(57)【要約】本発明は、実質的に精製されたピロロキノリンキノンを含有する組成物を含み、この組成物は、低酸素または虚血によって引き起こされる心臓損傷の処置および防止のための方法において有用である。本発明はまた、本発明の組成物をヒト患者と接触させることを含む心臓損傷の処置および防止のための方法も含む。特定の実施形態では、本発明は、虚血−再灌流損傷を防止、処置、または低減するための方法であって、それを必要としている被験体に、治療的に有効な量のピロロキノリンキノンを投与し、それによって該被験体の臓器および組織を、虚血性傷害により引き起こされる再灌流損傷から保護することを含む、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血−再灌流損傷を防止、処置、または低減するための方法であって、それを必要としている被験体に、治療的に有効な量のピロロキノリンキノンを投与し、それによって該被験体の臓器および組織を、虚血性傷害により引き起こされる再灌流損傷から保護することを含む、方法。
【請求項２】
前記虚血−再灌流損傷が、心臓損傷である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ピロロキノリンキノンが、前記被験体の体重１ｋｇあたり１ｍｇと１０ｍｇとの間の量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ピロロキノリンキノンが、前記被験体の体重１ｋｇあたり約３ｍｇの量で投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ピロロキノリンキノンが、前記虚血性傷害の前に前記被験体に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ピロロキノリンキノンが、前記虚血性傷害の後に前記被験体に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ピロロキノリンキノンが、再灌流の開始前、開始時、または開始後に前記被験体に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記虚血−再灌流損傷が、発作である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記発作が、心臓発作の結果である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
治療的に有効な量のタモキシフェンを、それを必要とする被験体に投与することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ピロロキノリンキノンが、前記被験体の体重１ｋｇあたり１ｍｇと１０ｍｇとの間の量で投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記ピロロキノリンキノンが、前記虚血性傷害の前に前記被験体に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ピロロキノリンキノンが、前記虚血性傷害の後に前記被験体に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記ピロロキノリンキノンが、再灌流の開始前、開始時、または開始後に前記被験体に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記虚血−再灌流損傷が、腎臓損傷である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記腎臓損傷が、腸虚血または胃腸管障害の結果である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ピロロキノリンキノンが、前記被験体の体重１ｋｇあたり１ｍｇと１０ｍｇとの間の量で投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ピロロキノリンキノンが、前記虚血性傷害の前に前記被験体に投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ピロロキノリンキノンが、前記虚血性傷害の後に前記被験体に投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記ピロロキノリンキノンが、再灌流の開始前、開始時、または開始後に前記被験体に投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
虚血−再灌流損傷を処置することを必要とする被験体における虚血−再灌流損傷を処置するための薬学的組成物であって、１つ以上のポリマーに連結されたピロロキノリンキノンの治療的に有効な量を含む、薬学的組成物。
【請求項２２】
前記ポリマーが、ポリビニルアルコールである、請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記ポリマーが、ＰＥＧ−ＮＨ２である、請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
虚血−再灌流損傷を処置することを必要とする被験体における虚血−再灌流損傷を処置するための薬学的組成物であって、治療的に有効な量のピロロキノリンキノンおよび腎臓保護剤を含む、薬学的組成物。
【請求項２５】
前記腎臓保護剤が、プロベネシドである、請求項２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
治療的に有効な用量のピロロキノリンキノンが、１ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇとの間であり、治療的に有効な用量のプロベネシドが、１００ｍｇ／ｋｇと２００ｍｇ／ｋｇとの間である、請求項２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
前記腎臓保護剤が、シラスタチンである、請求項２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
ピロロキノリンキノンが、１つ以上のポリマーに連結される、請求項２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
前記虚血−再灌流損傷が、発作損害である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記虚血−再灌流損傷が、四肢において発生する、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
四肢損傷が、糖尿病の結果、または糖尿病関連障害である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記虚血−再灌流損傷が、肺で発生する、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
虚血−再灌流損傷を処置することを必要とする被験体における虚血−再灌流損傷を処置するための薬学的組成物であって、治療的に有効な用量のピロロキノリンキノンおよびメトプロロールを含む、薬学的組成物。
【請求項３４】
前記治療的に有効な用量のピロロキノリンキノンが、１ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇとの間である、請求項３３に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
前記治療的に有効な用量のピロロキノリンキノンが、３ｍｇ／ｋｇである、請求項３４に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
前記治療的に有効な用量のメトプロロールが、１ｍｇ／ｋｇである、請求項３５に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
前記虚血−再灌流損傷が、心筋硬塞である、請求項３３に記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
虚血性傷害に起因する損傷を処置または防止するためのキットであって、１つ以上の容器中に、治療的に有効な用量のピロロキノリンキノンと、薬学的に許容されるキャリアと、該キットの使用説明書と、必要があれば、メトプロロール、プロベネシド、およびシラスタチンから成る群から選ばれる１つ以上の化合物と、を含む、キット。
【請求項３９】
前記ピロロキノリンキノンが、１つ以上のポリマーに連結される、請求項３８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
心臓は、酸素および栄養分の送達ならびに有害代謝産物の除去について、絶え間ない血流に決定的に依存する。虚血は、心筋の代謝および細胞損傷における急速な変化に至り、その損傷の程度は、虚血の重篤度に依存する。連続した虚血は、数時間で、全組織壊死に至る。
【０００２】
再灌流は、一般に有益であると考えられるが、いくつかの機構により組織損傷を引き起こす。臨床的には、開胸手術、心臓移植、および心臓疾患の逆転において、虚血−再灌流による損傷に対する心筋の保護は、最大の臨床的関心となっている問題である。さらに、再灌流による酸素付加の回復（再酸素付加）後の低酸素損傷の悪化は、他のタイプの臓器移植における細胞損傷、ならびに肝臓、腸、脳、腎臓、および他の虚血性症候群における細胞損傷の重要な機構である。細胞の低酸素および再酸素付加は、反応性酸素種（ＲＯＳ）を生成することにより部分的に虚血−再灌流損傷を引き起こす。
【０００３】
１９７０年代末期における細菌からの遊離ＰＱＱの最初の単離以来、さらなる研究は、ＰＱＱが脊椎動物にとっての必須栄養素であり、おそらくビタミンＢ群に属することを示している（非特許文献１）。遊離ＰＱＱは、赤血球、好中球、脳脊髄液、滑液、胆汁において（非特許文献２）、および人乳（非特許文献３）において確認されている。痕跡量の遊離ＰＱＱもまた、ヒトの脾臓、膵臓、肺、脳、心臓、腸、肝臓、および精巣、血漿および尿、ならびにラットの小腸、肝臓および精巣において検出されている（非特許文献４）。ＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼ酵素は、マウスにおけるアミノ酸リジン分解経路にとって極めて重要である。この反応において、ＰＱＱは哺乳動物レドックス補因子として作用する（非特許文献５）。ヒトの組織および体液中のＰＱＱレベルは、食品中で見出されるレベルよりも５〜１０倍低いので、ヒトの組織中のＰＱＱが、少なくとも部分的に、野菜および肉を含む食事源に由来する可能性がある（非特許文献６）。ＰＱＱを欠く食餌をマウスに与えた場合、マウスは成長が遅く、脆い皮膚および低下した免疫応答を有し、繁殖が良好ではない。ＰＱＱの補充により、化学的に既定された、ただし他の点では栄養的に完全な食餌を供給されたマウスにおいて、繁殖能力、成長を改善することができ、新生仔の細胞外マトリックス生産および成熟の指数を調節し得ることが示されている（非特許文献７）。グルタミン酸受容体のＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）サブタイプの過剰な活性化は、低酸素／虚血におけるニューロン損傷プロセスにおいて決定的であり、ＮＭＤＡアンタゴニストはグルタミン酸媒介性神経毒性のインビトロモデルおよびインビボモデル両方においてニューロン損傷を改善し得る。以前の研究の結果は、ＰＱＱが脳低酸素／虚血の齧歯類モデルにおいて脳損傷に対する保護効果を有することを証明し、ＰＱＱが発作の治療における潜在的用途を有し得ることを示唆した（非特許文献８）。ＰＱＱは限局性脳虚血および癲癇の動物モデルにおいて有効なことが示されているが、保護機構は十分に理解されていない（非特許文献９）。
【０００４】
１つの報告だけが、ＰＱＱの潜在的心臓保護効果を調査した。この研究は、心臓排出液中に放出されるＬＤＨ活性で測定したところ、ＰＱＱが、単離されたウサギ心臓を再酸素付加損傷から保護することを示した（非特許文献１０）。しかしながら、この情報に基づいて、ＰＱＱが、予防的に（前処置）または虚血発症後の再灌流時（処置）のいずれかで与えられた場合に梗塞サイズを低減するのに有効な薬剤であるか否かは、決定できなかった。
【非特許文献１】Ｐａｚ  ＭＡら，Ｔｈｅ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ＰＱＱ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ＶＬ編：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｑｕｉｎｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，１９９２，ｂｙ  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｐ３８１−３９３．，Ｋａｓａｈａｒａ  Ｔ，およびＫａｔｏ  Ｔ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００３；４２２：８３２
【非特許文献２】Ｇａｌｌｏｐ  ＰＭら，Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ  １９９３；２９：１５３−１６１
【非特許文献３】Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ＡＥら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９９；２６９：３１７−３２５
【非特許文献４】Ｋｕｍａｚａｗａ  Ｔら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９２；１１５６：６２−６６
【非特許文献５】Ｋａｓａｈａｒａ，Ｔ．およびＫａｔｏ，Ｔ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００；４２２：８３２
【非特許文献６】Ｋｕｍａｚａｗａ  Ｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９９５；３０７：３３１−３３３
【非特許文献７】Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ  Ｆら，Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  （Ｍａｙｗｏｏｄ）２００３；２２８：１６０−１６６，Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ  ＦＭら，Ｊ  Ｎｕｔｒ  １９９４；１２４：７４４−７５３
【非特許文献８】Ｊｅｎｓｅｎ  ＦＥら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４；６２（２）：３９９−４０６
【非特許文献９】Ｚｈａｎｇ  ＹおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＰＡ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２；１６：１０１５−１０２４．，Ｊｅｎｓｅｎ  ＦＥら
【非特許文献１０】Ｘｕ  Ｆら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  １９９３，１９３：４３４−４３９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書において、本発明者らは、ＰＱＱを用いた前処置または処置が、虚血または虚血−再灌流損傷のインタクトなラットモデルの心筋梗塞サイズを著しく低減し得ることを初めて証明する。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、心筋の酸化的ストレスが、特定の心臓保護因子の投与によって防止または最小化され得、従って、心血管疾患および他の疾患を処置することに関して利点があるという知見に関する。特に、無毒性投与量のピロロキノリンキノン（「ＰＱＱ」）薬が心臓保護剤として有用であり、従って、例えば、冠動脈遮断に起因した、例えば虚血−再灌流損傷、鬱血性心不全、心停止および心筋梗塞のような種々の様々な心臓関連の病気の処置において、ならびに心臓保護のために、有益であることが見出されている。ＰＱＱは特に、（酸化的ストレスの対象である）心筋細胞が細胞死から保護されるように、心筋の酸化的ストレスを調節することが見出されている。
【０００７】
本発明の組成物および方法は、インビボおよびエキソビボでの低酸素／虚血性の心臓損傷の減少または除去、ならびに心血管疾患の予防および／または処置の必要のあるヒトなどの哺乳動物における心血管疾患の予防および／または処置に驚くほど役立つ。
【０００８】
本発明の別の態様において、ＰＱＱは、ミトコンドリアチャネルｍｉｔｏＫＡＴＰ、一酸化窒素−プロテインキナーゼＣ経路、およびアンジオテンシン変換酵素経路のような、心臓保護シグナリング経路を調節、例えば、その効果を増強または維持することが見出されている。
【０００９】
本発明の別の態様において、本発明は、心筋細胞が細胞死から保護されるように心筋の酸化的ストレスを調節する薬剤を投与することにより、被験体の心筋細胞における心筋の酸化的ストレスを処置または防止することに関した。
【００１０】
本発明の別の態様において、本発明は、心筋細胞が細胞死から保護されるように心筋の低酸素性損傷または虚血性損傷を調節する薬剤を投与することにより、被験体における心筋の低酸素性損傷または虚血性損傷を処置または防止することに関した。
【００１１】
本発明の別の態様において、ＰＱＱは、心筋の酸化的ストレスによって引き起こされるフリーラジカル損傷を調節することが見出された。虚血条件または低酸素条件によって生成されるフリーラジカルは、心筋死に至る心筋損傷の重大な原因であることが見出されている。従って、インビボで無毒性投与量において投与されるＰＱＱの投与は、心筋の酸化的ストレスのフリーラジカル損傷を阻害または防止するための有効な処置である。
【００１２】
本発明はさらに、冠動脈血流を改善されるように、無毒性量のＰＱＱを被験体に投与することにより、冠動脈血流を改善する方法に関する。
【００１３】
一つの態様において、本発明は、ピロロキノリンキノンを、例えば、心臓損傷を処置または防止するのに有効な量、投与することにより、被験体における低酸素または虚血によって引き起こされる心臓損傷を処置または防止することに関する。ＰＱＱは一般的に、無毒性濃度、例えば、９００μＭ未満、７００μＭ未満、５００μＭ未満、３００μＭ未満、１００μＭ未満、または５０μＭ未満を含む約１ｎＭ〜１０μＭ未満、で投与される。他の実施形態において、ＰＱＱは、約１〜１０μＭの濃度で投与され得る。他の実施形態において、ＰＱＱは、被験体の体重に応じて投与される。ＰＱＱは一般的に、被験体の体重１Ｋｇ当たり、５００ｍｇ／ｋｇ未満、２５０ｍｇ／ｋｇ未満、１００ｍｇ／ｋｇ未満、１０ｍｇ／ｋｇ未満、５ｍｇ／ｋｇ未満、３ｍｇ／ｋｇ未満、２ｍｇ／ｋｇ未満、１ｍｇ／ｋｇ未満、５００μｇ／ｋｇ未満、２５０μｇ／ｋｇ未満、１００μｇ／ｋｇ未満、１０μｇ／ｋｇ未満、５μｇ／ｋｇ未満、２μｇ／ｋｇ未満または１μｇ／ｋｇ未満を含む約１μｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇの濃度で投与され得る。
【００１４】
本発明は、例えば、心臓保護をもたらすのに有効な量のＰＱＱ、および薬学的に許容されるキャリアを含有する心臓保護薬をさらに含む。また、心臓損傷、発作、または片頭痛の危険性がある患者を処置するためのキットであって、１つ以上の容器中に、有効量のピロロキノリンキノン、薬学的に許容されるキャリア、および使用説明書を含むキットも含まれる。
【００１５】
別の態様において、本発明は、ＮＡＤＰＨ依存性メトヘモグロビンレダクターゼ基質の投与による、インビボで低酸素または虚血によって引き起こされる心臓損傷の処置または防止；ならびに有効量のＮＡＤＰＨ依存性メトヘモグロビンレダクターゼ基質、薬学的に許容されるキャリア、および使用説明書を含む、心臓損傷の処置または防止に使用するためのキットに関する。本発明のいくつかの実施形態において、ＮＡＤＰＨ依存性メトヘモグロビンレダクターゼ基質は、哺乳動物赤血球（例えば、ヒト、ウシ、もしくはマウス）または非哺乳動物赤血球（例えば、Ｒａｎａ  ｃａｔｅｓｂｅｉａｎａ）のような赤血球から精製される。
【００１６】
さらに別の態様において、本発明は、臓器または組織移植中の臓器損傷を防止する方法であって、ＰＱＱが、臓器または組織の取り出し前に、および／または取り出しと同時に臓器ドナーに投与される方法、ならびに、臓器または組織移植中の臓器損傷を防止するために使用されるキットであって、有効量のピロロキノリンキノン、薬学的に許容されるキャリア、および使用説明書を備えるキットに関する。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、所望の保護効果を得るのに有効な量のＰＱＱを投与することにより、例えば、心不全を患っている被験体において、発作を防止するための方法に関する。ＰＱＱは、望ましくは、例えば、約１〜１０μＭの濃度で投与され得る。１つの実施形態において、ＰＱＱは、発作を患う危険にさらされている被験体における発作を防止するために、治療的に有効な量のタモキシフェンと同時投与され得る。
【００１８】
本発明は、ＰＱＱおよび１つ以上の付加的な治療用化合物を投与することによって、被験体における心不全を処置するための方法を含む。いくつかの実施形態において、付加的な治療用化合物は、抗血小板薬、抗凝固薬および／または抗血栓薬、あるいはそれらの組み合わせであり得る。
【００１９】
別の態様において、本発明は、心筋梗塞が低減または安定化されるようなレベルでＰＱＱを投与することによって、被験体における心筋梗塞を処置する方法に関する。
【００２０】
さらに別の態様では、本発明は、ＰＱＱで被験体を処置することによって、被験体における片頭痛を防止する方法に関する。ＰＱＱは望ましくは、例えば、約１〜約１０μＭの濃度で投与され得る。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、ＰＱＱで被験体を処置することによって、低体温症を患っているかまたは低体温症の危険性がある被験体における再灌流損傷を防止する方法に関する。ＰＱＱは望ましくは、例えば、約１〜約１０μＭの濃度で投与され得る。
【００２２】
本発明はさらに、ＰＱＱで被験体を予め処置することによって、被験体におけるバルーン血管形成術後の血管閉塞を防止するための方法に関する。被験体はまた、ＰＱＱおよび１つ以上の付加的な治療用化合物（例えば、クマジン、カプトプリル、ベナゼプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、キナプリル、ラミプリル、イミダプリル、ペリドプリルエルブミンおよびトランドラプリルのようなアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、ならびにロサルタン、イルベサルタン、カンデサルタンシレキセチルおよびバルサルタンのようなＡＣＥ受容体遮断薬で予め処置されてもよい。いくつかの実施形態において、付加的な治療用化合物は、抗血小板薬、抗凝固薬および／もしくは抗血栓薬、あるいはそれらの組み合わせであり得る。
【００２３】
別の態様において、本発明は、被験体にＰＱＱを投与することによって、低体温損傷を患う被験体における再灌流損傷を防止または低減するための方法を含む。
【００２４】
本発明はさらに、治療的に有効な用量のピロロキノリンキノンおよび治療的に有効な用量のメトプロロールを含む、心筋梗塞の処置を必要とする被験体における心筋梗塞を処置するための薬学的組成物に関する。心筋梗塞を処置するための薬学的組成物の１つの実施形態において、ピロロキノリンキノンの治療的に有効な用量は、３ｍｇ／ｋｇである。心筋梗塞を処置するための薬学的組成物の別の実施形態において、メトプロロールの治療的に有効な用量は、１ｍｇ／ｋｇである。
【００２５】
本発明はさらに、低酸素または虚血に関連した心臓損傷を処置または防止するためのキットに関し、このキットは、１つ以上の容器中に、ピロロキノリンキニーネ、メトプロロール、薬学的に許容されるキャリア、およびこのキットの使用説明書を含む。
【００２６】
本発明はさらに、心筋の酸化的ストレスの処置または防止を必要とする被験体に治療的に有効な用量のピロロキノリンキノンおよび治療的に有効な用量のメトプロロールを投与することを含む、被験体における心筋の酸化的ストレスを処置または防止する方法に関する。
【００２７】
本発明はさらに、心筋梗塞の処置または防止を必要とする被験体に治療的に有効な用量のピロロキノリンキノンおよび治療的に有効な用量のメトプロロールを投与することを含む、被験体における心筋梗塞を処置または防止する方法に関する。
【００２８】
本発明はさらに、低酸素または虚血によって引き起こされる心臓損傷の処置または防止を必要とする被験体に治療的に有効な用量のピロロキノリンキノンおよび治療的に有効な用量のメトプロロールを投与することを含む、被験体における低酸素または虚血によって引き起こされる心臓損傷を処置または防止する方法に関する。
【００２９】
本発明はさらに、蛋白質ニトロ化に起因する血管損傷また疾患の処置を必要とする被験体に治療的に有効な用量のピロロキノリンキノンを単独で、または尿酸塩と組み合わせて投与することにより、蛋白質ニトロ化に起因する血管損傷または疾患を処置するための方法を提供する。
【００３０】
