(57)【要約】  本発明は、ＡＢＬチロシンキナーゼのＡＴＰポケットに対して高いアフィニティーを示す低分子量化合物、すなわち、テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール類を提供する。例えば、これらの化合物は、特にＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体に対して、有意な抑制効力をも示すＡＴＰ競合性チロシンキナーゼインヒビターである。本発明の化合物は、ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性ＡＢＬ媒介性疾患、例えばイマチニブ耐性慢性骨髄性白血病の治療において有用である。さらに、本発明は、キナーゼタンパク質、特にＴ３１５Ｉ突然変異ＡＢＬキナーゼのＡＴＰポケットに結合しうる化合物の特定のためのスクリーニング方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性チロシンキナーゼ活性を抑制するための方法であり、式（Ｉ）の化合物
【化１】
2009531386.tif 000011
［式中、Ｒは水素またはメチルである；
Ｒ１はヒドロキシまたは直鎖状もしくは分枝状Ｃ１−Ｃ３アルキルもしくはアルコキシ基である；
Ｒ２は水素またはハロゲン原子である：
Ｘは、メチレン（−ＣＨ２−）またはフルオロメチレン（−ＣＨＦ−）から選ばれる二価基であり、あるいはそれは、酸素（−Ｏ−）または窒素（−ＮＲ’−）から選ばれるヘテロ原子またはヘテロ原子基であり、ここで、Ｒ’は水素原子、直鎖状または分枝状Ｃ１−Ｃ４アルキル基またはＣ３−Ｃ６シクロアルキル基である］またはその医薬上許容される塩の有効量とＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性チロシンキナーゼポリペプチドを接触させることを含んでなる、方法。
【請求項２】
ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性チロシンキナーゼポリペプチドがＡＢＬチロシンキナーゼのＴ３１５Ｉ突然変異体である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビターがイマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ媒介性疾患の治療方法であって、治療を要する哺乳動物に、請求項１に定義される式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩の有効量を投与することを含んでなる、方法。
【請求項５】
前記ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ媒介性疾患がＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性白血病である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
疾患がＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性慢性骨髄性白血病である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビターがイマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）である、請求項４から６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
Ｒが水素であり、Ｒ１がメトキシであり、Ｒ２が水素であり、ならびにＸがメチレン（−ＣＨ２−）であるか又は酸素（−Ｏ−）もしくは窒素（−ＮＲ’−）（Ｒ’は水素原子、またはメチル、エチル、イソプロピル、シクロプロピルもしくはｔｅｒｔ−ブチルから選ばれるアルキル基である。）から選ばれるヘテロ原子もしくはヘテロ原子基である式（Ｉ）の化合物あるいはその医薬上許容される塩を使用して行う、請求項１から７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
式（Ｉ）の化合物が、
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−エチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−イソプロピルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−シクロプロピルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−ピペリジン−１−イルベンズアミド；
４−（４−フルオロピペリジン−１−イル）−Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−モルホリン−４−イルベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メチル−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メチル−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−エチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−フェニルプロパノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−ピペリジン−１−イルベンズアミド；
４−（４−フルオロピペリジン−１−イル）−Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−フェニルプロパノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝ベンズアミド；
４−モルホリン−４−イル−Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−フェニルプロパノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝ベンズアミド
よりなる群から選ばれる、請求項１から７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
式（Ｉ）の化合物が、
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−エチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−イソプロピルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−シクロプロピルピペラジン−１−イル）ベンズアミド
よりなる群から選ばれる、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
式（Ｉ）の化合物がＮ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンズアミドである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
キナーゼタンパク質のＡＴＰポケットに結合しうる化合物の特定のためのスクリーニング方法であって、該キナーゼタンパク質、該キナーゼタンパク質のＡＴＰポケットに対するアフィニティーを有し該ＡＴＰポケットへの結合に際して蛍光シグナルを生成しうるインドリノン誘導体、および該試験化合物の系列希釈物を含む反応混合物を準備し、該試験化合物の非存在下で生成した蛍光シグナルを、種々の濃度の該試験化合物の存在下で生成した蛍光シグナルと比較する工程を含んでなり、蛍光レベルの減少が、該試験化合物が該インドリノン誘導体を置換する能力を示す、方法。
【請求項１３】
キナーゼタンパク質とインドリノン誘導体とを予め混合する、請求項１２の方法。
【請求項１４】
キナーゼタンパク質と試験化合物とを予め混合する、請求項１２の方法。
【請求項１５】
キナーゼタンパク質がＡＢＬキナーゼである、請求項１２から１４のいずれか一項の方法。
【請求項１６】
ＡＢＬキナーゼがＴ３１５Ｉ突然変異型ＡＢＬキナーゼである、請求項１５の方法。
【請求項１７】
インドリノンが、式（ＩＩ）
【化２】
2009531386.tif 000012
（式中、Ｒ１は水素またはメチルアミノスルホニルまたはベンジルスルホニルであり、Ｒ２は水素またはメチルであり、Ｒ３はメチルまたは４−クロロフェニルまたは２，４−ジフルオロフェニルである。）の化合物である、請求項１２から１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
インドリノンが、
２，４−ジメチル−５−［２−オキソ−５−フェニルメタンスルホニル−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ジエチルアミノ−エチル）−アミド；
４−（４−クロロフェニル）−Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−２−メチル−５−（（Ｚ）−｛５−［（メチルアミノ）スルホニル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン｝メチル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド；
Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−メチル−５−（（Ｚ）−｛５−［（メチルアミノ）スルホニル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン｝メチル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド；
４−（４−クロロフェニル）−Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−２−メチル−５−［（Ｚ）−（４−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド
よりなる群から選ばれる、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ媒介性疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１または４に定義される式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＴＰ競合性小分子キナーゼインヒビターの使用による突然変異ＡＢＬ媒介性疾患の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、骨髄性系列の悪性増殖により特徴づけられる、成人白血病の約１５％を占める血液障害である。ＣＭＬの遺伝的特徴は、いわゆるフィラデルフィア（Ｐｈ）染色体を生成する、染色体９および２２間の相互転座である。この生殖体間交換の分子的結末は、チロシンキナーゼドメインが構成的に活性化される、チロシンキナーゼポリペプチドをコードするキメラ遺伝子ＢＣＲ−ＡＢＬの生成である。この融合タンパク質の発現はＣＭＬ細胞のトランスフォーム表現型に必要かつ十分であることが示されている（ＦＡＤＥＲＬ，Ｓら，Ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９９９，ｖｏｌ．３４１，ｎｏ．３，ｐ．１６４−１７２．ＳＡＷＹＥＲＳ，Ｃ．Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９９９，ｖｏｌ．３４０，ｎｏ．１７，ｐ．１３３０−１３４０）。ＣＭＬに加えて、Ｐｈ染色体転座から生じるＡＢＬキナーゼ活性の脱調節も成人リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）患者の２０％までにおいて見出される（ＯＴＴＭＡＮＮ，Ｏ．Ｇ．ら，Ａ  ｐｈａｓｅ  ２  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｉｍａｔｉｎｉｂ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｌａｐｓｅｄ  ｏｒ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａｓ．Ｂｌｏｏｄ．２００２，ｖｏｌ．１００，ｎｏ．６，ｐ．１９６５−１９７１）。
【０００３】
ＡＢＬは、細胞骨格構造を調節するために細胞表面増殖因子受容体および接着受容体からシグナルを伝達する。多数のシグナリングタンパク質が、ある範囲のシグナリング経路を活性化するＡＢＬと相互作用することが示されている。したがって、ＡＢＬの抑制は、ＣＭＬ患者に対する療法を改善するための新規アプローチとなる。
【０００４】
ＣＭＬの発病にはＢＣＲ−ＡＢＬが必要であり、ＢＣＲ−ＡＢＬ媒介性トランスフォーメーションにはＡＢＬのチロシンキナーゼ活性が必須であるという知見は、ＡＢＬキナーゼを、治療的介入のための魅力的な標的とした。イマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）；ＳＴＩ５７１としても公知である；ＥＰ  ５６４４０９  Ａ）は、ＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ活性を強力に抑制する、ＢＣＲ−ＡＢＬのＡＴＰ競合性インヒビターである。イマチニブの高い選択性および効力は、それがＢＣＲ−ＡＢＬに、該酵素の触媒的に不活性なコンホメーションにおいて結合しそれを遮断しうることによるものである。前臨床および臨床研究はイマチニブの顕著な効力および高い許容性を示しており、イマチニブは現在、すべての新たに診断されたＣＭＬ患者に対する第一線級の治療剤となっている（ＤＥＩＮＩＮＧＥＲ，Ｍら，Ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｍａｔｉｎｉｂ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ．２００５，ｖｏｌ．１０５，ｎｏ．７，ｐ．２６４０−２６５３）。しかし、イマチニブは該疾患の初期段階においては非常に有効であるが、ＣＭＬの促進・芽段階の患者およびＰｈ＋  ＡＬＬの患者は、しばしば、イマチニブ耐性を現す（ＤＲＵＫＥＲ，Ｂ．Ｊ．ら，Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＢＣＲ−ＡＢＬ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｌａｓｔ  ｃｒｉｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００１，ｖｏｌ．３４４，ｎｏ．１４，ｐ．１０３８−１０４２．ＳＡＷＹＥＲＳ，Ｃ．Ｌ．ら，Ｉｍａｔｉｎｉｂ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｂｌａｓｔ  ｃｒｉｓｉｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｓｔｕｄｙ．Ｂｌｏｏｄ．２００２，ｖｏｌ．９９，ｎｏ．１０，ｐ．３５３０−３５３９）。イマチニブ耐性の主要メカニズムは、ＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ触媒ドメイン内に点突然変異を獲得しており該インヒビターとの相互作用を直接的に妨げ又は弱めるクローンの発生である。それらのほとんどは、イマチニブの結合に必要な閉じた不活性なコンホメーションをＡＢＬキナーゼドメインがとるのを妨げる構造変化を誘発するが（ＳＨＡＨ，Ｎ．Ｐ．ら，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ＳＴＩ５７１  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００３，ｖｏｌ．２２，ｎｏ．４７，ｐ．７３８９−７３９５）、トレオニン３１５からイソロイシンへの置換（以下、Ｔ３１５Ｉと称される。）のような幾つかの突然変異はＡＴＰ結合ポケットにおける��マチニブの相互作用を直接的に妨げる。
【０００５】
イマチニブ耐性の分子的基礎の理解は、臨床的に認められるイマチニブ耐性ＡＢＬ媒介性疾患に対して有効な新規ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビターに関する探索を促進している。ＢＣＲ−ＡＢＬの幾つかの第２世代のＡＴＰ競合性インヒビター、例えばＡＭＮ１０７（ＷＥＩＳＢＥＲＧ，Ｅら，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＭＮ  １０７，ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｍｕｔａｎｔ  Ｂｃｒ−Ａｂｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２００５，ｖｏｌ．７，ｐ．１２９−１４１）およびＢＭＳ−３５４８２５（デサチニブ（Ｄｅｓａｔｉｎｉｂ）としても公知である。）（ＳＨＡＨ，Ｎ．Ｐ．ら，Ｏｖｅｒｒｉｄｉｎｇ  ｉｍａｔｉｎｉｂ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＡＢＬ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００４，ｖｏｌ．３０５，ｎｏ．５６８２，ｐ．３９９−４０１）が開発されており、現在、初期臨床試験において評価中である。これらの化合物はイマチニブ耐性ＡＢＬ突然変異体の大多数に対して活性であるが、それらはいずれも、イマチニブ耐性患者において２番目に多く見られる突然変異であるＴ３１５Ｉ突然変異体に対しては活性でない（Ｏ’ＨＡＲＥ，Ｔら，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｃｒ−Ａｂｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ＡＭＮ  １０７  ａｎｄ  ＢＭＳ−３５４８２５  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｉｍａｔｉｎｉｂ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ＡｂＩ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｕｔａｎｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００５，ｖｏｌ．６５，ｎｏ．１１，ｐ．４５００−４５０５）。Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異をＡＴＰ競合性化合物で抑制することは特に困難であると結論づけられうる。実際、ごく最近まで、Ｔ３１５Ｉ突然変異体にも活性であると報告されている唯一のインヒビターは、実際には基質競合性（すなわち、非ＡＴＰ競合性）インヒビターであるＯＮ１２３８０であった（ＧＵＭＩＲＥＤＤＹ，Ｋ．ら，Ａ  ｎｏｎ−ＡＴＰ−  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＢＣＲ−ＡＢＬ  ｏｖｅｒｒｉｄｅｓ  ｉｍａｔｉｎｉｂ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．．２００５，ｖｏｌ．１０２，ｎｏ．６，ｐ．１９９２−１９９７）。
【０００６】
最近、２つのＡＴＰ競合性分子、すなわち、ＶＸ−６８０（ＨＡＲＲＩＮＧＴＯＮ，Ｅ．Ａ．ら，ＶＸ−６８０，ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｕｒｏｒａ  ｋｉｎａｓｅｓ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００４，ｖｏｌ．１０，ｎｏ．３，ｐ．２６２−２６７）およびＢＩＲＢ−７９６（ＰＡＲＧＥＬＬＩＳ，Ｃら，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ３８  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｂｙ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．．２００２，ｖｏｌ．９，ｎｏ．４，ｐ．２６８−２７２）がＡＢＬのＴ３１５Ｉ突然変異チロシンキナーゼドメインに低ナノモルのＫｄでインビトロで結合しうることが報告されているが、細胞においてはＴ３１５Ｉ  ＢＣＲ−ＡＢＬの抑制に関して低い効力を示した（ＣＡＲＴＥＲ，Ｔ．Ａ．ら，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ＡＢＬ，ＫＩＴ，ａｎｄ  ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｉｎａｓｅｓ．．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．．２００５，ｖｏｌ．１０２，ｎｏ．３１，ｐ．１１０１１−１１０１６）。
【０００７】
