(57)【要約】  一般式（Ｉ）：［式中、Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ２０−アルキル、シクロアルキルまたはアリール−Ｃ１〜Ｃ４−アルキルであり、ｎは、１〜４であり、Ｘは、−Ｏ−、−ＮＨ−または−ＮＲ２−であり、そしてＲ２は、ＨまたはＣ１〜Ｃ２０−アルキルである］で示される化合物の少なくとも１種、および上記式（Ｉ）に対応する化合物であるが、とりうる意味のうちＸが−ＮＨ−であるＸＲ１が、α−アミノ酸の残基である化合物の少なくとも１種を含む化粧品組成物であって、特に、局所的に適用可能な化粧品組成物；基底膜のタンパク質の合成を刺激するための、これらの化合物および組成物の使用；ならびに一般式（Ｉ）で示される化合物であって、Ｘが−ＮＲ２−であり、Ｒ１とＲ２の両方がＨ以外である化合物、および一般式（Ｉ）に対応する化合物であるが、とりうる意味のうちＸが−ＮＨ−であるＸＲ１が、α−アミノ酸の残基である化合物の両方。
2009535310.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2009535310.tif 000007
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ２０−アルキル、シクロアルキルまたはアリール−Ｃ１〜Ｃ４−アルキルであり、
ｎは、１〜４であり、
Ｘは、−Ｏ−、−ＮＨ−または−ＮＲ２−であり、そして
Ｒ２は、ＨまたはＣ１〜Ｃ２０−アルキルである］
で示される化合物の少なくとも１種；および
上記式（Ｉ）に対応する化合物であるが、とりうる意味のうちＸが−ＮＨ−であるＸＲ１が、α−アミノ酸の基である化合物の少なくとも１種を含む組成物であって、
特に、局所的に適用可能な組成物。
【請求項２】
請求項１記載の化合物が、皮膚科学的に許容しうる塩の形態で存在していることを特徴とする、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
請求項１記載の化合物におけるアミノ酸の基が、ラセミ体または鏡像異性的に純粋なＬおよびＤ体で存在することを特徴とする、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
請求項１記載の式（Ｉ）で示される化合物であって、Ｒ１が、ＨまたはＣ１〜Ｃ２０−アルキルであり、ｎが、２または４であり、そしてＸが−Ｏ−である化合物が、請求項１記載の一般式（Ｉ）に対応する化合物であるが、とりうる意味のうちＸが−ＮＨ−であるＸＲ１が、天然α−アミノ酸の基であり、ｎが２である化合物と組み合わされていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
組み合わせのパートナーが、Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−ＯＨおよびＰａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−Ｔｈｒ−ＯＨであることを特徴とする、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
請求項中で述べられた化合物を、０．５〜５，０００ppm（ｗ／ｗ）の範囲で、好ましくは１〜１，０００ppm（ｗ／ｗ）の範囲で含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
剥離活性化合物、にきび止め活性化合物、ビタミンＢ３化合物、レチノイド、ジ、トリ、テトラ、ペンタおよびヘキサペプチドならびにそれらの誘導体、ヒドロキシ酸、フリーラジカル捕捉剤、抗炎症剤、日焼け活性化合物、美白剤、抗蜂巣炎剤、フラボノイド、抗微生物活性化合物、皮膚治癒剤、抗真菌活性化合物、日焼け止め活性化合物、ファルネソール、フィタントリオール、アラントイン、グルコサミンならびにそれらの混合物から選択されるスキンケア活性化合物の少なくとも１種を、安全かつ有効な量でさらに含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載の、特に局所的に適用可能な組成物。
【請求項８】
皮膚科学的な担体をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
活性化合物を、溶液中に、分散液として、乳濁液としてか、または担体中に、好ましくはマクロ−、ミクロ−もしくはナノカプセルか、リポソームもしくはキロミクロン中に封入するか、あるいはマクロ−、ミクロ−もしくはナノ粒子中に、またはミクロスポンジで包んで、あるいは粉末化された有機高分子、タルク、ベントナイトおよび関連する鉱物担体に吸着させることで含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】
乳濁液（油／水および水／油）の形態で、乳液として、ローションとして、軟膏として、ゲル形成性及び粘稠な界面活性及び乳化性ポリマー中に、ポマードとして、シャンプーとして、石けんとして、ゲルとして、粉末として、スティックもしくはペンシルとして、スプレーとして、ボディオイルとして、顔面マスクまたはパッチとして存在することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の組成物を製造するための、式（Ｉ）で示される化合物の少なくとも１種と、式（Ｉ）に対応する化合物であるが、とりうる意味のうちＸが−ＮＨ−であるＸＲ１が、α−アミノ酸の基である化合物の少なくとも１種との一緒の使用。
【請求項１２】
基底膜の分子、特にそのタンパク質の合成を刺激するための、請求項１〜１０のいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項１３】
基底膜の分子、特にそのタンパク質の合成を刺激するための、式（Ｉ）で示される化合物の少なくとも１種と、式（Ｉ）に対応する化合物であるが、とりうる意味のうちＸが−ＮＨ−であるＸＲ１が、α−アミノ酸の基である化合物の少なくとも１種との一緒の使用。
【請求項１４】
ラミニンＶの合成、コラーゲンＩＶの合成、コラーゲンＶＩＩの合成、コラーゲンＸＶＩＩの合成および／またはインテグリンβ４の合成を刺激するための、請求項１２および１３のいずれか１項記載の使用。
【請求項１５】
内因性または外因性の基底膜の退化により生じる皮膚のたるみ、荒れおよびしわを改善するための、請求項１２〜１４のいずれか１項記載の使用。
【請求項１６】
皮膚のたるみ、荒れおよびしわの形成を予防するための、請求項１２〜１４のいずれか１項記載の使用。
【請求項１７】
スキンケア活性化合物の少なくとも１種を組み合わせた、請求項１１〜１６のいずれか１項記載の使用。
【請求項１８】
Ｘが−ＮＲ２−であり、Ｒ１とＲ２の両方がＨ以外である、請求項１記載の一般式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項１９】
請求項１記載の一般式（Ｉ）に対応する化合物であるが、とりうる意味のうちＸが−ＮＨ−であるＸＲ１が、α−アミノ酸の基である化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基底膜の分子、特にそのタンパク質の合成を刺激するための、特定のペプチド誘導体の少なくとも２種を含む化粧品組成物、特に局所的に適用可能な化粧品組成物、および、基底膜の分子、特にそのタンパク質の合成を刺激するための、これらの特定のペプチド誘導体の使用に関する。
【０００２】
真皮−表皮の連結上にある基底膜（ＢＭ）にはいくつかの機能があり、その最も明白な機能は表皮を真皮に強固に連結することであり、このようにして２層の組織の機械的に安定な接着を確保している。表皮の「極性」および構成も、基底膜により影響され、同時にＢＭは表皮と真皮との間の明確な境界である。ＢＭは、ケラチノサイトの表皮分化を開始し、基底層の増殖性状態を保持すると考えられている。通常の条件下では、ＢＭは、表皮細胞が真皮に直接接触することを防いでいる。しかしながら、ＢＭの損傷を伴う怪我の後では、真皮との直接的な接触が起こり、その後細胞はその挙動を変えて傷の治癒プロセスを開始する。
【０００３】
