(57)【要約】  本発明は(a)細胞膜受容体なしで細胞膜を透過できるようにするＰＴＤ(protein transduction domain)；及び(b)単独では活性を持たないが哺乳動物の細胞内で活性になり、次いで細胞外へ分泌されてＷｎｔ信号伝逹を抑制する機能を持つＷＡＤ(Wnt antagonist domain)を含む非活性Ｗｎｔ抑制ポリペプチド(WIPs)、その製造方法及び前記非活性ＷＩＰｓを有効成分として含む医薬組成物に関するものである。本発明による非活性ＷＩＰｓは、実用的に組換え大腸菌のようなバクテリアの培養によって大量生産が可能で、投与する前には非活性状態であるので、従来から知られた類似の用途の活性タンパク質(ｓＦＲＰ類、ＤＫＫ類など)に比べて、その生産コストが数十分の一に過ぎなく、分離・精製及び取り扱い・投薬過程が非常に簡単で便利である。本発明による非活性ＷＩＰｓを生体内に投与する場合、従来から知られているｓＦＲＰ類やＤＫＫ類とは異なる薬理機構によって、癌細胞の浸潤性成長と転移を抑制し、リウマチ性関節炎のような兔疫性疾患の治療効果を持つ。
2009517080.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)細胞膜受容体なしで、Ｗｎｔが細胞膜を透過できるようにするタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）；及び(b)単独では活性を持たないが哺乳動物の細胞内で活性化され、次いで細胞外へ分泌されてＷｎｔ信号伝逹を抑制する機能を持つＷｎｔアンタゴニストドメイン（ＷＡＤ）を含む、非活性Ｗｎｔ抑制ポリペプチド(WIP)。
【請求項２】
前記ポリペプチドが(c)マクロピノソームまたはエンドソームによる生物学的活性の減少を回避することができ、そして細胞導入率を向上することができるエンドソームエスケープドメイン（ＥＥＤ）をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ＥＥＤは、ＨＡ２ドメイン、ｄｉＩＮＦ−７ドメイン、ＴＬＭ１ドメイン、ＴＬＭ２ドメイン、ＨＰＶ３  ３Ｌ２ドメイン、ＨＰＶ１  ６Ｌ２ドメイン、ＨＰＶ１  ８Ｌ２ドメイン、Ｈｉｓｔａｔｉｎ５ドメイン、ｄｈｖａｒ４ドメイン及びｄｈｖａｒ５ドメインからなる群から選ばれるいずれかの１つまたは２つ以上が結合しているものであることを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ＨＡ２ドメインは配列番号４または配列番号５で表されるアミノ酸配列を有し、前記ｄｉＩＮＦ−７ドメインは配列番号６で表されるアミノ酸配列を有し、前記ＴＬＭ１ドメインは配列番号７で表されるアミノ酸配列を有し、前記ＴＬＭ２は配列番号８で表されるアミノ酸配列を有し、前記ＨＰＶ３  ３Ｌ２ドメインは配列番号９で表されるアミノ酸配列を有し、前記ＨＰＶ１  ６Ｌ２は配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有し、前記ＨＰＶ１  ８Ｌ２は配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有し、前記Ｈｉｓｔａｔｉｎ５は配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有し、前記ｄｈｖａｒ４は配列番号１３で表されるアミノ酸配列を有し、前記ｄｈｖａｒ５は配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ＷＡＤはｓＦＲＰ−１(secreted Frizzled-related protein-1, FRP, SARP2, FrzA)、ｓＦＲＰ−２(SARP1)、ｓＦＲＰ−３(FzB, Fritz)、ｓＦＲＰ−４(FrzB-2)、ｓＦＲＰ−５(SARP3)、Ｓｉｚｚｌｅｄ、Ｓｉｚｚｌｅｄ２、Ｃｒｅｓｃｅｎｔ、ＷＩＦ−１、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｃｏｃｏ、ＤＫＫ−１(Dickkopf-1)、ＤＫＫ−２、ＤＫＫ−３(REIC)、ＤＫＫ−４、及びＳｏｇｇｙ(DKKL2)からなる群から選ばれるいずれかの１つまたは２つ以上が結合されたことを特徴とする、請求項１に記載の非活性Ｗｎｔ抑制ポリペプチド(WIP)。
【請求項６】
前記ＰＴＤはＴＡＴ、ＡｎｔＨＤ、ＶＰ２２ペプチド、ｍｐｈ−１−ｂｔｍ、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、Ｂｕｆｏｒｉｎ  ＩＩ、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ、Ｋｕ７０、Ｐｒｉｏｎ、ｐＶＥＣ及びPep-1からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の非活性Ｗｎｔ抑制ポリペプチド(WIP)。
【請求項７】
ＰＴＤとＷＡＤが融合されている、請求項1に記載の非活性Ｗｎｔ抑制ポリペプチド(WIP)。
【請求項８】
ｓＦＲＰ−１(FRP, SARP2, FrzA)、ｓＦＲＰ−２(SARP1)、ｓＦＲＰ−３(FzB, Fritz)、ｓＦＲＰ−４(FrzB-2)、ｓＦＲＰ−５(SARP3)、Ｓｉｚｚｌｅｄ、Ｓｉｚｚｌｅｄ２、Ｃｒｅｓｃｅｎｔ、ＷＩＦ−１、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｃｏｃｏ、ＤＫＫ−１、ＤＫＫ−２、ＤＫＫ−３(REIC)、ＤＫＫ−４、及びＳｏｇｇｙ(DKKL2)からなる群から選ばれたＷＡＤをコードするＤＮＡの５’の上流に、ＰＴＤの塩基配列、タギングのための塩基配列、及び分離・精製のための４つ以上のヒスチジンをコードする塩基配列が挿入されている組換えベクター。
【請求項９】
マクロピノソームまたはエンドソームによる生物学的活性の減少を回避することができ、細胞導入率を向上することができるＥＥＤをコードする塩基配列をさらに含む、請求項８に記載の組換えベクター。
【請求項１０】
前記ＥＥＤはＨＡ２ドメイン、ｄｉＩＮＦ−７ドメイン、ＴＬＭ１(translocation motif1)ドメイン、ＴＬＭ２ドメイン、ＨＰＶ３  ３Ｌ２ドメイン、ＨＰＶ１  ６Ｌ２ドメイン、ＨＰＶ１  ８Ｌ２ドメイン、Ｈｉｓｔａｔｉｎ５ドメイン、ｄｈｖａｒ４ドメイン及びｄｈｖａｒ５ドメインからなる群から選ばれるいずれかの１つまたは２つ以上が結合されていることを特徴とする、請求項９に記載の組換えベクター。
【請求項１１】
前記ＨＡ２ドメインは配列番号４または配列番号５で表されるアミノ酸配列を有し、前記ｄｉＩＮＦ−７ドメインは配列番号６で表されるアミノ酸配列を有し、前記ＴＬＭ１ドメインは配列番号７で表されるアミノ酸配列を有し、前記ＴＬＭ２は配列番号８で表されるアミノ酸配列を有し、前記ＨＰＶ３  ３Ｌ２ドメインは配列番号９で表されるアミノ酸配列を有し、前記ＨＰＶ１６Ｌ２は配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有し、前記ＨＰＶ１  ８Ｌ２は配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有し、前記Ｈｉｓｔａｔｉｎ５は配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有し、前記ｄｈｖａｒ４は配列番号１３で表されるアミノ酸配列を有し、前記ｄｈｖａｒ５は配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１０に記載の組換えベクター。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれかの一項に記載の組換えベクターで形質転換されたバクテリア。
【請求項１３】
次の段階を含む非活性WIPの製造方法：
(a)請求項８の組換えベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、ＰＴＤ−ＷＡＤ融合ポリペプチドを発現させる段階；
(b)前記培養液から細胞を回収した後、これに尿素溶液を加えて前記ポリペプチドの二次及び三次構造をとり除くか、一次線形構造に変形させる段階；及び
(c)一次線形構造のＰＴＤ−ＷＡＤ融合ポリペプチド(非活性WIP)を精製する段階。
【請求項１４】
前記ＰＴＤはＴＡＴ、ＡｎｔＨＤ(Drosophila homeoprotein atennapedia transcription protein)、ＶＰ２２ペプチド、ｍｐｈ−１−ｂｔｍ、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、Ｂｕｆｏｒｉｎ  ＩＩ、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ、Ｋｕ７０、Ｐｒｉｏｎ、ｐＶＥＣ及びPep-1からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記精製段階は前記融合ポリペプチドをＮｉ−Ｔｉビーズに結合させ、これを尿素溶液で洗浄した後、イミダゾールと塩含有緩衝溶液を使って溶出させることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
次の段階を含む非活性WIPの製造方法：
(a)請求項９〜１１のいずれかの一項に記載の組換えベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、ＰＴＤ−ＥＥＤ−ＷＡＤ融合ポリペプチドを発現させる段階；
(b)前記培養液から細胞を回収した後、これに尿素溶液を加えて前記ポリペプチドの二次及び三次構造をとり除くか、一次線形構造に変形させる段階；及び
(c)一次線形構造のＰＴＤ−ＥＥＤ−ＷＡＤ融合ポリペプチド(非活性WIP)を精製する段階。
【請求項１７】
前記ＰＴＤはＴＡＴ、ＡｎｔＨＤ(Drosophila homeoprotein atennapedia transcription protein)、ＶＰ２２ペプチド、ｍｐｈ−１−ｂｔｍ、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、Ｂｕｆｏｒｉｎ  ＩＩ、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ、Ｋｕ７０、Ｐｒｉｏｎ、ｐＶＥＣ及びPep-1からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１６に記載の方法.
