(57)【要約】【課題】本発明は、細胞表面に細胞外ドメインをつなぐことができる支持領域に連結した可溶性受容体を含む細胞外ドメイン、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、「ゼータカイン（ｚｅｔａｋｉｎｅｓ）」というキメラ膜貫通免疫受容体に関する。【解決手段】ゼータカインは、Ｔリンパ球の表面上で発現すると、可溶性受容体リガンドが特異的である受容体を発現する特異的細胞へとＴ細胞活性を指向させる。ゼータカインキメラ免疫受容体は、特にヒト悪性疾患に用いられる自己分泌／パラ分泌サイトカイン系による様々な癌の治療への適用を含む、Ｔ細胞の抗原特異性を再指向させるための抗体基材免疫受容体の新規な進展である。好ましい態様では、ＩｇＧのＦｃ領域に連結したＩＬ−１３Ｒα２特異的ＩＬ−１３突然変異体ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）の細胞外標的指向ドメイン、ヒトＣＤ４の膜貫通ドメイン及びヒトＣＤ３ζ鎖を含むグリオーマ特異的免疫受容体である。【選択図】図１
2009515555.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１５を含むキメラ免疫受容体。
【請求項２】
ヒト癌を治療する方法であって、癌に罹患しているヒトに、請求項１記載の免疫受容体を発現する複数の細胞を投与することを含む、前記方法。
【請求項３】
請求項１記載のキメラ免疫受容体を含む、ベクター。
【請求項４】
配列番号１４である、請求項３記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌療法及びヒト脳腫瘍及び他の癌の治療におけるキメラ免疫受容体を発現する遺伝子組換えＴリンパ球の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
原発性脳腫瘍は、青少年の癌に関連した死亡率の３番目の主因であり、小児では２番目の主因であり、そして小児及び老人の集団共に発生率が増加していると考えられる１−４。グリオーマは、原発性脳腫瘍の最も一般的なタイプであり、米国では、年に２０，０００症例が診断され、グリオーマに関連した死亡は１４，０００件にのぼる５−８。グリオーマの悪性挙動は不均一であり、そのうち最も一般的かつ悪性の形態である、未分化星状細胞腫（ＡＡ−ＩＩＩ度）及び多形性グリア芽細胞腫（ＧＢＭ−ＩＶ度）では、急性進行性かつほぼ一様に致死性である９；１０。現在適用可能な治療方法は、当該高悪性度の腫瘍を最低限治療しうるが、中枢神経系内に局在することにより、既に重症の罹病状態がさらに悪化する場合が多い。したがって、悪性グリオーマに罹患した患者は、人生の最も生産的な時期を損なわれることが多く、様々な知的能力の低下及び高い致命率により、当該腫瘍固有の個人的及び社会的影響力の原因となる場合が多い。
【０００３】
悪性グリオーマの腫瘍学的管理の基本は切除及び放射線療法である１１−１６。最新の外科手術及び放射線療法の技術で、平均生存期間は、多形性グリア芽細胞腫では８２週間及び未分化星状細胞腫では２７５週間に延びたが、５年の生存率は、多形性グリア芽細胞腫で３〜６％及び未分化星状細胞腫で１２．１％増加しただけであった６−８。長期生存の主な予後指標は、より若い年齢（＜４０歳）及び一般状態（ＫＰＳスコア＞７０）である１７。巨大腫瘍の＞９０％の切除は、通常は、致命的機能性解剖が容認される場合に試みられる。術後放射線療法と共に用いられる場合、生存期間への切除程度の影響力は明らかではない１８；１９。切除及び放射線化学療法を加えても、未分化星状細胞腫又は多形性グリア芽細胞腫の患者に最低限の生存効果を与えるにすぎない２０−２３。ニトロソ尿素類は、単独又はプロカルバジン及びビンクリスチンとの組合せで、社会で用いられる慣用的な薬物であり、全生存期間中央値に影響を与えずに、１年及び２年の生存率を１５％改善すると考えられる２４；２５。白金基材薬物及びトポイソメラーゼ阻害剤を組み入れた、より攻撃的な治療方法が研究されている２６。幹細胞救出を伴う高用量化学療法の役割はこれまで示されてこなかった２７−２９。
【０００４】
再発性腫瘍の約８０％は、完全に切除されなかった元の腫瘍がＸ線で促進された残部に由来する１０；３０；３１。再発が一点でありかつその場所で攻撃的再切除に適する場合、本アプローチは、特に、未分化星状細胞腫の患者、及びＫＰＳ＞７０の多形性グリア芽細胞腫の患者の生存期間を延ばすことができる７０。再切除で処置された再発性多形性グリア芽細胞腫患者の生存期間中央値は３６週間である１０；３０；３１。近接照射療法か又は定位放射線手術法の形態の放射線療法は、再切除された再発性多形性グリア芽細胞腫患者の生存期間を１０〜１２週間だけ延ばすことができる３２。再発性疾患で化学療法を用いることは、本患者集団での効力が未だ示されていないが、適用可能な臨床試験に関連しているはずである。
【０００５】
悪性グリオーマの悪化が持続する予後により、遺伝子治療（ＴＫ自殺、腫瘍増殖因子受容体のアンチセンス阻害、条件致死ウイルスベクター）、免疫療法（抗体、腫瘍細胞ワクチン、イムノトキシン、活性リンパ球の養子免疫細胞移入）及び抗血管新生のアプローチが含まれるがこれらに限定されない新規な治療物質の臨床研究が促進された３３−４０。悪性グリオーマに有効なアジュバント療法の開発での多数の課題としては、正常な脳実質中への腫瘍細胞の広範な浸潤性増殖；当該腫瘍から産生される可溶性因子が免疫応答の発生を減衰する機能；及び中枢神経系（ＣＮＳ）に治療薬を投与する場合の臨床的に有意な治療上の比率決定が困難であることがあげられる。新規な治療薬の早期臨床評価は、本患者集団で明らかに示される。
【０００６】
最近は、トランスフェリン及び増殖因子の受容体は、毒素又は放射性ヌクレオチドに共役した当該受容体のリガンドを送達系として利用した実験的グリオーマ治療薬の課題であった４１。本アプローチの特異性は、正常脳と比較して、グリオーマ細胞上の標的受容体固有の発現又は過発現に依存する。興味深いことに、免疫系で用いられるインターロイキンの受容体複合体のいくつかは、グリオーマ、特に高親和性ＩＬ−１３受容体で発現される４２−４８。免疫系で用いられる、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−４Ｒβ及びγｃからなるＩＬ−１３受容体三分子複合体とは異なり、グリオーマ細胞は、ＩＬ−４Ｒβ又はγｃの要件とは関係なくＩＬ−１３を結合できる固有のＩＬ−１３Ｒα２を過発現する４４；４９；５０。その相同ＩＬ−４のように、ＩＬ−１３にはＣＮＳ外の多面発現性免疫調節活性がある５１−５３。双方のサイトカインは、Ｂリンパ球によるＩｇＥ生産を刺激してマクロファージによる前炎症性サイトカイン生産を抑制する。ＣＮＳ内のＩＬ−１３の免疫生物学はほとんど知られていない。
【０００７】
放射性標識されたＩＬ−１３によるオートラジオグラフィーを用いたＤｅｂｉｎｓｋｉらの詳細な研究は、試験したほとんど全ての悪性グリオーマ組織上で多量のＩＬ−１３が結合を示した４２；４５；４６；４８。さらに、当該結合は、腫瘍部分内の単細胞分析で極めて均一である４６；４８。ヒトグリオーマ細胞系へ結合するＩＬ−１３のスキャッチャード分析は、平均して１７，０００〜２８，０００結合部位／細胞を示す４５。ＩＬ−１３Ｒα２ｍＲＮＡに特異的なプローブを用いた分子分析は、全てのＣＮＳ解剖学的位置での正常脳の要素によるグリオーマ特異的受容体の発現を示すことができない４２；４３。さらに、放射性標識ＩＬ−１３でのオートラジオグラフィーは、ＣＮＳ内の検出可能な特異的ＩＬ−１３結合を示すことができなかったので、共有するＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４β／γｃも、ＣＮＳ内において検出可能なレベルで発現されないことが示唆された。当該知見は、独立して、非病理学的脳部分で免疫組織化学的技法を用いて、ＩＬ−１３Ｒα１及びＩＬ−４βに特異的な抗体で証明された５４。したがって、ＩＬ−１３Ｒα２は、これまでに報告されたグリオーマについて最も特異的かつ遍在的に発現される細胞表面標的である。
【０００８】
ＣＮＳ内のＩＬ−１３Ｒα２のグリオーマ特異的発現を有効利用する戦略として、様々な細胞毒素（シュードモナス属外毒素及びジフテリア毒素）をカルボキシル末端に融合するＩＬ−１３サイトカインの分子構築体が報告されている５５−５８。ＩＬ−１３受容体への結合時の当該毒素の内在化は当該融合タンパク質の選択的毒性に基づく。当該毒素は、インビトロのグリオーマ細胞に対してピコモル濃度で強力な細胞傷害性を示す５５。免疫欠損マウスへのヒト頭蓋内グリオーマ異種移植片は、毒素なしに、ＩＬ−１３−毒素融合タンパク質の腫瘍内注入により排除することができる５５。当該研究は、ＩＬ−１３標的抗毒素を悪性グリオーマについて所々局部的に（loco-regionally）利用した臨床研究の開始をサポートする。
【０００９】
