(57)【要約】  本発明は、新規なアジュバント及びワクチン中のような医薬組成物中の使用に関する。特に、本発明は、感染性疾病、炎症性疾病、自己免疫性疾病、腫瘍、アレルギーの治療における予防的及び／又は治療的ワクチン接種のためのアジュバント及び／又は免疫調節物質として、並びにヒト又は動物の集団の受胎能の制御のために有用な、ビスアシルオキシシステイン型の新規な複合体を提供する。この化合物は、全身性としてだけではなく、更に好ましくは粘膜性アジュバントとして特に有用である。更に、本発明は、医薬組成物中の活性成分としてのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１：
【化１】
2009517350.tif 000003
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、同一、又は異なっていることができ、そしてアシル部分であり；
Ｌは、ＮＨ、Ｏ、Ｓ又はＯＣＯの群から選択されるリンカー部分であり；
Ｒ３は、同一、又は異なっていてもよい、少なくとも二つの、式：
Ｘ１−［（ＣＨＲ４）ｘ−Ｏ］ｎ−（ＣＨＲ４）ｙ−
のポリアルキレングリコール単位を含んでなる共有結合により連結した複合体部分であり、
式中、
Ｘ１は、水素、又はヘテロ原子を含有していてもよい炭化水素であり；
Ｒ４は、独立に水素、ＯＨ、直鎖又は分枝鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル基、ＯＲ５或いはＣＯ−Ｒ６のいずれか一つであり；
Ｒ５は、独立に水素或いは直鎖又は分枝鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル基のいずれか一つであり；
Ｒ６は、独立に水素、ＯＨ、ＯＲ５又はＮＲ７Ｒ８のいずれか一つであり；
Ｒ７及びＲ８は、独立に水素、又はヘテロ原子を含有していてもよく、そして環を形成していてもよい炭化水素のいずれか一つであり；
ｎは、１〜１００の整数であり；
ｘは、独立に１〜１０の整数であり；
ｙは、０〜１０の整数である］
で表される、ビスアシルオキシプロピルシステイン−複合体。
【請求項２】
式１：
【化２】
2009517350.tif 000004
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、同一、又は異なっていることができ、そしてアシル部分であり；
Ｌは、アミノ−３’−デオキシアデノシン、アミノ−３’−デオキシグアノシン、アミノ−３’−デオキシイノシン、又はアミノ−３’−デオキシキサンチンであり、そして
Ｒ３は、非存在であってもよく、又はプリン残基と共有結合していてもよく、そして同一、又は異なっていてもよい少なくとも一つの、式：
Ｘ１−［（ＣＨＲ４）ｘ−Ｏ］ｎ−（ＣＨＲ４）ｙ−
［式中、
Ｘ１は、水素、又はヘテロ原子を含有していてもよい炭化水素であり；
Ｒ４は、独立に水素、ＯＨ、直鎖又は分枝鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル基、ＯＲ５或いはＣＯ−Ｒ６のいずれか一つであり；
Ｒ５は、独立に水素或いは直鎖又は分枝鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル基のいずれか一つであり；
Ｒ６は、独立に水素、ＯＨ、ＯＲ５又はＮＲ７Ｒ８のいずれか一つであり；
Ｒ７及びＲ８は、独立に水素、又はヘテロ原子を含有していてもよく、そして環を形成していてもよい炭化水素のいずれか一つであり；
ｎは、１〜１００の整数であり；
ｘは、独立に１〜１０の整数であり；
ｙは、０〜１０の整数である］
のポリアルキレングリコール単位である］
で表される、ビスアシルオキシプロピルシステイン−複合体。
【請求項３】
前記同一、又は異なっていてもよい残基Ｒ１及びＲ２が、Ｃ７−Ｃ２５アシル基であることを特徴とする、請求項１または２に記載の複合体。
【請求項４】
前記アシル基が、置換されていてもよい、直鎖、環式又は分枝鎖Ｃ８−Ｃ２２−アルキル、直鎖、環式又は分枝鎖Ｃ８−Ｃ２２−アルケニル、或いは、直鎖、環式又は分枝鎖Ｃ８−Ｃ２２−アルキニル基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項５】
前記複合体が、Ｓ−［２，３−ビス（アシルオキシ）−（２Ｓ）−プロピル］−Ｌ−システイニルカルボキシ−複合体、好ましくはＳ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２Ｓ）−プロピル］−Ｌ−システイニルカルボキシ−複合体であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６】
前記複合体が、Ｓ−［２，３−ビス（アシルオキシ）−（２Ｒ）−プロピル］−Ｌ−システイニルカルボキシ−複合体、好ましくはＳ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２Ｒ）−プロピル］−Ｌ−システイニルカルボキシ−複合体であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項７】
Ｒ３中で、ポリアルキレングリコール単位が、エチレングリコール、プロピレングリコール、及び／又はブチレングリコール単位或いはこれらの組合せを含んでなり、そしてｎが、３〜５０の整数であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８】
Ｘ１が、独立にメトキシ又はエトキシ基であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９】
Ｒ３中で、ポリアルキレングリコール単位が、ｎが独立に３〜１０、好ましくは独立に３又は４であるメトキシポリエチレングリコール単位であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１０】
前記複合体部分が、（Ｓ）−１０−アミノ−６，９，１３，１６−テトラオキソ−Ｎ，Ｎ’，８，１４−テトラキス（３，６，９，１２−テトラオキサトリデカ−１−イル）−５，８，１４，１７−テトラアザヘンイコサン−１，２１−ジアミドであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１１】
前記複合体が、式（２）：
【化３】
2009517350.tif 000005
で表される複合体であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に定義された複合体、及び医薬的に受容可能な担体、希釈剤、保存剤、アジュバント、免疫調節物質又は賦形剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項１３】
感染性疾病、敗血症性ショック、癌、腫瘍、自己免疫性疾病、アレルギー、或いは慢性若しくは急性炎症性過程を予防又は治療するための医薬品の調製のための、請求項１〜１１のいずれか１項に定義された複合体の使用。
【請求項１４】
ヒト又は動物の集団の受胎能を制御するための医薬品の調製のための、請求項１〜１１のいずれか１項に定義された複合体の使用。
【請求項１５】
前記感染性疾病が、呼吸器管、胃腸管、尿生殖器管、骨関節系、心血管系、神経系、皮膚又は粘膜のレベルにおけるヒト或いは動物の疾病を起こすものから選択される感染性病原体によって産生される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
治療的又は予防的介入治療のために、抗原提示細胞の抗原提示機能をｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで活性化又は増強するための、請求項１〜１１のいずれか１項に定義した複合体の使用。
【請求項１７】
マクロファージ及び樹状細胞の刺激、並びに抗体の産生、又は免疫刺激剤としての細胞ベースのワクチンの調製のための、請求項１〜１１のいずれか１項に定義した複合体の使用。
【請求項１８】
予防的又は治療的介入治療のために、ＴＬＲ−１、ＴＬＲ−２及び／又はＴＬＲ−６受容体のようなＴｏｌｌ様受容体分子を発現している細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで標的とするための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の複合体の使用。
【請求項１９】
Ｔｏｌｌ２及び／又はＴｏｌｌ６受容体を発現している細胞を標的とすることによってワクチンの効力を改良するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の複合体の使用。
【請求項２０】
アジュバントとしての請求項１〜１１のいずれか１項に定義した化合物又は複合体、医薬的に活性な成分、及び医薬的に受容可能な担体、希釈剤、保存剤、請求項１〜９のいずれか１項に定義した化合物又は複合体以外のアジュバント、免疫調節物質或いは賦形剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項２１】
前記医薬組成物が、予防的及び／又は治療的ワクチンであることを特徴とする、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記活性成分が、ペプチド、タンパク質、多糖、糖脂質又はこれらをコードするＤＮＡ及び／又は、ビロソーム、物理的粒子、好ましくはマイクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、ＩＳＣＯＭ、コポリマー及び／又は生物学的粒子、好ましくは細菌のゴースト、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ポリオーマ様粒子ＰＬＰ又は弱毒化ワクチンのような抗原送達システムの形態の、少なくとも一以上の異なった抗原を含んでなる、請求項２０又は２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記抗原が、感染性疾病、敗血症性ショック、癌、腫瘍、自己免疫性疾病、アレルギー、或いは慢性若しくは急性炎症性過程を予防又は治療するための、腫瘍抗原又は感染性病原体に由来する抗原であることを特徴とする、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記アジュバントが、抗原と混合又は同時処方される、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
更に、一以上の抗炎症性分子、抗血管新生分子、細胞毒性分子、免疫調節分子、好ましくはケモカイン、サイトカイン、ＣＤ４０リガンド、同時刺激性分子又は抗体或いはこれらの混合物を含んでなる、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記抗原及び／又は複合体が、物理的粒子、好ましくはマイクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、ＩＳＣＯＭ、コポリマー及び／又は生物学的粒子、好ましくは細菌のゴースト、ビロソーム、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ポリオーマ様粒子（ＰＬＰ）又は弱毒化ワクチンに伴われ及び／又はそれに組込まれ及び／又はそれに被覆されることを特徴とする、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
粘膜性投与、特に、鼻腔内、ＮＡＬＴ内、口腔、直腸内、肺内、気管支内、髄孔内、結膜、膣内又は尿道内投与、乳房の乳管への投与、或いは吸入よる投与のために適した製剤で提供される、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
非経口投与、特に、皮下、経皮（局所ワクチン接種）、静脈内、皮膚内又は筋肉内投与のために適した製剤で提供される、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
感染性疾病、癌、腫瘍、自己免疫性疾病、若しくはアレルギー、或いは慢性若しくは急性炎症性過程の予防又は治療における、或いはヒト又は動物の集団の受胎能を制御するための、同時、別個又は連続使用のための組合せ組成物としての、請求項２０〜２８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物を含んでなるキット。
【請求項３１】
アジュバントとしての請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物、及び抗原性構造物を含み、医薬的に受容可能な担体、希釈剤、保存剤、請求項１〜１１のいずれか１項に定義した複合体以外のアジュバント、免疫調節物質又は賦形剤を含んでいてもよい、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
感染性疾病、癌、腫瘍、自己免疫性疾病、若しくはアレルギー、或いは慢性若しくは急性炎症性過程の予防又は治療のための、或いはヒト又は動物の集団の受胎能を制御するための免疫調節物質としての、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の複合体を含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、ビスアシルオキシプロピルシステイン型の新規なアジュバント、及びワクチンのような医薬組成物中での使用に関する。特に、本発明は、アジュバント及び／又は感染性疾病、炎症性疾病、自己免疫性疾病、腫瘍、アレルギーの治療における予防的及び／又は治療的ワクチン接種のための免疫調節物質として、並びにヒト又は動物の集団の受胎能を制御するために有用な新規な化合物を提供する。化合物は、全身性だけではなく、好ましくは粘膜性アジュバントとして特に有用である。更に、本発明は、医薬組成物中の活性成分としてのその使用にも関する。
【０００２】
発明の背景
感染性疾病は、罹患率及び死亡率の主要な原因であり、毎年世界中で起こる死亡の３分の１を占める。更に、感染性病原体は、新しい癌の少なくとも１５％に対して直接の原因であり、そしてこれらは、更にいくつかの慢性疾病（例えば炎症性、血管性及び変性疾患）の病態生理学にも関係するように見受けられる。伝統的な感染性疾病は、更に感染した患者の健康関連経費及び仕事の生産性の損失において非常に高価である。
【０００３】
感染性疾病を予防するために使用される主要な戦略は、治療及び予防である。ワクチン接種は、感染を予防するための最も対費用効果の高い方法となっている。しかしながら、ワクチンがいまだ利用可能ではない、或いは利用可能なワクチンが低い効力、高い反応原性、乏しい安定性及び／又は高い費用のために、完全に満足できない多くの疾病がなお存在する。従って、新規な、そして改良されたワクチンに対する緊急な必要性がなお存在する。
【０００４】
ワクチンが感染性疾病の予防のために伝統的に使用されてきたという事実にも関わらず、最近の発見は、これらが、伝染性疾病（例えばウイルス性肝炎、ヘリコバクターピロリ感染、ヘルペスウイルス感染、等）の免疫療法の強力な道具であることも示唆する。更に、ワクチンは、自己免疫性疾病、炎症性疾病、腫瘍、アレルギーの免疫療法又は免疫予防のために、そしてヒト及び／又は動物の集団の受胎能の制御のために使用することができる。特に、後者の適用は、生殖器管のレベルにおける有効な粘膜性応答の誘発を必要とするように見受けられる。
【０００５】
