３の蛋白質、ｍ／ｚ比が約１４．９の蛋白質、ｍ／ｚ比が約１５．６の蛋白質、ｍ／ｚ比が約１５．８の蛋白質、ｍ／ｚ比が約１６．２の蛋白質、ｍ／ｚ比が約１６．５の蛋白質、ｍ／ｚ比が約１８．６の蛋白質、及びｍ／ｚ比が約１９．５の蛋白質から構成される群から選択され、ＨＤＬと会合した２種以上の蛋白質を検出し、ＨＤＬと会合した前記２種以上の蛋白質が検出された場合に前記ＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する段階を含む前記方法。
【請求項２】
前記検出段階が前記蛋白質の３種以上を検出する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出段階が前記蛋白質の４種以上を検出する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記検出段階が前記蛋白質の５種以上を検出する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記検出段階が前記蛋白質の６種以上を検出する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記検出段階が前記蛋白質の７種以上を検出する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記検出段階が前記蛋白質の全８種を検出する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物がヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳動物がアテローム性動脈硬化症をもつと診断されたヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物がアテローム性動脈硬化症の危険があると診断されたヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出段階がイムノアッセイを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物における向炎症性ＨＤＬの検出又は定量方法であって、前記哺乳動物からのＨＤＬと会合したヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質濃度を測定し、ヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質濃度が正常抗炎症性ＨＤＬで検出されるヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質濃度に比較して上昇している場合に前記ＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する段階を含む前記方法。
【請求項１３】
前記ヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質がヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、トランスフェリン、可溶性ＣＤ１６３、及びミエロペルオキシダーゼから構成される群から選択される１種以上の蛋白質を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法がＨＤＬと会合したヘモグロビンの量を測定する段階と、ＨＤＬと会合したハプトグロビンの量を測定する段階を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法がＨＤＬと会合したヘモグロビンとハプトグロビンの積を計算する段階を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
血漿の非リポ蛋白質画分中の同一ヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質の濃度を測定し、血漿の非リポ蛋白質画分中のヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質に対するＨＤＬ中のヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質の比が正常抗炎症性ＨＤＬをもつ対象で検出される比に比較して増加している場合に前記哺乳動物からのＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する段階を更に含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記測定段階がイムノアッセイを含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記測定段階がＥＬｌＳＡを含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物における向炎症性ＨＤＬの検出又は定量方法であって、
前記哺乳動物からのＨＤＬと会合した１種以上のヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質の濃度を測定する段階と；
前記哺乳動物からの血漿中の同一ヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質の１種以上の濃度を測定し、血漿中のヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質に対するＨＤＬ中のヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質の比が１よりも大きい場合に前記哺乳動物からのＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する段階を含む前記方法。
【請求項２０】
前記ヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質がヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、トランスフェリン、可溶性ＣＤ１６３、及びミエロペルオキシダーゼから構成される群から選択される１種以上の蛋白質を含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
血漿中のヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質に対するＨＤＬ中のヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質の比が前記蛋白質の２種以上で１よりも大きい場合に前記哺乳動物からのＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
血漿中のヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質に対するＨＤＬ中のヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質の比が前記蛋白質の３種以上で１よりも大きい場合に前記哺乳動物からのＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
血漿中のヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質に対するＨＤＬ中のヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質の比が前記蛋白質の１種、２種、３種、又は４種で１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、及び０．２から構成される群から選択される値よりも大きい場合に前記哺乳動物からのＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
哺乳動物における向炎症性ＨＤＬの検出又は定量方法であって、
前記哺乳動物からのＨＤＬと会合したヘム濃度を測定し、ＨＤＬと会合したヘム濃度が防御性ＨＤＬと会合したヘム濃度に比較して上昇している場合に前記ＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する段階を含む前記方法。
【請求項２５】
濃度上昇が９０％、９５％、９８％又は９９％以上の信頼水準で統計的に有意である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
哺乳動物における向炎症性ＨＤＬの検出又は定量方法であって、
前記哺乳動物からのＨＤＬの鉄含量を測定し、前記ＨＤＬの鉄含量が正常抗炎症性ＨＤＬの鉄含量に比較して上昇している場合に前記哺乳動物からの前記ＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する段階を含む前記方法。
【請求項２７】
濃度上昇が９０％、９５％、９８％又は９９％以上の信頼水準で統計的に有意である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物における向炎症性ＨＤＬの検出又は定量方法であって、
前記哺乳動物からのＨＤＬと会合した鉄含有蛋白質濃度を測定し、前記ＨＤＬと会合した鉄含有蛋白質濃度が正常抗炎症性ＨＤＬと会合した鉄含有蛋白質濃度に比較して上昇している場合に前記哺乳動物からの前記ＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する段階を含む前記方法。
【請求項２９】
濃度上昇が９０％、９５％、９８％又は９９％以上の信頼水準で統計的に有意である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
向炎症性ＨＤＬの検出又は定量方法であって、ＨＤＬの一酸化窒素消費能を測定し、ＨＤＬの一酸化窒素消費能が正常抗炎症性ＨＤＬの一酸化窒素消費能に比較して増加している場合に向炎症性ＨＤＬの存在、量又は活性を判定する段階を含む前記方法。
【請求項３１】
前記一酸化窒素を化学的に発生させる請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記一酸化窒素を電子シグナルにより測定する請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
哺乳動物における炎症反応を特徴とする病変の存在又は素因のアッセイ方法であって、
請求項１から３２のいずれか一項に記載のアッセイの任意１種以上を実施し、陽性試験結果を前記病変の存在又は素因の指標とする前記方法。
【請求項３４】
前記病変がアテローム性動脈硬化症、脳卒中、ハンセン病、結核、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ性多発筋痛症、結節性多発動脈炎、強皮症、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、アルツハイマー病、慢性腎不全、糖尿病、糖尿病網膜症、糖尿病性腎症、移植拒絶反応、移植後アテローム性動脈硬化症，虚血再潅流障害、成人呼吸器症候群、鬱血性心不全、糸球体炎、代謝症候群、多発性硬化症、敗血症症候群、鎌状赤血球症、血管性痴呆、クローン病、内皮機能不全、細動脈機能不全、エイズ、リウマチ性多発筋痛症、結節性多発動脈炎、強皮症、特発性肺線維症、冠動脈石灰化、石灰化大動脈弁狭窄症、骨粗鬆症、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、自己免疫疾患、及び関節リウマチから構成される群から選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
炎症反応を特徴とする病変をもつヒトの治療方法であって、
請求項１から３２のいずれか一項に記載のアッセイの任意１種以上を実施する段階と；
前記アッセイで陽性の対象に更に積極的な治療を処方する段階を含む前記方法。
【請求項３６】
哺乳動物における向炎症性ＨＤＬの検出又は定量方法であって、前記哺乳動物からのＨＤＬをＬＤＬと接触させる段階と、前記ＬＤＬの凝集を測定し、ＬＤＬ凝集レベルが正常抗炎症性ＨＤＬと接触させたＬＤＬの凝集に比較して上昇している場合に前記哺乳動物からのＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する段階を含む前記方法。
【請求項３７】
ＬＤＬ凝集率を分光光度法で測定することにより前記凝集を測定する請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
アルブミン除去カラムを使用して前記凝集を測定する請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本願はＵＳＳＮ６０／８４３，２１３（出願日２００６年９月７日）及びＵＳＳＮ６０／７７２，４２９（出願日２００６年２月１０日）の特典と優先権を主張し、言及により両出願の開示内容全体を全目的で本明細書に組込む。
【０００２】
（連邦政府支援研究開発から創出された発明の権利に関する陳述）
本発明は国立衛生研究所助成番号第１ＲＯ１ＨＬ７１７７６号及びＨＬ３０６５８号を助成の一部とする。米国政府は本発明に所定の権利をもつ。
【０００３】
（発明の技術分野）
本発明はアテローム性動脈硬化症の診断法に関する。特に異常ＨＤＬの検出用改善型アッセイを提供する。
【背景技術】
【０００４】
アテローム性動脈硬化症は大・中動脈の慢性炎症性疾患であり、西欧諸国で罹患率と死亡率の主要原因である。スタチン導入の結果、死亡率の３分の１は減少した。しかし、スタチン治療にも拘わらず、この疾患に起因する死亡率の３分の２は依然として残っている。
【０００５】
低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）の酸化はヒトアテローム性動脈硬化症の要因である（Ｗｉｔｚｔｕｍ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，１１：９３−１０２；Ｗｉｔｚｔｕｍ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ（１９９１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８８：１７８５−１７９２）。ＬＤＬの内皮下スペース取込み及び酸化と、その後の内皮細胞と単球間の相互作用がアテローム性動脈硬化病変発症の主要プロセスである（Ｎａｖａｂら（１９９６）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，１６：８３１−８４２；Ｂｅｒｌｉｎｅｒら（１９９５）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９１：２４８８−２４９６）。最低限に修飾／酸化されたＬＤＬ（ＭＭ−ＬＤＬ）は炎症性物質（例えばケモカイン、接着分子、及び増殖因子）を産生するように内皮細胞を誘導することが可能な生体活性分子を含む。これらの炎症性分子は単球の内皮細胞動員及び接着を促進する（Ｂｅｒｌｉｎｅｒら（１９９５）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９１：２４８８−２４９６）。数種の生体活性酸化リン脂質がＭＭ−ＬＤＬと動物モデルのアテローム性動脈硬化病変で同定されている（Ｗａｔｓｏｎら（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９５：７７４−７８２；Ｗａｔｓｏｎら（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６：２８８２−２８９１；Ｗａｔｓｏｎら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１３５９７−１３６０７；Ｗａｔｓｏｎら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：２４７８７−２４７９８；Ｌｅｉｔｉｎｇｅｒら（１９９９）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，１９：１２９１−１２９８；Ｓｕｂｂａｎａｇｏｕｎｄｅｒら（２０００）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，２８：１７５１−１７６１）。酸化−Ｌ−α−１−パルミトイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ｏｘ−ＰＡＰＣ）とその３種の成分である１−パルミトイル−２−（５−オキソバレロイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＶＰＣ）、１−パルミトイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＧＰＣ）及び１−パルミトイル−２−（５，６−エポキシイソプロスタンＥ２）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＥＩＰＣ）（Ｗａｔｓｏｎら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７４：２４７８７−２４７９８；Ｌｅｉｔｉｎｇｅｒら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９９）９６：１２０１０−１２０１５；Ｓｕｂｂａｎａｇｏｕｎｄｅｒら（２０００）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，２０：２２４８−２２５４）は単球と内皮細胞の結合を誘導し、ＭＭ−ＬＤＬによる内皮細胞の活性化に主要な役割を果たす。これらの分子の発見後、リン脂質のｓｎ−２位の不飽和脂肪酸の酸化により形成される一連の他の酸化リン脂質が同様の生物活性をもつものとして同定されている（Ｂｅｒｌｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｔｓｏｎ（２００５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５３：９−１１）。
【０００６】
ＨＤＬとアテローム性動脈硬化症の危険の間に負の相関があることは周知である。ＨＤＬの抗アテローム発生機能は簡単には説明できないと思われるが、その蛋白質成分に大きく依存するＨＤＬの機能状態が冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）の重要な決定要因であることが明らかになっている（Ｎａｖａｂら（２００１）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，２１：４８１−４８８）。パラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦ−ＡＨ）、プロテイナーゼ（エラスターゼ様）、ホスホリパーゼＤ、アルブミン、ａｐｏＪ及びａｐｏＡ−ＩはＭＭ−ＬＤＬ形成を防止することが可能な抗アテローム発生特性をもつＨＤＬ中の蛋白質である。ＨＤＬはＬＤＬ酸化の防止に役割を果たすことが分かっている。ＨＤＬはＬＤＬの弱い酸化を抑制し、従って、ヒト動脈壁細胞による強力な単球化学遊走性ＭＣＰ−１の産生を抑制することが分かっている。
【０００７】
ＨＤＬは状況及び環境に応じて抗炎症性分子又は向炎症性分子として存在することができる。ウサギ及びヒトの急性相反応（ＡＰＲ）はＨＤＬを抗炎症性形態から向炎症性形態に転換することができ、即ちＨＤＬはＬＤＬにより誘発される炎症に対するその防御能を低下し、その向炎症性状態では、ＨＤＬは実際にＬＤＬにより誘発される炎症を促進する。特定理論に結び付けるものではないが、基本条件下でＨＤＬは抗炎症性機能を果たすが、ＡＰＲ中に抗酸化酵素活性が低下し、ａｐｏＡ−Ｉが損傷し、ＨＤＬと会合した蛋白質の置換及び／又は交換の結果として、向炎症性ＨＤＬとなる。例えば、遺伝的にアテローム性動脈硬化症になり易いマウスにアテローム発生飼料を与えると、（遺伝的にアテローム性動脈硬化症になりにくいマウスと異なり）ＨＤＬは抗炎症性から向炎症性に転換することが示されている（Ｎａｖａｂら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９９：２００５−２０１９）。その後、数件の研究が動物モデルにおける向炎症性ＨＤＬの存在と性質について報告している（Ｎａｖａｂら（２００５）Ａｎｎ．Ｍｅｄ．，３７：１７３−１７８で検討されているＣａｓｔｅｌｌａｎｉら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：４６４−４７４）。
【０００８】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（遺伝的に飼料誘発性アテローム性動脈硬化症になり易い系統）からのＨＤＬは通常飼料を与えたマウスでは抗炎症性であったが、マウスにアテローム発生飼料を与えた場合には向炎症性であった（Ｓｈｉｈら（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９７：１６３０−１６３９）。他方、アテローム性動脈硬化症になりにくいＣ３Ｈ／ＨｅＪ（Ｃ３Ｈ）マウスからのＨＤＬはマウスに通常飼料又はアテローム発生飼料のどちらを与えたかに関係なく、抗炎症性であった（前出）。今日までに試験されているマウスモデルでマクロファージリッチ病変をもつアテローム性動脈硬化症を発症する全マウスモデルは向炎症性ＨＤＬをもつ。これらのマウスとしては、アテローム発生飼料を与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（前出）、通常飼料でａｐｏＡ−ＩＩを過剰発現するトランスジェニックマウス（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：４６４−４７４）、アテローム発生飼料を与えたＰＯＮ１ヌルマウス（前出）、ａｐｏＥヌルマウス（Ｎａｖａｂら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９９：２００５−２０１９）、通常飼料を与えたａｐｏＥヌルマウスとＰＯＮ１ヌルマウス（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：４６４−４７４）、高脂肪飼料を与えたＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）ヌルマウス（Ｎａｖａｂら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９９：２００５−２０１９）、及びｓＰＬＡ２を過剰発現するトランスジェニックマウス（Ｌｅｉｔｉｎｇｅｒら（１９９９）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，１９：１２９１−１２９８）が挙げられる。いずれも高脂血症であるが、いずれもアテローム性動脈硬化症を発症しない遺伝的に特異なマウスモデルでは、ＨＤＬは抗炎症性であることが分かった（Ｎａｖａｂら（２００５）Ａｎｎ．Ｍｅｄ．，３７：１７３−１７８）。他方、いずれもマクロファージリッチ病変を特徴とするアテローム性動脈硬化症を発症した他の７種のマウスモデルは向炎症性ＨＤＬをもち（前出）、ＨＤＬ機能の抗又は向炎症性はアテローム性動脈硬化症の有無の指標としてＨＤＬコレステロール濃度よりも高感度の指標となると予想される。ＨＤＬの品質と機能は新規治療法を開発するための魅力的なターゲットとなっている（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：４６４−４７４；Ｎａｖａｂら（２００５）Ａｎｎ．Ｍｅｄ．，３７：１７３−１７８；Ｒｉｄｋｅｒ（２００２）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０５：２−４；Ａｎｓｅｌｌら（２００３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０８：２７５１−２７５６）。
【０００９】
多数の蛋白質及び酵素活性がＨＤＬに関連付けられているが、どの特定蛋白質プロファイルが向炎症性ＨＤＬと関係があるかについては殆ど分かっていない。
【非特許文献１】Ｗｉｔｚｔｕｍ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，１１：９３−１０２
【非特許文献２】Ｗｉｔｚｔｕｍ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ（１９９１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８８：１７８５−１７９２
【非特許文献３】Ｎａｖａｂら（１９９６）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，１６：８３１−８４２
【非特許文献４】Ｂｅｒｌｉｎｅｒら（１９９５）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９１：２４８８−２４９６
【非特許文献５】Ｗａｔｓｏｎら（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９５：７７４−７８２
【非特許文献６】Ｗａｔｓｏｎら（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６：２８８２−２８９１
【非特許文献７】Ｗａｔｓｏｎら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１３５９７−１３６０７
【非特許文献８】Ｗａｔｓｏｎら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：２４７８７−２４７９８
【非特許文献９】Ｌｅｉｔｉｎｇｅｒら（１９９９）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，１９：１２９１−１２９８
【非特許文献１０】Ｓｕｂｂａｎａｇｏｕｎｄｅｒら（２０００）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，２８：１７５１−１７６１
【非特許文献１１】Ｌｅｉｔｉｎｇｅｒら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９９）９６：１２０１０−１２０１５
【非特許文献１２】Ｓｕｂｂａｎａｇｏｕｎｄｅｒら（２０００）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，２０：２２４８−２２５４
【非特許文献１３】Ｂｅｒｌｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｔｓｏｎ（２００５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５３：９−１１
【非特許文献１４】Ｎａｖａｂら（２００１）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，２１：４８１−４８８
【非特許文献１５】Ｎａｖａｂら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９９：２００５−２０１９
【非特許文献１６】Ｎａｖａｂら（２００５）Ａｎｎ．Ｍｅｄ．，３７：１７３−１７８
【非特許文献１７】Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：４６４−４７４
【非特許文献１８】Ｓｈｉｈら（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９７：１６３０−１６３９
【非特許文献１９】Ｒｉｄｋｅｒ（２００２）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０５：２−４
【非特許文献２０】Ａｎｓｅｌｌら（２００３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０８：２７５１−２７５６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＨＤＬの品質と機能の測定はアテローム性動脈硬化イベントの危険のある者の検出を改善し、新型且つ新規な治療法を開発するために不可欠である。異常ＨＤＬの現在の試験はＨＤＬの各種パラメーター及び成分を測定しており、比較的面倒で費用がかかる。
【００１１】
本発明は異常ＨＤＬを予測するための簡単な新型アッセイを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
所定態様において、本発明は向炎症性ＨＤＬを正常／抗炎症性ＨＤＬから区別する蛋白質プロファイルの同定に関する。従って、アテローム性動脈硬化症、炎症反応を特徴とする他の病変の存在及び／又は素因を早期検出するためのバイオマーカーを提供し、ひいては新規治療介入ストラテジーを提供する。
【００１３】
各種態様では、アッセイはヘム関連ＨＤＬ会合蛋白質（例えばハプトグロビン、ヘモペキシン等）の測定、及び／又は血漿／血清のＨＤＬ及び非リポ蛋白質画分間のＨＤＬ会合蛋白質の相対分布の測定、及び／又は向炎症性ＨＤＬの一酸化窒素消費能の測定、及び／又はＨＤＬのＬＤＬ凝集抑制能の測定を含む。
【００１４】
所定態様では、本発明は哺乳動物における向炎症性ＨＤＬの検出又は定量方法を提供する。前記方法は一般に、哺乳動物に由来し、ＨＤＬを含有する生体サンプルを準備する段階と；ｍ／ｚ比が約９．３の蛋白質、ｍ／ｚ比が約１４．９の蛋白質、ｍ／ｚ比が約１５．６の蛋白質、ｍ／ｚ比が約１５．８の蛋白質、ｍ／ｚ比が約１６．２の蛋白質、ｍ／ｚ比が約１６．５の蛋白質、ｍ／ｚ比が約１８．６の蛋白質、及びｍ／ｚ比が約１９．５の蛋白質から構成される群から選択され、ＨＤＬと会合した２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上又は８種の異なる蛋白質を検出し、ＨＤＬと会合した２種以上の蛋白質が検出された場合にＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する段階を含む。所定態様では、哺乳動物は非ヒト哺乳動物又はヒト（例えばアテローム性動脈硬化症をもつと診断されたヒト、アテローム性動脈硬化症の危険があると診断されたヒト、炎症反応を特徴とする別の病変をもつと診断されたヒト、又は前記病変の危険があると診断されたヒト）である。
【００１５】
