(57)【要約】  本発明は、骨変性疾患を治療または予防する方法を提供する。治療または予防される障害としては、例えば、骨減少症、骨軟化症、骨粗鬆症、骨髄腫、骨形成異常症、パジェット病、骨形成不全症、ならびに慢性腎疾患、副甲状腺機能亢進症、およびコルチコステロイドの長期使用に関連する骨変性疾患が挙げられる。開示された治療法は、哺乳動物に、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５の阻害物質を：（１）骨変性疾患の治療または予防；（２）骨の老化の遅延；（３）失われた骨の回復；（４）新生骨形成の刺激；および／または（５）骨量および／または骨質の維持に有効な量で投与することを含む。本発明はまた、増加した骨密度または骨量により特徴づけられる骨障害を治療するために、ＧＤＦ−９作動物質またはＢＭＰ−１５作動物質を投与する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における骨障害を治療または予防する方法であって、これを必要とする哺乳動物に、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のモジュレータを、前記骨障害を治療または予防するために十分な量および期間で投与することを含む方法。
【請求項２】
ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５の前記モジュレータがＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５の阻害物質であり、前記骨障害が骨変性疾患である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記阻害物質がＧＤＦ−９阻害物質である請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記阻害物質がＢＭＰ−１５阻害物質である請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記骨障害が、骨減少症、骨軟化症、骨粗鬆症、骨髄腫、骨形成異常症、パジェット病、骨形成不全症、骨硬化症、再生不良性骨障害、体液性高カルシウム血症骨髄腫、多発性骨髄腫、および転移後に骨が脆くなることからなる群から選択される、請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記障害が骨粗鬆症である請求項５記載の方法。
【請求項７】
骨粗鬆症が、閉経後、ステロイド誘発性、老年性、またはチロキシンの使用により誘発されるものである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物における前記骨障害が：高カルシウム血症、慢性腎疾患、腎臓透析、原発性および二次性副甲状腺機能亢進症、炎症性腸疾患、クローン病、およびコルチコステロイドまたはＧｎＲＨ作動物質もしくは拮抗物質の長期使用の１以上に関連する、請求項１記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物における骨の老化の遅延、骨の維持、失われた骨の回復、または新生骨形成の刺激の方法であって、これを必要とする哺乳動物に、治療上有効な量のＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のモジュレータを、老化を遅らせるか、失われた骨を回復するか、または新生骨形成を刺激するために十分な量または期間投与することを含む方法。
【請求項１０】
前記モジュレータがＧＤＦ−９阻害物質である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記モジュレータがＢＭＰ−１５阻害物質である請求項９記載の方法。
【請求項１２】
骨の老化が、骨量の低下により特徴づけられる請求項９記載の方法。
【請求項１３】
骨量の低下が、骨ミネラル濃度を測定することにより決定される請求項９記載の方法。
【請求項１４】
骨の老化が、骨質の変性により特徴づけられる請求項９記載の方法。
【請求項１５】
前記骨質の変性が、骨の微細構造的完全性を評価することにより決定される請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物がヒトである請求項１または９記載の方法。
【請求項１７】
前記モジュレータが、化合物、抗体、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＲＮＡ干渉剤からなる群から選択される請求項１または９記載の方法。
【請求項１８】
前記モジュレータが抗体である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体が、抗ＧＤＦ−９抗体、抗ＧＤＦ−９レセプター抗体、抗ＢＭＰ−１５抗体、および抗ＢＭＰ−１５レセプター抗体からなる群から選択される請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体がヒト抗体またはそのヒト化誘導体である請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体が単クローン性である請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体が成熟ＧＤＦ−９タンパク質と特異的に結合する請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体が成熟ＢＭＰ−１５タンパク質と特異的に結合する請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
前記モジュレータが、成熟ＧＤＦ−９タンパク質または成熟ＢＭＰ−１５タンパク質と特異的に結合する請求項１７記載の方法。
【請求項２５】
前記モジュレータが、ＧＤＦ−９ポリペプチドおよびそのレセプター間の相互作用が関与するシグナル伝達を阻害するか、または前記モジュレータがＢＭＰ−１５ポリペプチドおよびそのレセプター間の相互作用が関与するシグナル伝達を阻害する、請求項１７記載の方法。
【請求項２６】
前記モジュレータが、可溶性ＧＤＦ−９レセプター、ＧＤＦ−９レセプターと結合するタンパク質、可溶性ＢＭＰ−１５レセプター、およびＢＭＰ−１５レセプターと結合するタンパク質からなる群から選択される請求項１７記載の方法。
【請求項２７】
前記ＲＮＡ干渉剤が二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である請求項１７記載の方法。
【請求項２８】
前記ｓｉＲＮＡがＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５を転写サイレンシングにより阻害する請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記モジュレータが全身投与される請求項１または９記載の方法。
【請求項３０】
前記モジュレータが、１μｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇおよび１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ、ならびに５００μｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇの範囲から選択される有効用量で投与される請求項１または９記載の方法。
【請求項３１】
前記モジュレータが少なくとも２週間の期間にわたって繰り返し投与される請求項１または９記載の方法。
【請求項３２】
皮質骨密度を増加させる方法であって、治療上有効な量の請求項１７記載のモジュレータを哺乳動物に投与することを含み、これにより皮質骨密度を増大させる方法。
【請求項３３】
骨梁密度を増大させる方法であって、治療上有効な量の請求項１７記載のモジュレータを哺乳動物に投与することを含み、これにより骨梁密度を増大させる方法。
【請求項３４】
ビスホスホネート、カルシトニン、エストロゲン、選択的エストロゲンレセプターモジュレータ、副甲状腺ホルモン、ビタミン、およびその組み合わせからなる群から選択される１以上の骨障害治療剤を哺乳動物に投与することをさらに含む請求項１または９記載の方法。
【請求項３５】
前記骨障害治療剤が選択的エストロゲンレセプターモジュレータである請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記骨障害治療剤がビスホスホネートである請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
前記哺乳動物に１以上の骨形成タンパク質を投与することをさらに含む請求項１または９記載の方法。
【請求項３８】
前記骨形成タンパク質が、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、およびＭＰ５２からなる群から選択される請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記骨形成タンパク質がＢＭＰ−３の阻害物質である請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
哺乳動物において、受胎能を低下させ、骨障害を治療または予防する方法であって、受胎能を低下させ、骨変性疾患を治療または予防するために十分な量および期間で、これを必要とする哺乳動物に、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５の阻害物質を投与することを含む方法。
【請求項４１】
前記阻害物質がＧＤＦ−９阻害物質である請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記阻害物質がＢＭＰ−１５阻害物質である請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
前記骨障害が、骨減少症、骨軟化症、骨粗鬆症、骨髄腫、骨形成異常症、パジェット病、骨形成不全症、骨硬化症、再生不良性骨障害、体液性高カルシウム血症骨髄腫、多発性骨髄腫、および転移後に骨が脆くなることからなる群から選択される請求項４０記載の方法。
【請求項４４】
前記障害が骨粗鬆症である請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記哺乳動物における前記骨障害が：高カルシウム血症、慢性腎疾患、腎臓透析、原発性および二次性副甲状腺機能亢進症、ならびにコルチコステロイドの長期使用の１以上と関連する請求項４０記載の方法。
【請求項４６】
哺乳動物における、受胎能の低下および骨の老化の遅延、骨の維持、失われた骨の回復、または新生骨形成の刺激の方法であって、これを必要とする哺乳動物に、治療上有効な量のＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５の阻害物質を、受胎能を低下させ、劣化を遅らせるか、骨損失を回復するか、または新生骨形成を刺激するために十分な量において投与することを含む方法。
【請求項４７】
前記阻害物質がＧＤＦ−９阻害物質である請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
前記阻害物質がＢＭＰ−１５阻害物質である請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
骨の老化が骨量の損失により特徴づけられる請求項４６記載の方法。
【請求項５０】
骨量の損失が、骨ミネラル濃度を測定することにより決定される請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
骨の老化が骨質の変性により特徴づけられる請求項４６記載の方法。
【請求項５２】
骨質の変性が、骨の微細構造的完全性を評価することにより決定される請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記哺乳動物がヒトである請求項４０または４６記載の方法。
【請求項５４】
対象において変化した骨密度をスクリーンおよび／または診断する方法であって：ａ）前記対象から得られる試験サンプル中のＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のレベルを決定し；ｂ）試験サンプル中のＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のレベルを、対象サンプル中のＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のレベルと比較することを含み、対象サンプルと比較して試験サンプルにおいてＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のレベルが変化していることが、前記対象における骨密度の変化および／または骨密度の変化が起こる素因を示すものである方法。
【請求項５５】
ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のレベルが、前記対照サンプルと比較して上昇し、前記対象は骨密度が減少しているか、または骨密度が減少する危険性が増大している、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のレベルが前記対照サンプルと比較して減少し、前記対象は骨密度が増加しているか、または骨密度が増加する可能性が増大している、請求項５４記載の方法。
【請求項５７】
捕捉剤を用いてＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のレベルを決定する請求項５４記載の方法。
【請求項５８】
前記捕捉剤が抗体である請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
前記抗体が検出可能な標識を含む請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
前記の検出可能な標識が、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物および化学発光化合物からなる群から選択される請求項５４記載の方法。
【請求項６１】
ＧＤＦ−９ポリペプチドまたはＢＭＰ−１５ポリペプチドについて特異的な捕捉剤、試薬および使用上の注意を含む診断キット。
【請求項６２】
対象において変化した骨密度についてスクリーンする方法であって、前記対象から得られる試験サンプル中のＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５をコード化するポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つの核酸変化が存在するか、または存在しないかを決定することを含み、少なくとも１つの核酸変化が存在することは、前記対象における骨密度の変化および／または骨密度が変化する素因を示すものである方法。
【請求項６３】
少なくとも１つの核酸変化が存在するか、または存在しないかが、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５をコード化するポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと前記サンプルを接触させることにより検出される、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１、および配列番号３として記載されるポリヌクレオチドの群から選択されるＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの少なくとも約１５のヌクレオチド部分を含む、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、およびｍＲＮＡからなる群から選択される、請求項６２記載の方法。
【請求項６６】
ポリヌクレオチドが変異体ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５をコード化する請求項６２記載の方法。
【請求項６７】
ポリヌクレオチドが突然変異体ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５をコード化する請求項６２記載の方法。
【請求項６８】
突然変異体ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５が切断されたＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５である請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
これを必要とする哺乳動物における骨障害を治療または予防するための医薬を製造するためのＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のモジュレータの使用。
【請求項７０】
ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５の前記モジュレータがＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５の阻害物質であり、前記骨障害が骨変性疾患である、請求項１記載の使用。
【請求項７１】
前記阻害物質がＧＤＦ−９阻害物質である請求項７０記載の使用。
【請求項７２】
前記阻害物質がＢＭＰ−１５阻害物質である請求項７０記載の使用。
【請求項７３】
前記骨障害が、骨減少症、骨軟化症、骨粗鬆症、骨髄腫、骨形成異常症、パジェット病、骨形成不全症、骨硬化症、再生不良性骨障害、体液性高カルシウム血症骨髄腫、多発性骨髄腫、および転移後に骨が脆くなることからなる群から選択される請求項７０記載の使用。
【請求項７４】
前記骨障害が骨粗鬆症である請求項７３記載の使用。
【請求項７５】
前記骨粗鬆症が、閉経後、ステロイド誘発性、老年性、またはチロキシンの使用により誘発されるものである、請求項７４記載の使用。
【請求項７６】
前記哺乳動物における前記骨障害が：高カルシウム血症、慢性腎疾患、腎臓透析、原発性および二次性副甲状腺機能亢進症、炎症性腸疾患、クローン病、およびコルチコステロイドまたはＧｎＲＨ作動物質もしくは拮抗物質の長期使用の１以上と関連する請求項７０記載の使用。
【請求項７７】
これを必要とする哺乳動物において骨の老化の遅延、骨の維持、失われた骨の回復、または新生骨形成の刺激のための医薬の製造のためのＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のモジュレータの使用。
【請求項７８】
前記モジュレータがＧＤＦ−９阻害物質である請求項７７記載の使用。
【請求項７９】
前記モジュレータがＢＭＰ−１５阻害物質である請求項７７記載の使用。
【請求項８０】
骨の老化が骨量の損失により特徴づけられる請求項７７記載の使用。
【請求項８１】
骨量の損失が、骨ミネラル濃度を測定することにより決定される請求項８０記載の使用。
【請求項８２】
骨質の変性により骨の老化が特徴づけられる請求項７７記載の使用。
【請求項８３】
骨の微細構造的完全性を評価することにより骨質の変性が決定される請求項８２記載の使用。
【請求項８４】
前記哺乳動物がヒトである請求項７０または７７記載の使用。
【請求項８５】
前記モジュレータが、化合物、抗体、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＲＮＡ干渉剤からなる群から選択される請求項７０または７７記載の使用。
【請求項８６】
前記モジュレータが抗体である請求項８５記載の使用。
【請求項８７】
前記抗体が、抗ＧＤＦ−９抗体、抗ＧＤＦ−９レセプター抗体、抗ＢＭＰ−１５抗体、および抗ＢＭＰ−１５レセプター抗体からなる群から選択される請求項８６記載の使用。
【請求項８８】
前記抗体がヒト抗体またはそのヒト化誘導体である請求項８６記載の使用。
【請求項８９】
前記抗体が単クローン性である請求項８６記載の使用。
【請求項９０】
前記抗体が成熟ＧＤＦ−９タンパク質と特異的に結合する請求項８６記載の使用。
【請求項９１】
前記抗体が成熟ＢＭＰ−１５タンパク質と特異的に結合する請求項８６記載の使用。
【請求項９２】
前記モジュレータが、成熟ＧＤＦ−９タンパク質または成熟ＢＭＰ−１５タンパク質と特異的に結合する請求項８５記載の使用。
【請求項９３】
前記モジュレータが、ＧＤＦ−９ポリペプチドおよびそのレセプター間の相互作用が関与するシグナル伝達を阻害するか、または前記モジュレータが、ＢＭＰ−１５ポリペプチドおよびそのレセプター間の相互作用が関与するシグナル伝達を阻害する、請求項８５記載の使用。
【請求項９４】
前記モジュレータが、可溶性ＧＤＦ−９レセプター、ＧＤＦ−９レセプターと結合するタンパク質、可溶性ＢＭＰ−１５レセプター、およびＢＭＰ−１５レセプターと結合するタンパク質からなる群から選択される請求項８５記載の使用。
【請求項９５】
前記ＲＮＡ干渉剤が二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である請求項８５記載の使用。
【請求項９６】
ｓｉＲＮＡがＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５を転写サイレンシングにより阻害する請求項９５記載の使用。
【請求項９７】
前記モジュレータが全身投与される請求項７０または７７記載の使用。
【請求項９８】
前記モジュレータが、１μｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇおよび１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ、ならびに５００μｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇの範囲から選択される有効な用量で投与される、請求項７０または７７記載の使用。
【請求項９９】
前記モジュレータが少なくとも２週間の期間にわたって繰り返し投与される請求項７０または７７記載の使用。
【請求項１００】
これを必要とする哺乳動物において皮質骨密度を増加させるための医薬を製造するためのＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のモジュレータの使用であって、前記モジュレータが、化合物、抗体、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＲＮＡ干渉剤からなる群から選択される使用。
【請求項１０１】
これを必要とする哺乳動物において骨梁密度を増加させるための医薬を製造するためのＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のモジュレータの使用であって、前記モジュレータが、化合物、抗体、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＲＮＡ干渉剤からなる群から選択される使用。
【請求項１０２】
前記組成物が、ビスホスホネート、カルシトニン、エストロゲン、選択的エストロゲンレセプターモジュレータ、副甲状腺ホルモン、ビタミン、およびその組み合わせからなる群から選択される１以上の骨障害治療剤をさらに含む、請求項７０または７７記載の使用。
【請求項１０３】
前記骨障害治療剤が選択的エストロゲンレセプターモジュレータである請求項３４記載の使用。
【請求項１０４】
前記骨障害治療剤がビスホスホネートである請求項３４記載の使用。
【請求項１０５】
前記組成物が１以上の骨形成タンパク質をさらに含む請求項７０または７７記載の使用。
【請求項１０６】
前記骨形成タンパク質が、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、およびＭＰ５２からなる群から選択される請求項１０５記載の使用。
【請求項１０７】
前記骨形成タンパク質がＢＭＰ−３の阻害物質である請求項１０５記載の使用。
【請求項１０８】
これを必要とする哺乳動物において、受胎能を低下させ、骨障害を治療または予防するための医薬を製造するためのＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のモジュレータの使用。
【請求項１０９】
前記阻害物質がＧＤＦ−９阻害物質である請求項１０８記載の使用。
【請求項１１０】
前記阻害物質がＢＭＰ−１５阻害物質である請求項１０８記載の使用。
【請求項１１１】
前記骨障害が、骨減少症、骨軟化症、骨粗鬆症、骨髄腫、骨形成異常症、パジェット病、骨形成不全症、骨硬化症、再生不良性骨障害、体液性高カルシウム血症骨髄腫、多発性骨髄腫、および転移後に骨が脆くなることからなる群から選択される、請求項１０８記載の使用。
【請求項１１２】
前記障害が骨粗鬆症である請求項１１１記載の使用。
【請求項１１３】
前記哺乳動物における前記骨障害が：高カルシウム血症、慢性腎疾患、腎臓透析、原発性および二次性副甲状腺機能亢進症、およびコルチコステロイドの長期使用の１以上と関連する請求項１０８記載の使用。
【請求項１１４】
これを必要とする哺乳動物における、受胎能の低下および骨の老化の遅延、骨の維持、失われた骨の回復、または新生骨形成のための医薬を製造するためのＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５の阻害物質の使用。
【請求項１１５】
前記阻害物質がＧＤＦ−９阻害物質である請求項１１４記載の使用。
【請求項１１６】
前記阻害物質がＢＭＰ−１５阻害物質である請求項１１４記載の使用。
【請求項１１７】
骨の老化が骨量の損失により特徴づけられる請求項１１４記載の使用。
【請求項１１８】
骨量の損失が、骨ミネラル濃度を測定することにより決定される、請求項１１７記載の使用。
【請求項１１９】
骨の老化が骨質の変性により特徴づけられる、請求項１１４記載の使用。
【請求項１２０】
骨質の変性が骨の微細構造的完全性を評価することにより特徴づけられる請求項１１９記載の使用。
【請求項１２１】
前記哺乳動物がヒトである請求項１０８または１１４記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年３月２８日に出願された米国仮出願番号６０／７８７，２４６（その開示は出典明示により本発明の一部とされる）について優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の技術分野は、骨障害、たとえば骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、骨形成異常症、および骨折の治療におけるＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５モジュレータの治療的使用に関する。
【０００３】
形質転換増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）超科のメンバーは、重要な増殖調節および形態形成特性を有する（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．８：１３３−１４６（１９９４）；Ｈｏｏｄｌｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２８：２３５−２７２（１９９８））。近年、２つのＴＧＦ−β超科メンバー：成長および分化因子９（ＧＤＦ−９）および骨形態形成タンパク質−１５（ＢＭＰ−１５、ＧＤＦ−９ｂとも呼ばれる；ＭｃＮａｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｅｐｒｏｄ．１２８：３７９−３８６（２００４）；Ｊｕｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ．Ｕｐｄ．１１：１４４−１６１（２００５））の卵巣機能および受胎能における役割に関して大いに注目されている。
【０００４】
ＧＤＦ−９は、はじめて１９９３年に、卵巣において特異的に発現されるＴＧＦ−β超科の新規メンバーとして記載された（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３４４４−３４４９（１９９３））。ＴＧＦ−β科の他のメンバーと同様に、ＧＤＦ−９は、シグナルペプチド、プロ領域、およびフリン様プロテアーゼ群に属する細胞内プロテアーゼにより前駆ペプチドから切断されるＣ末端成熟領域からなるプレプロペプチドとしてコード化される。ＧＤＦ−９ｍＲＮＡは、卵胞発生のすべての段階で卵母細胞中に存在し、一次卵胞段階から排卵後までに発現される（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３４４４−３４４９（１９９３）；ＭｃＧｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９：１３１−１３６（１９９５）；Ｅｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３：１０３５−１０４８（１９９９））。ＧＤＦ−９が欠失した雌マウスは、一次卵胞段階での卵母細胞の発達の停止のために不妊である（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３８３：５３１５３５（１９９６）；Ｃａｒａｂａｔｓｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０４：３７３−３８４（１９９８））。
【０００５】
ＢＭＰ−１５は、ＧＤＦ−９ｂとも呼ばれ、ＧＤＦ−９の相同体をコード化するＸ結合遺伝子であって、成熟領域中のＧＤＦ−９に対して５２％のアミノ酸同一性を有するものであることが判明した（Ｄｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２：１８０９−１８１７（１９９８）；Ｌａｉｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．７８：１３５−１４０（１９９８））。ＢＭＰ−１５発現はＧＤＦ−９の発現と同じであるが、ＧＤＦ−９ノックアウトマウスにおけるＧＤＦ−９の非存在を補うことができない。ＢＭＰ−１５が欠失した雌マウスは低受胎性であり、産仔サイズおよび月あたりの産仔数が減少する（Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５：８５４−８６６（２００１））。ヒツジにおいては、ＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５はどちらも受精に必須である（Ｊｕｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏ．Ｒｅｐｒｏｄ．６７：１７７７−１７８９（２００２））。ヒツジにおいて天然に存在するＢＭＰ−１５突然変異は、ホモ接合雌における不妊の原因である。ＢＭＰ−１５はまた、人間の女性の受精において重要な役割を果たす。その理由は、ＢＭＰ−１５突然変異が女性における卵巣発育異常と関連するからである（Ｄｉ  Ｐａｓｑｕａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７５：１０６−１１１（２００４））
【０００６】
ＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５は、今日まで記載されているＴＧＦ−βファミリーのメンバーの内、成熟領域において７つの特徴的な保存システイン残基のうちの４つが欠失している点で独自のものである（Ｄｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２：１８０９−１８１７（１９９８）；Ｌａｉｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．７８：１３５−１４０（１９９８））。第四のシステインは特に重要である。その理由は、これがほとんどのＴＧＦ−βファミリーの成熟二量体のサブユニット間のジスルフィド結合の形成に関与するためである。ＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５は、このシステインが欠失し、共有結合した二量体を形成しないが、研究により、ＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５はどちらもインビトロでホモ二量体ならびにヘテロ二量体を形成することが判明している（Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３７１３−３７１９（２００３）；Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１７３９１−１７３９６（２００４））
【０００７】
ＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５両方の発現は、哺乳動物において増殖する卵胞の卵母細胞に主に限定される。この発現パターンと一致して、これらの遺伝子において突然変位を有する動物、例えばヒツジおよびマウスにおいて、卵巣の外側では影響は見られず、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５ペプチドで免疫化されたヒツジにおいても見られない（Ｇａｌｌｏｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２５：２７９−２８３（２０００）；Ｈａｎｒａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．１２１：８４３−８５２（２００４）；Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３８３：５３１−５３５（１９９６）；Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎａｌ．１５：８５４−８６６（２００１）；Ｊｕｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．７０：５５７−５６１（２００４）；およびＥｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３：１０１８−１０３４（１９９９））。このように、これらの因子は、女性不妊の新規臨床的治療法を開発する目的、女性用の新規非ステロイド系避妊薬を開発するため、および農業環境における受胎能を調節するためなどをはじめとする、非卵巣副作用の危険性が低い受胎能の操作の魅力的な目標と考えられてきた（例えば、米国特許第６，０３０，６１７号参照）。
【０００８】
主に卵巣に限定されるが、ＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５発現は、下垂体および睾丸を包含する非卵巣組織において観察されてきた（Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３９：２５７１−２５７８（１９９８）；Ａａｌｔｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８４：２７４４−２７５０（１９９９）；Ｅｃｋｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９２：１１５−１２６（２００２）；ＯｔｓｕｋａおよびＳｈｉｍａｓａｋｉ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４３：４９３８−４９４１（２００２））。しかしながら、これらのタンパク質の発現はおもに卵巣に限定されているので、ＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５の非生殖機能および使用はあまり注目を集めなかった。
【０００９】
多くの症状は、特に高齢者および／または閉経後の女性において、骨の損失と関連する。例えば、骨粗鬆症は、骨格の骨量およびミネラル密度の減少、骨の構造劣化および対応する骨脆砕性の増加、ならびに骨折しやすさにより特徴づけられる、衰弱性疾患である。ヒトにおける骨粗鬆症は、臨床的骨減少症が先行し、米国において約２５００万人においてみられる状態である。
【００１０】
成年期全体にわたって、骨は骨形成および吸収の結合プロセスを通してターンオーバーを継続的に経験する。骨吸収には、骨吸収細胞、破骨細胞（単核食細胞により形成される）が関与する。失われた骨と置き換わる新しい骨は、造骨細胞、骨芽細胞（間葉性間質細胞により形成される）により堆積される。再形成プロセスに関与する様々な他の細胞種は、全身性因子（例えば、ホルモン、リンホカイン、成長因子、およびビタミン）および局所因子（例えば、サイトカイン、接着分子、リンホカイン、および成長因子）により厳重に抑制される。骨再形成プロセスの適切な時空調整は、骨量および完全性の維持に必須である。多くの骨変性疾患は、骨再形成サイクルにおける不均衡と関連があり、その結果、骨粗鬆症、骨増殖（骨軟化症）、骨形成異常症、およびパジェット病などの代謝性骨疾患をはじめとする異常な骨量の低下（骨減少症）が起こる。
【００１１】
現在、骨粗鬆症の治療に利用可能な２種の薬剤療法が存在する。第一の最も一般的な方法は、骨組織の再吸収を減少させるホルモン療法の使用である。エストロゲン代償療法（ＥＲＴ）はさらなる劣化を予防し、かくして骨折の可能性を軽減することが知られている。しかしながら、長期エストロゲン療法は子宮癌、子宮内膜癌、乳癌、頻発性膣出血、および血栓症の危険性と関連すると考えられているので、治療薬としてのエストロゲンの使用は限定される。これらの重大な副作用のために、多くの女性はこの治療を回避することを選択する。さらに、この種類の治療法に同意する男性はほとんどいない。骨粗鬆症に対する第二の主な治療法は、ビスホスホネート、特に、アレンドロネート、リセドロネート、およびイバンドロネートの使用である。試験により、これらの化合物は骨粗鬆症の患者において骨ミネラル濃度を一貫して増大させることがわかるが、ビスホスホネートによる骨粗鬆症の治療に関しては、食道および上部胃腸管の刺激をはじめとする重大な問題がある。
【特許文献１】米国仮出願番号６０／７８７，２４６公報
【特許文献２】米国特許第６，０３０，６１７号
【非特許文献１】Ｋｉｎｇｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．８：１３３−１４６（１９９４）
【非特許文献２】Ｈｏｏｄｌｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２８：２３５−２７２（１９９８）
【非特許文献３】ＭｃＮａｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｅｐｒｏｄ．１２８：３７９−３８６（２００４）
【非特許文献４】Ｊｕｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ．Ｕｐｄ．１１：１４４−１６１（２００５）
【非特許文献５】ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３４４４−３４４９（１９９３）
【非特許文献６】ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：  ３４４４−３４４９（１９９３）
【非特許文献７】ＭｃＧｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９：１３１−１３６（１９９５）
【非特許文献８】Ｅｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３：１０３５−１０４８（１９９９）
【非特許文献９】Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３８３：５３１５３５（１９９６）
【非特許文献１０】Ｃａｒａｂａｔｓｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０４：  ３７３−３８４（１９９８）
【非特許文献１１】Ｄｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２：１８０９−１８１７（１９９８）
【非特許文献１２】Ｌａｉｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．７８：１３５−１４０（１９９８）
【非特許文献１３】Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５：８５４−８６６（２００１）
【非特許文献１４】Ｊｕｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏ．Ｒｅｐｒｏｄ．６７：１７７７−１７８９（２００２）
【非特許文献１５】Ｄｉ  Ｐａｓｑｕａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７５：１０６−１１１（２００４）
【非特許文献１６】Ｄｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２：１８０９−１８１７（１９９８）
【非特許文献１７】Ｌａｉｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．７８：１３５−１４０（１９９８）
【非特許文献１８】Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３７１３−３７１９（２００３）
【非特許文献１９】Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１７３９１−１７３９６（２００４）
【非特許文献２０】Ｇａｌｌｏｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２５：２７９−２８３（２０００）
【非特許文献２１】Ｈａｎｒａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．１２１：８４３−８５２（２００４）
【非特許文献２２】Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３８３：５３１−５３５（１９９６）
