(57)【要約】  不活動性ＴＢ症例を活動性ＴＢ症例から識別できる血清抗体アッセイは、少なくとも３種のヒト結核菌タンパク質抗原の組合せを含み、その少なくとも１種は陽性反応が不活動性ＴＢおよび抗原に一致し、その少なくとも１種は陰性反応が不活動性ＴＢに一致する。好ましいアッセイはさらに他のＴＢ類も識別する。また、このようなアッセイを実施するための抗原キット。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活動性結核を不活動性結核から識別できる、ヒト血清試料中の結核についてのアッセイであって、血清認識が不活動性結核と一致するが活動性結核とは一致しない第１型の少なくとも１種の抗原と、血清認識が活動性結核と一致するが不活動性結核とは一致しない第２型の少なくとも１種の抗原と、第１型および第２型からなる群から選択される少なくとも１種の追加の抗原とを含む、少なくとも３種のヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）タンパク質抗原に試料中の抗体を曝露することと、前記抗原に対する血清抗体を検出することとを含み、第１型のすべての抗原が血清を認識し、第２型のどの抗原もが血清を認識しない組合せが、試料が活動性ＴＢよりも不活動性ＴＢである可能性が高いことの指標であるアッセイ。
【請求項２】
１６ｋＤａ抗原（遺伝子ｒｖ２０３１ｃの産物）およびＥＳＡＴ−６抗原（遺伝子ｒｖ３８７５の産物）からなる群から選択される前記第１型の少なくとも１種の抗原を含む、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
Ｒｖ２６２６ｃ抗原、ＡｌａＤＨ抗原（遺伝子ｒｖ２７８０の産物）および３８ｋＤａ抗原（遺伝子ｒｖ０９３４の産物）からなる群から選択される前記第２型の少なくとも１種の抗原を含む、請求項１または２に記載のアッセイ。
【請求項４】
前記第１型の少なくとも２種の抗原、および前記第２型の少なくとも２種の抗原を含む、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項５】
血清認識が不活動性結核および活動性ＴＢと一致するが、潜伏結核または非感染の試料とは一致しない、第３型の少なくとも３種の抗原を含み、前記第３型の前記少なくとも３種の抗原による強いシグナルが、試料が潜伏結核または非感染の試料よりも活動性または不活動性結核である可能性が高いことの指標である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項６】
前記第３型の少なくとも１種の抗原が、前記第１型の抗原でもある、請求項５に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記第３型の前記抗原が、１６ｋＤａ抗原、ＥＳＡＴ−６抗原およびＦｄｘＡ抗原（遺伝子ｒｖ２００７ｃの産物）からなる群から選択される少なくとも１種の抗原を含む、請求項５または６に記載のアッセイ。
【請求項８】
前記アッセイに使用される抗原と、前記抗原に対する抗体の結合を検出するための試薬とを含む、請求項１乃至７のいずれか１項に記載のアッセイに使用するための試薬キット。
【請求項９】
各抗原が、表面上の異なる場所に固定される、請求項８に記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））についてのアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
結核（ＴＢ）疾患の診断は伝統的に、臨床的、細菌学的およびＸ線像による証拠の組合せ、典型的には、培養およびスミア試験、ツベルクリン反応検査（ＴＳＴ）ならびに胸部Ｘ線の組合せを含む。
【０００３】
ヒト結核菌により発現されるいくつかのタンパク質に特異的な抗体は、ヒトの血清中に検出できる。抗体アッセイは、迅速かつ比較的安価であり、したがって潜在的に有益な診断技術およびスクリーニング技術である。ＴＢに関するいくつかの診断的区分がある:活動性疾患、不活動性（既往の）ＴＢ、ならびに胸部Ｘ線異常がないことを特徴とする２種の区分として潜伏感染および非感染。活動性ＴＢの検出は当然ながら臨床的に重要である。不活動性ＴＢの人は、潜伏ＴＢを有する人よりも活動性ＴＢを発病する可能性が一桁以上高いので、不活動性ＴＢの検出は臨床的に意義がある。感染源（ＴＢにより最も深刻な影響を受けた地方に非常に限定される場合が多く、そこでは危険性が最も高い）を集中させることが可能となるため、活動性ＴＢを不活動性ＴＢから識別することは、公衆衛生の立場から意義がある。不活動性ＴＢを、胸部Ｘ線が正常であることを特徴とする状態から識別することは、公衆衛生の立場から同様に重要である。
【非特許文献１】Am. J. Respir. Crit. Care Med. (2000年4月) 164巻 (4 pt 2): S221〜47頁
【特許文献１】米国再発行特許第３，６５４，０９０号
【特許文献２】米国再発行特許第３，７９１，９３２号
【特許文献３】米国再発行特許第３，８５０，７５２号
【特許文献４】米国再発行特許第３，８３９，１５３号
【特許文献５】米国再発行特許第３，８７９，２６２号
【非特許文献２】Havlir, D. V. ら (1991) Infect. Immun. 59、665〜670頁
【非特許文献３】Lodes, M. J.ら (2001) J Clin Microbiol 39、2485〜2493頁
