(57)【要約】ワクチン組成物における脂肪アジュバントの含有は、ある抗原性成分、特に界面活性剤成分を含む抗原と障害を生じ得る。抗原および脂肪アジュバントを含む免疫原性組成物を調製するための方法は、界面活性剤の不存在下で実質的な抗原の精製を包含する。界面活性剤を避けることができない場合、以下：（ｉ）界面活性剤を含む抗原成分、および（ｉｉ）脂肪アジュバント成分を組合わせられ、この脂肪アジュバントと界面活性剤の重量比が１０００：１より小さい組成物を与える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原性組成物を調製するためのプロセスであって、（ｉ）界面活性剤を含む抗原成分と（ｉｉ）脂肪アジュバント成分とを組み合わせる工程を包含し、該脂肪アジュバントと該界面活性剤の重量比が１０００：１より小さい組成物を与える、プロセス。
【請求項２】
免疫原性組成物であって、ここで（ａ）該組成物が、抗原成分および脂肪アジュバント成分を含み；（ｂ）該抗原成分が界面活性剤を含み；そして（ｃ）該脂肪アジュバントと該界面活性剤の重量比が１０００：１より小さい、免疫原性組成物。
【請求項３】
前記脂肪アジュバントが代謝可能な油を含む、請求項１または２に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項４】
前記脂肪アジュバントがスクアレンおよびポリソルベート８０のサブミクロン水中油型乳剤を含む、請求項３に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項５】
前記脂肪アジュバントが脂肪酸部分を含む分子を含む、請求項１または２に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項６】
前記脂肪アジュバントが３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（「３Ｄ−ＭＰＬ」）である、請求項５に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項７】
前記３Ｄ−ＭＰＬがアシル化により変化する分子の混合物である、請求項６に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項８】
前記脂肪アジュバントが
【化１】
2009503051.tif 000028
を含む、請求項６または７に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項９】
前記３Ｄ−ＭＰＬが粒子の形態である、請求項６〜８のいずれか１つに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１０】
前記粒子が濾過滅菌され得る、請求項９に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１１】
前記３Ｄ−ＭＰＬがアルミニウム塩との組み合わせである、請求項６〜１０のいずれか１項に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１２】
前記アルミニウム塩がリン酸アルミニウムである、請求項１１に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１３】
前記３Ｄ−ＭＰＬがアルミニウム塩に吸着される請求項１２に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１４】
前記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンエステルである、請求項１〜１３のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１５】
前記エステルがポリソルベート２０である、請求項１４に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１６】
前記界面活性剤の濃度が５０μｇ／ｍＬ以下である、請求項１４または１５に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１７】
前記抗原がウイルス表面抗原である、請求項１〜１６のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１８】
前記抗原が粒子状のＢ型肝炎表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）であり、界面活性剤の存在下で精製される、請求項１７に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項１９】
前記ＨＢｓＡｇが酵母細胞で発現される、請求項１８に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２０】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１９に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２１】
前記ＨＢｓＡｇが非グリコシル化され、そして／またはホスファチジルイノシトールを含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２２】
前記ＨＢｓＡｇがＢ型肝炎ウイルスのサブタイプａｄｗ２由来である、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２３】
前記抗原が、ウイルス表面抗原および異種抗原を含むハイブリッドタンパク質である、請求項１〜２２のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２４】
前記ウイルス表面抗原がＨＢｓＡｇであり、前記異種抗原がマラリア抗原である、請求項２３に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２５】
前記ハイブリッドタンパク質がＨＢｓＡｇおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのスポロゾイド周囲タンパク質のフラグメントを含む、請求項２４に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２６】
前記ハイブリッドタンパク質がＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイド周囲タンパク質のＣ末端部分、スポロゾイド周囲タンパク質の免疫優性領域の４つ以上の縦列反復およびＨＢｓＡｇを含む、請求項２５に記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２７】
前記脂肪アジュバントと前記界面活性剤の重量比が５００：１より小さい、請求項１〜２６のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２８】
前記脂肪アジュバントと前記界面活性剤の重量比が５０：１より小さい、請求項１〜２７のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項２９】
前記脂肪アジュバントが３Ｄ−ＭＰＬであり、該脂肪アジュバントと前記界面活性剤の重量比が２．５：１と２５：１の間である、請求項１〜２８のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項３０】
前記組成物が２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間の重量オスモル濃度を有する、請求項１〜２９のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項３１】
前記組成物がリン酸緩衝液を含む、請求項１〜３０のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項３２】
前記組成物が６．０と７．０の間のｐＨを有する、請求項１〜３１のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
【請求項３３】
患者に投与するための医薬の製造における（ｉ）界面活性剤を含む抗原成分および（ｉｉ）脂肪アジュバントの使用であって、（ｉｉ）のアジュバントと（ｉ）の界面活性剤の重量比が１０００：１より小さい、使用。
【請求項３４】
免疫原性組成物を調製するためのプロセスであって、（ｉ）ポリソルベート２０を含むＨＢｓＡｇ成分と（ｉｉ）リン酸アルミニウム塩に吸着される３Ｄ−ＭＰＬを含むアジュバント成分とを組み合わせる工程を包含し、３Ｄ−ＭＰＬとポリソルベート２０の重量比が１０００：１より小さい組成物を与える、プロセス。
【請求項３５】
免疫原性組成物であって、（ａ）該組成物がＨＢｓＡｇ、ポリソルベート２０、３Ｄ−ＭＰＬおよびリン酸アルミニウムアジュバントを含み；そして（ｂ）３Ｄ−ＭＰＬとポリソルベート２０の比が１０００：１より小さい、免疫原性組成物。
【請求項３６】
免疫原性組成物を調製するためのプロセスであって、（ａ）該組成物が抗原および脂肪アジュバントを含み；（ｂ）該抗原が界面活性剤の不在下で実質的に精製される、プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
明細書中に引用されるすべての文書は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、アジュバントワクチンを製造する分野にある。特に界面活性剤含有抗原に基づいたワクチンの製造の間に脂肪アジュバントを使用することに関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
ワクチン抗原に対する免疫応答を増強するためのアジュバントの使用は周知である（例えば、参考文献１および２（非特許文献１および非特許文献２）を参照のこと）。長年ヒト使用に関して認可されたアジュバントはアルミニウム塩のみであったが、ＭＦ５９アジュバントおよびＲＣ−５２９アジュバントを含むワクチンが、イタリア（ＣｈｉｒｏｎのＦＬＵＡＤＴＭ製品）およびアルゼンチン（Ｂｅｒｎａ  ＢｉｏｔｅｃｈのＳＵＰＥＲＶＡＸＴＭ製品）を含む種々の国々で認可されている。さらに後期のヒトの実験的使用におけるアジュバントとして、コレステロールおよびサポニンの混合物、ＩＳＣＯＭ、ＭＰＬＴＭ、ＡＳ０４、ビロソーム、ＳＢＡ４などが挙げられる。
【０００４】
アルミニウム塩のいくつかの代替物の一般的特徴は、脂肪成分の存在である。例えば、ＭＦ５９アジュバントは、スクアレン（１種の油）を含み、ＭＰＬＴＭは、ジグルコサミンバックボーンに結合された複数の脂肪酸鎖を有するモノホスホリルリピドＡの脱アシル化形態を含む。
【０００５】
本発明は、これら脂肪アジュバントと界面活性剤成分を含む抗原との間で生じ得る干渉の回避に関する。
【非特許文献１】Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅシリーズの第４２巻、ＩＳＢＮ：１−５９２５９−０８３−７、Ｏ’Ｈａｇａｎ編
【非特許文献２】Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｂａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ＆Ｎｅｗｍａｎ）、１９９５年、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ：０−３０６−４４８６７−Ｘ）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（本発明の要旨）
本発明者は、ワクチン組成物中の脂肪アジュバントが界面活性剤成分を含む抗原と不適合であり得ることを見出した。しかしながら多くの場合において、脂肪アジュバントと抗原／界面活性剤混合物とを組み合わせることが依然として所望され、そのようにすることで生じ得る障害を回避する方法を提供することが本発明の目的である。さらに不適合性が回避されるアジュバントと抗原を組み合わせるためのプロセスを提供することが目的である。
【０００７】
代表的に界面活性剤を使用することにより精製される抗原を使用する場合、これら不適合性の問題を回避するために、本発明の第１の局面は、免疫原性組成物を調製するためのプロセスを提供し、ここで（ａ）この組成物は、抗原および脂肪アジュバントを含む；そして（ｂ）この抗原は、界面活性剤の実質的な不在下で精製される。界面活性剤の使用を回避する代替経路によって抗原を精製することにより、脂肪アジュバントとのあらゆる不適合性を克服し得る。
【０００８】
しかしながら、臨床的、歴史的または規制的理由のため、界面活性剤の使用なしに抗原を精製することもワクチンから界面活性剤を完全に取り除くことも不可能であり得る。この場合において、本発明は組成物中の油と界面活性剤の比を減少させることにより干渉を回避する。代表的なＭＦ５９／ＨＢｓＡｇワクチンは、４０００：１（重量で）を超える油：界面活性剤比を有する、界面活性剤に比べ非常に過剰量の油を含む。本発明は、組成物中の脂肪アジュバントの量を最小限にすることを目的とし、第２の局面において本発明は、最大でも１０００倍重量過剰な油を使用する。従って、本発明は、（ｉ）界面活性剤を含む抗原成分と（ｉｉ）脂肪アジュバント成分とを組み合わせる工程を包含する免疫原性組成物を調製するためのプロセスを提供し、この脂肪アジュバントと界面活性剤の重量比が１０００：１より小さい組成物を与える。同様に、本発明は、免疫原性組成物を提供し、ここで（ａ）この組成物は抗原成分および脂肪アジュバント成分含み；（ｂ）この抗原成分は界面活性剤を含み；そして（ｃ）この脂肪アジュバントと界面活性剤の重量比が１０００：１より小さい。
【０００９】
（脂肪アジュバント）
本発明の第１および第２の両方の局面は、脂肪アジュバント、すなわち脂肪分子を含むアジュバント成分を利用する。代表的な脂肪アジュバントは、代謝可能な油、脂肪酸および／または脂肪酸部分を含む分子を含む。
【００１０】
２つの好ましい脂肪アジュバントは、「ＭＦ５９」および「ＭＰＬ」として公知のアジュバントである。「ＭＦ５９」は、脂肪アジュバントである。なぜなら、代謝可能な油であるスクアレンを含むからである。「ＭＰＬ」は脂肪アジュバントである。なぜなら、複数の脂肪酸鎖で置換された二糖類を含むからである。ＭＦ５９に加え、他の水中油型乳剤アジュバントもまた使用され得る。
