(57)【要約】  本発明は、修飾されていない親ポリペプチドと比較して、インビボでの回収が増大した、修飾された治療用ポリペプチドの分野に関する。すなわち、本発明は、直接的に連結された又は場合によりリンカーペプチドによって連結された回収増大用ポリペプチドと治療用ポリペプチドとの融合体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト又は動物において治療用ポリペプチドのインビボでの回収を増大させる方法であって、
ａ）治療用ポリペプチドが、回収増大用タンパク質と直接的に又はリンカーペプチドを介して融合され、そして
ｂ）インビボでの回収が、非融合型治療用ポリペプチドのインビボでの回収の少なくとも１１０％まで増大する、
上記方法。
【請求項２】
回収増大用ポリペプチドが、アルブミン、その変異体又は断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
治療用ポリペプチドが、ビタミンＫ依存性タンパク質を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
治療用ポリペプチドが、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子若しくは第ＶＩＩａ因子又はそれらの断片若しくは変異体を含む、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
治療用ポリペプチド部分が、アルブミン部分のＮ末端に融合される、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
治療用ポリペプチドが、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩａ因子である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ペプチドリンカーが、アルブミン部分から第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩａ因子部分を分離することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ペプチドリンカーが、翻訳後修飾のための部位の挿入によって修飾されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
翻訳後修飾が、１つ又はそれ以上のＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ構造のＮ−グリコシル化部位を含み、Ｘが、プロリン以外の何れかのアミノ酸を示すことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第ＶＩＩ因子ポリペプチド部分が、凝固促進活性を有することを特徴とする、請求項６〜９に記載の方法。
【請求項１１】
治療用ポリペプチドが、第ＩＸ因子である、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
ペプチドリンカーが、アルブミン部分から第ＩＸ因子部分を分離することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ペプチドリンカーが、翻訳後修飾のための部位の挿入によって修飾されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
翻訳後修飾が、１つ又はそれ以上のＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ構造のＮ−グリコシル化部位を含み、Ｘが、プロリン以外の何れかのアミノ酸を示すことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
第ＩＸ因子ポリペプチド部分が、凝固促進活性を有することを特徴とする、請求項１１〜１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾されていない親ポリペプチドと比較して、インビボでの回収（in vivo recovery）が増大した、修飾された治療用ポリペプチドの分野に関する。すなわち、本発明は、直接的に連結された又は場合によりリンカーペプチドによって連結された回収増大用ポリペプチドと治療用ポリペプチドとの融合体に関する。
【０００２】
本発明の要旨は、特に、治療用ポリペプチドとして、例えばヒト第ＶＩＩ因子、ヒト第ＶＩＩａ因子、ヒト第ＩＸ因子、及びヒトタンパク質ＣのようなビタミンＫ依存性ポリペプチド、並びに回収増大ポリペプチドとして、アルブミンによって証明される。それゆえ、特に、本発明は、介在性ペプチドリンカーをコードするオリゴヌクレオチドによって連結され得る、ヒト血清アルブミンをコードするｃＤＮＡに遺伝子的に融合された、ビタミンＫ依存性ポリペプチド及び誘導体の何れかをコードするｃＤＮＡ配列、このようにコードされた誘導体は改良されたインビボでの回収を示し、このようなｃＤＮＡ配列を含有する組換え発現ベクター、このような組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞、修飾されていない野生型ポリペプチドに匹敵する生物学的活性を有しながらインビボでの回収が改良された組換えポリペプチド及び誘導体、並びにこのような組換えポリペプチド及びそれらの誘導体の製造のための方法にも関する。本発明は、また、インビボで生成物レベルを増大させるのに有用なこのような修飾されたＤＮＡ配列を含む、ヒト遺伝子治療において使用するための転送ベクターも包含する。
【背景技術】
【０００３】
治療用ポリペプチド
本発明における治療用ポリペプチドとは、ヒト又は動物への適用に際して、予防上の又は治療上の効果を生じることが可能なタンパク質又はポリペプチドである。これらの治療用ポリペプチドは、ヒト又は動物へ、経口的、局所的、非経口的又は他の経路を介して適用される。すなわち、本発明の実施例によって包含される治療用ポリペプチドの特定のクラスは、ある程度までその血漿由来又は組換え型として商業的に入手可能なビタミンＫ依存性ポリペプチドである。
【０００４】
回収増大用ポリペプチド
本発明における回収増大用ポリペプチドとは、修飾されていない治療用ポリペプチドと比較して、治療用ポリペプチドへ融合させることにより、融合体のインビボでの回収を増大させる全てのポリペプチド又はタンパク質である。このような回収増大用ポリペプチドの具体的な例は、アルブミン、その変異体又は断片、及び免疫グロブリン、その変異体又は断片である。
【０００５】
インビボでの回収
インビボでの回収は、適用後の短い時間（５〜１０分間）の後に血流中で検出可能な治療用ポリペプチドの、投与される治療用ポリペプチドの総量に対する割合として定義される。血流中で予測される治療用ポリペプチド濃度の算出の根拠として、１ｋｇあたり４０ｍＬの血漿容積が一般的に想定される。
【０００６】
融合タンパク質又は融合ポリペプチド
本発明における融合タンパク質又は融合ポリペプチドとは、治療用ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸と、回収増大用ポリペプチドをコードする核酸とを含む遺伝子構築体から発現可能なタンパク質であり、この構築体中で、回収増大用ポリペプチドとのペプチド結合によって治療用ポリペプチドが連結されるタンパク質を、該遺伝子構築体が導入される宿主細胞中での発現が生じるようなやり方で、フレームを合わせて両核酸が連結される。場合により、治療用ポリペプチド及び回収増大ポリペプチドは、短いペプチドリンカーによっても連結可能である。
【０００７】
ビタミンＫ依存性ポリペプチド
ビタミンＫ依存性ポリペプチドは、γ−カルボキシル化によって翻訳後修飾され、例えば、血液凝固第ＩＩ因子（プロトロンビン）、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び第Ｘ因子、抗凝血タンパク質Ｃ及びＳ、及びトロンビン標的タンパク質Ｚ、骨タンパク質オステオカルシン、石灰化阻害マトリックスタンパク質、細胞増殖を制御する増殖抑止特異的遺伝子６タンパク質（Ｇａｓ６）及びその機能が現段階では未知である４つの膜貫通Ｇｌａタンパク質（ＴＭＧＰ）を含む。それらのポリペプチドのうち、幾つかは、特定の種類の血友病及び出血性障害を治療するために使用される。血友病Ａは、遺伝性出血性障害である。血友病Ａは、血液凝固第ＶＩＩＩ因子のＸ染色体連鎖型欠損の結果として生じるものであり、臨床的な徴候は、増大した出血傾向である。この疾病は、血漿由来又は組換え体由来のＦＶＩＩＩ濃縮物の注入によって治療される。血友病Ｂは、非機能性の又は欠損している第ＩＸ因子によって生じ、第ＩＸ因子の血漿由来又は組換え体態由来の第ＩＸ因子濃縮物で治療される。血友病Ａ及び血友病Ｂの両者において、前記疾病を治療する上で最も深刻な医学上の問題は、補充した因子に対する同種抗体の生成である。血友病Ａ患者全体の約３０％までが、第ＶＩＩＩ因子に対する抗体を生成させる。第ＩＸ因子に対する抗体の頻度は低い。
【０００８】
