(57)【要約】  この発明は、試料中のタンパク質イソ型(例えば、選択的スプライシングによるもの、又は種々の疾病タンパク質イソ型又は分解産物)を検出するための方法、試薬及び装置に関するものであり、検出／測定されるべきイソ型を同定するための捕捉剤の組合せの利用を含むものである。
2009531062.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の複数の標的タンパク質イソ型の一種以上の存在を明りょうに検出する方法であって、下記を含む当該方法：
ａ．標的タンパク質イソ型を、予め選択したプロテアーゼの混合物を用いて断片化して、各々第一のエピトープ及び第二のエピトープを含む複数の標的ペプチドを生成すること；
ｂ．これらの複数の標的ペプチドを、少なくとも部分が一種より多くのペプチド上に存在する、それぞれの第一のエピトープに結合する固定化された第一の結合剤と接触させること；
ｃ．これらの複数の標的ペプチドを、それぞれの第二のエピトープに結合する検出可能に標識した第二の結合剤に接触させること;及び
ｄ．前記の第一の及び第二の結合剤の組合せにより結合された標的ペプチドを検出して、標的タンパク質イソ型の試料中の存在を明りょうに示すこと。
【請求項２】
それぞれの第二のエピトープの少なくとも部分が、各々、一種より多くのペプチド上に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一及び第二のエピトープの組合せの少なくとも部分が、各々、一種より多くのペプチド上に存在する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｄ．が、第一及び第二の結合剤のそれぞれの組合せが結合した標的ペプチドからの相対的シグナルをデコンボルートすることを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
予め選択したプロテアーゼの混合物が、トリプシン又はＬｙｓ−Ｃを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第一の結合剤を、固体支持体上の既知の位置に固定化する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
固体支持体が、アレイを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
固体支持体が、複数のビーズを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
試料を、ステップｂ．の前に、精製及び／又は変性により、予備処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第一の及び／又は第二の結合剤が、抗体又はその機能性断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記の標的ペプチドに対する前記の第一又は第二の結合剤の結合を定量して、前記の標的タンパク質イソ型の試料中の量及び／又は濃度を測定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
第二の結合剤の一つが、蛍光標識により、検出可能に標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
標的タンパク質イソ型が、選択的スプライシングを受けたＲＮＡの発現生成物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
選択的スプライシングを受けたＲＮＡの発現生成物が、試料中に存在するイソ型だけである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
第一及び第二のエピトープが、異なるエキソンの発現生成物間のジャンクションに及ばない、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
標的ペプチドが、第一のエキソンの発現生成物の少なくとも部分を含む第一のエピトープ及び第二のエキソンの発現生成物の少なくとも部分を含む第二のエピトープを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記の結合剤の結合を定量して、試料中の少なくとも２つの異なる標的タンパク質イソ型の少なくとも相対的量を測定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
結合の検出を、固体支持体上の選択した位置で捕捉された前記の標的ペプチドに結合した第二の結合剤上の光学的標識により生成された光学的シグナルを検出することにより達成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ステップｄ．が、前記の第一及び第二の結合剤の多数の組合せにより結合された多数の標的ペプチドを検出して、前記の標的タンパク質イソ型が試料中に存在するかどうかを明りょうに測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
タンパク質の混合物を含む試料中の複数の異なる標的タンパク質イソ型の多重検出のための装置であって、該装置は、複数の固定化された捕捉剤を含み、その各々は、該試料中の標的タンパク質イソ型の消化により生成され、それぞれのタンパク質の少なくとも一部分をコードする複数のエキソンの発現生成物の少なくとも部分を含む標的ペプチド上の第一のエピトープに結合し、それぞれの標的ペプチドの存在が、試料中のそれぞれの標的タンパク質イソ型の存在を明りょうに示す、当該装置。
【請求項２１】
それぞれの前記の標的ペプチド上のそれぞれの第二のエピトープに結合する一組の検出可能に標識された結合剤を更に含み、該第二のエピトープが前記の第一のエピトープをコードするエキソンと異なるエキソンの発現生成物の少なくとも部分を含み、捕捉剤と検出可能に標識した結合剤の対の結合が、試料中の標的タンパク質イソ型の存在を明りょうに示す、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
捕捉剤が、固体表面にアレイに固定化され、検出可能に標識した結合剤が、光学的に検出可能な標識を含む、請求項２０に記載の装置。
【請求項２３】
前記の標的ペプチドを確実に生成するように、前記の試料中の前記のタンパク質の混合物の消化のための指示を特定するプロトコールを更に含む 、請求項２０に記載の装置。
【請求項２４】
前記の標的ペプチドを確実に生成するように、前記の試料中の前記のタンパク質の混合物の消化のための装置又は試薬を更に含む、請求項２０に記載の装置。
【請求項２５】
タンパク質の混合物を含む試料中の標的タンパク質を検出するための方法であって、該方法は下記を含む当該方法：
ａ．標的タンパク質を、予め選択したプロテアーゼを用いて断片化して、共に潜在的に試料中の他のタンパク質中に存在する第一のエピトープ及び第二のエピトープを含むペプチドを生成すること；
ｂ．該ペプチドを、該第一及び第二のエピトープにそれぞれ結合する第一及び第二の結合剤の対と接触させ、これらの結合剤の組合せの結合が、試料中の標的タンパク質の存在を明りょうに示し；そして
ｃ．該第一及び第二の結合剤の該ペプチドへの結合を、試料中の標的タンパク質の存在の指示として検出すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００６年３月２３日に出願された米国特許出願第１１／３８７，３８９号(その全開示をすべての目的のために参考として本明細書中に援用する)の部分継続出願である。
【背景技術】
【０００２】
抗体のアレイは、一つの生物学的試料中の多数のタンパク質を同時に検出するのに有用である。この多数のタンパク質の研究のための重要で且つ発展中の応用分野は、類似のアミノ酸配列を有するタンパク質例えば、遺伝子レベルの事象例えば遺伝子のスプライシング及び遺伝子の転座から生じるタンパク質イソ型の同定及び定量である。
【０００３】
米国特許出願公開番号ＵＳ２００４−００２９２９２Ａ１は、多数のタンパク質を一つのアレイを用いて同定するために利用することのできる技術を記載している。簡単にいえば、任意のタンパク質の一次アミノ酸配列から出発して、そのタンパク質を一義的(ユニーク)に表す一連の線状エピトープ(ＰＥＴ)を同定することができる。分析の前にタンパク質を変性して断片化することにより、これらのユニークな領域を露出させて個々に又はグループに分けることができる。次いで、これらのユニークな領域に特異的な抗体を、例えば、明りょうなタンパク質指定及び定量的測定のために利用することができる。
【０００４】
しかしながら、哺乳動物の遺伝子は、類似のアミノ酸配列と限られたユニーク領域のみを有する修飾されたタンパク質型を生成する修飾を受けうる。例えば、哺乳動物の遺伝子は、典型的には、染色体上にエキソン−イントロン構造で配置される。一度ＤＮＡがプレｍＲＮＡに転写されれば、これらのイントロンは、スプライシングと呼ばれるプロセスにおいて切り出される。プレｍＲＮＡのイントロンが一通りより多くの仕方でスプライスされうる場合には、選択的スプライシングが起こりえて、これは、所定の遺伝子に対して幾つかの可能な成熟ｍＲＮＡ種を生成する。図１は、ｍＲＮＡの選択的スプライシングを説明する概略図であり、該選択的スプライシングは、選択的スプライシングを受けたｍＲＮＡが翻訳された場合に類似のアミノ酸配列を有する異なるタンパク質生成物を生じさせる。
【０００５】
ＲＮＡスプライシングは、慣用の遺伝子アレイと比較して、潜在的タンパク質バイオマーカー、診断薬、及び標的の数を増大させる。大部分のヒトの遺伝子が選択的スプライシングを受けるという証拠があり、これは、各遺伝子が、複数のＲＮＡ及びタンパク質生成物例えば多数のスプライスイソ型をコードすることができることを意味している。同じ遺伝子のスプライスイソ型は、しばしば、異なる機能、及び反対の機能さえ有する。ますます、研究者は、病気の背後の機構を理解する努力において、単に遺伝子ではなくて特定のスプライスイソ型に集中している。
【０００６】
その上、スプライスイソ型が組織特異的であり、疾病特異的であり、且つ／又は集団特異的であること、個体に特異的であること、及び／又は薬物応答に関連することを示す増大する多数の研究がある。従って、選択的スプライシングは、重要な調節機構であり、しばしば、発生若しくは組織特異的因子により制御され又は病理学的状態によってさえ制御される。変化しやすいエキソンの組込み又は排除にかかわらず、それは、単一遺伝子が、多数のＲＮＡを生成することを可能にし、それらは、翻訳されて、類似のアミノ酸配列を有する機能的及び構造的に異なるイソ型となりうる。
【０００７】
類似のアミノ酸配列を有する多数の異なるタンパク質を生成する身体の能力は、選択的スプライシングの現象に固有のものではない。例えば、ハンチントン舞踏病においては、無傷の病気関連タンパク質(例えば、ＨＤタンパク質)の部分的プロセッシングが、無傷のタンパク質の種々の部分を含むタンパク質断片、又はＣＡＧ反復によりコードされた種々の長さのポリグルタミンストレッチの生成へと導く。これらの部分的タンパク質は、ある意味で、互いに関連しており、同様に、種々の選択的スプライシングイソ型が互いに関連している。従って、類似のアミノ酸配列を有する多数の異なるタンパク質例えば遺伝子レベルの事象から生じるタンパク質イソ型の検出及び／又は定量は、病気の診断に有用でありうる。
【０００８】
類似のアミノ酸配列を有する一種以上の異なるタンパク質が分析すべき同じタンパク質試料中に存在しうるので、これらのタンパク質の識別は、魅力的な応用分野である。例えば、単一遺伝子から生成されるイソ型は、例えば共有されるエキソンによって、互いに多くの配列同一性を有しうる。
【０００９】
不幸にして、一試料中の類似のアミノ酸配列を有する異なるタンパク質を分析するための現在の方法は、不十分なものである。多くのアッセイは、ジャンクション領域の利用に依存している。当業者は認めるであろうが、選択的イソ型は、例えば同じタンパク質の他のスプライシングイソ型と比較して異なるエキソンの融合により作られたユニークなジャンクション領域を含むことができる。しかしながら、ジャンクション領域における一意性を認識する抗体を生産するための配列の選択は、そのジャンクション領域を含むアミノ酸に依存して限られており、かかる限られた選択は、望ましいものとはいえない。例えば、ジャンクション領域は、余りにも疎水性であったり、余りにも短いものであったりして、かかる領域を、有効な捕捉因子(例えば、抗体又はその機能的断片)を生産するためには乏しい候補にしている。従って、ジャンクション領域に対する抗体を開発することは必ずしも可能ではない。更に、ジャンクション領域の配列が一般にイソ型ファミリーに対してユニークなものであっても、それらは、全プロテオームを横切ってユニークではありえない。事実、それらは、所定の分析すべき試料中のすべての他のタンパク質に対してさえユニークではありえない。
【００１０】
従って、分析前に試料を変性して断片化することと合わせて、複数のスプライスジャンクションに及ぶ直鎖状エピトープに対して生産された抗体は、類似のアミノ酸配列を有する別々のタンパク質例えば、一のタンパク質試料中で遺伝子的事象から生じるタンパク質イソ型の検出のための部分的な限られた分離しか示さない。従って、この問題の一層完全で且つ包括的解決に対する要求がある。
【００１１】
図面の簡単な説明
図１は、幾つかの選択的スプライシングの型を示している。
【００１２】
図２は、Ｂｃｌ−ｘの長型及び短型を示している。
【００１３】
図３は、トリプシン又はｌｙｓＣにより消化した場合の、Ｂｃｌ−ｘの断片化パターン及び新規なサンドイッチ対の形成を示している。
【００１４】
図４は、Ｂｃｌ−ｘの長型(SEQ ID NO:１)及び短型(SEQ ID NO:２)の配列アラインメントである。
【００１５】
図５は、新規なサンドイッチ対が、Ｂｃｌ−ｘ長型及び短型のｌｙｓＣ消化に際して形成されることを示している。これらの配列は、SEQ ID NO:３〜５によって表される。
【００１６】
図６は、新規なサンドイッチ対が、Ｂｃｌ−ｘ長型及び短型のトリプシン消化に際して形成されることを示している。これらの配列は、SEQ ID NO:６〜７によって表される。
【００１７】
図７は、様々なＣＤ４４エキソン及び選択したＣＤ４４イソ型の略図(縮尺は合ってない)である。
【００１８】
図８は、各ＣＤ４４エキソン中のＬｙｓＣ消化部位を示している。
【００１９】
図９は、可変エキソン領域に隣接する不変エキソン(例えば、ＣＤ４４のエキソン５及び１６)に対して生産された抗体が、サンドイッチ対の形成における「アンカー」として利用できることを示している。
【００２０】
図１０は、ＣＤ４４イソ型、Ｍｅｔａ−１の概略配置図であり、ｌｙｓＣ断片化における新規なサンドイッチ対の形成を示している。
【００２１】
図１１は、ＣＤ４４イソ型、ＣＤ４４ｓの概略配置図であり、ｌｙｓＣ断片化における新規なサンドイッチ対の形成を示している。
【００２２】
図１２は、ＣＤ４４イソ型のＣＤ４４ｓ、Ｍｅｔａ−１、及びＭｅｔａ−２を含むｌｙｓＣ消化した試料の略図である。別々のサンドイッチ対を利用する３つの測定が、様々なスプライスイソ型を同定／定量することができる。
【００２３】
図１３は、全ＣＤ４４イソ型中に存在する４〜５の最もＮ末端側の不変エキソンに特異的な捕捉因子対を利用する全ＣＤ４４測定を示している。
【００２４】
図１４は、多数のＣＤ４４イソ型を含む試料の略図である。
【００２５】
図１５は、個々のイソ型が、新規なサンドイッチ対形成に基くユニークなシグネーチャー(signature)及び定量を生じることを示している。異なる捕捉剤を、１２の細区分(太線で縁取られている)内の各正方形内に固定する。各細区分(最大１２の捕捉剤を検出に利用することができる)の上側の６列の正方形(左から右)についての検出捕捉剤は、検出すべき及び、次のエキソンによりコードされたそれぞれのペプチド内のＰＥＴに特異的である：１ｖ、２ｖ、３ｖ、４ｖ、５ｖ及び６ｖ。各細区分の下側６列(左から右)についての検出捕捉剤は、検出すべき及び次のエキソンにコードされるそれぞれのペプチド内のＰＥＴに特異的である：７ｖ、８ｖ、９ｖ、１０ｖ、５及び１６。
【００２６】
図１６は、試料中の各イソ型の、各サンドイッチ対の定量による個々のシグネーチャーのすべての総計を示している。
【００２７】
図１７は、あるスプライス変異体システムのモデルについての断片化計画を示している。長型及び短型は、このシステムにおけるモデルイソ型を表している。ＨＡ、ＡＵ５、及びＧｌｕ−Ｇｌｕは、選択したエピトープ(又は、対応するエピトープ)に対する抗体を指している。これらのモデルイソ型は、実施例５に記載のように、Ｌｙｓ−Ｃで消化される。これらの配列は、SEQ ID NO:８〜１１により表される。
【００２８】
図１８は、実施例５のスプライス変異体システムモデルから予想された結果を示しており、長型及び短型のイソ型が、独立に、断片化されて分析されている。ＨＡ＋ＡＵ５及びＨＡ＋Ｇｌｕ−Ｇｌｕは、抗体の組合せを示している。
【００２９】
図１９は、実施例５のスプライス変異体システムモデルから予想された結果を示しており、長型及び短型のイソ型が、同一試料中で、２つの異なる割合で断片化されて分析されている。
【００３０】
発明の概要
本発明は、一般に、試料中の多数の標的タンパク質を検出し且つ／又は定量するための方法及び装置を提供する。この発明は、標的ペプチドを生成するための予め選択した断片化計画及び、一種より多くの結合剤に結合する各標的ペプチド上の一種より多くのエピトープの利用を採用する同定計画を含む。ペプチド当たり一種より多い結合剤の利用は、一種以上のエピトープが試料中の２以上の断片上に現れる場合であっても、試料中の標的タンパク質の明りょうな同定を与える。この明りょうな同定は、例えば、各標的ペプチドに結合した第一、第二、第三・・・の結合剤の様々な「組合せ」を、他の標的ペプチドに結合したものと比較し且つ／又はデコンボルート(deconvolute)することによって達成することができる。
【００３１】
試料中のこれらの標的タンパク質の明りょうな同定は、それぞれの標的エピトープが試料中で又は試料中のペプチド間でユニークであることを必要としないので、本発明は、類似のアミノ酸配列を有するタンパク質例えばタンパク質イソ型例えばＲＮＡスプライシング事象から生じるタンパク質イソ型の存在の指示について(他のもののうちで)有用である。ＲＮＡスプライシング事象から生じたタンパク質イソ型も又、ここでは、「タンパク質スプライシング変異体」又は単に「スプライシング変異体」と呼ぶ。
【００３２】
従って、一面において、この発明は、試料中の一種以上の複数の標的タンパク質イソ型を明りょうに検出する方法を提供する。
【００３３】
この発明のこの面の第一のステップにおいて、標的タンパク質イソ型は、予め選択したプロテアーゼの混合物を利用して断片化されて、各々第一のエピトープと第二のエピトープを含む複数の標的ペプチドを生成する。ある幾つかの具体例において、各標的ペプチドは、２種より多くの例えば３、４、５、６又はより多くのエピトープを含むことができる。ある具体例において、予め選択したプロテアーゼの混合物には、トリプシン及び／又はＬｙｓ−Ｃを含有させることができる。プロテアーゼを予め選択してあるので、既知のタンパク質のペプチド断片を予め決定することができる。従って、標的ペプチドの予備のセットを当分野で公知の任意の方法により、例えば標準的な化学的方法を利用して生成することができ、次いで、それらを用いて、その後のステップで使う結合剤を生成することができる。ある幾つかの具体例においては、結合剤は、ペプチドの結合に有用な当分野で公知の任意の結合剤例えば抗体又は機能的な抗体断片を含むことができる。
【００３４】
この発明の第二のステップにおいては、複数の標的ペプチドを、それぞれの第一のエピトープに結合する第一の結合剤と接触させる。これらの第一のエピトープの少なくとも一部分は、一種より多くのペプチド上に存在することができる。その上、これらの第一の結合剤は、固定化することができる。ある具体例において、固定化は、例えば、固体支持体に対する既知の位置での、例えばアレイにおける固定化を含むことができる。他の例として、これらの第一の結合剤を、各々何れの捕捉剤が結合したかの表示を含む複数のビーズ又はミクロスフェア上に固定化することができる。
【００３５】
この発明のこの面の第三のステップにおいて、複数の標的ペプチドを、標的ペプチド上のそれぞれの第二のエピトープに結合する第二の結合剤に接触させることができる。これらの結合剤は、任意の公知の手段によって、検出可能に標識することができる。ある具体例においては、この検出可能な標識は、光学的標識例えば蛍光標識であってよい。かかる具体例においては、結合の検出は、固体支持体上の選択した位置で捕捉された標的ペプチドに結合した第二の結合剤上の光学的標識により生成される光学的シグナルを検出することにより実施することができる。
【００３６】
この発明のこの面の第四のステップにおいて、第一及び第二の結合剤の組合せ物により結合された標的ペプチドが検出されて、試料中の標的タンパク質イソ型の存在を明りょうに示す。本発明の方法によれば、これらの標的タンパク質イソ型の存在は、第一及び第二の結合剤の組合せによって明りょうに示されうる。ある具体例において、このステップは、前記の第一及び第二の結合剤の多数の組合せ物により結合された多数の標的ペプチドを検出して、前記の標的タンパク質イソ型が試料中に存在するか否かを明りょうに決定することを含むことができる。ある具体例においては、標的ペプチド上のそれぞれの第二のエピトープの少なくとも一部分は、一種より多くのペプチド上に存在することができる。
【００３７】
更に、これらの第一及び第二のエピトープの組合せの少なくとも一部分は、各々、一種より多くのペプチド上に存在することができる。第一及び第二のエピトープの組合せが各々一種より多くのペプチド上に存在する場合には、ある更なる具体例は、上記の標的ペプチドの検出の第四のステップの部分として、第一及び第二の結合剤のそれぞれの組合せが結合した標的ペプチドからの相対的シグナルをデコンボルートすることを含むことができる。
【００３８】
ある具体例においては、様々な追加の又は中間のステップを実施することができる。例えば、試料を、精製及び／又は変性によって、第二のステップの前に、予備処理することができる。他の例としては、ある具体例は、試料中の標的タンパク質イソ型の量及び／又は濃度を測定するために、定量ステップ、例えば、標的ペプチドに結合した第一の結合剤、第二の結合剤、又は結合剤の組合せ物の結合を定量する更なるステップを含むことができる。その上、幾つかの具体例においては、一種以上のペプチドにおいて、二種より多くのエピトープを組み合わせて、又は結合物の群にて利用することができる。適宜、如何なる追加のエピトープ(組合せ又は組合せの群にて)も、第一及び第二のエピトープについてここに記載の様々な特性を含むことができる。
【００３９】
標的ペプチド並びに標的タンパク質のイソ型の同定及び／又は定量は、直接的に及び／又は相対的に測定することができる。例えば、図５に示したように、結合剤１及び２の組合せは、短型タンパク質イソ型を、この図に示した３種類のペプチドを含む試料から直接、同定及び／又は定量することができる。この例において、結合剤１及び２の組合せは、短型タンパク質イソ型を示すペプチドにユニークであり、又はそれを明りょうに示している(たとえ、結合剤１及び２の各々が、この図に示した３種類のペプチドの試料においてユニークなものでなくても)。或は、同定及び／定量は、相対的なものであってよく、又は直接的なものと相対的なものが混在してよい。例えば、、図１２に示したように、Ｍｅｔａ−２イソ型は、測定１及び測定２の組合せを分析して比較することによって相対的に同定及び／又は定量することができる。この例において、結合剤４ｖ及び５の組合せは、Ｍｅｔａ−１タンパク質イソ型を示すペプチドにユニークであり、直接測定される。しかしながら、結合剤７ｖ及び１６の組合せは、測定２において、Ｍｅｔａ−２タンパク質イソ型を示すペプチドにユニークではない。即ち、結合剤７ｖ及び１６の組合せは又、Ｍｅｔａ−１タンパク質イソ型からのペプチドをも示す。それ故、この測定２においてＭｅｔａ−２タンパク質イソ型を示すペプチドを、測定１と比較して測定する。同様に、結合剤５及び１６の組合せは、測定３においてＣＤ４４ｓタンパク質イソ型を示すペプチドにユニークではなく、このＣＤ４４ｓタンパク質イソ型を示すペプチドは、測定２及び１と比較して測定される。従って、ある具体例においては、この方法は、これらの結合剤の結合を定量して、少なくとも、２種の異なる標的タンパク質イソ型の資料中の相対的な量を決定するステップを含む。
【００４０】
上記のように、本発明は、類似のアミノ酸配列を有するタンパク質、例えばタンパク質イソ型の存在を示すために有用である。様々な具体例において、これらのイソ型は、スプライシング変異体(或は、選択的スプライシングを受けたＲＮＡの発現産物として言及される)を含むことができる。幾つかの具体例において、これらのスプライシング変異体は、この試料中に存在する唯一のイソ型でありうる。
【００４１】
差次的エキソン発現により生成されるタンパク質イソ型、例えば、遺伝子の転座の又は選択的スプライシングを受けたＲＮＡの発現産物の同定のために、この発明の方法は、様々な具体例において、例えば第一、第二、第三等のエピトープ(異なるエキソンの発現産物間のジャンクションに及ばない)を各々含む標的ペプチドを生成して検出することを含むことができる。幾つかの具体例は又、ペプチド上の異なるエキソンの発現産物の部分を各々含むエピトープを含む標的ペプチドをも含むことができる。例えば、第一のペプチドのエピトープは、第一のエキソンの発現産物の少なくとも一部分を構成することができ、適宜、第二のエピトープは、第二のエキソンの発現産物の少なくとも一部分を含むことができる、以下、同様である。
【００４２】
他の面において、この発明は、タンパク質の混合物を含む試料中の複数の異なる標的タンパク質イソ型の多重検出のための装置を提供する。この装置は、複数の固定化された捕捉剤を含むことができ、その各々は、標的タンパク質イソ型の消化により生成され、それぞれのタンパク質の少なくとも一部分をコードする複数のエキソンの発現産物の少なくとも部分を含む標的ペプチド上の第一のエピトープに結合する。それぞれの標的ペプチドの存在は、試料中のそれぞれの標的タンパク質イソ型の存在を明りょうに示すことができる。
【００４３】
この発明のこの面の様々な具体例において、この装置は、一組の検出可能に標識された結合剤を含むことができ、それらは、それぞれの標的ペプチド上のそれぞれの第二のエピトープに結合する。これらの第二のエピトープは、第一のエピトープをコードするエキソンと異なるエキソンの発現産物の少なくとも一部分を含むことができる。ある具体例においては、捕捉剤と検出可能に標識した結合剤の対の結合が、試料中の標的タンパク質イソ型の存在を明りょうに示すことができる。この発明のこの面の様々な具体例において、これらの捕捉剤は、固体表面にアレイに固定化することができ、検出可能に標識した結合剤は、光学的に検出可能な標識を含むことができる。加えて、様々な具体例において、この装置は、標的ペプチドを確実に生成するように試料中のタンパク質の混合物の消化のための指示を特定するプロトコールを含むことができる。この装置は、更に、或は別法として、前記の標的ペプチドを確実に生成するように、試料中のタンパク質の混合物の消化のための装置及び／又は試薬を更に含むことができる。
【００４４】
他の面において、この発明は、タンパク質の混合物を含む試料中の標的タンパク質を検出するための方法を提供する。この発明のこの面の第一のステップにおいて、標的タンパク質は、予め選択したプロテアーゼを用いて断片化されて、第一のエピトープ及び第二のエピトープ(これらの両方とも、潜在的に、試料中の他のタンパク質中に存在する)を含む標的ペプチドを生成する。様々な具体例において、これらの第一及び第二のエピトープのすべて、幾つかは試料中の他のタンパク質中に存在し、又は何れも存在しない。ある具体例において、各標的ペプチドは、２種類より多くのエピトープ例えば３、４、５、６、又はそれより多くのエピトープを含む。
【００４５】
この発明のこの面の第二のステップにおいて、これらのペプチドを、前記の第一及び第二のエピトープにそれぞれ結合する第一及び第二の結合剤の対と接触させ、これらの結合剤の組合せ物の結合は、試料中の標的タンパク質の存在を明りょうに示す。この発明のこの面の第三のステップにおいて、第一及び第二の結合剤のこれらのペプチドへの結合を検出して、試料中の標的タンパク質の存在を示す。様々な具体例において、この標的タンパク質は、ある一つのタンパク質イソ型であってよい。
【００４６】
この発明の種々の具体例(この発明の異なる面で記載したものを含む)は、一般に、この発明のすべての面に適用可能であることを意味するということは理解されるべきである。如何なる具体例も、不適当でない限り、他の任意の具体例と組み合わせることができる。この発明の前述の面及び具体例は、下記の図面、詳細な説明及び請求の範囲を参照することによって、一層完全に理解されうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
１．概観
この発明は、試料中のタンパク質イソ型例えば様々な選択的スプライシング変異体又は疾病関連タンパク質イソ型の存在を検出し且つ／又は定量するための方法を提供する。
【００４８】
この方法は、広く、試料中のタンパク質を消化して複数のペプチド(ペプチド断片又は断片とも呼ばれる)を生成する第一のステップを含む。このタンパク質は、選択的スプライシングイソ型、様々な病状に特異的な他のイソ型、又は分解産物などを有することが予想され又は疑われるものであってよい。これらのイソ型の存在／量は、予め選択したある種のペプチド断片を好ましくはサンドイッチアッセイを利用して検出／定量することにより測定される。予め選択した各ペプチド断片について、サンドイッチアッセイは、予め選択したペプチド断片上のエピトープ(例えば、第一のエピトープ及び第二のエピトープ)を認識する捕捉剤の組合せを採用する。これらのエピトープが関心のあるプロテオームにおいてユニーク(例えば、試料につきユニーク)であることは、望ましいことであるが、必須ではない。しかしながら、捕捉剤の組合せを利用して、ペプチドが由来したイソ型を明りょうに同定することができる。
【００４９】
予め選択したペプチド又はペプチド断片の検出／定量を実施するためには、その消化混合物を、これらのペプチド上のエピトープにそれぞれ結合する結合剤(例えば、抗体又は様々な機能を有するその断片)と接触させる。断片化プロトコール並びにエピトープ及びそれらの結合剤の選択は、一種以上の結合剤の組合せの結合が標的タンパク質イソ型の試料中の存在を明りょうに示す方法の実施を可能にする。換言すれば、結合剤のペプチド断片への結合の組合せの検出が、標的タンパク質イソ型の試料中の存在を明りょうに示すことができる。
【００５０】
この発明は、一般に、タンパク質の識別及び定量のための改良された方法に関係する。特に、この発明は、類似のアミノ酸配列を有するタンパク質例えばタンパク質イソ型の識別及び定量のための新しいアプローチを提供する。ある具体例において、「サンドイッチ」は、単一のタンパク質断片中に存在する２つの異なるエピトープが試料のタンパク質消化により遊離されたものに対して生産された抗体により形成される。この分析前の試料の消化は、ａ）抗体が結合できるように線状エピトープを露出させるため(ある場合には、変性のみでも達成できる)及びｂ）様々なイソ型の間の識別のための顕著な特徴を創出する(例えば、特定のペプチド断片上の特定のエピトープの組合せを分離する)ために利用される。