【非特許文献４】Bothamley (2003) Lancet 361、2082頁
【非特許文献５】Bothamley,G. H. (2004) Clin Diagn Lab Immunol 11、942〜951頁
【非特許文献６】Singh, K. K.ら (2005) Clin Diagn Lab Immunol 12、354〜358頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＴＢの状態を診断するために血清抗体の検出を利用する試みは、結合がＴＢの特定の状態と明確に相関する１種または複数の抗原、例えばＥＬＩＳＡの結果が陽正であることが活動性ＴＢを示唆する抗原を見出すことに集中している。抗体血清検査によるＴＢの状態の診断は正確さに欠けるという弱点がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一態様は、ＴＢの状態を正確に予測する、特に活動性ＴＢと不活動性ＴＢとを区別する能力が改善された、ヒト血清抗体の検出のためのアッセイである。
本発明の別の態様は、そのような抗体アッセイのための抗原としてのヒト結核菌タンパク質を含む試薬キットである。
【０００６】
ＴＢの状態は５つの公認クラスを含む。クラス１（クラス０〜１と命名されることもある）は感染がないことを示す。本出願において、本出願人らはこの状態を「非感染」と言う。クラス２は潜伏感染である。前述の２つのクラスは両方とも胸部Ｘ線異常がないことを特徴とし、この状態を本出願人は時として「胸部Ｘ線正常」または略して「ＣＸＲ正常」と称する。クラス３は活動性ＴＢである。クラス４は不活動性ＴＢである。クラス５はＴＢの疑いがある、診断未決である。この５つのクラス系は、米国胸部疾患協会（ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）の役員会により、「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｌａｔｅｎｔ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」と題した米国疾病管理センター（ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）（ＣＤＣ）との共同声明において、１９９９年７月に採択された。該クラスは米国感染症学会（ｔｈｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）の協議会により承認された。Am. J. Respir. Crit. Care Med. (2000年4月) 164巻 (4 pt 2): S221〜47頁を参照されたい。クラス４の不活動性ＴＢは、「臨床的には活動性ではない結核である。このクラスは、ツベルクリン反応試験に対して陽性反応があり、細菌学的調査（行った場合）が陰性であり、現疾患の臨床的および／またはＸ線像による証拠がない個人において、以前の結核症状の発現履歴または異常であるが安定しているＸ線検査結果により定義される。クラス４の人は、化学療法を受けたことはない可能性があり、潜伏感染のための治療を受けている可能性があり、または以前に処方された化学療法のコースを完了している可能性がある。」のように定義される。
【０００７】
本発明は、公知の単独抗体アッセイと比較して、不活動性ＴＢを活動性ＴＢから、ならびに好ましくは、さらに潜伏ＴＢおよび非感染の区分から識別する能力が改善された、ＴＢのためのヒト血清抗体アッセイである。本発明によるアッセイは周知の抗原抗体反応に基づき、これを利用している。サンドイッチアッセイまたは競合的アッセイといったプロトコルの型は重要ではない。本出願人は、第１試薬として固定化された抗原、および第２試薬として第１試薬により固定化された抗体に結合する標識した抗体を含むサンドイッチ形式である、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ））を利用する。しかし、血清抗体の検出のための他の形式も使用できる。例えば、米国再発行特許第３，６５４，０９０号、３，７９１，９３２号、３，８５０，７５２号、３，８３９，１５３号、および３，８７９，２６２号を参照されたい。
【０００８】
本発明のアッセイは、ヒト結核菌のタンパク質を試薬として、血清抗体を固定化するための抗原の第１試薬または抗原標識試薬のどちらかとして、あるいは両方として利用する。本発明のアッセイは、少なくとも３種の抗原の使用、および少なくとも２つの型の抗原、第１にその存在が活動性ＴＢに対する不活動性ＴＢの指標である抗体に特異的な少なくとも１種の抗原と、第２にその不存在が活動性ＴＢに対する不活動性ＴＢの指標である抗体に特異的な少なくとも１種の抗原とを含有することを特徴とする。本出願人の好ましいサンドイッチアッセイに利用する場合、第２型の１種または複数の抗原からの陰性反応（つまり、陽性反応の不存在）と合わさった第１型の１種または複数の抗原からの陽性反応は、活動性ＴＢから区別される不活動性ＴＢを示す。特定の好ましいアッセイは、その陽性反応が、潜伏ＴＢまたは非感染から区別される活動性ＴＢまたは不活動性ＴＢ、あるいは両方の指標である、第３型の、１種または複数の抗原を含む。第１型の抗原は場合によっては第３型の抗原であるが、第３型の抗原は第１型の抗原である必要がある。同様に、第２型の抗原は場合によっては第３型の抗原であってよい。
【０００９】
