(57)【要約】本発明は、少なくとも１回の陽イオン交換クロマトグラフィと、少なくとも１回の疎水性相互作用クロマトグラフィとを含み、前記２回のクロマトグラフィステップが、任意の順序で直ちに連続して行われる、組換え顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を得る方法に関する。特に本発明は、それぞれ疎水性相互作用クロマトグラフィの前および後に実施される２回の陽イオン交換クロマトグラフィステップを含む、Ｇ−ＣＳＦと他の蛋白質との混合物からＧ−ＣＳＦを精製する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１回の陽イオン交換クロマトグラフィと、少なくとも１回の疎水性相互作用クロマトグラフィとを含み、前記クロマトグラフィステップが、任意の順序で直ちに連続して行われる、組換え顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を精製する方法。
【請求項２】
それぞれ疎水性相互作用クロマトグラフィの前および後に実施される２回の陽イオン交換クロマトグラフィを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
最後の陽イオン交換クロマトグラフィに続いて接線流ろ過を更に含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
陰イオン交換クロマトグラフィが実施されない請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ゲルろ過が実施されない請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＨＰＬＣが実施されない請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
アフィニティクロマトグラフィが実施されない請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィが実施されない請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
スルホプロピルマトリックスが陽イオン交換クロマトグラフィに使用される請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
フェニル基が疎水性相互作用クロマトグラフィ用の疎水性リガンドとして用いられる請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
Ｇ−ＣＳＦと、緩衝液、塩および安定化剤などの医薬として許容され得るアジュバントとを含む医薬製剤を製造するための、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法により精製されるＧ−ＣＳＦの使用方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法により精製されたＧ−ＣＳＦと、緩衝液、塩および安定化剤などの医薬として許容され得るアジュバントとを含む医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１回の陽イオン交換クロマトグラフィと、少なくとも１回の疎水性相互作用クロマトグラフィとを含み、この２種のクロマトグラフィが任意の順序で互いに直ちに連続して行われる、組換え顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の製造方法に関する。特に本発明は、それぞれ疎水性相互作用クロマトグラフィの前および後に実施される２回の陽イオン交換クロマトグラフィステップを含む、Ｇ−ＣＳＦと他の蛋白質との混合物からＧ−ＣＳＦを精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）は、天然由来の成長因子であり、広義ではサイトカイン類に属し、本明細書ではコロニー刺激因子の群に属する。Ｇ−ＣＳＦは、造血において決定的な役割を担い、造血前駆体細胞の増殖および分化、ならびに好中球の活性化を高める。そのような性質により、Ｇ−ＣＳＦは種々の医療分野、例えば化学療法もしくは照射に続く正常な血液細胞集団の再生に、または感染性病原への免疫応答を刺激するために用いられるようになっている。つまり臨床的に述べると、Ｇ−ＣＳＦは、主として抗腫瘍療法、特に化学療法の結果起こる好中球減少症の処置に用いられ、更に骨髄移植および感染疾患の処置に用いられる。
【０００３】
天然由来のヒトＧ−ＣＳＦは分子量約２０，０００ダルトンで５個のシステイン残基を有する糖蛋白質である。これらの残基のうち４個は、当該蛋白質の活性に本質的に重要な２個の分子内ジスルフィド架橋を形成する。Ｇ−ＣＳＦは天然の供給源から少量しか入手できないため、例えばＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ））細胞などのほ乳類細胞内または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核細胞内での発現によって得ることができる組換え形態のＧ−ＣＳＦが、主として医薬品の製造に用いられている。ほ乳類細胞内で発現される組換え蛋白質は、天然由来のＧ−ＣＳＦとは異なり、別の糖鎖形成パターンを有するが、大腸菌内で発現される蛋白質では、細菌での発現の結果として追加のＮ末端メチオニン残基を有することができ、糖鎖形成が全てに存在するわけではない。
【０００４】
Ｇ−ＣＳＦの組換え体生成は、１９８７年に初めて特許文献に記載された（特許文献１参照）。組換えＧ−ＣＳＦを基にした最初の市販Ｇ−ＣＳＦ製剤は、１９９１年にドイツで認められ、商品名ニューポジェン（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）（登録商標）としてアムジェン（Ａｍｇｅｎ）により製造および販売されている。
【０００５】