殆んどの感染性疾病は、粘膜に限定されるか、又は病原体は感染の初期段階に粘膜を通過する必要があるかのいずれかである。従って、ワクチン接種の結果として、全身性だけではなく、局所的な粘膜性免疫応答を得て、これによって感染（即ちコロニー形成）及び疾病の発生の両方を遮断することが好ましい。これは、感染に対する更に有効な保護となることができ、更にヒトが唯一の貯蔵所である疾病の根絶（即ち感受性な宿主への伝染を遮断する）を容易にする。非経口的に投与されたワクチンは、主として全身性応答を刺激し、一方粘膜経路によって投与されたワクチンは、自然感染によって誘発される免疫応答を模倣し、そして有効な粘膜性及び全身性応答に導くことができる。全身性及び粘膜性免疫系の明白な区分化のために、非経口的に投与されたワクチンは、粘膜性病原体に対する保護において効果が低い（ＭｃＧｈｅｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｓｔｅｃｋｙ，Ｊ．，Ｄｅｒｔｚｂａｕｇｈ，Ｍ．Ｔ．，Ｅｌｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｈ．，Ｈｉｒａｓａｗａ，Ｍ．ａｎｄ  Ｋｉｙｏｎｏ，Ｈ．（１９９２）Ｔｈｅ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：ｆｒｏｍ  ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １０，７５−８８）。従って、粘膜経路を介した免疫原の投与は、十分な保護を達成することが必要とされる。しかしながら、殆んどの利用可能なワクチンは、非経口経路によって投与され、これによって個体中の全身性免疫を誘発する。
【０００６】
粘膜経路によるワクチンの投与は、非経口ワクチン接種に対していくつかの利益を提供する。これらの利益は、投与の容易さ、自己投与の可能性（例えば鼻腔内、直腸又は経口投与によって）、感染した針の使用又は非滅菌作業に起因する望ましくない交差感染の機会の排除、低い率の副作用、大衆によるより高い容認、ワクチン接種プロトコルのより良好な遵守（即ち全体的効力の増加）、より簡単な投与の管理及びより低い運搬経費を含み、大量免疫プログラムに特に適している。しかしながら、粘膜免疫系のレベルにおける区分化を考慮しなければならない。事実、鼻腔内ワクチン接種後に観察することができる免疫応答は、必ずしも経口又は直腸内免疫化後に起こることができない。例えば、経口ワクチン接種は、尿生殖器及び／又は呼吸器管において効率的な応答を刺激することができない。
【０００７】
不幸なことには、粘膜経路による抗原の放出は、重要な問題、即ちこの経路によって放出される抗原は、一般的に乏しい免疫原性を伴う。これは、（ｉ）非特異的な宿主の排除機構（例えば繊毛活性、蠕動運動）による促進された抗原排除、（ｉｉ）局所酵素による抗原の分解、（ｉｉｉ）極端なｐＨ（例えば胃における酸性、腸におけるアルカリ性）の結果としての抗原の変質及び／又は構造的変化、（ｉｖ）粘膜を介する乏しい抗原の浸透性、（ｖ）ワクチン抗原の抗原提示細胞への制約された接近、及び（ｖｉ）局所的末梢寛容、のような異なった機構の結果である。
【０００８】
これらの問題を克服するために、抗原の捕捉、或いは物理的又は生物学的粒子（例えばマイクロ粒子、ナノ粒子、細菌のゴースト）との会合、ビロソーム又はウイルス様粒子の使用、リポソーム又はＩＳＣＯＭＳの使用、遺伝子導入植物の使用、弱毒化ウイルス或いは慣用的なベクター又は核酸ワクチンのための担体のいずれかとして作用する細菌担体による抗原の産生及び／又は粘膜性アジュバントとのこれらの投与のような、異なった戦略が使用されている。しかしながら、近年の前臨床研究において得られた大量の実験の証明にも関わらず、殆んどの候補物質は、ワクチン開発の経路に移されなかった。
【０００９】
最適なアジュバントの使用は、ワクチン接種において重要な役割を果たす。アジュバントを伴わずに投与された抗原は、まれにしか十分な免疫応答を媒介しない。更に、強さだけではなく、誘発された免疫応答の質も問題である。正しくない免疫パターンの刺激は、免疫病理学的応答及び感染の症状の悪化に導くかもしれない。これに関連して、アジュバントは、所望の免疫応答を補助することを援助することができる。言い換えれば、アジュバントは、免疫応答を調節し、又は免疫応答の方向を変更して、所望の方向で免疫応答の均衡を保たせることができる。
【００１０】
“アジュバント”として言及される物質は、体液性及び／又は細胞媒介の免疫応答を増強するために、実際の抗原（即ち所望の免疫応答を引き起こす物質）に対する免疫化において加えられ及び／又は同時処方されるものである（“Ｌｅｘｉｋｏｎ  ｄｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ  ｕｎｄ  Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｅ”，１．Ｂａｎｄ，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ，Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  １９９５）。即ち、アジュバントは、特に、抗原と同時投与された場合、免疫増強特性を有する化合物である。多くのアジュバントの使用は、実験のみに基づき、そしてその効果は、正確に説明又は予測のいずれもできない。特に、次の群のアジュバント：水酸化アルミニウム、鉱油の乳液、サポニン、デタージェント、ケイ素化合物、チオ尿素、グラム陰性細菌の内毒素、グラム陽性細菌の外毒素、殺菌された又は弱毒化された生きた細菌或いはその部分が、伝統的に使用されている。
【００１１】
現在知られている粘膜性アジュバント及び送達システム、例えばタンパク質−ＤＮＡ−及びＲＮＡ−ベースのワクチンのための上述の粒子、ＩＣＯＭＳ、リポソーム及びウイルス様粒子に対する概観は、Ｖａｊｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００４，８２，６１７−６２７中に与えられる。その中に、粘膜性ワクチンの免疫増強における現時点で利用可能なアプローチが考察されている。
【００１２】
即ち、全身性投与のために有用なアジュバントの代替物として役立つ筈である各種の粘膜性アジュバントが記載され、例えば上掲Ｖａｊｄｙ等を参照されたい。これらの粘膜性アジュバントは、熱不安定性エンテロトキシン及び解毒されたその変異体を含む。特に、Ｅ．ｃｏｌｉの熱不安定性のエンテロトキシンの遺伝子的に解毒された変異体が、有用な粘膜性アジュバントとして開発されている。更に、コレラ菌のコレラ毒素は、粘膜性ワクチン接種のために有用なアジュバントとして知られている。更に、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドの適用が記載されている。ＣｐＧが、Ｔｈ１応答に対する免疫応答に偏らせることができ、そして既存の免疫応答を調節できることが示された。サポニンも、主として免疫応答を調節及び／又は活性化する特異的サイトカインの誘導を介する免疫調節物質として記載された。
【００１３】
不幸なことには、粘膜性アジュバントとして有用である先に記載した殆んどの化合物は、その本来的な毒性、例えば細菌性トキソイドの神経組織への逆行性ホーミング、及び／又は経鼻ワクチン接種後の誘導体における／その中の毒素のために、利用不可能である。
【００１４】
更に、粘膜ワクチン接種において有用であるかもしれないアジュバントとして、以下のことが記載されている：
ＬＰ−２分子及びその誘導体、ビスアシルオキシプロピルシステイン−複合体、例えばビスパルミトイルオキシプロピルシステイン−ＰＥＧ分子、は、マクロファージの強力な活性化因子を代表することが知られている。アジュバントとしてのＭＡＬＰ−２の有用性は、以前に示され、例えばＷＯ２００４／００９１２５及びＷＯ２００３／０８４５６８を参照されたい。特に、ＭＡＬＰ−２が、免疫応答を増強する有効なアジュバントとして作用することができ、例えば抗原特異的ＩｇＡ抗体の増強された発現を促進することが証明された。
【００１５】
更に、ＭＡＬＰ−２が、樹状細胞及びＢ細胞、両方とも特異的体液性免疫応答の誘導において重要な役割を果たす、を活性化することができることが示された。更に、予備的な研究は、生物学的に活性なＨＩＶ−１ｔａｔタンパク質及び合成ＭＡＬＰ−２の組合せが、例えば粘膜経路を介する有効なアジュバントとしてＭＡＰＬ−２成分を伴う有望なワクチンであるかもしれないことを証明する。
【００１６】
しかしながら、ＷＯ２００４／００９１２５に記載されているような一つのポリアルキレン単位を有するビスアシルオキシプロピルシステイン−複合体、ＢＰＰｃｙｓＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＭＰＥＧは、ポリアルキレン単位の大きさが異なり、そして従って、広い範囲の分子の大きさを有する多分散分子のみとして得ることが可能である。従って、単一の大きさの複合体を、既知の、そして工業的に適用可能な技術によって精製することは不可能である。
【００１７】
より安定で、そして活性な、即ち改良された生体利用性を有し、従ってワクチン中のアジュバントの投与量を減少することを可能にするアジュバントを提供することに対する必要性がなお存在する。更に、親水性溶媒中の改良された溶解度を有し、そして体内のその滞留時間が改良された、特に代謝及び排泄に対してより安定な化合物を提供することに対する必要性がなお存在する。更に、新規な化合物は、改良された有効期間を有する必要がある。
【００１８】
従って、これらの以前に記載された粘膜性アジュバントのいずれもは、いまだ認可されていないが、しかし、今日、二つの全身性アジュバントのみが、ヒトへ投与することに対して認可を受け、そして、従って、ヒトのワクチンの調製のために使用されている。これらのアジュバントは、Ａｌｕｍ及びＭＦ５９である。しかしながら、両方とも粘膜性アジュバントとして有効ではない。
【００１９】
近年、粘膜投与経路のためのものを含む新規なアジュバントのための、集中的な探求が存在している。僅かな物質のみが、粘膜性応答を増強することが可能であることが見出されている。これらの中で、いくつかのものは、抗原が、それに結合又は融合されていなければならない担体として作用する。先に概略記載したように、抗原と混合される、更に僅かな普遍的に使用可能な“真の”アジュバントが見出されている。
【００２０】
従って、アジュバントとして、特に粘膜性アジュバント及び／又はワクチンとして有用な新規の化合物を提供することに対する、従来の技術における必要性がなお存在する。特に、体液性及び細胞性成分の両方に関係する均衡のとれた又は調節された免疫応答を表す強力な免疫応答を誘発することができ、従って、各種の疾病及び症状、特に感染性疾病又は癌の予防又は治療に有効であることを可能にする、粘膜性アジュバントに対する必要性が存在する。更に、前記のアジュバントの生体利用率は、優れた安定性及び活性を伴って良好であるべきであり、従ってアジュバントの投与量の減少、及びバイオセーフティーの向上が可能になる。
【００２１】
従って、本発明の目的は、個体又は対象における（既存の）免疫応答を誘発及び／又は増強及び／又は調節することができる粘膜性アジュバントの提供にある。特に、本発明は、ある範囲の新規な高度に活性なアジュバント、特にヒトに対して非毒性であり、そして特に癌及びＤＮＡワクチンを含む予防的又は治療的ワクチンのような慣用的な或いは新規なワクチン中で補助される、広い範囲の活性成分と共に使用することができる粘膜性アジュバントの開発の目的に基づく。
【００２２】
発明の説明
この技術的問題点は、特許請求の範囲において特徴づけられる態様の提供によって解決される。
【００２３】
本発明は、一般的に免疫調節化合物、特にアジュバント、好ましくは粘膜性アジュバントとして有用な、新規な複合体或いはその塩又は溶媒和物の提供に関する。更に、本発明は、本明細書中に記載されるとおりの複合体を、医薬的に受容可能な担体と、所望により更なる活性成分と共に含んでなる新規な医薬品に関する。
【００２４】
即ち、本発明は、治療的又は予防的ワクチン接種におけるアジュバント及び／又は免疫調節物質として有用な特異的化合物或いは複合体の使用の提供に関する。前記の化合物及び複合体は、全身性として有用であり、そして個体の粘膜を介して適用される粘膜性アジュバントとして特に有用である。
【００２５】
本発明者等は、ビスアシルオキシプロピルシステイン−複合体の特異的形態が、治療的又は予防的ワクチン接種のためのワクチン中のアジュバントとして特に有用であることを、いまや見出した。特に、本明細書中に記載される化合物は、非経口アジュバントとして、そして特に低い投与量における粘膜性アジュバントとしての適用性を証明する。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語“アジュバント”は、活性な抗原に対する免疫化において加えられ及び／又は同時に調合される物質、即ち活性な抗原に対する体液性及び／又は細胞媒介（細胞性の）免疫応答を増強又は誘発又は調節するために、所望の免疫応答を引き起こす物質を意味する。好ましくは、本発明によるアジュバントは、更に自然免疫応答を増強又は誘発することも可能である。
【００２７】
用語“療法”又は“治療”は、哺乳動物、例えばしばしば患者として呼ばれるヒト、又は動物、のような個体の症状に利益のある変化を生じることを意図する方法を指す。利益のある変化は、例えば、一以上の：機能の回復、症状の軽減、疾病、疾患、又は症状の進行の制約又は減速、或いは予防、患者の症状、疾病又は疾患の悪化の制約或いは減速を含むことができる。このような治療は、通常特に薬物の投与を包含する。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語“送達システム”は、アジュバントより不活性であり、そしてより低い免疫調節効果を有し、そしてワクチンを保護し、投与の部位から関心のある部位へ送達することができる系を指す。特に、送達システムは、免疫系への抗原のより有効な提示を可能にする。送達システムの例は、ウイルス又はウイルス様粒子、ＩＳＣＯＭ、ナノ粒子、マイクロ粒子、リポソーム、ビロソーム、ポリオーマ様粒子、弱毒化ワクチン及び弱毒化ウイルス様粒子である。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語“ペグ化”は、化合物部分の、少なくとも二つのポリアルキレン単位を含有する複合体部分との結合を指す。特に、この用語ペグ化は、化合物部分の、少なくとも二つのポリエチレングリコール単位を有する複合体部分との結合を指す。用語“ペグ化”は、ビスアシルオキシプロピルシステイン残基の直線ペグ化を有する形態を含まない。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語“粘膜”は、鼻腔、口腔、胃腸、直腸、泌尿器、結膜、腺、例えば乳腺、上皮粘膜のような身体の粘膜性表面を指す。
