(57)【要約】イヌに存在する１つまたはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子を同定するための方法であって、（ａ）表４〜６のいずれか１つにおける１つまたはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子について特定された多形性位置にもしくは各々の多形性位置に存在するヌクレオチドを決定するか、または表４〜６に特定される１つまたはそれ以上の多形性位置と連鎖不平衡にある多形性位置に存在するヌクレオチドを決定する工程と；（ｂ）それから、このイヌにおける１つまたはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子の有無を同定する工程とを含む、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌに存在する１つまたはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子を同定するための方法であって、
（ａ）表４〜６のいずれか１つにおける１つまたはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子について特定された多形性位置にもしくは各々の多形性位置に存在するヌクレオチドを決定するか、または表４〜６に特定される１つまたはそれ以上の多形性位置と連鎖不平衡にある多形性位置に存在するヌクレオチドを決定する工程と；
（ｂ）それから、前記イヌにおける１つまたはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子の有無を同定する工程とを含む、方法。
【請求項２】
工程（ａ）が、ＭＨＣ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドと、特定の結合因子とを前記多形性についてまたは各々の多形性について接触させる工程と、前記因子が前記ポリヌクレオチドに結合するか否かを決定する工程とを含み、前記ポリヌクレオチドに対する前記因子の結合が前記多形性または各々の多形性の存在を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記因子がポリヌクレオチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の方法であって、前記多形性または各々の多形性が、ゲル電気泳動の間にＭＨＣポリペプチドまたはＭＨＣ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドの移動度を測定することによって検出される、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の前記多形性または各々の多形性を検出し得る、プローブ、プライマーまたは抗体。
【請求項６】
請求項１に記載の多形性または各々の多形性を検出するための手段を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法を行うためのキット。
【請求項７】
請求項５に記載のプローブ、プライマーまたは抗体を含む、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
イヌがＭＨＣ対立遺伝子関連障害に感受性であるか否かを決定する方法であって、
（ａ）請求項１から４のいずれか一項に記載の方法によってイヌにおける１つまたはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子の有無を同定する工程と；
（ｂ）それから、前記イヌがＭＨＣ対立遺伝子関連障害に対して感受性であるか否かを決定する工程とを含む、方法。
【請求項９】
ＭＨＣ対立遺伝子関連障害に対して感受性であるイヌのために特注生産された食物を調製する方法であって、
（ａ）前記イヌが請求項８に記載の方法によってＭＨＣ対立遺伝子関連障害に感受性であるか否かを決定する工程と；
（ｂ）前記イヌに適切である食物を調製する工程と
を含む、方法。
【請求項１０】
前記特注生産されたイヌの食物が、ＭＨＣ対立遺伝子関連障害を妨げるかまたは軽減する成分を含み、そして／またはＭＨＣ対立遺伝子関連障害に寄与するかまたは悪化させる成分を含まない、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の方法であって、前記イヌ、イヌの所有者またはイヌに給餌する責任者に対して食物を提供する工程をさらに含む、方法。
【請求項１２】
ＭＨＣ対立遺伝子関連障害について治療的である化合物の使用であって、請求項８に記載の方法によってＭＨＣ対立遺伝子関連障害に対して感受性であると同定されているイヌにおけるＭＨＣ対立遺伝子関連障害の予防または処置のための医薬の製造における、使用。
【請求項１３】
ＭＨＣ対立遺伝子関連障害についてイヌを処置する方法であって、前記障害を予防または処置する有効量の治療化合物を前記イヌに投与する工程を含み、前記イヌが請求項８に記載の方法によってＭＨＣ対立遺伝子関連障害に感受性であると同定されている、方法。
【請求項１４】
表４〜６のいずれか１つに記載のＭＨＣ対立遺伝子多形性に関する情報および場合によってＭＨＣ対立遺伝子関連障害とのそれらの関連を含む、データベース。
【請求項１５】
イヌにおいて１つまたはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子を同定するための方法であって、
（ａ）表４〜６のいずれか１つにおける１つまたはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子について特定された多形性位置または各々の多形性位置に存在するヌクレオチドのデータをコンピュータシステムに入力する工程と；
（ｂ）前記データを請求項１４に記載のコンピュータデータベースに対して比較する工程と；
（ｃ）前記比較に基づいて、前記イヌにおける１つまたはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子の有無を同定する工程と
を含む、方法。
【請求項１６】
コンピュータプログラムであって、前記プログラムがコンピュータで行われる場合、請求項１５に記載の全ての工程を行うためのプログラムコード手段を含む、コンピュータプログラム。
【請求項１７】
コンピュータプログラム製品であって、前記プログラム製品がコンピュータで行われる場合、請求項１５に記載の方法を行うためのコンピュータ読み取り可能な媒体に記憶されるプログラムコード手段を含む、コンピュータプログラム製品。
【請求項１８】
搬送波上にプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム製品であって、前記プログラムコード手段が、コンピュータシステム上で実行される場合、コンピュータシステムを指図して、請求項１５に記載の方法を行う、コンピュータプログラム製品。
【請求項１９】
（ａ）前記イヌにおいて表４〜６のいずれか１つに特定される多形性位置または各々の多形性位置に存在するヌクレオチドのデータを受容するための手段と；
（ｂ）前記データと請求項１４に記載のデータベースとを比較するためのモジュールと；
（ｃ）前記比較に基づいて１つまたはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子の有無を決定するための手段と
を含む、請求項１５に記載の方法を行うように配置されたコンピュータシステム。
【請求項２０】
ＭＨＣ対立遺伝子関連障害に感受性であるイヌについて特注生産された食物を調製する方法であって、
（ａ）前記イヌがＭＨＣ対立遺伝子関連障害に感受性であるか否かを、請求項１５に記載の方法によって決定する工程と；
（ｂ）前記イヌに適切な特注生産されたイヌの食物処方を電気的に生成する工程と；
（ｃ）前記特注生産されたイヌの食物処方に従って食物製造装置の操作を制御するように電気的製造指示を作成する工程と；
（ｄ）前記電気的製造指示に従って前記特注生産されたイヌの食物を製造する工程と
を含む、方法。
【請求項２１】
（ｄ）前記イヌに適切な特注生産されたイヌの食物処方を電気的に生成するための手段と；
（ｅ）前記特注生産されたイヌの食物処方に従って食物製造装置の操作を制御する電気的製造指示を生成するための手段と；
（ｆ）食品製造装置と
をさらに含む、請求項１９に記載のコンピュータシステム。
