(57)【要約】  本発明は、Ｏｃｔ４発現能を有する臍帯血由来の多分化能成体幹細胞及びその製造方法に係り、さらに詳細には、臍帯血（へその緒の血液）由来の血液から分離した単球を、ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）及びヒト血清またはプラズマを含む培地で培養して分離した多分化能成体幹細胞（multipotent adult stem cell）に関する。本発明に係る幹細胞は、成体幹細胞であるにもかかわらず、骨形成細胞、神経細胞などに分化可能な多分化能を持っており、難治性疾患及び難病の治療に有用に使用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
臍帯血由来の単球をｂＦＧＦ及びヒト血清またはプラズマ含有の培地で培養し生体幹細胞を回収する工程を含む成体幹細胞の製造方法であって、
（ａ）Ｏｃｔ４発現能を有すること；
（ｂ）ＣＤ２４、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ４５及びＣＤ４９Ｂに対して陽性の免疫学的反応を示し、ＣＤ３４、ＣＤ５１／６１、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ７３
、ＣＤ９０、ＣＤ１３３及びＣＤ１３５に対して陰性の免疫学的反応を示すこと；
（ｃ）プラスチックに付着して成長し、円形(round-shape)または紡錘形(spindle-shape)の形態学的特性を示すこと；及び
（ｄ）中胚葉、内胚葉及び外胚葉由来の細胞への分化能を有すること、
を特徴とする、前記製造方法。
【請求項２】
前記ｂＦＧＦ及びヒト血清またはプラズマの含量は、それぞれ１〜３０ｎｇ／ｍｌ及び５〜３０％であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒト血清またはプラズマは、自家(autologous)または他家(allologous)であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記培地は、α−ＭＥＭであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
請求項１または請求項４の方法によって得られ、次のような特性を有する成体幹細胞：
（ａ）Ｏｃｔ４発現能を有する；
（ｂ）ＣＤ２４、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ４５及びＣＤ４９Ｂに対して陽性の免疫学的反応を示し、ＣＤ３４、ＣＤ５１／６１、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１３３及びＣＤ１３５に対して陰性の免疫学的反応を示す；
（ｃ）プラスチックに付着して成長し、円形または紡錘形の形態学的特性を示す；及び
（ｄ）中胚葉、内胚葉及び外胚葉由来の細胞への分化能を有する。
【請求項６】
ＳＨ−２、ＳＨ−３及びＳＨ−４からなる群から選択される１つ以上に対する陽性の免疫学的反応をさらに示すことを特徴とする請求項５に記載の成体幹細胞。
【請求項７】
ＣＤ４４、ＣＤ１０５及びＣＤ１１７に対しては、陽性または陰性の免疫学的反応を示すことを特徴とする請求項５に記載の成体幹細胞。
【請求項８】
前記中胚葉由来細胞は、骨形成細胞または血管内皮細胞であることを特徴とする請求項５に記載の成体幹細胞。
【請求項９】
前記外胚葉由来細胞は、神経細胞であることを特徴とする請求項５に記載の成体幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｏｃｔ４発現能を有する臍帯血由来の多分化能性成体幹細胞及びその製造方法に係り、さらに詳細には、臍帯血（へその緒の血液）由来の血液から分離した単球をｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）及びヒト血清またはプラズマを含む培地で培養して分離した多分化能性成体幹細胞（multipotent adult stem cell）に関する。
【背景技術】
【０００２】
ライフサイエンス及び医学の発展につれ、現代社会においては過去の多様な疾病が治療されているが、依然として虚血性壊死疾患、癌、認知症（dementia）、やけどのような難治性疾患及び難病が存在しており、臓器移植分野においても多くの問題点がある。このような疾病の根源的な治療方法として最も多くの脚光を浴びているものが細胞治療法（cell therapy）である。
【０００３】