所定態様では、哺乳動物における向炎症性ＨＤＬの検出又は定量方法を提供する。前記方法は一般に、哺乳動物からのＨＤＬと会合したヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質濃度を測定し、ヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質濃度が正常抗炎症性ＨＤＬで検出されるヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質濃度に比較して上昇している場合にＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する段階を含む。所定態様では、ヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質はヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、トランスフェリン、可溶性ＣＤ１６３、及びミエロペルオキシダーゼから構成される群から選択される１種以上の蛋白質を含む。所定態様では、前記方法はＨＤＬと会合したヘモグロビンの量を測定する段階と、ＨＤＬと会合したハプトグロビンの量を測定する段階を含む。所定態様では、前記方法はＨＤＬと会合したヘモグロビンとハプトグロビンの積を計算する段階を含む。所定態様では、前記方法は血漿の非リポ蛋白質画分中の同一ヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質濃度を測定し、血漿の非リポ蛋白質画分中のヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質に対するＨＤＬ中のヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質の比が正常抗炎症性ＨＤＬをもつ対象で検出される比に比較して増加している場合に前記哺乳動物からのＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する段階を含む。
【００１６】
更に哺乳動物における向炎症性ＨＤＬの検出又は定量方法を提供する。各種態様では、前記方法は哺乳動物からのＨＤＬと会合した１種以上のヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質の濃度を測定する段階と；哺乳動物からの血漿（又は血清）中の同一ヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質の１種以上の濃度を測定し、血漿中のヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質に対するＨＤＬ中のヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質の比が１よりも大きい場合に前記哺乳動物からのＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する段階を含む。所定態様では、ヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質はヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、トランスフェリン、可溶性ＣＤ１６３、及びミエロペルオキシダーゼから構成される群から選択される１種以上の蛋白質を含む。所定態様では、ヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質はハプトグロビンとヘモペキシンを含む。所定態様では、血漿中のヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質に対するＨＤＬ中のヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質の比が前記蛋白質の２種以上、３種以上、４種以上、５種以上又は６種で１よりも大きい場合に前記哺乳動物からのＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する。所定態様では、血漿中のヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質に対するＨＤＬ中のヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質の比が前記蛋白質の１種、２種、３種、４種、５種、又は６種で１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、及び０．２から構成される群から選択される値よりも大きい場合に前記哺乳動物からのＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する。
【００１７】
更に哺乳動物における向炎症性ＨＤＬの検出又は定量方法を提供する。前記方法は一般に、哺乳動物からのＨＤＬと会合したヘム濃度を測定し、ＨＤＬと会合したヘム濃度が防御性ＨＤＬと会合したヘム濃度に比較して上昇している場合にＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する段階を含む。所定態様では、濃度上昇は９０％、９５％、９８％又は９９％以上の信頼水準で統計的に有意である。
【００１８】
所定態様では、哺乳動物における向炎症性ＨＤＬの検出又は定量方法として、哺乳動物からのＨＤＬの鉄含量を測定し、ＨＤＬの鉄含量が正常抗炎症性ＨＤＬの鉄含量に比較して上昇している場合に哺乳動物からのＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する段階を含む方法を提供する。所定態様では、濃度上昇は９０％、９５％、９８％又は９９％以上の信頼水準で統計的に有意である。
【００１９】
各種態様では、哺乳動物における向炎症性ＨＤＬの検出又は定量方法を提供する。前記方法は一般に、哺乳動物からのＨＤＬと会合した鉄含有蛋白質濃度を測定し、ＨＤＬと会合した鉄含有蛋白質濃度が正常抗炎症性ＨＤＬと会合した鉄含有蛋白質濃度に比較して上昇している場合に哺乳動物からのＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する段階を含む。所定態様では、濃度上昇は９０％、９５％、９８％又は９９％以上の信頼水準で統計的に有意である。
【００２０】
向炎症性ＨＤＬを検出又は定量するための一酸化窒素アッセイの使用方法も提供する。前記方法は一般に、ＨＤＬの一酸化窒素消費能を測定し、ＨＤＬの一酸化窒素消費能が正常抗炎症性ＨＤＬの一酸化窒素消費能に比較して増加している場合に向炎症性ＨＤＬの存在、量又は活性を判定する段階を含む。所定態様では、一酸化窒素を化学的に発生させる。所定態様では、一酸化窒素を電子シグナルにより測定する。
【００２１】
哺乳動物における向炎症性ＨＤＬの検出又は定量用凝集アッセイも提供する。これらのアッセイは一般に、哺乳動物からのＨＤＬをＬＤＬと接触させる段階と、ＬＤＬの凝集を測定し、ＬＤＬ凝集レベルが正常抗炎症性ＨＤＬと接触させたＬＤＬの凝集に比較して上昇している場合に哺乳動物からのＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する段階を含む。所定態様では、ＬＤＬ凝集率を分光光度法で測定することにより凝集を測定する。所定態様では、アルブミン除去カラムを使用して凝集を測定する。
【００２２】
所定態様では、哺乳動物における炎症反応を特徴とする病変の存在又は素因のアッセイ方法を提供する。前記方法は一般に、本明細書に記載するアッセイの任意１種以上を実施し、陽性試験結果を前記病変の存在又は素因の指標とする段階を含む。各種態様では、病変はアテローム性動脈硬化症、脳卒中、ハンセン病、結核、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ性多発筋痛症、結節性多発動脈炎、強皮症、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、アルツハイマー病、慢性腎不全、糖尿病、糖尿病網膜症、糖尿病性腎症、移植拒絶反応、移植後アテローム性動脈硬化症，虚血再潅流障害、成人呼吸器症候群、鬱血性心不全、糸球体炎、代謝症候群、多発性硬化症、敗血症症候群、鎌状赤血球症、血管性痴呆、クローン病、内皮機能不全、細動脈機能不全、エイズ、リウマチ性多発筋痛症、結節性多発動脈炎、強皮症、特発性肺線維症、冠動脈石灰化、石灰化大動脈弁狭窄症、骨粗鬆症、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、自己免疫疾患、及び関節リウマチから構成される群から選択される。
【００２３】
所定態様では、本明細書に記載するアッセイは非ヒト哺乳動物又はヒト（例えばアテローム性動脈硬化症をもつと診断されたヒト、アテローム性動脈硬化症の危険があると診断されたヒト、炎症反応を特徴とする別の病変をもつと診断されたヒト、又は前記病変の危険があると診断されたヒト）に由来するサンプルで実施する。
【００２４】
所定態様では、本明細書に記載するアッセイで検出及び／又は定量する蛋白質はイムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）を使用して検出及び／又は定量する。
【００２５】
炎症反応を特徴とする病変をもつヒト又は非ヒト哺乳動物の治療方法も提供する。前記方法は一般に、本明細書に記載するアッセイの任意１種以上を実施する段階と、アッセイで陽性の対象に更に積極的な治療（例えばスタチン、及び／又は言及により全目的で本明細書に組込む米国特許第７，１６６，５７８号、７，１４８，１９７号、７，１４４，８６２号、６，９３３，２７９号、６，９３０，０８５号、及び６，６６４，２３０号に記載の治療剤の投与）を処方する段階を含む。
【００２６】
（定義）
本明細書では以下の略語を使用する場合がある。ＡＰＲ，急性相反応；ＣＡＤ，冠動脈性疾患；ＨＤＬ−Ｃ，ＨＤＬコレステロール；ＭＭ−ＬＤＬ，最低限に修飾／酸化されたＬＤＬ；ＰＯＮ，パラオキソナーゼ；ＡｐｏＡ１，アポリポ蛋白質Ａ１；ａｐｏＥ，アポリポ蛋白質Ｅ；ＣＭ１０，弱カチオンチップ；ＣＶＤ，心臓血管疾患；ＣＨＤ，冠動脈性心疾患；ＦＰＬＣ，高速蛋白質液体クロマトグラフィー；Ｈｂ，ヘモグロビン；Ｈｂ−α，ヘモグロビンα鎖；Ｈｂ−β，ヘモグロビンβ鎖；Ｈｐ，ハプトグロビン；Ｈｘ，ヘモペキシン；ＨＤＬ，高比重リポ蛋白質；ＨＰＬＣ，高性能液体クロマトグラフィー；ＬＤＬ，低比重リポ蛋白質；ＬＤＬＲ，ＬＤＬ受容体；ｍｅｔＨｂ，メトヘモグロビン；ＮＰ２０チップ，順相チップ；ｏｘｙＨｂ，オキシヘモグロビン；ＰＯＮ，パラオキソナーゼ；ｐＨＤＬ，ＨＤＬ後画分；Ｑ１０チップ，強アニオン交換チップ；ＲＢＣ，赤血球；ＳＥＬＤＩ，表面増強レーザー脱離／イオン化；ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ，表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析法；μＬＣ−ＭＳＭＳ，微量液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法；ＶＬＤＬ，超低比重リポ蛋白質。
【００２７】
「イムノアッセイ」とは抗体を利用して検体（例えばハプトグロビン及び／又はヘモペキシン）と特異的に結合させるアッセイである。イムノアッセイは検体を単離、ターゲティング、及び／又は定量するために特定抗体の特異的結合特性を利用することを特徴とする。
【００２８】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「蛋白質」なる用語は本明細書では同義に使用し、アミノ酸残基のポリマーを意味する。この用語は１個以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学的類似体であるアミノ酸ポリマーと、天然アミノ酸ポリマーに適用される。
【００２９】
「アテローム性動脈硬化症の１種以上の症状を改善」に関して使用する場合の「改善」なる用語はアテローム性動脈硬化症及び／又は関連病変に特徴的な１種以上の症状の緩和、予防、又は除去を意味する。このような緩和としては限定されないが、酸化リン脂質の低減又は除去、アテローム斑形成及び破裂の低減、心臓発作、狭心症又は脳卒中等の臨床イベントの低減、高血圧の低下、炎症性蛋白質生合成の低下、血漿コレステロールの低減等が挙げられる。
【００３０】
「低比重リポ蛋白質」ないし「ＬＤＬ」なる用語は当業者の通常の用法に従って定義される。一般に、ＬＤＬとは超遠心により単離した場合にｄ＝１．０１９〜ｄ＝１．０６３の密度範囲に存在する脂質−蛋白質複合体を意味する。
【００３１】
「高比重リポ蛋白質」ないし「ＨＤＬ」なる用語は当業者の通常の用法に従って定義される。一般に、「ＨＤＬ」とは超遠心により単離した場合にｄ＝１．０６３〜ｄ＝１．２１の密度範囲に存在する脂質−蛋白質複合体を意味する。
【００３２】
「Ｉ群ＨＤＬ」ないし「防御性ＨＤＬ「ないし「正常抗炎症性ＨＤＬ」なる用語は（例えば低比重リポ蛋白質中の）酸化脂質を低減するか又は酸化剤による酸化から脂質を防御する高比重リポ蛋白質又はその成分（例えばａｐｏＡ−Ｉ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ等）を意味する。
【００３３】
「異常ＨＤＬ」なる用語は脂質を酸化から防御するか又は酸化脂質を修復する（例えば低減する）活性が低下又は喪失しており、これらの酸化脂質の炎症帰結を防止することが実質的にできないＨＤＬを意味する。
【００３４】
「ＨＤＬ成分」なる用語は高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）を含有する成分（例えば分子）を意味する。脂質を酸化から防御するか又は修復する（例えば酸化脂質を低減する）ＨＤＬのアッセイとしては、このような活性を示すＨＤＬ成分（例えばａｐｏＡ−Ｉ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ等）のアッセイが挙げられる。
【００３５】
「ヘモペキシン」又は「ハプトグロビン」とは夫々全長天然ヘモペキシン又はハプトグロビン、あるいはヘモペキシン又はハプトグロビンの代用マーカー（例えばヘモペキシン又はハプトグロビンフラグメント、アイソザイム等）であって、マーカーの検出／定量により全長分子の量／濃度を測定できるものを意味する。
【００３６】
「抗体」なる用語は検体（抗原）と特異的に結合してこれを認識する１個以上の免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントにより実質的にコードされるポリペプチドを意味する。認識される免疫グロブリン遺伝子としてはκ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子に加え、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖はκ又はλとして分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、又はεとして分類され、夫々免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを規定する。典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は四量体からなる。各四量体は各々１本の「軽鎖」（約２５ｋＤ）と１本の「重鎖」（約５０〜７０ｋＤ）をもつ同一のポリペプチド鎖２対から構成される。各鎖のＮ末端は主に抗原認識に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸からなる可変領域を規定する。可変領域軽鎖（ＶＬ）及び可変領域重鎖（ＶＨ）なる用語は夫々これらの軽鎖と重鎖を意味する。
【００３７】
抗体は例えば無傷の免疫グロブリン又は各種ペプチダーゼによる消化により生成された多数の十分に特性決定されたフラグメントとして存在する。従って、例えば、ペプシンはヒンジ領域のジスルフィド結合下の抗体を消化し、ジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１と結合した軽鎖であるＦａｂの二量体であるＦ（ａｂ）’２を生成する。Ｆ（ａｂ）’２を穏和な条件下で還元すると、ヒンジ領域のジスルフィド結合を切断し、Ｆ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’単量体に変換することができる。Ｆａｂ’単量体は本質的にヒンジ領域の部分をもつＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．１９９３参照）。各種抗体フラグメントが無傷の抗体の消化により定義されるが、当業者に自明の通り、このようなフラグメントは化学的合成又は組換えＤＮＡ法の使用によりｄｅ  ｎｏｖｏ合成することができる。従って、本明細書で使用する抗体なる用語は無傷の抗体の修飾により生成される抗体フラグメント、組換えＤＮＡ法を使用してｄｅ  ｎｏｖｏ合成された抗体フラグメント（例えば１本鎖Ｆｖ）、及びディスプレイライブラリー（例えばファージディスプレイライブラリー）に存在する抗体フラグメントも含む。
【００３８】
「健常対照」なる用語は症状を示さないか又は該当病態／病変試験に陰性のほぼ同一年齢及び同一性別の個体又は個体集団を意味する。
【００３９】
「血液又は血液画分中のハプトグロビン及び／又はヘモペキシン及び／又は他の蛋白質濃度を検出」なる用語は血液、血液画分又は血液もしくは血液画分に由来するサンプル中のハプトグロビン及び／又はヘモペキシン及び／又は他の蛋白質の検出及び／又は定量を意味する。検出は無傷のハプトグロビン及び／又はヘモペキシン及び／又は他の蛋白質の直接検出、及び／又はハプトグロビン及び／又はヘモペキシン及び／又は他の蛋白質フラグメントの検出、アイソフォームの検出、及び／又は該当蛋白質の他の各種代用マーカーの検出を含むことができる。
【００４０】
「哺乳動物に由来する生体サンプルを準備」なる用語はサンプル（例えば血液サンプル）を直接採取すること又は第三者により哺乳動物から採取された生体サンプルを入手もしくは準備することを意味する。
【００４１】
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕ＨＤＬと会合した蛋白質のウェスタン分析を示す。ウェスタン分析の結果、アテローム発生飼料（Ａ）を与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおけるヘモグロビン（Ｈｂ）、ハプトグロビン（Ｈｐ）、及びヘモペキシン（Ｈｘ）とＨＤＬの会合は通常飼料（Ｃ）に比較して１０倍に増加することが判明した。図面から明らかなように、これらの蛋白質はＶＬＤＬ又はＬＤＬとは会合しなかった。
【００４２】
〔図２〕ＡｐｏＥヌルマウスＨＤＬが通常飼料で向炎症性であり、経口Ｄ−４Ｆ投与後に抗炎症性に転換することを示す。９カ月齢雌性ａｐｏＥヌルマウス（ｎ＝４匹／群）に通常飼料を与え、アポリポ蛋白質Ａ−Ｉ模倣ペプチドＤ−４Ｆ（５０μｇ／ｍＬ飲料水）の投与前（０日）とＸ軸に示す日数間投与後に採血した。ａｐｏＥヌルマウスＨＤＬがＬＤＬ＋ＤＣＦの蛍光を阻害する能力をその炎症性の尺度として測定した。データから明らかなように、投与前にａｐｏＥヌルマウスＨＤＬは向炎症性であった（即ち、０日のａｐｏＥヌルＨＤＬを添加すると、蛍光はＬＤＬ単独により誘導される強度よりも増加した）が、Ｄ−４Ｆ投与後（１〜２１日）に抗炎症性となった。
【００４３】
〔図３〕血清ヘモペキシン濃度がＤ−４Ｆ投与後に低下することを示す。上記図２に記載したマウスにおける血清ヘモペキシン濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
【００４４】
〔図４〕血清ハプトグロビン濃度がＤ−４Ｆ投与後に低下することを示す。上記図２に記載したマウスにおける血清ハプトグロビン濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
【００４５】
〔図５〕Ｄ−４Ｆ投与によりａｐｏＥヌルマウスのＨＤＬ中のハプトグロビン（Ｈｐ）及びヘモペキシン（Ｈｘ）が低下することを示す。図２に記載したマウスからＨＤＬを単離し、Ｈｐ、Ｈｘ、及びアポリポ蛋白質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）含量を測定した。
【００４６】
〔図６〕Ｄ−４Ｆ投与の結果、ＲＢＣに含まれるヘモグロビンと同等の分子量でネイティブＰＡＧＥゲル上の非ＲＢＣヘモグロビンが増加したことを示す。図２に記載したマウス４匹の各々から投与前（０日）及び２１日後（２１日）に採取した血清、ＨＤＬ及び赤血球（ＲＢＣ）をネイティブＰＡＧＥ（４〜１５％）ゲル上で泳動させ、ウェスタン分析によりヘモグロビンを分析した。データによると、投与前には、血清及び（ＨＤＬと非リポ蛋白質画分を含む）ＨＤＬ上清中の全ヘモグロビンは溶血ＲＢＣからのヘモグロビンよりも有意に高い見かけの分子量でネイティブＰＡＧＥゲル上を泳動した。しかし、Ｄ−４Ｆを２１日間投与後には、血清及びＨＤＬ上清中のヘモグロビンの有意量が溶血ＲＢＣからのヘモグロビンと同等の見かけの分子量でゲル上を泳動した。
【００４７】
〔図７〕アテローム発生飼料を与えた野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスではヘモグロビンのα鎖とβ鎖の両者が増加したことを示す。本図は更に、通常飼料を与えたａｐｏＥヌルマウスでもヘモグロビンのα鎖とβ鎖の両者の含量が増加し、両鎖は図２に記載したようなＤ−４Ｆ投与と共に減少したことを示す。
【００４８】
〔図８〕通常飼料を７日間（Ｄ７Ｃ）又はアテローム発生飼料を７日間（Ｄ７Ａ）もしくは１５週間（Ｗ１５Ａ）与えた野生型Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスでＨＤＬ中のオキシヘモグロビンとメトヘモグロビンの含量を測定したことを示す。通常飼料を与えたａｐｏＥヌルマウス（ａｐｏＥ）でもオキシヘモグロビンとメトヘモグロビンの含量を測定した。図面から明らかなように、アテローム発生飼料を与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと通常飼料を与えたａｐｏＥヌルマウスでＨＤＬと会合したヘモグロビンの大部分はオキシヘモグロビンであった。
【００４９】
〔図９〕一酸化窒素（ＮＯドナー）を化学的に発生させ、通常飼料を７日間与えた野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｄ７Ｃ）に由来するＨＤＬを添加し、電流（ｐＡ）として測定した処、消費しなかったことを示す。
【００５０】
〔図１０〕化学的に発生させた一酸化窒素（ＮＯドナー）にオキシヘモグロビン（ＨｂＯ２）を添加し、電流（ｐＡ）として測定した処、減衰曲線の急速な一過的低下を生じたことを示す。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を添加しても自然減衰曲線は変化しなかった。他方、アテローム発生飼料を７日間与えた野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに由来するＨＤＬ（Ｄ７Ａ  ＨＤＬ−Ｈｂ）を添加すると、減衰曲線は急速且つ劇的に低下し、この向炎症性ＨＤＬは一酸化窒素を急速に消費したことが分かった。
【００５１】
〔図１１〕向炎症性ＨＤＬ（アテローム発生飼料を７日間与えた野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに由来するＨＤＬ；Ｄ７Ａ  ＨＤＬ）が一酸化窒素減衰曲線の急速且つ劇的な低下を生じ、向炎症性ＨＤＬが一酸化窒素を急速に消費したことを示す。他方、ＨＤＬ中のオキシヘモグロビン（ＨＤＬ−ＨｂＯ２）をメトヘモグロビン（ＨＤＬ−ｍｅｔＨｂ）に変換するＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６でこのＨＤＬを処理した後にＨＤＬを添加すると、減衰曲線は有意に変化せず、一酸化窒素は消費されないことが分かった。
【００５２】
〔図１２〕通常飼料を７日間（左上パネル）もしくは１５週間（右上パネル）、又はアテローム発生飼料を７日間（左下パネル）もしくは１５週間（右下パネル）与えた野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの血清のウェスタン分析を使用してヘモグロビン染色した二次元ゲルを示す。各パネルの左端のレーンは各病態に由来する溶血赤血球（ＲＢＣ）からのヘモグロビンを示す。
【００５３】
〔図１３〕野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにアテローム発生飼料を７日間（Ｄ７Ａ）又は１５週間（Ｗ１５Ａ）与えた図１２の下段パネルを示し、ヘモグロビン染色をライトブルーで示す（グレーで再現）。
【００５４】
〔図１４〕図１３に示したウェスタンブロットを剥離し、ハプトグロビンに対する抗体で再プローブした。得られた画像（マゼンタ）を図１３の画像に重ねた。ダークブルー領域はヘモグロビンとハプトグロビンの両者が同時に局在する領域に相当する。
【００５５】
〔図１５〕図１４に示したウェスタンブロットを剥離し、ヘモペキシンに対する抗体で再プローブした。得られた画像（黄色）を図１４の画像に重ねた。非常に暗い画像はヘモグロビン、ハプトグロビン、及びヘモペキシンが同時に局在する領域に相当する。
【００５６】
〔図１６〕向炎症性ＨＤＬはＬＤＬ凝集を抑制しないが、抗炎症性ＨＤＬは抑制することを示す。向炎症性ＨＤＬとＮＣＥＰ  ＡＴＰ  ＩＩＩ基準による冠動脈疾患又は等価疾患をもつ対象（ＣＨＤ患者）４人と健常ボランティア（正常）４人に由来するＨＤＬをホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）により誘導したＬＤＬ凝集の抑制能について試験した。ＨＤＬを添加しない陽性対照（ＬＤＬ＋ＰＬＣ）の値を赤線で示す。陰性対照（ＬＤＬ単独）の値を一番下の青線で示す。データによると、４人のＣＨＤ患者に由来するＨＤＬはＰＬＣにより誘導したＬＤＬ凝集を抑制することができなかったが、４人の健常ボランティア（正常）に由来するＨＤＬはＰＬＣにより誘導したＬＤＬ凝集を有意に抑制した。
【００５７】
〔図１７〕投与前には向炎症性ａｐｏＥヌルＨＤＬはホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）により誘導したＬＤＬ凝集を抑制しないが、Ｄ−４Ｆを２１日間経口投与後にＨＤＬは抗炎症性になり、ＰＬＣにより誘導したＬＤＬ凝集を抑制することを示す。図２に記載したような経口Ｄ−４Ｆ投与前後のａｐｏＥヌルＨＤＬについて、ＰＬＣにより誘導したＬＤＬ凝集の抑制能を試験した。図２に示すように、投与前にＨＤＬは向炎症性であった。図１７に示すように、投与前にはこのａｐｏＥヌルＨＤＬはＰＬＣにより誘導したＬＤＬ凝集を抑制することができなかった。しかし、２１日間投与後にＨＤＬは抗炎症性になり（図２）、図１７に示すようにＰＬＣにより誘導したＬＤＬ凝集を有意に抑制した。陽性対照（ＬＤＬ＋ＰＬＣ（ＨＤＬ不添加））の値と、陰性対照ｉ）ＬＤＬ＋ＰＬＣ＋通常飼料を与えた正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに由来するＨＤＬ（正常マウスＨＤＬ）及びｉｉ）ＬＤＬ（ＰＬＣ不添加）（ＬＤＬ単独）の値も示す。
【００５８】
〔図１８〕ＦＰＬＣ分画によるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス血清サンプルのコレステロールプロファイルを示す。マウス（ｎ＝８）からの血清プール５００μｌをＦＰＬＣにより分画した。最初の１０個の１ｍＬ画分を捨て、その後の各１ｍＬのコレステロール含量を分析した。Ｃ−通常飼料７日間、Ａ−アテローム発生飼料７日間、ＣＣ−通常飼料２１日間、ＡＣ−アテローム発生飼料７日間後に通常飼料１４日間。
【００５９】
〔図１９〕Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス血清に由来するＨＤＬの炎症特性を示す。ＨＤＬをＨＤＬ試薬で単離し、反応性酸素種含量（蛍光強度）、パラオキソナーゼ（ＰＯＮ）活性アッセイ、コレステロール流出アッセイ（％コレステロール流出）、及びコレステロール含量（ＨＤＬコレステロール）について分析した。Ｃ−通常飼料７日間、Ａ−アテローム発生飼料７日間、ＡＣ−アテローム発生飼料７日間後に通常飼料１４日間。＊はｐ＜０．０１を表す。
【００６０】
〔図２０〕アテローム性動脈硬化症の４種のマウスモデルに高濃度のｍ／ｚ  １４．９ｋ（ヘモグロビンα鎖）及びｍ／ｚ  １５．６ｋ（ヘモグロビンβ鎖）が存在することを示す。アテローム発生飼料（Ｄ７＝７日間，Ｗ１５＝１５週間）もしくは西欧型飼料を１０日間（ＷＤ）与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス、又は西欧型飼料を８週間与えたＬＤＬＲヌルマウス（ＬＤＬＲ）、又は通常飼料を与えた１２週齢ａｐｏＥヌルマウス（ａｐｏＥ）に由来する血清サンプル（ｎ＝８）をＱ１０（ｐＩ＜７）ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイでＳＥＬＤＩ分析した。アテローム発生血清中の２個の該当ＳＥＬＤＩピーク（ｍ／ｚ  １４．９ｋ及びｍ／ｚ  １５．６ｋ）を通常飼料の対応する対照マウス群に由来する血清のピークと比較し、又はａｐｏＥヌルマウスの場合には通常飼料の同年齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比較し、得られた強度を統計分析した。報告するデータは各ピークの平均増加倍率である。報告するデータはいずれもｐ値＜０．０５で統計的に有意である。なお、この分析は疎水性でｐＩ＜７．０の蛋白質と複合体を除去するＱ１０蛋白質チップで捕捉した蛋白質のデータである。この方法により分析したヘモグロビンはＨＤＬと会合したヘモグロビンに相当する。
【００６１】
〔図２１〕ｍ／ｚ  １４．９ｋ（ヘモグロビンα鎖）及びｍ／ｚ  １５．６ｋ（ヘモグロビンβ鎖）に相当するピークのｐＩの測定を示す。通常飼料（Ｃ）又はアテローム発生飼料（Ａ）を７日間（Ｄ７）又は１５週間（Ｗ１５）与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝８）に由来する個々の血清サンプルを脱塩し、アニオン交換スピンカラムと各種指定ｐＨの緩衝液を使用して分画した。溶出した画分をカチオン交換（ＣＭ１０：ｐＩ＞４）又はアニオン交換（Ｑ１０：ｐＩ＜４）ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイでＳＥＬＤＩ分析した。１４．９ｋと１５．６ｋの相対強度を示す。
【００６２】