原核細胞内でのＧ−ＣＳＦの産生は、簡単な発現系および培養条件を利用できるため、ほ乳類細胞内での産生に比較して好ましいが、原核細胞での組換え蛋白質の産生において多く生じる問題は、発現される蛋白質の変性形態が、難溶性の細胞内凝集体の形態、いわゆる封入体を形成することであり、それは部分的に二次構造を有し、細菌細胞の細胞質内に見出される可能性がある。
【０００６】
上記封入体が形成されるため、活性構造を保持するには、封入体を適切な手段により適度な速度で遠心分離して単離した後、蛋白質を可溶化および復元する必要がある。この場合、変性蛋白質から正しいフォールディング中間体への転換と複数のタンパク質分子の凝集との競合反応が、復元蛋白質の収率を限定する主要因子となる。
【０００７】
当該技術分野では、複数の特許文書が、封入体から得られた蛋白質を可溶化および復元する態様を扱っている。例えば特許文献２に、可溶化およびリフォールディングをはじめ
とするＧ−ＣＳＦの単離および精製が記載されている。変性蛋白質の可溶化および復元に関する一般的技術は、特許文献３、４、５および６に記載されており、更に科学文献から、そして蛋白質化学の標準作業から取り入れることができる。
【０００８】
続いて、リフォールディングされた蛋白質は、クロマトグラフィ法により精製され、即ち、それを可溶化および復元後に存在する他の蛋白質および更なる不純物から分離される。
【０００９】
大腸菌宿主細胞内でのＧ−ＣＳＦの産生が最初に記載された既に先に述べた特許文献１でも、クロマトグラフィ精製を扱っている。特許文献１の実施例７には組換えＧ−ＣＳＦの精製の範囲内で、ＣＭセルロースカラムを用いた陽イオン交換クロマトグラフィが記載されている。
【００１０】
特許文献７では、可溶化と、可溶化剤を除去するためのダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）による酸化に続いて、陰イオン交換クロマトグラフィおよび陽イオン交換クロマトグラフィによりＧ−ＣＳＦが精製される。特許文献７では陽イオン交換クロマトグラフィにＣＭセファロースも用いられる。
【００１１】
特許文献８には金属アフィニティクロマトグラフィ、より厳密には固定化金属でのクロマトグラフィ（固定化金属アフィニティクロマトグラフィ、ＩＭＡＣ）を実施する、Ｇ−ＣＳＦの精製方法が記載されている。特許文献９によれば、金属アフィニティクロマトグラフィに続いて、陽イオン交換クロマトグラフィおよび／またはゲルろ過が実施されてもよい。
【００１２】
特許文献１０では、最初に疎水性相互作用クロマトグラフィ、続いてヒドロキシアパタイトクロマトグラフィが実施される、Ｇ−ＣＳＦの精製方法が記載されている。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィに続いて、陽イオン交換クロマトグラフィが実施される。
【特許文献１】ＰＣＴ国際公開第８７／０１１３２Ａ１号
【特許文献２】欧州特許出願出願公開第０７１９８６０号
【特許文献３】欧州特許出願出願公開第０５１２０９７号
【特許文献４】欧州特許出願出願公開第０３６４９２６号
【特許文献５】欧州特許出願出願公開第０２１９８７４号
【特許文献６】ＰＣＴ国際公開第０１／８７９２５号
【特許文献７】欧州特許出願出願公開第０７１９８６０号
【特許文献８】ＰＣＴ国際公開第０３／０５１９２２号
【特許文献９】ＰＣＴ国際公開第０３／０５１９２２号
【特許文献１０】ＰＣＴ国際公開第０１／０４１５４号（発明の開示）  本発明の基礎をなす問題は、Ｇ−ＣＳＦを十分な純度および収率で得ることが可能な、生物活性の組換えヒトＧ−ＣＳＦの精製方法を開示することにある。この場合、該方法は、実施が可能な限り単純かつ簡単でなければならない。技術の複雑さおよび経費を低く保ち、蛋白質の多量の損失を避けるために、可能な限り少ないクロマトグラフィ工程数により実施し得る精製方法が望ましい。
【００１３】
上記のおよび更なる問題は、請求項１に記載の方法により解決される。好ましい実施形態は従属請求項に記載されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
陽イオン交換クロマトグラフィおよび疎水性相互作用クロマトグラフィによる復元されたＧ−ＣＳＦのクロマトグラフィ精製では、組換え体の生物活性Ｇ−ＣＳＦの許容され得る純度および十分な収率を実現し得ることが見出された。第２の陽イオン交換クロマトグ
ラフィステップによって、純度を更に上昇させることができる。
【００１５】
つまり本発明は、少なくとも１回の陽イオン交換クロマトグラフィと、少なくとも１回の疎水性相互作用クロマトグラフィとを実施し、前記ステップの間に他のクロマトグラフィステップおよび他の精製ステップが実施されないことを条件として、前記２種のクロマトグラフィステップが任意の順序で実施される、組換え生成された生物活性ヒトＧ−ＣＳＦの精製方法に関する。つまり陽イオン交換クロマトグラフィと、疎水性相互作用クロマトグラフィとが、直ちに連続して行われる。
【００１６】
本発明によれば、用語「生物活性ヒトＧ−ＣＳＦ」は、本発明による方法で精製されたＧ−ＣＳＦが、造血前駆細胞の分化および増殖を高めることができ、かつ造血系の成熟細胞を活性化させることができることを示す。つまり本発明の方法で得られたＧ−ＣＳＦは、Ｇ−ＣＳＦの投与が有利な症例の適応症を処置するのに適している。用語「生物活性ヒトＧ−ＣＳＦ」は、アミノ酸配列が野生型の配列と比較して変化していながら野生型Ｇ−ＣＳＦと類似の生物活性を有するＧ−ＣＳＦの突然変異型および修飾型、例えばＰＣＴ国際公開第０１／８７９２５号および欧州特許第０４５６２００号に記載されたものも包含する。それはＧ−ＣＳＦ共役体にもあてはまる。好ましくは精製されるＧ−ＣＳＦは、大腸菌細胞内で産生されたヒトＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦである。
【００１７】
本発明の一つの実施形態において、Ｇ−ＣＳＦを精製する方法は、それぞれ疎水性相互作用クロマトグラフィの前および後に実施される２回の陽イオン交換クロマトグラフィステップを含む。
