(57)【要約】  病原体、特に性感染症に関連する生物体、特にヒトパピローマウイルス遺伝子型を検出するための方法に関する。前記方法は、特別に設計されたプローブを用いたリアルタイムＰＣＲの使用を含む。前記プローブ、前記方法を実行するためのキット、および本発明の方法における使用に適したプライマーを設計する方法にも関する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１の病原体の存在を検出する方法であって、少なくとも４のプローブを含んでなる組とサンプルから得られる核酸とを接触させることを含んでなり、前記プローブのそれぞれは、４または５の相補的な塩基対に隣接する病原体に由来する配列と相補的な配列を含んでなり、前記塩基は、病原体に由来する核酸とのハイブリダイゼーションの非存在下においてステム構造を形成し、前記プローブは、第１の相互作用標識および第２の相互作用標識で標識され、前記プローブと前記病原体に由来する核酸とのハイブリダイズにより検出されるシグナルに変化を引き起こす方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記第１の相互作用標識および前記第２の相互作用標識はＦＲＥＴドナーおよびＦＲＥＴアクセプターである方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記ＦＲＥＴアクセプターはクエンチャーである方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、前記病原体に由来する配列と相補的な配列は、結合配列により、いずれかの末端において前記相補的な塩基対と結合する方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、前記相補的な塩基対はＣ−Ｇ対を含んでなる方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記プローブは配列
３’−ＣＧＣＧ−Ｆ−病原体に特有の配列−Ｆ’−ＣＧＣＧ−５’
を含んでなり、ＦおよびＦ’は任意の結合配列である方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、プローブ内の病原体に特有の配列は、病原体のゲノム配列との少なくとも１のミスマッチを含む方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、前記プローブのそれぞれは、他の前記プローブのそれぞれと区別される方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法であって、前記プローブのそれぞれは、限定された位置において固体の支持体と結合する方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、前記プローブの組は、少なくとも１０、少なくとも１５または少なくとも２０のプローブを含んでなる方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、前記方法は、前記プローブの１つおよび前記サンプルから得られる相補的な核酸により形成される２本鎖核酸分子の融点を決定することをさらに含んでなる方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプルから得られる核酸は、前記プローブの組と接触させる前に増幅される方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行われる方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の方法であって、増幅された核酸の生成は継続的にモニターされる方法。
【請求項１５】
請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法であって、前記増幅された核酸は、増幅の１サイクルの後に前記プローブの組と接触させる方法。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法であって、前記増幅された核酸は、各増幅サイクルの後に前記プローブの組と接触させる方法。
【請求項１７】
請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、前記増幅は前記プローブの組の存在下で行われる方法。
【請求項１８】
請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法であって、内標準の増幅をさらに含んでなる方法。
【請求項１９】
請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の方法であって、混入核酸の増幅が妨げられる方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記混入核酸の増幅は、ウラシルの存在下で増幅を行うことにより妨げられる方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、増幅の前に前記核酸をウラシル-ＤＮＡグリコシラーゼで処理することをさらに含んでなる方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプルは、気管支吸引、尿、前立腺（prostata massate）、精液、血液および子宮頸部、外陰部、肛門、生殖器、皮膚もしくは咽喉の細胞学的なサンプル、切屑または生検から選択される方法。
【請求項２３】
性感染症に関連する病原体を検出するための、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも１のＨＰＶ遺伝子型の存在を検出するための、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
高いリスクまたは低いリスクのＨＰＶ遺伝子型を検出するための、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２４または請求項２５に記載の方法であって、前記プローブの組は、配列番号３３〜５２または配列番号１０５〜１１７から選択される少なくとも１の配列を含んでなる少なくとも１のプローブを含む方法。
【請求項２７】
請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプルから得られる核酸は、配列番号１〜３２から選択される少なくとも１のプライマーを利用して増幅される方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、前記サンプルから得られる核酸は配列番号１〜３２を含んでなるプライマー混合物を利用して増幅される方法。
【請求項２９】
少なくとも４のプローブを含んでなるプローブの組であって、前記プローブのそれぞれは、４または５の相補的な塩基対に隣接する病原体に由来する配列と相補的な配列を含んでなり、前記塩基は、病原体に由来する核酸とのハイブリダイゼーションの非存在下でステム構造を形成し、前記プローブは、第１の相互作用標識および第２の相互作用標識で標識され、前記プローブが前記病原体に由来する核酸とハイブリダイズすることにより、検出されるシグナルに変化を引き起こす方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載のプローブの組であって、前記第１の相互作用標識および前記第２の相互作用標識はＦＲＥＴドナーおよびＦＲＥＴアクセプターであるプローブの組。
【請求項３１】
請求項３０に記載のプローブの組であって、前記ＦＲＥＴアクセプターはクエンチャーであるプローブの組。
【請求項３２】
請求項２９〜３１のいずれか１項に記載のプローブの組であって、前記病原体に由来する配列と相補的な配列は、結合配列により、いずれかの末端において前記相補的な塩基対と結合する方法。
【請求項３３】
請求項２９〜３２のいずれか１項に記載のプローブの組であって、前記相補的な塩基対はＣ−Ｇ対を含んでなるプローブの組。
【請求項３４】
請求項３３に記載のプローブの組であって、前記プローブのそれぞれは配列
３’−ＣＧＣＧ−Ｆ−病原体に特有の配列−Ｆ’−ＣＧＣＧ−５’
を含んでなり、ＦおよびＦ’は任意の結合配列であるプローブの組。
【請求項３５】
請求項２９〜３４のいずれか１項に記載のプローブの組であって、プローブ内の病原体に特有の配列は、病原体のゲノム配列との少なくとも１のミスマッチを含むプローブの組。
【請求項３６】
請求項２９〜３５のいずれか１項に記載のプローブの組であって、前記プローブのそれぞれは他の前記プローブのそれぞれと区別されるプローブの組。
【請求項３７】
請求項２９〜３６のいずれか１項に記載のプローブの組であって、前記プローブのそれぞれは、限定された位置において固体の支持体と結合するプローブの組。
【請求項３８】
請求項２９〜３７のいずれか１項に記載のプローブの組であって、前記病原体は性感染症に関連する生物体であるプローブの組。
【請求項３９】
請求項３８に記載のプローブの組であって、前記生物体はウイルスであるプローブの組。
【請求項４０】
請求項３９に記載のプローブの組であって、前記ウイルスはヒトパピローマウイルスであるプローブの組。
【請求項４１】
請求項４０に記載のプローブの組であって、前記プローブのそれぞれはＨＰＶ遺伝子型と相補的である配列を含んでなるプローブの組。
【請求項４２】
請求項４１に記載のプローブの組であって、前記プローブのそれぞれは高いリスクのＨＰＶ遺伝子型と相補的な配列を含んでなるプローブの組。
【請求項４３】
請求項４１に記載のプローブの組であって、前記プローブのそれぞれは低いリスクのＨＰＶ遺伝子型と相補的な配列を含んでなるプローブの組。
【請求項４４】
請求項４０〜４３のいずれか１項に記載のプローブの組であって、配列番号３３〜５２または配列番号１０５〜１１７から選択される少なくとも１の配列を含んでなる少なくとも１のプローブを含むプローブの組。
【請求項４５】
請求項４４に記載のプローブの組であって、前記プローブの組の各プローブは、配列番号３３〜５２または配列番号１０５〜１１７から選択される配列を含んでなるプローブの組。
【請求項４６】
請求項４４または請求項４５に記載のプローブの組であって、前記プローブの組の各プローブは、配列番号３３〜５２から選択される配列を含んでなるプローブの組。
【請求項４７】
配列番号３３〜５２のいずれか１を含んでなる核酸配列。
【請求項４８】
配列番号１０５〜１１７のいずれか１を含んでなる核酸配列。
【請求項４９】
少なくとも１のＨＰＶ遺伝子型の存在または非存在を検出するための、請求項４７または請求項４８に記載の核酸の使用。
【請求項５０】
ポリメラーゼ連鎖反応を利用した請求項４９に記載の使用であって、増幅された核酸の生成は継続的にモニターされる使用。
【請求項５１】
２以上の関連する生物体に由来する核酸配列を増幅する最小のプライマーの組を同定する方法であって、
（a）前記生物体間で少なくとも３０％の同一性を有するプライマー結合部位を同定することと；
（b）（a）で同定されたプライマー部位において増幅を惹起することができるプライマーの組を設計することと；
ここで、前記プライマーのそれぞれは、前記生物体の少なくとも１におけるプライマー結合部位と３以下のミスマッチを有し、前記プライマーのそれぞれは、前記プライマーのそれぞれと４以下のヌクレオチドが異なる
（c）可能な限り多くの前記生物体を検出するために必要な最も少ない数のプライマーを決定することを含んでなる方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法であって、さらに、
（d）前記生物体の全てに由来する核酸配列の均等な増幅を保証するために、前記プライマーの組において必要な各プライマーの相対的な量を決定すること
を含んでなる方法。
【請求項５３】
請求項５１または請求項５２に記載の方法であって、前記生物体は性感染症に関連する方法。
【請求項５４】
請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の方法であって、前記生物体はウイルスである方法。
【請求項５５】
請求項５４に記載の方法であって、前記ウイルスはヒトパピローマウイルスである方法。
【請求項５６】
請求項５１〜５５のいずれか１項に記載の方法であって、前記ステップ（d）は１以上のプライマーを加えることをさらに含んでなり、前記プライマーは、前記生物体におけるプライマー結合部位と３以下のミスマッチを有し、そのプライミングは均等な増幅を達成するために補正を必要とする方法。
【請求項５７】
請求項５１〜５６のいずれか１項に記載の方法であって、前記ミスマッチは５’末端に最も近いプライマーの半分にある方法。
【請求項５８】
請求項５１〜５７のいずれか１項に記載の方法であって、前記プライマーの組は、全ての生物体の検出感度を２オーダーのマグニチュードで表すことを可能にする方法。
【請求項５９】
配列番号１〜３２から選択される少なくとも１のプライマーを含んでなる、請求項５５〜５８のいずれか１項に記載の方法により得られるプライマーの組。
【請求項６０】
配列番号１〜３２を含んでなる、請求項５９に記載のプライマーの組。
【請求項６１】
請求項２９〜４６のいずれか１項に記載のプローブの組を含んでなる、１以上の病原体を検出するためのキット。
【請求項６２】
請求項５１〜５８のいずれか１項に記載の方法により同定されるプライマーの組を含んでなる、１以上の病原体を検出するためのキット。
【請求項６３】
請求項６１に記載のキットであって、請求項５１〜５８のいずれか１項に記載の方法により同定されるプライマーの組をさらに含んでなるキット。
【請求項６４】
請求項６１〜６３のいずれか１項に記載のキットであって、前記病原体は性感染症に関連する生物体であるキット。
【請求項６５】
請求項２９〜４６のいずれか１項に記載のプローブの組を含んでなる、１以上のＨＰＶ遺伝子型を検出するためのキット。
【請求項６６】
請求項５９または請求項６０に記載のプライマーの組を含んでなる、１以上のＨＰＶ遺伝子型を検出するためのキット。
【請求項６７】
請求項５９または請求項６０に記載のプライマーの組をさらに含んでなる、請求項６５に記載のキット。
【請求項６８】
内標準をさらに含んでなる、請求項６１〜６７のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の説明】
【０００１】
本発明は、性感染症に関連する生物体に特異的な診断、特に、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）遺伝子型、特に生殖ヒトパピローマウイルス遺伝子型の検出に関する。
【０００２】
ヒトパピローマウイルスおよびその意義
世界保健機関（ＷＨＯ）によると、子宮頸癌は、女性の癌による死の２番目に多い原因である。ＨＰＶ感染の存在は、世界的に、子宮頸癌の９９％以上で関連付けられている。推定では、世界で毎年５００，０００人以上の女性に子宮頸癌の症状が現れ、そのうちの２７３，０００人以上が致命的である。Ｐａｐスクリーニングプログラムを用いても、毎年多くの女性が子宮頸癌で死亡している。
【０００３】
ＨＰＶ感染は、世界的に最も頻繁な性感染症（ＳＴＤ）であり、性的に活動性の女性の６０％が、彼女たちの人生で一度は生殖器官においてＨＰＶに感染するであろう。ＨＰＶ感染状態にかかわらず、１０，０００人に１人より少ない女性が浸潤子宮頸癌を発症する。ＨＰＶに感染した女性のほとんどが細胞学的な異常または癌を発症しないという事実は、ＨＰＶに感染した女性において子宮頸部の疾患から癌への進行を調節する因子の重要性をはっきりと示す。これらの因子には、ＨＰＶ遺伝子型および分子変異体、ＨＰＶウイルス負荷、ＨＩＶ感染の残存、他のＳＴＤ病原体との同時感染、宿主の免疫状態および喫煙のような環境的な因子が含まれてよい。
【０００４】
パピローマウイルスは、哺乳動物の上皮細胞に感染し、良性、例えば線維乳頭腫（いぼ）または悪性の上皮増殖障害を引き起こす。全てのパピローマウイルスは、ゲノムサイズ、組成、オープンリーディングフレーム、およびタンパク質機能が共有されていることにおいて類似である。全てではないが、多くのゲノム領域は、種々のパピローマウイルス間で保存されている。
【０００５】
パピローマウイルスのライフサイクルと宿主細胞の分化状態との間の近い連関のため、パピローマウイルスのライフサイクルの詳細は、完全には明らかにされていない。パピローマウイルスは宿主の上皮基底細胞に感染することが知られており、ウイルスゲノムは確立され、宿主細胞複製と共に複製する低いコピー数のエピソームとして維持される。感染した細胞がケラチノサイトに分化する場合、ウイルスＤＮＡは増幅され、後期遺伝子が誘導され、パピローマウイルスの増殖型の複製が続く。
【０００６】