【００５１】
この試料は、適宜、より良い消化結果を与えるために予備処理される。可能な処理には、試料の変性(熱及び／又は化学試薬例えば６〜８Ｍ グアニジンＨＣｌ若しくは尿素若しくはＳＤＳなどによる)が含まれる。ＵＳ２００５−００６９９１１Ａ１を参照。
【００５２】
ある具体例において、検出すべきタンパク質断片は、エキソン間の(例えば、不変エキソンと可変エキソン間の)ユニークなジャンクション領域に及ぶように選択される。しかしながら、エピトープがジャンクション領域自体を含むことは必要でない。個々のエピトープ配列は、完全長タンパク質と一種以上の他のイソ型との間で共有されうるが、エピトープの組合せ又は組合せのセット(下記するように、「組合せＰＥＴ」、又は一般的に「ＰＥＴ」とも呼ばれる)は、試料中のイソ型の存在のユニークな識別子である。
【００５３】
ある具体例において、少なくとも幾つかの断片は、一種以上の可変エキソンの完全な又は部分的な配列(又は、ある種のイントロンさえも、図１参照)を含みうる(幾つかのものに見られるが、すべてのイソ型ではない)。他の断片は、すべての選択的スプライシングイソ型において見られる共通の又は不変のエキソンの完全な又は部分配列のみを含むことができる。更に別の断片は、可変エキソン(例えば、幾つかのイソ型で見られるが、すべてのイソ型ではない)のみの完全な又は部分的な配列を含むことができる。試料中の一種以上のスプライシングイソ型の存在を明りょうに示すのは、試料中の選択した小数のペプチド断片の検出／定量である。ある種の可変エキソンを含む任意のペプチド断片は、検出／定量するために予め選択されたペプチド断片であってよい。一具体例において、予め(検出／定量するために)選択したペプチドは、共通のエキソンの一部分、及び可変エキソンの一部分を含むことができる。従って、この予め選択したペプチドは、スプライスジャンクションを含むことができる。
【００５４】
様々な具体例において、多くのイソ型が、実質的に同時に及び／又は定量的に検出される。従って、この方法は、タンパク質の混合物を含む試料中の複数の異なるタンパク質イソ型の多重検出に適合させることができる。この場合、この方法は、試料中の複数のタンパク質を消化して、第一及び第二のエピトープを与える複数のペプチド断片を生成すること並びにそれぞれのタンパク質の少なくとも一部分をコードする異なるエキソンの発現産物の少なくとも部分を含む複数のペプチド断片を生成することを含む。又、この消化プロトコール並びにこれらのエピトープ及びそれぞれの結合剤の選択は、少なくとも幾つかの断片の存在が試料中のイソ型の存在を明りょうに示し、それらの断片の存在を第一及び第二のエピトープ対への結合事象の検出により知ることができるようにデザインする。試料中の更なるイソ型は、下記の実施例２及び３に記載のように、試料中のペプチドの組合せからのシグナルを比較してデコンボルートすることによって明りょうに同定することができる。
【００５５】
下記の節は、この発明のある特徴を詳細に記載している(それは又、ＵＳ２００４−００２９２９２Ａ１、ＵＳ２００４−００３８３０７Ａ１、ＵＳ２００４−０１８０３８０Ａ１、ＵＳ２００５−００６９９１１Ａ１、ＵＳ２００６−００１４２１２Ａ１、及び／又はＵＳ２００５−０２５５４９１Ａ１、ＥＰ１３２０７５４、及びそれらが優先権を主張する他の出願にも一層詳細に記載されうる)。
【００５６】
２．定義
ここで用いる場合、用語「ＰＥＴ(ペプチドエピトープタグ)」は、特定の試料中で(単独で及び／又は他のＰＥＴと組合せで及び／又はＰＥＴのグループで)検出された場合に、タンパク質例えばそれが由来した特定のイソ型が試料中に存在することを明りょうに示すアミノ酸配列を含むタンパク質エピトープを意味することを意図している。例えば、単一のＰＥＴは、その試料中の存在(配列と選択的に結合するようにデザインされた捕捉剤を用いた信頼できる結合事象の検出により示される)が、その配列を含むタンパク質がその試料中に存在することを必然的に意味するように選択されうる。有用なＰＥＴは、タンパク質混合物を変性及び／又は断片化した場合に、溶媒が接近可能な結合表面を与えなければならず、そして有意の特異性で選択した捕捉剤と最少の交差反応で結合しなければならない。単一のＰＥＴは、それが由来したタンパク質中に存在し且つ研究している試料、細胞型、又は種に存在しうる他のタンパク質中には存在しない。その上、単一のＰＥＴは、好ましくは、試料中に存在しうる他のタンパク質間で密接に関連した配列(ニアレストネイバー分析により測定されるようなもの)を有しない。しかしながら、タンパク質イソ型例えば選択的スプライシングイソ型、同タンパク質の分解産物、又は異なる長さのタンパク質産物(例えば、ＨＤタンパク質)をコードするある種の病気の遺伝子の関連において、ＰＥＴは、例えば、試料中の一種以上のイソ型によって共有されうる。ＰＥＴは、タンパク質の表面領域、隠れた領域、スプライスジャンクション、又は翻訳後修飾領域に由来しうる。
【００５７】
二種の捕捉剤により認識される２つのエピトープが(それぞれ)同じペプチド断片上に存する主題のサンドイッチイムノアッセイなどのある具体例において、一つの断片上のこれらの２つのエピトープの組合せは、たとえ個々のエピトープが単一のＰＥＴとして適格でありえない場合でさえ、試料中の一のタンパク質例えばタンパク質イソ型にユニークでありうる。例えば、スプライシング変異体１は、エピトープａ及びｂを有しえて、スプライシング変異体２は、エピトープｂ及びｃを有しえて、スプライシング変異体３は、エピトープａ及びｃを有しうる。３つの変異体すべてが一の試料中に存在する場合、これらのエピトープ(ａ、ｂ又はｃ)の何れも、用語の厳密な意味において「単一ＰＥＴ」として適格でない。従って、第一の結合剤も第二の結合剤も、単独では、単一ＰＥＴ一つによって一つの標的タンパク質の存在を明りょうに示さない。しかしながら、第一及び第二の結合剤の組合せの結合は、標的タンパク質の一つの存在を、例えば図５に示したように、明りょうに示しうる。従って、エピトープの組合せ、即ちＰＥＴ、ａ及びｂは、スプライシング変異体１をユニークに同定し、それ故、この変異体についての一つのシグネーチャーを構成する。
【００５８】
ある具体例において、２以上のＰＥＴの唯一の組合せが、試料中の一の標的タンパク質の存在を明りょうに示すことができ、他の組合せは、例えば図１２における結合剤１６と７の組合せにより示されるように、２以上のタンパク質を示すことができ、この組合せは、２つの断片(一つは、Ｍｅｔａ−１に由来し、他はＭｅｔａ−２に由来する)を認識する。分離して見た場合には単一の標的タンパク質を明りょうに示さないが、かかる組合せのエピトープも又、ここでは、ＰＥＴと呼び、組合せ型ＰＥＴと考えることができる。これは、２以上のかかる組合せは、それぞれのＰＥＴ／抗体組合せとそれらのそれぞれのペプチド断片との間の結合をデコンボルートするのに十分なデータを与えることができ、それにより、試料中に存在する多数の標的タンパク質の存在を、標的タンパク質の一つの存在を明りょうに示す唯一の結合剤ＰＥＴの対に基いて、明りょうに検出し及び／又は量を測定するからである。
【００５９】
組合せＰＥＴの概念は、タンパク質スプライシング変異体又はイソ型に限られない。単独ＰＥＴとして適格でない(例えば、各配列が、試料中の、異なる、恐らくは無関係のタンパク質に共有されるので)任意の２つのエピトープは、他のタンパク質に共有されないユニークな組合せを表すことができる。サンドイッチアッセイと組み合わせての、組合せＰＥＴの利用は、単一捕捉剤アッセイを超える明確な利点を有する強力なアプローチである。
【００６０】
記したように、単一のＰＥＴは、一の種のプロテオーム中の唯一つのタンパク質中に存在する理想的なペプチド配列である。しかし、ヒト試料において有用な単一ＰＥＴを含むペプチドは、実際は、他の生物体のタンパク質の構造内に存在しうる。成体細胞試料において有用な単一ＰＥＴは、たとえそれが同じ生物体の他のタンパク質の構造中に、その生涯の他の時点(胚形成中など)で又は同じ研究下の他の組織若しくは細胞型に存在しえても、その試料に「ユニーク」なものである。単一ＰＥＴは、たとえ同じアミノ酸配列が、異なるタンパク質由来の試料中に存在しても、ユニークでありうる(但し、そのアミノ酸の少なくとも一つは、誘導体化されており、それらのペプチドを分離するバインダーを開発することができる)。
【００６１】
本願において、単一ＰＥＴに関して「ユニークネス」という場合には、この言及は、常に、前述との関連においてなされる。従って、ヒトのゲノムにおいて、単一ＰＥＴは、それが由来したタンパク質に対して真にユニークなアミノ酸配列であってよい。或は、それは、それが由来した試料に対して正にユニークであってよいが、同じアミノ酸配列が、例えばマウスのゲノム中に存在してよい。同様に、多数の異なる生物体からのタンパク質を含みうる試料に言及する場合、ユニークネスは、異なる生物体(例えば、宿主又は病原体)からのタンパク質を明りょうに同定して識別する能力を指す。
【００６２】
従って、単一ＰＥＴは、それが由来した試料に対してユニークであれば、種において一種類より多くのタンパク質内に存在しうる。例えば、単一ＰＥＴは、ある細胞型例えば肝臓、脳、心臓、腎臓又は筋肉の細胞に；ある種の生物学的試料例えば血漿、尿、羊水、生殖器液、髄、脊髄液、又は囲心腔液試料に；ある種の生物学的経路例えばＧタンパク質共役レセプターシグナル経路又は腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)シグナル経路に対してユニークなアミノ酸配列であってよい。
【００６３】
ＰＥＴ(単一ＰＥＴ又は組合せＰＥＴ)を同定するための情報は、様々な起源から容易に得ることができる。例えば、生物体の全ゲノムが関係する場合、配列決定されたゲノムは、このゲノムによりコードされうる各タンパク質配列を与え、ときには、仮説的タンパク質さえ含む。この配列決定されたゲノムから得られる「事実上翻訳されたプロテオーム」は、試料中の全タンパク質を表すことによって、最も包括的であることが期待される。或は、試料中の転写されたｍＲＮＡ種の型(「事実上翻訳されたトランスクリプトーム」)も又、如何なる型のタンパク質が試料中に存在しうるかに関して有用な情報を与えることができる。存在するｍＲＮＡ種は、ＤＮＡマイクロアレイ、ＳＮＰ分析、又は分子生物学の分野で利用可能な任意の他の適当なＲＮＡ分析ツールにより同定されうる。ＲＮＡ分析の更なる利点は、選択的スプライシング及び突然変異などの情報をも与えうることである。最後に、質量分析などの技術を利用する直接的タンパク質分析は、特異的な翻訳後修飾及び突然変異の存在を同定するのを助成することができ、これは、特定の応用に対する特定のＰＥＴのデザインを助成することができる。例えば、ＷＯ０３／００１８７９Ａ２は、ポリペプチド又は細胞のリン酸化状態又は硫酸化状態を、質量分析、特にＩＣＰ−ＭＳを利用して測定するための方法を記載している。関連する面において、質量分析は、２−Ｄ電気泳動、ＧＣ／ＬＣなどの分離技術と結合させた場合、特定の試料において発現されたタンパク質のプロフィルに関する豊富な情報を提供してきた。
【００６４】
例えば、Pieper等(Proteomics 3: 1345-1364, 2003)は、ＭＳベースのタンパク質プロファイリング研究のための典型的なアプローチを例示している。かかる典型的な研究において、特定の試料からのタンパク質は、先ず、選択した適当な方法(例えば、２−ＤＥ)を利用して分離される。分離したタンパク質を同定するために、ゲルのスポット及びバンドを切り出してから、ゲル中トリプシン消化を行なう。そのゲルは、質量分析に適合性の染料例えばコロイド状クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０又はＦａｒｍｅｒ’ｓ銀染色で染色しなければならない。このトリプシン消化物を、次いで、ＭＳ例えばＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析する。その結果得られるペプチドの質量スペクトル、ペプチドマスフィンガープリント即ちＰＭＦは、配列データベースに対して検索される。ＰＭＦは、イン・シリコで生成されたすべての理論的トリプシンペプチドのマスと検索プログラムによって比較される。Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ、Ｓｅｑｕｅｓｔ及びＭａｓＣｏｔ(Matrix Science, Ltd., 英国、London)などのプログラムを利用して、データベース検索を行なうことができる。例えば、ＭａｓＣｏｔは、統計学ベースのＭｏｗｓｅスコアを生成し、何らかのマッチが有意であるか否かを示す。ＭＳ／ＭＳは、典型的には、データベースマッチを得る見込みを増大させるために利用される。ＰＭＦは、ペプチドのマスを含むだけである。ペプチドのＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ(衝突誘導された直列ＭＳの解離)は、アミノ酸配列についての情報を含む断片イオンのスペクトルを与える。この情報をペプチドマスフィンガープリントへ加えることは、Ｍａｓｃｏｔが統計的に有意のマッチを増大することを可能にする。幾つかの場合においては、単一ペプチドの生のＭＳ／ＭＳスペクトルだけを投入することによりタンパク質を同定することも又、可能である(いわゆる、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ)(これらのスペクトルに含まれる情報の量はそのようなものである)。ＰＭＦにおけるペプチドのＭＳ／ＭＳも又、タンパク質同定の信頼性を大いに増大させることができ、ときには、非常に高いＭｏｗｓｅスコアを与える(特に、ＴＯＦ／ＴＯＦ(商標)からのスペクトルを用いて)。
【００６５】
Applied Biosystems 4700 プロテオミクスアナライザー、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ(商標)直列質量分析器は、トリプシン消化物からのタンパク質の同定に関して、その感度及び速度のために、無類のものである。高速バッチデータ獲得は、Ｍａｓｃｏｔ検索エンジンの局所的ランニングコピーを利用する自動化データベース検索に結合される。タンパク質が、ペプチドマスマッピングによって明りょうに同定できない場合、その消化物を、デノボペプチド配列決定のためのＱＳＴＡＲ質量分析器(Applied Biosystems Inc., カリフォルニア、Foster City)におけるハイブリッドナノスプレー／ＥＳＩ−Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−ＴＯＦ−ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ、シーケンスタグ、及び／又はＭＳ／ＭＳイオンサーチにより更に分析することができる。静電ナノスプレーＭＳ／ＭＳは、特に有用であり、標的タンパク質が未知の(データベースにない)場合に用いられる。Applied Biosystems のＱＳＴＡＲ(商標)Ｐｕｌｓａｒを、Ｄｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅキャピラリーナノＬＣシステムを有する直列質量分析器で利用して、ペプチド混合物のＥＳ−ＬＣ−ＭＳ及びＭＤＬＣ(Multi-Dimensional-Liquid Chromatography)分析を行なうことができる。これらの装置の組合せは又、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＭＤＬＣ−ＥＳ−ＭＳ／ＭＳ、ＬＣ−ＭＡＬＤＩ、及びゲル−Ｃ−ＭＳ／ＭＳをも実施することができる。Ｐｒｏｂｏｔ(商標)ミクロ分画コレクターを用いて、ＨＰＬＣをＭＡＬＤＩと連結することができ、ナノＬＣから溶出したペプチドを直接ＭＡＬＤＩ標的プレート上にスポットすることができる。プロテオミクスのためのこの新規なＬＣ−ＭＡＬＤＩ作業の流れは、複雑な混合物中のタンパク質の検出のための最大潜在能力を、慣用の２−ＤＥベースのアプローチを補うことによって与える。伝統的な２−ＤＥアプローチに対しては、新規な改良された装置例えばBio-Rad Protein 6-gel-2-DE装置及びPackard MultiProbe II-EXロボット式試料ハンドラーが、Applied Biosystems 4700 Proteomics Analyzerと共に、完全なプロテオーム特性表示のための一層高い試料スループットを与える。
【００６６】
このような研究は、上記と同等の装置を利用して、発現されたタンパク質及びそれらの特異的プロテアーゼ消化断片に関する多量のＭＳデータを蓄積してきた(主として、覆うのＭＳデータベースの形式で保存されたトリプシン断片)。例えば、ＭＳＤＢ(Proteomics Department at the Hammersmith Campus of Imperial College Londonにより維持される同じでないタンパク質配列データベース。ＭＳＤＢは、特に、質量分析応用のためにデザインされている)を参照されたい。ＰＥＴ分析をこれらのトリプシンペプチドに対して行なって、ＰＥＴを同定することができ、それは、更に、ＰＥＴ特異的抗体の生成に利用される。このアプローチの利点は、疑いなくこれらの(トリプシン)ペプチド断片が関心ある試料中に生成されることが知られていることである。
【００６７】
上記の種々の方法に基いて同定されたＰＥＴは、組み合わせることができる。例えば、この発明のある具体例においては、多数のＰＥＴが、任意所定の標的タンパク質について同定されることが必要である。これらのＰＥＴの幾つかは、配列決定されたゲノムデータから同定することができ、他のものは、トリプシンペプチドデータベースから同定することができる。
【００６８】
このＰＥＴは、それが由来するネイティブなタンパク質中に、隣接する又は隣接しないアミノ酸配列として見出すことができる。それは、典型的には、一層大きいペプチド又はタンパク質の配列の一部分を含み、それは、補足剤により、無傷の又は部分的に分解された又は消化されたタンパク質の表面において、又は予め決められた断片化プロトコールにより生成されるタンパク質の断片上で認識されうる。このＰＥＴは、５，６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０アミノ酸残基長であってよい。好適具体例において、このＰＥＴは、６、７、８、９又は１０アミノ酸残基長、好ましくは、８アミノ酸残基長である。
【００６９】
「〜を識別することのできる捕捉剤」などにおける用語「識別する」は、捕捉剤の意図したタンパク質分析物への結合と試料中に存在する他のタンパク質(又は、化合物)へのバックグラウンド結合における相対的差異を指す。特に、捕捉剤は、結合定数の差異がアッセイプロトコール及び検出感度下での結合における統計的に有意の差異を生じるようなものであるならば、タンパク質の２つの異なる種(又は、修飾の種)間で識別することができる。好適具体例において、この捕捉剤は、少なくとも０．５の、尚一層好ましくは少なくとも０．１、０．００１の、又は０．０００１の識別インデックス(Ｄ.Ｉ.)さえ有する。ここに、Ｄ.Ｉ.は、Ｋd(ａ)／Ｋd(ｂ)として定義され、Ｋd(ａ)は、意図した分析物についての解離定数であり、Ｋd(ｂ)は、試料中に存在する任意の他のタンパク質(又は、修飾型)についての解離定数である。
【００７０】
ここで用いる場合、用語「捕捉剤」は、ユニーク認識配列を含むタンパク質に例えば少なくとも検出可能な選択性で結合することのできる任意の薬剤を包含する。捕捉剤は、ユニーク認識配列と特異的に相互作用し(直接又は間接に)、又は結合する(直接又は間接に)ことができる。この捕捉剤は、好ましくは、検出しうるシグナルを生成することができる。好適具体例において、この捕捉剤は、抗体又はその断片例えば一本鎖抗体、又はディスプレーライブラリーから選択したペプチドである。他の具体例において、この捕捉剤は、人工的タンパク質、ＲＮＡ又はＤＮＡアプタマー、アロステリックリボザイム又は小分子であってよい。他の具体例において、この捕捉剤は、ユニーク認識配列の、電子的(例えば、コンピューターベースの又は情報ベースの)認識を与えるものであってよい。一具体例において、この捕捉剤は、細胞において天然には見出されない薬剤である。
【００７１】
ここで用いる場合、用語「プロテオーム」は、生物体で見出される化学的に区別できるタンパク質の完全なセットを指す。
【００７２】
ここで用いる場合、用語「生物体」は、動物例えば鳥類、昆虫、哺乳動物例えばヒト、マウス、ラット、サル、又はウサギ；微生物例えば細菌、酵母及びカビ例えば大腸菌、カンピロバクター菌、リステリア菌、レジオネラ属、ブドウ球菌、連鎖球菌、サルモネラ菌、ボルダテラ菌、肺炎双球菌、根粒菌、クラミジア属、 リケッチア属、ストレプトミセス属、マイコプラスマ、ヘリコバクター・ピロリ、クラミジア・ニューモニア、コクシエラ・バーネッティイ、炭疽菌、及びナイセリア属；原生動物例えばトリパノソーマ・ブルセイ；ウイルス例えばヒト免疫不全症ウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、サル免疫不全症ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ＲＳウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、パラボウイルス、カポジ肉腫随伴ヘルペスウイルス(ＫＳＨＶ)、アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)、シンドビスウイルス、ラッサウイルス、西ナイルウイルス、エンテロウイルス、例えば、２３コクサキーＡウイルス、６コクサキーウイルスＢウイルス、及び２８エコウイルス、エプスタイン−バールウイルス、カリシウイルス、アストロウイルス、及びノルウォークウイルス；真菌類例えばリゾプス、ニューロスポラ、酵母、又はプクキニア；条虫類、例えばエキノコッカス・グラニュロサス、Ｅ．マルチロキュラリス、Ｅ．ボゲリ及びＥ．オリガトラス；及び植物例えば、シロイスナズナ、イネ、小麦、トウモロコシ、トマト、アルファルファ、ナタネ、大豆、綿、ヒマワリ又はカノーラを含む任意の生きている生物体を包含する。
【００７３】
ここで用いる場合、「試料」は、タンパク質分析物を含有しうる任意のものを指す。この試料は、生物学的液体又は生物学的組織などの生物学的試料であってよい。生物学的液体の例には、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、大便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、羊水などが含まれる。生物学的組織は、通常、特定の種類の細胞の集合体であって、それらの細胞間物質(ヒト、動物、植物、細菌、真菌類又はウイルス構造の構造物質の一つを形成する)を伴うものであり、結合組織、上皮組織、筋肉組織及び神経組織が含まれる。生物学的組織の例には、臓器、腫瘍、リンパ節、動脈及び個々の細胞も又含まれる。この試料は又、標的タンパク質(イン・ビトロで生成された分子を含む)の混合物であってもよい。
【００７４】
ここで用いる場合、「比較対照用試料」は、試験試料と比較して少なくとも一つの限定された面において異なるだけの対照用試料を指し、本発明の方法、キット又はアレイが、これらの試験試料と対照用試料との間で、例えば、発現されたタンパク質の量又は種類について及び／又はタンパク質修飾プロフィルについて、これらの限定された差異の効果を同定するために利用される。例えば、対照用生物試料は、生理学的に正常な状態から誘導することができ及び／又は種々の物理的、化学的、生理学的若しくは薬物での処理にかけることができ、又は、種々の生物学的ステージなどから得ることができる。
【００７５】
「処理から予想可能に生じる」は、ペプチド断片が、ある処理例えば位置特異的プロテアーゼ消化又は化学的断片化によって信頼可能に生成されうることを意味する。これらの消化部位は全く特異的であるので、特異的処理により生成されたペプチド断片は、イン・シリコで信頼可能に予想されうる。
【００７６】
この発明の様々な面の更なる詳細を以下に記す。
【００７７】
３．スプライスイソ型の同定
関心ある種々のタンパク質のスプライスイソ型のデータベースは、配列決定されたヒトゲノムなどの配列決定された生物ゲノムから編集することができる。かかるデータ／情報は又、公開されたデータベース例えばＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑ及びＥＳＴデータベースから得ることもできる(National Center for Biotechnology Information website参照、「ncbi.nlm.nih dot gov」参照)。ゲノムアラインメントなどの標準的分子生物学技術を利用して、関心あるタンパク質のエキソンの境界が注解される。異なるスプライシング生成物は、タンパク質／ｃＤＮＡ配列エビデンス並びに予想アルゴリズムに基いて予想されたスプライス生成物を用いて同定される。
【００７８】
４．試料及び試料の調製
捕捉剤又は捕捉剤のアレイは、典型的には、ペプチドのコレクションを生成するように断片化した試料例えば生物学的液体、水試料又は食物試料と、関心あるタンパク質に対応するＰＥＴへの結合に適した条件下で接触される。
【００７９】
本発明の捕捉剤を利用してアッセイすべき試料は、様々な生理学的起源、環境的起源又は人工的起源から引き出すことができる。特に、生理学的試料例えば患者又は生物の体液又は組織試料を、アッセイ試料として利用することができる。かかる液体には、唾液、粘液、汗、全血液、血清、尿、羊水、性器液、糞便、骨髄、血漿、脊髄液、囲心腔液、胃液、腹腔液、腹膜液、胸膜液及び他の身体部分からの抽出物、及び他の腺からの分泌物が含まれるが、これらに限られない。或は、患者から採取された細胞から引き出し又は培養で増殖させた生物学的試料を利用することができる。かかる試料には、上清、全細胞溶解物、又は細胞材料の溶解及び分画から得られた細胞画分が含まれる。細胞及びその画分(生物学的実在物から直接のもの及び人工的環境で成長させたものを含む)の抽出物も又、利用することができる。加えて、生物学的試料は例えば血液、血漿、血清、胃腸分泌液、組織若しくは腫瘍のホモジェネート、滑液、糞便、唾液、痰、嚢胞液、羊水、脳脊髄液、腹腔液、肺洗浄液、精液、リンパ液、涙又は前立腺液から得ることができ且つ／又は引き出すことができる。
【００８０】
試料を、本発明の方法において、使用前に試料調製するための一般的方法を、ここに記載する。簡単にいえば、試料を、試料中に存在するある種の物質による邪魔を最少にするために抽出及び／又は希釈によって予備処理することができる。その試料を、次いで、化学的に還元し、変性し、アルキル化し、又は熱変性にかけることができる。変性工程に関係なく、変性された試料を、次いで、プロテアーゼ例えばトリプシンにより消化してから、次のアッセイに用いる。化学的変性を利用したならば、脱塩工程を、プロテアーゼ消化の直後に加えることもできる。この工程は、一般に、単純であり、丈夫であって、再現可能であり、一般に、血清、細胞溶解物及び組織を含む主要な試料型に適用可能である。
【００８１】
試料は、無関係の物質を除去するために前処理し、安定化させ、緩衝処理し、保存し、濾過し、或は、条件付けすることができる(所望し又は必要であるならば)。試料中のタンパク質は、典型的には、この発明の方法の部分として又はこれらの方法の実施に先立って断片化される。断片化は、任意の当分野で認められた所望の方法を利用して例えば化学的開裂(例えば、シアノゲンブロミド)；酵素的手段(例えば、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カルボキシペプチダーゼ、カルパイン、ズブチリシン、ｇｌｕｃ−Ｃ、ｅｎｄｏ ｌｙｓ−Ｃ及びプロテイナーゼＫなどのプロテアーゼの利用、又はこれらの集合又は下位集合)；又は物理的手段(例えば、物理的剪断による断片化又は超音波処理による断片化)を利用して行なうことができる。ここで用いる場合、用語「断片化」、「開裂」、「タンパク質分解性開裂」、「タンパク質分解」「制限」などは、交換可能に用い、タンパク質中の化学結合典型的にはペプチド結合を切断してペプチド(タンパク質の断片とも呼ばれる)の集合を生成することを指す。
【００８２】
この断片化の目的は、可溶性であって捕捉剤との結合に利用できるＰＥＴを含むペプチドを生成することである。本質において、試料調製物は、試料中に存在しうる関連タンパク質の上又は内部に存在するすべてのＰＥＴが捕捉剤との反応に利用できる程度を保証するようにデザインされる。このストラテジーは、タンパク質チップをデザインするための以前の試みで遭遇した、タンパク質−タンパク質複合体形成、翻訳後修飾などにより引き起こされる多くの問題を回避することができる。
【００８３】
一具体例において、関心ある試料を、予め決めたプロトコールを利用して処理する。該プロトコールは、(Ａ)標的タンパク質−タンパク質非共有結合若しくは共有結合性複合体形成若しくは凝集、標的タンパク質分解若しくは変性、標的タンパク質の翻訳後修飾、又は標的タンパク質の三次構造に環境的に誘導された変化により引き起こされる標的タンパク質のマスキングを阻止し、そして(Ｂ)標的タンパク質を断片化し、それにより、少なくとも一つのペプチドエピトープの組合せ(即ち、ＰＥＴ)を生成し、その濃度は、試料中の標的タンパク質の真の濃度に直接比例する。この試料処理プロトコールは、所定の捕捉剤との反応に利用できるＰＥＴを再現可能に生成するようにデザインされて、経験的に試験される。この処理は、タンパク質分離；タンパク質分画；溶媒の改変例えば極性の変化、浸透圧変化、希釈又はｐＨ変化；加熱;凍結；沈殿；抽出;試薬例えばエンド、エキソ又は部位特異的プロテアーゼとの反応；非タンパク質分解性消化；酸化；還元；幾つかの生物学的活性の中和、及び当業者に公知の他のステップを含むことができる。
【００８４】
例えば、試料を、ジスルフィド／ジチオール交換によりダイマー又は他の凝集体の形成を阻止するためにアルキル化剤及び還元剤で処理することができる。ＰＥＴ含有ペプチドの試料を処理して、リン酸化、メチル化、グリコシル化、アセチル化、プレニル化を含む(これらに限られない)二次的修飾を、例えば、それぞれの修飾に特異的な酵素例えばホスファターゼなどを利用して除去することもできる。
【００８５】
一具体例において、試料のタンパク質は、変性、還元及び／又はアルキル化されるが、タンパク質分解的に開裂されない。タンパク質は、熱変性又は有機溶媒によって変性させてから、直接検出にかけ又は適宜更なるタンパク質分解性開裂を行なうことができる。
【００８６】
溶液中での酵素消化の前のタンパク質の熱変性(５０〜９０℃で約２０分間)の利用は、後続の分析の前に行なうのが望ましいか又は必要とされる精製／濃縮を必要としないので、化学的変性(例えば、６〜８Ｍ グアニジンＨＣｌ又は尿素)よりも好適である。Park及びRussellは、タンパク質分解に耐性のタンパク質の酵素消化が熱変性によって有意に増進されることを報告した(Anal. Chem., 72(11): 2667-2670, 2000)。タンパク質分解に感受性のネイティブなタンパク質は、類似の又は僅かに低い消化収率を熱変性後に示す。消化に耐性のタンパク質は、タンパク質の大きさに関係なく、熱変性後に、一層消化に感受性になる。例えば、消化物断片からのアミノ酸配列範囲は、ミオグロビンで１５から８６％に、オバルブミンで０から４３％に増加する。これは、一層迅速で信頼できる本発明によるタンパク質(特に、プロテアーゼ耐性タンパク質)の同定へと導く。