現在のところ、前記の次世代のインヒビターでの治療により選択されると予想される、イマチニブ治療後に再発する全患者の２０％を占めると見積もられているＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性Ｔ３１５Ｉ／ＡＢＬ媒介性疾患に罹患した患者に対する有効なキナーゼ標的化治療は存在しない。このことは、ＢＣＲ−ＡＢＬのＴ３１５Ｉ突然変異体の強力な新規ＡＴＰ競合性インヒビターに対する医学的要求が満たされていないことを表している。本発明はこの課題を解決するものである。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明は、ＡＢＬチロシンキナーゼのＡＴＰポケットに対して高いアフィニティーを示す低分子量化合物を提供する。例えば、これらの化合物は、ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体、特にイマチニブ耐性Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体に対して有意な抑制効力を示すＡＴＰ競合性チロシンキナーゼインヒビターである。チロシンキナーゼ活性の抑制は、ＡＢＬおよびＴ３１５Ｉ突然変異体により媒介されるシグナリングカスケードの遮断をもたらす。
【０００９】
所望の活性を示す本発明の化合物は、プロテインキナーゼのＡＴＰポケットを標的化するよう設計されたテトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾールである。この化学クラスの化合物はオーロラ（Ａｕｒｏｒａ）キナーゼの強力なＡＴＰ競合性インヒビターであることが示されている（ＦＡＮＣＥＬＬＩ，Ｄ．ら，Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｕｒｏｒａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００５，ｖｏｌ．４８，ｎｏ．８，ｐ．３０８０−３０８４．ＰＣＴ／ＷＯ  ２００５００５４２７）。意外にも、同じ化学骨格を有する化合物はＡＢＬに対して有意な抑制効力を示すことが判明しており、特に、それらはインビトロでＡＢＬのＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性Ｔ３１５Ｉ突然変体をも抑制しうる。
【００１０】
それらの生物活性を考慮すると、本発明の化合物は、ＡＢＬ媒介性疾患に罹患したイマチニブ耐性患者集団に対する治療法の開発のための新規方針を提供する。
【００１１】
本発明は、標的タンパク質キナーゼ、特にＡＢＬチロシンキナーゼのＡＴＰポケットに結合する追加的化合物の特定のためのアッセイをも提供する。このアッセイは、標的ＡＴＰポケットへの結合の結果を検出する能力に基づくものであり、それは、該ＡＴＰポケットへの化合物の結合アフィニティーが測定されうるよう定量的条件で行われる。
【００１２】
発明の詳細な説明
第１の態様において、本発明は、式（Ｉ）
【００１３】
【化３】
2009531386.tif 000002
［式中、Ｒは水素またはメチルである；
Ｒ１はヒドロキシまたは直鎖状もしくは分枝状Ｃ１−Ｃ３アルキルもしくはアルコキシ基である；
Ｒ２は水素またはハロゲン原子である：
Ｘは、メチレン（−ＣＨ２−）またはフルオロメチレン（−ＣＨＦ−）から選ばれる二価基であり、あるいはそれは、酸素（−Ｏ−）または窒素（−ＮＲ’−）から選ばれるヘテロ原子またはヘテロ原子基であり、ここで、Ｒ’は水素原子、直鎖状または分枝状Ｃ１−Ｃ４アルキル基またはＣ３−Ｃ６シクロアルキル基である］またはその医薬上許容される塩の有効量とＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性チロシンキナーゼポリペプチドを接触させることを含んでなる、ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性チロシンキナーゼ活性を抑制するための方法に関する。
【００１４】
本発明の式（Ｉ）の化合物は不斉炭素原子を有し、したがって個々の光学異性体、ラセミ混合物、または２つの光学異性体のうちの１つを優勢に含む任意の他の混合物として存在することが可能であり、これらは全て、本発明の範囲内であると意図される。
【００１５】
化合物が互変異性体として存在しうる場合、各異性体は、それらが平衡状態で存在するか又は一方の形態が優勢に存在するかにかかわらず、本発明に含まれると意図される。
【００１６】
したがって、特に示さない限り、式（Ｉａ）または（Ｉｂ）の以下の互変異性体の一方のみが示されている場合、もう一方も本発明の範囲内に含まれるとみなされなければならない。
【００１７】
【化４】
2009531386.tif 000003
【００１８】
本明細書において、特に示さない限り、直鎖状または分枝状Ｃ１−Ｃ３またはＣ１−Ｃ４アルキルなる語は、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチルおよびｓｅｃ−ブチルのような基のいずれかを意味する。
【００１９】
直鎖状または分枝状Ｃ１−Ｃ３アルコキシなる語は、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシおよびイソプロポキシのような基のいずれかを意味する。
【００２０】
ハロゲン原子なる語はフッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子を意味する。
【００２１】
Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルなる語は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロブチルのようないずれかの基を意味する。
【００２２】
明らかに、Ｘ基の性質に応じて、式（Ｉ）の化合物のフェニレン部分に結合しているこの同じ複素環はピペリジノ、４−フルオロピペリジノ、ピペラジノ、４−アルキル−ピペラジノ、４−シクロアルキル−ピペラジノまたはモルホリノ環を表しうる。
【００２３】
式（Ｉ）の化合物は国際特許出願ＷＯ２００５／００５４２７に記載され特許請求されており、そこに開示されている方法に従い製造されうる。
【００２４】
本発明の方法はインビトロまたはインビボで実施されうる。完全長チロシンキナーゼポリペプチドが使用可能であり、あるいは、その断片、一部分または類似体が使用されうる。
【００２５】
より詳しくは、本発明の選択された化合物の抑制活性はゲル−キナーゼアッセイにより測定される。該アッセイは、試験化合物の存在下、ＡＢＬキナーゼによる放射能標識リン酸部分の、基質への転移よりなる。該反応を停止させたら、反応混合物をポリアクリルアミドゲル上にローディングし、放射能シグナルを検出する。この抑制アッセイは実施例の節において更に詳しく例示されている。
【００２６】
さらに、本発明の選択された化合物の抑制活性は細胞系において測定される。適当な細胞としては、ＢＣＲ−ＡＢＬ染色体転座が天然で生じる細胞、例えば、ヒト白血病細胞Ｋ−５６２、およびＴ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異遺伝子を含有する組換え構築物でトランスフェクトされた細胞が挙げられる。実施例の節において更に詳しく例示するとおり、細胞を本発明の化合物で処理し、免疫ブロット法により抑制活性を検出する。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態においては、ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性チロシンキナーゼポリペプチドはＡＢＬチロシンキナーゼのＴ３１５Ｉ突然変異体である。
【００２８】
本発明のより好ましい実施形態においては、ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビターはイマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）である。
【００２９】
第２の態様においては、本発明は、ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ媒介性疾患の治療方法であって、それを要する哺乳動物に、前記の式（Ｉ）の化合物の有効量を投与することを含んでなる治療方法に関する。
【００３０】
本発明において特許請求されている治療方法の範囲内には、式（Ｉ）の化合物の全ての考えられうる異性体およびそれらの混合物ならびに代謝産物および医薬上許容される生物前駆体（プロドラッグとも称される。）の両方の使用が含まれる。プロドラッグは、式（Ｉ）の活性な親薬物をインビボで遊離する任意の共有結合化合物である。
【００３１】
本発明の前記の２つの方法は、好ましくは、Ｒが水素であり、Ｒ１がメトキシであり、Ｒ２が水素であり、Ｘがメチレン（−ＣＨ２−）であるか又は酸素（−Ｏ−）もしくは窒素（−ＮＲ’−）（ここで、Ｒ’は水素原子、またはメチル、エチル、イソプロピル、シクロプロピルもしくはｔｅｒｔ−ブチルから選ばれるアルキル基である。）から選ばれるヘテロ原子もしくはヘテロ原子基である式（Ｉ）の化合物を使用して行われる。
【００３２】
より好ましくは、該化合物は、以下のものよりなる群から選ばれる：
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−エチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−イソプロピルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−シクロプロピルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−ピペリジン−１−イルベンズアミド；
４−（４−フルオロピペリジン−１−イル）−Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−モルホリン−４−イルベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メチル−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メチル−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−エチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−フェニルプロパノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−ピペリジン−１−イルベンズアミド；
４−（４−フルオロピペリジン−１−イル）−Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−フェニルプロパノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝ベンズアミド；
４−モルホリン−４−イル−Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−フェニルプロパノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝ベンズアミド。
【００３３】
より一層好ましいのは、以下のものよりなる化合物の小集団である：
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−エチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−イソプロピルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−シクロプロピルピペラジン−１−イル）ベンズアミド。
【００３４】
本発明の前記の２つの方法において使用される最も好ましい化合物はＮ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド（以下、「化合物１」と称する。）である。
【００３５】
式（Ｉ）の化合物の医薬上許容される塩には、例えば硝酸、塩酸、臭化水素酸、硫酸、過塩素酸、リン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、イセチオン酸およびサリチル酸のような無機または有機酸との酸付加塩が含まれる。
【００３６】
「Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ媒介性疾患」なる語は、直接的または間接的にＴ３１５Ｉ  ＡＢＬチロシンキナーゼの活性の抑制が望ましい疾患を含むと意図される。
【００３７】
「ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター」なる語は、ＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質の酵素活性を抑制する能力を有するＡＴＰ競合性分子を含むと意図される。そのような分子の非限定的な例としては、イマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）、デサチニブ（Ｄｅｓａｔｉｎｉｂ）およびＡＭＮ１０７が挙げられる。
【００３８】
前記方法の好ましい実施形態においては、該疾患は、ＡＢＬチロシンキナーゼのＴ３１５Ｉ突然変異体により引き起こされるＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性白血病である。より好ましい実施形態においては、該白血病は慢性骨髄性白血病である。
【００３９】
前記方法のもう１つの好ましい実施形態においては、ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビターはイマチニブである。
【００４０】
式（Ｉ）の化合物は、該化合物での治療により改善される疾患または望ましくない状態を対象が有すると判定されたら、該対象に投与されうる。医師または臨床家は対象における疾患または状態の診断の一部としての判定をなしうる。該化合物は、そのような状態の予防にも使用されうる。該予防は、対象が該状態の１以上を有する可能性を減少させることとみなされうる。
【００４１】
本発明の方法は、Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体の活性の１以上を抑制する式（Ｉ）の化合物と細胞を接触させることにより行われうる。この方法は、（例えば、該細胞を該化合物と共に培養することにより）インビトロで、あるいは（例えば、該化合物を対象に投与することにより）インビボで行われうる。対象から得られインビトロで処理され該対象に戻される細胞の場合のように、それはエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）でも行われうる。
【００４２】
インビボにおいては、標的タンパク質を抑制する治療用組成物の効果は適当な動物モデルにおいて評価されうる。
【００４３】
本明細書中で用いる、化合物の有効量は、その意図される目的を達成するのに十分な量を意味する。有効量の決定は、所望の効果の達成に基づいて当業者がなしうる範囲内に十分に含まれる。有効量は、対象のサイズおよび／または対象が罹患している疾患もしくは望ましくない状態が進行している度合を含む（これらに限定されるものではない）要因に左右されるであろう。有効量は、該化合物が対象に１回量で投与されるのか又は時間経過と共に定期的に対象に投与されるのかどうかによっても左右されるであろう。
【００４４】
本発明の式（Ｉ）の化合物は対象の治療を意図したものである。本明細書中で用いる「対象」なる語は哺乳動物および非哺乳動物を含む。哺乳動物の具体例には、哺乳綱の任意のメンバー、例えばヒト、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー）ならびに他の霊長類およびサル種；農場動物、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ；家畜、例えばウサギ、イヌおよびネコ；実験用動物、例えばラット、マウスおよびモルモットのようなげっ歯類などが含まれるが、これらに限定されるものではない。非哺乳動物の具体例には、鳥類、魚類などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
本明細書中で用いる「治療」なる語は、治療利益を得ることを含む。治療利益は、治療される根本障害の除去または改善を意味する。例えば、癌患者においては、治療利益は、根本となる癌の除去または改善を含む。また、治療利益は、患者が根本障害に尚も苦しめられうる場合であっても患者において改善が認められるような、根本障害に関連した生理学的症状の１以上の除去または改善により達成される。
【００４６】
本発明の方法は、式（Ｉ）の化合物を単一の物質として又は本明細書に開示されている疾患もしくは望ましくない状態の治療に適した１以上の他の分子もしくは他の物質と組合せて投与することを含む。組合せ治療に適した典型的な分子および物質としては、静細胞または細胞毒性物質、抗生物質型物質、アルキル化物質、代謝拮抗物質、ホルモン物質、免疫学的物質、インターフェロン型物質、シクロオキシゲナーゼインヒビター（例えば、ＣＯＸ−２インヒビター）、マトリックスメタロプロテアーゼインヒビター、テロメラーゼインヒビター、チロシンキナーゼインヒビター、抗増殖因子受容体物質、抗ＨＥＲ物質、抗ＥＧＦＲ物質、抗血管新生物質（例えば、血管新生インヒビター）、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、ｒａｓ−ｒａｆシグナル伝達経路インヒビター、細胞周期インヒビター、他のｃｄｋインヒビター、チューブリン結合物質、トポイソメラーゼＩインヒビター、トポイソメラーゼＩＩインヒビターなどが挙げられる。
【００４７】
本発明はまた、式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩と、担体または希釈剤でありうる医薬上許容される賦形剤とを含んでなる医薬組成物を含む。
【００４８】
本発明の化合物を含有する医薬組成物は一般に、通常の方法に従い製造され、適当な医薬形態で投与される。
【００４９】
例えば、固体経口形態は、該活性化合物と共に、希釈剤、例えばラクトース、デキストロース、サッカロース、スクロース、セルロース、コーンスターチまたはジャガイモデンプン；滑沢剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムもしくはカルシウムおよび／またはポリエチレングリコール；結合剤、例えばデンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニルピロリドン；崩壊剤、例えばデンプン、アルギン酸、アルギナートまたはデンプングリコール酸エステルナトリウム；起泡性混合物；色素；甘味剤；湿潤剤、例えばレシチン、ポリソルベート、ラウリルスルファート；および一般には、医薬製剤中で使用される無毒性で薬理学的に不活性な物質を含有しうる。これらの医薬製剤は、公知方法、例えば混合、顆粒化、錠剤化、糖衣化またはフィルムコーティング法により製造されうる。
【００５０】
経口投与用の液体分散剤は例えばシロップ剤、乳剤または懸濁剤でありうる。
【００５１】
一例として、該シロップ剤は、担体として、サッカロース、またはサッカロースとそれに伴うグリセリンおよび／またはマンニトールおよびソルビトールを含有しうる。
【００５２】
該懸濁剤および該乳剤は、担体の具体例として、天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニルアルコールを含有しうる。
【００５３】
筋肉注射用の懸濁剤または溶液剤（水剤）は、該活性化合物と共に、医薬上許容される担体、例えば無菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール、例えばプロピレングリコール、および所望により適量の塩酸リドカインを含有しうる。
【００５４】
静脈注射または注入用の溶液は担体として無菌水を含有しうる。あるいは好ましくはそれらは無菌、水性、等張性の塩溶液の形態であることが可能であり、あるいはそれらは担体としてプロピレングリコールを含有することが可能である。静脈注入は１から６週周期の週ごとの治療計画に従い約１時間から約１０時間の時間間隔で行われうる。
【００５５】
坐剤は、該活性化合物と共に、医薬上許容される担体、例えばカカオ脂、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル界面活性剤またはレシチンを含有しうる。
【００５６】
本発明での使用に適した医薬組成物には、有効成分が有効量（すなわち、治療される状態において治療および／または予防利益を達成するのに有効な量）で存在する組成物が含まれる。個々の適用に有効な実際の量は、治療される状態、対象の状態、製剤および投与経路、ならびに当業者に公知の他の要因に左右されるであろう。本発明の化合物の有効量の決定は、本明細書中の開示を考慮して当業者がなしうる範囲内に十分に含まれ、通常の最適化技術を用いて決定される。
【００５７】
治療用途においては、本発明の化合物は約３０ｍｇ／ｍ２から約３０００ｍｇ／ｍ２体表面積／日の投与レベルで対象に投与される。約１００ｍｇ／ｍ２から１０００ｍｇ／ｍ２の投与レベルが特に適当な範囲となる。成人対象には、約５０ｍｇから約５０００ｍｇ／用量、より好ましくは、約１５０ｍｇから約１０００ｍｇ／用量の投与量（１日１から５回）が、非限定的な例として用いられうる。必要に応じて、本明細書中に開示されているものより低い又は高い用量が用いられうる。しかし、そのような投与量は、治療すべき状態、投与方法、治療計画、個々の対象の要件、治療する状態の重症度および実施者の判断を含む（これらに限定されるものではない）多数の変数に応じて改変されうる。個々の治療計画に関する変数の数は多数であり、これらの推奨値からの逸脱は珍しいことではないため、前記の範囲は示唆的なものに過ぎない。