本発明に従ったアッセイは、別個の場所または容器、例えばカードまたはスティック表面上の別個のスポットあるいはマイクロタイタープレートの別個のウェルにおいて別個の反応を実施することを含む。このような形式において、１種または複数のどの抗原が陽性反応、即ち発色を引き起こすかを示すことができるので、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの発色標識の使用が可能である。本発明に従ったアッセイは、抗原第１試薬を特定可能なアレイ表面の別個の場所に固定し、全アレイを血清に曝露し、洗浄し、共通の第２試薬に曝露し、再度洗浄し、読み取る場合に起こるような、単一アレイの別個の場所に共通な別個の反応を実施することをさらに含む。この取り組みにおいて、さまざまな第１試薬抗原の個別の場所における陽性結果が検出できるように、第２試薬はシグナル標識、例えば蛍光部位または放射性同位元素により標識される。
【００１０】
本発明に従った好ましいアッセイは、それぞれの抗原に関して２つの結果、陽性結果または陰性結果、を有するように構成される。本出願人が使用しおよび本出願に記載したサンドイッチＥＬＩＳＡの型のために、陽性と陰性との間に区分点（カットオフ点）を定め、ならびにアッセイにおける抗原の濃度または他の条件を、カットオフより上の結果のみが陽性の結果を示すように調整する。これは、表３を参照することにより説明することができる。表３において、ＡｌａＤＨ抗原に関する中央値結果は、活動性ＴＢの場合は０．１９９；不活動性ＴＢの場合は０．１４０；およびＣＸＲ正常の場合は０．１０６であった。アッセイの設計において、抗原濃度は、所望のカットオフが得られるように、即ち活動性ＴＢの場合のみ「陽性」と判断するのに十分な色を発するように調整できる。他のすべての場合は、不十分な色（または無色）を示し、本アッセイにおいて「陰性」と判断する。したがって、ＡｌａＤＨ抗原の結果が陽性の場合は活動性ＴＢと一致するが不活動性ＴＢとは一致しないと見込まれ、さらに活動性ＴＢと一致するがＣＸＲ正常クラスとは一致しないと見込まれる。しかし、陽性または陰性の結果は不活動性ＴＢをＣＸＲ正常クラスから区別しないと思われる。何故ならば、それらの結果はすべて陰性だからである。特許請求の範囲を含めた本出願において、このような陽性の結果は抗原による血清の認識を表すと考えられる。ＥＳＡＴ−６および１６ｋＤａに関する中央値を見ると、カットオフのために適切に調整された濃度は、陽性の結果が不活動性ＴＢと一致するが活動性ＴＢおよびＣＸＲ正常クラスの両方とは一致しないということを意味することが理解できる。この場合、陰性結果は活動性ＴＢとＣＸＲ正常クラスとを識別しないと思われる。
【００１１】
陽性と考えられる結果に関して、それぞれの第１試薬抗原は適切なシグナルを示さなくてはならない。例えば、活動性ＴＢを示すと考えられるアッセイのために、表４に記載された抗原のうち１を超えるオッズ比（ＯＲ）を有する抗原は「高」シグナルを示さなくてはならず、１以下のＯＲを有する抗原は低シグナルを示さなくてはならない（３８ｋＤａ  Ａｇの場合、低または中シグナル）；および表５に記載された抗原のうちすべてが、不活動性ＴＢをＣＸＲ正常状態から区別するために「高」シグナルを示さなくてはならない。
【００１２】
結果の信頼性を改善するためには、さらなる抗原を含むことができ、ＯＲが１．０より大きく異なる抗原を利用でき、異なるα値または前述の２種以上の組合せを利用できる。
【００１３】
本発明に従ったアッセイを進展させるために、特徴付けられた血清試料の群および抗原の想定されるセットを用いて開始でき、表３に示すようなデータを得ることができる。抗原のサブセットまたはすべての抗原に関して、次いで統計的解析、例えば表４および５に関連して検討される解析を実施する。すでに検査された抗原に関する表３のデータを作り出す必要なく、構成に別の抗原（抗原Ｘ）を組み入れるために、当初使用した血清試料を単純に保存し、これらに対して抗原Ｘを検査する。この追加の検査のみを用い、新規のセットまたは新規のサブセットを統計的に解析し、拡張した表４および５を作成できる。本発明のアッセイに含めるためのヒト結核菌の別のタンパク質の評価が、本明細書中に説明するアッセイおよびデータ解析手法に従ってごく普通に完了できる。本明細書中に記載されたＥＬＩＳＡに従った抗体の血清レベルの測定を含む手法は、「光学密度」または吸光度（ＯＤ４５０）として従来の方式で表現され、表３に報告されたようなデータを得、このときボンフェローニ法を使用した多重比較のために調節されたｐおよび調節されないｐが＜０．０５である場合のみ差が有意であると考えられ、統計的に有意であると特定されたこれらの抗原のみを使用して、多重ロジスティック回帰モデルを予測し、表４に示したように、１つのモデルまたは他を使用して、各々の、およびすべての抗原に関連したオッズ比が統計的に有意である（ＣＩが１．０を含まない）ように変数減少法を使用する。
【００１４】
