(57)【要約】本発明は、細胞生物学、免疫学及び腫瘍学の分野に属する。特に、本発明は、非ヒト起源の可変領域及びヒト起源の免疫グロブリンの少なくとも一部分を含むｖ６インテグリンを認識するヒト化抗体に関する。本発明は又、これらの抗体を調製するプロセス、これらの抗体を含む薬学的組成物、及びヒト化抗ｖ６抗体を投与することにより種々の疾患を処置する方法にも関する。本発明は又、腫瘍細胞及び組織の表面におけるインテグリンαｖβ６の差次的発現の特定、腫瘍細胞の転移の可能性を測定することにおけるこの差次的発現の使用、並びにインテグリンαｖβ６に結合するリガンド、特に抗体を使用して、腫瘍転移を診断及び処置／予防する、及び残存する転移腫瘍細胞を排除する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の重鎖可変ドメイン配列及び配列番号２の軽鎖可変ドメインを含む、αｖβ６に特異的に結合するヒト化抗体。
【請求項２】
前記重鎖可変ドメインが、配列番号１のアミノ酸残基３１〜３５（ＣＤＲ１）、５０〜６５（ＣＤＲ２）及び９８〜１０９（ＣＤＲ３）により規定される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項３】
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２のアミノ酸残基２４〜３５（ＣＤＲ１）、５１〜５７（ＣＤＲ２）及び９０〜９８（ＣＤＲ３）により規定される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項４】
前記重鎖可変ドメインが、配列番号１のアミノ酸残基１〜３０（ＦＲ１）、３６〜４９（ＦＲ２）、６６〜９７（ＦＲ３）及び１１０〜１２０（ＦＲ４）により規定されるフレームワーク領域（ＦＲ）を含む、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項５】
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２のアミノ酸残基１〜２３（ＦＲ１）、３６〜５０（ＦＲ２）、５８〜８９（ＦＲ３）及び９９〜１０８（ＦＲ４）により規定されるフレームワーク領域（ＦＲ）を含む、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項６】
前記抗体が、前記ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、ＣＤＲ３配列又はフレームワーク配列の重鎖又は軽鎖可変ドメインに少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１〜５の何れか１項に記載のヒト化抗体。
【請求項７】
前記抗体が、前記重鎖可変ドメインに、配列番号１のＱ３Ｍ及びＮ７４Ｓからなるアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含む、請求項６に記載のヒト化抗体。
【請求項８】
前記抗体が、前記重鎖可変ドメイン（ＨＶ１）に、配列番号１のＱ３Ｍ及びＮ７４Ｓからなるアミノ酸置換を含む、請求項７に記載のヒト化抗体。
【請求項９】
前記抗体が、前記重鎖可変ドメイン（ＨＶ２）に、配列番号１のＮ７４Ｓからなるアミノ酸置換を含む、請求項７に記載のヒト化抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、前記重鎖可変ドメイン（ＨＶ３）に配列番号１の配列を含む、請求項７に記載のヒト化抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、前記軽鎖可変ドメインに、配列番号２のＥ１Ｑ、Ｌ４７Ｗ、Ｉ５８Ｖ、Ａ６０Ｖ及びＹ８７Ｆからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項６に記載のヒト化抗体。
【請求項１２】
前記抗体が、前記軽鎖可変ドメイン（ＬＶ１）に、配列番号２のＬ４７Ｗ、Ｉ５８Ｖ、Ａ６０Ｖ及びＹ８７Ｆからなるアミノ酸置換を含む、請求項１１に記載のヒト化抗体。
【請求項１３】
前記抗体が、前記軽鎖可変ドメイン（ＬＶ２）に、配列番号２のＬ４７Ｗ及びＩ５８Ｖからなるにアミノ酸置換を含む、請求項１１に記載のヒト化抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、前記軽鎖可変ドメイン（ＬＶ３）に、配列番号２のＬ４７Ｗからなるアミノ酸置換を含む、請求項１１に記載のヒト化抗体。
【請求項１５】
前記抗体が、前記軽鎖可変ドメイン（ＬＶ４）に、配列番号２のＥ１Ｑ及びＬ４７Ｗからなるアミノ酸置換を含む、請求項１１に記載のヒト化抗体。
【請求項１６】
前記抗体が、前記軽鎖可変ドメイン（ＬＶ５）に、配列番号２の配列を含む、請求項１１に記載のヒト化抗体。
【請求項１７】
配列番号１の重鎖可変ドメイン配列（ＨＶ３）及び配列番号２の軽鎖可変ドメイン（ＬＶ５）を含む、αｖβ６に特異的に結合するヒト化抗体。
【請求項１８】
前記相補性決定領域（ＣＤＲ）がマウス３Ｇ９抗体に由来する、請求項１又は１７に記載のヒト化抗体。
【請求項１９】
前記抗体がαｖβ６への結合においてマウス３Ｇ９抗体と競合することができる、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項２０】
前記抗体が該抗体をコードする核酸を含む組換えベクターにより生成される、請求項１又は１７に記載のヒト化抗体。
【請求項２１】
前記組換えベクターがｐＫＪＳ１９５、ｐＫＪＳ１８９及びｐＫＪＳ１９６からなる群より選択されるプラスミドである、請求項２０に記載のヒト化抗体。
【請求項２２】
前記プラスミドｐＫＪＳ１９５が配列番号５を含む、請求項２１に記載のヒト化抗体。
【請求項２３】
前記プラスミドｐＫＪＳ１８９が配列番号６を含む、請求項２１に記載のヒト化抗体。
【請求項２４】
前記プラスミドｐＫＪＳ１９６が配列番号７を含む、請求項２１に記載のヒト化抗体。
【請求項２５】
請求項１及び１７に記載の抗体の何れか１つにより認識されるエピトープに対する特異性を有するヒト化抗体。
【請求項２６】
αｖβ６を特異的に結合するヒト化抗体であって、
（ａ）マウス３Ｇ９抗体由来の３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン軽鎖由来の軽鎖可変領域フレームワーク（ＦＲ）配列を含む、ヒト化軽鎖；ならびに
（ｂ）マウス３Ｇ９抗体由来の３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン重鎖由来の重鎖可変領域フレームワーク（ＦＲ）配列を含む、ヒト化重鎖；
を含む、ヒト化抗体。
【請求項２７】
配列番号１〜５の何れか１つのコード配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２８】
配列番号１〜５の何れか１つのアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２９】
請求項２７に記載の核酸分子を含む、組換えベクター。
【請求項３０】
ヒト化免疫グロブリン軽鎖をコードする融合遺伝子を更に含み、該遺伝子が、αｖβ６に対する結合特異性を有する非ヒト抗体の軽鎖に由来するＣＤＲ及びヒト起源の軽鎖に由来するフレームワーク領域をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２９に記載の組換えベクター。
【請求項３１】
前記非ヒト抗体がマウス３Ｇ９抗体である、請求項３０に記載の組換えベクター。
【請求項３２】
前記ベクターがプラスミドｐＫＪＳ１９５である、請求項３０に記載の組換えベクター。
【請求項３３】
ヒト化免疫グロブリン重鎖をコードする融合遺伝子を更に含み、該遺伝子が、αｖβ６に対する結合特異性を有する非ヒト抗体の重鎖に由来するＣＤＲ及びヒト起源の重鎖に由来するフレームワーク領域をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２９に記載の組換えベクター。
【請求項３４】
前記非ヒト抗体がマウス３Ｇ９抗体である、請求項３３に記載の組換えベクター。
【請求項３５】
前記ベクターがプラスミドｐＫＪＳ１８９である、請求項３３に記載の組換えベクター。
【請求項３６】
前記ベクターがプラスミドｐＫＪＳ１９６である、請求項３３に記載の組換えベクター。
【請求項３７】
請求項２９〜３６の何れか１項に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項３８】
哺乳動物においてαｖβ６により媒介される疾患を予防又は処置するための組成物であって、請求項１、１７及び２６の何れか１項に記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項３９】
前記抗体が細胞毒性因子にコンジュゲートされる、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
ヒト化抗体を調製する方法であって、ヒト化抗体の発現に適切な条件下で請求項３７に記載の宿主細胞を培養する工程を含み、ヒト化抗体鎖が発現され、ヒト化抗体が生成される、方法。
【請求項４１】
前記ヒト化抗体を単離する工程を更に含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
αｖβ６により媒介される疾患を有する、又は有する危険性がある被験体を処置する方法であって、該被験体に請求項３８に記載の組成物を投与し、それによって該疾患の発症を軽減又は延期する工程を含む、方法。
【請求項４４】
前記被験体がヒトである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記疾患が線維症である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記線維症が硬皮症、瘢痕化、肝線維症、腎線維症又は肺線維症である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記疾患が乾癬である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記疾患が癌である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記癌が上皮癌である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記癌が口腔癌、皮膚癌、子宮頚癌、卵巣癌、喉頭癌（pharyngeal cancer）、喉頭癌（ｌaryngeal cancer）、食道癌、肺癌、乳癌、腎臓癌又は結腸直腸癌である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記疾患がアルポート症候群である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
αｖβ６に特異的に結合するヒト化抗体であって、配列番号３の重鎖可変ドメイン配列及び配列番号４の軽鎖可変ドメインを含む、ヒト化抗体。
【請求項５３】
前記重鎖可変ドメインが、配列番号３のアミノ酸残基３１〜３５（ＣＤＲ１）、５０〜６６（ＣＤＲ２）及び９９〜１１５（ＣＤＲ３）により規定される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項５２に記載のヒト化抗体。
【請求項５４】
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号４のアミノ酸残基２４〜３８（ＣＤＲ１）、５４〜６０（ＣＤＲ２）及び９３〜１０１（ＣＤＲ３）により規定される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項５２に記載のヒト化抗体。
【請求項５５】
前記重鎖可変ドメインが、配列番号３のアミノ酸残基１〜３０（ＦＲ１）、３６〜４９（ＦＲ２）、６７〜９８（ＦＲ３）及び１１６〜１２６（ＦＲ４）により規定されるヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む、請求項５２に記載のヒト化抗体。
【請求項５６】
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号４のアミノ酸残基１〜２３（ＦＲ１）、３９〜５３（ＦＲ２）、６１〜９２（ＦＲ３）及び１０２〜１１１（ＦＲ４）により規定されるヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む、請求項５２に記載のヒト化抗体。
【請求項５７】
前記抗体が、前記ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、ＣＤＲ３配列又はフレームワーク配列の重鎖又は軽鎖可変ドメインに少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項５２〜５６の何れか１項に記載のヒト化抗体。
【請求項５８】
前記抗体が、前記重鎖可変ドメインに、配列番号３のＡ２４Ｇ、Ｇ２６Ｓ、Ｑ３９Ｌ、Ｍ４８Ｉ、Ｖ６８Ａ、Ｒ７２Ｖ及びＴ７４Ｋからなるアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含む、請求項５７に記載のヒト化抗体。
【請求項５９】
前記抗体が、前記重鎖可変ドメイン（ＨＶ１’）に、配列番号３のＡ２４Ｇ、Ｇ２６Ｓ、Ｑ３９Ｌ、Ｍ４８Ｉ、Ｖ６８Ａ、Ｒ７２Ｖ及びＴ７４Ｋからなるアミノ酸置換を含む、請求項５８に記載のヒト化抗体。
【請求項６０】
前記抗体が、前記重鎖可変ドメイン（ＨＶ２’）に、配列番号３のＭ４８Ｉ、Ｖ６８Ａ、Ｒ７２Ｖ及びＴ７４Ｋからなるアミノ酸置換を含む、請求項５８に記載のヒト化抗体。
【請求項６１】
前記抗体が、前記重鎖可変ドメイン（ＨＶ３’）に、配列番号３のＶ６８Ａ、Ｒ７２Ｖ及びＴ７４Ｋからなるアミノ酸置換を含む、請求項５８に記載のヒト化抗体。
【請求項６２】
前記抗体が、前記軽鎖可変ドメインに、配列番号４のＥ１Ｄ、Ｌ４６Ｆ及びＹ４９Ｋからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項５７に記載のヒト化抗体。
【請求項６３】
前記抗体が、前記軽鎖可変ドメイン（ＬＶ１’）に、配列番号４のＥ１Ｄ、Ｌ４６Ｆ及びＹ４９Ｋからなるアミノ酸置換を含む、請求項６２に記載のヒト化抗体。
【請求項６４】
前記抗体が、前記軽鎖可変ドメイン（ＬＶ２’）に、配列番号４のＬ４６Ｆ及びＹ４９Ｋからなるアミノ酸置換を含む、請求項６２に記載のヒト化抗体。
【請求項６５】
前記抗体が、前記軽鎖可変ドメイン（ＬＶ３’）に、配列番号４のＹ４９Ｋからなるアミノ酸置換を含む、請求項６２に記載のヒト化抗体。
【請求項６６】
前記相補性決定領域（ＣＤＲ）がマウス８Ｇ６抗体に由来する、請求項５２〜５６の何れか１項に記載のヒト化抗体。
【請求項６７】
前記抗体がαｖβ６への結合においてマウス８Ｇ６抗体と競合することができる、請求項５２〜５６の何れか１項に記載のヒト化抗体。
【請求項６８】
配列番号３〜４の何れか１つのコード配列を含む、単離された核酸分子
【請求項６９】
配列番号３〜４の何れか１つのアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項７０】
請求項６８に記載の核酸分子を含む、組換えベクター。
【請求項７１】
ヒト化免疫グロブリン軽鎖をコードする融合遺伝子を更に含み、該遺伝子が、αｖβ６に対する結合特異性を有する非ヒト抗体の軽鎖に由来するＣＤＲ及びヒト起源の軽鎖に由来するフレームワーク領域をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項７０に記載の組換えベクター。
【請求項７２】
前記非ヒト抗体がマウス８Ｇ６抗体である、請求項７１に記載の組換えベクター。
【請求項７３】
ヒト化免疫グロブリン重鎖をコードする融合遺伝子を更に含み、該遺伝子が、αｖβ６に対する結合特異性を有する非ヒト抗体の重鎖に由来するＣＤＲ及びヒト起源の重鎖に由来するフレームワーク領域をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項７０に記載の組換えベクター。
【請求項７４】
前記非ヒト抗体がマウス８Ｇ６抗体である、請求項７３に記載の組換えベクター。
【請求項７５】
請求項７０〜７４の何れか１項に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項７６】
哺乳動物においてαｖβ６により媒介される疾患を予防又は処置するための組成物であって、請求項５２〜５６の何れか１項に記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項７７】
前記抗体が細胞毒性因子にコンジュゲートされる、請求項７６に記載の組成物。
【請求項７８】
ヒト化抗体を調製する方法であって、ヒト化抗体の発現に適切な条件下で請求項７５に記載の宿主細胞を培養する工程を含み、ここで、ヒト化抗体鎖が発現され、ヒト化抗体が生成される、方法。
【請求項７９】
前記ヒト化抗体を単離する工程を更に含む、請求項７８の方法。
【請求項８０】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
αｖβ６により媒介される疾患を有する、又は有する危険性がある被験体を処置する方法であって、該被験体に請求項７６に記載の組成物を投与し、それによって、該疾患の発症を軽減又は延期する工程を含む、方法。
【請求項８２】
前記被験体がヒトである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記疾患が線維症である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記疾患が癌である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
前記疾患がアルポート症候群である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８６】
プラスミドｐＫＪＳ１８９（配列番号６）を含む組換えベクターにより生成される重鎖可変ドメイン３型（ＨＶ３）及びプラスミドｐＫＪＳ１９５（配列番号５）を含む組換えベクターにより生成される軽鎖可変ドメイン５型（ＨＶ５）を含む、ヒト化抗体。
【請求項８７】
プラスミドｐＫＪＳ１９６（配列番号７）を含む組換えベクターにより生成されるアグリコシル重鎖可変ドメイン３型（ａ−ＨＶ３）及びプラスミドｐＫＪＳ１９５（配列番号５）を含む組換えベクターにより生成される軽鎖可変ドメイン５型（ＨＶ５）を含む、ヒト化抗体。
【請求項８８】
患者における原発腫瘍の二次的な位置への転移を低減又は予防する方法であって、該原発腫瘍内の１つ以上の細胞上のインテグリンαｖβ６の１つ以上のサブユニットに結合する１つ以上のリガンドの治療有効量を該患者に投与する工程を含み、該リガンドの該インテグリンへの結合が、該腫瘍細胞の死滅、化学的感受性又は浸潤性の低下をもたらす、方法。
【請求項８９】
前記腫瘍が癌腫である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記癌腫が腺癌である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記癌腫が、乳癌腫、子宮内膜癌腫、膵臓癌腫、結腸直腸癌腫、肺癌腫、卵巣癌腫、子宮頚癌腫、前立腺癌腫、肝臓癌腫、食道癌腫、頭頚部癌腫、胃癌腫及び脾臓癌腫からなる群より選択される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記癌腫が乳癌腫である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
前記乳癌腫が上皮内乳癌腫（in situ breast carcinoma）である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記上皮内乳癌腫が、上皮内腺管癌（ＤＣＩＳ）及び上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）からなる群より選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記癌腫が子宮内膜癌腫である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９６】
前記癌腫が膵臓癌腫である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９７】
前記癌腫が結腸直腸癌腫である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９８】
前記癌腫が子宮頚癌腫である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９９】
前記癌腫が肺癌腫である、請求項８９に記載の方法。
【請求項１００】
αｖβ６インテグリンに結合する前記リガンドが、抗体又はそのαｖβ６エピトープ結合フラグメントである、請求項８８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記モノクローナル抗体が、キメラ、霊長類化又はヒト化モノクローナル抗体である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記モノクローナル抗体が、２Ａ１、２Ｅ５、１Ａ８、２Ｂ１０、２Ｂ１、１Ｇ１０、７Ｇ５、１Ｃ５、８Ｇ６、３Ｇ９、１０Ｄ５及びＣＳβ６からなる群より選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記モノクローナル抗体が３Ｇ９である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
前記モノクローナル抗体が８Ｇ６である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０６】
前記モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ヒト化モノクローナル抗体がｈｕ３Ｇ９（ＢＧ０００１１）である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ヒト化モノクローナル抗体がｈｕ８Ｇ６である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０９】
前記リガンドが少なくとも１つの細胞毒性化合物にコンジュゲートされる、請求項８８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記リガンドが、少なくとも１つの細胞毒性化合物の前記患者への投与と組み合わせて該患者に投与される、請求項８８に記載の方法。
【請求項１１１】
前記細胞毒性化合物が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、メルファラン、ドキソルビシン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、エトポシド、メクロレタミン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、カリケアマイシン、マイタンシン、トリコテネ、ＣＣ１０６５、ジフテリアＡ鎖、緑膿菌外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質、モモルジカ・チャランティア阻害物質、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス阻害物質、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、トリコテセン、リボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項１０９又は１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記細胞毒性化合物が、放射性同位体及びプロドラッグ活性化酵素からなる群より選択される、請求項１０９又は請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１３】
前記放射性同位体が、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、並びにＬｕの放射性同位体からなる群より選択される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記プロドラッグ活性化酵素が、アルカリホスファターゼ、アリールスルファターゼ、シトシンデアミナーゼ、プロテアーゼ、Ｄ−アラニルカルボキシペプチダーゼ、炭水化物開裂酵素、Ｐ−ラクタマーゼ及びペニシリンアミダーゼからなる群より選択される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１５】
前記リガンドが、該リガンド及び１つ以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む薬学的組成物の形態で前記患者に投与される、請求項８８に記載の方法。
【請求項１１６】
前記リガンド又は組成物が、経口投与、非経口投与、頭蓋内投与、肺内投与及び鼻内投与からなる群より選択される経路を介して前記患者に投与される、請求項８８又は請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記リガンド又は組成物が、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与及び皮下投与からなる群より選択される非経腸経路を介して前記患者に投与される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記非経腸経路が、注射を介して前記患者に前記リガンド又は組成物を投与することを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
浸潤性癌腫に進行する可能性がより高い癌腫を診断する方法であって、
（ａ）腫瘍又はその一部分を含む癌性上皮組織試料、及び非癌性上皮組織試料を患者から得る工程；
（ｂ）インテグリンαｖβ６の１つ以上のサブユニットに結合する１つ以上のリガンドと該組織試料とを接触させる工程；及び、
（ｃ）該組織試料におけるインテグリンαｖβ６の発現レベルを測定する工程
を含み、
該非癌性組織試料におけるインテグリンαｖβ６の発現レベルに比べて該癌性組織試料におけるインテグリンαｖβ６の発現レベルが増大していることが、浸潤性癌腫に進行する可能性がより高い癌腫が該患者に存在することを示す、方法。
【請求項１２０】
前記腫瘍が癌腫である、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記癌腫が腺癌である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記癌腫が、乳癌腫、子宮内膜癌腫、膵臓癌腫、結腸直腸癌腫、肺癌腫、卵巣癌腫、子宮頚癌腫、前立腺癌腫、肝臓癌腫、食道癌腫、頭頚部癌腫、胃癌腫及び脾臓癌腫からなる群より選択される、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
前記癌腫が乳癌腫である、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記乳癌腫が上皮内乳癌腫である、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記上皮内乳癌腫が、上皮内腺管癌（ＤＣＩＳ）及び上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）からなる群より選択される、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記癌腫が子宮内膜癌腫である、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２７】
前記癌腫が膵臓癌腫である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２８】
前記癌腫が結腸直腸癌腫である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２９】
前記癌腫が子宮頚癌腫である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１３０】
前記癌腫が肺癌腫である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１３１】
αｖβ６インテグリンに結合する前記リガンドが、抗体又はそのαｖβ６エピトープ結合フラグメントである、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１３２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記モノクローナル抗体が、キメラ、霊長類化又はヒト化モノクローナル抗体である、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記モノクローナル抗体が、２Ａ１、２Ｅ５、１Ａ８、２Ｂ１０、２Ｂ１、１Ｇ１０、７Ｇ５、１Ｃ５、８Ｇ６、３Ｇ９、１０Ｄ５及びＣＳβ６からなる群より選択される、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３５】
前記モノクローナル抗体が３Ｇ９である、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３６】
前記モノクローナル抗体が８Ｇ６である、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３７】
前記モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３８】
前記ヒト化モノクローナル抗体がｈｕ３Ｇ９（ＢＧ０００１１）である、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
前記ヒト化モノクローナル抗体がｈｕ８Ｇ６である、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４０】
前記リガンドが少なくとも１つの検出可能な標識にコンジュゲートされる、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記検出可能な標識が、発色原標識、酵素標識、放射性同位体標識、非放射性同位体標識、蛍光標識、毒性標識、化学発光標識、Ｘ線撮影用標識、スピンラベル及び核磁気共鳴造影剤標識からなる群より選択される、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
前記発色原標識が、ジアミノベンジジン及び４−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸からなる群より選択される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記酵素標識が、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼからなる群より選択される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４４】
前記放射性同位体標識が、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、１５２Ｅｕ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ及び１０９Ｐｄからなる群より選択される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４５】
前記非放射性同位体標識が、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｔｒ、５６Ｆｅ、９９ｍＴｃ及び１１２Ｉｎからなる群より選択される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４６】
前記蛍光標識が、１５２Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリスリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）標識、ｏ−フタルデヒド標識及びフルオレサミン標識からなる群より選択される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４７】
前記毒性標識が、ジフテリア毒素標識、リシン標識及びコレラ毒素標識からなる群より選択される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４８】
前記化学発光標識が、ルミノール標識、イソルミノール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識及びエクオリン標識からなる群より選択される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４９】
前記Ｘ線撮影用標識がバリウム又はセシウムである、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１５０】
前記スピンラベルが重水素である、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１５１】
前記核磁気共鳴造影剤標識が、Ｇｄ、Ｍｎ及び鉄からなる群より選択される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１５２】
患者におけるαｖβ６陽性転移腫瘍細胞を排除する方法であって、１つ以上のαｖβ６陽性転移腫瘍細胞上のインテグリンαｖβ６の１つ以上のサブユニットに結合する１つ以上のリガンドの治療有効量を該患者に投与する工程を含み、該リガンドの該インテグリンへの結合が、該転移腫瘍細胞の死滅、化学的感作又は浸潤性の低下をもたらす、方法。
【請求項１５３】
前記腫瘍細胞が転移癌腫に由来する、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記癌腫が腺癌である、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記癌腫が、乳癌腫、子宮内膜癌腫、膵臓癌腫、結腸直腸癌腫、肺癌腫、卵巣癌腫、子宮頚癌腫、前立腺癌腫、肝臓癌腫、食道癌腫、頭頚部癌腫、胃癌腫及び脾臓癌腫からなる群より選択される、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５６】
前記癌腫が乳癌腫である、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５７】
前記乳癌腫が上皮内乳癌腫である、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
前記上皮内乳癌腫が、上皮内腺管癌（ＤＣＩＳ）及び上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）からなる群より選択される、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
前記癌腫が子宮内膜癌腫である、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１６０】
前記癌腫が膵臓癌腫である、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１６１】
前記癌腫が結腸直腸癌腫である、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１６２】
前記癌腫が子宮頚癌腫である、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１６３】
前記癌腫が肺癌腫である、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１６４】
αｖβ６インテグリンに結合する前記リガンドが、抗体又はそのαｖβ６エピトープ結合フラグメントである、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１６５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記モノクローナル抗体が、キメラ、霊長類化又はヒト化モノクローナル抗体である、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
前記モノクローナル抗体が、２Ａ１、２Ｅ５、１Ａ８、２Ｂ１０、２Ｂ１、１Ｇ１０、７Ｇ５、１Ｃ５、８Ｇ６、３Ｇ９、１０Ｄ５及びＣＳβ６からなる群より選択される、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６８】
前記モノクローナル抗体が３Ｇ９である、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６９】
前記モノクローナル抗体が８Ｇ６である、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１７０】
前記モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１７１】
前記ヒト化モノクローナル抗体がｈｕ３Ｇ９（ＢＧ０００１１）である、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
前記ヒト化モノクローナル抗体がｈｕ８Ｇ６である、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７３】
前記リガンドが少なくとも１つの細胞毒性化合物にコンジュゲートされる、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１７４】
前記リガンドが、少なくとも１つの細胞毒性化合物の前記患者への投与と組み合わせて該患者に投与される、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１７５】
前記細胞毒性化合物が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、メルファラン、ドキソルビシン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、エトポシド、メクロレタミン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、カリケアマイシン、マイタンシン、トリコテネ、ＣＣ１０６５、ジフテリアＡ鎖、緑膿菌外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質、モモルジカ・チャランティア阻害物質、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス阻害物質、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、トリコテセン、リボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項１７３又は請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
前記細胞毒性化合物が、放射性同位体及びプロドラッグ活性化酵素からなる群より選択される、請求項１７３又は請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７７】
前記放射性同位体が、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、並びにＬｕの放射性同位体からなる群より選択される、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
前記プロドラッグ活性化酵素が、アルカリホスファターゼ、アリールスルファターゼ、シトシンデアミナーゼ、プロテアーゼ、Ｄ−アラニルカルボキシペプチダーゼ、炭水化物開裂酵素、Ｐ−ラクタマーゼ及びペニシリンアミダーゼからなる群より選択される、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７９】
前記リガンドが、該リガンド及び１つ以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む薬学的組成物の形態で前記患者に投与される、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１８０】
前記リガンド又は組成物が、経口投与、非経口投与、頭蓋内投与、肺内投与及び鼻内投与からなる群より選択される経路を介して前記患者に投与される、請求項１５２又は請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
前記リガンド又は組成物が、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与及び皮下投与からなる群より選択される非経腸経路を介して前記患者に投与される、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
前記非経腸経路が、注射を介して前記患者に前記リガンド又は組成物を投与することを含む、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８３】
患者の組織又は臓器から腫瘍を外科的に摘出した後に該患者から残存するαｖβ６陽性腫瘍細胞を排除する方法であって、該組織又は臓器に残存する１つ以上の腫瘍細胞上のインテグリンαｖβ６の１つ以上のサブユニットに結合する１つ以上のリガンドの治療有効量を該患者に投与する工程を含み、該リガンドの該インテグリンへの結合が、該腫瘍細胞の死滅、化学的感受性又は浸潤性の低下をもたらす、方法。
【請求項１８４】
前記腫瘍細胞が転移癌腫に由来する、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
前記癌腫が腺癌である、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
前記癌腫が、乳癌腫、子宮内膜癌腫、膵臓癌腫、結腸直腸癌腫、肺癌腫、卵巣癌腫、子宮頚癌腫、前立腺癌腫、肝臓癌腫、食道癌腫、頭頚部癌腫、胃癌腫及び脾臓癌腫からなる群より選択される、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８７】
前記癌腫が乳癌腫である、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８８】
前記乳癌腫が上皮内乳癌腫である、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
前記上皮内乳癌腫が、上皮内腺管癌（ＤＣＩＳ）及び上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）からなる群より選択される、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
前記癌腫が子宮内膜癌腫である、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１９１】
前記癌腫が膵臓癌腫である、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１９２】
前記癌腫が結腸直腸癌腫である、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１９３】
前記癌腫が子宮頚癌腫である、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１９４】
前記癌腫が肺癌腫である、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１９５】
αｖβ６インテグリンに結合する前記リガンドが、抗体又はそのαｖβ６エピトープ結合フラグメントである、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１９６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１９５に記載の方法。
【請求項１９７】
前記モノクローナル抗体が、キメラ、霊長類化又はヒト化モノクローナル抗体である、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９８】
前記モノクローナル抗体が、２Ａ１、２Ｅ５、１Ａ８、２Ｂ１０、２Ｂ１、１Ｇ１０、７Ｇ５、１Ｃ５、８Ｇ６、３Ｇ９、１０Ｄ５及びＣＳβ６からなる群より選択される、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９９】
前記モノクローナル抗体が３Ｇ９である、請求項１９６に記載の方法。
【請求項２００】
前記モノクローナル抗体が８Ｇ６である、請求項１９６に記載の方法。
【請求項２０１】
前記モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である、請求項１９６に記載の方法。
【請求項２０２】
前記ヒト化モノクローナル抗体がｈｕ３Ｇ９（ＢＧ０００１１）である、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０３】
前記ヒト化モノクローナル抗体がｈｕ８Ｇ６である、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０４】
前記リガンドが少なくとも１つの細胞毒性化合物にコンジュゲートされる、請求項１８３に記載の方法。
【請求項２０５】
前記リガンドが、少なくとも１つの細胞毒性化合物の前記患者への投与と組み合わせて該患者に投与される、請求項１８３に記載の方法。
【請求項２０６】
前記細胞毒性化合物が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、メルファラン、ドキソルビシン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、エトポシド、メクロレタミン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、カリケアマイシン、マイタンシン、トリコテネ、ＣＣ１０６５、ジフテリアＡ鎖、緑膿菌外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質、モモルジカ・チャランティア阻害物質、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス阻害物質、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、トリコテセン、リボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項２０４又は２０５に記載の方法。
【請求項２０７】
前記細胞毒性化合物が、放射性同位体及びプロドラッグ活性化酵素からなる群より選択される、請求項２０４又は請求項２０５に記載の方法。
【請求項２０８】
前記放射性同位体が、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、並びにＬｕの放射性同位体からなる群より選択される、請求項２０７に記載の方法。
【請求項２０９】
前記プロドラッグ活性化酵素が、アルカリホスファターゼ、アリールスルファターゼ、シトシンデアミナーゼ、プロテアーゼ、Ｄ−アラニルカルボキシペプチダーゼ、炭水化物開裂酵素、Ｐ−ラクタマーゼ及びペニシリンアミダーゼからなる群より選択される、請求項２０７に記載の方法。
【請求項２１０】
前記リガンドが、該リガンド及び１つ以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む薬学的組成物の形態で前記患者に投与される、請求項１８３に記載の方法。
【請求項２１１】
前記リガンド又は組成物が、経口投与、非経口投与、頭蓋内投与、肺内投与及び鼻内投与からなる群より選択される経路を介して前記患者に投与される、請求項１８３又は請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１２】
前記リガンド又は組成物が、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与及び皮下投与からなる群より選択される非経腸経路を介して前記患者に投与される、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１３】
前記非経腸経路が、注射を介して前記患者に前記リガンド又は組成物を投与することを含む、請求項２１２に記載の方法。
【請求項２１４】
患者における原発性の前転移性又は前浸潤性腫瘍の転移性又は浸潤性腫瘍への進行を低減又は予防する方法であって、該前転移性又は前浸潤性腫瘍内の１つ以上の細胞上のインテグリンαｖβ６の１つ以上のサブユニットに結合する１つ以上のリガンドの治療有効量を該患者に投与する工程を含み、該リガンドの該インテグリンへの結合が、該患者における該原発腫瘍を囲む組織領域への該前転移性又は前浸潤性癌細胞の浸潤の低減又は予防をもたらす、方法。
【請求項２１５】
前記前転移性又は前浸潤性腫瘍が癌腫である、請求項２１４に記載の方法。
【請求項２１６】
前記癌腫が腺癌である、請求項２１５に記載の方法。
【請求項２１７】
前記癌腫が、乳癌腫、子宮内膜癌腫、膵臓癌腫、結腸直腸癌腫、肺癌腫、卵巣癌腫、子宮頚癌腫、前立腺癌腫、肝臓癌腫、食道癌腫、頭頚部癌腫、胃癌腫及び脾臓癌腫からなる群より選択される、請求項２１５に記載の方法。
【請求項２１８】
前記癌腫が乳癌腫である、請求項２１５に記載の方法。
【請求項２１９】
前記乳癌腫が上皮内乳癌腫である、請求項２１８に記載の方法。
【請求項２２０】
前記上皮内乳癌腫が、上皮内腺管癌（ＤＣＩＳ）及び上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）からなる群より選択される、請求項２１９に記載の方法。
【請求項２２１】
前記癌腫が子宮内膜癌腫である、請求項２１５に記載の方法。
【請求項２２２】
前記癌腫が膵臓癌腫である、請求項２１５に記載の方法。
【請求項２２３】
前記癌腫が結腸直腸癌腫である、請求項２１５に記載の方法。
【請求項２２４】
前記癌腫が子宮頚癌腫である、請求項２１５に記載の方法。
【請求項２２５】
前記癌腫が肺癌腫である、請求項２１５に記載の方法。
【請求項２２６】
αｖβ６インテグリンに結合する前記リガンドが、抗体又はそのαｖβ６エピトープ結合フラグメントである、請求項２１４に記載の方法。
【請求項２２７】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２２６に記載の方法。
【請求項２２８】
前記モノクローナル抗体が、キメラ、霊長類化又はヒト化モノクローナル抗体である、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２２９】
前記モノクローナル抗体が、２Ａ１、２Ｅ５、１Ａ８、２Ｂ１０、２Ｂ１、１Ｇ１０、７Ｇ５、１Ｃ５、８Ｇ６、３Ｇ９、１０Ｄ５及びＣＳβ６からなる群より選択される、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２３０】
前記モノクローナル抗体が３Ｇ９である、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２３１】
前記モノクローナル抗体が８Ｇ６である、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２３２】
前記モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２３３】
前記ヒト化モノクローナル抗体がｈｕ３Ｇ９（ＢＧ０００１１）である、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３４】
前記ヒト化モノクローナル抗体がｈｕ８Ｇ６である、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３５】
前記リガンドが少なくとも１つの細胞毒性化合物にコンジュゲートされる、請求項２１４に記載の方法。
【請求項２３６】
前記リガンドが、少なくとも１つの細胞毒性化合物の前記患者への投与と組み合わせて該患者に投与される、請求項２１４に記載の方法。
【請求項２３７】
前記細胞毒性化合物が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、メルファラン、ドキソルビシン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、エトポシド、メクロレタミン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、カリケアマイシン、マイタンシン、トリコテネ、ＣＣ１０６５、ジフテリアＡ鎖、緑膿菌外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質、モモルジカ・チャランティア阻害物質、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス阻害物質、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、トリコテセン、リボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項２３５又は２３６に記載の方法。
【請求項２３８】
前記細胞毒性化合物が、放射性同位体及びプロドラッグ活性化酵素からなる群より選択される、請求項２３５又は請求項２３６に記載の方法。
【請求項２３９】
前記放射性同位体が、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、並びにＬｕの放射性同位体からなる群より選択される、請求項２３８に記載の方法。
【請求項２４０】
前記プロドラッグ活性化酵素が、アルカリホスファターゼ、アリールスルファターゼ、シトシンデアミナーゼ、プロテアーゼ、Ｄ−アラニルカルボキシペプチダーゼ、炭水化物開裂酵素、Ｐ−ラクタマーゼ及びペニシリンアミダーゼからなる群より選択される、請求項２３８に記載の方法。
【請求項２４１】
前記リガンドが、該リガンド及び１つ以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む薬学的組成物の形態で前記患者に投与される、請求項２１４に記載の方法。
【請求項２４２】
前記リガンド又は組成物が、経口投与、非経口投与、頭蓋内投与、肺内投与及び鼻内投与からなる群より選択される経路を介して前記患者に投与される、請求項２１４又は請求項２４１に記載の方法。
【請求項２４３】
前記リガンド又は組成物が、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与及び皮下投与からなる群より選択される非経腸経路を介して前記患者に投与される、請求項２４２に記載の方法。
【請求項２４４】
前記非経腸経路が、注射を介して前記患者に前記リガンド又は組成物を投与することを含む、請求項２４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、細胞生物学、免疫学及び腫瘍学の分野に属する。特に、本発明は、非ヒト起源の可変領域及びヒト起源の免疫グロブリンの少なくとも一部分を含むｖ６インテグリンを認識するヒト化抗体に関する。本発明は又、これらの抗体を調製するプロセス、これらの抗体を含む薬学的組成物、及びヒト化抗ｖ６抗体を投与することにより種々の疾患を処置する方法にも関する。本発明は又、腫瘍細胞及び組織の表面におけるインテグリンαｖβ６の差次的発現の特定、腫瘍細胞の転移の可能性を測定することにおけるこの差次的発現の使用、並びにインテグリンαｖβ６に結合するリガンド、特に抗体を使用して、腫瘍転移を診断及び処置／予防する、及び残存する転移腫瘍細胞を排除する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術）
インテグリンは、細胞外マトリックスタンパク質を結合し、細胞−細胞及び細胞−細胞外マトリックスの相互作用（一般的には細胞接着事象と呼ばれる）を媒介する細胞表面糖タンパク質受容体である（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，  Ｅ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ８７：１−５  （１９９１）；  Ｈｙｎｅｓ，  Ｒ．Ｏ．，  Ｃｅｌｌ  ６９：１１−２５  （１９９２））。これらの受容体は、互いに組み合わさると、異なる細胞特異性及び接着特異性を有する種々のヘテロ２量体タンパク質が生じる、非共有結合により会合したアルファ（α）及びベータ（β）鎖からなる（Ａｌｂｅｄａ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ６８：４−１４  （１９９３））。最近の試験では、細胞接着、遊走、浸潤、分化、増殖、アポトーシス及び遺伝子発現を含めた細胞プロセスの調節において特定のインテグリンが関与していることが示唆されている（Ａｌｂｅｄａ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ６８：４−１４  （１９９３）；  Ｊｕｌｉａｎｏ，  Ｒ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔ．  Ｒｅｖ．  １３：２５−３０  （１９９４）；  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ，  Ｊ．Ｃ．，  Ｃｅｌｌ  ７７：４７７−４７８  （１９９４）；及びＲｕｏｓｌａｈｔｉ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｇｉａｎｃｏｔｔｉ，  Ｆ．Ｇ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  １：１１９−１２６  （１９８９）；  Ｐｌｏｗ，  Ｈａａｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｆｌｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ  ２００１）。