【００１１】
従って、本発明の好ましい脂肪アジュバントとして、（ａ）水中油型乳剤（例えば、スクアレンおよびポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（および必要に応じて、ソルビタントリオレアート）を含むサブミクロンの水中油型乳剤）；および／または（ｂ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが挙げられる。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートはまた、ポリソルベート８０としても公知である。
【００１２】
「ＭＦ５９」および「ＭＰＬ」に加え、本発明とともに使用され得る他の脂肪アジュバントとして：グルコサミニドホスフェート誘導体：Ｎ−アシル−プソイドジペプチド；「ＯＭ−１７４」として公知のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉリピドＡ由来の可溶性アジュバント；ホスフェート含有非環式バックボーンに結合された脂質を含む化合物；および非環式合成リピドＡアナログが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１３】
ＭＦ５９のような水中油型乳剤アジュバントが使用される場合、この乳剤が容積で総組成物の５０％であるように、代表的に等容積の水性抗原組成物に添加される。３Ｄ−ＭＰＬアジュバントが使用される場合、代表的な用量は、２５μｇ／ｍｌと２００μｇ／ｍｌの間（例えば、５０〜１５０μｇ／ｍｌ、７５〜１２５μｇ／ｍｌ、９０〜１１０μｇ／ｍｌの範囲）または約１００μｇ／ｍｌである。通常、用量あたり２５〜７５μｇの間の３Ｄ−ＭＰＬ（例えば、４５〜５５μｇの間）または用量あたり約５０μｇの３Ｄ−ＭＰＬが投与される。ＭＦ５９のような乳剤アジュバントは、代表的には、抗原と別個の容器に提供され、使用時に即座に混合されるか、またはすでに抗原と混合され提供され得る。３Ｄ−ＭＰＬアジュバントは、代表的に末端の使用者への配布前に抗原とすでに混合されている。
【００１４】
（ＭＦ５９）
「ＭＦ５９」アジュバントは、スクアレン、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）およびＳｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレアート）から形成された水中油型乳剤である。この乳剤は、微細流動化され、サブミクロンの小滴サイズを有する乳剤を与える。ＭＦ５９の調製は、もともと参考文献３に記載され、この生成物は、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造され販売されている。さらなる詳細は、参考文献２の第１０章、参考文献１の第１２章および参考文献４〜６において見出され得る。ＭＦ５９の組成は、容積で、５％スクアレン、０．５％ポリソルベート８０および０．５％Ｓｐａｎ  ８５である。重量に換算して、これらの割合は、４．３％スクアレン、０．５％ポリソルベート８０および０．４８％Ｓｐａｎ  ８５である。本発明の第２の局面において油：界面活性剤の比を計算する場合、その比は抗原の界面活性剤含有量に基づくため、ＭＦ５９固体の界面活性剤含有量は考慮されない。
【００１５】
ＭＦ５９乳剤は、有利なことにクエン酸塩イオン（例えば、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液）を含む。
【００１６】
（他の水中油型乳剤）
ＭＦ５９アジュバントの代替物として、他の水中油型乳剤が使用され得る。アジュバント乳剤は、代表的に少なくとも１種の油および少なくとも１種の界面活性剤を含み、この油および界面活性剤は生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。この乳剤中の油小滴は、一般的に直径が５μｍより小さく、代表的にはサブミクロンの直径を有する。小さい小滴サイズは、微細流動化装置を用いて達成され得、安定な乳剤を提供する。２２０ｎｍより小さいサイズを有する小滴が、それらを濾過滅菌に供することができるので、好ましい。
【００１７】
上記乳剤は、鉱油よりも動物（例えば、魚）または植物供給源からのような油を含み得る。植物油の供給源として、ナッツ類、種子類および穀物類が挙げられる。ピーナッツ油、ダイズ油、ココナッツ油およびオリーブ油が最も一般的に入手可能な代表的なナッツ油である。例えば、ホホバ豆から得られるホホバ油が使用され得る。種子油として、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油などが挙げられる。穀物群において、トウモロコシ油が最も容易に入手可能であるが、小麦、燕麦、ライ麦、イネ、テフ、トリチカレなどの他のシリアル穀物類の油もまた使用され得る。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素の脂肪酸エステルは、種子油内には天然に存在しないが、ナッツ油および種子油から出発した適切な物質の加水分解、分離およびエステル化により調製され得る。哺乳動物のミルク由来の脂肪および油は代謝可能であり、従って、本発明の実施において使用され得る。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、けん化および他の方法に関する手順は、当該分野において周知である。ほとんどの魚は、容易に回収され得る代謝可能な油を含む。例えば、タラの肝油、サメの肝油、および鯨ろうのようなクジラ油が代表的な種々の魚油であり、本明細書中において使用され得る。いくつかの分枝鎖油は、５炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、一般的にテルペノイドといわれる。サメの肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサンとして公知の分枝、不飽和テルペノイドを含み、本明細書において特に好ましい。スクアレンの飽和アナログであるスクアランもまた好ましい油である。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、市販の供給源から容易に入手可能であるか、または当該分野において公知の方法により得られ得る。他の好ましい油は、トコフェロール（以下参照）である。油の混合物が使用され得る。
【００１８】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）により分類され得る。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、そしてより好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎといわれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（例えば、ＤＯＷＦＡＸＴＭ商標名で販売される直線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー）；エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の繰返し数が変動し得るオクトキシノール、特にオクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）に関心がある；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）のようなリン脂質；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）（例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０））；およびソルビタンエステル（一般的にＳＰＡＮとして公知）（例えば、ソルビタントリオレアート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレート）を含む界面活性剤を用いて使用され得るが、これらに限定されない。乳剤中に含む好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレアート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。界面活性剤の混合物は、例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物またはＴｗｅｅｎ  ８０／Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００混合物が使用され得る。
【００１９】
本発明に有用な水中油型乳剤アジュバントとして、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。
−スクアレン、トコフェロールおよびＴｗｅｅｎ  ８０の乳剤。この乳剤は、リン酸緩衝生理食塩水を含み得る。またＳｐａｎ  ８５（例えば、１％で）および／またはレシチンも含み得る。これらの乳剤は、２〜１０％スクアレン、２〜１０％トコフェロールおよび０．３〜３％Ｔｗｅｅｎ  ８０を有し得、より安定な乳剤を提供する場合、スクアレン：トコフェロールの重量比は、１以下が好ましい。そのような乳剤の１つは、２％溶液を与えるためにＰＢＳ中にＴｗｅｅｎ  ８０を溶解し、次いでこの溶液９０ｍｌを（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍＬのスクアレンの）混合物とともに混合し、次いでこの混合物を微細流動化することにより作製され得る。この生じた乳剤は、サブミクロンの油小滴（例えば、平均直径が１００ｎｍと２５０ｎｍの間、好ましくは約１８０ｎｍ）を有し得る。
−スクアレン、トコフェロールおよびＴｒｉｔｏｎ界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の乳剤。
−スクアレン、ポリソルベート８０およびポロクサマー４０１（「ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭＬ１２１」）の乳剤。この乳剤は、リン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４で処方され得る。この乳剤は、ムラミルジペプチドに有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバントにおいてトレオニル−ＭＤＰとともに使用される［７］（０．０５〜１％  Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％スクアレン、２．５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％ポリソルベート８０）。「ＡＦ」アジュバントの場合、Ｔｈｒ−ＭＤＰなしでもまた使用され得る［８］（５％スクアレン、１．２５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％ポリソルベート８０）。微細流動化が好ましい。
−０．５〜５０％油、０．１〜１０％リン脂質、および０．０５〜５％非イオン性界面活性剤を有する乳剤。参考文献９に記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロン小滴サイズが有利である。
−代謝不可能な油（例えば、軽油）および少なくとも一種の界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ  ８０またはＳｐａｎ  ８０）のサブミクロン水中油型乳剤。付加物として、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−親油性物結合体（例えば、参考文献１０に記載される、グルクロン酸のカルボキシル基を介して脱アシルサポニンに脂肪族アミンを付加することにより産生されるＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドおよび／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンが挙げられ得る。
−サポニン（例えばＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）がらせん状のミセルとして会合される乳剤［１１］。
【００２０】
上記乳剤は、好ましくは、送達時、即時に抗原と混合される。従って、アジュバントおよび抗原は、代表的にパッケージされたワクチンまたは配布されたワクチンに別個に保たれ、使用時に最終処方物に準備される。この抗原は一般的に水性の形態であり、このワクチンは最終的に２つの液体の混合により調製される。混合のための２つの液体の容積比は、変更し得る（例えば、５：１と１：５の間で）が、一般的に約１：１である。
【００２１】
組成物がトコフェロールを含む場合、α、β、γ、δ、εまたはζトコフェロールのいずれかが使用され得るが、α−トコフェロールが好ましい。このトコフェロールは、いくつかの形態をとり得る（例えば、異なる塩および／または異性体）。塩として、有機塩（例えば、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩など）が挙げられる。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールの両方が使用され得る。好ましいα−トコフェロールはＤＬ−α−トコフェロールであり、このトコフェロールの好ましい塩は、コハク酸塩である。
【００２２】
（３Ｄ−ＭＰＬ）
