(57)【要約】  本発明は、ストア作動性カルシウム流入およびCRACチャネル活性を調節し得る生物活性剤を同定するための、カルシウム放出活性化Ca+2(CRAC)チャネル(CRACM)、例えば、CRACM1およびCRACM2の使用に関する。本発明はさらに、CRACMをコードする組換え核酸の使用に関する。本発明の1つの局面は、候補生物活性剤のCRACMポリペプチドへの結合を決定し、CRACMポリペプチドがCRACチャネル透過性に影響を与えるようなその活性を調節する方法を含む。本発明はさらに、CRACMをコードする核酸の細胞内発現を調節する方法および組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
CRACMポリペプチドの活性を調節できる候補生物活性剤をスクリーニングする方法であって:
a) CRACMポリペプチドを発現する細胞を提供し;
b) 該細胞を候補生物活性剤と接触させ;そして、 
c) CRACMポリペプチドの発現またはイオンチャネル活性を測定すること(ここで、該候補生物活性剤の非存在下におけるCRACMポリペプチドの発現またはイオンチャネル活性と比較したときのCRACMポリペプチドの発現またはイオンチャネル活性の変化は、候補生物活性剤がCRACMポリペプチドの活性を調節できることを示す)
を含む、方法。
【請求項２】
該イオンチャネル活性が、ストア作動性カルシウム流入を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
該CRACMポリペプチドが、CRACM1ポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
該CRACMポリペプチドが、CRACM2ポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
細胞の二価カチオン透過性を調節できる候補生物活性剤をスクリーニングする方法であって:
a) CRACMを発現する細胞を候補薬剤と接触させ;そして、
b) 該候補薬剤が、細胞の二価カチオン透過性を調節するか否かを決定すること
を含む、方法。
【請求項６】
細胞の二価カチオン透過性が、該候補薬剤との接触により増加する、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
細胞の二価カチオン透過性が、該候補薬剤との接触により減少する、請求項5に記載の方法。
【請求項８】
二価カチオンが、Ca+2、Ba+2、Sr+2 およびMn+2からなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
【請求項９】
CRACMポリペプチドに結合できる生物活性剤をスクリーニングする方法であって:
a) CRACMポリペプチドを発現する組換え核酸を含む組換え細胞を提供し;
b) 組換え細胞を候補薬剤と接触させ;そして、
c) 細胞のCa+2透過性の調節を検出すること;
(ここで、Ca+2透過性の調節は、生物活性剤がCRACMポリペプチドに結合できることを示す)
を含む、方法。
【請求項１０】
Ca+2透過性が、該候補薬剤により増加する、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
Ca+2透過性が、該候補薬剤により減少する、請求項11に記載の方法。
【請求項１２】
該CRACMが、CRACM1である、請求項9に記載の方法。
【請求項１３】
該CRACMが、CRACM2である、請求項9に記載の方法。
【請求項１４】
CRACMポリペプチドに結合できる候補生物活性剤をスクリーニングする方法であって:
a) CRACMポリペプチドを候補薬剤と接触させ;そして、
b) 該候補薬剤のCRACMポリペプチドへの結合を決定すること
を含む、方法。
【請求項１５】
2個またはそれ以上の候補薬剤のライブラリーをCRACMポリペプチドと接触させる、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
該CRACMポリペプチドが、CRACM1ポリペプチドである、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
該CRACMポリペプチドが、CRACM2ポリペプチドである、請求項14に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも1個の細胞を、CRACM発現を阻害する薬剤と接触させることを含む、CRAC活性を阻害する方法。
【請求項１９】
少なくとも1個の細胞をCRACMポリペプチドのCRACM活性を阻害する薬剤と接触させることを含む、CRAC活性を阻害する方法。
【請求項２０】
CRACMが、CRACM1またはCRACM2である、請求項18または19に記載の方法。
【請求項２１】
該薬剤が、アンチセンスCRACM1核酸である、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
該薬剤が、アンチセンスCRACM2核酸である、請求項20に記載の方法。
【請求項２３】
該薬剤が、抗CRAC1抗体である、請求項20に記載の方法。
【請求項２４】
該薬剤が、抗CRAC2抗体である、請求項20に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2006年4月10日に出願した仮出願第60/791,038号に対して、合衆国法典第35巻§119(e)のもとでの利益を主張し、それは、引用により本明細書の一部とする。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本研究は、NIH補助金5-R37-GM053950(JPK)、R01-AI050200およびR01-NS040927(RP)、R01-GM065360(AF)により、一部、補助された。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
非興奮性細胞、特に、免疫細胞での受容体仲介シグナル伝達は、細胞内ストアからの放出による初期の細胞内Ca2+の上昇を伴う。その結果生じた細胞内ストアの減少は、カルシウム放出活性化カルシウム(CRAC)チャネルによる細胞膜を介したCa2+流入を誘導する(J. W. Putney, Jr., Cell Calcium 11, 611 (Nov-Dec, 1990); M. Hoth, R. Penner, Nature 355, 353 (Jan 23, 1992); A. B. Parekh, R. Penner, Physiol Rev 77, 901 (1997))。この現象は、遺伝子転写、増殖およびサイトカイン放出のような多くの生理学的過程の中心にある(A. B. Parekh, R. Penner, Physiol Rev 77, 901 (1997); M. Partiseti et al., J Biol Chem 269, 32327 (Dec 23, 1994); R. S. Lewis, Annu Rev Immunol 19, 497 (2001))。生物物理学的に、CRAC電流は、十分に特徴づけられているが(M. Hoth, R. Penner, Nature 355, 353 (Jan 23, 1992); M. Hoth, R. Penner, J Physiol (Lond) 465, 359 (1993); A. Zweifach, R. S. Lewis, Proc Natl Acad Sci U S A 90, 6295 (1993))、CRACチャネル自身の同定およびその活性化を生じさせる経路は、まだ未知である。最近、2つのグループが、独立して、ストア作動性カルシウム流入の重要な構成要素であるSTIM1を同定した(J. Liou et al., Curr Biol 15, 1235 (Jul 12, 2005); J. Roos et al., J Cell Biol 169, 435 (May 9, 2005))。このタンパク質は、おそらくERの部分を示す細胞内コンパートメントに局在する。それは、内腔Ca2+レベルのためのERセンサーとして仮定される機能のために重要であるように思われる内腔EF-ハンド(hand)モチーフを有する単一膜貫通ドメインを有する。貯蔵減少で、STIM1は、細胞膜表面下に移動および蓄積し、異なる構造(殻孔)に再分布する。実際にSTIM1が細胞膜に組み込まれるか否かについては、論争中である(J. Liou et al., Curr Biol 15, 1235 (Jul 12, 2005); .S. L. Zhang et al., Nature 437, 902 (Oct 6, 2005); M. A. Spassova et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103, 4040 (Mar 14, 2006))。STIM1は、CRAC電流を活性化するために必要であるが、その存在またはさらにそのトランスロケーションは、SCID患者由来のリンパ球が正常なSTIM1を有し、なおCRACチャネルを活性化できないので、十分ではない(S. Feske, et al., J Exp Med 202, 651 (Sep 5, 2005))。これは、他の分子構成要素が、ストア作動性Ca2+流入メカニズムに参加していることを示す。
【発明の開示】
【０００４】
発明の要約
本発明は、カルシウム放出活性化Ca+2(CRAC)チャネルモジュレーター(CRACM)、例えば、CRACM1およびCRACM2の使用に関する。本発明はさらに、CRACMをコードする組換え核酸の使用に関する。本発明の1つの局面は、候補生物活性剤が、CRACMポリペプチドのイオンチャネル活性を調節できるか否かを決定する方法を含む。また、本発明に包含されるのは、それがCRACチャネル透過性に影響を与えるとき、CRACMポリペプチド活性を調節できる薬剤をスクリーニングする方法である。本発明はさらに、CRACMをコードする核酸の細胞発現を調節する方法および組成物に関する。
【０００５】
本発明の1つの局面は、CRACMポリペプチドに結合する候補生物活性剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法では、CRACMポリペプチドを候補薬剤と接触させ、該候補薬剤が、CRACMポリペプチドに結合するか否かを決定する。本発明の1つの態様は、CRACMポリペプチドを2個またはそれ以上の候補薬剤のライブラリーと接触させ、次いで、1個またはそれ以上の候補薬剤のCRACMポリペプチドへの結合を決定することを提供する。好ましい態様では、CRACMポリペプチドは、図4で示したアミノ酸配列を有するCRACM1またはショウジョウバエCRACM2ポリペプチドを含む。
【０００６】
さらなる態様では、本発明は、細胞のCRAC活性を調節する生物活性候補薬剤をスクリーニングする方法を提供する。この態様では、細胞を候補薬剤と接触させ、二価カチオン透過性の調節を検出する。ある態様では、候補薬剤は、カチオン透過性を増加させる。他の態様では、候補薬剤は、カチオン透過性を減少させる。好ましいカチオンは、Ca+2である。
【０００７】
さらに、CRACMポリペプチドの発現を調節できる、候補生物活性剤をスクリーニングする方法を提供することが、本発明の目的である。この方法では、CRACMポリペプチドを発現できる組換え細胞が提供される。組換え細胞を候補薬剤と接触させ、CRACMポリペプチド発現に対する候補薬剤の効果を決定する。ある態様では、候補薬剤は、小分子、タンパク質、ポリペプチド、または核酸(例えば、アンチセンス核酸)を含み得る。本発明の他の態様では、CRACMポリペプチド発現レベルを、候補薬剤の存在下で決定し、これらのレベルを、内在性CRACM発現レベルと比較する。CRACMポリペプチド発現を制御するそれらの候補薬剤は、同様の効果が再現されるか否かを決定するために、非組換え細胞で試験し得る。
【０００８】
本発明はまた、少なくとも1個の細胞を(1)CRACM発現を阻害する薬剤および/またはCRACMポリペプチドを阻害する薬剤と接触させることを含む、CRAC活性を阻害する方法を提供する。
【０００９】
アンチセンスCRACM核酸および抗CRACM抗体は、また、本発明に包含される。
【００１０】
図の簡単な説明
図1は、ショウジョウバエにおけるストア作動性Ca2+流入の重要なレギュレーターとして、CRACM1およびCRACM2の同定を示す。自動蛍光イメージングプレートリーダー(FLIPR)を用いて、一次ハイスループットスクリーニングで、ショウジョウバエS2R+細胞で測定したCa2+シグナル。(A) CRACM1 dsRNAから取得した相対蛍光強度(r.f.u.)におけるFluo-4-AM蛍光変化。参照トレースを、Rho1 dsRNA (モック)およびSTIM1 dsRNAのために提供する。細胞を無Ca2+溶液で保ち、タプシガルギン(2 μM)に曝し、その後、2 mM Ca2+を添加した。トレースは、一次スクリーニングの2回の独立した試行を代表する。(B) (A)と同様ではあるが、CRACM2 dsRNAで処理した細胞に関するプロトコール。(C) ショウジョウバエKc細胞で測定したIP3誘導(20 μM) ICRACの標準化した平均経時変化。個々の細胞の電流を−80 mVで測定し、それらの各々の細胞サイズで標準化し、平均化および対時間プロット(± S.E.M.)した。細胞質カルシウムを、10 mM BAPTAおよび4 mM CaCl2を用いて、150 nMに固定した。トレースは、未処理コントロール(wt; 黒丸、n = 10)、Rho1 dsRNA (モック; 白丸、n = 8)、CRACM1 dsRNA (赤丸、n = 6)およびCRACM2 dsRNA (緑丸、n = 9)に相当する。(D) −100から＋100 mVまでの50 msランプ電圧により誘導された電流からの60 sで、代表的な細胞から抽出したICRACの、漏洩抽出し、準化した平均電流電圧 (I/V)データトレース。トレースは、未処理コントロール(wt、n = 9)、CRACM1 dsRNA (n = 5)およびCRACM2 dsRNA (n = 6)に相当する。(E) IP3が除外され、受動的貯蔵減少を誘導するために、[Ca2+]iが10 mM BAPTAでほぼゼロに固定されたこと以外、パネル(C)と同様。トレースは、未処理コントロール(wt;黒丸、n = 4)およびCRACM1 dsRNA (赤丸、n = 3)に相当する。(F) −100から＋100 mVまでの50 msランプ電圧により誘導された電流からの200 sで、代表的な細胞から抽出したICRACの、漏洩抽出し、準化した平均電流電圧 (I/V)データトレース。トレースは、未処理コントロール(wt、n = 4)およびCRACM1 dsRNA (n = 3)から取得した受動的減少誘導ICRACに相当する。
【００１１】
図2は、HEK293およびJurkat細胞でのCRACM1 siRNAによるストア作動性Ca2+流入およびICRACの抑制を示す。(A) 左パネル: 2個の異なるCRACM1特異的siRNAおよびスクランブル配列コントロールで感染させた、HEK293細胞からのCRACM1 mRNAの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)。サイクル数: 24、27、30。右パネル: 小リボソームタンパク質に特異的なプライマーを使用したRT-PCRのためのポジティブコントロール。サイクル数: 24、27、30。(B) HEK293細胞で、スクランブル(コントロール)および2個の異なるCRACM1特異的siRNAで処理した細胞での[Ca2+]iのFura-2-AM蛍光測定。細胞を無Ca2+溶液で保ち、タプシガルギン(2 μM)に曝し、その後、2 mM Ca2+を添加した。トレースは、3回の独立した実験を代表する。(C) (B)と同様ではあるが、Jurkat細胞に関するプロトコール。トレースは、3回の独立した実験の平均である。(D) HEK293細胞で測定したIP3誘導(20 μM) ICRACの標準化した平均経時変化。トレースは、スクランブル(黒丸、n = 13)、CRACM1 siRNA-1 (赤丸、n = 10)およびCRACM1 siRNA-2 (青丸、n = 9)に相当する。(E) −100から＋100 mVまでの50 msランプ電圧により誘導された電流からの60 sで、代表的な細胞から抽出したICRACの、漏洩抽出し、準化した平均電流電圧 (I/V)データトレース。トレースは、スクランブル(n = 10)、CRACM1 siRNA-1 (n = 8)およびCRACM1 siRNA-2 (n = 7)に相当する。(F) パネル(D)と同じではあるが、Jurkat細胞に関する。トレースは、スクランブル(黒丸、n = 9)、CRACM1 siRNA-1 (赤丸、n = 8)およびCRACM1 siRNA-2 (青丸、n = 8)に相当する。(G) −100から＋100 mVまでの50 msランプ電圧により誘導された電流からの60 sで、代表的な細胞から抽出したICRACの、漏洩抽出し、準化した平均電流電圧 (I/V)データトレース。トレースは、スクランブル(n = 9)、CRACM1 siRNA-1 (n = 7)およびCRACM1 siRNA-2 (n = 8)に相当する。
【００１２】