【００８７】
好適具体例において、ＳＤＳを熱と共に利用して、最適な変性及び(同時の又はその後の)消化を促進することができる。
【００８８】
たとえ幾つかのタンパク質が熱変性の際に凝集しても、それらのタンパク質凝集物は、トリプシンによって容易に消化されて、タンパク質の同定に十分な数の消化物断片を生成する。事実、タンパク質凝集は、熱変性が殆どの場合に消化を促進する理由でありうる。タンパク質凝集物は、変性型タンパク質のオリゴマー化生成物であると考えられる(Copeland, R.A. Methods for Protein Analysis; Chapman & Hall: New York, NY, 1994)。一般に、タンパク質の疎水性部分は、内側に位置され、比較的疎水性でない部分が水性環境に露出される。熱変性中、無傷のタンパク質は、徐々に、広げられて変性コンホメーションとなり、ネイティブなコンホメーションへと折り畳まるのを妨げるのに十分なエネルギーが与えられる。他の変性タンパク質との相互作用の可能性は増大し、それ故、タンパク質の露出された疎水性部分間の疎水性相互作用が可能となる。加えて、この変性タンパク質のタンパク質凝集物は、一層多くの開裂部位が環境に露出されているので、未変性タンパク質よりも一層プロテアーゼ不安定な構造を有しうる。タンパク質凝集物は、容易に消化され、それで、タンパク質凝集物は、３時間のトリプシン消化の終了時には認められない(Park及びRussell, Anal. Chem., 72(11): 2667-2670, 2000)。その上、タンパク質凝集物のトリプシン消化は、一層特異的な開裂生成物を生成する。
【００８９】
普通のプロテアーゼ例えばトリプシンを、変性後に使用することができる。この工程は、最初の変性・消化の後、一回以上繰り返すことができる。或は、この熱変性工程は、更に、変性と消化が同時になされうるように、好熱性トリプシン様酵素を利用することによって助成することができる。例えば、Nongporn Towatana等(J of Bioscience and Bioengineering 87(5): 581-587, 1999)は、バチルス ｓｐ．ＰＳ７１９(温泉の土壌試料から単離された新規な好アルカリ性、好熱性細菌)の培養上清からのアルカリプロテアーゼの見かけ均質性までの精製を報告した。このプロテアーゼは、アゾカゼインに対する最大活性をｐＨ９．０で、７５℃で示した。この酵素は、ｐＨ範囲８．０〜１０．０及び８０℃以下で、Ｃａ2+の非存在下で安定であった。この酵素は、Ｎ−α-ｐ−トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン(ＴＬＣＫ)に加えて、フェニルメチルスルホニルフルオリド(ＰＭＳＦ)及び３，４−ジクロロイソクマリン(ＤＣＩ)が活性を完全に阻害したので、トリプシン様セリンプロテアーゼであるようである。試験した様々なオリゴペプチジル−ｐ−ニトロアニリドの内で、このプロテアーゼは、基質の切れやすいカルボキシル側のアルギニン残基における開裂に対する優先性を示し、ｐ−ニトロアニリンをＮ−カルボベンゾキシ(ＣＢＺ)−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリドを、それぞれ０．６ｍＭ及び１．０μモル分-1ｍｇタンパク質-1のＫm及びＶmax値で遊離させた。
【００９０】
或は、このプロテアーゼを化学的に改変して、この種の応用における使用に対して増進された熱安定性を達成することができる。Mozhaev等(Eur J Biochem. 173(1): 147-54, 1988)は、以前に提案された、タンパク質分子の表面上に位置された非極性クラスターの、水との接触が、タンパク質を不安定化するという考えを実験的に確認した。タンパク質の安定化は、化学的改変によるタンパク質小球の表面領域の人工的な親水化によって達成することができるということが示された。この親水化アプローチの確認のために、２つの実験系が研究された。一の実験においては、トリプシンの表面チロシン残基が、２段階改変(テトラニトロメタンによるニトロ化とその後の亜ジチオン酸ナトリウムによる還元)を利用してアミノチロシンにトランスフォームされた。改変された酵素は、不可逆的な熱不活性化に対して遥かに安定であった(安定化効果は、トリプシン中のアミノチロシン残基の数と共に増大し、この改変酵素は、ネイティブなものの１００倍以上の安定性に達することができた)。他の実験においては、アルファ−キモトリプシンを、芳香族カルボン酸の無水物及びクロロ無水物を用いる処理により、共有結合により改変した。その結果、異なる数の追加のカルボン酸基(改変試薬の構造に依存して、最大で５)が各改変Ｌｙｓ残基に導入された。環状ピロメリト酸及びメリト酸による、アルファ−キモトリプシンのすべての利用可能なアミノ基のアシル化は、このタンパク質の相当な親水化を生じた(水性フィコール４００／デキストラン７０二相系における分配により評価)。これらの改変された酵素調製物は、高温(６５〜９８℃)での不可逆的な熱不活性化に対して極めて安定であった(それらの熱安定性は、事実上、今日までに知られている最も安定なプロテイナーゼである極度に好熱性の細菌からのタンパク質分解酵素の安定性と同じであった)。同様のアプローチを、主題の方法のために、任意の他の選択したプロテアーゼに利用することができる。
【００９１】
他の具体例において、試料を、還元剤例えばβ−メルカプトエタノール、ＤＴＴ、又はＴＣＥＰ(トリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン)を用いて予備処理して、ジスルフィド結合を還元して消化を促進することができる。
【００９２】
分画は、任意の単一の又は多次元のクロマトグラフィー例えば逆相クロマトグラフィー(ＲＰＣ)、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー又は親和性分画例えばイムノアフィニティー及び固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを利用して行なうことができる。好ましくは、この分画は、表面媒介による選択ストラテジーを含む。電気泳動(スラブゲル又はキャピラリー電気泳動)も又、試料中のペプチドを分画するために利用することができる。スラブゲル電気泳動法の例には、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)及びネイティブゲル電気泳動が含まれる。分画に利用することのできるキャピラリー電気泳動法には、キャピラリーゲル電気泳動(ＣＧＥ)、キャピラリーゾーン電気泳動(ＣＺＥ)及びキャピラリーエレクトロクロマトグラフィー(ＣＥＣ)、キャピラリー等電集束法、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー及びアフィニティー電気泳動が含まれる。
【００９３】
タンパク質沈殿は、当分野で周知の技術を利用して行なうことができる。例えば、沈殿は、公知の沈殿剤例えばチオシアン酸カリウム、トリクロロ酢酸及び硫酸アンモニウムを利用して達成することができる。
【００９４】
断片化に続いて、試料を、本発明の捕捉剤例えばここに記載の二次元支持体又はビーズ上に固定化された捕捉剤と接触させることができる。或は、断片化試料(ペプチドの集合を含む)を、例えば、大きさ、翻訳後修飾(例えば、グリコシル化又はリン酸化)又は抗原特性に基づいて分画し、その後、本発明の捕捉剤例えば二次元支持体又はビーズ上に固定化された捕捉剤と接触させる。
【００９５】
ここで、やはり提供するのは、血清試料の、熱変性又は化学的変性を利用した予備処理の説明のための例である。簡単にいえば、熱変性のためには、１００μＬのヒトの血清(総タンパク質は、約７５ｍｇ／ｍＬ)を、先ず、１０倍に希釈して約７．５ｍｇ／ｍＬとする。この希釈試料を、次いで、９０℃に５分間加熱して、それらのタンパク質を変性させ、その後、３０分間のトリプシン消化を５５℃で行なう。このトリプシンは、消化後に、８０℃で不活性化する。
【００９６】
化学的変性のためには、約１．８ｍＬのヒトの血清タンパク質を約４ｍｇ／ｍＬに希釈したものを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液(ｐＨ８．０)、８Ｍ 尿素及び１０ｍＭ ＤＴＴの終濃度にて変性させる。次いで、インドアセタミドを２５ｍＭの終濃度まで加える。この変性した試料を、次いで、更に、プロテアーゼ消化のために、約１ｍｇ／ｍＬまで希釈する。消化した試料は、後続のアッセイで使用する前に、脱塩カラムを通過させる。
【００９７】
血清タンパク質及び細胞溶解物(ＭＯＬＴ４及びＨｅｌａ細胞)の、ここに記載した方法を利用した熱変性及び化学的変性は、試験したタンパク質のすべてではないにしても殆どのものについて上首尾であり、両方法は、タンパク質の変性及び断片化に関して同等の結果を達成した。
【００９８】
ある種の応用のための好適具体例においては、ＳＤＳを熱変性と組み合わせて用いる(例えば、実施例４参照)。かかる応用のためには、慣用のプロテアーゼの代わりに熱安定性プロテアーゼを用いることができる(特に、同時の変性及び消化において)。
【００９９】
上記の例／プロトコールは、説明目的のためだけのものであり、決して制限するものではない。このプロトコールの特定の用途に依存する小規模な改変は、個々のアッセイにおける最適結果のために、容易に達成することができる。
【０１００】
５．ＰＥＴの選択
本発明のＰＥＴの一つの利点は、ＰＥＴを、それらが由来するタンパク質のクローニング又は精製をせずに、イン・シリコで決定して、イン・ビトロで生成することができる(例えば、ペプチド合成による)ことである。ＰＥＴは又、抗体を各ペプチド断片上の限定されたＰＥＴに予想可能に狙いを定めるのに、完全長のトリプシン断片(又は、任意の他の処理から予想可能に生じる如何なる他の断片)よりも有利である。トリプシン断片自体は、その長さの故に(ペプチドのストレッチが長いほど、それはユニークでありやすい)、容易にユニークたりうるであろうが、トリプシン断片に対して生産された抗体は、その断片内の多くのエピトープを標的とするであろう。直接的意味は、完全長の(トリプシン)ペプチド断片よりも比較的短くてユニークなＰＥＴを利用することにより、別々の結合剤の組合せをペプチド断片に割り当てることができることである。単一ＰＥＴについては、このアプローチは、他のペプチド断片と交差反応しうる抗体を生成する危険を完全に除かないとしても、大いに減じる。更なる利点は、ニアレストネイバー分析及びランキング優先順位付け(下記参照)などのＰＥＴ選択工程により加えられえて、これは、更に、交差反応の機会を除去する。すべてのこれらの特徴は、ＰＥＴベースの方法を、多重化技術を利用するゲノムワイド分析に特に適したものにする。
【０１０１】
本発明のＰＥＴは、様々な方法で選択することができる。最も簡単な具体例において、所定の生物又は生物学的試料についてのＰＥＴを、関連データベースの包括的な検索によって、所定の長さの理論的に可能なすべてのＰＥＴを利用して、発生させ又は同定することができる。この方法は、コンピューターにより、例えば、何れかの当分野で利用可能な配列検索ツール又はそれを改変した物を利用して、好適に実施される。例えば、５アミノ酸長のＰＥＴ(可能なＰＥＴの候補の総数は、３２０万)を同定するために、３２０万の候補の各々を、問合せ配列として利用して、ヒトプロテオームに対する検索をすることができる。例えば、単一ＰＥＴについては、１つより多くのヒットを有する如何なる候補(２以上のタンパク質において見出される)も、更なる検索を行なう前に直ちに排除することができる。検索の終わりに、１つ以上のＰＥＴを有するヒトタンパク質のリストが得られる。同じ又は類似の手順を、任意の予め決めた生物又はデータベースに対して利用することができる。
【０１０２】
各ヒトタンパク質に対するＰＥＴを、次の手順を利用して同定することができる。ヒトタンパク質における限定された長さＮ(アミノ酸)の２０Nにより与えられるすべての可能なペプチドの発生を計算するためにパールプログラムが開発されている。例えば、全タグスペースは、４量体ペプチドについて、１６０，０００(２０4)であり、５量体ペプチドについて、３．２Ｍ(２０5)であり、６量体ペプチドについて、６４Ｍ(２０6)であり、以下同様である。予想されるヒトタンパク質配列は、Ｎアミノ酸のすべての可能なペプチドの存否について分析される。従って、特異的ＰＥＴの存在は、タンパク質配列の固有の特性であり、操作に依らない。このアプローチによって、決定的なＰＥＴのセットを規定することができ、試料の処理手順に依らずに利用できる(操作非依存性)。
【０１０３】
一具体例において、検索プロセスを早くするために、コンピューターアルゴリズムを開発し又は改変して、実際的検索を開始する前に、不必要な検索を排除することができる。
【０１０４】
上記の例を利用して、２つの高度に関連する(少数のアミノ酸の位置のみ異なる)ヒトタンパク質を整列させることができ、多数の候補のＰＥＴを、同一領域の配列に基づいて、排除することができる。例えば、２０アミノ酸の同一の配列の範囲があれば、５アミノ酸の１６のＰＥＴを、それらの２つの同一でないヒトタンパク質における同時の出現によって、検索なしで排除することができる。この排除プロセスは、できるだけ多くの高度に関連するタンパク質(例えば、進化的に保存されたタンパク質例えばヒストン、グロビンなど)の対又はファミリーを利用して続けることができる。
【０１０５】
他の具体例においては、所定のタンパク質について同定されたＰＥＴを、ある種の基準に基づいて順位付け、一層高いランクのＰＥＴを特異的捕捉剤の生成において用いるのが好ましいようにすることができる。
【０１０６】
例えば、あるＰＥＴは、自然にはタンパク質の表面に存在しえて、それ故、プロテアーゼにより消化した場合に可溶性であるので、よい候補となる。他方、あるＰＥＴは、タンパク質の内部又はコア領域に存在しえて、消化後でも容易に可溶性とならない。かかる溶解度特性は、利用可能なソフトウェアによって評価することができる。Boger,J.,Emini,E.A.及びSchmidt,A., Surface probability profile-An heuristic approach to the selection of synthetic peptide antigens, Report on the Sixth International Congress in Immunology (Toronto) 1986 p.250に記載された溶媒接近可能性法も又、関心あるタンパク質の表面に位置しているＰＥＴを同定するために利用することができる。パッケージＭＯＬＭＯＬ(Koradi,R.等(1996) J.Mol.Graph.14:51-55)及びEisenhaberのＡＳＣ法(Eisenhaber及びArgos(1993) J.Comput.Chem.14:1272-1280；Eisenhaber等(1995) J.Comput.Chem.16:273-284)も又、利用できる。表面ＰＥＴは、一般に、内部ＰＥＴよりも一層高いランキングを有している。一具体例においては、ＰＥＴ又はＰＥＴを含有するタンパク質分解された断片について計算することができるｌｏｇＰ又はｌｏｇＤ値を、計算して、タンパク質試料が捕捉剤と接触する条件下での類似の溶解度に基づいてＰＥＴを順位付けるために利用することができる。
【０１０７】
ＰＥＴを生成する仕方に関係なく、多くの応用について、理想的なＰＥＴは、好ましくは、８アミノ酸長であり、親のトリプシンペプチドは、２０アミノ酸長より小さいものであるべきである。しかしながら、主題のサンドイッチイムノアッセイについては、親断片は、２つの抗体による同時結合を支持するのに十分な長さでなければならない。抗体は、典型的には、４〜８アミノ酸のペプチドエピトープを認識するので、主題のサンドイッチイムノアッセイに用いるポリペプチド断片の好適な長さは、一般に、少なくとも約１５アミノ酸長、２０アミノ酸長、２５アミノ酸長、又は約３０アミノ酸長である。これらの約１２〜２０アミノ酸のペプチドは又、慣用的にも、抗体産生に用いられている。
【０１０８】
ある具体例においては、標的の長さ(平均で)のポリペプチド断片を生成する傾向のプロテアーゼが、好適である。例えば、ＬｙｓＣは、平均断片サイズがトリプシンによるものより僅かに長いので、殆どのサンドイッチイムノアッセイに関して(トリプシンより)好適な酵素である。
【０１０９】
しかしながら、これらのペプチド断片を生成するために用いられる予め選択されるプロテアーゼには、当分野で公知の任意のプロテアーゼが含まれうる。ある具体例においては、これらの予め選択されたプロテアーゼには、トリプシン及び／又はＬｙｓＣが含まれうる。試料の更なる予備処理には、ある具体例においては、タンパク質を予想可能な位置で確実に消化する酵素(例えば、トリプシン、ＬｙｓＣなど)及び／又は化学薬品(例えば、ＣＮＢｒ)による試料の消化が含まれうる。このタンパク質試料を、タンパク質消化の前に又は該消化と同時に変性させて、二次、三次、及び四次構造を減じ又は完全に破壊することができる。同時の変性と消化のために、プロテアーゼ耐性又は熱耐性プロテアーゼを用いて試料を消化することができる。これらの工程を実施して、試料の複雑さを減じて、アッセイ条件を標準化するために、及びアミノ酸配列を含むペプチド断片(例えば、タンパク質の異なる部分をコードする種々のエキソンの発現)を生成するために、試料中のタンパク質を変性して開裂させることができる。
【０１１０】
トリプシンが消化酵素である場合には、ＰＥＴは、試料調製中にＰＥＴがトリプシンによって開裂されないように、配列の中間部にＫ又はＲを含むべきでない。一層一般的な意味において、選択したＰＥＴは、アッセイが、特異的にＰＥＴが消化後に破壊されることを優先するのでない限り、消化後に破壊されることが予想されるように、消化部位を含有又は重複すべきでない。
【０１１１】
加えて、理想的なＰＥＴは、好ましくは、疎水性の親トリプシンペプチドを有さず、高度に抗原性であり、そしてニアレストネイバー分析により規定される最も密接に関連するペプチド(ニアレストネイバーペプチド又はＮＮＰ)を最少数有する。
【０１１２】
何れのＰＥＴにも、注釈が付随してもよく、該注釈は、有用な情報例えばそのＰＥＴがある種のプロテアーゼ(例えばトリプシン)によって破壊されうるか、比較的硬い又は柔軟な構造を有する消化されたペプチド上に出現することがありそうかというような情報を含むことができる。これらの特性は、特に、所定のタンパク質に結合した多数のＰＥＴがある場合に特異的捕捉剤を生成するならば、用途につきＰＥＴを順位付けするのを助けることができる。ＰＥＴは、所定の生物における特定の用途に依って変化しうるので、順位は、特定の用法に依って変化しうる。あるプロテアーゼにより破壊される確立のために低ランキングでありうるＰＥＴは、異なるプロテアーゼを利用する異なる断片化計画においては一層高くランクされうる。
【０１１３】
他の具体例において、抗体生成のためにタンパク質から最適のＰＥＴを選択するためのコンピューターアルゴリズムは、抗体−ペプチド相互作用のデータを考慮する。Nearest-Neighbor Analysis (ＮＮＡ)などのプロセスを利用して、各タンパク質について最もユニークなＰＥＴを選択することができる。タンパク質中の各ＰＥＴは、それが有するnearest neighborsの数に基づく相対的スコア(又は、ＰＥＴ ユニークネス・インデックス)を与えられる。ＰＥＴ ユニークネス・インデックスが高いほど、そのＰＥＴは、一層ユニークである。ＰＥＴ ユニークネス・インデックスは、アミノ酸置換マトリクス例えば表ＶＩＩＩのGetzoff, ED, Tainer JA及びLerner RA The chemistry and meachnism of antibody binding to protein antigens. 1988. Advances. Immunol. 43:1-97のものを利用して計算することができる。このマトリクスにおいて、各アミノ酸の残りの１９アミノ酸による置換可能性が、単一変異の(ペプチド配列中の各アミノ酸を残りの１９アミノ酸で置換した)多数のペプチドに対する抗体の交叉反応性についての実験データに基づいて計算された。例えば、タンパク質に由来する各８量体ＰＥＴは、ヒトプロテオーム中に存在する８７０万の８量体と比較されて、ＰＥＴ ユニークネス・インデックスが計算される。このプロセスは、特定のタンパク質について最もユニークなＰＥＴを選択するだけでなく、このＰＥＴについてのNearest Neighbor Peptideをも同定する。これは、Nearest Neighbor Peptideは、特定の抗体と交叉反応することが最もありそうなので、ＰＥＴ特異的抗体の交叉反応性の限定に重要になる。
【０１１４】
ＰＥＴ ユニークネス・インデックスの他に、各ＰＥＴについて下記のパラメーターも又、計算することができて、ＰＥＴのランク付けを助ける：
ａ）ＰＥＴ溶解度インデックス：これは、ＰＥＴのＬｏｇＰ及びＬｏｇＤの計算を含む。
ｂ）ＰＥＴ疎水性及び水接近容易性：親水性ペプチド及び良好な水接近容易性を有するペプチドが選択される。
ｃ）ＰＥＴ長：一層長いペプチドは、溶液中でコンホメーションを有する傾向があるので、８アミノ酸の限定された長さのＰＥＴペプチドを利用する。ＰＥＴ特異的な抗体は、これらの一層短いペプチド配列中のエピトープの限定された数のために、一層良好な限定された特異性を有する。これは、これらの抗体を利用する複合的アッセイには非常に重要である。一具体例においては、この方法により精製された抗体だけが、複合的アッセイに利用される。
ｄ）進化保存インデックス：各ヒトＰＥＴは、ＰＥＴ配列が、種を超えて保存されているかどうかを示すために、他の種と比較される。理想的には、例えば、マウスとヒトの配列の間で、最小の保存を有するＰＥＴが選択される。これは、マウスにおける良好な免疫応答及びモノクローナル抗体を生成する可能性を最大にする。
【０１１５】
６．捕捉剤
本発明によれば、用いられる(第一及び第二の)捕捉剤は、ＰＥＴ部分との選択的な親和性反応が可能であるべきである。一般に、かかる相互作用は、非共有結合性であるが、本発明は、ＰＥＴに共有結合により結合される捕捉剤の利用をも企図している。
【０１１６】
使用できる捕捉剤の例には、次のものが含まれるが、これらに限られない：ヌクレオチド；オリゴヌクレオチドを含む核酸、二本鎖又は一本鎖の核酸(直鎖状又は環状)、核酸アプタマー及びリボザイム；ＰＮＡ(ペプチド核酸)；抗体を含むタンパク質(モノクローナル又は組換えにより作られた抗体又は抗体断片など)、Ｔ細胞レセプター及びＭＨＣ複合体、レクチン及び足場ペプチド；ペプチド；他の天然のポリマー例えば炭水化物；人工のポリマー(プラスティボディーを含む)；小型有機分子例えば薬物、代謝産物及び天然物など。好適な捕捉剤は、動物において合成ペプチドに対して生成された抗体である。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方とも使用することができる。
【０１１７】
ある具体例において、これらの捕捉剤は、固体支持体例えばビーズ、チップ、又はスライド上に、永久的に又は可逆的に固定化される。タンパク質の複雑な混合物を分析するために用いられる場合には、この固定化捕捉剤は、結合データのデコンボルーションのためにアレイ化され且つ／又は標識され、捕捉剤(従って、それが結合したタンパク質)の正体を明らかにし、(適宜)結合を定量する。或は、これらの捕捉剤は、溶液(溶媒)中に遊離状態で与えることができ、同時にＰＥＴ結合をデコンボルートするために他の方法を利用することができる。
【０１１８】
ある具体例において、これらの捕捉剤は、蛍光分子又は酵素などのレポーター分子と結合体化して、例えば「サンドイッチ」型アッセイにおいて、基材(例えば、チップ又はビーズ)上の結合ＰＥＴの存在を検出するために利用するが、該アッセイにおいては、一つの捕捉剤を支持体上に固定化して、一種のＰＥＴを捕捉し、その捕捉されたＰＥＴに特異的な標識した第二の捕捉剤を加えてその捕捉されたＰＥＴを検出／定量することもできる。この具体例において、ペプチド断片は、２つの重複しないＰＥＴを含み、一方は、固定化された捕捉剤により認識され、他方は、標識された検出用捕捉剤により認識される。関連する具体例において、一のペプチド断片にユニークなＰＥＴは、幾つかのタンパク質ファミリーメンバー又はスプライシングイソ型に共有される共通のＰＥＴと一緒に使用することができる。これらの２つのＰＥＴの空間配置は、一の捕捉剤による結合が、他の捕捉剤による結合に実質的に影響を与えないようにする(例えば、これらの結合部位を、数アミノ酸離すことができる)。加えて、ペプチド断片の長さは、それが、２つのＰＥＴを互いに適当に離すようなものである。好ましくは、ペプチド断片は、サンドイッチアッセイのためには、少なくとも約１５残基である。他の具体例においては、標識されたＰＥＴペプチドを競合結合アッセイで利用して、捕捉剤に結合する(試料由来の)未標識のＰＥＴの量を測定する。この具体例において、このペプチド断片は、一のＰＥＴを含むのに十分な長さを有してさえいればよく、それ故、５〜８残基ほどの短いペプチドが適当でありうる。
【０１１９】
一般に、サンドイッチアッセイは、競合結合アッセイよりも(例えば、約１０、１００又は１０００倍以上)感度がよい傾向がある。
【０１２０】
この発明の重要な利点は、検出すべきタンパク質の試料が存在しない場合でさえ、有用な捕捉剤を同定及び／又は合成しうることである。ヒト、ハエ(例えば、キイロショウジョウバエ)及び線虫(例えば、Ｃ．エレガンス)など幾つかの生物の全ゲノム解析が完了すれば、所定の長さのＰＥＴ又はそれらの組合せをある種の生物の所定の単一タンパク質のために同定し、次いで、関心あるこれらのタンパク質の何れに対する捕捉剤でも、完全長タンパク質をクローン化して発現させることなく作成することができる。
【０１２１】
加えて、捕捉剤の抗原又は標的として役立つ任意のＰＥＴの適否を、更に他の利用可能な情報に対してチェックすることができる。例えば、今や、多くのタンパク質のアミノ酸配列を、利用可能なゲノムでデータから推論することができるので、試料にユニークなタンパク質の構造から配列を、コンピューター検索によって測定することができ、そのペプチドのタンパク質中での位置、及び無傷のタンパク質においてそれに接近できるかどうかを測定することができる。一度適当なＰＥＴペプチドが見出されれば、それを、公知技術を利用して合成することができる。手に入れたＰＥＴの試料を用いて、該ペプチドと相互作用する抗体又はペプチドバインダーなどの薬剤を、該ペプチドに対して生産し又はパニングによってライブラリーから得ることができる。この状況においては、任意の選択した試料の断片化プロトコールがタンパク質を、ＰＥＴを破壊し又は傷つけることにより制限することのないことを保証するように注意しなければならない。これは、理論的及び／又は実験的に測定でき、このプロセスを、選択したＰＥＴが捕捉剤によって確かに回収されるまで反復することができる。
【０１２２】
本発明の教示により選択されたＰＥＴセットは、それらが生成された元のタンパク質の酵素的開裂及びペプチドの選択により、又は好ましくはペプチド合成法によって、ペプチドを生成するために利用することができる。
【０１２３】
タンパク質分解により開裂されたペプチドは、周知の従来技術によって、クロマトグラフィー又は電気泳動手順によって分離して、精製して、復元することができる。
【０１２４】
合成ペプチドは、当分野で公知の古典的な方法によって、例えば、標準的な固相技術を利用することにより調製することができる。これらの標準的方法は、排除固相合成、部分固相合成法、断片濃縮、古典的な溶液合成を包含し、組換えＤＮＡ技術によるものさえ含まれる。例えば、Merrifield, J.Am.Chem.Soc., 85:2149 (1963)を参照されたい。固相ペプチド合成手順は、当分野で周知であり、John Morrow Stewart and Janis Dillaha Young, Solid Phase Peptide Syntheses (第二版、Pierce Chemical Company, 1984)に一層記載されている。
【０１２５】
合成ペプチドは、調製用高性能液体クロマトグラフィー[Creighton T. (1983) Proteins, structures and molecular principles. WH Freeman and Co. ニューヨーク]により精製することができ、その組成は、アミノ酸配列決定により確認することができる。
【０１２６】
加えて、他の添加剤例えば安定剤、緩衝剤、ブロッカーなども、捕捉剤と共に提供しうる。
【０１２７】
Ａ．抗体
好適具体例において、捕捉剤は、抗体又は抗体様分子(集合的に「抗体」という)である。従って、捕捉剤として有用な抗体は、完全長抗体又はその断片であってよく、これは、抗体の「抗原結合部分」を含む。用語「抗原結合部分」は、ここで用いる場合、抗原に特異的に結合する能力を保持している抗体の少なくとも一つの断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって遂行されうるということが示されている。抗体の「抗原結合性部分」なる用語に包含される結合性断片の例には、(ｉ)Ｆａｂ断片(ＶL、ＶH、ＣL及びＣH1ドメインよりなる一価の断片)；(ii)Ｆ(ａｂ')2断片(ヒンジ領域でジスルフィド橋により結合された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片)；(iii)ＶH及びＣH1ドメインよりなるＦｄ断片；(iv)抗体の単一アームのＶL及びＶHドメインよりなるＦｖ断片；(ｖ)ＶHドメインよりなるｄＡｂ断片(Ward等(1989)Nature 341:544-546)；及び(vi)単離された相補性決定領域(ＣＤＲ)が含まれる。その上、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶL及びＶHは、別々の遺伝子によりコードされており、それらは、組換え法を利用して、合成リンカーによって結合することができ、該リンカーは、それらが単一のタンパク質の鎖として作成されることを可能にし、該タンパク質中で、ＶL及びＶH領域は、対合して一価の分子を形成する(一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として公知；例えば、Bird等(1988) Science 242:423-426；及びHuston等 (1988) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；及びOsbourn等、1998, Nature Biotechnology 16:778参照)。かかる一本鎖抗体も又、抗体の「抗原結合性部分」なる用語に包含されるものである。特定のｓｃＦｖの任意のＶH及びＶL配列を、完全なＩｇＧ分子又は他のイソ型をコードする発現ベクターを生成するために、ヒト免疫グロブリン定常領域ｃＤＮＡ又はゲノム配列に結合させることができる。ＶH及びＶLは又、タンパク質化学又は組換えＤＮＡ技術を利用するＦａｂ、Ｆｖ又は他の免疫グロブリン断片の生成においても利用することができる。他の形態の一本鎖抗体例えばディアボディーも又、含まれる。ディアボディーは、二価の、二重特異性抗体であり、そのＶH及びＶLドメインは、一本鎖ポリペプチド上で発現されるが、同鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを利用しており、それにより、これらのドメインは、他方の鎖の相補性ドメインとの対合を強いられて、２つの抗原結合部位が造られる(例えば、Holliger, P.等 (1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak, R.J.等 (1994) Structure 2:1121-1123参照)。