本発明はまた、ＰＱＱ投与に関連した腎毒性の低減を必要とする被験体に治療的に有効な用量のピロロキノリンキノンをプロベネシソ、シラスタチン、または他の通管流遮断剤と組み合わせて被験体に投与することにより、ＰＱＱ投与に関連した腎毒性を低減する方法も提供する。
【００３１】
本発明のこれらおよび他の目的は、以下に提供する発明の詳細な説明から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
（発明の詳細な説明）
本発明の特徴および他の詳細は、添付の図面を参照してより詳細に記載され、特許請求の範囲において示される。本明細書に記載される特定の実施形態が例示として示され、そして、本発明の限定ではないことが理解される。本発明の主な特徴は、本発明の範囲を逸脱することなく、各種実施形態において使用され得る。全ての部および百分率は、他に特定しない場合には、重量による。
【００３３】
（定義）
便宜上、明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語をここで集める。他に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。しかしながら、これらの定義が当該分野内で広まっている意味から変化する場合には、下記の定義が優先するものとする。
【００３４】
「虚血」は、身体のいずれかの臓器または組織への血流の減少または停止を含む。本明細書で用いられるように、用語「虚血」は、例えば、血管虚血（例えば、心臓および肺）、肝臓虚血、腸虚血、脳虚血、腎臓虚血、および肢虚血を含むいかなる虚血症候群にも関する。
【００３５】
「低酸素」は、身体組織に到達する酸素量の欠乏を含む。
【００３６】
「低酸素または虚血関連損傷」は、心臓損傷を含むが、これに限定されない。
【００３７】
「再灌流」は、心臓発作または発作の後のように、その血液供給が中断された臓器または組織への血流の回復を含む。
【００３８】
「酸化的ストレス」は、過剰のフリーラジカル、抗酸化剤レベルの減少、またはその両方が存在する場合に発生する状態を含む。
【００３９】
「壊死」は、特に、心筋のような身体の局部における損傷または疾患による細胞または組織の死を含む。
【００４０】
「アポトーシス」とは、プログラム細胞死をいう。
【００４１】
「β遮断剤」としては、アテノロール、メトプロロールおよびプロプラノロールのようなアドレナリンβ受容体において競合的アンタゴニストとして作用する薬剤が含まれる。このような薬剤はまた、減少した全身性副作用を許容する、心臓（β−１）受容体に関してより選択的な薬剤も含む。β遮断剤は、高血圧、心臓不整脈、片頭痛、および交感神経系に関連した他の障害と関係がある症状を低減させる。β遮断剤はまた、時々、心臓発作後に、心拍を安定させるために与えられる。交感神経系の中で、βアドレナリン作用性受容体は主に、心臓、肺、腎臓、および血管中に位置する。β遮断剤は、神経刺激ホルモンエピネフリンとこれらの受容体部位を競合し、従って、エピネフリンの作用を妨害し、血圧および心拍数を低下させ、不整脈を止め、そして片頭痛を防止する。
【００４２】
「心臓損傷」は、虚血−再灌流損傷；鬱血性心不全；心停止；心筋梗塞；薬物（例えば、ドキソルビシン、ハーセプチン、チオリダジンおよびシサプリド）のような化合物によって引き起こされる心臓毒性；寄生生物感染（細菌、菌類、リケッチア、およびウイルス、例えば、梅毒、慢性Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ感染）に起因する心臓損傷；劇症心臓アミロイドーシス；心臓手術；心臓移植；および外傷性心臓損傷（例えば、穿通性もしくは閉鎖性心臓損傷、大動脈弁破裂）を含む、心臓および／または関連組織（例えば、心膜、大動脈および他の関連血管）を含む任意の慢性または急性の病理学的事象を含む。
【００４３】
「被験体」は、ヒト、サル、雌ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、畜牛、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、それらからの培養細胞、およびそれらのトランスジェニック種のような生きている生物体を含む。好ましい実施形態において、被験体は、ヒトである。処置される被験体に対する本発明の組成物の投与は、公知の手順を用いて、被験体における状態を処置するのに有効な投与量でかつ有効な期間にわたって実行され得る。治療効果を達成するのに必要な治療用化合物の有効量は、被験体の年齢、性別、および体重のような要因、ならびに治療用化合物が被験体における外来因子を処置する能力に従って変化し得る。投与量のレジメンは、最適治療応答を提供するように調節され得る。例えば、いくつかに分割された用量が毎日投与されてもよく、または用量は治療状態の緊急性により示されるように比例して減少されてもよい。
【００４４】
「実質的に純粋な」とは、化合物、例えば、天然では付随する成分から分離された、薬剤、タンパク質またはポリペチドを含む。典型的には、試料中の全材料の（体積、湿重量または乾燥重量、あるいはモルパーセントまたはモル分率によって）少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９９％が目的の化合物である場合、その化合物は実質的に純粋である。純度は、任意の適切な方法、例えば、ポリペチドの場合、カラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析、によって測定され得る。化合物、例えば、タンパク質はまた、天然で会合している成分を実質的に含まない場合、または天然の状態で付随している天然の夾雑物から分離されている場合、実質的に精製されている。用語「実質的に純粋な」の意味の範囲内に含まれるのは、試料中の総タンパク質の（体積、湿重量または乾燥重量、あるいはモルパーセントまたはモル分率によって）少なくとも９５％が目的のタンパク質またはポリペチドである、均一に純粋である化合物、例えば、タンパク質またはポリペチドである。
【００４５】
「投与する」は、本発明の組成物がその意図された機能、例えば、低酸素または虚血によって引き起こされる心臓損傷の処置または防止、を発揮し得る投与経路を含む。処置されるべき疾患または状態に依存して、非経口投与（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下の注射）、経口投与（例えば、食事）、局所、鼻、直腸、または徐放性マイクロキャリアが含まれるが、これらに必ずしも限定されるわけではない様々な投与経路が可能である。口腔投与、非経口投与および静脈内投与は好ましい投与形態である。投与されるべき化合物の処方物は、選択される投与経路（例えば、液剤、乳剤、ゲル剤、エアゾール剤、カプセル剤）に従って変化する。投与されるべき化合物を含む適切な組成物は、生理的に受容され得るビヒクルまたはキャリアおよび必要に応じて佐剤および保存剤中で調製され得る。液剤または乳剤に関して、適切なキャリアとしては、例えば、生理的食塩水および緩衝化媒質、滅菌水、クリーム、軟膏、ローション、オイル、ペーストおよび固体キャリアを含む、水性またはアルコール性／水性溶液、乳液または懸濁液が含まれる。非経口的ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルまたは不揮発性油が含まれ得る。静脈内ビヒクルとしては、様々な添加剤、保存剤または流体、栄養分もしくは電解質補充剤が含まれ得る（一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１６版，Ｍａｃｋ、Ｅｄ．（１９８０）を参照のこと）。
【００４６】
「有効量」は、その意図された機能、例えば、本明細書に記載される通りの低酸素または虚血によって引き起こされる心臓損傷を部分的または完全に処置または防止すること、を実行することを可能にするピロロキノリンキノン量を含む。有効量は、生物学的活性、年齢、体重、性別、全般的健康状態、処置されるべき状態の重篤度、ならびに適切な薬物動態学的特性を含む多くの要因に依存する。例えば、活性物質の投与量は、約０．０ｌｍｇ／ｋｇ／日〜約５００ｍｇ／ｋｇ／日、有利には、０．ｌｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。活性物質の治療上有効な量は、一回用量または複数回用量で、適切な経路により投与され得る。さらに、活性物質の投与量は、治療状況または予防状況の緊急性により示されるように、比例して増減され得る。
【００４７】
「特異的結合」または「特異的に結合する」は、ピロロキノリンキノンまたはそのリガンドを認識して結合するが、試料中の他の分子を実質的には認識も結合もしない抗体のようなタンパク質が含まれる。
【００４８】
「薬学的に許容されるキャリア」としては、化合物の活性と適合性がありかつ被験体にとって生理的に受容され得る、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。薬学的に許容されるキャリアの例は、緩衝化通常生理食塩水（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）である。薬学的に活性な物質のためのこのような媒質および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒質または薬剤が治療用化合物と適合性がない場合を除いて、薬学的投与に適する組成物におけるその使用が意図される。補助的な活性化合物もまた、組成物に組み込まれ得る。
【００４９】
「薬学的に許容されるエステル」としては、本発明の治療用化合物の比較的無毒性のエステル型生成物が含まれる。これらのエステルは、治療用化合物の最終的な単離および精製中に、またはその遊離酸形態もしくはヒドロキシルの精製された治療用化合物を適切なエステル化剤と別々に反応させることによって、現場で調製することができ；いずれも、当業者に公知の方法である。酸は、例えば、触媒存在下でのアルコールを用いた処理によって、当業者に周知の方法に従って、エステルに変換され得る。
【００５０】
「付加的な成分」としては、以下のうちの１つ以上が含まれるがこれらに限定されない：賦形剤；界面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；顆粒化および崩壊剤；結合剤；滑沢剤；甘味料；フレーバー剤；着色剤；保存剤；ゼラチンのような生理的に分解可能な組成物；水性ビヒクルおよび溶媒；油性ビヒクルおよび溶媒；懸濁剤；分散または湿潤剤；乳化剤、粘滑剤；緩衝剤；塩；増粘剤；充填材；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；安定剤；および薬学的に許容されるポリマー材料または疎水性材料。本発明の薬学的組成物に含まれ得る他の「付加的な成分」は、当該分野で公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。
【００５１】
「単位用量」は、所定量の活性成分を含む、別々の量の薬学的組成物を含む。
【００５２】
ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）は、様々な還元剤と酸化剤との間で触媒的に電子を移動させ得る水溶性アニオン性キノンであり、真核生物細胞における可溶性電子伝達系の一部であり得る。本来のＰＱＱは、以下の一般構造のものである：
【００５３】
【化１】
2009535410.tif 000002
本明細書で用いられるように、「ピロロキノリンキノン」すなわち「ＰＱＱ」は、ＰＱＱの密接に関連した異性体類似物および立体異性体類似物を含む、化学的類似性を有するピロロキノリンキノンファミリーの任意のメンバーを含み（例えば、Ｚｈａｎｇら，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１２：４１−４７，１９９５参照）、さらに任意のＰＱＱ連結ポリマー（例えば、ＰＱＱ連結ポリビニルポリマー）を含む。ＰＱＱは、メトキサチンとしても知られている。ＰＱＱは、動物の組織および体液中に見出される。理論により束縛されることを望まないが、ＰＱＱは、特に反応性酸素種（ＲＯＳ）のフリーラジカルスカベンジャーとして部分的に作用し得る。従って、ＰＱＱは、ＮＡＤＰＨ依存性メトヘモグロビンレダクターゼ基質として機能し得る（例えば、Ｘｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９（６）：２１３０−４参照）。他のＮＡＤＰＨ依存性メトヘモグロビンレダクターゼ基質は、低酸素または虚血に関連した心臓損傷を減少させるかまたは除去するように機能し得る。
【００５４】
実質的に精製されたピロロキノリンキノンを含む組成物は、ピロロキノリンキノンを単独で、またはβ遮断剤のような他の成分、およびフェニレフリン、スフィンゴシン−１−リン酸またはガングリオシドＧＭ−１のような心臓保護シグナリング経路を好都合に調節するのに効果的である化合物と組み合わせて含み得る。ピロロキノリンキノンは、当業者に周知の方法のいずれかによって実質的に精製され得る（例えば、Ｅ．Ｊ．ＣｏｒｅｙおよびＡｌｆｏｎｓｏ  Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３，５５９９−５６００（１９８１）；Ｊ．Ａ．Ｄｕｉｎｅ，Ｒｅｖｉｅｗ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８，４０３（１９８９）参照）。
【００５５】
１つの実施形態において、本発明は、１つ以上のポリマーに連結させられ、それによって組織保護のためのＰＱＱの薬物動態学、薬力学、効力、および安全性を改善するＰＱＱを提供する。ＰＱＱが連結させられ得るポリマーとしては、ポリビニルアルコール、ＰＥＧ−ＮＨ２、または以下の実施例７および参照書類Ａ（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるポリマーのいずれかが含まれるが、それらに限定されない。
【００５６】
本発明のピロロキノリンキノンは、１つの実施形態において、薬学的組成物の１つの成分であり、薬学的組成物はまた、薬学的組成物として受容され得る、緩衝剤、塩、他のタンパク質、および他の成分を含み得る。本発明はまた、ピロロキノリンキノンの改変形態を含み、これは、本明細書に記載される通りの低酸素／虚血性の心臓損傷を防止または低減し得る。
【００５７】
本発明の治療用化合物の構造は、不斉炭素原子を含み得る。このような非対称性から生じる異性体（例えば、エナンチオマーおよびジアステレオマー）は本発明の範囲内に含まれることがしたがって理解されるべきである。このような異性体は、古典的分離技術によって、および立体配置的に制御された合成によって、実質的に純粋な形態で入手され得る。本出願の目的のため、明示的にそうでないと注記されない限り、治療用化合物は各キラル中心においてＲ立体異性体またはＳ立体異性体の両方を含むと解釈されるものとする。特定の実施形態において、本発明の治療用化合物は、カチオンを含む。カチオン性基が水素Ｈ＋であれば、治療用化合物は酸と考えられる。水素が金属イオンまたはその等価物と置き換えられれば、治療用化合物は酸の塩である。治療用化合物の薬学的に許容される塩は、本発明の範囲内にあり、例えば、薬学的に許容されるアルカリ金属（例えば、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、またはＫ＋）塩、アンモニウムカチオン塩、アルカリ土類カチオン塩（例えば、Ｃａ２＋、Ｂａ２＋、Ｍｇ２＋）、より高原子価のカチオン塩、またはポリカチオン性対イオン塩（例えば、ポリアンモニウムカチオン）である（例えば、Ｂｅｒｇｅら（１９７７）「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９参照）。塩形成対イオン（もしあれば）に対するアニオン性化合物の化学量論が、この化合物のアニオン性部分の電荷（もしあれば）およびこの対イオンの電荷に依存して変化することが理解される。好ましい薬学的に許容される塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩が含まれるが、他の塩もまた、それらの薬学的に許容される範囲内で意図される。
【００５８】
本発明は、被験体における、低酸素または虚血によって引き起こされるような、心筋の酸化的ストレスを処置または防止する方法にも関する。これは、その必要のある被験体に、酸化的ストレスの標的である心筋細胞が細胞死から保護されるように、好ましくは無毒性量のＰＱＱのような心筋の酸化的ストレスを調節する薬剤を投与することによって行われる。細胞死は、例えば、壊死またはアポトーシスに起因し得る。
【００５９】
心臓保護シグナリング経路は、当該分野で公知である。これらの経路は、心臓保護シグナリング経路の効果を強化または維持するのに有効な量のピロロキノリンキノンを投与することによって、心臓保護を必要とする患者における強化のために目標とされ得る。
【００６０】
虚血性条件または低酸素条件によって発生されるフリーラジカルが、心筋の死に至る心筋損傷の重大な原因であることが見出されている。従って、例えば、無毒性投与量において、インビボで投与されるＰＱＱの投与は、ＰＱＱ媒介性フリーラジカルスカベンジング、またはフリーラジカル生成阻害のいずれかによって、心筋の酸化的ストレスのフリーラジカル損傷を阻害または防止するための有効な処置である。
【００６１】
臨床的に必要であるかまたは望ましい場合、例えば、再灌流の開始時、または再灌流の前に、本発明の化合物の投与がなされ得る。
【００６２】
冠動脈流の改善の必要のある被験体に無毒性量のピロロキノリンキノンを投与することによって、被験体、例えば、低血流状態を患う被験体において冠動脈流が有益に改善され得ることもまた、驚くべきことに見出された。これは、実施例において、例示される。冠動脈流は、左心室拡張期圧（「ＬＶＤＰ」）または左心室拡張末期圧（「ＬＶＥＤＰ」）のような、いくつかの指標によって測定され得る。ＬＶＤＰまたはＬＶＥＤＰを決定することによるような、冠動脈流の測定は、当業者の技術範囲内である。
【００６３】
従って、心筋梗塞のような、低酸素または虚血によって引き起こされる心臓損傷は、好ましくは無毒性投与量の、例えば、約１０μＭ未満の濃度のピロロキノリンキノンの投与によって処置または防止され得る。
【００６４】
ラットを、２つの異なるモデルに準拠するＰＱＱ処置にかけた。モデル１（図１０Ａに模式的に示される）において、雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、再灌流なしで２時間の左前下行（ＬＡＤ）冠動脈結紮に供した。モデル２（虚血−再灌流、図１０Ｂに示される）において、ラットは、左心室（ＬＶ）血行力学をモニタリングしつつ１７分間または３０分間のＬＡＤ閉塞および２時間の再灌流に供した。ＰＱＱ（１５〜２０ｍｇ／ｋｇ）を、ヒトにおける臨床状態を模倣するために、ＬＡＤ閉塞の３０分前にｉ．ｐ．注射によって（前処置）、または再灌流の開始時にｉ．ｖ．注射によって（処置）のいずれかで与えた。対照は、ビヒクル（２％  ＮａＨＣＯ３）を受けた。
【００６５】
モデル１において、ＰＱＱ処置の後の梗塞サイズ（梗塞量／ＬＶ量）は、対照より小さかった（１９．１±２．１％の対照に対して、ＰＱＱ処置は１０．０±１．５の梗塞サイズの結果になった；ｎ＝９、Ｐ＜０．０１）。モデル２において、ＰＱＱでの前処置または処置のいずれもが、梗塞サイズ（梗塞量／危険領域）の減少をもたらした（ＰＱＱ前処置の梗塞サイズが１８．４±２．３、処置の梗塞サイズが２５．６±３．５％、これに対し、対照は３８．１±２．６％、Ｐ＜０．０１）。ＰＱＱは、１〜２の後、より高いＬＶ発生圧力、ＬＶ（＋）ｄＰ／ｄｔおよびより低いＬＶ（−）ｄＰ／ｄｔにおいて、虚血誘発性の心臓機能不全を防止した。
【００６６】
要約すると、ＰＱＱは、虚血か虚血−再灌流からなる２つの別々のインタクトなラットの梗塞形成モデルにおいて心臓保護効果を有した。ＰＱＱは、虚血もしくは虚血−再灌流の前に与えられた場合、または再灌流の開始時に与えられた場合のいずれにおいても、梗塞サイズを低下させた。さらに、ＰＱＱは、１〜２時間の再灌流において増加した左心室（ＬＶ）発生圧力およびＬＶ（＋）ｄＰ／ｄｔにより証明されたように、有益な血行力学的効果を有した。ＰＱＱでの前処置は、ラットあたりの心室性細動（ＶＦ）の平均エピソードおよびＶＦを有するラットのパーセンテージを減少させたのに対し、ＰＱＱでの処置は、虚血および再灌流中にＶＦを有するラットのパーセンテージを減少させた。ＰＱＱの用量は、梗塞サイズに逆相関した。ＰＱＱは、虚血心筋における脂質過酸化の指標である、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）のレベルを低下させた。
【００６７】
モデル２における３つの群の虚血−再灌流期間中の死亡率は、ＰＱＱ後に減少する傾向があった（対照：２８．６％、前処置：１２．９％、処置：２１．７％）。しかしながら、これらの結果は、統計的有意差には達しなかった。研究が梗塞サイズおよび血行力学の測定に集中しており、より多数の動物を必要とする死亡率試験として設計されなかった点に留意すべきである。
【００６８】
ＰＱＱは、再灌流の開始時に与えられる場合も効果的である。チオバルビツール酸と反応する脂質過酸化産物であるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の心筋組織レベルの研究を完了した。虚血／再灌流は、ＭＤＡレベルを上昇させ、ＰＱＱはこの上昇を防止した。虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）後のＰＱＱと偽対照とを比較した値は、３倍異なった。同様の効果が、離れた「正常」心筋において見られた。
【００６９】
前処置としてまたは再灌流の開始時の処置としてのいずれかで与えられるＰＱＱは、虚血および虚血−再灌流のラットモデルにおいて用量関連様式で、心筋梗塞サイズを減らして、心機能を改善することに非常に効果的である。脂質過酸化のこの指標がＰＱＱによって減少したことを示すマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の結果は、ＰＱＱが虚血心筋においてフリーラジカルスカベンジャーとして作用することを示唆する。
【００７０】
理論に束縛されることを望まないが、１つの考え得るＰＱＱ作用機構は、ＰＱＱがフリーラジカルスカベンジャーとして作用するということである。最近の研究は、ＰＱＱがキノンタンパク質酵素の補因子として作用することに加えてフリーラジカルスカベンジャーとして機能することを示す（Ｕｒａｋａｍｉ  Ｔら，Ｊ  Ｎｕｔｒ  Ｓｃｉ  Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ（Ｔｏｋｙｏ）１９９７；４３：１９−３３，Ｈｅ  Ｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００３；６５：６７−７４）。ＰＱＱは、ペルオキシ硝酸形成を抑制することによって、神経保護剤として作用し得る（Ｚｈａｎｇ  ＹおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＰＡ）。ＰＱＱは、ミトコンドリアを酸化的ストレス誘発性脂質過酸化、タンパク質カルボニル形成およびミトコンドリア呼吸鎖の不活化から保護する有効な抗酸化剤であった（Ｈｅ  Ｋら，Ｍｉｙａｕｃｈｉ  Ｋら，Ａｎｔｉｏｘｉｄ  Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ  １９９９；１：５４７−５５４）。単球および好中球のような食細胞は、刺激に応答して超酸化物を生成する。ＰＱＱのレドックスサイクリングのいくつかのインヒビターは、刺激された好中球および単球双方による超酸化物放出についての遮断剤であることが証明された。これは、ＰＱＱがマクロファージおよび好中球双方の呼吸バーストに関係していることを示唆する（Ｂｉｓｈｏｐ  Ａら，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏ  Ｍｅｄ  １９９５；１８：６１７−６２０，Ｂｉｓｈｏｐ  Ａら，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏ  Ｍｅｄ  １９９４；１７：３１１−３２０）。
【００７１】
本発明者らの結果は、上記の研究と一致している。本発明者らは、ＰＱＱでの前処置が梗塞ゾーンの、および離れた「正常」心筋の心筋ＭＤＡレベルを有意に低下させることを見出した。本発明者らのデータは、ＭＤＡがこの推定上の正常領域においてＩ／Ｒによって増加させられたことを示しており、ヒトおよび動物における急性虚血中の離れた心筋におけるＬＶ機能不全の存在を示している他の研究者による報告と一致する（Ｙａｎｇ  Ｚら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００４；１０９：１１６１−１１６７，Ｋｒａｍｅｒ  ＣＭら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９６；９４：６６０−６６６）。本発明者らの観察は、ＰＱＱが脂質過酸化を減らし、虚血性心筋および非虚血性心筋双方の超酸化物を不活化するという仮説と一致する。従って、虚血−再灌流損傷に対するＰＱＱの保護効果は、フリーラジカルスカベンジャーとしてのその作用に起因し得る。本発明者らの研究において、前処置または処置のいずれかとして与えられるＰＱＱはまた、心室性細動の発生率を低下させた。さらに、ＰＱＱは、直接的な抗不整脈効果を有することができ、その抗虚血特性によってＶＦの減少を引き起こし得る。
【００７２】