【請求項１８】
前記精製段階は前記融合ポリペプチドをＮｉ−Ｔｉビーズに結合させ、これを尿素溶液で洗浄した後、イミダゾールと塩含有緩衝溶液を使って溶出させることを特徴とする、請求項１６に記載の方法.
【請求項１９】
請求項１〜７のいずれかの一項に記載の非活性Ｗｎｔ抑制ポリペプチド(WIP)を有効成分として含む、癌細胞の成長及び転移抑制用医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１〜７のいずれかの一項に記載の非活性Ｗｎｔ抑制ポリペプチド(WIP)を有効成分として含む、免疫疾患治療用医薬組成物。
【請求項２１】
前記免疫疾患は関節炎であることを特徴とする、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１〜７のいずれかの一項に記載の非活性Ｗｎｔ抑制ポリペプチド(WIP)を有効成分として含む、肺線維症抑制用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の技術分野】
【０００１】
本発明は(a)細胞膜受容体なしに細胞膜を透過できるようにするＰＴＤ(protein transduction domain)；及び(b)単独では活性を持たないが哺乳動物の細胞内で活性化され、次いで細胞外へ分泌されてＷｎｔ信号伝逹を抑制する機能を持つＷＡＤ(Wnt antagonist domain)を含む、非活性Ｗｎｔ抑制ポリペプチド(Wnt inhibition polypeptides： WIPs),その製造方法、及び前記非活性ＷＩＰｓを有効成分として含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｗｎｔ遺伝子は、Drosophilaの発生を調節する遺伝子(wingless)がマウスの癌発生遺伝子(Int-1)と同じものという事実から由来した(Cell, 50：649, 1987)。その後、Ｗｎｔ信号伝達体系は約20個の類似遺伝子群からなり、これらは特定の受容体、すなわちＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体(Fz)とＬＲＰ５／６補助受容体を介して細胞内で信号を伝達すると知られている。ＦｚとＬＲＰを介して伝達された信号はＤｖｌ(Dishevelled)、ＡＰＣ(adenomatous polyposis coli)、Ａｘｉｎを経って、最後にはＧＳＫ３−β(glycogen synthase kinase 3-β)によるβ-カテニン(β-catenin)の活性化を調節し、したがってβ-カテニンはＷｎｔ信号伝達体系の鍵となる調節因子である(Science, 303：1483, 2004；Genes Dev., 11：3286, 1997)。一方、β-カテニンはＴＣＦ(T-cell factor)／Ｌｅｆ(lymphoid enhancing factor)と結合して多様な遺伝子の転写と、β-カテニンを含むＷｎｔ信号伝逹構成要素の異相を調節し、最も代表的な癌発生因子である(Biochem. Biophy. Acta, 1653：1, 2003)。
【０００３】
ヒトに発生する悪性腫瘍が、正常細胞または組織と異なる二つの特徴は、連続した細胞分裂と、他の臓器への転移である。特に、上皮由来の腫瘍(悪性腫瘍の95%)の他の部位への転移は、患者の生存に決定的な役目を担うようになる。しかし、癌細胞の細胞学的転移機構はよく知られていない。今まで上皮細胞の細胞間接合タンパク質は、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎが転移を調節する重要な因子として考えられたが、癌細胞のＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ発現調節機構はほとんど知られていない。最近、ヒトのＳｎａｉｌ遺伝子がＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎのｍＲＮＡ転写を直接的に抑制すると報告され(Nature Cell Biol., 2：84, 2000；Nature Cell Biol., 2：76, 2000；Nature Rev. Mol. Cell Biol., 3：155, 2002)、より最近は、Ｗｎｔ信号伝達体系がＧＳＫ３−β活性化を抑制してβ-カテニンだけではなく、Ｓｎａｉｌのリン酸化と半減期を調節すると知られている(J. Biol. Chem., 280：11740, 2005)。これはＷｎｔ信号伝達体系が癌発生だけではなく、癌細胞の転移過程をもともに調節することを示唆することであり、したがってＷｎｔ信号伝達体系を遮断する場合、癌細胞の成長と転移の抑制の可能性を示唆するものである。
【０００４】
一方、リウマチ性関節炎(Rheumatic Arthritis, RA)の一番代表的な発病機構は、活性化ＦＬＳ(fibroblast-like synoviocytes)の増殖とこれによる関節の退行性変化であり、最近ＦＬＳの増殖がＷｎｔによって誘導され、Ｗｎｔアンタゴニスト(antagonist)を使えば、FLSの活性化が力強く抑制されて、ＲＡの新しい治療法としての可能性が提示されている(Rhuematol., 44：708, 2005)。また、肺線維症(pulmonary fibrosis)のような纎維症疾患でも、Ｗｎｔ/β-カテニン信号伝逹の活性化が呼吸困難をもたらす肺纎維症をもたらすと知られて(Am. J. Pathol., 162：1495, 2003)、Ｗｎｔ信号伝達体系は幹細胞分化だけではなく(Nature, 432：324, 2004)、多様な疾患の発病機構として把握されている。したがって、Ｗｎｔ信号伝達体系を効果的に遮断できる方法が提示されたら、癌を含む多様な疾患の画期的な治療法が開発できるだろう。
【０００５】
特に、ヒトを含む高等動物ではＷｎｔ信号を抑制できるタンパク質群が存在する。これらはＷｎｔタンパク質と同じように分泌されてＦｚ受容体やＬＲＰ補助受容体に結合することで、Ｗｎｔ信号に拮抗(antagonist)作用する(J. Cell Sci., 116：2627, 2003)。これらＷｎｔアンタゴニストは二つの群として分類することができる：(1)ｓＦＲＰ１−５、ｓｉｚｚｌｅｄ１−２、Ｃｒｅｓｃｅｎｔ、ＷＩＦ−１、ＣｏｃｏのようなｓＦＲＰ(secreted Frizzled-related protein)群(J. Cell Sci., 116：2627, 2003)；及び(2)ＤＫＫ１−４、Ｓｏｇｇｙ(Nature, 411：255, 2001)のようなＤｉｃｋｋｏｐｆ(DKK)群。
【０００６】
したがって、これらＷｎｔアンタゴニストがＳｎａｉｌ遺伝子のリン酸化を促進して、結果的にＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ転写を増加させ、上皮由来癌細胞の浸潤性成長と転移を抑制できたら(J. Biol. Chem., 280：11740, 2005)、癌細胞の転移を抑制する画期的な治療法を提示して、さらにはＷｎｔ信号によって誘導される多様な疾患の効果的な治療法を開発できるだろう。
【０００７】
しかし、タンパク質を効果的に細胞及び組織に伝達する方法はさまざまな技術的問題を起こす。最近、タンパク質を細胞内で効果的に伝達できるタンパク質導入ドメイン(protein transduction domain： PTD；Joliot、A.ら、Nature Cell Biol., 6：198, 2004；アメリカ特許2006/0222657A1)が発見されることによって、生物学的活性の期待できる多様なペプチドの細胞内への伝達が可能となった。
【０００８】
ＰＴＤとしてはＴＡＴ(transactivator of transcription)、ＡｎｔＨＤ(Drosophilahomeoprotein atennapedia transcription protein)、ＶＰ２２(virus protein22)ペプチド及びｍｐｈ−１−ｂｔｍ(mouse transcription inhibitory facter-1-biomolecule transduction mortif)、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、Ｂｕｆｏｒｉｎ  ＩＩ、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ、Ｋｕ７０、Ｐｒｉｏｎ、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−１、ＰＴＤ−５、ＫＡＬＡ(Joliot、A.ら、Nature Cell Biol., 6：198, 2004；Kabouridis, P.S., Trends Biotechnol., 21：498, 2003)などが知られている。前記ＰＴＤは、典型的には自然状態で陽イオンであり、細胞膜受容体なしにエンドソーム(endosome)にある脂質ラフト(lipid raft)へ入いることによって、細胞質に輸送され、細胞内でエンドソームの形態である運搬体を分離する。