しかしながら、ＩＬ−１３基材細胞毒素が広範に発現するＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４β／γｃ受容体複合体へ結合する場合、ＣＮＳ外の正常組織へ有害な傷害性を媒介する可能性があるため、当該物質の全身投与が制限される。ＩＬ−１３は、分子レベルで十分に研究されており、個々の受容体サブユニットと会合するのに重要な本サイトカインの構造ドメインはマッピングされている５５；５８。結果として、ＩＬ−１３で選択されたアミノ酸置換には、本サイトカインがその受容体サブユニットと会合する場合に予測可能な効果がある。ＩＬ−１３のαヘリックスＡ、具体的には、アミノ酸１３のアミノ酸置換は、ＩＬ−４βと会合するその機能を阻害して、ＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４β／γｃ受容体に対するＩＬ−１３の親和性を選択的に５倍低下させる５５；５７；５８。驚くべきことに、突然変異体ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）のＩＬ−１３Ｒα２への結合は保存されただけでなく、野生型ＩＬ−１３に対して５０倍高まった。したがって、置換を最小限にしたＩＬ−１３類似体は、ＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４β／γｃ受容体がある正常組織に対して、ＩＬ−１３Ｒα２へ選択的に結合することによるグリオーマ細胞へのＩＬ−１３の特異性及び親和性を同時に高めることができる。
【００１０】
悪性グリオーマは免疫療法治療に極めて魅力的な臨床物質であるが、それは、（１）切除及び放射線療法を行っている大部分の患者の疾患負荷状態が最小限になること及び（２）ＣＮＳ範囲内の当該腫瘍の解剖学的位置により、エフェクター細胞を直接所々局部的投与できるという理由からである。少なくとも二つの病理学的研究により、悪性グリオーマ中の血管周囲リンパ球浸潤の程度が、予後の改善と相関することが示された５９−６１。動物モデル系により、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞ではないグリオーマ特異的Ｔ細胞が、大脳内に移植したグリオーマの退行を介在できることが示された６２−７１。Ｔ細胞は、ＬＡＫ細胞とは異なり、脳実質中に浸潤する機能があるため、原発性腫瘍から離れている浸潤性腫瘍細胞でも標的とすることができる。当該知見にもかかわらず、グリオーマが、主として、グリオーマ反応性Ｔ細胞応答の誘導／増幅を阻害する免疫抑制サイトカイン（ＴＧＦ−β２）及びプロスタグランジンの生成により、免疫破壊を活発に阻害するという証拠が多数存在する７２−７４。当該知見により、生体内反応がおきる腫瘍が介在する制限を克服する戦略としての養子免疫療法のための生体外での拡大抗グリオーマエフェクター細胞の評価が促進された。
【００１１】
これまで、悪性グリオーマ切除腔への生体外活性化リンパ球の投与を伴う少なくとも１０件の試験的研究が報告された７５−８５。様々なエフェクター細胞タイプ（ＬＡＫ、ＴＩＬ、同種抗原反応性ＣＴＬ）；患者毎の不均一組成／組成変動；及びグリオーマ標的に対する当該エフェクター細胞のインビトロ反応性が低いことが多いにもかかわらず、当該研究は、全体として、逸話的長期生存者を含む再発性／難治性疾患患者で約５０％の反応率を報告している。当該研究は、グリオーマの細胞免疫療法の優れた臨床作用が、均一の極めて強力なエフェクター細胞で期待されるという前提を支持する。
【００１２】
当該試験的研究は、悪性グリオーマ患者の切除腔中へ、Ｔ細胞増殖因子であるインターロイキン−２（ＩＬ−２）及び生体外活性化リンパ球を直接投与する場合の安全性及び寛容性についても報告している７５；７６；７８；８２；８６−９２。個々の細胞用量（＞１０９個／用量）が多い場合でも、累積細胞用量（＞２７ｘ１０９個）が高い場合でも、傷害性はわずかであり、典型的には、ＩＩ度又はそれ未満の一過性頭痛、悪心、嘔吐及び熱が含まれる。上記のように、当該研究では、さらに、ｒｈＩＬ−２を共投与により、転移リンパ球の生体内生存が支持された。リンパ球と同時又はリンパ球投与後に逐次的に与えられる多数回用量は、４８時間ごとに送達されるＩＬ−２の１２用量過程について１．２ｘ１０６ＩＵ／用量と同程度の高い用量で許容された。
【００１３】
上記で概要された知見に基づき、グリオーマ免疫療法で用いられるリンパ球エフェクター細胞の抗腫瘍力価を改善する戦略が開発されている。１のアプローチとしては、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）結合ドメインを用いたグリオーマ標的を含む抗ＣＤ３ドメインによりＴリンパ球を共局在化かつ活性化することができる二重特異性抗体を用いる９３−９６。自己リンパ球と組み合わせた当該二重特異性抗体での予備的臨床実験では、Ｔ細胞が切除腔中で活性化されることを示唆する。しかしながら、脳実質内の浸潤性腫瘍細胞を標的とすることが本アプローチの潜在的に重大な限界である。Ｔ細胞が、グリオーマにより発現される標的抗原に特異的である場合、抗グリオーマ活性が有意に高まることがありうると考えられる。増加する、ＳＡＲＴ−１遺伝子を含む、Ｔリンパ球が反応性である腫瘍抗原をコードするヒト遺伝子をクローニングしたが、それは、高悪性度グリオーマのほぼ７５％で発現されると考えられる９７。樹状細胞基材インビトロ細胞培養技術や四量体基材Ｔ細胞選択技術により、養子免疫療法のための抗原特異的Ｔ細胞の単離が可能になった。ＳＡＲＴ−１等の抗原は、制限性ＨＬＡ対立遺伝子の場合にＴ細胞で認識されるため、抗原特異的アプローチでは、一般的なグリオーマ患者集団に広く適用できる当該抗原を提示できる制限性ＨＬＡ対立遺伝子及び抗原の数を実質的に増やす必要があるだろう。
【００１４】
Ｔ細胞抗原受容体複合体ζ鎖（ｓｃＦｖＦｃ：ζ）の細胞内シグナル伝達ドメインに融合した細胞外一本鎖抗体（ｓｃＦｖＦｃ）からなるように遺伝子操作されたキメラ抗体受容体がＴ細胞中で発現された場合、単クローン性抗体の特異性に基づく抗原認識を再指向させる機能がある９８。腫瘍細胞表面エピトープへ標的特異性があるｓｃＦｖＦｃ：ζ受容体の設計は、存在する抗腫瘍免疫に依存しないため、養子免疫療法の抗腫瘍免疫エフェクター細胞を生成する概念的に魅力的な戦略である。当該受容体は、ＭＨＣ非依存態様で抗原を結合する点で「普遍的」であり、１の受容体構築体を用いて、抗原陽性腫瘍患者集団を治療することができる。Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＣＥＡ、ＥＲＲＢ−２、ＣＤ４４ｖ６に特異性がある受容体及び腎細胞癌で選択的に発現するエピトープを含めた、ヒト腫瘍を標的とする構築体が参考文献に報告されている９８−１０４。当該エピトープは全て、キメラＴ細胞受容体によるｓｃＦｖ結合に用いられる細胞表面部分であるという共通の特徴がある。インビトロ研究により、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋双方のＴ細胞エフェクター機能が、当該受容体により惹起されうることが示された。さらに、動物モデルにより、養子免疫細胞に導入されたｓｃＦｖＦｃ：ζ発現性Ｔ細胞に樹立された腫瘍を除去する機能があることが示された１０５。腫瘍特異的ｓｃＦｖＦｃ：ζ受容体を発現する一次ヒトＴ細胞の機能をインビトロで評価したが、当該細胞は腫瘍標的を特異的に溶解してＩＬ−２、ＴＮＦ、ＩＦＮ−γ及びＧＭ−ＣＳＦを含む一連の前炎症性サイトカインを分泌する１０４。第１相試験的養子免疫療法研究が、ＨＩＶ感染個体のＨＩＶｇｐ１２０に特異的な自己ｓｃＦｖＦｃ：ζ発現性Ｔ細胞と、乳房及び結腸直腸の腺癌を含む多様な腺癌で発現するＴＡＧ−７２に特異性がある自己ｓｃＦｖＦｃ：ζ発現性Ｔ細胞を用いて進行している。
【００１５】
Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅの研究者は、ＣＤ２０＋Ｂ細胞悪性疾患を標的とする目的のＣＤ２０特異的ｓｃＦｖＦｃ：ζ受容体構築体と、神経芽細胞腫を標的とするＬ１−ＣＡＭ特異的キメラ免疫受容体を作製した１０６。前臨床実験室研究により、再編成されていない染色体に組込まれたベクターＤＮＡの単一コピーを含有しかつＣＤ２０特異的ｓｃＦｖＦｃ：ζ受容体を発現するＣＤ８＋ＣＴＬクローンを、健康な個体及びリンパ腫患者から単離しかつ増やすことができることが示された１０７。本課題を達成するために、ＣＭＶ前／初期プロモーターの転写制御下のキメラ受容体配列と、ＳＶ４０初期プロモーターの転写制御下のＮｅｏＲ遺伝子とを含有する精製直鎖状プラスミドＤＮＡを、エレクトロポレーションという手順であって、細胞及びＤＮＡを短時間電流へ暴露することにより、活性化ヒト末梢血単核細胞中に導入した。Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, Washinton のＦＤＡ認可臨床試験で現在用いられている選択、クローニング及び増量の方法を用いて、ＣＤ２０特異的細胞溶解活性がある遺伝子組換えＣＤ８＋ＣＴＬクローンを、６人の健康な志願者から、１５回の別々のエレクトロポレーション手順で作製した。当該クローンは、ヒトＣＤ２０＋リンパ腫細胞系パネルと共培養した場合に増殖し、標的細胞を特異的に溶解して刺激をして、サイトカインを生成する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、細胞外ドメインであって、細胞表面に細胞外ドメインをつなぐことができる支持領域に連結した可溶性受容体、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、「ゼータカイン（zetakines）」というキメラ膜貫通免疫受容体に関する。ゼータカインは、Ｔリンパ球の表面上で発現すると、可溶性受容体リガンドが特異的である受容体を発現する細胞へＴ細胞活性を指向させる。ゼータカインキメラ免疫受容体は、特に、ヒト悪性疾患に用いられる自己分泌／パラ分泌サイトカイン系を介在する、様々な癌の治療へ適用を含む、Ｔ細胞の抗原特異性を再指向させる抗体基材免疫受容体の新規な進展を示す。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