図3は、HEK293、Jurkat細胞およびRBL-2H3細胞でのCRACM1の過剰発現を示す。(A) 抗mycまたは抗His C末端抗体を用いた免疫沈降および抗myc抗体を用いたイムノブロッティングによる、CRACM1の過剰発現に関するHEK293細胞の解析。空ベクタートランスフェクション細胞からのコントロール免疫沈降は、あらゆるバンドを示さなかった。(B) HEK293細胞で測定したIP3-誘導(20 μM) ICRACの標準化した平均経時変化。個々の細胞の電流は、−80 mVで測定し、それらの各々の細胞サイズで標準化し、平均化および対時間プロット(± S.E.M.)した。細胞質カルシウムを、10 mM BAPTAおよび4 mM CaCl2を用いて、150 nMに固定した。トレースは、空ベクターをトランスフェクションした細胞(コントロール;黒丸、n = 13)およびGFP＋CRACM1でトランスフェクションした細胞(赤丸、n = 14)に相当する。(C) パネル(B)と同じではあるが、Jurkat細胞に関する。トレースは、空ベクタートランスフェクション細胞(コントロール;黒丸、n = 4)およびGFP＋CRACM1でトランスフェクションした細胞(赤丸、n = 5)に相当する。(D) パネル(B)と同じではあるが、RBL-2H3細胞に関する。トレースは、空ベクタートランスフェクション細胞(コントロール;黒丸、n = 9)およびGFP＋CRACM1でトランスフェクションした細胞(赤丸、n = 9)に相当する。(E) 共焦点顕微鏡で視覚化したHEK293細胞でのCRACM1の免疫蛍光局在。インタクト細胞(左パネル)および透過性細胞(右パネル)でのCRACM1-flag-N末端(上パネル)またはCRACM1-myc-C末端(下パネル)のための免疫染色。(F) (E)の右下パネルと同じではあるが、細胞膜染色を示すための選択した細胞のより高い倍率。
【００１３】
図4Aは、ヒトCRACM1の核酸配列である。
【００１４】
図4Bは、ヒトCRACM1のアミノ酸配列である。
【００１５】
図5は、HEK-293細胞で発現したCRACM1からのデータを示す。(A) Flag-CRACM1およびCRACM1-Myc-Hisを共トランスフェクションしたHEK293細胞からのCRACM1の共沈。レーン2は、Flag-CRACM1が、CRACM1-Myc-Hisと共沈することを示す。レーン3は、逆の共IPを示し、レーン1および4は、コントロールIPを示す。(B) HEK-293に共トランスフェクションさせたFlag-CRACM1およびStim1-Myc-Hisの共沈。全細胞ライセートを、抗myc抗体(第1レーン)または抗flag抗体(第2レーン)で免疫沈降し、抗myc抗体(上パネル)または抗flag抗体(下パネル)でブロットした。(C) ヒトCRACM1、CRACM2、およびCRACM3ならびにさまざまな種(ショウジョウバエ、マウス、ラット、およびニワトリ)由来のCRACM1の配列アライメント(酸性残基を強調し、残基数は、CRACM1のヒト配列に関する)。(D) D110/112A-CRACM1およびE106Q-CRACM1突然変異体のwt-CRACM1との共IP。レーン1は、D110/112A-CRACM1-Myc-Hisが、Flag-CRACM1と共IPし得ることを示し、レーン3は、CRACM1-Myc-Hisが、Flag-E106Q-CRACM1と共IPし得ることを示す。レーン2および4は、コントロールを示す。(E) Flag-CRACM1、D110/112A-CRACM1-Myc-His、Flag-E190Q-CRACM1およびFlag-E106Q-CRACM1でトランスフェクトし、突然変異体の細胞局在を示すために、各々、抗mycまたは抗flag抗体で染色したHEK293細胞の共焦点イメージ。
【００１６】
図6は、CRACM1突然変異体を用いた選択性実験の結果を示す。(A) STIM1を、野生型CRACM1(黒丸、n = 14)およびE106Q突然変異体(赤丸、n =9)と共発現させたHEK293細胞で測定した、IP3誘導(20 μM) CRAC電流の標準化した平均経時変化。個々の細胞の電流を−80 mVで測定し、細胞静電容量で標準化し、平均化および対時間プロット(± S.E.M.)した。細胞質カルシウムを、20 mM BAPTAでゼロ近くに固定した。棒は、無二価(DVF)溶液の適用を示す。(B) 実験において120 sで、パネルAで示した代表的なHEK293細胞から抽出した、CRAC電流の平均電流電圧 (I/V)関係。データは、−100から＋150 mVまでの50 msランプ電圧により誘導された平均漏洩抽出電流を示し、細胞静電容量(pF)まで標準化した。トレースは、STIM1 ＋ wt-CRACM1 (wt、n = 12)またはSTIM1 ＋ E106Q突然変異体(n = 6)に相当する。(C) E106D突然変異体により産生された−80および＋130 mVでのIP3誘導(20 μM)電流の標準化した平均経時変化。細胞を、黒色棒で示した時間で、名目上無Ca2+外液(黒丸、n = 6)または無Na+溶液(赤丸、n = 6)に曝した。電流は、パネルAのとおり解析した。120 s (黒色トレース、n = 6)で、および無Ca2+(青色トレース、n = 6)もしくは無Na+(赤色トレース、n = 6)溶液(パネルCで示したものと同じ細胞)の適用の後に抽出したE106D突然変異体の平均I/Vトレース。データ解析は、パネルBのとおりである。(E) wt-CRACM1(黒丸、n = 9)またはE106D突然変異体(赤丸、n = 7)を発現するHEK293でのCRAC電流の標準化した平均経時変化。解析は、パネルAのとおりである。細胞を、黒色棒で示した時間で、10 mM Ba2+ (および0 Ca2+)を含む外液で表面かん流した。Na+電流混入を避けるために、細胞を、細胞外Na+(TEA+で置換された)の非存在下で、Ba2+で表面かん流したことに留意すべきである。(F) Ba2+適用の前(120 s、n = 4)後(180 s、n = 4)で、パネルEで示したE106D突然変異体を発現する代表的なHEK293細胞から抽出した電流の平均I/Vデータトレース。解析は、パネルBのとおりである。(G) E190Q突然変異体で産生した−80および＋130 mVでのIP3誘導(20 μM)電流の標準化した平均経時変化。細胞を、名目上無Ca2+外液(黒丸、n = 7)または無Na+溶液に曝し、そこでは、Ca2+は、棒で示した時間でBa2+ (赤丸、n = 8)で置換された。電流は、パネルAのとおり解析した。(H) 120 s (黒色トレース、n = 8)および10 Ba2+ (赤色トレース、n = 8)または無Ca2+溶液(青色トレース、n = 7;パネルGで示したとおりの同じ細胞)の適用の最後で抽出された、E190Q突然変異体の平均I/Vトレース。データ解析は、パネルBのとおりである。
【００１７】
図7は、CRACM1のポア突然変異体を用いた選択性実験を示す。(A) STIM1を、wt-CRACM1 (黒丸、n = 12)またはCRACM1のD110/112A突然変異体 (赤丸、n =11)と共発現させたHEK293細胞で測定した、IP3誘導(20 μM) CRAC電流の標準化した平均経時変化。個々の細胞の電流を−80 mVおよび＋130 mVで測定し、細胞静電容量で標準化し、平均化および対時間プロット(± S.E.M.)した。細胞質カルシウムを、20 mM BAPTAでゼロ近くに固定した。黒色棒は、TEA+で置換されたNa+と共に10 mM Ca2+を含む外液の適用を示す。(B) wt-CRACM1 (黒色トレース、図2Aで示したものと同じデータ)またはD110/112A突然変異体により産生された、IP3誘導(20 μM)電流の平均経時変化。電流は、120 s (I/I120s)での一致まで標準化した。D110/112A突然変異体を発現する細胞を、Na+ の存在下(130 mM、n = 13)、または非存在下で(TEA+置換、n = 5)、名目上無Ca2+外液で表面かん流した。かん流時間は、黒色棒により示す。電流は、パネルAのとおり解析した。(C) パネルAおよびBで示した代表的なHEK293細胞から抽出した、CRAC電流の平均I/V関係。データは、−100から＋150 mVまでの50 msランプ電圧により誘導された平均漏洩抽出電流を示し、細胞静電容量(pF)まで標準化した。トレースは、10 mM Ca2+を含む無Na+溶液(180 s)の適用後のwt-CRACM1発現細胞(黒色トレース、n = 10; D110/112A突然変異体の内部電流サイズに適合させるための1.7までの規模で)および通常のNa+を含む名目上の無Ca2+溶液の適用前(120 sで、青色トレース、n = 11)またはその間(赤色トレース、n = 11)に抽出したD110/112A突然変異体を示す。(D) Na+ (赤線、パネルBで示したものと同じデータ)、K+ (黒丸、n = 12)またはCs+ (青丸、n = 9)を含む名目上の無Ca2+溶液で表面かん流した細胞のD110/112A突然変異体により産生した、IP3誘導(20 μM)電流の標準化した平均経時変化 (I/I120s)。適用時間は、黒色棒により示す。電流は、パネルAのとおり解析した。(E) wt-CRACM1 (黒丸、n = 8)またはD110/112A突然変異体 (赤丸、n = 8)により産生したIP3誘導(20 μM)電流の標準化した平均経時変化(I/I120s)。細胞を、黒色棒により示したとおり、10 μM Ca2+を補充した名目上の無二価外液で、表面かん流した。電流は、パネルAのとおり解析した。(F) wt-CRACM1 (黒丸、n = 5-14)またはD110/112A突然変異体(赤丸、n = 5-8)の異常モル断片効果(Anomalous mole fraction effect)。異なるCa2+濃度で測定した電流サイズを、10 mM Ca2+で取得した電流振幅に関連して設定し、平均化および増加した細胞外Ca2+濃度に対するプロットを行った。(G) 外液で表面かん流した細胞で、wt-CRACM1により産生したIP3誘導(20 μM)電流の標準化した平均経時変化 (I/I120s)［そこでは、10 mM Ca2+を、等モル濃度で、Na+ の非存在下(Na+電流混入を避けるために、TEA+で置換した)、Ba2+ (黒丸、n = 9)またはSr2+ (青丸、n = 7)で置換した］。電流は、パネルAのとおり解析した。(H) 10 mM Ca2+を、Na+の非存在下(Na+電流混入を避けるために、TEA+で置換した)、等モル濃度で、Ba2+ (黒丸、n = 7)またはSr2+ (青丸、n = 7)で置換した外液で表面かん流した細胞において、D110/112A突然変異体により産生されたIP3誘導(20 μM)電流の標準化した平均経時変化 (I/I120s)。電流は、パネルAのとおり解析した。(I) wt-CRACM1 (黒色、n = 5-12)またはD110/112A突然変異体 (赤色、n = 5-14)の透過プロファイル。−80 mVの電流を、外部適用交換の後、評価し(180 s)、適用前の電流に関連して設定し(120 s)、平均化および静止電流として割合(%)でプロットした。デ���タを適用条件(10 mM Ca2+、10 mM Ba2+、10 mM Sr2+、130 mM Na+、130 mM K+、130 mM Cs+)により分類した。一価コンダクタンスを、標準的なMg2+濃度(2 mM)の存在下、名目上無Ca2+溶液で評価した。データは、パネルAからパネルHの要約を示す。
【００１８】
発明の詳細な説明
機能的CRACMは、CRACチャネル活性のために必要とされる。本発明は、部分的に、CRACMポリペプチドに結合し、CRACMとの相互作用によりCRACイオンチャネル活性を調節し、細胞内のCRACポリペプチドの発現を変える分子を同定するのに有用な方法に関する。
【００１９】
CRACM1は、ショウジョウバエおよびヒトで発現する。CRACM1は、免疫細胞で発現すると考えられている。したがって、CRACM1タンパク質との相互作用またはCRACM1発現の破壊により、CRACチャネル活性を調節する薬剤は、炎症過程、アレルギー反応および自己免疫疾患を調節するのに使用し得る。
【００２０】
CRACM2は、ショウジョウバエで発現しており、ヒトでは、既知のオーソログは有していない。CRACM2のCRACチャネル活性を破壊するか、またはCRACM2の発現を阻害する薬剤は、農薬として使用し得る。
【００２１】
本明細書で使用するとき、“CRACM”なる用語は、カルシウム放出活性Ca+2(CRAC)チャネルモジュレーターのファミリーのことを言う。CRACMポリペプチドは、それらのアミノ酸配列、それらをコードする核酸、およびそれらの特性により定義される。
【００２２】
ヒトCRACM1ポリペプチドの配列は、本明細書の図4Bに開示する。ショウジョウバエCRACM1およびCRACM2の配列は、オンラインで、(1)ショウジョウバエCRACM1(olf186-F): http://flybase.bio.indiana.edu/.bin/ asksrs.html?%5Blibs%3D%7BFBgn%20PFgn%7D-all%3AFBgn0041585%5Dおよび(2)ショウジョウバエCRACM2(dpr3): http://flybase.bio.indiana.edu/.bin/ asksrs.html?%5Blibs%3D%7BFBgn%20PFgn%7D-all%3AFBgn0053516%5Dに見出し得る。
【００２３】
“CRACM配列”なる用語は、特に、自然に生じる欠失もしくは分泌型(例えば、細胞外ドメイン配列またはアミノ末端断片)、自然に生じる変異型(例えば、オルタナティブスプライシング型)および自然に生じるアレル変異型を包含する。
【００２４】
本発明の方法で、または他の目的のために使用し得るCRACMポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列と、少なくとも約80%アミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約85%アミノ酸配列同一性、さらに、より好ましくは、少なくとも約90%アミノ酸配列同一性、そして、さらに、より好ましくは、少なくとも約95%、97%、98%または99%配列同一性
を有するポリペプチド、またはその断片を含む。該CRACMポリペプチドは、例えば、1個またはそれ以上のアミノ酸残基が、NもしくはC末端で、および1個またはそれ以上の内部ドメイン内で、置換および/または欠失しているポリペプチドを含む。アミノ酸変化が、CRACMポリペプチド変異型の翻訳後過程を変え得る、例えば、グリコシル化サイトの数もしくは位置を変えるか、または膜アンカー特性を変えることを、当業者は、十分に理解している。あらゆるCRACMポリペプチドは、しかしながら、本明細書に記載した1個またはそれ以上のCRACMポリペプチドの新規特性を示す。
【００２５】
本明細書で同定したCRACMポリペプチド配列に関する“割合(%)アミノ酸配列同一性”は、所望により、最大の配列割合同一性を達成するために、配列を並べ、ギャップを導入した後、配列番号2のアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の割合として定義し、あらゆる保存的置換は、配列同一の一部として考えない。%同一性値は、WU BLAST 2により作成し得る(Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460 480 (1996))。WU BLAST 2は、いくつかの探索パラメーターを使用し、その多くは、デフォルト値に設定されている。調節可能なパラメーターは、下記の値に設定する: 重複範囲 =1、重複率(fraction) = 0.125、ワード(word)閾値 (T) = 11。HSP SおよびHSP S2パラメーターは、動的値(dynamic values)であり、特定の配列の構成および興味がある配列を探索している特定のデータベースの構成に依存して、プログラム自身により確立されている;しかしながら、該値は、感度を高めるために調節し得る。A %アミノ酸配列同一性値は、並べた領域の“より長い”配列の全残基数で割った一致する同一残基の数により決定する。“より長い”配列は、並べた領域の最も現実的な残基を有する配列である(アライメントスコアを最大にするために、WU Blast 2により導入されたギャップは、無視する)。
【００２６】
さらなる態様では、本明細書で使用する%同一性値は、PILEUPを用いて作成する。PILEUPは、逐次的ペアアライメントを用いて、関連する配列の群からの多配列アライメントを作成する。それはまた、アライメントを作成するために使用する、クラスタリング関係を示すツリーをプロットし得る。PILEUPは、Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)の簡素化進歩的アライメント法を使用し;該方法は、Higgins & Sharp CABIOS 5:151-153 (1989)に記載されたものに類似する。有用なPILEUPパラメーターは、3.00のデフォルトギャップ重量、0.10のデフォルトギャップ長重量、および重量末端ギャップを含む。
【００２７】