凝固の生理学的引き金が、血管の外側に通常存在するＴＦ発現細胞の表面上での組織因子（ＴＦ）と第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）との間の複合体形成であると、凝固状態の最新のモデルは述べている。これにより第ＩＸ因子及び第Ｘ因子が活性化され、若干のトロンビンを最終的に生成させる。正のフィードバックループにおいて、トロンビンは、血液凝固カスケードのいわゆる「内因性の」経路である第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子を直接的に又は間接的に活性化し、それにより、完全な止血を達成するための完全なトロンビンバーストの発生に必要な、第Ｘａ因子の生成を増幅させる。第ＶＩＩａ因子の超生理学的濃度を投与することによって、第ＶＩＩＩａ因子及び第ＩＸａ因子の要求性を回避して、止血が達成可能であることが示された。第ＶＩＩ因子のｃＤＮＡのクローニング（米国特許第４,７８４,９５０号）によって、医薬として活性化型第ＶＩＩ因子を開発することが可能になった。第ＶＩＩａ因子は、１９８８年に初めて投与に成功した。それ以来、第ＶＩＩａ因子の適応数が着実に伸び、出血を止めるための普遍的な止血薬となる可能性を示した（Ｅｒｈａｒｄｔｓｅｎ，２００２）。しかしながら、約２時間という第ＶＩＩａ因子の短い半減期及びインビボでの回収の低下によって、その適用が限定されている。
【０００９】
第ＶＩＩ因子及び第ＶＩＩａ因子
第ＶＩＩ因子は、分子量５０ｋＤａの単鎖糖タンパク質であり、４０６個のアミノ酸の不活性型酵素前駆体として、肝細胞によって血流中へ分泌される。第ＶＩＩ因子は、ポリペプチドのＮ末端側Ｇｌａドメイン中に局在する１０個のγ−カルボキシ−グルタミン酸残基を含有する。Ｇｌａ残基は、その生合成のためにビタミンＫを必要とする。ＧｌａドメインのＣ末端側に、２つの上皮増殖因子ドメイン、そしてその後にトリプシン型セリンプロテアーゼドメインが存在する。第ＶＩＩ因子のさらなる翻訳後修飾は、ヒドロキシル化（Ａｓｐ６３）、Ｎ型グリコシル化（Ａｓｎ１４５及びＡｓｎ３２２）及びＯ型グリコシル化（Ｓｅｒ５２及びＳｅｒ６０）を包含する。
【００１０】
第ＶＩＩ因子は、Ａｒｇ１５２−Ｉｌｅ１５３での単一のペプチド結合のタンパク質分解によってその活性型の第ＶＩＩａ因子へと変換され、それにより２つのポリペプチド鎖、すなわちＮ末端側軽鎖（２４ｋＤａ）及びＣ末端側重鎖（２８ｋＤａ）が形成され、それらは互いに１つのジスルフィド架橋によって保持される。他のビタミンＫ依存性凝固因子とは対照的に、これらの他のビタミンＫ依存性凝固因子の活性化中に切断される活性化ペプチドは、第ＶＩＩ因子に関しては記載されていない。第ＶＩＩａ因子の活性型高次構造を得るために不可欠なのは、Ｉｌｅ１５３とＡｓｐ３４３との間の活性化切断後の塩架橋の形成である。第ＶＩＩ因子の活性化切断は、第Ｘａ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩ因子活性化プロテアーゼ（ＦＳＡＰ）及びトロンビンによってインビトロで達成可能である。Ｍｏｌｌｅｒｕｐら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９９５）４８：５０１−５０５）は、Ａｒｇ２９０及び又はＡｒｇ３１５でも重鎖に切断が幾つか生じると報告した。
【００１１】
第ＶＩＩ因子は、約５００ｎｇ／ｍＬの濃度で血漿中に存在する。第ＶＩＩ因子約１％又は５ｎｇ／ｍＬは、第ＶＩＩａ因子として存在する。第ＶＩＩ因子の血漿半減期は、約４時間であり、第ＶＩＩａ因子の血漿半減期は、約２時間であることが観察された。止血を達成するための複数回の静脈内注射又は連続注入が必要となるために、第ＶＩＩａ因子の２時間の半減期は、第ＶＩＩａ因子の治療用途に関して重大な欠点となる。この結果、患者にとって非常に高い治療経費及び不便さが生じる。血漿半減期及びインビボでの回収の両者の改良は、患者に対して利点をもたらすであろう。これまで、インビボでの回収が改良された第ＶＩＩａ因子の医薬調製物は、市販されておらず、インビボでの回収が改良された第ＶＩＩ因子／第ＶＩＩａ因子変異体を示すデータも全く発表されていない。第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子は、普遍的な止血剤として使用される可能性があるため、インビボでの回収が改良された第ＶＩＩａ因子の形態を開発する高い医学的必要性が、なおも存在する。
【００１２】
第ＩＸ因子
ヒト第ＩＸ因子は、分子量５７ｋＤａの単鎖糖タンパク質であり、４１５個のアミノ酸の不活性型酵素前駆体として、肝細胞によって血流中へ分泌される。ヒト第ＩＸ因子は、ポリペプチドのＮ末端側Ｇｌａドメイン中に局在する１２個のγ−カルボキシ−グルタミン酸残基を含有する。Ｇｌａ残基は、その生合成のためにビタミンＫを必要とする。ＧｌａドメインのＣ末端側に局在するのは、２つの上皮増殖因子ドメイン及び１つの活性化ペプチド、そしてその後にトリプシン型セリンプロテアーゼドメインが存在する。第ＩＸ因子のさらなる翻訳後修飾は、ヒドロキシル化（Ａｓｐ６４）、Ｎ型グリコシル化（Ａｓｎ１５７及びＡｓｎ１６７）及びＯ型グリコシル化（Ｓｅｒ５３、Ｓｅｒ６１、Ｔｈｒ１５９、Ｔｈｒ１６９、及びＴｈｒ１７２）、硫酸化（Ｔｙｒ１５５）、並びにリン酸化（Ｓｅｒ１５８）を包含する。
【００１３】
第ＩＸ因子は、Ａｒｇ１４５−Ａｌａ１４６及びＡｒｇ１８０−Ｖａｌ１８１での活性化ペプチド結合のタンパク質分解によってその活性型の第ＩＸａ因子へと変換され、それにより２つのポリペプチド鎖、すなわちＮ末端側軽鎖（１８ｋＤａ）及びＣ末端側重鎖（２８ｋＤａ）が形成され、それらは互いに１つのジスルフィド架橋によって保持される。第ＩＸ因子の活性化切断は、例えば第ＸＩａ因子又は第ＶＩＩａ因子／ＴＦによってインビトロで達成可能である。
【００１４】
第ＩＸ因子は、約５〜１０μｇ／ｍＬの濃度でヒト血漿中に存在する。ヒトにおける第ＩＸ因子の血漿半減期は、約１５〜１８時間であることが観察された（Ｗｈｉｔｅ  ＧＣ  ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．７８：２６１−２６５；Ｅｗｅｎｓｔｅｉｎ  ＢＭ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４２：１９０−１９７）。
【００１５】
血友病Ｂ患者はしばしば、自発的な出血を回避するために、第ＩＸ因子の予防的投与を隔週で受けるために、適用される第ＩＸ因子生成物のインビボでの回収を増大させることによって、適用の間隔を低下させることが望ましい。血漿半減期及びインビボでの回収の両者の改良は、患者に対して有意な利点をもたらすであろう。これまで、血漿半減期又はインビボでの回収が改良された第ＩＸ因子の医薬調製物は、市販されておらず、インビボでの半減期を延長しそしてインビボでの回収が改良された第ＩＸ因子の変異体を示すデータも全く発表されていない。それゆえ、インビボでの機能的半減期のより長い及び／又はインビボでの回収が改良された第ＩＸ因子の形態を開発することに対する高い医学的必要性がなおも存在する。
【００１６】
組換え体の治療用ポリペプチド薬物は通常、高価であり、このような薬物をベースとした治療法は全ての国で安価に利用可能というわけではない。このような薬物のインビボでの回収を増大させることはまた、従来技術の治療をより安価にし、従って、より多くの患者が、インビボでの回収の増大の利点を得るであろう。
【００１７】
Ｂａｌｌａｎｃｅら（ＷＯ０１／７９２７１）は、ヒト血清アルブミンに融合される場合、インビボでの機能的半減期が増大し、保存期間が延長されると予測される、異なる多数の治療用タンパク質の融合ポリペプチドについて記載している。可能性のある融合パートナーの長いリストが、これらのタンパク質のほぼ全てに関して、それぞれのアルブミン融合ポリペプチドが実際に生物活性を保持し、改良された特性を有することを、実験データによって示すことなく記載されている。この治療用ポリペプチドのリストには、第ＩＸ因子及び第ＶＩＩ因子／第ＶＩＩａ因子もまた、該発明の例として言及されている。Ｂａｌｌａｎｃｅらは、このような融合タンパク質のインビボでの回収については何も述べていない。
【００１８】
ビタミンＫ依存性ポリペプチドのインビボでの回収
ＩＵ／ｋｇあたり０.８４〜０.８６ＩＵ／ｄＬの組換え第ＩＸ因子（ＢｅｎｅＦＩＸ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のインビボでの回収は、ＩＵ／ｋｇあたり１.１７〜１.７１ＩＵ／ｄＬのモノニン（Ｍｏｎｏｎｉｎｅ）のような血漿由来の第ＩＸ因子のインビボでの回収と比べて、血友病Ｂ患者において有意に低いことが報告されている（Ｗｈｉｔｅ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ３５（Ｓｕｐｐｌ．２）：３３−３８（１９９８）；Ｅｗｅｎｓｔｅｉｎ  Ｂ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４２（２）：１９０−１９７（２００２））。結果として、血友病Ｂの同等に効率的な治療を達成するために血漿由来の第ＩＸ因子と比較して、組換え第ＩＸ因子は少なくとも２０％多い量が適用される。
【００１９】
Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  ＷＰ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１２６：５６５−５７３）は、ヒト第ＩＸ因子アルブミン融合ポリペプチドを発現させており、第ＩＸ因子ノックアウトマウスにおいて、ヒト第ＩＸ因子−アルブミン融合タンパク質のインビボでの回収が、非融合型のヒト第ＩＸ因子分子よりも有意に低い（半分未満である）ということを薬物動態学的実験において示した。
【００２０】