【００１８】
本発明の更なる実施形態において、該方法は、一回のみの陽イオン交換クロマトグラフィ（２回以上の陽イオン交換クロマトグラフィステップを実施する場合には最後の陽イオン交換クロマトグラフィ）の後に、接線流ろ過を含む。
【００１９】
更なる実施形態において、Ｇ−ＣＳＦを精製する方法で、陰イオン交換クロマトグラフィの実施が省略される。
更なる実施形態において、本発明による精製方法は、ゲルろ過クロマトグラフィを行わなくても十分である。
【００２０】
本発明の更なる実施形態において、分取ＨＰＬＣの実施が省略される。同じことが逆相クロマトグラフィにもあてはまり、これは本発明による疎水性相互作用クロマトグラフィと区別され調製時に同様に省略され得る。逆相ＨＰＬＣは分析目的のみに用いられる。
【００２１】
更なる実施形態において、アフィニティクロマトグラフィ、特に染色剤、金属または免疫グロブリンアフィニティクロマトグラフィは該方法の範囲内では実施されない。
更なる実施形態において、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィの実施は、精製方法の範囲内で省略される。
【００２２】
つまり好ましい実施形態において、本発明による精製方法は、２種の異なるクロマトグラフィ分離法、即ち、電荷イオンの競合的相互作用に基づくイオン交換の方法、および蛋白質の非極性表面領域が塩濃度の高い固定相の弱疎水性リガンドに吸着されることを特徴とする疎水性相互作用の方法のみを利用する。
【００２３】
それから区別されるのが、それぞれのマトリクスに結合した結合パートナーへの分子の特異的かつ可逆的な吸着に基づくアフィニティクロマトグラフィの分離原理である。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィは、無機ヒドロキシアパタイト結晶の使用に基づくもので、陽イオン交換クロマトグラフィとしてのイオン交換クロマトグラフィおよび疎水性
相互作用クロマトグラフィとは異なる更なる分離法である。
【００２４】
上記のクロマトグラフィの原理は、専門家の間でも相応に区別される（例えば、ドイツ、ベルリン、ハイデルベルグの、バイオアナリティック、Ｆ．ロッツピーチ、Ｈ．ゾルバス（編集）著「スペクトラム・アカデミック・バーラグ」１９９８年（Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ，  Ｆ．  Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，  Ｈ．  Ｚｏｒｂａｓ  （ｅｄ），  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ，  Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄ．  Ｖｅｒｌａｇ  １９９８）参照）。
【００２５】
好ましい実施形態において、クロマトグラフィ精製は、３回を超えるクロマトグラフィステップを含まず、２回のみの異なるクロマトグラフィ分離法を用いる。
復元Ｇ−ＣＳＦは、医薬製剤の形態で使用され得る純度を実現するよう転換されていることになっており、クロマトグラフィ精製用の出発材料として用いられる。
【００２６】
この場合、蛋白質の可溶化およびリフォールディングは、例えば欧州特許出願出願公開第１６３０１７３号に記載されたような当業者に公知の方法により実施することができる。
【００２７】
リフォールディングの後、そして最初のクロマトグラフィステップの前に、例えばろ過、濃縮、沈殿、酸性化および／または透析により、リフォールディングＧ−ＣＳＦを調製することができる。
【００２８】
多くの場合、最初のクロマトグラフィステップの前にフォールディング準備物を精製すること、即ち、ほとんどがフォールディングで形成された蛋白質凝集体である高分子量粒子を除去することが有利となろう。前記精製は、粒状化バルク材料がろ過手段として働く深層ろ過により実施することができる。そのような固体粒子は、フィルタ手段の孔径よりも大きいか、またはバルクの内部表面で吸着されることにより保持される。
【００２９】
深層ろ過では、フィルタ手段としてセルロースエステル繊維が使用されるのが好ましい。適切なろ過手段および対応する使用機器は、例えば、商品名ミリスタック・プラスＣ０ＨＣ（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ  Ｐｌｕｓ  Ｃ０ＨＣ）およびミリスタック＋Ｂ１ＨＣ（Ｍｉｌｉｓｔａｋ＋Ｂ１ＨＣ）としてミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）から入手できる。
【００３０】
好ましくはフォールディング準備物は、深層ろ過の前に酸性化されるため、ろ液を特に効率的な手法で、陽イオン交換クロマトグラフィに直ちに使用することができる。この場合、フォールディング準備物のpH値は、好ましくは４．０未満、特に好ましくは３．２に設定される。
【００３１】
陽イオン交換クロマトグラフィでは、従来の市販マトリックスを用いることができる。この場合Ｇ−ＣＳＦは、総電荷が正であるため特異的なpH範囲内で陽イオン交換マトリックスに結合するが、宿主細胞に由来する核酸、リポ多糖および蛋白質、ならびにＧ−ＣＳＦのイオン性同位体、およびpH値が異なるＧ−ＣＳＦの変性形態などの混入物質のほとんどは、結合することができないか、または洗浄により除去することができる。
【００３２】
適切な陽イオン交換マトリックスとしては、非限定的に、カルボキシメチル（ＣＭ）セルロース、ＡＧ５０Ｗ、バイオ・レックス７０（Ｂｉｏ−Ｒｅｘ  ７０）、カルボキシメチル（ＣＭ）セファデックス（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ（ＣＭ）  Ｓｅｐｈａｄｅｘ）、スルホプロピル（ＳＰ）セファデックス、カルボキシメチル（ＣＭ）セファロースＣＬ−６Ｂ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ（ＣＭ）  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ）、ＣＭセファロースＨＰ、ハイパーＤ−Ｓセラミック（バイオセプラ（Ｂｉｏｓｅｐｒａ）
