(57)【要約】本発明は、新規の拮抗性抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体、その産生方法及びその使用方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列
2009536522.tif 000053
を含むポリペプチドであって、
2009536522.tif 000054
上記ポリペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列
2009536522.tif 000055
を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
2009536522.tif 000056
請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
2009536522.tif 000057
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
2009536522.tif 000058
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
2009536522.tif 000059
請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
2009536522.tif 000060
請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項８】
2009536522.tif 000061
請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
Ｘ１がＬであり、Ｘ２がＶであり、Ｘ３がＬであり、Ｘ４がＬであり且つＸ５がＦである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
アミノ酸配列
2009536522.tif 000062
を含むポリペプチドであって、
Ｘ１がＬであり且つＸ２がＩである、又はＸ１がＩであり且つＸ２がＶである
上記ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む結合性物体。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む抗体。
【請求項１３】
ヒト抗体の定常領域を含む、好ましくはＩｇＧ定常領域を含む、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
該定常領域、好ましくはヒトＩｇＧ４定常領域又は変異したヒトＩｇＧ１定常領域が、補体活性化に乏しい、請求項１２又は１３に記載の抗体。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド、及び／又は請求項１１に記載の結合性物体、及び／又は請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１１に記載の結合性物体、及び／又は請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の抗体、及び／又は請求項１５に記載の核酸を含む細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、拮抗性抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体。
【請求項１８】
請求項１７に記載の、脱免疫化された拮抗性抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体。
【請求項１９】
アミノ酸配列
2009536522.tif 000063
を含む、請求項１７又は請求項１８に記載の拮抗性抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体であって、
2009536522.tif 000064
上記拮抗性抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体。
【請求項２０】
アミノ酸配列
2009536522.tif 000065
を含む、請求項１９に記載の拮抗性抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体。
【請求項２１】
Ｘ６がＴ又はＳであり、Ｘ７がＤ又はＱであり、Ｘ８がＱ又はＰであり、Ｘ９がＶ又はＡであり、Ｘ１０がＶ又はＬであり、且つＸ１１がＦ又はＹである、請求項１９又は請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
Ｘ６がＴであり、Ｘ７がＱであり、Ｘ８がＰであり、Ｘ９がＡであり、Ｘ１０がＶであり、且つＸ１１がＹである、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２３】
請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の抗体を含む細胞。
【請求項２４】
該抗体を産生する、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
ハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＮＳ０細胞又はＰＥＲ−Ｃ６（商標）細胞である、請求項１６、２３又は請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
番号・・・下で、・・・コレクションで寄託された、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】
請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の細胞を含む細胞培養物。
【請求項２８】
抗体を生産する方法であって、請求項１６、２３〜２６のいずれか１項に記載の細胞を培養すること及び該培養物からの該抗体を回収することを含む上記方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法により得られる抗体。
【請求項３０】
精製された、請求項２９に記載の抗体。
【請求項３１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１１に記載の結合性物体、請求項１２〜１４、１７〜２２、２９又は３０のいずれか１項に記載の抗体、請求項１５に記載の核酸、及び／又は請求項１６、２３〜２６のいずれか１項に記載の細胞を含む医薬組成物。
【請求項３２】
医薬として使用する為の、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１１に記載の結合性物体、請求項１２〜１４、１７〜２２、２９又は３０のいずれか１項に記載の抗体、請求項１５に記載の核酸、及び／又は請求項１６、２３〜２６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３３】
自己免疫疾患及び／若しくは炎症性疾患の症状を改善する為の、並びに／又は移植片拒絶を減少する為の、並びに／又はＣＤ４０陽性癌の処置の為の医薬の製造の為に、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１１に記載の結合性物体、請求項１２〜１４、１７〜２２、２９又は３０のいずれか１項に記載の抗体、請求項１５に記載の核酸、及び／又は請求項１６、２３〜２６のいずれか１項に記載の細胞を使用する方法。
【請求項３４】
該自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、水疱性類天疱瘡及びアトピー性皮膚炎の群から選ばれる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
該自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患が、炎症性腸疾患を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
該炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）又はクローン病（ＣＤ）を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
抗体を個体に与える方法であって、請求項１２〜１４、１７〜２２、２９又は３０のいずれか１項に記載の抗体を該個体に与えることを含む上記方法。
【請求項３８】
抗ヒトＣＤ４０アンタゴニスト抗体を選択する方法であって、
原型の抗ヒトＣＤ４０アンタゴニスト抗体を産生する第１の細胞株を作ること及び該第１の細胞株により産生される原型の抗体の量を決定することを含み、
該原型の抗体は重鎖可変ドメインアミノ酸配列
2009536522.tif 000066
を含み、
ここでＸ１及びＸ２は、Ｘ１＝Ｉ且つＸ２＝Ｖ；Ｘ１＝Ｌ且つＸ２＝Ｉ；Ｘ１＝Ｖ且つＸ２＝Ｖ；Ｘ１＝Ｌ且つＸ２＝Ｌ；又はＸ１＝Ｌ且つＸ２＝Ｖから成る群からついで選ばれる、
該方法がさらに、
該原型の抗体の変異体を産生する少なくとも１のさらなる細胞株を作ること、
ここで該変異体抗体が、該原型の抗体と比較されたときに、約１〜５アミノ酸の挿入、欠失、逆位及び／又は置換を含む改変された原型の抗体であり、
ここで該改変はＸ１及びＸ２により同定される位置でのアミノ酸の改変から成ることは無い、
及び
該少なくとも１のさらなる細胞株により産生される変異体抗体の量を決定すること、
を含み、
該方法がさらに、
原型の抗体の量の少なくとも５０％である量で産生された変異体抗体を選択することを含む、
上記方法。
【請求項３９】
該原型の抗体が軽鎖アミノ酸配列
2009536522.tif 000067
を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
該約１〜５のアミノ酸の挿入、欠失、逆位及び／又は置換が、該原型の抗体中の対応する鎖のアミノ酸配列と比較したときに、該重鎖アミノ酸配列又は該軽鎖アミノ酸配列の中にある、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
該約１〜５のアミノ酸の挿入、欠失、逆位及び／又は置換が、該原型の抗体の該重鎖配列と比較したときに、該重鎖アミノ酸配列中にある、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
該選択された抗体を産生する抗体産生細胞株を作ることをさらに含む、請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
該選択された抗体を集めることをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法により得られる、抗ヒトＣＤ４０アンタゴニスト抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、減少された免疫原性を有するヒト抗体、ヒト化抗体及びモノクローナル抗体、それらの使用方法並びにそれらの生産の方法に関する。本発明は特に、拮抗性抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ４０分子は、５０ｋＤａのＩ型膜糖タンパク質であり、そして、Ｂ細胞、単球／マクロファージ上、樹状細胞（ＤＣ）上及び活性化内皮細胞上に発現される１−６。或る条件下では、ＣＤ４０は、線維芽細胞上、上皮細胞上及び角化細胞上でも見られる７。３２ｋＤａのＩＩ型膜内在性糖タンパク質であるＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１５４）は、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞及び少数の活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞上で一時的に発現される８、９。加えて、ＣＤ４０Ｌは、肥満細胞、好塩基球、Ｂ細胞、好酸球、ＤＣ及び血小板を含む、活性化後の多数の他の細胞タイプ上で発見される１０、１１。
【０００３】
マウスモデルにおける研究は、種々の自己免疫疾患の病態生理学におけるＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用の関与を明白に示した（概説については、参考文献１２を参照されたい）。致死の炎症性腸疾患を獲得するＣＤ４０Ｌトランスジェニックマウスからの証拠は、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用が炎症性腸疾患の発病においても役割を果たしうることの最初の証拠を提供した１３。抗マウスＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、ＴＮＢＳにより誘発された大腸炎における固有層ＣＤ４＋Ｔ細胞による粘膜炎症及びインターフェロン−γ産生を有効に防ぐ１４。重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス炎症性腸疾患モデルにおいて、Ｔ細胞再構成の日からの抗ＣＤ４０Ｌによる処置が、実験的な大腸炎の臨床的及び組織学的な出現を完全に防いだことが示された１５。さらに、Ｔ細胞再構成後５週からの抗ＣＤ４０Ｌ投与は、病気の進行をなお防ぐことができ、そして、処置された動物は、対照動物と比較して、病気の症状及び組織学における改善を示した１５。加えて、ＣＤ４０ＬノックアウトマウスからのＴ細胞によるＳＣＩＤマウスの再構成はさらに、病気の進展及びインターロイキン−１２産生におけるＣＤ４０Ｌ発現性Ｔ細胞の非常に重要な役割を示した１６。
【０００４】
ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用は、ＣＤ４０Ｌ又はＣＤ４０に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）により拮抗されうる。活性化血小板上のＣＤ４０Ｌの発現は、より高い用量の水準でのＩｇＧ１抗ヒトＣＤ４０Ｌ  Ｍａｂによるヒトの処置の間の血栓塞栓性の現象を結果し及びこれらのＭａｂの開発の終了を結果した１７、１９。それ故に、ＣＤ４０を拮抗することは、より魅力的な試みであると思われる。Ｍａｂ  ５Ｄ１２（抗ヒトＣＤ４０）の非刺激性拮抗的活性は、種々のＣＤ４０産生性細胞タイプを用いたさまざまなインビトロ研究において示され２０、２２、そして、キメラ５Ｄ１２（ｃｈ５Ｄ１２）アンタゴニスト活性が、種々の非ヒト霊長類疾患モデルを用いてインビボで確認された２３、２７。ｃｈ５Ｄ１２は、５Ｄ１２の重鎖及び軽鎖のマウス可変ドメインを有する分子的に改変されたヒトＩｇＧ４抗体であり、そして、ヒトにおいて用いられたときに、免疫原性についての能力を減少するため及びマウス５Ｄ１２  Ｍａｂのインビボでの半減期を増すために構築された。
【０００５】
クローン病を有する患者は、胃腸管の衰弱性炎症疾患をわずらい、この正確な病因学及び原因は捕え所のないままである２８、２９。該病は、活性化したＴ細胞、Ｂ細胞及びマクロファージの病気の粘膜への流入３０、３１、可溶性の炎症メディエーターの局所的な産生並びに関係する組織の損傷により特徴付けられる２８、２９。粘膜のＣＤ４＋Ｔ細胞及びマクロファージ並びに、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α及びＩＬ１２のようなサイトカインは、クローン病における炎症のループを開始することにおいて中心的な役割を果たすと示されている３２、３８。炎症の粘膜からのＴ細胞は、より高い増殖能力を示し２８、２９、そして、増加した量のＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌する。増加した水準のＴ細胞関連サイトカインｍＲＮＡ転写物は、クローン病患者からの粘膜バイオプシーにおいて発見された３３。活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌの最も有力な役割が、クローン病病変におけるＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ発現についての我々の研究中で提案された３９。
ＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４０産生性細胞、主にＢ細胞及びマクロファージの強力な活性化を媒介することができ、すなわち病変におけるＴＮＦ−α及びＩＬ−１２の増加した産生を結果する。免疫組織化学を用いて、５Ｄ１２による増加した染色が、病気でない領域と比較して、クローン病患者からの病気の領域の全ての試料において発見された。ＣＤ４０と、ＣＤ２０（Ｂ細胞）又はＣＤ６８（マクロファージ）とについての二重の染色は、クローン病を有する患者からの切片において、ＣＤ４０＋細胞は主に、リンパ濾胞においてＢ細胞であり、及び固有層においてマクロファージであったことを示した。クローン病患者の炎症の粘膜からの固有層Ｔ細胞は、共培養の４８時間後で、単球が、かなりの量のＩＬ−１２及びＴＮＦ−αを産生することを誘発した。５Ｄ１２の添加は、減少したＩＬ−１２及びＴＮＦ−αの産生を結果した；産生の水準は、ＩＦＮ−Υの不在下及び存在下の両方において、対照固有層Ｔ細胞を用いて観察された水準に減少された３９。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、インビボでの５Ｄ１２の安全性及び／又は有効性の性質を少なくとも共有するが、該安全性及び／又は有効性の量は必ずしも共有しない、代替的な分子を提供することである。抗体５Ｄ１２、又は少なくともその可変ドメインは、マウスのバックグラウンドを有する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、５Ｄ１２の重鎖及び軽鎖の可変ドメインの変異体を提供する。この目的のために、本発明は、式（Ｉ）
2009536522.tif 000002
のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここで、
2009536522.tif 000003
該ポリペプチドは、５Ｄ１２抗体の重鎖可変ドメインとの広範な配列同一性を含むが、該ポリペプチドは、そのようなものとして又は該ポリペプチドを含む抗体において投与されたヒトの個体においてより免疫原性でない。表示された位置Ｘ１〜Ｘ５で、いくつかのアミノ酸は、表示されたとおりに存在しうる。本発明のポリペプチドを含む結合性分子は、よいＣＤ４０結合特性を有する。細胞における抗体の産生は、表示された位置でのアミノ酸の種類によりいくらか変わりうることが注目される。これは、本明細書中の以下のほかの場所において詳述されるであろう。
【０００８】
本発明はさらに、本発明に従うポリペプチドであって、アミノ酸配列
2009536522.tif 000004
を含む上記ポリペプチドを提供する。上記のポリペプチドは本質的に、マウス５Ｄ１２抗体の重鎖の可変ドメインにわたる。該アミノ酸配列は、マウス配列に対していくつかの位置で変化される。該変化したポリペプチドは、良い結合特性を有し、同時に、該ポリペプチドを与えられたヒトによる忍容性が良好である。原型のマウスポリペプチドと比較したときに、該ポリペプチドの少なくとも免疫学的特性を劇的に減少せず及び／又は変化することなく、表示された位置で、種々のアミノ酸が挿入されうる。本発明のポリペプチドは、位置Ｘ１で、
2009536522.tif 000005
を含むことが好ましい。このようにして、哺乳類細胞における該ポリペプチドの少なくとも産生特性は、原型のマウス又はキメラのポリペプチドと比較して、劇的に減少されず及び／又は変化されない。特に好ましい実施態様において、
2009536522.tif 000006
これらのポリペプチドは、特に抗体の文脈における、哺乳類細胞における高水準産生にとってより適当である。
【０００９】
本発明はさらに、本発明に従うポリペプチドを提供し、ここで
2009536522.tif 000007
これらのポリペプチドは、高水準抗体産生にとってより適当であると同時にヒトにおける良い忍容特性を示す。本発明はさらに、式（Ｉ）のポリペプチドであって、Ｘ１がＬであり；Ｘ２がＩであり；Ｘ３がＰであり；Ｘ４がＭであり；及び／又はＸ５がＳである上記ポリペプチドを提供する。このポリペプチドは特に好ましく、なぜなら、抗体ｃｈ５Ｄ１２の結合特性及び薬理学的特性を模倣するが、マウス又はｃｈ５Ｄ１２抗体と比較したときに免疫学的特性がヒトにおいて改善される抗体の文脈におけるその優れた産生特性の故であり、ここで該ポリペプチドの少なくとも産生はマウス又はキメラのカウンターパートと比較して劇的に減少されない
【００１０】
本発明はさらに、式（Ｉ）のポリペプチドであって、Ｘ１がＩであり；Ｘ２がＶであり；Ｘ３がＰであり；Ｘ４がＭであり；及び／又はＸ５がＳである上記ポリペプチドを提供する。このポリペプチドは特に好ましく、なぜなら、抗体ｃｈ５Ｄ１２の結合特性及び薬理学的特性を模倣するが、マウス又はｃｈ５Ｄ１２の抗体と比較してヒトにおいて免疫学的特性が改善される抗体の文脈におけるその優れた産生特性の故であり、ここで該ポリペプチドの少なくとも産生がマウス又はキメラのカウンターパートと比較して劇的に減少されない。
【００１１】
少なくとも１の位置Ｘ１〜Ｘ５で、キメラ５Ｄ１２と対応する位置で比較したときに逸脱する抗体は、ヒトにおいて、キメラ５Ｄ１２抗体よりも良い免疫学的特性を有する。そのような抗体の好ましい実施態様において、本発明は、本発明に従うポリペプチドであって、Ｘ１がＩであり且つＸ２がＶである；Ｘ１がＩであり且つＸ２がＩである；Ｘ１がＬであり且つＸ２がＩでる；又は、Ｘ１がＬであり且つＸ２がＶである上記ポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、Ｘ３がＰ；Ｘ４がＭ；及びＸ５がＦ又はＳであることとの組み合わせにおいて特に好ましい。１つの実施態様において、本発明は、本発明に従うポリペプチドであって、Ｘ１がＬであり；Ｘ２がＶであり；Ｘ３がＬであり；Ｘ４がＬであり且つＸ５がＦである上記ポリペプチドを提供する。該ポリペプチドを含む抗体の産生が非常によく、同時に、ｃｈ５Ｄ１２と比較したときに、ヒトにおける改善された免疫学的特性を提供する。本発明はさらに、アミノ酸配列
2009536522.tif 000008
を含むポリペプチドを提供し、ここでＸ１はＬであり且つＸ２はＩである；又は、Ｘ１はＩであり且つＸ２はＶである。このポリペプチドは、５Ｄ１２重鎖可変断片の改変ＣＤＲ１を含む。このＣＤＲ１は、抗体５Ｄ１２の重鎖可変断片のＣＤＲ１と比較して少なくとも１の異なるアミノ酸を含む。このアミノ酸変化は、改変された５Ｄ１２又はｃｈ５Ｄ１２の改善された免疫学的特性を両方とももたらし、ここで、該改変は、５Ｄ１２又はｃｈ５Ｄ１２における該ポリペプチドの対応する配列の、本発明のポリペプチドとの少なくとも置換を含むが、同時に哺乳類細胞における該抗体の良い産生を可能とする。
【００１２】