パピローマウイルスは広い種類の動物に感染し、ヒトが含まれる。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）（Papillomaviridae属、α-、β-、γ-、δ-、μ-パピローマウイルスおよび分類のないPapillomaviridae generaが含まれる）は、性感染症の一般的な原因である。いくつかのタイプのＨＰＶは、ＤＮＡ配列データにより同定され、９６ＨＰＶ遺伝子型は、今日までに完全に配列決定されている。ＨＰＶの遺伝子型は、Ｌ１、Ｅ６、およびＥ７遺伝子のＤＮＡ配列に基づく。以前に確立された株に関する配列における１０％の差異は、新しい型のウイルスを定義するのに十分である。
【０００７】
ヒトパピローマウイルス群の異種性は、一般的に、deVilliers, 1989, J. Virology 63:4898-4903に記載されており、これは本明細書の一部として援用される。多数のＨＰＶ型のゲノムは、配列決定され、および／または特徴付けられている。
【０００８】
ＨＰＶはＤＮＡ腫瘍ウイルスであり、そのゲノムは３つの領域に組織化されている：初期遺伝子（Ｅ１〜Ｅ７）、後期遺伝子（Ｌ１およびＬ２）領域および上方制御領域（ＵＲＲ）または遺伝子発現調節領域（ＬＣＲ）。ＵＲＲは、多くのリプレッサーおよび転写の活性化因子に対する結合部位を有し、特定のＨＰＶ型に対する宿主の範囲を決定する役割を果たす。一方、Ｅ１およびＥ２は、染色体外のＤＮＡ複製およびウイルスのライフサイクルの終了に対して重要なタンパク質をコードする。Ｅ２は、２つのタンパク質をコードする：１つは、初期領域の転写を阻害し；他方は、初期領域の転写を増大させる。ＨＰＶに付随する子宮頸癌の特徴は、ウイルス性のＥ２タンパク質の発現を欠いていることである。近年、Ｅ２タンパク質の部分を有する小さなＥ８ ＯＲＦの産物からなる新規のＥ２タンパク質について述べられている。このタンパク質は、ウイルスの複製および転写の両方を阻止することができ、それ故ウイルス潜伏において主要な役割を有すると考えられている。
【０００９】
Ｅ４タンパク質は、完全なビリオンが形成された場合、感染の後期の段階において発現し、形質転換特性を有することは知られていない；しかしながら、ウイルスの成熟および複製に対して重要な役割を果たすと考えられている。Ｅ４タンパク質は、ヒトケラチノサイトにおいて細胞質サイトケラチンネットワークの崩壊も引き起こし、感染細胞からのビリオンの放出を補助し得る。
【００１０】
一方、Ｅ５オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は子宮頸癌細胞において欠失していることが多く、宿主細胞の悪性転換の維持において必要ではないことを示す。存在する場合、Ｅ５は、上皮成長因子、血小板由来の成長因子β、およびコロニー刺激因子の受容器のような種々の膜貫通タンパク質と相互作用する。ＨＰＶ１６感染細胞を用いた研究では、Ｅ５タンパク質が弱い形質転換活性を有することが見出された。
【００１１】
発癌において、Ｅ６およびＥ７ ＯＲＦは、最も主要な役割を果たすと考えられる。これらの２つの単位は、ウイルスの複製およびＨＰＶ ＤＮＡを受け入れる細胞の不死化および形質転換を可能にする腫瘍性タンパク質をコードする。
【００１２】
後期領域単位Ｌ１およびＬ２は、ビリオン構築の後期段階の間に、ウイルスキャプシドタンパク質をコードする。Ｌ１によりコードされるタンパク質は、異なるパピローマウイルス種間で高度に保存される。Ｌ２によりコードされる微量のキャプシドタンパク質は、Ｌ１タンパク質の場合よりも配列の差異を有する。
【００１３】
ＨＰＶは、皮膚の基底上皮細胞または内部組織の裏に感染し、従って、皮膚または粘膜（肛門）型に分類される。
【００１４】
ＨＰＶ ＤＮＡは、通常、良性の頚部の前駆的な病変において染色体外またはエピソームである。しかしながら、多くの子宮頸癌細胞ならびに子宮頸癌細胞株およびインビトロにおけるＨＰＶ形質転換ヒトケラチノサイトにおいて、ＨＰＶ ＤＮＡは宿主ゲノムに組み込まれる。
【００１５】
癌組織は、エピソームおよび組み込まれたＨＰＶ ＤＮＡを同時に含有し得るが、組み込みは、ＨＰＶ１６が関連する子宮頸癌よりもＨＰＶ１８が関連する子宮頸癌においてより頻繁に生じるように思われる。ＨＰＶ ＤＮＡの組み込みの間、ウイルスゲノムは、通常Ｅ１／Ｅ２領域で崩壊する。前記崩壊は、通常、Ｅ１およびＥ２領域の欠失を生じる。Ｅ６およびＥ７領域の転写を阻害するものが含まれるタンパク質をコードするＥ２の欠失は、Ｅ６およびＥ７発癌タンパク質の発現の非制御および増大を生じることが既知である。一方、Ｅ６およびＥ７の発現の増大は、宿主細胞の悪性の形質転換および腫瘍形成を生じることが観察された。宿主ゲノムＤＮＡへのＨＰＶウイルスの組み込みは、前癌病変（ＣＩＮ）においてポリクローナルからモノクローナルの状態への進行を伴い、これらの事象は、低いグレードから高いグレードの頸部新生物形成への進行において基礎的な役割を果たしている。
【００１６】
ＤＮＡコピー数不均衡（ＣＮＩ）のパターンは、頸部扁平上皮内病変（ＳＩＬ）グレード、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の状態および術後再発の特徴になる。いくつかのＣＩＮはＨＧ-ＳＩＬ（高いグレードのＳＩＬ）およびＬＧ-ＳＩＬ（低いグレードのＳＩＬ）において同様の頻度で見られる一方で、１ｑ、３ｑおよび１６ｑを含む他のものは、ＨＧ-ＳＩＬでは頻繁に見られるが、ＬＧ-ＳＩＬでは見られなかった。ＨＧ-ＳＩＬがＨＰＶ１６ Ｅ２遺伝子の欠失を示す場合、およびＨＧ-ＳＩＬがその後再発した場合に、有意に多いＣＮＩが存在した。データは、頸部ＳＩＬ進行におけるＣＮＩの経時的な獲得と一致する。Ｅ２遺伝子欠失に伴うＣＩＮのより高い頻度は、高いリスクのＨＰＶの組み込みがゲノムの不安定性と関連するというインビトロでの証拠を支持する。
【００１７】
入手可能な分子、臨床的および疫学的なデータに基づいて、ＨＰＶの一部は、明解に、子宮頸癌およびその前駆体に対する病因学的な原因である。ＨＰＶは、頸部の腺癌および扁平上皮細胞癌の約９０％で検出されている。ＨＰＶ感染の大多数は自然に除去されるが、潜伏性のＨＰＶ ＤＮＡ感染は頸部腫瘍から生じる転移において見られる。既知の高いリスク（または発癌性）のＨＰＶ型が子宮頸癌に対する重大なリスクファクターである一方で、他の癌におけるそれらの役割に対して次第に認識されている。実質的に、全ての子宮頸癌（９９％）はハイリスクＨＰＶの遺伝子を含有し、最も一般的な型は、１６、１８、３１、および４５である。他の高いリスクの型には、タイプ３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、および７３が含まれる。ＨＰＶ３１、３３、３５、５１および５２は、癌におけるよりも軽いまたは重篤な形成異常病変において一般的であるため、しばしば「中度のリスク」とみなされる。高いリスクの系統において、ＨＰＶ１６および１８は、子宮頸癌に最も密接に関与する。ＨＰＶ１６ ＤＮＡが扁平上皮細胞癌の５０％以上で見られる一方で、ＨＰＶ１８ ＤＮＡは腺癌の５０％以上で見られる。しかしながら、肛門性器のＨＰＶの大部分は、発癌ポテンシャルを有する。
【００１８】
ＨＰＶと宿主細胞との相互作用は、２つの主要な生物学的な結果を有する：
a）全ての肛門性器のＨＰＶは、低いグレードの扁平上皮病変を引き起こし、それは増殖性感染の形態学的な相関および正常なＥ６、Ｅ７の発現により及ぼされる不死化表現型である。前記不死化は、パピローマウイルスに固有のストラテジーであり、ＤＮＡ複製のための力を動員し、新しい子孫を産生する。
【００１９】
b）まれに、ＨＰＶは高いグレードの病変として認識される増殖性の上皮表現型を誘導し、浸潤性の子宮頸癌の細胞組織学的な前駆物質であり、非調節性のＥ６、Ｅ７の発現に関与する。
【００２０】
今日までに、ＨＰＶ感染に関連する臨床的な疾患、ＨＰＶ検出の適用の可能な領域および分類方法には、尖圭コンジローマ、硬化性苔癬（lichen sclerosus）、扁平上皮細胞過形成（squamosus cell hyperplasia）、外陰部上皮新生物形成（vulvar intraepithelial neoplasia）、扁平上皮細胞癌（squamosus cell carcinoma）、頸部上皮新生物形成（cervical intraepithelial neoplasia）、子宮頸癌、頸部の腺癌、肛門上皮新生物形成（anal intraepithelial neoplasia）、陰茎上皮新生物形成、喉頭の腺癌、反復性呼吸器乳頭腫症、およびいぼ状の表皮異形成が含まれる。最近の証拠は、ＨＰＶが男性の前立腺癌の発生においても同様に、ある一定の役割を果たすことを示す。
【００２１】
子宮頸癌前駆病変（上皮内の病変）または細胞学的な異常は、発明者George Papanicolaouによるパパニコロー試験として既知のパパニコロー染色剤を用いて試験される。前記技術は、ガラススライドに頸部切屑を塗抹すること、およびヘマトキシリンで肛門管から得られた細胞を核染色することを含む。しかしながら、Ｐａｐ試験は再現性を欠き、差し迫ったＨＰＶ誘発性の新生物形成を予測するのに不十分である。進行型のインサイチューの癌を有する患者の２５％が診断の数年前には正常なＰａｐ試験を呈するか、または最後の陰性の細胞診断は、再試験において子宮頸癌に対して均一に陽性であった。ますます多くなる問題は、陰性のＰａｐ試験の３年以内における浸潤性の癌の出現である。
【００２２】
偽陰性の現在の許容可能な割合（すなわち、塗抹サンプルよりも組織生検を見る病理学者の専門家団によると異形成を有するが、決まった塗抹標本スクリーニングを通しては診断されない女性）は、およそ５〜１０％であるが、最近の研究では実際にはずっと高いことが示されている。さらに、約７〜８％の場合において、Ｐａｐ試験は、未確定の優位性の異型扁平上皮細胞細胞（ＡＳＣＵＳ）を示す。付加的な２０〜３０％の場合において、Ｐａｐ試験は、炎症性細胞の存在により分析に不十分である。頸部の場合において、扁平いぼ（膣鏡検査により可視化される）は、予め悪性の病変であることが疑われる。扁平いぼのインサイチューにおける癌および子宮頸癌への組織病理学的な進行については、よく述べられている。
【００２３】
上皮内の病変は、一般的に、偶発的なＨＰＶ感染を伴う女性の間で初期の事象であり、偶発的なＨＰＶ-１６またはＨＰＶ-１８感染と生検で確認されたＣＩＮグレード２〜３との間のインターバルは、相対的に短く思われる。しかしながら、研究は、リスクの高いＨＰＶ型への感染が一過性であることを示す。ＨＩＶ感染の持続は、実質的に、高いグレードの上皮内病変および浸潤性の疾患への進行のリスクを増大させる。
【００２４】
疾患の進行は変化しやすく、ＨＰＶの喪失または持続を伴う。有意な数の異形成病変は自然に消失し、進行しないものもあるが、いくつかは急速に進行する。
【００２５】
子宮頸癌における高いリスクの表現型の特別な役割の結果として、ならびに他の病理学的な状態に対する異なる、重要な、特有の型のパターンのため、ＨＰＶの同定および分類は非常に重要である。加えて、異なる型の高いリスクのＨＰＶは、感染した個体に異なるリスクをもたらす。例えば、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８は、他のＨＰＶ型よりも高いグレードの頸部異形成および癌において決まって同定される。ＨＰＶ１６は扁平上皮癌の場合により多く、ＨＰＶ１８は腺癌の場合により多い。
【００２６】
ＨＰＶ診断
1980年から、いくつかのウイルスゲノムはクローン化され、ＨＰＶの診断において型特異的なプローブとして使用されている。フィルターハイブリダイゼーション技術は、決まった細胞診断に対する試料と平行して採取される頸部切屑においてＨＰＶ ＤＮＡを検出するために使用される。ＨＰＶ ＤＮＡプローブは、臨床的な由来の組織サンプルにおいてＨＰＶ ＤＮＡを検出するために、サザンおよびハイブリッドドット／サザン分析のような異なるハイブリダイゼーションに基づく試験において使用される。加えて、精製した生検ＤＮＡおよび保存された組織検体におけるインサイチューハイブリダイゼーション、すなわち核酸プローブに対して相補的な配列の無処置の細胞内における直接的な局在化について示されている。
【００２７】
リバースブロッティング（reverse-blotting）法を利用するＨＰＶ ＤＮＡ型を検出するための方法は報告されている。前記方法は、４つの異なるＨＰＶ型に由来するゲノムＤＮＡが結合する膜を形成すること、および生物学的なサンプルに由来する標識化されたＤＮＡを前記膜に結合したＤＮＡとハイブリダイズすることを含む。
【００２８】
型特異的な反応を用いてヒトパピローマウイルスの型を検出するために、多数の方法が開発されており、同時に１つのＨＰＶ型を検出する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、増幅するためならびにＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ ＤＮＡの存在を検出するため、特に口腔および頸部の生検においてＨＰＶ１６を検出するために使用される。プライマーの混合物は、１a、５、６a、８、１１、１６、１８、および３３の型におけるＨＰＶ配列のＰＣＲによる特異的な増幅に対して述べられている。米国特許第4,683,195号および4,683,202号では、ＰＣＲおよび試料における核酸配列の存在および非存在を検出するためのＰＣＲの使用について開示されている。
【００２９】
本明細書の一部として援用される米国特許第5,447,839号は、ＨＰＶの検出方法および分類について開示している。この方法において、サンプルにおけるＨＰＶ ＤＮＡ配列は、発癌性および非発癌性の両方のＨＰＶ型を増幅するコンセンサスプライマーを用いてＰＣＲにより増幅される。それ故、サンプルにおけるＨＰＶの存在は、増幅産物の形成により示される。ＨＰＶは、ＤＮＡの増幅領域とハイブリダイズする型特異的なＤＮＡプローブを用いて分類される。前記特許において開示されている型特異的なハイブリダイゼーションプローブは、５つの既知の発癌性のＨＰＶの型、すなわちＨＰＶ-６、ＨＰＶ-１１、ＨＰＶ-１６、ＨＰＶ-１８およびＨＰＶ-３３を同定し、および区別することができる。
【００３０】
高いリスクの型のＨＰＶを検出するための種々の方法が考案されている。これらの多くは、ＨＰＶゲノムにおける独特の配列の検出に依存する。例えば、特定の高いリスクのＨＰＶ株の遺伝子の一部と相補的なＤＮＡまたはＲＮＡプローブは、患者のサンプルにおける高いリスクのＨＰＶの特定の株の存在に対するスクリーニングにおいて有用であるとして、当該分野で報告されている（本明細書の一部として援用される米国特許第4,849,332号）。本明細書の一部として援用される米国特許第5,705,627号は、変性または混合したコンセンサスプライマーを用いてＨＰＶ ＤＮＡを増幅および検出するためにＰＣＲを使用すること、ならびに遺伝子型に特異的なＤＮＡプローブの混合物を用いて分類することを報告する。コンセンサスプライマーを使用する他の例は、米国特許第5,364,758号およびKleter, B. et al., Am. J. of Pathology, vol. 153, No. 6, 1731-39 (1998)に見られる。これらの参考文献は、本明細書の一部として援用される。
【００３１】
商業的な方法が利用可能であり、ハイブリダイゼーションおよびシグナル増幅に基づく（Hybrid Capture II, Digene Corp.）。しかしながら、この方法は、ＨＰＶゲノムのいくつかの部分の高い配列相同性により、特定の問題があるようである。
【００３２】
増幅に基づく方法は、感受性（増幅）の原因である部分からなり、特異性（ハイブリダイゼーションによる検出）の原因である部分から分離される。これらの技術は、増幅されるゲノム部分、プライマーの数および検出の技術において異なる。最もよく使用される増幅技術は、ＧＰ5＋-ＧＰ6＋（通常のプライマー-ＧＰ）、ＭＹ9-ＭＹ11、ＰＧＭＹ、ＳＰＦ、Ｌ1Ｃおよび型特異的なＰＣＲ反応である。最もよく使用される検出技術は、配列特異的なハイブリダイゼーション、制限断片長多型（ＲＥＬＰ）およびラインプローブアッセイ（ＬｉＰＡ）である。ときどき、稀であるが、配列決定または他の方法が適用される。増幅の分析的な性質は、広い範囲で変化し、増幅され得る遺伝子型の数、分析感度、遺伝子型の増幅／検出の特異性および遺伝子型間の感受性の違いにより特徴付けられる。
【００３３】
ＨＰＶリアルタイムＰＣＲ
ヒトパピローマウイルス-１６（ＨＰＶ-１６）ウイルス負荷は、高いグレードの頸部病変の存在を予測する生物マーカーになり得る。いくつかのリアルタイムＰＣＲ分析は、ＨＰＶ-１６ウイルス負荷（ＨＰＶ-１６ Ｌ１、ＨＰＶ-１６ Ｅ６、およびＨＰＶ-１６ Ｅ６ ＰＧ）を正確に測定するために開発された。前記方法は、リアルタイムでＨＰＶ検出を行うことを我々に教示するが、同時に１つの遺伝子型のみ検出される。
