(57)【要約】  希釈及び溶血のなされていない全血中のヘモグロビンを定量的に決定する一方法であって、本方法は、改変されていない全血の試料を毛管キュベット内に採取すること、吸収測定用の装置に前記キュベットを提示すること、定められた時間の間、吸収測定を遅延させること、キュベット内の試料に直接に、４９０〜５２０ｎｍの範囲の第１の波長で第１の吸収測定を実行すること、さらに、第１の波長とは異なり、その波長における吸収が第１の波長における吸収よりも実質的に小さい第２の波長で第２の吸収測定を実施すること、並びに試料中のヘモグロビン濃度を決定するために第１及び第２の吸収測定の結果を処理することを含む。この方法を実現するシステムも開示される。
2009535639.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
希釈及び溶血のなされていない全血中のヘモグロビンを定量的に決定する方法であって、
改変されていない全血の試料を毛管キュベット内に採取すること、
吸収測定用の装置に前記キュベットを提示すること、
定められた時間の間、吸収測定を遅延させること、
キュベット内の試料に直接に、４９０〜５２０ｎｍの範囲の第１の波長で第１の吸収測定を実行すること、
さらに、第１の波長とは異なり、その波長における吸収が第１の波長における吸収よりも実質的に小さい第２の波長で第２の吸収測定を実施すること、並びに
試料中のヘモグロビン濃度を決定するために、第１及び第２の吸収測定の結果を処理すること
を含む上記方法。
【請求項２】
前記遅延が、試料を採取する前に予め設定された所定の時間にわたって実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記提示が、吸収測定を実行する機器のホルダ内に前記キュベットを配置することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記所定の時間が、ホルダ内にキュベットが配置されたときに開始される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記所定の時間が少なくとも３０秒であり、より好ましくは６０〜９０秒である、請求項２から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記処理が、所定のアルゴリズムによって実行される、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記処理が、試料中のヘモグロビン濃度を、下式を計算することによって決定し、
［Ｔｏｔ  Ｈｂ］＝（Ａｂｓ１−Ａｂｓ２）・ｋ１＋ｋ２
上式で、［Ｔｏｔ  Ｈｂ］が試料中の全ヘモグロビン濃度、Ａｂｓ１が第１の吸収測定の測定吸光度、Ａｂｓ２が第２の吸収測定の測定吸光度、ｋ１及びｋ２が測定構成によって決まる較正係数である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
第１の吸収測定が、５００〜５１０ｎｍの範囲の波長、より好ましくは波長５０６ｎｍで実行される、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
第２の吸収測定が、６５０〜１２００ｎｍ、より好ましくは８５０〜９１０ｎｍ、最も好ましくは８６０〜９００ｎｍの範囲の波長で実行される、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記キュベットが、１ｍｍ未満、より好ましくは０．２ｍｍ未満の光路長を有する、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記キュベットが、０．０５〜０．２ｍｍの範囲の光路長を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記遅延が、吸収測定の結果を監視し、前記結果が実質的に一定であるときに、試料中のヘモグロビン濃度を決定するために第１及び第２の吸収測定を実行させることによってなされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
希釈及び溶血のなされていない全血中のヘモグロビンを定量的に決定するシステムであって、
４９０〜５２０ｎｍの第１の範囲の第１の波長の光、及びその波長における血液中の光の吸収が第１の波長における光の吸収よりも実質的に小さい第２の範囲の第２の波長の光を発する手段と、
改変されていない全血の試料を保持した毛管キュベットを受け取るように構成されたキュベットホルダと、
前記第１の範囲の光の第１の吸収測定及び前記第２の範囲の光の第２の吸収測定において、試料を透過した光を検出する検出器と、
キュベットホルダ内へのキュベットの配置と吸収測定の実行との間に、定められた時間の遅延を生み出すコントローラと、
試料中のヘモグロビン濃度を決定するために、第１及び第２の吸収測定の結果を処理する処理ユニットと
を含む上記システム。
【請求項１４】
前記光を発する手段、キュベットホルダ及び検出器が光度計として構成された、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記処理ユニットが前記光度計内に埋め込まれた、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記処理ユニットが前記光度計に接続された、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１７】
前記検出器の検出領域が、事実上、直接透過光だけが検出されるようなサイズを有する、請求項１３から１６までのいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１８】
前記検出器が、試料ホルダから１０ｍｍ未満のところに配置された、請求項１３から１７までのいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１９】