【０００９】
一番よく知られているＴＡＴの場合、ＴＡＴタンパク質に存在する９つの塩基性アミノ酸(RKKRRQRRR)からなる部分が、細胞膜を通過するのに重要な役割を担うのが明かになった。しかし、ＴＡＴ(RKKRRQRRR)は陽電荷を持つアミノ酸が高い頻度で存在するので透過率が低く、ＴＡＴ−融合タンパク質は自然状態では細胞内に運ばれず、変性状態で細胞内へ運ばれた後、細胞内でタンパク質のリフォールディング(refolding)が起きて活性を持つので、ＴＡＴ−融合タンパク質の安定性及び細胞内での保持性が、自然状態より効率的でないという問題があるだけではなく(Schwartze, S.R.ら、Trends in Cell Biology, 10：290, 2000)、ＴＡＴ−融合タンパク質がエンドサイトーシス(endocytosis)を介して細胞内へ入ると、細胞内運搬体と結合した形態で残っているので後続過程として起きる細胞質(cytoplasm)、核(necleus)または細胞器官(organelle)への移動が効率的に起きないという問題がある。また、ＡｎｔＨＤ(Drosophila homeoprotein atennapedia transcription protein)の場合、１００アミノ酸未満の長さのタンパク質だけを融合できるという問題がある。
【００１０】
タンパク質を細胞内へ効果的に伝達できる、もう一つの物質として、インフルエンザ膜融合タンパク質(influenza membrane fusion protein)であるヘマグルチニン２(haemagglutinin2, HA2 domain；Skehel, J.J.ら、Biochem. Society Med., 10：310, 2004；Jehangir, S.W.ら、Nature Medicine, 10：310, 2004；Vaccaro, L.ら、Biophy. J., 88：25, 2005)が知られており、それは、マクロピノソーム(macropinosome)またはエンドソーム(endosome)による生物学的活性の減少を回避することができ、そして細胞透過率を向上することができる。
【００１１】
インフルエンザのヘマグルチニン(HA)は、ウィルス外被(viral envelope)の成分である糖タンパク質(glycoprotein)の一種で、標的細胞にウィルスが附着するようにするか、標的細胞膜とウィルス外被膜(viral envelope membrane)が融合するようにすることによって介在する役目を担う。一般的なウィルス感染の場合、細胞表面に附着したウィルスは、エンドソームに入って相対的に低いｐＨに露出される。前記のようなｐＨの変化は、構造変化の引き金となり、この構造変化は、ＨＡのアミノ末端がたくさん露出する形態的な変化だけではなく、ウィルス外被とエンドソーム膜間の融合を起こす。
【００１２】
ＨＡはＨＡ１とＨＡ２の２個のポリペプチド断片で構成され、ＨＡ１断片は、シアル酸(sialic acid)-結合部位を形成して宿主細胞表面に附着するように介在する役目を担う。ＨＡ２断片は膜−ｓｐａｎｎｉｎｇ  ａｎｃｈｏｒを形成して、前記アミノ-末端部位が融合反応機構で作用するようになる。
【００１３】
ヘマグルチニン２(haemagglutinin2, HA2 domain)は一つ以上のＴ−ヘルパー細胞認識部位を持つが、Ｂ−細胞認識部位は持たないので、ＨＡ２ドメインに結合した抗原に対してＴ−依存性免疫学的反応を誘発するが、その自体に対しては抗体反応を誘導しない。ＨＡ２セグメントは、ウィルスの脂質外膜によって一般的に延長されたカルボキシ末端近くに疎水性アミノ酸配列を含むので、リポソームの脂質二重層との結合を促進して細胞内へタンパク質を効果的に伝達できるヘルパーペプチドとして適する。また、ＨＡ２とＰＴＤを同時に利用する場合、エンドソーム(endosome)から細胞質(cytoplasm)、核(nucleus)または他の細胞内器官へ、ポリペプチド、タンパク質などの異種分子(heterologous molecules)を分泌する機能が向上して、細胞内への透過を促進すると報告されている(アメリカ特許2006/0222657A1)。
【００１４】
ＨＡ２と類似の機能をするペプチドとしてはインフルエンザウィルス由来ｄｉＩＮＦ−７ドメイン、B型肝炎ウィルス(Hepatitis B virus, HBV)由来ＴＬＭ(translocation motif)、ヒトパピロマウィルス(Human Papilloma Virus, HPV)由来Ｌ２  ｄｏｍａｉｎ、抗生物質として開発されたヒスタチン５(Histatin 5)ドメイン、合成ペプチドであるｄｈｖａｒ４ドメイン及びｄｈｖａｒ５ドメインなどが知られている(Stoeckl, L.ら、Proc. Natl. Acad. Sci., 103：6730；2006；Kamper, N., J. Virol., 80：759, 2006；Mastrobattista, E.ら、J. Biol. Chem., 277：27135, 2002；den Hertog, A.L.ら、Biochem. J., 379：665, 2004)。これらは、細胞内へ導入されたウィルスやペプチドが、囲まれている脂質膜を通過し、細胞質に流離するように機能する(endosomal escape、endosomal rescue)。
【００１５】
ＰＴＤを利用する場合、比較的大きいタンパク質も受容体なしに細胞内へ伝達できることが知られていて、ＨＳＰｓ(heat shock proteins)などによって生物学的活性を持ったタンパク質にリフォールディング(refolding)されることが期待できる(Nature Med., 4：1449, 1998；Science, 285：1569, 1999)。しかしながら、細胞及び組織にタンパク質を効果的に運搬する方法は、様々な技術的問題に直面している。最近、ＨＩＶに存在するタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）を用いて、細胞にタンパク質を効果的に運搬する方法が示唆された(Nature Med., 4:1449, 1998; Science, 285:1569, 1999)。しかし、ｓＦＲＰやＤＫＫ群と同じように分泌するタンパク質の場合、タンパク質が細胞内へ効果的に伝達されると言っても、活性化アンタゴニストが分泌され、さらにはＷｎｔ信号を抑制する機能を遂行することができるかについては、全然知られておらず、これのためには次のような具体的な過程に対する実験的証明が必要である：(1)ＰＴＤ融合タンパク質の細胞内導入とこれによる活性化したタンパク質の分泌；(2)生体で分泌するタンパク質は、細胞内でヒューリンのような前駆タンパク質転換酵素(proprotein convertase)などによる切断と、グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）のような活性化過程を伴うので、ＰＴＤを利用して導入したタンパク質の適切な細胞内活性化過程；及び(3)分泌されたタンパク質が適切な生物学的機能を示すかについての検証。
【００１６】
Ｗｎｔアンタゴニストを利用した臨床治療効果については、まだ本格的な研究が行われていない。現在市販中のＷｎｔアンタゴニストは研究用だけで使われているし、これらは前記の翻訳後修飾(post-translational modification)の問題から、大部分昆虫細胞(sf21)から誘導したＤＫＫ−１、動物細胞(NSO)から誘導したＤＫＫ−４、ｓＦＲＰ−４などである。しかし、これらは細胞を形質転換し、培地内へ分泌された活性タンパク質を分離・精製するため生産コストが非常に高く、また、抽出過程における活性の消失が避けられず大量生産には限界がある。
【００１７】
したがって、当業界では前記ｓＦＲＰ類やＤＫＫ類と同等以上の生医学的効用性を持ち、従来から知られているタンパク質に比べて製造コストが非常に安く、分離・精製段階での非効率的な不便性と、保管、取り扱い及び投薬段階での不便性と活性の低下問題とを根源的に解決することができる、新しい生化学的物質の開発が要求されている。
【００１８】