ＢＭのさらに重要な機能は、表皮および真皮細胞との間の正しいコミュニケーションである。表皮および真皮は互いに独立には機能しないため、通常の皮膚ホメオスタシスには、２つのタイプの細胞間で双方向に生化学的シグナルが定期的に通過することが要求される。一般的に、これは１つの区画で生産される小さな分子であり、それらの「メッセージ」を他方へ伝達するためにはＢＭを介して選択的に輸送されなくてはならない。このような状況において、ＢＭは活性フィルターとして振舞い、かつ要求に応じてシグナル分子を通過させるか、もしくはこれらを単にブロックするという重要な機能を有する。ＢＭを介する表皮−真皮コミュニケーションが正しく機能することは、皮膚にとって必須である。
【０００４】
一方ＢＭ自身も、透明帯、基底板および繊維網層の３つの層に形態学的に分けることができる。透明帯は、表皮細胞と基底板との間の領域であって、ＢＭ中に高電子密度のプラークとして見えるヘミデスモソームを含む。ヘミデスモソームは、増殖可能な基底ケラチノサイトをＢＭに連結し、とりわけコラーゲンＸＶＩＩ（またはｂｐ１８０）およびインテグリンα６／β４から構築されている。コラーゲンＸＶＩＩの欠失により、水疱（単純性表皮水疱症）を頻繁に起こす脆弱性皮膚になりうる。基底板は、主としてコラーゲンＩＶからなる平坦な構造（シート）である。
【０００５】
ＢＭの構成成分は、基本的にタンパク質、プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンである。係留複合体の重要な要素の１つは、ラミニンＶである。ラミニンＶの変異により同様に重篤な皮膚の水疱（Ｈｅｒｌｉｔｚ′ｓ接合部型表皮水疱症）になりうるため、ラミニンＶは、とりわけ表皮の真皮組織への接着に必須である。一方でラミニンＶはヘミデスモソームの膜貫通性インテグリンα６／β４と結合し、他方でラミニンＶはコラーゲンＶＩＩと結合しており、結果として係留繊維を真皮の中へ形成する。コラーゲンＶＩＩは、繊維網層の主要要素である。従って、さらなるタンパク質と一緒に、構造タンパク質コラーゲンＩＶ、ＶＩＩ、ＸＶＩＩとラミニンＶおよびインテグリンα６、β４は、ＢＭおよびヘミデスモソームの構築に必須な主要要素であり、ゆえに、皮膚中のＢＭの正しくかつ多様な機能のために重要である。
【０００６】
内因性（加齢性）または外因性（光関連性）の老化は、特に皮膚において不可逆的な組織の退化として現れることが知られており、次第にしわ、たるみ、表面の荒れ、変則的な色素沈着等の形態として巨視的に視認できるようになる。これらの変化は、コラーゲン、とりわけＢＭのタンパク要素における同化反応（合成）の減少および異化反応（破壊）の増加により生じる。組織学的に視認できる変化は、短縮化され未構築であるエラスチン繊維の濃縮（弾力繊維症）、コラーゲン繊維の減少、炎症メディエーターの浸潤および非定型非極性ケラチノサイトを伴う表皮の萎縮である。例えば、ＢＭから真皮へ入る係留繊維の数と、この繊維の元となるコラーゲンＶＩＩの量は、光により老化した皮膚において急激に減少し、従ってＢＭから真皮への結合の安定性が損なわれる。老化した皮膚では、ＢＭの他のタンパク質も部分的に寛解され、ＢＭの構造的組織は加齢と共に劣化する。
【０００７】
以上に述べたＢＭの構造タンパク質は主にケラチノサイトとして、そして一部は繊維芽細胞としても発現する。皮膚基質における合成反応は、主にポリペプチド、いわゆる成長因子およびサイトカインによって調節される。これらのペプチドの中でも、ＴＧＦ−β１は、この皮膚基質の合成反応に関与する最も重要な調節物質の１つである。それはケラチノサイトおよび繊維芽細胞によって基質中においても分泌されている。外部から供給される、ＢＭタンパク質の合成を刺激する活性化合物は、一方で加齢によるＢＭの劣化を補うことができ、さらに加齢に関連するＢＭタンパク含有量の低下を遅らせることにより予防的な特徴を既に有している。
【０００８】
驚くべきことに、局所的に適用可能な化粧品組成物中に存在する、特定の美容的に活性なトリペプチド誘導体の少なくとも１種と、特定の美容的に活性なテトラペプチド誘導体の少なくとも１種の組み合わせ（以降「本発明の化合物」と称する）により、皮膚の外観の明らかな改善および加齢による基底膜タンパクの破壊の減速がうまく達成されることが見いだされた。これは、本発明の化合物が、速やかに、かつ十分な濃度で、角質層および表皮を通って表皮と真皮の間の境界領域にある作用部位に到達し、そこの基底膜のタンパク質合成に、速やかでかつ強力な刺激をもたらすことによりなされる。従って、特定のトリペプチド誘導体の少なくとも１種と、特定のテトラペプチド誘導体の少なくとも１種の組み合わせにより、コラーゲンＩＶ、ＶＩＩ、ＸＶＩＩ、ラミニンＶおよびインテグリンβ４の濃度が著しく増大することを証明できる。
【０００９】
本発明は、特許請求の範囲において定義される。具体的には、本発明は一般式（Ｉ）：
【００１０】
【化２】
2009535310.tif 000003
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ２０−アルキル、シクロアルキルまたはアリール−Ｃ１〜Ｃ４−アルキルであり、
ｎは、１〜４であり、
Ｘは、−Ｏ−、−ＮＨ−または−ＮＲ２−であり、そして
Ｒ２は、ＨまたはＣ１〜Ｃ２０−アルキルである］
で示される化合物の少なくとも１種；および
上記式（Ｉ）に対応する化合物であるが、とりうる意味のうちＸが−ＮＨ−であるＸＲ１が、α−アミノ酸の基である化合物の少なくとも１種を含む化粧品組成物であって、特に局所的に適用可能な化粧品組成物に関する。
【００１１】
本発明はまた、上記の式（Ｉ）で示される化合物を、上記の式（Ｉ）に対応する化合物であるが、とりうる意味のうちＸが−ＮＨ−であるＸＲ１が、α−アミノ酸の基である化合物の少なくとも１種と共に使用すること、上記に定義された組成物の製造、および基底膜の分子、特に該基底膜のタンパク質の合成を刺激するための組成物の使用に関する。
【００１２】
本発明はまた、基底膜の分子、特にそのタンパク質の合成を刺激するために、上記の式（Ｉ）で示される化合物を、上記の式（Ｉ）に対応する化合物であるが、とりうる意味のうちＸが−ＮＨ−であるＸＲ１が、α−アミノ酸の基である化合物と共に使用することに関する。
【００１３】
本発明はまた、上記の一般式（Ｉ）で示される化合物であって、Ｘが−ＮＲ２−であり、Ｒ１とＲ２の両方がＨ以外である化合物、および上記の一般式（Ｉ）に対応する化合物であるが、とりうる意味のうちＸが−ＮＨ−であるＸＲ１が、α−アミノ酸の基である化合物それ自体に関する。
【００１４】
式（Ｉ）で示される化合物および上記の一般式（Ｉ）に対応する化合物であるが、とりうる意味のうちＸが−ＮＨ−であるＸＲ１が、α−アミノ酸の基である化合物において、アミノ酸はラセミ体または鏡像異性的に純粋なＬおよびＤ体で存在しうる。
【００１５】
上記において使用された一般的表現を、以下に定義する：
【００１６】
「アルキル」は、直鎖状および分岐鎖状両方の飽和炭化水素基を意味するものとして理解される。例えば、非分岐鎖基としてはメチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−ウンデカニル、ｎ−ドデカニル、ｎ−トリデカニル、ｎ−ヘキサデカニル、ｎ−ヘプタデカニル、ｎ−オクタデカニルまたはｎ−ノナデカニルであり、分岐鎖基としてはイソプロピル、tert−ブチル、イソブチル、sec−ブチルまたはイソアミルである。
【００１７】
「シクロアルキル」は、８個までの炭素原子を有する環状飽和炭化水素基を意味するものとして理解され、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロへキシルまたはシクロヘプチルである。
【００１８】
「アリール」は、例えばアルキル、アルコキシ、ハロゲンおよび／またはトリフルオロエチルにより一または多置換されていてもよい、１０個までの炭素原子を有する芳香族系の単−もしくは多環式炭化水素基を意味するものとして理解され、例えば、フェニル、ｐ−トリル、ｏ−トリル、ｍ−トリル、３，４−ジメトキシフェニル、２−ナフチルまたは３−ナフチルである。「アリール」はさらに、ヘテロアリール基も含み、すなわち任意で準じて置換されている芳香族系の単−もしくは多環式へテロシクリル基、例えば２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−キノリニルまたは３−イソキノリニルを含む。
【００１９】