組換え第ＶＩＩａ因子（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ，Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）のインビボでの回収は、第ＶＩＩ因子欠損患者で約１９〜２２％（Ｂｅｒｒｅｔｔｉｎｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ８６：６４０−６４５）、血友病患者で約４６〜４８％（Ｌｉｎｄｌｅｙ  ＣＭ  ｅｔ  ａｌ，１９９４．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．５５：６３８−６４８）であることが報告されている。同様に、組換え第ＶＩＩａ因子のインビボでの回収は、血友病Ａイヌで約３４％、血友病Ｂイヌで約４４％と、それぞれ記載された（Ｂｒｉｎｋｈｏｕｓ  ＫＭ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：１３８２−１３８６）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
一般に、治療用ポリペプチドは、その製造方法に費用がかかることにより、かなり高価であるため、インビボでの回収の増大は、より安価な価格でこのような製品を提供し、現に可能であるよりも多くの人々を治療するのに役立つであろう。さらに、適用頻度を低下することによって、患者の利便性が改良されるであろう。
【００２２】
それゆえ、本発明の基礎にある技術的な課題は、治療用ポリペプチド、特に、インビボでの回収の増大を示し、それにより、製品が適用される用量又は頻度の低減を促進するビタミンＫ依存性ポリペプチドを開発することであった。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
驚くべきことに、アルブミンとの融合タンパク質として発現する場合、ビタミンＫ依存性ポリペプチドが、インビボでの改良された回収を示すことが発見された。非限定的な例によって、本発明者は、Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄｓ  ＷＰ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１２６：５６５−５７３）によって発表された第ＩＸ因子アルブミン融合タンパク質による結果とは対照的に、ヒト第ＩＸ因子アルブミン融合タンパク質が、非融合型第ＩＸ因子と比較して、インビボでの改良された回収を示すことを発見した。さらに、ヒト血清アルブミンへの第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子の融合によって、第ＶＩＩ因子／第ＶＩＩａ因子融合タンパク質を生じ、それが第ＸＩＩ因子／第ＶＩＩａ因子生物活性を保持し、インビボでの増大した回収を示すに至ることも発見した。
【００２４】
本発明の一局面はそれゆえ、アルブミンのＮ末端若しくはＣ末端又はその他の回収増大用ポリペプチドへ融合された治療用ポリペプチドであり、治療用ポリペプチドにおいて、融合タンパク質は、組換え方法で製造されたそれぞれの非融合型治療用ポリペプチド又はペプチドのインビボでの回収が少なくとも１１０％、好ましくは１２５％以上、さらにより好ましくは１４０％以上を示す。
【００２５】
本発明の別の局面は、アルブミン又は何れかの他の回収増大用ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合されたビタミンＫ依存性ポリペプチドである。融合タンパク質は、組換え方法で製造されたそれぞれの野生型ビタミンＫ依存性ポリペプチドのインビボでの回収に対して有意な増大を示す。
【００２６】
本発明のさらなる局面は、非融合型組換え第ＶＩＩ因子／第ＶＩＩａ因子と比較して、インビボでの回収の有意な増大を示す、第ＶＩＩ因子／第ＶＩＩａ因子ポリペプチドがアルブミンのＮ末端に融合された融合タンパク質である。
【００２７】
本発明の別の局面は、非融合型第ＩＸ因子と比較して、第ＩＸ因子ポリペプチドが、インビボでの回収が有意な増大を示すアルブミンのＮ末端に融合された融合タンパク質である。
【００２８】
本発明の一局面はそれゆえ、対応する組換え非融合型ポリペプチドと比較してインビボでの回収が少なくとも１０％、好ましくは２５％を超えて、さらにより好ましくは４０％を超えて増大するアルブミンのＮ末端又はＣ末端に融合されたビタミンＫ依存性ポリペプチドである。
【００２９】
本発明は、治療用ポリペプチド、特に、アルブミンのような回収増大用ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に連結されたビタミンＫ依存性ポリペプチド、組成物、医薬組成物、製剤及びキットを包含する。本発明はまた、非融合型治療用ポリペプチドも適用可能であろう特定の医療適適応症における、治療用ポリペプチドを連結した該回収増大用ポリペプチドの使用も包含する。本発明はまた、本発明の治療用ポリペプチドを連結した回収増大用ポリペプチドをコードする核酸分子、並びにこれらの核酸を含有するベクター、これらの核酸及びベクターで形質転換された宿主細胞、これらの核酸、ベクター及び／又は宿主細胞を使用して本発明の治療用ポリペプチドを連結した回収増大用ポリペプチドを製造する方法も包含する。
【００３０】
本発明はまた、ビタミンＫ依存性ポリペプチド又はその断片若しくは変異体、場合によりペプチドリンカー、及びアルブミン又はその断片若しくは変異体、及び医薬的に許容される担体とを含む組成物も提供する。本発明の別の目的は、出血性障害を有する患者を治療する方法を提供することである。この方法は、ビタミンＫ依存性ポリペプチドを含む融合ポリペプチドの有効量を投与する工程を含む。
【００３１】
本発明の別の局面は、ビタミンＫ依存性ポリペプチド又はその断片若しくは変異体、場合によりペプチドリンカー、及びアルブミン又はその断片若しくは変異体を含むアルブミン融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子、並びにこのような核酸分子を含むベクターを提供することである。
【００３２】
本発明はまた、ビタミンＫ依存性ポリペプチド又はその断片若しくは変異体、ペプチドリンカー、及びアルブミン又はその断片若しくは変異体とを含むアルブミン融合ポリペプチドを製造するための方法も提供し、ここで該方法は、
（ａ）哺乳動物細胞において発現可能なアルブミンポリペプチドに連結されたビタミンＫ依存性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供すること；
（ｂ）生物体において核酸を発現させ、アルブミンポリペプチドに連結されたビタミンＫ依存性ポリペプチドを生成すること；及び
（ｃ）アルブミンポリペプチドに連結されたビタミンＫ依存性ポリペプチドを精製すること
を含む。
【００３３】
本発明のアルブミン融合ポリペプチドは好ましくは、ビタミンＫ依存性ポリペプチドの少なくとも１つの断片若しくは変異体と、遺伝的融合等によって互いに連結した、ヒト血清アルブミンの少なくとも１つの断片若しくは変異体とを含む（すなわち、ビタミンＫ依存性ポリペプチド部分とアルブミン部分との間にリンカーペプチドを導入して、リンカー配列をコードするポリヌクレオチドによって場合により連結されるアルブミンの全部又は一部をコードするポリヌクレオチドの５’末端へフレームをそろえて、ビタミンＫの全部又は一部をコードするポリヌクレオチドが連接される核酸の翻訳によって、アルブミン融合ポリペプチドが生成する）。
【００３４】
一実施態様において、本発明は、血清アルブミンポリペプチドのＮ末端に融合された、生物活性があるか若しくは生物学的に活性化可能な、及び／又は治療活性があるか若しくは治療的に活性化可能なビタミンＫ依存性ポリペプチドを含むか、又はそれらからなる、ビタミンＫ依存性ポリペプチドアルブミン融合ポリペプチドを提供する。
【００３５】
他の実施態様において、本発明は、生物活性があるか若しくは生物学的に活性化可能な、及び／又は治療活性があるか若しくは治療的に活性化可能なビタミンＫ依存性ポリペプチドの断片と血清アルブミンのＮ末端に融合されたペプチドリンカーとを含むか、又はそれらからなる、アルブミン融合ポリペプチドを提供する。
【００３６】
他の実施態様において、本発明は、血清アルブミンポリペプチドのＮ末端に融合された、生物活性があるか若しくは生物学的に活性化可能な、及び／又は治療活性があるか若しくは治療的に活性化可能な、ビタミンＫ依存性ポリペプチドの変異体と場合によりペプチドリンカーを含むか、又はそれらからなる、ビタミンＫ依存性ポリペプチドアルブミン融合ポリペプチドを提供する。
【００３７】
さらなる実施態様において、本発明は、血清アルブミンの断片若しくは変異体のＮ末端に融合されたビタミンＫ依存性ポリペプチドの、生物活性があるか若しくは生物学的に活性化可能な、及び／又は治療活性があるか若しくは治療的に活性化可能な断片若しくは変異体と、場合によりペプチドリンカーを含むか、又はそれらからなる、ビタミンＫ依存性ポリペプチドアルブミン融合ポリペプチドを提供する。
【００３８】
幾つかの実施態様において、本発明は、血清アルブミンの成熟部分のＮ末端に融合されたビタミンＫ依存性ポリペプチドの成熟部分及び場合によりペプチドリンカーを含むか、又はそれらからなる、アルブミン融合ポリペプチドを提供する。
【００３９】
本発明の融合タンパク質は、非融合型ポリペプチド又はタンパク質が適用可能である全ての適応症において治療的に使用され得る。
【００４０】
本発明の詳細な記述
本発明の目的は、特にヒトアルブミン又はその断片若しくは変異体のような回収増大用ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端への融合によって、治療用ポリペプチド、特にビタミンＫ依存性ポリペプチド又はその断片若しくは変異体のインビボでの回収を、非融合型治療用ポリペプチドと比較して増大させる方法を提供することである。本発明の非制限的例として、治療用ポリペプチド、特にビタミンＫ依存性ポリペプチドの、血清アルブミンのＮ末端への融合は、場合により、ビタミンＫ依存性ポリペプチドとアルブミンとの間の介入ペプチドリンカーと共に提供される。