また、他の態様では、ヒトから、もしくは他の生物からのCRACMポリペプチドを、適当なゲノムもしくはcDNAライブラリーを用いて、オリゴヌクレオチドプローブまたは縮重ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマー配列を使用することにより、同定および単離し得る。当業者により理解されているとおり、配列番号1のヌクレオチド配列またはその部分を有する固有のCRACM核酸は、特に、プローブまたはPCRプライマー配列として有用である。一般に、当業者に既知のとおり、好ましいPCRプライマーは、約15から約35ヌクレオチド長、好ましくは、約20から約30であり、所望により、イノシンを含み得る。PCR反応のための条件は、当業者に既知である。
【００２８】
好ましい態様では、CRACMは、組換え技術を用いて、すなわち、組換えCRACM核酸の発現を介して製造される、“組換えタンパク質”または“組換えポリペプチド”である。組換えタンパク質は、少なくとも1個またはそれ以上の特性により、自然に生じたタンパク質から区別される。例えば、該タンパク質は、通常、その野生型宿主に関連するいくつかのまたはすべてのタンパク質および化合物から、単離または精製され得て、したがって、実質的に、純粋であり得る。例えば、単離したタンパク質は、通常、その自然状態で関連する少なくともいくつかの物質を伴わず、好ましくは、特定のサンプル中、全タンパク質重量で、少なくとも約0.5%、より好ましくは、少なくとも約5%を構成する。実質的に純粋なタンパク質は、全タンパク質重量で、少なくとも約75%、好ましくは、少なくとも80%、より好ましくは、少なくとも約90%、とりわけ好ましくは、少なくとも約95%を含む。定義は、異なる生物または宿主において、ある生物由来のタンパク質の産生を含む。あるいは、タンパク質は、誘導可能プロモーターまたは高発現プロモーターの使用を介して、通常見られるよりも、十分に高濃度で製造され得て、その結果、タンパク質は、増加した濃度レベルで製造される。あるいは、タンパク質は、通常は、事実上見出されない形態であり得て、例えば、下記したとおり、エピトープタグの添加またはアミノ酸置換、付加および欠失の添加された形態である。
【００２９】
本明細書で使用する“CRACM核酸”またはそれらの文法的同等物は、CRACMポリペプチドをコードする核酸のことを言う。CRACM核酸は、CRACM1およびCRACM2に対する配列相同性を示し、そこでは、相同性は、配列を比較することによるか、またはハイブリダイゼーションアッセイにより決定する。
【００３０】
CRACMポリペプチドをコードするCRACM核酸は、図4Aで示したDNA配列と相同である。該CRACM核酸は、好ましくは、約75%相同性を超え、より好ましくは、約80%を超え、より好ましくは、約85%を超え、そして最も好ましくは、90%相同性を超える。ある態様では、相同性は、約93%、95%、97%、98%または99%の高さである。本明細書中で、相同性は、配列類似性または同一性を意味し、同一性が好ましい。相同性目的のための好ましい比較は、シークエンシング差異(sequencing differences)を含む配列を、既知のCRACM配列と比較することである。この相同性は、非限定的に、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局地的相同性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アライメントアルゴリズム、Pearson & Lipman, PNAS USA 85:2444 (1988)の相同性探索法、これらのアルゴリズムのコンピューター実施(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WIのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)、Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12:387-395 (1984)により記載されたBest Fit配列プログラムを含む、当業者に既知の標準的な技術を用いて、好ましくは、デフォルト設定を用いるか、または検討により決定する。
【００３１】
好ましい態様では、本明細書で使用する%同一性値は、PILEUPアルゴリズムを用いて作成する。PILEUPは、逐次的ペアアライメントを用いて、関連する配列の群からの多配列アライメントを作成する。それはまた、アライメントを作成するために使用する、クラスタリング関係を示すツリーをプロットし得る。PILEUPは、Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)の簡素化進歩的アライメント法を使用し;該方法は、Higgins & Sharp CABIOS 5:151-153 (1989)に記載されたものに類似する。有用なPILEUPパラメーターは、3.00のデフォルトギャップ重量、0.10のデフォルトギャップ長重量、および重量末端ギャップを含む。
【００３２】
好ましい態様では、BLASTアルゴリズムを使用する。BLASTは、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, (1990)およびKarlin et al., PNAS USA 90:5873-5787 (1993)に記載されている。特に有用なBLASTプログラムは、Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460 480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.htmlから取得した、WU-BLAST-2である。WU BLAST 2は、いくつかの探索パラメーターを使用し、その多くは、デフォルト値に設定されている。調節可能なパラメーターは、下記の値に設定する: 重複範囲 =1、重複率 = 0.125、ワード閾値 (T) = 11。HSP SおよびHSP S2パラメーターは、動的値であり、特定の配列の構成および興味がある配列を探索している特定のデータベースの構成に依存して、プログラム自身により確立されている;しかしながら、該値は、感度を高めるために調節し得る。A %アミノ酸配列同一性値は、並べた領域の“より長い”配列の全残基数で割った一致する同一残基の数により決定する。“より長い”配列は、並べた領域の最も現実的な残基を有する配列である(アライメントスコアを最大にするために、WU Blast 2により導入されたギャップは、無視する)。
【００３３】
好ましい態様では、“パーセント(%)核酸配列同一性”は、CRACMヌクレオチド残基配列と同一である候補配列におけるヌクレオチド残基の割合として定義する。好ましい方法は、デフォルトパラメーターに設定された(重複範囲および重複画分が、それぞれ、1および0.125に設定されている)WU-BLAST-2のBLASTNモジュールを利用する。
【００３４】
アライメントは、並べられた配列におけるギャップの導入を含み得る。さらに、CRACM1またはCRACM2のそれらよりもより多いか、またはより少ないヌクレオシドを含む配列に関しては、相同性割合は、ヌクレオシドの全数との関連で、相同なヌクレオシドの数に基づいて決定されるものと理解されるべきである。したがって、例えば、本明細書で同定した、および下記した配列のそれらよりも短い配列の相同性は、より短い配列のヌクレオチドの数を用いて決定される。
【００３５】
上記したとおり、CRACM核酸はまた、ハイブリダイゼーション研究を介して決定された相同性により定義し得る。ハイブリダイゼーションは、低ストリンジェンシー条件下、より好ましくは、中ストリンジェンシー条件下、最も好ましくは、高ストリンジェンシー条件下で測定する。該相同な核酸によりコードされたタンパク質は、本明細書に記載した少なくとも1個の新規CRACMポリペプチド特性を示す。したがって、例えば、配列番号1で示した配列を有する核酸およびそれらの相補体に、高ストリンジェンシー下、ハイブリダイズする核酸は、それらが、CRACM特性を有するタンパク質をコードするとき、CRACM核酸配列であると考えられる。
【００３６】
ハイブリダイゼーション反応の“ストリンジェンシー”は、当業者により容易に決定し得て、一般に、プローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存した経験的計算である。一般には、より長いプローブは、適当なアニーリングのためにより高い温度を必要とし、処理短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、変性したDNAが、相補鎖がそれらの融点以下の環境で存在するとき、再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列間の望む相同性の程度が高い程、使用し得る相対的な温度は、高くなる。結果として、当然に、より高い相対的な温度は、反応条件をよりストリンジェントにする傾向があり、より低い温度は、そうしない傾向がある。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる例に関しては、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと(その全体を引用により本明細書の一部とする)。
【００３７】
本明細書に記載した“ストリンジェント条件”または“高ストリンジェント条件”は、下記により同定し得る: (1) 洗浄のために、低イオン強度および高温を、例えば、50℃で、0.015 M塩化ナトリウム/0.0015 Mクエン酸ナトリウム/0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを使用する;(2) ハイブリダイゼーションの間、変性剤、例えば、ホルムアミド、例えば、42℃で、0.1%ウシ血清アルブミンを含む50% (v/v)ホルムアミド/0.1%フィコール/0.1%ポリビニルピロリドン/750 mM塩化ナトリウム、75 mMクエン酸ナトリウムを含むpH 6.5の50mMリン酸ナトリウム緩衝液を使用する; または(3)42℃で、50%ホルムアミド、5 x SSC (0.75 M NaCl、0.075 Mクエン酸ナトリウム)、50 mMリン酸ナトリウム(pH 6.8)、0.1%ピロリン酸ナトリウム、5 x デンハルト溶液、超音波破砕サケ精子DNA(50 μg/ml)、0.1% SDS、および10%硫酸デキストランを使用し、42℃で0.2 x SSC (塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)および55℃で50%ホルムアミドで洗浄し、その後、55℃で、EDTAを含む0.1 x SSCからなる高ストリンジェンシー洗浄を行う。
【００３８】
“中ストリンジェント条件”は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されたとおり同定し得て、上記したもの程ストリンジェントでない洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件(例えば、温度、イオン強度および%SDS)の使用を含む。中ストリンジェント条件の例は、20%ホルムアミド、5 x SSC (150 mM NaCl、15 mMクエン酸三ナトリウム)、50 mMリン酸ナトリウム(pH 7.6)、5 x デンハルト溶液、10%硫酸デキストラン、および20 mg/mL変性剪断サケ精子DNAを含む溶液で、37℃で一晩インキュベーションし、その後、約37-50℃で、フィルターを、1 x SSCで洗浄する。当業者は、温度、イオン強度などを調節し、必要に応じて、プローブ長などのような因子を適合させる方法を認識している。一般に、ストリンジェント条件は、定義したイオン強度pHで、特異的な配列のための熱融点(Tm)よりも約5-10℃低いように選択される。Tmは、標的に相補的なプローブの50%が、平衡で、標的配列にハイブリダイズする(Tmで、標的配列が過度に存在するとき、プローブの50%が、平衡で占有する)温度である(定義したイオン強度、pHおよび核酸濃度下)。ストリンジェント条件は、塩濃度が、pH 7.0から8.3で、約1.0 Mナトリウムイオン未満、典型的には、約0.01から1.0 Mナトリウムイオン濃度(または他の塩)未満であり、温度が、短プローブ(例えば、10から50ヌクレオチド)のために少なくとも約30℃、長プローブ(例えば、50ヌクレオチド以上)のために少なくとも約60℃である条件である。ストリンジェント条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加で達成し得る。
【００３９】
他の態様では、あまりストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件を使用し;例えば、当業者に既知のとおり、中または低ストリンジェンシー条件を使用し得る。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに関するさらなる詳細に関しては、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【００４０】
本明細書に記載したCRACM核酸は、記載したとおり、一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または二本鎖もしくは一本鎖配列の両方の部分を含み得る。当業者により理解されるとおり、一本鎖なる描写は、また、他方の鎖の配列を定義し;したがって、本明細書に記載された配列は、また、該配列の相補体を含む。核酸は、DNA、ゲノムおよびcDNAの両方、RNAまたはハイブリッドであり得て、そこでは、核酸は、デオキシリボおよびリボヌクレオチドのあらゆる組合せ、ならびに、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む塩基の組合せを含む。本明細書で使用する“ヌクレオシド”なる用語は、ヌクレオチドおよびヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体、および修飾ヌクレオシド、例えば、アミノ酸修飾ヌクレオシドを含む。さらに、“ヌクレオシド”は、自然に生じない類似体構造を含む。したがって、例えば、各々塩基を含むペプチド核酸の個々のユニットは、本明細書では、ヌクレオシドと呼ばれる。
【００４１】
本明細書に記載したCRACM核酸は、組換え核酸である。本明細書の“組換え核酸”なる用語は、一般には、通常は自然に見出されない形態で、ポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼによる核酸の操作により、もともとインビトロで形成された核酸を意味する。したがって、直線型の単離した核酸、または通常は加わらないDNA分子を結合させることにより、インビトロで形成した発現ベクターは、本発明の目的のための組換え体であると考えられる。組換え核酸が作製され、宿主細胞もしくは生物に再導入されると、それは、非組換え的に、すなわち、インビトロ操作よりもむしろ宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製する;しかしながら、そのような核酸は、いったん組換え的に産生されると、その後、非組換え的に複製されたとしても、まだ本発明の目的のための組換え体であると考えられると理解されるべきである。CRACM核酸分子のホモログおよびアレルは、定義に含まれる。
【００４２】
CRACM配列は、GenBankのような公のデータベースまたは私的な配列データベースに置かれ、利用可能である他の既知の配列と比較し、そして並べ得る。分子の限定した領域内の、または完全長配列の配列同一性(アミノ酸またはヌクレオチドレベルで)は、コンピューターソフトウェアプログラム、例えば、相同性を測定するのにさまざまなアルゴリズムを使用するALIGN、DNAstar、BLAST、BLAST2およびINHERITを用いて、配列アライメントを介して決定し得る(上記したとおりである)。
【００４３】
他の態様では、本明細書に記載したCRACM核酸は、自然に生じるCRACM核酸を検出する診断適用、およびスクリーニング適用を含む、さまざまな適用において有用であり;例えば、CRACM核酸配列に対する核酸プローブを含むバイオチップを作製し得る。
【００４４】
他の態様では、CRACM核酸配列は、より巨大な遺伝子のcDNA断片であり、それは、すなわち、核酸断片である。本明細書中の“遺伝子”は、コード領域、非コード領域、およびコード領域と非コード領域の混合を含む。したがって、当業者に理解されているとおり、本明細書で提供した配列を使用し、より長い配列または完全長配列をクローン化するために当業者に既知の技術を用いることにより、CRACM遺伝子のさらなる配列を取得し得る;上記のManiatis et al.およびAusubel, et al.を参照のこと(それは、引用により本明細書の一部とする)。
【００４５】
上記したとおり、CRACM核酸を同定すると、それをクローン化し得て、所望により、その構成部分を再結合して、全CRACM遺伝子を形成し得る。天然源から単離したとき、例えば、プラスミドもしくは他のベクターに含まれるか、または直線核酸断片としてそこから切り出したとき、組換えCRACM核酸は、さらに、他の多細胞真核生物由来の他のCRACM(例えば、さらなるコード領域)を同定するか、または単離するためのプローブとして使用し得る。