本発明の化合物は、酸と一価もしくは多価の、均一もしくは混合の塩を形成することができ、例えば塩酸、臭化水素、硫酸もしくはリン酸のような無機酸；またはギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、フマル酸、マロン酸、マレイン酸、シュウ酸、フタル酸、クエン酸、乳酸もしくは酒石酸のような脂肪族系モノカルボン酸もしくはジカルボン酸のような適切なカルボン酸；または安息香酸もしくはサリチル酸のような芳香族カルボン酸；またはマンデル酸もしくはケイ皮酸のような芳香族−脂肪族カルボン酸；またはニコチン酸のようなヘテロ芳香族カルボン酸；またはメタンスルホン酸もしくはトルエンスルホン酸のような脂肪族もしくは芳香族スルホン酸と形成することができる。皮膚科学的に許容しうる塩が好ましい。
【００２０】
一般式（Ｉ）は全ての異性体およびその混合物を含み、すなわちラセミ混合物および回転異性体の混合物を含む。
【００２１】
一般式（Ｉ）で示される化合物であって、Ｒ１がＨまたはＣ１〜Ｃ２０−アルキルであり、ｎが２または４であり、Ｘが酸素である化合物と、一般式（Ｉ）に対応する化合物であるが、とりうる意味のうちＸが−ＮＨ−であるＸＲ１が、天然α−アミノ酸の基であり、ｎが２である化合物の組み合わせが好ましい。
【００２２】
以下の表１に示される化合物の組み合わせが特に好ましい：
１．１    Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ
１．２    Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｏｒｎ−ＯＨ
１．３    Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−ＯＨ
１．４    Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−ＯＭｅ
１．５    Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−Ｏｏｃｔｙｌ
１．６    Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−Ｏｃｅｔｙｌ
１．７    Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−ＮＨ２
１．８    Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−ＮＨｂｕｔｙｌ
１．９    Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−Ｎ（ｂｕｔｙｌ）２
１．１０  Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−ＮＨｏｃｔｙｌ
１．１１  Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−Ｎ（ｏｃｔｙｌ）２
１．１２  Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−ＮＨｃｅｔｙｌ
１．１３  Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−Ｎ（ｃｅｔｙｌ）２または
１．１４  Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｐ−ＯＨ
と
２．１    Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＯＨ
２．２    Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＯＨ
２．３    Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−ＯＨ
２．４    Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−ＯＨ
２．５    Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−Ｇｌｕ−ＯＨ
２．６    Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−Ａｓｐ−ＯＨ
２．７    Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−Ｔｈｒ−ＯＨ
２．８    Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−Ｌｙｓ−ＯＨ
２．９    Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−Ｍｅｔ−ＯＨ
２．１０  Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−Ａｓｎ−ＯＨ
２．１１  Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−Ｈｉｓ−ＯＨ
２．１２  Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−Ｎｌｅ−ＯＨまたは
２．１３  Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−Ｐｈｅ−ＯＨ
【００２３】
極めて特に好ましい組み合わせのパートナーは、Ｐａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−ＯＨ（１．３）とＰａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−Ｔｈｒ−ＯＨ（２．７）である。
【００２４】
本発明の化合物は、０．５〜５，０００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）の間で変化する濃度、好ましくは１〜１，０００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）の間で変化する濃度で化粧品の最終製品に使用することができる。
【００２５】
本発明の化合物は、溶液、分散液、乳濁液の形態で、あるいはマクロ−、ミクロ−もしくはナノ−カプセルのような担体、リポソームもしくはキロミクロン中に封入して、あるいはマクロ−、ミクロ−もしくはナノ−粒子、またはミクロスポンジで包んで、あるいは粉末化された有機重合体、タルク、ベントナイトおよび他の鉱物性担体に吸着させて用いることができる。
【００２６】
本発明の化合物は、いかなる製剤形態：油／水および水／油乳濁液、乳液、ローション剤、軟膏、ゲル形成性及び粘稠な界面活性及び乳化性ポリマー、ポマード、シャンプー、石けん、ゲル、粉末、スティックもしくはペンシル、スプレー、ボディオイル、顔面マスクまたはパッチでも使用できる。
【００２７】
本発明の化合物は、通常使用される他のいかなる成分とも、共に使用することができる。そのような組成物は、抽出脂質および／または合成脂質、ゲル形成性及び粘稠の界面活性及び乳化性ポリマー、水もしくは脂肪に可溶な主要活性物質、植物抽出物、組織抽出物、海洋抽出物、日焼け止め剤、抗酸化剤、水分保持およびバリアー剤、皮膚再生上活性な化合物、追加的なスキンケア活性化合物または保護剤を含んでもよい。
【００２８】
本発明の化合物は、通常使用される他のいかなる化粧用スキンケア活性化合物とも組み合わせて使用することができる。追加的なスキンケア活性化合物の例としては、しわ止め活性化合物／抗萎縮活性化合物が挙げられ、本発明の組成物は、しわ止め活性化合物または抗萎縮活性化合物の１種以上を、安全かつ有効な量含んでもよい。本発明の組成物に用いるのに適したしわ止め／抗萎縮活性化合物の例は、含硫黄Ｄ−およびＬ−アミノ酸およびそれらの誘導体ならびに塩、特にＮ−アセチル誘導体（好ましい例はＮ−アセチル−Ｌ−システインである）；チオール；ヒドロキシ酸（例えば、乳酸およびグリコール酸のようなα−ヒドロキシ酸、またはサリチル酸およびオクタノイル誘導体などのサリチル酸誘導体のようなβ−ヒドロキシ酸）、フィチン酸、リポ酸；リゾホスファチド酸、皮膚剥離剤（例えばフェノールなど）、ビタミンＢ３化合物およびレチノイドであり、皮膚をなめらかにするという本発明の利点を向上する。
【００２９】
ａ）ビタミンＢ３化合物
