(57)【要約】  本発明は一般的にはＳＦＲＰ−４結合剤の調製および同一物の使用に関する。とりわけ本発明は抗ＳＦＲＰ−４抗体の調製およびＳＦＲＰ−４検出のためのその使用およびＳＦＲＰ−４媒介の機能の調整に関する。本発明の組成物および方法を多様な組織で用いてＳＦＲＰ−４ポリペプチド発現の変化により現れる障害を検出すること、およびかかるＳＦＲＰ−４ポリペプチド関連障害に関してそれを必要とする対象において治療的および予防的救済に影響を及ぼすことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：３；配列番号：４；および配列番号：５からなる群から選択される少なくとも一つのポリペプチドに免疫特異的に結合し；そして配列番号：２のポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体組成物。
【請求項２】
抗体がポリクローナル抗体；モノクローナル抗体；キメラ抗体；ヒト化抗体および抗体関連ポリペプチドからなる群から選択される請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
請求項１に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項４】
配列番号：３；配列番号：４；および配列番号：５からなる群から選択される少なくとも一つのポリペプチドに免疫特異的に結合し；そして配列番号：２のポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体またはそのフラグメントをコードする単離された核酸。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項６】
核酸分子に作動可能なように連結されたプロモーターをさらに含む請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
請求項５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
（ａ）請求項６に記載のベクターを含有する細胞を抗体またはそのフラグメントの発現を提供する条件下で培養すること：および
（ｂ）発現された抗体またはそのフラグメントを回収すること；
を含む配列番号：３；配列番号：４；および配列番号：５からなる群から選択される少なくとも一つのポリペプチドに免疫特異的に結合し；そして配列番号：２のポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを調製するための方法。
【請求項９】
（ａ）試料を提供すること；
（ｂ）試料を請求項１に記載の抗体組成物と接触させること；および
（ｃ）免疫反応性ポリペプチドに結合する抗体組成物の存在または量を決定し、それにより試料中の免疫反応性ポリペプチドの存在または量を決定すること；
を含む試料中の免疫反応性ポリペプチドの存在または量を決定するための方法。
【請求項１０】
対象において分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ポリペプチド４型関連障害を処置または予防するのに十分な量で有効量の請求項１に記載の抗体組成物をかかる処置または予防が望ましい対象に投与することを含む分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ポリペプチド４型関連障害を処置または予防する方法。
【請求項１１】
分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ポリペプチド４型関連障害が脳癌；乳癌；前立腺癌；子宮癌；脾臓の癌；膵臓癌；結腸癌；直腸癌；小腸の癌；胃癌；食道癌；虚血の結果であるアポトーシス、心不全；心筋梗塞；卒中；神経変性障害；ハンチントン病；末梢脱髄性疾患；多発性硬化症；アルツハイマー病；筋萎縮性側索硬化症；パーキンソン病；外傷；冠動脈心疾患；炎症；および炎症性腸疾患からなる群から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
対象において配列番号：２のポリペプチドの発現に関連する医学的症状を処置または予防するのに有効な量で請求項４に記載の核酸をかかる処置または予防が望ましい対象に投与することを含む分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ポリペプチド４型関連障害を処置または予防する方法。
【請求項１３】
分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ポリペプチド４型関連障害が脳癌；乳癌；前立腺癌；子宮癌；脾臓の癌；膵臓癌；結腸癌；直腸癌；小腸の癌；胃癌；食道癌；虚血の結果であるアポトーシス、心不全；心筋梗塞；卒中；神経変性障害；ハンチントン病；末梢脱髄性疾患；多発性硬化症；アルツハイマー病；筋萎縮性側索硬化症；パーキンソン病；外傷；冠動脈心疾患；炎症；および炎症性腸疾患からなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物に少なくとも一種の請求項１に記載の抗体を投与することを含む哺乳動物において配列番号：２の配列を含むアミノ酸配列でポリペプチドの発現または活性を調整する方法。
【請求項１５】
抗体組成物が請求項１に記載の抗体組成物である分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ポリペプチド４型関連障害の処置用医薬品の製造のための抗体組成物の使用。
【請求項１６】
請求項３に記載の医薬組成物およびその内容物を使用するための説明書を一個またはそれより多い容器中に含むキット。
【請求項１７】
請求項５に記載の医薬組成物およびその内容物を使用するための説明書を一個またはそれより多い容器中に含むキット。
【請求項１８】
（ａ）被験試料を提供すること；
（ｂ）抗体が分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ポリペプチド４型ポリペプチド生物学的マーカーと複合体形成して抗体／分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ポリペプチド４型ポリペプチド生物学的マーカー複合体を形成する条件下で被験試料を請求項１に記載の抗体と接触させること；
（ｃ）抗体／分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ポリペプチド４型ポリペプチド生物学的マーカー複合体を検出すること；および
（ｄ）被験試料中の抗体／分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ポリペプチド４型ポリペプチド生物学的マーカー複合体を定量すること；
を含む分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ポリペプチド４型ポリペプチド生物学的マーカーを検出する方法。
【請求項１９】
（ａ）第一の哺乳動物対象からの被験試料を提供すること；
（ｂ）抗体が分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ポリペプチド４型ポリペプチド生物学的マーカーと複合体形成して抗体／分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ポリペプチド４型ポリペプチド生物学的マーカー複合体を形成する条件下で第一の哺乳動物対象からの被験試料を請求項１に記載の抗体と接触させること；
（ｃ）抗体／分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ポリペプチド４型ポリペプチド生物学的マーカー複合体のレベルを検出すること；
（ｄ）第一の哺乳動物対象からの試料中の分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ポリペプチド４型ポリペプチドの発現のレベルを定量すること；および
（ｅ）工程（ａ）の試料中の分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ポリペプチド４型ポリペプチドのレベルを疾患を有さないかまたはその素因のないことが分かっている第二の哺乳動物対象からの対照試料中に存在する分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ポリペプチド４型ポリペプチドのレベルと比較すること；
を含み、ここで第二の哺乳動物対象からの対照試料と比較されるように第一の対象における分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ポリペプチド４型ポリペプチドの発現レベルの変化が疾患の存在またはそれに対する素因を示す第一の哺乳動物対象における分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ポリペプチド４型ポリペプチドのレベル変化に関連する疾患の存在またはそれに対する素因を決定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般的には免疫グロブリン、抗体およびそのフラグメントに関する。とりわけ本発明は分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質４（ＳＦＲＰ−４）結合剤の調製および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Ｗｎｔ遺伝子ファミリーは分化および発達において重要な役割を提供するタンパク質をコードする。Ｗｎｔタンパク質はＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーの７回膜貫通型受容体と相互作用し、そして核に至るシグナリング経路を活性化する。Dennis et al., J. Cell Sci., １１２（２１）：３８１５−２０（１９９９）。Ｗｎｔ−１シグナリングの一次的な生化学的効果はＬｅｆ／ｔｃｆファミリーの転写因子と関連して遺伝子発現を調節する細胞質（ベータ）カテニンの安定化である。Ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質の細胞外リガンド結合ドメインに類似する分泌型タンパク質、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＳＦＲＰ）の新しいクラスが最近同定され、それはさらなるメカニズムがＷｎｔシグナリングを調節できることを示唆した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＳＦＲＰ−４は、Ｗｎｔまたはｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体のいずれかに結合することによりＷｎｔ／ｆｒｉｚｚｌｅｄ経路のシグナリング機能を拮抗する可溶性細胞外糖タンパク質である。ＳＦＲＰ−４は脳、腎臓、肺、卵巣、前立腺、乳腺および子宮内膜において発現され、そして細胞生存に関して複合的な機能を示す。Jones et al., Bioessays ２４：８１１−２０（２００２）。ＳＦＲＰ−４は骨代謝（Fujita et al., Geriat. and Gerontol. Intern. ４：１７５−８０（２００４））、排卵（Drake et al., Apoptosis ８：３８９−９７（２００３））、腫瘍抑制（Hrzenjak et al., J. Path. ２０４：１９−２７（２００４）；Horvath et al., Clin. Cancer Res. １０：６１５−２５（２００４））に関与することが示唆されており、そして骨軟化症に随伴される腫瘍により発現される循環性リン酸塩尿症因子として特徴付けされた（Berndt et al., J Clin Invest １１２：７８５−９４（２００３））。これらの生物学的過程におけるその関与のために、ＳＦＲＰ−４は癌、ホルモン調節性生殖組織の疾患および神経変性の分野で潜在的バイオマーカー（すなわち生物学的マーカー）として考えられている。したがって当分野では、ＳＦＲＰ−４ポリペプチドを標的化（例えば結合）および／または調整するために有用なさらなる薬剤が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要旨
本発明はＳＦＲＰ−４ポリペプチドを標的化および／または調整するために有用な薬剤を提供する。本発明は配列番号：３；配列番号：４；および配列番号：５；からなる群から選択されるＳＦＲＰ−４ポリペプチドに免疫特異的に結合し、そして配列番号：２のポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体組成物を提供する。抗体はポリクローナル抗体；モノクローナル抗体；キメラ抗体；ヒト化抗体、および抗体関連ポリペプチドでよい。
【０００５】
本発明はまた本発明の抗体を作成および使用する方法をも提供する。したがって本発明は薬学的に許容される担体中に本発明の抗体を含有する医薬組成物を提供する。本発明はＳＦＲＰ−４ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体またはそのフラグメントをコードする単離された核酸を提供する。本発明はまた本発明の核酸を含有するベクターおよび宿主細胞をも提供する。
【０００６】
本発明はさらに分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ポリペプチド４型関連障害を処置または予防する方法を提供する。障害は脳癌；乳癌；前立腺癌；子宮癌；脾臓の癌；膵臓癌；結腸癌；直腸癌；小腸の癌；胃癌；食道癌；虚血の結果であるアポトーシス、心不全；心筋梗塞；卒中；神経変性障害；ハンチントン病；末梢脱髄性疾患；多発性硬化症；アルツハイマー病；筋萎縮性側索硬化症；パーキンソン病；外傷；冠動脈心疾患；炎症；または炎症性腸疾患でよい。本発明は本発明の抗体を投与することによりポリペプチドの発現または活性を調整する方法を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
したがって本発明は分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ポリペプチド４型関連障害の処置のための医薬品の製造のための抗体組成物の使用を提供する。
【０００８】
簡単な図面の説明
図面は例示により好ましい実施態様を表すものであり、限定によるものではない。
図１はＨｉｓタグ化ＳＦＲＰ−４ポリペプチドのウェスタンブロット分析を示す。パネルＡは培養の４８時間（左レーン）および１４４時間（右レーン）後の培養上澄１０μｌにおいて検出される免疫反応性Ｈｉｓタグ化ＳＦＲＰ−４ポリペプチドを示す。パネルＢはＨｉｓタグ化ＳＦＲＰ−４含有培養上澄（４８時間試料）の脱グリコシル処理の効果を示す。レーン１：Ｈｉｓタグ化ＳＦＲＰ−４含有培養上澄（４８時間試料）において観察されたＳＦＲＰ−４免疫反応性タンパク質；レーン２：ｍｏｃｋ処理Ｈｉｓタグ化ＳＦＲＰ−４含有培養上澄（４８時間試料）において観察されたＳＦＲＰ−４免疫反応性タンパク質；レーン３：ＰＮＧａｓｅ処理Ｈｉｓタグ化ＳＦＲＰ−４含有培養上澄（４８時間試料）において観察されたＳＦＲＰ−４免疫反応性タンパク質。
【０００９】
図２はＳＦＲＰ−４  ＥＬＩＳＡ標準曲線を示すグラフである。
図３は組織におけるスポットの大きさを示すチャートを伴うハイスループットウェスタンブロットの写真である。検定された組織は以下のとおりである：１、胎盤；２、空レーン；３、脂肪；４、膀胱；５、脳；６、乳房；７、小脳；８、頸部；９、結腸；１０、横隔膜；１１、十二指腸；１２、食道；１３、胆嚢；１４、心臓；１５、回腸；１６、空腸；１７、腎臓；１８、肝臓；１９、肺；２０、卵巣；２１、膵臓；２２、胎盤；２３、直腸；２４、骨格筋；２５、皮膚；２６、脾臓；２７、胃；２８、精巣；２９、胸腺；３０、甲状腺；３１、扁桃腺；３２、子宮。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
命名および定義
特記しない場合、本明細書にて使用される全ての技術的および科学的用語は一般的には本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書および添付の請求の範囲にて使用される際には、単数形態「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、その内容が明らかに別に指示する場合を除いて、複数の指示対象を含む。例えば「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は二つまたはそれより多い細胞の組み合わせ等を含む。一般的には、本明細書にて使用される命名ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学および核酸化学および以下に記載されるハイブリダイゼーションにおける実験手順は当分野において周知であり、そして一般的に用いられるものである。核酸およびペプチド合成に関する標準的な技術が用いられる。また本明細書にて使用される命名ならびに以下で記載される分析化学および有機合成における実験手順は当分野において周知であり、そして一般的に用いられるものである。標準的な技術またはその修飾は化学的合成および化学的分析に関して使用される。あたか各個々の出版物、特許または特許出願が具体的におよび個々にその全てにおいて、全ての目的に関して出典明示により本明細書の一部とされるのと同程度に、本明細書にて引用される全ての参照文献をその全てにおいて、および全ての目的に関して出典明示により本明細書の一部とする。
【００１１】
本明細書にて使用されるようなある用語の定義を以下に提供する。その他の用語の定義をIllustrated Dictionary of Immunology, ２nd Edition, Cruse, J.M. and Lewis, R.E., eds.（CRC Press, Boca Raton, Florida, １９９５）に見出すことができる。
本明細書にて使用される際には、「分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質４」（ＳＦＲＰ−４）なる用語は天然発生ＳＦＲＰ−４および合成または組換えＳＦＲＰ−４を包含する。さらに「分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質４」なる用語はアレルバリアント、種バリアント、スプライスバリアントおよび保存アミノ酸置換バリアントを包含する。ＳＦＲＰ−４遺伝子発現の発現は哺乳動物においてＳＦＲＰ−４スプライスバリアントを上昇させる。Yam et al. Gene PMID：１６００５５８２（Epub ahead of print, July ７, ２００５）。その用語はまた全長ＳＦＲＰ−４およびＳＦＲＰ−４フラグメントを包含する。ＳＦＲＰ−４には、限定するものではないがヒトＳＦＲＰ−４およびネズミＳＦＲＰ−４が含まれる。
【００１２】
本明細書にて使用される際には、薬剤または薬物の対象への投与には、自己投与および他者による投与が含まれる。記載されるような医学的症状の処置または予防の種々の様態は「実体のあるもの」を意味すると意図され、それには完全な処置または予防が含まれるが、しかし完全に満たないものもまた含まれ、そしてここで何らかの生物学的または医学的に関連性のある結果が達成されるということもまた理解される。
【００１３】
本明細書にて使用される際には、「アミノ酸」なる用語には天然発生アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然発生アミノ酸に類似した様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸擬似物質が含まれる。天然発生アミノ酸は遺伝子コードによりコードされるもの、および後に修飾されるこれらのアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは天然発生アミノ酸と同一の基本化学構造を有する化合物、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合するα−炭素、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。かかる類似体は修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチドバックボーンを有するが、天然発生アミノ酸と同一の基本化学構造を保持する。アミノ酸擬似物質とはアミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然発生アミノ酸に類似した様式で機能する化学的化合物を指す。本明細書ではアミノ酸をその一般に公知の三文字記号によるか、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会により推奨される一文字記号によるかのいずれかで言及することができる。同様にヌクレオチドをその一般に許容される一文字コードにより言及することができる。
【００１４】
本明細書にて使用される際には、「抗体」なる用語は抗原を特異的に結合し、そして認識する免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメントからのフレームワーク領域を含むポリペプチド、例えばＳＦＲＰ−４ポリペプチドを意味する。抗体なる用語の使用は一本鎖全抗体およびその抗原結合フラグメントを含む全抗体を含むとされる。
【００１５】
本明細書にて使用される際には、「抗体関連ポリペプチド」なる用語は、可変領域単独または以下のポリペプチドエレメント：抗体分子のヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン；の全てもしくは一部との組み合わせを含み得る、一本鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントを意味する。可変領域およびヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの任意の組み合わせもまた本発明に含まれる。本発明の結合剤として有用な抗体関連分子には、例えば限定するものではないがＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）およびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントが含まれる。実例には：（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド橋により連結された二つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ward et al., Nature ３４１：５４４−５４６（１９８９））；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。
【００１６】
本明細書にて使用される際には、「生物学的試料」なる用語とは生存細胞から誘導されたか、またはそれに接触した試料を意味する。「生物学的試料」なる用語には対象ならびに対象内に存在する組織、細胞および液体から単離された組織、細胞および生物学的液体が含まれると意図される。
本明細書にて使用される際には、「ＣＤＲグラフト化抗体」なる用語は「アクセプター」抗体の少なくとも一つのＣＤＲが、望ましい抗原特異性を保有する「ドナー抗体」からのＣＤＲ「グラフト」により置き換えられている抗体を意味する。
【００１７】
本明細書にて使用される際には、「キメラ抗体」なる用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて一つの種からのモノクローナル抗体のＦｃ定常領域（例えばマウスＦｃ定常領域）が別の種の抗体からのＦｃ定常領域（例えばヒトＦｃ定常領域）と置き換えられている抗体を意味する。一般的にはRobinson et al., ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Akira et al.、欧州特許出願第１８４１８７号；Taniguchi、欧州特許出願第１７１４９６号；Morrison et al.、欧州特許出願第１７３４９４号；Neuberger et al.、第ＷＯ８６／０１５３３号；Cabilly et al.、米国特許第４８１６５６７号；Cabilly et al.、欧州特許出願第１２５０２３号；Better et al., Science ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）；Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA ８４：３４３９−３４４３（１９８７）；Liu et al., J Immunol １３９：３５２１−３５２６（１９８７）；Sun et al., Proc Natl Acad Sci USA ８４：２１４−２１８（１９８７）；Nishimura et al., Cancer Res ４７：９９９−１００５（１９８７）；Wood et al., Nature ３１４：４４６−４４９（１９８５）；およびShaw et al., J Natl Cancer Inst ８０：１５５３−１５５９,（１９８８）を参照のこと。
【００１８】
本明細書にて使用される際には、「比較ウィンドウ」なる用語は２０から６００、通常的には約５０から約２００、さらに通常約には約１００から約１５０個のアミノ酸またはヌクレオチドからなる群から選択されるいずれか一つの隣接位置の数のセグメントを意味し、ここでは二つの配列を最適にアラインした後、配列を同一数の隣接位置の参照配列に比較することができる。
本明細書にて使用される際には、「コンセンサスＦＲ」なる用語はコンセンサス免疫グロブリン配列におけるフレームワーク（ＦＲ）抗体領域を意味する。抗体のＦＲ領域は抗原とは接触しない。
本明細書にて使用される際には、「コンセンサス配列」なる用語は関連配列のファミリーにおいて最も頻繁に生じるアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列を指す（例えばWinnaker, From Genes to Clones（Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany １９８７）参照）。すなわち、タンパク質のファミリーでは、コンセンサス配列の各位置がそのファミリーのその位置で最も頻繁に生じるアミノ酸により占められる。二つのアミノ酸が同等の頻度である場合、いずれかがコンセンサス配列に含まれ得る。
【００１９】
本明細書にて使用される際には、「接触した」なる用語は細胞に適用される場合、本発明のＳＦＲＰ−４結合剤（例えば抗体、抗体組成物、細胞毒性剤もしくは部分、遺伝子、タンパク質、および／またはアンチセンス配列）が標的細胞に分配されるかまたは標的細胞の直近に配置される過程を指す。この分配はインビトロまたはインビボでよく、そして組換えベクター系の使用を伴うことができる。
【００２０】
本明細書にて使用される際には、「細胞毒性部分」なる用語は細胞に近接するか、または細胞により吸収された場合に細胞成長を阻止するか、または細胞死を促進する部分を意味する。細胞毒性部分は、非限定例としては化学療法剤、光活性化毒素または放射性薬剤でよい。
本明細書にて使用される際には、「ダイアボディー」なる用語は二つの抗原結合部位を有する小型抗体フラグメントを指し、そのフラグメントは同一ポリペプチド鎖（ＶＨＶＬ）に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。非常に短くて同一鎖上の二つのドメイン間で対形成することができないリンカーを使用することにより、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、そして二つの抗原結合部位を創成する。ダイアボディーは例えば欧州特許第４０４０９７号；第ＷＯ９３／１１１６１号；およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ９０：６４４４−６４４８（１９９３）にてさらに十分に記載されている。