【００４６】
他の態様では、CRACMポリペプチドをコードする上記したCRACM核酸(例えば、cDNAまたはゲノムDNA)を、クローン化(DNAの複製)のために、または発現のために、複製可能なベクターに挿入し得る。さまざまなベクターが、一般に、利用可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態であり得る。適当な核酸配列を、さまざまな手順により、ベクターに挿入し得る。一般には、DNAは、当業者に既知の技術を用いて、適当な制限エンドヌクレアーゼサイトに挿入される。ベクター構成要素は、一般に、非限定的に、1個またはそれ以上のシグナル配列、複製開始点、1個またはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列を含む。これらの構成要素の1個またはそれ以上を含む適当なベクターの構築は、当業者に既知の標準的なライゲーション技術を使用する。
【００４７】
該ベクターを含む宿主細胞を、また、提供する。一例として、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、COS細胞、ヒト骨髄から単離した細胞、ヒト脾臓もしくは腎臓細胞、ヒト心臓組織から単離した細胞、ヒト膵臓細胞、ならびにヒト白血球および単球細胞を含む、ほ乳類宿主細胞株であり得る。宿主細胞のより特定の例は、SV40で形質転換したサル腎臓CV1株(COS-7、ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株(293または懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977));チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));ヒト膵臓β細胞;マウスセルトリ細胞(TM4、Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980));ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75);ヒト肝臓細胞(Hep G2、HB 8065);およびマウス乳癌細胞(MMT 060562、ATCC CCL51)を含む。適当な宿主細胞の選択は、当業者の範囲内にあると考えられる。好ましい態様では、HEK-293を宿主細胞として使用する。さらに、CRACMポリペプチドを製造する方法を提供し、CRACMポリペプチドの発現のための適当な条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養からCRACMポリペプチドを回収することを含む。
【００４８】
他の態様では、使用される発現およびクローニングベクターは、通常、mRNA合成に向けられるように、操作可能にCRACMをコードする核酸配列と結合した構成的または誘導性のプロモーターを含む。さまざまな潜在的宿主細胞により認識されるプロモーターは、十分に既知である。ほ乳類宿主細胞におけるCRACM DNAコードベクターの転写は、好ましくは、誘導性プロモーターにより、例えば、異種ほ乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、および熱ショックプロモーターから取得されるプロモーターにより制御される。本発明で実施し得る誘導性プロモーターの例は、シングルもしくはバイナリシステムで使用され、熱ショックにより誘導される、hsp 70プロモーター; 銅またはカドミウムにより誘導される、メタロチオネインプロモーター(Bonneton et al., FEBS Lett. 1996 380(1-2): 33-38); ショウジョウバエレチノイドにより誘導される、ショウジョウバエオプシンプロモーター(Picking, et al., Experimental Eye Research. 1997 65(5): 717-27);およびテトラサイクリン誘導性完全長CMVプロモーターを含む。同定されたすべてのプロモーターの中で、テトラサイクリン誘導性完全長CMVプロモーターが最も好ましい。構成的プロモーターの例は、発現が、特異的プロモーターによるか、または局所位置効果により制御される、GAL4エンハンサートラップ株;および操作可能に結合したプロモーターの型に依存して、構成的であり得るか、または誘導的であり得る、E. coliに由来する転写活性化因子応答性プロモーターを含む。
【００４９】
より高等な真核生物によるCRACMをコードするDNAの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより、増加させ得る。エンハンサーは、通常、約10から300 bpのDNAシス作動性エレメントであり、その転写を増加させるために、プロモーター上で作用する。多くのエンハンサー配列は、ほ乳類遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン、およびインスリン)からは未知である。しかしながら、典型的には、当業者は、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例は、複製開始点のレートサイド(late side)上(bp 100-270)でのSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製開始点のレートサイド上でのポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。エンハンサーは、CRACMコード配列に対して5'または3'の位置で、ベクターに挿入し得るが、好ましくは、プロモーターから5'の位置に置かれる。
【００５０】
CRACMの調節
本発明の方法は、CRACMに結合するか、CRACイオンチャネルの活性を調節するか、または細胞内のCRACMの発現を変える候補生物活性剤を同定するために、CRACMポリペプチドまたはCRACMポリペプチドをコードする核酸を利用する。
【００５１】
本発明の好ましい局面は、CRACMポリペプチドのイオンチャネル活性を調節できる候補生物活性剤をスクリーニングする方法を提供する。1つの態様では、そのような方法は、CRACMポリペプチドを発現する細胞を提供する工程を含む。細胞を候補生物活性剤と接触させ、CRACMポリペプチドのイオンチャネル活性を、細胞と候補生物活性剤間の接触の前後で決定する。CRACMポリペプチドのイオンチャネル活性における変化は、該候補生物活性剤がCRACMポリペプチドの活性を調節できることを示す。
【００５２】
本発明の1つの態様は、CRACMに結合できる候補生物活性剤をスクリーニングする方法を提供する。結合アッセイのための好ましい態様では、CRACMまたは候補生物活性剤のどちらかを、例えば、蛍光、化学発光、化学薬品または放射性シグナルで標識し、候補薬剤のCRACMへの結合を検出する手段を提供する。標識はまた、酵素、例えば、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼであり得て、それは、適当な基質を提供すると、検出可能な産物を産生する。あるいは、標識は、標識化合物または小分子、例えば、酵素阻害剤であり得て、それは、結合はするが、酵素により触媒されないか、または変えられない。標識はまた、部分または化合物、例えば、エピトープタグまたは特異的にストレプトアビジンに結合するビオチンであり得る。ビオチンの例に関しては、ストレプトアビジンを上記したとおり標識し、それにより、結合したCRACMのための検出可能なシグナルを提供する。当業者に既知のとおり、非結合標識ストレプトアビジンは、解析前に除去される。あるいは、CRACMを、表面に固定するか、または共有結合的に結合させ、標識した候補生物活性剤と接触させ得る。あるいは、候補生物活性剤のライブラリーを、バイオチップに固定するか、または共有結合的に結合させ、標識したCRACMと接触させ得る。また、使用しうる手順をバイオチップに使用し、それは、当分野で既知である。
【００５３】
本明細書で使用する“候補生物活性剤”なる用語は、CRACMに結合するか、CRACの活性を調節するか、または細胞内のCRACMの発現を変えるあらゆる分子を記載する。本明細書に記載する分子は、オリゴペプチド、有機小分子、ポリサッカライド、ポリヌクレオチド、または多価カチオンなどであり得る。一般には、複数のアッセイ混合物を、異なる薬剤濃度で平行して走らせ、さまざまな濃度での反応差を得る。典型的には、これらの濃度のうち1つを、ネガティブコントロール、すなわち、ゼロ濃度または検出レベル以下として使用する。
【００５４】
候補薬剤は、典型的には、多価カチオンもしくは有機分子、または100ダルトン(D)よりも大きいか約2,500ダルトンよりも小さい分子量を有する小分子有機化合物であるが、それらは、多くの化学クラスを包含する。好ましい小分子は、2000 D未満、または1500 D未満または1000 D未満または500 D未満である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用のために必要な官能基、とりわけ、水素結合を含み、典型的には、少なくとも、アミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を、好ましくは、化学官能基のうち少なくとも2個を含む。候補薬剤は、しばしば、1個またはそれ以上の上記官能基で置換された、環式炭素もしくはヘテロ環式構造および/または芳香族もしくはポリ芳香族構造を含む。候補薬剤はまた、ペプチド、サッカライド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的類似体またはその組合せを含む生物分子の中に見出される。特に好ましいのは、ペプチドである。
【００５５】
候補薬剤は、合成または天然化合物のライブラリーを含む、さまざまな起源から取得される。例えば、多くの手段は、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現を含む、さまざまな有機化合物および生物分子のランダムおよび指向性合成のために利用できる。あるいは、植物および動物抽出物の形態での天然化合物ライブラリーが、利用可能であるか、または容易に産生される。さらに、天然または合成産生ライブラリーおよび化合物は、慣用的な化学的、物理的および生化学的手段を介して修飾される。既知の薬剤は、指向性があるか、またはランダムな化学修飾、例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化を受け、構造類似体を産生し得る。
【００５６】
候補薬剤は、イオンチャネルタンパク質に結合するか、イオンチャネルタンパク質活性を調節するか、または細胞内のイオンチャネルタンパク質の発現を変えることが既知である生物活性剤であり得る。候補薬剤はまた、イオンチャネルタンパク質に結合するか、イオンチャネルタンパク質活性を調節するか、または細胞内のイオンチャネルタンパク質の発現を変えることが以前に未知であった生物活性剤であり得る。
【００５７】
好ましい態様では、候補生物活性剤は、タンパク質である。本明細書で“タンパク質”は、少なくとも2個の共有的に結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを含む。タンパク質は、自然に生じるアミノ酸およびペプチド結合、または合成ペプチド模倣剤構造からなり得る。本明細書で使用する“アミノ酸”、または“ペプチド残基”は、自然に生じる、および合成のアミノ酸を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシン(noreleucine)は、本発明の目的のためのアミノ酸であると考える。“アミノ酸”はまた、イミノ酸残基、例えば、プロリンおよびヒドロキシプロリンを含む。側鎖は、(R)または(S)配置であり得る。好ましい態様では、アミノ酸は、(S)またはL配置である。自然に生じない側鎖を使用するとき、例えば、インビボでの分解を妨げるか、または遅らせるために、非アミノ酸置換基を使用し得る。
【００５８】
好ましい態様では、候補生物活性剤は、自然に生じるタンパク質または自然に生じるタンパク質の断片である。したがって、例えば、タンパク質を含む細胞抽出物、またはタンパク性細胞抽出物のランダムなもしくは指向性のある消化物を、使用し得る。この方法で、多細胞真核タンパク質のライブラリーを、本発明の方法でのスクリーニングのために作製し得る。この態様で特に好ましいのは、多細胞真核タンパク質のライブラリーであり、次に好ましいのは、ほ乳類タンパク質であり、とりわけ好ましいのは、ヒトタンパク質である。
【００５９】
好ましい態様では、候補生物活性剤は、約5個から約30個のアミノ酸、好ましくは、約5個から約20個のアミノ酸、特に好ましくは、約7個から約15個のアミノ酸からなるペプチドである。ペプチドは、上記したとおり、自然に生じるタンパク質の消化物、ランダムなペプチド、または“偏った”ランダムペプチドであり得る。本明細書の“ランダム化した”または文法的な同等物は、各核酸およびペプチドが、基本的に、各々、ランダムなヌクレオチドおよびアミノ酸からなることを意味する。一般に、これらのランダムなペプチド(または、下記の核酸)は、化学的に合成されるので、それらは、あらゆるヌクレオチドまたはアミノ酸を任意の位置に組み込み得る。合成工程は、ランダムなタンパク質または核酸を製造するために設計し得て、配列の長さにわたって、あらゆるまたは大部分の考え得る組合せの形成を可能にし、したがって、ランダムな候補生物活性タンパク性薬剤のライブラリーを形成し得る。
【００６０】
1つの態様では、ライブラリーは、完全にランダムであり、任意の位置での配列選択性または不変性(constants)を有さない。好ましい態様では、ライブラリーは、偏っている。すなわち、配列内のいくつかの位置は、一定であるか、または限られた数の可能性から選択される。例えば、好ましい態様では、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基は、限られたクラスの中で、例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏った(小さいか、または大きい)残基の中で、架橋のための核酸結合ドメインの創出、システインの創出のために、SH-3ドメインのためのプロリン、リン酸化サイトのためのセリン、トレオニン、チロシンまたはヒスチジン、またはプリン類などの中で、ランダムである。
【００６１】
好ましい態様では、候補生物活性剤は、核酸である。
【００６２】
タンパク質に関して、一般に上記したとおり、核酸候補生物活性剤は、自然に生じる核酸、ランダムな核酸、または“偏った”ランダム核酸であり得る。例えば、原核または真核ゲノムの消化物を、タンパク質に関して上記したとおり、使用し得る。
【００６３】
好ましい態様では、候補生物活性剤は、有機化学部分であり、さまざまなものが、文献で利用可能である。
【００６４】
CRACM発現の調節
好ましい態様では、アンチセンスRNAおよびDNAを、インビボにおいて、あるCRACM遺伝子の発現を妨害するための治療剤として使用し得る。低分子アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞内に導入し、そこで、それらは、細胞膜での制限された吸収により生じる低い細胞内濃度にもかかわらず、阻害剤として作用し得ることがすでに示されてきている(Zamecnik et al., (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146)。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらの吸収を高めるために、例えば、負に帯電したホスホジエステル基を非荷電基で置換することにより、修飾し得る。好ましい態様では、CRACMアンチセンスRNAおよびDNAは、mRNAへのCRACM遺伝子転写を妨害するために、タンパク質へのCRACM mRNAの翻訳を阻害するために、そして既存のCRACMタンパク質の活性を妨害するために使用し得る。
【００６５】
CRACM遺伝子のダウンレギュレーションまたはCRACMタンパク質活性の阻害は、脊椎動物において、免疫応答を緩和する。本明細書に記載されたような生物活性剤は、炎症性疾患、疾患と関連する状態、または自己免疫疾患もしくは移植片対宿主拒絶反応のような障害、または他の関連する自己免疫疾患障害の処置において有用であり、ここで、軽減した、または緩和した免疫応答は、脊椎動物の改善した状態を生じる(すなわち、疾患、疾患と関連する状態、または障害を、予防するか、解消するか、または軽減する)。生物活性剤はまた、アレルギー反応を減らすために使用し得る。
【００６６】
他の態様は、細胞内のCRACMの発現レベルを調節する候補生物活性剤をスクリーニングするために提供する。完全に細胞内のCRACMの発現を抑制し、それにより、細胞表現型を変える候補薬剤を使用し得る。さらに好ましい態様では、細胞内のCRACMの発現を高め、それにより、細胞表現型を変える候補薬剤を使用し得る。これらの候補薬剤の例は、CRACMをコードする核酸の転写または翻訳を調節する、アンチセンスcDNAおよびDNA、制御性結合タンパク質および/または核酸、ならびに、本明細書に記載した他の候補生物活性剤のいずれかを含む。