実施例における以下の記載は、８種の抗原の初期パネルによる研究である。このパネルを用いた結果はすばらしいが、パネルを変えることによって本アッセイ手法を最適化する研究はいまだなされていない。しかし、多くのＴＢ抗原が公知である。他のＴＢ抗原を利用した、マウス、霊長類およびヒト由来の血清を用いた報告済みの研究から、本出願人は本発明に従ったキットおよびアッセイにおける評価のためのいくつかの候補を特定した。これらは、Ｒｖ０４４０、Ｒｖ３８８１ｃおよびＲｖ２１９５(Havlir, D. V. ら (1991) Infect. Immun. 59、665〜670頁); Lodes, M. J.ら (2001) J Clin Microbiol 39、2485〜2493頁)；Ｒｖ２４９５ｃ、Ｒｖ２１９５、Ｒｖ２７００およびＲｖ３７６３(Bothamley (2003) Lancet 361、2082頁); (Bothamley,G. H. (2004) Clin Diagn Lab Immunol 11、942〜951頁)；ならびにＲｖ１８３７ｃおよびＲｖ３８０３ｃ(Singh, K. K.ら (2005) Clin Diagn Lab Immunol 12、354〜358頁)を含む。
【００１５】
本出願に報告された実験研究は、特別でとりわけ困難な人の集団由来の血清を用いた。大部分の活動性ＴＢ症例は、喀痰塗抹標本における細菌検査では陰性であった。胸部Ｘ線によりこのような個人を正しく診断することは、非常に困難であり熟練した医師の主観的判断を必要とする。この活動性症例群に関して個々の抗原は、不活動性ＴＢおよびＣＸＲ正常クラスＴＢを含む集団において活動性症例を特定するときには全く効果がない。表６に示し、以下に記載したように、個々の抗原が活動性症例を正しく示したのはわずか６〜１５％の確率であった。不活動性ＴＢと正の相関関係がある抗原および不活動性ＴＢと負の相関関係がある抗原の両方を含むパネルを含む本発明のアッセイは４３％もの確率で、３倍優れていた。この改善は特に意義がある。移民調査のために使用する場合、例えば、最初に検査した最適化していない抗原パネルを使用しても別のやり方では検出されないと思われる活動性ＴＢ症例のほぼ半数が検出されるであろう。
【００１６】
本発明は、第１の固定化試薬としてまたは第２の標識試薬として、あるいはそれらの両方として複数のヒト結核菌抗原を含むアッセイキットをさらに含む。好ましいキットは、第１試薬として複数のヒト結核菌抗原、および標識第２試薬として抗ヒトＩｇＧ抗体を含む。
【００１７】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明において説明する。本発明の他の特徴、目的および利点は説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
ＴＢのための血清抗体アッセイに関する公知の方策は、１種または複数のヒト結核菌タンパク質抗原による陽性反応を探す方策が特徴であるのに対して、本発明は陰性反応をも探し、その上不活動性ＴＢを活動性ＴＢから、および好ましくはさらにＣＸＲ正常クラスから区別する。
【００１９】
本出願人の指示に従って実施された実験研究および統計的解析の報告書が本出願の一部として以下に含まれる。該報告書は本発明の態様を支持し、説明するデータおよび解析を提示する。該報告書は、３５３のヒト対象の臨床的に評価された集団からの血清試料を利用する抗原として８種の異なる公知のＴＢタンパク質を用いる研究を説明する。
【００２０】
アッセイ結果（表３に示す）の解析に基づいて、モデルを設計し、１つのＴＢ状態を別の状態から、１つの状態を別の状態に対立するものとして結果を示唆するオッズ比（「ＯＲ」）および信頼区間（「ＣＩ」）を計算することによって識別した。３つの解析モデルをロジスティック回帰に関して使用した。α値が異なるモデルを利用した。α値はボンフェローニ基準に従って選択した。２つのモデル（モデル１、α＝０．００３において有意である所定の抗原に関する結果に基づく；およびモデル２、α＝０．０５において有意である所定の抗原に関する結果に基づく）を不活動性ＴＢを活動性ＴＢから識別するために使用した。１つのモデルは、不活動性ＴＢと胸部Ｘ線正常とを識別するために使用した：モデル３、α＝０．００３において有意である所定の抗原に関する結果に基づく（α値０．００３は、０．０５を１６で割ることによって得られ、１６はパネル内の抗原数（８）に識別すべき状態（すべての状態において２）をかけた積である）。
【００２１】
表４を参照すると、該解析はモデル１およびモデル２を使用する５種の抗原それぞれに関するオッズ比（ＯＲ）を提示する。該解析は計算された信頼区間（ＣＩ）をさらに提示する。１．０を含む信頼区間は、相関関係があいまいすぎること示す。モデル１を使用すると、Ｒｖ２６２６ｃに関するＣＩは０．２〜０．８であった（これはさほどあいまいではない）が、モデル２を使用するとＣＩは０．２〜１．４であった（これはあまりにあいまいである）。明確な結果は、結果を単純に「低」と「高」とに二分することによってほとんどの症例において得ることができ、「高」は強い抗体反応を表し、「低」はそうではない。しかし３８ｋＤａ抗原の場合、モデル２を使用して結果を「低」、「中」、および「高」に三分することが必要であったが、「高」のみが本発明に従ったアッセイの目的のための強い抗原反応を表す。表４は、３８ｋＤａ抗原を用いた「中」の結果に関する信頼区間が０．２〜１．６であり、あいまいであったことを示すが、同じ抗原を用いた「高」の結果に関する信頼区間は０．１〜０．７であり、あいまいではなかったことを示す。
【００２２】