【００５８】
ヒトにおける使用のための有効量は動物モデルから決定されうる。例えば、ヒトに対する用量は、動物において有効であると判明した循環肝、局所および／または胃腸濃度が達成されるよう定められうる。
【００５９】
第３の態様においては、本発明は、キナーゼタンパク質のＡＴＰポケットに結合しうる化合物の特定のためのスクリーニング方法であって、該キナーゼタンパク質、該キナーゼタンパク質のＡＴＰポケットに対するアフィニティーを有し該ＡＴＰポケットへの結合に際して蛍光シグナルを生成しうるインドリノン誘導体、および該試験化合物の系列希釈物を含む反応混合物を準備し、該試験化合物の非存在下で生成した蛍光シグナルを、種々の濃度の該試験化合物の存在下で生成した蛍光シグナルと比較する工程を含んでなり、蛍光レベルの減少が、該試験化合物が該インドリノン誘導体を置換しうることを示す、方法に関する。
【００６０】
該スクリーニング方法の好ましい実施形態においては、該キナーゼタンパク質と該インドリノン誘導体とを予め混合する。
【００６１】
該スクリーニング方法のもう１つの好ましい実施形態においては、該キナーゼタンパク質と該試験化合物とを予め混合する。
【００６２】
該スクリーニング方法のもう１つの好ましい実施形態においては、該キナーゼタンパク質はＡＢＬキナーゼである。より好ましい実施形態においては、該ＡＢＬキナーゼはＴ３１５Ｉ突然変異型ＡＢＬキナーゼである。
【００６３】
「キナーゼタンパク質」なる語は、完全長天然タンパク質、および該キナーゼタンパク質のＡＴＰポケットを含むその断片を含む。
【００６４】
「ＡＴＰポケット」なる語は該キナーゼタンパク質内のＡＴＰ結合部位を示す。
【００６５】
該インドリノン誘導体は、好ましくは、以下の式（ＩＩ）
【００６６】
【化５】
2009531386.tif 000004
（式中、Ｒ１は水素またはメチルアミノスルホニルまたはベンジルスルホニルであり、Ｒ２は水素またはメチルであり、Ｒ３はメチルまたは４−クロロフェニルまたは２，４−ジフルオロフェニルである。）の化合物である。
【００６７】
より好ましくは、該インドリノン誘導体は、２，４−ジメチル−５−［２−オキソ−５−フェニルメタンスルホニル−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ジエチルアミノ−エチル）−アミド（これは国際特許出願ＷＯ０２／０９６３６１に開示されている。）；
４−（４−クロロフェニル）−Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−２−メチル−５−（（Ｚ）−｛５−［（メチルアミノ）スルホニル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン｝メチル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド；
Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−メチル−５−（（Ｚ）−｛５−［（メチルアミノ）スルホニル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン｝メチル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド；
４−（４−クロロフェニル）−Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−２−メチル−５−［（Ｚ）−（４−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミドよりなる群から選ばれる化合物である。
【００６８】
該インドリノン誘導体は、野生型および突然変異型の両方のＡＢＬのＡＴＰポケットに結合するそれらの能力、アッセイの安定性、および公知ＡＢＬインヒビター（例えば、イマチニブ）に関する公開データとの一致性に関して選択した。
【００６９】
該蛍光シグナルは、例えば、フュージョン（Ｆｕｓｉｏｎ）α−ＦＰ  ＨＴプレートリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ）のようなプレートリーダーにより測定されうる。試験化合物の置換能は該キナーゼタンパク質のＡＴＰポケットに対する化合物のアフィニティーと直接相関する。試験化合物のアフィニティー結合定数（ＫＤ）は実施例の節における説明のとおりに決定されうる。
【００７０】
本発明のアッセイは、キナーゼタンパク質へのインドリノン誘導体の結合に際して蛍光強度における有意な増加が観察されるという新規知見に基づく。従来は、標的部分に結合しうるアフィニティープローブに化学的に連結された基が蛍光シグナルを与えた。しかし、そのような方法は、高感度アッセイをもたらす可能性を損なう、キナーゼポケットに対する低いアフィニティーに関連した欠点を伴う。現在用いられている代替アプローチは、固相アッセイの典型的な欠点（例えば、立体障害および洗浄の必要性）を伴う固定化プローブリガンドまたはキナーゼタンパク質に基づくものである。
【００７１】
本発明はこれらの欠点を克服するものである。なぜなら、インドリノンは標的キナーゼに対して比較的高いアフィニティーを示し、結合に際して生成するシグナルは結合に直接左右され、均一アッセイの構築を可能にするからである。
【００７２】
本スクリーニングアッセイは本明細書中ではＡＢＬキナーゼで例示されているが、当業者は、過度な実験を伴うことなく、ＡＴＰポケットを含有する他のキナーゼタンパク質を同様に使用して、それを実施しうるであろう。実際、本発明者らは、インスリン様増殖因子（未リン酸化および三リン酸化体）、インスリン受容体（未リン酸化および三リン酸化体）、ｃ−Ｍｅｔ、Ａｌｋ、Ｃｈｋ１およびＰＤＫ１を使用して該アッセイを行った場合に、蛍光シグナルの変化を検出できている。したがって、本発明のアッセイにおいて、他のタンパク質キナーゼが適切に使用されうると予想される。
【００７３】
最後に、本発明は、ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ媒介性疾患を治療するための医薬の製造における、式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩（前記のとおりのもの）の使用に関する。
【００７４】
つぎに、本発明を更に例示するために、それに対する限定を何ら伴わない以下の実施例を記載する。
【００７５】
実施例
以下の実施例において、アミノ酸残基の番号はＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢＬタンパク質ＡＡＢ６０３９４のアイソフォーム１ａに基づくものである。
【実施例１】
【００７６】
組換えＡＢＬキナーゼドメインのクローニング、発現および精製
ＡＢＬキナーゼドメイン（残基２２９−５１２に対応）をヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅した。フォワードオリゴヌクレオチド：５’ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＡＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＡＣＴＡＣＧＡＣＡＡＧＴＧ−３’［配列番号１］およびリバースオリゴヌクレオチド：５’ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＴＴＴＴＣＣＡＣ−３’［配列番号２］を使用して、増幅を行った。
【００７７】
クローニングのために、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるクローニングに適したａｔｔＢ隣接ＰＣＲ産物を得るために該オリゴヌクレオチドはａｔｔＢ部位を含んでいた。さらに、精製のために、フォワードプライマーはＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）切断部位（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含んでいた。得られたＰＣＲ産物をバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）修飾体内にクローニングした。発現および精製のために、ＡＢＬキナーゼドメインのＮ末端にＧＳＴタグを付加した。Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）マニュアルに記載されているプロトコールに従い、クローニングを行った。
【００７８】
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用する部位特異的突然変異誘発により、イマチニブ耐性Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体を作製した。該突然変異誘発反応において使用したオリゴヌクレオチドは５’−ＣＣＣＣＧＴＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴＴＧＡＧＴＴＣＡＴＧＡＣＣＴＡＣＧ−５’［配列番号３］であった。
【００７９】
ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して発現ベクターおよびウイルスＤＮＡでＳｆ９昆虫細胞をコトランスフェクトすることにより、バキュロウイルスを作製した。５日後にウイルス上清を回収し、３ラウンドの増幅に付してウイルス力価を増加させた。１０億個の細胞当たり３ｍｌのウイルス上清を１×１０６細胞／ｍｌの密度でＨｉｇｈ５昆虫細胞に感染させることにより、組換えタンパク質を産生させた。４８時間の感染の後、細胞を回収し、ペレット化し、−８０℃で凍結した。組換えタンパク質の精製のために、ペレットを解凍し、細胞溶解バッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０  ｍＭ，ＮａＣｌ  １５０ｍＭ，ＣＨＡＰＳ  ０．２％，ＤＴＴ  ２０ｍＭ，グリセロール  １０％）に再懸濁させ、音波処理により細胞溶解させた。ライセートを２０００ｇで３０分間の遠心分離により清澄化し、グルタチオンセファロース４Ｂ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラム上にローディングした。十分な洗浄の後、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼの存在下のインキュベーションにより、組換えタンパク質を切断し、溶出させた。