【００２１】
本明細書にて使用される際には、「エフェクター細胞」なる用語は、免疫応答の認識および活性化相とは対照的に、免疫応答のエフェクター相に関与する免疫細胞を意味する。免疫細胞の実例には、骨髄性またはリンパ性器官の細胞、例えばリンパ球（例えばＢ細胞および細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、マスト細胞および好塩基球が挙げられる。エフェクター細胞は特異的Ｆｃ受容体を発現し、そして特異的免疫機能を実行する。エフェクター細胞は抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導することができ、例えばＡＤＣＣを誘起できる好中球である。例えば、ＦｃαＲを発現する単球、マクロファージ、好中球、好酸球およびリンパ球は、標的細胞の特異的死滅および免疫系のその他の構成成分への抗原の提示、または抗原を提示する細胞への結合に関与する。エフェクター細胞はまた標的抗原、標的細胞、転移癌細胞または微生物を貧食することもできる。
【００２２】
本明細書にて使用される際には、「エピトープ」なる用語は抗体に特異的に結合できるタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面系列からなり、そして通常特異的な三次元構造的特徴および特異的な電荷特徴を有する。立体構造的および非立体構造的エピトープは、前者への結合は変性溶媒の存在で喪失されるが、後者は喪失されないとういう点で区別される。
【００２３】
本明細書にて使用される際には、組成物の「有効量」なる用語は望ましい治療的および／または予防的効果を達成するのに十分な量、例えば処置される疾患、例えば本明細書にて列挙される標的ポリペプチドに関連する疾患に関連する病徴の予防または低下に至る量である。対象に投与される本発明の組成物の量は疾患の型および重篤度、ならびに一般健康状態、年齢、性別、体重および薬物耐性のような個体の特徴に依存するであろう。それはまた疾患の程度、重篤度および型にも依存するであろう。当業者はこれらのおよびその他の因子に依存して適切な投薬量を決定することができるであろう。本発明の組成物を互いに、または一つもしくはそれより多いさらなる治療用化合物と組み合わせて投与することもできる。
【００２４】
本明細書にて使用される際には、「発現」には、限定するものではないが一つまたはそれより多い以下のものが含まれる：遺伝子の前駆体ｍＲＮＡへの転写；成熟ｍＲＮＡを生成するための前駆体ｍＲＮＡのスプライシングおよびその他のプロセシング；ｍＲＮＡ安定性；成熟ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳（コドン使用およびｔＲＮＡ利用性を含む）；ならびに適切な発現および機能に必要な場合、翻訳生成物のグリコシル化および／またはその他の修飾。
【００２５】
本明細書にて使用される際には、「融合ポリペプチド」はＳＦＲＰ−４ポリペプチドと実質的に相同でないポリペプチドに相当するアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えばＳＦＲＰ−４ポリペプチドと異なり、そして同一または異なる生物から誘導されたポリペプチドに作動可能なように連結されたＳＦＲＰ−４ポリペプチドを含む。
本明細書にて使用される際には、「遺伝子」なる用語はプロモーター、エクソン、イントロンおよび発現を制御するその他の未翻訳領域を含むＲＮＡ生成物の調節された生合成に関する全ての情報を含有するＤＮＡのセグメントを意味する。
【００２６】
本明細書にて使用される際には、「遺伝子型」なる用語は個体の一対の相同染色体上の遺伝子座における一つまたはそれより多い多型または変異部位で見出されるヌクレオチド対の非段階的（unphased）５’から３’配列を意味する。本明細書にて使用される際には、遺伝子型には全遺伝子型または遺伝子亜型が含まれる。
本明細書にて使用される際には、「ヒト配列抗体」なる用語はヒト生殖系免疫グロブリン配列から誘導される可変および定常領域（存在する場合）を有する抗体を含む。本発明のヒト配列抗体にはヒト生殖系免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えばインビトロでランダムもしくは部位特異的変異誘発により、またはインビボで体細胞変異により導入される変異）。例えばＰＣＴ公開番号第ＷＯ０１／１４４２４号および第ＷＯ００／３７５０４号に記載されるような非ヒトトランスジェニック動物においてかかる抗体を作成することができる。しかしながら、「ヒト配列抗体」なる用語は本明細書にて使用される際には、マウスのような別の哺乳動物種の生殖系から誘導されたＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体（例えばヒト化抗体）を含まないと意図される。
【００２７】
本明細書にて使用される際には、「同一の」または「同一性」パーセントなる用語は、二つまたはそれより多い核酸またはポリペプチド配列の局面で用いられる場合、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２.０配列比較アルゴリズムを用いて以下に記載されるデフォルトパラメーターで、または手作業のアラインメントおよび目視検査により（例えばＮＣＢＩウェブサイト参照）測定されるように、同一であるか、または特定のパーセンテージの、同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する（すなわち、比較ウィンドウまたは指定された領域にわたって最大一致のために比較され、そしてアラインされた場合、特定の領域（例えば本明細書に記載される抗体をコードするヌクレオチド配列、または本明細書に記載される抗体のアミノ酸配列）にわたって約６０％同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらに高い同一性）二つまたはそれより多い配列または部分配列を指す。かかる配列は次いで「実質的に同一」であるとされる。この用語はまた被験配列の相補体を指すか、またはそれに適用され得る。用語はまた欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有するものを含む。以下に記載されるように、好ましいアルゴリズムはギャップ等を明らかにすることができる。好ましくは、同一性は少なくとも約２５アミノ酸もしくはヌクレオチド長である領域にわたって、またはさらに好ましくは５０−１００アミノ酸もしくはヌクレオチド長である領域にわたって存在する。
【００２８】
「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたは生物学的に活性なその部分は、ＳＦＲＰ−４結合剤が誘導される細胞もしくは組織供給源からの細胞性材料もしくはその他の夾雑ポリペプチドを実質的に含まない、または化学的に合成された場合、化学的前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まない。例えば抗ＳＦＲＰ−４抗体である単離されたＳＦＲＰ−４結合剤は、薬剤の診断的または治療的使用を干渉する材料を含まない。かかる干渉材料には、酵素、ホルモンならびにその他のタンパク質性および非タンパク質性溶質が含まれ得る。
【００２９】
本明細書にて使用される際には、「インタクトな抗体」なる用語は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも二つの重（Ｈ）鎖ポリペプチドおよび二つの軽（Ｌ）鎖ポリペプチドを有する抗体を意味する。
本明細書にて使用される際には、「免疫応答」なる用語は、癌性細胞、転移性腫瘍細胞、悪性メラノーマ、浸潤性病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、または自己免疫もしくは病理学的炎症の場合、正常ヒト細胞もしくは組織の選択的損傷、破壊またはヒト身体からの排除を招くリンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球および前記の細胞または肝臓により生成される可溶性高分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）の協奏的な作用を指す。
【００３０】
本明細書にて使用される際には、「免疫学的交差反応性」および「免疫学的に反応性」なる用語は同一（「免疫学的反応性」）または異なる（「免疫学的交差反応性」）抗原を用いて作成された抗体と特異的に反応する抗原を意味するために互換的に用いられる。一般的には、抗原はＳＦＲＰ−４、そのバリアントまたは部分配列である。
本明細書にて使用される際には、「免疫学的反応条件」とは抗原の特定のエピトープに対して作成された抗体が、抗体が全てのその他のエピトープに結合するよりも検出可能なより大きな程度で、一般的にはバックグラウンド結合を超えて少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドを超えて少なくとも５倍で、そのエピトープに結合することを可能にする条件を意味する。免疫学的反応条件は抗体結合反応の形式に依存し、そして典型的にはイムノアッセイプロトコールで利用されるものである。イムノアッセイ形式および条件の記載に関してはHarlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Publications, New York, １９８８）を参照のこと。
【００３１】
本明細書にて使用される際には、「リンパ球」なる用語は血液、リンパおよびリンパ系組織、例えばＢおよびＴリンパ球において見出されるいずれかの単核、非食作用白血球を意味する。
本明細書にて使用される際には、「医学的症状」なる用語には、限定するものではないが、処置および／または予防が望ましい一つまたはそれより多い身体的および／または心理学的病徴として現れる任意の症状または疾患が含まれ、そして以前におよび新たに同定された疾患およびその他の障害が含まれる。
【００３２】
本明細書にて使用される際には、「モジュレーター」なる用語は阻害剤およびアクチベーターを含む。阻害剤は例えば結合してＳＦＲＰ−４ポリペプチドの活性を部分的または全体的に刺激遮断する、低下させる、予防する、活性化遅延させる、不活性化する、脱感作する、または下方調節する薬剤、例えばアンタゴニストである。アクチベーターは例えば結合してＳＦＲＰ−４ポリペプチドの活性を刺激する、上昇させる、開放する、活性化する、促進する、活性化強化する、感作するまたは上方調節する薬剤、例えばアゴニストである。モジュレーターは例えばタンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、多糖類または前記の組み合わせ、例えばリポタンパク質、糖タンパク質糖を含む、アクチベーターまたは阻害剤、受容体に結合するタンパク質とＳＦＲＰ−４ポリペプチドとの相互作用を変化させる薬剤を含む。モジュレーターには例えば活性変化を伴う天然発生ＳＦＲＰ−４ポリペプチド遺伝子の修飾体、ならびに天然発生および合成リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、小型化学分子等が含まれる。
【００３３】
本明細書にて使用される際には、「モノクローナル抗体」なる用語は任意の真核細胞性、原核細胞性またはファージクローンを含む単一のクローンから誘導される抗体を意味し、そしてそれが生成される方法ではない。モノクローナル抗体組成物は特定のエピトープに関する単一の結合特異性および親和性を表示する。限定するものではないがハイブリドーマ、組換え体およびファージディスプレイテクノロジーを含む、当分野において公知の広範な種類の技術を用いてモノクローナル抗体を調製することができる。
【００３４】
本明細書にて使用される際には、「中和抗体」なる用語は少なくとも一つのＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドの生物学的機能を排除するかまたは有意に低下させることができる抗体分子を意味する。
本明細書にて使用される際には、「ヌクレオチド対」なる用語は二つのヌクレオチド鎖の間で互いに結合した二つのヌクレオチドを意味する。
本明細書にて使用される際には、「薬学的に許容される担体」なる用語は、医薬用投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌性および抗真菌性化合物、等張および吸収遅延化合物等を含むと意図される。
【００３５】
本明細書にて使用される際には、「ポリクローナル抗体」なる用語は少なくとも二つの抗体生成細胞系から誘導される抗体の調製物を意味する。この用語の使用は抗原の異なるエピトープまたは領域に特異的に結合する抗体を含有する少なくとも二つの抗体の調製物を含む。
本明細書にて使用される際には、「ポリヌクレオチド」なる用語は未修飾または修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡでよい任意のＲＮＡまたはＤＮＡを意味する。
【００３６】
本明細書にて使用される際には、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」なる用語は本明細書では互換的に用いられて、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合した二つまたはそれより多いアミノ酸を含む重合体、すなわちペプチドアイソスターを意味する。ポリペプチドとは一般にペプチド、糖ペプチドまたはオリゴマーと称される短鎖、および一般的にはタンパク質と称されるより長い鎖の双方を指す。ポリペプチドは２０個の遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような天然の過程か、または当分野において周知の化学的修飾技術のいずれかにより修飾されたアミノ酸配列を含む。かかる修飾は基本的な教科書およびさらに詳記されたモノグラフ、ならびに膨大な研究文献に十分に記載されている。
【００３７】
本明細書にて使用される際には、「組換え」なる用語は例えば細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して用いられる場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが異種性核酸もしくはタンパク質の導入、または未変性核酸もしくはタンパク質の変化により修飾されているか、またはそのように修飾された細胞から材料が誘導されることを示す。
本明細書にて使用される際には、「一本鎖抗体」または「一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」なる用語はＦｖフラグメントの二つのドメインＶＬおよびＶＨの抗体融合分子を指す。Ｆｖフラグメントの二つのドメインＶＬおよびＶＨは別個の遺伝子によりコードされるが、組換え方法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域を対形成させて、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知の一価分子を形成する一本鎖タンパク質として作成されることを可能にする合成リンカーにより、それらを結合させることができる。例えばBird et al., Science ２４２：４２３−４２６（１９８８）；およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ８５：５８７９−５８８３（１９８８）を参照のこと。「抗体」フラグメントなる用語を参照することにより、かかる一本鎖抗体が含まれ、そして組換え技術またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断により調製されることができる。
【００３８】
本明細書にて使用される際には、「小型分子」なる用語は約５ｋＤａ未満、そしてさらに好ましくは約２ｋＤａ未満の分子量を有する組成物を意味する。小型分子は例えば核酸、ペプチド、ポリペプチド、糖ペプチド、ペプチド擬似物質、炭水化物、脂質、リポ多糖類、これらの組み合わせまたはその他の有機もしくは無機分子でよい。
本明細書にて使用される際には、「特異的結合」なる用語は少なくとも１０−６Ｍの結合親和性でのＳＦＲＰ−４結合剤と抗原との間の接触を意味する。好ましい結合剤は少なくとも約１０−７Ｍ、そして好ましくは１０−８Ｍから１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍの親和性で結合する。
【００３９】
本明細書にて使用される際には、「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」なる語句は、プローブが典型的には核酸の複合混合物中、その標的部分配列にハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェント条件は配列依存性であり、そして様々な環境で異なる。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する詳しい手引きは、Tijssen, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology  Hybridization with Nucleic Probes（１９９３）に見出される。一般的には、ストリンジェント条件は、規定のイオン強度ｐＨで具体的な配列に関する熱融解点（Ｔｍ）よりも約５−１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは標的に対して相補的であるプローブの５０％が平衡時に標的配列にハイブリダイズする（標的配列がＴｍで過剰に存在するので、プローブの５０％が平衡時に占有される）温度（規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）である。ホルムアミドのような不安定化剤の添加でストリンジェント条件を達成することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションのためには、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。ストリンジェント条件の実例は以下のとおりでよい：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベーション、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベーション、０.２×ＳＳＣの洗浄、および６５℃で０.１％ＳＤＳを伴う。
【００４０】
本明細書にて使用される際には、「対象」なる用語は、好ましくは対象がヒトのような哺乳動物であるが、動物、例えば家庭用動物（例えばイヌ、ネコ等）、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等）および実験用動物（例えばサル、ラット、マウス、ウサギ、モルモット等）でもよいことを意味する。
本明細書にて使用される際には、「標的細胞」なる用語は本発明のＳＦＲＰ−４結合剤により標的化され得る対象（例えばヒトまたは動物）における任意の細胞を意味する。
本明細書にて使用される際には、「治療薬」なる用語は、有効量で存在する場合、それを必要とする対象において望ましい治療効果を生み出す化合物（例えばＳＦＲＰ−４結合剤）を意味すると意図される。
【００４１】
本発明の一つまたはそれより多い実施態様の詳細を以下に添付する記載を示す。本明細書に記載されるものに類似または均等な任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料をここで記載する。本発明のその他の特色、目的、および利点は記載および請求の範囲から明白であろう。一般的には、酵素反応および精製工程は製造者の仕様書に従って実施される。技術および手順は一般的には当分野における従来の方法および種々の一般的な参照文献に従って実施される。一般的には、Sambrook et al., Molecular Cloning：A Laboratory Manual, ２d Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, １９８９）（本文書を通して提供される）を参照のこと。
【００４２】
本発明の組成物
概要：
本発明はＳＦＲＰ−４ポリペプチド、そのフラグメントおよびバリアントに指向するＳＦＲＰ−４結合剤を提供する。ＳＦＲＰ−４は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質の推定Ｗｎｔ結合部位に相同なシステインリッチドメインを含有するＳＦＲＰファミリーのメンバーである。Ｗｎｔネットワークは発達上の細胞運命、細胞極性および接着から腫瘍形成およびアポトーシスにわたる生物学的過程に影響する。Jones et al., Bioessays ２４：８１１−２０（２００２）。ＳＦＲＰはＷｎｔシグナリングの可溶性モジュレーターとして作用する。選択的スプライシングメカニズムによりＳＦＲＰ−４遺伝子の哺乳動物発現から多種タンパク質生成物を誘導できる。Yam et al. Gene PMID：１６００５５８２（Epub ahead of print, July ７（２００５）。ヒトＳＦＲＰ−４（ＮＭ  ００３０１４.２；配列番号：１）をコードするヌクレオチド配列を表１に示す。
【００４３】
【表１】
2009526020.tif 000002
【００４４】
ヒトＳＦＲＰ−４ポリペプチドのアミノ酸配列（ＮＰ  ００３００５.１；配列番号：２）を表２に示す。
【００４５】
【表２】
2009526020.tif 000003
【００４６】
一つの態様では、本発明の目的は本発明のＳＦＲＰ−４結合剤の調製に有用な免疫原性組成物を提供することである。そのために、ヒトＳＦＲＰ−４ポリペプチドのアミノ酸配列をBiobench２（Novartis）および国立バイオテクノロジー情報センターのＢＬＡＳＴネットワークサービスを用いて分析して本発明の結合剤に関する標的として有用なＳＦＲＰ−４ドメインを同定した（実施例Ｉ参照）。この分析の結果、四つのＳＦＲＰ−４ドメインが同定され、それを以下の表３にまとめる。
【００４７】
【表３】
2009526020.tif 000004
【００４８】
ポリペプチドを生成するために有用な任意の技術、例えば化学的合成、分子生物学的技術、ＳＦＲＰ−４ポリペプチドのタンパク質溶解性または化学的分解により標的ドメインを調製することができる。一つの実施態様では、ＳＦＲＰ−４標的ドメインを化学的合成により調製する。ペプチドの化学的合成のための方法は当分野において周知である。一つの実施態様では、ＳＦＲＰ−４標的ドメインを別の化合物、例えば卵白アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニンに対する抱合を促進するために修飾する。一般的には以下のポリクローナル抗血清および免疫原の調製を参照のこと。別の実施態様では、システイン残基をＳＦＲＰ−４標的ドメインのＣ末端に組み込み、ＳＦＲＰ−４標的ドメインの別の化合物への抱合を促進する。本発明の、および別の化合物への抱合に有用な標的ドメインを含む配列を以下の表４に記載する。
【００４９】
【表４】
2009526020.tif 000005
【００５０】
ＳＦＲＰ−４標的ドメイン１から４は本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を生成するための免疫原として単独でまたは組み合わせで有用である（実施例Ｉ参照）。一つの実施態様では、本発明の免疫原性組成物は：配列番号：３；配列番号：４；配列番号：５；配列番号：６；配列番号：７；配列番号：８；配列番号：９；および配列番号：１０からなる群から選択される少なくとも一つのポリペプチドを含む。
【００５１】
ＳＦＲＰ−４は多くのヒトおよび動物腫瘍、例えば乳房、前立腺、子宮、脾臓、結腸およびその他の組織により産生される。したがってＳＦＲＰ−４発現は癌（例えば脳、乳房、前立腺、子宮、脾臓、膵臓、胃腸管（例えば結腸、直腸、小腸、胃、食道））、虚血（例えば心不全、心筋梗塞；卒中）の結果であるアポトーシス；神経変性疾患（例えばハンチントン病、末梢脱髄性疾患；多発性硬化症；アルツハイマー病；筋萎縮性側索硬化症；パーキンソン病；外傷）；冠動脈心疾患、炎症（例えば炎症性腸疾患）のような病態の生物学マーカーである。一般的にはWong, S et al., J. Pathol. １９６：１４５−１５３（２００２）；Schumann J et al., Cardiovascular Res. ４５：７２０−７２８（２００２）；Jones et al., Bioessays ２４：８１１−２０（２００２）； Horvath LG et al.,（２００４）Clin. Cancer Res. １０：６１５−２５（２００４）；Abuh Jawdeh et al. Lab Invest. ７９：４３９−４７（１９９９）、および実施例ＩＩＩを参照のこと。したがって本発明の種々の態様はＳＦＲＰ−４結合剤の調製、発現および特徴付けに関する。標的結合ドメイン１から４の各々に指向するＳＦＲＰ−４結合剤は被験試料（例えば生物学的試料）中のＳＦＲＰ−４ポリペプチド（標的ポリペプチドとも称される）を検出するために、およびＳＦＲＰ−４媒介機能を調整するために、単独で、または組み合わせで有用である。このように、本発明の種々の態様はさらに本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を使用して医学的症状に対する素因を有する個体を同定するか、または薬物応答性、副作用もしくは最適薬物用量に関して個体を分類する診断／テラノスティック方法およびキットに関する。ＳＦＲＰ−４を単独で、またはその他の生物学的マーカー、例えばアポトーシスもしくは増殖関連マーカー（例えばｃ−ｍｙｃ、サイクリンＤ１）；Ｗｎｔ経路マーカー（例えばEtheredge et al., Stem Cells ２２：８４９−８６０（２００４）参照）；Ｅｒｂ１；または前立腺特異的抗原と組み合わせて使用することができる。
【００５２】
その他の態様では、本発明はＳＦＲＰ−４媒介障害を予防または処置するための、ならびにリガンド、例えばＳＦＲＰ−４ポリペプチドに結合する小型分子をスクリーニングおよび／または確認するためのＳＦＲＰ−４結合剤の使用のための方法を提供する。具体的には、本発明のＳＦＲＰ−４結合剤はＳＦＲＰ−４ポリペプチド発現の変化、例えば増加または低下により現れる障害、例えば癌（例えば脳、乳房、前立腺、子宮、脾臓、膵臓、胃腸管（例えば結腸、直腸、小腸、胃、食道））、虚血（例えば心不全、心筋梗塞；卒中）の結果であるアポトーシス；神経変性疾患（例えばハンチントン病、末梢脱髄性疾患；多発性硬化症；アルツハイマー病；筋萎縮性側索硬化症；パーキンソン病；外傷）；冠動脈心疾患、炎症（例えば炎症性腸疾患）の予防的処置または治療的処置に有用である。これらの態様を説明する種々の特定の実施態様は以下のとおりである。
【００５３】
本発明のＳＦＲＰ−４結合剤
一つの態様では、本発明は結合剤とも称されるＳＦＲＰ−４結合剤組成物を提供する。本発明の結合剤を、結合剤により認識されるかまたは特異的に結合される本発明のポリペプチドのエピトープまたは部分、例えばポリペプチドの表面に位置するＳＦＲＰ−４ポリペプチドの領域（例えば親水性領域）に関して記載または特定することができる。抗体生成を標的化するための手段として、親水性および疎水性の領域を示すヒドロパシープロットを、例えばフーリエ変換を伴うかまたは伴わないかのいずれかのKyte−DoolittleまたはHopp−Woods法（例えばHopp & Woods, Proc. Nat. Acad. Sci. USA ７８：３８２４−３８２８（１９８１）；Kyte & Doolittle, J. Mol. Biol. １５７：１０５−１４２（１９８２）参照）を含む当分野において周知の任意の方法により作成することができる。エピトープまたはポリペプチド部分を例えばＮ末端およびＣ末端位置により、隣接アミノ酸残基の大きさにより本明細書にて記載されるように特定することができる。本発明は本発明のポリペプチドに特異的に結合し、そして同一物の排除を可能にする結合剤を含む。
【００５４】