表４に提示された解析において、「高」結果に当てはまる１を超えるオッズ比（陽性結果のための「カットオフ」点が「低」範囲の上限を超える、または三分する場合は「中」範囲の上限を超えるように設定されるべきである）は、試料が活動性ＴＢを有する対象よりも、試料が不活動性ＴＢを有する対象に由来する場合のほうがより起こりやすい結果を示している。ＯＲが高くなるほどそれが当てはまるオッズまたは可能性が高くなる。逆に言えば、１．０より低い「高」結果に当てはまるＯＲは、試料が活動性ＴＢを有する対象よりも不活動性ＴＢを有する対象に由来する場合には起こりにくい結果を示している。これは例えばＡｌａＤＨに当てはまる。表３より、ＡｌａＤＨに関して、適切なカットオフによって「高」範囲のみにあるように設計された陽性結果も活動性ＴＢをＣＸＲ正常類から区別することが分かる。表５に提示された解析は同様に解釈されるが、「高」結果は常に、正常な胸部Ｘ線状態を有する対象よりも、不活動性ＴＢを有する対象に由来する可能性が高い試料を示す（すべての場合に１を超えるＯＲ）。
【００２３】
表４と表５を比較すると、検査した抗原の２種、１６ｋＤａおよびＥＳＡＴ−６、が両方の表に現れることに気がつくであろう。これらの抗原に関して「高」結果は試料が活動性ＴＢまたはＸ線学的異常がない状態（潜伏感染または非感染）というよりも不活動性ＴＢであると思われることを示唆している。
【００２４】
高／低または高／中／低は、反応のレベルを反映するそれぞれの抗体に関する区分である、即ち血清中にどれだけの抗体があるかということと理解されよう。１を超えるまたは１未満のＯＲ比は、特定の抗体レベルを有する人が活動性または不活動性のどちらか（表４）および不活動性またはＣＸＲ正常のどちらか（表５）である可能性を示唆する。つまり、はじめに抗体レベルの区分を作成し、次いでオッズ比を推定することによってＴＢ状態の相関関係に関して統計的にこれらを解析する。
【００２５】
表４より、本出願人は不活動性ＴＢを活動性ＴＢから識別するための、本発明に従ったアッセイに関するいくつかの抗原の組合せを特定した。モデル１解析を使用した場合、該組合せはＲｖ２６２６ｃ、１６ｋＤａおよびＥＳＡＴ−６である。モデル２解析を使用した場合、該組合せは１６ｋＤａ、ＥＳＡＴ−６、ＡｌａＤＨおよび３８ｋＤａ  Ａｇの群からの３種以上の抗原であり、このとき、少なくとも１種は１．０を超えるＯＲを有し、少なくとも１種は１．０以下のＯＲを有する。実施例は１６ｋＤａ  Ａｇ、ＥＳＡＴ−６ならびにＡｌａＤＨおよび３８ｋＤａ  Ａｇの１種または両方と、ＡｌａＤＨ、３８ｋＤａ  Ａｇならびに１６ｋＤａ  ＡｇおよびＥＳＡＴ−６の１種または両方とを含む。表４および表５から、ＣＲＸ正常状態から不活動性ＴＢの区別も含む好ましいアッセイは、抗原ＦｄｘＡ、ＥＳＡＴ−６、１６ｋＤａ  ＡｇならびにＡｌａＤＨおよび３８ｋＤａ  Ａｇの１種または両方、つまり検査した群からの４種または５種の抗原どちらかを含むであろう。抗原ＦｄｘＡは、任意のこのような組合せにおいて追加の抗原として含まれ得る。より好ましいのは、少なくとも２種の抗原、つまり１６ｋＤａ  Ａｇ、ＥＳＡＴ−６およびＦｄｘＡの少なくとも２種を、不活動性ＴＢをＣＲＸ正常状態から区別するために含むアッセイである。
【００２６】
実験研究および解析
材料および方法
研究対象集団  本研究は１９９５年から１９９８年に得られた、移民からＴＢの疑いがあるとしてＭｏｎｔｒｅａｌ  Ｃｈｅｓｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａに付託された、および肺ＴＢを有するカナダ生まれのヒトからの保存された血清試料を用いて実施した。インフォームド・コンセントは患者から得、本研究を行う上でＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓの人体実験のガイドラインおよび／または著者の研究所（Ｍｏｎｔｒｅａｌ  Ｃｈｅｓｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｂｏａｒｄ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）の人体実験のガイドラインに従った。
【００２７】
血清は４つの群から収集した：（ｉ）活動性結核：細菌学的データおよび臨床評価に基づき活動性肺ＴＢを有すると診断された５３人（７人は培養および塗抹が陽性であり、３１人は培養陽性および塗抹陰性であり、残りの１５人は両方の検査で陰性であった）。（ｉｉ）不活動性結核：この区分は、ツベルクリン反応検査（ＴＳＴ）に対して陽性反応であり（＞１０ｍｍ）、過去のＴＢに一致する異常であるが安定胸部Ｘ線（ＣＸＲ）結果、現在の疾患の臨床的、細菌学的またはＸ線像による証拠がないことによって定義される（１）。２１８人が不活動性ＴＢであると診断され、そのうち治療済みのＴＢの病歴を有するものは誰もいなかった。（ｉｉｉ）ＴＳＴ陽性：３２人の対象がＴＳＴに対して陽性であり（＞１０ｍｍ）、胸部Ｘ線は正常であった。および（ｉｖ）ＴＳＴ陰性：５０人の研究対象がＴＳＴ陰性であった。
【００２８】
抗原。抗体反応を誘発することが公知である、例えば３８ｋＤａ  Ａｇ（８）、ＥＳＡＴ−６（２２）、グルタミン合成酵素（ＧｌｕＳ）（９）、アラニンデヒドロゲナーゼ（ＡｌａＤＨ）（１１）、スーパーオキサイドジスムスターゼＡ（ＳｏｄＡ）（３０）、１６ｋＤａ  Ａｇ（２９）という理由、または複製しないバチルスにおいて選択的に発現することが期待されるという理由のどちらかにより、ヒト結核菌のタンパク質を選択した。本明細書中で「１６ｋＤａ」と称する抗原は、遺伝子ｒｖ２０３１ｃの産物であり、文献においては時として「１４ｋＤａ」と称する。１６ｋＤａ  Ａｇ（α−クリスタリン、Ａｃｒ）、フェレドキシンＡ（ＦｄｘＡ）およびＲｖ２６２６ｃはすべて、いわゆる休眠性（ｄｏｓＲ）レギュロンにおいて見出された遺伝子によりコードされる（１８、２５）。ヒト結核菌タンパク質を、組換え産物として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）において発現させ、連続的なカラムクロマトグラフィーによって（５）に記載のようにほぼ均質になるまで精製した。明確にするために、抗原とこれらを産生した遺伝子とを相関させることは有用であり得る。その相関関係は、１６ｋＤａ抗原、遺伝子ｒｖ２０３１ｃ；ＥＳＡＴ−６、遺伝子ｒｖ３８７５；ＡｌａＤＨ、遺伝子ｒｖ２７８０；３８ｋＤａ、遺伝子ｒｖ０９３４；ＦＤＸａ、遺伝子ｒｖ２００７ｃである。