本明細書中で使用される場合、用語“複合体”は、複合体部分及び化合物部分を含んでなる化合物を指す。化合物部分は、ビスアシルオキシプロピルシステイン残基である。用語“複合体部分”は、ビスアシルオキシプロピルシステイン残基に連結した分子を指す。複合体部分は、本明細書中で開示される化合物の適用性を増加することを目的とする。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語“抗原構造”又は“抗原”は、細胞性又は体液性免疫応答を起こすことが可能な構造を指す。エピトープとしても知られる抗原構造は、抗原の一部分であり、これは、ＭＨＣ又はＭＨＣ様分子によって表される。更に、エピトープ又は抗原構造は、前記の抗原に対する抗体によって認識される抗原の一部分を表す。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語“免疫応答を調節する”は、免疫応答の現在の状態のいずれもの変化を意味する。免疫応答は、応答が誘発されるか、或いは既存の免疫応答が増強又は減少される限り、調節することができる。更に、免疫応答は、免疫応答をより体液性から、より細胞性免疫応答に変化することよって、或いはその逆でも同様に調節することができる。更に、免疫応答は、応答をＴｈ１からＴｈ２若しくはＴｈ３応答に切換え又は方向を変更することによって、或いはその逆で、特に均衡のとれたＴｈ１／Ｔｈ２の応答に調節することができる。更に、免疫応答の調節は、自然免疫応答の活性化又は増強を包含することができる。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、本明細書中で互変的に使用される用語“個体”又は“対象”は、治療又は予防を必要とする個体又は対象を指す。好ましくは、対象又は個体は、脊椎動物、なお更に好ましくは哺乳動物、特に好ましくはヒトである。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語“担体”は、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はベヒクルを指す。
第１の側面において、本発明は、式１：
【００３５】
【化１】
2009517350.tif 000002
【００３６】
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、同一、又は異なっていることができ、そしてアシル部分であり；
Ｌは、ＮＨ、Ｏ、Ｓ又はＯＣＯの群から選択されるリンカー部分であり；
Ｒ３は、同一、又は異なっていてもよい、少なくとも二つの式：
Ｘ１−［（ＣＨＲ４）ｘ−Ｏ］ｎ−（ＣＨＲ４）ｙ−
のポリアルキレングリコール単位を含んでなる、共有結合により連結した複合体部分であり、
式中、
Ｘ１は、水素、又はヘテロ原子を含有していてもよい炭化水素、例えば直鎖又は分枝鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル基或いは直鎖又は分枝鎖Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基であり；
Ｒ４は、独立に水素、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ６直鎖又は分枝鎖アルキル基、ＯＲ５或いはＣＯ−Ｒ６のいずれか一つであり；
Ｒ５は、独立に水素或いはＣ１−Ｃ６直鎖又は分枝鎖アルキル基のいずれか一つであり；
Ｒ６は、独立に水素、ＯＨ、ＯＲ５又はＮＲ７Ｒ８のいずれか一つであり；
Ｒ７及びＲ８は、独立に水素、又はヘテロ原子を含有していてもよく、そして環を形成していてもよい炭化水素のいずれか一つであり；
ｎは、１〜１００の整数であり；
ｘは、独立に１〜１０の整数であり；
ｙは、０〜１０の整数である］
で表されるビスアシルオキシプロピルシステイン−複合体の、治療的又は予防的ワクチン接種のためのアジュバントとしての使用に関する。
【００３７】
第２の側面において、本発明は、式（１）で表されるビスアシルオキシシステイン誘導体に関し、ここで、Ｒ１及びＲ２は、上記で定義したとおりであり、Ｌは、アミノ−３’−デオキシアデノシン、アミノ−３’−デオキシグアノシン、アミノ−３’−デオキシイノシン、又はアミノ−３’−デオキシキサンチンであり、そしてＲ３は、非存在であってもよく、又はプリン残基、例えばプリン環の６位において共有結合していてもよく、そして上記で概略したように定義される。好ましくは、前記の誘導体は、Ｓ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２Ｓ又は２Ｒ）−プロピル］−Ｌ−システイニルカルボキシ−３’アミノ−３’−デオキシアデノシン（ＢＰＰｃｙｓＡｄａ）である。別の方法によれば、式（１）で表されるビスアシルオキシシステイン誘導体は、更にスクシニル化されていてもよい。
【００３８】
好ましくは、複合体は、同一又は異なっていてもよいＲ１及びＲ２残基が、独立にＣ７−Ｃ２５アシル基、好ましくはＣ８−Ｃ２２−アルキル、−アルケニル、又はアルキニル基であり、そして不飽和の位置が、好ましくはｃｉｓ配置であり、アルキル−、アルケニル−、及びアルキニル残基が、直鎖、分枝鎖又は環式残基であってもよく、これらは、置換されていてもよい、ことにおいて特徴づけられる。
【００３９】
用語“これは置換されていてもよい”は、直鎖又は分枝鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル基或いは直鎖又は分枝鎖Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、及び／又はハロゲン、ヒドロキシル基又はカルボキシル基による置換を意味する。
【００４０】
本発明による複合体の複合体部分は、共有結合した生理学的に寛容な複合体部分であり、それはビスアシルオキシプロピルシステイン残基を更に水溶性の形態に転換するために適している。複合体部分は、水のような親水性溶媒中で良好な溶解性を提供し、そして免疫原性ではないことにおいて特徴づけられる。更に、複合体部分は、相当高いプロテアーゼ安定性、有意に減少した免疫原性、及び腎排出の知覚可能な遅延を提供する。新規なペグ化構造は、薬物分子をほとんど完全に覆い、このようにしてこれを、抗体及び内在性酵素による早期の分解を効率よく遮蔽する。更に、この遮蔽試薬の援助により、薬物は、免疫系及び酵素的分解過程による攻撃に抵抗することができ、その目的地にスムーズに達し、そしてその治療的効果を効率よく発揮することができる。従って、所望の効果を達成するために必要なアジュバント又は活性成分の量は、生体利用率を改良しながら、有意に減少することができる。
【００４１】
特に、本出願中で特許請求される複合体の複合体部分は、一列ではなく、分枝鎖構造で存在する、少なくとも二つのポリアルキレングリコール単位を含有する複合体部分である。分枝鎖構造は、この単位が、枝分かれ分子を介して直接的又は間接的に共有結合し、そして前記の枝分かれ分子が、同一又は異なっていてもよい式：
Ｘ１−［（ＣＨＲ４）ｘ−Ｏ］ｎ−（ＣＨＲ４）ｙ−
のビスアシルオキシプロピルシステイン残基と、直接的又は間接的に連結することを意味し、
式中、
Ｘ１は、水素、又は直鎖又は分枝鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル基或いは直鎖又は分枝鎖Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基のようなヘテロ原子を含有していてもよい炭化水素であり；
Ｒ４は、独立に水素、ＯＨ、直鎖又は分枝鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル基、ＯＲ５或いはＣＯ−Ｒ６のいずれか一つであり；
Ｒ５は、独立に水素或いは直鎖又は分枝鎖Ｃ１−Ｃ６アルキルのいずれか一つであり；
Ｒ６は、独立に水素、ＯＨ、ＯＲ５又はＮＲ７Ｒ８のいずれか一つであり；
Ｒ７及びＲ８は、独立に水素、又はヘテロ原子を含有していてもよく、そして環を形成していてもよい炭化水素のいずれか一つであり；
ｎは、１〜１００の整数であり；
ｘは、独立に１〜１０の整数であり；
ｙは、０〜１０の整数である。
【００４２】
好ましくは、ｎは、２〜５０の整数、２〜１０のような、特に３〜５である。
ｙは、好ましくは１〜５、特に１〜３の整数であり、他の好ましい態様において、ｙは０である。
【００４３】
好ましくは、ｘは、２、３、又は４の整数、特に２である。
Ｘ１は、優先的にＯＲ９、Ｎ（Ｒ９）２、ＳＲ９又はＣＯＯＲ９であり、ここにおいて、それぞれのＲ９は、個別に、水素、ベンジル、或いは直鎖又は分枝鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル、好ましくはメトキシ、エトキシ又はプロポキシ基のような直鎖又は分枝鎖Ｃ１−Ｃ６アルコキシである。
【００４４】
Ｒ４は、好ましくは水素原子である。
従って、上述のポリアルキレングリコール単位は、好ましくは少なくともエチレングリコール、プロピレングリコール又はブチレングリコール、或いはこれらの組合せの二つのサブユニットを含有していてもよい。それぞれのポリアルキレングリコール単位の鎖長は、１〜１００サブユニット、好ましくは２〜１０サブユニットのような２〜５０サブユニットの範囲、特に３〜５サブユニットの範囲であってもよい。
【００４５】
本発明による複合体中に存在するポリアルキレン単位は、直鎖の複合体部分は有せず、少なくとも二つの単位が、例えば図１０及び１１に示すように枝分かれした形態で存在する。
【００４６】
特に好ましいポリアルキレングリコールサブユニットは、アルキレン分子がエチレン又はプロピレン分子であるメトキシポリアルキレングリコール−カルボニル−残基である。
従って、本明細書中で定義したようなペグ化された形態は、親水性溶媒及び親水性環境中の溶解度を増加することを可能にする。更に、複合体部分は、化合物部分を保護することを可能にする、即ち活性な粘膜性アジュバント部分を、酵素的分解、ｐＨの変化による構造の変化、機械的除去、等に対して保護することを可能にする。従って、第一に化合物の安定性は増加される。複合体の別の利益のある効果は、前記生物によってよく寛容されながら、例えば非免疫原性でありながら、固体中の滞留時間を増加する、例えば腎排出を遅らせることである。従って、本発明による複合体は、改良された生体利用性を示し、一方で所望の効果を誘発するために必要な投与量の減少を可能にする。
【００４７】
更に、本発明による複合体又は誘導体は、図１２に示すように、室温で２ヶ月の貯蔵後でさえ、その活性を維持する。
具体的には、複合体部分は、ポリアルキレングリコール単位を有する少なくとも四つの鎖を含んでなる。この複合体は、それぞれの腕がポリアルキレングリコール単位を含有する分枝鎖化合物であることができる。特に好ましいものは、ポリアルキレングリコール単位が、ポリエチレン、ポリプロピレン又はポリブチレングリコール単位である複合体部分である。
【００４８】
特に好ましい態様において、複合体部分と共有結合で連結された化合物部分は、少なくとも二つの腕が、３〜５個のエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコール単位、及びポリエチレン基の自由末端にメトキシ基を含有する分枝鎖分子である。特に、分枝鎖分子は、それぞれ３個のエチレングリコールサブユニット及びポリエチレン基の自由末端にメトキシ基を有する４又は６又は８本の腕を含んでなる。
【００４９】
特に、複合体は、複合体部分が、本明細書中にその全てが援用される、ＷＯ２００４／１０８６３４に記載されているような、４ａｒｍＰＥＧ（（Ｓ）−１０−アミノ−６，９，１３，１６−テトラオキソ−Ｎ，Ｎ’，８，１４−テトラキス（３，６，９，１２−テトラオキサトリデカ−１−イル）−５，８，１４，１７−テトラアザヘンイコサン−１，２１−ジアミド）、６ａｒｍＰＥＧ又は８ａｒｍＰＥＧであることにおいて特徴づけられる。少なくとも二つのポリエチレン単位を含んでなる他の適した複合体部分は、例えばｃｅｌａｒｅｓ  ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌａｒｅｓ．ｃｏｍを参照、又はＮｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｗｗｗ．ｎｅｋｔａｒ．ｃｏｍ／ｐｅｇから得ることが可能であり、そして具体的な例を、図９に示す。
【００５０】
特に好ましい態様は、図１１に示すような式（２）の化合物である。
本明細書中に記載される複合体は、医薬的に受容可能な非毒性のその塩の形態であることができる。塩は、無機酸（例えば塩酸、硫酸、硝酸及びリン酸）又は有機酸（例えば酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、オレイン酸、パルミチン酸、クエン酸、コハク酸、酒石酸、フマル酸、グルタミン酸、パントテン酸、ラウリル硫酸、メタンスルホン酸及びフタル酸）との塩のような、酸付加塩を含む。
【００５１】
複合体は、その溶媒和（例えば水和）された形態であることができる。
更に、複合体は、金属イオンのようなカチオン性イオン、特にアルカリ又はアルカリ土類金属イオン、或いはＮＨ４＋との塩を形成することができる。
【００５２】
好ましくは、本発明による複合体は、Ｓ−［２，３−ビス（アシルオキシ）−（２Ｓ）−プロピル］−Ｌ−システイニルカルボキシ−複合体、好ましくはＳ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２Ｓ）−プロピル］−Ｌ−システイニルカルボキシ−複合体である。
【００５３】
もう一つの態様において、複合体は、Ｓ−［２，３−ビス（アシルオキシ）−（２Ｒ）−プロピル］−Ｌ−システイニルカルボキシ−複合体、好ましくはＳ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２Ｒ）−プロピル］−Ｌ−システイニルカルボキシ−複合体である。
【００５４】
先に記載したとおりの複合体は、更に、感染性疾病、癌、腫瘍、自己免疫性疾病又はアレルギー、或いは慢性若しくは急性の炎症性過程を予防又は治療するための医薬組成物中の免疫調節物質として、或いはヒト又は動物の集団の受胎能を制御するために使用することができる。
【００５５】
複合体の合成は、当業者にとって既知の方法によって行うことができる。例えば、ヒドロキシル基を、ハロゲン残基、例えばＣｌ．Ｂｒ、Ｉに転換することができ、そしてこの残基を、遊離アミノ基を有する修飾された複合体と反応させることができる。例えば、ペグ化された複合体の合成は、参照により本明細書中に援用される、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  Ｆ．Ｍ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２２（２００１），４０５−４１７及びＫｏｄｅｒａ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．（１９９８），２３，１２３３−１２７１に記載される。
【００５６】
好ましい態様において、複合体或いはその塩又は溶媒和物は、粘膜性アジュバントとして、特に鼻腔内、ＮＡＬＴ内、口腔、直腸内、結膜、膣内、髄孔内、気管支内、肺内、又は尿道内投与、乳房の乳管への或いは吸入よる投与のための粘膜性アジュバントとして有用である。
【００５７】
特に好ましいものは、鼻腔内投与又は適したエアゾール製剤を使用する吸入による投与である。ワクチンの投与のために有用なエアゾール製剤は、当技術において既知である。
複合体或いはその塩又は溶媒和物は、更に全身性アジュバントとしても適している。従って、本明細書中に記載されるアジュバントは、非経口アジュバント、特に皮下、局所（経皮ワクチン接種）、静脈内、皮膚内、局所又は筋肉内投与としても適用可能である。
【００５８】
本発明のアジュバントは、当業者にとって既知の全ての方法によって、ワクチン接種を意図している抗原又は活性分子と連結させることができ、後者と共に物理的（例えばマイクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、ＩＳＣＯＭ、ポリマー）又は生物学的粒子（細菌、細菌の部分）又はビロソーム中に取り込まれることができ、或いは抗原と混合されることができる。例えば、このアジュバントは、抗原と同時処方又は混合することができる。担体と結合するために、運搬分子又は運搬タンパク質を担体として与えることも可能である。