そこで、本発明者らは癌転移やリウマチ性関節炎のような、Ｗｎｔ信号介在疾患を効果的に治療することができる、新しい製剤を開発するために鋭意努力した結果、細胞膜受容体なしに細胞膜を透過できるようにするＰＴＤ(protein transduction domain)；及び単独では活性を持たないが、哺乳動物の細胞内で活性化され、次いで細胞外へ分泌されてＷｎｔ信号伝逹を抑制する機能を持つＷＡＤ(Wnt antagonist domain)を含む非活性Ｗｎｔ抑制ポリペプチド(WIPs)に着目して、前記非活性ＷＩＰｓが従来の活性タンパク質に比べて、その製造コストが非常に低く、保管及び取り扱いが容易なだけでなく、投与が非常に簡単に済むことを確認し、さらに前記非活性ＷＩＰｓが受容体なしに細胞内へ透過されて細胞内でＨＳＰ(heat shock protein)などによって活性化され、活性タンパク質の多量分泌によって、Ｗｎｔ信号伝逹を抑制するという新しい薬理機構を持つことを確認し、本発明を完成するようになった。
【発明の要約】
【００１９】
本発明の主な目的は、Ｗｎｔ信号伝達体系を抑制することによって、上皮由来の癌細胞の成長と転移を抑制するか、リウマチ性関節炎のようにＷｎｔ信号で介在される疾患を治療するため、人体に直接投薬されるように設計され、従来から知られている活性タンパク質とは全然異なる構造と特性及び薬理機轉を持つ、非活性Ｗｎｔ抑制ポリペプチド(WIPs)及びその製造方法を提供するものである。
【００２０】
本発明の他の目的は、前記非活性ＷＩＰｓを有効成分として含む医薬組成物を提供するものである。
【００２１】
前記のような目的を果たすために、本発明は(a)細胞膜受容体なしで、細胞膜を透過できるようにするタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）(protein transduction domain)；及び(b)単独では活性を持たないが哺乳動物の細胞内で活性化され、次いで細胞外へ分泌されてＷｎｔ信号伝逹を抑制する機能を持つＷｎｔアンタゴニストドメイン（ＷＡＤ）(Wnt antagonist domain)を含む非活性Ｗｎｔ抑制ポリペプチド(WIP)を提供する。
【００２２】
本発明による非活性Ｗｎｔ抑制ポリペプチド(WIP)はマクロピノソーム(macropinosome)またはエンドソーム(endosome)による生物学的活性の減少を回避することができるし、細胞導入率を向上するようにエンドソームエスケープドメイン（ＥＥＤ）(Endosomal Escape domain)をさらに含むことを特徴とする。
【００２３】
さらに本発明は、ｓＦＲＰ−１(FRP, SARP2, FrzA)、ｓＦＲＰ−２(SARP1)、ｓＦＲＰ−３(FzB, Fritz)、ｓＦＲＰ−４(FrzB-2)、ｓＦＲＰ−５(SARP3)、Ｓｉｚｚｌｅｄ、Ｓｉｚｚｌｅｄ２、Ｃｒｅｓｃｅｎｔ、ＷＩＦ−１、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｃｏｃｏ、ＤＫＫ−１、ＤＫＫ−２、ＤＫＫ−３(REIC)、ＤＫＫ−４、及びＳｏｇｇｙ(DKKL2)からなる群から選ばれるＷＡＤ(Wnt antagonist domain)をコードするＤＮＡと５'の上流にＰＴＤの塩基配列、タギング(tagging)のための塩基配列及び分離・精製のための4つ以上のヒスチジン(histidine)をコードする塩基配列が挿入されている組換えベクター及び前記組換えベクターで形質転換されたバクテリアを提供する。
【００２４】
本発明による組換えベクターは、マクロピノソーム(macropinosome)またはエンドソーム(endosome)による生物学的活性の減少を回避することができるし、細胞透過率を向上することができるＥＥＤ(Endosomal Escape domain)をコードする塩基配列をさらに含むことを特徴とする。
【００２５】
さらに本発明は、(a)前記形質転換されたバクテリアを培養してＰＴＤ−ＷＡＤ融合ポリペプチドまたはＰＴＤ−ＥＥＤ−ＷＡＤ融合ポリペプチドを発現させる段階；(b)前記培養液から細胞を回収した後、これに尿素溶液を加えて前記ポリペプチドの二次及び三次構造をとり除くか、一次線形構造に変形させる段階；及び(c)一次線形構造のＰＴＤ−ＷＡＤポリペプチドまたはＰＴＤ−ＥＥＤ−ＷＡＤ融合ポリペプチド(非活性WIP)を精製する段階を含む非活性Ｗｎｔ抑制ポリペプチド(WIP)の製造方法を提供する。
【００２６】
さらに本発明は、前記非活性ＷＩＰを有効成分として含む癌細胞の成長及び転移抑制用医薬組成物を提供する。さらに本発明は、前記非活性ポリペプチドを有効成分として含む免疫疾患及び炎症治療用医薬組成物を提供する。さらに本発明は、前記非活性ポリペプチドを有効成分として含む肺線維症抑制用医薬組成物を提供する。
【００２７】
本発明の他の特徴及び具体例は次の詳細な説明及び添付された特許請求の範囲からさらに明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ヒトＤＫＫ−１(hDKK-1)発現によってＳｎａｉｌ発現が抑制されたのを示す図である。
【図２】形質転換された大腸菌ＢＬ２１の培養の時、ＩＰＴＧでタンパク質発現を誘導する以前と以後の、全体タンパク質の電気泳動写真である。
【図３】抗Ｘ−ｐｒｅｓｓ抗体(anti-X-press antibody)を利用して行ったＴＡＴ−ＤＫＫ−１のウェスタンブロット(western blot)の結果である。
【図４】本発明によるＴＡＴ−ＤＫＫ−１が、細胞内でE-カドヘリン(E-caherin)プロモーター活性を増加可能であるかを確認した結果である。
【図５】本発明のＴＡＴ−ＤＫＫ−１による癌細胞浸潤抑制効果を示す図である。
【図６】本発明によるＴＡＴ−ＤＫＫ−１とＴＡＴ−ＨＡ２−ＤＫＫ−１を投与した後、細胞培地に分泌された活性化ＤＫＫ−１を免疫沈降法によって確認した図である。
【発明の詳細な説明及び望ましい具体例】
【００２９】
本発明は、(a)細胞膜受容体なしで、細胞膜を透過できるようにするＰＴＤ(protein transduction domain)；及び(b)単独では活性を持たないが哺乳動物の細胞内で活性化され、次いで細胞外へ分泌されてＷｎｔ信号伝逹を抑制する機能を持つＷＡＤ(Wnt antagonist domain)を含む非活性Ｗｎｔ抑制ポリペプチド(WIP)に関する。
【００３０】
従来の活性ＤＫＫ類やｓＦＲＰ類を製造するためには、生産性が顕著に低いｓｆ２１やＮＳＯのように組換え動物細胞培養に依存しなければならない問題がある。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のＤＫＫ−１、ＤＫＫ−４、ｓＦＲＰ−４のような組換えタンパク質は、上述の通り、分離・精製が複雑で高コストの問題がある。一般的に使われる安価の組換え大腸菌の培養によって一部組換えタンパク質を製造しているが、この場合にも製造しようとする、分泌タンパク質の生化学的構造と活性に多くの制約を受けるようになる。
【００３１】
本発明ではこのように、Ｗｎｔアンタゴニストを人体や哺乳類動物生体に投与する際に、第一に非効率性の問題となる生化学的活性、すなわち三次立体構造を持たない非活性ポリペプチドに着目した。本発明者は、細胞膜受容体なしに非活性ポリペプチドを細胞内へ透過させるために、ＴＡＴのようなＰＴＤに融合させて、細胞膜透過を試みた。その結果、本発明による非活性ＴＡＴ−ＤＫＫ−１は、細胞膜を透過して細胞内へ導入され、Ｗｎｔ信号伝逹を抑制することによって、Ｓｎａｉｌ遺伝子の発現を減少させ、結果的に癌細胞の浸潤を抑制した。
【００３２】
本発明において、前記ＷＡＤはｓＦＲＰ−１(FRP, SARP2, FrzA)、ｓＦＲＰ−２(SARP1)、ｓＦＲＰ−３(FzB, Fritz)、ｓＦＲＰ−４(FrzB-2)、ｓＦＲＰ−５(SARP3)、Ｓｉｚｚｌｅｄ、Ｓｉｚｚｌｅｄ２、Ｃｒｅｓｃｅｎｔ、ＷＩＦ−１、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｃｏｃｏ、ＤＫＫ−１、ＤＫＫ−２、ＤＫＫ−３(REIC)、ＤＫＫ−４、Ｓｏｇｇｙ(DKKL2)などのように、細胞内に透過されてＨＳＰなどによって活性化し、分泌してＷｎｔ信号を抑制する限り、これらに限定されない。特に、これら遺伝子に大部分存在する、システインが豊富なドメイン(cystein-rich domain)との組変えは、特定信号伝逹を抑制するのに効果的であるだろう(Brott, B.K. & Sokol, S.Y., Mol. Cell Biol., 22：6100, 2002)。
【００３３】