本発明の組成物は、ビタミンＢ３化合物を、安全かつ有効な量で含有してもよい。ビタミンＢ３化合物は、１９９７年４月１１日に出願された同時継続中の米国特許出願第０８／８３４，０１０号（１９９７年１０月３０日公開の国際公開特許第９７／３９７３３Ａ１号公報に対応）に記載されるように、皮膚の状態を調節するのに特に有効である。前述のビタミンＢ３化合物の誘導体の例は、ニコチン酸の非血管拡張性エステルを含む、ニコチン酸エステル（例えばニコチン酸トコフェリル）、ニコチニルアミノ酸、カルボン酸のニコチニルアルコールエステル、ニコチン酸Ｎ−オキシドおよびナイアシンアミドＮ−オキシドを包含する。
【００３０】
ｂ）レチノイド
本発明の組成物は、レチノイドを含有してもよい。本明細書で使用される、「レチノイド」は、ビタミンＡの全ての天然および／もしくは合成類似体、または皮膚においてビタミンＡの生物学的活性を有するレチノール様化合物、ならびにこれらの化合物の幾何異性体および立体異性体も包含する。レチノイドは、好ましくは、レチノール、レチノールエステル（例えば、パルミチン酸レチニル、酢酸レチニル、プロピオン酸レチニルのような、レチノールのＣ２〜Ｃ２２アルキルエステル）、レチナールおよび／またはレチノイン酸（retic acid）（オールトランス型−レチノイン酸および／または１３−シス−レチノイン酸を包含する）、特にはレチノイル酸以外のレチノイドである。その他の適切なレチノイドは、レチノイン酸トコフェリル［（トランスまたはシスの）レチノイン酸のトコフェロールエステル］、アダプタレン｛６−［３−（１−アダマンチル）−４−メトキシフェニル］−２−ナフトエ酸｝、およびタザロテン（６−［２−（４，４−ジメチルチオクロマン−６−イル）エチニル］ニコチン酸エチル）である。好ましいレチノイドは、レチノール、パルミチン酸レチニル、酢酸レチニル、プロピオン酸レチニル、レチナールおよびそれらの組み合わせである。本発明の組成物は、結果として得られる組成物が、角質組織の状態を調節するのに、好ましくは皮膚における視覚的および／または触覚的な不連続性を調節するのに、より好ましくは皮膚加齢の兆候を調節するのに、さらに好ましくは皮膚加齢に付随する皮膚表面の性質における視覚的および／または触覚的な不連続性を調節するのに安全かつ有効であるように、レチノイドを安全かつ有効な量で含有できる。
【００３１】
ｃ）ヒドロキシ酸
本発明の組成物は、ヒドロキシ酸を、安全かつ有効な量で含有できる。本発明の組成物に用いるのに好ましいヒドロキシ酸は、サリチル酸およびサリチル酸誘導体を包含する。
【００３２】
ｄ）ペプチド
本発明の組成物は、ジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−およびヘキサペプチドを非限定的に包含する追加のペプチドを含有できる。そのようなペプチドおよび／またはその誘導体は、安全かつ有効な量で本発明の組成物に添加できる。ここでいう「ペプチド」は、天然に産するペプチドおよび合成されたペプチドの両方を意味し、ペプチド模倣体、および「ペプチド」の金属錯体も包含する。ここでは、ペプチドを含有する、天然に産出する組成物および商業的に入手できる組成物も使用できる。
【００３３】
本発明の組成物に用いるのに適切なジペプチドは、カルノシン（β−Ａｌａ−Ｈｉｓ）を含む。これに適切なトリペプチドは、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＡｒｇおよびＨｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを含む。好ましいトリペプチドおよびその誘導体は、Ｂｉｏｐｅｐｔｉｄｅ ＣＬＴＭ（フランスのＳｅｒｄｅｍａ社より商業的に入手可能な１００ｐｐｍのパルミトイル−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ）として調達できるパルミトイル−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ、ペプチドＣＫ（Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ）、ペプチドＣＫ＋（ａｃ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２）およびＳＹＮ（登録商標）−ＡＫＥの商品名の下でスイスのＰｅｎｔａｐｈａｒｍ社により市販されているβ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｄａｂ−ＮＨ−ベンジルを含む。本発明の組成物に用いるのに適切なテトラペプチドは、ペプチドＥを含む。適切なペンタペプチドの例は、フランスのＳｅｒｄｅｍａ社から入手可能なマトリキシル（パルミトイル−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ）およびＷＯ０３／０３７９３３に記載されているもの（スイスのＰｅｎｔａｐｈａｒｍ社）である。用いるのに適切なヘキサペプチドは、スペインのＬｉｐｏｔｅｃ社により製造されているアルジルリン（Ａｃ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２）である。
【００３４】
本発明の化合物およびそれらを含む化粧品組成物は、スキンケア製品に採用され、特に皮膚の外見の向上および基底膜のタンパク質の破壊により生じる皮膚の加齢の悪影響に対抗するために採用される。
【００３５】
下記の実施例は、本発明を制限することなく例示することを意図したものである。文章および実施例１〜９で用いられる略語の意味は：
ＡｃＯＨ：          酢酸
ＡＣＮ：            アセトニトリル
ＡＢ：              抗体
Ａｌａ：            アラニン
Ａｒｇ：            アルギニン
Ａｓｎ：            アスパラギン
Ａｓｐ：            アスパラギン酸
Ｂｏｃ：            tert−ブトキシカルボニル
ＢＳＡ：            ウシ血清アルブミン
ＣＴＲ：            クロロトリチル樹脂
Ｄａｂ：            ２，４−ジアミノ酪酸
Ｄａｐ：            ２，３−ジアミノプロピオン酸
ＤＢＵ：            １，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン（１，５−５）
ＤＣＣ：            Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＭＣ：              メチレンクロリド
ＤＩＣ：            Ｎ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ：        ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＥＭ：          ダルベコ改変イーグル培地
ＤＭＦ：            ジメチルホルムアミド
ＥＭ：              電子顕微鏡
ＥＴＯＡｃ：        酢酸エチル
ＦＣＳ：            ウシ胎児血清
Ｆｍｏｃ：          ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＧＦ／Ａ：          ガラス繊維マイクロフィルター
Ｇｌｎ：            グルタミン
Ｇｌｕ：            グルタミン酸
ＨａＣａＴ：        ヒト不死化ケラチノサイト
ＨＯＢｔ：          １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＩＬｅ：            イソロイシン
ＬＨ２０：          Ａｍｅｒｓｈａｍ社サイズ排除樹脂
Ｌｙｓ：            リジン
Ｍｅｔ：            メチオニン
ＭＳ：              マススペクトル
ＮＭＭ：            Ｎ−メチルモルホリン
ＮＭＲ：            核磁気共鳴
Ｎｌｅ：            ノルロイシン
Ｏｒｎ：            オルニチン
Ｐａｌｍ：          パルミトイル
ＰＢＳ：            リン酸緩衝生理食塩水
ＰＥ：              石油エーテル
Ｐｈｅ：            フェニルアラニン
