(57)【要約】  本出願は、妊娠女性において、胎児由来のある種の遺伝子（例えば、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＡＰＣ、ＣＡＳＰ８、ＲＡＲＢ、ＳＣＧＢ３Ａ１、ＤＡＢ２ＩＰ、ＰＴＰＮ６、ＴＨＹ１、ＴＭＥＦＦ２、及びＰＹＣＡＲＤ）が高メチル化され、母体起源の同遺伝子はメチル化されないという発見を記載する。この発見は、試料中の胎児ＤＡＮの存在の普遍的な指標として役立つ、妊娠女性由来の生物試料におけるこれらのメチル化胎児遺伝子の１以上を容易に検出することができる。これらの胎児メチル化マーカーは、胎児ＤＮＡの質及び量がモニターされる非侵襲的な分析プロセスのために正の対照として特に有用である。これらの新規に同定された胎児マーカーはまた、ある種の妊娠に関連した状態の診断に直接測定され得る。
2009535049.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠女性由来の生物試料中の胎児ＤＮＡを検出する方法であって、
（ａ）メチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡを別個に修飾する薬物で該試料を処置し；及び
（ｂ）該試料中のＲＡＳＳＦ１Ａ、ＡＰＣ、ＣＡＳＰ８、ＲＡＲＢ、ＳＣＧＢ３Ａ１、ＤＡＢ２１Ｐ、ＰＴＰＮ６、ＴＨＹ１、ＴＭＥＦＦ２又はＰＹＣＡＲＤのＤＮＡ配列を検出し、ここで、該ＤＮＡ配列の存在が試料中の胎児ＤＮＡの存在を指示し、該ＤＮＡ配列の不存在が試料中の胎児ＤＮＡの不存在を指示する
工程を含む前記方法。
【請求項２】
前記試料が全血である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が血漿である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が尿である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試料が唾液である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記薬物が非メチル化ＤＮＡを消化するが、メチル化ＤＮＡを消化しない、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記薬物がメチル化感受性酵素である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記メチル化感受性酵素がメチル化感受性制限酵素である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記メチル化感受性制限酵素がＨｐａＩＩ又はＢｓｔＵＩである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記薬物が亜硫酸水素塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｂ）が増幅プロセスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記増幅プロセスがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＣＲがリアルタイムＰＣＲである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｂ）がＤＮＡ配列の量を測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）が試料中の胎児ＤＮＡの存在を指示し、さらに、
（ｃ）第２試料中の第２胎児ＤＮＡ配列の量を測定し、ここで、第２試料が薬物で処理される前の工程（ａ）の試料と同一であり、第２配列がＲＡＳＳＦ１Ａ、ＡＰＣ、ＣＡＳＰ８、ＲＡＲＢ、ＳＣＧＢ３Ａ１、ＤＡＢ２１Ｐ、ＰＴＰＮ６、ＴＨＹ１、ＴＭＥＦＦ２又はＰＹＣＡＲＤでなく；及び
（ｄ）該２配列の量と標準対照とを比較し、ここで、対照からの第２配列の量の増加が妊娠に関連した状態の存在又はそれを発症する危険性の増加を指示する
工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記工程（ｃ）の第２試料が、メチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡを別個に修飾するいずれの薬物でも処理されていない、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記工程（ｃ）の第２試料が、第２胎児ＤＮＡ配列の量が測定される前に、薬物で処理される請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記工程（ｃ）の第２試料が、第２胎児ＤＮＡ配列の量が測定される前に、メチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡを別個に修飾する第２の異なった薬物で処理される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
妊娠に関連した状態が、子癇前症、早期陣痛又は子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｂ）が試料中の胎児ＤＮＡの存在を指示し、さらに、
（ｃ）第２試料中の第２胎児ＤＮＡを検出し、ここで、第２試料が薬物で処理される前の工程（ａ）の試料と同一であり、第２配列がＲｈＤ血液型の遺伝子、ＡＢＯ血液型の遺伝子、ＲｈＣ血液型の遺伝子、ＲｈＥ血液型の遺伝子、ＨＬＡ型の遺伝子、Ｙ染色体上に位置した遺伝子、又は所定の突然変異を含む遺伝子であり、第２配列の存在が胎児ゲノム中にＲｈＤ血液型、ＡＢＯ血液型、ＲｈＣ血液型、ＲｈＥ血液型、ＨＬＡ型、Ｙ染色体又は突然変異の存在を指示する
工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｃ）の第２試料がメチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡを別個に修飾するいずれの薬物でも処理されていない、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｃ）が増幅プロセスである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記増幅プロセスがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＣＲがリアルタイムＰＣＲである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
妊娠女性における妊娠に関連した状態を検出する方法であって、
（ａ）メチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡを別個に修飾する薬物で女性から得た生物試料を処理し；
（ｂ）該試料中のＲＡＳＳＦ１Ａ、ＣＡＳＰ８、ＲＡＲＢ、ＳＣＧＢ３Ａ１、ＤＡＢ２１Ｐ、ＰＴＰＮ６、ＴＨＹ１、ＴＭＥＦＦ２又はＰＹＣＡＲＤのＤＮＡ配列の量を検出し；及び
（ｃ）該ＤＮＡ配列の量と標準対照とを比較し、ここで、対照からの増加が妊娠に関連した状態の存在又はそれを発症する危険性の増加を指示する
工程を含む前記方法。
【請求項２７】
前記薬物が非メチル化ＤＮＡを消化するが、メチル化ＤＮＡを消化しない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記薬物がメチル化感受性酵素である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記メチル化感受性酵素がメチル化感受性制限酵素である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記メチル化感受性制限酵素がＨｐａＩＩ又はＢｓｔＵＩである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記薬物が亜硫酸水素塩を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
工程（ｂ）が増幅プロセスを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記増幅プロセスがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＰＣＲがリアルタイムＰＣＲである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
妊娠に関連した状態が、子癇前症、早期陣痛又は子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）である、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容が全ての目的のために全体として参照により本明細書中に援用される、２００６年５月３日に出願された米国仮特許出願第６０／７９７，５０６号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
妊娠中又は分娩中の潜在的な合併症及び胎児の遺伝的欠陥を含む妊娠に関連した状態の早期検出は極めて重大である。これは、母体及び胎児の両方の安全に必要な早期の医療介入を可能にするためである。出生前診断は、絨毛膜標本採取、絨毛膜試料（ＣＶＳ）又は羊水穿刺などの手法を通じて胎児から単離された細胞を用いて日常的に行われている。しかしながら、これらの従来法は、侵襲的であり、最も注意深い対処にもかかわらず、母体及び胎児の両方に対するかなりのリスクを与える（Ｔａｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  １：１２８７−１２９３，１９８６）。
【０００３】
これらの侵襲的なアプローチに対する代替手段が、出生前スクリーニングについて開発されつつあり、例えば、胎児異常を検出することであり、これは、いくつかのタイプの胎児細胞が母体循環において見出すことができるという発見に基づいており（Ｊｏｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．１５：９２１−９３１，１９９５）、より重要なことには、循環している細胞を含まない胎児ＤＮＡが母体の血漿及び血清において検出可能である（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｌａｎｃｅｔ  ３５０：４８５−４８７，１９９７）。母性血液中の胎児ＤＮＡの量は、胎児細胞を単離し、濃縮するための工程を必要とする代替の方法とは対照的に、血漿又は血清の複雑な処置なしに遺伝的分析には十分であることを示している。胎児リーサス（ｒｈｅｓｕｓ）Ｄ（ＲｈＤ）遺伝子型（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３９：１７３４−１７３８，１９９８）、胎児性決定（Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１５０２，２００２）、いくつかの胎児障害の診断（Ａｍｉｃｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４６：３０１−３０２，２０００；Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３５６：１１７０，２０００；ａｎｄ  Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｌａｎｃｅｔ  ３６０：９９８−１０００，２００２）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの技術を用いて、母性血漿及び血清における胎児ＤＮＡを検出することによって達成されている。
【０００４】