【請求項２２】
特注生産されたイヌの食品を作製するための請求項２１に記載のコンピュータシステムの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、イヌのゲノムに存在するＭＨＣ対立遺伝子を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
イヌのＭＨＣ分子は、イヌ白血球抗原（ＤＬＡ）として公知である。ＤＬＡ複合体は第１２染色体に存在し、ＤＬＡは、クラスＩ、ＩＩおよびＩＩＩの領域に分けられる場合もある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
発明の要旨
イヌＭＨＣ対立遺伝子を同定するための従来公知の方法としては、配列決定およびリファレンス・ストランド・メディエーティッド・コンフォメーション・アナリシス（reference strand-mediated conformation analysis）（ＲＳＣＡ）が挙げられる。しかし、これらの技術の両方とも、時間を浪費し、かつ慣用的に行うには高価である。従って、イヌＭＨＣ対立遺伝子を同定する別の方法を提供することが有益である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、各々のイヌＭＨＣ対立遺伝子を独自に同定するために用いられ得る一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ）を同定している。これによって、イヌＭＨＣ対立遺伝子の同定のためのＳＮＰベースの試験の開発が可能になっている。さらに、本発明者らは、以前には未知であったイヌＭＨＣ対立遺伝子のコレクションを同定している。従って、本発明は、イヌに存在する１つまたはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子を同定するための方法を提供し、この方法は、
（ａ）表４〜６のいずれか１つにおける１つまたはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子について特定された多形性位置にもしくは各々の多形性位置に存在するヌクレオチドを決定するか、または表４〜６に特定される１つまたはそれ以上の多形性位置と連鎖不平衡にある多形性位置に存在するヌクレオチドを決定する工程と；
（ｂ）それから、このイヌにおける１つまたはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子の有無を同定する工程とを含む。
【０００５】
本発明はさらに以下を提供する：
本明細書に規定されるような多形性または各々の多形性を検出し得る、プローブ、プライマーまたは抗体と；
本発明の方法を行うためのキットであって、本明細書に規定されるような多形性または各々の多形性を検出するための手段を含む、キットと；
イヌがＭＨＣ対立遺伝子関連障害に感受性であるか否かを決定する方法であって、
（ａ）本発明に従う方法によってイヌにおける１つまたはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子の有無を同定する工程と；
（ｂ）それから、このイヌがＭＨＣ対立遺伝子関連障害に対して感受性であるか否かを決定する工程とを含む方法と；
ＭＨＣ対立遺伝子関連障害に対して感受性であるイヌのために特注生産された食物を調製する方法であって、
（ａ）このイヌが本発明の方法によってＭＨＣ対立遺伝子関連障害に感受性であるか否かを決定する工程と；
（ｂ）このイヌに適切である食物を調製する工程と、
を含む方法と；
ＭＨＣ対立遺伝子関連障害について治療的である化合物の使用であって、本発明による方法によってＭＨＣ対立遺伝子関連障害に対して感受性であると同定されているイヌにおけるＭＨＣ対立遺伝子関連障害の予防または処置のための医薬の製造における使用と；
ＭＨＣ対立遺伝子関連障害についてイヌを処置する方法であって、この障害を予防または処置する有効量の治療化合物をこのイヌに投与する工程を含み、このイヌが本発明に従う方法によってＭＨＣ対立遺伝子関連障害に感受性であると同定されている、方法と；
表４〜６のいずれか１つに記載のＭＨＣ対立遺伝子多形性に関する情報および場合によってＭＨＣ対立遺伝子関連障害とのそれらの関連を含む、データベースと；
イヌにおいて１つまたはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子を同定するための方法であって；
（ａ）表４〜６のいずれか１つにおける１つまたはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子について特定された多形性位置または各々の多形性位置に存在するヌクレオチドのデータをコンピュータシステムに入力する工程と；
（ｂ）このデータを本明細書に規定されるようなコンピュータデータベースに対して比較する工程と；
（ｃ）この比較に基づいて、このイヌにおける１つまたはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子の有無を同定する工程とを含む方法と；
コンピュータプログラムであって、このプログラムがコンピュータで行われる場合、本発明の方法の全ての工程を行うためのプログラムコード手段を含むコンピュータプログラムと；
コンピュータプログラム製品であって、このプログラム製品がコンピュータで行われる場合、本発明の方法を行うためのコンピュータ読み取り可能な媒体に記憶されるプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム製品と；
搬送波上にプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム製品であって、このプログラムコード手段が、コンピュータシステム上で実行される場合、コンピュータシステムを指図して、本発明による方法を行う、コンピュータプログラム製品と；
本発明による方法を行うように配置されたコンピュータシステムであって、
（ａ）前記イヌにおいて表４〜６のいずれか１つに特定される多形性位置または各々の多形性位置に存在するヌクレオチドのデータを受容するための手段と；
（ｂ）このデータと本明細書に規定されるようなデータベースとを比較するためのモジュールと；
（ｃ）この比較に基づいて１つまたはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子の有無を決定するための手段と
を備えるコンピュータシステムと；
ＭＨＣ対立遺伝子関連障害に感受性であるイヌについて特注生産された食物を調製する方法であって、
（ａ）このイヌがＭＨＣ対立遺伝子関連障害に感受性であるか否かを、本発明による方法によって決定する工程と；
（ｂ）このイヌに適切な特注生産されたイヌの食物処方を電気的に生成する工程と；
（ｃ）前記特注生産されたイヌの食物処方に従って食物製造装置の操作を制御するように電気的製造指示を生成する工程と；
（ｄ）この電気的製造指示に従ってこの特注生産されたイヌの食物を製造する工程と；
を含む方法と；
特注生産されたイヌの食品を作製するための、本明細書に規定されるようなコンピュータシステムの使用。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
発明の詳細な説明
いくつかの疾患および障害に対する特定の特徴および感受性は、特定のＭＨＣ対立遺伝子またはハプロタイプの存在に関連することが公知である。従って、本発明の方法は、「ＭＨＣ対立遺伝子関連障害（MHC allele-related disorder）」と本明細書において呼ばれる、１つまたはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子との公知の関連を有する疾患に対して感受性であるイヌを同定するためにさらに用いられ得る。１つまたはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子またはハプロタイプの存在に関連する疾患感受性の例は、糖尿病、甲状腺機能亢進症およびレーシュマニア症である。
【０００７】
任意の品種のイヌを本発明の方法によって試験することができる。下記の表は、イヌの品種の例を示し、ここでＳ＝小、Ｍ＝中、Ｌ＝大そしてＸＬ＝特大である。
【０００８】
【表１】
2009517071.tif 000002
【表２】
2009517071.tif 000003