本発明による非活性Ｗｎｔ抑制ポリペプチド(WIP)は、ＰＴＤとＷＡＤのみを含んでも良いが、マクロピノソーム(macropinosome)またはエンドソーム(endosome)による生物学的活性の減少を回避することができ、細胞導入率を向上することができるＨＡ２ドメインのようなＥＥＤ(Endosomal Escape Domain)を含むのがさらに望ましい。すなわち、ＨＡ２ドメインのようなＥＥＤを含む場合、非活性Ｗｎｔ抑制ポリペプチドが細胞膜を透過して、エンドソーム(endosome)またはマクロピノソーム(macropinosome)内部に限局される問題を克服するのが可能である(Jehangir, S.W.ら、Nature Med., 10：310, 2004)。
【００３４】
本発明では、ＥＥＤとしてインフルエンザウィルス由来のＨＡ２ペプチドを用いたが、これに限られることではない。例えば、細胞透過性ペプチドが脂質二重層(lipid bilayer)に密封されていることを回避することができるクロロキン(chloroquine)またはスクロース(sucrose)のような薬物や、インフルエンザウィルス由来のｄｉＩＮＦ−７ドメイン、B型肝炎ウィルス(Hepatitis B virus、HBV)由来のＴＬＭ(translocation motif)、ヒトパピロマウィルス(Human Papilloma Virus, HPV)由来のL2ドメイン、抗生物質で開発されたＨｉｓｔａｔｉｎ５ドメイン、合成ペプチドであるｄｈｖａｒ４ドメイン及びｄｈｖａｒ５ドメインなどのようなＥＥＤを使うこともできる(Stoeckl, L.ら、Proc. Natl. Acad. Sci., 103：6730；2006；Kamper, N., J. Virol., 80：759, 2006；Mastrobattista, E.ら、J. Biol. Chem., 277：27135, 2002；den Hertog, A.L.ら、Biochem. J., 379：665, 2004)
【００３５】
より具体的には、配列番号４のアミノ酸配列(GLFGAIAGFIENGWEGMIDG)を有するＨＡ２ドメイン；配列番号５のアミノ酸配列(GLFEAIAEFIEGGWEGLIEG)を有するＨＡ２ドメイン類似体；配列番号６のアミノ酸配列(GLFEAIEGFIENGWEGMIDG)を有するｄｉＩＮＦ−７ドメイン、配列番号７のアミノ酸配列(LLNQLAGRMIPK)を有するＴＬＭ１(translocation motif1)；配列番号８のアミノ酸配列(TLDHVLDHVQTM)を有するＴＬＭ２；配列番号９のアミノ酸配列(SYFILRRRRKRFPY)を有するＨＰＶ３  ３Ｌ２；配列番号１０のアミノ酸配列(SYYMLRKRRRKRLPY)を有するＨＰＶ１  ６Ｌ２；配列番号１１のアミノ酸配列(LYYFIRKKRKRVPY)を有するＨＰＶ１  ８Ｌ２；配列番号１２のアミノ酸配列(DSHAKRHHGYKRKFHEKHHSHRGY)を有するＨｉｓｔａｔｉｎ５；配列番号１３のアミノ酸配列(KRLFKKLLFSLRKY)を有するｄｈｖａｒ４；または配列番号１４のアミノ酸配列(LLLFLLKKRKKRKY)を有するｄｈｖａｒ５と、これらが2つ以上結合されている結合体を用いることができる。
【００３６】
本発明による非活性ＷＩＰｓは、細胞膜受容体なしで、細胞膜が透過できるようにするＰＴＤと、ＨＳＰ(heat shock protein)などによって細胞内で活性化され、分泌されてＷｎｔ信号を抑制することができるＷＡＤ、及び選択的に、マクロピノソーム(macropinosome)またはエンドソーム(endosome)による生物学的活性の減少を回避することができ、細胞導入率を向上することができるＥＥＤを含むポリペプチドであって、単独では活性を持たないが、生物体や細胞へ透過された後、前記タンパク質が活性化され、その活性化されたタンパク質が細胞外へ分泌されて効果を示すようになる。このような、本発明による非活性ＷＩＰｓは製造コストが高く、保管及び取り扱いが容易でなく、受容体を必ず要する従来の活性タンパク質が持つ問題のすべてを解決できる。
【００３７】
本発明は、他の観点として、ｓＦＲＰ−１(FRP、SARP2、FrzA)、ｓＦＲＰ−２(SARP1)、ｓＦＲＰ−３(FzB, Fritz)、ｓＦＲＰ−４(FrzB-2)、ｓＦＲＰ−５(SARP3)、Ｓｉｚｚｌｅｄ、Ｓｉｚｚｌｅｄ２、Ｃｒｅｓｃｅｎｔ、ＷＩＦ−１、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｃｏｃｏ、ＤＫＫ−１、ＤＫＫ−２、ＤＫＫ−３(REIC)、ＤＫＫ−４、及びＳｏｇｇｙ(DKKL2)からなる群から選ばれるいずれかの１つまたは2つ以上の組合せであるＷＡＤ(Wnt antagonist domain)をコードするＤＮＡの５’の上流にＰＴＤの塩基配列、タギング(tagging)のための塩基配列及び分離・精製のための４つ以上のヒスチジン(histidine)をコードする塩基配列が挿入されている組換えベクター及び前記組換えベクターで形質転換されたバクテリアに関する。
【００３８】
まず、本発明では、ＤＫＫ−１遺伝子の５’部位(5' region)の上流にタギング(tagging)のための塩基配列、分離・精製のための4つ以上のヒスチジン(histidine)をコードする塩基配列及び開始塩基配列であるATGを挿入して組換えベクターを製作した。本発明による組換えベクターは前述したＥＥＤをコードする塩基配列をさらに含むのがさらに望ましい。
【００３９】
本発明において、前記Ｗｎｔ信号抑制遺伝子として、ＤＫＫ−１をコードする遺伝子を用いたが、これに限られることではない。また、前記ＰＴＤとしてＴＡＴ(YGRKKRRQRRR)を用いたが、これに限られることではない。
【００４０】
例えば、ＡｎｔＨＤ(Drosophila homeoprotein atennapedia transcription protein, RQIKIWFQNRRMKWKK, 配列番号１５)、ＶＰ２２ペプチド(Gene Therapy, 8：1, Blackbirch Press, 2001)、ｍｐｈ−１−ｂｔｍ(アメリカ特許2005/0147971)、ｐｏｌｙ−Ａｒｇ(RRRRRRR, 配列番号１６)、ＰＴＤ−５(RRQRRTSKLMKR, 配列番号１７)、ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ(GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL, 配列番号１８)、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ(PQIKIWFQNRRMKWKK、配列番号１９)、Ｂｕｆｏｒｉｎ  ＩＩ(TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK、配列番号２０)、Ｋｕ７０(VPMLK-PMLKE, 配列番号２１)、SynB1(RGGRLSYSTTTFSTSTGR, 配列番号２２)、Pep-1(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV, 配列番号２３)、Ｐｅｐ−７(SDLWEMMMVSLACQY, 配列番号24)、ＨＮ−１(TSPLNIHNGQKL, 配列番号25)などのようなＰＴＤを用いることもできる(Joliot, A. & Prochiantz, Nature Cell Biol., 6：198, 2004；Kabouridis, P.S., Trends Biotechnol., 21：498, 2003)。また、前記タギング塩基配列としてＸ−ｐｒｅｓｓのタグ(tag)を用いたが、Ｆｌａｇ、Ｍｙｃ、Ｈａ、ＧＳＴなどを用いることもできる。
【００４１】
前記組換えベクターを製作するために、本発明ではアンピシリン(ampicillin)抵抗性を持ち、商業的に販売されているpRSETを用いたが、これに限られることではない。例えば、選択的マーカーとしてカナマイシン(kanamycin)を持つバクテリアベクター、ｐｃＤＮＡのような哺乳類細胞発現用ベクター(mammarian cell expression vector)、ｐＰＧＳ、ｐＢａｂｅのようなウィルスベクターを用いることもできる。
【００４２】
本発明は、他の観点として、(a)ＰＴＤの塩基配列及びＷＡＤをコードするＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、ＰＴＤ−ＷＡＤ融合ポリペプチドを発現させる段階；(b)前記培養液から細胞を回収した後、これに尿素溶液を加えて前記ポリペプチドの二次及び三次構造をとり除くか、一次線形構造に変形させる段階；及び(c)一次線形構造のＰＴＤ−ＷＡＤ融合ポリペプチド(非活性WIP)を精製する段階を含む非活性Ｗｎｔ抑制ポリペプチド(WIP)の製造方法に関する。