ＲＴ：              室温
Ｓｅｒ：            セリン
ｔＢｕ：            ｔ−ブチル
ＴＢＴＵ：          Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート
ＴＣＴＵ：          Ｏ−（１Ｈ−６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＴＧＦ−β１／２：  形質転換成長因子β１またはβ２
ＴＦＡ：            トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：            テトラヒドロフラン
Ｔｈｒ：            トレオニン
Ｔｒｉｓ：          トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン
Ｔｗｅｅｎ２０：    ポリエチレングリコールソルビタンモノラウラート溶液
Ｖａｌ：            バリン
Ｚ：                ベンジルオキシカルボニル
【００３６】
実施例１
ヒト不死化ケラチノサイト細胞株のケラチノサイト細胞培養を本発明のペプチド誘導体で処理した場合におけるラミニンＶ合成の刺激の決定
インビトロで培養したヒト不死化ケラチノサイトの、細胞当りのラミニンＶ産生を、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸収アッセイ）で検出した。ペプチド性活性化合物存在下での細胞によるラミニンＶ産生の増加を、この方法により定量した。
【００３７】
ヒト不死化ケラチノサイトは、ハイデルベルグのDeutsche KrebsforschungszentrumのFusenig教授から提供され、標準的な細胞培養方法により培地中で培養した。対応するペプチド（活性化合物）と共に７２時間インキュベートした後、ラミニンＶに特異的な抗体を用いて定量的決定を行った。ラミニンＶ含有量の決定をした後、細胞数をMolecular Probes社のＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）により決定した。細胞当りのラミニンＶ含有量は、各値からのユニットとして計算した。
【００３８】
材料：
培養培地： 試験培地：
−ＤＭＥＭ                              −ＤＭＥＭ
−１０％  ＦＣＳ                        −ＦＣＳなし
−１００IU/ml  ペニシリン               −１００IU/ml  ペニシリン
−０．１mg/ml  ストレプトマイシン       −０．１mg/ml  ストレプトマイシン
洗浄緩衝液： 乳液：
−０．０５M  トリス、ｐＨ８．５         −洗浄緩衝液
−０．１５M  ＮａＣｌ                   −５％  乳粉末
−０．１％  ＢＳＡ
−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０
ＡＢ  希釈液： 基質溶液：
−５０ml  Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ          −ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）ＯＰＤ
（３７５１５；Ｐｉｅｒｃｅ）            １錠（３４００６；Ｐｉｅｒｃｅ）
−４５０ml  Ｈ２Ｏ                       −９ml  Ｈ２Ｏ
−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ                −１ml  安定的過酸化物基質緩衝液、１０倍
（３４０６２；Ｐｉｅｒｃｅ）
【００３９】
第一ＡＢ（P3H9-2;Santa Cruz Biotechnology,Inc.）を１／６０，０００に、そして第二ＡＢ（31430;Socochim S.A.）を１／５００にＡＢ希釈液を用いて希釈した。
【００４０】
方法：
ケラチノサイトを、９６ウェルプレートに約５，０００セル／ウェルの密度で播種し、培地中で３日間、コンフルエンスまでインキュベートした（３７℃／１０％ＣＯ２）。培地を、３つの異なる濃度の試験物質を有する、三重の試験培地で交換した。各プレート上で、以下の対照も試験した。
【００４１】
負の対照： 正の対照：
Ａ）                                  Ａ）
−細胞あり                            −細胞あり
−第一ＡＢなし、第二ＡＢあり          −第一および第二ＡＢあり
Ｂ）                                  Ｂ）
−細胞なし                            −細胞あり
−第一および第二ＡＢあり              −第一および第二ＡＢあり
−１０ng/ml  ＴＧＦ−β２あり
Ｃ）各ペプチドについて、細胞なしのウェルを１つ試験して、両ＡＢの非特異的結合を排除した。
【００４２】
プレートをさらに７２時間インキュベートした。このインキュベート時間が完了した後、沈殿したラミニンＶを以下のプロトコルに従って検出および定量した：
・培地を捨て、２００μｌ／ウェルのＰＢＳで洗浄する。
・１００μｌ／ウェルのメタノールで固定する。→１５分／室温／振とう器６００rpm
・メタノールを捨て、２００μｌ／ウェルの乳液で遮断する。→３０分／室温／振とう器６００rpm
・乳液を捨て、１００μｌ／ウェルの第一ＡＢ希釈液と共にインキュベートする。→２時間／室温／振とう器６００rpm
・第一ＡＢ希釈液を捨て、２００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液で３回洗浄する。
・１００μｌ／ウェルの第二ＡＢ希釈液と共にインキュベートする。→３時間／室温／振とう器６００rpm
・第二ＡＢ希釈液を捨て；２００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液で３回、そして１００μｌ／ウェルのＰＢＳで１回洗浄する。
・１００μｌ／ウェルの基質溶液を加える。→１５分／室温／振とう器６００rpm
・５０μｌ／ウェルのＨ２ＳＯ４（２M）で反応を停止し、４９２nmで測定する。
・染料溶液を捨て、精製水でプレートを洗浄する。約１６時間−８０℃で凍結する。
・プレートを解凍し、細胞数を、製造者の手順に従ってＣｙＱＵＡＮＴアッセイにより測定した。
細胞当りのラミニンＶ産生を、次の式に従って計算した：（ＯＤラミニンＶ値／ＲＦＵ細胞数値）×１００
計算された値は、任意単位である。
【００４３】
【表１】
2009535310.tif 000004
【００４４】
実施例２
ヒト不死化ケラチノサイト細胞株のケラチノサイト細胞培養を本発明のペプチド誘導体で処理した場合におけるコラーゲンＩＶ合成の刺激の決定
インビトロで培養したヒト不死化ケラチノサイトの、細胞当りのコラーゲンＩＶ産生を、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸収アッセイ）で検出した。ペプチド性活性化合物存在下での細胞によるコラーゲンＩＶ産生の増加を、この方法により定量した。ヒト不死化ケラチノサイトは、ハイデルベルグのDeutsche KrebsforschungszentrumのFusenig教授から提供され、標準的な細胞培養方法により培地中で培養した。対応するペプチド（活性化合物）と共に７２時間インキュベートした後、コラーゲンＩＶに特異的な抗体を用いて定量的決定を行った。コラーゲンＩＶ含有量の決定をした後、細胞数をMolecular Probes社のＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）により決定した。細胞当りのコラーゲンＩＶ含有量は、各値からのユニットとして計算した。
【００４５】
材料：
培養培地： 試験培地：
−ＤＭＥＭ                              −ＤＭＥＭ
−１０％  ＦＣＳ                        −ＦＣＳなし
−１００IU/ml  ペニシリン               −１００IU/ml  ペニシリン