下記の実施例５に示されるデータは、ＰＱＱが脂質過酸化を減らすとともに超酸化物をスカベンジングすることを示唆する。Ｉ／Ｒ損傷に対するＰＱＱの保護効果がフリーラジカルスカベンジャーとしてのその作用に起因するというさらなる証拠。ＭＤＡが推定の正常領域においてＩ／Ｒ後に増加したという観察は、ヒトおよび動物モデル双方において、梗塞ゾーンから離れた心筋が抑制された機能を呈することを示す他の研究者により報告された観察と一致する。
【００７３】
再灌流時に梗塞サイズを減らすのに効果的であるＰＱＱの最少用量もまた、実施例５に示されるように決定した。加えて、本発明者らは、ミトコンドリア機能に対するこの用量のＰＱＱの効果を決定した。これらの研究のために、以前に記載された組織調製法を用いた。心臓を、左前下行冠動脈によって灌流される領域を含む前部分と、非梗塞性後部部分とに目視で長手方向に分割した。ラットを、２時間の再灌流の開始の直前の３０分間の虚血（Ｉ／Ｒ）後、ＰＱＱにより処置、または処置しなかった（偽対照）。
【００７４】
１ｍｇ／ｋｇのＰＱＱを用いた再灌流開始時の処置は、心臓も単離されたインタクトなミトコンドリアも、Ｉ／Ｒ損傷から保護しなかった。しかしながら、３ｍｇ／ｋｇのＰＱＱのみでの処置は、梗塞サイズを４９％減少させるのに、そしてミトコンドリア呼吸を回復させるのに非常に効果的であった。これらの実験において、血行力学の結果は、以前の報告に記載されている結果と異ならなかった。
【００７５】
本発明者らのデータはまた、高危険度患者におけるＰＱＱの予防的投与または活性な虚血性エピソード時の処置のいずれもが、梗塞サイズおよび心室性不整脈を減らすことによって有益であることを示す。本発明者らの結果はまた、これらの手順が急性心筋梗塞の早期処置として使用される場合、ＰＱＱでの処置が、化学的血栓崩壊またはバルーン血管形成術／ステント術と同時に発生する再灌流時にも有効であることを示す。この研究において全身血行力学に対する抑制効果がないことも有望である。フリーラジカル生成が損傷の最大の原因である虚血−再灌流損傷の他のモデルにおけるさらなる調査が所望され得る。急性毒性、特にラットにおいて記載された腎機能に対する有害な副作用（Ｗａｔａｎａｂｅ  Ａら，Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  １９８９；３８：４９−５１）、およびヒトにおけるＰＱＱの潜在的利点は、あるとしても、未決定のままである。
【００７６】
それゆえ、虚血前の前処置として、または虚血後の再灌流開始時の処置としてのいずれかで与えられるＰＱＱは、インタクトなラットにおいて用量関連様式で、心筋梗塞サイズを減らして、心機能を改善することに非常に効果的である。ＰＱＱは、虚血心筋においてフリーラジカルスカベンジャーとして作用するようである。
【００７７】
メトプロロールは、β１選択的（心選択性）アドレナリン作用性受容体遮断剤である。メトプロロールは、心臓の酸素要求量を減らし、心拍数を減らし、そして安静時および運動時の心拍出量を減らし；とりわけ、収縮期血圧を減らす。この薬物は、５０ｍｇおよび１００ｍｇの錠剤として、酒石酸塩（ＬＯＰＲＥＳＳＯＲ（登録商標），Ｇｅｉｇｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）として米国内で入手可能である。有効な１日用量は１００ｍｇ〜４５０ｍｇであり、ＬＯＰＲＥＳＳＯＲ（登録商標）は通常、２つの１日用量で与えられる１００ｍｇとして投与される。メトプロロールは、コハク酸塩（ＴＯＰＲＯＬ  ＸＬ（登録商標），Ａｓｔｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）として５０ｍｇ、１００ｍｇおよび２００ｍｇの長期放出錠剤として米国内で入手可能であり、これは、１日に１回投与され得る）
ＰＱＱは、メトプロロールと同時投与され得る。下記の実施例６に示される結果は、ＰＱＱおよびメトプロロールの併用により、ＰＱＱまたはメトプロロールを単独で使用するよりも大きく梗塞サイズを減らす傾向があったことを示す。１つの実施形態において、メトプロロールは、１：３の比でＰＱＱの用量と共に投与される。例えば、３ｍｇ／ｋｇの用量のＰＱＱには、１ｍｇ／ｋｇの用量のメトプロロールが付随する。別の実施形態において、メトプロロールは、１日あたり約５０ｍｇ〜約５００ｍｇ／日の１日用量のＰＱＱと組み合わせて、約５０ｍｇ〜約４５０ｍｇの１日用量で投与される。心筋の酸化的ストレスは、ＰＱＱとメトプロロールとの組み合せの投与によって、防止または最小化することができ、それゆえ、心血管および他の疾患を処置することに関して利点を有する。特に、ＰＱＱとメトプロロールとの組み合せは、心臓保護剤として有効であり、従って、冠動脈妨害に起因するような虚血−再灌流損傷、鬱血性心不全、心停止および心筋梗塞などの種々の様々な心臓関連の病気の処置において、そして、心臓保護のために有用である。この組み合せは特に、心筋細胞（これは、酸化的ストレスの対象である）を細胞死から保護するように心筋の酸化的ストレスを調節するのに有用である。
【００７８】
本発明は、被験体における低酸素または虚血によって引き起こされる心臓損傷を処置または防止する方法を包含し、ここで、ＰＱＱは、低酸素または虚血に関連した損傷が防止または減少させられるように、その必要のある被験体に投与される。特定の実施形態において、ＰＱＱは、約１０μＭ未満の濃度で投与される。他の実施形態では、ＰＱＱは、約１０ｎＭ〜約１０μＭ、約１０ｎＭ〜約１μＭ、１００ｎＭ〜約１０μＭ、および１００ｎＭ〜約５００ｎＭの範囲の濃度で投与される。本発明のさらに他の実施形態では、ＰＱＱは、心臓の組織部位におけるＰＱＱの濃度が１０ｎＭ〜約１０μＭの範囲にあるような濃度で投与される。ＰＱＱはまた、被験体の体重の関数として投与され得る。本発明のいくつかの実施形態では、ＰＱＱは、５００ｍｇ／ｋｇ未満、２５０ｍｇ／ｋｇ未満、１００ｍｇ／ｋｇ未満、１０ｍｇ／ｋｇ未満、５ｍｇ／ｋｇ未満、３ｍｇ／ｋｇ未満、２ｍｇ／ｋｇ未満、１ｍｇ／ｋｇ未満、５００μｇ／ｋｇ未満、２５０μｇ／ｋｇ未満、１００μｇ／ｋｇ未満、１０μｇ／ｋｇ未満、５μｇ／ｋｇ未満、２μｇ／ｋｇ未満または１μｇ／ｋｇ未満を含む、被験体の体重１ｋｇあたり約１μｇと１ｇとの間の濃度で投与される。本発明のさらなる実施形態では、ＰＱＱは、無毒性濃度で投与され、この無毒性濃度は、細胞増殖阻害性であるが細胞毒性ではないＰＱＱ濃度、および意図された１つ以上の細胞型（例えば、心筋細胞）以外の細胞型に対して細胞毒性である濃度を含む。１つ以上の細胞型に対する既知濃度のＰＱＱの細胞毒性の決定は、当業者の能力範囲内である。非限定的な例として、培養された成体マウス心筋細胞に対する毒性は、１００μＭのＰＱＱの濃度で観察される。いくつかの実施形態では、ＰＱＱは、抗血小板薬、抗凝固薬および抗血栓薬のような他の化合物と共に投与される。
【００７９】
本発明の方法および組成物により処置または防止され得る心臓損傷としては、低酸素および／または虚血によって引き起こされるかまたはそれらによって影響を受ける全ての心臓損傷が含まれる。このような損傷としては、虚血−再灌流損傷、鬱血性心不全、心筋梗塞、薬物（例えば、ドキソルビシン）のような化合物によって引き起こされる心臓毒性、寄生生物感染、劇症心臓アミロイドーシス、心臓手術、心臓移植、および外傷性心臓損傷に起因する心臓損傷が含まれるが、これらに限定されない。関連する血管および／または心膜のような組織を含む、心臓の全体または一部が損傷し得る。
【００８０】
本発明はまた、低酸素または虚血によって引き起こされる心臓損傷を処置または防止する必要のある被験体にＮＡＤＰＨ依存性メトヘモグロビンレダクターゼ基質を投与し、その結果、低酸素または虚血関連の損傷が防止または減少させられるように、被験体における低酸素または虚血によって引き起こされる心臓損傷を処置または防止する方法を含む。本発明の実施形態では、ＮＡＤＰＨ依存性メトヘモグロビンレダクターゼ基質は、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシまたはマウス）の赤血球または非哺乳動物（例えば、ウシガエル：Ｒａｎａ  ｃａｔｅｓｂｅｉａｎａ）の赤血球から精製される。当業者は、最小の実験を用いてＮＡＤＰＨ依存性メトヘモグロビンレダクターゼ基質を単離および精製する方法を知っている。
【００８１】
本発明は、臓器または組織の再灌流によって引き起こされる損傷が減少または防止されるように、臓器または組織の取り出しより前にまたは取り出しと同時にピロロキノリンキノンをドナーに投与することにより、臓器移植または組織移植中の臓器または組織の損傷を防止する方法をさらに包含する。好ましい実施形態において、移植されるべき臓器または組織は、心臓または心臓組織である。ＰＱＱは、ドナーからの臓器または組織の外科的取り出し後に、臓器または組織と接触され得る。いくつかの実施形態では、ＰＱＱは、ウィスコンシン大学溶液またはＣｅｌｓｉｏｒ溶液のような公知の臓器保存溶液または組織保存溶液に加えて添加される（例えば、Ｔｈａｂｕｔら，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，２００１，１６４（７）：１２０４−８；Ｆａｅｎｚａら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００１，７２（７）：１２７４−７参照）。
【００８２】
本発明はまた、虚血時に臓器または組織が保護されるように、治療的に有効な量のＰＱＱを単独でまたは別の生物学的に活性な薬剤と組み合わせて、それを必要とする被験体に投与することにより、腸虚血、肝臓虚血、脳虚血、腎臓虚血、血管虚血、または肢虚血のような虚血症候群の結果生じる臓器不全または組織損傷を処置、または低減させるための方法も提供する。保護され得る臓器および組織としては、腎臓、肺、肝臓、心臓、胃、膵臓、虫垂、脳、眼、生殖器、心臓組織、および皮膚組織が含まれるが、これらに限定されない。
【００８３】
本発明はまた、治療的に有効な量のテトラヨードサイロ酢酸（Ｔｅｔｒａｃ）および／またはＰＱＱを、それを必要とする被験体に投与することにより、上昇した肺血圧のような急性高山病または高度病もしくは高高度肺水腫のような症状を処置、または低減させるための方法も提供する。保護され得る臓器および組織としては、腎臓、肺、肝臓、心臓、胃、膵臓、虫垂、脳、眼、生殖器、心臓組織、および皮膚組織が含まれるが、これらに限定されない。
【００８４】
本発明は、ピロロキノリンキノンおよび薬学的に許容されるキャリアで被験体を処置することによって、心不全を患っている被験体（例えば、ヒト）の発作を防止することにより神経保護を提供する方法をさらに包含する。いくつかの実施形態において、ピロロキノリンキノンは、約１０μＭ未満の濃度で被験体に投与される。ＰＱＱは、患者における発作の可能性を増大させ得る外科的手順の前またはその手順と同時に投与され得る。１つの実施形態において、手順は、バルーン血管形成術である。他の手順としては、冠動脈バイパス手術および弁置換手術が含まれる。ＰＱＱは、抗血栓剤（例えば、クマジン）の前、抗血栓剤と同時または抗血栓剤後に投与され得る。さらに別の実施形態において、神経保護は、治療的に有効な用量のタモキシフェンが発作の危険性がある被験体に投与される前、投与と同時に、または投与後にＰＱＱを投与することにより達成され得る。
【００８５】
本発明はまた、ピロロキノリンキノンおよび薬学的に許容されるキャリアで被験体を処置することによって、被験体（例えば、ヒト）の頭痛を低減または予防する方法も包含する。このような頭痛としては、急性および慢性の片頭痛および副鼻洞頭痛が含まれる。
【００８６】
本発明は、ピロロキノリンキノンおよび薬学的に許容されるキャリアで被験体を処置することによって、低体温を患う被験体（例えば、ヒト）の再灌流損傷を防止する方法をさらに包含する。被験体は、当該分野で一般に公知であるように、低体温症を患っている人を処置するための標準復温手順の前またはこの手順と同時にＰＱＱで処置され得る。
【００８７】
上記のように、ＰＱＱとメトプロロールとの併用治療は、本発明の一部である。本発明の併用治療は、患者における心筋梗塞の所望の処置を得るために、任意の適切な様式によって投与される。実質的に同時の投与は、例えば、固定されたＰＱＱ対メトプロロール比を有する単一の注入液、または複数の単一注射を被験体に投与することによって達成され得る。併用治療の成分は、上記のように、同じ経路によって、または異なる経路によって投与され得る。例えば、ＰＱＱは経口投与され、その一方で、メトプロロールは静脈内に投与される；あるいは、全ての治療剤は、静脈内注射により投与され得る。治療剤が投与される順序は、決定的であるとは考えられない。
【００８８】
ＰＱＱはまた、腎毒性を低減または防止するために、腎臓保護剤と同時投与され得る。ＰＱＱとの同時投与に適する腎臓保護剤としては、通管流にとってのインピーダンス遮断剤である任意の化合物、すなわち、腎毒性を引き起こす化合物の通管流を妨げる化合物が含まれる。代表的な化合物としては、プロベネシドおよびシラスタチンが含まれる。プロベネシドは現在、慢性の痛風および痛風性関節炎の処置において使用するために市販されている。プロベネシドは、痛風に関連する発作がひとたび起きた場合にその発作を処置するためではなく、その発作を防止するために用いられる。プロベネシドは、腎臓に対して作用して（尿細管分泌を抑制）、体が尿酸を除去するのを助ける。プロベネシドはまた、体が特定の抗生物質を尿中に通すことを防止することにより、それらの抗生物質をより効果的にするためにも用いられる。
【００８９】
高用量のＰＱＱ単独での腎毒性が、ラットにおいて観察されている（実施例５参照）。ＰＱＱは、腎毒性を低減または防止するために、プロベネシドと同時投与され得る。以下の実施例８の結果は、ＰＱＱとプロベネシドとの併用が腎毒性を低減する傾向があったことを示している。１つの実施形態において、ＰＱＱは、プロベネシドの用量と１：４〜１：１００の比率で投与される。例えば、２５ｍｇ／ｋｇ用量のＰＱＱは、１００ｍｇ／ｋｇ用量のプロベネシドにより随伴され、もしくは１ｍｇ／ｋｇ用量のＰＱＱは、１００ｍｇ／ｋｇ用量のプロベネシドにより随伴され、または２ｍｇ／ｋｇ用量のＰＱＱは、１００ｍｇ／ｋｇ用量のプロベネシドにより随伴され、あるいは、３ｍｇ／ｋｇ用量のＰＱＱは、１００ｍｇ／ｋｇ用量のプロベネシドにより随伴される。腎毒性は、ＰＱＱとプロベネシドとの組み合わせの投与により防止または最小限にされ得る。従って、ＰＱＱをプロベネシドと組み合わせて投与することにより、ＰＱＱを用いた様々な徴候の処置（例えば、心臓保護）が可能になる一方で、腎毒性を防止または最小限にすることができる。
【００９０】
別の実施形態において、本発明は、腎毒性および／または腎不全を防止または低減するためのＰＱＱとシラスタチンとの併用治療を提供する。シラスタチンは、腎臓のデヒドロペプチダーゼ−Ｉおよびロイコトリエンジペプチダーゼ阻害薬インヒビターである。シラスタチンは一般に、腎臓によるその分解を妨げることによりその有効性を増大するために抗生物質イミペネムと共に投与される。
【００９１】
各治療剤の逐次的なまたは実質的に同時の投与は、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、および粘膜組織を通した直接吸収を含むがこれらに限定されない任意の適切な経路によって行われ得る。治療剤は、同じ経路によって投与されてもよく、または異なる経路によって投与されてもよい。例えば、選択される組合せの第１の治療剤は静脈内注射により投与されることができ、一方、組合せの他の治療剤は経口投与され得る。あるいは、例えば、全ての治療剤は経口投与されてもよく、または、全ての治療剤は、静脈内注射により投与されてもよい。治療剤が投与される順序は、厳密に決定的というわけではない。
【００９２】
ＰＱＱと腎臓保護剤との組み合わせについて、腎臓保護剤は、ＰＱＱの前に、ＰＱＱと同時に、またはＰＱＱの後に投与され得る。好ましい実施形態において、腎臓保護剤は、ＰＱＱ投与の前に投与され、その結果、腎臓保護剤は、血流中に存在してＰＱＱのどのような潜在的な毒作用も阻止する。逐次投与ができない急性のケースのような別の実施形態において、腎臓保護剤は、ＰＱＱと同時に、またはＰＱＱの後に投与され得る。１つの特に好ましい実施形態としては、２００ｍｇ／ｋｇのプロベネシドをＰＱＱ投与前に投与し、そして１００ｍｇ／ｋｇのプロベネシドをＰＱＱ投与後に投与することが含まれる。
【００９３】
「併用治療」はまた、他の生物学的に活性な成分および非薬物療法とさらに組合せた上記の通りの治療剤の投与を包含し得る。併用治療が非薬物処置をさらに含む場合、治療剤と非薬物処置との組合せの協働による有益な効果が達成される限り、非薬物療法は任意の適切な時点で実施され得る。例えば、適切な場合、非薬物処置が治療剤の投与から一時的に、おそらく数日間または数週間にもわたり、取り除かれたときに、有益な効果は依然として達成される。
【００９４】
従って、本発明の化合物および他の薬理活性薬剤は、同時に、逐次的に、または併用して、患者に投与され得る。逐次投与される場合、投与の間隔は、０．１〜約４８時間まで一般に変化する。本発明の組合せを使用する場合、本発明の化合物および他の薬理活性薬剤が同じ薬学的に許容されるキャリア中に存在してもよく、従って、同時に投与され得ることが認識される。それらは、同時に採られる従来の経口投与形態のような別々の薬学的キャリア中に存在し得る。用語「併用」は、複数の化合物が別々の投与形態において提供されて逐次投与される場合をさらにいう。
【００９５】
本発明の併用組成物の有益な効果としては、治療剤の併用から得られる薬物動態学的協働または薬力学的協働が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、治療剤の協働は、相加的である。別の実施形態では、治療剤の協働は、相乗的である。別の実施形態では、治療剤の協働は、薬剤の一方または両方の治療レジメンを改善する。
【００９６】
本発明は、心筋梗塞を患う患者を処置するためのキットにさらに関し、このキットは、治療的に有効な用量の少なくとも一つのメトプロロールおよびＰＱＱを同じかまたは別々の包装中に含み、そしてその使用指示書を備える。メトプロロールは、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。メトプロロールは、ＰＱＱと約２：１〜約１：３の比率で投与される。例えば、１ｍｇ／ｋｇのメトプロロールが投与される場合、同時投与すべき１つの適切な用量は、１ｍｇ／ｋｇのＰＱＱである。別の適切なＰＱＱの用量は、２ｍｇ／ｋｇである。別の用量は、３ｍｇ／ｋｇのＰＱＱである。
【００９７】
患者が（処置）によって利益を得ているか否かを評価するために、定量的方法で、再発頻度の減少によって、または持続した進行までの時間の増加によって患者の症状を調べる。成功した処置において、患者の状態は改善し、再発の測定数または再発頻度は減少し、または持続した進行までの時間は増加する。
【００９８】
あらゆる薬物に関して、投与量は、処置の成功および患者の健康の重要な部分である。あらゆる場合において、指定された範囲内で、医師は、性別、年齢、体重、身長、病理学的状態および他のパラメータに従って、所定の患者に関して最良の投与量を決めなければならない。
【００９９】
本発明の薬学的組成物は、治療に有効な量の活性薬剤を含む。化合物の量は、処置される患者次第である。患者の体重、病気の重篤度、投与様式および処方医の判断は、適当な量を決定する際に考慮されるべきである。ＰＱＱまたはメトプロロールの治療に有効な量の決定は、十分に当業者の技術範囲内である。
【０１００】
場合によっては、患者を処置するために薬学的包装の添付書類中で述べられる範囲外の投与量を使用することが必要なことがある。それらの場合は、処方医にとって明らかである。それが必要な場合、医師はまた、特定の患者の応答に関連して、どのようにいつ処置を中断、調節または終了するかがわかる。
【０１０１】
本発明は、低酸素／虚血性の心臓損傷の防止または減少に役立つ化合物を活性成分として含む薬学的組成物の調製および使用を包含する。このような薬学的組成物は、被験体に対する投与に適した形態の活性成分単独からなっていてもよく、または薬学的組成物は、活性成分および１つ以上の薬学的に許容されるキャリア、１つ以上のさらなる成分またはこれらのなんらかの組合せを含んでもよい。当該分野で周知のように、活性成分は、例えば、生理的に許容されるカチオンまたはアニオンとともに、薬学的に許容されるエステルまたは塩の形態で薬学的組成物中に存在してもよい。さらに、ピロロキノリンキノンは、例えば、虚血または再灌流損傷を減少させるかまたは阻害する際に、調製物の効力に悪影響を与えない限り、薬学的製品に一般に使用される薬理学的に許容される添加剤（例えば、キャリア、ビヒクルおよび希釈剤）、安定剤または調製物を処方するために必要な成分を含み得る。
【０１０２】
添加剤および安定剤の例としては、単糖（例えば、グルコースおよびフルクトース）、二糖（例えば、スクロース、ラクトースおよびマルトース）および糖アルコール（例えば、マンニトールおよびソルビトール）のような糖；クエン酸、マレイン酸および酒石酸のような有機酸ならびにその塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩およびカルシウム塩））；グリシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のようなアミノ酸ならびにその塩（例えば、ナトリウム塩、カルシウム塩またはカリウム塩）；ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーおよびポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルのような界面活性剤；ヘパリン；ならびにアルブミンが含まれる。
【０１０３】
本明細書に記載される薬学的組成物の処方物は、薬理学の分野で公知であるかまたは今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、このような予備的な方法は、活性成分をキャリアまたは１つ以上の他の補助成分と合わせること、次いで、必要であるかまたは望ましい場合、生成物を成形するかまたは包装して望ましい単一用量単位または複数用量単位にすることを含む。
【０１０４】
本明細書において提供される薬学的組成物の説明は、主にヒトへの要処方箋投与に適する薬学的組成物に関するが、このような組成物が一般に、全ての種類の動物への投与に適していることが当業者によって理解される。組成物を様々な動物への投与に適するようにするための、ヒトに対する投与に適している薬学的組成物の改変は十分に理解され、そして当該分野の獣医学薬理学者は、あったとしても単なる通常の実験によってこのような改変を設計および実施し得る。本発明の薬学的組成物の投与が意図される被験体としては、ヒトおよび他の霊長類が含まれるがこれらに限定されない。
【０１０５】
本発明の方法に役立つ薬学的組成物は、口腔投与、直腸投与、膣投与、非経口投与、局所投与、肺投与、鼻腔内投与、頬内投与、眼投与、または別の投与経路に適した処方物において調製、包装または販売され得る。好適な形態は、静脈内投与である。
【０１０６】
ピロロキノリンキノンおよび上記の成分は適切に混合されて、散剤、顆剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤等が得られる。他の意図される処方物としては、計画されたナノ粒子、リポソーム処方物、活性成分を含有する再封止された赤血球、および免疫学に基づいた処方物が含まれる。
【０１０７】
本発明の薬学的組成物は、バルクで、単一の単位用量として、または複数の単一単位用量として、調製、包装または販売され得る。活性成分の量は一般に、被験体に投与される活性成分の投与量、または、例えばこのような投与量の半分または３分の１のようなこのような投与量の便利な画分に等しい。
【０１０８】
本発明の薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容されるキャリア、および任意の付加的な成分の相対量は、処置されるべき被験体の正体、サイズ、および状態に応じて、そして組成物が投与されるべき経路にさらに応じて変化する。例えば、組成物は、０．１％（ｗ／ｗ）と１００％（ｗ／ｗ）との間の活性成分を含み得る。
【０１０９】
活性成分に加えて、本発明の薬学的組成物は、１つ以上の付加的な薬学的に活性な薬剤をさらに含み得る。
【０１１０】
特に意図される付加的な薬剤としては、制吐剤ならびにシアン化物およびシアン酸塩スカベンジャーのようなスカベンジャーが含まれる。本発明の薬学的組成物の制御放出処方物または徐放性処方物は、従来技術を使用して製造され得る。
【０１１１】
経口投与に適している本発明の薬学的組成物の処方物は、各々が所定量の活性成分を含む、錠剤、硬質カプセル剤もしくは軟質カプセル剤、カシェ剤、トローチ剤または菓子錠剤を含むがこれらに限定されない別々の固体用量単位の形態で調製、包装または販売され得る。経口投与に適している他の処方物としては、粉末化処方物もしくは顆粒状処方物、水性懸濁剤もしくは油性懸濁剤、水溶液もしくは油性溶液、または乳濁液が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１２】