本発明はさらに、式（Ｉ）のポリペプチドを含む重鎖可変ドメインを提供する。該可変ドメインは、好ましくは９０〜１３０、より好ましくは１００〜１２０、より好ましくは１０５〜１１５、最も好ましくは１１３のアミノ酸を含む。該ポリペプチドは、合成的に又は細胞により産生されうる。好ましくは該重鎖可変ドメインは、細胞により産生される。天然には、少なくとも５タイプの重鎖が存在し：Υ、δ、α、μ及びε、それぞれのタイプは、免疫グロブリンのクラスを定義する。本発明のポリペプチドは、結合性物体として直接に用いられてよく、又は、抗体中に組み込まれてよい。抗体中に組み込まれるときには、該ポリペプチドは好ましくは、抗体重鎖の定常部分と組み合わせられる。この目的のために、本発明はさらに、式（Ｉ）のポリペプチドを含む抗体重鎖を提供する。当技術分野は、可変ドメイン抗体の多くの誘導体及び類似体を知っている。しかしながら、現在、多くのさまざまな抗体の部分、誘導体及び／又は類似体が使用されている。そのような部分、誘導体及び／又は類似体の非限定的な例は、一本鎖Ｆｖ断片、モノボディ（monobody）、ＶＨＨ、Ｆａｂ断片、人工結合性タンパク質、例えばアビマー（avimer）など、及びその同様物である。そのような特異的結合性物体の共通点は、重鎖可変ドメインの存在である。すなわち、本発明はさらに、式（Ｉ）のポリペプチドを含む結合性物体を提供する。
【００１３】
抗体は、天然に発生する構造を含むので、本発明の好ましい結合性物体は抗体である。それ故に、好ましい実施態様における本発明は、本発明に従うポリペプチドを含む抗体を提供する。
【００１４】
本発明に従う結合性物体は好ましくは、動物において忍容性が良好である結合性物体である。ポリペプチドについての動物の忍容は、多くの種々の面により支配される。Ｔ細胞媒介性である、Ｂ細胞媒介性である又は他である免疫は、ポリペプチドについての動物の忍容において包含される変化するものの一つである。上記で述べられたように、５Ｄ１２抗体は、マウスバックグラウンドを有する。式（Ｉ）のポリペプチドは、ヒトにおいて減少した免疫原性を有する。それ故にときどき、５Ｄ１２の重鎖可変ドメインの脱免疫化変異体と言われる。すなわち、１つの局面において、本発明は、５Ｄ１２抗体のエピトープ特異性を含む抗体を提供し、ここで、該抗体の重鎖は式（Ｉ）のポリペプチドである。本明細書において用いられるときの脱免疫化は、原型の抗体よりも動物においてより免疫原性でないとして定義される。式（Ｉ）のポリペプチドは、既知のヒトＴ細胞エピトープの除去を通じて、５Ｄ１２における重鎖と比較して、脱免疫される。Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有するタンパク質の中のアミノ酸配列である。Ｔ細胞エピトープの除去により、該抗体はより免疫原性でない。好ましくは、本発明の可変ドメインはさらに、ヒト化され、例えばベニア化（veneer）される。ベニア化技術（veneering  technique）を用いることにより、免疫系により容易に遭遇される外面の残基が、ヒトの残基と選択的に置き換えられて、弱い免疫原性の又は実質的に非免疫原性の、ベニア化表面（veneered  surface）を含むハイブリッド分子を提供する。本発明において用いられるときの動物は、好ましくは哺乳類であり、より好ましくは霊長類であり、最も好ましくはヒトである。
【００１５】
本発明に従う抗体は好ましくは、ヒト抗体の定常領域を含む。それらの重鎖定常ドメインにおける違いに従い、抗体は５つのクラス又はアイソタイプに分類される：ＩｇＧ，ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥ。これらのクラス又はアイソタイプは、対応するギリシャ文字により名付けられる該重鎖の少なくとも１つを含む。好ましい実施態様において、本発明は、本発明に従う抗体を提供し、ここで該定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ，ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥ定常領域の群から選ばれ、より好ましくは該定常領域は、ＩｇＧ定常領域を、より好ましくはＩｇＧ１定常領域を含み、最も好ましくは該定常領域はＩｇＧ４定常領域である。さらに、該ＩｇＧ４定常領域は好ましくは、ヒトＩｇＧ４定常領域である。好ましくは、本発明の該ＩｇＧ４抗体は、図１８において描かれるとおりの、重鎖及び軽鎖アミノ酸配列の定常領域を含む。好ましくは、本発明の該ＩｇＧ４抗体は、図１８において描かれるとおりの重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含む。ＩｇＧ４の定常領域におけるいくつかの変異が、得られた抗体の免疫学的特性を変化することなく、天然に発生し及び／又は許容される。典型的には、約１〜５アミノ酸の間で、置換が該定常領域中において許容される。ＩｇＧ４定常領域を有する抗体又は変異したＩｇＧ１定常領域を有する抗体は、抗体の薬理学的特性の少なくとも大部分を有するが、補体に結合せず、すなわち、インビボでそれが結合する細胞の欠乏を誘発しないであろう。好ましくは、該定常領域はヒト抗体の定常領域である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】４の用量水準での０日目での単回投与後のｃｈ５Ｄ１２血清濃度を示すグラフである。
【図２】ｃｈ５Ｄ１２注入後２８日期間の間の、クローン病活性指標（ＣＤＡＩ）スコアにおける変化を示すグラフである。
【図３】０日目及び２８日目での組織学的な病気の活性スコアを示すグラフである。
【図４】炎症応答の減少についての例として示される、患者０１２からの結腸バイオプシー（３．０ｍｇ／ｋｇ)及び患者０１１からの回腸バイオプシー（３．０ｍｇ／ｋｇ）の図である。
【図５】マウス５Ｄ１２ＶＨ及びＶＬ領域のコンセンサスＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。
【図６】５Ｄ１２のベニア化され且つ脱免疫化されたＶ領域を有するマウスＶ領域のアミノ酸比較を示す図である。
【図７】１２変異体  ＤＩ５Ｄ１２ＶＨ。親マウス配列（ｃｈ５Ｄ１２）及び完全に脱免疫化された配列（ＤＩ５Ｄ１２）と比較した、脱免疫化された５Ｄ１２  ＶＨの１２の試験されたアミノ酸変異体（Ｑ５Ｅ、Ｋ１３Ａ、Ｅ１６Ｑ、Ｔ１７Ｓ、Ｉ２９Ｌ、Ｉ３７Ｖ、Ｐ４５Ｌ、Ｍ４８Ｌ、ＳＴＳ６０ＮＳＡ、Ｔ６８Ｓ、Ｓ７９Ｆ、及びＴ１０８Ｓ）のアラインメントを示す図である。
【図８−１】ＪＹ細胞を用いたＦＡＣＳ分析の結果を示す図である。
【図８−２】ＪＹ細胞を用いたＦＡＣＳ分析の結果を示す図である。
【図８−３】ＪＹ細胞を用いたＦＡＣＳ分析の結果を示す図である。
【図９】ＤＩ５Ｄ１２ＶＨのＶ−Ｌ−Ｉ変異体。親のキメラ配列（ｃｈ５Ｄ１２）、完全に脱免疫化された配列（ＤＩ５Ｄ１２；２９Ｉ−３７Ｉ）及びＰＧ１０２（２９Ｌ−３７Ｉ）と比較した脱免疫された５Ｄ１２  ＶＨの位置２９及び３７についての追加のＶ−Ｌ−Ｉ変異体のアラインメントを示す図である。
【図１０】ＰＧ１０２抗体を産生するＧＳ−ＣＨＯ細胞株及び“過増殖”２４−ウェルプレート培養物についての抗体生産性の分布を示すグラフである。
【図１１】ＣＤＡＣＦ流加振盪フラスコ培養における、細胞株Ａ）Ｌ１０７（ＤＣ１；上のパネル）、Ｂ）Ｌ２５（ＤＣ２；中間のパネル）及びＣ）Ｍ９５（ＤＣ３；下のパネル）についての増殖及び抗体蓄積のプロファイルを示すグラフである。
【図１２】３の異なる水準で固定化されたＣＤ４０への、ＰＧ１０２（赤）及びｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）（青）の結合性の比較を示すグラフである。
【図１３】抗体イディオタイプｍＡｂ  １７３−３６−１による、ヒトＣＤ４０を発現するＪＹ細胞へ結合するＣＤ４０ｍＡｂの抑制を示すグラフである。
【図１４】ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２のヒトＣＤ４０−Ｆｃへの、濃度の関連する結合性を示すグラフである。
【図１５】ＪＹ細胞に結合する抗ＣＤ４０ｍＡｂのＦＡＣＳ定量化の結果を示すグラフである。
【図１６】非ラベル化ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２抗体によるＪＹ細胞へ結合するｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）−ＰＥ及びＰＧ１０２−ＰＥの抑制を示すグラフである。
【図１７】ジャーカット細胞との共培養後の、ＴＨＰ−１細胞によるＩＬ−８放出の抑制を示すグラフである。
【図１８】ＩｇＧ４  ＰＧ１０２重鎖及び軽鎖の核酸配列及びアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
１つの実施態様において、本発明は、本発明に従うポリペプチド、及び／又は本発明に従う結合性物体、及び／又は本発明に従う抗体をコードする核酸を提供する。本発明において用いられるときの核酸は典型的にはリボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であるが、これに限定されない。代替的な核酸は、当技術分野の当業者にとって利用可能であり、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）などである。本発明に従う核酸は、例えば細胞に含まれる。該核酸が該細胞で発現されるとき、該細胞は、本発明に従うポリペプチド及び／又は結合性物体及び／又は抗体を産生する。それ故に、１つの実施態様における本発明は、本発明に従うポリペプチド、本発明に従う結合性物体、本発明に従う抗体及び／又は本発明に従う核酸を含む細胞を提供する。該細胞は、好ましくは動物細胞であり、より好ましくは哺乳類細胞であり、より好ましくは霊長類細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。本発明の目的にとって、適当な細胞は、本発明に従うポリペプチド、本発明に従う結合性物体、本発明に従う抗体及び／又は本発明に従う核酸を含むことができる任意の細胞、及び好ましくは産生することができる任意の細胞である。
【００１８】
本発明はさらに、本発明に従う抗体を含む細胞を提供する。好ましくは該細胞は、該抗体を産生する。好ましい実施態様において、該細胞は、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞又はＰＥＲ−Ｃ６（商標）細胞である。特に好ましい実施態様において、該細胞はＣＨＯ細胞である。さらに、本発明に従う細胞を含む細胞培養物が提供される。種々の機関及び企業が、例えば臨床的な使用の為に、抗体のラージスケール生産の為の細胞株を開発した。そのような細胞株の非限定的な例は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞又はＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞である。これらの細胞は、タンパク質の生産などの他の目的の為にも用いられる。タンパク質及び抗体の工業的スケール生産の為に開発された細胞株は、本明細書において、さらに工業的細胞株といわれる。すなわち、好ましい実施態様において、本発明は、本発明の抗体の生産の為の、タンパク質及び／又は抗体のラージスケール生産の為に開発された細胞株の使用方法を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、抗体を生産する方法であって、本発明の細胞を培養すること及び該培養物から該抗体を回収することを含む上記方法を提供する。好ましくは該細胞は、無血清培地において培養される。好ましくは、該細胞は、懸濁増殖に適合している。さらに、本発明に従う抗体を生産する方法により得られる抗体が提供される。該抗体は、好ましくは、該培養物の培地から精製される。好ましくは、該抗体はアフィニティー精製される。
【００２０】
本発明の細胞は、例えば、ハイブリドーマ細胞株、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞又は、臨床的な目的の為の抗体生産にとってのその適合性について既知の他の細胞タイプである。特に好ましい実施態様において、該細胞は、ヒト細胞であり、好ましくは、アデノウィルスＥ１領域又はその機能的等価物により形質転換された細胞である。そのような細胞株の好ましい例は、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞株又はその機能的等価物である。特に好ましい実施態様において、該細胞はＣＨＯ細胞又はその変異体であり、好ましくは、抗体の発現の為にグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）ベクター系を使用する変異体である。
【００２１】
上記の位置Ｘ１〜Ｘ５でのいくつかのアミノ酸は、抗体産生細胞における、式（Ｉ）のポリペプチドを含む抗体の高水準の産生にとってより適当でないことが指摘された。好ましい実施態様において、該抗体中の式（Ｉ）のポリペプチドはＸ１〜Ｘ５を含み、ここで
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より好ましくは、Ｘ１はＬであり、Ｘ２はＩであり、Ｘ３はＰであり、Ｘ４はＭであり、及び／又はＸ５はＳである。Ｘ１がＩであり且つＸ２がＶである、Ｘ１がＩであり且つＸ２がＩである、Ｘ１がＬであり且つＸ２がＩである、Ｘ１がＬであり且つＸ２がＬである、Ｘ１がＶであり且つＸ２がＩである、Ｘ１がＶであり且つＸ２がＶである、Ｘ１がＬであり且つＸ２がＬである、Ｘ１がＶであり且つＸ２がＬである、又は、Ｘ１がＬであり且つＸ２がＶであるときが特に好ましい。これらの後者のポリペプチドは特に、Ｘ３がＰであり、Ｘ４がＭであり、且つＸ５がＦ又はＳ、好ましくはＳであることとの組み合わせにおいて好ましい。一つの実施態様において、本発明は本発明に従うポリペプチドを提供し、ここでＸ１はＬであり、Ｘ２はＶであり、Ｘ３はＬであり、Ｘ４はＬであり、及びＸ５はＦである。該ポリペプチドを含む抗体の産生が良く、同時に、ｃｈ５Ｄ１２と比較したときに、ヒトにおける改善された免疫学的特性を提供する。
【００２２】
他の好ましい実施態様において、本発明は、本発明に従うポリペプチドを提供し、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４又はＸ５の少なくとも１つが、本発明により特に良い発現水準を生じることが示される配列中の対応する位置でのアミノ酸と同じであり、且つさらに、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４又はＸ５の少なくとも１つが、５Ｄ１２アミノ酸配列中の対応する位置でのアミノ酸と同じである。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４又はＸ５の少なくとも１つが５Ｄ１２アミノ酸配列中の対応する位置でのアミノ酸と同じであるところの本発明に従うポリペプチドの利点は、そのようなポリペプチドを含む本発明に従う結合性物体が、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４又はＸ５のどれもが５Ｄ１２アミノ酸配列中の対応する位置でのアミノ酸と同じでないところの本発明に従うポリペプチドよりも、良い発現水準を示すことである。理論にとらわれることなく、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及び／又はＸ５の位置でのアミノ酸が、該アミノ酸が５Ｄ１２アミノ酸配列における対応する位置でのアミノ酸と同じであるときに、本発明に従う結合性物体の適当な構築に寄与するという事実に、該良い発現水準は起因すると考えられる。
【００２３】
式（Ｉ）のポリペプチドを含む抗体は、非刺激性の拮抗性活性を示す。ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用は、種々の炎症性疾患、例えば自己免疫疾患及び移植片拒絶などの病態生理に関与するので、本発明に従うポリペプチドは、それ故に、炎症性疾患の症状を改善するのに特に適する。１つの実施態様において、抗体は、本発明の結合性物体を含む。好ましい実施態様において、該抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体技術は、本質的に純粋な抗体の大量の産生を可能とし、すなわち予測可能な産物を得る。それ故に、１つの実施態様における本発明は、本発明に従うポリペプチドを含む、拮抗性抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体を提供する。本発明に従う結合性物体は、その目的にとっていっそう適当である。なぜなら、それは、１つの実施態様において、マウス５Ｄ１２及び／又はキメラ５Ｄ１２と比較して脱免疫化されるからである。それ故に、本発明の結合性物体は、マウス５Ｄ１２及び／又はキメラ５Ｄ１２と比較して、ヒトにおいて、減少された免疫原性を有しそして増加された半減期を有する。その結果として、本発明の結合性物体は、種々の炎症性疾患に対して持続可能な医薬的能力を有する。すなわち、好ましい実施態様において、本発明は、本発明に従う、脱免疫化拮抗性抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体を提供する。
【００２４】
前に言及されたとおり、本発明は、５Ｄ１２アミノ酸配列に関してアミノ酸変化を含む５Ｄ１２様分子を提供し、ここで該変化は少なくとも重鎖可変ドメイン中にあり、そして、好ましくは軽鎖可変ドメイン中にもある。この文脈において、本発明はさらに、本発明に従う結合性物体であって、式（ＩＩ）
2009536522.tif 000010
のアミノ酸配列を含む上記結合性物体を提供し、
ここで、
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該結合性物体は、好ましくは、本発明に従う拮抗性抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体である。好ましい実施態様において、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０又はＸ１１から選ばれるＸは、実施例２において示されるとおり、５Ｄ１２アミノ酸配列中の対応する位置でのアミノ酸配列に似ており且つ／又は良い発現水準を生じると本発明により示される配列中の対応する位置でのアミノ酸に似ている群から選ばれる。それ故に、本発明に従う結合性物体は好ましくは、式（ＩＩ）のアミノ酸配列を含み、ここで
2009536522.tif 000012
他の実施態様において、本発明は、本発明に従う拮抗性抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体であって、以下のとおりのアミノ酸配列を含む本発明の式（ＩＩ）のポリペプチドを含む上記抗体を提供する。
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好ましい実施態様において、本発明は、本発明の式（ＩＩ）のポリペプチドを提供し、ここでＸ６はＴ又はＳであり、Ｘ７はＤ又はＱであり、Ｘ８はＱ又はＰであり、Ｘ９はＶ又はＡであり、Ｘ１０はＶ又はＬであり且つＸ１１はＦ又はＹであり、より好ましくはＸ６はＴであり、Ｘ７はＱであり、Ｘ８はＰであり、Ｘ９はＡであり、Ｘ１０はＶであり且つＸ１１はＹである。式（Ｉ）のポリペプチド及び式（ＩＩ）の好ましいポリペプチドを含む５Ｄ１２様抗体は、産生細胞における良い発現水準と、ヒトにおける良い忍容特性及び薬力学的特性とを兼備する。
【００２５】
本発明の抗ヒトＣＤ４０アンタゴニスト抗体は好ましくは、式（Ｉ）の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び式（ＩＩ）の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。そのような抗体は良い特徴を有する。そのような原型の抗体の変異体を、その中の１以上のアミノ酸を改変することにより産生することももちろん可能である。そのような変異体の多くは、該原型のものと比較したときに、多かれ少なかれ同様に振舞うであろう。そのような変異体は、本発明の範囲内にも含まれる。本発明の抗体を改変する為の多くのやり方がある。そのような改変の非限定的な例は、グルタメートの変わりにピログルタメートを含む抗体である。そのような改変の他の非限定的な例は、該原型の抗体と比較したときの、１以上のアミノ酸の挿入、欠失、逆位及び／又は置換である。本発明は、そのような変異体を産生するための手段及び方法を提供する。それは、該変異体の特徴を決定する試験も提供する。好ましい実施態様において、本発明は、本発明の原型の抗体の変異体を提供し、該変異体は、該原型の抗体のアミノ酸配列と比較したときに、約１〜１０アミノ酸の挿入、欠失、逆位及び／又は置換を含む。好ましくは、該挿入、欠失、逆位及び／又は置換は、原型の抗体の式（Ｉ）の重鎖可変ドメインの位置Ｘ１及び位置Ｘ２でのアミノ酸を含まない。
【００２６】
好ましい実施態様において、本発明は、抗ヒトＣＤ４０アンタゴニスト抗体を選択する方法であって、原型の抗ヒトＣＤ４０アンタゴニスト抗体を産生する第１の細胞株を作ること及び該第１の細胞株により産生される原型の抗体の量を決定することを含む上記方法を提供し、
ここで該原型の抗体は、重鎖可変ドメインアミノ酸配列
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を含み、ここでＸ１及びＸ２は、Ｘ１＝Ｉ且つＸ２＝Ｖ、Ｘ１＝Ｌ且つＸ２＝Ｉ、Ｘ１＝Ｖ且つＸ２＝Ｖ、Ｘ１＝Ｌ且つＸ２＝Ｌ、又はＸ１＝Ｌ且つＸ２＝Ｖから成る群から対で選ばれる、
該方法はさらに、
該原型の抗体の変異体を産生する少なくとも１のさらなる細胞株を作ること、ここで該変異体抗体は該原型の抗体と比較したときに、約１〜５のアミノ酸の挿入、欠失、逆位及び／又は置換を含む改変された原型の抗体であり、ここで該改変はＸ１及びＸ２により同定される位置でのアミノ酸の改変から成らない、
及び、
該少なくとも１のさらなる細胞株により産生される変異体抗体の量を決定すること
を含み、
該方法はさらに、
原型の抗体の量の少なくとも５０％である量で産生される変異体抗体を選択することを含む。
好ましくは、該原型の抗体は、軽鎖アミノ酸配列
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を含む。
【００２７】
該約１〜５のアミノ酸の挿入、欠失、逆位及び／又は置換は、位置Ｘ１及びＸ２でのアミノ酸でなく又は位置Ｘ１及びＸ２でのアミノ酸を含まない、抗体の任意の部分内であってよい。好ましくは、該約１〜５アミノ酸の挿入、欠失、逆位及び／又は置換は、該原型の抗体中の対応する鎖のアミノ酸と比較したときに、該重鎖アミノ酸配列又は該軽鎖アミノ酸配列の中にある。好ましくは、該約１〜５アミノ酸の挿入、欠失、逆位及び／又は置換は、該原型の抗体中の該重鎖配列と比較したときに、該重鎖アミノ酸配列中にある。好ましくは、該方法はさらに、該選択された抗体を産生する抗体産生細胞株を作ることを含む。この産生細胞株は、該さらなる細胞株であってよく、又は該選択された抗体を産生するさらに他の細胞株であってもよい。好ましくは、該方法はさらに、該選択された抗体を集めることを含む。該方法はさらに、本発明に従う方法により得られる、単離された及び／又は組み換えの抗ヒトＣＤ４０アンタゴニスト抗体を提供する。好ましい実施態様において、該抗ヒトＣＤ４０アンタゴニスト抗体は、重鎖アミノ酸配列