−０．１mg/ml  ストレプトマイシン       −０．１mg/ml  ストレプトマイシン
洗浄緩衝液： 乳液：
−０．０５M  トリス、ｐＨ８．５         −洗浄緩衝液
−０．１５M  ＮａＣｌ                   −５％  乳粉末
−０．１％  ＢＳＡ
−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０
ＡＢ  希釈液： 基質溶液：
−５０ml  Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ          −ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）ＯＰＤ
（３７５１５；Ｐｉｅｒｃｅ）            １錠（３４００６；Ｐｉｅｒｃｅ）
−４５０ml  Ｈ２Ｏ                       −９ml  Ｈ２Ｏ
−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ                −１ml  安定的過酸化物基質緩衝液、１０倍
（３４０６２；Ｐｉｅｒｃｅ）
【００４６】
第一ＡＢ（H-234;Santa Cruz Biotechnology,Inc.）を１／２００に、そして第二ＡＢ（31460;Socochim S.A.）を１／５００にＡＢ希釈液を用いて希釈した。
【００４７】
方法：
ケラチノサイトを、９６ウェルプレートに約５，０００セル／ウェルの密度で播種し、培地中で３日間、コンフルエンスまでインキュベートした（３７℃／１０％ＣＯ２）。培地を、３つの異なる濃度の試験物質を有する、三重の試験培地で交換した。各プレート上で、以下の対照も試験した。
【００４８】
負の対照： 正の対照：
Ａ）                                  Ａ）
−細胞あり                            −細胞あり
−第一ＡＢなし、第二ＡＢあり          −第一および第二ＡＢあり
Ｂ）                                  Ｂ）
−細胞なし                            −細胞あり
−第一および第二ＡＢあり              −第一および第二ＡＢあり
−１０ng/ml  ＴＦＧ−β２あり
Ｃ）各ペプチドについて、細胞なしのウェルを１つ試験して、両ＡＢの非特異的結合を排除した。
【００４９】
プレートをさらに７２時間インキュベートした。このインキュベート時間が完了した後、沈殿したコラーゲンＩＶを以下のプロトコルに従って検出および定量した：
・培地を捨て、２００μｌ／ウェルのＰＢＳで洗浄する。
・１００μｌ／ウェルのメタノールで固定する。→１５分／室温／振とう器６００rpm
・メタノールを捨て、２００μｌ／ウェルの乳液で遮断する。→３０分／室温／振とう器６００rpm
・乳液を捨て、１００μｌ／ウェルの第一ＡＢ希釈液と共にインキュベートする。→２時間／室温／振とう器６００rpm
・第一ＡＢ希釈液を捨て、２００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液で３回洗浄する。
・１００μｌ／ウェルの第二ＡＢ希釈液と共にインキュベートする。→３時間／室温／振とう器６００rpm
・第二ＡＢ希釈液を捨て；２００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液で３回、そして１００μｌ／ウェルのＰＢＳで１回洗浄する。
・１００μｌ／ウェルの基質溶液を加える。→１５分／室温／振とう器６００rpm
・５０μｌ／ウェルのＨ２ＳＯ４（２M）で反応を停止し、４９２nmで測定する。
・染料溶液を捨て、精製水でプレートを洗浄する。約１６時間−８０℃で凍結する。
・プレートを解凍し、細胞数を、製造者の手順に従ってＣｙＱＵＡＮＴアッセイにより測定した。
・細胞当りのコラーゲンＩＶ産生を、次の式に従って計算した：
（ＯＤコラーゲンＩＶ値／ＲＦＵ細胞数値）×１００
計算された値は、任意単位である。
【００５０】
表１の化合物１．１、１．１０、１．１１および２．５〜２．７は良好〜非常に良好な刺激作用を示した。
【００５１】
実施例３
ヒト不死化ケラチノサイト細胞株のケラチノサイト細胞培養を本発明のペプチド誘導体で処理した場合におけるコラーゲンＶＩＩ合成の刺激の決定
インビトロで培養したヒト不死化ケラチノサイトの、細胞当りのコラーゲンＶＩＩ産生を、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸収アッセイ）で検出した。ペプチド性活性化合物存在下での細胞によるコラーゲンＶＩＩ産生の増加を、この方法により定量した。ヒト不死化ケラチノサイトは、ハイデルベルグのDeutsche KrebsforschungszentrumのFusenig教授から提供され、標準的な細胞培養方法により培地中で培養した。対応するペプチド（活性化合物）と共に７２時間インキュベートした後、コラーゲンＶＩＩに特異的な抗体を用いて定量的決定を行った。コラーゲンＶＩＩ含有量の決定をした後、細胞数をMolecular Probes社のＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）により決定した。細胞当りのコラーゲンＶＩＩ含有量は、各値からのユニットとして計算した。
【００５２】
材料：
培養培地： 試験培地：
−ＤＭＥＭ                              −ＤＭＥＭ
−１０％  ＦＣＳ                        −ＦＣＳなし
−１００IU/ml  ペニシリン               −１００IU/ml  ペニシリン
−０．１mg/ml  ストレプトマイシン       −０．１mg/ml  ストレプトマイシン
洗浄緩衝液： 乳液：
−０．０５M  トリス、ｐＨ８．５         −洗浄緩衝液
−０．１５M  ＮａＣｌ                   −５％  乳粉末
−０．１％  ＢＳＡ
−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０
ＡＢ  希釈液： 基質溶液：
−５０ml  Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ          −ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）ＯＰＤ
（３７５１５；Ｐｉｅｒｃｅ）            １錠（３４００６；Ｐｉｅｒｃｅ）
−４５０ml  Ｈ２Ｏ                       −９ml  Ｈ２Ｏ
−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ                −１ml  安定的過酸化物基質緩衝液、１０倍
（３４０６２；Ｐｉｅｒｃｅ）
【００５３】
第一ＡＢ（C-16;Santa Cruz Biotechnology,Inc.）を１／２００に、そして第二ＡＢ（31402;Socochim S.A.）を１／５００にＡＢ希釈液を用いて希釈した。
【００５４】
方法：
ケラチノサイトを、９６ウェルプレートに約５，０００セル／ウェルの密度で播種し、培地中で３日間、コンフルエンスまでインキュベートした（３７℃／１０％ＣＯ２）。培地を、３つの異なる濃度の試験物質を有する、三重の試験培地で交換した。各プレート上で、以下の対照も試験した。
【００５５】
負の対照： 正の対照：
Ａ）                                  Ａ）
−細胞あり                            −細胞あり
−第一ＡＢなし、第二ＡＢあり          −第一および第二ＡＢあり
Ｂ）                                  Ｂ）
−細胞なし                            −細胞あり
−第一および第二ＡＢあり              −第一および第二ＡＢあり
−１０ng/ml  ＴＦＧ−β２あり
Ｃ）各ペプチドについて、細胞なしのウェルを１つ試験して、両ＡＢの非特異的結合を排除した。
【００５６】
プレートをさらに７２時間インキュベートした。このインキュベート時間が完了した後、沈殿したコラーゲンＶＩＩを以下のプロトコルに従って検出および定量した：