細胞治療法とは、細胞及び組織の機能を復元させるために、自家（autologous）、同種（allogenic）または異種（xenogenic）の幹細胞を体外で増殖または選別するか、または細胞の生物学的特性を変化させる他の方法などによって疾病を治療及び予防する方法である。細胞治療法は、患者自身や他人または他の動物の体細胞を採取して増殖させるか、または幹細胞を所望の細胞に分化させて治療に利用するなど、その適用範囲が広いので、各種の難治性疾患及び難病の治療において無限の可能性を持っている。
【０００４】
骨格筋芽細胞（skeletal myoblast）、内皮前駆細胞（endothelial progenitor cell）または骨髄幹細胞（bone marrow stem cell）を梗塞の起こった心筋（myocardium）に移植すると、心筋の機能が改善されることは既に報告されている(Menasche, P. et al., J. Am. Coll. Cardiol.,41:1078, 2003; Strauer, B.E. et al., Circulation, 106:1913, 2002; and Stamm, C. et al., Lancet, 361:45, 2003)。このような心筋機能の改善は、幹細胞から分泌された動脈性サイトカイン(arteriogenic cytokine)によって機械的足場(mechanical scaffold)が形成されるか、または虚血性部位に他の有益な細胞(beneficial cell)が集まるためである(Orlic, D. et al., Circ Res, 91:1092, 2002)。
【０００５】
一方、幹細胞(stem cells)というのは自己複製能力を持ち、二つ以上の細胞に分化する能力を持つ細胞をいい、全能性幹細胞(totipotent stem cells)、多能性幹細胞(pluripotent stem cells)、多分化能性幹細胞(multipotent stem cells)に分類することができる。
【０００６】
全能性幹細胞(totipotent stem cells)は一つの完全な個体として発生していくことができる、全能性の特性を持った細胞であり、卵子と精子の受精後8細胞期までの細胞がこのような特性を持ち、この細胞を分離して子宮に移植すると、一つの完全な個体に発生することができる。
【０００７】
多能性幹細胞(pluripotent stem cells)は外胚葉、中胚葉、内胚葉層由来の多様な細胞と組織として発生することができる細胞であり、受精4〜5日後に現われる胚盤胞(blastocyst)の内側に位置する内細胞塊(inner cell mass)から由来して、これを胚性幹細胞(embryonic stem cell)といい、多様な他の組織細胞に分化するが新しい生命体を形成することはできない。
【０００８】
多分化能性幹細胞(multipotent stem cells)は、この細胞が含まれている組織及び器官に特異的な細胞だけに分化することができる幹細胞で、胎児期、新生児期及び成体期の各組織及び臓器の成長と発達はもちろん、成体組織の恒常性維持と組織損傷時の再生を誘導する機能に関与しており、組織特異的多分化能性細胞を総称して成体幹細胞という。
【０００９】
これまで知られた臍帯血由来の成体幹細胞としては、骨細胞や骨格筋に分化可能な間葉系幹細胞（mesenchymal stem cells）(Lee, O.K. et al., Blood, 103:1669, 2004; Gang, E.J. et al., BBRC, 321:102, 2004; Gang, E.J. et al., Stem Cell, 22:617, 2004)、心臓細胞に分化可能な心臓幹細胞(US 2004/0126879) 及び内皮前駆細胞(Yamamoto, K. et al., Arterio. Thromb. Vasc. Biol., 24:192, 2004)などがある。
【００１０】
特に、成体幹細胞は、骨髓に多く含まれていることが知られており、胚芽期の中胚葉から由来するため、骨、軟骨、脂肪などにのみ分化可能であると考えられていたが、外胚葉由来の神経細胞にも分化可能であるということが明らかになって、疾患の治療においてその効用範囲がさらに広がると期待されている。
【００１１】
しかし、前記幹細胞は、間葉系幹細胞による骨細胞や骨格筋への分化、心臓幹細胞による心臓細胞への分化、内皮前駆細胞による血管内皮細胞への分化などの制限された組織への分化能のみを示すため、本当の多分化能性幹細胞とは言い難い。
【００１２】
本発明者らは、臍帯血由来血液から分離した単球をｂＦＧＦ及びヒト血清またはプラズマを含む培地に培養して分離した成体幹細胞が、優れたプラスチックへの付着能を有し、胚性幹細胞の特異的マーカーであるＯｃｔ４を発現することができ、また、骨形成細胞、神経細胞などの多様な組織に分化可能であるということを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の要約】