）およびスルホナート（Ｓ）セファロース、ＳＰセファロースＦＦ、ＳＰセファロースＨＰ、ＳＰセファロースＸＬ、ＣＭセファロースＦＦ、ＴＳＫゲルＳＰ  ５ＰＷ、ＴＳＫゲルＳＰ−５ＰＷ−ＨＲ、トーヨーパールＳＰ−６５０Ｍ（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ−６５０Ｍ）、トーヨーパールＳＰ−６５０Ｓ、トーヨーパールＳＰ−６５０Ｃ、トーヨーパールＣＭ−６５０Ｍ、トーヨーパールＣＭ−６５０Ｓ、マクロ・プレップ・ハイＳサポート（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ  Ｓｕｐｐｏｒｔ）、マクロ・プレップ・Ｓサポート、マクロ・プレップ・ＣＭサポートなどが挙げられる。
【００３３】
陽イオン交換クロマトグラフィを実施するための適切なマトリックスおよびプロトコルは、当業者によりアマシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｅｒｓｈａｍｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ、現在のＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））またはバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ−ｒａｄ．ｃｏｍ）のような供給業者の製品情報から入手できる。
【００３４】
スルホプロピルマトリックス、特にドイツ、フレイバーグのアマシャム・バイオサイエンシーズ（現在のＧＥヘルスケア）から入手できる製品ＳＰセファロースＸＬおよびＳＰセファロースＦＦ（ファースト・フロー（Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ））が、好ましくは陽イオン交換クロマトグラフィ用のマトリックスとして用いられる。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態において、２種の陽イオン交換クロマトグラフィが、すなわちそれぞれ疎水性相互作用クロマトグラフィの前および後に実施されるが、その両方でスルホプロピルマトリックスが使用され、特に好ましくは最初の陽イオン交換クロマトグラフィでＳＰセファロースＸＬ、そして２番目の陽イオン交換クロマトグラフィでＳＰセファロースＦＦが使用される。
【００３６】
陽イオン交換クロマトグラフィ用の適切な緩衝液としては、マレイン酸塩、マロン酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酢酸塩、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、およびビシン緩衝液が挙げられる。好ましくは緩衝液の濃度は、１０〜１００mM、好ましくは２０mM〜５０mMに含まれる。Ｇ−ＣＳＦを精製する場合、緩衝液のpH値が可能な限り７．０を超えてはならず、好ましくは６．５を超えてはならない。
【００３７】
好ましい実施形態において、平衡化および洗浄で利用される２０mM酢酸ナトリウム、pH５．０が、陽イオン交換クロマトグラフィに用いられる。
２番目の陽イオン交換クロマトグラフィを実施する場合、ここでは、５０mMリン酸ナトリウム、pH５．４が、好ましくは平衡化および洗浄に用いられる。
【００３８】
洗浄に続いて、変化させることにより、つまり陽イオン交換クロマトグラフィの場合にはpH値の上昇またはイオン強度の上昇により、Ｇ−ＣＳＦをカラムから溶離させることができる。
【００３９】
好ましくは溶離はイオン強度の上昇により実施する。２０mM酢酸ナトリウム、pH５．０の溶液を緩衝液として用いる場合、例えば２０mM酢酸ナトリウム、pH５．０および２００mM  ＮａＣｌの溶液が溶離に適している。
【００４０】
陽イオン交換クロマトグラフィの更なる適切な条件は、例えば２００２年発行のドイツ、フレイバーグのアマシャム・バイオサイエンシーズ（現在のＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））によるマニュアル「イオン・エクスチェンジ・クロマトグラフィ−プリンシプルズ・アンド・メソッズ（Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  −  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」などの関連文献か
ら入手できる。
【００４１】
陽イオン交換クロマトグラフィ用の荷電緩衝液中の塩濃度は、マトリックスに結合させるために十分に低くなければならず、その場合の結合は溶液のpH値にも依存する。
陽イオン交換クロマトグラフィの範囲内では、マトリックスへの荷電および結合のために異なる緩衝液を用いることができ、例えば緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、トリス／ＨＣｌ、トリス／酢酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩、２−（Ｎ−モルホリノエタンスルホナート）（ＭＥＳ）、および他の緩衝液からなる群から選択される。
【００４２】
カラムを荷電した後、カラムを洗浄し、次に蛋白質をカラムから溶離させる。この場合の溶離は、イオン強度を上昇させることにより実施することができ、それは、緩衝溶液中の塩濃度を上昇させることにより実施される。あるいはpH値の上昇が適している。この場合、不連続ステップ勾配、直線勾配、またはそのような勾配の適切な組合わせを用いることができる。
【００４３】