【００３４】
若年発症再発性呼吸器乳頭腫症を伴う患者におけるＨＰＶ ＤＮＡの同定は、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンリアルタイムＰＣＲを用いて行われた。前記方法は、リアルタイムＰＣＲ反応において複数のヒトパピローマウイルス遺伝子型を検出するために使用される。しかしながら、前記増幅方法は、本発明において記載されているものとは異なる。産生される単位複製配列は、当該分野におけるプローブに基づくリアルタイム複製に対して認められているものより長い（約４５０ｂｐ）。好ましい長さは、１５０ｂｐ以下である。前記検出方法は、非特異的であり、遺伝子型を正確に区別することができず、ＨＰＶの型６、１１、１６、１８、３１、および３３に対する型特異的なプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲにより、続いてウイルス分類する必要がある。これは、ヒトパピローマウイルスの型を単離して再び検出するが、同時に１の遺伝子型のみである。
【００３５】
同様に、一般的な方法でヒトパピローマウイルス遺伝子型を検出するために単一チューブを組み込んだ反応を用いる方法が使用された。しかしながら、群の特異的な検出については述べられていない。
【００３６】
他の方法は、２段階のアプローチを用いて遺伝子型およびウイルス負荷データの両方を評価することにより、性交のパートナーにおいてヒトパピローマウイルスＤＮＡを検出するために使用された。前記方法は、ＧＰ５＋／６＋ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用し、続いてリバースライン（reverse-line）ブロット分析を行った。子宮頸部および陰茎の切屑サンプルにおいて４５ＨＰＶ型を検出するために使用された。ウイルス負荷は、ライトサイクラー（Light Cycler）に基づくリアルタイムＰＣＲ分析により、ＨＰＶの型１６、１８、３１、および３３に対して陽性の切屑サンプルにおいて続いて決定された。ＧＰ５＋／ＧＰ６＋ ＰＣＲは、１５０ｂｐ長の単位複製配列を生じ、リアルタイムプローブに基づく方法の適用を可能にする。しかしながら、前記方法は、１回の反応で複数の遺伝子型または群を検出することはできない。
【００３７】
核酸増幅の均質なリアルタイム検出および定量のための方法は、制限酵素消化を用いて考案された。この均質なシステムにおいて、検出は、制限酵素認識配列をコードするＤＮＡの短い切片により隔てられた５’末端において、レポーターおよびクエンチャー部分を含有するプライマーにより媒介される。一本鎖の形態において、蛍光レポーターに由来するシグナルは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により消光される。しかしながら、プライマーが二本鎖の単位複製配列中に組み込まれるにつれ、反応中に存在する制限酵素がレポーターおよびクエンチャーが結合するＤＮＡを切断し、レポーターの非制限的な蛍光を可能にする。このシステムは、切断可能なエネルギー移動標識が結合したヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６のＥ６遺伝子に対して特異的なプライマーを用いて試験され、ＨＰＶ１６陽性ＤＮＡを増幅するために使用された。前記方法は、複数の遺伝子型または群の検出に対して使用することができない。
【００３８】
子宮頸癌の高いリスクを伴うヒトパピローマウイルスの型の同時の定量のためのリアルタイムＰＣＲに基づくシステムについても記載されている。ＨＰＶ１６、-１８、-３１、-３３、-３５、-３９、-４５、-５２、-５８、および-６７の検出および定量のためのリアルタイムＰＣＲ分析が開発されている。前記分析は、各患者サンプルに由来する３つの平行したリアルタイムＰＣＲに基づく：（i）反応１は、３つの異なるフルオロフォアを用いてＨＰＶ１６、-３１、-１８、および-４５を検出および定量する（ＨＰＶ１８および-４５は、１つのプローブを用いて一緒に検出および定量された）；（ii）反応２は、再び３つの異なるフルオロフォアを用いてＨＰＶ３３、-３５、-３９、-５２、-５８、および-６７を検出および定量し、３つの異なるプローブのみが使用された（ＨＰＶ３３、-５２、-５８、および-６７は、一緒に検出および定量された）；（iii）反応３は、ヒトの単一のコピー遺伝子の量を検出および定量する（ＨＭＢＳ，ホモサピエンスヒドロキシメチルビランシンターゼ；GenBank受付番号M95623.1）。反応１は、全部で７のＰＣＲプライマーおよび３のプローブを含み、反応２は、全部で７のＰＣＲプライマーおよび３のプローブを含み、反応３は、２のＰＣＲプライマーおよび単一のプローブを含む。前記方法は、TaqMan加水分解性リアルタイムＰＣＲプローブを適用する。１つの反応において３のみのプローブを使用することにより、同じ反応において最大６の遺伝子型を検出することが述べられている。前記方法は、遺伝子型間の配列の同一性が限定されるため、複数のＨＰＶ遺伝子型を検出する反応を設計するための一般的な教示として使用できない。
【００３９】
発癌性のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の検出および定量のための方法は、蛍光５’エキソヌクレアーゼ分析を用いることにより以前に開発された。前記方法はＨＰＶの型１６、１８、３１、３３、および３５に対する型特異的なプローブを用いたシングルＰＣＲにおいて、Ｅ１オープンリーディングフレームの３’部分に由来する１８０ｂｐ断片を増幅することに基づく。前記プローブは、各分析ごとに、単独または３以内のプローブを組み合わせて使用されてよい。前記方法は、各分析ごとに３のプローブに制限された。
【００４０】
ＳｙｂｒＧｒｅｅｎおよび分子標識ポリメラーゼ連鎖反応を用いたヒトパピローマウイルスの検出および遺伝子型決定のための方法について述べられている。前記分析は、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎにより一般的なＨＰＶ検出が達成され、ＨＰＶ-ＤＮＡ単位複製配列を報告し、リアルタイム分子標識ＰＣＲによりいくつかの公知のＨＰＶ型（ＨＰＶ-６、-１１、-１６、-１８、-３１、-３３、-４５）の遺伝子型が決定される。前記２段階の方法は、１回のＰＣＲ反応において３つの別々に標識された分子標識を使用する。
【００４１】
他の方法についても述べられている：スコーピオン（Scorpion）として既知の変性ＨＰＶ自己プロービング蛍光プライマーおよびスコーピオンの混合物は、尾状の一般的なプライマーとの接合において使用された。尾状のプライマーを利用することにより、単一のスコーピオンが多くの異なるＨＰＶ単位複製配列を認識することを可能にするコンセンサス部位を導入することが可能となった。これは、理論的に４０を超える異なるＨＰＶ型を検出できる二段階法である。１０のスコーピオン類のプライマーがこの研究において使用された（ＨＰＶ６、１１、１６、１８、３１、３３、３９、４５、５１、５６）。各スコーピオンのプライマー配列は、型特異的であり、JacobsらのＧＰ６＋プライマーと同じ位置に位置する。前記方法は、ＨＰＶの存在を検出するための一般的な検出方法および陽性サンプルを分類するために使用される型特異的な検出方法を教示する。プローブ交差反応を生じる複合的なプローブを用いたスクリーニングの問題は解決されていない。実際に、前記方法は、１の反応において複数のプローブを使用することを避けている。
【００４２】
リアルタイムライトサイクラー（登録商標）およびタクマン（TaqMan：登録商標）分析を用いたリアルタイムＰＣＲに基づくＨＰＶ検出方法は、頸部切屑標本におけるヒトパピローマウイルス負荷を評価するための通常のＧＰ５＋／６＋ ＰＣＲ／酵素免疫測定法（ＥＩＡ）と比較された。両方のリアルタイムＰＣＲ分析は切屑標本におけるＨＰＶ１６負荷を同様に決定したが、これらの分析とＧＰ５＋／６＋ ＰＣＲ／ＥＩＡとの間であまり一致せず、後者の方法はＨＰＶ ＤＮＡの定量に適さないことを示唆する。ＨＰＶ６／１１およびＨＰＶ１６／１８ＤＮＡ負荷も、同時に２のＨＰＶ遺伝子型を検出するリアルタイム蛍光定量ＰＣＲにより決定される。
【００４３】
コンセンサスプライマー設計方法
１のみのヒトパピローマウイルス核酸分子、例えばＬ１の一部をコードする核酸分子を検出するために使用されるプライマーおよびプローブは、例えばＯＬＩＧＯ（Molecular Biology Insights Inc., Cascade, Colo.）のようなコンピュータプログラムまたはプライマー３を用いて設計することができる。これらのオリゴヌクレオチドの適切な特徴は、当業者に周知である。
【００４４】
ＰＣＲプライマー設計の一般的な原理についての多くの文献があり、多くのソフトウェア処理に導き、とりわけプライマー３および種々の拡張子である。対の適合性に対してプライマーを試験するための高速の動力学的なプログラミング構築も開発されている。マルチプレックスＰＣＲの適用は、過去10年間に渡って着実に増加しており、より複雑なプライマー選択プロトコルを必要とする。異なるアルゴリズムが特定の目的に好都合であってよく、または、特定の技術の土台（platform）に対して設計されてよい。一般的に、単一の試験の多重化（multiplexing）レベルを最大にするためのプライマー対の同定の問題点は、ＮＰ-完全（NP-complete）であることが示されている。３’塩基相補性を除去する一方、生成物の大きさの制限に対処する近似アルゴリズムが存在する。
【００４５】
本発明の方法は、マルチプレックスＰＣＲの設計、特にコンセンサスプライマーの設計の問題点に関する。この問題に対する一般的なアプローチは、標的の数よりも少ないプライマー対を用いて多数の標的を増幅するためのコンセンサスプライマーを設計することである。さらに、設計は、コンセンサスなヘルペスウイルスにより例示されるマルチプレックスＰＣＲアッセイの設計ルールも同様に考慮に入れる。
【００４６】
コンセンサス-変性ハイブリッドオリゴヌクレオチドプライマー（ＣＯＤＥＨＯＰｓ）に基づいて、遠く関連する遺伝子配列を同定する特定のアプローチが開発された。高いレベルの保存を有するタンパク質の短い領域は、多重にアラインされたタンパク質配列の連続したブロックと説明される。ＣＯＤＥＨＯＰは、これらの保存された配列ブロックに由来し、それらの間の領域を増幅するためにＰＣＲにおいて使用される。ＣＯＤＥＨＯＰ ＰＣＲプライマーは、３’変性コア領域にそれぞれ異なる配列を含むプライマーのプールからなり、各プライマーは配列ブロック内の標的３-４保存アミノ酸をコードする可能なコドンの組み合わせの１つを提供する。加えて、プールにおける各プライマーは、標的のモチーフに隣接する保存されたアミノ酸をコードする各位置において、最も確実なヌクレオチドに由来する同一の５’コンセンサスクランプ領域を有する。増幅は、アニーリングおよび３’変性コアにおいて標的の鋳型と最も類似性を有するプールにおけるプライマーの伸長により惹起される。アニーリングは、標的の鋳型と部分的に一致する５’コンセンサスクランプにより安定化される。一度プライマーが取り込まれると、それに続く増幅サイクルに対する鋳型となる。全てのプライマーが５’コンセンサスクランプ領域において同一であるため、全てが続く増幅の回転の間に高い厳密さでアニールする。この方法は、ウイルス学の分野でも同様に使用される。前記アプローチは、関連する配列の効果的な複製を達成するために特異的な配列ブロックが使用される点で本発明の方法とは異なる。Codehopプログラムは未知の標的を増幅するためのプライマーを見出すが、ＤＮＡ配列の代わりにタンパク質配列アラインメントを用いて研究する。
【００４７】
コンセンサス／変性プライマーの設計に関する多くの方法があるが、それらは一般的に、基本的に同じ問題を解決するために異なるアルゴリズムを使用し、関連する標的配列の効率的な増幅のための最も適合したプライマーを同定する。プライマー間の協同作用は、考慮に入れない。
【００４８】
もう１つのアプローチは、PriFiプログラムである（http://cgi-www.daimi.au.dk/cgi-chili/PriFi/main）。これは、予備的な配列情報が入手可能でない種におけるゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅に有用なプライマー対を設計する。前記プログラムは、系統的に関連する種に由来するＤＮＡ配列のアラインメントを用いて動作し、プライマーが他の系統的に関連する種におけるオルソロガスな配列を増幅する高い可能性を有するように、多くの基準を満たす可能な変性プライマー対のリストを出力する。しかしながら、前記プログラムは、プライマー間の協同作用の概念を使用しない。
【００４９】
ＤＮＡ配列のアラインされた群においてＰＣＲプライマーを設計するための単位複製配列（Amplicon）プログラムは、同様の方法である。単位複製配列に対する最も重要な適用は、ある一定の分類学的な群に由来するＤＮＡ領域を増幅するが、他の分類学的な群に由来するオルソロガスな領域を増幅しない、「群特異的な」ＰＣＲプライマー組の設計である。プライマー間の協同作用は考慮に入れなかった。
【００５０】
多くの関連する増幅標的をターゲッティングすることにより検出するための増幅反応プライマーの設計は、文献において直接的なルールがない。しかしながら、プライマー間の予期せぬ相互作用および増幅源に対する競合が反応の感度を低下させ、より多くのプライマーを使用することは、特定の産物を産生するミスプライミングをする可能性が大きくなり、さらに前記源に対して競合することを意味すると一般的に受け入れられている。
【００５１】
子宮頸癌のスクリーニングにけるＨＰＶ試験の潜在的な役割は、存在する基盤に高度に依存する。効果的な、よく組織化された、細胞学に基づくプログラムが挿入された臨床的な設定に対して、問題は、ＨＰＶ試験を現存のプログラムに加えるかどうか、ならびに費用対効果の問題、クオリティコントロール、および現在の実務に対する付加価値が前面に出るかどうかである。対照的に、スクリーニングが存在しないか、または炎症の塗抹の高い割合による低品質の細胞診断もしくは固有の限定のため非効率的である設定に対しては、感度、特異性、および試験方法の単純さのより基本的な問題が重要になる。
【００５２】
リアルタイムＰＣＲ技術は、上述した両方のシナリオにおける要求を満たし、且つ超える特徴を提供する。最近の研究では、頸部悪性腫瘍（ＣＩＳ）への進行の決定因子として最も高頻度の高いリスクのＨＰＶ型のいくつかに対するＨＰＶ ＤＮＡの量を決定した。細胞当りのコピー数の範囲は、ＨＰＶ型の間で相違がないが、最も高いウイルス負荷の場合の百分位数におけるＣＩＳに対するオッズ比は、ＨＰＶ３１（ＯＲ＝3.2; 95％ ＣＩ＝1.1−9.1）またはＨＰＶ１８／４５（ＯＲ＝2.6; 95％ ＣＩ＝1.0−6.4）よりもＨＰＶ１６の方が実質的に高い（ＯＲ＝36.9; 95％ ＣＩ＝8.9−153.2）。それ故、ＨＰＶウイルス負荷は、塗抹標本が扁平上皮の異常に対して陰性である場合、あるステージにおける子宮頸部ＣＩＳの将来のリスクの指標になり得る。リアルタイム技術は、現存のＨＰＶ検出法よりも正確にウイルス負荷を測定するための前提を提供する。しかしながら、１つの反応で３より多いヒトパピローマウイルスの型を検出できるリアルタイム増幅および検出方法はない。また、臨床的に重要なウイルスの群、例えば低いリスクまたは高いリスクのヒトパピローマウイルスの群を１の反応で検出する方法は開発されていない。
【００５３】
正確な自己サンプルＨＰＶ試験は、大いに関連がある。そのような試験は、骨盤の試験を受けることができないまたは気が進まない女性を調べる可能性を開く。開発中の領域において、これは現在の実務を超える利点を提供する。組織的なスクリーニングが適した領域において、自己サンプリングは、通常のスクリーニングを受けることを拒否する女性に達するための付加的なアプローチを提供し、短い間隔で経過観察の試験が必要とされるＨＰＶ陽性細胞診断陰性の女性の治療後の調査またはモニタリングにおいても役割を有する。患者に近い試験特性を用いる自己サンプリングアプローチは、スクリーニングプログラムの質および受けやすさを改善する。
【００５４】
従来のおよび予備的なスクリーニング市場の両方を標的とするＨＰＶ試験は、これらのニーズの全てを満たすべきである。リアルタイムＰＣＲ技術は、これらの要求に技術的に取り組むために特に適する。前記技術に固有の単純性は、基本的な障壁を減少させ、他の技術よりも費用対効果が高い。一方、リアルタイムＰＣＲ技術は、分析感度およびＨＰＶ検出の特異性をより重大に増大させ、これらのパラメータの臨床的な対応の改善のより堅い基礎を提供する。内標準は、システムにクオリティコントロール能を加える。
【００５５】