【００１３】
本発明は、一つの観点において、ｂＦＧＦ及びヒト血清またはプラズマを含む培地を利用して臍帯血由来血液からＯｃｔ４発現能を有する多分化能性成体幹細胞を分離する方法を提供する。
【００１４】
本発明は、他の観点において、臍帯血由来の単球がｂＦＧＦ及びヒト血清またはプラズマ含有の培地で培養して得られ、次のような特性を有する成体幹細胞の製造方法を提供する：
（ａ）Ｏｃｔ４発現能を有する；
（ｂ）ＣＤ２４、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ４５及びＣＤ４９Ｂに対して陽性の免疫学的反応を示し、ＣＤ３４、ＣＤ５１／６１、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１３３及びＣＤ１３５に対して陰性の免疫学的反応を示す；
（ｃ）プラスチックに付着して成長し、円形(round-shape)または紡錘形(spindle-shape)の形態学的特性を示す；及び
（ｄ）中胚葉、内胚葉及び外胚葉由来の細胞への分化能を有する。
【００１５】
本発明において、前記ｂＦＧＦ及びヒト血清またはプラズマの含量は、それぞれ１〜３０ｎｇ／ｍｌ及び５〜３０％であり、前記ヒト血清またはプラズマは、自家(autologous)または他家(allologous)であり、前記培地は、α−ＭＥＭであることを特徴とすることができる。
【００１６】
また、本発明は、前記方法によって得られ、次のような特性を有する成体幹細胞を提供する：
（ａ）Ｏｃｔ４発現能を有する；
（ｂ）ＣＤ２４、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ４５及びＣＤ４９Ｂに対して陽性の免疫学的反応を示し、ＣＤ３４、ＣＤ５１／６１、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１３３及びＣＤ１３５に対して陰性の免疫学的反応を示す；
（ｃ）プラスチックに付着して成長し、円形または紡錘形の形態学的特性を示す；及び
（ｄ）中胚葉、内胚葉及び外胚葉由来の細胞への分化能を有する。
【００１７】
本発明において、前記成体幹細胞は、ＳＨ−２、ＳＨ−３及び／またはＳＨ−４に対して陽性の免疫学的反応を追加的に示し、ＣＤ４４、ＣＤ１０５及びＣＤ１１７に対しては、陽性または陰性の免疫学的反応を示すことを特徴とすることができる。また、前記中胚葉由来細胞は、骨形成細胞または血管内皮細胞であり、前記外胚葉由来細胞は、神経細胞であることを特徴とすることができる。
【００１８】
本発明の他の特徴及び具現例は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲からさらに明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明に係る臍帯血由来の多分化能性成体幹細胞を示す写真である。
【図２】フローサイトメータを利用した臍帯血由来の多分化能性成体幹細胞の免疫学的反応を示す図である（Ａ及びＥ：対照群；Ｂ：ＣＤ３４；Ｃ：ＣＤ４５；Ｄ：ＳＨ−２；Ｆ：ＳＨ−３）。
【図３】本発明に係る多分化能性成体幹細胞で抗原の発現の有無を調査するためのＰＡＳ染色結果を示したものである。
【図４】臍帯血由来の多分化能性成体幹細胞の骨形成細胞への分化を示す写真（Ａ及びＢ）であり、Ｃ及びＤは、Ｖｏｎ−Ｋｏｓｓａ染色法で染色した結果を示す写真である。
【図５】臍帯血由来の多分化能性成体幹細胞と特異抗原との結合を示す写真である。Ａ及びＢは、それぞれ神経系ニューロンの特異抗原であるＮＳＥ（neuron-specific enolse）及び神経系星霜細胞の特異抗原であるＧＦＡＰ（glial fibrillary acidic protein）で陽性反応を表すことを示すもので、Ｃ及びＤは、その対照群を示すものである。
【図６】臍帯血由来の多分化能性成体幹細胞を免疫染色して、Ｏｃｔ４の発現を示す写真である（A:phase contrast; B:Oct4; C:merge）。
【図７】臍帯血由来の多分化能性成体幹細胞を免疫染色して、ＳＨ−４及びＯｃｔ４の発現を示す写真である（A:SH-4; B:Oct4; C:merge）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、臍帯血由来血液からＯｃｔ４発現能を有する多分化能性成体幹細胞を分離する方法に係り、その分離過程は下記の通りである。
【００２１】