〔図２２〕図２２、２２Ｂ及び２２Ｃは非ＲＢＣヘモグロビンとＲＢＣヘモグロビンを比較し、血清のリポ蛋白質及び非リポ蛋白質画分間の非ＲＢＣヘモグロビンの分布を比較する。血清及びリポ蛋白質を１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、ヘモグロビンに対してイムノブロットした。通常飼料を与えたマウスから得られた溶血ＲＢＣをヘモグロビンの標準としてロードした。図２２Ａ：通常飼料（Ｃ）又はアテローム発生飼料（Ａ）を７日間（Ｄ７）又は１５週間（Ｗ１５）与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに由来する血清サンプル（ｎ＝８）；図２２Ｂ：Ｄ７及びＷ１５群の血清サンプルプールに由来するＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ及びＨＤＬ後（ｐＨＤＬ）ＦＰＬＣ画分。図２２Ｃ：Ｄ７−Ｃ及びＤ７−Ａ血清サンプルに由来するＨＤＬ及びｐＨＤＬ領域をカバーする個々のＦＰＬＣ画分（画分２５〜４０）をコレステロール（ＯＤ４９０）とヘム（ＯＤ４１０）について分析した。図２２Ａから明らかなように、通常飼料又はアテローム発生飼料を７又は１５日間与えたマウスでは非ＲＢＣヘモグロビン総量に有意差がなかった。更に同図から明らかなように、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上で非ＲＢＣヘモグロビンと溶血ＲＢＣに由来するヘモグロビンの分子量は同等である。図２２Ｂから明らかなように、アテローム発生飼料を７日間又は１５週間与えると、非ＲＢＣヘモグロビンでは非リポ蛋白質画分（ｐＨＤＬ）からＨＤＬ画分への変化を生じた。図２２Ｃは図２４Ｂのデータを裏付けるものであり、通常飼料を７日間与えた後に殆どヘモグロビンはＨＤＬと会合していないが、アテローム発生飼料を７日間与えた後にＨＤＬ画分中に実質的なヘモグロビンが存在していた。
【００６３】
〔図２３〕図２３Ａ及び２３Ｂはアテローム発生飼料によるアテローム発生血清及びＨＤＬ画分中の非ＲＢＣヘモグロビンが特異な性質をもつことを示す。図２３Ａ：通常飼料（Ｃ）又はアテローム発生飼料（Ａ）を与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝８）に由来する血清サンプルプールをＦＰＬＣにより分画し、順相（ＮＰ２０）又はアニオン交換（Ｑ１０；ｐＩ＜７）ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイでＳＥＬＤＩ分析した。１４．９ｋ（Ｈｂ−α）及び１５．６ｋ（Ｈｂ−β）の相対強度を示す。図２３Ｂ：図２に記載したｐＨ７．０及びｐＨ４．０に相当するアニオン交換カラム画分を１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、ヘモグロビンに対してイムノブロットした。これらのシステムで測定したアテローム発生飼料による非ＲＢＣヘモグロビンの性質の変化はヘモグロビンとＨＤＬ及び他のＨＤＬ蛋白質との会合に一致する。
【００６４】
〔図２４〕アテローム発生血清中のヘモグロビンが特異なｐＩ値をもつことを示す。通常飼料（Ｃ）又はアテローム発生飼料（Ａ）を７日間（Ｄ７）又は１５週間（Ｗ１５）与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに由来する血清サンプル（ｎ＝８）を使用前にプールした。Ｄ７マウスからのＲＢＣを血清勾配により単離し、洗浄し、溶血させた。血清サンプルをＦＰＬＣにより分画し、Ｄ７マウスからのＨＤＬ画分をプールした。プールした血清、ＨＤＬ及び溶血ＲＢＣをＩＥＦゲル（ｐＨ３〜１０）にロードし、ヘモグロビンに対してイムノブロットした。通常飼料を与えたマウスからの溶血ＲＢＣ（左レーン）をヘモグロビンの標準としてロードした。同図から明らかなように、ＲＢＣヘモグロビンの特性は通常飼料又はアテローム発生飼料を与えたマウスと差異がなかった。更に同図から明らかなように、通常飼料を与えたマウスからのＨＤＬにはヘモグロビンが会合していなかったが、アテローム発生飼料を与えたマウスからのＨＤＬにはヘモグロビンが会合しており、そのｐＩはＲＢＣヘモグロビンと著しく相違していた。
【００６５】
〔図２５〕非ＲＢＣヘモグロビンがアテローム発生飼料によるＨＤＬ画分と会合し（左パネル）、アテローム発生飼料を１５週間与えた後にＲＢＣヘモグロビンと同様に泳動する非ＲＢＣヘモグロビンが失われる（右パネル）ことを示す。通常飼料（Ｃ）又はアテローム発生飼料（Ａ）を７日間（Ｄ７）又は１５週間（Ｗ１５）与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝８）からの血清サンプルプール（右パネル）又はＤ７からのＨＤＬ画分プール（左パネル）をネイティブＰＡＧＥにロードし、ヘモグロビンに対してイムノブロットした。通常飼料を与えたマウスからの溶血ＲＢＣもゲルにロードした（左パネルの左端）。
【００６６】
〔図２６〕図２６Ａ及び２６ＢはＨＤＬ中のＨｂの分光光度測定の結果を示す。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ  ６４０分光光度計を使用してＨＤＬを含有するＦＰＬＣ画分プールからＨｂの量と形状を測定した。全サンプル及び純粋種のスペクトルを３８０〜７００ｎｍで走査した（図２６Ａ）。放出速度の遅いＮＯドナーであるＮＯＮＯａｔｅをサンプルに加え、ｏｘｙＨｂからｍｅｔＨｂへの変換を観察した（図２６Ｂ，代表的グラフ）。１組の純粋種の「基本スペクトル」を線形回帰により測定スペクトルにフィットさせることにより、ｏｘｙＨｂとｍｅｔＨｂの濃度を逆重畳した（Ｖａｕｇｈｎら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：２３４２−２３４８）。
【００６７】
〔図２７〕健常ボランティア１０人と、ＮＣＥＰ  ＡＴＰＩＩＩガイドラインの定義による冠動脈心疾患（ＣＨＤ）又は等価疾患をもつ患者１０人に由来するＨＤＬ中のヘモグロビンを比較する。左パネルはヘモグロビンに対してイムノブロットした健常ボランティア１０人（左レーン）又はＣＨＤ患者１０人（右レーン）に由来する血漿プールからのＨＤＬ画分のネイティブＰＡＧＥゲルを示す。右パネルはＲＢＣを溶血させてＨＤＬ画分の単離前に血漿に添加した後の同一分析を示す。その結果、患者では健常ボランティアよりも著しく多量のヘモグロビンがＨＤＬと会合していた（左パネル）。更に同図から明らかなように、過剰のＲＢＣヘモグロビンを血漿に添加すると、健常ボランティアとＣＨＤ患者の両者のＨＤＬ画分でヘモグロビンが増加したが、依然として患者のＨＤＬのヘモグロビンのほうが有意に多量であった。
【００６８】
〔図２８〕図２８Ａ、２８Ｂ及び２８Ｃは若年性糖尿病患者とＣＨＤ患者に由来するＨＤＬでは非ＲＢＣヘモグロビンとハプトグロビンの両者が増加していることを示す。健常ボランティア１２人、若年性糖尿病患者１４人（成人８人；幼児６人）、又はスタチン投与中のＣＨＤもしくはＣＨＤ等価疾患対象８人から血清を採取した。ヒトａｐｏＡ−Ｉに対する抗体を９６ウェルプレートにコーティングした。対象からの血清を加え、一晩４℃でインキュベートした。プレートを十分に洗浄し、ヒトヘモグロビン又はヒトハプトグロビンに対する一次ヤギ抗体を加えて４℃で一晩インキュベートした。プレートを十分に洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識したヤギＩｇＧに対する二次抗体を加え、２時間室温でインキュベートした。プレートを十分に洗浄し、ＨＲＰ基質を加え、光学密度（ＯＤ）を測定した。図２８Ａは非ＲＢＣヘモグロビン（ＨＲＰμｇ／ｍＬ）を示す。図２８Ｂはハプトグロビン（ＨＲＰμｇ／ｍＬ）を示す。図２８Ｃは非ＲＢＣヘモグロビン値にハプトグロビン値を乗じた積を示す。その結果、後者方法で得られた値は健常ボランティアを糖尿病患者とＣＨＤ患者から切り離し、全くオーバーラップしなかった。
【００６９】
〔図２９〕４カ月齢ａｐｏＥヌルマウス（ｎ＝８匹／群）の飲料水にＤ−４Ｆを２カ月間添加する（＋Ｄ−４Ｆ）と、これらのマウスからのＨＤＬ上清中のトランスフェリン含量はＤ−４Ｆを添加しない飲料水を与えたマウス（Ｄ−４Ｆ不添加）に比較して有意に低下したことを実証する。
【００７０】
〔図３０〕４カ月齢ａｐｏＥヌルマウス（ｎ＝８匹／群）の飲料水にＤ−４Ｆを２カ月間添加する（＋Ｄ−４Ｆ）と、これらのマウスからのＨＤＬ上清中のミエロペルオキシダーゼ含量はＤ−４Ｆを添加しない飲料水を与えたマウス（Ｄ−４Ｆ不添加）に比較して非常に有意に低下したことを実証する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７１】
本発明は異常高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）の新規アッセイに関する。異常ＨＤＬ（例えば向炎症性ＨＤＬ）は心疾患及び炎症反応を特徴とする他の病態の病因に関係があるとみなされている。従って、異常ＨＤＬのアッセイはアテローム性動脈硬化症及び／又は炎症反応を特徴とする他の病態（例えば関節リウマチ、紅斑性狼瘡、結節性多発動脈炎、骨粗鬆症、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、ハンセン病、結核、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ性多発筋痛症、結節性多発動脈炎、強皮症、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、アルツハイマー病、慢性腎不全、糖尿病、糖尿病網膜症、糖尿病性腎症、移植拒絶反応、移植後アテローム性動脈硬化症，虚血再潅流障害、成人呼吸器症候群、鬱血性心不全、糸球体炎、代謝症候群、多発性硬化症、敗血症症候群、鎌状赤血球症、血管性痴呆、クローン病、内皮機能不全、細動脈機能不全、エイズ、リウマチ性多発筋痛症、結節性多発動脈炎、強皮症、特発性肺線維症、冠動脈石灰化、石灰化大動脈弁狭窄症、骨粗鬆症、細菌感染症、真菌感染症、自己免疫疾患、関節リウマチ、鬱血性心不全、内皮機能不全、細動脈機能不全、ウイルス性疾患、多発性硬化症等）の検出及び／又は予後診断に診断法及び予後診断法として有用である。
【００７２】
ＨＤＬ炎症特性／抗炎症特性がアテローム性動脈硬化症等の疾患におけるＨＤＬの役割の重要な決定因子であり、ＨＤＬコレステロール濃度に非依存性であることを示唆する証拠は益々増えつつある。本発明はＨＤＬの炎症特性を測定する新規アッセイに関する。本明細書に記載するアッセイは一般に主に２種類に分類することができる。
【００７３】
Ｉ．ＨＤＬの炎症性を反映するＨＤＬ会合蛋白質の測定；及び
【００７４】
ＩＩ．ＨＤＬのＬＤＬ凝集抑制能の測定
【００７５】
Ｉ．ＨＤＬの炎症性を反映するＨＤＬ会合蛋白質の測定
Ａ）アテローム性動脈硬化症／高脂血症のマウスモデルでＨＤＬと会合した８種の蛋白質
本発明者らはマウス及びヒトの両者において、ＨＤＬの炎症特性が冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）の指標としてＨＤＬコレステロール濃度よりも高感度の指標であることを既に報告している。所定態様では、本発明はＩ群／防御性ＨＤＬを「異常」ＨＤＬから区別する特異的な蛋白質フィンガープリントの同定にも関する。実施例２及び３ではマウスＨＤＬについて例証するが、同一蛋白質／蛋白質フィンガープリント及び生理的メカニズムがヒト及び他の哺乳動物でも機能していると考えられる。特に、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ技術を表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）と併用し、アテローム発生飼料を与えたマウスＨＤＬから正常マウスＨＤＬを区別する特異的な蛋白質フィンガープリントを同定した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにアテローム発生飼料を１週間与えた結果、ＨＤＬコレステロール濃度が低下し、パラオキソナーゼ活性が低下し、反応性酸素種含量が増加し、マクロファージからのコレステロール流出を促進するＨＤＬの能力が低下した。通常飼料に戻して更に２週間マウスに与えると、ＨＤＬの向アテローム発生特性は正常表現型に復帰した（例えば図１９参照）。通常飼料を与えたマウスに由来する正常ＨＤＬに比較してアテローム発生飼料を与えたマウスに由来する向炎症性ＨＤＬにｐ＜０．０５で示差的に存在する合計８８個のＳＥＬＤＩピークを同定した。飼料を元に戻すと、８８個の血清ピークのうちの７４個が正常レベルに復帰した。短期飼料交換と非アテローム発生因子に起因するアーチファクト／変化を排除するように更に分析後、向炎症性ＨＤＬと示差的に会合している蛋白質に相当する２４個のＳＥＬＤＩ  ｍ／ｚピークを同定した。２４個の蛋白質ピークのうちの１４個はアテローム性動脈硬化症／高脂血症の他の３種の広く使用されている動物モデル、即ち西欧型飼料を与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊ、ＬＤＬＲヌルマウス及びａｐｏＥヌルマウスに由来する向炎症性ＨＤＬと共通であることが判明した。更に、全４種の動物モデルに由来する血清サンプルの蛋白質プロファイリングの結果、向炎症性ＨＤＬの同定用血清バイオマーカーパネルとしてマウスで使用可能な８蛋白質コアシグネチャー（上記１４個のＳＥＬＤＩ  ｍ／ｚピークのサブセット）が同定され、同様のシグネチャーをヒト及び他の哺乳動物でも使用することができる。これらの８コアシグネチャー蛋白質については実施例２に詳細に記載する。
【００７６】
この蛋白質シグネチャーは（例えば本明細書に記載するような質量分析法及び／又は蛋白質チップ法を使用して）容易に検出することができるので、例えば患者の体内の向炎症性ＨＤＬを識別するために使用することができる。従って、アテローム性動脈硬化症及び／又は炎症反応を特徴とする他の病態の診断法及び／又は予後診断法として蛋白質シグネチャーの存在又は大きさを使用することができる。
【００７７】
場合により、患者の蛋白質シグネチャーの強度を識別又は定量するための迅速な検出／定量法を提供するために、限定されないが、電気泳動、クロマトグラフィー、及び／又はイムノアッセイ等の他の標準方法を使用して蛋白質の１種以上を検出することができる。
【００７８】
Ｂ）アテローム性動脈硬化症／高脂血症のマウスモデルでは非ＲＢＣヘモグロビンがＨＤＬと会合しているという驚くべき知見
上記のように、正常／抗炎症性ＨＤＬを向炎症性ＨＤＬから区別するために個々に又は組み合わせて使用可能な強アニオン交換ＳＥＬＤＩ  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ技術を使用して８種の特異的蛋白質を同定した。マウスモデルで向炎症性ＨＤＬと最も顕著に会合していたバイオマーカーピークの２個（ｍ／ｚ  １４，９００及びｍ／ｚ  １５，６００）を更に特性決定した。微量液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法を使用し、ｍ／ｚ  １４，９００及びｍ／ｚ  １５，６００に相当するＳＥＬＤＩピークを夫々マウスヘモグロビンα鎖（Ｈｂ−α，１４．９ｋＤａ）及びマウスヘモグロビンβ鎖（Ｈｂ−β，１５．９ｋＤａ）として同定した。ウェスタンブロット分析により、Ｈｂが正常ＨＤＬと比較して向炎症性ＨＤＬと示差的に会合していることを確認した。ＨＤＬと会合したＨｂの生化学的特性決定の結果、向炎症性ＨＤＬと会合したＨｂはｐＩの低下（遊離ＨｂのｐＩ７．５以上に対してｐＩ４．０及びｐＩ７．０）、ＨＤＬを含む画分に存在する高分子量複合体との会合等の特異な物理化学的性質をもつことも判明した。
【００７９】
この非ＲＢＣヘモグロビンを詳細に分析した結果、アミノ酸配列はＲＢＣヘモグロビンと相違しないことが判明した。実際に、向炎症性ＨＤＬと会合した非ＲＢＣヘモグロビンの物性変化はＨＤＬと会合している他の蛋白質（例えばハプトグロビン）とこのヘモグロビンの強い会合に起因すると思われる。
【００８０】
マウス及びヒトでは血漿及び血清中に常に少量の非ＲＢＣヘモグロビンが存在するということが本発明により意外にも判明した。この非ＲＢＣヘモグロビンの濃度は１０マイクロモルのオーダーである。他方、全血中のヘモグロビン濃度は１モルを上回る。従って、ＲＢＣ以外に存在するのは全血中のヘモグロビンの約０．００１％に過ぎない。
【００８１】
正常マウス及び正常ヒトではこの少量の非ＲＢＣヘモグロビンが血漿又は血清の非リポ蛋白質画分に局在しているということも本発明により意外にも発見された。アテローム発生飼料を与えたマウス、又はアテローム性動脈硬化症を発症するように遺伝的に操作したマウス、又は糖尿病もしくはＣＨＤをもつヒト、又は向炎症性ＨＤＬの他の原因をもつヒトではこの非ＲＢＣヘモグロビンがＨＤＬに存在するということも本発明により意外にも発見された。
【００８２】
ＨＤＬと会合しているヘモグロビンの主形態はオキシヘモグロビン（ｏｘｙＨｂ）であった。ｏｘｙＨｂの酸化促進性により、本発明のデータはＨｂがアテローム発生条件下でＨＤＬの向炎症性に寄与している可能性を示唆している。更に、特定理論に結び付けるものではないが、本発明者らはアテローム性動脈硬化症又は炎症反応を特徴とする他の病変の新規バイオマーカーとしてＨＤＬと会合したＨｂを利用できると考える。これらの試験の所定の詳細については実施例３に記載する。
【００８３】
Ｃ）アテローム性動脈硬化症／高脂血症のマウスモデルでＨＤＬと会合した急性相蛋白質
上記のように、本発明者らは赤血球Ｈｂと著しく相違する物理化学的性質をもつヘモグロビン（Ｈｂ）がアテローム性動脈硬化症の動物モデルでＨＤＬと会合し、アテローム発生条件下でＨＤＬの向炎症性に寄与することを発見した。従って、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝１２匹／群）にアテローム発生飼料を１週間与えると、通常飼料を与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに比較して、ｉ）ＨＤＬコレステロール濃度が低下し、ｉｉ）パラオキソナーゼ活性が低下し、ｉｉｉ）反応性酸化種が増加し、ｉｖ）マクロファージからのコレステロール流出を促進するＨＤＬの能力が低下した（例えば図１９、実施例２参照）。
【００８４】
ヘモペキシンとハプトグロビンはＨｂの２種の周知スカベンジャーである。ハプトグロビン（Ｈｐ）はＨＤＬと会合していることが分かっており、溶血と共に血漿濃度が増加することに加え、急性相反応中に増加する。ヘモペキシン（Ｈｘ）も向炎症性ＨＤＬと会合しており、同様に急性相反応と共に増加することが本発明により意外にも発見された。
【００８５】
図１に示すように、ウェスタン分析の結果、アテローム発生飼料（Ａ）を与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスｃから得られたＨＤＬ画分とＨｂ、Ｈｘ、及びＨｐ蛋白質複合体の会合は通常飼料（Ｃ）に比較して増加することが分かった（＞１０倍）。
【００８６】
Ｈｂ、Ｈｘ、及びＨｐ蛋白質複合体は通常飼料を与えたａｐｏＥヌルマウスからのＨＤＬとも会合していることが判明した。ヘム経路に関連するこれらのＨＤＬ会合蛋白質濃度の増加がアテローム性動脈硬化症を構成する炎症の有効な新規マーカーであるか否かを判定するために、これらのａｐｏＥヌルマウスにアポリポ蛋白質Ａ−Ｉ模倣ペプチドＤ−４Ｆ（５０μｇ／ｍｌ飲料水）を２１日間まで投与し、そのＨＤＬを炎症特性とヘム経路に関連するＨＤＬ会合蛋白質について分析した。
【００８７】
Ｄ−４Ｆ投与の結果、ｉ）ＨＤＬが向炎症性から抗炎症性に転換し（例えば図２参照）、ｉｉ）ＥＬＩＳＡにより測定した血清中のＨｘ（例えば図３参照）及びＨｐ（例えば図４参照）濃度が有意に低下し、ｉｉｉ）ＨＤＬ画分中のＨｘ及びＨｐ蛋白質複合体が減少し（例えば図５参照）、ｉｖ）ａｐｏＥヌル血清及びａｐｏＥヌルＨＤＬ上清中のＨｂの物理化学的性質が部分的に正常（即ち赤血球中に認められる性質）に回復した（例えば図６参照）。従って、所定態様では、本発明は向炎症性ＨＤＬの成分であるＨＤＬと会合したヘム関連蛋白質の検出方法を提供する。
【００８８】
図７に示すように、アテローム発生飼料を与えた野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスではヘモグロビンのアルファ（α）鎖とベータ（β）鎖の両者が増加した。通常飼料を与えたａｐｏＥヌルマウスでもヘモグロビンのα鎖とβ鎖の両者の含量が増加し、両鎖はＤ−４Ｆ投与と共に減少した。
【００８９】
図８に示すように、通常飼料を７日間（Ｄ７Ｃ）又はアテローム発生飼料を７日間（Ｄ７Ａ）もしくは１５週間（Ｗ１５Ａ）与えた野生型Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスでＨＤＬ中のオキシヘモグロビンとメトヘモグロビンの含量を測定した。通常飼料を与えたａｐｏＥヌルマウス（ａｐｏＥ）でもオキシヘモグロビンとメトヘモグロビンの含量を測定した。
【００９０】
オキシヘモグロビンは一酸化窒素を消費するが、メトヘモグロビンは一酸化窒素を消費しない。図９に示すように、正常マウスＨＤＬを添加しても、化学的に発生させた一酸化窒素の自然減衰は変化しなかった。他方、図１０に示すように、化学的に発生させた一酸化窒素（ＮＯドナー）にオキシヘモグロビン（ＨｂＯ２）を添加し、電流（ｐＡ）として測定した処、化学的に発生させた一酸化窒素の減衰は急速に劇的に変化し、オキシヘモグロビンにより消費されたことが分かった。更に図１０に示すように、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を添加しても減衰曲線は変化せず、溶媒（ＰＢＳ）の添加の結果として一酸化窒素の消費は生じなかったことが分かった。他方、アテローム発生飼料を７日間与えた野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに由来するＨＤＬ（Ｄ７Ａ  ＨＤＬ−Ｈｂ）を添加すると、減衰曲線は劇的に低下し、この向炎症性ＨＤＬは一酸化窒素を急速に消費したことが分かった。
【００９１】
図１１に示すように、アテローム発生飼料を与えたマウスに由来する向アテローム発生ＨＤＬを、オキシヘモグロビンをメトヘモグロビンに変換する物質［Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６］で処理すると、一酸化窒素を急速に消費する向炎症性ＨＤＬの能力は失われた。
【００９２】
図１２は通常飼料を７日間（左上パネル）もしくは１５週間（右上パネル）、又はアテローム発生飼料を７日間（左下パネル）もしくは１５週間（右下パネル）与えた野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに由来する赤血球（ＲＢＣ）ヘモグロビン及び血清中のヘモグロビンの二次元ゲルを示す。図１３はヘモグロビン染色をライトブルーで示す以外は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにアテローム発生飼料を７日間（Ｄ７Ａ）又は１５週間（Ｗ１５Ａ）与えた図１２の下段パネルを再現する。図１３に示したウェスタンブロットを剥離し、ハプトグロビンに対する抗体で再プローブした（図１４）。図１４に示したウェスタンブロットを剥離し、ヘモペキシンに対する抗体で再プローブした（図１５）。
【００９３】
図１２〜１５に示す実験によると、ヘモグロビン、ハプトグロビン及びヘモペキシンはアテローム発生血清中の同一粒子に局在すると思われる。
【００９４】
図１に示すように、アテローム発生飼料では、これらは主にＨＤＬと会合している。ハプトグロビン及び／又はヘモペキシンに対してヌルであったＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにアテローム発生飼料を７日間与えた処、ハプトグロビンは向炎症性ＨＤＬの形成に重要な役割を果たすことが判明した。要約すると、野生型（ＷＴ）又はヘモペキシン（Ｈｘ）ヌル又はハプトグロビン（Ｈｐ）ヌル又はヘモペキシンとハプトグロビンの両者にヌル（Ｈｐ／Ｈｘ）のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに通常飼料（Ｃ）又はアテローム発生飼料（Ａ）を７日間与えた。マウスから採血し、その血漿のＦＰＬＣ画分におけるコレステロール含量とヘム含量を測定した。野生型ＨＤＬは実質的にヘムを会合していなかった。これらのマウスにアテローム発生飼料を７日間与えると、ＨＤＬ画分と会合したヘムが検出された（下段パネルの黄色い線）。ヘモペキシンの不在下では、通常飼料でもＨＤＬ画分と会合したヘムは認められず、アテローム発生飼料を７日間与えると、これらのマウスのＨＤＬのヘム含量は増加した。他方、ハプトグロビンを欠損するマウスでは、アテローム発生飼料を与えてもＨＤＬと会合したヘムは認められなかった（右下パネルの緑色の線；右下パネルの赤線）。従って、ヘムがＨＤＬと会合するためにはハプトグロビンが必要であった。
【００９５】
別の実験では、野生型（ＷＴ）又はヘモペキシン（Ｈｘ）ヌル又はハプトグロビン（Ｈｐ）又はヘモペキシンとハプトグロビンの両者にヌル（Ｈｐ／Ｈｘ）のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに通常飼料又はアテローム発生飼料を７日間与えた。マウスから採血し、その血漿のＦＰＬＣ画分におけるコレステロール含量と反応性酸素種（ＲＯＳ）含量を測定した。ＨＤＬは実質的にＲＯＳを会合していなかった。これらのマウスにアテローム発生飼料を７日間与えると、ＨＤＬ画分と会合したＲＯＳが検出された。ヘモペキシンの不在下では、通常飼料でもＨＤＬ画分と会合したＲＯＳは認められず、アテローム発生飼料を７日間与えると、これらのマウスのＨＤＬのＲＯＳ含量は増加した。他方、ハプトグロビンを欠損するマウスでは、アテローム発生飼料を与えてもＨＤＬと会合したＲＯＳは認められなかった。従って、ＲＯＳがＨＤＬと会合するためにはハプトグロビンが必要であった。
【００９６】
本明細書に記載するデータから明らかなように、ＨＤＬと会合したシグネチャー蛋白質又はＨＤＬと会合した蛋白質を含有するヘム濃度により向炎症性ＨＤＬを検出できることが意外にも判明した。本発明によると、ＨＤＬと会合したヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質濃度と血漿／血清の非リポ蛋白質画分中のこれらの蛋白質濃度の比が向炎症性ＨＤＬの予測指標となることも意外にも判明した。更に本発明によると、ＨＤＬと会合したヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質の不在下ではＨＤＬは向炎症特性（例えばＲＯＳ含量増加）を示すことができないことも意外にも判明した。
【００９７】
これらの予想外の知見に基づき、向炎症性（異常）ＨＤＬを同定するための多数のアッセイを提供する。このようなアッセイとしては限定されないが、ｍ／ｚ比が約９．３、１４．９、１５．６、１５．８、１６．２、１６．５、１８．６、１９．５であり、ＨＤＬと会合した蛋白質の１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、又は８種を検出し、これらの蛋白質がＨＤＬと会合している場合に前記ＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する方法が挙げられる。
【００９８】
上記のように、本発明によると、ｍ／ｚ比が１４．９ｋ及び１５．６ｋの蛋白質は夫々ヘモグロビンα鎖及びβ鎖であることが意外にも発見された。本発明によると、ｍ／ｚ比比が１９．５ｋの蛋白質はＸＩＩ群ＰＬＡ２であることも意外にも発見された。
【００９９】
別の態様では、アッセイはＨＤＬと会合したヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質（例えばヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ等）、又はヘム結合蛋白質と結合する蛋白質（例えば可溶性ＣＤ１６３）の濃度を測定し、ＨＤＬと会合した前記蛋白質の１種以上、２種以上、３種以上又は４種の濃度が（例えば防御性ＨＤＬで検出される濃度に比較して）上昇している場合にＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する段階を含む。
【０１００】
所定態様では、アッセイはＨＤＬと会合したヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質（例えばヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ）の濃度をＨＤＬの非リポ蛋白質画分中のこれらのヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質の濃度と比較測定し、（例えば防御性ＨＤＬで検出される濃度に比較して）濃度が上昇している場合にＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する段階を含む。各種態様では、アッセイはＨＤＬと会合したヘム含有蛋白質（例えばヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ）と血漿及び／又は血清の非リポ蛋白質画分中のこれらのヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質の比を測定し、蛋白質の少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、又は４種の比が約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、又は１以上である場合にＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する段階を含む。
【０１０１】
各種態様では、アッセイの予測値はヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質の２種以上の測定により改善される。各種態様では、ヘム含有及び／又はヘム結合蛋白質の２種以上の測定を組み合わせることができ、及び／又は他の因子により加重することができる。従って、例えば、測定した蛋白質の各々の加重因子を決定するために判別関数分析又はクラスタ分析を使用することができる。１具体例では、図２８Ｃに示す例のように、（例えば各々の値を乗じることにより得られた値を測定して）ヘム含有又はヘム結合蛋白質の２種以上の含量の積を計算することができる。図２８Ｃに示す例を使用し、このような分析は対象から採血中又は図２７に示す例のように採血後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで溶血が発生する場合にアッセイの予測値を改善することができる。従って、例えば、ＨＤＬと会合したヘモグロビンとＨＤＬと会合したハプトグロビンの値（いずれもＨＲＰμｇ／ｍＬで表す）の積を計算し、アッセイ関数を提供することができる。
