(57)【要約】  本発明は、中枢神経系障害の治療用医薬の調製のための、ａＮＳＣの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
中枢神経系障害の治療用医薬の調製のための、成体神経幹細胞（ａＮＳＣ）の使用。
【請求項２】
炎症を低減させることにより組織防御を誘導するための医薬の調製のための、幹細胞の使用。
【請求項３】
前記炎症が中枢神経系障害に関連したものである、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
中枢性寛容および／または末梢性寛容を誘導するための医薬の調製のための、幹細胞の使用。
【請求項５】
中枢神経系での中枢性寛容および／または末梢性寛容を誘導するための、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
中枢神経系炎症および／もしくは神経変性障害での中枢性寛容および／または末梢性寛容を誘導するための、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
中枢神経系浸潤性前炎症性Ｔ細胞のアポトーシスを誘導するための医薬の調製のための、幹細胞の使用。
【請求項８】
前記前炎症性Ｔ細胞がＣＤ４５＋炎症性細胞である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記幹細胞が胚性幹細胞でない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記幹細胞がヒト胚性幹細胞でない、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記幹細胞が成体多能性体性幹細胞である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記幹細胞がａＮＳＣである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記幹細胞が成体神経前駆細胞である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
前記ａＮＳＣが成体脳または脊髄由来である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記幹細胞が炎症部位への標的化部分を含んでなる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
前記炎症部位が中枢神経系の炎症を起こした損傷である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記幹細胞が標的化部分を発現するように遺伝的に改変されている、請求項１５または１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記標的化部分が、炎症を起こした領域の選択的な標的化を可能にする、インテグリン、細胞接着分子（ＣＡＭ）または機能的ケモカイン受容体である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
前記インテグリンがα４インテグリン超後期抗原（ＶＬＡ）−４である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記ＣＡＭがＣＤ４４である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記ケモカイン受容体が、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ３およびＣＸＣＲ４からなる群より選択される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２２】
前記幹細胞がプロアポトーシス分子を発現している、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
前記幹細胞がプロアポトーシス分子を発現するように遺伝的に改変されている、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記プロアポトーシス分子が主要細胞死受容体（major death receptor）リガンドである、請求項２２または２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記主要細胞死受容体リガンドが、ＦａｓＬ、Ａｐｏ３ＬおよびＴＲＡＩＬより選択される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記幹細胞が、ネズミ、ヒト、ブタ、ネコまたはイヌのものである、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
前記治療を中枢神経系障害の発症後に行う、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
前記医薬が神経変性障害の治療用である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
前記医薬が中枢神経系障害の治療用であり、かつ該中枢神経系障害が、認知症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、脳腫瘍、脊髄損傷および虚血性脳卒中からなる群より選択される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
前記中枢神経系障害が、多発性硬化症、脳腫瘍、脊髄損傷および虚血性脳卒中からなる群より選択される、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記医薬が、慢性炎症を特徴とする全身性障害または臓器特異的障害の治療用である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３２】
前記医薬が、関節リウマチまたはＩ型糖尿病の治療用である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記幹細胞が、静脈内または髄腔内に投与されるものである、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３４】
中枢神経系障害に関連した炎症（神経炎症）を低減させることにより組織防御を誘導する方法であって、以下のステップ：
（ｉ）任意により、中枢神経系障害に罹患した患者での幹細胞投与のために、炎症に関連するタイムウィンドウを特定するステップ；および
（ｉｉ）該患者に幹細胞を投与するステップ
を含む、上記方法。
【請求項３５】
中枢神経系障害において中枢性寛容および／または末梢性寛容を誘導する方法であって、以下のステップ：
（ｉ）任意により、中枢神経系障害に罹患した患者での幹細胞投与のために、炎症に関連するタイムウィンドウを特定するステップ；および
（ｉｉ）該患者に幹細胞を投与するステップ
を含む、上記方法。
【請求項３６】
磁気共鳴画像法を用いて炎症を特定する、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記幹細胞が胚性幹細胞でない、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記幹細胞がヒト胚性幹細胞でない、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記幹細胞が多能性体性幹細胞である、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記幹細胞がａＮＳＣである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記幹細胞が成体神経前駆細胞である、請求項３４〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記幹細胞が、請求項１１〜２３のいずれか１項に記載されるものである、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
中枢神経系障害の発症後に前記幹細胞を投与する、請求項３４〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記中枢神経系障害が炎症性障害および／または神経変性障害である、請求項３４〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記中枢神経系障害が、認知症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、脳腫瘍、脊髄損傷および虚血性脳卒中からなる群より選択される、請求項３４〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記中枢神経系障害が、多発性硬化症、脳腫瘍、脊髄損傷および虚血性脳卒中からなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記幹細胞を、静脈内または髄腔内に投与する、請求項３４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は炎症を低減するための多能性体性幹細胞の使用に関し、具体的には、中枢神経系障害に関連した炎症を治療するためのならびに神経変性障害での中枢性寛容および／または末梢性寛容を誘導するための成体神経幹細胞（ａＮＳＣ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、それ自身を無制限に再生する能力を有する未分化の細胞であり、適切な条件の下で、ヒト体内において多種多様な成熟細胞型を生み出すことができる。正常細胞の喪失、または正常細胞に対する損傷を伴う任意の障害が幹細胞補充療法の候補になりうるので、幹細胞の可能性は奥深い。幹細胞からの臓器および組織発生、ならびにそれらのその後の移植によって、糖尿病、中枢神経系（ＣＮＳ）障害、肝疾患、心疾患および自己免疫障害を含む、いくつかの病変に対する有望な治療が提供される。
【０００３】
幹細胞は大部分の臓器または組織において同定されている。おそらく、最も特徴付けられているのは造血幹細胞（ＨＳＣ）である。骨髄、血液、臍帯血、胎児肝臓および卵黄嚢から単離されるＨＳＣは前駆細胞であり、これは血液細胞を生み出しまたは、移植後、複数の造血系を再惹起し、レシピエントの生涯にわたって造血を再惹起することができる（米国特許第５，６３５，３８７号および米国特許第５，４６０，９６４号）。
【０００４】
研究されてきた別の成体幹細胞がａＮＳＣである。ａＮＳＣは胎児脳の嗅球および脳室下帯において最初に同定された。最近まで、成体脳にはもはや幹細胞能を有する細胞は含まれていないと考えられていた。しかしながら、齧歯類、ならびに最近になって同様にヒト以外の霊長類およびヒトでのいくつかの研究によって、幹細胞が成体脳に存在し続けることが示されている。これらの幹細胞はｉｎ ｖｉｖｏにおいて増殖し、少なくとも一部の神経細胞をｉｎ ｖｉｖｏにおいて継続的に再生しうる。
【０００５】
ＣＮＳ障害に対する幹細胞療法は、その衰弱性および広範な出現のため、格別の関心を抱かせている。ＣＮＳ障害は、続発性神経変性（例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、脊髄損傷（ＳＣＩ）、脳損傷および脳卒中）をもたらす原発性炎症により、または続発性反応性炎症を伴う原発性神経変性（例えば、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）およびてんかん）により特徴付けられる多数の急性および慢性病を包含する。そのような障害の最終的な正味の影響は、ＣＮＳの特定の部分における神経細胞の喪失および／または変性であり、結果としてこれらの細胞またはその脳領域がその意図した機能を遂行できなくなり、このことが挙動の異常を引き起こす。
【０００６】
今日まで、ＣＮＳ障害の治療は主に、医薬化合物の投与によっていた。不幸にも、この型の治療は、血液脳関門を横切って薬物を輸送する制限された能力、および薬物を長期間投与された患者が獲得する薬物耐性を含め、多くの問題を伴ってきた。したがって、幹細胞の使用は、これらの障害の治療において期待できる可能性がある。しかしながら、慢性炎症により特徴付けられるＣＮＳ障害を患う患者でのａＮＳＣの移植は、再発またはＣＮＳ常在細胞、および移植された治療用細胞の両方を標的とし、破壊しうる持続的炎症によって治療効果がほとんどないかもしれない。
【０００７】
炎症は、傷害性の刺激の除去または中和、および組織の完全性の回復を目的とする自己防衛反応である。末梢性炎症と同様に、神経炎症は有害な過程になることがあり、それは多くの中枢神経系障害の発病の一因になりうると今では広く受け入れられている。ＣＮＳ炎症はミエリン鞘の喪失または軸索の喪失を含め、ある程度の組織損傷と一般に関連しており、ＭＳを有するヒト患者での主題である。
【０００８】
ＭＳおよびその動物モデル、つまり実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は炎症性の遅延型過敏反応に関連しており、サイトカインが細胞間シグナル伝達およびエフェクター機能のメディエーターとして主要な役割を果たしている。細胞接着分子、共刺激リガンドおよびマトリックスメタロプロテイナーゼは、自己免疫反応の間に同じくアップレギュレートされており、ＣＮＳへの白血球浸潤に関与している（Owens et al., Neurol. Clin. 13, 51-73 (1995)）。組織損傷の結果として起こる炎症反応は、さらなる損傷の一因となりうる。
【０００９】
いくつかのサイトカイン、ケモカインおよび関連するメディエーターがＥＡＥに関連付けられてきた。特に、Ｔｈ１関連サイトカインＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＴｈ１誘導性のサイトカインＩＬ−１２は、活動性疾患または再発に関連しているのに対し、Ｔｈ−２サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３は、疾患の寛解または抑制のいずれかに関連している（Owens et al., Nature Medicine 7 161-166 (2001)）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
組織炎症を低減するうえで有効な治療法を開発する必要性が残っている。本出願はこの問題に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は意外にも、幹細胞が炎症の低減により組織防御を誘導するその能力によって慢性炎症性ＣＮＳ（および非ＣＮＳ）障害においてかなりの治療用途を有することを明らかにする。
【００１２】
本発明者らは、全身注射によって、未分化成体幹細胞がこれまでに同定されていない免疫様機能を発揮することで脳修復を促進することを明らかにした。具体的には、本発明者らは、ＳＪＬマウスでの再発性ＥＡＥ（Ｒ−ＥＡＥ）のような、実験的免疫性ＣＮＳ障害において、ａＮＳＣの移植が抗炎症性Ｔｈ２、血液由来（blood-borne）ＣＮＳ浸潤性細胞ではなく、前炎症性Ｔｈ１細胞の生体内（ｉｎ ｓｉｔｕ）での（すなわち、炎症を起こしたＣＮＳ血管周囲領域での）プログラム細胞死を誘導することで顕著な神経保護を発揮することを実証した。さらに、移植されたａＮＳＣは、未分化表現型も顕著な増殖能および免疫調節能の両者を維持することで再発性の炎症症状の発現を切り抜けて生存し、このようにして慢性的な神経組織の喪失および疾患関連の障害を長期にわたって防ぐことができる[Pluchino et al., Nature 436: 266-271 (2005)]。すなわち、ＣＮＳ炎症性の微小環境は、生物学的経路（例えば、脳脊髄液、血流）を通じて注入されたａＮＳＣの、運命（および治療効果の機構）を決定付けている。ある特定の状況では、Ｂ６マウスでの慢性ＥＡＥ（Ｃ−ＥＡＥ）の場合のようにとりわけＣＮＳ変性がまん延している場合には、移植されたａＮＳＣは内因性のミエリン産生細胞に有利に働いて、成熟した表現型を獲得することや損傷した神経細胞に置き換わることもできる[Pluchino et al., Nature 422: 688-694 (2003)]。
【００１３】
ＣＮＳ障害の治療に免疫調節性の成体幹細胞を用いることの利点のいくつかを以下に概略する：
・治療用成体幹細胞は未分化細胞として増殖因子の存在下で増殖し、実質的に無限な数の移植可能な細胞の発生を可能にすることができる。  
・静脈内に注射された神経幹細胞は、恒常的に機能するホーミング分子（例えば、α４インテグリン、ＣＤ４４およびＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ））を用いて、ＣＮＳの炎症を起こした血管周囲領域のなかに選択的に蓄積し、これが病原性のＣＮＳ浸潤性血液由来リンパ球／単球によって通常使用される。  
・ＣＮＳのなかで、移植された神経幹細胞は血管周囲領域に蓄積し、ここで反応性アストロサイト、炎症性内皮細胞および脳炎誘発性Ｔ細胞が主要な幹細胞調節因子の局所放出を通じてＣＮＳの「非定型的な血管周囲のニッチ」形成に寄与する。これらの新たに形成されたニッチ様の血管周囲領域のなかで、移植されたａＮＳＣは、移植後に未分化表現型を選択的に維持し、ＣＮＳ炎症の反復発現を脱し、その反復発現を切り抜けて生存することが潜在的に可能である。  