【００４３】
さらに本発明は、もう一つの観点として、(a)ＰＴＤの塩基配列、ＥＥＤをコードする塩基配列及びＷＡＤをコードするＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換されたバクテリアを培養して、ＰＴＤ−ＥＥＤ−ＷＡＤ融合ポリペプチドを発現させる段階；(b)前記培養液から細胞を回収した後、これに尿素溶液を加えて前記ポリペプチドの二次及び三次構造をとり除くか、一次線形構造に変形させる段階；及び(c)一次線形構造のＰＴＤ−ＥＥＤ−ＷＡＤ融合ポリペプチド(非活性WIP)を精製する段階を含む非活性WIPの製造方法に関するものである。
【００４４】
本発明による非活性WIPの製造方法において、前記精製段階は前記ポリペプチドをＮｉ−Ｔｉビーズに結合させ、これを尿素溶液で洗浄した後、イミダゾールと塩含有緩衝溶液を用いて溶出させることを特徴とするが、これに限ることではない。
【００４５】
前記組換えベクターで形質転換された微生物を培養して本発明による非活性ＷＩＰｓを発現させた後、前記発現されたタンパク質を分離・精製した。本発明で形質転換された大腸菌は通常使われる培地で培養できるし、融合ポリペプチドの過発現を誘導するためにＩＰＴＧを添加するのが望ましい。
【００４６】
本発明では形質転換微生物として大腸菌(E. coli)を用いたが、他の種類のバクテリア、酵母、またはカビ(fungi)を使うことも可能であり、また微生物を利用せず、化学的方法で有効部位のみを合成して使うこともできる。
【００４７】
前記形質転換微生物の培養によって発現された融合ポリペプチドはＧＳＴ−融合タンパク質(GST-fusion protein)やその他の通常のタンパク質分離・精製方法を使って分離することができる。例えば、尿素(urea)や硫酸アンモニウムの濃度勾配を利用してタンパク質の沈澱を誘導させ、これを透析して塩(salt)をとり除くことで、本発明による非活性ＷＩＰｓを精製することができる。また、本発明では、過発現されたポリペプチドの二次及び三次構造が必要ではないから、尿素を使って二次及び三次構造のタンパク質を非活性の一次線形構造に変更して用いるのが望ましいが、本発明に記述された機能ドメインを含むと、二次及び三次構造でも細胞内側に透過して類似の効果を示すことができる。本発明では分離・精製のためのＨｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔａｇ、発現検証のためのＸ−ｐｒｅｓｓ  ｔａｇ、細胞膜透過のためのＰＴＤ、エンドソーム(endosome)による活性減少を回避するためのＥＥＤ(Endosomal Escape Domain)、Ｗｎｔ信号を抑制するためのＷＡＤの順に構成されているが、それぞれの機能的ドメインが含まれたら、これらの他の形態の組換えも類似の効果が現れる。
【００４８】
また、ＷＯ２００６／１０４３０６Ａ１の記述のように、プロプロテインコンベルターゼ（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ）による切断とタンパク質の変形で分泌タンパク質の活性を持つので、生物学的活性の増加のために本来ヒューリン分裂部位(furin cleavage site)を有すか、または人為的にヒューリン分裂部位(furin cleavage site)が加えられたら、生理学的活性の増大が期待できる。特に、一部ｓＦＲＰ類とＤＫＫ類の場合、推定のヒューリン分裂部位(putative furin cleavage sites)が存在すると知られているが、まだヒューリン(furin)による活性化過程はほとんど知られていない(Kawano, Y. & Kypta, R., J. Cell Sci., 116：2627, 2003)。
【００４９】
本発明による非活性ＷＩＰｓは実用的に組換え大腸菌のようなバクテリアの培養によって大量生産が可能で、人体内へ投与される前には生化学的で非活性状態であるので、従来から知られている類似用途の活性タンパク質に比べて、生産コストが数十〜数百分の一に過ぎなく、分離・精製過程と取り扱い・投薬過程が非常に簡単なので便利である。
【００５０】
本発明は、さらに他の観点から、前記非活性WIPを有効成分として含む癌細胞の成長及び転移抑制用医薬組成物に関する。本発明は、さらに他の観点から、前記非活性ポリペプチドを有効成分として含む免疫疾患治療用医薬組成物に関するものである。本発明において、前記免疫疾患は関節炎であることを特徴とする。また、本発明は他の観点から、前記非活性ポリペプチドを有効成分として含む肺線維症抑制用医薬組成物に関する。
【００５１】
本発明による非活性ＷＩＰｓは三次立体規則性を持たないで、それ単独では活性を持たないが、細胞内へ透過された後ＨＳＰ(heat shock trotein)などによって活性化されて、前記活性化されたタンパク質が細胞外へ分泌して効果を示す。本発明による非活性ＷＩＰｓは、上皮由来癌細胞の成長及び転移を抑制して、リウマチ性関節炎のような免疫疾患の進行を抑制して、さらに治療効果を持つ。
【００５２】
本発明では、従来から知られている活性組換えタンパク質が共通に持っていた高コストの問題と、活性製品の分離・精製、保管及び投薬の非効率的特性を根源的に解決して、非活性ポリペプチドを人体や哺乳類動物生体に直接投薬しながらも、Ｗｎｔ信号伝逹を抑制する効果を示すのを確認した。
【００５３】
本発明の非活性ＷＩＰｓを癌細胞、前駆細胞、活性化したＦＬＳ(fibroblast-like synoviocytes)、幹細胞などに投与する場合、前記非活性ＷＩＰｓが、ＨＳＰなどによって再構成され、Ｎ−グリコシル化（N-ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）のような活性化過程を通じて分泌されるようになる。この時、細胞へ透過された非活性ＷＩＰｓは、細胞の種類と活性によって、３〜２４時間の半減期を持ち、これは透過されたタンパク質が、細胞によって多様な活性化時間を持つということを意味する。
【００５４】
本発明で精製された非活性ＷＩＰｓを０．１ｎＭ以上細胞に投与する場合、前記非活性ＷＩＰｓは濃度依存的に細胞内へ移動して、細胞内で活性化したＤＫＫなどに転換された後、活性ＤＫＫ形態で細胞外へ分泌される。本発明の非活性ＷＩＰｓは、細胞膜に存在するFz受容体、またはＬＲＰ５／６補助受容体の存在とは無関係に、１時間以内に大部分細胞の細胞膜を直接透過し、細胞膜透過過程は受容体を介しない温度-非依存的(temperature independent)なものであった。
【００５５】
つまり、本発明による非活性ＷＩＰｓは、三次構造を維持する必要がなく、一次線形構造状態で細胞内へ透過して活性Ｗｎｔアンタゴニストなどに転換された後、分泌される機構を示す。すなわち、従来のＤＫＫ、ｓＦＲＰが直接的に効果(potency)を示す一方、本発明による非活性ＷＩＰｓは間接的な活性で効果を示すようになる。したがって、三次構造維持のための追加的な装備やコストが必要なく、分離・精製が非常に容易で、生産工程が簡単で生産コストが低く、医学的な効率が増加し、従来組換えタンパク質が持つ問題すべてを解決することができる。本発明による非活性ＷＩＰｓの特性を、従来組換えＷｎｔアンタゴニストタンパク質と比べて、表１に示した。表１は本発明による非活性ＷＩＰｓ製品を分離・精製、保管、投薬する過程と特徴を、従来から知られている活性ＤＫＫ、ｓＦＲＰ類の場合と比べたものである。
【００５６】
【表１】
2009517080.tif 000003
【００５７】
本発明による非活性ＷＩＰｓは、上皮由来癌細胞の増殖を抑制し、さらには転移を抑制する場合や、リウマチ性関節炎の進行を抑制して治療する場合のように、Ｗｎｔ信号伝達によって介在される疾患の治療や進行抑制のために使われることができる。また、幹細胞の分化を調節して応用するのに使われることができる。
【００５８】
本発明による非活性ＷＩＰｓは、そのまま使うか薬剤学的に許容できる酸付加塩または金属複合体、例えば、亜鉛、鉄などのような塩の状態で用いる。より具体的には、酸付加塩は塩化水素、臭化水素、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸、アスコルビン酸塩または酒石酸塩を用いるのが望ましい。
【００５９】