さらに、母性血漿／血清における胎児ＤＮＡの定量的異常性は、子癇前症（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：１８４−１８８，１９９９  ａｎｄ  Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１８４：４１４−４１９，２００１）、胎児トリソミー２１（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：１７４７−１７５１，１９９９  ａｎｄ  Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．２０：７９５−７９８，２０００）、及び妊娠悪阻（Ｓｅｋｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７：２１６４−２１６５，２００１）において報告されている。出生前の遺伝的分析のための母性血液中の胎児核酸の検出はまた、米国特許第６，２５８，５４０号に開示されている。
【０００５】
胎児ＤＮＡは妊娠女性の血液、例えば血清又は血漿の無細胞部分における母性ＤＮＡと共存しているので、胎児ＤＮＡに基づく診断における正確な結果を確保するために、胎児起原のＤＮＡと母体起原のＤＮＡとを区別する必要がある。胎児ＤＮＡ及び母性ＤＮＡがそれらの異なるメチル化プロフィールによって区別され得ることは、２００３００４４３８８として公開された米国特許出願第０９／９４４，９５１に最初に開示された。Ｌａｎｄｅｓら（米国特許出願公開第２００３０２１１５２２号）もまた、異なるメチル化マーカーが出生前診断に必要であると提案していた。他方、胎児ＤＮＡに基づく試験方法の効率を確保し、このような方法から得られる胎児ＤＮＡの不十分な回収に起因した試験結果の誤った解釈を排除するために、試験手法に使用される試料中の胎児ＤＮＡの存在及び量を測定することが必要である。したがって、一般に試験試料における胎児ＤＮＡの存在又は不存在の普遍的な指標として効果的に用いることができる胎児ＤＮＡマーカーを同定することが望まれる。このような胎児ＤＮＡマーカーは、母性のその対応物を一貫して均一に区別し、マーカーの存在又は不存在は、母性ＤＮＡのバックグラウンドを超えて容易に測定され、一般に胎児ＤＮＡの存在又は不存在と直接的に一致することができることが重要である。本発明は、この必要性及び他の関連した必要性を扱う。
【０００６】
本出願では、多数のヒト遺伝子が、胎児組織（例えば、胎盤由来）及び母性組織における非常に区別されたメチル化パターンを有するものとして初めて同定された。胎児由来の場合、これらの遺伝子は、均一に高レベルでメチル化されるが、母性血液に相当量の細胞を含まないＤＮＡを放出する母性起原由来の遺伝子は、均一に同様の高レベルで非メチル化される。これらの特徴は、十分量の胎児ＤＮＡがこのプロセス中に試料において回収されたことを確かめるという目的で、出生前診断プロセスの用いられた試験試料の内部の正の対照として効果的に遺伝子を用いることを可能にする。起原に関しては、これらの遺伝子のメチル化状態における均一の高レベルのために、これらの遺伝子は、特に確実な対照であり、胎児ＤＮＡの定性及び定量の両方を示す。胎児マーカーとしてのこれらの遺伝子の別の利点は、非メチル化母性対応物とは対照的に、メチル化された胎児バージョンのみの検出において相対的に容易であることである。さらに、本出願に記載されている胎児遺伝子はまた、妊娠に関連したある種の状態又は障害のための診断マーカーとして直接的に使用可能である。
【発明の開示】
【０００７】
発明の簡単な概要
本発明の第１局面では、妊娠女性の生物試料において胎児ＤＮＡを検出する方法を提供する。本方法は、下記：（ａ）メチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡを別個に修飾する薬物で試料を処理する工程；及び、（ｂ）該試料中のＲＡＳＳＦ１Ａ、ＡＰＣ、ＣＡＳＰ８、ＲＡＲＢ、ＳＣＧＢ３Ａ１、ＤＡＢ２１Ｐ、ＰＴＰＮ６、ＴＨＹ１、ＴＭＥＦＦ２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ ０１６１９２）又はＰＹＣＡＲＤ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ ０１３２５８）のＤＮＡ配列を検出する工程を含む。ＤＮＡ配列の存在は、試料中の胎児ＤＮＡの存在を指示し、ＤＮＡ配列の不存在は試料中の胎児ＤＮＡの不存在を指示する。
【０００８】
いくつかの態様では、妊娠女性からの試料は全血である。代替として、試料は、血漿、血清、尿又は唾液である。いくつかの態様では、メチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡを別個に修飾することができる薬物は、非メチル化ＤＮＡを消化するが、メチル化ＤＮＡを消化しない。この薬物は、メチル化感受性酵素、特にメチル化感受性制限酵素、例えばＨｐａＩＩ又はＢｓｔＵＩであってもよい。他の態様では、薬物は亜硫酸水素塩を含んでもよい。
【０００９】
いくつかの態様では、本方法の工程（ｂ）は、増幅プロセスを含む。例示的な態様では、増幅プロセスはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えばリアルタイムＰＣＲである。他の態様では、工程（ｂ）は、ＤＮＡ配列の定量を測定する。
【００１０】
いくつかの態様では、工程（ｂ）が試料中の胎児ＤＮＡの存在を指示する場合、本方法は、さらに、（ｃ）第２試料中の第２胎児ＤＮＡ配列の量を測定する工程を含んでもよい。第２試料は、メチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡを別個に修飾する薬物で処理される前の工程（ａ）の試料と同一であり、第２配列は、ＲＡＳＳＦｌＡ、ＡＰＣ、ＣＡＳＰ８、ＲＡＲＢ、ＳＣＧＢ３Ａ１、ＤＡＢ２ＩＰ、ＰＴＰＮ６、ＴＨＹ１、ＴＭＥＦＦ２又はＰＹＣＡＲＤであり、（ｄ）第２配列の量と標準対象とを比較することを含む。対照からの第２配列の量の増加が検出されると、妊娠に関連した状態の存在又はこのような状態を発症する危険性の増大のいずれかの指標として解釈される。あるケースでは、工程（ｃ）の第２試料は、メチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡを別個に修飾する薬物で処理されておらず、他のケースでは、工程（ｃ）の第２試料は、第２胎児ＤＮＡ配列の量が測定される前に薬物で処理される。例えば、工程（ｃ）の第２試料は、第２胎児ＤＮＡ配列の量が測定される前にメチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡを別個に修飾する第２の別の薬物で処理される。この方法は、妊娠中に、種々の妊娠に関連した条件の存在又はそれを発症する危険性の増加を検出するために適している。このような条件のいくつかの例には、子癇前症、早期陣痛又は子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）が挙げられる。
【００１１】
他の態様では、工程（ｂ）は試料中の胎児ＤＮＡの存在を指示する場合、本方法は、さらに、（ｃ）第２試料中の第２胎児ＤＮＡ配列を検出する工程を含んでもよい。第２試料は、ＲｈＤ血液型の遺伝子、ＡＢＯ血液型の遺伝子、ＲｈＣ血液型の遺伝子、ＲｈＥ血液型の遺伝子、ＨＬＡ型の遺伝子、又はＹ染色体に位置した遺伝子、又は所定の突然変異を含む遺伝子であり、第２配列の存在は、胎児ゲノムの遺伝子内の特定のＲｈＤ血液型、特定のＡＢＯ血液型、特定のＲｈＣ血液型、特定のＲｈＥ血液型、特定のＨＬＡ型、Ｙ染色体又は所定の突然変異を指示する。いくつかのケースでは、工程（ｃ）の第２試料は、メチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡを別個に修飾する薬物で処理されていない。場合により、工程（ｃ）は、増幅プロセスを含む。例示的な態様では、増幅工程は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えばリアルタイムＰＣＲである。
【００１２】
本発明の第２の局面では、妊娠女性におくて妊娠に関連した状態を検出する方法が提供される。この方法は、（ａ）メチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡを別個に修飾する薬物で女性から得た生物試料を処理する工程；（ｂ）該試料中のＲＡＳＳＦ１Ａ、ＣＡＳＰ８、ＲＡＲＢ、ＳＣＧＢ３Ａ１、ＤＡＢ２１Ｐ、ＰＴＰＮ６、ＴＨＹ１、ＴＭＥＦＦ２又はＰＹＣＡＲＤのＤＮＡ配列の量を検出する工程；（ｃ）該ＤＮＡ配列の量と標準対照とを比較する工程であって、対照からの増加が妊娠に関連した状態の存在又はそれを発症する危険性の増加を指示する前記工程を含む。
【００１３】
いくつかの態様では、メチル化ＤＮＡ又は非メチル化ＤＮＡを別個に修飾することができる薬物は、非メチル化ＤＮＡを消化するが、メチル化ＤＮＡを消化しない。１つの可能性は、薬物がメチル化感受性酵素、例えばメチル化感受性制限酵素（例えば、ＨｐａＩＩ又はＢｓｔＵＩ）であることである。別の可能性は、薬物が亜硫酸水素塩を含むことである。
【００１４】
いくつかの態様では、この方法の工程（ｂ）は、増幅プロセスを含み、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えばリアルタイムＰＣＲを含む種々の手段によって達成されてもよい。この方法は、子癇前症、早期陣痛又は子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）を含む多数の妊娠に関連した状態の診断、モニタリング又はリスク評価に適している。
【００１５】
定義
用語「妊娠に関連した障害」とは、本出願で使用されるとき、妊娠女性、女性が懐妊している胎児、又は女性と胎児の両方に影響を与え得るいずれかの状態又は疾患を指す。このような状態又は疾患は、限定された期間、例えば妊娠中又は分娩中にその症状を現す場合もあり、あるいはその出生後の胎児の全寿命に存続する場合がある。妊娠に関連した障害のいくつかの例には、子癇前症、早期陣痛、及び子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）が含まれる。
【００１６】
本出願では、用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）、及び一本鎖又は二本鎖形態のいずれかのその重合体を意味する。特に限定がなければ、この用語には、参照核酸と類似した結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同じように代謝される天然のヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸が含まれる。他に指示がなければ、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたその改変体（例えば、縮重したコドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、点突然変異を含む突然変異、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、及び相補配列、並びに明確に指示された配列を暗に含む。具体的には、縮重したコドン置換は、１以上の選択された（又は全ての）コドンの第３部分が混在した塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換される（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。核酸なる用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと互換可能に用いられる。
【００１７】
用語「遺伝子」とは、ポリペプチド鎖の産生に関与したＤＮＡのセグメントを意味する；遺伝子産物の転写／翻訳に関与したコード領域の前後の領域（リーダー及びトレーラー）、及び転写／翻訳の調節、並びに個々のコーディングセグメント（エクソン）間に介入されている配列（イントロン）を含む。
【００１８】