・相当数（例えば７〜８％）の移植神経幹細胞は同様に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて増殖能を維持し、このようにして、特異的な環境シグナルに応じてそのｉｎ ｖｉｖｏでの運命（増殖；静止；遊走および分化）を調節することが潜在的に可能である。
【００１４】
本発明は幹細胞を介した免疫調節機構に関する。本発明者らは、成体神経幹細胞が炎症性ＣＮＳ疾患および神経変性疾患において中枢性寛容と末梢性寛容の両方を誘導する能力を示すことを観察した。実際に、本発明者らは、神経系（neural-committed）幹細胞が血液由来ＣＮＳ浸潤性前炎症性Ｔｈ１細胞のプログラム細胞死（アポトーシス）の誘導（中枢性寛容）（Pluchino et al (1995) Nature 436:266-271）を通じてまたは／および、例えば、ＭＳでの末梢性（例えば、二次リンパ器官の）寛容において免疫寛容をもたらす二次免疫調節機構を通じて慢性炎症性ＣＮＳ疾患における炎症を阻止または軽減できることを明らかにした。
【００１５】
したがって、本発明者らは、成体神経幹細胞を用いてＣＮＳおよび非ＣＮＳの炎症状態を治療する新たな方法を構想する。実際に、成体神経幹細胞は大規模な細胞補充を介して治療上有効であるというよりは、ＣＮＳ（またはその他の）炎症性疾患において慢性炎症を阻止するおよび／または阻害するための強力な免疫調節薬として使用することができる。
【００１６】
本発明の１つの態様によれば、中枢神経系障害の治療用医薬の調製のための、ａＮＳＣの使用が提供される。
【００１７】
本発明の別の態様によれば、前記の疾患に罹患した患者において中枢神経系障害を治療する方法であって、治療上有効量のａＮＳＣを患者に投与するステップを含む方法が提供される。
【００１８】
本発明の別の態様によれば、中枢性寛容および／または末梢性寛容を誘導するための医薬の調製のための、幹細胞の使用が提供される。
【００１９】
本発明の別の態様によれば、患者において中枢性寛容および／または末梢性寛容を誘導する方法であって、治療量の幹細胞を患者に投与するステップを含む方法が提供される。
【００２０】
本発明の別の態様によれば、炎症を低減させることによる組織防御を誘導するための医薬の調製のための、幹細胞の使用が提供される。
【００２１】
本発明の別の態様によれば、炎症に罹患した患者において炎症を低減する方法であって、治療上有効量の幹細胞を患者に投与するステップを含む方法が提供される。
【００２２】
好ましくは炎症は中枢神経系障害に関連したものであり、より好ましくは慢性の中枢神経系障害に関連したものである。
【００２３】
１つの実施形態では、疾患は関節リウマチまたは１型糖尿病などの、慢性炎症を特徴とする全身性障害または臓器特異的障害である。
【００２４】
本発明の別の態様によれば、中枢神経系浸潤性前炎症性Ｔ細胞のアポトーシスを誘導するための医薬の調製のための、幹細胞の使用が提供される。
【００２５】
本発明の別の態様によれば、前記の疾患に罹患した患者において中枢神経系障害を治療する方法であって、治療上有効量の幹細胞を患者に投与することにより中枢神経系浸潤性前炎症性Ｔ細胞のアポトーシスを誘導するステップを含む方法が提供される。
【００２６】
好ましくは、前炎症性Ｔ細胞は血液由来ＣＤ４５＋炎症性細胞である。
【００２７】
好ましくは幹細胞は胚性幹細胞ではなく、より好ましくはヒト胚性幹細胞ではない。
【００２８】
好ましくは幹細胞は分化万能性（pluripotent）細胞ではなく、より好ましくはヒト分化万能性細胞ではない。
【００２９】
好ましくは幹細胞は全能性細胞ではなく、より好ましくはヒト全能性細胞ではない。
【００３０】
好ましくは、幹細胞は多能性幹細胞である。
【００３１】
１つの実施形態では、幹細胞は多能性体性幹細胞である。
【００３２】
好ましくは、多能性体性幹細胞は神経細胞である。
【００３３】
好ましくは、ａＮＳＣは成体脳または脊髄由来である。これは胎児脳または脊髄由来のａＮＳＣを含む。
【００３４】
好ましくは、ａＮＳＣは脳室下帯由来である。
【００３５】
１つの実施形態では、先に定義の幹細胞はＣＮＳの炎症を起こした損傷などの、炎症部位への標的化部分を発現している。幹細胞は標的化部分を発現するように遺伝的に改変されてもよい。
【００３６】
好ましくは、幹細胞は炎症を起こした領域の選択的な標的化を可能にする、インテグリン、細胞接着分子（ＣＡＭ）または機能的ケモカイン受容体を発現している。
【００３７】
好ましくは、インテグリンはα４インテグリン超後期抗原（ＶＬＡ）−４である。
【００３８】
好ましくは、ＣＡＭは、ヒアルロン酸を結合する広範に発現した分子ＣＤ４４である。
【００３９】
好ましくは、ケモカイン受容体はＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ３およびＣＸＣＲ４からなる群より選択される。
【００４０】
別の実施形態では、本発明において使用される幹細胞は、プロアポトーシス分子を発現している。前記幹細胞はプロアポトーシス分子を発現するように遺伝的に改変されてもよい。
【００４１】
好ましくは、プロアポトーシス分子は、ＦａｓＬ、Ａｐｏ３ＬおよびＴＲＡＩＬなどの、主要細胞死受容体（major death receptor）リガンドである。
【００４２】
１つの実施形態では、幹細胞は哺乳動物、例えば、ネズミ、ヒト、霊長類、ブタ、ネコまたはイヌのものである。
【００４３】
別の実施形態では、医薬および／または治療は中枢神経系障害の発症後に施される。
【００４４】
好ましくは、中枢神経系障害は慢性中枢神経系障害である。
【００４５】
好ましくは、中枢神経系障害は神経変性障害である。
【００４６】
中枢神経系障害の例としては認知症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、脳腫瘍、急性脊髄損傷および虚血性脳卒中が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００４７】
好ましくは、本発明において使用される幹細胞は静脈内または髄腔内に投与されるものである。
【００４８】
本発明の別の態様によれば、中枢神経系障害に関連した炎症（神経炎症）を低減させることにより組織防御を誘導する方法であって、以下のステップ：
（ｉ）中枢神経系障害に罹患した患者での幹細胞投与のために、炎症に関連するタイムウィンドウを特定するステップ；および
（ｉｉ）該患者に幹細胞を投与するステップ
を含む方法が提供される。
【００４９】
好ましくは、磁気共鳴画像法を用いて炎症を特定する。
【００５０】
前記方法において使用される幹細胞は、上記に定義の任意の幹細胞とすることができる。
【００５１】
好ましくは前記方法において使用される幹細胞は胚性幹細胞ではなく、より好ましくはヒト胚性幹細胞ではない。
【００５２】
好ましくは前記方法において使用される幹細胞は分化万能性細胞ではなく、より好ましくはヒト分化万能性幹細胞ではない。
【００５３】
好ましくは前記方法において使用される幹細胞は全能性細胞ではなく、より好ましくはヒト全能性幹細胞ではない。
【００５４】
好ましくは、幹細胞は中枢神経系障害、好ましくは慢性の中枢神経系障害の発症後に投与されるものである。
【００５５】
１つの実施形態では、前記方法により治療される中枢神経系障害は、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、脳腫瘍、急性脊髄損傷および虚血性脳卒中からなる群より選択される。
【００５６】
より好ましくは、中枢神経系障害は多発性硬化症、脳腫瘍、脊髄損傷および虚血性脳卒中からなる群より選択される。
【００５７】
好ましくは、前記方法において投与される幹細胞は静脈内または髄腔内に投与されるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
詳細な説明
本発明の実践にあたって、特に指定のない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来技術を利用するが、これらは当業者の能力の範囲内である。そのような技術は文献に説明されている。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995および定期的な補遺; Current Protocols in Molecular Biology, 9章, 13章, および16章, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; ならびにE. M. Shevach and W. Strober, 1992および定期的な補遺, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, NYを参照されたい。これらの一般教科書の各々は参照により本明細書に組み入れられる。
【００５９】
幹細胞
幹細胞は、無期限に増殖する能力も特定の種類の細胞に分化する能力もともに有する、未分化な原始細胞である。哺乳動物幹細胞は、ＥＳ、ＥＧもしくはＥＣ細胞などの、哺乳動物胚に由来する分化万能性細胞株とすることができ、または多能性かつ成体由来のものとすることができる。哺乳動物幹細胞はネズミ、ヒトまたはその他の霊長類（例えば、チンパンジー、カニクイザル、ヒヒ、およびその他の旧世界ザル）、ブタ、イヌ、ウマならびにネコなどの、任意の哺乳類動物種由来のものとすることができる。
【００６０】
分化万能性幹細胞は、体内の任意の分化細胞を作出する潜在能を持った幹細胞である。
【００６１】
多能性幹細胞は、より多くの幹細胞を生み出す（自己再生を示す）およびそれらが得られる組織の細胞型に最終分化しうる子孫を生み出す広範な増殖能を持った未分化細胞と特徴付けられる。
【００６２】
全能性細胞は、生物全体に発達する潜在能を持った細胞と定義される。
【００６３】
胚性幹細胞
胚性幹（ＥＳ）細胞は、着床前の胚盤胞期胚の分化万能性内細胞塊（ＩＣＭ）細胞に由来する幹細胞である。胚盤胞の増殖（outgrowth）培養によって異なるタイプの細胞コロニーを生じ、この一部が未分化表現型を有する。これらの未分化細胞を支持細胞層に継代培養すると、それらは増えて、不死のように見える樹立ＥＳ細胞株を形成することができる。これらの分化万能性幹細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて胚の３種類の一次胚葉に対応する多種多様な細胞型に分化することができる。ＥＳ細胞を得る方法は、例えば、Evans et al. 1981; Nature; 29; 154-156から分かる。
【００６４】
ヒト分化万能性幹細胞を単離する方法は、例えば、Trounson, A. O. Reprod. Fertil. Dev 2001; 13 (7-8): 523-32によって記述されている。単離には支持細胞（および２０％ウシ胎仔血清）または支持細胞由来の馴化培地が必要になる。分化万能性細胞を産生するための別の方法は、国際公開第０１／３０９７８号から知られており、この中には全ての雄性または雌性由来ＤＮＡを含有する卵母細胞からの分化万能性細胞の誘導が記述されている。さらに、幹細胞様の株は、例えば、国際公開第０１／１９７７７号に記述されているように異種間の核移植によって、例えば、国際公開第０１／００６５０号に記述されているようにレシピエント細胞を脱分化するための細胞質移入によって、または分化能増強のために分化万能性幹細胞を用いて細胞を「再プログラミング」することによって（国際公開第０２／１４４６９号参照）産生することができる。
【００６５】
成体幹細胞
好ましくは、本発明において使用される幹細胞は成体幹細胞である。成体幹細胞は組織または臓器内の分化細胞のなかに見出される未分化細胞であり、これはそれ自身を再生することができ、組織または臓器の主要な特殊細胞型を生じるよう分化することができる。
【００６６】
成体幹細胞は間葉細胞、造血細胞、神経細胞および上皮細胞を含む。任意の哺乳動物幹細胞を使用してもよいが、この幹細胞は適切にはネズミ、ヒト、ブタ、霊長類、ネコまたはイヌのものである。好ましくは、成体幹細胞は神経幹細胞である。
【００６７】
好ましくは、成体幹細胞は多能性である。
【００６８】
神経幹細胞
神経幹細胞は、成体神経組織に見出される幹細胞であり、ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトを生み出すことができる。神経幹細胞の概説はGalli et al., Circulation Research 92 (6):598; Gage FH. Science. 2000; 287: 143-1438に示されている。
【００６９】
限られた脳領域内に真正の神経幹細胞（ＮＳＣ）の機能特性を保有する前駆細胞が残留することで、ニューロンを含む細胞の代謝回転が、成熟したＣＮＳで起こることが最近になって明らかにされている。幹細胞は脳室下帯（ＳＶＺ）、つまり側脳室の側壁長に沿って位置する分裂細胞の薄層と、海馬、つまり側頭葉内部の皮質との両方から単離することができる。実際に、成体哺乳動物脳では、新たなニューロンの発生が海馬歯状回の顆粒下層および側脳室の脳室下帯（ＳＶＺ）において相次いで実証されている（Galli et al., Circulation Research 92 (6):598; Gage FH. Science. 2000; 287: 1433-1438; Luskin MB. Neuron. 1993; 11; 173-189; Lois C, Alvarez-Buylla A. Science. 1994; 264: 1145-1148）。
【００７０】
ＳＶＺには４種類の主要な細胞型：新生ニューロン、アストロサイト、急速に分裂する前駆細胞、および上衣細胞が含まれる。急速に分裂する未成熟な前駆細胞は、ＳＶＺのアストロサイトの突起によって形成されたグリア管を移動する新生ニューロンの鎖と密接に結び付いている。それらは鎖のネットワークに沿った局所クラスタ内に散乱している。多線毛（multiciliated）上衣細胞は脳室腔を裏打ちしている。一連の所見から、特定の型のＳＶＺアストログリア細胞が実際の神経幹細胞であることが示唆される（Alvarez-Buylla A., J Neurosci. 2002; 22: 629-34）。
【００７１】
ＮＳＣは、成熟実質組織が第４脳室または脊髄などの、上衣単層と直接的に接触している非標準的な（non-canonical）神経に起因する脳室周囲領域（neurogenic periventricular regions）から単離され、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて増殖されうることが明らかにされている（Johansson et al., Cell. 1999; 96: 25-34）。
【００７２】
特異的マーカーの欠如からＮＳＣの一義的な同定および特徴付けが阻まれてきたが、最近になって、推定上の幹細胞マーカーであるＡＣ１３３、ＰＮＡｌｏｗ／ＨＳＡｌｏｗ、およびＬｅＸ／ｓｓｅａ−１が同定された（Uchida et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2000; 97: 14720-14725; Rietze et al., Nature. 2001; 412: 736-739; Capela et al., Neuron. 2002; 35: 865-875）。
【００７３】
特異的な系の使用によりｅｘ ｖｉｖｏでのＮＳＣの単離および増殖が可能になっており、ヒトを含めて、さまざまな生物種からのＮＳＣ株の樹立ができるようになっている（Gage, Science. 2000; 287: 1433-1438; McKay, Science. 1997; 276; 66-71; Gritti et al., Cultures of stem cells of the central nervous system. Chapter 14. In: Fedoroff S, Richardson A, eds. Protocols for Neural Cell Culture. 3rd ed. Totowa, NJ: Humana Press; 2001）。
【００７４】
適切な条件下でならびに分裂促進因子（上皮増殖因子（ＥＧＦ）および／または線維芽細胞増殖因子［ＦＧＦ］）の存在下で、成体哺乳動物脳の特定の神経原性領域、例えば、薄層（stratum）、ＳＶＺ、海馬および嗅球から、急速に分裂する前駆細胞の増殖を誘導することが可能である（Gritti et al., J Neurosci 19, 3287-97 (1999); Gritti et al., J Neurosci 16, 1091-100 (1996)）。少なくともｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、これらの前駆細胞は真正幹細胞の判定基準の大部分を満たす（Gritti et al., J Physiol Paris. 2002; 96: 81-90; Vescovi et al., Brain Pathol. 1999; 9: 569-598; Weiss et al., Trends Neurosci. 1996; 19: 387-393）。分裂促進因子の除去により、ＮＳＣの子孫はＣＮＳの３種の主要な細胞型（アストロサイト、オリゴデンドロサイトおよびニューロン）に速やかに分化する（McKay R. Science (1997) 276: 66-71）。
【００７５】