１の好ましい態様では、悪性グリオーマ及び腎細胞癌によるＩＬ−１３Ｒα２の腫瘍限定発現を細胞免疫療法の標的として用いて、ＩＬ−１３Ｒα２へ選択的高親和性で結合するＩＬ−１３サイトカイン突然変異体ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）を、ＩＬ−１３Ｒα２発現性腫瘍細胞へＴ細胞抗原特異性を再指向できるＩ型膜貫通キメラ免疫受容体へ変換した。ゼータカインの本態様は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃに融合した細胞外ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）,
膜貫通ＣＤ４及び細胞内Ｔ細胞抗原受容体ＣＤ３複合体ζ鎖からなる。細胞表面上で受容体を選択的に発現する様々な癌細胞タイプのいずれにも特異的である類似の免疫受容体を生じうるが、その選択的リガンドは公知又は遺伝子組換えで作製することができる。
【発明の効果】
【００１８】
当該免疫受容体を発現するように安定に形質転換されたヒトＴ細胞の大量系（bulk lines）及びクローンは特異的な癌細胞系に再指向された細胞を溶解するが、同時に、非標的細胞に対する傷害性は無視できる。当該遺伝子組換えＴ細胞は、グリオーマ等の治療が困難な癌を含む悪性疾患の強力かつ選択的な治療法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
遺伝子組換えにより再指向されたＴ細胞で腫瘍を標的とするのに理想的な細胞表面エピトープとは、腫瘍細胞上で均一な態様で予後が同じ患者集団内の全ての腫瘍で単独で発現するものである。腫瘍細胞膜からの標的分子の調節及び／又は流出は、再指向されたＴ細胞認識のための具体的な標的エピトープの有用性にも影響を与えることがありうる。これまで、「理想的な」腫瘍特異的エピトープはあまり明確でなかったが、二次エピトープは、臨界的正常組織で発現しないこと又は腫瘍で相対的に過発現することに基づいて標的とされた。悪性グリオーマの場合、この癌の治療のためにＴ細胞を腔内投与すると、ＣＮＳ外の他の組織による発現にさほど厳密にならず、正常ＣＮＳではない腫瘍細胞上で発現される場合に標的エピトープ量が増加しうる。腔内投与経路、及び（ｂ）典型的に全身投与される細胞用量と比較して細胞の投与数が低い場合に基づく、交差反応性による傷害性に関する問題がある。
【００２０】
ＩＬ−１３Ｒα２受容体は、悪性グリオーマの最も遍在的で特異的な細胞表面標的として存在する４７。感受性オートラジオグラフィー及び免疫組織化学的研究ではＣＮＳ内のＩＬ−１３受容体を検出することができない４６；４８。さらに、グリオーマに限定されたＩＬ−１３Ｒα２受容体を選択的に結合するＩＬ−１３サイトカインの突然変異は、ＣＮＳ外のＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４β＋正常組織に対するＩＬ−１３で指向された治療薬の有害な反応性に対するもう一つの防御手段である５５；５７。グリオーマＩＬ−１３Ｒα２を標的とすることの潜在的有用性、ＣＤ４ＴＭ、及びＣＤ３ζの細胞質尾部へと順次融合するヒトＩｇＧ４ Ｆｃにより原形質膜に結合した細胞外ＩＬ−１３突然変異サイトカイン（Ｅ１３Ｙ）からなるＴ細胞の特異性を再指向させるための新規な遺伝子組換えキメラ免疫受容体の設計及び試験。本キメラ免疫受容体は、「ＩＬ−１３ゼータカイン」とした。ＩＬ−１３Ｒα２受容体／ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）受容体−リガンド対は、一般的にゼータカインで用いる受容体−リガンド対の適合性を理解しかつ評価するための優れた指針である。理想的なゼータカインは、ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）の性質（独特の癌細胞表面受容体への特異性；天然に存在する可溶性細胞シグナル分子に由来する生体内安定性；同様の理由による免疫原性が低いこと）である細胞外可溶性受容体リガンドを含む。可溶性受容体リガンドは、細胞外環境で安定であり、非抗原性であり、より選択的であると考えられる点で、抗体断片（ｓｃＦｖＦｃ免疫受容体等）又は細胞接着分子の先行技術を用いるより明確に有利であるとして可溶性受容体リガンドを用いることができる。
【００２１】
本発明のキメラ免疫受容体は、細胞内受容体シグナル伝達ドメインへ順次連結した膜貫通ドメインを介して細胞表面にリガンドを結合する細胞外支持領域に連結した可溶性受容体リガンドを含む細胞外ドメインを含む。所望の可溶性受容体リガンドの例としては、自己分泌及びパラ分泌増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、ホルモン及び相当な特異性を示す遺伝子組換え人工低分子リガンドがあげられる。天然リガンド配列も、特定の標的細胞への特異性を高めるように遺伝子操作することができる。特定のゼータカインで用いるための可溶性受容体リガンドの選択は、グリオーマに用いるのに好ましいリガンドであるＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）分子に関する上記の品質及び標的細胞の性状に依存する。所望の支持領域の例としては、免疫グロブリンの定常（Ｆｃ）領域；ヒトＣＤ８∝；及び標的細胞上の受容体結合へより接近させるために細胞表面から離れて標的指向部分を移動させるのに有用な人工リンカーがあげられる。好ましい支持領域は、ＩｇＧ（ＩｇＧ４等）のＦｃ領域である。適する膜貫通ドメインの例としては、白血球ＣＤマーカー、好ましくは、ＣＤ８の膜貫通ドメインがあげられる。細胞内受容体シグナル伝達ドメインの例としては、Ｔ細胞抗原受容体複合体、好ましくは、ＣＤ３のζ鎖、さらには、単独で又はＣＤ３ζと連続した、ＦｃγＲIII共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８、ＤＡＰ１０、ＣＤ２のものがあげられる。
【００２２】
ＩＬ−１３ゼータカイン態様では、Ｅ１３Ｙアミノ酸置換があるヒトＩＬ−１３ｃＤＮＡを、ＰＣＲスプライスオーバーラップ伸長で合成した。完全長ＩＬ−１３ゼータカイン構築体を、ＰＣＲスプライスオーバーラップ伸長により構築したが、これは、ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体α鎖リーダーペプチド；ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ；ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ；ヒトＣＤ４ＴＭ及びヒト細胞質ζ鎖からなる。本ｃＤＮＡ構築体を、ヒト伸長因子−１αプロモーター（Invivogen, San Diego）の転写制御下で修飾ｐＭＧプラスミドのマルチクローニングサイトで連結した。本発現ベクターは、単一分子内で、形質転換体のインビトロ選択のためのハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ活性及び細胞の生体内除去のためのＨＳＶチミジンキナーゼ活性と、ＣＭＶ前／初期プロモーターからのガンシクロビルとを組み合わせる融合タンパク質ＨｙＴＫをコードするＨｙＴＫｃＤＮＡを共発現する。グリコシル化の阻害剤であるツニカマイシンと共にプレインキュベートした全細胞Ｊｕｒｋａｔ溶解産物を抗ζ抗体プローブでウェスタンブロットすると、予想した無傷の５６−ｋＤａキメラ受容体タンパク質が発現されるということが示された。本受容体は、天然ＩＬ−１３サイトカインの翻訳後修飾と一致し、激しくグリコシル化される１０８。抗ヒトＩＬ−１３及び抗ヒトＦｃ特異的抗体でのＩＬ−１３ゼータカイン＋Ｊｕｒｋａｔ細胞のフローサイトメトリー分析により、ＩＬ−１３ゼータカインがＩ型膜貫通タンパク質として細胞表面で発現されたことが確認された。
【００２３】
Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅで開発された樹立ヒトＴ細胞遺伝子修飾法を用いて１０７、ＩＬ−１３ゼータカインキメラ免疫受容体を発現する一次ヒトＴ細胞クローンを、前臨床機能性特性決定のために生成した。ＩＬ−１３ゼータカイン＋ＣＤ８＋ＣＴＬクローンは、生体外増幅培養物で強い増殖活性を示す。増幅したクローンは、４時間クロム放出検定で、ヒトＩＬ−１３Ｒα２＋グリア芽細胞腫細胞系に対して、再指向された細胞溶解活性を示す。その細胞溶解活性レベルは、Ｔ細胞上のゼータカイン発現レベル及びグリオーマ標的細胞上のＩＬ−１３Ｒα２受容体密度レベルと相関する。死滅に加え、ＩＬ−１３ゼータカイン＋クローンは、サイトカイン分泌（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ）で活性化される。無関係なキメラ免疫受容体を発現するＣＴＬクローンは、グリオーマ細胞に応答せず、活性化はＴ細胞形質転換体上のＩＬ−１３及びグリオーマ標的細胞上のＩＬ−１３Ｒα２に対する遮断抗体又は可溶性ＩＬ−１３を培養物へ添加することにより用量依存態様で阻害されうるため、活性化はグリオーマ細胞上のＩＬ−１３Ｒα２受容体とＩＬ−１３ゼータカインの相互作用により特異的に媒介された。最後に、ＩＬ−１３ゼータカイン発現性ＣＤ８＋ＣＴＬクローンは、培養物中でグリオーマ細胞により刺激された場合に増殖する。強力な抗グリオーマエフェクター活性があるＩＬ−１３ゼータカイン＋ＣＴＬクローンは、正常ＣＮＳへの限られた側副損傷を伴う悪性グリオーマに対して有意に臨床活性があるであろう。
【００２４】
本発明の免疫受容体は、当該技術分野で公知のいかなる手段でも作製できるが、好ましくは、組換えＤＮＡ技術を用いて作製する。キメラ受容体のある領域をコードする核酸配列は、標準的な分子クローニング技術（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマー補助連結反応、部位特異的突然変異誘発等）で製造しかつ完全なコード配列を構築することができる。得られたコード領域を、好ましくは、発現ベクター中に挿入し、適当な発現宿主細胞系、好ましくは、Ｔリンパ球細胞系、最も好ましくは、自己Ｔリンパ球細胞系に形質転換するのに用いる。第三部分は、免疫受容体の発現のために、形質転換した体液又は異種（xerogenic）免疫エフェクター細胞系であるＴ細胞系／クローンをもたらした。ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、ＬＡＫ細胞、ＬＩＫ細胞、及び当該細胞へ分化する幹細胞も用いることができる。好ましい態様では、リンパ球は白血球搬出（leukopharesis）で患者から入手し、当該自己Ｔ細胞をゼータカインを発現するように形質導入し、いずれか臨床的に許容しうる手段で投与して患者に戻し、抗癌療法を達成する。
【００２５】
治療効果に適する用量は、好ましくは、一投薬サイクルで約１０６〜１０９個細胞／用量であると考えられる。好ましい投薬方式は、０日目に約１０７個細胞で始めて５日目までに約１０８個細胞の標的用量まで漸増させる、４回の用量を徐々に増やす１週間投薬サイクルである。適当な投与様式としては、静脈内、皮下、腔内（例えば、貯蔵アクセス装置（reservoir-access device））、腹腔内及び腫瘍塊中への直接注入があげられる。
【００２６】
以下の実施例は、本発明の１の態様を詳しく説明するためのものにほかならない。
【実施例】
【００２７】
実施例１：免疫受容体コード配列の構築
本発明による免疫受容体のコード配列は、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）コード配列の de novo合成で、以下のプライマーを用いて構築した（免疫受容体コード配列及び発現ベクターの構築を示すフローチャートは、図８を参照されたい）。
【００２８】
【化１】
2009515555.tif 000003
【００２９】
最終配列（４１７ｂｐ）を、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩで末端消化してプラスミドｐＳＫ（Stratagene, LaJolla, ＣＡ）で連結３１２＃３として連結した。連結３１２＃３を突然変異誘発して（stratagene kit、製造者の使用説明書による）、
プライマー５’：ＩＬ１３ ３１２＃３ｍｕｔ５−３
【００３０】
【化２】
2009515555.tif 000004
【００３１】
及び３’：ＩＬ１３ ３１２＃３ｍｕｔ３−５
【００３２】
【化３】
2009515555.tif 000005
【００３３】
と、鋳型として連結３１２＃３を用いて、欠失したヌクレオチドを固定して、連結３４８＃１（ＩＬ１３ゼータカイン／ｐＳＫ）を作製した。
コーディングヒトＧＭ−ＣＳＦＲα鎖シグナルペプチド（ｈｓｐ）コード配列を、標準的ＰＣＲスプライスオーバーラップ伸長でＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）の５’末端に融合した。ｈｓｐ配列（１０１ｂｐ）は、鋳型連結３１０＃１０（ｈｓｐ／ｐＳＫ）（ヒトＴ細胞ｃＤＮＡのヒトＧＣＳＦ受容体α鎖リーダー配列）から、
プライマー５’：１９ｈｓｐ５’
【００３４】
【化４】
2009515555.tif 000006
【００３５】
（ＸｂａＩ部位を太字で強調する）
及び３’：ｈｓｐ−ＩＬ１３ＦＲ
【００３６】
【化５】
2009515555.tif 000007
【００３７】
を用いて獲得した。ＩＬ−１３配列（３７１ｂｐ）は、
プライマー５’：ｈｓｐ−ＩＬ１３ＦＦ
【００３８】
【化６】
2009515555.tif 000008
【００３９】
及び３’：ＩＬ１３−ＩｇＧ４ＦＲ
【００４０】
【化７】
2009515555.tif 000009
【００４１】
と、鋳型として連結３１２＃３を用いて獲得した。このようにして得られた１０１ｂｐのｈｓｐ配列及び３７１ｂｐのＩＬ１３配列と、プライマー５’：１９ｈｓｐ５’及び３’：ＩＬ１３−ＩｇＧ４ＦＲを用いて融合して４３８ｂｐの融合ｈｓｐ−ＩＬ１３配列を作製した。
【００４２】
ＩｇＧ４ Ｆｃ領域ＩｇＧ４ｍ：ζをコードする配列を、同様の方法を用いて、ｈｓｐ−ＩＬ１３融合配列の３’末端に融合した。ＩｇＧ４ｍ：ζ配列（１１１９ｂｐ）は、
プライマー５’：ＩＬ１３−ＩｇＧ４ＦＦ
【００４３】
【化８】
2009515555.tif 000010
【００４４】
及び３’：ＺｅｔａＮ３’
【００４５】
【化９】
2009515555.tif 000011
【００４６】
（ＮｏｔＩ部位を太字で強調する）
を用い、鋳型として配列Ｒ９．１０（ＩｇＧ４ｍＺｅｔａ／ｐＳＫ）を用いて得た。その１１１９ｂｐのＩｇＧ４ｍ：ζ配列を、鋳型として各配列と、プライマー５’：１９ｈｓｐ５’及び３’：ＺｅｔａＮ３’を用いて、ｈｓｐ−ＩＬ１３融合配列に融合して、１５２２ｂｐのｈｓｐ−ＩＬ１３−ＩｇＧ４ｍ：ζ融合配列を作製した。当該末端を、ＸｂａＩ−ＮｏｔＩで消化してｐＳＫ中に連結３５１＃７として連結して、プラスミドＩＬ１３ゼータカイン／ｐＳＫ（４４６４ｂｐ）を作製した。
【００４７】
実施例２：発現ベクターの構築
ＩＬ１３ゼータカインコード配列を含有する発現ベクターは、実施例１のＩＬ１３ゼータカイン／ｐＳＫをＸｂａＩ−ＮｏｔＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗで平滑末端を作り、得られた断片をプラスミドｐＭＧ＾Ｐａｃ（Invitrogen）（ＳｇｒＡＩで開環し、Ｋｌｅｎｏｗで平滑にしてＳＡＰでの脱リン酸で最初に作製する）中に連結して、プラスミドＩＬ１３ゼータカイン／ｐＭＧをつくることにより作製した。図８を参照されたい。ＩＬ１３ゼータカイン／ｐＭＧのハイグロマイシン耐性領域を、ＮｏｔＩ−ＮｈｅＩで消化して除去し、ＮｏｔＩ−ＮｈｅＩで消化してプラスミドＣＥ７Ｒ／Ｈｙ−ｐＭＧ（Jensen, City of Hope）から獲得した選択／自殺融合ＨｙＴＫで置換して、発現ベクターＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧ（６７８５ｂｐ）を作製した。本プラスミドは、ヒト伸長因子−１αプロモーター（ｈＥＦ１ｐ）を塩基６〜５４９に、ＩＬ１３ゼータカインコード配列を塩基６９２〜２１８５に、Simian Virus ４０後期ポリアデニル化シグナル（Late ＳＶ４０ｐＡＮ）を塩基２２３２〜２５００に、最小の大腸菌（E. coli）複製起点（ＯｒｉＣｏｌＥ１）を塩基２５０１〜３２４７に、合成ポリＡ及びポーズ部位（ＳｐＡＮ）を塩基３２４８〜３４３４に、Immeate early ＣＭＶエンハンサー／プロモーター（ｈＣＭＶ−１Ａｐｒｏｍ）を塩基３４５５〜４０７７に、ハイグロマイシン耐性−チミジンキナーゼコード領域融合（ＨｙＴＫ）を塩基４２５９〜６３３４に及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル及び転写ポーズ（ＢＧｈ ｐＡｎ）を塩基６３３５〜６６３３に含む。当該プラスミドは、塩基３２３５〜３２４２にＰａｃＩ線状化部位がある。ｈＥＦ１ｐ及びＩＬ１３ゼータカイン要素は、ＩＬ１３ゼータカイン／ｐＭＧに由来し、残りの要素は、ＣＥ７Ｒ／ＨｙＴｋ−ｐＭＧに（ＨｙＴＫ要素を除き、最終的には、親プラスミドｐＭＧ＾Ｐａｃに）由来した。要すれば、ＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴｋ−ｐＭＧは、修飾ｐＭＧ主鎖であり、ＩＬ１３ゼータカイン遺伝子をｈＥＦ１プロモーターから、ＨｙＴＫ融合をｈＣＭＶ−１Ａプロモーターから発現する。プラスミドＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴｋ−ｐＭＧのマップは、図９より明らかである。当該プラスミドの完全核酸配列は図１０に示されている。ＩＬ１３ゼータカイン挿入配列を、下の配列番号１５として示す。