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の改変を含み、
ここで、Ｘ１及びＸ２は、Ｘ１＝Ｉ且つＸ２＝Ｖであり；Ｘ１＝Ｌ且つＸ２＝Ｉ；Ｘ１＝Ｖ且つＸ２＝Ｖ；Ｘ１＝Ｌ且つＸ２＝Ｌ；又は、Ｘ１＝Ｌ且つＸ２＝Ｖから成る群から対で選ばれる、
該改変は、該重鎖アミノ酸配列と比較したときに、約１〜５アミノ酸の挿入、欠失、逆位及び／又は置換を含み、及び、該改変は、Ｘ１及びＸ２により同定される位置でのアミノ酸の改変から成らない。
【００２８】
１つの実施態様において、本発明は、本発明に従うポリペプチド、本発明に従う結合性物体、本発明に従う抗体、本発明に従う核酸及び／又は本発明に従う細胞を含む医薬組成物を提供する。また、本発明は、医薬としての使用の為の、好ましくは、自己免疫疾患及び／若しくは炎症性疾患の症状を改善する為の、並びに／又は移植片拒絶を減少する為の、並びに／又はＣＤ４０陽性癌の処置の為の医薬としての使用の為の、本発明に従うポリペプチド、本発明に従う結合性物体、本発明に従う抗体、本発明に従う核酸及び／又は本発明に従う細胞を提供する。好ましい実施態様において、該自己免疫及び／又は炎症性疾患は、炎症性腸疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、水疱性類天疱瘡及びアトピー性皮膚炎の群から選ばれる。
【００２９】
本発明に従うポリペプチドは、その非刺激性ＣＤ４０拮抗性特性の故に、炎症性疾患の症状を改善するのに特に適しているので、本発明に従うポリペプチドは、いくつかの疾患の症状を改善するのに適している。本発明において用いられるときに、炎症性疾患は、炎症性成分を伴う任意の疾患として定義される。本発明の関心について、炎症性疾患は、自己免疫疾患及び／又は移植片拒絶を特に包含する。免疫応答の開始、増幅及び延長におけるＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用の中心的な役割は、本発明のポリペプチドを、自己免疫疾患における免疫調節にとって特に適したものにする。
【００３０】
本明細書以下において、炎症性疾患におけるＣＤ４０及びそのリガンドの役割を説明する為に、ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌについての情報が与えられる。ＣＤ４０分子は、５０ｋＤａタイプＩ膜糖タンパク質であり、Ｂ細胞、単球／マクロファージ、及び樹状細胞（ＤＣ）上に発現される４５〜５０。さらに、病理学的条件下において、ＣＤ４０は、内皮細胞（ＥＣ）、線維芽細胞、上皮細胞及び角化細胞上に発見されうる５１。３２ｋＤａのタイプＩＩ膜内在性糖タンパク質であるＣＤ４０リガンド（ｇｐ３９、ＴＢＡＭ、ＴＲＡＰ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１５４）は、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞上及び少数の活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞上に、一過性に発現される５２、５３。加えて、ＣＤ４０Ｌは、肥満細胞、好塩基球、Ｂ細胞、好酸球、ＤＣ及び血小板を含む、活性化後の多数の他の細胞タイプ上に発見されている。
【００３１】
ＣＤ４０ＬによるＣＤ４０の結合は、増殖、活性化マーカーの発現、免疫グロブリン（Ｉｇ）産生、アイソタイプスイッチ、ホモタイプの接着及びアポトーシスからの救出を含む、Ｂ細胞における多くの生物学的現象を誘発する５６、５７。しかしながら、上記で記載されたように、ＣＤ４０分子の分布は、当初に仮定されたとおり、Ｂ細胞に限定されない。新鮮に単離されたヒト単球は、低水準のＣＤ４０分子を発現し、これはＩＦＮ−Υの存在下における培養により上方制御されうる４７−４９、５８。単球／マクロファージのＣＤ４０ライゲーションは、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２などの、大量の炎症促進性メディエーターの分泌を誘発し、これは炎症性応答及び殺腫瘍性活性を誘発し４７−４９、５８、そしてアポトーシスからそれらを救出する４８。ＣＤ４０ライゲーションは、ＤＣが、それらの分化及び活性化を増強すること、ＣＤ８６、ＣＤ８０及びＣＤ５８のような共刺激性分子の発現を増強すること、サイトカイン産生を増すこと、及びアポトーシスを抑制することを引き起こす５０、５９。さらに、炎症性条件下で発現されたときに、ＣＤ４０情報伝達は、ＥＣ上の、細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）及びＥ−セレクチンの発現を誘発できる５５。これらの結果は、Ｔ細胞−ＥＣ相互作用の間の、ＣＤ４０を通じた情報伝達が、ＥＣ活性化の制御及び白血球の非リンパ系組織への動員における重要な段階でありうることを示唆する。インビボでの研究は、体液性免疫応答の発生における６０、６１、抗原特異的Ｔ細胞のプライミング及び活性化における６２、マクロファージの一時的な活性化における６３、並びに、ニューモシスティス、クリプトスポリジウム及びリーシュマニアなどの細胞内寄生性感染に対する、Ｔ細胞媒介性マクロファージ活性化を通じた保護的な細胞媒介性免疫応答における６４−６６、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用の重要性を示した。
【００３２】
ＣＤ４０及びそのリガンドについての特定の役割が、自己免疫疾患のマウスモデルにおいて示される。動物モデル研究は、種々の自己免疫疾患の病態生理におけるＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用の関与を明白に示した。これらの研究において、自発的な又は実験的な自己免疫疾患を患うマウスを用いて、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用により干渉することは、明白な有益な効果を有した。マウスＣＤ４０ＬへのＭａｂは、コラーゲンにより誘発される関節炎、実験的なアレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ；ＭＳについての動物モデル）、（ＳＷＲ×ＮＺＢ）Ｆ１ループスマウスにおいて、及び、自発的にＴ細胞依存性自己免疫糖尿病を発症する非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスにおいて、病気の症状を防ぐ又は減少することが示された。証拠は、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用が、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症成長疾患の病変形成においても役割を果たすことを示唆する。高い導入遺伝子コピー数を有するＣＤ４０Ｌトランスジェニックマウスは、病気の組織へのＣＤ４０＋細胞及びＣＤ４０Ｌ＋Ｔ細胞の浸潤により特徴付けられる、致命的な炎症性腸疾患を獲得することが示された６７。抗ＣＤ４０Ｌ  Ｍａｂは、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸により誘発された大腸炎を有する動物における、固有層ＣＤ４＋Ｔ細胞による粘膜の炎症及びＩＦＮ−Υ産生を有効に防ぐ４４。非常に最近、抗ＴＮＦ−α処置と、抗ＣＤ４０Ｌ  Ｍａｂを用いたＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ経路の干渉との間の、同系のＳＣＩＤマウス実験的炎症性腸疾患モデルにおける直接の比較がなされた。このモデルにおいて、ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＣＤ４＋細胞がＳＣＩＤマウスに注入され、続いて、実験的な炎症性腸疾患の症状として、下痢又は軟便を発症し、そしてＴ細胞再構成後３〜５週間で開始する進行性の体重減少を示す。Ｔ細胞再構成の日からの、抗ＴＮＦ−α又は抗ＣＤ４０Ｌによる処置は、実験的炎症性腸疾患の臨床的及び組織学的な出現を防いだ。さらに、Ｔ細胞再構築後５週からの抗ＣＤ４０Ｌ投与はなお、該病気の進行を防ぐことができ、そして、処置された動物は、対照動物と比較して病気の症状及び組織学における改善を示した（未発表の観察）。
【００３３】
最近の研究は、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ経路による干渉が、移植モデルにおいて強力に免疫抑制的であることも実証した。マウスＣＤ４０Ｌへの、同種間の小リンパ球又はＴ細胞枯渇小リンパ球プラス抗体による組み合わせの処置は、主要又は非主要組織適合性部位において異なった４０のレシピエントのうち３７において、無期限の膵島同種移植片の生着を許容した６８。これらの実験から、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用の有効な干渉が、アロ反応性宿主Ｔ細胞による小さい休止リンパ球上の共刺激性分子の誘発を防ぐことを最も結果しそうであることが結論付けられた。他の最近の研究において、移植時でのマウスＣＤ４０ＬへのＭａｂの投与が、未処理の宿主及び感作された宿主の両方において、完全に異なるマウスの心臓の同種移植片の生着を、著しく延長したことが実証された。しかしながら、抗ＣＤ４０Ｌ治療が、手術後５日まで遅らされたとき、抗ＣＤ４０Ｌは、移植片の生存を延長できなかった。この研究から、エフェクター機能についてのＴ細胞の援助を最初に干渉することにより、抗ＣＤ４０Ｌ治療が、同種移植片拒絶を抑制したことが結論付けられた。ＣＤ８０／ＣＤ８６−ＣＤ２８及びＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ経路を同時に干渉することは、インビトロ及びインビボでのＴ細胞クローン増殖を有効に中断し、完全に同種異系間の（allogeneic）皮膚移植片の長期間の生着を促し、そして、最初に血管新生した心臓の同種移植片の慢性の血管拒絶の発症を抑制することがさらに示された。さらに、任意的にＣＤ８０／ＣＤ８６−ＣＤ２８経路の干渉との組み合わせにおける、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ経路の干渉が、アカゲザル腎臓同種移植片モデルにおいて、腎臓同種移植片拒絶を防いだ６９、７０。炎症性疾患における５Ｄ１２の効果についてのさらなる情報については、例えば参考文献７１−８１を参照されたい。
【００３４】
多発性硬化症は、中枢（脳脊髄の）神経系の自己免疫疾患である。この疾患において、神経線維を囲む白質が硬化する。語「多発性硬化症（ＭＳ）」は文字通り、「多くの瘢痕」を意味する。神経組織の硬化した領域は、斑と呼ばれる。多発性硬化症の症状、重度及び経過は、非常にさまざまであり、斑の部位及び白質の変質の程度に部分的に依存する。神経系中の白質の変質は、神経インパルスをゆっくりにし、神経系に協調不全をもたらす。
【００３５】
コモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）における実験的な自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症の有用な前臨床モデルである（８６、８７、１０２、１０４において概説されている）。このＥＡＥモデルのさまざまなバージョンにおいて発生する中枢神経系（ＣＮＳ）白質病変は、病理形態学的、放射線学的及び免疫学的な特徴を、ＭＳと共有する９５、９８、１０１。それ故に、マーモセットＥＡＥモデルは、前臨床段階での、薬剤開発パイプラインにおける有望な処置の選択を妨げる、ヒトとげっ歯類との間の広い免疫学的なギャップを橋渡しすることができる９６、９９、１０３。
【００３６】
ヒトＭＯＧの細胞外断片（アミノ酸１〜１２５）を表す組み換えタンパク質であるｒｈＭＯＧにより免疫されたマーモセットは、症例の１００％においてＥＡＥを発症し、これは夫々のサルのレパートリーにおける単形性のＭＳＣクラスＩＩ感受性エレメントＣａｊａ−ＤＲＢ＊Ｗ１２０１の存在に起因する。治療開発についてのこのモデルの特に有用な面は、脳白質中において病変が発展することが、臨床的に関連する磁気共鳴映像技術により、視覚化されることができ、そして仮に特徴付けられることができることがである９２、１０５。磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）による脳白質病変の縦方向の分析は、病変の大部分における、量の進行的な増加及び持続的な炎症性活性を示した。さらに、ＭＲＩと前に記載された組織学的基準１０１によるＣＮＳ病理学の特徴付けは、病変の大部分が、早期の活性段階にあることを示した１０６。
【００３７】
ｒｈＭＯＧにより誘発されたＥＡＥモデルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）とＴ細胞との共刺激性分子を標的とする抗体が、ＭＳにとって可能性のある処置であるかどうかを試験する為に用いられた。ＣＤ４０とそのリガンドＣＤ１５４の相互作用は、Ｂ細胞活性化、抗原提示細胞（ＡＰＣ）活性化、抗原特異的Ｔ細胞応答の開始及びマクロファージエフェクター機能の誘発を含む、ＥＡＥにおいて作用する種々の免疫病原性プロセスにおいて重要な役割を果たす９０、９３、９７、７。１９９６年に実施された研究は、ＣＤ１５４に対する抗体により処置されたマウスが、ＥＡＥに対して保護されることを確認した８８。しかしながら、ＣＤ１５４に対する抗体によるＭＳ患者における臨床試験は、動物実験において観察されなかった予期されない副作用により中止された１７。
【００３８】
マウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ）５Ｄ１２（ｍｕ５Ｄ１２）が、ヒトＣＤ４０に対して提起された。５Ｄ１２抗体は、いくつかの細胞タイプに対するＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ媒介性活性化の強力なインヒビターを現し、そして、多くの他の抗ＣＤ４０Ｍａｂとは異なり、ＣＤ４０刺激性活性を発揮しない２１、２２、３９。マウス抗ヒトＣＤ４０抗体ｍｕ５Ｄ１２及びこの抗体のキメラバージョンであるｃｈ５Ｄ１２の両方が、マーモセットＥＡＥモデルにおいてＣＮＳ白質病変の発達と神経障害に対する強力な抑制効果を示し、且つ、目立った副作用を示さなかった２３、２４。同じ研究が、ＭＳにおいて前に発見されたように８８、ＥＡＥに冒されたコモンマーモセットへの静脈内に注入された抗ＣＤ４０Ｍａｂが、浸潤したマクロファージ及び活性化したミクログリア上でＣＤ４０分子が著しく発現される脳白質病変に接近することができることを示した９５。これは、ｃｈ５Ｄ１２も、すでに存在している病変に対して治療的な効果を有するかどうかという疑問を提起した。
【００３９】
‘ｔ  Ｈａｒｔらは、脳病変の発達は、７ｒｈＭＯＧにより免疫されたサルにおいて、２週間の間隔での一連の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）により監視した７６。この研究の結果は、病変炎症の抑制を、ｃｈ５Ｄ１２により処置された３の全てのサルにおいて示した一方で、病変の拡大が、ｃｈ５Ｄ１２により処置された３のサルの２において減少された。
【００４０】
該病気のプロセスにおいて早期での、活性化Ｔ細胞上でのＣＤ４０とそのリガンドＣＤ１５４との結合の阻止は、げっ歯類８８、８９、９１、９４、１００及び非ヒト霊長類モデル２３、２４において、ＥＡＥの臨床的及び神経病理学的発現に対して有意な影響を有する。ＣＤ４０は、ＭＳ患者並びにＥＡＥに冒されたげっ歯類８８及び非ヒト霊長類９５のＣＮＳ白質病変内で顕著に発現される。ＣＮＳ内の、ＣＤ４０を有するＡＰＣ、例えば浸潤したマクロファージ並びに血管周囲細胞及び実質性グリア細胞などがＥＡＥの病変形成に有意に寄与することは、骨髄キメラマウスにおいてエレガントに示された８３。
【００４１】
‘ｔ  Ｈａｒｔら、Ｌａｍａｎら及びＢｏｏｎらの結果７６、７９、８１は、ＣＤ４０の抗体遮断が、ＭＳの潜在的に有効な処置であることを示唆する。重要なことに、ｃｈ５Ｄ１２  Ｍａｂは、マーモセットＥＡＥモデルにおいても他の霊長類種においても明白な副作用を有さない８０。ヒトミエリン７９又はｒｈＭＯＧ８１により夫々誘発された、マーモセットにおける２つのＥＡＥモデルにおけるポラセボ対照実験において、抗ＣＤ４０抗体の有益な臨床的効果が示された。加えて、‘ｔ  Ｈａｒｔらは、すでに存在する病変に対する抗ＣＤ４０抗体処置の抑制効果を示した７６。
【００４２】
乾癬は、人口の１〜２％を苦しめる炎症性皮膚疾患である。この疾患において、病変におけるＴ細胞及び角化細胞は、活性化され、そして、活性化マーカー及び共刺激性分子を発現する。角化細胞上及びＴ細胞上で発現されるいくつかの共刺激性分子が互いに相互作用すること、及び、これらの相互作用が病気の活性に寄与することが考えられる１０８−１１０。１つのそのような一連の分子は、ＣＤ４０であり得、これは活性化角化細胞上に発現され、及びＣＤ１５４（ＣＤ４０リガンド）であり得、これは活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞上に一過性に発現される。Ｔ細胞と角化細胞との間のＣＤ４０−ＣＤ１５４ライゲーションは、乾癬病変において豊富に見られる炎症性メディエーターをこれらの細胞から放出しうる。ＣＤ４０、ＣＤ１５４及びＣＤ４０−ＣＤ１５４相互作用が、最近、概説された１１１。
【００４３】
培養された角化細胞もＣＤ４０を発現する；発現は、ＩＦＮ処理により増強される。ＩＦＮ−γ処理された角化細胞（本文書を通じてＣＤ４０＋＋角化細胞と言われる）上に高度に発現したＣＤ４０と、ＣＤ１５４とのライゲーションは、ＩＣＡＭの上方制御及びサイトカインの増加した産生を結果する１１２−１１４。
【００４４】
これまで、乾癬の病変形成に、このライゲーションを関係させるただ一つの報告が出た１１３。乾癬の病変においてＣＤ４０を発現する細胞タイプは後者の研究において同定されず、そして、それらの発生率及び病変の状態は記載されなかった。乾癬病変中のＣＤ１５４＋Ｔ細胞の存在も研究されなかった。すなわち、乾癬病変において豊富に見られる、ケラチノサイトによるケモカイン及び補体の産生についてのシグナルの一つとして、ＣＤ１５４が作用するかどうかは分からないままである。
【００４５】
Ｐａｓｃｈらは最近、１０の乾癬患者からの病変皮膚及び非病変皮膚における免疫組織化学によりＣＤ４０＋及びＣＤ１５４＋の細胞の存在及び局在を実証した１１６。ＣＤ４０についての増加した陽性が角化細胞のクラスター上に観察され、そしてＣＤ４０の高発現が、正常、非病変及び病変の表皮におけるほとんど全てのＣＤ１ａ＋ランゲルハンス細胞上に示された。加えて、ＣＤ４０の高発現が、乾癬病変におけるほとんど全てのＣＤ８３＋上に存在した；それらは、非病変皮膚及び正常皮膚においてもまれに見られた１１６。また、少数のＴ細胞が、大抵の患者において、ＣＤ４０＋細胞に近い位置で、ＣＤ１５４発現を示した。これらの結果は、ＣＤ１５４＋Ｔ細胞が、ＣＤ４０＋角化細胞、ランゲルハンス細胞、及びＣＤ８３＋樹状細胞とライゲートしうること、そして該病変においてそれらからメディエーターを放出しうることの可能性を提起した。加えて、彼らは、ＣＤ４０ライゲーションが、ケモカイン（ＩＬ−８、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、及びＭＣＰ−１）の放出を誘発することを実証した１１６。同じ刊行物において、Ｐａｓｃｈらは、ケモカインＩＬ−８、ＭＣＰ−１、及びより少ない程度のランテスの、ＣＤ４０に関連する放出が、拮抗性抗ＣＤ４０抗体５Ｄ１２により抑制されたことを示した１１６。これらのデータは、アンタゴニスト抗ＣＤ４０  ｍＡｂ  ５Ｄ１２が、乾癬病変において見られる炎症に対する効果を、少なくとも一部分において有しうることを示唆する。
【００４６】
米国特許出願公開第２００３／０１６５４９９号明細書は、５Ｄ１２及び他の拮抗性抗ＣＤ４０抗体の測定できる抗乾癬性効果を、乾癬処置についてのモデルとして用いられるＳＣＩＤマウス異種移植モデル系において開示し、これは拮抗性抗ＣＤ４０抗体が乾癬の処置の為に用いられうることを示す。このインビボ系における５Ｄ１２の治療的効果が実証された。
【００４７】
特に好ましい実施態様において、該自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患は、炎症性腸疾患を含む。他の好ましい実施態様において、該炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎（ＵＣ）又はクローン病（ＣＤ）を含むところの本発明の使用方法が提供される。
【００４８】
上記で説明されたとおり、本発明に従うポリペプチドは、自己免疫疾患及び移植片拒絶を含む、多種多様な炎症性疾患の処置に適している。それ故に、一つの実施態様における本発明は、自己免疫疾患及び／若しくは炎症性疾患の症状を改善する為の並びに／又は移植片拒絶を減少する為の方法を提供する。さらなる実施態様において、本発明は、自己免疫疾患及び／若しくは炎症性疾患の症状を改善する為の並びに／又は移植片拒絶を減少する為の、本発明に従うポリペプチド、本発明に従う結合性物体、本発明に従う抗体、本発明に従う核酸及び／又は本発明に従う細胞を使用する方法を提供する。本発明において用いられるときに、症状を改善することは、疾患の少なくとも１の症状を少なくとも部分的に改善することとして定義される。本発明は、自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患について特定の関心があり、これらについて効果のある処置は現在では存在しない。これらの疾患の例は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸疾患、水疱性類天疱瘡及びアトピー性皮膚炎である。任意的に本発明の結合性物体若しくは細胞に含まれる及び／又は本発明の核酸によりコードされる、本発明に従うポリペプチドは、本発明に従うポリペプチドの定義された特性が、特定の様式でＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ経路を干渉することを許すので、自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の症状を改善するのに特に適している。さらに、本発明に従う結合性物体は好ましくは脱免疫化されるので、本発明に従う結合性物体は、持続した時間存在し、そして従って、相当な時間、患者においてその拮抗性活性を示す。それ故に、一つの実施態様における本発明は、自己免疫疾患及び／若しくは炎症性疾患の症状を改善する為の並びに／又は移植片拒絶を減少する為の医薬の製造の為に、本発明に従うポリペプチド、本発明に従う結合性物体、本発明に従う抗体、本発明に従う核酸及び／又は本発明に従う細胞を使用する方法を提供し、ここで該自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸疾患、水疱性類天疱瘡及びアトピー性皮膚炎の群から選ばれる。
【００４９】
図面の簡単な説明
【００５０】
図１．記号により示されるとおりの４の用量水準での０日目での単回投与後のｃｈ５Ｄ１２血清濃度。値は、μｇｃｈ５Ｄ１２／ｍｌ血清として与えられ、そして、参考文献２７において詳述されたとおりの酵素結合免疫吸着検定により測定された。
【００５１】