活性成分を含む錠剤は、例えば、活性成分と、必要に応じて１つ以上の付加的な成分を圧縮または成形することによって作製され得る。圧縮錠剤は、適切なデバイスにおいて、粉末または顆粒状調製物のような自由流動形態の活性成分を、必要に応じて結合剤、滑沢剤、ビヒクル、界面活性剤および分散剤のうちの１つ以上と混合して圧縮することにより調製され得る。成形錠剤は、適切なデバイスにおいて、活性成分、薬学的に許容されるキャリアおよび少なくとも混合物を湿らせるために充分な液体の混合物を成形することによって作製され得る。錠剤の製造において使用される薬学的に許容されるビヒクルとしては、不活性希釈剤、顆粒化および崩壊剤、結合剤および滑沢剤が含まれるがこれらに限定されない。公知の分散剤としては、馬鈴薯澱粉および澱粉グリコール酸ナトリウムが含まれる。公知の表面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウムが含まれる。公知の希釈剤としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、微結晶性セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、およびリン酸ナトリウムが含まれる。公知の顆粒化および崩壊剤としては、トウモロコシ澱粉およびアルギン酸が含まれる。公知の結合剤としては、ゼラチン、アカシア、予め糊化されたトウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースが含まれる。公知の滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、二酸化ケイ素およびタルクが含まれる。
【０１１３】
錠剤は非被覆でもよく、または錠剤は、被験体の胃腸管における遅延崩壊を達成し、それによって、活性成分の持続的な放出および吸収を提供するために公知の方法を使用して被覆されてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンのような材料が、錠剤を被覆するために用いられ得る。さらに例えば、錠剤は、浸透圧的に制御された放出の錠剤を形成するために、例えば、米国特許第４，２５６，１０８号、同第４，１６０，４５２号、および同第４，２６５，８７４号に記載される方法を使用して被覆され得る。錠剤は、薬学的に洗練されて口当たりの良い調製物を提供するために、甘味料、香料、着色剤、保存剤またはこれらのなんらかの組み合せをさらに含み得る。
【０１１４】
活性成分を含む硬質カプセル剤は、ゼラチンのような生理的に分解可能な組成物を使用して作製され得る。このような硬質カプセル剤は活性成分を含み、そして付加的な成分（例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンのような不活性固体希釈剤をさらに含み得る。
【０１１５】
活性成分を含む軟質ゼラチンカプセルは、ゼラチンのような生理的に分解可能な組成物を使用して作製され得る。このような軟質カプセルは、活性成分を含み、そしてこれは、水または落花生油、流動パラフィンもしくはオリーブ油のような油性媒体と混合され得る。
【０１１６】
経口投与に適している本発明の薬学的組成物の液状処方物は、液体形態において、または使用前に水もしくは他の適切なビヒクルを用いて再構成することが意図される乾燥製品の形態のいずれかで調製、包装または販売され得る。
【０１１７】
液体懸濁液は、活性成分の水性ビヒクルまたは油性ビヒクル中での懸濁を達成するために従来法を使用して調製され得る。水性ビヒクルとしては、例えば、水および等張性生理食塩水が含まれる。油性ビヒクルとしては、例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、落花生油、オリーブ油、ゴマ油またはヤシ油、分画植物油のような植物油、および流動パラフィンのような鉱油が含まれる。液体懸濁液は、懸濁剤、分散剤または湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、保存剤、緩衝剤、塩、フレーバー剤、着色料および甘味料を含むがこれらに限定されない１つ以上の付加的な成分をさらに含み得る。油性懸濁液は、増粘剤をさらに含み得る。公知の懸濁剤としては、ソルビトールシロップ、水素添加食用脂、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アラビアゴム、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体が含まれるがこれらに限定されない。公知の分散剤または湿潤剤としては、天然に存在するレシチンのような燐脂質、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、アルキレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、脂肪酸およびヘキシトールから誘導された部分エステルとアルキレンオキシドとの縮合生成物、または脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導された部分エステルとアルキレンオキシドとの縮合生成物（例えば、それぞれ、ポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレート、およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレート）が含まれる。公知の乳化剤としては、レシチンおよびアカシアが含まれる。公知の保存剤としては、メチル−パラ−ヒドロキシベンゾエート、エチル−パラ−ヒドロキシベンゾエートまたはｎ−プロピル−パラ−ヒドロキシベンゾエート、アスコルビン酸、およびソルビン酸が含まれる。公知の甘味料としては、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、スクロース、およびサッカリンが含まれる。油性懸濁液のための公知の増粘剤としては、例えば、蜜蝋、固形パラフィン、およびセチルアルコールが含まれる。
【０１１８】
水性溶媒または油性溶媒中の活性成分の液体溶液は、液体懸濁液と実質的に同じ様式で調製することができ、主な違いは、活性成分が溶媒中に懸濁されるよりはむしろ、溶解されるということである。本発明の薬学的組成物の液体溶液は、液体懸濁液に関して記載されている成分の各々を含むことができ、懸濁剤は、溶媒中に活性成分を溶解するのを必ずしも補助しないことが理解される。水性溶媒としては、例えば、水および等張生理食塩水が含まれる。油性溶媒は、例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、落花生油、オリーブ油、ゴマ油もしくはヤシ油、分画植物油のような植物油、および流動パラフィンのような鉱油が含まれる。
【０１１９】
本発明の薬学的調製物の粉末状および顆粒状の処方物は、公知の方法を使用して調製され得る。このような処方物は、被験体に直接投与されてもよく、あるいは、例えば、錠剤を形成するか、カプセルを充填するか、または、水性もしくは油性のビヒクルを添加することによって水性もしくは油性の懸濁液もしくは溶液を調製するために使用されてもよい。これらの処方物の各々は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤および保存剤のうちの１つ以上をさらに含み得る。充填剤および甘味料、フレーバー剤、または着色剤のような付加的な賦形剤も、これらの処方物に含まれ得る。
【０１２０】
本発明の薬学的組成物はまた、水中油型乳剤または油中水型乳剤の形態で調製、包装または販売され得る。油相は、オリーブ油または落花生油のような植物油、流動パラフィンのような鉱油、あるいはこれらの組み合せであり得る。このような組成物は、アラビアゴムまたはトラガカントゴムのような天然に存在するゴム、ダイズ燐脂質またはレシチン燐脂質のような天然に存在する燐脂質、ソルビタンモノオレエートのような脂肪酸とヘキシトール無水物との組み合せに由来するエステルまたは部分エステル、およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートのようなこのような部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物のような１つ以上の乳化剤をさらに含み得る。これらの乳剤はまた、例えば、甘味剤またはフレーバー剤を含む付加的な成分も含み得る。
【０１２１】
本発明の薬学的組成物は、直腸投与に適する処方物において調製、包装または販売され得る。このような組成物は、例えば、坐剤、停留浣腸調製物、および直腸灌注または結腸灌注用の溶液の形態であり得る。
【０１２２】
坐剤処方物は、通常の室温（すなわち、約２０℃）では固体であって、被験体の直腸温（すなわち、健常なヒトでは約３７℃）では液体である非刺激性の薬学的に許容される賦形剤と活性成分とを組み合わせることによって作製され得る。好適な薬学的に許容される賦形剤としては、カカオバター、ポリエチレングリコール、および様々なグリセリドが含まれるが、これらに限定されない。坐剤処方物は、抗酸化剤および保存剤を含むがこれらに限定されない様々な付加的な成分をさらに含み得る。
【０１２３】
停留浣腸調製物または直腸灌注もしくは結腸灌注用の溶液は、活性成分と薬学的に許容される液体キャリアとを合わせることによって作製され得る。当該分野で周知のように、浣腸調製物は、被験体の直腸の解剖学的構造に適応した送達デバイスを使用して投与することができ、そしてこのような送達デバイス内に包装することができる。浣腸用調製物は、抗酸化剤および保存剤を含むがこれらに限定されない様々な付加的な成分をさらに含み得る。
【０１２４】
本発明の薬学的組成物は、膣内投与に適する処方物において調製、包装または販売され得る。このような組成物は、例えば、坐剤、タンポンのような含浸または被覆された膣挿入可能材料、灌注調製物、ゲルもしくはクリームないしは膣洗浄用溶液の形態であり得る。
【０１２５】
化学組成物を材料に含浸またはコーティングする方法は当該分野で公知であり、そして化学組成物を表面上へ堆積させるかまたは結合する方法、材料の合成中に化学組成物を材料の構造に組み込む方法（すなわち、例えば、生理的に分解可能な材料を用いる場合のような）、および水性または油性の溶液または懸濁液を吸収材料に吸収させる方法（その後の乾燥を伴っても伴わなくてもよい）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２６】
灌注調製物または膣洗浄用溶液は、活性成分と薬学的に許容される液体キャリアとを組み合わせることによって作製され得る。当該分野で公知のように、灌注調製物は、被験体の膣の解剖学的構造に適応した送達デバイスを用いて投与することができ、そしてこの送達デバイス中に包装することができる。
【０１２７】
灌注調製物は、抗酸化剤、抗生物質、抗真菌剤および保存剤を含むがこれらに限定されない様々な付加的な成分をさらに含み得る。
【０１２８】
化合物の投与のための付加的な送達方法としては、米国特許第５，９２８，１９５号に記載されている薬物送達デバイスのような薬物送達デバイスが含まれる。
【０１２９】
本明細書中で使用される場合、薬学的組成物の「非経口投与」は、被験体の組織の物理的破損によって特徴付けられる投与および組織の裂け目を通る薬学的組成物の投与の任意の経路を含む。従って、非経口投与は、組成物の注射による薬学的組成物の投与、外科的切開部を通した組成物の適用による薬学的組成物の投与、組織を貫通する非外科的創傷を通した組成物の適用による薬学的組成物の投与などを含むが、これらに限定されない。特に、非経口投与は、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射、胸骨内注射、および腎臓透析注入技術を含むことが意図されるが、これらに限定されない。
【０１３０】
非経口投与に適する薬学的組成物の処方物は、滅菌水または滅菌等張生理食塩水のような薬学的に許容されるキャリアと組み合わされた活性成分を含む。このような処方物は、ボーラス投与または連続投与に適する形態で調製、包装、または販売され得る。注射可能な処方物は、アンプルのような単位用量形態において、または保存剤を含む複数用量容器において、調製、包装、または販売され得る。非経口投与用処方物としては、油性または水性のビヒクル中の懸濁剤、液剤、乳剤、ペースト剤および埋め込み可能な徐放性または生分解性の処方物が含まれるが、これらに限定されない。このような処方物は、懸濁剤、安定剤または分散剤を含むがこれらに限定されない１つ以上の付加的な成分をさらに含み得る。非経口投与のための処方物の１つの実施形態において、活性成分は、再構成された組成物の非経口投与の前に、適切なビヒクル（例えば、発熱性物質を含まない滅菌水）を用いて再構成するための乾燥した（すなわち、粉末または顆粒状）形態で提供される。
【０１３１】
薬学的組成物は、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁剤または液剤の形態で調製、包装、または販売され得る。この懸濁剤または液剤は、当該分野の技術に従って処方することができ、そして活性成分に加えて、本明細書に記載される分散剤、湿潤剤または懸濁剤のような付加的な成分を含み得る。このような無菌の注射可能な処方物は、例えば水または１，３−ブタンジオールのような、無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒を使用して調製され得る。他の許容される希釈液および溶媒としては、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム溶液、および合成のモノグリセリドまたはジグリセリドのような不揮発性油が含まれるが、これらに限定されない。他の非経口的投与可能な有用な処方物としては、活性成分を、微結晶形態で、リポソーム調製物中に、または生分解性ポリマー系の一成分として含む処方物が含まれる。徐放または埋め込みのための組成物は、乳濁液、イオン交換樹脂、溶解性の高くないポリマー、または溶解性の高くない塩のような、薬学的に許容されるポリマー性または疎水性の材料を含み得る。
【０１３２】
局所投与に適している処方物としては、液体または半液体の調製物（例えば、糊膏、ローション剤、水中油型乳剤または油中水型乳剤（例えば、クリーム剤、軟膏またはペースト）および液剤または懸濁剤が含まれるが、これらに限定されない。局所投与可能な処方物は、例えば、約１％〜約１０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得るが、活性成分の濃度は、溶媒中での活性成分の溶解限界と同程度に高くてもよい。局所投与用処方物は、本明細書に記載される付加的な成分のうちの１つ以上をさらに含み得る。
【０１３３】
本発明の薬学的組成物は、口腔前庭を介した肺投与に適している処方物において、調製、包装、または販売され得る。このような処方物は、乾燥粒子を含むことができ、この乾燥粒子は、活性成分を含み、かつ約０．５〜約７ナノメートル、好ましくは約１〜約６ナノメートルの範囲の直径を有する。このような組成物は、便利には、噴射剤の流れが向けられて粉末を分散し得る乾燥粉末レザーバを備えるデバイスを使用する、または自己噴射式の溶媒／粉末分散容器（例えば、密封容器中の低沸点噴射剤に溶解または懸濁した活性成分を備えるデバイス）を使用する、投与のための乾燥粉末の形態である。好ましくは、このような粉末は粒子を含み、粒子の少なくとも９８重量％が０．５ナノメートルより大きい直径を有し、そして粒子数の少なくとも９５％が７ナノメートル未満の直径を有する。より好ましくは、粒子の少なくとも９５重量％は１ナノメートルより大きい直径を有し、粒子数の少なくとも９０％は６ナノメートル未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は好ましくは、糖のような固体の微細粉希釈剤を含み、そして単位用量形態で便利に提供される。
【０１３４】
低沸点噴射剤は一般に、大気圧で６５°Ｆ（１８．３℃）未満の沸点を有する液体噴射剤を含む。一般に、噴射剤は組成物の５０〜９９．９％（ｗ／ｗ）を構成することができ、活性成分は組成物の０．１〜２０％（ｗ／ｗ）を構成し得る。噴射剤は、（好ましくは、活性成分を含む粒子と同じオーダーの粒子サイズを有する）液体の非イオン性界面活性剤または固体のアニオン界面活性剤もしくは固体の希釈剤のような付加的な成分をさらに含み得る。
【０１３５】
肺送達用に処方される本発明の薬学的組成物はまた、溶液または懸濁液の液滴の形態で活性成分を提供し得る。このような処方物は、活性成分を含む、必要に応じて無菌の、水性または希アルコール性の溶液もしくは懸濁液として調製、包装または販売され得、そして任意のネブライズデバイスまたはアトマイズデバイスを使用して便利に投与され得る。このような処方物は、サッカリンナトリウムのようなフレーバー剤、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤、またはメチルヒドロキシベンゾエートのような保存剤を含むがこれらに限定されない１つ以上の付加的な成分をさらに含み得る。この投与経路によって提供される液滴は好ましくは、約０．１〜約２００ナノメートルの範囲の平均直径を有する。
【０１３６】
肺送達に有用であるとして本明細書中で記載される処方物はまた、本発明の薬学的組成物の鼻腔内送達にも有用である。
【０１３７】
鼻腔内投与に適している別の処方物は、活性成分を含んでおり、かつ約０．２〜５００マイクロメートルの平均粒子を有している粗粉末である。このような処方物は、嗅ぎタバコが服用されるやり方で、すなわち、鼻の近くに保持された粉末容器からの鼻通路を介した迅速な吸入によって投与される。
【０１３８】
経鼻投与に適する処方物は、例えば、わずか０．１％（ｗ／ｗ）の、そして１００％（ｗ／ｗ）もの多くの活性成分を含み得、そして本明細書に記載される付加的な成分のうちの１つ以上をさらに含み得る。
【０１３９】
本発明の薬学的組成物は、頬内投与に適する処方物において、調製、包装または販売され得る。このような処方物は、例えば、従来法を使用して作製される錠剤または菓子錠剤の形態であり得、そして例えば０．１〜２０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得、残りは、経口的に溶解性であるかまたは分解可能な組成物、および必要に応じて、本明細書に記載される付加的な成分のうちの１つ以上を含み得る。あるいは、頬内投与に適する処方物は、活性成分を含んでいる、粉末、またはエアロゾル化もしくはアトマイズした溶液もしくは懸濁液を含み得る。このような粉末化、エアロゾル化またはアトマイズ化された処方物は、分散される場合、好ましくは約０．１〜約２００ナノメートルの範囲の平均粒子サイズまたは液滴サイズを有し、そして本明細書に記載される付加的な成分のうちの１つ以上をさらに含み得る。
【０１４０】
本発明の薬学的組成物は、眼への投与に適する処方物において、調製、包装または販売され得る。このような処方物は、例えば、水性または油性の液体キャリア中の例えば、０．１〜１．０％（ｗ／ｗ）の活性成分の液剤または懸濁剤を含む、点眼剤の形態であり得る。このような点眼剤は、緩衝剤、塩、または本明細書に記載される付加的な成分のうちの１つ以上の他のものをさらに含み得る。眼に投与可能な有用な他の処方物としては、微結晶形態の、またはリポソーム調製物中に活性成分を含む処方物が含まれる。
【０１４１】
ピロロキノリンキノンと薬理学的に許容される添加剤との混合物は好ましくは、凍結乾燥製品として調製され、そして使用時に溶解される。このような調製物は、注射用蒸留水または滅菌精製水にピロロキノリンキノンを溶解することによって、約０．０１〜１００．０ｍｇ／ｍｌのピロロキノリンキノンを含む溶液に調製され得る。より好ましくは、この調製物は、生理的に等張の塩濃度および生理的に望ましいｐＨ値（ｐＨ６〜８）を有するように調節される。
【０１４２】
用量は症状、体重、性別、動物種等に応じて適切に決定されるが、血中濃度を約１μＭに保持する処置選択肢が好ましいと一般に想定される。この血漿濃度は、１日につき１用量〜数用量の投与によって達成され得る。ピロロキノリンキノンが被験体に投与されるべきである場合、０．１ｎｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、１ｎｇ〜１ｍｇ／ｋｇ体重）のピロロキノリンキノンを静脈内に投与できる。
【０１４３】
化合物は、１日に数回の頻度で動物に与えられてもよく、または化合物は、１日に一度、１週間に一度、２週間に一度、１ヶ月に一度、または数ヶ月に一度、もしくは１年に一度ないしはそれ未満のより低い頻度で投与されてもよい。用量の頻度は、当業者には容易に明らかになり、処置される疾患の種類および重篤度、動物の種類および年齢等の多くの要因に依存するが、これらに限定されない。
【実施例】
【０１４４】
これらの実施例は例示のみを目的として提供されており、本発明はこれらの実施例に限定されるとは決して解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書中に提供される教示の結果として明白になるあらゆるおよび全てのバリエーションを包含すると解釈されるべきである。
【０１４５】
実施例１．心筋細胞生存率のＰＱＱ保存のインビトロ研究
培養された成体マウス心筋細胞のインビトロモデルを、ＰＱＱによる心臓保護を研究するために開発した。これらの細胞は、生理的ｐＨで４８時間まで培養して生存可能であり、＞９０％が桿状細胞からなる。これらの細胞は、トリパンブルー排除による細胞生存率の決定のために、そして、生化学研究、免疫化学研究および分子研究のために容易に用いられ得る。このモデルでは、低酸素チャンバ中で０％酸素に２〜３時間さらされると、細胞の約３５％は死ぬ。図１に示されるように、細胞を高度の低酸素（０％酸素で２〜３時間）に供する１時間前に添加された１μＭ  ＰＱＱは、トリパンブルー排除によって示されたように、生存可能細胞の比率の有意な増加を生じる。より高濃度のＰＱＱ（１００μＭ）は、１００％細胞死により証明されたように、正常酸素条件下では非常に毒性がある。図２は、低酸素誘発性の細胞死に対する１μＭ  ＰＱＱ保護が１０μＭ  ５−ヒドロキシデカン酸（ミトコンドリアのＫＡＴＰチャネルインヒビター）により阻害されないことを実証する。理論に束縛されることを望まないが、これらのデータは、ＰＱＱがミトコンドリアＫＡＴＰチャネルを開くことによって心臓保護を発揮するわけではないことを示唆する。
【０１４６】
実施例２．心機能のＰＱＱ保存のエキソビボ研究
ランゲンドルフ技術を使用して単離されたマウス心臓調製物を使用してエキソビボ研究を実施した。このアプローチでは、心臓を取り出して灌流装置に載せ、この灌流装置においては、薬物を大動脈のカニューレを介して与えることができる。心臓は、一定速度でペーシングされ、そして左心室発生圧力［ＬＶＤＰ；（左心室収縮期圧）−（左心室拡張末期圧）］、左心室拡張末期圧［ＬＶＥＤＰ］、および左心室圧の正および負の最大一次導関数［＋ｄＰ／ｄｔｍａｘおよび−ｄＰ／ｄｔｍａｘ］を記録する。心臓を２０分間平衡化する。薬物またはビヒクルの注入後、心臓を２０分間の虚血［冠動脈流完全停止］、続いて３０分間の再灌流に供する。冠動脈血流の反射としての冠状静脈洞血流も測定する。このプロトコルにより、血行力学的パラメータで測定した場合に重篤な心筋損傷がもたらされる。
【０１４７】
図３に見られるように、冠動脈血流の完全停止前に２分間のみ注入した１００ｎＭのＰＱＱは、ＬＶＤＰベースライン１の有意な保存を生じる。ＶＤＰは、平均６０ｍｍＨｇである。類似の結果が、ＬＶＥＤＰを用いて得られる［図４］。ＬＶＥＤＰベースラインは平均８ｍｍＨｇである。（ＬＶＥＤＰの増加が有害な応答を表すことに注意されたい）。予想通り、＋ｄＰ／ｄｔｍａｘおよび−ｄＰ／ｄｔｍａｘに関するデータは、ＬＶＤＰの結果を追う［図５および図６］。同様に、冠動脈流は、対照と比較して、ＰＱＱ前処置によって有意に改善される［図７］。
【０１４８】
図８において、示される濃度におけるＰＱＱでの２分間の前処置が１０ｎＭと１μＭとの間では次第に好ましい応答を有するが、１０μＭでは毒性が生じることが示される。主に興味深いことは、再灌流（ＰＱＱ処置）開始時に与えられた１００ｎＭ  ＰＱＱが前処置と同等であることである。従って、ＰＱＱは、前処置、例えば、心臓手順または他の外科的手順において、および症状が発生した後、例えば、急性の重大な事象の両方において有用である。
【０１４９】
図９は、ＰＱＱ前処置後の梗塞サイズの測定実験結果を示す。示されるように、１０ｎＭと１μＭとの間では梗塞サイズが漸減し、血行力学のデータに対応する。後者と一致して、梗塞サイズは１０μＭ  ＰＱＱでは減少しない。
【０１５０】
実施例３．酸化的ストレスを受けた細胞のＰＱＱ保存
培養された心筋細胞を、Ｈ２Ｏ２のインビトロ投与によって、酸化的ストレスに供する。２つの研究を行い、一方の研究では、心臓筋細胞に１０ｎＭと１０μＭ未満との間の濃度のＰＱＱを添加し、その後、Ｈ２Ｏ２を添加する。他方の研究では、心筋細胞を２時間のＨ２Ｏ２の損傷インビトロ投与に供し、その後、ＰＱＱを１０ｎＭと１０μＭ未満との間の濃度で添加する。両方の研究において、ＰＱＱは保護することが見出される。
【０１５１】
実施例４．インビボでの酸化的ストレスの防止／減少のためのＰＱＱの使用
雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、虚血または虚血−再灌流の前にピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）によって、ランダムに処置した。ＰＱＱ（１５〜２０ｍｇ／ｋｇ）を、腹腔内投与によって左前下行冠動脈（ＬＡＤ）閉塞の３０分前に（前処置）、または、静脈内注射によって再灌流開始時に（処置）与えた。左心室（ＬＶ）血行力学をモニタリングしながら、ラットを１７分間または３０分間のＬＡＤ閉塞および２時間の再灌流に供した。前処置または処置のいずれかとして与えられたＰＱＱは、これらのラットモデルにおいて梗塞サイズを減少させた。ＰＱＱは、虚血により誘発される心臓機能不全から保護し、１〜２時間の再灌流後、ＬＶ発生圧力、ＬＶ（＋）ｄＰ／ｄｔはより高く、ＬＶ（−）ｄＰ／ｄｔはより低かった。ＰＱＱ処置ラットにおいては、心室性細動（ＶＦ）エピソードはより少なかった。心筋のマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）（脂質過酸化の指標）は、ＰＱＱによって減少した。従って、前処置としてまたは再灌流の開始時の処置のいずれかとして与えられたＰＱＱは、虚血および虚血−再灌流のラットモデルにおいて用量関連様式で心筋梗塞サイズを減らし、心機能を改善することに非常に効果的である。ＭＤＡの結果は、ＰＱＱが虚血心筋においてフリーラジカルスカベンジャーとして働くことを示唆する。
