(57)【要約】  分析用マルチスペクトル光学検出システム及び方法。光源（１）は、光学的に結合した１つ又は複数の線（例えば、離散波長）の高いスペクトル純度の励起光を、デリバリー光ファイバーケーブル（３）により試料に提供する。試料ホルダー（４）の近位に置かれたプローブインターフェース（８）中でデリバリー光ファイバーケーブルと束ねられたコレクション光ファイバーケーブル（５）を用いて、放射光を収集し、発光検出器、例えば回折勾配分光光度計発光検出器（７）に提供する。プローブインターフェースは、１つ以上の試料の上でスキャンされてもよく、或いは１つ以上の試料は、固定されたインターフェースプローブの近位でスキャンされてもよい。複数の励起波長は、可視スペクトルの複数の蛍光色素の同時励起及び検出を可能にする。これは、試料処理能力を増大し、異なる時間におけるシグナル取得に関連するシグナル変動を減少させる。この光学システムは、他のシステムを超えた高い感度を含むいくつかの利点、蛍光色素との改善された適合性、優れたシグナル識別、増大したシステム信頼性、並びに減少した製造及びサービスコストを提供する。
2009515153.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）試料容器；
（ｂ）複数の異なる離散波長の光を含む励起光を、試料容器に提供するように設定された光源；及び
（ｃ）試料容器から放射された光を受け、成分波長へと空間的に分離するように設定された発光検出器
を含んで成る、試料中の誘導された発光の検出のための装置。
【請求項２】
光源が少なくとも３つのレーザーダイオードを含んで成る、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
光源が、試料容器に励起光を送るのに効果的な光ファイバーケーブルを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
検出器が、試料容器から放射された光を受けるのに効果的な光ファイバーケーブルを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
光源が、シングルビームマルチラインレーザーを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
光源が、約４７０ｎｍの波長を有する光を発生する第一のレーザーダイオード、約５３０ｎｍの波長を有する光を発生する第二のレーザーダイオード、及び約６３０ｎｍの波長を有する光を発生する第三のレーザーダイオードを含んで成る、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
光源が、約６８５ｎｍの波長を有する光を発生する第四のレーザーダイオード更に含んで成る、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
光源が、約５９０ｎｍの波長を有する光を発生する第五のレーザーダイオードを更に含んで成る、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
光源が試料容器に励起光を送るのに効果的な第一の光ファイバーケーブルを含み、検出器が試料容器から放射された光を受けるのに効果的な第二の光ファイバーケーブルを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
試料容器が、１つの試料反応装置、貫流容器又は貫流反応装置を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
更に複数の試料容器を含んで成る、請求項９に記載の装置。
【請求項１２】
試料容器が、自動円形トレイの上に置かれている、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
第一及び第二の光ファイバーケーブルが、Ｘロボットアーム、Ｘ−Ｙロボットアーム又はＸ−Ｙ−Ｚロボットアームの１つと連結している、請求項１１に記載の装置。
【請求項１４】
発光検出器が分光光度計を含んで成る、請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
発光検出器が、受けた光から散乱励起レーザー光を減少させる又は除去するための１つ以上のシングルラインフィルター及び／又は１つ以上のマルチノッチラインフィルターを含んで成る、請求項１に記載の装置。
【請求項１６】
試料容器の温度を制御する手段を更に含んで成る、請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
試料容器が、核酸試料、タンパク質試料又は炭水化物試料の１つを含んで成る、請求項１に記載の装置。
【請求項１８】
第一及び第二の光ファイバーケーブルの端が、単一の試料インターフェースを形成するように一緒に束ねられた、請求項９に記載の装置。
【請求項１９】
試料インターフェースが、試料容器の上に置かれる、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
試料インターフェースが、試料容器の側面の近位に置かれる、請求項１８に記載の装置。
【請求項２１】
試料容器が試料流路を含み、試料インターフェースが実質的に流路に平行に置かれる、請求項１８に記載の装置。
【請求項２２】
試料容器が、試料に結合していない蛍光プローブ又はリン光プローブを含んで成る、請求項１に記載の装置。
【請求項２３】
試料容器が、試料に結合した蛍光プローブ又はリン光プローブを含んで成る、請求項１に記載の装置。
【請求項２４】
試料容器が、蛍光物質又はリン光物質を含んで成る、請求項１に記載の装置。
【請求項２５】
試料容器が、複数の蛍光プローブ及び／又はリン光プローブを含んで成る、請求項１に記載の装置。
【請求項２６】
