(57)【要約】  本発明は、ペプチド及び結合体が、Ｔ細胞媒介炎症性疾患の予防及び治療に効果がある、Ｔ細胞受容体アルファ膜貫通領域由来のジアステレオマーペプチド、及びこの親油性結合体を提供する。本発明は、これらのジアステレオマーペプチド及び結合体を含む医薬組成物、並びに炎症性疾患、自己免疫及び移植片拒絶反応を治療するためのこの使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２個の塩基性アミノ酸残基を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖膜貫通領域由来のジアステレオマーペプチド。
【請求項２】
ジアステレオマーペプチドの少なくとも２個のアミノ酸残基が、Ｄ−異性体立体配置である、請求項１のジアステレオマーペプチド。
【請求項３】
２個の塩基性アミノ酸残基が、３〜５個の疎水性アミノ酸残基により隔てられる、請求項１のジアステレオマーペプチド。
【請求項４】
２個の塩基性アミノ酸残基が、４個の疎水性アミノ酸残基により隔てられる、請求項３のジアステレオマーペプチド。
【請求項５】
５〜５０アミノ酸残基長である、請求項１のジアステレオマーペプチド。
【請求項６】
ＴＣＲ膜貫通領域が、配列番号４〜９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１のジアステレオマーペプチド。
【請求項７】
ＴＣＲ膜貫通領域が、マウスＴＣＲ由来である、請求項１のジアステレオマーペプチド。
【請求項８】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、少なくとも１個のアミノ酸残基が、Ｄ−異性体立体配置、並びにこの誘導体、フラグメント、類似体、伸長物、結合体及び塩である、請求項７のジアステレオマーペプチド。
【請求項９】
ジアステレオマーペプチドが、アミノ酸配列
【化１】
2009508937.tif 000019
を有し、３位及び８位の下線付きのアミノ酸配列が、「Ｄ」異性体立体配置である（配列番号２）、請求項８のジアステレオマーペプチド。
【請求項１０】
ＴＣＲ膜貫通領域が、ヒトＴＣＲ由来である、請求項１のジアステレオマーペプチド。
【請求項１１】
配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１０のジアステレオマーペプチド。
【請求項１２】
配列番号１２〜１７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、請求項１のジアステレオマーペプチド。
【請求項１３】
配列番号１９〜２８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、請求項１のジアステレオマーペプチド。
【請求項１４】
配列番号３７〜４７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、請求項１のジアステレオマーペプチド。
【請求項１５】
親油性部分に結合している、請求項１のジアステレオマーペプチド。
【請求項１６】
親油性部分が、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、単不飽和脂肪酸、多価不飽和脂肪酸及び分岐脂肪酸からなる群から選択される脂肪酸である、請求項１５のジアステレオマーペプチド。
【請求項１７】
脂肪酸が、少なくとも３個の炭素原子からなる、請求項１６のジアステレオマーペプチド。
【請求項１８】
脂肪酸が、オクタン酸（ＯＡ）、デカン酸（ＤＡ）、ウンデカン酸（ＵＡ）、ドデカン酸（ＤＤＡ；ラウリン酸）、ミリスチン酸（ＭＡ）、パルミチン酸（ＰＡ）、ステアリン酸、アラキジン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、トランス−ヘキサデカン酸、エライジン酸、ラクトバシル酸、ツベルクロステアリン酸、及びセレブロン酸からなる群から選択される、請求項１６のジアステレオマーペプチド。
【請求項１９】
配列番号２９〜３６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、請求項１５のジアステレオマーペプチド。
【請求項２０】
配列番号４８〜５０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、請求項１５のジアステレオマーペプチド。
【請求項２１】
少なくとも２個の塩基性アミノ酸残基を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖膜貫通領域由来のペプチドであって、前記ペプチドのアミノ酸残基が全て「Ｄ」異性体立体配置であるペプチド。
【請求項２２】
１〜９位の下線付きのアミノ酸残基が、「Ｄ」異性体立体配置である、
【化２】
2009508937.tif 000020
（配列番号３）及び
【化３】
2009508937.tif 000021
（配列番号１１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項２３】
親油性部分に結合している、請求項２１のペプチド。
【請求項２４】
活性成分である請求項１から２３のいずれか一項に記載のペプチド、及び薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項２５】
Ｔ細胞媒介病態の治療を必要とする被験者におけるＴ細胞媒介病態の治療方法であって、被験者に、少なくとも２個の塩基性アミノ酸残基を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖膜貫通領域由来のジアステレオマーペプチドの治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項２６】
ジアステレオマーペプチドの少なくとも２個のアミノ酸残基が、Ｄ−異性体立体配置である、請求項２５の方法。
【請求項２７】
ペプチドが、５〜５０アミノ酸残基長である、請求項２５の方法。
【請求項２８】
ペプチドが、Ｄ−異性体立体配置の少なくとも１個のアミノ酸残基、並びにこの誘導体、フラグメント、類似体、伸長物、結合体及び塩を有する配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２５の方法。
【請求項２９】
前記ジアステレオマーペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、請求項２８の方法。
【請求項３０】
前記ジアステレオマーペプチドが、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、並びにこの誘導体、フラグメント、類似体、伸長物、結合体及び塩を有する、請求項２５の方法。
【請求項３１】
ペプチドが、配列番号１２〜１７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、請求項２８の方法。
【請求項３２】
ペプチドが、配列番号１９〜２８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、請求項２８の方法。
【請求項３３】
ペプチドが、配列番号３７〜４７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、請求項２８の方法。
【請求項３４】
ジアステレオマーペプチドが、親油性部分に結合している、請求項２５の方法。
【請求項３５】
親油性部分が、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、単不飽和脂肪酸、多価不飽和脂肪酸及び分岐脂肪酸からなる群から選択される脂肪酸である、請求項３４の方法。
【請求項３６】
脂肪酸が、オクタン酸（ＯＡ）、デカン酸（ＤＡ）、ウンデカン酸（ＵＡ）、ドデカン酸（ＤＤＡ；ラウリン酸）、ミリスチン酸（ＭＡ）、パルミチン酸（ＰＡ）、ステアリン酸、アラキジン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、トランス−ヘキサデカン酸、エライジン酸、ラクトバシル酸、ツベルクロステアリン酸、及びセレブロン酸からなる群から選択される、請求項３５の方法。
【請求項３７】
ペプチドが、配列番号２９〜３６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、請求項３５の方法。
【請求項３８】
ペプチドが、配列番号４８〜５０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、請求項３５の方法。
【請求項３９】
Ｔ細胞媒介病態が、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患である、請求項２５の方法。
【請求項４０】
自己免疫疾患が、多発性硬化症、自己免疫性神経炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬、Ｉ型糖尿病（ＩＤＤＭ）、シェーグレン病、甲状腺疾患、重症筋無力症、サルコイドーシス、自己免疫性ブドウ膜炎、炎症性腸疾患（クローン大腸炎及び潰瘍性大腸炎）、自己免疫性肝炎、関節リウマチ、特発性血小板減少症、強皮症、円形脱毛症、溶血性貧血、糸球体腎炎、皮膚炎及び天疱瘡からなる群から選択される、請求項２５の方法。
【請求項４１】
自己免疫疾患が、関節リウマチである、請求項３９の方法。
【請求項４２】
Ｔ細胞媒介病態が、Ｔ細胞媒介炎症性疾患である、請求項２５の方法。
【請求項４３】
Ｔ細胞媒介病態が、同種移植片反応及び移植片対宿主疾患からなる群から選択される、請求項２５の方法。
【請求項４４】
Ｔ細胞活性化の阻害を必要とする被験者におけるＴ細胞活性化の阻害方法であって、被験者に、少なくとも２個の塩基性アミノ酸残基を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖膜貫通領域由来のジアステレオマーペプチドの治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項４５】
ジアステレオマーペプチドの少なくとも２個のアミノ酸残基が、Ｄ−異性体立体配置である、請求項４４の方法。
【請求項４６】
ペプチドが、５〜５０アミノ酸残基長である、請求項４４の方法。
【請求項４７】
ペプチドが、Ｄ−異性体立体配置の少なくとも１個のアミノ酸残基、並びにこの誘導体、フラグメント、類似体、伸長物、結合体及び塩を有する配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４４の方法。
【請求項４８】
前記ジアステレオマーペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、請求項４４の方法。
【請求項４９】
前記ジアステレオマーペプチドが、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、並びにこの誘導体、フラグメント、類似体、伸長物、結合体及び塩を有する、請求項４４の方法。
【請求項５０】
ペプチドが、配列番号１２〜１７、１９〜２８及び３７〜４７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、請求項４４の方法。
【請求項５１】
ジアステレオマーペプチドが、親油性部分に結合している、請求項４４の方法。
【請求項５２】
親油性部分が、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、単不飽和脂肪酸、多価不飽和脂肪酸及び分岐脂肪酸からなる群から選択される脂肪酸である、請求項５１の方法。
【請求項５３】
ペプチドが、配列番号２９〜３６及び４８〜５０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、請求項５２の方法。
【請求項５４】
Ｔ細胞媒介病態の治療及びＴ細胞活性化の阻害を必要とする被験者におけるＴ細胞媒介病態の治療及びＴ細胞活性化の阻害方法であって、被験者に、請求項２０及び２１のいずれか一項に記載のペプチド又はこの親油性結合体の治療有効量を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＣＲα膜貫通領域由来のジアステレオマーペプチド及びこの親油性結合体、これらを含む医薬組成物、並びにＴ細胞媒介炎症性疾患、自己免疫及び移植片拒絶反応を治療するためのこの使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔリンパ球（Ｔ細胞）は、免疫応答に関与する種々の異なる細胞型の１つである。正常な免疫系は厳密に制御されている一方、免疫応答の異常は珍しいことではない。不適切なＴ細胞応答が疾患の１つの構成要素となる、数多くのＴ細胞媒介炎症性疾患が知られている。これらには、Ｔ細胞に直接媒介される疾患、及び不適切なＴ細胞応答が、異常抗体の産生に寄与する疾患の両方が含まれる。
【０００３】
幾つかの例では、免疫系は不適切に機能し、宿主の構成要素に対し、実際、これが異物であるかのように応答する。このような応答は、宿主免疫系が宿主自身の組織を攻撃する、自己免疫疾患をもたらす。免疫系の主要な制御因子であるＴ細胞は、このような自己免疫病態に直接的又は間接的に影響する。Ｔ細胞はまた、臓器移植拒絶反応又は骨髄（造血幹細胞）移植による移植片対宿主疾患において重要な役割を果たす。したがって、こうした免疫応答を制御することが、治療上望ましい。
【０００４】
Ｔ細胞の活性は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と関連してＴ細胞に提示される抗原により制御される。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、次いで、ＭＨＣ−抗原複合体に結合する。抗原がＭＨＣと複合体を形成すると、ＭＨＣ−抗原複合体は、Ｔ細胞上の特定のＴＣＲにより結合されるため、このＴ細胞の活性を変化させる。故に、ＣＤ３／ＴＣＲは、免疫修飾の魅力的な標的である。
【０００５】
大多数の成熟Ｔ細胞のＣＤ３／Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体は、ＣＤ３のγ、δ、ε及びζ鎖に結合したＴＣＲαβヘテロ二量体である。この複合体は、ＴＣＲ鎖の膜貫通領域とＣＤ３サブユニットとの相互作用により安定化される。ＴＣＲと、主要組織適合性複合体分子（ＭＨＣ）により提示されたペプチドとの相互作用は、ＣＤ３リン酸化を誘発する、ＴＣＲのコンフォメーション変化を誘導する。
【０００６】
コアペプチド（ＣＰ）として示される、ＴＣＲα鎖膜貫通領域由来の９つのアミノ酸（ａａ）ペプチドは、インビトロ及びインビボでのＴ細胞の抗原特異的活性化を阻害する（Ｍａｎｏｌｉｏｓ等、１９９７年）。ＣＰペプチドは、ＴＣＲ分子との共局在化によりＴ細胞の抗原特異的活性化を阻害することで、ＴＣＲ−ＣＤ３複合体の適切な会合を阻害すると想定された（Ｇｅｒｂｅｒ等、２００５年；Ｍａｎｏｌｉｏｓ等、１９９７年；Ｗａｎｇ等、２００２年；Ｗａｎｇ等、２００２年ｂ；Ｂｅｎｄｅｒ等、２００４年）。この相互作用は、ＣＰの二次構造及びこれの２つの陽性残基の側鎖に依存すると考えられている。なぜなら、グリシンによるこれらの置換又は負に帯電したａａによる置換は、ペプチド活性を消失させるためである（Ｍａｎｏｌｉｏｓ等、１９９７年；Ｂｅｎｄｅｒ等、２００４年）。本発明者は、最近、鏡像ペプチド（全Ｄ  ＣＰ）が、野生型（全Ｌ  ＣＰ）と同程度にＴＣＲと会合することができることを立証した（Ｇｅｒｂｅｒ等、２００５年）。本発明者は、これは、螺旋キラリティーの変化に適応するため膜内で生じる全Ｄ  ＣＰの構造的再配向によるものであり、これがＬ分子との相互作用を可能にすると仮定した。
【０００７】
Ｔ細胞受容体ペプチドを免疫関連疾患の治療法に使用することが、幾つか開示されている。例えば、米国特許第５，６１４，１９２号は、Ｔ細胞媒介疾患の重症度を減少させることができるペプチドを開示する。該ペプチドは、こうしたＴ細胞媒介疾患に特徴的なＴ細胞受容体の第２の相補性決定領域の少なくとも一部を含むアミノ酸配列を有する。
【０００８】