前記光を発する手段が、前記第１の波長の光を発し、前記第２の波長の光を発するように構成された１つの光源を含む、請求項１３から１８までのいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２０】
前記光を発する手段が、前記第１の波長の光を発するように構成された第１の光源と、前記第２の波長の光を発するように構成された第２の光源とを含む、請求項１３から１８までのいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２１】
前記光を発する手段によって発せられる第１の波長が、５００〜５１０ｎｍの範囲にあり、より好ましくは５０６ｎｍである、請求項１３から２０までのいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２２】
前記光を発する手段によって発せられる第２の波長が、６５０〜１２００ｎｍ、より好ましくは８５０〜９１０ｎｍ、最も好ましくは８６０〜９００ｎｍの範囲にある、請求項１３から２１までのいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２３】
キュベットホルダが、１ｍｍ未満、より好ましくは０．２ｍｍ未満の光路長を有するキュベットを受け取るように構成された、請求項１３から２２までのいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２４】
キュベットホルダが、０．０５〜０．２ｍｍの範囲の光路長を有するキュベットを受け取るように構成された、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
前記処理ユニットが、所定のアルゴリズムを使用して前記処理を実行する、請求項１３から２４までのいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２６】
前記処理が、試料中のヘモグロビン濃度を、下式を計算することによって決定し、
［Ｔｏｔ  Ｈｂ］＝（Ａｂｓ１−Ａｂｓ２）・ｋ１＋ｋ２
上式で、［Ｔｏｔ  Ｈｂ］が試料中の全ヘモグロビン濃度、Ａｂｓ１が第１の吸収測定の測定吸光度、Ａｂｓ２が第２の吸収測定の測定吸光度、ｋ１及びｋ２が測定構成によって決まる較正係数である、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】
前記コントローラが、所定の時間の遅延を生み出すタイマを含む、請求項１３から２６までのいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２８】
前記タイマが、少なくとも３０秒、より好ましくは６０〜９０秒の遅延を引き起こすように構成された、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】
前記コントローラが、吸収測定の結果を監視するアナライザを含み、監視された結果が実質的に一定であることをアナライザが確認したことに応答して、前記コントローラが吸収測定の実行を可能にする、請求項１３から２６までのいずれか一項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析法及びこの分析を実行するシステムに関する。具体的には、本発明は、改変されていない全血中のヘモグロビンを決定する方法、及びこの決定に使用することができるシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
流体試料を採取し、その試料を試薬と混合し、試薬と混合されたこの試料の光学分析を直接に実施する使い捨てキュベットは、米国特許第４０８８４４８号により以前から知られている。この知られているキュベットは、一般に、試料採取手順を簡略化する、器具の数を減らす、分析手順が分析実施者の操作技術に左右されないようにすることによって分析の正確さを相当に向上させる、といったいくつかの利点を有する。同じ原理に基づき、改良された流動特性を有するキュベット構造が米国特許第５６７４４５７号に開示されている。
【０００３】
これらの特許に従って開発された使い捨てキュベットは現在、希釈されていない全血のヘモグロビン測定（Ｈｂ決定）に広く使用されている。この目的のため、キュベットの空洞は、血液試料がキュベット内に吸い込まれたときに赤血球の壁が破壊され、化学反応が開始されるように、試薬で前処理されている。この反応の結果は、キュベットの透明な壁を通して直接に吸収を測定することによって、Ｈｂ決定を可能にする。キュベットの透明な壁は、測定ゾーンにおいては光学窓とも呼ばれ、対向する平らな壁の内面間の正確に画定された所定の距離を有する。この測定法は、Ｖａｎｚｅｔｔｉ，Ｇ．、「血中ヘモグロビン決定のためのアジドメトヘモグロビン法（Ａｎ  ａｚｉｄｅ−ｍｅｔｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ）」、Ａｍ．Ｊ．Ｌａｂ．＆  Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．６７、１１６〜１２６（１９６６）による修正アジドメトヘモグロビン法に基づく。
【０００４】
この分光測定は５７０及び８８０ｎｍで実施される。固相化学分析（ｄｒｙ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）に基づくこの定量的測定法は、標準湿式Ｈｂ決定法で得られる結果と比較して、同等か、又はよりいっそう優れた結果を与えたため、例えばｖｏｎ  Ｓｃｈｅｎｃｋ，Ｈ．、Ｆａｌｋｅｎｓｓｏｎ，Ｍ．及びＬｕｎｄｂｅｒｇ，Ｂ．による論文「ヘモグロビン決定のための新しいデバイス、『ＨｅｍｏＣｕｅ』の評価（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ‘ＨｅｍｏＣｕｅ’，ａ  ｎｅｗ  ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２巻、３号、５２６〜５２９ページ、１９８６年から分かるように、相当な成功を収めた。使用される試薬は、赤血球を溶血させるデオキシコール酸ナトリウム、ヘモグロビンをアジドメトヘモグロビンに転化させるアジ化ナトリウム及び亜硝酸ナトリウムを含む。