複数のプローブのそれぞれが、異なる放射波長を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
試料容器が、複数の蛍光物質及び／又はリン光物質を含んで成る、請求項１に記載の装置。 
【請求項２８】
（ａ）試料容器；
（ｂ）受けた光を成分波長へと空間的に分離するように設定された発光検出器；
（ｃ）複数の異なる離散波長を有する励起光を発生するように設定された励起源；
（ｄ）第一の入力端と第一の出力端を有する第一の光ファイバーケーブル、ここで、第一の入力端は励起源からの励起光を受けるように置かれている；
（ｅ）第二の入力端と第二の出力端を有する第二の光ファイバーケーブル、ここで、第二の出力端は試料容器から放射された光を発光検出器に提供するように置かれている；
（ｆ）第一の出力端及び第二の入力端を試料容器の近位に一緒に保持するように設定されているケーブルインターフェース、ここで、第一の出力端が試料容器に励起光を提供し、第二の入力端は試料容器から放射された光を受ける；及び
（ｇ）試料容器から放射された光から散乱励起光を除去するための光フィルター
を含んで成る、試料中の誘導された発光の検出のためのシステム。
【請求項２９】
複数の離散波長を有する励起光を発生すること；
第一の単一光路により励起光を試料容器に提供すること；
受けた光を成分波長に空間的に分離するように設定された発光検出器を用いて、試料容器から放射された光を受け、そして分析すること
を含んで成る、試料中の誘導された発光を検出する方法。
【請求項３０】
発光検出器が、波長を識別することができない感光検出器を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３１】
発光検出器が、プリズム又は回折格子の１つを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３２】
発光検出器が、ＣＣＤ装置、リニアダイオードアレイ、フォトダイオードアレイ又は光電子増倍管アレイを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３３】
光源が、１つ以上のＬＥＤ素子、及び／又はレーザーダイオード素子を含み、各素子は異なる離散波長の光を発生する、請求項１に記載の装置。
【請求項３４】
試料容器から放射される光は、蛍光発光、ルミネセンス発光、化学発光及びリン光発光から成る群から選択される誘導された発光を含む、請求項１に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、シグナル検出及び分析、より具体的には、マルチスペクトル蛍光シグナル検出及び分析に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日では、固体又は液体試料中の蛍光シグナルを励起及び検出する多くのシステムが存在する。このようなシステムの例は、ＵＳ６．０１５．６７４、ＵＳ５．９２８．９０７、ＵＳ６．７１３．２９７、ＵＳ２００２／０１０９８４４Ａ１、ＥＰ１０８０３６４Ｂｌ及びＥＰ１０８０３６４Ａ１に見出すことができる。
【０００３】
これらのシステムはそれぞれ、欠点を有する。ＵＳ６．０１５．６７４Ａ及びＵＳ５．９２８．９０７Ａにおける多くの光ファイバーケーブルの使用、並びにＵＳ６．７１３．２９７Ｂ２、ＵＳ２００２／０１０９８４４Ａ１、ＥＰ１０８０３６４Ｂ１及びＥＰ１０８０３６４Ａ１における各サンプルのための独立した光学素子は、光学システム部品の数を増大させる。多くの市販のシステムは、光の帯域幅を制御するフィルターも使用し、これは光学部品の数を更に増大させる。これは、高い製造及びサービスコストを伴った検出精度の低下をもたらす。
【０００４】
フィルターベースの光学システムの別の限界は、例えば医学的診断アッセイにおいて一般的に用いられる全ての蛍光色素の検出の不可能性である。色素の励起スペクトルが重なり、色素の発光スペクトルが重なるので、各色素は、検出のための１つ以上の具体的な帯域幅フィルターを必要とする。フィルターの具体的な組み合わせは、フィルターベースのシステムを用いる場合に、色素混合物中のある色素を他の色素から識別するために必要とされる。
【０００５】
現在、フィルターベースの光学システムは、色素混合物中の７つの色素（又は、発光スペクトル）しか分解できない。５つ以上の色素を含む混合物の発光スペクトルの重複は、数学アルゴリズム及び光学制御を用いて補正することが困難である。これは、医学的診断のために用いられるアッセイにおいて色素を定量的に検出するフィルターベースの光学システムの能力を制限する。
【０００６】
フィルターベースの光学システムの他の重要性は、光学システムはアッセイの問題を補正するために又は新規の色素を対応するために、容易に調整できないということである。例えば、医学的診断試験が患者の試料について誤った結果を生み出した場合、光学システムから更なる情報を得て、この問題を補うことができない。光シグナル帯域幅の仕様は固定されている。
【０００７】
固定された帯域幅も、このようなシステムをアップグレードするのに必要とされるコストと時間を増大させる。新規の色素が利用可能となった場合に、フィルターが変えられる必要があるだろう。光学システムが医学的診断機器の一部として用いられる場合、これは、光学システムの全体を再実証することを必要とする。更に、前の色素がもはやその機器と連動しない場合には、いくつかのフィルターはアップグレードすることができない。
【０００８】
現在利用可能な市販の光学デザインの多くは、試料チューブホルダーの下又は中に光インターフェースを置く。例を図６に示す。前試料処理の間、塩及び他の化学物質などの化合物は、チューブの外側に沈殿し得る。この物質は、光インターフェース中で蓄積し、部分的又は完全な光路の閉鎖を引き起こし得る。これは、不正確な結果を生み出し得る。
【０００９】