ＷＯ９４／１９４７０は、サプレッサーＴ細胞により産生される可溶性Ｔ細胞受容体α鎖の予防又は治療有効量を含む、自己免疫疾患を治療するための予防及び治療組成物を開示する。
【０００９】
ＷＯ９７／４３４１１は、Ｔ細胞受容体α鎖定常領域の実質的部分又は全部を含有するポリペプチドを開示する。該ポリペプチドは、免疫抑制効果を有するが、投与してもこれ自体に対する抗体産生の実質的原因にならない。この出願は、該ポリペプチドをコードするＤＮＡのほか、活性成分としてこれらのポリペプチドを含有する医薬組成物を開示する。
【００１０】
ＵＳ６，０５７，２９４は、恐らくＴ細胞抗原受容体での作用により、Ｔ細胞に影響するペプチドであって、これらのペプチドの使用を含む、炎症性疾患状態及び免疫疾患状態の治療に有用なペプチドを開示する。該ペプチドは、以下の式である：Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ（Ａは、欠如しているか又は１個若しくは２個の疎水性アミノ酸であり、Ｂは、正に帯電した１個のアミノ酸であり、Ｃは、３〜５個の疎水性アミノ酸からなる１個のペプチドであり、Ｄは、正に帯電した１個のアミノ酸であり、Ｅは、欠如しているか又は最大８個の疎水性アミノ酸である）。‘２９４特許は、Ｄ−異性体アミノ酸を有するペプチドの使用を開示又は示唆しない。
【００１１】
Ｍａｎｏｌｉｏｓ等（１９９７年）は、トリスリンカーを介した、カルボキシル末端でのＣＰのパルミチン酸との結合を記載する。これは、インビトロでのＴ細胞のインターロイキン−２（ＩＬ−２）産生を、ペプチド単独よりも大幅に阻害する結果となった。
【００１２】
激しく乱された二次構造を有するＣＰ由来ペプチドが、この免疫抑制活性を保持できることを開示又は示唆する背景技術はない。背景技術は、ＣＰ由来ジアステレオマーペプチドに結合した脂肪酸を含む親油性結合体の産生及び使用を開示又は示唆しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
Ｔ細胞媒介の炎症性疾患又は免疫疾患を治療又は改善する、及びＴ細胞媒介病態を改善する有効な手段が、長年切望されている。患者における免疫応答を制御するべく使用される従来の試薬及び方法は、望ましくない副作用ももたらし、効果も限られる。例えば、自己免疫疾患患者の治療に使用される免疫抑制試薬（例えば、シクロスポリンＡ、アザチオプリン、及びプレドニゾン）は、患者の全ての免疫応答も抑制するため、感染リスクを増加させ、非リンパ組織に対する有害な副作用の原因になりうる。さらに、疾患が進行し続ける間に、通常は疾患の症状のみが治療されうるため、重度の衰弱又は死をもたらす場合が多い。したがって、このような治療は理想的には、単に症状を低減するのではなく、不適切なＴ細胞応答を制御すべきである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）膜貫通領域（ＴＭ）由来のジアステレオマーペプチド及びリポペプチド、これらを含む医薬組成物、並びにＴ細胞媒介炎症性疾患、自己免疫及び移植片拒絶反応を治療するためのこの使用を提供する。
【００１５】
意外にも、コアペプチド（ＣＰ）として示される、ＴＣＲαＴＭ由来の既知ペプチドの二次構造の破壊は、ペプチドの免疫抑制活性を消失させないことが、今回初めて開示される。本発明は、Ｄ及びＬアミノ酸の両方を組み込むジアステレオマーＣＰ（この結果得られるペプチドは、場合により脂肪酸に結合する可能性がある）は、意外にも、天然ＣＰに比べ、ペプチドに優れた免疫抑制活性を付与できることを初めて開示する。
【００１６】
本発明は、ＴＣＲαＴＭのフラグメントに基づくアミノ酸配列を有する、ジアステレオマーペプチド、この誘導体及び結合体を提供する。１つの実施形態では、フラグメントは、本明細書ではＣＰとして示される、マウス由来ＴＣＲαＴＭ由来のペプチドであり、アミノ酸配列ＧＬＲＩＬＬＬＫＶ（配列番号１）を有する。他の実施形態では、ペプチドは、他の種、例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類及び両生類のＴＣＲαＴＭ由来である。配列番号４〜９として示される、選択された種のＴＣＲαＴＭフラグメントの相同な特定の非限定例は、以下の表１に示される。
【００１７】
第１の態様によれば、少なくとも２個の塩基性アミノ酸残基を含むＴＣＲアルファ鎖膜貫通領域由来のジアステレオマーペプチドが提供される。
【００１８】
用語「ジアステレオマーペプチド」は、Ｄ−アミノ酸残基及びＬ−アミノ酸残基の両方を有するペプチドを意味する。Ｄ−アミノ酸残基の位置は、Ｔ細胞活性化においてペプチドの阻害活性が保持される限り、変わりうる。ある特定の実施形態では、ペプチドは、少なくとも２個のＤ−アミノ酸残基を含む。
【００１９】
１つの実施形態では、ペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸残基が、Ｄ−異性体立体配置である、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む。
【００２０】
別の実施形態では、ジアステレオマーペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列（Ｄ−アミノ酸残基は、太字で下線付きである）：
【化１】
2009508937.tif 000002
を有する２Ｄ−ＣＰである。
【００２１】
本発明の種々の実施形態によれば、ＣＰ並びにこの相同体のジアステレオマーなペプチド誘導体、フラグメント、類似体、伸長物、結合体及び塩が提供される。前記ペプチドは、少なくとも２個の塩基性アミノ酸残基を含み、未知のタンパク質又はペプチドである。ある実施形態では、２個の塩基性アミノ酸残基は、３〜５個の疎水性（非極性）アミノ酸残基により隔てられてよい。ある特定の実施形態では、２個の塩基性アミノ酸残基は、４個の疎水性アミノ酸残基により隔てられる。こうしたＣＰ由来ジアステレオマーペプチドの特定の非限定例のアミノ酸配列は、以下の表２に示されている。
【００２２】
本発明によるペプチド、この誘導体、フラグメント、類似体、伸長物及び塩は、好ましくは、５〜５０アミノ酸長であり、より好ましくは、５〜３０アミノ酸長であり、及び最も好ましくは、７〜１５アミノ酸長である。
【００２３】
別の特定の実施形態では、前記ジアステレオマーペプチドは、ヒトＴＣＲαＴＭ由来である。ある他の特定の実施形態では、前記ペプチドは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列（
【化２】
2009508937.tif 000003
Ｄ−アミノ酸残基は、太字で下線付きである）又はこの誘導体、フラグメント、類似体、伸長物、結合体及び塩を有する。
【００２４】
特定の他の実施形態によれば、ジアステレオマーペプチドは、以下の表２に記載された配列番号１２〜１７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する。他の特定の実施形態では、ジアステレオマーペプチドは、配列番号１９〜２８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する。さらに別の特定の実施形態では、ジアステレオマーペプチドは、配列番号３７〜４７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＣＰ類似体又は誘導体である（表２参照）。
【００２５】
別の実施形態では、ジアステレオマーペプチドは、親油性部分に結合している。
【００２６】
本発明の１つの実施形態によれば、親油性部分は、脂肪酸である。１つの実施形態では、脂肪酸は、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、単不飽和脂肪酸、多価不飽和脂肪酸及び分岐脂肪酸からなる群から選択される。現在好ましい実施形態によれば、脂肪酸は、少なくとも３個、好ましくは少なくとも６個、及びより好ましくは少なくとも８個の炭素原子からなる。本発明のペプチドに結合することができる脂肪酸の例には、オクタン酸（ＯＡ）、デカン酸（ＤＡ）、ウンデカン酸（ＵＡ）、ドデカン酸（ＤＤＡ；ラウリン酸）、ミリスチン酸（ＭＡ）、パルミチン酸（ＰＡ）、ステアリン酸、アラキジン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、トランス−ヘキサデカン酸、エライジン酸、ラクトバシル酸、ツベルクロステアリン酸、及びセレブロン酸が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、脂肪酸は、オクタン酸である。特定の他の現在好ましい実施形態によれば、脂肪酸は、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、ミリスチン酸、及びパルミチン酸から選択される。
【００２７】
脂肪酸は、ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、又はペプチド鎖に沿った任意の他の遊離官能基、例えば、リシンのεアミノ基に結合することができる。
【００２８】
ある特定の実施形態では、ジアステレオマーペプチド親油性結合体（リポペプチド）は、以下の表２に示された、配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有する。他の特定の実施形態では、ジアステレオマーリポペプチドは、配列番号３０〜３６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する。ある他の特定の実施形態では、ジアステレオマーリポペプチドは、配列番号４８〜５０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する（表２参照）。
【００２９】
別の態様では、少なくとも２個の塩基性アミノ酸残基を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖膜貫通領域由来のペプチドであって、前記ペプチドのアミノ酸残基が全て「Ｄ」異性体立体配置であるペプチドが提供される。
【００３０】
別の態様では、本発明は、配列番号３（
【化３】
2009508937.tif 000004
、全Ｄ  ＣＰとして示されている；Ｄ−アミノ酸残基は、太字で下線付きである）及び配列番号１１（
【化４】
2009508937.tif 000005
、ヒト全Ｄ  ＣＰとして示されている；Ｄ−アミノ酸残基は、太字で下線付きである）のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するエナンチオマーペプチドを提供する。他の実施形態では、本発明は、脂肪酸に結合している配列番号３及び１１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するペプチドを含む、親油性結合体を提供する。
【００３１】
本発明のジアステレオマー及びエナンチオマーなペプチド及び結合体は、以下を含むがこれらに限定されない、多くのＴ細胞媒介病態に効果がある：多発性硬化症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、自己免疫性神経炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、Ｉ型糖尿病、シェーグレン病、甲状腺疾患、重症筋無力症、サルコイドーシス、自己免疫性ブドウ膜炎、炎症性腸疾患（クローン大腸炎及び潰瘍性大腸炎）、自己免疫性肝炎、特発性血小板減少症、強皮症、円形脱毛症、溶血性貧血、糸球体腎炎、皮膚炎及び天疱瘡、Ｔ細胞媒介炎症性疾患、アレルギー及び移植片拒絶反応。
【００３２】
別の実施形態では、本発明は、活性成分として本発明のペプチド又は結合体、及び薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００３３】
他の態様では、本発明は、Ｔ細胞媒介病態の治療又は予防を必要とする被験者におけるＴ細胞媒介病態の治療又は予防方法であって、被験者に、本発明のペプチド又は結合体の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００３４】
１つの実施形態では、Ｔ細胞媒介病態は、自己免疫疾患である。別の実施形態では、自己免疫疾患は、多発性硬化症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、自己免疫性神経炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、Ｉ型糖尿病、シェーグレン病、甲状腺疾患、重症筋無力症、サルコイドーシス、自己免疫性ブドウ膜炎、炎症性腸疾患（クローン大腸炎及び潰瘍性大腸炎）、自己免疫性肝炎、特発性血小板減少症、強皮症、円形脱毛症、溶血性貧血、糸球体腎炎、皮膚炎及び天疱瘡からなる群から選択される。特定の実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチである。
【００３５】
別の実施形態では、Ｔ細胞媒介病態は、Ｔ細胞媒介炎症性又はアレルギー性疾患である。特定の実施形態では、炎症性又はアレルギー性疾患は、遅延型過敏症である。
【００３６】
別の実施形態では、Ｔ細胞媒介病態は、移植片拒絶反応である。
【００３７】
別の態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化の阻害を必要とする被験者におけるＴ細胞活性化の阻害方法であって、被験者に、本発明のペプチド又は結合体の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明のこれら及び他の実施形態は、以下の記述、図、実施例、及び特許請求の範囲との関連においてよく理解されるであろう。
【００３９】
本発明は、ペプチド及び結合体が、Ｔ細胞媒介炎症性疾患を予防又は治療するのに効果がある、ＴＣＲα膜貫通領域コアペプチド（ＣＰ）由来のジアステレオマーペプチド、及びこの親油性結合体を提供する。本発明は、これらのジアステレオマーペプチド及び結合体を含む医薬組成物、並びに炎症性疾患、自己免疫及び移植片拒絶反応を治療するためのこの使用を提供する。
【００４０】
ジアステレオマーペプチドの使用は、当技術分野で記載されている（例えば、ＷＯ２００５／０６０３５０及びＵＳ２００４／０５３８４７参照）。
【００４１】
意外にも、ＣＰ由来のジアステレオマーペプチドは、ＣＰに導入された２つのＤ  ａａが、ＣＰの二次構造を乱すことが観察されているにもかかわらず、天然ペプチドの免疫抑制活性を保持することが今回開示される（図１）。
【００４２】
本発明は、一部には、膜に結合すると、２Ｄ−ＣＰ（配列番号２）と呼ばれるジアステレオマーペプチドは、野生型の機能性を示し、ＴＣＲ複合体と共局在化し（図２）、抗原に誘導されたＴ細胞活性化を妨げる（図３、４及び５）という驚くべき所見に基づく。著しくは、ジアステレオマーペプチド２Ｄ−ＣＰは、野生型の全Ｌ  ＣＰよりも強力な免疫抑制活性を示した。インビトロでは、２Ｄ−ＣＰは、全Ｌ  ＣＰよりも低濃度でより活性であった（図３）。インビボでは、２Ｄ−ＣＰの投与は、全Ｌ  ＣＰと比較した場合、ＡＡの臨床徴候のより大きな減少をもたらし（図４）、治療設定においてＤＴＨ反応を阻害するのに使用される場合、全Ｌ  ＣＰよりも２倍効果があった（図５）。
【００４３】
ペプチド、誘導体及び結合体
本発明のペプチドは、当技術分野でよく知られた方法により合成又は調製することができる。ペプチドは、メリフィールドの固相ペプチド合成法（１９６３年）により合成することができる。或いは、本発明のジアステレオマーペプチドは、当技術分野でよく知られた標準溶液法（例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、１９８４年）を用いて、又はペプチド合成に関する当技術分野で知られたいずれか他の方法により合成することができる。
【００４４】
本発明は、本明細書でコアペプチド（ＣＰ）：ＧＬＲＩＬＬＬＫＶ（配列番号１）として示される、ＴＣＲα膜貫通領域のフラグメントに基づくアミノ酸配列を有する、このペプチド誘導体及び結合体を提供する。特に指定のない限り、本明細書に記載のアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体又は「Ｄ」異性体のどちらかであり得る。