【０００５】
使用される試薬の吸湿性のため、保管寿命は限られ、乾燥剤を含む密封されたパッケージに入れてキュベットを保管することが求められる。そうしなければ試薬が破壊され、測定が不正確になり、したがって測定が無駄になるため、高湿度環境では、パッケージから取り出した後、数分以内にキュベットを使用しなければならないことはなお問題である。
【０００６】
しかしながら、米国特許第６６３８７６９号に開示されているように、これらの試薬を使用してはならないことが分かったため、使用される試薬の吸湿性に起因するこれらの問題は排除することができる。この開示によれば、最初の吸収測定が、マイクロキュベット内の試料に対して直接に、４９０〜５２０ｎｍの波長範囲で実行される。しかしながら、この特許出願に開示された発明によれば、測定を実行する前に、血液が溶血されている必要がある。したがって、赤血球を破壊し、これらの中に含まれるヘモグロビンを解放するため、キュベット空洞は溶血剤を含まなければならない。血液試料中のヘモグロビンの吸光度の測定を実行するときに溶血剤を使用する必要があることは、例えば米国特許第５０６４２８２号（Ａｒｔｅｌ）にも開示されている。
【０００７】
溶血剤を使用せずに全血のヘモグロビンを光学的に決定する定量法は知られているが、これらの方法は全て共通して、比較的に複雑である。これは、とりわけ、高い赤血球濃度による血液の不均質性に依存し、その結果、不均質な血液試料のこれらの粒子と相互作用して光が散乱される。したがって、光は試料を直接に透過せず、ある散乱角範囲にわたって偏向される。問題を引き起こす他の因子は、血液が、５種類もの異なるヘモグロビンを含む可能性があることである。これらの課題に取り組んでいる特許公開は一般に、米国特許第６２６２７９８号（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ）及びＷＯ０１／５３８０６（ラジオメーター（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ））である。
【０００８】
米国特許第６２６２７９８号に開示された発明によれば、正確な測定を達成するために複数の波長が必要である。多くの波長が必要であることは、分光光度計を相対的に複雑にする。これらの波長は、最小の分散及び最大の吸光度でヘモグロビン種を区別する能力によって選択される。この特許は、検出範囲を超える散乱の問題を緩和する大型の検出器の使用も開示している。
【０００９】
ＷＯ０１／５３８０６は、特に全血の光学測定に使用可能な装置を開示している。この装置は、散乱レベルが変化すると観察される検出器感度及び有効光路長の変動を補正する吸収フィルタ又は干渉フィルタを含む。この装置は、吸収フィルタ又は干渉フィルタを透過した散乱光を検出するために大型の検出器を使用する。
【００１０】
米国特許第６８３１７３３号には、溶血剤も、米国特許第６２６２７９８号に開示された複数の波長も使用せずに、全血中の総ヘモグロビン量の正確な決定を実施することができることが示されている。米国特許第６８３１７３３号によれば、４９０〜５２０ｎｍの範囲の第１の波長、及びその吸収が第１の波長における吸収よりも実質的に小さい第２の波長での２つの吸光度測定を実行することによって、全血中の総ヘモグロビン量を決定することができる。次いで、第１及び第２の吸収測定の結果を処理することによって、試料中のヘモグロビンの濃度を決定することができる。第１の吸収測定と第２の吸収測定の間の吸収の差は主に、ヘモグロビンの吸収の差に起因する。しかしながら、吸収の差に影響を及ぼす因子は他にもある。最も重要な他の因子は、試料内での散乱の差である。米国特許第６８３１７３３号によれば、散乱の影響は、第２の吸収測定において測定される吸光度に依存すると考えられる。したがって、意外にも、試料中のヘモグロビン濃度は、散乱を補償する項を使用することによって、単に２つの吸収測定間の吸収の差として測定することができることが分かった。この補償項は、第２の吸収測定の結果に依存する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、改変されていない全血中のヘモグロビンを決定する高速定量法を提供することにある。
【００１２】
第２の目的は、改変されていない全血中のヘモグロビンを決定する方法であって、血液試料の採取にも使用することができるマイクロキュベット内で実行することができる方法を提供することにある。
【００１３】
第３の目的は、改変されていない全血中のヘモグロビンを決定するために吸収測定の結果を処理する単純な方法を提供することにある。
【００１４】
第４の目的は、改変されていない全血中のヘモグロビンを決定する上記の方法を実現するシステムを提供することにある。
【００１５】
この他の目的は、以下の説明及び添付の請求項から明白となろう。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の一態様によれば、このようにヘモグロビンを決定する一方法が、改変されていない全血の試料を毛管キュベット内に採取すること、吸収測定用の装置に前記キュベットを提示すること、定められた時間の間、吸収測定を遅延させること、キュベット内の試料に直接に、４９０〜５２０ｎｍの範囲の第１の波長で第１の吸収測定を実行すること、さらに、第１の波長とは異なり、その波長における吸収が第１の波長における吸収よりも実質的に小さい第２の波長で第２の吸収測定を実施すること、並びに試料中のヘモグロビン濃度を決定するために、第１及び第２の吸収測定の結果を処理することを含む。
【００１７】