【表３】
2009517071.tif 000004
【表４】
2009517071.tif 000005
【表５】
2009517071.tif 000006
【０００９】
多形性の検出
本発明に従って試験される動物は、イヌである。試験されるイヌは、任意の品種であってもよいし、または異種交配（mix）もしくは交雑(crossbred)されたイヌ、または非近交系(outbred)のイヌ（雑種(mongrel)）であってもよい。検出される多形性は、表４〜表６に示される多形性のうちの１つまたはそれ以上である。代表的には、表４〜６に記載される多形性のうちの少なくとも５、例えば、少なくとも１０、２０、５０、１００または少なくとも２００が検出される。本発明による多形性の検出は、イヌのポリヌクレオチドまたはタンパク質と、多形性について特異的な結合因子とを接触させる工程と、この因子がポリヌクレオチドまたはタンパク質に結合するか否かを決定する工程とを含み得、この因子の結合は、多形性の存在を示し、この因子が結合しないことは、多形性が存在しないことを示す。
【００１０】
この方法は一般には、イヌ由来のサンプル上でインビトロで行われる。このサンプルは代表的には、イヌの体液および／または細胞を含み、例えば、スワブ、例えば、口腔のスワブを用いて得ることができる。このサンプルは、血液、尿、唾液、皮膚、口腔の細胞または毛根のサンプルであってもよい。このサンプルは代表的には、この方法を行う前に処理され、例えば、ＤＮＡ抽出が行われてもよい。サンプル中のポリヌクレオチドまたはタンパク質は、例えば、適切な酵素を用いて、物理的に切断されてもまたは化学的に切断されてもよい。１実施形態では、サンプル中のポリヌクレオチドの一部は、例えば、多形性を検出する前にクローニングすることまたはＰＣＲベースの方法を用いることによって、コピーされるかまたは増幅される。
【００１１】
本発明では、任意の１つまたはそれ以上の方法は、イヌにおける１つまたはそれ以上の多形性の有無を決定する工程を含み得る。多形性は代表的に、イヌのポリヌクレオチドまたはタンパク質における多形性配列の存在を直接決定することによって検出される。このようなポリヌクレオチドは代表的にはゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡである。多形性は、任意の適切な方法（例えば、下記に言及されるような方法）によって検出することができる。
【００１２】
特異的な結合因子とは、多形性を有するタンパク質またはポリペプチドに対して優先的または高い親和性で結合するが、他のポリペプチドまたはタンパク質に対しては結合しないか、もしくは低い親和性でしか結合しない因子である。この特異的な結合因子は、プローブであってもプライマーであってもよい。このプローブは、タンパク質（例えば、抗体）またはオリゴヌクレオチドであってもよい。このプローブは、標識されてもよいし、または間接的に標識されていてもよい。ポリヌクレオチドまたはタンパク質に対するプローブの結合を用いて、プローブまたはポリヌクレオチドまたはタンパク質のいずれかを固定化してもよい。
【００１３】
一般にはこの方法では、多形性に対する因子の結合の決定は、イヌのポリヌクレオチドまたはタンパク質に対する因子の結合を決定することによって行うことができる。しかし、１実施形態では、この因子はまた、対応する野性型配列に、例えば、多形性位置に隣接するヌクレオチドまたはアミノ酸に結合することによって結合することができるが、野性型配列に対する結合の様式は多形性を含有するポリヌクレオチドまたはタンパク質の結合に対して検出可能なほど異なる。
【００１４】
この方法は、２つのオリゴヌクレオチドプローブが用いられるオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイに基づいてもよい。これらのプローブは、多形性を含有するポリヌクレオチド上の隣接領域に結合し、これによって結合後、２つのプローブが適切なリガーゼ酵素によって一緒に連結される。しかし、このプローブのうちの一つの中の単一のミスマッチの存在によって、結合およびライゲーションが破壊される場合がある。このように連結されたプローブのみが、多形性を含有するポリヌクレオチドと一緒に生じ、従って、連結された生成物の検出を用いて、この多形性の存在を検出することができる。
【００１５】
１実施形態では、このプローブは、ヘテロ二重鎖分析ベースのシステムで用いられる。このようなシステムでは、多形性を含有するポリヌクレオチド配列にプローブが結合する場合、これはこの多形性が存在する部位でヘテロ二重鎖を形成し、従って二本鎖構造を形成しない。このようなヘテロ二重鎖構造は、一本鎖または二本鎖に特異的な酵素の使用によって検出することができる。代表的にはプローブは、ＲＮＡプローブであり、このヘテロ二重差領域は、ＲＮＡａｓｅ  Ｈを用いて切断され、この多形性は、この切断生成物を検出することによって検出される。
【００１６】
この方法は、例えば、PCR Methods and Applications 3,268-71(1994)およびProc.Natl.Acad.Sci.85,4397-4401(1998)に記載される蛍光化学切断ミスマッチ分析に基づいてもよい。
【００１７】
１実施形態では、ＰＣＲ反応をプライムするＰＣＲプライマーであって、多形性を含有するポリヌクレオチドにそのプライマーが結合する場合にのみＰＣＲ反応をプライムするＰＣＲプライマー、例えば、配列または対立遺伝子に特異的なＰＣＲシステムが用いられ、多形性の存在は、このＰＣＲ産物を検出することによって決定され得る。好ましくは、この多形性に相補的であるプライマーの領域は、このプライマーの３’末端かまたはその近くである。この多形性の存在は、蛍光色素を用い、ＴａｑｍａｎＰＣＲ検出システムのような消光剤ベースのＰＣＲアッセイを用いて決定することができる。
【００１８】
この特異的な結合因子は、多形性配列によってコードされるアミノ酸配列に特異的に結合し得る。例えば、この因子は、抗体であっても抗体フラグメントであってもよい。この検出方法は、ＥＬＩＳＡシステムに基づいてもよい。この方法は、ＲＦＬＰベースのシステムであってもよい。これは、ポリヌクレオチド中の多形性の存在が、制限酵素によって認識される制限部位を作製または破壊する場合に用いることができる。
【００１９】
多形性の存在は、その多形性の存在が、ゲル電気泳動の間のポリヌクレオチドまたはタンパク質の移動を生じる変化に基づいて決定することができる。ポリヌクレオチドの場合、一本鎖高次構造多形性（single-stranded conformation polymorphism）（ＳＳＣＰ）または変性勾配ゲル電気泳動（denaturing gradient gel electrophoresis）（ＤＤＧＥ）分析を用いてもよい。多形性を検出する別の方法では、多形性領域を含むポリヌクレオチドを、多形性を含む領域にまたがって配列決定して、多形性の存在を決定する。
【００２０】
多形性の存在は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって検出され得る。詳細には、多形性は、二重ハイブリダイゼーションプローブシステムによって検出され得る。この方法は、互いに近く位置し、かつ目的の標的ポリヌクレオチドの内部セグメントに相補的である２つのオリゴヌクレオチドプローブの使用を含み、ここで２つのプローブの各々が蛍光で標識される。任意の適切な蛍光標識または色素が発蛍光団として用いられ得、その結果、１つのプローブ（ドナー）上の発蛍光団の発光波長が、第二のプローブ（アクセプター）上の発蛍光団の励起波長に重複する。代表的なドナー発蛍光団は、フルオレセイン（ＦＡＭ）であり、代表的なアクセプター発蛍光団としては、テキサス・レッド（Texas red）、ローダミン（rhodamine）、ＬＣ−６４０、ＬＣ−７０５およびシアニン５（Ｃｙ５）が挙げられる。
【００２１】
蛍光共鳴エネルギー移動が生じるように、２つの発蛍光団は、標的に対する両方のプローブにハイブリダイゼーションする際に近接することが必要である。ドナー発蛍光団が適切な波長の光で励起される場合、この発光スペクトルエネルギーを、アクセプタープローブ上の発蛍光団に移動して、その蛍光を生じる。従って、この波長の光の検出は、ドナー発蛍光団に適切な波長での励起の間、ハイブリダイゼーションおよび２つのプローブ上の発蛍光団の密接な会合を示す。各々のプローブを、一端を発蛍光団で標識して、その結果上流（５’）に位置するプローブはその３’末端で標識され、下流（３’）に位置するプローブは、その５’末端で標識することができる。２つのプローブの間のギャップは、標的配列に結合する場合、１〜２０ヌクレオチド、好ましくは１〜１７ヌクレオチド、より好ましくは１〜１０ヌクレオチド、例えば、１、２、４、６、８または１０ヌクレオチドのギャップであってもよい。