【００５９】
複合体或いはその塩又は溶媒和物は、好ましくは、鼻腔内、ＮＡＬＴ（鼻腔関連リンパ組織）内、エアゾール化、口腔、直腸内、結膜、膣内、泌尿器内投与のために、或いは乳房の乳腺への投与のために適し、そして提供される活性なワクチン接種成分（例えば抗原）との製剤中に存在する。特に、この製剤は、呼吸器管又は胃腸管を経由して取込まれるために適した処方において与えられる。別の方法として、本発明の粘膜性アジュバントは、前述の経路の一つによるワクチンとの同時投与のためのキット中に存在することができる。即ち、ワクチンは、活性なワクチン接種成分と同時、連続又は別個に投与することができる。
【００６０】
従って、本発明による複合体は、免疫応答を均衡のとれたＴｈ１／Ｔｈ２免疫応答に導く。更に、前記の複合体は、Ｔｈ２免疫応答を増強することによって免疫応答を偏らせることができる。
【００６１】
もう一つの態様において、本発明は、免疫応答を調節することによって治療することができる疾病又は症状に苦しむ個体を治療する方法に関し、前記の個体に、有効な量の本明細書中で定義したとおりの複合体、その塩及び溶媒和物を、アジュバントとして、特に粘膜性アジュバントとして、活性なワクチン接種成分と一緒に、そして所望により医薬的に受容可能な担体を含んでなる医薬品を投与することを含んでなる。
【００６２】
好ましくは、この方法は、感染性疾病に苦しむ個体の治療に関し、ここにおいて、この感染性疾患は、呼吸器管、胃腸管、尿生殖器、骨関節系、皮膚及び粘膜における、ヒト又は動物の疾病を起こすものから選択される感染性病原体によって産生される。
【００６３】
本明細書中で定義されたとおりの複合体或いはその塩又は溶媒和物は、治療又は予防的介入治療のための抗原提示細胞の抗原提示機能を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで活性化又は増強するための粘膜性アジュバントとして特に有用である。これは、このアジュバントが、マクロファージを刺激することができ、体液性免疫応答を刺激又は増強する、例えば抗体の産生を増強又は刺激することができることを意味する。更に、このアジュバントは、更に細胞性免疫応答を増強又は刺激する、例えばＴ細胞の増殖を増加することもできる。更に、アジュバントを、細胞培養におけるｅｘ  ｖｉｖｏの刺激のために、例えば樹状細胞の産生のため、等に使用することが可能である。ｅｘ  ｖｉｖｏの刺激によって得られたこれらの細胞は、移植における自己細胞移植のために、或いは癌、自己免疫性疾病又はアレルギーを含む上述の疾病又は症状のような疾病又は症状に対する細胞ベースのワクチンとして使用することができる。
【００６４】
更に、本発明による複合体は、例えば、対象の予防的又は治療的介入治療のために、制約されるものではないが、ＴＬＲ１、ＴＬＲ−２及び／又はＴＬＲ−６受容体を含み、例えばＴｏｌｌ様受容体系を発現する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏの細胞を標的とするために有用である。好ましくは、本発明による複合体の使用は、Ｔｏｌｌ  ２及び／又はＴｏｌｌ  ６受容体を発現している細胞を標的とすることによってワクチンの効力を改良することを可能にする。
【００６５】
従って、本明細書中で定義したとおりの複合体或いはその塩又は溶媒和物を、アジュバントとして使用する場合、本発明による医薬組成物は、好ましくは、前記の化合物又は複合体或いはその塩又は溶媒和物を、医薬的に受容可能なアジュバントとして、活性なワクチン接種成分（例えば抗原）と一緒に、そして所望により、医薬的に受容可能な担体、希釈剤、保存剤、本発明によるアジュバント以外のアジュバント、免疫調節物質又は賦形剤を含んでなるワクチンである。
【００６６】
活性なワクチン接種成分は、個体における免疫応答を誘発、増強又は調節するために適したいずれもの成分であることができる。活性なワクチン接種成分は、鼻腔内、ＮＡＬＴ内、口腔、直腸内、結膜、膣内、エアゾール化又は泌尿器内投与、或いは乳房の乳腺への投与のために特に適している。
【００６７】
例えば、活性なワクチン接種成分、医薬組成物の活性成分は、少なくとも一以上の異なった抗原を、ペプチド、タンパク質、多糖、糖脂質又はこれらをコードするＤＮＡ又は細菌のゴースト、ビロソーム或いは弱毒化ワクチンの形態で含んでなる。
【００６８】
優先的には、抗原は、腫瘍抗原又は感染性病原体に由来する抗原である。感染性病原体は、通常粘膜を通ることによって個体の器官に侵入する病原体を含む。
本発明によるアジュバント、活性なワクチン接種成分、所望により更なる担体、希釈剤、保存剤、本発明によるアジュバント以外のアジュバント、免疫調節物質又は賦形剤を含んでなる医薬組成物は、一以上の抗炎症性分子、抗血管新生分子、細胞毒性分子、免疫調節性分子、好ましくはケモカイン、サイトカイン、ＣＤ４０リガンド、同時刺激性分子又は抗体、或いはこれらの混合物のような化合物のような成分を更に含有することができる。
【００６９】
しかしながら、アジュバントとして使用するための本明細書中で定義したとおりの複合体並びにその塩及び溶媒和物は、更に非経口投与、特に、皮下、経皮（局所ワクチン接種）、静脈内、皮内又は筋肉内投与のために適した製剤中で提供される、医薬組成物の成分であることもできる。
【００７０】
更に、本発明による化合物は、腫瘍治療及び移植における適合細胞転移のための自己細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生又はｉｎ  ｖｉｔｒｏのプライミングを含む腫瘍治療において有用である。更に、このアジュバントは、微生物成分によって誘導される敗血症性ショック又は他の重度の形態の疾病に対して保護するために、内毒素のような微生物成分に対する交叉耐性の誘導のために有用である。
【００７１】
更に、本明細書中で定義したとおりの化合物自体は、医薬的活性を示すことができ、例えば、癌、感染性疾病、敗血症性ショック、慢性及び炎症性過程、自己免疫性疾病、アレルギー、等のような各種の疾病又は症状の予防及び治療において有用である。
【００７２】
従って、この複合体或いはその塩又は溶媒和物は、更に、感染性疾病、敗血症性ショック、癌、腫瘍、自己免疫性疾病、アレルギー、或いは慢性又は急性炎症性過程を予防又は治療するための医薬品の調製のためにも有用である。
【００７３】
本発明による複合体及びその塩又は溶媒和物は、感染性疾病、敗血症性ショック、腫瘍、自己免疫性疾病、アレルギー、或いは慢性又は急性炎症性過程の予防又は治療のために有用な医薬品中の活性成分として使用することができる。特に、この複合体或いはその塩又は溶媒和物は、黒色腫、前立腺、乳房、結腸直腸、胃、咽喉及び頚部、膵臓、子宮頸部、卵巣、骨、白血病及び肺癌のような癌及び／又は腫瘍；Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス、ヘリコバクターピロリ、ヘルペスウイルス、等のようなウイルス感染症；結核症、ライ病及びリステリア病のような細菌性感染、並びにマラリアのような寄生虫感染症の予防又は治療のために有用な医薬品中に含有される。
【００７４】
従って、更なる側面において、本発明は、本明細書中で定義したとおりの複合体或いはその塩又は溶媒和物、特に、本明細書中で定義したとおりの、少なくとも二つのポリアルキレングリコール単位を含んでなる少なくとも一つの複合体部分を含有する複合体、或いはその塩又は溶媒和物を、そして所望により、医薬的に受容可能な担体を含んでなる医薬組成物に関する。このような医薬組成物は、治療的に有効な量の複合体及び、所望により、医薬的に受容可能な担体を含んでなる。この医薬組成物は、本明細書中で記載したように、生理学的に受容可能な担体と共に患者に投与することができる。具体的な態様において、用語“医薬的に受容可能な”は、動物において、そして更に特にヒトにおいて使用するために、監督官庁又は他の一般的に認められた薬局方によって認可されていることを意味する。用語“担体”は、これらと共に治療剤が投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はベヒクルを指す。このような医薬的担体は、水、及びピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油、等のような石油、動物、野菜又は合成起源のものを含む油のような滅菌液体であることができる。水は、医薬組成物が静脈内に投与される場合、好ましい担体である。生理食塩溶液並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液も、液体担体として、特に注射用溶液のために使用することができる。適した医薬的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、等を含む。組成物は、所望する場合、更に少量の湿潤剤又は乳化剤、或いはｐＨ緩衝剤も含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放性製剤等の形態を取ることができる。この組成物は、伝統的な結合剤及びトリグリセリドのような担体と共に、座薬として処方することができる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、マグネシウムステアレート、サッカリンナトリウム、セルロース、マグネシウム、炭酸塩、等のような標準的な担体を含むことができる。適した医薬的担体の例は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（１８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０））中に記載されている。このような組成物は、治療的に有効な量の前述の複合体及びその塩又は溶媒和物を、好ましくは精製された形態で、適した量の担体と一緒に、患者への適当な投与のための形態を与えるように含有するものである。製剤は、投与方法に適していなければならない。
【００７５】
典型的には、医薬的に又は治療的に受容可能な担体は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、そして宿主又は患者にとって毒性ではない担体媒体である。
もう一つの好ましい態様において、組成物は、ヒトへの静脈内投与のために適合された医薬組成物として日常的方法によって処方される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、組成物は、更に可溶化剤及び注射の部位における疼痛を和らげるために、リドカインのような局所麻酔剤を含むこともできる。一般的に、成分は、別個に、又は一緒に混合された単位投与剤形のいずれかで、例えば活性剤の量が示されたアンプル又はサッシェのような気密に密封された容器中の乾燥した凍結乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として、供給される。組成物が注入によって投与される場合、これは、滅菌の医薬グレードの水又は生理食塩水を含有する注入用ビンで調剤することができる。組成物が注射によって投与される場合、成分を投与の前に混合することができるように、注射のための滅菌水又は生理食塩水のアンプルを用意することができる。
【００７６】
本発明に関連して使用するための医薬組成物は、中性又は塩の形態で処方することができる。医薬的に受容可能な塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、等に由来するアニオンと形成されたもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、等に由来するカチオンと形成されたものを含む。
【００７７】
本発明の組成物に適用されているような“治療的に又は医薬的に有効な量”は、所望の生物学的結果を誘発するために十分な組成物の量を指す。結果は、兆候、症状、又は疾病の原因の軽減、或いは生物学的な他のいずれの所望の変化であることができる。本発明において、結果は、典型的には、感染に対する免疫学的応答の増加、又は炎症性過程に対する応答の抑制を含むものであろう。
【００７８】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイは、最適な投与量の範囲を規定することを援助するために、所望により使用することができる。処方中に使用される正確な投与量は、更に投与の経路、及び疾病又は疾患の重篤度に依存するものであり、そして医師の判定及びそれぞれの患者の状況によって決定されるべきである。有効な投与量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は動物モデル試験系に由来する用量−応答曲線から外挿することができる。好ましくは、医薬組成物は、直接又はアジュバントとの組合せで投与される。
【００７９】
用語“投与される”は、治療的に有効な投与量の本明細書中で定義したとおりの複合体並びにその塩及び溶媒和物を含んでなる前述の医薬組成物の、個体への投与を意味する。“治療的に有効な量”によって、これが投与された効果を生じる投与量を意味する。正確な投与量は、治療の目的に依存するであろうし、そして既知の技術を使用する当業者によって確認可能であろう。当技術において既知であり、そして先に記載したように、全身性対局所放出、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与の時間、薬物の相互作用及び症状の重篤度に対する調節は、必要なことであることができ、そして当業者による日常的実験によって確認可能であるものである。
【００８０】
なおもう一つの態様において、本発明は、感染性疾病、敗血症性ショック、腫瘍、自己免疫性疾病、アレルギー、或いは慢性又は急性の炎症性過程に苦しむ個体を治療する、有効な量の複合体或いはその塩又は溶媒和物を活性成分として、そして所望により、医薬的に受容可能な担体を含んでなる医薬品の、前記の個体への投与の段階を含んでなる方法に関する。特に、この方法は、黒色腫、前立腺、乳房、結腸直腸、胃、咽喉及び頚部、膵臓、子宮頸部、卵巣、骨、白血病及び肺癌のような癌及び／又は腫瘍；Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス、ヘリコバクターピロリ、ヘルペスウイルス、等のようなウイルス感染症；結核症、ライ病及びリステリア病のような細菌性感染、並びにマラリアのような寄生虫感染症を予防又は治療するために有用である。
【００８１】
更に、この医薬組成物は、更なる成分、例えば一以上の抗炎症性分子、抗血管新生性分子、細胞毒性分子、免疫調節性分子、好ましくはケモカイン、サイトカイン、ＣＤ４０リガンド、同時刺激性分子又は抗体、或いはこれらの混合物のような化合物も含有することができる。
【００８２】
更に、本明細書中に記載されている医薬組成物は、医薬組成物の成分が、物理的粒子、好ましくはマイクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、ＩＳＣＯＭ、コポリマー及び／又は生物学的粒子、好ましくは細菌のゴーストに伴われ及び／又は組込まれ及び／又は被覆されていることにおいて特徴づけることができる。
【００８３】