【００２９】
酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。ポリスチレンの９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、４℃で一晩２．０μｇ／ｍｌ（０．２ｍｌ／ウェル）の炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中の精製抗原により被覆した。プレートを、０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０含有リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）（ＰＢＳ−Ｔ）中の１％脱脂スキムミルクで３７℃において３時間遮断し、ＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した。血清を１％スキムミルク含有ＰＢＳ−Ｔで１：５０に希釈し、希釈した血清０．２ｍｌを抗原で被覆したウェルに２連で加え、３７℃において３０分間インキュベートした。陽性および陰性の対照血清を、相互のおよび内部の経過変化を照らし合わせるために２連で含めた。ＰＢＳ−Ｔによる洗浄後、プレートを１％スキムミルク含有ＰＢＳ−Ｔで１：２００００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した０．２ｍｌ／ウェルのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｄａｋｏ、ＧＩｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）とともに３７℃において３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、０．２ｍｌ／ウェルＴＭＢペルオキシダーゼ基質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて室温で３０分間インキュベートすることによって、酵素活性を測定した。反応を０．０５ｍｌの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えることによって停止した。４５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ４５０）を自動マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｓｈｅｌｌ、Ｔｅｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて測定した。
【００３０】
血清学的データ解析。カイ２乗検定を使用して、人口統計区分と診断区分の間の関連性を評価した。結核状態による抗体反応の比較を、２つの独立した変数に関するウィルコクソンの順位和検定および３つ以上の独立した変数に関するクラスカル・ワーリス検定などのノンパラメトリック検定を使用して実施した。
【００３１】
ロジスティック回帰モデルを、活動性ＴＢ対不活動性ＴＢの症例に関して、およびＣＸＲ正常（即ち、Ｘ線写真で活動性または不活動性ＴＢの兆候を有さない対象）対不活動性ＴＢの症例に関して、前項に記載した解析によって統計的に有意であると特定された抗体反応を含む全モデルから変数減少法を介して、別々に推定し、ＢＣＧワクチン接種および出身の世界的地域に関して調整した。抗体結果を中央値より高いか低いかに従って、「低および高」の区分に二分し、あるいは抗体分布の三分位数に従って「低、中、および高」に三分した。初期モデル化研究は抗体の三分パラメーター化を利用した；２つの隣接する抗体区分間の危険性の差が小さかった場合、２分パラメーター化を選択した。
【００３２】
結果
研究対象集団の特徴。本研究に含まれる３５３の対象を４つの区分、活動性ＴＢ、不活動性ＴＢ、潜伏ヒト結核菌感染（ＴＳＴ陽性）、およびヒト結核菌非感染（ＴＳＴ陰性）に分けた（表１）。研究対象集団の人口統計の特徴を表２に記載する。年齢群（ｐ＝０．２９）、性別（ｐ＝０．０７）、出生国（ｐ＝０．１２）、Ｍ．ボビスＢＣＧ（Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ）によるワクチン接種状態（ｐ＝０．１９）またはカナダにおける年数（１未満、１を超える；ｐ＝０．５３）などの結核の危険性に関連する因子については４つの診断的区分間にカイ２乗検定による統計的有意差は見出せなかった（１）。
【００３３】
抗体レベルの分布。特異的ＩｇＧ抗体の血清レベルをＥＬＩＳＡによって測定し、ＯＤ４５０としての発現した。Ｒｖ２６２６ｃ抗体のみがロジスティック変換後ほぼ正規であった（データは示さず）。したがって、対象３５３人のすべてに関する血清抗体レベルのＥＬＩＳＡ測定を、中央値および範囲（最小値および最大値）で提示する（表３）。