洗浄および溶離に適した溶離緩衝液は、ＮａＣｌまたはＫＣｌなどの塩を加えた酢酸塩、クエン酸塩、トリス／ＨＣｌ、トリス／酢酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩、ＭＥＳ、および他の適切な緩衝液から選択することができる。溶離を実施するイオン強度および塩濃度は緩衝溶液のpH値に依存する。緩衝液のpH値が高いほど、カラムから蛋白質を溶離させるのに必要なイオン強度が低くなる。
【００４４】
疎水性相互作用クロマトグラフィは、従来のマトリックスによっても実施することができる。適切なのは、ブチル、フェニルまたはオクチルセファロース（アマシャム・バイオサイエンシーズ、現在のＧＥヘルスケア）、マクロ・プレップ・メチルまたはマクロ・プレップ・ｔ−ブチル（バイオラッド）、およびプロピルまたはフェニルリガンドを用いるフラクトゲルＥＭＤ（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ）（メルク（Ｍｅｒｋ））などのマトリックスである。
【００４５】
好ましくは疎水性リガンドは、ブチル基、フェニル基またはオクチル基、特に好ましくはフェニル基である。この場合アマシャム・バイオサイエンシーズ（現在のＧＥヘルスケア）の製品を用いることができる。
【００４６】
疎水性相互作用クロマトグラフィを実施するための適切なマトリックスおよびプロトコルは、当業者によりアマシャム・バイオサイエンシーズ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｅｒｓｈａｍｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ．現在のＧＥヘルスケアまたはバイオラッド（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｒａｄ．ｃｏｍ）のような供給業者の製品情報から入手できる。
【００４７】
好ましくはマトリックスは、アマシャム・バイオサイエンシーズ（現在のＧＥヘルスケア）から入手できるフェニルセファロースＨＰ（ハイパフォーマンス（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ））である。
【００４８】
他の種類のクロマトグラフィでも用いられる従来の緩衝液は、疎水性相互作用クロマトグラフィの緩衝液として適している。好ましい実施形態において、クエン酸塩緩衝液が用いられる。有利には溶離は、pH値を上昇させることにより実施する。約pH３．０から約pH６．０へのpH勾配が、特に適していることが立証されている。
【００４９】
疎水性相互作用クロマトグラフィに適した更なる条件は、例えば２００２年発行のドイツ、フレイバーグのアマシャム・バイオサイエンシーズ（現在のＧＥヘルスケア）によるマニュアル「ハイドロフォビック・インタラクション・クロマトグラフィ−プリンシプル
ズ・アンド・メソッズ（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  −  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」などの関連文献から入手できる。
【００５０】
一般に当業者は、本発明による方法で用いられるクロマトグラフィ原理に通じており、場合によりそれらは、クロマトグラフィマトリックス、カラムおよび他の手段の供給業者による既定のマニュアルまたはプロトコルに詳細に記載されている。
【００５１】
接線流ろ過（ＴＦＦ）は、本発明の一つの実施形態の範囲内で、クロマト精製に続いて、特に唯一のまたは最後の陽イオン交換クロマトグラフィに続いて実施されるが、例えばミリポアおよびポールコーポレーション（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）社により販売される従来のＴＦＦ装置およびプロトコルにより実施することができる。ＴＦＦは、陽イオン交換クロマトグラフィおよび疎水性相互作用クロマトグラフィという先行の精製ステップとは対照的な追加の精製ステップとしてのろ過である。
【００５２】
本発明の範囲内で精製されたＧ−ＣＳＦは、従来の遺伝子工学的方法で宿主細胞内に発現される。好ましくはそれはヒトＧ−ＣＳＦである。大腸菌細胞内で発現される様々な発現系が市販されている。適切なのは、例えば、誘導プロモータ、例えばＩＰＴＧ誘導プロモータの制御下でのヒトＧ−ＣＳＦの発現であり、例えば、サムブルックおよびラッセル著「モレキュラー・クローニング−ア・ラボラトリー・マニュアル、サードエディション」１５章（２００１年）、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバーのコールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス発行（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００１、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  ＵＳＡ，  ｃｈａｐｔｅｒ  １５）、または例えばプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）による既定の製造業者のプロトコルを参照されたい。
【００５３】
発酵は、特許および科学文献に記載された標準プロトコルに従って、例えばバッチ培養およびフェドバッチ培養からなる２段階工程で実施される。
大腸菌内で過剰発現されたＧ−ＣＳＦを含むいわゆる封入体の採取、およびそのような封入体の溶解は、先に議論された特許文献に一部が記載されている。しかしながら適切なプロトコルを、蛋白質化学での標準的作業、および実験室マニュアルに見出すことができる。同じことが、先に議論したとおり様々な特許文書の目的である可溶化およびリフォールディングにも当てはまる。
【００５４】