【０１２８】
尚更に、抗体又はその抗原結合部分は、抗体又は抗体の部分の少なくとも一つの他のタンパク質又はペプチドとの共有又は非共有結合により形成される一層大きい免疫接着分子の部分であってよい。かかる免疫接着分子の例には、四量体ｓｃＦｖ分子を作るためのストレプトアビジンコア領域の利用(Kipriyanov, S.M.等 (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)及び二価のビオチン化ｓｃＦｖ分子を作るためのシステイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグの利用(Kipriyanov, S.M.等 (1994) Mol.Immunol.31:1047-1058)が含まれる。抗体部分例えばＦａｂ及びＦ(ａｂ')2断片は、全抗体から、慣用技術例えば、それぞれ、全抗体のパパイン又はペプシン消化を利用して製造することができる。その上、抗体、抗体タンパク質及び免疫接着分子は、標準的組換えＤＮＡ技術を利用して得ることができる。
【０１２９】
抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナル抗体であってもよい。用語「モノクローナル抗体」及び「モノクローナル抗体組成物」は、ここで用いる場合、抗原の特定のエピトープと免疫反応することのできる唯一種の抗原結合部位を含む抗体分子の集団を指し、用語「ポリクローナル抗体」及び「ポリクローナル抗体組成物」は、特定の抗原と相互作用できる多数種の抗原結合部位を含む抗体分子の集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応する特定の抗原に対する単一の結合親和性を示す。
【０１３０】
当分野で認められた任意の方法を利用して、ＰＥＴに向けられた抗体を生成することができる。例えば、ＰＥＴ(単独又はハプテンと結合したもの)を利用して、適当な患者(例えば、ウサギ、ヤギ、マウス又は他の哺乳動物又は脊椎動物)を免疫化することができる。例えば、米国特許第５，４２２，１１０号；５，８３７，２６８号；５，７０８，１５５号；５，７２３，１２９号及び５，８４９，５３１号に記載された方法を利用することができる。免疫原性調製物には、更に、アジュバント例えば完全若しくは不完全フロイントアジュバント又は類似の免疫刺激剤が含まれうる。適当な患者の、ＰＥＴによる免疫化は、ポリクローナル抗ＰＥＴ抗体応答を誘導する。この抗ＰＥＴ抗体の免疫化された患者における力価は、標準的技術例えば固定化ＰＥＴを利用する酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)によって経時的にモニターすることができる。
【０１３１】
ＰＥＴに向けられた抗体分子は、哺乳動物から(例えば、血液から)単離し、更に、周知技術例えばプロテインＡクロマトグラフィーにより精製してＩｇＧ画分を得ることができる。免疫化した後、適当な時点で(例えば、抗ＰＥＴ抗体力価が最高のとき)、抗体産生細胞を患者から得て、例えば、標準的技術例えばKohler及びMilstein (1975) Nature 256:495-497により最初に記載されたハイブリドーマ技術(Brown等 (1981) J.Immunol.127:539-46；Brown等 (1980)J.Biol.Chem.255:4980-83；Yeh等 (1976) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:2927-31；及びYeh等 (1982) Int.J.Cancer 29:269-75も参照されたい)、一層最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor等 (1983) Immunol Today 4:72)又はＥＢＶハイブリドーマ技術(Cole等 (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., p.77-96)によってモノクローナル抗体を製造するために利用することができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを生成するための技術は、周知である(一般的には、R.H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analysis, Plenum Publishing Corp., New York, ニューヨーク(1980)；E.A. Lerner (1981) Yale J.Biol.Med., 54:387-402；M.L. Gefter等 (1977) Somatic Cell Genet.3:231-36を参照されたい)。簡単にいえば、不滅化細胞株(典型的には、ミエローマ)を、上記のように、ＰＥＴ免疫原で免疫化した哺乳動物由来のリンパ球(典型的には、脾臓細胞)と融合させ、その結果生成したハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、ＰＥＴに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
【０１３２】
リンパ球と不滅化細胞株との融合に利用される多くの周知のプロトコールの何れでも、抗ＰＥＴモノクローナル抗体を生成する目的のために適用することができる(例えば、G. Galfre等 (1977) Nature 266:55052；Gefter等、Somatic Cell Genet., 前出；Lerner, Yale J.Biol.Med., 前出；Kenneth, Monoclonal Antibodies, 前出を参照されたい)。その上、当業者は、かかる方法のやはり有用な多くの変法があることを認めよう。典型的には、不滅化細胞株(例えば、ミエローマ細胞株)は、リンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。例えば、マウスハイブリドーマを、本発明の免疫原性調製物で免疫化したマウスに由来するリンパ球を不滅化マウス細胞株と融合させることによって作成することができる。好適な不滅化細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養培地(「ＨＡＴ培地」)に感受性のマウスミエローマ細胞株である。多くのミエローマ細胞株(例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３又はＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４ミエローマ細胞株)の何れでも、標準的技術に従って、融合パートナーとして利用することができる。これらのミエローマ株は、ＡＴＣＣから入手できる。典型的には、ＨＡＴ感受性のマウスミエローマ細胞を、ポリエチレングリコール(「ＰＥＧ」)を利用して、マウス脾臓細胞に融合させる。その融合から生じたハイブリドーマ細胞を、次いで、ＨＡＴ培地を利用して選択する。該培地は、未融合のミエローマ細胞及び非生産性の融合ミエローマ細胞を殺す(未融合脾臓細胞は、トランスフォームされないので数日後に死ぬ)。この発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、ハイブリドーマ培養上清をＰＥＴに結合する抗体について例えば標準的ＥＬＩＳＡアッセイを利用してスクリーニングすることによって検出する。
【０１３３】
加えて、標的タンパク質／ＰＥＴのアレイに対する抗体又は足場ライブラリーの自動化スクリーニングは、タンパク質発現プロファイリングのために利用されうる数千の試薬を開発するための最も迅速な方法であろう。その上、ライブラリーシステムに由来するポリクローナル抗血清、ハイブリドーマ又は選択も又、必要な捕捉剤を迅速に生成するために利用することができる。抗体単離のための高スループットな方法は、Hayhurst及びGeorgiou, Curr Opin Chem Biol 5(6):683-9, 2001年12月に記載されている。
【０１３４】
ＰＥＴ特異的抗体の生成ために用いられるＰＥＴ抗原は、好ましくは、Ｎ又はＣ末端でブロックされ、最も好ましくは、両端がブロックされて、中性原子団を生成しているものである(何故なら、末端が中和されてないペプチドに対して生産された抗体は、この発明の方法に関して機能的でありえないからである)。このＰＥＴ抗原は、標準的分子生物学又は化学的方法を利用して(例えば、ペプチドシンセサイザーを使用して)、最も容易に合成することができる。これらの末端は、適宜ＮＨ2−又はＣＯＯ−基で、又は任意の他のブロッキング剤でブロックして、遊離末端を排除することができる。好適具体例においては、ＰＥＴの一末端(Ｎ又はＣ末端)を、キャリアータンパク質例えばＫＬＨ又はＢＳＡと結合させて、抗体生成を促進する。ＫＬＨは、原始的軟体動物の海産巻貝であるカサガイのヘモシアニン(カサガイ(Megathura crenulata)で見出された酸素を運ぶ銅タンパク質)を表す。ＫＬＨは、複雑な分子配置を有していて、種々の抗原性構造を含み、宿主動物において、強い非特異的免疫応答を誘出する。それ故、小型ペプチド(非常に免疫原性ではありえない)を免疫原として用いる場合に、それらは、好ましくは、宿主動物における増進された免役応答のために、ＫＬＨ又は他のキャリアータンパク質(ＢＳＡ)に結合される。その結果生成した抗体は、関心あるＰＥＴ含有トリプシンペプチドに対応するポリペプチドを用いて、アフィニティー精製することができる。
【０１３５】
抗体生成におけるＰＥＴの末端のブロッキングは、多くの場合(殆どではないにせよ)、選択したＰＥＴが一層大きい(トリプシン)断片中に含まれるので、有利である。これらの場合には、ＰＥＴ特異的な抗体が、ペプチド断片の中間部のＰＥＴに結合するために必要とされる。それ故、ＰＥＴのＣ及びＮ末端の両方をブロックすることは、消化した試料におけるペプチド断片の抗体結合を最もよく刺激する。同様に、選択したＰＥＴ配列が、Ｎ又はＣ末端に生じたならば、免疫原の他端のみを好ましくはＫＬＨ又はＢＳＡなどのキャリアーによってブロックすることが必要なだけである。
【０１３６】
好適具体例において、改良された方法を利用して、標的タンパク質例えば小さいペプチド断片例えば合成ペプチドに対する抗体を生成することができる。特に、試料の消化により生成されたペプチド断片中に如何に存在するかのコンテキストにおいて、ＰＥＴ配列を正確に狙う高度に特異的なポリクローナルプールを生成するために、免疫原をデザインして抗体を精製するために新たなアプローチが用いられる。如何なる特定の理論に拘束されることも望まないが、動物を短いペプチドで免疫化すると、そのペプチドの一端がキャリアータンパク質に共有結合するに違いないと考えられる。しかし、他端は、構造を有しないので、それは、「風の中でバタバタする」ように動く。抗体が、ペプチドの「自由な」末端を標的とする免疫原に対する応答として生成されることは、そのエネルギーがその末端を抗体誘導に必要な結合ポケットに適合させるのを助けるので、普通のことである。出願人は、こうして生成された抗体が、末端が自由でない場合には、正確に同じペプチド配列に結合できないことを見出した。これは、ＰＥＴは、ペプチドの小さい断片によって形成されるので、一層長いペプチド断片(トリプシン断片など)の中にあるペプチド配列を標的とする場合には、重要な問題である。更に、ポリクローナル抗体を作る場合には、たとえそれらの「クローン」の幾つかが一層長いペプチド断片に対する望ましい結合を有していても、「クローン」の大部分が自由末端を標的とするならば、その抗体プールの効用は限られたものとなろう。
【０１３７】
この問題を解決するためには、免疫原を、標的ＰＥＴが、物理的構造が両端を拘束する構築物中に位置されるように調製する(出願人は、ＧＳＧリンカーを利用したが、多くの他のものも利用可能である)。そのようにして、完全なＰＥＴ配列を標的とする抗体は、その配列を、消化した試料中で遭遇する自由末端の物理的硬さのコンテキストにおいて、「見る」。ポリクローナル抗体を採取するために、次の工程は、抗体を、ＰＥＴ配列自体を利用して精製することであるが、免疫原において用いたリンカーは異なるリンカーで置き換える(免疫原において用いたリンカーに対する抗体を精製しないように)。推奨されるアプローチは、リンカーとして選択したＰＥＴを囲むネイティブなタンパク質配列を利用することである。精製に異なるリンカーを利用する理由の部分は、リンカー領域に結合する抗体が選択されることでありうる。モノクローナル抗体の生成のためには、そのストラテジーは、同様の理由により、上記の精製ペプチドに対するクローンをスクリーニングすることである。
【０１３８】
ＰＥＴ特異的抗体好ましくはモノクローナル抗体を生成する場合、本質的に標的のＰＥＴ配列よりなるペプチド免疫原を、短いペプチド抗原についての標準的な抗体生成プロトコールに従って、動物に投与することができる。一具体例において、この短いペプチド抗原は、キャリアー例えばＫＬＨと結合させることができる。しかしながら、このＰＥＴ配列に特異的な抗体をスクリーニングする場合、そのＰＥＴ配列を含む親ペプチド断片(例えば、トリプシン消化から生成する断片)を用いるのが好ましい。これは、同定された抗体が元のＰＥＴ配列に特異的であるだけでなく、抗体をデザインしたＰＥＴペプチド断片をも認識することを確実にする。適宜、この同定された抗体の特異性は、更に、元の免疫原例えば末端ブロックしたＰＥＴ配列自体との反応によって確認することができる。
【０１３９】
ある具体例において、異なるＰＥＴ配列に対する幾つかの異なる免疫原を、同じ動物に同時に投与し、それで、異なる抗体を一の動物において生成するようにできる。明らかに、免疫原に特異的な抗体を同定するためには、各免疫原について別々のスクリーニングが必要とされる。
【０１４０】
別の具体例においては、異なるＰＥＴを、動物に投与するための単一の一層長い免疫原に結合することができる。そのリンカー配列は、柔軟なリンカー例えばＧＳ、ＧＳＳＳＳ又はこれらの繰り返し(例えば、３反復)であってよい。
【０１４１】
上記の両具体例において、異なる免疫原は、同じ又は異なる生物体又はプロテオームに由来するものであってよい。これらの方法は、すべて、抗体生成におけるコストを減じる潜在的手段である。結合したＰＥＴ配列を免疫原として利用することの予想外の利点は、一層長い免疫原は、ある状況で、短いＰＥＴ配列を用いて生成したものより一層高い親和性の抗体を生成することである。
【０１４２】
Ｂ．タンパク質及びペプチド
本発明の捕捉剤を生成する他の方法には、例えばDower等、ＷＯ９１／１７２７１、McCafferty等、ＷＯ９２／０１０４７、Herzig等、米国特許第５，８７７，２１８号、Winter等、米国特許第５，８７１，９０７号、Winter等、米国特許第５，８５８，６５７号、Holliger等、米国特許第５，８３７，２４２号、Johnson等、米国特許第５，７３３，７４３号及びHoogenboom等、米国特許第５，５６５，３３２号に記載されたファージディスプレー技術が含まれる。これらの方法においては、メンバーが、それらの外表面に、異なる抗体、抗体結合部位又はペプチドを提示しているファージのライブラリーを生成する。抗体は、通常、Ｆｖ又はＦａｂ断片として提示される。所望の特異性を有するファージディスプレー配列を、特異的ＰＥＴに対するアフィニティー富化によって選択する。
【０１４３】
酵母ディスプレー及びイン・ビトロリボソームディスプレーなどの方法も又、本発明の捕捉剤を生成するために利用することができる。前述の方法は、例えば、Methods in Enzymology 328巻 - Ｃ部：Protein-protein interactions & Genomics and Bradbury A. (2001) Nature Biotechnology 19:528-529に記載されている。
【０１４４】
関連する具体例において、タンパク質又はポリペプチドも又、本発明の捕捉剤として作用しうる。これらのペプチド捕捉剤も又、所定のＰＥＴに特異的に結合し、例えば、固定化ＰＥＴに対するファージディスプレースクリーニングを利用して、又は任意の他の当分野で認められた方法を利用して同定することができる。一度同定されたならば、それらのペプチド捕捉剤は、ペプチド配列を製造するための周知の方法の何れかを利用することにより製造することができる。例えば、これらのペプチド捕捉剤は、原核又は真核宿主細胞中で、特定のペプチド配列をコードするポリヌクレオチドの発現により生成することができる。或は、かかるペプチド捕捉剤は、化学的方法によって合成することができる。組換え体宿主における異種ペプチドの発現、ペプチドの化学合成、及びイン・ビトロ翻訳のための方法は、当分野で周知であり、Maniatis等、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 第二版、Cold Spring Harbor, N.Y.；Berger及びKimmel, Methods in Enzymology, 152巻、Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.；Merrifield, J. (1969) J.Am.Chem.Soc.91:501；Chaiken, I.M. (1981) CRC Crit.Rev.Biochem.11:255；Kaiser等 (1989) Science 243:187；Merrifield, B. (1986) Science 232:342；Kent, S.B.H. (1988) Ann.Rev.Biochem.57:957；及びOfford,R.E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing に更に記載されている。
【０１４５】
これらのペプチド捕捉剤は又、溶液相及び固相化学合成を含む化学的なペプチド合成のための適当な方法によっても製造することができる。好ましくは、これらのペプチドは、固体支持体上で合成する。ペプチドを化学合成する方法は、当分野で周知である(例えば、Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) 及びGrant, G.A.(編). Synthetic Peptides: A User's Guide, W.H. Freeman and Company, New York (1992)を参照されたい)。これらのペプチド捕捉剤を作成するのに有用な自動化ペプチド合成機は、市販されている。
【０１４６】
Ｃ．足場ペプチド
本発明で使用するための捕捉剤の生成への別のアプローチは、抗体を利用し、それらは、足場付きペプチド例えばタンパク質の表面に提示されたペプチドである。この考えは、ペプチドの自由度を、それを表面に露出されたタンパク質のループに組み込むにより制限することが、標的タンパク質への結合のエントロピーコストを低下させることができて、一層高い親和性を生じるというものである。例えば、チオレドキシン、フィブロネクチン、トリ膵臓ポリペプチド(ａＰＰ)及びアルブミンは、多くの配列変化を許容するであろう表面ループを有する小さい、安定なタンパク質である。標的ＰＥＴに選択的に結合する足場付きペプチドを同定するために、ランダムペプチドがネイティブなループ配列を置換するのに利用されていて、親和性突然変異の過程により、関心あるＰＥＴに選択的に結合するものが同定されるキメラタンパク質のライブラリーを生成させることができる。
【０１４７】
Ｄ．単純ペプチド及びペプチド模倣化合物
ペプチドは又、小型分子とタンパク質の利点を併せ持つので、捕捉剤の魅力的な候補でもある。大きい、多様なライブラリーを生物学的に又は合成によって作ることができ、ＰＥＴ部分に対する結合スクリーニングにおいて得られる「ヒット」を大量に合成することができる。
【０１４８】
ペプチド様オリゴマー(Soth等 (1997) Curr.Opin.Chem.Biol. 1:120-129)例えばペプトイド(Figliozzi等 (1996) Methods Enzymol. 267:437-447)も又、捕捉剤として利用することができ、ペプチドを超えるある利点を有しうる。それらは、プロテアーゼを受け付けず、それらの合成は、特に、２０種類の一般的アミノ酸において見出されない官能基の利用を考えるならば、ペプチドの合成よりも簡単で且つ安価でありうる。
【０１４９】
Ｅ．核酸
他の具体例において、ＰＥＴに特異的に結合するアプタマーも又、捕捉剤として利用することができる。ここで用いる場合、用語「アプタマー」、例えばＲＮＡアプタマー又はＤＮＡアプタマーには、標的分子に特異的に結合する一本鎖オリゴヌクレオチドが含まれる。アプタマーは、例えば、指数関数的富化によるリガンドの系統的進化と称するイン・ビトロ進化プロトコールを利用することにより選択される。アプタマーは、標的分子に固く且つ特異的に結合し；タンパク質に対する殆どのアプタマーは、１ｐＭ〜１ｎＭの範囲内のＫd(解離平衡定数)で結合する。アプタマー及びそれらの製造方法は、例えば、E.N.Brody等(1999) Mol.Diagn.4:381-388に記載されている。
【０１５０】
一具体例において、主題のアプタマーは、タンパク質の代りに核酸よりなる非常に高親和性のレセプターを生成する方法であるＳＥＬＥＸを利用して生成することができる。例えば、Brody等 (1999) Mol.Diagn.4:381-388を参照されたい。ＳＥＬＥＸは、伝統的なタンパク質ベースの抗体技術に代わる完全にイン・ビトロのコンビナトリアルケミストリーを提供する。ファージディスプレーと同様に、ＳＥＬＥＸは、特定の標的ＰＥＴに対する特異的結合剤の生成に関与する動物宿主が不要であり、時間と労力が低減され、そして精製が簡単になるという点で有利である。
【０１５１】
更に説明するために、ＳＥＬＥＸは、例えば、公知のプライマー配列と隣接した２０塩基長より大きいランダムオリゴヌクレオチドライブラリーを合成することにより実行することができる。ランダム領域の合成は、配列中の各位置において４種類の全ヌクレオチドを混合することにより達成することができる。従って、このランダム配列の多様性は、最大で、４n(ここに、ｎは、配列の長さである)から、パリンドローム及び対称性配列の頻度を引いたものである。ＳＥＬＥＸにより与えられる一層大きい多様性は、３次元の結合部位を形成するオリゴヌクレオチドを選択する一層大きい機会を与える。高親和性オリゴヌクレオチドの選択は、ランダムＳＥＬＥＸライブラリーを固定化した標的ＰＥＴにさらすことにより達成される。容易に結合して洗い去られない配列は、保持されて、その後の数ラウンドのＳＥＬＥＸのために、ＰＣＲにより増幅される(該ＳＥＬＥＸは、別のアフィニティー選択と結合核酸配列のＰＣＲ増幅よりなる)。典型的には、４〜５ラウンドのＳＥＬＥＸは、アプタマーの高親和性セットを生成するのに十分である。
【０１５２】
それ故、数百〜数千のアプタマーを、経済的に可能な仕方で、作ることができる。血液と尿を、タンパク質を捕捉して定量するアプタマーチップ上で分析することができる。ＳＥＬＥＸは又、５−ブロモ(５−Ｂｒ)及び５−ヨード(５−Ｉ)デオキシウリジン残基の利用にも適合された。これらのハロゲン化塩基は、タンパク質と特異的に架橋することができる。イン・ビトロ進化中の選択圧を、結合特異性と特異的光架橋性の両方について加えることができる。これらは、典型的なサンドイッチアッセイにおいて、一つの試薬、光架橋性アプタマーを２つの試薬、捕捉剤抗体及び検出用抗体の代用とするのに十分に独立のパラメーターである。結合、洗浄、架橋及び洗剤洗浄のサイクルの後に、タンパク質は、特異的に且つ共有結合によりそれらの同起源のアプタマーを結合する。他のタンパク質はこれらのチップ上に存在しないので、タンパク質特異的な汚れは、今や、チップ上のピクセルの意味のあるアレイを示す。アルゴリズムの学習及び後向き研究との結合により、この技術は、丈夫でしかもシンプルな診断用チップへと導くはずである。
【０１５３】
更に別の関連する具体例において、捕捉剤は、アロステリックリボザイムであってよい。用語「アロステリックリボザイム」は、ここで用いる場合、様々なエフェクター例えばヌクレオチド、二次メッセンジャー、酵素補因子、医薬、タンパク質、及びオリゴヌクレオチドにより引き金を引かれたときに触媒作用を遂行する一本鎖オリゴヌクレオチドを包含する。アロステリックリボザイム及びそれらの製造方法は、例えば、S. Seetharaman等(2001) Nature Biotechnol.19:336-341に記載されている。Seetharaman等によれば、試作品のバイオセンサーは、特異的エフェクターにより引き金を引かれたときにリボザイム媒介の自己開裂を受ける処理されたＲＮＡ分子スイッチから組み立てられた。各々の型のスイッチは、金への固定化を与えて、個々にアドレス指定可能なピクセルを形成する５’−チオトリホスフェート部分を利用して製造される。各ピクセルを含むリボザイムは、それらの対応するエフェクターと共に存在する場合にのみ活性となり、それで、各型のスイッチは、特異的な分析物用センサーとして役立つ。７つの異なるＲＮＡスイッチにより造られたアドレス指定されたアレイは、金属イオン、酵素補因子、代謝産物、及び薬物分析物を含む複雑な混合物中の標的の状態を報告するために利用された。ＲＮＡスイッチのアレイは又、自然に生成された３’，５’−環状アデノシン一リン酸(ｃＡＭＰ)を細菌培養培地において検出することによって、アデニレートシクラーゼ機能について大腸菌株の表現型を測定するためにも利用された。
【０１５４】
Ｆ．プラスティボディー
ある具体例において、主題の捕捉剤は、プラスティボディーである。用語「プラスティボディー」は、選択したテンプレート分子を刻印されたポリマーを指す。例えば、Bruggemann (2002) Adv Biochem Eng Biotechnol 76:127-63；及びHaupt等 (1998) Trends Biotech. 16:468-475を参照されたい。このプラスティボディーの原理は、分子刻印即ち、ポリマー鎖の側鎖にグラフトされ、それにより例えば抗体の結合部位を模倣するペンダント官能基の立体規則性ディスプレーにより生成されうる認識部位に基づいている。
【０１５５】
Ｇ．２つの低親和性リガンドに由来するキメラ結合剤
適当な捕捉剤を生成するための更に別のストラテジーは、２つ以上の控えめの親和性のリガンドを結合させて、高い親和性の捕捉剤を生成することである。適当なリンカーがあれば、かかるキメラ化合物は、ＰＥＴに対する２つの個々のリガンドの親和性の積に近い親和性を示すことができる。説明のために、化合物の集合を、標的ＰＥＴの弱い相互作用相手について高濃度でスクリーニングする。次いで、互いに競争しない化合物を同定し、キメラ化合物のライブラリーを、異なる長さのリンカーにより作成する。次いで、このライブラリーを、ＰＥＴに対する結合について、ずっと低濃度でスクリーニングして、高い親和性のバインダーを同定する。かかる技術は又、ペプチド又は任意の他の型の控えめの親和性のＰＥＴ結合性化合物にも適用することができる。
【０１５６】
Ｈ．捕捉剤の標識
本発明の捕捉剤は、当業者に公知の技術例えば蛍光標識、放射性標識、色標識、光学標識、及び他の物理的又は化学的標識を利用して、後記のように、検出を可能にするように改変することができる。
【０１５７】
Ｉ．その他
加えて、任意所定のＰＥＴについて、上記の捕捉剤の範疇の各々に属する多数の捕捉剤を利用することができる。これらの多数の捕捉剤は、ＰＥＴに対する種々の特性例えば親和性／アビディティー／特異性を有しうる。異なる親和性は、幾つかのタンパク質が示しうる発現の動的範囲をカバーするのに有用である。特定の利用に応じて、捕捉剤の任意所定のアレイにおいて、異なる種類／量の捕捉剤が、最適の全体的性能を達成するように、単一のチップ／アレイ上に存在することができる。
【０１５８】
好適具体例において、捕捉剤を、関心あるタンパク質の表面例えば親水性領域に位置するＰＥＴに対して生産することができる。関心あるタンパク質の表面に位置するＰＥＴは、当分野で利用できる周知のソフトウェアの何れかを利用して同定することができる。例えば、Ｎａｃｃｅｓｓプログラムを利用することができる。
【０１５９】
Ｎａｃｃｅｓｓは、ＰＤＢ(Protein Data Bank)フォーマットのファイルからの分子の接近可能な領域を計算するプログラムである。それは、タンパク質及び核酸の両方について、原子及び残基の接近可能性を計算することができる。Ｎａｃｃｅｓｓは、プローブが巨大分子のファンデルワールス面の周りを回る場合の原子の接近可能な領域を計算する。かかる三次元座標のセットは、Brookhaven国立研究所のＰＤＢから入手できる。このプログラムは、Lee及びRichards (1971) J.Mol.Biol.,55,379-400の方法を利用しており、それにより、所定半径のプローブは、分子表面の周囲を回り、その中心により追跡された道筋が接近可能な面である。
【０１６０】
Boger, J., Emini, E.A. & Schmidt, A., Surface probability profile-An heuristic approach to the selection of synthetic peptide antigens, Reports on the Sixth International Congress in Immunology (Toronto) 1986 250頁に記載された溶媒接近可能性方法も又、関心あるタンパク質の表面に位置するＰＥＴを同定するために利用することができる。パッケージＭＯＬＭＯＬ(Koradi, R.等 (1996) J.Mol.Graph.14:51-55)及びEisenhaberのＡＳＣ法(Eisenhaber及びArgos (1993) J.Comput.Chem.14:1272-1280；Eisenhaber等 (1995) J.Comput.Chem.16:273-284)も又、利用することができる。
【０１６１】
他の具体例においては、タンパク質の接近可能なペプチド表面よりも、無傷のタンパク質の消化により生成されたペプチドと結合するようにデザインされた捕捉剤を生産することができる。この具体例においては、研究中の試料内のすべてのＰＥＴを再現可能に生成する断片化プロトコールを利用することが好ましい。
【０１６２】
７．アレイ