この方法は、ヒトの治療及び脊椎動物の適用の両方に適用可能である。本明細書中に記載される所望の治療活性を有する化合物は、本明細書中で記載したように、生理学的に受容可能な担体中で患者に投与することができる。導入の方法にもよるが、この化合物は、以下で考察するように種々の方法で処方することができる。処方中の治療的に活性な化合物の濃度は、約０．１−１００重量％で変化することができる。薬剤は、単独で、又は他の治療との組合せで投与することができる。
【００８４】
この医薬組成物の投与は、制約されるものではないが、経口、皮下、経皮（局所ワクチン接種）、皮内、静脈内、動脈内、結節内、髄内、髄孔内、脳室内、鼻腔内、結膜、気管支内、経皮、直腸内、腹腔内、筋肉内、肺内、膣的、直腸的、又は眼球内的を含む、先に考察したような各種の方法で行うことができる。ある場合には、例えば、創傷及び炎症の治療において、医薬的に有効な薬剤は、溶液の乾燥噴霧として直接適用することができる。
【００８５】
担当医師及び臨床因子は、投与量管理を決定するものである。典型的な投与量は、例えば、０．００１〜１０００μｇの範囲であることができる；しかしながら、この例示的な範囲の下又は上の投与量が、特に前述の因子を考慮した場合に想定される。
【００８６】
更に、複数のポリアルキレン単位を有する複合体の使用は、個体における有効な免疫調節又は免疫賦活活性を得るための投与量当りの、前記の複合体の必要量を減少することを可能にする。特に、図１０に示す分子、ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ、のような複数のポリアルキレン単位を有する複合体を使用する場合、ＢＰＰｃｙｓＰＥＧと比較した場合、有意にアジュバントの投与量を減少することが可能である。
【００８７】
なおもう一つの側面において、本発明は、ヒト又は動物の集団の受胎能を制御するための医薬製剤中の、本明細書中で定義したとおりの複合体、或いはその塩又は溶媒和物の使用に関する。
【００８８】
最後に、本発明は、本発明による複合体或いはその塩又は溶媒和物を含んでなるキットに関する。特に、キットは、医薬組成物の調製のために有用である。所望により、キットは、医薬組成物を調製するための説明書を含有する。
【００８９】
その好ましい態様において、キットは、アジュバントとしての本発明による複合体或いはその塩又は溶媒和物、及び抗原構造を含んでなる抗原を、そして所望により、医薬的に受容可能な担体、希釈剤、保存剤、本発明による複合体以外のアジュバント、免疫調節物質又は賦形剤、並びにワクチンを調製するための説明書を含有する。
【００９０】
これらの、そして他の態様は、そして本発明の特許請求の範囲並びに説明及び実施例によって開示され、包含される。更に、本発明によって使用される方法、使用及び化合物のいずれか一つに関する文献は、公共の図書館から、例えば電子機器を使用して検索することができる。例えば、公共のデータベース“Ｍｅｄｌｉｎｅ”は、インターネットで利用可能であり、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌ．によって利用可能である。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ．ｆｒ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／のような更なるデータベース及びアドレスは、当業者にとって既知であり、そして更に例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｏｏｇｌｅ．ｄｅ．を使用して得ることもできる。遡及的検索及び現時点の認識のために有用な、バイオテクノロジーの特許情報の概説及び特許情報の関連情報源の調査は、Ｂｅｒｋｓ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １２（１９９４），３５２−３６４中に与えられている。
【００９１】
実施例
ＢＰＰＣｙｓＡｄａの合成
０．１ｍｍｏｌ（約２７ｍｇ）の３’−アミノ−３’−デオキシアデノシン（３’−Ａｄａ）を、１０ｍｌのＤＭＳＯ中に湿度を排除して溶解した。その後、３’−Ａｄａを、０．１２５ｍｍｏｌのＢＰＰＣｙｓＧｌｙｃ（１１２ｍｇ）、０．１２ｍｍｏｌのジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、１８．６μｌ）及び０．１２ｍｍｏｌの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、１６．２ｍｇ）と共に３０分間インキュベートした。一晩のインキュベーション後、化合物を真空によって乾燥し、残りをメタノールと混合し、そしてドロップ−アウトとして、非晶質の白色の粉末（６７ｍｇ、収率５９％）が残った。４７ｍｇのこの化合物を、１ｍｌの２０％のピペリジン（ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の）と混合（ｓｐｉｋｅｄ）し、そして１５分後、真空乾燥した。僅かな着色を、シリカゲルを充填したカラムクロマトグラフィー（溶出剤：９：１の比のジクロロメタン及びメタノール）によって洗浄した。これらの工程後、２２ｍｇ（収率６０％）の非晶質の白色固体の粉末を得る。化学構造を１Ｈ−ＮＭＲ及び質量スペクトル分析によって分析した。ＢＰＰＣｙｓＡｄａの溶解度及び安定性を最適化するための、二つの可能性：ａ）５’−ＯＨ基の選択的リン酸化又はｂ）アデニン環構造の６位のペグ化がある。
【００９２】
ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧの合成
４３３ｍｇ（０．４８ｍｍｏｌ）の化合物２（図１３参照）を、１０ｍｌの無水のジクロロメタン（ＤＣＭ）中に溶解した。短時間のインキュベーション後、８０Ｍｌのジイソプロピルカルボジイミド（０．５２ｍｍｏｌ）３及び５２ｍｇの無水のヒドロキシベンゾトリアゾール（０．３８ｍｍｏｌ）４を溶液に加えた。１５分後、溶液を、２１６ｍｇのＣｅｌａｒｅｓ社の４ａｒｍＰＥＧ（０．１７ｍｍｏｌ）１及び２．５ｍｌの無水のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で完結させた。溶液を一晩除湿条件下で混合し、試料（ｐｒｏｂｅ）をロータリーエバポレーターによって濃縮した。残渣を少量のＤＣＭ（約１００μｌ）中に溶解し、そしてシリカゲル及び９５：５／９０：１０の比のＤＣＭ／メタノールを用いたカラムクロマトグラフィーによって精製した。ｆＭＯＣで保護された化合物６を、３ｍｌのＤＭＦ中に溶解し、これをピペリジン（２０％）で完結させ、そして１０分後に濃縮した。化合物６を、シリカゲル及び９５：５及び８５：１５の比のＤＣＭ／メタノールを用いたカラムクロマトグラフィーによって精製した。その後、２００ｍｇ（化合物１の６０％）の精製された化合物６をＭＳ及びＮＭＲスペクトル分析によって特徴づけした。
【００９３】
１．  ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａによる一次骨髄由来マウス樹状細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏの刺激
実験プロトコル：  一次骨髄由来樹状細胞培養物を、確立されたプロトコルにより組換えＧＭ−ＣＳＦ（５×１０４Ｕ／ｍｌ）の存在中で前駆体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの成熟後、ＢＡＬＢ／ｃマウスから得た。成熟した樹状細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉのリポ多糖（ＬＰＳ）又は５ｎｇ／ｍｌのＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧで刺激し、刺激の１２、２４及び／又は４８時間後、細胞をフローサイトメトリーによって分析して、その抗原提示能力に関係する表面マーカーの発現を評価した。
【００９４】
ワクチンの分野におけるｉｎ  ｖｉｖｏの適用のためのアジュバントとして潜在性を有することができる化合物を確認するために、骨髄由来樹状細胞の一次培養物の使用に基づく最初のｉｎ  ｖｉｔｒｏのスクリーニングを確立した。これらは、最も効率のよい抗原提示細胞であり、そしてこれらは、一次免疫応答によって重要な役割を果たすため、樹状細胞を選択した。事実、これらは、ｉｎ  ｖｉｖｏで一次免疫応答を開始する休止Ｔ細胞を活性化することが可能な唯一の細胞種である。従って、樹状細胞培養物を、試験された分子又はＬＰＳで処理し、これを、正の対照として使用した。異なった時間間隔で試料を採取し、樹状細胞の抗原提示能力にとって重要な細胞マーカーに対して特異的な蛍光標識抗体で染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。
【００９５】
得られた結果（図１）は、正の対照とは対照的に、ＣＤ５４、並びに同時刺激性分子ＣＤ８６及びＣＤ８０の発現が、ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧで処理した樹状細胞においてアップレギュレートされたことを証明した。他方、ＣＤ４０の発現に対する影響は、もしあったとしても僅かであった。同時刺激分子はシグナルを放出し、これは、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって加工されたエピトープの提示に加えて、Ｔ細胞の効率のよい活性化のために必須である。コレラ毒素のような十分に確立された粘膜性アジュバントのアジュバント活性が、同時刺激性分子の発現の選択的なアップレギュレートに関係することが、以前に報告されている。
【００９６】
骨髄由来のＤＣの成熟及び活性化に対するＢＰＰＣｙｓＡｄａの刺激能力を試験するために、未成熟のＤＣ’ｓを、ｉｎ  ｖｉｒｔｏでＢＰＰＣｙｓＡｄａで刺激した。ＣＤ１１ｃ＋−依存性のＤＣ表面マーカーを、予備処理の１６又は４０時間後に、ＦＡＣＳ分析によって調査した。図１Ｂに示すように、５０ｎｇ／ｍｌのＢＰＰＣｙｓＡｄａとの予備インキュベーションは、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子の増加した発現となった。同時刺激分子ＣＤ８６の発現も、更にＢＰＰＣｙｓＡｄａによる刺激後、アップレギュレートされた。ＢＰＰＣｙｓＡｄａで刺激されたＤＣも、更に接着分子ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）の増強した発現を示した。ＭＡＬＰ−２の濃度を１００ｎｇ／ｍｌに増強した場合、表面マーカーの発現の差は、観察されなかった（示されていない）。得られた結果は、未成熟のＤＣのＢＰＰＣｙｓＡｄａとの予備インキュベーションが、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ、ＣＤ８６並びにＣＤ５４の増加した発現を伴う細胞の活性化をもたらすことを証明する。
【００９７】
２．  ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで効率のよいＴ細胞が媒介する増殖応答を刺激する
実験プロトコル：  脾臓を取出し、そして細胞免疫応答の分析のためにプールした。細胞を、１０％の胎児ウシ血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノール及び１ｍＭのＬ−グルタミンで補充したＲＰＭＩ  １６４０（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で増殖させ、そして３７℃の加湿した５％ＣＯ２の雰囲気中で維持した。リンパ節及び脾臓細胞懸濁液を、完全培地中で５×１０６細胞／ｍｌに調節し、細胞を平底の９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）のウェル当り１００μｌでまき、そしてプレートを４日間異なった濃度の可溶性β−ｇａｌの存在中でインキュベートした。それぞれの濃度を、四重で試験した。培養の最後の１８時間の間、１μＣｉの［３Ｈ］チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、それぞれのウェルに加えた。次いで細胞を濾紙（Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ  Ａ；Ｗａｌｌａｃ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上に、細胞回収器（Ｉｎｏｔｅｃｈ，Ｗｏｈｌｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用することによって回収し、そして増殖した細胞のＤＮＡ中に組込まれた［３Ｈ］チミジンの量を、β−シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ  １４５０、Ｍｉｃｒｏ−Ｔｒｉｌｕｘ）によって決定した。結果を、［３Ｈ］チミジン取込みの算術平均としてｃｐｍで表示する。
【００９８】
Ｔ細胞媒介の免疫応答を、ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａで再刺激した後の脾臓から回収した細胞の増殖を測定することによって４８時間調査した。ＢＰＰｃｙｓＡｄａ．４ａｒｍＰＥＧ又はＡｄａで再刺激した脾臓細胞を、負の対照として選択した。ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａの投与は、全身性（脾臓細胞）のレベルにおいて、効率のよい増殖応答の誘発を、高い刺激指数で引き起こした（図２）。
【００９９】
３．  可溶性抗原と同時投与されたＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａは、効率のよいＴ細胞媒介の増殖応答を刺激する
実験プロトコル：  脾臓を、生後６週間のメスのＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ，Ｈａｒｌａｎ  Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ）から取出し、そして細胞の免疫応答の分析のためにプールした。細胞を、１０％の胎児ウシ血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノール及び１ｍＭのＬ−グルタミンで補充したＲＰＭＩ  １６４０（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で増殖させ、そして３７℃の加湿した５％ＣＯ２の雰囲気中で維持した。リンパ節及び脾臓細胞懸濁液を、完全培地中で５×１０６細胞／ｍｌに調節し、細胞を平底の９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）のウェル当り１００μｌでまき、そしてプレートを４日間異なった濃度の可溶性β−ｇａｌの存在中でインキュベートした。それぞれの濃度を、四重で試験した。培養の最後の１８時間の間、１μＣｉの［３Ｈ］チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、それぞれのウェルに加えた。次いで細胞を濾紙（Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ  Ａ；Ｗａｌｌａｃ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上に、細胞回収器（Ｉｎｏｔｅｃｈ，Ｗｏｈｌｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用することによって回収し、そして増殖した細胞のＤＮＡ中に組込まれた［３Ｈ］チミジンの量を、β−シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ  １４５０、Ｍｉｃｒｏ−Ｔｒｉｌｕｘ）によって決定した。結果を、［３Ｈ］チミジン取込みの算術平均としてｃｐｍで表示する。