蛍光シグナルの正確性及び精密度も、ランダムウエルの部分的な妨害の影響を受けやすい。光路伝達効率は変わり得るので、それによりウエル間の試料結果の再現性を低下させる。シグナル変動も、シグナル処理アルゴリズムにおいてより多くのひずみを生み出し、更に再現性を低下させる。温度制御効率及び均一性も、これらの他のデザインの温度制御ブロック中に存在する穴に起因する弱点を有する。
【００１０】
上記の又は他の問題を克服する改善された光学検出システム及び蛍光シグナルを測定する方法に対する必要性が存在することは明らかである。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
本発明は、蛍光シグナルを測定するためのシステム及び方法を提供する。本発明のシステム及び方法は、液体試料又は固体表面、たとえば核酸又はタンパク質検出アレイの高度に正確な蛍光ベースの測定法を提供する。例えば、本発明のシステム及び方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システム、特に医学的診断に用いられるリアルタイム、定量的ＰＣＲシステムにおいて特に有用である。
【００１２】
本発明によると、分析用マルチスペクトル光学検出システムは、直接的に又は光ファイバーケーブルにより、例えば励起光デリバリー光ファイバーケーブルと束になったコレクション光ファイバーケーブルを用いて試料と光学的に結合した１つ又は複数の離散波長の高いスペクトル純度の励起光を提供する光源を含む。放射光は集められ、発光検出器、例えば回折勾配分光光度計発光検出器に提供され、これは、放射光を成分波長へと空間的に分離する。従って、単一光路は、全ての試料及び蛍光色素からの全てのスペクトルシグナルに対して用いることができる。有利には、本発明のハードウェア・コンポーネント及びデザインは、ハードウェア・コンポーネントの数を最小にし、組み立ての複雑性を減少させる。この光学システムは、より高い感受性、蛍光色素との向上した適合性、より優れたシグナル識別、増大したシステムの信頼性及び減少した製造及びサービスコストを含む他の同様のシステムを超えたいくつかの利点も提供する。
【００１３】
本明細書中に記載された光学システムは、固体表面をスキャンし、指定領域からの固有色発光の定量的な量を測定することができる。最も一般的な例は、スライドグラスの表面上又はマイクロタイタープレートのウエル中で化学反応が実施される空間分解マイクロアレイであるだろう。この光学システムは、より高い正確性でより多くの色素を検出することができるという点で、従来の光学システムに優る同様の利点を提供する。
【００１４】
ある側面において、本発明は、可視スペクトル中の複数の蛍光色素の同時励起及び検出を利用する。これは、試料処理能力を増大し、異なる時間におけるシグナル取得に関連するシグナル変動を減少させる。それは、直接励起及び／又はエネルギー移動色素のような色素が検出されることを可能にし、この光学システムを将来のアッセイとより互換性のあるものにする。
【００１５】
本発明の１つの側面によると、誘導された発光の検出のための装置が提供される。この装置は典型的には、試料容器、及び試料容器に励起光を提供するように設定された光源を含み、ここで、励起光は、複数の異なる離散波長の光を含む。この装置は典型的には、試料容器から放射された光を受け、成分波長へと空間的に分離するように設定された発光検出器も含む。ある側面において、光源は、試料容器に励起光を送るように置かれた第一の光ファイバーケーブルを含む。ある側面において、この装置は、試料容器から放射された光を受け、それを発光検出器へと送るように置かれた第二の光ファイバーケーブルを含む。１つの側面において、第二の光ファイバーケーブル又は発光検出器は、散乱励起光を除去する１つ以上のフィルターを含む。ある側面において、光源は、１つの又は複数のレーザーダイオードを含み、このレーザーダイオードは、１つ又は複数の離散波長を発生する。
【００１６】
本発明の別の側面によると、試料中の誘導された発光の検出のためのシステムが提供される。このシステムは、典型的には、試料容器、発光検出器、及び複数の異なる離散波長を有する励起光を発生するように設定された励起源を含む。発光検出器は、受けた光を成分波長に空間的に分離するように設定される。このシステムは典型的には、第一の入力端及び第一の出力端を有する第一の光ファイバーケーブル（ここで、第一の入力端は励起源からの励起光を受けるように設置される）、第二の入力端及び第二の出力端を有する第二の光ファイバーケーブル（第二の出力端は、試料容器から受けた放射光を発光検出器に提供するように設置される）、及び第一の出力端及び第二の入力端を一緒に試料容器の近位に保持するように設定されたケーブル表面を含む。操作中、第一の出力端は、試料容器に励起光を提供し、第二の入力端は、試料容器から放射された光を受ける。第二の光ファイバーケーブル又は発光検出器は、散乱励起光を除去する１つ以上のフィルターを含むことができる。
【００１７】
本発明の別の側面によると、試料中の誘導された発光の検出のためのシステムが提供される。このシステムは典型的には、試料容器、発光検出器、及び複数の異なる離散波長を有する励起光を発生するように設定された励起源を含む。試料容器は、励起源から直接的に励起光を受けるように設置され、発光検出器は、励起された試料から直接的に放射光を受けるように設置される。操作中、レーザー又は多重レーザーは、励起光を試料容器に提供し、検出器は、試料容器から放射光を直接的に受ける。発光検出器は、散乱放射光を除去する１つ以上のフィルターを含むことができる。このような直接的な光検出及び分析システムは、有利に、光ファイバーケーブルを必要としない。しかし、ある側面において、励起光を試料容器に送るように設定された光ファイバーケーブルを用いることができ、及び／又は、試料容器から放射された光（例えば、散乱放射光及び放射蛍光）を受けるように設定された光ファイバーケーブルを用いることができる。