ある具体例において、これらの捕捉剤は、複雑な化学的もしくは生物学的試料又は多数の化合物のスクリーニングに十分な捕捉剤のアレイ例えば高密度アレイを構築するために、固体支持体(例えば、平面的支持体又はビーズ)上に固定化することが必要である。様々な方法が、生物学的分子を固体支持体上に結合させるための技術分野で公知である。一般的には、Affinity Techniques, Enzyme Purification: Part B, Meth. Enz. 34 (W.B. Jakoby及びM. Wilchek編、Acad. Press, N.Y. 1974)及び Immobilized Biochemicals and Affinity Chromatography, Adv. Exp. Med. Biol. 42 (R. Dunlap, Plenum Press, N.Y. 1974)を参照されたい。下記は、アレイの構築の際の、幾つかの問題点である。
【０１６３】
Ａ．形式及び表面の考慮すべき問題
タンパク質のアレイは、ありふれた免疫アッセイ例えばＥＬＩＳＡ及びドットブロッティングの小型化としてデザインされ(しばしば、蛍光読出しを利用)、多数のアッセイを同時に実行することを可能にするロボット工学及び高スループット検出システムによって促進された。一般的な物理的支持体には、スライドガラス、シリコン、ミクロウェル、ニトロセルロース若しくはＰＶＤＦ膜、及び磁気その他のミクロビーズが含まれる。平面上に送達されたタンパク質の微小液滴が広く利用されているが、関連する別の構成には、ミクロな液体中での発展に基づくＣＤ遠心分離装置[Gyros]及び特殊化チップデザイン例えばプレート中の処理されたミクロチャンネル[The Living Chip(商標)、Biotrove]及びシリコン表面上の小さい３Ｄポスト[Zyomyx]が含まれる。懸濁液中の粒子も又、それらが同定のためにコード化され；システムが、ミクロビーズ[Luminex, Bio-Rad]及び半導体ナノクリスタル[QDots(商標)、Quantum Dots]のためのカラーコーディング、並びにビーズ[UltraPlex(商標)、Smartbeads]及びマルチメタルミクロロッド[Nanobarcodes(商標)粒子、Surromed]のためのバーコーディングを含む場合には、アレイの基礎として利用することができる。ビーズは又、半導体チップ上に二次元アレイに組み立てることもできる[LEAPS 技術、BioArray Solutions]。
【０１６４】
Ｂ．固定化で考慮すべきことがら
タンパク質例えば抗体の固定化における変数には、カップリング試薬及び結合される表面の性質の両方が含まれる。理想的には、利用する固定化方法は、再現可能であり、種々の特性(大きさ、親水性、疎水性)のタンパク質に適用可能であり、高スループット及び自動化に従順であり、そして完全に機能的なタンパク質活性の保持と両立すべきである。表面結合されたタンパク質の向きは、そのリガンド又は基質(活性状態)への提示における重要な因子として認められており；捕捉剤アレイに関して、最も効率的な結合結果は、方向付けられた試薬を用いて得られ、これは、一般に、タンパク質の部位特異的な標識を必要とする。
【０１６５】
良好なタンパク質アレイ支持体表面の特性は、カップリング手順の前後で化学的に安定であり、良好なスポット形態を与え、最小の非特異的結合を提示し、検出システムにおいてバックグラウンドに寄与せず、そして種々の検出系と両立すべきであることである。
【０１６６】
タンパク質固定化の共有結合法及び非共有結合法の両方が利用され、様々な賛否両論がある。表面への受動的吸着は、方法論的に単純であるが、定量的又は方向付けた制御が殆どできず；タンパク質の機能的特性を変えるかもしれず、そして再現性及び効率が、変化しやすい。共有結合法は、安定な結合を与え、ある範囲のタンパク質に適用できて且つ良好な再現性を有するが；方向付けが変わりやすく、化学的誘導体化が、タンパク質の機能を変えるかもしれず、安定な相互作用性の表面を必要とする。タンパク質上のタグを利用する生物学的捕捉方法は、安定な結合を提供し且つ該タンパク質と特異的に、再現可能な向きで結合するが、生物学的試薬は、先ず適当に固定化されなければならず、そのアレイは、特殊な取扱いを必要とし変わり易い安定性を有しうる。
【０１６７】
タンパク質アレイの作成のために、幾つかの固定化用化学及びタグが、記載されている。共有結合のための基材には、アミノ又はアルデヒド含有シラン試薬で被覆されたスライドガラス[Telechem]が含まれる。Versalinx(商標)システム[Prolinx]においては、可逆的共有結合が、フェニルジボロン酸で誘導体化されたタンパク質と、支持体表面に固定化されたサリチルヒドロキサム酸との間の相互作用により達成される。これは又、低いバックグラウンド結合及び低い固有の蛍光をも有して、固定化されたタンパク質が機能を保持することを可能にする。未修飾タンパク質の非共有結合は、HydroGel(商標)[PerkinElmer]などの多孔性構造中に、３次元ポリアクリルアミドゲルベースで生じ；この基材は、ガラスマイクロアレイに特に低いバックグラウンドを与え、高いタンパク質機能の容量及び保持を有することが報告されている。広く用いられている生物学的捕捉方法は、ビオチン／ストレプトアビジン又はヘキサヒスチジン／Ｎｉ相互作用(適宜改変されたタンパク質を有する)によるものである。ビオチンは、二酸化チタン[Zyomyx]又は五酸化タンタル[Zeptosens]などの表面に固定化されたポリリジン主鎖に結合させることができる。
【０１６８】
Arenkov等は、例えば、微細加工されたポリアクリルアミドゲルを利用してタンパク質を捕捉し、次いで、微細電気泳動によりマトリクスを通過する拡散を加速することによって、タンパク質を、それらの機能を保持しながら固定化する方法を記載している(Arenkov等(2000), Anal Biochem 278(2):123-31)。特許文献も又、生物学的分子を固体支持体に結合するための多くの異なる方法を記載している。例えば、米国特許第４，２８２，２８７号は、多層のビオチン、アビジン及び増量剤の連続適用によってポリマー表面を改変する方法を記載している。米国特許第４，５６２，１５７号は、生化学的リガンドを、光化学的に反応性のアリールアジドに結合することにより表面に結合する技術を記載している。米国特許第４，６８１，８７０号は、遊離のアミノ基又はカルボキシル基をシリカマトリクスに導入するための方法であって、該基が、次いで、カルボジイミドの存在下でタンパク質と共有結合する当該方法を記載している。加えて、米国特許第４，７６２，８８１号は、ポリペプチド鎖を固体基材に結合する方法であって、光感受性の不自然アミノ酸基を該ポリペプチド鎖に組み込み、その生成物を低エネルギー紫外線に曝すによって結合する当該方法を記載している。
【０１６９】
支持体の表面は、更なる結合化学に利用できる少なくとも一つの反応性の化学基を有するように、又は該基を有するように化学的に誘導体化されるものを選択する。支持体と捕捉剤との間に挿入された随意の可撓性のアダプター分子があってよい。一具体例において、捕捉剤は、物理的に、支持体上に吸着される。
【０１７０】
この発明のある具体例においては、捕捉剤を、捕捉剤のＰＥＴ結合領域とそれが支持体と結合される領域とを離す仕方で、支持体上に固定化される。好適具体例において、この捕捉剤は、その一端と支持体上のアダプター分子との共有結合を形成するように巧みに処理される。かかる共有結合は、シッフ塩基結合、マイケル付加により生成される結合又はチオエーテル結合によって形成されうる。
【０１７１】
アダプターによる結合又は直接捕捉剤による結合を可能にするために、基材の表面は、適当な反応性の基を造るための準備を必要としうる。かかる反応性の基は、単純な化学的部分例えばアミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、カルボキシレート、アルデヒド、エステル、アミド、アミン、ニトリル、スルホニル、ホスホリル、又は同様に化学的に反応性の基を包含することができよう。或は、反応性の基は、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ニトリロトリ酢酸、活性化ヒドロキシル、ハロアセチル(例えば、ブロモアセチル、ヨードアセチル)、活性化カルボキシル、ヒドラジド、エポキシ、アジリジン、スルホニルクロリド、トリフルオロメチルジアジリジン、ピリジルジスルフィド、Ｎ−アシル−イミダゾール、イミダゾールカーバメート、アリールアジド、アンヒドリド、ジアゾアセテート、ベンゾフェノン、イソチオシアネート、イソシアネート、イミドエステル、フルオロベンゼン、ビオチン及びアビジンを含む(但し、これらに限られない)一層複雑な部分を含むことができる。かかる反応性の基を、機械的、物理的、電気的又は化学的手段によって基材上に配置する技術は、当分野で周知であり、例えば、米国特許第４，６８１，８７０号(参考として本明細書中に援用する)に記載されている。
【０１７２】
一度反応性の基の基材上の初期の準備が完了したならば(必要ならば)、アダプター分子を、適宜、該基材の表面に加えて、該表面を更なる結合化学に適したものにすることができる。かかるアダプターは、基材上の反応性の基と捕捉剤との連続的結合を形成する化学結合の主鎖及び該主鎖に沿った自由に回転する複数の結合を有して、既に基材上にある反応性の基と固定化すべき捕捉剤とを共有結合により結させる。基材アダプターは、化合物の任意の適当なクラスから選択することができ、有機酸、アルデヒド、アルコール、チオール、アミンなどのポリマー又はコポリマーを含むことができる。例えば、ヒドロキシル−、アミノ−又はジ−カルボン酸例えばグリコール酸、乳酸、セバシン酸又はサルコシンのポリマー又はコポリマーを用いることができる。或は、飽和又は不飽和の炭化水素例えばエチレングリコール、プロピレングリコール、糖類などのポリマー又はコポリマーを利用することができる。好ましくは、この基材アダプターは、結合すべき捕捉剤が、試料溶液中の分子と自由に相互作用して有効な結合を形成することを可能にするのに適当な長さであるべきである。これらの基材アダプターは、分枝していてもいなくてもよいが、この及び他のアダプターの構造的属性は、立体化学的に捕捉剤の関連機能例えば、ＰＥＴ相互作用に干渉すべきでない。当業者に公知の保護基を利用して、アダプターの最後の基の望ましくない反応又は時期尚早の反応を防止することができる。例えば、米国特許第５，４１２，０８７号は、アダプターのチオール基における光除去可能な保護基の利用を記載している。
【０１７３】
捕捉剤の結合親和性を保存するために、捕捉剤を、それが支持体基材に、そのリガンド即ちＰＥＴとの相互作用の原因である領域から離れた領域で結合するように改変することは好ましい。
【０１７４】
捕捉剤を、基材表面の又はアダプター上の反応性の末端基に結合する方法には、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、アミド結合、カーバメート結合、尿素結合、エステル結合、カーボネート結合、エーテル結合、ヒドラゾン結合、シッフ塩基結合、及び例えばイオン性又は疎水性相互作用により媒介される非共有結合性結合などの結合を形成する反応が含まれる。反応の種類は、勿論、基材／アダプター及び捕捉剤の両者の利用可能な反応性の基に依存する。
【０１７５】
Ｃ．アレイ作成において考慮すべきことがら
好ましくは、固定化捕捉剤は、固体支持体上例えばシリコンベースのチップ又はスライドガラス上でアレイに配列させる。所定の公知のタンパク質(前に存在が認識されたもの)の存在(及び、適宜、濃度)を検出するようにデザインされた少なくとも一つの捕捉剤は、アレイ中の複数のセル／領域の各々に固定化される。従って、特定のセル／領域でのシグナルは、試料中の公知のタンパク質の存在を示し、そのタンパク質の正体は、そのセルの位置によって示される。或は、一つ又は複数のＰＥＴの捕捉剤を、ビーズ上に固定化する(適宜、それらを、意図する標的分析物を同定するために標識する)か又はミクロウェルプレートなどのアレイに分配する。
【０１７６】
一具体例において、マイクロアレイは、高密度であり、１ｃｍ2当たり、約１００スポットより大きい、好ましくは、約１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００スポットより大きい、更に好ましくは、約９０００、１００００、１１０００、１２０００又は１３０００スポットより大きい密度を有し、捕捉剤を、高密度の反応性の基を造るように官能化され又は反応性の基を有する高密度のアダプターの付加により官能化された支持体表面に結合させることにより形成される。他の具体例において、このマイクロアレイは、試料中で、病気の診断、細胞型の決定、病原体の同定などの証拠を提供するパターンを生成する特異的タンパク質の様々な組合せを検出するために選択された比較的少数(例えば、１０〜５０)の捕捉剤を含む。
【０１７７】
基材又は支持体の特徴は、意図する用途によって変わりうるが、それらの基材の形状、材料及び表面改変は、考慮しなければならない。基材が実質的に二次元の又は平らな少なくとも一つの面を有することは好適なことであるが、それは、へこみ、突起、段、隆起、段丘などを含んでもよく、如何なる幾何学的形態(例えば、円筒形、円錐形、球形、凹面、凸面、ひも状、又はこれらの任意のものの組合せ)を有してもよい。適当な基材材料には、ガラス、セラミック、プラスチック、金属、合金、炭素、紙、アガロース、シリカ、石英、セルロース、ポリアクリルアミド、ポリアミド、及びゼラチン並びに他のポリマー支持体、他の固体材料支持体又は可撓性膜支持体が含まれるが、これらに限られない。基材として利用しうるポリマーには、ポリスチレン；ポリ(テトラ)フルオロエチレン(ＰＴＦＥ)；ポリビニリデンジフルオリド；ポリカーボネート；ポリメチルメタクリレート；ポリビニルエチレン；ポリエチレンイミン；ポリオキシメチレン(ＰＯＭ)；ポリビニルフェノール；ポリラクチド；ポリメタクリルイミド(ＰＭＩ)；ポリアルケンスルホン(ＰＡＳ)；ポリプロピレン；ポリエチレン；ポリヒドロキシエチルメタクリレート(ＨＥＭＡ)；ポリジメチルシロキサン；ポリアクリルアミド；ポリイミド；及び様々なブロックコポリマーが含まれるが、これらに限られない。この基材は又、多層構造中に材料(水透過性又は非透過性)の組合せを含むこともできる。この基材の好適具体例は、表面にＳｉ−ＯＨ官能基を有する単純な２．５ｃｍ×７．５ｃｍのスライドガラスである。
【０１７８】
アレイの作成方法は、ロボットによる密着プリンティング、インクジェット、圧電スポッティング及びフォトリソグラフィーを包含する。多くの市販のアレイ[例えば、Perkin Elmer]並びに手動装置[V & P Scientific]が利用可能である。細菌コロニーを、イン・シトゥーでタンパク質発現を誘導するために、ＰＶＤＦ膜上に、ロボットによってグリッドに据えることができる。
【０１７９】
ナノアレイは、スポットの大きさ及び密度の限界にあり、ナノメートルの空間的スケールのスポットは、数千の反応を１平方ｍｍ未満の単一チップ上で行なうことを可能にする。BioForce Laboratoriesは、８５平方ミクロン中に１５２１のタンパク質のスポットを有する(２５００万スポット／平方ｃｍに匹敵する)光学検出の限界にあるナノアレイを開発したが；それらの読出し方法は、蛍光及び原子間力顕微鏡(ＡＦＭ)である。
【０１８０】
スライドガラス上のアレイを有する自動化試料インキュベーション及び洗浄のためのミクロな液体のシステムが、NextGen及びPerkinElmerによって同時に開発された。
【０１８１】
例えば、捕捉剤マイクロアレイは、少量の反応物質を基材表面の特定の位置に分配する「スポッティング」を含む多くの方法によって生成することができる。スポッティングのための方法には、ミクロな液体のプリンティング、マイクロスタンピング(例えば、米国特許第５，５１５，１３１号、米国特許第５，７３１，１５２号、Martin, B.D.等(1998), Langmuir 14:3971-3975及びHaab, BB等(2001) Genome Biol 2 及びMacBeath, G.等(2000) Science 289:1760-1763参照)、マイクロコンタクトプリンティング(例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２９６２９参照)、インクジェットヘッドプリンティング(例えば、Roda, A.等(2000) BioTechniques 28:492-496,及びSilzel, J.W.等(1998) Clin Chem 44:2036-2043参照)、ミクロな液体の直接的塗布(Rowe, C.A.等(1999) Anal Chem 71:433-439及びBernard, A.等(2001), Anal Chem 73:8-12)及びエレクトロスプレー付着(Morozov, V.N.等(1999) Anal Chem 71:1415-1420及びMoerman R.等(2001) Anal Chem 73:2183-2189)が含まれるが、これらに限られない。一般に、分配装置には、試料分配量を制御するための較正手段が含まれており、試料を支持体表面に対して動かして位置決めするための構造も含まれうる。アレイにおける捕捉剤ごとに分配すべき液体の容積は、そのアレイの意図する用途及び利用可能な装備によって変化する。好ましくは、一度の分配により形成される容積は、１００ｎＬ未満であり、一層好ましくは、１０ｎＬ未満であり、最も好ましくは、約１ｎＬである。その結果生成されたスポットのサイズは、そのように変化し、好適具体例において、これらのスポットは、２０，０００μｍ未満の直径であり、一層好ましくは、２，０００μｍ未満の直径であり、最も好ましくは、約１５０〜２００μｍの直径である(約１６００スポット／平方センチメートルが得られる)。ブロッキング剤の溶液をこのマイクロアレイに加えて、捕捉剤に結合しなかった反応性の基による非特異的結合を防止することができる。例えば、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、カゼイン、又は無脂肪乳の溶液をブロッキング剤として用いて、後続のアッセイにおけるバックグラウンド結合を減少させることができる。
【０１８２】
好適具体例において、高い精度の、密着プリンティングロボットを利用して、小さい容積の溶解した捕捉剤をミクロ滴定プレートのウェルからピックアップして、約１ｎＬの溶液を基材例えば化学的に誘導体化された顕微鏡用のスライドガラスの表面上の規定された位置に繰り返し送達する。かかるロボットの例には、Affymetrix(カリフォルニア、Santa Clara在)から市販されているＧＭＳ４１７Ａｒｒａｙｅｒ、及びBrown研のウェブサイト(http://cmgm.stanford.edu/pbrown)からダウンロードできる指示に従って構築されるスプリットピンアレイヤーが含まれる。これは、スライドガラス上の化合物の顕微鏡的スポットの形成を生じる。しかしながら、当業者は、本発明が、１ｎＬの容積の溶液の送達に限定されず、特定のロボット装置の利用に限定されず、又は化学的に誘導体化されたスライドガラスの利用に限定されないこと、及びピコリットル以下の容積を送達することのできる別の送達手段を利用することができることを認めよう。それ故、高精度のアレイロボットに加えて、インクジェットプリンター、圧電プリンター及び小容積ピペッティングロボットを含む(これらに限られない)これらの化合物を送達するための他の手段を利用することができる。
【０１８３】
一具体例において、本発明の捕捉剤を含む組成物(例えば、マイクロアレイ又はビーズ)は、他の成分例えば特定のペプチド、代謝産物、薬物又は薬物候補、ＲＮＡ、ＤＮＡ、脂質などを認識して結合する分子をも含むことができる。従って、ＰＥＴに幾らかしか結合しない捕捉剤のアレイは、この発明の具体例を構成することができる。
【０１８４】
二次元マイクロアレイに代わるものとして、蛍光活性化セルソーティング(ＦＡＣＳ)と組み合せたビーズベースのアッセイが、複合免疫アッセイを実施するために開発されている。蛍光活性化セルソーティングは、２０年より長く、診断において日常的に用いられてきた。ｍＡｂを利用して、細胞表面マーカーが、正常及び新生物細胞の集団において同定され、これらは、様々な形態の白血病の分類を可能にし、又は病気のモニターを可能にする(最近、Herzenberg等 Immunol Today 21(2000), p.383-390により総説された)。
【０１８５】
ビーズベースのアッセイシステムは、マイクロアレイアッセイに慣用的に用いられている二次元基材の代りに、ミクロスフェアを捕捉分子のための固体支持体として利用する。個々の免疫アッセイにおいて、捕捉剤を、別の種類のミクロスフェアに結合させる。この反応は、これらのミクロスフェアの表面で起きる。個々のミクロスフェアは、赤及び橙色の蛍光色素の一様な及び別個の混合物により色分けされる。適当な捕捉分子への結合の後に、異なる色分けのビーズのセットをプールすることができ、免疫アッセイを単一反応バイアル中で行なう。ＰＥＴ標的とそれらの各捕捉剤との異なる種類のビーズ上での生成物形成を、蛍光ベースのレポーターシステムによって検出することができる。シグナル強度は、フローサイトメーターで測定され、これは、捕捉された標的の量を個々のビーズ上で定量することができる。各ビーズの種類及び各固定化標的は、第二蛍光シグナルにより測定される色分けを利用して同定される。これは、単一試料に由来する多数の標的の複合的定量を可能にする。感度、信頼性及び精度は、標準的ミクロ滴定ＥＬＩＳＡ手順で認められるものと類似している。色分けされたミクロスフェアを利用して、最大１００の異なる種類のアッセイを同時に行なうことができる(ＬａｂＭＡＰシステム、ラボラトリー・マルチプル・アナライト・プロファイリング、米国、テキサス、Austin在、Luminex)。例えば、ミクロスフェアベースのシステムは、生物学的試料に由来するサイトカイン又は自己抗体を同時に定量するために用いられてきた(Carson及びVignali, J Immunol Methods 227 (1999), p41-52；Chen等、Clin Chem 45(1999), p1693-1694；Fulton等、Clin Chem 43(1997), p.1749-1756)。Bellisario等(Early Hum Dev 64(2001), p21-25)は、この技術を利用して、新生児の乾燥させた血液スポット試料に由来する３つのＨＩＶ−１抗原に対する抗体を測定した。
【０１８６】
ビーズベースのシステムは、幾つかの利点を有している。捕捉剤分子は、別々のミクロスフェアに結合されているので、個々のカップリング事象を、完全に分析することができる。従って、複合免疫アッセイのために、品質制御されたビーズだけをプールすることができる。その上、もし更なるパラメーターがこのアッセイに含まれなければならないならば、新しい型の積載ビーズを加えなければならないだけである。洗浄ステップは、このアッセイを行なう際には必要とされない。この試料は、異なる種類のビーズ及び蛍光標識された検出用抗体と共にインキュベートされる。サンドイッチ免疫複合体の形成後に、ミクロスフェアの表面に限定的に結合されたフルオロフォアだけが、フローサイトメーターで計数される。
【０１８７】
Ｄ．関連する非アレイ形式
捕捉剤のアレイに代わるものは、いわゆる「分子インプリンティング」技術により作成されたものであり、該技術においては、ペプチド(例えば、選択されたＰＥＴ)をテンプレートとして利用して、構造的に相補性の配列特異的な空隙を重合可能なマトリクス中に生成し；その後、これらの空隙は、適当な一次アミノ酸配列を有する(消化された)タンパク質を特異的に捕捉することができる[ProteinPrint(商標)、Aspira Biosystems]。説明のために、選択したＰＥＴを合成することができ、重合可能なモノマーの万能マトリクスが該ペプチドの周囲で自動組み立てされ、空間内に架橋される。次いで、このＰＥＴ又はテンプレートを除去すると、形状及び機能において相補的な空隙が残る。これらの空隙は、フィルム、アレイの分離された部位又はビーズの表面上に形成することができる。断片化したタンパク質の試料をこの捕捉剤にさらすと、このポリマーは、選択的に当該ＰＥＴを含む標的タンパク質を保持して他のすべてを排除する。洗浄後に、結合したＰＥＴ含有ペプチドが残る。一般的な染色及びタグ手順、又は下記の任意の非標識技術を利用して、発現レベル及び／又は翻訳後修飾を検出することができる。例えば、ＷＯ０１／６１３５４Ａ１及びＷＯ０１／６１３５５Ａ１を参照されたい。
【０１８８】
或は、捕捉されたペプチドを、更なる分析例えば質量分析のために溶出させることができる。ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を配列決定するための幾つかの十分確立された化学的方法(例えば、エドマン分解法)が公知であるにもかかわらず、質量分析法が、それらの速度及び使用の容易さのために、益々、重要になりつつある。質量分析法は、混合物中のペプチドを、如何なる予備的な化学的精製又は分離も行なわずに、典型的には、エレクトロスプレーイオン化及びタンデム質量分析(ＭＳ／ＭＳ)を利用して配列決定できるという適切さのために開発された。例えば、Yates III (J. Mass Spectrom, 1998 vol.33 pp.1-19)、Papayannopoulos (Mass Spectrom. Rev. 1995, vol.14 pp.49-73)、及びYates III, McCormack, 及びEng (Anal. Chem. 1996 vol.68 (17) pp.534A-540A)参照。従って、典型的なＭＳ／ＭＳ配列決定実験においては、特定のペプチドの分子イオンが、第一質量分析器によって選択されて、中性ガス分子との衝突セルにおける衝突によって断片化される。次いで、第二質量分析器を用いて、一般に部分的な及びしばしば完全な決定すべき配列を与えるのに十分な情報を含む断片イオンスペクトルを記録する。例えば、米国特許第６，４８９，６０８号、５，４７０，７５３号、５，２４６，８６５号及び関連する出願／特許を参照されたい。
【０１８９】
診断及び発現プロファイリングにおいて利用することの出来る他の方法は、ProteinChip(登録商標)アレイ[Ciphergen]であり、該方法において、固相クロマトグラフィー表面は、血漿又は腫瘍抽出物などの混合物に由来する類似の帯電特性又は疎水性を有するタンパク質と結合し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析が、保持されたタンパク質の検出に利用される。ProteinChip(登録商標)は、新規な病気のマーカーを同定する能力を有すると信じられている。しかしながら、この技術は、一般に、特異的なリガンド相互作用の検出のための個々のタンパク質の固定化を含まないので、ここで論じているタンパク質アレイとは異なるものである。
【０１９０】
Ｅ．単一アッセイ形式
ＰＥＴ特異的な親和性捕捉剤は又、単一アッセイ形式においても利用することができる。例えば、かかる薬剤は、循環剤例えばＰＳＡの検出のための一層良好なアッセイを、増大された感度、ダイナミックレンジ及び／又は回収率を与えることにより開発するために利用することができる。例えば、単一アッセイは、伝統的なＥＬＩＳＡ及び他の免疫アッセイを超える機能性能特性例えば：参照標準例えば比較対照試料についての０．９５以上の回帰係数(Ｒ２)、一層好ましくは０．９７、０．９９又は０．９９５より大きいＲ２；少なくとも５０パーセントの、一層好ましくは少なくとも６０、７５、８０又は９０パーセントの回収率；少なくとも９０パーセントの、一層好ましくは少なくとも９５、９８又は９９パーセントの試料中のタンパク質の存在についての陽性予測値；９９パーセント以上の、一層好ましくは少なくとも９９．５パーセントの又は９９．８パーセントの試料中のタンパク質の存在についての診断感度(ＤＳＮ)；９９パーセント以上の、一層好ましくは少なくとも９９．５又は９９．８パーセントの試料中のタンパク質の存在についての診断特異性(ＤＳＰ)の少なくとも一つを有することができる。
【０１９１】
８．結合事象の検出方法
この発明の捕捉剤並びにこれらの捕捉剤を含む組成物例えばマイクロアレイ又はビーズは、健康産業において例えば治療、診断、イン・ビボイメージング又は薬物の発見において広範囲の応用を有する。本発明の捕捉剤は又、産業及び環境における応用例えば環境診断薬、産業診断薬、食品安全性、毒物学、反応触媒、又は高スループットスクリーニングにおける応用；並びに農業及び基礎研究例えばタンパク質配列決定における応用をも有する。
【０１９２】
本発明の捕捉剤及び方法は、強力な分析用ツールでを提供し、ユーザーが、特異的タンパク質、又は複雑な試料中に存在する関心ある一群のタンパク質を検出することを可能にする。加えて、この発明は、試料の効率的で迅速な分析；試料の保存及び直接的な試料の比較を可能にする。この発明は、タンパク質試料の「多パラメーター」分析を可能にする。ここで用いる場合、タンパク質試料の「多パラメーター」分析は、複数のパラメーターに基づくタンパク質試料の分析を包含することを意図している。例えば、タンパク質試料を、複数のＰＥＴと接触させることができ、各ＰＥＴは、試料中の異なるタンパク質を検出することができる。試料中で検出されたタンパク質の組合せ(及び、好ましくは、相対的濃度)に基づいて、当業者は、試料の正体を決定し、病気若しくは病気の素因を診断し、又は病気の段階を診断することができよう。
【０１９３】
本発明の捕捉剤は、タンパク質又はポリペプチドの検出に適した任意の方法例えば免疫沈降、免疫細胞化学、ウエスタンブロット又は核磁気共鳴分光分析(ＮＭＲ)において利用することができる。
【０１９４】
捕捉剤と相互作用するタンパク質の存在を検出するために、当分野で公知の様々な方法を利用することができる。検出すべきタンパク質を検出可能な標識で標識することができ、結合した標識の量を直接測定することができる。用語「標識」は、ここでは、広い意味に用いて、直接に又はシグナル生成系の少なくとも一つの更なるメンバーとの相互作用によって検出可能なシグナルを与えることのできる薬剤を指す。直接検出できる標識及び本発明において用途を見出すことができる標識には、例えば、蛍光標識例えばフルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、シアニン染料(例えば、GE製)、Alexa染料(例えば、Invitroge.製)、蛍光染料、ホスホルアミダイト、ビーズ、化学発光化合物、コロイド粒子などが含まれる。適当な蛍光染料は、当分野で公知であり、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)；ローダミン及びローダミン誘導体；テキサスレッド；フィコエリトリン；アロフィコシアニン；６−カルボキシフルオレセイン(６−ＦＡＭ)；２’，７’−ジメトキシ−４１，５１−ジクロロカルボキシフルオレセイン(ＪＯＥ)；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン(ＲＯＸ)；６−カルボキシ−２１，４１，７１，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン(ＨＥＸ)、５−カルボキシフルオレセイン(５−ＦＡＭ)；Ｎ，Ｎ，Ｎ１，Ｎ’−テトラメチルカルボキシローダミン(ＴＡＭＲＡ)；スルホン化ローダミン；Ｃｙ３；Ｃｙ５などが含まれる。放射性同位元素例えば35Ｓ、32Ｐ、3Ｈ、125Ｉなども又、標識に利用することができる。加えて、標識には、近赤外染料(Wang等、Anal.Chem, 72:5907-5917(2000)、アップコンバーティング蛍光体(Hampl等、Anal.Biochem.,288:176-187(2001)、ＤＮＡデンドリマー(Stears等、Physiol.Genomics 3:93-99(2000)、量子ドット(Bruchez等、Science 281:2013-2016(1998)、ラテックスビーズ(Okana等、Anal.Biochem.202:120-125(1992)、セレン粒子(Stimpson等、Proc.Natl.Acad.Sci.92:6379-6383(1995)及びユーロピウムナノ粒子(Harma等、Clin.Chem.47:561-568(2001)も含まれうる。この標識は、好ましくは、変わり易いシグナルを与えないで、所定期間にわたって一定した再現性のあるシグナルを与えるものである。検出可能な標識は、捕捉剤又は結合剤(例えば、抗体)に、共有結合を介して、直接結合することができるが、結合しなくてもよい。この標識は、非共有結合力の利用によって実現することができる。例えば、検出のための捕捉剤は、ビオチンで標識することができ、これは、ストレプトアビジンに結合した蛍光体と固く結合する。