本発明の結合剤をその交差反応性に関して記載または特定することもできる。本発明の標的ポリペプチドの任意のその他の類似体、オルソログまたは相同体に結合しない結合剤は含まれる。本発明の標的ポリペプチドに対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満の同一性（当分野において公知の、および本明細書に記載される方法を用いて計算されるように）を有するポリペプチドに結合しない結合剤もまた本発明に含まれる。さらにストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドにのみ結合する結合剤は本発明に含まれる。本発明の結合剤をその結合親和性に関して記載または特定することもできる。好ましい結合親和性には１０−６Ｍ未満、５×１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１５Ｍおよび５×１０−１５Ｍの解離定数、すなわちＫｄを有するものが含まれる。
【００５５】
本発明の範囲内のＳＦＲＰ−４結合剤には、限定するものではないが、標的ポリペプチド、その相同体、誘導体またはフラグメントに特異的に結合するモノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、ダイアボディーならびにヒトモノクローナルおよびヒトポリクローナル抗体が含まれる。本明細書にて使用される際には、「ＳＦＲＰ−４様」ポリペプチドは、ＳＦＲＰ−４ポリペプチドとは異なるが、本発明のＳＦＲＰ−４結合剤と免疫学的に反応するポリペプチドを意味する。ＳＦＲＰ−４様ポリペプチドをＳＦＲＰ−４ポリペプチドと同一の生物または異なる生物から誘導することができる。ＳＦＲＰ−４様ポリペプチドはＳＦＲＰ−４ポリペプチドと同一または異なる遺伝子によりコードされ得る。本発明の結合剤として有用な抗体には、例えば限定するものではないがＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭおよびＩｇＹが含まれる。
【００５６】
別の実施態様では、本発明の結合剤はＳＦＲＰ−４ポリペプチド、その相同体または誘導体に指向する抗体関連ポリペプチドである。典型的には結合剤の抗原結合領域、例えば抗ＳＦＲＰ−４結合領域は、本発明の結合剤の結合の特異性および親和性において最も重要である。いくつかの実施態様ではＳＦＲＰ−４結合剤は、例えば抗体の一部を欠失、付加または置換することにより修飾されている抗ＳＦＲＰ−４ポリペプチドモノクローナル抗体、抗ＳＦＲＰ−４ポリペプチドキメラ抗体および抗ＳＦＲＰ−４ポリペプチドヒト化抗体のような抗ＳＦＲＰ−４ポリペプチド抗体である。例えば抗ＳＦＲＰ−４ポリペプチド抗体を修飾して抗体の半減期、例えば血清半減期、安定性または親和性を上昇されることができる。
【００５７】
一つの実施態様では、ＳＦＲＰ−４ポリペプチドの特定のドメインに特異的である抗体の選択は、かかるドメインを保有するＳＦＲＰ−４ポリペプチドのフラグメントに結合するハイブリドーマの作成により促進される。故にＳＦＲＰ−４ポリペプチド、またはその誘導体、フラグメント、類似体もしくは相同体内の望ましいドメインに特異的である抗体であるＳＦＲＰ−４結合剤もまた本明細書にて提供される。
【００５８】
本発明はさらに本発明の結合剤に対して抗イディオタイプである抗体を含む。本発明の結合剤は一特異性、二特異性、三特異性であるか、またはより多い多特異性のものでよい。多特異性結合剤は本発明のＳＦＲＰ−４ポリペプチドの異なるエピトープに関して特異的でよいか、または本発明のポリペプチドおよび、異種ポリペプチドもしくは固体支持材料のような異種性組成物の双方に関して特異的でよい。例えば第ＷＯ９３／１７７１５号；第ＷＯ９２／０８８０２号；第ＷＯ９１／００３６０号；第ＷＯ９２／０５７９３号；Tutt et al., J. Immunol. １４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第５５７３９２０号、第４４７４８９３号、第５６０１８１９号、第４７１４６８１号、第４９２５６４８号；第６１０６８３５号；Kostelny et al., J. Immunol. １４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。本発明の結合剤は鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源に由来してよい。好ましくは、結合剤はヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリである。
【００５９】
本発明の結合剤は例えばＳＦＲＰ−４機能を調整することが望ましい対象への投与に適当である。したがって、ＳＦＲＰ−４モジュレーターであるＳＦＲＰ−４結合剤組成物、例えばＳＦＲＰ−４ポリペプチドの機能的アンタゴニストまたは機能的アゴニストを提供することがさらなる目的である。ＳＦＲＰ−４ポリペプチドの部分的アンタゴニストおよび部分的アゴニストであるＳＦＲＰ−４結合剤組成物を提供することもまた目的である。同様にＳＦＲＰ−４ポリペプチドに結合する抗ＳＦＲＰ−４抗体を中和することも含まれる。好ましい実施態様では、本発明の結合剤は：（１）ローリー法（Lowry et al., J. Biol. Chem. １９３：２６５（１９５１））により決定されるように抗体の９５重量％をより大きく、そして最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップ配列決定装置の使用により少なくとも１５残基のＮ末端もしくは内部アミノ酸配列を得るにの十分な程度まで、または（３）クーマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いて、還元もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一になるまで精製される。抗体の天然環境の少なくとも一つの構成成分が存在しないので、組換え細胞内の原位置のポリペプチドは単離された結合剤に含まれる。しかしながら通常はＳＦＲＰ−４結合剤、例えば単離された抗ＳＦＲＰ−４抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００６０】
本発明はさらにＳＦＲＰ−４ポリペプチドのモジュレーターとして作用する化合物を同定、設計および生成するのに有用な構造基盤の方法に関する。
本発明の結合剤を単独でまたはその他の組成物の組み合わせのいずれかで使用することができる。本発明のＳＦＲＰ−４結合剤をさらにＮもしくはＣ末端で異種性ポリペプチドに組換え的に融合させるか、またはポリペプチドもしくはその他の組成物に化学的に抱合（共有結合的および非共有結合的抱合を含む）させることができる。例えば本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を、検出アッセイにおいて標識として有用な分子および異種性ポリペプチド、薬物または毒素のようなエフェクター分子に組換え的に融合させるか、または化学的に抱合させることができる。例えば第ＷＯ９２／０８４９５号；第ＷＯ９１／１４４３８号；第ＷＯ８９／１２６２４号；米国特許第５３１４９９５号；および欧州特許第０３９６３８７号を参照のこと。
【００６１】
ある実施態様では、本発明のＳＦＲＰ−４結合剤は、一つまたはそれより多い治療用または細胞毒性部分にカップリングまたは抱合されて本発明のＳＦＲＰ−４結合剤抱合タンパク質を生じる抗ＳＦＲＰ−４抗体または抗ＳＦＲＰ−４抗体関連ポリペプチドである。本発明のＳＦＲＰ−４結合剤抱合タンパク質を用いて所定の生物学的応答を修飾するかまたは生物学的応答を創成することができる（例えばエフェクター細胞の再利用）。治療用部分は、古典的な化学的治療薬に限定されるように解釈されるべきではない。例えば治療用部分は望ましい生物学的活性を保有するタンパク質またはポリペプチドでよい。かかるタンパク質には、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素もしくはジフテリア毒素のような酵素的に活性な毒素もしくはその活性フラグメント；腫瘍壊死因子もしくはインターフェロン−アルファのようなタンパク質；または例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）もしくはその他の成長因子のような生物学的応答修飾因子が含まれ得る。
【００６２】
本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を調製する方法
一般的な概説
最初に、結合剤（例えば抗ＳＦＲＰ−４抗体）を上昇させることができる標的ポリペプチドを選択する。標的ポリペプチドに指向する結合剤を作成するための技術は当業者に周知である。
本発明の開示に従って使用するための結合剤として適当であるのは天然発生抗体のみならず、ＳＦＲＰ−４ポリペプチドに指向する組換え操作された抗体および抗体フラグメント、例えば抗体関連ポリペプチドもまた適当であることは理解されるべきである。
【００６３】
本明細書にて示される技術に供され得る結合剤、例えば抗ＳＦＲＰ−４抗体には、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、ならびにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ダイアボディー、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または抗体フラグメントのような抗体フラグメントが含まれる。抗体Ｆｖ含有ポリペプチド、例えばＦａｂ’およびＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントの高収率生成に有用な方法が記載されている。米国特許第５６４８２３７号を参照のこと。
由来する種は本発明の結合剤または結合剤のライブラリーを作成するのに有用であった任意の種、例えばラット、マウス、ウサギ、ニワトリ、サル、ヒト等である。
【００６４】
好ましい実施態様では、ＳＦＲＰ−４結合剤は抗ＳＦＲＰ−４抗体である。ファージまたはファージミドディスプレイテクノロジーは本発明の結合剤を誘導するための有用な技術である。本発明において有用な抗ＳＦＲＰ−４抗体は「ヒト抗体」（例えばヒトから単離された抗体）または「ヒト配列抗体」である。ファージディスプレイ法を含む種々の当分野において公知の種々の方法によりヒト抗体を作成することができる。米国特許第４４４４８８７号、第４７１６１１１号、第５５４５８０６号および第５８１４３１８号；ならびに第ＷＯ９８／４６６４５号、第ＷＯ９８／５０４３３号、第ＷＯ９８／２４８９３号、第ＷＯ９８／１６６５４号、第ＷＯ９６／３４０９６号、第ＷＯ９６／３３７３５号および第ＷＯ９１／１０７４１号を参照のこと。ポリファージ粒子をスクリーニングすることにより多量体ポリペプチド複合体のメンバーをコードする核酸配列を同定するための有用な方法が記載されている。Rudert et al.、米国特許第６６６７１５０号。また組換え免疫グロブリンを生成することもできる。Cabilly、米国特許第４８１６５６７号；Cabilly et al.、米国特許第６３３１４１５号およびQueen et al. , Proc. Nat’l Acad. Sci. USA ８６：１００２９−１００３３（１９８９）。モノクローナル抗体を作成およびクローニングするための技術は当業者に周知である。好ましくは本発明のＳＦＲＰ−４結合剤は高い免疫反応性、すなわちその標的抗原に特異的に結合できるように正確にフォールディングされる抗体分子の割合を有する。結合剤、例えば本発明の抗体をコードする配列の発現を以下に記載されるような大腸菌において実施することができる。かかる発現は通常少なくとも８０％、９０％、９５％または９９％の免疫反応性を招く。
【００６５】
ポリクローナル抗血清および免疫原の調製
本発明の抗体または抗体フラグメントを作成する方法には、典型的には精製されたＳＦＲＰ−４ポリペプチドで、またはＳＦＲＰ−４ポリペプチドを発現する細胞で対象（一般的にはマウスまたはウサギのような非ヒト対象）を免疫することが含まれる。ＳＦＲＰ−４の任意の免疫原性部分を免疫原として用いることができる。適切な免疫原性調製物は例えば組換えにより発現されたＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたは化学的に合成されたＳＦＲＰ−４ポリペプチドを含有できる。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製のための標準的な技術を用いて、単離されたＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはその一部もしくはフラグメントを免疫原として使用してＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはその一部もしくはフラグメントに結合するＳＦＲＰ−４結合剤を作成することができる。全長ＳＦＲＰ−４ポリペプチドを使用することができるか。またはこれに代えて本発明は免疫原としてＳＦＲＰ−４ポリペプチドフラグメントの使用を提供する。ＳＦＲＰ−４ポリペプチドは配列番号：１に示されるアミノ酸配列の少なくとも４個のアミノ酸残基を含み、そしてペプチドに対して上昇した抗体がＳＦＲＰ−４ポリペプチドと特異的免疫複合体を形成するようなＳＦＲＰ−４ポリペプチドのエピトープを包含する。好ましくは、抗原性ペプチドは少なくとも５、８、１０、１５、２０または３０個のアミノ酸残基を含む。より長い抗原性ペプチドは時により短い抗原性ペプチドよりも好ましく、それは使用に依存し、そして当業者に周知の方法に従う。典型的には、免疫原は少なくとも約８個のアミノアシル残基の長さ、そして好ましくは少なくとも約１０個のアシル残基の長さである。所定のエピトープの多量体は時に単量体よりも有効である。
【００６６】
必要により、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または卵白アルブミン（ＯＶＡ）のようなハプテンに融合または抱合させることにより、ＳＦＲＰ−４（またはそのフラグメント）の免疫原性を上昇させることができる。多くのかかるハプテンが当分野において公知である。またＳＦＲＰ−４ポリペプチドをフロイントの複合体または不完全アジュバントのような従来のアジュバントと組み合わせて、対象のポリペプチドに対する免疫反応を上昇させることもできる。免疫学的応答を上昇させるために用いられる種々のアジュバントには、限定するものではないがフロイント（完全および不完全）、ミネラルゲル（例えば水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、ジニトロフェノール等）、カルメットゲラン桿菌およびコリネバクテリウム・パルバムのようなヒトアジュバント、または類似の免疫刺激性化合物が含まれる。これらの技術は当分野において標準的である。
【００６７】
適切な免疫に続いて、ＳＦＲＰ−４結合剤、例えば抗ＳＦＲＰ−４ポリクローナル抗体を対象の血清から調製することができる。所望により、ＳＦＲＰ−４ポリペプチドに対して指向する抗体分子を哺乳動物から（例えば血液から）単離し、そしてＩｇＧ分画を得るためのポリペプチドＡクロマトグラフィーのような周知の技術によりさらに精製することができる。
【００６８】
モノクローナル抗体
本発明の一つの実施態様では、結合剤は抗ＳＦＲＰ−４モノクローナル抗体である。本発明の一つの実施態様では抗ＳＦＲＰ−４モノクローナル抗体はヒト抗ＳＦＲＰ−４モノクローナル抗体である。特定のＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはその誘導体、フラグメント、類似体もしくは相同体に向かって指向するモノクローナル抗体を調製するために、連続細胞系培養による抗体分子の生成を提供する任意の技術を利用できる。かかる技術には、限定するものではないがハイブリドーマ技術（例えばKohler & Milstein, Nature ２５６：４９５−４９７（１９７５）参照）；トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（例えばKozbor, et al., Immunol. Today ４：７２（１９８３）参照）およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（例えばCole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy（Alan R. Liss, Inc., １９８５）７７−９６頁参照）が含まれる。ヒトモノクローナル抗体を本発明の実施において利用することができ、そしてヒトハイブリドーマを使用することにより（例えばCote, et al., Proc Natl Acad Sci USA ８０：２０２６−２０３０（１９８３）参照）、またはインビトロでヒトＢ細胞をエプスタイン・バーウイルスで形質転換することにより（例えばCole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy（Alan R. Liss, Inc., １９８５）７７−９６頁参照）生成することができる。これに代えて、日常的な方法を用いて対象を免疫し、そして次に対象の脾臓からハイブリドーマを単離することにより、抗ＳＦＲＰ−４モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを調製することができる。例えばGalfre & Milstein, Methods Enzymol ７３：３−４６（１９８１）を参照のこと。標準的な方法を用いてハイブリドーマをスクリーニングして、種々の特異性（すなわち様々なエピトープに関して）および親和性のモノクローナル抗体を生成する。ハイブリドーマにより発現されるような望ましい特性、例えばＳＦＲＰ−４結合性を有する選択されたモノクローナル抗体を使用できるか、その特性を変化させるためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような分子にそれを結合させることができるか、またはそれをコードするｃＤＮＡを種々の方式で単離、シークエンシングおよび操作できる。ハイブリドーマ技術には、当分野において公知のもの、およびHarlow et al., Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, ３４９（１９８８）；Hammerling et al., Monoclonal Antibodies And T−Cell Hybridomas, ５６３−６８１（１９８１）において教示されるものが含まれる。ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体を生成するためのその他の方法は当業者に周知である。
【００６９】
ファージディスプレイ技術
前記したように、組換えＤＮＡおよびファージディスプレイテクノロジーの適用により本発明の結合剤を生成することができる。例えば当分野において公知の種々のファージディスプレイ法を用いて本発明の結合剤、例えば抗ＳＦＲＰ−４抗体を調製することができる。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインを、それをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面に表示する。抗原、典型的には固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗原で直接選択することにより、望ましい結合特性を有するファージをレパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えばヒトまたはネズミ）から選択する。これらの方法において使用されるファージは典型的にはｆｄおよびＭ１３を含む糸状ファージであり、Ｆａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインがファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換えにより融合されている。加えて方法をＦａｂ発現ライブラリーの構築に適用して（例えばHuse, et al.,. Science ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）参照）ＳＦＲＰ−４ポリペプチド、例えばポリペプチドまたはその誘導体、フラグメント、類似体もしくは相同体に関して望ましい特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速および有効な同定を可能にする。本発明の結合剤を作成するために使用できるファージディスプレイ法のその他の実例にはHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., ８７：１０６６−１０７０（１９９０）；Brinkman et al., J. Immunol. Methods １８２：４１−５０（１９９５）；Ames et al., J. Immunol. Methods １８４：１７７−１８６（１９９５）；Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. ２４：９５２−９５８（１９９４）；Persic et al., Gene １８７：９−１８（１９９７）；Burton et al., Advances in Immunology ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；第ＷＯ９０／０２８０９号；第ＷＯ９１／１０７３７号；第ＷＯ９２／０１０４７号；第ＷＯ９２／１８６１９号；第ＷＯ９３／１１２３６号；第ＷＯ９５／１５９８２号；第ＷＯ９５／２０４０１号；第ＷＯ９６／０６２１３号；第ＷＯ９２／０１０４７号（Medical Research Council et al.）；第ＷＯ９７／０８３２０号（Morphosys）；第ＷＯ９２／０１０４７号（ＣＡＴ／ＭＲＣ）；第ＷＯ９１／１７２７１号（Affymax）；ならびに米国特許第５６９８４２６号、第５２２３４０９号、第５４０３４８４号、第５５８０７１７号、第５４２７９０８号、第５７５０７５３号、第５８２１０４７号、第５５７１６９８号、第５４２７９０８号、第５５１６６３７号、第５７８０２２５号、第５６５８７２７号および第５７３３７４３号に開示されるものが挙げられる。ジスルフィド結合を介してポリペプチドを結合させることによりバクテリオファージの表面にポリペプチドを表示するのに有用な方法はLohning、米国特許第６７５３１３６号に記載されている。前記の参照文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージから抗体コード化領域を単離し、そしてそれを用いてヒト抗体を含む全抗体または任意のその他の望ましい抗原結合フラグメントを作成し、そして哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞��酵母および細菌を含む任意の望ましい宿主において発現させることができる。例えば第ＷＯ９２／２２３２４号；Mullinax et al., BioTechniques １２：８６４−８６９（１９９２）；およびSawai et al., AJRI ３４：２６−３４（１９９５）；およびBetter et al., Science ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）に開示されるもののような当分野において公知の方法を使用してＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換えにより生成するための技術を用いることもできる。
【００７０】
一般的には、抗体または抗体フラグメントはファージまたはファジミド粒子の表面に存在するので、ディスプレイベクターにクローン化されたハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを、良好な結合活性を維持したバリアントを同定するために適切な抗原に対して選択することができる。例えばBarbas III et al., Phage Display, A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., ２００１）を参照のこと。しかしながら、選択および／またはスクリーニングのために溶菌ファージベクター（修飾Ｔ７またはラムダＺａｐシステム）に抗体フラグメントライブラリーをクローニングするようなその他のベクター形式をこの方法に使用することができる。
【００７１】
ＳＦＲＰ−４結合剤をコードする核酸のライブラリー
前記の方法の結果、ＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドに関して特異的親和性を有するＳＦＲＰ−４結合剤、例えば抗ＳＦＲＰ−４抗体鎖をコードする核酸配列のライブラリーに至る。核酸のライブラリーは典型的には少なくとも５、１０、２０、５０、１００、１０００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８または１０９の異なるメンバーを有する。通常ライブラリーで単一のメンバーが全配列の２５％または５０％を超えて構成することはない。典型的には少なくとも２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％または９９.９％のライブラリーメンバーがＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドに関して特異的親和性を有するＳＦＲＰ−４結合剤をコードする。二本鎖抗ＳＦＲＰ−４抗体ライブラリーの場合、重および軽鎖の各々をコードする一対の核酸セグメントはライブラリーメンバーと考えられる。核酸ライブラリーは遊離形態で任意のベクターの構成成分として、またはベクターの構成成分として宿主細胞にトランスフェクトされて存在し得る。インビボ手順では必要とされない抗原組み合わせ分子または抗体をコードする遺伝子のライブラリーを生成するために有用な方法はWigler et al.、米国特許第６３０３３１３号；第６４７９２４３号に記載されている。
【００７２】
組換えＳＦＲＰ−４結合剤の発現
前記したように、本発明の結合剤を組換えＤＮＡテクノロジーの適用により生成することができる。本発明のＳＦＲＰ−４結合剤をコードする組換えポリヌクレオチド構築物には典型的には、天然に随伴されるかまたは異種性のプロモーター領域を含む抗ＳＦＲＰ−４抗体鎖のコード化配列に作動可能なように連結された発現制御配列が含まれる。そのように、本発明の別の態様は本発明のＳＦＲＰ−４結合剤をコードする一つまたはそれより多い核酸配列を含有するベクターを含む。本発明の一つまたはそれより多いポリペプチドの組換え発現のために、当分野において周知の組換えＤＮＡ技術により、および以下に詳記されるように、ＳＦＲＰ−４結合剤をコードするヌクレオチド配列の全てまたは一部を含有する核酸を適切なクローニングベクターまたは発現ベクター（すなわち挿入されたポリペプチドコード化配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含有するベクター）に挿入する。多様な集団のベクターを生成するための方法がLerner et al.、米国特許第６２９１１６０号；第６６８０１９２号に記載されている。
【００７３】
一般に、組換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態である。一度ベクターが適切な宿主に組み込まれると、ＳＦＲＰ−４結合剤をコードするヌクレオチド配列の高レベル発現ならびにＳＦＲＰ−４結合剤、例えば交差反応性ＳＦＲＰ−４抗体の収集および精製に適当な条件で宿主を維持する。一般的には、米国特許出願番号第２００２０１９９２１３号を参照のこと。ベクターはまた細胞外抗体フラグメントの分泌を志向するために有用なシグナルペプチド、例えばペクチン酸リアーゼをコードすることもできる。米国特許第５５７６１９５号を参照のこと。