【００２２】
２つのプローブのうち第一のプローブは、多形性に隣接する遺伝子の保存配列に結合するように設計されてもよく、第二のプローブは、１つまたはそれ以上の多形性を含む領域に結合するように設計されてもよい。第二のプローブによって標的とされる遺伝子の配列内の多形性は、得られた塩基のミスマッチによって生じる融点の変化を測定することによって検出することができる。融点の変化の程度は、ヌクレオチド多形性に関与する数および塩基タイプに依存する。
【００２３】
ある集団中で互いと連鎖不平衡にある多形性は代表的には、同じ染色体上で一緒に見出される。代表的には、１つは、少なくとも３０％の回数、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％の回数で見出され、その他は、この集団における個体で特定の染色体で見出される。従って、機能的な感受性多形性ではないが、機能的な多形性と連鎖不平衡にある多形性は、機能的な多形性の存在を示すマーカーとして作用し得る。
【００２４】
本明細書において言及される多形性と連鎖不平衡にある多形性は代表的には、多形性の５００ｋｂ内に、好ましくは４００ｋｂ内に、２００ｋｂ内に、１００ｋｂ内に、５０ｋｂ内に、１０ｋｂ内に、５ｋｂ内に、１ｋｂ内に、５００ｂｐ内に、１００ｂｐ内に、５０ｂｐ内に、または１０ｂｐ内に位置する。
【００２５】
ポリヌクレオチド
このポリヌクレオチドは代表的には、少なくとも１０、１５、２０、３０、５０、１００、２００または５００塩基長、例えば、少なくともまたは最大１ｋｂ、１０ｋｂ、１００ｋｂ、１０００ｋｂまたはそれ以上の長さである。このポリヌクレオチドは代表的には、多形性の片側または両側（５’または３’）上の隣接ヌクレオチド、例えば、少なくとも２、５、１０、１５またはそれ以上の隣接ヌクレオチドを全部でまたは各側に含む。代表的には、このポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％、それよりさらに好ましくは少なくとも９９．９％同一である。このような数の置換基および／または挿入および／または欠失および／または同一性パーセンテージを、ポリヌクレオチドの全長でとってもよいし、または５０、３０、１５、１０もしくはそれ以下の隣接ヌクレオチドにわたって全部でまたは各側でとってもよい。
【００２６】
このポリヌクレオチドは、ＲＮＡであってもＤＮＡであってもよく、これにはゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む。このポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。このポリヌクレオチドは、合成ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチド、例えば、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、またはアクリジンもしくはポリリジン鎖の付加を、その分子の３’末端および／もしくは５’末端で含んでもよい。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲのために、プライマーとして、またはプローブとして用いることができる。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、露出標識（revealing label）を担持し得る。適切な標識としては、放射性同位体（例えば、３２Ｐまたは３５Ｓ）、蛍光標識、酵素標識または他のタンパク質標識、例えば、ビオチンが挙げられる。
【００２８】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含み、かつ本発明のポリペプチドを発現し得る発現ベクターを提供する。このようなベクターはまた、タンパク質発現を可能にするために、適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサーおよび他のエレメント、例えば、必要であり得、正確な方向に位置されるポリアデニル化シグナルなどを含んでもよい。従って、このベクター中のコード配列はこのようなエレメントに作動可能に連結され、その結果それらは、コード配列の発現を提供する（代表的には細胞中）。「作動可能に連結される（operably linked）」という用語は、記載される成分がそれらの意図される様式で機能することを可能にする関係である並置をいう。
【００２９】
ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルスまたはファージのベクターであってもよい。代表的には、ベクターは複製起点を有する。このベクターは、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合には、アンプリコン耐性遺伝子、または真菌ベクターについては耐性遺伝子を含んでもよい。ベクターはインビトロで、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡの生成のために用いられてもよく、または宿主細胞、例えば哺乳動物宿主細胞をトランスフェクトもしくは形質転換するために用いられてもよい。ベクターはまた、インビボにおいて、例えば、遺伝子治療の方法において用いられるように適合されてもよい。
【００３０】
プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、発現が意図される宿主細胞と適合するように選択され得る。例えば、酵母プロモーターとしては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＡＬ４およびＡＤＨプロモーター、Ｓ．ｐｏｍｂｅ  ｎｍｔ１およびａｄｈプロモーターが挙げられる。哺乳動物のプロモーターとしては、メタロチオネインプロモーターが挙げられ、これは、カドミウムのような重金属に応答して誘導され得る。ウイルスプロモーター、例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーターまたはアデノウイルスプロモーターもまた用いられてもよい。哺乳動物プロモーター、例えば、β−アクチンプロモーターが用いられ得る。組織特異的なプロモーターが特に好ましい。ウイルスプロモーター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス長末端反復配列（Moloney murine leukaemia virus long terminal repeat）（ＭＭＬＶ  ＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーター、アデノウイルス、ＨＳＶプロモーター（例えば、ＨＳＶ  ＩＥプロモーター）、またはＨＰＶプロモーター、特にＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）もまた用いることができる。
【００３１】
このベクターはさらに、真核生物ゲノム配列、好ましくは哺乳動物ゲノム配列、またはウイルスゲノム配列に対して相同な配列を含むポリヌクレオチドを生じるポリヌクレオチドに隣接する配列をさらに含み得る。これによって、相同組み換えによる、本発明のポリヌクレオチドの真核生物細胞またはウイルスのゲノムへの導入が可能になる。詳細には、ウイルス配列に隣接される発現カセットを含むプラスミドベクターを用いて、本発明のポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に送達するために適切なウイルスベクターを調製することができる。適切なウイルスベクターの他の例としては、単純ヘルペスウイルスベクターおよびレトロウイルスが挙げられ、これにはレンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびＨＰＶウイルスが挙げられる。これらのウイルスを用いる遺伝子移入技術は、当業者に公知である。例えば、レトロウイルスベクターを用いてポリヌクレオチドを安定に組み込んで宿主ゲノム中にポリヌクレオチドを生じさせてもよい。複製欠損アデノウイルスベクターは、対照的に、エピソームを保持し、従って、一過性の発現を可能にする。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチドは、ある多形性に選択的に結合し得るプローブまたはプライマーとして用いることができる。好ましくは、このプローブまたはプライマーは参照ポリヌクレオチド配列に選択的に結合し得る。このように本発明は、本発明による方法における使用のためのプローブまたはプライマーを提供し、このプローブまたはプライマーは、多形性の存在を選択的に検出することができる。好ましくは、このプローブは、単離された核酸または組み換えの核酸である。これは、参照ポリヌクレオチド配列に対応してもよいし、またはそれに対してアンチセンスであってもよい。このプローブは、アレイ、例えば、ポリヌクレオチドアレイ上に固定されてもよい。