図２．ｃｈ５Ｄ１２注入後２８日期間の間の、クローン病活性指標（ＣＤＡＩ）スコアにおける変化。陰付きの領域は、ｃｈ５Ｄ１２水準が、霊長類における機能的な拮抗する血清であるとわかった２４−２７１０μｇ／ｍＬ濃度を超える期間を示す（図１も参照されたい）。０．３ｍｇ／ｋｇの集団において、血清水準は、決して該１０μｇ／ｍＬ水準を超さなかった。
【００５２】
図３．０日目及び２８日目での組織学的な病気の活性スコア。最大の活性スコアは１６であり、そして、活性スコアは、参考文献４０に従い実施された。９の被験者からの回腸（ひし形）からの試料及び１１の被験者からの結腸（colon）（四角）からの試料が、０日目及び２８日目で得られ、そして、結果が、ｃｈ５Ｄ１２の用量水準当たりで提示される[（ａ）０．３ｍｇ／ｋｇ；（ｂ）１．０ｍｇ／ｋｇ；（ｃ）３．０ｍｇ／ｋｇ及び（ｄ）１０．０ｍｇ／ｋｇ]。
【００５３】
図４．患者０１２からの結腸バイオプシー（３．０ｍｇ／ｋｇ)及び患者０１１からの回腸バイオプシー（３．０ｍｇ／ｋｇ）が、炎症応答の減少についての例として示される。試料は、Ｔリンパ球（ＣＤ３）、Ｂ細胞（ＣＤ１９）、マクロファージ（ＣＤ６８）及びＣＤ４０（＋）細胞全てを認識する抗体により、ｃｈ５Ｄ１２の投与の前（ａ、ｃ）及び投与の後２８日目（ｂ、ｄ）で染色された。ＨＥ，ヘマトキシリン−エオシン。
【００５４】
図５．マウス５Ｄ１２ＶＨ及びＶＬ領域のコンセンサスＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列。
【００５５】
図６．５Ｄ１２のベニア化され且つ脱免疫化されたＶ領域を有するマウスＶ領域のアミノ酸比較。
【００５６】
図７．親マウス配列（ｃｈ５Ｄ１２）及び完全に脱免疫化された配列（ＤＩ５Ｄ１２）と比較した、脱免疫化された５Ｄ１２  ＶＨの１２の試験されたアミノ酸変異体（Ｑ５Ｅ、Ｋ１３Ａ、Ｅ１６Ｑ、Ｔ１７Ｓ、Ｉ２９Ｌ、Ｉ３７Ｖ、Ｐ４５Ｌ、Ｍ４８Ｌ、ＳＴＳ６０ＮＳＡ、Ｔ６８Ｓ、Ｓ７９Ｆ、及びＴ１０８Ｓ）のアラインメント。
【００５７】
図８．ＪＹ細胞を用いたＦＡＣＳ分析。５Ｄ１２の一過性に発現された変異体（Ｑ５Ｅ、Ｋ１３Ａ、Ｅ１６Ｑ、Ｔ１７Ｓ、Ｉ２９Ｌ、Ｉ３７Ｖ、Ｐ４５Ｌ、Ｍ４８Ｌ、ＳＴＳ６０ＮＳＡ、Ｔ６８Ｓ、Ｓ７９Ｆ及びＴ１０８Ｓ）のＰＥＲ．Ｃ６細胞上清が４８時間後に回収された。対照として、ニセ物（プラスミドでない）により形質導入された細胞からの上清と一緒に、ｃｈ５Ｄ１２又はＤＩ５Ｄ１２により形質導入された細胞の上清が回収された。発現された抗体の結合性は、ＪＹ細胞を用いて、ＦＡＣＳにより、抗ヒトＦＩＴＣラベル化二次抗体（１／１００希釈された）と一緒に試験された。ＦＡＣＳ対照として、ＪＹ細胞が、二次ＦＩＴＣラベル化抗体だけと一緒にインキュベートされた。
【００５８】
図９．親のキメラ配列（ｃｈ５Ｄ１２）、完全に脱免疫化された配列（ＤＩ５Ｄ１２；２９Ｉ−３７Ｉ）及びＰＧ１０２（２９Ｌ−３７Ｉ）と比較した脱免疫化された５Ｄ１２  ＶＨの位置２９及び３７についての追加のＶ−Ｌ−Ｉ変異体（２９Ｉ−３７Ｖ、２９Ｖ−３７Ｉ、２９Ｉ−３７Ｌ、２９Ｖ−３７Ｖ，２９Ｌ−３７Ｌ、２９Ｖ−３７Ｌ、２９Ｌ−３７Ｖ）のアラインメント。
【００５９】
図１０．ＰＧ１０２抗体を産生するＧＳ−ＣＨＯ細胞株及び“過増殖”２４−ウェルプレート培養物についての抗体生産性の分布。細胞株の数はＸ軸上にプロットされ、抗体濃度範囲はＹ軸上にプロットされる（抗体濃度範囲は、０〜２５μｇ／ｍｌで開始する上昇する群に区分される）。
【００６０】
図１１．ＣＤＡＣＦ流加振とうフラスコ培養物における、細胞株Ａ）Ｌ１０７（ＤＣ１；上のパネル）、Ｂ）Ｌ２５（ＤＣ２；中間のパネル）及びＣ）Ｍ９５（ＤＣ３；下のパネル）についての増殖及び抗体蓄積のプロファイル。
【００６１】
図１２．３の異なる水準で固定化されたＣＤ４０への、ＰＧ１０２（赤）及びｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）（青）の結合性の比較。
【００６２】
図１３．抗体イディオタイプｍＡｂ  １７３−３６−１による、ヒトＣＤ４０を発現するＪＹ細胞へ結合するＣＤ４０ｍＡｂの抑制。抗ＣＤ４０ｍＡｂは、１μｇ／ｍｌの濃度で評価された。データは、平均±標準誤差を示す。夫々の抗体についての４の別の測定の平均。
【００６３】
図１４．ＣＤ４０−Ｆｃ  ＥＬＩＺＡ。ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２のヒトＣＤ４０−Ｆｃへの、濃度の関連する結合性。プレートは、２５０ｎｇ／ｍｌのヒトＣＤ４０−Ｆｃにより一晩被覆された。アイソタイプ対照ｍＡｂであるｃｈＦＵＮ−１が、ヒトＣＤ８６に対して向けられる。データは、平均±標準誤差を示す。平均（全てｎ＝３）。
【００６４】
図１５．ＪＹ細胞に結合する抗ＣＤ４０  ｍＡｂのＦＡＣＳ定量化。ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２は、比較可能な最大の半分の結合する濃度を示した。抗ＣＤ８６  ｍＡｂであるｃｈＦＵＮ−１もまた、これらの実験においてＪＹ細胞へと、この細胞株によるヒトＣＤ８６の表面発現の故に結合することを示した。データは、夫々の抗体についての二重測定の平均を示す。
【００６５】
図１６．非ラベル化ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２抗体によるＪＹ細胞へのｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）−ＰＥ結合性及びＰＧ１０２−ＰＥ結合性の抑制。ラベル化ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）（Ａ）及びＰＧ１０２（Ｂ）が、競合する非ラベル化抗体の増加する濃度の存在下において、１μｇ／ｍｌでインキュベートされた。ラベル化抗体結合性が、フローサイトメトリーにより平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定された。ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）ＰＥ及びＰＧ１０２ＰＥの結合性についての最大のＭＦＩは夫々、３６９蛍光ユニット（Ａ）及び３０５蛍光ユニット（Ｂ）であった。データは、平均±標準誤差を示す。４の別個の実験の平均。
【００６６】
図１７．ジャーカット細胞との共培養後のＴＨＰ−１細胞によるＩＬ−８放出の抑制。ＩＦＮγによりパルスされたＴＨＰ−１細胞は、増加する濃度のｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）又はＰＧ１０２の存在下において、ジャーカット細胞と共培養される。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌを介したＴＨＰ−１細胞へのジャーカット細胞の結合性により誘発される、ＴＨＰ−１細胞からのＩＬ−８放出が、ＥＬＩＳＡにより測定された。データは、１回の実験からの結果を示す。
【００６７】
図１８．ＩｇＧ４  ＰＧ１０２重鎖及び軽鎖の核酸配列及びアミノ酸配列。
【００６８】
実施例
【実施例１】
【００６９】
材料と方法
放射線学的証拠、内視鏡的証拠又は組織学的証拠により確認されたクローン病の臨床診断を有し且つ少なくとも２２０だが４５０より多くないクローン病活性指標（ＣＤＡＩ）スコアを有する（治験薬投与（study  drug  administration）に先立つ７日にわたり採点された）１８の成人の被験者（年齢１８〜６０歳）が、治験取り込み（study  inclusion）の為に選ばれた。被験者は、治験の前及び間に以下の処置を有することが許された：スクリーニングの前４週間で安定なままである用量による８週間又はそれより多い週間のメサラミン処置；スクリーニング前２週で安定なままである用量による、８又はそれより多い週間の１日当たり最大の３０ｍｇのコルチコステロイド（又は１日当たり９ｍｇブデソニド）；スクリーニングの前８週間安定なままである用量による４またはそれより多い月の間のメルカプトプリン又はアザチオプリン。被験者は、スクリーニング前３ヶ月内でシクロスポリンＡ又はメトトレキセートによる処置を受けることができず、また、彼らはＭａｂによる処置へ先に曝されることは許されなかった。登録された全ての被験者の平均年齢は３５．８歳であり、そのうち７が男性であり及び１１が女性であった。全ての被験者は、コーカサス人種であった。取り込みでの、種々の集団における患者の間の明白な差異は、より低い３つの用量群において対象の大部分が女性であった一方で最も高い用量の群（１０．０ｍｇ／ｋｇ）が男性の被験者だけからなったことを除き、観察されなかった（表１）。ベースラインの心電図（ＥＣＧ）、バイタルサイン、理学的検査、クローン病兆候及び症状の病歴、並びにベースラインの実験室での値に関して、４つの集団の間で顕著な差異は無かった。４つの用量の集団の間で、ベースラインの特徴に関して有意な差は無かった。しかしながら、最も高い用量の集団は、ベースラインで、最高のＣＤＡＩスコアも示した。この治験は、ルーバン大学病院の倫理委員会、ベルギー、ライデン大学医療センター、オランダ、医学クリニック（medizinische  klinik）、キール、ドイツ、及びハダッサ医療センター、エルサレム、イスラエルにより承認された。全ての患者は、本治験にインフォームドコンセントを与えた。
【００７０】
治験計画及び処置プロトコル
ｃｈ５Ｄ１２は、Ｍａｂ  ５Ｄ１２親バージョンの重鎖及び軽鎖の可変ドメインを有する、分子的に操作されたヒトＩｇＧ４抗体である。このＭａｂは、ＣＤ４０を有する細胞に結合すること及び種々の細胞のＣＤ４０媒介の活性化を拮抗することが示された２０−２７。ｃｈ５Ｄ１２は、非盲検の、単回投与の、多施設試験で投与され、４つの用量水準を治験した。３の被験者だけが登録された最後の用量集団を除き、夫々の処置群には、５の対象があった。ｃｈ５Ｄ１２の０．３、１．０、３．０及び１０．０ｍｇ／ｋｇの用量水準での単回投与が、静脈内に行われた。１の用量の群へのリクルートメント（recruitment）の完了後、次の群へのリクルートメントが、現在の用量水準で安全性が確立されたときにだけ開始された。臨床的な病気の活性は、最初の２８日期間の週１回の夫々の来診及び、５６日目での次の最後の来診で評価された。２つの被験者（３．０ｍｇ／ｋｇ用量集団）が２８日目の評価のあとの治験から除かれたが、それらのデータは評価に含まれる。治験の経過の間、彼らの現在の投薬の同じ用量について安定なままであった。許容されない併用の投薬は、本治験の間で用いられなかった。ｃｈ５Ｄ１２処置への応答は、１００ポイント以上のＣＤＡＩにおける減少として定義され、及び、臨床的な病気の寛解は、１５０以下のＣＤＡＩ（合計スコア）且つ少なくとも１００のＣＤＡＩの減少として定義された。スクリーニングで及び２８日目で内視鏡検査を受けた全ての被験者（ｎ＝１１）が、彼らのクローン病内視鏡検査的な重症度の指標（ＣＤＥＩＳ））の採点指標における減少について分析された。バイオプシーは、組織病理学及び免疫組織化学について、ｃｈ５Ｄ１２投与の前に及びｃｈ５Ｄ１２投与後２８日目で、これらの１１の患者から取られた。安全性評価は、理学的検査、バイタルサイン、ＥＣＧ、及び、抗ｄｓＤＮＡ、ｐＡＮＣＡ及びヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）評価を含む実験室データ（化学、血液学及び検尿）を含んだ。ＨＡＣＡは、参考文献（２７）に説明されるとおり、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）により測定された。
【００７１】
薬物動態学
ｃｈ５Ｄ１２の血清濃度が、前に記載されたとおりにＥＬＩＳＡにより決定された２７。注入されたｃｈ５Ｄ１２によるＣＤ４０の被覆を測定する為に、血液がヘパリンチューブ中に集められ、そしてＰＢＳ中に２倍に希釈された。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）が、勾配遠心分離により単離され（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、Ｎｙｃｏｍｅｄ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）、そして５００，０００の細胞が、ＦＩＴＣラベル化ｃｈ５Ｄ１２及びＰｅｒＣＰラベル化抗ＣＤ２０（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、米国）により染色され、そして氷上で３０分間インキュベートされた。５Ｄ１２−ＦＩＴＣ結合性についての背景対照として、ＰＢＭＣの別のチューブが、ＰｅｒＣＰラベル化抗ＣＤ２０抗体だけにより染色された。結合していない抗体は洗い流され、そして、細胞がフローサイトメトリーを用いて分析された（ＦＡＣＳｏｒｔ；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。イベントの取得は、全部で５０００のイベントについて、ＣＤを２０発現する細胞をゲートすること及び取得することにより実施された。もしＣＤ２０を発現する細胞が、試料セットに関してより低かったならば、染色されていない調製物及び染色された調製物の両方において、同じ数のイベントを取得する為のケアが取られた。
【００７２】
組織学及び免疫組織化学
標準の鉗子により０日目及び２８日目における処理に先立ち、回腸結腸内視鏡検査法（ileocolonoscopy）の間に得られた回腸および結腸からの膜のバイオプシーが、通常の分析の為に、フォルマリン６％中に固定された。追加の試料がすぐに、液体窒素により冷却されたイソペンタン中のＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ最適切削温度化合物（Ｍｉｌｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ、米国）中で瞬間凍結された（snap  frozen）。試料は、さらなる使用まで−８０℃で保存された。ホルマリン固定化試料は、通常にパラフィン加工された。５マイクロメーターの薄い切片が、ヘマトキシリン及びエオシンにより調製されそして染色された。該切片は、Ｌｅｉｔｚ  Ｗｅｔｚｌａｒ顕微鏡（Ｗｅｔｚｌｅｒ、ドイツ）を用いて分析された。夫々の試料についての４つの準連続的切片の全てが分析された。凍結された試料は免疫組織化学分析の為に用いられ、これは、リンパ球及び単球／マクロファージの種々のサブセットの存在を評価する為に、Ｍａｂのパネルを用いて実施された。該パネルは、ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌに対して向けられたＭａｂにより完了された。免疫組織化学的染色が、クリオスタット切片について実施され、室温で一晩乾燥され、そして、１０分間無水アセトン中に固定された。再水和されたスライドが以下のＭａｂと３０分間インキュベートされた；ＣＤ３（クローン：ＵＣＨＴ１、１／１０希釈）（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）、ＣＤ４（クローン：ＭＴ３１０、１／１０希釈）（Ｄａｋｏ）、ＣＤ８（クローン：１４４Ｂ、１／２０希釈）（Ｄａｋｏ）、ＣＤ１９（クローン：ＨＤ３７、１／３０希釈）（Ｄａｋｏ）、ＣＤ４０（クローン：５Ｄ１２、１／１００希釈）（ＰａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ、アムステルダム、オランダ）、ＣＤ６８（クローン：Ｋｐ１、１／５０希釈）（Ｄａｋｏ）、ＣＤ１５４（クローン：Ｍ９０、１／１０希釈）（Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、英国）。二次Ｍａｂは、ビオチンラベル化抗マウスイムノグロブリン（１／４００希釈；Ｄａｋｏ）であり、３０分間適用された。内因性のペルオキシダーゼを効率的にブロックする為に、切片はまた、０．３％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２を有するメタノール溶液中で２０分間インキュベートされた。ＰＢＳによる３回の洗浄後、アビジン／ビオチンペルオキシダーゼラベル化複合体（Ｄａｋｏ）が添加された。インキュベーションの間に、該切片は、リン酸緩衝生理食塩水中でｐＨ７で１５分間洗浄された。反応産物は、０．０５％の３−アミノ−９−エチル−カルバゾール（Ｊａｎｓｓｅｎ、Ｂｅｅｒｓｅ、ベルギー）及び０．０１％Ｈ２Ｏ２を有する０．０５ｍｌのアセテートバッファー中でｐＨ４．９で１０分間、該切片をインキュベートすることにより視覚化され、明るい赤の免疫反応性部位を結果した。その後、該スライドは、Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリンにより淡く対比染色され、蒸留水によりリンスされ、そして、カバーガラスがグリセロールと一緒に適用された。負であった対照は、一次又は二次抗体の脱落、色素原単独の使用、及び無関係のアイソタイプマッチのＩｇＧ（ビメンチン；Ｄａｋｏ）の使用からなった。
【００７３】
ヘマトキシリン及びエオシンにより染色されたパラフィン切片は全て、試料の由来について分からなくされた同じ病理学者（Ｋ．Ｇ．）により分析された。病気の活性が、最大の活性が１６に対応した組織学的数値スコア４０を用いて評価された。免疫組織化学的に染色された切片も、盲検法の様式で分析された。１５セットのバイオプシーについて、陽性に染色する細胞が、強拡大視野中（拡大率  ×４０）で数えられた。該視野は、間質細胞の最も高い密度に従い選ばれた。数は、該間質中の単核細胞の総数の百分率として表された。これらの計数は、陽性に染色する細胞の強度が４の分類（−、＋／−、＋及び＋＋）にさらに分割されるところのスコアリング系の構築の為に用いられた。回腸及び結腸の両方についての、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ１９＋、及びＣＤ６８＋についての正常値は＋である。ＣＤ４０＋及びＣＤ１５４＋細胞についての正常値は負（−）である。
【００７４】
免疫性の安全性パラメーター
ｃｈ５Ｄ１２による何らかの非特異的免疫抑制を評価する為に、フィトヘマグルチニンマイトジェン（ＰＨＡ）に応答した抹消血Ｔ細胞の増殖が評価された。ＰＨＡ刺激（１μｇ／ｍＬ）が、前に報告されたとおりに、単離されたＰＢＭＣに対して実施された４１。加えて、循環するＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ２０＋細胞の百分率が、循環する細胞の枯渇を排除する為に測定された。フローサイトメトリーの為に、血液が、指示された時間でヘパリンチューブ中に集められ、夫々の試験管中の１００μＬの全血が、以下のとおりに染色された（全てのＭａｂは、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから購入された）：抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ１９−ＰＥ、抗ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ、抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４−ＰＥ、抗ＣＤ８−ＰＥ及び抗ＣＤ１４−ＰＥ。該染色された細胞は次に、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー中で分析された（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。このプロトコルは、ＣＤ４＋対ＣＤ８＋細胞の比を計算する為に及びリンパ球系集団内のＢ細胞の割合を決定する為に、実施された。ＣＤ３及びＣＤ１９について報告された百分率は、リンパ球系集団内のＴ細胞及びＢ細胞の百分率であった一方で、ＣＤ４及びＣＤ８細胞は、ＣＤ３細胞の百分率として報告された。ＣＤ１４（単球系の集団）だけが、全ＣＤ４５集団の百分率として示される。
【００７５】
結果
【００７６】
薬物動態学
単回の静脈内注入後のｃｈ５Ｄ１２の平均のピーク水準は、用量依存的であり且つ用量比例的であった（図１）。２４時間後、投与されたｃｈ５Ｄ１２の約５０％が、最も高い３の用量集団において血清中に検出された。０．３ｍｇ／ｋｇ集団について、１５％だけが、２４時間後の血清中に存在した。非ヒト霊長類研究から、８〜１０日のｔ１／２βが計算され２７、これは現在のヒトのデータにより確認された。ＦＩＴＣラベル化ｃｈ５Ｄ１２を用いたエクスビボ競合検定により決定されたときに、末梢血Ｂ細胞上のＣＤ４０の完全な被覆は、０．３ｍｇ／ｋｇの注入により達成されなかった（示されていない）。１．０ｍｇ／ｋｇの集団について、循環するＢ細胞上のＣＤ４０の約１週の被覆が観察されることができた一方で、２の最も高い用量集団では、この期間は２〜３週に増加した。これは、最も低い用量集団において、ＣＤ４０の拮抗が不完全であったが、他方完全な拮抗が、１．０ｍｇ／ｋｇ集団では１週間達成され、そして、より高い用量集団ではより長くさえ達成されたことを示す。
【００７７】
臨床的な応答
ＣＤＡＩ評価の分析は、１８の被験者のうち１３（７２％）が、ｃｈ５Ｄ１２注入後に有利な応答を経験したことを示す。同様に、１８の被験者のうち４（２２％）が、その期間の間に寛解を経験した。２１日目で評価されたときに、有利な応答が１８の被験者のうち１０において記録された。集団２及び４は、ＣＤＡＩにおける最大の平均の減少を示し、そして明白な用量−効果の関係は観察されなかった（図２；表２）。事後の反復測定分散分析は、５６日観察期間にわたって、ＣＤＡＩにおける統計的に有意な減少を示した（Ｐ＜０．００１）。集団の間の差は、統計的に有意でなかった。（内視鏡検査が、集団１及び２における３の被験者だけにおいて実施されたので）集団３及び４においてだけ、ＣＤＥＩＳが評価された。集団３において、５の被験者のうち２が、ＣＤＥＩＳにおける減少を有したが、集団４において３の被験者のうち２が減少を有した。これらの２の集団における残りの被験者は、変化を示さなかった（示されていない）。
【００７８】
組織学的変化
バイオプシーが取られた患者（ｎ＝１１）において、ただ一人の調査員が、組織病理学及び免疫組織化学における変化の評価を実施した。バイオプシー材料について実施された評価は、該病気の微小な活性に対する及び固有層単核細胞浸潤の強度に対する、処置の明白な影響を示す。
【００７９】
ベースラインから２８日目への組織病理学の活性スコアの変化が図３に示される。０日目での、９の患者の回腸からの試料及び１１の患者の結腸からの試料が入手できた。４の症例において、該回腸は、スクリーニングで含まれなかったが、５の患者は、活性な回腸の病気を有した。活性な病気（active  disease）を有するそれらについての０日目での平均の組織学的スコアは、４．６であった（範囲  ３〜７）。５の患者についての平均の組織学的スコアは、２８日目で、１．０に減少した（範囲０〜３）。１１の患者のうち４において、結腸は、０日目で含まれず、そして、これらの患者からの結腸の試料は２８日目で正常なままであった。７の患者において、結腸は明白に、０日目で４．５の平均の組織学的スコアを伴った（範囲２〜１２）。これは、２８日目で、１．７の平均スコアに減少した（範囲０〜７）。７の患者のうち５において、２８日目でのスコアは、正常なバイオプシーを示す０又は構造上の異常だけを指す１であった。最も低い用量集団において（パネルａ）、１の被験者の結腸のスコアは減少したが、この集団における他の結腸のスコアは高いままであり、そして回腸スコアは増加さえした。より高い用量集団において（パネルｂ〜ｄ）、結腸又は回腸又は両方が、ｃｈ５Ｄ１２による処置後２８日目で、活性スコアにおいて減少した。終局的には、陽性応答[参考文献（４１）において定義されるとおり]が、被験者の８１％（９／１１）で観察された。加えて、０日目で活性な病気を有する７の被験者は、好中球がそれらのバイオプシーにおいて２８日目で存在しなかったというところまで、好中球活性の減少を示した。