本発明による非活性ＷＩＰｓを有効成分として含む組成物は、通常の投与方法、投与形態及び治療目的によって前記有効成分を薬学的に許容可能な賦形剤またはマトリックスの担体とともに混合して希釈するか、容器形態の担体内に封入するのが望ましい。この時、目的のｐＨ、等張性、安定性などを持つ、生理的に許容可能なタンパク質組成物の製法は、本発明の分野で関係する通常の技術範囲内にあるものを用いることができる。
【００６０】
本発明で前記マトリックスは生物接合性、生物分解性、機械的特性、美的外観及び接触特性によって硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム（tricalcuimphosphate）、ハイドロキシ‐アパタイト、ポリ乳酸、およびポリ無水物のような生物分解性を有する化学的物質や；真皮コラーゲン、その他純粋タンパク質または細胞のマトリックス成分のような生物分解性を有する生物学的物質；焼結されたハイドロキシ‐アパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、または他のセラミックのような非生物分解性の化学的物質；ポリ乳酸、ハイドロキシ‐アパタイト、コラーゲン及びリン酸三カルシウムのような前記の物質の配合物を用いるのが望ましい。しかし、前記担体に、本発明が制限されるものではない。
【００６１】
本発明で賦形剤はラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチル・セルロース、非晶質セルロース、ポリビニールピロリドン、ステアリン酸マグネシウム、水、ヒドロキシ安息香酸メチル（methylhydroxybenzoate）、ヒドロキシ安息香酸プロピル（propylhydroxybensoate）、タルク、鉱油などが用いられる。
【００６２】
一方、本発明による非活性ＷＩＰｓを含む組成物は、治療効果を必要とする部位に粘稠液の形態にて注射するか、カプセルとして用いるのが望ましい。本発明による組成物の投与量は、使われる腑形剤やマトリックスなどの担体種類と、患者の状態、患者の年齢、性別及び食餌療法、感染の重篤度の程度、投与時間及び他の臨床的要因を考慮して調節されることができる。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明を具体的な実施例によってより詳しく説明する。しかし、本発明は下記実施例によって限定されることではなく、本発明の思想と範囲内でさまざまな変形または修正することができるのはこの分野の当業者に明らかである。
【００６４】
特に、下記実施例では、非活性ＷＩＰｓを構成するＷＡＤの遺伝子として、ＤＫＫ−１だけを例示したが、ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２、ｓＦＲＰ−３、ｓＦＲＰ−４、ｓＦＲＰ−５、Ｓｉｚｚｌｅｄ、Sizzled-2、Ｃｒｅｓｃｅｎｔ、ＷＩＦ−１、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｃｏｃｏ、ＤＫＫ−１、ＤＫＫ−３、ＤＫＫ−４、Ｓｏｇｇｙなどの遺伝子からなる群から選ばれるいずれかの１つまたは２つ以上が結合された遺伝子など、細胞外へ分泌されてＷｎｔ信号伝逹を抑制するタンパク質の遺伝子を用いることができることは当業者に明らかである。同時に、人間由来のＷｎｔアンタゴニストだけでなく、ラット、牛、豚などのような哺乳類及びその外の高等動物由来のＷｎｔアンタゴニストを用いることができることも当業者に明らかである。
【００６５】
下記実施例では、ＰＴＤとしてＴＡＴだけを例示したが、ＡｎｔＨＤ(Drosophila homeoprotein atennapedia transcription protein)、ＶＰ２２ペプチド、ｍｐｈ−１−ｂｔｍ、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、Ｂｕｆｏｒｉｎ  ＩＩ、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ、Ｋｕ７０、Ｐｒｉｏｎ、Ｐｖｅｃ、Ｐｅｐ−１などからなる群から選ばれる遺伝子を用いることができることは当業者に明らかである。また、下記実施例では、ＥＥＤとしてＨＡ２だけを例示したが、ｄｉＩＮＦ−７ドメイン、ＴＬＭ１ドメイン、ＴＬＭ２ドメイン、ＨＰＶ３  ３Ｌ２ドメイン、ＨＰＶ１  ６Ｌ２ドメイン、ＨＰＶ１  ８Ｌ２ドメイン、Ｈｉｓｔａｔｉｎ５ドメイン、ｄｈｖａｒ４ドメイン及びｄｈｖａｒ５ドメインからなる群から選ばれるいずれかの１つまたは２つ以上が結合されている遺伝子を用いることができることは当業者に明らかである。
【００６６】
《実施例１》ＤＫＫ−１発現ベクターを利用したＳｎａｉｌ発現抑制
Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇは、ＧＳＫ３−βを抑制する機構を介してＳｎａｉｌの活性化を誘導する。一方、ＳｎａｉｌはＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの転写抑制と上皮由来細胞の移動/転移を調節すると知られている(Nature Cell Biol., 2：84, 2000；Nature Cell Biol., 2：76, 2000；Nature Rev. Mol. Cell Biol., 3：155, 2002)。つまり、Ｗｎｔ信号伝逹はＳｎａｉｌを経由してＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ発現を抑制して、さらには癌細胞の浸潤性成長と転移を誘導するようになる。したがって、Ｗｎｔによって調節されるＳｎａｉｌの発現を抑制することができたら、癌細胞の浸潤性成長と転移を抑制することができる。
【００６７】
本実施例では、配列番号１及び配列番号２のプライマーを利用して２９３細胞(American Type Culture Collection, ATCC CRL-1573)のmRNAを鋳型として用いたＲＴ−ＰＣＲによってｈＤＫＫ−１をコードする遺伝子を増幅した。
配列番号1：5'-gct tgc aaa gtg acg gtc att-3'
配列番号2：5'-cta tcc aaa tgc agt gaa ctc-3'
【００６８】
前記増幅された遺伝子をTAクローニングベクター(Invitrogen, Inc)に挿入して、ＧｅｎＢａｎｋの塩基配列(NCBI, NM_012242)と比べた結果、ｈＤＫＫ−１遺伝子と同じであることを確認した。前記クローニングされたｈＤＫＫ−１遺伝子をｐＣＲ３．１発現ベクター(mammalian expression vector, Invitrogen, Inc)のＢａｍＨ１、ＥｃｏＲＩ部位にさらにクローニングし、前記ｈＤＫＫ−１遺伝子の停止コドンの前に発現検証のためのＨＡタグを挿入した。完成した発現ベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ(Invitrogen)を利用して２９３細胞にＳｎａｉｌ遺伝子とともに発現を誘導した。Ｓｎａｉｌ遺伝子はflagでタギングし、Ｓｎａｉｌの発現とＤＫＫの発現を、それぞれａｎｔｉ−ｆｌａｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ(Sigma)とａｎｔｉ−ＨＡ  ａｎｔｉｂｏｄｙ(Roche)を利用してウェスタンブロットで検証した(図１)。
【００６９】
その結果、図１に示したように、ｈＤＫＫ−１の発現を介するＷｎｔ信号伝達体系の抑制は、Ｓｎａｉｌの半減期を抑制することで、Ｓｎａｉｌ遺伝子の発現を減少させることがわかり、この結果は先行文献の機構と一致することを確認することができた(J. Biol. Chem., 280：11740, 2005)。
【００７０】
《実施例２》ＴＡＴ−ＤＫＫ−１を利用したＷｎｔ信号伝逹抑制及び癌細胞浸潤抑制
前記実施例1でクローニングしたｈＤＫＫ−１遺伝子をバクテリア発現ベクターであるpRSET(Invtrogen)にさらにクローニングした。この時、前記ｈＤＫＫ−１遺伝子の５’部位(5' region)の上流にＴＡＴ(YGRKKRRQRRR：配列番号3)塩基配列を挿入した後、その前にＸ−ｐｒｅｓｓ(Invitrogen, Inc)タグ(tag)と、分離・精製のための６つのヒスチジン(histidine)をコードする塩基配列と開始塩基配列であるATGを挿入して、ｈＤＫＫ−１の発現のための組換え発現ベクター(expression vector)を製作した。
【００７１】
前記製作された組換えベクターを熱ショック(heat shock)法で大腸菌ＢＬ２１(E. coli BL21；Invitrogen Inc.)に導入し、３７℃で２〜３時間培養した後、ＩＰＴＧ(isopropylthio-galactoside)1mMを添加し、２〜１８時間追加培養し、ＴＡＴ−ＤＫＫ−１の発現を誘導した。