【非特許文献２３】Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎａｌ．１５：８５４−８６６（２００１）
【非特許文献２４】Ｊｕｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．７０：５５７−５６１（２００４）
【非特許文献２５】Ｅｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３：１０１８−１０３４（１９９９）
【非特許文献２６】Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３９：２５７１−２５７８（１９９８）
【非特許文献２７】Ａａｌｔｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８４：２７４４−２７５０（１９９９）
【非特許文献２８】Ｅｃｋｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９２：１１５−１２６（２００２）
【非特許文献２９】ＯｔｓｕｋａおよびＳｈｉｍａｓａｋｉ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４３：４９３８−４９４１（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、骨障害を治療し、予防するための新規治療法を開発する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
ＧＤＦ−９は、皮質骨および骨梁ミネラル濃度の両方を包含する骨密度に影響を及ぼす。従って、本発明は、ＧＤＦ−９のモジュレータを投与することにより、骨障害を治療または予防するためのＧＤＦ−９の調節法を提供する。本発明はさらに、ＢＭＰ−１５のモジュレータを投与することにより、骨障害を治療または予防するための方法も提供する。本発明はさらに、哺乳動物における骨障害の治療または予防用医薬を製造するための、治療上有効な量のＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のモジュレータを含む組成物の使用を提供する。
【００１４】
一つの実施形態においては、骨変性疾患を治療または予防するために、ＧＤＦ−９の阻害物質が投与される。別の実施形態においては、骨変性疾患を治療または予防するために、ＢＭＰ−１５の阻害物質が投与される。いくつかの実施形態において、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のモジュレータは、骨変性疾患を治療または予防するための医薬を製造するために使用される。治療または予防される障害としては、例えば、骨減少症、骨軟化症、骨粗鬆症、骨髄腫（ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｏｍａ）、骨形成異常症、パジェット病、骨形成不全症、骨硬化症、再生不良性骨障害、体液性高カルシウム血症骨髄腫、多発性骨髄腫および転移後に骨が脆くなることが挙げられる。治療または予防される障害としてはさらに、高カルシウム血症、慢性腎疾患（末期腎不全を包含する）、腎臓透析、原発性または二次性副甲状腺機能亢進症、炎症性腸疾患、クローン病、およびコルチコステロイドまたはＧｎＲＨ作動物質もしくは拮抗物質の長期使用と関連する骨変性疾患が挙げられる。
【００１５】
本発明の方法は、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５阻害物質を：
（１）骨変性疾患の治療または予防；
（２）骨の老化の遅延；
（３）失われた骨の回復；
（４）新生骨形成の刺激；および／または；
（５）骨（骨量および／または骨質）の維持に有効な量で哺乳動物に投与することを含む。本発明はさらに、
（１）骨変性疾患の治療または予防；
（２）骨の老化の遅延；
（３）失われた骨の回復；
（４）新生骨形成の刺激；および／または；
（５）骨（骨量および／または骨質）の維持に有効な医薬を製造するための、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５の阻害物質を含む組成物の使用を提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、モジュレータは、例えば、抗ＧＤＦ−９抗体、抗ＢＭＰ−１５抗体、抗ＧＤＦ−９レセプター抗体、抗ＢＭＰ−１５レセプター抗体、可溶性ＧＤＦ−９レセプター、可溶性ＢＭＰ−１５レセプター、優性阻害ＧＤＦ−９ペプチド、または優性阻害ＢＭＰ−１５ペプチドをはじめとする、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５の阻害物質である。ある実施形態において、阻害物質は、例えば、ｓｉＲＮＡをはじめとするＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５の発現を減少させる。
【００１７】
本発明はさらに、骨変性疾患を治療するためのＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５の阻害物質の有効性を評価するための分析を提供する。本発明の方法において使用される投与法、組成物および装置も提供される。
【００１８】
本発明はまた、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５の作動物質を投与することにより、骨密度を減少させる方法、および骨密度を減少させる医薬を製造するためのＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５の作動物質の使用を提供する。治療される障害としては、例えば、硬化骨形成異常、骨格の骨形成異常、例えば、大理石骨病または骨硬化症および骨内膜骨化過剰症；Ｃａｍｕｒａｔｉ−Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ病（ＴＧＦ−βシグナル伝達の増加と関連する）；Ｖａｎ  Ｂｕｃｈｅｎ病および骨硬化症（ＢＭＰシグナル伝達の増加をもたらす）；常染色体優性骨硬化症；常染色体優性大理石骨病Ｉ型；ならびにＷｏｒｔｈ病が挙げられる。従って、本発明の方法および使用は、哺乳動物に、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５作動物質を、骨形成異常障害を治療または予防するために有効な量で投与することを包含する。
【００１９】
本発明のさらなる目的および利点は以下の説明において一部記載され、この記載から一部明らかになるか、あるいは本発明の実施によりわかるであろう。本発明の目的および利点は、添付の請求の範囲において具体的に指摘される要素および組み合わせにより実現され、達成されるであろう。
【００２０】
前記の一般的説明および以下の詳細な説明は、例示および説明のみであって、主張されるように、本発明を限定するものではないと理解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、骨障害を治療または予防するために、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のモジュレータを哺乳動物に投与する方法を提供する。
【００２２】
本発明の方法は、骨障害を治療または予防するために、かかる治療を必要とする任意の哺乳動物、具体的には、ヒト、霊長類、サル、齧歯類、ヒツジ、ウサギ、イヌ、モルモット、ウマ、ウシ、およびネコにおいて用いることができる。
【００２３】
ある実施形態において、ＧＤＦ−９阻害物質またはＢＭＰ−１５阻害物質は、骨変性疾患を治療または予防するために投与される。ＧＤＦ−９阻害物質またはＢＭＰ−１５阻害物質の投与により治療または予防される障害としては、例えば、骨減少症、骨軟化症、骨粗鬆症（例えば、閉経後、ステロイド誘発性、老年性、またはチロキシン使用誘発性）、骨髄腫、骨形成異常症、パジェット病、骨形成不全症、体液性高カルシウム血症骨髄腫、多発性骨髄腫および転移後に骨が脆くなることが挙げられる。治療または予防される障害としては、さらに、高カルシウム血症、慢性腎疾患、原発性または二次性副甲状腺機能亢進症、炎症性腸疾患、クローン病、コルチコステロイドまたはＧｎＲＨ作動物質もしくは拮抗物質の長期使用、および栄養失調に関連する骨変性疾患が挙げられる。
【００２４】
他の実施形態において、ＧＤＦ−９作動物質またはＢＭＰ−１５作動物質は、例えば、過度の骨成長または骨格の異常増殖により特徴づけられる障害、例えば、硬化骨形成異常をはじめとする骨障害を治療または予防するために投与される。この障害は、「骨硬化症」と称し、一般的な骨格の異常増殖、巨人症、脳神経の取り込み、頭蓋骨の頭蓋冠の拡張による頭蓋内圧の増加、ならびに骨梁および皮質骨両方の厚さおよび密度の増加により特徴づけられる進行性疾患である。過度の骨成長または骨格の異常増殖により特徴づけられる障害としては、これに限定されないが、硬化骨形成異常、骨格の骨形成異常、例えば、骨硬化症、大理石骨病、および骨内膜骨化過剰症；Ｃａｍｕｒａｔｉ−Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ病；Ｖａｎ  Ｂｕｃｈｅｎ病および骨硬化症；常染色体優性骨硬化症；常染色体優性大理石骨病Ｉ型；およびＷｏｒｔｈ病が挙げられる。Ｗｅｓｅｎｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔ．７２：７６３−７７１（２００３）、およびその引例参照。
【００２５】
一つの実施形態において、本発明は、閉経後の女性における骨変性疾患を治療または予防する方法を提供する。本発明の一つの実施形態は、ステロイド誘発性骨粗鬆症の個体における骨変性疾患を治療または予防する方法を提供する。本発明はまた、個体における老年性骨粗鬆症を治療または予防する方法も提供する。本発明の別の実施形態は、個体において、チロキシンの使用またはグルココルチコイドの使用により誘発される骨粗鬆症を治療または予防する方法を提供する。
【００２６】
本発明は、哺乳動物において、受胎能を低下させ、同時に、骨の老化を遅らせるか、骨を維持するか、失われた骨を回復するか、または新生骨形成を刺激する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、女性の受胎能を低下させ、骨変性疾患を同時に治療または予防する方法を提供する。
【００２７】
本発明はさらに、男性において骨変性疾患を治療または予防する方法も提供する。
【００２８】
開示される方法は、哺乳動物に、ＧＤＦ−９の阻害物質またはＢＭＰ−１５の阻害物質を：
（１）骨変性疾患の治療または予防；
（２）骨の老化の遅延；
（３）失われた骨の回復；
（４）新生骨形成の刺激；および／または
（５）骨（骨量および／または骨質）の維持に有効な量で投与する方法を包含する。
【００２９】
本発明の方法は、骨梁および皮質骨における微細欠陥を治療するために使用できる。骨質は、例えば、骨の微細構造的完全性を評価することにより決定することができる。
【００３０】
一般に、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のモジュレータは、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、２０、もしくは４０週間または少なくとも１、１．５、もしくは２年の期間から最高で対象の寿命までの期間、繰り返し投与される。ある実施形態において、単回ボーラス投与を、以下に詳細に記載するように、例えば、注射可能であるかまたは移植可能な組成物の投与により投与することができる。
【００３１】
一般に、ＧＤＦ−９の阻害物質またはＢＭＰ−１５の阻害物質をはじめとする、本発明の方法において有用なＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５のモジュレータは、１０−８から１０−７；１０−７から１０−６；１０−６から１０−５；または１０−５から１０−４ｇ／ｋｇの間の用量で投与することができる。１つの動物モデルにおいて達成される治療的に有効な用量は、ヒトを包含する別の動物において使用するために、当該分野において公知の変換係数を用いて変換することができる（例えば、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９６６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐｏｒｔｓ、５０（４）：２１９−２４４参照）。
【００３２】
本発明の方法において用いられるモジュレータの正確な用量は、所望の結果に基づいて経験的に決定される。結果の例としては：（ａ）骨変性疾患が治療または予防される、（ｂ）骨の老化が遅延される；（ｃ）失われた骨が回復される；（ｄ）新規骨成長が形成される；および／または（ｅ）骨量および／または骨質が維持される。例えば、モジュレータは、骨の老化（例えば、骨量および／または骨ミネラル濃度の損失）を少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、または５００％遅らせるために有効な量で投与される。
【００３３】
本発明の一つの実施形態において、モジュレータは、卵巣の血中卵胞バリア（電荷およびサイズ選択的である）を克服しないで、骨密度に対して所望の治療効果をもたらすことができる（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５８：７０５−７１１（１９９８））。このようなモジュレータの差動効果は、例えば全身投与後に、異なる組織におけるその電荷、および／またはその相対的有効濃度の関数であり得る。
【００３４】
骨の老化に関連する結果は、骨梁の損失（骨梁穿孔）；（骨幹端）皮質骨の損失；海綿骨の損失；骨ミネラル濃度の減少、骨ミネラル質の減少、骨再形成の減少；血清アルカリホスファターゼおよび酸ホスファターゼのレベルの増加；骨の脆弱性（骨折率の増加）、骨折治癒機転の減少に関して、ＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５のモジュレータの特異的効果により評価することもできる。骨量および骨質を評価する方法は、当該分野において公知であり、これに限定されないが、Ｘ線回折；ＤＸＡ；ＤＥＱＣＴ；ｐＱＣＴ、化学分析、密度分画、組織測光法、組織形態計測、および例えば、Ｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．１８：２１０５−２１１５（２００３）において記載されている組織化学分析を包含する。皮質骨密度を決定するための一つの分析法はＭｉｃｒｏＣＴ分析である。ｐＱＣＴ測定後、例えば、大腿骨に関してＳｃａｎｃｏ  ｍＣＴ４０（Ｓｃａｎｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡＧ）を用いることにより、ｍｉｃｒｏＣＴ評価を行うことができる。
【００３５】
本発明はまた、カルセイン標識により骨形成を測定する方法も提供する。例えば、マウスに、組織採取前９日および２日にカルセインを注射（例えば、１５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｌ／マウス、ｓ．ｃ．）することができる。骨組織を、大腿骨と脛骨との両方、ならびに脊椎から集めることができる。カルセイン標識された石灰化骨層間の距離を測定するための骨サンプルの組織学的特性化を用いて、骨形成を評価する。
【００３６】
本発明のさらなる用途は、骨インプラント、マトリックス、およびデポーシステムをコーティングするか、またはこれらの中に組み入れて、骨融合を促進するための、ＧＤＦ−９および／またはＢＭＰ−１５モジュレータの使用を包含する。かかるインプラントの例としては、歯科インプラントおよび関節置換インプラントが挙げられる。
【００３７】
本発明はさらに、骨変性疾患の治療に関するＧＤＦ−９モジュレータまたはＢＭＰ−１５モジュレータの有効性を評価するための分析を含む。
【００３８】
このような分析は：
（１）モジュレータを哺乳動物（例えば、ＯＶＸラット）に、少なくとも２、４、６、または８週間の期間投与し；
（２）骨に対するモジュレータの効果を決定することを含み、
モジュレータに起因する骨（例えば、骨量および／または骨質）の老化の遅延は、このモジュレータが骨変性疾患の治療に有効であることを示し；モジュレータに起因する骨密度の減少は、このモジュレータが、硬化骨形成異常または不適切に上昇した骨量の障害の治療に有用であることを示す。
【００３９】
ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のモジュレータは、骨変性疾患を包含する骨障害の１以上の動物モデルにおいて、および／またはヒトにおいて評価することができると理解される。骨減少症は、運動不足、低カルシウム食、高リン食、コルチコステロイドの長期使用、またはＧｎＲＨ作動物質もしくは拮抗物質、卵巣機能の停止、または老化により誘発され得る。例えば、卵巣摘出（ＯＶＸ）により誘発される骨減少症は、ヒト閉経後骨粗鬆症の十分に確立された動物モデルである。別の十分に有効なモデルは、コルチコステロイドの投与を含む。かかるモデルとしては：カニクイザル、イヌ、マウス、ウサギ、フェレット、モルモット、ミニブタ、およびヒツジが挙げられる。骨粗鬆症の様々な動物モデルの総説については、例えば、Ｔｕｒｎｅｒ、Ｅｕｒ．ＣｅｌｌｓおよびＭａｔｅｒｉａｌｓ  １：６６−８１（２００１）参照。
【００４０】
さらなるインビトロ試験は、培養物における骨芽細胞に対する影響、例えば、コラーゲンおよびオステオカルシン合成に対する影響またはアルカリホスファターゼおよびｃＡＭＰ誘発のレベルに対する影響の評価を含む。適切なインビボおよびインビトロ試験は、例えば、米国特許第６，３３３，３１２号において記載されている。
Ｉ．ＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５モジュレータ
【００４１】
ＧＤＦ−９は、２７アミノ酸シグナル配列および２９２アミノ酸プロペプチドを含む、約４５４アミノ酸（ａａ）（配列番号２）のプレプロポリペプチドとして合成される。ＧＤＦ−９の成熟Ｃ末端フラグメントは、１３５アミノ酸の長さであり、ヌクレオチド配列分析により測定すると、約１５．６ｋＤの非グリコシル化分子量を有することが予想される。ＧＤＦ−９シグナル伝達には、Ｉ型レセプターＡＬＫ５（Ｍａｚｅｒｂｏｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１８：６５３−６６５（２００４））およびＩＩ型レセプターＢＭＰＲＩＩ（Ｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６７：４７３−４８０（２００２））が関与する。成熟ヒトＧＤＦ−９のアミノ酸配列は、配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００５２５１．１）内に含まれる。ヒトＧＤＦ−９野生型遺伝子の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００５２６０、米国特許第５，８２１，０５６号；第６，１９１，２６１号；および第６，３６５，４０２号、ならびに米国特許公開番号２００２／０１２７６１２および２００４／０１５２１４３において開示されている。マウスＧＤＦ−９遺伝子のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００８１１０において見出され；ヌクレオチド２９〜１３５４はマウスＧＤＦ−９タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３２１３６．１）をコード化する。ラットＧＤＦ−９遺伝子のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０２１６７２において見出され；ヌクレオチド１〜１３２３は、ラットＧＤＦ−９タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０６７７０４．１http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=NP_032136.1）をコード化する。
【００４２】
ＢＭＰ−１５は、１８アミノ酸シグナル配列および２４９アミノ酸プロペプチドを含む、約３９２アミノ酸（配列番号４；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００５４３９．１）のプレプロポリペプチドとして合成され；ヌクレオチド残基１から１１７９は配列番号４をコード化する。ＢＭＰ−１５の成熟Ｃ末端フラグメントは、１２５アミノ酸の長さであり、アミノ酸残基２６８〜３９２のプレプロポリペプチドからなる。ＢＭＰ−１５シグナル伝達には、Ｉ型レセプターＡＬＫ６およびＩＩ型レセプターＢＭＰＲＩＩが関与する（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３０４−３１０（２００３））。成熟ヒトＢＭＰ−１５のアミノ酸配列は、配列番号４内に含まれる。ヒトＢＭＰ−１５（ＧＤＦ−９ｂ）野生型遺伝子の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００５４４８、米国特許第５，７２８，６７９号および第５，６３５，３７２号、および米国特許公開番号２００４／００９２００７において開示されている。マウスＢＭＰ−１５遺伝子のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００９７５７において見出され；ヌクレオチド３５８〜１５３６は、マウスＢＭＰ−１５タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３３８８７）をコード化する。ラットＢＭＰ−１５遺伝子のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０２１６７０において見出され；ヌクレオチド２４７〜１４２２は、ラットＢＭＰ−１５タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０６７７０２．１）をコード化する。