【００８０】
どの細胞がｃｈ５Ｄ１２による処置によって標的とされたかを評価する為に、免疫組織化学的評価が、プロトコル当たりで、利用できるバイオプシーに対して、Ｔ細胞（ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８）及びＢ細胞（ＣＤ１９）マーカー並びにマクロファージマーカー（ＣＤ６８）を用いて実施された。結果は表３に記載される。最も低い用量集団において、２８日目で減少は観察されなかった一方で、他の全ての集団において、減少した浸潤が観察された。ベースラインでの回腸からの試料において、９の症例のうち６において、増加したＣＤ３＋Ｔ細胞の数があった。結腸において、増加したＣＤ３＋Ｔ細胞の数が、１１の患者のうち３において存在し、その全てが、通常の組織学について活性名病気を有しもした。２８日目で、ＣＤ３＋Ｔ細胞数は、１の患者以外の全てにおいて正常化された。この患者（患者００１；最も低い用量集団；０．３ｍｇ／ｋｇ）において、通常の組織学についての持続性の炎症活性及び肉芽腫性の炎症と同時に、回腸及び結腸において持続性のＣＤ３＋細胞増加があった。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞が、ＣＤ３＋と同様のパターンに従った。
【００８１】
ＣＤ１９＋Ｂ細胞についてのパターンは、Ｔ細胞について観察されたものと比較可能であった。０日目で、回腸のバイオプシーが利用できる９の患者のうち６において及び結腸からの１１の試料のうち４において、Ｂ細胞の上昇があった。２８日目で、Ｂ細胞の量が、低い用量集団からの１の患者以外の全ての症例において、正常化された。
【００８２】
２８日での同様の減少が、ＣＤ６８＋単球／マクロファージについて観察された。０日目で、回腸のバイオプシーが利用可能であった９の患者のうち５において及び結腸からの１１の試料のうち４において、ＣＤ６８＋単球／マクロファージ細胞の増加した量があった。結腸試料においてＣＤ６８＋単球／マクロファージ細胞について高いままであり且つ回腸バイオプシーにおいて増加さえする（この患者が２８日目で活性な病気をなお有したことを示す。）１の低い用量の集団の患者を除き、やはり、２８日で全ての増加が正常化された。
【００８３】
図４は、患者０１１の回腸バイオプシー（活性スコア：７）及び患者０１２の結腸バイオプシー（活性スコア：１２）における、ｃｈ５Ｄ１２投与前での及びｃｈ５Ｄ１２投与後２８日目での全ての３の主要な細胞タイプ（Ｔ細胞、Ｂ細胞及び単球／マクロファージ細胞）の減少の代表的な例を示す。
【００８４】
安全性
有害事象（ＡＥ）の大部分が重症度において軽度から中等度であるＡＥ群の故に、治験から取り除かれた被験者は無かった。ＡＥの総数の５％以上で発生するＡＥの評価は、最も一般的なＡＥが発熱、関節痛、筋肉痛及び頭痛であることを明らかにした。ベースラインで及び続く期間の間の両方でしばしば発生する関節痛は、該続く期間の経過にわたり頻度において減少した。インフルエンザ様症状及びそう痒性発疹が４の被験者において発生し、そのうち１の被験者だけが、治験薬投与（３．０ｍｇ／ｋｇ）後すぐに開始する中等度の発疹を経験した。全体的にみて、頭痛／片頭痛の可能性を除いて、いずれの単独のＡＥについても明白な用量応答は無かった。
【００８５】
６の被験者において注目された６の重篤な有害事象（ＳＡＥ）があった；０．３ｍｇ／ｋｇ集団において事象は発生しなかった、１．０ｍｇ／ｋｇ集団では３の事象、３．０ｍｇ／ｋｇ集団では２の事象、及び１０．０ｍｇ／ｋｇ集団では１の事象。６のＳＡＥのうち５は、おそらく治験薬に関連すると考えられ、１の事象は関連しないと考えられた。１の事象以外の全ては、胃腸の事象であった（いずれも１．０ｍｇ／ｋｇにおいて２のサブイレウス（sub  ileus）；１．０及び３．０ｍｇ／ｋｇ被験者において２の悪化したクローン病；及び３．０ｍｇ／ｋｇ被験者において１の悪化した腹部の痛み）。しかしながら、これらの事象のうち２は、治験薬との因果関係が非常にありそうもないような時点（１の被験者は注入の日及び他の被験者は治験薬投与後２９日での内視鏡検査を受けた後）で発生した。治験薬又は用量に関連していると見える観察された異常は無かった。
【００８６】
免疫学的安全性パラメーター
ｃｈ５Ｄ１２は、インビトロでのＢ細胞活性化を抑制するので、合計のイムノグロブリン水準は、フォローアップ期間の経過にわたり安定であると測定され且つ分かった。ｃｈ５Ｄ１２が循環からＢ細胞を枯渇できることの可能性を排除する為に、我々は治験の経過にわたりＰＢＭＣのサブセット分析を実施した。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ１４陽性細胞の百分率及び絶対数は、ｃｈ５Ｄ１２投与により影響されなかった。循環するＣＤ１９＋Ｂ細胞の絶対計数は、ｃｈ５Ｄ１２投与後直ちに一過性に減少し、そして、循環からｃｈ５Ｄ１２が取り除かれた後にそれらの元の値に回復した（示されていない）。
【００８７】
ｃｈ５Ｄ１２による処置が全身的免疫抑制効果を引き起こすだろうかどうかを研究する為に、処置前及び後の種々の時点で単離されたＰＢＭＣがポリクローナルＴ細胞アクチベーターＰＨＡにより刺激された。残念ながら、１０．０ｍｇ／ｋｇ用量集団からの細胞は適切に凍結されず、そしてそれ故に、ＰＨＡに応答することができなかった、これはｃｈ５Ｄ１２投与前に得られた細胞を含む。ＰＨＡとのインキュベーションにより誘発された刺激指標は非常に可変であったが、ｃｈ５Ｄ１２処置後の減少についての傾向は検出されなかった（データは示されていない）。
【００８８】
抗ｃｈ５Ｄ１２抗体は、全部の治験を通じて、２のより低い用量の集団において検出できでなかった。３．０ｍｇ／ｋｇ集団において、１の被験者が、抗ｃｈ５Ｄ１２応答を開始したことが分かったが、そのシグナルはとても低く、そしてこの患者の希釈されていない２８日試料においてだけ検出されることができた。最も高い用量の集団において、他の被験者は、治験の２８日及び５６日で、抗ｃｈ５Ｄ１２抗体を有した。これらは、１：６４希釈により検出されることができた。それ故に、２の被験者だけが、ｃｈ５Ｄ１２投与へのあり得る免疫応答を有した。
【００８９】
考察
この非盲検の多施設試験において、ｃｈ５Ｄ１２の４の用量水準が、中等度から重症のクローン病を有する被験者に投与された。１８の被験者が登録され、３の被験者だけが登録された最後の用量の集団を除き、夫々の処置の集団において５の被験者を有した。ｃｈ５Ｄ１２血清水準は用量依存的に増加し、そして、カニクイザルにおいて観察された長い血清半減期２７がヒトにおいて確認された。本研究は、主な副作用が無く、ｃｈ５Ｄ１２を用いて、ＣＤ４０媒介の細胞活性化（CD40-mediated  cell  activation）を拮抗することの実行可能性を示す。ＣＤＡＩ分析は、被験者の７２％が臨床的な応答を経験したこと、そして、２２％が治験の間の寛解を経験したことを示す。これらの結果は有望である；しかしながら、非盲検設計及び対照群の欠如は、観察された変化を、治験薬の投与に明確に帰することを不可能とする。しかしながら、我々は、ｃｈ５Ｄ１２の抗炎症性効果を支持するいくつかの論拠を有する。第１に、２の最も高い用量の集団における被験者の間の、ＣＤＥＩＳにおいて観察された減少は、処置の効能を指示する。第２に、バイオプシーについてなされた組織学的及び免疫組織化学的分析の結果は、ｃｈ５Ｄ１２が、回腸又は結腸における炎症活性を減少することを示す。低用量集団において、明白な効果は観察されなかった。１０．０ｍｇ／ｋｇ集団における被験者は、０日目での最も低い組織学的活性スコアを有し、そしてそれ故に、この集団において、活性スコアにおける減少は限定される。ベースラインでの最高のスコアが、１．０ｍｇ／ｋｇ及び３．０ｍｇ／ｋｇ集団において見られ、そして、これらの患者において、２８日目での組織学的スコアにおける明白な減少があった。本治験において、２の患者は、抗ｃｈ５Ｄ１２抗体を有すると同定されたが、ＨＡＣＡ抗体の水準は非常に低いままであり、そして非常に低い血清希釈で検出可能であるだけであった。抗ｃｈ５Ｄ１２応答が、続く研究において検出されるであろうかどうかはまだ確立されていない。
【００９０】
この試験は、特にはヒトへの、全身における抗ＣＤ４０Ｍａｂ及びｃｈ５Ｄ１２の最初の投与を説明する。しかしながら、Ｍａｂ５Ｄ１２の生物学的活性の証拠は、マーモセットサルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにおいてインビボで、前に得られた。病気の誘発後２〜４週間で開始する５Ｄ１２の投与は、明白な有益な効果を有した２３。このインビボでの概念実証は、５Ｄ１２の組み換えヒト化及びさらなる開発を開始した。ｃｈ５Ｄ１２の生物学的活性は、マーモセットＥＡＥモデルにおいても評価された。ＭＯＧ−免疫後５０日目で、プラセボ集団における病気の発生率は１００％であり（ＥＡＥのそれらの重症度の故に動物の５０％が殺された）、一方でｃｈ５Ｄ１２処置集団では病気の兆候は観察されなかった２４。さらに、ｃｈ５Ｄ１２は、アカゲザルの腎臓移植モデルにおいて２５、及び、アデノウィルス粒子及びそれらの産物に対する免疫応答を防ぐ為に免疫抑制的戦略として用いられたときに２６、機能的な活性を示した。ヒト及びカニクイザルの組織についての組織交差反応性研究は、ｃｈ５Ｄ１２が、リンパ系器官におけるＢ細胞及びＤＣの細胞表面に結合したことを示した。ヒト又はカニクイザルの組織のいずれにおいても、予期されない交差反応性は観察されなかった。ｃｈ５Ｄ１２についての安全性及び忍容性（tolerability）の評価が、カニクイザルにおいて実施され、これにおいて４週間のｃｈ５Ｄ１２の週ごとの投与が、全てのサルにおいて安全であり且つ何らの副作用を伴わないと示された。この研究において、ｃｈ５Ｄ１２が、Ｂ細胞の活性化及び増殖を防ぐことができることの機能的な証拠が得られた２７。集合的に、これらの研究は、アンタゴニスト抗ヒトＣＤ４０Ｍａｂ  ｃｈ５Ｄ１２が、予期されない交差反応性を有さず、安全であり、カニクイザルにおける免疫反応性を限定し、及びマーモセットサルにおける中枢神経系の原型慢性炎症性疾患を抑制することを示した。それ故に、前臨床評価は、患者における使用の為のさらなる進展を支持した。
【００９１】
ＣＤ４０−ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）共刺激性経路が、自己免疫疾患及び移植拒絶の処置の為の有望な臨床標的として動物モデルにおいて検証された１５。潜在的に、ＣＤ４０−ＣＤ１５４相互作用は、ＣＤ４０又はＣＤ１５４を標的とすることにより抑制されうる。全ての以前の研究は、活性化したＴ細胞上及び血小板上に選択的に発現されるＣＤ１５４を拮抗することに焦点を当てた８〜１１。血栓塞栓性の事象の故に、抗ヒトＣＤ１５４Ｍａｂを用いたヒトの臨床研究は停止された１２〜１４。この抗ＣＤ１５４Ｍａｂは、Ｆｃ−受容体に非常によく結合するヒト化ＩｇＧ１として構築されるので、抗ＣＤ１５４ＭａｂはＦｃ−受容体へＣＤ１５４を架橋し、血液の血餅の形成を結果する。最近、ＣＤ４０が、血小板活性化の為の刺激としての可溶性ＣＤ１５４を用いて、血小板上に恒常的に発現されると報告されそして機能的に重要であると分かった。血小板の活性化を結果したこれらの刺激性効果は、抗ＣＤ１５４又は抗ＣＤ４０Ｍａｂの添加により抑制された４２。我々は、ヒト血小板による実験においてもｃｈ５Ｄ１２の非刺激性特徴を確認した。なぜなら、ＡＤＰ又はコラーゲンの最適以下の濃度を用いて予備刺激された血小板へのｃｈ５Ｄ１２の添加は、血小板の活性化状態に対して何らの効果も伴わなかったからである（Ｍ．Ｆ．Ｈｏｙｌａｅｒｔｓ，未発表の観察、ルーベン、ベルギー）。さらに、ｃｈ５Ｄ１２ＭａｂバックボーンのＩｇＧ４  Ｆｃ部分は、ＩｇＧ１バックボーンと比較して、血小板上に発現されるＦｃ−受容体へ結合する能力を減少した。さらに、２つのアプローチの間の区別は、ｃｈ５Ｄ１２はＢ細胞、単球、マクロファージ及びＤＣを標的とするのに対し、抗ＣＤ１５４Ｍａｂは主に活性化Ｔ細胞を標的とし、顕著に異なる臨床的戦略を結果するとの事実から来る。この研究において試験された患者のいずれにおいても血栓塞栓症の徴候は観察されなかった。
【００９２】
ｃｈ５Ｄ１２の効果は、ＣＤ４０媒介の細胞活性化の干渉に大部分は基づく。ＣＤ４０を誘発することは、マクロファージ及びＤＣによるサイトカイン及びケモカインの分泌を誘発し、そして後者の抗原提示能力を増強する。ｃｈ５Ｄ１２はＣＤ４０受容体（これによりＴＮＦ−α産生が誘発される３９）を拮抗するので、それは、クローン病において疑いの余地なく重要なサイトカインであるＴＮＦ−α分泌も拮抗しうる４３。しかしながら、ＩＬ−８及びＩＬ−１２など３９の、他の炎症性サイトカインの多くも、ＣＤ４０を誘発することにより誘発され、そしてそれ故に、ｃｈ５Ｄ１２はＴＮＦ−α産生の阻止に加え抗炎症性特性を有しうる。観察された効果が、減少されたＴ細胞活性化に主に依存するのか又はサイトカイン及びケモカインの減少された放出に主に依存するのかは、さらなる調査を待つ。
【００９３】
ｃｈ５Ｄ１２によるヒトへの最初の投与の治験（first-into-man study）は、重篤な副作用が無く、有望な臨床的有益性を示す。さらなる臨床的治験が、寛解の維持において及び複数の注入の安全性監視において、ｃｈ５Ｄ１２についての役割及び最適な投与スキームを確立する為に、必要とされるであろう。明らかに、ＣＤ４０を拮抗することによる治療的有益性は、クローン病に限定されないであろうし、そして、多くの他の炎症性疾患へ潜在的に拡張されうる。
【実施例２】
【００９４】
材料と方法
【００９５】
５Ｄ１２のキメラバージョンの産生
５Ｄ１２ハイブリドーマ細胞株から始まり、５Ｄ１２のマウス可変領域がクローン化された。簡潔にいうと、Ｑｉａｇｅｎを用いて溶解された細胞から全ＲＮＡが単離された。
2009536522.tif 000017
配列分析後、Ｖ領域についてのコンセンサス配列が決定された。次に、該Ｖ領域が、キメラＩｇＧ４免疫グロブリン発現プラスミドを構築する為に、ヒトＩｇＧ４及びヒトκをコードするゲノム配列と一緒に、ｐｃＤＮＡ３００２（Marissen et al, J. of Virol, 2005: 79:4672-4678）中に再クローン化された。
【００９６】
５Ｄ１２の脱免疫されたバージョンの産生
Ｂｉｏｖａｔｉｏｎと共同で、彼らの専売のＤｅＩｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ技術を用いて、Ｖ領域内に、潜在的なＴ細胞エピトープが同定された。ヘルパーＴ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有するタンパク質内の短いアミノ酸配列を含む。Ｔ細胞エピトープの除去により、該抗体は、Ｔ細胞援助及びそれに対する続く免疫原性をもはや誘発できない。同定は、ペプチドスレディング（Peptide Threading）を用いてなされた。ペプチドスレディングアプローチは、Ｘ線結晶学により解析された既知の構造に基づく１８の異なるヒトＭＨＣクラスＩＩ分子へのペプチドの結合性を予測する、コンピューターに基づく方法である。さらに、データベース（www.wehil.wehi.edu.au）から、既知のヒトＴ細胞結合性ペプチドの存在についてＶ領域を探索するための分析が行われた。
【００９７】
原型のマウスＶ領域アミノ酸配列に基づき、表面ヒト化（ベニア化）Ｖ領域が設計された。これらのベニア化ＶＨ配列内に、８の潜在的なＴ細胞エピトープが、及びベニア化ＶＬ領域内に、４のＴ細胞エピトープが、同定された。同定されたＴ細胞エピトープは、アミノ酸置換により除去された。この分析に基づき、脱免疫化ＶＨ及びＶＬ領域をコードするＤＮＡ配列が合成され、そして、ｐｃＤＮＡ３００２−ｈＩｇＧ４−κ発現プラスミド中に再クローン化された。
【００９８】
部位特異的変異
脱免疫化ｐｃＤＮＡ３００２発現プラスミドのＶＨ領域内のマウス配列を再建するために、ＳｔｒａｔｅｇｅｎｅのＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ部位特異的変異キットが、製造者のプロトコルに従い用いられた。表４において、用いられたオリゴヌクレオチドが示される。簡潔にいうと、該プラスミドが変性され、所望の変異を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーのアニーリングが続いた。Ｂｉｏｍｅｔｒａ  Ｔ勾配ＰＣＲ装置を用いて、１６回のの繰り返し（３０秒９５℃；３０秒５５℃；６００秒６８℃）により、変異配列が組み込まれた。変異していない親プラスミドが、メチル化ＤＮＡだけを切断するＤｐｎＩを用いて消化された。その後、変異したプラスミドを有するＰＣＲ混合物が、ＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテント細胞中に形質転換された。コロニーが選ばれ、正確なプラスミドについてのＤＮＡ配列により分析された。実験の第２の設定は、特に、Ｉの構造的に関連するＶ又はＬとの置換による、位置２９及び３７の追加の変異体を産生することに焦点を当てた。上記で記載されたのと同様のやり方で、表６に示されたとおりのオリゴヌクレオチドを用いてプラスミドが産生された。二重変異体を作成する為に、２の変異誘発ラウンドが要求された（表７）。プラスミドは、ＸＬ１−ｂｌｕｅコンピテント細胞を形質転換するために用いられた。
【００９９】
ＰＥＲ．Ｃ６（商標）における発現
５Ｄ１２の種々のバージョンの発現がＰＥＲ．Ｃ６（商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ）において一過性に行われた。簡潔にいうと、形質導入の前日にＰＥＲ．Ｃ６（商標）がトリプシン処理され、そして数えられた。細胞は、１０％ＦＣＳにより置換されたＤＭＥＭ中に、Ｔ２４ウェルプレート中にウェル当たり４×１０５細胞の密度で蒔かれた。次の日に、培地が、０．５ｍｌの新鮮培地と交換された。それぞれのウェルについて、１μｇのプラスミドＤＮＡが、５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ中に希釈され、これは３μｌのＬｉｐｏＦｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（ＬＦ２０００）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有する等量のＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉと混合された。混合物は、室温で２０分間インキュベートされて、ＤＮＡ−ＬＦ２０００試薬複合体を形成することを許した。続いて、ＤＮＡ−ＬＦ２０００試薬複合体（１００μｌ）が、それぞれのウェルに直接に添加された。形質移入された細胞は、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃でインキュベートされた。４８時間後、上清が、抗体発現について分析された。
【０１００】
ＥＬＩＳＡ
発現された抗体の量が、サンドウィッチＥＬＩＳＡにより測定された。簡潔にいうと、９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３５９０）が、一晩４℃で、ＰＢＳ中に１／１０００希釈されたポリクローナル抗体抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  １０９−００５−０８８）により被覆された（１００μｌ／ウェル）。０．０５％Ｔｗｅｅｎ及び１％ＢＳＡを有するＰＢＳによるブロッキング後、プレートは、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎにより３回洗浄された。続いて、基準として、精製されたキメラ５Ｄ１２が、４００ｎｇ／ｍｌで開始し０へのタイトレーションにおいて、３回、適用された。試料（一過性の上清）も、タイトレーションにおいて適用された。全ての希釈は、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ中になされた。プレートは３７℃で１時間インキュベートされた。３回の洗浄後、１／５０００希釈された検出抗体（アルカリホスファターゼラベル化
抗ヒトκ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ２０６０−０４））が、それぞれのウェルに適用された。プレートは、３７℃で１時間インキュベートされた。インキュベーションの除去後、プレートは５回洗浄された。染色は、ＰＮＰ基質（Ｓｉｇｍａ  Ｎ−２７６５）（１ｍｇＰＮＰ／ｍｌ基質緩衝液−１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ｐＨ  ９．５−）によりなされた。ＯＤ４０５ｎｍが、基準として６５５ｎｍを用いて、ＢｉｏＲａｄ  ５５０  Ｔｉｔｅｒｔｅｋ上で測定された。
【０１０１】
ＦＡＣＳ
ＦＡＣＳ分析により、発現された抗体の抗原特異性が分析された。ＪＹ細胞は、ＥＢＶにより形質転換されたヒトＢ細胞であり、ＣＤ４０を発現する。簡潔にいうと、１００，０００のＪＹ細胞が、一過性発現実験からの１００μｌ上清と、４℃で２０分間インキュベートされた。結合していない抗体を除く為に、細胞は、０．０５％ＮａＡｚｉｄｅ及び１％ＢＳＡを有するＰＢＳにより洗浄された。二次抗体として、１／１００希釈されたＦＩＴＣラベル化抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  １０９−０９５−１２７）が用いられた。４℃での２０分のインキュベーション後、細胞は洗浄された。最終的に、細胞試料は、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ）上で測定された。
【０１０２】
結果
【０１０３】
いくつかのクローンの分析後、そのコンセンサス配列が、マウスの５Ｄ１２のＶ領域について決定された（図５）。
【０１０４】
ヒトの表面に従って、Ｖ領域が再設計され、重大なマウスアミノ酸を維持した。ペプチドスレディング法及びデータベース検索により、これらの再設計された配列内の潜在的なＴ細胞エピトープが決定された。ＶＨ領域内に８（潜在的エピトープの最初の塩基：位置２７、３０、４３、４６、５７、６１、７７及び８３）の及びＶＬ領域内に４（位置７、１３、２８及び８６）の潜在的エピトープが同定された。Ｔ細胞エピトープマッピング及びベニア化（veneering）プロセスに基づき、最適な脱免疫化されたＶＨ及びＶＬアミノ酸配列が定められた（図６）。ＶＨ領域中の位置６１でのＴ細胞エピトープを除去する為に、潜在的なＮ−グリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓ）を導入しないための特別な注意がとられた：ＮＳＡはＳＴＳにより置換された。この最終の設計において、ＶＨ領域中の１２の位置が変化された（位置６０〜６２は１の変化として数える）。ＶＬ領域について、８の位置が変化された。