【００４８】
【化１０】
2009515555.tif 000012
【００４９】
実施例３：免疫受容体の発現
発現した構築体の完全性の評価を、最初に、グリコシル化阻害剤であるツニカマイシンの存在下又は不存在下で共培養したＪｕｒｋａｔＴ細胞安定形質転換体１０７に由来する全細胞溶解産物の抗ζ抗体でプローブしたウェスタンブロットで示した（図１）。ＪｕｒｋａｔＴ細胞安定形質転換体（Jurkat−ＩＬ１３−ｐＭＧ大量系）は、ＪｕｒｋａｔＴ細胞をＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴｋ−ｐＭＧ発現ベクターでエレクトロポレーション後、陽性形質転換体の選択及び増幅により獲得した。Ｊｕｒｋａｔ−ＩＬ１３−ｐＭＧ大量系から、２４穴プレート中に、２×１０６個／穴の細胞を、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ又は２０μｇ／ｍｌのツニカマイシンを含むか又は含まずにプレーティングした。当該プレートを３７℃で２２時間インキュベートした。細胞を各穴から採取し、各試料をＰＢＳで洗浄して１錠／１０ｍｌの 完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）含有の５０μｌのＲＩＰＡ緩衝液（ＰＢＳ、１％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）中に再懸濁させた。試料を氷上で３０分間インキュベート後、２１ゲージ針のシリンジで吸引して破壊後、氷上でさらに３０分間インキュベートし、４℃で１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。遠心分離された溶解産物上澄みの試料を採取し、等容量の試料緩衝液で減圧条件で沸騰後、１２％アクリルアミドゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。ニトロセルロースへの転移後、膜を４℃で一晩乾燥させた。翌日、膜を、Ｔ−ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水ｐＨ８．０中の０．０２％Ｔｗｅｅｎ）中に０．０４ｇ／ｍｌの脱脂粉乳を含有する Blotto 溶液中で１時間ブロッキングした。次に、膜を、１μｇ／ｍｌの濃度の一次マウス抗ヒトＣＤ３ζ単クローン性抗体（Pharmingen, San Diego, CA）と共に２時間インキュベートし、洗浄後、ヤギ抗マウスＩｇＧアルカリ性ホスファターゼ共役二次抗体（Bio-Rad ImmunoStar Kit, Hercules, CA）の１：３０００希釈（Blotto 溶液中）と共に１時間インキュベートした。展開する前に、膜をＴ−ＴＢＳでさらに４回洗浄後、３ｍｌのリン酸基質溶液（BioRad ImmunoStar Kit, Hercules, CA）と共に室温で５分間インキュベートした。次に、膜をプラスチックで覆い、Ｘ線フィルムに感光した。野生型ヒトＩＬ−１３の既知のグリコシル化パターンと一致し、発現したＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）ゼータカインの電気泳動移動度は、ツニカマイシンの存在下で発現した場合に約５４ｋＤａのアミノ酸主鎖に低減した著しくグリコシル化したタンパク質を示す。
【００５０】
ＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）ゼータカインは、フィコエリトリン（ＰＥ）共役抗ヒトＩＬ１３単クローン性抗体及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）共役マウス抗ヒトＦｃ（γ）断片特異的Ｆ（ａｂ’）２抗体での形質転換体のフローサイトメトリー分析で示されるように、ホモ二量体Ｉ型膜貫通タンパク質として細胞表面へと移行する（図２）。Ｊｕｒｋａｔ ＩＬ１３ゼータカイン−ｐＭＧ形質転換体を、細胞表面キメラ受容体発現の分析のため、抗ヒトＦｃ（ＦＩＴＣ）抗体（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）、組換えヒトＩＬ１３Ｒα２／ヒトＩｇＧ１キメラ（Ｒ＆Ｄ Systems, Minneapolis, MN）、その後、ＦＩＴＣ共役抗ヒトＩｇＧ１単クローン性抗体（Sigma, St. Louis, MO）及び抗ＩＬ１３（ＰＥ）抗体（Becton, Dickinson, San Jose, CA）で染色した。健康なドナー一次細胞も、ＦＩＴＣに共役した抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＴＣＲ及びイソ型対照単クローン性抗体（Becton, Dickinson, San Jose, CA）で染色して、細胞表面表現型を評価した。各染色した１０６個細胞を洗浄して２％ＦＣＳ、０．２ｍｇ／ｍｌのＮａＮ３及び５μｌのストック抗体を含有する１００μｌのＰＢＳ中で再懸濁させた。４℃で３０分インキュベーション後、細胞を２回洗浄して二次抗体で染色するか又は１％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に再懸濁させ、ＦＡＣＳＣaliber サイトメーターで分析した。
【００５１】
実施例４：ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）ゼータカインのＩＬ１３Ｒα２受容体への結合
ヒトＩｇＧ４Ｆｃで細胞膜に結合したＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）（すなわち、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）ゼータカイン）は、可溶性ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ融合タンパク質を用いたフローサイトメトリー分析で評価されるように、標的ＩＬ１３Ｒα２受容体に結合しうる（図３）。クローン化ヒトＰＢＭＣ ＩＬ１３ゼータカイン−ｐＭＧ形質転換体は、ＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧ発現ベクターでＰＢＭＣをエレクトロポレーションした後、陽性の形質転換体の選択及び増幅を行って獲得した１０７。ＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＴＬクローン細胞を、細胞表面キメラ受容体発現の分析のため、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）共役マウス抗ヒトＦｃ（γ）断片特異的Ｆ（ａｂ’）２（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）、組換えヒトＩＬ１３Ｒα２／ヒトＩｇＧ１キメラ（Ｒ＆Ｄ Systems, Minneapolis, MN）、その後、ＦＩＴＣ共役抗ヒトＩｇＧ１単クローン性抗体（Sigma, St. Louis, MO）及びフィコエリトリン（ＰＥ）共役抗ヒトＩＬ１３単クローン性抗体（Becton, Dickinson, San Jose, CA）で染色した。健康なドナー一次細胞も、ＦＩＴＣに共役した抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＴＣＲ及びイソ型対照単クローン性抗体（Becton, Dickinson, San Jose, CA）で染色して、細胞表面表現型を評価した。各染色のうち１０６個細胞を洗浄して２％ＦＣＳ、０．２ｍｇ／ｍｌのＮａＮ３及び５μｌの抗体を含有する１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。４℃で３０分インキュベーション後、細胞を２回洗浄して二次抗体で染色するか又は１％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に再懸濁させ、ＦＡＣＳＣaliber サイトメーターで分析した。
【００５２】