【０１５２】
統計解析
全ての結果は、平均±ＳＥＭとして示される。２つの投与群（前処置および処置）を、複数群比較のための回帰式を用いて一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して正常対照群と比較した。３つの群の間での閉塞および再灌流期間中の死亡率の差を、χ二乗検定により評価した。ＶＦを有するラットのパーセンテージを、フィッシャーの正確確率検定により評価した。全ての計算を、Ｍｉｎｉｔａｂバージョン７．２（Ｍｉｎｉｔａｂ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）またはＰｒｉｍｏｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ：Ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒａｍバージョン３．０３（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）の一般線形モデル手順を使用して行った。統計的有意性を、ｐ＜０．０５に設定した。
【０１５３】
虚血および虚血−再灌流モデル
ＰＱＱをビヒクル（２％  ＮａＨＣＯ３）に溶解した。腹膜内（ｉ．ｐ．）または静脈内（ｉ．ｖ．）のいずれかで与えられた体積は、１ｍｌであった。全ての対照を１ｍｌのビヒクルにより処置した。モデル１において、２０ｍｇ／ｋｇのＰＱＱを、ＬＡＤ結紮により誘発される２時間の虚血の３０分前に、ｉ．ｐ．で与えた。モデル２において、１５ｍｇ／ｋｇのＰＱＱを、１７分間か３０分間の虚血の３０分前にｉ．ｐ．で与え、続いて２時間の再灌流を行った（前処置）。他のモデル２の実験において、１５ｍｇ／ｋｇのＰＱＱを、再灌流の開始時に大腿静脈を介してｉ．ｖ．ボーラス注射によって与えた（処置）。これらのプロトコルを、図１０にまとめる。
【０１５４】
麻酔（ケタミン８０ｍｇ／ｋｇ、キシラジン４ｍｇ／ｋｇ体重、腹膜内）導入後、気管切開術を実施し、動物をＨａｒｖａｒｄ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒ（モデル６８３、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）において通気した。モデル１のラットを再灌流のない２時間の近位左前下行（ＬＡＤ）冠動脈結紮に供した。モデル２は、以前に記載された通りの虚血−再灌流（Ｓｉｅｖｅｒｓ  ＲＥら，Ｍａｇｎ  Ｒｅｓｏｎ  Ｍｅｄ  １９８９；１０：１７２−８１）を使用した。このモデルにおいて、可逆冠動脈係蹄オクルーダーを、正中線胸骨切開術により近位ＬＡＤ冠動脈周辺に配置した。次いで、ラットを１７分間または３０分間のＬＡＤ閉塞および１２０分の再流動に供した。加えて、モデル２ラットは、血行力学的測定値を記録された。４Ｆ  Ｍｉｌｌａｒカテーテルを、右頸動脈を通して左心室（ＬＶ）に挿入した。２０分間の平衡化後、心拍数（ＨＲ）、収縮期圧（ＬＶＳＰ）、拡張末期期圧（ＬＶＥＤＰ）、ＬＶ（＋）ｄＰ／ｄｔｍａｘ、ＬＶ（−）ｄＰ／ｄｔｍａｘを、ＭａｃＬａｂ／４Ｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用してモニタリングした。ＬＶ発生圧力（ＬＶＤＰ）を、ＬＶＥＤＰをＬＶＳＰから差し引くことにより算出した。
【０１５５】
モデル１およびモデル２、セット１およびセット２の両方における３群のラットにおける体重は異ならなかった（対照群、前処置群および処置群についての値はそれぞれ、以下の通りであった：３２０±１６、３２１±２２、および３０６±１８ｇ；分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって、ｐ＝０．７９９）。
【０１５６】
ベースラインではモデル２の対照群、前処置群および投与群の間で心拍数、ＬＶＳＰ、ＬＶＥＤＰ、ＬＶ（＋）ｄＰ／ｄｔ、およびＬＶ（−）ｄＰ／ｄｔに有意差は皆無であった。前処置によって与えられるかまたは処置として与えられるかにかかわらず、ＰＱＱは、虚血誘発性の心臓機能不全を防止し、１〜２時間の再灌流後、より高いＬＶＳＰ、ＬＶＤＰ、ＬＶ（＋）ｄＰ／ｄｔ、およびより低いＬＶ（−）ｄＰ／ｄｔを有した（図１１Ａ〜Ｂ；１２Ａ〜Ｂ）。
【０１５７】
梗塞サイズ
梗塞サイズを、以前に記載された通りに測定した（Ｓｉｅｖｅｒｓ  ＲＥら，Ｍａｇｎ  Ｒｅｓｏｎ  Ｍｅｄ  １９８９；１０：１７２−８１、Ｚｈｕ  Ｂ−Ｑら，Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  １９９７；３０：１８７８−８５）。モデル１において、心臓を、２時間の虚血期間の終わりに切り出した。次いで、切片を、生存可能な心筋が赤レンガ色に着色されるまで塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）の１％溶液中で１０〜１５分間インキュベートした。
【０１５８】
モデル２において、２時間の再灌流後、ＬＡＤを再閉塞し、そして、フタロシアニン色素（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ，Ｌｏｕｉｓｅｖｉｌｌｅ，ＫＹ）をＬＶ腔に注射し、通常に灌流された心筋を青色に染色した。次いで、心臓を切り出し、過剰な色素をすすぎ洗いし、そして頂部から基部に向かって横断的にスライスして２ｍｍ厚の切片にした。切片を、上記の通りにＴＴＣ中でインキュベートした。梗塞を起こした心筋は、ＴＴＣで染色できない。次いで、組織切片を、１０％ホルマリン溶液中で固定し、計量した。各横断スライスの両面のカラーディジタル画像を、顕微鏡（Ｓｔｅｒｅｏ  Ｚｏｏｍ  ６  Ｐｈｏｔｏ，Ｌｅｉｃａ）に接続したビデオカメラ（Ｌｅｉｃａ  ＤＣ  ３００Ｆ）を使用して得た。青に染色された組織（非虚血性）、赤に染色された組織（虚血性であるが、非梗塞性）および染色されていない組織（梗塞性）を示す領域を、各色画像上で輪郭を描き、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  １．５９（国立衛生研究所，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を使用して盲検様式で測定した。それぞれの面で、梗塞関連組織を表すＬＶ面積の割合（２つの画像の平均）にその切片の重量を掛けることにより、梗塞関連組織の絶対重量を決定した。各心臓についての梗塞サイズを、以下のように表現した：
【０１５９】
【数１】
2009535410.tif 000003
次いで、危険領域のパーセンテージとしての梗塞サイズを、以下の通り計算した：
【０１６０】
【数２】
2009535410.tif 000004
虚血モデル（モデル１）では、ＰＱＱ後の梗塞サイズ（梗塞量／ＬＶ量、フタロシアニン青色色素は注射されていない）は、対照よりも小さかった（図１３）。モデル２における実験の第１セットにおいて、虚血は１７分間であり、その後、２時間の再灌流が行われ、梗塞サイズ（梗塞量／危険領域、梗塞量／ＬＶ量）は、２０ｍｇ／ｋｇのＰＱＱでの前処置によって減少した（図１４）。モデル２の実験の第２セットにおいて、虚血は３０分間であり、その後、２時間の再灌流が行われ、１５ｍｇ／ｋｇのＰＱＱでの前処置または処置のいずれかの後での梗塞サイズは、対照よりも小さかった（図１５）。
【０１６１】
図１６は、前処置として与えられたＰＱＱの用量が、梗塞サイズと逆に相関したことを示す。これらの実験において、１７分間の虚血に続いて２時間の再灌流を行った。
【０１６２】
心室性細動（ＶＦ）
皮下針電極を四肢に挿入することによって心電図（ＥＣＧ、誘導ＩＩ）を得た。ＥＣＧを虚血および再灌流の間モニタリングし、そして発作性ＶＦのエピソードを記録した。ラット１匹当たりのＶＦのエピソード数および各群におけるＶＦを有するラットのパーセンテージを算出した。閉塞および再灌流の前または間に抗不整脈剤を受けたラットは皆無であった。露出した心筋を１つの手の親指および人さし指で迅速に打つことによってＶＦエピソードを好首尾に処置した。
【０１６３】
１５または２０ｍｇ／ｋｇのＰＱＱでの前処置は、ラット１匹あたりのＶＦの平均エピソードを減少させた（図１７Ａ）。１５または２０ｍｇ／ｋｇのＰＱＱでの前処置または処置は、ＶＦを有するラットのパーセンテージを低下させた（図１７Ｂ）。
【０１６４】
マロンジアルデヒドを測定した別の付加的な実験（下記参照）において、偽群またはＰＱＱ群（各々ｎ＝５）のいずれにおいてもＶＦのエピソードは皆無であった。しかしながら、Ｉ／Ｒ群（３０分間の虚血、続いて２時間の再灌流）におけるＶＦは平均１．８±０．４エピソード／ラットであり、１５ｍｇ／ｋｇのＰＱＱでの前処置によって０．２±０．２エピソード／ラット（各群ｎ＝５、二元ＡＮＯＶＡによってＰ＜０．００１、ＰＱＱとＩ／Ｒとの間でＰ＝０．００２の有意な相互作用を有する）に減少した。
【０１６５】
心筋マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）測定
心筋組織ＭＤＡ（チオバルビツール酸と反応する脂質過酸化生成物）を、５３２ｎｍの吸光度にて分光測光法により決定した。試料の濃度を、１．５６×１０５／Ｍｃｍの吸光係数を使用して算出し、結果をｎｍｏｌ／ｇ湿重量心臓として表した（Ｏｈｋａｗａ  Ｈら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９７９；９５：３５１−３５８、Ｍｏｒｉｔｚ  Ｆら，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００３；５９：８３４−８４３）。
【０１６６】
心筋組織ＭＤＡ（脂質過酸化の指標）の測定のために、種々の組織調製法を用いた。心臓を、ＬＡＤによって灌流される領域を含む前部分と残りの非虚血性部分に、頂部から基部まで目視で分けた。ラットを、１５ｍｇ／ｋｇのＰＱＱによって予め処置しまたは処置せず（偽対照）、そして３０分間の虚血および２時間の再灌流に供した。これらの付加的な実験において、血行力学的結果は、上記の結果と異ならなかった。図１８Ａに見られるように、Ｉ／ＲはＭＤＡレベルを上昇させ、ＰＱＱはこの上昇を妨げた。Ｉ／Ｒ後のＰＱＱ値および対照値は３倍異なった（図１８Ａ）。同様の効果が、離れた「正常」心筋において見られた（図１８Ｂ）。再灌流の開始時に与えた場合、１５ｍｇ／ｋｇのＰＱＱはまた、虚血心筋におけるＭＤＡレベルを１７６±１６から１２３±１７ｎｍｏｌ／ｇへと低下させた（ｎ＝８，Ｐ＜０．０５）。
【０１６７】
実施例５．ＰＱＱは、ミトコンドリア呼吸を低濃度で回復させ、虚血／再灌流損傷のインビボモデルにおいて心臓保護的である
成体雄ラットは、３０分間の左前下行（ＬＡＤ）冠動脈閉塞および２時間の再灌流を受けた。ヒトにおける再灌流治療の潜在的利益を評価するために、ＰＱＱを、再灌流の開始時に、１および３ｍｇ／ｋｇ体重の用量でｉ．ｖ．注射によって与えた。取り出し後、心臓を、頂部から基部まで、ＬＡＤ灌流した領域を含む前部と後部セグメントとに分け、ミトコンドリアを単離した。各心筋セグメントのミトコンドリア呼吸を測定し、（ＰＱＱなしで）あらかじめ馴化して偽手術を行った心臓から単離したミトコンドリア呼吸と比較した。
【０１６８】
１ｍｇ／ｋｇのＰＱＱでの処置は、ミトコンドリアをＩ／Ｒ損傷から保護しなかった。しかしながら、３ｍｇ／ｋｇのＰＱＱでの処置は、ミトコンドリア呼吸の回復に非常に効果的であった。虚血領域の呼吸調節およびＡＤＰ−酸素消費率（ＲＣＲ：８．０±０．５、ＡＤＰ／Ｏ；４．５）、ならびに状態３呼吸速度（ＲＲ：４１ｎｍｏｌ  Ｏ  ａｔｏｍ／分／ｍｇタンパク質、ｎ＝５）は、偽のものと一致し（ＲＣＲ：８．２±０．３、ＡＤＰ／Ｏ：３．７、ＲＲ＝４３ｎｍｏｌ  Ｏ  ａｔｏｍ／分／ｍｇタンパク質）、一方で、ＰＱＱなしであらかじめ馴化した心臓のＲＣＲ値は、驚くべきことに２０％低かった。虚血性の未処置の心臓のミトコンドリアからの呼吸応答は、５０〜１００％減少した。ＰＱＱで処置した組織およびミトコンドリアの電子顕微鏡写真は、心筋損傷に典型的な形態を示さなかった。ＰＱＱはまた、梗塞サイズおよび心筋のマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）組織濃度をそれぞれ、４９％および６１％低下させた。
【０１６９】
再灌流時に与えられた低用量の３ｍｇ／ｋｇのＰＱＱは、虚血によって阻害されたミトコンドリア呼吸を非常に効果的に回復させ、ミトコンドリアに対する酸化的損傷およびＩ／Ｒ損傷における梗塞サイズを減少させる。ＰＱＱは、脂質過酸化インヒビターまたはラジカルスカベンジャーとしてその心臓保護機能を発揮し得る。それゆえ、ＰＱＱ処置は、急性虚血症候群の強力な治療剤として出現し得る。
【０１７０】
虚血性領域の呼吸調節およびＡＤＰ−酸素消費率（ＲＣＲ：８．０  ０．５、ＡＤＰ／Ｏ、４．５）、ならびに状態３呼吸速度（ＲＲ：４１ｎｍｏｌ  Ｏ  ａｔｏｍ／分／ｍｇタンパク質、ｎ＝５）は、偽のものと一致し、一方、ＰＱＱなしであらかじめ馴化された心臓のＲＣＲ値は、驚くべきことに２０％低かった。虚血性の未処置の心臓のミトコンドリアからの呼吸応答は、５０〜１００％減少した。ＲＣＲデータを、図１９に視覚的に示す。ＰＱＱ処置した組織およびミトコンドリアの電子顕微鏡写真は、心筋損傷に典型的な形態を示さなかった。それゆえ、再灌流時に与えられた低用量の３ｍｇ／ｋｇのＰＱＱは、虚血により阻害されるミトコンドリア呼吸を非常に効果的に回復させ、ミトコンドリアに対する酸化的損傷およびＩ／Ｒ損傷における梗塞サイズを減少させた。
【０１７１】
毒性研究も実行した。本発明者らは、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの用量で腎毒性も肝臓毒性も見出さなかった（表１参照）。上記のように、再灌流時に与えられた３ｍｇ／ｋｇのＰＱＱは、有効な心臓保護用量であるように思われた。１５ｍｇ／ｋｇにおいて、７／８の動物は、腎毒性も肝臓毒性も全く示さなかったが、表１に示されるデータから除外した１匹のラットは、４日目に尿毒症を発症して１０日目に死んだ。２０ｍｇ／ｋｇを受けたラットは、予め２週間、３０ｍｇ／ｋｇの累積用量で１０ｍｇ／ｋｇを受けていた。表１に示すように、これらの動物の全ては尿毒症を発症して１０日目に死んだ。全ての実験室研究を、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＶＡ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒの臨床実験室によって盲検様式で実施した。アルブミンのような、いくつかの尺度のベースラインレベルが、ヒトにおけるよりもラットにおいて低いが、その一方で、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）のような他のものはより高いことに留意されたい。
【０１７２】
【表１】
2009535410.tif 000005
実施例６．心機能に対するＰＱＱおよびメトプロロールの効果の研究
１５ｍｇ／ｋｇのＰＱＱでの前処置または処置は、梗塞サイズを低減させ、虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）のラットモデルにおける心機能を改善した。β遮断剤メトプロロールは、急性心筋梗塞症患者における標準処置として使用される。従って、メトプロロールおよび低用量ＰＱＱを用いた心筋梗塞の併用処置を各薬物単独と比較して研究するために実験を行った。心臓保護機構を決定するために、変化を、ミトコンドリア機能および脂質過酸化において測定した。
【０１７３】
インタクトな雄ラットを、左心室血行力学をモニタリングしながら、３０分間の左前下行冠動脈閉塞および２時間の再灌流に供した。予備実験において、１ｍｇ／ｋｇの用量のメトプロロールは、梗塞サイズを減少させるために、このシステムにおいて最適であるとわかった。従って、臨床処置を模倣するために、メトプロロール（１ｍｇ／ｋｇ）および／またはＰＱＱ（３ｍｇ／ｋｇ）を、再灌流の開始時に大腿静脈注射によって与えた。別々の実験において、虚血／再灌流後、虚血性心筋および非虚血性心筋のミトコンドリア呼吸調節およびＡＤＰ−酸素消費率（ＲＣＲ）、ならびにマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）（脂質過酸化の指標）のレベルを測定した。
【０１７４】
結果は、メトプロロールまたはＰＱＱのいずれかを用いた処置が心筋梗塞サイズ（梗塞重量／危険領域）を低減させたことを示す。これらの薬剤を組み合わせて使用することは、梗塞サイズをさらに減らす傾向があった。メトプロロールおよび／またはＰＱＱはまた、１〜２時間の再灌流後、虚血により誘発された左心室（ＬＶ）機能不全から保護した。それゆえ、ＬＶ発生圧力は増加し、そしてＬＶ拡張末期圧力は減少した。メトプロロールおよび／またはＰＱＱはまた、ＣＫ放出を減少させた。虚血性心筋および非虚血性心筋におけるミトコンドリアＲＣＲは、主にＰＱＱによって強化され、そしてメトプロロールによってはそれほどではなかった。ＰＱＱは、虚血性心筋および非虚血心筋におけるＭＤＡを減少させた。これらの結果は、下記の表２にまとてある。
【０１７５】
これらの実験は、ＰＱＱおよびメトプロロールが心筋梗塞の処置に有効であるが、ＰＱＱとメトプロロールとの組み合せはいずれかの薬剤単独よりも効果的であり得ることを示唆する。ミトコンドリア保護については、ＰＱＱが優れている。メトプロロールまたはプラセボにランダム化された４５，８５２人の急性心筋梗塞症患者の最近の大規模研究において、心臓性ショックの発生率がメトプロロール群において約３０％より高かった点に留意すべきである（Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｒら，ＣＯＭＭＩＴ／ＣＣＳ−２；Ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｍｅｔｏｐｒｏｌｏｌ  ｉｎ  ４６，０００  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｌａｔｅ−ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｔｒｉａｌｓ  ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  Ａｎｎｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｅｓｓｉｏｎ  ２００５．Ｍａｒｃｈ  ６−９，２００５．Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｌａ．）。これは、メトプロロールがミトコンドリア機能を回復することができないことに少なくとも一部起因し得る。
【０１７６】
【表２】
2009535410.tif 000006
実施例７：ＰＱＱ連結ポリビニルアルコールおよびＰＱＱ連結ポリマーの合成
ＰＱＱを最初に活性化させ、次いで、ポリマーと反応させてＰＱＱ連結ポリマーを得た。９ｋ〜１００の異なる分子量のポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）を、本出願において試験した。ＰＶＡは、その多くの望ましい特徴のため、特に様々な薬学的お生物医学的用途にとって大いに関心のあるポリマーである。
【０１７７】
合成手続は、図２０Ａに示してある。これは２ステップ反応である。第１のステップにおいて、ＰＱＱは、脱水剤（例えば、ＤＣＣまたはＣＤＩ）と反応して活性なｉｍｍｅｄｉａｔｅを得た。第２のステップにおいて、活性ＰＱＱはＰＶＡと反応し、エステル結合が形成され、ＰＱＱは、ＰＶＡ主鎖に化学的に結合された。
【０１７８】
実験の設計が表３に示してある。ＰＱＱ負荷レベルは１〜１０％であり、反応温度は、０、２５および５０℃に制御した。
【０１７９】
【表３】
2009535410.tif 000007
＊実験は、ＤＭＦ溶液中で実施した。３つの分子量のＰＶＡを試験した（Ｍ．Ｗ．〜１０Ｋ、４０Ｋ、および１０Ｋ）。
【０１８０】
合成および精製手順：
１．  ＰＱＱは、制御された温度（０℃、２５℃、および５０℃）でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液に溶解した。
【０１８１】
２．  脱水剤（ＤＣＣまたはＣＤＩ）を溶液に添加して活性化ＰＱＱｉｍｍｅｄｉａｔｅを形成した。
【０１８２】
３．  ＰＶＡを溶液に添加し、反応を２０時間保持した。
【０１８３】
４．  溶液を透析管（ＣＯＭＷ  ４，０００）に移送し、脱イオン水中で２日間透析を行った。水は１日３回交換した。
【０１８４】
５．  透析後、溶液を真空下で濃縮し、真空オーブン中にて５０℃で乾燥した。
【０１８５】
Ｈ−ＮＭＲ分析
受け取られたＰＱＱおよびＰＱＱ／ＰＶＡ連結物のプロトンＮＭＲスペクトルを、図４５および図４６に示す。８．５８ｐｐｍおよび７．１９ｐｐｍに２つのピークが示され、これらのピークは、ＰＱＱ中に示される２つの芳香族プロトンに割り当てられた。ｄ６−ＤＭＳＯピークは２．５０ｐｐｍに現れ、水残留物からのピークは３．３１ｐｐｍに示された。純度は、プロトン積分面積を比較することにより算出し、２つのリソースについて＞９５±５％であった。ＰＱＱ／ＰＶＡ連結物のＮＭＲスペクトルは、連結結合の形成を明確に示した。低フィールドでは、８．５８ｐｐｍおよび７．１９ｐｐｍの２つのピークはＰＱＱからであり、高フィールドの４〜１ｐｐｍの複数ピークは、ＰＶＡからであった。
【０１８６】
ＰＱＱおよびＰＶＡのＦＴ−ＩＲスペクトル
ＰＶＡ、ＰＱＱ、および連結されたＰＱＱ／ＰＶＡのＡＴＲモードＦＴ−ＩＲスペクトルを、図４７、図４８、および図４９に示す。３，０００ｃｍ−１近くの特性ピークは、ＰＶＡ中のヒドロキシル基からである。ＰＱＱ／ＰＶＡ連結物において、このピークは、連結反応により明らかに減少されられている。さらに、１７２０ｃｍ−１の強いピークが、新しいエステル結合の結果として形成された。
【０１８７】
ＰＶＡ粉末のＸＲＤスペクトル
Ｘ線回折は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＸＲＤ−６０００において実施した。結晶化度は、ＰＱＱ放出動力学に対し大きな効果がある。結晶化度は、多くの要因（例えば、分子量および分子量多分散、熱履歴、等）によって決定される。受け取られたＰＶＡ（ＭＷ：１０Ｋ）は、同様な結晶化度を示し、この結晶過度は、図５０に示されるように、約３２〜３４％であり、１９〜２０（２θ）に主ピークを有する。ＰＱＱがＰＶＡと反応してＰＱＱ／ＰＶＡ連結物を形成する場合、生成物は、非晶質ピークのみを示した。この連結反応は、微視的構造を完全に変えた。
【０１８８】
ＨＰＣＬによるＰＱＱの定量アッセイ
標準較正曲線が図５１に示してあり、これは、０．１ｎｇ／２０μｌまでのＰＱＱ量を検出することができる。量の限界および検出限界はそれぞれ、０．２ｎｇ／２０μｌおよび０．１ｎｇ／２０μｌであり、このことは、ＰＱＱ量が＞０．１ｎｇ／２０μｌである場合、ＰＱＱは、効果的に検出され得ることを意味する（図５２および図５３）。ＰＱＱ量が＞０．２ｎｇ／２０μｌである場合、この量は、較正曲線を用いて知ることができ。
【０１８９】
ＧＰＣによるＰＱＱ連結ＰＶＡ系の確認
透析の間に、ＵＶランプにより、溶液を流出ＰＱＱについてチェックした。２日間の透析後、検出可能な量のＰＱＱは皆無であった。ＰＱＱ連結ＰＶＡ溶液を、ロータリーエバポレータにより濃縮し、最終複合物をオーブンで乾燥した。
【０１９０】
ポリマーへのＰＱＱの結合を確認するため、ＧＰＣ分析は実施した。図２１は、蛍光検出器を用いた、ＰＱＱのＧＰＣスペクトルを示している。鋭いピークが１４．９０分に現れ、これは、この操作条件における純ＰＱＱの保持である。ピークの構造は、図２２に示されるようなＵＶ吸収スペクトルにより確認された。
【０１９１】
ＰＶＡが蛍光検出器により検出された場合、強度はＰＱＱの強度に比べて非常に弱かった。これは、ＰＶＡがほとんど蛍光を示さなかったためである。
【０１９２】
ＰＱＱ連結ＰＶＡのＧＰＣスペクトルは、図２３に示してあり、ピークが１０．１９分、１３．６７分に、そしてオーバーラップピークが１４．９０分に示された。計算から、分子量は、約４０Ｋ、１０Ｋおよび低分子量分子であった。ＰＱＱは蛍光検出器によって検出できるので、すべての分子はＰＱＱを含んでいた。さらなる確認を、各ピークのＵＶ吸収スペクトルを調べることにより行った。一般に、それらのピークは、分子中の新たなエステル結合形成に起因するわずかな違いがあるが、同じである（図２４）。
【０１９３】
様々な分析方法を、このＰＱＱ連結ＰＶＡ生成物ように用いることができる。プロトンＮＭＲ試験は、ＧＰＣを除き、ＰＶＡとのＰＱＱの結合をさらに詳細に調べるために実施した。
【０１９４】
ＰＱＱ−ＰＶＡ連結物は、２０ｗｔ％のＰＱＱおよび８０ｗｔ％のＰＶＡも含み得る。言い換えれば、すべての３０反復ＰＶＡ単位が１つのＰＱＱ分子を含有し、すべてのＰＶＡ分子が約６〜約１６個のＰＱＱ分子、好ましくは約７〜約８個のＰＱＱ分子を含有する。図２０Ｂおよび図２０Ｃ参照。ＰＱＱ／ＰＶＡ連結物は、ＣＤＩをを脱水剤として用いて、ＰＱＱをＤＭＦ溶液中のＰＶＡと反応させて合成した。一般的な負荷レベルは、約２０ｗｔ％である。純粋生成物を、加水分解および凍結乾燥後に得た。純度は、ＨＰＬＳにより確認した。連結生成物は、様々な方法により特性決定した。
【０１９５】
ＰＱＱ連結ポリマー