【０１０５】
ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００と新たに命名される）と比較して、完全に脱免疫化された５Ｄ１２（ＤＩ５Ｄ１２）の発現水準を比較する予備実験から、導入された変異により、ＤＩ５Ｄ１２は、親の配列と比較したときに、より低い水準で発現されたことが分かった（データは示されていない）。
【０１０６】
原理上、それぞれの置換は発現された抗体の特徴に影響することができる。それ故に、抗体の特徴についてのＶＨ領域におけるそれぞれの変化された位置の影響を調査する為に、１２の追加の変異体が設計された（図７）。それぞれの変異体において、１の位置が、原型のマウスアミノ酸配列に戻された。
【０１０７】
種々のバージョンの発現水準及び機能性を試験する為に、１４のｐｃＤＮＡ３００２発現プラスミドが構築された。それぞれのプラスミドは、ＶＨ領域が連結されたヒトＩｇＧ４バックボーン及びＶＬ領域が連結されたヒトκ領域を有する。１のプラスミドはｃｈ５Ｄ１２についてコードし、そこにはマウスＶ領域が用いられた。他の１３のプラスミドは脱免疫化されたバージョンであり、そこには脱免疫されたＶＬ領域が、図７に示される脱免疫されたＶＨ領域又は１２のＶＨ変異体の一つとの組み合わせで用いられる。続いて、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞が、ＬｉｐｏＦｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて１４のプラスミドにより形質移入された。負のニセの形質移入（プラスミドなし）も含まれた。４８時間後、それぞれの形質移入物から一過性の上清が回収され、そして、抗体発現について分析された。図８において、ＦＡＣＳデータが示される。明白に、全ての試験された構築物はＪＹ細胞に結合し、５Ｄ１２のＣＤ４０結合特異性が保存されることを示す。
【０１０８】
さらに、ＦＡＣＳデータは、産生された抗体水準が異なることを示す。明白に、ＤＩ５Ｄ１２とｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）の間の発現水準において違いがある。変異体Ｑ５Ｅ、Ｋ１３Ａ，Ｅ１６Ｑ、Ｔ１７Ｓ、ＳＴＳ６０ＮＳＡ及びＴ６８Ｓは、ＤＩ５Ｄ１２と同じ発現特徴を示す。他の変異体は、発現水準を増すように思われる。種々の発現水準を正確に測定する為に、全ての上清が、抗体水準を測定する定量的ＥＬＩＳＡにより分析された。表５において示されるとおり、試験された変異体は３つの群に分類されることができる：無し又は発現水準について低い改善（Ｑ５Ｅ、Ｋ１３Ａ、Ｅ１６Ｑ、Ｔ１７Ｓ及びＳＴＳ６０ＮＳＡ）、変異体Ｐ４５Ｌ、Ｍ４８Ｌ、Ｓ７９Ｆ及びＴ１０８Ｓはｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）と比較して最大で４０％まで発現水準を回復する、他方Ｉ２９Ｌ及びＩ３７Ｖ変異体は５０％超の水準を回復する。特に、位置２９での置換（ＩからＬへ）は発現水準について大きな影響を有すると思われる。Ｉ２９Ｌ変異体は次に、ＰＧ１０２抗体と新たに命名された。
【０１０９】
位置２９（ＩからＬへ）及び３７（ＩからＶへ）での置換は両方とも発現水準に対する大きな影響を有するとの観察はとりわけ予期されない。なぜなら、アミノ酸Ｉ、Ｌ及びＶは構造的に近似しており、３つは一緒に側鎖アミノ酸のグループを形成するからである。続く研究において、位置２９及び３７でのアミノ酸Ｉの構造的に近似のアミノ酸Ｖ又はＬとの組み合わせられた置換の効果が何かが、さらに確立された。
【０１１０】
図９は、ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）、ＤＩ５Ｄ１２及びＰＧ１０２（Ｉ２９Ｌ変異体）とのアラインメントにおいて設計されたＶ−Ｌ−Ｉ変異体を示す。
【０１１１】
これらのＶ−Ｌ−Ｉ変異体の発現水準及び機能性を試験する為に、追加のｐｃＤＮＡ３００２発現プラスミドが構築され、これは、上記されたとおり、変異体の１のＶＨ領域が連結されたヒトＩｇＧ４バックボーン及びＶＬ領域が連結されたヒトκ領域を有する。次にＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞が、ＬｉｐｏＦｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いてプラスミドにより形質移入された。４８時間後、それぞれの形質移入物から一過性の上清が回収され、そして抗体発現について分析された。種々の発現水準を正確に測定する為に、全ての上清が、抗体水準を測定する定量的ＥＬＩＳＡにより分析された。表８において示されたとおり、位置２９及び３７についてのＶ、Ｌ又はＩの種々の組み合わせが、可変の産生水準と関連する。これはさらに、全てのＶ、Ｌ及びＩ置換が最終的に、より高い産生水準をもたらすのではないことをさらに示す。
【０１１２】
考察
【０１１３】
治療的抗体の免疫原性を減少することにより、特徴が変化しうる。この研究において、脱免疫化設計はその抗原への結合能力をなお有する抗体を結果するが、該抗体は低い水準で産生されることができただけであったことが示される。おそらくは、発現の際に、脱免疫化されたＶＨ及びＶＬ領域の構築における問題がある。それぞれの置換された位置をＶＨ領域内の原型のマウス配列に戻すことにより、いくつかの位置が、抗体の適切な発現にとって必須であることが明らかにされた。特に、ペプチドスレディングアプローチに基づく部位が、発現水準に対して大きな影響を有した。全てがベニア化に基づき導入されたＮ−末端変化はほとんど影響を有さなかった。顕著に、位置２９でのＩのＬによる置換は、最も大きな影響を有し、これは両方のアミノ酸が構造的に近似するので予期されなかった。Ｉ２９Ｌ変異体は続いて、ＰＧ１０２抗体と新たに命名された。
【０１１４】
次の研究は、位置２９及び３７でのＶ、Ｌ又はＩの種々の組み合わせが、産生水準における変動をもたらしたことを実証し、３の側鎖アミノ酸Ｖ、Ｌ及びＩは構造的に近似するが、位置２９及び３７についてのこれらのそれぞれの置換は完全抗体の産生水準に対する影響を有することを実証した。
【実施例３】
【０１１５】
材料と方法
【０１１６】
ＰＧ１０２（Ｉ２９Ｌ変異体）の産生の為のＧＳ−ＣＨＯ細胞株の構築、選択及び発展
Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｌｏｎｚａ）が、ＰａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ  ＢＶにより、ヒト組み換えＩｇＧ４／κ抗体ＰＧ１０２（Ｉ２９Ｌ変異体）を発現するＧＳ−ＣＨＯ細胞株の構築、選択及び評価を引き受けるよう要請された。細胞株は、Ｌｏｎｚａのグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（国際公開第２００３／０５４１７２号パンフレット）を用いて作られたベクターによりＣＨＯＫ１ＳＶ宿主細胞を形質移入することにより構築された。遺伝子配列は、Ｐａｎｇｅｎｅｔｉｃｓにより供給された。該細胞株ＣＨＯＫ１ＳＶは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株ＣＨＯＫ１の懸濁変異体（suspension  variant）であり、これは、化学的に規定された、動物成分無しの（ＣＤＡＣＦ）培地に適合している（Bebbington et al (1192) Biotechnology 10:169-75; de la Cruz Edmonds MC et al (2006) Mol. Biotechnol. 34:179-90）。
【０１１７】
全ての試薬、培地成分、材料は、公認の供給者から入手された。フィードＳＦ４０及びＳＦ４１、培地ＣＭ４２並びに培地補充ＳＰＥの配合は、Ｌｏｎｚａから得られた。培地ＣＤ−ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、ＣＤＡＣＦ適合細胞株の通常の継代培養について選択剤Ｌ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）の添加と一緒に、及び、形質移入についてフェノールレッドと一緒にもまた用いられた。選択剤ＭＳＸは、Ｓｉｇｍａにより供給された。これらの培地及び餌は抗生物質を含有しない。ＰＧ１０２についての遺伝子をコードするＧＳ発現ベクターの構築もまたＬｏｎｚａで実施された。ＣＨＯＫ１ＳＶ宿主細胞は、Ｌｏｎｚａの凍結保存された正常に機能する細胞バンク２６９−Ｗのバイアルから得られた。
【０１１８】
細胞培養、濃縮及び生存率
細胞は、３７℃へすばやく温めること及び約５０ｍｌの増殖培地中に希釈することにより、凍結保存されたストックのバイアルから生き返らされた。凍結保護物質は、細胞を遠心すること、上清を捨てること及び新鮮な増殖培地中に細胞を再懸濁することにより、除去された。
【０１１９】
静置培養のために、細胞は５〜１５ｍＬの培養容積を有するＴ２５フラスコ中で増殖された。これらの静置培養物は、空気中に１０％ｖ／ｖＣＯ２の雰囲気を有するインキュベーター中に３５．５〜３７．０℃で置かれた。
【０１２０】
懸濁培養のために、培養物は、適当な体積の増殖倍地中で展開され、そして、ＣＤＡＣＦ培地中で増殖のために４日毎に継代培養された。用いられた容器は、１２５ｍＬ振とうフラスコ（１０〜３０ｍＬの培養量のため）、２５０ｍＬ振とうフラスコ（３０〜５０ｍＬの培養量のため）、５００ｍＬ振とうフラスコ（５０〜１００ｍＬの培養量のため）、１Ｌローラーボトル（１００〜２００ｍＬの培養量のため）、又は２Ｌローラーボトル（２００〜４００ｍＬの培養量のため）であった。それぞれの培養物のヘッドスペースは、空気中の５％ｖ／ｖＣＯ２が供給され、そして、フラスコは封された。培養物は次に、１４０±５ｒｐｍで回転する振とうプラットフォーム上で３５．５〜３７．０℃でインキュベートされた。
【０１２１】
全ての及び生存可能な細胞の濃度は、無菌的に培養物の試料を除くこと、トリパンブルーにより非生存細胞を染色すること及び改造されたフックスローゼンタール血球計算盤を用いる顕微鏡的試験により得られた。必要に応じて、試料は、計数の前に希釈された。
【０１２２】
代わりに、全ての及び生存可能な細胞の濃度は、ＣＡＳＹ−１粒子カウンター又はＶｉ−ＣＥＬＬ  ＸＲ自動化細胞カウンターを用いて測定された。ＣＡＳＹ−１カウンターのために、培養物の試料は、無菌的にそれぞれのフラスコから除去され、Ｃａｓｙｔｏｎ緩衝液により希釈され、そして、生存可能な且つ全ての細胞の数が決定された。生存細胞（variable  cell）及び非生存細胞は、サイズにより区別された。百分率生存率は、１００を掛け算された、全細胞に対する生存細胞の比として計算された。Ｖｉ−ＣＥＬＬ  ＸＲカウンターのために、０．７ｍＬの細胞培養物が無菌的に除去されそして自動化トリパンブルー計数が実施された。一連のカメラ写真とコンピューター解析アルゴリズムが、生存細胞及び非生存細胞を同定し且つ計数するために用いられる。全ての計数方法について、百分率生存率は、１００を掛け算された、全細胞に対する生存細胞の比として計算された。
【０１２３】
ＣＨＯＫ１ＳＶ宿主細胞の形質移入
形質移入の日に、非選択培地中で増殖する細胞が、遠心により回収され、そして、１．４３×１０７生存細胞／ｍＬの濃度で再懸濁された。それぞれの形質移入について、約０．７ｍＬの細胞懸濁物及び４０μｇのプラスミドＤＮＡが、エレクトロポレーションキュベットに添加された。エレクトロポレーションキュベットは次に、エレクトロポレーション装置中に置かれ、そして、３００Ｖ，９００μＦの１回のパルスが送達された。エレクトロポレーションに続き、キュベットからの細胞が、９６ウェルプレート中に約５０００宿主細胞／ウェルで、培地ＣＤ−ＣＨＯ／フェノールレッドを用いて分配された。プレートは、空気中の１０％ｖ／ｖＣＯ２の雰囲気中で、３５．５〜３７．０℃でインキュベートされた。形質移入の次の日、１５０μＬの選択培地ＣＤ−ＣＨＯ／フェノールレッド／６６．６μＭ  ＭＳＸが、それぞれのウェルに添加された。それぞれのウェル中のＭＳＸの最終濃度は５０μＭであった。プレートは、いつ形質移入されていない細胞が死んで形質移入された細胞の増殖巣（focus）を離れたかを決定する為に監視された。形質移入された細胞の増殖巣は、形質移入後約３〜４週で明白となった。試験され且つさらに発展された全ての形質移入体は、視覚の評価により決定されたときに、単独のコロニーだけを有するウェルから来た。
【０１２４】
静置培養における細胞株の生産性の評価
９６ウェルプレートは、コロニー形成を許すための形質移入に続き、約３〜４週間インキュベートされた。コロニーは、それらが適当なサイズ（ウェルの底の６０％超を覆う）であること及びそれぞれのウェル中に１つのコロニーだけが存在することを確認する為に、顕微鏡的に調べられた。培養物上清は次に、以下で「アセンブリーＥＬＩＳＡ」と記載される、集合した抗体についてのＬｏｎｚａのＥＬＩＳＡ分析を用いて抗体産生について分析された。ウェルの百分率集密度は、サンプリングの時に評価された。該分析結果を百分率集密度により割り算することによって得られた値は、細胞株を順位付けするために用いられた。
【０１２５】
高い順位の細胞株の培養物が、２４ウェルプレート中に、培地ＣＤ−ＣＨＯ／フェノールレッド／２５μＭ  ＭＳＸ中で展開され、そして、放置されて集密に達した。集密に達したときに、この培養物は、培地ＣＤ−ＣＨＯ／フェノールレッド／２５μＭ  ＭＳＸ中でＴ２５フラスコを植菌する為に用いられ、一方、残りの培養物は、新鮮なＣＤ−ＣＨＯ／フェノールレッド／２５μＭ  ＭＳＸを再度与えられ、そしてさらなる１４日間インキュベートされた。このときに、培養物上清が、２４ウェルプレートから集められ、そして抗体濃度が、Ｌｏｎｚａの、集合した抗体についてのＬｏｎｚａのＥＬＩＳＡ分析を用いて測定された。最も生産的な細胞株の選択がなされた。Ｔ２５フラスコ中で集密に達したときに、選択された細胞株は、多層が許容され、そして次に、ＣＤ−ＣＨＯ／２５μＭ  ＭＳＸを再度与えられた。フィーディング後、培養物は、培地が再度オレンジ色／黄色に戻り且つ細胞がフラスコから浮き上がるまで、さらなる４〜７日間インキュベーターに再度戻された。
【０１２６】
ＣＤＡＣＦ懸濁培養物への細胞株の展開
懸濁培養物は、集密なＴ２５フラスコ培養物から開始された。該懸濁培養物は、ＣＤ−ＣＨＯ／２５μＭ  ＭＳＸ培地を有する１２５ｍＬ振とうフラスコ中に０．０５〜０．２×１０６生存細胞／ｍＬの濃度で植菌された。もし生存細胞濃度が、Ｔ２５フラスコ中での最大の１４日後に０．０５×１０６生存細胞／ｍＬに達していなかったならば、それぞれの培養物の１５ｍＬが、１２５ｍＬ振とうフラスコ中の１５ｍＬのＣＤ−ＣＨＯ／２５μＭ  ＭＳＸ中に機械的に進められた。細胞株は、次に、新鮮なＣＤ−ＣＨＯ／２５μＭ  ＭＳＸ培地中へと、０．２×１０６生存細胞／ｍＬの植菌濃度で、４日の継代培養計画について、許容可能且つ再現可能な増殖特性が得られるまで、連続的に継代培養された。
【０１２７】
懸濁培養物における細胞株の増殖と生産性の評価
流加（Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）振とうフラスコ培養
夫々の選択された細胞株の一重の培養物が、５００ｍＬ振とうフラスコ中で、ＣＭ４２／４×ＳＰＥ培地を用いた、１００ｍＬの細胞懸濁物により調製された。培養物は、０．２×１０６生存細胞／ｍＬで植菌され、そして、夫々の培養物のヘッドスペースは、空気中の５％  ｖ／ｖ  ＣＯ２により平衡化された。該培養物は、１４０±５ｒｐｍで回転する振とうプラットフォーム上で３５．５〜３７．０℃で、生存細胞濃度がピーク後に０．６×１０６生存細胞／ｍＬより少なくなるか若しくは等しくなるか又は１５日が達せられる（「過増殖される」）まで、インキュベートされた。このときに、該培養物が回収された。細胞濃度は、Ｖｉ−ＣＥＬＬ自動化細胞カウンターを用いて毎日測定された。１．４〜２．２×１０６生存細胞／ｍＬの細胞濃度で、栄養素フィードＳＦ４０のボーラス添加（bolus  addition）がなされた。さらなるボーラス添加が、該最初の添加後約２４、４８及び７２時間でなされた。第二のフィード（ＳＦ４１）が、４．０×１０６生存細胞／ｍＬが得られた時点で適用された。培養物の試料が適当な間隔で取られ、遠心され、そしてプロテインＡ  ＨＰＬＣにより抗体濃度について分析されるまで−２０±５℃で上清が保存された。夫々の過増殖培養物からの回収上清は、−２０±５℃で保存された。最も高い抗体濃度を有する１０の過増殖培養物がさらに、産生された抗体の性質について評価された。試料は、プロテインＡ精製及び還元及び非還元ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)及び等電点電気泳動（ＩＥＦ）分析及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ）オリゴ糖分析による抗体の特徴付けの前に、ゲル浸透高速液体クロマトグラフィー（ＧＰ−ＨＰＬＣ）法を用いて凝集水準について評価された。
【０１２８】
凍結保存
細胞は、作業計画を通じて要所で凍結保存された。増殖する培養物中の細胞は、遠心により回収され、そして、凍結保存混合物中に再懸濁された。これは、適当な増殖培地（９２．５％ｖ／ｖ）及びジメチルスルホキシド（７．５％ｖ／ｖ）から成った。
次に、細胞のアリコート（aliquot）が、ラベルが付されたバイアル中に分配され、夫々のアリコートは約１．５ｍＬの凍結保存培地及び約０．５〜１．５×１０７生存細胞を有した。バイアルは、次に、自動的なプログラム可能細胞凍結装置中で凍結され、次に液体窒素冷蔵庫へと移された。
【０１２９】
世代数
選択された細胞株の夫々について、細胞の世代数が、培養物が懸濁物中に継代された時点でゼロとして定義された。世代数は、次に、以下の等式から導かれる手順を用いて夫々の継代培養で計算された（最も近い０．５世代に切り捨てされた）。
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【０１３０】
データ分析
増殖曲線下の面積の時間積分（生存細胞濃度の時間積分（ＩＶＣ）；１０９細胞・ｈ／Ｌ）が、隣接する細胞濃度の値の間の面積（直角台形に近似された）を合計することにより計算された。該面積は、２の測定の間の経過時間（ｈ）により、２の生存細胞濃度（細胞／ｍＬ）の平均を掛け算することにより計算された。この方法は、Ｒｅｎａｒｄら（１９８８）により、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｅｒｓ  １０（２）９１〜９６ページにおいて記載されたものに基づく。必要に応じて、全体の比生産速度（ｑｐ  全体：ｍｇ／１０９細胞／ｈ）が、生存細胞濃度の時間積分に対する抗体濃度（ｍｇ／Ｌ）の線形回帰分析により計算された。この直線の傾きは、ｑｐ全体に等しい。回収の比生産速度（ｑｐ回収）は、回収抗体濃度を、回収でのＩＶＣの値により割り算することにより計算された。
【０１３１】
アセンブリーＥＬＩＺＡ
上清試料の抗体濃度が、集合したヒトＩｇＧを測定するＥＬＩＳＡを用いて決定された。これは、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃにより被覆された９６ウェルプレート上への、試料中及び標準中の集合した抗体の捕捉に関係した。結合した抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼを結合したヤギ抗ヒト軽鎖及び発色基質テトラメチルベンジジンにより明らかにされた。色の発展は、試料中に存在する抗体の量（mass）に比例した。該濃度は、ＩｇＧ標準（ロットナンバーＬ０７３８７／５／２）を用いて作られた標準曲線を用いて決定された。
【０１３２】
プロテインＡ  ＨＰＬＣ
産物濃度が、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００ＨＰＬＣ上で、プロテインＡ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量された。抗体は、ＰＯＲＯＳプロテインＡ免疫検出カラムに選択的に結合された。結合していない物質はカラムから溶出され、そして、残る結合した抗体が、溶媒のｐＨを減少させることにより遊離された。溶出は、多波長検出器を用いて２８０ｎｍでの吸光度により監視された。抗体は、抗体標準（ロット  Ｌ０７３８５／４／１０）に対して（Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いて）定量され、そして
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の吸光計数について補正された。
【０１３３】
プロテインＡアフィニティー精製
重力送りのｒｍｐプロテインＡセファロースカラム（５ｍＬ）が調製された。該カラムは、６ＭグアニジンＨＣｌにより、使用の前に清潔にされ、そして、５０ｍＭグリシン／グリシネート−２５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０により平衡化された。カラム充填物質のｐＨは、カラムへの適用の前に、ｐＨ８．０±０．１に調節された。該ｒｍｐプロテインＡアフィニティーカラムは、平衡緩衝液により洗浄され、そして、０．１Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ３．５により溶出された。カラム溶出物は、２Ｍ  Ｔｒｉｓ  Ｂａｓｅにより約ｐＨ７．０に中和され、そして、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのホスフェート緩衝生理食塩水に対して、ＩＥＦ及びＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析の為の準備において、透析された。
【０１３４】
プロテインＡアフィニティー精製された抗体のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析
細胞培養物試料が、プロテインＡ精製による分析の為に調製された。電気泳動は、４〜２０％のプレキャストのＮｏｖｅｘポリアクリルアミドゲルを用いて実施された。還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥの為に、試料は、２−メルカプトエタノールを用いて還元され、そして、ＳＤＳによりｐＨ８．０で変性された。試料は、それらがゲルにロードされる（レーン当たり１０μｇ）前に、２．０±０．５分間加熱された。還元されていないＳＤＳ  ＰＡＧＥが、同じゲル及びＮｏｖｅｘ非還元性試料緩衝液（２−メルカプロエタノールが添加されていない）を用いて実施された。試料は、それらがゲル上にロードされる（レーン当たり４μｇ）前に、１０±０．５分の標準時間、加熱された。電気泳動に続き、タンパク質は、クマシーブリリアントブルーＲ２５０により７５分間染色することにより視覚化され、そして、メタノール／酢酸により脱染された。
【０１３５】
プロテインＡアフィニティー精製された抗体のＩＥＦ分析