【０１０２】
各種態様では、ＨＤＬと会合したヘム濃度を測定、及び／又はＨＤＬの鉄含量を測定、及び／又はＨＤＬと会合した鉄含有蛋白質濃度を測定し、これらの測定値が（例えば防御性ＨＤＬで検出される濃度に比較して）上昇している場合にＨＤＬは向炎症性ＨＤＬであると判定する段階を含む。
【０１０３】
ＨＤＬの一酸化窒素消費能を識別／定量するアッセイも提供する。
【０１０４】
ＩＩ．ＨＤＬのＬＤＬ凝集抑制能の測定
各種態様では、本発明は向炎症性ＨＤＬがＬＤＬ凝集を防止せず、抗炎症性ＨＤＬがＬＤＬ凝集を防止するという意外な知見にも関する。従って、ＬＤＬ凝集アッセイは向炎症性ＨＤＬをアッセイ及び検出する簡便な手段となる。各種ＬＤＬ凝集アッセイが当業者に公知であり、本発明は特定凝集アッセイ又はフォーマットに限定されない。凝集アッセイプロトコールの１例を実施例４に記載する。
【０１０５】
図１６に示すように、このアッセイはＣＨＤ又はＣＨＤ等価疾患をもつ対象から向炎症性ＨＤＬを容易に検出することができ、値は健常ボランティアから採取したＨＤＬで得られた値と著しく相違していた。図１７に示すように、このアッセイはａｐｏＥヌルマウス（アテローム性動脈硬化症のマウスモデル）から向炎症性ＨＤＬを容易に検出することができ、値は正常マウスＨＤＬで得られた値と著しく相違していた。更に、このアッセイはａｐｏＥヌルマウスにａｐｏＡ−Ｉ模倣ペプチドＤ−４Ｆを投与する有効性を実証する簡単な手段となった。
【０１０６】
ＩＩＩ．アッセイの使用
従って、本発明は防御性及び／又は異常（向炎症性）ＨＤＬの検出及び／又は定量用の多数のアッセイを提供し、このようなアッセイはアテローム性動脈硬化症又は炎症反応を特徴とする他の病態（例えばアテローム性動脈硬化症、脳卒中、ハンセン病、結核、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ性多発筋痛症、結節性多発動脈炎、強皮症、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病、エイズ、リウマチ性多発筋痛症、結節性多発動脈炎、強皮症、特発性肺線維症、冠動脈石灰化、石灰化大動脈弁狭窄症、骨粗鬆症、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、自己免疫疾患、関節リウマチ、クローン病等）を検出するための診断法及び／又は予後診断法となる。アッセイはアテローム性動脈硬化症及び（例えば上記のような）他の炎症病態の危険のある者を検出し、各種治療及び治療プロトコールの有効性をモニターするためにも非常に有用である。
【０１０７】
各種態様では、アッセイはヘム関連ＨＤＬ会合蛋白質（例えばヘモグロビン、及び／又はハプトグロビン、及び／又はヘモペキシン、及び／又はミエロペルオキシダーゼ等）の測定、血漿／血清のＨＤＬ及び非リポ蛋白質画分間のＨＤＬ会合蛋白質の相対分布の測定、向炎症性ＨＤＬの一酸化窒素消費能の測定、及びＨＤＬのＬＤＬ凝集抑制能の測定を含む。
【０１０８】
この点では、ヘモペキシンは弱い急性相反応体であることが知られているが、アテローム性動脈硬化症又は異常ＨＤＬの予測因子であるとは従来考えられていなかった。実際に、本発明者らの知るところては、ＨＤＬとのその会合は従来立証されていなかった。この蛋白質は主にハプトグロビンと共働して過剰のヘムを循環から除去すると考えられていた。従って、ヘモペキシンがＨＤＬと会合しており、その血漿中濃度、特にＨＤＬと会合したヘモペキシン含量がアテローム性動脈硬化症及び異常ＨＤＬの高度予測因子であることは意外な発見であった。
【０１０９】
上記のように、所定態様では、本発明はアテローム性動脈硬化症又は炎症反応を特徴とする他の病態の検出のための診断法及び／又は予後診断法に関する。本明細書に記載する診断法は各種対象の治療に有用である。対象（例えば患者）が異常ＨＤＬをもつと診断される場合には、防御性ＨＤＬ濃度を回復もしくは上昇させる１種以上の薬剤及び／又は各種スタチン（例えばアトルバスタチン（Ｌｉｐｉｔｏｒ（登録商標），Ｐｆｉｚｅｒ）、シンバスタチン（Ｚｏｃｏｒ（登録商標），Ｍｅｒｃｋ）、プラバスタチン（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ（登録商標），Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、フルバスタチン（Ｌｅｓｃｏｌ（登録商標），Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ロバスタチン（Ｍｅｖａｃｏｒ（登録商標），Ｍｅｒｃｋ）、ロスバスタチン（Ｃｒｅｓｔｏｒ（登録商標），Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）、及びピタバスタチン（Ｓａｎｋｙｏ）等）の良好な候補である。防御性ＨＤＬ濃度を回復又は上昇させるこのような薬剤（活性剤）としては限定されないが、Ｄ４Ｆ（例えばＬｉら（２００４）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１０：１７０１−１７０５参照）、いずれも言及により本明細書に組込むＰＣＴ／ＵＳ２００１／２６４９７、及び／又はＰＣＴ／ＵＳ２００１／２６４９７、及び／又はＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６２８８、及び／又はＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２８２９４、及び／又はＰＣＴ／ＵＳ２００３／０９９８８、及び／又はＵＳＳＮ  １０／２７３，３８６に記載の活性剤等が挙げられる。
【０１１０】
当然のことながら、所定態様では、本発明のアッセイは一般に当業者が前記特定病態又は炎症反応を特徴とする病態を前記対象で同定できるような鑑別診断として実施される。
【０１１１】
ＩＶ．ＨＤＬ会合蛋白質の検出／定量
各種態様では、本発明のアッセイは１種以上の蛋白質（例えば限定されないが、ヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ、トランスフェリン、可溶性ＣＤ１６３等のＨＤＬ会合蛋白質）を検出及び／又は定量する段階を含む。これらは周知であり、十分に特性決定された蛋白質である。例えば、ハプトグロビン（例えばＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００５１３４参照）は比較的共通の多形性をもつ陽性急性相蛋白質であり（Ｖｌｉｅｒｂｅｒｇｈｅら（２００４）Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ．，３４５：３５−４２．）、一般に血液中の遊離ヘモグロビンと結合してその調節を助長する。ＣＤ１６３はハプトグロビン−ヘモグロビン複合体の取込みとクリアランスに関与する単球−マクロファージ特異的スカベンジャー受容体である（Ａｒｉｓｔｏｅｌｉら（２００６）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １８４；３４２−３４７）。ヘモペキシンは６０ＫＤａ血漿糖蛋白質である（Ｄｅｌａｎｇｈｅ（２００１）Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，３１２：１３−２３）（例えばＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿０００６０４，蛋白質ファミリーのＰＦＡＭ  Ｐｆａｍデータベース及びＨＭＭアクセション番号ＰＦ０００４５参照）。ヘモグロビン、ミオグロビン、又はヘム含有酵素（例えばカタラーゼ）の分解中に遊離ヘムが血漿中で形成されると、ヘモペキシンと１：１の比で結合する（Ｄｅｌａｎｇｈｅ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｌｏｉｓ（２００１）Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，３１２：１３−２３；Ｓｈｉｐｕｌｉｎａら（２０００）Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．，１９：２３９−２４８；Ｓｏｌａｒら（１９８９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２５６：２２５−２２９；Ｋｕｚｅｌｏｖａら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１３３６：４９７−５０１）。ヘモペキシンはヘムと鉄代謝を結び付ける重要な要素であり、他の鉄トランスポーターであるハプトグロビン及びトランスフェリンと共働して肝臓による鉄ホメオスタシスを維持する（Ｄｅｌａｎｇｈｅ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｌｏｉｓ（２００１）Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，３１２：１３−２３）。
【０１１２】
ヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ等の検出／定量方法は当業者に周知である。例えば、医療用ハプトグロビンアッセイは急性リウマチ性疾患、胆管閉塞、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎等（ハプトグロビン上昇）又は慢性肝疾患、胎児赤芽球症、血腫、溶血性貧血、Ｇ６ＰＤ欠損による溶血性貧血、特発性自己免疫性溶血性貧血、免疫性溶血性貧血、薬物誘発性免疫性溶血性貧血、原発性肝疾患及び輸液反応（ハプトグロビン濃度低下）の鑑別診断で実施される。
【０１１３】
本発明の方法では特定蛋白質を検出／定量するための本質的に任意方法を使用することができる。このような方法としては限定されないが、キャピラリー電気泳動、ウェスタンブロット、質量分析法、クロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ）、イムノアッセイ等が挙げられる。
【０１１４】
Ａ）サンプル採取及び処理
ヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ等は哺乳動物、より好ましくはヒト患者に由来する生体サンプル（例えば全血、血漿等）中で定量することが好ましい。本明細書で使用する生体サンプルとは異常ＨＤＬの存在及び／又はレベルに相関させることが可能な濃度で本明細書に記載する１種以上のアッセイ蛋白質（例えばハプトグロビン及び／又はヘモペキシン）を含有する生体組織又は体液のサンプルである。所定の好ましい生体サンプルとしては限定されないが、全血又は各種血液画分（例えば血漿、血清等）が挙げられる。所定態様では、生体サンプルはＨＤＬを含有する。所定態様では、生体サンプルは血清又は血漿を含み、あるいは血清又は血漿を含む別のサンプルを準備する。
【０１１５】
生体サンプルは必要に応じて所望により適切な緩衝液で希釈することにより前処理してもよいし、濃縮してもよい。生理的ｐＨのリン酸、Ｔｒｉｓ等の各種緩衝液の１種を利用する多数の標準水性緩衝液の任意のものを使用することができる。
【０１１６】
上記のように、所定態様では、アッセイは全血、血清又は血漿を使用して実施される。血液及び／又は血液調製物の取得と保存は当業者に周知である。一般には静脈穿刺により採血する。当業者に周知の緩衝液又は他の試薬を加えて血液を希釈し、測定前に２４時間まで２〜８℃、又は−２０℃以下で２４時間以上保存することができる。特に好ましい態様では、血液又は血液調製物（例えば血清）は防腐剤を加えずに−７０℃で永久的に保存される。
【０１１７】
各種態様では、上記のように、サンプルはＨＤＬを含有しており、及び／又はサンプルからＨＤＬを単離する。ＨＤＬの単離方法は当業者に周知であり、下記実施例に例証する。
【０１１８】
Ｂ）免疫結合アッセイ
好ましい１態様では、多数の周知免疫結合アッセイの任意のものを使用して生体サンプル中の蛋白質を検出及び／又は定量する（例えば米国特許第４，３６６，２４１号、４，３７６，１１０号、４，５１７，２８８号、４，８３７，１６８号、６，９７４，７０４号、６，９６４，８７２号、６，８８７，３６２号、６，８７８，５５８号、６，８５５，５６２号、６，８４９，４５７号、６，８３５，５４３号、６，８３０，７３１号、６，８１８，４５６号、６，８１８，４５５号、６，７７０，４８９号、６，７３７，２７７号、６，７２３，５２４号、６，６８９，３１７号、６，６８２，６４８号、６，６７３，５６２号、６，６３２，６０３号等参照）。一般的なイムノアッセイの概説については、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ３７：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｓａｉ，ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｔｉｔｅｓ  ＆  Ｔｅｒｒ，ｅｄｓ．（１９９１）も参照。
【０１１９】
免疫結合アッセイ（ないしイムノアッセイ）は一般に検体（この場合にはヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ等、及び／又はそのフラグメント）と特異的に結合し、多くの場合には固定化するための「捕捉剤」を使用する。捕捉剤は検体と特異的に結合する部分である。好ましい１態様では、捕捉剤はこの場合にはヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ等及び／又はそのフラグメントもしくはアイソフォームと特異的に結合する抗体である。
【０１２０】
この点では、ヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、及びミエロペルオキシダーゼ等を検出及び定量するためのモノクローナル及びポリクローナル抗体が市販されている（例えば抗ハプトグロビン抗体ａｂ８９６８（ヒツジポリクローナル）、ａｂ４２４８（ニワトリポリクローナル）及びａｂ１３４２９（マウスモノクローナル）、抗ヘモペキシン抗体ａｂ２７７１０（マウスモノクローナル）及びａｂ２７７１１（Ａｂｃａｍ，Ｉｎｃ．から市販されているマウスモノクローナル）等参照）。
【０１２１】
イムノアッセイは多くの場合には捕捉剤と検体により形成される結合複合体と特異的に結合してこれを標識するための標識剤も使用する。あるいは、抗体／ハプトグロビン及び／又は抗体／ヘモペキシンと特異的に結合する第３の分子（例えば別の抗体）を標識剤としてもよい。
【０１２２】
所定態様では、標識剤はラベルを付けた抗ハプトグロビン及び／又は抗ヘモペキシン及び／又は抗ヘモグロビン及び／又は抗ミエロペルオキシダーゼ抗体を含む。あるいは、抗体にはラベルを付けず、抗体の起源である種の抗体に特異的な第３の標識抗体と結合してもよい。従って、例えば、第３の標識分子（例えば酵素標識ストレプトアビジン）が特異的に結合することができる検出可能な部分（例えばビオチン）で抗ハプトグロビン抗体を修飾することができる。
【０１２３】
免疫グロブリン定常領域と特異的に結合することが可能な他の蛋白質（例えばプロテインＡ又はプロテインＧ）も標識剤として使用することができる。これらの蛋白質は連鎖球菌の細胞壁の通常成分である。これらの蛋白質は種々の種に由来する免疫グロブリン定常領域に対して強い非免疫原性反応性を示す（例えばＫｒｏｎｖａｌら（１９７３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１１：１４０１−１４０６；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍら（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３５：２５８９−２５４２等参照）。
【０１２４】
アッセイ全体を通して試薬の添加後毎にインキュベーション及び／又は洗浄段階を実施することができる。インキュベーション段階は約５秒間〜数時間、好ましくは約５分間〜約２４時間とすることができる。しかし、インキュベーション時間はアッセイフォーマット、検体、溶液容量、濃度等により異なる。通常では、アッセイは周囲温度で実施されるが、４℃〜４０℃等の一定範囲の温度で実施することもできる。
【０１２５】
１）非競合アッセイフォーマット
各種態様では、ヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ等を検出又は定量するためのイムノアッセイは競合アッセイでも非競合アッセイでもよい。非競合イムノアッセイは捕捉する検体（この場合にはヘモグロビン、及び／又はハプトグロビン、及び／又はヘモペキシン、及び／又はミエロペルオキシダーゼ等）の量を直接測定するアッセイである。好ましい「サンドイッチ」アッセイの１例では、例えば、捕捉剤（例えば抗ハプトグロビン抗体、及び／又は抗ヘモグロビン抗体、及び／又は抗ヘモペキシン抗体、及び／又は抗ミエロペルオキシダーゼ抗体）を固体支持体に直接結合し、固定化する。これらの固定化抗体はその後、試験サンプル中に存在するヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、及び／又はミエロペルオキシダーゼを捕捉する。こうして固定化された捕捉蛋白質をその後、標識剤（例えばラベルを付けた第２のハプトグロビン及び／又はヘモペキシン抗体）と結合する。
【０１２６】
あるいは、第２の抗体にはラベルを付けず、第２の抗体の起源である種の抗体に特異的な第３の標識抗体と結合してもよい。第２の抗体は第３の標識分子（例えば酵素標識ストレプトアビジン）が特異的に結合することができる検出可能な部分（例えばビオチン）で修飾することができる。
【０１２７】
２）競合アッセイフォーマット
競合アッセイでは、添加した（外来）検体（例えばハプトグロビン、ヘモペキシン、ヘモグロビン、ミエロペルオキシダーゼ等）がサンプル中に存在する検体により捕捉剤（例えば抗ヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ抗体）から置換される（又は競合排除される）量を測定することにより、サンプル中に存在する検体（ヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ等）の量を間接的に測定する。競合アッセイの１例では、この場合には既知量のヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ等をサンプルに添加した後に、サンプルを捕捉剤（この場合にはヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ等と特異的に結合する抗体）と接触させる。抗体と結合したヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ等の量はサンプル中に存在する検体の濃度に反比例する。
【０１２８】
所定態様では、抗体を固体支持体に固定化する。抗体に結合したヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ等の量は、抗体／検体複合体中に存在するヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ等の量を測定するか、又は結合していない残りのヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ等の量を測定することにより測定することができる。ヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ等の量は標識ヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ等を準備することにより測定することができる。
【０１２９】
別の適切な競合アッセイはハプテン阻害アッセイである。このアッセイでは、既知検体，この場合にはヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ等を固体支持体に固定化する。既知量の抗ヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ抗体等をサンプルに加えた後、サンプルを固定化モグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ等と接触させる。この場合には、固定化ヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ等と結合した抗ヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ抗体等の量はサンプル中に存在する検体の量に反比例する。この場合も、固定化抗体の量は固定化蛋白質画分又は溶液中に残存する抗体の画分を検出することにより検出することができる。
【０１３０】
抗体を標識して直接検出してもよいし、上記のように抗体と特異的に結合する標識部分を後から加えることにより間接的に検出してもよい。
【０１３１】
３）ＲＩＡによる蛋白質検出
所定態様では、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を使用してサンプルのヘモグロビン、及び／又はハプトグロビン、及び／又はヘモペキシン、及び／又はミエロペルオキシダーゼ含量を定量する。ラジオイムノアッセイの詳細なプロトコールは例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．）Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ等に記載されている。
【０１３２】
４）他のアッセイフォーマット
別の態様では、ウェスタンブロット（イムノブロット）分析を使用してサンプル中の検体蛋白質の存在を検出及び定量する。この技術は一般に分子量に基づいてゲル電気泳動によりサンプル蛋白質を分離する段階と、分離した蛋白質を適切な固体支持体（例えばニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、又は誘導体化ナイロンフィルター）に転写する段階と、標的検体（例えばヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ミエロペルオキシダーゼ等）と特異的に結合する抗体と共にサンプルをインキュベートする段階を含む。該当検体に特異的な抗体は固体支持体上に存在する検体と特異的に結合する。これらの抗体は直接標識してもよいし、あるいは抗ハプトグロビン及び／又はヘモペキシンと特異的に結合する標識抗体（例えば標識ヒツジ抗マウス抗体）を使用して後から検出してよい。
【０１３３】
他のアッセイフォーマットとしては限定されないが、特定分子（例えば抗体）と結合し、封入試薬又はマーカーを放出するように設計されたリポソームを使用するリポソームイムノアッセイ（ＬＩＡ）が挙げられる。その後、放出された薬品を標準技術に従って検出する（Ｍｏｎｒｏｅら（１９８６）Ａｍｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｖ．５：３４−４１参照）。
【０１３４】
以上のアッセイは例証を目的とし、限定的ではない、本明細書の教示を使用し、他のアッセイフォーマットも当業者に想到されよう。なお、実施例には特定プロトコールも記載する。
【０１３５】
Ｃ．アッセイのスコアリング
本発明のアッセイは当業者に周知の標準方法に従ってスコアリングする。本発明のアッセイは一般に被験蛋白質の濃度差が検出可能な場合に陽性と判定される。所定態様では、変化は例えば提供されるデータセットに適した任意統計的検定法（例えばｔ検定、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、セミパラメトリック法、ノンパラメトリック法（例えばＷｉｌｃｏｘｏｎ  Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｔｅｓｔ，Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｓｉｇｎｅｄ  Ｒａｎｋｓ  Ｔｅｓｔ，Ｓｉｇｎ  Ｔｅｓｔ，Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  Ｔｅｓｔ等））を使用して判定した場合の統計的有意変化である。統計的有意変化は少なくとも８５％の信頼水準で有意であることが好ましく、少なくとも９０％がより好ましく、少なくとも９５％が更に好ましく、少なくとも９８％又は９９％が最も好ましい。所定態様では、変化は少なくとも１０％の変化であり、少なくとも２０％の変化が好ましく、少なくとも５０％の変化がより好ましく、少なくとも９０％の変化が最も好ましい。
【０１３６】
Ｖ．一酸化窒素アッセイ
向炎症性ＨＤＬは一酸化窒素を消費（して硝酸を生成）するが、防御性ＨＤＬは一酸化窒素を実質的に消費しないことも本発明により発見された。従って、一酸化窒素消費／減少の測定は防御性ＨＤＬの迅速で簡便なアッセイとなる。
【０１３７】
一酸化窒素消費の検出方法は当業者に周知である。これらの方法は一般に一酸化窒素又一酸化窒素の化学的供与体を準備する段階と、分光光度法による吸光度測定又は電気化学的方法を使用して一酸化窒素の消費を検出する段階を含む。
【０１３８】
ＶＩ．ＬＤＬ凝集アッセイ
所定態様では、向炎症性ＨＤＬがＬＤＬ凝集を防止しないのに対して防御性ＨＤＬがＬＤＬ凝集を防止できるという性質に基づく非防御性ＨＤＬのアッセイを提供する。アッセイは一般にＬＤＬ（例えば単離ＬＤＬ）を該当ＨＤＬと接触させる段階と、ＬＤＬの凝集量又は率を測定する段階を含む。ＬＤＬ凝集の測定方法は当業者に周知である。
【０１３９】
簡単な１態様では、ＬＤＬを単にボルテックスにより溶液に溶かし、例えば適当な対照（例えばブランク溶液、及び／又は防御性ＨＤＬによる同一実験）に対して６８０ｎｍの吸光度を経時的（例えば１０秒間隔）に読み取ることにより凝集率を測定する（凝集アッセイの具体例については、例えばＫｈｏｏら（１９８８）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ８：３４８−３５８参照）。所定態様では、例えば実施例４に記載するようにアルブミン除去カラムを使用して凝集を測定する、
【０１４０】
ＶＩＩ．アッセイ最適化
本発明のアッセイは例えば生体サンプル及び／又は特定試験物質の起源及び／又は種類、及び／又は利用可能な分析施設に応じて特定状況での使用に最適化することができる。従って、例えば、最適化は結合アッセイに最適な条件、最適なサンプル処理条件（例えば好ましい単離条件）、信号対雑音比を最大にする抗体条件、スループットを改善するプロトコール等を決定する段階を含むことができる。更に、装置及び／又は試薬の入手可能性に従ってアッセイフォーマットを選択及び／又は最適化することができる。
【０１４１】
アッセイフォーマットの通常の選択及び最適化は当業者に周知である。
【０１４２】
ＶＩＩＩ．キット
所定態様では、本発明は本明細書に記載するアッセイの１種以上を実施するためのキットに関する。一般に、このようなキットはヘモグロビン、及び／又はミエロペルオキシダーゼ、及び／又はハプトグロビン、及び／又はヘモペキシンを検出するための１種以上の試薬を含む。このような試薬としては限定されないが、各種蛋白質に特異的な抗体が挙げられる。所定態様では、キットはＬＤＬ凝集アッセイ又は一酸化窒素消費アッセイを実施するための１種以上の試薬を含む。
【０１４３】
キットは場合により採血、及び／又はＨＤＬ及び／又はＬＤＬの単離等のための他の材料を含むことができる。
【０１４４】
更に、キットは場合により本発明の方法を実施するための手順（即ちプロトコール）を含む説明書を含むことができる。好ましい説明書はハプトグロビン及び／又はヘモペキシン濃度を測定するためにキット内容物を利用するプロトコールを提供する。説明書は一般に文書又は印刷物を含むが、これらに限定されない。このような説明書を記憶し、エンドユーザーに伝達することが可能な任意媒体が本発明に含まれる。このような媒体としては限定されないが、電子記憶媒体（例えば磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えばＣＤＲＯＭ）等が挙げられる。このような媒体はこのような説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むものでもよい。
【実施例１】
【０１４５】
以下の実施例は本発明の例証を目的とし、限定するものではない。
【０１４６】
ヘモグロビン、ハプトグロビン及びヘモペキシンの測定
ハプトグロビン及びヘモペキシンのＥＬＩＳＡプロトコール、ＨＤＬ上清の調製プロトコール並びにａｐｏＡ−Ｉ会合免疫吸着蛋白質のプロトコールを以下に示す。
【０１４７】
（ヒトヘモグロビンＥＬＩＳＡ）
【表１】
2009526233.tif 000003
【０１４８】
（磁気ビーズ試薬によるＨＤＬ単離）
１．緑色キャップ管又は血清分離管を使用し、５℃にて２３００ｒｐｍで２０分間遠心して血漿又は血清を血液サンプルから分離する。
【０１４９】
２．上清（血清又は血漿）を取り出す。注：サンプルを予め凍結している場合には、サンプルを解凍し、室温にて１２，０００ｒｐｍで５分間遠心する。こうして、アッセイに影響を与える可能性のある血清又は血漿中に存在する粒子を除去する。
【０１５０】
３．上清（最大２５０μＬ／ウェル）を透明丸底９６ウェルプレートに加える。
【０１５１】
４．上清の総容量の１／５の磁気ビーズ試薬（最大５０μＬ／ウェル）を各サンプルに加え、混合する。５分間静置する。
【０１５２】
５．磁気粒子コンセントレーターの上にプレートを載せ、５分間置く。
【０１５３】
６．上清を取り出し、マイクロ遠心管に加える。注：上清はＨＤＬを含有している。ＡｐｏＢを含有する粒子は除去されている。
【０１５４】
７．５℃にて１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、ビーズを除去する。
【０１５５】
８．上清を取り出す。
【０１５６】
（緩衝液の調製）
１．コーティングバッファー：２５ｍＬ  ｄｄＨ２Ｏ＋８ｍＬバッファーＡ＋１７ｍＬバッファーＢ（バッファーＡ：０．２Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３；バッファーＢ：０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３）を調製する。
【０１５７】
２．洗浄バッファー：０．７５ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ  ２０＋１５０ｍＬ  １０×ＰＢＳ＋１３５０ｍＬ  ｄｄＨ２Ｏを調製する。
【０１５８】