【００７４】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適当な形態のＳＦＲＰ−４結合特性を有する化合物をコードする核酸を含み、それは組換え発現ベクターが、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択される、発現される核酸配列に作動可能なように連結された一つまたはそれより多い調節配列を含むことを意味する。かかる調節配列は例えばGoeddel, Gene Expression Technology：Methods in Enzymology, １８５（Academic Press, San Diego, Calif., １９９０）に記載される。一つの実施態様では、本発明のＳＦＲＰ−４結合剤をコードするポリヌクレオチドは、Ｂプロモーターに作動可能なように連結されており、そして宿主細胞において発現可能である。米国特許第５０２８５３０号を参照のこと。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して、それにより本明細書に記載されるような核酸によりコードされる融合ポリペプチドを含むポリペプチドまたはペプチドを生成することができる。
【００７５】
本発明の別の態様は、一つまたはそれより多いＳＦＲＰ−４結合剤をコードする核酸を含有するＳＦＲＰ−４結合剤発現宿主細胞に関連する。原核または真核細胞におけるＳＦＲＰ−４結合剤の発現のために本発明の組換え発現ベクターを設計することができる。例えばＳＦＲＰ−４結合剤を大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、真菌細胞、例えば酵母、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現させることができる。適当な宿主細胞はGoeddel, Gene Expression Technology：Methods in Enzymology, １８５（Academic Press, San Diego, Calif., １９９０）においてさらに論じられている。これに代えて、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて組換え発現ベクターをインビトロで転写および翻訳することができる。確率的に作成されたポリヌクレオチド配列の発現を介して、予め決定された特性を有するポリペプチド、例えばＳＦＲＰ−４結合剤の調製物スクリーニングのために有用な方法が記載されている。米国特許第５７６３１９２号；第５７２３３２３号；第５８１４４７６号；第５８１７４８３号；第５８２４５１４号；第５９７６８６２号；第６４９２１０７号；第６５６９６４１号を参照のこと。
【００７６】
原核細胞におけるポリペプチドの発現は大腸菌において融合または非融合のいずれかのポリペプチドの発現を指向する構成性または誘導プロモーターを含有するベクターを用いて実施されるのが最も頻繁である。典型的な融合発現ベクターには、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合ポリペプチドまたはポリペプチドＡの各々を標的組換えポリペプチドに融合するｐＧＥＸ（Pharmacia Biotech Inc；Smith & Johnson, Gene ６７：３１−４０（１９８８））、ｐＭＡＬ（New England Biolabs, Beverly, Mass.）およびｐＲＩＴ５（Pharmacia, Piscataway, N.J.）が含まれる。
【００７７】
適当な誘導非融合大腸菌発現ベクターの実例には、ｐＴｒｃ（Amrann et al., Gene ６９：３０１−３１５（１９８８））およびｐＥＴ  １１ｄ（Studier et al., Gene Expression Technology：Methods in Enzymology, １８５（Academic Press, San Diego, Calif., １９９０）６０−８９頁）が挙げられる。ポリペプチド融合を介して多機能ポリペプチドを生じるための、区別される活性ペプチドまたはタンパク質ドメインの標的化された組み立ての方法がPack et al.米国特許第６２９４３５３号；第６６９２９３５号に記載されている。大腸菌において組換えポリペプチド発現、例えばＳＦＲＰ−４結合剤を最大にする一つの計画は、組換えポリペプチドをタンパク質溶解により切断するための能力を損なった宿主細菌においてポリペプチド発現することである。例えばGottesman,  Gene Expression Technology：Methods in Enzymology, １８５（Academic Press, San Diego, Calif., １９９０）１１９−１２８頁を参照のこと。別の計画は、各アミノ酸に関する個々のコドンが発現宿主、例えば大腸菌において優先的に利用されるものであるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変化させることである。（例えばWada, et al., Nucl. Acids Res. ２０：２１１１−２１１８（１９９２）を参照のこと）。本発明の核酸のかかる変化を標準的なＤＮＡ合成技術により実施することができる。
【００７８】
別の実施態様では、ＳＦＲＰ−４結合剤発現ベクターは酵母発現ベクターである。出芽酵母における発現のためのベクターの実例にはｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldari, et al., EMBO J. ６：２２９−２３４（１９８７））、ｐＭＦａ（Kurjan & Herskowitz, Cell ３０：９３３−９４３, １９８２）、ｐＪＲＹ８８（Schultz et al., Gene ５４：１１３−１２３（１９８７））、ｐＹＥＳ２（Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.）およびｐｉｃＺ（InVitrogen Corp, San Diego, Calif.）が挙げられる。これに代えて、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞においてＳＦＲＰ−４結合剤を発現させることができる。培養昆虫細胞（例えばＳＦ９細胞）におけるポリペプチド、例えばＳＦＲＰ−４結合剤の発現に利用可能なバキュロウイルスには、ｐＡｃシリーズ（Smith, et al., Mol. Cell. Biol. ３：２１５６−２１６５（１９８３））およびｐＶＬシリーズ（Lucklow & Summers, Virology １７０：３１−３９（１９８９））が含まれる。
【００７９】
さらに別の実施態様では、哺乳動物発現系を用いて哺乳動物細胞において本発明のＳＦＲＰ−４結合剤をコードする核酸を発現させる。哺乳動物発現ベクターの実例には、例えば限定するものではないがｐＣＤＭ８（Seed,. Nature ３２９：８４０（１９８７））およびｐＭＴ２ＰＣ（Kaufman et al., EMBO J. ６：１８７−１９５（１９８７））が挙げられる。哺乳動物細胞において使用される場合、発現ベクターの調節機能はしばしばウイルス調節エレメントにより提供される。例えば一般に用いられるプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０から誘導される。本発明のＳＦＲＰ−４結合剤の発現のために有用な原核および真核細胞の双方に適当なその他の発現系に関して。例えばSambrook et al., Molecular Cloning：A Laboratory Manual. ２nd Ed.（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, １９８９）の第１６および１７章を参照のこと。
【００８０】
別の実施態様では、組換え哺乳動物発現ベクターは特定の細胞型において優先的に核酸の発現を志向することが可能である（例えば組織特異的調節エレメントを用いて核酸を発現させる）。組織特異的調節エレメントは当分野において公知である。適当な組織特異的プロモーターの非限定的な実例にはアルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkert, et al.,. Genes Dev. １：２６８−２７７（１９８７））、リンパ系特異的プロモーター（Calame & Eaton, Adv. Immunol. ４３：２３５−２７５（１９８８））、とりわけＴ細胞受容体のプロモーター（Winoto & Baltimore, EMBO J. ８：７２９−７３３（１９８９））および免疫グロブリン（Banerji, et al., Cell ３３：７２９−７４０（１９８３）；Queen & Baltimore, Cell ３３：７４１−７４８（１９８３））、ニューロン特異的プロモーター（例えばニューロフィラメントプロモーター；Byrne & Ruddle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：５４７３−５４７７（１９８９））、膵臓特異的プロモーター（Edlund et al., Science ２３０：９１２−９１６（１９８５））および乳腺特異的プロモーター（例えば乳清プロモーター；米国特許第４８７３３１６号および欧州特許出願公開第２６４１６６号）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーター、例えばネズミホックスプロモーター（Kessel & Gruss, Science ２４９：３７４−３７９（１９９０））およびα−フェトプロテインプロモーター（Campes & Tilghman,. Genes Dev. ３：５３７−５４６（１９８９））もまた包含される。
【００８１】
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関連する。宿主細胞は任意の原核または真核細胞でよい。例えばＳＦＲＰ−４結合剤を大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞において発現させることができる。哺乳動物細胞は免疫グロブリンまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチドセグメントを発現するのに好ましい宿主である。Winnacker, From Genes To Clones,（VCH Publishers, NY, １９８７）を参照のこと。
【００８２】
宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするのに適当な方法をSambrook, et al, .Molecular Cloning：A Laboratory Manual ２nd Ed.（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., １９８９）およびその他の実験マニュアルにおいて見出すことができる。
組換えポリペプチドの精製は当分野において周知であり、そして硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティークロマトグラフィー精製技術、カラムクロマトグラフィー、イオン交換精製技術、ゲル電気泳動等（一般的にはScopes, Protein Purification, Springer−Verlag, N.Y., １９８２）を参照のこと）を含む。
【００８３】
ポリクローナル抗ＳＦＲＰ−４抗体のライブラリーを提供するための核酸の発現
核酸ライブラリーを発現させて、ＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドに関して特異的親和性を有するＳＦＲＰ−４結合剤、例えば抗ＳＦＲＰ−４結合抗体のポリクローナルライブラリーを作成することができる。かかるライブラリーの組成をヌクレオチドライブラリーの組成から決定する。故にかかるライブラリーは典型的には異なるアミノ酸組成を伴う少なくとも５、１０、２０、５０、１００、１０００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、または１０９個のメンバーを有する。通常ライブラリーで単一のメンバーが全ポリペプチドの２５％または５０％を超えて構成することはない。ＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドに関して特異的親和性を有する抗ＳＦＲＰ−４抗体鎖ライブラリーにおける抗ＳＦＲＰ−４抗体の割合は典型的には抗ＳＦＲＰ−４抗体鎖をコードする対応する核酸の割合よりも低い。差は、適切なフォールディングを支持するための適切な一次アミノ酸配列を有するにもかかわらず、全てのポリペプチドが結合に適切な構造にフォールディングされるわけではないという事実による。いくつかのライブラリーでは、少なくとも２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％または９９.９％の抗ＳＦＲＰ−４抗体鎖が標的分子に関して特異的親和性を有する。さらに多鎖抗体のライブラリーでは、各抗ＳＦＲＰ−４抗体（例えばＦａｂまたはインタクトな抗体）がライブラリーメンバーと考えられる。様々な抗ＳＦＲＰ−４抗体鎖は、標的のための繊細な結合特異性および親和性に関して互いに異なる。いくつかのかかるライブラリーは同一抗原、例えばＳＦＲＰ−４ポリペプチド上の異なるエピトープに結合するメンバーを含む。かかるライブラリーは互いに競合せずに同一抗原に結合する少なくとも二つのメンバーを含み得る。
【００８４】
前記の方法の結果であるヒト抗ＳＦＲＰ−４抗体のポリクローナルライブラリーは、本ライブラリーの高親和性結合物質が高パーセンテージであることにより、および本ライブラリーは典型的には天然集団に存在する抗体の同一の多様性を示さないという点の双方でヒト抗体の天然集団から区別される。全てのヒト免疫グロブリン遺伝子を含むわけではない供給材料を提供する非ヒトトランスジェニック動物から多様性の低下したライブラリーを誘導することができる。例えばいくつかのポリクローナル抗体ライブラリーはラムダ軽鎖を有する抗ＳＦＲＰ−４抗体を含まない。本発明のいくつかの抗ＳＦＲＰ−４ポリクローナル抗体ライブラリーは１０、２０、３０または４０より少ないＶＨ遺伝子によりコードされる抗体重鎖を有する。本発明のいくつかのポリクローナル抗ＳＦＲＰ−４抗体ライブラリーは１０、２０、３０または４０より少ないＶＬ遺伝子によりコードされる抗体軽鎖を有する。
【００８５】
一本鎖抗体
一つの実施態様では、本発明の結合剤は一本鎖抗ＳＦＲＰ−４抗体である。本発明によれば、技術をＳＦＲＰ−４ポリペプチドに特異的な一本鎖抗体の生成に適用することができる（例えば米国特許第４９４６７７８号参照）。一本鎖Ｆｖおよび本発明の抗体を生成するために使用できる技術の実例には、米国特許第４９４６７７８号および第５２５８４９８号；Huston et al., Methods in Enzymology, ２０３：４６−８８（１９９１）；Shu, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；ならびにSkerra et al., Science ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載されるものが含まれる。
【００８６】
キメラおよびヒト化抗体
一つの実施態様では、本発明の結合剤はキメラ抗ＳＦＲＰ−４抗体である。一つの実施態様では、本発明の結合剤はヒト化抗ＳＦＲＰ−４抗体である。本発明の一つの実施態様では、ドナーおよびアクセプター抗体は異なる種からのモノクローナル抗体である。例えばアクセプター抗体はヒト抗体（ヒトにおける抗原性を最小化するため）であり、その場合、得られたＣＤＲグラフト化抗体は「ヒト化」抗体と称される。
【００８７】
標準的な組換えＤＮＡ技術を用いてヒトおよび非ヒト部分の双方を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体のような組換え抗ＳＦＲＰ−４抗体を作成することができ、それは本発明の範囲内である。ヒトにおける本発明の結合剤のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイにおけるこれらの結合剤の使用を含むいくつかの使用に関しては、キメラ、ヒト化またはヒト抗ＳＦＲＰ−４抗体を使用することが好ましい。当分野において公知の組換えＤＮＡ技術によりかかるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体を生成することができる。かかる有用な方法には、例えば限定するものではないが国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；米国特許第５２２５５３９号；欧州特許出願第１８４１８７号；欧州特許出願第１７１４９６号；欧州特許出願第１７３４９４号；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ８６／０１５３３号；米国特許第４８１６５６７号；第５２２５５３９号；欧州特許出願第１２５０２３号；Better, et al., Science ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）；Liu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８４：３４３９−３４４３（１９８７）；Liu, et al., J. Immunol. １３９：３５２１−３５２６（１９８７）；Sun, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８４：２１４−２１８（１９８７）；Nishimura, et al., Cancer Res. ４７：９９９−１００５（１９８７）；Wood, et al., Nature ３１４：４４６−４４９（１９８５）；Shaw, et al., J. Natl. Cancer Inst. ８０：１５５３−１５５９（１９８８）；Morrison, Science ２２９：１２０２−１２０７（１９８５）；Oi, et al., BioTechniques ４：２１４（１９８６）；Jones, et al., Nature ３２１：５５２−５２５（１９８６）；Verhoeyan, et al., Science ２３９：１５３４（１９８８）；Morrison, Science ２２９：１２０２（１９８５）；Oi et al., BioTechniques ４：２１４（１９８６）；Gillies et al., J. Immunol. Methods, １２５：１９１−２０２（１９８９）；米国特許第５８０７７１５号；およびBeidler, et al., J. Immunol. １４１：４０５３−４０６０（１９８８）に記載される方法が含まれる。例えばＣＤＲグラフト化（欧州特許第０２３９４００号；第ＷＯ９１／０９９６７号；米国特許第５５３０１０１号；第５５８５０８９号；第５８５９２０５号；第６２４８５１６号；欧州特許第４６０１６７号）、ベニアリング（veneering）またはリサーフェシング（resurfacing）（欧州特許第５９２１０６号；欧州特許第０５１９５９６号；Padlan E. A., Molecular Immunology, ２８：４８９−４９８（１９９１）；Studnicka et al., Protein Engineering ７：８０５−８１４（１９９４）；Roguska et al., PNAS ９１：９６９−９７３（１９９４））および鎖シャッフリング（chain shuffling）（米国特許第５５６５３３２号）を含む種々の技術を用いて抗体をヒト化できる。一つの実施態様では、ネズミ抗ＳＦＲＰ−４モノクローナル抗体をコードするｃＤＮＡを、Ｆｃ定常領域をコードする配列を特異的に除去するために選択された制限酵素で消化し、そしてヒトＦｃ定常領域をコードするｃＤＮＡの均等部分を置換する（Robinson et al.、ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Akira et al., 欧州特許出願第１８４１８７号；Taniguchi、欧州特許出願第１７１４９６号；Morrison et al.、欧州特許出願第１７３４９４号；Neuberger et al.、第ＷＯ８６／０１５３３号；Cabilly et al.、米国特許第４８１６５６７号；Cabilly et al.、欧��特許出願第１２５０２３号；Better et al., Science ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）；Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA ８４：３４３９−３４４３（１９８７）；Liu et al., J Immunol １３９：３５２１−３５２６（１９８７）；Sun et al., Proc Natl Acad Sci USA ８４：２１４−２１８（１９８７）；Nishimura et al. , Cancer Res ４７：９９９−１００５（１９８７）；Wood et al., Nature ３１４：４４６−４４９（１９８５）；およびShaw et al., J Natl Cancer Inst ８０：１５５３−１５５９（１９８８））；米国特許第６１８０３７０号；米国特許第６３０００６４号；第６６９６２４８号；第６７０６４８４号；第６８２８４２２号を参照のこと）。
【００８８】
ＣＤＲ抗体
一つの実施態様では、本発明の結合剤は抗ＳＦＲＰ−４ＣＤＲ抗体である、一般的には、抗ＳＦＲＰ−４ＣＤＲ抗体を作成するために用いられたドナーおよびアクセプター抗体は異なる種からのモノクローナル抗体であり；典型的にはアクセプター抗体はヒト抗体（ヒトにおける抗原性を最小化するため）であり、その場合、得られたＣＤＲグラフト化抗体は「ヒト化」抗体と称される。グラフトはアクセプター抗体の単一のＶＨもしくはＶＬ内の単一のＣＤＲ（またはさらには単一のＣＤＲの一部）のものでよいか、またはＶＨおよびＶＬの一つもしくは双方の複数のＣＤＲ（またはその部分）のものにできる。アクセプター抗体の全ての可変ドメインの三つのＣＤＲ全てが対応するドナーＣＤＲで置き換えられることが頻繁にあるが、得られたＣＤＲグラフト化抗体のＭｅｔＡｐ３への十分な結合を可能にするために必要なものと同数ののみを置き換える必要がある。ＣＤＲグラフト化およびヒト化抗体を作成するための方法はQueen et al. 、米国特許第５５８５０８９号、米国特許第５６９３７６１号；米国特許第５６９３７６２号；およびWinter、米国特許第５２２５５３９号；ならびに欧州特許第０６８２０４０号により教示される。ＶＨおよびＶＬポリペプチドを調製するために有用な方法はWinter et al.、米国特許第４８１６３９７号；第６２９１１５８号；第６２９１１５９号；第６２９１１６１号；第６５４５１４２号；欧州特許第０３６８６８４号；欧州特許第０４５１２１６号；欧州特許第０１２０６９４号により教示される。
【００８９】
同一のファミリーおよび／または同一のファミリーメンバーから適当なフレームワーク領域候補を選択した後、由来する種からのＣＤＲをハイブリッドフレームワーク領域にグラフト化することにより重および軽鎖可変領域のいずれかまたは双方を生成する。当業者に公知の従来の方法を用いて前記の態様のいずれかに関してハイブリッド可変鎖領域を有するハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントの組み立てを達成することができる。例えばオリゴヌクレオチド合成および／またはＰＣＲにより、本明細書に記載されるハイブリッド可変ドメインをコードするＤＮＡ配列（すなわち標的種および由来する種からのＣＤＲに基づくフレームワーク）を生成することができる。適当な制限酵素を用いてＣＤＲ領域をコードする核酸を由来する種抗体から単離し、そして適当なライゲーション酵素でライゲートすることにより標的種フレームワークにライゲートすることもできる。これに代えて由来する種抗体の可変鎖のフレームワーク領域を部位特異的変異誘発により変化させることができる。
【００９０】
核酸フレームワーク領域に相当する複数の候補の中での選択からハイブリッドを構築するので、本明細書に記載される原理に従って構築し易い多くの配列の組み合わせが存在する。したがって、個々のフレームワーク領域の様々な組み合わせを伴うメンバーを有するハイブリッドのライブラリーを組み立てることができる。かかるライブラリーは配列の電子データベースコレクションまたはハイブリッドの物理的コレクションでよい。
【００９１】
典型的にはこの過程はグラフト化ＣＤＲをフランキングするアクセプター抗体のＦＲを変化させない。しかしながら、ＦＲをドナー抗体の対応するＦＲにさらに類似させるために所定のＦＲのある残基を置き換えることより、得られた抗ＳＦＲＰ−４ＣＤＲグラフト化抗体の抗原結合親和性を時に改善することができる。置換の好ましい位置にはＣＤＲに隣接するか、またはＣＤＲと相互作用できるアミノ酸残基が含まれる（例えば米国特許第５５８５０８９号、特に段落１２−１６参照）。または、ドナーＦＲで開始し、そしてアクセプターＦＲもしくはヒトコンセンサスＦＲにさらに類似するようにそれを修飾することができる。これらの修飾を作成するための技術は当分野において公知である。特に得られたＦＲがヒトコンセンサスＦＲをその位置に適合させるか、またはかかるコンセンサスＦＲと少なくとも９０％もしくはそれを超えて同一である場合、そのようにすることは完全なヒトＦＲを伴う同一抗体と比較して有意に、得られた修飾された抗ＳＦＲＰ−４ＣＤＲ抗体の抗原性を上昇させないかもしれない。
【００９２】
Ｔ細胞エピトープ修飾による治療用タンパク質の脱免疫
多くの治療用タンパク質が臨床使用では望ましくない抗体応答を引き出すことが示されており、それが副作用に繋がっている場合もある。本発明の一つの実施態様では、組換え抗ＳＦＲＰ−４抗体、ＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４結合剤は、そのアミノ酸配列において所定の種のＴ細胞に関する一つまたはそれより多い潜在的エピトープを同定し、そして少なくとも一つのＴ細胞エピトープを排除するためにアミノ酸配列を修飾することにより、所定の種に非免疫原性または低免疫原性を付与する。これは所定の種の免疫系に暴露された場合、ポリペプチドまたはタンパク質の免疫原性を排除または低下させる。特にこの方式でモノクローナル抗体およびその他の免疫グロブリン様分子を脱免疫することから利益を享受でき、例えばマウスから誘導された免疫グロブリンをヒトの治療的使用のために脱免疫することができる。当分野においてポリペプチドまたはタンパク質を脱免疫するための方法。例えばCarr, et al.、米国特許出願第２００３０１５３０４３号；およびDe Groot, et al., AIDS Res. and Human Retroviruses １３：５３９−５４１（１９９７）；Schafer, et al., Vaccine １６：１８８０−１８８４（１９９８）；De Groot, et al., Dev. Biol. １１２：７１−８０（２００３）；De Groot, et al., Vaccine １９：４３８５−４３９５（２００１）；Reijonen and Kwok Methods ２９：２８２−２８８；Novak, et al., J. Immunology １６６：６６６５−６６７０（２００１）を参照のこと。
【００９３】
イディオタイプ抗体
限定するものではないが：（ｉ）抗体分子のペプシン消化により生成されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド橋を還元することにより作成されるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元化合物での抗体分子の処理により作成されるＦａｂフラグメント；ならびに（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；を含む当分野において公知の技術によりＳＦＲＰ−４ポリペプチドに対するイディオタイプを含有する抗体フラグメントを生成することができる。例えばGreenspan et al., FASEB J. ７：４３７−４４４（１９９３）およびNissinoff, J. Immunol. １４７：２４２９−２４３８（１９９１）を参照のこと。例えば結合し、そしてポリペプチド多量体化および／または本発明のポリペプチドのリガンドへの結合を競合的に阻止する抗体を用いて、ポリペプチド多量体化および／または結合ドメインを「模倣」し、そして結果的に標的ポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、そして中和する抗イディオタイプを作成することができる。抗イディオタイプまたはかかる抗イディオタイプのＦａｂフラグメントのかかる中和を治療レジメンで用いて標的ポリペプチドリガンドを中和することができる。例えばかかる抗イディオタイプ抗体を用いて、本発明のポリペプチドに結合、および／またはそのリガンド／受容体に結合し、そしてそれにより抗イディオタイプ抗体の不在下で観察される生物学的活性のレベルに相対して、標的ポリペプチド生物学的活性を調整、例えば上昇または低下させることができる。