本発明の他の態様によれば、このようにヘモグロビンを決定する一システムが、４９０〜５２０ｎｍの第１の範囲の第１の波長の光、及びその波長における血液中の光の吸収が第１の波長における光の吸収よりも実質的に小さい第２の範囲の第２の波長の光を発する手段と、改変されていない全血の試料を保持した毛管キュベットを受け取るように構成されたキュベットホルダと、前記第１の範囲の光の第１の吸収測定及び前記第２の範囲の光の第２の吸収測定において、試料を透過した光を検出する検出器と、キュベットホルダ内へのキュベットの配置と吸収測定の実行との間に、定められた時間の遅延を生み出すコントローラと、試料中のヘモグロビン濃度を決定するために、第１及び第２の吸収測定の結果を処理する処理ユニットとを含む。
【００１８】
本発明によれば、意外にも、改変されていない全血の試料、すなわち希釈及び溶血のなされていない全血の試料に対する直接のヘモグロビンの定量的決定を容易に実行できるだけでなく、ヘモグロビンの定量的決定を、単に２つの吸収測定を異なる波長で実施し、これらの結果を処理することによって達成することもできることが分かった。
【００１９】
この決定は、アジ化ナトリウム、硝酸ナトリウムなどの吸湿性の試薬又は溶血剤を使用していない血液試料に対して実行することができる。したがって、このヘモグロビン決定は、ヘモグロビンが赤血球の内部に閉じ込められている間に吸収を測定することに基づく。したがって、赤血球を溶解してヘモグロビンを解放することなく、ヘモグロビン濃度を決定することができる。
【００２０】
さらに、意外にも、赤血球の散乱の影響を補償する必要もないことも分かった。２つの吸収測定間の差は、ヘモグロビンにおける光の吸収による影響と、赤血球による光の散乱による影響の両方を反映する。しかしながら、吸収測定を実行する際に遅延を使用することによって、吸収測定を実行する時期を制御することができる。本発明の開発において、吸収測定の結果が、血液試料を採取してからの時間とともに変化することが観察された。第１の吸収測定の結果はより大幅に変化する。このことは、２つの吸収測定間の差が、測定が実行された時点によって異なることを含意している。したがって、吸収測定を実行する際の遅延時間によって、吸収測定が実行される時点を制御することができ、血液試料中の正しいヘモグロビン濃度値を出力するため、これに応じて結果の処理を較正することができる。
【００２１】
具体的には、吸収測定結果間の差は、血液試料が採取されてからの最初の時間の間に、大幅に低下する。その後、この差はある時間の間、比較的に安定し、しばらくして再び増大し始める。したがって、この遅延時間を、測定結果が比較的に安定しているときに測定が実行されるように適合させることができる。こうすることによって、決定されたヘモグロビン濃度の結果が、実行された時点による影響をあまり受けなくなる。したがって、結果は、採取された試料が測定装置に即座に提示されるのか、又は採取された試料が測定装置に提示されるまでに少し時間があくのかに依存しない。
【００２２】
測定結果の変動は、少なくとも部分的には、試料がキュベット内へ採取されるときの試料内の運動によるものと考えられる。しばらくするとこの運動は自然に落ち着き、測定結果はより安定する。赤血球の散乱の影響も低減され、したがって、吸収測定の結果の処理において、赤血球の散乱の影響が第１及び第２の吸収測定に対して異なることを考慮する必要もない。後に、赤血球がキュベットの底部に沈降し始めると、測定結果は再び増大し始めることがある。したがって赤血球はキュベットの底に集まり、これによって散乱の影響は増大する。
【００２３】
したがって、本発明によれば、ヘモグロビン決定が単純な方法で実行される。改変されていない全血の試料を使用した２つ吸収測定だけが必要である。さらに、ヘモグロビン含量は、２つの吸収測定の結果を処理する単純なアルゴリズムを使用して決定することができる。このことは、そのアルゴリズムを使用して正しい結果を提示するための機器の較正が容易であることを含意している。しかしながら、この較正の容易さは、分析結果を得るのにやや長い時間がかかることと引換えに達成される。分析に長い時間がかかるのは、散乱の影響を考慮する必要がないことを保証するために分析を遅延させる必要があるためである。
【００２４】
本出願の文脈では、用語「吸収測定（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）」を、試料中での吸収に関係した測定と解釈すべきである。吸収測定では、試料と相互作用した後に検出された光の強度が、試料に照射した光の強度と比較される。検出された光はその試料に対する透過率に対応する。検出器に達しなかった光は吸収されたとみなされる。したがって、測定の結果においては、吸収の代わりに透過率を使用することができる。透過率は吸収の逆数なので、透過率の検出も吸収測定であると言える。しかしながら、一部の光は試料中で散乱されて検出器に達しないため、この測定された吸収は、試料に本当に吸収された光だけに対応するものではない。
【００２５】
さらに、用語「決定（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）」は、絶対的に正確な試料中のヘモグロビン濃度値を必ずしも与えない測定と解釈すべきである。したがって、ヘモグロビン濃度は、結果がただ単に濃度の桁を与えるというだけではないが、絶対的な値を必ず与えるというわけでもない合理的な誤差の範囲内で「決定される」。
【００２６】
前記処理は、所定のアルゴリズムによって実行することができる。このことは、このアルゴリズムを機器内にプログラムすることができること、及び吸収測定が実行された後に、この機器が分析結果を直接に返すことができることを含意している。
【００２７】
この処理は、試料中のヘモグロビン濃度を、下式を計算することによって決定することができ、
［Ｔｏｔ  Ｈｂ］＝（Ａｂｓ１−Ａｂｓ２）・ｋ１＋ｋ２
上式で、［Ｔｏｔ  Ｈｂ］は試料中の全ヘモグロビン濃度、Ａｂｓ１は第１の吸収測定の測定吸光度、Ａｂｓ２は第２の吸収測定の測定吸光度、ｋ１及びｋ２は測定構成によって決まる較正係数である。