【００６７】
CRACチャネルのカチオン透過性の調節
他の態様は、CRACチャネルのCa+2 透過性を調節する候補生物活性剤をスクリーニングする方法を提供する。CRACチャネルのCa+2 透過性の調節は、例えば、ホールセルパッチクランプアッセイまたは単一チャネル膜パッチアッセイで、候補生物活性剤の存在および非存在での内向きおよび外向き電流を測定することにより決定し得る。他の態様では、一価カチオン活性の調節は、CRACチャネルを含む細胞の一価カチオン電流および/または膜ポテンシャルの機能としてモニターする。例えば、膜ポテンシャルの調節は、膜ポテンシャル感受性プローブの使用で検出する。好ましい態様では、膜ポテンシャル感受性プローブは、蛍光プローブ、例えば、ビス-(1,3-ジブチルバルビツール酸)トリメチンオクソノル(DiBAC4(3))(Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 9th ed. Molecular Probes、これは、引用により本明細書の一部とする)である。蛍光膜ポテンシャル感受性プローブの使用は、蛍光検出を利用したハイスループットスクリーニング法の使用を含む、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、および蛍光分光法のような方法を用いて、蛍光変化をモニタリングすることにより、膜ポテンシャルにおける変化の素早い検出を可能にする(Alvarez-Barrientos, et al., “Applications of Flow Cytometry to Clinical Microbiology”, Clinical Microbiology Reviews, 13(2): 167-195, (2000))。
【００６８】
候補薬剤によるCRACチャネルのカチオン透過性の調節は、CRACMを発現する細胞を、カチオンと反応し、シグナルを産生する二価カチオン指標と接触させることより決定し得る。二価カチオンの細胞内レベルは、候補生物活性剤の存在および非存在での指標シグナルを検出することにより測定する。好ましいカチオンは、Ca+2、Ba+2、Sr+2およびMn+2である。Mn+2は、fura-2蛍光をクエンチする能力により、使用および検出し得るが、好ましいカチオンは、Ca+2である。他の態様は、候補生物活性剤の存在および非存在下で、CRACおよびCRACMを発現する細胞中における細胞内二価カチオンレベルを、CRACMを発現しない細胞におけるそれと比較することを提供する。
【００６９】
細胞内Ca2+レベルは、Ca2+に特異的な指標を用いて検出し得る。Ca2+に特異的な指標は、fura-2、indo-1、rhod-2、fura-4F、fura-5F、fura-6Fおよびfura-FF、fluo-3、fluo-4、Oregon Green 488 BAPTA、Calcium Green、X-rhod-1ならびにfura-redを含む(Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 9th ed. Molecular Probes)。
【００７０】
好ましい態様では、細胞内Ca2+もしくは他の二価カチオンのレベルおよび膜ポテンシャルの変化を、同時に測定する。この態様では、Ca2+特異的指標を、Ca2+のレベルを検出するために使用し、膜ポテンシャル感受性プローブを、膜ポテンシャルの変化を検出するために使用する。Ca2+指標および膜ポテンシャル感受性プローブは、指標およびプローブからのシグナルが、同時に検出できるように選択される。例えば、指標およびプローブは、蛍光シグナルを有するが、各々の指標の励起および/または放出スペクトルは異なり、その結果、各指標からのシグナルを同時に検出し得る。
【００７１】
CRACチャネルはまた、一価(例えば、Na+)に対して透過性がある。したがって、CRACMと相互作用する薬剤によるCRACチャネル活性の調節は、一価イオンを用いて測定し得る。
【００７２】
本明細書で使用するとき、一価カチオン指標は、容易に細胞膜を透過可能か、あるいは、例えば、リポソームなどにより細胞への輸送を受けやすい分子であり、細胞に入り、一価カチオンとの接触で高められるか、またはクエンチされる蛍光シグナル、もしくは他の検出可能なシグナルを示す。本発明で有用な一価カチオン指標の例は、Haugland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals., 9th ed. Molecular Probes, Inc Eugene, OR, (2001)に示されており、それは、その全体を引用により本明細書の一部とする。
【００７３】
CRACチャネルは、細胞内Ca2+ストアの減少により活性化されるに違いない。これは、例えば、カルシウムイオノフォア、イノシトール1,4,5-トリホスフェート(IP3)を産生するすべての受容体アゴニスト、BAPTAのような適当なCa2+キレート、Ca2+ポンプ阻害剤タプシガルギンまたはあらゆる他のSERCAポンプ阻害剤(例えば、タプシガルギン)により達成し得る。
【００７４】
本発明の好ましい態様では、CRACチャネルは、カルシウムイオノフォアにより活性化される。カルシウムイオノフォアは、脂質二重膜に溶解し、カルシウムの透過性を増加させる疎水性小分子である。カルシウムイオノフォアの例は、イオノマイシン、カルシマイシンA23187、および4-ブロモカルシマイシンA23187(Sigma-Aldrichカタログ2004/2005、引用により本明細書の一部とする)を含む。
【００７５】
好ましい態様では、CRACチャネルのイオン透過性は、インタクト細胞、好ましくは、CRACMをコードした核酸およびそれに操作可能に結合した誘導性プロモーターを含むベクターで形質転換したHEK-293細胞で測定する。プロモーターの誘導後、CRACMポリペプチドを産生させる。細胞内イオンの内在性レベルを、誘導前に測定し、誘導後に測定した細胞内イオンのレベルと比較する。
【００７６】
CRACMペプチドに対する抗体
また他の態様では、本発明は、CRACMポリペプチド上の固有のエピトープ、例えば、該タンパク質の固有のエピトープに、特異的に結合する抗体を提供する。該抗体は、CRACMへの結合に関してだけではなく、CRACチャネルのCRACMモジュレーターを調節するそれらの能力に関して、アッセイし得る。
【００７７】
抗CRACM抗体は、ポリクローナル抗体を含み得る。ポリクローナル抗体を製造する方法は、当業者に既知である。ポリクローナル抗体は、ほ乳類で、例えば、1回または複数回の免疫剤および所望によりアジュバントの注射により作製し得る。典型的には、免疫剤および/またはアジュバントは、頻回皮下もしくは腹腔内注射により、ほ乳類に注入する。免疫剤は、CRACMポリペプチドまたはその融合タンパク質を含み得る。該免疫剤を、免疫されるほ乳類で免疫原性があることが既知であるタンパク質と結合させることは、有用であり得る。該免疫原性タンパク質の例は、非限定的に、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および大豆トリプシン阻害剤を含む。使用し得るアジュバントの例は、フロイント完全アジュバントおよびMPL-TDMアジュバント(モノホスホリル・リピドA、合成トレハロースジコリノミコレート)を含む。免疫化プロトコールは、当業者により、過度の実験なく選択し得る。
【００７８】
抗CRACMポリペプチド抗体は、さらに、モノクローナル抗体を含み得る。該モノクローナル抗体は、CRACMポリペプチドに結合することに加えて、また、CRACMチャネル一価カチオン透過性を調節する生物活性候補薬剤として同定し得る。モノクローナル抗体は、例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されたようなハイブリドーマ法を用いて作製し得る。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター、または他の適当な宿主動物を、典型的には、免疫剤で免疫し、特異的に免疫剤に結合する抗体を産生するか、または産生することが可能である白血球を誘導する。あるいは、白血球は、インビトロで免疫し得る。
【００７９】
免疫剤は、典型的には、CRACMポリペプチドまたはその融合タンパク質を含む。一般には、ヒト起源の細胞が望まれるとき、いずれかの末梢血リンパ球(“PBL”)が使用され、または、非ヒトほ乳類起源が望まれるとき、脾臓細胞、腎臓細胞、もしくはリンパ節細胞が使用される。次いで、リンパ球を、適当な融合剤、例えば、ポリエチレングリコールを用いて、不死化細胞株と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]。不死化細胞株は、通常、形質転換したほ乳類細胞であり、とりわけ、齧歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常は、ラットまたはマウス骨髄腫細胞株を使用する。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、非融合不死化細胞の成長または生存を阻害する1個またはそれ以上の物質を含む、適当な培養培地で培養し得る。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を欠いているとき、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン(“HAT培地”)を含み、該物質は、HGPRT欠損細胞の成長を妨げる。
【００８０】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定的な高レベルの抗体発現を支持し、HAT培地のような培地に感受性があるものである。より好ましい不死化細胞株は、マウス骨髄腫株であり、それは、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California and the American Type Culture Collection, Rockville, Marylandから入手し得る。ヒト骨髄腫およびマウス-ヒト異種骨髄腫細胞株がまた、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている[Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63]。
【００８１】
ハイブリドーマ細胞を培養する培養培地を、次いで、CRACMポリペプチドに向けられたモノクローナル抗体の存在に関してアッセイし得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降法によるか、またはインビトロ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)もしくは酵素免疫測定法(ELISA)により決定する。そのような技術およびアッセイは、当分野で既知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、the Scatchard analysis of Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)により決定し得る。
【００８２】
望むハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを、限界希釈法によりサブクローン化し、標準的な方法で増殖させる[上記したGoding]。この目的のための適当な培養培地は、例えば、ダルベッコ修飾イーグル培地およびRPMI-1640培地を含む。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、ほ乳類での腹水として、インビボで増殖させ得る。
【００８３】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体を、慣用的な免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインA Sepharose、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィーにより、培養培地または腹水液から、単離または精製し得る。
【００８４】
モノクローナル抗体はまた、組換えDNA法、例えば、米国特許第4,816,567号に記載された方法により、作製し得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは、慣用的な手順を用いて、容易に、単離および塩基配列決定し得る(例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによる)。本発明のハイブリドーマ細胞は、該DNAの好ましい起源として使用する。単離した後、DNAを発現ベクターの中に入れ、次いで、宿主細胞、例えば、あるいは、免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、または骨髄腫細胞中にトランスフェクションし、組換え宿主細胞において、モノクローナル抗体の合成を得る。DNAはまた、例えば、相同なマウス配列の代わりに、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのためのコード配列を置換することによるか[上記した米国特許第4,816,567号; Morrison et al.]、または免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドのためのコード配列のすべてもしくは一部を共有的に加えることにより修飾し得る。該免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換し得るか、またはキメラ二価抗体を作製するために、本発明の抗体の1個の抗原結合サイトの可変ドメインの代わりに置換し得る。
【００８５】
抗CRACMポリペプチド抗体は、さらに、一価抗体を含み得る。一価抗体を製造する方法は、当業者に既知である。例えば、1つの方法は、免疫グロブリン軽鎖および修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は、一般に、重鎖架橋を妨げるために、Fc領域中の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を、架橋を妨げるために、他のアミノ酸残基で置換するか、または欠失させる。
【００８６】
インビトロ法は、また、一価抗体を製造するために適当である。断片、とりわけ、Fab断片を産生するためのその抗体の消化は、当業者に既知の通常の技術を用いて、達成し得る。
【００８７】
抗CRACMポリペプチド抗体は、さらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含み得る。非ヒト(例えば、マウス)抗体のヒト化型は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片(例えば、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2または抗体の他の抗原結合部分配列)であり、それは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)からの残基を、非ヒト種、例えば、望む特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギ(ドナー抗体)のCDR由来の残基で置換された、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。ある例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、相当する非ヒト残基で置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても、インポートされたCDRまたはフレームワーク配列においても見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、実質的に、少なくとも1個の、および典型的には2個の可変ドメインのすべてを含み得て、そこでは、CDR領域のすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのそれらに相当し、FR領域のすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれらである。ヒト化抗体は、最適には、また、少なくとも一部の免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれを含む[Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]。