【０００３】
αｖβ６受容体は、細胞表面へテロ２量体タンパク質として発現されるインテグリンファミリーの１つのメンバーである（Ｂｕｓｋ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７（９）：５７９０−５７９６  （１９９２））。αｖサブユニットは、種々のβサブユニット（βｌ、β３、β５、β６及びβ８）とヘテロ２量体を形成できるのに対して、β６サブユニットは、αｖサブユニットとヘテロ２量体として発現されるのみである。αｖβ６インテグリンは、フィブロネクチン結合、潜時関連ペプチド（ＬＡＰ）結合、及びテナシンＣ結合細胞表面受容体であることが知られており、これらのＲＧＤトリペプチド結合部位を介して細胞外マトリックスと相互作用する（Ｂｕｓｋ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７：５７９０−５７９６  （１９９２）；  Ｗｅｉｎａｃｋｅｒ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：６９４０−６９４８  （１９９４）；  Ｐｒｉｅｔｏ，  ＡＸ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：１０１５４−１０１５８  （１９９３））。αｖβ６インテグリンは１０年以上前に最初に特定され、配列決定されたが、特に疾患におけるαｖβ６の生物学的重要性は依然として調査中である。αｖβ６の発現は上皮細胞に制限されており、これらの細胞においてαｖβ６は、健常組織において比較的低レベルで発現され、発達、傷害及び創傷治癒時には有意にアップレギュレートされる（Ｂｒｅｕｓｓ，  Ｊ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  ４１：１５２１−１５２７  （１９９３）；  Ｂｒｅｕｓｓ，  Ｊ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １０８：２２４１−２２５１  （１９９５）；  Ｋｏｉｖｉｓｔｏ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎｉｃ．  ７：２４５−２５７  （１９９９）；  Ｚａｍｂｒｕｎｏ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １２９（３）：８５３−８６５  （１９９５）；  Ｈａｋｋｉｎｅｎ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  ４８（６）：９８５−９９８  （２０００））。最近増えつつある報告では、αｖβ６が、例えば、結腸癌腫（Ｎｉｕ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ９２：４０−４８  （２００１）；  Ｂａｔｅｓ，  Ｒ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１５：３３９−３４７  （２００５））、卵巣癌（Ａｈｍｅｄ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ８４：６７５−６８６  （２００２）；  Ａｈｍｅｄ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  ５０：１３７１−１３７９  （２００２）；  Ａｈｍｅｄ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ．  ２３：２３７−２４４  （２００２））、扁平上皮細胞癌腫（Ｋｏｉｖｉｓｔｏ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２５５：１０−１７  （２０００）；  Ｘｕｅ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  ２８８：６１０−６１８  （２００１）；  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｇ．Ｊ．��  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １１７：６７−７３  （２００１）；  Ｔｈｏｍａｓ，  ＧＪ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ９２：６４１−６５０  （２００１）；  Ｒａｍｏｓ，  Ｄ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．  ２１：２９７−３０７  （２００２）；  （Ａｇｒｅｚ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８１：９０−９７  （１９９９）；  Ｈａｍｉｄｉ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８２（８）：１４３３−１４４０  （２０００）；  Ｋａｗａｓｈｉｍａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐａｔｈｏｌ．  Ｒｅｓ．  Ｐｒａｃｔ．  ９９（２）：５７−６４  （２００３））及び乳癌（Ａｒｉｈｉｒｏ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ７：１９−２６  （２０００））を含めた上皮起源の癌においてアップレギュレートされることが示されている。又、αｖサブユニットは、腫瘍転移に関与する場合があり、このサブユニットを阻害することで転移が予防される場合があることも報告されている（例えば、Ｉｍｈｏｆ，  Ｂ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａｔｔｅｍｐｔｓ  ｔｏ  Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｉ，”  Ｕ．  Ｇuｎｔｈｅｒｔ  ａｎｄ  Ｗ．  Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ，  ｅｄｓ．，  Ｂｅｒｌｉｎ：  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  ｐｐ．  １９５−２０３  （１９９６）を参照）。
【０００４】
αｖβ６インテグリンは、腫瘍細胞の生物学において複数の調節機能を有する場合がある。最近の研究では、β６サブユニットの細胞外及び原形質ドメインが種々の細胞活性を媒介することが示されている。これらの細胞外及び膜貫通ドメインは、ＴＧＦ−βの活性化及び接着を媒介することが示されている（Ｓｈｅｐｐａｒｄ，  Ｄ．，  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．  ２４：３９５−４０２  （２００５）；  Ｍｕｎｇｅｒ，  Ｊ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ９６：３１９−３２８  （１９９９））。β６サブユニットの原形質ドメインは、αｖβ６調節細胞の増殖、ＭＭＰの生成、遊走及び生存促進の媒介において重要となる固有の１１アミノ酸配列を含有する（Ｌｉ，  Ｘ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８（４３）：４１６４６−４１６５３  （２００３）；  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｇ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍ．  １１７（１）：６１−７３  （２００１）；  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｇ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８７（８）：８５９−８６７  （２００２）；  Ｊａｎｅｓ，  Ｓ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｗａｔｔ，  Ｆ．Ｍ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６６（３）：４１９−４３１  （２００４））。β６サブユニットは、既にクローニング、発現及び精製されており（開示内容が全体が参考として本明細書で援用される、Ｓｈｅｐｐａｒｄ等の特許文献１）、αｖβ６インテグリンに選択的に結合する機能阻害抗体が報告されている（開示内容が全体が参考として本明細書で援用される、Ｗｅｉｎｒｅｂ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９：１７８７５−１７８７７  （２００４））。αｖβ６の拮抗物質（特定のモノクローナル抗体を含む）も又、急性の肺傷害及び線維症の特定の型を処置する可能性が示唆されている（開示内容が全体が参考として本明細書で援用される、特許文献２及び特許文献３を参照）。
【０００５】
αｖβ６は、フィブロネクチン、テネイシン、潜時関連ペプチド−１及び−３（ＬＡＰ１及びＬＡＰ３）、即ちアルギニン−グリシン−アスパルテート（ＲＧＤ）モチーフとの直接の相互作用を介したＴＧＦ−β１の潜伏性前駆体型のＮ末端２７８アミノ酸を含めた、幾つかのリガンドに結合することができる（Ｂｕｓｋ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７（９）：５７９０−５７９６  （１９９２）；  Ｙｏｋｏｓａｋｉ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１（３９）：２４１４４−２４１５０  （１９９６）；  Ｈｕａｎｇ，  Ｘ．Ｚ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １１１：２１８９−２１９５  （１９９８）；  Ｍｕｎｇｅｒ，  Ｊ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ９６：３１９−３２８  （１９９９））。ＴＧＦ−βサイトカインは、成熟活性Ｃ末端ＴＧＦ−βサイトカインに非共有結合により会合したＮ末端ＬＡＰを有する潜伏性複合体として合成される。この潜伏性ＴＧＦ−β複合体は、その同属体受容体に結合することができず、従って活性型に変換されるまでは生物学的活性を有さない（Ｂａｒｃｅｌｌｏｓ−Ｈｏｆｆ，  Ｍ．Ｈ．，  Ｊ．  Ｍａｍｍ．  Ｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌ．  １（４）：３５３−３６３  （１９９６）；  Ｇｌｅｉｚｅｓ，  Ｐ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １５（３）：１９０−１９７  （１９９７）；  Ｍｕｎｇｅｒ，  Ｊ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｋｉｄ．  Ｉｎｔ．  ５１：１３７６−１３８２  （１９９７）；  Ｋｈａｌｉｌ，  Ｎ．，  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．  １（１５）：１２５５−１２６３  （１９９９））。ＬＡＰ１又はＬＡＰ２へのαｖβ６の結合によって、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３の潜伏性前駆体型の活性化がもたらし（Ｍｕｎｇｅｒ，  Ｊ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ９６：３１９−３２８  （１９９９））、これは、ＴＧＦ−βによるその受容体への結合を可能にする潜伏性複合体の構造変化によるものであることが提案されている。即ち、αｖβ６のアップレギュレートされた発現によってＴＧＦ−βの局所的な活性化がもたらされ、ひいては下流の事象が連鎖的に活性化される可能性がある。
【０００６】
ＴＧＦ−β１サイトカインは、細胞の増殖、分化及び免疫応答を調節する多面発現性の成長因子である（Ｗａｈｌ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８０：１５８７−１５９０  （１９９４）；  Ｍａｓｓａｇｕｅ，  Ｊ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６７：７５３−７９１  （１９９８）；  Ｃｈｅｎ，  Ｗ．  ａｎｄ  Ｗａｈｌ，  Ｓ．Ｍ．，  ＴＧＦ−β：  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｎｄ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，  Ｂａｓｅｌ：Ｋａｒｇｅｒ，  ｐｐ．  ６２−９１  （２００２）；  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｄ．Ａ．  ａｎｄ  Ｍａｓｓａｇｕｅ，  Ｊ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ８：３６９−３８０  （２００５））。癌においてＴＧＦ−β１が果たす役割は２つの側面がある。ＴＧＦ−βは腫瘍抑制物質及び生育抑制活性と認識されているが、多くの腫瘍がＴＧＦ−β１の生育抑制活性に対して耐性を発生させている（Ｙｉｎｇｌｉｎｇ，  Ｊ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ３（１２）：１０１１−１０２２  （２００４）；  Ａｋｈｕｒｓｔ，  Ｒ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １１（１１）：Ｓ４４−Ｓ５１  （２００１）；  Ｂａｌｍａｉｎ，  Ａ．  ａｎｄ  Ａｋｈｕｒｓｔ，  Ｒ．Ｊ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２８（６９８０）：２７１−２７２  （２００４））。樹立された腫瘍において、ＴＧＦ−β１の発現及び活性は、腫瘍の生存、進行及び転移の促進において関与している（Ａｋｈｕｒｓｔ，  Ｒ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １１（１１）：Ｓ４４−Ｓ５１  （２００１）；  Ｍｕｒａｏｋａ，  Ｒ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０９（１２）：１５５ｌ  （２００２）；  Ｙａｎｇ，  Ｙ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０９（１２）：１６０７−１６１５  （２００２））。これは、免疫監視機構、血管形成及び腫瘍間質圧力の増大に対するＴＧＦ−βの作用を含めた、局所的な腫瘍−支質環境におけるオートクリン及びパラクリンの両作用により媒介されていると仮定されている。現在、幾つかの研究で、ＴＧＦ−β１を抑制する抗腫瘍及び抗転移作用が示されている（Ａｋｈｕｒｓｔ，  Ｒ．Ｊ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０９（１２）：１５３３−１５３６  （２００２）；  Ｍｕｒａｏｋａ，  Ｒ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０９（１２）：ｌ５５ｌ  （２００２）；  Ｙｉｎｇｌｉｎｇ，  Ｊ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ３（１２）：１０１１−１０２２  （２００４）；  Ｙａｎｇ，  Ｙ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０９（１２）：ｌ６０７−１６１５  （２００２）；  Ｈａｌｄｅｒ，  Ｓ．Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ７（５）：５０９−５２１  （２００５）；  Ｉｙｅｒ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ４（３）：２６ｌ−２６６  （２００５））。
【０００７】
腫瘍における、特に腫瘍−支質の界面におけるαｖβ６の発現の増大は、ＴＧＦ−β１の局所的活性化に固有な機序、並びに腫瘍の生存、浸潤及び転移を促進する能力を反映する場合がある。ヒト転移における高レベルの発現は、転移の樹立におけるαｖβ６の潜在的な役割を示しており、これはαｖβ６が、上皮から間葉への転移、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける腫瘍細胞の浸潤、及び転移と相関する発現をマウスモデルにおいて媒介することができるという以前の報告と合致している（Ｂａｔｅｓ，  Ｒ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１５（２）：３３９−３４７  （２００５）；  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｇ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８７（８）：８５９−８６７  （２００２）；  Ｍｏｒｇａｎ，  Ｍ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９（２５）：２６５３３−２６５３９  （２００４））。
【０００８】
以前に本発明者等は、αｖβ６のヒト及びマウスの両型に結合し、αｖβ６のそのリガンドへの結合及びＴＧＦ−β１のαｖβ６媒介活性化を阻害する、強力且つ選択的な抗αｖβ６モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生成について報告している（Ｗｅｉｎｒｅｂ，  Ｐ．Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９（１７）：１７８７５−１７８８７  （２００４））。全体が参考として本明細書で援用される特許文献４にも記載の通り、αｖβ６に対する高親和性抗体は、このような抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）における重要アミノ酸残基の同定及び分析を含め、発見及び特徴付けされている。特にこれらの高親和性抗体は、（ａ）αｖβ６に特異的に結合し；（ｂ）αｖβ６のそのリガンド、例えばＩＣ５０値が１０Ｄ５の値よりも低いＬＡＰ、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びテナシンとの結合を抑制し（特許文献３）；（ｃ）ＴＧＦ−βの活性化を阻害し；（ｄ）αｖβ６への結合特異性をもたらすＣＤＲ中の特定のアミノ酸配列を含有し；（ｅ）β６サブユニットに特異的に結合し；及び／又は（ｆ）免疫染色操作法、例えばパラフィン包埋組織の免疫染色でαｖβ６認識する。
【０００９】
特許文献４には又、αｖβ６に結合する抗体を生物物理学的に異なるクラス及びサブクラスに分類できるという発見についても記載している。抗体の１つのクラスは、リガンド（例えばＬＡＰ）のαｖβ６への結合を阻害する能力を示す（ブロッカー）。このクラスの抗体は、更にカチオン依存性ブロッカー及びカチオン非依存性ブロッカーのサブクラスに分割することができる。カチオン依存性ブロッカーの一部は、アルギニン−グリシン−アスパルテート（ＲＧＤ）ペプチド配列を含有するのに対し、カチオン非依存性ブロッカーは、ＲＧＤ配列を含有しない。別のクラスの抗体は、αｖβ６に結合する能力を示すが、αｖβ６のリガンドへの結合は阻害しない（非ブロッカー）。
【００１０】
更に、特許文献４は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３が、αｖβ６への結合特異性をもたらす特定のアミノ酸配列からなる重軽鎖を含む抗体も開示している。第ＷＯ０３／１０００３３号は又、αｖβ６に特異的に結合するが潜時関連ペプチド（ＬＡＰ）へのαｖβ６の結合を抑制しない抗体、並びに同じエピトープに結合する抗体も提示している。
【００１１】
特許文献４は更に、ハイブリドーマ細胞６．１Ａ８、６．２Ｂ１０、６．３Ｇ９、６．８Ｇ６、６．２Ｂｌ、６．２Ａｌ、６．２Ｅ５、７．１Ｇ１０、７．７Ｇ５及び７．１Ｃ５、コード配列を含む単離された核酸、及び抗αｖβ６抗体のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドも開示している。特に特許文献４は、ハイブリドーマ６．１Ａ８、６．３Ｇ９、６．８Ｇ６、６．２Ｂｌ、６．２Ｂ１０、６．２Ａｌ、６．２Ｅ５、７．１Ｇ１０、７．７Ｇ５又は７．１Ｃ５により生成される抗体として重軽鎖ポリペプチド配列を含む抗αｖβ６抗体を開示している。ハイブリドーマの数種は、ブダペスト条約に基づきＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（“ＡＴＣＣ”；Ｐ．Ｏ．  Ｂｏｘ  １５４９，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１０８，  ＵＳＡ）に寄託されている。特にハイブリドーマクローン６．３Ｇ９及び６．８Ｇ６は、２００１年８月１６日に寄託され、それぞれ受入番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３６４９及びＰＴＡ−３６４５を有する。ハイブリドーマ６．３Ｇ９及び６．８Ｇ６により生成されるマウス抗体は、ヒト化抗体として開発する可能性に関して、本出願において更に検討する。
【００１２】
マウスモノクローナル抗体３Ｇ９は、ヒト可溶性αｖβ６で免疫化されたβ６インテグリン−／−マウス（Ｈｕａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １３３：９２１−９２８  （１９９６））から単離されたマウスＩｇＧ１  κ抗体である。３Ｇ９抗体は、傷害、線維症及び癌の間にアップレギュレートされたレベルで発現されるαｖβ６インテグリンエピトープを特異的に認識する（例えば、Ｔｈｏｍａｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １１７：６７−７３  （２００１）；  Ｂｒｕｎｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ３：２１５−２２６  （２００１）；  Ａｇｒｅｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８１：９０−９７  （１９９９）；  Ｂｒｅｕｓｓ，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０８：２２４１−２２５１  （１９９５）を参照）。これはその他のαｖインテグリンには結合せず、ヒト及びマウスの両分子に対して交差反応性を有する。マウスモノクローナル抗体３Ｇ９は、精製されたヒト可溶性αｖβ６への、又はβ６発現細胞へのリガンドの結合を阻害することから判断される通り、αｖβ６のＬＡＰへの結合を阻害し、これによりＴＧＦ−β受容体活性化の線維症促進活性を抑制することが報告されている（特許文献４を参照）。又、既知のαｖβ６抗体の１つである１０Ｄ５よりもＩＣ５０値が低いＴＧＦ−βのαｖβ６媒介活性化を抑制することも示されている（Ｈｕａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  ＣｅＩｌ  Ｓｃｉ．  １１１：２１８９  −２１９５  （１９９８））。
【００１３】
マウスモノクローナル抗体８Ｇ６は、特許文献４に記載の通り、αｖβ６インテグリンエピトープも認識するマウスＩｇＧ１  κ抗体である。マウスモノクローナル抗体８Ｇ６は、１０Ｄ５よりもＩＣ５０値が低いＴＧＦ−βのαｖβ６媒介活性化を抑制する能力を示す、αｖβ６のカチオン依存性高親和性ブロッカーである（特許文献４を参照）。
【００１４】
３Ｇ９及び８Ｇ６の両マウス抗体は、特許文献４に記載の通り、腎臓及び肺の線維症を予防するのに有効であった。更に、マウス抗体３Ｇ９は、ヒト腫瘍異種移植片モデルにおいて腫瘍成長を効果的に抑制することができ、癌の病理におけるαｖβ６の潜在的な役割、及びαｖβ６に指向された抗体を使用するこのような阻害の有効性が示唆されている。
【００１５】
従って、ヒトにおいてより抗原性が低く、αｖβ６経路に関与する疾患の処置において有用な場合があるαｖβ６抗体を開発することが必要とされている。組換えＤＮＡ法の出現により、抗体遺伝子を構造的に操作し、ハイブリドーマ技術では得られない特性を有する修飾された抗体分子を生成することが可能となった。治療現場において、本方法の１つの目的は、ヒトにおけるげっ歯類モノクローナル抗体の免疫原性を、それらの一次アミノ酸構造を修飾することによって低減することであった。免疫応答の誘導により、治療用抗体の排除の増進とそれに伴う薬効の損失から、極端な場合は致命的なアナフィラキシーにまで至る、一連の患者における有害作用を引き起こす可能性があることから、治療用抗体の免疫原性を低下させることが望まれている。
【００１６】
外来性モノクローナル抗体の免疫原性を低減する１つの方策は、モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖定常ドメインをヒト起源の類似ドメインで置き換えて、外来性抗体の可変領域ドメインに影響が及ばないようにすることであった。重軽鎖の可変領域ドメインは、抗体と抗原の間の相互作用を担っている。ヒト定常ドメインに連結したマウス可変ドメインを有するキメラ抗体分子は、通常キメラの由来元のマウス抗体と同じ親和性定数を有する抗原に結合する。このようなキメラ抗体は、その完全なマウス対応型よりもヒトにおける免疫原性が低い。それにもかかわらず、マウス可変ドメイン全体を維持する抗体は、患者のかなりの割合において免疫応答を誘発する傾向がある。
【００１７】
ヒトが全マウス可変ドメインに対して免疫応答を示すことは予測されたことであり、従って、より多いヒト特性を有する可変ドメインを得る取組みが、このような標準的なキメラ抗体の臨床試験結果が報告されるよりも前から開始されていた。「ヒト化」と呼ばれることが多い方法の１つの区分は、マウスとヒトの両特性を有する抗体可変ドメインを組換え構築することにより、マウスモノクローナル抗体の可変ドメインをよりヒト型に変換することを目的としている。ヒト化の方策は、抗体構造データの幾つかの合意された理解に基づいている。第１に、可変ドメインは、種内で保存されているが、進化的に遠い種同士（例えばマウスとヒト）の間では異なるペプチド配列の隣接地帯を含有する。第２に、その他の隣接地帯は、種内で保存されていないが、同じ個体内の抗体生成細胞の間でさえも異なる。第３に、抗体と抗原の接触は、主に可変ドメインの非保存領域を介して起こる。第４に、抗体可変ドメインの分子アーキテクチャーは、種の間で十分に類似することから、種間で対応するアミノ酸残基の位置が、実験データを使用せずに位置のみに基づいて特定される場合がある。
【００１８】
ヒト化の方策は、マウス配列に特徴的なアミノ酸残基をヒト抗体の対応する位置に存在する残基で置き換えることで、結果として得られる抗体のヒトにおける免疫原性を低下させることができるという前提に基づいている。しかしながら、種間の配列の置き換えると、通常は抗体によるその抗原への結合を低下させることになる。そのため、ヒト化の技術は、免疫原性を低下させるための元のマウス配列の置き換えと、ヒト化分子が抗原結合の治療的有用性を維持する必要性とのバランスを取ることにある。このバランスは２つの手法を使用して取られている。
【００１９】
特許文献５に例示されている１つの手法では、特徴的な点として、ヒト型である残基が、（ｉ）抗原との相互作用において有意な化学的役割を果たさず、（ｉｉ）側鎖が溶媒内に突出して配置されていることが判明している又は予測されているマウス可変ドメイン残基で置き換えられている。即ち、抗原結合部位から遠い外部残基をヒト化されるのに対して、内部残基、抗原結合残基、並びに可変ドメイン間の界面を形成する残基は、マウス型のままである。この手法の１つの欠点は、残基が抗原結合において有意な化学的役割を果たさず、特定の３次元抗体構造において溶媒内に配置されるかどうかを判定するために、かなり広範な実験データが必要となる点である。
【００２０】
特許文献６に例示されている別のより一般的な手法では、保存されていると考えられるマウス可変ドメインペプチド配列の隣接地帯が、ヒト抗体の対応する地帯で置換される。このより一般的な手法では、抗原結合に関与する非保存の領域を除いて、全ての可変ドメイン残基がヒト化される。置き換えに適切な隣接地帯を決定するに当たり、特許文献６では、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １３２（２）：２１１−２５０  （１９７０）にて以前に開発されている抗体可変ドメイン配列の分類を利用している。
【００２１】
Ｗｕ及びＫａｂａｔは、抗体ペプチド配列のアライメントを開拓しており、この点における両者の寄与は数倍にも及んでいる。第一に、Ｋａｂａｔ及びＷｕは、可変ドメイン間の配列類似性の研究を通して、全脊椎動物種の全抗体にわたってある程度は相同である対応する残基を同定した。これらは、同様の三次元構造を採用し、同様の機能的役割を果たし、近隣残基と同様に相互作用し、同様の化学的環境に存在することから、同定が可能であった。第２に、Ｋａｂａｔ及びＷｕは、相同の免疫グロブリン残基が同じ位置番号に割り付けられているペプチド配列番号付け系を考案した。当業者であれば、配列そのものを超えた何れかの実験データに依存することなく、通常Ｋａｂａｔ番号付けと呼ばれるものを何れかの可変ドメイン配列に明白に割り付けることができる。第３に、Ｋａｂａｔ番号を有する配列位置のそれぞれについて、Ｋａｂａｔ及びＷｕは可変性を計算した。この可変性とは、可変ドメイン配列がアラインされる場合における多少の可能なアミノ酸の発見を意味する。Ｋａｂａｔ及びＷｕは、４つの低可変性の隣接領域内に埋め込んだ３つの高可変性の隣接領域を同定した。その他の研究者等は、概ねこれらの領域（超可変領域）における可変性を以前に報告しており、高可変性領域が、抗原結合に使用されるアミノ酸残基を表すと提唱している。Ｋａｂａｔ及びＷｕは、これらの可変地帯を構成する残基を以前に区分けしており、これらを、抗体と抗原の間の化学的相補性を指す「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼んだ。抗原認識ではなく可変ドメインの３次元折り畳みにおける役割は、残余の低可変領域に起因するとされており、これは現在では「フレームワーク領域」と呼ばれている。第４に、Ｋａｂａｔ及びＷｕは、抗体ペプチド及び核酸配列の公的データベースを確立しており、これは現在でも継続して維持され、当業者に周知である。
【００２２】
Ｋａｂａｔの分類の使用において特許文献６に開示されるヒト化の方法は、１つの抗体由来のＣＤＲ、及び種、起源、特異性、サブクラス又はその他の特徴が異なる別の抗体由来のフレームワーク領域を含むキメラ抗体をもたらす。しかしながら、何れの特定の配列又は特性も、フレームワーク領域に起因するとはされておらず、実際に特許文献６では、何れのセットのフレームワークも何れのセットのＣＤＲと組み合わせることができると教示している。以来、フレームワーク配列は、良好な抗原結合を維持するのに必要な抗体の可変領域の三次元構造を与える上で重要であると認識されている。その後のこの分野の進歩は、対応するマウス抗体のアビディティと相対比較した場合の一部のヒト化抗体を使用した場合に観察される抗原に対するアビディティの喪失を取り扱う特許文献６の適用範囲内における改良となっている。
【００２３】
特許文献７は、抗体をヒト化するための特許文献６の１つの改良を開示しており、立体的又はその他の化学的な不適合成のためにマウス抗体内に存在する結合可能な構造へのＣＤＲの折り畳みを妨害するヒト化フレームワークにおける構造モチーフにおける問題点がアビディティ喪失の原因であるとする前提に基づいている。この問題を論じるために、特許文献７は、ヒト化するマウス抗体のフレームワーク配列に対して直鎖ペプチド配列において緊密に相同であるヒトフレームワーク配列を使用することを教示している。従って、特許文献７の方法は、種間のフレームワーク配列を比較することに焦点を置いている。一般的には、全ての使用可能なヒト可変ドメイン配列を特定のマウス配列と比較し、対応するフレームワーク残基の間の同一性パーセントを計算する。ヒト可変ドメインは、ヒト化プロジェクトのためのフレームワーク配列が提供されるように、最高パーセントを有するものが選択される。特許文献７は又、結合可能な構造においてＣＤＲを支持するのに重要なマウスフレームワーク由来の特定のアミノ酸残基を、ヒト化フレームワーク内で保持することが重要であるとも教示している。
【００２４】
その他の手法では、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２（６１６２）：３２３−３２７  （１９８８）に記載の通り、低アビディティのヒト化コンストラクトが得られた後に、単一残基をマウス配列に先祖返りさせ、抗原結合を試験することにより、特定のフレームワークアミノ酸残基の重要性が実験的に測定されている。フレームワーク配列におけるアミノ酸の重要性を同定する別の例の手法は、特許文献８及び特許文献９に開示されている。これらの参考文献は、ヒト化抗体においてはアビディティを維持するために対応するマウスアミノ酸との置換を必要とする場合があるフレームワーク内の特定のＫａｂａｔ残基位置を開示している。従って、一部がヒト型であり一部がマウス型である結果として構築されたフレームワークは、依然としてヒト免疫原性又は低下した抗原結合を示すことが多く、このため、治療的使用に好適なフレームワークを得るには、フレームワークの構築において数多くの反復が必要となる。
【００２５】
従って、ヒトにおいてより抗原性が低いαｖβ６抗体を開発することが当該技術分野で必要とされている。本発明は、αｖβ６に対する特異的な反応性を有するヒト化抗体の生成を提供する。本発明は又、このようなヒト化抗体を作成する方法であって、好適なヒトフレームワーク配列を確実に同定するヒト化抗体を提供することで、非ヒトＣＤＲ領域をサポートし、更にヒトにおいて高い抗原結合性と低い免疫原性を維持するヒト化抗体を提供することにより行われる方法も提供する。本発明は又、種々の疾患及び障害の処置、診断及び／又は予防における、このようなαｖβ６に対する反応性を有するヒト化抗体の使用も提供する。
【特許文献１】米国特許第６，７８７，３２２Ｂ２号明細書
【特許文献２】米国特許第６，６９２，７４１Ｂ２号明細書
【特許文献３】国際公開第９９／０７４０５号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０３／１０００３３号パンフレット
【特許文献５】米国特許第５，８６９，６１９号明細書
【特許文献６】米国特許第５，２２５，５３９号明細書
【特許文献７】米国特許第５，６９３，７６１号明細書
【特許文献８】米国特許第５，８２１，３３７号明細書
【特許文献９】米国特許第５，８５９，２０５号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、αｖβ６に対する高親和性ヒト化抗体の発見及び特徴付け、例えばこのような抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）における中核的なアミノ酸の同定及び分析、並びにフレームワーク配列における重要なアミノ酸残基の同定及び分析に少なくとも部分的に基づいている。
【００２７】
一実施形態において、本発明は、αｖβ６インテグリンに対する結合特異性を有するヒト化モノクローナル抗体であって、該抗体がそれぞれ配列番号１及び配列番号２の重軽鎖可変ドメインを含む抗体に関する。このようなヒト化抗体は、マウス３Ｇ９抗体のヒト化に由来する。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３が配列番号１のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６５及び９８〜１０９によりそれぞれ定義される重鎖を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、ＣＤＲ１、２及び３が配列番号２のアミノ酸残基２４〜３５、５１〜５７及び９０〜９８によりそれぞれ定義される軽鎖を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、フレームワーク領域（ＦＲ）１、２、３及び４が配列番号１のアミノ酸残基１〜３０、３６〜４９、６６〜９７及び１１０〜１２０によりそれぞれ定義される重鎖を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、フレームワーク領域（ＦＲ）１、２、３及び４が配列番号２のアミノ酸残基１〜２３、３６〜５０、５８〜８９及び９９〜１０８によりそれぞれ定義される軽鎖を含む。
【００２８】
特定の実施形態において、ヒト化抗体は、配列番号１のＱ３Ｍ及びＮ７４Ｓからなる重鎖アミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、配列番号２のＥ１Ｑ、Ｌ４７Ｗ、Ｉ５８Ｖ、Ａ６０Ｖ及びＹ８７Ｆからなる軽鎖アミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含む。
【００２９】
特定の実施形態において、ヒト化抗体は、重鎖が配列番号１のアミノ酸置換Ｑ３Ｍ及びＮ７４Ｓからなる重鎖型１（「ＨＶ１」）を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、重鎖が配列番号１のアミノ酸置換Ｎ７４Ｓからなる重鎖型２（「ＨＶ２」）を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、重鎖が配列番号１からなる重鎖３型（「ＨＶ３」）を含む。
【００３０】
特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖が配列番号２のアミノ酸置換Ｌ４７Ｗ、Ｉ５８Ｖ、Ａ６０Ｖ及びＹ８７Ｆからなる軽鎖型１（「ＬＶ１」）を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖が配列番号２のアミノ酸置換Ｌ４７Ｗ及びＩ５８Ｖからなる軽鎖型２（「ＬＶ２」）を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖が配列番号２のアミノ酸置換Ｌ４７Ｗからなる軽鎖３型（「ＬＶ３」）を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖が配列番号２のアミノ酸置換Ｅ１Ｑ及びＬ４７Ｗからなる軽鎖型４（「ＬＶ４」）を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖が配列番号２からなる軽鎖５型（「ＬＶ５」）を含む。
【００３１】
特定の実施形態において、ヒト化抗体は、重鎖が配列番号１からなるＨＶ３、及び軽鎖が配列番号２からなるＬＶ５を含む重軽鎖可変ドメインを含む。
【００３２】
特定の実施形態において、ヒト化抗体は、マウス６．３Ｇ９抗体に由来するＣＤＲを有する（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−３６４９）。
【００３３】
関連する実施形態において、本発明は又、αｖβ６インテグリンに対する結合特異性を有するヒト化モノクローナル抗体であって、抗体が配列番号３及び配列番号４の重軽鎖可変ドメインを含む抗体にも関する。このようなヒト化抗体は、マウス８Ｇ６抗体のヒト化に由来する。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３が配列番号３のアミノ酸残基（即ち一部の保存された変異を除く）３１〜３５、５０〜６６及び９９〜１１５によりそれぞれ定義される重鎖を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、ＣＤＲ１、２及び３が配列番号４のアミノ酸残基２４〜３８、５４〜６０及び９３〜１０１によりそれぞれ定義される軽鎖を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、フレームワーク（ＦＲ）１、２、３及び４が配列番号３のアミノ酸残基１〜３０、３６〜４９、６７〜９８及び１１６〜１２６によりそれぞれ定義される重鎖を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、ＦＲ１、２、３及び４が配列番号４のアミノ酸残基１〜２３、３９〜５３、６１〜９２及び１０２〜１１１によりそれぞれ定義される軽鎖を含む。
【００３４】
特定の実施形態において、ヒト化抗体は配列番号３のＡ２４Ｇ、Ｇ２６Ｓ、Ｑ３９Ｌ、Ｍ４８Ｉ、Ｖ６８Ａ、Ｒ７２Ｖ及びＴ７４Ｋからなる重鎖アミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は配列番号４のＥ１Ｄ、Ｌ４６Ｆ及びＹ４９Ｋからなる軽鎖アミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含む。
【００３５】
特定の実施形態において、ヒト化抗体は重鎖型１（「ＨＶ１’」）を含み、重鎖は配列番号３のアミノ酸置換Ａ２４Ｇ、Ｇ２６Ｓ、Ｑ３９Ｌ、Ｍ４８Ｉ、Ｖ６８Ａ、Ｒ７２Ｖ及びＴ７４Ｋからなる。特定の実施形態において、ヒト化抗体は重鎖型２（「ＨＶ２’」）を含み、重鎖は配列番号３のアミノ酸置換Ｍ４８Ｉ、Ｖ６８Ａ、Ｒ７２Ｖ及びＴ７４Ｋからなる。特定の実施形態において、ヒト化抗体は重鎖３型（「ＨＶ３’」）を含み、重鎖は配列番号３のアミノ酸置換Ｖ６８Ａ、Ｒ７２Ｖ及びＴ７４Ｋからなる。
【００３６】
特定の実施形態において、ヒト化抗体は軽鎖型１（「ＬＶ１’」）を含み、軽鎖は配列番号４のアミノ酸置換Ｅ１Ｄ、Ｌ４６Ｆ及びＹ４９Ｋからなる。特定の実施形態において、ヒト化抗体は軽鎖型２（「ＬＶ２’」）を含み、軽鎖は配列番号４のアミノ酸置換Ｌ４６Ｆ及びＹ４９Ｋからなる。特定の実施形態において、ヒト化抗体は軽鎖３型（「ＬＶ３’」）を含み、軽鎖は配列番号４のアミノ酸置換Ｙ４９Ｋからなる。
【００３７】
特定の実施形態において、ヒト化抗体は、マウス６．８Ｇ６抗体に由来するＣＤＲを有する。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、αｖβ６への結合においてマウス８Ｇ６抗体と競合することができる。
【００３８】
本発明は又、上述の抗体の何れかと同じエピトープに結合するヒト化抗体を包含する。
【００３９】
本発明は又、ヒト化抗体をコードする核酸を含む組換えベクターにより生成される該抗体を包含する。特定の実施形態において、組換えベクターはｐＫＪＳ１９５（配列番号５）、ｐＫＪＳ１８９（配列番号６）及びｐＫＪＳ１９６（配列番号７）からなる群より選択されるプラスミドである場合がある。
【００４０】
本発明は又、配列番号１〜７の何れか１つのコード配列を含む、単離された核酸及び配列番号１〜７の何れか１つのアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを包含する。
【００４１】
本発明は又、上述のヒト化抗体の何れかの核酸を含む組換えベクターを包含する。
【００４２】
本発明は又、上述のヒト化抗体の何れかの核酸を含む組換えベクターを含む宿主細胞を包含する。
【００４３】
本発明は又、本発明のヒト化抗体１つ以上及び薬学的に許容される担体を含む組成物を包含する。これらの組成物の一部においては、ヒト化抗体は毒素又は放射性核種のような細胞毒性因子（即ち細胞の生存性及び／又は機能を損傷させる薬剤）にコンジュゲートする。組成物は疾患を処置（例えば軽減、緩和、低減、予防、発症延期）するためにαｖβ６により媒介される疾患を有する、又は有する危険性がある被験体（例えばヒトのような哺乳動物）に投与できる。このような疾患の例には、線維症（例えば硬皮症、瘢痕化、肝線維症、肺線維症又は腎線維症）；乾癬；癌（本明細書において別途記載、例えば上皮癌；口腔癌、皮膚癌、子宮頚癌、卵巣癌、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、肺癌、乳癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌又は結腸直腸癌）；アルポート症候群；肺、肝臓、腎臓及び他の内臓の急性及び慢性の傷害；及び肺、肝臓、腎臓及び他の内臓の硬化症が含まれるが、これらに限定されない。このような疾患を有する危険性は、遺伝的素因；特定の生活様式、例えば喫煙及びアルコール症；アスベストのような環境汚染物質への曝露；生理学的病態、例えば糖尿病、肝炎、ウィルス感染（例えばＣ型肝炎ウィルス感染）、自己免疫疾患；及び医療処置、例えば放射線処置に起因するものである場合がある。
【００４４】
本発明は又、ヒト化抗体の発現に適切な条件下で上記宿主細胞の何れかを培養することにより、上記ヒト化抗体の何れかを調製する方法であって、ヒト化抗体鎖が発現され、ヒト化抗体が生成される、方法も包含する。特定の実施形態において、本方法は、ヒト化抗体を単離する手順を更に含む。特定の実施形態において、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
【００４５】
ハイブリドーマクローン６．３Ｇ９及び６．８Ｇ６は、ブダペスト条約に基づきＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（“ＡＴＣＣ”；Ｐ．Ｏ．  Ｂｏｘ  １５４９，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１０８，  ＵＳＡ）に２００１年８月１６日に寄託されており、それぞれ受入番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３６４９及び−３６４５を有する。
【００４６】
本発明のヒト化抗体は、完全な抗体、例えば２重鎖及び２軽鎖を含む抗体を指すか、又は完全な抗体の抗原結合フラグメント、例えばＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦ（ｖ）フラグメントを指す。本発明のヒト化抗体は、何れかのアイソタイプ及びサブタイプ、例えばＩｇＡ（例えばＩｇＡｌ及びＩｇＡ２）、ＩｇＧ（例えばＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭであってもよく、この場合、免疫グロブリンの軽鎖は、κ型である場合もあれば、λ型である場合もある。
【００４７】
幾つかの実施形態において、本発明のヒト化抗体は、抗体の抗原結合能力に影響することなく抗体のエフェクター機能（例えばＦｃ受容体又は補体因子に結合する抗体の能力）が改変されるように重鎖の特定の位置の１つ以上（例えば２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ）において突然変異（例えば欠失、置換又は付加）を含む場合がある。
【００４８】
他の実施形態において、本発明のヒト化抗体は、グリコシル部位が排除されるようにグリコシル化のための部位であるアミノ酸残基において突然変異を含有する場合がある。このようなヒト化抗体は、臨床上有益な低減されたエフェクター機能又は他の望ましくない機能を有するが、抗原結合親和性は保持する。グリコシル化部位の突然変異は又、プロセスの開発（例えばタンパク質発現及び精製）にも有益である。
【００４９】
本発明の特定の実施形態において、ヒト化抗体は、自身のＣＤＲがマウス３Ｇ９抗体に由来するアグリコシル軽鎖を含む。特定の実施形態において、ヒト化３Ｇ９抗体はＣＤＲ１領域が配列番号２のアミノ酸残基２６においてアスパラギン（Ｎ）からセリン（Ｓ）への置換を含有する軽鎖可変ドメインを含有する。マウス３Ｇ９ＣＤＲ１領域はこのアミノ酸部位においてアスパラギンを含有する。しかしながら、３Ｇ９抗体のヒト化型においては、５種類の軽鎖型（ＬＶ１、ＬＶ２、ＬＶ３、ＬＶ４及びＬＶ５）が全て、この位置において３Ｇ９ＣＤＲ１内にセリンを含有する。ヒト化３Ｇ９抗体の全軽鎖型におけるこの部位のアグリコシル化はタンパク質発現及び軽鎖精製の両方のために有益であることが解っている。特定の実施形態において、ヒト化３Ｇ９抗体は正常なＦｃ受容体結合のために通常は必要であるグリコシル化部位において突然変異を含有する。特定の実施形態において、ヒト化３Ｇ９抗体はアスパラギン（Ｎ）からグルタミン（Ｑ）へのアミノ酸置換を含有する。特定の実施形態において、ヒト化３Ｇ９抗体はプラスミドｐＫＪＳ１９６（配列番号７）を含む組換えベクターにより生成される重鎖３型（ＨＶ３）においてＮからＱへのアミノ酸置換を含有する。特定の実施形態において、ＮからＱへのアミノ酸置換は配列番号７のアミノ酸残基３１９において起こる。ヒト化３Ｇ９抗体の重鎖３型（ＨＶ３）におけるコン部位のアグリコシル化はヒト化抗体の抗原結合親和性に影響することなく正常なＦｃ受容体結合に必要なグリコシル化シグナルを除去することがわかっている。特定の実施形態において、ヒト化３Ｇ９抗体はプラスミドｐＫＪＳ１８９（配列番号６）を含む組換えベクターにより生成される重鎖３型（ＨＶ３）及びプラスミドｐＫＪＳ１９５（配列番号５）を含む組換えベクターにより生成される軽鎖５型（ＬＶ５）を含む。特定の実施形態において、ヒト化３Ｇ９抗体はプラスミドｐＫＪＳ１９６（配列番号７）を含む組換えベクターにより生成されるアグリコシル重鎖３型（ａ−ＨＶ３）及びプラスミドｐＫＪＳ１９５（配列番号５）を含む組換えベクターにより生成される軽鎖５型（ＬＶ５）を含む。
【００５０】
更に別の実施形態において、重鎖又は軽鎖は親和性又は力価を増大させる突然変異を含有できる。
【００５１】
本発明のヒト化抗体はαｖβ６のそのリガンド、例えばＬＡＰ及びフィブロネクチンへの結合により媒介される何れかの臨床的に望ましくない病態又は疾患（本明細書において考察する通り）を処置するのに有用である。これらのヒト化抗体は、より高い親和性又はアビディティ、及びリガンドへの結合のカチオン依存性又は非依存性により、以前より知られているαｖβ６抗体よりも強力であってもよい。マウスモノクローナル抗体とは対照的に、本発明のヒト化抗体は被験体、特にヒトの身体において抗マウス免疫グロブリン抗体生成を誘発せず、むしろ、延長された血半減期を示し、有害作用の頻度が低下しており、このため、αｖβ６により媒介される疾患の処置における薬効においてマウスモノクローナル抗体よりも優秀であることが期待される。
【００５２】
別の態様において、本発明は、αｖβ６結合抗体のようなαｖβ６結合リガンドを使用した癌を診断、処置及び予防する方法に関する。一実施形態において、本発明は、患者における原発腫瘍の二次的な位置への転移を低減又は予防する方法であって、原発腫瘍内の１つ以上の細胞上のインテグリンαｖβ６の１つ以上のサブユニットに結合する１つ以上のリガンドの治療有効量を患者に投与する工程を含み、リガンドのインテグリンへの結合は腫瘍細胞の死滅、化学的感受性又は浸潤性の低下をもたらす、方法を提供する。関連する実施形態において、本発明は、患者における転移前腫瘍から転移腫瘍への進行を低減又は予防する方法であって、転移前腫瘍内の１つ以上の細胞上のインテグリンαｖβ６の１つ以上のサブユニットに結合する１つ以上のリガンドの治療有効量を患者に投与する工程を含み、リガンドのインテグリンへの結合は原発腫瘍を囲む組織区域内への転移前癌細胞の浸潤の低減又は予防をもたらす、方法を提供する。本発明の特定のこのような実施形態において、腫瘍細胞は癌腫、例えば腺癌である。より特定される実施形態において、癌腫は乳癌腫、子宮内膜癌腫、膵臓癌腫、結腸直腸癌腫、肺癌腫、卵巣癌腫、子宮頚癌腫、前立腺癌腫、肝臓癌腫、食道癌腫、頭頚部癌腫、胃癌腫及び脾臓癌腫である。より特定すれば、癌腫は乳癌（例えば限定しないが上皮内乳癌腫(in situ breast carcinoma)、例えば上皮内腺管癌（ＤＣＩＳ）又は上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ））、子宮内膜癌腫、膵臓癌腫、結腸直腸癌腫、子宮頚癌腫又は肺癌腫である。
【００５３】
本発明のこの態様による好適な実施形態は、αｖβ６結合抗体又はそのαｖβ６エピトープ結合フラグメントであるαｖβ６インテグリン結合リガンドを使用する。特定のこのような実施形態によれば、抗体はモノクローナル抗体（キメラ、霊長類化又はヒト化である場合がある）、例えば全体が参考として本明細書で援用される米国特許出願公開第２００５／０２５５１０２Ａｌ号に開示されているものである。好適なこのような抗体には、１Ａ８、３Ｇ９、８Ｇ６、２Ｂｌ、２Ｂ１０、２Ａｌ、２Ｅ５、１Ｇ１０、７Ｇ５、１Ｃ５、１０Ｄ５（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１２３８２）及びＣＳβ６と標記されたαｖβ６結合モノクローナル抗体並びにそのフラグメント、キメラ及びハイブリッドが含まれるが、これらに限定されない。本発明のこのような実施形態における使用に特に好適なものは、モノクローナル抗体３Ｇ９及び８Ｇ６である。又、本発明のこのような実施形態における使用に同様に特に好適なものは、ヒト化モノクローナル抗体、例えばｈｕ３Ｇ９（ＢＧ０００１１）と呼ばれるヒト化３Ｇ９抗体、及びｈｕ８Ｇ６と呼ばれるヒト化８Ｇ６抗体である。
【００５４】
本発明のこのような特定の治療実施形態において、αｖβ６結合リガンド（例えばαｖβ６結合抗体）は、細胞又は組織上の１つ以上のαｖβ６インテグリンへのαｖβ６結合リガンド−毒性化合物コンジュゲートの結合時に細胞又は組織の死滅をもたらす、又は誘発する１つ以上の細胞毒性化合物又は薬剤とコンジュゲート又は結合させる。本発明の追加の治療実施形態において、αｖβ６結合リガンド（例えばαｖβ６結合抗体）は、１つ以上のこのような細胞毒性化合物又は薬剤と組み合わせて患者に投与される。本発明のこれらの態様に従って好適に使用することができる細胞毒性の化合物又は薬剤には、細胞毒性因子（例えばシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、メルファラン、ドキソルビシン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、エトポシド、メクロレタミン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、カリケアマイシン、マイタンシン、トリコテネ(trichothene)、ＣＣ１０６５、ジフテリアＡ鎖、緑膿菌外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシン(dianthin)タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質、モモルジカ・チャランティア（momordicacharantia）阻害物質、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サポナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)阻害物質、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)、トリコテセン(tricothecene)、リボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼ）、放射性同位体（例えば２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、並びにＬｕの放射性同位体）及びプロドラッグ活性化酵素（例えばアルカリホスファターゼ、アリールスルファターゼ、シトシンデアミナーゼ、プロテアーゼ、Ｄ−アラニルカルボキシペプチダーゼ、炭水化物開裂酵素、Ｐ−ラクタマーゼ及びペニシリンアミダーゼ）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、αｖβ６インテグリン結合１つ以上のリガンドは、αｖβ６インテグリン結合１つ以上のリガンドの有効量及び１つ以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む薬学的組成物の形態で患者に投与する。αｖβ６インテグリン結合１つ以上のリガンド、及び／又はαｖβ６インテグリン結合１つ以上のリガンドを含む薬学的組成物は、薬学的組成物を投与する何れかの好適な様式、例えば限定しないが経口投与、非経口投与（例えば筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下の経路による）、頭蓋内投与、経皮投与、肺内投与及び鼻内投与により患者に投与できる。
【００５５】
別の実施形態において、本発明は、浸潤性癌腫に進行する可能性がより高い、及び／又は、インテグリンαｖβ６の１つ以上のサブユニットに結合するリガンドを使用した処置に応答する可能性がより高い、腺癌のような癌腫を診断又は発見する方法を提供する。このような好適な方法は、例えば、（ａ）腫瘍又はその一部分を含む癌性上皮組織試料、及び非癌性上皮組織試料を患者から得る；（ｂ）インテグリンαｖβ６の１つ以上のサブユニットに結合する１つ以上のリガンドに組織試料を接触させる；及び（ｃ）組織試料におけるインテグリンαｖβ６の発現レベルを測定することを含む場合があり、非癌性組織試料におけるインテグリンαｖβ６の発現レベルに比べて癌性組織試料におけるインテグリンαｖβ６の発現レベルが増大していることは、（ａ）ｉｎ  ｓｉｔｕ又は非浸潤性の形態から浸潤性の転移性形態に進行する可能性がより癌種；及び／又は（ｂ）αｖβ６結合リガンド、特に、上述のような１つ以上の細胞毒性化合物又は薬剤にコンジュゲートされるかこれと組み合わせて投与されるαｖβ６結合リガンドの結合に依存している上述の処置方法の１つ以上による処置に応答する可能性がより高い癌腫が患者に存在することを示す。このような方法は、種々の癌腫、例えば限定しないが上述の上皮組織が関与するものを診断又は発見するのに好適である。特定のこのような実施形態において、インテグリンαｖβ６の１つ以上のサブユニットに結合するリガンドはαｖβ６インテグリン結合抗体（上述のようなモノクローナル抗体である場合がある）又はそのαｖβ６エピトープ結合フラグメントである。本発明のこのような診断方法における使用に特に好適なものは、検出可能に標識された、即ち、発色原標識（例えばジアミノベンジジン又は４−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸）、酵素標識（例えばリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ又はアセチルコリンエステラーゼ）、放射性同位体標識（例えば３Ｈ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、１５２Ｅｕ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ又は１０９Ｐｄ）、非放射性同位体標識（例えば１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｔｒ、５６Ｆｅ、９９ｍＴｃ又は１１２Ｉｎ）、蛍光標識（例えば１５２Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリスリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）標識、ｏ−フタルデヒド標識又はフルオレサミン標識）、毒性標識（例えばジフテリア毒素標識、リシン標識又はコレラ毒素標識）、化学発光標識（例えばルミノール標識、イソルミノール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識又はエクオリン標識）、Ｘ線撮影用標識（例えばバリウム又はセシウム）、スピンラベル（例えば重水素）及び核磁気共鳴造影剤標識（例えばＧｄ、Ｍｎ及び鉄）のような少なくとも１つの検出可能な標識を含むか、それにコンジュゲートされるか、又はそれに結合された、αｖβ６結合リガンド（例えば抗体）である。