【００１８】
本発明の別の側面によると、試料中の誘導された発光の検出のためのシステムが提供される。このシステムは、典型的には、試料容器、放射検出器、及び複数の異なる離散波長を有する励起光を発生するように設定された励起源を含む。試料容器は、励起源から直接的に励起光を受けるように設置され、発光検出器は、励起された試料から直接的に放射光を受けるように設置される。操作中、レーザー及び多重レーザーは、励起光を試料容器に提供し、検出器は、放射光を試料容器から直接的に受ける。発光検出器は、散乱励起光を除去する１つ以上のフィルターを含むことができる。散乱光フィルターは、マルチライン又はシングルラインであることができる。散乱光を除去するフィルターは、例えばサーボモーターのような制御機械装置を用いて、光システム通路中に置くことができる。このデザインの１つの利点は、検出器へ送られた放射スペクトルを制御し、より多くの試料の蛍光情報を集めることを可能にすることができるという点である。このような光学検出及び分析システムは、放射光路のための光ファイバーを用いても用いなくてもよく、励起放射光路のための光ファイバーを用いても用いなくてもよい。
【００１９】
本発明の更に別の側面によると、方法は、試料中の誘導された発光を検出するために提供される。この方法は典型的には、複数の離散波長を有する励起光を発生すること、第一の単一光路を超えて励起光を試料容器に提供すること、受けた光を成分波長に空間的に分離するように設定された発光検出器を備えた試料容器から放射した放射光を受け取り分析することを含む。ある側面において、第一及び第二の単一光路の端は、試料容器の近位の単一表面において、一緒に連結される。放射経路は、散乱励起光を除去する１つ以上のフィルターを含むことができる。
【００２０】
図面及び特許請求の範囲を含む明細書の残りの部分を参照することにより、本発明の他の特徴及び利点を認識するだろう。本発明の更なる特徴及び利点、並びに本発明の様々な実施態様の構造及び実施は、添付の図面に関して以下に詳細に説明される。図面において、同じ参照番号は、同一の又は機能的に類似の要素を指す。
【００２１】
定義
本明細書で用いる場合、「試料容器」は、容器、ホルダー、チャンバー、容器又は所望の方法で調べられる液体又は固体試料を単離するように設定された他の要素を指す。例としては、カバーされた又はカバーされていない試料ウエル、プラットフォームの表面上に１つ以上のウエル及び／又は１つ以上のアドレス可能な場所を有するプラットフォーム、バイアル、チューブ、キャピラリーチューブ、及び流路（例えば、流体チャネル又はマイクロチャネル）が挙げられる。試料容器は、分析される任意のタイプの試料、例えば生物学的試料又は化学試料を含み又は単離することができる。非制限的な例としては、核酸試料、タンパク質試料、又は炭水化物試料が挙げられる。
【００２２】
本明細書中で用いられる「光源」又は「励起源」は、試料容器に提供又は送られる励起光源を表す。光源は、１つ又は複数の発光素子を含むことができ、ここで、各素子は、１つ又は複数の離散波長又は様々な波長において光を放射することができる。放射光は、コヒーレント又は非コヒーレントであることができる。コヒーレント発光素子の１つの例は、レーザーダイオードである。他の例としては、励起ダイオードレーザー、気体又は固体レーザー、エキシマレーザー、チューナブル・レーザー及び当業者に明らかな他のものが挙げられる。発光ダイオード（ＬＥＤ）は、発光素子の別の例である。光源又は励起源としては、単一タイプの発光素子、例えば１つ以上のＬＥＤ又は１つ以上のレーザーダイオードが挙げられる。光源又は励起源としては、複数のタイプの発光素子、例えば１つ以上のＬＥＤ及び１つ以上のレーザーダイオードが挙げられる。
【００２３】
「複数の異なる離散波長の光」を含む励起光は、励起光中の２つ以上の異なる離散波長の光を表す。「離散波長の光」は、光源により放射された光のバンド幅又は線幅を表す。典型的には、レーザー又は他の光源は、ガウス型発光プロファイルを有する特定の周波数（波長）で発光するだろう。ガウスプロファイルの中心周波数（波長）は、典型的には、出力の「周波数」を規定し、バンド幅はガウス発光プロファイルにより規定される。レーザーについては、バンド幅を規定する一般的な特徴は、ガウス発光プロファイルの半値全幅（ＦＷＨＭ）であることができる。レーザー及び他の光源については、約±２ｎｍのオーダーのより小さなバンド幅が望ましいが、約±５ｎｍ又は約±１０ｎｍ又は２０ｎｍのバンド幅を有するレーザー又は他の光源は有用であり得る。
【００２４】
本明細書中で用いる場合、「単一光路」は、同一の経路上を進む１つ又は複数の波長要素を有する光を表す。光ファイバーケーブルが用いられる場合、光路は、光ファイバーケーブルにより画成される。他の光学素子が用いられる場合、又は光学素子が用いられない場合、光路は、所定の方向、例えば光源から試料、又は試料から検出器、又は光源から検出器に沿った光の伝播により画成される。
【００２５】
本明細書中で用いる場合、「試料容器から放射する光」は、散乱励起光、及びもしあれば試料容器により制約された試料から放射する光を表す。試料から放射する光は、試料容器により制約又は単離された試料の構成成分に応じて、誘導された発光、例えば蛍光、リン光、ルミネセンス、化学発光及び例えば４００ナノメートルから１．２マイクロメートルの範囲の他の放射が挙げられる。例えば、蛍光発光の場合、試料は、励起光を吸収、或いは励起光により励起若しくは活性化され、励起波長とは異なる波長で発光する発光物質又はプローブを含むか又はそれに連結していることができる。特定の物質又はプローブが発光する波長は、その物質又はプローブの構成成分による。
【００２６】
本明細書中で用いられる場合、「誘導された発光」は、対象の物質にエネルギーを移す外部刺激により誘導される電磁放射線の放射を表す。外部刺激源としては、化学的、電気的、物理的、磁気的、電磁気的及び酵素的ソースが挙げられる。放射メカニズムとしては、蛍光、リン光、ルミネセンス及び化学発光が挙げられる。