【００４３】
「ＧＤＦ−９」および「ＢＭＰ−１５」なる用語は、本明細書において用いられる場合、それぞれ、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５の１以上のイソ型を意味する。この用語は、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５の完全長の未処理前駆体形態、ならびに翻訳後開裂から得られる成熟およびプロペプチド形態を意味する。「プロペプチド」なる用語は、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５前駆体タンパク質のアミノ末端ドメインから開裂されるポリペプチドを意味する。「成熟タンパク質」なる用語は、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５前駆体タンパク質のカルボキシ末端ドメインから開裂されるタンパク質を意味する。成熟ＧＤＦ−９は、モノマー、ホモ二量体、または例えば、ＢＭＰ−１５とのヘテロ二量体として存在し得る。成熟ＢＭＰ−１５は、モノマー、ホモ二量体、またはヘテロ二量体として存在し得る。条件に応じて、成熟タンパク質は、ありとあらゆるこれらの異なる形態間に平衡を確立することができる。その生物学的に活性な形態において、成熟ＧＤＦ−９は、「活性ＧＤＦ−９」とも称し、成熟ＢＭＰ−１５は、「活性ＢＭＰ−１５」とも称する。この用語は、本明細書において議論されるように、成熟ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５と関連する少なくともいくつかの生物学的活性を維持するＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５の任意のフラグメントおよび変異体（修飾された配列を包含する）も意味する。本発明は、これに限定されないが、ヒト、ウシ、ニワトリ、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、シチメンチョウ、オナガザル、および魚をはじめとする全ての脊椎動物種からのＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５のモジュレータを採用することができる。
【００４４】
「ＧＤＦ−９レセプター」および「ＢＭＰ−１５レセプター」なる用語は、特に指示がない限り、それぞれＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５イソ型の少なくとも１つと結合する任意のレセプターを意味する。ＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５、ならびにそのレセプターの、構造的および機能的態様は、当該分野において周知である（例えば、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．２３：７８７−８２３（２００２）；Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２３４：６７−７３（２００５）；Ｊｕｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｕｐｄａｔｅ  １１：１４４−１６１（２００４）参照）。
Ａ．ＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５阻害物質
【００４５】
「ＧＤＦ−９阻害物質」なる用語およびその同語源語、例えば、「拮抗物質」、「中和」、および「下方制御」とは、ＧＤＦ−８の生物学的活性の阻害物質として作用する化合物（または必要に応じてその性質）を意味する。ＧＤＦ−９阻害物質は、例えば、ＧＤＦ−９と結合し、その活性を中和するか；ＧＤＦ−９発現レベルを低下させるか；前駆体分子の安定性またはその活性な成熟形態の変換に影響を及ぼすか；１以上のレセプターに対するＧＤＦ−９の結合を妨害するか；またはＧＤＦ−９レセプターの細胞内シグナル伝達を妨害する。「直接ＧＤＦ−９阻害物質」なる用語は、一般に、ＧＤＦ−９の生物学的活性を直接下方制御する任意の化合物を意味する。ＧＤＦ−９遺伝子、ＧＤＦ−９転写物、ＧＤＦ−９リガンド、またはＧＤＦ−９レセプターとの相互作用により、活性を下方制御するならば、分子はＧＤＦ−９の生物学的活性を「直接、下方制御」する。「中和する」、「中和」、「阻害」およびその同語源語は、同じ阻害物質の非存在下でのＧＤＦ−９の活性に比較しての、ＧＤＦ−９阻害物質によるＧＤＦ−９の活性の減少を意味する。活性の減少は、好ましくは、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上である。ＧＤＦ−９の活性を変える化学物質を同定する方法、例えば、メス受胎能を変える方法は、米国特許第６，６８０，１７４号に記載されている。
【００４６】
ＧＤＦ−９の活性をブロックできるＧＤＦ−９阻害物質は、本発明の方法において有用である。かかる阻害物質は、ＧＤＦ−９自体と相互作用することができる。別法として、阻害物質は、例えば、ＧＤＦ−９レセプター（例えば、ＡＬＫ５またはＢＭＰＲＩＩ）または他の結合パートナーと相互作用することができる。阻害物質は、ＧＤＦ−９の結合後に、ＧＤＦ−９のそのレセプターに対する結合および／またはif they block レセプターの活性を低下またはブロックすることができる。阻害物質は、もちろん、ＧＤＦ−９および第二の因子（例えばそのレセプター）の両方と相互作用することができる。この点に関して、ＧＤＦ−９阻害物質は、（ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９レセプターに対する）抗体、修飾可溶性レセプター、他のタンパク質（ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９レセプターと結合するものを包含する）、ＧＤＦ−９の修飾形態またはそのフラグメント、プロペプチド、ペプチド、およびこれらの阻害物質の全ての模倣物質を包含する。非タンパク性阻害物質としては、例えば、小分子および核酸が挙げられる。
【００４７】
「ＧＤＦ−９活性」なる用語は、活性ＧＤＦ−９タンパク質と関連する１以上の生理的成長調節または形態形成活性を意味する。ＧＤＦ−９活性をインビボまたはインビトロで測定する分析法は当該分野において公知である。より頻繁に用いられるバイオアッセイの数例としては次のものが挙げられる：
（１）顆粒膜細胞におけるプロゲステロン、プロスタグランジンＥ２の合成（米国特許第６，６８０，１７４；Ｅｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１０２８８−１０２９３（２０００））；
（２）ヒアルロン酸合成酵素、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ２）、ステロイド産生急性調節タンパク質（ＳｔＡＲ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）レセプター、アクチビン／インヒビンβ、ホリスタチン、およびグレムリン（ｇｒｅｍｌｉｎ）をはじめとするＧＤＦ−９誘発性遺伝子の発現の誘発（米国特許第６，６８０，１７４号；Ｅｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１０２８８−１０２９３（２０００））；
（３）ラット卵巣の顆粒膜細胞の増殖の誘発（Ｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６７：４７３−４８０（２００２）；Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１７３９１−１７３９６（２００４））；
（４）マウス卵丘細胞の粘液分泌期および膨張（Ｂｕｃｃｉｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１３８：１６−２５（１９９０）；Ｓａｌｕｓｔｒｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１３８：２６−３２（１９９０）；Ｅｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３：１０３５−１０４８（１９９９））；
（５）Ｐ１９癌細胞におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合したＣＡＧＡプロモーターの誘発（Ｍａｚｅｒｂｏｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１８：６５３−６６５（２００４））；
（６）機能的に適格な骨芽細胞への間葉性幹細胞の分化に対する影響（Ｊａｉｓｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：２９５−３１２（１９９７））；
（７）レセプター結合分析（Ｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６７：４７３−４８０（２００２））；
（８）Ｓｍａｄｓタンパク質のリン酸化反応（Ｍａｚｅｒｂｏｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１８：６５３−６６５（２００４））；および
（９）レセプターリン酸化反応（Ｂｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１Ｂ：１１０−１４９（１９９１）；Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１：１４９−１５２（１９９１）；Ｗｒａｎａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：９４４−９５０（１９９４）；Ｗｅｉｓｅｒ、ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：２１９９−２２０８（１９９５））。
【００４８】
「ＢＭＰ−１５阻害物質」なる用語およびその同語源語、例えば、「拮抗物質」、「中和」、および「下方制御」は、ＢＭＰ−１５の生物活性の阻害物質として作用する化合物（必要に応じてその性質）を意味する。ＢＭＰ−１５阻害物質は、例えば、ＢＭＰ−１５と結合し、その活性を中和するか；ＢＭＰ−１５発現レベルを低下させるか；前駆体分子の安定性またはその活性な成熟形態への変換に影響を及ぼすか；ＢＭＰ−１５の１以上のレセプターへの結合を妨害するか；またはＢＭＰ−１５レセプターの細胞内シグナル伝達を妨害する。「直接的ＢＭＰ−１５阻害物質」なる用語は、一般に、ＢＭＰ−１５の生物活性を直接的に下方制御する任意の化合物を意味する。ＢＭＰ−１５遺伝子、ＢＭＰ−１５転写物、ＢＭＰ−１５リガンド、またはＢＭＰ−１５レセプターとの相互作用により、活性を下方制御するならば、分子は、ＢＭＰ−１５の生物活性を「直接的に下方制御」する。用語「中和する」、「中和」、「阻害「およびその同語源語は、同阻害物質の非存在下でのＢＭＰ−１５の活性と比較して、ＢＭＰ−１５によるＢＭＰ−１５の活性の減少を意味する。活性の減少は、好ましくは少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上である。
【００４９】
ＢＭＰ−１５の活性をブロックできるＢＭＰ−１５阻害物質は、本発明において有用である。かかる阻害物質は、ＢＭＰ−１５自体と相互作用することができる。別法として、阻害物質は、例えば、ＢＭＰ−１５レセプター（例えば、ＡＬＫ６またはＢＭＰＲＩＩ）または他の結合パートナーと相互作用することができる。阻害物質は、ＢＭＰ−１５の結合後に、ＢＭＰ−１５のそのレセプターに対する結合および／またはif they block レセプターの活性を減少またはブロックすることができる。阻害物質は、もちろん、ＢＭＰ−１５および第二の因子（例えば、そのレセプター）の両方と相互作用することができる。この点に関して、ＢＭＰ−１５阻害物質としては、抗体（ＢＭＰ−１５および／またはＢＭＰ−１５レセプター）、修飾可溶性レセプター、他のタンパク質（ＢＭＰ−１５および／またはＢＭＰ−１５レセプターと結合するものを包含する）、ＢＭＰ−１５の修飾形態またはそのフラグメント、プロペプチド、ペプチド、およびこれらの阻害物質の全てを模倣物質を包含する。非タンパク性阻害物質としては、例えば、小分子および核酸が挙げられる。
【００５０】
「ＢＭＰ−１５活性」なる用語は、活性ＢＭＰ−１５タンパク質と関連する１以上の生物的成長調節または形態形成活性を意味する。インビボおよびインビトロでＢＭＰ−１５活性を測定する分析法は当該分野において公知である。より頻繁に使用されるバイオアッセイの数例としては、次のものが挙げられる：
（１）ラット卵巣顆粒膜細胞の増殖の誘発（Ｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６７：４７３−４８０（２００２）；Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１７３９１−１７３９６（２００４））；
（２）顆粒膜細胞キットリガンドの発現の誘発（Ｏｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：８０６０−８０６５（２００２））；
（３）卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）レセプター発現の阻害（Ｏｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１１３８７−１１３９２（２００１））；
（４）ＦＳＨ誘発性プロゲステロン合成の抑制（Ｏｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３９５２３−３９５２８（２０００））；
（５）ステロイド産生急性調節タンパク質（ＳｔＡＲ）、Ｐ４５０側鎖切断酵素（Ｐ４５０ｓｃｃ）、３β−ヒドロキシステロイドデヒドエロゲナーゼ（３β−ＨＳＤ）、ＬＨレセプター、および顆粒膜細胞におけるインヒビン／アクチビンサブユニット（βＡ、および登録商標Ｂ）のＦＳＨ誘発性発現の抑制（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２３４：６７−７３（２００５））；
（６）間葉性幹細胞の機能的に適格な骨芽細胞への分化に対する影響（Ｊａｉｓｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：２９５−３１２（１９９７）；
（７）レセプター結合分析（Ｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６７：４７３−４８０（２００２））；
（８）Ｓｍａｄｓタンパク質のリン酸化反応（Ｍａｚｅｒｂｏｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１８：６５３−６６５（２００４））；および
（９）レセプターリン酸化反応（Ｂｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１Ｂ：１１０−１４９（１９９１）；Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１：１４９−１５２（１９９１）；Ｗｒａｎａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：９４４−９５０（１９９４）；Ｗｅｉｓｅｒ、ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：２１９９−２２０８（１９９５））。
【００５１】
ＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５阻害物質は、任意にグリコシル化するか、ペギル化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）するか、または別の非タンパク性ポリマーと結合させてもよい。ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５の阻害物質は、変更されたグリコシル化パターン（即ち、本来の、または天然のグリコシル化パターンから変更された）を有するように修飾してもよい。本明細書において用いられる場合、「変更」とは、本来の阻害物質と比較して、１以上の炭水化物部分が付加または欠失している、および／または１以上のグリコシル化部位が付加または欠失していることを意味する。グリコシル化部位の阻害物質への付加は、当該分野において周知のグリコシル化部位コンセンサス配列を含有するようにアミノ酸配列を変更することにより、達成することができる。炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、阻害物質のアミノ酸残基とグリコシドの化学的または酵素カップリングによる。これらの方法は、ＷＯ ８７／０５３３０、およびＡｐｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、(1981) Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：２５９−３０６（１９８１）において記載されている。レセプター上に存在する炭水化物部分の除去は、Hakimuddin Ｓｏｊａｒ  ｅｔ  ａｌ．、(1987) Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２−５７（１９８７）；Ｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．、(1981) Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１−１３７（１９８１）；およびＴｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．、(1987) Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０−３５９（１９８７）により記載されているように化学的または酵素により行うことができる。
【００５２】
本発明の方法において有用なＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５阻害物質は、検出可能または機能的標識で標識することもできる。検出可能な標識としては、放射性標識、例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉまたは９９Ｔｃが挙げられ、これらは当該分野において公知の通常の化学反応を用いて阻害物質に結合させることができる。標識は、酵素標識、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼを含む。標識は、化学部分、例えば、ビオチンをさらに含み、これは、特異的な同種の検出可能な部分、例えば、標識されたアビジンとの結合により検出することができる。
１．抗体
【００５３】
ＧＤＦ−９活性を阻害する抗体を、本発明の方法において用いることができる。ＢＭＰ−１５活性を阻害する抗体も本発明において有用である。
【００５４】
「抗体」なる用語は、本明細書において用いられる場合、イムノグロブリンまたはその一部を意味し、供給源、種の起源、産生法、および特性に関係なく、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含する。非制限的例として、「抗体」なる用語は、ヒト、オランウータン、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、およびニワトリ抗体を包含する。この用語は、これに限定されないが、多クローン性、単クローン性、単一特異性、多特異性、非特異性、ヒト化、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）、一本鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、突然変異、およびＣＤＲ−グラフト化抗体を包含する。本発明に関して、特に記載しない限り、抗体フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＶＨＨ（ナノ抗体（ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）とも称する）、および抗原結合機能を保持する他の抗体フラグメントも包含する。