【００８８】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当業者に既知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである起源から導入された1個またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、“インポート(import)”残基と呼ばれ、典型的には、“インポート”可変領域から得られる。ヒト化は、基本的には、Winterおよび共同研究者の方法[Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]にしたがって、ヒト抗体の相当する配列を、齧歯類CDRまたはCDR配列に置換することにより行い得る。したがって、該“ヒト化”抗体は、キメラ抗体であり(米国特許第4,816,567号)、ここで、実質的に、インタクトなヒト可変ドメインよりも少ないものが、非ヒト種由来の相当する配列で置換される。実際、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのCDR残基および考え得るいくつかのFR残基が、齧歯類抗体の類似するサイト由来の残基で置換されているヒト抗体である。
【００８９】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーを含む、当業者に既知のさまざまな技術を用いて作製し得る[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]。Cole et al. and Boerner et al.の技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の製造のために利用可能である[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)およびBoerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、トランスジェニック動物、例えば、内在性の免疫グロブリン遺伝子が、部分的または完全に不活性化されたマウスに導入することにより製造し得る。チャレンジすると、ヒト抗体産生が観察され、それは、遺伝子再配列、集合、および抗体レパートリーを含むあらゆる点で、ヒトで見られるものと非常に似ている。この方法は、例えば、米国特許第5,545,807号; 第5,545,806号; 第5,569,825号; 第5,625,126号; 第5,633,425号; 第5,661,016号、および下記の科学文献: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994);  Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
【００９０】
抗CRACMポリペプチド抗体はさらに、ヘテロ結合抗体を含み得る。ヘテロ結合抗体は、2個の共有的に結合した抗体からなる。該抗体は、例えば、不要細胞に対して免疫系細胞を標的とし[米国特許第4,676,980号]、HIV感染の処置[WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]のために提案された。抗体は、架橋剤を含む方法を含む、合成タンパク質化学における既知の方法を用いて、インビトロで製造し得ることが意図される。例えば、抗毒素は、ジスルフィド交換反応を使用するか、またはチオエーテル結合を形成することにより、構築し得る。この目的のための適当な試薬の例は、イミノチオレートおよびメチル-4-メルカプトブチルイミデート、および、例えば、米国特許第4,676,980号で開示したものを含む。
【００９１】
さらなる実験では、抗CRACMポリペプチド抗体は、さまざまな利用性を有し得る。例えば、抗CRACMポリペプチド抗体は、CRACMポリペプチドのための診断アッセイで使用し得て、例えば、特定の細胞、組織、または血清でのその発現を検出し得る。当業者に既知のさまざまな診断アッセイ、例えば、競合的結合アッセイ、直接または間接のサンドウィッチアッセイおよび不均一層または均一層で行われる免疫沈降アッセイ[Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]を使用し得る。診断アッセイで使用される抗体は、検出可能部分を用いて標識し得る。検出可能部分は、直接または間接的に、検出可能なシグナルを産生することができるべきである。例えば、検出可能部分は、放射性同位体、例えば、3H、14C、32P、35S、もしくは125I、蛍光もしくは化学発光化合物、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリン、または酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼであり得る。Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981);およびNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法を含む、抗体を検出可能部分に結合させるための当業者に既知のあらゆる方法を使用し得る。
【００９２】
さらに、CRACM抗体を、一価カチオンに対するCRACチャネルの透過性を調節するそれらの能力をスクリーニングするために、本発明の方法で使用し得る。
【００９３】
CRACチャネルおよび疾患
非限定的に免疫不全疾患、神経系疾患、および心疾患を含む多くの疾患は、CRACチャネルにおける突然変異と関連している。例えば、CRACチャネルの重要な構成要素の突然変異が、Tリンパ球機能不全および重症複合型免疫不全症(SCID)を生じる遺伝的欠損が記載されている(Partiseti et al., J Biol. Chem. (1994) 269: 32327-35; Feske et al., Nature (2006) 441:179-85)。これらの疾患および他のCRAC関連疾患の研究、診断および処置における強力な武器は、(1)これらの疾患状態でIcrac活性の根底にあるCRACチャネルホモログおよび(2)該CRACチャネルを調節する薬剤を、同定する能力である。
【００９４】
下記の実施例は、本発明の組成物および方法を例示するために提供し、主張する発明を限定するものではない。
【実施例】
【００９５】
実施例
実施例1: CRACチャネルをコードする遺伝子を同定するためのゲノムスクリーニング
CRACチャネルをコードする遺伝子またはその制御に関与する他のタンパク質を同定するために、ハイスループット-ゲノムワイドRNA干渉(RNAi)スクリーニングを、ショウジョウバエS2R+細胞で行った。23,000個までの遺伝子のノックダウン効果を、自動Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR, Molecular Devices)を用いて、384ウェルマイクロプレート中で、動態(kinetic)[Ca2+]iアッセイを行うことにより試験し、そこでは、[Ca2+]iの変化を、通常使用されるSERCA阻害剤タプシガルギンに対する応答で測定した。
【００９６】
S2R+細胞を、10 μlの無血清Schneider's 培地(Invitrogen)中、dsRNA(0.25 μg/ウェル)を含んだ384ウェルプレートに分配し、40分間インキュベートした。40分後、細胞を、30 μlの10%血清含有Schneider's 培地で満たし、3日間インキュベートした。3日後、細胞を、ショウジョウバエ生理食塩水中、1時間、蛍光Ca2+指標Fluo-4-AMに載せ、洗浄し、0.1 mM EGTA含有Ca2+不含ショウジョウバエ生理食塩水に再懸濁した。各ウェルを、最初に、基準蛍光を決定するために、1分間撮像した。細胞を、次いで、2 μMタプシガルギンで刺激し、ERからの排出による生じたCa2+放出を、5分間測定した。緩衝液を、次いで、2 mM CaCl2で補充し、生じたカルシウム流入を、さらに5分間記録した。
【００９７】
63個すべてのプレートは、ポジティブコントロールとしてstim1およびthreadに対するdsRNAを、ネガティブコントロールとしてGFPおよびRho1に対するdsRNAを含んでいた。全ライブラリーを、2回スクリーニングした。各々の異なるdsRNAにより生じたCa2+流入の阻害を計算するために、ポジティブコントロールstim1 dsRNAで見られた阻害を100として、ネガティブコントロールで見られた阻害を0として設定した。各プレート上の残り380個の遺伝子で見られた阻害割合を、次いで、コントロールに関して計算した。制限可能にカルシウム流入を阻害した全27個の遺伝子を、さらに、単一細胞パッチクランプアッセイを用いて、二次スクリーニングで評価した。
【００９８】
パッチクランプ実験を、21-25℃で、密着シール(tight-seal)ホールセル形態で行った。高分解能電流記録を、EPC-9 (HEKA)を用いて獲得した。−100から＋100 mVの範囲にわたる50 ms持続の電圧ランプは、100-300 secの間、0.5 Hz の速度で、0 mVの保持電位から伝えられた。すべての電圧を、10 mVの液体接合ポテンシャルに関して収集した。電流を、2.9 kHzでフィルターにかけ、100 μs間隔でデジタル化した。容量性電流を決定し、各々のランプ電圧前に収集した。個々のランプ電流記録から−80 mVでの電流振幅を抽出することにより、両電流の低分解能時間的推移を評価した。所望により、平均データの統計誤差を、n個(determinations)で、平均 ± S.E.M.として提供する。標準的な外液は、下記のとおりであった(mMで): 120 NaCl、2.8 KCl、10 CsCl、2 MgCl2、10 CaCl2、10 HEPES、NaOHでpH 7.2、300 mOsm。標準的な内液は、下記のとおりであった: 120 Cs−グルタミン酸、8 NaCl、10 Cs・BAPTA、4 CaCl2、3 MgCl2、10 HEPES、0.02 IP3、CsOHでpH 7.2、300 mOsm。いくつかの実験のために、[Ca2+]iを、10 mM Cs・BAPTAでゼロまで中和した。受動的減少実験のために、内液は、IP3およびカルシウムの存在下、Cs・BAPTAで補充された。いくつかの細胞では、10 μMイオノマイシンを、広口ガラスピペットを用いて、3 sで適用した。
【００９９】
二次パッチクランプスクリーンから、CRACチャネル機能のために重要な2個の新規遺伝子、CRACM1(ショウジョウバエではolf-186Fで、ヒトではFLJ14466でコードされる)およびCRACM2(ショウジョウバエではdpr3でコードされ、ヒトではオーソログが存在しない)が、同定された。図1Aおよび1Bは、一次スクリーニングにおいてこれら2個の遺伝子に相当するウェルからのリアルタイム[Ca2+]iイメージデータを示す。CRACM1およびCRACM2 dsRNAにより仲介されるカルシウム流入の阻害を、ネガティブコントロールRho1およびポジティブコントロールstim1と比較して示す。図1Cおよび1Dは、各々、イノシトール1,4,5-トリホスフェート(IP3)仲介CRAC電流発生(−80 mVでの標準化した電流振幅により評価した)およびショウジョウバエKc細胞における特徴的なI/V関係の経時変化を示す。未処理コントロール野生型(wt)およびモック処理細胞の両方が、ICRACに特有な内部整流Ca2+電流を活性化することによりIP3仲介貯蔵減少に応答し、それはまた、ショウジョウバエに存在する。対照に、CRAC電流は、CRACM1およびCRACM2のためのdsRNAで処理した細胞で、基本的に停止した。CRACM1に関する実験のいくつかで、我々はまた、完全な貯蔵減少を保証するために、パッチピペットに含まれる20 μM IP3の上に、細胞外でイオノマイシン(10 μM)を適用したが、これは、ICRACを誘導できなかった(n = 4、データは、示していない)。上記したIP3およびイオノマイシンによる活性化貯蔵減少プロトコールのとおり、CRAC電流はまた、Ca2+キレーターBAPTAによる受動的貯蔵減少を誘導したとき、存在しなかった(図1EおよびF)。
【０１００】
CRACM2とは異なり、CRACM1は、FLJ14466遺伝子でのヒトオーソログを有しているので、我々は、このタンパク質を特徴づけることに決め、この遺伝子の機能が種を超えて保存されていること、およびストア作動性Ca2+流入に関与していることを確認したかった。これを試験するために、我々は、ヒト胎児腎臓細胞(HEK293)およびヒトT細胞(Jurkat)におけるヒトCRACM1のsiRNA仲介サイレンシングを使用した。2個のCRACM1特異的siRNA配列および1個のコントロールスクランブル配列を選択し、レトロウイルスベクター、pSUPER.retro(Oligoengine)にクローン化した。siRNA感染細胞を、ピューロマイシンを用いて選択し、Ca2+イメージングおよび電気生理学的解析のために使用した。
【０１０１】
CRACM1メッセージの選択的ノックダウンは、半定量的RT-PCR解析により確認した(図2A)。図2Bは、HEK293でのタプシガルギン誘導貯蔵減少に応答したCa2+流入のsiRNA仲介阻害を証明する。両方のCRACM1特異的siRNA配列は、一時的なカルシウム放出に影響を与えることなく、HEK293でのタプシガルギン誘導貯蔵減少に応答したカルシウム流入の60-70%阻害を示した(図2B)。図2Dおよび2Eは、細胞内IP3かん流に応答したsiRNA処理HEK293細胞から取得したパッチクランプ記録を示し、ほとんど完全なCRAC電流の阻害を証明する。Jurkat細胞では、Ca2+シグナルのsiRNA仲介阻害は、ほぼ20%であり(図2C)、HEK293細胞ほど劇的ではなかった。しかしながら、Jurkat細胞でのICRACは、両siRNA配列により、効果的に緩和された(図2Fおよび2G)。
【０１０２】
実施例2: 細胞株でのCRACM1の過剰発現
完全長ヒトCRACM1を、pcDNA/4TO/myc-Hisプラスミド(Invitrogen)中の、C末端myc-Hisタグを有するフレームに、クローン化した。完全長遺伝子を、C末端myc-Hisタグと共に再増幅し、異なる細胞株での過剰発現のために、MIGW緑色蛍光タンパク質(GFP)レトロウイルス中に、サブクローン化した。HEK293、Jurkat、およびRBL-2H3細胞を、CRACM1+GFP発現レトロウイルスで感染させ、HEK293細胞でのタンパク質の過剰発現を、抗mycタグ抗体を用いたIP、その後のウエスタンブロットで確認した(図3A)。CRACM1タンパク質の過剰発現は、HEK293細胞でのタプシガルギン誘導性カルシウム流入に影響を与えなかった(データは、示していない)。同様に、コントロールレベルを超えたCRAC電流振幅の有意な増加は、HEK293(図3B)またはJurkat細胞(図3C)で検出されず、RBL細胞(図3D)でわずかな増加が検出された。これらのデータは、CRACM1が、CRAC活性のために必要ではあるが、それ自体、顕著に大きなCRAC電流を産生しない。
【０１０３】
実施例3: CRACM1の局在
CRACM1は、それが、ERに(STIM1と同様)、または細胞膜に局在するのかを我々が知りたかった、ストア作動性Ca2+流入に関与する膜貫通タンパク質である。この問題に取り組むために、CRACM1のどちらかの末端にタグを付け、コンストラクトを、HEK293細胞にトランスフェクトした。24時間後、免疫蛍光共焦点解析は、どちらかのコンストラクトを発現するインタクト細胞での染色を示さず、これは、両方のタグが細胞内にあることを示す。細胞を透過処理した後、両コンストラクトは、蛍光抗体により明確に検出され、主な細胞膜周辺の染色を示した(図3Eおよび3F)。これらのデータは、4個の予測される膜貫通ドメインを含み、両末端がサイトゾルに面している、CRACM1の提案された構造に、十分適合している。
【０１０４】
要約すると、実験結果は、CRACM1が、CRACチャネルによるストア作動性Ca2+流入のために重要であることを証明している。CRACM1の過剰発現は、CRAC電流の大きさを変えないが、このタンパク質の細胞膜局在および複数の膜貫通ドメインの存在は、ストア作動性カルシウム流入におけるより直接的なCRACM1の役割に向けられる。我々の結果に基づいて、これらのメカニズムに本発明を限定することを意図しないが、多くの考え得る機能が、CRACM1に関して想定し得る。第1に、CRACM1は、CRACチャネル自身として機能し得る。このシナリオでは、CRACM1過剰発現細胞における変わらないCRAC電流は、CRACチャネル活性の上流の律速因子(例えば、STIM1)によるものであり得る。第2に、CRACM1は、多量体チャネル複合体の重要なサブユニットであり得て、この場合には、他のサブユニットが律速因子になり得て、CRACM1過剰発現がより大きなCRAC電流を産生するのを妨げる。最後に、CRACM1は、CRACチャネル自身の重要な分子構成要素ではなく、むしろ、おそらくはSTIM1またはまだ同定されていないシグナル伝達機構の構成要素のための、細胞膜アクセプターまたはドッキングタンパク質として機能し得て、最終的に、CRACチャネル活性化およびストア作動性Ca2+流入を生じる。
【０１０５】
実施例4: CRACM1は、それ自身結合し、CRACチャネル複合体を形成する