【００２７】
本明細書中で用いられる場合、「光を成分波長へと空間的に分離する」（及び、類似の用語）は、光をその成分波長に分散させることを表す。光の分散は、屈折又は回折によることができる。例えば、２つの異なる光の特定の成分波長を含む光ビームの場合、屈折の原理（例えば、スネルの法則）に基づいた素子を用いると、２つの成分波長は、異なる量で屈折されるだろう。屈折素子から離れた特定の距離では、１つの成分波長は、他の成分波長から空間的に分離されるだろう。空間的な方法で光を分散するのに有用な素子の例としては、プリズム（屈折）及び回折格子が挙げられる。
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明は、１つ又は複数の固体又は液体試料からマルチスペクトルシグナルを測定するための、特にマルチスペクトル蛍光シグナルを測定するためのシステム及び方法を提供する。
【００２９】
図１は、本発明の実施態様の分析用マルチスペクトル光学検出システム１０を示す。図１に示すように、ソース１からのレーザー光は、光ファイバーケーブル３と連結し、例えば蛍光励起のために試料容器４に送られる。その後、試料からの放射光は、同一の光ファイバーケーブルインターフェース８により回収される。その後、放射光は、散乱光を除去するために１つのフィルター又は一連のフィルターにかけ、放射光がその成分スペクトルへと空間的に分離される分光光度計７又は他の光検出システムへと移される。検出は、リニアダイオードアレイ、電荷結合素子（ＣＣＤ）又は感光装置を用いて空間的に達成され、例えば機能に基づいたアルゴリズムを用いて分析される。
【００３０】
集積レーザーモジュールからの励起光ビームは、ある側面において、励起光ファイバーケーブル３に連結し、これは、光を液相又は固相試料を含む容器４に送る。任意の非球面レンズ２は、励起光を光ファイバーケーブル３へと集中させるのに用いることができる。集積レーザーシステムからの励起光の発生は、例えばＴＴＬ調節を用いて制御することができる。これは、シグナル取得の間、レーザーを出力することのみによって、レーザーの寿命を延ばすことを可能にする。ＴＴＬ調節は、必要であれば、色素が励起されるより多くの制御が、放射光のノイズ比に対するシグナルを改善することを可能にする。
【００３１】
励起光は、１つ以上の単一光源１に集積される固体レーザーダイオード及び／又は励起レーザーダイオードにより発生することができる。ある側面において、光の２、３、４，５又はそれ以上の離散波長は、光源１により、例えば２、３、４、５又はそれ以上のレーザーダイオードを用いて発生される。或いは、又は更に、ブロックプリズム又は類似のビーム結合光学素子を用いて複数のレーザービームを結合するシングルビームマルチラインレーザーを用いることができる。可視スペクトル中の任意の数の異なる波長、例えば約４７０ｎｍ、約５３０ｎｍ、約５９０ｎｍ、約６３０ｎｍ、及び／又は約６８５ｎｍを用いることができることが理解されるべきである。１つの具体的な例において、例えば４７３ｎｍ±２ｎｍ、５３２ｎｍ±２ｎｍ及び６３３±２ｎｍの光の特定の離散波長を有する１つ以上のレーザー線を含むシングル励起光ビームが発生される。
【００３２】
光源は任意のタイプのレーザーを含むことができるが、レーザーダイオードは、好ましい技術である。出力は、以下の条件：色素フォト漂白率、検出限界、色素容積、試料形状及び光源あたりの試料の数に依存して、約５００マイクロワットから約１００マイクロワットの範囲であることができる。約４００ｎｍから約１２００ｎｍのレーザー波長は、色素の仕様に応じて用いることができる。単一の広い波長レーザーが、類似の励起スペクトルを有する複数の色素を励起するのに用いることができる場合を除いて、狭帯域レーザーが、分析に利用可能な放射スペクトルを増大させるために好ましい。
【００３３】
マルチスペクトル励起光は、集束レンズを用いて又は用いずに、容器４に向けられる（例えば、空気を通して）。例えば約５０ミクロンから約２００ミクロンの外径の小さな光ファイバーケーブルの使用は、励起光を試料上に焦点を合わせるのを助ける。その後、照射された試料４から放射する光は、１つ以上の放射光ファイバーケーブル５を用いて収集される。放射光は、典型的には、試料４からの蛍光発光及び散乱励起光を含む。１つの側面においては、光ファイバーケーブル５は、試料インターフェース８中で、励起光ファイバーケーブルと束ねられ、又は近位に設定される。放射及び励起光ファイバーケーブルを束ねることは、単一の光ファイバーケーブル及び試料インターフェースが、それによりデザインの複雑性を減少させることを可能にする。
【００３４】
ファイバーケーブル５により収集された光は、分光光度計７に送られ、ここで、試料４からの光は、例えば回折格子を用いてその成分波長へと分離され、例えばＣＣＤを用いて空間的に検出される。他の検出素子を用いることができることが理解されるべきである。例えば、収集された光の波長を空間的に分離するための適切な分散特性を有するプリズム又は他の光学素子を、回折格子の代わりに用いることができ、回折格子は、窓、レンズ又は鏡上に刻まれることができる。更に、検出器としては、リニアダイオードアレイ、光電子増倍管アレイ、電荷結合素子（ＣＣＤ）チップ若しくはカメラ又はフォトダイオードアレイが挙げられる。特定の側面において、３ｎｍ超の分解能を有する検出器を用いることができるが、検出器は約３ｎｍ又はそれよりも優れたスペクトル分解能を有する。例えば、回折勾配分光光度計は、最適な放射分析のために、少なくとも３ナノメートルの分解能までスペクトルを分解すべきである。より大きな波長分解能は、より少ない色素を用いる特定の用途に使用することができる。６００ライン／ｍｍの格子間隔は、透過型回折格子を最適化し、同時に３ナノメートルの放射分解能を提供する。３００ライン／ｍｍから２，４００ライン／ｍｍの間隔は、用途に応じて使用することができる。他のタイプの光学デザイン、例えばプリズム又はレンズなどの他の光学素子中に切り取られた又は刻まれた格子を、このシステム中で使用することができる。ホログラフィックレンズ及び他の折り畳まれた光学デザインを使用することができるので、このシステムはＣｚｅｒｎｙ  Ｔｕｒｎｅｒデザインにも限定されない。特定の側面において、光学システムの有用な条件は、放射光がその色成分に分離され、それぞれが約３０ナノメートル未満の分解能まで検出可能である。