ＨＰＶ検出の患者に近い適用において、リアルタイム技術は最も実行可能なオプションである。患者に近い試験は、予備的なスクリーニングにおいて次の分野であり、リアルタイム技術は、他の病原体の場合に、この分野において既に多くの注意を引き付けており、実務に付加価値を与えることができる。
【００５６】
他の方法と比較したリアルタイムＰＣＲの増大した感度、ならびにサンプル保持および増幅された産物のリアルタイム検出を含むリアルタイムＰＣＲにより与えられる特性の改善は、臨床的な研究室におけるヒトパピローマウイルス感染の決まった診断に対するこの技術の実行の可能性を示す。
【００５７】
第１の側面において、本発明は、少なくとも１の病原体の存在を検出する方法であって、少なくとも４のプローブを含んでなる組とサンプルから得られる核酸を接触させることを含んでなる方法を提供し、前記プローブのそれぞれは、４または５対の相補的な塩基が隣接する病原体に由来する配列と相補的な配列を含んでなり、前記塩基は、病原体に由来する核酸とのハイブリダイゼーションの非存在下で幹構造を形成し、前記プローブは、第１の相互作用標識および第２の相互作用標識を用いて標識され、前記プローブを病原体に由来する核酸とハイブリッド形成させることにより、検出されるシグナルに変化を引き起こす。
【００５８】
ここで使用される場合、「核酸」は、ＤＮＡならびにｍＲＮＡおよびｈｎＲＮＡのような種々の形態のＲＮＡを意味する。核酸は、１本鎖または２本鎖であってよい。
【００５９】
ここで使用される場合、「病原体」は、動物の正常な生理を乱す生物学的な病原体であり、疾患および疾病を引き起こすか、または関連する。病原体は、原因物質、すなわち、患者が病原体に感染することにより、単独またはもう１つの他の補因子の存在下で疾患を引き起こすものであってよい。
【００６０】
好ましくは、前記病原体は、性的に伝染する疾患を伴う生物体である。ここで使用される場合、「性的に伝染する疾患を伴う生物体」という用語は、性感染症に罹患している患者において存在する生物体を意味する。性感染症に関連する生物体の例には、クラミジアに関連するクラミジア・トラコーマ、淋病に関連する淋菌、陰部疱疹に関連するヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）、性器いぼに関連するヒトパピローマウイルスおよび梅毒に関連する梅毒トレポネーマが含まれる。前記生物体は、好ましくはウイルスであり、より好ましくはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）である。前記方法は、好ましくは、１以上のＨＰＶ遺伝子型の存在を検出するために使用される。
【００６１】
本発明の方法は病原体の検出に関するが、この方法は、いずれかの生物体、特に１以上の亜種を含む病原体、または関連する病原体の存在または非存在を検出するために使用され得る。ここで使用される場合、「関連する病原体」は、同じ分類、属または種に由来する病原体を意味し、高いレベルの遺伝的類似性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは９０％の同一性を有する。前記関連する病原体は、好ましくはウイルスであり、より好ましくはヒトパピローマウイルスである。
【００６２】
各プローブは、好ましくは以下の一般構造を有する。
【００６３】
３’−ステム−Ｆ−ＨＰＶ相補配列−Ｆ’−ステム’−５’
ＦおよびＦ’は、任意の結合配列であり、隣接する塩基対に対して相補的な配列、ステムおよびステム’を結合する。ステムおよびステム’は、溶液においてダブルヘリックスステム構造を形成する相補的な塩基対により形成される配列である。これらの配列は、好ましくは回文構造である。プローブの各末端には、好ましくは４の塩基が存在する。ステムを構成する塩基は、好ましくはＣ−Ｇ対、好ましくは１、２、３、４または５のＣ−Ｇ対を含んでなる。ステムは、好ましくは配列ＣＧＣＧを有する。
【００６４】
我々の実験において、４の塩基対−ステム分子標識は、検出可能な標的ＤＮＡの非存在下において、次第に予期せぬ誤った増幅シグナルを引き起こす相互作用をせず、これはステム構造のオンオフ速度（on-off rate）に依存するように見える。時折、５円きついステム分子標識は、反応を最適化するために使用される必要がある。シングルプレックスおよびマルチプレックス検出の両方において、より長いステムを有する標識は、制御不能な誤った増幅シグナルを発する。より短いステムの標識は、融解温度が低すぎてリアルタイム増幅反応において有用でないことが通常である。
【００６５】
「相互作用する標識」という用語は、ここで使用される場合、標識の対の他方と協同作用する標識の対の１つを意味する。この協同作用は、プローブがステムループ構造を有する場合のように標識が近接している場合に生じる。プローブが相補的な核酸にハイブリダイズした場合、標識間の協同作用は減少または完全に除去され、それらの間の距離は増大する。前記標識は、プローブの各末端に結合し、好ましくは、ステムループ構造を形成する相補的な塩基上に、または隣接して結合する。プローブがある立体構造から他の構造に変化する、すなわちステムループから開いた構造に変化する場合、シグナルにおける変化が検出されることを提示する標識がどこに結合するかは重要ではない。プローブが開いた状態にある場合、すなわち、相補的な核酸配列にハイブリダイズしている場合、例えば、１つの相互作用する標識が第２の相互作用する標識に由来するシグナルを消す場合、シグナルにおける変化はシグナルにおいて増大し得る。あるいは、シグナルにおける変化は、相補的な核酸配列にハイブリダイズしてプローブが開いた状態の場合、例えば、第１の相互作用する標識が第２の相互作用シグナルからシグナルを放出させた場合にシグナルが減少する。
【００６６】
好ましい実施形態において、前記相互作用する標識は、ＦＲＥＴドナーおよび対応するＦＲＥＴアクセプターである。
【００６７】
ＦＲＥＴ技術（例えば、米国特許第4,996,143号、5,565,322号、5,849,489号、および6,162,603号を参照されたい）は、ドナーおよび対応するアクセプターの蛍光部分が互いにある一定の距離内に位置する場合、エネルギーの移動は、可視化または他の検出および／または定量化できる２つの蛍光部分の間で起こるという事実に基づく。ここで使用される場合、ＦＲＥＴ技術構造は、ヒトパピローマウイルスの存在または非存在を検出するために分子標識技術を利用する。分子標識技術は、ドナーの蛍光部分およびアクセプターの蛍光部分で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用する。前記蛍光標識は、典型的に、プローブの各末端に位置する。分子標識技術は、二次構造形成（例えばヘアピン）を可能にする配列を有するプローブオリゴヌクレオチドを使用する。プローブ内における二次構造形成の結果として、プローブを溶液中に存在させた場合、両方の蛍光部分は空間的に近接する。標的核酸（すなわちＨＰＶ遺伝子型核酸）とハイブリダイズした後、プローブの二次構造は破壊され、蛍光部分は互いに離され、適切な波長の光で励起させた後、第１の蛍光部分の発光は、ＨＰＶ遺伝子型に由来する核酸の非存在下で検出された場合とは異なる。
【００６８】
ドナーおよび対応するアクセプターの蛍光部分に関してここで使用される場合、「対応する」とは、ドナー蛍光部分の励起スペクトルと重複する発光スペクトルを有するアクセプター蛍光部分を意味する。アクセプター蛍光部分の発光スペクトルの波長極大は、好ましくは、ドナー蛍光部分の励起スペクトルの波長極大より少なくとも１００ｎｍ大きいべきである。従って、効率的な無放射のエネルギー伝達は、その間で生じ得る。
【００６９】
蛍光ドナーおよびアクセプターの部分は、一般的に、（a）高い効率のフォースター（Forster）エネルギー伝達；（b）大きな最終的なストークスシフト（＞100nm）；（c）可視スペクトルの赤い部分（＞600nm）への可能な限りの発光のシフト；および（d）ドナー励起波長における励起により生じるラマン水蛍光放出よりも高い波長への発光のシフトに対して選択される。例えば、ドナー蛍光部分は、レーザー線に近い励起極大（例えば、ヘリウム−カドミウム442nmまたはアルゴン488nm）、高い吸光係数、高い量子収量、およびその蛍光放出と対応するアクセプター蛍光部分の励起スペクトルとの良好な重複を有するように選択される。対応するアクセプター蛍光部分は、高い吸光係数、高い量子収量、その励起とドナー蛍光部分の発光との良好な重複、および可視スペクトルの赤い部分における発光（＞600nm）を有するように選択されてよい。
【００７０】
ＦＲＥＴ技術において種々のアクセプター蛍光部分と共に使用することができる代表的なドナー蛍光部分には、フルオレセイン、ルシファーイエロー、B-フィコエリトリン、9-アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローVS、4-アセトアミド-4'-イソチオ-シアナトスチルベン-2,2'-ジスルホン酸、7-ジエチルアミノ-3-(4'-イソチオシアナトフェニル)-4-メチルクマリン、スクシンイミジル（succinimdyl） 1-ピレンブチレート、4-アセトアミド-4'-イソチオシアナトスチルベン-2,2'-ジスルホン酸誘導体、任意に置換されたピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドール、ベンズインドール、オキサゾール、ベンズオキサゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、4-アミノ-7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール、シアニン、カルボシアニン、カルボスチリル、ポルフィリン、サリチレート、アントラニレート、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、クマリン、ポリアザインダセン、キサンテン、オキサジン、ベンズオキサジン、カルバジン、フェナレノン、ベンズフェナレノン、カルバジン、オキサジン、4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン、フルオロフォアセイン（fluorophorescein）、ローダミン、ロドール（rhodol）、5-カルボキシフルオロフォアセイン（FAM）、5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸（EDANS）、アントラニルアミド、テルビウムキレート、リアクティブレッド4、テキサスレッド、ATTO色素、EVO色素、DYO色素、Alexa色素およびBODIPY色素が含まれる。
【００７１】
使用されるドナー蛍光部分に依存する代表的なアクセプター蛍光部分には、LC.TM.-RED 640（ライトサイクラー.TM.-レッド 640-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル）、LC.TM.-RED 705 (ライトサイクラー.TM.-レッド 705-ホスホラミダイト)、CY5およびCY5.5のようなシアニン色素、リサミンローダミンB スルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアナート、ローダミンｘイソチオシアナート、エリスロシンイソチオシアナート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテートまたは他のランタニドイオンのキレート（例えば、ユーロピウムまたはテルビウム）が含まれる。ドナーおよびアクセプター蛍光部分は、例えば、Molecular Probes (Junction City, Oreg.)またはSigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.)から得られる。
【００７２】
好ましくは、前記アクセプター蛍光部分はクエンチャーである。ここで使用される場合、クエンチャーは、蛍光標識により放出される蛍光を減少させる部分である。これには、蛍光の放出の完全なおよび部分的な阻害が含まれる。阻害の程度は、クエンチャーが除去された場合に蛍光における変化が検出できる限り重要でない。
【００７３】
クエンチング部分は、好ましくは、任意に置換されたフェニル、ナフチル、アントラセニル、ベンゾチアゾール、ベンゾキサゾール、もしくはベンズイミダゾール、ピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドール、ベンズインドール、オキサゾール、ベンズオキサゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、4-アミノ-7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール、シアニン、カルボシアニン、カルボスチリル、ポルフィリン、サリチレート、アントラニレート、アズレン、ぺリレン、ピリジン、キノリン、クマリン、ポリアザインダセン、キサンテン、オキサジン、ベンズオキサジン、カルバジン、フェナレノン、ベンズフェナレノン、カルバジン、オキサジン、4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダゼン、フルオロフォアセイン、ローダミン、ロドール、5-カルボキシフルオロフォアセイン(FAM)、5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸(EDANS)、アントラニルアミド、テルビウムキレート、リアクティブレッド4、ダブシル（dabsyl）、ニトロチロシン、マラカイトグリーン、テキサスレッド、ジニトロベンゼン、ATTO色素、EVO色素、DYO色素、Alexa色素およびBODIPY色素からなる群より選択される。
【００７４】
ＦＲＥＴドナーおよびアクセプターまたはクエンチャーの適切な対の選択は、当業者の知識の範囲内である。
【００７５】
一般的に、ＦＲＥＴがある一定量で検出され、ヒトパピローマウイルス核酸分子を欠いているサンプルにおけるＦＲＥＴの量と実質的に異なる場合、個体におけるヒトパピローマウイルス感染の存在が示される。核酸とプローブのハイブリダイゼーションはドナーとアクセプター部分との間の距離を増大させ、それ故、ＦＲＥＴ相互作用が減少する。検出される波長発光における変化は、クエンチャーが使用される場合のように、発光または異なる波長における発光における増大であり得る。あるいは、非クエンチングドナーアクセプターが使用される場合、発光または異なる波長における発光における減少があってよい。
【００７６】
蛍光分析は、例えば、光子計数落射蛍光顕微鏡システム（photon counting epifluorescent microscope system）（特定の範囲において蛍光放出をモニタリングするのに適したダイクロイックミラーおよびフィルターを含む）、光子計数光電子倍増管システム、または蛍光光度計を使用して行われてよい。エネルギー伝達を開始するための励起は、アルゴンイオンレーザー、強度の高い水銀（Ｈｇ）アークランプ、光ファイバーの光源、または望ましい範囲における励起に対して適切にフィルターされる他の強度の高い光源を使用して行われてよい。
【００７７】
ドナーおよびアクセプターの蛍光部分は、好ましくは、結合配列においてプローブに結合する。ドナーおよびアクセプターの蛍光部分は、リンカーアームを介して適切なプローブオリゴヌクレオチドに結合してよい。リンカーアームはドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分との間の距離に影響を与えるため、各リンカーアームの長さも重要である。本発明の目的において、リンカーアームの長さは、ヌクレオチド塩基から蛍光部分がオングストローム（ＡＮＧ）の距離である。一般的に、リンカーアームは、約１０〜約２５ＡＮＧである。リンカーアームは、WO 84/03285に記載されている種類であってよい。WO 84/03285は、リンカーアームを特定のヌクレオチド塩基に結合させる方法および蛍光部分をリンカーアームに結合させる方法についても記載されている。
【００７８】
プローブは、適切な条件下で、性感染症に関連する１以上の病原体または生物体に由来する核酸とハイブリダイズすることができるように、性感染症に関連する病原体または生物体の核酸との十分な同一性のレベルを有する必要がある。ある１本鎖核酸は、間に二本鎖が形成された場合に他とハイブリダイズすると言われている。これは、ある核酸が他と逆または相補的である核酸を含む場合に生じる（この同様の配列は、ゲノムにおいてＤＮＡのセンスとアンチセンスの鎖の間に天然の相互作用を生じ、二重ヘリックスの立体配値の基礎となる）。ハイブリダイズ領域間の完全な相補性は、２本鎖を形成するために必要ではなく；使用されるハイブリダイゼーション条件下において、対になった塩基の数が２本鎖を維持するために十分である必要があるのみである。プローブの配列と病原体のゲノムの配列との間に１以上のミスマッチがあることはしばしば望ましい。プローブ内における望ましくない二次構造の形成は妨げられる必要がある。それ故、１つの好ましい実施形態において、プローブ内の病原体に対して特有の配列は、病原体のゲノム配列と少なくとも１のミスマッチを含む。