本出願においては、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において互換可能に用いられ、アミノ酸残基の重合体を意味する。この用語は、１以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在しているアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸重合体、並びに天然に存在しているアミノ酸重合体及び天然に存在していないアミノ酸重合体に適用される。本明細書中で使用されるとき、この用語は、アミノ酸残基が共有的なペプチド結合によって連結されている全長タンパク質（即ち、抗原）を含む任意の長さのアミノ酸鎖を含む。
【００１９】
用語「アミノ酸」は、天然に存在しているアミノ酸、及び合成したアミノ酸、並びに、天然に存在しているアミノ酸に似たように機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を意味する。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされているもの、並びに後に修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸塩、及びＯ−ホスホセリンである。
【００２０】
アミノ酸は、本明細書において、通常知られている３文字シンボル、又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されている１文字シンボルによって表してもよい。同様に、ヌクレオチドは、それらが通常承認されている１文字コードによって表してもよい。
【００２１】
用語「亜硫酸水素塩」とは、本明細書中で使用するとき、メチル化シトシンを化学的に修飾することなしに、シトシン（Ｃ）からウラシル（Ｕ）に化学的に変換することができ、したがって、ＤＮＡのメチル化状態に基づいてＤＮＡ配列を別個に修飾する用いることができる全てのタイプの亜硫酸水素塩が含まれ、例えば亜硫酸水素ナトリウムがある。
【００２２】
本明細書中で使用するとき、メチル化ＤＮＡ又は非メチル化ＤＮＡを別個に修飾する試薬には、区別され得る生成物が結果としてメチル化及び非メチル化ＤＮＡから得られるプロセスにおいてメチル化ＤＮＡ及び／又は非メチル化ＤＮＡを修飾し、それによってＤＮＡメチル化状態の同定を可能にする任意の試薬が含まれる。このようなプロセスには、限定されないが、化学的な試薬（例えば、亜硫酸水素塩によるＣ→Ｕ変換）及び酵素的処理（例えばメチル化依存性エンドヌクレアーゼによる開裂）が含まれてもよい。このようにして、メチル化ＤＮＡを選択的に開裂又は消化する酵素は、ＤＮＡがメチル化された場合に非常に高い効率でＤＮＡ分子を開裂又は消化することができるものであり、一方、非メチル化ＤＮＡを選択的に開裂又は消化する酵素は、ＤＮＡがメチル化されない場合に有意に高い効率を示す。
【００２３】
本出願では、単語「存在」又は「不存在」は、相対的な意味で用いられ、特定のＤＮＡ配列のレベルを記載する。換言すれば、所定のＤＮＡ配列又は遺伝子が試験試料に「存在する」と言われる場合、それは、このＤＮＡ配列又は遺伝子のレベルが予め決定された閾値を上回ることを意味する；一方、ＤＮＡ配列又は遺伝子は、試験試料中のそのレベルがこのような閾値を下回る場合に「存在しない」。
【００２４】
「増加」又は「減少」は、確立した標準対照からの定量における検出可能な正又は負の変化を意味する。増加は、対照値の少なくとも１０％、より好ましくは５０％、なおより好ましくは２倍、さらにより好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも１０倍の正の変化である。同様に、減少は、対照の好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは５０％、なおより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の負の変化である。定量的変化又は比較基準との差異を支持する他の用語、例えば、「より多く」又は「より少なく」とは、上述したのと同じように本出願において用いられる。
【００２５】
「ポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーション法」は、本明細書中で使用するとき、適切なハイブリダイゼーション条件下で、既知の配列のポリヌクレオチドプローブとワトソン−クリック型塩基対を形成する能力に基づき、ポリヌクレオチドの存在及び／又は量を検出する方法を指す。このようなハイブリダイゼーション法の例にはサザンブロッティング及びノーザンブロッティングが挙げられる。
【００２６】
「プライマー」は、本明細書中で使用するとき、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅法において用いられ、メチル化又は非メチル化された対象の遺伝子、例えば、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＡＰＣ、ＣＡＳＰ８、ＲＡＲＢ、ＳＣＧＢ３Ａ１、ＤＡＢ２ＩＰ、ＰＴＰＮ６、ＴＨＹ１、ＴＭＥＦＦ２又はＰＹＣＡＲＤに対応するポリヌクレオチド配列に基づいてヌクレオチド配列を増幅することができる。ポリヌクレオチド配列の少なくとも１つの増幅用ＰＣＲプライマーは、この配列に配列特異的である。
【００２７】
「標準対照値」は、本明細書中で使用するとき、大腿由来であって、確定した試料に存在するゲノム配列の予め測定した量を指す。標準対照値は、試験試料中に存在する対象遺伝子（又は非コード配列）の量を比較するために、本発明の方法の使用に適している。標準対照として使用する確定した試料は、妊娠中の所定期間（例えば、妊娠第１期）に、正常な胎児を懐妊している平均的な健常の妊娠女性の血液中に典型的に存在する対象の胎児遺伝子の平均量を提供し、ともに何れかの妊娠に関連した障害又は合併症を発症するリスクがないものである。標準対照値は、対象のゲノム配列及び試料の性質に非常に依存していてもよい。
【００２８】
用語「平均」とは、妊娠女性を記述するという関連において使用するとき、妊娠に関連した状態（例えば、子癇前症又は早期陣痛）などの関連性の少なくとも１つの状態がない事実を指す。用語「平均」とは、他の関連で用いられるとき、染色体が正常である胎児を懐妊しているが、任意の妊娠に関連した疾患又は状態に感受性ではない、無作為に選択された健常な女性群を代表する、女性の血液に見られる母性起源及び胎児起源の特定の遺伝子の量又はメチル化状態などのある種の特徴を指す。この選択された群は、これらの女性の中で、対象遺伝子の平均量又はメチル化プロフィールが、合理的な正確さをもって、健常な胎児を懐妊している健常な妊娠女性の一般集団において対応するプロフィールを反映するように、十分な数の女性を含むべきである。さらに、選択された女性群は、一般に、潜在的な妊娠に関連した障害の指示のために血液を検査する女性に類似した妊娠期間を有する。本発明の実施のための好ましい妊娠期間は、スクリーニングされる障害に非常に依存していてもよい。例えば、妊娠女性は、好ましくは妊娠の妊娠第２期に子癇前症のリスクについてスクリーニングされ、一方、胎児の染色体異数性は、好ましくは、できるだけ早期にスクリーニングされ、診断される。さらに、試験のための好ましい妊娠期間はまた、試験する対象遺伝子に依存していてもよい。
【００２９】
用語「子癇前症」とは、本明細書中で使用するとき、妊娠中に生じる状態を指す。その主な症状は、尿中のタンパク質の存在および浮腫（膨潤）をしばしば伴う、様々な型の高血圧である。子癇前症は、時に妊娠中毒症と呼ばれ、発作を伴う子癇前症であり「子癇」と呼ばれる、より重症の障害と関係がある。これらの状態は、出産直後または妊娠２０週以前に現れることがあるが、通常、妊娠後半（２０週以降）に現れる。
【００３０】
用語「早期陣痛」又は「早産の陣痛」は、本明細書中で使用するとき、約４０週の十分な妊娠期間の３週間以上前に陣痛が始まり、治療をしなければしばしば早産を引き起こす状態を指す。
【００３１】
用語「子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）」とは、胎児の成長が異常な程に遅い状態を指し、妊娠期間で胎児の体重は１０％である。出生した場合、乳児は、その年齢に対して非常に小さく、栄養不良である。ＩＵＧＲはまた、子宮内発育制限とも呼ばれ、新生児における内科的疾患及び死亡のリスク増加と関連する。
【００３２】
本出願で使用するとき、「ＲｈＤ血液型の遺伝子、ＡＢＯ血液型の遺伝子、ＲｈＣ血液型の遺伝子、ＲｈＥ血液型の遺伝子、ＲｈＥ血液型の遺伝子、ＨＬＡ型の遺伝子又はＹ染色体上の遺伝子」は、ＲｈＤ、ＡＢＯ、ＲｈＣ若しくはＲｈＥ血液型に従って特定の血液型に代表されるものとして認識されている遺伝子、又はＹ染色体上に位置されている遺伝子を指す。胎児ＤＮＡにおけるこのような遺伝子の検出は、胎児が特定の血液型、ＨＬＡ型又は男性であることを示す。
【００３３】
発明の詳細な説明
Ｉ．導入
母性血漿中の胎児ＤＮＡの存在は、１９９７年に初めて報告され、母性血液試料の分析を通じてだけ非侵襲的な出生前診断に対して可能性を提供した（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３５０：４８５−４８７，１９９７）。しかしながら、母性血漿中の胎児ＤＮＡとバックグラウンドの母性ＤＮＡの共存は、胎児起源及び母体起源のＤＮＡを区別するための確実な手法を要求する。従来、いくつかの遺伝子は、それらの胎児バージョンと母体バージョンとの間に別個にメチル化されることが示されている。例えば、Ｃｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１４７５３−１４７５８，２００５を参照されたい。
【００３４】
本発明者らは、第１に、胎児由来の多数の遺伝子（例えば、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＡＰＣ、ＣＡＳＰ８、ＲＡＲＢ、ＳＣＧＢ３Ａ１、ＤＡＢ２ＩＰ、ＰＴＰＮ６、ＴＨＹ１、ＴＭＥＦＦ２、及びＰＹＣＡＲＤ）は、非常にメチル化され、一方、胎児を妊娠している女性由来の同じ遺伝子はメチル化されないことを発見した。他の遺伝子は、従来、遺伝子の胎児版及び母性版を比較した場合に異なるメチル化プロフィールを有することが報告されていたが、本発明者らによる発見は、これらの特定の遺伝子に関して、このような区別が従来知られていなかっただけでなく、胎児遺伝子のメチル化における高レベルの均一性及び母体遺伝子のメチル化の欠損もまた従来には見られなかったという点で独特である。したがって、この発見は、胎児及び母性ゲノムＤＮＡを区別するための新規であり、より正確であり、より効果的なアプローチを提供する。特に、非侵襲的な出生前診断のための分析プロセスにおいて試料中の本明細書で特定される胎児遺伝子のいずれか１つの検出は、試料中の一般的な胎児ＤＮＡ（本明細書中で指定された遺伝子に限定されない）が質及び量において適切に保存されるように設計されるように、試料回収及び操作を含むプロセスが首尾よく操作しているという確証を可能にする。さらに、これらの新規に同定された遺伝子はまた、胎児ＤＮＡマーカーとして直接使用し、ある種の妊娠に関連した状態及び合併症の存在又はそれらに対するリスクの増大を指示することができる。これは、これらの遺伝子がそれらの母体の対応物と比較して均一にメチル化され、遺伝子の母性コピー及び胎児コピー間での容易な区別を可能にするためである。
【００３５】
ＩＩ．一般的な方法論
本発明の実施は、分子生物学の分野における日常的な技術を利用する。本発明の使用のための一般的な方法を開示している基本書には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄ．２００１）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；ａｎｄ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４））が挙げられる。
【００３６】
核酸に関して、サイズは、キロベース（ｋｂ）又は塩基対（ｂｐ）で与えられる。これらは、アガロース若しくはアクリルアミドゲル電気泳動、配列決定された核酸、又は開示されているＤＮＡ配列から誘導して推定される。タンパク質については、サイズは、キロダルトン（ｋＤａ）又はアミノ酸残基数で与えられる。タンパク質サイズは、ゲル電気泳動、配列決定されたタンパク質、誘導されたアミノ酸配列、又は開示されているタンパク質配列から推定される。