【００５６】
別の実施形態において、本発明は、患者におけるαｖβ６陽性転移腫瘍細胞を排除する方法であって、１つ以上のαｖβ６陽性転移腫瘍細胞上のインテグリンαｖβ６の１つ以上のサブユニットに結合する１つ以上のリガンドの治療有効量を患者に投与する工程を含み、リガンドのインテグリンへの結合は転移腫瘍細胞の死滅、化学的感受性又は浸潤性の低下をもたらす、方法を提供する。このような方法は、転移性の癌腫、例えば限定しないが上述の上皮組織が関与するものから生じるもののような、患者における種々の転移腫瘍細胞を排除するのに好適である。本発明のこの態様による好適な実施形態は、上述のαｖβ６結合抗体又はそのαｖβ６エピトープ結合フラグメント、特にモノクローナル抗体又はその変異型又はフラグメントであるαｖβ６インテグリン結合リガンドを使用する。本発明の特定のこのような治療実施形態において、αｖβ６結合リガンド（例えばαｖβ６結合抗体）は細胞又は組織上の１つ以上のαｖβ６インテグリンへのαｖβ６結合リガンド−毒性化合物コンジュゲートの結合時に細胞又は組織の死滅をもたらす、又はそれを誘発する１つ以上の細胞毒性化合物又は薬剤とコンジュゲート又は結合させる。本発明の別の治療実施形態において、αｖβ６結合リガンド（例えばαｖβ６結合抗体）は１つ以上の細胞毒性化合物又は薬剤と組み合わせて患者に投与する。本発明のこれらの態様に従って好適に使用することができる細胞毒性の化合物又は薬剤には、上述の細胞毒性因子、放射性同位体及びプロドラッグ活性化酵素が含まれるが、これらに限定されない。本発明のこの態様によれば、αｖβ６インテグリン結合リガンド又はリガンド及び１つ以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む薬学的組成物は、上述の投与様式に従って患者に投与できる。
【００５７】
別の実施形態において、本発明は、患者の組織又は臓器から腫瘍を外科的に摘出した後に前記患者から残存するαｖβ６陽性腫瘍細胞を排除する方法であって、前記組織又は臓器に残存する１つ以上の腫瘍細胞上のインテグリンαｖβ６の１つ以上のサブユニットに結合する１つ以上のリガンドの治療有効量を前記患者に投与する工程を含み、前記リガンドの前記インテグリンへの結合が、前記腫瘍細胞の死滅、化学的感受性又は浸潤性の低下をもたらす、方法を提供する。このような方法は、癌腫、例えば限定しないが上述の上皮組織が関与するものから生じるもののような、種々の患者組織における種々の転移腫瘍細胞を排除するのに好適である。本発明のこの態様による好適な実施形態は、上述のαｖβ６結合抗体又はそのαｖβ６エピトープ結合フラグメント、特にモノクローナル抗体又はその変異型又はフラグメントであるαｖβ６インテグリン結合リガンドを使用する。本発明の特定のこのような治療実施形態において、αｖβ６結合リガンド（例えばαｖβ６結合抗体）は細胞又は組織上の１つ以上のαｖβ６インテグリンへのαｖβ６結合リガンド−毒性化合物コンジュゲートの結合時に細胞又は組織の死滅をもたらす、又はそれを誘発する１つ以上の細胞毒性化合物又は薬剤とコンジュゲート又は結合させる。本発明のこれらの態様に従って好適に使用することができる細胞毒性の化合物又は薬剤には、上述の細胞毒性因子、放射性同位体及びプロドラッグ活性化酵素が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
本発明のその他の好ましい実施形態は、以下の図面及び本発明の説明及び特許請求の範囲を鑑みれば、当業者に明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと同様又は同等である如何なる方法及び物質も、本発明の実施又は試験で使用することができるが、好ましい方法及び物質を以下に説明する。以下には例示的な方法及び物質を記載するが、本明細書に記載のものと同様又は同等である方法及び材料も、本発明の実施で使用することができる。本明細書に記載する全ての刊行物及びその他の参考文献は全て、全体が参考として援用される。矛盾がある場合は、本明細書が定義を含めて優先される。物質、方法及び実施例は、単に例示するものであり、限定するものとは意図されない。本明細書全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、或いは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変化形は、記載した整数又は整数群を包含することを意味し、その他何れかの整数又は整数群を除外することを意味しないものとして理解されるであろう。
【００６０】
定義
「約」：何れかの数値を指す場合に本明細書で使用する場合、「約」という用語は、記載した値の±１０％の値を意味する（例えば「約５０℃」とは両端を含む４５℃〜５５℃の温度範囲を包含し；同様に「約１００ｍＭ」とは両端を含む９０ｍＭ〜１１０ｍＭの濃度範囲を包含する）。
【００６１】
「拮抗物質」：本明細書で使用される「拮抗物質」という用語は、細胞、組織又は生物中のαｖβ６インテグリンの生物学的及び／又は生理学的作用を低減、実質的に低減又は完全に抑制する化合物、分子、部分又は複合体を指す。αｖβ６に対するリガンドである場合がある拮抗物質は、種々の方法でこのような作用を発揮する場合があり、これらの方法には、細胞表面上のαｖβ６への結合において他のリガンドと競合する方法；その他のリガンドに結合するインテグリンの能力を低減、実質的に低減又は抑制するようにαｖβ６と相互作用する方法；その他のリガンドがもはや結合できない（又は低減又は実質的に低減した親和性及び／又は効率においてのみ結合できる）構造をインテグリンが採るように細胞表面αｖβ６に結合するかその構造変化を誘導する方法；その他のリガンドの結合又はこのようなリガンドにより細胞上のαｖβ６への結合時に誘導される生理学的シグナルが低減、実質的に低減又は完全に抑制されるように、細胞、組織又は生物において、生理学的変化（例えば、細胞内シグナル伝達複合体の増大；転写阻害物質の増大；細胞表面αｖβ６発現の低減等）を誘導する方法；及び当業者が熟知するであろう、拮抗物質がその活性を実行するその他の機序、が含まれるが、これらに限定されない。当業者が理解する通り、拮抗物質は、それが拮抗する別のαｖβ６結合部分（例えばαｖβ６結合リガンド）と同様の構造を有する場合もあれば（例えば、拮抗物質は作動物質のムテイン、変異型、フラグメント又は誘導体である場合がある）、完全に無関係の構造を有する場合もある。
【００６２】
「結合」：本明細書で使用される「結合した」という用語は、共有結合、例えば化学共役によるもの、又は非共有結合、例えばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合等である場合がある結合又は連結を指す。共有結合は、例えばエステル、エーテル、ホスホエステル、チオエステル、チオエーテル、ウレタン、アミド、アミン、ペプチド、イミド、ヒドラゾン、ヒドラジド、炭素−硫黄結合、炭素−リン結合等であってもよい。「結合」という用語は、「共役」、「コンジュゲート」及び「連結」等のような用語よりも広義であり、これらを包含する。
【００６３】
「コンジュゲート／コンジュゲーション」：本明細書で使用される「コンジュゲート」とは、αｖβ６に結合するリガンド、例えばαｖβ６結合抗体又はそれらのフラグメントへのある部分、例えば化学物質又は放射性同位体の共有結合による産物を指す。「コンジュゲーション」とは、前文において定義したコンジュゲートの形成を指す。タンパク質又はポリペプチド（抗体を含む）のような生物学的活性物質への化学物質又は放射性同位体のコンジュゲーションの技術分野における当業者により通常使用される方法は何れも、本発明で使用することができる。
【００６４】
「疾患、障害、病態」：本明細書で使用される「疾患」又は「障害」という用語は、腫瘍、癌、アレルギー、依存症、自己免疫、感染、中毒又は最適な精神又は身体の機能の減損を含めたヒト又は動物の何れかの有害病態を指す。本明細書で使用される「病態」は、疾患及び障害を含むが、生理学的病態も指す。例えば生殖性は生理学的病態であるが、疾患又は障害ではない。従って、生殖性を減少させることによる妊娠の予防に好適な本発明の組成物は、病態（生殖性）の処置として記載されるが、障害又は疾患の処置とは記載されない。その他の病態については、当業者の知る通りである。
【００６５】
「有効量」：本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望の生物学的作用を実現するために必要又は十分である所定の化合物、コンジュゲート又は組成物の量を指す。本発明の方法による所定の化合物、コンジュゲート又は組成物の有効量は、この選択された結果を達成する量であると考えられ、このような量は、不必要な実験を必要とすることなく、当該技術分野で既知の及び／又は本明細書に記載の試験を使用して、当業者が日常的に決定することができる。例えば、癌の転移を処置又は予防するのに有効な量は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍細胞の基底膜又は内皮層への遊走及び浸潤を予防するのに必要な量であると考えられる。本用語は又、「十分な量」とも同義である。何れかの特定の用途に有効な量は、処置する疾患、障害又は病態、投与する特定の組成物、投与経路、被験体の体格、及び／又は疾患又は病態の重症度のような因子により異なる可能性がある。本発明の特定の化合物、コンジュゲート又は組成物の有効量は、不必要な実験を必要とすることなく、本明細書に示す指針に従って、当業者が経験的に決定することができる。
【００６６】
「１つ」：本開示内容において「１つ」という用語を使用する場合、特に記載がない限り、「少なくとも１つ」又は「１つ以上」を意味する。即ち、「１つ」、「１つ以上」及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書で交換可能に使用できる。
【００６７】
「ペプチド、ポリペプチド、タンパク質」：本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、単一の「ポリペプチド」並びに複数の「ポリペプチド」を包含することを意図しており、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）により線状に連結された単量体（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、複数のアミノ酸の何れかの鎖を指し、特定の長さの産物を指すわけではない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」又は複数のアミノ酸の鎖を指すために使用されるその他何れかの用語は、「ポリペプチド」の定義に包含され、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語の何れかの代わりに、又はそれと交換可能に使用される場合がある。「ポリペプチド」という用語は又、ポリペプチドの発現後の修飾、例えば限定しないが、グリコシル化、アセチル化、ホスホリル化、アミド化、既知保護／阻害基による誘導体化、タンパク質分解開裂、又は非天然のアミノ酸による修飾の産物を指すことも考慮する。ポリペプチドは天然の生物学的原料に由来する場合もあれば、組換え技術により生成される場合もあるが、所定の核酸配列から必ずしも翻訳されるわけではない。これは、化学合成を含めた何れかの様式で生成される場合がある。この定義によれば、本発明で使用されるポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１０００以上、又は２０００以上のアミノ酸のサイズのものである場合がある。ポリペプチドは、所定の３次元構造を有する場合があるが、このような構造を必ずしも有するわけではない。所定の３次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれているとも呼ばれ、所定の３次元構造を有さず、むしろより多くの数の異なる構造を採用することができるポリペプチドは、折り畳まれていないと呼ばれる。本明細書で使用される糖タンパク質という用語は、アミノ酸残基、例えばセリン残基又はアスパラギン残基の酸素含有又は窒素含有側鎖を介してタンパク質に連結している少なくとも１つの炭水化物部分に共役されたタンパク質を指す。本発明に従って使用される好ましいポリペプチドには、αｖβ６上の１つ以上のエピトープを認識してそれに結合する抗体（特にモノクローナル抗体）を含むがこれに限定されない、リガンドであるポリペプチド、又は細胞表面上のαｖβ６インテグリンに結合するポリペプチドが含まれる。
【００６８】
「単離された」ポリペプチド又はそのフラグメント、変異型又は誘導体とは、その天然の存在域周囲にはないポリペプチドを考慮する。精製の特定のレベルは必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、そのネイティブ又は天然の環境から取り出してもよい。組換えより生成されるポリペプチド及び宿主細胞に発現されるタンパク質は、何れかの好適な技法により分離、分画又は部分的又は実質的に精製されている天然又は組換えポリペプチドと同様に、本発明において単離されたと考えられる。
【００６９】
同様に本発明のポリペプチドとして含まれるものには、上述のポリペプチドのフラグメント、誘導体、類縁体又は変異型及び何れかのこれらの組み合わせがある。「フラグメント」、「変異型」、「誘導体」及び「類縁体」という用語には、抗αｖβ６抗体又は抗体ポリペプチドを指す場合、対応する天然抗体又はポリペプチドの抗原結合特性の少なくともある程度を保持する何れかのポリペプチド、即ち、αｖβ６インテグリンの１つ以上のエピトープに結合する能力を保持するポリペプチドが含まれる。本発明のポリペプチドのフラグメントには、本明細書で別途考察する特定の抗体フラグメントに加えて、タンパク質分解フラグメント、並びに欠失フラグメントが含まれる。本発明に従って有用な抗αｖβ６抗体及び抗体ポリペプチドの変異型には、上述のようなフラグメント、更にはアミノ酸の置換、欠失又は挿入によりアミノ酸配列が改変されているポリペプチドも含まれる。変異型は天然である場合もあれば、非天然である場合もある。非天然の変異型は、当該技術分野で既知の突然変異誘発法を使用して生成される場合がある。変異型のポリペプチドは、保存又は非保存アミノ酸の置換、欠失又は付加を含む場合がある。本発明に従って有用な抗αｖβ６抗体及び抗体ポリペプチドの誘導体には、天然ポリペプチドに存在しない追加の特徴を示すように改変されているポリペプチドがある。例としては融合タンパク質が含まれる。変異型ポリペプチドは又、本明細書において「ポリペプチド類縁体」と呼ばれる場合もある。本明細書で使用される、抗αｖβ６抗体又は抗体ポリペプチドの「誘導体」とは、官能性側鎖基の反応により化学的に誘導された１つ以上の残基を有する目的のポリペプチドを指す。又、「誘導体」として含まれるものには、２０の標準アミノ酸の１つ以上の天然のアミノ酸誘導体を含有するペプチドもある。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンで置換される場合があり；５−ヒドロキシリジンはリジンで置換される場合があり；３−メチルヒスチジンはヒスチジンで置換される場合があり；ホモセリンはセリンで置換される場合があり；オルニチンはリジンで置換される場合がある。
【００７０】
「実質的に、実質的な」：本明細書で使用されるタンパク質のコンジュゲーションは、コンジュゲートしたタンパク質の受容体への結合の速度及び／又は量が、コンジュゲートしていない対応するサイトカイン、ケモカイン、成長因子又はポリペプチドホルモンの結合の速度及び／又は量の少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００以上である場合に、タンパク質がその受容体に結合する能力を「実質的に」妨害していないとされる。
【００７１】
「処置」：本明細書で使用される「処置」、「処置する」、「処置された」又は「処置すること」という用語は、特に目的が望ましくない生理学的変化又は障害、例えば多発性硬化症の進行を予防又は緩徐化（低減）するような、予防及び／又は施療を指す。有益な又は望ましい臨床的結果には、症状の軽減、疾患の範囲の低減、疾患の安定化された（即ち悪化しない）病態、疾患の進行の遅延又は緩徐化、疾患状態の改善又は緩和、及び緩解（部分的又は完全）が、検知可能か不可能かにかかわらず含まれるが、これらに限定されない。「処置」は又、処置を受けない場合に予測される生存と比較した場合の延長された生存を意味してもよい。処置を要するものには、病態又は障害を既に有するもの、並びに病態又は障害を有し易いもの、又は病態又は障害を予防するものが含まれる。「被験体」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」とは、診断、予後又は処置が望ましい何れかの被験体、特に哺乳動物被験体を意味する。哺乳動物被験体には、ヒト及びその他の霊長類、家畜動物、牧場動物、及び動物園、競技又はペット用の動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛等が含まれる。
【００７２】
概要
本発明は、インテグリンαｖβ６に対して特異的なヒト化抗体を特徴とする。本明細書には、本発明の抗体を製造する種々の方法を記載する。当該技術分野で既知であるが、本明細書に具体的に記載していない方法も本発明の適用範囲に含まれる。
【００７３】
本発明は又、インテグリンαｖβ６は、それが非転移性であるかより転移能が低い腫瘍細胞上で観察される発現レベルと比べて転移性であるかより転移能が高い腫瘍細胞上で増量されて発現されるという点において、腫瘍細胞表面上で差次的に発現されるという発見に少なくとも部分的に基づいている。この差次的発現を分析するために、本発明は、インテグリンαｖβ６に結合するリガンド、特に抗体（更に具体的には、本発明により提供されるヒト化抗体）を使用する。他の実施形態において、本発明は、腫瘍細胞の浸潤性及び／又は転移性の能力の測定において、及び進行性又は転移性の癌腫に進行する可能性がより高い特定の腺癌及びｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫（ＤＣＩＳ及びＬＣＩＳを含む）のような癌腫の発見において、この差次的発現の同定を使用する方法を提供する。本発明は又、腫瘍を構成している細胞がインテグリンαｖβ６に結合する１つ以上のリガンドを使用した処置に応答する可能性がより高い腫瘍を同定する方法を提供する。本発明は又、腫瘍の転移の診断及び処置／予防、及び腫瘍の外科的摘出後の残存する転移腫瘍細胞を排除する方法も提供する。
【００７４】
ヒト化抗体
一実施形態において、本発明により提供される抗体はモノクローナル抗体であり、これは好ましい実施形態においては他の種に由来する同属体抗αｖβ６抗体のヒト化型である。ヒト化抗体は、抗原結合に必要ではないヒト免疫グロブリンの軽鎖又は重鎖のアミノ酸の一部又は全て（例えば定常領域及び可変ドメインのフレームワーク領域）を使用して同属体、非ヒト抗体の軽鎖又は重鎖から対応するアミノ酸を置換する組換えＤＮＡ技術により生成された抗体である。一例として、所定の抗原に対するマウス抗体のヒト化型はその重軽鎖の両方において、（１）ヒト抗体の定常領域；（２）ヒト抗体の可変ドメイン由来のフレームワーク領域；及び（３）マウス抗体由来のＣＤＲを有する。必要に応じて、ヒトフレームワーク領域の１つ以上の残基をマウス抗体の対応する位置における残基に変化させることにより、抗原に対するヒト化抗体の結合親和性を維持することができる。この変化を「復帰突然変異」と称する場合がある。ヒト化抗体は一般的に、キメラヒト抗体と比べて、前者がかなり少量の非ヒト成分を含有することから、ヒトにおいて免疫応答を誘発する可能性がより低い。
【００７５】
本発明のヒト化抗体を製造するのに好適な方法は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ  ＥＰ０２３９４００；Ｊｏｎｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５  （１９８６）；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７  （１９８８）；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６  （１９８８）；  Ｑｕｅｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８６：１００２９  （１９８９）；  米国特許第６，１８０，３７０号；及びＯｒｌａｎｄｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８６：３８３３  （１９８９）に記載されており、その開示内容は全体が参考として本明細書で援用される。一般的にヒト化抗体へのマウス（又は他の非ヒト）ＣＤＲの移植は、以下の通り行う。重軽鎖可変ドメインをコードするｃＤＮＡをハイブリドーマから単離する。ＣＤＲを含む可変ドメインのＤＮＡ配列を配列決定により決定する。ＣＤＲをコードするＤＮＡは、部位指向性突然変異誘発によりヒト抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメインコード配列の対応する領域に転移させる。次に所望のアイソタイプ（例えばＣＨの場合はγ１、ＣＬの場合はκ）のヒト定常領域遺伝子セグメントを付加する。ヒト化重軽鎖遺伝子を哺乳動物宿主細胞（例えばＣＨＯ又はＮＳＯ細胞）中で同時発現することにより可溶性ヒト化抗体を製造する。抗体の大規模製造を容易にするには、このようなヒト化抗体を抗体発現細胞の入ったバイオリアクター中で生成するか、或いは乳汁中に抗体を発現するトランスジェニック哺乳動物（例えばヤギ、ウシ又はヒツジ）を生成する（例えば米国特許第５，８２７，６９０号を参照）ことが望ましい場合が多い。
【００７６】
一方、ヒトフレームワークへのＣＤＲの直接転移は、得られる抗体の抗原結合親和性を消失させる。その理由は一部の同属体抗体において、フレームワーク領域内の特定のアミノ酸がＣＤＲと相互作用し、これにより抗体の全体的抗原結合親和性に影響する。このような場合、同属体抗体の抗原結合活性を保持するには、アクセプター抗体のフレームワーク領域において「復帰突然変異」（前掲）を導入することが重要である。
【００７７】
復帰突然変異を起こす一般的な手法は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｑｕｅｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．（前掲）、Ｃｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８８：２８６９−２８７３  （１９９１）及び国際特許第ＷＯ９０／０７８６１号（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）は、２つの重要な段階を含む手法を記載している。まず、ヒト可変フレームワーク領域を、同属体マウス抗体の可変領域フレームワークとの最適タンパク質配列相同性を目標にコンピュータ分析により選択する。次に、マウス可変領域の３次構造をコンピュータでモデル化することによりマウスＣＤＲと相互作用する可能性があるフレームワークアミノ酸残基を可視化し、次にこれらのマウスアミノ酸残基を相同ヒトフレームワーク上に重ね合わせる。
【００７８】
この２段階手法では、ヒト化抗体の設計に関する基準が幾つか存在する。第１の基準は、非ヒトドナー免疫グロブリンに通常は相同である特定のヒト免疫グロブリン由来のフレームワークをヒトアクセプターとして使用すること、或いは多くのヒト抗体由来のコンセンサスフレームワークを使用することである。第２の基準は、ヒトアクセプター残基が通常ではなく、ドナー残基がフレームワークの特定の残基におけるヒト配列に一般的である場合に、アクセプターではなくドナーのアミノ酸を使用することである。第３の基準は、ＣＤＲに直ぐ隣接する位置において、アクセプターではなくドナーフレームワークアミノ酸残基を使用することである。
【００７９】
又、例えばＴｅｍｐｅｓｔ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６−２７１  （１９９１）に記載のような異なる手法を使用する場合もある。この手法では、それぞれＮＥＷＭ及びＲＥＩ重軽鎖に由来する可変領域フレームワークを、マウス残基のラジカルな導入を行うことなくＣＤＲグラフティングに使用する。この手法を使用する利点は、ＮＥＷＭ及びＲＥＩ可変領域の３次元構造がＸ線結晶学的分析により判明し、このためＣＤＲと可変領域フレームワーク領域残基の間の特定の相互作用が容易にモデル化できる点である。
【００８０】
本発明者等は、ＷＯ０３／１０００３３に記載の通りハイブリドーマ６．３Ｇ９及び６．８Ｇ６から単離したｍＲＮＡから、抗体重鎖可変領域ｃＤＮＡ及び軽鎖可変領域ｃＤＮＡを調製した。これらのハイブリドーマは、αｖβ６インテグリンに結合するＩｇＧ１クラスのマウスモノクローナル抗体を生成する。キメラヒト抗体発現ベクターは、ヒト抗体重鎖定常領域又はヒト抗体軽鎖定常領域をコードする配列を含有する発現ベクター内にｃＤＮＡを挿入することにより構築した。次に、このようなベクターを動物細胞に導入することにより抗αｖβ６キメラヒト抗体の生成を行う。生成したキメラ抗体の内、抗αｖβ６キメラヒト抗体３Ｇ９及び８Ｇ６はαｖβ６インテグリンと反応し、阻害活性を示すことが見出されている。
【００８１】
上述の手法を使用して、キメラ抗体３Ｇ９及び８Ｇ６のヒト化型を作成した。３Ｇ９抗体については、本明細書に記載する実施例において説明する通り、マウス３Ｇ９可変重軽鎖領域のクローニングを行う。次に重軽鎖のマウス３Ｇ９可変領域をコードするｃＤＮＡを使用して、本明細書に記載する実施例において説明する通り、マウス３Ｇ９可変領域をヒトＩｇＧ１（重鎖の場合）及びヒトκ（軽鎖の場合）の定常領域に連結したマウス−ヒトキメラの発現のためのベクターを構築する。２９３−ＥＢＮＡ細胞内へのトランスフェクションの後の重軽鎖の３Ｇ９発現ベクターの発現は、キメラ３Ｇ９トランスフェクト細胞は重軽鎖を効率的に組み立て、抗体を分泌したことを示していた（実施例２を参照）。更に、キメラ３Ｇ９抗体のアグリコシル突然変異型も作成した。３Ｇ９の軽鎖の最初のＣＤＲのＮ連結グリコシル化部位内のアスパラギン（Ｎ）からセリン（Ｓ）へのアミノ酸置換は、結合親和性を改変することなくタンパク質の発現及び精製を大幅に向上させることが示されている（図１）。
【００８２】
ヒト化３Ｇ９抗体を生成するために、ヒト生殖細胞配列との相同性マッチングによりヒトアクセプターフレームワークドメインを選択した。実施例３に記載する通り、軽鎖については、ヒトＬ６アクセプターフレームワークは最も相同であることが見出され、重鎖についてはヒト３−７アクセプターフレームワークが最も相同であることが見出された。これらの選択されたヒトアクセプターフレームワークを使用しながら、重軽鎖可変ドメインを設計し、それぞれの変異型／型の多くを作成し、発現させた（実施例４）。
【００８３】
本発明は、配列番号１の重鎖可変ドメイン及び配列番号２の軽鎖可変ドメインを含むものとしてヒト化３Ｇ９抗体を記載する。
【００８４】
【化１】
2009500041.tif 000002
３Ｇ９重軽鎖の異なる変異型／型を種々の程度の復帰突然変異で作成することによりどの組み合わせがαｖβ６に対して優れた結合親和性及び阻害活性を有する最良のヒト化抗体をもたらすか調べた。生成した５種類の軽鎖型及び３種類の重鎖型のうち、３Ｇ９重鎖３型（ＨＶ３）と３Ｇ９軽鎖５型（ＬＶ５）の対が最良のヒト化抗体をもたらした（実施例４）。このヒト化３Ｇ９５型（Ｈ３／Ｌ５）抗体は、プラスミドｐＫＪＳ１８９（配列番号６）を含む重鎖３型（Ｈ３）に関する組換えベクターをプラスミドｐＫＪＳ１９５（配列番号５）を含む軽鎖５型（ＬＶ５）に対する組換えベクターと組み合わせて発現することにより生成される。
【００８５】
【化２】
2009500041.tif 000003
【００８６】
【化３】
2009500041.tif 000004
正常なＦｃ受容体結合に必要であることが示されている定常領域のグリコシル化部位が除去されるように重鎖が突然変異しているヒト化３Ｇ９５型（Ｈ３／Ｌ５）の別の型も作成した（実施例５）。ヒト化３Ｇ９抗体のこのアグリコシル型（ａ−Ｈ３／Ｌ５）は、重鎖３型（Ｈ３）の定常領域においてアミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）をグルタミン（Ｑ）と置換することにより生成される。アグリコシルヒト化３Ｇ９（ａ−Ｈ３／Ｌ５）抗体は、プラスミドｐＫＪＳ１９６（配列番号７）を含むアグリコシル重鎖３型（ａ−Ｈ３）に関する組換えベクターをプラスミドｐＫＪＳ１９５（配列番号５）を含むアグリコシル軽鎖５型（ａ−Ｌ５）に関する組換えベクターと組み合わせて発現することにより生成される（配列番号５；上記を参照）。
【００８７】
【化４】
2009500041.tif 000005
【００８８】
【化５】
2009500041.tif 000006
同様の手法をヒト化８Ｇ６抗体の設計に使用した（実施例７）。８Ｇ６可変軽鎖及び可変重鎖の３つの型が設計されており、第１の型が最大の復帰突然変異を含有し、第３の型が最小の復帰突然変異を含有した（最大「ヒト化」）（実施例５）。
【００８９】
【化６】
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【００９０】
【化７】
2009500041.tif 000008
その他の部分
以下に更に詳述する通り、本発明のヒト化モノクローナル抗体は、その他の部分を更に含むことにより、所望の機能を作用させる場合がある。例えば、ヒト化抗体は、抗体がターゲティングする細胞を殺傷するために毒素部分（例えば破傷風トキソイド又はリシン）又は放射性核種（例えば１１１Ｉｎ又は９０Ｙ）を含む場合がある（例えば米国特許第６，３０７，０２６号を参照）。ヒト化抗体は、単離又は検出を容易にするための部分（例えばビオチン、蛍光部分、放射性部分、ヒスチジンタグ又は他のペプチドタグ）を含む場合がある。ヒト化抗体は又、その血清半減期を延長することができる部分、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む場合もある。
【００９１】
種々の化学療法剤は、ターゲティングヒト化抗体に共役してもよい。好ましくは、結合時に内在化するヒト化抗体が最良であるが、非内在化ヒト化抗体の使用は除外されない。例えば、腫瘍細胞表面に結合し、腫瘍又は腫瘍細胞近接部内に薬剤を放出する抗体−薬剤コンジュゲートの使用、及び細胞内への拡散又は輸送により、使用薬剤に応じて抗腫瘍活性が得られる場合がある。コンジュゲートを調製するために使用できる薬剤の一覧は広範であり、所望の化合物に化学修飾を行うことによりその化合物の反応を本発明のコンジュゲートを調製する目的のためにより好都合なものとする方法は、当業者に既知であろう。例えば、薬剤は、血清中では差次的により安定しているが腫瘍細胞内部では活性剤を放出する「放出性」リンカーを介して共役すると考えられる。数種の放出機序を特定の薬剤に応じて使用できる。これらの放出機序の例には、酸感受性ヒドラゾン、レドックス感受性リンカー、例えばジスルフィド及びタンパク質分解開裂されたペプチドリンカーの使用が含まれる。以下に示すものは、数種の異なるクラスに由来する一部の代表的な薬剤である：
（Ａ）アルキル化剤：これらの薬剤の一部の特定の例には、シクロホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン及びニトロソ尿素がある；
（Ｂ）代謝拮抗物質及び抗増殖材、例えばアントラサイクリン、ビンカ薬剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、ヌクレオシド、プテリジン、エンジイン：例としては、アドリアマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アミノプテリン、メトトレキセート、マイトマイシンＣ、アクチノマイシン−Ｄ、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、タキソール、タキサン、シトカラシンＢ、コルヒチン及びピューロマイシンエトポシド、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、カリケアマイシン、マイタンシノイド誘導体及びドリスタチン誘導体がある；
（Ｃ）ホルモン及びホルモン拮抗物質、例えばコルチコステロイド、プロゲスチン及びエストロゲン。
【００９２】
プロドラッグは、抗体に連結されている場合「低効力の」化学的形態において存在するが、内在化時には酵素的に分解して高効力の薬剤形態を生じさせる薬剤として定義される。これと同じ応用を内在化しない抗体コンジュゲートに対しても行うことができ、例えば酵素的分解は、腫瘍細胞表面上で起こり、薬剤が隣接する腫瘍環境内に放出され、腫瘍細胞により同化される。この一部の例には、リン酸、スルフェート及びペプチドを含有する薬剤がある。
【００９３】
生物学的活性を有するタンパク質毒素、例えばリシンＡ鎖、ジフテリア毒素、シガトキシン、破傷風又は毒性酵素の連結は本発明で考慮される抗体−コンジュゲートの別の形態である。このようなコンジュゲートは、化学的コンジュゲート法を使用して、又は抗体−毒性コンストラクトの直接の発現が可能な遺伝子操作法を使用して調製することができ、これらの方法は当業者が容易に知るところである。
【００９４】
本発明のヒト化モノクローナル抗体は又、放射性核種のようなその他の部分を含む場合もある。放射線免疫療法において、癌を処置するために治療用放射性同位体を特異的にターゲティングするためのヒト化αｖβ６抗体の使用は、本発明により考慮される。関連する同位体の一覧には、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ及び１８８Ｒｅが含まれる場合があるが、これらに限定されない。同様に考慮されるものには、α放射同位体、例えば２１１Ａｔ、２１２Ｂｉがある。同位体連結の方法は変動し、使用する特定の同位体により異なる。何れかの特定の同位体の連結のコンジュゲーション化学の方法は、当業者が熟知し、決定できるであろう。
【００９５】
放射線免疫診断において、ヒト化αｖβ６抗体は、ターゲティングされた癌及び／又は何れかの特定の疾患の罹患臓器／組織に対する画像化及び線量算定を実施する機会を与える。このことは既知腫瘍部位に対して局在化を確認する、並びに治療薬投与の最適投薬を可能にするのに有用である。特に、純粋なγ同位体９９ＭＴｃに追加して、陽電子放射線同位体（例えば８６Ｙ）を治療薬投与時に与えることができる。
【００９６】
上述の放射線免疫療法／放射線免疫診断の適用は非内在化抗体の使用に限定されない。特に異化後にキレートとして細胞内に保持される同位体を使用して放射性同位体をターゲティングするための内在化抗体の効果的な使用の例が存在する。例えば、９０Ｙ標識抗体は、ＭＸ−ＤＩＰＡ又はＣＨＸ−ＤＴＰＡのような高親和性キレート剤を使用して調製される。
【００９７】
上述の抗体コンジュゲートの何れかには、フラグメントＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ミニボディー、ＣＨ２ドメイン欠失抗体コンストラクト及びＦｃＲｎ−突然変異型の使用も含まれる。これらのＡｂフラグメント又は遺伝子的に修飾されたコンストラクトは特定の用途において利点をもたらす未損傷のＩｇＧとは異なる薬物動態、腫瘍浸透性及び腫瘍局在性を有する。例えば、より急速に浄化されるＦａｂは、放射線免疫診断等の診断の用途に有用である場合がある。一方、放射線免疫療法又は薬剤ターゲティングのためには、より長い血清中ｔ１／２を有するターゲティングビヒクルを選択することがより効果的である場合がある。
【００９８】
疾患病態及び動物モデル
本発明のヒト化抗体は、αｖβ６媒介疾患の予防を含む診断及び処置において有用である。例えば、これらのヒト化抗体は、ＴＧＦ−βの活性化を阻害すること、又はフィブロネクチン、ビトロネクチン及びテナシンのようなその他何れかのリガンドへのαｖβ６の結合を阻害することにより、線維症（例えば肺線維症、急性肺傷害、腎線維症、肝線維症、Ａｌｐｏｒｔ症候群及び硬皮症）及び本明細書に別途記載するその他の疾患及び障害を処置するために使用することができる。特に、本発明のヒト化抗体は、傷害／線維症に関連する肺疾患（例えば、特発性肺線維症、放射線誘導線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、硬皮症、ブレオマイシン誘導線維症、慢性喘息、珪肺症、アスベスト誘導線維症、急性肺傷害及び急性呼吸窮迫症（例えば細菌性肺炎誘導性、外傷誘導性、ウィルス性肺炎誘導性、換気装置誘導性、非肺敗血症誘導及び吸引誘導性）が含まれるがこれらに限定されない）を処置するために使用することができる。本発明のヒト化抗体は又、傷害／線維症に関連する慢性腎症（例えば、狼瘡、糖尿病、硬皮症、糸球体腎炎、巣状分節状糸球体硬化症、ＩｇＧ腎症、高血圧、自家移植片及びＡｌｐｏｒｔ疾患が含まれるがこれらに限定されない）を処置するためにも使用することができる。ヒト化抗体は又、腸の線維症、硬皮症、放射線誘導線維症を処置するにも有用である。本発明のヒト化抗体は、肝線維症、例えば限定しないが胆管傷害誘導線維症を処置するためにも使用することができる。本発明のヒト化抗体が処置に有用である可能性があるその他の適応症には、頭頚部線維症、放射線誘導線維症、角膜瘢痕形成、ＬＡＳＩＸ、角膜移植、柵状織切除術、肥大性瘢痕形成、熱傷誘導線維症、外科的線維症、サルコイドーシス、乾癬及び脊髄傷害／線維症が含まれる。
【００９９】
以下で詳述する通り、線維性の疾患又は病態以外に、本発明のヒト化抗体は癌又は癌の転移（腫瘍の成長及び浸潤を含む）、特に上皮癌を処置するのに有用である。上皮癌のサブセットは、扁平上皮癌腫、例えば頭頚部（口腔、喉頭、咽頭、食道）、乳房、肺、前立腺、子宮頚部、結腸、膵臓、皮膚（基底細胞癌腫）及び卵巣の癌である。新規のαｖβ６モノクローナル抗体を使用する本発明者等の試験によれば、αｖβ６は、多くの上皮癌において、特に腫瘍のリーディングエッジ上において高度に発現している。新規の抗体は又、αｖβ６により媒介されるその他何れかの疾患、例えば乾癬に対しても使用することができる。
【０１００】
本発明の抗体の薬効は、種々の動物モデルにおいて試験することができ、その一部は後述する非限定的な実施例において説明する。肺線維症のマウスモデルには、ブレオマイシン（Ｐｉｔｔｅｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０７（１２）：１５３７−１５４４  （２００１）；  及びＭｕｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，前掲）及び照射誘導性の肺線維症（Ｆｒａｎｋｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｄ．  Ｒｅｓ．  １４０：３４７−３５５  （１９９４））が含まれる。ブレオマイシン投与マウスにおいて、肺の上皮肺胞細胞においてαｖβ６の発現が増大する。しかし、β６ノックアウトマウスは、ブレオマイシン誘導傷害及び線維症から保護された。
【０１０１】
腎線維症のマウスモデルには、ＣＯＬ４Ａ３−／−  マウス（例えばＣｏｓｇｒｏｖｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍｅｒ．  Ｊ．  Ｐａｔｈ．  １５７：１６４９−１６５９  （２０００）を参照）、アドリアマイシン誘導傷害マウス（Ｗａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ５８：１７９７−１８０４  （２０００）；  Ｄｅｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １６：１４７−１５０  （２００１）），  ｄｂ／ｄｂ  マウス（Ｚｉｙａｄｅｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９７：８０１５−８０２０  （２０００））、並びに片側性尿管閉塞マウス（Ｆｏｇｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ８１：１８９Ａ  （２００１）；及びＦｏｇｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  １２：８１９Ａ  （２００１））が含まれる。これらの全モデルにおいて、マウスは、腎不全にまで進行する腎傷害及び線維症を発症している。αｖβ６は、ＣＯＬ４Ａ３−／−マウス、アドリアマイシン投与マウス、及び片側性尿管閉塞を発症しているマウスの腎の上行及び下行細管のｉｎ  ｓｉｔｕ層において、αｖβ６がアップレギュレートされている。αｖβ６発現は又、種々の腎傷害モデルにおいても増大する。
【０１０２】
同じく後に詳述する通り、抗αｖβ６モノクローナル抗体は、標準的なｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍成長及び転移のモデルのような動物モデルにおいて、腫瘍の成長、進行及び転移を抑制するその能力についても試験することができる。例えば、Ｒｏｃｋｗｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ４９：７３５  （１９７２）；  Ｇｕｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １２：９５４  （１９９２）；  Ｗｙｃｋｏｆｆ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６０：２５０４  （２０００）；及びＯｆｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  ８：１２４３  （１９９８）を参照されたい。癌における重要なαｖβ６リガンドには、転移に関与するＴＧＦ−β（Ａｋｈｕｒｓｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１：Ｓ４４−Ｓ５１  （２００１）を参照）、フィブロネクチン及びビトロネクチンが含まれる。
【０１０３】
本発明の処置の薬効は、多くの使用可能な診断ツール、例えば身体測定、血液検査、尿タンパク質測定、クレアチン濃度及びクレアチンクリアランス、肺機能試験、血漿血中尿素態窒素（ＢＵＮ）濃度、瘢痕形成又は線維性患部の観察及び採点、コラーゲン、平滑筋アクチン及びフィブロネクチンのような細胞外マトリックスの付着、腎機能試験、超音波、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）及びＣＴスキャンにより測定される場合がある。
【０１０４】
薬学的組成物
本発明は又、本発明の１つ以上のヒト化抗体又はその薬学的に許容される誘導体を場合により何れかの薬学的に許容される担体と共に含む薬学的組成物を提供する。本明細書で使用される「担体」という用語には、既知の許容されるアジュバント及びビヒクルが含まれる。
【０１０５】
本発明によれば、薬学的組成物は、滅菌注射用調製品の形態、例えば滅菌注射用水性又は油性懸濁液である場合がある。この懸濁液は、当該技術分野で既知の技法に従い、好適な分散剤、水和剤及び懸濁剤を使用して配合される場合がある。
【０１０６】
本発明の薬学的組成物は、所望により経口、局所、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、骨髄内、動脈内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、肝内又は頭蓋内に投与される場合もあれば、単に炎症又は腫瘍成長部位に局所的に投与される場合もある。本発明の薬学的組成物は又、例えばネブライザー、ドライパウダー吸入器又は計量投薬吸入器の使用を介して吸入により投与される場合もある。
【０１０７】
所望の作用をもたらすために有効な本発明の抗体の用量及び投薬比率は、処置する疾患の性質、被験体の体格、処置の目標、使用する特定の薬学的組成物、及び担当医師の判断のような種々の因子に応じたものとなる。一日当たり約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば一日当たり約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の活性成分化合物の用量レベルが有用である。例えば、本発明の抗体は約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲、例えば約０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲の用量において、１〜１４日毎の間隔で投与される。別の実施形態において、抗体は、腹腔内投与される場合に約０．３〜１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。更に別の実施形態において、抗体は、静脈内投与される場合に約５〜１２．５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。一実施形態において、抗体組成物は、少なくとも１ｍｇ／ｋｇの抗体の血漿中濃度を得るのに有効な量で投与される。
【０１０８】
その他の好適な用量及び投与の計画及び様式は、当業者が熟知しており；更に他のものは、本明細書で以下に更に詳述する。
【０１０９】
インテグリンαｖβ６に対するリガンドの結合
別の実施形態において、本発明は又、細胞によるインテグリンαｖβ６の発現レベルを測定することによって、転移癌細胞を同定する、又は腫瘍内の細胞の転移能力（即ち腫瘍内の細胞が原発腫瘍部位から二次的、又は転移性の部位にｉｎ  ｖｉｖｏ転移する可能性）を予測する方法であって、αｖβ６の細胞表面発現の増大が、癌細胞が転移する可能性がより高いことを示す、方法も対象とする。関連する実施形態において、本発明は、腫瘍を除去するための医療介入（例えば腫瘍の外科的切除、又は化学療法又は放射線療法による腫瘍の低減又は剥離）の後にαｖβ６を発現する残存腫瘍細胞、特に転移性の腫瘍細胞を排除する方法を対象とする。別の関連する実施形態において、本発明は、浸潤性又は転移性の形態への進行の可能性がより高い癌腫、特に腺癌又はｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫（例えば乳房の上皮内腺管癌（ＤＣＩＳ）又は上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ））の非浸潤性の形態を発見する方法を提供する。特定のこのような実施形態は、癌腫の細胞中、又は癌腫を包囲する筋肉上皮中、このような癌腫に罹患しする患者から得た組織切片中におけるインテグリンαｖβ６の発現レベルを測定することを含み、非腫瘍組織試料（理想的には同じ患者の同じ臓器に由来）と比べてインテグリンαｖβ６の発現レベルが上昇していることは、癌腫が近い将来の何れかの時点において浸潤性又は転移性の形態の癌に進行する可能性がより高いことを示す。このような実施形態のそれぞれにおいて、本発明は、腫瘍細胞中のαｖβ６の増大した発現の同定又は利用に依存しており、その同定は、組織、腫瘍又は腫瘍細胞中のインテグリンαｖβ６に結合する１つ以上のリガンドに組織、腫瘍又は腫瘍細胞を接触させることにより達成される。特定の実施形態において、組織、腫瘍又は腫瘍細胞は、癌腫の組織、腫瘍又は腫瘍細胞、例えば腺癌のような癌腫に由来するものである。より特定の実施形態において、癌腫は、乳癌腫、子宮内膜癌腫、膵臓癌腫、結腸直腸癌腫、肺癌腫、卵巣癌腫、子宮頚癌腫、前立腺癌腫、肝臓癌腫、食道癌腫、頭頚部癌腫、胃癌腫又は脾臓癌腫である。より具体的には、癌腫は乳癌腫（上皮内乳癌腫、例えば上皮内腺管癌（ＤＣＩＳ）及び上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）を含むがこれらに限定されない）、子宮内膜癌腫、膵臓癌腫、結腸直腸癌腫、子宮頸癌腫又は肺癌腫である。
【０１１０】
本発明の特定の実施形態において、αｖβ６に結合するリガンドは、αｖβ６の拮抗物質である。このような拮抗物質には、αｖβ６に特異的に結合する抗体；β６に特異的に結合する抗体；αｖに結合する抗体；αｖβ６に対するリガンドに結合する抗体；αｖβ６に対するリガンド；アンチセンス核酸；及びこのようなリガンドのペプチド、非ペプチド及びペプチドミメティック類縁体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
本発明の特定のこのような実施形態において、インテグリンαｖβ６に結合するリガンドは、インテグリンαｖβ６に結合する抗体、又はそのインテグリンαｖβ６結合フラグメント、変異型又は誘導体である。このような抗体は、インテグリンの一方のサブユニット（例えばαｖサブユニット上に位置するエピトープに、又はβ６サブユニット上に位置するエピトープに結合する抗体）に結合する場合もあれば、両方のサブユニット（αｖ及びβ６の両方を架橋するインテグリンへテロ２量体の領域に位置するエピトープに結合する抗体）に結合する場合もある。天然の抗体のような完全サイズの抗体に特に言及しない限り、「αｖβ６抗体」という用語は、完全サイズの抗体、並びにこのような抗体のαｖβ６結合フラグメント、変異型、類縁体又は誘導体、例えば抗体分子と同様の様式で抗原に結合する天然の抗体又は免疫グロブリン分子又は操作された抗体の分子又はフラグメントを包含する。抗体は合成、モノクローナル又はポリクローナル抗体であってもよければ、当該技術分野で周知の技法により作成してもよい。治療用途において、抗体に対する患者の免疫応答を最小限にするには、ヒトの定常及び可変領域を有する「ヒト」モノクローナル抗体が好ましい場合が多い。このような抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニック動物を免疫化することにより作成することができる（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７６４：５２５−５３５  （１９９５）を参照）。合成及び半合成の抗体との関連において、このような用語は、抗体フラグメント、アイソタイプスイッチ抗体、ヒト化抗体（例えばマウス−ヒト、ヒト−マウス等）、ハイブリッド、複数の特異性を有する抗体、完全合成抗体様分子等を網羅することが意図されるが、これらに限定されない。
【０１１２】
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、本明細書で交換可能に使用される。抗体又は免疫グロブリンは重鎖の少なくとも可変ドメインを含み、通常は少なくとも重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系統における基本的な免疫グロブリンの構造は比較的よく理解されている。例えばＨａｒｌｏｗ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  １９８８）を参照されたい。当業者が理解する通り、「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、生化学的に区別することができる種々の広範なクラスのポリペプチドを含む。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロン（γ、μ、α、δ又はε）として分類され、それらには一部のサブクラス（例えばγ１〜γ４）が存在することを理解するであろう。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ又はＩｇＥとして決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１等は、機能的な特化を付与するために、適切に特徴付けられ、周知となっている。これらのクラス及びアイソタイプそれぞれの修飾型は、本開示内容を鑑みれば当業者が容易に知りえるものであり、従って本発明の適用範囲に含まれる。
【０１１３】
本発明における使用に好適である、αｖβ６に結合する抗体、又はそれらのαｖβ６結合フラグメント、変異型又は誘導体には、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化、霊長類化又はキメラ抗体、１本鎖抗体、エピトープ結合フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、１本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬ又はＶＨドメインの何れかを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリにより生成されるフラグメント、及び抗特発性（抗Ｉｄ）抗体（例えば本明細書に開示される抗αｖβ６抗体の抗Ｉｄ抗体を含む）が含まれるが、これらに限定されない。ＳｃＦｖ分子は、当該技術分野で既知であり、例えば米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本発明の免疫グロブリン又は抗体の分子は、免疫グロブリン分子の何れかの型（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものであってもよい。
【０１１４】
１本鎖抗体を含めた抗体フラグメントは、可変領域を単独で、又は以下のもの、即ちヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの全体又は一部分と組み合わせて含む場合がある。又、本発明には、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインと可変領域の何れかの組み合わせも含む抗原結合フラグメントも含まれる。本明細書に開示した診断及び処置の方法において使用するための抗体又はその免疫特異的フラグメントは、トリ及び哺乳動物を含めた何れかの動物起源由来のものである場合がある。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ラット、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、ウシ又はニワトリの抗体である。より好ましくは、抗体は、ヒト、ヒト化又は霊長類化の抗体、又はキメラ抗体、特にモノクローナル抗体である。本明細書で使用される「ヒト」抗体には、後述する通り、及び例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ等の米国特許第５，９３９，５９８号に記載の通り、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を包含し、ヒト免疫グロブリンライブラリから、又は１つ以上のヒト免疫グロブリンに関しトランスジェニックであり、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離した抗体が含まれる。本明細書で使用される「キメラ抗体」という用語は、免疫反応性の領域又は部位が第１の種から得られるかこれに由来し、定常領域（未損傷であるか、本明細書に従って部分であるか、修飾される場合がある）が第２の種から得られる何れかの抗体を意味するものとする。好ましい実施形態において、標的結合領域又は部位は、非ヒト原料（例えばマウス又は霊長類）に由来し、定常領域はヒトである。
【０１１５】
本発明に従った使用に特に好ましい抗体は、抗αｖβ６モノクローナル抗体、例えばＷｅｉｎｒｅｂ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９（１７）：１７８７５−１７８７７  （２００４）（開示内容は全体が参考として本明細書で援用される）に開示されているもの、例えば前記参考文献に開示されるモノクローナル抗体６．８Ｇ６（「８Ｇ６」）及び６．３Ｇ９（「３Ｇ９」）である。αｖβ６に結合し、そのため本発明による使用に好適な別の抗体には、インテグリンαｖβ６のβ６サブユニットに結合する（このため「抗β６抗体」と見なされる）抗体（又はそのフラグメント、変異型又は誘導体）、例えば全体が参考として本明細書で援用されるＷｅｉｎａｃｋｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２６９：１−９  （１９９４）及び全体が参考として本明細書で援用される米国特許第６，６９２，７４１Ｂ２号の特にコラム２〜３及び７〜８に開示されているもの、例えば１０Ｄ５と標記されるモノクローナル抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１２３８２，１９９７年８月６日寄託、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｐ．Ｏ．  Ｂｏｘ  １５４９，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ２０１０８）（米国特許第６，６９２，７４１号のコラム３，７−１３行及びコラム７−８を参照）及びＣＳβ６（米国特許第６，６９２，７４１号、コラム７−８を参照）が含まれる。本発明のこの態様による好適な実施形態は、αｖβ６結合抗体又はそのαｖβ６エピトープ結合フラグメントであるαｖβ６インテグリン結合リガンドを使用する。本発明のこの態様に従って使用するのに好適な更なる抗体には、開示内容全体が参考として本明細書で援用される米国特許出願公開第２００５／０２５５１０２Ａ１号に開示されるαｖβ６結合モノクローナル抗体、例えば、３Ｇ９、８Ｇ６、１Ａ８、２Ｂｌ、２Ｂ１０、２Ａｌ、２Ｅ５、ＩＧ１Ｏ、７Ｇ５、１Ｃ５、並びにそれらのフラグメント、キメラ及びハイブリッドが含まれるが、これらに限定されない。本発明に従った使用に特に好適な抗体は、モノクローナル抗体２Ｂ１、３Ｇ９及び８Ｇ６である。