【００３３】
このようなプライマー、プローブおよび他のフラグメントは好ましくは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、または少なくとも２０、例えば、少なくとも２５、少なくとも３０または少なくとも４０ヌクレオチド長である。それらは代表的には、４０、５０、６０、７０、１００または１５０ヌクレオチド長にまで及ぶ。プローブおよびフラグメントは、１５０ヌクレオチド長より長くても、例えば、最大２００、３００、４００、５００、６００、７００ヌクレオチド長までであっても、または本発明の全長ポリヌクレオチド配列の、最大２〜３ヌクレオチドまでであっても、例えば、５または１０ヌクレオチドという短さであってもよい。
【００３４】
相同体
ポリヌクレオチドまたはタンパク質の配列の相同体が本明細書に言及される。このような相同体は代表的には、例えば、少なくとも１５、２０、３０、１００またはそれ以上連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の領域にわたって、少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性を有する。この相同性は、ヌクレオチドまたはアミノ酸の同一性（時に、「ハードホモロジー（hard homology）」と呼ばれる）に基づいて算出することができる。
【００３５】
例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性（例えば、そのデフォールトセッティングで用いられる）を算出するために用いられ得るＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Devereux et al(1984)Nucleic Acids Research 12,p387-395）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて相同性またはラインアップ配列（line up sequence）を、例えば、Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300;Altschul,S,F et al(1990)J Mol Biol 215:403-10に記載されるように、算出することができる（代表的にはデフォルトセッティングの際に、等しい配列または対応する配列を同定する、など）。
【００３６】
ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列において同じ長さのワードと整列させた場合、ある程度の陽性値の閾値スコアＴにマッチするか、またはこれを満足する、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することによってハイスコアリング配列対（high scoring sequence pairs）（ＨＳＰ）を最初に特定する工程を含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al、前出）。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含むＨＳＰを見出すために検索を開始するためのシードとして機能する。このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大され得る限りは、両方の方向に、各々の配列に沿って伸長される。各々の方向におけるワードヒットについての伸長は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアが、その最大達成値からＸ量ずつ低下する場合；累積スコアが１つまたはそれ以上の負のスコアリング残留アラインメント（negative-scoring residue alignments）の累積に起因して０またはそれ以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォールトとして１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff (1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919を参照のこと）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両方の鎖の比較を用いる。
【００３７】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列の間の類似性の統計学的分析を行う；例えば、Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787を参照のこと。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定値は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これによって、２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のマッチが偶然に生じる確率の指標が得られる。例えば、配列は、第二の配列に対する第一の配列の比較における最小合計確率が、約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満である場合、別の配列と同様であるとみなされる。
【００３８】
この相同配列は代表的には、ヌクレオチドまたはアミノ酸の置換、欠失または挿入であってもよい少なくとも１、２、５、１０、２０またはそれ以上の変異によって異なる。これらの変異は、相同性を算出するのに関連して上述される任意の領域にまたがって測定され得る。タンパク質の場合には、この置換は好ましくは、保存的置換である。これらは以下の表に従って規定される。第二の縦列の同じブロック、好ましくは第三の縦列の同じ列のアミノ酸は、互いに置換されてもよい。
【表６】
2009517071.tif 000007
【００３９】
より短いポリペプチド配列はまた、本発明の範囲内である。例えば、本発明のポリペプチド配列のフラグメントは代表的には、少なくとも１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１５０または２００アミノ酸長である。本発明のポリペプチドは、化学的に改変されていてもよく、例えば、翻訳後改変されてもよい。このポリペプチドは、グリコシル化されても、または改変アミノ酸残基を含んでもよい。このような改変ポリペプチドは、本発明の「ポリペプチド」という用語の範囲内に含まれる。
【００４０】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または抗体は、単離された形態で、または実質的に精製された形態で存在してもよい。それらは、それらの意図される用途と干渉しないキャリアまたは希釈剤と混合されてもよく、やはり実質的に単離されているとみなされ得る。それらはまた、実質的に精製された形態であってもよく、この場合、それらは一般に、タンパク質、ポリヌクレオチド、細胞または調製物の乾燥質量の少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、９８％または９９％を含む。
【００４１】