３．ブロッキング／希釈バッファー：２０ｍＬ  １０×ＰＢＳ＋１０ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ  ２０＋０．５ｇ  ＢＳＡ＋１７０ｍＬ  ｄｄＨ２Ｏを調製する。
【０１５９】
４．停止溶液：１．３８ｍＬ  Ｈ２ＳＯ４＋４８．６２ｍＬ  Ｈ２Ｏを調製する。
【０１６０】
（サンプル及び標準曲線の作成）
１．サンプル（血清又はＨＤＬ上清）をコーティングバッファーで２００倍に希釈する（ＨＤＬ  ２．５μＬ／コーティングバッファー４９７．５μＬ）。
【０１６１】
２．ヘモグロビンをコーティングバッファーで濃度１０００ｎｇ／ｍＬに調製する（ヘモグロビン２μＬ／コーティングバッファー２ｍＬ）。
【０１６２】
３．１０００ｎｇ／ｍＬ溶液をコーティングバッファーで２倍系列希釈して５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６３ｎｇ／ｍＬ溶液とすることにより三重標準点を作成する。
【０１６３】
４．ブランクとしてコーティングバッファーのみをウェルに加える。
（サンプル及び標準のプレート添加）
【０１６４】
１．各標準及び各サンプル１１０μＬをポリプロピレン製丸底９６ウェルプレート３枚に加える。
【０１６５】
２．マルチチャンネルピペットを使用し、各ウェルから１００μＬを取り出し、イムロンプレートに加える。
【０１６６】
３．一晩４℃でインキュベートする。
【０１６７】
４．抗原をバイオハザード廃棄物容器に廃棄する。
【０１６８】
５．洗浄バッファー３００μＬで３回洗浄する。プレートを逆さにし、内容物をデカントし、吸水性ペーパータオルの上で４〜５回叩き、各段階で液体を完全に取り除く。
【０１６９】
（ブロッキング及び一次抗体）
１．ブロッキングバッファー２００μＬを全ウェルに加え、室温で１時間インキュベートする。
【０１７０】
２．洗浄バッファー３００μＬで３回洗浄する。プレートを逆さにし、内容物をデカントし、吸水性ペーパータオルの上で４〜５回叩き、各段階で液体を完全に取り除く。
【０１７１】
３．ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトヘモグロビンを１００００倍に希釈する（抗体１μＬ／希釈バッファー１０ｍＬ）。
【０１７２】
４．２００００倍希釈液５０μＬを各ウェルに加える。
【０１７３】
５．洗浄バッファー３００μＬで３回洗浄する。プレートを逆さにし、内容物をデカントし、吸水性ペーパータオルの上で４〜５回叩き、各段階で液体を完全に取り除く。
【０１７４】
（ＴＭＢ及び停止溶液の添加）
１．ＴＭＢ  Ａ１部をＴＭＢ  Ｂ１部と混合する。
【０１７５】
２．ＴＭＢ混液１００μＬを各ウェルに加え、２０分間インキュベートする。
【０１７６】
３．停止溶液１００μＬを各ウェルに加える。
【０１７７】
（プレートリーダーの読取り）
１．波長を４５０ｎｍに設定したプレートリーダーで読取る。
【０１７８】
（ハプトグロビンＥＬＩＳＡ）
【表２】
2009526233.tif 000004
【０１７９】
（磁気ビーズ試薬によるＨＤＬ単離）
１．緑色キャップ管又は血清分離管を使用し、５℃にて２３００ｒｐｍで２０分間遠心して血漿又は血清を血液サンプルから分離する。
【０１８０】
２．上清（血清又は血漿）を取り出す。注：サンプルを予め凍結している場合には、サンプルを解凍し、室温にて１２，０００ｒｐｍで５分間遠心する。こうして、アッセイに影響を与える可能性のある血清又は血漿中に存在する粒子を除去する。
【０１８１】
３．上清（最大２５０μＬ／ウェル）を透明丸底９６ウェルプレートに加える。
【０１８２】
４．上清の総容量の１／５の磁気ビーズ試薬（最大５０μＬ／ウェル）を各サンプルに加え、混合する。５分間静置する。
【０１８３】
５．磁気粒子コンセントレーターの上にプレートを載せ、５分間置く。
【０１８４】
６．上清を取り出し、マイクロ遠心管に加える。注：上清はＨＤＬを含有している。ＡｐｏＢを含有する粒子は除去されている。
【０１８５】
７．５℃にて１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、ビーズを除去する。
【０１８６】
８．上清を取り出す。
【０１８７】
（緩衝液の調製）
１．洗浄バッファー濃厚液（キット同梱）を試薬グレード水で１０倍に希釈する。
【０１８８】
２．ＥＩＡ希釈剤濃厚液（キット同梱）を試薬グレード水で１０倍に希釈する。
【０１８９】
（血漿／血清又はＨＤＬ上清の調製）
１．血漿／血清又はＨＤＬ上清をＥＩＡ希釈剤（キット同梱）で４０００倍に希釈する。
【０１９０】
２．まず１００倍に希釈する（ＨＤＬ  ５μＬ／希釈剤４９５μＬ）。
【０１９１】
３．１００倍希釈液の４０倍希釈液を調製する（１００倍希釈液１２．５μＬ／希釈剤４８７．５μＬ）。
【０１９２】
（標準曲線の作成）
１．ハプトグロビン標準（キット同梱）１００μｇをＥＩＡ希釈剤２ｍＬで再構成し、濃度５０μｇ／ｍＬとする。
【０１９３】
２．希釈液を調製する前に１０分間標準を静かに撹拌しながら静置する。
【０１９４】
３．標準溶液（５０μｇ／ｍＬ）をＥＩＡ希釈剤で４倍系列希釈して１２．５、３．１３、０．７８、０．１９５、及び０．０４９μｇ／ｍＬ溶液とすることにより三重標準点を作成する。
【０１９５】
（サンプルのプレート添加）
１．ビオチン化ハプトグロビン（キット同梱）をＥＩＡ希釈剤４ｍＬで希釈する。
【０１９６】
２．各標準及び各サンプル３５μＬをポリプロピレン製丸底９６ウェルプレート３枚に加える。
【０１９７】
３．マルチチャンネルピペットを使用し、各ウェルから２５μＬを取り出し、ヒトハプトグロビンマイクロプレート（キット同梱）に加える。
【０１９８】
４．マルチチャンネルピペットを使用し、ビオチン化ハプトグロビン２５μＬを各ウェルに加える。
【０１９９】
５．ウェルにシーリングテープ（キット同梱）を貼り付け、室温で静かに撹拌しながら１時間インキュベートする。
【０２００】
６．洗浄バッファー２００μＬで５回洗浄する。プレートを逆さにし、内容物をデカントし、吸水性ペーパータオルの上で４〜５回叩き、各段階で液体を完全に取り除く。
【０２０１】
（ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートの添加）
１．ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートを短時間遠沈させる。
【０２０２】
２．コンジュゲートをＥＩＡ希釈剤で１００倍に希釈する。
【０２０３】
３．ＳＰコンジュゲート５０μＬを各ウェルに加え、３０分間インキュベートする。
【０２０４】
４．洗浄バッファー２００μＬで５回洗浄する。プレートを逆さにし、内容物をデカントし、吸水性ペーパータオルの上で４〜５回叩き、各段階で液体を完全に取り除く。
【０２０５】
（基質及び停止溶液の添加）
１．色素基質（キット同梱）５０μＬ／ウェルを加え、８分間インキュベートする。
【０２０６】
２．停止溶液（キット同梱）５０μＬを各ウェルに加える。
【０２０７】
（プレートリーダーの読取り）
１．波長を４５０ｎｍに設定したプレートリーダーで読取る。
【０２０８】
（ヘモペキシンＥＬＩＳＡ）
【表３】
2009526233.tif 000005
【０２０９】
（磁気ビーズ試薬によるＨＤＬ単離）
１．緑色キャップ管又は血清分離管を使用し、５℃にて２３００ｒｐｍで２０分間遠心して血漿又は血清を血液サンプルから分離する。
【０２１０】
２．上清（血清又は血漿）を取り出す。注：サンプルを予め凍結している場合には、サンプルを解凍し、室温にて１２，０００ｒｐｍで５分間遠心する。こうして、アッセイに影響を与える可能性のある血清又は血漿中に存在する粒子を除去する。
【０２１１】
３．上清（最大２５０μＬ／ウェル）を透明丸底９６ウェルプレートに加える。
【０２１２】
４．上清の総容量の１／５の磁気ビーズ試薬（最大５０μＬ／ウェル）を各サンプルに加え、混合する。５分間静置する。
【０２１３】
５．磁気粒子コンセントレーターの上にプレートを載せ、５分間置く。
【０２１４】
６．上清を取り出し、マイクロ遠心管に加える。注：上清はＨＤＬを含有している。ＡｐｏＢを含有する粒子は除去されている。
【０２１５】
７．５℃にて１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、ビーズを除去する。
【０２１６】
８．上清を取り出す。
【０２１７】
（緩衝液の調製）
１．コーティングバッファー：２５ｍＬ  ｄｄＨ２Ｏ＋８ｍＬバッファーＡ＋１７ｍＬバッファーＢ（バッファーＡ：０．２Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３；バッファーＢ：０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３）を調製する。
【０２１８】
２．洗浄バッファー：０．７５ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ  ２０＋１５０ｍＬ  １０×ＰＢＳ＋１３５０ｍＬ  ｄｄＨ２Ｏを調製する。
【０２１９】
３．ブロッキング／希釈バッファー：２０ｍＬ  １０×ＰＢＳ＋１０ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ  ２０＋０．５ｇ  ＢＳＡ＋１７０ｍＬ  ｄｄＨ２Ｏを調製する。
【０２２０】
４．停止溶液：１．３８ｍＬ  Ｈ２ＳＯ４＋４８．６２ｍＬ  Ｈ２Ｏを調製する。
【０２２１】
（サンプル及び標準曲線の作成）
１．サンプル（血漿又はＨＤＬ上清）をコーティングバッファーで２００倍に希釈する（ＨＤＬ  ２．５μＬ／コーティングバッファー４９７．５μＬ）。
【０２２２】
２．ヘモペキシンをコーティングバッファーで濃度１０００ｎｇ／ｍＬに調製する（ヘモペキシン２μＬ／コーティングバッファー２ｍＬ）。
【０２２３】
３．１０００ｎｇ／ｍＬ溶液をコーティングバッファーで２倍系列希釈して５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６３ｎｇ／ｍＬ溶液とすることにより三重標準点を作成する。
【０２２４】
４．ブランクとしてコーティングバッファーのみをウェルに加える。
【０２２５】
（サンプル及び標準のプレート添加）
１．各標準及び各サンプル１１０μＬをポリプロピレン製丸底９６ウェルプレート３枚に加える。
【０２２６】
２．マルチチャンネルピペットを使用し、各ウェルから１００μＬを取り出し、イムロンプレートに加える。
【０２２７】
３．一晩４℃でインキュベートする。
【０２２８】
４．抗原をバイオハザード廃棄物容器に廃棄する。
【０２２９】
５．洗浄バッファー３００μＬで３回洗浄する。プレートを逆さにし、内容物をデカントし、吸水性ペーパータオルの上で４〜５回叩き、各段階で液体を完全に取り除く。
【０２３０】
（ブロッキング及び一次抗体）
１．ブロッキングバッファー２００μＬを全ウェルに加え、室温で１時間インキュベートする。
【０２３１】
２．洗浄バッファー３００μＬで３回洗浄する。プレートを逆さにし、内容物をデカントし、吸水性ペーパータオルの上で４〜５回叩き、各段階で液体を完全に取り除く。
【０２３２】
３．ＨＲＰ標識ニワトリ抗ヒトヘモペキシンを２００００倍に希釈する（抗体１μＬ／希釈バッファー２０ｍＬ）。
【０２３３】
４．２００００倍希釈液５０μＬを各ウェルに加える。
【０２３４】
５．洗浄バッファー３００μＬで３回洗浄する。プレートを逆さにし、内容物をデカントし、吸水性ペーパータオルの上で４〜５回叩き、各段階で液体を完全に取り除く。
【０２３５】
（ＴＭＢ及び停止溶液の添加）
１．ＴＭＢ  Ａ１部をＴＭＢ  Ｂ１部と混合する。
【０２３６】
２．ＴＭＢ混液１００μＬを各ウェルに加え、２０分間インキュベートする。
【０２３７】
３．停止溶液１００μＬを各ウェルに加える。
【０２３８】
（プレートリーダーの読取り）
１．波長を４５０ｎｍに設定したプレートリーダーで読取る。
【０２３９】
（ＡｐｏＡ−Ｉ会合免疫吸着蛋白質ヘモグロビンＥＬＩＳＡ）
【表４】
2009526233.tif 000006
【０２４０】
（磁気ビーズ試薬によるＨＤＬ単離）
１．緑色キャップ管又は血清分離管を使用し、５℃にて２３００ｒｐｍで２０分間遠心して血漿又は血清を血液サンプルから分離する。
【０２４１】
２．上清（血清又は血漿）を取り出す。注：サンプルを予め凍結している場合には、サンプルを解凍し、室温にて１２，０００ｒｐｍで５分間遠心する。こうして、アッセイに影響を与える可能性のある血清又は血漿中に存在する粒子を除去する。
【０２４２】
３．上清（最大２５０μＬ／ウェル）を透明丸底９６ウェルプレートに加える。
【０２４３】
４．上清の総容量の１／５の磁気ビーズ試薬（最大５０μＬ／ウェル）を各サンプルに加え、混合する。５分間静置する。
【０２４４】
５．磁気粒子コンセントレーターの上にプレートを載せ、５分間置く。
【０２４５】
６．上清を取り出し、マイクロ遠心管に加える。注：上清はＨＤＬを含有している。ＡｐｏＢを含有する粒子は除去されている。
【０２４６】
７．５℃にて１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、ビーズを除去する。
【０２４７】
８．上清を取り出す。
【０２４８】
（緩衝液の調製）
１．コーティングバッファー：２５ｍＬ  ｄｄＨ２Ｏ＋８ｍＬバッファーＡ＋１７ｍＬバッファーＢ（バッファーＡ：０．２Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３；バッファーＢ：０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３）を調製する。
【０２４９】
２．洗浄バッファー：０．７５ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ  ２０＋１５０ｍＬ  １０×ＰＢＳ＋１３５０ｍＬ  ｄｄＨ２Ｏを調製する。
【０２５０】
３．ブロッキング／希釈バッファー：２０ｍＬ  １０×ＰＢＳ＋１０ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ  ２０＋０．５ｇ  ＢＳＡ＋１７０ｍＬ  ｄｄＨ２Ｏを調製する。
【０２５１】
４．停止溶液：１．３８ｍＬ  Ｈ２ＳＯ４＋４８．６２ｍＬ  Ｈ２Ｏを調製する。
【０２５２】
（サンプル及び標準曲線の作成）
１．サンプル（血清又はＨＤＬ上清）をコーティングバッファーで２００倍に希釈する（ＨＤＬ  ２．５μＬ／コーティングバッファー４９７．５μＬ）。
【０２５３】
２．ヘモグロビンをコーティングバッファーで濃度１０００ｎｇ／ｍＬに調製する（ヘモグロビン２μＬ／コーティングバッファー２ｍＬ）。
【０２５４】
３．１０００ｎｇ／ｍＬ溶液をコーティングバッファーで２倍系列希釈して５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６３ｎｇ／ｍＬ溶液とすることにより三重標準点を作成する。
【０２５５】
４．ブランクとしてコーティングバッファーのみをウェルに加える。
【０２５６】
（サンプル及び標準のプレート添加）
１．各標準及び各サンプル１１０μＬをポリプロピレン製丸底９６ウェルプレート３枚に加える。
【０２５７】
２．マルチチャンネルピペットを使用し、各ウェルから１００μＬを取り出し、抗ヒトＡｐｏＡ１をコーティングしたマイクロウェルプレート（Ａ１キット同梱）に加える。
【０２５８】
３．一晩４℃でインキュベートする。
【０２５９】
４．抗原をバイオハザード廃棄物容器に廃棄する。
【０２６０】
５．洗浄バッファー３００μＬで３回洗浄する。プレートを逆さにし、内容物をデカントし、吸水性ペーパータオルの上で４〜５回叩き、各段階で液体を完全に取り除く。
【０２６１】
（ブロッキング及び一次抗体）
１．ブロッキングバッファー２００μＬを全ウェルに加え、室温で１時間インキュベートする。
【０２６２】
２．洗浄バッファー３００μＬで３回洗浄する。プレートを逆さにし、内容物をデカントし、吸水性ペーパータオルの上で４〜５回叩き、各段階で液体を完全に取り除く。
【０２６３】
３．ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトヘモグロビンを１００００倍に希釈する（抗体１μＬ／希釈バッファー１０ｍＬ）。
【０２６４】
４．２００００倍希釈液５０μＬを各ウェルに加える。
【０２６５】
５．洗浄バッファー３００μＬで３回洗浄する。プレートを逆さにし、内容物をデカントし、吸水性ペーパータオルの上で４〜５回叩き、各段階で液体を完全に取り除く。
【０２６６】
（ＴＭＢ及び停止溶液の添加）
１．ＴＭＢ  Ａ１部をＴＭＢ  Ｂ１部と混合する。
【０２６７】
２．ＴＭＢ混液１００μＬを各ウェルに加え、２０分間インキュベートする。
【０２６８】
３．停止溶液１００μＬを各ウェルに加える。
【０２６９】
（プレートリーダーの読取り）
１．波長を４５０ｎｍに設定したプレートリーダーで読取る。
【０２７０】
（ＡｐｏＡ−Ｉ会合免疫吸着蛋白質ハプトグロビンＥＬＩＳＡ）
【表５】
2009526233.tif 000007
【０２７１】
（磁気ビーズ試薬によるＨＤＬ単離）
１．緑色キャップ管又は血清分離管を使用し、５℃にて２３００ｒｐｍで２０分間遠心して血漿又は血清を血液サンプルから分離する。
【０２７２】
２．上清（血清又は血漿）を取り出す。注：サンプルを予め凍結している場合には、サンプルを解凍し、室温にて１２，０００ｒｐｍで５分間遠心する。こうして、アッセイに影響を与える可能性のある血清又は血漿中に存在する粒子を除去する。
【０２７３】
３．上清（最大２５０μＬ／ウェル）を透明丸底９６ウェルプレートに加える。
【０２７４】
４．上清の総容量の１／５の磁気ビーズ試薬（最大５０μＬ／ウェル）を各サンプルに加え、混合する。５分間静置する。
【０２７５】
５．磁気粒子コンセントレーターの上にプレートを載せ、５分間置く。
【０２７６】
６．上清を取り出し、マイクロ遠心管に加える。注：上清はＨＤＬを含有している。ＡｐｏＢを含有する粒子は除去されている。
【０２７７】
７．５℃にて１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、ビーズを除去する。
【０２７８】
８．上清を取り出す。
【０２７９】
（緩衝液の調製）
１．コーティングバッファー：２５ｍＬ  ｄｄＨ２Ｏ＋８ｍＬバッファーＡ＋１７ｍＬバッファーＢ（バッファーＡ：０．２Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３；バッファーＢ：０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３）を調製する。
【０２８０】
２．洗浄バッファー：０．７５ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ  ２０＋１５０ｍＬ  １０×ＰＢＳ＋１３５０ｍＬ  ｄｄＨ２Ｏを調製する。
【０２８１】
３．ブロッキング／希釈バッファー：２０ｍＬ  １０×ＰＢＳ＋１０ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ  ２０＋０．５ｇ  ＢＳＡ＋１７０ｍＬ  ｄｄＨ２Ｏを調製する。
【０２８２】
４．停止溶液：１．３８ｍＬ  Ｈ２ＳＯ４＋４８．６２ｍＬ  Ｈ２Ｏを調製する。
【０２８３】
（ＨＤＬ上清の調製）
１．ＨＤＬ上清をコーティングバッファーで４０００倍に希釈する。
【０２８４】
２．まず１００倍に希釈する（ＨＤＬ  ５μＬ／バッファー４９５μＬ）。
【０２８５】
３．１００倍希釈液の４０倍希釈液を調製する（１００倍希釈液１２．５μＬ／バッファー４８７．５μＬ）。
【０２８６】
（標準曲線の作成）
１．ハプトグロビン標準（キット同梱）１００μｇをバッファー２ｍＬで再構成し、濃度５０μｇ／ｍＬとする。
【０２８７】
２．希釈液を調製する前に１０分間標準を静かに撹拌しながら静置する。
【０２８８】
３．標準溶液（５０μｇ／ｍＬ）をバッファーで４倍系列希釈して１２．５、３．１３、０．７８、０．１９５、及び０．０４９μｇ／ｍＬ溶液とすることにより三重標準点を作成する。
【０２８９】
（サンプル及び標準のプレート添加）
１．各標準及び各サンプル１１０μＬをポリプロピレン製丸底９６ウェルプレート３枚に加える。
【０２９０】
２．マルチチャンネルピペットを使用し、各ウェルから１００μＬを取り出し、抗ヒトＡｐｏＡ１をコーティングしたマイクロウェルプレート（Ａ１キット同梱）に加える。
【０２９１】
３．一晩４℃でインキュベートする。
【０２９２】
４．抗原をバイオハザード廃棄物容器に廃棄する。
【０２９３】
５．洗浄バッファー３００μＬで３回洗浄する。プレートを逆さにし、内容物をデカントし、吸水性ペーパータオルの上で４〜５回叩き、各段階で液体を完全に取り除く。
【０２９４】
（ブロッキング及び一次抗体）
１．ブロッキングバッファー２００μＬを全ウェルに加え、室温で１時間インキュベートする。
【０２９５】
２．洗浄バッファー３００μＬで３回洗浄する。プレートを逆さにし、内容物をデカントし、吸水性ペーパータオルの上で４〜５回叩き、各段階で液体を完全に取り除く。
【０２９６】
３．ＨＲＰ標識抗ヒトハプトグロビンを２００００倍に希釈する（抗体１μＬ／希釈バッファー２０ｍＬ）。
【０２９７】
４．２００００倍希釈液５０μＬを各ウェルに加える。
【０２９８】
５．洗浄バッファー３００μＬで３回洗浄する。プレートを逆さにし、内容物をデカントし、吸水性ペーパータオルの上で４〜５回叩き、各段階で液体を完全に取り除く。
【０２９９】
（ＴＭＢ及び停止溶液の添加）
１．ＴＭＢ  Ａ１部をＴＭＢ  Ｂ１部と混合する。
【０３００】
２．ＴＭＢ混液１００μＬを各ウェルに加え、２０分間インキュベートする。
【０３０１】
３．停止溶液１００μＬを各ウェルに加える。
【０３０２】
（プレートリーダーの読取り）
１．波長を４５０ｎｍに設定したプレートリーダーで読取る。
【０３０３】
（ＡｐｏＡ−Ｉ会合免疫吸着蛋白質ヘモペキシンＥＬＩＳＡ）
【表６】
2009526233.tif 000008
【０３０４】
（磁気ビーズ試薬によるＨＤＬ単離）
１．緑色キャップ管又は血清分離管を使用し、５℃にて２３００ｒｐｍで２０分間遠心して血漿又は血清を血液サンプルから分離する。
【０３０５】
２．上清（血清又は血漿）を取り出す。注：サンプルを予め凍結している場合には、サンプルを解凍し、室温にて１２，０００ｒｐｍで５分間遠心する。こうして、アッセイに影響を与える可能性のある血清又は血漿中に存在する粒子を除去する。
【０３０６】
３．上清（最大２５０μＬ／ウェル）を透明丸底９６ウェルプレートに加える。
【０３０７】
４．上清の総容量の１／５の磁気ビーズ試薬（最大５０μＬ／ウェル）を各サンプルに加え、混合する。５分間静置する。
【０３０８】
５．磁気粒子コンセントレーターの上にプレートを載せ、５分間置く。
【０３０９】
６．上清を取り出し、マイクロ遠心管に加える。注：上清はＨＤＬを含有している。ＡｐｏＢを含有する粒子は除去されている。
【０３１０】
７．５℃にて１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、ビーズを除去する。
【０３１１】
８．上清を取り出す。
【０３１２】
（緩衝液の調製）
１．コーティングバッファー：２５ｍＬ  ｄｄＨ２Ｏ＋８ｍＬバッファーＡ＋１７ｍＬバッファーＢ（バッファーＡ：０．２Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３；バッファーＢ：０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３）を調製する。
【０３１３】
２．洗浄バッファー：０．７５ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ  ２０＋１５０ｍＬ  １０×ＰＢＳ＋１３５０ｍＬ  ｄｄＨ２Ｏを調製する。
【０３１４】
３．ブロッキング／希釈バッファー：２０ｍＬ  １０×ＰＢＳ＋１０ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ  ２０＋０．５ｇ  ＢＳＡ＋１７０ｍＬ  ｄｄＨ２Ｏを調製する。
【０３１５】
４．停止溶液：１．３８ｍＬ  Ｈ２ＳＯ４＋４８．６２ｍＬ  Ｈ２Ｏを調製する。
【０３１６】
（サンプル及び標準曲線の作成）
１．サンプル（ＨＤＬ上清）をコーティングバッファーで２００倍に希釈する（ＨＤＬ  ２．５μＬ／コーティングバッファー４９７．５μＬ）。
【０３１７】
２．ヘモペキシンをコーティングバッファーで濃度１０００ｎｇ／ｍＬに調製する（ヘモペキシン２μＬ／コーティングバッファー２ｍＬ）。
【０３１８】
３．１０００ｎｇ／ｍＬ溶液をコーティングバッファーで２倍系列希釈して５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６３ｎｇ／ｍＬ溶液とすることにより三重標準点を作成する。
【０３１９】
４．ブランクとしてコーティングバッファーのみをウェルに加える。
【０３２０】
（サンプル及び標準のプレート添加）
１．各標準及び各サンプル１１０μＬをポリプロピレン製丸底９６ウェルプレート３枚に加える。
【０３２１】
２．マルチチャンネルピペットを使用し、各ウェルから１００μＬを取り出し、抗ヒトＡｐｏＡ１をコーティングしたマイクロウェルプレート（Ａ１キット同梱）に加える。
【０３２２】
３．一晩４℃でインキュベートする。
【０３２３】
４．抗原をバイオハザード廃棄物容器に廃棄する。
【０３２４】
５．洗浄バッファー３００μＬで３回洗浄する。プレートを逆さにし、内容物をデカントし、吸水性ペーパータオルの上で４〜５回叩き、各段階で液体を完全に取り除く。
【０３２５】
（ブロッキング及び一次抗体）
１．ブロッキングバッファー２００μＬを全ウェルに加え、室温で１時間インキュベートする。
【０３２６】
２．洗浄バッファー３００μＬで３回洗浄する。プレートを逆さにし、内容物をデカントし、吸水性ペーパータオルの上で４〜５回叩き、各段階で液体を完全に取り除く。
【０３２７】
３．ＨＲＰ標識ニワトリ抗ヒトヘモペキシンを２００００倍に希釈する（抗体１μＬ／希釈バッファー２０ｍＬ）。
【０３２８】
４．２００００倍希釈液５０μＬを各ウェルに加える。
【０３２９】
５．洗浄バッファー３００μＬで３回洗浄する。プレートを逆さにし、内容物をデカントし、吸水性ペーパータオルの上で４〜５回叩き、各段階で液体を完全に取り除く。
【０３３０】
（ＴＭＢ及び停止溶液の添加）
１．ＴＭＢ  Ａ１部をＴＭＢ  Ｂ１部と混合する。
【０３３１】
２．ＴＭＢ混液１００μＬを各ウェルに加え、２０分間インキュベートする。
【０３３２】
３．停止溶液１００μＬを各ウェルに加える。
【０３３３】
（プレートリーダーの読取り）
１．波長を４５０ｎｍに設定したプレートリーダーで読取る。
【０３３４】
なお、本明細書に記載するプロトコールは例証を目的とし、限定的ではない。本明細書に記載する教示を使用し、他のアッセイ及びアッセイフォーマットも当業者に容易に利用可能になるであろう。
【０３３５】
（結果）
健常ボランティア１０人と、基準によるＣＨＤ患者１０人から血漿をプールした。ＨＤＬを単離し、ネイティブＰＡＧＥゲルで泳動させ、ウェスタン分析を使用してヘモグロビンに対してイムノブロットした。図２７の左パネルに示すように、健常ボランティア１０人からのＨＤＬではＣＨＤ患者１０人に比較して著しく多量のヘモグロビンが検出された。図２７の右パネルに示すように、ＨＤＬ単離前に溶血ＲＢＣを血漿に添加すると、どちらの群でもＨＤＬと会合したヘモグロビンの量は増加したが、これらの極度溶血条件下でも健常ボランティアとＣＨＤ患者の有意差は依然として明白であった。
【０３３６】
他の実験では、別の群の健常ボランティア１２人、若年性糖尿病患者１４人（成人８人；幼児６人）、及びＮＣＥＰ  ＡＴＰ  ＩＩＩ基準によるＣＨＤ又は等価疾患をもつ対象８人から血清を採取した。最後の群の全患者はスタチンを投与中の者とした。ヒトａｐｏＡ−Ｉに対する抗体を９６ウェルプレートにコーティングした。対象からの血清を加え、一晩４℃でインキュベートした。プレートを十分に洗浄し、ヒトヘモグロビン又はヒトハプトグロビンに対する一次ヤギ抗体を加えて４℃で一晩インキュベートした。プレートを十分に洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識したヤギＩｇＧに対する二次抗体を加え、２時間室温でインキュベートした。プレートを十分に洗浄し、ＨＲＰ基質を加え、光学密度（ＯＤ）を測定した。図２８Ａは非ＲＢＣヘモグロビン（ＨＲＰμｇ／ｍＬ）を示す。図２８Ｂはハプトグロビン（ＨＲＰμｇ／ｍＬ）を示す。図２８Ｃは非ＲＢＣヘモグロビン値にハプトグロビン値を乗じた積を示す。その結果、後者方法で得られた値は健常ボランティアを糖尿病患者とＣＨＤ患者から切り離し、全くオーバーラップしなかった。
【０３３７】
これらの結果から明らかなように、本明細書に報告する新規アッセイは糖尿病やＣＨＤ等の疾患をもつ対象の検出に有用であり、これらの患者を健常者から区別するための手段となる。
【実施例２】
【０３３８】
向炎症性ＨＤＬにおける蛋白質プロファイル
本発明者らはマウス及びヒトの両者において、ＨＤＬの炎症特性がアテローム性動脈硬化症の指標としてＨＤＬコレステロール濃度よりも高感度の指標であることを既に報告している。本実施例では、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ技術を表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）と併用し、アテローム発生飼料を与えたマウスＨＤＬから正常マウスＨＤＬを区別する特異的な蛋白質フィンガープリントの同定について記載する。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにアテローム発生飼料を１週間与えた結果、ＨＤＬコレステロール濃度が低下し、パラオキソナーゼ活性が低下し、反応性酸素種含量が増加し、マクロファージからのコレステロール流出を促進するＨＤＬの能力が低下した。通常飼料に戻して更に２週間マウスに与えると、ＨＤＬの向アテローム発生特性は正常表現型に復帰した。通常飼料を与えたマウスに由来する正常ＨＤＬに比較してアテローム発生飼料を与えたマウスに由来する向炎症性ＨＤＬにｐ＜０．０５で示差的に存在する合計８８個のＳＥＬＤＩピークを同定した。飼料を元に戻すと、８８個の血清ピークのうちの７４個が正常レベルに復帰した。短期飼料交換と非アテローム発生因子に起因するアーチファクト／変化を排除するように更に分析後、向炎症性ＨＤＬと示差的に会合している蛋白質に相当する２４個のＳＥＬＤＩ  ｍ／ｚピークを同定した。２４個の蛋白質ピークのうちの１４個はアテローム性動脈硬化症／高脂血症の他の３種の広く使用されている動物モデル、即ち西欧型飼料を与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊ、ＬＤＬＲヌルマウス及びａｐｏＥヌルマウスに由来する向炎症性ＨＤＬと共通であることが判明した。更に、全４種の動物モデルに由来する血清サンプルの蛋白質プロファイリングの結果、向炎症性ＨＤＬの同定用血清バイオマーカーパネルとして使用可能な８蛋白質コアシグネチャー（上記１４個のＳＥＬＤＩ  ｍ／ｚピークのサブセット）が同定された。