次に、一次ヒトＴ細胞のための代理抗原受容体としてのＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）ゼータカインの免疫生物学を評価した。一次ヒトＴ細胞を、プラスミド発現ベクターでエレクトロポレーションした。陽性形質転換細胞をハイグロマイシンで選択し、限界希釈中でクローン化後、ＯＫＴ３、ＩＬ−２及び照射支持細胞での反復刺激サイクルで増加させた。次に、ウェスタンブロット及びＦＡＣＳでＩＬ１３ゼータカイン発現を示すクローンを、様々なＩＬ−１３Ｒα２＋／ＣＤ２０−グリオーマ細胞系（Ｕ２５１、ＳＮ−Ｂ１９、Ｕ１３８）及びＩＬ−１３Ｒα−／ＣＤ２０＋Ｂ細胞リンパ球系 Daudi）に対して、４時間クロム放出検定で機能性評価を行った。当該試験により、ＩＬ１３ゼータカインが、グリオーマ細胞に特異的である細胞溶解活性をもたらしたこと（図４ａ）及び本特異的細胞溶解活性が、クラスとしてのグリオーマ細胞に存在するということ（図ｂ）が示された。ＭＪ−ＩＬ１３−ｐＭＧクローンの細胞溶解活性は、５１Ｃｒ標識されたＳＮ−Ｂ１９、Ｕ２５１及びＵ１３８グリオーマ細胞系（ＩＬ１３Ｒα２＋／ＣＤ２０−）及びＤａｕｄｉ（ＣＤ２０＋／ＩＬ１３Ｒα２−）を標的として用いて検定した。ＭＪ−ＩＬ１３エフェクターは、刺激後８〜１２日に検定した。エフェクターを採取し、洗浄して検定培地中に再懸濁させた。２．５×１０５個、１．２５×１０５個、２．５×１０４個及び５×１０３個のエフェクターを、９６穴Ｖ底微量滴定プレートで、５×１０３個の標的細胞と共に、三重反復試験で３７℃で４時間で培養した。インキュベーション後、細胞不含上澄みの１００μｌアリコートを採取し、上澄み中の５１Ｃｒをγカウンターで検定した。特異的細胞溶解比率を、次のように計算した。
【００５３】
【数１】
2009515555.tif 000013
【００５４】
標的細胞を含有する対照穴を標的細胞単独でインキュベートした。最大５１Ｃｒ放出は、２％ＳＤＳの存在下で標識標的細胞から放出される５１Ｃｒを測定して決定した。約４０％のＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）ゼータカイン＋ＴＣＲα／β＋リンパ球からなる安定なトランスフェクションしたヒトＴ細胞の大量系は、４時間クロム放出検定で、１３Ｒα２＋グリオーマ標的に特異的で再指向された細胞溶解を示し（２５：１のＥ：Ｔ比で＞５０％の特異的溶解）、ＩＬ−１３Ｒα２−標的に対する活性は無視できる程度であった（２５：１のＥ：Ｔ比で＜８％の特異的溶解）。抗ＩＬ−１３抗体への高レベル結合基準で選択されたＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ）ゼータカイン＋ＣＤ８＋ＴＣＲα／β＋ＣＴＬクローンも、再指向されたＩＬ１３Ｒα２特異的グリオーマ細胞死滅を示す（図４ｂ）。
【００５５】
ＩＬ−１３ゼータカイン発現性ＣＤ８＋ＣＴＬクローンは、培養物中のグリオーマ細胞で刺激されると活性化されて増殖する（図５〜７）。ＩＬ−１３ゼータカインを発現するＭＪ−ＩＬ１３−ｐＭＧ Ｃｌ．Ｆ２応答細胞を、インビトロのＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦα生産の受容体を介するトリガーリング（triggering）について評価した。２×１０６個の応答細胞を、２４穴組織培養プレートで、全２ｍｌ中に２×１０５個の照射刺激細胞（Ｄａｕｄｉ、線維芽細胞、神経芽細胞腫１０ＨＴＢ及びグリア芽細胞腫Ｕ２５１）と共培養した。遮断性ラット抗ヒトＩＬ１３単クローン性抗体抗体（Pharmingen, San Diego, CA）、組換えヒトＩＬ１３（Ｒ＆Ｄ Systems, Minneapolis, MN）及びＩＬ１３Ｒα２特異的ヤギＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ Systems, Minneapolis, MN）を、応答細胞を加える３０分前に、Ｕ２５１刺激細胞のアリコート（２×１０５／ｍｌ）に、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌの濃度で加えた。プレートを、３７℃で７２時間インキュベートし、各時間後、培養物上澄みを採取し、小分けして−７０℃で貯蔵した。ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦαのＥＬＩＳＡ検定は、Ｒ＆Ｄ Systems（Minneapolis, MN）キットを製造者の使用説明書を用いて行った。試料は、未希釈又は１：５又は１：１０に希釈した二重反復試験穴で調べた。展開さしＥＬＩＳＡプレートを、マイクロプレートリーダーで評価してサイトカイン濃度は、標準曲線からの外挿により決定した。結果は、ピコグラム／ｍｌとして報告されているが、グリオーマ刺激細胞によるサイトカイン生産について強い活性化を示す（図５、図６）。
【００５６】
最後に、ＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＤ８＋ＣＴＬのＩＬ−２非依存増殖を、ＩＬ１３Ｒα２刺激物ではないグリオーマ刺激物との共培養時に観察した（図７ａ）。ｒｈＩＬ−１３抗体を添加して増殖を阻害し（図７ｂ）、増殖が確認され、その増殖はＩＬ−１３Ｒα２グリオーマ細胞特異的受容体へのゼータカインの結合に依存することが示された。
【００５７】
実施例５：治療的使用に適するＩＬ−１３ゼータカイン＋Ｔ細胞の製造
単核細胞を、ヘパリン処理した全血から、臨床レベル以上のFicoll（Pharmcia, Uppsula, Sweden）で遠心分離して分離する。ＰＢＭＣを、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水（Irvine Scientific）で２回洗浄してＲＰＭＩ１６４０ＨＥＰＥＳ、１０％熱失活ＦＣＳ及び４ｍＭ Ｌ−グルタミンからなる培地中に懸濁させる。患者ＰＢＭＣ中に存在するＴ細胞を、オルソクローンＯＫＴ３（３０ｎｇ／ｍｌ）の培養物へ添加してポリクローナルに活性化させる。次に、細胞培養物を、研究対象者の指定インキュベーターでベント式Ｔ７５組織培養フラスコでインキュベートする。培養開始から２４時間後に２５Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２を加える。
【００５８】
培養開始から３日後、ＰＢＭＣを採取し、遠心分離して低張エレクトロポレーション緩衝液（Eppendorf）に２０×１０６個細胞／ｍｌで再懸濁させる。実施例３の２５μｇのプラスミドＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧを、４００μｌの細胞懸濁液と共に、滅菌済０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに加える。各キュベットを、２５０Ｖ／４０μｓの単一電気パルスに供し、再度、ＲＴで１０分間インキュベートする。生存細胞をキュベットから採取し、プールして２５Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２を含有する培地に再懸濁させる。フラスコを患者の指定組織培養インキュベーター中に入れる。エレクトロポレーション後３日目に、ハイグロマイシンを０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度で細胞に加える。エレクトロポレーション後のＰＢＭＣを、４８時間ごとに培地及びＩＬ−２を補充しながら全１４日間培養する。
【００５９】
エレクトロポレーション後のＯＫＴ３活性化患者ＰＢＭＣのハイグロマイシン耐性ＣＤ８＋ＣＴＬのクローニングを培養１４日目に開始する。端的には、生存可能な患者ＰＢＭＣを、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３及び５０Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２を含有する２００ｍｌ容量の培地中の１００×１０６個の低温保存（cyropreserved）照射支持ＰＢＭＣ及び２０×１０６個の照射ＴＭ−ＬＣＬの混合物に加える。本マスターミックスを、各穴に１０個の９６穴クローニング用プレート中に０．２ｍｌプレーティングする。プレートをアルミニウム箔中に包み、蒸発減量を減少させて患者の指定組織培養インキュベーター中に入れる。培養１９日目に、各穴に０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度のハイグロマイシンを入れる。３０日目に穴の細胞増殖を倒立顕微鏡での目視で調べて再刺激用に陽性穴に印を付ける。
【００６０】
細胞増殖する各々のクローニング穴の内容物を、個々に、２５ｍｌの組織培地中に５×１０６個の照射ＰＢＭＣ、１０×１０６個の照射ＬＣＬ及び３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３があるＴ２５フラスコに移す。再刺激から１日、３日、５日、７日、９日、１１日及び１３日後に、５０Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２及び１５ｍｌの新鮮培地をフラスコに入れる。刺激サイクルの５日目に、さらに、０．２ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンをフラスコに補充する。播種から１４日後、細胞を採取し、計数して５０ｍｌの組織培地中に１５０×１０６個の照射ＰＢＭＣ、３０×１０６個の照射ＴＭ−ＬＣＬ及び３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３があるＴ７５フラスコ中で再刺激する。フラスコに、上記したｒｈＩＬ−２及びハイグロマイシンの培養物への添加物を加える。