【実施例２】
【００８０】
キナーゼアッセイ
組換え野生型およびＴ３１５Ｉ突然変異型ＡＢＬキナーゼドメインによるミエリン塩基性タンパク質のリン酸化を測定するゲル−キナーゼアッセイにおいて、化合物の活性を評価した。１５ｎＭ  組換え酵素、基質としての１０μＭ  ミエリン塩基性タンパク質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１５ｎＭ  Ｎａ３ＶＯ４、４％  ＤＭＳＯ、３ｎＭ  ＡＴＰ、０．１μキュリーのγＰ３２−ＡＴＰを含有する２０μｌの反応混合物中、キナーゼアッセイを行った。化合物１を試験し、参照体として並行してイマチニブも試験した。該インヒビターの濃度は１０ｎＭから１０μＭの範囲であった。酵素および基質を該インヒビターと共に室温で１５分間プレインキュベートした後、ＡＴＰを加え、反応を３０℃で３０分間行い、ゲルローディングバッファーの添加および５分間の煮沸により停止させた。ついで反応混合物を１０％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にローディングした。分離後、ゲルを乾燥させ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒ系（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して放射能シグナルを表示させた。
【００８１】
予想どおり、イマチニブは野生型ＡＢＬキナーゼドメインのみのキナーゼ活性を抑制することが可能であったに過ぎず、それは、Ｔ３１５Ｉ突然変異体に対しては完全に不活性であった。これに反して、該試験化合物は野生型およびＴ３１５Ｉ突然変異型の両方に対して同一効力で活性であった。
【実施例３】
【００８２】
ＡＴＰ部位依存的置換アッセイの準備および妥当性評価
試験化合物の定量的アフィニティー評価のために、ＡＴＰ部位依存的置換アッセイを準備した。
【００８３】
該アッセイは、キナーゼタンパク質への或るインドリノンの結合に際して観察される蛍光強度における有意な増加を利用するものである。以下において、本発明者らは、ＡＢＬへの結合の際の蛍光増加の大きさに基づいて潜在的プローブとして選択された２つの異なるインドリノンで得られた結果を示す。
【００８４】
３．１  インドリノンプローブ２，４−ジメチル−５−［２−オキソ−５−フェニルメタンスルホニル−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ジエチルアミノ−エチル）−アミド
インドリノン２，４−ジメチル−５−［２−オキソ−５−フェニルメタンスルホニル−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ジエチルアミノ−エチル）−アミドを野生型ＡＢＬキナーゼドメインおよびＴ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体へのその結合能に関して力価測定実験において評価した。アッセ性能（Ｚ’因子）ならびにＡＴＰγＳおよびイマチニブによる該プローブの置換を評価した。すべての実験において、フュージョン（Ｆｕｓｉｏｎ）α−ＦＰ  ＨＴプレートリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して蛍光シグナルを測定した。Ｄｙｎａｆｉｔソフトウェアを使用して、データ分析を行った。
【００８５】
特に、力価測定データを以下の平衡式：酵素＋プローブ＜＝＝＞複合体酵素−プローブに当てはめ、一方、置換データを以下の平衡式：酵素＋プローブ＜＝＝＞複合体酵素−プローブ、酵素＋化合物＜＝＝＞複合体酵素−化合物［ここで、該酵素へのプローブおよび化合物の結合は互いに排他的である（純粋競合メカニズム）］に当てはめた。
【００８６】
該力価測定実験は以下のとおりに行った：１０ｎＭ  ＡＢＬキナーゼドメイン（野生型またはＴ３１５Ｉ突然変異体）、５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１％  ＤＭＳＯ、３μＭ  Ｎａ３ＶＯ４（バッファー１）中の１：１．５の希釈段階を伴う３μＭから０のインドリノン濃度。得られた結果（後記表１に示す）は、該プローブが該ＡＢＬキナーゼドメインの試験形態の全てに結合しうることを示している。Ｚ’因子（Ｚ’＝１−（３＊（ＳＤプローブ＋タンパク質＋ＳＤプローブ）／（平均プローブ＋タンパク質−平均プローブ））を以下のとおりに決定した。飽和プローブ濃度（ＡＢＬ野生型未リン酸化（０Ｐ）、野生型およびＴ３１５Ｉに関してそれぞれ０．１５、０．１２および０．４２μＭ）を１０および５ｎＭ  タンパク質の存在下（プローブ＋タンパク質）または非存在下（プローブ）で評価した。すべての場合において、Ｚ’値は０．８より大きく、このことは、該アッセイが安定であることを示している。
【００８７】
以下のとおりに行った置換アッセイにおいてＡＴＰγＳおよびイマチニブを使用して、該アッセイの妥当性を評価した。まず、試験化合物の系列希釈物（希釈段階１：２）を７％  ＤＭＳＯ中で調製し、アッセイバッファー１中で更に希釈して、最終ＤＭＳＯ濃度を１％にした。ＡＴＰγＳを最高濃度としての２５０μＭで試験し、一方、イマチニブの最高濃度は１０μＭであった。該酵素は１０ｎＭの最終濃度で存在した。プローブ最終濃度はＡＢＬ野生型未リン酸化（０Ｐ）、野生型およびＴ３１５Ｉに関してそれぞれ０．１５、０．１２および０．４２μＭであった。既に希釈された化合物に酵素およびプローブの混合物を加えた。結果（表１）は、該プローブが該試験ＡＢＬ構築物の全てからのＡＴＰγＳにより完全に置換され得たことを示しており、このことは、該インドリノンがＡＴＰポケット内に結合することを示している。これに一致して、純粋競合メカニズムでのフィッティング（当てはめ）によりアフィニティー結合定数（ＫＤ）が決定された。ＫＤ値は、３つの独立した実験の平均値である。
【００８８】
予想どおり、イマチニブは、ＡＢＬの未リン酸化体に対して、ＡＢＬのリン酸化形態に対してよりも高いアフィニティーを示し、一方、Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体上で置換は全く観察されなかった。
【００８９】
【表１】
2009531386.tif 000005
【００９０】
総合すると、これらの結果は、該置換アッセイがＡＴＰ部位依存的であり、測定されたアフィニティーがイマチニブに関する公開データ（ＣＡＲＴＥＲ，Ｔ．Ａ．ら，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ＡＢＬ，ＫＩＴ，ａｎｄ  ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｉｎａｓｅｓ．．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．．２００５，ｖｏｌ．１０２，ｎｏ．３１，ｐ．１１０１１−１１０１６．ＦＡＢＩＡＮ，Ｍｉｌｅｓ  Ａ．ら，Ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｍａｐ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｎａｔ．ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００５，ｖｏｌ．２３，ｎｏ．３，ｐ．３２９−３３６）に符合することを示している。
【００９１】
組換えＡＢＬキナーゼドメインでのＡＴＰ部位依存的置換アッセイ
組換え野生型およびＴ３１５Ｉ突然変異型ＡＢＬキナーゼドメインに関する化合物結合アフィニティーを該置換アッセイにおいて評価した。ピロロピラゾール化学クラスの化合物を試験し、比較のためにイマチニブを含めた。
【００９２】
表２は種々のＡＢＬ構築物に関するアフィニティー結合定数の決定（ＫＤ）を示す。ＶＸ−６８０は、Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体に対するインビトロ結合能を有することが最近報告された、ＶｅｒｔｅｘからのＡＴＰ競合性チロシンキナーゼインヒビターである。化合物１は本発明の代表的化合物である。
【００９３】
【表２】
2009531386.tif 000006
【００９４】
本発明の他の代表的化合物に関しても、Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体に対するアフィニティー結合定数（ＫＤ）を決定した。結果を以下の表３に示す。ここで、化合物２はＮ−［５−（（Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニル−アセチル）−１，４，５，６−テトラヒドロ−ピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル］−４−ピペリジン−１−イル−ベンズアミドであり、化合物３は４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−Ｎ−［５−（（Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニル−アセチル）−１，４，５，６−テトラヒドロ−ピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル］−ベンズアミドであり、化合物４は４−（４−シクロプロピル−ピペラジン−１−イル）−Ｎ−［５−（（Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニル−アセチル）−１，４，５，６−テトラヒドロ−ピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル］−ベンズアミドであり、化合物５は４−（４−イソプロピル−ピペラジン−１−イル）−Ｎ−［５−（（Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニル−アセチル）−１，４，５，６−テトラヒドロ−ピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル］−ベンズアミドである。
【００９５】
【表３】
2009531386.tif 000007
【００９６】
希釈段階１：１．５での試験最高インヒビター濃度として３μＭを用いて、前記のとおりに該置換アッセイを行った。表２および３に示す結果は、該試験化合物の全てがＴ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体に対して活性であったことを示している。
【００９７】