【０３３９】
（実験手順）
（動物実験）
これらの実験ではＣ５７ＢＬ／６Ｊ、ＬＤＬＲヌル／Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及びａｐｏＥヌル／Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性８〜１２週齢マウスを使用した。通常飼料（Ｒａｌｓｔｏｎ  Ｐｕｒｉｎａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｈｏｗ）、又は１５．８％脂肪、１．２５％コレステロール、及び０．５％コール酸ｗ／ｗ／ｗを含有するアテローム発生飼料（Ｔｅｋｌａｄ／Ｈａｒｌａｎ  Ｃａｔａｌｏｇ）、又は西欧型飼料（Ｔｅｋｌａｄ／Ｈａｒｌａｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ，ｄｉｅｔ  Ｎｏ．８８１３７；４２％脂肪、０．１５％コレステロールｗ／ｗ）の３種の飼料のうちの１種を指定期間マウスに与えた。一晩絶食させたマウスから血清サンプルを単離し、従来記載されているように（Ｎａｖａｂら（２０００）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，４１：１４８１−１４９４）１０％スクロースで低温保存処理し、使用時まで−８０℃で保存した。
【０３４０】
（リポ蛋白質単離）
直列に配置したデュアルＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６カラムから構成されるゲル濾過高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）システムにより血清サンプルを分画した。非金属製Ｂｅｃｋｍａｎ  ＨＰＬＣポンプで滅菌ＰＢＳを流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで供給して血清（０．５ｍｌ）を溶出し、１ｍｌ毎に分画した。製造業者のプロトコールに従い、コレステロール試薬（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＣＯ）を使用して各画分のコレステロール含量を定量し、ＢＣＡアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して蛋白質含量を定量した。
【０３４１】
（ＳＥＬＤＩ分析及びｅｘ  ｖｉｖｏアッセイのためのＨＤＬ単離）
ＬｉｐｉＤｉｒｅｃｔ  ＨＤＬ試薬（Ｐｏｌｙｍｅｄｃｏ，Ｃｏｒｔｌａｎｄ  Ｍａｎｏｒ，ＮＹ）を製造業者のプロトコールに従って使用してＨＤＬを新たに単離した。ＨＤＬを含有する上清のコレステロール含量とＢＣＡ蛋白質を定量し、単離後４８時間以内に使用した。
【０３４２】
（ＨＤＬ中の反応性酸素種（ＲＯＳ））
従来記載されているように（Ｎａｖａｂら（２００１）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，４２：１３０８−１３１７）２，７，７’ジクロロフルオレセインジアセテート（Ｈ２ＤＣＦＤＡ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してＨＤＬのＲＯＳ含量を測定した。要約すると、ＨＤＬをメタノール中でＨ２ＤＣＦＤＡ（１０μｇ／ｍｌ）と共に３０分間３７℃でインキュベートした。４８５ｎｍ／５２５ｎｍの蛍光強度を測定することによりＲＯＳの指標としてのＤＣＦ形成を検出した。
【０３４３】
（パラオキソナーゼ（ＰＯＮ）アッセイ）
従来記載されているように（Ｖａｎ  Ｌｅｎｔｅｎら（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６：２７５８−２７６７）ＨＤＬ中のＰＯＮ活性を測定した。ＨＤＬをパラオキソンと共にインキュベートし、４０５ｎｍの吸光度の増加を１２分間測定することによりＰＯＮ活性を分析した。添加したＨＤＬ  １ｍｌ当たり毎分１ｎｍｏｌの４−ニトロフェノールの形成としてＰＯＮ活性１単位を定義した。
【０３４４】
（コレステロール流出）
従来記載されているように（Ｎａｖａｂら（２００４）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０９：３２１５−３２２０）細胞内コレステロール流出を実施した。要約すると、マウスＲＡＷ２６４．７細胞を２４ウェル組織培養プレートで培養し、１０％  ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地で一晩増殖させた。細胞を無血清培地で洗浄し、０．５％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する培地に３Ｈ−コレステロール（０．５μＣｉ／ｍｌ）とアセチル化ＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）を添加した液を一晩加えた。標識細胞を洗浄し、０．５％  ＢＳＡを含有する培地に再懸濁し、ＨＤＬと共に６時間３７℃でインキュベートした。培地に放出された合計放射能カウントの百分率としてコレステロール流出を表した。
【０３４５】
（ＳＥＬＤＩ分析用サンプル調製）
製造業者のプロトコール（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）に従い、強アニオン交換（Ｑ１０）チップで血清及びＨＤＬサンプルを処理した。要約すると、加湿チャンバーでＱ１０アレイスポットを結合バッファー（１×ＰＢＳ／０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，ｐＨ７）で室温にて１５分間平衡化した。各サンプルをまず９Ｍ尿素／２％  Ｃｈａｐｓ／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ，ｐＨ９．０で５倍に希釈し、更に結合バッファーで２５倍に希釈した。平衡化したＱ１０蛋白質アレイチップに各希釈サンプル５μｌをスポットし、加湿チャンバーで３０分間室温にてインキュベートした。チップを結合バッファーで２回、ＨＰＬＣ  Ｈ２Ｏで１回洗浄した後、風乾した。チップをシナピン酸溶液で先ず１００％飽和溶液０．５μｌ、次いで５０％飽和溶液１μｌで順次処理した。シナピン酸溶液はＥＡＭ溶液（５０％アセトニトリル及び０．５％トリフルオロ酢酸）をシナピン酸（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸）で飽和することにより新たに調製する。
【０３４６】
（Ｃｉｐｈｅｒｅｅｎ  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ  ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析）
アレイをＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ  Ｒｅａｄｅｒ（モデルＰＢ  ＳＩＩ）で分析した。２３０〜２８０任意単位のレーザー強度の平均６５個のレーザーショットを使用することにより蛋白質の質量スペクトルを生成した。低分子量蛋白質のデータ獲得には、検出寸法範囲を２〜１８ｋＤａに設定し、最大寸法２５ｋＤａとした。高分子量蛋白質には、検出寸法範囲を２０〜１５０ｋＤａに設定し、最大寸法２５０ｋＤａとした。外部校正標準（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）であるウシインスリン（５，７３３．６Ｄａ）、ヒトユビキチン（８，５６４．８Ｄａ）、ウシチトクロームｃ（１２，２３０．９Ｄａ）、ウシスーパーオキシドジスムターゼ（１５，５９１．４Ｄａ）、ウシラクトグロブリンＡ（１８，３６３．３Ｄａ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（４３，２４０Ｄａ）、ＢＳＡ（６６，４１０Ｄａ）、及びニワトリコンアルブミン７７，４９０Ｄａ）に従い、アレイ表面で捕捉した各蛋白質の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を決定した。
【０３４７】
（統計分析）
ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐデータ分析ソフトウェアバージョン３．２（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してデータを分析した。各比較について、群の全プロファイルの総イオン電流を使用して粗強度データを正規化した。ピーク強度は低分子量範囲ではｍ／ｚ  ３，０００〜２５，０００Ｄａ、高分子量範囲では４，０００〜２５０，０００Ｄａの総イオン電流に正規化した。Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｗｉｚａｒｄアプリケーション（ノンパラメトリック計算；Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して全スペクトルをコンパイルし、定量質量ピークを自動検出した。プロファイル群でサンプル統計を実施した（抗炎症性ＨＤＬ対向炎症性ＨＤＬ；正常血清対アテローム発生血清）。各群間の蛋白質差（変化倍率）を計算した。一方の群に比較してその強度に統計的有意差が認められた場合（ｐ＜０．０５）に蛋白質は２群間で示差的に会合しているとみなした。
【０３４８】
（結果）
（モデルシステム）
ＨｅｄｒｉｃｋらはＣ５７ＢＬ／６Ｊ低比重リポ蛋白質受容体欠損（ＬＤＬＲヌル）マウスにアテローム発生飼料を短期間（７日間まで）与えると、血漿ＰＯＮ活性及び質量が劇減し、血漿及びＨＤＬ脂質ヒドロペルオキシドが増加することを示した（Ｈｅｄｒｉｃｋら（２０００）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，２０：１９４６−１９５２）。興味深いことに、マウスがアテローム発生飼料を７日間消費した後に通常飼料に交換して３日間与えると、ＰＯＮ質量及び活性は正常レベルに戻った。他方、Ｈｅｄｒｉｃｋらは通常飼料に交換して３日間与えても全ＨＤＬ特性が完全に回復するわけではないことに注目した（前出）。本発明者らは向炎症性ＨＤＬで示差的に会合した蛋白質を同定する目的で同様のマウスモデルシステムを利用した。通常飼料を与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは抗炎症性ＨＤＬをもつが、アテローム発生飼料を与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは向炎症性ＨＤＬをもつ（Ｓｈｉｈら（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９７：１６３０−１６３９）。図１８及び１９に示すように、７日目に飼料をアテローム発生飼料から通常飼料に交換し、更に１４日間与えると、ＨＤＬコレステロール（図１８及び図１９，右下）、反応性酸素種含量（図１９，左上）、ＰＯＮ活性（図１９，右上）、及びＨＤＬによるコレステロール流出（図１９，左下）は正常レベルに回復した。これらの３種の実験条件（実験によって２１日間までの全実験期間通常飼料、実験によって２１日間までの全実験期間アテローム発生飼料、又は７日間アテローム発生飼料後に１４日間通常飼料）からのＨＤＬを使用することにより、ＨＤＬが向炎症性状態に転換するときにＨＤＬと会合又は解離している蛋白質を同定するためのシステムが得られるのではないかと推論した。
【０３４９】
（特定ＳＥＬＤＩピークは向炎症性ＨＤＬと示差的に会合している。）
先ずＳＥＬＤＩ分析を使用し、アテローム発生飼料でＨＤＬと示差的に会合する蛋白質を同定した。８週齢雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝８匹／群）に通常飼料を７日間（Ｃ）、アテローム発生飼料を７日間（Ａ）、通常飼料を２１日間（ＣＣ）、又はアテローム発生飼料を７日間後に通常飼料を更に１４日間（ＡＣ）与えた。各期間の終了時に各飼料群から血清サンプルを採取した（一晩絶食後に採取）。各血清からのＨＤＬをＬｉｐｉＤｉｒｅｃｔ  ＨＤＬ試薬で単離し、ＳＥＬＤＩ分析し、通常飼料を与えたマウスからの血清及びＨＤＬと比較してアテローム発生飼料を与えたマウスからのアテローム発生血清及びＨＤＬの蛋白質プロファイルを同定した。各群からの個々の血清サンプル（ｎ＝８）から蛋白質プロファイルを得た。「Ｃ」群の蛋白質プロファイルを「Ａ」の蛋白質プロファイルと比較し、「ＣＣ」群の蛋白質プロファイルを「ＡＣ」の蛋白質プロファイルと比較した。第１組の分析では、正常血清（「Ｃ」群）からのＨＤＬと比較してアテローム発生血清（「Ａ」群）からのＨＤＬで示差的に検出されたｍ／ｚピークを更にＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐソフトウェアにより従来記載されているように統計分析した（Ｋｏｚａｋら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１００：１２３４３−１２３４８）。２１日間アテローム発生飼料を与えたマウスからのＨＤＬでは、２１日間通常飼料を与えたマウスからのＨＤＬに対して有意差（ｐ＜０．０５）のある合計８８個のピークが検出された。
【０３５０】
（ＨＤＬ中の蛋白質ピークは飼料交換を反映する。）
これらの蛋白質プロファイルを「ＡＣ」群に対して分析した処、８８個のピークのうちの７４個が通常飼料のＨＤＬで認められる正常レベルに復帰しており、これらのピークは抗炎症性から向炎症性及びその逆のＨＤＬの転換に関連する蛋白質プロファイルに相当すると予想された（表１２）。
【０３５１】
（短期及び長期飼料により誘導した向炎症性ＨＤＬの両者に共通の蛋白質プロファイルが存在する。）
アテローム発生飼料を１５週間（Ｗ１５Ａ）与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝８）からのアテローム発生血清中のＨＤＬと通常飼料を１５週間（Ｗ１５Ｃ）与えたマウスからの血清中のＨＤＬを比較することにより、ＳＥＬＤＩプロファイルも作成した。更に、短期飼料により誘導したＨＤＬ（上記７４個のピーク）と長期（１５週間）飼料により誘導したＨＤＬに共通するピークを測定した。この比較により短期飼料交換に起因するアーチファクト／変化を排除できると推論した。期間に関係なくアテローム発生飼料（７日間アテローム発生飼料及び１５週間アテローム発生飼料）を与えたマウスからのＨＤＬでは、通常飼料を与えたマウスからのＨＤＬに比較して特異的且つ有意差のある合計２４個のＳＥＬＤＩピークを同定した（表７）。
【０３５２】
【表７】
2009526233.tif 000009
【０３５３】
アテローム発生飼料は０．５％コール酸を含有しているので、コール酸を含まない西欧型飼料（ＷＤ）を与えたマウス（ｎ＝８）から得られた血清サンプルからのＨＤＬで上記全実験を繰返し、両者高脂肪高コレステロール飼料（コール酸を含有するアテローム発生飼料とコール酸を含有しない西欧型飼料の両者）によるＨＤＬと示差的に会合した蛋白質に相当する２１個のｍ／ｚピークから構成される蛋白質シグネチャーを同定した（表８）。通常飼料を与えたマウスからのＨＤＬと比較すると、１３個の蛋白質ピークがアテローム発生飼料又は西欧型飼料を与えたマウスからのＨＤＬと強く会合／増加しており（黒の数字）、８個の蛋白質ピーク（括弧内）がアテローム発生飼料又は西欧型飼料を与えたマウスからのＨＤＬで解離／減少していた（表８）。
【０３５４】
【表８】
2009526233.tif 000010
【０３５５】
（高脂血症マウスモデルでＨＤＬと示差的に会合した共通蛋白質プロファイル）
アテローム性動脈硬化症のマウスモデルに由来するＨＤＬを対照マウスに由来するＨＤＬから区別する蛋白質プロファイルを同定したが、これを検証するために、西欧型飼料を与えたＬＤＬＲヌルマウスと通常飼料を与えたａｐｏＥヌルマウスを含むアテローム性動脈硬化症の他の周知マウスモデルを更に利用した。これらのマウスはアテローム性動脈硬化症になり易く、向炎症性ＨＤＬをもつ（Ｎａｖａｂら（２００５）Ａｎｎ．Ｍｅｄ．，３７：１７３−１７８；Ｓｈｉｈら（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９７：１６３０−１６３９；Ｒｉｄｋｅｒ（２００２）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０５：２−４）。これらのアテローム発生マウスからのＨＤＬサンプルをＳＥＬＤＩ分析し、プロファイルをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスモデルと交差検証した。これらの試験により、短期飼料交換と非アテローム発生因子に起因するアーチファクト／変化を排除するのみならず、複数のアテローム発生モデルで共通のＨＤＬのバイオマーカーを同定した。向炎症性ＨＤＬと会合するとしてＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスモデルで同定された２１個のピークのうちの１４個はＬＤＬＲヌルマウス及びａｐｏＥヌルマウスに由来するＨＤＬで検出されたピークと共通であった（表９）。
【０３５６】
【表９】
2009526233.tif 000011
【０３５７】
（向炎症性ＨＤＬと会合した潜在的血清バイオマーカー）
アテローム発生／高脂血症飼料によるＨＤＬと会合した蛋白質に相当する血清蛋白質プロファイルを更に同定するために、全４種のアテローム性動脈硬化症マウスモデルからの血清サンプルをＨＤＬについて実施したと同様にＳＥＬＤＩ分析した。ＳＥＬＤＩ分析の結果、アテローム発生／高脂血症マウス血清で共通のバイオマーカーとして１３個のピークが同定された（表１０）。更に、アテローム発生／高脂血症血清で検出された１３個の蛋白質ピークのうちの８個はアテローム発生／高脂血症飼料によるＨＤＬで同定されたピーク（上記１４個のピーク）と共通であった（表１１）。これらの結果から、同定された８個の蛋白質はマウス血清で直接検出可能な向炎症性ＨＤＬと会合した潜在的バイオマーカーであると予想される。
【０３５８】
【表１０】
2009526233.tif 000012
【０３５９】
【表１１】
2009526233.tif 000013
【０３６０】
（考察）
近年、ＨＤＬ機能はアテローム性動脈硬化症に対してＨＤＬ−Ｃよりも選択的な治療ターゲットとなり得ることが明らかになっている（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：４６４−４７４；Ｎａｖａｂら（２００５）Ａｎｎ．Ｍｅｄ．，３７：１７３−１７８；Ｒｉｄｋｅｒ（２００２）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０５：２−４；Ａｎｓｅｌｌら（２００３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０８：２７５１−２７５６）。多数の蛋白質及び酵素活性がＨＤＬと関連付けられているが、どの特定蛋白質プロファイルが正常／抗炎症性ＨＤＬを向炎症性ＨＤＬからより良好に区別するのに役立つかについては殆ど分かっていない。アテローム性動脈硬化症の確立マウスモデルでＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ技術を使用し、アテローム発生飼料を与えたマウスでＨＤＬと示差的に会合する蛋白質に相当するｍ／ｚピークを同定した。
【０３６１】
全実験を個々のマウスサンプル（ｎ＝８／群）で実施し、各サンプルを三重に測定した。更に、群間で有意差（ｐ＜０．０５）のあったｍ／ｚピークのみをその後の分析の候補ピークとして採用した。第１組の実験では、飼料をアテローム発生飼料（７日間）から通常飼料に交換して更に１４日間与えたときに、ＨＤＬの合計７４個のｍ／ｚピーク（表１２）が正常レベルに戻った。飼料の短期交換に起因するアーチファクトを排除するために、アテローム発生飼料を１５週間与えたマウスに由来するＨＤＬサンプルから得られた蛋白質プロファイルに対してこれらのピークを更に比較した。興味深いことに、アテローム発生飼料を１５週間与えたマウスから得られたＨＤＬで検出された元の７４個のピークのうちの２４個（表７）しか検出されず、残りの５９個のｍ／ｚピークは短期飼料交換及び／又は非アテローム発生因子に起因するものと思われた。しかし、残りの５９個のｍ／ｚピークはＨＤＬのアテローム発生への転換の初期段階で向炎症性ＨＤＬと会合している蛋白質に相当する可能性もある。
【０３６２】
【表１２】
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【０３６３】
興味深いことに、西欧型飼料を与えたマウスから得られた蛋白質プロファイルに比較すると、アテローム発生飼料を与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（短期又は長期）からのＨＤＬではｍ／ｚ  ５１００、ｍ／ｚ  ３５３００、及びｍ／ｚ  １９７０００の３種の蛋白質が検出されなかった（表８）。使用した２種の飼料の主な相違はコール酸であるので、これらの３種の蛋白質はコール酸代謝及び毒性に特異的な蛋白質に相当すると考えられる。これらの蛋白質の同定と特性決定は胆汁酸代謝に関連するＨＤＬ炎症特性の解明に有用であると思われる。驚くべきことに、アテローム性動脈硬化症の他の２種の動物モデル（西欧型飼料を与えたＬＤＬＲヌルマウスと通常飼料を与えたａｐｏＥヌルマウス）から得られた向炎症性ＨＤＬから蛋白質プロファイルを作成し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスからの向炎症性ＨＤＬの共通蛋白質プロファイルと比較した処、３種のモデル間で共通していたのは２１個のピークのうちの１４個のみであった（表８及び表９）。
【０３６４】
血清蛋白質プロファイリングは疾患診断及び／又は薬剤有効性判定におけるバイオマーカーの使用の簡単且つ効率的なストラテジーとなる。ＨＤＬから得られたプロファイルと異なる多数の血清中の蛋白質を同定した（表１３）。アテローム性動脈硬化症／高脂血症の各種全マウスモデルからの１３個のピークのコアシーケンスを同定した（表１０）。血清プロファイリングとＨＤＬプロファイリングから得られた最終セットの蛋白質プロファイルを比較した処、８個の蛋白質ピークの共通セットを同定した（表１０）。これらの８個のピークに相当する蛋白質は向炎症性ＨＤＬを同定するために血清サンプルを直接アッセイする場合のみならず、向炎症性ＨＤＬの性質を更に解明するための試験にも非常に重要なマーカーパネルを形成することができる。
【０３６５】
【表１３】
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【０３６６】
【表１４】
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【０３６７】
これらのｍ／ｚピーク（表１１）に相当する蛋白質は高脂血症及びアテローム性動脈硬化症のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスモデルからの向炎症性ＨＤＬと示差的に会合している。第１のスクリーンとして、各種ｐＨの緩衝液を使用してイオン交換カラムにより正常及びアテローム発生血清を分画した後、ＳＥＬＤＩ分析し、各該当蛋白質ピークのｐＩ値を得た（Ｋｏｚａｋら（２００５）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，５：４５８９−４５９６）。各蛋白質ピークのｐＩと質量情報を使用してデータベース（ＴａｇＩｄｅｎｔ）を検索し、該当ＳＥＬＤＩピークに相当する候補蛋白質を得た。アテローム発生飼料を与えたマウスのＨＤＬにはヘモグロビンが会合していると判定した。これらの試験の詳細については実施例３に記載する。
【０３６８】
以上をまとめると、向炎症性ＨＤＬにおける８個のｍ／ｚ  ＳＥＬＤＩバイオマーカーピークを特性決定し、これらがアテローム発生／高脂血症血清で示差的に発現していることを確認した。総合すると、これらのマーカーはマウスで正常／抗炎症性ＨＤＬから向炎症性ＨＤＬへの転換に関与する分子メカニズムの決定に役立つであろう。これらのマーカーとヒト向炎症性ＨＤＬにおけるマーカーを同定することにより、アテローム性動脈硬化症及び炎症反応を特徴とする他の病変の早期検出を改善するための臨床アッセイの開発が促進される。
【実施例３】
【０３６９】
アテローム発生／高脂血症飼料を与えたマウスに由来する血清中の高比重リポ蛋白質と会合したヘモグロビン
実施例２では、アテローム性動脈硬化症のマウスモデルで正常／抗炎症性ＨＤＬを向炎症性ＨＤＬから区別する強アニオン交換ＳＥＬＤＩ  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ技術を使用して８個の特異的な蛋白質フィンガープリントを同定した。微量液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法を使用し、ｍ／ｚ  １４，９００及びｍ／ｚ  １５，６００に相当するＳＥＬＤＩピークを夫々マウスヘモグロビンα鎖（Ｈｂ−α，１４．９ｋＤａ）及びマウスヘモグロビンβ鎖（Ｈｂ−β，１５．９ｋＤａ）として同定した。ウェスタンブロット分析により、Ｈｂが正常ＨＤＬと比較して向炎症性ＨＤＬと示差的に会合していることを確認した。ＨＤＬと会合したＨｂの生化学的特性決定の結果、向炎症性ＨＤＬと会合したＨｂはｐＩの低下（遊離ＨｂのｐＩ７．５以上に対してｐＩ４．０及びｐＩ７．０）、ＨＤＬを含む画分に存在する高分子量複合体との会合等の特異な物理化学的性質をもつことも判明した。ＨＤＬと会合したヘモグロビンの主形態はオキシヘモグロビン（ｏｘｙＨｂ）であった。ｏｘｙＨｂの酸化促進性により、本発明のデータはＨｂがアテローム発生条件下でＨＤＬの向炎症性に寄与している可能性を示唆している。更に、ＨＤＬと会合したＨｂはアテローム性動脈硬化症及び炎症反応を特徴とする他の病変の新規バイオマーカーとして利用できると結論する。
【０３７０】
（実験手順）
（動物実験）
３種のマウスモデルを比較する実験で、野生型、低比重リポ蛋白質受容体欠損（ＬＤＬＲヌル）及びａｐｏＥヌルの８〜１２週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウス（ｎ＝８匹／群）を使用した。これらの実験では、通常飼料（Ｒａｌｓｔｏｎ  Ｐｕｒｉｎａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｈｏｗ）、又は１５．８％脂肪、１．２５％コレステロール及び０．５％コール酸ｗ／ｗ／ｗを含有するアテローム発生飼料（Ｔｅｋｌａｄ／Ｈａｒｌａｎ  Ｃａｔａｌｏｇ）の２種類の飼料の一方をマウスに与えた。短期試験ではマウス（ｎ＝８匹／群）に上記飼料を７日間与え、長期試験ではマウスに上記飼料を１５週間与えた。一晩絶食させたマウスから血清サンプルを単離し、１０％スクロースで低温保存処理し、使用時まで−７０℃で保存した。
【０３７１】
（リポ蛋白質単離）
直列に配置したデュアルＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６カラムから構成されるシステムにより血清サンプルプールを分画した。非金属製Ｂｅｃｋｍａｎ  ＨＰＬＣポンプで滅菌ＰＢＳを流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで供給して血清（０．５ｍｌ）を溶出し、１ｍｌ毎に分画した。最初の１０個の１ｍＬ画分を捨て、その後の各１ｍＬ画分を採取し、製造業者のプロトコールに従い、コレステロール含量（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＣＯ）分析と、ＢＣＡ蛋白質アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を実施した。全実験に備えてＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ及びＨＤＬ後画分をプールした。実験によっては、製造業者のプロトコールに従い、ＬｉｐｉＤｉｒｅｃｔ  ＨＤＬ試薬（Ｐｏｌｙｍｅｄｃｏ，Ｃｏｒｔｌａｎｄ  Ｍａｎｏｒ，ＮＹ）を使用して個々の血清サンプルからのＨＤＬを新たに単離した。ＨＤＬを含有する上清のコレステロール含量とＢＣＡ蛋白質を定量し、単離後４８時間以内に使用した。
【０３７２】
（ＳＥＬＤＩ分析用サンプル調製）
リポ蛋白質又は血清サンプルを調製し、製造業者のプロトコール（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）に従い、順相（ＮＰ−２０）、強アニオン交換（Ｑ１０）、及び弱カチオン交換（ＣＭ１０）ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイで処理した。要約すると、ＮＰ−２０、Ｑ１０及びＣＭ１０アレイスポットを結合バッファー（１×ＰＢＳ／０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，ｐＨ７）で室温にて１０分間平衡化した。結合バッファーで希釈したサンプル（血清２５倍、リポ蛋白質画分２倍）をアレイチップにスポットし、加湿チャンバーで３０分間室温にてインキュベートした。チップを結合バッファーで２回、ＨＰＬＣ  Ｈ２Ｏで１回洗浄した後、風乾した。チップをシナピン酸溶液で先ず１００％飽和溶液０．５μｌ、次いで５０％飽和溶液１μｌで順次処理した。シナピン酸溶液はＥＡＭ溶液（５０％アセトニトリル及び０．５％トリフルオロ酢酸）をシナピン酸（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸）で飽和することにより新たに調製した。
【０３７３】
（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｉｐ  ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析）
アレイを実施例２に記載したようにＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ  Ｒｅａｄｅｒ（モデルＰＢ  ＳＩＩ）で分析した。
【０３７４】
（統計分析）
実施例２に記載したＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐデータ分析ソフトウェアバージョン３．２（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を使用してデータを分析した。