【００４５】
具体的には、本発明は、少なくとも２個の塩基性アミノ酸残基を含むＴ細胞受容体アルファ鎖（ＴＣＲα）膜貫通領域（ＴＭ）由来のジアステレオマーペプチドを提供する。
【００４６】
用語「由来の」とは、当業者に知られた適切な手段のいずれか１つ、例えば、当技術分野の標準プロトコルによる化学合成などを用いた配列知識に基づくペプチド構築を言う。ＴｃＲα  ＴＭ配列由来のペプチドは、ペプチドが、少なくとも２個の正に帯電したアミノ酸を含み、及び前記ペプチドが、Ｔ細胞活性化を阻害する能力を保持する限り、天然ＴｃＲα  ＴＭ配列の類似体、フラグメント、結合体又は誘導体、及びこれらの塩であってよい。本発明の合成ジアステレオマーペプチドは、Ｌアミノ酸、及び天然Ｌアミノ酸のＤ異性体の両方を含み、他の人工アミノ酸（アミノ酸模倣物）又は非天然アミノ酸を含んでいてもよい。ＴｃＲα  ＴＭ配列は、典型的には、疎水性配列により隔てられる２個の正に帯電したアミノ酸を含む。有利には、本発明のＴｃＲα  ＴＭ由来ペプチドは、３〜５個、又は別の実施形態では、４個の疎水性アミノ酸残基により隔てられる２個の正に帯電したアミノ酸を含む。
【００４７】
ＴｃＲαの膜貫通領域に含まれるアミノ酸配列は、例えば、膜貫通領域予測アルゴリズムを用いて、当業者により容易に決定されうる。ＴｃＲα  ＴＭ配列は、典型的には、約２０〜３０アミノ酸長の間である。例えば、配列番号１８で示された、ヒトＴｃＲα  ＴＭは、以下の表２に示されている。
【００４８】
疎水性は、一般に、非極性溶媒と水との間のアミノ酸の分配に関して定義される。疎水性アミノ酸は、非極性溶媒を好むような酸である。自然発生する疎水性アミノ酸の例は、脂肪族アミノ酸アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、及びバリン、並びに芳香族アミノ酸トリプトファン及びフェニルアラニンである。これらのアミノ酸は、タンパク質内の残基として見出された場合、脂肪族側鎖の長さ及び芳香族側鎖の大きさの１つの機能として疎水性を付与する。疎水性アミノ酸もまた、例えば、α−アミノイソ酪酸など、遺伝情報によりコードされないアミノ酸を含む。
【００４９】
１つの実施形態によれば、本発明は、ジアステレオマーペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基、又は別の実施形態では少なくとも２個のアミノ酸残基が、Ｄ−異性体立体配置である、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むジアステレオマーペプチドを提供する。
【００５０】
別の実施形態では、ジアステレオマーペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列
【化５】
2009508937.tif 000006
（３位及び８位の太字で下線付きのアミノ酸残基は、「Ｄ」異性体立体配置である）を有する２Ｄ−ＣＰである。他の実施形態では、ペプチド又は誘導体が、以下に詳述の通り、既知のタンパク質又はペプチドではないという条件で、この誘導体、フラグメント、類似体、伸長物、結合体及び塩が意図される。
【００５１】
本発明のペプチドは、好ましくは、５から５０個のアミノ酸、より好ましくは５から３０個のアミノ酸、及び最も好ましくは７から１５個のアミノ酸である。本発明のジアステレオマーペプチドは、免疫抑制活性が保持される限り配列番号２のアミノ酸配列と同一である必要はなく、下記の通り、好ましくは増加されることを理解すべきである。
【００５２】
用語「類似体」は、本明細書に具体的に示された配列の１つと実質的に同一のアミノ酸配列を有するいずれかのペプチドであって、１個又は複数個の残基が、機能的に類似した残基で保存的に置換されており、本明細書に記載された能力を示すペプチドを含む。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンなど１個の非極性（疎水性）残基の別の残基に対する置換、アルギニン及びリシン間、グルタミン及びアスパラギン間など１個の極性（親水性）残基の別の残基に対する置換、グリシン及びセリン間の置換、リシン、アルギニン若しくはヒスチジンなど１個の塩基性残基の別の残基に対する置換、又はアスパラギン酸若しくはグルタミン酸など、１個の酸性残基の別の残基に対する置換が挙げられる。
【００５３】
ペプチド誘導体とは、種々の変化を受けやすい本発明のペプチドのアミノ酸配列を含む分子を言い、こうした変化が、ペプチドの免疫抑制活性を破壊しない化学修飾、置換、挿入、伸長及び欠失を含むが、これらに限定されない。及びこのような誘導体は、既知のペプチド又はタンパク質ではない。
【００５４】
化学修飾を有するペプチド誘導体は、例えば、側鎖又は官能基の反応により化学的に誘導体化された１個又は複数個の残基を有するペプチドのいずれかの化学的誘導体を含む。このような誘導体化された分子には、例えば、遊離アミノ酸残基が、誘導体化されてアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルミル基を形成するような分子が挙げられる。遊離カルボキシル基は、誘導体化されて塩、メチル及びエチルエステル若しくは他のタイプのエステル、又はヒドラジドを形成することができる。遊離ヒドロキシル基は、誘導体化されて０−アシル又は０−アルキル誘導体を形成することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、誘導体化されてＮ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成することができる。また、化学誘導体として、２０種類の標準アミノ酸残基の１個又は複数個の自然発生アミノ酸誘導体を含有するペプチドも挙げられる。例えば、４−ヒドロキシプロリンは、プロリンを置換することができ、５−ヒドロキシリシンは、リシンを置換することができ、３−メチルヒスチジンは、ヒスチジンを置換することができ、ホモセリンは、セリンを置換することができ、オルニチンは、リシンを置換することができる。ある特定の実施形態によれば、ペプチドは、Ｃ末端でアミド化することができる。
【００５５】
本発明のペプチド誘導体は、由来となった配列と実質的に同一となるように構築される。好ましくは、本発明のジアステレオマーペプチドは、このアミノ酸配列において、２Ｄ−ＣＰ（配列番号２）のアミノ酸配列に対し、少なくとも約４０％の同一性、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％、及び最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有することができる。本発明のペプチド誘導体は、疎水性アミノ酸配列、好ましくは３〜５個の疎水性アミノ酸により隔てられた２個の塩基性アミノ酸残基のコンセンサス配列を含むこと理解すべきである。
【００５６】
本発明のペプチドはまた、Ｔ細胞活性化において必要な阻害活性が維持される限り、本発明のペプチド配列、本明細書に示された配列に対して、１つ又は複数の残基の付加及び／又は欠失を有するいずれかのペプチドも含む。用語「フラグメント」又は「活性フラグメント」は、故に、本発明の完全長ペプチド（例えば、２Ｄ−ＣＰ）のペプチド部分に関する。ペプチド部分は、少なくとも２個の正に帯電したアミノ酸を保持し、対応する完全長ペプチドに特有の少なくとも１つの活性を有する。故に、例えば、ＴＣＲαＴＭのフラグメントは、完全長ＴＭを除いて、ＴＭ部分と同一のアミノ酸配列を含む。アミノ酸伸長物は、単一のアミノ酸残基又は複数の残基の伸展からなることができる。伸長物は、ジアステレオマーペプチドのカルボキシ又はアミノ末端、及びペプチド内の位置で作製されうる。このような伸長物は、一般に、２から１５アミノ酸長の範囲となり、２個の正に帯電したアミノ酸残基間の距離は、好ましくは、５アミノ酸長を超えない。特定の実施形態では、ジアステレオマーペプチドは、既知のタンパク質又はペプチドではないという条件で、完全長ＴＣＲα膜貫通領域の誘導体、又はこの活性フラグメントを含むことができる（例えば、それぞれ、表２及び１の配列番号１８及び４〜９参照）。ある特定の実施形態では、ジアステレオマーペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸残基が、「Ｄ」異性体立体配置である、ＴＣＲα鎖の膜貫通領域に対応する配列を含むが、ＴＣＲα鎖の他の領域、例えば、細胞質領域、細胞外領域又はこの実質的部分を欠いている。
【００５７】
ある特定の実施形態によれば、ジアステレオマーペプチドは、以下の表２に示された、配列番号１２〜１７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する。他の特定の実施形態では、ジアステレオマーペプチドは、配列番号１９〜２８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する（表２参照）。さらに別の特定の実施形態では、ジアステレオマーペプチドは、配列番号３７〜４７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＣＰ類似体又は誘導体である（表２参照）。
【００５８】
本発明のジアステレオマーペプチドは、別のタンパク質又はポリペプチドと結合（ｃｏｕｐｌｅｄ）又は結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）して結合体を産生することができる。このような結合体は、単独で使用されるペプチドより有利であり得る。例えば、本発明のジアステレオマーペプチドは、Ｔ細胞媒介病態に関与する抗原に結合することができる。作用のいずれかの理論又は機序に拘ろうとしなければ、このような結合体のワクチン接種は、結合抗原に対するＴ細胞活性化の低下をもたらすことができ、これにより、前記疾患標的抗原に対する寛容原性免疫応答を誘導することができ、或いは、前記抗原に応答するＴ細胞のサイトカインプロフィールを変えることができる（Ｔｈ１からＴｈ２参照）。ペプチドは、本発明が関係する当技術分野でよく知られているように、アミド結合を介して直接結合することができ、二重リガンドペプチドとして合成することができ、リンカー部分により連結することができる。
【００５９】
自己免疫疾患に関与する既知の抗原の例には、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイトグリコプロテイン及びミエリンプロテオリピドタンパク質（多発性硬化症に関与）、アセチルコリン受容体コンポーネント（重症筋無力症に関与）、コラーゲン及びマイコバクテリアｈｓｐペプチド１８０〜１８８（関節炎に関与）、ラミニン及びｐ５３ペプチド（全身性エリテマトーデスに関与）、並びにｐ２７７（ヒトＨＳＰ６０の４３７〜４６０位）及びグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）などインスリン依存性糖尿病に関与するＡｇが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
別の実施形態では、本発明は、脂肪酸に結合したジアステレオマーペプチドであって、ジアステレオマーペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基が、Ｄ−異性体立体配置、並びにこの類似体、フラグメント、誘導体及び伸長物である、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むジアステレオマーペプチドを含む親油性結合体を提供する。１つの実施形態では、ジアステレオマーペプチドの少なくとも２個のアミノ酸残基は、Ｄ−異性体立体配置である。
【００６１】
本明細書及び特許請求の範囲を通じて同じ意味で使用される用語「親油性結合体」及び「リポペプチド」は、親油性部分、例えば、脂肪酸に共有結合したペプチドを含む結合体を指す。
【００６２】
本発明のペプチドに結合することができる脂肪酸は、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、単不飽和脂肪酸、多価不飽和脂肪酸及び分岐脂肪酸から選択される。典型的には、脂肪酸は、例えば、オクタン酸（ＯＡ）、デカン酸（ＤＡ）、ウンデカン酸（ＵＡ）、ドデカン酸（ラウリン酸）、ミリスチン酸（ＭＡ）、パルミチン酸（ＰＡ）、ステアリン酸、アラキジン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノレン酸、アラキドン酸、トランス−ヘキサデカン酸、エライジン酸、ラクトバシル酸、ツベルクロステアリン酸、及びセレブロン酸など、少なくとも３個、好ましくは少なくとも６個、及びより好ましくは少なくとも８個の炭素原子からなる。１つの実施形態では、親油性部分は、オシル基である。別の特定の実施形態では、前記脂肪酸は、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸及びミリスチン酸から選択される。
【００６３】
脂肪酸は、Ｎ末端、Ｃ末端、又はペプチド鎖に沿ったいずれか他の遊離官能基、例えば、リシンのεアミノ基に結合することができる。脂肪酸のペプチドとの結合は、ペプチド合成中のアミノ酸のペプチドとの結合と同様に行われる。脂肪酸は、ペプチドと共有結合することを理解すべきである。用語「結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）」及び「結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）」は、本明細書では同じ意味で使用され、脂肪酸のペプチドとの共有結合をもたらし親油性結合体を生ずる、化学反応のことを言う。
【００６４】
１つの特定の実施形態では、親油性結合体は、ペプチドに直接結合される。別の実施形態では、親油性部分は、リンカーを介してペプチドに結合している。
【００６５】
１つの特定の実施形態では、ジアステレオマーペプチドは、配列番号２９、又は他の実施形態では、３０〜３６に記載のアミノ酸配列を有するリポペプチドである（表２）。他の特定の実施形態では、ジアステレオマーペプチドは、配列番号４８〜５０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＣＰ類似体又は誘導体リポペプチドである（表２参照）。
【００６６】
本発明のペプチドは、マウス由来ＴＣＲαのＴＭ由来、又は種間に進化的関係があることから、この相同体、すなわち、これと大幅に関連のある配列由来であってよい。表１は、種々の種の野生型ＴＣＲα膜貫通領域（ＴＭ）フラグメントを示す。高度に保存された塩基性アミノ酸は、太字イタリック体で示されている。
表１−ＴＣＲαＴＭ配列
【表１】
2009508937.tif 000007
【００６７】
別の特定の実施形態では、前記ジアステレオマーペプチドは、ヒトＴＣＲαＴＭ由来である。ある他の特定の実施形態では、前記ペプチドは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列（
【化６】
2009508937.tif 000008
Ｄ−アミノ酸残基は、太字で下線付きである）又はこの誘導体、フラグメント、類似体、伸長物、結合体及び塩を有する。
【００６８】
表２は、本発明の典型的なジアステレオマーペプチド及びリポペプチド、並びに天然（全Ｌ）及び本明細書に記載されたエナンチオマー（全Ｄ）ＴＭ由来配列を含む、ＴＣＲα膜貫通領域（ＴＭ）由来ペプチドを示す。Ｄ−アミノ酸残基は、太字で下線付きである。
表２−ＴＣＲαＴＭ由来ペプチド
【表２−１】
2009508937.tif 000009
【表２−２】
2009508937.tif 000010
【００６９】
脂肪酸は、変えることができること、及び開示されたリポペプチドは、非限定的な代表的実施形態であることを理解すべきである。
【００７０】