【００７９】
適切なハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知である。例えば、0.2×SSC/0.1% SDS、42℃（中程度の厳密性の条件）；および0.1×SSC、68℃（高い厳密性の条件）である。洗浄は、与えられた条件の１のみを用いて行われるか、または各条件が使用されてよい（例えば、上述したオーダーで10〜15分間洗浄する）。洗浄のいずれかまたは全てが繰り返される。光学的な条件は変化してよく、当業者により経験的に決定される。
【００８０】
プローブと病原体の核酸との間の同一性の程度は、プローブの機能に依存して変化する。例えば、プローブは、病原体の全ての亜種、例えば全てのＨＰＶ遺伝子型の存在を同定するために使用されてよく、この場合プローブは、ＨＰＶ遺伝子型のような全ての亜種の間で高度に保存されている核酸の領域に由来する配列とハイブリダイズする配列であろう。
【００８１】
プローブは、ある一定のリスク群、例えば高いリスクまたは低いリスクの遺伝子型等から病原体、例えばＨＰＶ遺伝子型の存在を検出するために使用される。プローブの配列は、適宜設計される。例えば、プローブは、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、および７３の型に結合することができる高いリスクの遺伝子型を検出するために設計されるが、他の遺伝子型に由来する核酸は検出しない。これらは、「リスク群プローブ」と呼ばれる。
【００８２】
あるいは、各プローブは、ある特定の遺伝子型の可変領域と高いレベルで類似性を有する配列を有し、それは、その遺伝子型に由来する核酸とのみハイブリダイズする。そのようなプローブは、「遺伝子型特異的」と呼ばれる。多くのヒトパピローマウイルスの型特異的なプローブは、定義された遺伝子型特異的な領域内でハイブリダイズすることができ、好ましくは、増幅されたＤＮＡ上に配列番号５３〜１０３を含んでなる。ＨＰＶ遺伝子型に特異的なプローブは、好ましくは、配列番号３３〜５２または配列番号１０５〜１１７を含んでなる。これらの配列は、病原体に特有の配列の全てまたは一部を形成する。
【００８３】
プローブ組は、少なくとも４のプローブ、好ましくは５、１０、１５または２０の異なるプローブを含んでなる。プローブは、含まれる配列がステムループ構造の「ループ」を含む場合、検出されるべき核酸中の望ましい配列とハイブリダイズするのみでなく、他のプローブのループにおける配列と二次構造を形成しないように、注意深く設計される。それ故、プローブのループ部分に対する配列は、一般的に、検出されるゲノムにおける配列とちょうど１００％相補的である配列ではない。好ましくは、ヒトパピローマウイルスの型特異的なプローブは、定義された型特異的な領域内でハイブリダイズし、好ましくは、配列番号５３〜１０３または配列番号１０５〜１１７を含んでなる。１つの好ましい実施形態において、各プローブは、配列番号３３〜５２または配列番号１０５〜１１７から選択される配列を含んでなる。特に好ましい実施形態において、プローブの組は、以下を含んでなる：
5’TET-CGGCGGGTCATCCTTATTTTTCCATAAGCCG-Dabcyl-3’
5’TET-CGGCGGGACATCCATATTACTCTATCAAAGCCG-Dabcyl-3’
5’TET-CGCGGGTCACCCTTATTACTCTATTACAAAACGCG-Dabcyl-3’
5’TET-CCGGCACCCATATTTCCCCCTTAAACCGG-Dabcyl-3’
5’TET-CCGGACGACCAGCAAACAAGACACCCGG-Dabcyl-3’
5’FAM-CGGCCAATAACAAAATATTAGTTCCTAAAGCCG-Dabcyl-3’
5’FAM-CCGGTATCCTGCTTATTGCCACCCCGG-Dabcyl-3’
5’FAM-CGGCCATACCTAAATCTGACAATCCGCCG-Dabcyl-3’
5’FAM-GCCGTTTTTTAGCGTTAGTAGGATTTTTCGGC-Dabcyl-3’
5’FAM-CGGCAAAACAAGATTCTAATAAAATAGCAGCCG-Dabcyl-3’
5’FAM-CGGCTTAAAGTGGGTATGAATGGTTGGCCG-Dabcyl-3’
5’FAM-CCGGGCTGTTCCTAAGGTATCCGCCGG-Dabcyl-3’
5’FAM-CGGCAGCACGCGTTGAGGTTTTAGCCG-Dabcyl-3’
5’FAM-CCGGAGTTTTAGTTCCCAAGGTGTCCCGG-Dabcyl-3’
5’FAM-CCCGCTGTGACTAAGGACAATACCAAACGGG-Dabcyl-3’
5’FAM-CGGCTTCCATCAAAAGTCCCAATAACGCCG-Dabcyl-3’
5’FAM-CGGCAAAGGTGGTAATGGTAGACAGGGCCG-Dabcyl-3’
5’FAM-CGGCAATCTGGTACCAAAACAAACATCGCCG-Dabcyl-3’
5’FAM-CGGCTTAAGGTTCCTATGTCTGGGGGCCG-Dabcyl-3’ and
5’(テキサスレッド)-TTTTTT-(フルオレセイン)-CGGCTGACATAGATCCCCATAGACAGTTGCCG-Dabcyl-3’
特定のリスク群に由来する病原体の存在は、２つの方法で検出することができる。第１に、「リスク群」プローブが使用される。好ましくは、プローブの組は１以上のリスク群プローブの型を含み、各型は区別して標識される。例えば、高いリスク群のプローブは、低いリスクのプローブと区別される。それ故、どちらか一方のリスク群に由来するＨＰＶのような病原体の存在を検出することができる。あるいは、プローブの組は、遺伝子型特異的なプローブを含んでよく、ある一定のリスク群、例えば高いリスクの遺伝子型に由来する遺伝子に対する全てのプローブは、同じ相互作用標識で全て標識される。それ故、特異的な遺伝子型の存在の同一性は決定することができないが、ある一定の群に由来する遺伝子型の存在を確認することができる。
【００８４】
好ましい実施形態において、前記方法は、前記プローブの１つおよび前記サンプルから得られる相補的な核酸により形成される２本鎖核酸分子の融解温度を決定することをさらに含んでなる。各プローブはある一定の核酸配列を有するため、プローブおよび前記サンプルから得られた相補的な核酸により形成される２本鎖核酸分子の融解温度は、各プローブに特有である。それ故、特定の病原体または遺伝子型の存在を検出することができる。例えば、ある一定のリスク群に対する遺伝子型特異的なプローブの組は、その群に由来する遺伝子型が存在するかどうかを確認するために使用することができる。融解温度は、特定の遺伝子が存在することを同定することができる。
【００８５】
ＨＰＶ型を個々に検出する方法は、ヒトパピローマウイルスファミリー、属、もしくは群を検出するために前記方法を行った後、またはヒトパピローマウイルスを検出するための方法と同時に行われてよい。
【００８６】
１以上のプローブが使用される場合、それらは、好ましくは他と区別され、すなわち各プローブは、ある一定の波長で励起された場合に検出可能な異なるシグナルを放出する。それ故、２つのプローブが使用された場合、一方は、病原体に由来する核酸とハイブリダイズした場合にある一定の波長で発光し、溶液中のプローブ（すなわちＨＰＶ遺伝子型のような病原体に由来する核酸とハイブリダイズしない）および病原体に由来する核酸とハイブリダイズした他のプローブと区別することができる。これは、核酸とハイブリダイズする両方のプローブの存在を同時に可視化することを可能にする。あるいは、前記２つのプローブは、異なる波長で励起する異なる相互作用標識、例えばＦＲＥＴドナーで標識される。
【００８７】
これは、ＦＲＥＴドナーおよびアクセプターのように、異なる相互作用標識の組み合わせを用いることにより達成することができる。相互作用標識の適切な組み合わせの選択は、当業者にとって通常の技術である。
【００８８】
前記方法は、好ましくは、４以上のプローブを利用して４以上の病原体または遺伝子型の存在を検出する。好ましくは、前記プローブは、各型のプローブが他のプローブの位置と区別可能な空間的に限定された位置にあるように固相に結合される。これは、同じまたは同様の波長においてシグナルを生じる同じまたは同様の相互作用標識で標識されたプローブを使用することを可能にする一方で、各プローブにより生じるシグナルを区別するための方法も提供する。あるいは、前記プローブは、各型のプローブにより異なるシグナルが生じるように標識されてよい。当業者は、ある一定範囲の可能な固体の支持がアレイの領域において共通に利用され、これらの「基質」のいずれかは、本発明のプローブのアレイの産生において利用可能であることを理解するであろう。
【００８９】
１つの好ましい実施形態において、１の反応において少なくとも４のリアルタイム分子標識プローブを使用して、多数の関連する検出標的をターゲッティングする検出のための反応を構築する方法を提供する。前記方法には、プローブ結合部位を選択すること、プローブにおいて通常適用される基準を満たすプローブの配列を決定すること（例えば、プライマー３のような全体の相補性におけるコンピュータプログラムと対照してプローブをチェックすること）、塩基、好ましくは４または５の塩基をプローブの配列の両末端に加えること、それらに相補性を与えることが含まれ、同じオリゴヌクレオチドの２つの末端を厳密に含む２本鎖ステムを形成することができる。これらの構造は、一般的に、４ステム分子標識と呼ばれる。加えて、プローブ配列の融点は、加熱速度および冷却速度を平衡状態の近くで測定した場合にステム構造の融点より高いべきである。４塩基ステム分子標識は、一般的に、他のステム長さを超えて有利であり、より長いステムよりも短いオンオフ速度を有し、より短いステム分子標識よりも高い融点を有する。
【００９０】
一般的に、プローブ混合物の要素は、ある一定の規定された型特異的な領域内で増幅産物にハイブリダイズする。プローブは、典型的に、一方の末端がドナー蛍光部分で標識され、他方の末端は、典型的に、対応するアクセプターまたはクエンチャー蛍光部分で標識される。いくつかの実施形態において、前記ドナー蛍光部分は、いわゆるハーベスター色素を含む蛍光色素の特定の複合体を含んでよく、プローブの発光の波長をシフトさせ、検出に対して特有の蛍光シグナルを提供する。前記方法は、ドナー蛍光部分およびアクセプターまたはクエンチャー蛍光部分の間の蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）における存在、非存在または変化を検出することをさらに含む。ＦＲＥＴにおける存在または変化は、生物学的なサンプルにおけるヒトパピローマウイルスの存在の指標となり、一方、ＦＲＥＴの非存在は、生物学的なサンプルにおけるヒトパピローマウイルスの非存在の指標となる。
【００９１】
一般的に、核酸は、プローブとハイブリダイズされ、ドナー蛍光部分により吸収される波長で励起される。結合プローブの存在または非存在は、アクセプターまたはクエンチャー蛍光部分により放出される波長を測定および／または可視化することにより検出される。あるいは、ＦＲＥＴを定量化することにより検出することができる。
【００９２】
１つの好ましい実施形態において、サンプルから得られる核酸は、前記プローブの組と接触させる前に増幅される。好ましくは、前記増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行われる。前記増幅反応は、ＰＣＲであってよい（例えば、米国特許第4,683,195号および第4,683,202号、ならびにInnis et al, editors, PCR Protocols, (Academic Press, New York, 1989; Sambrook et al, Molecular Cloning, Second Edition, (Cold Spring Harbour Laboratory, New York 1989)を参照されたい)。ＰＣＲは、ＲＮＡが単離され、好ましくは逆転写によりｃＤＮＡに変換された場合に使用されてもよい。好ましくは、ＰＣＲは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、例えばAmplitaq（登録商標）（Perkin-Elmer, Norwalk, Conn.）を用いて行われる。Ｔａｑポリメラーゼは、MBI Fermentas, Perkin Elmer, Boehringer Mannheim and Beckman Instrumentsから得ることもできる。対応する、好ましくは熱安定性のＤＮＡポリメラーゼは、本発明の方法において使用され、例えばTfl （Thermus flavus）ポリメラーゼである（Gut et al, Virol. Methods 77(1): 37-46 (1999)）。
【００９３】
あるいは、前記増幅反応は、ＲＴ−ＰＣＲであってよく（Yajima et al, Clin. Chem, 44(12): 2441-2445 (1998); Martell et al, J. Clin. Microbiol., 37(2): 327-332 (1999); Gut et al, Virol. Methods 77(1): 37-46 (1999); Predhomme et al, Leukemia, 13(6): 957-964 (1999)）、ＲＮＡはｃＤＮＡへと逆転写され、その後ＰＣＲ増幅に供される。
【００９４】
周知のように、ＰＣＲは、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）のサンプルの抽出および変性（好ましくは熱による）を含む。過剰なモル濃度のオリゴヌクレオチドプライマーが熱安定性のポリメラーゼおよび増幅された配列の形成のためのｄＮＴＰｓと共に加えられる。前記オリゴヌクレオチドプライマーは、増幅のために設計された配列の反対の末端にハイブリダイズするように設計される。増幅の第１ラウンドにおいて、ポリメラーゼはＤＮＡを複製して２つの「長い産物」を産生し、それぞれのプライマーを用いて開始する。２つの長い産物および２つの最初の鎖を含む全ＤＮＡは、その後変性され、重合の第２ラウンドが行われる（例えば温度を下げて）。第２ラウンドの結果物は、２つの最初の鎖、第１ラウンドからの２つの長い産物、２つの新しい長い産物（最初の鎖から産生される）、および長い産物から産生される２つの「短い産物」である。これらの短い産物は、各末端に標的配列（センスまたはアンチセンス）を有する。各付加的な増幅ラウンドについて、短い産物の数は指数関数的に増加し、各ラウンドは、２つの付加的な長い産物および前のラウンドの終わりに残存する長い産物と短い産物との和に等しい多くの短い産物を産生する。
【００９５】
オリゴヌクレオチドプライマーは、多くのアプローチ、例えばOzaki et al, Nuc. Acids Res. 20: 5205-5214 (1992); Agrawal et al, Nuc. Acids Res. 18: 5419-5423 (1990)等により合成することができる。都合のいいことに、オリゴヌクレオチドプローブは、自動化されたＤＮＡ合成装置、例えば、ホスホラミダイト化学のような標準的な化学を用いたアプライドバイオシステムズ, Inc, Foster City, California model 392または394 ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置において合成される（Beaucage and Iyer, Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992), 米国特許第4980460号、第4725677号、第4415732号、第4458066号および第4973679号）。ホスホロチオネートおよびホスホロアミデートのような天然でない骨格の基を含む代替の化学が使用されてもよく、結果のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率が逆に影響を受けないということを提供する。ＤＮＡプライマーの正確な長さおよび配列は、増幅される標的ポリヌクレオチドに依存する。好ましくは、ＤＮＡプライマーの長さは、１０〜６０ヌクレオチドの範囲であり、より好ましくは１５〜３０または２５ヌクレオチドの範囲である。
【００９６】