【００５５】
抗体は、伝統的なハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９９（１９７５））、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）、または抗体ライブラリーを用いたファージディスプレー技術（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１））により調製できる。様々な他の抗体産生技術については、Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照。
【００５６】
「抗原結合ドメイン」なる用語は、抗原の一部または全部と特異的に結合するか、または相補的である部分を含む抗体分子の一部を意味する。抗原が大きい場合、抗体は抗原の特定の部分とのみ結合する。「エピトープ」または「抗原決定基」は、抗体の抗原結合ドメインとの特異的相互作用に関与する抗原分子の一部である。抗原結合ドメインは、１以上の抗体可変ドメイン（例えば、ＶＨドメインからなる、いわゆるＦｄフラグメント）により提供される。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域ＶＨ）を含むことができる。ラクダおよびラマ（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ、ｃａｍｅｌｉｄｓ）から得られる抗体は、重鎖のみにより形成され、軽鎖を欠いている単一種の抗体を包含する。かかる抗体の抗原結合部位は、ＶＨＨと称する１つのドメインである。これらは、「ラクダ化抗体」または「ナノ抗体」と称する。例えば、米国特許第５，８００，９８８号、米国特許第６，００５，０７９号、国際出願番号ＷＯ９４／０４６７８、および国際出願番号ＷＯ９４／２５５９１を参照（本発明の一部として参照される）。
【００５７】
「レパートリー」なる用語は、ヌクレオチドの様々な集団、例えば、ＤＮＡ、発現されたイムノグロブリンをコード化する配列から全体的にまたは部分的に誘導される配列を意味する。配列は、例えば、Ｈ鎖のＶ、Ｄ、およびＪセグメントおよび、Ｌ鎖の例えば、ＶおよびＪセグメントのインビボ転位により生成される。別法として、配列は、インビトロ刺激により、またどの転位が起こるかに応じて、細胞系から生成させることができる。別法として、配列の一部または全部は、例えば、未配列のＶセグメントのＤおよびＪセグメントとの組み合わせ、ヌクレオチド合成、ランダム化突然変異生成、および米国特許第５，５６５，３３２号に開示されているような他の方法により、得ることができる。
【００５８】
「特異的相互作用」または「特異的に結合する」などの用語は、２つの分子が生理学的条件下で比較的安定である複合体を形成することを意味する。この用語は、例えば、抗原結合ドメインが、多くの抗原により運ばれる特定のエピトープに対して特異的であり、この場合、抗原結合ドメインを有する抗体は、このエピトープを有する様々な抗原と結合することができる。このように、抗体は、例えば、ＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５の両者により媒介されるエピトープと結合する限り、ＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５と特異的に結合できる。
【００５９】
特異的結合は、高親和性および低から中程度の結合能により特徴づけられる。非特異的結合は、通常、中から高結合能で、低親和性を有する。典型的には、結合は、親和性定数Ｋａが１０６Ｍ−１より高いか、または好ましくは１０８Ｍ−１より高い場合に特異的と見なされる。必要ならば、非特異性結合は、結合条件を変えることにより、特異的結合に実質的に影響を及ぼすことなく、減少させることができる。このような条件は当該分野において公知であり、当業者は、通常の技術を用いて、適切な条件を選択できる。条件は、通常、抗体の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合に許容される時間、非関連分子（例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度等に関して定義される。
【００６０】
「実質的に記載したとおりである」という表現は、関連するＣＤＲ、ＶＨ、またはＶＬドメインが、その配列が本明細書において記載されている特定の領域と同一であるか、または非常に類似しているかのいずれかであることを意味する。例えば、かかる置換は、ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２、またはＬ３）の配列中の任意の５のアミノ酸のうちの１または２を含む。
【００６１】
「単離された」なる用語は、その自然環境が実質的にない分子を意味する。例えば、単離されたタンパク質は、細胞物質または由来する細胞もしくは組織源からの他のタンパク質が実質的にない。この用語は、単離されたタンパク質が治療用組成物として投与されるために十分純粋である、即ち、少なくとも７０％から８０％（ｗ／ｗ）の純度、さらに好ましくは少なくとも８０％〜９０％（ｗ／ｗ）の純度、なお一層好ましくは９０〜９５％の純度；最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（ｗ／ｗ）の純度の調製物を意味する。
Ａ）ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５に対する抗体
【００６２】
前述の方法に従って、ＧＤＦ−９タンパク質自体と特異的に結合する抗体を作製できる。これらの抗体は、ＧＤＦ−９の活性を阻害するならば、例えば、ＧＤＦ−９のそのレセプターとの結合をブロックするならば、本発明の方法において有効である。本発明において最も有効な抗体は、ＧＤＦ−９／ＧＤＦ−９レセプター複合体のＧＤＦ−９と特異的に結合する特性を有する。このような抗体は、成熟ＧＤＦ−９と高親和力で結合でき、モノマー形態、ホモ二量体形態、および／またはヘテロ二量体形態の成熟タンパク質を、例えば、ＢＭＰ−１５と結合させることができる。
【００６３】
ＧＤＦ−９に対する抗体は、例えば、米国特許第６，１９１，２６１号に記載されているように、当該分野において記載されており、本発明において使用されることが想定される。
【００６４】
ＧＤＦ−９の中和抗体は、当該分野において記載されており、本発明において使用されることが想定される。ｍＡｂ−ＧＤＦ９−５３は、特異的抗ヒトＧＤＦ−９中和単クローン性抗体である（Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．７１：７３２−７３９（２００４））。この抗体の免疫化ペプチドは、ヒトＧＤＦ−９のＣ末端に近いペプチド配列に対応する合成の３２アミノペプチドであった。エピトープマッピングにより、ｍＡｂ−ＧＤＦ９−５３が低分子４−ａペプチド配列、ＥＰＧＤ（免疫化ペプチドの中程に位置する）を認識することが明らかになった。いくつかの脊椎動物種からのＣ末端ＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５アミノ酸配列の整列により、ＥＰＤＧ配列が種間で高度に保存されるが、ＢＭＰ−１５における対応する領域との類似性レベルは低いことがわかった。ｍＡＢ−ＧＤＦ９−５３は、組換えマウスＧＤＦ−９について強力な免疫親和性を示し、ＢＭＰ−１５との非常に低い交差反応性を示した。Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．において記載されている中和活性を有する他の抗ヒトＧＤＦ−９抗体は、ｍＡｂ−ＧＤＦ９−２２、ｍＡｂ−ＧＤＦ９−１９、ｍＡｂ−ＧＤＦ９−３７を包含する。
【００６５】
前述の方法に従って、ＢＭＰ−１５タンパク質自体と特異的に結合する抗体を作製できる。これらの抗体は、ＢＭＰ−１５の活性を阻害するならば、例えば、ＢＭＰ−１５のそのレセプターとの結合をブロックするならば、本発明において有効である。本発明において最も有効な抗体は、ＢＭＰ−１５／ＢＭＰ−１５レセプター複合体のＢＭＰ−１５と特異的に結合する性質を有する。かかる抗体は、成熟ＢＭＰ−１５を高親和力で結合し、モノマー形態、ホモ二量体形態、および／またはヘテロ二量体形態の成熟タンパク質を、例えば、ＧＤＦ−９と結合させることができる。
【００６６】
ＢＭＰ−１５に対する抗体は、例えば、米国特許公開番号２００４／０２６７００３および２００４／００９２００７に記載されているように、当該分野において記載されており、本発明において使用されることが想定される。
Ｂ）ＧＤＦ−９レセプターまたはＢＭＰ−１５レセプターに対する抗体
【００６７】
前述の方法に従って、ＧＤＦ−９レセプターと結合する抗体を作製できる。これらの抗体は、ＧＤＦ−９のそのレセプターとの結合をブロックするならば、またはＧＤＦ−９の結合後にレセプター活性をブロックするならば、本発明において有効である。抗体は、全レセプタータンパク質、または細胞外ドメインのみに対して作製することができる。抗体は、ＡＬＫ５（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００４６０３）、ＡＬＫ５変異体、ＢＭＰＲＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１１９５）、ＢＭＰＲＩＩ変異体、およびＧＤＦ−９の他のレセプターに対して作製できる。例えば、マウスＡＬＫ５に対する多クローン性および単クローン性（クローン１４１２２９）抗体は、Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から入手可能であり；マウスヒトＢＭＰＲＩＩに対する多クローン性および単クローン性（クローン７３８０５）抗体は、Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能である。
【００６８】
同様に、ＢＭＰ−１５レセプターと結合する抗体を作製できる。これらの抗体は、ＢＭＰ−１５のそのレセプターとの結合をブロックするならば、またはＢＭＰ−１５の結合後のレセプターの活性をブロックするならば、本発明において有効であろう。抗体は、全レセプタータンパク質に対して、または細胞外ドメインのみに対して作製できる。抗体は、ＡＬＫ６（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１１９４）、ＡＬＫ６変異体、ＢＭＰＲＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１１９５）、ＢＭＰＲＩＩ変異体、およびＢＭＰ−１５の他のレセプターに対して作製できる。例えば、マウスＡＬＫ６多クローン性抗体は、ＲおよびＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から入手可能であり、ヒト組換えＡＬＫ−６／Ｆｃキメラおよびマウス組換えＡＬＫ−６／Ｆｃキメラ抗体（ＲおよびＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、およびヒト／マウスＡＬＫ−６単クローン性抗体（クローン８８６１４；ＲおよびＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ））も同様である。
２．修飾された可溶性レセプター
【００６９】
ＧＤＦ−９の修飾された可溶性レセプターを本発明において用いることができる。Such modified 可溶性レセプターは、ＧＤＦ−９レセプターの細胞外ドメイン（外部ドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）とも称する）、例えば、ＡＬＫ５またはＢＭＰＲＩＩの全部または一部を含み得る。細胞外ドメイン、特異性フラグメントおよびレセプターの変異体の説明を包含するＡＬＫ５レセプターのアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００４６０３において説明されている。
【００７０】
一つの実施形態において、可溶性レセプターは、ＧＤＦ−９ならびにＢＭＰ−１５の両方のレセプターである、ＢＭＰＲＩＩの細胞外ドメインの全部または一部を含み得る。細胞外ドメイン、特異性フラグメントおよびレセプターの変異体の説明を包含するＢＭＰＲＩＩのアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１１９５において説明されている。ＧＤＦ−９を阻害する、ＢＭＰＲＩＩ外部ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６７：４７３−４８０（２００２）において説明されている。
【００７１】
もう一つ別の実施形態において、ＢＭＰ−１５の修飾された可溶性レセプターを本発明において用いることができる。Such modified s可溶性レセプターは、ＢＭＰ−１５レセプター、例えば、ＡＬＫ６またはＢＭＰＲＩＩの細胞外ドメインの全部または一部を含み得る。細胞外ドメイン、特異性フラグメントおよびレセプターの変異体の記載を包含するＡＬＫ６レセプターのアミノ酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１１９４において説明されている。ＡＬＫ６外部ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６７：４７３−４８０（２００２）において説明されている。
【００７２】
可溶性レセプターは、組換えにより、または無傷レセプターの化学的もしくは酵素的切断により、産生することができる。本発明の修飾可溶性レセプターは、血流中のＧＤＦ−９および／またはＢＭＰ−１５を結合させ、ＧＤＦ−９および／またはＢＭＰ−１５が体内でその天然のレセプターと結合する能力を低下させる。このようにして、これらの修飾可溶性レセプターはＧＤＦ−９および／またはＢＭＰ−１５の活性を阻害する。
Ａ）レセプター融合
【００７３】
本発明の修飾可溶性レセプターは、別のタンパク質または別のタンパク質の一部との融合により、さらに安定にすることができる。安定性が増大することは、低用量または低頻度で投与できるので、治療法として有利である。イムノグロブリンの少なくとも一部、例えば、抗体の定常領域、任意にイムノグロブリンのＦｃフラグメントとの融合は、本発明の修飾可溶性レセプターまたは他のタンパク質の安定性を増大させることができる（例えば、Gerburg Ｓｐｉｅｋｅｒｍａｎｎ ,  ｅｔ  ａｌ．、(2002) Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６： ３０３−３１０（２００２）参照）。
３．他のタンパク質
【００７４】
ＧＤＦ−９活性を阻害する他のタンパク質を本発明の方法において用いることができる。かかるタンパク質は、ＧＤＦ−９自体と相互作用することができ、その活性またはそのレセプターとの結合を阻害する。別法として、阻害物質は、ＧＤＦ−９レセプター（例えば、ＡＬＫ５またはＢＭＰＩＩＲ）と相互作用することができ、ＧＤＦ−９のそのレセプターとの結合をブロックするならば、またはＧＤＦ-−９の結合後にレセプターの活性をブロックするならば、組成物または方法において有効である。阻害物質は、もちろん、ＧＤＦ−９およびそのレセプターの両方と相互作用できる。ＢＭＰ−１５活性を阻害するタンパク質も、ＢＭＰ−１５自体および／またはそのレセプターとの相互作用により、本発明において用いることができる。
Ａ）ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５と結合するタンパク質
【００７５】
ＧＤＦ−９と結合し、そのレセプターとの結合を包含するその活性を阻害するタンパク質は、本発明の方法において使用できる。いくつかのタンパク質が公知であるが、さらなるタンパク質を、スクリーニング技術、ＡＬＫ５またはＢＭＰＩＩＲ結合分析、または前述のレポーター遺伝子を用いて単離できる。タンパク質のサンプル、ならびにタンパク質のライブラリーをスクリーンすることができる。ＢＭＰ−１５と結合し、その活性を阻害するタンパク質も本発明の方法において用いることができる。
（１）ＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５プロペプチド
【００７６】
ＧＤＦ−９プロペプチドは、ＧＤＦ−９の阻害物質として用いることができる。天然に存在するＧＤＦ−９プロペプチドのインビボ半減期を増加させるために、本発明のＧＤＦ−９プロペプチド阻害物質を修飾および／または安定化させて、薬物速度論的特性、例えば、循環半減期を改善することができる（Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｊ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、６：５９７−６４１（１９９０）；Ｊｉａｎｇ、ｅｔ  ａｌ．、ＢＢＲＣ  ３１５：５２５−５３１（２００４）；Ｇｒｅｇｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２７９７０−２７９８０（２００５））。
【００７７】
一つの実施形態において、ＢＭＰ−１５プロペプチドは、ＢＭＰ−１５の阻害物質として使用できる。天然に存在するＢＭＰ−１５プロペプチドのインビボ半減期を増大させるために、薬物速度論的特性、例えば、循環半減期を改善するように本発明のＢＭＰ−１５プロペプチド阻害物質を修飾および／または安定化することができる。
【００７８】
かかる修飾プロペプチドとしては、プロペプチドおよびＩｇＧ分子のＦｃ領域を含む融合タンパク質（安定化タンパク質として）が挙げられる。これらの阻害物質は、ＧＤＦ−９もしくはＢＭＰ−１５プロペプチドまたはプロペプチドの１以上の生物活性を保持する該プロペプチドのフラグメントもしくは変異体を含むことができる。本発明において用いられるプロペプチドは、天然に存在する（天然の）ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５プロペプチドから合成的に産生し、誘導することができるか、または遺伝子操作の分野において周知である様々な試薬、宿主細胞および方法のいずれかを用いて組換えにより産生することができる。一つの実施形態において、修飾プロペプチドはＩｇＧ分子またはそのフラグメントと共有結合したヒトプロペプチドを含む。プロペプチドは、ＩｇＧ分子のＦｃ領域と直接結合できるか、またはリンカーペプチドを介してＩｇＧ分子のＦｃ領域と結合させることができる（Ｊｉａｎｇ、ｅｔ  ａｌ．、ＢＢＲＣ  ３１５：５２５−５３１（２００４）；Ｇｒｅｇｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２７９７０−２７９８０（２００５））。他の安定化修飾法は、ＷＯ０２／０６８６５０（その全体として本発明の一部として参照される）に記載されている。
（２）優性阻害ＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５タンパク質
【００７９】
ＢＭＰ−１５突然変異タンパク質は、本発明の方法において阻害物質として用いることができる。天然に存在するＢＭＰ−１５変異体、Ｙ２３５Ｃ−ＢＭＰ−１５は、ＢＭＰ−１５のプロ領域において非保存性置換を有し、インビボおよびインビトロの両方において野生型ＢＭＰ−１５活性に対して優性阻害効果を有する（Ｄｉ  Ｐａｓｑｕａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７５：１０６−１１１（２００４））。本発明はまた、本発明の方法における、優性阻害タンパク質を包含するＧＤＦ−９変異タンパク質の使用も想定する。
（３）ホリスタチンおよびホリスタチンドメイン含有タンパク質
【００８０】
ホリスタチンはＢＭＰ−１５と結合し、ＢＭＰ−１５の阻害物質として使用できる（Ｏｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８９：９６１−９６６（２００１））。従って、本発明は、ＢＭＰ−１５のレベルまたは活性を調節するために、少なくとも１つのホリスタチンドメインを含むタンパク質を提供し、ＢＭＰ−１５のレベルまたは活性の調節に関連する障害を治療するために用いることができる。
【００８１】
ホリスタチンそれ自体およびホリスタチンドメイン含有タンパク質（米国特許公開番号２００３／０１６２７１４および２００３／０１８０３０６に記載）はどちらも、本発明の組成物および方法において用いることができる。
【００８２】
少なくとも１つのホリスタチンドメインを含有するタンパク質は、ＧＤＦ−９と結合し、阻害する。少なくとも１つのホリスタチンドメインを有するタンパク質の例としては、これに限定されないが、ホリスタチン、ホリスタチン様関連遺伝子（ＦＬＲＧ）、ＦＲＰ（ｆｌｉｋ、ｔｓｃ３６）、アグリン、オステオネクチン（ＳＰＡＲＣ、ＢＭ４０）、ヘビン（ＳＣ１、ｍａｓｔ９、ＱＲ１）、ＩＧＦＢＰ７（ｍａｃ２５）、およびＵ１９８７８が挙げられる。ＧＡＳＰ１およびＧＡＳＰ２は、少なくとも１つのホリスタチンドメインを含むタンパク質の他の例である。
【００８３】