【０１９５】
非常に有用な標識剤は、水溶性の量子ドット、又はいわゆる「官能化ナノクリスタル」又は「半導体ナノクリスタル」である(米国特許第６，１１４，０３８号に記載されたものなど)。一般に、量子ドットを製造することができ、それは、以前に、記載されたように(Bawendi等、1993, J.Am.Chem.Soc.115:8706)、相対的単分散(例えば、調製物において量子ドット間で凡そ１０％未満で変化するコアの直径)を生じる。量子ドットの例は、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ及びＣｄＴｅ(集合的に「ＣｄＸ」と呼ばれる)よりなる群から選択されるコアを有することが当分野で公知である(例えば、Norris等、1996, Physical Review B.53:16338-16346；Nirmal等、1996, Nature 383:802-804；Empedocles等、1996, Physical Review Letters 77:3873-3876；Murray等、1996, Science 270:1355-1338；Effort等、1996, Physical Review B.54:4843-4856；Sacra等、1996, J.Chem.Phys.103:5236-5245；Murakoshi等、1998, J.Colloid Interface Sci.203:225-228；Optical Materials and Engineering News, 1995, Vol.5, No.12；及びMurray等、1993, J.Am.Chem.Soc.115:8706-8714；(これらの開示を参考として本明細書中に援用する)を参照されたい)。
【０１９６】
ＣｄＸ量子ドットは、その上に一様に付着した無機被覆(「シェル」)により不動態化している。コア量子ドットの表面の不動態化は、この無機被覆の性質に依って、化学発光放射のカンタム収率の増大を生じうる。この量子ドットの不動態化に利用されるシェルは、好ましくは、ＹＺよりなる(ここに、Ｙは、Ｃｄ又はＺｎであり、Ｚは、Ｓ又はＳｅである)。ＣｄＸコア及びＹＺシェルを有する量子ドットは、当分野で記載されている(例えば、Danek等、1996, Chem.Mater.8:173-179；Dabbousi等、1997, J.Phys.Chem.B 101:9463；Rodriguez-Viejo等、1997, Appl.Phys.Lett.70:2132-2134；Peng等、1997, J.Am.Chem.Soc.119:7019-7029；1996, Phys.Review B.53:16338-16346；(これらの開示を、参考として本明細書中に援用する)参照)。しかしながら、上記の量子ドットは、無機シェルを利用して不動態化しており、有機、非極性(又は弱く極性)の溶媒中でしか可溶性でない。量子ドットを生物学的応用において有用なものとするために、量子ドットは水溶性であることが望ましい。「水溶性」は、ここで用いる場合、水ベースの溶液例えば水又は水ベースの溶液又は緩衝剤溶液(当業者に公知の生物学的又は分子検出システムにおいて利用されるものを含む)において十分に溶解性であるか懸濁可能であることを意味する。
【０１９７】
米国特許第６，１１４，０３８号は、非同位体検出システムで用いるための官能化ナノクリスタルを含有する組成物を与えている。この組成物は、少なくとも一つの更なる化合物を連続的様式で操作可能に結合することにより水溶性で且つ官能化されている量子ドット(一層のキャッピング化合物でキャップされている)を含む。好適具体例において、少なくとも一つの更なる化合物は、ナノクリスタル上に連続層を形成する。一層詳細には、これらの官能化ナノクリスタルは、このキャッピング化合物でキャップされた量子ドットを含み、且つこのキャッピング化合物に操作可能に結合された少なくとも一のジアミノカルボン酸を有する。従って、これらの官能化ナノクリスタルは、このキャッピング化合物を含む第一の層及びジアミノカルボン酸を含む第二の層を有することができ；そして更に、アミノ酸の層、アフィニティーリガンドの層、又はこれらの組合せを含む多層を含む少なくとも一つの連続層を含むことができる。この組成物は、高い量子収量の分離した発光ピークを有する検出可能な発光放射を生じる単一波長の光で励起させることのできる量子ドットのクラスを含む。かかる官能化ナノクリスタルを利用して、本発明の捕捉剤を、それらの、結合事象の検出及び／又は定量における利用のために標識することができる。
【０１９８】
米国特許第６，３２６，１４４号は、量子ドットの特定のサイズを選択することにより所望のエネルギーに同調できる特徴的なスペクトル放射を有する量子ドット(ＱＤ)を記載している。例えば、２ナノメートルの量子ドットは、緑色光を放射し、５ナノメートルの量子ドットは、赤色光を放射する。これらの量子ドットの放射スペクトルは、試料のサイズ不均一度に依存する２５〜３０ｎｍの狭い準位幅、及び対称的なテイリング領域のないガウス型又は殆どガウス型の線形状を有する。同調可能性、狭い準位幅、及びテイリング領域のない対称的放射スペクトルの組合せは、システム内の多様なサイズの量子ドットの高い解像度を与えて、研究者が、ＱＤで標識した様々な生物学的部分を同時に調べることを可能にする。加えて、ナノクリスタル量子ドットの励起波長の範囲は広く、エネルギーにおいて、すべての利用可能な量子ドットの放射波長より高くてよい。従って、これは、単一光源(通常、紫外線又は青色領域のスペクトル)を有するシステム内のすべての量子ドットの同時励起を与える。ＱＤは又、慣用の有機蛍光染料よりも丈夫であり、それらの有機染料よりも光退色に耐性である。ＱＤの丈夫さは又、調べている系内の有機染料の分解産物の汚染の問題をも軽減する。これらのＱＤは、タンパク質、核酸及び他の天然の生物学的分子の捕捉剤の標識に利用することができる。セレン化カドミウム量子ドットナノクリスタルは、カリフォルニア、Hayward のQuantum Dot Corporationから入手可能である。
【０１９９】
或は、試験すべき試料を標識せずに、第二ステージの標識試薬を、試料中のタンパク質の存在を検出し又は量を定量するために加える。かかる「サンドイッチベースの」検出方法は、各タンパク質について２つの捕捉剤(一つは、ＰＥＴを捕捉し、一つは、一度それが捕捉されたならば標識する)を開発しなければならないという不都合を有する。かかる方法は、それらが一つのペプチド上の異なる点における２つの結合反応を利用し、従って、ノイズ比に対する増大したシグナルの故に、タンパク質の存在及び／又は濃度を一層正確に且つ高精度で測定することができるので、ノイズ比に対して本質的に改良されたシグナルによって特徴付けられるという利点を有する。
【０２００】
更に別の具体例において、主題の捕捉剤アレイは、「仮想アレイ」であってよい。例えば、抗体その他の捕捉剤をビーズ上に固定化した仮想アレイを生成することができ、その正体は、結合した捕捉剤の故にそれが特異的である特定のＰＥＴに関して、２種以上の共有結合した染料の特定の比率によりコード化されるものである。コード化されたＰＥＴビーズの混合物を試料に加えて、固定化捕捉剤により認識されるＰＥＴ実在物の捕捉を生じる。
【０２０１】
捕捉された種を定量するために、捕捉されたＰＥＴに結合する蛍光標識された抗体を利用するサンドイッチアッセイ、又は捕捉剤に対する蛍光標識されたリガンドを利用する競合結合アッセイをこの混合物に加える。一具体例において、標識されたリガンドは、分析物のＰＥＴと捕捉剤への結合について競合する標識されたＰＥＴである。次いで、これらのビーズを、各ビーズ上の様々な蛍光シグナルの強度を読むフローサイトメーターなどの機器に導入して、該ビーズの正体を、染料の比を測定することにより決定することができる(図３)。この技術は、比較的早くて効率的であり、研究者が、殆どの関心あるＰＥＴのセットをモニターするために適合させることができる。
【０２０２】
他の具体例において、捕捉剤のアレイを、イオン化に適したマトリクスに包埋する(例えば、Fung等 (2001) Curr.Opin.Biotechnol.12:65-69に記載のように)。試料の添加及び未結合分子の除去(洗浄による)後に、保持されたＰＥＴタンパク質を質量分光分析により分析する。幾つかの場合には、イオン化の前に、結合種のトリプシンによる更なるタンパク質分解性消化が必要とされうる(特に、エレクトロスプレーが、ペプチドのイオン化の手段ならば)。
【０２０３】
上記のすべての試薬は、これらの捕捉剤を標識するために利用することができる。好ましくは、標識すべき捕捉剤を、検出すべきタンパク質上に存在する基例えばアミン基、チオール基又はアルデヒド基と反応する活性化染料と結合させる。
【０２０４】
この標識は又、適当な基質の添加後に検出可能な産生物シグナルを与えることのできる共有結合された酵素であってもよい。本発明で利用するのに適した酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、マレートデヒドロゲナーゼなどが含まれる。
【０２０５】
酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)も又、捕捉剤と相互作用するタンパク質の検出に利用することができる。ＥＬＩＳＡにおいて、指標分子は、酵素に共有結合されて、分光光度計により、酵素が純粋な基質を相関生成物に変換する初速度を測定することにより定量されうる。ＥＬＩＳＡを実施する方法は、当分野で周知であり、例えば、Perlmann, H.及びPerlmann, P.(1994). Enzyme-Linked Immunosorbent Assay.In: Cell Biology: A Laboratory Handbook. San Diego, カリフォルニア、Academic Press, Inc., 322-328；Crowther, J.R.(1995). Methods in Molecular Biology, Vol.42-ELISA: Theory and Practice. Humana Press, Totowa, ニュージャージー；及びHarlow, E.及びLane, D.(1988). Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 553-612に記載されている(これらの各々の内容を参考として援用する)。サンドイッチ(捕捉)ＥＬＩＳＡは又、２つの捕捉剤と相互作用するタンパク質を検出するために利用することができる。これらの２つの捕捉剤は、同じペプチド(例えば、上記のように、関心ある試料の断片化により生成されたペプチド)上に存在する２つのＰＥＴと特異的に相互作用することができてよい。或は、これらの２つの捕捉剤は、共に同じペプチド(例えば、上記のように、関心ある試料の断片化により生成されたペプチド)上に存在する一つのＰＥＴ及び一つのユニークでないアミノ酸配列と特異的に相互作用することができてよい。関心あるタンパク質の定量のためのサンドイッチＥＬＩＳＡは、試料中のタンパク質の濃度が低く且つ／又は関心あるタンパク質が高濃度の夾雑タンパク質を含む試料中に存在する場合に、特に価値がある。
【０２０６】
高スループットのための完全に自動化されたマイクロアレイベースのアプローチであるＥＬＩＳＡは、Mendoza等(BioTechniques 27:778-780, 782-786, 788, 1999)により記載された。このシステムは、テフロンマスクにより分離された９６ウェルを有する光学的に均一なガラス板よりなった。１００より多くの捕捉剤分子が、各ウェル中に固定化された。試料のインキュベーション、洗浄及び蛍光ベースの検出を、自動化液体ピペッターにより行なった。これらのマイクロアレイを、スキャニング電荷結合素子(ＣＣＤ)検出器を利用して定量的にイメージ形成した。そうして、整列させた抗原の多重検出の、高スループット様式での実行可能性を、成功裏に示すことができた。加えて、Silzel等(Clin Chem 44 p.2036-2043, 1998)は、多数のＩｇＧサブクラスを、マイクロアレイ技術を利用して、同時に検出することができることを示すことができた。Wiese等(Clin Chem 47 p.1451-1457, 2001)は、前立腺特異的な抗原(ＰＳＡ)、-(１)-抗キモトリプシン結合ＰＳＡ及びインターロイキン６(マイクロアレイ形式)を測定することができた。Arenkov等(前出)は、マイクロアレイサンドイッチ免疫アッセイ及び直接抗原又は抗体検出実験を、改変ポリアクリルアミドゲルを固定化捕捉剤分子の基質として利用して行なった。
【０２０７】
当分野で記載されたマイクロアレイアッセイ形式の殆どは、化学発光又は蛍光ベースの検出方法に依存している。感度に関する更なる改良には、蛍光標識及び導波管技術の適用が含まれる。蛍光ベースのアレイの免疫センサーは、Rowe等(Anal Chem 71 (1999), p.433-439；及びBiosens Bioelectron 15 (2000), p.579-589)により開発されて、サンドイッチ免疫アッセイ形式を利用する臨床分析物の同時検出に適用された。ビオチン化した捕捉用抗体を、アビジンコートした導波管上にフローチャンバーモジュールシステムを利用して固定化した。捕捉用分子の別々の領域を、導波管表面に垂直に配置した。関心ある試料をインキュベートして、標的をそれらの捕捉用分子に結合させた。捕捉された標的を、次いで、適当な蛍光標識した検出用分子を利用して可視化した。このアレイ免疫センサーは、標的の、様々な臨床試料における生理的に適当な濃度での検出及び測定に適していることが示された。
【０２０８】
導波管技術を利用する更なる感度の増大が、二次元導波管技術の開発により達成された(Duveneck等、Sens Actuators B B38 (1997), p.88-95)。薄いフィルム導波管が、高屈折率の物質例えばＴａ2Ｏ5(該物質を透明基材上に付着させる)から生成される。所望の波長のレーザー光を回折格子手段によって二次元導波管に結合させる。光は二次元導波管内を伝搬して、１平方センチメートルより大きい領域が、均一に明るくなりうる。この面において、伝搬する光は、いわゆるエバネセント場を生成する。これは、この溶液に及んで、表面に結合された蛍光体のみを活性化する。周囲の溶液中の蛍光体は、励起されない。表面近くにおいて、励起場強度は、標準的共焦点励起により達成されるものの１００倍でありうる。ＣＣＤカメラを利用して、二次元導波管の全領域を横切るシグナルを同時に同定する。従って、二次元導波管における捕捉用分子のマイクロアレイ形式での固定化は、高感度の小型化されて平行化された免疫アッセイの性能を与える。このシステムは、４０ｆＭもの低濃度のインターロイキン６を検出するために成功裏に利用され且つ未結合の検出用分子を除去するのに通常必要とされる洗浄ステップなしでアッセイを行なうことができるという利点を有する(Weinberger等、Pharmacogenomics 1 (2000), p.395-416)。
【０２０９】
感度を増大させるために遂行された別のストラテジーは、シグナル増幅手順に基づいている。例えば、イムノＲＣＡ(免疫ローリングサークル増幅)は、検出用分子(例えば、サンドイッチ型アッセイ形式における第二の捕捉剤)に共有結合されたオリゴヌクレオチドプライマーを含む。この結合したオリゴヌクレオチドに相補的な環状ＤＮＡをテンプレートとして利用して、ＤＮＡポリメラーゼは、該結合したオリゴヌクレオチドを伸張させて、検出用分子に結合したままの数百コピーの環状ＤＮＡよりなる長いＤＮＡ分子を生成する。数千の蛍光標識されたヌクレオチドの組込みは、強力なシグナルを生成する。Schweitzer等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97 (2000), p.10113-10119)は、この検出技術を、マイクロアレイベースのアッセイにおける利用について評価した。ｈｕＩｇＥ及び前立腺特異的抗原についてのサンドイッチ免疫アッセイは、マイクロアレイ形式で行なわれた。これらの抗原は、フェムトモル濃度で検出することができ、個々の抗体−抗原複合体から生じた別々の蛍光シグナルを計数することにより単一の特異的に捕捉された抗原を記録することが可能であった。これらの著者は、ローリングサークルＤＮＡ増幅を利用する免疫アッセイが、抗原の超高感度検出のための多用途プラットホームであり、従って、タンパク質マイクロアレイ技術における利用に適していることを示した。
【０２１０】
タンパク質検出、近接連結(proximity ligation)のための新規な技術が、最近、ＤＮＡマイクロアレイのイン・サイチュー合成のための改良された方法と共に開発された。近接連結は、抗ＰＥＴ抗体と共に用いることのできる他の増幅ストラテジーであってよい。近接連結は、試料中に存在するタンパク質の、核酸配列への特異的及び定量的変換を可能にする。いわゆる近接プローブの対は、個々の標的分子に別個の部位(例えば、同じ標的分子上の２つの隣接するエピトープ)で結合するので、これらの近接プローブは、密接に近位にもたらされる。これらのプローブは、共通のコネクターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることのできる遊離の３’又は５’末端を有するオリゴヌクレオチドに結合したタンパク質特異的部分よりなる。これらのプローブが、標的結合により促進されて、近接している場合には、ポリヌクレオチド鎖は、酵素的連結により結合されうる。次いで、形成される核酸配列を、実時間監視ポリメラーゼ連鎖反応又は任意種類のポリヌクレオチド増幅法(例えば、ローリングサークル増幅など)において、増幅して、定量的に検出することができる。ある具体例において、この共通のコネクターオリゴヌクレオチドは、省略することができ、これらの近接プローブ上のオリゴヌクレオチドの末端は、直接、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって連結することができる。この便利なアッセイは、実施するのが簡単で、高感度のタンパク質検出を与える。それは又、イムノＰＣＲ法に伴うバックグラウンドの問題(非特異的に結合したオリゴヌクレオチドも又非常に感度のよいＰＣＲ法により、はからずも増幅されうる)を排除又は有意に低減させる(Sano等、Chemtech Jan. 1995, p24-30)。ＷＯ９７／００４４６、ＷＯ０１／６１０３７及びＷＯ０３／０４４２３１を参照されたい。
【０２１１】
ある具体例において、イムノＰＣＲ法例えばSano等、Chemtech Jan. 1995, p24-30に記載されたものを利用して、固定化された標的分析物に特異的に結合する任意の捕捉剤(例えば、Ａｂ)を検出することができる。
【０２１２】
放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)も又、捕捉剤と相互作用するタンパク質の検出に利用することができる。ＲＩＡにおいては、指標分子を、放射性同位元素で標識して、放射性崩壊事象をシンチレーションカウンターで計数することにより定量することができる。直接的又は競合ＲＩＡを実施する方法は、当分野で周知であり、例えば、Cell Biology: A Laboratory Handbook. San Diego, カリフォルニア、Academic Press, Inc.に記載されている。
【０２１３】
他の免疫アッセイは、一般に、細胞試料中のタンパク質のレベルを定量するために利用され、当分野で周知であって、本発明における利用のために適合させることができる。この発明は、特定のアッセイ手順に限定されず、それ故、均一手順及び不均一手順の両方を包含するものである。この発明により行なわれうる典型的な他の免疫アッセイには、蛍光偏光免疫アッセイ(ＦＰＩＡ)、蛍光免疫アッセイ(ＦＩＡ)、酵素免疫アッセイ(ＥＩＡ)、免疫比朧法(ＮＩＡ)が含まれる。指標部分(又は、標識基)を、患者の抗体に結合させることができ、該部分は、この方法の様々な用途の要求に合うように選択するが、それらは、しばしば、アッセイ装置及び適合性の免疫アッセイ手順の利用可能性により指図される。上記の様々な免疫アッセイの実施において用いるべき一般的技術は、当業者には公知である。一具体例において、生物学的試料におけるタンパク質レベルの測定は、マイクロアレイ分析(タンパク質チップ)により実施されうる。
【０２１４】
幾つかの他の具体例において、捕捉剤と相互作用するタンパク質の存在の検出は、標識なしで達成することができる。例えば、タンパク質の捕捉剤に結合する能力の測定は、実時間バイオモレキュラーインタラクションアナリシス(ＢＩＡ)などの技術を利用して達成することができる。Sjolander, S.及びUrbaniczky, C. (1991) Anal.Chem.63:2338-2345及びSzabo等 (1995) Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705。ここで用いる場合、「ＢＩＡ」は、生体特異的な相互作用を、如何なる反応体をも標識せずに、実時間で研究するための技術である(例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ)。
【０２１５】
他の具体例において、特定の回折格子表面を有するバイオセンサーを利用して、処理した(消化した)生物学的試料中の非標識ＰＥＴ含有ペプチドとバイオセンサー表面の固定化捕捉剤との間の結合を検出／定量することができる。この技術の詳細は、B. Cunningham, P. Li, B. Lin, J. Pepper, 「Colorimetric resonant reflection as a direct biochemical assay technique」Sensors and Actuators B, Vol 81, p.316-328, 2002年１月５日、及びＰＣＴ No. ＷＯ０２／０６１４２９Ａ２及びＵＳ２００３／００３２０３９に一層詳しく記載されている。簡単にいえば、導波モードの共鳴現象を利用して、平行化された白色光で照らされた場合に単一波長(色)だけを反射するようにデザインされた光学的構造を生成する。分子をこのバイオセンサーの表面に結合させたときに、反射した波長(色)は、格子に結合された光の経路の変化のためにシフトする。レセプター分子を格子表面に結合することにより、相補的結合分子を、如何なる種類の蛍光プローブ又は粒子標識の利用もなしで検出／定量することができる。このスペクトルのシフトを分析して、与えられた発現データを測定すること、及び特定の指示の存否を示すことができる。
【０２１６】
このバイオセンサーは、典型的には、高い屈折率を有する物質よりなる二次元の格子、この二次元格子を支持する基材層、及びこの二次元格子の表面(基材層の反対側)に固定された少なくとも一つの検出用プローブを含む。バイオセンサーが照らされると、共鳴格子効果が、反射放射スペクトルに生じる。この二次元格子の深さ及び周期は、共鳴格子効果の波長より小さい。
【０２１７】
光学的波長の狭いバンドは、このバイオセンサーから、それが広いバンドの光学的波長で照らされたときに反射しうる。その基材は、ガラス、プラスチック又はエポキシを含むことができる。この二次元格子は、硫化亜鉛、二酸化チタン、酸化タンタル、及び窒化珪素よりなる群から選択する材料を含むことができる。
【０２１８】
この基材及び二次元格子は、適宜、単一ユニットを含むことができる。この二次元格子を構成する単一ユニットの表面は、高い屈折率を有する材料で被覆され、少なくとも一つの検出用プローブが、該高い屈折率を有する材料の表面に固定化される(単一ユニットの反対側)。この単一ユニットは、ガラス、プラスチック及びエポキシよりなる群から選択する材料よりなってよい。
【０２１９】
このバイオセンサーは、適宜、基材層の反対側の二次元格子の表面に被覆層を含むことができる。少なくとも一つの検出用プローブが、二次元格子の反対側の被覆層の表面に固定化される。この被覆層は、高い屈折率の二次元格子材料より一層低い屈折率を有する材料を含むことができる。例えば、被覆層は、ガラス、エポキシ及びプラスチックを含むことができる。
【０２２０】
二次元格子は、線、四角形、円、楕円、三角形、台形、正弦波、卵形、長方形及び六角形よりなる群から選択する形状の反復パターンよりなってよい。形状の反復パターンは、直線的グリッド即ち平行線のグリッド、長方形グリッド、又は六角形のグリッドに配置することができる。二次元格子は、約０．０１ミクロン〜約１ミクロンの周期及び約０．０１ミクロン〜約１ミクロンの深さを有することができる。
【０２２１】
説明のために、マイクロアレイスライド、ミクロ滴定プレート又は他のデバイスの表面に埋められた熱量測定共鳴光学的バイオセンサーの表面で起きる生化学的相互作用は、センサー表面で、蛍光タグ又は熱量測定標識の利用なしで、直接検出して測定することができる。このセンサー表面は、平行化白色光で照らされた場合に、狭いバンドの波長(色)だけを反射するようにデザインされた光学的構造を含む。この狭い波長は、波長の「ピーク」として記載される。「ピーク波長値」(ＰＷＶ)は、生物学的物質がセンサー表面付着し又は該表面から除去されたとき例えば結合が起きたようなときに変化する。かかる結合に誘導されたＰＷＶの変化は、ＵＳ２００３／００３２０３９に開示された測定用機器を利用して測定することができる。
【０２２２】
一具体例において、この機器は、平行化白色光をセンサー構造に向けることによりバイオセンサー表面を照らす。照らされる光は、平行化光のスポットの形態をとってよい。或は、この光は、扇型の光線の形態で生成される。この機器は、照らされたバイオセンサー表面からの反射光を集める。この機器は、このバイオセンサー表面の多くの位置からの反射光を同時に集めることができる。この機器は、光を、バイオセンサー表面を横切る不連続な幾つかの位置に向ける複数の照明プローブを含むことができる。この機器は、バイオセンサーが埋め込まれたミクロ滴定プレート内の離れた位置のピーク波長値(ＰＷＶ)を、分光計を利用して測定する。或は、イメージング分光計を利用する。この分光計は、センサー表面のＰＷＶイメージマップを生成することができる。一具体例において、この測定機器は、空間的に、ＰＷＶイメージを２００ミクロン未満の解像度で分析する。
【０２２３】
一具体例において、サブ波長構造化面(ＳＷＳ)を利用して、鋭い光学的共鳴反射を、特定の波長で造ることができ、これは、生物学的物質例えば特異的結合性物質又は結合パートナー又はこれら両者の相互作用を高感度で追跡するために利用することができる。熱量共鳴回折格子面は、特異的結合性物質(例えば、本発明の固定化捕捉剤)のための表面結合プラットホームとして作用する。ＳＷＳは、薄いフィルムコーティングの効果を模倣することのできる非在来型の回折光学部品である。(Peng及びMorris,「Resonant scattering from two-dimensional gratings」、J.Opt.Soc.Am.A, Vol.13,No.5,p.993, 5月；Magnusson及びWang, 「New principle for optical filters」、Appl.Phys.Lett.,61,No.9,p.1022,1992年8月；Peng及びMorris,「Experimental demonstration of resonant anomalies in diffraction from two-dimensional gratings」、Optics Letters, Vol.21,No.8,p.549, 1996年4月)。ＳＷＳ構造は、表面起伏、二次元格子を含み、該格子においては、入射光の波長と比べて格子周期が小さく、それで反射及び伝達されるゼロ次以外の回折次数は伝搬できない。ＳＷＳ表面狭帯域フィルターは、基材層と格子の溝を満たす被覆層との間に挟まれた二次元格子を含むことができる。適宜、被覆層は、利用されない。格子領域の有効屈折率が基材又は被覆層より大きい場合には、導波管が造られる。フィルターをこのようにデザインする場合には、入射光は、導波管領域に進む。二次元格子構造は、狭帯域の波長の光を選択的に導波管に結合する。この光は、短距離(１０〜１００マイクロメートルのオーダー)だけ伝搬し、散乱を受け、そして前方及び後方へ伝搬するゼロ次の光と結合する。鋭敏なカップリング条件は、共鳴格子効果を反射した放射スペクトルに生成することができ、狭帯域の反射又は伝達波長(色)を生じる。この二次元格子の深さ及び周期は、共鳴格子効果の波長より小さい。
【０２２４】
この構造の反射又は伝達色は、分子例えば捕捉剤若しくはそれらのＰＥＴ含有結合パートナー又はこれら両方を被覆層の上面又は二次元格子表面に添加することにより調節することができる。これらの添加された分子は、この構造を通る入射放射の光学距離を増し、そうして、最大の反射率又は透過率が生じる波長(色)を改変する。従って、一具体例において、バイオセンサーは、白色光で照らされたときに単一波長だけを反射するようにデザインされる。特異的な結合物質がこのバイオセンサーの表面に結合した場合には、反射した波長(色)は、格子に結合された光の光路の変化のためにシフトする。特異的結合物質のバイオセンサー表面への結合により、相補的結合パートナー分子を、如何なる種類の蛍光プローブ又は粒子標識も利用することなく検出することができる。この検出技術は、例えば、約０．１ｎｍの厚みのタンパク質結合の変化を分析することができ、且つバイオセンサーの液体に浸した又は乾燥した表面により実施することができる。このＰＷＶ変化は、例えば通常の入射角で光ファイバープローブによる、例えばバイオセンサーの小さいスポットを照らす光源よりなる検出システムにより検出することができる。分光計は、反射光を、例えば、やはり通常の入射角の第二の光ファイバープローブによって集める。励起／検出システムとバイオセンサー表面との間の物理的接触が生じないので、空間結合プリズムは必要ない。それ故、このバイオセンサーは、一般に用いられるアッセイプラットホーム(例えば、ミクロ滴定プレート及びマイクロアレイスライドを含む)に適合させることができる。分光計の読みは、数ミリ秒で行なうことができ、従って、バイオセンサーの表面で並行して起きる多数の分子の相互作用を効率的に測定すること及び反応速度論をリアルタイムでモニターすることができる。上記のバイオセンサーの様々な具体例、変形物は、ＵＳ２００３／００３２０３９に見出すことができる。
【０２２５】