好ましくは、増幅された核酸の産生は、継続的にモニターされる。ここで使用される場合、「継続してモニターされる」とは、増幅される産物の量を一定の基準に基づいて測定することを意味する。例えば、読みは第１の増幅サイクルの後に行われ、その後、１、２、または５サイクルごとに行われる。あるいは、増幅産物の量の測定は、ある一定の時間間隔、例えば、１、２、５、または１０秒毎に行われる。これは、過程を「リアルタイム」でモニターすることを可能にする。当業者は、結合プローブにより産生されるシグナルのレベルが、サイクルがアニーリング、増幅、および変性の種々の段階を通過する場合に上下することを理解するであろう。
【００９７】
ＦＲＥＴ技術と結合した通常のＰＣＲ法は、本発明の方法を実施するために使用されてよい。１つの実施形態において、LIGHTCYCLER（登録商標）機器のような高速サーモサイクラーが使用される。LIGHTCYCLER（登録商標）システムならびにＰＣＲのリアルタイムおよびオンラインモニタリングの詳細な説明は、ロシュのウェブサイトで見られる。以下の特許出願は、LIGHTCYCLER（登録商標）テクノロジーにおいて使用されるようなリアルタイムＰＣＲについて述べている：WO 97/46707、WO 97/46714およびWO 97/46712。LIGHTCYCLER（登録商標）機器は、高品質の光学を利用したマイクロ容積の蛍光定量器（fluorimeter）を組み合わせた高速サーモサイクラーである。この高速サーモサイクリング技術は、反応容器として薄いガラスのキュベットを使用する。反応容器の加熱および冷却は、加熱および周囲空気を変化させることにより調節される。空気の低い質量およびキュベットの容積に対する表面積の高い比により、熱的な容器内において非常に速い温度変化速度を達成することができる。前記機器は、リアルタイムおよびオンラインでＰＣＲがモニタリングされることを可能にする。さらに、前記キュベットは、シグナル収集のための光学的な要素として役立ち（グラスファイバー光学と同様）、キュベットの先にシグナルを集める。効果は、マイクロ容積のサンプルの効率的な照明および蛍光のモニタリングである。キュベットを収容するカルーセルは、前記機器から除かれてよい。それ故、サンプルは装置の外部で負荷される（例えばＰＣＲクリーンルーム）。加えて、この特徴は、サンプルカルーセルが容易に洗浄され且つ滅菌されることを可能にする。装置の一部としての蛍光定量器は、光源を備える。放出された光は、ろ過され、キュベットの上部の落射レンズにより集められる。サンプルから放出される蛍光は、その後、同じレンズにより集められ、二色性ミラーを通過し、適切にろ過され、データ収集フォトハイブリッド上に集められる。前記装置の光学ユニットは、好ましくは３つのバンドパスフィルターを含み（530nm、640nm、および710nm）、６色の検出およびいくつかの蛍光獲得オプションを提供する。しかしながら、本発明は、商業的に入手可能な装置の配置により制限されない。データ収集オプションには、サイクリングステップ当り１回のモニタリング、融点分析のための完全に連続的な単一サンプル獲得、連続的なサンプリング（サンプリング頻度はサンプル数に依存する）および／または規定された温度間隔の後の全てのサンプルの段階的な測定が含まれる。サーモサイクラーは、好ましくはＰＣワークステーションを用いて操作され、ウィンドウズ（登録商標）ＮＴオペレーティングシステムを利用できる。サンプルからのシグナルは、機械がキャピラリーを結果的に光学ユニットの上に位置させた場合に得られる。ソフトウェアは、各測定の直後に、リアルタイムで蛍光シグナルを示すことができる。蛍光獲得時間は10〜100μ秒である。各サイクリングステップの後、蛍光対サイクル数の定量的な表示は、全てのサンプルについて継続的に更新することができる。得られたデータは、さらなる分析のために保存することができる。
【００９８】
好ましい実施形態において、前記核酸は、配列番号１〜３２から選択される少なくとも１のプライマー、より好ましくは配列番号１〜３２を含んでなるプライマー混合物を用いて増幅される。
【００９９】
１つの好ましい実施形態において、前記方法は、好ましくは、異なる区別可能な波長においてシグナルまたはＦＲＥＴを検出することにより、または検出に使用される波長にかかわらずプローブが結合する固相の空間的に区別可能な位置における発光の変化を測定することにより、人工または天然の内部標準ＤＮＡを利用する。
【０１００】
上述した方法は、さらに、先行する増幅反応に由来する混入物の核酸の増幅を妨げることを含んでよい。そのような望ましくない増幅を妨げることは、ウラシルの存在下において増幅ステップを行うことおよび第１の増幅ステップの前にウラシル-ＤＮＡグリコシラーゼで生物学的なサンプルを処理することを含んでよい。加えて、サイクリングステップは、適切な増幅条件を確認するために別々の対照サンプルにおいて行われてよい。対照サンプルには、ヒトパピローマウイルス核酸分子の一部が含まれてよい。あるいは、そのような対照サンプルは、１対の対照プライマーを用いて増幅されてよく、１対の対照プローブを用いてハイブリダイズされてよい。対照増幅産物は、サンプル中に対照鋳型が存在する場合に産生され、対照プローブは対照増幅産物にハイブリダイズする。
【０１０１】
本発明の方法は、生物学的なサンプルから得られる核酸において行われる。代表的な生物学的サンプルには、子宮頸部の切屑、生検、塗抹またはパラフィン組織切片、ヒトパピローマウイルス感染が起きた他の解剖学的な部位の切屑および尿が含まれる。好ましくは、前記サンプルは、気管支吸引、尿、前立腺（prostata massate）、精液、血液および頸部、外陰部、肛門、生殖器、皮膚もしくは咽喉の細胞学的なサンプル、切屑または生検から選択される。
【０１０２】
第２の側面において、本発明は、少なくとも４のプローブを含んでなるプローブの組を提供し、前記プローブのそれぞれは、４つの相補的な塩基対に隣接する病原体に由来する配列と相補的な配列を含んでなり、前記塩基は、病原体に由来する核酸とのハイブリダイゼーションの非存在下でステム構造を形成し、前記プローブは、第１の相互作用標識および第２の相互作用標識で標識され、前記プローブと前記病原体に由来する核酸とのハイブリダイズは検出されるシグナルにおいて変化を引き起こす。
【０１０３】
プローブに関する第１の側面の好ましい実施形態は、第２の側面に適用する。
【０１０４】
上述したように、プローブの「ループ」部分を形成する配列は、標的の生物体において望ましい配列とハイブリダイズするだけでなく、それらが他のプローブのループ領域と二次構造を形成しないように選択される。本発明の第３の側面において、配列番号３３〜５２または配列番号１０５〜１１７のいずれか１を含んでなる核酸配列を提供する。これらの核酸配列は、１以上のＨＰＶ遺伝子型の存在を検出するために、他の方法において使用することができる。それ故、本発明は、少なくとも１のＨＰＶ遺伝子型の存在または非存在を検出するための本発明の核酸の使用も提供する。好ましくは、前記核酸は、サンプルから得られる核酸の増幅を継続的にモニターする方法において使用される。
【０１０５】
そのような方法にはＴＡＱＭＡＮ（登録商標）技術、分子スコーピオンの部分としての配列の使用、および他のＰＣＲに基づく方法が含まれる。
【０１０６】
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）技術は、増幅産物の存在または非存在を検出するため、ヒトパピローマウイルスの存在または非存在を検出する。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）技術は、２つの蛍光部分で標識された１本鎖ハイブリダイゼーションプローブを利用する。第１の蛍光部分が適切な波長の光で励起された場合、吸収されたエネルギーはＦＲＥＴの原理に従って第２の蛍光部分に伝達される。前記第２の蛍光部分は、一般的に、クエンチャー分子である。ＰＣＲ反応のアニーリングステップの間、前記標識されたハイブリダイゼーションプローブは標的ＤＮＡに結合し、引き続く伸長相の間にＴａｑポリメラーゼの５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性により変性される。結果として、励起された蛍光部分および第２の蛍光部分は、空間的に互いに離れる。結果として、第２の蛍光の非存在下における第１の蛍光部分の励起に基づいて、第１の蛍光部分からの蛍光放出は検出可能に変化する。例えば、前記第２の蛍光部分がクエンチャーである場合、前記第１の蛍光部分からの蛍光放出は増大するため、検出可能である。実施例によると、ABI PRISM（登録商標）7700配列検出システム（アプライドバイオシステムズ, Foster City, Calif.）は、TAQMAN（登録商標）技術を使用し、ヒトパピローマウイルスを検出するための方法を行うのに適している。ＰＣＲ増幅およびABI PRISM（登録商標）7700システムを用いた検出についての情報は、アプライドバイオシステムズのウェブサイトで見られる。
【０１０７】
第６の側面において、本発明は、２以上の関連する生物体に由来する核酸配列を増幅するプライマーの最小の組を同定する方法を提供し、以下を含んでなる：
（a）前記生物体間で少なくとも３０％の同一性を有するプライマー結合部位を同定することと；
（b）（a）で同定されたプライマー結合部位において増幅を惹起することができるプライマーの組を設計することと（前記プライマーのそれぞれは、前記生物体の少なくとも１におけるプライマー結合部位と３以下のミスマッチを有し、前記プライマーのそれぞれは、前記プライマーのそれぞれと４以下のヌクレオチドが異なる）；
（c）可能な限り多くの前記生物体を検出するために必要な最も少ない数のプライマーを決定することと；
（d）前記生物体の全てに由来する核酸配列の均等な増幅を保証するために、前記プライマーの組において必要な各プライマーの相対的な量を決定すること。
【０１０８】
ここで使用される場合、「関連する生物体」は、同じ網、属または種に由来し、高いレベルの遺伝的な類似性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する生物体を意味する。前記関連する生物体は、好ましくはウイルスであり、より好ましくはヒトパピローマウイルスである。プライマーは、好ましくは、ヒトパピローマウイルスのＬ１領域を増幅する。
【０１０９】
２つの核酸配列のパーセント同一性は、最適な比較を目的として配列を整列し（例えば、前記配列との最も良いアラインメントのために、第１の配列にギャップが導入されてよい）、対応する位置においてヌクレオチドを比較することにより決定される。「最も良いアラインメント」は、結果として最も高いパーセント同一性を生じる２つの配列のアラインメントである。パーセント同一性は、比較される配列における同一のヌクレオチドの数により決定される（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／位置の全数×100）。
【０１１０】
２つの配列間のパーセント同一性の決定は、当業者に既知の数学的なアルゴリズムを用いて達成される。２つの配列を比較するための数学的アルゴリズムの例は、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 改変されたKarlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877のアルゴリズムである。Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410のNBLASTおよびXBLASTプログラムは、そのようなアルゴリズムに組み込まれている。BLASTヌクレオチドサーチは、NBLASTプログラム, スコア＝100, 語長＝12を用いて行うことができ、本発明の核酸分子と相同性のヌクレオチド配列を得られる。比較を目的としてギャップアラインメントを得るために、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402において述べられているようにギャップBLASTを使用することができる。あるいは、分子間の距離的な関係を検出する繰り返し検索を行うために、PSI-Blastを使用することができる（Id.）。BLAST、ギャップBLAST、およびPSI-Blastプログラムを使用する場合、各プログラムのデフォルトパラメータ（例えば、XBLASTおよびNBLAST）が使用される。配列の比較のために使用される数学的アルゴリズムの他の例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。ALIGNプログラム（バージョン2.0）は、CGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であり、そのようなアルゴリズムが組み込まれている。当該分野で既知の配列分析のための他のアルゴリズムには、Torellis and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10 :3-5に記載されているようなADVANCEおよびADAM；ならびにPearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8に記載されているようなFASTAが含まれる。FASTAにおいて、ktupは検索の感度およびスピードを設定するコントロールオプションである。
【０１１１】
プライマーの最小の組は、必要な多くの関連する生物体に由来する核酸配列を増幅するために必要とされる最小の数のプライマーを含むプライマーの組である。前記プライマーの組は、任意に、特定のプライマー結合部位におけるプライマー間のプライミング差異をコントロールするために使用される補正プライマーを含んでよい。前記補正プライマーは、作用するために設計されたプライマー結合部位に対して３以下のミスマッチを有するべきである。補正プライマーの付加は、検出されることが意図される全ての生物体、例えば全てのヒトパピローマウイルスに対して、少なくとも２オーダーのマグニチュード以上の検出感度のレベルにするための助けとなる。
【０１１２】
ここで使用される場合、「ミスマッチ」は、プライマーにおける塩基がワトソン−クリックの塩基対規則に従ってプライマー結合部位における対応する塩基と塩基対を形成しない場合を意味する。ミスマッチは、２つの対応する塩基がワトソン-クリック基準、例えば、Ｃ−Ｔ、Ｇ−Ａと一致しない場合に形成される。ミスマッチは、好ましくは、５’末端に最も近いプライマーの半分以内であり、より好ましくは、プライマーの５’末端の前の３ヌクレオチドを形成するものである。
【０１１３】
プライマーの組における各プライマーは、前記組における他のプライマーのそれぞれと４以下のヌクレオチドしか違わない。それ故、プライマーの長さが全１５ヌクレオチドである場合、１つのプライマーにおける１１ヌクレオチドは他のプライマーのそれぞれにおける１１ヌクレオチドと同一である。前記同一のヌクレオチドは、好ましくは連続的でない。
【０１１４】
１つの好ましい実施形態において、ヒトパピローマウイルス増幅に対する高度に複雑な複合反応を構築するための方法を提供する。前記方法は、適切な近い位置において保存されたプライマー結合部位（７０％未満の可変性）を選択することを含む。プライマー結合部位は、適切な大きさの単位複製配列が作られることを保証するために、相互にある一定の距離に位置するべきである。好ましくは、３０〜１６０ヌクレオチドの長さの単位複製配列が作られ、より好ましくは、４０〜１２０、５０〜１００、６０〜９０または７０〜８０の長さのヌクレオチドである。１３０〜１６０の長さのヌクレオチドの単位複製配列が特に好ましい。プライマーは、作られる単位複製配列の一部を形成する。前記プライマーは、好ましくは、１０〜３０ヌクレオチド長、より好ましくは１２〜２５、１５〜２２または１８、１９、２０、もしくは２１ヌクレオチド長である。プライマーが通常プライマーに適用される基準（例えば、プライマー３のように、完全な相補性においてコンピュータープログラムに対してプライマーをチェックすること）を満たすプライマーの完全な組の配列が決定され、可能な限り最小の数のプライマーが、好ましくはプライマーの一方の末端、より好ましくは５’末端において、増幅されることが意図されるヒトパピローマウイルス型のような関連する全ての生物体に対して３のミスマッチのみを有するように設計される。加えて、前記プライマーは、ほぼ等しい数の型に結合するべきであり、３以下のミスマッチを有する。さらに、増幅の相違は、プライマーの相対的な濃度を変化させることにより制御される。検出の結果の感度は、好ましくは、ヒトパピローマウイルスのような検出されることが意図されている全ての関連する生物体に対して少なくとも２のマグニチュードである。
【０１１５】