本発明は、本発明により得られるＧ−ＣＳＦを含む医薬製剤にも関する。得られたＧ−ＣＳＦは、凍結乾燥品の形態または液体形態のいずれでも貯蔵することができる。それは、皮下または静注のいずれかにより投与される。組換え発現Ｇ−ＣＳＦの配合剤の適切なアジュバントは、例えば、糖および糖アルコールなどの安定化剤、アミノ酸、例えばポリソルバート２０／８０などの界面活性剤、ならびに適切な緩衝物質である。配合剤の例は、欧州特許第０６７４５２５号、欧州特許第０３７３６７９号、および欧州特許第０３０６８２４号に記載されており、「ロート・リステ２００４（ＲＯＴＥ  ＬＩＳＴＥ  ２００４）」内の商品ニューポジェン（登録商標）およびグラノサイト（Ｇｒａｎｏｃｙｔｅ）も参照されたい。
実施例
以下の実施例は、本発明を例示しており、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５５】
ヒトＧ−ＣＳＦを、大腸菌細胞内のＩＰＴＧ誘導プロモータの制御下で発現させた。適
切な発現系の例は、例えば、実験室マニュアルのサムブルックおよびラッセル著「モレキュラー・クローニング−ア・ラボラトリー・マニュアル、サードエディション」１５章（２００１年）、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバーのコールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス発行（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００１、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  ＵＳＡ，  ｃｈａｐｔｅｒ  １５）、または例えばプロメガまたはストラタジーンによる既定の製造業者のプロトコルから入手できる。
【００５６】
発酵は、特許および科学文献に記載されたような標準プロトコルに従って、バッチ培養およびフェドバッチ培養を含む２段階工程で実施した。細菌を１７〜１８時間培養した後、１mM  ＩＰＴＧを添加し細菌を刺激して組換えＧ−ＣＳＦを形成させた。誘導期間は、４．０時間であった。
【００５７】
細菌の採取は、５，０００ｇ、４℃で２０分間ビーカー遠心分離することにより実施した。遠心分離の後、上清を廃棄して、再度、細胞に緩衝液（２０mM  リン酸ナトリウム、pH７．０；１mM  ＥＤＴＡ）を発酵容量まで充填した後、８００バールで３回通過させることによりそれらを溶解させた。続いて、溶解物を分離により精製した（ＣＳＡ１−セパレータ、ドイツ、オエルデのウエストファリア（ＣＳＡ１−Ｓｅｐａｒａｔｏｒ，  Ｗｅｓｔｆａｌｉａ，  Ｏｅｌｄｅ  Ｇｅｒｍａｎｙ））
封入体の濃縮
原則として、採取により得られた封入体の懸濁液は、直ちに次の可溶化に用いることができる。しかしこの場合、可溶化物中の最大の実行可能な蛋白質濃度は、非常に限定され、それがフォールディング時の制約につながる場合がある。つまり封入体の懸濁液は、可溶化物中の蛋白質を高濃度にするために、採取および洗浄に続いて遠心分離により濃縮しなければならない。
【００５８】
封入体の懸濁を、ビーカー遠心分離により１０，０００ｇで２０分間遠心分離した。遠心分離により得られた封入体のペーストは、−２０℃で少なくとも１２週間貯蔵することができる。
可溶化
より大きなペレットの封入体を比較的短時間で効果的に可溶化するためには、例えばウルトラタラックス（Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ）処理による、前記ペレットの機械的破砕が更に必要となる。遠心分離により得られた封入体のペーストを、重量測定し、９．０ml／ｇ封入体  の可溶化緩衝液（３０mM  トリス、１mM  ＥＤＴＡ、６．０Ｍ  グアニジン−ＨＣｌ、１００mM  ＧＳＨ、pH８．０）と混合し、ウルトラタラックス処理で破砕した。その準備物を完全にボルテックス処理し、その後、ローラーミキサまたは磁器撹拌装置上で室温で約２時間インキュベートした。
リフォールディング
ＢＳＡを標準蛋白質として用い、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）による方法で、可溶化物中の蛋白質濃度を測定した。フォールディングでは、所望の量の緩衝液中で蛋白質濃度７００μｇ／mlを達成するのに必要な量を、リフォールディング緩衝液（３０mM
トリス、２mM  ＧＳＳＧ、２mM  ＧＳＨ、３Ｍ  尿素、pH７．５；４℃）に添加した。可溶化物または蛋白質の濃度が部分的に上昇するのを避けるために磁器撹拌装置で撹拌しながら、対応する量の可溶化物を緩やかに、かつ絶え間なく添加した。流入速度および混合様式は、それぞれ用いられる可溶化準備物の容量に適合させてもよい。可溶化物の添加が完了した後、準備物を４℃で少なくとも１２時間インキュベートした。この期間は、更なる混合は必要なかった。
深層ろ過
リフォールディングに続いて、最初のクロマトグラフィステップを実施する前に、リフォールディング準備物をろ過する。この場合、例えば深層フィルタ、例えばドイツ、シュワルバッハのミリポアによる適切なフィルタを、ろ過に用いることができる。ろ過の前に、pH値を２Ｍクエン酸でpH３．２に調整する。
最初の陽イオン交換クロマトグラフィの実施
最初のクロマトグラフィステップは、標的蛋白質を捕捉して尿素、ＧＳＨ、ＧＳＳＧなどのリフォールディング剤がフォールディング準備物内に存在するならばそれを標的蛋白質から分離する働きがある。前記ステップでは、フォールディングが正しくない蛋白質および宿主細胞蛋白質も分離される。この場合、陽イオン交換クロマトグラフィを用いる。アマシャム・バイオサイエンシーズ（現在のＧＥヘルスケア）によるＳＰセファロースＸＬを、マトリクスとして用いる。クロマトグラフィはpH５．０で実施する。
【００５９】
ＳＰセファロースＸＬマトリックスは、カラム容量の１．５倍の２０mM  酢酸ナトリウム、pH５．０で平衡化した。ろ過したリフォールディング準備物をカラムに加え、次にカラム容量の１．５倍の洗浄緩衝液（２０mM酢酸ナトリウム、pH５．０）で洗浄した。次にＧ−ＣＳＦを、カラム容量の３倍の溶離緩衝液（２０mM酢酸ナトリウム、２００mM  ＮａＣｌ、pH５．０）でカラムから溶離させた。溶離したＧ−ＣＳＦの純度を逆相ＨＰＬＣで測定したが、それは８０％より高かった。ろ過したフォールディング準備物に関しては、収率も８０％より高かった。