【００９４】
融合タンパク質
一つの実施態様では、本発明の結合剤は融合タンパク質である。ポリペプチドの取り扱いを容易にするためのペプチド部分の付加は当分野においてよく知られており、そして日常的な技術である。本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドのようなマーカー配列に融合することができる。好ましい実施態様では、マーカーアミノ酸配列は、とりわけその多くが市販により入手可能であるｐＱＥベクター（QIAGEN, Inc., ９２５９ Eton Avenue, Chatsworth, Calif., ９１３１１）で提供されるタグのようなヘキサヒスチジンペプチドである。例えばGentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の都合のよい精製を提供する。精製に有用な別のペプチドタグである「ＨＡ」タグはインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から誘導されるエピトープに相当する。Wilson et al., Cell ３７：７６７（１９８４）。
【００９５】
故に本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを用いて、これらの前記の融合のいずれかを操作することができる。また融合タンパク質によりインビボ半減期の延長を示すことができる。
ジスルフィド連結された二量体構造を有する融合タンパク質（ＩｇＧによる）は、単量体の分泌型タンパク質またはタンパク質フラグメント単独以外の分子の結合および中和においてさらに有効であり得る。Fountoulakis et al., J. Biochem. ２７０：３９５８−３９６４（１９９５）。
【００９６】
同様に、ＥＰ−Ａ−Ｏ  ４６４５３３（カナダ対応特許第２０４５８６９号）は免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を、別のヒトタンパク質またはその部分と一緒に含む融合タンパク質を開示している。多くの場合、融合タンパク質のＦｃ部分は治療および診断に有利であり、そして故に例えば薬物動態特性の改善に至り得る。欧州特許出願第０２３２２６２（Ａ）号参照。これに代えて、融合タンパク質が発現、検出および精製された後にＦｃ部分の欠失が望ましい。例えば、融合タンパク質を抗原として免疫に使用する場合、Ｆｃ部分は治療および診断を妨害し得る。創薬において、例えばｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイの目的でＦｃ部分と融合されている。Bennett et al., J. Molecular Recognition ８：５２−５８（１９９５）；K. Johanson et al., J. Biol. Chem., ２７０：９４５９−９４７１（１９９５）。
【００９７】
一つの実施態様では、宿主細胞において発現時に封入体を形成する融合タンパク質の一部として候補結合剤をコードするゲノムＤＮＡまたはＥＳＴを用いて本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を調製する。宿主細胞において発現時に封入体を形成する融合タンパク質の一部として候補結合剤をコードするゲノムＤＮＡまたはＥＳＴを調製するために有用な方法が記載されている。米国特許第６６５３０６８号；米国特許出願第２００４０１５７２９１号参照。例えば封入体は標的（ポリ）ペプチドに特異的に結合する結合パートナー、例えばＳＦＲＰ−４結合剤を作成するのに有用である。
【００９８】
ＳＦＲＰ−４結合剤抱合タンパク質
前記したように、ある好ましい実施態様では、本発明のＳＦＲＰ−４結合剤は、本発明のＳＦＲＰ−４結合剤抱合タンパク質を生じるために一つまたはそれより多い治療用または細胞毒性部分にカップリングまたは抱合された抗ＳＦＲＰ−４抗体である。場合によっては、本発明のＳＦＲＰ−４結合剤は、新生物疾患の処置のための投与に例示されるように、ＳＦＲＰ−４結合剤−細胞毒素抱合分子として有用である。同種および異種機能性の双方の種々の二機能性または多機能性試薬（例えばPierce Chemical Co., Rockford, ILのカタログに記載されるもの）をリンカー基として用いることができることは当業者には明白であろう。例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基または酸化された炭水化物残基によりカップリングは影響され得る（例えば米国特許第４６７１９５８号を参照のこと）。
【００９９】
代替えのカップリング方法としては、米国特許第５０５７３１３号および第５１５６８４０号に記載されるように、例えばグリコシル化部位の酸化された炭水化物基により、ある部分を本発明のＳＦＲＰ−４結合剤にカップリングすることができる。ＳＦＲＰ−４結合剤をある部分にカップリングするさらに別の代替え方法は、ストレプトアビジン／ビオチン、またはアビジン／ビオチンのような非共有結合対の使用による。これらの実施態様では、対の一方のメンバーはＳＦＲＰ−４結合剤に共有結合によりカップリングし、そして結合対の他方のメンバーはその部分に共有結合によりカップリングする。
【０１００】
切断可能なリンカー
本発明の免疫抱合体のＳＦＲＰ−４結合剤部分がない場合に細胞毒性または治療用部分がさらに強力である場合、細胞への内部移行の間もしくはその時に、切断できるか、または細胞外環境で時間をかけて徐々に切断できるリンカー基を使用するのが望ましいかもしれない。多くの様々な切断可能なリンカー基が記載されている。これらのリンカー基からの細胞毒性部分の細胞内放出の実例には、限定するものではないがジスルフィド結合の還元（例えば米国特許第４４８９７１０号）による、感光性結合の照射（例えば米国特許第４６２５０１４号）による、誘導体化アミノ酸側鎖の加水分解（例えば米国特許第４６３８０４５号）による、血清補体媒介の加水分解（例えば米国特許第４６７１９５８号）および酸触媒加水分解（例えば米国特許第４５６９７８９号）による切断が含まれる。
【０１０１】
一つの実施態様では、本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を、一を超える治療用、細胞毒性および／または造影部分にカップリングする。本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を多誘導体化する（poly−derivatising）ことにより、いくつかの細胞毒性計画を同時に実行できるか、ＳＦＲＰ−４結合剤をいくつかの可視化技術用にコントラスト剤として有用にできるか、または可視化技術によるトラッキングのために治療用抗体を標識することができる。一つの実施態様では、細胞毒性部分の複数の分子を一つのＳＦＲＰ−４結合剤にカップリングする。一つの実施態様では、本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を：細胞毒性部分；治療用部分；および標識／造影部分；からなる群から選択される少なくとも二つの部分の混合物にカップリングする。すなわち一を超える型の部分をＳＦＲＰ−４結合剤にカップリングすることができる。例えば、ポリヌクレオチドまたはアンチセンス配列のような治療用部分を、化学毒性または放射線毒性部分に連結されたＳＦＲＰ−４結合剤に抱合させて、化学または放射線毒性治療の有効性を上昇させ、そして望ましい治療効果を得るために必要な要求される投薬量を低下させることができる。特定の実施態様に関わらず、一を超える部分との免疫抱合体を種々の方式で調製することができる。例えば一を超える部分をＳＦＲＰ−４結合剤に直接カップリングすることができるか、または結合のための複数の部位を提供するリンカー（例えばデンドリマー）を使用することができる。これに代えて、一を超える細胞毒性部分を保持する能力を維持するキャリアを使用することができる。
【０１０２】
前記で説明されたように、ＳＦＲＰ−４結合剤は、直接またはリンカー基を介するかのいずれかで共有結合、および非共有結合性会合を含む種々の方式で部分を担持できる。一つの実施態様では、ＳＦＲＰ−４結合性のカップリングされたタンパク質をカプセル化担体と組み合わせることができる。これは標的細胞に接近してそれを集中させる間に、治療用組成物が時間をかけてＳＦＲＰ−４結合剤化学毒性部分を徐々に放出することを可能にできるので、特に化学毒性治療の実施態様において有用である。
【０１０３】
放射性核種と抱合されたＳＦＲＰ−４結合剤
一つの実施態様では、本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を放射性核種である細胞毒性部分とカップリングする。本発明の細胞毒性部分として使用するための好ましい放射性核種は、薬理学的投与に適当である放射性核種である。
化学毒性部分
一つの実施態様では、本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を化学毒性部分とカップリングする。本発明で有用な好ましい化学毒性剤には、限定するものではないがメトトレキサートならびにピリミジンプリン類似体のような小型分子薬物が含まれる。
【０１０４】
タンパク質毒素
一つの実施態様では、本発明のＳＦＲＰ−４結合剤をタンパク質毒素部分とカップリングする。本発明の細胞毒性部分としての使用のための好ましい毒素タンパク質には、限定するものではないが放線菌またはストレプトミセス抗体、デュオカルマイシン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（anthracin didne）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシならびにその類似体または相同体が含まれる。細胞毒性部分としての使用のための好ましい毒素タンパク質にはさらにリシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、シュードモナス外毒素、赤痢菌毒素、ポークウィード抗ウイルスタンパク質および医薬品生化学の分野で公知のその他の毒素タンパク質が含まれる。これらの毒素薬剤は対象において望ましくない免疫応答を引き出すので、特に血管内に注射される場合、それらが本発明のＳＦＲＰ−４結合剤、例えば本発明の抗ＦＲＰ−４抗体および抗体関連ポリペプチドへのカップリングのための担体中でカプセル化されるのが好ましい。
【０１０５】
酵素的に活性な毒素
一つの実施態様では、本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を酵素的に活性な毒素とカップリングする。酵素的に活性な毒素は細菌もしくは植物起源のもの、またはかかる毒素の酵素的に活性なフラグメント（「Ａ鎖」）のものでよい。本発明で有用な酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントはジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（modeccin）Ａ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンシン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス（Sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシンおよびエノマイシンである。種々の二機能性タンパク質カップリング剤を用いて本発明のＳＦＲＰ−４結合剤の細胞毒素部分との抱合体を作成する。かかる試薬の実例はＳＰＤＰ、ＩＴ、ジメチルアジポイミデートＨＣｌのようなイミドエステルの二機能性誘導体、スベリン酸ジサクシイミジルのような活性エステル、グルタルアルデヒドのようなアルデヒド、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンのようなビス−アジド化合物、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンのようなビス−ジアゾニウム誘導体、トリレン２,６−ジイソシアナートのようなジイソシアナート、および１,５−ジフルオロ−２,４−ジニトロベンゼンのようなビス−活性フッ素化合物である。毒素の溶解部分を抗体、例えばＳＦＲＰ−４結合剤のＦａｂフラグメントの結合させることができる。
【０１０６】
治療用部分
一つの実施態様では、本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を治療用部分とカップリングする。かかる治療用部分の、本発明のＳＦＲＰ−４結合剤への抱合のための技術は当分野において周知である。例えばArnon et al., 「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al.（eds.）,２４３−５６頁（Alan R. Liss, Inc. １９８５）；Hellstrom et al., 「Antibodies For Drug Delivery」, in Controlled Drug Delivery（２nd Ed.）, Robinson et al.（eds.）,６２３−５３頁（Marcel Dekker, Inc. １９８７）；Thorpe, 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」, in Monoclonal Antibodies ８４：Biological And Clinical Applications, Pinchera et al.（eds.）,４７５−５０６頁（１９８５）；「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al.（eds.）,３０３−１６頁（Academic Press １９８５）、およびThorpe et al., 「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody−Toxin Conjugates」, Immunol. Rev., ６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。
【０１０７】
標識されたＳＦＲＰ−４結合剤
一つの実施態様では、本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を標識部分、すなわち検出可能な基とカップリングする。本発明のＳＦＲＰ−４結合剤に抱合される特定の標識または検出可能な基は、本発明のＳＦＲＰ−４結合剤のＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドへの特異的結合と有意に干渉しない限り、本発明の重要な態様というわけではない。検出可能な基は検出可能な物理学的または化学的特性を有する任意の材料でよい。かかる検出可能な標識はイムノアッセイおよび造影の分野で十分に開発されており、一般にかかる方法で有用なたいていの任意の標識を本発明に適用することができる。故に標識は分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能な任意の組成物である。本発明において有用な標識には磁性ビーズ（例えばDynabeads（商標））、蛍光色素（例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン等）、放射性標識（例えば３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１２１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、マイクロバブルのようなその他の造影剤（超音波造影用）、１８Ｆ、１１Ｃ、１５Ｏ（陽電子放出型断層撮影用）、９９ｍＴＣ、１１１Ｉｎ（単一電子放出型断層撮影用）、酵素（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼおよびＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されるその他のもの）およびコロイド金または着色ガラスもしくはプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）ビーズのような熱量測定標識が含まれる。かかる標識の使用を記載する特許には、米国特許第３８１７８３７号；第３８５０７５２号；第３９３９３５０号；第３９９６３４５号；第４２７７４３７号；第４２７５１４９号；および第４３６６２４１号（その各々を、その全てにおいて、および全ての目的に関して出典明示により本明細書の一部とする）が含まれる。Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals（６th Ed., Molecular Probes, Inc., Eugene OR.）をも参照のこと。
【０１０８】
当分野において周知の方法によるアッセイの望ましい構成成分に標識を直接的または間接的にカップリングすることができる。前記で示したように、必要とされる感受性、化合物との抱合のし易さ、安定性要件、利用可能な装置および処分の規定に依存して標識を選択して、広範な種類の標識を使用することができる。
【０１０９】
非放射性標識をしばしば間接的手段により結合させる。一般的には、リガンド分子（例えばビオチン）は分子に共有結合する。次いで本質的に検出可能であるか、または検出可能な酵素、蛍光化合物もしくは化学発光化合物のようなシグナル系に共有結合しているかのいずれかである抗リガンド（例えばストレプトアビジン）分子にリガンドを結合させる。多くのリガンドおよび抗リガンドを使用することができる。リガンドが天然の抗リガンド、例えばビオチン、チロキシン、およびコルチゾールを有する場合、それを標識された天然発生抗リガンドと併せて使用することができる。これに代えて、任意のハプテン性または抗原性化合物を抗体、例えば抗ＳＦＲＰ−４抗体と組み合わせて使用することができる。
【０１１０】
例えば酵素またはフルオロフォアとの抱合により分子をシグナル発生化合物に直接抱合させることができる。標識としての目的の酵素は一次的には加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、または酸化還元酵素、特にペルオキシダーゼであろう。標識部分として有用な蛍光化合物には、限定するものではないが例えばフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等が含まれる。標識部分として有用な化学発光化合物には、限定するものではないが例えばルシフェリンおよび２,３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールが含まれる。使用できる種々の標識またはシグナル生成系の概説に関しては、米国特許第４３９１９０４号を参照のこと。
【０１１１】
標識を検出する手段は当業者に周知である。したがって、例えば標識が放射性標識である場合、検出のための手段にはシンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーにおけるような写真用フィルムが含まれる。標識が蛍光標識である場合、適切な波長の光を有する蛍光色素を励起し、そして得られた蛍光を検出することによりそれを検出することができる。写真用フィルムにより、電荷結合素子（ＣＣＤ）のような電気的検出器または光電子増倍管等の使用により蛍光を肉眼的に検出することができる。同様に、酵素に関する適切な基質を提供し、そして得られた反応生成物を検出することにより酵素標識を検出することができる。最後に標識に随伴される色を観察することにより単純な比色分析用標識を簡単に検出することができる。故に種々のディップスティックアッセイにおいて抱合された金がしばしばピンクに見えるが、種々の抱合されたビーズはビーズの色に見える。
【０１１２】
標識された構成成分の使用を必要としないアッセイ形式もある。例えば凝集アッセイを用いて標的抗体、例えば抗ＳＦＲＰ−４抗体の存在を検出することができる。この場合、抗原コーティングされた粒子は標的抗体を含む試料により凝集する。この形式では、標識される必要のある構成成分はなく、そして単純な肉眼検査により標的抗体の存在が検出される。
【０１１３】
医薬組成物の処方
本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を投与に適当な医薬組成物に組み込むことができる。一般的には医薬組成物は対象への投与に適当な形態の少なくとも一つのＳＦＲＰ−４結合剤および薬学的に許容される担体を含む。薬学的に許容される担体を投与される特定の組成物、および組成物を投与するために用いられる特定の方法によりある程度決定される。したがって抗体組成物を投与するのに適当な広範な種類の医薬組成物の処方がある（例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, １８th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, １９９０参照）。医薬組成物は一般的には滅菌され、実質的には等張で、そして米国食品医薬品局の適性製造基準（ＧＭＰ）の規制に全面順守して処方される。
【０１１４】
「薬学的に許容される」、「生理学的に耐性の」なる用語およびその文法的な変形体は、組成物、担体、希釈剤および試薬に言及する場合、互換的に用いられ、そして材料が、組成物の投与を禁止する程度までの望ましくない生理学的影響を生み出さないで対象への、または対象における投与が可能であることを表す。例えば「薬学的に許容される賦形剤」とは一般的に安全で、無毒性の、そして望ましい医薬組成物を調製するのに有用である賦形剤を意味し、そして脊椎動物での使用およびヒトの医薬的使用に許容される賦形剤が含まれる。かかる賦形剤は固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合気体でよい。「薬学的に許容される塩およびエステル」とは薬学的に許容され、そして望ましい薬理学的特性を有している塩およびエステルを意味する。本発明の特定の薬物および組成物の投与の適切な時期、順序および投薬量は当業者には困難なく決定されるであろう。
【０１１５】
かかる担体または希釈剤の好ましい実例には、限定するものではないが水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソームおよび固定油のような非水性ベヒクルを使用することもできる。医薬的に活性な物質のためのかかる培地および化合物の使用は当分野において周知である。任意の従来の培地または化合物がＳＦＲＰ−４結合剤と不適合である場合を除いて、組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性化合物を組成物に組み込むこともできる。
【０１１６】
一つの実施態様ではＳＦＲＰ−４結合剤を、インプラントおよびマイクロカプセル化分配系を含む放出制御処方のような、身体からの急速な排泄に対してＳＦＲＰ−４結合剤を保護する担体と共に調製する。酢酸エチレンビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステルおよびポリ乳酸のような生分解性、生体適合性重合体を使用することができる。かかる処方の調製のための方法は当業者に明白であろう。その材料を市販によりAlza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc. から入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞に標的化されたリポソームを含む）を薬学的に許容される担体として使用することもできる。当業者に公知の方法に従って、例えば米国特許第４５２２８１１号に記載されるようにこれらを調製することができる。
【０１１７】
投与のし易さおよび投薬量の均一性のために、経口または非経口組成物を投薬単位形態で処方するのが特に有利である。本明細書にて使用されるような投薬単位形態とは、処置される対象に関して単位の投薬量として適した物理的に区別された単位を指し；各単位は必要とされる医薬用担体を伴って、望ましい治療効果を生み出すために計算された予め決定された量の結合剤を含有する。本発明の投薬単位形態に関する明記は結合剤の独自の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに対象の処置のためのかかるＳＦＲＰ−４結合剤の配合の分野で固有の制限により決定され、そしてそれに直接依存する。
【０１１８】
本発明の核酸分子をベクターに挿入し、そして遺伝子治療ベクターとして使用することができる。例えば静脈内注射、局部投与により（例えば米国特許第５３２８４７０号参照）、または定位注射により（例えばChen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９１：３０５４−３０５７（１９９４）参照）遺伝子治療ベクターを対象に分配することができる。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は接近可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含むことができるか、または遺伝子分配ベヒクルが包埋されている放出遅延マトリックスを含むことができる。これに代えて、完全な遺伝子分配ベクターを組換え細胞、例えばレトロウイルスベクターからインタクトで生成できる場合、医薬製剤は遺伝子分配系を生成する一つまたはそれより多い細胞を含むことができる。医薬組成物を投与のための説明書と一緒に容器、パックまたはディスペンサーに含めることができる。
【０１１９】
本発明のＳＦＲＰ−４結合剤の同定および特徴付け
本発明の結合剤を同定および／またはスクリーニングするための方法
ＳＦＲＰ−４ポリペプチドに対して望ましい特異性を保有する結合剤、例えば抗ＳＦＲＰ−４抗体および抗ＳＦＲＰ−４抗体関連ポリペプチドを同定およびスクリーニングするために有用な方法には、当分野において公知の任意の免疫学媒介技術が含まれる。免疫応答の構成成分をインビトロで当業者に周知の種々の方法により検出することができる。例えば（１）細胞毒性Ｔリンパ球を放射活性標識された標的細胞と共にインキュベートし、そして放射活性の放出によりこれらの標的細胞の溶解を検出することができる；（２）ヘルパーＴ細胞を抗原および抗原提示細胞と共にインキュベートし、そして標準的な方法によりサイトカインの合成および分泌を測定することができる（Windhagen A；et al., Immunity, ２：３７３−８０（１９９５））；（３）抗原提示細胞を全タンパク質抗原と共にインキュベートし、そしてＴリンパ球活性化アッセイまたは生物物理学的方法のいずれかによりＭＨＣ上のその抗原の提示を検出することができる（Harding et al., Proc. Natl. Acad. Sci., ８６：４２３０−４（１９８９））；（４）マスト細胞をそのＦｃ−イプシロン受容体と架橋する試薬と共にインキュベーションし、そして酵素イムノアッセイによりヒスタミン放出を測定することができる（Siraganian et al., TIPS, ４：４３２−４３７（１９８３））；ならびに（５）酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。
【０１２０】