【００２８】
このことは、試料中の全ヘモグロビン濃度が、単に、２つの吸収測定間の差を計算することによって決定されることを含意している。曲線の傾き及びその曲線の座標原点からのずれを処理することができる２つの較正係数だけが必要である。したがって、２つの較正係数値を決定することだけが必要であり、それによって機器の較正を単純な方法で達成することができる。
【００２９】
前記提示は、吸収測定を実行する機器のホルダ内にキュベットを配置することを含むことができる。このことは、機器内の正確な吸収測定位置までキュベットを案内することができることを含意している。
【００３０】
一実施形態によれば、前記遅延が、試料を採取する前に予め設定された所定の時間にわたって実施される。したがって、吸収測定の実行を所定の時間だけ遅延させるように、測定装置を予め設定することができる。これに応じて測定装置を較正することができる。この所定の時間は、その時間が経過した後に吸収測定を実行することを可能にするタイマによって制御することができる。
【００３１】
この所定の時間は、ホルダ内にキュベットが配置されたときに開始することができる。したがって、機器は、赤血球の散乱の影響が実質的になくなる最小の時間だけ分析が遅延されるように制御することができる。したがって、この機器を、ホルダ内にキュベットを受け取ってからある特定の時間の後に吸収測定を可能にするように構成することができる。
【００３２】
この所定の時間は少なくとも３０秒であり、より好ましくは６０〜９０秒である。これは、赤血球での散乱が分析結果に影響を及ぼさないように試料が適当に落ち着く可能性を与える。
【００３３】
他の実施形態によれば、前記遅延が、吸収測定の結果を監視し、結果が実質的に一定であるときに、試料中のヘモグロビン濃度を決定するために第１及び第２の吸収測定を実行させることによって実行される。このことは、血液試料中での散乱がヘモグロビン濃度の決定にあまり影響を及ぼさない時点で吸収測定が実行されることを保証する第１のチェックが実施されることを含意している。これが確立されたときに吸収測定が実行される。あるいは、第１のチェックは、血液試料内の運動が落ち着いたと判定する他の方法で実施することもできる。
【００３４】
第１の吸収測定は、５００〜５１０ｎｍの範囲の波長、より好ましくは波長５０６ｎｍで実行することができる。４９０〜５２０ｎｍ、特に５００〜５１０ｎｍの波長範囲では、ヘモグロビンの５つの異なる形態、すなわちオキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビン、一酸化炭素ヘモグロビン、メトヘモグロビン及びスルフヘモグロビンの吸収がかなり大きく、似ている。したがって、この波長範囲における吸収は、血液中のヘモグロビンの異なる形態間の分布に、わずかにしか左右されない。特に、５０６ｎｍでは、オキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンの吸光度の差がゼロに近い。通常の血液中ではこれらの形態のヘモグロビンが支配的であるため、オキシ及びデオキシヘモグロビンの吸収を、５０６ｎｍにおいて、測定された吸収をヘモグロビンの濃度に関係づける吸収係数を決定する目的に有利に使用することができる。したがって、血液試料中のヘモグロビンの異なる形態の含量に関するいくつかの仮定が設定される。ヘモグロビンのこれらの形態の分布が非常に異なる血液試料に測定が実施される場合には、ヘモグロビン決定が正確でないか、又は測定結果の処理が修正されなければならない。さらに、この測定は、全ヘモグロビン濃度を決定するだけであり、ヘモグロビンの特定の形態の濃度を決定しない。
【００３５】
第２の吸収測定は、６５０〜１２００ｎｍ、より好ましくは８５０〜９１０ｎｍ、最も好ましくは８６０〜９００ｎｍの範囲の波長で実行することができる。これらの波長範囲で、ヘモグロビンの吸収は第１の波長よりもかなり小さい。さらに、この波長は、血液試料中の他の物質の吸収が、第１の波長と第２の波長で実質的に同じであるように選択されなければならない。このことは、吸収の差を、試料中のヘモグロビン濃度に関係づけることができることを含意している。第２の波長は、８６０〜９００ｎｍの範囲で有利に選択することができ、こうすることによって、他の物質の吸収は分析結果に影響を及ぼさない。
【００３６】
キュベットは、１ｍｍ未満、より好ましくは０．２ｍｍ未満の光路長を有することができる。このことは、吸収測定を統計学的に有意にするために、十分な強度の光が試料を透過することができることを保証する。これよりも短い光路は、検出される光の強度をより大きくするであろう。
【００３７】
キュベットは、０．０５〜０．２ｍｍの範囲の光路長を有することができる。このことは、ヘモグロビン濃度の決定を可能にする十分な量の血液中を光が透過し、同時に、強い光源を使用しなくても十分な強度の光を検出することができることを含意している。
【００３８】
前記光を発する手段、キュベットホルダ及び検出器を光度計として構成することができる。これにより、この光度計は、この分析を実行するように適合された装置を提供するであろう。この光度計は容易に持ち運ぶことができ、それにより、分析が必要な場所、例えば医療場所で分析を実行することができる。
【００３９】
前記処理ユニットをこの光度計内に埋め込むことができる。こうすると、光度計は、自体の表示画面に分析結果を返すことができ、追加の機器を使用する必要がない。しかしながら、処理ユニットを光度計に接続しても構わない。このことは、処理ユニットを、光度計を接続することができるコンピュータとして構成することができることを含意している。このことは、使用者が、吸収測定の結果をさらに詳細に分析することを可能にするであろう。
【００４０】
検出器は、事実上、直接透過光だけが検出されるようなサイズの検出領域を有することができる。このことは、大幅に異なる方向に散乱された光が検出されず、それによって、吸収測定が、散乱又は吸収されることなく透過した光の量を決定することを含意している。したがって、この測定では、他の方向に散乱された全ての光が検出されないと仮定することができる。