【００４１】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びヒトアルブミン（ＨＡ）という語は、本明細書において同じ意味で使用される。「アルブミン」及び「血清アルブミン」という語は、より広義であり、ヒト血清アルブミン（及びその断片及び変異体）及び他の種由来のアルブミン（及びその断片及び変異体）を包含する。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「アルブミン」とは、アルブミンの１つ又はそれ以上の機能的活性（例えば、生物活性）を有するアルブミンのポリペプチド又はアミノ酸配列、又はアルブミンの断片若しくは変異体を集約的に指す。特に、「アルブミン」とは、ヒトアルブミン又はその断片、本明細書で配列番号２０において示されるようなヒトアルブミンの成熟型、又は他の脊椎動物由来のアルブミン若しくはその断片、又はこれらの分子の類縁体若しくは変異体又はその断片を指す。
【００４３】
アルブミンの連結したポリペプチドのアルブミン部分は、上述のようなＨＡ配列の全長を含み得るか、又は治療活性を安定化若しくは長期化できる前記ＨＡ配列の１つ若しくはそれ以上の断片を含み得る。このような断片は、長さ１０個又はそれ以上のアミノ酸であり得るか、又はＨＡ配列由来の約１５、２０、２５、３０、５０個、又はそれ以上の連続したアミノ酸を含み得るか、又はＨＡの特異的ドメインの一部又は全部を含み得る。
【００４４】
本発明のアルブミンの連結したポリペプチドのアルブミン部分は、正常なＨＡの変異体であってもいい。本発明のアルブミンの連結したポリペプチドのビタミンＫ依存性ポリペプチド部分はまた、本明細書に記載されるようなビタミンＫ依存性ポリペプチドの変異体であってもいい。「変異体」という表現には、挿入体、欠失体及び置換体が含まれ、保存的又は非保存的の何れかであり、このような改変は、ビタミンＫ依存性ポリペプチドの治療活性を付与する活性部位又は活性ドメインを実質的に変化させない。
【００４５】
特に、本発明のアルブミンの連結されたポリペプチドには、ヒトアルブミンの天然の多型変異体及びヒトアルブミンの断片が含まれ得る。アルブミンは、何れかの脊椎動物由来であり、特に何れかの哺乳動物、例えば、ヒト、雌ウシ、ヒツジ、又はブタ由来であり得る。非哺乳動物アルブミンには、雌トリ及びサケが含まれるが、それらに限定されるわけではない。アルブミンの連結されたポリペプチドのアルブミン部分は、ビタミンＫ依存性ポリペプチド部分とは異なる動物に由来してもいい。
【００４６】
一般的に言えば、アルブミン断片又は変異体は、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも４０個、最も好ましくは７０個を超えるアミノ酸の長さであろう。アルブミン変異体は選択的に、アルブミンの少なくとも１つの全ドメイン又は該ドメインの断片、例えば、ドメイン１（配列番号２０の１〜１９４番目のアミノ酸）、ドメイン２（配列番号２０の１９５〜３８７番目のアミノ酸）、ドメイン３（配列番号２０の３８８〜５８５番目のアミノ酸）、ドメイン１＋２（配列番号２０の１〜３８７番目）、２＋３（配列番号２０の１９５〜５８５番目）、又は１＋３（配列番号２０の１〜１９４番目のアミノ酸＋配列番号２０の３８８〜５８５番目のアミノ酸）からなるか、又はそれらを含む。各ドメインはそれ自体、Ｌｙｓ１０６〜Ｇｌｕ１１９、Ｇｌｕ２９２〜Ｖａｌ３１５及びＧｌｕ４９２〜Ａｌａ５１１の残基を含む、柔軟性のあるサブドメイン間リンカー領域を有する２つの相同的なサブドメイン、すなわち１〜１０５、１２０〜１９４、１９５〜２９１、３１６〜３８７、３８８〜４９１及び５１２〜５８５からなる。
【００４７】
本発明のアルブミン融合ポリペプチドのアルブミン部分は、ＨＡの少なくとも１つのサブドメイン若しくはドメイン、又はその保存的修飾体を含み得る。
【００４８】
本発明は、修飾型ビタミンＫ依存性ポリペプチドのインビボでの回収が、アルブミンに連結されていないビタミンＫ依存性ポリペプチドと比較して増大するよう、介入ペプチドリンカーが、修飾されたビタミンＫ依存性ポリペプチドとアルブミンとの間に場合により導入されるよう、ビタミンＫ依存性ポリペプチド又はその断片若しくは変異体をアルブミンポリペプチド又はその断片若しくは変異体のＮ末端又はＣ末端に連結することを含む、修飾型ビタミンＫ依存性ポリペプチドに関する。
【００４９】
本願において使用される「ビタミンＫ依存性ポリペプチド」には、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩ因子（プロトロンビン）、プロテインＣ、活性型プロテインＣ、プロテインＳ、活性型プロテインＳ、ＧＡＳ６、活性型ＧＡＳ６、プロテインＺ、活性型プロテインＺ等が含まれるが、それらに限定されるわけではない。さらに、有用なビタミンＫ依存性ポリペプチドは、野生型であり得るか又は変異体を含有し得る。グリコシル化又は他の翻訳後修飾の程度及び位置は、選択された宿主細胞及び宿主細胞の環境の性質に応じて変動し得る。特定のアミノ酸配列を言及する場合、このような配列の翻訳後修飾は、本願において包含される。
【００５０】
上述の定義内の「ビタミンＫ依存性ポリペプチド」には、天然アミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。前記ビタミンＫ依存性ポリペプチドには、わずかに修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えば、個々のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性を前記ポリペプチドが実質的に保持する限り、末端のアミノ酸欠失又は付加を含む修飾されたＮ末端又はＣ末端を有するポリペプチドも含まれる。上述の定義内の「ビタミンＫ依存性ポリペプチド」にはまた、個体毎に存在及び発生し得る天然対立遺伝子由来の変異も含まれる。上述の定義内の「ビタミンＫ依存性ポリペプチド」にはさらに、ビタミンＫ依存性ポリペプチドの変異体も含まれる。このような変異体は、野生型の配列から１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が異なる。このような差異の例には、Ｎ末端及び／又はＣ末端の１つ又はそれ以上のアミノ酸残基（例えば、１〜１０個のアミノ酸残基）の短縮、又はＮ末端及び／又はＣ末端での１つ又はそれ以上の余分な残基の付加、及び保存的アミノ酸置換、すなわち、同様の特徴、例えば、（１）小分子アミノ酸、（２）酸性アミノ酸、（３）極性アミノ酸、（４）塩基性アミノ酸、（５）疎水性アミノ酸、及び（６）芳香族アミノ酸を有するアミノ酸の群内で実施される置換が含まれ得る。このような保存された置換の例を、表１に示す。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
本発明のビタミンＫ依存性ポリペプチドとアルブミンとの融合によるインビボでの回収は、非融合型ビタミンＫ依存性ポリペプチドのインビボでの回収と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、及びより好ましくは少なくとも４０％増大している。
【００５３】
本発明の第ＶＩＩ因子とアルブミンの連結されたポリペプチドのインビボでの回収は通常、ヒト第ＶＩＩ因子の野生型のインビボでの回収よりも、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約４０％高い。
【００５４】
本発明の第ＶＩＩａ因子とアルブミンの連結されたポリペプチドのインビボでの回収は通常、ヒト第ＶＩＩａ因子の野生型のインビボでの回収よりも、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約４０％高い。
【００５５】
本発明の第ＩＸ因子とアルブミンの連結されたポリペプチドのインビボでの回収は通常、ヒト第ＩＸ因子の野生型のインビボでの回収よりも、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約４０％高い。
【００５６】
本発明によると、ビタミンＫ依存性ポリペプチド部分は、ペプチドリンカーによってアルブミン部分へ連結される。リンカーは、柔軟であり、非免疫原性であるべきである。典型的なリンカーには、（ＧＧＧＧＳ）n又は（ＧＧＧＳ）n又は（ＧＧＳ）nが含まれ、式中、ｎは、１よりも大きな又は１に等しい整数であり、Ｇは、グリシンを表し、Ｓは、セリンを表す。
【００５７】
本発明の別の実施態様において、ビタミンＫ依存性ポリペプチド部分とアルブミン部分との間のペプチドリンカーは、翻訳後修飾の付加のためのコンセンサス部位を含有する。好ましくは、このような修飾は、グリコシル化部位からなる。より好ましくは、このような修飾は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ構造（Ｘが、プロリン以外の何れかのアミノ酸を示す）の少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位からなる。さらにより好ましくは、このようなＮ−グリコシル化部位は、ペプチドリンカーのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端近くに挿入され、それにより、それぞれ、ビタミンＫ依存性ポリペプチド部分がペプチドリンカー中に移行しており、ペプチドリンカーがアルブミン部分の配列中に移行している配列で生じ得る新生エピトープ（ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ）を、前記Ｎ−グリコシル化部位が遮蔽できる。
【００５８】