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ；また、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡまたは３−Ｏ−脱アシル−４’−モノホスホリルリピドＡと称される）は、公知のアジュバントである。この名前は、モノホスホリルリピドＡ中の還元末端グルコサミンの３位置が脱アシル化されることを示す。３Ｄ−ＭＰＬは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトース欠損（ｈｅｐｔｏｓｅｌｅｓｓ）変異体から調製され、そして化学的にリピドＡに類似しているが、酸に不安定なホスホリル基および塩基に不安定なアシル基を欠いている。それは、単球／マクロファージ系統の細胞を活性化し、そしてＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦを含む数種のサイトカインの放出を刺激する。３Ｄ−ＭＰＬの調製は、最初は参考文献１２に記載され、そしてその産物は、Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって、商標名「ＭＰＬ」の下で製造および販売されている。さらなる詳細は参考文献１３〜１６に見出され得る。
【００２３】
３Ｄ−ＭＰＬは、それらのアシル化によって変動する（例えば、異なる長さであり得る３、４、５または６のアシル鎖を有する）関連分子の混合物の形態をとり得る。２つのグルコサミン（２−デオキシ−２−アミノ−グルコースとしても公知の）単糖は、それらの２位の炭素（すなわち、２位および２’位）でＮ−アシル化され、そしてまた３’位でＯ−アシル化されている。炭素２に結合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ１Ｒ１’を有する。炭素２’に結合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ２Ｒ２’を有する。炭素３’に結合する基は、式−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ３Ｒ３’を有する。代表的な構造は以下：
【００２４】
【化２】
2009503051.tif 000002
である。
【００２５】
基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は各々独立して−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３である。ｎの値は、好ましく８〜１６の間であり、より好ましくは９〜１２の間であり、そして最も好ましくは１０である。
【００２６】
基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は各々独立して：（ａ）−Ｈ；（ｂ）−ＯＨ；または（ｃ）−Ｏ−ＣＯ−Ｒ４であり得、ここでＲ４は−Ｈまたは−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３のいずれかであり、ここでｍの値は、好ましくは８〜１６の間であり、そしてより好ましくは１０、１２または１４である。２位では、ｍは好ましくは１４である。２’位では、ｍは好ましくは１０である。３’位では、ｍは好ましくは１２である。基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は従って好ましくはドデカン酸、テトラデカン酸またはヘキサデカン酸由来の−Ｏ−アシル基である。
【００２７】
Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のすべてが−Ｈである場合、上記３Ｄ−ＭＰＬは３つのアシル鎖のみを有する（２、２’および３’位の各々に１つ）。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうち２つのみが−Ｈである場合、上記３Ｄ−ＭＰＬは４つのアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうち１つのみが−Ｈである場合、上記３Ｄ−ＭＰＬは５つのアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のいずれもが−Ｈではない場合、上記３Ｄ−ＭＰＬは、６つのアシル鎖を有し得る。本発明に従って用いられる３Ｄ−ＭＰＬアジュバントは、３〜６つのアシル鎖を備えたこれらの形態の混合物であり得るが、この混合物中に６つのアシル鎖をもつ３Ｄ−ＭＰＬを含むことが好ましく、そして特に６つのアシル鎖形態が総３Ｄ−ＭＰＬの少なくとも１０重量％、例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上またはさらに多くを占めることが好ましい。６つのアシル鎖を備えた３Ｄ−ＭＰＬは、最もアジュバント活性な形態であることが見出された。
【００２８】
従って、本発明の組成物に含めるために３Ｄ−ＭＰＬの最も好ましい形態は、
【００２９】
【化３】
2009503051.tif 000003
である。
【００３０】
３Ｄ−ＭＰＬが混合物の形態で使用される場合、本発明の組成物中の３Ｄ−ＭＰＬの量または濃度に関する言及は、混合物中の合わせた３Ｄ−ＭＰＬ種をいう。
【００３１】
水性条件では、３Ｄ−ＭＰＬは、異なるサイズを備えた（例えば、直径＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍを備えた）ミセル凝集体または粒子を形成し得る。これらのいずれか、または両方は、本発明とともに使用され得、そしてより良好な粒子が通常のアッセイによって選択され得る。より小さな粒子（例えば、３Ｄ−ＭＰＬの透明な水性懸濁物を与えるに十分小さい）が、より優れた活性のため［１７］、本発明に従う使用に好ましい。好ましい粒子は、２２０ｎｍより小さい、より好ましくは２００ｎｍより小さい、１５０ｎｍより小さい、あるいは１２０ｎｍより小さい平均直径を有し、１００ｎｍより小さい平均直径を有しさえし得る。しかしながら、大部分の場合において、この平均直径は、５０ｎｍより小さくはない。これらの粒子は、濾過滅菌に適するほどに十分小さい。粒子直径は、通常の動的光散乱法の技法によって評価され得、平均粒子直径が明らかとなる。粒子がｘｎｍの直径を有するといわれる場合、一般的にはおおよそこの平均の粒子の分布が存在するが、粒子の数で少なくとも５０％（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、またはそれより多く）がｘ±２５％の範囲内の直径を有する。
【００３２】
３Ｄ−ＭＰＬはそれ自体でアジュバントとして使用され得るか、またはさらに１つ以上のアジュバント化合物と組み合わせて使用され得る。例えば、ＱＳ２１サポニン［１８］、ＱＳ２１および水中油型乳剤［１９］、リン酸アルミニウム［２０］、水酸化アルミニウム［２１］、またはサポニンおよびインターロイキン−１２［２２］と組み合わせて３Ｄ−ＭＰＬを使用することが公知である。
【００３３】
特にＨＢｓＡｇと使用するための好ましいアジュバント混合物は、３Ｄ−ＭＰＬおよびアルミニウム塩、好ましくはリン酸アルミニウムの混合物を含む。利点として、この３Ｄ−ＭＰＬはアルミニウム塩に吸着される。好ましくは、少なくとも５０％（重量で）（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、またはそれより多く）の３Ｄ−ＭＰＬが吸着される。
【００３４】
現在使用されるアルミニウムアジュバントは、代表的に「水酸化アルミニウム」アジュバントまたは「リン酸アルミニウム」アジュバントのいずれかをいう。しかしながらこれらは便宜上の名前である。なぜなら、いずれも存在している実際の化合物を正確に記載していないからである（例えば、参考文献２の第９章を参照のこと）。３Ｄ−ＭＰＬのような脂肪アジュバントとの組み合わせのために、本発明は、アジュバントとして一般的に使用される「水酸化物」または「リン酸塩」の塩のいずれかを使用し得る。
【００３５】
「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、代表的には、オキシ水酸化アルミニウム塩であり、これらは、通常、少なくとも部分的に結晶である。式ＡｌＯ（ＯＨ）によって表され得るオキシ水酸化アルミニウムは、赤外（ＩＲ）分光学によって、特に、１０７０ｃｍ−１における吸収帯および３０９０〜３１００ｃｍ−１における強力なショルダーの存在によって水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３のようなその他のアルミニウム化合物と区別され得る［参考文献２の第９章］。
【００３６】
「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、代表的には、ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、しばしば、少量の硫酸塩をまた含む。それらは沈殿によって得られ得、そして沈殿の間の反応条件および濃度は、この塩中のヒドロキシルからリン酸の置換への程度に影響する。ヒドロキシリン酸塩は、一般に、０．３〜０．９９の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシリン酸塩は、厳密なＡｌＰＯ４からヒドロキシル基の存在によって区別され得る。例えば、３１６４ｃｍ−１におけるＩＲスペクトルバンド（例えば、２００℃に加熱した場合）は、構造的ヒドロキシルの存在を示す［参考文献２の第９章］。
【００３７】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、一般に０．３〜１．２の間、好ましくは０．８〜１．２の間、そしてより好ましくは０．９５±０．１である。このリン酸アルミニウムは、一般に、非晶質である（特にヒドロキシリン酸塩について）。代表的なアジュバントは、０．８４〜０．９２の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウムであり、０．６ｍｇＡｌ３＋／ｍｌで含む。このリン酸アルミニウムは、一般に、粒子状である。この粒子の代表的な直径は、任意の抗原の吸着の後、０．５〜２０μｍの範囲（例えば、約５〜１０μｍ）である。
【００３８】
リン酸アルミニウムのＰＺＣは、ヒドロキシルからリン酸への置換の程度に逆に相関し、そしてこの置換の程度は、沈殿によって塩を調製するために用いられる反応条件および反応物質の濃度に依存して変動し得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離のリン酸イオンの濃度を変化することによるか（より多くのリン酸＝より酸性のＰＺＣ）、またはヒスチジン緩衝液（ＰＺＣをより塩基性にする）のような緩衝液を添加することにより変更される。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、一般に、４．０〜７．０の間、より好ましくは５．０〜６．５の間、例えば、約５．７のＰＺＣを有する。
【００３９】
本発明の組成物を調製するために用いられるリン酸アルミニウム溶液は、緩衝剤を含み得る（例えば、リン酸塩またはヒスチジンまたはＴｒｉｓ緩衝剤）が、常に必要なわけではない。このリン酸アルミニウム溶液は、好ましくは、無菌であり、そして発熱物質を含まない。このリン酸アルミニウム溶液は、遊離の水性リン酸イオンを含み得る（例えば、１．０〜２０ｍＭの間、好ましくは５〜１５ｍＭの間、そしてより好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する）。このリン酸アルミニウム溶液はまた、塩化ナトリウムを含み得る。塩化ナトリウムの濃度は、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲（例えば、０．５〜５０ｍｇ／ｍｌ、１〜２０ｍｇ／ｍｌ、２〜１０ｍｇ／ｍｌ）であり、そしてより好ましくは約３±１ｍｇ／ｍｌである。ＮａＣｌの存在は、抗原の吸着前のｐＨの正確な測定を容易にする。
【００４０】
リン酸アルミニウムは、好ましくは３Ｄ−ＭＰＬ（および必要に応じて抗原）が添加される水溶液の形態で使用される（ＮＢ：「溶液」として水性リン酸アルミニウムをいうことが標準的であるが、厳密な物理化学的観点から、この塩は、不溶性であり、懸濁液を形成する）。リン酸アルミニウムを必要とされる濃度に希釈し、３Ｄ−ＭＰＬおよび／または抗原の添加前に均質な溶液を確保することが好ましい。
【００４１】
（Ｎ−アシル−プソイドジペプチド）
Ｎ−アシル−プソイドジペプチドアジュバントは、好ましくは中性の形態または荷電した形態で酸性基によってエステル化されるヒドロキシル基を含む。このアシル基は、プソイドジペプチドに脂肪特性を付与する。このアジュバントは、好ましくは式（Ｉ）：
【００４２】
【化４】
2009503051.tif 000004
を有し、ここで、
Ｒ１は、２〜２４個の炭素原子を有する飽和または不飽和、直鎖または分枝鎖のカルボン酸から誘導されるアシル基であり、このカルボン酸は、非置換であるか、またはヒドロキシル基、アルキル基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アミノ基、アシルアミノ基、アシルチオ基および（（Ｃ１〜２４）アルキル）チオ基からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換され；
Ｒ２は、２〜２４個の炭素原子を有する飽和または不飽和、直鎖または分枝鎖のカルボン酸から誘導されるアシル基であり、このカルボン酸は、非置換であるか、またはヒドロキシル基、アルキル基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アミノ基、アシルアミノ基、アシルチオ基および（（Ｃ１〜２４）アルキル）チオ基からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換され；
Ｘは、中性の形態または荷電した形態のいずれかの水素原子あるいは酸性基であり；
Ｙは、中性の形態または荷電した形態のいずれかの水素原子あるいは酸性基であり；
Ａは、酸素原子、硫黄原子またはイミノ基−ＮＨ−であり；
Ｂは、酸素原子、硫黄原子またはイミノ基−ＮＨ−であり；
ｍは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；
ｎは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；
ｐは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；
ｑは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である
（ただし少なくとも１つの置換基ＸまたはＹが中性の形態またはイオンの形態で酸性基を表す）。
【００４３】