細胞培養物試料が、プロテインＡ精製による分析の為に調製された。ＩＥＦ分析は、プレキャストのアガロースＩＥＦゲル、ｐＨ３〜ｐＨ１０を用いて実施された。レーン当たり約１０μｇのタンパク質試料が、ゲル上にロードされ、そして次に７０Ｖｈについて予備フォーカスされた。試料適用ストリップの除去後、電気泳動は、１５００Ｖｈについて継続された（ゲル当たり、１５００Ｖ、２０ｍＡ、２５Ｗ）。ＩＥＦゲルは、トリクロロ酢酸：スルホサリチル酸：メタノール溶液中に固定され、そして次に、クマシーブリリアントブルーＲ２５０（クマシーブルーのロットナンバー    ００３／Ｌ１１９０５／１１８及び００３／Ｌ１１９０５／１３１）により染色された。ゲルは次に、脱染されそして乾燥された。（脱染のロットナンバー  ００３／Ｌ１１９０５／１１７及び００３／Ｌ１１９０５／１２１）
【０１３６】
ＧＰ−ＨＰＬＣ
ＧＰ−ＨＰＬＣ法は、タンパク質成分のサイズに従い、タンパク質成分を分ける。大きな成分、例えばタンパク質凝集体などは大きすぎて、どの大きさの程度のマトリックス粒子にも進入することができず、それ故に、小さな成分、例えばタンパク質モノマーなどより先にカラムから溶出される。より小さな成分、例えば断片などは、より容易にマトリックスに進入し、そしてモノマーの後に溶出される。この技術はそれ故に、凝集体及び断片の両方から、抗体モノマーを分離する為に用いられた。該モノマー成分は、その特有の保持時間及び位置により、検量マーカー（calibration  marker）と比較して同定された。
希釈されていない試料が、産物濃度が１〜５ｍｇ／ｍＬであった（Ｌｏｎｚａの分析の確認されたロード範囲）ところの５０〜２５０μｇロードを与える為に注入された。ＧＦ−２５０カラムについての分子量範囲は、４〜４００ｋＤａであった。試料成分は、２８０ｎｍで検出され、そして、ピークのクロマトグラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いて分析された。積分は、凝集体については垂直液滴法を用いて、そして、断片についてはタンジェントスキム（tangent  skim）を用いて、実施された。試料成分の割合は、全ての積分されたピーク面積と比較した、夫々の成分のピーク面積の計算により決定された。
【０１３７】
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ分析
夫々の細胞株により産生されたＰＧ１０２抗体のオリゴ糖分析が、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳにより、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ（商標）ＭＡＬＤＩ−ＬＲを用いて、遅延引き出しと組合せて実施された。ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳは、陽イオンモードによりリフレクトロンコンフィグレーションにおいて操作された。装置は、混合されたＮ−グリカン標準を用いて校正された。
抗体は、ＰＯＲＯＳプロテインＡカラムを用いて、回収上清から精製された。該精製された画分が集められ、そして、ジスルフィド結合がジチオスレイトールにより還元され、ヨード酢酸を用いた還元されたチオールのアルキル化が続いた。オリゴ糖は、酵素Ｎ−グリカネース（Ｎ−ｇｌｙｃａｎａｓｅ）（ＰＮＧａｓｅＦ）を用いて遊離され、そして、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳの為の標的プレート上の、スーパー−ジヒドロキシ安息香酸（スーパー−ＤＨＢ）マトリックスの２層の間に、サンドウィッチされた。
【０１３８】
結果
ＣＨＯＫ１ＳＶ宿主細胞の形質移入
ＰＧ１０２遺伝子配列が、Ｌｏｎｚａにより、ＣＨＯＫ１ＳＶ宿主細胞株をエレクトロポレーションにより形質移入する為に用いられたダブル遺伝子（double  gene）ベクターｐＰＧ１０２／ＤＧＶ（示されていない）を構築する為に用いられた。形質移入の６セットが、ベクターｐＰＧ１０２／ＤＧＶを用いて実施され、そして、２５５の形質移入物の上清が、抗体産生について、９６ウェルプレート中でアセンブリーＥＬＩＳＡにより選抜された。検出できる抗体水準は、選抜された形質移入物の９９．６％により産生された。４３の高い順位の形質移入物が、２４ウェルプレートにおけるさらなる評価のために選択された。
【０１３９】
静置培養の展開及び懸濁物適合
選択されたＧＨ−ＣＨＯ細胞株の培養物が最初に、２４ウェルプレート中に展開され、そして次に、Ｔ２５静置フラスコ中に展開された。２４ウェルプレート中に残る細胞は、新鮮な培地が与えられ、そして抗体生産性を評価する前に「過増殖」された。選択された細胞株は、８．３〜１２０ｍｇ／Ｌの抗体濃度の範囲を示した（図１０）。
アセンブリーＥＬＩＳＡにより測定されたときに、最も高い産生濃度を有する２３の細胞株の培養物が、さらなる評価の為に選択された。該選択された培養物は、懸濁培養におけるＣＤＡＣＦ培地中に進められた。全ての細胞株は懸濁培養に成功裏に適合され、そして、流加培養におけるさらなる評価の為に選択された。
【０１４０】
流加振とうフラスコ培養における選択された細胞株の増殖及び生産性の特性の評価
２３の選択された細胞株の増殖及び生産性の特性が、流加振とうフラスコ培養において評価された。一重の培養物（singlet  culture）が、夫々の細胞株について調製された。２のフィード（ＳＦ及びＳＦ４１）が、生存細胞濃度がフィーディング基準を満たしたときに、培養物に添加された。フィード計画について用いられたプロトコルは、Ｌｏｎｚａの一般的なＧＳ−ＣＨＯ発酵プロセスを技術的に可能な限り近く模倣する。２３の選択された細胞株についての増殖及び生産性のデータは、表９中に提示される。流加振とうフラスコ培養物の回収された上清のプロテインＡ  ＨＰＬＣ分析は、４の細胞株が、１０００ｍｇ／Ｌ超の抗体濃度を産生したことを示した。細胞株Ｌ１０７は、最も高い抗体濃度、１６７４ｍｇ／Ｌを産生した。
【０１４１】
選択されたＣＨＯ細胞株の流加振とうフラスコ培養から精製された抗体の特徴付け
最高の抗体濃度を有する１０の細胞株の回収試料が、分析に先立ち、ｒｍｐプロテインＡセファロースクロマトグラフィーを用いて精製された。該プロテインＡ精製された抗体は次に、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びＩＥＦを用いて分析された。非還元的条件下におけるＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析された、プロテインＡ精製された試料の視覚的分析は、全ての試料が互いに比較できたことを示し、約２００ｋＤａでの完全抗体バンドを示した（データは示されていない）。追加のマイナーバンドが見えたが、それらはゲル画像上では全てが視認できたわけではなかった。１１６と２００ｋＤａとの間の分子量を有する３つのバンド（６６と９７ｋＤａとの間の分子量を有する１のバンド、３７と５５ｋＤａとの間の分子量を有する１のバンド及び２２と３１ｋＤａとの間の分子量を有する２のバンド）もまた観察された。６６と９７ｋＤａとの間に観察された追加のバンドは、非還元性条件下におけるＩｇＧ４抗体の典型的な半抗体である。同じ半抗体は、ＩｇＧ４内部評価対照（ＩＡＣ）においても観察される。
還元性条件下におけるＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析された、プロテインＡ精製された試料もまた、互いに比較可能であり、約５０ｋＤａでの重鎖バンド及び約２５ｋＤａでの軽鎖バンドを示した（データは示されていない）。選択された細胞株からのプロテインＡ精製された抗体試料の完全性は、Ｌ９７、Ｍ９２及びＭ５９を除く全ての細胞株について、ｐＩ範囲８．１５〜９．３０中に６の主要なバンド（３のメジャーバンド及び３のマイナーバンド）を有する、比較可能なプロファイルを実証したことを、ＩＥＦ分析は示した。これらの３の細胞株は、３のメジャーバンド及び２のマイナーバンドを示した。追加のバンドは、試料Ｊ３及びＪ４において観察されたが、これらはゲル画像上ではすべて視認できたわけではなかった。
【０１４２】
抗体のオリゴ糖分析
流加振とうフラスコ培養物におけるさらなる評価の為に選択された１０の細胞株のそれぞれにより産生された抗体のオリゴ糖分析が、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳにより測定された。１０の細胞株から得られた抗体中の主なオリゴ糖構造はＧ０Ｆ及びＧ１Ｆであり、これは抗体上に観察される典型的なＮ−結合型オリゴ糖構造である。比較的低い水準のオリゴマンノース構造が、細胞株Ｌ５２から生じた抗体について測定された全グリカンの、６．７％の最高の水準を有して観察された。オリゴマンノース−５（ｍａｎ−５）構造は、全グリカンの１．１〜４．６％の範囲で、全ての試料において観察された。分析された試料の全ては、比較できる水準のオリゴ糖を有し、且つ、比較的低い濃度のｍａｎ−５を有した（データは示されていない）。
【０１４３】
ＧＰ−ＨＰＬＣ
さらなる評価の為に選択された１０の細胞株の夫々により産生された抗体がＧＰ−ＨＰＬＣにより分析されたときに、より低い分子量成分（ＬＭＷＣ）は最も重要性が低いが、２５％より低い水準が好ましい。全ての試料は、２７．１％の水準を示したＬ５２を除き、２５％より低い水準を示した（表１０）。
ＬＭＷＣ水準が試料の間で非常に変化したので、凝集体の割合の２の異なる計算は通常は用いられないだろうが、必要であると思われた。
ＬＭＷＣを排除し且つモノマーとより大きなピークだけを見る、データのさらなる分析は、全てのサンプルについて、２．２％より少ない凝集体ピーク面積を示した（表１１）。５％より低い水準は、許容できると考えられる。
【０１４４】
細胞株の選択
３の細胞株が、プリシード（ｐｒｅ−ｓｅｅｄ）ストック（ＰＳＳ）の調製の為に選択された。用いられた選択基準は、高い回収抗体濃度、許容できる増殖特性及び許容できる産物品質特性の組合せであった。
【０１４５】
細胞株Ｌ１０７は、許容できる増殖及び産物品質の特性に加えて、評価された２３の細胞株のうち最高の回収抗体濃度を示したので、リード細胞株として選択された（図１１Ａ）。細胞株Ｌ２５は、許容できる増殖及び産物品質の特性に加え、評価された細胞株のうち二番目に高い回収抗体濃度を示した（図１１Ｂ）。それ故に、細胞株Ｌ２５は、第１のバックアップ細胞株として選択された。
細胞株Ｍ９５は、評価された２３の細胞株のうち３番目に高い回収抗体濃度を示し、且つ許容できる増殖及び産物品質の特性を有した（図１１Ｃ）。この根拠に基づき、細胞株Ｍ９５は、第２のバックアップ細胞株として選択された。
【０１４６】
プリシードストックの凍結保存
プリシードストック（ストック当たり２０のバイアル）が、３の選択された細胞株の夫々について凍結保存された。これらのストックは、蒸気層液体窒素冷蔵庫中で保存された。細胞株Ｌ１０７、Ｌ２５及びＭ９５は夫々、ＤＣ１、ＤＣ２及びＤＣ３を新たに命名された。
【０１４７】
考察
Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓは、ヒト組み換えＩｇＧ４／κ抗体ＰＧ１０２を発現するＧＳ−ＣＨＯ細胞株の構築、選択及び評価を行うよう要請された。
遺伝子配列は、ＰａｎＧｅｎｅｔｉｃｓにより供給され、そして、ベクターは、ＬｏｎｚａのＧｌｕｔａｍｉｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＧＳ）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて産生された。化学的に規定された、動物成分フリー培地に適合したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株ＣＨＯ−Ｋ１の懸濁変異体である細胞株ＣＨＯＫ１ＳＶが、エレクトロポレーションにより形質移入された。
ＣＨＯＫ１ＳＶ形質移入から、抗体を分泌した２５４の細胞株が得られた。４３の細胞株が、２４ウェルプレート中において増殖及び生産性について評価された。最大で１２０μｇ／ｍＬの抗体濃度が得られた。２３の細胞株が、一重の流加振とうフラスコ培養において評価された。１２１〜１６７４μｇ／ｍＬの範囲の回収抗体濃度が得られた。１０００ｍｇ／Ｌを超える回収抗体濃度が、４の細胞株について得られた。最高の抗体濃度を有する１０の細胞株が、産物品質分析の為に選択された。該選択された細胞株の夫々からの精製された抗体の産物品質は、還元された及び還元されていないドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動並びに等電点電気泳動分析により互いに比較可能であった。１０の選択された細胞株の夫々からの精製された抗体のオリゴ糖分析は比較的低い水準（＜４．６％）のオリゴマンノース−５を示した。
ＧＰ−ＨＰＬＣ分析は、凝集体水準が、トップの３つの細胞株の夫々について１％より低かったことを示した。
３の細胞株（Ｌ１０７、Ｌ２５及びＭ９５）が、増殖、生産性及び産物品質のデータに基づきさらなる評価の為に選択された。夫々の細胞株の２０のバイアルのプリシードストックが凍結保存された。３の細胞株は夫々、ＤＣ１、ＤＣ２及びＤＣ３と新たに命名された。
【実施例４】
【０１４８】
表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）による、ヒトＣＤ４０−Ｆｃへ結合するｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２（Ｉ２９Ｌ変異体）の動態学の測定
【０１４９】
材料と方法
ヒトＣＤ４０に結合するｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２（Ｉ２９Ｌ変異体）の動態学が、表面プラズモン共鳴により、２５．０℃の一定温度で、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００装置を用いて、比較された。ヒトＩｇＧ１−Ｆｃドメイン（ｈｕＣＤ４０−Ｆｃ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログナンバー  １４９−ＣＤ−５０）へと結合された組み換えヒトＣＤ４０細胞外ドメインが、これらの実験において標的抗原として用いられた。ｈｕＣＤ４０−Ｆｃ（１０ｍＭアセテート緩衝液、ｐＨ５．０、中の１μｇ／ｍＬ）が、Ｌｙｓ残基のアミン基を介して、カルボジイミド活性化されたＢｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５チップへと結合されて、１２７．４ＲＵの抗原固定化レベルを結果した。動態学分析の為に、ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２（範囲１０．０μｇ／ｍＬ〜０．３１３μｇ／ｍＬ）の希釈系列が、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＥＤＴＡ及び界面活性剤を有する、ＨＥＰＥＳにより緩衝された生理食塩水：ＨＢＳ−ＥＰ）中に調製された。動態学的分析が、３０μＬ／分の流速で実施された。試料は、同じ流速で、４分間結合することを許され、そして、５分間解離することを許された。該チップ表面は次に、３０ｍＭ  ＮａＯＨを用いて３０秒間再生され、そして、ベースラインが、次の試料の注入の前に、ＨＢＳ−ＥＰ中で、２．５分間再確立された。ＰＧ１０２及びｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）の交互の試料が注入されて、レプリケート（replicate）の第１設定について、夫々の希釈で濃度を増し、そして、レプリケートの第２設定については減少した。。
ＢＩＡｃｏｒｅコントロールソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．２）が、データ補正の為に用いられ、そして、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１）が動態学的データの分析の為に用いられた。結合パラメーターは、分子相互作用の２つの異なるモデルを用いて計算された：二価アナライトモデル及びラングミュア１：１結合性モデル。
【０１５０】
結果
ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２抗体についての観察された結合性の最大水準は夫々、１５２．５ＲＵ及び１４０．２ＲＵであった。
【０１５１】
ラングミュア及び二価結合性モデルに従う、計算された動態学的速度定数（夫々、ｋａ及びｋｄ、又はｋａ１及びｋｄ１）は、２つの抗体について若干異なった。すなわち、ＰＧ１０２は、ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）よりも早い結合速度及び解離速度を示したが（図１２）、２の抗体の全体の親和性（ＫＤ）は、モデルの間ではっきりとは異ならなかった。これらの実験からの動態学的パラメーター以下に集約される：
2009536522.tif 000020
2009536522.tif 000021
【０１５２】
２つの方法についての適合度（Ｇｏｏｄｎｅｓｓ  ｏｆ  Ｆｉｔ）の分析は、データが、二価結合性モデルによってより良く記述されることを示唆した。
【０１５３】
２の抗体変異体の計算された親和性はモデル間で異なったが、同じモデルによる夫々の抗体について得られた解離定数（ＫＤ）の推定値は比較可能であった；ラングミュアモデルを用いて、ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２について夫々、２．７１×１０−１０Ｍ及び２．３７×１０−１０Ｍ、及び二価アナライトモデルを用いて夫々、５．２５×１０−９Ｍ及び５．４１×１０−９Ｍ）。
【実施例５】
【０１５４】
抗イディオタイプ抗体を用いた、ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２がＪＹ細胞へ結合することの抑制
【０１５５】
ＰＧ１０２（Ｉ２９Ｌ変異体）が、その親の分子ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）と同じ、ＣＤ４０のエピトープと結合することを実証するために、抗イディオタイプ抗体が、ＣＤ４０発現性ＪＹ細胞へのＰＧ１０２又はｃｈ５Ｄ１２の結合性を抑制するために用いられ、ＦＡＣＳにより測定された。
【０１５６】
材料と方法
ヒトＣＤ４０を発現するＪＹ細胞が、室温で３０分間５％ヒト血清によりブロックされた。マウスｍＡｂ  ５Ｄ１２（クローン１７３−３６−１）への抗イディオタイプ抗体が、種々の濃度で（０〜１０μｇ／ｍＬ）、ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）（１μｇ／ｍＬ）、ＰＧ１０２（１μｇ／ｍＬ）又は負の対照のキメラ抗ｈｕＣＤ８６抗体（ｃｈＦＵＮ−１；１μｇ／ｍＬ）と一緒に、５０μＬ／チューブの全量で予備インキュベートされ、そして１５分間インキュベートされた。ＪＹ細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ、１％ＢＳＡ及び０．０５％アジ化ナトリウム）により洗浄され、そして、上清が廃棄された。ＪＹ細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液中に、２×１０６細胞／ｍＬの濃度へと再懸濁された。５０μＬのＪＹ細胞懸濁物が、予備インキュベートされた抗体混合物へと添加されて、１００μＬ／チューブの最終体積を与えた。細胞は、４ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液／チューブにより洗浄する前に、３０分間４℃でインキュベートされ、そして、上清が廃棄された。細胞ペレットは、ＦＡＣＳ緩衝液中に希釈された（１：１００）ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ．  カタログナンバー  １０９−０９５−１２７）の１００μＬ中に再懸濁され、そして、３０分間４℃でインキュベートされた。細胞は、４ｍｌＦＡＣＳ緩衝液により洗浄され、そして上清が廃棄された。ペレットは、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁され、そして、結合した抗体が、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて測定された。
【０１５７】
結果
抗イディオタイプｍＡｂ  １７３−３６−１は濃度依存的様式で、ＪＹ細胞上に発現されたｈｕＣＤ４０へと結合するＰＧ１０２及びｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）を抑制した（図１３）。ＪＹ細胞上でも発現されるＣＤ８６へのｃｈＦＵＮ−１の結合性は、ｍＡｂ１７３−３６−１により影響されなかった。ＪＹ細胞上のＣＤ４０へのＣＤ４０特異的抗体の結合性に対する、抗イディオタイプｍＡｂ  １７３−３６−１のブロッキング効果における有意な差はなかった。例えば、ｍＡｂ  １７３−３６−１により媒介される、ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）（バッチ１）及びＰＧ１０２（バッチ２）の抑制についての計算されたｌｏｇ  ＩＣ５０の値は夫々、−５．７４±０．１４及び−５．７６±０．１１であった（ｐ＞０．０５；両方ともｎ＝４）。これらの値は、約１．８μｇ／ｍＬ（〜１２ｎＭ）の抗イディオタイプ濃度に相当する。表１２は、ＪＹ細胞に結合するｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２の、抗イディオタイプにより媒介される抑制についての、計算された−ｌｏｇＩＣ５０の値の概要を示す。
【実施例６】
【０１５８】
ＥＬＩＳＡにより測定される、ＣＤ−４０Ｆｃへのｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２の結合性
【０１５９】
材料と方法
ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ＥＩＡ／ＲＩＡプレート、Ｃｏｒｎｉｎｇカタログナンバー３５９０）が、１００μＬ／ウェルのｈｕＣＤ４０−ｍｕＩｇ（Ａｎｃｅｌｌ、カタログナンバー５０４−０２０）（ＰＢＳ中で２５０ｎｇ／ｍＬへと希釈された）により被覆され、そして、湿潤環境において４℃で一晩インキュベートされた。プレートは、２００μＬ／ウェルの洗浄バッファー（ＢＰＳ中の０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）により３回洗浄された。次に、プレートは、２００μＬ／ウェルのブロッキングバッファー（洗浄バッファー中に５％  ＢＳＡフラクションＶ（Ｒｏｃｈｅ、カタログナンバー７３５０９４））により、ブロックされ、そして３７℃で１時間インキュベートされた（湿潤環境）。プレートは、洗浄バッファーにより３回洗浄された。試験抗体（ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）、ＰＧ１０２及び負の対照のキメラ抗ｈｕＣＤ８６抗体ｃｈＦＵＮ−１）が、ブロッキングバッファー中に０〜１２００ｎｇ／ｍＬ範囲で希釈され、そして、アッセイプレートへと１００μＬ／ウェルの最終体積で移され、そして３７℃での１時間のインキュベーション（湿潤環境）が続いた。プレートは、洗浄バッファーにより３回洗浄され、ブロッキングバッファー中に１：１０００で希釈されたヤギ抗ヒトκ−ＡＰ検出抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、カタログナンバー２０６０−０）の１００μＬ／ウェルの添加が続いた。プレートは、洗浄バッファーによる３回の洗浄及びＰＢＳによるさらなる１回の洗浄の前に、１時間、３７℃で、湿潤環境においてインキュベートされた。ＰＮＰ基質が、１タブレットのｐ−ニトロフェニルホスフェートタブレット（Ｓｉｇｍａ、カタログナンバーＮ−２７６５）を１５ｍＬのＰＮＰ基質緩衝液（１２．１ｇ  Ｔｒｉｓ、５．８４ｇ  ＮａＣｌ、１．０２ｇ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（ＨＣｌによりｐＨ９．６に調整された））に添加することにより調製された。ＰＮＰ基質は、１００μＬ／ウェルでアッセイプレートに添加された。プレートは、数分間（最大で３０分）、３７℃でインキュベートされて、色の発生を許し、その後３ＭのＮａＯＨの添加により該反応が停止された。色の強度は、４０５ｎｍで、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｒａｄ、モデル５５０）を用いて測定された。