・培地を捨て、２００μｌ／ウェルのＰＢＳで洗浄する。
・１００μｌ／ウェルのメタノールで固定する。→１５分／室温／振とう器６００rpm
・メタノールを捨て、２００μｌ／ウェルの乳液で遮断する。→３０分／室温／振とう器６００rpm
・乳液を捨て、１００μｌ／ウェルの第一ＡＢ希釈液と共にインキュベートする。→２時間／室温／振とう器６００rpm
・第一ＡＢ希釈液を捨て、２００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液で３回洗浄する。
・１００μｌ／ウェルの第二ＡＢ希釈液と共にインキュベートする。→３時間／室温／振とう器６００rpm
・第二ＡＢ希釈液を捨て；２００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液で３回、そして１００μｌ／ウェルのＰＢＳで１回洗浄する。
・１００μｌ／ウェルの基質溶液を加える。→１５分／室温／振とう器６００rpm
・５０μｌ／ウェルのＨ２ＳＯ４（２M）で反応を停止し、４９２nmで測定する。
・染料溶液を捨て、精製水でプレートを洗浄する。約１６時間−８０℃で凍結する。
・プレートを解凍し、細胞数を、製造者の手順に従ってＣｙＱＵＡＮＴアッセイにより測定した。
・細胞当りのコラーゲンＶＩＩ産生を、次の式に従って計算した：
（ＯＤコラーゲンＶＩＩ値／ＲＦＵ細胞数値）×１００
計算された値は、任意単位である。
【００５７】
表１の化合物１．１０および２．５〜２．７は良好〜非常に良好な刺激作用を示した。
【００５８】
実施例４
ヒト不死化ケラチノサイト細胞株のケラチノサイト細胞培養を本発明のペプチド誘導体で処理した場合におけるインテグリンβ４合成の刺激の決定
インビトロで培養したヒト不死化ケラチノサイトの、細胞当りのインテグリンβ４産生を、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸収アッセイ）で検出した。ペプチド性活性化合物存在下での細胞によるインテグリンβ４産生の増加を、この方法により定量した。ヒト不死化ケラチノサイトは、ハイデルベルグのDeutsche KrebsforschungszentrumのFusenig教授から提供され、標準的な細胞培養方法により培地中で培養した。対応するペプチド（活性化合物）と共に７２時間インキュベートした後、インテグリンβ４に特異的な抗体を用いて定量的決定を行った。インテグリンβ４含有量の決定をした後、細胞数をMolecular Probes社のＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）により決定した。細胞当りのインテグリンβ４含有量は、各値からのユニットとして計算した。
【００５９】
材料：
培養培地： 試験培地：
−ＤＭＥＭ                              −ＤＭＥＭ
−１０％  ＦＣＳ                        −ＦＣＳなし
−１００IU/ml  ペニシリン               −１００IU/ml  ペニシリン
−０．１mg/ml  ストレプトマイシン       −０．１mg/ml  ストレプトマイシン
洗浄緩衝液： 乳液：
−０．０５M  トリス、ｐＨ８．５         −洗浄緩衝液
−０．１５M  ＮａＣｌ                   −５％  乳粉末
−０．１％  ＢＳＡ
−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０
ＡＢ  希釈液： 基質溶液：
−５０ml  Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ          −ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）ＯＰＤ
（３７５１５；Ｐｉｅｒｃｅ）            １錠（３４００６；Ｐｉｅｒｃｅ）
−４５０ml  Ｈ２Ｏ                       −９ml  Ｈ２Ｏ
−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ                −１ml  安定的過酸化物基質緩衝液、１０倍
（３４０６２；Ｐｉｅｒｃｅ）
【００６０】
第一ＡＢ（A9;Santa Cruz Biotechnology,Inc.）を１／２００に、そして第二ＡＢ（31430;Socochim S.A.）を１／５００にＡＢ希釈液を用いて希釈した。
【００６１】
方法：
ケラチノサイトを、９６ウェルプレートに約５，０００セル／ウェルの密度で播種し、培地中で３日間、コンフルエンスまでインキュベートした（３７℃／１０％ＣＯ２）。培地を、３つの異なる濃度の試験物質を有する、三重の試験培地で交換した。各プレート上で、以下の対照も試験した。
【００６２】
負の対照： 正の対照：
Ａ）                                  Ａ）
−細胞あり                            −細胞あり
−第一ＡＢなし、第二ＡＢあり          −第一および第二ＡＢあり
Ｂ）                                  Ｂ）
−細胞なし                            −細胞あり
−第一および第二ＡＢあり              −第一および第二ＡＢあり
−１０ng/ml  ＴＦＧ−β２あり
Ｃ）各ペプチドについて、細胞なしのウェルを１つ試験して、両ＡＢの非特異的結合を排除した。
【００６３】
プレートをさらに７２時間インキュベートした。このインキュベート時間が完了した後、沈殿したインテグリンβ４を以下のプロトコルに従って検出および定量した：
・培地を捨て、２００μｌ／ウェルのＰＢＳで洗浄する。
・１００μｌ／ウェルのメタノールで固定する。→１５分／室温／振とう器６００rpm
・メタノールを捨て、２００μｌ／ウェルの乳液で遮断する。→３０分／室温／振とう器６００rpm
・乳液を捨て、１００μｌ／ウェルの第一ＡＢ希釈液と共にインキュベートする。→２時間／室温／振とう器６００rpm
・第一ＡＢ希釈液を捨て、２００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液で３回洗浄する。
・１００μｌ／ウェルの第二ＡＢ希釈液と共にインキュベートする。→３時間／室温／振とう器６００rpm
・第二ＡＢ希釈液を捨て；２００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液で３回、そして１００μｌ／ウェルのＰＢＳで１回洗浄する。
・１００μｌ／ウェルの基質溶液を加える。→１５分／室温／振とう器６００rpm
・５０μｌ／ウェルのＨ２ＳＯ４（２M）で反応を停止し、４９２nmで測定する。
・染料溶液を捨て、精製水でプレートを洗浄する。約１６時間−８０℃で凍結する。
・プレートを解凍し、細胞数を、製造者の手順に従ってＣｙＱＵＡＮＴアッセイにより測定した。
・細胞当りのインテグリンβ４産生を、次の式に従って計算した：
（ＯＤインテグリンβ４値／ＲＦＵ細胞数値）×１００
計算された値は、任意単位である。
【００６４】
表１の化合物１．１および２．５〜２．７は良好〜非常に良好な刺激作用を示した。
【００６５】
実施例５
ヒト不死化ケラチノサイト細胞株のケラチノサイト細胞培養を本発明のペプチド誘導体で処理した場合におけるコラーゲンＸＶＩＩ合成の刺激の決定
インビトロで培養したヒト不死化ケラチノサイトの、細胞当りのコラーゲンＸＶＩＩ産生を、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸収アッセイ）で検出した。ペプチド性活性化合物存在下での細胞によるコラーゲンＸＶＩＩ産生の増加を、この方法により定量した。ヒト不死化ケラチノサイトは、ハイデルベルグのDeutsche KrebsforschungszentrumのFusenig教授から提供され、標準的な細胞培養方法により培地中で培養した。対応するペプチド（活性化合物）と共に７２時間インキュベートした後、コラーゲンＸＶＩＩに特異的な抗体を用いて定量的決定を行った。コラーゲンＸＶＩＩ含有量の決定をした後、細胞数をMolecular Probes社のＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）により決定した。細胞当りのコラーゲンＸＶＩＩ含有量は、各値からのユニットとして計算した。