分子内相互作用は、立体的に制約される。したがって、配列特異的相互作用が、Ｄ及びＬ−立体異性体間で生じることはないと考えられた。驚くべきことに、ＣＰ（Ｄ−ＣＰ）のＤ−立体異性体は、Ｔ細胞活性化を阻害することができることが開示される。Ｌ−ＣＰ及びＤ−ＣＰは、膜においてＴＣＲと共局在化し、配列特異的な形でＴ細胞活性化を阻害した。
【００７１】
別の態様では、少なくとも２個の塩基性アミノ酸残基を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖膜貫通領域由来のペプチドであって、前記ペプチドのアミノ酸残基が全て「Ｄ」異性体立体配置であるペプチドが提供される。
【００７２】
別の態様では、本発明は、配列番号３（
【化７】
2009508937.tif 000011
、全Ｄ  ＣＰとして示されている；Ｄ−アミノ酸残基は、太字で下線付きである）及び１１（
【化８】
2009508937.tif 000012
、ヒト全Ｄ  ＣＰとして示されている；Ｄ−アミノ酸残基は、太字で下線付きである）のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。種々の実施形態では、この類似体、フラグメント及び誘導体が提供される。前記類似体、フラグメント及び誘導体における全てのアミノ酸残基は、Ｄ−異性体立体配置である。別の特定の実施形態では、前記ペプチドは、そのＣ末端でアミド化される。
【００７３】
他の実施形態では、本発明は、脂肪酸に結合した配列番号３及び１１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するペプチドを含む、親油性結合体を提供する。
【００７４】
医薬組成物
別の態様によれば、本発明は、本発明の原則によるペプチド又は結合体の治療有効量、及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
【００７５】
本発明の実践において有用な医薬組成物は、典型的には、薬学的に許容可能な塩の形態として医薬組成物に処方される本発明のペプチド又は結合体を含有する。薬学的に許容可能な塩は、無機酸及び有機酸を含む、薬学的に許容可能な非毒性酸から調製することができる。こうした酸には、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パモン酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸などが挙げられる。
【００７６】
薬学的に許容可能な塩は、無機塩基及び有機塩基を含む薬学的に許容可能な非毒性塩基から調製することができる。無機塩基由来の塩には、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、鉄、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガン、第一マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛などが挙げられる。薬学的に許容可能な有機非毒性塩基由来の塩には、第一アミン、第二アミン、及び第三アミン、天然の置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、及び塩基性イオン交換樹脂、例えば、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチル−モルホリン、Ｎ−エチルピペリシン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリシン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどの塩が挙げられる。
【００７７】
本発明のペプチドの治療有効量は、患者に投与した場合、以下に記載の通り、Ｔ細胞活性化を阻害することができる。
【００７８】
活性成分にペプチドを含有する医薬組成物の調製は、当技術分野ではよく知られている。典型的には、こうした組成物は、液体溶液又は懸濁液の注射剤として調製される。しかし、注射前に懸濁又は可溶化することができる固形もまた、調製されうる。調製は、乳化することもできる。活性治療成分は、薬学的に許容可能で活性成分に適合する、無機及び／又は有機担体と混合される。担体は、適切な稠度又は形を組成物に付与するため医薬組成物に添加される不活性物質を多かれ少なかれ含む、薬学的に許容可能な賦形剤（ビヒクル）である。適切な担体は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びこれらの組成物である。さらに、所望ならば、組成物は、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、及び抗酸化剤など、活性成分の有効性を高める少量の補助剤を含有することができる。薬剤の処方及び投与法は、参照により本明細書に完全に組み込まれている、「レミントンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡの最新版に見ることができる。
【００７９】
注射では、医薬組成物の活性成分は、水溶液において、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩緩衝液などの生理的に適合可能な緩衝液において処方することができる。
【００８０】
非経口投与用の医薬組成物には、水溶性型の活性調製物の水溶液が挙げられる。さらに、活性成分の懸濁液は、適切な油性又は水性の注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油などの油脂、又はオレイン酸エチル、トリグリセリド、若しくはリポソームなどの合成脂肪酸エステルが挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランなど、懸濁液の粘性を増加する物質を含有することができる。場合により、懸濁液は、高濃度溶液の調製を可能にするため、適切な安定剤又は活性成分の可溶性を増加する物質を含有することもできる。或いは、活性成分は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、滅菌した、ピロゲンフリーの、水性溶液などと構成するため、粉末形態であってもよい。
【００８１】
本発明の医薬組成物は、局所及び病巣内適用にも有用である。本明細書では、用語「局所」とは、特定の表面領域に関することを意味し、前記表面の特定の領域に適用される局所剤は、これが適用される領域のみに影響するであろう。本発明は、幾つかの実施形態では、本発明のペプチド又は結合体を活性成分として含む局所組成物を提供する。幾つかの実施形態では、本発明は、基本的に本発明の前記ペプチド及び結合体からなる組成物を提供する。
【００８２】
局所医薬組成物は、非水溶性（油中水型）クリーム又は水溶性（水中油型）クリーム、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、ローション、ゲル、懸濁液、水性又は共溶媒溶液、軟膏（ｓａｌｖｅ）、乳剤、創傷被覆材、被覆された包帯又は他のポリマー被覆剤、スプレー、エアロゾール、リポソーム及び薬剤の局所投与に適したいずれか他の薬学的に許容可能な担体を含むことができるが、これらに限定されない。
【００８３】
当技術分野でよく知られている通り、担体の物理化学的特性は、増粘剤、ゲル化剤、湿潤剤、凝集剤、懸濁化剤などを含むがこれらに限定されない、種々の賦形剤を添加して操作することができる。これらの任意の賦形剤は、適用が、より快適又は便利となりうるように、得られた製剤の物理化学的特性を決定づけるであろう。選択された賦形剤は、好ましくは、製剤の貯蔵安定性を高めるべきであり、いかなる場合も製剤の貯蔵安定性を妨げてはならないことが、当業者には理解されるであろう。
【００８４】
軟膏及びクリームは、例えば、適切な増粘剤及び／又はゲル化剤を添加して水性又は油性基剤と共に処方することができる。ローションは、水性又は油性基剤と共に処方することができ、一般には、１種又は複数種の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤、又は着色剤も含有するであろう。例えば、クリーム製剤は、活性化合物に添加して、（ａ）疎水性成分、（ｂ）親水性水性成分、及び（ｃ）少なくとも１種の乳化剤を含むことができる。クリームの疎水性成分は、鉱油、黄色軟パラフィン（バセリン）、白色軟パラフィン（バセリン）、パラフィン（固形パラフィン）、重パラフィン油、含水羊毛脂（含水ラノリン）、羊毛脂（ラノリン）、羊毛アルコール（ラノリンアルコール）、ペトロラタム及びラノリンアルコール、蜜ロウ、セチルアルコール、アーモンド油、落花生油、ヒマシ油、硬化ヒマシ油ワックス、綿実油、オレイン酸エチル、オリーブ油、ゴマ油、及びこれらの混合物からなる群により例示される。クリームの親水性成分は、水単独、プロピレングリコール、或いは薬学的に許容可能な緩衝液又は溶液により例示される。乳化剤は、クリームを安定化させ、液滴合体を回避するためにクリームに添加される。乳化剤は、表面張力を低下させ、安定な、コヒーレント界面薄膜を形成する。適切な乳化剤は、コレステロール、セトステアリルアルコール、羊毛脂（ラノリン）、羊毛アルコール（ラノリンアルコール）、含水羊毛脂（含水ラノリン）、及びこれらの混合物からなる群により例示することができるが、これらに限定されない。
【００８５】
局所懸濁液は、例えば、活性化合物に添加して、（ａ）水性培地、及び（ｂ）懸濁化剤又は増粘剤を含むことができる。場合により、追加の賦形剤が添加される。適切な懸濁化剤又は増粘剤は、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、アルギン酸及びこの誘導体、キサンタンガム、グアーガム、アラビアガム、トラガカント、ゼラチン、アカシア、ベントナイト、デンプン、微結晶セルロース、ポビドン及びこれらの混合物からなる群により例示することができるが、これらに限定されない。水性懸濁液は、場合により、例えば、湿潤剤、凝集剤、増粘剤など、追加の賦形剤を含有することができる。適切な湿潤剤は、グリセロールポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール及びこれらの混合物、並びに界面活性剤からなる群により例示されるが、これらに限定されない。懸濁液中の湿潤剤の濃度は、湿潤剤の実現可能な最低濃度により懸濁液内で医薬品粉末の最適分散を実現するように選択されるべきである。適切な凝集剤は、電解質、界面活性剤、及びポリマーからなる群により例示されるが、これらに限定されない。懸濁化剤、湿潤剤及び凝集剤は、薬学的有効物質の安定な懸濁液を形成するのに有効な量で提供される。
【００８６】
局所ゲル製剤は、例えば、活性化合物に添加して、少なくとも１種のゲル化剤及び１種の酸化合物を含むことができる。適切なゲル化剤は、親水性ポリマー、天然及び合成ゴム、架橋タンパク質及びこれらの混合物からなる群により例示することができるが、これらに限定されない。ポリマーは、例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、並びにアミロース、デキストラン、キトサン、プルラン及びその他の多糖類の類似の誘導体；アルブミン、ゼラチン及びコラーゲンなどの架橋タンパク質；カルボポールなどのアクリルベースのポリマーゲル、ユードラギット（Ｅｕｄｒａｇｉｔ）及びヒドロキシエチルメタクリレートベースのゲルポリマー、ポリウレタンベースのゲル並びにこれらの混合物を含むことができる。
【００８７】
本発明の局所医薬組成物は、さらに、溶液として処方することができる。こうした溶液は、活性化合物に添加して、水、緩衝液、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、グリコフォロール（ｇｌｙｃｏｆｏｒｏｌ）、クレモフォール、乳酸エチル、乳酸メチル、Ｎ−メチルピロリドン、エトキシル化トコフェロール及びこれらの混合物などの有機溶媒からなる群により例示されるがこれらに限定されない少なくとも１種の共溶媒を含む。
【００８８】
本発明の組成物は、経粘膜送達、例えば、経皮送達に使用することができる。本明細書では、用語「経皮」送達とは、医薬品の送達部位を言う。典型的には、送達は、血液循環が意図される。しかし、送達は、表皮内又は皮内送達、すなわち、角質層の下の、それぞれ表皮又は皮層への送達を含むことができる。経粘膜投与では、浸透するバリアに適した浸透剤が、製剤として使用される。このような浸透剤は、当技術分野において一般的に知られている。
【００８９】
２種類の一般的な経皮パッチデザイン、すなわち、薬剤に対し透過性である基底面を有する貯蔵層内に薬剤が含有される貯蔵層タイプ、及び皮膚に添付されるポリマー層で薬剤が分散される、マトリックスタイプがある。両タイプのデザインは、典型的には、バッキング層及び使用前に除去される内部放出ライナー層も含む。こうした経皮パッチの調製は、当業者の能力の範囲内である。治療薬の経皮送達に適したパッチの例としては、例えば、米国特許第５，５６０，９２２号、第４，５５９，２２２号、第５，２３０，８９８号及び第４，６６８，２３２号を参照のこと。
【００９０】
経口投与では、医薬組成物は、活性化合物を当技術分野でよく知られた薬学的に許容可能な担体と組み合わせて、容易に処方することができる。こうした担体は、患者による経口摂取のため、医薬組成物が、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方されるのを可能にする。経口使用のための薬理製剤は、固体賦形剤を用いて、場合によりその結果得られる混合物を粉砕し、所望の適切な補助剤を添加後、顆粒混合物を加工して作製し、錠剤又は糖衣錠コアを得ることができる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む、糖などの充填剤；例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、及びカルボメチルセルロースナトリウムなどのセルロース製剤；及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容可能なポリマーである。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、アガール、又はアルギニン酸若しくはアルギニン酸ナトリウムといったこの塩などの崩壊剤が、添加されてよい。
【００９１】
糖衣錠コアは、適切な被覆により提供される。この目的のため、場合によりアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、及び適切な有機溶媒又は溶液混合液を含有することができる濃縮糖液が、使用されうる。染料又は色素は、活性化合物量の同定のため又は活性化合物量の異なる組合せを特性化するため、錠剤又は糖衣錠被覆に添加することができる。
【００９２】
経口使用することができる医薬組成物には、ゼラチン製プッシュフィットカプセルのほか、ゼラチン製ソフトカプセル、密閉カプセル、及びグリセロール又はソルビトールなどの可塑剤が挙げられる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、タルク又はステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、及び、場合により、安定剤と混合して活性成分を含有することができる。ソフトカプセルでは、活性成分は、油脂、流動パラフィン、又は液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体中で溶解又は懸濁することができる。さらに、安定剤が添加されうる。経口投与用製剤は全て、選択された投与経路に適した用量であるべきである。
【００９３】
口腔投与では、組成物は、従来の様式で処方された錠剤又はトローチ剤の形をとることができる。
【００９４】
治療的使用
他の態様では、本発明は、Ｔ細胞媒介病態の症状の治療又は予防を必要とする被験者におけるＴ細胞媒介病態の症状の治療又は予防方法であって、被験者に、本発明のペプチド又は結合体の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００９５】