【０１００】
Ｔ細胞媒介の免疫応答を、３８日目に、β−ｇａｌによるｉｎ  ｖｉｔｒｏの再刺激後の脾臓から回収した細胞の増殖を測定することによって調査した。従って、マウスを、β−ガラクトシダーゼ単独、或いは異なった量のＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａと混合されたβ−ガラクトシダーゼのいずれかで免疫化した。ワクチン接種後３８日目に、脾臓細胞を精製し、２０μｇ／ｍｌのβ−ガラクトシダーゼの存在中でｉｎ  ｖｉｔｒｏで再刺激し、そしてその増殖能力を、β−シンチレーションカウンターを使用して、そのＤＮＡへの［３Ｈ］チミジンの組込みを測定することによって評価した。正の対照として選択された、β−ｇａｌ単独のｓ．ｃ．注射によって免疫化されたマウスからの脾臓細胞は、非免疫化グループと比較して有意な増殖応答を示した（図３Ａ）。増殖の更なる増加は、ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ及び抗原を同時投与された動物からの脾臓細胞において注目された（ｐ＜０．０５）。注目すべきは、最も強力なＴ細胞増殖応答が、ｉ．ｎ．及び／又はｓ．ｃ．経路によってＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ及びβ−ｇａｌで免疫化されたマウスの脾臓細胞で観察された。β−ｇａｌ単独のｉ．ｎ．投与は、検出可能な細胞増殖を誘発することに失敗したが、ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧの同時投与は、増加した刺激指数によって示されるように（図３Ｂ）、全身性（脾臓細胞）のレベルにおいて効率のよい増殖応答の誘発を引き起こした。それぞれ０．５４ｎｍｏｌ又は２．７１ｎｍｏｌの投与量における新規な粘膜性アジュバントＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧの使用は、統計的に有意（ｐ＜０．０５）なＴ細胞増殖の増加となった。更に、図３ａにおいて証明されるように、ＢＰＰｃｙｓＰＥＧの投与量より１０倍低い投与量におけるＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧは、同等のレベルの刺激を導く。
【０１０１】
４．  一酸化窒素放出アッセイ
簡単には、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス由来の腹膜のマクロファージを、マクロファージ源として使用した。これらを、９６ウェルのマイクロタイタープレート中で培養し、そしてｒＩＮＦ−γ及びマクロファージ活性化物質の一連の希釈物で同時に刺激した。必要な場合（即ちＲ−Ｍａｌｐ−２／標準）、マクロファージ活性化物質を、第１の希釈工程において、２５ｍＭのオクチルグルコシド中に溶解し、そして次いで培地で更に希釈した。４５−４８時間のインキュベーション時間後、硝酸塩を硝酸レダクターゼで還元し、そして出発物質の一酸化窒素を、硝酸塩及び亜硝酸塩の合計としてＧｒｉｅｓｓ試薬を使用して決定した。１単位（Ｕ）／ｍｌを、最大半量の刺激が起こる希釈度として定義する。
【０１０２】
マクロファージ活性化試験の結果を、図４に示す。図から、ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ、即ち本発明によるマクロファージ活性化物質は、既知のＭａｌｐ−２が有するより、マクロファージを活性化することに対する顕著に高い潜在性を有していることを知ることができる。図４は、ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧが、同じ程度のマクロファージの活性化を、Ｍａｌｐ−２のそれより１０〜１００倍低い濃度で既に達成していることを示す。図４は、更にこのＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧの場合におけるこの卓越した、そして予期していなかった活性化効果が、可溶化剤、この場合オクチルグルコシドを、加えることによって顕著に改良されず、一方このような添加が、Ｍａｌｐ−２の効果を最適に示すために必要であることを示す。従って、本発明による新規なＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ複合体は、有機溶媒又はデタージェントによるいずれもの更なる、そして恐らく生理学的に不利益な可溶化を必要としない。Ｍａｌｐ−２と比較したＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧのもう一つの利益は、４ａｒｍＰＥＧ遮蔽の事実に起因すると考えることができる高い安定性である。
【０１０３】
５．  ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａの可溶性抗原との鼻腔内及び腹膜内への同時投与は、効率のよい全身性体液性応答を刺激する
実験プロトコル：  生後６−８週間のメスのＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスを、Ｈａｒｌａｎ  Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ  ＧｍｂＨ（Ｂｏｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、そして地域及び欧州共同体の指針によって処理した。それぞれ５匹のマウスのグループを、１、１４及び２８日目に、５０μｇのβ−ｇａｌ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の単独、或いは０．５４又は２．７１ｎｍｏｌの合成ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ、４ｎｍｏｌのＢＰＰｃｙｓＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａ（１０μｇ、１０．８ｎｍｏｌ）を伴って、或いはＡｄａ単独（１０μｇ）で免疫化した。鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫化のために、それぞれの鼻腔に１０μｌを適用し、一方ｓ．ｃ．注射のために、ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧを伴う又は伴わないβ−ｇａｌを、２５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。血清の試料を、免疫化後の異なった時点で（０、１３、２７及び３８日目）採取し、そしてβ−ｇａｌ特異的抗体の決定まで−２０℃で保存した。９６ウェルのＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  ＭａｘｉＳｏｒｐアッセイプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、ウェル当り０．０５Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍｌのβ−ｇａｌ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）１００μlで被覆した。１％のＢＳＡ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を伴うＰＢＳ中の、血清又は洗浄液の一連の２倍希釈物を加え（１００μｌ／ウェル）、そしてプレートを２時間３７℃でインキュベートした。洗浄後、ビオチニル化γ鎖−特異的ヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を加え、そしてプレートを更に１時間３７℃でインキュベートした。４回の洗浄後、１００μｌのペルオキシダーゼ複合ストレプトアビジン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を細胞に加え、そしてプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。４回の洗浄後、反応物を０．０１％のＨ２Ｏ２を含有する０．１Ｍのクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４．３５）中のＡＢＴＳで展開した。終点力価を、最終希釈物のｌｏｇ２の逆数として表示し、これは、４０５ｎｍにおける、１５〜３０分のインキュベーション後の負の対照の値より０．１単位上の光学密度を与えた。
【０１０４】
予備研究において得られた有望な結果を考慮し、二つの最も有効な経路、即ちｓ．ｃ．及びｉ．ｎ．によって、アジュバントとしてのＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧで刺激することによって得られる免疫応答を詳細に分析し、そしてこれを十分に確立された粘膜アジュバントと比較することを決定した。従って、効率のよい体液性免疫応答を刺激するＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧの能力を、ワクチン接種されたマウス中のβ−ｇａｌ特異的抗体の血清力価を決定することによって評価した。図５に示すように、β−ｇａｌ単独（３０μｇ／投与）のｉ．ｎ．投与は、二回目のブースト後でさえ、非常に低い抗体力価の誘発となった。対照的に、ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａの存在中で、β−ｇａｌのｉ．ｎ．投与は、１回の投与後の全てのマウスにおいて、既に特異的ＩｇＧの非常に高い力価を誘発した（図５Ａ／Ｂ）。ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧを使用して得られた抗体応答の動力学及び全体的な効率は、ｓ．ｃ．経路によるβ−ｇａｌの投与によって観察されたものと同様であった。
【０１０５】
有意なアジュバント効果は、ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａが、ｓ．ｃ．経路によって投与された場合にも観察された。具体的には、ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａの同時注射は、β−ｇａｌ単独で免疫化されたマウスと比較して、増加したβ−ｇａｌ特異的ＩｇＧ力価となった（図５Ｃ及びＤ）。この差は、最初の免疫化後既に存在し、そしてブースター注射において維持された。同様な抗体力価は、ｉ．ｎ．又はｓ．ｃ．経路のいずれかによって免疫化された動物において３８日目に検出された。しかしながら、ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ同時投与後の一次応答は、ｉ．ｎ．免疫化においてより明白であった。
【０１０６】
６．  ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａと可溶性抗原の鼻腔内同時投与は、効率のよい粘膜抗体応答を刺激する
実験プロトコル：
３８日目に、マウスを犠牲にし、そして最後の試料採取を行った。膣及び肺の洗浄液を、器官を１ｍｌの、５０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＢＳＡ、及び１０ｍＭのＰＭＳＦで補充されたＰＢＳで洗浄することによって得た。次いで洗浄液を遠心（３０００×ｇで１０分間）して細片を除去し、そして上清液体を−２０℃で保存した。肺及び膣洗浄液中に存在する全ＩｇＡに濃度を決定するために、対応する試料の一連の希釈物を、捕捉抗体（１００μｌ／ウェル）としてのヤギ抗マウスＩｇＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｅ）で、前もって被覆したマイクロタイタープレート中でインキュベートした。精製されたマウスのＩｇＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｅ）の一連の希釈物を、標準曲線を作製するために使用した。
【０１０７】
ｉ．ｎ．経路によって同時投与された抗原に対する粘膜応答を刺激するＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａの能力を調査するために、免疫化された動物からの肺及び膣洗浄液中のβ−ｇａｌ特異的ＩｇＡ（図６Ａ）、又はＢＰＰｃｙｓＡｄａ（図６Ｂ）に対する産生を分析した。対照として、ＢＰＰｃｙｓＭＰＥＧを使用した。この化合物は、ＢＰＰｃｙｓの、普通に使用されるＰＥＧ（平均分子量２０００Ｄａ）の代わりに、より高い分子量（平均分子量５０００Ｄａ）を有するＰＥＧ種との結合を含んでなる。β−ｇａｌ単独によるｉ．ｎ．免疫化は、肺洗浄液中の検出可能なレベルのβ−ｇａｌ特異的ＩｇＡの産生を刺激することに失敗したが、抗原特異的ＩｇＡのレベルの有意な増加が、β−ｇａｌ及びＢＰＰｃｙｓＧｌｙ４ａｒｍＰＥＧで免疫化された動物において検出された（図６Ａ）。ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧの同時投与は、更に、膣洗浄液中の有意な濃度のβ−ｇａｌ特異的ＩｇＡの存在によって証明されるように、離れた粘膜部位における効率のよいＩｇＡ産生の刺激となった（図６Ａ）。異なった投与量のＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧで免疫化された動物間の粘膜性β−ｇａｌ特異的抗体のレベルでの統計的有意差は、観察されなかった。同じ結果が、ＢＰＰｃｙｓＡｄａ（１０μｇ）を使用して得られた、図６Ｂを参照されたい。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、異なった投与量のＢＰＰｃｙｓＡｄａ及びβ−ｇａｌの鼻腔内投与は、ＯＶＡ単独の鼻腔内投与よりも、血清におけるβ−Ｇａｌ特異的ＩｇＧ応答と同様に、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）及び膣洗浄液（ＶＬ）における有意に高いレベルのβ−Ｇａｌ特異的ＩｇＡ応答を誘発した。更に、β−ｇａｌのＢＰＰｃｙｓＡｄａとの鼻腔内投与は、β−Ｇａｌ又はＯＶＡ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａレベルを有意に増大した（示されていない）。更に、有意なレベルのＩＬ−２及びＩＬ−４が、全てのＢＰＰｃｙｓＡｄａ同時投与グループで誘発された（図６Ｂ）。
【０１０８】
７．  ＢＰＰｃｙｓＧｌｙ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａをアジュバントとして使用することによって刺激された、ヘルパーＴのパターンの分析
実験プロトコル：