これは、近年のプライマーの配列的な付加の分野における技術を超える重要な成功であり、試験的および誤りの方法を伴う。発明された方法は、競合を最小に維持する。全ての標的に対する補正されたプライミング効率は、結果として高度に均等な増幅感度を生じる。加えて、ミスプライミングの可能性は、プライマーを好ましくはその５’末端において可変に維持することにより減少される。
【０１１６】
プライマーの混合物は、少なくとも１のヒトパピローマウイルス型Ｌ１領域を増幅することができ、好ましくは配列番号５３〜１０３を含んでなる。配列番号１〜１６の群に由来する少なくとも１の順方向プライマーおよび配列番号１７〜３２の群に由来する少なくとも１の逆方向プライマーが含まれることが好ましい。
【０１１７】
第７の側面において、本発明は、配列番号１〜３２から選択される少なくとも１のプライマーを含んでなる第６の側面の方法により得ることができるプライマーの組を提供する。好ましくは、配列番号１〜１６の群に由来する少なくとも１の順方向プライマーおよび配列番号１７〜３２の群に由来する少なくとも１の逆方向プライマーを含んでなる。より好ましくは、配列番号１〜３２を含んでなる。
【０１１８】
さらなる側面において、本発明は、前記第２の側面において述べたようなプローブの組を含んでなる、１以上の病原体を検出するためのキットを提供する。前記キットは、好ましくは、前記第６の側面の方法により同定されたプライマーの組をさらに含んでなる。
【０１１９】
加えて、本発明は、前記第６の側面に方法により同定されたプライマーの組を含んでなる、１以上の病原体を検出するためのキットを提供する。
【０１２０】
好ましくは、前記キットは、性感染症に関連する１以上の生物体、好ましくはＨＰＶ遺伝子型を検出するために使用することができる。好ましくは、前記プローブは、配列番号１７〜３３から選択される配列を含んでなる。プライマーの組は、好ましくは、配列番号１〜３２から選択される少なくとも１の配列、より好ましくは、配列番号１〜１６から選択される少なくとも１の配列および配列番号１７〜３２から選択される少なくとも１の配列を含んでなる。最も好ましくは、前記プライマー混合物は、配列番号１〜３２のプライマーを含んでなる。
【０１２１】
好ましくは、前記キットは内標準をさらに含んでなる。
【０１２２】
前記キットは、生物学的なサンプルにおいてヒトパピローマウイルスの存在または非存在を検出するためにプライマーの混合物およびプライマーの対を使用するために、説明書を有するパッケージラベルまたはパッケージ挿入を含んでもよい。
【０１２３】
前記キットは、ＰＣＲに必要な試薬のような他の要素をさらに含んでよい。そのような試薬には、緩衝剤、適切なＤＮＡポリメラーゼ、ならびにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰのようなｄＮＴＰｓが含まれる。前記キットの構成要素は、多くのバイアルまたは他の容器中に存在してよい。前記試薬は、使用前に後に再構築するために凍結乾燥されてよい。あるいは、前記構成要素は、使用できるように適切な緩衝溶液中に提供されてよい。そのような溶液には、適切な保存剤が含まれてよい。
【０１２４】
他に定義しない限り、ここで使用される全ての技術的および化学的な用語は、本発明が属する分野の当業者により共通に理解されるような同じ意味を有する。ここで述べられているのと類似または均等な方法および物質が本発明の実施または試験において使用されてよいが、適切な方法および物質は以下に述べる。加えて、物質、方法、および実施例は、説明のためのみに記載し、限定することを意図するものではない。ここで言及されている全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が本明細書の一部として援用される。抵触する場合、定義を含み、本明細書が支配する。
【０１２５】
本発明は、非限定的な実施例に従って説明される。本発明の他の特性、目的、および利点は、図面および詳細な説明ならびに特許請求の範囲から明らかにされる。
【実施例】
【０１２６】
例１
高いリスクおよび低いリスクのＨＰＶ ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ検出
全反応容積は20μlであり、以下を含む：2μl（〜0,2pg）クローン化HPV DNA、18μl ポリメラーゼ緩衝液（最終濃度：90 mM TRIS-HCl（pH=8,0）、1mM DTT、50 mM KCl、7 mM MgCl2、1％Tween-20 (SIGMA)、1％Ficoll、1％PVP、250μMの各dNTP（ATP, CTP, GTP, TTP）（Promega）、0,28μMの各プライマー：配列番号1〜32、各0,18μMの分子標識配列番号33〜52、および7,5 U AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ（ROCHE））。反応は、以下のパラメータを用いて、ライトサイクラー（LightCycler）2.0 PCR 熱サイクラーにおいて行われた：
ステップ１：95℃で10分間；
ステップ２：55℃で5分間；
ステップ３：サイクル1〜37：95℃で30秒間、42℃で60秒間−シングル検出モード、および72℃で30秒間。
【０１２７】
高いリスクのHPV遺伝子型は、分子標識配列番号38〜51により検出された。蛍光データは530nmで収集された。  
低いリスクのHPV遺伝子型は、分子標識配列番号33〜37により検出された。蛍光データは560nmで収集された。  
反応内標準は、分子標識配列番号52により検出された。蛍光データは610nmで収集された。
【０１２８】
以下の遺伝子型は首尾よく検出された：低いリスク（6、11、42、43、44/55）、高いリスク（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68）および内標準。
【０１２９】
例２
ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８およびＨＰＶ６、ＨＰＶ１１ ＨＰＶ ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ検出
全反応容積は20μlであり、以下を含む：2μl（〜0,2pg）クローン化HPV DNA、18μl ポリメラーゼ緩衝液（最終濃度: 90 mM TRIS-HCl (pH=8,0)、10mM DTT、50 mM KCl、7 mM MgCl2、1％Tween-20 (SIGMA)、1％Ficoll、1％PVP、250μMの各dNTP (ATP, CTP, GTP, TTP) (Promega)、0,28μMの各プライマー: 配列番号1〜32、各0,18μMの分子標識配列番号33、34、38、39、52、および7,5 U AmpliTaq Gold DNA ポリメラーゼ(ROCHE)）。反応は、以下のパラメータを用いて、ライトサイクラー（LightCycler）2.0 PCR 熱サイクラーにおいて行われた：
ステップ１：95℃で10分間；
ステップ２：55℃で5分間；
ステップ３：サイクル1〜37：95℃で30秒間、42℃で60秒間−シングル検出モード、および72℃で30秒間。
【０１３０】
HPV16およびHPV18遺伝子型は、分子標識配列番号38〜39により検出された。蛍光データは、530nmにおいて収集された。  
HPV6およびHPV11遺伝子型は、分子標識配列番号33〜34により検出された。蛍光データは560nmにおいて収集された。  
反応内標準は、分子標識配列番号52により検出された。蛍光データは610nmにおいて収集された。
【０１３１】
以下の遺伝子型は、首尾よく検出された：低いリスク（6, 11）、高いリスク（16, 18）および内標準。
【０１３２】
添付１
順方向プライマー：
配列番号１  KP-F/1  CGCACCAACATATTTTATT
配列番号２  KP-F/2  CGCACAAGCATCTATTATTA
配列番号３  KP-F/3  CGCACAAGCATATTTTATC
配列番号４  KP-F/4  CGCACCAGTATATTTTATCA
配列番号５  KP-F/5  CGCACAAGCATTTACTATCA
配列番号６  KP-F/6  CGCACCAACTACTTTTACC
配列番号７  KP-F/7  CGTACCAGTATTTTCTACCAC
配列番号８  KP-F/8  CGCACAGGCATATATTACT
配列番号９  KP-F/9  CGCACCAACATATATTATCA
配列番号１０  KP-F/10 CGTACCAACCTGTACTATTATG
配列番号１１  KP-F/11 GCACCAACTTATTTTACCAT
配列番号１２  KP-F/12 ACCAACCTCTTTTATTATGG
配列番号１３  KP-F/13 AGCACAAATATATATTATTATGG
配列番号１４  KP-F/14 CGCACCGGATATATTACT
配列番号１５  KP-F/15 CGCACAAATATTTATTATTATGC
配列番号１６  KP-F/16 CGGACGAATGTTTATTACC
逆方向プライマー：
配列番号１７  L1C2  TACCCTAAATACTCTGTATTG
配列番号１８  L1R2  TACCCTAAATACCCTATATTG
配列番号１９  R1    AATTCTAAAAACTCTGTACTG
配列番号２０  R45   TACTCTAAATACTCTGTATTG
配列番号２１  R11   TACCTTAAACACTCTATATTG
配列番号２２  R16   TATTCTAAATACCCTGTATTG
配列番号２３  R42   AACTCTAAATACTCTGTACTG
配列番号２４  R44   CATCTTAAAAACCCTATATTG
配列番号２５  R03   AACCCTAAACACCCTGTATTG
配列番号２６  R04   AACGCGAAAAACCCTATATTG
配列番号２７  R05   TACCCTAAAGACCCTATACTG
配列番号２８  R06   AACTCTAAATACCCTATACTG
配列番号２９  R07   AACGTGAAATACACGATATTG
配列番号３０  R08   CACACGGAACACCCTGTACTG
配列番号３１  R54   CACCCTAAACACCCTATATTG
配列番号３２  R85   AACCCGAAACACTCGATACTG
プローブ配列
配列番号３３  HPV6B3:  GGGTCATCCTTATTTTTCCATAA
配列番号３４  HPV11B2:  GGGACATCCATATTACTCTATCAAA
配列番号３５  HPV42B2:   GGTCACCCTTATTACTCTATTACAAAA
配列番号３６  HPV43B2:    CACCCATATTTCCCCCTTAAA
配列番号３７  HPV44/55B2: ACGACCAGCAAACAAGACAC
配列番号３８  HPV16B5:   CAATAACAAAATATTAGTTCCTAAA
配列番号３９  HPV18B8:    TATCCTGCTTATTGCCACC
配列番号４０  HPV31B5:    CATACCTAAATCTGACAATCC
配列番号４１  HPV33B7:    TTTTTTAGCGTTAGTAGGATTTTT
配列番号４２  HPV35B2:    AAAACAAGATTCTAATAAAATAGCA
配列番号４３  HPV39B3:    TTAAAGTGGGTATGAATGGTTG
配列番号４４  HPV45B3:    GCTGTTCCTAAGGTATCCG
配列番号４５  HPV51B2:    AGCACGCGTTGAGGTTTTA
配列番号４６  HPV52B2:    AGTTTTAGTTCCCAAGGTGTC
配列番号４７  HPV56B2:    CTGTGACTAAGGACAATACCAAA
配列番号４８  HPV58B2:    TTCCATCAAAAGTCCCAATAAC
配列番号４９  HPV59B2:    AAAGGTGGTAATGGTAGACAGG
配列番号５０  HPV66B2:    AATCTGGTACCAAAACAAACATC
配列番号５１  HPV68B2:    TTAAGGTTCCTATGTCTGGGG
配列番号５２  HPV-ICB2:   TGACATAGATCCCCATAGACAGTT
配列番号５３
＞Hpv2a
cgga ctaatgtgta ttaccatggt ggcagttcta ggcttctcac tgtgggtcat ccatattact ctataaagaa gagtaataat aaggtggctg tgcccaaggt atctgggtac caatatcgtg tatttcacgt g
配列番号５４
＞HPV3
cgc accaacattt attattatgc aggcagttct cgcttgctga ccgtgggtca tccttatttt gctatcccca aatcttctaa ttccaagatg gatattccta aggtgtccgc ctttcaatat agagtgttta gggtg
配列番号５５
＞HPV6
cgcacca acatatttta tcatgccagc agttctagac ttcttgcagt gggtcatcct tatttttcca taaaacgggc taacaaaact gttgtgccaa aggtgtcagg atatcaatac agggtattta
aggtg
配列番号５６
＞hpv11
cgcacc aacatatttt atcatgccag cagttctaga ctccttgctg tgggacatcc atattactct atcaaaaaag ttaacaaaac agttgtacca aaggtgtctg gatatcaata tagagtgttt aaggta
配列番号５７
＞HPV13
cgtac caacatattt tatcatgcta gcagttctag actacttgca gtgggaaatc cttattttcc tattaagaaa caaaacaaaa ctgttgtccc taaggtatct ggttatcagt ttagggtatt taaagtt
配列番号５８
＞HPV16
cgcacaa acatatatta tcatgcagga acatccagac tacttgcagt tggacatccc tattttccta ttaaaaaacc taacaataac aaaatattag ttcctaaagt atcaggatta caatacaggg tatttagaat a
配列番号５９
＞HPV18
c ccacaagcat attttatcat gctggcagct ctagattatt aactgttggt aatccatatt ttagggttcc tgcaggtggt ggcaataagc aggatattcc taaggtttct gcataccaat atagagtatt tagggtg
配列番号６０
＞HPV26
cgcacc ggcatatatt attatgcggg cagctctcgt ttattaacat taggacatcc atatttttcc atacctaaaa ctggccaaaa ggccgaaatt cctaaggtat ctgcctatca gtacagggta tttagagtg
配列番号６１
＞HPV27
cggacgaatg tctattacca tggtggcagt tctaggctcc tcactgtcgg ccacccatat tattctataa agaagggtag caataatagg ttggcagtgc ctaaggtgtc cggctaccaa taccgtgtat ttcacgtt
配列番号６２
＞HPV28
cgca ccaatattta ttattatgca ggcacttctc ggttgctgac cgtgggtcat ccttattttc ccattcctaa atcatccact aacaaagcag atgtgcccaa agtgtccgcc tttcagtata gggtattccg ggtg
配列番号６３
＞HPV29
c gcacaaatat ttattattat gcaggcagtt ctcgcctgct cactgtgggt catccacatt attcaattcc caaatcctct ggtaataagg tagatgtgcc taaggtgtct gcatttcagt acagggtttt ccgtgtg
配列番号６４
＞HPV30
cg caccaatata ttttatcatg caggcagctc acgtttgctt gctgttggac atccatatta ttctatttct aaggctggta attccaaaac agatgttccc aaggtgtctg catttcagta tagggtcttt agggtc
配列番号６５
＞HPV31