【０３７５】
（特異的ｍ／ｚピークに相当する蛋白質の同定）
（血清蛋白質分画）
製造業者のプロトコールに従い、Ｐ−６  Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎクロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ）で血清を脱塩した。製造業者のプロトコールに従い、ｐＨ８．５、７．５、７．０、６．０、５．０、４．０、及び２．０にｐＨを漸減させた一連の緩衝液で溶出することにより、Ｑ１０アニオン交換スピンカラム（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を使用して血清サンプルを分画した。Ｑ１０又はＣＭ１０  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイを使用してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ  ＰＳＩＩで蛋白質画分を分析した。どちらのアレイも使用前に１０ｍＭ  ＨＣｌ／結合バッファーで平衡化した。
【０３７６】
（血清蛋白質精製、受動溶出及びＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる確認）
ＳＥＬＤＩ分析により該当ピークの有意大部分を含むことが確認された画分をプールし、遠心蒸発により乾燥した。蛋白質を含有する画分を更にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ染色液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で染色した。該当ピークに対応する分子量をもつバンドを切り出し、ゲルスライスを２分の１に切断し、ゲルスライスの２分の１を従来記載されているように受動溶出した（Ｌｅ  Ｂｉｈａｎら（２００４）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，４：２７３９−２７５３）。要約すると、ゲルを脱水し、熱ブロックで乾燥し、有機混合物で再水和した。ゲルを音波処理した後、ボルテックスした。溶出した蛋白質を使用し、ＳＥＬＤＩ  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ分析により該当ピークの存在を確認した。残りの２分の１は下記のようにゲル消化に使用した。
【０３７７】
（トリプシン消化）
従来記載されているようにゲル内トリプシン消化を実施した（Ｇｏｍｅｚら（２００３）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２：１０６８−１０８５）。要約すると、（ＳＥＬＤＩにより確認後の）該当ピークを含有する溶出液をＤＴＴで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化し、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理した。ゲルスライスをＨＰＬＣグレード水で飽和することによりペプチドを回収し、アセトニトリル／トリフルオロ酢酸で抽出した。抽出液を冷ＳＡＶＡＮＴ  Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ（Ｇｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）で乾燥し、従来記載されているようにμＬＣ−ＭＳＭＳ（前出）に付した。データを使用し、Ｓｏｎａｒ  ｍｓ／ｍｓ（登録商標）（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）とＴｕｒｂｏＳＥＱＵＥＳＴ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ）を使用してマウスデータベースを検索した。
【０３７８】
（電気泳動及びイムノブロット）
ＩＥＦ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌゲル及び他の全電気泳動用試薬はＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から購入した。血清サンプル（２μＬ）を１５％  ＳＤＳＰＡＧＥ、ＩＥＦ（ｐＨ３〜１０）、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌネイティブ（４〜１５％）又はＩＥＦ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ２Ｄゲルにロードした。２Ｄゲルでは、製造業者のプロトコール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に従い、ＩＥＦゲルからの各レーンを切り出し、ネイティブゲルに挿入した。製造業者のプロトコール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に従い、血清サンプルをゲルにロードし、ニトロセルロース膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に転写した。膜をヘモグロビンに対して１０００倍（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）又はａｐｏＡ−１に対して１０，０００倍（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）でイムノブロットした。ＨＲＰ標識二次抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１００００倍希釈液として使用し、バンドをＥＣＬ検出試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で可視化した。
【０３７９】
（Ｈｂの分光光度測定）
Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ  ６４０分光光度計を使用してＨｂを測定するためにＨＤＬを含有するＦＰＬＣ画分をプールした。全サンプル及び純ヘモグロビン種のスペクトルを３８０〜７００ｎｍで走査した。オキシヘモグロビン（ｏｘｙＨｂ）を含有するサンプルに放出速度の遅いＮＯドナーであるスペルミンＮＯＮＯａｔｅ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）を加え、ｏｘｙＨｂからメトヘモグロビン（ｍｅｔＨｂ）への変換を観察した。１組の純粋種「基本スペクトル」を線形回帰により測定スペクトルにフィットさせることにより、ｏｘｙＨｂとｍｅｔＨｂの濃度を逆重畳した（Ｖａｕｇｈｎら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：２３４２−２３４８）。ｏｘｙＨｂの消費とｍｅｔＨｂの生成が１対１の比を示し、全ヘモグロビンが全サンプルで保存されたときに逆重畳法の妥当性を確認した。
【０３８０】
（結果）
（ＳＥＬＤＩピークｍ／ｚ  １４．９ｋ及びｍ／ｚ  １５．６ｋはアテローム発生／高脂血症血清及びＨＤＬと会合している。）
強アニオン交換（Ｑ１０）ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐｓを使用するＳＥＬＤＩ分析の結果、ｍ／ｚ  １４．９ｋ及びｍ／ｚ  １５．６ｋに相当するピークはいずれもアテローム性動脈硬化症／高脂血症の４種の異なるマウスモデルから得られた血清（図２０，上段パネル）及びＨＤＬ（図２０，下段パネル）中の対照に比較して最低数倍高いことが判明した。ＳＥＬＤＩピークｍ／ｚ  １４．９ｋ及びｍ／ｚ  １５．６ｋに相当する蛋白質の同定及び特性決定に関するその後の全実験は短期間（７日間）及び長期間（１５週間）アテローム発生飼料を与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから得られた血清及びＨＤＬサンプルで実施した。
【０３８１】
（サイズ、ｐＩ及びＴａｇＩｄｅｎｔを使用する潜在的候補蛋白質ＳＥＬＤＩピークｍ／ｚ  １４．９及びｍ／ｚ  １５の同定）
２個のＳＥＬＤＩピークに相当する蛋白質を同定するために、まず２個のピークのｐＩ範囲を試験した。通常飼料又はアテローム発生飼料を７日間（短期）又は１５週間（長期）与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝８匹／群）から得られた各血清サンプルを以下の方法によりアニオン交換分画した。画分を各種ｐＨの緩衝液で溶出し、ＣＭ１０及びＱ１０  ＳＥＬＤＩチップで更に分析した（図２１）。２個のピークｍ／ｚ  １４．９ｋ及びｍ／ｚ  １５．６ｋに相当する強度の大部分はｐＨ７．５〜ｐＨ８．０の緩衝液で溶出した（図２１）。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析から決定したサイズとアニオン交換分画により測定した対応するｐＩ（図２１）を使用してオンラインＴａｇＩｄｅｎｔ（蛋白質データベース）検索を実施した。０．５％サイズ誤差と＋２ｐＩ範囲を許容する検索基準を使用し、１４．９ｋＤａ及び１５．６ｋＤａの潜在的候補蛋白質として夫々Ｈｂ−α及びＨｂ−βを同定した。文献によると、遊離ＨｂのｐＩは７．５〜８．５である。興味深いことに、ｍ／ｚ  １４．９ｋ及びｍ／ｚ  １５．６ｋに相当する２個のピークはｐＨ７．０とｐＨ４．０の緩衝液で溶出したアテローム発生血清からの画分と会合していることも判明した（図２１）。これらのデータから、ｉ）アテローム発生サンプル中のＨｂは種々の化学的性質をもつか、又はｉｉ）ｍ／ｚ  １４．９ｋ及びｍ／ｚ  １５．６ｋに相当する蛋白質はＨｂ以外のものであると予想された。以下に記載するように、その後の研究の結果、これらのピークは実際にＨｂに相当し、ＨＤＬと会合したＨｂが種々の物理化学的性質をもつのは他のＨＤＬ会合蛋白質（例えばハプトグロビン）との強い会合に起因することが判明した。
【０３８２】
（分画及びトリプシンペプチド断片化及びタンデム質量分析により２種のバイオマーカー蛋白質がＨｂ−α及びＨｂ−βであることを確認した。）
２種のバイオマーカーの同定を更に確認するために、夫々のサイズに対応するピークを脱アルブミンとアニオン交換クロマトグラフィー後にマウス血清から部分精製した。部分精製蛋白質をトリプシン消化後にμＬＣ−ＭＳＭＳ分析し、得られたフラグメントをヒト蛋白質データベース（Ｓｏｎａｒ及びＳＥＱＵＥＳＴ）で検索した。その結果、１４．９ｋＤａ蛋白質はα−Ｈｂであり、１５．６ｋＤａ蛋白質はβ−Ｈｂであることが確認された。
【０３８３】
（マウスモデルにおける向炎症性ＨＤＬの潜在的マーカーとしてのヘモグロビンの同定）
アテローム発生血清及びＨＤＬにおけるＨｂの存在を非ＳＥＬＤＩ法により更に検証するために、先ずアテローム発生飼料を与えたマウスからの血清サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで試験した後に、Ｈｂについてウェスタンブロッティングを実施した。血清サンプル中のＨｂの総量は正常血清とアテローム発生血清の間で有意差がなかった（図２２Ａ）。
【０３８４】
なお、血清中の総Ｈｂ濃度（即ち非ＲＢＣ  Ｈｂ）は１０マイクロモルのオーダーである。他方、全血中のＨｂ濃度は１モルを上回る。従って、ＲＢＣ以外の血液中に存在するのはＨｂの約０．００１％に過ぎない。図２２Ａに示すように、血清中のこの非ＲＢＣ  Ｈｂの量は通常飼料を与えたマウスとアテローム発生飼料を与えたマウスで相違しない。
【０３８５】
他方、正常血清（即ち通常飼料を与えたマウスからの血清）のＦＰＬＣ分画リポ蛋白質では、ＨｂはＨＤＬ後画分（ｐＨＤＬ）と会合していたが、アテローム発生血清中のＨｂとＨＤＬ画分と会合していた（図２２Ｂ）。更に、個々のＦＰＬＣ画分の４１０ｎｍにおけるＯＤ測定により得られたＨｂのヘム含量は図２２Ｂの結果を裏付けた（図２２Ｃ）。アテローム発生飼料を１５週間与えたマウスでは、ＨｂはＨＤＬ画分にしか検出されなかった（図２２Ｂ）。これらの実験によると、Ｈｂはマウスにおける向炎症性ＨＤＬのマーカーである。
【０３８６】
（アテローム発生血清と会合したヘモグロビンは特異な物理化学的性質を示す。）
血清サンプルのウェスタンブロット分析は正常血清とアテローム発生血清の間にＨｂ質量の有意差を示さなかった（図２２Ａ）ので、ＨｂとＨＤＬの会合はアテローム発生飼料を与えると変化するが、ヘモグロビンの質量は一定のまま維持されると予想された。ｐＩ＜７の蛋白質を選択するＱ１０アレイを使用するＳＥＬＤＩでアテローム発生血清と会合したバイオマーカーを発見するための実験を実施した。更に、上記アニオン交換分画実験では、ｍ／ｚ  １４．９ｋ及びｍ／ｚ  １５．６ｋに相当する２個のピークの有意量がｐＨ７．０とｐＨ４．０の緩衝液で溶出したアテローム発生血清画分と会合していることが判明した（図２１）。これらのデータから、ｉ）Ｈｂの質量はアテローム発生条件下で有意に変化せず、ｉｉ）特異なｐＩ値により立証されるようにＨｂの化学的性質はアテローム発生条件下で変化し（図２１）、ｉｉｉ）アテローム発生条件下のＨＤＬの変化及び／又はＨｂの変化の結果としてＨｂはＨＤＬと会合し、１５週間アテローム発生飼料を与えた後はＨｂしかＨＤＬと会合しなくなったと予想される。
【０３８７】
アテローム発生血清中のＨｂの特異な性質を特性決定するために、ＮＰ２０及びＱ１０アレイを使用して長期試験（Ｗ１５）からの血清サンプルとＦＰＬＣリポ蛋白質画分でＳＥＬＤＩ分析を実施した。全蛋白質と結合するＮＰ２０アレイは正常血清サンプルとアテローム発生血清サンプルの両方から等量のＨｂを捕捉した（図２３Ａ，左パネル）。更に、ＮＰ−２０アレイにおいて、Ｈｂピークは非アテローム発生サンプルではｐＨＤＬ画分と会合し、アテローム発生サンプルではＨＤＬ画分と完全に会合した（図２３Ａ，左パネル）。これらのデータは図２２Ｂに示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のウェスタンブロット分析と一致する。他方、Ｑ１０アレイはアテローム発生サンプルのみから得られた血清及びＨＤＬ画分中のＨｂを捕捉し（図２３Ａ，右パネル）、アテローム発生血清中で会合しているＨｂは特異な性質をもち、ＨＤＬと会合していることが示唆された。アテローム発生条件下における特異なｐＩをもつＨｂの発生を更に試験するために、図２１からのＳＥＬＤＩで確認したアニオン交換カラムの血清画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析後にウェスタン分析した。アテローム発生血清はＨ７及びｐＨ４からのアニオン交換カラム画分中にＨｂを含んでいた（図２３Ｂ）。
【０３８８】
（ＨＤＬ画分と会合したＨｂの特性決定）
ＨＤＬと会合したＨｂの物理化学的性質を更に検証するために、Ｄ７及びＷ１５群からの血清サンプルとＤ７群からのＨＤＬ画分を等電点電気泳動（ＩＥＦ）とネイティブゲル電気泳動で試験した。ＩＥＦゲルによると、正常ＨｂのｐＩが約７．５であるのに対して、アテローム発生血清中のＨｂのｐＩ値は約４に低下していることが判明した（図２４）。Ｄ７群からのサンプルでは正常Ｈｂ（ｐＩ７．５）からＨｂ（ｐＩ４．０）への変化が明白に認められた（図２４）。同一マウス群から単離したＲＢＣは正常ｐＩをもつＨｂを示したので、これらの変化はＲＢＣの変化に起因するものではなかった（図２４）。更に、Ｄ７群からのＨＤＬ画分と会合したＨｂはＨｂの改変形を示した（図２４）。ネイティブゲルはアテローム発生血清サンプル中の高分子量（ＨＭＷ）粒子に対するＨｂの免疫反応性会合を示し、１５週間アテローム発生飼料を与えた後にはＨｂしかＨＤＬと会合しなくなった（図２５）。更に、ＩＥＦ／ネイティブ２Ｄゲル（図１２）によると、アテローム発生血清からのＨｂは主にＨＭＷ粒子と会合する複数形態（ｐＩに基づく）をもつことが確認された。ＨＤＬと会合したＨｂの特定形態（ｏｘｙＨｂ又はｍｅｔＨｂ）を決定するために、ＨＤＬのプール画分を分光分析した。ＨＤＬと会合したＨｂの主形態はｏｘｙＨｂであり、ｍｅｔＨｂは少量であることが判明した（図２６及び表１５）。
【０３８９】
【表１５】
2009526233.tif 000017
【０３９０】
（考察）
蛋白質プロファイリングは血清サンプル中の示差的に発現及び／又は会合した蛋白質を判定するために有効な方法であり、生物学的に重要な機能を迅速に評価することができる。Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）は複雑な生体混合物の蛋白質プロファイリングを容易にするために表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）と組み合わせたＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ技術を開発した（Ｒｕｂｉｎ  ａｎｄ  Ｍｅｒｃｈａｎｔ（２０００）Ａｍ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．１９：２８−２９；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６：８６−９１；Ｆｕｎｇら（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６５−６９；Ｉｓｓａｑら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９２：５８７−５９２）。ＳＥＬＤＩは複雑なソース（血清、尿、糞便、ＣＳＦ、組織培養抽出物、細胞溶解液）からの微量（低フェムトモル）検体を分析できるという点でユニークである。「予備活性化」表面ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイも該当標的検体が分かっているときにチップ表面と「ベイト」分子の共有結合に対する各種選択性（例えば電荷、疎水性、特異的結合親和性、抗体）のオープンプラットフォームとして利用できる。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ技術は血清中の癌蛋白質マーカーの発見に有効であることが最近立証された（Ｗｒｉｇｈｔら（１９９９）Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｄｉｓ．２：２６４−２７６；Ｌｉら（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４８：１２９６−１３０４）。本発明者らはＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳシステムの利用に成功し、卵巣癌の早期検出用バイオマーカーの同定について既に報告している（Ｋｏｚａｋら（２００Ｓ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１００：１２３４３−１２３４８；Ｋｏｚａｋら（２００５）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５：４５  ８９−９６）。
【０３９１】
ｍ／ｚ  １４．９ｋ及びｍ／ｚ  １５．６ｋに相当する２個のピークのｐＩ測定（図２１）後にデータベース検索した処、アテローム発生血清中の向炎症性ＨＤＬと会合した潜在的バイオマーカーとしてＨｂ−βとＨｂ−αが同定された。μＬＣ−ＭＳＭＳ法を使用してこれらの知見を確認した。機械的操作及び／又はサンプル調製の結果としてＲＢＣ溶血とＨｂ放出を生じる可能性があるので、本発明者らは当初はこの知見を疑った。しかし、その後、これらの実験を注意深く繰返した処、Ｈｂはアーチファクトではなく、アテローム発生血清中に存在する向炎症性ＨＤＬの特異的で重要なマーカーであることが判明した。第１に、総Ｈｂ質量が通常飼料とアテローム発生飼料を与えたマウスから得られた血清サンプル間で相違しないことを示した（図２２Ｂ）。血清中のＨｂ（即ち非ＲＢＣ  Ｈｂ）の総濃度は１０マイクロモルのオーダーである。他方、全血中のＨｂ濃度は１モルを上回る。従って、ＲＢＣ以外の血液中に存在するのはＨｂの約０．００１％に過ぎない。図２２Ａに示すように、血清中のこの非ＲＢＣ  Ｈｂの量は通常飼料を与えたマウスとアテローム発生飼料を与えたマウスで相違しない。
【０３９２】
第２に、正常ＨＤＬから向炎症性ＨＤＬへの転換（Ｄ７通常飼料とＤ７アテローム発生飼料）中に、同一マウスから得られた溶血ＲＢＣ中のＨｂ（質量及び品質）に何ら変化は検出されず、Ｈｂと向炎症性ＨＤＬの会合は向炎症性条件下の特異的現象であることが再び示唆された。第３に、Ｄ７及びＷ１５リポ蛋白質サンプル中のＨｂを比較すると明らかなように、Ｈｂと向炎症性ＨＤＬの会合は向炎症性条件の程度に依存性である（図２２Ｂと図２４及び２５）。最後に、通常飼料で向炎症性ＨＤＬをもつａｐｏＥヌルマウスを含むアテローム性動脈硬化症／高脂血症の４種の異なるモデルにおいて、ＨｂはＨＤＬと会合していることが判明した。これらの結果をまとめると、ＨＤＬと会合したＨｂは向炎症性ＨＤＬのマーカーであると判断される。
【０３９３】
Ｈｂの正常ｐＩはｐＩ７．０〜８．０であることが報告されている。本発明者らは向炎症性ＨＤＬと会合したＨｂが特異なｐＩ値をもつ少なくとも２種のＨｂ種をもつことを見出した（図２１及び図２４）。１５週間アテローム発生飼料を与えた後に、ＨＤＬと会合した全Ｈｂはこの異常なｐＩを示した。アテローム発生飼料を与えた後のＨｂのｐＩの変化はヘモグロビンの変化に起因するのではなく、ヘモグロビンがＨＤＬ中で強く会合した蛋白質に起因することが判明した。これらの条件下のＨｂの大部分はオキシヘモグロビンであることが判明したので、アテローム発生飼料により誘発される酸化ストレスはこれらの変化の原因であると思われる。同一マウスからのＲＢＣ  Ｈｂにはこのような変化が存在しないことから、遊離Ｈｂはこれらの条件下で示差的に変化していると予想される。全血清Ｈｂが通常飼料又はアテローム発生飼料で相違しなかったという事実は、ＲＢＣ溶血の増加がこのプロセスの要因でなかったことを示唆している。
【０３９４】
ハプトグロビン（Ｈｐ）とヘモペキシン（Ｈｘ）は夫々ヘモグロビン（Ｈｂ）（Ｋｄ１ｐＭ）及びヘム（Ｋｄ＜１ｐＭ）に対して最高の結合親和性をもつ血漿蛋白質である。これらは主に肝臓で発現され、急性相蛋白質ファミリーに属し、その合成は炎症プロセス中に誘導される（Ｂｏｗｍａｎ  ａｎｄ  Ｋｕｒｏｓｋｙ（１９８２）Ａｄｖ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．１２：１８９−２６１；Ａｌｔｒｕｄａら（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３８４１−３８５９）。Ｈｂ（赤血球中に最も多量に存在し、機能的に最も重要な蛋白質）は一旦赤血球から放出されると、ヘムの酸化性により高毒性となり、フェントン反応に加わり、反応性酸素種を生成し、細胞傷害の原因となることは周知である（Ｈｏｆｆｍａｎら（１９９５）Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．２ｎｄ  ｅｄ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ）。ヘムの毒性はヘム疎水性により増加し、蛋白質と会合していない場合には脂質膜及び他の親油性区画に割り込むことができる（Ｂａｌｌａら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：９２８５−９２８９）。通常では、赤芽球の除核と老化した赤血球の破壊中に少量の血管外溶血が生じ、その結果、血漿中にＨｂが放出される。血管内溶血に関連する病態（例えば出血、異常ヘモグロビン症、虚血再潅流障害、又はマラリア）では、大量の遊離Ｈｂが放出される（Ｗａｇｅｎｅｒら（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．２２：５２−５４）。一旦血漿中に放出されると、遊離ＨｂはＨｐと結合している二量体中で急速に解離する。血漿Ｈｂの代謝は組織マクロファージの主機能であるとみなされ、マクロファージはマクロファージスカベンジャー受容体ＣＤ１６３を介してＨｂ−Ｈｐ複合体を取込み（Ｓｃｈａｅｒら（２００６）Ｂｌｏｏｄ  １０７：３７３−３８０；Ｆａｂｒｉｅｋら（２００５）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２１０：１５３−１６０）、内在化することができる（Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：１９８−２０１）。興味深いことに、非常に最近の研究により、低比重リポ蛋白質受容体関連蛋白質（ＬＲＰ）／ＣＤ９１（Ｈｖｉｄｂｅｒｇら（２００５）Ｂｌｏｏｄ  １０６：２５７２−２５７９）がヘモペキシン−ヘム複合体のスカベンジングに関与する受容体として同定された。ＬＲＰ／ＣＤ９１は受容体によるエンドサイトーシスによりヘム−Ｈｘ複合体を内在化することが可能なマクロファージや肝細胞等の数種の細胞型で発現される（Ｈｕｎｔら（１９９６）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６８：７１−８０）。本実施例に報告する実験では、ＲＢＣからのＨｂの放出は認められず、ＨＤＬ画分と会合する（従来報告されていない）形態への既存Ｈｂの転換が認められた。酸化ストレス条件下では、Ｈｂ−Ｈｐ−Ｈｘ複合体が形成され、ＨＤＬと会合し、循環から迅速に除去されると考えられる。実際に、ＨｐはＨＤＬの主要蛋白質成分であるａｐｏＡ１と会合することが報告されている（Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒら（１９８７）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６０：１１９−１２６；Ｋｕｎｉｔａｋｅら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１９８８−１９９３；Ｐｏｒｔａら（１９９９）Ｚｙｇｏｔｅ  ７：６７−７７；Ｓｐａｇｎｕｏｌｏら（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：１１９３−１１９８）。ＨｐとａｐｏＡ１の会合はＨＤＬ機能を変化させる（Ｂａｌｅｓｔｒｉｅｒｉら（２００１）Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ．５９：１８６−１９１；Ｃｉｇｌｉａｎｏら（２００１）Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ６６：８８９−８９６）。図１２〜１５のデータによると、非ＲＢＣヘモグロビン、ハプトグロビン、及びヘモペキシンはアテローム発生条件下ではいずれもＨＤＬ中で同一複合体に存在すると予想される。
【０３９５】
Ｈｂは血糖症、酸化ストレス、高血圧、インスリン抵抗性、肥満症、及び糖尿病に関連する疾病及び疾患の公知マーカーである（Ｚｈａｎｇら（２００４）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ４：２４４−２５６；ｄｅ  Ｖａｌｋ  ａｎｄ  Ｍａｒｘ（１９９９）Ａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．１５９：１５４２−１５４８；Ａｌａｙａｓｈら２００１）Ａｎｔｉｏｘｉｄ  Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ  ３：３１３−３２７）。遊離Ｈｂはそのヘム（Ｆｅ）及びヘムと結合した反応性基により潜在的酸化剤でもあり（Ａｌａｙａｓｈ（１９９９）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：５４５−５４９）、このような基はｉｎ  ｖｉｖｏでＬＤＬを酸化することも示されている（Ｐａｇａｎｇａら（１９９２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０３：１５４−１５８；Ｍｉｌｌｅｒら（１９９６）Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．３２６：２５２−２６０；Ｚｉｏｕｚｅｎｋｏｖａら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１８９１６−１８９２４）ので、Ｈｂは毒性であることも知られている。本発明者らの知見によると、酸化ストレス環境においてＨｂはマウスでＨＤＬ画分と会合することが初めて明らかになった。アテローム発生血清中の向炎症性ＨＤＬは脂質ヒドロペルオキシド（ＬＯＯＨ）を含有しており、パラオキソナーゼ活性をもたず、単球を活性化し、ＬＤＬの酸化を防止することができず、コレステロール流出が少ない。本実施例では、Ｈｂがアテローム発生マウスで向炎症性ＨＤＬと特異的に会合することを報告する。特定理論に結び付けるものではないが、ＨｂとＨＤＬの会合は抗炎症性から向炎症性へのＨＤＬの転換に関与していると考えられる。
【０３９６】
結論として、Ｈｂはアテローム性動脈硬化症の動物モデルで向炎症性ＨＤＬと会合する。ヒトに敷衍すると、ＨＤＬと会合したＨｂは向炎症性ＨＤＬのマーカーとして利用できると考えられる。
【実施例４】
【０３９７】
Ｑｉａｇｅｎアルブミン除去カラムを使用するＬＤＬ凝集アッセイのプロトコール
（材料）
アルブミン除去カラムを使用するＬＤＬ凝集アッセイの典型的材料を表１６に示す。
【０３９８】
【表１６】
2009526233.tif 000018
【０３９９】
（方法）
（サンプルの調製）
１．血清又は血漿２５μＬを希釈バッファー７５μＬで希釈する。
【０４００】
２．アルブミン／ＩｇＧ除去スピンカラムを５００×ｇで短時間遠心し、スクリューキャップから樹脂を除去する。
【０４０１】
３．スクリューキャップを外し、スピンカラムの底栓を外し、重力流により保存バッファーを排出する。
【０４０２】
４．希釈バッファーの２×０．５ｍＬアリコートをスピンカラムにピペッティングして重力流により各々流出させることによりスピンカラムを平衡化する。
【０４０３】
５．スピンカラムにＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ用キャップを装着する。  
【０４０４】
６．ステップ１で調製したサンプルをカラムに添加する。
【０４０５】
７．スピンカラムに蓋をし、激しく振盪して均質懸濁液を得る。シェーカーで５分間室温にてインキュベートする。
【０４０６】
８．ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅを取り出し、スピンカラムを透明遠心管に移す。
【０４０７】
９．カラムのキャップを４分の１回転緩める。
【０４０８】