まず、収集した臍帯血から得た血液サンプル７０〜１００ｍｌをＰＢＳと１：１の割合で希釈して撹拌した後、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｇｕｅ：臍帯血＝１５：２５の割合でフィコール相分離を実施する。１５ｍｌのフィコール（Ficoll）溶液にＰＢＳと１：１の割合で希釈された血液サンプルを遠心分離した後、白色の層（単球層）を得て遠心分離する。上清は完全に取り除き、沈殿物は氷に保管する。
【００２２】
次いで、沈殿物を穏やかに振って分散させ、培養液１０ｍｌを添加して均一に分散させた後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清を全て取り除き、培養液１０ｍｌを添加して１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して（前記過程を二回繰り返して行った）、細胞を得る。
【００２３】
得られた細胞にヒト血清またはプラズマ５〜３０％及びｂＦＧＦ(basic fibroblast growth factor)[Roche, Switzerland]１０ｎｇ／ｍｌを含むα−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を添加し、適正数の細胞（約３〜５×１０６／ｍｌ）を培養用容器(cultural vessel)に播種して３日間培養する。３日後、培養液の下層液には、ＲＢＣ（red blood cell）を含む比較的に重い細胞が存在し、上層の液には、分離しようとする成体幹細胞が存在する。その上層の液を注意深く新しい培養用容器に移して培養することによって、最終的にＯｃｔ４発現能を有する成体幹細胞を得る。
【００２４】
前記得られた幹細胞液から目的の表面抗原を発現している多分化能性幹細胞を取得する方法としてはソーティング機能を持つフローサイトメータを用いるＦＡＣＳ法(Int. Immunol., 10:275, 1998)、磁気ビーズを用いる方法、多分化能性幹細胞を特異的に認識する抗体を用いるパンニング法(J. Immunol., 141:2797, 1998)などがある。また、大量の培養液などから多分化能性幹細胞を取得する方法としては、細胞の表面に発現された分子(以下、表面抗原と称する)を特異的に認識する抗体を単独または組み合わせて、これをカラムとして使う方法がある。
【００２５】
フローサイトメータのソーティング方式としては、水滴荷電方式、セル捕獲方式などがあげられる。いずれかの方法も、細胞の表面抗原を特異的に認識する抗体を蛍光で標識して、標識された抗体と抗原の結合体に対する蛍光を測定して蛍光強度を電気信号として変換することで、細胞の抗原発現量を定量することができる。また、使われる蛍光物質の種類を組み合わせることで、複数の表面抗原を発現している細胞を分離することも可能である。これに使用可能な蛍光物質では、ＦＩＴＣ(fluorescein isothiocyanate)、ＰＥ(phycoerythrin)、ＡＰＣ(allo-phycocyanin)、ＴＲ(TexasRed)、Ｃｙ３、ＣｙＣｈｒｏｍｅ、Ｒｅｄ６１３、Ｒｅｄ６７０、ＴＲＩ−ＣＯＬＯＲ、ＱｕａｎｔｕｍＲｅｄなどがある。
【００２６】
フローサイトメータを用いたＦＡＣＳ法としては、前記で得られた幹細胞溶液を収集して、遠心分離などの方法で細胞を分離した後、直接抗体で染色する方法と、一度適当な培地で培養、増殖させた後、抗体を染色する方法を利用することができる。細胞の染色はまず、表面抗原を認識する一次抗体と目的細胞のサンプルを混合して、氷上で３０分〜１時間インキュベーションする。
【００２７】
一次抗体が蛍光にて標識されている場合には、洗浄後フローサイトメータで分離を実施する。一次抗体が蛍光標識されていない場合には、洗浄後、一次抗体に対して結合活性を持つ蛍光標識された二次抗体と一次抗体が反応した細胞を混合して、さらに氷水で３０分〜１時間インキュベーションする。洗浄後、一次抗体と二次抗体で染色された細胞をフローサイトメータで分離を実施する。
【００２８】
磁気ビーズを使用する方法では目的表面抗原を発現している細胞を大量に分離することができる。分離純度は、前述のフローサイトメータ（flow cytometer）を使用する方法には及ばないが、精製を繰り返すことによって十分に高い細胞純度を確保することができる。
【００２９】
各種のマーカーとしては、胚性幹細胞の特異的発現タンパク質、造血関連抗原、間葉系細胞の表面抗原、神経系ニューロンの特異抗原などが挙げられる。前記胚性幹細胞の特異的発現タンパク質としては、Ｏｃｔ４などがあり、前記造血関連抗原としては、ＣＤ３４、ＣＤ４５などがあり、間葉系細胞の表面抗原としては、ＳＨ−２、ＳＨ−３などがあり、神経系ニューロンの特異抗原としては、ＮＳＥ、ＧＦＡＰなどがある。前述の各種の表面抗原を認識する抗体を単独でまたは組み合わせて使用することによって、目的細胞を得ることができる。
【００３０】