同様に、当業者に周知である種々の方法によりモデル生物（例えばマウス）またはヒト対象のいずれかでの免疫応答の生成物を検出することもできる。例えば（１）臨床検査室で現在用いられる標準的な方法、例えばＥＬＩＳＡにより、ワクチン接種に応答した抗体の生成を容易に検出することができる；（２）皮膚の表面を引っ掻き、そして引っ掻き部位を超えて移動する細胞を捕捉する滅菌容器を配置することにより、免疫細胞の炎症部位への移動を検出することができる（Peters et al., Blood, ７２：１３１０−５（１９８８））；（３）マイトジェンに応答した末梢血単核細胞の増殖または混合リンパ球反応を３Ｈ−チミジンを用いて測定することができる；（４）ＰＢＭＣをウェル中で標識された粒子と一緒に配置することによりＰＢＭＣの顆粒球、マクロファージおよびその他の食細胞の食作用能力を測定することができる（Peters et al., Blood, ７２：１３１０−５（１９８８））；ならびに（５）ＣＤ４およびＣＤ８のようなＣＤ分子に対する抗体でＰＢＭＣを標識し、そしてこれらのマーカーを発現するＰＢＭＣの分画を測定することにより免疫系細胞の分化を測定することができる。
【０１２１】
一つの実施態様では、複製可能な遺伝子パッケージの表面上の候補結合剤の表示を用いて本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を選択する。例えば米国特許第５５１４５４８号；第５８３７５００号；第５８７１９０７号；第５８８５７９３号；第５９６９１０８号；第６２２５４４７号；第６２９１６５０号；第６４９２１６０号；欧州特許第５８５２８７号；欧州特許第６０５５２２号；欧州特許第６１６６４０号；欧州特許第１０２４１９１号；欧州特許第５８９８７７号；欧州特許第７７４５１１号；欧州特許第８４４３０６号を参照のこと。望ましい結合特異性を有する結合分子をコードするファージミドゲノムを含有する糸状バクテリオファージ粒子を生成／選択するのに有用な方法が記載されている。例えば欧州特許第７７４５１１号；米国特許第５８７１９０７号；米国特許第号５９６９１０８号；米国特許第６２２５４４７号；米国特許第６２９１６５０号；米国特許第６４９２１６０号を参照のこと。
【０１２２】
一つの実施態様では、酵母宿主細胞の表面上の候補結合剤の表示を用いて本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を選択する。酵母表面表示によるｓｃＦｖポリペプチドの単離に有用な方法がKieke et al., Protein Eng.１０（１１）：１３０３−１０（１９９７ Nov）記載されている。
一つの実施態様では、リボソーム表示を用いて本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を選択する。リボソーム表示を用いてペプチドライブラリーにおけるリガンドを同定するのに有用な方法は、Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９１：９０２２−２６（１９９４）；およびHanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９４：４９３７−４２（１９９７）に記載されている。
【０１２３】
一つの実施態様では、候補結合剤のｔＲＮＡ表示を用いて本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を選択する。ｔＲＮＡ表示を用いるリガンドのインビトロ選択に有用な方法はMerryman et al., Chem. Biol., ９：７４１−４６（２００２）により記載されている。
一つの実施態様では、ＲＮＡ表示を用いて本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を選択する。ＲＮＡ表示ライブラリーを用いてペプチドおよびタンパク質を選択するのに有用な方法はRoberts et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, ９４：１２２９７−３０２（１９９７）；およびNemoto et al., FEBS Lett., ４１４：４０５−８（１９９７）により記載されている。非天然ＲＮＡ表示ライブラリーを用いてペプチドおよびタンパク質を選択するのに有用な方法はFrankel et al., Curr. Opin. Struct. Biol., １３：５０６−１２（２００３）により記載されている。
【０１２４】
一つの実施態様では、本発明のＳＦＲＰ−４結合剤はグラム陰性細菌の周辺質において発現され、そして標識されたＳＦＲＰ−４ポリペプチドと混合される。第ＷＯ０２／３４８８６号を参照のこと。ＳＦＲＰ−４ポリペプチドに関する親和性を有する組換えポリペプチドを発現するクローンでは、結合剤に結合する標識されたＳＦＲＰ−４の濃度が上昇し、そしてHarvey et al., Proc. Natl Acad. Sci. ２２：９１９３−９８（２００４）および米国特許第２００４／００５８４０３号に記載されるように、細胞がライブラリーの残りから単離されることが可能になる。
【０１２５】
望ましいＳＦＲＰ−４結合剤の選択の後、当業者に公知の任意の技術、例えば原核または真核細胞発現等によりそれを大容量で生成できることが企図される。元来の種抗体結合特異性（本明細書に記載される技術に従って操作されるような）を保持するために必要とされるＣＤＲおよび必要な場合可変領域フレームワークの最小部分が由来する種抗体から誘導され、そして抗体の残りが標的種免疫グロブリンから誘導され、本明細書で記載されるように操作されて、それによりハイブリッド抗体重鎖の発現のためのベクターを生成することができる、抗体重鎖をコードする発現ベクターを構築するための従来の技術を用いることにより、例えば限定するものではないが抗ＳＦＲＰ−４ハイブリッド抗体またはそのフラグメントであるＳＦＲＰ−４結合剤を生成することができる。
【０１２６】
ＳＦＲＰ−４結合の測定
一つの実施態様では、ＳＦＲＰ−４結合アッセイとは、ＳＦＲＰ−４ポリペプチドおよびＳＦＲＰ−４結合剤を、ＳＦＲＰ−４ポリペプチドとＳＦＲＰ−４結合剤との間の結合に適当な条件下で混合し、そしてＳＦＲＰ−４ポリペプチドとＳＦＲＰ−４結合剤との間の結合の量を評価するアッセイ形式を指す。ＳＦＲＰ−４ポリペプチドの不在下での結合の量、非特異的免疫グロブリン組成物の存在下での結合の量、または双方でよい適当な対照と結合の量を比較する。結合の量を任意の適当な方法により評価することができる。結合アッセイ方法には、例えばＥＬＩＳＡ、ラジオレセプター結合アッセイ、シンチレーション近接アッセイ、細胞表面受容体結合アッセイ、蛍光エネルギー移動アッセイ、液体クロマトグラフィー、膜ろ過アッセイ等が含まれる。ＳＦＲＰ−４結合剤へのＳＦＲＰ−４結合の直接測定のための生物物理学的アッセイは、例えば核磁気共鳴、蛍光偏光、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲチップ）等である。当分野において公知の標準的なアッセイ、例えば放射性リガンド結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＦＲＥＴ、免疫沈殿、ＳＰＲ、ＮＭＲ（２Ｄ−ＮＭＲ）、質量分析等により特異的結合を決定する。候補ＳＦＲＰ−４結合剤の特異的結合が候補ＳＦＲＰ−４結合剤の不在下で観察される結合よりも少なくとも１％大きい場合、候補ＳＦＲＰ−４結合剤は本発明のＳＦＲＰ−４結合剤として有用である。
【０１２７】
ＳＦＲＰ−４ポリペプチドおよびＳＦＲＰ−４結合剤の共結晶もまた分子相互作用を決定する方法として本発明により提供される。ＳＦＲＰ−４結合剤とＳＦＲＰ−４との間の結合に適当な条件は化合物およびそのリガンドに依存し、そして当業者により容易に決定できる。
【０１２８】
ＳＦＲＰ−４結合剤生物学的活性の測定
本発明のＳＦＲＰ−４結合剤、例えば抗ＳＦＲＰ−４抗体および抗ＳＦＲＰ−４抗体関連ポリペプチドを、本明細書に開示される特異的活性を含む生物学的活性に関するアゴニストまたはアンタゴニストとして特定することができる。例えばＳＦＲＰ−４結合剤であるＳＦＲＰ−４アゴニストおよびアンタゴニストを当分野において公知の方法を用いて作成することができる。例えば第ＷＯ９６／４０２８１号；米国特許第５８１１０９７号；Deng et al., Blood ９２：１９８１−１９８８（１９９８）；Chen et al., Cancer Res., ５８：３６６８−３６７８（１９９８）；Harrop et al., J. Immunol. １６１：１７８６−１７９４（１９９８）；Zhu et al., Cancer Res., ５８：３２０９−３２１４（１９９８）；Yoon et al., J. Immunol., １６０：３１７０−３１７９（１９９８）；Prat et al., J. Cell. Sci., １１１：２３７−２４７（１９９８）；Pitard et al., J. Immunol. Methods, ２０５：１７７−１９０（１９９７）；Liautard et al., Cytokinde, ９：２３３−２４１（１９９７）；Carlson et al., J. Biol. Chem., ２７２：１１２９５−１１３０１（１９９７）；Taryman et al., Neuron, １４：７５５−７６２（１９９５）；Muller et al., Structure, ６：１１５３−１１６７（１９９８）；Bartunek et al., Cytokinem, ８：１４−２０（１９９６）を参照のこと。ＳＦＲＰ−４ポリペプチドの生物学的活性を測定するために開発された任意の従来のインビボおよびインビトロアッセイを用いて、ＳＦＲＰ−４結合剤の生物学的活性、主にアゴニストまたはアンタゴニスト特性を特徴付けすることができる。
【０１２９】
本発明のＳＦＲＰ−４結合剤の使用
概要：
本発明の結合剤はＳＦＲＰ−４ポリペプチドの局在および／または定量に関係する分野において公知の方法において（例えば適切な生理学的試料中のＳＦＲＰ−４ポリペプチドのレベルの測定における使用のため、診断方法における使用のため、ポリペプチドの造影における使用のため等）有用である。一つの実施態様では、結合ドメインから誘導された抗体を含有するＳＦＲＰ−４結合剤は薬理学的に活性な組成物として有用である。本発明の結合剤は、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈殿のような標準的な技術によりＳＦＲＰ−４ポリペプチドを単離するのに有用である。本発明のＦＲＰ−４結合剤は、生物学的試料、例えば細胞からの天然の免疫反応性ＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたは免疫反応性ＳＦＲＰ−４様ポリペプチド、および宿主系において発現された組換えにより生成された免疫反応性ＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドの精製を促進することができる。さらに免疫反応ポリペプチドの発現の存在量およびパターンを評価するために、ＳＦＲＰ−４結合剤を用いて（例えば細胞ライゼートまたは細胞上澄中の）免疫反応性ＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたは免疫反応性ＳＦＲＰ−４様ポリペプチドを検出することができる。本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を診断用に使用して、臨床検査手順の一部として組織における免疫反応性ＳＦＲＰ−４ポリペプチドレベルおよび／または免疫反応性ＳＦＲＰ−４様ポリペプチドレベルをモニタリングして、例えば所定の処置レジメンの効果を決定することができる。前記されたように、本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を検出可能な物質にカップリング（すなわち物理的連結）することにより検出を促進することができる。
【０１３０】
ＳＦＲＰ−４ポリペプチド発現の検出
生物学的試料中のＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドの存在または不在を検出するための方法の実例は、被験対象から生物学的試料を得ること、およびＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドの存在が生物学的試料中で検出されるように、ＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドを検出できる本発明のＳＦＲＰ−４結合剤と生物学的試料を接触させることを伴う。ＳＦＲＰ−４結合剤の実例はＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドに結合できる配列番号：１に対して上昇させた抗体、好ましくは検出可能な標識を伴う抗体である。結合剤に関して「標識された」なる用語は、検出可能な物質を結合剤にカップリング（すなわち物理的連結）することによる結合剤の直接的標識、および直接標識されている別の化合物との反応性による結合剤の間接的標識を包含すると意図される。間接的標識の実例には、蛍光標識された二次抗体を用いる一次抗体の検出および蛍光標識されたストレプトアビジンで検出できるような、ビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識が挙げられる。
【０１３１】
本発明の検出方法を用いて生物学的試料中のＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドをインビトロおよびインビボで検出することができる。ＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドの検出のためのインビトロ技術には、酵素結合免疫吸アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈殿および免疫蛍光が含まれる。さらに、ＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドの検出のためのインビボ技術には、標識されたＳＦＲＰ−４結合剤、例えば抗ＳＦＲＰ−４抗体を対象に導入することが含まれる。例えば対象におけるその存在および位置を標準的な造影技術により検出できる放射活性マーカーで抗体を標識することができる。一つの実施態様では、生物学的試料は被験対象からのポリペプチド分子を含有する。
【０１３２】
イムノアッセイおよび造影
本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を用いて、生物学的試料中のＳＦＲＰ−４タンパク質レベルまたはＳＦＲＰ−４様タンパク質レベルを抗体基盤の技術を用いて検定することができる。例えば組織におけるタンパク質発現を古典的な免疫組織学的方法で研究することができる。Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. １０１：９７６−９８５（１９８５）；Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. １０５：３０８７−３０９６（１９８７）。タンパク質遺伝子発現を検出するのに有用なその他の抗体基盤の方法には、酵素結合免疫吸アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のようなイムノアッセイが含まれる。適当な抗体アッセイ標識は当分野において公知であり、そしてグルコースオキシダーゼのような酵素標識、ならびにヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）およびテクネチウム（９９ｍＴｃ）のような放射性同位体またはその他の放射性薬剤、ならびにフルオレセインおよびローダミンのような蛍光標識、ならびにビオチンが含まれる。
【０１３３】
生物学的試料中の分泌型ＳＦＲＰ−４タンパク質レベルまたはＳＦＲＰ−４様タンパク質レベルの検定に加えて、インビボで造影により分泌型ＳＦＲＰ−４タンパク質レベルまたはＳＦＲＰ−４様タンパク質レベルを検出することもできる。ＳＦＲＰ−４タンパク質レベルまたはＳＦＲＰ−４様タンパク質レベルのインビボ造影のためのＳＦＲＰ−４結合剤、例えば抗ＳＦＲＰ−４抗体標識またはマーカーには、Ｘ線検査、ＮＭＲまたはＥＳＲにより検出可能なものが含まれる。Ｘ線検査に適当な標識には、検出可能な放射線を放射するが、対象には有害でないことが明らかであるバリウムまたはセシウムのような放射性同位体が含まれる。ＮＭＲおよびＥＳＲに適当なマーカーには、ＳＦＲＰ−４結合剤を発現する関連するクローンのための栄養を標識することによりＳＦＲＰ−４結合剤に組み込むことができる、重水素のような検出可能な特徴的なスピンを有するものが含まれる。
【０１３４】
放射性同位体（例えば１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射線不透過性物質または核磁気共鳴により検出可能な材料のような適切な検出可能な造影部分で標識されているＳＦＲＰ−４結合剤を（例えば非経口的、皮下または腹腔内に）対象に導入する。対象の大きさおよび用いられる造影系が診断画像を生じるために必要な造影部分の量を決定することは当分野では理解されよう。放射性同位体部分の場合、ヒト対象用に注射される放射活性の量は通常９９ｍＴｃ約５から２０ミリキュリーの範囲である。次いで標識されたＳＦＲＰ−４結合剤は、特異的標的ポリペプチドを含有する細胞の位置に優先的に蓄積される。例えばインビボ腫瘍造影はS. W. Burchiel et al., Tumor Imaging：The Radiochemical Detection of Cancer １３（１９８２）に記載されている。
【０１３５】
故に本発明は、（ａ）個体の細胞または体液中の本発明のＳＦＲＰ−４結合剤の結合を測定することによりポリペプチドの発現を検定すること；（ｂ）遺伝子発現のレベルを標準的なＳＦＲＰ−４ポリペプチド発現レベルと比較し、それにより標準的な発現レベルと比較された、検定されたＳＦＲＰ−４ポリペプチド発現レベルの上昇または低下が医学的症状の指標であること；を伴う、医学的症状、例えばＳＦＲＰ−４関連障害の診断方法を提供する。
【０１３６】
診断的使用
本発明のＳＦＲＰ−４結合組成物は診断方法において有用である。そのように本発明は、対象におけるＳＦＲＰ−４関連の医学的症状の診断に有用な本発明の結合剤を使用する方法を提供する。本発明の結合剤は、任意のレベルのエピトープ結合特異性およびＳＦＲＰ−４ポリペプチドに対する非常に高い結合親和性を有するように選択され得る。一般に、結合剤の結合親和性が高いほどよりストリンジェントな洗浄条件をイムノアッセイで実施して、標的ポリペプチドを除去することなく、非特異的結合材料を除去することができる。したがって診断アッセイにおいて有用な本発明のＳＦＲＰ−４結合剤は通常少なくとも１０８、１０９、１０１０、１０１１または１０１２Ｍ−１の結合親和性を有する。さらに診断試薬として用いられるＳＦＲＰ−４結合剤は、標準的な条件下で少なくとも１２時間、好ましくは少なくとも５時間、およびさらに好ましくは少なくとも１時間で平衡に達する十分な比率の動態を有するのが望ましい。
【０１３７】
本発明の方法には診断試薬として本発明の抗ＳＦＲＰ−４抗体および抗ＳＦＲＰ−４抗体関連ポリペプチド組成物のポリクローナル調製物を用いるものがあり、そしてモノクローナル単離体を用いる方法もある。ポリクローナル混合物の使用は、一つのモノクローナル抗ＳＦＲＰ−４抗体から作成された組成物と比較して多くの利点を有する。ＳＦＲＰ−４ポリペプチドの複数の部位への結合により、ポリクローナル抗ＳＦＲＰ−４抗体またはその他のポリペプチドは、ＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドの単一の部位に結合するモノクローナルよりも強いシグナル（診断用）を作成することができる。さらにポリクローナル調製物は原型の標的配列の非常に多くのバリアント（例えばアレルバリアント、種バリアント、株バリアント、薬物誘起のエスケープバリアント）に結合できるが、モノクローナル抗体は原型の配列またはそれに対するより狭い範囲のバリアントにしか結合できない。しかしながらモノクローナル抗ＳＦＲＰ−４抗体は、密接に関係した抗原の存在時または存在の可能性のある場合に単一の抗原を検出するのに有利である。
【０１３８】
前記された方法に従って調製されたポリクローナルヒト抗ＳＦＲＰ−４抗体を用いる方法では、調製物は典型的にはＳＦＲＰ−４結合剤の取り合わせ、例えば標的ポリペプチドに対する異なるエピトープ特異性を有する抗体を含有する。モノクローナル抗体を用いるいくつかの方法では、異なるエピトープ結合特異性の二つの抗体を有するのが望ましい。エピトープ結合特異性の差異を競合結合アッセイにより決定することができる。
【０１３９】
ヒト抗体であるＳＦＲＰ−４結合剤を任意の種類の試料のための診断試薬として使用することができるが、ヒト生物学的試料のための診断試薬として最も有用である。種々の標準的なアッセイ形式で所定のＳＦＲＰ−４ポリペプチドを検出するためにＳＦＲＰ−４結合剤を使用することができる。かかる形式には免疫沈殿、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイおよび免疫測定アッセイが含まれる。Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Publications, New York, １９８８）；米国特許第３７９１９３２号；第３８３９１５３号；第３８５０７５２号；第３８７９２６２号；第４０３４０７４号、第３７９１９３２号；第３８１７８３７号；第３８３９１５３号；第３８５０７５２号；第３８５０５７８号；第３８５３９８７号；第３８６７５１７号；第３８７９２６２号；第３９０１６５４号；第３９３５０７４号；第３９８４５３３号；第３９９６３４５号；第４０３４０７４号；および第４０９８８７６号を参照のこと。対象の任意の組織または体液から生物学的試料を得ることができる。
【０１４０】
免疫測定またはサンドイッチアッセイは本発明の診断方法のための好ましい形式である。米国特許第４３７６１１０号、第４４８６５３０号、第５９１４２４１号、および第５９６５３７５号を参照のこと。かかるアッセイは固相に固定された一つのＳＦＲＰ−４結合剤、例えば抗ＳＦＲＰ−４抗体または抗ＳＦＲＰ−４抗体の集団、および別の抗ＳＦＲＰ−４抗体または抗ＳＦＲＰ−４抗体の集団を使用する。典型的には抗ＳＦＲＰ−４抗体または抗ＳＦＲＰ−４抗体の集団の溶液は標識されている。抗体集団を使用する場合、集団は典型的には標的ポリペプチド内の異なるエピトープ特異性に結合する抗体を含有する。したがって、同一集団を固相および抗体溶液の双方に使用することができる。抗ＳＦＲＰ−４モノクローナル抗体を使用する場合、異なる結合特異性を有する第一および第二ＳＦＲＰ−４モノクローナル抗体を固相および溶液相に使用する。固相および抗体溶液を標的抗原と逐次的または同時のいずれかで接触させることができる。固相抗体を最初に接触させる場合、アッセイは順方向アッセイであると称される。逆に抗体溶液を最初に接触させる場合、アッセイは逆方向アッセイであると称される。標的を双方の抗体と同時に接触させる場合、アッセイは同時アッセイと称される。ＳＦＲＰ−４ポリペプチドを抗ＳＦＲＰ−４抗体と接触された後、通常約１０分から約２４時間まで様々であり、そして通常約１時間である期間、試料をインキュベートする。次いで洗浄工程を実施して診断試薬として使用されている抗ＳＦＲＰ−４抗体に特異的に結合しない試料の構成成分を除去する。固相および抗体溶液が別個の工程で結合する場合、いずれかまたは双方の結合工程の後に洗浄工程を実施することができる。洗浄工程の後、典型的には標識された抗体溶液の結合を介して固相に連結された標識を検出することにより結合を定量化する。通常所定の抗体対または抗体の集団および所定の反応条件に関して公知の濃度の標的抗原を含有する試料から検量線を準備する。次いで試験される試料中のＳＦＲＰ−４ポリペプチドの濃度を検量線からの内挿により読み取る。平衡時に結合している標識された抗体溶液の量からか、または平衡に達する前の一連の時点で結合した標識された抗体溶液の反応速度測定によるかのいずれかで分析物を測定することができる。かかる曲線の傾きは試料中のＳＦＲＰ−４ポリペプチドの濃度の測定値である。
【０１４１】
前記の方法における使用に適当な支持体には、例えばニトロセルロース膜、ナイロン膜および誘導体化ナイロン膜、ならびにアガロース、デキストラン基盤のゲル、ディプスティック、微粒子、マイクロスフェア、磁性粒子、試験管、マイクロタイターウェル、SEPHADEX（商標）（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.）等のような粒子もまた含まれる。吸収または共有結合による固定でよい。場合によっては抗ＳＦＲＰ−４抗体をアビジンのような表面結合リンカーへの結合のためのビオチンのようなリンカー分子に結合させることができる。
【０１４２】
予測医学
本発明はまた対象を予防的に処置する予後診断（予測）目的のために診断アッセイ、予後診断アッセイ、薬理ゲノミクスおよび臨床試験のモニタリングを使用する予測医学の分野にも関連する。したがって本発明の一つの態様は、対象がＳＦＲＰ−４ポリペプチド発現異常に関連する疾患もしくは障害に苦しむか、または障害を発達させる危険性を有するかどうかを決定するために、生物学的試料（例えば血液、血清、細胞、組織）中のＳＦＲＰ−４ポリペプチド発現を決定するための診断アッセイに関する。
【０１４３】
本発明はまた、個体がＳＦＲＰ−４ポリペプチド発現または活性に関連する障害を発達させる危険性を有するかどうかを決定するための予後診断（または予測）アッセイを提供する。ＳＦＲＰ−４ポリペプチドを特徴とするか、またはそれに関連する障害の発症の前に個体をそれにより予防的に処置するための予後診断または予測目的のためにかかるアッセイを使用することができる。さらに本発明のＳＦＲＰ−４結合剤がその多型形態のためにＳＦＲＰ−４ポリペプチドに関してより大きな親和性を有する場合（また逆も同様）、本発明の方法を用いて個体がＳＦＲＰ−４を発現するのか、またはＳＦＲＰ−４の多型形態を発現するのかを評価することもできる。
【０１４４】
対象の特定の組織中（または血液中）のあるポリペプチドのレベルは、対象に投与された場合の所定の薬物の毒性、効果、クリアランス速度または代謝速度の指標となり得る。本明細書に記載される方法を用いて、かかる対象のこれらの薬物に対する応答の予測を助けるために、対象におけるかかるポリペプチドのレベルを決定することもできる。本発明の別の態様は個体におけるＳＦＲＰ−４発現を決定し、それによりその個体のために適切な治療用または予防用化合物を選択する方法を提供する（本明細書では「薬理ゲノミクス」と称する）。薬理ゲノミクスにより、個体の遺伝子型（例えば個体が特定の化合物に応答する能力を決定するために試験された個体の遺伝子型）に基づいた個体の治療的または予防的処置のための化合物（例えば薬物）の選択が可能になる。
【０１４５】
本発明のＳＦＲＰ−４結合剤のＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドに対する結合を、例えば前記されたようなＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチド発現または活性に関連する障害を有するかまたはそれを発達させる危険性を有する対象を同定するために利用することができる。これに代えて、疾患または障害を有するかまたはそれを発達させる危険性を有する対象を同定するために予後診断アッセイを利用することができる。故に本発明はＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチド発現または活性異常に関連する疾患または障害を同定するための方法を提供し、ここで被験試料は対象から得られ、そしてＳＦＲＰ−４結合剤結合が検出され、ここでＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドの変化の存在は、ＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチド発現または活性異常に関連する疾患または障害を有するかまたはそれを発達させる危険性を有する対象を診断する。本明細書にて使用される際には、「被験試料」とは目的の対象から得られた生物学的試料を指す。
【０１４６】