多くのイオンチャネルは、多量体化して機能的なイオンポアを形成するので、我々は、HEK293で、2個の異なるタグ化バージョンタンパク質を共過剰発現し、相互共沈実験、その後、関連する抗タグ抗体を用いたイムノブロッティングを行うことにより、CRACM1の多量体化する傾向を試験した。図5は、各タグ化バージョンのCRACM1が、他のものと共沈することを示しており、CRACM1は、確かにそれ自身で多量体化することを示す。STIM1は、貯蔵減少後、細胞膜に移動するので、それは、CRACM1と相互作用するかもしれない。我々は、HEK293で、異なるタグのCRACM1およびSTIM1を共過剰発現させ、相互共沈実験、その後、関連する抗タグ抗体を用いたイムノブロッティングにかけることにより、これを試験した。図5Bで示したとおり、両タンパク質は、共沈し、これは、それらが互いに結合することを示す。
【０１０６】
我々は、CRACM1の一次配列を解析し、いくつかの種を超えてCRACM1およびそのホモログCRACM2/CRACM3(Orai2/Orai3)のために高度に保存されている、グルタミン酸残基(TM1のE106およびTM3のE190)を同定した(図5C)。さらに、TM1およびTM2ドメインをつなぐ第1細胞外ループは、潜在的にCa2+結合サイトとして使用し得る、いくつかの負に荷電したアスパラギン酸残基(D110、D112およびD114)を含む。我々は、CRACチャネルのポアを形成し、Ca2+のための高い特異性を与えることへのそれらの考え得る関与を試験するために、我々がこれらの残基を修飾したいくつかのCRACM1突然変異体を構築した。共沈は、これらの突然変異体タンパク質が、多量体化する能力を保持することを確認し(図5D)、共焦点顕微鏡は、適当な細胞膜への標的化を明らかにした(図5E)。次いで、我々は、安定的にSTIM1を過剰発現させたHEK293細胞でこれらの突然変異体タンパク質を過剰発現させ、ホールセルパッチクランプ記録により、電気生理学的にそれらを解析し、そこで、我々は、IP3仲介Ca2+貯蔵減少によるCRAC電流を誘導した。
【０１０７】
実施例5: CRACM1の膜貫通ドメイン1および3は、Ca2+選択性イオンチャネルポアを形成する
106位でのTM1のグルタミン酸がグルタミン残基に変化したCRACM1の点突然変異体を作製した(E106Q)。STIM1過剰発現HEK293細胞にトランスフェクションすると、この突然変異体は、fura-2蛍光測定でタプシガルギン誘導Ca2+流入を阻害し(データは、示していない)、パッチクランプ記録は、この突然変異体が、wt-CRACM1が産生したような大きなCRAC電流を産生せず(図6AおよびB)、STIM1過剰発現細胞または非トランスフェクトHEK293細胞で典型的に見られた小さな内在性CRAC電流(〜0.5 pA/pF)の完全な抑制を引き起こすことを確認した。wt-CRACM1が大きな一価電流を産生する無二価溶液へ曝したときでさえ、相当量の内部電流を産生しなかった(図6A)。突然変異は、多量体化するCRACM1の能力(図5D)またはその細胞膜への輸送(図5E)に影響を与えなかったので、E106Q突線変異体は、正常なCRACM1複合体を形成し、内在性CRACM1と共集合さえし得るドミナントネガティブタンパク質として作用するが、Ca2+またはNa+イオンの透過を可能にするポアを提供できない。
【０１０８】
電荷保存突然変異を、グルタミン酸をアスパラギン酸残基に変換(E106D)することより作製した。この突然変異体は、IP3仲介貯蔵減少後のwt-CRACM1と同様に活性化した膜電流を示したが、平均してより小さかった(−8 ± 1 pA/pF、n = 12対−30 ± 6 pA/pF、n = 14; 図6AおよびCを参照のこと)。これらの突然変異CRACM1チャネルの選択性は、また、wt-CRACM1とは著しく異なり、典型的な内部整流電流電圧関係を外部整流に変換し、その反転潜在性を、かなりの正電圧から0 mVに移す(図6BおよびDを参照のこと)。顕著な外部電流は、CRACチャネルを介して流れ、正確に同じ経時変化で内部電流として発展し、おそらく、主な細胞内カチオンCs+により行われる。細胞外Ca2+を除去すると、電流は、内部電流の大量の増加および外部電流のわずかな増加により、内部整流まで逆転した。これらの効果が、通常は、wt-CRACM1チャネルを介して、あらゆる一価内部もしくは外部電流を妨げる2 mM Mg2+の存在を維持しながら、単純なCa2+の除去により取得されたことに留意すべきである。Ca2+除去時の内部電流の大量の増加は、Ca2+イオンが存在し、大量のNa+の流れを妨げるとき、チャネルがなお、Ca2+イオンを内部に伝えることを示す。我々は、細胞外Ca2+を10 mMに維持し、細胞外Na+を非透過TEA+で置換した実験により、これを確認した。これは、50%までの内部電流の減少を引き起こし(図6、CおよびD)、そこでは、残りの内部電流は、Ca2+イオンにより、外部電流は、主な細胞内Cs+イオンにより行われる。
【０１０９】
さらなるイオン置換実験は、この突然変異体の修飾された選択性は、一価カチオンに限定されず、Ba2+イオンの相対的な透過性に影響を与えることを確認した。図6Eおよび6Fは、Ca2+のBa2+での等モル濃度置換は、同じイオン置換が、90%まで内部電流を減少させるwt-CRACM1チャネルとは著しく対照に、内部電流の小さな減少のみを引き起こすことを示す。したがって、E106D突然変異体は、wtと比較して、かなり増加したBa2+透過性を有する。E106残基は、したがって、CRACチャネルの高いCa2+選択性を与える重要な構造的要素であり、明白に、CRACM1が、確かにCRACチャネルのポア形成サブユニットを示すことを証明する。
【０１１０】
配列解析は、TM3(E190)において、CRACMタンパク質にわたって、等しく十分に保存された他の酸性および負に荷電した残基を明らかにする。我々は、このグルタミン酸をグルタミン残基に置換した(E190Q突然変異)突然変異体を構築した。STIM1発現HEK293細胞中に発現させたとき、我々は、細胞外Ca2+の除去(2 mM Mg2+を維持しながら)が約70%まで内部電流を減少させたため、この突然変異体が通常IP3誘導貯蔵減少後に活性化され、Ca2+により一次的に引き起こされる内部電流を産生することを発見した(図6G)。残りのNa+電流は、wt-CRACM1でのものよりも大きく、Na+を超えたCa2+の選択性を減少させたことを示す。しかしながら、E106D突然変異体を著しく対照的に、内部電流は、増加しなかった。興味深いことに、E190Q突然変異体を介した外部電流は、E106D突然変異体のそれよりも、より顕著で直線的であり(図6H)、Cs+の一価外部浸透がこの突然変異体ではかなり高められていることを示す。
【０１１１】
wt-CRACM1では非常に低いが、E106D突然変異体ではかなり増加するBa2+透過性を、E190Q突然変異体について調べた。Ca2+のBa2+での置換は、内部電流のほとんど完全な停止を生じ、内部電流のわずか5%のみがBa2+下で残っていた(図6G)。E190Q突然変異体は、したがって、wt-CRACM1と同様に、Ba2+を超えた高いCa2+選択性を保持する。
【０１１２】
実施例6: CRACM1の第1細胞外ループは、ポア選択性に貢献する
重要なE106残基に隣接して、3個の密集したアスパラギン酸残基(D110/112/114)が、CRACM1の第1細胞外ループに存在し、それは、チャネルの外部(outer mouth)で、Ca2+の結合を協調するのに参加し得る。二重突然変異体を、110位および112位で、最も保存された負に荷電したアスパラギン酸残基をアラニンに変えることにより(D110/112A突然変異)、この領域で作製した。この突然変異体の主な細胞膜局在およびその多量体化潜在性は、wt-CRACM1と比較可能であった(図5DおよびE)。D110/112A突然変異体により産生したCRAC電流は、wtチャネルで産生したものと類似の経時変化で活性化した(図7A)。−80 mVで両構築体の内部電流は、かなり類似しているが、突然変異体は、wtチャネルよりも、＋130 mVで、異なるずっと大きな外部電流を示した。wtおよび突然変異体構築体の電流電圧関係は、より詳細にこれらの特徴を示す(図7C)。したがって、負の電圧で、両構築体は、類似した内部整流電流を示し、一方で、＋80 mV以上の正の電圧では、D110/112A突然変異体は、かなり大きな量の外部電流を流す。図3Aはまた、wtおよび突然変異体チャネルの内部電流は、Na+をTEA+で置換し、唯一の電荷キャリアとして10 mM Ca2+を維持することにより細胞外Na+を除去したとき、大きな影響を受けないままであったことを証明する。これは、両チャネル構築体が、10 mM Ca2+が細胞外に存在するとき、Na+流入を超えたCa2+の高い選択性を保持することを示す。
【０１１３】
しかしながら、一価カチオンの外部移動がD110/112A突然変異体では高められたので、一価内部電流を、細胞外Ca2+を除去したイオン交換実験で、低い細胞外Ca2+で測定した。130 mM Na+および2 mM Mg2+を保持しながらCa2+を除去すると、wt CRAC電流は、基本的に停止し(図7B)、これは、残りのMg2+が、完全に、一価Na+透過を妨げることを証明する。対照に、D110/112A突然変異体による内部電流の阻害は、完全ではなく、Ca2+の非存在は、wtにおいてよりも、より多くのNa+透過を可能にすることを示す。残りのNa+内部電流は、次いで、細胞外Na+をTEA+で置換したとき、完全に妨害された(図7B)。さらなる実験は、D110/112A突然変異体が、制限されたK+イオンの透過および内部方向へのCs+のごくわずかな透過を可能にすることを明らかにした(図7D)。したがって、TMドメイン1および2間のループにおけるアスパラギン酸残基は、おそらくは、チャネルの外部へのCa2+結合を協調し、それにより、一価カチオンとCa2+イオンの区別に貢献することにより、CRACM1チャネルの選択プロファイルに貢献しているが、本発明は、このメカニズムに限定されるものではない。
【０１１４】
上記結果に基づいて、D110/112A突然変異体が、二価および一価の透過の相互作用を修飾することが予期され、そこでは、wt CRACチャネルは、特徴的な異常断片挙動(anomalous fraction behavior)をもって、それ自身、細胞外Ca2+のための用量応答曲線で示されるであろう(図7F)。したがって、細胞外二価イオンの完全な非存在下(名目上無二価溶液 ＋ 10 mM EDTA)では、CRACチャネルは、かなりのNa+透過を許す。しかしながら、EDTAなしで名目上の無二価溶液(1 μM未満で概算される、無Ca2+および無Mg2+)のみに細胞を曝すか、または10 μM Ca2+を加えると、実質的に、wt-CRACM1チャネルでの内部電流を排除する(図7E)。Ca2+がミリモル範囲で増加すると、CRAC電流は再び、選択的Ca2+透過性のために増加する。Na+透過性に関する低Ca2+濃度の阻害効果は、第1細胞外ループのアスパラギン酸残基へのCa2+の結合により仲介され得る。確かに、D110/112A突然変異体は、かなりの内部電流を産生し(図7E)、CRACチャネルの異常モル比率を変える(図7F)。Ca2+のより高い濃度では、再び電流は、wtと同様に動き、Ca2+選択的になる。
【０１１５】
この突然変異体の二価カチオン間の選択性を測定した。細胞外Ca2+を等モル濃度Ba2+またはSr2+で置換したとき、wt-CRACM1電流は、Ca2+により生じる電流よりもかなり小さくなる(10%未満になる)(図7G)。図7Hは、D110/112A突然変異体が、わずかにだけ増加したBa2+およびSr2+電流を産生したことを示し、それは、突然変異体が、主に、二価カチオンのための相対的な選択性を保持することを示す。図7Iの棒グラフは、wtおよびD110/112A CRACM1チャネルにおける、二価および一価カチオンにより生じる内部電流の相対的な大きさを要約し、それは、類似の二価透過性ではあるが、かなり増加した、特に、Na+の透過性を証明する。
【０１１６】
要約すると、本研究の結果は、CRACM1タンパク質が、細胞膜で多量体イオンチャネル複合体を形成し、そこで、それらは、Ca2+ 貯蔵減少後、おそらくSTIM1との相互作用により活性化され得ることを証明する。CRACM1のチャネルポアは、TM1およびTM2をつなぐ細胞外ループに位置するCa2+結合モチーフ内のTM1およびTM3における重要なグルタミン酸残基(E106およびE190)ならびにアスパラギン酸残基(D110およびD112)の存在のために、Ca2+に関して非常に選択的である。これらの重要な残基のいずれかの突然変異は、Ca2+に対する一価カチオン透過性を高めることによりCRACチャネル選択性を変え、CRACM1がCRACチャネルポアを構成する明確な証拠を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】図1は、ショウジョウバエにおけるストア作動性Ca2+流入の重要なレギュレーターとして、CRACM1およびCRACM2の同定を示す。自動蛍光イメージングプレートリーダー(FLIPR)を用いて、一次ハイスループットスクリーニングで、ショウジョウバエS2R+細胞で測定したCa2+シグナル。(A) CRACM1 dsRNAから取得した相対蛍光強度(r.f.u.)におけるFluo-4-AM蛍光変化。参照トレースを、Rho1 dsRNA (モック)およびSTIM1 dsRNAのために提供する。細胞を無Ca2+溶液で保ち、タプシガルギン(2 μM)に曝し、その後、2 mM Ca2+を添加した。トレースは、一次スクリーニングの2回の独立した試行を代表する。(B) (A)と同様ではあるが、CRACM2 dsRNAで処理した細胞に関するプロトコール。(C) ショウジョウバエKc細胞で測定したIP3誘導(20 μM) ICRACの標準化した平均経時変化。個々の細胞の電流を−80 mVで測定し、それらの各々の細胞サイズで標準化し、平均化および対時間プロット(± S.E.M.)した。細胞質カルシウムを、10 mM BAPTAおよび4 mM CaCl2を用いて、150 nMに固定した。トレースは、未処理コントロール(wt; 黒丸、n = 10)、Rho1 dsRNA (モック; 白丸、n = 8)、CRACM1 dsRNA (赤丸、n = 6)およびCRACM2 dsRNA (緑丸、n = 9)に相当する。(D) −100から＋100 mVまでの50 msランプ電圧により誘導された電流からの60 sで、代表的な細胞から抽出したICRACの、漏洩抽出し、準化した平均電流電圧 (I/V)データトレース。トレースは、未処理コントロール(wt、n = 9)、CRACM1 dsRNA (n = 5)およびCRACM2 dsRNA (n = 6)に相当する。(E) IP3が除外され、受動的貯蔵減少を誘導するために、[Ca2+]iが10 mM BAPTAでほぼゼロに固定されたこと以外、パネル(C)と同様。トレースは、未処理コントロール(wt;黒丸、n = 4)およびCRACM1 dsRNA (赤丸、n = 3)に相当する。(F) −100から＋100 mVまでの50 msランプ電圧により誘導された電流からの200 sで、代表的な細胞から抽出したICRACの、漏洩抽出し、準化した平均電流電圧 (I/V)データトレース。トレースは、未処理コントロール(wt、n = 4)およびCRACM1 dsRNA (n = 3)から取得した受動的減少誘導ICRACに相当する。
【図２】図2は、HEK293およびJurkat細胞でのCRACM1 siRNAによるストア作動性Ca2+流入およびICRACの抑制を示す。(A) 左パネル: 2個の異なるCRACM1特異的siRNAおよびスクランブル配列コントロールで感染させた、HEK293細胞からのCRACM1 mRNAの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)。サイクル数: 24、27、30。右パネル: 小リボソームタンパク質に特異的なプライマーを使用したRT-PCRのためのポジティブコントロール。サイクル数: 24、27、30。(B) HEK293細胞で、スクランブル(コントロール)および2個の異なるCRACM1特異的siRNAで処理した細胞での[Ca2+]iのFura-2-AM蛍光測定。細胞を無Ca2+溶液で保ち、タプシガルギン(2 μM)に曝し、その後、2 mM Ca2+を添加した。トレースは、3回の独立した実験を代表する。(C) (B)と同様ではあるが、Jurkat細胞に関するプロトコール。トレースは、3回の独立した実験の平均である。(D) HEK293細胞で測定したIP3誘導(20 μM) ICRACの標準化した平均経時変化。トレースは、スクランブル(黒丸、n = 13)、CRACM1 siRNA-1 (赤丸、n = 10)およびCRACM1 siRNA-2 (青丸、n = 9)に相当する。(E) −100から＋100 mVまでの50 msランプ電圧により誘導された電流からの60 sで、代表的な細胞から抽出したICRACの、漏洩抽出し、準化した平均電流電圧 (I/V)データトレース。トレースは、スクランブル(n = 10)、CRACM1 siRNA-1 (n = 8)およびCRACM1 siRNA-2 (n = 7)に相当する。(F) パネル(D)と同じではあるが、Jurkat細胞に関する。トレースは、スクランブル(黒丸、n = 9)、CRACM1 siRNA-1 (赤丸、n = 8)およびCRACM1 siRNA-2 (青丸、n = 8)に相当する。(G) −100から＋100 mVまでの50 msランプ電圧により誘導された電流からの60 sで、代表的な細胞から抽出したICRACの、漏洩抽出し、準化した平均電流電圧 (I/V)データトレース。トレースは、スクランブル(n = 9)、CRACM1 siRNA-1 (n = 7)およびCRACM1 siRNA-2 (n = 8)に相当する。