【００６１】
治療に用い得る程度に増殖するため選択されたＣＴＬを、ＣＲＢ−３００６に格納されたＦＡＣＳＣalibur で免疫蛍光し、ＦＩＴＣ共役単クローン性抗体ＷＴ／３１（ａβＴＣＲ）、Ｌｅｕ２ａ（ＣＤ８）及びＯＫＴ４（ＣＤ４）を用いて分析し、必要なクローン表現型（αβＴＣＲ＋、ＣＤ４−、ＣＤ８＋及びＩＬ１３＋）を確認する。臨床使用のためのクローンの選択判定基準としては、イソ型対照ＦＩＴＣ／ＰＥ共役抗体と比較して一様なＴＣＲαβ＋、ＣＤ４−、ＣＤ８＋及びＩＬ１３＋があげられる。プラスミドベクター染色体組込み単一部位はサザンブロット分析で確認する。遺伝子組換えＴ細胞クローンのＤＮＡは、当該プラスミドベクターに特異的なＤＮＡプローブでスクリーニングされるであろう。プラスミドベクターのＨｙＴＫに特異的なプローブＤＮＡは、フルオレセイン（florescein）共役ｄＵＴＰでの製造者の使用説明書（Amersham, Arlington Hts, IL）によるランダムプライミングで合成する。Ｔ細胞ゲノムＤＮＡを、標準的な技法で単離する。Ｔ細胞クローンからの１０マイクログラムのゲノムＤＮＡを、３７℃で一晩消化後、０．８５％アガロースゲルで電気泳動により分離する。次に、ＤＮＡを、アルカリキャピラリー転移法を用いてナイロンフィルター（BioRad, Hercules, CA）に移す。フィルターを、１０μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ（Sigma）を含有する０．５Ｍ Ｎａ２ＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ中のプローブで、６５℃一晩ハイブリッド形成させる。次に、フィルターを、４０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４、ｐＨ７．２、１％ＳＤＳで６５℃で４回洗浄後、化学発光ＡＰ共役抗フルオレセイン（florescein）抗体（Amersham, Arlington Hts, IL）を用いて可視化する。クローン選択判定基準は、単一バンド特有ベクターバンドである。
【００６２】
ＩＬ−１３ゼータカインの発現は、キメラ受容体タンパク質を抗ζ抗体で検出するウェスタンブロット手順で確認する。トランスフェクションしたＴ細胞クローンの全細胞溶解産物は、１錠／１０ｍｌのComplete Protease Inhibitor Cocktail（Boehringer Mannheim）を含有する１ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液（ＰＢＳ、１％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）で２×１０７個の洗浄した細胞を溶解させることにより生成する。氷上で８分インキュベーション後、遠心分離した全細胞溶解産物上澄みのアリコートを採取して等容量のローディング緩衝液中において還元条件下で沸騰後、プレキャスト１２％アクリルアミドゲル（BioRad）上のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行う。ニトロセルロースへの転移後、０．０７ｇｍ／ｍｌの脱脂粉乳を含有するブロット（blotto）溶液中で膜を２時間ブロックする。膜を、Ｔ−ＴＢＳ（Tris 緩衝化生理食塩水ｐＨ８．０中の０．０５％ Tween）中で洗浄後、１μｇ／ｍｌの濃度の一次マウス抗ヒトＣＤ３ζ単クローン性抗体８Ｄ３（Pharmingen, San Diego, CA）と共に２時間インキュベートする。Ｔ−ＴＢＳ中でさらに４回洗浄後、膜を、ヤギ抗マウスＩｇＧアルカリ性ホスファターゼ共役二次抗体の１：５００希釈と共に１時間インキュベートする。展開する前に、膜をＴ−ＴＢＳ中ですすぎ洗浄後、３０ｍｌの「ＡＫＰ」溶液（Promega, Madison, WI）で製造者の使用説明書で展開させる。クローン選択判定基準は、キメラζバンドの存在である。
【００６３】
ＩＬ−１３ゼータカインキメラ免疫受容体を発現するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞クローンは、細胞表面標的エピトープとキメラ受容体の相互作用後に、ヒトグリア芽細胞腫標的細胞を、ＨＬＡに制限されない態様で認識しかつ溶解する。標的ＩＬ−１３Ｒα２エピトープ発現及びクラスＩ ＭＨＣ非依存認識のための必要条件は、ＩＬ−１３Ｒα２＋Ｄａｕｄｉ細胞形質転換体及びＩＬ−１３Ｒα２−Ｄａｕｄｉ細胞に対するａβＴＣＲ＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４−、ＩＬ−１３ゼータカイン＋ＣＴＬクローンを各々検定して確認できるであろう。Ｔ細胞エフェクターを、ＯＫＴ３での刺激後１２〜１４日に検定する。エフェクターを採取し、洗浄して検定培地；及びＩＬ−１３Ｒα２を発現するＤａｕｄｉ細胞形質転換体中に再懸濁させる。２．５×１０５個、１．２５×１０５個、２．５×１０５個及び０．０５×１０５個のエフェクターを、Ｖ底微量滴定プレート（Costar, Cambridge, MA）中において５×１０３個の標的細胞と共に、三重反復試験で３７℃で４時間プレーティングする。遠心分離及びインキュベーション後、細胞不含上澄みの１００μｌアリコートを採取し、計数する。特異的細胞溶解比率を、次のように計算する。
【００６４】
【数２】
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【００６５】
対照穴は、検定培地中でインキュベートされた標的細胞を含有する。最大５１Ｃｒ放出は、２％ＳＤＳで溶解した標的細胞の５１Ｃｒ含有量を測定して決定する。クローン選択判定基準は、５：１のＥ：Ｔ比でＩＬ−１３Ｒα２＋Ｄａｕｄｉ形質転換体の＞２５％の特異的溶解及び同一のＥ：Ｔ比で親Ｄａｕｄｉの＜１０％の溶解である。
【００６６】
実施例６：ＩＬ−１３ゼータカイン発現性Ｔ細胞を用いたヒトグリオーマの治療
ＩＬ−１３Ｒゼータカインキメラ免疫受容体及びＨｙＴＫを発現するように実施例５の遺伝子組換えＴ細胞クローンを、以下について選択する：
ａ．フローサイトメトリーで決定されるＴＣＲα／β＋、ＣＤ４−、ＣＤ８＋、ＩＬ−１３＋細胞表面表現型；
ｂ．サザンブロットで示される染色体組込みプラスミドベクターＤＮＡの単一コピーの存在；
ｃ．ウェスタンブロットで検出されるＩＬ−１３ゼータカインタンパク質の発現；
ｄ．４時間クロム放出検定でのヒトＩＬ−１３Ｒα２＋標的の特異的溶解；
ｅ．インビトロ増殖での外因性ＩＬ−２への依存；
ｆ．＜５ＥＵ／ｍｌのマイコプラズマ、真菌、細菌の無菌レベル及び内毒素レベル；
ｇ．ガンシクロビルへのクローンのインビトロ感受性。
【００６７】
末梢血単核細胞を、白血球搬出で患者から、好ましくは、最初の切除手術の回復後及びステロイドの漸減除去及び／又は最近の全身化学療法から少なくとも３週間の時点で入手する。標的白血球搬出単核細胞収量は５×１０９個であり、ハイグロマイシン耐性細胞傷害性Ｔ細胞クローンの標的数は、生体外増加のための全ての品質対照パラメーターを満たす少なくとも５種類のクローンが識別されることを期待して２５である。クローンを低温保存して患者を、連続ラジオグラフィー及び臨床検査で監視する。疾患進行が再発した場合、患者は、再切除及び／又は腫瘍切除腔へＴ細胞を送達するためのレザバーアクセスデバイス（Oyama reservoir）を配置される。外科手術及びステロイドの漸減による回復後、適用可能ならば、患者にＴ細胞療法を開始する。
【００６８】
患者は少なくとも４回の１週サイクル標的の療法を受ける。最初のサイクルで、細胞用量の段階的上昇は、１０７個の０日目初期用量後、３日目の５×１０７個〜５日目の１０８個の標的細胞用量へと進行する。サイクル２は、サイクル１の開始から１週間程度先に開始する。残遺疾患がある腫瘍退行をＭＲＩで示された患者は、サイクル３及びサイクル４の反復後、１週間の休止／再度の病期分類からなる７週目以降に開始する他の治療プロセスを受けることができるが、当該治療は、疾患進行又はＣＲが、ラジオグラフィー評価に基づき達する時間まで十分に許容される（＜３度の最大傷害性）という条件付きである。
【００６９】
細胞用量は、少なくとも、類似の患者集団へ送達されるＬＡＫ細胞（１０９個までの個々の細胞用量及び２．７５×１０１０個程度に高い累積細胞数は、安全投与された）、生体外増量ＴＩＬ（最小限の傷害性で報告された１０９個細胞／用量まで）及び同種抗原反応性リンパ球（１０８個の出発細胞用量で、５１．５×１０８個までの累積細胞用量）を腔内に用いた研究で与えられる用量未満の対数である７５−８５。提案された細胞用量が少ない本プロトコールの根拠は、以前用いたエフェクター細胞集団の穏当な反応性プロフィールと比較して増加した、ＩＬ−１３ゼータカイン＋ＣＴＬクローンのインビトロ反応性／抗腫瘍力価に基づく。低用量反復投薬は、１回に多細胞数を滴下して起こりうると考えられる潜在的に危険な炎症性反応を回避するのに好都合である。注入は各々単一Ｔ細胞クローンからなるであろう。患者の治療過程中には同一のクローンを投与するであろう。Ｔ細胞投与の当日に、増加したクローンを、５０ｃｃのＰＢＳで２回洗浄して無菌処理後、患者に送達するための細胞用量を形成する２ｍｌの容量で医薬保存剤不含規定生理食塩水中に再懸濁させる。Ｔ細胞を５〜１０分にわたって滴下する。Ｔ細胞の後、２ｍｌのＰＦＮＳフラッシュを５分にわたり投与するであろう。当該療法への応答は、脳ＭＲＩ＋／−ガンドリニウム（gandolinium）により、分光法で評価する。