さらに本明細書に記載される予後診断アッセイを用いて、ＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチド発現または活性異常に関連する疾患または障害を処置するために対象に化合物（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド擬似物質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小型分子またはその他の候補薬物）を投与できるかどうかを決定することができる。例えばかかる方法を用いて、ＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチド関連障害に関して対象を化合物で有効に処置できるかどうかを決定することができる。故に本発明は、被験試料が得られ、そしてＳＦＲＰ−４結合剤を用いてＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドが検出される、ＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチド発現または活性異常に関連する障害に関して、対象を化合物で有効に処置できるかどうかを決定するための方法を提供する（例えばここでＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドの存在は、ＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチド発現または活性異常に関連する障害を処置するために化合物を投与できる対象を診断する）。
【０１４７】
対象から得られた血液または組織試料中のＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドのレベルを決定し、そして疾患のない個体から得られた血液試料または同一の組織型からの試料において見出されるレベルと比較する。健常対象から得られた試料と比較して、ＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチド関連疾患を有することが疑われる対象から得られた試料中のＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドの過剰（または過少）は、処置される対象におけるＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチド関連疾患の指標である。さらに陽性の診断を行うためにさらなる試験が必要とされ得る。
【０１４８】
あるＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチド分子の過剰発現（または過少発現）の程度が、疾患を有する対象が特定の型の治療または処置に応答する可能性があるかどうかの指標になると知られている多くの疾患がある。故に試料中のＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドを検出する方法を、例えば対象が治療または処置に応答する可能性を評価するための予後診断の方法として使用できる。対象からの適当な組織または血液試料中の関係する予後診断用ポリペプチドのレベルを決定し、そして適当な対照、例えば同一の疾患を有するが、処置に好ましく応答している対象のレベルと比較する。対照と比較して試料中の予後診断用ポリペプチドが過剰発現（または過少発現）される程度は、対象が処置または治療に好ましく応答しない可能性を予測し得る。対照に相対して過剰発現（または過少発現）が大きいほど、対象が処置に応答する可能性が低くなる。
【０１４９】
本明細書にて「予測ポリペプチド」と称される、ある標的ポリペプチドの過剰発現（または過少発現）の程度が、対象が疾患を発達させるかどうかの指標であることが知られている疾患が多くある。故に試料中のＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドを検出する方法を、対象が疾患を発達させるかどうかを予測する方法として使用することができる。疾患を発達させる危険性を有する対象からの適当な組織または血液試料中の関係する予測ポリペプチドのレベルを決定し、そして適当な対照、例えば疾患を発達させる危険性を有さない対象におけるレベルと比較する。対照と比較して試料中の予測ポリペプチドが過剰発現（または過少発現）される程度は、対象が疾患を発達させる可能性を予測し得る。対照に相対して過剰発現（または過少発現）が大きいほど、対象が疾患を発達させる可能性が高くなる。
【０１５０】
例えば少なくとも一つのプローブ試薬、例えば本明細書に記載されるＳＦＲＰ−４結合剤を含む予め包装された診断用キットを利用することにより本明細書に記載される方法を実施することができ、それを例えば臨床設定においてＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドを伴う疾患または病気の病徴または家族歴を呈する対象を診断するために都合よく使用できる。さらにＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドが発現される任意の細胞型または組織を本明細書に記載される予後診断アッセイにおいて利用することができる。
【０１５１】
ＳＦＲＰ−４結合剤の予防的および治療的使用
概要：
本発明のＳＦＲＰ−４結合剤は疾患を予防または処置するのに有用である。特に本発明は、ＳＦＲＰ−４結合剤発現または活性異常に関連する障害の危険性を有する（または影響を受けやすい）か、または障害を有する対象を処置する予防的および治療的双方の方法を提供する。したがって本発明は有効量のＳＦＲＰ−４結合剤を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるＳＦＲＰ−４関連の医学的症状、例えばＥＦＲＰ−４障害の関連する予防および／または処置のための方法を提供する。例えばＳＦＲＰ−４ポリペプチド（例えばインスリン）の不在またはレベル低下を置き換えるために、異なるポリペプチド（例えば抗ＳＦＲＰ−４抗体）の不在またはレベル低下を補うために、ポリペプチド（例えば癌遺伝子）の活性を阻止するために、ＳＦＲＰ−４ポリペプチドの活性を活性化するために（例えば受容体への結合により）、遊離リガンド（例えば炎症を低下させるのに用いられる可溶性ＴＮＦ受容体）に関してそれと競合することにより膜結合受容体の活性を低下させるために、または望ましい応答（例えば血管成長）をもたらすために、対象に本発明のＳＦＲＰ−４結合剤組成物を投与することができる。
【０１５２】
本発明のＳＦＲＰ−４結合剤は限定するものではないが：骨細胞の発達、分化および活性化を伴うもの；赤血球および血小板のような血液循環中の細胞の疾患または病理において；種々の免疫学的障害および／または病理；肺疾患および障害；自己免疫および炎症性疾患；心血管病；代謝性疾患；生殖器疾患、腎臓疾患、糖尿病、脳外傷、癌成長および転移（例えば脳、乳房、前立腺、子宮、脾臓、膵臓、胃腸管（例えば結腸、直腸、小腸、胃、食道）の癌）；ウイルス感染、癌治療、歯周病；組織再生（例えば神経および骨）；急性リンパ芽球性白血病；グリオーマ；神経系疾患；神経変性障害；造血障害；虚血（例えば心不全、心筋梗塞；卒中）の結果であるアポトーシス；神経変性疾患（例えばハンチントン病、末梢脱髄性疾患、多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病；外傷）；冠動脈心疾患；ならびに炎症（例えば炎症性腸疾患）を含む対象における種々の障害に関与する可能性のある予防的および治療的適用に有用である。
【０１５３】
治療用にインビボで使用する場合、ＳＦＲＰ−４結合剤、例えば本発明の抗ＳＦＲＰ−４抗体を有効量（すなわち望ましい治療効果を有する量）で対象に投与する。それは通常非経口的に投与される。用量および投薬レジメンはＳＦＲＰ−４関連疾患または障害の程度、使用される特定のＳＦＲＰ−４結合剤の特徴、例えばその治療インデックス、および対象の病歴に依存する。脈管構造の細胞を処置するために静脈内に、ならびに所属リンパ節を処置するために皮下および腹腔内にＳＦＲＰ−４結合剤を１−２週間の期間にわたって連続的に投与するのが有利である。場合によっては、放射線、化学療法処置、または腫瘍壊死因子、インターフェロンまたはその他の細胞保護もしくは免疫調節剤の投与の組み合わせサイクルのような補助治療の過程の間に投与を行う。
【０１５４】
非経口投与用に、ＳＦＲＰ−４結合剤を薬学的に許容される非経口用ベヒクルを伴って単位投薬注射用形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）に処方する。かかるベヒクルは本質的に無毒性であり、そして非治療用である。
【０１５５】
抗ＳＦＲＰ−４  ＩｇＭ抗体の使用はある適用には好ましいが、ＩｇＧ分子は、さらに小型化されることにより、ＩｇＭ分子よりもある型の感染細胞に局在することがさらに可能になり得る。インビボ補体活性化により炎症応答の誘導およびマクロファージの活性化を含む種々の生物学的効果を導くことは明白である。Unanue & Benecerraf, Textbook of Immunology, ２nd Edition（Williams & Wilkins １９８４）２１８頁。炎症を併発する血管拡張の上昇は、種々の薬剤が感染細胞に局在する能力を高めることができる。したがって本明細書により特定される型のＳＦＲＰ−４抗体組み合わせを多くの方式で治療的に使用することができる。加えて、抗原、例えば精製されたＳＦＲＰ−４ポリペプチド、そのフラグメントもしくは類似体（Hakomori, Ann. Rev. Immunol. ２：１０３（１９８４））またはかかる抗原に関係する抗イディオタイプ抗体（Nepom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８１：２８６４（１９８５）；Koprowski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８１：２１６（１９８４））を用いてヒト対象において活性な免疫応答を誘起することができる。かかる応答には望ましい生物学的効果、例えば標的細胞破壊のためにヒト補体を活性化できる抗体の形成が含まれる。
【０１５６】
疾患および障害
ＳＦＲＰ−４ポリペプチドのレベルまたは生物学的活性の上昇（疾患または障害を患わない対象に相対して）を特徴とする疾患および障害を、治療的または予防的様式で投与できる、活性を拮抗する（すなわち低下させるかまたは阻止する）ＳＦＲＰ−４結合剤基盤の治療用化合物で処置することができる。利用できる治療用化合物には、限定するものではないが：（ｉ）前記されたＳＦＲＰ−４結合剤；および（ｉｉ）ＳＦＲＰ−４結合剤をコードする核酸が含まれる。
【０１５７】
ＳＦＲＰ−４ポリペプチドのレベルまたは生物学的活性の低下（疾患または障害を患わない対象に相対して）を特徴とする疾患および障害を、ＳＦＲＰ−４活性を上昇（すなわちアゴニストである）ＳＦＲＰ−４結合剤基盤の治療用化合物で処置することができる。活性を上方調節する治療薬を治療的または予防的様式で投与することができる。利用できる治療薬には、限定するものではないがバイオアベイラビリティーを上昇させるＳＦＲＰ−４結合剤が含まれる。
【０１５８】
ＳＦＲＰ−４結合剤誘起のペプチドおよび／またはＲＮＡを定量すること、（例えば生検組織から）対象の組織試料を得て、そしてそれをインビトロでＲＮＡもしくはペプチドレベル、発現されたＳＦＲＰ−４ポリペプチド（または前記されたポリペプチドのｍＲＮＡ）の構造および／または活性レベルを検定することにより、上昇または低下したレベルを容易に検出することができる。当分野において周知である方法には、限定するものではないがイムノアッセイ（例えばウェスタンブロット分析、免疫沈殿、続いてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学等）および／またはｍＲＮＡの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えばノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーション等）が含まれる。
【０１５９】
ＳＦＲＰ−４は非常に多くの疾患および障害に関連し、その全てはＳＦＲＰ−４結合剤の開発により影響を受け得る。
本発明はＳＦＲＰ−４媒介障害を検出、予防または処置するためのＳＦＲＰ−４結合剤の使用のための方法を提供する。特に本発明のＳＦＲＰ−４結合剤はＳＦＲＰ−４ポリペプチド発現における変化、例えば上昇または低下により現れる障害、例えば癌（例えば脳、乳房、前立腺、子宮、脾臓、膵臓、胃腸管（例えば結腸、直腸、小腸、胃、食道））；虚血（例えば心不全、心筋梗塞；卒中）の結果であるアポトーシス；神経変性疾患（例えばハンチントン病、末梢脱髄性疾患、多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病；外傷）；冠動脈心疾患、炎症（例えば炎症性腸疾患）の予防的処置または治療的処置に有用である。
【０１６０】
本発明のＳＦＲＰ−４結合剤は乳癌の検出、予防または治療的処置に有用である。Wongおよび共同研究者は乳癌におけるＳＦＲＰの役割およびＷｎｔ−シグナリング経路に対するその関係を試験した。ＳＦＲＰ、Ｗｎｔ−１、ＡＰＣ、ベータカテニンおよびその標的遺伝子ｃ−ｍｙｃおよびサイクリンＤ１のインサイチュハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学分析をヒト乳房の浸潤性乳管癌の７０個の標本において行った。隣接する正常組織と比較して、６２個でＳＦＲＰ  ｍＲＮＡが下方調節され、そして８個の腫瘍標本で高くなった。しかしながら腫瘍進行の過程では腫瘍および隣接組織の双方でＳＦＲＰ  ｍＲＮＡが着実に上昇した。興味深いことに、腋窩リンパ節転移を伴う症例の数は、ＳＦＲＰが低下した群よりもＳＦＲＰが高くなった群で有意に低く、それはＳＦＲＰが浸潤性乳癌における予後診断因子として寄与し得ることを示唆している。Wong et al., J. Pathol. １９６：１４５−１５３（２００２）。
【０１６１】
本発明のＳＦＲＰ−４結合剤は過負荷誘起の心不全、心筋肥大およびアポトーシスを起こしやすい筋細胞表現型を有する対象におけるアポトーシスの検出、予防または治療的処置に有用である。Schumannおよび共同研究者は心不全のない心臓およびある心臓からの組織試料中のＳＦＲＰの心筋ｍＲＮＡ発現および可溶性ベータカテニンのレベルを比較した。Schumann, et al. Cardiovascular Res ４５：７２０−７２８（２００２）。ｓＦＲＰ１および２ではなく、アポトーシス促進性のｓＦＲＰ３および４のｍＲＮＡレベルがドナー心臓と比較して不全心室において高くなった。拡張型心筋症または冠動脈心疾患を患う患者の間で有意な差はなかった。ｓＦＲＰ３および４は心筋細胞において発現され、そしてその発現はアポトーシス促進性Ｆａｓ／Ｆａｓ−アンタゴニスト比のｍＲＮＡ発現と相関したが、抗アポトーシス性ｂｃｌ−ｘＬのｍＲＮＡレベルとは逆比例した。その結果により、ヒト心筋不全ではＷｎｔ／ベータカテニン経路が二つの内因性Ｗｎｔアンタゴニストの発現増強により弱められるという仮説が支持される。これは過負荷ヒト心筋のアポトーシスを起こしやすい表現型に寄与し得る。
【０１６２】
本発明のＳＦＲＰ−４結合剤は子宮癌、例えば子宮内膜癌の検出、予防または治療的処置に有用である。Hrzenjakおよび共同研究者は子宮内膜間質肉腫における分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質４およびベータカテニン発現の逆相関を観察した。Hrzenjak et al., J Pathol. ２０４（１）：１９−２７（２００４）。ｃＤＮＡアレイ分析の後、子宮内膜間質肉腫で調節解除された３００個を超える遺伝子が選択され、そしてシークエンシングされた。中でも最も有意に調節解除された遺伝子はＳＦＲＰ、とりわけＳＦＲＰ４のものであった。正常な子宮内膜と比較して、ＳＦＲＰ４の発現は低悪性度子宮内膜間質肉腫（ＥＳＳ；ｎ＝１０）および未分化子宮内膜肉腫（ＵＥＳ；ｎ＝４）の双方で低下し、後者のさらに侵襲性の形態でより低かった。これらの結果は、パラフィンワックス包埋組織で、定量的リアルタイムＰＣＲ分析およびインサイチュハイブリダイゼーションにより確認された。さらにＷｎｔ−シグナリング経路の重要な構成成分であるベータカテニンの発現はＳＦＲＰ４と反対の様式で調節され、特に未分化肉腫において上昇した。Ｗｎｔ−シグナリング経路の活性化はさらに、ベータカテニンがＵＥＳの核に転位置されたという免疫組織化学的実証により支持された。したがってＳＦＲＰ４はＷｎｔ経路の調節解除ならびにＥＳＳおよびＵＥＳの病変形成に関与する推定腫瘍サプレッサーであり得る。
【０１６３】
本発明のＳＦＲＰ−４結合剤は子宮癌、例えば子宮内膜癌および乳癌の検出、予防または治療的処置に有用である。Abuh−Jawdehおよび共同研究者はディフェレンシャルディスプレイ技術を用いて、正常子宮内膜と比較してヒト子宮内膜癌において差次的に発現される遺伝子を同定し、そしてＳＦＲＰをクローン化した。Abuh−Jawdeh, G et al., Lab Invest. ７９：４３９−４７（１９９９）。インサイチュハイブリダイゼーションを用いて、ＳＦＲＰが間葉系細胞ににより発現されるが、上皮細胞により発現されないことを決定した。ＳＦＲＰの発現は子宮内膜周期の間に調整された：それは増殖性子宮内膜の間質において発現され、そして分泌性または月経性子宮内膜では有意に検出されず、これはＳＦＲＰがホルモン調節下にあることを示唆している。加えて、ＳＦＲＰ  ｍＲＮＡの発現は子宮内膜肥厚および癌腫の間質において、ならびに原位置および浸潤乳癌の間質において著明に上方調節された。これらの結果により、ＳＦＲＰはＷｎｔ−ｆｒｉｚｚｌｅｄシグナリング経路のレギュレーターとして機能し、そして子宮内膜生理機能および発癌に関与することが示された。
【０１６４】
本発明のＳＦＲＰ−４結合剤は前立腺癌の検出、予防または治療的処置に有用である。Horvathおよび共同研究者は分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質４ペプチドの膜性発現が限局性前立腺癌の良好な予後を予測し、そしてインビトロＰＣ３細胞増殖を阻止することを実証している。Horvath et al., Clin. Cancer Res. １０：６１５−２５（２００４）。ＳＦＲＰ−４  ｍＲＮＡは前立腺癌（ＰＣ）において過剰発現されるので、Horvathの研究の目標は正常および悪性ヒト前立腺組織におけるＳＦＲＰ−４タンパク質発現のパターンを定義すること、および発現における変化が疾患進行および予後に関連したかどうかを決定すること、ならびにＰＣのインビトロモデルにおけるＳＦＲＰ−４過剰発現の表現型を定義することであった。カプラン・マイヤー分析により、ＰＣが細胞の＞２０％で膜性ＳＦＲＰ−４を発現した患者は＜／＝２０％膜性発現のものと比較して無再発性生存を改善したことが示された（Ｐ＝０.００２）。さらに膜性ＳＦＲＰ−４発現（Ｐ＝０.０４）はグリーソンスコアでモデル化した場合の再発（Ｐ＝０.００６）、病理学的段階（Ｐ＝０.００２）および術前前立腺特異的抗原レベル（Ｐ＝０.００４）の非依存的な再発の予測判断材料であった。加えてインビトロ研究により、対照ＰＣ３空ベクター細胞と比較した場合、ＳＦＲＰ−４でトランスフェクトされたＰＣ３細胞の増殖速度の低下が実証された（Ｐ＜０.０００１）。ＰＣ３−ＳＦＲＰ−４細胞におけるリン酸化グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータのレベル低下により、この表現型が「Ｗｎｔ／ベータカテニン」経路により媒介されることが示唆された。これらのデータにより、ＰＣ細胞増殖に及ぼす阻止効果の結果、ＳＦＲＰ４発現が限局性ＰＣに関する予後診断になり得る可能性があることが示唆される。
【０１６５】
予防的方法
一つの態様では本発明は、対象にＳＦＲＰ−４ポリペプチド発現または少なくとも一つのＳＦＲＰ−４ポリペプチド活性を調整するＳＦＲＰ−４結合剤を投与することにより、対象においてＳＦＲＰ−４発現または活性異常に関連する疾患または症状を予防するための方法を提供する。
【０１６６】
例えば本明細書に記載されるような診断または予後診断アッセイのいずれかまたは組み合わせにより、ＳＦＲＰ−４ポリペプチド発現または活性異常により引き起こされるかまたは寄与される疾患の危険性を有する対象を同定することができる。予防用適用では、ＳＦＲＰ−４結合剤の医薬組成物または医薬品を疾患または症状（すなわち免疫疾患）になりやすいか、またはそうでなければその危険性を有する対象に疾患、その合併症および疾患の発達中を提示する中間的な病理学的表現型の生化学的、組織学的および／または行動性病徴を含む疾患の危険性を排除もしくは低下させる、重篤度を低くする、または発生を遅延させるのに十分な量で投与する。疾患または障害が予防されるか、またはこれに代えてその進行において遅延されるように、予防用ＳＦＲＰ−４結合剤の投与を異常に特徴的な病徴の顕在化の前に行うことができる。異常の型に依存して、例えばＳＦＲＰ−４アゴニストまたはＳＦＲＰ−４アンタゴニストとして作用するＳＦＲＰ−４結合剤を、対象を処置するために使用することができる。本明細書に記載されるスクリーニングアッセイに基づいて適切な化合物を決定することができる。
【０１６７】
治療方法
本発明の別の態様には、治療目的で対象におけるＳＦＲＰ−４ポリペプチド発現または活性を調整する方法が含まれる。本発明の調整方法は、細胞に関連するＳＦＲＰ−４ポリペプチド活性の一つまたはそれより多い活性を調整する本発明のＳＦＲＰ−４結合剤と細胞を接触させることを伴う。治療適用では、組成物または医薬品をかかる疾患の疑いがあるか、または既にそれを患っている対象に、疾患の発達におけるその合併症および中間的な病理学的表現型を含む疾患の病徴（生化学的、組織学的および／もしくは行動性）を治癒させる、または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与する。治療的または予防的処置を達成するのに十分な量は治療的または予防的に有効な用量として定義される。
【０１６８】
ＳＦＲＰ−４ポリペプチド活性を調整する化合物が本明細書にて記載され、そして例えばＳＦＲＰ−４結合剤またはＳＦＲＰ−４結合剤ポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。一つの実施態様では、ＳＦＲＰ−４結合剤は一つまたはそれより多いＳＦＲＰ−４ポリペプチド活性を刺激する。かかる刺激性化合物の実例には、ＳＦＲＰ−４結合剤および細胞に導入されているＳＦＲＰ−４結合剤をコードする核酸分子（すなわちポリヌクレオチド）が挙げられる。別の実施態様では、ＳＦＲＰ−４結合剤は一つまたはそれより多いＳＦＲＰ−４ポリペプチド活性を阻止する。これらの調整方法をインビトロで（例えば細胞をＳＦＲＰ−４結合剤と共に培養することによる）またはこれに代えてインビボで（例えばＳＦＲＰ−４結合剤を対象に投与することによる）実施することができる。そのように本発明は、ＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４ポリペプチドをコードする核酸分子の発現または活性異常を特徴とするＳＦＲＰ−４関連疾患または障害に苦しむ個体を処置する方法を提供する。一つの実施態様では、その方法はＳＦＲＰ−４結合剤（例えば本明細書に記載されるスクリーニングにより同定される化合物）またはＳＦＲＰ−４発現または活性を調整（例えば上方調節または下方調節）するＳＦＲＰ−４結合剤の組み合わせを投与することを伴う。別の実施態様では、その方法はＳＦＲＰ−４発現または活性の低下または異常を補うための治療としてＳＦＲＰ−４結合剤またはＳＦＲＰ−４結合剤をコードする核酸分子を投与することを伴う。ＳＦＲＰ−４ポリペプチドが異常に下方調節されている状況ではＳＦＲＰ−４活性の刺激が望ましい。
【０１６９】
ＳＦＲＰ−４結合剤基盤の治療の生物学的効果の決定
本発明の種々の実施態様では、適当なインビトロまたはインビボアッセイを実施してＳＦＲＰ−４結合剤基盤の治療の効果、およびその投与が対象における罹患組織の処置に適応されるかどうかを決定する。
種々の実施態様では、所定のＳＦＲＰ−４結合剤基盤の治療がその細胞型で望ましい効果を奏するかどうかを決定するために、対象の障害に関与する代表的な型の細胞でインビトロアッセイを実施することができる。治療で使用するためのＳＦＲＰ−４結合剤をヒト対象で試験する前に、限定するものではないがラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ等を含む適当な動物モデル系で試験することができる。同様にインビボ試験のために、ヒト対象への投与の前に当分野において公知のいずれかの動物モデル系を使用することができる。
【０１７０】
処置レジメンおよび有効投薬量
いくつかの組成物は複数の（例えば二つまたはそれを超える）本発明のＳＦＲＰ−４結合剤を含む。いくつかの組成物では、組成物のそのＳＦＲＰ−４結合剤の各々はＳＦＲＰ−４ポリペプチドの区別される、予め選択されたエピトープに結合するモノクローナル抗体またはヒト配列抗体である。
本明細書に記載されるＳＦＲＰ−４関連症状および疾患の処置のための本発明のＳＦＲＰ−４結合剤、例えば抗ＳＦＲＰ−４抗体または抗ＳＦＲＰ−４抗体細胞毒素抱合体の有効用量は、投与の手段、標的部位、対象の生理学的状態、対象がヒトかまたは動物か、投与されるその他の薬物療法および処置が予防用かまたは治療用かを含む多くの様々な因子に依存して異なる。通常、対象がヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含むヒト以外の哺乳動物を処置することもできる。処置投薬量は安全性および有効性を最適にするために用量設定される必要がある。
【０１７１】
典型的には治療的または予防的効果を達成するために十分な本発明の組成物の有効量は約０.０００００１ｍｇ／ｋｇ体重／日から約１００００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲にわたる。好ましくは、投薬量範囲は約０.０００１ｍｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日である。ＳＦＲＰ−４結合剤、例えば抗ＳＦＲＰ−４抗体での投与のためには、投薬量は宿主体重の約０.０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、さらに通常的には０.０１から５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にわたる。例えば投薬量を１ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、または１−１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲内にできる。処置レジメンの実例は２週間毎に１回または月１回または３から６か月毎に１回の投与を必要とする。いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する二つまたはそれより多いＳＦＲＰ−４結合剤を同時に投与し、その場合、投与される各抗体の投薬量は指示された範囲内に入る。ＳＦＲＰ−４結合剤、例えば抗ＳＦＲＰ−４抗体は通常複数回投与される。１回の投薬の間の間隔は毎週、毎月または毎年でよい。間隔は対象における抗体の血中レベルを測定することにより指示されるように不規則でもよい。いくつかの方法では、血漿ＳＦＲＰ−４結合剤、例えば抗ＳＦＲＰ−４抗体濃度が１−１０００μｇ／ｍｌ、そしていくつかの方法では２５−３００μｇ／ｍｌを達成するように投薬量を調整する。これに代えてＳＦＲＰ−４結合剤、例えば抗ＳＦＲＰ−４抗体を徐放処方として投与することができ、その場合、要求される投与の頻度は少ない。投薬量および頻度は対象におけるＳＦＲＰ−４結合剤の半減期に依存して異なる。一般にヒト抗ＳＦＲＰ−４抗体は最も長い半減期を示し、ヒト化抗ＳＦＲＰ−４抗体、キメラ抗ＳＦＲＰ−４抗体および非ヒト抗ＳＦＲＰ−４抗体がこれに続く。投与の投薬量および頻度は、処置が治療的かまたは予防的かに依存して異なり得る。予防的適用では、相対的に低投薬量が相対的に低頻度の間隔で長期間にわたって投与される。一生処置を受け続ける対象もいる。治療的適用では、時に疾患の進行が低下または終止するまで、そして好ましくは対象が疾患の病徴の部分的または完全な寛解を示すまで、相対的に高投薬量が相対的に短い間隔で必要とされる。その後、患者に予防用レジメンを投与することができる。ＳＦＲＰ−４免疫原をコードする核酸に関する用量は対象あたりＤＮＡ約１０ｎｇから１ｇ、１００ｎｇから１００ｍｇ、１μｇから１０ｍｇ、または３０−３００μｇ  の範囲にわたる。感染性ウイルスベクターに関する用量は用量あたりビリオン１０−１００、またはそれを超えて異なる。