この方法に関する最も重要な概念は、それが、不均質な初代培養において、より方向付けされた（committed）前駆細胞および／または分化した成熟細胞が急速に死滅し、このようにして除去されるのに対し、未分化ＮＳＣは正に選択されて、活性な増殖状態に到達するよう強いられる選択的な系に相当するということである。ＮＳＣは、初めは接着細胞として増殖し始め、それから互いに付着し、最終的には浮遊状態で浮かびかついわゆる「神経スフェア」（neurosphere）を形成する球状のクラスタをもたらす。神経スフェアをもたらす際に、ＮＳＣは多数の対称性細胞分裂を起こし、これによって２つの新たなＮＳＣが各サイクルで生み出される。神経スフェアに見出されるＮＳＣの子孫のすべてが幹細胞であるとは限らない。実際に、これらの子孫の１０％〜５０％だけが幹細胞の特徴を保持し、残りのものは、自発的分化を起こす細胞である。その結果として、神経スフェアのサイズおよび培養の時間に応じ、神経スフェアは神経幹細胞、一過性増殖（transit-amplifying）神経前駆細胞、分化中の前駆細胞、さらには分化したニューロンおよびグリアの混合物である。これが、収集の後、機械的分離を行うことによっておよび同じ成長条件下にて再プレーティングすることによって神経スフェアを継代培養する理由である。初代培養と同様に、分化中の／分化した細胞は急速に死滅するが、ＮＳＣは増殖し続け、結果的に多くの二次的な神経スフェアおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの指数関数的成長をもたらす。このようにして、安定だが不均質なＮＳＣ細胞株を得ることができる（Galli et al., Circ. Res 92, 598-608 (2003)）。これらの特性により、遺伝子導入／遺伝的に改変されている持続的マウス（Galli et al., Development. 2002; 129: 1633-1644）またはヒトＮＳＣ株（Carpenter et al., Exp Neurol. 1999; 158: 265-278; Vescovi et al., Exp Neurol. 1999; 156: 71-83）を樹立することが可能とされている。
【００７６】
したがって、本発明の範囲内で「ａＮＳＣ」という用語は、成体神経前駆細胞（ａＮＰＣ）を含むことを理解されたい。それには同様に、例えば神経スフェアから誘導できる、ならびにａＮＳＣおよびａＮＰＣの少なくとも１つまたはその組み合わせを含む、細胞の混合群が含まれることができる。
【００７７】
炎症および慢性の中枢神経系障害
本明細書において定義されるように、ＣＮＳ障害は、ＣＮＳに関連する任意の疾患または障害を含む。ＣＮＳ障害は、続発性神経変性（例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、脊髄損傷（ＳＣＩ）、脳損傷および脳卒中）をもたらす原発性炎症により、または続発性反応性炎症を伴う原発性神経変性（例えば、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）およびてんかん）により特徴付けられる多数の急性および慢性病を包含する。そのような障害の最終的な正味の影響は、ＣＮＳの特定の部分における神経細胞の喪失および／または変性であり、結果としてこれらの細胞またはその脳領域がその意図した機能を遂行できなくなり、このことが挙動の異常を引き起こす。
【００７８】
炎症は、傷害性の刺激の除去または中和、および組織の完全性の回復を目的とする自己防衛反応である。末梢性炎症と同様に、神経炎症は有害な過程になることがあり、それはＣＮＳ障害の発病の一因になりうると今では広く受け入れられている。ＣＮＳ炎症はミエリン鞘の喪失または軸索の喪失を含め、ある程度の組織損傷と一般に関連している。例えば、そのような喪失は、ＭＳを有するヒト患者での主題である。ＭＳでは、免疫系が脳の白質および脊髄を攻撃し、結果的に身体障害および／または麻痺を引き起こす。ミエリン、オリゴデンドロサイトおよびニューロンは、免疫細胞による細胞傷害性サイトカイン、自己抗体および毒性量の興奮性神経伝達物質グルタミン酸の放出に起因して失われる。
【００７９】
ＣＮＳ炎症（神経炎症）は、ＣＮＳ障害に罹患した被験者において全身注射後のａＮＳＣが示す蓄積、残留と治療効果の両方を調整する要因として浮かび上がった。
【００８０】
神経炎症に関する本発明者らの現在の知識の大部分は、ＭＳを有するヒト患者において見られるＣＮＳ炎症および脱髄の様相を研究するのに良好な動物モデルになっている、ＥＡＥから得られたものである。ＭＳおよびＥＡＥは炎症性の遅延型過敏（Ｔｈ１）反応に関連しており、サイトカインが細胞間シグナル伝達およびエフェクター機能のメディエーターとして主要な役割を果たしている。細胞接着分子、共刺激リガンドおよびマトリックスメタロプロテイナーゼは、自己免疫反応の間に同じくアップレギュレートされており、ＣＮＳへの白血球浸潤に関与している。組織損傷の結果として起こる炎症反応は、さらなる損傷の一因となりうる（Owens et al., Nature Medicine 7 161-166 (2001)）。
【００８１】
研究から、ＥＡＥおよびＭＳがＣＮＳにおけるＴｈ１およびＴｈ１関連サイトカイン、ケモカインおよび反応性メディエーターの発現上昇により特徴付けられることが明らかにされている。これらのメディエーターの細胞供給源には、浸潤性Ｔ細胞およびマクロファージ、ならびに反応性グリアが含まれる。病態に関連する分子の発現は、寛解もしくは回復を弱める傾向があり、または再発をもたらす傾向がある。
【００８２】
いくつかのサイトカイン、ケモカインおよび関連するメディエーターがＥＡＥに関連付けられてきた。特に、Ｔｈ１関連サイトカインＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＴｈ１誘導性のサイトカインＩＬ−１２は、活動性疾患または再発に関連しているのに対し、Ｔｈ−２サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３は、疾患の寛解または抑制のいずれかに関連している（Owens et al., Nature Medicine 7 161-166 (2001)）。
【００８３】
以下に限定されないが、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に基づく技法などの検出方法は、ＣＮＳ（脳および脊髄）炎症のタイミングおよび特徴の評価を大いに手助けし、したがって神経幹細胞投与のため、炎症に関連するタイトな狭いタイムウィンドウの特定を可能にすることができる。この技法はＭＳでの炎症、脳卒中、頭部および脊髄の外傷、ならびに脳腫瘍の明確化のための感度が極めて高い。ＭＲＩは多発性の白質および灰白質病変、びまん性（不顕性）疾患、ならびに巨視的な組織萎縮をｉｎ ｖｉｖｏで検出する能力を有する（Bakshi et al., Neurology 63, S3-11 (2004)）。さらに、造影ＭＲＩはＭＳに罹患した患者での活動性脱髄性病変の早期描写を可能にし、炎症を起こした新規性または活動性病変との古いグリオティック（gliotic）病変の区別を可能とする。３倍用量のガドリニウムによって、さらに「軽度の」ＭＳの炎症の存在および程度のいっそう良好な評価を可能にすることができる（Gasperini, C. et al. Magn Reson Imaging 18, 761-3 (2000)）。拡散強調画像法および灌流法などの新規のＭＲＩ技法の利用によって、脳卒中の超急性期の間の低酸素性および無酸素性の両脳領域の特定が可能になり、したがって脳虚血後の主要な初期（炎症）および後期（変性）段階の特徴付けが可能になる（Provenzale, et al., Radiology 229, 347-59 (2003)）。さらに、ＭＲＩによって脳腫瘍の描写、拡大の評価、ならびに特徴付けおよび類別が可能になる（Henson et al., Lancet Oncol 6, 167-75 (2005)）。
【００８４】
より一般的には、本発明は、神経変性に至る原発性炎症性障害、または続発性反応性炎症が共通の付随的特徴である原発性神経変性障害を治療するために使用することができる。それらの疾患は、脳機能に影響を与える状態である。神経変性はニューロンおよび／またはグリアの変質から生じる。それらは次の２群に分けられる：
・動作障害を引き起こす状態
・記憶力に影響を与える状態および認知症に関連する状態。
【００８５】
したがって、本発明により治療できる疾患としては以下が挙げられる：
アレキサンダー病
アルパース病
アルツハイマー病
筋萎縮性側索硬化症
毛細血管拡張性運動失調症
バッテン病（別名スピールマイヤー・フォークト・シェーグレン・バッテン病）
カナバン病
コケイン症候群
ハンチントン病
ケネディ病
クラッベ病
レヴィ小体認知症
異染性白質萎縮症（Metakromatic leukodistrophy）
多発性硬化症
多系統萎縮症
パーキンソン病
ペリツェウス・メルツバッハー病
ピック病
原発性側索硬化症
レフサム病
サンドホフ病
テイ・サックス病。
【００８６】
炎症性障害はその全身的作用により特徴付けられる。これらの病気における免疫反応は、通常影響を受ける臓器以外の組織での機能不全を引き起こしうる。ＣＮＳが関与する場合、てんかん性発作ならびに頭痛、錯乱、および昏睡を含めて、広範な神経学的症状が現れる。発作またはその他の神経的異常は時に、全身性炎症性障害の初期のまたは場合により唯一の徴候であることもある。
【００８７】
本発明は同様に、関節リウマチおよび１型糖尿病などの、慢性炎症を特徴とする全身性障害または臓器特異的障害の治療に有用とすることができる。
【００８８】
細胞表面接着分子
炎症反応および免疫反応の進行は、損傷部位または抗原沈着部位への循環白血球の動員および遊走に依存している。白血球の蓄積は、炎症部位から生じる走化性シグナルに依存しているだけでなく、細胞間および細胞とマトリックスとの間の相互作用にも依存している。これらの細胞とマトリックスとの相互作用の多くは、免疫学的攻撃部位への循環細胞の標的化および貯留を促進する細胞表面接着分子（ＣＡＭ）［インテグリン、細胞表面プロテオグリカン、セレクチンなど］の発現に依存している（Springer, Nature, 346: 425-434 (1990); Albeda et al., FASEB J., 4: 2668-2680 (1990); Ruoslahti, J. Clin. Invest., 87: 1-5 (1991)）。
【００８９】
インテグリンは、他の細胞との細胞接着およびフィブロネクチンをはじめとする細胞外マトリックス成分との細胞接着を媒介する細胞表面ヘテロ二量体タンパク質のファミリーである。
【００９０】
管外遊出前の炎症細胞の接着および抑止を媒介するうえでのインテグリンおよびその他のＣＡＭの役割は複雑であるが、インテグリンがこれらの事象において中心的でありうることを示唆する証拠がある。
【００９１】
細胞レベルおよび分子レベルで、ＳＶＺ由来のａＮＳＣはα４インテグリン超後期抗原（ＶＬＡ）−４、およびＣＤ４４を発現しており、免疫細胞において報告されているのと同様の所見である。ａＮＳＣは、精製された血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）−１、つまりＶＬＡ−４の対向リガンド（counter-ligand）に自発的に接着する。実際に、ａＮＳＣは、ＶＬＡ−４などの恒常的に活性化されているインテグリンならびに／またはＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ３およびＣＸＣＲ４などの機能的ケモカイン受容体を通じて炎症を起こしたＣＮＳに選択的に進入する。
【００９２】
したがって、本発明において使用されるａＮＳＣでは、ＣＮＳの炎症を起こした損傷へのその遊走効果をさらに向上させるため、ＣＡＭとともにＧＰＣＲを使用することができる。
【００９３】
本発明において使用される幹細胞は、遺伝的に改変されてもよい。例えば、それらは上記の細胞表面接着分子を発現するように改変されてもよい。
【００９４】
遺伝子改変は幹細胞の中に、対象となる遺伝子をコードするポリヌクレオチドおよびベクターを導入することによって達成することができる。好ましくは、ベクターおよび／またはポリヌクレオチドは目的の遺伝子を発現する。
【００９５】
主要細胞死受容体リガンド
Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）およびＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）などの、細胞死受容体リガンドは、その細胞膜受容体に結合することによってアポトーシスを誘導することができる。これらのリガンドの組み換え型は、動物モデルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで化学療法薬の効果を増強することができる（Jong et al., Cancer Metastasis Rev. 2001;20(1-2):51-6を参照のこと）。
【００９６】
ベクター
当技術分野において周知であるように、ベクターは、ある環境から別の環境への物質の移入を可能にするかまたは促進するツールである。本発明によれば、および例証として、組み換えＤＮＡ技術において使用されるベクターには、本発明において使用されるヌクレオチド配列を含んだベクターを複製させるかおよび／または本発明において使用されるタンパク質を発現させるという目的で、宿主および／または標的細胞に、ＤＮＡのセグメントなどの物質が移入されることを可能にするものもある。組み換えＤＮＡ技術において使用されるベクターの例としては、プラスミド、染色体、人工染色体またはウイルスが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００９７】
本発明において使用されるポリヌクレオチドは、ベクターに組み込まれていることが好ましい。本発明において用いられるベクター中のポリヌクレオチドは、宿主細胞による、コード配列の発現を供与できる制御配列に機能的に連結されている、すなわち、ベクターが発現ベクターであることが好ましい。「機能的に連結されている」という用語は、記述の成分がその意図した方法でそれらを機能させる関係にあることを意味する。コード配列に「機能的に連結されている」調節配列は、その制御配列に適合した条件の下でコード配列の発現が達成されるように連結されている。
【００９８】
制御配列は、例えば、該制御配列によって指令される転写のレベルを、転写調節物質によく反応させるようさらなる転写調節エレメントの付加により改変することができる。
【００９９】
本発明において使用されるベクターは、例えば、複製起点、任意によりポリヌクレオチドの発現用プロモーターおよび任意によりプロモーターの調節因子を付与されたプラスミドまたはウイルスベクターとすることができる。該ベクターは１以上の選択可能なマーカー遺伝子、および／またはＧＦＰなどの追跡可能なマーカーを含むことができる。ベクターは、例えば、宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換するために使用することができる。
【０１００】
本発明において用いられるタンパク質をコードする配列に機能的に連結されている制御配列は、プロモーター／エンハンサーおよびその他の発現調節シグナルを含む。これらの制御配列は、発現ベクターをデザインして使用する、宿主細胞に適合するよう選択することができる。「プロモーター」という用語は、当技術分野において周知であり、サイズおよび複雑度が最小のプロモーターから、上流エレメントおよびエンハンサーを含んだプロモーターまで多岐にわたる核酸領域を包含する。
【０１０１】
プロモーターは、典型的には、哺乳動物細胞において機能的であるプロモーターから選択されるが、原核生物プロモーターおよび他の真核生物細胞において機能的なプロモーターが使用されてもよい。プロモーターは、典型的には、ウイルス遺伝子または真核生物遺伝子のプロモーター配列に由来するものである。例えば、それは、発現が行われる細胞のゲノムに由来するプロモーターであってもよい。真核生物プロモーターに関しては、それらは普遍的な様式で機能する（α−アクチン、β−アクチン、チューブリンのプロモーターなどの）プロモーター、または組織特異的な様式で機能する（ピルビン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターなどの）プロモーターとすることができる。ウイルスプロモーター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス末端反復（ＭＭＬＶ ＬＴＲ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーターまたはヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーターを用いることもできる。
【０１０２】
タンパク質
本明細書において用いられる場合、「タンパク質」という用語は、一本鎖ポリペプチド分子のほか、個々の構成ポリペプチドが共有結合的または非共有結合的手段により連結されている複数ポリペプチドの複合体も含む。本明細書において用いられる場合、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、単量体がアミノ酸でありかつペプチド結合またはジスルフィド結合を通じて結合されている多量体をいう。サブユニットおよびドメインという用語は同様に、生物学的機能を有するポリペプチドおよびペプチドをいうことができる。