疎水性相互作用クロマトグラフィの実施
２番目のクロマトグラフィステップでは、Ｇ−ＣＳＦの更なる精製を、ＳＰセファロースＸＬの溶離に基づいて実施する。特に生成物に関連する混入物を実質的に排除する。ここでは、アマシャム・バイオサイエンシーズ（現在のＧＥヘルスケア）によるフェニルセファロースＨＰを用いた疎水性相互作用クロマトグラフィを実施する。
【００６０】
フェニルセファロースＨＰカラムを、最初にカラム容量の２倍の１２％緩衝液Ｂ、８８％緩衝液Ａ（緩衝液Ｂ：２０mMクエン酸ナトリウム、pH６．７；緩衝液Ａ：２０mMクエン酸ナトリウム、pH２．７、１１０mM  ＮａＣｌ）で平衡化した。その後、５倍容量の緩衝液Ａ（２０mMクエン酸ナトリウム、pH２．７、１１０mM  ＮａＣｌ）で予め希釈したＳＰセファロースＸＬカラムの溶離液をカラムに加えた。次に、カラムをカラム容量の２倍の１２％緩衝液Ｂ、８８％緩衝液Ａで洗浄し、１２％から９０％までの緩衝液Ｂの直線勾配をカラム容量の５〜８倍で実施した。約pH３．０から約pH６．０までの前記直線pH勾配の範囲内で溶離させた。最後に、カラム容量の３倍の９０％緩衝液Ｂ、１０％緩衝液Ａで、カラムをすすいだ。
【００６１】
溶離された分画を、逆相ＨＰＬＣにより純度についてテストし、９５％より純度の高い分画をひとまとめにした。
疎水性相互作用クロマトグラフィの後に得られたＧ−ＣＳＦは、９６％を超える純度であった。ＨＩＣステップからの収率は、ほぼ８０％であった。
２番目の陽イオン交換クロマトグラフィの実施
３番目のクロマトグラフィステップでは、Ｇ−ＣＳＦを９９％を超える純度にするための更なる精製を、フェニルセファロースＨＰの溶離に基づいて実施する。特に生成物に関連する混入物を、実質的に排除する。ここでは、陽イオン交換クロマトグラフィを再度、利用する。この場合、アマシャム・バイオサイエンシーズ（現在のＧＥヘルスケア）によるＳＰセファロースＦＦを用いる。
【００６２】
ＳＰセファロースＦＦカラムを、カラム容量の３倍の１００％緩衝液Ａ（５０mM  リン酸ナトリウム、pH５．４）で平衡化した。続いて疎水性相互作用クロマトグラフィの溶離液をカラムに加え、カラムをカラム容量の２倍の１００％緩衝液Ａ（５０mM  リン酸ナトリウム、pH５．４）ですすいだ。この場合、加えられた試料は、約６０mM  ＮａＣｌを含
み、pH値は４．０〜４．２であった。ステップ勾配と直線pH勾配との組合わせにより、溶離を実施した。最初のステップは、最大１０％の緩衝液Ｂ（５０mM  リン酸ナトリウム、pH６．４）で実施し、前記濃度をカラム容量の１．５倍保持させた。この後、カラム容量の１倍の緩衝液Ｂ（５０mM  リン酸ナトリウム、pH６．４）で１０から１５％までの勾配を実施した。カラム容量の１２．５倍を超える緩衝液Ｂ（５０mM  リン酸ナトリウム、pH６．４）で１５％から３５％までの直線勾配でＧ−ＣＳＦを溶離させて、吸光度の高い溶離液の回収を２８０nmで実施した。最後に１段階の１００％緩衝液Ｂ（５０mM  リン酸ナトリウム、pH６．４）でカラムをすすいだ。
【００６３】
溶離された分画を、逆相ＨＰＬＣにより純度についてテストし、９９％より高い純度の分画をひとまとめにした。合計収率は８０％であった。
上記のクロマトグラフィステップの結果得られたＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦは、全てのＨＰＬＣ分析（逆相、ＳＥＣ、およびＩＥＸ）の後、少なくとも９９．５％の純度であった。
【００６４】
混入物の測定でも、ＤＮＡ、エンドトキシン、および宿主細胞蛋白質が非常によく除去されていた。
生物活性の測定
本発明の方法により得られたＧ−ＣＳＦの活性を、バイオアッセイにより測定し、標準的な市販のＧ−ＣＳＦ（ニューポジェン（登録商標））の活性と比較した。この目的では、Ｇ−ＣＳＦに応答性のあるマウス細胞系ＮＦＳ−６０を用いた。前記細胞系を、１．５g／l炭酸ナトリウム、４．５g／lグルコース、１０mM  ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、および１０mMピルビン酸ナトリウムを含むＲＰＭＩ１６４０培地（バッケム、ドイツ  ハイデルベルグ）に、２mMグルタミン、１０％ＦＣＳ、０．０５mM  ２−メルカプトエタノールおよび６０ng／ml  Ｇ−ＣＳＦを補足して培養した。
【００６５】
活性テストのために、Ｇ−ＣＳＦを含まない培地で細胞を２回洗浄し、９６穴プレートに２×１０４細胞／ウェルの濃度で加え、様々な濃度の精製Ｇ−ＣＳＦおよび標準物質と共に、３７℃、４．５％ＣＯ２で３日間インキュベートした。続いて細胞をＸＴＴ試薬で染色し、４５０nmでの吸光度をマイクロタイタープレートリーダで測定した。本発明により精製されたＧ−ＣＳＦで処理された細胞が、標準物質で処理された細胞と全く同程度に良好に増殖することが示され、その結果、両方のＧ−ＣＳＦ試料が同様の生物活性を有するという結論に至った。
【００６６】
ゲル電気泳動分析（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、等電点電気泳動法）では、クロマトグラフィ精製の後に得られたＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦも、標準として用いたニューポジェン（登録商標）と同様に挙動した。
【００６７】
フォールディング収率を測定するために、Ｇ−ＣＳＦを得た後で、蛋白質を変性させる逆相ＨＰＬＣを実施してもよい。ジスルフィド架橋が保持されるため、異なるジスルフィド架橋のものは、多くの場合、異なる疎水性表面を有し、それを用いて逆相ＨＰＬＣで分離することができる。つまり上記方法では正しいジスルフィド架橋の検出のみを実施することができる。しかし前者は決定的であり、小さな対応する架橋の蛋白質の多くでは、既に、正しいフォールディングの十分な基準である。サイズ排除（ＳＥ）−ＨＰＬＣも、更なる分析法として実施することができる。
【００６８】