本発明はさらに、本願において記載されるビタミンＫ依存性ポリペプチドとアルブミンとの融合体をコードするポリヌクレオチドに関する。「ポリヌクレオチド」という表現は一般的に、修飾されていないＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾されたＲＮＡ若しくはＤＮＡであり得る何れかのポリリボヌクレオチド若しくはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡであり得る。本明細書において、「ポリヌクレオチド」という表現には、１つ又はそれ以上の修飾された塩基及び／又はイノシン等の非通常型塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡが含まれる。ＤＮＡ及びＲＮＡに対して、当業者に公知の多くの有用な目的を供する多様な修飾がなされ得ることは理解されるであろう。本明細書において、「ポリヌクレオチド」という表現は、このように化学的に、酵素的に又は代謝的に修飾されるポリヌクレオチドの形態、並びにウイルス及び、例えば単純な及び複雑な細胞を含む細胞のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包含する。
【００５９】
当業者は、遺伝暗号の縮重に応じて、付与されたポリペプチドが、異なるポリヌクレオチドによってコード可能であることを理解するであろう。これらの「変異体」は、本発明によって包含される。
【００６０】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。「単離された」ポリヌクレオチドという表現は、それに限定されるわけではないが、他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡのような他の核酸配列を実質的に含まないポリヌクレオチドを指す。単離されたポリヌクレオチドは、宿主細胞から精製され得る。当業者に公知の従来の核酸精製方法は、単離されたポリヌクレオチドを得るために使用され得る。この表現にはまた、組換えポリヌクレオチド及び化学的に合成されたポリヌクレオチドが含まれる。
【００６１】
本発明のさらに別の局面は、本発明に従ったポリヌクレオチドを含むプラスミド又はベクターである。好ましくは、プラスミド又はベクターは、発現ベクターである。具体的な実施態様において、ベクターは、ヒト遺伝子の治療において使用するための転送ベクターである。
【００６２】
本発明のさらに別の局面は、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のプラスミド若しくはベクターを含む宿主細胞である。
【００６３】
本発明の宿主細胞は、本発明の一部であるビタミンＫ依存性ポリペプチドとアルブミンの融合体を製造する方法において用いられる。この方法は、
- ビタミンＫ依存性ポリペプチドアルブミン融合体が発現するような条件下で、本発明の宿主細胞を培養すること；及び
- 場合により、ビタミンＫ依存性ポリペプチドアルブミン融合体を培地から回収すること、
を含む。
【００６４】
提唱されるポリペプチドの発現
適切な宿主細胞における組換えタンパク質の高レベルの産生は、当業者に公知の方法に従って、多様な発現系において増殖可能な組換え発現ベクター中の適切な調節エレメントとともに、上述の修飾されたｃＤＮＡを効率的な転写単位へと組み入れることを必要とする。効率的な転写調節エレメントは、その天然宿主として動物細胞を有するウイルス由来であり得るか、又は動物細胞の染色体ＤＮＡ由来であり得る。好ましくは、サルウイルス４０、アデノウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、又はラウス肉腫ウイルスの末端反復配列、又はβ−アクチン若しくはＧＲＰ７８のような動物細胞中で強力に構成的に転写される遺伝子を含む、プロモーターとエンハンサーとの組み合わせが使用可能である。ｃＤＮＡから転写されたｍＲＮＡの安定した高いレベルを達成するために、転写単位は、その３’近位部分において、転写終結−ポリアデニル化配列をコードするＤＮＡ領域を含有する。好ましくは、この配列は、サルウイルス４０初期転写領域、ウサギβ−グロビン遺伝子、又はヒト組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子に由来する。
【００６５】
次に、ｃＤＮＡは、治療用ポリペプチドアルブミン融合ポリペプチドの発現に適切な宿主細胞系のゲノム中に組み込まれる。好ましくは、この細胞系は、正確な折りたたみ、Ｇｌａドメイン内でのグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ジスルフィド結合形成、アスパラギン連結型グリコシル化、Ｏ連結型グリコシル化、及び他の翻訳後修飾、並びに培地中への分泌を確実にするために、脊椎動物由来の動物細胞系であるべきである。他の翻訳後修飾の例は、チロシンＯ−硫酸化、ヒドロキシル化、リン酸化、新生ポリペプチド鎖のタンパク質分解加工、及びプロペプチド領域の切断である。使用可能な細胞系の例は、サルＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、ハムスターＢＨＫ−２１細胞、ヒト胚性腎２９３細胞、及びハムスターＣＨＯ細胞である。
【００６６】
対応するｃＤＮＡをコードする組換え発現ベクターは、幾つもの異なる方法で動物細胞中に導入可能である。例えば、組換え発現ベクターは、異なる動物ウイルスに基づくベクターから作製可能である。これらの例は、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、及び好ましくはウシパピローマウイルスに基づくベクターである。
【００６７】
組換えＤＮＡをゲノムに組み込んだ特異的細胞クローンの単離を容易にするため、対応するＤＮＡをコードする転写単位を動物細胞中に、これらの細胞中で優性選択可能なマーカーとして機能し得る別の組換え遺伝子と共に導入することも可能である。この種の優性選択可能なマーカー遺伝子の例は、ジェネテシン（Ｇ４１８）に対する抵抗性を与えるＴｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンに対する抵抗性を与えるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、及びピューロマイシンに対する抵抗性を与えるピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼである。このような選択可能なマーカーをコードする組換え発現ベクターは、所望のポリペプチドのｃＤＮＡをコードするものと同一のベクター上に存在しても良く、又は宿主細胞のゲノムに同時に導入及び組み込まれる別のベクター上でコードされ、その結果、異なる転写単位間で密接な物理的連結が頻繁に生じ得るようなものでも良い。
【００６８】
所望のタンパク質のcＤＮＡと共に使用可能な選択可能なマーカー遺伝子の他の種類は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）をコードする多様な転写単位に基づいている。この種の遺伝子を、内在性ｄｈｆｒ活性を欠失する細胞、好ましくはＣＨＯ細胞（ＤＵＫＸ−Ｂ１１、ＤＧ−４４）中に導入した後、ヌクレオシドを欠失する培地中で前記細胞が増殖可能となる。このような培地の一例は、ヒポキサンチン、チミジン及びグリシンを含まないＨａｍのＦ１２である。これらのｄｈｆｒ遺伝子は、血液凝固因子ｃＤＮＡ転写単位とともに、同一のベクター又は異別のベクターの何れかに連結されて、上述の種類のＣＨＯ細胞中に導入でき、それにより、組換えタンパク質を産生するｄｈｆｒ陽性細胞系が作製される。
【００６９】
上述の細胞系が、細胞毒性のｄｈｆｒ阻害剤メトトレキサートの存在下で増殖する場合、メトトレキサートに対して抵抗性のある新たな細胞系が生じる。これらの細胞系は、連結されたｄｈｆｒ及び所望のタンパク質の転写単位の増幅数に応じて増大した速度で、組換えタンパク質を産生し得る。メトトレキサートの増大する濃度（１〜１００００ｎＭ）でこれらの細胞系を増殖する場合、非常に速やかに所望のタンパク質を産生する新たな細胞系が得られ得る。
【００７０】
所望のタンパク質を産生する上述の細胞系は、懸濁培養物中で又は種々の固体支持体上での何れかで、大規模な増殖が可能である。これらの支持体の例は、デキストラン又はコラーゲンマトリックスベースのマイクロキャリア、又は中空繊維若しくは多様なセラミック材料の形態にある固体支持体である。細胞懸濁培養物中で、又はマイクロキャリア上で増殖される場合、上述の細胞系の培養は、バッチ培養として、又は長時間にわたって条件培地の連続的な生成による還流培養としての何れかで実施可能である。従って、本発明によると、上述の細胞系は、所望の組換えタンパク質の産生のための工業的方法の開発に非常に適している。
【００７１】
上述の種類の分泌細胞の培地中に蓄積する組換えタンパク質は、細胞培地中の所望のタンパク質と他の物質との間の大きさ、電荷、疎水性、溶解度、特異的親和性等の差異を利用する方法を含む、多様な生化学的方法及びクロマトグラフィー法によって、濃縮及び精製が可能である。
【００７２】
このような精製の一例は、固体支持体上に固定されたモノクローナル抗体又は結合ペプチドへの組換えタンパク質の吸着である。吸着後、タンパク質は、上述の特性をベースとした多様なクロマトグラフィー技術によってさらに精製可能である。
【００７３】
治療用ポリペプチド、例えば、本発明のビタミンＫ依存性ポリペプチドアルブミン融合体を、８０％以上の純度まで、より好ましくは９５％以上の純度まで精製することが好ましく、特に好ましいのは、夾雑高分子、特に他のタンパク質及び核酸に対して９９.９％以上の純度であり、そして感染性物質及び発熱性物質を含まない製薬的に純粋な状態である。好ましくは、単離又は精製された治療用ポリペプチド、例えば、本発明のビタミンＫ依存性ポリペプチドアルブミン融合体は、実質的に他のポリペプチドを含まない。