１つの態様では、本発明は、Ｔ細胞媒介病態の治療を必要とする被験者におけるＴ細胞媒介病態の治療方法であって、被験者に、少なくとも２個の塩基性アミノ酸残基を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖膜貫通領域由来のジアステレオマーペプチドの治療有効量を投与することを含む方法を提供する。１つの実施形態では、ペプチドは、ジアステレオマーペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基が、Ｄ−異性体立体配置である、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ジアステレオマーペプチドの少なくとも２個のアミノ酸残基が、Ｄ−異性体立体配置である。
【００９６】
別の実施形態では、ジアステレオマーペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、ペプチドは、ペプチド又は誘導体が、既知のタンパク質又はペプチドではないという条件で、配列番号２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、並びにこの誘導体、フラグメント、類似体、伸長物、結合体及び塩を含む。別の実施形態では、ジアステレオマーペプチドは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する。
【００９７】
ある特定の実施形態によれば、ジアステレオマーペプチドは、配列番号１２〜１７、１９〜２８及び３７〜４７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する。
【００９８】
別の実施形態では、ジアステレオマーペプチドは、親油性部分に結合している。
【００９９】
本発明の１つの実施形態によれば、親油性部分は、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、単不飽和脂肪酸、多価不飽和脂肪酸及び分岐脂肪酸からなる群から選択される脂肪酸である。現在好ましい実施形態によれば、脂肪酸は、少なくとも３個、好ましくは少なくとも６個、及びより好ましくは少なくとも８個の炭素原子からなる。別の実施形態では、脂肪酸は、オクタン酸（ＯＡ）、デカン酸（ＤＡ）、ウンデカン酸（ＵＡ）、ドデカン酸（ＤＤＡ；ラウリン酸）、ミリスチン酸（ＭＡ）、パルミチン酸（ＰＡ）、ステアリン酸、アラキジン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、トランス−ヘキサデカン酸、エライジン酸、ラクトバシル酸、ツベルクロステアリン酸、及びセレブロン酸からなる群から選択される。
【０１００】
１つの特定の実施形態では、ジアステレオマーペプチドは、配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有する。他の特定の実施形態では、ジアステレオマーペプチドは、配列番号３０〜３６及び４８〜５０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する。
【０１０１】
用語「Ｔ細胞媒介病態」とは、不適切又は有害なＴ細胞応答が、疾患又は障害の病因又は病態１つの構成要素となるいずれかの状況を言う。この用語は、Ｔ細胞に直接媒介される疾患、及び不適切又は有害なＴ細胞応答が、異常抗体の産生に寄与する疾患（例えば、病的ＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＥ抗体産生に関連した自己免疫疾患又はアレルギー性疾患）の両方、及び移植片拒絶反応を含むことが意図される。
【０１０２】
本明細書では、用語「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、予防的及び治療的（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）使用を含み、患者における特定の障害の症状緩和、特定の障害に関連した解明可能な測定の改善、又は特定の免疫応答（移植拒絶反応など）の予防を含む。
【０１０３】
種々の実施形態では、被験者は、ヒト及びヒト以外の動物から選択されてよい。
【０１０４】
本発明の１つの実施形態では、Ｔ細胞媒介病態は、以下を含むがこれらに限定されないＴ細胞媒介自己免疫疾患である：多発性硬化症、自己免疫性神経炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬、Ｉ型糖尿病（ＩＤＤＭ）、シェーグレン病、甲状腺疾患、重症筋無力症、サルコイドーシス、自己免疫性ブドウ膜炎、炎症性腸疾患（クローン大腸炎及び潰瘍性大腸炎）、自己免疫性肝炎及び関節リウマチ。１つの特定の実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチである。他の疾患には、特発性血小板減少症、強皮症、円形脱毛症、溶血性貧血、免疫媒介腎疾患（例えば、糸球体腎炎）、皮膚炎及び天疱瘡が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
別の実施形態では、Ｔ細胞媒介病態は、喘息（特にアレルギー性喘息）、過敏性肺疾患、過敏性肺炎、遅延型過敏症、間質性肺疾患（ＩＬＤ）（例えば、特発性肺腺維症、又は関節リウマチ若しくは他の炎症性疾患に関連したＩＬＤ）などの炎症性又はアレルギー性疾患を含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞媒介炎症性疾患である。
【０１０６】
他の実施形態では、Ｔ細胞媒介病態は、同種移植拒絶反応及び移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を含む、移植片拒絶反応である。臓器拒絶反応は、免疫応答を介した移植組織の宿主免疫細胞破壊により生じる。同様に、免疫応答は、ＧＶＨＤにも関与しているが、この場合では、外来性の移植免疫細胞が、宿主組織を破壊する。免疫応答、特にＴ細胞活性化を阻害する、本発明のジアステレオマーペプチドの投与は、臓器拒絶反応又はＧＶＨＤの予防において有効な療法となりうる。１つの実施形態では、移植される免疫細胞は、移植される前に本発明のジアステレオマーペプチドと共にインキュベートされる。
【０１０７】
別の態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化の阻害を必要とする被験者におけるＴ細胞活性化の阻害方法であって、被験者に、少なくとも２個の塩基性アミノ酸残基を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖膜貫通領域由来のジアステレオマーペプチドの治療有効量を投与することを含む方法を提供する。１つの実施形態では、ペプチドは、ジアステレオマーペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基が、Ｄ−異性体立体配置である、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ジアステレオマーペプチドの少なくとも２個のアミノ酸残基は、Ｄ−異性体立体配置である。
【０１０８】
別の実施形態では、ジアステレオマーペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、ペプチドは、ペプチド又は誘導体が、既知のタンパク質又はペプチドではないという条件で、配列番号２に記載のアミノ酸配列並びにこの誘導体、フラグメント、類似体、伸長物、結合体及び塩を含む。別の実施形態では、ジアステレオマーペプチドは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する。
【０１０９】
ある他の特定の実施形態によれば、ジアステレオマーペプチドは、配列番号１２〜１７、１９〜２８及び３７〜４７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する。
【０１１０】
別の実施形態では、ジアステレオマーペプチドは、親油性部分に結合している。
【０１１１】
本発明の１つの実施形態によれば、親油性部分は、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、単不飽和脂肪酸、多価不飽和脂肪酸及び分岐脂肪酸からなる群から選択される脂肪酸である。現在好ましい実施形態によれば、脂肪酸は、少なくとも３個、好ましくは少なくとも６個、及びより好ましくは少なくとも８個の炭素原子からなる。別の実施形態では、脂肪酸は、オクタン酸（ＯＡ）、デカン酸（ＤＡ）、ウンデカン酸（ＵＡ）、ドデカン酸（ＤＤＡ；ラウリン酸）、ミリスチン酸（ＭＡ）、パルミチン酸（ＰＡ）、ステアリン酸、アラキジン酸、リグノセリン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、トランス−ヘキサデカン酸、エライジン酸、ラクトバシル酸、ツベルクロステアリン酸、及びセレブロン酸からなる群から選択される。
【０１１２】
１つの特定の実施形態では、ジアステレオマーペプチドは、配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有する。他の特定の実施形態では、ジアステレオマーペプチドは、配列番号３０〜３６及び４８〜５０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する。
【０１１３】
別の態様では、本発明は、Ｔ細胞媒介病態の治療及びＴ細胞活性化の阻害を必要とする被験者における、Ｔ細胞媒介病態の治療及びＴ細胞活性化の阻害方法であって、被験者に、少なくとも２個の塩基性アミノ酸残基を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖膜貫通領域由来のペプチドの治療有効量を投与することを含み、アミノ酸残基が全て「Ｄ」異性体立体配置である方法を提供する。
【０１１４】
別の態様では、本発明は、Ｔ細胞媒介病態の治療又はＴ細胞活性化の阻害を必要とする被験者における、Ｔ細胞媒介病態の治療又はＴ細胞活性化の阻害方法であって、被験者に、配列番号３及び１１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するペプチド、又はこの親油性結合体の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【０１１５】
医薬組成物は、静脈内、筋肉内、注射、経口、鼻腔内、腹腔内、皮下、直腸、局所、又は、滑液などの他の領域を含むが、これらに限定されない、種々の局所及び全身送達経路により送達することができる。組成物の送達は、経皮パッチを介した拡散によるなど、経皮的にも意図される。１つの特定の実施形態では、局所及び経皮投与経路は、例えば、ＤＴＨ及び接触性皮膚炎に対し、意図される。
【０１１６】
組成物は、投与剤形と適合可能な方法で、及び治療有効量で投与される。投与量は、治療される被験者、及び被験者の血中止血系が活性成分を利用する能力に依存する。投与に必要な活性成分の正確な量は、開業医の判断に依存し、各個人に特有である。
【０１１７】
本明細書では、用語「治療有効量」とは、被験者に投与された場合、Ｔ細胞活性化を阻害することができる医薬組成物の量を言う。本発明のペプチドの活性を検出するためのアッセイは、Ｔ細胞抗原特異的増殖の阻害、並びに実施例に記載の、アジュバント関節炎及びＤＴＨを含むがこれらに限定されない、インビボ疾患モデルの阻害を含むことができるが、これらに限定されない。しかし、抗原特異的Ｔ細胞活性化の阻害を検出するための他の方法が、当技術分野ではよく知られており、本発明のペプチド活性の評価に使用されてよい。好ましくは、本発明のペプチドの治療有効量は、インビトロアッセイ又はインビボアッセイで測定した場合、Ｔ細胞活性化を、少なくとも１０パーセント、より好ましくは少なくとも５０パーセント、及び最も好ましくは少なくとも９０パーセント低減（阻害）する量である。好ましくは、医薬組成物は、本明細書でさらに記載される患者におけるＴ細胞媒介病態を阻害するのに有用である。この実施形態では、治療有効量は、患者に投与した場合、Ｔ細胞媒介病態を阻害する、好ましくは根絶するのに十分な量である。本発明のペプチド誘導体又は結合体の好ましい単回投与量は、体重ｋｇあたり約０．８μｇから約８ｍｇ、好ましくは体重ｋｇあたり約８μｇから約８００ｍｇ、及びより好ましくは体重ｋｇあたり約２０μｇから約３００μｇである。例えば、局所投与では、典型的には、全身投与量の５〜１０倍に等しい投与量が使用されてよい。典型的には、医師は、個々の患者に最も適する実際の投与量を決定するであろう。及びこれは、特定の患者の年齢、体重及び奏効により変わるであろう。当然、高用量又は低用量範囲がメリットとなる個々の例もあり得、このような例は、本発明の範囲内である。本発明のペプチド誘導体又は結合体は、例えば、上述の単回投与量を１日１回又は週１回投与することができる。
【０１１８】
本発明による疾患の治療法は、単一の活性薬剤として、又は別の治療法と併用しての本発明の医薬組成物の投与を含めることができる。本発明の治療法は、別の治療法と並行して、別の治療法前、又は別の治療法後であってよい。
【０１１９】
以下の実施例は、本発明の幾つかの実施形態をより充分に説明するために示される。しかし、これらは、本発明の幅広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１２０】
Ａ．ジアステレオマーペプチド
ペプチド合成及び蛍光標識
ペプチドを、以前に記載されている通り（Ｋｌｉｇｅｒ等、１９９７年；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ等、１９８２年）、ＰＡＭ−アミノ酸樹脂（０．１５ｍｅｑ）の固相により合成した。合成ペプチドを、０．０５％ＴＦＡにおける２０〜６０％アセトニトリルの直線勾配を用いてＣ４カラムでＲＰ−ＨＰＬＣにより６０分間精製した（＞９８％均一性）。ペプチドを、アミノ酸分析及び質量分析にかけ、これらの組成を確認した。特に指定のない限り、ＤＭＳＯ中の濃縮ペプチド原液を、使用前のペプチド凝集を回避するのに使用した。樹脂結合ペプチドを、５−カルボキシテトラメチルローダミン、スクシニミジルエステル（ローダミン−ＳＥ）で処理した。ローダミンとの反応は、２％ジイソプロピルエチルアミン含有ＤＭＦ中であった。蛍光プローブを、２当量を超えて使用し、樹脂結合Ｎ末端ローダミン標識ペプチドを形成した（Ｇｅｒｂｅｒ及びＳｈａｉ、２０００年；Ｇｅｒｂｅｒ等、２００４年）。１時間後、樹脂をＤＭＦ、次いで塩化メチレンで完全に洗浄した。精製ペプチドは全て、分析ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｇｅｒｂｅｒ及びＳｈａｉ、２０００年）により均一である（＞９８％）ことを示した。
【０１２１】
ＣＤ分光
ペプチドのＣＤスペクトルは、Ａｖｉｖ  ２０２分光偏光計（Ａｖｉｖ、レイクウッド、ＮＪ）で測定した。スペクトルを、１ｍｍ経路長で温度規定の石英光学セルにより走査した。各スペクトルを、２６０から１９０ｎｍの波長範囲で、平均化時間２０秒で１ｎｍ間隔にて記録した。ペプチドを、Ｈ２Ｏ又は１％ＬＰＣミセルにおいて５０μＭ濃度でテストした。
【０１２２】
分子動力学シミュレーション
本発明者は、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩソフトウェア（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、理想的なα−ヘリックス構造をもとに、全Ｌ  ＣＰ（野生型）及び２Ｄ−ＣＰ（ジアステレオマー）ペプチドの構造をモデル化した。２Ｄ−ＣＰでは、Ａｒｇ及びＬｙｓを、Ｄ−エナンチオマーと置換した。これらの構造を、分子動力学シミュレーションにおいて使用し、これらの構造安定性を比較した。シミュレーションは、真空で３００Ｋのコンシステント原子価力場（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ  ｖａｌｅｎｃｅ  ｆｏｒｃｅ  ｆｉｅｌｄ）（ｃｖｆｆ）により１０ｐｓで右巻きα−へリックスにおいて行った。使用した制約はなかった。シミュレーションにより作成した構造を、最小化後に当初の構造と比較し、炭素アルファ（ＣＡ）のＲＭＳＤを、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩソフトウェアのＤｅｃｉｐｈｅｒモジュールを用いて算出した。