【００４１】
検出器は、試料ホルダから１０ｍｍ未満のところに配置することができる。このことはさらに、小さな角度で散乱している光だけが検出されることを含意している。
【００４２】
光を発する手段は、第１の波長の光を発し、第２の波長の光を発するように構成された１つ光源を含むことができる。この場合、試料に正しい波長が照射されることを保証するためにフィルタを使用することができる。あるいは、光を発する手段は、第１の波長の光を発するように構成された第１の光源と、第２の波長の光を発するように構成された第２の光源とを含むことができる。この場合には、試料に正しい波長を照射するため、これらの異なる光源を適当にオン／オフすることができる。
【００４３】
次に、添付図面を参照して、本発明を、例を挙げて、さらに詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
次に、図１を参照して、本発明に基づくヘモグロビン決定法を説明する。最初に、使い捨て毛管キュベットに改変されていない全血試料を充填する（ステップ１）。このようにして分析する試料を採取する。血液試料の分析を遅延させる（ステップ２）。この遅延は、分析を実行する機器を、機器のホルダ内にキュベットを配置してから所定の時間後に分析を開始するように構成することによって達成することができる。この遅延によって、試料内の運動を落ち着かせることができ、それによって光を散乱させる赤血球の影響が小さくなる。次いで、４９０〜５２０ｎｍの範囲の波長で試料の第１の吸収測定を実行する（ステップ３）。さらに、この試料に第２の吸収測定を実行する（ステップ４）。第２の吸収測定は、６５０〜１２００ｎｍの範囲の波長で実行する。この第２の吸収測定は、後により詳細に説明するように、これらの２つの吸収測定間の吸光度の差を、試料中のヘモグロビン濃度にだけに関係づけることができるように選択される。最後に、試料中のヘモグロビン濃度を決定するため、所定のアルゴリズムを使用して、これらの測定の結果を処理する（ステップ５）。
【００４５】
本発明に従って使用される使い捨てマイクロキュベットは、米国特許第４０８８４４８号に開示されたタイプ、好ましくは米国特許第５６７４４５７号に開示されたタイプのマイクロキュベットとすることができる。これらの文献はともに参照によって本明細書に組み込まれる。キュベットは、光学窓（測定ゾーン）を有する空洞を少なくとも１つ含み、この空洞に面した２つの平面又は曲面が互いから所定の距離のところに配置されており、したがってこれら２つの面が所定の光路長を画定する、一体のボディ部材と定義することができる。測定ゾーンを画定するこれらの面間のこの距離は、ヘモグロビン測定に適した光路長を提供する際の決定的に重要な１つのパラメータである。キュベット内の試料を透過した光の強度が、試料中のヘモグロビンの決定を可能にするのに十分なものであることを保証するため、光路長は１ｍｍ未満でなければならない。好ましい一実施形態では、この距離が０．２ｍｍ未満、より好ましくは０．０５から０．２ｍｍである。空洞の残りの部分の内面間の距離は、このボディ部材の外部と連通した空洞入口を通して毛管力によって試料が空洞に入るようにするのに有効な０．１〜２ｍｍ程度であることが好ましい。さらに、この空洞は、約２５μｌ未満の所定の固定容積を有する。本発明の方法に基づく決定に、試薬、溶血剤などの活性添加剤は必要ない。
【００４６】
本発明に基づくキュベットは、必要な厳しい公差レベルでの形成を可能にする適当な任意の材料によって形成することができる。キュベットは、透明ポリマー材料の射出成形によって製造されることが好ましい。
【００４７】
キュベットの毛細充填に関する諸問題を解決するため、キュベットの内面に親水性を与える目的で、キュベットの内面を前処理する必要がある場合がある。これは、Ｂｒｉｊ３５などの適当な界面活性剤で表面をコーティングすることによって達成することができる。他の可能な方法は、キュベットの製造に親水性材料を選択する方法である。
【００４８】
本発明の方法の１つの特徴は、吸収測定が、４９０〜５２０ｎｍの範囲の波長、より好ましくは５００〜５１０ｎｍの範囲の波長、最も好ましくは波長５０６ｎｍで実行するべきであることである。第２の吸収測定は、６５０〜１２００ｎｍ、より好ましくは８５０〜９１０ｎｍ、最も好ましくは８６０〜９００ｎｍの範囲の波長で実行されることが好ましい。
【００４９】
吸収測定は、試料中の全血に対して直接、実行する。つまり、測定する血液は改変されていない（希釈及び溶血がなされていない）。
【００５０】
４９０〜５２０ｎｍの波長範囲では、ヘモグロビンの異なる５つの形態、すなわちオキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビン、一酸化炭素ヘモグロビン、メトヘモグロビン及びスルフヘモグロビンの吸収が似ており、かなり大きい。したがって、この波長範囲における吸収は、血液中のヘモグロビンの異なる形態間の分布に、わずかにしか左右されない。特に、５０６ｎｍでは、オキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンの吸光度の差がゼロに近い。通常の血液中ではこれらの形態のヘモグロビンが支配的であるため、オキシ及びデオキシヘモグロビンの吸収を、５０６ｎｍにおいて、測定された吸収をヘモグロビンの濃度に関係づける吸収係数を決定する目的に有利に使用することができる。したがって、血液試料中のヘモグロビンの異なる形態の含量に関するいくつかの仮定がなされる。ヘモグロビンのこれらの形態の分布が非常に異なる血液試料に測定が実施される場合には、ヘモグロビン決定が正確でないか、又は測定結果の処理が修正されなければならない。さらに、この測定は、全ヘモグロビン濃度を決定するだけであり、ヘモグロビンの特定の形態の濃度を決定しない。
【００５１】