【００７０】
グリオーマ切除腔へＴ細胞を投与する場合に考えられる副作用は、典型的には、自己限定性悪心嘔吐、熱、及び既存の神経欠損の一過性悪化からなる。当該傷害性は、分泌されたサイトカインの作用との組合せでのＴ細胞を介する腫瘍床中の局所炎症／浮腫双方に依存し得る。当該副作用は、典型的には、一過性で重症度はＩＩ度未満である。患者の傷害性がより重症であれば、単独又はガンシクロビルとの組合せで、デカドロン（decadron）は、炎症性過程を減衰し、注入した細胞を除去することが期待される。細菌又は真菌で汚染された細胞生産物を不注意にも注入すると、重症又は生命を危うくする傷害性引き起こす可能性がある。細胞生産物を注入前に十分培養して、汚染された組織培養フラスコを識別し、当該可能性を最小限にする。再注入の当日に、培養液や内毒素レベルのグラム染色を行う。
【００７１】
ＩＬ−１３Ｒα２の発現の十分な分子分析は、本分子が、ＣＮＳの場合に腫瘍特異的であることを示した４４；４６；４８；５４。さらに、明白なにＩＬ−１３Ｒα２発現する唯一のヒト組織は精巣であると考えられる４２。本腫瘍・精巣限定的な発現パターンは、様々なヒト癌、最も顕著には、黒色腫及び腎細胞癌により発現される腫瘍抗原（すなわち、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ）の増加数を暗示する１０９−１１１。ワクチン及び養子Ｔ細胞療法での臨床経験は、抗原の本クラスが、精巣で同時自己免疫攻撃をせずに、全身腫瘍免疫療法に利用されうることを示した１１２−１１４。おそらくは、これは、無傷の血液・精巣関門及び免疫学的に免除される精巣内環境の作用に選択的に反映される。突然変異体ＩＬ−１３標的指向部分の鋭敏な特異性にもかかわらず、細胞が、体循環中へと十分な数で放出されてＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４β受容体を発現する組織を認識する場合、理論的には傷害性の可能性がある。このかけ離れた危険、さらには、ある患者に滴下されたＴ細胞が、腫瘍床で過度の炎症性反応を引き起こす可能性に照らして、クローンには、ガンシクロビルでの生体内除去にＴ細胞を感受性にするＨｙＴＫ遺伝子が含まれる１１５−１１８。患者内Ｔ細胞用量の段階的上昇戦略との組合せでのガンシクロビル自殺は、潜在的危険を最小限にし、関与する対象を研究するのに役立つ。
【００７２】
療法に関連した副作用（頭痛、熱、悪寒、悪心等）は、その状態に適当な確立された治療を用いて管理する。治療する医師の見解で、患者が有意の医学的危険状態になるいかなる新たな３度又はいかなる４度の治療関連傷害性でも認められれば、患者にガンシクロビルを与える。非経口投与したガンシクロビルは１２時間ごとに１０ｍｇ／ｋｇ／日で投与する。１４日過程が処方されるが、当該時間間隔で症状が消散できなければ延長できる。ガンシクロビルの治療はＩＬ−１３ゼータカイン＋ＨｙＴＫ＋ＣＤ８＋ＣＴＬクローンを除去する。患者は、監視目的のため、ガンシクロビル療法の最初の７２時間入院すべきである。症状が４８時間以内にガンシクロビルに応答しない場合、コルチコステロイド及びシクロスポリンが含まれるがこれに制限されない他の免疫抑制剤を、治療する医師の裁量で追加することができる。傷害性が重症である場合、治療する医師の裁量で、デカドロン及び／又は他の免疫抑制薬を、ガンシクロビルと共に早期に用いる。
【００７３】
【表１】
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【００７４】
【表２】
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【００７５】
【表３】
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【００７６】
【表４】
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【００７７】
【表５】
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【００７８】
【表６】
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【００７９】
【表７】
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【００８０】
【表８】
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【００８１】
【表９】
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【００８２】
【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】ＩＬ１３ゼータカインキメラ免疫受容体は、ＪｕｒｋａｔＴ細胞中で無傷のグリコシル化タンパク質として発現されることを示すウェスタンブロットの結果である。
【図２】発現したＩＬ１３ゼータカインキメラ免疫受容体は、Ｉ型膜貫通タンパク質として細胞表面へ移行することを示すフローサイトメトリー分析の結果である。
【図３】代表的な一次ヒトＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＴＬクローンの細胞表面表現型を示すフローサイトメトリー分析の結果である。
【図４Ａ】ＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＴＬクローンは、グリオーマ特異的な再指向された細胞溶解活性を獲得したことを示すクロム放出検定の結果である。
【図４Ｂ】一次ヒトＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＤ８＋ＣＴＬクローンによる抗グリオーマ細胞溶解活性のプロフィールがグリオーマ細胞中で一般的に観察されたことを示すクロム放出検定の結果である。
【図５】ＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＴＬクローンはグリオーマ刺激細胞によるサイトカイン生産で活性化されることを示すサイトカイン生産のインビトロ刺激の結果である。
【図６】Ａ、Ｂ及びＣ共に、抗ＩＬ１３Ｒ Ｍａｂ及びｒｈＩＬ１３によるサイトカイン生産でＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＴＬ活性化の特異的阻害を示すサイトカイン生産のインビトロ刺激の結果である。
【図７Ａ】ＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＤ８＋ＣＴＬ細胞は、グリオーマ刺激物との共培養時に増殖することを示す増殖研究の結果である。
【図７Ｂ】ＩＬ１３ゼータカイン＋ＣＤ８＋ＣＴＬ細胞のグリオーマに刺激された増殖の、ｒｈＩＬ−１３による阻害を示す増殖試験の結果である。
【図８Ａ】ＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧ構築のフローチャートである。
【図８Ｂ】ＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧ構築のフローチャートである。
【図８Ｃ】ＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧ構築のフローチャートである。
【図９】ＩＬ１３ゼータカイン／ＨｙＴＫ−ｐＭＧのプラスミド地図である。
【図１０】プラスミドＤＮＡベクターの核酸配列（上：配列番号１４；下：配列番号１６）及びＩＬ１３ゼータカイン（配列番号１７）及びＨｙＴＫ（配列番号１８）の該当するアミノ酸配列である。
【図１１】ＩＬ１３ゼータカインインサートの配列を示している略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１０−７】
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【図１０−８】
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【図１０−９】
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【図１０−１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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