以下でおよび図５４Ａ〜ＪＪに開示されるように、付加的なＰＱＱ連結ポリマーを合成することができる。これらの化合物は、ＰＱＱ放出を制御するための多様な候補を提供する。ＰＥＧ−ＰＮＨ２は、候補の１つである。種々の分子量（数千〜２０Ｋ）および主鎖末端の１ないし２個のアミン基が商業的に利用可能である。アミド結合は、ＰＱＱ連結ＰＶＡ系におけるエステル結合と比較して、より長い放出時間を有することが期待される。
【０１９６】
ＰＱＱ連結ポリマー：係留マスキングおよび非係留マスキング
１．  中性電荷および最小原子容を有するポリマーとの連結
２．  最低／最小親油性のポリマーとの連結
３．  中間レベル親油性のポリマーとの連結
４．  高親油性ポリマーとの連結
５．  高親水性ポリマーとの連結
６．  両性ポリマーとの連結
７．  塩基性特性のポリマーとの連結
８．  ボーダーライン酸性特性のポリマーとの連結
９．  長さの短いポリマーとの連結−生体吸着増大のため
１０．  バックボーン長さの長いポリマーとの連結−生体吸着抑制のため
１１．  短鎖脂肪族アルコール部分（＜Ｃ６）との連結
１２．  長鎖脂肪族部分（＞Ｃ６〜Ｃ１４）との連結
１３．  極長鎖脂肪族部分（＞Ｃ１４）との連結
１４．  テレケリックポリマーおよび非テレケリックポリマーポリマーとの連結
１５．  芳香族非生理活性アルコールとの連結
１６．  小型アミンとの連結（非加水分解可能生成物）
１７．  中型アミンとの連結
１８．  大型アミン（長い半減期）との連結
１９．  膨潤性／ヒドロゲルポリマーとの連結
２０．  感熱性ポリマーとの連結
２１．  電気活性ポリマーとの連結
２２．  時間分解リンカー媒介ポリマーとの連結
２３．  ｐＨ反応性ポリマー連結
２４．  光反応性ポリマー連結
２５．  表面＆マトリックス支援吸着可能ポリマー連結
２６．  カイネチックポリマー連結
２７．  生体透過性ポリマーとの連結
２８．  細胞吸収ポリマー連結
２９．  熱力学的平衡（往復）ポリマー連結
３０．  アイソタクチック、シンジオタクチックおよびアタクチックな性質のホモおよびヘテロポリマーとの連結
インビトロでのＰＱＱ放出動力学
ＰＱＱ放出動力学は、ヒト血漿または純粋なエステラーゼを用いてインビトロで試験することができ、これは将来の臨床研究のための結果をもたらす。確立されたＨＰＬＣ方法はもまた、この研究のために用いることができる。
【０１９７】
実施例８：プロベネシドと組み合わせたＰＱＱは、腎毒性を低減する
方法：
ＰＱＱ／プロベネシド／ＰＱＱ類似物−ラット
実施日時：２００５年１月１１日〜１月１３日
用量ＰＱＱ：２５ｍｇ／ｋｇ
ＰＱＱ類似物：総重量によってではなく、ＰＱＱ当量（２５ｍｇ／ｋｇ）に基づく。
【０１９８】
容量プロベネシド：１００ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ（２０ｍｇ／ｍｌ溶液の５ｍｌ／ｋｇ）
処方物：
ＰＱＱ：
使用直前に２％ＮａＨＣＯ３から作られる：
１）  ２グラムのＮａＨＣＯ３にＤＤ  Ｈ２Ｏを加えて１００ｍｌとする＝２％ＮａＨＣＯ３
２）  ７５ｍｇＰＱＱ＋１５ｍｌ  ２％ＮａＨＣＯ３＝５ｍｇＰＱＱ／ｍｌ
プロベネシド：
１）  ６００ｍｇプロベネシドを秤量
２）  ２７ｍｌのＤＤ  Ｈ２Ｏ添加
３）  ４〜５滴の１９．１Ｎ  ＮａＯＨＯＨ
４）  撹拌
５）  １．０Ｎ  ＫＨ２ＰＯ４でｐＨを７．４にする
（１．３６グラムのリン酸二水素カリウムにＤＤ  Ｈ２Ｏを加えて１０ｍｌとする）
（０．５ｍｌ〜１．２ｍｌを必要とする）
６）  ＤＤ  Ｈ２Ｏを加えて３０ｍｌとする
使用直前にｆｔ
ＰＱＱ類似物：生理食塩水中で１０ｍｇ／ｍｌ溶液とする。類似物８１は、溶液１００％にならなかったことに留意のこと。
【０１９９】
実験：５雌ＳＤ／群
群１：対照−無処置
群２：５ｍｌ  ＰＱＱ／ｋｇＩＶ
群３：５ｍｌプロベネシド／ｋｇ  ＩＰ；５ｍｌ  ＰＱＱ  ＩＶ  ３０分間、６．０時間後にプロベネシド反復
群４：ＰＶＡ−ＰＱＱ−８０、１．９ｍｇＰＱＱ／ｍｌ、１３．２ｍｌ／ｋｇ
群５：ＰＶＡ−ＰＱＱ−８１、２．２ｍｇＰＱＱ／ｍｌ、１１．３ｍｌ／ｋｇ
４８時間後動物を殺し、ＢＵＮ、クレアチニン、血清リン用に血を抜き取り、重量および組織病理学用に腎臓を取り出す。
【０２００】
【表３Ａ−１】
2009535410.tif 000008
【０２０１】
【表３Ａ−２】
2009535410.tif 000009
【０２０２】
【表３Ａ−３】
2009535410.tif 000010
【０２０３】
【表３Ａ−４】
2009535410.tif 000011
【０２０４】
【表３Ａ−５】
2009535410.tif 000012
【０２０５】
【表３Ａ−６】
2009535410.tif 000013
【０２０６】
【表３Ａ−７】
2009535410.tif 000014
【０２０７】
【表３Ａ−８】
2009535410.tif 000015
【０２０８】
【表３Ａ−９】
2009535410.tif 000016
結論：
図２７は、単独投与のＰＱＱと対照とが有意に異なることを示している。しかしながら、プロベネシドと組み合わせたＰＱＱ（または類似物８０および８１）は、対照と比較して有意には異ならなかった。従って、プロベネシドと組み合わせて投与されたＰＱＱは、腎毒性を低減するのに有用である。
【０２０９】
実施例９：ＰＱＱは、内皮細胞単層におけるアクチンニトロ化およびＴＮＦ誘発性障壁不全を防止する
小さな肺動脈は、肺動脈圧および血管抵抗の主要な決定因子である。それらの内皮は、肺抵抗、リモデリング、および血液流動性を調整する。肺微細血管内皮細胞培養に対するＰＱＱの効果を研究して、血管損傷および血管損傷関連疾患の処置するためのＰＱＱの使用の利点を決定した。
【０２１０】
材料／試薬：
すべての試薬は、特に言及されない限り、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０２１１】
肺微細血管内皮細胞培養
ラットの肺微細血管内皮細胞（ＲＬＭＶＥＣ）およびウシの肺微細血管内皮細胞（ＢＬＭＶＥＣ）を、第４パッセージで入手した（Ｖｅｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｅｎｓｓｅｌａｅｒ，ＮＹ）。調製物は、Ｖｅｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって、以下のことにより純粋な個体群であると確認された：（ｉ）位相差顕微鏡で評価した場合の特徴的な「敷石状」外観、（ｉｉ）ファクターＶＩＩＩ関連抗原の存在、（ｉｉｉ）アシル化低密度リポタンパク質の取り込みおよび（ｉｖ）平滑筋アクチンの不在（間接免疫蛍光法）。すべての研究について、ＲＬＭＶＥＣおよびＢＬＭＶＥＣは両方とも、ＢＬＭＶＥＣについては、２０％胎仔ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）、１５μｇ／ｍｌＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）および１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を補ったＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を含有する培地中で、ＲＬＭＶＥＣについては、１０％胎仔ウシ血清（ＶＥＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＭＣＤＢ−１３１完全培地中で、４〜１２パッセージ培養された。両方の細胞系は、３７℃で５％ＣＯ２＋湿潤空気中で維持した。融合性肺微細血管内皮細胞単層（ＰＭＥＭ）には、３日〜４日かかった２ないし３回の個体群倍加で達した。
【０２１２】
処置
ＴＮＦ処置：１０μｇ／ｍｌの原液中のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｍｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）からの高度に精製された組み換えヒトＴＮＦαを用いた。標準のリムルスアッセイによって決定した場合、内毒素レベルは、ＴＮＦα  ０．１ｎｇ／μｇ未満であった。本発明者らはかねて、ＴＮＦαを０．７５時間煮沸するにより、内毒素汚染を全く示さない本発明者らの系（１４）におけるＴＮＦの効果が阻止されることを示した。ＰＭＥＭは、１００ｎｇ／ｍｌにおいてＴＮＦαで処理した。なぜならば、用量応答研究によりこの用量が透過性増大を一貫して引き起こすことが示されるからである。
【０２１３】
抗ＯＮＯＯ−剤：用いたＯＮＯＯ−インヒビターは、尿酸塩（５ＦＭ）およびＰＱＱ（１μＭ）であった。本発明者らはかねて、尿酸塩が、ＴＮＦ誘発性ＯＮＯＯ−をスカベンジングし、かつ内皮における細胞生育能力に全く影響しないことを示している（３０）。ＰＱＱは、推定されるビタミンおよび超酸化物アニオンラジカルスカベンジャーである。細胞は、尿酸塩またはＰＱＱ単独で処理するか、あるいは尿酸塩、ＰＱＱおよびＴＮＦで同時処理した。
【０２１４】
処置媒体：すべての研究について、ＴＮＦ、ＰＱＱ、尿酸塩およびすべての対応する対照を用いたＰＭＥＭのインキュベーションを、フェノールの潜在的な抗酸化効果を回避するために１０％ＦＢＳを補ったフェノールフリーＤＭＥＭ（ｐｆ−ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）により実施した。
【０２１５】
内皮透過性アッセイ
Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ  Ｔｒａｃｋ−Ｅｔｃｈ  Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（直径１３ｍｍ、孔サイズ０．８ｍｍ；Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を、ゼラチン（ウシ皮膚からのタイプＢ；Ｓｉｇｍａ）で被覆し、修正型Ｂｏｙｄｅｎ化学走性チャンバ（内径９ｍｍ；Ａｄａｐｓ，Ｄｅｄｈａｍ，ＭＡ）にＭＦセメントｎｏ．１（Ｍｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）でマウントし、かねて記載されたように、１２．０〜２４．０時間紫外光で滅菌した（８，１６）。ＢＬＭＶＥＣまたはＲＬＭＶＥＣ（ＤＭＥＭ  ０．５０ｍｌ中の１．５×１０５）を、ゼラチン化膜上で培養し、３〜５日以内での融合に到達させた（３７℃、５％ＣＯ２）。
【０２１６】
静水圧および膠質浸透圧の勾配のない経内皮輸送の研究の実験装置は、記載されている（１６）。簡単に言えば、このシステムは、上記のように内皮細胞単層でライニングされた微孔質ポリカーボネート膜によって分離された２つのコンパートメントから成る。ｌｕｍｉｎａｌ（上部）コンパートメント（０．７ｍｌ）を、ａｂｌｕｍｉｎａｌ（下部）コンパートメント（２５ｍｌ）中に吊り下げた。下部コンパートメントを、完全混合のために連続的に撹拌した。システム全体を、３７℃の一定温度で、水槽中で保持した。両方のコンパートメント中の流体高さは、対流を排除するために同じであった。
【０２１７】
内皮透過性は、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら（２９）により記載されたオリジナル技術の筆者らの改造（１６）を用いて、Ｅｖａｎｓ  Ｂｌｕｅ−ｌａｂｅｌｅｄアルブミンのクリアランスレートにより特性決定した。０．５％ウシ血清アルブミンおよび２０ｍＭ（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）バッファを含有するＨａｎｋｓ’Ｂｌａｒａｎｓｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を含有するバッファ溶液を単層の両側で用いた。ｌｕｍｉｎａｌコンパートメントバッファは、容量７００μｌ中の０．０５７％エバンスブルー色素の最終濃度でラベルした。ｌｕｍｉｎａｌコンパートメントおよびａｂｌｕｍｉｎａｌコンパートメント中の遊離Ｅｖａｎｓ  Ｂｌｕｅの吸光度は、バッファ中のエバンスブルーの全吸光度の１％未満であった。各研究の最初に、ｌｕｍｉｎａｌコンパートメント試料を、そのコンパートメントの初期吸光度を決定するために、１：１００に希釈した。ａｂｌｕｍｉｎａｌコンパートメント試料（３００ｍｌ）を、５分毎に６０分間採取した。試料の吸光度は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓマイクロプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により６２０ｎｍで測定した。エバンスブルーでラベルしたアルブミンのクリアランスレートは、対照および実験群について、１０分〜６０分の間で最小自乗線形回帰により求めた。
【０２１８】
免疫蛍光および共焦点顕微鏡
細胞調製および抗体処置：ＲＬＭＶＥＣかＢＬＭＶＥＣ（１×１０４／０．２０ｍｌの培地）を、３５ｍｍ培養皿内の１８ｍｍカバースリップ上で培養し、３７℃で２時間インキュベートして付着させ、次に、付加的な２ｍｌの培地中で融合まで生育させた（１６）。ＰＭＥＭを、示されるように処置し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で洗い、３．７％ホルムアルデヒド溶液により間室温（ＲＴ）で２０分間固定し、次いで、ＤＰＢＳ中の１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００によりＲＴで５分間透過化処理した。細胞をＤＰＢＳで洗い、次に、１０％正常ヤギ血清（Ｎｇｓ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中で、ＲＴで５分間ブロックした。ＰＭＥＭを、１０％ＮＧＳ中で１：１０００希釈したマウスモノクロナール抗ニトロチロシン抗体（クローン１Ａ６，Ｕｐｓｔａｔｅ）でインキュベートした。二次抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８ラベルしたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を１０％ＮＧＳ中に１：１０００希釈で添加し、ＲＴで１時間インキュベートし、次に十分に洗った。全βアクチンをマウスモノクロナール抗βアクチン抗体（クローンＡＣ７４）で、続いて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８ラベルしたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）染色した。
【０２１９】
蛍光画像のための定量化手順は、以下の通りである。ＰＭＥＭは、Ｌｅｉｃａ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＴＣＳ  ＳＰ２（Ｌｅｉｃａ  ＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ）を用いて共焦点顕微鏡により視覚化および定量化される。１つの研究あたり４の処置群および２つの処置時間がある４つの別々な研究があった。すべてのフィールドを、インタクトな内皮単層内の別の領域への顕微鏡ステージの無作為移動により選んだ。処置群あたり６つの全フィールドを、フィールドあたり１つの画像によって分析した。全処置群を、最大蛍光を有するスライドによって決定されるように、ノイズ、輝度およびコントラストについて設定を最初に調整することによって蛍光強度について正規化した（１６）。
【０２２０】
抗ニトロチロシン抗体の特異性は、抗体−抗原競合によって確認した。１０：１のモル比のニトロチロシン抗体とニトロチロシン抗原とを、ＰＭＥＭへの適用前に、１０％ＮＧＳ中で３０分間、３７℃でプレインキュベートした。カバースリップを、清浄なガラススライド上にＰｅｒｍａｆｌｕｏｒ封入剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  ＰＡ）でマウントした。ＰＭＥＭを、位相、光、および蛍光検出のために装備されたＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）上に設置されたＳｐｏｔ  ＲＴカラーカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，ＳｔｅｒｌｉｎｇＨｅｉｇｈｔｓ，ＭＩ）で視覚化した。例示のためのイメージは、倍率１００倍、露出時間８秒でキャプチャし、イメージをＳｐｏｔ  ＲＴイメージングソフトウェア（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）にダウンロードした（１６）。
【０２２１】
統計学
一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて処置間の値を比較した。もし処置間に有意性が確認されれば、事後多重比較検定をＢｏｎｆｅｒｒｏｎｅ（パラメトリック−等分散）またはＤｕｎｃａｎ（ノンパラメトリック−不等分散）検定と共に実施して、群間の有意差を決定した（３７）。適切な時に、データを平滑化するため、ｌｏｇ１０変換を実行した。各ＰＭＥＭウェルおよびフラスコは、単一の実験を表す。全データを、平均±ＳＥＭとして報告する。優位性は、ｐ＜０．０５であった。全研究において、１群あたり試料は５〜１０である。
【０２２２】
結論
本発明者らは、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）が、ニトロ化β−アクチン（ＮＯ２−β−アクチン）に関連する肺微細血管内皮単層（ＰＭＥＭ）の透過性においてペルオキシ亜硝酸塩（ＯＮＯＯ−）依存性増大を引き起こすという仮説を検定した。ＰＭＥＭの透過性は、エバンスブルーでラベルしたアルブミンのクリアランスレートにより評価した。ＮＯ２−β−アクチンの細胞区画化は、β−アクチン−免疫蛍光を伴うニトロチロシン−免疫蛍光の共焦点局在を示すことにより表示した。ＴＮＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を用いたＰＭＥＭの０．５時間および４．０時間のインキュベーションは、アルブミンの透過性増大という結果になった。０．５時間の時点で、β−アクチン−免疫蛍光を伴うニトロチロシン−免疫蛍光の共焦点局在があった。ＴＮＦ誘発性のβ−アクチン−免疫蛍光を伴うニトロチロシン−免疫蛍光の共焦点局在および透過性の増大は、抗ＯＮＯＯ−薬剤の尿酸塩（５μＭ）およびＰＱＱ（１μＭ）により防止された。このデータは、ＮＯ２−β−アクチンの生成に関連するＯＮＯＯ−依存性の障壁不全をＴＮＦが引き起こすことを示す。
【０２２３】
本発明者らの研究は、ＰＱＱが、（ｉ）ＴＮＦ−誘発性のニトロチロシン増大、（ｉｉ）ニトロチロシンとβ−アクチンとの共存、および（ｉｉｉ）肺微細血管内皮単層の透過性増大を防止することをさらに示す。従って、ＰＱＱは、ＴＮＦ誘発性のＯＮＯＯ−依存性の内皮細胞不全を防止する。従って、ＰＱＱおよび尿酸塩を用いる戦略の開発により、血管損傷および血管損傷関連疾患の療法のための新たな方向が提供される。
【０２２４】
実施例１０：ＰＱＱによる神経保護
ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）は、遊離した水溶性の陰イオン化合物であり、これは、潜在的なフリーラジカルスカベンジャー特性を有する酸化還元サイクリング平面オルトキノンである。メチルアルコールおよびアルコールデヒドロゲナーゼのようなＰＱＱ依存性酵素は補欠分子団としてＰＱＱに結合し、また、電子を受け入れ、それらの電子を、ミトコンドリア呼吸鎖における電子キャリアとして機能するユビキノンに提供するチトクロムｃも含む。
【０２２５】
ＰＱＱは、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）誘発性の電気応答を抑制することが実証されており、インビトロでＮＭＤＡ媒介性神経毒損傷に対して神経保護性であＪｅｎｓｅｎら（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ６２（１９９４）３９９−４０６）は、低酸素３０分前に腹腔内投与したＰＱＱが、生後７日の仔ラットにおけるインビボの脳低酸素／虚血（低酸素と組み合わせた両側頚動脈結紮）モデルにおいて神経行動学的副作用を引き起こすことなく、梗塞サイズを低減することを示した。しかしながら、全身的に与えられたＰＱＱが、神経行動学的結果を改善し、成体動物における限局的脳虚血モデルに起因する梗塞脳を守ることができるか否かを決定するために実施された以前の研究は皆無である。従って、成体ラットにおける神経行動学的測定および梗塞サイズ測定に続き２時間の可逆的な中大脳動脈閉塞（ｒＭＣＡｏ）により評価されるような神経保護をもたらす際のＰＱＱの有効性を評価した。梗塞体積に対するＰＱＱについての用量応答曲線も特性決定した。
【０２２６】
材料および方法
動物モデル
すべての動物実験手順は、実験用動物の管理と使用に関する指針に従い、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（３００〜３５０ｇ、Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）を、５０ｍｇ／ｋｇ硫酸アトロピン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を筋肉内注射で与えた後に、密閉チャンバ内でイソフルランで麻酔した。次に、それらのラットに気管挿入し、３０％Ｏ２／残分Ｎ２中の２．０％イソフルランにより機械的に通気した。血液ガス分析により、ＰａＣＯ２が３０ｍｍ〜４５ｍｍＨｇ、ＰａＯ２が９０ｍｍＨｇ以上であることが立証された。体温は、直腸プローブでモニタリングし、加熱パッドを用いて３７．０℃〜３７．５℃の間に維持した。側頭筋温度を、脳温度を反映するために用い、加熱ランプを用いて３６．０℃〜３７．０℃の間に維持した。圧力モニタリングおよび血液ガスサンプリングのために、１つの大腿部動脈にカニューレ挿入した。
【０２２７】
可逆的な中大脳動脈閉塞を、本発明者らの研究室で以前用いたように、Ｌｏｎｇら（Ｓｔｒｏｋｅ２０（１９８９）８４−９１）により記載されるように、実行した。４−０ナイロン腔内縫合糸を、外頚動脈動脈（ＥＣＡ）を介して右内頚動脈（ＩＣＡ）に導入した。総頚動脈およびＩＣＡを一時的にクリップ止めし、縫合糸をＥＣＡ断端内に設置し、ＩＣＡに遠し、抵抗が感じられるまで〜２０ｍｍ穏やかに進めた。縫合糸を適切な位置に２時間残し、次に回収した。ＰＱＱ（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、リン酸緩衝生理食塩水に溶解し（１０ｍＭ溶液）、１ｍｌの容量を、虚血開始の直前または３時間後に、１０、３、または１ｍｇ／ｋｇの用量を送達するために頚静脈に注射した。ビヒクル処置した対照は、等容量のリン酸緩衝生理食塩水を受けた。動物がビヒクルで処置されたか、ＰＱＱ注射で処置されたかについて、研究者は知らされなかった。体温および脳温度は、動物が麻酔から完全に回復させられて、そのケージに戻されるまで、実験全体を通して維持した。７２時間後、動物を殺し、脳を調べた。
【０２２８】
神経行動学的欠損スコアリング
神経行動学的欠損スコアリングは、Ｇａｒｃｉａら（Ｓｔｒｏｋｅ２６（１９９５）６２７−６３４）により記載された１８ポイントスケールに基づいた。神経学的状態は、各ラットにおいて、虚血の２４時間後に開始して、３日間、毎日記録した。各被験体は、概日リズムのどのような効果も回避するため、午後遅く試験した。神経行動学的欠損を評価す研究者は、ビヒクルが投与されたのか、またはＰＱＱが投与されたのかについて知らされなかった。神経行動学的尺度は、以下の６つの試験から構成された：１）自発的活動（０〜３ポイント）；２）四肢の動きの対称性（０〜３ポイント）；３）前肢伸ばし（０〜３ポイント）；４）クライミング（１〜３ポイント）；５）身体自己受容性（１〜３ポイント）、および６）鼻毛接触応答（１〜３ポイント）。評価完了時に各ラットに与えられたスコアは、合計６つの個別試験の合計である。最小神経学的スコアは３であり、最大は１８である。
【０２２９】
梗塞体積の測定
梗塞体積は、本発明者らの研究室で以前用いた（Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  １１（２０００）２６７５−２６７９）ように、塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）染色を用いて評価した。虚血の７２時間後、ラットに１２０ｍｇのペントバルビタールを注射した。次に脳を取り出し、２ｍｍセクションに切った。スライスを、２％ＴＴＣを含有するペトリ皿中に３０分間置き、どのスライスも底部に留まらないように周期的に撹拌し、次いで、１０％ホルムアルデヒド中に入れた。未染色組織の測定面積（ｍｍ２）（ＳｉｇｍａＳｃａｎ  Ｐｒｏ，ＳＰＳＳソフトウェア）を合計したものに、２ｍｍスライス厚さを掛けて、損傷体積を算出した。
【０２３０】
統計解析
神経行動学的スコアの統計的評価は、繰り返し測定ＡＮＯＶＡ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ，ＳｔａｔＳｏｆｔ  Ｉｎｃ．）により行った。梗塞体積の評価のために、処置群と対応するビヒクル群との間で比較を行った。非正規分布の体積の評価のため、ノンパラメトリックＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いた。差は、Ｐ＜０．０５で統計的に有意であると見なされた。
【０２３１】
結果
１０ｍｇ／ｋｇのＰＱＱによる神経保護