このアジュバントは、有機または無機塩基とともに酸または塩の形態のいずれかで使用され得る。
【００４４】
治療的使用が意図される塩を形成する塩基として、主に水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは水酸化リチウムのようなアルカリ金属塩基、アンモニウム塩；水酸化カルシウムまたは水酸化ストロンチウムおよびマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩基；第一鉄の金属塩など；メチルアミン、ジエチルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、ベンジルアミン、Ｎ−メチルベンジルアミン、ベラトリルアミン、トリメトキシベンジルアミンのような第一級、第二級、第三級アミンから誘導されるような有機塩基；リシンおよびオルニチンまたはアミノ糖のような塩基性アミノ酸が挙げられる。治療的使用が意図されない塩基の例は、ブルシン、ストリキニン、アグマチン、ホマリン、グルコサミン、Ｎ−メチルグルコサミンまたはＮ−メチルモルホリンである。
【００４５】
好ましい置換基ＸおよびＹは：
カルボキシ［（Ｃ１〜５）アルキル］
ＣＨ−［（ＣＨ２）ｒＣＯＯＨ］［（ＣＨ２）ｓＣＯＯＨ］、ここで：ｒは０、１，２，３、４または５であり；ｓは０、１，２，３、４または５である
ホスホノ［（Ｃ１〜５）アルキル］
ジヒドロキシホスホリルオキシ［（Ｃ１〜５）アルキル］
ジメトキシホスホリル
ホスホノ
ヒドロキシスルホニル
ヒドロキシスルホニル［（Ｃ１〜５）アルキル］
ヒドロキシスルホニルオキシ［（Ｃ１〜５）アルキル］
から選択される。
【００４６】
置換基Ｘおよび／またはＹが中性の形態で酸性基を示す場合、遊離カルボン酸、スルホン酸またはリン酸の形態が言及される。この酸性基が荷電した形態にある場合、カルボン酸塩、スルホン酸塩またはリン酸塩の形態が言及され、すなわち、有機塩基または無機塩基の添加により、好ましくは治療的使用が意図される。Ｘおよび／またはＹがカルボキシアルキル基、アルケニルビスカルボン酸基、ヒドロキシスルホニル基、ヒドロキシスルホニルアルキル基、ヒドロキシスルホニル−オキシアルキル基、ホスホノアルキル基またはホスホリル−オキシアルキル基を示す場合、同様な考慮が適用される。
【００４７】
ｍ＝１およびｎ＝０である場合、アジュバントはセリンから誘導される。ｍ＝２およびｎ＝０である場合、アジュバントはホモセリンから誘導される。ｍ＝３およびｎ＝０である場合、ペンタホモセリン化合物が言及される。ｍ＝４およびｎ＝０である場合、ヘキサホモセリン化合物が言及される。
【００４８】
ｐ＝３およびｑ＝１である場合、関心のある生成物は、シトルリン、オルニチンまたはアルギニン化合物であり得る。ｐ＝４およびｑ＝１である場合、ホモアルギニンまたはリシン化合物が言及される。
【００４９】
Ｒ１およびＲ２は、異なる性質または同じ性質の種々のサイズの鎖を有する飽和または不飽和、分枝鎖または直鎖のアシル誘導体であり、これはアルキル基、アミノ基、アシルアミノ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アシルチオ基およびアルキルチオ基からなる群から選択される１つ以上の置換基を有する。
【００５０】
そのようにアシル化し、置換した誘導体の例は、リシノレイル、１，２−ヒドロキシステアロイル、２−ヒドロキシ−３−メチル−ブチロイル、３−ヒドロキシ−２−アミノペンタノイル、パルミトイル、エライジル、エレオステアロイル、アラキドイル、アラキドニル、ガドレイル、ベヘニル、エルシル、８−メチルデカノイル、９−メチルデカノイル、ドコソヘキサエノイルまたはエイコサペンタノイルラジカルである。
【００５１】
好ましいアジュバントは式（Ｉａ）
【００５２】
【化５】
2009503051.tif 000005
を有し、ここでＡおよびＢは両方、酸素原子である。
【００５３】
式（Ｉａ）において、ＸおよびＹは、好ましくは水素原子またはホスホノ基のいずれかである。
【００５４】
式（Ｉａ）の適切なアジュバントとして：
３−（３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ）９−（３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ）４−オキソ−５−アザデカン−１，１０−ジオール１，１０−ジヒドロゲンホスフェートおよび有機塩基または無機塩基を用いて形成されるその付加塩
３−（３−ドデカノイルオキシ−テトラデカノイルアミノ）９−（３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ）４−オキソ−５−アザデカン−１，１０−ジオール１，１０−ビス（ジヒドロゲンホスフェート）および有機塩基または無機塩基を用いて形成されるその付加塩
３−（３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ）９−（３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ）４−オキソ−５−アザデカン−１，１０−ジオール１，１０−ビス（ジヒドロゲンホスフェート）および有機塩基または無機塩基を用いて形成されるその付加塩
３−（３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ）９−（３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ）４−オキソ−５−アザデカン−１，１０−ジオール１−ジヒドロゲンホスフェートおよび有機塩基または無機塩基を用いて形成されるその付加塩
３−（３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ）９−（３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ）４−オキソ−５−アザデカン−１，１０−ジオール１−ジヒドロゲンホスフェートおよび有機塩基または無機塩基を用いて形成されるその付加塩
３−（３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ）９−（３−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ）４−オキソ−５−アザデカン−１，１０−ジオール１０−ジヒドロゲンホスフェートおよび有機塩基または無機塩基を用いて形成されるその付加塩
が挙げられる。
【００５５】
式（Ｉ）のアジュバントを合成するための方法は、参考文献２３に詳細を開示され、以下の工程を包含する方法が挙げられる：酸分解および加水分解を受けやすいブロッキング試薬によりジアミノ酸の（ｑ＋１）位およびω位においてアミン官能基をそれぞれ保護し；遊離カルボン酸官能基を還元剤と反応させ相当するアルコールを得；（ｑ＋１）位においてアミン官能基を脱保護し、次いで式Ｒ２ＯＨのカルボン酸官能性誘導体によってアシル化し、続いて水素化分解により末端のアミン官能基を遊離させ一般式ＩＩのジアミノアルコールを得る：
【００５６】
【化６】
2009503051.tif 000006
このアミノアルコールは、不活性溶媒中ペプチド縮合試薬の存在下において、一般式ＩＩＩ
【００５７】
【化７】
2009503051.tif 000007
のω−ヒドロキシ、ω−アミノまたはωチオアミノ酸化合物と一緒になって縮合され、式（ＩＶ）：
【００５８】
【化８】
2009503051.tif 000008
のジペプチド化合物を提供し、必要な場合この末端遊離アルコール官能基は保護され得るか（例えば、アルキル基またはアシル基、あるいは任意の他の適した保護基）、そうでなければ、必要な場合カップリング試薬の存在下で置換され得る。この保護されたアルコールは、一般式Ｉの誘導体を得るために接触水素添加または他の脱保護処理に共され得る。
【００５９】
式（ＩＩ）のアジュバントを合成するための方法はまた、参考文献２３に詳細に記載され、以下の工程を包含する方法が挙げられる：酸分解および加水分解を受けやすい保護試薬により式Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）ｐＣＨＮＨ２（ＣＨ２）ｑ＋１ＣＯＯＨのジアミノ酸の（ｑ＋１）位およびω位においてアミン官能基をそれぞれ保護し；遊離カルボン酸官能基を還元剤と反応させ相当するアルコールを得、（ｑ＋１）位においてアミン官能基を脱保護し、次いで式Ｒ２ＯＨのカルボン酸官能性誘導体によってアシル化し、水素化分解により末端のアミン官能基を脱保護し、一般式ＩＩのアミノアルコールを得る：このアミノアルコールは、不活性溶媒中ペプチド縮合試薬の存在下において、一般式ＩＩＩａ：
【００６０】
【化９】
2009503051.tif 000009
のωヒドロキシアミノ酸官能性誘導体と一緒になって縮合される。ここでＸは、式（ＲＯ）２Ｐ−Ｏのジアルキルオキシ−またはジアリールオキシ−ホスホリルラジカルであり、式ＩＶａのペプチド様化合物を与える：
【００６１】
【化１０】
2009503051.tif 000010
ここでＲは加水分解を受けやすいラジカルであり、所望される場合、他のアルコール官能性基は、必要であればカップリング試薬の存在下でリン酸化試薬によってリン酸化され得る。この保護されたアルコールは、一方では必要に応じてアシル基Ｒ２に存在するアルコール官能基を脱保護するために、他方ではリン酸基を遊離するために接触水素添加に供され得、次いで一般式Ｖ：
【００６２】
【化１１】
2009503051.tif 000011
の誘導体を得るために、第２に必要に応じて存在するリン酸官能基を、水素化分解を介して脱保護し、そして必要に応じて有機塩基または無機塩基によって塩を形成するさらなる工程を実施する。
【００６３】
アシルアミノ基のキラル中心の立体化学は、最初に使用したアミノ酸の立体配置によって決定される一方、アシルアミノ基の立体化学は、最初に使用した脂肪酸の立体配置に依存する。一方はＬ型またはＤ型立体配置を有するジアミノ酸から、あるいはラセミ体の性質のジアミノ酸から出発し得る。他方は、Ｌ型、Ｄ型立体配置またはラセミ混合物の水酸化アミノ酸から出発し得る。そのような立体異性体またはジアステレオ異性体のすべては、本発明の範囲内である。
【００６４】
特に好ましいアジュバント、特にモノ−およびビス−リン酸化化合物は、「ＯＭ−２９４−ＭＰ」（式ＶＩ）および「ＯＭ−２９４−ＤＰ」（式ＶＩＩ）として公知の化合物：
【００６５】
【化１２】
2009503051.tif 000012
である。
【００６６】
（ＯＭ−１７４）
ＯＭ−１７４は、化学合成を通して得られ得、リピドＡ由来のトリアシルモチーフを保持する。参考文献２４〜２６に、より詳細に記載される。参考文献２６は、ＯＭ−１７４の式を：
【００６７】
【化１３】
2009503051.tif 000013
として与える。
【００６８】
従って、ＯＭ−１７４は、天然のリピドＡに見出されるように、１，４’−ビホスホリル化β（１→６）結合ジグルコサミンバックボーンを有する。ＯＭ−１７４は、ミセル性ＨＩ構造物との集合体の形態で存在し得る。すなわち、脂質分子は、内側に向けられたアシル鎖を有する円柱表面にこれらのバックボーンとともに組み込まれ、その円柱自体は六角形に充たされている。三次相は存在し得ない。ＨＩＩ相もまた存在し得ない。
【００６９】
（グルコサミニドホスフェート誘導体）
アミノアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）誘導体（例えば、ＲＣ−５２９［２７、２８］）はアシル鎖のため、脂肪アジュバントである。一般的に、これらの誘導体以下の式：
【００７０】
【化１４】
2009503051.tif 000014
を有し得［２９］、ここで
Ｘは、アキシアル位またはエクアトリアル位のいずれかにおける酸素原子または硫黄原子を表わし；
Ｙは、酸素原子またはＮＨ基を表わし；
「ｎ」、「ｍ」、「ｐ」および「ｑ」は、同じであるかまたは異なり、そして０〜６の整数であり；
同じであるかまたは異なり得るＲ１、Ｒ２、およびＲ３は、１〜約２０個の炭素原子を有する脂肪アシル残基であり、ここでＲ１、Ｒ２、またはＲ３のうちの１つが必要に応じて水素であり；
Ｒ４およびＲ５は、同じであるかまたは異なり、水素またはメチルであり；
Ｒ６およびＲ７は、同じであるかまたは異なり、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ホスホノ、ホスホノオキシ、スルホ、スルホオキシ、アミノ、メルカプト、シアノ、ニトロ、ホルミルまたはカルボキシならびにそのエステルおよびアミドであり；
Ｒ８およびＲ９は、同じであるかまたは異なり、ホスホノまたは水素であり、好ましくはＲ８および／またはＲ９のうちの少なくとも１つはホスホノである。
【００７１】
通常の脂肪アシル残基が結合される３’ステレオジエン中心の立体化学は、Ｒ体またはＳ体であるが、好ましくはＲ体である。Ｒ４またはＲ５が結合される炭素原子の立体化学は、Ｒ体またはＳ体であり得る。すべての立体異性体、エナンチオマーおよびジアステレオマーの両方、およびそれらの混合物は、従属する発明の範囲内にあると考えられる。適したアジュバントは、これら化合物の塩を含む。
【００７２】
好ましいＡＧＰ化合物は、「ＲＣ−５２９」
【００７３】
【化１５】
2009503051.tif 000015
であり、これは参考文献３０に記載されるとおりに調製され得る。
【００７４】
（非環式合成リピドＡアナログ）
本発明の組成物中にアジュバントとして使用され得るリピドＡアナログは、ＥＲ−１１２０２２［３１］、非環式バックボーンを介して連結されるリン脂質二量体：
【００７５】
【化１６】
2009503051.tif 000016
である。
【００７６】
ＥＲ−１１２０２２の各々の単量体単位は、間接的にホスフェートジエステル結合される３つの異なる脂肪基を含む。この脂肪基は、１０炭素のエーテル鎖、エーテル鎖に結合される不飽和の１２炭素アシルオキシ鎖、およびホスホジエステル近くに連結される１４炭素のｂ−オキソ−アミド鎖を含む。従って、この化合物は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の天然に生じるリピドＡに比べ、３つの異なる特性を有する：（ｉ）ＥＲ−１１２０２２は、環式糖質のバックボーンがない；（ｉｉ）第２に、このホスフェートは、Ｅ．ｃｏｌｉリピドＡにおけるホスホエステルとは異なり、構造的バックボーンの範囲内に組み込まれるホスホジエステルである；そして（ｉｉｉ）この構造は、対称的である（非糖質のバックボーンにおいて６つの対称的構成される脂肪酸）。