１０．５００×ｇで１０秒間遠心することによりフロースルーを集める。
【０４０９】
１１．カラムを希釈バッファーの２×１００μＬアリコートで洗浄し、５００×ｇで１０秒間遠心することにより各洗浄画分を集める。
【０４１０】
１２．ステップ１０からのフロースルー画分とステップ１１からの２個の洗浄画分を合わせる。
【０４１１】
（ＡｐｏＢ含有蛋白質の除去及びコレステロール測定）
１．アルブミンを除去したサンプルからデキストラン硫酸沈殿によりＡｐｏＢ含有蛋白質を除去する。デキストラン硫酸沈殿に備え、デキストラン硫酸とマグネシウムイオンを含有するＳｉｇｍａ  ＨＤＬコレステロール試薬を蒸留水に溶かした。デキストラン硫酸（１．０ｍｇ／ｍｌ）５０μＬを各サンプル５００μＬと混合し、室温で５分間インキュベートした後、３，０００ｇで１０分間遠心した。ＨＤＬを含有する上清を実験で使用した。
【０４１２】
２．アルブミン／ａｐｏＢを除去したＨＤＬ上清中の総コレステロールを標準コレステロールアッセイにより測定する。
【０４１３】
３．ＨＤＬ上清を各ウェルに１０μｇの濃度で加える。
【０４１４】
（ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）の調製）
１．ＰＬＣのバイアル（２５０単位／バイアル）に５６．３単位／ｍＬを調製するために十分なｄｄＨ２Ｏを加える。例えば、２５０単位を含むバイアルにｄｄＨ２Ｏ  ４．４ｍＬを加える。
【０４１５】
２．短時間ボルテックスする。
【０４１６】
３．ＰＬＣ溶液２００μＬをエッペンドルフチューブに分注する。
【０４１７】
−２０℃で凍結する。
【０４１８】
（ＬＤＬ＋サンプルのインキュベーション）
１．ウェルに相応に添加する（全対照、サンプル等を三重に試験する）。
【表１７】
2009526233.tif 000019
【０４１９】
２．プレートをｎｕｔａｔｏｒで３７℃にて１時間インキュベートする。
【０４２０】
３．波長を４７８ｎｍに設定したプレートリーダーでプレートを読取る。
【０４２１】
（ＰＬＣとのインキュベーション）
１．「ＬＤＬ単独」以外の各ウェルにＰＬＣ溶液２０μＬを加える。
【０４２２】
２．緩衝液２００μＬをＰＬＣ溶液２００μＬに加える。
【０４２３】
３．短時間ボルテックスする。
【０４２４】
４．希釈したＰＬＣ溶液２０μＬを指定通りに各ウェルに加える。
【０４２５】
５．０分、５分、１０分、３０分、４５分、及び６０分に４７８ｎｍでプレートを読取る。
【実施例５】
【０４２６】
Ｄ−４Ｆ投与はマウスでヘモグロビン及びそのスカベンジャーと高比重リポ蛋白質の会合を低減させる。
（目的）
アポリポ蛋白質Ａ−Ｉ（ａｐｏＡ−Ｉ）ミメティックであるＤ−４ＦがマウスとサルでＨＤＬを向炎症性から抗炎症性に転換したことは既に報告している。ヘモグロビン（Ｈｂ）がアテローム性動脈硬化症の動物モデルでＨＤＬと会合し、アテローム発生条件下でＨＤＬの向炎症性に寄与することを発見したので、Ｄ−４Ｆ投与によりアテローム性動脈硬化症の動物モデルでＨｂと向炎症性ＨＤＬの会合を低減させることができるか否かについて試験しようと図った。
【０４２７】
（方法及び結果）
図２のデータによると、ａｐｏＥヌルマウス（アテローム性動脈硬化症のマウスモデル）から採取したＨＤＬは向炎症性である。経口ａｐｏＡ−Ｉ模倣ペプチド（Ｄ−４Ｆ）の投与後に、ＨＤＬは抗炎症性に転換した。図３及び４に示すように、ＨＤＬの炎症特性の変化に伴い、マウスの血清中のヘモペキシンとハプトグロビンの濃度は低下した。
【０４２８】
マウスからのＨＤＬの分析の結果、向炎症性ＨＤＬから抗炎症性への転換に伴い、マウスＨＤＬ中のハプトグロビンとヘモペキシンの含量も低下したが、ＨＤＬ中のａｐｏＡ−Ｉ含量は変化しなかった（図５）。血清及びＨＤＬヘモペキシン及びハプトグロビン濃度の低下に伴い、正常ＲＢＣヘモグロビンと同様の特性で泳動した非ＲＢＣヘモグロビン濃度は増加し（図６）、ＨＤＬのヘモグロビン含量は低下した（図７右端のグラフ）。図２９及び３０に示すように、Ｄ−４Ｆを投与すると、ＨＤＬ上清中のトランスフェリン含量とミエロペルオキシダーゼ含量も有意に低下した。
【０４２９】
（結論）
Ｈｂとそのスカベンジャー蛋白質であるヘモペキシン及びハプトグロビンは向炎症性ＨＤＬの成分である。Ｄ−４Ｆが向炎症性ＨＤＬを抗炎症性ＨＤＬに転換するメカニズムの１つは酸化促進剤であるＨｂを含有する蛋白質とＨＤＬの会合の防止及び／又は停止であると考えられる。向炎症性ＨＤＬを抗炎症性ＨＤＬに転換する物質の投与に伴い、ＨＤＬと会合したヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、トランスフェリン、及びミエロペルオキシダーゼは明白に変化した。これらの結果から、本明細書に記載するアッセイは異常ＨＤＬを改善し、アテローム性動脈硬化症を緩和する治療をモニターするのに有用であると思われる。
【０４３０】
当然のことながら、本明細書に記載する実施例と態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑み、種々の変形又は変更が当業者に示唆され、これらの変形又は変更も本願の趣旨と範囲及び特許請求の範囲に含むものとする。本明細書に引用した全刊行物、特許及び特許出願は言及によりその開示内容全体を全目的で本明細書に組込む。
【図面の簡単な説明】
【０４３１】
【図１】ＨＤＬと会合した蛋白質のウェスタン分析を示す。ウェスタン分析の結果、アテローム発生飼料（Ａ）を与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおけるヘモグロビン（Ｈｂ）、ハプトグロビン（Ｈｐ）、及びヘモペキシン（Ｈｘ）とＨＤＬの会合は通常飼料（Ｃ）に比較して１０倍に増加することが判明した。図面から明らかなように、これらの蛋白質はＶＬＤＬ又はＬＤＬとは会合しなかった。
【図２】ＡｐｏＥヌルマウスＨＤＬが通常飼料で向炎症性であり、経口Ｄ−４Ｆ投与後に抗炎症性に転換することを示す。９カ月齢雌性ａｐｏＥヌルマウス（ｎ＝４匹／群）に通常飼料を与え、アポリポ蛋白質Ａ−Ｉ模倣ペプチドＤ−４Ｆ（５０μｇ／ｍＬ飲料水）の投与前（０日）とＸ軸に示す日数間投与後に採血した。ａｐｏＥヌルマウスＨＤＬがＬＤＬ＋ＤＣＦの蛍光を阻害する能力をその炎症性の尺度として測定した。データから明らかなように、投与前にａｐｏＥヌルマウスＨＤＬは向炎症性であった（即ち、０日のａｐｏＥヌルＨＤＬを添加すると、蛍光はＬＤＬ単独により誘導される強度よりも増加した）が、Ｄ−４Ｆ投与後（１〜２１日）に抗炎症性となった。
【図３】血清ヘモペキシン濃度がＤ−４Ｆ投与後に低下することを示す。上記図２に記載したマウスにおける血清ヘモペキシン濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
【図４】血清ハプトグロビン濃度がＤ−４Ｆ投与後に低下することを示す。上記図２に記載したマウスにおける血清ハプトグロビン濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
【図５】Ｄ−４Ｆ投与によりａｐｏＥヌルマウスのＨＤＬ中のハプトグロビン（Ｈｐ）及びヘモペキシン（Ｈｘ）が低下することを示す。図２に記載したマウスからＨＤＬを単離し、Ｈｐ、Ｈｘ、及びアポリポ蛋白質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）含量を測定した。
【図６】Ｄ−４Ｆ投与の結果、ＲＢＣに含まれるヘモグロビンと同等の分子量でネイティブＰＡＧＥゲル上の非ＲＢＣヘモグロビンが増加したことを示す。図２に記載したマウス４匹の各々から投与前（０日）及び２１日後（２１日）に採取した血清、ＨＤＬ及び赤血球（ＲＢＣ）をネイティブＰＡＧＥ（４〜１５％）ゲル上で泳動させ、ウェスタン分析によりヘモグロビンを分析した。データによると、投与前には、血清及び（ＨＤＬと非リポ蛋白質画分を含む）ＨＤＬ上清中の全ヘモグロビンは溶血ＲＢＣからのヘモグロビンよりも有意に高い見かけの分子量でネイティブＰＡＧＥゲル上を泳動した。しかし、Ｄ−４Ｆを２１日間投与後には、血清及びＨＤＬ上清中のヘモグロビンの有意量が溶血ＲＢＣからのヘモグロビンと同等の見かけの分子量でゲル上を泳動した。
【図７】アテローム発生飼料を与えた野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスではヘモグロビンのα鎖とβ鎖の両者が増加したことを示す。本図は更に、通常飼料を与えたａｐｏＥヌルマウスでもヘモグロビンのα鎖とβ鎖の両者の含量が増加し、両鎖は図２に記載したようなＤ−４Ｆ投与と共に減少したことを示す。
【図８】通常飼料を７日間（Ｄ７Ｃ）又はアテローム発生飼料を７日間（Ｄ７Ａ）もしくは１５週間（Ｗ１５Ａ）与えた野生型Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスでＨＤＬ中のオキシヘモグロビンとメトヘモグロビンの含量を測定したことを示す。通常飼料を与えたａｐｏＥヌルマウス（ａｐｏＥ）でもオキシヘモグロビンとメトヘモグロビンの含量を測定した。図面から明らかなように、アテローム発生飼料を与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと通常飼料を与えたａｐｏＥヌルマウスでＨＤＬと会合したヘモグロビンの大部分はオキシヘモグロビンであった。
【図９】一酸化窒素（ＮＯドナー）を化学的に発生させ、通常飼料を７日間与えた野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｄ７Ｃ）に由来するＨＤＬを添加し、電流（ｐＡ）として測定した処、消費しなかったことを示す。
【図１０】化学的に発生させた一酸化窒素（ＮＯドナー）にオキシヘモグロビン（ＨｂＯ２）を添加し、電流（ｐＡ）として測定した処、減衰曲線の急速な一過的低下を生じたことを示す。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を添加しても自然減衰曲線は変化しなかった。他方、アテローム発生飼料を７日間与えた野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに由来するＨＤＬ（Ｄ７Ａ  ＨＤＬ−Ｈｂ）を添加すると、減衰曲線は急速且つ劇的に低下し、この向炎症性ＨＤＬは一酸化窒素を急速に消費したことが分かった。
【図１１】向炎症性ＨＤＬ（アテローム発生飼料を７日間与えた野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに由来するＨＤＬ；Ｄ７Ａ  ＨＤＬ）が一酸化窒素減衰曲線の急速且つ劇的な低下を生じ、向炎症性ＨＤＬが一酸化窒素を急速に消費したことを示す。他方、ＨＤＬ中のオキシヘモグロビン（ＨＤＬ−ＨｂＯ２）をメトヘモグロビン（ＨＤＬ−ｍｅｔＨｂ）に変換するＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６でこのＨＤＬを処理した後にＨＤＬを添加すると、減衰曲線は有意に変化せず、一酸化窒素は消費されないことが分かった。
【図１２】通常飼料を７日間（左上パネル）もしくは１５週間（右上パネル）、又はアテローム発生飼料を７日間（左下パネル）もしくは１５週間（右下パネル）与えた野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの血清のウェスタン分析を使用してヘモグロビン染色した二次元ゲルを示す。各パネルの左端のレーンは各病態に由来する溶血赤血球（ＲＢＣ）からのヘモグロビンを示す。
【図１３】野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにアテローム発生飼料を７日間（Ｄ７Ａ）又は１５週間（Ｗ１５Ａ）与えた図１２の下段パネルを示し、ヘモグロビン染色をライトブルーで示す（グレーで再現）。
【図１４】図１３に示したウェスタンブロットを剥離し、ハプトグロビンに対する抗体で再プローブした。得られた画像（マゼンタ）を図１３の画像に重ねた。ダークブルー領域はヘモグロビンとハプトグロビンの両者が同時に局在する領域に相当する。
【図１５】図１４に示したウェスタンブロットを剥離し、ヘモペキシンに対する抗体で再プローブした。得られた画像（黄色）を図１４の画像に重ねた。非常に暗い画像はヘモグロビン、ハプトグロビン、及びヘモペキシンが同時に局在する領域に相当する。
【図１６】向炎症性ＨＤＬはＬＤＬ凝集を抑制しないが、抗炎症性ＨＤＬは抑制することを示す。向炎症性ＨＤＬとＮＣＥＰ  ＡＴＰ  ＩＩＩ基準による冠動脈疾患又は等価疾患をもつ対象（ＣＨＤ患者）４人と健常ボランティア（正常）４人に由来するＨＤＬをホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）により誘導したＬＤＬ凝集の抑制能について試験した。ＨＤＬを添加しない陽性対照（ＬＤＬ＋ＰＬＣ）の値を赤線で示す。陰性対照（ＬＤＬ単独）の値を一番下の青線で示す。データによると、４人のＣＨＤ患者に由来するＨＤＬはＰＬＣにより誘導したＬＤＬ凝集を抑制することができなかったが、４人の健常ボランティア（正常）に由来するＨＤＬはＰＬＣにより誘導したＬＤＬ凝集を有意に抑制した。
【図１７】投与前には向炎症性ａｐｏＥヌルＨＤＬはホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）により誘導したＬＤＬ凝集を抑制しないが、Ｄ−４Ｆを２１日間経口投与後にＨＤＬは抗炎症性になり、ＰＬＣにより誘導したＬＤＬ凝集を抑制することを示す。図２に記載したような経口Ｄ−４Ｆ投与前後のａｐｏＥヌルＨＤＬについて、ＰＬＣにより誘導したＬＤＬ凝集の抑制能を試験した。図２に示すように、投与前にＨＤＬは向炎症性であった。図１７に示すように、投与前にはこのａｐｏＥヌルＨＤＬはＰＬＣにより誘導したＬＤＬ凝集を抑制することができなかった。しかし、２１日間投与後にＨＤＬは抗炎症性になり（図２）、図１７に示すようにＰＬＣにより誘導したＬＤＬ凝集を有意に抑制した。陽性対照（ＬＤＬ＋ＰＬＣ（ＨＤＬ不添加））の値と、陰性対照ｉ）ＬＤＬ＋ＰＬＣ＋通常飼料を与えた正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに由来するＨＤＬ（正常マウスＨＤＬ）及びｉｉ）ＬＤＬ（ＰＬＣ不添加）（ＬＤＬ単独）の値も示す。
【図１８】ＦＰＬＣ分画によるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス血清サンプルのコレステロールプロファイルを示す。マウス（ｎ＝８）からの血清プール５００μｌをＦＰＬＣにより分画した。最初の１０個の１ｍＬ画分を捨て、その後の各１ｍＬのコレステロール含量を分析した。Ｃ−通常飼料７日間、Ａ−アテローム発生飼料７日間、ＣＣ−通常飼料２１日間、ＡＣ−アテローム発生飼料７日間後に通常飼料１４日間。
【図１９】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス血清に由来するＨＤＬの炎症特性を示す。ＨＤＬをＨＤＬ試薬で単離し、反応性酸素種含量（蛍光強度）、パラオキソナーゼ（ＰＯＮ）活性アッセイ、コレステロール流出アッセイ（％コレステロール流出）、及びコレステロール含量（ＨＤＬコレステロール）について分析した。Ｃ−通常飼料７日間、Ａ−アテローム発生飼料７日間、ＡＣ−アテローム発生飼料７日間後に通常飼料１４日間。＊はｐ＜０．０１を表す。
【図２０】アテローム性動脈硬化症の４種のマウスモデルに高濃度のｍ／ｚ  １４．９ｋ（ヘモグロビンα鎖）及びｍ／ｚ  １５．６ｋ（ヘモグロビンβ鎖）が存在することを示す。アテローム発生飼料（Ｄ７＝７日間，Ｗ１５＝１５週間）もしくは西欧型飼料を１０日間（ＷＤ）与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス、又は西欧型飼料を８週間与えたＬＤＬＲヌルマウス（ＬＤＬＲ）、又は通常飼料を与えた１２週齢ａｐｏＥヌルマウス（ａｐｏＥ）に由来する血清サンプル（ｎ＝８）をＱ１０（ｐＩ＜７）ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイでＳＥＬＤＩ分析した。アテローム発生血清中の２個の該当ＳＥＬＤＩピーク（ｍ／ｚ  １４．９ｋ及びｍ／ｚ  １５．６ｋ）を通常飼料の対応する対照マウス群に由来する血清のピークと比較し、又はａｐｏＥヌルマウスの場合には通常飼料の同年齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比較し、得られた強度を統計分析した。報告するデータは各ピークの平均増加倍率である。報告するデータはいずれもｐ値＜０．０５で統計的に有意である。なお、この分析は疎水性でｐＩ＜７．０の蛋白質と複合体を除去するＱ１０蛋白質チップで捕捉した蛋白質のデータである。この方法により分析したヘモグロビンはＨＤＬと会合したヘモグロビンに相当する。
【図２１】ｍ／ｚ  １４．９ｋ（ヘモグロビンα鎖）及びｍ／ｚ  １５．６ｋ（ヘモグロビンβ鎖）に相当するピークのｐＩの測定を示す。通常飼料（Ｃ）又はアテローム発生飼料（Ａ）を７日間（Ｄ７）又は１５週間（Ｗ１５）与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝８）に由来する個々の血清サンプルを脱塩し、アニオン交換スピンカラムと各種指定ｐＨの緩衝液を使用して分画した。溶出した画分をカチオン交換（ＣＭ１０：ｐＩ＞４）又はアニオン交換（Ｑ１０：ｐＩ＜４）ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイでＳＥＬＤＩ分析した。１４．９ｋと１５．６ｋの相対強度を示す。
【図２２Ａ】図２２Ａは非ＲＢＣヘモグロビンとＲＢＣヘモグロビンを比較し、血清のリポ蛋白質及び非リポ蛋白質画分間の非ＲＢＣヘモグロビンの分布を比較する。血清及びリポ蛋白質を１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、ヘモグロビンに対してイムノブロットした。通常飼料を与えたマウスから得られた溶血ＲＢＣをヘモグロビンの標準としてロードした。図２２Ａ：通常飼料（Ｃ）又はアテローム発生飼料（Ａ）を７日間（Ｄ７）又は１５週間（Ｗ１５）与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに由来する血清サンプル（ｎ＝８）。図２２Ａから明らかなように、通常飼料又はアテローム発生飼料を７又は１５日間与えたマウスでは非ＲＢＣヘモグロビン総量に有意差がなかった。更に同図から明らかなように、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上で非ＲＢＣヘモグロビンと溶血ＲＢＣに由来するヘモグロビンの分子量は同等である。図２２Ｂから明らかなように、アテローム発生飼料を７日間又は１５週間与えると、非ＲＢＣヘモグロビンでは非リポ蛋白質画分（ｐＨＤＬ）からＨＤＬ画分への変化を生じた。
【図２２Ｂ】２２Ｂは非ＲＢＣヘモグロビンとＲＢＣヘモグロビンを比較し、血清のリポ蛋白質及び非リポ蛋白質画分間の非ＲＢＣヘモグロビンの分布を比較する。血清及びリポ蛋白質を１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、ヘモグロビンに対してイムノブロットした。通常飼料を与えたマウスから得られた溶血ＲＢＣをヘモグロビンの標準としてロードした。図２２Ｂ：Ｄ７及びＷ１５群の血清サンプルプールに由来するＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ及びＨＤＬ後（ｐＨＤＬ）ＦＰＬＣ画分。図２２Ａから明らかなように、通常飼料又はアテローム発生飼料を７又は１５日間与えたマウスでは非ＲＢＣヘモグロビン総量に有意差がなかった。更に同図から明らかなように、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上で非ＲＢＣヘモグロビンと溶血ＲＢＣに由来するヘモグロビンの分子量は同等である。図２２Ｂから明らかなように、アテローム発生飼料を７日間又は１５週間与えると、非ＲＢＣヘモグロビンでは非リポ蛋白質画分（ｐＨＤＬ）からＨＤＬ画分への変化を生じた。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは非ＲＢＣヘモグロビンとＲＢＣヘモグロビンを比較し、血清のリポ蛋白質及び非リポ蛋白質画分間の非ＲＢＣヘモグロビンの分布を比較する。血清及びリポ蛋白質を１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、ヘモグロビンに対してイムノブロットした。通常飼料を与えたマウスから得られた溶血ＲＢＣをヘモグロビンの標準としてロードした。図２２Ａから明らかなように、通常飼料又はアテローム発生飼料を７又は１５日間与えたマウスでは非ＲＢＣヘモグロビン総量に有意差がなかった。更に同図から明らかなように、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上で非ＲＢＣヘモグロビンと溶血ＲＢＣに由来するヘモグロビンの分子量は同等である。図２２Ｂから明らかなように、アテローム発生飼料を７日間又は１５週間与えると、非ＲＢＣヘモグロビンでは非リポ蛋白質画分（ｐＨＤＬ）からＨＤＬ画分への変化を生じた。図２２Ｃは図２４Ｂのデータを裏付けるものであり、通常飼料を７日間与えた後に殆どヘモグロビンはＨＤＬと会合していないが、アテローム発生飼料を７日間与えた後にＨＤＬ画分中に実質的なヘモグロビンが存在していた。
【図２３Ａ】図２３Ａはアテローム発生飼料によるアテローム発生血清及びＨＤＬ画分中の非ＲＢＣヘモグロビンが特異な性質をもつことを示す。図２３Ａ：通常飼料（Ｃ）又はアテローム発生飼料（Ａ）を与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝８）に由来する血清サンプルプールをＦＰＬＣにより分画し、順相（ＮＰ２０）又はアニオン交換（Ｑ１０；ｐＩ＜７）ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイでＳＥＬＤＩ分析した。１４．９ｋ（Ｈｂ−α）及び１５．６ｋ（Ｈｂ−β）の相対強度を示す。
【図２３Ｂ】図２３Ｂはアテローム発生飼料によるアテローム発生血清及びＨＤＬ画分中の非ＲＢＣヘモグロビンが特異な性質をもつことを示す。図２３Ｂ：図２に記載したｐＨ７．０及びｐＨ４．０に相当するアニオン交換カラム画分を１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、ヘモグロビンに対してイムノブロットした。これらのシステムで測定したアテローム発生飼料による非ＲＢＣヘモグロビンの性質の変化はヘモグロビンとＨＤＬ及び他のＨＤＬ蛋白質との会合に一致する。
【図２４】アテローム発生血清中のヘモグロビンが特異なｐＩ値をもつことを示す。通常飼料（Ｃ）又はアテローム発生飼料（Ａ）を７日間（Ｄ７）又は１５週間（Ｗ１５）与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに由来する血清サンプル（ｎ＝８）を使用前にプールした。Ｄ７マウスからのＲＢＣを血清勾配により単離し、洗浄し、溶血させた。血清サンプルをＦＰＬＣにより分画し、Ｄ７マウスからのＨＤＬ画分をプールした。プールした血清、ＨＤＬ及び溶血ＲＢＣをＩＥＦゲル（ｐＨ３〜１０）にロードし、ヘモグロビンに対してイムノブロットした。通常飼料を与えたマウスからの溶血ＲＢＣ（左レーン）をヘモグロビンの標準としてロードした。同図から明らかなように、ＲＢＣヘモグロビンの特性は通常飼料又はアテローム発生飼料を与えたマウスと差異がなかった。更に同図から明らかなように、通常飼料を与えたマウスからのＨＤＬにはヘモグロビンが会合していなかったが、アテローム発生飼料を与えたマウスからのＨＤＬにはヘモグロビンが会合しており、そのｐＩはＲＢＣヘモグロビンと著しく相違していた。
【図２５】非ＲＢＣヘモグロビンがアテローム発生飼料によるＨＤＬ画分と会合し（左パネル）、アテローム発生飼料を１５週間与えた後にＲＢＣヘモグロビンと同様に泳動する非ＲＢＣヘモグロビンが失われる（右パネル）ことを示す。通常飼料（Ｃ）又はアテローム発生飼料（Ａ）を７日間（Ｄ７）又は１５週間（Ｗ１５）与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝８）からの血清サンプルプール（右パネル）又はＤ７からのＨＤＬ画分プール（左パネル）をネイティブＰＡＧＥにロードし、ヘモグロビンに対してイムノブロットした。通常飼料を与えたマウスからの溶血ＲＢＣもゲルにロードした（左パネルの左端）。
【図２６Ａ】図２６ＡはＨＤＬ中のＨｂの分光光度測定の結果を示す。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ  ６４０分光光度計を使用してＨＤＬを含有するＦＰＬＣ画分プールからＨｂの量と形状を測定した。全サンプル及び純粋種のスペクトルを３８０〜７００ｎｍで走査した（図２６Ａ）。１組の純粋種の「基本スペクトル」を線形回帰により測定スペクトルにフィットさせることにより、ｏｘｙＨｂとｍｅｔＨｂの濃度を逆重畳した（Ｖａｕｇｈｎら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：２３４２−２３４８）。
【図２６Ｂ】図２６ＢはＨＤＬ中のＨｂの分光光度測定の結果を示す。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ  ６４０分光光度計を使用してＨＤＬを含有するＦＰＬＣ画分プールからＨｂの量と形状を測定した。放出速度の遅いＮＯドナーであるＮＯＮＯａｔｅをサンプルに加え、ｏｘｙＨｂからｍｅｔＨｂへの変換を観察した（図２６Ｂ，代表的グラフ）。１組の純粋種の「基本スペクトル」を線形回帰により測定スペクトルにフィットさせることにより、ｏｘｙＨｂとｍｅｔＨｂの濃度を逆重畳した（Ｖａｕｇｈｎら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：２３４２−２３４８）。
【図２７】健常ボランティア１０人と、ＮＣＥＰ  ＡＴＰＩＩＩガイドラインの定義による冠動脈心疾患（ＣＨＤ）又は等価疾患をもつ患者１０人に由来するＨＤＬ中のヘモグロビンを比較する。左パネルはヘモグロビンに対してイムノブロットした健常ボランティア１０人（左レーン）又はＣＨＤ患者１０人（右レーン）に由来する血漿プールからのＨＤＬ画分のネイティブＰＡＧＥゲルを示す。右パネルはＲＢＣを溶血させてＨＤＬ画分の単離前に血漿に添加した後の同一分析を示す。その結果、患者では健常ボランティアよりも著しく多量のヘモグロビンがＨＤＬと会合していた（左パネル）。更に同図から明らかなように、過剰のＲＢＣヘモグロビンを血漿に添加すると、健常ボランティアとＣＨＤ患者の両者のＨＤＬ画分でヘモグロビンが増加したが、依然として患者のＨＤＬのヘモグロビンのほうが有意に多量であった。
【図２８Ａ】図２８Ａは若年性糖尿病患者とＣＨＤ患者に由来するＨＤＬでは非ＲＢＣヘモグロビンとハプトグロビンの両者が増加していることを示す。健常ボランティア１２人、若年性糖尿病患者１４人（成人８人；幼児６人）、又はスタチン投与中のＣＨＤもしくはＣＨＤ等価疾患対象８人から血清を採取した。ヒトａｐｏＡ−Ｉに対する抗体を９６ウェルプレートにコーティングした。対象からの血清を加え、一晩４℃でインキュベートした。プレートを十分に洗浄し、ヒトヘモグロビン又はヒトハプトグロビンに対する一次ヤギ抗体を加えて４℃で一晩インキュベートした。プレートを十分に洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識したヤギＩｇＧに対する二次抗体を加え、２時間室温でインキュベートした。プレートを十分に洗浄し、ＨＲＰ基質を加え、光学密度（ＯＤ）を測定した。図２８Ａは非ＲＢＣヘモグロビン（ＨＲＰμｇ／ｍＬ）を示す。その結果、後者方法で得られた値は健常ボランティアを糖尿病患者とＣＨＤ患者から切り離し、全くオーバーラップしなかった。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは若年性糖尿病患者とＣＨＤ患者に由来するＨＤＬでは非ＲＢＣヘモグロビンとハプトグロビンの両者が増加していることを示す。健常ボランティア１２人、若年性糖尿病患者１４人（成人８人；幼児６人）、又はスタチン投与中のＣＨＤもしくはＣＨＤ等価疾患対象８人から血清を採取した。ヒトａｐｏＡ−Ｉに対する抗体を９６ウェルプレートにコーティングした。対象からの血清を加え、一晩４℃でインキュベートした。プレートを十分に洗浄し、ヒトヘモグロビン又はヒトハプトグロビンに対する一次ヤギ抗体を加えて４℃で一晩インキュベートした。プレートを十分に洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識したヤギＩｇＧに対する二次抗体を加え、２時間室温でインキュベートした。プレートを十分に洗浄し、ＨＲＰ基質を加え、光学密度（ＯＤ）を測定した。図２８Ｂはハプトグロビン（ＨＲＰμｇ／ｍＬ）を示す。その結果、後者方法で得られた値は健常ボランティアを糖尿病患者とＣＨＤ患者から切り離し、全くオーバーラップしなかった。
【図２８Ｃ】図２８Ｃは若年性糖尿病患者とＣＨＤ患者に由来するＨＤＬでは非ＲＢＣヘモグロビンとハプトグロビンの両者が増加していることを示す。健常ボランティア１２人、若年性糖尿病患者１４人（成人８人；幼児６人）、又はスタチン投与中のＣＨＤもしくはＣＨＤ等価疾患対象８人から血清を採取した。ヒトａｐｏＡ−Ｉに対する抗体を９６ウェルプレートにコーティングした。対象からの血清を加え、一晩４℃でインキュベートした。プレートを十分に洗浄し、ヒトヘモグロビン又はヒトハプトグロビンに対する一次ヤギ抗体を加えて４℃で一晩インキュベートした。プレートを十分に洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識したヤギＩｇＧに対する二次抗体を加え、２時間室温でインキュベートした。プレートを十分に洗浄し、ＨＲＰ基質を加え、光学密度（ＯＤ）を測定した。図２８Ｃは非ＲＢＣヘモグロビン値にハプトグロビン値を乗じた積を示す。その結果、後者方法で得られた値は健常ボランティアを糖尿病患者とＣＨＤ患者から切り離し、全くオーバーラップしなかった。
【図２９】４カ月齢ａｐｏＥヌルマウス（ｎ＝８匹／群）の飲料水にＤ−４Ｆを２カ月間添加する（＋Ｄ−４Ｆ）と、これらのマウスからのＨＤＬ上清中のトランスフェリン含量はＤ−４Ｆを添加しない飲料水を与えたマウス（Ｄ−４Ｆ不添加）に比較して有意に低下したことを実証する。
【図３０】４カ月齢ａｐｏＥヌルマウス（ｎ＝８匹／群）の飲料水にＤ−４Ｆを２カ月間添加する（＋Ｄ−４Ｆ）と、これらのマウスからのＨＤＬ上清中のミエロペルオキシダーゼ含量はＤ−４Ｆを添加しない飲料水を与えたマウス（Ｄ−４Ｆ不添加）に比較して非常に有意に低下したことを実証する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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