少なくとも一つの特異的捕捉剤を、二次元格子又は被覆層(存在する場合)上に固定化することができる。固定化は、上記の方法の何れかによって起こりうる。適当な捕捉剤は、例えば、核酸、ポリペプチド、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体(ｓｃＦｖ)、Ｆ(ａｂ)断片、Ｆ(ａｂ')２断片、Ｆｖ断片、小型有機分子であってよく、細胞、ウイルス又は細菌であってもよい。生物学的試料を、例えば、血液、血漿、血清、胃腸の分泌液、組織若しくは腫瘍のホモジェネート、滑液、大便、唾液、痰、嚢胞液、羊水、脳脊髄液、腹腔液、肺洗浄液、精液、リンパ液、涙又は前立腺液から得ること及び／又は導くことができる。好ましくは、少なくとも一つの特異的捕捉剤を、バイオセンサー上の別個の位置のマイクロアレイに配置する。捕捉剤のマイクロアレイは、少なくとも一種の特異的捕捉剤をバイオセンサー表面に含み、それで、バイオセンサー表面は、各々異なる捕捉剤又は異なる量の特異的捕捉剤を有する複数の別個の位置を含む。例えば、一つのアレイは、１、１０、１００、１，０００、１０，０００、又は１００，０００の別個の位置を含むことができる。多数の別個の位置を有するバイオセンサー表面は、少なくとも一種の特異的捕捉剤が典型的にはｘ−ｙ座標内に規則的なグリッドパターンで置かれているので、マイクロアレイと呼ばれる。しかしながら、マイクロアレイは、規則的な又は不規則なパターンで置かれた少なくとも一つの特異的捕捉剤を含むことができる。
【０２２６】
マイクロアレイスポットは、直径が約５０ミクロンから約５００ミクロンに及びうる。或は、マイクロアレイスポットは、直径が約１５０ミクロンから約２００ミクロンに及びうる。少なくとも一種の特異的捕捉剤を、それらの特異的ＰＥＴ含有結合パートナーに結合させることができる。
【０２２７】
一つのバイオセンサーの具体例において、バイオセンサー上のマイクロアレイは、少なくとも一種の特異的捕捉剤の微小液滴を、例えば二次元格子又は被覆層表面上のｘ−ｙ座標の位置に置くことにより造られる。バイオセンサーを、少なくとも一つのＰＥＴ結合パートナーを含む試験試料にさらした場合、それらの結合パートナーは、優先的に、それらのＰＥＴ結合パートナーに対する高い親和性を有する捕捉剤を含むマイクロアレイ上の別個の位置に結合する。これらの別個の位置の幾つかは、結合パートナーをそれらの表面に集めるが、他の位置は集めない。従って、特異的捕捉剤は、そのＰＥＴ結合パートナーに特異的に結合するが、バイオセンサー表面に加えられた他のＰＥＴ結合パートナーには実質的に結合しない。別の具体例においては、核酸マイクロアレイ(例えば、アプタマーアレイ)が与えられ、該マイクロアレイにおいては、アレイ内の各別個の位置が異なるアプタマー捕捉剤を含む。マイクロアレイスポッターを利用する特異的捕捉剤のバイオセンサーへの塗布により、１平方インチ当たり１０，０００の特異的結合物質の密度を得ることができる。光ファイバープローブの照明光線を単一マイクロアレイ位置に集中して送ることにより、バイオセンサーは、標識なしのマイクロアレイ読み出しシステムとして利用することができる。
【０２２８】
約０．１ｎｇ／ｍｌ未満の濃度のＰＥＴ結合パートナーの検出のためには、バイオセンサーに結合した結合パートナーを増幅して、バイオセンサー表面の追加層に変換することができる。バイオセンサー上に付着した増大した量を、増大した光学距離の結果として検出することができる。一層大きい量のバイオセンサー表面への組込みにより、その表面上の結合パートナーの光学密度も増大し、従って、この追加量のない場合よりも一層大きい共鳴波長シフトを与える。この量の追加は、例えば、酵素的に、「サンドイッチ」アッセイにより又は該量(例えば、ＰＥＴペプチドに特異的な第二の捕捉剤)を、適当に結合されたビーズ又は様々な大きさ及び組成のポリマーの形態で、バイオセンサー表面に直接塗布することによって達成することができる。これらの捕捉剤は、ＰＥＴ特異的であるので、異なる種類及び特異性の多数の捕捉剤を、一緒に、捕捉されたＰＥＴに加えることができる。この原理は、他の型の光学的バイオセンサーに利用されて、該量の増幅なしで達成される感度限界を超える１５００倍の感度増大が示されている。例えば、Jenison等「Interference-based detection of nucleic acid targets on optically coated silicon」、Nature Biotechnology, 19:62-65, 2001を参照されたい。
【０２２９】
別の具体例において、バイオセンサーは、表面起伏容積回折構造(ＳＲＶＤバイオセンサー)を包含する。ＳＲＶＤバイオセンサーは、広帯域の光学波長で照らされたときに、主として特定の狭帯域の光学波長で反射する表面を有する。特異的捕捉剤及び／又はＰＥＴ結合パターンをＳＲＶＤバイオセンサー上に固定化した場合、反射された光の波長は、シフトする。一次元的表面例えば薄膜干渉フィルター及びブラッグ反射体は、反射し又は透過した波長の狭帯域を広帯域励起源から選択することができる。しかしながら、追加の物質例えば特異的捕捉剤及び／又はＰＥＴ結合パートナーのそれらの上面への付着は、共鳴波長ではなく、共鳴準位幅の変化だけを生じる。対照的に、ＳＲＶＤバイオセンサーは、追加の物質例えば特異的捕捉剤及び／又は表面への結合パートナーにより反射波長を変える能力を有する。
【０２３０】
ＳＲＶＤバイオセンサーは、第一及び第二の表面を有するシート材料を含む。このシート材料の第一の表面は、起伏容積回折構造を規定する。シート材料は、例えば、プラスチック、ガラス、半導体ウェハー、又は金属フィルムを含むことができる。起伏容積回折構造は、例えば、上記のような二次元格子、又は三次元の表面起伏容積回折格子であってよい。起伏容積回折構造の深さ及び周期は、バイオセンサーから反射される光の共鳴波長より小さい。三次元の表面起伏容積回折格子は、例えば、三次元の位相量子化した段丘面起伏パターンであってよく、その溝のパターンは、階段状ピラミッドに似ている。かかる格子を広帯域放射の光線で照らしたならば、光は、等しく間隔をあけた段丘から、周囲の媒質の屈折率と段間隔の積の２倍により与えられる波長で、可干渉的に反射される。所定波長の光は、半波長離れた段から、段数に反比例する帯域幅で、干渉的に屈折又は反射される。この反射又は屈折された色は、新しい波長が選択されるような誘電体層の付着によって、該コーティングの屈折率に依存して、制御することができる。
【０２３１】
階段状構造は、先ず、薄いフォトレジストフィルムを３つのレーザー光線に可干渉的にさらすことにより、前に記載されたように、フォトレジストで製造することができる。例えば、Cowen,「The recording and large scale replication of crossed holographic grating arrays using multiple beam interferometry」(International Conference on the Application, Theory, and Fabrication of Periodic Structures, Diffraction Gratings), 及び Moire Phenomena II, Lerner等、Proc.Soc.Photo-Opt.Instrum.Eng., 503, 120-129, 1984；Cowen,「Holographic honeycomb microlens」Opt.Eng.24,796-802(1985)；Cowen及びSlafer,「The recording and replication of holographic micropatterns for the ordering of photographic emulsion grains in film systems」J Imaging Sci.31,100-107, 1987を参照されたい。フォトレジストに特徴的な非線形エッチングを利用して露出されたフィルムを現像して、三次元的起伏パターンを造る。このフォトレジスト構造を、次いで、標準的なエンボス手順を利用して複製する。例えば、薄い銀フィルムをフォトレジスト構造上に付着させて、導電層を形成することができ、該層上に薄いニッケルのフィルムを電気めっきすることができる。次いで、このニッケル「マスター」プレートを利用して、直接、ビニールなどのプラスチックフィルム(熱又は溶剤により軟化させてある)に浮彫り細工を施す。階段状ピラミッドに似た三次元相量子化段丘面浮き彫りパターンのデザイン及び加工を記述する理論が記載されている：「Aztec surface-relief volume diffractive structure」J.Opt.Soc.Am.A,7:1529(1990)。三次元相量子化段丘面浮き彫りパターンの例は、階段状ピラミッドに似たパターンであってよい。各逆ピラミッドは、直径約１ミクロンである。好ましくは、各逆ピラミッドは、直径約０．５〜５ミクロンであってよい(例えば、約１ミクロンを含む)。これらのピラミッド構造は、直径１５０〜２００ミクロンの典型的なマイクロアレイスポットが数百の階段状ピラミッド構造を組み込むことができるように、最密であってよい。これらの浮き彫り容積回折構造は、約０．１〜１ミクロンの周期及び約０．１〜１ミクロンの深さを有する。
【０２３２】
少なくとも一種の上記の特異的な結合物質を、ＳＲＶＤバイオセンサーの反射材上に固定化する。少なくとも一種の特異的な結合物質を、上記のように、反射材上に、マイクロアレイの別個の位置に配置することができる。
【０２３３】
ＳＲＶＤバイオセンサーは、広帯域の光学波長で照らされた場合、主として第一の単一の光学波長で光を反射し、少なくとも一種の結合物質を反射面上に固定化した場合には、第二の単一の光学波長で光を反射する。この第二の光学波長での反射は、光学的干渉から生じる。ＳＲＶＤバイオセンサーは又、少なくとも一種の特異的な捕捉剤をそれらのそれぞれのＰＥＴ結合パートナーに結合させた場合には、光学的干渉のために、第三の単一の光学波長でも光を反射する。反射された色の読出しは、顕微鏡の対物レンズを個々のマイクロアレイスポットに焦点を合わせて、反射されたスペクトルを分光器若しくはイメージング分光計の補助により読むことによって逐次的に行なうことができ、又は、例えば、マイクロアレイの反射したイメージを高解像度のカラーＣＣＤカメラを組み込んだイメージング分光計にかけることによって並行して行なうことができる。
【０２３４】
ＳＲＶＤバイオセンサーは、例えば、金属マスタープレートを製造して、浮き彫り容積回折構造を例えばビニールのようなプラスチック材料に刻印することによって製造することができる。刻印した後に、その表面を、例えば金、銀又はアルミニウムなどの薄い金属フィルムのブランケット付着により反射するようにする。写真平版技術、エッチング及びウェハー結合手順に依存するＭＥＭＳベースのバイオセンサーと比較して、ＳＲＶＤバイオセンサーの製造は、非常に安価である。
【０２３５】
ＳＷＳ又はＳＲＶＤバイオセンサーの具体例は、内面を含むことができる。一つの好適具体例において、かかる内面は、液体を含有する容器の底面である。液体含有容器は、例えば、ミクロ滴定プレートのウェル、試験管、ペトリ皿、又はミクロな液体のチャンネルであってよい。一具体例において、ＳＷＳ又はＳＲＶＤバイオセンサーは、ミクロ滴定プレートに組み込まれる。例えば、ＳＷＳバイオセンサー又はＳＲＶＤバイオセンサーは、ミクロ滴定プレートの底面に、これらの反応容器の壁を共鳴反射面上に、各反応「スポット」が別個の試験試料にさらされうるように組み立てることによって組み込むことができる。それ故、各個別のミクロ滴定プレートのウェルは、別々の反応容器として作用しうる。それ故、別々の化学反応が、隣接するウェル内で混合反応液なしで起き、化学的に別個の試験溶液を個別のウェルに適用することができる。
【０２３６】
この技術は、多くの生体分子相互作用が並行的に測定される応用において、特に、分子標識が研究中の分子の機能を変化させ又は阻害する場合に有用である。タンパク質標的を用いる医薬化合物の高スループットスクリーニング、及びプロテオミクスのためのタンパク質−タンパク質相互作用のマイクロアレイスクリーニングは、この発明の組成物及び方法により与えられる感度及びスループットを必要とする応用の例である。
【０２３７】
表面プラズモン共鳴、共鳴鏡及び導波管バイオセンサーと異なり、記載した組成物及び方法は、数千の個別の結合反応がバイオセンサー表面で同時に起きることを可能にする。この技術は、多数の生体分子相互作用が並行的に(例えば、アレイ中で)測定される応用において、特に、分子標識が研究中の分子の機能を変化させ又は阻害する場合に有用である。これらのバイオセンサーは、特に、タンパク質標的を用いる医薬化合物ライブラリーの高スループットのスクリーニング、及びプロテオミクスのためのタンパク質−タンパク質相互作用のマイクロアレイスクリーニングに適している。この発明のバイオセンサーは、例えば、プラスチックエンボス手順を利用して、大きい領域で製造することができ、従って、一般的な使い捨ての研究室用のアッセイプラットホーム例えばミクロ滴定プレート及びマイクロアレイスライドに安価に組み込むことができる。
【０２３８】
他の類似のバイオセンサーも又、本発明において利用することができる。多くのバイオセンサーが、オリゴヌクレオチドを含む様々な生体分子複合体、抗体−抗原相互作用、ホルモン−レセプター相互作用、及び酵素−基質相互作用を検出するために開発されている。一般に、これらのバイオセンサーは、高度に特異的な認識用エレメントと分子的認識を定量可能なシグナルに変換するトランスデューサーの２つの構成要素からなる。シグナル変換は、蛍光、干渉法(Jenison等「Interference-based detection of nucleic acid targets on optically coated silicon」、Nature Biotechnology, 19,p.62-65；Lin等「A porous silicon-based optical interferometric biosensor」Science, 278,p.840-843, 1997)及び重量法(A. Cunningham, Bioanalytical Sensors, John Wiley & Sons (1998))を含む多くの方法により達成されてきた。光学ベースの変換方法の内で、蛍光化合物による分析物の標識を必要としない直接的方法が、相対的なアッセイの容易性及び小型分子と容易に標識されないタンパク質との相互作用を研究する能力のために興味深い。
【０２３９】
これらの直接的な光学的方法は、表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)(Jordan及びCorn,「Surface Plasmon Resonance Imaging Measurements of Electrostatic Biopolymer Adsorption onto Chemically Modified Gold Surfaces」、Anal.Chem.,69:1449-1456(1997)；プラズモン共鳴粒子(ＰＲＰ)(Schultz等、Proc.Nat.Acad.Sci., 97:996-1001(2000)；格子カップラー(Morhard等「Immobilization of antibodies in micropattems for cell detection by optical diffraction」、Sensors and Actuators B,70,p.232-242,2000)；楕円偏光法(Jin等「A biosensor concept based on imaging ellipsometry for visualization of biomolecular interactions」、Analytical Biochemistry, 232,p.62-72,1995)、エバネセント波装置(Huber等「Direct optical immunosensing (sensitivity and selectivity)」、Sensors and Actuators B,6,p.122.126,1992)、共鳴光散乱(Bao等、Anal.Chem.,74:1792-1797(2002)、及び反射率(Brecht及びGauglitz「Optical probes and transducers」、Biosensors and Bioelectronics, 10,p.923-936,1995)を包含する。表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)の光学現象における変化は、生物学的分子の間のリアルタイムの反応の指標として利用できる。これらの検出方法の理論的に予想される検出限界は、測定されており、診断的に適当な濃度範囲まで実行可能であることが実験的に確認されている。
【０２４０】
表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)は、成功裏に、様々な生化学的分析物の簡単で迅速且つ非標識のアッセイのための免疫センサー形式に組み込まれた。タンパク質、複雑な結合体、毒素、アレルゲン、薬物及び農薬を、検出エレメントとして高い感度及び選択性を有する自然抗体又は合成レセプターを利用して直接測定することができる。免疫センサーは、抗原−抗体反応をリアルタイムでモニターすることができる。広範囲の分子を、１０-9〜１０-13モル／Ｌの範囲の下限で検出することができる。幾つかの上首尾に商業的に開発されたＳＰＲ免疫センサーが利用可能であり、それらのウェブページには、技術情報が豊富である。Wayne等(Methods 22:77-91,2000)は、多くの最近のＳＰＲベースの免疫アッセイにおける開発、金表面の官能化、分子認識の新しいレセプター及び感度増強のための進歩した技術を総説して強調している。
【０２４１】
光学現象表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)の利用には、１９０２年のWoodによるその初期の発見(Phil.Mag.4(1902),p.396-402)以来、多大な発展が見られた。ＳＰＲは、簡単な、直接的検出技術であり、それを利用して、薄い金属フィルム表面の非常に近くで起きる屈折率(η)の変化をプローブ検出することができる(Otto Z. Phys.216(1968),p.398)。この検出機構は、全反射部位に生成されたエバネセント場の特性を利用している。この場は、金属フィルム内に透過し、振幅がガラス金属界面から指数関数的に減少する。表面プラズモン(金属フィルムの上面に沿って振動し伝搬する)は、平面偏光エネルギーの幾らかをこのエバネセント場から吸収して、全反射光の強度Ｉrを変化させる。Ｉrの入射角(又は反射角)θに対するプロットは、角度で測った強度プロフィルを生じ、鋭い伏角を示す。最小伏角の正確な位置(即ち、ＳＰＲ角θr)は、少数のダイオードからのＩrシグナルを最小に適合させる多項式アルゴリズムを利用して測定することができる。上部金属面への分子の結合は、表面媒質のηの変化を引き起こし、それは、θrのシフトとして観察することができる。
【０２４２】
バイオセンサー目的のためのＳＰＲの潜在的能力は、１９８２〜１９８３年に、Liedberg等により理解され、彼らは、免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)抗体上塗層を金検出フィルムに吸着させて、その後のＩｇＧの選択的結合及び検出を生じた(Nylander等、Sens.Actuators 3(1982),p.79-84；Lieberg等、Sens.Actuators 4(1983),p.229-304)。バイオセンサー技術としてのＳＰＲの原理は、以前に総説されている(Daniels等、Sens.Actuators 15(1988),p.11-18；VanderNoot及びLai, Spectroscopy 6(1991),p.28-33；Lundstrom Biosens.Bioelectron,9(1994),p.725-736；Liedberg等、Biosens.Bioelectron,10(1995)；Morgan等、Clin.Chem.42(1996),p.193-209；Tapuchi等、S.Afr.J.Chem.49(1996),p.8-25)。ＳＰＲのバイオセンサーへの応用は、ウイルス粒子から性ホルモン結合性グロブリン及び梅毒に至る広範囲の分子について示された。最も重要なことは、ＳＰＲは、多用途性及び、生体分子の蛍光又は放射性標識を必要とせずに結合相互作用をモニターする能力において、他の型のバイオセンサーを超える固有の利点を有することである。このアプローチは又、濃度、速度論的定数、及び個々の生体分子の相互作用ステップの結合特異性のリアルタイムの測定における有望性をも示した。抗体−抗原相互作用、ペプチド／タンパク質−タンパク質相互作用、ＤＮＡハイブリダイゼーション条件、ポリマーの生体適合性研究、生体分子−細胞レセプター相互作用、及びＤＮＡ／レセプター−リガンド相互作用を、すべて分析することができる(Pathak及びSavelkoul, Immunol.Today 18(1997),p.464-467)。商業的には、ＳＰＲベースの免疫アッセイの利用は、Biacore(スウェーデン、Uppsala在)(Jonsson等、Ann.Biol.Clin.51(1993),p.19-26)、Windsor Scientific (英国)(Windsor Scientific IBIS Biosensor のＷＷＷ ＵＲＬ)、Quantech (ミネソタ)(QuantechのＷＷＷ ＵＲＬ)及びTexas Instruments (テキサス、Dallas在)(Texas InstrumentsのＷＷＷ ＵＲＬ)などの会社により促進されてきた。
【０２４３】
更に別の具体例において、ＷＯ０２／０７４９９７に記載のように、蛍光ポリマースーパークエンチングベースのバイオアッセイを利用して、未標識ＰＥＴのその捕捉剤への結合を検出することができる。この具体例においては、標的ＰＥＴペプチド及び化学部分の両方に特異的な捕捉剤を利用する。この化学部分は、(ａ)捕捉剤のための認識エレメント、(ｂ)蛍光特性を変えるエレメント、及び(ｃ)この認識エレメントと特性を変えるエレメントを結合する繋留エレメントを含む。蛍光ポリマーを含む組成物と捕捉剤を、一つの支持体上の同じ場所に配置する。化学部分が捕捉剤に結合した場合には、その化学部分の特性を変えるエレメントは、蛍光ポリマーにより放射される蛍光を変える(消光する)だけ、蛍光ポリマーに十分に近い。分析物試料が導入された場合、この標的ＰＥＴペプチドは(存在するならば)、この捕捉剤に結合し、それにより、この化学部分をレセプターから退去させ、消光減少及び検出される蛍光の増加を生じる。標的の生物学的薬剤の存在を検出するためのアッセイも又、この出願で開示する。
【０２４４】
他の関連する具体例において、これらの捕捉剤とＰＥＴとの間の結合事象は、ＵＳ２００３／０００８４１４Ａ１に記載されたような水溶性の発光性量子ドットを利用することにより検出することができる。一具体例において、水溶性発光性半導体量子ドットは、コア、キャップ及び親水性結合基を含む。ＩＩＢ−ＶＩＢ、ＩＩＩＢ−ＶＢ又はＩＶＢ−ＩＶＢ半導体の何れのコアでもこの関連で利用することができるが、このコアは、キャップとの組合せにおいて、発光性量子ドットを生じるようでなければならない。ＩＩＢ−ＶＩＢ半導体は、周期律表のＩＥＢ族に由来する少なくとも一つの元素及びＶＩＢ族に由来する少なくとも一つの元素を含む化合物などである。好ましくは、このコアは、大きさが約１ｎｍから約１０ｎｍに及ぶＩＩＢ−ＶＩＢ、ＩＩＩＢ−ＶＢ又はＩＶＢ−ＩＶＢ半導体である。このコアは、一層好ましくは、ＩＩＢ−ＶＩＢ半導体であり、大きさにおいて約２ｎｍから約５ｎｍに及ぶ。最も好ましくは、このコアは、ＣｄＳ又はＣｄＳｅである。このことに関して、ＣｄＳｅは、特に大きさが約４．２ｎｍのものは、コアとして特に好ましい。
【０２４５】
この「キャップ」は、コアの半導体とは異なる半導体であって、コアに結合し、それにより、コア上に表面層を形成する。このキャップは、所定の半導体コアとの組合せに際して、発光性量子ドットを生じるようでなければならない。このキャップは、コアを、コアより高いバンドギャップを有することにより不動態化すべきである。これに関して、キャップは、好ましくは、高いバンドギャップのＩＩＢ−ＶＩＢ半導体である。一層好ましくは、キャップは、ＺｎＳ又はＣｄＳである。最も好ましくは、キャップは、ＺｎＳである。コアがＣｄＳｅ又はＣｄＳである場合には、キャップは、好ましくは、ＺｎＳであり、コアがＣｄＳｅである場合には、キャップは、好ましくは、ＣｄＳである。
【０２４６】
「結合基」は、ここで用いる場合、任意の安定な物理的又は化学的結合によって発光性半導体量子ドットのキャップの表面に結合することができ、量子ドットをもはや発光性にすることなく水溶性にすることのできる任意の有機基を指す。従って、この結合基は、親水性部分を含む。好ましくは、この結合基は、親水性量子ドットを少なくとも約１時間、１日、１週間又は１ヶ月にわたって溶液中に維持することを可能にする。望ましくは、結合基は、共有結合によりキャップに結合され、親水性部分が露出されるような仕方でキャップに結合される。好ましくは、親水性結合基は、硫黄原子を介して量子ドットに結合される。一層好ましくは、親水性結合基は、硫黄原子及び少なくとも１つの親水性結合基を含む有機基である。適当な親水性結合基には、例えば、カルボン酸若しくはその塩、スルホン酸若しくはその塩、スルファミン酸若しくはその塩、アミノ置換基、第四アンモニウム塩、及びヒドロキシが含まれる。本発明の親水性結合基の有機基は、好ましくは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基又はアリール基、一層好ましくは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、尚一層好ましくは、Ｃ１〜Ｃ３アルキル基である。それ故、好適具体例において、本発明の結合基は、チオールカルボン酸又はチオールアルコールである。一層好ましくは、この結合基は、チオールカルボン酸である。最も好ましくは、この結合基は、メルカプト酢酸である。
【０２４７】
従って、水溶性発光性半導体量子ドットの好適具体例は、約４．２ｎｍの大きさのＣｄＳｅコア、ＺｎＳキャップ及び結合基を含むものである。水溶性発光性半導体量子ドットの他の好適具体例は、ＣｄＳｅコア、ＺｎＳキャップ及び結合基メルカプト酢酸を含むものである。特に好適な水溶性発光性半導体量子ドットは、約４．２ｎｍのＣｄＳｅコア、約１ｎｍのＺｎＳキャップ及びメルカプト酢酸結合基を含む。
【０２４８】
本発明の捕捉剤は、親水性結合基を介して量子ドットに結合できる。この捕捉剤は、任意の安定な物理的又は化学的結合などにより、水溶性発光性量子ドットの親水性結合基に、直接又は間接的に、任意の適当な手段によって、少なくとも１つの共有結合によって、捕捉剤又は量子ドットの機能を害しない随意のリンカーを介して結合することができる。例えば、結合基がメルカプト酢酸であって、核酸生体分子がこの結合基に結合するならば、リンカーは、好ましくは、第一アミン、チオール、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ビオチンなどの分子である。結合基がメルカプト酢酸であって、タンパク質生体分子又はその断片がこの結合基に結合するならば、リンカーは、好ましくは、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ビオチンなどの分子である。
【０２４９】
量子ドット捕捉剤結合体の利用により、ＰＥＴ含有試料は、上記のように結合体と接触した場合、発光の放射を促進する(結合体の捕捉剤がＰＥＴペプチドに特異的に結合する場合)。これは、捕捉剤が核酸アプタマー又は抗体である場合、特に有用である。アプタマーを利用する場合、蛍光クエンチャーを、自己対合ステムループ構造を介して量子ドットに隣接して位置させることができる(アプタマーがＰＥＴ含有配列に結合しない場合)別の具体例を採用することができる。アプタマーがＰＥＴに結合する場合、ステムループ構造は、開き、そうして、クエンチング効果を和らげて、発光を生じる。
【０２５０】
他の関連する具体例において、ＵＳ２００２／０１１７６５９Ａ１に記載されたようなナノワイヤー又はナノチューブを含むナノセンサーのアレイを利用して、ＰＥＴ−捕捉剤相互作用の検出及び／又は定量を行なうことができる。簡単にいえば、「ナノワイヤー」は、１ナノメートルほどの薄い断面寸法を有することのできる伸長されたナノスケールの半導体である。同様に、「ナノチューブ」は、中空のコアを有するナノワイヤーであり、当業者に公知のナノチューブが含まれる。「ワイヤー」は、少なくとも半導体又は金属の伝導性を有する任意の材料を指す。これらのナノワイヤー／ナノチューブは、ナノワイヤーがさらされた試料中の分析物(例えば、ＰＥＴペプチド)を測定するために構築されて配置されたシステムにおいて利用することができる。ナノワイヤーの表面は、捕捉剤で被覆することにより官能化されている。分析物の官能化ナノワイヤーへの結合は、ナノワイヤーの導電性又は光学特性の検出可能な変化を引き起こす。従って、分析物の存在を、ナノワイヤーの特性典型的には電気的特性又は光学特性の変化を測定することにより測定することができる。アミノ酸、タンパク質、糖、ＤＮＡ、抗体、抗原及び酵素などを含む様々な生体分子実在物を被覆に利用することができるが、これらに限られない。ナノワイヤーの構築、様々な生体分子(例えば、本発明の捕捉剤)による官能化、及びナノワイヤー装置での検出などについて、一層詳細には、ＵＳ２００２／０１１７６５９Ａ１を参照されたい。各々異なる捕捉剤を官能化原子団として有する多数のナノワイヤーを並行的に利用することができるので、この技術は、生物学的試料中のＰＥＴ含有粒子の、ＰＥＴペプチドの標識を必要としない、大規模なアレイ化検出に理想的に適している。このナノワイヤー検出技術は、ｐＨ変化(Ｈ+結合)、ビオチン−ストレプトアビジン結合、抗体−抗原結合、金属(Ｃａ2+)結合を、ピコモルの感度で、リアルタイムで検出するために、上首尾に利用されてきた(Cui等、Science 293:1289-1292)。
【０２５１】
マトリクス補助レーザー脱着／イオン化飛行時間質量分析(ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ)は、レーザーパルスを利用して、タンパク質を表面から脱着し、その後、質量分析を行なって、それらのタンパク質の分子量を同定する(Gilligan等、Mass spectrometry after capture and small-volume elution of analyte from a surface plasmon resonance biosensor. Anal.Chem.74(2002),p.2041-2047)。この方法は、タンパク質の質量だけを界面で測定するので、及び脱着プロトコールが断片化を生じないだけ十分に穏やかであるので、ＭＡＬＤＩは、結合したＰＥＴペプチドの正体、又はＰＥＴペプチドの任意の酵素的改変を確認するような直接的で有用な情報を与えることができる。この問題に関しては、ＭＡＬＤＩを利用して、固定化捕捉剤に結合したタンパク質を同定することができる。結合したタンパク質を同定するのに重要な技術は、アレイ(及び該アレイに選択的に結合したタンパク質)をプロテアーゼで処理してから、その結果生成したペプチドを分析して、配列データを得ることに依存している。
【０２５２】