【０１１６】
幾つかの実施形態において、抗体はハイブリドーマ６．１Ａ８、６．３Ｇ９、６．８Ｇ６、６．２Ｂ１、６．２Ｂ１０、６．２Ａ１、６．２Ｅ５、７．１Ｇ１０、７．７Ｇ５又は７．１Ｃ５により生成される抗体と同じ重軽鎖ポリペプチド配列を含む。本発明に従った使用に特に好適な抗体は、ハイブリドーマ６．２Ｂ１により生成される２Ｂ１抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３６４６、２００１年８月１６日寄託、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｐ．Ｏ．  Ｂｏｘ  １５４９，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１０８）、ハイブリドーマ６．８Ｇ６により生成される８Ｇ６抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３６４５、２００１年８月１６日寄託、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｐ．Ｏ．  Ｂｏｘ  １５４９，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１０８）及びハイブリドーマ６．３Ｇ９により生成される３Ｇ９抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３６４９、２００１年８月１６日寄託、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｐ．Ｏ．  Ｂｏｘ  １５４９，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１０８）（全体が参考として本明細書で援用される米国特許出願公開第２００５／０２５５１０２Ａｌ号の、特に１ページのパラグラフ０００８；２ページのパラグラフ００３２及び００３６；及び６〜１４ページの実施例を参照）、及び１０Ｄ５と標記される抗体（この抗体を分泌するハイブリドーマは１９７７年８月６日にＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１２３８２として寄託、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｐ．Ｏ．  Ｂｏｘ  １５４９，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１０８）（全体が参考として本明細書で援用される米国特許第６，６９２，７４１号（特にコラム３、７〜１３行、及びコラム７〜８）を参照）と同じ重軽鎖ポリペプチド配列を含むモノクローナル抗体である。
【０１１７】
幾つかの実施形態において、抗体は、自身の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３が以下の表１に示す配列より本質的になる（即ち一部の保存された変異を除く）重鎖を含む。特定の実施形態において、抗体は、ＣＤＲ１が本質的に配列番号１０１〜１０５の何れか１つからなり；ＣＤＲ２が本質的に配列番号１０６〜１１１の何れか１つからなり；ＣＤＲ３が本質的に配列番号１１２〜１１７の何れか１つからなる重鎖；及び／又はＣＤＲ１、２及び３が本質的にそれぞれ配列番号１１８〜１２３、１２４〜１２７及び１２８〜１３３の何れか１つからなる軽鎖を含む。
【０１１８】
【化８】
2009500041.tif 000009
【０１１９】
【化９】
2009500041.tif 000010
【０１２０】
【化１０】
2009500041.tif 000011
他の関連する実施形態において、本発明により使用されるモノクローナル抗体は、キメラ抗体、即ち、１つの種（例えばマウス、ラット又はウサギ）由来の同属体抗体が、ヒンジ及び／又は重鎖及び／又は軽鎖の定常領域の部分又は全てが他の種（例えばヒト）に由来する抗体の対応する成分で置き換えられるように、組換えＤＮＡ技術により改変されているものである。一般的に、操作された抗体の可変ドメインは、同属体抗体の可変ドメインに対して同一のままであるか、又は実質的に同一である。このような操作された抗体は、キメラ抗体と呼ばれ、ヒンジ及び／又は定常領域の由来元の種（例えばヒト）の個体に投与した場合に、同属体抗体よりも抗原性が低い。キメラ抗体を製造する方法は、当該技術分野で周知である。
【０１２１】
他の関連する実施形態において、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、完全にヒト抗体である。このような完全ヒトモノクローナル抗体を作成する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、参考として本明細書で援用される米国特許出願第２００５／０２５５１０２Ａ１号の４ページ、パラグラフ００６９〜００７０を参照）。
【０１２２】
他の関連する実施形態において、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、その他の種に由来する同属体抗αｖβ６抗体のヒト化型である。ヒト化抗体は、抗原結合に必要ではないヒト免疫グロブリンの軽鎖又は重鎖のアミノ酸の一部又は全て（例えば、定常領域及び可変ドメインのフレームワーク領域）を使用して同属体、非ヒト抗体の軽鎖又は重鎖から対応するアミノ酸を置換する、組換えＤＮＡ技術により生成された抗体である。一例として、所定の抗原に対するマウス抗体のヒト化型は、その重軽鎖の両方において、（ａ）ヒト抗体の定常領域；（ｂ）ヒト抗体の可変ドメイン由来のフレームワーク領域；及び（ｃ）マウス抗体由来のＣＤＲを有する。必要に応じて、ヒトフレームワーク領域の残基１つ以上を、マウス抗体の対応する位置における残基に変化させることにより、抗原に対するヒト化抗体の結合親和性を維持することができる。この変化は「復帰突然変異」と呼ばれる場合がある。一般的にヒト化抗体は、キメラヒト抗体と比べると、前者の方がかなり少ない非ヒト成分を含有することから、ヒトにおいて免疫応答を誘発する可能性がより低い。このようなヒト化モノクローナル抗体を生成する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、参考として本明細書で援用される米国特許出願第２００５／０２５５１０２Ａ１号の４〜５ページ、パラグラフ００７２〜００７７を参照）。
【０１２３】
このような抗体に加えて、ヒト化抗体は、異なる抗体の重鎖及び／又は軽鎖の対応するＣＤＲに由来する重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲを１つ以上含む。このような抗体の１つの好適な非限定的例には、寄託した３Ｇ９抗体の軽鎖ＣＤＲ１の配列（配列番号２１）の代わりに２Ｂ１抗体に由来する軽鎖ＣＤＲ１の配列（配列番号２０）を有する軽鎖ＣＤＲ１含むヒト化３Ｇ９抗体がある。配列番号２０に示す軽鎖ＣＤＲ１配列を有するこのようなヒト化３Ｇ９抗体は、本明細書においてｈｕ３Ｇ９（又はＢＧ０００１１）と呼ぶ。このような抗体の別の好適な非限定的例には、寄託した８Ｇ６抗体の軽鎖ＣＤＲ１の配列（配列番号１８）の代わりに２Ｂ１抗体に由来する軽鎖ＣＤＲ１の配列（配列番号２０）を有する軽鎖ＣＤＲ１を含むヒト化８Ｇ６抗体がある。配列番号２０に示す軽鎖ＣＤＲ１配列を有するこのようなヒト化８Ｇ６抗体は、本明細書においてｈｕ８Ｇ９と呼ぶ。重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲの１つ以上が別の抗体由来の１つ以上の対応する重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲにより置き換えられており、且つ本発明による使用に好適である、このような誘導体抗体の更なる例は、表１に記載する配列及び本明細書に示す指針を鑑みれば、当業者に容易に明らかになるであろう。このようなヒト化抗体、例えばこのような誘導体ヒト化抗体を調製するのに好適な方法は、当業者が熟知しており、例えば、開示内容全体が参考として本明細書で援用される米国特許出願第２００５／０２５５１０２Ａ１号に記載されている。
【０１２４】
αｖβ６結合リガンドのコンジュゲート及びその他の修飾
特定の実施形態において、αｖβ６に結合するリガンド、例えば抗体は、未コンジュゲートの形態で使用することができる。他の実施形態において、αｖβ６に結合するリガンド、例えば抗体は、例えば検出可能な標識、薬剤、プロドラッグ又は同位体にコンジュゲートすることができる。
【０１２５】
以下に更に詳述する本発明の特定の方法、例えば、腫瘍細胞の転移能の指標として、又は組織内のｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫（例えばＤＣＩＳ又はＬＣＩＳ）を同定する手段として、細胞又は組織におけるαｖβ６の発現を検出する方法では、αｖβ６結合リガンド（例えば抗体）が、１つ以上の検出可能な標識にコンジュゲートされる。このような用途において、αｖβ６結合リガンド、例えばαｖβ６結合抗体は、発色原、酵素、放射性同位体、同位体、蛍光、毒性、化学発光、核磁気共鳴造影剤又はその他の標識の共有結合又は非共有結合による連結により、検出可能に標識される場合がある。
【０１２６】
好適な発色原標識の例には、ジアミノベンジジン及び４−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸が含まれる。
【０１２７】
好適な酵素標識の例には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、コウボアルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが含まれる。
【０１２８】
好適な放射性同位体標識の例には、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１２５１、１３１１、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、１５２Ｅｕ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄ等が含まれる。１１１Ｉｎは、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化を使用する場合には、肝臓による１２５Ｉ又は１３１Ｉ標識αｖβ６結合リガンドの脱ハロゲン化の問題を回避できるため、好ましい同位体となる。更に、この放射性核種は、画像化により望ましいガンマ放射エネルギーを有する（Ｐｅｒｋｉｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  １０：２９６−３０１  （１９８５）；Ｃａｒａｓｑｕｉｌｌｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ２５：２８１−２８７  （１９８７））。例えば、１−（Ｐ−イソチオシアナトベンジル）−ＤＰＴＡでモノクローナル抗体にカップリングした１１１Ｉｎは、非腫瘍製の組織、特に肝臓における取り込みがわずかであることが示されており、このため、腫瘍局在化の特異性を増強する（Ｅｓｔｅｂａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ２８：８６１−８７０  （１９８７））。
【０１２９】
好適な非放射性同位体標識の例には、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｔｒ及び５６Ｆｅが含まれる。
【０１３０】
好適な蛍光標識の例には、１５２Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フォコエリスリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）標識、ｏ−フタルデヒド標識及びフルオレサミン標識が含まれる。
【０１３１】
好適な毒素標識の例には、ジフテリア毒素、リシン及びコレラ毒素が含まれる。
【０１３２】
ケミルミネセント標識の例には、ルミノール標識、イソルミノール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識及びエクオリン標識が含まれる。
【０１３３】
核磁気共鳴造影剤の例には、Ｇｄ、Ｍｎ及び鉄が含まれる。
【０１３４】
上述の標識をαｖβ６結合リガンド、例えばαｖβ６結合抗体に結合させる一般的な技法は、Ｋｅｎｎｅｄｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ  ７０：１−３１  （１９７６）；及びＳｃｈｕｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ  ８１：１−４０  （１９７７）に記載されている。後者で言及されているカップリング法は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸エステル法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル法であり、これらの方法は全て参考として本明細書で援用される。
【０１３５】
手術後の残存腫瘍剥離又は転移の予防のような本発明の特定の治療法で使用するために、αｖβ６結合リガンドは、１つ以上の薬剤、プロドラッグ又は同位体とコンジュゲートするできる。好ましいこのようなコンジュゲートは、１つ以上の細胞毒性剤にコンジュゲートしたαｖβ６に結合する１つ以上のリガンド、例えば１つ以上の抗体又はそれらのフラグメント、誘導体又は変異体を含み；このようなコンジュゲートは、本発明により提供される腫瘍転移の処置及び予防の方法において有用である。本発明の特定のこのような実施形態によれば、αｖβ６結合リガンド、例えば抗体は、細胞毒性剤にコンジュゲートされる。αｖβ６結合リガンド−細胞毒性剤コンジュゲートの作成において有用な細胞毒性剤、例えば化学療法剤は、当該技術分野で周知であり、これには、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、メルファラン、ドキソルビシン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、エトポシド、メクロレタミン、シクロホスファミド、及びブレオマイシンが含まれるが、これらに限定されない。本発明のこの態様に従って使用するのに好適なその他の化学療法剤は、当該技術分野で周知であり、当業者が熟知するであろう。
【０１３６】
１つ以上のαｖβ６結合リガンド、例えば１つ以上のαｖβ６結合抗体、及び小分子毒素、例えばカリケアマイシン、マイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号）、トリコテン及びＣＣ１０６５のコンジュゲートの使用も本発明において考慮される。本発明の一実施形態において、αｖβ６結合リガンドは、１つ以上のマイタンシノイド分子（例えば、αｖβ６リガンド当たり約１〜約１０マイタンシノイド分子）にコンジュゲートされる。マイタンシノイドは、例えば、Ｍａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換される場合があり、これはＭａｙ−ＳＨ３に還元され、修飾されたαｖβ６結合リガンドと反応させる（Ｃｈａｒｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１  （１９９２）））ことにより、マイタンシノイド−αｖβ６結合リガンドコンジュゲートを作成する場合がある。
【０１３７】
或いは、αｖβ６結合リガンドは、１つ以上のカリケアマイシン分子にコンジュゲートすることができる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、２本鎖ＤＮＡ切断をピコモル未満の濃度で誘発することができる。使用される場合があるカリケアマイシンの構造類縁体には、γ１１、ａ２ｌ、α３１、Ｎ−アセチル−γ１１、ＰＳＡＧ及びΦ１１が含まれるが、これらに限定されない（Ｈｉｎｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２  （１９９３）；及びＬｏｄｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８  （１９９８））。
【０１３８】
１つ以上のαｖβ６結合リガンド、例えば１つ以上のαｖβ６結合抗体とのコンジュゲートの生成に使用できる酵素活性を有する毒素及びそれらのフラグメントには、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルジカ・チャランティア阻害物質、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス阻害物質、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンが含まれる。例えば、全体が参考として本明細書で援用される１９９３年１０月２８日に英語で公開された国際特許第ＷＯ９３／２１２３２号を参照されたい。マイタンシノイドは又、１つ以上のαｖβ６結合リガンド、例えば１つ以上のαｖβ６結合抗体とコンジュゲートされる場合もある。
【０１３９】
本発明は更に、核分解活性を有する化合物（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）のようなリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ）にコンジュゲートされるαｖβ６結合リガンドも考慮する。
【０１４０】
種々の放射性同位体も又、本発明の治療方法において使用するための放射性コンジュゲートαｖβ６遺伝子都合リガンドの生成に利用可能である。例としては、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ及びＬｕの放射性同位体が含まれる。
【０１４１】
αｖβ６結合リガンドと細胞毒性剤のコンジュゲートは、種々の２官能性のタンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイイミドメチル）シクロヘキサン−Ｉ−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば塩酸ジメチルアジピミデート）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトリエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えばｌ，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作成される場合がある。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８  （１９８７）に記載の通り調製することができる。１４炭素標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＰＴＡ）は、αｖβ６結合リガンドに放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするための例示的なキレート剤である。国際特許第ＷＯ  ９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは、細胞内における細胞毒性剤の放出を促進する「開裂可能なリンカー」である場合がある。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチド感受性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１  （１９９２））が使用される場合がある。
【０１４２】
或いは、αｖβ６結合リガンド及び細胞毒性剤を含む融合タンパク質は、例えば組換え法又はペプチド合成により作成される場合がある。
【０１４３】
更に別の実施形態において、αｖβ６結合リガンドは、「プレターゲティング」で利用する「受容体」（例えばストレプトアビジン）にコンジュゲートされる場合があり、この場合、αｖβ６結合リガンド−受容体コンジュゲートは、患者に投与された後、浄化剤を使用して循環系から未結合のコンジュゲートを除去され、次いで細胞毒性剤（例えば放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートされた「リガンド」（例えばアビジン）が投与される。
【０１４４】
本発明のαｖβ６結合リガンドは又、プロドラッグ（例えばペプチジル化学療法剤；国際特許第ＷＯ  ８１／０１１４５号を参照）を活性剤に変換するプロドラッグ活性化酵素とコンジュゲートされる場合もある。例えば、国際特許第ＷＯ  ８８／０７３７８号及び米国特許第４，９７５，２７８号を参照されたい。このようなコンジュゲートの酵素成分には、プロドラッグに作用してこれをより活性を有する細胞毒性形態に変換することができる何れかの酵素が含まれる。
【０１４５】
本発明の方法において有用な酵素には、ホスフェート含有プロドラッグを遊離薬剤に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；スルフェート含有プロドラッグを遊離薬剤に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性の５−フルオロシトシンを抗癌剤５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬剤に変換するのに有用なペプチダーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、テルモリシン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン（例えばカテプシンＢ及びＬ）；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチアーゼ；グリコシル化されたプロドラッグを遊離薬剤に変換するのに有用な炭水化物分解酵素、例えばＯ−ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼ；Ｐ−ラクタムで誘導体化された薬剤を遊離薬剤に変換するのに有用なＰ−ラクタマーゼ；及び自身のアミン窒素においてフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基それぞれで誘導体化されている薬剤を遊離薬剤に変換するのに有用なペニシリンアミダーゼ、例えばペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。
【０１４６】
酵素は、ヘテロ二官能性交差結合試薬の使用といった当該技術分野で周知の技法によりαｖβ６結合リガンドに共有結合することができる。或いは、酵素の少なくとも機能的活性を有する部分に連結された本発明のαｖβ６結合リガンドの少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質を、当該技術分野で周知の組換えＤＮＡ法を使用して構築することができる（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８  （１９８４）を参照）。
【０１４７】
疾患の診断及び予後
今回、転移性の特定の腫瘍に由来する細胞が、低転移性又は非転移性の細胞に比べて、インテグリンαｖβ６の有意に増大したレベルを発現することを見出した。更に、本発明者等は、ｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫の特定の形態、例えば乳房の上皮内腺管癌（ＤＣＩＳ）又は上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ））において、腫瘍を包囲する筋肉上皮が、癌腫の腫瘍細胞と比べて、及び正常な乳房組織と比べて、有意に増大したレベルのインテグリンαｖβ６を発現することも発見した。従って、本発明は、腺癌のような癌腫由来の腫瘍を含めた腫瘍細胞の転移能を診断するのに有用な方法を提供する。より特定の実施形態において、癌腫は、乳癌腫、子宮内膜癌腫、膵臓癌腫、結腸直腸癌腫、肺癌腫、卵巣癌腫、子宮頚癌腫、前立腺癌腫、肝臓癌腫、食道癌腫、頭部頚部癌腫、胃癌腫及び脾臓癌腫である。より具体的には、癌腫は、乳癌腫（例えば上皮内乳癌腫、例えば上皮内腺管癌（ＤＣＩＳ）又は上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ））、子宮内膜癌腫、膵臓癌腫、結腸直腸癌腫、子宮頚癌腫又は肺癌腫である。
【０１４８】
本発明のこの特徴による方法は、腫瘍細胞中又は組織試料中の筋肉上皮中のαｖβ６の発現レベルを試験する、及びこれらの発現レベルを標準的なαｖβ６発現レベル（例えば正常細胞、非転移細胞又は正常組織、好まくは同じ動物、例えばヒト患者から得られたもの）と比較することを伴い、腫瘍又はその細胞のけるαｖβ６の発現の増大は、その腫瘍又はその細胞の高値の浸潤性及び／又は転移性の能力を示すか、或いは腫瘍を包囲する筋肉上皮又は組織切片中の上皮細胞クラスターにおけるαｖβ６の発現の増大は、浸潤性になり、潜在的に転移を形成する可能性がより高いｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫、例えばＤＣＩＳ又はＬＣＩＳの存在を示す。
【０１４９】
癌の診断が従来の方法により既に行われている場合、本発明は予後のインジケーターとして有用であり、これにより増大したレベルのαｖβ６発現を呈している腫瘍細胞は、浸潤性となって原発腫瘍部位から遠位の転移部位まで転移する可能性がより高いと予測されることになる。同様に、ｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫の疑惑の診断が従来の方法（例えば乳房の石灰化した結節のマンモグラフィーによる検出）により行われている場合、本発明は確認のためのインジケーターとして有用であり、これにより筋肉上皮におけるαｖβ６の発現の増大したレベルを呈している石灰化の領域に由来する生検組織は、浸潤性となりαｖβ６ｍＡｂ投与に応答する可能性があるｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫、例えばＤＣＩＳ又はＬＣＩＳの存在を示している。このような予後及び診断の転帰に基づいて、次に、治療担当医師は治療の計画を適宜調節し、これにより転移前又は前癌病態の早期の検出、そしてその結果としての、患者にとってより望ましい臨床転帰を可能とすることができる。
【０１５０】
「αｖβ６の発現レベルを試験する」とは、第１の生物学的試料（例えば腫瘍試料、組織生検又は吸引物等）中のαｖβ６のレベルを、直接的（例えば試料中のαｖβ６の絶対量を測定又は推定することによる）に、又は相対的（例えば、第１の生物学的試料中のαｖβ６の発現レベルを第２の生物学的試料中のものと比較することによる）に、定性的又は定量的に測定又は推定することを考慮する。好ましくは、第１の生物学的試料中のαｖβ６のレベルを測定又は推定し、癌又は前癌性の患部を有さない個体から得た第２の生物学的試料から得た標準値と比較する。当該分野で知られる通り、標準αｖβ６発現レベルが所定の非癌性組織に関して判明すれば、それを比較のための標準値として反復して使用できる。
【０１５１】
「生物学的試料」とは、個体（例えば患者）、細胞系統、組織培養物、又は細胞又は細胞外マトリックスのような細胞産物を含有する可能性のある他の原料から得られた何れかの生物学的試料を考慮する。このような生物学的試料には、αｖβ６を発現する白血球、卵巣、前立腺、心臓、胎盤、膵臓、肝臓、脾臓、肺、乳房、頭頚部の組織（例えば口腔、咽頭、舌及び喉頭の組織）、子宮内膜、結腸（又は結腸直腸）、子宮頚部、胃及び臍帯組織を含めた哺乳動物の身体の組織又は細胞が含まれる。組織生検及び体液を哺乳動物から得るための方法は、当該技術分野で周知である。好ましい哺乳動物には、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ及びヒトが含まれる。特に好ましくはヒトである。
【０１５２】
生物学的試料におけるαｖβ６の発現レベルの試験は、何れかの当該技術分野で既知の方法を使用して行うことができる。生物学的試料におけるαｖβ６の発現レベルの試験には、免疫学的技法が好ましい。例えば、組織におけるαｖβ６の発現は、古典的な免疫組織学的方法により試験することができる。これらの方法では、αｖβ６に結合する一次リガンド、例えば抗体（ポリクローナル又はモノクローナル）により特異的認識が行われる。この一次リガンドは、例えば蛍光、ケミルミネセント、りん光、酵素又は放射性同位体の標識により標識することできる。或いは、本発明のこれらの方法は、二次的な検出系を使用することもでき、この場合、αｖβ６結合リガンドを認識してこれに結合する二次リガンド、例えば第１のαｖβ６結合抗体を認識してこれに結合するいわゆる「二次」抗体は、上述の通り検出可能に標識される。その結果、病理学的検査のための組織切片の免疫組織学的染色が得られる。或いは、αｖβ６の発現レベルがより低いことが知られる標準的な組織又は細胞試料と比べて、直接定量化するために、ウェスタンブロット又はドット／スロット試験（Ｊａｌｋａｎｅｎ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １０１：９７６−９８５  （１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １０５：３０８７−３０９６  （１９８７））用にαｖβ６タンパク質を遊離させるために、組織及び細胞の試料を例えば尿素及び中性洗剤で抽出することもできる。
【０１５３】
上述の通り、本発明の方法は、哺乳動物における転移癌を検出する、腫瘍細胞の転移能を測定する（即ち、所定の腫瘍細胞が原発腫瘍部位から遠位の転移部位に転移する可能性を予測する）、及び非浸潤性又はｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫が浸潤性又は転移性の癌腫に進行する可能性を測定するのに有用である。特に、本発明の方法は、上皮組織の浸潤性及び／又は転移性癌（即ち、浸潤性及び／又は転移性癌腫）、例えば乳房、卵巣、前立腺、肝臓、肺、膵臓、結腸（又は結腸直腸）、頭頚部組織（例えば口腔、咽頭、舌及び喉頭組織）、子宮内膜、子宮頚部、胃及び脾臓の癌を検出するのに有用である。本発明の方法による検出に特に好適なものは、浸潤性及び／又は転移性の表現型に進行する可能性が高い浸潤性及び／又は転移性腺癌であり、これには、乳癌腫、膵臓癌腫、結腸直腸癌腫、子宮頸癌腫、肺癌腫、及びｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫（例えば乳房の特定の上皮内腺管癌（ＤＣＩＳ）又は上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ））が含まれるが、これ等に限定されない。このような癌腫の早期の発見及び処置は、患者の良好な長期の予後に関連している。例えば、未処置のままの場合、ＤＣＩＳ腫瘍がかなりの比率で浸潤性となり、更に予後不良の転移癌をもたらす可能性があることが報告されている（Ｓａｋｏｒａｆａｓ，  Ｇ．Ｈ．，  ａｎｄ  Ｔｓｉｏｔｏｕ，  Ａ．Ｇ．Ｈ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｒｅｖ．  ２６：１０３−１２５  （２０００）を参照）。
【０１５４】
従って、本発明は、患者における未浸潤性の患部又は癌腫を同定し、患者を処置することで未浸潤性患部が浸潤性形態まで発展する機会を得るよりも前にこれを排除することによって、転移癌を処置又は予防する方法を考慮する。このような方法は、例えば、（ａ）癌又は未浸潤性の患部を含有することが疑われる組織試料、及び癌又は未浸潤性の患部を含有しない組織試料（好ましくは癌又は未浸潤性の患部を含有することが疑われるものと同じ組織又は臓器に由来）を得る；（ｂ）組織試料を１つ以上のαｖβ６結合リガンド、例えば１つ以上のαｖβ６結合抗体又はそれらのフラグメントに、（存在する場合）組織内のαｖβ６インテグリンへの１つ以上のαｖβ６結合リガンドの結合に好都合な存在下で、接触させる；並びに（ｃ）組織へのαｖβ６結合リガンドの結合のレベル又はパターンを検出することを含み、過形成（例えば腫瘍）を包囲する筋肉上皮におけるαｖβ６結合リガンドの局在化結合が、過形成自体（又はその細胞）における結合と比べて増大していること、或いは癌性又は未浸潤性の患部を含有する組織試料におけるαｖβ６結合リガンドの結合のレベルが、非癌性の組織試料（又はその細胞）における結合と比べて増大していることが、浸潤性となり潜在的に転移する可能性がより高い癌腫を示している。他の関連する実施形態において、本発明は、患者における未転移又は未浸潤腫瘍の転移又は浸潤性腫瘍への進行を低減又は予防する方法であって、未転移又は未浸潤腫瘍における１つ以上の細胞上のインテグリンαｖβ６の１つ以上のサブユニットに結合する１つ以上のリガンドの治療有効量を患者に投与する工程を含み、リガンドのインテグリンへの結合が、原発腫瘍を囲む組織領域への未転移又は未浸潤の癌の細胞の浸潤の低減又は予防をもたらす、方法を考慮する。
【０１５５】
本発明の方法に従って使用するために試料の入手元となりえる好適な組織及び臓器には、本明細書に別途記載する上皮組織が含まれるが、これらに限定されない。本発明のこのような方法により好都合に処置又は予防される場合がある癌及び腫瘍には、癌腫、特に腺癌、例えば本明細書に別途詳述する癌腫及び腺癌が含まれるが、これらに必ずしも限定されない。このような癌腫が本発明の方法により検出されれば、次にそれを、外科的、化学療法、放射線、又は当該技術分野で周知であり当業者が熟知するであろうその他の癌治療方法を介して患者から除去することができる。或いは、このような癌腫は、本発明の処置方法を使用して、１つ以上のαｖβ６結合リガンド、例えば１つ以上のαｖβ６結合抗体又はそれらのフラグメントを、患者に又は患者の臓器又は組織に投与することにより、排除することができる。このような実施形態の特定の非限定的例において、１つ以上のαｖβ６結合リガンドは、上に詳述した通り、１つ以上の細胞毒性化合物又は薬剤とコンジュゲートされている。このような実施形態の更なる非限定的例において、１つ以上のαｖβ６結合リガンド、例えば１つ以上のαｖβ６結合抗体又はそれらのフラグメントは、上に詳述した通り、１つ以上の細胞毒性化合物又は薬剤と組み合わせて被験体、例えば患者に投与される。
【０１５６】
関連する実施形態において、本発明は、腫瘍又は癌細胞によるαｖβ６の発現を測定することにより腫瘍又は癌細胞の転移能を測定することを考慮する。このような実施形態において、腫瘍又は細胞の試料は、上述のような患者より入手し、腫瘍又は癌細胞上のαｖβ６の発現レベルについて本明細書に記載の方法に従い試験する。このような好ましい方法には、本明細書に記載したもののようなαｖβ６結合抗体（又はそれらのフラグメント、変異体又は誘導体）を使用した免疫組織化学分析が含まれる。本発明のこれらの方法によれば、腫瘍又は癌細胞によるαｖβ６の発現レベルと腫瘍又は癌細胞の転移能との間には、直接的な相関関係が存在しており：即ち、腫瘍又は癌細胞によるαｖβ６の発現の増大は、腫瘍又は癌細胞が原発腫瘍部位から二次的場所に転移する可能性がより高いことを指す。従って、腫瘍又は癌細胞によるαｖβ６の発現レベルは、腫瘍又は癌細胞の転移能の予後インジケーターとして使用することができ、これは癌患者及びその医師が現在又は予想される将来の癌の攻撃性又は浸潤性に基づき適切な処置を決定するに当たって役立つ可能性がある。
【０１５７】
個体から得られた生物学的試料、例えば組織又は腫瘍細胞の試料中のαｖβ６発現レベルを試験することに加えて、αｖβ６の発現レベル及びパターンは又、画像化によりｉｎ  ｖｉｖｏで検出することもできる。本発明のこのような方法において、１つ以上のαｖβ６結合リガンド、例えば１つ以上のαｖβ６結合抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化に好適な１つ以上の標識で検出可能に標識される。ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化に好適な標識又はマーカーには、Ｘ線撮影、ＮＭＲ又はＥＳＲにより検出可能なものが含まれる。Ｘ線撮影の場合、好適な標識には、検出可能な放射線を発射するが、被験体に悪影響を与えない放射性同位体、例えばバリウム又はセシウムが含まれる。ＮＭＲ及びＥＳＲに好適なマーカーには、重水素のような検出可能な特徴的スピンを有するものが含まれる。
【０１５８】
放射性同位体（例えば１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射線不透明物質又は核磁気共鳴により検出可能な物質のような適切で検出可能な画像化部分で標識されているαｖβ６結合リガンド、例えばαｖβ６結合抗体又は抗体フラグメントは、ｉｎ  ｓｉｔｕで癌又は癌腫に関して検査する哺乳動物内に導入（例えば非経腸、皮下又は腹腔内）される。被験体の体格及び使用する画像化システムにより診断画像を作成するのに必要な画像化部分の量が決定されることは、当該技術分野で理解されるであろう。放射性同位体部分の場合、ヒト被験体において、注入される放射能の量は、通常の場合９９ｍＴｃ約５〜２０ミリキューリーの範囲となる。その後、αｖβ６結合リガンド、例えばαｖβ６結合抗体又は抗体フラグメントは、αｖβ６インテグリンを含有又は発現する細胞又は組織の位置に優先的に蓄積する。次に、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍画像化が、Ｓ．Ｗ．  Ｂｕｒｃｈｉｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ”  （Ｃｈａｐｔｅｒ  １３，  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：  Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，  Ｓ．Ｗ．  Ｂｕｒｃｈｉｅｌ  ａｎｄ  Ｂ．Ａ．  Ｒｈｏｄｅｓ，  ｅｄｓ．，  Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．  （１９８２））に記載の通り実施される。
【０１５９】
αｖβ６結合リガンドの治療的使用
本発明の別の実施形態において、αｖβ６結合リガンド、例えばαｖβ６結合抗体又はそれらのフラグメントは、特定の疾患、特に特定の癌腫、例えば本明細書に別途記載するものに罹患した哺乳動物を処置する治療計画において使用される場合がある。本発明のこのような方法は、癌及び関連する事象、例えば腫瘍の生育、転移及び血管形成を処置するのに有用である。このような方法に特に好適なものは、疾患に罹患した哺乳動物の組織又は細胞におけるαｖβ６発現レベルの増大を特徴とし、且つαｖβ６発現レベルの増大を示す組織又は細胞をターゲティングし、これらの組織又は細胞を排除する処置に応答するような疾患又は癌である。これらの方法により特に処置が可能な疾患には、乳房、卵巣、前立腺、肝臓、肺、膵臓、結腸、頭頚部組織（例えば口腔、咽頭、舌及び喉頭組織）、子宮内膜、子宮頚部、胃及び脾臓を含めた上皮組織の転移癌（即ち、転移癌腫及び／又は腺癌）が含まれる。本発明のこれらの方法による処置に特に好適なものには、子宮内膜、膵臓、結腸（例えば結腸直腸癌腫）、子宮頚部、肺及び乳房（上皮内腺管癌（ＤＣＩＳ）及び上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）を含む）の癌腫がある。処置に好ましい哺乳動物には、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ及びヒトが含まれる。特に好ましくはヒトである。
【０１６０】
特定のこのような治療計画において、本発明の方法は、異なる方法による腫瘍の除去、処置又は根絶の後の、例えば残存転移細胞の残存腫瘍細胞を排除するのに好適である。例えば、本発明のこのような方法は、腫瘍の外科的切除、又は放射線照射、化学療法等のような方法による腫瘍の根絶の後に、患者に残存している場合がある残存腫瘍細胞又は転移細胞を排除するのに使用することができる。このような治療計画において、本発明の方法は、外科的、放射線的及び／又は化学療法的な腫瘍の除去の前、その間、及び／又は、後に、患者にαｖβ６結合リガンド、例えばαｖβ６結合抗体又はそれらのフラグメントを投与することを含む場合がある。
【０１６１】
関連する実施形態において、本発明は、患者における転移腫瘍への未転移腫瘍の進行を低減又は予防する方法であって、未転移の腫瘍における１つ以上の細胞上のインテグリンαｖβ６の１つ以上のサブユニットに結合する１つ以上のリガンドの治療有効量を患者に投与する工程を含み、インテグリンへのリガンドの結合が、原発腫瘍を囲む組織領域への未転移癌の細胞の浸潤の低減又は予防をもたらす、方法を提供する。
【０１６２】
本発明のこれらの治療方法を実施する場合、αｖβ６結合リガンド、例えばαｖβ６結合抗体又はそれらのフラグメントは、治療用製剤（本明細書においては交換可能及び同等に薬学的組成物とも呼ばれる）の形態で患者に投与される場合がある。本発明に従って使用されるαｖβ６結合リガンドの治療用製剤は、例えば凍結乾燥した製剤又は水溶液の形態で、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤と所望純度のαｖβ６結合リガンドを混合することにより調製して保存に付される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．  （１９８０））。αｖβ６結合リガンドのような薬理学的活性を有する化合物の他に、本発明の治療方法で使用される組成物は、薬学的に使用できる調製品への活性化合物の加工を容易にする賦形剤及び補助剤を含む１つ以上の好適な薬学的に許容される担体を含有してもよい。本発明の薬学的調製品は、それ自体既知の様式で、例えば従来の混合、顆粒化、糖衣錠製造、溶解又は凍結乾燥の加工法により製造される。即ち、経口用途の薬学的調製品は、活性化合物を固体賦形剤と組み合わせて、場合により得られた混合物を粉砕し、必要に応じて好適な補助剤を添加した後に、顆粒混合物を下行することにより、錠剤又は糖衣錠のコアを得る。
【０１６３】
好適な賦形剤は、特に、充填剤、例えば糖類、例えば乳糖又はスクロース、マンニトール又はソルビトール、セルロース調製品及び／又はリン酸カルシウム、例えばリン酸３カルシウム又はリン酸水素カルシウム、並びに結合剤、例えば澱粉ペースト、例えばトウモロコシ澱粉、コムギ澱粉、コメ澱粉、バレイショ澱粉、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又は、ポリビニルピロリドン使用のものである。所望により、錠剤崩壊剤、例えば上述の澱粉及びカルボキシメチル澱粉、交差結合ポリビニルピロリドン、寒天又はアルギン酸又はその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加することができる。補助剤は、とりわけ、流動調節剤及び潤滑剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸又はその塩、例えばステアリン酸マグネシウム又はステアリン酸カルシウム及び／又はポリエチレングリコールである。糖衣錠のコアは、所望により胃液に対して耐性を有する好適なコーティングが施される。この目的では、濃縮糖溶液を使用することができ、これは場合によりアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液及び好適な有機溶媒又は溶媒混合物を含有する場合がある。胃液に対して耐性を有するコーティングを作成するには、好適なセルロース調製品、例えばアセチルセルロースフタレート又はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートの溶液が使用される。染料及び顔料を、例えば識別のため、又は活性化合物用量の組合せを特徴付けるために、錠剤又は糖衣錠コーティングに添加することができる。
【０１６４】
経口使用できるその他の薬学的調製品には、ゼラチンから作成したプッシュフィットカプセル、並びにゼラチン及び可塑剤、例えばグリセロール又はソルビトールから作成したソフトシールカプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、乳糖のような充填剤、澱粉のような結合剤、及び／又はタルク又はステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、及び場合により安定化剤と混合される場合がある顆粒の形態で活性化合物を含有してもよい。ソフトカプセルの場合、活性化合物は、好ましくは好適な液体、例えば油脂又は流動パラフィンに溶解又は懸濁される。更に、安定化剤が添加される場合もある。
【０１６５】
非経口投与に好適な製剤には、水溶性形態の活性化合物の水溶液、例えば水溶性の塩及びアルカリの溶液が含まれる。アルカリ塩には、例えばトリス、水酸化コリン、ビストリスプロパン、Ｎ−メチルグルカミン又はアルギニンを使用して調製されたアンモニウム塩が含まれてもよい。更には、適切な油性の注射用懸濁液としての活性化合物の懸濁液を投与することもできる。好適な親油性の溶媒又はビヒクルには、油脂類、例えばゴマ油又は合成の脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル又はトリグリセリド又はポリエチレングリコール−４００（これらの化合物はＰＥＧ４００に可溶である）が含まれる。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含有してもよい。場合により懸濁液は、安定化剤も含有する場合がある。
【０１６６】
本発明の化合物は、点眼液として、又は軟膏、ゲル、リポソーム又は生物学的適合性を有する重合体ディスク、ペレットとして動物及びヒトの眼に投与される場合もあれば、コンタクトレンズ内に担持される場合もある。眼内組成物は又、当業者が従来の基準を使用して選択できる通り、生理学的適合性を有する眼科用のビヒクルを含有する場合がある。ビヒクルは、既知の眼科用ビヒクルから選択される場合があり、これには、水、ポリエーテル（例えばポリエチレングリコール４００）、ポリビニル（例えばポリビニルアルコール）、ポビドン、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロース）、石油誘導物（例えば鉱物油及び白色ワセリン）、動物性脂肪（例えばラノリン）、植物性脂肪（例えばピーナツ油）、アクリル酸の重合体（例えばカルボキシルポリメチレンゲル）、多糖類（例えばデキストラン及びグリコサミノグリカン、例えば塩化ナトリウム及び塩化カリウム）、塩化亜鉛、及び緩衝物質（例えば重炭酸ナトリウム又は乳酸ナトリウム）が含まれるが、これらに限定されない。高分子量の分子も使用することができる。組成物中の本発明の化合物を不活性化しない生理学的適合性を有する保存料には、アルコール、例えばクロロブタノール、塩化ベンザルコニウム及びＥＤＴＡ、又は等業者に既知のその他何れかの適切な保存料が含まれる。
【０１６７】
皮下投与に採用される抗体の凍結乾燥製剤は、全体が参考として本明細書で援用される米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。このような凍結乾燥された製剤は、高いタンパク質含有量となるように好適な希釈剤で再構成される場合があり、再構成された製剤は、本明細書において処置する患者に皮下投与される場合がある。
【０１６８】
αｖβ６結合リガンドは又、例えばコアセルベーション法により、又は界面重合法により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンのマイクロカプセル、及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中で、コロイド状の薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中で、又はマクロエマルジョン中で捕獲される場合もある。このような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．  （１９８０）に開示されている。
【０１６９】
αｖβ６結合リガンドの除放性調製品が調製される場合がある。除放性調製品の好適な例には、αｖβ６結合リガンドを含有する固体疎水性重合体の半透性のマトリックスであって、形状付与された物品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態であるマトリックスが含まれる。除放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性の乳酸−グリコール酸共重合体、例えばＬＵＰＲＯＮＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸重合体及び酢酸ロイプロリドよりなる注射用微小球）及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【０１７０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、滅菌されていなければならない。これは、滅菌濾過膜で濾過することにより容易に達成される。
【０１７１】
αｖβ６結合リガンドは、何れかの好適な手段、例えば非経腸、肺内、頭蓋内、経費及び鼻内投与により被験体又は患者に投与される場合がある。非経腸の注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が含まれる。更に、αｖβ６結合リガンドは、パルス注入により、例えばαｖβ６結合リガンドの漸減用量を使用して適宜投与される場合がある。好ましくは、投薬は、投与が短期であるか長期であるかに部分的に応じて、注射、最も好ましくは静脈内又は皮下注射により行われる。
【０１７２】
本発明の特定の例示される実施形態において、αｖβ６結合リガンドは、約１ｍｇ／ｍ２〜約５００ｍｇ／ｍ２の用量において患者に（例えば静脈内に）投与される。例えば、αｖβ６結合リガンドは、約１ｍｇ／ｍ２、２ｍｇ／ｍ２、３ｍｇ／ｍ２、４ｍｇ／ｍ２、５ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、１５ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、３０ｍｇ／ｍ２、３５ｍｇ／ｍ２、４０ｍｇ／ｍ２、４５ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２、５５ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、６５ｍｇ／ｍ２、７０ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、８０ｍｇ／ｍ２、８５ｍｇ／ｍ２、９０ｍｇ／ｍ２、９５ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２、１１０ｍｇ／ｍ２、１１５ｍｇ／ｍ２、１２０ｍｇ／ｍ２、１２５ｍｇ／ｍ２、１３０ｍｇ／ｍ２、１３５ｍｇ／ｍ２、１４０ｍｇ／ｍ２、１４５ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２、１５５ｍｇ／ｍ２、１６０ｍｇ／ｍ２、１６５ｍｇ／ｍ２、１７０ｍｇ／ｍ２、１７５ｍｇ／ｍ２、１８０ｍｇ／ｍ２、１８５ｍｇ／ｍ２、１９０ｍｇ／ｍ２、１９５ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、２１０ｍｇ／ｍ２、２１５ｍｇ／ｍ２、２２０ｍｇ／ｍ２、２２５ｍｇ／ｍ２、２３０ｍｇ／ｍ２、２３５ｍｇ／ｍ２、２４０ｍｇ／ｍ２、２４５ｍｇ／ｍ２、２５０ｍｇ／ｍ２、２５５ｍｇ／ｍ２、２６０ｍｇ／ｍ２、２６５ｍｇ／ｍ２、２７０ｍｇ／ｍ２、２７５ｍｇ／ｍ２、２８０ｍｇ／ｍ２、２８５ｍｇ／ｍ２、２９０ｍｇ／ｍ２、２９５ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、３０５ｍｇ／ｍ２、３１０ｍｇ／ｍ２、３１５ｍｇ／ｍ２、３２０ｍｇ／ｍ２、３２５ｍｇ／ｍ２、３３０ｍｇ／ｍ２、３３５ｍｇ／ｍ２、３４０ｍｇ／ｍ２、３４５ｍｇ／ｍ２、３５０ｍｇ／ｍ２、３５５ｍｇ／ｍ２、３６０ｍｇ／ｍ２、３６５ｍｇ／ｍ２、３７０ｍｇ／ｍ２、３７５ｍｇ／ｍ２、３８０ｍｇ／ｍ２、３８５ｍｇ／ｍ２、３９０ｍｇ／ｍ２、３９５ｍｇ／ｍ２又は４００ｍｇ／ｍ２の用量において投与される場合がある。
【０１７３】
αｖβ６結合リガンドは、広範な種類の投薬日程に従って投与できる。例えばαｖβ６結合リガンドは、所定時間量（例えば４〜８週間又はそれ以上）にわたり一日一回、又は所定時間量（例えば４〜８週間又はそれ以上）にわたり、週当たりの日程に従って（例えば週に１日、週に２日、週に３日、週に４日、週に５日、週に６日又は週に７日）投与することができる。「週１回」の投薬日程の特定の例は、投与期間の第１、８、１５及び２２日におけるαｖβ６結合リガンドの投与である。代替の実施形態において、αｖβ６結合リガンドは、数ヶ月の期間にわたり間歇的に投与される場合がある。例えば、αｖβ６結合リガンドは、年２回３週連続で毎週投与（即ち、週当たり投薬日程を６ヶ月毎に反復）される場合がある。このような投与様式は、初期の処置により得られる有益な治療作用が維持されるように長期間（数年）継続される場合があることが理解されるであろう。更に他の実施形態において、このような維持治療は、癌性、転移性又はｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫の病態の急性期の症状を低減するように設計された急性期用量計画に従って行われる場合もある。
【０１７４】
処置期間を通して各時点で投与されるαｖβ６結合リガンドの量は、同じであってもよければ；或いは、処置期間の各時点で投与される量は異なってもよい（例えば、所定時点において投与される量は、以前に投与された量よりも増減してよい）。例えば、維持療法の間の用量は、処置の急性期に投与されたものより少なくてもよい。特定の状況に応じた適切な用量日程については、当業者に明らかになるであろう。
【０１７５】
本発明の特定の実施形態においては、αｖβ６結合リガンドの複数の型又は種を互いに組み合わせて患者に投与することにより、１つ以上の癌性、転移性又はｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫の病態が処置される。例えば、本発明は本明細書に開示したもののようなαｖβ６結合抗体２種以上の患者への投与を考慮する。複数のαｖβ６結合リガンドを患者に投与する場合、異なるαｖβ６結合リガンドは、単一の薬学的組成物内で共に投与することができ、又はより好ましくは、別個の投薬において逐次的に投与できる。このような他剤の有効量は製剤中に存在するαｖβ６結合リガンドの量、処置する疾患又は障害の型、及びその他の因子により異なる。
【０１７６】
本発明は又、癌性、転移性又はｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫の病態を処置する方法であって、第１の薬剤を第２の薬剤と組み合わせて患者に投与する工程を含み、第１の薬剤がαｖβ６結合リガンドであり、第２の薬剤が１つ以上の癌性、転移性又はｉｎ  ｓｉｔｕ癌腫の病態の処置に有用であるが、必ずしもαｖβ６結合リガンドでなくてもよい薬剤である、方法も含む。第１の薬剤を第２の薬剤と「組み合わせて」投与するとは、第１の薬剤を第２の薬剤の患者への投与よりも前、同時又は後に、患者に投与することにより、両薬剤を治療計画において患者に投与することができることを意味している。例えば、本発明の特定のこのような実施形態によれば、αｖβ６結合リガンドは、患者に対するその他１つ以上のインテグリン受容体（例えばα１β１、α４βｌ、αｖβ８、αｖβ５、α５β１等）の拮抗物質、例えば当該技術分野で既知の１つ以上のインテグリン受容体（例えばα１β１、α４βｌ、αｖβ８、αｖβ５、α５β１等）に対して特異的な抗体、ポリペプチド拮抗物質及び／又は小分子の投与と組み合わせて（即ち、該投与の前、同時又は後に）、患者に投与される。
【０１７７】
本発明のこの特徴の特定の実施形態において、αｖβ６結合リガンドと組み合わせて投与される第２の薬剤には、例えばステロイド、細胞毒性化合物（本明細書に別途記載したものを含む）、放射性同位体（本明細書に別途記載したものを含む）、プロドラッグ活性化剤（本明細書に別途記載したものを含む）、コルヒチン、酸素、又は抗酸化剤（例えばＮ−アセチルシステイン）、金属キレート形成剤（例えばテトラチオモリブデート）、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、α−抗トリプシン等がある。本発明のこの態様による治療目的のために１つ以上のαｖβ６結合リガンドのような１つ以上の第１の薬剤と組み合わせて患者に投与できる更なる第２の薬剤又は化合物は、当業者が熟知するはずであり；従って、このような更なる第１の薬剤又は化合物の使用は、本発明により包含されるとみなされる。
【０１７８】
本明細書に記載した方法及び用途のその他の好適な改変及び応用は自明であり、従って、本発明又は本発明の何れかの実施形態の適用範囲から逸脱することなく行われることが、当業者に容易に明らかになるであろう。以上において本発明を詳述してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することにより更に明確に理解されるであろう。但し、これらの実施例は、単に本発明の例示を目的としたものであり、限定を目的としたものではない。
【実施例】
【０１７９】
実施例１  ｍｕ３Ｇ９可変領域のクローニング
製造業者の推奨するプロトコルに従い、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニキットを使用し、３Ｇ９マウスのハイブリドーマ細胞由来の総細胞ＲＮＳを調製した。重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする相補的ＤＮＡは、Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キットを使用し、プライミングのためにランダム六量体を使用し、製造業者の推奨するプロトコルに従い、総細胞ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによってクローン化した。