【００７７】
同様に有用な化合物として、参考文献３２に定義されるように、式ＸＩＶ、ＸＶまたはＸＶＩを有する化合物、あるいはそれらの塩：
【００７８】
【化１７】
2009503051.tif 000017
が挙げられ、「ＥＲ８０３０５８」、「ＥＲ８０３７３２」、「ＥＲ８０４０５３」、「ＥＲ８０４０５８」、「ＥＲ８０４０５９」、「ＥＲ８０４４４２」、「ＥＲ８０４６８０」、「ＥＲ８０４７６４」、「ＥＲ８０３０２２」または「ＥＲ８０４０５７」のような、例えば
【００７９】
【化１８】
2009503051.tif 000018
である。
【００８０】
ホスフェート含有非環式バックボーンに連結される脂質を含む化合物はまた、アジュバントとして使用され得る（例えば、ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４）［３３、３４］：
【００８１】
【化１９】
2009503051.tif 000019
（界面活性剤）
本発明の第１の局面は、実質的に抗原精製の間に界面活性剤の使用を回避することであり、界面活性剤は本発明において使用される抗原成分内に見い出されない。しかしながら、第２の局面において、界面活性剤が使用されるが、脂肪アジュバントに比例した
調整されたレベルである。
【００８２】
この界面活性剤は代表的に非イオン性界面活性剤、特にワクチン処方物においてすでに見い出されている界面活性剤である。有機界面活性剤が好ましい。これらは代表的にアルキレン酸化物（例えば、エチレン酸化物）と脂肪アルコール、脂肪酸、アルキルフェノール、アルキルアミンまたは少なくとも１つの活性水素原子を有する他の適した化合物とのとの反応生成物である。ほとんどの界面活性剤に関して、最も一般的なアルコール、アミンおよび酸は、Ｃ８〜Ｃ１８の範囲の長さの炭素鎖を有する。最も一般的なアルキルフェノールは、ノニルフェノールおよびオクチルフェノールである。界面活性剤含有ポリ（オキシエテン）残基が特に好ましい。
【００８３】
例えば、本発明は：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎといわれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（例えば、ＤＯＷＦＡＸＴＭ商標名で販売される直線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー）；エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の繰返し数が変動し得るオクトキシノール、特にオクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）に関心がある；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）（例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０））；およびソルビタンエステル（一般的にＳＰＡＮとして公知）（例えば、ソルビタントリオレアート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレート）を含む界面活性剤を用いて使用され得るが、これらに限定されない。
【００８４】
関心のある２つの具体的な界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびポリソルベート２０である。従って、本発明の第１の局面の好ましい実施形態は特に、実質的にこれら２つの非イオン性界面活性剤の使用を回避し、好ましくは実質的にいずれの非イオン性界面活性剤の使用も回避する。同様に、本発明の第２の局面の好ましい実施形態は、これら２つの非イオン性界面活性剤のうちの１つを含む抗原成分を使用する。
【００８５】
本発明は特に、ポリソルベート２０を用いる使用が適している。この界面活性剤は、ヒトへの投与に関する安全なプロフィールを確立し、ワクチン内に含まれる。
【００８６】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）により分類され得る。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０のＨＬＢを有し、好ましくは少なくとも１５、そしてより好ましくは少なくとも１６である。
【００８７】
本発明の第２の局面において、患者に対して大用量の界面活性剤を投与することを回避するために、組成物中の界面活性剤の濃度は、５０μｇ／ｍｌ以下（例えば、４０μｇ／ｍｌ以下、３５μｇ／ｍｌ以下、３０μｇ／ｍｌ以下、２５μｇ／ｍｌ以下、２０μｇ／ｍｌ以下、１５μｇ／ｍｌ以下、１０μｇ／ｍｌ以下、５μｇ／ｍｌ以下など）であることが好ましい。２０μｇ／ｍｌ以下の濃度が好ましい。
【００８８】
（抗原）
本発明は、抗原の使用を含む。本発明は特に、代表的に界面活性剤を使用することにより精製される抗原を用いる使用に適している。これらの抗原は、代表的に親油性である。これらは通常、少なくとも１つの膜通過領域を含み、これはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて脂質二重層内の抗原を局在化するため（例えば、病原体の表面）に機能する。本発明は特に、ウイルス表面抗原を用いる使用に有用である。
【００８９】
本発明の第２の局面において、抗原成分は界面活性剤を含む。抗原および界面活性剤の単純な混合物よりむしろ、抗原および界面活性剤が複合体の形態にあることが好ましい。抗原／界面活性剤複合体は、抗原を含む界面活性剤安定化リポソーム、およびニオソームを含み、これらは合成非イオン性の両親媒性化合物から形成されるベシクルである。好ましい抗原／界面活性剤複合体は、界面活性剤の存在下精製される粒子状のＢ型肝炎表面抗原である。参考文献３５は、組み替えＨＢｓＡｇ粒子が、これらの精製の間に使用されたＴｗｅｅｎ  ２０をどのように保持するか（１００μｇＨＢｓＡｇあたり２５μｇＴｗｅｅｎ  ２０まで）を記載する。
【００９０】
本発明の第２の局面を用いる使用のための最も好ましい抗原は、従ってＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の表面抗原であり、実質的に球状の粒子（平均直径約２０ｎｍ）の形態であり、リン脂質および非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）の両方を含有する脂質マトリックスを含む。非イオン性界面活性剤は、精製の間に粒子中に組み込まれ得る。
【００９１】
しかしながら本発明の第１の局面に関して、ＨＢｓＡｇの好ましい形態は、ＨＢｓＡｇが非イオン性界面活性剤の使用なしに精製されるものであり、このＨＢｓＡｇ粒子はいずれの界面活性剤も組み込まないので脂肪アジュバントとの干渉を回避する。
【００９２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ウイルス性肝炎を引き起こす公知の因子の１つである。ＨＢＶビリオンは、外部タンパク質被膜またはカプシドにより囲まれた内部コアからなり、このウイルス性コアはウイルス性ゲノムを含む。このカプシドの主要成分は、ＨＢＶ表面抗原として公知のタンパク質、またはより一般的には、代表的に約２４ｋＤａの分子量を有する２２６個のアミノ酸ポリペプチドである「ＨＢｓＡｇ」として公知のタンパク質である。既存のすべてのＢ型ワクチンは、ＨＢｓＡｇを含んでおり、この抗原が正常なワクチン被接種者に投与された場合、ＨＢＶ感染を防ぐ抗ＨＢｓＡｇ抗体の産生を刺激する。
【００９３】
ワクチンの製造に関して、ＨＢｓＡｇは、２つの方法で作製され得る。大量のＨＢｓＡｇは、ＨＢＶ感染中肝臓で合成され、血流に放出されるので、第１の方法は、慢性Ｂ型肝炎の保有者の血漿から粒子の形態での抗原を精製する工程を包含する。第２の方法は、組換えＤＮＡ法により、タンパク質を発現させる工程を包含する。本発明の方法を用いて使用するためのＨＢｓＡｇは、酵母で組換え発現される。適した酵母として、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｐｉｃｈｉａ（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはＨａｎｅｎｓｕｌａ（例えば、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）宿主が挙げられる。代替物として抗原は、組換え哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、Ｂｕ３細胞など）、組換え昆虫細胞（例えば、バキュロウイルスベクターを使用する）、または組換え植物細胞に発現され得る。しかしながら、一般的に、酵母発現が使用される。
【００９４】
酵母で発現されるＨＢｓＡｇは、好ましくはグリコシル化されていない。天然のＨＢｓＡｇ（すなわち、血漿を精製した製品）と違って、酵母で発現されるＨＢｓＡｇは、一般的にグリコシル化されておらず、本発明を用いる使用に関してはこれが最も好ましいＨｂｓＡｇの形態である。なぜなら免疫原性が高く、血液製品の汚染の危険なしに調製され得るからである。酵母で発現される粒子は、天然のＨＢＶビリオンには見い出されないホスファチジルイノシトールを含み得る。この粒子はまた、免疫系を刺激するために、非毒性量のＬＰＳを含み得る［３６］。
【００９５】
ＨＢｓＡｇを精製するための多くの方法が、当該分野において公知である（参考文献３７〜６２を参照のこと）。これら種々のプロセスのうち、本発明の第１の局面は、非イオン性界面活性剤が使用されないプロセスを使用する。反対に、本発明の第２の局面は、精製の間、非イオン性界面活性剤を使用するので、界面活性剤は最終の粒子状ＨＢｓＡｇ産物に組み込まれるようになる。組換え酵母細胞の分裂の間、精製開始時にポリソルベート２０を使用することは、ＨＢｓＡｇ粒子に界面活性剤を導入するために好ましい方法である。
【００９６】
細胞分裂後のＨＢｓＡｇ精製のための好ましい方法として：限外濾過；サイズ排除クロマトグラフィー；陰イオン交換クロマトグラフィー；超遠心分離；脱塩；および滅菌濾過が挙げられる。溶解産物は、細胞分裂後沈殿され得（例えば、ポリエチレングリコールを用いて）、溶液中のＨＢｓＡｇを残し、限外濾過をできるようにする。滅菌濾過の前後で、ホルムアルデヒドを用いて処理することによりＨＢｓＡｇ粒子を安定させることができる。次いで過剰のホルムアルデヒドは、限外濾過またはクロマトグラフィーにより除去され得る。さらに滅菌濾過が使用され得る。
【００９７】
ＨＢｓＡｇは、好ましくはＨＢＶサブタイプａｄｗ２由来である。
【００９８】
「Ｓ」配列に加えて、表面抗原は、ｐｒｅ−Ｓ配列のすべてまたは一部（例えば、ｐｒｅ−Ｓ１および／またはｐｒｅ−Ｓ２配列のすべてまたは一部）を含み得る。
【００９９】
本発明を用いて使用され得る他のウイルス性表面抗原は、一般的にエンベロープウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質である。本発明を用いて使用するためのウイルス表面抗原として以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：
−Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅタンパク質。Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅは、ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓおよびｓｐｕｍａｖｉｒｕｓｅｓを含む。関心のあるウイルスとして、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を含むＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、チンパンジー泡沫状ウイルスおよびヒトスプマウイルスが挙げられる。
−Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、Ｆタンパク）。Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅは、（ａ）Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ、ＲｕｂｕｌａｖｉｒｕｓｅｓおよびＭｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓｅｓを含む）および（ｂ）Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓｅｓを含む）を含む。関心のあるウイルスとして、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、ヒトパラミクソウイルス、牛疫ウイルス、小反すう動物病ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ニバーウイルス、ヘンドラウイルス、ウマ麻疹ウイルス（ＥＭＶ）、リッサウイルスおよびメナングルウイルスが挙げられる。
−Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅタンパク質。Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅは、マルブルクウイルスおよびエボラウイルスを含む。
−Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅタンパク質のスパイク糖タンパク質。Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅは、ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓおよびｔｏｒｏｖｉｒｕｓｅｓを含む。関心のあるウイルスとして、ヒトコロナウイルス（ＳＡＲＳコロナウイルスを含む）、トリ感染性気管支炎ウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、ネズミ肝炎ウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタ血液凝集性脳脊髄炎ウイルス、ブタ感染性胃腸炎ウイルス、およびベルヌ（Ｂｅｒｎｅ）ウイルスが挙げられる。
−Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅタンパク質（例えば、Ｇタンパク質）。Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅは、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓｅｓ、Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ、Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓｅｓ、Ｅｐｈｅｍｅｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、ＣｙｔｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓｅｓおよびＮｕｃｌｅｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓｅｓを含む。関心のあるウイルスとして、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、モコラウイルス、ウシ一日熱ウイルスが挙げられる。
−Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅタンパク質。Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅは、ＡｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓおよびＲｕｂｉｖｉｒｕｓｅｓを含む。関心のあるウイルスとして、シンドビスウイルス、東部および西部脳炎ウイルス、セムリキフォレストウイルス、風疹ウイルス、アウラウイルス、ババンキ（Ｂａｂａｎｋｉ）ウイルス、バーマフォレストウイルスａｖｉｓ−Ａ、ベバル（ｂｅｂａｒｕ）ウイルス、バギークリーク（Ｂｕｇｇｙ  Ｃｒｅｅｋ）ウイルス、チクングニヤウイルス、エヴァグレースウイルス、フォートモーガンウイルス、ゲタウイルス、ハイランズＪウイルス、キジラガッハ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）ウイルス、マヤロ（Ｍａｙａｒｏ）ウイルス、ミデルビュルフウイルス、ムカンボウイルス、ヌズム（Ｎｄｕｍｕ）ウイルス、オケルボ（Ｏｃｋｅｌｂｏ）ウイルス、オニョンニョンウイルス、ピクスナ（Ｐｉｘｕｎａ）ウイルス、ロスリバーウイルス、サギヤマウイルス、ウナウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎、およびワタロア（Ｗｈａｔａｒｏａ）ウイルスが挙げられる。
−Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅのエンベロープ（「Ｅ」）糖タンパク質。Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅは、Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ、ＰｅｓｔｉｖｉｒｕｓｅｓおよびＨｅｐａｃｉｖｉｒｕｓｅｓを含む。関心のあるウイルスとして、デングウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ウシ下痢ウイルス、およびダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ウイルスが挙げられる。
−Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅタンパク質。Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅは、Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓｅｓ、Ｎａｉｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、Ｐｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓｅｓ、ＨａｎｔａｖｉｒｕｓｅｓおよびＴｏｓｐｏｖｉｒｕｓｅｓを含む。関心のあるウイルスとして、ブンヤウイルス、ブンヤムウェラウイルス、カルフォルニア脳炎ウイルス、Ｌａ  Ｃｒｏｓｓウイルス、ハンターンウイルス、シンノンブルウイルス、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、スナバエ熱シチリア人ウイルス、およびリフトバレー熱ウイルスが挙げられる。
−Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅタンパク質。Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅは、リンパ球性脈絡髄膜炎、イッピー（ｉｐｐｙ）ウイルスおよびラッサウイルスを含む。
−Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅタンパク質（ＨＢｓＡｇを含む）。Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅは、ｏｒｔｈｏｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓｅｓおよびａｖｉｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓｅｓを含む。ならびにヒトＢ型肝炎ウイルス、このウイルスファミリーは、リスＢ型肝炎ウイルス、ウッドチャックＢ型肝炎ウイルス、ヨウモウザルＢ型肝炎ウイルス、北極リスＢ型肝炎ウイルス、アヒルＢ型肝炎ウイルス、サギＢ型肝炎ウイルスおよびＲｏｓｓガチョウＢ型肝炎ウイルスを含む。
−Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅタンパク質。Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅは、Ｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｅｓ、Ｖａｒｉｃｅｌｌｏｖｉｒｕｓｅｓ、Ｒｏｓｅｏｌｏｖｉｒｕｓｅｓ、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ、Ｍｕｒｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ、ＬｙｍｐｈｏｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓｅｓおよびＲｈａｄｉｎｏｖｉｒｕｓｅｓが挙げられる。関心のあるウイルスとして、ヒトヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）などを含む）が挙げられる。適した抗原は、糖タンパク質ｇＢ、ｇＣ、ｇＤおよびｇＨ（例えば、ＨＳＶ中の）から選択され得る。ＨＳＶ  ｇＤ２が特に好ましい。
−Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅタンパク質。Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅとして、インフルエンザウイルスおよびトゴトウイルスが挙げられる。インフルエンザウイルス由来の抗原（インフルエンザＡ、ＢまたはＣウイルス）が好ましく、表面抗原ヘムアグルチニン（ＨＡ）および／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含む。
【０１００】
これらウイルス表面抗原は、代表的に界面活性剤を使用することにより精製され、この抗原成分は、特に脂質を含む粒子形態中に存在する場合、界面活性剤を含み得る。
【０１０１】
本発明はまた、ウイルス表面抗原および異種の抗原を含むハイブリッドタンパク質または融合タンパク質をベースにした粒子状抗原に有用である。例えば、ＨＢｓＡｇ配列を異種性の抗原に融合させＨＢｓＡｇの能力を利用し、粒子を組立てることが公知である。
【０１０２】
例えば、参考文献６３は、サイズおよび密度の点で天然のＨＢｓＡｇ粒子に似ている（約２５％の脂質組成および粒子あたり約１００の含有量のｇｐ１２０に一致する）、自発的に粒子を組立てるタンパク質を与えるＨＩＶ−１  ｇｐ１２０のＨＢｓＡｇへの融合を報告する。このｇｐ１２０は、この融合において天然の構造に折り込むことができ、その生物学的活性を維持した。同様に、ＨＩＶ  ｇｐ４１エピトープは、ＨＢｓＡｇを用いて内部融合を作ることにより改善され、この融合タンパク質は、酵母において２２ｎｍのリポタンパク粒子を自己組立てした［６４］。
【０１０３】
この手法はまた、マラリアワクチンにも使用される。参考文献６５は、マラリアｇｐ１９０抗原由来の６１ａａまでのエピトープをＨＢｓＡｇ配列に挿入し、発現したハイブリッド粒子は動物において抗ｇｐ１９０免疫応答を惹起したことを報告する。参考文献６６は、ＨＢｓＡｇを有する融合タンパク質として発現されたスポロゾイド周囲タンパク質の４マー配列の１６回の反復を有するタンパク質を報告する。参考文献６７は、ＨＢｓＡｇに融合されたＰｆｓ１６から構成されるウイルス様粒子の酵母における産生を報告する。参考文献６８は、スポロゾイド周囲タンパク質がＨＢｓＡｇに融合されるハイブリッド抗原を開示する。参考文献６９は、２０〜４５ｎｍサイズの免疫原性粒子を形成したＰ．ｖｉｖａｘのメロゾイト表面タンパク質１のＣ末端領域の融合を開示する。自己組立ての粒子形態においてマラリア抗原を提示するためのＨＢｓＡｇの使用は、当該分野において周知である。
【０１０４】
従って、本発明は、ウイルス表面抗原および異種抗原を含むハイブリッド抗原を用いて使用され得る。この異種抗原は、ウイルス表面抗原配列に挿入され得るか、ウイルス表面抗原配列のＮ末端またはＣ末端に融合され得る。天然のウイルス表面抗原が粒子を組立て得（例えば、ＨＢｓＡｇ）、挿入または融合はこの組立てを妨げない。
【０１０５】
これらハイブリッドタンパク質において、異種抗原は、バクテリア由来、真菌由来、寄生虫由来、ウイルス由来（しかし、定義上、異種抗原はＨＢｓＡｇではない）などであり得る。ハイブリッドタンパク質において、完全な異種抗原を含むことは可能であるが、この抗原の抗原性フラグメントを含むことがより普通である。
【０１０６】
特にウイルス表面抗原がＨＢｓＡｇである場合、異種抗原は、ＨＩＶ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅまたはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ由来であり得る。ＨＢｓＡｇハイブリッドを作製するための適切なＨＩＶ抗原は、エンベロープ糖タンパクｇｐ１２０またはその抗原性フラグメントが挙げられる［６３］。ＨＢｓＡｇハイブリッドを作製するのに適したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ抗原は、スポロゾイド周囲表面抗原（「ＣＳＰ」）のサブユニットに基づき得（例えば、そのＮＡＮＰモチーフの３と２０の間の繰返しを含み得る（配列番号２））、そして／またはＣＳＰのＣ末端領域を含み得る（しかし、代表的にはＣ末端から最後の１２アミノ酸を含まない）。例えば、本発明は、「ＲＴＳ」として公知の抗原を使用し得、これはＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＮＦ５４または７Ｇ８単離物由来のＣＳＰのＣ末端の大部分を含み（アミノ酸２１０〜３９８であり、１９個のＮＡＮＰ繰返しおよびアミノ酸３６７〜３９０のＴ細胞エピトープ領域を含む）、ＨＢｓＡｇのｐｒｅＳ２の４アミノ酸によりＨＢｓＡｇのＮ末端に融合される。酵母で発現される場合、タンパク質に加え脂質（主にリン脂質）を含むＲＴＳは粒子を形成する。従って、ＲＴＳの配列は：（ｉ）Ｎ末端のメチオニン残基；（ｉｉ）Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ；（ｉｉｉ）Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ７Ｇ８由来のＣＳタンパク質のアミノ酸２１０〜３９８かまたはＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ＮＦ５４由来のＣＳタンパク質のアミノ酸２０７〜３９５のいずれかに相当する１８９アミノ酸；（ｉｖ）ＡｒｇまたはＧｌｙ；（ｖ）Ｂ型肝炎ｐｒｅ−Ｓ２タンパク質由来のＰｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ；および（ｖｉ）ＨＢｓＡｇを含む。７Ｇ８単離物由来の完全長ＲＴＳは、参考文献７０中に配列番号１として与えられる配列を有する（参考文献７１の図５も参照のこと）：
【０１０７】
【化２０】
2009503051.tif 000020
本ハイブリッドタンパク質は、配列番号１をコードする配列を用いて酵母で発現され得る。酵母に正常のＨＢｓＡｇと共にハイブリッドタンパク質を共発現することが好ましい。この手法は、以前にＲＴＳを用いて使用され、この共発現の産生物を「ＲＴＳ，Ｓ」という。約１：４のＲＴＳ：Ｓ比が有用である。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母における発現は、ハイブリッドタンパク質をコードする配列を有するプラスミドを使用することが好ましく、ここでこのプラスミドは：（１）このコード配列の発現を制御するためのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子から上流プロモーター；および（２）このコード配列下流のＡＲＧ３転写ターミネーターを含む。このプラスミドはまた、代表的に（３）ＬＥＵ２選択マーカー；（４）２μプラスミド配列；および（５）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおける機能的な複製起点を含む。
【０１０８】