【０１０３】
ポリヌクレオチド
本発明において使用されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むことができる。それらは一本鎖または二本鎖とすることができる。多数の異なるポリヌクレオチドが遺伝暗号の縮重の結果として同一のポリペプチドをコードできることを当業者は理解するであろう。さらに、当業者は日常的な技術を用い、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するようにして、本発明において使用されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列に影響を与えないヌクレオチド置換を行いうることが理解されるべきである。ポリヌクレオチドは、当技術分野において利用可能な任意の方法によって改変することができる。そのような改変は、本発明のポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ活性または寿命を増強するために行うことができる。
【０１０４】
変異体、誘導体、類似体、ホモログおよび断片
本明細書において言及されているタンパク質およびヌクレオチドに加えて、本発明は同様に、その変異体、誘導体、類似体、ホモログおよび断片の使用を包含する。
【０１０５】
本発明との関連で、所与の配列の変異体は、当該ポリペプチドまたはポリヌクレオチドがその内在的機能の少なくとも１つを保持するように、（アミノ酸残基であれ核酸残基であれ）残基の特定配列が改変されている配列である。変異体配列は、天然のタンパク質中に存在する少なくとも１つの残基の付加、欠失、置換、改変、交換および／または変異によって得ることができる。
【０１０６】
本発明のタンパク質またはポリペプチドに関して、本明細書において用いられる「誘導体」という用語は、結果として生じるタンパク質またはポリペプチドがその内在的機能の少なくとも１つを保持することを条件として、その配列からのもしくはその配列への１つ（もしくは複数）のアミノ酸残基の任意の置換、変異、改変、交換、欠失および／または付加を含む。
【０１０７】
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して、本明細書において用いられる「類似体」という用語は、任意の模倣体、すなわち、それが模倣するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの内在的機能の少なくとも１つを保有する化合物を含む。
【０１０８】
治療
治療に対する本明細書における全ての言及は、治癒的治療、待機的治療および予防的治療を含むと理解されるべきである。哺乳動物の治療が特に好ましい。ヒトの治療も動物の治療もともに本発明の範囲内である。
【０１０９】
好ましい実施形態では、治療はＣＮＳ障害の発症後に行われる。
【０１１０】
医薬組成物
本発明において使用される幹細胞は、医薬組成物の形態であってもよい。医薬組成物は、治療上有効量の製薬上活性な薬剤を含むか、またはそれからなる組成物である。医薬組成物は、製薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤（それらの組み合わせを含む）を含むことが好ましい。治療的使用に許容される担体または希釈剤は製薬技術分野において周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)に記述されている。製薬用担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図した投与経路および標準的な薬務に関して行うことができる。医薬組成物は、担体、賦形剤もしくは希釈剤として、または担体、賦形剤もしくは希釈剤に加えて、任意の適当な結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤を含むことができる。
【０１１１】
製薬上許容される担体の例としては、例えば、水、塩溶液、アルコール、シリコン、ワックス、ワセリン、植物油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、リポソーム、糖、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、界面活性剤、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、石油（petroethral）脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【０１１２】
投与
本発明において使用される幹細胞は任意の適当な方法によって投与することができる。そのような方法は当業者に周知である。１つの実施形態では、幹細胞は非経口的に、例えば海綿静脈洞内に（intracavernosally）、静脈内に、脳脊髄液の中に（髄腔内におよび／もしくは大槽内に）、筋肉内にまたは皮下に投与される。非経口投与の場合、本組成物は、その他の物質、例えば溶液を血液と等張にさせるのに十分な塩または単糖を含んでもよい滅菌水溶液の形態で最良に使用することができる。幹細胞は、該幹細胞が体内に存在する位置に直接的に投与することができる。好ましくは、本発明において使用されるａＮＳＣは、静脈内にまたは髄腔内に投与される。
【実施例】
【０１１３】
本発明のさらに好ましい特徴および実施形態は、以下に、非限定的な例によっておよび添付の図面に関連して記述されよう。
【０１１４】
実施例１−材料と方法
成体ＮＰＣの誘導および培養
ａＮＰＣ培養物は既報（Pluchino S. et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature 422, 688-94 (2003)）のように、６〜８週齢のＳＪＬおよびＣ５７ＢＬ／６系マウスの脳のＳＶＺから樹立した。手短に言えば、マウスをペントバルビタール（１２０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔し、頸椎脱臼により殺処理した。脳を取り出し、室温で９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を通気した人工ＣＳＦ（ａＣＳＦ）（１２４ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．３ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、および１０ｍＭ Ｄ−グルコース、ｐＨ ７．３）の中に入れた。上衣下組織（subependyma）を除く、ＳＶＺの神経組織を冠状断（coronal sectioning）の後に単離し、１ｍｍ３の小片に寸断した。小片を１．３ｍｇ／ｍｌトリプシン、０．６７ｍｇ／ｍｌヒアルロニダーゼ、および０．２ｍｇ／ｍｌキヌレン酸（全てＳｉｇｍａより）の入ったａＣＳＦ ３０ｍｌの中に移し、３２〜３４℃で９０分間、連続的に酸素供給および撹拌しながらインキュベートした。その後、組織切片をａＣＳＦの中で１０分間すすぎ、０．７ｍｇ／ｍｌオボムコイド（Ｓｉｇｍａ）の入ったＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地に移し、火炎研磨されたパスツール・ピペットで注意深く磨り潰した。細胞を遠心分離により回収し、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．６％グルコース、９．６ｍｇ／ｍｌプトレシン、６．３ｎｇ／ｍｌプロゲステロン、５．２ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム、０．０２５ｍｇ／ｍｌインスリン、０．１ｍｇ／ｍｌトランスフェリン、および２μｇ／ｍｌヘパリン（Ｓｉｇｍａ）の入った既知組成ＧＦ不含ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に再懸濁した。その後、細胞を２０ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子（ＥＧＦ）および１０ｎｇ／ｍｌ線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−ＩＩ（増殖培地）（ともにＰｅｐｒｏｔｅｃｈより）の入ったＮＳ−Ａ培地（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ）の中で培養した。一次スフェア（primary spheres）の数をｉｎ ｖｉｔｒｏでの日数（ＤＩＶ）７〜１２日間の後に計測した。
【０１１５】
細胞増殖のため、細胞８０００個／ｃｍ２を未処理の組織培養フラスコ中にて継代培養の各継代の時点でプレーティングした。３〜４日（細胞数の倍加を得るために推定された時間）後、神経スフェアを回収し、機械的に分離し、計測し、同じ培養条件の下で再プレーティングした。継代数１５以下のａＮＰＣを全てのｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ実験に使用した。
【０１１６】
Ｒ−ＥＡＥの誘導
報告（McRae, B. L. et al. Induction of active and adoptive relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) using an encephalitogenic epitope of proteolipid protein. J Neuroimmunol 38, 229-40 (1992)）の通り、ＳＪＬ系マウス（Charles-River）を完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中のＰＬＰ１３９−１５１（Ｅｓｐｉｋｅｍ） ２００μｇで免疫した。体重および臨床スコア（０＝健常；１＝尾の引きずり；２＝運動失調および／または後肢麻痺；３＝後肢麻痺および／または前肢麻痺；４＝四肢麻痺；５＝瀕死または死亡）を毎日記録した。臨床的再発は、臨床スコアの増加０．５の発生が最低３日間連続して持続する場合と定義した。
【０１１７】
ａＮＰＣ移植
核移行シグナル（ｎｌｓ）を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子で遺伝子操作されている第三世代のレンチウイルスベクターｐＲＲＬｓｉｎ．ＰＰＴ−ｈＣＭＶを用いて、ａＮＰＣをｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて標識した（Pluchino, S. et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature 422, 688-94 (2003)）。単一細胞に分離したａＮＰＣ（ＰＢＳ １５０μｌ中の細胞１〜２×１０６個）を尾静脈を通じて静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。ＰＢＳのみをｉ．ｖ．注射した偽処置の年齢適合、雌雄適合および系統適合マウスを対照として使用した。ｉ．ｖ．注射したａＮＰＣの生体内（ｉｎ ｓｉｔｕ）での増殖を評価するため、１０６ｄｐｉのＲ−ＥＡＥマウスを既報（McRae, B. L. et al. Induction of active and adoptive relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) using an encephalitogenic epitope of proteolipid protein. J Neuroimmunol 38, 229-40 (1992)）のように、３日間連続してブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ，Ｒｏｃｈｅ，５０ｍｇ／ｋｇ）でｉ．ｐ．処置し、その後すぐに殺処理した。動物に関する全ての手順は、本発明者らの機関の動物倫理委員会（ＩＡＣＵＣ）のガイドラインにしたがって行った。
【０１１８】
神経病理学
パラフィン包埋組織切片（５μｍ）をヘマトキシリンおよびエオジン、ルクソール（Ｌｕｘｏｌ）ファストブルーならびにビルショウスキー（Ｂｉｅｌｓｈｏｗｓｋｙ）で染色して、それぞれ、炎症性浸潤、脱髄および軸索消失を検出した（Lindvall, O., Kokaia, Z. & Martinez-Serrano, A. Stem cell therapy for human neurodegenerative disorders-how to make it work. Nat Med 10 Suppl, S42-50 (2004)）。ｉｎ ｖｉｖｏの、ｉ．ｖ．注射されたａＮＰＣを検出するため、２つの異なるプロトコルを使用した。（ｉ）新鮮なアガロース包埋ＣＮＳ組織切片（５０〜８０μｍ）を切り出し、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）溶液中にて３７℃で終夜インキュベートして、核のβ−ｇａｌ活性を検出した。その後、β−ｇａｌ＋のアガロース包埋切片を再び切り出し（５〜７μｍ）、免疫組織化学的検査のために処理した。（ｉｉ）β−ｇａｌ＋細胞を同様に、５μｍの凍結切片にてマウス抗β−ガラクトシダーゼ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて免疫蛍光検査により検出した。核を４’−６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｒｏｃｈｅ）で染色した。計１２０４個のβ−ｇａｌ＋細胞を計測した。両方のプロトコルを用いて、マウス１匹あたり４０枚の脳切片および７０枚の脊髄切片（１００μｍの間隔で採取）を分析した；１群あたりマウス５匹を評価した。ＣＮＳ損傷の定量化は、計３１５枚の脊髄切片（マウス１匹あたり２１枚の切片、１群あたりマウス５匹）にてＩＭ−５０画像解析ソフトウェア（Ｌｅｉｃａ）を用い行った。共焦点顕微鏡（Ｂｉｏ Ｒａｄ，ＭＲＣ １０２４）検査および光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，ＢＸ５１）検査を行って組織染色を解析した。共焦点像用に処理した組織切片を０．５μｍの間隔で解析した。
【０１１９】
抗体のリスト
免疫蛍光検査には、以下の抗体を使用した：ウサギ抗Ａｓｈ １（Ｍａｓｈ １）（１：２５０，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ラット抗ＣＤ１１ｂ（ＭＡＣ−１）（１：４００，Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗Ｄｌｘ−２（ＣｅＭｉｎｅｓ，Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ，ＣＯ，ＵＳＡ）、ヤギ抗Ｊａｇｇｅｄ（１：１００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ラット抗マウスＣＤ４５（１：１００，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ラット抗マウス胚ＮＣＡＭ（ＣＤ５６）（１：１００，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ウサギ抗ラミニン（１：５００，Ｓｉｇｍａ）、ラット抗マウスＣＤ３１（１：１００，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ラット抗ＢｒｄＵ（１：４０，Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗クラスＩＩＩニューロンβ−チューブリン（１：１０００，Ｃｏｖａｎｃｅ）、マウス抗ネスチン（１：５００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、マウス抗ニューロン核（ＮｅｕＮ）（１：１０００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ウサギ抗ＮＧ２（１：１００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ウサギ抗ＧＦＡＰ（１：５００，Ｄａｋｏ）、ウサギ抗ＰＤＧＦｒ−α（１：１０００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ヤギ抗ＢＭＰ−４（１：１００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ヤギ抗Ｎｏｇｇｉｎ（１：１００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ抗Ｋｉ６７（１：１０００，Ｎｏｖｏ Ｃａｓｔｒａ）、ラット抗ＶＣＡＭ−１（６μｇ／ｍｌ，ＡＴＣＣ）、ウサギ抗マウス活性型カスパーゼ−３（１：２５０，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびラット抗ヒトＣＤ３（１：２００，Ｓｅｒｏｔｅｃ）。適切な抗ラット、抗マウス、抗ヤギ、抗ヒトおよび抗ウサギ・フルオロフォア（Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ ４８８，５４６；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）結合またはビオチン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）結合二次抗体を使用した。免疫細胞化学検査の場合、以下の抗体を使用した：マウス抗マウスネスチン（１：２００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ヤギ抗マウスＣＣＲ２（１：５０）、ヤギ抗マウスＣＣＲ５（１：５０）、ウサギ抗マウスＣＸＣＲ３（１：１００）、ウサギ抗マウスＣＸＣＲ４（１：１００，全てＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより）、ラット抗マウスＶＬＡ−４（２０μｇ／ｍｌ，ＰＳ／２，ＡＴＣＣ）、ウサギ抗マウスＦａｓＬ／ＣＤ９５−リガンド（１：１０）およびウサギ抗マウスＴｗｅａｋ（１：１０，ともにＳａｎｔａ Ｃｒｕｚより）。適切な抗マウス、抗ヤギまたは抗ウサギ・フルオロフォア結合（Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ ４８８，５４６，３５０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）二次抗体を使用した。