ポリヌクレオチドおよびタンパク質に関連する上記の任意の特徴はまた、本明細書で言及される他のポリペプチドおよびタンパク質、例えば、本発明のスクリーニングおよび治療的な態様において用いられるポリペプチドおよびタンパク質の特徴であり得ることが理解される。詳細には、このような特徴は、上述のような任意の長さ、改変およびベクターの形態であってもよい。
【００４２】
検出抗体（detector antibodies）
本発明はまた、本発明のポリペプチドに特異的である検出抗体を提供する。検出抗体は、１つの多形性に特異的であるが、いずれの他の多形性にも結合しない。本発明の検出抗体は、例えば、免疫沈降技術を含む精製、単離またはスクリーニングの方法において有用である。
【００４３】
抗体は、本発明のポリペプチドの特異的なエピトープに対して惹起され得る。抗体、または他の化合物は、それが、特異的であるタンパク質に対して、優先的にまたは高い親和性で結合するが、他のポリペプチドに対して実質的に結合しないかまたは低い親和性でしか結合しない場合、そのポリペプチドに対して「特異的に結合する」。抗体の特異的な結合能力を決定するための競合的結合または免疫放射定量測定法についての種々のプロトコールは、当分野で周知である（例えば、Maddox et al, J.Exp.Med.158,1211-1226,1993を参照のこと）。このような免疫アッセイは代表的には、特異的なタンパク質とその抗体との間の複合体の形成、および複合体形成の測定を含む。
【００４４】
本発明の目的に関しては、「抗体」という用語は、反対に特定されない限り、本発明のポリペプチドに結合するフラグメントを含む。このようなフラグメントとしては、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびに単鎖抗体が挙げられる。さらに、抗体およびそのフラグメントは、キメラ抗体、ＣＤＲ−グラフト（grafted）抗体またはヒト化抗体であってもよい。
【００４５】
抗体は、生物学的サンプル（例えば、本明細書で上述される任意のこのようなサンプル）中で本発明のポリペプチドを検出するための方法であって、以下、
Ｉ  本発明の抗体を提供する工程と；
ＩＩ  生物学的なサンプルとこの抗体とを、抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートする工程と；
ＩＩＩ  この抗体を含む抗体−抗原複合体が形成されるか否かを決定する工程と
を含む方法において用いることができる。
【００４６】
本発明の抗体は、任意の適切な方法によって生成することができる。抗体を調製および特徴付けるための手段は、当分野で周知であり、例えば、Harlow and Lane(1988)「Antibodies:A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NYを参照のこと。例えば、抗体は、宿主動物においてポリペプチド全体またはそのフラグメント、例えばその抗原性エピトープ（本明細書において以降では「免疫原」）に対して抗体を惹起することによって生成することができる。このフラグメントは、本明細書に上記されるような任意のフラグメントであってもよい（代表的には、少なくとも１０または少なくとも１５アミノ酸長）。
【００４７】
ポリクローナル抗体を生成するための方法は、適切な宿主動物、例えば実験動物を、免疫原を用いて免疫する工程、およびこの動物の血清から免疫グロブリンを単離する工程を含む。従って、この動物は、免疫原、この動物から引き続いて取り出された血液および精製されたＩｇＧ画分を接種されてもよい。モノクローナル抗体を生成するための方法は、所望の抗体を生成する細胞を不死化する工程を含む。ハイブリドーマ細胞は、接種された実験動物由来の脾臓細胞と腫瘍細胞とを融合させることによって生成することができる（Kohler and Milstein(1975)Nature 256,495-497）。
【００４８】
所望の抗体を生成する不死化細胞は、従来の手順によって選択することができる。このハイブリドーマは、培養物中で増殖させてもよく、または同種宿主もしくは免疫抑制状態宿主の腹水の形成のために、腹腔内にもしくは血流中に注射されてもよい。ヒト抗体は、ヒトリンパ球のインビトロ免疫によって、続いて、エプスタイン・バーウイルスでのこのリンパ球の形質転換によって調製され得る。
【００４９】
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方の産生のために、実験動物は適切には、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ニワトリ、ヒツジまたはウマである。所望の場合、この免疫原は、この免疫原が、例えば、適切なキャリアへアミノ酸残基の１つの側鎖を介して結合される、結合体として投与されてもよい。このキャリア分子は代表的には、生理学的に許容可能なキャリアである。得られた抗体は、単離されて、所望の場合、精製されてもよい。
【００５０】
検出キット
本発明はまた、１つまたはそれ以上のイヌＭＨＣ多形性の有無を決定するための手段を含むキットを提供する。詳細には、このような手段は、特定の結合因子、プローブ、プライマー、プライマーの対もしくは組み合わせ、または抗体を含んでもよく、この抗体とは、多形性を検出し得るかまたは検出を補助し得る、本明細書に規定されるような抗体フラグメントを含む。このプライマーまたはプライマーの対もしくは組み合わせは、本明細書に考察されるような、検出されるべき多形性を含むポリヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅のみを生じる配列特異的なプライマーであってもよい。このキットはまた、この多形性が存在しないことを検出し得る、特異的な結合因子、プローブ、プライマー、プライマーの対もしくは組み合わせ、または抗体を含んでもよい。このキットはさらに、緩衝液または水溶液を含んでもよい。
【００５１】
このキットはさらに、上述の方法の任意の実施形態を行うことを可能にする、１つまたはそれ以上の他の試薬または装置を含んでもよい。このような試薬または装置は、以下の１つまたはそれ以上を含んでもよい。多形性に対する因子の結合を検出するための手段、検出可能な標識、例えば、蛍光標識、ポリヌクレオチド上で作用し得る酵素、代表的にはポリメラーゼ、制限酵素、リガーゼ、ＲＮＡｓｅ  Ｈまたはポリヌクレオチドに対して標識を結合し得る酵素、酵素試薬のための適切な緩衝液または水溶液、本明細書に考察されるような多形性に隣接する領域に結合するＰＣＲプライマー、ポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロール、ゲル電気泳動の装置、サンプルからＤＮＡを単離する手段、個体からサンプルを得る手段、例えば、スワブもしくはニードルを含む装置、または検出反応が行われ得るウェルを含む支持体。このキットは、アレイ、例えば、本発明の特異的な結合因子、好ましくはプローブを含むポリヌクレオチドアレイであっても、それを含んでもよい。このキットは代表的には、キットを用いるための１セットの指示書を含む。
【００５２】
ＭＨＣ関連障害の処置
本発明はまた、ＭＨＣ関連障害についてイヌを処置する方法を提供し、この方法は、ＭＨＣ関連障害に感受性であるイヌを本発明の方法によって同定する工程と、ＭＨＣ関連障害を処置する治療剤の有効量をこのイヌに投与する工程とを含む。ＭＨＣ対立遺伝子関連障害は、本明細書に言及される任意の疾患または障害、例えば、糖尿病、甲状腺機能亢進症およびリーシュマニア症であってもよい。
【００５３】
この治療剤は、種々の様式で、例えば、経口的に、頭蓋内に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、経鼻的に、皮内に、そして皮下に投与され得る。治療剤を含む医薬組成物は、通常は、用いられる投与の特定の方式に依存して適切な薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤とともに処方される。例えば、非経口処方物は通常、注射用液であって、これは薬学的に許容可能なそして生理学的に許容可能な液体、例えば生理学的食塩水、平衡化した塩溶液などをビヒクルとして用いる。経口処方物は他方では、固体、例えば、錠剤もしくはカプセル、または液体溶液もしくは懸濁液であってもよい。好ましい実施形態では、この治療剤は、イヌに対してその食餌中で、例えば、飲料水または食物中で投与される。
【００５４】