ＰＱＱは最初、Ｊｅｎｓｅｎらによる以前の報告（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ６２（１９９４）３９９−４０６）に基づき１０ｍｇ／ｋｇの用量で研究した。梗塞体積は、ビヒクル処置した動物においては３１９ｍｍ３（ＳＤ：９６．２；ｎ＝７）であり、虚血開始直前に１０ｍｇ／ｋｇのＰＱＱを与えた動物では５０ｍｍ３（ＳＤ：３９；ｎ＝８）で有意に少なかった（ｐ＜０．０１；Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。梗塞体積は、ビヒクル処置した動物において３６２ｍｍ３（ＳＤ：１１０；ｎ＝５）であり、虚血開始３時間後にＰＱＱを与えた動物では６７ｍｍ３（ＳＤ：５３；ｎ＝８）で有意に少なかった（ｐ＜０．０５；Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。これらのデータを、図３１Ａおよび図３２に示す。行動スコアもまた、図３３Ａおよび図３３Ｂに示されるように、虚血開始直前および虚血開始３時間後にＰＱＱが与えられた場合、対応するビヒクル処置対照と比較してＰＱＱ処置群においてより良好であった。
【０２３２】
３ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇにおけるＰＱＱによる神経保護
虚血開始３時間後に与えた１０ｍｇ／ｋｇのＰＱＱが、虚血と同時のＰＱＱ投与と同程度に効果的と思われたので、虚血開始３時間後の異なる容量の効果を試験した。なぜならば、虚血開始後の３時間は、処置のための治療機会を提供するからである（Ｓｔｒｏｋｅ  ３０（１９９９）２７５２−２７５８）。虚血開始３時間後に３ｍｇ／ｋｇでＰＱＱを与えた場合、梗塞体積は、ビヒクル処置した動物においては４０６ｍｍ３（ＳＤ：１１４；ｎ＝１０）であり、ＰＱＱ処置した動物では１２０ｍｍ３（ＳＤ：４７；ｎ＝８）で有意に少なかった（ｐ＜０．０１；Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定；図２Ａ、図３）。この用量では、行動スコアもまた、ビヒクル群と比較してＰＱＱ群においてより良好であった（図３３Ｃ）。用量応答曲線が図３１Ｂに示してある。
【０２３３】
虚血３時間後に１ｍｇ／ｋｇでＰＱＱを与えた場合、梗塞体積は、ビヒクル処置した動物においては３１６ｍｍ３（ＳＤ：１３２；ｎ＝６）であり、ＰＱＱ処置した動物では３２８ｍｍ３（ＳＤ：１１２；ｎ＝６）であり、有意差は全く見られなかった（ｐ＞０．０５；Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定；図２Ａ）。行動スコアもまた、ビヒクル処置群と比較してＰＱＱ処置群において有意に異ならなかった（図３３Ｄ）。
【０２３４】
図３２は、正常な偽対照動物、ビヒクル処置動物、ＰＱＱ１０ｍｇ／ｋｇ処置動物およびＰＱＱ３ｍｇ／ｋｇ処置動物の４つの代表的スライドを示す。
【０２３５】
考察
本研究は、成体ラットにおける限局的可逆性中大脳虚血／再灌流の広く用いられるモデルにおける梗塞体積および神経行動学的結果の両方で評価したＰＱＱの神経保護を調べる最初の研究である。データは、ＰＱＱが虚血前または再灌流の１時間後に与えられた場合に行動面および梗塞体積面での神経保護をもたらす上で効果的であること、および、ＰＱＱによりもたらされる神経保護が容量関連であることを実証している。
【０２３６】
ＰＱＱのいくつかの特性は、神経保護に含まれ得るであろう。第１に、ＰＱＱはペルオキシ亜硝酸塩形成を抑制し得る。虚血性発作における酸化窒素の神経毒性は、ペルオキシ亜硝酸塩へのその変換に依存すると提案されてきた。フリーラジカルスカベンジャーおよびキノプロテイン酵素にとっての補因子として、ＰＱＱは、ペルオキシ亜硝酸塩形成を抑制し得る。第２に、ＰＱＱは、ＮＭＤＡ受容体酸化還元部位を酸化し得る。ＮＭＤＡ受容体の病的活性化は、虚血を含む様々なＣＮＳ疾患に関係してきた。第３に、ＰＱＱは、ミトコンドリア脂質およびタンパク質を保護する際の効果的な酸化防止剤として機能することができ、さらに、酸化損傷からミトコンドリア機能を保護することが明らかにされている。
【０２３７】
要約すると、本発明者らは、２時間のｒＭＣＡｏの開始３時間後に単一用量として与えられた場合に、ＰＱＱは、梗塞サイズを低減し、行動スコアを改善することを見出した。これらの条件の下で、ＰＱＱは、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇで有効であるが、１ｍｇ／ｋｇでは有効ではない。従って、様々な系において必須栄養素、酸化防止剤および酸化還元モジュレーターとして働くＰＱＱは、効果的な神経保護をもたらし、成人発作の治療における潜在的な使用を有する新しい種類の薬剤である。
【０２３８】
実施例１１：ラットにおけるＰＱＱの薬物動態学
プロベネシドがある場合およびプロベネシドがない場合のＰＱＱに対する反応を評価するため、ラット血漿中の経時的なＰＱＱ濃度測定に着手した。群Ａ（ラット１〜３）には、２０ｍｇＰＱＱ／ｋｇをｉ．ｖ．で投与した。群Ｂ（ラット４〜６）には、１００ｍｇプロベネシド／ｋｇをｉ．ｐ．で投与し、３０分後に２０ｍｇＰＱＱ／ｋｇをｉ．ｖ．で投与した。投与の０分後、５分後、および３０分後、ならびに投与の１時間後、２時間後、４時間後、および６時間後に、群Ａおよび群Ｂ両方のラットから血液を採取した。
【０２３９】
試料調製：
ラット血液：１００μｌラット血液＋６０μｌヘパリン処理生理食塩水を、遠心分離；６０μｌ血漿を試験管に定量的にピペットで取り、分析まで−８０℃で冷凍した。
【０２４０】
較正試料：ラット血漿を生理食塩水で希釈し（８０：６０，ｖ／ｖ）、これを用いて１組の較正曲線試料を、ＰＱＱ標準を３１．２５〜２５００ｎｇ／ｍｌラット血漿の範囲で加えることにより準備した。図３４参照。
【０２４１】
結果：
群Ａおよび群Ｂのラットの各々についてのラット血漿中ＰＱＱ濃度の結果は、以下の図３５および表４に示される。ラット血漿試料は、２段階抽出によって調製し、ＨＰＬＣ分析前に２〜１００倍に希釈した。
【０２４２】
【表４】
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図３６は、群Ａおよび群Ｂにおける各時点について平均値の血漿ＰＱＱ濃度−時間曲線の比較を例示している。
【０２４３】
実施例１２．インビボにおける酸化的ストレス防止／低減のためのＰＱＱおよびプロベネシドの使用
雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、虚血か虚血−再灌流の前に、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、プロベネシド、または両方で無作為に処理した。ＰＱＱ（１〜３ｍｇ／ｋｇ）および／またはプロベネシド（１００ｍｇ／ｋｇ）を、左前下行冠動脈（ＬＡＤ）閉塞の３０分前に腹腔内注射（前処置）により、または再灌流開始時に静脈注射（処置）により与えた。ラットを、左心室（ＬＶ）血行力学モニタリングしつつ、１５分間または３０分間のＬＡＤ閉塞および３０分間、１時間または２時間の再灌流に供した。プロベネシドと組み合わせたＰＱＱは、これらのラットモデルにおいて梗塞サイズを減少させた。プロベネシドと組み合わせたＰＱＱは、虚血誘発性の心臓機能不全を防止し、３０分〜２時間の再灌流後、より高いＬＶ収縮期圧、ＬＶ発生圧力、ＬＶ（＋）ｄＰ／ｄｔおよびより低いＬＶ（−）ｄＰ／ｄｔを有した。クレアチンキナーゼ（ＣＫ）産生は、プロベネシドと組み合わせたＰＱＱにより低減された。従って、プロベネシドと組み合わせたＰＱＱは、虚血および虚血−再灌流のラットモデルにおいて用量に関連して心筋梗塞サイズを低減し心機能を改善するのに非常に効果的である。
【０２４４】
統計分析
すべての結果を、平均±ＳＥＭとして示す。２つの処置群（前処置および処置）を、複数群比較のための回帰式を用いて一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して正常対照群と比較した。３つの群の間での閉塞および再灌流期間中の死亡率の差を、χ二乗検定により評価した。ＶＦを有するラットのパーセンテージを、フィッシャーの正確確率検定により評価した。全ての計算を、Ｍｉｎｉｔａｂバージョン７．２（Ｍｉｎｉｔａｂ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）またはＰｒｉｍｏｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ：Ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒａｍバージョン３．０３（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）の一般線形モデル手順を使用して行った。統計的有意性を、ｐ＜０．０５に設定した。
【０２４５】
虚血および虚血−再灌流モデル
ＰＱＱをビヒクル（２％  ＮａＨＣＯ３）に溶解した。腹膜内（ｉ．ｐ．）または静脈内（ｉ．ｖ．）のいずれかで与えられた体積は、１ｍｌであった。全ての対照を１ｍｌのビヒクルにより処置した。１〜３ｍｇ／ｋｇのＰＱＱを、１５分間か３０分間の虚血の３０分前にｉ．ｖ．で与え、続いて３０分間、１時間または２時間の再灌流を行った。
【０２４６】
６００ｍｇのプロベネシドを、２７ｍｌのｄｄＨ２Ｏに溶解した。４〜５滴の１９．１Ｎ  ＮａＯＨを添加し、ｐＨを、１．０Ｎ  ＫＨ２ＰＯ４で７．４に調節した。プロベネシドを、１５分間か３０分間の虚血の３０分前に与え、続いて３０分間、１時間または２時間の再灌流を行った。
【０２４７】
麻酔（ケタミン８０ｍｇ／ｋｇ、キシラジン４ｍｇ／ｋｇ体重、腹膜内）導入後、気管切開術を実施し、動物をＨａｒｖａｒｄ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒ（モデル６８３、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）において通気した。梗塞サイズ測定ラットを、再灌流のない２時間の近位左前下行（ＬＡＤ）冠動脈結紮に供した。虚血に再流動が続くこのモデルは、以前に記載された通りの虚血−再灌流（Ｓｉｅｖｅｒｓ  ＲＥら，Ｍａｇｎ  Ｒｅｓｏｎ  Ｍｅｄ  １９８９；１０：１７２−８１）を使用した。このモデルにおいて、可逆冠動脈係蹄オクルーダーを、正中線胸骨切開術により近位ＬＡＤ冠動脈周辺に配置した。次いで、ラットを１５分間または３０分間のＬＡＤ閉塞および３０分間、６０分間または１２０分の再流動に供した。加えて、これらのラットは、血行力学的測定値を記録された。４Ｆ  Ｍｉｌｌａｒカテーテルを、右頸動脈を通して左心室（ＬＶ）に挿入した。２０分間の平衡化後、心拍数（ＨＲ）、収縮期圧（ＬＶＳＰ）、拡張末期期圧（ＬＶＥＤＰ）、ＬＶ（＋）ｄＰ／ｄｔｍａｘ、ＬＶ（−）ｄＰ／ｄｔｍａｘを、ＭａｃＬａｂ／４Ｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用してモニタリングした。ＬＶ発生圧力（ＬＶＤＰ）を、ＬＶＥＤＰをＬＶＳＰから差し引くことにより算出した。
【０２４８】
ベースラインでは、対照群、前処置群および投与群の間で心拍数、ＬＶＳＰ、ＬＶＥＤＰ、ＬＶ（＋）ｄＰ／ｄｔ、およびＬＶ（−）ｄＰ／ｄｔに有意差は皆無であった。前処置によって与えられるかまたは処置として与えられるかにかかわらず、プロベネシドと組み合わせたＰＱＱは、虚血誘発性の心臓機能不全を防止し、図５〜９に示されるように、３０分間、１時間または２時間の再灌流後、より高いＬＶＳＰ、ＬＶＤＰ、ＬＶ（＋）ｄＰ／ｄｔ、およびより低いＬＶ（−）ｄＰ／ｄｔを有した。（＊＜０．０５対Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を用いたＡＮＯＶＡによる以前刊行されたＩ／Ｒ（対照）データ。Ｚｈｕｒａ．，Ｊｏｕｒａｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅａｐｅｕｔｉｃｓ；１１（２）：１１９−１２８（２００６））および図３７〜図４１。
【０２４９】
【表５】
2009535410.tif 000018
【０２５０】
【表６】
2009535410.tif 000019
【０２５１】
【表７】
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【０２５２】
【表８】
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【０２５３】
【表９】
2009535410.tif 000022
梗塞サイズ
虚血−再灌流ラットモデルを用い、ラットを、１７分間または３０分間の左前下降冠動脈結紮および２時間の再灌流に供し、梗塞サイズを、以前に記載された通りに測定した（Ｓｉｅｖｅｒｓ  ＲＥら，Ｍａｇｎ  Ｒｅｓｏｎ  Ｍｅｄ  １９８９；１０：１７２−８１、Ｚｈｕ  Ｂ−Ｑら，Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  １９９７；３０：１８７８−８５）。心臓を、２時間の虚血期間の終わりに切り出した。次いで、切片を、生存可能な心筋が赤レンガ色に着色されるまで塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）の１％溶液中で１０〜１５分間インキュベートした。
【０２５４】
モデル２において、２時間の再灌流後、ＬＡＤを再閉塞し、そして、フタロシアニン色素（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ，Ｌｏｕｉｓｅｖｉｌｌｅ，ＫＹ）をＬＶ腔に注射し、通常に灌流された心筋を青色に染色した。次いで、心臓を切り出し、過剰な色素をすすぎ洗いし、そして頂部から基部に向かって横断的にスライスして２ｍｍ厚の切片にした。切片を、上記の通りにＴＴＣ中でインキュベートした。梗塞を起こした心筋は、ＴＴＣで染色できない。次いで、組織切片を、１０％ホルマリン溶液中で固定し、計量した。各横断スライスの両面のカラーディジタル画像を、顕微鏡（Ｓｔｅｒｅｏ  Ｚｏｏｍ  ６  Ｐｈｏｔｏ，Ｌｅｉｃａ）に接続したビデオカメラ（Ｌｅｉｃａ  ＤＣ  ３００Ｆ）を使用して得た。青に染色された組織（非虚血性）、赤に染色された組織（虚血性であるが、非梗塞性）および染色されていない組織（梗塞性）を示す領域を、各色画像上で輪郭を描き、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  １．５９（国立衛生研究所，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を使用して盲検様式で測定した。それぞれの面で、梗塞関連組織を表すＬＶ面積の割合（２つの画像の平均）にその切片の重量を掛けることにより、梗塞関連組織の絶対重量を決定した。各心臓についての梗塞サイズを、以下のように表現した：
【０２５５】
【数３】
2009535410.tif 000023
次いで、危険領域のパーセンテージとしての梗塞サイズを、以下の通り計算した：
【０２５６】
【数４】
2009535410.tif 000024
虚血モデル（モデル１）では、ＰＱＱ後の梗塞サイズ（梗塞量／ＬＶ量、フタロシアニン青色色素は注射されていない）は、対照よりも小さかった（図１３）。モデル２における実験の第１セットにおいて、虚血は１７分間であり、その後、２時間の再灌流が行われ、梗塞サイズ（梗塞量／危険領域、梗塞量／ＬＶ量）は、２０ｍｇ／ｋｇのＰＱＱでの前処置によって減少した（図１４）。モデル２の実験の第２セットにおいて、虚血は３０分間であり、その後、２時間の再灌流が行われ、１５ｍｇ／ｋｇのＰＱＱでの前処置または処置のいずれかの後での梗塞サイズは、対照よりも小さかった（図１５）。
【０２５７】
図４２および図４３は、ＰＱＱとプロベネシドとの組み合わせが、危険領域の百分率および左心室量の百分率の両方としての梗塞サイズを減少させることを示す。図４４は、ＰＱＱとプロベネシドとの組み合わせが、クレアチンキナーゼの増加を減少させたことを示す。従って、ＰＱＱとクレアチンキナーゼとの組み合わせは、特に心臓の病理に関連するインビボにおける酸化性ストレスの防止および低減に効果的である。以下の表１０〜１５は、ＰＱＱ投与の毒性をより完全に例示する。
【０２５８】
【表１０】
2009535410.tif 000025
【０２５９】
【表１１】
2009535410.tif 000026
【０２６０】
【表１２−１】
2009535410.tif 000027
【０２６１】
【表１２−２】
2009535410.tif 000028
【０２６２】
【表１３−１】
2009535410.tif 000029
【０２６３】
【表１３−２】
2009535410.tif 000030
（表１４  病理学）
生理食塩水  対照
１−５  正常な組織学的構造
１００ｍｇプロベネシド
６−１０  正常な組織学的構造
１０ｍｇＰＱＱ／ｋｇ
１１−１５  正常な組織学的構造
２０ｍｇＰＱＱ／ｋｇ
１６−２０  細管が若干拡張
４０ｍｇＰＱＱ／ｋｇ
２１  非常に重篤な皮質細管上皮外傷
全面的な細管上皮壊死（近位および遠位細管上皮）
糸球体および集合管は存続
２２  ＃２１に同じ
２３  軽度の外傷、５％壊死細管
２４  ＃２１に同じ
２５  ＃２１に同じ
１００ｍｇプロベネシド／ｋｇ、１０ｍｇ  ＰＱＱ／ｋｇ
２６−３０  正常な組織学的構造
１００ｍｇプロベネシド／ｋｇ、１０ｍｇ  ＰＱＱ／ｋｇ
３１−３５  １６−２０と同様に、細管が若干拡張
１００ｍｇプロベネシド／ｋｇ、１０ｍｇ  ＰＱＱ／ｋｇ
３６−４０  本質的に＃２１に同じ
イヌを用いた予備的研究におけるプロベネシドと併用または併用しないＰＱＱ投与の毒性学研究を以下の表１５に示す。
【０２６４】
【表１５】
2009535410.tif 000031
イヌ１３５７：注入毒性無；２日目および３日目に重篤な外傷；用量がＭＴＤを十分上回ると思われたため３日目に屠殺；臨床所感は、もう１日も持たないであろうと思われた。
【０２６５】
イヌ１４７５：処置１時間後に嘔吐および悪心（注入毒性）；その後は完全に正常と思われた。
【０２６６】
虚血−再灌流についてラットにおけるプロベネシドを用いた処置の結果を以下に示す。第１の注射が、虚血の３０分後のプロベネシドおよびＰＱＱまたはＮＳであることに留意されたい。第２の注射は、再灌流の１時間のプロベネシドである。Ｐ値は、ＰＱＱ群対対照群の場合、２試料ｔ検定によるものである。
【０２６７】
【表１６−１】
2009535410.tif 000032
【０２６８】
【表１６−２】
2009535410.tif 000033
均等物
当業者は、本明細書に記載される特定の手順に対する多数の均等物を認識するか、または慣例的実験法に過ぎないものを使用してこれを確認することが可能である。このような均等物は、本発明の範囲内にあると考えられ、特許請求の範囲によりカバーされる。様々な置換、変更、および改変は、特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に対して行われ得る。他の態様、利点、および改変は、本発明の範囲内である。本出願全体にわたって引用される全ての参照文献、発行特許、および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２６９】
【図１】図１は、ＰＱＱでの前処置による、低酸素後に生存可能な成体マウス心筋細胞の増加を示す棒グラフである。
【図２】図２は、ＰＱＱ保護が１０μＭの５−ヒドロキシデカン酸（ミトコンドリアＫＡＴＰチャネルインヒビター）により阻害されないことを示す棒グラフである。
【図３】図３は、虚血前のＰＱＱ処置が左心室発生圧（ＬＶＤＰ）を保つことを示す折れ線グラフである。
【図４】図４は、虚血前のＰＱＱ処置が左心室拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ）（左心室収縮期圧−左心室拡張末期圧）を保つことを示す折れ線グラフである。
【図５】図５は、左心室圧（ＬＶＤＰ）の正の最大一次導関数によって測定した場合の、虚血前のＰＱＱ処置の効果を示す折れ線グラフである。
【図６】図６は、左心室圧（ＬＶＤＰ）の負の最大一次導関数によって測定した場合の、虚血前のＰＱＱ処置の効果を示す折れ線グラフである。
【図７】図７は、冠動脈血流が、ＰＱＱ処置によって、対照と比較して有意に改善されることを示す折れ線グラフである。
【図８】図８は、示されるいくつかの濃度でのＰＱＱを用いた２分間の前処置が、１０ｎＭと１μＭとの間で次第に好ましい応答を有するが、毒性が１０μＭで発生することを示す棒グラフである。
【図９】図９は、ＰＱＱ前処置後の心筋梗塞サイズの変化を示す棒グラフである。１０ｎＭと１μＭとの間では梗塞形成サイズが漸減するが、梗塞形成サイズは１０μＭ  ＰＱＱでは低減されない。
【図１０】図１０は、実験プロトコルのモデル１（２時間虚血）およびモデル２（虚血／再灌流）を示す概略図である。モデル２は、２つの別々の実験セット、セット１：（虚血１７分／再灌流２時間）およびセット２：（虚血３０分／再灌流２時間）を含んでいた。前処置ラットは、３０分間の虚血の前にｉ．ｐ．注射によってＰＱＱを受けた。処置群において、ＰＱＱは、再灌流開始時にｉ．ｖ．注射によって与えられた。対照ラットは、示される時間に、等体積のビヒクルを与えられた。矢印は、ＰＱＱ投与のタイミングを示す。ｉ．ｐ．＝腹腔内；ｉ．ｖ．＝静脈内；Ｉ＝虚血；ＬＡＤ＝左前下行冠動脈。
【図１１Ａ】図１１Ａは、虚血／再灌流時のモデル２ラットにおける左心室収縮期圧（ＬＶＳＰ）を示す折れ線グラフである。ＰＱＱでの前処置（３０分間の虚血の前のｉ．ｐ．注射によるＰＱＱ）かＰＱＱでの処置（再灌流開始時のｉ．ｖ．注射によるＰＱＱ）が、２時間の再灌流においてＬＶＳＰの増加をもたらした。Ｂ＝ベースライン；Ｉ＝虚血；Ｒ＝再灌流。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、虚血／再灌流中のモデル２ラットにおける左心室発生圧（ＬＶＤＰ）を示す折れ線グラフである。ＰＱＱでの処置は、３０分間の再灌流後および２時間の再灌流後の両方でＬＶＤＰを増加させた。ＰＱＱでの前処置は、２時間の再灌流においてＬＶＤＰを増加させた。Ｂ＝ベースライン；Ｉ＝虚血；Ｒ＝再灌流。
【図１２Ａ】図１２Ａは、虚血／再灌流時のモデル２ラットにおける左心室（ＬＶ）（＋）ｄＰ／ｄｔを示す折れ線グラフである。ＰＱＱでの前処置かＰＱＱでの処置が、２時間の再灌流においてＬＶ（＋）ｄＰ／ｄｔを有意に増加させた。Ｂ＝ベースライン；Ｉ＝虚血；Ｒ＝再灌流。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、虚血／再灌流時のモデル２ラットにおける左心室（ＬＶ）（−）ｄＰ／ｄｔを示す折れ線グラフである。ＰＱＱでの前処置かＰＱＱでの処置が、２時間の再灌流においてＬＶ（−）ｄＰ／ｄｔを有意に減少させた。Ｂ＝ベースライン；Ｉ＝虚血；Ｒ＝再灌流。
【図１３】図１３は、モデル１（虚血のみ）における心筋梗塞サイズを示す棒グラフである。２０ｍｇ／ｋｇのＰＱＱでの前処置は、梗塞サイズ（梗塞量／ＬＶ量％）を有意に減少させた。虚血は、再灌流のなしでの２時間のＬＡＤ結紮により誘発された。
【図１４】図１４は、モデル２（虚血／再灌流）における心筋梗塞サイズを示す棒グラフである。これらの実験において、虚血は、１７分間のＬＡＤ閉塞、続いての２時間の還流（再灌流）により誘発された。２０ｍｇ／ｋｇのＰＱＱでの前処置は、梗塞サイズを有意に減少させた（梗塞量／危険領域％または梗塞量／ＬＶ量％のいずれかで測定した場合）。
【図１５】図１５は、モデル２（虚血／再灌流）における付加的な実験の心筋梗塞サイズを示す棒グラフである。これらの実験において、３０分間の虚血後に、２時間の再灌流が続いた。１５ｍｇ／ｋｇのＰＱＱでの前処置が１５ｍｇ／ｋｇのＰＱＱでの処置が、梗塞サイズを有意に減少させた（梗塞量／危険領域％または梗塞量／ＬＶ量％のいずれかで測定した場合）。Ｐ値は、それぞれのＩ／Ｒ梗塞サイズ測定を指す。
【図１６】図１６は、ｉ．ｐ．注射によって、示された範囲のＰＱＱ用量で前処置された５群のラットの梗塞サイズに対する異なる用量のＰＱＱでの前処置の効果を示す折れ線グラフである。梗塞サイズとＰＱＱの用量との間には強い負の相関が存在した。
【図１７Ａ】図１７Ａは、モデル１およびモデル２双方からのデータを組み合わせた際の、ラット１匹あたりの心室性細動（ＶＦ）の平均エピソードを示す棒グラフである。１５〜２０ｍｇ／ｋｇのＰＱＱでの前処置は、ラット１匹あたりのＶＦの平均エピソードを有意に減少させた。分析は、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）により行った。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、モデル１およびモデル２からの久美合わせたデータを使用している、ＶＦを有するラットのパーセンテージを示す棒グラフである。１５〜２０ｍｇ／ｋｇのＰＱＱでの前処置または１５〜２０ｍｇ／ｋｇのＰＱＱでの処置は、ＶＦを有するラットのパーセンテージを有意に低下させた。分析をフィッシャーの正確確率検定によって行った。
【図１８Ａ】図１８Ａは、３０分間のＬＡＤ閉塞、続いて２時間の再灌流に供したＬＶの前部セグメントからの心筋のＭＤＡレベルを示す折れ線グラフである。１５ｍｇ／ｋｇのＰＱＱでの前処置は、虚血心筋におけるＭＤＡを有意に減少させた。Ｉ／Ｒおよび処置に供したラットとそうでないラット（対照）との差は、二元分散分析によって有意であった。偽＝全研究期間について閉塞のないＬＡＤ冠動脈単離に供したラット。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ＬＶの後部セグメント（非虚血性）からの心筋のＭＤＡレベルを示す折れ線グラフである。１５ｍｇ／ｋｇのＰＱＱでの前処置も、この非虚血性の離れた心筋におけるＭＤＡを減少させた。
【図１９】図１９は、以下の条件下でラット心臓から単離されたミトコンドリアの呼吸制御比を示す棒グラフである：（ｉ）対照：３時間のペントバルビタール麻酔、ｎ＝４、（ｉｉ）ＰＱＱ処置：３ｍｇ／ｋｇ、２０分間の平衡化期間、３０分間の虚血、ＰＱＱ注射、２時間の再灌流、ｎ＝５；および（ｉｉｉ）虚血／再灌流：２０分間の平衡化期間、３０分間の虚血、続いて２時間の再灌流、ｎ＝３。