第２の吸収測定は、血液中の光の吸収が実質的により小さい波長で実行される。このような吸収測定は、６５０〜１２００ｎｍの範囲の波長で適当に実行することができる。この場合、吸収測定間の差はヘモグロビンの吸収に起因すると考えられる。
【００５２】
しかしながら、光の散乱は、試料中のヘモグロビン濃度とともに変化するが、ヘモグロビン濃度だけによって決まるわけではない。光の散乱は、赤血球、白血球、脂質粒子などの血液中の粒子と光の相互作用による。本発明によれば、分析を遅延させることによって、試料内の運動が落ち着き、試料中での散乱の影響が低下することが分かっている。したがって、意外にも、測定機器の較正を散乱の影響の処理に使用することができること、及び試料中のヘモグロビン濃度を、２つの吸収測定間の吸収の差に直接に関係づけることができることが分かった。
【００５３】
次に、図２の概略図を参照して、ヘモグロビン濃度を決定するアルゴリズムの原理を説明する。図２では、実線が、高いヘモグロビン濃度を有する第１の試料で測定された吸収を概略的に示す。この吸収は、真の吸収と、散乱されて検出器に達しなかった光の両方を含む。図２の点線は、より低いヘモグロビン濃度を有する試料で測定された吸収を概略的に示す。測定された吸収は、少なくとも、試料がキュベット内に採取されてから定められた時間の遅延が実施され、それによって試料内の運動が落ち着いた後に実行される。図２の概略図は、全血試料の吸収の主要な特徴を単に強調したものであり、実際の試料の吸収を示しているわけではないことに留意されたい。図２から分かるように、両方の試料で、５０６ｎｍの第１の波長における吸収と８８０ｎｍの第２の波長における吸収との間にはかなりの差がある。前述のとおり、この差は、試料中のヘモグロビン濃度と、試料中での光の散乱量とに依存する。試料内での細胞の運動が落ち着くと、光の散乱の影響は低減される。したがって、その後の吸収の差は主に、試料中のヘモグロビン濃度に依存する。したがって、単に２つの吸収測定間の吸収の差を使用し、この差を較正定数によってヘモグロビン濃度に関係づけることによって、試料中のヘモグロビン濃度を決定した受け入れ得る結果を得ることができることが分かった。
【００５４】
以上によれば、試料中のヘモグロビン濃度を決定するためには吸収測定の結果を処理しなければならない。この処理は、ある所定のアルゴリズムによって実行することができる。このアルゴリズムによって、前述のスキームに従ってヘモグロビン濃度が計算される。
【００５５】
この処理は、試料中のヘモグロビン濃度を、下式を計算することによって決定することができ、
［Ｔｏｔ  Ｈｂ］＝（Ａｂｓ１−Ａｂｓ２）・ｋ１＋ｋ２
上式で、［Ｔｏｔ  Ｈｂ］は試料中の全ヘモグロビン濃度、Ａｂｓ１は第１の吸収測定の測定吸光度、Ａｂｓ２は第２の吸収測定の測定吸光度、ｋ１及びｋ２は測定構成によって決まる較正係数である。較正係数ｋ１及びｋ２は、ヘモグロビン決定に使用される機器ごとに固有であり得る。
【００５６】
これらの較正係数は、既知のヘモグロビン濃度を有する一組の血液試料に吸収測定を実行することによって決定することができる。これらの較正測定は、機器が製造されるときに実行してもよい。また、機器が正しい分析結果を返すことを保証するために、一定の間隔で較正測定を実行してもよい。この場合、機器の性能の差を処理するために、較正係数を定期的に更新することができる。
【００５７】
図３に、分析の実行が時間に依存することを示す。図３は、上記のアルゴリズムを使用したヘモグロビン濃度の結果が、キュベット内への血液試料の採取と吸収測定の実行との間の経過時間によってどのように変化するのかを示している。図３は、異なるヘモグロビン濃度値を有する異なるいくつかの試料の結果を示す。太線は、全ての試料のヘモグロビン濃度の平均値を表す。このアルゴリズムによって返される値は、最初の数秒の間に大幅に低下する。これは、吸収測定値のドリフトによるものである。したがって、吸収測定を少なくとも３０秒遅延させると、ヘモグロビン濃度値は安定し、正しい結果を示すようにこのアルゴリズムを較正することができる。アルゴリズムの予測可能な結果を得、機器を正確に較正することを可能にするためには、吸収測定を６０〜９０秒遅延させることが好ましい。
【００５８】
この遅延は、単に、機器のホルダ内にキュベットが配置されてから予め設定されたある時間が経過するまで、吸収測定が実行されないようにすることによって達成することができる。しかしながら、この遅延はあるいは、吸収測定値のドリフトが止まったことが確認されたときに吸収測定が実行されるようにすることによって達成することもできる。これは、少なくとも一方の吸収測定の値をある時間のあいだ監視し、ドリフトが止まったときに、処理に使用する吸収測定の結果を決定することによって達成することができる。
【００５９】
次に、図４を参照して、前述の方法を実現するシステムを説明する。このシステムは、４９０〜５２０ｎｍの第１の範囲の第１の波長の光及び６５０〜１２００ｎｍの範囲の第２の波長の光を発する手段１０を含む。光を発するこの手段１０は、いくつかの波長の光を発する光源又は幅広い波長範囲の光を発する光源とフィルタとの組合せによって実現することができる。したがって、この光源は、第１の波長の光と第２の波長の光の両方を発するように構成される。フィルタを使用することによって、発せられる波長を、これらの範囲のうちの一方の範囲内にあるように選択的に制御することができる。あるいは、それぞれ第１及び第２の波長を発射する第１及び第２の光源を使用することもできる。光源として発光ダイオードを使用することができる。この場合には、これらの２つの光源をオン／オフすることにより、第１又は第２の波長の光を発するよう、光を発する手段１０を選択的に制御することができる。
【００６０】
光を発する手段１０によって発せられる第１の波長は５００〜５１０ｎｍの範囲にあることが好ましく、５０６ｎｍであることがより好ましい。また、光を発する手段１０によって発せられる第２の波長は８５０〜９１０ｎｍの範囲にあることが好ましく、８６０〜９００ｎｍの範囲にあることがより好ましい。