イヌに投与される治療剤の量は、処置される状態、処置下のイヌの性質および処置下の状態の重篤度を含む、種々の要因に依存する。代表的な一日用量は、特定のインヒビターの活性、処置されるイヌの年齢、体重および状態、疾患のタイプおよび重篤度ならびに投与の頻度および経路に従って、体重１ｋｇあたり約０．１〜５０ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜１０ｍｇである。好ましくは、１日投薬レベルは５ｍｇ〜２ｇである。
【００５５】
特注生産された食物
１つの態様では、本発明は、イヌＭＨＣ対立遺伝子の存在に基づいて特注生産された、イヌのための特注生産された食餌に関する。このような食物は、例えば、水分のあるペットフード、やや湿り気のある（semi-moist）ペットフード、乾燥したペットフードおよびペットのトリート（treats）の形態であってもよい。水分のあるペットフードは一般には、６５％の水分含量を有する。やや湿り気のあるペットフードは代表的には、２０〜６５％の間の水分含量を有し、保湿剤および微生物の増殖を防ぐための他の成分を含んでもよい。乾燥ペットフードはまた、キブル（kibble）とも呼ばれ、一般には、２０％未満の水分含量を有し、その処理は代表的には、熱のもとでの押し出し（extruding）、乾燥（drying）および／または焼付け（baking）を含む。乾燥ペットフードの成分としては一般には、シリアル、穀類、肉、家禽、脂肪、ビタミンおよびミネラルが挙げられる。この成分は代表的には混合されて、押し出し機（extruder）／クッカー（cooker）を通じて入れられる。次いで、その生成物は代表的には成型されて乾燥され、乾燥後に、香味料および脂肪が、その乾燥生成物上にコーティングまたは噴霧されてもよい。
【００５６】
従って、本発明によって、特定のＭＨＣ対立遺伝子または対立遺伝子の組み合わせ（ハプロタイプ）を有するイヌに適切な特注生産された食物の調製が可能になる。詳細には、この食物は、ＭＨＣ対立遺伝子関連障害に感受性であるイヌについて特注生産されてもよく、この特注生産されたイヌの食物処方物は、ＭＨＣ対立遺伝子関連障害を予防もしくは緩和する成分を含み、そして／またはＭＨＣ対立遺伝子関連障害に寄与するかもしくは悪化させる成分は含まない。このような成分は、ＭＨＣ対立遺伝子関連障害を予防または緩和することが当分野で公知である任意の成分であってもよい。特注生産されたイヌの食物の調製は、電気的な手段によって、例えば、コンピュータシステムを用いることによって行われてもよい。
【００５７】
本発明はまた、特注生産されたイヌの食物を提供する方法であって、この方法が、特定のＭＨＣ対立遺伝子を有するイヌに適切な食物をこのイヌ、このイヌの所有者またはこのイヌに給餌する責任者に対して提供する工程を含み、このＭＨＣ対立遺伝子が、本発明の方法によって同定されている方法に関する。本発明の１態様では、この特注生産された食物は、在庫に作製され、在庫から供給され、すなわち、この特注生産された食物は、注文に対して作製されるのではなく事前製造される。従って、本発明のこの態様によれば、この特注生産された食物は、１匹の特定のイヌについて特異的に設計されるのではなく、２匹以上のイヌに適切であるように設計される。あるいは、この特注生産された食物は、特定のＭＨＣ対立遺伝子を有するイヌの小グループ、例えば、特定の品種、サイズまたはライフステージのイヌにとって適切であり得る。別の実施形態では、この食物は、個々のイヌの栄養的な要件を満たすように特注生産されてもよい。
【００５８】
バイオインフォマティクス
ＭＨＣ対立遺伝子の配列は、電気的なフォーマットで、例えば、コンピュータデータベースに保管されてもよい。従って、本発明は、ＭＨＣ多形性配列に関連する情報を含むデータベースを提供する。このデータベースは、多形性についてのさらなる情報、例えば、この集団における、または各々の品種におけるこの多形性の頻度を含み得る。本発明の１態様では、このデータベースはさらに、特定のＭＨＣ対立遺伝子を保有するイヌに適切である食物成分、および適切でない食物成分に関する情報を含む。
【００５９】
本明細書に記載されるようなデータベースは、イヌに存在するＭＨＣ対立遺伝子を同定するために用いられ得る。このような決定は、電気的手段によって、例えば、コンピュータシステム（例えば、ＰＣ）を用いることによって行われ得る。代表的には、この決定は、イヌからの遺伝的データをコンピュータシステムに入力すること；この遺伝的データをＭＨＣ多形性に関する情報を含むデータベースと比較すること；およびこの比較に基づいて、イヌに存在するＭＨＣ対立遺伝子または各々のＭＨＣ対立遺伝子を同定することによって行われる。
【００６０】
本発明はまた、プログラムコード手段を含むコンピュータプログラムであって、このプログラムがコンピュータで行われる場合、本発明の方法の全ての工程を行うためのプログラムコード手段を含むコンピュータプログラムを提供する。また、プログラムコード手段を含むコンピュータプログラム製品であって、このプログラムがコンピュータで行われる場合、本発明の方法を行うためにコンピュータ読み取り可能な媒体に記憶される、プログラムコード手段を含むコンピュータプログラム製品が提供される。搬送波上にプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム製品であって、このプログラムコード手段が、コンピュータシステム上で実行する場合、本発明の方法を行うようにこのコンピュータシステムを指示する、コンピュータプログラム製品がさらに提供される。
【００６１】
図１に例示されるとおり、本発明はまた、本発明による方法を行うように配列された装置を提供する。この装置は代表的にはコンピュータシステム、例えばＰＣを含む。１実施形態では、このコンピュータシステムは、イヌから遺伝的データを受け取るための手段２０；このデータとＭＨＣ多形性に関する情報を含むデータベース１０とを比較するためのモジュール３０；および、この比較に基づいて、このイヌに存在するＭＨＣ対立遺伝子を同定するための手段４０を含む。
【００６２】
食物の製造
本発明の１実施形態では、特注生産されたイヌの食物の製造は、電気的に制御することができる。代表的には、イヌに存在するＭＨＣ対立遺伝子または各々のＭＨＣ対立遺伝子に関する情報は、特注生産されたイヌの食物処方を生成するために電気的に処理することができる。次いで、この特注生産されたイヌの食物処方を用いて、食物製造装置の操作を制御する電気的製造指示を作成することができる。これらの工程を行うために用いられる装置は代表的には、コンピュータシステム、例えばＰＣを含み、これは栄養情報を処理して特注生産されたイヌの食物処方を作成するための手段５０；食物製造装置の操作を制御するため電気的製造指示を生じるための手段６０；および、食品製造装置７０を含む。
【００６３】
本発明において用いられる食品製造装置は代表的には、以下の１つまたはそれ以上の構成要素を備える。乾燥ペットフード成分のための容器；液体の容器；ミキサー；フォーマー（former）および／または押し出し機（extruder）；切断デバイス（cut-off device）；調理手段（例えば、オーブン）；クーラー；パッケージング手段；および標識手段。乾燥成分容器は代表的には、底に開口を有する。この開口は、ロータリー・ロック（rotary lock）のような量調節構成要素によってカバーされ得る。この量調節構成要素は、ペットフードへの乾燥成分の添加を調節するために、電気的製造指示に従って、開口または閉鎖され得る。
【００６４】
ペットフードの製造で代表的に用いられる乾燥成分としては、コーン、コムギ、肉および／または家禽のひき肉（meal）が挙げられる。ペットフードの製造に代表的に用いられる液体成分としては、脂肪、獣脂および水が挙げられる。液体容器は、ペットフードへ測定された量の液体を添加するために、例えば、電気的製造装置によって制御され得るポンプを含んでもよい。
【００６５】
１実施形態では、この乾燥成分容器および液体容器を、ミキサーに接続して、特定の量の乾燥成分および液体をミキサーに送達する。このミキサーは、電気的製造指示によって制御することができる。例えば、混合の期間または速度を制御することができる。次いで、この混合された成分が代表的にはフォーマーまたは押し出し機に送達される。このフォーマー／押し出し機は、混合された成分を要求される形状に成型するために用いられ得る、当分野で公知の任意のフォーマーまたは押し出し機であってもよい。代表的には、この混合された成分は、圧力下で制限された開口部を通じて、連続した鎖を形成するように強制される。この鎖が押し出される場合、これは、ナイフのような切断デバイスによって小片（キブル）に切断されてもよい。キブルは代表的には、例えば、オーブン中で調理される。この調理時間および温度は、電気的な製造指示によって制御することができる。この調理時間は、食物の所望の含水量を生じるように変更され得る。次いで、この調理されたキブルを、クーラー、例えば、１つまたはそれ以上のファンを含むチャンバに移してもよい。