【００３４】
抗体分布の比較を、正規性の仮定を必要とする一元配置ＡＮＯＶＡではなく、ウィルコクソンの順位和検定およびクラスカル・ワールス検定などのノンパラメトリック解析法によって実施した。ＴＳＴ陽性群とＴＳＴ陰性群の間に考えられる任意の抗体に関する統計的有意差は見出されなかった（すべてに対してｐ＞０．５０）（データは示さず）。この結果は、潜伏感染自体は強い抗体反応を誘発するために十分な抗原刺激を与えることができないという考えに一致する（３、１２、２４）。したがってこれらの２つの区分を組み合わせて、ヒト結核菌感染にかかわらずその後の解析では単独のＸ線正常群（「ＣＸＲ正常」）とした。
【００３５】
抗体反応を、状態、即ち活動性ＴＢ、不活動性ＴＢおよびＣＸＲ正常により解析した。状態間の差がすべての抗体に対してｐ＜０．０５において統計的に有意であることが見出された。不活動性ＴＢ群とＣＸＲ正常群とは、血清学的に識別可能であるという発見は、不活動性結核を有する人が、ＣＸＲ異常のない潜伏感染を有する人より、高い抗原負荷量に耐え得ることを強く暗示する。この解釈は正常なＣＸＲを有する潜伏感染に関連する疾患再活動化の危険性よりも不活動性ＴＢに関連する疾患再活動化の危険性のほうが大きいことに一致する（６、７、１６）。
【００３６】
ポストホック比較においてα値が０．００３で統計的有意性が断言され、それによって、ボンフェローニ法による多重比較を考慮に入れた（８種の抗原および疾患状態間の２種の比較がα＝０．００３（０．０５／（８×２）の近似値）を示す）。不活動性結核を基準状態として本解析のために任意に用いた（表３）。ＡｌａＤＨ、３８ｋＤａ  Ａｇ、ＥＳＡＴ−６および１６ｋＤａ  Ａｇに対する抗体は、不活動性ＴＢを活動性ＴＢおよびＣＸＲ正常状態の両方から識別した。Ｒｖ２６２６ｃに対する抗体は不活動性ＴＢを活動性ＴＢから識別し、一方ＦｄｘＡに対する抗体は不活動性ＴＢをＣＸＲ正常状態から識別した。この３つの状態においてＳｏｄＡおよびＧｌｕＳに対する抗体のレベルに差は見出せなかった（データは示さず）。したがって、これらの２種の抗体はさらなる解析から除外した。
【００３７】
ロジスティック回帰結果。抗体プロフィールは３つのＴＢ状態（活動性ＴＢ、不活動性ＴＢおよびＣＸＲ正常）で異なったので、ロジスティック回帰モデルを、図３に提示した解析において統計的有意性が特定された抗体の関数として、ＴＢ状態を予測するために推定した。すべてのモデルに対して変数減少法を使用した。不活動性ＴＢ対活動性ＴＢの２つのモデルを推定した：モデル１はα＝０．００３において統計的に有意であると特定された抗体に基づき、モデル２はα＝０．０５において統計的に有意であるとして特定された抗体に基づいた（表４）。モデル１によれば、１６ｋＤａ  ＡｇおよびＥＳＡＴ−６に対して高レベルの抗体ならびにＲｖ２６２６ｃに対して低レベルの抗体が活動性ＴＢと比較して不活動性ＴＢのオッズを上げた。モデル２はさらに、ＡｌａＤＨおよび３８ｋＤａ  Ａｇに対して低レベルの抗体が活動性ＴＢを上回り、不活動性ＴＢのオッズを上げたことを示した。後者のモデルでは、Ｒｖ２６２６ｃに対する抗体の貢献が統計的有意性をなくした。
【００３８】
すべての抗体がα＝０．００３およびα＝０．０５の両方において統計的に有意であったので（表５）、不活動性ＴＢ対ＣＸＲ正常に関して、１つのモデルのみを推定した（モデル３）。モデル３によれば、１６ｋＤａ  Ａｇ、ＥＳＡＴ−６およびＦｄｘＡに対して高レベルの抗体は、不活動性ＴＢ対ＣＸＲ正常のオッズを上げた。オッズを上げる傾向が抗体レベルの３つの区分において検出され、この比較結果をさらに強化した。
【００３９】
不活動性ＴＢに関連する抗体プロフィールは活動性ＴＢに関連する抗体プロフィールとは異なり、潜伏感染中の抗体反応の標的が活動性疾患の間に現れる標的とは異なることを強く示唆している。これらのデータは、ヒトにおいて各結核状態が細菌性抗原の痕跡によって特徴付けられる。これらの痕跡は、「バーコード」、即ち抗原特異的マーカーの存在および不存在の特定の組合せに似ている。バーコード案は、単に特定の状態に正に関連するマーカーを特定することに基づいてきた、ＴＢの免疫診断開発の現在の方針の欠陥を明らかにする。
【００４０】
本研究において作り出された抗体プロフィールの他の態様は、それほど単純ではない。１６ｋＤａ  Ａｇ、ＦｄｘＡおよびＲｖ２６２６ｃに対する抗体プロフィールは異なる結核状態に特異的である。しかし、これらの３種の抗原は同じ「休眠性」レギュロンのメンバーである遺伝子（ａｃｒ、ｆｄｘＡおよびｒｖ２６２６ｃ）によってコードされる（１８、２５）。これらの抗原に対する異なる抗体プロフィールはしたがって、ヒトにおけるこれらの細菌性遺伝子の異なる制御、または相対的免疫優勢、抗体親和性または免疫調節の差を示唆する。例えば、異なるＦｄｘＡおよび１６ｋＤａ  Ａｇ、Ｒｖ２６２６ｃは、不活動性ＴＢにおいて抗体産生の閾値レベルを達成することができず、したがって、より高い細菌性負荷に関連する活動性ＴＢにおいてのみ検出可能となる。より興味深いことに、活動性ＴＢにおけるＦｄｘＡおよびＲｖ２６２６ｃに対する抗体の検出は十分な抗原刺激を示し、１６ｋＤａ  Ａｇに対する抗体反応が同時に欠如することはおそらく、特定のヒト宿主の微環境におけるａｃｒの刺激に対する反応の選択的な制御、または低い多様性で成長する結核桿菌によって特徴付けられる疾患の形態においてこの抗原が抗体産生を誘発できなかったことのどちらかによるものである（現在の研究においてほとんどの活動性ＴＢ症例は、塗抹陰性の肺疾患を持っている）ことを示唆する。同様の解釈が、不活動性ＴＢと強く相関する抗ＥＳＡＴ−６抗体についてのデータに対しても可能である。実際、抗１６ｋＤａ−Ａｇおよび抗ＥＳＡＴ−６抗体は相互に関連する（データは示さず）。