【００７４】
それぞれ本発明に記載されているビタミンＫ依存性ポリペプチドアルブミン融合体である治療用ポリペプチドは、治療上の使用のため、医薬調製物中に製剤可能である。精製されたタンパク質は、従来の生理学的に適合性のある水性緩衝水溶液中に溶解され得、場合により、そこに医薬賦形剤が添加され、医薬調製物を提供し得る。
【００７５】
このような医薬担体及び賦形剤並びに適切な医薬製剤は、本分野で周知である（例えば、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｆｒｏｋｊａｅｒら、Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ(２０００)又は「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、第３版、Ｋｉｂｂｅら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）参照）。特に、本発明のポリペプチド変異体を含む医薬組成物は、凍結乾燥された形態又は安定した可溶性形態で製剤され得る。治療用ポリペプチドは、当該分野で公知の多様な手法によって凍結乾燥され得る。凍結乾燥された製剤は、注射用滅菌水又は滅菌生理塩類溶液のような医薬的に許容される希釈剤を１つ又はそれ以上添加することによって再構成された後、使用される。
【００７６】
組成物の製剤は、医薬的に適切な何れかの投与手段によって個体に送達される。多様な送達システムが公知であり、何れかの簡便な経路によって組成物を投与するのに使用可能である。好ましくは、本発明の組成物は、全身投与される。全身使用のため、アルブミンの連結された本発明の融合タンパク質は、従来の方法に従って、非経口的（例えば、静脈内、皮下的、筋肉内、腹腔内、脳内、肺内、鼻腔内又は経皮的）送達用に又は経腸（例えば、経口、膣内又は直腸内）送達用に製剤される。投与の最も好ましい経路は、静脈内投与である。製剤は、注入によって又はボーラス投与によって連続的に投与可能である。幾つかの製剤は、遅延放出系を包含する。
【００７７】
それぞれアルブミンの連結された本発明のビタミンＫ依存性ポリペプチドである、本発明の治療用ポリペプチドは、所望の効果を生じるのに十分な用量を意味する、治療有効量で患者に投与され、耐えられない負の副作用を生じる用量に到達することなく、治療されている症例又は適応症を予防又はその重度若しくは広がりを軽減する。実際の用量は、例えば、適応症、製剤及び投与様式のような多くの因子に依存しており、各個々の適応症に関して前臨床試験及び臨床治験において決定されなければならない。
【００７８】
本発明の医薬組成物は、単独で又は他の治療薬と共に投与され得る。これらの薬剤は、同一の医薬品の一部として組み込まれ得る。
【００７９】
本発明の多様な製剤は、医薬品として有用である。従って、本発明は、本明細書に記載されているアルブミンの連結されたビタミンＫ依存性ポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のプラスミド若しくはベクターを含む医薬組成物に関する。
【００８０】
本発明の修飾されたＤＮＡもまた、ヒト遺伝子治療において使用するための転送ベクター中に組み込まれ得る。
【００８１】
本発明の別の局面は、出血性障害の治療又は予防のための医薬の製造のための、本発明の治療用ポリペプチド、例えば、本明細書に記載されているアルブミンの連結されたビタミンＫ依存性ポリペプチドの使用、本発明のポリヌクレオチドの使用、本発明のプラスミド若しくはベクターの使用、本発明の宿主細胞の使用である。出血性障害には、血友病Ａが含まれるが、それに限定されるわけではない。本発明の別の実施態様において、治療は、ヒト遺伝子治療を含む。
【００８２】
本発明はまた、以下の適応症の１つ又はそれ以上において個体を治療する方法にも関する：「血友病Ａ又はＢ」、「遺伝性又は後天性血液凝固欠乏を有する患者における出血性エピソード」、「例えば、遺伝性又は後天性因子欠乏を有する患者における血栓症のような血管閉塞性エピソード」、「敗血症」、「血液凝固因子（第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子）に対する阻害物質を伴う遺伝性又は後天性血友病を有する患者における出血性エピソード及び手術」、「抗血小板薬又は抗凝固薬等の薬物治療の結果として生じた止血不全の反転」、「二次止血の改善」、「感染中又はビタミンＫ欠乏症または重度肝臓疾患のような疾患中に生じた止血不全」、「肝臓切除」、「蛇にかまれた結果として生じた止血不全」、「胃腸性出血」。また、「外傷」、「大量輸血の帰結（希釈性凝固障害）」、「第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子以外の血液凝固因子欠乏」、「ＶＷＤ」、「第Ｉ因子欠乏」、「第Ｖ因子欠乏」、「第ＶＩＩ因子欠乏」、「第Ｘ因子欠乏」、「第ＸＩＩＩ因子欠乏」、「ＨＵＳ」、「血小板減少症、ＩＴＰ、ＴＴＰ、ＨＥＬＬＰ症候群、ベルナール・スーリエ症候群、グランツマン血小板無力症、ＨＩＴのような遺伝性又は後天性血小板疾患及び障害」、「シェディアック・東症候群」、「ヘルマンスキー・パドラック症候群」、「ランデュー・オスラー症候群」、「ヘノッホ・シェーンライン紫斑病」、「創傷治癒」、及び「敗血症」も、好ましい徴候である。この方法は、本明細書に記載のビタミンＫ依存性のアルブミンの連結されたポリペプチドの有効量を該個体に投与することを含む。別の実施形態において、この方法は、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のプラスミド若しくはベクターの有効量を個体に投与することを含む。あるいは、この方法は、本明細書に記載されている本発明の宿主細胞の有効量を個体に投与することを含み得る。
【実施例】
【００８３】
実施例１：第ＶＩＩ因子及び第ＶＩＩ因子−アルブミン融合タンパク質をコードするｃＤＮＡの作成
プライマーＷｅ１３０３及びＷｅ１３０４（配列番号１及び２）を使用して、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリ（ＰｒｏＱｕｅｓｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から、ＰＣＲによって、第ＶＩＩ因子をコードする配列を増幅した。プライマーＷｅ１２８６及びＷｅ１２８７（配列番号３及び４）を使用したＰＣＲの第２ラウンドの後、得られた断片をｐＣＲ４ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化した。そこから、内部ＸｈｏＩ部位が既に欠失されているｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＥｃｏＲＩ部位中に、第ＶＩＩ因子ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ断片として組み込んだ。得られたプラスミドをｐＦＶＩＩ−６５９と命名した。
【００８４】
続いて、オリゴヌクレオチドＷｅ１６４３及びＷｅ１６４４（配列番号５及び６）を使用して、標準的なプロトコールに従った部位特異的変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって、天然第ＶＩＩ因子の終止コドンの部位（図１）においてＸｈｏＩ制限部位をｐＦＶＩＩ−６５９中に導入した。得られたプラスミドをｐＦＶＩＩ−７００と命名した。
【００８５】
標準的なＰＣＲ条件下で、等モル濃度（１０ｐｍｏｌ）のオリゴヌクレオチドＷｅ１７３１及びＷｅ１７３２（配列番号７及び８）をアニールし、２分間のＰＣＲプロトコールを使用して、充填及び増幅した。９４℃で初期変性した後、９４℃で１５秒間の変性、５５℃で１５秒間のアニーリング、７２℃で１５秒間の伸長を７回繰返し、最後に、７２℃、５分間で伸長停止を行った。得られた断片を制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで消化し、同一酵素で消化しておいたｐＦＶＩＩ−７００中に連結した。第ＶＩＩ因子をコードする配列及びトロンビン切断可能なグリシン／セリンリンカーのＣ末端伸長部を含有する得られたプラスミドをｐＦＶＩＩ−７３３と命名した。
【００８６】
ｐＦＶＩＩ−７３３を基にして、トロンビン切断部位及びさらなるＮグリコシル化部位を含まない他のリンカーを挿入した。そのため、プライマー対Ｗｅ２１４８及びＷｅ２１４９（配列番号９及び１０）、Ｗｅ２１４８及びＷｅ２１５１（配列番号９及び１１）、Ｗｅ２１５２及びＷｅ２１５４（配列番号１２及び１３）、Ｗｅ２１５２及びＷｅ２１５５（配列番号１２及び１４）並びにＷｅ２１５６及びＷｅ２１５７（配列番号１５及び１６）をそれぞれ、上述のようにアニールし増幅した。個々のＰＣＲ断片を制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ及びＢａｍＨ１で消化し、同一酵素で消化しておいたｐＦＶＩＩ−７３３中に挿入した。得られたプラスミドのＢａｍＨ１部位中に、及びｐＦＶＩＩ−７３３のＢａｍＨ１部位中に、成熟ヒトアルブミンのｃＤＮＡを含有するＢａｍＨ１断片を挿入した。標準的な条件下でプライマーＷｅ１８６２及びＷｅ１９０２（配列番号１７及び１８）を使用する、アルブミンｃＤＮＡ配列に対するＰＣＲによって、この断片を生成した。最終的なプラスミドをそれぞれ、ｐＦＶＩＩ−９３５、ｐＦＶＩＩ−９３７、ｐＦＶＩＩ−９３９、ｐＦＶＩＩ−９４０、ｐＦＶＩＩ−９４１及びｐＦＶＩＩ−８３４と命名した。
【００８７】