【０１２０】
生体顕微鏡検査
モノクローナル抗体（Ｍａｂ）である抗ＶＣＡＭ−１（ＭＫ ２．７およびＰＳ／２）、抗ＩＣＡＭ−１（Ｙ．Ｎ．１．７）、および抗ＭＡｄＣＡＭ−１（ＭＥＣＡ ３６７）ならびにアイソタイプ適合の対照抗体をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）によって標識した。脳および胸部の筋微細血管でのＶＣＡＭ−１のｉｎ ｖｉｖｏ発現を、１５、２４および３５ｄｐｉのＭＯＧ３５−５５免疫Ｃ５７ＢＬ／６系メスマウスにおいて、ならびに注射から６時間後のＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）処置マウス（１２ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）において調べた。
【０１２１】
免疫細胞化学検査
単細胞に分離したかまたはスフェアに凝集したａＮＰＣを、増殖培地中、マトリゲルをコーティングしたガラスチャンバースライドに細胞３×１０４個／ｃｍ２でプレーティングし、３７℃で１時間インキュベートした。蛍光サンプルをＢｉｏＲａｄ，ＭＲＣ １０２４共焦点像顕微鏡で解析した。Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ ｐｌｕｓソフトウェアをＶＬＡ−４分布の解析に使用した。
【０１２２】
ａＮＰＣのｉｎ ｖｉｖｏ分布研究
ａＮＰＣ（細胞２×１０６個／マウス）を、増殖培地中、１００μＣｉ／ｍｌ ２，３−［３Ｈ］グリセロール（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）とともに３７℃で４時間インキュベートし、その後、ＣＦＡ（加えて百日咳毒素５００ｎｇ）２中のミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）３５−５５（Ｅｓｐｉｋｅｍ）２００μｇで免疫したＣ５７Ｂｌ／６系マウスと、ＰＬＰ１３９−１５１を免疫したＳＪＬ系マウスの両方にｉ．ｖ．注射した（McRae, B. L. et al. Induction of active and adoptive relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) using an encephalitogenic epitope of proteolipid protein. J Neuroimmunol 38, 229-40 (1992)）。発病開始後すぐにマウスに注射し、移植から２４時間後にマウスを殺処理した。既報（Constantin, G., Laudanna, C. & Butcher, E. C. Novel method for following lymphocyte traffic in mice using [3H]glycerol labeling. J Immunol Methods 203, 35-44 (1997)）のように、灌流の後、脳、脊髄、腎臓、脾臓および肝臓を回収し、計量し、超音波処理し、組織の放射活性含有量をβカウンター（ＬＳ１８０１；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）の中で測定した。データは一連の４回の独立した実験からの少なくとも１群あたりマウス６匹の蓄積細胞の平均パーセンテージ（±ＳＥ）／ｇｒ．組織として表される。
【０１２３】
静的接着アッセイ
既報（Constantin, G. et al. Chemokines trigger immediate beta2 integrin affinity and mobility changes: differential regulation and roles in lymphocyte arrest under flow. Immunity 13, 759-69 (2000)）のように、（１μｇ／ｍｌ）精製マウスＶＣＡＭ−１（ＲＡＮＤ Ｄ）で４℃にて終夜コーティングした１８ウェルガラススライドにａＮＰＣを７０×１０３個／２５μｌ／ウェルで加えた。分裂促進因子（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート［ＰＭＡ］）（１００ｎｇ／ｍｌ））で１０分間刺激した脾臓由来ＣＤ４＋Ｔ細胞を陽性対照として使用した。活性化前炎症性ケモカイン（１μＭ）（すなわち、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０、ＣＸＣＬ１１／Ｉ−ＴＡＣ、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ１α）を２５×１０３個／２５μｌ／ウェルですぐに加え、３７℃にて３分間置いた。固定化されたＶＣＡＭ−１の平方マイクロメートルあたりの部位密度を計算し、データを接着細胞の平均数（±ＳＥ）として表した。データは一連の４回の独立した実験からの接着細胞の平均数（±ＳＥ）として表される。
【０１２４】
走化性アッセイ
既報（Lazarini, F. et al. Differential signalling of the chemokine receptor CXCR4 by stromal cell-derived factor 1 and the HIV glycoprotein in rat neurons and astrocytes. Eur J Neurosci 12, 117-25 (2000)）のように、改良４８ウェルｍｉｃｒｏｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ Ｂｏｙｄｅｎチャンバーシステム（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ）を用いて、種々のケモカインに対するａＮＰＣの走化反応を評価した。
【０１２５】
アポトーシス実験
未免疫（naive）ＳＪＬ系マウスの脾臓由来ＣＤ３＋細胞または脳炎誘発性ＣＤ４＋ ＰＬＰ１３９−１５１特異的なＴ細胞株を、３７℃、７％ ＣＯ２で１８時間、用量設定濃度（titrated concentrations）のａＮＰＣとともにｉｎ ｖｉｔｒｏで共培養した。その後、Ｔ細胞を回収し、適切な抗体を用いＦＡＣＳ分析を行って、アポトーシスおよびネクローシスＣＤ３＋細胞を計数した。ｈｒＴＲＡＩＬ−Ｒ２：Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）、ｍｒＦｎ１４：Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）、またはＦａｓ：Ｆｃ（２０μｇ／ｍｌ）（全てＡｌｅｘｉｓより）を用い、細胞死受容体リガンドをブロックする抗体によるａＮＰＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの前処理（室温で３０分）を行った。それぞれ、ウサギ抗マウスＩＦＮγブロック抗体（１０μｇ／ｍｌ，室温で３０分，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いるかまたは５−メチルイソチオ尿素硫酸塩（ＳＭＴ）ｉＮＯＳ阻害剤（５００μＭ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を共培養ウェルに加えるかのいずれかによって、ＩＦＮγおよびｉＮＯＳを同様にブロックした後に、アポトーシス実験を行った。データは各プロトコルについて最低３回の独立した実験からの、少なくとも１群あたりマウス３匹の、ベースラインと比べた陽性細胞の平均割合（±ＳＥ）として表される。
【０１２６】
ＰＬＰ１３９−１５１特異的なマウスＴｈ１およびＴｈ２細胞株の作出
ＰＬＰ１３９−１５１特異的なＴ細胞株を報告（Parras, C. M. et al. Mash1 specifies neurons and oligodendrocytes in the postnatal brain. Embo J 23, 4495-505 (2004)）の通り、１０ｄｐｉのＰＬＰ１３９−１５１免疫ＳＪＬ系マウスの排出リンパ節から得た。手短に言えば、細胞５×１０６個／ｍｌを３０μｇ／ｍｌ ＰＬＰ１３９−１５１（Ｅｓｐｉｋｅｍ）の存在下、５０μＭ ２−β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、１ｍＭペニシリン（Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）および１０％ ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ）を添加したＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中にて３７℃および７％ ＣＯ２で培養した。１４日間のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖の後、Ｔ細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下において１：５のＴ細胞／ＡＰＣ比で、３０μｇ／ｍｌ ＰＬＰ１３９−１５１により３日間、再刺激し、次に、細胞内染色後のＦＡＣＳ分析によってＴｈ１（ＩＦＮγ＋／ＴＮＦα＋／ＩＬ−４−）またはＴｈ２（ＩＦＮγ−／ＴＮＦα−／ＩＬ−４＋）サイトカイン産生のいずれかを特徴付けた。
【０１２７】
リンパ球／単球（ＬＮＣ）／ＮＰＣ共培養
マウスｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養系のために、増殖アッセイ用のリンパ球／単球（ＬＮＣ）を、免疫付与から１０日後の、ＰＬＰ１３９−１５１免疫ＳＪＬ系マウスの排出リンパ節から得た。７０μｍの細胞ろ過器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いてＬＮＣ懸濁液を調製した。細胞を２ｍＭグルタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）および５０μＭ β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）の入った完全ＲＰＭＩ培地に懸濁した。培養は全て３検体ずつで行った。ＬＮＣの増殖を３Ｈ−チミジンの取り込みによりｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイした。１０％ウシ胎仔血清、１μＭ Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を添加したＲＰＭＩ培地２００μｌの中に１ウェルあたり細胞７×１０５個を播種することによって、アッセイを行った。ベースラインの３Ｈ−チミジンの取り込み、および１〜３０μｇ／ｍｌのＰＬＰ１３９−１５５ペプチド（Ｅｓｐｉｋｅｍ，Ｆｌｏｒｅｎｃｅ，Ｉｔａｌｙ）に反応しての３Ｈ−チミジンの取り込みを調べた。抗原提示時のａＮＰＣの効果を調べるため、単一細胞に分離したマウスＮＰＣを９６ウェルプレートに移し（１：２のＮＰＣ／ＬＮＣ比）、その後、ＬＮＣと共培養した。上清を３日間の培養物から回収し、少なくとも７２時間のインキュベーションの後、標準的な３Ｈ−チミジン取り込みアッセイによりＴ細胞増殖をＲＰＭＩ培地中で調べた。細胞をｍｕｌｔｉｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ，ＶＡ，ＵＳＡ）によってガラス繊維フィルターに回収し、放射活性を標準的なシンチレーション法によって測定した。
【０１２８】
ＥＡＥの養子移植（Adoptive transfer）
養子移植のため、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの共培養期間の後、ＷＴのＳＪＬ系６〜８週齢メスマウスに静脈内注射により、１×１０６個の（事前に同系のａＮＰＣと共培養されたかまたはされていない）ＬＮＣを投与した。報告の通り、臨床的ＥＡＥを０〜５に類別した。
【０１２９】
ＲＴ−ＰＣＲ
リアルタイム定量的ＰＣＲはＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて、開発済みの（pre-developed）Ｔａｑｍａｎ（商標）Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔｓを用い製造元のプロトコルにしたがって行った。相対的な定量化のため細胞サンプルを集めた。細胞２００万個のサンプルを溶解用緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）の中で溶解し、製造元の使用説明書にしたがいＲＮＡを抽出するまで−８０℃で保存した。残存するゲノムＤＮＡをＲＮａｓｅ不含のＤｎａｓｅ Ｉ（Ｑｉａｇｅｎ）とインキュベートすることで除去し、ＲＮａｓｅ不含水によりＲＮｅａｓｙミニカラムから溶出した。総ＲＮＡの量をＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１００（Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により定量化し、ｃＤＮＡをＲｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により総ＲＮＡ ５μｇから合成し、ランダムヘキサマー（ｐｄ（Ｎ）６）の混合物をプライマーとして使用した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）による精製の後、ｃＤＮＡサンプルをＱＰＣＲでの使用の前に１：６に希釈した。ｃＤＮＡ ２５ｎｇを開発済みのＴａｑｍａｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるリアルタイムＰＣＲに使用した。リアルタイム定量的ＰＣＲはＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、製造元のプロトコルにしたがい行った。本発明者らはハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを標準化物質（normalizer）として、ならびにＣｏｎＡ（５μｇ／ｍｌで７２時間）活性化脾細胞（系統適合、雌雄適合および年齢適合マウス由来）を較正物質（calibrator）として使用した。データはｉｎ ｖｉｔｒｏでの増幅の継代数１０回以下の、３種の異なる非不死化ａＮＰＣ株から採取されたａＮＰＣサンプルを用いて得た。結果（３回の独立した実験の平均）は任意単位（ＡＵ）として表されており、陽性の内部較正物質として使用したＣｏｎＡ活性化脾細胞との比較での、ａＮＰＣにおいて検出されたｍＲＮＡレベルの誘導倍率（平均±ＳＤ）を示す。
【０１３０】
サイトカインおよびケモカインアッセイ
本発明者らはＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）を測定した。これらの分子は多重免疫化学発光ＥＬＩＳＡ（ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔＴＭ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）により製造元の使用説明書にしたがって測定した。９種のＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン特異的な（マウスＴｈ１／Ｔｈ２アレイ）、捕捉用抗体をＥＬＩＳＡマイクロプレートの各ウェルに予めスポットした。共培養上清をマウスＴｈ１／Ｔｈ２アレイ用のサンプル希釈液（Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ）で１０倍に希釈した。標準物質および上清５０μＬをウェルに加えた。１時間のインキュベーションおよび３回の十分な洗浄（洗浄用緩衝液（Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ）による）の後、ビオチン化抗体試薬（Ｂｉｏｔｙｎｉｌａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅａｇｅｎｔ）５０μＬを加えた。３０分間のインキュベーションおよび引き続く洗浄の後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ試薬５０μＬを各ウェルに加えた。３０分後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｓｔａｂｌｅ ＰｅｒｏｘｉｄｅおよびＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｏｌ Ｅｎｈａｎｃｅｒの１：１混合物）５０μｌを加えた。発光を冷却ＣＣＤカメラ（ＦｌｕｏｒＣｈｅｍＴＭ ８０００，Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）で測定した。Ａｒｒａｙ ＶｉｓｉｏｎＴＭソフトウェアをＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔＴＭイメージの解析に使用した。検出限界は次の通りであった：ＩＬ−２、０．２ｐｇ／ｍＬ；ＩＬ−４、０．４ｐｇ／ｍＬ；ＩＬ−１０、０．２ｐｇ／ｍＬ；ＩＦＮγ、０．２ｐｇ／ｍＬ；ＴＮＦα、１．６ｐｇ／ｍＬ。サンプルは全て２検体ずつ分析した。アッセイ内およびアッセイ間の不正確性は１５％未満であった（製造元の使用説明書）。