【００６６】
材料：
培養培地： 試験培地：
−ＤＭＥＭ                              −ＤＭＥＭ
−１０％  ＦＣＳ                        −ＦＣＳなし
−１００IU/ml  ペニシリン               −１００IU/ml  ペニシリン
−０．１mg/ml  ストレプトマイシン       −０．１mg/ml  ストレプトマイシン
洗浄緩衝液： 乳液：
−０．０５M  トリス、ｐＨ８．５         −洗浄緩衝液
−０．１５M  ＮａＣｌ                   −５％  乳粉末
−０．１％  ＢＳＡ
−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０
ＡＢ  希釈液： 基質溶液：
−５０ml  Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ          −ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）ＯＰＤ
（３７５１５；Ｐｉｅｒｃｅ）            １錠（３４００６；Ｐｉｅｒｃｅ）
−４５０ml  Ｈ２Ｏ                       −９ml  Ｈ２Ｏ
−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ                −１ml  安定的過酸化物基質緩衝液、１０倍
（３４０６２；Ｐｉｅｒｃｅ）
【００６７】
第一ＡＢ（STO-115;Davids Biotechnologie）を１／２００に、そして第二ＡＢ（31430;Socochim S.A.）を１／５００にＡＢ希釈液を用いて希釈した。
【００６８】
方法：
ケラチノサイトを、９６ウェルプレートに約５，０００セル／ウェルの密度で播種し、培地中で３日間、コンフルエンスまでインキュベートした（３７℃／１０％ＣＯ２）。培地を、３つの異なる濃度の試験物質を有する、三重の試験培地で交換した。各プレート上で、以下の対照も試験した。
【００６９】
負の対照： 正の対照：
Ａ）                                  Ａ）
−細胞あり                            −細胞あり
−第一ＡＢなし、第二ＡＢあり          −第一および第二ＡＢあり
Ｂ）                                  Ｂ）
−細胞なし                            −細胞あり
−第一および第二ＡＢあり              −第一および第二ＡＢあり
−１０ng/ml  ＴＦＧ−β２あり
Ｃ）各ペプチドについて、細胞なしのウェルを１つ試験して、両ＡＢの非特異的結合を排除した。
【００７０】
プレートをさらに７２時間インキュベートした。このインキュベート時間が完了した後、沈殿したコラーゲンＸＶＩＩを以下のプロトコルに従って検出および定量した：
・培地を捨て、２００μｌ／ウェルのＰＢＳで洗浄する。
・１００μｌ／ウェルのメタノールで固定する。→１５分／室温／振とう器６００rpm
・メタノールを捨て、２００μｌ／ウェルの乳液で遮断する。→３０分／室温／振とう器６００rpm
・乳液を捨て、１００μｌ／ウェルの第一ＡＢ希釈液と共にインキュベートする。→２時間／室温／振とう器６００rpm
・第一ＡＢ希釈液を捨て、２００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液で３回洗浄する。
・１００μｌ／ウェルの第二ＡＢ希釈液と共にインキュベートする。→３時間／室温／振とう器６００rpm
・第二ＡＢ希釈液を捨て；２００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液で３回、そして１００μｌ／ウェルのＰＢＳで１回洗浄する。
・１００μｌ／ウェルの基質溶液を加える。→１５分／室温／振とう器６００rpm
・５０μｌ／ウェルのＨ２ＳＯ４（２M）で反応を停止し、４９２nmで測定する。
・染料溶液を捨て、精製水でプレートを洗浄する。約１６時間−８０℃で凍結する。
・プレートを解凍し、細胞数を、製造者の手順に従ってＣｙＱＵＡＮＴアッセイにより測定した。
・細胞当りのコラーゲンＸＶＩＩ産生を、次の式に従って計算した：
（ＯＤコラーゲンＸＶＩＩ値／ＲＦＵ細胞数値）×１００
計算された値は、任意単位である。
【００７１】
表１の化合物１．１、１．１０、１．１１および２．５〜２．７は良好〜非常に良好な刺激作用を示した。
【００７２】
実施例６：軟膏の処方
手順：成分１〜５（Ａ）を７０℃に加熱した。成分６〜７（Ｂ）を７５℃に加熱した。撹拌しながらＢをＡに加え、混合物を５０℃に冷却し、均質化して３０℃に冷却した。次に、成分８および９（Ｃ）ならびに成分１０および１１（Ｄ）を連続して加え、混合物を冷却下で撹拌した。
【００７３】
【表２】
2009535310.tif 000005
【００７４】
実施例７：ゲルの処方
手順：成分２〜６（Ａ）を連続して脱イオン水に溶解した。成分７（Ｂ）により溶液をｐＨ６．０に調整した。次に成分８および９（Ｃ）を加えた。
【００７５】
【表３】
2009535310.tif 000006
【００７６】
実施例８：本発明の式（Ｉ）で示される化合物であって、Ｘが−ＮＲ２−であり、Ｒ１とＲ２の両方がＨ以外である化合物、および本発明の式（Ｉ）に対応する化合物であるが、とりうる意味のうちＸが−ＮＨ−であるＸＲ１が、α−アミノ酸の基である化合物、ならびにそのような化合物の塩の調製
本実施例に従って得られた溶出液および生成物の分析は、プロトンＮＭＲ、ＨＰＬＣ−エレクトロスプレーＭＳまたは元素分析によって行った。化合物は、以下に記載する公知の方法（M. Bodanszky "The Practice of Peptide Synthesis" Springer Verlag, 2nd edition 1994の一般的な指示）に従って製造した。したがって、例えばリシンのようなアミノ酸を、固相合成においてカルボキシ末端で樹脂に結合し、そのアミノ基を例えばＦｍｏｃ保護基のような保護基により保護した。側鎖は、例えばＢｏｃまたはｔ−ブチルにより保護した。保護基を必要に応じて選択的に外し、ペプチド合成において標準的な試薬により所望の配列が完全に構築されるまでさらなるアミノ酸誘導体を結合した。その後、ペプチドをカルボキシ末端において樹脂から外し、粗ペプチドを適切な溶媒混合物に滴下して沈殿させた。混合物をＨＰＬＣにより精製し、任意で対イオンに変換し、そしてその物質を凍結乾燥した。
【００７７】
実施例８．１：固相でのＰａｌｍ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｄａｂ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＣＴＲの調製
保護アミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨおよびパルミチン酸を、２−クロロトリチルクロリド樹脂１．７５ｇ（担持：０．８mmol／ｇ）に連続したペプチド結合により結合させ、このようにして保護ペプチドを構築した。
【００７８】
実施例８．２：固相でのＰａｌｍ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｄａｂ−Ｔｈｒ−ＯＨ・２ＴＦＡの調製
９５％ＴＦＡ １０mlで３０分間処理することでペプチドを樹脂から外した。樹脂を濾別し、溶液をＥｔ２Ｏ １００mlに滴下した。形成した沈殿を吸引により濾別し、洗浄し、そして乾燥の後に、分取ＨＰＬＣにより精製して凍結乾燥した。無色の粉末３９１mg（３４％）を得た。理論的質量６８６を、検出量６８７で確認した。
【００７９】
実施例８．３：本発明の式（Ｉ）で示される化合物であって、Ｘが−ＮＲ２−であり、Ｒ１とＲ２の両方がＨ以外である化合物の調製
そのような化合物は、実施例７のＷＯ２００４／０９９２３７Ａ１に記載されている手順と同様にして調製できる。
【国際調査報告】
2009535310.tif 000008
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