【００３５】
他の側面において、放射ケーブル５は、フィルター要素、例えば１つ以上のマルチノッチフィルター６を組み込み、これは、収集光シグナルから散乱励起光を除去する。これは、分光光度計７における回折格子の飽和を防ぎ、より完全な放射スペクトルの分析を可能にする。複数の連続的レーザー線をブロックするフィルターを使用することができるが、１つ又は数個のレーザー線をブロックする単一のフィルターを使用することが好ましい。これは、放射伝達を最大化し、光学システムデザインを単純化する。複数のシングルラインフィルターは、正確な分析のためのより大きな放射スペクトルを必要とする用途に対して好ましい。レーザー線フィルターは、励起光のみをブロックすべきであり、できる限り多くの試料放射光が通過することを可能にし、光学システムの検出限界を最適化する。現在、Ｓｅｍｒｏｃｋ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）は、最大で３つの固有レーザー線を同時にブロックするフィルターを製造する（以下の実施例を参照のこと）。
【００３６】
その後、試料中の蛍光化合物の定量的分析を提供するために、収集したデータを処理する。
【００３７】
このデザインは、スペクトル純度のレーザー光を有利に使用し、多くの従来のシステムにおいて必要とされている励起フィルターの必要性を除去する。回折格子による複数の放射フィルターの置換とのこの組み合わせは、ハードウエア構成要素、インターフェース及び可動部分の数を大きく減少させる。
【００３８】
特定の側面において、本発明の光学システムは、複数の集積レーザーダイオードを使用し、それぞれのレーザーは、固有のスペクトル励起レーザー線を発生する。例を図４に示す。この例において、４５０〜６５０ナノメートルの範囲の励起スペクトルを有する蛍光色素が検出される。約５６０〜約６７０ナノメートルの２つの追加のレーザーダイオードは、可視光励起スペクトルの範囲をより包括的にするために含まれることができる。利点としては、より長い製品寿命とより大きな潜在的試料試験メニューが挙げられる。別の利点は、利用者が、必要であれば増大した感受性の単一色素検出を可能にする単一光源（例えば、励起光の単一離散波長）を選択できることである。
【００３９】
単一光源を用いて複数の色素を励起する能力は、別の利点である。数個の色素を同時に検出することができ、より速い収集時間を可能にする。これは、試料処理能力の必要性を満たすために、速く独立した試料検出を必要とするランダムアクセス検出システムへの統合にとって重要である。
【００４０】
単一光路による同時励起は、従来のシステムと比較して、蛍光検出精度の更なる増大も提供する。全ての試料中の全ての色素は、検出光学に関連した同一の伝達変動を経験する。これは、複数の光路により導入されるシグナル変動及びタイミング変動を排除する。いくつかの色素の同時励起は、能力を増大させながらより低価格の製品を可能にする資本製造コストも減少させる。
【００４１】
各試料のための複数の光ファーバーケーブル及び／又は独立した光学システムの使用は、検出精度を低下させるだけでなく、製造及びサービスの問題も増大させる。本発明は、有利には、多くのこれらの構成要素及びインターフェースを最小化又は除去し、より高いロバスト性を有するデザインを提供する（例えば、図５を参照のこと）。本発明は、ハードウエア変動を補正するための単純な較正を実施する能力も提供する。
【００４２】
ロバスト性の向上は、試料容器ウエルの外側のオプティクスを保持することにより達成される。試料チューブの外側は、通常、検出前処理の間に塩や他の物質で汚染される。試料ホルダーの内側に光路を有する従来のシステムは、ブロック又は閉塞され、劣化蛍光シグナルの精度を減少させ得る（例えば、図６を参照のこと）。
【００４３】
複数のレーザーダイオードの出力を分光光度計検出システムに連結することにより、従来の発光ダイオードデザインを超えた多くの利点を提供する。第一に、レーザーダイオードのより高い出力と増大した光ファイバー結合能力は、より感受性の高い安定な検出システムを提供する。第二に、発光ダイオードのような光源からの光のスペクトルバンド幅を狭めるフィルターが必要とされない。本発明のシステムは、より早い反応時間で反応を観測することができ、より高い信頼性で低レベルのシグナルを識別することを可能にする。
【００４４】
本発明の全体の放射スペクトルの収集は、スペクトル異常のリアルタイムの補正も可能にする。検出の間に収集される限定された情報により、フィルターベースの方法ではこれは不可能である。本発明は、プローブと他の光発生源を区別し、より高い信頼性を提供することもできる。
【００４５】
図２は、１つの実施態様の自動蛍光光学検出システム１１を示す。束ねられた光ファイバーケーブルの試料インターフェース１８部分は、試料保持プラットフォーム１４に対する方向２及び３に沿ったインターフェース１８の二次元の平行移動のためのＸ−Ｙロボットアームに取り付けられ又は連結される。これは、光学システムが、プラットフォーム１８中の複数の試料容器を自動にスキャンすることを可能にする。光ファイバーインターフェースの一又は三次元の動きは、他の移動機構、例えばＸロボットアーム又はＸ−Ｙ−Ｚロボットアームを用いて行うことができることが理解されるべきである。