【０１３１】
ＦＡＣＳ分析
ＣＤ３、ＣＤ４、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ−４、ＦａｓＬおよびＴｗｅａｋ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＩＬ−４、ＩＦＮγおよびＴＮＦα（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を認識する標識抗体の異なる組み合わせでの細胞染色を、アネキシン−Ｖ、ＴＯＰＲＯ−３、ＰＩ（全てＰｈａｒｍｉｎｇｅｎより）染色と併せて用いた。
【０１３２】
フローサイトメトリーおよび細胞調製
マウスＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＰＳＧＬ−１、ヒトＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＰＳＧＬ−１、ヒトＣＤ５６／ＮＣＡＭ、白血球機能関連抗原（ＬＦＡ）−１、ＣＤ４４、細胞間細胞接着分子（ＩＣＡＭ）−１および２、α１、α２、α６、αｖ、β１、β２、β７インテグリンならびにヒトＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４に対する、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合、フィコエリスリン（ＰＥ）結合、またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）−フィコエリスリンシアニン５．５（Ｃｙ）結合抗体を使用した。一次抗体および適切なアイソタイプ対照抗体はともにＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＦＡＣＳＣａｎｔｏ機器（ともにＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡより）にて行った。細胞内のサイトカイン染色の場合、共培養実験の細胞を、ブレフェルジンＡ（１μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、イオノマイシン（Ionomicin）（１μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、ＰＭＡ（１μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）とともに３７℃、５％ＣＯ２で５時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、抗ＣＤ４抗体で染色し、３．７％ホルムアルデヒド中で固定し、０．５％サポニンのＰＢＳ液で透過処理し、抗ＩＦＮγ抗体、抗ＩＬ−４抗体、抗ＩＬ−２抗体、または抗ＩＬ１０抗体とともにインキュベートした。データはＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて収集し、ＦｌｏｗＪｏ，バージョン６．１．１（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を用いて解析した。
【０１３３】
実施例２−脳室下帯（ＳＶＺ）由来の同系（syngenic）ＮＰＣの治療能力
本発明者らは、度重なる炎症症状の発現の長期的結果として、脱髄および軸索消失などの神経変性特徴を含む慢性再発性の自己免疫性ＣＮＳ炎症、つまり再発−寛解型実験的自己免疫性脳脊髄炎（Ｒ−ＥＡＥ）のマウスモデルにおいて脳室下帯（ＳＶＺ）由来の同系（syngenic）ａＮＰＣの治療能力を評価した（McRae, B. L. et al. J Neuroimmunol 38, 229-40 (1992)）。Ｒ−ＥＡＥを有するＳＪＬ系マウスに、最初の疾患症状の発現時（免疫後１３．１±０．３日［ｄｐｉ］）に、または最初の臨床的再発の発生時（３０．９±１．１ｄｐｉ）に、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）標識ａＮＰＣ（細胞１×１０６個／マウス）を静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。移植後（ｐ．ｔ．）３ヶ月までマウスを追跡した。両処置プロトコルによって臨床的改善が認められた（表１および図１）。疾患発症時に移植が行われたマウスは３０〜６０ｄｐｉに回復し始め、この期間に、偽処置マウスと比べて、２倍低い臨床的再発を有意に示した（ｐ＜０．０５）。偽処置マウスと比べて、同様に低い再発率が経過観察の終わり（１０６ｄｐｉ）まで維持された（ｐ＜０．０５）。最初の再発の発症時に移植が行われたマウスは、もっと遅くに回復し始めたが、６０〜９０ｄｐｉの再発率が劇的に３倍低下していた（ｐ＜０．００５、偽処置マウスと比較した場合）。経過観察期間の終了時に、両群のマウスは偽処置マウスと比べて、有意に低いＲ−ＥＡＥの累積スコアならびに脱髄および軸索消失の程度の顕著な低下（５８％〜８０％）を示した。
【０１３４】
ａＮＰＣがＲ−ＥＡＥ発症時にまたは最初の臨床的再発の発生時に注射されたかどうかにかかわらず、多数のβ−ｇａｌ＋細胞がＣＮＳにとどまっていた（図２および図３）。（炎症を起こした血管壁を含む）偽処置マウスのＣＮＳにはβ−ｇａｌ活性が認められなかった（図３）。１０６ｄｐｉで、本発明者らは、疾患発症時に移植が行われたマウスで２．１（±０．２）のβ−ｇａｌ＋細胞／ｍｍ２、および最初の再発時に移植が行われたマウスで４．１（±０．５）のβ−ｇａｌ＋細胞／ｍｍ２を見出した。β−ｇａｌ＋細胞の大多数は、血液由来ＣＮＳ浸潤性ＣＤ４５＋炎症性免疫細胞と密着した状態で、炎症を起こしたＣＮＳの深部血管壁の周りに位置しており（図２ａおよびｂ）、未成熟な神経前駆細胞に特有な丸型の形態を維持していた（図２および図３）。β−ｇａｌ＋細胞の中にはネスチン＋（０．２８±０．１細胞／ｍｍ２）（図２ｃおよびｄ）、ＮｅｕＮ＋（０．２１±０．１細胞／ｍｍ２）（図２ｅおよびｆ）またはｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ−ｒｅｌａｔｅｄ（Ｄｌｘ）−２＋（０．１２±０．１細胞／ｍｍ２）（図２ｈおよびｉ）を示すものもあったが、それらのうち、前神経(pro-neural)転写因子である哺乳動物ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅホモログ（Ｍａｓｈ）−１（Parras, C. M. et al. Embo J 23, 4495-505 (2004)）（図２ｇ）に対し、またはポリシアル酸化神経細胞接着分子（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ）（Fukuda, S. et al. J Neurosci 23, 9357-66 (2003)）（図２ｊ〜ｍ）に対し免疫反応性を示すものは少なかった。β−ｇａｌ＋細胞にはＮＧ２、グリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）（図４）、β−チューブリンＩＩＩ、または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体−αに免疫反応性を示すものは全くなかった。時には、成体脳の幹細胞ニッチ内の移動性神経芽細胞について記述されているものによく似た、鎖状の移動（chain migration）によるストリーム様（stream-like）の管状パターンを示す移植ａＮＰＣが、血管壁と密着しているのが見出された（図３）。ＣＮＳの中にとどまっているａＮＰＣの動態をより良く定義するため、Ｒ−ＥＡＥマウスを１０６ｄｐｉの時点でＢｒｄＵにより処理した。同等の割合の移植β−ｇａｌ＋細胞：疾患発症時に移植が行われたマウスでは７．３％［±１．５］、および最初の再発時に移植が行われたマウスでは８．４％［±１．４］がＢｒｄＵ＋であった（図２ｎ）。時には、β−ｇａｌ＋／ＢｒｄＵ＋細胞が早期分化マーカー（例えば、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ）を発現していた（図４）。長期のＢｒｄＵ標識試験は、成体脳内に幹細胞ニッチを有するＲ−ＥＡＥマウス由来の血管周囲のＣＮＳ領域の類似性を証明しており、定義的な神経幹細胞／前駆細胞マーカーは依然として欠落しているが、血管周囲の（早期）分化表現型を依然として維持している、同等の部分集団の増殖性ｉ．ｖ．注射細胞の説明から、炎症を起こしたＣＮＳ血管周囲領域がＲ−ＥＡＥの間に、理想的な、とはいえ「非定型的な」ニッチ様領域として機能することが可能であり、その領域で移植細胞は「真正の」ａＮＰＣとして長期間（ｐ．ｔ．から３ヶ月まで）生存できることが強く示唆される。
【０１３５】
実施例３−炎症を起こした血管周囲のＣＮＳ領域内でのａＮＰＣ生存に有利に働くメカニズム
次いで、本発明者らは、炎症を起こした血管周囲のＣＮＳ領域内でのａＮＰＣ生存に有利に働く推定上のメカニズムを分析した。ａＮＰＣ移植にかかわらず、ともに血管新生にも神経新生にも関与している主要な幹細胞調節因子および増殖因子（すなわち、骨形成タンパク質［ＢＭＰ］、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｎｏｔｃｈ−Ｉ／Ｊａｇｇｅｄ−１、血管内皮増殖因子［ＶＥＧＦ］−α）が１０６ｄｐｉまでこれらの領域内に、タンパク質レベルで見出された（図５）。ＢＭＰ−４およびＮｏｇｇｉｎ（図６および図７）はβ−ｇａｌ−／ＧＦＡＰ＋アストロサイト（図６ａおよびｂ）ならびにβ−ｇａｌ−／ラミニン＋内皮細胞（図６ｃおよびｄ）によって分泌されただけでなく、血液由来ＣＮＳ浸潤性ＣＤ４５＋炎症性細胞（図６ｅ）によっても分泌された。この後者の結果は、脾臓由来のリンパ球にて、ｍＲＮＡレベルで確認された（図６ｆ）。
【０１３６】
実施例４−ｉ．ｖ．注射されたａＮＰＣがＲ−ＥＡＥマウスの炎症を起こした血管周囲のＣＮＳ領域に選択的に到達したことの細胞的および分子的基盤
次いで、本発明者らは、ｉ．ｖ．注射されたａＮＰＣがＲ−ＥＡＥマウスの炎症を起こした血管周囲のＣＮＳ領域に選択的に到達したことの細胞的および分子的基盤を探索した。マウスの系統（Ｃ５７Ｂｌ／６系およびＳＪＬ系）にかかわらず、本発明者らは、ａＮＰＣの半分（５３±１０％）がα４インテグリン超後期抗原（ＶＬＡ）−４を、クラスター状に組織された恒常的活性化分子として発現すること（１２±５％の細胞は陰性であったが、３１±９％の細胞は「分散性の」分布であった）（図８ａおよびｂ）、つまり免疫細胞において報告されたものに類似の所見（Constantin, G. et al. Immunity 13, 759-69 (2000)）を見出した。精製された血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）−１、つまりＶＬＡ−４の対向リガンドへのａＮＰＣの自発的な接着はベースラインで高率で、分裂促進因子によって活性化されたＣＤ４＋細胞で得られたものに匹敵していた（図８ｃ）。しかしながら、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０、ＣＸＣＬ１１／ＩＴＡＣおよびＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１αなどのケモカインでの刺激後、接着は顕著に増加しなかった（図８ｃ）。ＶＣＡＭ−１発現細胞に接着するａＮＰＣの自発的能力は、リポ多糖（ＬＰＳ）のｉ．ｐ．注射によって微細血管でのＶＣＡＭ−１発現のアップレギュレーションがもたらされた脳炎症の亜急性Ｃ５７Ｂｌ／６系マウスモデル（Constantin, G. et al. J Immunol 162, 1144-9 (1999)）において、生体顕微鏡検査により確認された（図８ｄ）。この所見は、ＶＣＡＭ−１を異所的に過剰発現する胸筋由来の細静脈に対するａＮＰＣの特異的結合によってさらに裏付けられた（図８ｅ〜ｇ）。ＶＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体は（脳および筋肉の両者で）６０％を超えるａＮＰＣの安定接着をブロックしたが、アイソタイプ適合した、抗ＩＣＡＭ−１抗体および抗ＭＡｄＣＡＭ−１抗体では顕著な効果がない。
【０１３７】
Ｒ−ＥＡＥでのこの現象の正当性を検証するため、３Ｈ−グリセロール標識ａＮＰＣ（２×１０６細胞／マウス）を最初の疾患症状の発現時に、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）１３９−１５１免疫ＳＪＬ系マウスにｉ．ｖ．注射した。細胞の注射から早ければ２４時間後に、ａＮＰＣはさまざまな身体臓器の中に見出されたが、３．１％（±０．２）の細胞がＣＮＳ内に蓄積していた（図８ｈ）。ＣＮＳ内の細胞動員の有意な減少（３９〜５４％；ｐ＜０．００５）は、抗ＶＬＡ−４ブロック抗体によるａＮＰＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの前処理後に得られた（図８ｈ）。ＶＬＡ−４のブロックによって、標識ａＮＰＣをｉ．ｖ．注射した未免疫マウスのＣＮＳ（およびその他の末梢臓器）への細胞動員の低下が誘導されなかったことから、この効果はＥＡＥ特異的であった（図８ｈ）。結果は、Ｃ５７Ｂｌ／６系マウスで得られたＥＡＥの慢性進行性モデルにおいてさらに確認された（図９）。
【０１３８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究により、前炎症性ケモカインが、ａＮＰＣ上に発現されたＶＬＡ−４の対向リガンドに対するベースラインの結合活性をさらには活性化しないことが示された。しかしながら、本発明者らは、分裂促進因子との培養プロトコルが何らかの形で、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてａＮＰＣのベースラインのＶＬＡ−４結合活性に影響を及ぼす可能性を排除しえない。例えば、ａＮＰＣの経内皮移動をさらに高めるには、または環境上の位置決めを媒介するには、次にＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）が、ｉｎ ｖｉｖｏで起こりうる条件などの、最適に近い条件に必要になるのかもしれない（Alt et al. Eur J Immunol 32, 2133-44 (2002); Karpus et al. J Leukoc Biol 62, 681-7 (1997)）。本発明者らは、ａＮＰＣがｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方で、広範な前炎症性ケモカイン受容体を発現することを見出した。神経スフェア内の大部分の細胞がＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ３およびＣＸＣＲ４を発現するが、しかしＣＣＲ３およびＣＣＲ７を発現しない（図８ｉ〜ｍ）。ａＮＰＣがＣＣＬ５／ＲａｎｔｅｓおよびＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１αに対し明らかに用量依存的な走化性を有して反応したことから、これらの受容体は機能的に活性であった（図１０）。この反応は明らかにＧＰＣＲ依存的であった。その反応がＧｉ−タンパク質阻害剤である百日咳毒素によるａＮＰＣの前処理で完全に阻害されたからである（図１０）。このように、ａＮＰＣはＣＡＭとともにＧＰＣＲを用いて、炎症を起こしたＣＮＳ損傷へのその遊走能をさらに向上させることができ、抗α４インテグリンブロック抗体によりＲ−ＥＡＥマウスでもたらされたａＮＰＣの管外遊出に対する部分的阻害を説明することができる。
【０１３９】
実施例５−Ｔ細胞のアポトーシス