【００３７】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｖａｎ  Ｄｅｖａｎｔｅｒ  ｅｔ．  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８（１９８４）に記載されるような自動化シンセサイザーを用いて、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ＆  Ｃａｒａｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２（１９８１）によって最初に記載された固相ホスホアミダイト・トリエステル法に従って化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｒｅａｎｉｅｒ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７−１４９（１９８３）に記載されるように、固有のアクリルアミドゲル電気泳動又は陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて実行される。
【００３８】
本発明において同定された遺伝子、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＡＰＣ、ＣＡＳＰ８、ＲＡＲＢ、ＳＣＧＢ３Ａ１、ＤＡＢ２ＩＰ、ＰＴＰＮ６、ＴＨＹ１、ＴＭＥＦＦ２、及びＰＹＣＡＲＤのいずれかの１つ、及び合成オリゴヌクレオチドのポリヌクレオチド配列は、例えば、Ｗａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  １６：２１−２６（１９８１）の二本鎖鋳型を配列決定するための連鎖停止法を用いて検証可能である。
【００３９】
ＩＩＩ．血液試料の取得及びＤＮＡ抽出
本発明は、例えば、妊娠に関連した状態又は障害の存在又はリスクを評価するために、胎児ＤＮＡを利用する非侵襲的な分析プロセスの適切な操作を指示する内部対照として用いられてもよい、一般的な胎児ＤＮＡの存在及び／又は量を検出する別々のメチル化状態に基づいて母性血液に見られるある種の胎児遺伝子の存在及び／又は量を決定することに関する。したがって、本発明の実施の第１段階は、胎児ＤＮＡが存在するものと期待される妊娠女性から生物試料を得て、このＤＮＡをメチル化状態に基づいて別個にＤＮＡを修飾する薬物で処理することである。このような薬物の一例は、非メチル化ＤＮＡだけを消化し、メチル化ＤＮＡを消化しないものである。場合により、このＤＮＡは試料から最初に抽出される。
【００４０】
Ａ．血液試料の取得
血液試料は、胎児ＤＮＡに基づく非侵襲的診断法を用いて試験に適した妊娠期間で妊娠女性から得られる。適切な妊娠期間は、試験される障害に依存して変更してもよい。女性からの血液回収は、病院又はクリニックが一般に知っている標準的なプロトコールに従って実行される。末梢血の適切な量、例えば、典型的には５〜５０ｍｌは、更なる調製前に標準的な手法に従って回収され、保存されてもよい。
【００４１】
Ｂ．血液試料の調製
本発明に従って、母性血液に見られる胎児ＤＮＡの分析は、例えば全血、血清又は血漿を用いて実行されてもよい。母性血液から血清又は血漿を調製する方法は、当業者に周知である。例えば、妊娠女性の血液は、血液凝固を防ぐためのＥＤＴＡ又はＶａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＳＳＴ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）などの特定に市販されている製品を含む試験管に入れることができ、次に、血漿は、遠心分離を通じて全血から得ることができる。遠心分離を用いる場合、次に、典型的には、限定されないが、例えば１，５００−３，０００×ｇの適切なスピードで実行される。血漿又は血清は、ＤＮＡ抽出ために新たな試験管に移す前に、更なる遠心分離工程に供されてもよい。
【００４２】
全血の無細胞部分に加えて、ＤＮＡはまた、細胞分画から回収され、軟膜部分に濃縮されてもよく、女性からの全血試料の遠心分離及び血漿の除去後に得ることができる。
【００４３】
Ｃ．ＤＮＡの抽出
血液を含む生物使用からＤＮＡを抽出するための方法は多数知られている。ＤＮＡ調製の一般的な方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｄ  ｅｄ．，２００１によって記載される）は下記のものが可能である：様々な市販の試薬又はキット、例えば、ＱｉａＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ又はＱｉａＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＧｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ（商標）Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、及びＧＦＸ（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）はまた、妊娠女性の血液試料からＤＮＡを得るために用いてもよい。これらの方法の１を超える組み合わせも用いることができる。
【００４４】
ＩＶ．ＤＮＡのメチル化特異的な化学的修飾
次に、試料から抽出されているかどうかを問わず、妊娠女性からの試料の存在するＤＮＡは、このＤＮＡ配列がメチル化されるかどうかに依存してＤＮＡを選択的に修飾することができる薬物で処理される。例えば、この薬物は、メチル化感受性な方法でＤＮＡを消化する酵素であり得て、即ち、非メチル化ＤＮＡだけが消化され、メチル化ＤＮＡは変化されないままである。別の可能性は、この薬物は、メチル化状態に依存してポリヌクレオチド配列を選択的に変換することである。典型的には、このような試薬は、ＤＮＡ分子における非メチル化Ｃ残基（又は複数）と反応し、各非メチル化Ｃ残基をウラシル（Ｕ）残基に変換し、メチル化Ｃ残基は変化されないままである。このＣ→Ｕ変換は、核酸の一次配列における変化に基づいて、メチル化状態の検出及び比較を可能にする。この目的に適した例示的な試薬は、亜硫酸水素ナトリウムなどの亜硫酸水素塩である。ＤＮＡの化学的修飾のための亜硫酸水素塩を用いる方法は、当該技術分野において周知であり（例えば、Ｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：９８２１−９８２６，１９９６）、本明細書では詳細には検討しない。
【００４５】
当業者は、本明細書では指定されていないが、別個に化学的に（又は任意の他のメカニズムを通じて）修飾しているメチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡの同じ特性を有する任意の他の試薬が本発明の実施に用いることができることは認識される。例えば、ＤＮＡのメチル化特異的な修飾はまた、メチル化感受性制限酵素によって達成されてもよく、その酵素のいくつかは、典型的には、非メチル化ＤＮＡ断片を開裂し、メチル化ＤＮＡを開裂せず、他のもの（例えば、メチル化依存性エンドヌクレアーゼＭｃｒＢＣ）はメチル化シトシンを含むＤＮＡを開裂するが、非メチル化ＤＮＡを開裂しない。さらに、化学的修飾及び制限酵素処理の組み合わせ、例えば、組み合わせた亜硫酸水素塩制限酵素分析（ＣＯＢＲＡ）は、本発明を実施するために用いることができる。
【００４６】
Ｖ．ポリヌクレオチド配列増幅及び測定
メチル化特異的な方法でのＤＮＡの化学的修飾又はメチル化感受性酵素消化などのＤＮＡのメチル化依存性特異的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）修飾後、処理したＤＮＡは、配列に基づく分析に供され、その結果、胎児供給源からの本発明の関連遺伝子（例えば、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＡＰＣ、ＣＡＳＰ８、ＲＡＲＢ、ＳＣＧＢ３Ａ１、ＤＡＢ２ＩＰ、ＰＴＰＮ６、ＴＨＹ１、ＴＭＥＦＦ２又はＰＹＣＡＲＤ）の１以上が、母性供給源からそれらの対応物を区別することができ、胎児遺伝子（又は複数）の存在及び量が測定され、標準対照と比較することができる。さらに、特に遺伝子（又は複数）が予め測定した閾値よりも大きい場合、胎児起源のこれらの遺伝子の１以上が試料に必ず存在することが判明されると、この試料及びその同等物は、更なる分析のために十分量の胎児ＤＮＡを含むと認められる。他方、妊娠に関連したある種の状態又は障害を指示する胎児マーカーとしてのこれらの特定の遺伝子の量を検出及び測定することができ、これは、母体起源の対応物の非メチル化状態と比較して、遺伝子の非常にメチル化された状態を活用している。この使用のために、試料中のＲＡＳＳＦ１Ａ、ＣＡＳＰ８、ＲＡＲＢ、ＳＣＧＢ３Ａ１、ＤＡＢ２ＩＰ、ＰＴＰＮ６、ＴＨＹ１、ＴＭＥＦＦ２、及びＰＹＣＡＲＤから選択される１以上の胎児遺伝子の労は、標準値と比較することができ、この場合、標準値からの増加は、このような妊娠に関連した障害の存在又は危険性の増加を指示する。
【００４７】
Ａ．ヌクレオチド配列の増幅
増幅反応は、メチル化依存的な特異的修飾プロセスによる処理後、本発明の胎児マーカーのための配列に基づく分析前に任意的である。本発明のいくつかの態様では、増幅は、特定のメチル化パターンを有する本発明の胎児マーカーを選択的に増幅するために行い、その結果、１つの特定の供給源、例えば、胎児の胎盤又は他の組織からのゲノム配列だけが検出及び分析される。
【００４８】
種々のポリヌクレオチド増幅法は十分に確立されており、研究で頻繁に使用されている。例えば、ポリヌクレオチド配列増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の一般的な方法は、当該技術分野において周知であり、したがって、本明細書では詳細に記述しない。ＰＣＲの方法、プロトコール、及びプライマーの設計における原理の概要については、例えば、Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．，１９９０を参照されたい。ＰＣＲ試薬及びプロトコールはまた、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓなどの商業的企業から利用可能である。
【００４９】
ＰＣＲは、最も一般的に、熱安定酵素で自動化プロセスとして実行される。このプロセスでは、反応混合物の温度は、変性範囲、プライマーアニーリング範囲、及び伸長反応範囲を通じて自動的にサイクル化される。この目的に特に適合される機器は市販されている。
【００５０】
標的ポリヌクレオチド配列（例えば、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＡＰＣ、ＣＡＳＰ８、ＲＡＲＢ、ＳＣＧＢ３Ａ１、ＤＡＢ２ＩＰ、ＰＴＰＮ６、ＴＨＹ１、ＴＭＥＦＦ２又はＰＹＣＡＲＤのもの）のＰＣＲ増幅は、典型的には、本発明の実施において使用されるが、当業者は、母性血液試料に見られるゲノム配列の増幅が、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写媒介増幅、及び自立配列複製又は核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）などの任意の既知の方法によって達成することができ、これらの各々は、十分な増幅を提供する。より最近になって開発された分岐鎖ＤＮＡ技術はまた、特定のメチル化パターンを表す本発明の特定のゲノム配列の存在を定量的に測定するか、又は母性血液中のこの特定のゲノム配列の量を定量的の測定するための用いることができる。臨床試料中の核酸配列を直接定量するための分岐鎖ＤＮＡのシグナル増幅の概要については、Ｎｏｌｔｅ，Ａｄｖ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３３：２０１−２３５，１９９８を参照されたい。
【００５１】
Ｂ．ポリヌクレオチド配列の決定