【０１８０】
マウス３Ｇ９免疫グロブリン重鎖可変ドメインのＰＣＲ増幅のために使用したプライマーは次の通りである。
【０１８１】
【化１１】
2009500041.tif 000012
この反応は、９５℃での２．５分間の初回溶解後に９４℃での３０秒間の溶解×１０サイクル、６０℃−１℃／サイクルでの４５秒間のアニーリング後、Ｃｌｏｔｅｃｈ社のＡｄｖａｎｔａｇｅ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して６８℃での１分間の伸長からなる。この反応に続き、追加的な９４℃での３０秒間の溶解×１０サイクル、５５℃での４５秒間のアニーリング、６８℃での１分間の伸長及び最終の６８℃での９分間の伸長を実施した。この反応はＱｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使用し、製造業者の推奨するプロトコルに従って精製した。過剰ｄＮＴＰ’ｓ存在下で、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｔａｑ増幅ＤＮＡの末端を平滑にし、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼによって平滑末端を生成した。精製され、平滑にした３Ｇ９重鎖可変領域遺伝子ＰＣＲ生成物は、ＴＯＰＯクローニングキットを使用して、製造業者の推奨するプロトコルに従い、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯクローニングベクターにサブクローニングした。重鎖ＲＴ−ＰＣＲサブクローンは、ｐＫＪＳ０６２と名付けた。
【０１８２】
３Ｇ９軽鎖可変ドメイン遺伝子は、プライマーを使用して、次の配列を増幅させた。
【０１８３】
【化１２】
2009500041.tif 000013
この反応は、９５℃での２．５分間の初回溶解後に９４℃での３０秒間の溶解×６サイクル、６０℃−１℃／サイクルでの４５秒間のアニーリング後、Ｃｌｏｔｅｃｈ社のＡｄｖａｎｔａｇｅ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して６８℃での２分間の伸長からなる。この反応に続き、追加的な９４℃での３０秒間の溶解×２４サイクル、５４℃での４５秒間のアニーリング、６８℃での２分間の伸長及び最終の６８℃での１０分間の伸長を実施した。１０回に１回の反応は、第２ラウンドのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）による増幅のための鋳型として使用した。この反応は、９５℃での２．５分間の初回溶解後に９４℃での３０秒間の溶解×２０サイクル、５５℃での４５秒間のアニーリング後、７２℃での１分間の伸長からなる。この反応生成物は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用し、製造業者の推奨するプロトコルに従って精製されたゲルであった。精製３Ｇ９軽鎖可変領域遺伝子ＰＣＲ生成物は、ＴＯＰＯクローニングキットを使用して、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯクローニングベクターにサブクローニングした。この軽鎖ＲＴ−ＰＣＲサブクローンはｐＫＪＳ０５４と名付けた。
【０１８４】
ｐＫＪＳ０５４及びｐＫＪＳ０６２両者の多重独立サブクローンのインサートの配列を決定した。両者とも、多重独立サブクローンの挿入部分の配列は同一であった。可変ドメイン配列のＢｌａｓｔ分析は両者の免疫グロブリン同一性を確認した。３Ｇ９重鎖可変ドメインは、マウスサブグループＩＩＩＤのメンバーである。３Ｇ９軽鎖可変領域は、マウスκサブグループＩＶのメンバーである。
【０１８５】
実施例２  ｃｈ３Ｇ９の構築及び発現
ｃＤＮＡｓは、マウス−ヒトキメラ（ｃｈ３Ｇ９）を発現するためのベクターを構築するために使用された重鎖及び軽鎖のマウス３Ｇ９可変領域をコードしており、ここでは、ｍｕ３Ｇ可変領域とヒトＩｇＧ１及びκ定常領域とが結合している。
【０１８６】
重鎖キメラを構築するため、３Ｇ９重鎖可変領域ドメインプラスミドｐＫＪＳ０６２の５０８ｂｐ  ＥｃｏＲＩフラグメントを線状化脱リン酸化したｐＵＣ由来クローニングベクターｐＮＮ０９のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。この段階に、この結果生じたプラスミドｐＫＪＳ０９３の隣接ＮｏｔＩ部位を加えた。プラスミドｐＫＪＳ０９３の重鎖配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。スプライスドナー部位の直後にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を加え、この部位を可変領域のちょうど下流のプラスミドｐＫＪＳ０９３に加え、変異原性オリゴヌクレオチドの部位指定変異導入により、次のように配列をコードする。
【０１８７】
【化１３】
2009500041.tif 000014
ここでは、製造業者の推奨するプロトコルに従ってＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発キットを使用した。この段階はプラスミドｐＫＪＳ１１６を発現させた。プラスミドｐＫＪＳ１３６を生成するｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＥＢＶ発現ベクター由来プラスミドｐＣＨ２６９のＮｏｔＩ部位に、ｐＫＪＳ１１６の０．４８ｋｂ  ＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ重鎖変異ドメインフラグメント及びヒトＩｇＧ１定常領域を含むプラスミドｐＥＡＧ９６４の１．２２ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントをサブクローニングした。
【０１８８】
軽鎖キメラの構造に関しては、結果として生じたプラスミドｐＫＪＳ１１２の隣接ＮｏｔＩ部位を加えて線状化脱リン酸化したクローニングベクターｐＮＮ０９のＥｃｏＲＩ部位に、３Ｇ９軽鎖可変ドメインプラスミドｐＫＪＳ０５４の４７４塩基対ＥｃｏＲＩフラグメントをサブクローニングした。プラスミドｐＫＪＳ１１２の軽鎖配列はＤＮＡ配列決定によって確認した。ＢｇＩＩＩ制限部位を可変領域のちょうど下流のプラスミドｐＫＪＳ１１２に加え、変異原性オリゴヌクレオチドの部位指定変異導入により、次のように配列をコードする。
【０１８９】
【化１４】
2009500041.tif 000015
ここでは、プラスミドｐＫＪＳ１３２を発現させるＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発キットを使用した。プラスミドｐＫＪＳ１４１を発現するｐＣＥＰ４（Ｉｎｔｒｏｇｅｎ）ＥＢＶ発現ベクター由来プラスミドｐＣＨ２６９のＮｏｔＩ部位に、ｐＫＪＳ１３２の４５３ｂｐ  ＮｏｔＩ−ＢｇＩＩＩ軽鎖可変ドメインフラグメント及びヒトκ軽鎖定常ドメイを含むプラスミドｐＥＡＧ９６３の６７８ｂｐ  ＢｃＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントをサブクローニングした。ｍｕ３Ｇ９のクローニング中に、軽鎖の最初のＣＤＲにグルコシル化シグナル配列（ＮＸＴ／Ｓ）が含まれていることに注意した。単回のＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅによるオリゴヌクレオチドの部位指定変異導入によって、次のようにＮＳＳからＳＳＳへとモチーフ配列が変換され、ベクターｐＫＪＳ１５７の発現が生じ、このグリコシル化シグナル配列が除去された。ｐＫＪＳ１５７の軽鎖可変領域配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１９０】
【化１５】
2009500041.tif 000016
発現ベクター（軽鎖ｐＫＪＳ１４１又はｐＫＪＳ１５７及び重鎖ｐＫＪＳ１３６）を２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時移入し、移入細胞を抗体分泌及び特異性に関して試験した。エンプティベクター移入細胞及びＥＢＶ発現ベクターと共にｃｈＭ９２に同時移入細胞胞（分子クローニングしたＣＤ１５４特異的ｍＡｂ）を対照群とした。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅａｓｙ滴定キットを使用し、製造業者の推奨するプロトコルに従ったならし培地の抗体力価分析及びウェスタンブロット分析（抗ヒト重鎖及び軽鎖抗体を使用して開発された）では、ｃｈ３Ｇ９−移入細胞が合成され、重鎖、軽鎖及び分泌抗体を効率的に集合させたことが示された。αｖβ６に対するＥＬＩＳＡ試験では、αｖβ６と結合したｃｈ３Ｇ９はｍｕ３Ｇ９と類似しているが、ｃｈＭ９２は類似していないことを示した。
【０１９１】
図１に示す通り、キメラ３Ｇ９（ｃｈ３Ｇ９；  三角形の記号で示される）及び軽鎖の最初のＣＤＲのＮ結合グリコシル化部位内でのＮからＳへの置換が含まれる大規模で一過性の遺伝子導入によって生成したキメラ３Ｇ９のアグリコシル突然変異型については、精製した後、ＥＬＩＳＡ試験でαｖβ６への類似の結合が示された。軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１内のグリコシル化部位の除去が、抗体の結合親和性に影響を及ぼすことも変化させることもなく、タンパク質発現及び精製を改善することが示されている。
【０１９２】
実施例３  ｈｕ３Ｇ９変異型１、２及び３の構築
ヒト化３Ｇ９（ｈｕ３Ｇ９）を発現させるために再形成された可変ドメインの設計は以下の通りに実施した。３Ｇ９軽鎖可変ドメインをヒトκ３に、重鎖可変ドメインをヒト重鎖サブグループ３に対応させた。ヒト受容体フレームワークの選択は、プログラムＩｇＢＬＡＳＴ：軽鎖のヒトＬ６（ヒトＪＫ４由来Ｊ領域を使用する）及び重鎖のヒト３−７（ヒトＪＨ４由来Ｊ領域を使用する）を使用して、ヒト生殖細胞系列配列への相同性マッチングによって実施した。表１に示す通り、再形成された可変軽鎖及び可変重鎖それぞれにつき３種類の変異型を設計した。第１変異型ではマウスドナー配列に突然変異を最も多く取り入れ、第３変異型では最も突然変異を最も少なくした（即ち、最も「ヒト化」した）。重鎖及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ領域は、下の表１に示す通り、従来のＫａｂａｔナンバリング分類システムによって定義されている。しかし、下に示した配列のナンバリングは、互いに関連する種々の配列の相対線形位置決め方式に基づいている。
【０１９３】
【化１６】
2009500041.tif 000017
ｈｕ３Ｇ９重鎖変異型１及び軽鎖変異型１、２及び３は、リン酸化上位鎖オリゴヌクレオチドの合成を連結反応することによって合成により生成され、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）と共に下位短鎖オリゴヌクレオチドによる並列位に保持される。この反応では９４℃での１分間×１５サイクルによって培養した後、５５℃−１℃／サイクルでの１分間及び６５℃での４分間によって、５’制限部位（ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩ）、単一配列、可変ドメインを含む単鎖鋳型ＤＮＡを生成し、定常ドメインの最初の特異領域へ向かっての伸長（軽鎖）又は特異領域にまで及ぶ伸長（重鎖）（軽鎖のＢｓｉ  ＷＩ及び重鎖のＡｇｅＩ）を実施した。これらの合成遺伝子のプライマーについては、以下に記載する。これらの遺伝子鋳型は、オリゴ糖を使用したＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって：
【０１９４】
【化１７】
2009500041.tif 000018
重鎖の
【０１９５】
【化１８】
2009500041.tif 000019
及び
【０１９６】
【化１９】
2009500041.tif 000020
軽鎖の
【０１９７】
【化２０】
2009500041.tif 000021
を増幅し、
二重鎖ＤＮＡを生成した。この反応は、９５℃での２．５分間の初回溶解後に９４℃での３０秒間の溶解×１６サイクル、６４℃での３０秒間のアニーリング後、７２℃での１分間の伸長からなる。この反応はＱｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ゲル抽出キットを使用し、製造業者の推奨するプロトコルに従って精製した。
【０１９８】
重鎖変異型１は、次の上位鎖５’リン酸化オリゴヌクレオチドから合成により生成した。
【０１９９】
【化２１】
2009500041.tif 000022
これらのオリゴ糖は、並列位の上位鎖オリゴヌクレオチドと約１５ｂｐ重複する次の下位鎖非リン酸化オリゴヌクレオチドによって並置に保持されていた。この下位鎖オリゴヌクレオチドは、以下の通りである。
【０２００】
【化２２】
2009500041.tif 000023
重鎖変異型２は、次の上位鎖５’リン酸化オリゴヌクレオチドから合成により生成した。
【０２０１】
【化２３】
2009500041.tif 000024
このようなオリゴ糖は、並列位の上位鎖オリゴヌクレオチドと約１５ｂｐ重複する次の下位鎖非リン酸化オリゴヌクレオチドによって並置に保持されていた。この下位鎖オリゴヌクレオチドは、以下の通りである。
【０２０２】
【化２４】
2009500041.tif 000025
ｈｕ３Ｇ９重鎖変異型１及び２の発現ベクターは、合成により生成されたヒト化変異体及びヒトＩｇＧ１定常領域の残基を含有する９１９ｂｐのプラスミドｐＫＪＳ１６０由来ＡｇｅＩ／ＢａｍＨＩフラグメントのヒトＩｇＧ１定常領域の最初の１０５ｂｐを含む５３８ｂｐのＮｏｔＩ−ＡｇｅＩ重鎖可変ドメインフラグメントを重鎖発現ベクターｐＫＪＳｑ１６６（変異型１）及びｐＫＪＳ１６７（変異型２）を生成するＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ分解ｐＫＪＳ１６０（ＥＢＶ発現ベクターｐＣＨ２６９由来ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と同一）にサブクローニングすることによって生成した。
【０２０３】
重鎖変異３型は、オリゴヌクレオチドを使用し、プラスミドｐＫＪＳ１６７で１ラウンドのＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ部位指向性突然変異を実施することによって発現させた。
【０２０４】
【化２５】
2009500041.tif 000026
この結果生じた変異３型重鎖プラスミドをｐＫＪＳ１６８とした。この結果生じたプラスミドの可変領域のｃＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０２０５】
軽鎖変異型１は、次の上位５’リン酸化オリゴヌクレオチドから合成により発現させた。
【０２０６】
【化２６】
2009500041.tif 000027
このようなオリゴ糖は、並置されている上位鎖オリゴヌクレオチドと約１５ｂｐ重複する次の下位鎖非リン酸化オリゴヌクレオチドによって、並置に保持されていた。この下位鎖オリゴヌクレオチドは以下の通りである。
【０２０７】
【化２７】
2009500041.tif 000028
軽鎖変異型２は、次の上位鎖５’リン酸化オリゴヌクレオチドから合成により発現させた。
【０２０８】
【化２８】
2009500041.tif 000029
このようなオリゴ糖は、並置されている上位鎖オリゴヌクレオチドと約１５ｂｐ重複する次の下位鎖非リン酸化オリゴヌクレオチドによって、並置に保持されていた。この下位鎖オリゴヌクレオチドは、以下の通りである。
【０２０９】
【化２９】
2009500041.tif 000030
軽鎖変異３型は、次の上位鎖５’リン酸化オリゴヌクレオチドから合成により発現させた。
【０２１０】
【化３０】
2009500041.tif 000031
このようなオリゴ糖は、並置されている上位鎖オリゴヌクレオチドと約１５ｂｐ重複する次の下位鎖非リン酸化オリゴヌクレオチドによって、並置に保持されていた。この下位鎖オリゴヌクレオチドは以下の通りである。
【０２１１】
【化３１】
2009500041.tif 000032
ｈｕ３Ｇ９軽鎖変異型１、２及び３の発現ベクターは、合成により発現されたヒト化変異体及びヒト免疫グロブリンκ定常領域を含有する３２４ｂｐのｐＫＪＳ１６２由来ＢｓｉＷＩ／ＢａｍＨＩフラグメントをＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ分解ｐＫＪＳ１６１（ＥＢＶ発現ベクターｐＣＨ２６９由来ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と同一）にサブクローニングすることによって生成させた。この結果生じたプラスミドはｐＫＪＳ１７２（変異型１）、ｐＫＪＳ１７３（変異型２）及びｐＫＪＳ１７４（変異３型）と名付けた。
【０２１２】
実施例４  ｈｕ３Ｇ９変異型１、２及び３の発現、並びに変異型４及び５の構築
ヒト化キメラ重鎖発現ベクターと軽鎖ベクターとの可能性のある全ての組み合わせを２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時移入した（１６通りの組み合わせ）。移入細胞胞は抗体分泌及び特異性について試験した。ならし培地のウェスタンブロット分析（抗ヒト重鎖及び軽鎖抗体を使用して検出する）及び簡易滴定（Ｐｉｅｒｃｅ）分析から、ｈｕ３Ｇ９移入細胞が合成され、重鎖及び軽鎖を効率的に分泌し、発現のレベルが抗体ヒト化の増大を伴って増大している思われることが示された。図２に示す通り、軽鎖変異型１を含有する変異体は、これよりも高レベルで発現する軽鎖変異型２を含有する変異体の発現量が乏しく、このことは、ヒト化が増大すると高次の発現を引き起こす傾向があることを示唆している。
【０２１３】
移入細胞のならし培地で染色したαｖβ６発現ＳＷ４８０細胞のＦＡＣＳ分析から、３Ｇ９重鎖のヒト化は、抗体のαｖβ６発現細胞との結合能力にマイナスの影響を及ぼさず、重鎖変異３型（ＣＤＲ移植変異型）には変異型１及び変異型２と比べて結合活性の増大が見られることが示された（図３）。又、ＦＡＣＳ分析からは、変異３型を含有するｈｕ３Ｇ９  ｍＡｂ変異体の結合能が、ｈｕ３Ｇ９軽鎖変異型２を含有する変異体よりもやや低いものの、両者の変異体は少なくともキメラ３Ｇ９とは結合すると思われることが示された（図３）。軽鎖変異型２及び変異３型とＣＤＲ移植３Ｇ９との間にはそれぞれ、わずか２個及び１個のアミノ酸の差しか見られない。このような軽鎖変異型には、αｖβ６に対してキメラ３Ｇ９と類似の結合活性が見られるため、２つの追加的変異型は、結合活性を改善できる可能性があるか又はＣＤＲ移植変異型を機能的にできるかどうかを明らかにするために作成した。
【０２１４】
変異型４では、軽鎖の位置１でのグルタミンのグルタミン酸置換に対する作用を探求した後、変異５型では完全なＣＤＲ移植３Ｇ９軽鎖となった（表１）。このような各変化の個々の寄与因子を検討するため、新しい軽鎖発現ベクターを構築した。変異３型軽鎖のＥ１Ｑ変異体であるプラスミドｐＫＪＳ１８６は、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ突然変異生成キットを使用し、オリゴヌクレオチド：
【０２１５】
【化３２】
2009500041.tif 000033
【０２１６】
【化３３】
2009500041.tif 000034
を使用したプラスミドｐＫＪＳ１７４の部位指向性突然変異生成によって生成し、軽鎖変異型４とした。ＣＤＲ移植３Ｇ９軽鎖であるプラスミドｐＫＪＳ１８８は、オリゴヌクレオチド：
【０２１７】
【化３４】
2009500041.tif 000035
を使用したプラスミドｐＫＪＳ１７４の部位指向性突然変異によって生成し、軽鎖変異５型とした。これらの軽鎖変異型については、配列を確認した後、重鎖変異型２又は３を２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時移入した。ＦＡＣＳ分析からは、完全ＣＤＲ移植対である重鎖変異３型及び軽鎖変異５型が、他のヒト化変異体対と同程度か更に強力にαｖβ６発現細胞と結合することが示された（図４）。このｐＫＪＳ１６８及びｐＫＪＳ１８８対合は、ｈｕ３Ｇ９変異５型（Ｈ３／Ｌ５）として設計した。
【０２１８】
ｃｈ３Ｇ９及びｈｕ３Ｇ９変異型２〜５の２９３−ＥＢＮＡ細胞の同時移入は規模が拡大し、ならし培地が採取可能となった。抗体をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上で精製し、精製されたｍＡｂｓを活性について評価した。αｖβ６への結合は、細胞株ＦＤＣＰ１−β６（図５）、ＥＬＩＳＡ（図６）、及びＬＡＰに対するビオチン化αｖβ６の遮断（図７）に関するＦＡＣＳ分析によって測定した。結合活性の等級序列は、変異５型（Ｈ３／Ｌ５）＞変異３型（Ｈ３／Ｌ３）＝ｃｈ３Ｇ９＝変異型２（Ｈ２／Ｌ２）であった。ＬＡＰに対するαｖβ６媒介ＦＤＣＰ１−β６細胞接着の遮断は、図８に示す。生体活性の等級序列は、ｃｈ３Ｇ９＝変異５型（Ｈ３／Ｌ５）＝変異型２（Ｈ２／Ｌ２）＞変異３型（Ｈ３／Ｌ３）であった。変異５型は、変異型２よりもヒト化されていたため、安定したＣＨＯ細胞株の生成のために選択した。
【０２１９】
ｈｕ３Ｇ９重鎖（変異型１、２、３及び５）並びに軽鎖（変異型１〜５）可変ドメインの種々の変異型に関するＤＮＡ及び対応するタンパク質配列を表２に示した。重鎖変異型ドメインの場合は、配列は以下を含む：
（ａ）ＶＨ３〜７のＦＲ１由来ヒトＦＲ１；
（ｂ）マウス３Ｇ９  ＣＤＲ１重鎖配列；
（ｃ）ＶＨ３〜７のＦＲ２由来ヒトＦＲ２；
（ｄ）マウス３Ｇ９  ＣＤＲ２重鎖配列；
（ｅ）ＶＨ３〜７のＦＲ３由来ヒトＦＲ３；
（ｆ）マウス３Ｇ９  ＣＤＲ３重鎖配列；及び
（ｇ）大多数のヒト抗体に存在し、ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳという配列を有するコンセンサスフレームワーク配列由来のヒトＦＲ４。
軽鎖可変ドメインの場合、配列は以下を含む：
（ａ）Ｌ６のＦＲ１由来ヒトＦＲ１；
（ｂ）アスパラギン（Ｎ）からセリン（Ｓ）へのアミノ酸置換を有するマウス３Ｇ９  ＣＤＲ１軽鎖配列；
（ｃ）Ｌ６のＦＲ２由来ヒトＦＲ２；
（ｄ）マウス３Ｇ９  ＣＤＲ２軽鎖配列；
（ｅ）Ｌ６のＦＲ３由来ヒトＦＲ３；
（ｆ）マウス３Ｇ９  ＣＤＲ３軽鎖配列；及び
（ｇ）大多数のヒト抗体に存在し、ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫという配列を有するコンセンサスフレームワーク配列由来のヒトＦＲ４。
【０２２０】
【化３５】
2009500041.tif 000036
【０２２１】
【化３６】
2009500041.tif 000037
【０２２２】
【化３７】
2009500041.tif 000038
【０２２３】
【化３８】
2009500041.tif 000039
実施例５  野生型及びアグリコシル−ｈｕ３Ｇ９変異５型の安定ＣＨＯ発現ベクターの構築
上述のＥＢＶベクターは、望ましくない外来５’並びに３’  ＵＴＲｓを含有する。ｈｕ−３Ｇ９重鎖変異３型及び軽鎖変異５型（Ｈ３／Ｌ５）のために安定ＣＨＯ発現ベクターを生成し、集合的に変異５型とし、この中から外来配列を除去した。更に、発現した３Ｇ９抗体とＦｃガンマ受容体との間に生じる可能性のある相互作用を除去するために、アグリコシル重鎖ベクターを生成した。
【０２２４】
図９に示した通り、ｐＫＪＳ１８８の７２３塩基対ＢａｍＨ１フラグメントをｐＫＪＳ０７７（ＰＤＭ−６４−０２−１３）生成プラスミドｐＫＪＳ１９５の６１８８塩基対新規含有ＢａｍＨ１消化ベクターフラグメントに連結させることによって、軽鎖安定ＣＨＯ発現ベクターを生成した。
【０２２５】
重鎖コード配列に隣接し、ｐＫＪＳ１７１を生成するＮｏｔ１制限部位を除去するため、最初にｐＫＪＳ１６８の１４４９塩基対ＢａｍＨ１フラグメントをｐＫＪＳ０７８（ＰＤＭ−６４−０２−１３）の６０５１塩基対ＢａｍＨ１消化ベクターフラグメントに連結させることによって、重鎖安定ＣＨＯ発現ベクターを生成した。Ｃ末端リジン残基をｐＫＪＡ１７１によってコードされた重鎖から遺伝子学的に除去し、２１９０塩基対ＢｓｒＧ１〜ＰＫＪＳ１７１のＸｂａｌフラグメントをＰＫＪＳ１８９を生じさせる２１８７塩基対ＢｓｒＧ１〜ＰＫＪＳ０７８のＸｂａｌフラグメント（ＰＤＭ−６４−０２−１３）に置換した。プラスミドｐＫＪＳ１８９は、図１０に示した通り、ｄｈｆｒ含有野生型ｈｕ−３Ｇ９安定ＣＨＯ発現ベクターである。重鎖のアグリコシル型を生成するため、ｐＫＪＳ１８９の５８７塩基対Ａｇｅｌ／ＢｓｒＧ１フラグメントを、ｐＫＪＳ１９６を生じさせるｐＣＲ０７６の５８７塩基対Ａｇｅｌ／ＢｓｒＧ１フラグメントに置換した。このベクターは、図１１に示した通り、ｄｈｆｒ含有アグリコシルｈｕ−３Ｇ９安定ＣＨＯ発現ベクターであり、正常なＦｃ受容体結合に必要なグリコシル化信号を除去するＮ３１９Ｑ置換反応を含有する。
【０２２６】
ｐＫＪＳ１８９、ｐＫＪＳ１９６及びｐＫＪＳ１９５において、ＢａｍＨＩ  ｃＤＨＡインサートのＤＮＡ配列を確認した。発現ベクターは、ＣＨＯ細胞に同時移入し、移入細胞は抗体分泌について試験した。図１２に示した通り、ならし培地の簡易滴定（Ｐｉｅｒｃｅ）ヒト抗体検出試験は、移入細胞が合成され、ＣＨＯ発現ベクターから効率的に重鎖及び軽鎖を分泌したことを示した。
【０２２７】
従って、抗体の結合親和性に影響を及ぼすことなく、ｈｕ−３Ｇ９抗体で修飾される可能性のある次の２種類のグリコシル化部位が存在すると思われる：（１）タンパク質発現及び精製を改善するグリコシル化部位（この部位は軽鎖可変ドメイン配列の５種類全ての変異型で修飾される）を除去するアスパラギン（Ｎ）からセリン（Ｓ）への置換反応が見られる領域である配列番号２のアミノ酸残基２６におけるＣＤＲ１領域内のｈｕ−３Ｇ９軽鎖可変ドメインにあるグリコシル化部位（２）Ｆｃ受容体結合に必要なグリコシル化部位を除去するアスパラギン（Ｎ）からグルタミン（Ｑ）への置換が見られる領域であるｈｕ−３Ｇ９重鎖変異３型定常領域にあるグリコシル化部位。
【０２２８】
実施例６  ＣＨＯ細胞株発現ｈｕ３Ｇ９変異５型
ｈｕ３−Ｇ９変異５型の発現プラスミドｐＫＪＳ１８９、ｐＫＪＳ１９６及びｐＫＪＳ１９５をＣＨＯ細胞に移入した。αｖβ６への結合特異性を示す抗体分泌の見られる移入細胞胞のｈｕ−３Ｇ９変異５型（Ｈ３／Ｌ５）及びアグリコシル化したｈｕ−３Ｇ９変異５型（ａ−Ｈ３／Ｌ５）の発現が観察された。
【０２２９】
実施例７  ８Ｇ６抗αｖβ６抗体のヒト化設計
ヒト化抗体の設計においては、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）には抗体と最も結合する可能性の高い残基が含まれ、再形成された抗体の中に保存されていると考えられる。ＣＤＲｓは、Ｋａｂａｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．  ５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐｔ．  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  Ｕ．Ｓ．  Ｇｏｖｔ．  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ  （１９９１）に従った配列によって定義した。ＣＤＲｓは、重要な残基がＣＤＲループの広範囲の立体構造を決定する標準クラス（Ｃｈｏｔｈｉａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４２：８７７−８８３  （１９８９））に分類した。このような残基は、殆どの場合、再形成された抗体に保存されている。このＣＤＲｓの重鎖及び軽鎖は、以下の通り標準クラスに分類した。
軽鎖：                             重鎖：
Ｌ１：１５残基             クラス４     Ｈ１：５残基        クラス１
Ｌ２：７残基         クラス１     Ｈ２：１７残基            クラス２
Ｌ３：９残基         クラス１     Ｈ３：１７残基            標準クラスなし
このようなクラスに重要な標準的な残基を表３に示した。何れの標準的な残基もルールに従って記載している。ループＨ３には標準クラスは見られない。
【０２３０】
【化３９】
2009500041.tif 000040
【０２３１】
【化４０】
2009500041.tif 000041
プログラムＦＡＳＴＡを使用して、この可変軽鎖及び可変重鎖とマウスグループ及びヒトサブグループのコンセンサス配列とを比較した（Ｋａｂａｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）。
【０２３２】
８Ｇ６可変軽鎖は１１２アミノ酸重複部分に見られる特異度８１．２５０％のマウスサブグループκ３のメンバーであり、８Ｇ６可変重鎖は１２９ａａ重複部分に見られる特異度７１．３１８％のマウスサブグループ２ａのメンバーである。８Ｇ６可変軽鎖は１１３  ａａ重複領域でヒトサブグループκ４と特異度６５．４８７％で一致している。８Ｇ６可変重鎖は１３４  ａａ重複領域でヒトサブグループ１と特異度５８．９５５％で一致している。（配列番号４の）軽鎖のアミノ酸配置１０にある特異アミノ酸Ｆ及び（配列番号３の）重鎖のアミノ酸配置３９にある特異アミノ酸Ｌを除き、ＶＨ／ＶＬパッキング界面残基が保存されている。
【０２３３】
可変領域の構造のモデリングは次のように実施した。軽鎖及び重鎖は最新のＰＤＢデータベースの部位コピーと対照させて配列させ、軽鎖及び重鎖の三次元モデルを構築するために使用する構造的フレームを決定した。ＦＡＳＴＡを使用したところ、１１１ａａ重複部位では、８Ｇ６軽鎖がマウスＮ１０  Ｆａｂと９０．９９１％の配列同一性を有することがわかった（ＩＮＳＮ；解像度２．９A）。１２６アミノ酸重複部位では、８Ｇ６重鎖がマウスＪＥＬ４２Ｆａｂと８０．９５２％の配列同一性を有することがわかった（２ＪＥＬ；（解像度２．９A）。２ＪＥＬの重鎖と１ＮＳＮの軽鎖とを組み合わせることによって、完全な構造的鋳型が得られた。分子モデリングパッケージモデラー５．０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．）を使用し、鋳型構造を使用して、軽鎖及び重鎖の三次元構造を構築した。１０個の相同モデルを作成し、分子エネルギーに関して最適な一つを選択した。Ｐｒｏｃｈｅｃｋ分析から、ｐｈｉ／ｐｓｉマップの有効性の見られない領域では残基が認められないことが示された。
【０２３４】
再形成された可変領域の設計においては、抗体フレームワークとして使用するため、最も類似したヒト発現抗体配列を発見しようと試みた。最も近い発現配列を見つけるため、ＮＣＢＩ  ＮＲデータベースで、ＴｒＥＭＢＬデータベース及びＫａｂａｔデータベースで、最も相同性のある発現ヒトフレームワークの検索を実施した。重鎖及び軽鎖配列については、（マスキングありのＣＤＲ及びマスキングなしのＣＤＲによって）２通りの検索を実施した。最も適した発現配列の選択は、標準的な残基及び界面残基の配列相同性に関する検査及びＣＤＲループ長における類似性に関する検査等で実施した。又、抗体の発生源も決定因子の一つであった。以前にヒト化された抗体は除外した。ＮＣＢＩ  ＮＲ及びＴｒＢＭＢＬデータベース検索についてはＢＬＡＳＴを使用し、Ｋａｂａｔデータベース検索についてはＦＡＳＴＡを使用した。
【０２３５】
最も類似している発現軽鎖は、Ｋａｂａｔデータベースで発見された（Ｋａｂａｔ  ｉｄ  ０２６５２０  ＡＣ２１Ｂ’ＣＬ；  Ｏｈｌｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ３３：４７−５６  （１９９６））。これはファージ提示法からのＰＣＲ増幅ｓｃＦｖであるが、フレームワーク領域のＬ６生殖細胞系列と１００％同一である。重鎖については、ＮＣＢＩのＮＲデータベースからのヒトフレームワークｇｉ｜３９２７１５を選択した。これは、フレームワーク領域の生殖細胞系列ＶＨ１−２と１００％同一である。両配列とも生殖細胞系列の配列のデータベースを検索し（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）、この検索結果が次の選択された生殖細胞系列：軽鎖に関してはＬ６、重鎖に関しては１〜２をもたらした。
【０２３６】
モノクローナル抗体のヒト化における最も重要な手技は、ヒトフレームワーク残基からマウスへの復帰突然変異の同定である。経験から、このことが結合部位に近い標準的な残基、界面パッケージ残基及び特異マウス残基を保存するためには特に重要であることが示されている。更に、ＣＤＲｓの立体配座に及ぼす潜在的な影響については、何れかのＣＤＲ残基の６A内に位置する残基を綿密に分析する必要がある。
【０２３７】
これまでに８Ｇ６再形成可変軽鎖の３つの変異型及び８Ｇ６再形成可変重鎖の３つの変異型が設計されている。変異型１には復帰突然変異が最も多く含まれ、変異３型には最も少ない（即ち、最も「ヒト化」している）。表４では、ヒト化８Ｇ６（ｈｕ８Ｇ６）抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列を示す。
【０２３８】
【化４１】
2009500041.tif 000042
表５は、ｈｕ８Ｇ６重鎖（変異型１、２及び３）及び軽鎖（変異型１、２及び３）可変ドメインタンパク質配列を示す。重鎖可変ドメインの場合、配列は以下を含む：
（ａ）ＶＨ１〜２のＦＲ１由来のヒトＦＲ１；
（ｂ）マウス８Ｇ６  ＣＤＲ１重鎖配列；
（ｃ）ＶＨ１〜２のＦＲ２由来のヒトＦＲ２；
（ｄ）マウス８Ｇ６  ＣＤＲ２重鎖配列；
（ｅ）ＶＨ１〜２のＦＲ３由来のヒトＦＲ３；
（ｆ）マウス８Ｇ６  ＣＤＲ３重鎖配列；及び
（ｇ）ＮＲデータベースからのヒトフレームワークｇｉ｜３９２７１５と１００％同一であり、ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳという配列を有する大多数のヒト抗体に存在するコンセンサスフレームワーク配列由来のヒトＦＲ４。
軽鎖可変ドメインの場合、配列は以下を含む：
（ａ）Ｌ６のＦＲ１由来のヒトＦＲ１；
（ｂ）マウス８Ｇ６  ＣＤＲ１軽鎖配列；
（ｃ）Ｌ６のＦＲ２由来のＦＲ２由来のヒトＦＲ２；
（ｄ）マウス８Ｇ６  ＣＤＲ２軽鎖配列；
（ｅ）Ｌ６のＦＲ３由来のヒトＦＲ３；
（ｆ）マウス８Ｇ６  ＣＤＲ３軽鎖配列；及び
（ｇ）ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫという配列を有する大多数のヒト抗体に存在するコンセンサスフレームワーク配列由来のヒトＦＲ４。
【０２３９】
【化４２】
2009500041.tif 000043
【０２４０】
【化４３】
2009500041.tif 000044
以下は再形成可変軽鎖の復帰突然変異についての記載である：
Ｅ１Ｄ：  これはＣＤＲ立体構造／抗原結合（Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，  ８．９７１−９８０  （１９９３））を示す。モデルでは、このＥ１ＤとＣＤＲｓ  Ｌ１及びＬ３のＳ２６、Ｑ２７及び又はＥ９３の骨格又は側鎖との間に相互作用が見られる可能性がある。このＥ１Ｄは変異型２及び変異３型では、置換反応が保存的であることから、除去している。
【０２４１】
Ｌ４６Ｆ：  これはＶＨ／ＶＬパッキング界面残基である。これも、ＣＤＲ−Ｌ２残基Ｅ５５の真下に存在すると思われる。このＬ４６Ｆは変異３型では除去している。
【０２４２】
Ｙ４９Ｋ：  この物質はＣＤＲ−Ｌ２に隣接し、モデルでは残基Ｅ５５との間に相互作用が見られると思われる。このＹ４９Ｋは、極めて重要な復帰突然変異である可能性が高いため、除去しない。
【０２４３】
以下は再形成可変重鎖の復帰突然変異を説明している：
Ａ２４Ｇ：  この物質はＣＤＲ−Ｈ１の標準残基である。保存的突然変異。変異型２では除去している。
【０２４４】
Ｇ２６Ｓ：  この物質はＣＤＲ−Ｈ１の標準残基である。保存的突然変異。変異型２では除去している。
【０２４５】
Ｑ３９Ｌ：  この物質はパッキング界面残基である。このＱ３９Ｌは軽鎖と間の相互作用がきわめて少ないため、変異型２では除去している。
【０２４６】
Ｍ４８Ｉ：  この物質はよく見られる復帰突然変異である。モデルでは、この物質とＣＤＲ−Ｈ２のＹ５９及びＦ６３との間に相互作用が見られる可能性がある。変異３型では除去している。
【０２４７】
Ｖ６８Ａ：  この残基はＣＤＲ−Ｈ２の下部に位置し、Ｙ５９及びＦ６３との間に相互作用が見られる可能性がある。
【０２４８】
Ｒ７２Ｖ：  この物質はＣＤＲ−Ｈ２の標準残基である。
【０２４９】
Ｔ７４Ｋ：  この残基はＣＤＲ−Ｈ２の下部に位置し、Ｙ５３との間に相互作用が見られるか又は接触抗原との間に直接の相互作用が見られる可能性がある。
【０２５０】
実施例８  αｖβ６抗体インターナリゼーション
細胞によって取り込まれる抗体は、癌細胞を選択的に標的とし、癌細胞の増殖を阻害するための毒素、放射性化合物又は他の抗癌剤に抱合される可能性があるため、癌等の臨床適用に特定の利益をもたらす可能性がある。抗αｖβ６抗体が取り込まれる能力については、以前に国際特許第ＷＯ  ０３／１０００３３号に記載されていることから、ここでは参考としてそのまま転載する。国際特許第ＷＯ  ０３／１０００３３号では、６．８Ｇ６及び６．１Ａ８等のカチオン非依存的モノクローナル抗体（ＲＧＤ含有リガンド模倣剤）に関してインターナリゼーション（取り込み化）が観察されたことを発表した。しかし、６．３Ｇ９、７．１Ｃ５及び６．４Ｂ４等のカチオン依存性ｍＡｂｓにはインターナリゼーションは観察されなかった。８Ｇ６等の抗体が細胞によって取り込まれる能力は、取り込まれる抗体と治療的成分／治療薬との結合を有利にし、成分／薬剤の細胞内への送達を可能にする。例えば、薬剤又は毒素の成分は８Ｇ６取り込み抗体と接合する可能性がある。しかし、この同じ用法が３Ｇ９等の非取り込み抗体に適用できる可能性があり、その場合には、化学成分をこのような抗体と接合させ、標的の細胞表面（例えば、腫瘍細胞表面等）に送達させることが可能であると思われる。
【０２５１】
実施例９  αｖβ６は原発性腫瘍よりも転移性腫瘍で多く発現する
この実験では、上皮性起源の種々の癌でのαｖβ６の発現及び転移性部位での発現を試みた他、αｖβ６  ｍＡｂｓを遮断する機能がｉｎ  ｖｉｖｏでのαｖβ６発現腫瘍の増殖を阻害するかどうかを明らかにした。本発明者等は、ヒト咽頭癌、Ｄｅｔｒｏｉｔ６２に及ぼす自験の抗ヒトαｖβ６  ｍＡｂｓのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ抗抗体活性を評価した他、これとＴβＲＩＩ：Ｆｃのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性とを比較した。自験データは、ヒト癌におけるαｖβ６の役割の他、αｖβ６  ｍＡｂｓの機能的遮断による治療的介入の可能性を裏付けている。
【０２５２】
Ａ．  材料及び方法：
免疫組織化学のために、組織切片は蒸留水で再水和したキシレン及びエタノール中で脱パラフィン化した後、０．４５％Ｈ２Ｏ含有のメタノールに浸漬した。この組織をペプシン（００−３００９、Ｚｙｍｅｄ［米国カリフォルニア州サンフランシスコ］）で培養し、アビジン及びビオチン（ＳＰ−２００１；  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ［米国カリフォルニア州バーリンゲーム］）で阻害した。一次抗体を０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、その組織を４℃にて一晩培養した。マウス異種移植組織での免疫染色β６については、切片を抗αｖβ６  ｍＡｂ、２Ａ１（Ｗｅｉｎｒｅｂ，  Ｐ．Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９（１７）：  １７８７５−１７８８７  （２００４））のヒト／マウスキメラ型及び抗ヒトビオチン化二次抗体（ＰＫ−６１０３、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ［米国カリフォルニア州バーリンゲーム］）で培養した。ヒト組織での免疫染色β６については、切片をマウス２Ａ１及び抗マウスビオチン化二次抗体（ＰＫ−６１０２、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で培養した。この切片にアビジン−ビオチン複合ホースラディッシュ（セイヨウワサビ）ペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ、ＰＫ−６１０２）を使用して、室温にて３０分間培養した後、製造業者の指示通りに３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質を準備し（ＳＫ−４１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、切片に室温にて５分間使用した。組織切片をＭａｙｅｒのヘマトキシリンで１分間染色した後、水及びＰＢＳ中で洗い流した。
【０２５３】
Ｂ．  結果：
Ｉ．  転移腫瘍におけるαｖβ６発現
αｖβ６免疫染色を種々の転移腫瘍で評価した。転移腫瘍の７８％（４３／５５）が陽性に免疫染色されたことは、転移腫瘍の大多数が強度の染色であることを示す（図１３Ａ〜Ｆ；図１４Ａ〜Ｉ）。この結果から、頭頸部腫瘍のみで陽性の免疫染色率が増大し、子宮頸部腫瘍と膵臓腫瘍とは同程度の発現が見られることがわかった（表１）。
【０２５４】
【化４４】
2009500041.tif 000045
２．  子宮内膜腫瘍及び患者を対応させた転移腫瘍におけるαｖβ６の発現
上の表１に示した通り、αｖβ６免疫染色は試験した子宮内膜腫瘍の５３％で陽性であった。少数の例外はあるが、染色は高悪性度の腫瘍の浸潤性の高い領域になるほど、有意に認められた。一次腫瘍の３例をリンパ節転移腫瘍と対応させた。この内２例では、リンパ節転移腫瘍における免疫染色率は対応させた一次腫瘍と比較して有意に高値であった（図１５Ａと図１５Ｂとの比較、図１５Ｃと図１５Ｄとの比較）。３例目では、免疫染色率はリンパ節転移腫瘍及び対応させた一次腫瘍の両者で高値であった（データなし）。αｖβ６陽性腫瘍上皮染色率は、３例の一次腫瘍でそれぞれ１０％、２０％及び９０％であったが、対応させた転移リンパ節でのαｖβ６陽性腫瘍上皮の割合は、それぞれ８０％、１００％及び１００％であった。正常な子宮内膜では、嚢胞と同じように、染色が表面層の一部の細胞に限局していた。
【０２５５】
３．  浸潤性ヒト乳房腫瘍サンプルにおけるαｖβ６の発現
免疫組織化学を用い、上記の「材料及び方法」で記載した方法に従って、αｖβ６発現の程度に関してヒト乳癌細胞の１００サンプル以上を評価した。原位置での幾つかの腺管癌の症例（ＤＣＩＳ）において、αｖβ６発現は腫瘍を囲む筋上皮に限局され、腫瘍そのものは観察できなかった（例えば、ＢｒＣａ１９；図１６Ａ）。しかし、幾つかの浸潤性乳癌では、同じように腫瘍でαｖβ６が発現されていた（例えば、ＢｒＣａ２３；図１６Ｂ）。
【０２５６】
乳房組織の細胞（上皮細胞、筋上皮細胞及び線維芽細胞）における特異的な遺伝子の発現が、ＤＣＩＳ等の非浸潤性腫瘍を含む乳房組織、浸潤性乳癌を含む乳房組織では正常な乳房組織と比較して変化しているという証拠が見られる（Ａｌｉｎｅｎ，  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ６：１７−３２  （２００４）；  Ｂｕｒｓｔｅｉｎ，  Ｈ．Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３５０：１４３０−１４４１  （２００４））。このような遺伝子発現の変化の多くは、筋上皮細胞で発見されてきている。（正常組織及びＤＣＩＳ組織の両者の）筋上皮でのαｖβ６インテグリンの発現が、おそらくは限局的なＴＧＦ−β活性化を通して微小環境をもたらすと思われ、このことが腫瘍の生存能力を支援し、浸潤性腫瘍の進行を促進する可能性がある。ＭＣＦ１０ＤＣＩＳ．ｃｏｍ（Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｆ．Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃ．  Ｉｎｓｔ．  ９２：１１８５−１１８６  （２０００））等の浸潤性癌の進行を促進する可能性のあるＤＣＩＳのｉｎ  ｖｉｖｏモデルは、乳房腫瘍の進行過程でのａｖｂ６の発現を評価する一つの方法を提供していると思われる。腫瘍の非浸潤性初期段階の筋上皮でのαｖβ６の発現及びｉｎ  ｖｉｖｏでの浸潤性表現型への腫瘍進行期としてのαｖβ６の発現については、評価できるのではないかと思われる。又、このモデルでは、αｖβ６  ｍＡｂｓ遮断を使用してαｖβ６の機能的役割を試験できる他、共役αｖβ６  ｍＡｂｓの有効性も試験できる可能性があると思われる。
【０２５７】
４．  ヒト膵臓腫瘍サンプルでのαｖβ６発現、患者を対応させた転移及び浸潤性膵臓腫瘍のマウス異種移植モデル
上の表１に示す通り、αｖβ６免疫染色は試験した膵臓腫瘍の８０％で陽性であった。８名の別々の患者からの一次膵臓腫瘍のサンプルを免疫組織化学法によって試験したところ、高悪性度腫瘍の浸潤性領域で染色が著明であった（図１７Ａ〜１７Ｃ；  １８Ａ〜１８Ｅ）。この一次腫瘍サンプルは、リンパ節転移細胞とも対応しており（図１７Ｄ〜１７Ｆ；  １８Ｆ〜１８Ｊ）、この領域でも強力なαｖβ６染色が示されたことは、αｖβ６陽性細胞が一次腫瘍部位から播種されたものであるという考えを裏付けている。正常な膵臓（図１７Ｇ〜１７Ｈ；  １８Ｋ〜１８Ｌ）では、染色は表面層の一部の細胞に限局していた。
【０２５８】
本発明者等は、αｖβ６発現が腫瘍細胞浸潤に及ぼす影響をさらに試験するため、浸潤性ヒト膵臓腺癌のモデルとして、ＢｘＰＣ−３マウス腫瘍異種移植を使用した。動物の脇腹皮下に０．１ｍｌ／１匹の輸液を使用して、滅菌生理食塩水に懸濁させた５×１０６細胞／１匹を移植した（０日目）。３０日目に、何れの試験についても、株腫瘍（６０〜１００ｍｍ３）の見られるマウスを一対のペアとして、３つの治療群にそれぞれ割り付けた（ＰＢＳ；  ｍＡｂ  ３Ｇ９；  可溶性ＴＧＦ−β受容体ＩＩ−Ｉｇ融合タンパク質（ｓｏｌＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ））。試験薬は週３回の治療スケジュールでマウスの腹腔内に投与した。マウスに対し、用量１０ｍｇ／ｋｇの３Ｇ９、用量２ｍｇ／ｋｇのｓｏｌＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ又はＰＢＳ（負の調節）の何れかを注入した。腫瘍増殖は週２回測定し、腫瘍容積は［（幅）２×長さ］／２という計算式に従って推定した。治療群の腫瘍は切除し、１０％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した後、非阻害ｖ６キメラｍＡｂ  ６．２Ａ１を使用して免疫組織化学的分析のための切片にした。
【０２５９】
抗αｖβ６  ｍＡｂ  ３Ｇ９による治療は、腫瘍増殖に直接の影響をもたらし（図１９Ｂ、１９Ｃ）、この抗体による治療の約４８日後に腫瘍増殖の有意な減少が観察された。観察されたｓｏｌＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃによる増殖阻害の程度は、３Ｇ９に関して観察された場合よりも幾分低かった。このような結果は、ヒト膵臓癌の異種移植モデルで抗αｖβ６  ｍＡｂ  ３Ｇ９が腫瘍増殖を阻害することを示している他、このような遮断抗体が腫瘍増殖を阻害するのに有用であり、腫瘍浸潤を拡張することによって、原発性ヒト腺癌においても有用である可能性を示唆している。
【０２６０】
実施例１０  αｖβ６機能遮断ｍＡｂｓが腫瘍細胞遊走、浸潤の他、αｖβ６発現腫瘍細胞のＭＭＰ生成を阻害する
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、β６移入細胞の浸潤、遊走及びマトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）を生成する能力を遮断する能力について、αｖβ６遮断モノクローナル抗体（ｍＡｂ）３Ｇ９（Ｗｅｉｎｒｅｂ，  Ｐ．Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９（１７）：  １７８７５−１７８８７  （２００４））及び可溶性組換え型ＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｉｇ（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ，  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １５７（５）：  １６４９−１６５９  （２０００））を評価した。このような活性はそれぞれ、腫瘍細胞浸潤並びに遊走と関連付けてモニターした。３Ｇ９及びＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｉｇの効果は、非移入親細胞（Ｃ１）及びＣ１細胞のβ６移入誘導体（ＶＢ６）を使用して評価した。
【０２６１】
遊走並びに浸潤試験
既述の通り、Ｃ１及びＶＢ６ヒト口腔扁平癌細胞はＫＧＭ培地の中で増殖した（Ｔｈｏｍａｓ，  Ｇ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍ．  １１７（１）：６７−７３  （２００１）。本発明者等は遊走を測定するため、製造業者の指示に従ってＦＬＵＲＯＢＬＯＫＴＭプレート（平板培地）及びインサート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ［米国マサチューセッツ州ベッドフォード］）を使用した。手短に言えば、空のウェルにＫＧＭ培地を満たしたものか又は無血清ＫＧＭを陰性対照とした。細胞を回収し、抗体を使用して無血清培地で前培養した。５０，０００細胞をインサートに加え、これをウェルに入れ、組織培養器の３７℃にて２４時間培養した。培養後、細胞及び培地をインサートの上部から除去した。フィルター底部に遊走した細胞は２μｇ／ｍＬのカルセイン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｎ．［米国カリフォルニア州カールズバッド］）で１時間標識化し、底部読み取りモードの蛍光性を測定することによって、定量化した。阻害率は、抗体の存在下で遊走した細胞数を培地のみの場合と比較した減少率として計算した。浸潤度についても同じような方法で、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）でコーティングされたＦＬＵＲＯＢＬＯＣＫインサートを使用し、４８時間培養して測定した。
【０２６２】
ＭＭＰ生成の定量化
１％  ＦＢＳを含有する培地の細胞は、記載の時間にわたりＭＡＴＲＩＧＥＬコーティングウェル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で培養した。上澄みを採取し、細胞残渣を遠心分離で除去した後、試験まで凍結させた。ＭＭＰ濃度をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ，  Ｓｙｓｔｅｍｓ［米国ミネソタ州ミネアポリス］）によって定量化した。
【０２６３】
結果：
図２０Ａ〜２０Ｃに示す通り、αｖβ６遮断ｍＡｂ  ３Ｇ９はｉｎ  ｖｉｔｒｏで遊走、浸潤及びＶＢ６細胞によるＭＭＰ−９の生成を有意に阻害した。又、可溶性組換え可溶性ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＩｇによるＴＧＦ−β活性の遮断も、浸潤及びＶＢ６細胞によるＭＭＰ−９の生成を阻害したが（図２０Ｂ及び２０Ｃ）、このような細胞の遊走には作用を及ぼさなかった（図２１Ａ）。このようなデータは、αｖβ６機能の遮断とＴＧＦ−β活性の遮断とを比較して、明白な機能的差異を示している。この結論は、αｖβ６にはフィブロネクチンへの結合を通じての細胞接着及び遊走の両者を媒介する他、潜在的な前駆物質ＴＧＦ−βの活性化を媒介する能力（Ｓｈｅｐｐａｒｄ，  Ｄ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔ．  Ｒｅｖ．  ２４：３９５−４０２  （２００５））と一致している。
【０２６４】
実施例１１  αｖβ６  ｍＡｂはヒト結腸直腸癌の異種移植モデル（ＬＩＭ１８６３）における間質浸潤を阻止する
１．  背景
新規結腸癌モデルであるＬＩＭ１８６３は、最近になって特徴が明らかにされた（Ｂａｔｅｓ，  Ｒ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｍｅｒｃｕｒｉｏ，  Ａ．Ｍ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ  １４：１７９０−１８００  （２００３）；  Ｂａｔｅｓ，  Ｒ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１５（２）：３３９−３４７  （２００５））。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＬＩＭ１８９３細胞は懸濁培養中で増殖し、高分化型の３Ｄ球状体（奇形）となった。しかし、ＴＧＦ−β及びＴＮＦαへの曝露後、この細胞株は、典型的にはＥ−カドヘリンの損失が見られる上皮から間葉への移行（ＥＭＴ）を特徴とする形態学的変化を伴う移行性単分子層表現型に変換した。この移行はαｖβ６発現の有意な増大を伴う。Ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ヌードマウスの脇腹に皮下注入する場合、ＬＩＭ１８６３細胞は発癌性である（Ｂａｔｅｓ，  Ｒ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１５（２）：  ３３９−３４７  （２００５））。図６に示した通り、ＬＩＭ１８６３細胞はαｖβ６発現の著明なパターンを示している（上述）。具体的に言えば、αｖβ６の発現は一次腫瘤から腫瘍間質内への浸潤が見られる細胞において特に著明である。この所見は、先に記載した通り、このような細胞が上皮から間葉への移行（ＥＭＴ）を経ているという考えと一致している（上述を参照）。
【０２６５】
このため、本発明者等は、ヒト結腸直腸癌の異種移植モデルとしてＬＩＭ１８６３細胞を使用することを選択し、このモデルでの間質浸潤におけるαｖβ６の関与の可能性を試験した。
【０２６６】
２．  材料及び方法
ＬＩＭ１８６３細胞はＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ；  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．［米国カリフォルニア州ラホイヤ］）のオルガノイドとして増殖させ、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）で補完した。ＬＩＭ１８６３オルガノイド（約８×１０６細胞）は、雌のヌードマウスの脇腹に皮下的に接種した。試験した何れのマウスもＢｉｏｇｅｎ  ＩｄｅｃのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）の許可を得ていた。このマウス集団に１０ｍｇ／ｋｇの抗αｖβ６特異的マウスモノクローナル抗体３Ｇ９（Ｗｅｉｎｒｅｂ，  Ｐ．Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９（１７）：１７８７５−１７８８７  （２００４））、２ｍｇ／ｋｇの組み替え可溶性ＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｉｇ融合タンパク質（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  （１５７（５）：１６４９−１６５９  （２０００））又はビヒクルの対照物質（ＰＢＳ）を週３回腹腔内投与した。腫瘍容積は、測径器を使用して対応する時点に測定し、その腫瘍用量を計算式（Ｌ×Ｗ２）／２を使用して計算した。異種移植片は７週間後に採取し、これをホルマリンで固定し、パラフィンに埋め込んだ切片を上記実施例９（図２１）で記載した通りに実施された免疫組織化学法に使用した。
【０２６７】
結果
抗αｖβ６  ｍＡｂ  ３Ｇ９及び／又は可溶性の組み替えＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｉｇは、腫瘍増殖に直接的な作用を及ぼさなかった（図２２Ａ、２２Ｂ）。しかし、このようなリガンドは、治療に対して盲検であった病理学者によって実施された間質内のαｖβ６陽性腫瘍細胞領域（図２２〜２２Ｆ）の定量化から評価した通り、ＬＩＭ１８６３細胞の間質浸潤を約８０％と有意に阻害した（図２２Ｃ）。
【０２６８】
実施例１２  非ヒト霊長類細胞で発現したαｖβ６インテグリンに関するマウス６．３Ｇ９（ｍ３Ｇ９）の親和性及び生物活性
概要
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）αｖβ６インテグリン上の抗αｖβ６遮断モノクローナル抗体６．３Ｇ９（ｍ３Ｇ９）に関する親和性及び生物活性は、種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法によって測定した。蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を使用したところ、高濃度のαｖβ６を発現するＮＨＰ細胞株は、２種類の動物種から同定された（アフリカミドリザルからは１２ＭＢｒ６、アカゲザルからは４ＭＢｒ５）。ｍ３Ｇ９は１２ＭＢｒ６及び４ＭＢｒ５で発現したαｖβ６と結合し、ＥＤ５０値はそれぞれ０．３０μｇ／ｍＬ及び０．３８μｇ／ｍＬであった。又、ｍ３Ｇ９は１２ＭＢｒ６及び４ＭＢｒ５がそれぞれのＩＣ５０値０．２２μｇ／ｍＬ及び０．２９μｇ／ｍＬで、ＴＧＦβ１潜伏関連ペプチド（ＬＡＰ）と結合するのを阻害した。最終的に、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１プロモーター（ＴＭＬＣ）の一部を安定して発現するＴＧＦβ応答性ミンク肺上皮レポーター細胞による共培養試験を使用して、ＩＣ５０値０．３１μｇ／ｍＬで測定した通り、ｍ３Ｇ９は４ＭＢｒ５細胞株が潜在ＴＧＦβを活性化する能力を遮断した。
【０２６９】
緒言