【図３】図3は、HEK293、Jurkat細胞およびRBL-2H3細胞でのCRACM1の過剰発現を示す。(A) 抗mycまたは抗His C末端抗体を用いた免疫沈降および抗myc抗体を用いたイムノブロッティングによる、CRACM1の過剰発現に関するHEK293細胞の解析。空ベクタートランスフェクション細胞からのコントロール免疫沈降は、あらゆるバンドを示さなかった。(B) HEK293細胞で測定したIP3-誘導(20 μM) ICRACの標準化した平均経時変化。個々の細胞の電流は、−80 mVで測定し、それらの各々の細胞サイズで標準化し、平均化および対時間プロット(± S.E.M.)した。細胞質カルシウムを、10 mM BAPTAおよび4 mM CaCl2を用いて、150 nMに固定した。トレースは、空ベクターをトランスフェクションした細胞(コントロール;黒丸、n = 13)およびGFP＋CRACM1でトランスフェクションした細胞(赤丸、n = 14)に相当する。(C) パネル(B)と同じではあるが、Jurkat細胞に関する。トレースは、空ベクタートランスフェクション細胞(コントロール;黒丸、n = 4)およびGFP＋CRACM1でトランスフェクションした細胞(赤丸、n = 5)に相当する。(D) パネル(B)と同じではあるが、RBL-2H3細胞に関する。トレースは、空ベクタートランスフェクション細胞(コントロール;黒丸、n = 9)およびGFP＋CRACM1でトランスフェクションした細胞(赤丸、n = 9)に相当する。(E) 共焦点顕微鏡で視覚化したHEK293細胞でのCRACM1の免疫蛍光局在。インタクト細胞(左パネル)および透過性細胞(右パネル)でのCRACM1-flag-N末端(上パネル)またはCRACM1-myc-C末端(下パネル)のための免疫染色。(F) (E)の右下パネルと同じではあるが、細胞膜染色を示すための選択した細胞のより高い倍率。
【図４】図4Aは、ヒトCRACM1の核酸配列である。図4Bは、ヒトCRACM1のアミノ酸配列である。
【図５】図5は、HEK-293細胞で発現したCRACM1からのデータを示す。(A) Flag-CRACM1およびCRACM1-Myc-Hisを共トランスフェクションしたHEK293細胞からのCRACM1の共沈。レーン2は、Flag-CRACM1が、CRACM1-Myc-Hisと共沈することを示す。レーン3は、逆の共IPを示し、レーン1および4は、コントロールIPを示す。(B) HEK-293に共トランスフェクションさせたFlag-CRACM1およびStim1-Myc-Hisの共沈。全細胞ライセートを、抗myc抗体(第1レーン)または抗flag抗体(第2レーン)で免疫沈降し、抗myc抗体(上パネル)または抗flag抗体(下パネル)でブロットした。(C) ヒトCRACM1、CRACM2、およびCRACM3ならびにさまざまな種(ショウジョウバエ、マウス、ラット、およびニワトリ)由来のCRACM1の配列アライメント(酸性残基を強調し、残基数は、CRACM1のヒト配列に関する)。(D) D110/112A-CRACM1およびE106Q-CRACM1突然変異体のwt-CRACM1との共IP。レーン1は、D110/112A-CRACM1-Myc-Hisが、Flag-CRACM1と共IPし得ることを示し、レーン3は、CRACM1-Myc-Hisが、Flag-E106Q-CRACM1と共IPし得ることを示す。レーン2および4は、コントロールを示す。(E) Flag-CRACM1、D110/112A-CRACM1-Myc-His、Flag-E190Q-CRACM1およびFlag-E106Q-CRACM1でトランスフェクトし、突然変異体の細胞局在を示すために、各々、抗mycまたは抗flag抗体で染色したHEK293細胞の共焦点イメージ。
【図６】図6は、CRACM1突然変異体を用いた選択性実験の結果を示す。(A) STIM1を、野生型CRACM1(黒丸、n = 14)およびE106Q突然変異体(赤丸、n =9)と共発現させたHEK293細胞で測定した、IP3誘導(20 μM) CRAC電流の標準化した平均経時変化。個々の細胞の電流を−80 mVで測定し、細胞静電容量で標準化し、平均化および対時間プロット(± S.E.M.)した。細胞質カルシウムを、20 mM BAPTAでゼロ近くに固定した。棒は、無二価(DVF)溶液の適用を示す。(B) 実験において120 sで、パネルAで示した代表的なHEK293細胞から抽出した、CRAC電流の平均電流電圧 (I/V)関係。データは、−100から＋150 mVまでの50 msランプ電圧により誘導された平均漏洩抽出電流を示し、細胞静電容量(pF)まで標準化した。トレースは、STIM1 ＋ wt-CRACM1 (wt、n = 12)またはSTIM1 ＋ E106Q突然変異体(n = 6)に相当する。(C) E106D突然変異体により産生された−80および＋130 mVでのIP3誘導(20 μM)電流の標準化した平均経時変化。細胞を、黒色棒で示した時間で、名目上無Ca2+外液(黒丸、n = 6)または無Na+溶液(赤丸、n = 6)に曝した。電流は、パネルAのとおり解析した。120 s (黒色トレース、n = 6)で、および無Ca2+(青色トレース、n = 6)もしくは無Na+(赤色トレース、n = 6)溶液(パネルCで示したものと同じ細胞)の適用の後に抽出したE106D突然変異体の平均I/Vトレース。データ解析は、パネルBのとおりである。(E) wt-CRACM1(黒丸、n = 9)またはE106D突然変異体(赤丸、n = 7)を発現するHEK293でのCRAC電流の標準化した平均経時変化。解析は、パネルAのとおりである。細胞を、黒色棒で示した時間で、10 mM Ba2+ (および0 Ca2+)を含む外液で表面かん流した。Na+電流混入を避けるために、細胞を、細胞外Na+(TEA+で置換された)の非存在下で、Ba2+で表面かん流したことに留意すべきである。(F) Ba2+適用の前(120 s、n = 4)後(180 s、n = 4)で、パネルEで示したE106D突然変異体を発現する代表的なHEK293細胞から抽出した電流の平均I/Vデータトレース。解析は、パネルBのとおりである。(G) E190Q突然変異体で産生した−80および＋130 mVでのIP3誘導(20 μM)電流の標準化した平均経時変化。細胞を、名目上無Ca2+外液(黒丸、n = 7)または無Na+溶液に曝し、そこでは、Ca2+は、棒で示した時間でBa2+ (赤丸、n = 8)で置換された。電流は、パネルAのとおり解析した。(H) 120 s (黒色トレース、n = 8)および10 Ba2+ (赤色トレース、n = 8)または無Ca2+溶液(青色トレース、n = 7;パネルGで示したとおりの同じ細胞)の適用の最後で抽出された、E190Q突然変異体の平均I/Vトレース。データ解析は、パネルBのとおりである。
【図７】図7は、CRACM1のポア突然変異体を用いた選択性実験を示す。(A) STIM1を、wt-CRACM1 (黒丸、n = 12)またはCRACM1のD110/112A突然変異体 (赤丸、n =11)と共発現させたHEK293細胞で測定した、IP3誘導(20 μM) CRAC電流の標準化した平均経時変化。個々の細胞の電流を−80 mVおよび＋130 mVで測定し、細胞静電容量で標準化し、平均化および対時間プロット(± S.E.M.)した。細胞質カルシウムを、20 mM BAPTAでゼロ近くに固定した。黒色棒は、TEA+で置換されたNa+と共に10 mM Ca2+を含む外液の適用を示す。(B) wt-CRACM1 (黒色トレース、図2Aで示したものと同じデータ)またはD110/112A突然変異体により産生された、IP3誘導(20 μM)電流の平均経時変化。電流は、120 s (I/I120s)での一致まで標準化した。D110/112A突然変異体を発現する細胞を、Na+ の存在下(130 mM、n = 13)、または非存在下で(TEA+置換、n = 5)、名目上無Ca2+外液で表面かん流した。かん流時間は、黒色棒により示す。電流は、パネルAのとおり解析した。(C) パネルAおよびBで示した代表的なHEK293細胞から抽出した、CRAC電流の平均I/V関係。データは、−100から＋150 mVまでの50 msランプ電圧により誘導された平均漏洩抽出電流を示し、細胞静電容量(pF)まで標準化した。トレースは、10 mM Ca2+を含む無Na+溶液(180 s)の適用後のwt-CRACM1発現細胞(黒色トレース、n = 10; D110/112A突然変異体の内部電流サイズに適合させるための1.7までの規模で)および通常のNa+を含む名目上の無Ca2+溶液の適用前(120 sで、青色トレース、n = 11)またはその間(赤色トレース、n = 11)に抽出したD110/112A突然変異体を示す。(D) Na+ (赤線、パネルBで示したものと同じデータ)、K+ (黒丸、n = 12)またはCs+ (青丸、n = 9)を含む名目上の無Ca2+溶液で表面かん流した細胞のD110/112A突然変異体により産生した、IP3誘導(20 μM)電流の標準化した平均経時変化 (I/I120s)。適用時間は、黒色棒により示す。電流は、パネルAのとおり解析した。(E) wt-CRACM1 (黒丸、n = 8)またはD110/112A突然変異体 (赤丸、n = 8)により産生したIP3誘導(20 μM)電流の標準化した平均経時変化(I/I120s)。細胞を、黒色棒により示したとおり、10 μM Ca2+を補充した名目上の無二価外液で、表面かん流した。電流は、パネルAのとおり解析した。(F) wt-CRACM1 (黒丸、n = 5-14)またはD110/112A突然変異体(赤丸、n = 5-8)の異常モル断片効果。異なるCa2+濃度で測定した電流サイズを、10 mM Ca2+で取得した電流振幅に関連して設定し、平均化および増加した細胞外Ca2+濃度に対するプロットを行った。(G) 外液で表面かん流した細胞で、wt-CRACM1により産生したIP3誘導(20 μM)電流の標準化した平均経時変化 (I/I120s)［そこでは、10 mM Ca2+を、等モル濃度で、Na+ の非存在下(Na+電流混入を避けるために、TEA+で置換した)、Ba2+ (黒丸、n = 9)またはSr2+ (青丸、n = 7)で置換した］。電流は、パネルAのとおり解析した。(H) 10 mM Ca2+を、Na+の非存在下(Na+電流混入を避けるために、TEA+で置換した)、等モル濃度で、Ba2+ (黒丸、n = 7)またはSr2+ (青丸、n = 7)で置換した外液で表面かん流した細胞において、D110/112A突然変異体により産生されたIP3誘導(20 μM)電流の標準化した平均経時変化 (I/I120s)。電流は、パネルAのとおり解析した。(I) wt-CRACM1 (黒色、n = 5-12)またはD110/112A突然変異体 (赤色、n = 5-14)の透過プロファイル。−80 mVの電流を、外部適用交換の後、評価し(180 s)、適用前の電流に関連して設定し(120 s)、平均化および静止電流として割合(%)でプロットした。データを適用条件(10 mM Ca2+、10 mM Ba2+、10 mM Sr2+、130 mM Na+、130 mM K+、130 mM Cs+)により分類した。一価コンダクタンスを、標準的なMg2+濃度(2 mM)の存在下、名目上無Ca2+溶液で評価した。データは、パネルAからパネルHの要約を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年4月9日(2009.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CRACMポリペプチドの活性を調節できる候補生物活性剤をスクリーニングする方法であって:
a) CRACMポリペプチドを発現する細胞を提供し;
b) 該細胞を候補生物活性剤と接触させ;そして、 
c) CRACMポリペプチドの発現またはイオンチャネル活性を測定すること(ここで、該候補生物活性剤の非存在下におけるCRACMポリペプチドの発現またはイオンチャネル活性と比較したときのCRACMポリペプチドの発現またはイオンチャネル活性の変化は、候補生物活性剤がCRACMポリペプチドの活性を調節できることを示す)
を含む、方法。
【請求項２】
該イオンチャネル活性が、ストア作動性カルシウム流入を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
該CRACMポリペプチドが、CRACM1ポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
該CRACMポリペプチドが、CRACM2ポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
細胞の二価カチオン透過性を調節できる候補生物活性剤をスクリーニングする方法であって:
a) CRACMを発現する細胞を候補薬剤と接触させ;そして、
b) 該候補薬剤が、細胞の二価カチオン透過性を調節するか否かを決定すること
を含む、方法。
【請求項６】
細胞の二価カチオン透過性が、該候補薬剤との接触により増加する、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
細胞の二価カチオン透過性が、該候補薬剤との接触により減少する、請求項5に記載の方法。
【請求項８】
二価カチオンが、Ca+2、Ba+2、Sr+2 およびMn+2からなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
【請求項９】
CRACMポリペプチドに結合できる生物活性剤をスクリーニングする方法であって:
a) CRACMポリペプチドを発現する組換え核酸を含む組換え細胞を提供し;
b) 組換え細胞を候補薬剤と接触させ;そして、
c) 細胞のCa+2透過性の調節を検出すること;
(ここで、Ca+2透過性の調節は、生物活性剤がCRACMポリペプチドに結合できることを示す)
を含む、方法。
【請求項１０】
Ca+2透過性が、該候補薬剤により増加する、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
Ca+2透過性が、該候補薬剤により減少する、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
該CRACMが、CRACM1である、請求項9に記載の方法。
【請求項１３】
該CRACMが、CRACM2である、請求項9に記載の方法。
【請求項１４】
CRACMポリペプチドに結合できる候補生物活性剤をスクリーニングする方法であって:
a) CRACMポリペプチドを候補薬剤と接触させ;そして、
b) 該候補薬剤のCRACMポリペプチドへの結合を決定すること
を含む、方法。
【請求項１５】
2個またはそれ以上の候補薬剤のライブラリーをCRACMポリペプチドと接触させる、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
該CRACMポリペプチドが、CRACM1ポリペプチドである、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
該CRACMポリペプチドが、CRACM2ポリペプチドである、請求項14に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも1個の細胞を、CRACM発現を阻害する薬剤と接触させることを含む、CRAC活性を阻害する方法。
【請求項１９】
少なくとも1個の細胞をCRACMポリペプチドのCRACM活性を阻害する薬剤と接触させることを含む、CRAC活性を阻害する方法。
【請求項２０】
CRACMが、CRACM1またはCRACM2である、請求項18または19に記載の方法。
【請求項２１】
該薬剤が、アンチセンスCRACM1核酸である、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
該薬剤が、アンチセンスCRACM2核酸である、請求項20に記載の方法。
【請求項２３】
該薬剤が、抗CRAC1抗体である、請求項20に記載の方法。
【請求項２４】
該薬剤が、抗CRAC2抗体である、請求項20に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成21年5月8日(2009.5.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009533062000001.app
【国際調査報告】
2009533062.tif 000009
2009533062.tif 000010
2009533062.tif 000011