ポリヌクレオチド配列決定のための手法はまた十分に確立されており、関連する研究領域で幅広く実施されている。例えば、ポリヌクレオチド配列決定のための基本原理及び一般的手法は、分子生物学及び組み換え遺伝子工学に関連した種々の研究レポート及び論文に記載され、例えば、Ｗａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，上述；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，上述、及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，上述がある。手動又は自動の、研究室で日常的に行われているＤＮＡ配列決定法は、本発明を実施するために用いることができる。本発明の方法を実施するためのポリヌクレオチド配列における変化（例えば、Ｃ→Ｕ）の検出に適した更なる手段には、限定されないが、質量分析、プライマー伸長、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ、及び電気泳動が挙げられる。
【００５２】
ＶＩ．標準対照値の確定
本発明の方法を実施するための標準対照値を確定するために、健常な胎児を懐妊している１グループの健常な妊娠女性を初めに選択する。これらの女性は、同じような妊娠期間であり、本発明の方法を用いて子癇前症及び早期陣痛などの状態をスクリーニングするためには妊娠の適切な期間内である。
【００５３】
選択された妊娠女性及び彼女らが懐妊している胎児の健常な状態は、十分に確立した、日常的に採用された方法によって確認され、このような方法には、限定されないが、女性の血圧をモニターすること、陣痛の開始を記録すること、ＣＶＳ及び羊水穿刺を用いた胎児遺伝分析を行うことが含まれる。
【００５４】
さらに、健常な胎児を懐妊している健常な妊娠女性の選択されたグループは、妥当な大きさでなければならず、その結果、このグループから得られた母性血液中に存在する本発明において同定された特定の胎児遺伝子の平均量は、健常な胎児を懐妊している健常な女性の一般的集団の中で正常若しくは平均量又はメチル化プロフィールの代表として合理的にみなされ得る。好ましくは、選択された群は、少なくとも１０人の女性を含む。
【００５５】
選択された健常な対照群の各女性において見られる個々の値に基づいて、母性血液に存在する特定の胎児遺伝子について平均レベルが確定されると、この平均若しくは中央値又は代表的な値は、標準対照値であると考えられる。したがって、同様の量の胎児遺伝子を含む任意の生物試料（例えば血液試料）は、同種の試料（例えば血液試料）についての標準対照値を提供するために用いられ得る。さらに、平均若しくは中央値又は代表的な量でゲノムＤＮＡ配列を含む溶液はまた、人為的に集められ、標準対照値を与えることができる。標準対照値は、遺伝子ごとに異なっていてもよく、生物試料の性質に依存してもよく、例えば、ＲＡＳＳＦ１Ａに対する標準対照は、血漿試料と唾液試料とでは異なっていてもよい。
【実施例】
【００５６】
下記の実施例は、例示のみを目的として提供されるものであって、限定を目的としない。当業者は、同一又は類似の結果を本質的に生じるように変更又は修飾され得る種々の重要でないパラメータを容易に認識する。
【００５７】
実施例１：母性血液と比較した胎児において高メチル化される腫瘍抑制遺伝子
本発明者らは、母性血液において胎児特異的な後成的マーカーを同定することを目的とした。従来のデータは、母性血漿中の胎児ＤＮＡ分子が、主に胎盤由来であることを示唆している（Ｃｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，１０２，１４７５３−１４７５８；Ｍａｓｕｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ４１，２８９−２９２，２００４；Ｆｌｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  １９，７２３−７２４，２００４）、母性血漿のバックグラウンドは、母性血液細胞起源であってもよい（Ｌｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４８，４２１−４２７，２００２）。したがって、胎児の後成的マーカーを同定するために、ゲノム遺伝子座のメチル化プロフィールは、後述の２つの組織型の間での差異的なメチル化を示す遺伝子座を特定することを目的として、胎盤組織及び母性血液細胞の間において評価された。このようなマーカーは、出生前診断及び妊娠に関連した状態のモニターのために用いることができる。
【００５８】
被験者募集及び試料回収
被験者は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅ  ｏｆ  Ｗａｌｅｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇから募集した。ヒト臨床試料の試験及び回収は、施設内倫理委員会によって承認された。インフォームド・コンセンサスは、各被験者から要求された。妊娠第１期の胎盤組織は、手術による妊娠中絶の直後に回収した。妊娠第３期の胎盤組織は、合併症のない妊娠の手術による帝王切開分娩の直後に回収した。母性末梢血試料（１２ｍＬ  ＥＤＴＡ）は、産婦人科的手法の実行の直前に回収した。
【００５９】
試料加工及び亜硫酸水素塩配列決定
１，６００ｇで１０分間、４℃で血液試料を遠心分離した。上清を除去後、末梢血液細胞部分を再度２，５００ｇで遠心分離した。任意の残った血漿をさらに除去した。Ｎｕｃｌｅｏｎ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ抽出キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いて末梢血液細胞から、及びＱＩＡａｍｐ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて母体組織から、それぞれ製造業者の使用説明書に従ってＤＮＡを抽出した。メチル化されたシトシンは変化させないまま、亜硫酸水素塩は非メチル化シトシンをウラシルに変換する。抽出されたＤＮＡ試料は、製造業者の使用説明書に従って、ＣｐＧｅｎｏｍｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＮＡ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）を用いて亜硫酸水素塩変換された。各変換反応に関して、１μｇのＤＮＡは、試薬Ｉの添加後、５０℃で１６時間インキュベートされた。各亜硫酸水素塩変換されたＤＮＡ試料は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、メチル化配列と非メチル化配列とを区別しないプライマーによって、ＰＣＲに供した。その後の各ＰＣＲ産物は、製造業者の使用説明書に従って、大腸菌株ＪＭ１０９にトランスフォーメーションするために、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にＴＡクローニングした。クローンを無作為に拾い、次に、コロニーＰＣＲはベクタープライマーＴ７及びＳＰ６を用いて実行し、クローニングしたインサートを増幅した。サイクル配列決定は、ＢｉｇＤｙｅバージョン１．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び自動化キャピラリーＤＮＡシークエンサーＧｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。得られた配列は、ＳｅｑＳｃａｐｅソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて整列し、比較した。亜硫酸水素塩変換の完成性は、まず、スコアリングする前に確認した。シトシン又はチミン残基として配列決定されたＣｐＧ部位は、それぞれメチル化又は非メチル化としてスコアした。メチル化部位頻度は、各試料について、メチル化部位の全体数をクローニングした全てのＣｐＧ部位で割ることによって計算した。
【００６０】
データ比較及び統計学的分析
亜硫酸水素塩変換後、ＣｐＧ部位は配列がシトシンであればメチル化としてスコアされ；チミン残基（ウラシルのデオキシ対応物）によって占有されていれば非メチル化としてスコアされる。メチル化部位頻度は、各試料について、メチル化部位の全体数をクローニングされた全てのＣｐＧ部位で割ることによって計算された。
【００６１】
ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＡＰＣ、及びＲＡＲＢ
亜硫酸水素塩配列決定用のＰＣＲプライマー及びＰＣＲサイクル条件を図１に列挙する。亜硫酸水素塩配列決定の結果を図２及び３に列挙する。これらの結果は、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＡＰＣ、及びＲＡＲＢ配列が胎盤において高メチル化され、母性血液細胞ではメチル化されないことを示した。
【００６２】
ＣＡＳＰ８
亜硫酸水素塩配列決定用のＰＣＲプライマー及びＰＣＲサイクル条件を図４に列挙する。亜硫酸水素塩配列決定の結果を図５に列挙する。これらの結果は、ＣＡＳＰ８配列が胎盤において高メチル化され、母性血液細胞ではメチル化されないことを示した。
【００６３】
ＳＣＧＢ３Ａ１
亜硫酸水素塩配列決定用のＰＣＲプライマー及びＰＣＲサイクル条件を図６に列挙する。亜硫酸水素塩配列決定の結果を図７に列挙する。これらの結果は、ＳＣＧＢ３Ａ１配列が胎盤において高メチル化され、大部分は、母性血液細胞ではメチル化されないことを示した。
【００６４】
ＤＡＢ２相互作用タンパク質（ＤＡＢ２ＩＰ）
亜硫酸水素塩配列決定用のＰＣＲプライマー及びＰＣＲサイクル条件を図１７に列挙する。１つの胎盤組織試料と対応する母性血液細胞に関する亜硫酸水素塩配列決定の結果を図１８に列挙する。これらの結果は、ＤＡＢ２ＩＰ配列が胎盤において高メチル化され、母性血液細胞ではメチル化されないことを示した。
【００６５】
実施例２：メチル化感受性酵素消化、その後のリアルタイムＰＣＲ
メチル化感受性酵素は、それらの認識部位がメチル化されない場合にだけＤＮＡを切断する酵素である。より詳細には、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００５／０１５８７３９（Ｊｅｄｄｅｌｏｈら）を参照されたい。例えば、ＢｓｔＵＩは、ＣＧＣＧ部位を認識し、ＣｐＧがメチル化されていない場合にＤＮＡを切断する。図８に示されるように、１を超えるメチル化感受性酵素を用いて、非メチル化ＤＮＡを消化することができ、メチル化配列だけをそのままにする。リアルタイムＰＣＲなどの方法は、連続して、酵素消化後になおも増幅可能であるＤＮＡ配列を検出するために用いることができる。
【００６６】
材料及び方法
被験者募集及び試料回収
被験者は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅ  ｏｆ  Ｗａｌｅｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇから募集した。ヒト臨床試料の試験及び回収は、施設内倫理委員会によって承認された。インフォームド・コンセンサスは、各被験者から要求された。妊娠第３期の胎盤組織は、合併症がない妊娠の手術による妊娠中絶後に回収した。母性末梢血試料は、産婦人科的手法の実行の直前に回収した。
【００６７】
試料加工及びメチル化感受性酵素によるＤＮＡ消化
母性血液試料は、１，６００ｇで１０分間、及び１６，０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ及びＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔを用いて、製造業者の使用説明書に従って、それぞれ、２００μｌの軟膜及び０．２ｇの胎盤組織からＤＮＡを抽出した。１００ｎｇの胎盤及び母性軟膜ＤＮＡは、１×消化バッファー中、６０℃で１６時間、１００ＵのＢｓｔＵＩ、メチル化感受性酵素で消化された。
【００６８】
ＲＡＳＳＦ１Ａ配列に関するリアルタイムＰＣＲ検出