【００６６】
この食物製造装置は、パッケージング装置を含んでもよい。このパッケージング装置は代表的には、プラスチックまたは紙のバッグまたはボックスのような容器に食物をパッケージする。この装置はまた、代表的には食物がパッケージングされた後、食物を標識するための手段を含み得る。この標識は、以下のような情報を提供し得る。成分のリスト；栄養情報；製造日；賞味期限；重量；ならびにこの食物が適している種および／または品種。
【００６７】
本発明は、以下の実施例によって例示される。
【実施例１】
【００６８】
材料および方法
ＤＬＡ−ＤＲＢ１、ＤＱＡ１およびＤＱＢ１についてのＭＨＣ遺伝子型決定
イヌは、配列ベースのタイピング（sequence based typing）（ＳＢＴ）（Kennedy et al., 2002;Kennedy et al., 1998）またはリファレンス・ストランド・メディエーティッド・コンフォメーション・アナリシス（Reference Strand-mediated Conformation Analysis）（ＲＳＣＡ）（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）のいずれかを用いて３つのＤＬＡクラスＩＩ遺伝子座について特徴付けた。
【００６９】
全てのＰＣＲ反応は、２５ｎｇのＤＮＡを用いて、２５μｌの反応物中であって、Ｑｉａｇｅｎが提供する１×ＰＣＲ緩衝液（余分なマグネシウムを含まない）、Ｑ溶液（Ｑｉａｇｅｎ）、最終濃度０．１μＭの各々のプライマー、２００μＭの各々のｄＮＴＰを含有する反応物中で、２単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ  ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ）とともに用いて行う。何らかの混入を同定するために増幅の各々の実施（run）において、ＤＮＡテンプレートを含まないネガティブコントロールを含まなければならない。
【００７０】
用いられるプライマーは以下であった：ＤＲＢＦフォワード：ｇａｔ  ｃｃｃ  ｃｃｃ  ｇｔｃ  ｃｃｃ  ａｃａ  ｇ、ＤＲＢＲ３リバース:ｃｇｃ  ｃｃｇ  ｃｔｇ  ｃｇｃ  ｔｃａ、ＤＱＡｉｎ１フォワード：ｔａａ  ｇｇｔ  ｔｃｔ  ｔｔｔ  ｃｔｃ  ｃｃｔ  ｃｔ、ＤＱＡＩｎ２リバース：ｇｇａ  ｃａｇ  ａｔｔ  ｃａｇ  ｔｇａ  ａｇａ  ｇａ、ＤＱＢ１Ｂフォワード：ｃｔｃ  ａｃｔ  ｇｇｃ  ｃｃｇ  ｇｃｔ  ｇｔｃ  ｔｃおよびＤＱＢＲ２リバース：ｃａｃ  ｃｔｃ  ｇｃｃ  ｇｃｔ  ｇｃａ  ａｃｇ  ｔｇ。全てのプライマーはイントロンであり、遺伝子座特異的であり、生成物のサイズはＤＬＡ−ＤＲＢ１について３０３ｂｐ、ＤＱＡ１について３４５ｂｐ、ＤＱＢ１について３００ｂｐである。
【００７１】
標準的なタッチダウンＰＣＲプロトコールを全ての増幅のために用いた。この増幅は、最初の１５分９５℃で、３０秒間９５℃の１４のタッチダウンサイクル、続いて１分のアニーリングで、これは６２℃（ＤＲＢ１）、５４℃（ＤＱＡ１）、７３℃（ＤＱＢ１）で開始し、各サイクル０．５℃ずつ低下して、７２℃１分間から構成された。次いで、２０サイクルの９５℃で３０秒間、５５℃（ＤＲＢ１）、４７℃（ＤＱＡ１）、６６℃（ＤＱＢ１）で１分間、７２℃１分に加えて７２℃で１０分間の最終伸長。
【００７２】
生成物の存在についてチェックするために、５μｌを２％のアガロースゲル上で泳動した。ＲＳＣＡについては精製は要しなかった。しかし、これはＳＢＴを要した。２単位のエビのアルカリホスファターゼ（ＵＳＢ）および１０単位のＥｘｏｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を５μｌのＰＣＲ産物に添加した。この混合物を３７℃で１時間、次いで８０℃で１５分間インキュベートした。
【００７３】
ＲＳＣＡを行うために、ＦＬＲを、飼いイヌおよびハイイロオオカミ由来のある範囲のＤＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子座を用いて生成した。ＦＬＲは、クローニングされた対立遺伝子をテンプレートとして、５’−ＦＡＭ２２標識フォワードプライマーを用いてＰＣＲによって生成した。反応物中の標識された参照鎖の割合を増大するために、プライマーの割合を０．５μＭのＦＡＭ２２標識フォワードプライマーおよび０．１μＭのリバース未標識プライマーに変更した。ＰＣＲ反応の全ての他の態様は、同じままであった。この一本鎖ベースのＦＬＲを用いて、ＦＬＲ対立遺伝子ヘテロ二重鎖ピークの高さを引き続くＲＳＣＡにおけるホモ二重鎖に対して増大した（データ示さず）。全ての得られたＦＬＲを水の中で１：３０に希釈して、その後、ハイブリダイゼーション反応において使用した。
【００７４】
試験サンプルとＦＬＲとの間の二重鎖を形成するために、２μｌの希釈されたＦＬＲおよび２μｌの試験サンプルＰＣＲ産物を９６ウェルプレート中で混合して、サーマルサイクラー中で９５℃で１０分間インキュベートし、１秒あたり１℃で５５℃まで下降させ、５５℃で１５分間、そして４℃で１５分間とした。このプレートは必要になるまで４℃で保管した。引き続き、８μｌの蒸留水を各々のハイブリダイゼーション反応物に添加し、次いで２μｌを４．８μｌの水および０．２μｌのＧｅｎｅｓｃａｎ  Ｒｏｘ−５００サイズ標準（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と、３８４ウェルのプレート中で混合した。これらのサンプルを、５０ｃｍのキャピラリーアレイ、４％のＧｅｎｅｓｃａｎ非変性ポリマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＡＢＩ  ３１００  ＤＮＡアナライザーで泳動して、データはｍａｔｒｉｘ  ＤｙｅセットＤを用いて収集した。この条件は以下であった。注入電圧１５ｋＶ、注入時間１５秒、泳動電圧１５ｋＶ、泳動温度３０℃。各々の泳動は３５分かかった。このデータは、ソフトウェアプログラム「Ｇｅｎｅｓｃａｎ」および「Ｇｅｎｏｔｙｐｅｒ」（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。Ｇｅｎｅｓｃａｎを用いて、ＲＯＸ−５００標準に基づいて、各々のピークに対してサイズを割り当てた。Ｇｅｎｏｔｙｐｅｒを用いて、コントロールサンプルによって形成された対立遺伝子ピークを、用いられる各々のＦＬＲについて「ビン（ｂｉｎｓ）」に割り当てた。このビン（ｂｉｎｓ）を、各々のサンプルについて対立遺伝子を割り当てる社内のプログラム（Ｍａｒｔｉｎ  Ａ、非公開）にエクスポートした。
【００７５】
各々の対立遺伝子についての対立遺伝子の名称および配列を以下に示す。
【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【００７６】
ＳＮＰの特定
各々のＭＨＣ対立遺伝子を独自に同定する一塩基遺伝子多型（single nucleotide polymorphisms）（ＳＮＰ）を同定するために、上記の全ての対立遺伝子の配列を互いと比較した。この比較の結果は、表１〜３に示す。各々の対立遺伝子の名称は、左側の列に示す。上の右側にある数は、各々の多形性が存在する配列中の位置を示す。
【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【００７７】
対立遺伝子の間の比較に基づいて、特定の対立遺伝子を同定するために決定される必要があるＳＮＰ位置の最少数を特定することが可能である。これらは、表４〜６に示される。
【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明の装置を示す。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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