【図２０Ａ】図２０Ａは、ＰＱＱ連結ＰＶＡの合成機構を示す概略図である。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、１つのＰＱＱ分子を有するＰＶＡ単位を示す概略図である。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、複数のＰＱＱ分子を有するＰＶＡ分子を示す概略図である。
【図２１】図２１は、蛍光検出器を用いたＰＱＱの保持時間を示す。
【図２２】図２２は、水中のＰＱＱの吸収スペクトルを示す。
【図２３】図２３は、ＰＱＱ連結ＰＶＡのＧＰＣスペクトルを示す。
【図２４】図２４は、蛍光検出器を用いたＰＱＱのＧＰＣスペクトルを示す。
【図２５Ａ】図２５Ａは、以下のＵＶ吸収スペクトルを示す：（Ａ）１０．１９分間の保持時間を有するＰＱＱ連結ＰＶＡ（４０Ｋ分子量）。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、以下のＵＶ吸収スペクトルを示す：（Ｂ）１３．６７分間の保持時間を有するＰＱＱ連結ＰＶＡ（１０Ｋ分子量）。
【図２５Ｃ】図２５Ｃは、以下のＵＶ吸収スペクトルを示す：（Ｃ）ＰＱＱ残分。
【図２６】図２６は、８．４５ｐｐｍおよび７．２５ｐｐｍにおける芳香族ピークならびに３．８４ｐｐｍ、１．９３ｐｐｍおよび１．５０ｐｐｍにおける脂肪族ピークの積分面積に基づき、ローディングレベルは、約１〜１．５（±０．４）（ＰＶＡ分子鎖あたりＰＱＱ単位）であった。ロードダンプレベルは、連結生成物において約４（±２）ｗｔ％ＰＱＱである。
【図２７】図２７は、対照マウス、ＰＱＱ単独で処置したマウス、プロベネシドと組み合わせたＰＱＱで処置したマウス、およびＰＶＡと組み合わせたＰＱＱで処置したマウスにおける腎臓の肉眼的病理学の写真。
【図２８】図２８は、抗ニトロチロシン免疫細胞学的特異性ならびにＴＮＦ誘導性ニトロチロシン増大に対する尿酸塩およびＰＱＱの効果を示す、モノクロナール抗ニトロチロシンで免疫染色されたＰＭＥＭのニトロチロシン蛍光の代表的な顕微鏡写真（ウシ細胞）である。３−ニトロチロシンを用いた１０：１の抗原：抗体比での３０分間の抗体の前保温後に、同じ抗体で免疫染色したＰＭＥＭの顕微鏡写真。０．５時間後ないし４時間後のラットおよびウシ双方の対照、尿酸塩、ＰＱＱおよびＴＮＦ処置ＰＭＥＭから得られたニトロチロシン蛍光の共焦点ヒストグラム分析（Ｎ＝４，処置ごとに６回のサンプリング）。統計学的な差は、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓの順位による一元配置分散分析を用い、続いてＤｕｎｎの方法を用いる多重比較により決定される。＊＝対照群と異なる＃＝それぞれのＴＮＦ群と異なる
【図２９Ａ】図２９Ａ〜Ｂ。尿酸塩およびＰＱＱは、ニトロチロシンおよびＰＭＥＭ中のβ−アクチンとのＴＮＦ誘発性共存を防止する。０．５時間後（Ａ）および４．０時間後（Ｂ）の対照、ＰＱＱ、尿酸塩およびＴＮＦ処置ＰＭＥＭの共焦点顕微鏡写真（ウシ細胞）を表す。ニトロチロシンは、抗ニトロチロシンで免疫染色されており緑色蛍光として現れｒｙ。β−アクチンは、抗β−アクチンで免疫染色されており赤色蛍光として現れる。組み合わされた赤色および緑色の顕微鏡写真の結果として生じる色変化は、共存が消磁ている場合には黄色として現れる（挿入図：矢印）。合計４つの調製物が、各処置および時点についてラットおよびウシＰＭＥＭ双方から生成された。
【図２９Ｂ】図２９Ａ〜Ｂ。尿酸塩およびＰＱＱは、ニトロチロシンおよびＰＭＥＭ中のβ−アクチンとのＴＮＦ誘発性共存を防止する。０．５時間後（Ａ）および４．０時間後（Ｂ）の対照、ＰＱＱ、尿酸塩およびＴＮＦ処置ＰＭＥＭの共焦点顕微鏡写真（ウシ細胞）を表す。ニトロチロシンは、抗ニトロチロシンで免疫染色されており緑色蛍光として現れｒｙ。β−アクチンは、抗β−アクチンで免疫染色されており赤色蛍光として現れる。組み合わされた赤色および緑色の顕微鏡写真の結果として生じる色変化は、共存が消磁ている場合には黄色として現れる（挿入図：矢印）。合計４つの調製物が、各処置および時点についてラットおよびウシＰＭＥＭ双方から生成された。
【図３０】図３０。尿酸塩およびＰＱＱは、ＴＮＦ誘導性のＰＭＥＭにおけるアルブミンクリアランス速度の増加を防止する。組み合わされたデータのアルブミンクリアランス応答は、ラットおよびウシＰＭＥＭから得られた。処置は、４．０時間にわたる対照、尿酸塩、ＰＱＱおよびＴＮＦである。統計学的な差は、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓの順位による一元配置分散分析を用い、続いてＤｕｎｎの方法を用いる多重比較により決定される。＊＝対照群と異なる＃＝ＴＮＦ群と異なる
【図３１Ａ】図３１。ＰＱＱ１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）を用いた処置の脳梗塞サイズに対する効果（３１Ａ）。虚血の直前（０時間、ビヒクルおよびＰＱＱ１０ｍｇ群）および３時間後（３時間、ビヒクルおよびＰＱＱ１０ｍｇ群）に投与されたＰＱＱは、梗塞体積を有意に減少させた（ｐ＜０．０５；Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。虚血の３時間後に投与された場合、１ｍｇ／ｋｇ（３時間、ビヒクルＰＱＱ１ｍｇ群）ではなく３ｍｇ／ｋｇ（３時間、ビヒクルＰＱＱ３ｍｇ群）でのＰＱＱが、梗塞体積を減少させた。３ｍｇ／ｋｇ群においては有意な処置効果がある（ｐ＜０．０５；Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）が、１ｍｇ／ｋｇ群においては有意な効果はない（ｐ＞０．０５；Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。
【図３１Ｂ】図３１。ＰＱＱ１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）を用いた処置の用量応答曲線（３１Ｂ）。虚血の直前（０時間、ビヒクルおよびＰＱＱ１０ｍｇ群）および３時間後（３時間、ビヒクルおよびＰＱＱ１０ｍｇ群）に投与されたＰＱＱは、梗塞体積を有意に減少させた（ｐ＜０．０５；Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。虚血の３時間後に投与された場合、１ｍｇ／ｋｇ（３時間、ビヒクルＰＱＱ１ｍｇ群）ではなく３ｍｇ／ｋｇ（３時間、ビヒクルＰＱＱ３ｍｇ群）でのＰＱＱが、梗塞体積を減少させた。３ｍｇ／ｋｇ群においては有意な処置効果がある（ｐ＜０．０５；Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）が、１ｍｇ／ｋｇ群においては有意な効果はない（ｐ＞０．０５；Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。
【図３２】図３２。正常な動物の切片標本（Ａ）；ビヒクル処置した動物の切片標本（Ｂ）；ＰＱＱ１０ｍｇ／ｋｇ処置（虚血後３時間）した動物の切片標本（Ｃ）；ＰＱＱ３ｍｇ／ｋｇ処置した動物の切片標本（Ｄ）を表す。
【図３３Ａ】図３３。ＰＱＱ１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）を用いた処置の神経行動学的スコアに対する効果。虚血の直前（３３Ａ）および３時間後（３３Ｂ）のＰＱＱ１０ｍｇ／ｋｇを用いた処置は、２４、４８および７２時間時点における神経行動学的スコアを改善するという結果になる。３２Ａ群および３２Ｂ群双方において有意な処置効果がある（ｐ＜０．０５；反復測定ＡＮＯＶＡ）。虚血の３時間後のＰＱＱ３ｍｇ／ｋｇによる処置は、２４、４８および７２時間時点における神経行動学的スコアを改善するという結果になる。３ｍｇ／ｋｇ群においては虚血の３時間後に与えられた場合に有意な処置効果がある（４Ｃ、ｐ＜０．０５；反復測定ＡＮＯＶＡ）が、１ｍｇ／ｋｇ群においては虚血の３時間後に与えられた場合に有意な処置効果はない（３３Ｄ、ｐ＞０．０５、反復測定ＡＮＯＶＡ）。
【図３３Ｂ】図３３。ＰＱＱ１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）を用いた処置の神経行動学的スコアに対する効果。虚血の直前（３３Ａ）および３時間後（３３Ｂ）のＰＱＱ１０ｍｇ／ｋｇを用いた処置は、２４、４８および７２時間時点における神経行動学的スコアを改善するという結果になる。３２Ａ群および３２Ｂ群双方において有意な処置効果がある（ｐ＜０．０５；反復測定ＡＮＯＶＡ）。虚血の３時間後のＰＱＱ３ｍｇ／ｋｇによる処置は、２４、４８および７２時間時点における神経行動学的スコアを改善するという結果になる。３ｍｇ／ｋｇ群においては虚血の３時間後に与えられた場合に有意な処置効果がある（４Ｃ、ｐ＜０．０５；反復測定ＡＮＯＶＡ）が、１ｍｇ／ｋｇ群においては虚血の３時間後に与えられた場合に有意な処置効果はない（３３Ｄ、ｐ＞０．０５、反復測定ＡＮＯＶＡ）。
【図３３Ｃ】図３３。ＰＱＱ１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）を用いた処置の神経行動学的スコアに対する効果。虚血の直前（３３Ａ）および３時間後（３３Ｂ）のＰＱＱ１０ｍｇ／ｋｇを用いた処置は、２４、４８および７２時間時点における神経行動学的スコアを改善するという結果になる。３２Ａ群および３２Ｂ群双方において有意な処置効果がある（ｐ＜０．０５；反復測定ＡＮＯＶＡ）。虚血の３時間後のＰＱＱ３ｍｇ／ｋｇによる処置は、２４、４８および７２時間時点における神経行動学的スコアを改善するという結果になる。３ｍｇ／ｋｇ群においては虚血の３時間後に与えられた場合に有意な処置効果がある（４Ｃ、ｐ＜０．０５；反復測定ＡＮＯＶＡ）が、１ｍｇ／ｋｇ群においては虚血の３時間後に与えられた場合に有意な処置効果はない（３３Ｄ、ｐ＞０．０５、反復測定ＡＮＯＶＡ）。
【図３３Ｄ】図３３。ＰＱＱ１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）を用いた処置の神経行動学的スコアに対する効果。虚血の直前（３３Ａ）および３時間後（３３Ｂ）のＰＱＱ１０ｍｇ／ｋｇを用いた処置は、２４、４８および７２時間時点における神経行動学的スコアを改善するという結果になる。３２Ａ群および３２Ｂ群双方において有意な処置効果がある（ｐ＜０．０５；反復測定ＡＮＯＶＡ）。虚血の３時間後のＰＱＱ３ｍｇ／ｋｇによる処置は、２４、４８および７２時間時点における神経行動学的スコアを改善するという結果になる。３ｍｇ／ｋｇ群においては虚血の３時間後に与えられた場合に有意な処置効果がある（４Ｃ、ｐ＜０．０５；反復測定ＡＮＯＶＡ）が、１ｍｇ／ｋｇ群においては虚血の３時間後に与えられた場合に有意な処置効果はない（３３Ｄ、ｐ＞０．０５、反復測定ＡＮＯＶＡ）。
【図３４】図３４は、２ステップ抽出で処理され、ＨＰＬＣ蛍光検出器（３６０／４６０ｎｍ）で求めたラット血漿におけるＰＱＱ（３１．２５〜２５００ｎｇ／ｍｌ）の較正曲線を示す。
【図３５】図３５は、Ａ群（ＰＱＱ単独）およびＢ群（ＰＱＱ＋プロベネシド）のラットについてのラット血漿ＰＱＱ濃度を示す。
【図３６】図３６は、Ａ群（２０ｍｇＰＱＱ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）およびＢ群（１００ｍｇプロベネシド／ｋｇ、ｉ．ｐ．で前処置し、続いて２０ｍｇＰＱＱ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）のラット（ｎ＝３）における血漿ＱＱ濃度−時間曲線を示す。
【図３７】図３７は、１００ｍｇ／ｋｇのプロベネシドと２または３ｍｇ／ｋｇのＰＱＱとの併用による処置をしたまたはしない、ベースライン、１５分間の閉塞、３０分間の閉塞、３０分間の再灌流、６０分間の再灌流および１２０分間の再灌流におけるラットの左心室収縮期圧（ＬＶＳＰ）を示すグラフである。
【図３８】図３８は、１００ｍｇ／ｋｇのプロベネシドと２または３ｍｇ／ｋｇのＰＱＱとの併用による処置をしたまたはしない、ベースライン、１５分間の閉塞、３０分間の閉塞、３０分間の再灌流、６０分間の再灌流および１２０分間の再灌流におけるラットの左心室拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ）をすグラフである。
【図３９】図３９は、１００ｍｇ／ｋｇのプロベネシドと２または３ｍｇ／ｋｇのＰＱＱとの併用による処置をしたまたはしない、ベースライン、１５分間の閉塞、３０分間の閉塞、３０分間の再灌流、６０分間の再灌流および１２０分間の再灌流におけるラットの左心室発生圧力（ＬＶＤＰ）を示すグラフである。
【図４０】図４０は、１００ｍｇ／ｋｇのプロベネシドと２または３ｍｇ／ｋｇのＰＱＱとの併用による処置をしたまたはしない、ベースライン、１５分間の閉塞、３０分間の閉塞、３０分間の再灌流、６０分間の再灌流および１２０分間の再灌流におけるラットの左心室の正の最大一次導関数（ＬＶ＋ｄｐ／ｄｔ）を示すグラフである。
【図４１】図４１は、１００ｍｇ／ｋｇのプロベネシドと２または３ｍｇ／ｋｇのＰＱＱとの併用による処置をしたまたはしない、ベースライン、１５分間の閉塞、３０分間の閉塞、３０分間の再灌流、６０分間の再灌流および１２０分間の再灌流におけるラットの左心室の負の最大一次導関数（ＬＶ−ｄｐ／ｄｔ）を示すグラフである。
【図４２】図４２は、１００ｍｇ／ｋｇのプロベネシドと２または３ｍｇ／ｋｇのＰＱＱとの併用による処置をしたまたはしないラットにおける梗塞サイズ百分率を示す棒グラフである。
【図４３】図４３は、１００ｍｇ／ｋｇのプロベネシドと２または３ｍｇ／ｋｇのＰＱＱとの併用による処置をしたまたはしないラットにおける、梗塞サイズ／危険領域百分率および梗塞サイズ／左心室量を示す棒グラフである。
【図４４】図４４は、１００ｍｇ／ｋｇのプロベネシドと２または３ｍｇ／ｋｇのＰＱＱとの併用による処置をしたまたはしないラットにおける、クレアチンキナーゼの増加を示す棒グラフである。
【図４５】図４５は、２．５０ｐｐｍでラベルされた溶媒としてｄ６−ＤＭＳＯを用いた、受け取られたＰＱＱおよびＰＱＱ／ＰＶＡ連結物のプロトンＮＭＲスペクトルである。
【図４６】図４６は、ＰＱＱ／ＰＶＡ連結物のプロトンＨ−ＮＭＲスペクトルである（４．７９ｐｐｍで内部基準としてラベルされた溶媒としてＤ２Ｏを用いる）。
【図４７】図４７は、ＰＶＡ粉末のＡＴＲモードＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図４８】図４８は、ＰＶＡ粉末のＡＴＲモードＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図４９】図４９は、ＰＶＡ／ＰＱＱ連結物粉末のＡＴＲモードＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図５０Ａ】図５０は、２つのＰＶＡ粉末のＸＲＤスペクトルである。（Ａ）ＰＱＱ／ＰＶＡ連結物。（Ｂ）ＰＶＡ粉末。（Ｄ）ＰＱＱ粉末。（Ｄ）スチール基板。
【図５０Ｂ】図５０は、２つのＰＶＡ粉末のＸＲＤスペクトルである。（Ａ）ＰＱＱ／ＰＶＡ連結物。（Ｂ）ＰＶＡ粉末。（Ｄ）ＰＱＱ粉末。（Ｄ）スチール基板。
【図５０Ｃ】図５０は、２つのＰＶＡ粉末のＸＲＤスペクトルである。（Ａ）ＰＱＱ／ＰＶＡ連結物。（Ｂ）ＰＶＡ粉末。（Ｄ）ＰＱＱ粉末。（Ｄ）スチール基板。
【図５０Ｄ】図５０は、２つのＰＶＡ粉末のＸＲＤスペクトルである。（Ａ）ＰＱＱ／ＰＶＡ連結物。（Ｂ）ＰＶＡ粉末。（Ｄ）ＰＱＱ粉末。（Ｄ）スチール基板。
【図５１】図５１は、ＨＰＬＣ−ＦＬＤを用いたＰＱＱ（１０〜１，０００ｎｇ／ｍｌ）アッセイの標準較正曲線である。
【図５２】図５２は、ＰＱＱアッセイについてのＨＰＬＣ−ＦＬＤ法の量的限界（０．２ｎｇ／２０μｌ）である。
【図５３】図５３は、ＰＱＱアッセイについてのＨＰＬＣ−ＦＬＤ法の検出限界（０．１ｎｇ／２０μｌ）である。
【図５４Ａ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｂ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｃ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｄ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｅ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｆ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｇ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｈ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｉ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｊ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｋ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｌ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｍ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｎ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｏ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｐ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｑ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｒ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｓ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｔ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｕ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｖ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｗ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｘ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｙ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４Ｚ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４ＡＡ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４ＢＢ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４ＣＣ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４ＤＤ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４ＥＥ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４ＦＦ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４ＧＧ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４ＨＨ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４ＩＩ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図５４ＪＪ】図５４Ａ〜ＪＪは、小分子量（ＳＭＷ）ＰＱＱ連結物を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３４】
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【図３５】
2009535410.tif 000084
【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５０Ｃ】
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【図５０Ｄ】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４Ａ】
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【図５４Ｂ】
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【図５４Ｃ】
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【図５４Ｄ】
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【図５４Ｅ】
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【図５４Ｆ】
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【図５４Ｇ】
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【図５４Ｈ】
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【図５４Ｉ】
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【図５４Ｊ】
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【図５４Ｋ】
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【図５４Ｌ】
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【図５４Ｍ】
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【図５４Ｎ】
2009535410.tif 000119
【図５４Ｏ】
2009535410.tif 000120
【図５４Ｐ】
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【図５４Ｑ】
2009535410.tif 000122
【図５４Ｒ】
2009535410.tif 000123
【図５４Ｓ】
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【図５４Ｔ】
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【図５４Ｕ】
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【図５４Ｖ】
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【図５４Ｗ】
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【図５４Ｘ】
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【図５４Ｙ】
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【図５４Ｚ】
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【図５４ＡＡ】
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【図５４ＢＢ】
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【図５４ＣＣ】
2009535410.tif 000134
【図５４ＤＤ】
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【図５４ＥＥ】
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【図５４ＦＦ】
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【図５４ＧＧ】
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【図５４ＨＨ】
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【図５４ＩＩ】
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【図５４ＪＪ】
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【国際調査報告】
2009535410.tif 000142
2009535410.tif 000143
2009535410.tif 000144
2009535410.tif 000145