アイソタイプＥＬＩＳＡ：  ９６ウェルのＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  ＭａｘｉＳｏｒｐアッセイプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、ウェル当り１００μｌの、０．０５Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ８．２）中の５μｇ／ｍｌのβ−ｇａｌ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で被覆した。１％のＢＳＡ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を伴うＰＢＳ中の血清又は洗浄液の一連の２倍の希釈物を加え（１００μｌ／ウェル）、そしてプレートを２時間３７℃でインキュベートした。洗浄後、ビオチン結合ラット抗マウスＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えて、ＩｇＧのサブクラスを決定した。プレートを更に１時間３７℃でインキュベートした。４回の洗浄後、１００μｌのペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を細胞に加え、そしてプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。４回の洗浄後、反応物を０．０１％のＨ２Ｏ２を含有する０．１Ｍのクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．３５）中のＡＢＴＳで展開した。血清中のＩｇＧのサブクラスの濃度を決定するために、標準曲線を、アイソタイプ特異的ヤギ抗マウスＩｇＧでウェルを被覆し、そして次いで精製されたマウスのＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａ抗体（Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共にインキュベートすることによって得た。
【０１０９】
ワクチン接種されたマウスの血清中に存在するβ−ｇａｌ抗原特異的ＩｇＧアイソタイプの異なったサブクラスのパターンを、図８に示す。図８Ａは、β−Ｇａｌ単独、β−Ｇａｌ及びＢＰＰｃｙｓＭＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧのいずれかの鼻腔内投与の結果を示す。ワクチン接種のためのプロトコルは、実施例２に記載されたプロトコルと同一であった。図８から確認することができるように、ＩｇＧ１サブタイプ及びＩｇＧ２ａアイソタイプの抗原特異的抗体の量は、ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａを粘膜性アジュバントとして使用する抗原の鼻腔内投与後、堅調に増加した。更に、全身性投与、この場合皮下投与の場合も、更にＩｇＧ１アイソタイプ、並びにＩｇＧ２ａアイソタイプの発現は、ＢＰＰｃｙｓＡｄａに対して堅調に増加する、図８Ｂを参照されたい。データは、５匹の動物のグループの平均力価で表す。
【０１１０】
従って、ｃ−ｄｉＡＭＰの使用は、強力な抗原特異的抗体応答を誘発することを可能にする。誘発は、鼻腔内投与後だけではなく、更に非経口投与後も見ることができる。
サイトメトリックビーズアレイ：  増殖中の細胞から培養物の上清を、２及び４日目に収集し、そして−７０℃で保存した。ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２の決定を、ＢＤからの商業的キットを使用して製造業者の説明書によってサイトメトリックビーズアレイ分析によって行った。標準曲線を、それぞれのサイトカインに対して、対応する組換えマウスのサイトカイン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用することによって作成した。プローブを室温で更に２時間インキュベートした。次いでプローブを、フローサイトメトリーによって、ＢＤのプロトコルに記載されているように分析した。
【０１１１】
免疫化に続いて刺激されたＴｈ応答の型を特徴づけるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで再刺激された脾臓細胞の上清中の、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びＴＮＦαの含有量を測定した（図７）。これらのサイトカインの間で、ＩＬ−１０が最も顕著であることが見出され、優位なＴｈ２応答パターンが刺激されたことを示唆した。ＩＬ−１０のレベルは、ｉ．ｎ．経路によってＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧでワクチン接種されたマウスにおいて有意により高かった。事実、ＩＬ−１０分泌の強い刺激が、Ｔｈ１細胞によるサイトカイン合成の阻害、Ｂ細胞増殖の増大及びＩｇＡ産生の刺激におけるこのサイトカインによって演じられた役割と一致する。
【０１１２】
ＢＰＰｃｙｓＡｄａにおいて、ＩＬ−１０産生は、脾臓において有意に増加した。非常に高いレベルのＩＬ−１０が、β−Ｇａｌ抗原の投与量の増加によって誘導され、一方ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２及びＩＬ−６のレベルは、脾臓内のβ−Ｇａｌ抗原に対する応答におけるサイトカイン分泌の弱い増加のみを示した。鼻腔内、皮下又は筋肉内経路によるＢＰＰＣｙｓＡｄａの同時投与によって誘発されたエピトープ特異的細胞免疫応答を評価するために、ＭＨＣ  ｃｌ．  Ｉで制限されたβ−Ｇａｌ（ＴＰＨＰＡＲＩＧＬ）又はＯＶＡ（ＳＩＮＦＥＫＬ）ペプチドで脾臓細胞を刺激した後、ＩＦＮγ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞を分析した。ＩＦＮγ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、β−Ｇａｌで免疫化されたグループ又はＯＶＡ単独で処理されたグループと比較して、有意に減少した（示されていない）。これらの結果は、ＢＰＰｃｙｓＡｄａの粘膜及び非経口同時投与が、Ｔｈ２優勢の免疫応答を誘発することを証明した。
【０１１３】
興味あることに、僅かではあるが、Ｔｈ１サイトカイン、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γの分泌も、更にｉ．ｎ．経路によってβ−ｇａｌ及びＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａでワクチン接種されたマウス由来の細胞中で刺激された。これらの結果は、Ｔｈ２型応答が優勢であるが、ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａは、更にＴｈ１細胞を刺激することも援助することを確認する。
【０１１４】
８．  ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａをアジュバントとして使用することによって刺激された、ＴヘルパーのパターンのＥｌｉｓｐｏｔによる分析
実験プロトコル：  脾臓を取出し、そして細胞免疫応答の分析のためにプールした。細胞を、１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノール及び１ｍＭのＬ−グルタミンで補充したＲＰＭＩ  １６４０（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で生育させ、そして３７℃の加湿した５％ＣＯ２の雰囲気中で維持した。リンパ節及び脾臓細胞の懸濁液を、完全培地中で５×１０６細胞／ｍｌに調節し、細胞を平底の９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）のウェル当り１００μｌでまき、そしてプレートを４日間異なった濃度の可溶性β−ｇａｌの存在中でインキュベートした。ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、１００μｌ／ウェルの、被覆緩衝液中の１０μｇ／ｍｌの精製した捕獲抗体で被覆し、４℃で一晩インキュベートした。６回の洗浄工程後、プレートを、２００μｌ／ウェルの完全培地ＲＰＭＩ−１６４０で、室温で１時間ブロックした。活性化した細胞をウェル当り１００μｌでまき、そして３７℃、５％ＣＯ２で加湿したインキュベーター中で２４時間又は４８時間インキュベートした。５回の洗浄緩衝液の洗浄工程及び１回の蒸留水の工程後、アッセイ希釈液中の１μｇ／ｍｌの濃度のビオチニル化検出抗体を１００μｌ／ウェルで加え、そして室温で２時間インキュベートした。更なる複数の洗浄工程後、アッセイ希釈液中の１／１０００希釈のＡＶ−ＨＲＰを１００μl／ウェルで加え、そして室温で３０分間インキュベートした。更なる複数の洗浄工程後、１００μｌ／ウェルのＡＥＣ基質溶液を加え、そして室温で２０−６０分間、可視スポットが現れるまで展開した。２００μｌ／ウェルの蒸留水による（３×）の洗浄工程後、プレートを空気乾燥し、そしてＥＬＩＳＰＯＴリーダーによってスポットを計数することによって分析した。それぞれの濃度で、三重で試験した。
【０１１５】
ＭＨＣクラスＩで制限されたβ−ガラクトシダーゼ由来の免疫優勢エピトープを包含するペプチドによる再刺激に対する応答において、β−Ｇａｌ及びＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａで免疫化された動物中で脾臓のＩＦＮγ産生細胞の数の増加が観察された（図９Ａ及び９Ｂ）。更に、ｉ．ｎ．によって、そしてｓ．ｃ．経路によってでさえ、β−Ｇａｌ及びＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａで免疫化されたマウスにおいて、脾臓のＩＬ−２及びＩＬ−４産生細胞の増大した発現が示された。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１Ａ】図１は、一次樹状細胞を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究の結果を示す。一次骨髄由来の樹状細胞培養物を、ＢＡＬＢ／ｃマウスから、組換えＧＭ−ＣＳＦ（５×１０４Ｕ／ｍｌ）を使用して、前駆体のｉｎ  ｖｉｔｒｏの成熟によって得た。成熟した樹状細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉのリポ多糖（ＬＰＳ）又は５０及び１００ｎｇ／ｍｌのＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ及びＢＰＰｃｙｓＡｄａで、それぞれ刺激した。次いで、細胞を、ＣＤ１１ｃ（樹状細胞マーカー）に対して特異的な抗体で、抗−ＣＤ４０、抗−ＣＤ５４、抗−ＣＤ８０、抗−ＣＤ８６、抗−ＭＨＣクラスＩ、又は抗ＭＣＨ−クラスＩＩ抗体との組合せで二重標識した。ＣＤ１１ｃ依存性の細胞中のＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ５４、ＣＤ８６、抗−ＭＨＣクラスＩ、及びＭＣＨクラスＩＩの発現を、フローサイトメトリーによって分析した。
【図１Ｂ】図１は、一次樹状細胞を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究の結果を示す。一次骨髄由来の樹状細胞培養物を、ＢＡＬＢ／ｃマウスから、組換えＧＭ−ＣＳＦ（５×１０４Ｕ／ｍｌ）を使用して、前駆体のｉｎ  ｖｉｔｒｏの成熟によって得た。成熟した樹状細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉのリポ多糖（ＬＰＳ）又は５０及び１００ｎｇ／ｍｌのＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ及びＢＰＰｃｙｓＡｄａで、それぞれ刺激した。次いで、細胞を、ＣＤ１１ｃ（樹状細胞マーカー）に対して特異的な抗体で、抗−ＣＤ４０、抗−ＣＤ５４、抗−ＣＤ８０、抗−ＣＤ８６、抗−ＭＨＣクラスＩ、又は抗ＭＣＨ−クラスＩＩ抗体との組合せで二重標識した。ＣＤ１１ｃ依存性の細胞中のＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ５４、ＣＤ８６、抗−ＭＨＣクラスＩ、及びＭＣＨクラスＩＩの発現を、フローサイトメトリーによって分析した。
【図１Ｃ】図１は、一次樹状細胞を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究の結果を示す。一次骨髄由来の樹状細胞培養物を、ＢＡＬＢ／ｃマウスから、組換えＧＭ−ＣＳＦ（５×１０４Ｕ／ｍｌ）を使用して、前駆体のｉｎ  ｖｉｔｒｏの成熟によって得た。成熟した樹状細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉのリポ多糖（ＬＰＳ）又は５０及び１００ｎｇ／ｍｌのＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ及びＢＰＰｃｙｓＡｄａで、それぞれ刺激した。次いで、細胞を、ＣＤ１１ｃ（樹状細胞マーカー）に対して特異的な抗体で、抗−ＣＤ４０、抗−ＣＤ５４、抗−ＣＤ８０、抗−ＣＤ８６、抗−ＭＨＣクラスＩ、又は抗ＭＣＨ−クラスＩＩ抗体との組合せで二重標識した。ＣＤ１１ｃ依存性の細胞中のＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ５４、ＣＤ８６、抗−ＭＨＣクラスＩ、及びＭＣＨクラスＩＩの発現を、フローサイトメトリーによって分析した。
【図２Ａ−２Ｂ】図２は、異なった濃度のＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ及びＢＰＰｃｙｓＡｄａをアジュバントとして使用した、再刺激された脾臓細胞の細胞性応答を例示する。Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の脾臓細胞のＴ細胞増殖応答を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで４日間、異なった濃度での４０μｇ／ｍｌまでの可溶性ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又は２０μｇ／ｍｌまでのＰＰＢｃｙｓＡｄａの存在下で再刺激した。結果を毎分のカウント（Ａ）及び（Ｃ）、並びに刺激指数（試料のｃｐｍ／対照の非刺激細胞中のｃｐｍ）（Ｂ）として表示している。
【図２Ｃ】図２は、異なった濃度のＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ及びＢＰＰｃｙｓＡｄａをアジュバントとして使用した、再刺激された脾臓細胞の細胞性応答を例示する。Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の脾臓細胞のＴ細胞増殖応答を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで４日間、異なった濃度での４０μｇ／ｍｌまでの可溶性ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又は２０μｇ／ｍｌまでのＰＰＢｃｙｓＡｄａの存在下で再刺激した。結果を毎分のカウント（Ａ）及び（Ｃ）、並びに刺激指数（試料のｃｐｍ／対照の非刺激細胞中のｃｐｍ）（Ｂ）として表示している。