cg aaccaacata tattatcacg caggcagtgc taggctgctt acagtaggcc atccatatta
ttccatacct aaatctgaca atcctaaaaa aatagttgta ccaaaggtgt caggattaca atatagggta tttagggtt
配列番号６６
＞HPV33
cgcacaagca tttattatta tgctggtagt tccagacttc ttgctgttgg ccatccatat ttttctatta  aaatcctac taacgctaaa aaattattgg tacccaaagt atcaggcttg caatataggg tttttagggt c
配列番号６７
＞HPV34
cg cacaaatata tattattatg caggtagtac acgcttgctg gcagtaggac atccctatta tcctataaag gatactaatg ggaaacgtaa gattgctgta cctaaagttt caggtttgca atacagggta tttagaata
配列番号６８
＞HPV35
cgcacaaaca tctactatca tgcaggcagt tctaggctat tagctgtggg tcacccatac tatgctatta aaaaacaaga ttctaataaa atagcagtac ccaaggtatc tggtttgcaa tacagagtat ttagagt
配列番号６９
＞HPV39
c gcacaggcat atattattat gctggcagct ctagattatt aacagtagga catccatatt ttaaagtggg tatgaatggt ggtcgcaagc aggacattcc aaaggtgtct gcatatcaat atagggtatt tcgcgtg
配列番号７０
＞HPV40
cgcaccag tttatattat catgctggta gtgccaggtt actgactata ggacatccat actttgagtt aaaaaaaccc aatggtgaca tttcagtgcc taaggtttct ggacatcaat acagggtatt tagggta
配列番号７１
＞HPV42
cgcacca actactttta ccatgccagc agttctaggc tattggttgt tggtcaccct tattactcta ttacaaaaag gccaaataag acatctatcc ccaaagtgtc tggtttacag tacagagtat ttagagtt
配列番号７２
＞HPV43
cgcaccaact tattttatta tgctggcagt tcacgtttgc ttgcagtggg tcacccatat ttccccctta aaaattcctc tggtaaaata actgtaccta aggtttctgg ttatcaatac agagtattta gagtt
配列番号７３
＞HPV44
cgc accaacatat attaccatgc tagcagttct agacttcttg ctgtgggcaa cccttatttt gccatacgac cagcaaacaa gacacttgtg cctaaggttt cgggatttca atatagggtt tttaagatg
配列番号７４
＞HPV45
cgcaca agcatatttt atcatgcagg cagttcccga ttattaactg taggcaatcc atattttagg
gttgtaccta atggtgcagg taataaacag gctgttccta aggtatccgc atatcagtat agggtgttta gagta
配列番号７５
＞HPV51
cgc accggcatat attactatgc aggcagttcc agactaataa cattaggaca tccctatttt ccaataccta aaacctcaac gcgtgctgct attcctaaag tatctgcatt tcaatacagg gtatttaggg ta
配列番号７６
＞HPV52
c gcacaagcat ctattattat gcaggcagtt ctcgattact aacagtagga catccctatt tttctattaa aaacaccagt agtggtaatg gtaaaaaagt tttagttccc aaggtgtctg gcctgcaata cagggtattt agaatt
配列番号７７
＞HPV53
cgcaccact atattttatc atgctggaag ctctcgcttg cttaccgtgg gacatcctta ttaccccatt tctaaatctg gtaaagcaga catccctaag gtgtctgcat ttcagtatag ggtgtttaga gta
配列番号７８
＞HPV54
cgcaca agcatatact atcatgcaag cagctctaga ttattggctg ttggacatcc atattttaaa
gtacaaaaaa ccaataataa gcaaagtatt cctaaagtat caggatatca atatagggtg tttagggtg
配列番号７９
＞HPV55
cgc accaacatag tttaccatgc tagcagttct agacttcttg ctgtaggcaa cccttatttt gccatacgac cagcaaacaa gacacttgtg cctaaagttt caggatttca atatagggtt tttaaggtg
配列番号８０
＞HPV56
cgcacta gtatatttta tcatgcaggc agttcacgat tgcttgccgt aggacatccc tattactctg tgactaagga caataccaaa acaaacattc ccaaagttag tgcatatcaa tatagggtat ttagggta
配列番号８１
＞HPV57
cgg acgaatgttt attatcatgg tgggagctct cggctcctca cagtaggcca tccatattat tctataaaaa aaagtggcaa taataaggtg tctgtgccca aggtatcggg ctaccagtac cgtgtgttcc atgtg
配列番号８２
＞HPV58
c gcacaagcat ttattattat gctggcagtt ccagactttt ggctgttggc aatccatatt tttccatcaa aagtcccaat aacaataaaa aagtattagt tcccaaggta tcaggcttac agtatagggt ctttagggtg
配列番号８３
＞HPV59
cgtaccag tattttctac cacgcaggca gttccagact tcttacagtt ggacatccat attttaaagt
acctaaaggt ggtaatggta gacaggatgt tcctaaggtg tctgcatatc aatacagagt atttagggtt
配列番号８４
＞HPV61
cgcaccaact tattttatta tggtggcagt tcccgtctgc ttactgtagg acatccctat tgtagtttgc agcttgatgg gctgcagggc aagaaaaaca ctatccccaa ggtgtctggc tatcaatata gggtgtttag ggta
配列番号８５
＞HPV62
cgcacca acctttttta ttatgggggc agctcccgcc ttcttactgt gggacatcca tattgtactt tacaggttgg ccagggtaaa cgggccacca ttcctaaggt gtctgggtat cagtacaggg tgtttcgtgt
g
配列番号８６
＞HPV66
cgtacca gtatatttta tcatgcaggt agctctaggt tgcttgctgt tggccatcct tattactctg tttccaaatc tggtaccaaa acaaacatcc ctaaagttag tgcatatcag tatagagtgt ttagggta
配列番号８７
＞HPV67
cgcacaag catttactat tacgctggta gctccagact tttagctgta ggccatcctt acttttccat tcctaatccc tccaacacta aaaaggtgtt agtgcccaag gtgtcaggtt tgcagtatag ggtatttagg gtt
配列番号８８
＞HPV68
cgcactggca tgtattacta tgctggtaca tctaggttat taactgtagg ccatccatat tttaaggttc ctatgtctgg gggccgcaag cagggcattc ctaaggtgtc tgcatatcaa tacagagtgt ttagggtt
配列番号８９
＞HPV69
cgcac cggatatatt actatgcagg cagctctcga ttattaactt tgggtcatcc ctattttcca attcctaaat ctggttcaac agcagaaatt cctaaagtgt ctgcttacca atatagggtt tttcgtgtt
配列番号９０
＞HPV70
cgta caggcatata ttattatgct ggaagctctc gcttattaac agtagggcat ccttatttta aggtacctgt aaatggtggc cgcaagcagg aaatacctaa ggtgtctgca tatcagtata gggtatttag ggta
配列番号９１
＞HPV72
cgcacca acctctatta ttatggtggc agttctcgtc tactaactgt aggacatcct tactgtgcca tacctctcaa cggacagggc aaaaaaaaca ccattcctaa ggtttcgggg tatcaataca gggtgtttag agta
配列番号９２
＞HPV73
agaaca aatatatatt attatgcagg tagcacacgt ttgttggctg tgggacaccc atattttcct atcaaggatt ctcaaaaacg taaaaccata gttcctaaag tttcaggttt gcaatacagg gtgtttaggc tt
配列番号９３
＞HPV74
cgcacc aacatctttt atcatgctag cagttctaga ctacttgctg taggaaatcc ctatttccct ataaaacagg ttaacaaaac agttgttcct aaagtgtctg gatatcaatt tagggtgttt aaggtg
配列番号９４
＞HPV81
cgcacc aacctttttt attatggggg cagttcccgc cttcttactg tagggcatcc atattgtaca ttaactattg gtacccaagg aaagcgttcc actattccca aggtgtctgg gtatcagtac cgggtgtttc gtgtg
配列番号９５
＞HPV82
cgc accggcatat attattatgc aggcagttcc agacttatta ccttaggaca tccatatttt tcaataccca aaaccaatac acgtgctgaa atacctaagg tatctgcctt tcagtatagg gtgtttaggg ta
配列番号９６
＞HPV83
cg caccaacctc ttttattacg gtggcagctc cagacttctt accgtaggac atccatatta tcctgtacag gttaatggtc aaggaaaaaa agccactatc cccaaggttt ctggctacca atatagggtg tttcgcatt
配列番号９７
＞HPV84
cgcaccaac ttattttatt atggtggtag ttctcgcctg cttactgtgg gacatccata ttattctgtt cctgtgtcta cccctgggca aaacaacaaa aaggccacta tccccaaggt ttctgggtat caatacaggg tgtttagggt c
配列番号９８
＞HPV85
cgta ccagtacatt ttatcatgct ggcagctcta ggcttctaac cgttggacat ccatactata aagttacctc aaatggaggc cgcaagcaag acattcctaa agtgtctgcc tatcagtatc gagtgtttcg ggtt
配列番号９９
＞HPV86
cgtaccaac ctattttatt atggtggtag ttcccgcttg cttactgtgg gccatccata ttatcctgtt actgtttcct ccagccctgg acaaaacaac aaaaaggcca atattcccaa ggtttcgggg tatcaataca
gggtttttag ggtg
配列番号１００
＞HPV87
cgcaccaac ttattttatt atggtggcag ttctcgcctg cttactgtgg gtcaccctta ctatccagtt actgttacca cccctggtca gaacaagaaa tccaatattc caaaggtgtc tggctatcag tacagggtgt ttcgggtg
配列番号１０１
＞HPV89
cgtaccaac ctgtactatt atggaggcag ctcccgcctt attacagttg gccaccctta ttatactgta caggtcaatg gtgctaacaa aaaggccaac atacctaagg tatcagggta tcaatacagg gtatttaggg ta
配列番号１０２
＞HPV90
agaacaaacata tattattatg caggcagttc ccgactgtta actgttggcc atccttattt tgctatcaaa aagcaatcag gaaaaaaccc tatagtggtt cccaaggtgt ctggatatca atatagggtg tttagggta
配列番号１０３
＞HPV91
cgcacc aacttatttt accatgctgg cagttcccgt ttactggctg tgggccaccc tttttttcct ataaaaaata attctggtaa agtaattgtt cctaaagttt caggtcacca atatagggtg tttagagtt
配列番号１０４
HPV-IC
CGGACGAATGTTTATTACCAGATAGATAGAGATAGATACCCATATACAGATAATGACATAGATCCCCATAGACAGTTTATACAGATCAGTAGCAGTTTTTATATATGAGATGATGATAGCAATACAGAGTATTTAGGGTA
配列番号１０５  HPV11B3/2: AAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTG
配列番号１０６  HPV42B1: CAAAAAGGCCAAATAAGACA
配列番号１０７  HPV43B6: CCCCCTTAAAAATTCCTCT
配列番号１０８  HPV44/55B1 ATACGACCAGCAAACAAGAC
配列番号１０９  HPV39B4: TATGAATGGTGGTCGCAAG
配列番号１１０  HPV52B7: AAAACACCAGTAGTGCTAATG
配列番号１１１  HPV56B3: CCAAAACAAACATTCCCAA
配列番号１１２  HPV59B3: ATCCATATTTTAAAGTACCTAAAG
配列番号１１３  HPV66B1: CAAATCTGGTACCAAAACAAA
配列番号１１４  HPV-ICB4: CCCATAGACAGTTTATACAGATCA
配列番号１１５  HPV6B6: ATAAAACGGGCTAACAAAA
配列番号１１６  HPV26B1: TACCTAAAACTGGCCAAAAG
配列番号１１７  HPV35B4: ATTCTAATAAAATAGCAGTACCCAAG
【配列表】
2009515545000001.app
【国際調査報告】
2009515545.tif 000002
2009515545.tif 000003
2009515545.tif 000004
2009515545.tif 000005
2009515545.tif 000006
2009515545.tif 000007
2009515545.tif 000008
2009515545.tif 000009
2009515545.tif 000010
2009515545.tif 000011