３．２  インドリノンプローブＮ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−メチル−５−（（Ｚ）−｛５−［（メチルアミノ）スルホニル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン｝メチル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド
インドリノンＮ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−メチル−５−（（Ｚ）−｛５−［（メチルアミノ）スルホニル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン｝メチル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミドを、野生型ＡＢＬキナーゼドメインおよびＴ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体へのその結合能に関して、前記のとおりに力価測定実験において評価した。適用条件は、飽和プローブ濃度（ＡＢＬ野生型未リン酸化体（０Ｐ）、野生型およびＴ３１５Ｉに関してそれぞれ２、３．３および０．２μＭ）およびプローブ最終濃度（ＡＢＬ野生型未リン酸化体（０Ｐ）、野生型およびＴ３１５Ｉに関してそれぞれ２、３．３および０．２μＭ）以外は同じであった。
【００９８】
この場合も、結果（表４）は、該プローブが該試験ＡＢＬ構築物の全てからのＡＴＰγＳにより完全に置換され得たことを示しており、このことは、該インドリノンがＡＴＰポケット内に結合することを示している。予想どおり、イマチニブは、ＡＢＬの未リン酸化体に対して、ＡＢＬのリン酸化形態に対してよりも高いアフィニティーを示し、一方、Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体上で置換は全く観察されなかった。
【００９９】
【表４】
2009531386.tif 000008
【０１００】
総合すると、これらの結果は、該置換アッセイがＡＴＰ部位依存的であり、測定されたアフィニティーがイマチニブに関する公開データ（ＣＡＲＴＥＲ，Ｔ．Ａ．ら，前掲；ＦＡＢＩＡＮ，Ｍｉｌｅｓ  Ａ．ら，前掲）に符合することを示している。
【０１０１】
組換えＡＢＬキナーゼドメインでのＡＴＰ部位依存的置換アッセイ
組換え野生型およびＴ３１５Ｉ突然変異型ＡＢＬキナーゼドメインに関する化合物結合アフィニティーを、同じピロロピラキソール化合物を試験する、３．１節に記載の置換アッセイにおいて評価した。表５は種々のＡＢＬ構築物に関するアフィニティー結合定数の決定（ＫＤ）を示す。
【０１０２】
【表５】
2009531386.tif 000009
【０１０３】
本発明の他の代表的化合物（前記の化合物２から５）に関しても、Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体に対するアフィニティー結合定数（ＫＤ）を決定した。結果を以下の表６に示す。
【０１０４】
【表６】
2009531386.tif 000010
【０１０５】
試験最高インヒビター濃度として３μＭを用いて、前記のとおりに該置換アッセイを行った。表５および６に示す結果は、３つの独立した実験の平均である。それらは、該試験化合物の全てがＴ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体に対して活性であったことを示している。
【実施例４】
【０１０６】
細胞におけるＡＢＬ活性の抑制
材料および方法
ＡＢＬポリペプチドのクローニング
ＡＢＬ  ｃＤＮＡ（残基２７−１１３０に対応）をヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅した。フォワードオリゴヌクレオチド：５’ＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＡＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣＧＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＴＡＧ−３’（配列番号４）およびリバースオリゴヌクレオチド：５’ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＡＣＣＴＣＴＧＣＡＣＴＡＴＧＴＣＡＣＴＧ−３’（配列番号５）を使用して、増幅を行った。
【０１０７】
クローニングのために、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるクローニングに適したａｔｔＢ隣接ＰＣＲ産物を得るために該オリゴヌクレオチドはａｔｔＢ部位を含んでいた。得られたＰＣＲ産物を哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ｎＶ５  ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングした。Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）マニュアルに記載されているプロトコールに従い、クローニングを行った。
【０１０８】
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用する部位特異的突然変異誘発により、イマチニブ耐性突然変異Ｔ３１５Ｉを作製した。該突然変異誘発反応において使用したオリゴヌクレオチドは５’−ＣＣＣＣＧＴＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴＴＧＡＧＴＴＣＡＴＧＡＣＣＴＡＣＧ−３’（配列番号６）であった。
【０１０９】
免疫ブロット法
標準的な方法に従い、免疫ブロット法を行った。１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）および２％  ＳＤＳ中で細胞を調製した。サンプルを音波処理し、９５℃で５分間加熱した。ＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により決定した１０μｇのタンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にローディングした。スーパー（Ｓｕｐｅｒ）シグナル化学発光キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を、検出に使用した。以下の抗体を使用して、免疫ブロット分析を行った：抗ＡＢＬ（ＳＩＧＭＡ，カタログ番号Ａ５８４４）、抗ｐＹ４１２−ＡＢＬ（ＣＥＬＬ  ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ，カタログ番号２８６５）、抗Ｓｔａｔ−５（ＣＥＬＬ  ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ，カタログ番号９３５２）、抗ｐＳｔａｔ−５、抗Ｃｒｋｌ、抗ｐ−Ｃｒｋｌ、抗ＥｌＦ４ｅ（ＢＣＲ／ＡＢＬ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ，ＣＥＬＬ  ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ，カタログ番号７１３０）。
【０１１０】
結果
内因性発現ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞に対する本発明の１つの代表的化合物の抑制活性を確認するために、ＢＣＲ−ＡＢＬの転座に関連したフィラデルフィア染色体を含有するＫ−５６２白血病細胞において化合物１を試験した。細胞を化合物１またはイマチニブで１時間処理した。細胞を集め、ＡＢＬのキナーゼ活性化ループ内に位置する４１２位チロシン残基（Ｙ４１２）のＡＢＬ自己リン酸化の抑制に関して免疫ブロット法により分析した。また、Ｓｔａｔ−５またはＣｒｋｌのような公知下流シグナリングタンパク質をそれらのリン酸化状態に関して分析した。化合物１およびイマチニブ（臨床的に妥当な濃度のもの）はＹ４１２のリン酸化およびＢＣＲ−ＡＢＬ  Ｓｔａｔ−５およびＣｒｋｌの下流メディエーターのリン酸化を抑制し（図２）、このことは、予想された作用メカニズムを証明するものであり、一方、Ｓｒｃに対する影響は見られず、このことは、タンパク質リン酸化に対する全般的影響を排除するものである（データ非表示）。
【０１１１】
Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体に対する細胞におけるイマチニブおよび化合物１の細胞活性を試験するために、ＨＣＴ−１１６細胞を野生型または突然変異型発現構築物（前記「材料および方法」を参照されたい）でトランスフェクトし、イマチニブおよび化合物１（５μＭ）に関して抑制活性を試験した。予想どおり、イマチニブは野生型ＡＢＬ構築物のみに対して抑制活性を示し、一方、Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異型構築物は耐性であった。これとは対照的に、化合物１は野生型およびＴ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体の両方に対して強力な抑制活性を示した（図３）。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図１は、野生型ＡＢＬおよびＴ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異キナーゼドメインのキナーゼ活性に対する化合物１およびイマチニブの抑制活性を示す。該抑制活性を、漸増濃度の該化合物の存在下、ゲルキナーゼアッセイにより測定した。ミエリン塩基性タンパク質を基質として使用した。
【図２】図２は、化合物１（レーン２）またはイマチニブ（レーン３）で処理されたＫ−５６２白血病細胞におけるＢＣＲ−ＡＢＬの抑制を示す免疫ブロット法である。下流標的ＳＴＡＴ５またはＣＲＫＬのリン酸化状態を分析して、ＢＣＲ−ＡＢＬシグナリングの抑制をモニターした。レーン１は未処理Ｋ−５６２細胞を示す。
【図３】図３は、ＨＣＴ−１１６トランスフェクト化細胞における化合物１による野生型およびＴ３１５Ｉ突然変異ＡＢＬの抑制を示す免疫ブロット法である。ＨＣＴ−１１６結腸直腸腫瘍細胞をＡＢＬ野生型（レーン１）またはＴ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体発現構築物（レーン２）でトランスフェクトした。細胞ライセートを、全ＡＢＬタンパク質（α−ＡＢＬ）に対する抗体またはＹ４１２位（α−ｐＹ４１２−ＡＢＬ）においてリン酸化されたＡＢＬを認識するホスホ特異抗体を使用する免疫ブロット法により分析した。未処理（−）細胞および処理（＋）細胞間の比較は、化合物１が野生型およびＴ３１５Ｉ突然変異型の両方のＡＢＬを抑制しうることを示している。