前述のように、ホリスタチンドメインは、システインリッチな繰り返しにより特徴づけられる、アミノ酸ドメインをコード化するアミノ酸ドメインまたはヌクレオチドドメインとして定義される。ホリスタチンドメインは典型的には、６５〜９０アミノ酸スパンを含み、１０の保存システイン残基およびＫａｚａｌセリンプロテアーゼ阻害物質ドメインに類似した領域を含有する。一般に、システイン残基間のループ領域はホリスタチンドメインにおいて配列変化を示すが、若干の保存が明らかである。第４および第５のシステイン間のループは、通常、小さく、１または２アミノ酸しか含有しない。第７および第８のシステイン間のアミノ酸は、一般に、最も高度に保存され、（Ｇ，Ａ）−（Ｓ，Ｎ）−（Ｓ，Ｎ，Ｔ）−（Ｄ，Ｎ）−（Ｇ，Ｎ）のコンセンサス配列とそれに続く（Ｔ，Ｓ）−Ｙモチーフを含有する。第９および第１０システイン間の領域は、一般に、別のアミノ酸で隔てられた２つの疎水性残基（具体的には、Ｖ、Ｉ、またはＬ）を含有するモチーフを含有する。
【００８４】
ホリスタチンドメイン含有タンパク質は、 refers to proteins comprising 少なくとも１であるが、おそらくは１より多いホリスタチンドメインを含むであろう。この用語は、かかるタンパク質の任意の変異体（フラグメント；置換、付加、または欠失突然変異を有するタンパク質；および融合タンパク質を含む）であって、天然のタンパク質、特にＢＭＰ−１５結合活性に関するもの、例えば、アミノ酸配列に対して保存または非保存性変化を伴って修飾された配列に関する公知生物活性を維持するものを意味する。これらのタンパク質は、任意の供給源（天然または合成）由来であってよい。このタンパク質は、ヒトまたは、ウシ、ニワトリ、ネズミ、ラット、ブタ、ヒツジ、シチメンチョウ、オナガザル、および魚をはじめとする任意の動物源由来であってよい。
【００８５】
ＢＭＰ−１５と結合する、少なくとも１つのホリスタチンドメインを含むタンパク質は、様々な方法を用いて単離することができる。例えば、ＢＭＰ−１５を用いたアフィニティー精製を用いることができる。加えて、ｃＤＮＡライブラリーの低ストリンジェンシースクリーニングを使用することができるか、またはホリスタチンドメインに向けられるプローブを用いた縮重ＰＣＲ技術を用いることができる。より多くのゲノムデータが入手可能になっているので、多くの配列プロファイリングおよび分析プログラム、例えば、ＭｏｔｉｆＳｅａｒｃｈ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＰｒｏｆｉｌｅＳｅａｒｃｈ（ＧＣＧ）、およびＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）を用いた類似性検索および分析を用いて、公知ホリスタチンドメインと顕著な相同性を含有する新規タンパク質を見出すことができる。本発明の一つの実施形態において、成熟ＢＭＰ−１５またはそのフラグメントと特異的に結合する少なくとも１つのホリスタチンドメインを含むタンパク質は、モノマー形態、活性二量体形態、またはＢＭＰ−１５潜在的複合体に複合体形成しているかのいずれであっても、０．００１から１００ｎＭの間、または０．０１から１０ｎＭの間、または０．１から１ｎＭの間の親和性を有する。
Ｂ）ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５レセプターと結合するタンパク質
【００８６】
ＧＤＦ−９レセプター（例えば、ＡＬＫ５またはＢＭＰＩＩＲ）と結合し、ＧＤＦ−９のレセプターとの結合またはレセプター自体の活性を阻害するタンパク質は、本発明の範囲内での使用が可能である。同様に、ＢＭＰ−１５レセプター（例えば、ＡＬＫ６またはＢＭＰＲＩＩ）と結合し、レセプター活性自体としてＢＭＰ−１５のレセプターに対する結合を阻害するタンパク質は、本発明の範囲内での使用が可能である。かかるタンパク質は、前述のスクリーニング技術および分析またはレポーター遺伝子分析を用いて単離できる。一つの実施形態において、レセプター結合タンパク質は抗体である。タンパク質のサンプル、ならびにタンパク質のライブラリーをスクリーンできる。
Ｃ）結合タンパク質のいずれかとの融合
【００８７】
ＧＤＦ−９、ＢＭＰ−１５、ＧＤＦ−９レセプター、またはＢＭＰ−１５レセプターと結合するタンパク質のいずれかの融合タンパク質は、別のタンパク質または別のタンパク質の部分との融合により、さらに安定にすることができる。安定性が増大することは、低用量または低頻度での投与ができるので、治療法として有利である。イムノグロブリンの少なくとも一部、例えば、定常領域 of an antibody、任意にイムノグロブリンのＦｃフラグメントとの融合により、これらのタンパク質の安定性を増大させることができる。かかる融合タンパク質の調製は当該分野において周知であり、容易に行うことができる（例えば、Gerburg Ｓｐｉｅｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、(2002) Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９６： ３０３−３１０（２００２）参照）。
Ｄ）ＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５免疫化ペプチド
【００８８】
本明細書において用いられる「ワクチン」なる用語は、抗体反応または細胞応答のいずれかを含む、保護免疫応答を誘発する組成物または化合物を意味する。例えば、ＧＤＦ−９「ワクチン」は、ＧＤＦ−９機能に拮抗する免疫応答を誘発する。ＧＤＦ−９ワクチンは、米国特許第６，０３０，６１７号に記載されている。ワクチンとして用いられるＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５免疫原は、タンパク質の三次構造を実質的に保存しつつ、１つまたはいくつかの免疫優勢およびプロミスキャス（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）Ｔ細胞エピトープを導入することにより修飾された、相同性ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５タンパク質であり得る；例えば、ＷＯ０１／０５８２０（本発明の一部として参照される）を参照。ＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５ペプチドを短期および長期免疫化でヒツジに投与した（Ｊｕｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．７０：５５７−５６１（２００３）；Ｊｕｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６７：１７７７−１７８９（２００２）；ＭｃＮａｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｅｐｒｏｄ．１２８：３７９０３８６（２００４））。
４．ＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５阻害物質の模倣物質
【００８９】
ＧＤＦ−９阻害物質の模倣物質を本発明の方法において用いることができる。これらのＧＤＦ−９阻害物質の任意の合成類似体、特に改善されたインビボ特性、例えば、より長い半減期を有するもの、または消化系により簡単には分解されないものが有用である。
【００９０】
ＧＤＦ−９に対する抗体、ＧＤＦ−９に対する抗体レセプター、修飾可溶性レセプターおよびレセプター融合物の模倣物質、およびＧＤＦ−９、例えば、ＧＤＦ−９プロペプチド、変異ＧＤＦ−９プロペプチド、ホリスタチンおよびホリスタチンドメイン含有タンパク質と結合する他のタンパク質、およびそのＦｃ融合物を本発明においてすべて用いることができる。
【００９１】
これらの模倣物質は、ＧＤＦ−９の活性をブロックするならば、即ち、ＧＤＦ−９のそのレセプターとの結合をブロックするならば、本発明の方法において有効である。本発明において最も有効な模倣物質は、ＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９／ＧＤＦ−９レセプター複合体と特異的に結合する性質を有する。かかる模倣物質は、成熟ＧＤＦ−９を高親和力で結合することができ、モノマー形態、活性二量体形態、またはＧＤＦ−９潜在複合体の状態で複合体形成されるかどうかにかかわらず、成熟タンパク質と結合できる。本発明の方法において有用な模倣物質は、例えば、ＡＬＫ５またはＢＭＰＩＩＲ結合およびレポーター遺伝子分析の阻害により示されるように、インビボおよびインビトロでＧＤＦ−９活性を阻害することができる。さらに、開示された模倣物質は、骨格筋量および骨密度の負の調節に関連してＧＤＦ−９活性を阻害できる。
【００９２】
ＢＭＰ−１５阻害物質の模倣物質も本発明の方法において用いることができる。これらのＢＭＰ−１５阻害物質の任意の合成類似体、特に改善されたインビトロ特性を有するもの、例えば、より長い半減期を有するもの、または消化系により簡単には分解されないものが有用である。
【００９３】
ＢＭＰ−１５に対する抗体、ＢＭＰ−１５レセプターに対する抗体、修飾可溶性レセプターおよびレセプター融合物、およびＢＭＰ−１５プロペプチドなどのＢＭＰ−１５と結合する他のタンパク質、突然変異ＢＭＰ−１５プロペプチド、ホリスタチンおよびホリスタチンドメイン含有タンパク質、およびそのＦｃ融合物は全て本発明において用いることができる。
【００９４】
これらの模倣物質は、ＢＭＰ−１５の活性をブロックするならば、即ち、ＢＭＰ−１５のそのレセプターとの結合をブロックするならば、本発明において有効である。本発明において最も有効な模倣物質は、ＢＭＰ−１５またはＢＭＰ−１５／ＢＭＰ−１５レセプター複合体と特異的に結合する特性を有する。かかる模倣物質は、成熟ＢＭＰ−１５を高親和力で結合させることができ、モノマー形態、活性二量体形態、またはＢＭＰ−１５潜在複合体の状態で複合体形成されているかどうかにかかわらず、成熟タンパク質と結合できる。本発明の方法において有用な模倣物質は、例えば、ＡＬＫ６またはＢＭＰＩＩＲ結合およびレポーター遺伝子分析の阻害により示されるように、インビトロおよびインビボでＢＭＰ−１５活性を阻害することができる。さらに、好適な模倣物質は、骨格筋量および骨密度の負の調節に関連してＢＭＰ−１５活性を阻害できる。
５．非タンパク性阻害物質
【００９５】
例えば、小分子および核酸を含む非タンパク性阻害物質も、本発明の方法において使用できる。
Ａ）小分子
【００９６】
本発明の方法において有用なＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５阻害物質は、小分子を包含する。小分子は、合成および精製された天然に存在するＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５阻害物質を包含する。小分子は、模倣物質または分泌促進物質であり得る。
【００９７】
ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５などの興味のあるタンパク質を特異的に標的とする小分子を同定する方法は当該分野において周知である。小分子および／またはペプチドライブラリーを、これに限定されないが、ＣＯＳ−７、ＣＶ−１、Ａ２０４、または顆粒膜細胞におけるＣＡＧＡ−ルシフェラーゼ、ＭＳＸＩＩ−ルシフェラーゼ、またはＢＲＥ−ルシフェラーゼの発現を包含する、前述のＧＤＦ−９機能分析のいずれかを用いて、ＧＤＦ−９の阻害についてスクリーンすることができる。小分子および／またはペプチドライブラリーは、ＧＤＦ−９の、例えば、可溶性レセプターを包含するそのレセプターとの競合性放射性リガンド結合分析においてスクリーンすることもできる。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベースの分析、例えば、増幅発光近接均一分析（「ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ」（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）とも呼ばれる）も、好適な小分子阻害物質を同定するために使用できる。この実施形態において、ＧＤＦ−９ペプチドまたはＢＭＰ−１５ペプチドをビーズの第一「ドナー」集団と結合させ、ビーズの第二「アクセプター」集団と結合した集団内の相互作用分子を同定するために使用できる。ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５と相互作用するペプチドも、スクリーニング分析に使用できる。かかる分析において用いられる１つのＧＤＦ−９ペプチドは：ＳＱＬＫＷＤＮＷＩＶＡＰＨＲＹＮＰＲＹＣＫＧＤＣ（配列番号５）である。他のＦＲＥＴベースの分析の他の例は、リガンド二量化の阻害物質についてスクリーンするため、または規定のＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５ペプチドと相互作用する小分子を同定するための時間分解ＦＲＥＴ（例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）ののＬＡＮＣＥシステム）を包含する。別の実施形態において、小分子またはペプチドのＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５との相互作用を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてリアルタイムで分析できる。本発明はまた、例えば、前項で詳細に記載された分析を用いて骨細胞分化および機能、ならびに骨密度に対するかかる分子の効果をさらに同定するために、さらなるスクリーニング分析、例えば、二次および三次分析の使用を想定する。
Ｂ）核酸
【００９８】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」なる用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および、適切な場合には、リボ核酸（ＲＮＡ）、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）を意味する。この用語は、ヌクレオチド類似体、および一本または二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）も包含すると理解されるべきである。ポリヌクレオチドの例としては、これに限定されないが、プラスミドＤＮＡまたはそのフラグメント、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ、ＲＮＡｉなどが挙げられる。「プラスミドＤＮＡ」なる用語は、環状である二本鎖ＤＮＡを意味する。「ｓｉＲＮＡ」および「ＲＮＡｉ」なる用語は、ｍＲＮＡの分解を誘発し、これにより遺伝子発現を抑制する能力を有する二本鎖ＲＮＡである核酸を意味する。
【００９９】
ＧＤＦ−９の活性をブロックできる核酸は、本発明の方法において有用である。かかる阻害物質はＧＤＦ−９自体と相互作用するタンパク質をコード化できる。あるいは、かかる阻害物質は、ＧＤＦ−９レセプター（例えば、ＡＬＫ５またはＢＭＰＩＩＲ）と相互作用できるタンパク質をコード化でき、コード化されたタンパク質がＧＤＦ−９のそのレセプターに対する結合をブロックするか、またはＧＤＦ−９の結合後にレセプターの活性をブロックするならば、本発明において有効である。阻害物質は、もちろん、ＧＤＦ−９およびそのレセプターの両方と相互作用するタンパク質をコード化できる。かかる核酸は、本発明のＧＤＦ−９阻害物質を発現するために使用できる。
【０１００】
同様に、ＢＭＰ−１５の活性をブロックできる核酸は、本発明の方法において有用である。かかる阻害物質は、ＢＭＰ−１５自体と相互作用するタンパク質をコード化することができる。あるいは、かかる阻害物質はＢＭＰ−１５レセプター（例えば、ＡＬＫ５またはＢＭＰＩＩＲ）と相互作用できるタンパク質をコード化することができ、コード化されたタンパク質がＢＭＰ−１５のそのレセプターに対する結合をブロックするならば、またはＢＭＰ−１５の結合後にレセプターの活性をブロックするならば、本発明において有効である。阻害物質は、もちろん、ＢＭＰ−１５およびそのレセプターの両方と相互作用するタンパク質をコード化できる。かかる核酸は、本発明のＢＭＰ−１５阻害物質を発現するために使用できる。
【０１０１】
本発明の方法は、ＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９のレセプター、例えば、ＡＬＫ５またはＢＭＰＩＩＲの発現を減少させるためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用を包含する。ＲＮＡｉは、標的遺伝子の発現を阻害または抑制するために、核酸分子、例えば、合成低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはＲＮＡ干渉剤を導入することにより開始できる。例えば、米国特許公開番号２００３／０１５３５１９および２００３／０１６７４９０１、および米国特許第６，５０６，５５９号、および第６，５７３，０９９号参照。
【０１０２】
本明細書において用いられる「ＲＮＡ干渉剤」は、標的遺伝子またはゲノム配列の発現をＲＮＡ干渉により妨害または阻害する任意の化学物質である。かかるＲＮＡ干渉剤としては、これに限定されないが、標的遺伝子またはゲノム配列と相同性であるＲＮＡ分子、またはそのフラグメント、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンまたは小ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）、およびＲＮＡ干渉により標的遺伝子の発現を妨害または阻害する小分子をはじめとする核酸分子が挙げられる。
【０１０３】
本明細書において用いられる場合、「標的遺伝子発現の阻害」は、発現またはタンパク質活性または標的遺伝子によりコード化される標的遺伝子もしくはタンパク質のレベルの減少を包含する。この減少は、標的遺伝子の発現またはＲＮＡ干渉剤により標的とされない標的遺伝子によりコード化されるタンパク質の活性もしくはレベルと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％またはそれ以上である。
【０１０４】
ｓｉＲＮＡは、化学的に合成できるか、インビトロ転写により産生できるか、または宿主細胞内で産生できる。典型的には、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１５−５０ヌクレオチドの長さ、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドの長さである。一つの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、約１５から約４０ヌクレオチドの長さ、例えば、約１５から約２８ヌクレオチドの長さ（約１９、２０、２１、または２２ヌクレオチドの長さを含む）の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、約０、１、２、３、４、５、または６ヌクレオチドの長さを有する各鎖上に、３’および／または５’オーバーハンドを含有し得る。一つの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、転写サイレンシングにより標的遺伝子を阻害することができる。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡの分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）により、ＲＮＡ干渉を促進できる。
【０１０５】
本発明の方法において有用なｓｉＲＮＡは、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）も包含する。ｓｈＲＮＡは、低分子（例えば、約１９から約２５ヌクレオチド）アンチセンス鎖と、それに続く約５から約９ヌクレオチドのヌクレオチドループ、および類似センス鎖からなる。別法として、センス鎖はヌクレオチドループ構造に先行してもよく、アンチセンス鎖がその後に続いてもよい。これらのｓｈＲＮＡは、プラスミドおよびウイルスベクター中に含まれていてもよい。
【０１０６】
本発明のｓｉＲＮＡ分子の標的領域は、所定の標的配列から選択できる。例えば、ヌクレオチド配列は、開始コドンの下流約２５〜１００ヌクレオチドから開始できる。ヌクレオチド配列は、５’または３’未翻訳領域、ならびに開始コドン付近の領域を含有することができる。ＲＮＡｉ試薬として配列を選択するための様々な規則を含む、ｓｉＮＲＡ分子の設計および調製法は、当該分野において周知である（例えば、Ｂｏｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３９２：７３−９６（２００５）参照）。
【０１０７】