【００７２】
前記培養物から大腸菌を遠心分離して、細胞ペレット(cell pellet)を取得して、前記細胞ペレットに８Ｍの尿素溶液を添加し、ＤＫＫ−１の二次及び三次構造をとり除いた後、Ｎｉ−Ｔｉビーズ(Qiagen)を添加してＴＡＴ−ＤＫＫ−１をビーズに結合させた後、これを尿素溶液で３回洗浄し、イミダゾールと塩含有緩衝溶液を使って溶出し、精製されたＴＡＴ−ＤＫＫ−１融合ポリペプチドを得た(図２)。
【００７３】
図２は形質転換された大腸菌ＢＬ２１の培養の時、ＩＰＴＧでタンパク質発現を誘導して精製過程を電気泳動で確認したものである。ここで、矢印はＩＰＴＧによって誘導されたＴＡＴ−ＤＫＫ−１融合タンパク質を示し、レーン1は誘導されなかったＴＡＴ−ＤＫＫ−１(uninduced TAT-DKK-1)、レーン２はＩＰＴＧに誘導されたＴＡＴ−ＤＫＫ−１、レーン３〜６はＮｉ−ＴｉビーズからＴＡＴ−ＤＫＫ−１を分離する時、イミダゾール(imidazole)の濃度を徐々に増加させて溶出したのである。図２に示したように、ＩＰＴＧ添加によって融合タンパク質生成を誘導した場合、対照群に比べてＴＡＴ−ＤＫＫ−１融合タンパク質がより多く生成したことを確認され、分離の時イミダゾールの濃度を増加させた場合、ＴＡＴ−ＤＫＫ−１融合タンパク質がより多く溶出されるということも確認された。
【００７４】
一方、前記製造したＴＡＴ−ＤＫＫ−１の細胞内への透過の可否を確認するために、ＭＣＦ−７乳癌細胞株(ATCC, HTB-22)にＴＡＴ−ＤＫＫ−１  ４ｎＭを２時間処理した後、細胞を取得し、抗Ｘ−ｐｒｅｓｓ第一抗体(Invitrogen, Inc)を利用してウェスタンブロットを行った(図３)。
【００７５】
その結果、図３に示したように、ＴＡＴ−ＤＫＫ−１は４時間以内に大部分が細胞内へ透過されたことが分かった。レーン1〜6は４ｎＭのＴＡＴ−ＤＫＫ−１を、それぞれ０時間、１５分、３０分、１時間、２時間、及び４時間処理して細胞に存在するＴＡＴ−ＤＫＫ−１の発現を抗Ｘ−ｐｒｅｓｓ抗体を利用してウェスタンブロットした結果である。
【００７６】
細胞内へ導入したＴＡＴ−ＤＫＫ−１が、生物学的活性を持つＤＫＫ−１に変換され、これらがＷｎｔ信号を抑制してＳｎａｉｌ発現を抑制することで、究極的にＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ発現増加を誘導するかを確認するために、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎｐｒｏｘｉｍａｌプロモーターをもっているルシフェラーゼリポーター遺伝子分析(luciferase reporter gene assay)を行った(J. Biol. Chem., 280：11740, 2005)。ＭＣＦ−７細胞にFugene-6を利用して前記リポーター遺伝子をｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎし、２４時間後、２ｎＭのＴＡＴ−ＤＫＫ−１を２４時間投与し、ルシフェラーゼ活性を利用してＥ−カドヘリンプロモーター活性を測定した。この時、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎプロモーターのＳｎａｉｌ結合部位を突然変異させたＥ−ｃａｄ(-108)３ＸＭｕｔを負の対照群（negative control）として用いた(図４)。
【００７７】
その結果、図４に示したように、本発明によるＴＡＴ−ＤＫＫ−１が実施例１から分かった結果と同じように、Ｓｎａｉｌの発現を抑制し、これらがＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎプロモーターを活性化させることでＷｎｔ信号伝達を効果的に抑制するということが分かった。
【００７８】
《実施例３》ＴＡＴ−ＤＫＫ−１を利用したＷｎｔ信号伝逹の抑制及び癌細胞浸潤の抑制
本発明による非活性ＴＡＴ−ＤＫＫ−１が癌細胞の浸潤性成長を抑制して、さらには転移抑制剤としての使用の可能性を調べるために、ＭＣＦ−７細胞にＷｎｔ−１発現を誘導した(J. Biol. Chem., 280：11740, 2005)。浸潤能がないＭＣＦ−７は、Ｗｎｔ発現によって浸潤性成長をし、この過程で癌細胞の浸潤はＳｎａｉｌ発現とＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎプロモーター活性度に全面的に依存するようになる(J. Biol. Chem., 280：11740, 2005)。したがって、ＴＡＴ−ＤＫＫ−１がＷｎｔ信号を抑制したら、Ｗｎｔ信号によって誘導される浸潤性成長を抑制することができるのであろう。これを検証するために、本実施例ではＷｎｔ発現ＭＣＦ−７細胞株に５ｎＭのＴＡＴ−ＤＫＫ−１を処理して鶏卵の絨毛尿膜（chorioalｌantoic membrane）で４８時間培養し、癌細胞浸潤を蛍光顕微鏡で観察した(図５)。
【００７９】
その結果、図５に示したように、ＴＡＴ−ＤＫＫ−１はＷｎｔ信号によって誘導される癌細胞の浸潤性成長を完璧に遮断した。さらに本発明による非活性ＴＡＴ−ＤＫＫ−１は、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ発現がなくて浸潤能が非常に強いと知られているＭＤＡ−ＭＢ−２３１(ATCC HTB-26)細胞株でも浸潤性成長を強力に抑制した。この結果から、本発明による非活性ＴＡＴ−ＤＫＫ−１が癌細胞の成長と転移を強く抑制するということを確認することができた。
【００８０】
《実施例４》ＨＡ２−ＴＡＴ−ＤＫＫ−１の製作
前記実施例２で製作した発現ベクターのＴＡＴ塩基配列後に、代表的なＥＥＤとしてＨＡ２ドメイン(配列番号４)をコードする塩基配列を挿入して組換えベクターを製作した後、実施例２と同じ方法で、形質転換大腸菌を製作、培養及び精製してＴＡＴ−ＨＡ２−ＤＫＫ−１融合ポリペプチドを製造した。前記製造されたＴＡＴ−ＨＡ２−ＤＫＫ−１融合ポリペプチドとＴＡＴ−ＤＫＫ−１融合ポリペプチドを、２９３細胞株に１０ｎＭの濃度で２時間処理し、６時間追加培養した後、抗−ＨＡ免疫沈降法を利用して培地内へ分泌された活性化ＤＫＫ−１を測定した。この時、ＴＡＴコード配列がない組換えタンパク質を負の対照群(negative control, N/C)として用いた。
【００８１】
その結果、ＴＡＴ−ＤＫＫ−１とＴＡＴ−ＨＡ２−ＤＫＫ−１を投与した場合に、活性化したＤＫＫ−１が細胞培地内へ発現されるのを確認することができ、特に、ＥＥＤが含まれているＴＡＴ−ＨＡ２−ＤＫＫ−１の場合、より多い活性化タンパク質が分泌されるのを確認することができた。免疫沈降法に用いられた抗体の兔疫グロブリン(immunoglobulin)の軽鎖を対照群として用いた(図６)。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
以上、上述したように、本発明は、細胞膜受容体なしで細胞膜を透過できるようにするＰＴＤ、単独では活性を持たないが哺乳動物の細胞内で活性化し、次いで細胞外へ分泌されてＷｎｔ信号伝逹を抑制する機能を持つＷＡＤを含む非活性ＷＩＰｓ、その製造方法、及び前記非活性ＷＩＰｓを有効成分として含む、癌細胞の成長及び転移抑制用組成物と免疫疾患治療用組成物を提供する効果がある。
【００８３】
本発明によるＷＩＰｓは、細胞膜受容体と結合するための三次構造を維持する必要がなく、一次線形構造状態で細胞内へ透過して細胞内でＨＳＰなどによって活性された後、分泌されて効果を示す。したがって、三次構造の維持のための追加的な装備やコストが必要なく、ヒスチジン配列を含み、分離・精製が非常に容易で、生産工程が簡単で、生産コストが低く、医学的な効率が増加して、新規治療用タンパク質として有用である。
【００８４】
以上のように、本発明の内容の特定部分を詳しく記述したところ、当業界の通常の知識を持った者において、この具体的記述はただ望ましい実施様態であるだけであり、これによって本発明の範囲が制限されることではない点は明らかであるだろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付された特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義されることである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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