【０１２３】
脂質二重層モデルでは、シミュレーションシステムは、１０７  ＤＭＰＣ分子、３６５５水分子及び調べられるペプチドからなる。シミュレーションボックスを中性に保つため、２個の水分子を、２個の対Ｃｌアニオンで置換した。ＤＭＰＣ膜の開始コンフォメーションは、カルガリー大学Ｄ．Ｐ．Ｔｉｅｌｅｍａｎのグループサイトからダウンロードした（ｈｔｔｐ：／／ｍｏｏｓｅ．ｂｉｏ．ｕｃａｌｇａｒｙ．ｃａ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｐａｇｅ＝Ｄｏｗｎｌｏａｄｓ）。シミュレーション及びデータ分析は、Ｇｒｏｍａｃｓ  ３．２．１スイート（Ｂｅｒｅｎｄｓｅｎ等、１９９５年）を用いて行った。システムは、定圧及び定温（ＮＰＴ）下で弱結合を維持した（Ｂｅｒｅｎｄｓｅｎ等、１９８４年）。１バールの定圧を、最適な分子密度を可能にするため、シミュレーションボックスの３方向に、結合定数τＰ＝１．０ｐｓで独立に結合した。温度槽を、結合定数イオン、水、脂質及びタンパク質の分子に、３１０Ｋ及びτＴ＝０．１ｐｓで別個に結合した。静電相互作用及びレナード−ジョーンズ相互作用のカットオフ距離を、それぞれ１５Å及び１２Åに設定した。隣接原子リストを、２０フェムト秒（ｆｓ）ごとにアップデートした。長距離の静電相互作用を、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｍｅｓｈ  Ｅｗａｌｄ（ＰＭＥ）和を用いて算出した（Ｄａｒｄｅｎ等、１９９３年）。結合長を、ＬＩＮＣＳアルゴリズムを用いて制約した（Ｈｅｓｓ等、１９９７年）。脂質パラメータの向上のために改良された融合原子ＧＲＯＭＯＳ−９６力場の修正版を使用した（ｖａｎ  Ｇｕｎｓｔｅｒｅｎ等、１９９６年）。全ての極性水素原子を、明示的に処理したのに対し、脂肪族水素原子は、力場で暗示的に記述した。フレキシブルシンプル点電荷（ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｓｉｍｐｌｅ  ｐｏｉｎｔ  ｃｈａｒｇｅ）（ＳＰＣ）水ポテンシャル記述（Ｂｅｒｅｎｄｓｅｎ等、１９８１年）を使用した。総シミュレーション時間は、最初の１００ｐｓの制限ランとは別に、１０ｎｓとした。シミュレーション中は、２ｆｓ時間ステップを使用した。ＣＰＵ時間は、インテル２．７ＧＨｚジオンプロセッサでナノ秒あたり約３６時間であった。
【０１２４】
動物
２カ月齢の雌のルイスラットを使用した。ラットは、ワイツマン科学研究所の動物育種センターにおいて無菌条件下で飼育し、維持した。８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、同様の無菌条件下で維持した。実験は、ワイツマン科学研究所の所内動物管理使用委員会の監督及びガイドライン下で行った。
【０１２５】
蛍光顕微鏡法
活性化したＡ２ｂ  Ｔ細胞（ｖａｎ  Ｅｄｅｎ等、１９８８年）（１０５細胞／試料）を、パラ−ホルムアルデヒド４％含有ＰＢＳ１００μｌで１５分間、氷上でインキュベートした。次いで、試料を、冷たいＰＢＳで洗浄し、１１００ｒｐｍにて７分間遠心分離した。次いで、ＢＳＡ１％含有ＰＢＳを、非特異的結合を防止するため室温で添加した。３０分後、ＴＣＲに対するＦＩＴＣ標識抗体を、１：１００の希釈で添加し、２．５時間インキュベートした。ＴＣＲのペプチドとの共局在化では、ローダミン２Ｄ−ＣＰを、最終濃度１μＭ（ＤＭＳＯ原液）で添加し、５分間インキュベートした。次いで、試料を、ＰＢＳで１回洗浄し、顕微鏡用スライドに添加した。
【０１２６】
次いで、細胞を、蛍光共焦点顕微鏡下で観察した。ＦＩＴＣ励起は、フルオロフォアの退色を最小化するためレーザーを２０％パワーに設定して、４８８ｎｍとした。蛍光データは、５０５〜５２５ｎｍから回収した。ローダミン励起は、レーザーを５％パワーに設定して、５４３ｎｍとした。蛍光データは、５６０ｎｍ以上から回収した。
【０１２７】
ＦＩＴＣ（ドナー）及びローダミン（アクセプター）間の蛍光エネルギー転移を、ローダミンプローブが退色した領域のＦＩＴＣ蛍光の増加として検出した。退色は、レーザーを１００％に設定して５４３ｎｍで６秒間、点励起により達成した。ＦＩＴＣ蛍光の増加は、自己蛍光が原因でないことを検証するため、退色を、最初は４８８ｎｍレーザーを用いて、次いで５４３ｎｍで行った。５０５〜５２５ｎｍ又は５６０＜のどちらにおいても信号は観察されず、自己蛍光の可能性は排除された。
【０１２８】
蛍光標識ペプチドのＴＣＲ分子との免疫共沈降
活性化したＡ２ｂ  Ｔ細胞（２×１０６）を、ＣＰ又は２Ｄ−ＣＰ（２５μｇ／ｍｌ）或いは２Ｇ−ＣＰ存在下で３７℃にて１時間培養し、０．１ｍｌ溶解緩衝液で１５分間、氷上で溶解した（Ａｄａｃｈｉ等、１９９６年）。不溶性物質を、４℃にて１０分間、１０．０００ｇで遠心分離により除去した。次いで、溶解物を、ラットＴＣＲ又はＭＨＣクラスＩに対する抗体に結合したプロテインＡ−プラスアガロースビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、サンタクルス、カリフォルニア、ＵＳＡ）と共に一晩インキュベートした。ラットＴＣＲ（クローンＲ７３）又はＨＳＰ６０（クローンＬＫ１）に対し反応する抗体を、研究室で各ハイブリドーマから精製した。ラットＣＤ２８に対する抗体、アクチン及びラットＭＨＣクラスＩは、Ｓｅｒｏｔｅｃ（オックスフォード、ＵＫ）から購入した。４℃で一晩インキュベートした後、ビーズを溶解緩衝液で洗浄し、１０分間煮沸し、タンパク質上清を、４〜２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。免疫共沈降したペプチドの存在を、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９４００可変モード撮像装置により検出した。
【０１２９】
Ｔ細胞増殖
Ｔ細胞増殖アッセイは、Ｍｔで免疫したラット由来のＬＮＣを用いて行った。ＰＰＤ及び６５  ｋＤａ熱ショックタンパク質（ＨＳＰ６５）のＭｔ１７６−９０ペプチド（Ｑｕｉｎｔａｎａ等、２００２年）に対する強いＴ細胞応答が検出できる場合、膝下及び鼠径ＬＮＣを、不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）中のＭｔを注射後２６日目に除去した。ＬＮＣを、２×１０５細胞／ウェルの濃度で培養し、５×１０４  Ａ２ｂ  Ｔ細胞を、以前に記載されている通りに調製した、ウェルあたり、照射した５×１０５胸腺抗原提示細胞の存在下で刺激した（ｖａｎ  Ｅｄｅｎ等、１９８５年）。細胞を、種々の濃度の試験下ペプチド及びＰＰＤ又はＭｔ１７６−９０の存在下で、抗原有り又は抗原無しで、２００μｌ丸底マイクロタイターウェルに４連で播種した。培養物を、７．５％ＣＯ２の加湿雰囲気で３７℃にて７２時間インキュベートした。Ｔ細胞応答は、インキュベーションの最後の１８時間で添加した、［メチル−３Ｈ］−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、バッキンガムシャー、ＵＫ；１μＣｉ／ウェル）の取り込みにより検出した。Ｔ細胞増殖実験の結果を、ペプチド非存在下で抗原刺激により誘発したＴ細胞増殖に対する阻害の％として示す。
【０１３０】
ＡＡの誘導及び評価
インビボでのＴ細胞活性化に与えるＣＰの影響をテストするため、実験的Ｔ細胞媒介自己免疫疾患アジュバント関節炎（ＡＡ）を使用した。ＡＡは、尾の基底にＩＦＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）で懸濁したＭｔ  ５０μｌを注射して誘導した。ＡＡ誘導時に、各ラットは、ＩＦＡ  ５０μｌで溶解し、ＡＡを誘導するのに使用したＭｔ／ＩＦＡと混合した全Ｌ  ＣＰ、２Ｄ−ＣＰ又は２ＧＣＰ対照ペプチド（又はＰＢＳ）１００μｇも投与された。ＡＡ誘導日は、０日目とした。疾患重症度は、各動物の４肢全てを直接観察して評価した。０から４の間の相対スコアを、関節の炎症、発赤及び変形の程度に基づき、各肢に割り当てた。したがって、各動物の最大となるスコアは、１６であった（Ｑｕｉｎｔａｎａ等、２００２年）。平均ＡＡスコア（±ＳＥＭ）を、各実験群について示す。関節炎はまた、キャリパーで後肢径を測定して定量化した。測定は、ＡＡ誘導当日及び２６日後（ＡＡピーク時）に行った。結果を、各群の動物全てについて２値間の差の平均±ＳＥＭで示す。疾患をスコア化する者は、群のアイデンティティを盲検化された。
【０１３１】
ＰＰＤに対する遅延型過敏反応
ＰＰＤ２０μｌ（ＰＢＳの０．５ｍｇ／ｍｌ）を、ＡＡ誘導後１６日目に各ラットの右耳の耳介に皮内注射した。滅菌ＰＢＳ  ２０μｌを、対照として左耳に注射した。耳の厚さを、ノギスを用いて４８時間後に測定し、左右の耳の差として表した（Ｑｕｉｎｔａｎａ等、２００５年）。
【０１３２】
オキサザロンに対する遅延型過敏反応
５匹のメスの近交系ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）群を、アセトン／オリーブ油［４：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）］に溶解した２％オキサゾロン１００μｌを局所適用し、剪毛した腹部皮膚で感作した。ＤＴＨ感受性は、耳の両側に１０μｌずつ局所適用した、アセトン／オリーブ油中の０．５％オキサゾロン２０μｌでマウスを曝露して、５日後に誘発した。耳の一定の領域を、曝露直前及び曝露２４時間後に、ミツトヨエンジニアズマイクロメータ（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ  ｅｎｇｉｎｅｅｒ’ｓ  ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ）で測定した。耳の腫張を測定する者は、マウス群のアイデンティティについて分かっていなかった。ＤＴＨ反応を、１０〜２ｍｍ単位で平均±ＳＥＭとして表した、曝露後の耳の腫張の増加で示す。曝露１時間後、マウスの耳を、いずれも４０μｌ  ＤＭＳＯで溶解した、全Ｌ  ＣＰ又は２Ｄ−ＣＰで局所処理した。ペプチド治療活性を、「未治療マウス」についてはＤＭＳＯ単独による治療、陽性対照としてはデキサメタゾン（生理食塩中１００μｇ／ｍｌ）による治療と比較した。
【０１３３】
統計的有意
ＩｎＳｔａｔ２．０１プログラム（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、ＣＡ）を、統計分析に使用した。スチューデントｔテスト及びマン−ホイットニーＵテスト（両側）を行い、異なる実験群間の有意差をアッセイした。
【０１３４】
実施例１  ２Ｄ−ＣＰは安定なα−ヘリカル構造に欠ける
最近、本発明者らは、ＣＰのＴ細胞活性化に対する阻害活性は、ペプチドキラリティーに依存しないことを示した。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と相互作用しＴ細胞活性化を妨げる能力に対する、二次構造及び側鎖配列の寄与の差を分析するため、本発明者らは、ＣＰの２個の陽性残基（Ａｒｇ及びＬｙｓ）をこれらのＤ−エナンチオマー（２Ｄ−ＣＰ）で置換した。Ｄ  ａａのＬペプチドへの挿入は、ａａ配列を保ちながら二次構造を不安定化することが記載されている（図１）。配列特異性をテストするため、本発明者らは、２個の陽性残基が、グリシンに変異した既知の変異体（Ｇｅｒｂｅｒ等、２００５年；Ｍａｎｏｌｉｏｓ等、１９９７年）を合成した。実施例１〜５に使用されたＣＰペプチドの指定及びａａ配列は、以下の通りである。
全Ｌ  ＣＰ（野生型）：ＧＬＲＩＬＬＬＫＶ（配列番号１）。
２Ｄ−ＣＰ（ジアステレオマー）：
【化９】
2009508937.tif 000013
（配列番号２；Ｄ−ａａは太字で下線付きである）。
２Ｇ−ＣＰ（対照）：
【化１０】
2009508937.tif 000014
（配列番号５１；Ｇｌｙ変異は太字イタリック体である）。
【０１３５】
２つのＤ  ａａのＣＰペプチドへの導入は、二次構造を不安定化することが期待される。本発明者は、２つの実験条件：Ｈ２Ｏ、及び１％リソホスファチジル−コリン（ＬＰＣ）ミセルにおいて、２Ｄ−ＣＰペプチドの円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを試験した（図１Ｂ）。後者は、膜の疎水性環境を模倣する。全Ｌ  ＣＰは、以前の報告と同様、ミセル中でα−ヘリカル二次構造を有した（Ｇｅｒｂｅｒ等、２００５年；Ａｌｉ等、２００１年）。期待された、２Ｄ−ＣＰペプチドの有意な二次構造は見られなかった（図１Ｂ）。
【０１３６】
本発明者らはさらに、以下に記載されている通り、全Ｌ  ＣＰ及び２Ｄ−ＣＰの二次構造の安定性を、分子動力学シミュレーションを行って比較した。
【０１３７】
（ｉ）真空での分子動力学シミュレーション：分子動力学シミュレーションの結果得られる二次構造の比較は、全Ｌ  ＣＰが、２Ｄ−ＣＰ変異体では失われるα−ヘリカル構造を維持することを示す（図１Ｃ）。本発明者は、インサイトＩＩソフトウェアのＤｅｃｉｐｈｅｒ分析パッケージを使用して全Ｌ  ＣＰ及び２Ｄ−ＣＰペプチドの安定性を比較した。分子構造としてのＲＭＳＤ増加は、当初の構造から逸れ、いったん新規の安定したコンフォメーションが得られると停滞期に入る。図１Ｃは、平衡到達後の全Ｌ  ＣＰ及び２Ｄ−ＣＰを示す。全Ｌ  ＣＰが、ヘリカル構造を維持したのに対し、２Ｄ−ＣＰは螺旋性を失っていた。２つのペプチドについてＣＡのＲＭＳＤを比較した場合、野生型全Ｌ  ＣＰ及び２Ｄ−ＣＰはどちらも、真空で約４ｐｓ後、平衡化することが見出された。平衡相に対し算出したＲＭＳＤは、全Ｌ  ＣＰ及び２Ｄ−ＣＰそれぞれ、２．１６及び３．３９である。２Ｄ−ＣＰのＲＭＳＤは、全Ｌ  ＣＰのＲＭＳＤより６０％高く、この場合もやはり、２Ｄ−ＣＰが、全Ｌ  ＣＰより安定性の低い二次構造を示すことを示している。
【０１３８】
（ｉｉ）脂質二重層モデルでの分子動力学シミュレーション：本発明者はさらに、脂質二重層モデルにおいて１０ナノ秒間、分子動力学シミュレーションを行って全Ｌ  ＣＰ及び２Ｄ−ＣＰの二次構造の安定性を比較した。分子動力学シミュレーションの結果得られる二次構造の比較は、全Ｌ  ＣＰが、２Ｄ−ＣＰ変異体では失われるそのα−ヘリカル構造を維持することを示す。全Ｌ  ＣＰ及び２Ｄ−ＣＰペプチドの安定性は、平衡状態で比較した。分子構造としてのＲＭＳＤ増加は、当初の構造から逸れ、いったん新規の安定したコンフォメーションが得られると停滞期に入る。全Ｌ  ＣＰが、ヘリカル構造を維持したのに対し、２Ｄ−ＣＰは螺旋性を失っていた。２つのペプチドについてＣＡのＲＭＳＤを比較した場合、野生型全Ｌ  ＣＰ及び２Ｄ−ＣＰはいずれも、脂質二重層で約４ｎｓ後、平衡化することが見出された。平衡相に対し算出したＲＭＳＤは、全Ｌ  ＣＰ及び２Ｄ−ＣＰそれぞれ、０．２５ｎｍ（図１Ｄ）及び０．４ｎｍ（図１Ｅ）である。２Ｄ−ＣＰのＲＭＳＤは、全Ｌ  ＣＰのＲＭＳＤより６２．５％高く、この場合もやはり、２Ｄ−ＣＰが、全Ｌ  ＣＰより安定性の低い二次構造を示すことを示している。２つのペプチドの、二重層への挿入後の膜密度に与える影響に、有意差は認められなかった。
【０１３９】
結論として、このコンピュータ分析と、ＣＤスペクトルのコンピュータ分析を併せた結果、２つのＤ  ａａは、全Ｌ  ＣＰペプチドでとられる右巻きα−ヘリカル構造を乱すことを示す。
【０１４０】
実施例２  ＣＰのα−ヘリカル構造はＴ細胞の結合及び共局在化に必要ではない
ＣＰペプチドは、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体に自らを挿入し、この同種抗原により誘発されるＴ細胞活性化を妨げることが記載されている（Ｍａｎｏｌｉｏｓ等、１９９７年；Ｗａｎｇ等、２００２年；Ｗａｎｇ等、２００２年ｂ）。ＣＰ−ＣＤ３／ＴＣＲ相互作用に対する二次構造の寄与を、Ｔ細胞膜におけるローダミン標識２Ｄ−ＣＰ及びＴＣＲ特異的ＦＩＴＣ標識抗体（αＴＣＲ−ＦＩＴＣ）の共局在化を試験して分析した。図２は、αＴＣＲ−ＦＩＴＣ及びローダミン２Ｄ−ＣＰの共局在化を表す（図２）。これは、２Ｄ−ＣＰ類似体が、野生型ＣＰで見られたように、Ｔ細胞膜に挿入し、ＴＣＲと共局在化することを示唆している（Ｇｅｒｂｅｒ等、２００５年；Ｗａｎｇ等、２００２年ｂ）。