ＲＡＳＳＦ１Ａ配列は、プライマー：ＲＳＦ−ｂ１５１Ｆ、５’−ＡＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＡＴＴＧＡＧＣＴＧ−３’（配列番号２７）及びＲＳＦ−ｄｓｇｎＲ、５’−  ＡＣＣＡＧＣＴＧＣＣＧＴＧＴＧＧ−３’（配列番号２８）、並びに小溝結合（ＭＧＢ）蛍光プローブＲＳＦ−ｄｓｇｎＴ、５’−ＦＡＭ−ＣＣＡＡＣＧＣＧＣＴＧＣＧＣＡＴ−ＭＧＢ−３’（配列番号２９）を用いて、リアルタイムＰＣＲによって増幅された。検出可能な蛍光シグナルの出現に必要とされるＰＣＲサイクルの時期又は数は、インプットＤＮＡ試料中のＲＡＳＳＦ１Ａ配列の労と反比例して相関している。換言すれば、ＤＮＡ試料中のＲＡＳＳＦ１Ａ配列の量が高くなるにつれて、蛍光シグナルはより容易に出現し、より低い閾値サイクル数をもたらす。
【００６９】
図９ａは、ＢｓｔＵＩ消化との胎盤及び母性血液細胞からのＲＡＳＳＦ１Ａ分子のリアルタイムＰＣＲ定量の一例を示す。酵素消化しない場合、胎盤及び母性軟膜の両方からのＲＡＳＳＦ１Ａ分子が検出された。酵素消化した場合、胎盤由来のＲＡＳＳＦ１Ａだけが検出された。β−アクチンに関しては、それらの起源とは関係なく、酵素消化しない場合のみに検出することができた（図９ｂ）。β−アクチン配列はメチル化されないのでそれが期待される。図９ｃは、胎盤及び母性軟膜についてのβ−アクチンの亜硫酸水素塩配列決定の結果を示す。胎盤組織及び母性軟膜の両方は全くメチル化されなかった。
【００７０】
実施例３：酵素消化後の母性血漿におけるＲＡＳＳＦ１Ａの検出
実施例１では、亜硫酸水素塩配列決定によって、本発明者らは、母性血液細胞のＲＡＳＳＦ１Ａ遺伝子が全くメチル化されず、（胎児由来の）胎盤のものは非常にメチル化されていることを示した。実施例２では、本発明者らは、母性血液細胞からのＲＡＳＳＦ１Ａい配列がメチル化感受性制限酵素によって完全に消化されたが、胎盤由来のＲＡＳＳＦ１Ａ配列が同酵素によって部分的にだけ消化された。血漿ＤＮＡは、母性起源のＤＮＡ（大部分は、母性血液細胞に由来し、したがって、メチル化されていない）、及び胎児起源のＤＮＡ（胎盤は主な寄与因子であり、したがって、本特許出願に記載されるマーカーについてメチル化される）から構成されている。このようにして、血漿ＤＮＡのメチル化感受性酵素消化を用いて、母性ＤＮＡバックグラウンドを除去し、母性血漿中の胎児由来のＲＡＳＳＦ１Ａ分子の分別濃度を高めることは実行可能である。
【００７１】
説明図が図１０ａに示され、母体由来のＲＡＳＳＦ１Ａはメチル化されず、したがって、メチル化感受性酵素によって消化され、胎児由来のＲＡＳＳＦ１Ａのいくらかはメチル化され、したがって、消化されない。酵素消化が完了すると、胎児由来のメチル化ＤＮＡだけがそのまま残り、ＰＣＲ増幅用の鋳型として用いることができる。β−アクチンの場合、母性及び胎児由来のＤＮＡ配列がメチル化されないので、完全な酵素消化は、全ての配列を破壊し、その後、このβ−アクチン配列を用いたＰＣＲ増幅は達成され得ない。人為的なエラー及び試薬の質が、ときどき、不完全な酵素消化を引き起こす場合がある。したがって、β−アクチンは、内部対照として用いて、不完全な消化を指示することができる（図１０ｂ）。ＰＣＲ増幅が酵素消化後にβ−アクチンについて上手くいった場合、酵素消化が不完全である可能性がある。この場合には、ネガティブな結果がβ−アクチンアッセイについて達成されるまで、全アッセイを繰り返すことが必要となる場合がある。
【００７２】
材料及び方法
試料加工及びメチル化感受性酵素によるＤＮＡ消化
母性血液試料は、１，６００ｇで１０分間、１６，０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。ＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、１．６ｍｌの血漿から抽出し、５０μｌのＨ2Ｏで溶出した。３５μｌの血漿ＤＮＡは、１×消化バッファー中、１００ＵのＢｓｔＵＩ酵素を用いて６０℃、１６時間により消化した。
【００７３】
ＲＡＳＳＦ１Ａ及びβ−アクチン配列のためのリアルタイムＰＣＲ検出
ＲＡＳＳＦ１Ａ配列を増幅し、上述したようなリアルタイムＰＣＲで定量した。β−アクチン配列を増幅し、プライマー：Ａｃｔｉｎ−１６３Ｆ、５’−ＧＣＧＣＣＧＴＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴ−３’（配列番号３０）及びＡｃｔｉｎ−２９８Ｒ、５’−ＣＧＧＣＧＧＡＴＣＧＧＣＡＡＡ−３’（配列番号３１）、並びにＭＧＢ蛍光プローブＡｃｔｉｎ−２４３Ｔ、５’−ＶＩＣ−ＡＣＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＧＣＧＴＣ−ＭＧＢ−３’（配列番号３２）を用いてリアルタイムＰＣＲによって定量した。ＳＲＹ配列は、プライマー：ＳＲＹ−１０９Ｆ、５’−ＴＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＣＡＡＡＴＴＣＧＣ−３’（配列番号３３）及びＳＲＹ−２４５Ｒ、５’−ＣＣＣＣＣＴＡＧＴＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＧＴＡＴＴ−３’（配列番号３４）、並びに蛍光プローブＳＲＹ−１４２Ｔ、５’−ＦＡＭ−ＡＧＣＡＧＴＡＧＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＧＡＧＧＣＡＧＡ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号３５）を用いて増幅及び定量した。ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＳＲＹ及びβ−アクチンアンプリコンをそれぞれ１コピー含むＤＮＡ構築物は、３つのアッセイの定量的な標準として確定した。較正曲線は、既知量のＤＮＡ構築物の連続希釈によって作製し、血漿ＲＡＳＳＦ１Ａ、β−アクチン及びＳＲＹの定量についてリアルタイムＰＣＲの各ラウンドに含まれた。
【００７４】
図１１は、ＢｓｔＵＩで消化した場合と消化しない場合の妊娠第１期及び第３期の母性血漿由来のＲＡＳＳＦ１Ａ分子のリアルタイムＰＣＲ定量の一例を示す。妊娠第１期の試料については、ＲＡＳＳＦ１Ａ濃度は、酵素消化により、６８８コピー／ｍＬ血漿から４９コピー／ｍＬ血漿に減少した。この劇的な減少は、大部分のＤＮＡ分子（平均して９６．６％、Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  １９９８，６２：７６８−７７５）が母性起源であり、したがって、メチル化されず、消化されるので期待される。妊娠第３期の試料については、ＲＡＳＳＦ１Ａ濃度は、酵素消化により、１２７５コピー／ｍＬ血漿から７４コピー／ｍＬ血漿に減少した。本発明者らは、ＲＡＳＳＦ１Ａ分子に関するこのアッセイを用いて、７１人の女性（妊娠第１期にある２８人、妊娠第３期にある４３人）を分析した。ＲＡＳＳＦ１Ａ配列は、メチル化感受性酵素消化後の血漿ＤＮＡ試料の全てについて検出することができた。β−アクチン消化対照は、全ての試料について分析した。全てのケースについて、β−アクチン配列は、酵素消化しない場合にだけ検出された。
【００７５】
実施例４：酵素消化後の母性血漿のＲＡＳＳＦ１Ａ配列の胎児特異性の実証
酵素消化後のＤＮＡ配列の胎児特性は、出生前診断及び妊娠モニタリングへの応用に重要である。この例では、本発明者らは、４系統の実験によって母性血漿の酵素消化後のＲＡＳＳＦ１Ａ配列の胎児特異性を示す。
【００７６】
第１の実験では、ＲＡＳＳＦ１Ａ配列は、妊娠していない女性では酵素消化後に検出されなかったことが示される。これは、酵素消化後のＲＡＳＳＦ１Ａ分子が胎児特異的である場合に、妊娠していない女性において検出されるべきでないため重要である。図１２では、妊娠していない女性の１ケースを示す。ＲＡＳＳＦ１Ａ配列は、酵素消化しない場合にのみ検出された。酵素消化した場合、検出可能なＲＡＳＳＦ１Ａ配列は見られなかった。期待される通りに、β−アクチン消化対照は、酵素消化しない場合にのみ検出された。２５人の妊娠していないボランティアにおいて、本発明者らは、この試験のために応募し、メチル化感受性制限酵素消化後に血漿中に検出可能なＲＡＳＳＦ１Ａシグナルを示したものはいなかった。
【００７７】
第２の実験では、酵素消化後のＲＡＳＳＦ１Ａ配列は、出産後に検出できなかったことを示す。酵素消化後のＲＡＳＳＦ１Ａ分子が胎児特異的であれば、このような分子を放出する供給源（胎盤はマウスのものである）は分娩後に除去されるので、母性血漿からそれらは消えることが期待される。他の胎児特異的なマーカー、例えばＳＲＹは、分娩後に類似の浄化を示すことが示されている（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  １９９８，６２：７６８−７７５）。５対の分娩前後の母性血漿試料を回収した。全てのケースについて、酵素消化後、ＲＡＳＳＦ１Ａ分子は、分娩前に検出することができたが、分娩後には検出することができなかった（表１）。同様に、胎児特異的なＳＲＹマーカーは、分娩前だけに検出することができた。
【００７８】
第３の実験では、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）マーカーを用いて、母体由来及び胎児由来のＲＡＳＳＦ１Ａ配列を区別した。酵素消化後のＲＡＳＳＦ１Ａ配列が胎児特異的であることが確かめられれば、このような配列の遺伝子型は、母体のものというよりはむしろ、胎児のものでなければならない。例えば、ＳＮＰマーカーが胎児においてＣＣであり、母体においてＡＣである場合、酵素消化後のＤＮＡの遺伝子型は、ＡＣというよりはむしろＣＣでなければならない。同様に、ＡＣ／ＣＣ（胎児／母体）対に関して、酵素消化後のＤＮＡの遺伝子型は、ＣＣというよりはむしろＡＣでなければならない。消化していない血漿ＤＮＡについては、遺伝子型は、大部分の血漿ＤＮＡが母体起源であるため、母体のものと同じであり得る。
【００７９】
材料及び方法
ＲＡＳＳＦ１Ａ遺伝子型決定
上述したように、母性血漿、母性軟膜及び胎盤からＤＮＡを抽出した。各母性血漿ＤＮＡ試料の３５μｌを上述したように１６時間、ＢｓｔＵＩ酵素消化に供した。ＲＡＳＳＦ１Ａ配列のＰＣＲ増幅は、プライマー：ＲＳＦ−ｂｌ５１Ｆ、５’−ＡＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＡＴＴＧＡＧＣＴＧ−３’（配列番号２７）及びＲＳＦ−ｄｓｇｎＲ、５’−ＡＣＣＡＧＣＴＧＣＣＧＴＧＴＧＧ−３’（配列番号２８）を用いて、鋳型として、酵素消化していない母性軟膜ＤＮＡ、胎盤ＤＮＡ、母性血漿ＤＮＡ、酵素消化後の母性血漿ＤＮＡを用いて行った。ＲＡＳＳＦ１Ａアンプリコン内には単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｉｄ：ｒｓ４６８８７２５）があるため、様々な組織のＲＡＳＳＦ１Ａ遺伝子型を測定してもよい。プライマー伸長反応は、ＲＡＳＳＦ１Ａ  ＤＮＡの遺伝子型のために設定された。各１４μの反応は、１０μｌのＰＣＲ産物、０．７７μＭの伸長プライマーＲｓｆ−Ｒ１７、５’−ＣＡＧＣＣＧＧＧＴＧＧＧＣＣＣＴ−３’（配列番号３６）、１．１５Ｕ熱配列及びジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ及びｄｄＴＴＰ）及びデオキシヌクレオチドｄＧＴＰ（各６４μＭ）の混合物を含んでいた。遺伝子型Ａを有するＲＡＳＳＦ１Ａについては、プライマーは、５’−ＣＡＧＣＣＧＧＧＴＧＧＧＣＣＣＴｄｄＴ−３’（配列番号３７）を生成するために伸長され、分子量は５４７６．６Ｄａであった。遺伝子型Ｃを有するＲＡＳＳＦ１Ａ配列については、プライマーは、５’−ＣＡＧＣＣＧＧＧＴＧＧＧＣＣＣＴＧｄｄＣ−３’（配列番号３８）を生成するために伸長され、分子量は５７９０．８Ｄａであった。この最終塩基伸長産物は、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（ＳＥＱＵＥＮＯＭ）によって分析した。ＲＡＳＳＦ１Ａの遺伝子型は、ＴｙｐｅｒＡｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（ＳＥＱＵＥＮＯＭ）によって測定した。
【００８０】
図１３は、酵素消化した場合としない場合の母性血漿ＤＮＡ、母性軟膜ＤＮＡ及び胎盤ＤＮＡについての遺伝子型決定実験結果の例を示す。期待されるように、酵素消化後の母性血漿ＤＮＡの遺伝子型は、胎盤のもの（胎児遺伝子型）と同じであったが、母性軟膜のものと同じでなかった。表２は、４３ケースの遺伝子型決定結果を示し、そこでは、酵素消化した場合としない場合の母性血漿ＤＮＡ、母性軟膜ＤＮＡ及び胎盤ＤＡＮの全てを分析した。４３ケースのそれぞれにおいて、酵素消化後の母性血漿ＤＮＡの遺伝子型は、胎盤（胎児）遺伝子型と同一であった。