ＲＴＳ，Ｓは、他のマラリア抗原（例えば、トロンボスポンジン関連アノニマスタンパク（ＴＲＡＰ））と組合わせられ得る。ＲＴＳ，Ｓとともに使用するための好ましい脂肪アジュバントは、水中油型乳剤、３ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ−２１サポニンが挙げられる。
【０１０９】
（脂肪アジュバントおよび界面活性剤比）
本発明の第２の局面において、組成物中の脂肪アジュバントと抗原の界面活性剤の重量比は、１０００：１より少ない。
【０１１０】
ＭＦ５９アジュバントに関して、重量比はスクアレンの量に基づいている。抗原成分中に０．１μｇ／ｍｌ界面活性剤を含む組成物において、スクアレン濃度は１００μｇ／ｍｌより少ない。抗原成分中に１μｇ／ｍｌ界面活性剤を含む組成物において、スクアレン濃度は１ｍｇ／ｍｌより少ない。抗原成分中に１０μｇ／ｍｌ界面活性剤を含む組成物において、スクアレン濃度は１０ｍｇ／ｍｌより少ないが、代表的なＭＦ５９アジュバント組成物（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）中のスクアレン濃度は、４３ｍｇ／ｍｌ（すなわち、４３００：１）である。
【０１１１】
３Ｄ−ＭＰＬアジュバントに関して、重量比は３Ｄ−ＭＰＬの総量に基づいている（すなわち、存在するすべての異なるアシル形態を含む）。抗原成分中に０．１μｇ／ｍｌ界面活性剤を含む組成物において、３Ｄ−ＭＰＬの総濃度は、１００μｇ／ｍｌより少ない。抗原成分中に１μｇ／ｍｌ界面活性剤を含む組成物において、３Ｄ−ＭＰＬの総濃度は、１ｍｇ／ｍｌより少ない。
【０１１２】
１０００：１の比が最大である。アジュバント中の油と抗原中の界面活性剤との間の干渉の可能性をさらに減少させるために、この比は減少され得る。従って、この比は、５００：１以下、４００：１以下、３００：１以下、２００：１以下、１００：１以下、５０：１以下または２５：１以下でさえあり得る。１００：１以下の比で、抗原成分中に１０μｇ／ｍｌの界面活性剤を含む組成物は、１ｍｇ／ｍｌ以下の油含有量（例えば、スクアレンまたは３Ｄ−ＭＰＬ含有量）を含む。２５：１以下の比で、抗原成分中に１０μｇ／ｍｌの界面活性剤を含む組成物は、２５０μｇ／ｍｌ以下の油含有量（例えば、スクアレンまたは３Ｄ−ＭＰＬ含有量）を含み；反対に、１００μｇ／ｍｌの３Ｄ−ＭＰＬを含む組成物は、抗原の一部として４μｇ／ｍｌ以上の界面活性剤を有する。
【０１１３】
この比は、好ましくは１．５：１より大きい（例えば、２：１以上、２．５：１以上、３：１以上、４：１以上、５：１以上またはそれ以上）。
【０１１４】
３Ｄ−ＭＰＬに関して、２．５：１と２５：１の間の比が好ましく、より好ましくは２．５：１と１０：１の間、なおより好ましくは２．５：１と５：１の間である。従って、抗原成分中に１０μｇ／ｍｌの界面活性剤を含む組成物は、２５μｇ／ｍｌ〜２５０μｇ／ｍｌの間、好ましくは２５μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの間、なおより好ましくは２５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌの間の３Ｄ−ＭＰＬ含有量を有し；反対に１００μｇ／ｍｌの３Ｄ−ＭＰＬを含む組成物は、４μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌの間、好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌの間、なおより好ましくは２０μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌの間の界面活性剤含有量を有する。
【０１１５】
（免疫原性組成物）
抗原および脂肪アジュバント（および、第２の局面において低レベルの界面活性剤）を含有することに加え、本発明の組成物は、以下により詳細に記載されるように、キャリア、アジュバント、賦形剤、緩衝液などを含有し得る。これらの非抗原性成分は、種々の供給源を有し得る。例えば、これらは、製造の間に使用される抗原またはアジュバント材料のうちの１つにおいて存在し得るか、または非抗原性成分とは別々に添加され得る。
【０１１６】
本発明の好ましい組成物は、１つ以上の薬学的キャリアおよび／または賦形剤を含有する。
【０１１７】
張度を制御するために、生理的塩（例えば、ナトリウム塩）を含有することが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得る。
【０１１８】
組成物は、一般に２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の重量オスモル濃度を有し、より好ましくは２８０〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内にある。重量オスモル濃度は、ワクチン接種により引き起こされる痛みに対して影響を有しないことが以前に報告されている［７２］が、この範囲に重量オスモル濃度を維持することが、やはり好ましい。
【０１１９】
本発明の組成物は、１つ以上の緩衝液を含有し得る。代表的な緩衝液として：リン酸緩衝液；Ｔｒｉｓ緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液；またはクエン酸緩衝液が挙げられる。緩衝液は、代表的に５〜５０ｍＭの範囲で含有され、好ましくは５〜２０ｍＭの範囲である。
【０１２０】
本発明の組成物のｐＨは、一般的に５．０と７．５の間、より代表的には至適安定性のため５．０と６．０の間、または６．０と７．０の間である。それ故本発明のプロセスは、投薬容器にパッケージされる前のバルクワクチンのｐＨを調整する工程を包含し得る。ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを含むワクチンは、トキソイドにおける（特にジフテリアトキソイドにおける）毒性の復帰変異のリスクを避けるために好ましくは６以上のｐＨを有し、従って、トキソイドおよびＨＢｓＡｇ抗原を含むワクチンは、好ましくは６．０と７．０の間のｐＨを有する。一価のＨＢｓＡｇワクチンを含む他のワクチンに関して、６より小さいｐＨが受容され得る。
【０１２１】
本発明の組成物は、好ましくは、滅菌である。
【０１２２】
本発明の組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、用量あたり１より小さいＥＵ（エンドトキシン単位、標準測定）、そして好ましくは用量あたり０．１より小さいＥＵを含む）。
【０１２３】
本発明の組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。
【０１２４】
吸着されたＨＢｓＡｇが使用される場合、最終のワクチン産物は、濁った外観をもつ懸濁液であり得る。この外観は、微生物汚染が容易に見えず、そのためこのワクチンは、好ましくは抗微生物薬剤を含むことを意味する。これは、このワクチンが複数用量容器にパッケージされる場合、特に重要である。含有物として好ましい保存剤は、２−フェノキシエタノールおよび／またはチメロサールである。しかし、たとえチロメサールが多くの既存のＨＢＶワクチンに見出されても、本発明のプロセスの間に水銀の保存剤を用いないことが推奨される。しかし、安全性のために、最終組成物が約２５ｎｇ／ｍｌより少ない水銀を含むことが好ましい。より好ましくは、この最終的なワクチン産物は、検出可能なチメロサールを含まない。これは、一般に、本発明のプロセスにおいて抗原調製物の添加前に抗原調製物から水銀保存剤を除去するか、組成物を作製するために用いられる成分の調製の間にチメロサールの使用を避けることによって達成される。ＨＢｓＡｇは、ＨＢｓＡｇ調製の間使用され得るチメロサールのような任意の水銀の保存剤を除去するために透析にかけられ得る（例えば、システインを用いて）［７３、７４］。
【０１２５】
製造の間に、所望の最終濃度を与えるための成分の希釈は、通常、ＷＦＩ（注射用水）を用いて実施される。
【０１２６】
本発明の組成物中のリン酸アルミニウムの濃度は、Ａｌ３＋によって表され、好ましくは、５ｍｇ／ｍｌより少ない（例えば、４ｍｇ／ｍｌ以下、３ｍｇ／ｍｌ以下、２ｍｇ／ｍｌ以下、１ｍｇ／ｍｌ以下など）。
【０１２７】
本発明の組成物中のＨＢｓＡｇの濃度は、好ましくは、１００μｇ／ｍｌより少ない（例えば、９０μｇ／ｍｌ以下、８０μｇ／ｍｌ以下、７０μｇ／ｍｌ以下、６５μｇ／ｍｌ以下、６０μｇ／ｍｌ以下、５５μｇ／ｍｌ以下、５０μｇ／ｍｌ以下、４５μｇ／ｍｌ以下、４０μｇ／ｍｌ以下など）。約４０μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌの濃度が代表的である。
【０１２８】
本発明の組成物は、好ましくは、患者に０．５ｍｌ用量で投与される。０．５ｍｌ用量に関して、通常の分散（例えば、０．５ｍｌ±０．０５ｍｌ）を含むことが理解される。
【０１２９】
本発明は、個々の用量へのパッケージングに適したバルク材料を提供し得、次いで患者に投与するために分配され得る。上が言及される濃度は、最終的にパッケージされた用量の代表的な濃度であり、そのためバルクワクチン中の濃度はより高くてもよい（例えば、希釈によって最終濃度まで減少される）。
【０１３０】
本発明の組成物は、一般に、水性形態である。
【０１３１】
（本発明の組成物のパッケージング）
抗原とアジュバントを合わせた後、本発明のこのプロセスは、抽出する工程および０．５ｍｌ混合物サンプルを容器にパッケージする工程を包含し得る。複数回投与の状況に関して、複数回投薬量が抽出され１つの容器に一緒にパッケージされる。上が言及されるように、代替の取り決めにおいて、使用時に即座に混合するために、抗原およびアジュバントは別個にパッケージされる。
【０１３２】
本発明のプロセスは、使用のためにワクチンを容器にパッケージするさらなる工程を含み得る。適した容器として、バイアルおよび使い捨てシリンジ（好ましくは滅菌されたもの）が挙げられる。
【０１３３】
本発明の組成物が、バイアルにパッケージされる場合、これらは、好ましくは、ガラスまたはプラスチック材料から作製される。このバイアルは、好ましくは、上記組成物がバイアルに添加される前に滅菌され得る。ラテックス感受性患者にともなう問題を避けるために、バイアルは、好ましくは、ラテックスを含まないストッパーでシールされる。このバイアルは、単回用量のワクチンを含み得るか、またはそれは、２回以上の用量（「複数回用量」バイアル）、例えば、１０回用量を含み得る。複数回用量バイアルを用いる場合、各用量は、厳密な無菌状態下で滅菌針およびシリンジで引き出されるべきであり、バイアル内容物を汚染することを避けるよう注意をする。好ましいバイアルは、色のないガラスから作製される。
【０１３４】
バイアルは、あらかじめ充填されたシリンジがキャップに挿入され得るように適したキャップ（例えば、Ｌｕｅｒロック）を有し得、シリンジの内容物は、バイアル中に排出され得、バイアル中の内容物は、シリンジに戻され得る。バイアルからシリンジをはずした後、次いで針は患者に添えられ、組成物が投与され得る。このキャップは、好ましくは、シールまたはカバーの内側に位置され、このシールまたはカバーは、キャップが接触され得る前に取り除かれるはずである。
【０１３５】
上記組成物が、シリンジ中にパッケージされる場合、このシリンジは、通常、シリンジに取り付けられた針を有さないが、別個の針が組み立て、使用するためにシリンジとともに提供され得ることが好ましい。安全針が好ましい。１−インチ２３−ゲージ、１−インチ２５−ゲージおよび５／８−インチ２５−ゲージの針が代表的である。シリンジには、その上に内容物のロット番号および使用期限日がプリントされ得る剥ぎ取りラベルが提供され得、記録保持を容易にする。このシリンジ中のプランジャーは、好ましくは、ストッパーを有し、プランジャーが吸引の間に偶発的に外れることを防ぐ。ブチルゴムプランジャーストッパーが好ましい。これらのシリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有し得る。使い捨てシリンジは、単回用量のワクチンを含む。このシリンジは、一般に、先端部キャップを有し、この先端部を針の取り付けの前にシールし、そしてこの先端部キャップは、好ましくはブチルゴムから作製される。このシリンジと針とが別個にパッケージされる場合、次いでこの針は、好ましくは、ブチルゴムシールドと合うように作られる。Ｇｒｅｙブチルゴムが好ましい。好ましいシリンジは、商標名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」ＴＭの下で販売されるものである。
【０１３６】
ガラス容器（例えば、シリンジまたはバイアル）が用いられる場合、ソーダ石灰ガラス製よりもホウケイ酸ガラス製の容器を用いることが好ましい。
【０１３７】
組成物が容器中にパッケージされた後、この容器は、次いで、配布のために箱内、（例えば、段ボールの箱の内）に囲われ得、そしてこの箱は、ワクチンの詳細、例えば、その商標名、ワクチン中の抗原のリスト（例えば、「Ｂ型肝炎組換え体」など）、容器の説明（例えば、「使い捨て予備充填Ｔｉｐ−Ｌｏｋシリンジ」または「１０×０．５ｍｌ単回用量バイアル」）、その用量（例えば、「各々１回の０．５ｍｌ用量を含む」）、警告（例えば、「成人使用のみ」または「小児使用のみ」）、使用期限日、適応症（例えば、「腎不全を有する患者（血液透析前および血液透析患者を含む）のためのすべて公知のサブタイプにより引き起こされるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する能動性免疫、１５歳より上」など）、患者番号などでラベルされる。各箱は、２つ以上のパッケージされたワクチン、例えば、５または１０のパッケージされたワクチン（特にバイアルについて）を含み得る。このワクチンがシリンジ中に含まれる場合、この箱は、シリンジの絵を示し得る。
【０１３８】
ワクチンは、ワクチンの詳細、例えば、投与のための指示書、ワクチン内の抗原の詳細などを含む印刷物とともに一緒に（例えば、同じ箱中に）パッケージされ得る。これらの指示書はまた、警告、例えば、ワクチン接種の後のアナフィラキシー反応の場合、直ちに利用できるようにアドレナリンの溶液を準備しておくことなどを含み得る。
【０１３９】
このパッケージされたワクチンは、好ましくは、２℃〜８℃の間で貯蔵される。それは、凍結されるべきではない。
【０１４０】
（処置およびワクチンの投与の方法）