【０１４１】
これらの共局在化の結果を確かめるため、本発明者らは、ローダミン２Ｄ−ＣＰ及びαＴＣＲ−ＦＩＴＣ間の蛍光エネルギー転移実験を行った。５４３ｎｍレーザーを用いて、高輝度のローダミン２Ｄ−ＣＰ及びαＴＣＲ−ＦＩＴＣを示すＴ細胞膜上の点を照射し、ローダミン２Ｄ−ＣＰにより発生したシグナルを退色させたが、αＴＣＲ−ＦＩＴＣにより発生した発光はそのままにした。この処置は、図２Ｄに示したαＴＣＲ−ＦＩＴＣ蛍光の有意な増加をもたらした。５０５〜５２５ｎｍ範囲にある増加したシグナル源としての自己蛍光を除外するため、２つの対照を使用した。１つ目は、同じ位置を、４８８ｎｍレーザーで退色させた。この結果、シグナルの完全な退色が得られた。これは、上記に見られる蛍光増加は、ＦＩＴＣプローブにより発生したこと、試料における自己蛍光の結果ではないことを示唆するものである。２つ目は、本発明者らは、蛍光シグナルを示さないローダミン２Ｄ−ＣＰ及びαＴＣＲ−ＦＩＴＣで染色した細胞表面の点を選択し、５４３ｎｍレーザーでこれを退色させた。ＦＩＴＣ蛍光の増加は観察されなかった。これは、ＦＩＴＣの範囲にある蛍光源としての自己蛍光を除外するものである。全体として、これらの結果は、野生型ＣＰ及びこの２Ｄ−ＣＰ立体異性体が、これらの二次構造の相違とは無関係に、Ｔ細胞膜において同じ局在化を示すことを追認する。
【０１４２】
次に、共局在化実験を行った。ＴＣＲ／ＣＰ、ＴＣＲ／２Ｄ−ＣＰ及びＴＣＲ／２Ｇ−ＣＰ相互作用の親和性を、異なる濃度のＲｈｏ−標識ＣＰ、２Ｄ−ＣＰ及び２Ｇ−ＣＰペプチドにより一連の共沈実験を行って比較した。図６は、ＣＰ及び２Ｄ−ＣＰがいずれも、ＴＣＲと共沈できることを示すが、ＴＣＲ／ＣＰ相互作用は、親和性が高いように思われる。ＣＰ及び２Ｄ−ＣＰはいずれも、２Ｇ−ＣＰ変異体より著しくＴＣＲと相互作用する。一方、対照受容体として使用されたＭＨＣ  Ｉ分子と共に、著しく共沈したペプチドはなかった。これらの結果は、さらに、２Ｄ−ＣＰのＴＣＲ分子との特異的相互作用を裏付ける。
【０１４３】
実施例３  ２Ｄ−ＣＰはインビトロでのＴ細胞活性化と相互作用する
本明細書に示された共局在化試験（図２）は、ＣＰの二次構造が、Ｔ細胞膜に挿入し、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体と相互作用するＣＰの能力に不可欠ではないことを示した。ＣＰの二次構造が、抗原によるＴ細胞活性化をＣＰが妨げることに寄与したかどうかをテストするため、本発明者らは、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｍｔ）免疫したラット由来のリンパ節細胞（ＬＮＣ）を単離し、ツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）又はＭｔ１７６−９０ペプチドにより、インビトロでＴ細胞を活性化した。ＰＰＤ及びＭｔ１７６−９０はいずれも、Ｍｔ免疫したラットのＬＮＣにおいて強いＴ細胞増殖反応を誘導することが報告されている（Ｑｕｉｎｔａｎａ等、２００２年；Ｑｕｉｎｔａｎａ等、２００３年）。野生型全Ｌ  ＣＰ及び２Ｄ−ＣＰはいずれも、ＰＰＤ及びＭｔ１７６−９０に対するＴ細胞増殖を、用量依存的な形で阻害した（図３）。しかし、特筆すべきことは、低濃度では、２Ｄ−ＣＰの阻害が、全Ｌ  ＣＰにより生じる阻害より幾分大きかった（ｐ＜０．０２）点である（図３Ｂ）。反対に、２Ｇ  ＣＰ変異体は、Ｔ細胞増殖に対しいかなる阻害作用も有さなかった。このことは、阻害が配列特異的であること、重大な分子相互作用が、Ｇｌｙ残基を２個の陽性ａａが置換することで乱されたことを示唆するものである（図１参照）。いずれのペプチド（全Ｌ  ＣＰ、２Ｄ−ＣＰ又は２Ｇ  ＣＰ）も、標的細胞と共にインキュベートした場合、毒性作用を有さなかった。このことは、抗原誘発増殖に対する影響は、細胞死が原因であったことを除外するものである。故に、ＣＰの二次構造は、Ｔ細胞活性化に対するＣＰの阻害作用に必要ではないと思われる。Ｔ細胞活性化は、２Ｇ  ＣＰ変異体により証明された通り、正確な側鎖相互作用に依存したままであった。
【０１４４】
実施例４  ２Ｄ−ＣＰはインビボでのＴ細胞免疫を阻害する
次に、インビボでのＴ細胞活性化において、ＣＰ阻害作用に対する二次構造及び側鎖の寄与を、実験的自己免疫疾患アジュバント関節炎（ＡＡ）を用いて分析した。ルイスラットのＭｔによる免疫化は、自己抗原と交差反応する、Ｍｔ特異的Ｔ細胞により誘発される自己免疫疾患、ＡＡを誘発する（Ｈｏｌｏｓｈｉｔｚ等、１９８４年；Ｈｏｌｏｓｈｉｔｚ等、１９８３年）。ＰＰＤ及びＭｔ１７６−９０は、関節炎を発症させるＴ細胞応答により標的される（Ａｎｄｅｒｔｏｎ等、１９９４年）。実際、関節炎の進行を阻害する免疫調節療法は、ＰＰＤ及びＭｔ１７６−９０に対するＴ細胞応答の低下、及びＰＰＤに対する遅延型過敏（ＤＴＨ）反応の減弱に関連している（ｖａｎ  Ｅｄｅｎ等、１９８５年）。
【０１４５】
ＡＡ誘導時にＭｔと共に全Ｌ  ＣＰ又は２Ｄ−ＣＰを投与した結果、臨床スコアの点でも（図４Ａ）、肢の腫脹の点でも（図４Ｂ）著しく軽度の関節炎をもたらした。２Ｇ  ＣＰペプチドは、ＡＡに影響しなかった。平均最大スコアは、２Ｇ  ＣＰ治療したラットで１２±０．３であったのに対し、２Ｄ−ＣＰ治療したラットで６．６±０．７及び全Ｌ  ＣＰ群で７．７±０．７であった（２Ｇ  ＣＰ群と比較した場合、全Ｌ  ＣＰ及び２Ｄ−ＣＰ群ではｐ＜０．０５）。２Ｄ−ＣＰの用量が、ラットあたり９００μｇに増加すると、ＡＡスコアはさらに２５％低下し（データ不図示）、肢の腫脹は５０％改善した（図４Ｃ）ことから、２Ｄ−ＣＰのＡＡに対する影響は、用量依存的であった。
【０１４６】
ＡＡ誘導後１６日目のＰＰＤに対するＤＴＨ反応の試験は、野生型全Ｌ  ＣＰ又は２Ｄ−ＣＰの投与が、ＰＰＤに対するＤＴＨ反応を、それぞれ３９％及び５１％減少させることにつながったことを明らかにした。２Ｇ  ＣＰによる治療は、ＤＴＨ反応の８．５％の阻害をもたらすのみであった。
【０１４７】
以上のことから、これらの結果は、２Ｄ−ＣＰ及び野生型全Ｌ  ＣＰはいずれも、ペプチドの二次構造に依存しない配列特異的な形で、インビボでＴ細胞活性化を妨げうることを示している。
【０１４８】
実施例５  ２Ｄ−ＣＰは治療設定においてＤＴＨ反応を減少させる
ＴＣＲ膜貫通ペプチドが、既存のＤＴＨ反応性の誘出を阻害するかどうかテストするため、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス群を、２％オキサゾロンに感作した。５日後、マウスを、０．５％オキサゾロンを耳に投与して曝露した。曝露１時間後、マウスを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＭＳＯ中の全Ｌ  ＣＰ  １５０μｇ（６ｍｇ／ｋｇ）、ＤＭＳＯ中の２Ｄ−ＣＰ  １５０μｇ（６ｍｇ／ｋｇ）、又はデキサメタゾンを局所適用して治療した。翌日、耳の厚さを、ＤＭＳＯで治療したマウスの腫脹（０．３３±０．０１ｍｍ）により測定し、全Ｌ  ＣＰ（０．３０±０．０１ｍｍ）、２Ｄ−ＣＰ（０．２７±０．０１ｍｍ）及びデキサメタゾン（０．１５±０．０２ｍｍ）で治療したマウスの腫脹と比較した。耳の腫脹の有意な減少が、２Ｄ−ＣＰで治療したマウスにおいて観察された（ＤＭＳＯ群と比較した場合、ｐ＜０．０１）。実際、２Ｄ−ＣＰは、全Ｌ  ＣＰによる治療で生じた減少の２倍の減少をもたらした（ＤＭＳＯ群と比較した場合、ｐ＜０．０５）（図５）。故に、２Ｄ−ＣＰは、既に抗原に感作した被験者におけるＴ細胞媒介免疫応答を阻害することができる。
【０１４９】
実施例６  ＣＰ親油性結合体。
（ｉ）材料
４−メチル  ベンジドリルアミン樹脂（ＢＨＡ）及びブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）アミノ酸は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏ．（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ  ＵＳＡ）から購入した。ペプチド合成に使用した他の試薬には、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、Ｓｉｇｍａ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、Ｓｉｇｍａ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、Ｆｌｕｋａ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１−ＨＯＢＴ、Ｐｉｅｒｃｅ）、及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、ペプチド合成グレード、Ｂｉｏｌａｂ、ＩＬ）が挙げられる。他の試薬は全て、分析グレードである。緩衝液は、再蒸留水で調製する。
【０１５０】
（ｉｉ）ペプチド合成、アシル化及び精製
ペプチドを、４−メチル  ベンジドリルアミン樹脂（ＢＨＡ）（０．０５ｍｅｑ）（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ等、１９８２年；Ｓｈａｉ等、１９９０年）において固相法により合成する。樹脂結合ペプチドを、フッ化水素（ＨＦ）で樹脂から切断し、ＨＦ蒸発、及び乾燥エーテルで洗浄後、５０％アセトニトリル／水により抽出した。ＢＨＡ樹脂結合ペプチドのＨＦ切断は、Ｃ末端アミド化ペプチドをもたらす。粗ペプチド製剤を、ＲＰ−ＨＰＬＣにかける。合成ペプチドを、さらに、Ｃ１８逆相Ｂｉｏ−Ｒａｄセミ分取カラム（２５０×１０ｍｍ、３００ｎｍ細孔径、５−μｍ粒子径）でＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。カラムを、０．０５％  ＴＦＡ（ｖ／ｖ）も含有する水中での２５〜６０％アセトニトリル直線勾配を、流速１．８ｍｌ／分にて用い、４０分で溶出する。次いで、精製ペプチドを、分析ＨＰＬＣ、アミノ酸分析及びエレクトロスプレー質量分析にかけ、この組成及び分子量を確認した。脂肪酸を、ペプチド合成のため保護アミノ酸を結合するのに使用したのと同じプロトコルにより、ペプチドのＮ末端に結合する。
【０１５１】
以下のリポペプチドを、本明細書に記載の通りに合成する。デカン酸（ＤＡ）、ウンデカン酸（ＵＡ）、及びオクタン酸（ＯＡ）を、ジアステレオマーＣＰ由来ペプチドに結合して以下の親油性結合体を得る。
【化１１】
2009508937.tif 000015
【０１５２】
（ｉｉｉ）インビトロアッセイ
次いで、実施例３に記載した通り、インビトロでのＴ細胞活性化を妨げるリポペプチドの能力について調べる。
【０１５３】
（ｉｖ）インビボアッセイ
リポペプチドを、実施例４及び５に記載した通り、Ｔ細胞活性化のインビボアッセイにかける。
【０１５４】
Ｂ．全Ｄペプチド
ペプチド合成及び蛍光標識
ペプチドを、ＰＡＭ−アミノ酸樹脂（０．１５ｍｅｑ）の固相により合成した。合成ペプチドを、０．０５％ＴＦＡにおける２０〜６０％アセトニトリルの直線勾配を用いてＣ４カラムでＲＰ−ＨＰＬＣにより６０分間精製した（＞９８％均一性）。ペプチドを、アミノ酸分析及び質量分析にかけ、これらの組成を確認した。特に指定のない限り、ＤＭＳＯ中の濃縮ペプチド原液を、使用前のペプチド凝集を回避するのに使用した。各実験では、ＤＭＳＯの最終濃度は、研究中のシステムに影響しなかった。樹脂結合ペプチドを、それぞれ、４−クロロ−７−ニトロベンゼン−２−オキサ１，３−ジアゾール  フルオリド（ＮＢＤ−Ｆ）又は５−カルボキシテトラメチルローダミン、スクシニミジル  エステル（５−ＴＡＭＲＡ，ＳＥ（ローダミン−ＳＥ）で処理した。ＮＢＤ−Ｆとの反応は、ＤＭＦ単独中で生じ、ローダミンとの反応は、２％ジイソプロピルエチルアミン含有ＤＭＦ中であった。蛍光プローブを、２当量を超えて使用し、樹脂結合Ｎ末端ＮＢＤペプチド又はローダミンペプチドを形成した。１時間後、樹脂をＤＭＦ、次いで塩化メチレンで完全に洗浄した。精製ペプチドは全て、分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより均一である（＞９８％）ことを示した。
【０１５５】
表３は、実施例７〜１０で使用されたペプチドの配列及び割り当てを示す。
表３．ペプチドの割り当て及び配列
【表３】
2009508937.tif 000016
【０１５６】
円偏光二色性（ＣＤ）分光法
ペプチドのＣＤスペクトルは、Ａｖｉｖ  ２０２分光偏光計で測定した。スペクトルを、１ｍｍ経路長で温度規定の石英光学セルにより走査した。各スペクトルを、２６０から１９０ｎｍの波長範囲で、平均化時間２０秒で１ｎｍ間隔にて記録した。ペプチドを、１％ＬＰＣミセルにおいて１００μＭ濃度で走査した。
【０１５７】
動物
２カ月齢のメスのルイスラットを使用した。ラットは、ワイツマン科学研究所の動物育種センターにおいて無菌条件下で飼育し、維持した。実験は、動物福祉委員会の監督及びガイドライン下で行った。
【０１５８】
Ｔ細胞増殖
Ｔ細胞増殖アッセイは、Ｍｔ１７６−９０ペプチドと反応する、リンパ節細胞（ＬＮＣ）又はＡ２ｂ  Ｔ細胞系を用いて行った。ＰＰＤ及びＭｔ１７６−９０に対する強いＴ細胞応答が検出できる場合、膝下及び鼠径ＬＮＣを、不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）中のヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｍｔ）の注射後２６日目に除去した。ＬＮＣを、２×１０５細胞／ウェルの濃度で培養し、５×１０４  Ａ２ｂ  Ｔ細胞を、以前に記載されている通りに調製した、ウェルあたり、照射した５×１０５胸腺抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で刺激した。細胞を、種々の濃度の試験下ペプチドの存在下で、抗原有り又は抗原無しで、２００μｌ丸底マイクロタイターウェルに４通りに播種した。培養物を、７．５％ＣＯ２の加湿雰囲気で３７℃にて７２時間インキュベートした。Ｔ細胞応答は、インキュベーションの最後の１８時間で添加した、［メチル−３Ｈ］−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、バッキンガムシャー、ＵＫ；１μＣｉ／ウェル）の取り込みにより検出した。Ｔ細胞増殖実験の結果を、ペプチド非存在下で抗原により誘発したＴ細胞増殖の阻害の％として示す。
【０１５９】
アジュバント関節炎（ＡＡ）の誘導及び評価
インビボでのＴ細胞活性化に与えるＣＰの影響をテストするため、モデル系としてＡＡを使用した。ＡＡは、尾の基底にＩＦＡ（０．５ｍｇ／ｍｌ）で懸濁したＭｔ  ５０μｌを注射して誘導した。ＡＡ誘導時に、各ラットは、ＩＦＡ  ５０μｌで溶解し、ＡＡを誘導するのに使用したＭｔ／ＩＦＡと混合したＬ−ＣＰ、Ｄ−ＣＰ又は２Ｇ  ＣＰ対照ペプチド（又はＰＢＳ）１００μｇも投与された。ＡＡ誘導日は、０日目とした。疾患重症度は、各動物の４肢全てを直接観察して評価した。０から４の間の相対スコアを、関節の炎症、発赤及び変形の程度に基づき、各肢に割り当てた。したがって、各動物の最大となるスコアは、１６であった。平均ＡＡスコア（±ＳＥＭ）を、各実験群について示す。関節炎はまた、キャリパーで後肢径を測定して定量化した。測定は、ＡＡ誘導当日及び２６日後（ＡＡピーク時）に行った。結果を、各群の動物全てについて２値間の差の平均±ＳＥＭで示す。疾患をスコア化する者は、群のアイデンティティを盲検化された。
【０１６０】
遅延型過敏反応（ＤＴＨ）
ＰＰＤ２０μｌ（ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍｌ）を、ＡＡ誘導後１６日目に右耳の耳介に皮内注射した。滅菌ＰＢＳ２０μｌを、対照として左耳に注射した。耳の厚さを、ノギスを用いて４８時間後に測定し、左右の耳の差として表した。