【００８１】
第４の実験では、本発明者らは、２つのマーカー、即ち、酵素消化後のＲＡＳＳＦ１Ａ配列及びＳＲＹ配列は、互いに相関する母性血漿における濃縮を有することを示した。血漿ＤＮＡは、１人の男児を懐妊している２４人の妊娠第３期の妊娠女性から抽出した。図１４に示されるように、正の相関は、酵素消化後のＲＡＳＳＦ１Ａ配列とＳＰＹ配列との間に観察された（ｒ＝０．７１７、ｐ＜０．０００１、スピアマン相関）。さらに、主に母体由来である、酵素消化していない全ＲＡＳＳＦ１Ａの濃縮は、ＳＲＹのものとは相関しなかった。
【００８２】
これらの４実験は、結論として、酵素消化後のＲＡＳＳＦ１Ａ配列が、（本発明者らが用いた技術の程度まで）全く胎児起源であったことを示した。したがって、ＲＡＳＳＦ１Ａは、出生前診断及び妊娠モニタリングに有用である。
【００８３】
実施例５：ＲｈＤ血液型の出生前診断のための正の分析マーカーとしてのＲＡＳＳＦ１Ａの実証
リーサスＤ（ＲｈＤ）血液群の不適合性は、胎児及び新生児の溶血性疾患の重大な原因である。この障害の病因は、父親の遺伝子座によってコードされ、胎児の赤血球の表面に提示されるＲｈＤ抗原によって、ＲｈＤ陰性の妊娠女性の同種免疫を伴う。母体の同種免疫は、通常、ＲｈＤ陽性の胎児の組織が母性血液と接触するようになると、分娩中に起こる。これは、胎盤を横切ることができる抗ＲｈＤ抗体を生じ、ＲｈＤ陽性の胎児をもつ次の妊娠において胎児赤血球を破壊する。母体の同種免疫は、最初のＲｈＤ陽性乳児の分娩の前後で予防的な抗ＲｈＤ免疫グロブリンを与えることによって予防又は最小化することができる。したがって、分娩前に胎児のＲｈＤ状態を知ることは有益である。しかしながら、羊水穿刺によってＲｈＤ遺伝子型決定／表現型決定のために胎児細胞を得ることは、経胎盤出血のリスクを伴い、胎児がＲｈＤ陽性であれば、抗ＲｈＤの母性産生を感作し得る。非侵襲的な出生前のＲｈＤ遺伝子型決定の開発は、ＲｈＤ遺伝子型決定のために胎児細胞を得ることに代えて安全性を提供する（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９９８；３３９：１７３４−１７３８）。この技術は、母性血漿中の胎児ＲｈＤ配列の検出を伴う。ＲｈＤ陰性の妊娠女性の血漿中のＲｈＤ配列の存在は、ＲｈＤ陽性の胎児を指示することになる。しかしながら、母性血漿においてこのような配列がないことは、２通りに解釈され得る：１）胎児がＲｈＤ陰性である；又は、２）正確なＲｈＤタイピングを可能にするには母性血漿中の胎児ＤＮＡが不十分であある。母性血漿ＤＮＡにおける正の対照としての普遍的な胎児ＤＮＡマーカーは、第２の可能性を排除するために有用となる。母性血漿ＤＮＡにおける正の対照の胎児ＤＮＡマーカーの検出は、ＲｈＤ陰性の胎児の存在を支持し、胎児ＤＮＡマーカーがないことは、母性血漿における不十分な胎児ＤＮＡを示唆する。今日まで、正の対照として用いることができる利用可能な胎児ＤＮＡマーカーは、Ｙ染色体のＤＮＡ及びＤＮＡ多形を含む。これらの２つのタイプのマーカーは、ある小集団の妊娠にだけ適用可能である。Ｙ染色体のＤＮＡは、男児を有する妊娠にだけ適用可能である。ＤＮＡ多形は、特定の遺伝型の組み合わせにのみ適用可能であり、その場合、ある種の遺伝型は、胎児のみ存在し、妊娠女性には存在しない。これに関連して、上記章において例証されたメチル化されたＲＡＳＳＦ１Ａ配列は、胎児の性又は多形に関わらずに、全ての妊娠に適用可能である普遍的な胎児ＤＮＡマーカーとして用いることができる。当業者はまた、メチル化されたＲＡＳＳＦ１Ａマーカーに加えて、本明細書に記載されている他のマーカーもこのように用いることができることを認識する。
【００８４】
図１５は、胎児の非侵襲的なＲｈＤタイピングの１つのストラテジーをまとめた説明図を示す。これは、高メチル化された胎児ＤＮＡマーカーがＲｈＤ血液型の出生前診断のために正の分析マーカーとして用いることができる唯一の方法では決してない。当業者はまた、ＲＡＳＳＦ１Ａなどの高メチル化された胎児ＤＮＡマーカーが、他の状態、例えば、β−サラセミア、嚢胞性線維症、先天性副腎皮質過形成、及び染色体異数性の出生前診断のための正の分析マーカーとして用いることができることを承認し得る。この正の分析マーカーはまた、ＲｈＤ血液型などの状態の実際の出生前評価前又は同時に評価されてもよい。
【００８５】
材料及び方法
被験者募集及び試料回収
妊娠第１期のダウン症スクリーニングを受けている被験者は、Ｋｉｎｇ’ｓ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍから募集した。ヒト臨床試料の試験及び回収は、施設内倫理委員会によって承認された。インフォームド・コンセンサスは、各被験者から要求された。絨毛膜組織は、絨毛膜サンプリング手法を介して回収した。母性末梢血試料は、産婦人科的手法の実行の直前に回収した。
【００８６】
ＲＨＤ配列のための試料加工及びリアルタイムＰＣＲ検出
前章において記載されるように、母性血漿、軟膜及びＣＶＳ試料からＤＮＡを抽出した。母体及び胎児のＲｈＤ状態は、鋳型としてそれぞれ母性軟膜ＤＮＡ及びＣＶＳ  ＤＮＡを用いて、以前に記載されるように（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９９８，３３９：１７３４−１７３８；Ｒｉｊｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  ２００４，１０３：１５７−１６４）、ＲＨＤ遺伝子のエクソン７及びエクソン１０の配列のリアルタイム増幅によって測定した。本発明者らの一団において、エクソン７及びエクソン１０アッセイは、試験した全ての被験者について同一の結果を与えた。母性血漿におけるＲＨＤ配列の検出可能性は、鋳型として５μｌの血漿ＤＮＡを用いた同じリアルタイムＰＣＲシステムによって測定された。全ての実験は二重で行った。試料は、二重のいずれかが正であれば、正としてスコアした。母性血漿中の胎児ＤＮＡの存在は、母性血漿ＤＮＡからの酵素消化後のＳＲＹ配列（男児について）及びＲＡＳＳＦ１Ａ配列の増幅によって確認した。ＳＲＹ遺伝子を標的とするリアルタイムＰＣＲは、鋳型として、酵素消化していない血漿ＤＮＡを用いて実行した。ＲＡＳＳＦ１Ａ及びβ−アクチン配列のリアルタイムＰＣＲは、鋳型として、酵素消化後の母性血漿ＤＮＡを用いて行った。
【００８７】
結果
３５５人の妊娠女性のＲｈＤ状態をスクリーニングした。それらの５４人は、ＲＨＤ陰性であった。このグループの被験者は、ＲｈＤ陽性の胎児による同種免疫の危険にあるので、それらの血漿及びＣＶＳは、胎児ＲｈＤ状態のためにさらに調査に供した。ＥＨＤ配列は、３５人の被験者の母性血漿ＤＮＡにおいて検出され、１９人の被験者の母性血漿において陰性であった。陰性の母性血漿ＲＨＤ結果を有する１９人のうちの１５人において、ＲＡＳＳＦ１Ａ配列は、酵素消化後の血漿ＤＮＡにおいて検出された。他の４例は、酵素消化後のＲＡＳＳＦ１Ａについて陰性であった。β−アクチンシグナルは、全ての症例で陰性であり、これは、ＢｓｔＵＩ酵素消化が１９例全てにおいて完全であったことを指示する。ＣＶＳ試料の分析に基づいて、酵素消化後のＲＡＳＳＦ１Ａの正の検出を有する１５人の被験者全員が、ＲｈＤ陰性の胎児を懐妊していた。それらの血漿におけるＲＨＤ及びＲＡＳＳＦ１Ａの陰性の検出を示す４人の被験者では、ＣＶＳは、それらの２人においてＲＨＤ陽性であった。したがって、これらの２例に関しては、母性血漿ＲＨＤ遺伝子型決定は、誤った陰性結果を生じ、それは、酵素消化後の正の分析マーカーＲＡＳＳＦ１Ａを検出しないことによって獲得された。この性に依存しない胎児マーカーの重要性を例証するために、これらの結果は、既存の胎児ＤＮＡマーカーであるＳＲＹと比較した。ＳＲＹアッセイは、胎児が男児である場合にのみ陽性となる。血漿においてＲＨＤ配列の陰性検出を有する１９人の被験者について、それらの６人は、ＳＲＹについて陽性であった。これは、分析した血漿試料において増幅可能な胎児ＤＮＡの存在を指示し、このようにして、さらには、胎児のＲｈＤ陰性状態の真の性質を確認した。残りの１３例では、血漿ＤＮＡにおけるＲＨＤ及びＳＲＹ配列の負の検出は、ＲｈＤ陰性の男児の結果であるのか又は母性血漿の不十分な胎児ＤＮＡであるのかは、胎児ＤＮＡの正の対照としてＲＡＳＳＦ１Ａプロトコールを用いることなしには、解明することができない。
【００８８】
実施例６：子癇前症をモニターするための性依存性マーカーとしてＲＡＳＳＦ１Ａの実証
高メチル化胎児ＤＮＡマーカーの臨床利用は、正の分析マーカーとして使用する範囲を超えている。酵素消化後にＲＡＳＳＦ１Ａ単独の検出及び／又は定量化は、出生前診断及び妊娠のモニタリングに有用であり得る。換言すれば、母性血漿におけるこれらの高メチル化胎児ＤＮＡは、自らの正確さによってバイオマーカーとして役立つ可能性がある。従来、母性血漿中の胎児ＤＮＡ濃度は、子癇前症及び胎児異数性などのある種の状態において増大することが示されている。しかしながら、性依存性の胎児ＤＮＡマーカーの欠如により、従来の試験は、男児を懐妊している妊娠女性に限定された（Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １９０：７０７−７１３；Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４７：１４７−１３９）。この実施例では、本発明者らは、酵素消化後のＲＡＳＳＦ１Ａ配列を標的化することによって、子癇前症を患っている５人の女性の血漿中の胎児ＤＮＡ濃度と、如何なる妊娠に関連した合併症もない妊娠期間が適合した５人の女性とを比較した。２つのグループの酵素消化後の母性血漿ＤＮＡ試料において測定されたＲＡＳＳＦ１Ａ濃度を図１６に示す。子癇前症の有無に関係なく、妊娠女性の濃度の中央値は、それぞれ９４００コピー／ｍＬ血漿及び２２００コピー／ｍＬ血漿であった。２つのグループ間の相違は、統計学的には有意であった（ｐ＝０．０１６、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験）。
【００８９】
開示されたアミノ酸又はポリヌクレオチド配列を含む全ての特許、特許出願、及び本出願に引用された他の刊行物は、全ての目的のために、参照により全体として援用される。
【００９０】
【表１】
2009535049.tif 000003
【００９１】
表１  分娩後の母性血漿由来のＲＡＳＳＦ１Ａ及びＳＲＹ配列のクリアランス。分娩直前及び分娩２４時間後の男児を懐妊している５人の妊娠女性から血液を採取した。母性血漿ＤＮＡがメチル化感受性酵素によって処理された後、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＳＲＹ配列は、分娩前の全ての被験者の血漿において検出されたが、分娩２４時間後の血漿試料のいずれにおいても検出することができなかった。
【００９２】
【表２】
2009535049.tif 000004
【００９３】
表２  ４３人の妊娠女性の酵素消化の有無の母性軟膜ＤＮＡ、胎盤ＤＮＡ、及び母性血漿ＤＮＡのＲＡＳＳＦ１Ａ遺伝子型。４３例のそれぞれにおいて、酵素消化した母性血漿ＤＮＡの遺伝子型は、胎盤（胎児）遺伝子型と同一であり、胎児特異的なＤＮＡ分子だけが母性血漿ＤＮＡ試料の酵素消化後に増幅可能であることを示唆した。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】ＲＡＳＳＦ１Ａ（配列番号１〜８）、ＡＰＣ（配列番号９及び１０）、及びＲＡＲＢ（配列番号１１〜１４）配列のためのプライマー、プローブ及び標準的な較正配列、並びにＰＣＲ反応条件。
【図２Ａ】（ａ）妊娠第１期及び（ｂ）妊娠第３期の胎盤組織及び対応する母性血液細胞におけるＲＡＳＳＦ１Ａ  ＣｐＧ島のメチル化状態。分析されたＣｐＧ部位は、連続的に番号付けされ、ＲＡＳＳＦ１（ヒト）ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ ００７１８２に従って命名され、位置＋１（括弧内）としてタンパク質をコードしている配列の開始コドンを有する。第１のＣｐＧ部位（−１１３）は、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（２００４年５月アセンブリー、ｈｇ１７）におけるヒトゲノムのｃｈｒ３：５０３５３３５４（反対鎖）に対応する。黒丸及び白丸は、それぞれメチル化及び非メチル化ＣｐＧ部位を表す。