ｓｉＲＮＡは、Ｈａｎｎｏｎ、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ、４１８：２４４−２５１（２００２）；ＭｃＭａｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．、（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖｉｅｗｓ、３：７３７−７４７（２００２）；Ｈｅａｓｍａｎ、（２００２）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２４３：２０９−２１４（２００２）；Ｓｔｅｉｎ、（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０８：６４１−６４４（２００１）；およびＺａｍｏｒｅ、（２００１）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、８（９）：７４６−７５０（２００１）に記載されている標準的技術を用いて産生できる。好ましいｓｉＲＮＡは、５−プライムリン酸化されている。
【０１０８】
ｓｉＲＮＡ阻害物質は、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−９レセプター（ＡＬＫ５およびＢＭＰＲＩＩを含む）、ＢＭＰ−１５、またはＢＭＰ−１５レセプター（ＡＬＫ６およびＢＭＰＲＩＩを含む）を標的とするために使用できる。ＧＤＦ−８作用の用量に依存した抑制に関連するＡＬＫ５についてのｓｉＲＮＡの配列は、Ｍａｚｅｒｂｏｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１８：６５３−６６５（２００４））に記載されている。
【０１０９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−９レセプター、ＢＭＰ−１５、またはＢＭＰ−１５レセプターの発現を減少させるためにも使用できる。「アンチセンス」は、本明細書において用いられる場合、配列相補性によりｍＲＮＡのコーディングおよび／または非コーディング領域の一部とハイブリダイズでき、これによりｍＲＮＡからの翻訳を妨害する核酸を意味する。アンチセンス核酸は、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、およびＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１ｓｔ  ｅｄ．、ｅＥｄ．Ｃｒｏｏｋｅ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ（２００１）に記載されている標準的技術を用いて産生することができる。ＢＭＰＲＩＩアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、Ｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６７：４７３−４８０（２００２）に記載されている。
【０１１０】
核酸は、症状の重症度および疾患の進行に応じて、約１μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与できる。適切な有効用量は、治療する医師により、次の範囲から選択される：約１μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇから約１００μｇ／ｋｇ、約１００μｇから約１ｍｇ／ｋｇ、および約５００μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ。核酸阻害物質は、局所、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下または経皮手段により投与することができる。
【０１１１】
核酸は、その自然環境から、実質的に純粋または均一な形態で、獲得、単離、および／または精製することができる。様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のシステムは周知である。好適な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、並びに酵母およびバクロウイルス系が挙げられる。ヘテロローガスなポリペプチドの発現のために当該分野において利用可能な哺乳動物細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、新生児ハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウスメラノーマ細胞および多くの他のものを包含する。一般的な細菌宿主は、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。核酸からタンパク質を産生するために好適な他の細胞については、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｅＥｄｓ．ＦｅＲＮＡｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）参照。
【０１１２】
必要に応じて、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、選択またはマーカー遺伝子および他の配列を包含する適切な調節配列を含有する好適なベクターを選択または構築できる。ベクターは、必要に応じてプラスミドまたはウイルス、例えば、ファージ、またはファージミドであってよい。さらに詳細には、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、２ｎｄ  ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８９）参照。例えば、核酸構築物の調製、突然変異生成、配列決定、ＤＮＡの細胞中への導入および遺伝子分析、ならびにタンパク質の分析における核酸の操作についての多くの公知の技術およびプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｅＥｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、２ｎｄ  ｅｄ．、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９２）において詳細に記載されている。
【０１１３】
核酸を、追加のポリペプチド配列をコード化する他の配列、例えば、マーカーまたはレポーターとして機能する配列と融合させることができる。マーカーまたはレポーター遺伝子の例としては、−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性に関与する）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（−ガラクトシダーゼをコード化）、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）、ルシフェラーゼ、および当該分野において公知の他のものが挙げられる。
ＩＩ．医薬組成物および投与方法
【０１１４】
医薬組成物の投与方法は当該分野において公知である。「投与」は、これに限定されないが、任意の特定の送達システムであり、制限なく、非経口（皮下、静脈内、髄内、関節内、筋肉内、腔内、または腹腔内注射を包含する）、直腸、局所、経皮、または経口（例えば、カプセル、懸濁液、または錠剤で）を包含する。個体への投与は、単回投与または連続もしくは断続的繰り返し投与、および様々な生理学的に許容される塩形態、および／または医薬組成物（前述）の一部として許容される医薬担体および／または添加剤を用いて行われる。
【０１１５】
ＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５のモジュレータは、医薬組成物として処方することができる。生理的に許容される塩形態および標準的医薬処方技術および賦形剤は当業者に周知である（例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ）２００３、５７ｔｈ  ｅｄ．、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、２００２；ａｎｄ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、ｅｄｓ．Ｇｅｎｎａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．、２０ｔｈ  ｅｄ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２０００参照）。
【０１１６】
本発明の方法において有用なモジュレータは、症状の重症度および疾患の進行に応じて、１μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与できる。適切な有効投与量は、治療を行う医師により次の範囲から選択される：例えば、約１μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇから約１００μｇ／ｋｇ、約１００μｇから約１ｍｇ／ｋｇ、および約５００μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、本発明の方法において使用される組成物は、医薬的に許容される賦形剤をさらに含む。本明細書において用いられる場合、「医薬的に許容される賦形剤」なる表現は、医薬投与に適合性のあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを意味する。医薬的に活性な物質についてのかかる媒体および薬剤の使用は、当該分野において周知である。組成物は、補助的、付加的、または向上した治療機能を提供する他の活性化合物も含有してよい。医薬組成物は、容器、パック、またはディスペンサー中に投与の説明書とともに入れることもできる。
【０１１８】
医薬組成物は、その意図される投与経路に適合性であるように処方される。かかる組成物の例は、そのまま、または生分解性ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ＰＬＧＡ）との組み合わせにおいて提供される結晶性タンパク質処方を包含する。
【０１１９】
本発明のモジュレータは、担体ゲル、マトリックス、賦形剤、またはガイド骨再生および／または骨置換に使用される他の組成物と組み合わせた医薬組成物として投与することができる。かかるマトリックスの例としては、合成ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−、ヒドロキシアパタイト、コラーゲンおよびフィブリン系マトリックス、ｔｉｓｓｅｅｌフィブリン接着剤などが挙げられる。賦形剤は、医薬的に許容される塩、多糖類、ペプチド、タンパク質、アミノ酸、合成ポリマー、天然ポリマー、および界面活性剤を含むことができる。
【０１２０】
本発明のある実施形態において、ＧＤＦ−９モジュレータおよびＢＭＰ−１５モジュレータは、注入可能または移植可能な組成物として送達のために処方される。組成物は、体内に固体状態で注入または移植するために適した円柱ロッドの形態をとることができる。一つの実施形態において、注入可能な処方は、米国特許公開番号２００５０２８７１３５（本発明の一部として参照される）に詳細に記載されるように、阻害物質およびヒアルロン酸エステルを含む。例えば、Ｈｙａｆｆ１１ｐ６５は、ヒアルロン酸として使用できる。別の実施形態において、注入可能な処方は、モジュレータおよびリン酸カルシウム材料、例えば、米国特許公開番号２００５００８９５７９（本発明の一部として参照される）において詳細に記載されるような、アモルファスアパタイトリン酸カルシウム、低結晶性アパタイトリン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、フルオロアパタイトおよびその組み合わせを包含する。
【０１２１】
ある実施形態において、ＧＤＦ−９阻害物質および／またはＢＭＰ−１５阻害物質は、他の治療化合物、例えば、ビスホスホネート（窒素含有および非窒素含有）、アポミン、テストステロン、エストロゲン、フッ化ナトリウム、ストロンチウムラネレート、ビタミンＤおよびその類似体、カルシトニン、カルシウムサプリメント、選択的エストロゲンレセプターモジュレータ（ＳＥＲＭ、例えば、ラロキシフェン）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−２）、スタチン、ＲＡＮＫＬ阻害物質、性ステロイドの核内転写制御を介さないエストロゲン様シグナル伝達のアクチベーター（ＡＮＧＥＬＳ）、および副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）と組み合わせて、または同時に投与することができる。（アポミンは新規１，１，−ビスホスホン酸エステルであり、ファーネイオン（ｆａｒｎｅｉｏｎ）Ｘ活性化レセプターを活性化し、ＨＭＧ  ＣｏＡ（３−ヒドロキシ−３−メチルグリタリル−補酵素Ａ）還元酵素の分解を促進する（例えば、米国特許公開番号２００３／００３６５３７およびその引用文献参照）。一つの好ましい実施形態において、ＧＤＦ−９の阻害物質またはＢＭＰ−１５は、ビスホスホネート、例えばこれに限定されないが、アレンドロン酸塩、シマドロネート、クロドロネート、ＥＢ−１０５３、エチドロネート、イバンドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、パミドロネート、リセドロネート、チルドロネート、ＹＨ５２９、ゾレンドロネート、およびその医薬的に許容される塩、エステル、酸、および混合物と同時投与される。別の好ましい実施形態において、ＧＤＦ−９および／またはＢＭＰ−１５の阻害物質は、これに限定されないが、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、およびＭＰ５２を包含する１以上の骨形成タンパク質と同時投与することができる。一つの実施形態において、ＧＤＦ−９の阻害物質は、ＢＭＰ−３の阻害物質と同時投与することができる。
【０１２２】
治療薬を本発明の方法に従って個体に投与することも、遺伝子療法により行うことができ、モジュレータをコード化する核酸配列を患者にインビボで投与するか、またはインビトロで細胞に投与し、これを次に患者に投与する。具体的な遺伝子療法プロトコルに関しては、Ｍｏｒｇａｎ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２ｎｄ  ｅｄ．、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）参照。
ＩＩＩ．スクリーニング法および診断法
【０１２３】
本発明は、遺伝的に骨密度が変更されやすいか、または現在骨密度が変更されている対象を同定するために使用できる。一つの実施形態において、変更された骨密度をスクリーンおよび／または診断するために、対象からの試験サンプルおよび対照サンプル中のＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５の相対的レベルを比較する。試験サンプル中のＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のレベルが変更されていることは、対象における骨密度の変化および／または骨密度が変化する傾向を示す。別の実施形態において、本発明は、野生型核酸配列を有する対象と比較して、核酸含有サンプルにおけるＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５変異体核酸配列の存在を検出する方法を提供する。
【０１２４】
一つの実施形態において、対象におけるＧＤＦ−９および／またはＢＭＰ−１５のレベルは、対照サンプルに対して上昇し、対象は骨密度が減少するか、骨密度が減少する危険性が増加する。別の実施形態において、対象におけるＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のレベルは対照サンプルに対して減少し、対象は骨密度が増加するか、または骨密度が増加する可能性が増加する。
【０１２５】
抗ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５特異性抗体または抗ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５変異体特異性抗体を用いて、サンプル中の各タンパク質のレベルを決定することができる。本発明は、スクリーンまたは診断される対象において、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５またはその変異体を検出する方法であって、抗ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５抗体を細胞またはタンパク質と接触させ、抗体との結合を検出することを含む方法を提供する。抗体は、その抗原との結合の検出を可能にする化合物または検出可能な標識で直接標識することができる。異なる標識および標識法は、当業者に周知である。本発明において使用できる標識の種類の例としては、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物、リン光化合物、および生物発光化合物が挙げられる。ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のレベルは、体液および組織から単離されたサンプル中で検出できる。検出可能な量の抗原を含有する任意のサンプルを使用できる。本発明の好ましいサンプルは、骨組織である。疑似細胞中のＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のレベルを、対象の骨密度が変更され易いかどうかを決定するために、正常な細胞中のレベルと比較することができる。
【０１２６】
本発明の抗体は、例えば、液相を包含するイムノアッセイにおける使用に適しているか、固相担体に結合される。抗体を使用するイムノアッセイは、直接または間接形式のいずれかの競合的および非競合的イムノアッセイ、例えば、放射免疫測定（ＲＩＡ）およびサンドイッチ（免疫測定）分析を包含する。抗体は、生理学的サンプルに対する免疫組織化学分析を用いて、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５を検出するためにも使用できる。
【０１２７】
もう一つ別の実施形態において、本発明は、野生型核酸配列を有する対照サンプルと比較して、対象から単離された核酸含有試験サンプル中の、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５変異体核酸配列の存在を検出するための方法を提供する。
【０１２８】
「変異体」とは、本明細書において用いられる場合、野生型ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５核酸配列に対応しないＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５核酸配列、ならびに対応するアミノ酸配列を意味する。本発明の方法は、野生型ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５配列の対応するセグメントと配列同一性を共有しないＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５のセグメントの変異体を包含する。
【０１２９】
本発明の方法および分析において有用な変異体は、突然変異、制限フラグメント長さの多型、一塩基変異多型（ＳＮＰ）、核酸欠失、または自然に存在するか、もしくは意図的に操作された核酸置換により生じる変化を包含する。「欠失」は、１以上のヌクレオチド残基が存在しないヌクレオチド配列における変化である。「置換」は、１以上のヌクレオチド残基の同じでないヌクレオチド残基での置換の結果得られる。
【０１３０】
変異体は、置換、欠失、またはタンパク質骨格中への挿入を含有するペプチド、または完全長タンパク質であって、対応する部分全体にわたって、元のタンパク質と７０％相同性を有するものである。保存的置換の例は、同じかまたは類似した性質を有するアミノ酸を含む。アミノ酸保存的置換の例は：アラニンからセリン；アルギニンからリシン；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン；アスパラギン酸塩からグルタミン酸塩；システインからセリン；グルタミンからアスパラギン；グルタミン酸塩からアスパラギン酸塩；グリシンからプロリン；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン；イソロイシンからロイシンまたはバリン；ロイシンからバリンまたはイソロイシン；リシンからアルギニン、グルタミン、またはグルタミン酸塩；メチオニンからロイシンまたはイソロイシン；フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニン；セリンからトレオニン；トレオニンからセリン；トリプトファンからチロシン；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン；バリンからイソロイシンからロイシンを包含する。
【０１３１】