【０１６０】
結果
多くの独立の実験群において、連続的に希釈されたｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２（Ｉ２９Ｌ変異体）が、固定化されたＣＤ４０−Ｆｃに比較できる程度に結合されたことが分かり（図１４）、他方、抗ＣＤ８６対照抗体は、ＣＤ４０−Ｆｃへの目に見えるほどの結合性を示さなかった。全ての実験についての、計算された最大の半分が結合する濃度が、表１３に集約されている。評価された抗ＣＤ４０抗体バッチのいずれについても、該最大の半分が結合する濃度において有意な差は観察されなかった。
【実施例７】
【０１６１】
ＦＡＣＳにより測定された、ＪＹ細胞上に発現されたｈｕＣＤ４０へのｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２の結合性
【０１６２】
材料と方法
ＣＤ４０発現性ＪＹ細胞が、ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ、１％ＢＳＡ及び０．０５％アジ化ナトリウム）により洗浄された。上清が廃棄され、そして、ＪＹ細胞が２×１０６細胞／ｍＬの濃度へとＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁された。その後、５０μＬのＪＹ細胞懸濁物が、濃度範囲０〜９００ｎｇ／ｍＬで調製された試験抗体（ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）、ＰＧ１０２及び負の対照のキメラ抗ｈｕＣＤ８６抗体ｃｈＦＵＮ−１）の夫々の５０μＬに添加され、そして、３０分間４℃でインキュベートされた。細胞は、４ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液／チューブにより洗浄され、そして上清が廃棄された。細胞ペレットは、ＦＡＣＳ緩衝液中で１：１００に希釈されたヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ．カタログナンバー１０９−０９５−１２７）の１００μＬ中に再懸濁された。細胞は、４ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液により洗浄され、そして、上清が廃棄された。ペレットは、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁され、そして、結合した抗体は、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて測定された。
【０１６３】
結果
ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２の全ての試験されたバッチは、比較できる最大の半分の抗体が結合する濃度（表１４）で、ＪＹ細胞上に発現されたＣＤ４０へと結合することの同様の特性（表１５）を示した。ｃｈＦＵＮ−１もまた、ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２より低い平均蛍光強度（ＭＦＩ）であるが、ＪＹ細胞に結合した。これは、ＪＹ細胞もヒトＣＤ８６を発現するからである。
【０１６４】
考察
種々のＰＧ１０２（Ｉ２９Ｌ変異体）及びｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）のバッチのＣＤ４０結合性特性は、インビトロでの細胞性及びＥＬＩＳＡに基づくアッセイを用いて測定された。ＣＤ４０を発現するＪＹ細胞への、ＰＧ１０２及びｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）の結合性は、抗イディオタイプｍＡｂ１７３−３６−１により等しい力価で抑制された。すなわち、ＰＧ１０２及びＣＨ５Ｄ１２（ＰＧ１００）のバッチについての計算された平均−ｌｏｇＩＣ５０値の範囲は夫々、５．５１〜６．１１（ｎ＝８）及び５．４３〜６．０４（ｎ＝１０）であった（ｐ＞０．０５）。抗体１７３−３６−１は、マウスｍＡｂ  ５Ｄ１２であるｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）前駆体の可変領域に対して向けられ、そして、抗ＣＤ８６アイソタイプ対照抗体の結合性を抑制しなかった。さらなる実験において、ＰＧ１０２及びｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）の最大の半分が結合する濃度が、ヒトＣＤ４０−Ｆｃへと結合する抗体のＥＬＩＳＡ分析により及びＪＹ細胞への結合性のＦＡＣＳ分析により、測定された。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、試験されたいずれのバッチについても、ＰＧ１０２及びｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）の最大の半分が結合する濃度の間で有意な差はなかった。例えば、ＰＧ１０２及びｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）のバッチについての、計算された平均−ｌｏｇ最大の半分が結合する濃度は夫々、７．４７±０．０４及び７．５４±０．０３であり（Ｐ＞０．０５、両方ともｎ＝４）、約３０ｎｇ／ｍｌに対応した。同様の最大の半分が結合する濃度が、ＪＹ細胞上に発現されるＣＤ４０へと結合するＰＧ１０２及びｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）のＦＡＣＳ実験において観察された。これらの結果は、ＰＧ１０２及びｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）が、ＣＤ４０へと結合するＰＧ１０２及びｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）の抑制の為の抗イディオタイプ抗体の比較できる力価特性により実証されるとおり、同じＣＤ４０結合性パラトープを共有することを示す。さらに、両方の抗体とも、ＥＬＩＳＡ及び細胞に基づくアッセイにおいて、ヒトＣＤ４０への結合性についての、同様のインビトロ力価を示す。あわせて、提示されたデータは、ヒトＣＤ４０へのＰＧ１０２及びｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）の結合性特性が同じであることを示唆する。
【実施例８】
【０１６５】
ラベル化されていない抗ＣＤ４０抗体を用いた、ヒトＣＤ４０を発現するＪＹ細胞へ結合するｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）−ＰＥ及びＰＧ１０２−ＰＥの競合的抑制
【０１６６】
材料と方法
ＪＹ細胞（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルスにより形質転換されたヒトＢリンパ芽球様細胞株）が、１０％の熱不活性化胎児仔ウシ血清（foetal  calf  serum、ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン及び５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを有するＩｓｃｏｖｅの修正Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）中で、５％のＣＯ２を有する空気加湿された雰囲気中で３７℃で、増殖された。細胞は、フローサイトメトリー測定の日に回収された。ラベル化されていないｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）（バッチ４）及びＰＧ１０２（バッチ２）抗体が、これらの実験において用いられた。両方の抗体は、フローサイトメトリーによるＪＹ細胞への結合性の直接の測定の為に、ＰＥ−ラベル化形態でも用いられた。抗体は、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ（オックスフォード、英国）によってＰＥを注文でラベル化された。夫々のＦＡＣＳ分析について、以下のプロトコルが用いられた。ＪＹ細胞は、細胞培養物から回収され、そして計数された。次に、１×１０５ＣＤ４０発現性ＪＹ細胞／２００μＬインキュベーション緩衝液（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％アジ化ナトリウム）が、１μｇ／ｍＬのラベル化ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）又はＰＧ１０２抗体と一緒に、種々の濃度（０〜１０μｇ／ｍＬ）のラベル化されていない競合するｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）又はＰＧ１０２の存在下で、３０分間４〜８℃で、インキュベートされた。細胞は洗浄され、全ての濃度でのＭＦＩがＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ＆Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて測定されたフローサイトメトリー分析が続いた。５０００イベント／試料が測定され、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）ソフトウェアを用いて分析された（Ｂｅｃｔｏｎ＆Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。
【０１６７】
結果
ラベル化されていないｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２抗体は、これらのアッセイにおいて同様の抑制特性を示した（図１６）。ラベル化されていないｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２による１μｇ／ｍＬ  ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）結合性の抑制についての平均−ｌｏｇＩＣ５０値は夫々、７．５０±０．０３及び７．６３±０．０３であり（両方ともｎ＝４）、一方で、ラベル化されていないｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２による１μｇ／ｍｌ  ＰＧ１０２結合性の抑制についての平均−ｌｏｇＩＣ５０値は夫々、７．５４±０．０１及び７．６５±０．０２であった（両方ともｎ＝４）。これらの−ｌｏｇＩＣ５０値は、約２０〜３０ｎｇ／ｍＬ（すなわち、〜１３０〜２００ｐＭ）のＰＧ１０２濃度及びｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）濃度に相当する。
【実施例９】
【０１６８】
ＴＨＰ−１細胞からのＩＬ−８放出の抑制
【０１６９】
材料と方法
ＰＧ１０２の機能性が、細胞に基づく機能的バイオアッセイを用いて測定された。簡潔にいうと、１日目で、ＴＨＰ−１及びジャーカット３９．８／５０ヒト細胞が、Ｉｓｃｏｖｅの修正Ｄｕｌｂｅｃｃｏｎｏ培地（ＩＭＤＭ、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、カタログナンバーＢＥ１２−７２２Ｆ、１０％胎児仔ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ、ｒｅｆ１０２７０−１０６）及び５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログナンバー１５７５０−０４５）を補われた）中で培養された。ＴＨＰ−１細胞は、ｒｈｕＩＦＮ−Υにより、１０００ユニット／細胞培養物のｍＬでパルスされた。
バイオアッセイの３日目で、４×１０５細胞／ｍＬの濃度で、ＴＨＰ−１及びジャーカット３９．８／５０細胞が要求された。ＴＨＰ−１及びＪ３９．８／５０細胞が計数され、そして、それらの生存率が測定された。細胞は次に、約１×１０６細胞／ｍＬの濃度へ希釈され、細胞懸濁物は１：１で混合され、そして、３７℃で、湿潤された５％ＣＯ２雰囲気中で、４８時間インキュベートされた。
【０１７０】
３日目で、ＴＨＰ−１及びＪ３９．８／５０細胞は、以下のとおりに洗浄された（ＴＨＰ−１細胞の場合、洗浄ステップはＩＦＮ−Υを除く為であった）：５ｍＬのＩＦＮ−ΥによりパルスされたＴＨＰ−１及びＪ３９．８／５０細胞懸濁物が、５０ｍＬファルコンチューブへ移された。４０ｍＬのＨａｎｋのＢａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）が添加され、そして、細胞が、（ＩＥＣ遠心機を用いて）１５００ｒｐｍで６分間遠心された。上清が廃棄された。細胞ペレットが、１０％ＦＣＳを補われた、予め温められたＩＭＤＭ中に再懸濁された。ＴＨＰ−１細胞及びＪ３９．８／５０細胞は、４×１０５細胞／ｍＬの濃度に調節された。
【０１７１】
抑制アッセイのために、試験試料ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）又はＰＧ１０２（Ｉ２９Ｌ変異体）は、１０％胎児ウシ血清を補われた、温められたＩＭＤＭ培地中に逐次に希釈されて、範囲０〜１６０ｎｇ／ｍＬの最終アッセイ濃度を得た。ＴＨＰ−１、Ｊ３９．８／５０及び試験試料は、３通りに、丸底細胞培養プレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標））へ以下の指令において添加された：５０μＬのＴＨＰ−１細胞（ウェル当たり２×１０４細胞と同等）、５０μＬの試験試料及び５０μＬのＪ３９．８／５０細胞。全部の量は、ウェル当たり１５０μｌであった。細胞培養プレートは、多孔性の食品包装ラップ（cling  film）中にラップされ、そして、３７℃で、湿潤された５％ＣＯ２雰囲気中で４８時間インキュベートされた。
【０１７２】
５日目で、４８時間の培養期間後、７０μＬの細胞培養物上清が吸引され、丸底マイクロタイタープレートに移された。該回収された細胞培養上清は、市販のＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、ヒトＩＬ−８サイトセット（cytoset）、カタログナンバーＣＨＣ１３０４）を用いて製造者の指示に従い、ＩＬ−８含有量について分析された。
【０１７３】
結果
ＰＧ１０２（Ｉ２９ｌ変異体）及びｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）は、ＴＨＰ−１細胞により誘起されたＩＬ−８放出に対して同様の抑制効果を示した（図１７）。２の抗体について計算された−ｌｏｇＩＣ５０値は夫々、８．４２及び８．２８であった。これらの値は、約３０ｐＭのＩＣ５０濃度に相当する。
【実施例１０】
【０１７４】
ヒト及びカニクイザルの組織に対する前の組織交差反応性研究は、ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）が、リンパ系器官中のＢ細胞及びＤＣの細胞表面に結合することを示した。ヒト又はカニクイザルの組織のいずれについても、予期されない交差反応性は観察されなかった。この研究は、ＰＧ１０２について繰り返され、そして、同様の結果が得られ（データは示されていない）、ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２が、同様の様式で種々の組織切片に結合することを示唆した。
【０１７５】
ｃｈ５Ｄ１２についての前の安全性及び忍容性評価も、カニクイザルにおいて実施され、このなかで、４週間のｃｈ５Ｄ１２の週毎の投与が、全てのサルにおいて安全であり且つ何らの副作用を有さないことが示された。この研究において、ｃｈ５Ｄ１２がＢ細胞活性化及び増殖を防ぐことができることの機能的な証拠が得られた２７。安全性治験は、より長期のプロトコルを用いてＰＧ１０２について繰り返された。簡潔に言うと、３の用量水準（０、２５及び１００ｍｇ／ｋｇ、静脈内注入）および２６のサル（処置集団当たり６のサル（３Ｍ、３Ｆ）、加えて夫々の活性な処置治療群における回復集団として４のサル（２Ｍ、２Ｆ）を用いた、カニクイザルにおける、１４週の回復期間を有する、１３週の静脈内毒性試験が設計された。以下の測定がなされた：ＴＫ、抗ＰＧ１０２応答、フローサイトメトリー（ＰＢＭＣのＣＤ４０コーティングを含む）、リンパ節バイオプシーおよび、血液学及び免疫組織化学などの標準毒性学評価。
この研究の結果は、試験された用量水準のいずれについても、観察された毒性はないことを実証した。ＰＧ１０２は安全であり且つ忍容性が良好であった。
【０１７６】
まとめると、これらの研究は、アンタゴニスト抗ヒトＣＤ４０  Ｍａｂ  ＰＧ１０２は、その親抗体ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）のように、予期されない交差反応性を有さず、且つ、インビボで安全であり且つ忍容性が良好である。
【０１７７】
表１
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【０１７８】
表２
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【０１７９】
表３
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【０１８０】
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変異原性オリゴヌクレオチド。アミノ酸位置５、１３、１６、１７、２９、３７、４５、４８、６０、６８、７９及び１０８での変異を導入する為に用いられたオリゴヌクレオチド。夫々の位置について、センス及びアンチセンス（“ｒｅｖ”）オリゴヌクレオチドが必要である。
【０１８１】
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ＦＡＣＳ及び定量的ＥＬＩＳＡにより測定されたときの全体像発現データ。ｃｈ５Ｄ１２及びＤＩ５Ｄ１２と一緒の夫々の５Ｄ１２変異体（Ｑ５Ｅ、Ｋ１３Ａ、Ｅ１６Ｑ、Ｔ１７Ｓ、Ｉ２９Ｌ、Ｉ３７Ｖ、Ｐ４５Ｌ、Ｍ４８Ｌ、ＳＴＳ６０ＮＳＡ，Ｔ６８Ｓ、Ｓ７９Ｆ、及びＴ１０８Ｓ）について、ＭＦＩ値（ＦＡＣＳより測定されたときの）、及び、回収された上清中の抗体濃度（ＥＬＩＺＡにより測定されたときの）が示される。ニセの形質移入物及び培地対照についてもＭＦＩ値が示される。比は、ｃｈ５Ｄ１２値（１００％として表される）と比較したＥＬＩＳＡデータを用いて計算される。
【０１８２】
表６：変異原性オリゴヌクレオチド。アミノ酸位置２９及び３７での変異を導入する為に用いられたオリゴヌクレオチド。センス及びアンチセンス（ｒｅｖ）オリゴヌクレオチドが表にされる。
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【０１８３】
表７：２の変異誘発ラウンドが要求される二重変異の作成。以下で、追加のＤＩ５Ｄ１２変異体に達する為に、どのプライマーセットがステップ１及びステップ２において夫々用いられたかが表にされる。
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【０１８４】
表８．定量的ＥＬＩＳＡにより測定されたときの発現データ。夫々の追加の５Ｄ１２変異体（２９Ｉ−３７Ｖ、２９Ｖ−３７Ｉ、２９Ｉ−３７Ｌ、２９Ｖ−３７Ｖ、２９Ｌ−３７Ｌ、２９Ｖ−３７Ｌ及び２９Ｌ−３７Ｖ）について、ｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）、ＤＩ５Ｄ１２及びＰＧ１０２（Ｉ２９Ｌ変異体）と一緒に、回収された上清中の抗体濃度が示される。
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【０１８５】
表９
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【０１８６】
表１０
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【０１８７】
表１１
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【０１８８】
表１２
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表１２：ＪＹ細胞へ結合するｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２の、抗イディオタイプ媒介の抑制についての、計算された−ｌｏｇＩＣ５０の概要。データは、平均±標準誤差を示す。ｎ回測定の平均。試験された抗体バッチのいずれによっても、抗イディオタイプの抑制力価において有意差はなかった（ｐ＞０．０５、ＡＮＯＶＡに続き多重比較の為のテューキー検定が続く）。
【０１８９】
表１３
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表１３：ＥＬＩＳＡにより測定されたときの、ヒトＣＤ４０−Ｆｃに結合するｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２についての、計算された−ｌｏｇ最大の半分が結合する濃度の概略。データは、平均±標準誤差を示す。ｎ回測定の平均。試験されたいずれの抗体バッチの結合性において有意差は無かった（ｐ＞０．０５、ＡＮＯＶＡに続き多重比較の為のテューキー検定が続く）。参考のために、７．４５の−ｌｏｇ最大の半分が結合する濃度は、約３５ｎｇ／ｍｌ（〜２００ｐｍｏｌ）の濃度に相当する。
【０１９０】
表１４
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表１４：ＥＬＩＳＡにより測定されたときの、ヒトＣＤ４０を発現するＪＹ細胞へ結合するｃｈ５Ｄ１２（ＰＧ１００）及びＰＧ１０２についての、計算された−ｌｏｇ最大の半分が結合する濃度の概略。データは、二重測定の平均を示す。参考のために、７．４５の−ｌｏｇ最大の半分が結合する濃度は、３５ｎｇ／ｍｌ（〜２００ｐｍｏｌ）の濃度に相当する。
【０１９１】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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