【図２Ｂ】（ａ）妊娠第１期及び（ｂ）妊娠第３期の胎盤組織及び対応する母性血液細胞におけるＲＡＳＳＦ１Ａ  ＣｐＧ島のメチル化状態。分析されたＣｐＧ部位は、連続的に番号付けされ、ＲＡＳＳＦ１（ヒト）ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ ００７１８２に従って命名され、位置＋１（括弧内）としてタンパク質をコードしている配列の開始コドンを有する。第１のＣｐＧ部位（−１１３）は、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（２００４年５月アセンブリー、ｈｇ１７）におけるヒトゲノムのｃｈｒ３：５０３５３３５４（反対鎖）に対応する。黒丸及び白丸は、それぞれメチル化及び非メチル化ＣｐＧ部位を表す。
【図３−１】妊娠第１期及び妊娠第３期の胎盤組織及び対応する母性血液細胞におけるＡＰＣ及びＲＡＲＢ  ＣｐＧ島のメチル化状態。ＡＰＣについては、分析されたＣｐＧ部位は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ ００００３８に従って命名され、位置＋１としてタンパク質をコードする配列の開始コドンを有する。第１のＣｐＧ部位（−１７３７１）は、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（２００４年５月アセンブリー、ｈｇ１７）におけるヒトゲノムのｃｈｒ５：１１２１０１１１５に対応する。ＲＡＲＢについては、分析したＣｐＧ部位は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ ０１６１５２に従って命名され、位置＋１としてタンパク質をコードする配列の開始コドンを有する。第１のＣｐＧ部位（−７３２３１）は、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（２００４年５月アセンブリー、ｈｇ１７）におけるヒトゲノムのｃｈｒ３：２４３３３３７５（フォワード鎖）に対応する。黒丸及び白丸は、それぞれメチル化及び非メチル化ＣｐＧ部位を表す。
【図３−２】妊娠第１期及び妊娠第３期の胎盤組織及び対応する母性血液細胞におけるＡＰＣ及びＲＡＲＢ  ＣｐＧ島のメチル化状態。ＡＰＣについては、分析されたＣｐＧ部位は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ ００００３８に従って命名され、位置＋１としてタンパク質をコードする配列の開始コドンを有する。第１のＣｐＧ部位（−１７３７１）は、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（２００４年５月アセンブリー、ｈｇ１７）におけるヒトゲノムのｃｈｒ５：１１２１０１１１５に対応する。ＲＡＲＢについては、分析したＣｐＧ部位は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ ０１６１５２に従って命名され、位置＋１としてタンパク質をコードする配列の開始コドンを有する。第１のＣｐＧ部位（−７３２３１）は、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（２００４年５月アセンブリー、ｈｇ１７）におけるヒトゲノムのｃｈｒ３：２４３３３３７５（フォワード鎖）に対応する。黒丸及び白丸は、それぞれメチル化及び非メチル化ＣｐＧ部位を表す。
【図４】ＣＡＳＰ８（配列番号１５〜１８）に対するプライマー、プローブ及び標準較正配列、並びにＰＣＲ反応条件。
【図５】妊娠第１期及び妊娠第３期の胎盤組織及び対応する母性血液細胞におけるＣＡＳＰ８  ＣｐＧ島のメチル化状態。分析されたＣｐＧ部位は、ＣＡＳＰ８（ヒト）ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ ０３３３５５に従って命名され、位置＋１としてタンパク質をコードする配列の開始コドンを有する。第１のＣｐＧ部位（−８１６７）は、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（２００４年５月アセンブリー、ｈｇ１７）におけるヒトゲノムのｃｈｒ２：２０１９４８５５０に対応する。黒丸及び白丸は、それぞれメチル化及び非メチル化ＣｐＧ部位を表す。
【図６】ＳＣＧＢ３Ａ１（配列番号１９〜２２）に対するプライマー、プローブ及び標準的な較正及びＰＣＲ反応条件。
【図７】妊娠第３期の胎盤組織及び対応する母性血液細胞におけるＳＣＧＢ３Ａ１  ＣｐＧ島のメチル化状態。分析されたＣｐＧ部位は、ＳＣＧＢ３Ａ１（ヒト）ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ ０５２８６３に従って命名され、位置＋１としてタンパク質をコードする配列の開始コドンを有する。第１のＣｐＧ部位（−３９０）は、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（２００４年５月アセンブリー、ｈｇ１７）におけるヒトゲノムのｃｈｒ５：１７９９５１４３５に対応する。
【図８】メチル化ＤＮＡ配列の選択的増幅。遺伝子配列に連結したサークルは、メチル化感受性制限酵素の開裂部位を表す。白丸及び黒丸は、これらのメチル化感受性制限酵素開裂部位での非メチル化及びメチル化配列をそれぞれ表す。メチル化感受性制限酵素消化は、酵素制限部位で非メチル化ＤＮＡ配列を開裂する。結果として、開裂しないメチル化ＤＮＡ配列だけが、リアルタイムＰＣＲ増幅工程で検出可能である。
【図９Ａ】（ａ）胎盤及び母性軟膜ＤＮＡ試料におけるＲＡＳＳＦ１Ａに対するリアルタイムＰＣＲ増幅プロット。メチル化感受性制限酵素消化後、ＲＡＳＳＦ１Ａ配列は、胎盤ＤＮＡ試料において検出されたが、母性軟膜ＤＮＡ試料では検出されなかった。
【図９Ｂ】（ｂ）胎盤及び母性軟膜ＤＮＡ試料におけるβ−アクチンに対するリアルタイムＰＣＲ増幅。酵素消化後、β−アクチンは、胎盤及び母性軟膜ＤＮＡにおいて検出されなかった。
【図９Ｃ】（ｃ）妊娠第３期の胎盤及び対応する母性血液細胞におけるβ−アクチンＣｐＧ島のメチル化状態。分析されたＣｐＧ部位は、ヒト細胞質ベータ−アクチンＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ１０２７７に従って命名され、位置＋１としてタンパク質をコードする配列の開始コドンを有する。第１のＣｐＧ部位（−９７０）は、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（２００４年５月アセンブリー、ｈｇ１７）におけるヒトゲノムのｃｈｒ７：５５３６８７９に対応する。
【図１０Ａ】（ａ）母性血漿ＤＮＡにおける胎児誘導ＲＡＳＳＦ１Ａ配列の選択的増幅の原理を示す概略図。遺伝子配列に連結したサークルは、メチル化感受性制限酵素の開裂部位を表す。白丸及び黒丸は、これらのメチル化感受性制限酵素部位での非メチル化及びメチル化配列をそれぞれ表す。メチル化感受性制限酵素は、酵素制限部位で非メチル化ＤＮＡを特異的に消化する。結果として、母体誘導のＲＡＳＳＦ１Ａ（Ｒｓｆ）及びβ−アクチン配列、並びに胎児誘導のβ−アクチン配列は消化され、検出可能な胎児誘導のＲＡＳＳＦ１Ａ配列を放出する。黒及び白矢印は、それぞれＲＡＳＳＦ１Ａ及びβ−アクチン遺伝子を標的としたＰＣＲプライマーを表す。したがって、胎児誘導のＲＡＳＳＦ１Ａ配列だけがリアルタイムＰＣＲシステムによって検出することができる。
【図１０Ｂ】（ｂ）β−アクチンの内部対照による不安全な酵素消化の検出を説明する概略図である。メチル化感受性制限酵素消化が不完全である場合、いくつかの母性誘導のＲＡＳＳＦ１Ａ及びβ−アクチン配列、並びにいくつかの胎児誘導のβ−アクチン配列がＤＮＡ試料中に残る。この場合、不完全消化により母性誘導及び胎盤誘導の配列に由来する可能性があるＲＡＳＳＦ１Ａシグナルは、胎児ＤＮＡに特異的でない。この内部対照システムは、不完全な酵素消化により、誤った正の検出を最小化するように設計される。
【図１１Ａ】妊娠第３期の妊娠女性（ａ）及び妊娠第１期の妊娠女性（ｂ）由来の血漿に対するＲＡＳＳＦ１Ａ及びβ−アクチンについてのリアルタイム増幅プロット。酵素消化後、ＲＡＳＳＦ１Ａ配列は両女性について母性血漿で検出可能なままであった。増幅曲線の右シフトは、メチル化感受性制限酵素による母性誘導おＲＡＳＳＦ１Ａ配列の消化後のＲＡＳＳＦ１Ａ配列の量の低下による。対照的に、β−アクチン配列は、酵素によって消化され、したがって検出できなかった。７１人の妊娠被験者の細胞を含まない血漿ＤＮＡ試料を分析した。それらのうち２８人は、妊娠第１期であり、４３人は第３期であった。ＲＡＳＳＦ１Ａ配列は、メチル化感受性酵素消化後の血漿ＤＮＡ試料の滑ってにおいて検出することができた。
【図１１Ｂ】妊娠第３期の妊娠女性（ａ）及び妊娠第１期の妊娠女性（ｂ）由来の血漿に対するＲＡＳＳＦ１Ａ及びβ−アクチンについてのリアルタイム増幅プロット。酵素消化後、ＲＡＳＳＦ１Ａ配列は両女性について母性血漿で検出可能なままであった。増幅曲線の右シフトは、メチル化感受性制限酵素による母性誘導おＲＡＳＳＦ１Ａ配列の消化後のＲＡＳＳＦ１Ａ配列の量の低下による。対照的に、β−アクチン配列は、酵素によって消化され、したがって検出できなかった。７１人の妊娠被験者の細胞を含まない血漿ＤＮＡ試料を分析した。それらのうち２８人は、妊娠第１期であり、４３人は第３期であった。ＲＡＳＳＦ１Ａ配列は、メチル化感受性酵素消化後の血漿ＤＮＡ試料の滑ってにおいて検出することができた。
【図１２】妊娠していない女性の母性血漿ＤＮＡに対するＲＡＳＳＦ１Ａ及びβ−アクチンについてのリアルタイム増幅プロット。酵素消化後、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びβ−アクチンは、血漿ＤＮＡ試料において検出されなかった。この試験に採用された妊娠していない２５人の女性では、メチル化感受性酵素消化後に血漿中に検出可能なＲＡＳＳＦ１Ａシグナルを示さなかった。
【図１３】このケースでは、母体（母性軟膜ＤＮＡ）及び胎児（胎盤ＤＮＡ）のＲＡＳＳＦ１Ａ遺伝子型は、それぞれＡＣ及びＣＣであった。酵素消化なしの場合、母性血漿のＲＡＳＳＦ１Ａ遺伝子型は、ＡＣである母体のものと同一であった。酵素消化後、母体血漿のＲＡＳＳＦ１Ａの遺伝子型は、胎盤（胎児）遺伝子型と同一であるＣＣに変化した。
【図１４】２４人の妊娠第３期の妊娠女性に対する酵素消化の有無による母体血漿におけるＳＲＹ対ＲＡＳＳＦ１Ａの濃度の相関関係。全ての患者は、男児胎児を懐妊していた。酵素消化では、母体血漿におけるＳＲＹ濃度とＲＡＳＳＦ１Ａ濃度との間に正の相関関係があった（ｒ＝０．７１７、ｐ＜０．０００１、スピアマン相関）。しかしながら、酵素消化のない場合に測定したＳＰＹ濃度とＲＡＳＳＦ１Ａ濃度との間には相関関係がない（ｒ＝０．２２８、ｐ＝０．２８０、スピアマン）。
【図１５】妊娠女性における非侵襲的な胎児リーサスＤ試験のストラテジーを示す説明図。
【図１６】母性血漿における酵素消化後のＲＡＳＳＦ１Ａ配列の濃度を子癇前期妊娠において評価した。
【図１７】ＤＡＢ２ＩＰ（配列番号２３−２６）の亜硫酸水素塩配列に対するプライマー配列及びＰＣＲ反応条件。
【図１８】妊娠第３期の組織試料及び対応する母性血液細胞におけるＤＡＢ２ＩＰ  ＣｐＧ島のメチル化状態。分析したＣｐＧ部位は、ＤＡＢ２ＩＰ（ヒト）ＧｅｎＢａｎｋ受入ＮＭ ９３２５５２に従って命名され、位置＋１としてタンパク質をコードする配列の開始コドンを有する。第１ＣｐＧ部位（−５９５７２）は、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（２００４年５月アセンブリー、ｈｇ１７）におけるヒトゲノムのｃｈｒ９：１２１５４１２２１に対応する。黒丸及び白丸は、それぞれメチル化及び非メチル化ＣｐＧ部位を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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