【０１６１】
蛍光顕微鏡法
活性化したＴ細胞（１０５細胞／試料）を、パラ−ホルムアルデヒド４％含有ＰＢＳ１００μｌで１５分間、氷上でインキュベートした。次いで、試料を、冷たいＰＢＳで洗浄し、１１００ｒｐｍにて７分間遠心分離した。次いで、ＢＳＡ１％含有ＰＢＳを、非特異的結合を防止するため周囲温度で添加した。３０分後、ＴＣＲに対するＦＩＴＣ標識抗体を、１：１００の希釈で添加し、２．５時間インキュベートした。ＴＣＲのペプチドとの共局在化では、Ｌ−ＣＰ−Ｒｈｏ、Ｄ−ＣＰ−Ｒｈｏ又は２Ｄ  ＣＰ−Ｒｈｏを、最終濃度１μＭ（ＤＭＳＯ原液）で添加し、５分間インキュベートした。次いで、試料を、ＰＢＳで１回洗浄し、顕微鏡用スライドに添加した。
【０１６２】
次いで、細胞を、蛍光共焦点顕微鏡下で観察した。ＦＩＴＣ励起は、フルオロフォアの退色を最小化するためレーザーを２０％パワーに設定して、４８８ｎｍとした。蛍光データは、５０５〜５２５ｎｍから回収した。ローダミン励起は、レーザーを５％パワーに設定して、５４３ｎｍとした。蛍光データは、５６０ｎｍ以上から回収した。
【０１６３】
ＦＩＴＣ（ドナー）及びローダミン（アクセプター）間のＦＲＥＴを、ローダミンプローブが退色した領域のＦＩＴＣ蛍光の増加として観察した。退色は、レーザーを１００％に設定して５４３ｎｍで６秒間、点励起により達成した。ＦＩＴＣ蛍光の増加は、自己蛍光が原因でないことを検証するため、本発明者は、４８８ｎｍレーザーを用いて、次いで５４３ｎｍのみで退色させた。５０５〜５２５ｎｍ又は５６０＜のどちらにおいても信号は観察されず、自己蛍光の可能性は排除された。
【０１６４】
実施例７  Ｄ−ＣＰはＬ−ＣＰの構造的鏡像である
３つのＣＰペプチドを化学合成した：標的抗原によるＴ細胞活性化を阻害することが示されている野生型Ｌ−ＣＰ；第１のペプチドの鏡像であるＤ−ＣＰ；及び不活性変異体ペプチド（２Ｇ  ＣＰ）。表３は、ペプチド配列及び割り当てを示し、図７は、２つのジアステレオマーの構造的違いを、標準ヘリカル構造を想定して視覚的に示す。Ｄ−ＣＰでは２つの分厚い陽性側鎖が、Ｌ−ＣＰの陽性側鎖の反対方向を向いていることに注目。
【０１６５】
Ｄ−ＣＰの二次構造が、実際にＬ−ＣＰの鏡像であることを確実にするため、円偏光二色性実験を行った。実験は、Ｍｅｌｙｎｋ等、２００４年に記載されている通り、膜環境を刺激するため両性イオン界面活性剤（Ｈ２Ｏ中１％ＬＰＣ）において行った。Ｄ−ＣＰのスペクトルは、Ｌ−ＣＰのまさしく鏡像であることが見出された（図８）。両方とも部分的にヘリカルである。両方のペプチドは、９  ａａ長であるため、これらの構造は、完全長タンパク質の状況での構造よりも不安定である可能性があることに注目。
【０１６６】
実施例８  Ｄ−ＣＰはＬ−ＣＰと同様にＴ細胞活性化を妨げる
本発明者は、Ｍｔ抗原ＰＰＤ又はＭｔ１７６−９０ペプチドに対する、Ｍｔ免疫したラット由来のＬＮＣのＴ細胞応答を試験した。これらの抗原は、ＡＡラットの所属ＬＮＣ（ｄｒａｉｎｉｎｇ  ＬＮＣ）においてＴ細胞から強力な増殖応答を誘導することが知られている。図９Ａ及び９Ｂは、Ｌ−ＣＰ及びＤ−ＣＰが、ＰＰＤ及びＭｔ１７６−９０に対するＴ細胞増殖応答を用量依存的な形で阻害したことを示す。さらに、２Ｇ  ＣＰに阻害作用はなかった。このことは、阻害が配列特異的であること、重大な分子相互作用が、Ｇｌｙ残基を２個の陽性ａａが置換することで乱されたことを示唆するものである（表３参照）。Ｌ−ＣＰ、Ｄ−ＣＰ及び２Ｇ  ＣＰは、細胞と共にインキュベートした場合、毒性作用を有さなかった。このことは、抗原誘発増殖に対するＬ及びＤ−ＣＰペプチドの阻害作用は、細胞死が原因であったことを除外するものである。興味深いことに、低濃度では、Ｄ−ＣＰの阻害は、Ｌ−ＣＰの阻害よりも一貫して高い。
【０１６７】
実施例９  Ｄ−ＣＰはＬ−ＣＰと同程度にインビボでのＴ細胞免疫を阻害する
インビボでの特異的Ｔ細胞の活性化に与えるＣＰの阻害作用をテストするため、アジュバント関節炎（ＡＡ）モデルを使用した。ルイスラットの油中Ｍｔによる免疫化は、自己抗原と交差反応するＭｔ特異的Ｔ細胞により誘発される実験的自己免疫疾患、ＡＡを誘発する。Ｍｔ１７６−９０特異的Ｔ細胞は、ＡＡ誘導において検出することができる。実際、Ａ２ｂ  Ｔ細胞クローンは、軟骨と交差反応しＡＡを媒介する。Ｌ及びＤ−ＣＰは、インビトロでのＰＰＤ及びＭｔ１７６−９０に対する、初回免疫したＬＮＣ及びクローンＡ２ｂとのＴ細胞応答を阻害したため（図９）、本発明者は、ＡＡを誘発するインビボでのＴ細胞活性化に与えるＬ−及びＤ−ＣＰの影響も調査した。ＡＡ誘導時に抗原を投与されたＤ−ＣＰ又はＬ−ＣＰは、臨床スコアの点でも（図１０Ａ）、足首の腫脹の点でも（図１０Ｂ）著しく軽度の関節炎をもたらした。対照ペプチド２Ｇ  ＣＰは、ＡＡを阻害しなかった。平均最大スコアは、対照治療したラットで１２±０．３であったのに対し、Ｄ−ＣＰ治療したラットで６±０．７及びＬ−ＣＰ治療したラットで７．３±０．７であった（対照群と比較した場合、Ｌ及びＤ−ＣＰ群ではｐ＜０．０５）。
【０１６８】
ＡＡを媒介するＴ細胞活性化は、ＰＰＤに対する遅延型過敏（ＤＴＨ）反応を試験してインビボで検出することもできる。本発明者は、３つのペプチドで治療したラットにおけるＡＡ誘導後１６日目のＰＰＤに対するＤＴＨ反応を試験した。図１１は、Ｄ−ＣＰ又はＬ−ＣＰの投与が、ＰＰＤに対するＤＴＨ反応を、それぞれ４８％及び３９％減少させたのに対し、２Ｇ  ＣＰペプチドによる治療により生じた阻害は、１０％未満であったことを示す。
【０１６９】
以上のことから、これらの結果は、Ｄ及びＬ−ＣＰはいずれも、特異的抗原により誘導されたＴ細胞活性化をインビボで妨げることができることを示している。この妨害は、Ｍｔ抗原との反応において、より軽度のＡＡをもたらし（図１０Ａ及び１０Ｂ）、ＤＴＨ反応性を低下させた（図１１）。さらに、インビボでのＤ−ＣＰの影響は、Ｌ−ＣＰよりも大きいように思われる。
【０１７０】
実施例１０  Ｌ−ＣＰ及びＤ−ＣＰのＴＣＲとの共局在化
ＣＰペプチドは、ＴＣＲとＣＤ３との間のシグナルを脱共役することで機能するため、これらは、受容体複合体と共局在化する必要がある。この仮説をテストするため、本発明者は、ＴＣＲに対するＦＩＴＣ標識抗体、及びローダミン標識したＬ−ＣＰ又はＤ−ＣＰでＴ細胞を標識した。ＴＣＲの標識は、活性化Ｔ細胞のキャッピング現象特性を示した。ＴＣＲとＣＰのＬ又はＤ類似体との間にほぼ完全な重なりが認められた。これらの結果は、ＣＰ類似体は、Ｔ細胞膜に結合し、キャッピング領域内でＴＣＲと共局在化することを示す。本発明者は、同じ結果がＮＢＤ標識ペプチド及びＰＥ標識ＴＣＲで得られたことから、標識は共局在化に影響しないと考える。
【０１７１】
共局在化の結果を裏付けるため、本発明者は、ＣＰペプチドとＴＣＲとの間の蛍光エネルギー転移を実証する一連の退色実験を行った。本発明者は、５４３ｎｍレーザーを用いて、高輝度のローダミン及びＦＩＴＣを示す細胞膜上の点を退色させた。こうして、ＣＰローダミン退色ペプチドが退色されたのに対し、ＴＣＲα−ＦＩＴＣは影響されなかった。この処置は、図１２の矢印に示された、ＴＣＲα−ＦＩＴＣ蛍光の有意な増加をもたらした。故に、本発明者は、ＴＣＲとＬ−ＣＰ又はＤ−ＣＰペプチドとの間で蛍光エネルギー転移が生じると結論することができた。５０５から５２５ｎｍ範囲にある増加したシグナル源としての自己蛍光の可能性を除外するため、本発明者は２つの対照実験を行った。１つ目は、同じ位置を、４８８ｎｍレーザーで退色させた。この結果、シグナルの完全な退色が得られた。これは、上述の蛍光増加が、試料からの自己蛍光というよりＦＩＴＣプローブにより発生することを示唆するものである。次に、本発明者は、ほとんどシグナルのない位置で５４３ｎｍレーザーにより退色させた。細胞は影響されないままであり、ＦＩＴＣ蛍光の増加を観察することはなかった。これは、ＦＩＴＣの同じスペクトル範囲での自己蛍光の可能性を排除するものである。
【０１７２】
前述の特定の実施形態は、他の者が、現在の知見を応用して、過度な実験を行うことなく、及び類概念から逸脱することなく、このような特定の実施形態の修正及び／又は種々の適用を容易に行うことができるように、本発明の一般的性質を充分に明らかにするであろう。したがって、このような適応及び修正は、開示された実施形態の均等物の意味及び範囲内で理解されるべきであり、理解されることが意図される。本発明は、この特定の実施形態と併せて記載されたが、多くの代替、修正及びバリエーションが当業者には明らかであろうことは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広範な範囲内にあるこのような代替、修正及びバリエーションを全て含むことが意図される。
【０１７３】
詳細な記述及び特定の実施例は、本発明の趣旨及び範囲内の種々の変更及び修正が、この詳細な記述から当業者には明らかになるため、本発明の好ましい実施形態を示しつつ、実例としてのみ与えられる。
「引用文献」
2009508937.tif 000017
2009508937.tif 000018
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】２Ｄ−ＣＰは、α−ヘリカル構造に折り畳まれないことを示す図である。Ａ．Ｈ２Ｏ中の２Ｄ−ＣＰ（黒い菱形）、１％ＬＰＣミセル中の２Ｄ−ＣＰ（白い菱形）及び１％ＬＰＣミセル中の全Ｌ  ＣＰ（白い四角）のＣＤスペクトル。Ｂ．分子動力学シミュレーションにより生まれた全Ｌ  ＣＰ（左）及び２Ｄ−ＣＰ（右）の構造。Ｄ  ａａが、ＣＰのα−ヘリカル構造を乱すことを示す。Ｃ．脂質二重層における初回５ｎｓの全Ｌ  ＣＰ刺激を通じた全原子のＲＭＳＤプロフィル。Ｄ．２Ｄ−ＣＰのＲＭＳＤプロフィル。
【図２】２Ｄ−ＣＰペプチドは、ＴＣＲ受容体と共局在化することを示す図である。Ａ．ＴＣＲが、ＴＣＲ−ＦＩＴＣ抗体により視覚化されている。励起は４８８ｎｍであり、発光は５０５から５２５ｎｍの間で回収された。Ｂ．２Ｄ−ＣＰは、Ｎ末端に結合したローダミンプローブにより視覚化された。励起は５４３ｎｍであり、発光は５６０ｎｍ以上から回収された。Ｃ．退色前の２つの経路の融合は、２Ｄ−ＣＰがＴＣＲと共局在化することを示す。Ｄ．円は、退色した領域を囲んでいる。退色は、レーザー（５４３ｎｍ）を６秒間、１００％パワーに設定して達成された。故に、ＦＩＴＣドナー分子は、影響されなかった。緑色の増加は、ローダミン標識２Ｄ−ＣＰペプチドとＴＣＲ−ＦＩＴＣとの間に蛍光エネルギー転移があったことを示す。
【図３】２Ｄ−ＣＰペプチドは、Ｔ細胞活性化を妨げることを示す図である。Ｍｔ初回免疫したラット由来のＬＮＣは、野生型全Ｌ  ＣＰ（黒）、２Ｄ−ＣＰ（グレー）又は２Ｇ  ＣＰ（白）の存在下、ＰＰＤ（Ａ）又はＭｔ１７６−９０（Ｂ）によりインビトロで活性化された。
【図４】野生型及び２Ｄ−ＣＰによるアジュバント関節炎（ＡＡ）の阻害を示す図である。アジュバント関節炎は、油中Ｍｔにより誘導され、全Ｌ  ＣＰ（野生型）、２Ｄ−ＣＰ、２Ｇ  ＣＰ又はＰＢＳと混合された。関節炎は、１０日目から２〜３日ごとにスコア化された。Ａ．平均±ＳＥＭで表されたＡＡスコアの時間的経過。２Ｄ−ＣＰ又は全Ｌ  ＣＰ治療した動物の結果を、ＰＢＳ又は２Ｇ  ＣＰで治療した対照群の結果と比較した場合、ｐ＜０．０５。Ｂ．ＡＡ誘導後２６日目に測定された肢の腫脹。結果は、０及び２６日目に測定された後肢径の２値間の差の平均±ＳＥＭで表されている。ＰＢＳ又は２Ｇ  ＣＰで治療した対照群と全Ｌ  又は２Ｄ−ＣＰ治療したラット（ｐ＜０．０５）との間では、ｐ＜０．０５。Ｃ．２６日目に肢の腫脹により測定された、２Ｄ−ＣＰのＡＡに与える影響の用量依存性。Ｄ．ペプチドの、Ｍｔに対する免疫応答に与える影響を定量化するため、ＤＴＨは、方法のセクションに記載の通りに測定された。結果は、Ｍｔに対する阻害されないＤＴＨ反応のパーセントで表されている。全Ｌ  ＣＰ又は２Ｄ−ＣＰで治療したラットにおいて観察された減少は、２Ｇ  ＣＰの影響と比較した場合、有意（ｐ＜０．０５）である。
【図５】２Ｄ−ＣＰは、マウスにおけるオキサゾロンに対するＤＴＨ反応を阻害することを示す図である。ＤＭＳＯ単独、全Ｌ  ＣＰ、２Ｄ−ＣＰ又はデキサメタゾンで治療したマウスの、オキサゾロンによる初回免疫１時間後に測定されたＤＴＨ反応。結果は、デキサメタゾン治療マウスで観察された減少（１００％とみなした）と比較した、ペプチド治療後に得られた耳の厚さの減少、±ＳＥＭとして表されている。
【図６】ＣＰ及び２Ｄ−ＣＰはいずれもＴＣＲと共に免疫共沈降することを示す図である。ＣＰ、２Ｄ−ＣＰ又は２Ｇ−ＣＰは、活性化Ａ２Ｂ細胞、及び（ａ）ＴＣＲ又は（ｂ）ＭＨＣ  Ｉ分子のいずれかと共にインキュベートされ、免疫共沈降された。ＣＰ及び２Ｄ−ＣＰは、２Ｇ−ＣＰ変異体よりも有意にＴＣＲと共に免疫共沈降した。ペプチドは、有意な程度ではＭＨＣ  Ｉ分子と共に免疫共沈降しなかった。
【図７】Ｌ及びＤ−ＣＰ間の構造差を説明する図である。側鎖位置に与えるＤ−アミノ酸置換の影響を実証するため、アルギニン及びリシンの側鎖が可視化される。Ｄ−ＣＰ骨格は、野生型類似体よりも反対方向に向いている。
【図８】Ｌ及びＤ−ＣＰはいずれも鏡像構造を有することを示す図である。Ｌ−ＣＰ（三角）及びＤ−ＣＰ（菱形）の遠紫外線円偏光二色性スペクトルは、膜模倣環境（１％ＬＰＣ）において回収された。スペクトルは、０．１ｃｍ光路を用いて、２０秒平均化時間で１ｎｍ間隔にてＡｖｉｖ分光偏光計で測定された。Ｙ軸は、１％ＬＰＣ単独のバックグラウンドスペクトルを減じた後の生データ（ｍｄｅｇ）を表す。構造は、このような短ペプチドで期待されうる標準α−ヘリックスではない（ランダムコイルコンフォメーションを有する集団にはありがちである）。しかし、Ｌ−ＣＰ及びＤ−ＣＰのスペクトルは、まさしく鏡像である。
【図９】Ｌ及びＤ−ＣＰはいずれも、同じようにインビトロでＴ細胞を不活性化することを示す図である。Ｔ細胞活性化の阻害は、抗原特異的活性化後の以下の増殖により測定された。Ｔ細胞は、ＰＰＤ（Ａ）又はＭｔ１７６−９０（Ｂ）により活性化された。活性化は、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ及び７５μｇ／ｍｌの濃度で、Ｌ−ＣＰ（黒）、Ｄ−ＣＰ（グレー）又は２Ｇ  ＣＰ（白）の存在下で生じた。
【図１０】Ｌ及びＤ−ＣＰによるＡＡの阻害を示す図である。ＡＡは、油中Ｍｔに対する免疫化により誘導され、Ｌ−ＣＰ、Ｄ−ＣＰ、２Ｇ  ＣＰ又はＰＢＳと混合された（１群あたり３ラット）。関節炎は、１０日目から２〜３日ごとにスコア化された。パネルＡは、ＡＡ疾患の時間的経過を示す。パネルＢは、ＡＡ誘導後２６日目に測定された肢の腫脹を示す。結果は、０及び２６日目に測定された後肢径の値間の差の平均±ＳＥＭで表されている。Ｌ及びＤ−ＣＰいずれの存在も、対照群に比べてＡＡの重症度を有意に低下させる（ｐ＜０．０５）。
【図１１】Ｌ−ＣＰ及びＤ−ＣＰはインビボでの細胞性免疫応答に影響することを示す図である。ラットは、Ｌ−ＣＰ、Ｄ−ＣＰ、２Ｇ  ＣＰ、又はＰＢＳの存在下、ＡＡを誘導するためＭｔにより免疫化された。ペプチドの、Ｍｔに対する免疫応答に与える影響を定量化するため、ＤＴＨは、方法のセクションに記載の通りに測定された。結果は、ＤＴＨ反応のパーセント阻害として正規化された。ＰＢＳと共免疫したラットで測定された値は、ゼロ阻害とみなされた。結果は、Ｌ及びＤ−ＣＰのインビボにおける有意な影響を示す。
【図１２】Ｌ及びＤ−ＣＰペプチドは膜においてＴＣＲ受容体と共局在化することを示す図である。（Ａ）ＴＣＲは、αＴＣＲ−ＦＩＴＣを用いて視覚化される。励起は４８８ｎｍであり、発光は５０５及び５２５ｎｍの間で回収された。（Ｂ）ペプチドは、このＮ末端に結合したローダミンプローブを用いて視覚化される。励起は５４３ｎｍであり、発光は５６０ｎｍ以上から回収された。（Ｃ）（Ａ）及び（Ｂ）の融合は、全てのＣＰペプチドがＴＣＲと共局在化することを示す。（Ｄ）１００％で６秒間のレーザーによる、５４３ｎｍでの点退色は、ＣＰ−ＲｈｏペプチドとＴＣＲ  ＦＩＴＣ標識抗体との間にエネルギー転移があることを示す。矢印は、退色処置を受けた領域を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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