逆相ＨＰＬＣまたはＳＥ−ＨＰＬＣを実施するための適切な材料およびプロトコルは、当業者によりビダック（Ｖｙｄａｃ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｙｄａｃ．ｃｏｍ）またはトーソーバイオサイエンス（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｏｓｏｈｂｉｏｓｅｐ．ｄｅ）などの供給業者による製品情報から入手できる。Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦの収率の測定は、ハーマン他著、ファーマシューティカル・バイオ
テクノロジー（１９９６年）９巻ｐ３０３〜３２８（Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ  ａｌ． (１９
９６) Ｐｈａｒｍ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ９：  ３０３−３２８）にも記載されている。この場合、Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦの厳密な割合は、ピーク面積の積分と吸光係数を基にした変換率とにより決定される。
【００６９】
精製に続いて、Ｇ−ＣＳＦを量および活性に関して分析することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析と、続くクーマシーブリリアントブルー染色または逆相ＨＰＬＣにより、定量分析を実施することができる。市販のＧ−ＣＳＦ製剤を、分析用の標準物質として用いることができる。加えて、ペプチドマップまたは質量分析を実施することができる。精製したＧ−ＣＳＦの活性は、例えば、シラフジ他著（１９８９年）、エクスペリメンタル・ヘマトロジー１７（２）：ｐ１１６〜１１９；オーエダ他著（１９９０年）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６５（２０）：ｐ１１４３２〜１１４３５；スチュート他著（１９９２年）ブラッド  ７９（１１）：ｐ２８４９〜２８５４、およびオシマ他著（２０００年）バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション、２６７（３）：ｐ９２４〜９２７（Ｓｈｉｒａｆｕｊｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．１７（２）：１１６−１１０；Ｏｈ−Ｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５（２０：１１４３２−１１４３５；Ｓｔｕｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｂｌｏｏｄ  ７９（１１）：２８４９−２８５４、およびＯｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２６７（３）：９２４−９２７）に記載されたような生物学的テスト法により測定することができる。
【００７０】
ちなみに、クロマトグラフィは全て、マトリックスまたはカラムの供給業者の推奨およびプロトコル（例えば、流速、洗浄または溶離に利用されるカラム容量、カラムの口径およびベッド高などに関するもの）に従って実施される。
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月15日(2007.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１回の陽イオン交換クロマトグラフィと、少なくとも１回の疎水性相互作用クロマトグラフィとを含み、前記クロマトグラフィステップが、任意の順序で直ちに連続して行われる、組換え顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を精製する方法。
【請求項２】
それぞれ疎水性相互作用クロマトグラフィの前および後に実施される２回の陽イオン交換クロマトグラフィを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
最後の陽イオン交換クロマトグラフィに続いて接線流ろ過を更に含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
陰イオン交換クロマトグラフィが実施されない請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ゲルろ過が実施されない請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＨＰＬＣが実施されない請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
アフィニティクロマトグラフィが実施されない請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィが実施されない請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
スルホプロピルマトリックスが陽イオン交換クロマトグラフィに使用される請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
フェニル基が疎水性相互作用クロマトグラフィ用の疎水性リガンドとして用いられる請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法によりＧ−ＣＳＦを精製することを含む、組換えＧ−ＣＳＦと、緩衝液、塩および安定化剤などの医薬として許容され得るアジュバントとを含む医薬製剤を製造する方法。
【国際調査報告】
2009501195.tif 000002
2009501195.tif 000003
2009501195.tif 000004
2009501195.tif 000005
2009501195.tif 000006
2009501195.tif 000007