【００４６】
１つの側面において、検出器プローブ１８は、例えば１００ミリ秒の時間間隔でシグナルを獲得する間に、１つの軸を連続的に動く。一般的に、シグナルを獲得するための時間間隔は、約１０ミリ秒から約５００ミリ秒の範囲であることができる。軸スキャン速度をシグナル獲得時間と同期化することにより、各試料容器からの複数の読み取りを得ることができる。その後、カスタムアルゴリズムは、更なるシグナル処理のために、各チューブから最も良いシグナルを同定することができる。１つの実施態様において、それぞれの純粋色素スペクトルに対して構築された補間三次スプライン関数に基づいたアルゴリズムが使用される。その後、色素混合スペクトルは、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムを用いて三次スプライン又は類似の関数のための乗数を見つけ出すための非線形回帰を用いて分析される。これは、色素濃度に関する、又はさもなければ色素濃度を示す各色素に関する係数を生み出す。
【００４７】
励起光及び収集光のための単一光路の使用は、フィルターベースのデザインと比較して、機器内構成要素変動を有利に減少させる。
【００４８】
図３は、本発明の自動蛍光光学検出器システム２１の別の実施態様を示す。この実施態様においては、試料容器は、固定した検出器プローブ／インターフェース28の近位、例えば下部の円形トレイ２４上で回転する。このデザインは、より簡単な試料容器の移動などの利点をこの検出器モジュールに提供し、光ファイバーのストレス誘導性劣化の減少を提供する。
【００４９】
特定の側面において、試料の近位の光ファイバーの端を保持するプローブインターフェースの端は、試料の上、試料の下、又は試料の側面に位置することができる。更に、試料容器は流路（例えば、流体チャネル又はマイクロチャネル）を含むことができ、この場合、試料インターフェースプローブは、流路に対して実質的に平行に位置することができる。例えば、典型的な任意に補正されていないレーザーダイオードは、縦横２ミリメートルに６ミリメートルの楕円ビームを生み出す。この大きさと形は、マイクロ流体装置中のチャンバーを処理するのに理想的である。例えば、熱モデリングは、高速リアルタイムＰＣＲ分析のための特定のマイクロ流体システムのための最適加熱を提供することを示した。安価なレーザーは、複雑な光学を使用せずにチャンバー全体を照らすことができる。単一コピー標的検出に関連した流体力学を考慮する場合、チャンバー全体を照らすことが重要である。
【００５０】
図４は、生物学的試料の分析に使用される６つの最も一般的に利用される蛍光色素を励起する３つのレーザーダイオードの能力を示す。６３３ナノメートルのレーザーダイオード（６３３ｎｍ ＬＤ）が、５０〜７０％の効率でＪＡ２７０、ＣＹ５及びＣＹ５．５の色素を励起することに注目する。これらの６つの色素を励起するのに、３つのレーザーダイオードしか必要とされない。
【００５１】
最も市販されているフィルターベースの光学システムは、５超の可視色素を定量的に検出することができないことに苦しんでいる。これは、１つの色素の放射スペクトルが別の色素の励起と重複するため、各色素が特定の光スペクトルフィルターを必要とするという事実に起因する。複数のレーザーダイオードにより励起される色素のスペクトル全体を収集することは、分光光度計の波長検出範囲内の全ての可視色素の定量的検出を可能にする。
【００５２】
色が重複する色素は、フィルターベースのシステムにより識別することができないことに留意すべきである。これらの色素は、本発明により識別することができ、より多くの可視スペクトル色素の使用を可能にする。例えば、８０％が重複する２つの青色色素は、フィルターベースの分析によってのみ検出可能なシグナル強度において相違をもたらすだろう。色素を識別するための十分な情報は存在しない。約３ナノメートルの分解能を有する分光光度計は、スペクトルの相違を識別し、各色素をアルゴリズムにより同定することができる。
【００５３】
図４で議論した色素に加えて、この光学システムの規格内である励起及び放射波長を有する任意の蛍光色素又は物質を分析することができることが理解されるべきである。例えば、任意の蛍光物質を含んで成る試料を使用することができる；試料は、１つの蛍光物質、複数の蛍光物質、１つ以上の非結合蛍光プローブ、１つ以上の分析物に結合した蛍光プローブなどを含み得る。同様に、リン光プローブ又は物質を含んで成る試料は、検出及び定量されることができる。リン光物質の例としては、Ｌｕｘｃｅｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅの長期減衰Ｐｔ（ＩＩ）−及びＰｄ（ＩＩ）−コプロポルフリリン（ｃｏｐｒｏｐｏｒｐｈｒｙｒｉｎ）リン光標識が挙げられる。試料容器としては、試料反応装置、貫流容器又は貫流反応装置が挙げられる。
【００５４】
特定の実施態様において、蛍光物質、材料又はプローブは、フルオレセイン−ファミリー色素、ポリハロフルオレセイン−ファミリー色素、ヘキサクロロフルオレセイン−ファミリー色素、クマリン−ファミリー色素、ローダミン−ファミリー色素、シアニン−ファミリー色素、オキサジン−ファミリー色素、チアジン−ファミリー色素、スクアライン−ファミリー色素、キレートランタニド−ファミリー色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−ファミリー色素、及び非蛍光消光部分から成る群から選択することができる。非蛍光消光部分は、背景光放射を減少、除去又は制御し、検出能力を強化する物質である。それらは典型的にはＴａｑＭａｎプローブ中で使用され、プローブオリゴヌクレオチドの開裂の前に背景放射蛍光を減少又は除去する。特定の実施態様において、非蛍光消光部分としては、ＢＨＱ（登録商標）−ファミリー色素又はＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。