リンカーを含まない第ＶＩＩ因子アルブミン融合タンパク質を生成するため、プライマーＷｅ２１８１及びＷｅ２１８２（配列番号２５及び２６）を使用して、プラスミドｐＦＶＩＩ−９３５上に、上述のとおり、欠失変異誘発を適用した。得られたプラスミドをｐＦＶＩＩ−９７４と命名した。リンカー配列並びにこれらのプラスミドのＣ末端ＦＶＩＩ配列及びＮ末端アルブミン配列を図２に概略した。
【００８８】
実施例２：第ＩＸ因子及び第ＩＸ因子−アルブミン融合タンパク質をコードするｃＤＮＡの作成
プライマーＷｅ１４０３及びＷｅ１４０４（配列番号２７及び２８）を使用して、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリ（ＰｒｏＱｕｅｓｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から、ＰＣＲによって、第ＩＸ因子をコードする配列を増幅した。プライマーＷｅ１４０５及びＷｅ１４０６（配列番号２９及び３０）を使用したＰＣＲの第２ラウンドの後、得られた断片をｐＣＲ４ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化した。そこから、内部ＸｈｏＩ部位が既に欠失されている発現ベクターｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＥｃｏＲＩ部位中に、第ＩＸ因子ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ断片として転移させた。得られたプラスミドをｐＦＩＸ−４９６と命名し、第ＩＸ因子の野生型のための発現ベクターとした。
【００８９】
アルブミン融合構築体の作成のため、終止コドンを欠失し、代わりにＸｈｏＩ部位を導入するプライマーＷｅ２６１０及びＷｅ２６１１（配列番号３１及び３２）を使用する標準的な条件下でのＰＣＲによって、第ＩＸ因子ｃＤＮＡを再度増幅した。得られた第ＩＸ因子断片を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化し、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨ１で消化しておいたｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３中へ、ＸｈｏＩ／ＢａｍＨ１で消化しておいた以下に記載される１つのリンカー断片とともに連結した。
【００９０】
２つの異なるグリシン／セリンリンカー断片を生成した。標準的なＰＣＲ条件下で、等モル濃度（１０ｐｍｏｌ）でオリゴヌクレオチドＷｅ２１４８及びＷｅ２１５０（配列番号９及び３３）をアニールし、２分間のＰＣＲプロトコールを使用して、充填及び増幅した。９４℃で初期変性した後、９４℃で１５秒間の変性、５５℃で１５秒間のアニーリング、７２℃で１５秒間の伸長を７回繰返し、最後に、７２℃、５分間で伸長停止を行った。オリゴヌクレオチドＷｅ２１５６及びＷｅ２１５７（配列番号１５及び１６）を使用して、同一手法を行った。
【００９１】
得られたリンカー断片を制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ及びＢａｍＨ１で消化し、上述の連結反応において別個に使用した。得られた２つのプラスミドはそれゆえ、第ＩＸ因子をコードする配列と、グリシン／セリンリンカーのＣ末端伸長部とを含有した。次のクローニング工程において、これらのプラスミドをＢａｍＨ１で消化し、成熟ヒトアルブミンのｃＤＮＡを含有するＢａｍＨ１断片を挿入した。標準的な条件下でプライマーＷｅ１８６２及びＷｅ１９０２（配列番号１７及び１８）を使用する、アルブミンｃＤＮＡ配列に対するＰＣＲによって、この断片を生成した。最終的なプラスミドをｐＦＩＸ−９８０及びｐＦＩＸ−９８６とそれぞれ命名した。それらのリンカー配列並びにＣ末端ＦＩＸ配列及びＮ末端アルブミン配列を図３に概略した。
【００９２】
多量に第ＩＸ因子を発現している細胞中でプロペプチドを効率的に加工するには、フューリン（ｆｕｒｉｎ）の共発現を必要とした（Ｗａｓｌｅｙ  ＬＣ  ｅｔ  ａｌ．１９９３．ＰＡＣＥ／Ｆｕｒｉｎ  ｃａｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｈｅ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏ−ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｓeｃｒｅｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４５８−８４６５）。プライマーＷｅ１７９１及びＷｅ１７９２（配列番号３４及び３５）を使用して、肝臓ｃＤＮＡライブラリ（Ａｍｂｉｏｎ）からフューリンを増幅した。プライマーＷｅ１８０８及びＷｅ１８０９（配列番号３６及び３７）を使用するＰＣＲの第二のラウンドでは、カルボキシ末端の膜貫通ドメイン（ＴＭ）が欠失し、終止コドンが導入されているフューリン断片を生じ、この断片をｐＣＲ４ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化した。そこから、内部ＸｈｏＩ部位が既に欠失されているｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ部位中に、フューリンΔＴＭｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ断片として組み込んだ。得られたプラスミドをｐＦｕ−７９７と命名した。ｐＦｕ−７９７によってコードされた分泌型フューリンのアミノ酸配列を、配列番号３８として付与した。
【００９３】
実施例３：第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子及び個々のアルブミン融合タンパク質の形質移入及び発現
プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖し、標準的なプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。リポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＨＥＫ−２９３細胞に形質移入し、５０ｎｇ／ｍＬのビタミンＫ及び４μｇ／ｍＬのピューロマイシンの存在下で、無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓ）中で増殖した。フューリンΔＴＭｃＤＮＡの共形質移入を、１：５（ｐＦｕ−７９７：個々のｐＦＩＸ構築体）モル比で実施した。Ｔ字型フラスコを通して回転瓶又は小規模発酵槽中へ、形質移入された細胞集団を拡散し、そこから精製のために上清を回収した。
【００９４】
実施例４：第ＶＩＩ因子及び第ＶＩＩ因子−アルブミン融合ポリペプチドの精製
第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子アルブミン融合タンパク質を含有する細胞培養回収物を、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７.４）であらかじめ平衡化しておいた２.０６ｍＬのＱ−セファロースＦＦカラム上に適用した。その後、Ｈｅｐｅｓと呼ばれる緩衝液１０容積でカラムを洗浄した。２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液中の０〜１.０Ｍ  ＮａＣｌの線形勾配を２０カラム容積内で実施することによって、結合した第ＶＩＩ因子分子の溶出を達成した。溶出液は、タンパク質濃度０.５〜１ｇ／Ｌで、適用された第ＶＩＩ因子抗原の約８５〜９０％を含有した。
【００９５】
あるいは、欧州特許第０７７０６２５（Ｂ１）号に記載されるとおり、固定された組織因子を使用するクロマトグラフィーによって、第ＶＩＩ因子を精製した。
【００９６】
実施例５に記載されるとおり、第ＶＩＩ因子抗原及び活性を測定した。
【００９７】
実施例５：第ＶＩＩ因子活性及び抗原の測定
Ｓｅｌｉｇｓｏｈｎら，Ｂｌｏｏｄ（１９７８）５２：９７８−９８８によって記載されている方法に基づいて、市販の色素生産性検査キット（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ  Ｃｏａｓｅｔ  ＦＶＩＩ）を使用して、第ＶＩＩ因子活性を測定した。
【００９８】
Ｍｏｏｒｉｓｓｅｙら，（１９９３）Ｂｌｏｏｄ  ８１：７３４−７４４によって記載されている方法に基づいて、市販の検査キット（ＳＴＡＣＬＯＴ（登録商標）ＶＩＩａ−ｒＴＦ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ）を使用して、第ＶＩＩ因子活性を測定した。
【００９９】