【図１】
2009531386.tif 000013
【図２】
2009531386.tif 000014
【図３】
2009531386.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成20年12月1日(2008.12.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性チロシンキナーゼ活性を抑制するための方法であり、式（Ｉ）の化合物
【化１】
2009531386.tif 000016
［式中、Ｒは水素またはメチルである；
Ｒ１はヒドロキシまたは直鎖状もしくは分枝状Ｃ１−Ｃ３アルキルもしくはアルコキシ基である；
Ｒ２は水素またはハロゲン原子である：
Ｘは、メチレン（−ＣＨ２−）またはフルオロメチレン（−ＣＨＦ−）から選ばれる二価基であり、あるいはそれは、酸素（−Ｏ−）または窒素（−ＮＲ’−）から選ばれるヘテロ原子またはヘテロ原子基であり、ここで、Ｒ’は水素原子、直鎖状または分枝状Ｃ１−Ｃ４アルキル基またはＣ３−Ｃ６シクロアルキル基である］またはその医薬上許容される塩の有効量とＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性チロシンキナーゼポリペプチドを接触させることを含んでなる、方法。
【請求項２】
ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性チロシンキナーゼポリペプチドがＡＢＬチロシンキナーゼのＴ３１５Ｉ突然変異体である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビターがイマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ媒介性疾患の治療方法であって、治療を要する哺乳動物に、請求項１に定義される式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩の有効量を投与することを含んでなる、方法。
【請求項５】
前記ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ媒介性疾患がＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性白血病である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
疾患がＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性慢性骨髄性白血病である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビターがイマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）である、請求項４から６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
Ｒが水素であり、Ｒ１がメトキシであり、Ｒ２が水素であり、ならびにＸがメチレン（−ＣＨ２−）であるか又は酸素（−Ｏ−）もしくは窒素（−ＮＲ’−）（Ｒ’は水素原子、またはメチル、エチル、イソプロピル、シクロプロピルもしくはｔｅｒｔ−ブチルから選ばれるアルキル基である。）から選ばれるヘテロ原子もしくはヘテロ原子基である式（Ｉ）の化合物あるいはその医薬上許容される塩を使用して行う、請求項１から７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
式（Ｉ）の化合物が、
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−エチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−イソプロピルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−シクロプロピルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−ピペリジン−１−イルベンズアミド；
４−（４−フルオロピペリジン−１−イル）−Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−モルホリン−４−イルベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メチル−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メチル−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−エチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−フェニルプロパノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−ピペリジン−１−イルベンズアミド；
４−（４−フルオロピペリジン−１−イル）−Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−フェニルプロパノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝ベンズアミド；
４−モルホリン−４−イル−Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−フェニルプロパノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝ベンズアミド
よりなる群から選ばれる、請求項１から７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
式（Ｉ）の化合物が、
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−エチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−イソプロピルピペラジン−１−イル）ベンズアミド；
Ｎ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−シクロプロピルピペラジン−１−イル）ベンズアミド
よりなる群から選ばれる、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
式（Ｉ）の化合物がＮ−｛５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルエタノイル］−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル｝−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンズアミドである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
キナーゼタンパク質のＡＴＰポケットに結合しうる化合物の特定のためのスクリーニング方法であって、該キナーゼタンパク質、該キナーゼタンパク質のＡＴＰポケットに対するアフィニティーを有し該ＡＴＰポケットへの結合に際して蛍光シグナルを生成しうるインドリノン誘導体、および該試験化合物の系列希釈物を含む反応混合物を準備し、該試験化合物の非存在下で生成した蛍光シグナルを、種々の濃度の該試験化合物の存在下で生成した蛍光シグナルと比較する工程を含んでなり、蛍光レベルの減少が、該試験化合物が該インドリノン誘導体を置換する能力を示す、方法。
【請求項１３】
インドリノンが、式（ＩＩ）
【化２】
2009531386.tif 000017
（式中、Ｒ１は水素またはメチルアミノスルホニルまたはベンジルスルホニルであり、Ｒ２は水素またはメチルであり、Ｒ３はメチルまたは４−クロロフェニルまたは２，４−ジフルオロフェニルである。）の化合物である、請求項１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
インドリノンが、
２，４−ジメチル−５−［２−オキソ−５−フェニルメタンスルホニル−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ジエチルアミノ−エチル）−アミド；
４−（４−クロロフェニル）−Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−２−メチル−５−（（Ｚ）−｛５−［（メチルアミノ）スルホニル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン｝メチル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド；
Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−メチル−５−（（Ｚ）−｛５−［（メチルアミノ）スルホニル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン｝メチル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド；
４−（４−クロロフェニル）−Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−２−メチル−５−［（Ｚ）−（４−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド
よりなる群から選ばれる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ＢＣＲ−ＡＢＬインヒビター耐性Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ媒介性疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１または４に定義される式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩の使用。
【手続補正書】
【提出日】平成20年12月18日(2008.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009531386000001.app
【国際調査報告】
2009531386.tif 000018
2009531386.tif 000019
2009531386.tif 000020
2009531386.tif 000021
2009531386.tif 000022