この試験の目的は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）細胞で発現するαｖβ６インテグリンのためのαｖβ６モノクローナル抗体６．３Ｇ９（ｍ３Ｇ９）の親和性及び生物活性を測定することであった。ｍ３Ｇ９は、ヒト化モノクローナル抗体ｈｕ３Ｇ９（ＢＧ０００１１）のマウス前駆物質である。このマウス抗体は高親和性の特異的αｖβ６インテグリン標的試薬である１。ｍ３Ｇ９はその標的である高親和性（ＫＤ＝１６ｐＭ）のαｖβ６インテグリンと結合し、細胞発現αｖβ６とリガンド（ＴＧＦβ潜伏関連ペプチド（ＬＡＰ）及びフィブリネクチン）との結合を阻害し、αｖβ６が潜伏ＴＧＦβ１を活性化する能力を遮断する１。この抗体が結合するためにはαｖ及びβ６の両者のサブユニットの存在が必要であり、他の関連インテグリン（αｖβ３、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ３及びαＩＩｂβ３）との交差反応性は観察されておらず、このことはｍ３Ｇ９がαｖβ６に対して高度に特異的であることを示している１。
【０２７０】
マウスとヒトβ６インテグリンとは（相同性８９．５％）２、マウスとヒトαｖインテグリンとがそうであるように（相同性９２．８％）３、配列相同性が高度である。ＮＨＰからのαｖβ６の配列は、まだ決定されていないが、これも高度な配列相同性を有すると予測される。
【０２７１】
ＮＨＰαｖβ６のためのｍ３Ｇ９の親和性を決定するために、ＦＡＣＳによって結合性を測定した。ヒトＴＧＦβ１  ＬＡＰへの細胞接着を阻害するｍ３Ｇ９の能力は、細胞接着試験で評価した。最終的に、潜伏ＴＧＦβのＮＨＰαｖβ６媒介活性化を阻害するｍ３Ｇ９の能力は、共培養試験を使用して決定した。
【０２７２】
材料及び方法：
試薬
マウスモノクローナル抗体６．３Ｇ９（ｍ３Ｇ９）及び６．４Ｂ４は、参考文献１及び本明細書で上に記載した通り、生成及び精製した。組換えヒトＬＡＰ（ＬＡＰ）はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号２４６−ＬＰ）から購入した。ヒトβ６移入ＳＷ４８０（ヒト結腸直腸腺癌）細胞株（ＳＷ４８０β６）はＤｅａｎ  Ｓｈｅｐｐａｒｄ（ＵＣＳＦ）から提供された。
【０２７３】
ＮＨＰ細胞株
次の細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した：
【０２７４】
【化４５】
2009500041.tif 000046
蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）
細胞はトリプシン処理によって採取し、リン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄後、ＦＣ緩衝液中（ＰＢＳ、２％  ＦＢＳ、０．１％  ＮａＮ３、１  ｍＭ  ＣａＣｌ２、及び１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で再懸濁させた。次に、１×１０６細胞に１０μｇ／ｍＬ  ｍ３Ｇ９を加え、氷上の計５０μＬのＦＣ緩衝液中で０．５時間培養した。培養後の細胞は氷温のＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％  ＦＢＳ、０．１％  ＮａＮ３）で２回洗浄し、Ａｌｅｘａ４８８−共役ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の１：２００の希釈物を含有する１００μＬのＦＣ緩衝液中で再懸濁させた後、氷上で３０分間培養した。次に、細胞を氷温のＦＣ緩衝液で２回洗浄し、１００μＬのＦＣ緩衝液及び５０μＬのパラホルムアルデヒド中で再懸濁させた。標識した二次抗体の結合は、フローサイトメトリー（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｒｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙ）でモニターした。
【０２７５】
細胞接着試験
９６ウェルマイクロタイタープレートを重炭酸ナトリウム５０ｍＭ中で希釈した０．５μｇ／ｍＬ  ＬＡＰの５０μＬ／ウェルでコーティングし、ｐＨ９．２の４℃にて一晩保存した。このプレートをＰＢＳ（１００μＬ／ウェル）で２回洗浄し、ＰＢＳ（１００μＬ／ウェル）中の１％ＢＳＡにより、２５℃にて１時間、活性を遮断した後、分析緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ  ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣＬ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）の１００μＬ／ウェルで２回洗浄した。分析緩衝液中の１２ＭＢｒ６又は４ＭＢｒ５細胞（４〜１２×１０６細胞／ｍＬ）に２μＭ蛍光染料（ＢＣＥＣＦ−ＡＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）加え、３７℃の水槽で１５分間静かに振盪培養し、遠心分離によって採取した後、４〜１２×１０６細胞／ｍＬになるまで分析緩衝液中に再懸濁させた。洗浄したプレートの各ウェルに２５μＬの２倍濃度のｍ３Ｇ９及び標識細胞２５μＬを加え、２５℃にて０．５時間培養した。このプレートを分析緩衝液（１００μＬ／ウェル）で４〜６回洗浄し、プレート上で捕捉した細胞に起因する蛍光発光を９６ウェル蛍光プレート読み取り器（ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ４０００、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に記録した。最終洗浄段階の前（即ち、全細胞数を加えたもの）と後（結合した細胞）との蛍光発光と比較することによって、結合率を決定した。
【０２７６】
共培養試験
ＴＭＬＣ（プラスミノーゲン−アクチベーター阻害剤１タンパク質の一部を安定的に導入されたミンク肺上皮細胞株Ｍｖ  １  Ｌｕ）４を２ｍＬのＬグルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン及び２００μｇ／ｍＬのＧ４１８を加えたＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清中で増殖させた。細胞をＰＢＳ＋５ｍＭ  ＥＤＴＡによってフラスコから引き上げ、ＰＢＳ＋０．１％  ＢＳＡ中で洗浄し、血球計算板によってカウントした後、９６ウェルプレートに平板培養した。ＤＭＥＭ＋０．１％ＦＢＳ中の９６ウェルプレートに１０４細胞／ウェルでＴＭＬＣを植え込んでいる間、αｖβ６発現細胞は氷上で２時間保存し、３７℃にしてから接着させ、その後、結合したＴＭＬＣをＤＭＥＭ＋０．１％ＢＳＡで１回洗浄した。モノクローナル抗体はαｖβ６発現細胞に加えてＤＭＥＭ＋０．１％ＢＳＡで希釈した後、室温にて２０分間、前培養した。次に、ＤＭＥＭ＋０．１％ＢＳＡ中で、このαｖβ６発現細胞を４×１０４細胞／ウェルのＴＭＬＣに加えた（１００μＬ／ウェル）。プレートを加湿状態の二酸化炭素を強化した培養器で、３７℃、２０時間培養した。上澄み液は廃棄し、代わりに１００μＬ  ＰＢＳ＋１ｍＭ  Ｃａ＋２及び１ｍＭ  Ｍｇ＋２を補充した。細胞を溶解させ、マイクロプレート照度計（Ｔｒｏｐｉｘ  ＴＲ７１７マイクロプレート照度計、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＬｕｃＬｉｔｅ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ［米国マサチューセッツ州ボストン］）でルシフェラーゼ（発光酵素）を検出した。
【０２７７】
結果：
１．  霊長類αｖβ６インテグリンのためのマウス６．３Ｇ９（ｍ３Ｇ９）の結合親和性及び遮断効力
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）αｖβ６インテグリンのｍ３Ｇ９の親和性を試験するため、ＡＴＣＣから４種類のＮＨＰ細胞株を入手した。初回スクリーン（図２３）では、１２ＭＢｒ６並びに４ＭＢｒ５細胞株でαｖβ６発現量が最も高かったため、この２種類の細胞株をｍ３Ｇ９の特性決定のために使用した。αｖβ６非遮断抗体である６．４Ｂ４も又、ｍ３Ｇ９に関して観察された強度とほぼ同じ平均蛍光強度で１２ＭＢｒ６及び４ＭＢｒ５と結合した。
【０２７８】
１．１  細胞発現インテグリン（ＦＡＣＳ）との結合
ｍ３Ｇ９と１２ＭＢｒ６及び４ＭＢｒ５との結合は、材料及び方法の項で記載した通り、蛍光活性化細胞分類（ＤＡＣＳ）を使用して測定した。各細胞株にｍ３Ｇ９の完全滴定を実施し、非線形回帰を使用して、ＥＤ５０（半最大信号をもたらす抗体の濃度）を測定した。１２ＭＢｒ６及び４ＭＢｒ５のＥＤ５０値はそれぞれ０．３０μｇ／ｍＬ（図２４Ａ）及び０．３８μｇ／ｍＬ（図２４Ｂ）であった。
【０２７９】
１．２  ＬＡＰに対する細胞接着
１２ＭＢｒ６及び４ＭＢｒ５がＬＡＰと結合する能力は、細胞接着試験を使用して明らかにした。この接着はｍ３Ｇ９によって遮断されるが、対照用タンパク質（ＢＳＡ）又はαｖβ６非遮断抗体（６．４Ｂ４）によっては遮断されなかった（図２５）。この相互作用を遮断するｍ３Ｇ９の効力は、各細胞株に及ぼす阻害の濃度依存性を測定することによって評価した（図２６）。このような実験から、ＩＣ５０値（半最大阻害をもたらす抗体の濃度）を決定した。１２ＭＢｒ６及び４ＭＢｒ５のＩＣ５０値はそれぞれ０．２２０μｇ／ｍＬ及び０．２９μｇ／ｍＬであった。
【０２８０】
１．３  ＴＧＦβ活性化（共培養試験）
１２ＭＢｒ６及び４ＭＢｒ５が潜在的ＴＧＦβを活性化する能力は、共培養試験を使用して明らかにした。この試験では、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１プロモーター（ＴＭＬＣ）の一部を安定的に発現するＴＧＦβ応答性ミンク肺上皮レポーター細胞と共に細胞を培養した（図２７）。この試験では、細胞内シグナル伝達及び／又は潜在的ＴＧＦβの生成の差も活性化に影響を及ぼすと思われることから、αｖβ６の発現量はＴＧＦβ活性化を促進するには十分ではない。このような２種類の細胞株の内、４ＭＢｒ５のみが潜在的ＴＧＦβの活性化において効果的であり、一方の１２ＭＢｒ６は作用を示さなかった。又、ヒトαｖβ６を安定的に発現するβ６−移入ヒト結腸癌細胞株である陽性対照細胞株ＳＷ４８０β６を使用した場合にも、活性化が観察された。非移入対照親細胞株（ＳＷ  ４８０）は、予測通りに活性化を示さなかった。
【０２８１】
４ＭＢｒ５によるＴＧＦβ活性化を遮断するｍ３Ｇ９の能力は、同じ実験で測定した。ＴＧＦβ活性化は、１μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬの何れかをｍ３Ｇ９を加えることによって遮断されたが、非遮断抗αｖβ６抗体６．４Ｂ４を加えても遮断されなかった。このような濃度でのｍ３Ｇ９の４ＭＢｒ５細胞に及ぼす阻害作用は、ＳＷ４８０β６細胞株を使用して観察された場合と類似していた。個々の実験において、４ＭＢｒ５媒介性ＴＧＦβ活性化に関するｍ３Ｇ９阻害の用量依存性が明らかにされた（図２８）。４ＭＢｒ５及びＳＷ４８０β６のＩＣ５０値はそれぞれ０．３１μｇ／ｍＬ及び０．３７μｇ／ｍＬであった。
【０２８２】
２．  ｍ３Ｇ９の親和性に関する動物種間の比較
マウス、ＮＨＰ及びヒトαｖβ６に関するｍ３Ｇ９の結合及び活性について得られたデータを次の表にまとめている。この表の最初の欄は、ＦＡＣＳによって測定した結合ＥＤ５０ｓを示している。各場合の測定したＥＤ５０は０．３８μｇ／ｍＬ（２．５ｎＭ）以下であった。表の２番目の欄は、細胞接着のｍ３Ｇ９による阻害に関するＩＣ５０値を示している。各場合のｍ３Ｇ９による細胞接着は、ＩＣ５０≦０．２９μｇ／ｍＬ（１．９ｎＭ）で阻害されている。表の３番目の欄は、共培養試験を使用して明らかにしたように、αｖβ６媒介性ＴＧＦβ活性化の阻害に関するＩＣ５０値を示している。ＮＨＰ細胞株４ＭＢｒ５は、ヒト細胞株ＳＷ４８０β６と類似の活性を示した（ＩＣ５０値はそれぞれ０．４０μｇ／ｍＬ及び０．２４μｇ／ｍＬ）。
【０２８３】
【化４６】
2009500041.tif 000047
【０２８４】
【化４７】
2009500041.tif 000048
実施例１３  アルポート症候群を来したマウス（Ｃｏｌ４Ａ３−／−）におけるマウス抗αｖβ６モノクローナル抗体の作用
要約：
αｖβ６は、上皮のリモデリングの部位に優先的に発現し、潜在的前駆体であるＴＧＦ−βと結合して活性化することが明らかになっているＴＧＦ−βを誘導インテグリンである。本明細書では、αｖβ６が、膜性糸球体腎炎、糖尿病、ＩｇＡ腎症、グッドパスチャー症候群及びアルポート症候群においてヒト腎上皮で過剰発現することを明らかにする。腎疾患におけるαｖβ６の果たしうる調節の役割を評価するため、αｖβ６モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の阻害機能の作用及び、アルポート症候群のマウスモデルであるＣｏｌ４Ａ３−／−マウスにおける腎線維症に対するβ６サブユニットの遺伝子除去を試験した。アルポート症候群マウス腎におけるαｖβ６の発現は、主として皮質尿細管上皮細胞に認められ、線維症の進行と相関した。αｖβ６阻害ｍＡｂの投与により、活性化線維芽細胞の蓄積及び間質性コラーゲンマトリックスの沈着を阻害した。同様に、腎線維症の阻害がβ６欠損アルポート症候群マウスで認められた。腎組織の転写プロファイルは、αｖβ６阻害ｍＡｂが線維性及び炎症性媒介物質の発現の疾患関連変化を有意に阻害したことを明らかにした。組換えの可溶性ＴＧＦ−β  ＲＩＩの投与により同様の転写調節パターンが得られ、αｖβ６及びＴＧＦ−βの調節機能が分担していることが示唆された。これらの所見は、αｖβ６が腎線維症の調節に寄与することができることを示し、このインテグリンが治療標的としての可能性を有することを示唆している。
【０２８５】
緒言：
進行性線維症は、末期の腎疾患にいたる共通のプロセスであり、上皮リモデリング、線維芽細胞の活性化、炎症及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）との細胞の相互関係の再構築によって助長される。これらの事象に寄与する分子的機序は複雑で、ＴＧＦ−β軸の調節不全、ＥＣＭリモデリング異常及びインテグリンスーパーファミリーの細胞接着受容体の発現及び機能の変化を含む１〜５。近年の試験で、腎上皮及び間葉細胞において幾つかのインテグリン及び関連分子が重要な制御機能を有することが明らかにされた３、６〜８。
【０２８６】
インテグリンの中でも、腎疾患でその発現が強度に促進されるのは、ＴＧＦ−β誘導性インテグリンαｖβ６である５、９、１０。αｖβ６の発現は一般に上皮細胞に限定され、そこで正常な成人組織では低レベルで発現し、成長、外傷及び新生物があればレベルが上昇する９、１１〜１３。αｖβ６は健常な成人腎では比較的低レベルで発現するが、その発現は成長中のマウスの腎、特に近位尿細管、ヘンレ係蹄及び集合管で顕著である１１、１２、１４。近年、ヒトの種々の腎疾患において、αｖβ６の発現レベルが上昇することが報告されている。
【０２８７】
組織リモデリング中にｉｎ  ｖｉｖｏでαｖβ６の発現レベルが上昇することと一貫して、培養上皮細胞中のαｖβ６インテグリンの発現は、ＥＧＦ及びＴＧＦ−βをはじめとする上皮リモデリングを制御するサイトカインによって誘導することができる５、９。更に、トランスジェニックマウスの皮膚におけるβ６の過剰発現は、自発性慢性創傷の形成を惹起することが明らかになり１５、αｖβ６が上皮組織のリモデリングを調節する重要な役割を担っていることが示唆された。
【０２８８】
αｖβ６の既知のリガンドには、フィブロネクチン、テネイシン及び潜在性関連ペプチド１及び３（ＬＡＰ１及びＬＡＰ３）、ＴＧＦ−β１及びβ３の潜在的前駆体のＮ末端フラグメントが含まれる１６〜１９。これらのリガンドに結合した結果、αｖβ６は細胞接着、細胞伸展、細胞移動及び潜在的ＴＧＦ−βを媒介することができる。ＴＧＦ−βは、潜在的タンパク質として合成され、分割されて、成熟した活性Ｃ末端ＴＧＦ−βサイトカインと非共有結合的に関連するＮ末端ＬＡＰと共に分泌される。この潜在的ＴＧＦ−β複合体は、その固有の受容体と結合することができず、従ってプロテアーゼによる分割、低ｐＨ又はイオン化照射への曝露及び潜在的複合体の構造転換といった固有の受容体への結合を可能にするような幾つかの機序の一つによって活性型に変換されない限り、生物学的に不活性のままである２０〜２２。活性化をもたらす構造転換は、ＬＡＰ１及びＬＡＰ３に含まれるＲＧＤモチーフへの、αｖβ６が関与するインテグリンの直接結合によって誘導される可能性がある。この結合により、ＴＧＦ−β前駆体が、受容体への結合が可能な状態へと変換される１７，１９。これらの所見は、上皮細胞表面のαｖβ６の発現を促進することが、局所的なＴＧＦ−β活性化につながり、バイスタンダー細胞におけるＴＧＦ−β依存性事象がパラ分泌性に活性化されることを示唆するものである。これには、αｖβ６の発現部位で炎症及び線維症が最初に変化することによってＴＧＦ−β活性が間接的に低下したという可能性も含まれる。
【０２８９】
ＴＧＦ−βは腎線維症の中心的な調節物質として関与しているため、そのαｖβ６による局所的な活性化が腎疾患の発症及び進行において重要なプロセスになっており、αｖβ６機能を阻害することにより腎線維症の発現を抑制できるという仮説を立てた。本明細書に記載の試験で、αｖβ６がマウス腎線維症モデル及び線維症を来したヒト腎試料において高度にアップレギュレートされることを明らかにする。ヒトのアルポート症候群で認められるのと同じ進行性腎疾患のモデルであるＣｏｌ４Ａ３−／−マウスを使用して、モノクローナル抗体によるαｖβ６のリガンド結合及びＴＧＦ−β活性化機能の阻害２３並びにβ６の遺伝子除去が、糸球体及び尿細管間質性線維症の両方を抑制し、腎組織構造の破壊を遅延させることができることを示す。αｖβ６インテグリンの発現は腎においては尿細管上皮細胞に限定されるが、組織の遠位部でも保護作用を示すことを明らかにする。これらの所見は、抗線維症作用も、尿細管上皮細胞でのαｖβ６の直接的な阻害作用に加えて、間接的な腎外での作用によって媒介される可能性を示している。遅延投与試験では、αｖβ６の治療的阻害が腎線維症の進行を抑制するだけでなく、既存の線維症病変を治癒させる可能性も有していることが示されている。腎疾患進行に関連し、αｖβ６阻害によって影響を受ける分子署名を解析したところ、αｖβ６を阻害する抗体の治療的影響は、全身性のＴＧＦ−β阻害のそれと同じであり、ＴＧＦ−β活性の低下に機械的に関与することが示された。これらのデータは、αｖβ６が腎線維症の調節に関与しており、その治療的制御において新しい分子標的となりうることを示唆している。
【０２９０】
材料及び方法
１．  試薬
αｖβ６モノクローナル抗体を、本明細書及び過去の刊行物２３に記載の通りに生成した。ヒト／マウスキメラ２Ａ１及び３Ｇ９  ｃＤＮＡを、Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ［米国ニュージャージー州ピスカタウェイ］）を使用して、重鎖には定常領域プライマーＣＤＬ−７３９を、軽鎖にはＣＤＬ−７３８と共に個々の親ハイブリドーマの全ＲＮＡから生成した。重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子を、ｃＤＮＡ合成に使用したのと同じ３'プライマー及び殆どのマウス抗体遺伝子シグナル配列（請求により入手可能な配列）に特異的な縮重プライマーのプール及びＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ［米国カリフォルニア州ラホイヤ］）を使用してポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。クローン化した重鎖及び軽鎖の可変領域を、ヒトＩｇＧ１定常領域と共に哺乳類発現ベクターに結合させた。組換え可溶性マウスＴＧＦ−β受容体ＩＩ−Ｉｇ型融合タンパク質（ｒｓＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｉｇ）を、過去の刊行物７に記載の通り、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（５３２−Ｒ２、米国ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。抗体は下記の通り購入した。ＦＩＴＣ抱合汎抗サイトケラチンモノクローナル抗体（Ｃ−１１）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｆ３４１８、米国ミズーリ州セントルイス）；抗ラミニンＢ１鎖モノクローナル抗体（ＬＴ３）、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（ＭＡＢ１９２８、米国カリフォルニア州テメキュラ）；フィコエリトリン（ＰＥ）抱合抗αｖモノクローナル抗体（ＲＭＶ７）、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（ＣＢＬ１３４６Ｐ）；ウサギ抗αｖ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（ＡＢ１９３０）；ＰＥ−ラットＩｇＧ１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（５５３９２５、米国カリフォルニア州サンホゼ）；及び抗平滑筋アクチン（ＳＭＡ）−Ｃｙ３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｃ−６１９８）。潜在的ＴＧＦ−βを発現する２９３細胞の異種移植部位に比べて、本質的に活性なＴＧＦ−βを発現する２９３細胞の異種移植部位に優先的に結合する抗体として２４、ウサギポリクローナル抗ＴＧＦ−β、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ｓｃ−１４６、米国カリフォルニア州サンタクルーズ）を同定した。
【０２９１】
２．  動物
遺伝的背景１２９Ｓｖ／Ｊを有するＣｏｌ４Ａ３＋／−マウスを、Ｄｒ．  Ｄｏｍｏｎｉｑｕｅ  Ｃｏｓｇｒｏｖｅ（Ｂｏｙ'ｓ  Ｔｏｗｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、米国ネブラスカ州オハマ）から入手し、注射試験用に交配してＣｏｌ４Ａｄ−／−マウスを作成した。遺伝的背景１２９ＳＶを有するβ６−／−マウスを、Ｄｒ．  Ｄｅａｎ  Ｓｈｅｐｐａｒｄ（カリフォルニア大学［米国カリフォルニア州サンフランシスコ］）から入手し、Ｃｏｌ４Ａ３＋／−マウスと交配させた。全ての動物はＢｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃで飼育し、全ての動物試験は承認され、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（研究機関内の動物の管理及び使用に関する委員会）に従って実施した。
【０２９２】
３．  フローサイトメトリー
マウスβ６安定トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３ｂ６）を、過去の刊行物２３に記載の通り作成した。細胞をトリプシン処理により回収し、ＰＢＳで洗浄し、ＦＣ緩衝液（１×ＰＢＳ、２％ＦＢＳ、０．１％  ＮａＮ３、１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で再懸濁させた。細胞０．２×１０５を、精製一次抗体を含有する合計容量１００μＬのＦＣ緩衝液中で、氷上で１時間培養した。培養後、細胞を氷冷したＦＣ緩衝液で２回洗浄し、５μｇ／ｍＬのＰＥ抱合ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を含有するＦＣ緩衝液１００μＬで再懸濁し、氷上で３０分間培養した。αｖの発現を監視するため、細胞をＰＥ抱合ラット抗マウスαｖモノクローナル抗体（ＲＭＶ−７）及び対照のＰＥ抱合ラットＩｇＧ１と共に培養した。細胞を氷冷したＦＣ緩衝液で２回洗浄し、標識二次抗体の結合をフローサイトメトリーで監視した。
【０２９３】
４．  免疫組織化学
組織切片をキシレン及びエタノール中で脱パラフィン処理し、蒸留水で再水和して、０．４５％  Ｈ２Ｏを含有するメタノールに浸漬した。組織をペプシン（００−３００９，  Ｚｙｍｅｄ［米国カリフォルニア州サンフランシスコ］）と共に培養し、アジビン及びビオチン（ＳＰ−２００１；  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ［米国カリフォルニア州バーリンゲーム］）で阻害した。一次抗体を０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで希釈し、組織を一晩４℃にて培養した。マウス組織にβ６による免疫染色を施すため、切片をヒト／マウスキメラ型抗αｖβ６モノクローナル抗体２Ａ１２３及び抗ヒトビオチン化二次抗体（ＰＫ−６１０３，  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ［米国カリフォルニア州バーリンゲーム］）と共に培養した。ヒト組織にβ６による免疫染色を施すため、切片をマウス２Ａ１２３及び抗マウスビオチン化二次抗体（ＰＫ−６１０２、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に培養した。アビジン−ビオチン複合体−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ、ＰＫ−６１０２）を切片に塗布し、３０分間室温にて培養し、３，３'−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）マトリックスを指示通りに調製し（ＳＫ−４１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、室温にて５分間切片に塗布した。組織切片をＭａｙｅｒ'ｓ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎで１分間染色し、水及びＰＢＳで洗い流した。
【０２９４】
Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（カタログ番号４５８３、Ｓａｋｕｒａ［日本東京］）に包埋した凍結組織切片をアセトン中で固定して、ＰＢＳ中の０．５％カゼイン／０．０５％チメロサールで阻害した。ヒト組織にβ６による免疫染色を施すため、切片をマウス２Ａ１２３及び抗マウスＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５９４二次抗体（Ａ−１１０３２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共に培養した。又、マウス組織にβ６による免疫染色を施すため、切片を２Ａ１のヒト／マウスキメラ型及び抗ヒトＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏ  ５９４二次抗体（Ａ−１１０１４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共に培養した。ラミニン及びαｖの免疫染色については、抗ラットＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８抱合二次抗体（Ａ−１１００６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用した。その他全ての抗体は前記の通り直接抱合した。画像は全て２０倍で撮影したが、図２Ａのみは４０倍で撮影した。ヒト組織試料は全て、当地の施設内審査委員会の承認及び患者の承認を得てから入手した。
【０２９５】
５．  免疫組織化学の定量化
ＭｅｔａＭｏｒｐｈ  ｖ５．０（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ［米国カリフォルニア州サニーベール］）を使用して、ＳＭＡ免疫染色を定量化し、全体の画像サイズに対する陽性の百分率として表した。各動物について、少なくとも皮質切片５つ及び髄質切片１〜２つの２０倍画像を解析した。投与群の統計学的解析をＡＮＯＶＡを使用して実施した。
【０２９６】
６．  ｍＡｂｓ及びｒｓＴＧＦ−βＩＩ−ＩｇによるＣｏｌ４Ａ３−／−マウスの処置
遺伝的背景１２９Ｓｖ／Ｊを有するＣｏｌ４Ａ３−／−マウスを交配して、Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウスを作成した。マウスにはタンパク質を１週間に３回、３週齢から７又は８．５週齢になるまで指示通り腹腔内注射した。モノクローナル抗体は４ｍｇ／ｋｇ、ｒｓＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｉｇは２ｍｇ／ｋｇ腹腔内注射した。マウスを安楽死させ、ＲＮＡ採取及び免疫染色のため腎を回収した。全ての動物試験は承認され、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（研究機関内の動物の管理及び使用に関する委員会）に従って実施した。
【０２９７】
７．  全ＲＮＡの精製及びｃＤＮＡの合成
腎をＴＲＩｚｏｌ（１５５−９６−０１８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ［米国カリフォルニア州カールズバッド］）中で直接ホモジナイズし、製造業者のプロトコルに従いつつも、１ｍＬの酸フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール２５：２４：１  ｐＨ６．６抽出物を追加して、ＲＮＡを抽出した。精製された全ＲＮＡをＨ２Ｏ（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．［米国テキサス州オースチン］）で処理したジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）に再懸濁して、２６０及び２８０を記録した（Ｓｐｅｃｔｒａ  ｍａｘ  Ｐｌｕｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ［米国カリフォルニア州サニーベール］）。残留ＤＮＡをＤｎａｓｅ  Ｉ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｇｒａｄｅ（カタログ番号１８０６８−０１５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５単位を２０℃にて１５分使用して除去した。高性能ｃＤＮＡアーカイブキット（カタログ番号４３２２１７１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．［米国カリフォルニア州フォスターシティ］）を製造業者のプロトコル通りに使用して、ｃＤＮＡを作成した。
【０２９８】
８．  Ｔａｑｍａｎ用のプライマー、プローブ及びオリゴヌクレオチド標準テンプレートの設計
オリゴヌクレオチドプライマー及びＴａｑｍａｎ  ＭＧＢプローブをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ共通配列から、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を使用して設計した。Ｔａｑｍａｎ  ＭＧＢプローブは、５'共有結合の蛍光受容体染料（ＦＡＭ）と共に設計し、副溝結合剤／非蛍光クエンチャー（ＭＧＢＮＦ）が３'末端に共有結合した。オリゴヌクレオチド標準テンプレートは、アンプリコンの５'及び３'末端に１０ｂｐの遺伝子特異的配列を追加することによって設計した。逆相ＨＰＬＣでプライマーを精製し、オリゴヌクレオチド標準テンプレートはＢｉｏｓｅａｒｃｈ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州ノバト）から購入した。ＨＰＬＣで精製されたマウスグリセラルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）用のプライマー及びプローブを、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃで合成した［ＣＡＴＧＧＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＡ，  ＧＣＧＧＣＡＣＧＴＣＡＧＡＴＣＣ，  ６ＦＡＭ−ＣＣＣＣＡＡＴＧＴＧＴＣＣＧＴＣ］。
【０２９９】
９．  Ｔａｑｍａｎ熱サイクリング
下記の条件で、７９００ＨＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）サーマルサイクラーで、試料及び標準品の４連のＰＣＲ反応を処理した。５０℃にて２分間（ウラシルＮ−デグリコシラーゼ消化物）、９５℃にて１０分間（Ｔａｑ熱安定ポリメラーゼの活性化）及び９５℃にて１５秒間及び６０℃にて６０秒間を４０サイクル。各反応ウェルについて操作期間中７秒毎に蛍光を測定した。Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を使用してオリゴヌクレオチド標準曲線との比較によって、各試料の相対的転写量を決定した。
【０３００】
１０．  プローブの標識、ハイブリダイゼーション及び転写プロファイルのスキャニング
Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ［米国カリフォルニア州サンタクララ］）のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ（７０１０２１  ｒｅｖ  １）に記載のＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎプロトコルに従って、試料の標識、ハイブリダイゼーション及び染色を実施した。要約すれば、精製した全ＲＮＡ  ５μｇを、２００ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（カタログ番号１８０６４−０２２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び０．５μｇの（ｄＴ）−Ｔ７プライマー［５'−ＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＣＧＧ（Ｔ）２４］が入った２０μＬの第一鎖反応液で４２℃にて１時間使用した。第二鎖の合成は、４０Ｕの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号１８０１０−０２５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２Ｕの大腸菌ＲＮａｓｅ  Ｈ（カタログ番号１８０２１−０７１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１０Ｕの大腸菌ＤＮＡリガーゼ（カタログ番号１８０５２−０１９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した後に、１６℃にて２時間培養することによって実施した。この第二鎖合成反応液を、Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）  Ｓａｍｐｌｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｍｏｄｕｌｅ（カタログ番号９００３７１、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ［米国カリフォルニア州サンタクララ）を使用して製造業者のプロトコルに従って精製した。精製したｃＤＮＡを、ＢｉｏＡｒｒａｙ  ｈｉｇｈ  ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（カタログ番号４２６５５−４０、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．［米国ニューヨーク州パーミンデール］）を使用して製造業者のプロトコルに従って増幅し、７０〜１２０μｇのビオチン標識ｃＲＮＡ（相補的ＲＮＡ）を作成した。マウスＭｇＵ７４Ａｖ２、ＭｇＵ７４Ｂｖ２及びＭｇＵ７４Ｃｖ２  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プローブアレイを、製造業者のプロトコルに従って、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｖｅｎ  ６４０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ［米国カリフォルニア州サンタクララ）の中でプレハイブリダイズした。フラグメント化した標識ｃＲＮＡを、１００ｍＭの２−モルホリノエタンスルホン酸、１Ｍの［Ｎａ＋］、２０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．５ｍｇ／ｍＬのアセチル化ＢＳＡ、０．１ｍｇ／ｍＬのニシン精子ＤＮＡ、対照オリゴＢ２及び対照転写産物ｂｉｏＢ  １．５ｐＭ、ｂｉｏＣ  ５ｐＭ、ｂｉｏＤ  ２５ｐＭ及びｃｒｅ  １００ｐＭを含有する１×ハイブリダイゼーション緩衝液３００μＬ中で再懸濁させ、製造業者のプロトコルに従って、Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）プローブアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ［米国カリフォルニア州サンタクララ）とハイブリダイズした。ハイブリダイズしたＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プローブアレイを洗浄し、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎｉｎ（カタログ番号Ｓ８６６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ［米国オレゴン州ユージーン］）を使用して染色し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ［米国カリフォルニア州サンタクララ）を使用して、ビオチン化抗ストレプトアビジン（ＢＡ−０５００，  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ［米国カリフォルニア州バーリンゲーム］）で増幅した。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プローブアレイをＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ［米国オレゴン州コーバリス］）を使用してスキャンした。
【０３０１】
１１．  転写プロファイルデータ解析
アレイスキャンデータをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘの．ＣＥＬファイルに変換し、結果として得られたデータセット（全実験を代表する．ＣＥＬファイル群）を、Ｒｏｂｕｓｔ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ａｖｅｒａｇｅ（ＲＭＡ）法を使用して正規化した。ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（Ａｇｉｌｅｎｔ）及びＳｐｏｔｆｉｒｅ（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ）データマイニングツールを使用して、統計学的及びクラスタリング解析を実施した。二段階式ＡＮＯＶＡ及びＦｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅフィルタリングを使用して、シグナル強度が実験的投与により、非投与Ｃｏｌ４Ａ３−／−群に比べてｐ＜０．０５及び２倍以上変化したプローブセットを同定した。同様に、疾患関連転写産物を、非投与Ｃｏｌ４ａ３−ｎｕｌｌ及び未感作野生型群の間での発現の差から、統計学的カットオフ値をｐ＜０．０１、シグナルｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅカットオフ値を２として選択した。結果として得られた遺伝子群及び実験条件群のプロファイルを、階層的クラスタリングによって解析し描出した。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｄａｔａｂａｓｅ（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、バーチャル経路解析を実施した。
【０３０２】
結果：
１．  線維症を来したヒト腎試料におけるαｖβ６の発現
炎症性／線維性病理に起因する数種類のヒト腎疾患では、腎組織においてＴＧＦ−βの発現の亢進が対応して認められることが明らかになっている２５〜２７。免疫組織化学的解析を使用して、ＴＧＦ−βの活性化の亢進につながりうる機序として、慢性炎症及び線維症に起因するヒト腎生検試料のαｖβ６の発現を調査した（図２９Ａ及び２９Ｂ）。膜性糸球体腎炎、糖尿病、ＩｇＡ腎症、グッドパスチャー症候群、アルポート症候群及び狼瘡の組織試料では全て、拡大し損傷を受けた尿細管の上皮内膜に有意なαｖβ６の染色が認められた。対照的に、形態学的に正常な腎試料（腎癌及び正常組織）では、尿細管にわずかな免疫染色が時に認められた。糸球体の染色は解析した腎試料全てで認められなかった。この所見は、αｖβ６が健常な成人の上皮には低レベルでしか発現しないが、組織の外傷及び修復時にはアップレギュレートされるとした過去の報告と一致する１０、１１、１３、１５、１７。
【０３０３】
２．  Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウスの腎におけるαｖβ６の発現は、腎線維症の進行と相関する
ヒトアルポート症候群のマウスモデルであるＣｏｌ４Ａ３−／−マウスは、線維症の多数の標準的マーカー発現の増加を伴う、腎の糸球体及び間質の両方におけるＥＣＭの蓄積につながる進行性糸球体腎炎を発症する２８、２９。Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウスにｒｓＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｉｇを投与すると、腎線維症が抑制されるという過去の報告がある７。Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウスの腎は、約５〜６週齢から線維症の組織学的徴候を呈し始めた。疾患は年齢と共に迅速に進行し、マウスは約１１週間で腎不全のため死亡した。ヘテロ接合体Ｃｏｌ４Ａ３＋／−は糸球体腎炎を発症せず、その腎は野生型の同腹子のそれと組織学的に鑑別不可能である。年齢を経たＣｏｌ４Ａ３＋／−及びＣｏｌ４Ａ３−／−（アルポート）マウスの腎におけるαｖβ６の発現の力学を確認するため、４、７及び８週齢のマウスから単離した腎におけるαｖβ６の発現に関して免疫組織化学的解析を実施した（図３０Ａ〜Ｃ）。４週齢では、Ｃｏｌ４Ａ３＋／−及びＣｏｌ４Ａ３−／−マウスの両方の尿細管に時にαｖβ６の発現が認められた。７週齢までに、αｖβ６の発現はＣｏｌ４Ａ３−／−マウスの尿細管上皮細胞で有意に増加したが、Ｃｏｌ４Ａ３＋／−の腎ではこの増加は認められなかった。このαｖβ６発現量の増加は、Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウスで８週齢を超えても持続していた。又、６週齢を超えたＣｏｌ４Ａ３−／−（アルポート）マウスの拡大し損傷のある尿細管の上皮細胞におけるαｖβ６の染色の強度が増加し、αｖβ６の強い発現を示す腎組織の面積が有意に増加した。７〜８週齢の期間中の発現量の増加は、Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウスにおける腎線維症の迅速な進行と一致した。一方、Ｃｏｌ４Ａ３＋／−マウスの腎では、全ての期間にわたって、わずかなαｖβ６の発現及び年齢依存性の免疫染色の強度のわずかな上昇しか検出されなかった。Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウスの腎のαｖβ６発現量は線維症の進行と相関したため、αｖβ６機能の阻害が線維症病変の開始及び進行を阻害できるのかどうかを確認することにした。
【０３０４】
３．  Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウス腎におけるαｖβ６へのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）結合の特異性
本発明者等は過去に、リガンドへの結合能を損なうことなしにαｖβ６に結合するｍＡｂ（非阻害ｍＡｂ）及び、リガンド結合及びαｖβ６媒介性のＴＧＦ−β活性化の両方を阻害するｍＡｂ（阻害ｍＡｂ）をはじめとする強力且つ選択的な抗αｖβ６モノクローナル抗体の作成について報告した２３。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験で使用したαｖβ６を阻害するｍＡｂがαｖβ６インテグリンに選択的に結合しているのかどうかを確認するため、αｖβ６とｍＡｂとの結合を、トランスフェクトしていない親ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びマウスβ６  ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３ｂ６）を比較するＦＡＣ解析を実施した（図３１Ａ）。対照の抗αｖモノクローナル抗体であるＲＭＶ７では未トランスフェクト及びαｖβ６を発現している両方のＮＩＨ３Ｔ３細胞が染色されたのに対し、抗αｖβ６モノクローナル抗体は選択的にＮＩＨ３Ｔ３ｂ６細胞のみに結合した。腎におけるαｖβ６の結合の特異性を確認するため、阻害αｖβ６モノクローナル抗体の一つである３Ｇ９のヒト／マウスキメラ型を作成し、ウサギ抗αｖポリクローナル抗体で作成した免疫染色パターンを比較した（図３１Ｂ及び３１Ｃ）。３Ｇ９のキメラ型及び元来のマウス型は、ＦＡＣＳ及びＥＬＩＳＡで測定した場合（データなし）、標的との結合親和性が同等であった。３Ｇ９のキメラ型は、Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウスの腎において尿細管上皮細胞を特異的に免疫染色し、β６−／−マウスと交配させたＣｏｌ４Ａ３−／−マウス（Ｃｏｌ４Ａ３−／−；β６−／−）の腎切片は免疫染色しなかった。抗αｖ抗体による腎の免疫染色では、Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウスとＣｏｌ４Ａ３−／−；β６−／−マウスとに有意な差は認められなかった。
【０３０５】
４．  Ｃｏｌ４Ａ３−／−（アルポート）マウスに対する抗αｖβ６モノクローナル抗体の投与は、腎線維症を抑制する
腎線維症の制御においてαｖβ６が果たしうる機能的関与を調べるため、αｖβ６モノクローナル抗体の進行線維症病変の開始及び進行を阻害するための阻害能力を試験した。αｖβ６による阻害の予防的作用を評価するため、Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウスを３週齢から７週齢まで、又は３週齢から８．５週齢まで、２種類の阻害αｖβ６モノクローナル抗体である３Ｇ９及び８Ｇ６、非阻害αｖβ６モノクローナル抗体の６．８Ｂ３又はアイソタイプでマッチさせた陰性対照モノクローナル抗体の１Ｅ６を投与した。表現型の参照として、又ＴＧＦ−βの全身性の阻害作用を監視するため、これらの試験には、ｒｓＴＧＦβＲＩＩ−Ｉｇを投与するＣｏｌ４Ａ３−／−マウスも含めた。腎を回収して、組織学的評価を行い、ＲＮＡを単離した。線維症並びにＳＭＡ発現の組織学的特徴は、週齢でマッチさせたＣｏｌ４Ａ３＋／−マウスの腎に比べて、７及び８．５週齢のＣｏｌ４Ａ３−／−マウスの腎で劇的に増加した。陰性対照のｍＡｂを投与したＣｏｌ４Ａ３−／−マウスの腎では、糸球体のメサンギウムの拡大及び線維症及びボーマン嚢の半月体形成が認められた（図３２Ａ、１Ｅ６）。又、これらの腎では有意な筋線維芽細胞の活性化及び尿細管上皮の外傷及び拡張に起因する間質の線維症が認められた。阻害αｖβ６モノクローナル抗体６．３Ｇ９又は６．８Ｇ６を投与したＣｏｌ４Ａ３−／−では、糸球体及び間質の外傷及び線維症が有意に抑制され、相当量の腎構造が保持された（図３２Ａ、３Ｇ９及び８Ｇ６）。これらの阻害αｖβ６  ｍＡｂの作用は、ＳＭＡの発現の糸球体では＞６５％、間質領域では＞９０％の抑制を伴った（図３２Ｂ及び３２Ｃ）。糸球体のＳＭＡ発現に対する阻害ｍＡｂの作用は、αｖβ６インテグリンの発現は尿細管上皮細胞に限定されるが、その機能を阻害すれば組織の遠位部にも作用を及ぼすことができることを示唆している。それは少なくとも部分的には阻害αｖβ６  ｍＡｂの間接的な全身作用を介するものであると考えられる。非阻害αｖβ６  ｍＡｂである８Ｂ３を注射したＣｏｌ４Ａ３−／−マウスの腎では、線維症の進行に対する作用は全く認められなかった。ＴＧＦ−βの阻害を介して腎線維症が抑制されたとする過去の報告と矛盾することなく７、３０〜３３、Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウスに対するｒｓＴＧＦβＲＩＩ−Ｉｇの投与は、組織学的外観の変化及び腎組織中のＳＭＡの量が裏付けるように、阻害αｖβ６  ｍＡｂにより生じるのと同様の腎線維症の抑制をもたらした。ＳＭＡ発現に対するαｖβ６阻害ｍＡｂの作用は、腎全組織におけるコラーゲン１α１及びコラーゲン１α２  ｍＲＮＡの減少と並行した（図３３Ａ及び３３Ｂ）。Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウスに３Ｇ９、８Ｇ６又はｒｓＴＧＦ−βＩＩ−Ｉｇを投与したところ、コラーゲン１α１及びコラーゲン１α２  ｍＲＮＡ量が有意に減少したのに対し、非阻害αｖβ６  ｍＡｂ及び対照アイソトープｍＡｂは、これらの転写産物の量に有意な作用を及ぼさなかった。
【０３０６】
αｖβ６阻害が進行性腎線維症に与える作用を試験するため、６週齢のＣｏｌ４Ａ３−／−マウスにおける、その時点で腎に計測可能な外傷及びＳＭＡ陽性の活性化線維芽細胞の蓄積が認められる腎線維症に対するαｖβ６阻害ｍＡｂの作用を試験した。マウスには、αｖβ６阻害ｍＡｂである３Ｇ９又は対照アイソトープｍＡｂの１Ｅ６を２．５週間投与し、その後８．５週齢で屠殺した。ＳＭＡ免疫染色の定量化により、対照アイソトープｍＡｂの投与群に比べて、３Ｇ９を投与したＣｏｌ４Ａ３−／−マウス群の腎では、ＳＭＡ陽性の線維芽細胞の量が減少していることが明らかになった（図３４Ａ）。又同様に重要であるのは、３Ｇ９の長期投与によりＳＭＡ免疫染色の強度及び面積が、投与開始時に認められたＳＭＡレベルに比べて減弱していることであった（６週間）。Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウスに対する３Ｇ９の長期投与は、１Ｅ６を投与されたＣｏｌ４Ａ３−／−マウスの腎に比べて、尿細管の損傷及び間質の線維症を有意に抑制したことをはじめとして、疾患を有意に回復させた。
【０３０７】
これらの結果は、αｖβ６を治療的に阻害することにより、腎線維症の進行が阻害されるだけでなく、既存の線維症病変の治癒も可能であることを示唆している。
【０３０８】
５．  抗αｖβ６  ｍＡｂによる腎での遺伝子発現の制御
αｖβ６の機能に起因する疾患の機序を更に理解するため、野生型及びアルポート症候群マウスの腎組織における遺伝子発現のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析を実施した。Ｃｏｌ４ａ３−／−の腎において発現が変化した遺伝子の一群を、７週齢のＣｏｌ４ａ３−／−腎と週齢でマッチした野生型の腎とで正規化したシグナル強度にｐ＜０．０１で２倍以上の平均差が認められた３９５のＧｅｎｅＣｈｉｐプローブセットとして同定した（図３５）。異なる発現をみせた遺伝子の機能注釈を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ツールを使用して実施し、Ｃｏｌ４ａ３−／−の腎で過剰発現している遺伝子は、第一に炎症及び白血球機能の制御に関連しているのに対し、その発現が減少した遺伝子は主として代謝制御に関連していたことが示された（図３６）。
【０３０９】
αｖβ６阻害ｍＡｂの投与は、Ｃｏｌ４Ａ３−／−の腎において遺伝子のサブセットの特異な発現を緩和した。分散分析（Ｗｅｌｃｈ  ＡＮＯＶＡ）を使用して、ｐ＜０．０５で実験的投与によって影響を受けた転写産物を同定し、更に結果として得られたプローブセットをふるいにかけ、投与に反応してシグナル強度が２倍以上変化したものを選択した。この手順により、３Ｇ９、８Ｇ６及びＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃによってそれぞれ有意に影響を受けた５６、４２及び２８プローブセットが得られた。これらのプローブセットの一群には、有意な重複が認められ、各プローブセットが、Ｃｏｌ４ａ３−／−の腎で特異的に発現する転写産物に対応した３９５の全て含まれたサブセットであった（図３７Ａ）。過去の刊行物２３で２つの異なる生化学分類に属することが明らかになったαｖβ６阻害ｍＡｂの３Ｇ９及び８Ｇ６でも、同様の遺伝子発現の変化が認められた（図３５、図３７Ａ）。非阻害抗αｖβ６  ｍＡｂである８Ｂ３でも、対照アイソトープｍＡｂである１Ｅ６でも、遺伝子発現に対する有意な作用は認められなかった。このため、腎の遺伝子発現に対するαｖβ６  ｍＡｂの影響は、インテグリンシグナル伝達の活性化のためでも非特異的事象のためでもなく、αｖβ６機能の阻害に起因する可能性が高かった。正常な野生型の腎組織における遺伝子発現に対して、阻害αｖβ６  ｍＡｂである３Ｇ９の有意な作用は認められなかった。この所見は、本実験で認められたαｖβ６阻害ｍＡｂの作用が、主としてαｖβ６の疾患特異的な制御機能を反映するものであることを示唆した。
【０３１０】
αｖβ６  ｍＡｂにより調節された遺伝子と主要な制御経路との関係を明らかにするため、ＩＰＡソフトウェアを使用して、個々の遺伝子リストに対してバーチャルな制御ネットワーク解析を行った（図３７）。ＩＰＡは入力された遺伝子リストを、遺伝子及びタンパク質間の既知の物理的及び制御的相互作用の監督されたデータベース（ｃｕｒａｔｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ）と比較する。この解析では、変化がみられた遺伝子の所定の一覧を反映する可能性が最も高い制御経路の順位一覧及び個々の構成が得られる。しかし、３Ｇ９及び８Ｇ６によって変化させられた遺伝子の一覧は完全に同一ではなかった。ＩＰＡにより、３Ｇ９（図３７Ａ）並びに８Ｇ６（図３７Ｂ）によって影響を受ける最高スコア制御ネットワークとしてのＴＧＦβ依存性ネットワークが明らかになった。この所見と合致して、実験群の平均的遺伝子発現プロファイリングの階層的クラスタリングは、αｖβ６  ｍＡｂ及びｒｓＴＧＦβＲＩＩ−Ｉｇによる遺伝子の変化パターンが同一であることを明らかにした（図３５）。
【０３１１】
６．  αｖβ６の阻害はＣｏｌ４Ａ３−／−の腎においてＴＧＦβの発現を抑制する
３Ｇ９及び８Ｇ６ｍＡｂの投与により明らかになった腎線維症の減少が、ＴＧＦ−β発現量の減少に起因しているのかどうかを明らかにするため、腎切片を抗ＴＧＦ−β１  ｍＡｂで免疫染色した（図３８Ａ）。免疫染色に使用したｍＡｂは、潜在的ＴＧＦ−βに比べて本質的に活性のＴＧＦ−βを発現する組織切片に優先的に結合するものであった（データなし）２４。３Ｇ９又は８Ｇ６をこのマウスに投与すると、腎の間質領域でも糸球体領域でもＴＧＦ−β１の免疫染色が有意に減少した。ＴＧＦ−β発現量のこれらの変化は、ＴＧＦ−βｍＲＮＡの全腎組織レベルの類似の変化を伴っていた（図３８Ｂ）。ＴＧＦ−β１免疫染色パターンは、αｖβ６の発現が尿細管の内膜上皮に制限されているものの、αｖβ６機能の阻害は、αｖβ６発現部位に直接隣接しない糸球体領域のような遠位部でもＴＧＦ−βの発現量を減少させることができることを示した。これは、αｖβ６が局所性のＴＧＦ−βの活性化の初回のトリガーとして働くが、ＴＧＦ−βを広範囲にわたって制御する作用も示すことを示唆している。このような広範囲の作用の一つの考えられる機序とは、ＴＧＦ−βが自らの発現を自己分泌性又はパラ分泌性に活性化することができ、ＴＧＦ−βの発現組織部位の拡大につながることに基づくものである。又、これには、αｖβ６の阻害によるＴＧＦ−βの活性化の初回の局所性阻害が、炎症及び線維症のプロセスに干渉し、その後間接的にＴＧＦ−βの活性を更に抑制するという可能性も含む。
【０３１２】
７．  Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウスのβ６遺伝子の遺伝子除去
ｍＡｂの実験から得られた所見を裏付けるため、Ｃｏｌ４Ａ３及びβ６のダブルノックアウトマウス（Ｃｏｌ４Ａ３−／−；β６−／−）を作成した。週齢でマッチさせたＣｏｌ４Ａ３−／−；β６＋／−マウス及びＣｏｌ４Ａ３−／−；β６−／−マウスの腎の組織学的検査は、αｖβ６阻害ｍＡｂを使用した試験で得られた結果を裏付けた。７〜１０週齢のＣｏｌ４Ａ３−／−；β６−／−の腎では、週齢でマッチさせたＣｏｌ４Ａ３−／−；β６＋／−マウスに比べて、ＳＭＡ免疫染色の有意な抑制が認められた（データなし）。これは腎の糸球体及び間質領域における線維症の劇的な抑制を伴った（図３９）。これは、コラーゲン発現の抑制及び週齢でマッチさせたＣｏｌ４Ａ３−／−；β６＋／−マウスの腎に比べて、１０週齢のＣｏｌ４Ａ３−／−；β６−／−マウスのトリクロム・マッソン染色で認められたように良好に保持された腎構造により示されている。β６機能の遺伝子除去に比べて阻害αｖβ６  ｍＡｂの投与により認められた抗線維症作用の合致性は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるαｖβ６機能の阻害に対してはｍＡｂ投与が効率的な手法であることを示している。
【０３１３】
７．  Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウスにおける腎線維症の３Ｇ９による抑制の用量反応性
Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウスに、３Ｇ９の濃度を上昇させながら１週間に３回投与を行った。３週齢から７週齢までのマウスに投与を行い、その後屠殺した。ＳＭＡの免疫組織化学的分析を、腎の皮質及び髄質の両方で行った。用量漸増法により、３Ｇ９はＣｏｌ４Ａ３−／−マウスにおいてＥＤ５０が０．３〜０．４ｍｇ／ｋｇでＳＭＡの発現を抑制した（図４０）。
【０３１４】
考察：