本発明に係る多分化能性成体幹細胞は、ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ抗原であるＣＤ４５に対して陽性を示し、ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｌｉｎｅａｇｅの抗原であるＣＤ３４に対して陰性を示し、Ｏｃｔ４発現能を有しており、ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ細胞からｍｏｎｏｃｙｔｅに分化が進行中の幹細胞であると推定される。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであり、当業者ならば、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは理解できるであろう。
【００３２】
＜実施例１：臍帯血から成体幹細胞の分離＞
臍帯血は、臨床試験倫理委員会指針書(institutional Review Board guidelines)に従って、ソウル大学病院と三星第一病院において正常分娩及び早産分娩から収集した。
【００３３】
前記収集された臍帯血から得た血液サンプル７０〜１００ｍｌをＰＢＳと１：１の割合で希釈して撹拌した。その後、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｇｕｅ：臍帯血＝１５：２５の割合でフィコール相分離を行った。１５ｍｌのフィコール溶液に、ＰＢＳと１：１の割合で希釈された血液サンプルを静かに流して層が分離されるようにした後、遠心分離した（２５００ｒｐｍ、２０分）。遠心分離後、下から三つの相異なる層が形成されるが、そのうち中問層（単球層）のバッフィコート（buffy coat）をマイクロピペットで採取し、ＨＢＳＳで３回洗浄した後、遠心分離（１８００ｒｐｍ、１５分）した。上清は完全に取り除き、沈殿物は氷に保管した。
【００３４】
沈殿物を穏やかに振って分散させ、培養液１０ｍｌを添加して均一に分散させた後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清はすべて取り除き、培養液１０ｍｌを添加して１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して（前記過程を二回繰り返して行った）、細胞を得た。
【００３５】
得られた細胞にヒト血清またはプラズマ５〜３０％及びｂＦＧＦ(basic fibroblast growth factor)[Roche, Switzerland]１０ｎｇ／ｍｌを含むα−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を添加して、適正数の細胞（約３〜５×１０６／ｍｌ）を培養用容器に播種して３日間培養した。３日後、培養液の下層液には、ＲＢＣを含む比較的に重い細胞が存在し、上層の液には、分離しようとする成体幹細胞が存在した。その上層の液を注意深く新しい培養用容器に移して培養することによって、最終的に成体幹細胞を得た。
【００３６】
図１は、本発明に係る臍帯血由来の多分化能性成体幹細胞を顕微鏡で観察した写真である。
【００３７】
＜実施例２：臍帯血由来の多分化能性成体幹細胞の免疫学的反応＞
前記実施例１で得た臍帯血由来の多分化能性成体幹細胞の免疫学的反応を調べるために、細胞表面抗原の発現様相を調査した。すなわち、前記実施例１で培養した細胞を２×１０６〜１０７個準備して、ＰＢＳ溶液で洗浄し、各抗原に該当する抗体と室温で反応させた。抗原の発現の有無は、フローサイトメータを利用して確認した。また、ＰＡＳ染色（periodic acid Schiff staining）を行った。
【００３８】
その結果、図２に示すように、本発明の臍帯血由来の多分化能性成体幹細胞は、ＣＤ４５に対しては６３．３８％、ＳＨ−２に対しては９６．５４％、ＳＨ−３に対しては６３．９９％の陽性反応を示し、ＣＤ３４に対しては９０％以上陰性を示した。また、他の抗原に対する免疫表現型を確認した結果、ＣＤ５１／６１：陰性、ＣＤ６２Ｌ：陰性、ＣＤ６２Ｐ：陰性、ＣＤ１３３：陰性、ＣＤ１３５：陰性、ＣＤ９０：陰性、ＣＤ２９：陽性、ＣＤ４４：陽性または陰性、ＣＤ４９Ｂ：陽性、ＣＤ１０５（ＳＨ−２）：陽性または陰性、及びＣＤ９０：陰性の免疫学的反応を示した。
【００３９】
一方、図３に示すように、ＰＡＳ染色においても陽性反応を示した。
【００４０】
＜実施例３：臍帯血由来の多分化能性成体幹細胞の骨形成細胞への分化＞