性能が当業者に公知であるＥＬＩＳＡによって、第ＶＩＩ因子抗原を測定した。簡潔に述べれば、マイクロプレートを１ウェルあたり捕捉抗体（ヒツジ抗ヒトＦＶＩＩ  ＩｇＧ、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  ＣＬ２００３０ＡＰ、緩衝液Ａ［Ｓｉｇｍａ  Ｃ３０４１］中で１：１０００に希釈）１２０μＬと共に、室温で一晩インキュベートした。緩衝液Ｂ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ３５６３）でプレートを３回洗浄した後、各ウェルを２００μＬの緩衝液Ｃ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ３６８８）と共に、室温で１時間インキュベートした。緩衝液によるさらなる３回の洗浄工程の後、緩衝液Ｂ中の検査試料の連続希釈物及び緩衝液Ｂ中の標準的なヒト血漿の連続希釈物（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ；５０〜０.５ｍＵ／ｍＬ、ウェルあたりの容積：１００μＬ）を室温で２時間インキュベートした。緩衝液Ｂによる３回の洗浄工程の後、検出抗体（ヒツジ抗ヒトＦＶＩＩ  ＩｇＧ、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  ＣＬ２００３０Ｋ，ペルオキシダーゼ標識済み）の緩衝液Ｂ中での１：５０００希釈物１００μＬを各ウェルに添加し、室温でさらに２時間インキュベートした。緩衝液Ｂによる３回の洗浄工程の後、基質溶液（ＴＭＢ，Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ，ＯＵＶＦ）１００μＬを各ウェルに添加し、暗所において室温で３０分間インキュベートした。１００μＬの希釈されていない停止溶液（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ，ＯＳＦＡ）の添加によって、適切なマイクロプレートリーダーにおいて４５０ｎｍ波長で読み取るための試料が調製された。次に、標準的なヒト血漿による標準曲線を基準として使用して、検査試料の濃度を算出した。
【０１００】
実施例６：第ＩＸ因子及び第ＩＸ因子−アルブミン融合ポリペプチドの精製
第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子アルブミン融合タンパク質を含有する細胞培養回収物を、５０ｍＭトリスｘＨＣｌ／１００ｍＭＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８.０）であらかじめ平衡化しておいたＱ−セファロースＦＦカラム上に適用した。その後、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する平衡化緩衝液で、カラムを洗浄した。塩勾配を実施することによって、結合した第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子融合ポリペプチドの溶出を達成した。カラムクロマトグラフィーによって、ヒドロキシルアパタイト溶離液をさらに精製した。この目的のため、５０ｍＭトリスｘＨＣｌ／１００ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７.２）で平衡化しておいたヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーカラムに、Ｑ−セファロースＦＦの溶離液を負荷した。同一緩衝液でカラムを洗浄し、リン酸塩勾配を使用して、第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子−ＨＡＳを溶出した。溶出液を透析して、塩濃度を低下させ、生化学的分析に及びインビボでの回収を測定するために使用した。実施例７に記載されているとおり、第ＩＸ因子抗原及び活性を測定した。
【０１０１】
実施例７：第ＩＸ因子抗原及び活性の測定
市販のａＰＴＴ試薬を使用して、ＦＩＸ活性を凝固活性として測定した（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｐａｔｈｒｏｍｔｉｎ  ＳＬ及びＦＩＸ枯渇血漿）。
【０１０２】
当業者に公知の標準的なプロトコールに従ったＥＬＩＳＡによって、第ＩＸ因子抗原を測定した。簡潔には、１ウェルあたり捕捉抗体（ＦＩＸ  ＥＬＩＳＡに関して対形成された抗体１：２００、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）１００μＬと共にマイクロプレートを室温で一晩インキュベートした。ブロッキング緩衝液Ｂ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ３５６３）でプレートを３回洗浄した後、各ウェルを２００μＬの緩衝液Ｃ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ３６８８）と共に、室温で１時間インキュベートした。緩衝液Ｂによるさらなる３回の洗浄工程の後、緩衝液Ｂ中の検査試料の連続希釈物及び緩衝液Ｂ中の標準以下（ＳＨＰ）の連続希釈物（ウェルあたりの容積：１００μＬ）を室温で２時間インキュベートした。緩衝液Ｂによる３回の洗浄工程の後、検出抗体（ＦＩＸ  ＥＬＩＳＡに関して対形成された抗体、ペルオキシダーゼ標識済み、１：２００、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）の緩衝液Ｂ中での１：２００希釈物１００μＬを各ウェルに添加し、室温でさらに２時間インキュベートした。緩衝液Ｂによる３回の洗浄工程の後、基質溶液（ＴＭＢ，Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ，ＯＵＶＦ）１００μＬを各ウェルに添加し、暗所において室温で３０分間インキュベートした。希釈されていない１００μＬの停止溶液（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ，ＯＳＦＡ）の添加によって試料が調製され、適切なマイクロプレートリーダーにおいて４５０ｎｍ波長で読み取った。次に、標準的なヒト血漿による標準曲線を基準として使用して、検査試料の濃度を算出した。
【０１０３】
実施例８：インビボでの回収に関する第ＶＩＩ因子及び第ＶＩＩ因子−アルブミン融合タンパク質の比較
上述の組換え第ＶＩＩ因子野生型及び第ＶＩＩ因子アルブミン融合ポリペプチドを、体重１ｋｇあたり１００μｇの用量で、麻酔をかけたＣＤ／ルイスラット（１物質あたり６匹）に静脈内投与した。検査物質の適用５分後に開始する適切な間隔で、頸動脈から血液試料を採取した。その後、ヒト第ＶＩＩ因子に特異的なＥＬＩＳＡアッセイ（上述）によって、第ＶＩＩ因子抗原含有量を定量した。個々のラットの群の平均値を使用して、インビボでの回収を算出した。
【０１０４】
上記生成物の適用５分後に、インビボでの回収を測定した（表２）。尾静脈を介する静脈内適用の５分後に、血漿１ｍＬあたりで測定された第ＶＩＩａ因子抗原レベルを、１ｋｇあたりで適用された生成物の量と関連付けた。あるいは、注入５分後に測定される抗原レベル（ＩＵ／ｍＬ）を、１００％の回収時に予測される理論的な生成物レベル（１ｋｇあたりの４０ｍＬの理論的な血漿容積によって除される、１ｋｇあたりに適用される生成物）と関連付けることによって、百分率を算出した。
【０１０５】
ラットで適宜測定された第ＶＩＩ因子融合タンパク質のインビボでの回収は、非融合型組換え野生型第ＶＩＩ因子と比較して顕著に増大することが見いだされた。使用される構築体に応じて、野生型第ＶＩＩ因子を２.３〜７.９倍上回って増大した。
【０１０６】
【表２】
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【０１０７】
実施例９：インビボでの回収に関する第ＩＸ因子及び第ＩＸ因子−アルブミン融合タンパク質の比較
上述の市販の組換え第ＩＸ因子（ＢｅｎｅＦＩＸ、Ｗｙｅｔｈ、及びｒＦＩＸ野生型）及び第ＩＸ因子−アルブミン融合ポリペプチド（ｒＦＩＸ−Ｌ−ＨＳＡ９８０／７９７及びｒＦＩＸ−Ｌ−ＨＳＡ９８６／７９７）を、麻酔したウサギ（１つの物質あたり４匹）及びＣＤ／ルイスラット（１つの物質あたり６匹）にそれぞれ、体重１ｋｇあたり５０ＩＵの用量で静脈内投与した。検査物質の適用５分後に開始する適切な間隔で、頸動脈から血液試料を採取した。その後、ヒト第ＩＸ因子に特異的なＥＬＩＳＡアッセイ（上述）によって、第ＩＸ因子抗原含有量を定量した。個々の群の平均値を使用して、５分後のインビボでの回収を算出した。
【０１０８】
注入５分後のインビボでの算出された回収を表３に要約した。尾静脈を介する静脈内適用の５分後に血漿１ｍＬあたりで測定された第ＩＸ因子抗原レベルを、１ｋｇあたりで適用された生成物の量と関連付けた。あるいは、注入５分後に測定される抗原レベル（ＩＵ／ｍＬ）を、１００％の回収時に予測される理論的な生成物レベル（１ｋｇあたりの４０ｍＬの想定される血漿容積によって除される、１ｋｇあたりに適用される生成物）と関連付けることによって、百分率を算出した。
【０１０９】
ラット及びウサギにおいて、第ＩＸ因子融合タンパク質のインビボでの回収は、社内で調製された非融合型組換え第ＩＸ因子又は市販の第ＩＸ因子製品のＢｅｎｅＦＩＸと比較して顕著に増大することが発見された。ＢｅｎｅＦＩＸを上回る増大は、使用される動物種又は構築体に応じて、４９.７％、６９.４％又は８７.５％であった。対応する野生型第ＩＸ因子と比較して、第ＩＸ因子融合タンパク質の回収の増大は、さらにより高かった。
【０１１０】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】ＴＣＧによってＴＡＧを置換することによって、天然型第ＶＩＩ因子終止コドンの部位で導入されたＸｈｏＩ制限部位。変異を受けた塩基は、太字で示されている。さらなる構築に使用されたＮｏｔＩ部位は、二重下線を付されている。第ＶＩＩ因子のＣ末端のアミノ酸配列は、３文字表記（マス囲み）で付与されている。
【図２】種々のｐＦＶＩＩ構築体中の、第ＶＩＩ因子のＣ末端とアルブミンのＮ末端との間に挿入されたリンカー配列の概略。Ｎグリコシル化部位のアスパラギンは、二重下線を付されている。
【図３】種々のｐＦＩＸ構築体中の、第ＩＸ因子のＣ末端とアルブミンのＮ末端との間に挿入されたリンカー配列の概略。Ｎグリコシル化部位のアスパラギンは、二重下線を付されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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