腎疾患の進行には、集中的な組織リモデリング、炎症及び線維症病変の形成が伴い、最終的には腎組織構造の破壊及び腎機能の低下につながる。線維症はこのプロセスの中心にあり、線維芽細胞の活性化及び拡大、罹患組織の血管新生及び細胞外マトリックスの大量な沈着に関与する。これらの事象の主要な要因として関与する分子機序には、細胞が集まる線維症病変におけるＥＣＭタンパク質及びその受容体の発現の変化を伴うＴＧＦ−β軸の調節不全が含まれる３４〜３６。ＴＧＦ−βの発現亢進は線維症したヒト組織の特徴であり２５〜２７、組織の線維症の促進におけるＴＧＦ−βの機能的重要性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでも動物疾患モデルでも確認されてきた。ＴＧＦ−βの過剰発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける線維芽細胞の活性化及び血管新生を惹起し、器官培養及び細胞培養におけるＥＣＭの過剰生成を活性化するのに十分である３４，３７，３８。これに対して、ＴＧＦ−βシグナル伝達の遺伝的又は薬理学的破壊は、肺、皮膚及び腎の線維症モデルにおいて線維症からの効率的な保護をもたらす３０，３２，３３，３９〜４１。
【０３１５】
ＴＧＦ−βの機能を全身レベルで抑制することを目指した幾つかの試験では（阻害ｍＡｂ、ｒｓＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｉｇ、ＴＧＦ−β受容体キナーゼ阻害剤）、動物疾患モデルにおいて線維症を緩和することを明らかにしてきた。しかし、これらの手法は全て、活性化型のＴＧＦ−βを阻害することを目標にしてきたのに対し、ＴＧＦ−βの活性化を阻害することのできる物質の治療的可能性はそれほど研究されていない。ＴＧＦ−βは潜在的前駆体として発現し、反応性酸素種、ｐＨ、トロンボスポンジン−１、細胞外プロテアーゼ及びインテグリンをはじめとする多数の機序を介して、生物学的に活性なサイトカインに変換されることができる２１，４２〜４４。インテグリンの中でも特に興味をそそるのは、上皮リモデリング部位に発現し、潜在的ＴＧＦ−βの受容体及びアクチβーとして機能することが明らかになっている、ＴＧＦ−β誘導可能なインテグリンであるαｖβ６である１１，１７，４５。β６サブユニットは、幾つかの腎疾患ではアップレギュレートされ１０、その遺伝子除去は一側性尿管閉塞（ＵＵＯ）のマウスモデルにおける外傷が誘導する腎線維症からの有意な保護を提供することが明らかになった４６。β６欠損モデルの線維症からの同様の保護は、ブレオマイシン肺線維症モデルでも認められており、αｖβ６が種々の組織で線維症を媒介することができることを示唆している１７，４７。興味深いことに、ＴＧＦ−βのシグナル伝達の中心的媒介物質であるＳＭＡＤ２の、ＵＵＯが惹起するリン酸化はβ６欠損の腎において有意に抑制され、αｖβ６が実際にｉｎ  ｖｉｖｏでＴＧＦ−β制御回路の一部として働いていることを示した４６。
【０３１６】
β６ノックアウトマウスを使用した過去の試験では、αｖβ６が線維症の発症に役割を果たしているという確認が得られ、このインテグリンが新しい治療標的になりうることを示唆した。そこで、阻害ｍＡｂによるαｖβ６機能の薬理学的阻害が、常染色体劣性疾患であるアルポート症候群の動物モデルであるＣｏｌ４Ａ３−／−マウスにおいて腎線維症を緩和するかどうかを明らかにしようとした２８，２９。アルポート症候群は、Ｃｏｌ４Ａ３、Ｃｏｌ４Ａ４又はＣｏｌ４Ａ５遺伝子の突然変異によって引き起こされる遺伝性疾患である４８。これらの遺伝子における欠損は、コラーゲンＩＶネットワークの組立てに異常を生じさせ、糸球体及び尿細管の基底膜の異常形成を引き起こす。アルポート症候群の患者は、末期の腎疾患へとつながる進行性の糸球体腎炎を発症する。ヒトのアルポート症候群でも、Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウスでも、腎組織にαｖβ６の有意なアップレギュレーションが認められた。Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウス腎では、αｖβ６の発現亢進は尿細管上皮で特に顕著であり、そこではＳＭＡ陽性細胞の広範な拡大及びコラーゲンの沈着がその後に認められるか随伴した。この発現パターンに基づき、αｖβ６が外傷に対する上皮の反応サイクルにおいて早期にアップレギュレートされるようになり、持続的な上皮の損傷という状況において線維症の発症及び維持の両方において重要なメディエーターであるという仮説を立てた。本発明者等の試験の結果は、抗体が媒介するαｖβ６の阻害が、腎線維症の発症並びに早期の進行を阻害し、その維持を抑制することを明らかにしている。β６欠損のＵＵＯマウスモデルから得られた過去の所見４６と矛盾することなく、本発明者等の実験で認められたαｖβ６阻害ｍＡｂの抗線維症作用は、ＴＧＦ−βの活性及び発現の低下と相関した。興味深いことに、αｖβ６  ｍＡｂの投与後のＴＧＦ−β及びＳＭＡの発現のみかけの減少は、αｖβ６陽性細胞の隣接領域にのみ生じるのではなく、比較的遠位の組織領域でも検出することができた。この所見は、αｖβ６がＴＧＦ−β軸の活性化に直接的にも、ＴＧＦ−β発現のパラ分泌性自己活性化を介するといった間接的にも寄与する可能性があることを示唆しているが、αｖβ６の阻害が、全身の免疫機能の変化をはじめとする腎外の作用を介して保護を提供したという可能性も除外できない。本発明者等は、αｖβ６  ｍＡｂ投与から４週間後のマウスにおける多数のケモカイン及びサイトカインの血漿レベル及び末梢血分画を評価し、有意な変化はないことを確認した。但し、αｖβ６  ｍＡｂの投与又はβ６遺伝子の遺伝学的ノックアウトにより、Ｃｏｌ４Ａ３−／−の腎における単球のわずかな変化のみが免疫組織化学的に検出された。αｖβ６  ｍＡｂの投与又は移植による免疫系の機能状態を評価するような更なる試験が、この問題により完全に取り組むことができると考えられる。
【０３１７】
ＴＧＦ−β経路の調節不全及び過活動は、Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウスにおける腎疾患の進行に関与する顕著な機序であると目されてきた６。このサイトカインが線維性疾患でみかけは主要な役割を果たすことの裏付けとなるＴＧＦ−β回路の興味深い特性の一つは、ＴＧＦ−βの自らの発現を誘導する能力である。これにより、αｖβ６阻害の抗繊維化作用が少なくとも部分的には間接的な機序によって媒介されているという可能性が浮上する。これには、炎症及び線維症の状況を局所的に変化させ、続くＴＧＦ−βの活動亢進に干渉することによって、ＴＧＦ−βの発現を抑制することも含まれる。αｖβ６はＴＧＦ−βによって誘導され、潜在性ＴＧＦ−βの活性化を促進するため、Ｃｏｌ４Ａ３−／−の腎の病理の媒介におけるＴＧＦ−β及びαｖβ６の機能的関係を調査した。Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウスの腎における疾患関連転写産物の発現に対するαｖβ６  ｍＡｂ及びｒｓＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｉｇの作用を比較した。この比較により、αｖβ６依存性遺伝子とＴＧＦ−βの明らかな機能的因果関係及びαｖβ６  ｍＡｂ及びｒｓＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｉｇによる遺伝子の調節パターンの密接な類似性が明らかになった。更に、Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウスにαｖβ６阻害ｍＡｂを投与した場合、ＴＧＦ−βの腎での発現が阻害された。これらの所見は、阻害性αｖβ６  ｍＡｂの疾患改善作用が、おそらくは罹患組織の潜在的ＴＧＦ−βのαｖβ６を介する活性化の抑制を介して、ＴＧＦ−βの機能が阻害されることによるものであることを示している。上記のデータの興味をそそる一側面は、αｖβ６又はＴＧＦ−βの阻害を介した起炎症性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）遺伝子発現の阻害の阻害である。ＴＧＦ−βは、よく知られた抗炎症性及び免疫抑制機能を有するが、本発明者等の実験でｒｓＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｉｇ及び抗αｖβ６  ｍＡｂによる遺伝子調節パターンは、アルポート疾患モデルにおけるＴＧＦ−βの起炎症性機能を示すものであった。このみかけの起炎症性作用の実際の機序については更なる調査が必要であるが、ＴＧＦ−βの上皮細胞の成長停止及び死を誘導する既知の能力に基づくものと考えられる３１，４９〜５１。上皮の損傷は組織外傷に対する早期の先天免疫反応の活性化のための重要な機序を提供するため、本発明者等のデータが示唆するＴＧＦ−βのみかけの起炎症性機能は間接的なもので、腎上皮へのＴＧＦ−βが促進する外傷によって媒介されたものである可能性がある。このモデルに基づけば、αｖβ６は、上皮リモデリングのＴＧＦ−β依存性機序の重要な構成要素として機能しており、疾患におけるその機能の調節不全は更に疾患に起因する組織の損傷及び炎症を助長すると考えられる。
【０３１８】
本発明者等の試験の結果は、αｖβ６がヒトの腎疾患において高度にアップレギュレートされ、機能阻害抗体によるαｖβ６のターゲティングは腎線維症の治療的改善への効果的な新しい手法を提供する場合があることを示している。αｖβ６の発現は罹患組織において上皮細胞に大幅に制限されるため、この手法はＴＧＦ−β機能の選択的な局所的抑制を考慮に入れたものである。ＴＧＦ−βは種々の細胞及び組織に発現し、多数の種々のホメオスタシスプロセスを調節する重要な役割を果たしていることから、αｖβ６機能の阻害は、インテグリンαｖβ６がアップレギュレートされる疾患において、ＴＧＦ−βを全身性に阻害するよりも安全な代替法になりうる。
【０３１９】
結論
αｖβ６は炎症及び線維症を伴うヒトの腎疾患において過剰発現する。
【０３２０】
αｖβ６阻害ｍＡｂは、腎線維症の（アルポート）モデルであるＣｏｌ４Ａ３−／−において、線維症を抑制する。
【０３２１】
長期投与試験により、αｖβ６の治療的阻害が腎線維症の進行を阻害するだけでなく、既存の線維症を治癒させることもできることが示されている。
【０３２２】
β６の遺伝子ノックアウトはＣｏｌ４Ａ３−／−マウスを保護する。
【０３２３】
腎組織の転写産物プロファイルは、αｖβ６阻害ｍＡｂが、線維症及び炎症メディエーターの発現における疾患に起因する変化を有意に抑制することを明らかにした。
【０３２４】
同様の転写産物の変化パターンは、組換え可溶性ＴＧＦ−βＲＩＩの投与によっても認められ、αｖβ６及びＴＧＦ−βの制御機能は分担されたものであることが示唆された。
【０３２５】
【化４８】
2009500041.tif 000049
【０３２６】
【化４９】
2009500041.tif 000050
【０３２７】
【化５０】
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【０３２８】
【化５１】
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【０３２９】
【化５２】
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【０３３０】
【化５３】
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【０３３１】
【化５４】
2009500041.tif 000055
実施例１４  腎線維症のマウス一側尿管結紮モデルにおけるマウス３Ｇ９（ｍｕ３Ｇ９）の有効性
要約
一側尿管結紮（ＵＵＯ）は尿細管間質性線維症へと急激にいたる確立された腎の外傷動物モデルである。尿管結紮により尿管及び尿細管内の内腔圧が上昇し、腎実質性損傷を来す。ＵＵＯは、水腎症、尿細管拡大、尿細管アポトーシス、進行性腎萎縮、間質性細胞浸潤、腎ＴＧＦ−βの増加及び腎間質線維症を特徴とする［１］。インテグリンαｖβ６の機能は、ＴＧＦ−βの活性化及び上皮間葉移行のプロセスの両方に関与することができる。これらのプロセスは疾患の進行に寄与するため、ＵＵＯモデルを、抗αｖβ６モノクローナル抗体ｍｕ３Ｇ９及び組換え可溶性マウスＴＧＦ−β受容体ＩＩ−Ｉｇ型融合タンパク質（ｒｓＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｉｇ）の、迅速に進行する腎線維症に対する有効性を評価するのに使用した。用量４ｍ／ｋｇのｍｕ３Ｇ９を週３回、１０日間にわたって腹腔内投与したところ、平滑筋アクチン染色の平均阻害率は３２％であった。
【０３３２】
緒言
進行性線維症は、末期の腎疾患にいたる共通のプロセスであり、上皮リモデリング、線維芽細胞の活性化、炎症及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）との細胞の相互関係の再構築によって助長される。これらの事象に寄与する分子的機序は複雑で、ＴＧＦ−β軸の調節不全、ＥＣＭリモデリング異常及びインテグリンスーパーファミリーの細胞接着受容体の発現及び機能の変化を含む２〜９。近年の試験で、腎上皮及び間葉細胞において幾つかのインテグリン及び関連分子が重要な制御機能を有することが明らかにされた８、１０〜１３。
【０３３３】
インテグリンの中でも、腎疾患でその発現が強度に促進されるのは、ＴＧＦ−β誘導性インテグリンαｖβ６である３、１４、１５。αｖβ６の発現は一般に上皮細胞に限定され、そこで正常な成人組織では低レベルで発現し、成長、外傷及び新生物があればレベルが上昇する１４、１６〜１８。αｖβ６は健常な成人腎では比較的低レベルで発現するが、その発現は成長中のマウスの腎、特に近位尿細管、ヘンレ係蹄及び集合管で顕著である１６、１７、１９。近年、ヒトの種々の腎疾患において、αｖβ６の発現レベルが上昇することが報告されている１５。
【０３３４】
組織リモデリング中にｉｎ  ｖｉｖｏでαｖβ６の発現レベルが上昇することと一貫して、培養上皮細胞中のαｖβ６インテグリンの発現は、ＥＧＦ及びＴＧＦ−βをはじめとする上皮リモデリングを制御するサイトカインによって誘導することができる３、１４。更に、トランスジェニックマウスの皮膚におけるβ６の過剰発現は、自発性慢性創傷の形成を惹起することが明らかになり２０、αｖβ６が上皮組織のリモデリングを調節する重要な役割を担っていることが示唆された。
【０３３５】
αｖβ６の既知のリガンドには、フィブロネクチン、テネイシン及び潜在性関連ペプチド１及び３（ＬＡＰ１及びＬＡＰ３）、ＴＧＦ−β１及びβ３の潜在的前駆体のＮ末端フラグメントが含まれる２１〜２５。これらのリガンドに結合した結果、αｖβ６は細胞接着、細胞伸展、細胞移動及び潜在的ＴＧＦ−βを媒介することができる。ＴＧＦ−βは、潜在的タンパク質として合成され、分割されて、成熟した活性Ｃ末端ＴＧＦ−βサイトカインと非共有結合的に関連するＮ末端ＬＡＰと共に分泌される。この潜在的ＴＧＦ−β複合体は、その固有の受容体と結合することができず、従ってプロテアーゼによる分割、低ｐＨ又はイオン化照射への曝露及び潜在的複合体の構造転換といった固有の受容体への結合を可能にするような幾つかの機序の一つによって活性型に変換されない限り、生物学的に不活性のままである２６〜２９。活性化をもたらす構造転換は、ＬＡＰ１及びＬＡＰ３に含まれるＲＧＤモチーフへの、αｖβ６が関与するインテグリンの直接結合によって誘導されうる。この結合により、ＴＧＦ−β前駆体が、受容体への結合が可能な状態へと変換される２２、２５。これらの所見は、上皮細胞表面のαｖβ６の発現を促進することが、局所的なＴＧＦ−β活性化につながり、バイスタンダー細胞におけるＴＧＦ−β依存性事象がパラ分泌性に活性化されることを示唆するものである。
【０３３６】
ＴＧＦ−βは腎線維症の中心的な調節物質として関与しているため、そのαｖβ６による局所的な活性化が腎疾患の発症及び進行において重要なプロセスになっており、αｖβ６機能を阻害することにより腎線維症の発現を抑制できるという仮説を立てた。本明細書に記載の試験で、αｖβ６がマウス腎線維症モデルにおいて有意にアップレギュレートされることを明らかにする。又、このモデルで、リガンド結合及びαｖβ６によるＴＧＦ−βの活性化機能を阻害するｍＡｂ３０が線維症を阻害することを明らかにする。
【０３３７】
材料及び方法
１．  動物
雄で８〜１２週齢の２５．５±０．２ｇのウィルス抗原フリーのＣ５７ＢＬマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ［米国メーン州バーハーバー］）を本試験に使用した。動物はＢｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃウイルスフリー研究所動物施設において、換気型アイソレーターケージラックに収容し、試験の開始の７日前から飼育した。マウスには飼育及び実験期間を通じて、照射済み標準マウス飼料（ＬａｂＤｉｅｔ  Ｐｒｏｌａｂ（登録商標）  ５Ｐ７５  Ｉｓｏｐｒｏ（登録商標）  ＲＭＨ  ３０００）及び滅菌水を自由に摂取させた。マウスの健康のモニタリングの一環として定期的に体重を測定した。
【０３３８】
２．  抗体及び試薬
αｖβ６  ｍＡｂｓを、本明細書及び過去の刊行物３０に記載の通りに生成した。ヒト／マウスキメラ２Ａ１及び３Ｇ９  ｃＤＮＡを、Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ［米国ニュージャージー州ピスカタウェイ］）を使用して、重鎖には定常領域プライマーＣＤＬ−７３９を、軽鎖にはＣＤＬ−７３８と共に個々の親ハイブリドーマの全ＲＮＡから生成した。重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子を、ｃＤＮＡ合成に使用したのと同じ３'プライマー及び殆どのマウス抗体遺伝子シグナル配列（請求により入手可能な配列）に特異的な縮重プライマーのプール及びＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ［米国カリフォルニア州ラホイヤ］）を使用してポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。クローン化した重鎖及び軽鎖の可変領域を、ヒトＩｇＧ１定常領域と共に哺乳類発現ベクターに結合させた。組換え可溶性マウスＴＧＦ−β受容体ＩＩ−Ｉｇ型融合タンパク質（ｒｓＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｉｇ）を、過去の刊行物１１に記載の通り作成し、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（５３２−Ｒ２、米国ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。
【０３３９】
３．  免疫組織化学
組織切片をキシレン及びエタノール中で脱パラフィン処理し、蒸留水で再水和して、０．４５％  Ｈ２Ｏを含有するメタノールに浸漬した。組織をペプシン（００−３００９，  Ｚｙｍｅｄ［米国カリフォルニア州サンフランシスコ］）と共に培養し、アジビン及びビオチン（ＳＰ−２００１；  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ［米国カリフォルニア州バーリンゲーム］）で阻害した。一次抗体を０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで希釈し、組織を一晩４℃にて培養した。マウス組織にβ６による免疫染色を施すため、切片を抗αｖβ６  ｍＡｂ、２Ａ１３０及び抗ヒトビオチン化二次抗体のヒト／マウスキメラ型と共に培養した（ＰＫ−６１０３、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ［米国カリフォルニア州バーリンゲーム］）。アビジン−ビオチン複合体−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ、ＰＫ−６１０２）を切片に塗布し、３０分間室温にて培養し、３，３'−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）マトリックスを指示通りに調製し（ＳＫ−４１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、室温にて５分間切片に塗布した。組織切片をＭａｙｅｒ'ｓ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎで１分間染色し、水及びＰＢＳで洗い流した。
【０３４０】
４．  一側尿管結紮による腎線維症の誘発
試験のための手術を２日間かけて行い、マウスへの投与スケジュールを尿管結紮日に応じて決定した。ケタミン：キシラジン（１０００：１０ｍｇ／ｋｇ、皮下投与）による麻酔下で、正中左側の開腹により左側尿管を無菌的に取り出した。腎下極の位置で尿管を６−０絹縫合糸で２箇所結紮し、その間で尿管を切断した。腹壁を４−０ビクリル縫合糸で閉鎖し、皮膚を４−０ナイロン縫合糸で閉鎖した。ヒーティングパッドの上でマウスを回復させ、ブプレノルフィン０．０５ｍｇ／ｋｇを０日目及び１日目に１日２回皮下投与した。手術の前日からｍｕ３Ｇ９を週３回又はｓＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｉｇを週２回投与した。手順は以前に記載した報告書３１から適用した。
【０３４１】
５．  組織試料の収集及び疾患の指標の組織学的分析
結紮から１０日目に、マウスを二酸化炭素で安楽死させた。両側の腎（左結紮、右未結紮）を摘出し、腎盂の中心から横に二等分した。各腎の半分を１０％中性緩衝ホルマリンに入れて固定組織染色した。残る半分の腎は１５％スクロース液、その後３０％スクロース液に入れ、平滑筋アクチンの免疫組織化学的染色を行った。
【０３４２】
ホルマリンで固定した腎切片のコラーゲン成分にマッソン・トリクローム染色を施し、解剖学的構造にＨ＆Ｅ染色を施した。トリクロームで染色された切片を、ライカＱｗｉｎ画像解析システムを使用して、明視野顕微鏡で捕捉した画像で形態計測的に定量化した。画像を標準化した照明条件及びデジタルカメラの露出設定を使用して捕捉し、バックグラウンド補正を行い、距離標準で較正を行った。
【０３４３】
閾値を設定して、マッソン・トリクローム染色スライドのコラーゲン染色のダークブルーを検出した。コラーゲンの領域を２００倍で撮影した画像で解析した。全ての動物で、左腎の切片全体が写るような連続野を撮影して定量化した。
【０３４４】
６．  統計学的分析
各測定野のコラーゲン含量を、２００倍以内の全組織における百分率（白い空白は除く）として、即ち、青い面積の％として表した。各腎につき１６〜３５視野を測定した。これらには、切片の皮質及び髄質組織の全てを含め、腎乳頭は除外した。左側結紮腎の全ての視野で得られた平均の青い面積％を、各マウスで算出し、統計学的検定のためにそのマウスの線維症スコアとして取り扱った。幾つかの投与群における投与に起因する青い面積％の差の統計学的有意性を、一元配置分散分析により決定し、その後、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定で対の多重比較を行った。ｐ＜０．０５の場合に差を統計学的有意とした。
【０３４５】
結果
１．  ＵＵＯ後の腎におけるαｖβ６の発現
ＵＵＯ後の腎におけるαｖβ６インテグリンの発現を免疫組織化学的解析で調査した。無外傷（正常）の腎では検出されたαｖβ６の発現がわずかであったのに対し、ＵＵＯから７、１０及び１４日後では有意な発現亢進が明らかになった（図４１）。検出可能な発現は、ＵＵＯから３日後から測定された。
【０３４６】
２．  ｍｕ３Ｇ９の投与によるＵＵＯ腎における平滑筋アクチン免疫染色の阻害
マウスＵＵＯモデルにおける線維症の広がりを、免疫組織化学的α平滑筋アクチン染色（褐色の染色）又はマッソン・トリクロームコラーゲンマトリックス染色（青色の染色）の組織形態計測による解析で測定した。各試験で、線維症で占められた組織面積の比率を、担体又は対照アイソタイプｍＡｂを投与したＵＵＯマウス群（陰性対照群）、被験物質を投与したＵＵＯマウス群及び無結紮の正常マウス群で測定した。陰性対照群と被験物質投与群との間の染色面積の差の、陰性対照群と無結紮正常マウス群の差に対する比率を算出することにより、治療効果をマッソン・トリクロームコラーゲンマトリックス（青）染色又は平滑筋アクチン（褐色）染色の阻害率として表した。
【０３４７】
複数の試験間で結果を関連付けるため、治療効果はα平滑筋アクチン染色の阻害率として表した。ｍｕ３Ｇ９  ４ｍｇ／ｋｇを週に３回、１０日間にわたって腹腔内投与した場合の、平滑筋アクチン染色の平均阻害率は３２．８％であった。一方、ｒｓＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｉｇ  ２ｍｇ／ｋｇの平均阻害率は１３．２％であった（表１４．１）。
【０３４８】
【化５５】
2009500041.tif 000056
【０３４９】
【化５６】
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【０３５０】
【化５７】
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【０３５１】
【化５８】
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【０３５２】
【化５９】
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【０３５３】
【化６０】
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【０３５４】
【化６１】
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【０３５５】
【化６２】
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【０３５６】
【化６３】
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【０３５７】
【化６４】
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【０３５８】
【化６５】
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【０３５９】
【化６６】
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【０３６０】
【化６７】
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【０３６１】
【化６８】
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【０３６２】
【化６９】
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【０３６３】
【化７０】
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実施例１５  放射線誘発肺線維症のマウスモデルにおける抗αｖβ６阻害物質の使用
緒言
肺線維症は、肺外傷の後に異常なマトリックスリモデリングが続いた場合に発症する（Ｃｈａｐｍａｎ  ２００４）。肺線維症において異常制御される多くのシグナル因子の中でも、ＴＧＦβは特に重要な役割を果たす。動物モデルでは、ＴＧＦβのシグナル伝達を阻害すると、肺、腎、肝及び皮膚の線維症が予防できる。
【０３６４】
細胞内プロセシング後、ＴＧＦβ及びそのプロドメインは、非共有結合複合体として分泌される（Ａｎｎｅｓ，  Ｍｕｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。そのプロドメインに結合したＴＧＦβは潜在性で、即ちＴＧＦβ受容体に結合できない。このため、このプロドメインは潜在性関連ペプチド（ＬＡＰ）と呼ばれる。ＴＧＦβ阻害物質として働くと共に、ＬＡＰは潜在性ＴＧＦβ結合タンパク質（ＬＴＢＰ）ファミリーのタンパク質と、ジスルフィド結合を介して相互作用する。ＬＴＢＰはマトリックスタンパク質であり、ＥＣＭに潜在ＴＧＦβを係留する。ＬＡＰからのＴＧＦβの放出は、潜在ＴＧＦβの活性化と呼ばれるプロセスであり、ＴＧＦβシグナル伝達経路において必要な段階である。この活性化段階が、ＴＧＦβシグナル伝達を低減する戦略の標的になりうる。
【０３６５】
インテグリンαｖβ６及びαｖβ８は、個々のＬＡＰのＣ末端近傍に位置するＲＧＤアミノ酸配列と相互作用することによって、潜在性ＴＧＦβ及びＴＧＦβ３を活性化する（Ｍｕｎｇｅｒ，  Ｈｕａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９；  Ａｎｎｅｓ，  Ｒｉｆｋｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２；  Ｍｕ，  Ｃａｍｂｉｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。（最終のＴＧＦβアイソフォームであるＴＧＦβ２はＲＧＤ配列を有さず、これらのインテグリンによって活性化されない）。肺内で、インテグリンαｖβ６によるＴＧＦβの活性化は、ホメオスタシス及び外傷への反応で非重複的役割を果たしている。αｖβ６は正常な肺上皮では少量でしか発現しないが、外傷後迅速にアップレギュレートされる。β６遺伝子（Ｉｔｇｂ６−／−）の欠損したマウスは、ＴＧＦβのシグナル伝達が抑制された結果として、肺の炎症及び気腫を発症する。マウスの肺をブレオマイシンに曝露すると、αｖβ６の発現量の大幅な増加を伴う急性肺外傷を来し、その後ＴＧＦβ依存性の肺線維症が発現する。これに対しＩｔｇｂ６−／−マウスは、ブレオマイシン投与後に肺線維症を発現しない。
【０３６６】
イオン化放射線は肺線維症を引き起こす（Ｆｒａｎｋｏ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐｌｉｎ  １９９４；  Ｍｏｖｓａｓ，  Ｒａｆｆｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７；  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｌｅｆａｉｘ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；  Ａｂｒａｔｔ，  Ｍｏｒｇａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。線維症が肺外傷の数日後以内から始まるブレオマイシンによる肺線維症モデルと異なり、放射線誘発肺線維症（ＲＩＬＦ）は外傷から数ヵ月後に発症する。マウスＲＩＬＦは系統依存性である。実験に使用するＣ５７ＢＬ／６は敏感である。マウスＲＩＬＦモデルでは、線維症の発症時期周囲で実質的な遅延死亡が見られる。この死亡は肺血流の低下による可能性が高い（Ｆｒａｎｋｏ，  Ｎｇｕｙｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６；  Ｈａｓｔｏｎ，  Ｚｈｏｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。阻害物質の抗αｖβ６  ｍＡｂ（３Ｇ９）が開発された（Ｗｅｉｎｒｅｂ，  Ｓｉｍｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。これらの試験の目標は、（１）胸部への放射線照射に対するＩｔｇｂ６＋／＋及びＩｔｇｂ６−／−の反応を比較することによって、感受性マウス系統におけるＲＩＬＦのαｖβ６依存性を確立すること、（２）照射済みマウスにＴＧＦβ拮抗物質（可溶性ＴＧＦβ受容体）を投与することにより、マウスＲＩＬＦモデルのＴＧＦβ依存性を確認すること、及び（３）種々の用量の３Ｇ９を照射済みマウスに投与した場合の作用を評価することである。
【０３６７】
材料及び方法
１．  動物
使用したマウスは全て雌であった。Ｉｔｇｂ６−／−マウスはＵＣＳＦのＤｅａｎ  Ｓｈｅｐｐａｒｄ氏から寄贈され、本発明者等の施設で遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６として交配した。野生型マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（米国メーン州バーハーバー）から購入したＣ５７ＢＬ／６であり、到着時に７〜９週齢で、照射前に本発明者等の動物施設で１週間馴化した。全ての動物取り扱い手順及び実験は、ニューヨーク医科大学の動物ケア委員会により承認され、実験動物のケア及び使用のＮＩＨガイドラインに合致した。動物施設のプロトコルにより、１ケージにつき５匹までの飼育とした。マウスの罹患及び死亡を毎日監視した。瀕死のマウスは屠殺した。
【０３６８】
２．  抗体
２種類の抗体をＢｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）から入手し、本明細書の他の場所に記載の通りに調製した。最初の被験抗体である３Ｇ９は、αｖβ６を媒介するＴＧＦβの活性化を阻害する抗αｖβ６  ｍＡｂである。これはＩｇＧ１サブタイプであり、αｖβ６をカチオン非依存性に結合する。対照のＡｂ（１Ｅ６）は、マウスＬＦＡ−３と相互作用しないマウス抗ヒトＬＦＡ−３  ＩｇＧ１モノクローナル抗体とした。この対照抗体の最大用量２００ｍｇ／ｋｇ／週を４週間にわたって正常なマウスに投与したところ、毒性は全く認められなかった（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃのデータ）。滅菌ＰＢＳでの希釈により、用量０．３、１、３、６及び１０ｍｇ／ｋｇで総用量２００μＬとして抗体の画分を調製した。実験に応じて右側腹部への皮下注射又は腹腔内注射を、照射の１５週間後から開始した。
【０３６９】
３．  照射プロトコル
マウスには８〜１０週齢で照射を行った。照射前に、Ａｖｅｒｔｉｎ（２，２，２−トリブロモエタノール；Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ［米国ニュージャージー州］）の２．５％溶液１５μＬ／ｇを腹腔内に送達して麻酔を施した。その後、マウスを仰臥位にしてテープでプレキシガラス表面に貼り付けた。遮蔽用の鉛を適切に配置して、照射が胸部に限局するようにした。肺尖部から剣状突起までの照射野は１．８ｃｍであった。６０Ｃｏ線源を使用して、１４Ｇｙの放射線を送達した。線源から皮膚までの距離は６５ｃｍであった。この線源への曝露時間は１１分までであった。放射線への曝露後、マウスをケージの中に戻し、顔面を上にして寝かせ、回復を監視した。
【０３７０】
４．  屠殺マウスからの試料の収集
照射後、規定の時点まで生存したマウス（抗体試験では２６、２８又は３２週間）を屠殺して、下記の方法で処理した。Ａｖｅｒｔｉｎで深い麻酔をかけた後、７０％エタノールを胸部及び腹部の皮膚に噴霧した。胸腔を横隔膜を介して開いた。心室から直接４００〜５００μＬの血液を吸引した。気管を露出させ、２２ゲージの血管カテーテルを挿入した。１回につきＰＢＳ  ７００μＬで２回、肺を洗浄した。右側の主気管支を肺門で結紮し、各肺葉を摘出して別々の試験管に入れ、液体窒素で迅速に凍結し、−８０℃にて保存した。左肺は１０％ホルマリン４００μＬで充満させ、１０％ホルマリンに一晩漬け、パラフィンに包埋した。屠殺時に入手した気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液を２００μＬとその残りの２つに分けた。両方の試験管を２０００ＲＰＭで３分間遠心分離した。両方の試験管の上清液を合わせ、液体窒素で凍結させ、−８０℃にて保存した。大きな試験管の沈殿細胞を凍結標本にし、同じ方法で保存した。沈殿細胞２００μＬの画分を赤血球溶解緩衝液２００μＬで再懸濁し、十分に混合した。５０μＬは血球計での血球計算に使用した。残りの１５０μＬは、サイトスピンの準備に使用した。心穿刺により得た血液を使用して、下記のように血清又は血漿を作成した。Ｃａｐｉｊｅｃｔ試験管又はヘパリン加１．５ｃｃマイクロ遠心分離管で初回の混合を行った後、試料を１４０００ＲＰＭで２０分間遠心分離した。上清液を除去し、即刻−８０℃にて凍結した。
【０３７１】
５．  死亡又は瀕死のマウスからの試料収集
屠殺日までに死亡若しくは瀕死の状態であったマウスを解剖して肺標本を得た。瀕死のマウスは解剖前にＡｖｅｒｔｉｎで安楽死させた。胸腔を横隔膜を介して開いた。気管までの解剖は完全に露出させて実施した。気管に２２ゲージの血管カテーテルを挿入した。肺を１０％ホルマリン８００〜１０００μＬで充満させた。胸腔の内容物を一塊に摘出し、１０％ホルマリンに２４時間以上漬けてから、肺を分離してパラフィン包埋を行った。
【０３７２】
６．  細胞分画
サイトスピン用調製物をＤｉｆｆＱｕｉｋ法（Ｆｉｘａｔｉｖｅ、１％Ｅｏｓｉｎ−Ｙ、１％Ａｚｕｒｅ  Ａ及び脱イオン水の順番で１５秒ずつの浸漬）により染色した。その後脱水しスライド上に乗せた。好中球、リンパ球及びマクロファージの数を、２つの個別の強拡大（４００倍）視野で徒手的に計数した。
【０３７３】
７．  免疫組織化学
幾つかのホルマリン固定試料を、β６の免疫組織化学的検出のために使用した。内因性ペルオキシダーゼ活性をメタノール中の３％過酸化水素で１５分間停止させ、Ｄｉｇｅｓｔ−Ａｌｌ  ３  Ｐｅｐｓｉｎ（Ｚｙｍｅｄ［米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ］）を５〜７分間使用して抗原を回収した。アビジン／ビオチンブロック溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ［米国カリフォルニア州バーリンゲーム］）を製造業者の指示書に従って使用した。０．５％カゼイン溶液を使用して１５分間阻害した。ヒトＩｇＧ内にクローン化したマウス抗β６  ｍＡｂの種々の領域からなる抗β６モノクローナル抗体ｃｈ２Ａ１（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）を、０．１％  ＢＳＡで１：５００で希釈し室温にて１時間使用した。Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、抗ヒト二次抗体で、製造業者の指示に従い検出を実施した。ＤＡＢ  ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ［米国ミズーリ州セントルイス］）で発色を行い、ヘマトキシリンによるカウンター染色を行った。並行して取り扱われた切片の一次抗体を除外することがルーチンに行われ、Ｉｔｇｂ６−／−マウスの肺切片に対する予備試験の結果が陰性であったことから、この手順の特異性が確認された。
【０３７４】
８．  肺切片、三重染色及び線維症の割合の測定
ホルマリン固定パラフィン包埋肺を横方向に５ミクロンの厚さに切断した。肺の切片は、視覚的推定により肺門又はその近傍で採取した。スライド標本を脱イオン水まで脱パラフィン処理した（キシレン浴で各３分間２回、１００％エタノールで各３分間２回、９５％エタノールで各３分間２回、７０％エタノールで３分間、脱イオン水で３分間）。切片をマッソン三重染色で染色した（媒染処理のためにブアン液一晩、Ｗｅｉｇｅｒｔの鉄ヘマトキシリン５分間、ＢｉｅｂｒｉｃｈのＳｃａｒｌｅｔ−酸性フクシン５分間、リンタングステン／リンモリブデン酸溶液５分間、アニリンブルー溶液５分間、間の脱イオン水洗浄、及び酢酸１％  ２分間）。次いで、スライド標本を脱水し（７０％エタノール、９５％エタノール、１００％エタノール及びキシレン）、Ｐｅｒｍｏｕｎｔを使用してマウントした。
【０３７５】
Ｈａｓｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２，  ６２：３７２−８）に記載のパーセント線維症法（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を使用した。三重染色肺切片の低倍率（２〜３倍）像を得、デジタル形式で保存した。肺切片の高倍率（１００〜２００倍）でのマニュアル検査を光学顕微鏡により実施して、線維症の領域（コラーゲン沈着の増大及び構造の喪失により規定される）を特定した。ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  １．６２ソフトウェアを使用して線維症の断面積を肺切片の総断面積と共にデジタル画像上にその輪郭を描いた。線維症の面積の和を肺の総面積で割って、線維症の割合を求めた。肺の１つのランダムな横断切片は、１０枚のランダム切片と比較したとき、肺全体の線維症の割合を反映していることが示された（Ｈａｓｔｏｎ，  Ａｍｏｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。
【０３７６】
９．  ヒドロキシプロリン試験
ヒドロキシプロリン含量の測定は、Ｒｅｄｄｙ  ａｎｄ  Ｅｎｗｅｍｅｍｋａの方法の変法によった。右肺を除去し、重量を測定した。肺組織（湿重量が約２０ｍｇ）を４００μＬの２Ｎ  ＮａＯＨ中で１２時間培養し（室温にて）、次いで、ホモジナイズした。ホモジネート及び標準ヒドロキシプロリン溶液を１２０℃に３０分間加熱して加水分解した。クロラミンＴ溶液（０．０５６Ｍ、４５０μＬ）を５０μＬの加水分解物に加え、酸化を２５分間進行させた。エールリッヒ試薬（１Ｍ、５００μＬ）を加え、冷却して６５℃にて２０分間発色させた。次いで、５５０ｎｍでの吸光度を測定した。最終濃度をμｇヒドロキシプロリン／ｍｇ湿肺組織として表わす。
【０３７７】
１０．  ＲＶ／ＬＶ質量比の測定
この実験に使用したマウスは、照射後３２週目に屠殺したコホートに属していた。７匹の別の非照射Ｃ５７ＢＬ／６マウスを対照として使用した。照射マウスからの心臓は、２８〜３２週目に死亡したマウス又は３２週目の屠殺まで生存していたマウスからのものであった。心臓は、ホルマリンで固定した。解剖顕微鏡下で、心房を摘出し、壁を含まない右心室（ＲＶ）を左心室及び中隔（ＬＶ）から切り離した。心室組織の各断片の重量を測定し、比率を計算した。７匹の非照射Ｃ５７ＢＬ／６マウスを対照として使用した。
【０３７８】
１１．  統計処理
群間の線維症の割合の差の統計的有意性の検定は、ノンパラメトリックデータに関するＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して行った。死亡の日を記録し、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を作製するのに使用した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線の個々の群比較並びに総比較を対数順位（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を使用して行った。測定の平均値を平均値の対応する標準誤差又は標準偏差と共に報告する。ＲＶ／ＬＶ質量比の測定値の平均値の比較については、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（対応のない、両側）を使用した。Ｉｔｇｂ６−／−マウスとＩｔｇｂ６＋／＋マウスとの間の線維症の有無の比較にはＦｉｓｈｅｒの直接確率法を使用した。統計的有意性をｐ＜０．０５と定義した。
【０３７９】
結果
１．  マウスＲＩＬＦはαｖβ６発現を必要とする：胸郭照射後のＩｔｇｂ６−／−及びＩｔｇｂ６＋／＋マウスの比較
この実験は、ベースライン及び照射後のαｖβ６発現を比較し、αｖβ６の非存在が線維症を予防したかどうかを判断するために設計された。本発明者等はＩｔｇｂ６−／−及びＩｔｇｂ６＋／＋マウスを照射し、２８週目の前の種々の時点及び２８週目に屠殺した。
（ａ）  β６は照射後１８〜２０週目にアップレギュレートされる。
【０３８０】
照射後１８週目の前に屠殺したマウスは、免疫組織化学により測定した場合、正常な低いαｖβ６発現を有する。しかし、１８週目には、肺胞上皮全体にわたるβ６の発現のび漫性の増大が認められる（図４２）。
（ｂ）  高αｖβ６発現は線維症性領域で持続する。
【０３８１】
本発明者等は、照射後の時間に関わりなく、線維症性病変部内の内皮細胞における高レベルのαｖβ６発現を一貫して認めた（図４３）。しかし、１８週目に認められるαｖβ６の発現のび漫性の増大は、後の時点にはしばしばさほど明らかでない（図４３、２４週及び２７週と比較）。
（ｃ）  αｖβ６を欠くマウスはＲＩＬＦを発現しない。
【０３８２】
対照マウスでは、線維症の部位を識別することができた最も早い時点は、照射後２０〜２２週目であった（図示なし）。線維症性部位は、一般的に十分に境界が明らかで、胸膜下にある。本発明者等は、照射後２７週目に屠殺したＩｔｇｂ６−／−マウス（Ｎ＝１７）の肺の切片に線維症の部位を発見しなかった。これと対照的に、本発明者等は２３匹中２１匹のＩｔｇｂ６＋／＋マウスの切片に線維症の部位を発見した。これは統計的に有意な差である（ｐ＜０．００１、両側Ｆｉｓｈｅｒ直接確率法）（図４４）。Ｉｔｇｂ６＋／＋マウスの切片（照射後２７週目）の線維症性部位の割合（％）の平均値は、１７％±３％であった。本発明者等は、照射後２７週目のＩｔｇｂ６＋／＋及びＩｔｇｂ６−／−マウスの肺のヒドロキシプロリン含量を測定することによって組織学的所見を確認した（図４５）。
（ｄ）  αｖβ６の非存在は肺照射後の生存に影響しない。
【０３８３】
１４Ｇｙ胸郭照射後、死亡は、照射後１８週目まで無視でき、照射後ほぼ２５週目に５０％に達した。Ｉｔｇｂ６＋／＋及びＩｔｇｂ６−／−マウスの生存曲線の間に有意差はなかった（図４６）。
【０３８４】
２．  マウスＲＩＬＦモデルにおける３Ｇ９（０．３、１及び１ｍｇ／ｋｇ／週ＩＰ投与）及び可溶性ＴＧＦβＲの効果
以前の結果は、ＲＩＬＦがαｖβ６インテグリンの発現に依存し、αｖβ６の欠乏は照射後死亡率を悪化させないことを示している。αｖβ６の必要性は、潜在性ＴＧＦβ１のアクチベーターとしてのその既知の機能と一致している。これらの結果は、抗線維症戦略としてのαｖβ６阻害の実現可能性も示唆している。この着想を検定し、ＲＩＬＦのマウスモデルがＴＧＦβ依存性であることを確認するために、本発明者等は照射マウスに対照Ａｂ、可溶性ＴＧＦβ受容体又は３Ｇ９の３用量の内の１つを投与した（１群当たりＮ＝２７）。より少数のマウス（Ｎ＝１５）にＰＢＳ注射液（２００μＬ）のみを投与した。３Ｇ９は０．３、１及び１０ｍｇ／ｋｇの用量で使用し、照射Ａｂは１０ｍｇ／ｋｇで使用し、可溶性ＴＧＦβ受容体は５ｍｇ／ｋｇで使用した。投与は、照射後１５週目（αｖβ６アップレギュレーションの約３週間前）に開始し、照射後２６週目の屠殺まで週１回継続した（詳細については方法の項を参照）。
（ａ）  ３Ｇ９及び可溶性ＴＧＦβ受容体は線維症を低減する。
【０３８５】
０．３ｍｇ／ｋｇ群は対照群と比較して線維症の割合の低下を示さなかったが、１ｍｇ／ｋｇ群は線維症の有意な低減を示した。可溶性ＴＧＦβ受容体及び１０ｍｇ／ｋｇ群も対照より少ない線維症を示したが、屠殺マウスのみの解析における結果は統計的有意性に達しなかった（図４７）。計画屠殺時点の前に死亡したマウスは生存マウスと生物学的に異なっていた可能性がある。従って、本発明者等は試験期間中に死亡又は屠殺した全てのマウスにおける同様な解析を行った。全てのマウス（屠殺したマウス及び屠殺の前に死亡したマウス）を考慮した場合、対照と比較して有意に少ない線維症が１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ及び可溶性ＴＧＦβ受容体群に存在していた。０．３ｍｇ／ｋｇ群は、再び対照と比較して有意差を示さなかった（図４８）。
（ｂ）  １０ｍｇ／ｋｇの用量の３Ｇ９は好中球性及びリンパ球性肺胞隔炎を引き起こす。
【０３８６】
全ての屠殺マウスにおいて実施したＢＡＬで、対照と比較して１０ｍｇ／ｋｇ群の好中球及びリンパ球の割合の増加率（％）が明らかにされた（図４９）。他の群は、同様な増加を示さなかった。
（ｃ）  低用量の抗体によるαｖβ６遮断は肺照射後の生存に影響を及ぼさない。
【０３８７】
全群を比較した場合、生存の有意差はなかった（ｐ＝０．０８８；  対数順位Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定による全群の比較）。しかし、１０ｍｇ／ｋｇ群の死亡の増加の傾向は明白であった（図５０）。１０ｍｇ／ｋｇ群／週群と対照群のみを比較した場合（即ち、多重比較の補正なし）、生存曲線間の差は統計的に有意である。
【０３８８】
３．  マウスＲＩＬＦモデルにおける３Ｇ９（１、３、６及び１０ｍｇ／ｋｇ／週ＳＣ投与）の効果
以前の結果は、マウスモデルにおけるＲＩＬＦはＴＧＦβ媒介性であり、１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの用量の３Ｇ９により有意に低減することを示している。しかし、肺胞炎症の増加、及び死亡の増加の傾向が１０ｍｇ／ｋｇの用量で存在する。この実験では、本発明者等は３Ｇ９の投与はＲＩＬＦを予防するのではなく、ＲＩＬＦの発症を単に数週間遅延させるという可能性を検定するために、より後の時点（照射後３２週目まで）に線維症を評価した。又、１ｍｇ／ｋｇ用量と１０ｍｇ／ｋｇ用量との間の肺胞炎症及び生存の差をより十分に明らかにするために、本発明者等は１ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇの間の追加の用量を試験した。本発明者等は２７０匹のマウスを照射し、それらを３Ｇ９の４用量（１、３、６及び１０ｍｇ／ｋｇ）の内の１つ又は対照Ａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）の投与を受ける等しい群に分けた。投与は、照射後１５週目に開始し、後の屠殺まで週１回継続した。実験は、約１ヵ月の間隔をあけて照射したマウスの２群を使用して行った。１つの群では、マウスが照射後２８週目まで生存していた場合（群１）投与を開始したマウスを屠殺し、他の群では、マウスが３２週目まで生存していた場合（群２）屠殺した。抗体は、皮下に投与した（以前の実験におけるようにＩＰではない）。
（ａ）  １、３、６及び１０ｍｇ／ｋｇの用量の３Ｇ９は線維症を低減する。
【０３８９】
対照と比較して有意に低いレベルの線維症が３Ｇ９を投与した全ての群に認められた（ｐ＜０．０１）。これらの差は、死亡又は瀕死が認められたマウス、最終時点に屠殺したマウス、及び合わせた全てのマウスで有意であった（図５１）。
（ｂ）  高用量の３Ｇ９は好中球性及びリンパ球性肺胞隔炎を引き起こす。
【０３９０】
全ての屠殺マウス（Ｎ＝１０１）において実施したＢＡＬｓで、３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ群で対照と比較して高い割合（ｐ＜０．０２）の好中球及びリンパ球が示された（図５２）。又、１ｍｇ／ｋｇ群と比較して有意に高い割合が存在した（ｐ＜０．００１）。定性的には、「泡沫」マクロファージ（Ｉｔｇｂ６−／−マウスで認められたのと同一）及び細胞破片の数の増加がより高用量で認められる（図５３）。
（ｃ）  ６ｍｇ／ｋｇの用量の３Ｇ９は生存率の低下に関連する。
【０３９１】
１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ群と比較した対照群との間の死亡率の差はなかった（図５４及び５５）。しかし、対照と比較して６ｍｇ／ｋｇ群の死亡率は有意に高かった（ｐ＜０．０５）。１０ｍｇ／ｋｇ群は、対照マウスと比較して生存率の低下を示さなかった。差は２８週群でより顕著であったが、６ｍｇ／ｋｇ／週３Ｇ９群は２８週屠殺（群１）及び３２週屠殺（群２）コホートの両方でより不良な生存率を有していた（図５４及び５５）。
（ｄ）  ＲＶ／ＬＶ質量比及び肺潅流に対する肺照射の影響
以前の試験で、肺照射後の線維症相中の死亡は空気間隙（ａｉｒｓｐａｃｅ）閉塞（主として線維症に起因する）と肺胞潅流の喪失の組合せに起因する呼吸困難によることが示唆された（Ｓｈａｒｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋｏ  １９８９）。潅流の喪失は肺動脈高血圧及び右心室肥大の原因となるはずであり、ＲＶ質量の増加がこのモデルで報告された。本発明者等は３２週目まで生存していたマウス及び２８週目から３２週目までの間に死亡したマウスのＲＶ／ＬＶ質量比を測定した。死亡したマウスは、生存していたマウスと比較して、又非照射マウスと比較して有意に高いＲＶ／ＬＶ比を有していた（図５６）。更に、死亡した一部のマウスで、肺胞潅流が完全に喪失したことを示唆する所見である、肺胞壁に赤血球が完全に存在しない明瞭な部位が認められた（図５７）。
【０３９２】
考察
ＴＧＦβは、線維症誘発性メディエーターであることが知られている。以前の試験で、インテグリンαｖβ６が潜在性ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３を活性化し、Ｉｔｇｂ６−／−マウスはブレオマイシン誘発性肺線維症から保護されることが示された。ここに示す結果は、Ｉｔｇｂ６−／−マウスは放射線誘発性肺線維症からも保護されることを示している。これらの結果は、αｖβ６インテグリンを標的とする抗線維症療法の根拠を提供する。
【０３９３】
これらの試験において、本発明者等は１ｍｇ／ｋｇ／週及びより高用量で投与した３Ｇ９はＲＩＬＦを一貫して、且つ効果的に低減したことを見出した。より高用量、特に６〜１０ｍｇ／ｋｇ／週の用量は、ＢＡＬ液中の好中球及びリンパ球の割合の増加と関連していた。これらの変化は、Ｉｔｇｂ６−／−マウスの表現型と一致しており、３Ｇ９のこれらの用量が、動物がノックアウトを表現型模写するような程度までαｖβ６媒介性ＴＧＦβ活性化を阻害していることを示唆している。
【０３９４】
更に、３Ｇ９のより高用量は、マウスＲＩＬＦモデルにおける生存率の低下に可変的に関連している。最初の試験では、１０ｍｇ／ｋｇ／週の用量で死亡率の増加の強い傾向があったが、１又は０．３ｍｇ／ｋｇ／週を投与したマウスではなかった。２回目の試験では、６ｍｇ／ｋｇ／週群に死亡率の増加があったが、他の群（１０ｍｇ／ｋｇ／週を含む）にはなかった。用量／反応の不一致の理由は不明であるが、一般的な結果は、試験した最高用量で生存率が低いという傾向である。
【０３９５】
ＲＩＬＦモデルに発生する死亡は、呼吸困難に起因すると思われる。死亡は、系統依存性且つ性依存性である（Ｈａｓｔｏｎ，  Ｚｈｏｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。マウスＲＩＬＦモデルにおける肺機能不全及び死亡の原因が広範に研究された（Ｓｈａｒｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋｏ  １９８９）。この研究の著者らは、照射後に肺潅流が減少し、この障害が死亡の一因であった可能性があると結論付けた。放射線誘発性肺線維症に対して抵抗性であるマウスも放射線誘発性肺線維症モデルにおいて低い生存率を有する。これらのマウスにおける肺潅流の低下がこのモデルにおけるそれらの死亡に寄与する主要な因子であることが認められた。潅流障害のパターンは、系統に依存する。線維症に罹患しやすいマウスでは、潅流の完全な喪失（屠殺の３０秒前に静脈内注射したコロイド状炭素の存否により判断される）は、線維症の部位及び線維症政病変に隣接する偶発的な小部位に限定されている。更に、照射マウスの潅流部位には非照射対照より大きい炭素量の領域間の変動があり、潅流が低いが、非存在でない実質的な部位が存在していたことが示唆される。マウスの複数の系統で認められる肺潅流の喪失の他の証拠は、病変のない肺における小血管の数の低下、及びＲＶ／ＬＶ厚比により評価されるＲＶ肥大であった。肺胞壁における赤血球の数（潅流を評価する異なる方法）も照射マウス（Ａ／Ｊ系）で低かった。殆どのＣ５７ＢＬ／６マウスは、胸水を有さなかった。Ｃ５７ＢＬ／１０Ｊ系を除いて、照射の結果として心筋損傷は起こらなかった。
【０３９６】
死亡に関する本発明者等の所見は、Ｓｈａｒｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋｏのより広範な所見と一致している。対照マウスでは、線維症の量は屠殺まで生存していたマウスより死亡したマウスで大きく（図５１）、より大きい肺機能不全が死亡に関連することが示唆される。死亡するマウスは左心室肥大（ＲＶ／ＬＶ質量指数の増加と定義）を有するが、屠殺まで生存しているマウスは有さず（図５６）、この所見は、肺潅流の喪失が死亡に関連することを示唆している。死亡していたことが認められた一部のマウスでは、肺胞壁における赤血球を欠く肺の部位が組織学的切片に認められ（図５７）、それらの部位における潅流の完全な喪失と一致し、以前の記述（Ｓｈａｒｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋｏ  １９８９）と一致している。本発明者等は、死亡の原因となるような食道機能不全（瘢痕化、穿孔）の証拠を認めず、又心筋壊死も認めなかった。従って、以前の試験に照らして解釈した本発明者等の証拠は、線維症が予防された場合でさえも肺潅流の喪失がＣ５７ＢＬ／６マウスで起こり、線維症ではなく、肺潅流の喪失が死亡の原因であることを示唆している。本発明者等は又、注射（対照Ａｂ又は３Ｇ９の）後２日間の内にマウスが死亡した可能性がより高かったことを認めたことから、取扱いのストレス及び注射によるおそらく余分の液量がわずかなマウスの死亡を促進したことが示唆される。
【０３９７】
遺伝子切除によるαｖβ６の喪失はこのモデルにおける死亡に影響を及ぼさないが、３Ｇ９の高用量（６〜１０ｍｇ／ｋｇ／週）は、より低用量の３Ｇ９又は対照Ａｂを投与したマウスと比較して早期死亡に関連していた。最も明白な解釈は、より高用量の３Ｇ９が死亡率を悪化するということである。しかし、本発明者等は、対照Ａｂ及びより低用量の３Ｇ９が生存率を実際に改善するという可能性を排除することはできない。３つの実験における５０％の生存率までの時間の比較により、２つの群の存在が示されたように思われる。野生型及びＩｔｇｂ６−／−マウス（図４６）、ＩＰ実験においてＰＢＳ投与及び１０ｍｇ／ｋｇ／週  ３Ｇ９投与マウス（図５０）並びにＳＣ実験において６ｍｇ／ｋｇ／週  ３Ｇ９投与マウス（図５４）は約２２．５〜２５週間の生存時間中央値を有するが、他の全ての投与群は約２４．５〜３０週間の生存時間中央値を有する（図５０及び５４）。実験条件が異なっており、他の条件が実験の間に異なり、ベースライン死亡率の変化をもたらしていた可能性があるため、この点に関する決定的な結論は可能ではない。６〜１０ｍｇ／ｋｇ／週の３Ｇ９を投与したマウスでは、本発明者等は解剖時のマウスの肉眼的検査又は肺組織学的検査時の生存率の変化の原因となるような新たな異常（肺炎症以外の）を認めなかった。ＲＩＬＦモデルにおける３Ｇ９の低用量と高用量との間の生存率の差の理由は不明である。
【０３９８】
これらの試験は、αｖβ６媒介性ＴＧＦβ活性化をおそらく最大限に低下させない３Ｇ９のより低用量がマウスＲＩＬＦモデルにおける肺線維症を安全に予防するという結論を裏付けている。
【０３９９】
【化７１】