【００４１】
本研究にはいくつかの制限がある。１つは血清銀行の構成にあり、血清銀行は人口統計が高度に多様であること、および不活動性ＴＢ症例が非常に優勢であることによって特徴付けられる。もう１つは、現在の解析がわずか８種の抗体プロフィールに限られたことである。しかし、その後のロジスティック回帰モデルにおいて使用する抗体を選択するためのクラスカル・ワールス検定による血清学的データの統計的フィルタリングはヒト結核菌タンパク質マイクロアレイの使用によって検出できる抗体のような非常に多くの抗体を用いることのできる方策を利用する。さらに、本研究において判定される抗体プロフィールと結核状態の相関は、独立した集団において検証されなくてはならない。
【００４２】
結核状態に特有な免疫プロフィールの特定は、ヒト結核菌潜伏感染から、おそらく細菌増殖の再開を伴う活動性疾患への進行が、さらに細菌性抗原の組成の変化を伴う可能性があるということを示唆する。したがって、無症状の、再活動化疾患に進行している感染した個人は、そうではない人と血清学的に識別できる可能性がある。免疫学的スクリーニングを介した「進行者」の特定は、目標の潜伏結核の治療に非常に役に立つはずである。
【００４３】
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【００４４】
【表１】
2009503518.tif 000002
【００４５】
【表２】
2009503518.tif 000003
＊１年の指標を選択したのは、移民間のＴＢの大部分は新しい国に到着した後まもなく現れるという実質的な証拠があるからである（３１）
【００４６】
【表３】
2009503518.tif 000004
抗体分布が正規分布していないので、中央値および範囲（最小値および最大値）を示す。活動性ＴＢと不活動性ＴＢと、およびＣＸＲ正常と不活動性ＴＢとを比較するｐ値は、クラスカル・ワールス検定に基づいた。ｎ．ａ．は非適用を表す。
＊はα＝０．０５において統計的に有意である差異のしるしである。
＊＊はα＝０．００３において統計的に有意である差異のしるしである。
解析は、８種の抗体および２種の比較：不活動性ＴＢ対活動性ＴＢおよび不活動性ＴＢ対ＣＸＲ正常を含むため、αはボンフェローニ法に従って選択した（０．００３は０．０５／（２×８）の近似値である）。
【００４７】
【表４】
2009503518.tif 000005
ＥＬＩＳＡ結果を、中央値より高いか低いかに従って「低および高」の区分に二分、または抗体分布の三分位数に従って「低、中および高」に三分した。
モデル１は、表３のα＝０．００３において有意な抗体のみを使用したモデルからの変数減少法に基づく；モデル２は、表３のα＝０．０５において有意な抗体を使用するモデルからの変数減少法に由来する。
ＯＲ、オッズ比；ＣＩは信頼区間；Ｒｅｆは参照範囲；ｎ．ａ．は非適用を表す。
【００４８】
【表５】
2009503518.tif 000006
【００４９】
ＥＬＩＳＡ結果を、すべての抗体分布の三分位数に従って「低、中および高」の区分に三分した。モデル３は、表３のα＝０．００３において有意であると見出された抗体からの変数減少法に基づいた。
【００５０】
前述の解析に基づいて評価を行い、単独の抗原または検査した８種の抗原のパネルを用いて上記のＥＬＩＳＡを実施した結果を比較した。対象のモデルに基づく予測を、対象の抗体値を推定したロジスティック回帰モデルに代入することによって、および関心の結果の可能性、つまり不活動性ＴＢと診断される可能性について解くことによって得た。可能性が５０％を超えた場合、不活動性ＴＢの予測がなされ、そうでなければ予測は代替診断である。
【００５１】
「活動性ＴＢのみ」は活動性ＴＢを有すると正確に予測された活動性ＴＢを有する対象のパーセントを示し、「ＣＸＲ正常のみ」はＣＸＲ正常クラスを有すると正確に予測されたＣＸＲ正常を有する対象のパーセントである。結果を表６に提示する。
【００５２】
【表６】
2009503518.tif 000007
【００５３】
表６の右側を参照すると、選択したパネルが個々の抗原ＥＳＡＴ−６または１６ｋＤａより（たとえパネルが両方を含んでいても）劣ることが分かるであろう。この理由は、これらの抗原に対する抗体が和合しやすいからである。したがって、結合が不活動性ＴＢに相関する２種の抗原を組み合わせてもほとんど改善されなかった。表６の左側を参照すると、選択したパネルが、活動性症例の特定においてどの個々の抗原よりもずっと優れていることが理解されるであろう。
【００５４】
本発明の多くの実施形態を記載した。それでもなお、多様な変更が本発明の精神および範囲から逸脱することなくなし得ることが理解されるであろう。例えば、異なる抗原の組合せ、ならびに異なる抗体アッセイが使用できる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内である。
【国際調査報告】
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