他の有用な色素の例としては、例えばＴＡＭＲＡ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）、ＤＡＢＣＹＬ（４−（４’−ジメチルアミノフェニラゾ）安息香酸）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｃｙ３（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）又はＣｙ５（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられるが、これらに限定されない。他の有用な材料、プローブ及び物質の例は、米国特許第６，３９９，３９２号、同第６，３４８，５９６号、同第６，０８０，０６８号及び同第５，７０７，８１３号に見出される。
【００５５】
図５は、２つの市販の従来技術のシステムと本発明の光学検出システムの実施態様による、２４個の試料を処理するのに必要とされる光路ハードウエア構成要素の数を比較する。本発明のデザインは、他の従来技術のデザインと比較して２０〜５０倍で非常に単純化されている。この主な構成要素の減少は、レーザー光のスペクトル純度による光学フィルターの除去及び分光光度計により得られるより大きなスペクトルデータセットの分析によって起こる。
【００５６】
本発明の光学検出システムは、同じ光学ハードウエアを用いて各サンプルも試験する。これは、試料間のシグナル変動を減少させ、多くのインターフェースとハードウエア構成要素を含むシステムよりも高いシグナル精度をもたらす。多くのハードウエア構成要素とインターフェースの数を限定することで、製造コスト、サービスコスト、サービスの複雑性及び品質管理の問題に関連するコストも減少させる。
【００５７】
これらの利点に加えて、本発明のシステムは、インターフェースの数又は検出回数を増大させずにより多くの色素と試料が提供され得るので、フィルターベースのデザインよりも拡張可能である。試料の数は、データ収集のタイミングによってのみ制限される。
【実施例】
【００５８】
本発明のプロトタイプ光学システムから得られた蛍光分析データ。
【００５９】
【表１】
2009515153.tif 000003
【００６０】
図７は、本発明のプロトタイプ光学システムから得られた蛍光分析データを示す。光学システムの線形性を、５０ナノモルから０．０９ナノモルの滴定されたＨＥＸ色素プローブを用いて試験した。５３２ナノメートルのレーザーを励起光源として使用し、モデル三次スプライン関数の回帰フィットに基づいたベータ関数を計算することによりデータを分析した。光学システムの線形性は、図の上端に示すデータの線形回帰フィットにより示される。
【００６１】
図８は、蛍光分析プローブを含むポリメラーゼ連鎖反応を観察する本発明のプロトタイプ光学システムから得られた蛍光分析データを示す。ＰＣＲ試薬は、Ｃ型肝炎ウイルスを検出し、２つのプローブを含む：ＨＥＸ色素で標識した内部コントール及びＦＡＭ色素で標識した標的特異的プローブ。内部コントロールと標的の両方を増幅させて、ＦＡＭ及びＨＥＸシグナルを発生し、典型的なＨＣＶ診断試験シグナルを刺激した。励起光源として４７３ナノメートルのレーザーを使用し、モデル三次スプライン関数の回帰フィットに基づいてＦＡＭベータ関数を計算することによりデータを分析した。予測されたＰＣＲ成長曲線を示す。
【００６２】
図９は、図８に示したデータの分析を示す。この実施例において、ＰＣＲ反応は、ベースラインノイズの３標準偏差上であるシグナルが観察された。図９に示す分析は、ＦＡＭシグナル色素の初期の指数関数的な増大が２２サイクルで正確に検出されたことを実証する。これは、プロトタイプシステムが、標準的な商業用の条件を用いて、複数の色素のバックグラウンドにおいて、リアルタイムＰＣＲのシグナルを検出できることを実証する。
【００６３】
本発明は、実施例により、及び特定の実施態様との関連で説明されてきたが、本発明は開示された実施態様に限定されないことが理解されるべきである。反対に、当業者に明らかな様々な変更及び類似の設定をカバーすることが意図されている。例えば、プローブと物質は、連続的又は同時に励起され、連続的又は同時に分析され得る。従って、添付された特許請求の範囲は、全てのこのような変更及び類似の設定を包含するように、最も広く解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、本発明の１つの実施態様の分析用マルチスペクトル光学検出システムを示す。
【図２】図２は、本発明の１つの実施態様の自動蛍光光学検出器を示す。
【図３】図３は、本発明の自動蛍光光学検出器の別の実施態様を示す。
【図４】図４は、生物学的試料の分析に用いられる６つの最も一般的に利用される蛍光色素を励起する３つのレーザーダイオードの能力を示す。
【図５】図５は、本発明の光学デザイン及び光学検出システムにより２４個の試料を処理するのに必要とされる光路ハードウエア要素の数を比較する。
【図６】図６は、従来のシステムの例を示す。
【図７】図７は、本発明のプロトタイプ光学システムから得た蛍光分析データを示す。
【図８】図８は、本発明のプロトタイプ光学システムから得たリアルタイムＰＣＲ蛍光分析データを示す。
【図９】図９は、本発明のプロトタイプ光学システムから得たリアルタイムＰＣＲ蛍光分析データから得たデータの質の更なる分析を示す。
【図１】
2009515153.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2009515153.tif 000010
【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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