炎症は、Ｒ−ＥＡＥマウスのＣＮＳにおけるｉ．ｖ．注射ａＮＰＣの選択的動員および長期生存の両方を決定する「危険シグナル」として作用していることが上記の例から明らかである。アポトーシスはＣＮＳ浸潤性脳炎誘発性Ｔ細胞のプログラム細胞死を誘発することによって、ＥＡＥからの回復を促進する主要なメカニズムの１つと考えられる（Furlan, R. et al. J Immunol 167, 1821-9 (2001); Weishaupt, A. et al. J Immunol 165, 7157-63 (2000)）。早ければｐ．ｔ．２週間（３０ｄｐｉ）で、発症時に移植が行われたＲ−ＥＡＥマウスは、ＣＮＳ炎症性浸潤細胞数の有意な低下（ｐ＜０．０１）およびＣＮＳ浸潤性ＣＤ３＋／ＴＵＮＥＬ＋細胞数の３倍の増加（ｐ＜０．００５、偽処置マウスと比較した場合）を示した（図１１ａおよび図１２）。ａＮＰＣ処置マウスおよび偽処置マウスの両者で、アポトーシス細胞の大部分（８３．８±６．９％および９０．５±２．３％）は、ＣＮＳの血管周囲の炎症性浸潤内に限られていた。活性型カスパーゼ−３をアポトーシスのマーカーとして用い確認された結果から、移植されたβ−ｇａｌ＋細胞は、血管周囲のＣＮＳの炎症を起こした領域内で、アポトーシスを起こしていないことも実証された（図１１ｂ）。５０ｄｐｉの時点で、ＣＮＳ浸潤性ＣＤ３＋細胞にて行われたｅｘ ｖｉｖｏでのＦＡＣＳ分析から、偽処置マウス（５．２±０．６％）と比べて、発症時に移植が行われたＲ−ＥＡＥマウスでのアネキシンＶ＋／ＴＯＰＲＯ−３＋「後期アポトーシス」細胞の有意に（ｐ＝０．０１）高い割合（２７．３±１０．４％）が示された（図１１ｃ）。同じマウスにおいて、ＩＦＮγ＋（１７．６±２．２６％，偽処置および１２．２±３．５３％，ａＮＰＣ処置）、ＩＬ−２＋（１７．８±１．６４％，偽処置および３３．６±１０．７％，ａＮＰＣ処置）、およびＩＦＮγ＋／ＩＬ−２＋（５９．３±１．９６％，偽処置および４１．０±１５．７％，ａＮＰＣ処置）産生細胞の割合の有意でない差異から示されるように、ＣＮＳ浸潤性ＣＤ３＋細胞は免疫アネルギーの兆候を少しも示さなかった。Ｔ細胞に対するａＮＰＣのプロアポトーシス効果を、次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析により確認した。プラスチック固定化抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体により活性化された未免疫同系（syngenic）ＳＪＬマウスの脾臓由来ＣＤ３＋細胞は、漸増数の、単一細胞に分離したａＮＰＣとの共培養時にアポトーシスを起こした；細胞間の接触を回避するｔｒａｎｓ−ｗｅｌｌシステムにおいて、ＣＤ３＋細胞に対するａＮＰＣのプロアポトーシス効果は依然として測定可能であったが、それほど強くはなかった（図１２）。さらに、前炎症性Ｔｈ１（例えば、ＴＮＦα、ＩＦＮγ）サイトカインプロファイルを示すＰＬＰ１３９−１５１特異的なＣＤ４＋ Ｔ細胞株は、漸増数の、単一細胞に分離したａＮＰＣとのｉｎ ｖｉｔｒｏでの共培養時にアポトーシスを起こしたが、抗炎症性Ｔｈ２（例えば、ＩＬ−４）プロファイルを示すＰＬＰ１３９−１５１特異的なＣＤ４＋ Ｔ細胞株はそうでなかった（図１１ｄ）。線維芽細胞、全骨髄細胞（ＷＢＭＣ）、またはａＮＰＣ馴化培地では、ＰＬＰ１３９−１５１特異的なＴｈ１細胞との共培養時に、測定可能なプロアポトーシス効果を誘導しなかった。
【０１４０】
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのデータから、ａＮＰＣ介在性のアポトーシスは細胞死受容体介在経路（外因性）とミトコンドリア介在経路（内因性）の双方を介して誘導されうることが示唆される（総説としては、Marsden, V. S. & Strasser, A. Annu Rev Immunol 21, 71-105 (2003)を参照のこと）。細胞死受容体リガンド（例えば、ＦａｓＬ、Ａｐｏ３Ｌ、ＴＲＡＩＬ）のブロックによって、ＰＬＰ１３９−１５１特異的なＴｈ１細胞のアポトーシスが顕著に（２２．３〜５０．１％）減少したが、ＩＦＮγおよび誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）のブロックによっては減少しなかったことから（図１１ｄ）、細胞死受容体経路の主たる関与が示唆された。しかしながら、依然として、ミトコンドリアのアポトーシス経路の関与を排除しえない。実際に、前炎症性サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子［ＴＮＦα］、ＩＦＮγおよびインターロイキン［ＩＬ］−１β）によりｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて処理されたａＮＰＣは、細胞死受容体リガンド（例えば、ＦａｓＬ、Ｔｒａｉｌ、Ａｐｏ３Ｌ）の膜発現（図１１ｅ〜ｇ）だけでなく、ミトコンドリア介在性のアポトーシスに関わる可能性のある可溶性因子（例えば、ｉＮＯＳ、ＩＦＮγ、グリア由来神経栄養因子［ＧＤＮＦ］および白血病抑制因子［ＬＩＦ］）の産生も大いに（タンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルの両者で）増加させた（Weishaupt, A. et al. J Immunol 165, 7157-63 (2000); Marsden, V. S. & Strasser, A. Annu Rev Immunol 21, 71-105 (2003); Schere-Levy, C. et al. Exp Cell Res 282, 35-47 (2003); Tarrant, T. K. et al. J Exp Med 189, 219-30 (1999)）（図１２および図１３）。このように、本発明者らの結果から、ａＮＰＣ介在性のＴ細胞アポトーシスは、細胞死受容体介在性のものが主であるとはいえ、複数の異なる経路を介して起きていることが示唆される。最後に、本発明者らは１０６ｄｐｉで、ａＮＰＣ処置Ｒ−ＥＡＥマウス由来の血管周囲のＣＮＳ領域内に、突起を持ったＣＤ１１ｂ＋活性化ミクログリア細胞（図５）の数が増えていることを見出した（発症時に処置されたマウスでは７９．７［±１０．８］細胞／ｍｍ２、最初の再発時に処置されたマウスでは５８．６［±５．６］細胞／ｍｍ２、偽処置マウスでは３．３［±０．８］細胞／ｍｍ２、ｐ＜０，００１）。実に、ミクログリア細胞は前炎症性サイトカインを使ったｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性化によって、プロアポトーシス物質を産生できることが認められた（図１２）。このように、以前に示唆されているように（Pender, M. P. & Rist, M. J. Glia 36, 137-44 (2001)）、ＣＮＳ常在性のグリア細胞がＴ細胞アポトーシスを促進する一因となりうることも考慮しなければならない。
【０１４１】
ここでは、本発明者らは、全身注射により、未分化ａＮＳＣ（ａＮＰＣを含む）がこれまでに未同定の免疫様機能を発揮することで脳修復を促進することを実証している。本発明者らのデータによって、全身に移植されたａＮＳＣの運命および、結果としてその治療効果を、ＣＮＳの微小環境が決定付けていることが明らかに示唆される。神経変性が広がると、移植細胞は成熟した機能的表現型を獲得し、それによって、損傷した神経細胞を置き換える（Pluchino et al. (2003) Nature 422:688-694）。神経炎症が優位を占めると、本発明者らがここに示すように、移植されたａＮＳＣは、未分化表現型および増殖能の両者を維持することで、再発性の炎症性変化（inflammatory episodes）を切り抜けて生存する。この後者の状況において、炎症はＣＮＳ損傷の領域内でのａＮＳＣの動員および長期残留を調整する重要な「危険シグナル」である。動員は、血液由来のリンパ球がＣＮＳをパトロールするのに使われる選択された分子経路（例えば、ＶＬＡ−４、ＧＰＣＲ）を利用する「循環」ａＮＳＣの生得的な能力によって可能であり、その一方で、長期にわたってＣＮＳにとどまることは、血管周囲のニッチ様領域内での、移植されたａＮＳＣと炎症性ＣＮＳ浸潤性Ｔ細胞、ならびに炎症性浸潤を形成し、グリア原性（gliogenic）および神経原性（neurogenic）調節因子（Ｎｏｔｃｈ−ＩおよびＩＩＩ、Ｎｏｇｇｉｎ、ＶＥＧＦ−α）を産生するＣＮＳ常在細胞との間で行われる持続的なクロストークによるものである。これらの領域において、ａＮＳＣは未分化状態で生存し、血液由来ＣＮＳ浸潤性の、抗炎症性Ｔｈ２細胞ではなく、前炎症性Ｔｈ１細胞の生体内（ｉｎ ｓｉｔｕ）でのプログラム細胞死を誘導することでその神経保護効果を発揮する（Vandenbark, A. A. et al. Int Immunol 12, 57-66 (2000); Zhang, X. et al. J Exp Med 185, 1837-49 (1997)）。
【０１４２】
実施例６−ＮＰＣ依存的な免疫調節の分子的基盤の研究
本発明者らは、未分化ａＮＰＣの移植が、損傷したＣＮＳの軸索の再ミエリン化により、および免疫調節機能により、実験的多発性硬化症において長期にわたる神経保護を促進することを見出した。本発明者らは同様に、ａＮＰＣが、全身移植後、脳および脊髄に進入し、炎症を起こしたＣＮＳの領域、つまり主要な幹細胞調節因子が局部的に（再）発現される「非定型的な血管周囲のニッチ」に選択的に到達し、移植から１２０日後までｉｎ ｖｉｖｏにおいて生存することを見出した。蓄積して残留するこれらのＣＮＳの部位のなかで、ｉ．ｖ．注射されたａＮＰＣは血液由来ＣＮＳ浸潤性の、抗炎症性Ｔｈ２細胞ではなく、前炎症性Ｔｈ１細胞の生体内（ｉｎ ｓｉｔｕ）でのプログラム細胞死を誘導することで神経保護を顕著に発揮する。
【０１４３】
実験的ＭＳにおいてａＮＰＣ主導による免疫調節の分子的基盤をさらに詳細に研究するため、本発明者らは、再発−寛解型の実験的自己免疫性脳脊髄炎（Ｒ−ＥＡＥ）を有するマウスに同系の（syngenic）ａＮＰＣを移植した。ＳＪＬ系メスマウスをプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）１３９−１５１で皮下免疫し、疾患の発症時にａＮＰＣを静脈注射した。
【０１４４】
注射されたａＮＰＣがＣＮＳ（すなわち脳および脊髄）のなかに蓄積していることに並行して、かなりの量の移植ａＮＰＣが主要な二次リンパ器官のなかに蓄積し、移植後１００日間にわたってとどまっていた（図１４）。興味深いことに、リンパ節のなかで、「非定型的なＣＮＳの血管周囲のニッチ」の部位において先に記述したのと全く同じ幹細胞調節因子（例えば、ＦＧＦ−ＩＩ、Ｎｏｔｃｈ Ｉ、ＢＭＰなど）が劇的に、すなわち、臨床的に明らかな炎症性変化に反応して、タンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルの両者で発現しているように見えた（図１５）。
【０１４５】
このように、主要な幹細胞生存因子が炎症に反応して異所的に（再）発現される、標準的な中枢の身体部位（例えば、ＣＮＳ）および非標準的な末梢の身体部位（例えば、リンパ節）でもともに蓄積して残留するという能力のため、全身注射されたａＮＰＣは、長期にわたってさえもｉｎ ｖｉｖｏで生存することができる。
【０１４６】
抗原提示時のａＮＰＣの免疫調節性をさらに調べるため、つまりそれがＲ−ＥＡＥマウスのリンパ節内に蓄積したｉ．ｖ．注射ａＮＰＣに起こる場合であるため、本発明者らは、ＰＬＰ１３９−１５１免疫ＳＪＬ系マウスのリンパ節由来ＣＤ４＋細胞を同系の抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびａＮＰＣと共培養するｉｎ ｖｉｔｒｏの系を開発した。
【０１４７】
この共培養系のなかで、
ｉ．記載した抗原での最初の曝露時に、ａＮＰＣは抗原特異的な増殖を用量依存的に阻害することにより、共培養したＣＤ４＋細胞の極性化および抗原特異的な活性化を調節する（図１６）；
ｉｉ．上記の影響の合計として、多重免疫化学発光ＥＬＩＳＡから、ａＮＰＣと共培養されたＰＬＰ反応性のＴ細胞が明らかなＴｈ２様の表現型を獲得（かつｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養の間に維持）していたことが確認された。実際に、ａＮＰＣと共培養されたＰＬＰ反応性のＴ細胞は、共培養されなかった対照物よりも顕著に高いレベルで、ＩＬ−４およびＩＬ−１０などの、推定上の抗炎症性サイトカインを放出し、その一方で、推定上のＴｈ１様の前炎症性サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）の産生をダウンレギュレートする（図１６）；
ｉｉ．決定的な証拠として、同系のａＮＰＣと共培養されたＰＬＰ１３９−１５１反応性のＴ細胞株は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＥＡＥの養子移植という設定で研究した場合、共培養されなかった対照物よりも顕著に低い脳炎誘発性をもたらした（図１７）。
【０１４８】
全体的に見て、これらのｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでのデータから、ａＮＰＣが共通する機能的な免疫様の特徴（signature）を持っており、これによってそれらがＭＳおよびその他のＣＮＳ炎症性疾患での中枢性寛容および末梢性寛容の両方の誘導に関与する重要な免疫調節機能を発揮できることが明らかである。
【０１４９】
上記の明細書中に言及されている全ての刊行物は、参照により本明細書に組み入れられる。本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、本発明の記述の方法およびシステムのさまざまな変更および変形が当業者には明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して記述してきたが、主張の本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないと理解されるべきである。実際に、分子生物学分野または関連分野の当業者には明らかな、本発明を実行するための記述の様式のさまざまな変更は、以下の特許請求の範囲内であると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】同系（syngenic）ａＮＰＣのｉ．ｖ．注射がＲ−ＥＡＥマウスでの臨床的再発を低減することを示す図である。偽処置（ａ）ならびにａＮＰＣ処置（ｂおよびｃ）Ｒ−ＥＡＥマウスの両方での臨床的再発の発生の図示（各点は１回の再発を表す）。黒色の点は処置を受けていない期間の間に起きた１回の再発を表し、白色の点はａＮＰＣ処置の間に起こった再発を表す。各マウスはｙ軸上に番号で表されている。同系の（syngenic）ａＮＰＣを疾患発症時（ｂ）にまたは最初の臨床的再発時（ｃ）にｉ．ｖ．移植した。マウスは全て臨床的寛解期の間に１０６ｄｐｉ（黒色の矢印）で殺処理された。早ければ３０〜６０ｄｐｉで、疾患発症時に移植が行われたＲ−ＥＡＥマウスにおいて２倍低い臨床的再発が記録された；それらは経過観察の終わりまで同様に低い再発率を維持していた。最初の再発時に移植が行われたＲ−ＥＡＥマウスでは、もっと遅くに回復したが、６０〜９０ｄｐｉの再発率が劇的に３倍低下していた。
【図２】ｉ．ｖ．移植されたａＮＰＣが移植から３ヶ月後までＲ−ＥＡＥマウスの血管周囲の炎症を起こしたＣＮＳ領域内にとどまることを示す図である。（ａ），（ｂ）：ｉ．ｖ注射されたβ−ｇａｌ標識ａＮＰＣ（明部）は、ＣＮＳ炎症性浸潤を形成する血液由来ＣＤ４５＋免疫細胞（ｂ）がとどまる血管周囲のＣＮＳ領域内に残っている。血管周囲領域内のＣＤ４５＋細胞はＫｉ６７−（ｂ）であり、したがってそれらが最終エフェクターの脳炎誘発性細胞であることを示唆している。（ａ）中の核は暗い方の陰影の中にある（Ｄａｐｉ）。スケールバー；ａ，３０μｍ；ｂ，１５μｍ。（ｃ）〜（ｍ）：血管周囲領域内で、β−ｇａｌ標識細胞の一部（ｃ，ｅ，ｇ，ｈ，ｊ，ｌ中の明るい方の陰影）はネスチン（ｄ，矢頭）、ＮｅｕＮ（ｆ，矢頭）、Ｍａｓｈ−Ｉ（ｇ）、ＤＩｘ−２（ｉ，矢頭）、およびＰＳＡ−ＮＣＡＭ（ｊ，ｍ）に対し陽性である。（ｊ）および（ｋ）において、ＣＮＳの血管がラミニンで染色されている。（ｊ）中の囲みは（ｋ）〜（ｍ）に示されている。（ｃ），（ｅ），（ｈ）および（ｊ）中の核はＤａｐｉで染色されている。スケールバー：ｄ，３０μｍ；ｆ，２５μｍ；ｇ，１５μｍ；ｉ，４０μｍ；ｊ，２０μｍ；ｍ，１０μｍ。ｎ；ＢｒｄＵ染色されたｉ．ｖ．注射β−ｇａｌ標識ａＮＰＣ（矢頭）。スケールバー，１０μｍ。
【図３】ｉ．ｖ．注射された同系の（syngenic）ａＮＰＣがＲ−ＥＡＥマウスのＣＮＳの血管周囲領域内にとどまることを示す図である。（ａ）〜（ｃ）：同系の（syngenic）ａＮＰＣをｉ．ｖ．注射したＲ−ＥＡＥマウス由来のビブラトーム切断（７０μｍ）による脳および脊髄組織切片のＸ−ｇａｌ染色であり、移植されたＸ−ｇａｌ＋細胞（黒色の細胞）が臨床的な経過観察の終わり（１０６ｄｐｉ）まで血管周囲のＣＮＳ領域内にとどまっていることを示す。スケールバー：ａ，８０μｍ；ｂおよびｃ，４０μｍ。（ｄ）：血管周囲のＣＮＳ領域内にとどまるＸ−ｇａｌ＋のｉ．ｖ．注射ａＮＰＣ（黒色）は、ネスチン＋（矢頭）の表現型を保持している。スケールバー，２０μｍ。（ｅ）：遊走性のａＮＰＣは、それらが血管周囲領域外へ移動する限り、ＮｅｕＮ＋（矢頭）を発現するものはほとんどない。スケールバー，３５μｍ。（ｆ）：偽処置Ｒ−ＥＡＥマウス由来の典型的な脊髄切片におけるＸ−ｇａｌ染色（倍率２０×）。
【図４】１０６ｄｐｉのａＮＰＣ移植Ｒ−ＥＡＥマウスにおいて行われた共局在実験を示す共焦点像である。（ａ）：脊髄の血管周囲領域内でのＰＳＡ−ＮＣＡＭを発現する増殖中の（ＢｒｄＵ）ｉ．ｖ．移植β−ｇａｌ＋細胞（倍率１００×）。（ｂ）：ｉ．ｖ．移植β−ｇａｌ＋細胞の膜上でのＪａｇｇｅｄ−１発現（倍率１００×）。（ｃ）：ＢｒｄＵ（赤色）の取り込みから示されるように、ＣＮＳの血管周囲領域内に依然としてとどまっている、２個のβ−ｇａｌ＋（緑色）のｉ．ｖ．移植された増殖中のａＮＰＣ（倍率６３×）。β−ｇａｌ＋細胞のどれもＧＦＡＰ（ｄ，赤色）またはＮＧ２（ｅ）が陽性ではなかった。パネル（ｂ），（ｄ）および（ｅ）において、細胞核はＤａｐｉで染色されている。スケールバー：ｄ，４０μｍ；ｅ，２０μｍ。