【０１７２】
毒性
好ましくは、本明細書に記載されるＳＦＲＰ−４結合剤の有効用量は実質的な毒性を対象に引き起こすことなく治療上の有益性を提供する。本明細書に記載されるＳＦＲＰ−４結合剤の毒性を標準的な医薬的手順により細胞培養または実験動物において、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）またはＬＤ１００（集団の１００％に致死的な用量）を決定することにより決定することができる。毒性と治療的効果の間の用量比は治療インデックスである。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトにおける使用のために無毒性である投薬量範囲を処方するのに用いることができる。本明細書に記載されるＳＦＲＰ−４結合剤の投薬量は、好ましくは毒性がほとんどないか、または全くない有効用量を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量はこの範囲内で、用いる投薬形態および利用する投与経路に依存して異なり得る。個々の医師が対象の症状に鑑みて、正確な処方、投与経路および投薬量を選択することができる。例えばFingl et al., In：The Pharmacological Basis of Therapeutics（１９７５）第１章を参照のこと。
【０１７３】
キット
本発明のＦＲＰ−４結合剤組成物（例えば抗体細胞毒素抱合体、モノクローナル抗体、ヒト配列抗体、ヒト抗体、多特異的および二特異的分子）および使用のための説明書を含むキットもまた本発明の範囲内である。キットは生物学的試料中のＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドの存在を検出するために有用である。例えばキットは：生物学的試料中のＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドを検出できる標識されたＳＦＲＰ−４結合剤；試料中のＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドの量を決定するための手段；および試料中のＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドの量を標準と比較するための手段；を含むことができる。その化合物または化合物を適当な容器内に包装することができる。キットはさらにＳＦＲＰ−４ポリペプチドまたはＳＦＲＰ−４様ポリペプチドを検出するためにキットを使用するための説明書を含むことができる。
【０１７４】
以下の実施例は本発明の好ましい実施態様をさらに十分に説明するために提示される。この実施例は、添付の請求の範囲のように本発明の範囲を限定するとは決して解釈されるべきではない。
【０１７５】
実施例
実施例１
抗ＳＦＲＰ−４抗体調製
ＳＦＲＰ−４ポリペプチド抗原のクローニング
全長ヒトＳＦＲＰ−４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを入手した（OriGene Rockville, MD；１０ＫセレクションＢ０６１−Ｂ０６４  Ｏ０９  ｇｉ｜８４００７３３｜ｒｅｆ｜ＮＭ  ００３０１４.２）。Hoffmann−La Roche Inc.（Nutley, NJ；製品番号１７３２６５０）のハイフィデリティーＤＮＡポリメラーゼを用いて停止コドンのないオープン・リーディグ・フレームを６５℃で増幅した。以下のプライマーを用いてヒトＳＦＲＰ−４ポリペプチドをコードする核酸を増幅した：センスプライマー５’ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＴＧＴＴＣＣＴＣＴＣＣＡＴＣＣ３’（配列番号：１１）；アンチセンスプライマー５’ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＣＡＣＴＣＴＴＴＴＣＧＧＧＴＴＴＧＴＴＣＴＣ３’（配列番号：１２）。単位複製配列をゲル精製し（Qiagen Inc., Valencia, CA；製品番号２８７０４）、そして製造者の説明書に従ってｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯにライゲートした（Invitrogen, Carlsbad, CA；製品番号４５−０００８）。配列フィデリティーをSolvias AG（Basel, Switzerland）により確認した。ＴＯＰＯ構築物を宿主株大腸菌Ｔｏｐ１０（Invitrogen, Carlsbad, CA；製品番号４４−０３０１）において増幅した。インサートをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで切断し、精製し、そしてＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Roche Pharmaceuticals, Inc., Nutley, NJ；製品番号４８１２２０）を用いてｐＲＳ５ａ（起源：Novartis）にライゲートした。ｐＲＳ５ａ構築物を「ｐＳＦＲＰ４ｆｕｌｌＨｉｓ」（PlasNova entry no.：ＮＰＬ００６８１５）と称した。ｐＳＦＲＰ４ｆｕｌｌＨｉｓ構築物は天然Ｋｏｚａｃおよびリーダー配列をコードし、完全コード化配列（ＣＤＳ）およびＨｉｓタグはヒトＳＦＲＰ−４ポリペプチドの最後のアミノ酸に直接結合した。国立バイオテクノロジー情報センターのＢＬＡＳＴネットワークサービスを用いてＤＮＡおよびアミノ酸配列を分析した。
ＳＦＲＰ−４抗原のトランスフェクションおよび発現
ＨＥＫ２９３  Ｅｂｎａ細胞を標準的な成長条件下で６ウェルクラスター（１０６細胞／ウェル）に播種し、そして一晩インキュベートし；Lipofectamine２０００を用いて製造者の説明書に従って（Invitrogen, Carlsbad, CA；製品番号１１６６８−０２７）９５％コンフルエンスで各ウェルの細胞を２μｇのｐＳＦＲＰ４ｆｕｌｌＨｉｓまたはｐＲＳ５ａ対照でトランスフェクトした。各ウェルは培地２.５ｍｌを含有した。一過性の生成のために、細胞を４８時間後にＦＣＳ不含ＤＭＥＭ（Invitrogen−Gibco, Carlsbad, CA；製品番号３１９６６−０２１）に移した。培養上澄を７２時間毎に試料採取し、そしてウェスタンブロットによりＨｉｓタグ化組換えＳＦＲＰ−４に関して分析した。ＨＲＰ標識された抗Ｈｉｓタグ抗体（Quiagen、番号３４４６０）および化学発光基質（chemoluminogenic substrate）（Roche、番号２０１５１９６）を用いて製造者の説明書に従ってタンパク質を検出した。安定した細胞系を選択するために、細胞を４８時間後に１０％（容量／容量）ＦＣＳおよび２５０μｇ／ｍｌゼオシン含有ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）に移した。前記で記載されたように組換えＳＦＲＰ−４生成物を分析した。β−ガラクトシダーゼをコードするｐＲＫ−ＬａｃＺ−１（Novartis Pharma AG）で対照トランスフェクションを実施した。４８時間後に発色基質（colourigenic substrate）（Stratagene, La Jolla, Calif.；製品番号２００３８４−２）で染色することにより酵素活性を細胞レベルで可視化した。
【０１７６】
ＳＦＲＰ−４生成
Ｈｅｋ２９３Ｅｂｎａ細胞をｐＲＫ−ＬａｃＺ−１、ｐＲＳ５ａまたはｐＳＦＲＰ４ｆｕｌｌＨｉｓでトランスフェクトした。トランスフェクション効率はｐＲＫ−ＬａｃＺ−１対照のインサイチュβ−ガラクトシダーゼ染色により推測されるようにおよそ６０％であった。ｐＳＦＲＰ４ｆｕｌｌＨｉｓでトランスフェクトされた細胞は成長挙動の変化を示した。それらは凝集体を形成し、そしてＦＣＳ不含培地へ移した後７２時間から死滅した。８−１０週の選択の後、安定した細胞系が数個のみ得られた。対照的にベクター単独を含有する対照は正常な成長挙動を示した。
【０１７７】
ＦＣＳ不含培養上澄のウェスタンブロット分析により、組換えＳＦＲＰ−４がうまく生成され、そしてトランスフェクト細胞により分泌されたことが示された。５５ｋＤでバンドが観察され、それはグリコシル化タンパク質の分子量に相当した。（図１、パネルＡ、４８時間レーン；図１、パネルＢ、レーン１もまた参照）７２時間以降の時点でＳＦＲＰ−４ポリペプチド生成レベルは低下し、そして５５から４０ｋＤａの大きさの範囲にわたってタンパク質がスメアとして検出された（図１、パネルＡ、１４４時間レーン）。
【０１７８】
ＰＮＧａｓｅ  ＦでのＳＦＲＰ−４の脱グリコシル化
低分子量フラグメントの形成が部分的グリコシル化によるのか、またはタンパク質溶解によるのかを調べるために、ＳＦＲＰ−４生成細胞培養のＦＣＳ不含培養上澄を４８時間および１４４時間に試料採取した。製造者の指示書に従って４８時間上澄をペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）（New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts、製品番号Ｐ０７０４Ｌ）で処理した（図１参照）。脱グリコシル化実験では、４８時間に抜いた試料をＰＮＧａｓｅ  Ｆで処理した（図１、パネルＢ、レーン１から３）。ペプチド：ＰＮＧａｓｅ  Ｆとしても公知のＮ−グリコシダーゼＦは、Ｎ連結糖タンパク質からの高マンノース、ハイブリッドおよび複合オリゴ糖の一番奥のＧｌｃＮＡｃとアスパラギン残基の間を切断するアミダーゼである（Maley et al., Anal. Biochem., １８０, １９５−２０４（１９８９））。ＳＦＲＰ−４含有培養上澄のＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理は５５ｋＤａバンドおよびＳＦＲＰ−４免疫反応性ポリペプチドを、４０ｋＤａの区別されるバンドとして移動するペプチドに変換した（図１、パネルＢ、レーン１およびレーン２対レーン３）。この実験により、時間をかけて生じるフラグメント形成が部分的グリコシル化によるものであり、そしてタンパク質分解によるものではないことが示された。
【０１７９】
観察された分泌型ＳＦＲＰ−４の部分的グリコシル化により細胞生理不全が反映され得るというのが仮説であった。安定した細胞系はＳＦＲＰ−４を少ししか生成しなかった。したがってＥＬＩＳＡ開発のための材料は一過性の系で生成された。ここでＳＦＲＰ−４は７２時間トランスフェクトされたＨｅｋ２９３  Ｅｂｎａ細胞により生成された。抗生物質による選択圧は使用しなかった。培養上澄２００ｍｌから完全にグリコシル化された未変性ＳＦＲＰ−４ポリペプチドの全収量５０μｇが得られた。
【０１８０】
ＳＦＲＰ−４ポリペプチド抗原の精製および定量
７２時間培養後、ＳＦＲＰ−４生成細胞の培養上澄をＦＣＳ不含培地に収集した。２００ｍｌ上澄から組換えＳＦＲＰ−４を１.２５ｍｌ  Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Sigma−Aldrich, USA；製品番号Ｈ８２８６）により精製した。１０ｍＭイミダゾール含有リン酸塩バッファー（ｐＨ８）でカラムを平衡にした。シリンジで流速およそ２ｍｌ／分で培養上澄を適用した。組換えＳＦＲＰ−４を２５０ｍＭイミダゾール含有リン酸塩バッファー（ｐＨ８）で溶離した。０.５ｍｌ  Microcon  ＹＭ−３０（Millipore Corporation, Bedford, MA；製品番号４２４０９）を用いて溶離液を３００μｌまで濃縮した。
【０１８１】
ＢＣＡ法（Pierce Chemical Co., Rockford, IL、製品番号２３２３５）でタンパク質濃度を決定した。タンパク質の純度をＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％Bis−Trisゲル（Invitrogen, Carlsbad, CA, 製品番号ＮＰ０３２３ＢＯＸ）で１０％ベータ−メルカプトエタノール含有Laemmliサンプルバッファー（Bio−Rad, Hercules, CA, 製品番号１６１−０７３７）、ＮｕＰＡＧＥランニングバッファー（Bio−Rad, Carlsbad, CA；製品番号ＮＰ０００２）およびクーマシー・ブリリアント・ブルーＲ−２５０（BioRad Laboratories, Hercules, CA、製品番号１６１−０４３６）を用いて決定した。ＮｕＰＡＧＥ電気泳動系（Invitrogen, Carlsbad, CA）でゲルを流した。
【０１８２】
ポリクローナル抗体作成のためのＳＦＲＰ−４ペプチド調製
ＳＦＲＰ−４のアミノ酸配列をBiobench２（Novartis）および国立バイオテクノロジー情報センターのＢＬＡＳＴネットワークサービスを用いて分析した。アミノ酸残基２９２−３０５およびアミノ酸３０５−３１９に相当するヒトＳＦＲＰ−４の二つのペプチドは、その潜在的抗原性、疎水性、表面確率、グリコシル化可能性および特異性に基づいて選択された免疫原であった。選ばれたペプチドはヒトおよびカニクイザル（Macaca fascicularis）ＳＦＲＰ−４で同一であった。
【０１８３】
ペプチド合成およびカップリング
選択されたペプチドＨ２ＮＱＥＱＲＲＴＶＱＤＫＫＫＴＡＣ−ＣＯＮＨ２（ＥＰ０４０７５６とも称される；配列番号：８）およびＨ２Ｎ−ＡＧＲＴＳＲＳＮＰＰＫＰＫＧＫＣ−ＣＯＮＨ２（ＥＰ０４０７５５とも称される；配列番号：７）を合成し、そしてEurogentec GmbH（Liege, Belgium）でキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または卵白アルブミン（ＯＶＡ）に抱合させた。
【０１８４】
抗体作成
２匹のニュージーランドシロウサギ（Eurogentec, Liege, Belgium）ＳＺ２０６７およびＳＺ２０６８を各々２００μｇ／ｍｌ  ＫＬＨ抱合ＥＰ０４０７５５およびＥＰ０４０７５６の混合物で０、１４、２８、５６日に免疫した。免疫血清を８７日に収集した。各ペプチドに関して８７日からの免疫血清１０ｍｌ（各ウサギから５ｍｌ）を樹脂カラムでアフィニティー精製した（Eurogentec GmbH, Liege, Belgium）。
【０１８５】
カラム調製および抗体精製（Eurogentec, Liege, Belgium）
標準的な手順に従って、システインを介して各遊離ペプチド（ＥＰ０４０７５５またはＥＰ０４０７５６）５ｍｇをＡＦ−アミノTOYOPEARL  ６５０Ｍ（Tosoh）に抱合させることにより、各ペプチドに関して小型アフィニティーカラム（樹脂１ｍｌ）を調製した。抗血清１０ｍｌにＮａＣｌ  ０.２ｇを添加した。使用前にアフィニティーカラムを１００ｍＭグリシン（ｐＨ２.５）５ｍｌで２回、続いて２０ｇ／ｌ  ＮａＣｌを補充したＰＢＳ５ｍｌで３回洗浄した。血清をカラムに適用し、そしてフロースルーを回収した。これを５回繰り返した。カラムを２０ｇ／ｌ  ＮａＣｌを補充したＰＢＳ５ｍｌで３回洗浄し、そして１００ｍＭグリシン（ｐＨ２.５）１ｍｌで溶離した。１Ｍトリスバッファー（ｐＨ８.５）１００μｌを含有する管に抗体を回収した。溶離液をＰＢＳ５ｌに対して各々４時間で２回透析した。ＢＳＡを１％まで、およびアジ化ナトリウムを最終濃度０.１％まで添加した。
【０１８６】
抗体生成の検出
標準的な方法を用いて抗ＳＦＲＰ−４抗体生成を直接ＥＬＩＳＡにより分析した。簡単にはＯＶＡ抱合ペプチドＥＰ０４０７５５およびＥＰ０４０７５６をMaxisorb（商標）（Nunc）上に１μｇ／ｍｌの濃度で別個にコーティングした。プレートを洗浄し、そしてSuperblock（商標）（Pierce）遮断培地で遮断した。血清試料およびアフィニティー精製抗体を種々の希釈で添加し、そして室温で３時間インキュベートした。結合したウサギ抗体をＨＲＰ抱合ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃ抗体（Jackson ImmunoResearch, West Grove, Penn.；製品番号１１１−０３５−０４６）および発色基質（colourigenic substrate）（Roche Diagnostics（Roche Molecular Systems, Inc. とも称される）, Almeda, Calif.；製品番号１４８４２８１）により検出した。シグナル強度をMolecular Devices Thermomaxマイクロプレートリーダーで検出し、そしてデータをSoftmax Pro ３.１を用いて分析した。
【０１８７】
抗体特徴付け
標準的な方法を用いて抗体の品質を直接ＥＬＩＳＡにより分析した。組換えＳＦＲＰ−４をMaxisorb（商標）（Nunc）上に０−３００ｎｇ／ｍｌの濃度でコーティングした。プレートを洗浄し、そしてSuperblock（商標）（Pierce）遮断培地で遮断した。血清試料およびアフィニティー精製抗体を種々の希釈で添加し、そして室温で３時間インキュベートした。結合したウサギ抗体をＨＲＰ抱合ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃ抗体（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA.；製品番号１１１−０３５−０４６）および発色基質（colourigenic substrate）（Roche Diagnostics（Roche Molecular Systems, Inc.とも称される）, Almeda, Calif.；製品番号１４８４２８１）により検出した。シグナル強度をMolecular Devices Thermomaxマイクロプレートリーダーで検出し、そしてデータをSoftmax Pro ３.１を用いて分析した。
【０１８８】
加えて抗ＥＰ０４０７５５をウェスタンブロット（ＷＢ）により、検出用にＨＲＰ抱合ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃ抗体（Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania；製品番号１１１−０３５−０４６）および発色基質（colourigenic substrate）（Hoffmann−La Roche Inc., Nutley, New Jersey；製品番号２０１５１９６）を用いて評価した。
【０１８９】
ポリクローナル抗体作成
直接ＥＬＩＳＡで各々のＯＶＡカップリングされたペプチドを検出するためのウサギ抗血清およびアフィニティー精製抗ＥＰ０４０７５５および抗ＥＰ０４０７５６の能力を免疫前血清と比較した。双方のウサギの抗血清は抗原および組換えＳＦＲＰ−４ポリペプチドの双方を検出した。アフィニティー精製抗体はその各々の抗原を検出した。しかしながら、精製されたＥＰ０４０７５５のみは組換えＳＦＲＰ−４ポリペプチドをも検出した。ヒトにおける５.５−８０ｎｇ／ｍｌ  ＳＦＲＰ−４ポリペプチドの公知の血清／血漿濃度に基づいて、この抗体はサル血漿においてＳＦＲＰ−４を測定するのに十分な感受性であると考えられた。アフィニティー精製抗ＥＰ０４０７５５を使用してサル血漿における抗ＳＦＲＰ−４  ＥＬＩＳＡを設定した。ウェスタンブロット分析では、抗ＥＰ０４０７５５を用いるＳＦＲＰ−４の検出限界は７５ｎｇ絶対量であった。
【０１９０】
結論
未変性組換えＳＦＲＰ−４およびＳＦＲＰ−４特異的ポリクローナル抗体を作成した。以下の実施例ＩＩに詳記するように、その材料を用いてＡＦＩ０３０研究（ＢＭＤ  Ｒ０２５０７３６−０４）のカニクイザル血漿試料を測定するためのＥＬＩＳＡを設定することに成功した。
【０１９１】
実施例ＩＩ
生物学的試料中の免疫反応性ＳＦＲＰ−４の定量に有用なＳＦＲＰ−４の定量化のためのＳＦＲＰ−４  ＥＬＩＳＡの開発
本研究の目的は生物学的試料中のＳＦＲＰ−４免疫反応性ポリペプチドを検出するのに有用なＳＦＲＰ−４  ＥＬＩＳＡアッセイを構築することであった。具体的には、ＳＦＲＰ−４  ＥＬＩＳＡアッセイを開発し、そしてそれを使用して雌卵巣切除カニクイザル（Macaca fascicularis）の血清中のＳＦＲＰ−４免疫反応性ポリペプチドを４週間にわたって検出した。
【０１９２】
ＥＬＩＳＡによる血漿中のＳＦＲＰ−４の定量
特異的サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いてＳＦＲＰ−４を決定した。ＳＦＲＰ−４に関するサンドイッチＥＬＩＳＡはこのタンパク質に関する二つの特異的ポリクローナル抗体、前記実施例Ｉで詳記したようなＳＦＲＰ−４ペプチドＥＰ０４０７５５に対するアフィニティー精製ウサギ抗体、およびR&D Systems（カタログ番号Ａ１８２７）のヤギ抗ＳＦＲＰ−４抗体を利用した。公知の濃度のＳＦＲＰ−４ポリペプチドを含有する較正基準を各マイクロプレートで実行した。未知試料の濃度が検量線から得られた（図２参照）。試薬およびアッセイパラメーターを以下の表５から７で詳記する。
【０１９３】
【表５】
2009526020.tif 000006
【０１９４】
試料調製
試験期間の開始時（１日）および剖検直前（２９日または３０日）に各雌卵巣切除カニクイザルから血液を採取した。各被験試料から血漿を入手し、そして用時まで凍結した。ＳＦＲＰ−４  ＥＬＩＳＡアッセイの日に凍結血漿試料（ヘパリン含有管）を室温で解凍した。全試料を未希釈で分析した。較正基準および未知のものを２検体ずつで実行し、そして各値に関して算術平均を計算した。
【０１９５】
アッセイ手順
各インキュベーション工程の後、マイクロタイタープレートを洗浄バッファーで自動的に３サイクル洗浄する（表６参照）。
【０１９６】
【表６】
2009526020.tif 000007
【０１９７】
ＳＦＲＰ−４  ＥＬＩＳＡ検量線
全標準に関する精度を検査し、そして我々の許容基準に適合した（表７参照）。
【０１９８】
【表７】
2009526020.tif 000008
【０１９９】
全標準に関する精度が我々の許容基準に適合することを確認した。
結果の要旨
１５.７ｎｇ／ｍｌの感受性を有するサンドイッチＥＬＩＳＡを開発して、未希釈カニクイザル血漿中のＳＦＲＰ−４を決定した。全動物の血漿中のＳＦＲＰ−４を検出した（表８参照）。
【０２００】
【表８】
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【０２０１】
カニクイザル血漿中のＳＦＲＰ−４を定量するためのサンドイッチＥＬＩＳＡの開発に成功した。参照タンパク質および抗ＳＦＲＰ−４抗体は以前に社内で開発されている（ＢＭＤ  Ｒ０２５０７３６−０３；一般的には実施例Ｉ参照）。アッセイは生物学的試料、例えば血漿中のＳＦＲＰ−４免疫反応性ポリペプチド分析に適用されるのに十分感受性であった。
【０２０２】
実施例ＩＩＩ
ハイスループットウェスタンブロット分析による選択された組織におけるＳＦＲＰ−４免疫反応性タンパク質の定量
ハイスループットウェスタンブロット
ハイスループットウェスタンブロット−３１ Human Adult Normal Tissues（カタログ番号Ｗ８２３４４８０−Ｂ）を製造者の説明書に従って実施した（BioCAT GmbH, Heidelberg, Germany）。一次抗体として２μｇ／ｍｌアフィニティー精製ウサギ抗ＳＦＲＰ４  ＥＰ０４０７５５（実施例Ｉ参照）を使用した。抗体検出として２０ｎｇ／ｍｌヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ（Pierceカタログ番号３４０７５）を使用した。図３参照。
【０２０３】
３１個の異なる個体のヒト組織でのハイスループットウェスタンブロットにより、心臓で最高レベルのＳＦＲＰ−４タンパク質が示された。これは心筋梗塞、ミオパシーまたは冠動脈心疾患のための疾患バイオマーカー（診断、予後診断、病期分類、薬物効果）としてＳＦＲＰ−４の検出に有用である。
ハイスループットウェスタンブロットにより結腸、直腸、十二指腸で高レベルのＳＦＲＰ−４が、そして回腸、空腸、食道では少ないが依然平均発現を超えて示された。これは結腸直腸癌および消化管のその他の癌のための疾患バイオマーカー（診断、予後診断、病期分類、薬物効果）として、ならびに消化管の炎症性疾患の悪性度に関するマーカーとしてＳＦＲＰ−４の検出に有用である。
【０２０４】
ハイスループットウェスタンブロットにより脾臓および膵臓で平均レベルを超えるＳＦＲＰ−４が示された。これは脾臓または膵臓癌のための疾患バイオマーカー（診断、予後診断、病期分類、および薬物効果）としてＳＦＲＰ−４の検出に有用である。
ハイスループットウェスタンブロットにより子宮で平均レベルを超えるＳＦＲＰ−４が示された。これは子宮癌のための疾患バイオマーカー（診断、予後診断、病期分類、および薬物効果）としてＳＦＲＰ−４の検出に有用である。
ハイスループットウェスタンブロットにより脳で平均レベルを超えるＳＦＲＰ−４が示された。これは神経変性疾患（例えばハンチントン、ＡＬＳ、アルツハイマー病、ＭＳ、パーキンソン、末梢脱髄性疾患）および脳腫瘍のための疾患バイオマーカー（診断、予後診断、病期分類、および薬物効果）としてＳＦＲＰ−４の検出に有用である。
【０２０５】
均等
本発明は本出願で記載される特定の実施態様の用語に限定されるべきではなく、それは本発明の個々の態様の単なる説明として意図される。当業者に明白であるように、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の多くの修飾および変更を行うことができる。本明細書に列挙されるものに加えて、前記の記載から発明の範囲内の機能的に均等な方法および装置が当業者には明白であろう。かかる修飾および変更は添付の請求の範囲内に入ると意図される。本発明は、かかる請求の範囲が権利付与する均等物の全範囲と共に添付の請求の範囲の用語によってのみ限定される。本発明は特定の方法、試薬、化合物、組成物または生物学的系に限定されず、それはもちろん変化し得ると理解されるべきである。また本明細書で使用される専門用語は特定の実施態様を記載する目的のためだけのものであり、そして限定を意図するものではないこともまた理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２０６】
【図１】Ｈｉｓタグ化ＳＦＲＰ−４ポリペプチドのウェスタンブロット分析を示す。パネルＡは培養の４８時間（左レーン）および１４４時間（右レーン）後の培養上澄１０μｌにおいて検出される免疫反応性Ｈｉｓタグ化ＳＦＲＰ−４ポリペプチドを示す。パネルＢはＨｉｓタグ化ＳＦＲＰ−４含有培養上澄（４８時間試料）の脱グリコシル処理の効果を示す。レーン１：Ｈｉｓタグ化ＳＦＲＰ−４含有培養上澄（４８時間試料）において観察されたＳＦＲＰ−４免疫反応性タンパク質；レーン２：ｍｏｃｋ処理Ｈｉｓタグ化ＳＦＲＰ−４含有培養上澄（４８時間試料）において観察されたＳＦＲＰ−４免疫反応性タンパク質；レーン３：ＰＮＧａｓｅ処理Ｈｉｓタグ化ＳＦＲＰ−４含有培養上澄（４８時間試料）において観察されたＳＦＲＰ−４免疫反応性タンパク質。
【図２】ＳＦＲＰ−４  ＥＬＩＳＡ標準曲線を示すグラフである。
【図３】組織におけるスポットの大きさを示すチャートを伴うハイスループットウェスタンブロットの写真である。検定された組織は以下のとおりである：１、胎盤；２、空レーン；３、脂肪；４、膀胱；５、脳；６、乳房；７、小脳；８、頸部；９、結腸；１０、横隔膜；１１、十二指腸；１２、食道；１３、胆嚢；１４、心臓；１５、回腸；１６、空腸；１７、腎臓；１８、肝臓；１９、肺；２０、卵巣；２１、膵臓；２２、胎盤；２３、直腸；２４、骨格筋；２５、皮膚；２６、脾臓；２７、胃；２８、精巣；２９、胸腺；３０、甲状腺；３１、扁桃腺；３２、子宮。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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