本発明の組成物は、ヒト患者への投与に適しており、そして本発明は、患者における免疫応答を惹起する方法を提供し、本発明の組成物を患者に投与する工程を包含する。
【０１４１】
本発明はまた、医薬における使用のための本発明の組成物を提供する。
【０１４２】
本発明はまた、患者への投与のための医薬の製造における（ｉ）界面活性剤の不存在下において実質的に精製される抗原；および（ｉｉ）脂肪アジュバントの使用を提供する。
【０１４３】
本発明はまた、患者への投与のための医薬の製造における（ｉ）界面活性剤を含む抗原成分、および（ｉｉ）脂肪アジュバントの使用を提供し、ここで（ｉｉ）のアジュバントと（ｉ）の界面活性剤の重量比は１０００：１より小さい。
【０１４４】
本発明の免疫原性組成物は、例えば本発明の使用および／またはＢ型肝炎ウイルス感染の処置に関して好ましくはワクチンである。本発明の組成物を受容している患者は、好ましくは第１の免疫から６週後に測定される血清抗ＨＢｓＡｇ  ＧＭ力価が５００ｍＩＵ／ｍｌ以上を有する。より好ましくは、１２ヶ月後に測定されたときこの力価が５００ｍＩＵ／ｍｌ以上である。
【０１４５】
これら組成物は、既存のアジュバントワクチン（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ）（例えば、ＥＮＧＥＲＩＸ  ＢＴＭ製品）が無効である患者においてＢ型肝炎ウイルス感染に対する保護および／または処置に特に有用である。この組成物が特に適している患者のサブグループとして；免疫不全の患者；血液透析患者；血液透析前の患者；腎機能不全（ｒｅｎａｌ  ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を有する患者；腎不全（ｒｅｎａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ）を有する患者；血液透析を必要とする前の早期腎不全を有する患者；肝移植を待っている（例えば、順番待ちリスト上の）患者；末期の腎不全を有する患者；臓器移植（特に肝移植）を受けた患者（例えば、本発明のワクチンの第１の投薬前６ヶ月間に）；Ｂ型肝炎免疫グロブリン（ＨＢＩｇ）処置を受容する患者（または受けた患者、例えば、本発明のワクチンの第１の投薬前６ヶ月間に）；ＨＬＡ  ＤＱ２ハプロタイプを有する患者［７５］；ＨＬＡ  ＤＲ３ハプロタイプを有する患者［７５］；ＨＬＡ  ＤＲ７ハプロタイプを有する患者［７５］；ＨＬＡ対立遺伝子ＤＱＢ１＊０２０２を有する患者［７６］；ＨＩＶに感染した患者；慢性ＨＢＶ保有者；最近輸血を受けた患者；免疫抑制薬を受容する患者；ＡＩＤＳを患っている患者；腹水を有する患者；肝硬変を有する患者；脳症を有する患者；インターフェロン治療、特にｉｆｎ−αを受容する患者；タバコを吸う患者；葉巻を吸う患者；３０ｋｇ／ｍ２以上のボディマス指数を有する患者；ＨＢｓＡｇワクチンを受けたことがあるがセロコンバージョンしていない患者（例えば、標準的な最初の投薬スケジュール（例えば、ＥＮＧＥＲＩＸ  ＢＴＭの３回投与）後、１０ｍＩＵ／ｍｌより少ない血清抗ＨＢｓＡｇ力価を有する）が挙げられる。
【０１４６】
これらの患者は、３０ｍｌ／分より小さいクレアチニンクリアランス速度（通常の健常な範囲が男性において、約１００〜１４０ｍｌ／分、女性において、約９０〜１３０ｍｌ／分である）を有し得る。患者は、好ましくは少なくとも１５歳（例えば１５〜４０歳の間、１５〜６０歳の間、４０〜６０歳の間、または６０歳以上）である。５５歳より上の患者は、いずれの内在する病気にも関わらず、有効に処置され得る。
【０１４７】
本発明の組成物は、例えば、三角筋への筋肉内注射により投与され得る。
【０１４８】
本発明の組成物が、アルミニウムベースのアジュバントを含む場合、成分の沈殿が貯蔵の間に生じ得る。それ故、この組成物は、患者への投与の前に振盪しなければならない。振盪された組成物は、不透明な白い懸濁液である。
【０１４９】
（本発明の好ましいプロセスおよびワクチン）
免疫原性組成物を調製するための好ましいプロセスは、（ｉ）ポリソルベート２０を含むＨＢｓＡｇ成分と（ｉｉ）リン酸アルミニウム塩に吸着される３Ｄ−ＭＰＬを含むアジュバント成分とを組み合わせる工程を包含し、３Ｄ−ＭＰＬとポリソルベート２０の重量比が１０００：１より小さい組成物を与える。
【０１５０】
好ましい免疫原性組成物は、（ａ）組成物がＨＢｓＡｇ、ポリソルベート２０、３Ｄ−ＭＰＬおよびリン酸アルミニウムアジュバントを含み；そして（ｂ）３Ｄ−ＭＰＬとポリソルベート２０の重量比が１０００：１より小さい免疫原性組成物である。３Ｄ−ＭＰＬおよびＨＢｓＡｇは、好ましくはリン酸アルミニウムに吸着される。ＨＢｓＡｇ濃度は、約４０μｇ／ｍｌである。３Ｄ−ＭＰＬ濃度は、約１００μｇ／ｍｌである。Ａｌ３＋濃度は、約１ｍｇ／ｍｌである。
【０１５１】
本発明の別の好ましい組成物は、（ｉ）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから精製されるＨＢｓＡｇ、および（ｉｉ）リン酸アルミニウムと３Ｄ−ＭＰＬとの混合物を含むアジュバントを含む。ＨＢｓＡｇ濃度は、約４０μｇ／ｍｌである。３Ｄ−ＭＰＬ濃度は、約１００μｇ／ｍｌである。Ａｌ３＋濃度は、約１ｍｇ／ｍｌである。ＨＢｓＡｇは、ポリソルベート２０を含み、油：界面活性剤の重量比（すなわち、３Ｄ−ＭＰＬ：ポリソルベート２０の重量比）は、２．５：１と１００：１の間、すなわちポリソルベート２０は、１μｇ／ｍｌと４０μｇ／ｍｌの間のレベル（すなわち、１００μｇＨＢｓＡｇあたり２．５μｇと１００μｇの間のポリソルベート２０）で存在する。この比は、好ましくは２．５：１と２５：１の間であり、すなわちポリソルベート２０は４μｇ／ｍｌと４０μｇ／ｍｌの間のレベルで存在する。３Ｄ−ＭＰＬおよびＨＢｓＡｇは両方リン酸アルミニウムに吸着される。
【０１５２】
（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、専らＸからなり得るか、またはさらなる何かを含有し得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０１５３】
用語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくても良い。必要である場合、語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【０１５４】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１５５】
詳細に述べられていなければ、２つ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、混合の任意の特定の順序を要求しない。それ故、成分は任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在するとき、そのときは、２つの成分が互いと組み合わされ得、そして次にこの組み合わせが、第３の成分と組み合わされ得るなどである。上記のように、成分は製造中に混合され得るか、または使用時に即座に混合され得る。
【０１５６】
抗原がアジュバントに「吸着される」と記載される場合、少なくとも５０％（重量で）の抗原が吸着されることが好ましい（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上）。ＨＢｓＡｇは完全に吸着される、すなわち上清に検出されないことが好ましい。
【０１５７】
動物（および特にウシ）材料が細胞の培養に使用される場合、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）のない、および特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）のない供給源から取得しなければならない。
【０１５８】
ブチルゴムは、クロロブチルゴムおよびブロモブチルゴムを含む。
【０１５９】
イオン化可能な基は、明細書中の式に示される中性の形態で存在し得るか、または荷電した形態で存在し得る（例えば、ｐＨに依存して）ことが理解される。従って、ホスフェート基は、−Ｐ−Ｏ−（ＯＨ）２として示され得、この式は、単に代表的な中性ホスフェート基であり、他の荷電した形態は、本発明により包含される。同様に、糖環は、開いた形態または閉じた形態で存在し得、閉じた形態は、本明細書中の構造式で示されるが、開いた形態もまた、本発明により包含される。
【実施例】
【０１６０】
（本発明を実施するための様式）
３つの異なるＨＢｓＡｇ調製物を調べた：
・Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞に発現されたＨＢｓＡｇ、非イオン性界面活性剤を用いて精製される。
・Ｈａｎｅｎｓｕｌａ酵母細胞に発現されたＨＢｓＡｇ、非イオン性界面活性剤を用いて精製される。
・ｐｒｅＳ２配列を有するＣＨＯ細胞に発現されたＨＢｓＡｇ、界面活性剤の使用なしに精製される。
【０１６１】
２つの異なるアジュバントを調べた：
・水酸化アルミニウム（１ｍｇ／ｍｌ）
・クエン酸緩衝液中のＭＦ５９（１３ｍＭ）。
【０１６２】
６つの処方物を調製し、各々は、２０μｇ／ｍｌ  ＨＢｓＡｇ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０１％メルチオレートを有する：
【０１６３】
【化２１】
2009503051.tif 000021
ＭＦ５９は、霊長類において組み替えＨＢｓＡｇに対する抗体応答を増強することが報告されている［７７］。Ａ〜Ｄの処方物を、ミドリザルを免疫するために使用した。６つの群のサルを０日目および２８日目に筋肉内免疫した。０時間、次いで８週目まで２週ごとに採血を実施し、抗ＨＢｓＡｇ力価（ＧＭＴ）をＥＬＩＳＡにより測定した。力価を１．０に基準化し、これは各群の１４日目であり、基準化した結果は以下のとおりであった：
【０１６４】
【化２２】
2009503051.tif 000022
４２日目と５６日目の力価をみると、これらのデータは、ＣＨＯ発現抗原に対してＭＦ５９がアルミニウムアジュバントより大いに著しく力価を増加したことを示す（４２日目で１６０倍の増加対２０倍の増加）が、この状態は、Ｈａｎｅｎｓｕｌａ発現抗原の逆である（４２日目で８５倍の増加対１１０倍の増加）。
【０１６５】
同様な実験を、処方物Ｂ、ＥおよびＦを使用してヒヒで行った。ＧＭＴ値を最初の注射から１４日後で測定し、Ｆ群の値と比較して、以下のとおりであった：
【０１６６】
【化２３】
2009503051.tif 000023
ここで、アルミニウムアジュバントの代わりにＭＦ５９を使用することは、低ＧＭＴ応答（ＥおよびＦ群と比較して）を導く一方で増加が期待される（Ｂ群および参考文献７７）。
【０１６７】
処方物ＥおよびＦを使用する最初の注射から２８日後の抗ＨＢｓＡｇ応答もまた、アカゲザル、ミドリザルおよびＣ３Ｈマウスで比較した（ＮＢ：マウスには６０％ＨＢｓＡｇ用量を与えた）。加えてＧＭＴ値を測定し、応答者の数もまた数えた（すなわち、１０ｍＩＵ／ｍｌより大きい力価を示す動物）。Ｆ群に基準化した結果は以下のとおりであった：
【０１６８】
【化２４】
2009503051.tif 000024
それ故、マウスと対照的に、霊長類においてアジュバントとしてＭＦ５９を使用することは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ＨＢｓＡｇにおいてＧＭＴ値および応答者レベルの両方を実質的に減少させることになった。
【０１６９】
最終的に、処方物ＥおよびＦを用いるブースター予防接種により生じるＧＭＴの増加を、血清反応陽性のミドリザルで測定した。力価をブースター投与前、次いで再度２８日後に測定し、力価における増加は以下のとおりであった：
【０１７０】
【化２５】
2009503051.tif 000025
同様に水酸化アルミニウムアジュバントより低倍量の増加を与え、ＭＦ５９はブースター投与から２８日後、低ＧＭＴ値を与えた。
【０１７１】
それ故、全体的にＭＦ５９は、霊長類において酵母発現ＨＢｓＡｇに関してはアルミニウムアジュバントより悪いが、ＣＨＯ発現ＨＢｓＡｇに関しては良好であるようだ。これらの結果は、（ａ）酵母から精製されたＨＢｓＡｇにおける残留界面活性剤と（ｂ）ＭＦ５９アジュバントにおける過剰のスクアレン油の間の干渉により説明され得る。油として、スクアレンは、水性条件において界面活性剤の作用に左右され、逆もまた同じであり、抗原中の界面活性剤は、アジュバント中の油と不適合性であることが提案される。この不適合性は、界面活性剤（例えば、ＣＨＯ発現材料として）を使用することなしにＨＢｓＡｇを精製することによるか、油が確実に抗原中の界面活性剤と干渉するぐらい過量に存在しないようにすることによるいずれかで対処され得る。
【０１７２】
ＭＦ５９−アジュバントＨＢｓＡｇ組成物において、ある容量のＭＦ５９は、ある容量の抗原溶液と合わせられる。従って１００ｍｌ容量において、５０ｍｌ  ＭＦ５９および５０ｍｌ  ＨＢｓＡｇ溶液が存在する。この１００ｍｌは、ＭＦ５９由来のスクアレン２．１５ｇを含み、４０μｇ／ｍｌのＨＢｓＡｇ濃度で２ｍｇのＨＢｓＡｇを含む。１００μｇ  ＨＢｓＡｇあたり２５μｇのポリソルベート２０濃度で［３５］、１００ｍｌは、０．５ｍｇポリソルベート２０を含む。代表的なＭＦ５９アジュバントワクチンにおける油：界面活性剤比は、従って４３００：１である。１０００：１より小さくなるまで過剰の油を減少させることにより、アジュバント中の油と抗原中の界面活性剤の間の干渉を実質的に減らし得、従って、干渉を減少させる。
【０１７３】
本発明は、例系のみによって記載され、改変は、本発明の範囲および精神の中にあるままでもなされ得る。
【０１７４】
参考文献（その内容は、本明細書中に参考として援用される）
【０１７５】
【化２６】
2009503051.tif 000026
【０１７６】
【化２７】
2009503051.tif 000027
【配列表】
2009503051000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月3日(2008.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009503051000001.app
【国際調査報告】
2009503051.tif 000031
2009503051.tif 000032
2009503051.tif 000033
2009503051.tif 000034