【図５】Ｒ−ＥＡＥマウス由来の血管周囲のＣＮＳ領域が幹細胞調節因子を発現し、活性化ミクログリアを含むことを示す図である。（ａ）〜（ｄ）：偽処置Ｒ−ＥＡＥマウス由来の血管周囲のＣＮＳ領域内でのＢＭＰ−４（ａおよびｂ）ならびにＮｏｇｇｉｎ（ｃおよびｄ）発現。炎症性の血液由来単核細胞がこれらの領域内で視認できる。血管は抗ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ抗体で染色されている（倍率４０×）。（ｅ）：典型的なａＮＰＣ移植Ｒ−ＥＡＥマウス由来の脊髄組織切片中の分枝した活性化ＣＤ１１ｂ＋ミクログリア細胞（倍率４０×）。活性化ミクログリア細胞は、ＣＮＳ浸潤性血液由来免疫細胞と混ざり合っていることが認められた。全てのパネルにおいて、細胞核はＤａｐｉで染色されている。
【図６】幹細胞調節因子が、Ｒ−ＥＡＥマウス由来の血管周囲のＣＮＳ領域内にとどまっているｉ．ｖ．注射ａＮＰＣと共局在していることを示す図である。（ａ）〜（ｅ）：血管周囲のＣＮＳ領域において、ＢＭＰ−４（ａおよびｃ）ならびにＮｏｇｇｉｎ（ｂおよびｄ）を分泌する、ＧＦＡＰ＋のアストロサイト（ａおよびｂ）ならびにラミニン＋の内皮細胞（ｃおよびｄ）は、移植されたβ−ｇａｌ＋ ａＮＰＣと共局在している（ａ〜ｅ）。（ｅ）：Ｎｏｇｇｉｎを分泌する浸潤性の最終エフェクターＣＤ４５＋リンパ球を含んだ血管周囲のＣＮＳ領域。核はＤａｐｉで染色されている。スケールバー：ａおよびｂ，４０μｍ；ｃおよびｄ，２５μｍ；ｅ，５０μｍ。単一染色は図７で見ることができる。（ｆ）：ＳＪＬ系の未免疫マウスの脾臓由来リンパ球での幹細胞調節因子のｍＲＮＡレベルを示すリアルタイムＰＣＲ。Ｃｏｎ Ａ活性化リンパ球（黒色バー）および休止リンパ球（白色バー）の両方がＶＥＧＦ−α、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｎｏｔｃｈ ＩおよびＩＩＩを産生している。
【図７】幹細胞調節因子が、Ｒ−ＥＡＥマウス由来の血管周囲のＣＮＳ領域内にとどまっているｉ．ｖ．注射ａＮＰＣと共局在していることを示す図である。（ａ）〜（ｌ）：ＢＭＰ−４（ｃおよびｉ）ならびにＮｏｇｇｉｎ（ｆおよびｌ）を分泌する、ＧＦＡＰ＋のアストロサイト（ｂおよびｅ）ならびにラミニン＋の内皮細胞（ｈおよびｋ）は、移植されたβ−Ｇａｌ＋ ａＮＰＣと共局在している（ａ，ｄ，ｇ，ｊ）。スケールバー：ａおよびｃ，８０μｍ；ｇおよびｊ，４０μｍ。（ｍ）〜（ｐ）：Ｎｏｇｇｉｎ（ｏ）を分泌する浸潤性の最終エフェクターＣＤ４５＋リンパ球（ｎ）を含んだ典型的な血管周囲のＣＮＳ領域の重ね合わせ共焦点像（ｍ）。細胞核はＤａｐｉ（ｐ）で染色されている。スケールバー：ｍ，３０μｍ；ｎ〜ｐ ２０μｍ。
【図８】ＶＬＡ−４およびケモカイン受容体を恒常的に発現するａＮＰＣが、Ｒ−ＥＡＥマウス由来の、炎症を起こしたＣＮＳの微細血管の周りに蓄積していることを示す図である。（ａ），（ｂ）：ａＮＰＣでのＶＬＡ−４のクラスター化（ａ）および蛍光強度の３Ｄプロット（ｂ）。核はＤａｐｉで染色されている。スケールバー，２０μｍ。（ｃ）：非刺激（Ｕｎｓｔ．）ａＮＰＣおよびＰＭＡ刺激ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＶＣＡＭ−１に接着する。結合は、１μＭの種々のケモカインでのａＮＰＣ刺激（３７℃で３分間）によって増大しない。接着は非コーティング（Ｕｎｃ．）ウェルでは完全に見られない。（ｄ）〜（ｇ）：ＬＰＳ処置マウス由来の炎症を起こした脳（ｄ）および横紋筋細静脈（ｅ）に強く接着するａＮＰＣ（明るい血管内の点）を示す生体顕微鏡検査（倍率２０×）。炎症を起こした横紋筋細静脈中のＶＣＡＭ−１発現が（ｆ）に示されている。アイソタイプ適合の対照抗体（抗ヒトＲａｓ抗体）（ｇ）。（ｈ）：ｉ．ｖ．注射から２４時間後の、Ｒ−ＥＡＥ（黒色バー）マウスおよび未免疫対照（淡色の（light）バー）マウスの種々の臓器への２，３−［３Ｈ］−グリセロール標識ａＮＰＣの蓄積。抗ＶＬＡ−４抗体（ＰＳ／２）でのブロックによってＲ−ＥＡＥマウス（白色バー）由来の脳（３９％）および脊髄（５４％）でのａＮＰＣの動員は減るが、未免疫のａＮＰＣ注射対照マウス（濃灰色のバー）由来のものでは減らない（＊ｐ＝０．００５および＊＊ｐ＜０．０００１）。（ｉ）：マウスａＮＰＣは検出可能なｍＲＮＡレベルのＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ３およびＣＸＣＲ４を発現するが、検出可能なｍＲＮＡレベルのＣＣＲ３およびＣＣＲ７を発現しない。（ｊ）〜（ｍ）：ネスチン陽性ａＮＰＣはＣＣＲ２（ｊ）、ＣＣＲ５（ｋ）、ＣＸＣＲ３（ｌ）およびＣＸＣＲ４（ｍ）を発現する。核はＤａｐｉで染色されている。スケールバー：ｊ〜ｌ，８０μｍ；ｍ，１２０μｍ。
【図９】ａＮＰＣはＶＬＡ−４を恒常的に発現し、慢性進行性ＥＡＥのＣ５７Ｂｌ／６系マウス由来の、ＶＣＡＭ−１を発現するＣＮＳの炎症を起こした微細血管に接着することを示す図である。（ａ）〜（ｈ）：ＭＯＧ３５−５５で免疫したＣ５７Ｂｌ／６系ＥＡＥマウスにおけるＣＮＳの内皮細胞でのＶＣＡＭ−１発現。２４ｄｐｉの脳血管中に蓄積しているＡｌｅｘａ ４８８標識抗ＶＣＡＭ−１ ｍＡｂ（ｅおよびｆ）を示す、生体顕微鏡像（ａ，ｃ，ｅ，ｇ中の明るい点）および免疫蛍光像（ｂ，ｄ，ｆ，ｈ中の蛍光）。低下したレベルのＶＣＡＭ−１が前の時点（１５ｄｐｉ，ｃおよびｄ）ならびに後の時点（３５ｄｐｉ，ｇおよびｈ）で検出可能であった（倍率４０×）。血管は抗ラミニン抗体で染色されている。核はＤａｐｉで対比染色されている。倍率：ａ，ｃ，ｅおよびｇ，２０×；ｂ，ｄ，ｆおよびｈ，４０×。（ｉ）：ｉ．ｖ．細胞注射から２４時間後のＭＯＧ３５−５５免疫Ｃ５７Ｂｌ／６系マウス（黒色バー）由来の種々の臓器への２，３−［３Ｈ］−グリセロール標識ａＮＰＣの蓄積。２×１０６個のｉ．ｖ．注射ａＮＰＣの動員は、ブロック用のラット抗マウスＶＬＡ−４抗体によるｉｎ ｖｉｔｒｏでの前処理後の脳（４２％）および脊髄（５４％）において減少する（白色バー）（＊ｐ＜０．００１および＊＊ｐ＜０．０００１）。ブロック用のラット抗マウスＶＬＡ−４抗体で前処理された（濃灰色バー）または前処理されていない（薄灰色バー）同系の（syngenic）ａＮＰＣをｉ．ｖ．移植した未免疫対照マウス、および偽処置の未免疫マウス（中灰色バー）が対照として使用された。データは４回の独立した実験からの少なくとも１群あたりマウス６匹の蓄積細胞の平均パーセンテージ（±ＳＥ）／ｇｒ．組織として表される。（ｊ）〜（ｍ）：ａＮＰＣにて抗ＶＬＡ−４ブロック抗体の結合により誘導されるネクローシス（ｊおよびｌにおけるＰＩ染色）作用またはアポトーシス（ｋおよびｍにおけるアネキシン−Ｖ染色）作用がないことを示すＦＡＣＳ分析。
【図１０】ａＮＰＣが広範な機能的前炎症性ケモカイン受容体を発現することを示す図である。（ａ）〜（ｄ）：ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１（ａ）、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α（ｂ）、ＣＣＬ５／Ｒａｎｔｅｓ（ｃ）およびＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１α（ｄ）に反応したマウスａＮＰＣの４時間の走化性（chemotaxis）アッセイ。遊走性のａＮＰＣの数はＳＤＦ−１αおよびＲａｎｔｅｓで顕著に増加した。パネル中の白色の点は走化性実験を示し、黒色の点は化学運動性（chemokinesis）実験を示す。（ｅ）：ＰＴＸ（０．０１ｍｇ／ｍｌ，室温で１５分）で前処理したａＮＰＣは、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１αにもＣＣＬ５／Ｒａｎｔｅｓにも反応しなかった（°ｐ＜０．０００５；＊ｐ＜０．００５；＊＊ｐ＜０．０５）。
【図１１】ａＮＰＣがｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて脳炎誘発性Ｔ細胞のアポトーシスを誘導することを示す図である。（ａ）：ａＮＰＣ注射から１５日後（３０ｄｐｉ）のＲ−ＥＡＥマウスでの脊髄炎症の減少（黒色バー）およびＣＮＳ浸潤性アポトーシスリンパ球の増加（白色バー）（平均±ＳＥ；＊ｐ＜０．０１；＊＊ｐ＜０．００５、偽処置マウスと比較した場合）。（ｂ）：カスパーゼ−３（破線矢印）およびβ−ｇａｌ＋（実線矢印）について二重染色された脊髄の血管周囲領域。破線は血管を示す（倍率１００×）。（ｃ）：ａＮＰＣ注射から３５日後（５０ｄｐｉ）のＲ−ＥＡＥマウスにおいて顕著に増加した、後期アポトーシス性の（ＴＯＰＲＯ３＋／アネキシンＶ＋，黒色バー）、しかしネクローシス性ではない（ＴＯＰＲＯ３＋／アネキシンＶ−，白色バー）ＣＮＳ浸潤性ＣＤ３＋ Ｔ細胞を示すＦＡＣＳ分析。（ｄ）：ａＮＰＣはＰＬＰ１３９−１５１ Ｔｈ１（しかしＴｈ２ではない）細胞株のアポトーシス（アネキシンＶ＋／ＰＩ−細胞）を誘導する。ＦａｓＬ、Ａｐｏ３Ｌ、またはＴＲＡＩＬの阻害によって、ａＮＰＣ介在性のプロアポトーシス効果が有意に低下する（＊ｐ＜０．０１；＊＊ｐ＜０．０５ベースラインレベルとの比較）。（ｅ）〜（ｇ）：前炎症性サイトカインで処理されたａＮＰＣでの細胞死受容体（ＦａｓＬ／ＣＤ９５−リガンド［ｅ］、Ａｐｏ３Ｌ［ｆ］、ＴＲＡＩＬ［ｇ］）の発現を示す蛍光像。核はＤａｐｉで染色されている。スケールバー，１５μｍ。
【図１２】アポトーシスを起こしたＣＤ３＋細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの分析ことを示す図である。（ａ）および（ｂ）：偽処置Ｒ−ＥＡＥマウス（ａ）またはａＮＰＣ処置Ｒ−ＥＡＥマウス（ｂ）のいずれか由来の、ＴＵＮＥＬ染色された典型的な脊髄の血管周囲領域（倍率２０×）。（ａ）ではわずかなアポトーシス細胞（矢印）しか見えないのに対し、（ｂ）では血管周囲の細胞の大多数がＴＵＮＥＬ＋（黒色の点）である。（ｃ）：ＴＵＮＥＬおよびＣＤ３について二重染色された脊髄の血管周囲領域（破線矢印，ＴＵＮＥＬ＋ＣＤ３−細胞；実線矢印，ＴＵＮＥＬ＋ＣＤ３＋細胞；スケールバー，３０μｍ）。（ｄ）〜（ｇ）：偽処置（ｄおよびｅ）またはａＮＰＣ注射（ｆおよびｇ）Ｒ−ＥＡＥマウス由来の血管周囲領域を示す、ＣＤ３（ｄおよびｆ中の点）またはＴＵＮＥＬ（ｄおよびｆ中の黒色の点）染色された、典型的な脊髄の（５μｍ厚）連続切片（倍率４０×）。（ｄ）および（ｆ）中の核はヘマトキシリンで対比染色されている。ａＮＰＣ処置マウスにおいて有意に増加している（偽処置との対比でｐ＜０．００５）、ＣＤ３を発現するアポトーシス細胞の大多数が、早ければｐ．ｔ．２週間（３０ｄｐｉ）で、血管周囲の炎症を起こしたＣＮＳ領域内に限られていることに留意されたい。（ｈ）：ＣＤ３／ＣＤ２８で活性化された脾臓由来リンパ球は、ａＮＰＣと共培養されると、アポトーシス（アネキシンＶ＋／ＰＩ−細胞）を起こす（単一ウェル，黒色バー；ウェル間，白色バー）。（ｉ）：前炎症性サイトカインで処理されたａＮＰＣは、プロアポトーシス分子のｍＲＮＡを発現する。任意単位（ＡＵ）は処理細胞と未処理細胞との間のｍＲＮＡレベルの誘導倍率を表す。
【図１３】ａＮＰＣによる幹細胞増殖および分化の調節因子、免疫分子ならびに栄養因子の発現を示す図である。誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＲＡ）、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１α、インターロイキン（ＩＬ）−１０、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、インターフェロン（ＩＦＮ）γ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）α、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−ＩＩ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）β、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＶＥＧＦα、Ｎｏｔｃｈ Ｉ、Ｎｏｔｃｈ ＩＩＩ、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、および細胞傷害性Ｔリンパ球抗原（ＣＴＬＡ）−４のｍＲＮＡレベルを示すＲＴ−ＰＣＲ分析。ｍＲＮＡレベルを、未分化ａＮＰＣ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化ａＮＰＣ、未分化であるがｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＴＮＦα、ＩＦＮγおよびＩＬ１βで予め処理されたａＮＰＣ、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＴＮＦα、ＩＦＮγおよびＩＬ１βで予め処理されたｉｎ ｖｉｔｒｏ分化ａＮＰＣにおいて測定した。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＬＰＳおよびＴＮＦαで活性化されたまたは活性化されていない、マウスＮ９ミクログリア細胞を対照として使用した。データは任意単位（ＡＵ）として表されており、ＣｏｎＡ刺激された脾臓由来リンパ球に対しての種々の細胞集団でのｍＲＮＡレベルの誘導倍率を表す。ａＮＰＣ細胞サンプルは継代１０回以下のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増幅で得た。
【図１４】静脈内注射されたａＮＰＣは、Ｒ−ＥＡＥマウスの主要な二次リンパ器官に蓄積し、移植から１００日後にわたってとどまっていた。（ａ）〜（ｃ）：静脈内注射から１５日後に、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）免疫反応性移植ａＮＰＣは、導管周囲（periduttal）領域中のリンパ節間質（破線）にとどまっており、ＣＤ４５（ａおよびｂ）またはｆ４−８０（ｃ）免疫マーカーのいずれとも共局在していない。全てのパネルにおいて、細胞核はＤａｐｉで染色されている。（ｄ）および（ｅ）：同系のａＮＰＣを静脈内注射し、移植から１５日後（ｄ）または１００日後（ｅ）のいずれかで殺処理したＲ−ＥＡＥマウスの主要な排出リンパ節領域由来のｅＧＦＰについての一段階リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ。大部分のサンプルにおけるｅＧＦＰの３０７ｂｐの様々な強度のバンドの存在（ｄおよびｅ中の破線の囲い）に留意されたい。説明：Ａ，腋窩、Ｃ，頸部、Ｉ，鼠径、Ｍ，腸間膜（mesenteryc）、Ｐ，大動脈周囲（paraortic）。
【図１５】Ｒ−ＥＡＥマウス由来の排出リンパ節は、タンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルの両方で体性幹細胞の主要な調節因子を劇的に発現していることを示す図である。（ａ）：ＰＬＰによる能動免疫化後の異なる時点（１５日、３０日および１００日）でのＲ−ＥＡＥマウス由来の頸部排出リンパ節、鼠径排出リンパ節および腋窩排出リンパ節内での体性幹細胞の主要な調節因子のｍＲＮＡレベルを示すＲＴ−ＰＣＲ分析。データは任意単位（ＡＵ）として表されており、未免疫（雌雄適合、年齢適合および体重適合）対照マウス由来のリンパ節に対しての、Ｒ−ＥＡＥマウス由来のリンパ節におけるｍＲＮＡレベルの誘導倍率を示す。（ｂ）〜（ｄ）：ＥＡＥマウス由来の頸部排出リンパ節内のテネイシンＣ（ｂ）、ソニック・ヘッジホッグ（ｃ）およびＪａｇｇｅｄ−１（ｄ）タンパク質の発現。
【図１６】ａＮＳＣが脳炎誘発性ＣＤ４＋細胞の抗原特異的な増殖を阻害することを示す図である。（ａ）：Ｒ−ＥＡＥ誘発ＳＪＬ系マウスから得られた、リンパ節細胞（ＬＮＣ）に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨ−チミジン取り込みに及ぼすａＮＳＣの効果。ＬＮＣをａＮＳＣと共培養することの効果を０〜３０μｇ／ｍｌのＰＬＰ１３９−１５１への反応で調べた。ａＮＳＣは対照と比べて、用量依存的にＬＮＣでの３Ｈ−チミジンの取り込みを顕著に抑制した。（ｂ）：ＬＮＣ／ａＮＳＣ共培養から回収された上清の多重免疫化学発光ＥＬＩＳＡに基づくＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン分析。Ｔｈ２様の推定上の抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０，ＩＬ−４）は、共培養されていないＰＬＰ反応性のＣＤ４＋対照細胞株と比較した場合、ａＮＳＣと共培養されたＣＤ４＋ Ｔリンパ球由来のサンプルで顕著に高いことが分かる。
【図１７】同系のａＮＳＣと共培養されたＰＬＰ１３９−１５１反応性のＴ細胞株は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＥＡＥの養子移植という設定で研究した場合、共培養されなかった対照物よりも顕著に低い脳炎誘発性をもたらした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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