前記実施例１で得た臍帯血由来の多分化能性成体幹細胞液を１ｍｌの骨形誘導培地（0.1μmol/L dexamethasone[Sigma, USA], 0.05mmol/L ascorbic acid-2-phosphate [Sigma, USA] and 10mmol/L beta-glycophosphate [Sigma]、５〜３０％のヒト血清またはプラズマ）に希釈して細胞数を数えた後、フラスコで培養（５％のＣ０２、３７℃、培地は３〜４日に一回交換する）して多分化能性成体幹細胞の骨形成細胞に分化を誘導した。培養後１４日目に、Ｖｏｎ−Ｋａｓｓａ染色法を利用して臍帯血由来の多分化能性成体幹細胞が骨形成細胞に分化されたことを確認した（図４）。
【００４１】
＜実施例４：臍帯血由来の多分化能性成体幹細胞の神経細胞への分化＞
前記実施例１で得た臍帯血由来の多分化能性成体幹細胞を１ｍｌの神経因性培地（５〜３０％のヒト血清またはプラズマ、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのｂＥＧＦ（human epidermal growth factor)[Roche, Switzerland]、及び１０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ（human neural growth factor)[Invitrogen, USA]を添加）に希釈してフラスコに入れ、３７℃、Ｃ０２（５％）の培養器で培養して多分化能性成体幹細胞から神経細胞への分化を誘導した。培養後１４日目に、神経系ニューロンの特異抗原であるＮＳＥ（neuron-specific enolase）及び神経系の星霜細胞特異抗原であるＧＦＡＰ（glial fibrillary acidic protein）に対して陽性反応を示すことを確認することによって、臍帯血由来の多分化能性成体幹細胞が神経細胞に分化されたことを確認した（図５）。
【００４２】
＜実施例５：臍帯血由来の多分化能性成体幹細胞のＯｃｔ４発現＞
前記実施例１の成体幹細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、４％のパラホルムアルデヒド（paraformaldehyde）溶液を添加して室温で５〜１０分間反応させて細胞を固定した後、ＰＢＳで３回洗浄してパラホルムアルデヒド溶液を取り除いた。前記過程によって固定された細胞に０．３％のｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｉｎ  ＰＢＳ）を添加して室温で５分間反応させて、外部物質が細胞内に浸透しやすい状態（permeabilization）にした後、ＰＢＳで３回洗浄してｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を取り除いた。１０％のＮＧＳを添加して室温で３０分間反応させ、１次抗体（１：２００に希釈）及びＮＧＳ（１：１００に希釈）を含むＰＢＳを添加して４℃で一晩反応させた後、ＰＢＳで３回洗浄して反応液を取り除いた。２次抗体（１：２００に希釈）及びＮＧＳ（１：１００に希釈）を含むＰＢＳを添加して３７℃で１時間反応させ、ＰＢＳで３回洗浄して反応液を取り除いた後、マウンティングして顕微鏡で観察した。
【００４３】
その結果、図６に示すように、本発明の成体幹細胞は、胚性幹細胞の発現タンパク質であると同時に、未分化状態の細胞マーカーであるＯｃｔ４に対して陽性反応を示した。また、図７に示すように、本発明の成体幹細胞でＯｃｔ４及びＳＨ−４が同時に発現するということが確認された。
【００４４】
本発明の成体幹細胞が発現するＯｃｔ４は、胚性幹細胞で発現する転写因子（transcription factor）であって、細胞の分化を防止する役目を行い、細胞が自然的に分化され始めれば消滅するもので、全分化能幹細胞のマーカーとして知られている（Donovan, P.J., Nature Genet., 29:246, 2001; Pesce, M. and Scholer, H.R., Stem Cells, 19:271, 2001）。したがって、本発明の成体幹細胞が全分化能である胚性幹細胞のマーカーであるＯｃｔ４を発現するという前記結果は、本発明に係る成体幹細胞が全分化能であるということをさらに明確に立証する。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明は、ｂＦＧＦ及びヒト血清またはプラズマを含む培地を利用して、臍帯血由来血液からＯｃｔ４発現能を有する多分化能性成体幹細胞を分離する方法を提供する効果がある。本発明に係る幹細胞は、成体幹細胞であるにもかかわらず、骨形成細胞、神経細胞などに分化可能な多分化能を有しており、難治性疾患及び難病の治療に有用に使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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