【図３Ａ】図３は、異なった濃度のＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧをアジュバントとして使用した、ワクチン接種後に刺激された細胞性応答を証明する。ｉ．ｐ．又はｉ．ｎ．経路によって、β−ガラクトシダーゼ（３０μｇ／投与）単独、或いは異なった投与量のＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＰＥＧのいずれかと混合されたβ−ガレクトシダーゼで、０、１４及び２８日目に免疫化した、マウス由来の脾臓細胞のβ−ガラクトシダーゼ特異的Ｔ細胞増殖反応。一次免疫化の３８日後、マウスを犠牲にし、そして脾臓細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで４日間、異なった濃度の可溶性β−ガラクトシダーゼの存在中で再刺激した。結果をｉ．ｎ．投与後のチミジン組込み及び刺激指数（試料のｃｐｍ／対照の非刺激細胞中のｃｐｍ）（Ａ）、又は非経口投与後のチミジン組込み及び刺激指数（試料のｃｐｍ／対照の非刺激細胞中のｃｐｍ）（Ｂ）として表示する。（Ｃ）は、ＢＰＰｃｙｓＡｄａに対する刺激指数を示す。
【図３Ｂ】図３は、異なった濃度のＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧをアジュバントとして使用した、ワクチン接種後に刺激された細胞性応答を証明する。ｉ．ｐ．又はｉ．ｎ．経路によって、β−ガラクトシダーゼ（３０μｇ／投与）単独、或いは異なった投与量のＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＰＥＧのいずれかと混合されたβ−ガレクトシダーゼで、０、１４及び２８日目に免疫化した、マウス由来の脾臓細胞のβ−ガラクトシダーゼ特異的Ｔ細胞増殖反応。一次免疫化の３８日後、マウスを犠牲にし、そして脾臓細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで４日間、異なった濃度の可溶性β−ガラクトシダーゼの存在中で再刺激した。結果をｉ．ｎ．投与後のチミジン組込み及び刺激指数（試料のｃｐｍ／対照の非刺激細胞中のｃｐｍ）（Ａ）、又は非経口投与後のチミジン組込み及び刺激指数（試料のｃｐｍ／対照の非刺激細胞中のｃｐｍ）（Ｂ）として表示する。（Ｃ）は、ＢＰＰｃｙｓＡｄａに対する刺激指数を示す。
【図３Ｃ】図３は、異なった濃度のＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧをアジュバントとして使用した、ワクチン接種後に刺激された細胞性応答を証明する。ｉ．ｐ．又はｉ．ｎ．経路によって、β−ガラクトシダーゼ（３０μｇ／投与）単独、或いは異なった投与量のＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＰＥＧのいずれかと混合されたβ−ガレクトシダーゼで、０、１４及び２８日目に免疫化した、マウス由来の脾臓細胞のβ−ガラクトシダーゼ特異的Ｔ細胞増殖反応。一次免疫化の３８日後、マウスを犠牲にし、そして脾臓細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで４日間、異なった濃度の可溶性β−ガラクトシダーゼの存在中で再刺激した。結果をｉ．ｎ．投与後のチミジン組込み及び刺激指数（試料のｃｐｍ／対照の非刺激細胞中のｃｐｍ）（Ａ）、又は非経口投与後のチミジン組込み及び刺激指数（試料のｃｐｍ／対照の非刺激細胞中のｃｐｍ）（Ｂ）として表示する。（Ｃ）は、ＢＰＰｃｙｓＡｄａに対する刺激指数を示す。
【図４】図４は、一酸化窒素産生によって決定されたマクロファージ活性化の濃度依存性を示す（ＯＤ５５０ｎｍにおいて分光学的に決定）。異なった濃度のマクロファージ活性化物質ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ（一連の希釈）をアジュバントとして使用した再刺激されたマクロファージのＮＯ放出である。正の対照として、Ｍａｌｐ−２の一連の希釈物に応答する、そして４ａｒｍＰＥＧ分子に対する応答（負の対照）におけるマクロファージのＮＯ放出を示す。
【図５Ａ】図５は、ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ及びＢＰＰｃｙｓＡｄａをそれぞれアジュバントとして使用したワクチン接種後の体液性応答を例示する。マウスを、鼻腔内（ｉ．ｎ．）及び皮下、経皮（局所ワクチン接種）（ｓ．ｃ．）経路によって、β−ガラクトシダーゼ（３０μｇ）単独、或いはＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａと混合されたβ−ガラクトシダーゼのいずれかで、０、１４及び２８日目に免疫化した。一次免疫の３８日後、血清試料を採取し、そしてβ−ガラクトシダーゼ−特異的抗体の力価を、ＥＬＩＳＡによって決定した。対照として、動物をβ−ガラクトシダーゼ単独で免疫化したグループを使用した（Ａ）。（Ｂ）及び（Ｃ）において、抗原特異的血清ＩｇＧの動力学的特性を、鼻腔内ワクチン接種（Ｂ）及び非経口ワクチン接種（Ｃ）に対してそれぞれ示す。（Ｄ）は、ＢＰＰｃｙｓＡｄａを使用したｉ．ｎ．又はｓ．ｃ．ワクチン接種が、抗原特異的ＩｇＧの増強された発現となったことを証明する。抗原を単独で投与されたマウスに関して、差は、ｐ＜０．０５（＊）において統計的に有意であった。四つの独立した実験の内の一つの代表を示す。ＳＥＭは、垂直の線で示される。
【図５Ｂ】図５は、ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ及びＢＰＰｃｙｓＡｄａをそれぞれアジュバントとして使用したワクチン接種後の体液性応答を例示する。マウスを、鼻腔内（ｉ．ｎ．）及び皮下、経皮（局所ワクチン接種）（ｓ．ｃ．）経路によって、β−ガラクトシダーゼ（３０μｇ）単独、或いはＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａと混合されたβ−ガラクトシダーゼのいずれかで、０、１４及び２８日目に免疫化した。一次免疫の３８日後、血清試料を採取し、そしてβ−ガラクトシダーゼ−特異的抗体の力価を、ＥＬＩＳＡによって決定した。対照として、動物をβ−ガラクトシダーゼ単独で免疫化したグループを使用した（Ａ）。（Ｂ）及び（Ｃ）において、抗原特異的血清ＩｇＧの動力学的特性を、鼻腔内ワクチン接種（Ｂ）及び非経口ワクチン接種（Ｃ）に対してそれぞれ示す。（Ｄ）は、ＢＰＰｃｙｓＡｄａを使用したｉ．ｎ．又はｓ．ｃ．ワクチン接種が、抗原特異的ＩｇＧの増強された発現となったことを証明する。抗原を単独で投与されたマウスに関して、差は、ｐ＜０．０５（＊）において統計的に有意であった。四つの独立した実験の内の一つの代表を示す。ＳＥＭは、垂直の線で示される。
【図５Ｃ】図５は、ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ及びＢＰＰｃｙｓＡｄａをそれぞれアジュバントとして使用したワクチン接種後の体液性応答を例示する。マウスを、鼻腔内（ｉ．ｎ．）及び皮下、経皮（局所ワクチン接種）（ｓ．ｃ．）経路によって、β−ガラクトシダーゼ（３０μｇ）単独、或いはＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａと混合されたβ−ガラクトシダーゼのいずれかで、０、１４及び２８日目に免疫化した。一次免疫の３８日後、血清試料を採取し、そしてβ−ガラクトシダーゼ−特異的抗体の力価を、ＥＬＩＳＡによって決定した。対照として、動物をβ−ガラクトシダーゼ単独で免疫化したグループを使用した（Ａ）。（Ｂ）及び（Ｃ）において、抗原特異的血清ＩｇＧの動力学的特性を、鼻腔内ワクチン接種（Ｂ）及び非経口ワクチン接種（Ｃ）に対してそれぞれ示す。（Ｄ）は、ＢＰＰｃｙｓＡｄａを使用したｉ．ｎ．又はｓ．ｃ．ワクチン接種が、抗原特異的ＩｇＧの増強された発現となったことを証明する。抗原を単独で投与されたマウスに関して、差は、ｐ＜０．０５（＊）において統計的に有意であった。四つの独立した実験の内の一つの代表を示す。ＳＥＭは、垂直の線で示される。
【図５Ｄ】図５は、ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ及びＢＰＰｃｙｓＡｄａをそれぞれアジュバントとして使用したワクチン接種後の体液性応答を例示する。マウスを、鼻腔内（ｉ．ｎ．）及び皮下、経皮（局所ワクチン接種）（ｓ．ｃ．）経路によって、β−ガラクトシダーゼ（３０μｇ）単独、或いはＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＡｄａと混合されたβ−ガラクトシダーゼのいずれかで、０、１４及び２８日目に免疫化した。一次免疫の３８日後、血清試料を採取し、そしてβ−ガラクトシダーゼ−特異的抗体の力価を、ＥＬＩＳＡによって決定した。対照として、動物をβ−ガラクトシダーゼ単独で免疫化したグループを使用した（Ａ）。（Ｂ）及び（Ｃ）において、抗原特異的血清ＩｇＧの動力学的特性を、鼻腔内ワクチン接種（Ｂ）及び非経口ワクチン接種（Ｃ）に対してそれぞれ示す。（Ｄ）は、ＢＰＰｃｙｓＡｄａを使用したｉ．ｎ．又はｓ．ｃ．ワクチン接種が、抗原特異的ＩｇＧの増強された発現となったことを証明する。抗原を単独で投与されたマウスに関して、差は、ｐ＜０．０５（＊）において統計的に有意であった。四つの独立した実験の内の一つの代表を示す。ＳＥＭは、垂直の線で示される。
【図６Ａ】図６は、ｉ．ｎ．で免疫化したマウスの肺及び膣洗浄液中のβ−ｇａｌ−特異的分泌型ＩｇＡ発現を示す。抗原を単独で投与されたマウスに関する差は、ｐ＜０．０５（＊）において統計的に有意であった。四つの独立した実験の内の一つの代表を示す。ＳＥＭは、垂直の線で示されている。
【図６Ｂ】図６は、ｉ．ｎ．で免疫化したマウスの肺及び膣洗浄液中のβ−ｇａｌ−特異的分泌型ＩｇＡ発現を示す。抗原を単独で投与されたマウスに関する差は、ｐ＜０．０５（＊）において統計的に有意であった。四つの独立した実験の内の一つの代表を示す。ＳＥＭは、垂直の線で示されている。
【図７Ａ−７Ｂ】図７は、ワクチン接種されたマウスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ再刺激後のＴｈプロファイルを示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで再刺激された脾臓細胞によって分泌されたサイトカインを、ＣＢＡによって免疫化されたマウス中で決定した。結果をサイトカイン濃度比（ＩＬ−１０が最も顕著な検出されたサイトカインである）（Ｂ）及び（Ｄ）、並びに刺激指数（Ａ）及び（Ｃ）として表示する。
【図７Ｃ】図７は、ワクチン接種されたマウスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ再刺激後のＴｈプロファイルを示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで再刺激された脾臓細胞によって分泌されたサイトカインを、ＣＢＡによって免疫化されたマウス中で決定した。結果をサイトカイン濃度比（ＩＬ−１０が最も顕著な検出されたサイトカインである）（Ｂ）及び（Ｄ）、並びに刺激指数（Ａ）及び（Ｃ）として表示する。
【図７Ｄ】図７は、ワクチン接種されたマウスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ再刺激後のＴｈプロファイルを示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで再刺激された脾臓細胞によって分泌されたサイトカインを、ＣＢＡによって免疫化されたマウス中で決定した。結果をサイトカイン濃度比（ＩＬ−１０が最も顕著な検出されたサイトカインである）（Ｂ）及び（Ｄ）、並びに刺激指数（Ａ）及び（Ｃ）として表示する。
【図８Ａ】図８は、免疫化されたマウスの血清中のベータ−Ｇａｌ特異的ＩｇＧアイソタイプの分析を与える。ｉ．ｎ．又はｓ．ｃ．経路によって免疫化されたマウスの、ＰＢＳ、（対照）ベータ−Ｇａｌ＋ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＰＥＧ（図８Ａ）或いはＢＰＰｃｙｓＡｄａ又はＡｄａ単独（図８Ｂ）、或いはベータ−Ｇａｌ単独のいずれかで免疫化されたグループの、抗−ベータ−Ｇａｌ特異的ＩｇＧアイソタイプを、ＥＬＩＳＡによって決定した。結果を終点力価として表示する。ＩｇＧの力価は、実験グループ当り５匹の動物の平均を表す。抗原を単独で投与されたマウスに対して、差は、ｐ＜０．０５（＊）において統計的に有意であった。四つの独立な実験の内の一つの代表を示す。ＳＥＭは、垂直の線で示されている。
【図８Ｂ】図８は、免疫化されたマウスの血清中のベータ−Ｇａｌ特異的ＩｇＧアイソタイプの分析を与える。ｉ．ｎ．又はｓ．ｃ．経路によって免疫化されたマウスの、ＰＢＳ、（対照）ベータ−Ｇａｌ＋ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＰＥＧ（図８Ａ）或いはＢＰＰｃｙｓＡｄａ又はＡｄａ単独（図８Ｂ）、或いはベータ−Ｇａｌ単独のいずれかで免疫化されたグループの、抗−ベータ−Ｇａｌ特異的ＩｇＧアイソタイプを、ＥＬＩＳＡによって決定した。結果を終点力価として表示する。ＩｇＧの力価は、実験グループ当り５匹の動物の平均を表す。抗原を単独で投与されたマウスに対して、差は、ｐ＜０．０５（＊）において統計的に有意であった。四つの独立な実験の内の一つの代表を示す。ＳＥＭは、垂直の線で示されている。
【図９Ａ】図９は、ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＭＰＥＧ（Ａ）、或いはＢＰＰｃｙｓＡｄａ（Ｂ）及びモデル抗原β−ｇａｌ（３０μｇ）単独のいずれかでワクチン接種されたマウス由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで再刺激された脾臓細胞によって分泌されたサイトカインプロファイル（ＩＦＮγ、ＩＬ−４及びＩＬ−２）を与える。結果を、非免疫化対照マウスに対する免疫化グループのバックグラウンドを差引いたスポット形成単位として表示する。抗原を単独で投与されたマウスに対して、差は、ｐ＜０．０５（＊）において統計的に有意であった。
【図９Ｂ】図９は、ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧ又はＢＰＰｃｙｓＭＰＥＧ（Ａ）、或いはＢＰＰｃｙｓＡｄａ（Ｂ）及びモデル抗原β−ｇａｌ（３０μｇ）単独のいずれかでワクチン接種されたマウス由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで再刺激された脾臓細胞によって分泌されたサイトカインプロファイル（ＩＦＮγ、ＩＬ−４及びＩＬ−２）を与える。結果を、非免疫化対照マウスに対する免疫化グループのバックグラウンドを差引いたスポット形成単位として表示する。抗原を単独で投与されたマウスに対して、差は、ｐ＜０．０５（＊）において統計的に有意であった。
【図１０】図１０は、本発明による複合体部分の一部として使用可能なポリアルキレン単位の具体的な例を提供する。
【図１１】図１１は、本発明による特に好ましい複合体、ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧを示す。
【図１２】図１２は、ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧが、室温における２ヶ月間の貯蔵後に安定であることを証明する。
【図１３】図１３は、ＢＰＰｃｙｓＧｌｙｃ４ａｒｍＰＥＧの合成のスキームである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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