本明細書において用いられる「単離された」なる用語は、他の核酸、タンパク質、脂質、炭水化物または自然に関連する他の物質が実質的にないポリヌクレオチドを包含する。本発明のポリヌクレオチド配列は、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５変異体をコード化するＤＮＡおよびＲＮＡ配列を包含する。ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５変異体の全部または一部をコード化する全てのポリヌクレオチド、例えば、天然、合成、および意図的に操作されるポリヌクレオチドも本発明に含まれると理解される。本発明の方法および分析において有用なポリヌクレオチドは、遺伝子コードの結果として退縮である配列を包含する。相補的配列はアンチセンスヌクレオチドを包含する。フラグメントが変異体核酸のＤＮＡと特異的にハイブリダイズするために十分な、少なくとも１０〜１５塩基の長さである前記核酸配列のフラグメント（一部）も含まれる。
【０１３２】
本発明の方法および分析において有用な核酸配列は、当該分野において公知の方法により得ることができる。例えば、ＤＮＡは：１）相同ヌクレオチド配列を検出するための、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーのプローブでのハイブリダイゼーション、２）興味のあるＤＮＡ配列とアニールできるプライマーを用いた、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡに関するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および３）構造特性を共有するクローンされたＤＮＡフラグメントを検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニングにより単離できる。
【０１３３】
ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５をコード化する特異的ＤＮＡ配列、またはその変異体の作製は：１）ゲノムＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡ配列の単離；２）興味のあるポリペプチドの必要なコドンを提供するためのＤＮＡ配列の化学的製造；および３）真核ドナー細胞から単離されたｍＲＮＡの逆転写による二本鎖ＤＮＡ配列のインビトロ合成によっても得ることができる。後者の場合、ｍＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ配列補体が形成され、ｃＤＮＡと呼ばれる。
【０１３４】
好ましい実施形態において、本発明は、正常な骨密度および野生型ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５核酸配列を有する対象と比較して、骨密度が変化した対象から単離されたサンプル中の標的ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５変異体核酸配列の存在を検出することにより、変化した骨密度と関連する核酸変異体を同定するための方法を提供する。
【０１３５】
本発明は、対象において突然変異体を同定する方法を包含する。対象は、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５変異体に関して、ホモ接合であっても、またはヘテロ接合であってもよい。本明細書において用いられる場合、「対立遺伝子」は、遺伝子またはヌクレオチド配列、例えば、ゲノムにおいて１より多い形態（異なる配列）で存在する一塩基変異多型（ＳＮＰ）である。「ホモ接合」は、本発明によると、２つの遺伝子またはＳＮＰが、他の対立遺伝子に対して配列において同一であることを示す。例えば、野生型ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５遺伝子に関してホモ接合の対象は、少なくとも２つのＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５野生型配列を含有する。かかる対象は、骨密度が変更されやすくない。
【０１３６】
「ヘテロ接合」とは、本明細書において用いられる場合、ゲノム中に２つの異なる対立遺伝子、例えば、１つの野生型対立遺伝子と１つの変異型対立遺伝子が存在することを示す。かかるゲノムを有する対象はヘテロ接合である。「ヘテロ接合」は、そのＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５対立遺伝子において２つの異なる突然変異を有する対象も包含する。
【０１３７】
本発明の一つの実施形態は、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５遺伝子について対象の対立遺伝子特性を発現させる方法を提供する。「対立遺伝子特性」は、本明細書において用いられる場合、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５対立遺伝子またはその変異体の存在または非存在、およびコピー数に関する対象のゲノムの組成の判定である。
【０１３８】
好ましい実施形態において、本発明は、対象の骨密が変化する傾向を決定する方法を提供する。この方法は、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５配列を含む対象から核酸サンプルを単離し、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５核酸配列における突然変異の存在または非存在を決定することにより、対象のＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５対立遺伝子特性を決定することを含む。本発明はまた、対象から核酸サンプルを単離し；標的配列をハイブリダイズするプライマーで核酸を増幅することを含む、対象のＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５対立遺伝子特性を決定する診断または予測法も提供する。
【０１３９】
対立遺伝子多型を検出する任意の方法を用いることができる。例えば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を、かかる変異体を同定するためのプローブとして使用できる。ＡＳＯプローブは、興味のある配列を検出するために適した任意の長さであってよい。好ましくは、かかるプローブは１０〜５０ヌクレオチドの長さであり、アイソトープ法または非アイソトープ法により検出可能に標識される。標的配列は、サザンブロッティングによる免疫化の前に、任意に増幅し、ゲル電気泳動により分離することができる。別法として、未増幅核酸を含有する抽出物をニトロセルロースに転写し、ドットブロットとして直接プローブすることができる。
【０１４０】
加えて、対立遺伝子特異的な変化は、同時に起こる制限部位変化により同定できる。突然変異は、時として、制限酵素開裂部位を変更するか、あるいはそれまでに存在していなかった制限部位を導入する。制限酵素認識部位の変化および付加は、特定の変異体を同定するために使用できる。
【０１４１】
本発明の方法において使用されるプライマーは、このプライマーを利用する反応のストリンジェンシーの条件下で、標的核酸を含有するかなりの数の核酸分子の重合を特異的に開始する十分な長さおよび適切な配列のオリゴヌクレオチドを包含する。このようにして、興味のある核酸を含有する特異的標的核酸配列を選択的に増幅することが可能である。具体的には、本明細書において用いられる「プライマー」なる用語は、２以上、好ましくは少なくとも８のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む配列であって、標的核酸鎖に対して実質的に相補性であるプライマー伸長生成物の合成を開始できる配列を意味する。オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、１５〜２２またはそれ以上のヌクレオチドを含有するが、プライマーが、本質的に特に望ましい標的ヌクレオチド配列の増幅のみを可能にするために十分な特異性を有するものである（即ち、プライマーは実質的に相補性である）かぎり、さらに少ないヌクレオチドを含有し得る。
【０１４２】
本発明の方法に従って用いられるプライマーは、増幅される突然変異ヌクレオチド配列の各鎖と「実質的に」相補性であるように設計される。実質的に相補性とは、重合剤が機能するような条件下で、プライマーが、その各鎖とハイブリダイズするために十分相補性でなければならないことを意味する。言い換えると、プライマーは、突然変異ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、突然変異ヌクレオチド配列の増幅を許容するために十分なフランキング配列との相補性を有しなければならない。好ましくは、伸長されたプライマーの３’末端は、相補性フランキング鎖と完全塩基対相補性を有する。
【０１４３】
オリゴヌクレオチドプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応をはじめとする、増加した量の標的核酸を産生する任意の増幅プロセスにおいて用いることができる。典型的には、１つのプライマーは突然変異ヌクレオチド配列のマイナス（−）鎖に対して相補性であり、他のものはプラス（＋）鎖に対して相補性である。プライマーを変性核酸とアニールし、続いて酵素、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ）またはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチドまたはリガーゼにより伸長すると、標的核酸を含有する新たに合成された＋および−鎖が得られる。これらの新たに合成された核酸は鋳型でもあり、変性、プライマーアニーリング、および伸長のサイクルを繰り返すと、このプライマーにより定義される領域（即ち、標的突然変異ヌクレオチド配列）が指数的に産生される。増幅反応の生成物は、用いられた特定のプライマーの末端に対応する末端を有する独立した核酸二本鎖である。当業者らは、標的核酸のコピー数を増加させるために用いることもできる他の増幅法を知っているであろう。
【０１４４】
任意の組織サンプルから得られる核酸（精製形態または未精製形態）は、標的核酸を含有する特定の核酸配列を含有するか、または含有すると考えられるならば、出発核酸として用いることができる。このようにして、プロセスは、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む）を用いることができ、ここで、ＤＮＡまたはＲＮＡは一本鎖または二本鎖であり得る。ＲＮＡが、鋳型、酵素、および／または逆転写するために最適な条件として用いられる場合、ＤＮＡに対する鋳型を用いることができる。加えて、それぞれの１つの鎖を含有するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを用いることができる。核酸の混合物も用いることができるか、または同じかもしくは異なるプライマーを用いた本明細書において前述の増幅反応において産生された核酸をこのように使用できる。増幅される突然変異ヌクレオチド配列は、より大きな分子のフラクションであるか、または最初は別個の分子として存在できるので、特異的配列が核酸全体を構成する。増幅される配列が最初は純粋な形態で存在する必要はなく、例えば、全ヒトまたは動物ＤＮＡ中に含まれるような、複合混合物の微量フラクションであってよい。
【０１４５】
増幅された生成物を、放射性プローブを用いることなく、サザンブロット分析により検出することができる。このようなプロセスにおいて、非常に低レベルの突然変異ヌクレオチド配列を含有するＤＮＡの小サンプルを増幅し、サザンブロッティング技術により分析する。非放射性プローブまたは標識の使用は、高レベルの増幅シグナルにより促進される。
【０１４６】
標的核酸が増幅されない場合、適切なハイブリダイゼーションプローブを用いた検出は、分離された核酸に関して行うことができる。標的核酸が増幅される場合、適切なハイブリダイゼーションプローブでの検出は、増幅後に行われる。
【０１４７】
本発明のプローブは、検出された特異性フラグメントの分布、ならびに特異的な強力に結合（ハイブリダイズ）する配列の発生率を決定するためのプローブの結合の定量的（相対的）程度を調べるために使用できる。
【０１４８】
本発明のプローブは、最も一般的には放射性核種を用いて、原子または無機ラジカルで検出可能に標識することができるが、重金属も使用できる。適切なシグナルを提供し、十分な半減期を有する任意の放射性標識を用いることができる。他の標識は、標識されたリガンドの特異的結合対メンバーとして機能できるリガンドなどを含む。イムノアッセイにおいて一般的に用いられる多種多様の標識を使用できる。蛍光化合物は、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどを包含する。化学発光物としては、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオン（例えば、ルミノール）が挙げられる。
【０１４９】
本発明の方法により検出されるＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５変異体を有する核酸を、溶液中、または固体支持体に結合させた後のいずれかで、特異的ＤＮＡ配列の検出に通常適用される任意の方法、例えば、ＰＣＲ、オリゴマー制限（Ｓａｉｋｉ、ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：１００８−１０１２、１９８５）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ分析（Ｃｏｎｎｅｒ、ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：２７８、１９８３）、オリゴヌクレオチド結紮分析（ＯＬＡｓ）（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ、ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：１０７７、１９８８）などにより、さらに評価、検出、クローン、配列化などすることができる。
【０１５０】
本発明はさらに、ＧＤＦ−９および／またはＢＭＰ−１５におけるレベルの変化または差異を検出するためのキットも提供する。かかるキットは、検出可能に標識されているか、または標識することができるプローブである。かかるプローブは、それぞれ、標的タンパク質について特異的な抗体もしくはヌクレオチド、またはそのフラグメント、または標的核酸、またはそのフラグメントであり、ここで、標的は、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５、またはその変異体の存在を示すか、または存在と相関する。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドプローブをキット中に含め、ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５変異体の存在、ならびに特異的な強力に結合（ハイブリダイズ）する配列の発生率を決定するためのプローブの結合の定量的（相対的）程度を調べるために使用でき、このように骨密度が変化する、または変化する傾向のある対象の可能性を示す。
【０１５１】
一つの実施形態において、キットは、標的核酸を検出するために核酸ハイブリダイゼーションを利用し、このキットは、標的核酸配列の増幅のためのヌクレオチドを含有する容器も有し得る。標的核酸配列、例えば、変異核酸配列を増幅することが望ましい場合、これは増幅用プライマーであるオリゴヌクレオチドを使用して行うことができる。
【０１５２】
一つの実施形態において、キットは、標的タンパク質、またはそのフラグメント、またはかかるタンパク質の変異体、またはそのフラグメントと結合する抗体を含有する容器を提供する。このように、キットは、野生型ＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５またはその変異体と結合する抗体を含有し得る。かかる抗体を用いて、特定のＧＤＦ−９またはＢＭＰ−１５変異体の存在またはサンプル中のかかる変異体の発現レベルを識別できる。
【０１５３】
次の実施例は、本発明の実施形態例を提供する。当業者は、本発明の精神または範囲を変更することなく、多くの修正および変更を行うことができることを認識するであろう。かかる修正および変更は本発明の範囲内に含まれる。実施例は本発明をなんら制限しない。
【実施例】
【０１５４】
（実施例１：ＧＤＦ−９ノックアウトマウスにおける骨ミネラル濃度）
ＧＤＦ−９ゼロ突然変異の骨ミネラル濃度に対する影響を、メスマウスにおいて分析した。ＧＤＦ−９ノックアウトマウスはすでに記載されている（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３８３：５３１−５３５（１９９６））。合計、骨梁、および皮質容量骨ミネラル濃度（ｖＢＭＤ）を次のようにして、１６週齢（表１）および１０月齢（表２）メスマウスにおいて測定した。左大腿骨の容量骨ミネラル濃度（ｖＢＭＤ、ｍｇ／ｃｍ３）を、ＸＣＴ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ周辺定量的コンピューター断層撮影密度計（ｐＱＣＴ；Ｓｔｒａｔｅｃ  Ｍｅｄｉｚｉｎｅｔｅｃｈｎｉｋ、Ｐｆｏｒｚｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて評価した。大腿骨の遠位端から２．５ｍｍ近位で得られた厚さ０．５ｍｍのｐＱＣＴ断片を用いて、遠位大腿骨幹端について、合計および骨梁密度を計算した。大腿骨の末端から６ｍｍ近位で得られた第二の断片を用いて、皮質密度を評価した。トモグラフィー断片は、０．０７ｍｍの内面画素サイズを有していた。獲得後、画像を表示し、各スキャンに関して全大腿骨を含む興味のある領域の概要を示した。反復アルゴリズムを用いて軟組織を自動的に除去し、第一断片中の残りの骨の密度（合計密度）を測定した。次に、骨の外側の５５％を同心らせん状で剥がし、第一断片の残りの骨の密度（骨梁密度）をｍｇ／ｃｍ３で報告した。第二断片において、反復アルゴリズムを用いて、皮質および骨梁間の境界を決定し、皮質骨密度を決定した。
【表１】
2009531459.tif 000002
【表２】
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【０１５５】
本明細書は、明細書内に記載されている文献の教唆の観点から、最も十分に理解される。明細所内の実施形態は、本発明の実施形態を説明し、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきでない。当業者は、本発明に含まれる多くの他の実施形態を容易に認識する。この開示において言及されるすべての刊行物、特許、および生物学的配列は、その全体として本発明の一部として参照される。文献に含まれる物質が本出願と矛盾するか、または一致しない場合は、本明細書が任意のかかる物質に優先する。本明細書の任意の文献の記載は、かかる文献が本発明の先行技術であることを承認するものではない。
【０１５６】
特に指示がない限り、請求の範囲を含む明細書において用いられる、成分の量、細胞培養、処理条件などを表す全ての数値は、「約」という用語により全ての場合において修飾できると理解される。従って、特に反対の指示がない限り、数値パラメータは近似であり、本発明により求められる所望の特性に応じて変化し得る。特に指示がない限り、一連の要素の前の「少なくとも」という用語は、この一連の全ての要素についてであると理解される。当業者らは、単なる所定の実験を用いて、本明細書において記載される本発明の特定の実施形態についての多くの相当物を認識するか、または解明できる。かかる相当物は、以下の請求の範囲に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】配列番号１はヒトＧＤＦ−９遺伝子のヌクレオチド配列である（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿００５２６０も参照）。
【図２】配列番号２はヒトＧＤＦ−９のアミノ酸配列である（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００５２５１．１も参照）。
【図３】配列番号３はヒトＢＭＰ−１５遺伝子のヌクレオチド配列である（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿００５４４８も参照）。
【図４】配列番号４はヒトＢＭＰ−１５のアミノ酸配列である（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００５４３９も参照）。
【図５】配列番号５はＧＤＦ−９ペプチドのアミノ酸配列である。
【配列表】
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【国際調査報告】
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