９．タンパク質の高精度の機能的測定における多数のＰＥＴの利用
この発明のある具体例において、関心ある各タンパク質／断片について２以上のＰＥＴを生成することは有利でありうる。例えば、同じエキソン内の２つのＰＥＴを利用して、２つの異なる第一の捕捉抗体又は２つの異なる第二の(検出)抗体を生産して、重複する測定を提供することができる。この理由の部分は、トリプシン消化(又は、上記の任意の他のプロテアーゼ処理又は化学的断片化法)が不十分であるか又はある断片に偏っていることがありうることである。同様に、ＰＥＴ特異的捕捉剤による断片化されたポリペプチドの回復は、ときに、不完全であり及び／又は偏っていることがありうる。それ故、１つの特異的ＰＥＴ捕捉剤を標的ポリペプチドの測定に利用することに伴うある種のリスクがありうる。
【０２５３】
この潜在的問題を克服するため、又は少なくとも上記の不完全な消化／回復の問題を補償するために、関心あるポリペプチドに対する２以上のＰＥＴを生成して、本発明の同じアレイ上で使用することができ、又は同じポリペプチドの異なるＰＥＴを独立に検出するための競合アッセイの同じセットで使用することができる。かかる重複するＰＥＴ特異的捕捉剤を利用することにより得られる平均測定結果は、単一のＰＥＴ特異的捕捉剤を用いて得られる結果と比較して、遥かに正確で信頼できるものであるはずである。
【０２５４】
他方、ある種のタンパク質は、同じ生物学的試料中で異なる形態を有しうる。例えば、幾つかのタンパク質は、一箇所以上の特異的位置で、翻訳後修飾されうる。１００種より多くの異なる種類の翻訳後修飾があり、最も一般的なものは、アセチル化、アミド化、脱アミド化、プレニル化、ホルミル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、ミリストイル化、リン酸化、ユビキチン化、リボシル化及び硫酸化である。特定の修飾の型、例えばリン酸化について、一の部位でリン酸化されたＰＥＴペプチドは、リン酸化されてない同じＰＥＴペプチドに対して生産された捕捉剤により認識されえない。それ故、標的タンパク質(非修飾標的タンパク質を表す)の非修飾ＰＥＴペプチドに特異的な第一の捕捉剤の結果を、同じ標的タンパク質(如何なるリン酸化部位も含まず、それ故、標的タンパク質の全量を表す)中の他のＰＥＴに特異的な第二の捕捉剤の結果と比較することにより、リン酸化された標的タンパク質の該試料中のパーセンテージを測定することができる。
【０２５５】
同じ原理が、プロセッシングを受けてない／プレ型及びプレプロセッシングを受けた／成熟型のある種の成長因子、サイトカイン、及びプロテアーゼ；選択的スプライシング型；及びすべての形態の翻訳後修飾を含む、異なる形態を有するすべての標的タンパク質に当てはまる。
【０２５６】
ある具体例において、同じ標的タンパク質の異なるＰＥＴに特異的な捕捉剤は、同じカテゴリーである必要はない(例えば、ＰＥＴ１に特異的な抗体であってよいし、ＰＥＴ２に対する抗体でない結合性タンパク質などであってよい)。
【０２５７】
他の具体例においては、一以上のＰＥＴの存在又は非存在が、標的タンパク質のある機能状態を示す。例えば、幾つかのＰＥＴは、ある種のタンパク質のプロセッシングを受けてない型(例えば、ペプチドホルモン、成長因子、サイトカインなど)にのみ存在して、同じタンパク質の対応する成熟型／プロセッシングを受けた型には存在しない。これは、通常、プロセッシング部位がＰＥＴ内に存する状況において生じる。他方、他のＰＥＴは、プロセッシングを受けた型と受けてない型の両方に共通のものでありうる(例えば、如何なるプロセッシング部位も含まないもの)。もし両方の型のＰＥＴを同じアレイ又は同じ競合アッセイで用いるならば、プロセッシングを受けた標的タンパク質／プロセッシングを受けてない標的タンパク質の豊富さと比を評価することができる。
【０２５８】
他の具体例においては、多数のＰＥＴ特異的捕捉剤を利用する測定の大いに改良された全体的正確さの故に、この発明は、ある種の低い検出レベル(１〜５ｐＭなど)を有する(これは、バックグラウンドシグナルによって容易に曖昧なものとなる)ので以前には適当でなかったバイオマーカーの検出に適用される。例えば、上記のように、Punglia等(N. Engl. J. Med. 349(4): 335-42, ７月、2003年)は、ことを示した。標準的なＰＳＡベースの前立腺癌のスクリーニングにおいて、生検を行なうＰＳＡ値の閾値を４．１ｎｇ／１００万と設定したならば、若年者の８２パーセント及び一層高齢の者の６５パーセントが見落とされるであろう。従って、前立腺生検を勧めるための一層低いＰＳＡの閾値レベルは、特に若年者において、ＰＳＡ試験の臨床値を改善することができる。しかしながら、一層低い検出限界、バックグラウンドは、有意の問題となりうる。多数のＰＥＴ特異的捕捉剤のアッセイの感度／選択性のアッセイを用いて、低レベルのＰＳＡを高い信頼性と正確さで検出することができる。
【０２５９】
同様に、増大した測定の正確さの故に、濃度の小さな変化が、一層容易に且つ高い信頼度で検出される。それ故、同じ方法を、他の、以前には病気のバイオマーカーとして認められなかったタンパク質にも、タンパク質レベルの非常に小さい変化を非常に正確にモニターすることによって、利用することができる。「小さい変化」は、病気の試料を正常な／対照用試料と比較する際の、約５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、１％以下の濃度の変化を指す。
【０２６０】
測定の精度は、通常、個々の測定値の、多数の独立の測定の平均値により合理的に正確に表されうる真の値と比較した際の、変動の程度によって規定される。ある方法が一層正確であるほど、無作為の測定が、真の値と比較して一層近いものとなる。ｘ％の精度の測定は、それらの測定値のｘ％が平均値の１標準化偏差以内に入ることを意味する。この発明の方法は、通常、少なくとも約７０％の、好ましくは、８０％、９０％の又はそれを超える精度である。
【０２６１】
捕捉されたＰＥＴ含有ポリペプチド断片の存在及び量の検出は、結合事象の検出／定量に適用することのできる上記の方法の何れかを利用して、実施することができる。
【０２６２】
繰り返すために、例えば、アレイ上の各一次捕捉剤につき、一次捕捉剤により捕捉されるべきＰＥＴ含有ペプチドに結合する、特異的な、検出可能な二次捕捉剤を生成することができる。この二次捕捉剤は、捕捉されるべきポリペプチド分析物上の第二のＰＥＴ配列に特異的であってよく、又は捕捉されるべきポリペプチド分析物上に存在する翻訳後修飾(リン酸化など)に特異的であってもよい。検出／定量を促進するために、二次捕捉剤を、酵素、蛍光標識、着色可能な染料、化学発光性化合物、コロイド粒子、放射性同位体、近赤外染料、ＤＮＡデンドリマー、水溶性量子ドット、ラテックスビーズ、セレン粒子、又はユーロピウムナノ粒子から選択する検出可能名部分によって標識することができる。
【０２６３】
或は、捕捉されたＰＥＴ含有ポリペプチド分析物は、質量分析法、比色共鳴反射(ＳＷＳ又はＳＲＶＤ使用)、バイオセンサー、表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)、干渉法、重量測定、楕円偏光法、エバネセント波装置、共鳴光散乱、反射測定法、蛍光ポリマー消光ベースのバイオアッセイ、又はナノワイヤー若しくはナノチューブを含むナノセンサーのアレイを利用して、直接検出することができる。
【０２６４】
この発明の他の面は、試料中の一種以上の標的タンパク質に特異的な重複する捕捉剤を含むアレイを提供する。かかるアレイは、上記の方法(例えば、標的タンパク質の高精度の機能的測定)を実施するのに有用である。一具体例において、幾つかの異なる捕捉剤をアレイにして、同じ標的タンパク質に由来する異なるＰＥＴ含有ペプチド断片を検出する。他の具体例において、このアレイは、幾つかの異なる標的タンパク質を検出するために利用することができ、それらのタンパク質の少なくとも幾つか(すべてでなくてよい)は、それらの標的タンパク質の種々のＰＥＴに特異的な捕捉剤を利用することによって、２回以上検出されうる。
【０２６５】
この発明の他の面は、複数の捕捉剤を含む組成物を提供し、該捕捉剤の各々は、標的タンパク質の一のＰＥＴを認識して、それと相互作用する。この組成物は、上記のアレイ装置において、アレイ形式で利用することができる。
【実施例】
【０２６６】
この発明を、更に、下記の実施例(制限と解するべきではない)によって説明する。
【０２６７】
実施例１：  Ｂｃｌ−ｘイソ型の検出
タンパク質Ｂｃｌ−ｘの２つの型(イソ型１：ＮＰ＿６１２８１５；イソ型２：ＮＰ＿００１１８２)が、同定されており、下記に、図式表示(図２及び３)及び配列アラインメント(図４)で示してある。Ｂｃｌ−ｘは、アポトーシス因子のＢｃｌ−２ファミリーのメンバーである。Ｂｃｌ−ｘの選択的スプライシングは、反対のアポトーシス活性を有する２つのイソ型を生じる。Ｂｃｌ−ｘの長いイソ型は、抗アポトーシス的であるが、Ｂｃｌ−ｘの短いイソ型は、前アポトーシス的である。やはり図式表示したのは、プロテアーゼ開裂部位並びにトリプシン及びＬｙｓＣ消化の両者につきその結果生成したタンパク質断片である(図３)。タンパク質断片は、その型にユニークである２つのタンパク質イソ型の各々から選択してある。これらの図から分かるように、トリプシン消化及びＬｙｓＣ消化の両者は、各イソ型にユニークな少なくとも一のタンパク質分解性断片及び両者に共通のものの創出を生じている。確立されたＰＥＴ(peptide epitope tag)ピッキングアルゴリズムを利用して、８量体ＰＥＴ配列が、各断片について同定された(このプロテオームに対してユニークネス、Ｂｃｌ−ｘイソ型を除く)。この実験においては、各断片につき２つのＰＥＴを、両抗体がこの断片に同時に十分に接近して「抗体サンドイッチ」を形成することを確実にするために、それらの２配列間の４アミノ酸の最小間隔で選択した。
【０２６８】
図５及び６は、それぞれ、ｌｙｓＣ又はトリプシンによる断片化に際して生成された長い又は短い型のＢｃｌ−ｘに特異的であるペプチド断片についてのアミノ酸配列を描いている。各示した領域から選択したペプチド免疫原に対して抗体を生産して、各型のＢｃｌ−ｘに特異的な新規なサンドイッチ対を生成することができる。共通の抗体(例えば、図５における抗体１及び２)を、サンドイッチ対の２つの抗体の一方につき利用することができるが、同じ断片に結合する２つの抗体の組合せ(例えば、抗体対１及び２ｖ、抗体対１及び３ｖ、抗体対２及び４)は、ユニークであるということに注意されたい。その上、これらの２つのイソ型は、断片化されており、共通の抗体(例えば、抗体１及び２)が、一緒に、短い型のイソ型のみを同定する。即ち、長い型のイソ型が共通の抗体についてのＰＥＴを含んでいても、この断片化スキームは、それらの２つのＰＥＴを異なる断片上に生成する。
【０２６９】
実施例２：  ＣＤ４４イソ型の検出
幾つかのイソ型ファミリー(特に、多くの可変エキソンを組み込んだもの)については、すべてのイソ型の間でユニークに識別することは、上記の場合ほど簡単ではありえない(すべての又は幾つかのイソ型が、所定試料中に存在する)。一層複雑な場合には、イソ型は、共通のペプチド断片を共有する幾つかのグループに別れる。この応用の良好な例は、ＣＤ４４イソ型ファミリーである。
【０２７０】
ＣＤ４４は、細胞接着、リンパ球活性化、細胞−細胞及び細胞−細胞外マトリクス相互作用、及び腫瘍の成長及び発達において様々な役割を有する細胞表面レセプターである。このＣＤ４４の遺伝子は、２０エキソンよりなり、その中間部の１０個は、「可変」に対する「ｖ」を番号の後に伴って示される選択的スプライシングを受ける(図７参照)。エキソン１〜５及び１６〜２０は、不変であり、すべて公知のイソ型にて存する。１ダースほどのＣＤ４４イソ型しか同定されていないが、ＣＤ４４の選択的スプライシングは、数百のイソ型を生成する潜在的能力を有している。現在同定されているものの内で、殆どのものは、新規な機能をゆうしているか、新規な病気と関係している。標準型のＣＤ４４(ＣＤ４４ｓ)は、すべての可変エキソンを欠失しており、むしろいたるところで発現されるが、他の型は、非常に異なる発現パターンを有している。例えば、イソ型Ｍｅｔａ−１(４ｖ−７ｖ)及びＭｅｔａ−２(６ｖ−７ｖ)は、正常組織では検出されず、腫瘍の転移性拡大に関与している。上皮ＣＤ４４(８ｖ−１０ｖ)及びＣＤ４４ｖケラチノサイト(３ｖ−１０ｖ)は、それぞれ、上皮細胞及びケラチノサイトに限られた発現を有する。(図７参照)
【０２７１】
ＣＤ４４のｌｙｓＣでの消化は、一組のタンパク質分解断片(図８参照)を生じ、それらを利用して、２種の抗体をサンドイッチ形式で用いてイソ型を区別することができる。すべてのＣＤ４４の潜在的イソ型は、隣接する不変のエキソンを含むに違いないので、一以上の可変、イソ型特異的なエキソンを有する一のタンパク質分解断片に入るこれらの領域に対して生産された抗体は、サンドイッチ対の形成において「アンカー」として役立ちうる(図９参照)。加えて、全ＣＤ４４(試料中には、すべてのイソ型が存在する)のレベルは、不変のエキソン１〜４(又は、１６〜２０)から選択するサンドイッチ対によって定量することができる(これらの２つの領域は、ＬｙｓＣ消化によって開裂されず且つすべてのイソ型に存在するので)。
【０２７２】
Ａ．  ＣＤ４４イソ型の検出：ケース１ − ユニークに同定される２つの型
分析すべき試料中にＭｅｔａ−１とＣＤ４４ｓだけが存在する単純なケースの一例として、Ｍｅｔａ−１は、２つの新規なｌｙｓＣ断片：５−４ｖ−Ｎ末端５ｖ及びＣ末端５ｖ−６ｖ−７ｖ−１６−１７−１８の生成によってユニークに同定される(図１０参照)。ＣＤ４４ｓは、２つのアンカーエキソン：５−１６−１７を結合するタンパク質分解断片によってユニークに同定される(図１１参照)。
【０２７３】
同様に、ＣＤ４４ｓに関連する他のイソ型を、どの可変エキソンが、不変のＮ−(５)及びＣ−(１６)末端エキソンに融合されるかによって検出することができる。
【０２７４】
Ｂ．  ＣＤ４４イソ型の検出：ケース２ − 共通の特徴を共有する３つの型
２つの公知のイソ型の識別についてのケース１に記載した同定及び定量測定手順を、３以上のイソ型のケースに拡張することができる。ＣＤ４４ｓ、Ｍｅｔａ−１及びＭｅｔａ−２型を含む試料についての説明用の実施例として、下記の３つの測定を必要とする手順を利用する(図１２参照)。第一の測定は、Ｍｅｔａ−１についての結果を生じる(ユニークな５−４ｖ断片の測定による)。第二の測定は、Ｍｅｔａ−１＋Ｍｅｔａ−２の結果を生じる(共有される７ｖ−１６断片の測定による)。この結果は、上記の「１」と合わせて、Ｍｅｔａ−２の量を与える。第三の測定は、ＣＤ４４ｓ＋Ｍｅｔａ−２についての結果をあたえる(５及び１６の両方を含む断片の測定による)。Ｍｅｔａ−１は、５と１６の間で断片化されるので、たとえそれが５と１６の両方を含んでいても検出されない。この結果は、上記の「２」と合わせて、ＣＤ４４ｓの量を与える。
【０２７５】
個々のイソ型を測定するために一つより多くの方法を構想することができるということは理解されるべきである。ここ及び図１２に記載の具体例は、単に、説明目的のものに過ぎない。
【０２７６】
測定の妥当性は、更に、最初の５つの不変エキソンを標的とするサンドイッチ抗体の対の利用による、存在するＣＤ４４の全量の独立した測定によって確認することができる(図１３参照)。
【０２７７】
Ｃ．  ＣＤ４４イソ型の検出：ケース３ − 包括的なイソ型の識別
すべての可能なイソ型の検出のための包括的解決は、各可変エキソン並びに不変アンカーエキソンに対して生産した一組の捕捉剤抗体を組み込んだ抗体アレイを利用することができる。同じ捕捉剤抗体の組を、アレイをプローブ検査するための検出用抗体としても利用する。測定すべき試料中に存在する各ＣＤ４４イソ型は、消化後、ユニークな抗体シグネーチャーを生じる。各検出抗体は、ユニーク標識で標識され又はそのアレイは、順次的に、各検出抗体を用いてプローブ検査することができる。すべての可能な抗体対を表す一組のペプチド標準に対して抗体応答を較正することにより、各捕捉抗体についてのシグナルの定量測定が生成される。デコンボルーションアルゴリズムを利用して、この定量的結果は、すべての可能な抗体シグネーチャーの知識と組み合わせて、試料中に何れのイソ型が存在するかをそれらの相対的量と共に同定するために利用することができる。一例として、下記の試料中に存在する４つのイソ型のケースを考えよ(すべては、等モル濃度である(図１４))。
【０２７８】
各イソ型についてユニークな抗体アレイのシグネーチャーを、図１５に示してある。各矩形の横に沿った数値は、その点における捕捉剤抗体を表している。各スポット内のこれらのグリッドは、標識した検出抗体を表しており、従って、特異的サンドイッチ対の形成を示している。特異的アレイの位置に印を付けた正方形は、特異的な抗エキソン検出抗体の正の結合を表している。
【０２７９】
２ｖ−４ｖ−５ｖ−６ｖ−７ｖの例について、この不変のエキソン５に対して生産された捕捉剤抗体は、５（ｃ）(消化部位に対してＣ末端側のエキソン５の部分)、２ｖ、４ｖ、及び５ｖ−ｎ(消化部位に対してＮ末端側のエキソンの部分)に対して生産された検出抗体を用いてサンドイッチ対を形成することができる。従って、アレイの左上の隅には、「５」と標識されて太線で境界をつけられた矩形中に、この矩形内に存する１２の正方形がある。これらの１２の正方形の各々において、不変のエキソン５に対して生産された捕捉抗体を固定化し、それで、エキソン５のＣ末端部分、エキソン７(２ｖ)及び９(４ｖ)、並びにエキソン１０(５ｖ)のＮ末端部分を含むポリペプチド断片が、その捕捉抗体を有するこれらの正方形の各々にプルダウンされる。一具体例において、これらの正方形の少なくとも一つは、不変エキソン５に対する捕捉剤抗体の代わりに、正又は負の対照用抗体を含むことができる。他の具体例においては、同じペプチド断片の種々の領域例えばエキソン５の他の領域／エピトープに対して生産された種々の捕捉剤抗体を用いて、一層良好な平均結果を与えるために、同じデータの組の重複する測定を与えることができる。
【０２８０】
これらの配列を、次いで、同時に又は順次的に、検出及び定量のための種々の標識した二次抗体を用いて、プローブ検査する。
【０２８１】
例えば、「５」という名称を付けられた同じ矩形について、第一の正方形(１行、１列)は、エキソン６に対して生産された抗体(１ｖ)によりプローブ検査された(このエキソンは、スプライシングイソ型２ｖ−４ｖ−５ｖ−６ｖ−７ｖには存在しない)。それ故、サンドイッチ対は、この正方形では形成されず、この結果は、陰性である(これは、定量的実験においてバックグラウンドノイズレベルを与える負の対照たりうる)。同様に、第二の正方形(１行、２列)は、エキソン７に対して生産された抗体(２ｖ)によりプローブ検査された(このエキソンは、スプライシングイソ型２ｖ−４ｖ−５ｖ−６ｖ−７ｖ及びプルダウンされた５(ｃ)−２ｖ−４ｖ−５ｖ(ｎ)ペプチド断片に存在する)。それ故、サンドイッチ対が、この正方形においては形成され、その結果は、陽性である。エキソン４ｖ及び５ｖ(ｎ)に対して生産された検出抗体(それぞれ、１行、４列及び５列)についても同様である。この矩形中の残りの正方形は、すべて、陰性の結果を与えた(又は、陰性の結果を生じさせることが予想されるので単にプローブ検査をしなかった)。
【０２８２】
同アレイの他の矩形に対して、同じ分析を行ない、各矩形は、それらの外側に名称を付けられたそれぞれのエキソン(１ｖ、２ｖ、３ｖ、・・・１０ｖなど)に対して生産された異なる捕捉抗体を利用している。
【０２８３】
各陽性の正方形内の数は、その特定の断片及びサンドイッチ対についての定量的測定を表している。アレイの右下隅は、存在するＣＤ４４の最初の５つの不変エキソンを標的とするサンドイッチ抗体対の利用による測定の全量を与えている(図１５参照)。
【０２８４】
各サンドイッチ対の結合特性は、標準化されたアッセイ条件を用いて予備測定される。適宜、このアレイに対して用いられる各サンドイッチ対の量を、同じモル濃度のプルダウンペプチド断片が実質的に同じシグナル強度又は読み出し値を与えるように、較正／規格化することができる(これは、デコンボルーション工程を簡略化する)。
【０２８５】
個々のシグネーチャーは、４つすべてののイソ型からのシグナルの寄与により、直接には、試料測定から識別されえない。むしろ、この測定は、図１６に示したように、全応答の合計を与える(それは、図１５の４つのイメージを重ねることにより得ることができる)。例えば、このアレイの左上において、エキソン「５」と印された矩形において、１行、２列の唯一つの陽性の正方形しかない(図１５参照)。従って、図１６においては、１行、２列の累積シグナルは、「１」である。しかしながら、図１５において、４つの１行、４列の正方形の内の３つが陽性の正方形である。その結果、１行、４列についての累積結果は、図１６において、「３」である。
【０２８６】
全イソ型の全量は、アレイの右下隅に記録されており、この実施例では、それは、４モル当量である。これらのアレイエレメントの幾つかは又、４つの定量的測定をも報告しており、それは、この特徴が、下記ように、試料中の全イソ型に存在することを示している：５ｖ−ｎと同じ断片中の不変エキソン５及び５ｖ−ｃと同じ断片中の不変エキソン１６(各々、各抗体を捕捉剤として用いる２つの異なる測定により確認)。加えて、エキソン１ｖ、３ｖ、８ｖ、９ｖ又は１０ｖを含むイソ型がないということは明らかである。これは、残りのデータをデコンボルートして何れのＣＤ４４イソ型が試料中に存在するか、及び存在する場合に各々の濃度を測定することができるという枠組みを与える。
【０２８７】
この分析を、異なる断片化パターンを創出し、それ故異なるイソ型シグネーチャーの組を創出する異なるプロテアーゼを用いて繰り返すことは可能である。
【０２８８】
実施例４：典型的な試料調製
この発明の方法のための試料は、ここに記載の方法の何れかによって調製することができる。この実施例は、サンドイッチアッセイなどのある幾つかの具体例に好適である特別な調製方法を提供する。しかしながら、それは、決して制限ではないことは理解されるべきである。
【０２８９】
典型的な試料を、５ｍＭ ＴＣＥＰ(トリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン)、０．０５％(ｗ／ｖ)ＳＤＳ及び凡そ２０ｍＭのトリエタノールアミン(ｐＨ８．５)中に調製した。この混合物を約１００℃で約５分間にわたって加熱してから、室温(約２５℃)まで冷却した。次いで、インドアセトアミドを約１０ｍＭの濃度まで加えて、その試料を、約３０分間にわたって室温で(通常、暗黒中で)アルキル化した。次いで、試料中のタンパク質量に対して約１／２０(ｗ／ｗ)のトリプシンを加えた(例えば、全タンパク質濃度が約１ｍｇ／ｍｌであるならば、０．０５ｍｇ／ｍｌのトリプシンを加える)。消化を、２時間〜一晩、３７℃で行なった。
【０２９０】
実施例５：スプライス変異体のモデル系 − タンパク質分解例
下記のタンパク質分解の例は、本発明の具体例を説明するために与えられ、そこでは、２つのイソ型が同定され、そして第一及び第二のエピトープの２つの組合せを利用して、一試料中で定量することができる。各組合せ中の第一のエピトープ(ＨＡ抗体により結合される)及び一の組合せ中の第二のエピトープ(Ｇｌｕ−Ｇｌｕ抗体により結合される)の各々は、試料中の一種より多くのペプチド生成物上に存在する(消化後開裂されない短型イソ型を、ペプチド生成物と考える)。
【０２９１】
簡単なモデル系を、市販のペプチド特異的抗体及び合成ペプチドのセットを利用して生成する。このモデルは、表１で長型イソ型及び短型イソ型としてそれぞれ同定される２つの標的イソ型(合成物)を含む。この長型イソ型は、エキソン１、２及び３を含み、短型イソ型は、エキソン１及び３を含む。市販の抗体ＨＡ、ＡＵ５及びＧｌｕ−Ｇｌｕ(これらは、表１に記載のように、それぞれ、エキソン１、２及び３上のエピトープに対して特異的である)を購入することができる。
【表１】
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【０２９２】
長型及び短型イソ型の各々及び両方を、それぞれ含む試料を、予め選択した試料中のタンパク質を断片化するためのプロテアーゼＬｙｓ−Ｃで処理する。Ｌｙｓ−Ｃの選択性の故に、長型のみが、エキソン３がエキソン１及び２から分離することで、２つの断片に開裂される。短型は、無傷のままである。これらの２つのイソ型の混合物は、断片化後に、図１７に示したように、ＨＡ／ＡＵ５、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、及びＨＡ／Ｇｌｕ−Ｇｌｕと表示される３つの断片生成物を生じる。
【０２９３】
エキソン１に対する抗体(ＨＡ)を平面アレイにプリントする。対照用に、スプライス変異体イソ型(長型及び短型)をこのアレイとインキュベートしてから、エキソン２(ＡＵ５)又はエキソン３(Ｇｌｕ−Ｇｌｕ)上のペプチドをそれぞれ認識する標識した抗体を用いて検出する。予想された対照の結果を、図１８に示す。図１８において、左欄は、消化前の結合したペプチド−抗体の組合せを示しており、右欄は、Ｌｙｓ−Ｃによる消化後の結合したペプチド−抗体の組合せを示している。長型の並び(上段のボックス)は、長型のイソ型又はペプチド生成物のみを有する試料を示しており、短型の並び(下段のボックス)は、短型のイソ型又はペプチド生成物のみを有する試料を示している。長型の並びに示したように、消化前には、長型イソ型は、ＨＡ＋ＡＵ５抗体の組合せ及びＨＡ＋Ｇｌｕ−Ｇｌｕ抗体の組合せの両者によって検出される(何故なら、これらの３つのペプチド(それぞれのエキソン中の、ＨＡ／ＡＵ５／Ｇｌｕ−Ｇｌｕ)は、すべて、長型イソ型中に存在するので)。しかしながら、消化後には、エキソン１及び３は、長型において分離され、それ故、対応する抗体の組合せ(ＨＡ＋Ｇｌｕ−Ｇｌｕ)は、シグナルを示さない。短型は、消化に影響されない。従って、消化の前と後の両方で、これらの短型の２つのエピトープ(２つのエキソン中の、ＨＡ／Ｇｌｕ−Ｇｌｕ)に対する抗体の組合せは、シグナルを示している。短型中にないエピトープ(ＡＵ５)は、消化の前後で、対応する抗体の組合せ(ＨＡ＋ＡＵ５)からのシグナルを示していない。
【０２９４】
それ故、予想された結果は、断片化後に、ＨＡ＋Ｇｌｕ−Ｇｌｕ抗体の組合せが短型を明りょうに示すことを示している(断片化前には示していない)。加えて、断片化の前後で、ＨＡ＋ＡＵ５抗体の組合せは、長型を明りょうに示している。
【０２９５】
試料を用いた実施例として、図１９に示したように、長型及び短型の混合物を、Ｌｙｓ−Ｃによる断片化の前後で、同様のアレイにて比較する。第一の混合物は、１０％の短型と９０％の長型を含むが、第二の混合物は、各々５０％の短型と長型を含む。予想された結果は、消化前には、ＨＡ＋Ｇｌｕ−Ｇｌｕの抗体の組合せは、短型と断片化されてない長型イソ型の両方に結合するので、試料中の短型の存在を明りょうに示すことができないことを示している。しかしながら、図１９に示したように、消化後には、ＨＡ＋Ｇｌｕ−Ｇｌｕ抗体の組合せは、試料中の短型の存在を明りょうに示している(そして、上記のように、ＨＡ＋ＡＵ５抗体の組合せは、試料中の長型の存在を明りょうに示し続けている)。その上、ＨＡ＋Ｇｌｕ−Ｇｌｕ抗体の組合せの、１０％短型混合物と５０％短型混合物との間でのシグナルの差異は、例えば、シグナルが濃度に比例する場合、短型の相対的量又は濃度を示すことができる。
【０２９６】
その上、本発明のかかる具体例は、試料中のイソ型の濃度を、断片化の前及び／又は後で、直接測定するために利用することができる。断片化の前では、結合したＨＡ＋Ｇｌｕ−Ｇｌｕ抗体の組合せを定量して、両イソ型の濃度を合わせて測定する。次いで、結合したＨＡ＋ＡＵ５抗体の組合せを定量して、長型の濃度を直接測定する。この実施例において、短型の濃度は、これら２つの測定間で異なっている。Ｌｙｓ−Ｃ消化後には、結合したＨＡ＋ＡＵ５抗体の組合せは、再び、長型の濃度を測定するために利用される。短型の濃度は、ＨＡ＋Ｇｌｕ−Ｇｌｕ抗体の組合せから直接測定される(この抗体の組合せは、長型ペプチド断片に結合しないので)。
参考文献の援用
【０２９７】
本願で参照した刊行物及び特許文献の各々の全開示を、そっくりそのまま、参考として、すべての目的のために、個々の刊行物又は特許文献が個別に指示されたのと同程度に、援用する。
【０２９８】
同等物
この発明は、その精神又は本質的特徴から離れずに、他の特定の形態で具体化することができる。それ故、前述の具体例は、すべての点で、ここに記載の発明を制限するのではなく、説明するものと考えるべきである。従って、この発明の範囲は、前述の記載によってではなく、添付の請求の範囲によって示されるものであり、請求の範囲と同等の意味及び範囲内に入るすべての変形は、その中に含まれるべきものである。
【図面の簡単な説明】
【０２９９】
【図１】幾つかの選択的スプライシングの型を示している図である。
【図２】Ｂｃｌ−ｘの長型及び短型を示している図である。
【図３】トリプシン又はｌｙｓＣにより消化した場合の、Ｂｃｌ−ｘの断片化パターン及び新規なサンドイッチ対の形成を示している図である。
【図４】Ｂｃｌ−ｘの長型(SEQ ID NO:１)及び短型(SEQ ID NO:２)の配列アラインメントを示している図である。
【図５】新規なサンドイッチ対が、Ｂｃｌ−ｘ長型及び短型のｌｙｓＣ消化に際して形成されることを示している図である。
【図６】新規なサンドイッチ対が、Ｂｃｌ−ｘ長型及び短型のトリプシン消化に際して形成されることを示している図である。
【図７】様々なＣＤ４４エキソン及び選択したＣＤ４４イソ型の略図(縮尺は合ってない)である。
【図８】各ＣＤ４４エキソン中のＬｙｓＣ消化部位を示している図である。
【図９】可変エキソン領域に隣接する不変エキソン(例えば、ＣＤ４４のエキソン５及び１６)に対して生産された抗体が、サンドイッチ対の形成における「アンカー」として利用できることを示している図である。
【図１０】ＣＤ４４イソ型、Ｍｅｔａ−１の概略配置図であり、ｌｙｓＣ断片化における新規なサンドイッチ対の形成を示している図である。
【図１１】ＣＤ４４イソ型、ＣＤ４４ｓの概略配置図であり、ｌｙｓＣ断片化における新規なサンドイッチ対の形成を示している図である。
【図１２】ＣＤ４４イソ型のＣＤ４４ｓ、Ｍｅｔａ−１、及びＭｅｔａ−２を含むｌｙｓＣ消化した試料の略図である。
【図１３】全ＣＤ４４イソ型中に存在する４〜５の最もＮ末端側の不変エキソンに特異的な捕捉因子対を利用する全ＣＤ４４測定を示している図である。
【図１４】多数のＣＤ４４イソ型を含む試料の略図である。
【図１５】個々のイソ型が、新規なサンドイッチ対形成に基くユニークなシグネーチャー及び定量を生じることを示している図である。
【図１６】試料中の各イソ型の、各サンドイッチ対の定量による個々のシグネーチャーのすべての総計を示している図である。
【図１７】あるスプライス変異体システムのモデルについての断片化計画を示している図である。
【図１８】実施例５のスプライス変異体システムモデルから予想された結果を示しており、長型及び短型のイソ型が、独立に、断片化されて分析されている図である。
【図１９】実施例５のスプライス変異体システムモデルから予想された結果を示しており、長型及び短型のイソ型が、同一試料中で、２つの異なる割合で断片化されて分析されている図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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