【００６１】
このシステムはさらに、１ｍｍ未満の光路長を有し、改変されていない全血の試料を保持した毛管キュベットを受け取るように構成されたキュベットホルダ１２を含む。キュベットがホルダ１２内に配置されると、光源から光が光学窓に照射されるように、光学窓が正確に位置決めされる。キュベットホルダ１２は、０．２ｍｍ未満、より好ましくは０．０５〜０．２ｍｍの範囲の光路長を有するキュベットを受け取るように構成されることが好ましい。
【００６２】
このシステムはさらに、キュベットホルダ内へのキュベットの配置と吸収測定の実行との間に定められた時間の遅延を生み出すコントローラ１３を含む。コントローラ１３はしたがって、キュベット内への試料の採取及び試料の吸収測定の実行から十分な時間が経過することを保証する。これは、所定の時間の遅延を提供するタイマによって達成することができる。タイマ１３は、キュベットがキュベットホルダ１２内に配置されたことを検出するセンサ１３ａから入力を受け取ることができる。遅延時間を決定するクロック信号を受け取るため、タイマ１３は、システムの処理ユニット内に配置することができる。所定の時間が経過したときに、タイマ１３は、光源１２の機能を制御する制御ユニット１３ｂに信号を送信することができる。したがって、吸収測定を開始することができるように、制御ユニット１３ｂが使用可能にされる。
【００６３】
あるいは、コントローラは、吸収測定の結果を監視するアナライザ（ａｎａｌｙｓｅｒ）を含む。このアナライザは、試料を透過した光を検出する検出器１４から入力を受け取ることができる。検出器１４からの結果が実質的に一定になったことを確認したときに、アナライザは、必要な時間が経過したと判断することができる。したがって、このとき吸収測定の結果は安定であり、結果を処理するべく吸収測定を開始するように制御ユニット１３ｂをコントローラによって使用可能にさせる。
【００６４】
試料を透過した光は検出器１４によって検出され、その結果、第１の範囲の光に対する第１の吸収測定を得ることができ、第２の範囲の光に対する第２の吸収測定を得ることができる。
【００６５】
このシステムはさらに、前述のアルゴリズムに従って試料中のヘモグロビン濃度を決定するために第１及び第２の吸収測定の結果を処理する処理ユニット１６を含む。
【００６６】
このシステムは、光を発する手段１０、キュベットホルダ１２及び検出器１４を含む光度計として適当に実現することができる。これらの測定を実行するのに適した光度計は、適当な波長フィルタ及び発光ダイオードを有するように変更された光度計を使用することによって得ることができる。本発明の好ましい一実施形態によれば、光度計が２つの波長で吸光度を測定し、内蔵マイクロプロセッサが、プログラムされたアルゴリズムに従って血液中の全ヘモグロビン濃度を計算する。したがって、ＷＯ０１／５３８０６に開示されているような、検出器感度及び有効光路長の変動を補正する特別な吸収又は干渉フィルタは必要ない。
【００６７】
上記の場合、処理ユニット１６は光度計に埋め込まれる。しかしながら、処理ユニット１６を光度計に接続し、したがって光度計の外側に処理ユニット１６を実装することもできる。例えば、光度計に接続されたコンピュータを使用することができる。
【００６８】
散乱光を検出する必要はないので、事実上、直接透過光だけを検出するように検出器１４を構成することができる。このことは、検出器１４が、事実上、試料に照射され、試料を直接に透過した光ビームの直径の内側の光を検出することを含意している。もちろん、この直径の内側にあるといっても、一部の光は散乱されたものである可能性はある。好ましい一実施形態によれば、検出器１４の検出領域の直径を一般に約２ｍｍとすることができる。検出器１４は、試料ホルダから１０ｍｍ未満のところに配置されることが好ましい。このことは、小さな角度に散乱した光が検出されることを含意している。
【００６９】
以上に、本発明の好ましいある１つの実施形態を説明したが、以上の説明に本発明を限定する意図は一切ない。それとは逆に、本発明の範囲内において、細部の多くの修正、変形及び変更を実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明に基づく一方法の流れ図である。
【図２】ヘモグロビンの吸光度の概略図である。
【図３】ヘモグロビン濃度を決定するアルゴリズムの結果が、試料採取後の時間の経過に伴ってどのように変化するのかを示す図である。
【図４】本発明に基づく一システムの概略図である。
【図１】
2009535639.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年11月4日(2008.11.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
このシステムはさらに、キュベットホルダ内へのキュベットの配置と吸収測定の実行との間に定められた時間の遅延を生み出すコントローラを含む。コントローラはしたがって、キュベット内への試料の採取及び試料の吸収測定の実行から十分な時間が経過することを保証する。これは、所定の時間の遅延を提供するタイマによって達成することができる。タイマは、キュベットがキュベットホルダ１２内に配置されたことを検出するセンサから入力を受け取ることができる。遅延時間を決定するクロック信号を受け取るため、タイマは、システムの処理ユニット内に配置することができる。所定の時間が経過したときに、タイマは、光源１０の機能を制御する制御ユニットに信号を送信することができる。したがって、吸収測定を開始することができるように、制御ユニットが使用可能にされる。
【国際調査報告】
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2009535639.tif 000008
2009535639.tif 000009
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