2009500041.tif 000072
【０４００】
【化７２】
2009500041.tif 000073
実施例１６  肺線維症のブレオマイシンモデルにおける抗αｖβ６インテグリンモノクローナル抗体の有効性
概要
肺線維症の現行の療法は大部分が無効であり、新規の治療薬を開発することが極めて必要である。線維芽細胞の活性化と増殖、及び細胞外マトリックス分子の発現等の肺線維症を特徴付ける多くの病理学的過程の推進にＴＧＦ−βが中心的役割を果たしているため、ＴＧＦ−β経路を遮断する薬剤に特に関心が払われている。その線維症誘発活性に加えて、ＴＧＦ−βは重要な抗炎症性サイトカインであり、従って、ＴＧＦ−βの治療的阻害は、過度の炎症を促進せずに、線維症を理想的に阻止するはずである。以前の試験で、インテグリンαｖβ６はｉｎ  ｖｉｖｏ、特に肺におけるＴＧＦ−βの活性化の重要なメディエーターであることが示された。αｖβ６は細胞外間隙における潜在性ＴＧＦ−β複合体に直接結合し、この結合は、多くの場合、活性形の遊離を必要とする。αｖβ６を欠くマウスは、肺におけるＴＧＦ−βシグナリングの障害のため軽度の肺炎症を有し、ブレオマイシン誘発性肺線維症に対して抵抗性である。本発明者等は、潜在性ＴＧＦ−βへのαｖβ６の結合を阻止し、ＴＧＦ−βの活性化とその後のシグナリングを阻害するモノクローナル抗体を開発した。ここに本発明者等は、これらの抗体がマウスにおけるブレオマイシン誘発性線維症の減弱に有効であることを示す。本発明者等は更に、肺コラーゲン発現の減弱のほぼ最大の有効性が、気管支肺胞洗浄液中の炎症細胞の数により測定される付加的な炎症をもたらさない用量で達成することができることを示す。一方、線維症も減弱するより高用量の抗体は、αｖβ６欠乏マウスで認められるものと一致する炎症を誘発することができる。これらの所見は、αｖβ６媒介性ＴＧＦ−βの阻害の炎症誘発及び抗線維症効果はこのモデルにおいて分離可能であり、炎症誘発効果より線維症の抑制がより低用量で起こることを示している。
【０４０１】
緒言
ＴＧＦ−β１サイトカインは、罹患組織の過剰細胞外マトリックス（ＥＣＭ）による置換によって特徴付けられ、最終的に臓器瘢痕化及び不全の原因となる病理学的過程である線維症の開始及び維持に中心的なものである。ＴＧＦ−β１は、ＥＣＭの分泌及び線維症過程の進行の維持を担っている線維芽細胞増殖及び筋線維芽細胞の活性化を促進する［１−６］。ＴＧＦ−β１は、創傷治癒時に起こる組織リモデリング事象における十分に制御された役割を果たしている。しかし、多くの疾患において、この組織リモデリングの過程は、異常になり、長時間にわたるアップレギュレートされたＴＧＦ−βシグナリング、過剰な線維芽細胞蓄積、ＥＣＭ沈着及び瘢痕化によって特徴付けられる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの線維症の進行におけるＴＧＦ−β１の重要性は、機能の獲得試験並びに遮断により示された［１、７〜１２］。肺における様々なサイトカインのアデノウイルス及びトランスジェニック過剰発現は、ＴＧＦ−β１が著しい炎症の非存在下で線維症を促進するその能力が特有であることを示すものであった。線維症を促進する他のサイトカインは、組織におけるＴＧＦ−β１発現をアップレギュレートすることによってしばしば線維症を促進する。更に、試験により、ＴＧＦ−βシグナリングのメディエーターであるＳＭＡＤ３が欠乏したノックアウトマウスは、肺線維症の発現に対して抵抗性であることが示された［１３］。抗ＴＧＦ−β薬を使用した多くの試験で、疾患モデルにおける線維症からの顕著な保護が示されている［８、９、１１、１４〜１７］。従って、ＴＧＦ−β１は、線維症の病理学に関連する疾患の治療の潜在的治療標的として特定された。
【０４０２】
αｖβ６インテグリンは、ＴＧＦ−β１活性化の重要なレギュレータとして特定された。ＴＧＦ−β１は、成熟活性Ｃ末端ＴＧＦ−βサイトカインと非共有結合により結合したＮ末端ＬＡＰにより開裂され、分泌される潜在タンパク質として合成される。潜在ＴＧＦ−β１複合体は、その同族受容体の結合することができず、従って、プロテアーゼによる開裂、低ｐＨ又は電離放射線への曝露、その同族受容体への結合を可能にする潜在複合体の立体配座の変化を含む幾つかの代替機序の１つにより活性形に変換されるまで、生物学的に不活性の状態に留まる［１８〜２１］。αｖβ６インテグリンは、潜在ＴＧＦ−β１複合体におけるＲＧＤモチーフに結合し、それを活性形に変換する［１８、２２〜２５］。ＴＧＦ−β１の活性化の他の幾つかの機序が確認されたが、β６インテグリン欠乏マウス（β６ヌルマウス）における試験で、肺及び腎臓における線維症の発生にはＴＧＦ−βのαｖβ６媒介性活性化が必要であることが示唆されている［１８、２６］。αｖβ６は、正常成体組織において低レベル又は検出不能レベルで発現するが、炎症性／線維症性疾患において高度にアップレギュレートされ、一般的に上皮細胞に限られている［２７〜３０］。従って、組織損傷時の上皮細胞におけるαｖβ６のアップレギュレートされた発現は、ＴＧＦ−βの局所活性化の増大及びバイスタンダー細胞における後続のＴＧＦ−β依存性事象の機序をもたらす。αｖβ６［３１］リガンド結合の遮断は、特にαｖβ６のアップレギュレートされた発現が存在する組織におけるＴＧＦ−βの活性化の局所的阻害の方法を提供する。この手法は、ＴＧＦ−β経路の全体的な阻害に伴う臨床的安全性のリスクを低減する可能性がある。
【０４０３】
本明細書に記載する試験において、本発明者等は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）を含む、炎症性及び線維症性病状を伴うヒト肺疾患においてαｖβ６が有意にアップレギュレートされることを示す。以前の試験で、αｖβ６機能を欠くβ６ヌルマウスがブレオマイシン誘発性肺線維症から保護されることが示された［１８］。ここでは本発明者等は、αｖβ６のリガンド結合及びＴＧＦ−β活性化機能を遮断するモノクローナル抗体がブレオマイシン誘発性肺線維症を強力に抑制することを種々のマウス系統において、線維症の多くの各種の尺度により示す。本発明者等は更に、肺胞細胞集団はブレオマイシン損傷肺において低い有効量では変化せず、従って、抗線維症作用の機序は、予想通り、炎症を抑制することによって媒介されないことを示す。高い頻繁な投与によってのみ、このモデルにおいて付加的な炎症が認められ、β６ヌルマウスにおける付加的な炎症の所見と一致している。
【０４０４】
材料及び方法
１．  試薬
αｖβ６ｍＡｂｓを本明細書における他所に記載又は以前に記載した［３１］ように生成した。ヒト／マウスキメラ２Ａ１及び３Ｇ９  ｃＤＮＡｓを、重鎖の定常領域プライマーＣＤＬ−７３９及び軽鎖のＣＤＬ−７３８を含む各親ハイブリドーマ総ＲＮＡｓからＦｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ［米国ニュージャージー州ピスカタウェイ］）を使用して生成した。重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子は、ｃＤＮＡ合成に使用した同じ３’プライマー及び大部分のマウス抗体遺伝子シグナル配列（請求あり次第入手可能な配列）に特異的な縮重プライマーのプール及びＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ［米国カリフォルニア州ラホイヤ］）を使用してポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。クローン化した重鎖及び軽鎖可変領域を、ヒトＩｇＧ１定常領域を含む哺乳動物発現ベクターに結合させた。組換え可溶性マウスＴＧＦ−β受容体ＩＩ−Ｉｇ型融合タンパク質（ｓＴＧＦ−ｂＲＩＩ−Ｉｇ）を以前に記載した［３２］ように生成した。研究用ｍｕ３Ｇ９、１Ｅ６及びｓＴＧＦ−ｂＲＩＩ−Ｉｇ（リン酸緩衝生理食塩水中精製タンパク質）を全ての実験に使用した。
【０４０５】
２．  動物
マウス
肺ヒドロキシプロリンをエンドポイントとした実験にはＳＶ１２９マウスを使用した（Ｓｈｅｐｐａｒｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ［カリフォルニア大学サンフランシスコ校（ＵＣＳＦ）］）。組織形態計測又はＢＡＬ収集及び解析をエンドポイントとした実験にはＣ５７Ｂ１６マウスを使用した（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）。エンドポイントとしてのコラーゲン遺伝子発現の定量分析には、トランスジェニックリポーターマウスを使用した（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）。ｃｏｌＩα２遺伝子プロモーターの１７ｋｂ領域の制御下のルシフェラーゼリポーター遺伝子を運ぶトランスジェニックマウスは、以前に記載した［３３］。これらのマウスは、トランスジェニック雄をＣ５７Ｂ１／６ＸＤＢＡ／２  Ｆ１ハイブリッド雌と交配させて維持する（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。外来遺伝子陽性の子孫（テールルシフェラーゼ発現により評価）を下に概要を示すブレオマイシンチャレンジ実験のために選択した。
ハムスター（Ｇｉｒｉ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
体重が９０〜１１０ｇの雄ゴールデンシリアンハムスターをＳｉｍｏｎｓｅｎｓ，  Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州ギルロイ）から購入した。ハムスターは、ろ過空気を供給し、温度及び湿度を一定とした施設に４匹の群で収容した。全ての管理は、動物福祉法に関する国立衛生研究所ガイドに準拠した。ハムスターを投与前に１週間施設内で馴化させた。１２時間の明／暗サイクルを維持した。
【０４０６】
３．  免疫組織化学
マウス肺を採取し、１０％緩衝ホルマリンに入れ、一般的手法に従ってパラフィン組織学検査用に処理した。線維症性病状を伴う肺疾患を有する患者の肺のパラフィン組織切片は、Ｇ．  Ｄａｖｉｓ（バーモント大学）、Ｒ．  Ｌａｆｙａｔｉｓ（ボストン大学）、Ａｒｄａｉｓ  Ｃｏｒｐ．（米国マサチューセッツ州レキシントン）及びＡｓｔｅｒａｎｄ  Ｉｎｃ．（米国ミシガン州デトロイト）から入手した。組織切片をキシレン及びエタノールで脱パラフィン処理し、蒸留水で再水和し、次いで、０．４５％  Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに浸漬した。組織をペプシン（００−３００９、Ｚｙｍｅｄ［米国カリフォルニア州サンフランシスコ］）と共に培養し、アビジン及びビオチン（ＳＰ−２００１；  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ［米国カリフォルニア州バーリンゲーム］）で遮断した。一次抗体を０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで希釈し、組織を４℃にて一晩培養した。切片を、抗αｖβ６  ｍＡｂのヒト／マウスキメラ型、２Ａ１［３１］、及びマウス組織に対する抗ヒトビオチニル化二次抗体（ＰＫ−６１０３、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ［米国カリフォルニア州バーリンゲーム］）と共に培養した。
【０４０７】
切片を、２Ａ１［３１］、及びヒト組織に対する抗マウスビオチニル化二次抗体（ＰＫ−６１０２、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に培養した。アビジン−ビオチン複合体−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ、ＰＫ−６１０２）を切片に塗布し、室温にて３０分間培養し、３，３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質を指示通りに調製し（ＳＫ−４１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、切片に室温にて５分間塗布した。組織切片をマイアーのヘマトキシリンで１分間染色し、水及びＰＢＳで洗い流した。全てのヒト組織試料は、現地施設内審査の承認及び患者承認の元に入手した。
【０４０８】
３．１  マウスにおけるブレオマイシンの滴注
ＳＶ１２９系（Ｄ．  Ｓｈｅｐｐａｒｄ［ＵＣＳＦ］）
マウスには以前に記載した［１８］ようにブレオマイシン又は生理食塩水を気管内に滴注した。簡単に述べると、年齢及び性をマッチさせた１２９／ｔｅｒＳＶＥＭＳ系の８〜１２週齢のマウスを特定病原体のない環境で飼育管理した。ブレオマイシン（Ｍｅａｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ［米国ニュージャージー州プリンストン］）を滅菌生理食塩水に溶解した（６０ｍＬ中０．０３又は０．０５単位）。ブレオマイシン又は生理食塩水は、直接切開によりメトキシフルラン麻酔下で経気管投与した。
Ｃ５７Ｂ１／６系及びコラーゲンリポーターマウス（Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ）
１００ｍｇ／ｋｇケタミン及び１０ｍｇ／ｋｇキシラジンのＩＰ注射によりマウスを麻酔した。滅菌＃１５メスを使用して頚部に０．５〜１．０ｃｍの正中線切開を施して、視覚化のために気管を露出させた。気管を露出させ、口腔を経て気管内に噴霧チップを入れた後に、Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙ微量噴霧装置を使用してブレオマイシンを滴注した。生理食塩水は、対照動物に滴注した。滴注後、滅菌創傷クリップで手術部位を閉じた。術後疼痛に対してブプレノルフィン０．０５ｍｇ／ｋｇを皮下投与した．
これらのマウスブレオマイシン試験において複数の治療プロトコルを使用して被験物質を評価したため、結果の項で述べるものとする。
【０４０９】
３．２  ハムスターにおけるブレオマイシンの滴注
ペントバルビタール麻酔下で、ハムスターに０、７及び１４日目に生理食塩水（ＳＡ；４ｍＬ／ｋｇ）又はブレオマイシン（ＢＬ；６．５Ｕ／４ｍＬ／ｋｇ）をＩＴ滴注した。動物を次の６つの実験群に無作為に分けた。即ち、ＳＡ滴注、ＰＢＳ投与（ＳＡ＋ＰＢＳ）；ＢＬ滴注、ＰＢＳ投与（ＢＬ＋ＰＢＳ）；ＢＬ滴注、０日目に開始してｍｕ３Ｇ９投与（ＢＬ＋Ａｂ１）；ＢＬ滴注、７日目に開始してｍｕ３Ｇ９投与（ＢＬ＋Ａｂ２）；ＢＬ滴注、１４日目に開始してｍｕ３Ｇ９投与（ＢＬ＋Ａｂ３）；及びＢＬ滴注、０日目に開始して１Ｅ６投与（ＢＬ＋１Ｅ６）。動物を２８日目に屠殺し、それらの肺を除去し、ヒドロキシプロリン及び脂質過酸化の分析のために処理した。
【０４１０】
４．  コラーゲン含量を得るためのヒドロキシプロリン分析
肺をガラス管（Ｆｉｓｈｅｒ  ＃１４９６１）に入れた１ｍＬのｄＨ２Ｏ中でホモジナイズした。１２５μＬの５０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）をホモジネートに加え、氷上で２０分間培養した。試料を１０００ｒｐｍで４℃にて５分間遠心分離した。上清を捨て、１ｍＬの１２Ｎ  ＨＣｌをガラス管中のペレットに加えた。次いで、試料を１１０℃にて２４時間焼いた（ガラスビーカー中）。乾燥ペレットを２ｍＬのｄＨ２Ｏで再構成した。６つのヒドロキシプロリン標準（Ｓｉｇｍａ−Ｈ６００２）を０．２５ｍｇ／ｍＬから開始して調製した。５００μＬのクロラミンＴ（０．５Ｍ  酢酸Ｎａ及び１０％イソプロパノール中１．４％クロラミンＴ）を含む１．５ｍＬ  Ｅｐｐｅｄｏｒｆ管に、２００μＬの試料を加え、室温にて２０分間培養した。次いで、５００μＬのＥｈｒｌｉｃｈ’ｓ／ｐＤＭＢＡ（７０％イソプロパノール及び３０％過塩素酸中１Ｍ  ｐ−ＤＭＢＡ（ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド））を加え、６５℃にて１５分間培養した。１００μＬの最終反応溶液を９６ウェルプレートに移し、各試料について３回の測定を行い、２時間後に試料を５５０ｎｍで読み取った。
【０４１１】
５．  組織学指標
組織形態計測をエンドポイントとした実験では、屠殺時に各マウスの肺全体を組織学的に評価した。横断切片を切り出し、標準的手順によりマッソンの三色で染色した。各マウスの肺の複数の葉を含む横断切片を選択した。三重染色切片全体を対象として含む高倍率（１００倍）視野を写真撮影した（マウスにつき平均約３０視野）。各写真を、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ  ６．０．５ソフトウェアによりコラーゲン含量（三重染色組織学的切片において青色に見える）について評価した。青色の部位を色閾値により選択し、総組織面積の割合として表した。
【０４１２】
６．  ルシフェラーゼ分析
肺を採取し、１ｍＬの溶解緩衝液（０．１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４−ｐＨ７．８及び１ｍＭ  ＤＬ−ジチオトレイトール）中でホモジナイズした。次いで、試料を氷上に１０分間置き、４℃にて１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、次いで、１００μＬの各試料をＷａｌｌａｃ  Ｉｓｏｐｌａｔｔｅｒに移した。次いで、試料を再び氷上に１５分間置いた後、１００μＬのＬｕｃｌｉｔｅ基質（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＃６０１９１１）を加えた。次いで、ルシフェラーゼ活性をルミノメーターで読み取った。
【０４１３】
７．  気管支肺胞（ＢＡＬ）採取及びＢＡＬ細胞の分染
Ｉｎａｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ）の腹腔内注射（ＩＰ）によりマウスを安楽死させた。主として鈍的剥離により気管を露出させた。次いで、気管を鋏で２つの軟骨輪の間で開き、２３ゲージ鈍端針を気管に挿入した。Ｓｃｈｗａｒｔｚ一時クリップ（Ｒｏｂｏｚ）で軽く締め付けて針を所定の位置に保持した。０．８ｍＬのＣａ２＋又はＭｇ２＋不含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を肺に注入して、ＢＡＬを実施した。大きい圧力を加えずに液を注射器中に吸引し、氷上の１５ｍＬポリプロピレンＦａｌｃｏｎ管に移した。次いで、処置を繰り返し、過度の陰圧をかけずにＢＡＬ液を注射器中に吸引した。試料を氷上で保存し、細胞数の計測、分染のために処理し、ＢＡＬペレット及び液を採取し、−８０℃にて保存した。
【０４１４】
１．  次いで、ＢＡＬを卓上遠心分離機で４℃にて１８０ｇ、１０００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＰＲ）で１０分間遠心分離した。次いで、上清（ＢＡＬ液）を除去し、−８０℃にて凍結した。１．０ｍＬのＲＢＣ溶解溶液（Ｓｉｇｍａ）をペレットに加え、ボルテックスミキサーで２０秒間混合した。次いで、細胞数の計測及びサイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎｓ）を行った。
【０４１５】
２．  試料を氷上に保存し、血球計を使用し、細胞を血球計に加えた後１分間置き、読み取りの前に細胞を沈降させて計数した。
【０４１６】
３．  １００μＬの細胞懸濁液を室温にて５００ＲＰＭで５分間サイトスピンした（ＴｈｅｒｍｏＳｈａｎｄｏｎ）。細胞溶液を細胞遠心分離装置に入れ、５００ｒｐｍで５分間サイトスピンすることにより、サイトスピン標本を調製した。細胞濃度を調べて、スライド標本上の濃度が高すぎないことを確認した。スライド標本を一晩乾燥させ、ＤｉｆｆＱｕｉｋ（Ｆｉｓｈｅｒ）で染色した。染色は、製造業者の（ＤｉｆｆＱｕｉｋ）プロトコルに従って行った。スライド標本を乾燥させたら、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してカバーグラスをのせ、細胞を種類により分類し、１００個の無作為に選択した細胞を実験用細胞計（Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してカウントした。
【０４１７】
８．  統計解析
ビヒクル対照及び／又はアイソタイプ対照と被験物質との統計的比較を分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して行った。ＡＮＯＶＡを使用してｐ＜０．０５の確率で統計的有意差が立証された場合、群間の有意差をＤｕｎｎｅｔの多重比較検定により評価した。
【０４１８】
結果
１．  ヒト肺疾患及びブレオマイシンモデルにおけるαｖβ６の発現
アップレギュレートしたＴＧＦ−β発現及びシグナリングは、線維症性又は炎症性病状を伴う様々なヒト肺疾患において記載された［２０、３４］。しかし、αｖβ６の発現は、線維性炎症性肺疾患の小試料においてのみ記載された［２８］。本発明者等は、線維症性及び／又は炎症性変化を有すると特徴付けられた肺疾患を有する患者からの４１個の肺組織試料におけるαｖβ６の発現を評価した（表１６−１）。更に、本発明者等は、癌患者からの肺生検検体の直示的に正常な領域からの肺組織アレイを染色した（Ｉｍｇｅｎｅｘ）。正常肺におけるαｖβ６の発現は、免疫組織化学によって殆ど検出されなかった。「正常」肺組織アレイにおける一部の組織切片は、陽性αｖβ６染色を示したが、それらの切片のそれぞれが近傍に炎症性病状も有していた。４１個の肺試料の全てにおいて、線維症及び／又は炎症性変化を有する領域はαｖβ６発現の強いアップレギュレーションを示した（図５８）。αｖβ６は、顕性線維症の領域の上にある表皮表細胞又は炎症性浸潤巣に隣接する領域に限局化していた。アップレギュレートしたαｖβ６の存在は、特発性肺線維症、強皮症性肺疾患及び慢性閉塞性肺疾患を含む線維性炎症性疾患のスペクトルにわたって認められた。
【０４１９】
発現と特定の病理学的変化との相関関係をより十分に明らかにするために、本発明者等は染色組織試料を外部の訓練を積んだ肺病理学者に送った。購入した試料の多くの病理学的診断を検証することはできなかった（Ａｒｄａｉｓ  ａｎｄ  Ａｓｔｅｒａｎｄ）ものの、より低い線維症とより良好な予後を伴う病状である非特異的間質性肺炎（ＮＳＩＰ）と比較して線維症及び進行性疾患を伴う病状である「通常の間質性肺炎ではるかに高い強度のαｖβ６染色が認められた」ことを一貫して示した。ＵＩＰを有する患者からの生検検体の全てにおいて、ＩＩ型及びＩ型の肺胞管及び肺胞を裏打ちする肺細胞内に強い染色が認められるが、大気道は大部分陰性であり、肺胞内マクロファージは陰性である。要約すると、「高レベルの染色は線維症性部位及びＵＩＰに関連しており」、同様のパターンの強度がより低い染色がＮＳＩＰを含む線維症の他の例に認められた。ＵＩＰは特発性肺線維症（ＩＰＦ）を有する患者における主要な病状であるため、この病状を有する患者における線維症誘発サイトカインＴＧＦ−βのアクチベーターであるαｖβ６の強い過剰発現は、それが線維症の進行の推進における機能的役割を有する可能性があることを示唆している。
【０４２０】
２．  マウスブレオマイシンモデルにおけるαｖβ６の発現
αｖβ６が肺線維症のブレオマイシンマウスモデルにおいてもアップレギュレートされたことを確認するために、本発明者等はブレオマイシンの滴注後１、５及び１５日目に採取した組織切片上のαｖβ６タンパク質の存在を検討するために免疫染色した。５日目には、ブレオマイシンチャレンジにより損傷した肺の領域全体にわたる肺胞上皮でαｖβ６発現がアップレギュレートしている（図５９）。顕著な線維症の領域が顕在化する１５日目には、これらの線維症性部位における肺胞上皮でαｖβ６がより強くアップレギュレートされる。
【０４２１】
３．  ＳＶ１２９マウスにおけるヒドロキシプロリンによる線維症の評価
αｖβ６（β６ヌル）が遺伝的に欠乏したマウスは、ＳＶ１２９マウス系統におけるブレオマイシン誘発性肺線維症から保護されることが以前に示された［１８］。本発明者等は、この同じ系統におけるブレオマイシン誘発性肺線維症の減弱における抗αｖβ６モノクローナル抗体、即ちｍｕ３Ｇ９の有効性を評価することを追求した。本発明者等の共同研究者であるＵＣＳＦのＤｅａｎ  Ｓｈｅｐｐａｒｄの施設において一連の４つの実験を行った（表１６−２）。０日目にＳＶ１２９マウスの気管にブレオマイシンを滴注し、ブレオマイシンの滴注後０、１５又は３０日目に開始して週３回４ｍｇ／ｋｇのｍｕ３Ｇ９をＩＰ注射した。対照マウスにはＰＢＳ又は陰性対照抗体１Ｅ６を注射した。１Ｅ６は、ヒトＬＦＡ−３に対するマウスＩｇＧ１抗体であり、マウス抗原に結合しない。マウスを３０又は６０日目に屠殺し、総組織コラーゲンの尺度であるヒドロキシプロリン含量により線維症を評価した。４つの内の３つの実験において、ブレオマイシン誘発性線維症の減弱における有効性を示唆する、ｍｕ３Ｇ９投与マウスにおけるヒドロキシプロリンの統計的に有意な減少が認められた（図６０）。投与をブレオマイシンの滴注後３０日目まで遅延させた場合（図６０Ｃ）にのみ、ｍｕ３Ｇ９投与マウスの肺におけるヒドロキシプロリン含量がＰＢＳ又はアイソタイプ対照投与マウスと比較して有意に低下しなかった。
【０４２２】
４．  ４６日間治療したブレオマイシンチャレンジマウスの生存の評価
ブレオマイシンモデルにおける抗線維症有効性が生存率の改善と一般的に相関しないため、本発明者等はｍｕ３Ｇ９投与マウスの生存率が改善すると予想しなかった。しかし、これらのマウスには本発明者等が試験した最長治療期間（４６日）であった１５日目から６０日目まで週３回４ｍｇ／ｋｇのｍｕ３Ｇ９を投与した（図６０Ｄ）ため、本発明者等はその実験で試験した群に生存率の差があったかどうかを確認するために解析した。ｍｕ３Ｇ９を投与したマウスとＰＢＳ及び４Ｂ４非遮断対照抗体を投与したマウスと比較したところ、総生存率の有意差はなかった（表１６−２）。
【０４２３】
５．  Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおける線維症の組織形態計測分析
異なるマウスの系統及び異なる施設におけるｍｕ３Ｇ９の抗線維症有効性を検証するために、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃにおける一連の実験においてＣ５７Ｂｌ６マウス系を使用してｍｕ３Ｇ９を評価した。この系統は、ブレオマイシンモデルに頻繁に使用され、滴注後１４日目に測定することができる迅速な線維症を発現する。最初の３つの実験で、マウスに０日目にブレオマイシンを気管内に滴注し、ブレオマイシンチャレンジの１日前（−１日目）から開始してｍｕ３Ｇ９を週３回投与し、肺の採取のために１４日目に安楽死させた。第４の実験では、投与を１４日目まで遅延させ、２８日目に肺を採取した。これらの実験のそれぞれ（図６１）において、ｍｕ３Ｇ９は、マッソン三重染色組織切片における青色染色領域として組織形態計測により測定した線維症肺組織の割合をＰＢＳ投与対照と比較して一貫して低下させた。１Ｅ６  ｍＡｂを陰性ＩｇＧ対照として使用した２つの実験の内の１つにおいて、１Ｅ６  ｍＡｂも線維症組織の割合を有意に低下させた（図６１Ａ）。１Ｅ６  ｍＡｂのこの作用は、ヒドロキシプロリンをエンドポイントとして使用した以前の実験（図６０）においても遅延投与（１４〜２８日目）実験（図６１Ｄ）においても認められなかった。要約すると、複数の実験で、Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおいてブレオマイシンにより誘発される線維症組織の割合の低下におけるｍｕ３Ｇ９の有効性が実証された。しかし、組織形態計測エンドポイントの労働集約性のため、本発明者等は線維症を測定するためのより迅速且つ定量的な方法を探求した。
【０４２４】
６．  定量的エンドポイントとしてのコラーゲン−ルシフェラーゼリポーター外来遺伝子の使用
線維症モデルにおけるコラーゲンの発現の定量的読み取りを得るために、ルシフェラーゼリポーター遺伝子がコラーゲンＩα２プロモーターの制御下で発現する外来遺伝子を運ぶトランスジェニックマウスを以前に使用した［３３］；［３５］。１４日目に、生理食塩水対照と比較したブレオマイシンチャレンジマウスの肺ルシフェラーゼレベルの増加は約１０倍であり、このことから、肺ルシフェラーゼレベルはヒドロキシプロリン測定よりはるかに感度が高いエンドポイントである。このシステムを使用して、本発明者等は週１回の投与を使用して３Ｇ９抗体の用量調節を行ったが、ヒドロキシプロリン及び三色組織形態計測をエンドポイントとして使用した実験で使用した週３回投与法で４ｍｇ／ｋｇを投与したマウスの群を含めた。用量調節を３つの実験で評価し、各実験でＰＢＳ投与対照群を設けた（ｎ＝６、５及び６、合計ｎ＝１７）。ルシフェラーゼ測定の実験間の変動を補正するために、各実験における全ての群のルシフェラーゼ値をＰＢＳ対照の平均値に対して標準化した。ブレオマイシンチャレンジリポーターマウスのｍｕ３Ｇ９投与は、コラーゲンルシフェラーゼリポーターの用量依存的な減少をもたらし（図６２）、０．３ｍｇ／ｋｇの週１回の投与で有意な有効性が認められ、１〜３ｍｇ／ｋｇで最大の有効性が認められた。
【０４２５】
７．  気管支肺胞洗浄細胞組成の分析
本発明者等は線維症の抑制が肺における炎症細胞の主要な亜集団における炎症又は変化の減少に起因していたかどうかを判断するために、ブレオマイシンモデルの２、５、８及び１１日目の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）細胞集団を分析した。予想通り、生理食塩水滴注マウスと比較すると、ブレオマイシンの気管内投与に起因したＢＡＬ細胞数の上昇があった。しかし、時間的経過を通して、アイソタイプ対照抗体１Ｅ６を投与したマウスと比較して３Ｇ９の０．３、１．０及び３ｍｇ／ｋｇの有効量を投与したマウスに認められたＢＡＬ細胞の総数、マクロファージ、好中球又はリンパ球の数若しくは割合の有意差はなかった。次に本発明者等は、ヒドロキシプロリン及び組織形態計測エンドポイントを使用して有効性を実証するために最初に使用した週３回の投与を使用して、はるかに高い用量を試験した。マウスに、ブレオマイシンチャレンジに対して−１、＋１及び＋３日目にｍ３Ｇ９の４、２０及び４０ｍｇ／ｋｇの３用量を投与した。５日目にマウスを安楽死させ、ＢＡＬ細胞数を分析した。４ｍｇ／ｋｇの用量（総投与量１２ｍｇ／ｋｇ）では、再びＢＡＬ細胞の総数、マクロファージ、好中球又はリンパ球の数若しくは割合の有意な変化はなかった。２０及び４０ｍｇ／ｋｇの用量（合計６０及び１２０ｍｇ／ｋｇ）では、ＰＢＳ対照と比較してマクロファージの数の有意な増加があったが、ＩｇＧ１対照と比較した場合にはそうでなかった（図６２）。４０ｍｇ／ｋｇの用量で、好中球の総数の変化は有意性に達しなかったが、ＰＢＳ及びＩｇＧ対照と比較してＢＡＬ中の好中球の割合の有意な増加があった。非常に高い用量（合計１２０ｍｇ／ｋｇ）で起こる好中球の増加は、放射線線維症モデル（実施例１５参照）における高用量長期投与（６及び１０ｍｇ／ｋｇ投与、３〜４ヵ月）で認められたものと同様である。要約すると、抗αｖβ６抗体は０．３ｍｇ／ｋｇと低い用量での週１回の投与でブレオマイシン誘発コラーゲン発現を減弱することができるが、合計１２ｍｇ／ｋｇまでの用量はこのモデルにおけるＢＡＬ細胞集団の有意な変化を有意な変化をもたらさない。より高い用量は、総マクロファージ数及び好中球の割合の増加をもたらすことができる。
【０４２６】
８．  複数回ブレオマイシン投与ハムスターモデルにおける評価
本発明者等は、０、７及び１４日目に３連続ブレオマイシン投与を気管内に行う、ハムスター肺線維症モデルにおけるｍｕ３Ｇ９の有効性を検討した。３群のハムスターに０、７及び１４日目に開始して５ｍｇ／ｋｇのｍｕ３Ｇ９を週３回投与した（週当たり合計１５ｍｇ／ｋｇ）。２８日目に動物を屠殺し、ヒドロキシプロリン（図６５Ａ）及び脂質過酸化分析（図６５Ｂ）により線維症について評価した（Ｕ．  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ−Ｄａｖｓ［米国カリフォルニア州デービス］で実施された）。意外にも、このモデルにおける線維症の減弱の有効性は認められなかった。７及び１４日目に開始してｍｕ３Ｇ９を投与したハムスターの群の１群において、ハムスターはＰＢＳ及びＩｇＧ対照群と比較してヒドロキシプロリンの統計的に有意な増加を示した。脂質過酸化値は、ＩｇＧ対照群と比較して有意に上昇しなかった。本発明者等は、この明らかな増悪がハムスターの生存に影響を及ぼすかどうかを確認するために、種々の投与群の生存曲線を解析した。０日目に開始して投与したｍｕ３Ｇ９２マウス（図６５ＣのＢＬ＋Ａｂ１群）は、ＰＢＳ及びＩｇＧ対照よりわずかに早期に死亡し始めた。しかし、ＢＬ＋Ａｂ１生存曲線をＰＢＳ及びＩｇＧ対照と個別に比較したとき、差は有意でなかった（対数順位検定：ｐ＝０．１５対ＰＢＳ及びｐ＝０．２５対ＩｇＧ対照ｍＡｂ）。ｍｕ３Ｇ９２モノクローナル抗体がハムスターと交差反応するかどうかは不明であり、ハムスターがこのモデルに使用したマウス抗体に対して抗体反応を起こした可能性がある。このモデルにおける転帰の解釈は困難であるため、２つの異なるマウス肺線維症モデル（ブレオマイシン及び放射線誘発）で一貫した有効性が認められたため、有効性に関する異なる用量の評価は遂行しなかった。
【０４２７】
【化７３】
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【０４２８】
【化７４】
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結論
ｍｕ３Ｇ９は、線維症のブレオマイシンモデルにおける重症疾患の強力な抑制物質である。このシリーズの実験により以下のことが示された。
【０４２９】
（ａ）αｖβ６発現は、線維症及び／又は炎症性病状を伴う広いスペクトルのヒト肺疾患における上皮細胞上でアップレギュレートされる。αｖβ６は、マウスブレオマイシン線維症モデルにおいて同様にアップレギュレートされる。
【０４３０】
（ｂ）ｍｕ３Ｇ９は、解析のための複数のエンドポイントを使用した複数の実験においてブレオマイシン誘発性線維症を有意に低減した。有効性は、試験したマウスの全ての系統、即ち、ＳＶ１２９、Ｃ５７Ｂ１６及びＣ５７Ｂ１６ＸＤＢＡ雑種で認められた。コラーゲン発現を抑制するという点の有効性は、週１回０．３ｍｇ／ｋｇと低用量で認められた。
【０４３１】
（ｃ）ｍｕ３Ｇ９の作用機序は、抗炎症特性を有する線維症誘発サイトカインであるＴＧＦ−βの阻害によるものである。予想通り、線維症の抑制は、炎症の減弱を伴わずに生じる。ｍｕ３Ｇ９の高用量での頻繁な投与（２０及び４０ｍｇ／ｋｇを隔日に投与）は、５日目にブレオマイシンチャレンジマウスの気管支肺胞洗浄液中の総ＢＡＬ細胞、マクロファージ及び好中球のＰＢＳ対照と比較してわずかな増加を誘発することができるが、ＩｇＧ対照と比較したときこれはみられない。
【０４３２】
（ｄ）ｍｕ３Ｇ９は、ハムスターのブレオマイシンモデルにおける複数回投与で有効でなかった。１つのｍｕ３Ｇ９投与群における線維症の増悪が被験物質に関連していたかどうかは不明である。
【０４３３】
（ｅ）４６日間にわたる週３回の４ｍｇ／ｋｇの用量のｍｕ３Ｇ９の投与は、ブレオマイシンモデルの生存に影響を及ぼさなかった。
【０４３４】
【化７５】
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【０４３５】
【化７６】
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【０４３６】
【化７７】
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【０４３７】
【化７８】
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【０４３８】
【化７９】
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【０４３９】
【化８０】
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【０４４０】
【化８１】
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【０４４１】
【化８２】
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【０４４２】
【化８３】
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【０４４３】
【化８４】
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【０４４４】
【化８５】
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【０４４５】
【化８６】
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実施例１７  正常及び罹患マウス肺における抗αｖβ６インテグリンモノクローナル抗体の効果の分子的解析
概要
肺線維症の動物モデルは、ヒト特発性肺線維症（ＩＰＦ）の線維症病理の幾つかの側面をモデル化するのに有効である。しかし、どの動物モデルもＩＰＦの精密な病理を正確に模擬しない。更に、ＩＰＦにおける疾患の発症及び進行の機序の理解は不完全であるため、複数の疾患モデルにおいて潜在的な治療薬を試験し、線維症の病状の改善の点だけでなく、ヒト疾患に関連すると考えられている分子的経路への介入の点についてもそれらの有効性を評価することは重要である。ＴＧＦ−β経路は、ＩＰＦにおける重要な経路として暗示された。ヒトＩＰＦ肺の包括的転写プロファイリングにより、この疾患の主要な特徴が、線維芽細胞の活性化及び増殖並びに細胞外マトリックス分子の発現を含む肺線維症を特徴付ける多くの病理学的過程の推進におけるＴＧＦ−βの既知の役割と一致する、活性化ＴＧＦ−β経路の１つであることが示された。その線維症誘発活性に加えて、ＴＧＦ−βは重要な抗炎症サイトカインであり、従って、ＴＧＦ−βの治療的阻害によって、過度の炎症が促進されることなく、線維症が理想的に阻止されるはずである。インテグリンαｖβ６は、潜在ＴＧＦ−β複合体に直接結合し、ＴＧＦ−βの活性状態への変換に必要である。しかし、αｖβ６媒介性ＴＧＦ−β活性化は一部の組織においてのみ重要であるため、αｖβ６機能を完全に欠くマウスは肺にのみ病状を示し、一方、ＴＧＦ−β欠乏マウスは複数の器官系に炎症を示す。従って、ここで概説する治療戦略は、ＴＧＦ−β経路の完全な阻害を避けるようにαｖβ６機能を遮断し、ＴＧＦ−βシグナリングの増加に関連する線維症の病状を阻止する有効性を、ＴＧＦ−βの完全な喪失に伴う炎症を引き起こさない用量で達成することができることを示すことである。こでは、本発明者等は、線維症及び炎症性病状に関連するｍＲＮＡ及びタンパク質レベルでの分子的変化を特徴付ける。本発明者等は、高用量の抗αｖβ６インテグリンモノクローナル抗体ｍｕ３Ｇ９（臨床候補ＢＧ０００１１のマウス親）が、αｖβ６欠乏マウスと一致する肺における炎症性マーカーのｍＲＮＡ及びタンパク質変化をもたらすことを示す。本発明者等は更に、線維症の減弱に有効な低用量のｍｕ３Ｇ９はマウスにおけるこれらの炎症性変化をもたらさないことを示す。
【０４４６】
緒言
ＴＧＦ−βサイトカインは、線維芽細胞が最終的に臓器瘢痕化及び不全につながる過剰な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を産生することを刺激することが知られている線維症誘発性サイトカインである（Ｒｏｂｅｒｔｓ  １９８６）。肺における様々なサイトカインのアデノウイルス及び外来遺伝子過剰発現は、ＴＧＦ−β１は有意な炎症の非存在下で線維症を促進する能力が独特であることを示すものであった。ＴＧＦ−β経路における遺伝子のノックアウトマウスモデル（Ｂｏｎｎｉａｕｄ  ２００４、Ｍｕｎｇｅｒ  １９９９）及び抗ＴＧＦ−β剤を使用した多くの試験により、線維症の減弱の尺度としてのＴＧＦ−βの阻害の有効性が示された（Ｇｅｏｒｇｅ，  Ｊ．  １９９９；  Ｓｈａｒｍａ，  Ｋ．  １９９６；  Ｂｏｎｎｉｄａｕｄ，  Ｐ．  ２００４；  Ｚｈｅｎｇ，  Ｈ．  ２０００；  Ｋａｓｕｇａ，  Ｈ．  ２００１；  Ｚｉｙａｄｅｈ，  Ｆ．Ｎ．  ２０００；  Ｌａｐｉｎｇ，  Ｎ．Ｊ．  ２００３）。２つのサブユニット、即ち、αｖ及びβ６インテグリンからなるαｖβ６インテグリンは、特に肺におけるＴＧＦ−β１活性化の重要なレギュレータである。αｖβ６インテグリンは、損傷、炎症及び線維症時に上皮細胞上でアップレギュレートされ、潜在ＴＧＦ−β１複合体に結合してそれを活性形に変換する（Ｈｕａｎｇ  １９９８；  Ｍｕｎｇｅｒ  １９９９；  Ｂｕｓｋ  １９９２；  Ｙｏｋｏａｓｋｉ  １９９６；  Ａｎｎｅｓ  ２００２）。αｖβ６が潜在ＴＧＦ−β１に結合することを遮断することは、αｖβ６のアップレギュレートされた発現の部位におけるＴＧＦ−βの活性化の局所的抑制とそれによる全ての組織におけるＴＧＦ−β経路の完全な阻害の潜在的臨床的安全性リスクの回避の方法を提供する。
【０４４７】
上記の実施例において、本発明者等は、２つのマウス肺線維症モデル、即ち、ブレオマイシン誘発性線維症（実施例１６）及び放射線誘発性線維症（実施例１５）におけるマウス抗αｖβ６モノクローナル抗体ｍｕ３Ｇ９の有効性を明らかにした。更に、正常マウスにおけるｍｕ３Ｇ９の投与の影響は、毒性報告書に詳細に記載されている。この実施例では、本発明者等は、正常マウス及び肺線維症の疾患モデルにおけるｍｕ３Ｇ９の投与の肺におけるｍＲＮＡ及びタンパク質レベルに対する影響を明らかにする。
【０４４８】
肺組織の転写プロファイリングにより、αｖβ６の遮断はブレオマイシン誘発性肺線維症に関連するＴＧＦ−β標的遺伝子を減少させ、変化させることが示されている。これらのデータは、αｖβ６が肺線維症の調節に関与しており、その治療的調節のための新規の分子的標的となり得ることを示唆している。
【０４４９】
材料及び方法
１．  試薬
αｖβ６ｍＡｂｓを本明細書における他所に記載及び以前に記載した［２９］ように生成した。ヒト／マウスキメラ２Ａ１及び３Ｇ９  ｃＤＮＡｓを、重鎖の定常領域プライマーＣＤＬ−７３９及び軽鎖のＣＤＬ−７３８を含む各親ハイブリドーマ総ＲＮＡｓからＦｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ［米国ニュージャージー州ピスカタウェイ］）を使用して生成した。重鎖及び軽鎖可変領域は、ｃＤＮＡ合成に使用した同じ３’プライマー及び大部分のマウス抗体遺伝子シグナル配列（請求あり次第入手可能な配列）に特異的な縮重プライマーのプール及びＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ［米国カリフォルニア州ラホイヤ］）を使用したポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。クローン化した重鎖及び軽鎖可変領域を、ヒトＩｇＧ１定常領域を含む哺乳動物発現ベクターに結合させた。組換え可溶性マウスＴＧＦ−β受容体ＩＩ−Ｉｇ型融合タンパク質（ｓＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｉｇ）を以前に記載した［１０］ように生成した。研究用ｍｕ３Ｇ９、１Ｅ６及びｓＴＧＦ−ｂＲＩＩ−Ｉｇ（リン酸緩衝生理食塩水中精製タンパク質）を全ての実験に使用した。
【０４５０】
２．  動物
（ａ）ＲＮＡ分析のための正常マウスにおけるｍｕ３Ｇ９の投与：  正常Ｃ５７Ｂ１６マウスに５ｍｇ／ｋｇの可溶性ＴＧＦｂＲＩＩ−Ｉｇ、ＦＢＳ又は次の用量のｍｕ３Ｇ９を４週間にわたり週１回（１、８、１５及び２２日目）投与した：０．３、１、３、１０及び３０ｍｇ／ｋｇ。投与マウスの１コホートを２９日目（最終投与の１週後＝無回復）に採取したが、他のコホートは７８日目（最終投与の８週後＝７週間回復）に採取した。これらの実験は、ＣＤ−１系のマウスを試験し、８週間の回復を使用した、ｍｕ３Ｇ９マウス毒性報告書に記載されている実験と独立して実施した。
【０４５１】
（ｂ）ＢＡＬタンパク質の複数の分析対象物のプロファイリングのための正常マウスにおけるｍｕ３Ｇ９の投与：  正常Ｃ５７Ｂ１６マウスにＦＢＳ又は次の用量のｍｕ３Ｇ９を４週間にわたり週１回（１、８、１５及び２２日目）投与した：０．１、０．３、１、３及び１０ｍｇ／ｋｇ。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）採取のためにマウスを２９日目（最終投与の１週後）に採取した。これらの実験もＣＤ−１系のマウスを試験したｍｕ３Ｇ９マウス毒性報告書に記載されている実験と独立して実施した。
【０４５２】
（ｃ）放射線線維症モデルにおけるｍｕ３Ｇ９の投与：  放射線誘発性線維症の減弱の有効性の評価に使用した投与群及びエンドポイントの詳細は、ＢＩＩＢ報告書＃Ｒｓｃｈ−２００６−００７に含まれている。簡単に述べると、マウスに胸郭照射を行い、照射後１５週目から開始して０．３〜１０ｍｇ／ｋｇのｍｕ３Ｇ９の異なる用量を投与した３つの試験をＮｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＪｏｈｎ  Ｍｕｎｇｅｒの施設で実施した。試験中に死亡したことが認められた場合、組織学的検査／線維症の測定のためにマウスの肺を採取した。生存マウスは、照射後２６、２８及び３２週目に採取した。ＢＡＬ液を１つの肺葉から採取してＢｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣに送ったが、他の肺葉は組織学的検査／線維症の測定のために処理した。Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣでｍｕ３Ｇ９を投与した正常マウスからのＢＡＬ液の分析との比較を可能にするために、ＢＡＬ液タンパク質の分析をこの報告に含める。
【０４５３】
３．  気管支肺胞洗浄採取
過剰量のＩｎａｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ）の腹腔内注射（ＩＰ）によりマウスを安楽死させた。主として鈍的剥離により気管を露出させた。次いで、気管を鋏で２つの軟骨輪の間で開き、２３ゲージ鈍端針を気管に挿入した。Ｓｃｈｗａｒｔｚ一時クリップ（Ｒｏｂｏｚ）で軽く締め付けて針を所定の位置に保持した。０．８ｍＬのＣａ２＋又はＭｇ２＋不含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を肺に注入して、ＢＡＬを実施した。大きい圧力を加えずに液を注射器中に吸引し、氷上の１５ｍＬポリプロピレンＦａｌｃｏｎ管に移した。次いで、処置を繰返し、過度の陰圧をかけずにＢＡＬ液を注射器中に吸引する。試料を氷上で保存し、細胞数の計測、分染のために処理し、ＢＡＬペレット及び液を採取し、−８０℃にて保存する。
【０４５４】
１．  次いで、ＢＡＬを卓上遠心分離機で４℃にて１８０ｇ（１０００ｒｐｍ）（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＰＲ）で１０分間遠心分離する。次いで、上清（ＢＡＬ液）を除去し、−８０℃にて凍結する。１．０ｍＬのＲＢＣ溶解溶液（Ｓｉｇｍａ）をペレットに加え、ボルテックスミキサーで２０秒間混合した。次いで、細胞数の計測及びサイトスピンを行う。
【０４５５】
２．  試料を氷上に保存し、血球計を使用してカウントした。細胞を血球計に加えた後１分間置き、読み取りの前に細胞を沈降させる。
【０４５６】
３．  １００μＬの細胞懸濁液を室温にて５００ｒｐｍｎで５分間サイトスピンする（ＴｈｅｒｍｏＳｈａｎｄｏｎ）。細胞溶液を細胞遠心分離装置に入れ、５００ｒｐｍで５分間サイトスピンすることにより、サイトスピン標本を調製する。細胞濃度がスライド標本上で高すぎないことを確認した。細胞濃度が高すぎる場合、試料を再遠心分離する。スライド標本を一晩乾燥させ、ＤｉｆｆＱｕｉｋ（Ｆｉｓｈｅｒ）で染色する。染色は、製造業者の（ＤｉｆｆＱｕｉｋ）プロトコルに従って行う。スライド標本が乾燥させたならば、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してカバーグラスをのせ、細胞を種類により分類し、１００個の無作為に選択した細胞を実験用細胞計（Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してカウントする。
【０４５７】
４．  ＲＮＡ用の肺の採取
過剰量のＩｎａｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ）の腹腔内注射（ＩＰ）によりマウスを安楽死させた。動物に７０％ＥＴＯＨを噴霧し、滅菌鋏を使用して胸骨から頭部に向かって皮膚を切り取る。皮膚を除去したならば、胸骨及び肋骨を切り取り、心臓及び肺を露出させる。肺を摘出し、滅菌ガーゼ片の上にのせて血液産物を除去し、１４ｍＬポリプロピレン丸底管１７×１００ｍｍ（Ｆｉｓｈｅｒ）に速やかに入れる。液体窒素を肺を含むポリプロピレン管に加え、ドライアイス上に置く。肺を−８０℃にて保存する。
【０４５８】
５．  ＲＮＡ調製
製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｚｏｌ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して急速凍結肺組織から総ＲＮＡを精製した。ＲＮＡの質は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用したキャピラリー電気泳動により確認した。
【０４５９】
６．  プローブ標識、ハイブリッド形成及び転写物プロファイリングのためのスキャニング
試料の標識、ハイブリッド形成及び染色は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）発現分析に関するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ技術マニュアル（７０１０２１  ｒｅｖ  １）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ［米国カリフォルニア州サンタクララ］）における真核標的調製（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）プロトコルに従って行った。要約すると、５μｇの精製総ＲＮＡを、２００Ｕ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（カタログ番号１８０６４−０２２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び０．５μｇの（ｄＴ）−Ｔ７プライマー［５’−ＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＣＧＧ（Ｔ）２４］を使用した４５℃にて１時間の２０μＬ第一鎖反応に使用した。第二鎖合成は、４０Ｕ大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号１８０１０−０２５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２Ｕ大腸菌ＲＮアーゼＨ（カタログ番号１８０２１−０７１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１０Ｕ大腸菌ＤＮＡリガーゼ（カタログ番号１８０５２−０１９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた後、１６℃にて２時間培養して行った。第二鎖合成反応物を製造業者のプロトコルに従ってＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｓａｍｐｌｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｍｏｄｕｌｅ（カタログ番号９００３７１、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ［米国カリフォルニア州サンタクララ］）を使用して精製した。ＢｉｏＡｒｒａｙ高収率ＲＮＡ転写標識キット（カタログ番号４２６５５−４０、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．［米国カリフォルニア州バーリンゲーム］）を使用して、製造業者のプロトコルに従って精製ｃＤＮＡを増幅して、７０〜１２０μｇのビオチン標識ｃＲＮＡ（相補的ＲＮＡ）を生成させた。マウスＭｇＵ７４Ａｖ２、ＭｇＵ７４Ｂｖ２及びＭｇＵ７４Ｃｖ２  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プローブアレイを、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ハイブリッド形成オーブン６４０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ［米国カリフォルニア州サンタクララ］）中で製造業者のプロトコルに従って前ハイブリッド形成させた。フラグメント化標識ｃＲＮＡを、１００ｍＭ  ２−モルホリノエタンスルホン酸、１Ｍ  ［Ｎａ＋］、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．５ｍｇ／ｍＬアセチル化ＢＳＡ、０．１ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡ、対照オリゴＢ２並びに対照転写物ｂｉｏＢ  １．５ｐＭ、ｂｉｏＣ  ５ｐＭ、ＢｉｏＤ  ２５ｐＭ及びｃｒｅ  １００ｐＭを含む３００μＬの１Ｘハイブリッド形成緩衝液に再懸濁し、製造業者のプロトコルに従ってＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プローブアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ［米国カリフォルニア州サンタクララ］）とハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プローブアレイを洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリトリニン（カタログ番号Ｓ８６６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ［米国オレゴン州ユージーン］）を使用して染色し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ［米国カリフォルニア州サンタクララ］）を使用してビオチニル化抗ストレプトアビジン（ＢＡ−０５００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ［米国カリフォルニア州バーリ��ゲーム］）で増幅した。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プローブアレイをＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナー（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ［米国オレゴン州コーバリス］）を使用してスキャンした。
【０４６０】
７．  転写物プロファイリングデータ解析
アレイスキャンをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ．ＣＥＬファイルに変換し、得られたデータセット（完全な実験を表す．ＣＥＬファイルの群）をＲｏｂｕｓｔ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ａｖｅｒａｇｅ（ＲＭＡ）法を使用して標準化した。統計及びクラスタリング解析は、ＢＲＢ  Ａｒｒａｙ  Ｔｏｏｌｓ  ｖ．  ３．４．０  -  Ｂｅｔａ  ２  （ＮＣＩ）、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  （Ａｇｉｌｅｎｔ）及びＳｐｏｔｆｉｒｅ  （Ｓｐｏｔｆｉｒｅ）データマイニングツールを使用して行った。マイクロアレイの有意性解析（ＳＡＭ）を使用して、偽発見率（ＦＤＲ）閾値を０．９５信頼限界（ＣＬ）で０．０１を超えないように設定してＰＢＳ投与群と比較して実験的投与の何れかによってシグナル強度が変化したプローブセットを特定した。シグナル強度の少なくとも２倍の変化を示した有意に影響を受けた（ＦＤＲ＜０．０１、ＣＬ  ０．９５）プローブセットを選択することにより、必要な場合に更なるフィルタリングを行った。得られた遺伝子の群のプロファイル及び実験条件の分類を解析し、階層的クラスタリングにより視覚化した。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路解析データベース（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して仮想経路（Ｖｉｒｔｕａｌ  ｐａｔｈｗａｙ）解析を行った。
【０４６１】
８．  ＢＡＬ液タンパク質レベルの多重分析
上述の通り採取したＢＡＬ液から２００μＬの分割試料を採取した。これらの分割試料をＲｕｌｅｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｉｎｃ．（米国テキサス州オースチン）に送り、当社でＬｕｍｉｎｅｘに基づく技術を使用してマウスタンパク質の標準パネルについて分析した。
【０４６２】
９．  統計解析
転写物プロファイリング分析の統計解析は、上述の通りである。ＢＡＬ液中のタンパク質レベルの分析の統計的比較は、ビヒクル対照及び／又はアイソタイプ対照と被験物質の種々の用量との間で一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して行った。ＡＮＯＶＡを使用してｐ＜０．０５の確率で統計的有意差が立証された場合、Ｄｕｎｎｅｔの多重比較検定により群間の有意差を評価した。
【０４６３】
結果
１．  正常マウスへのｍｕ３Ｇ９の投与の影響：肺転写物分析
ＣＤ−１マウスにおける毒性試験の結果により、肺がｍｕ３Ｇ９の毒性の標的臓器として特定された。それらの試験で詳細に述べられたように、（αｖβ６インテグリンが欠乏している）インテグリンβ６ヌルマウスにおける所見と一致する肺の炎症がｍｕ３Ｇ９を投与したマウスで認められる。組織病理検査により評価したこの炎症は、１ｍｇ／ｋｇの用量でまれに認められるが、週１回の１０ｍｇ／ｋｇの用量で一貫して認められる。Ｃ５７Ｂ１６系（実施例１５及び１６において上述した有効性試験に使用した系統）におけるこのような炎症を評価するために、マウスに週１回０．３〜３０ｍｇ／ｋｇの用量でｍｕ３Ｇ９を投与し、ＲＮＡ及びマイクロアレイ分析のために肺を処理した。
【０４６４】
０．０１のＦＤＲ閾値及び０．９５のＣＬを使用したマイクロアレイの有意性解析（ＳＡＭ）を使用して、ＰＢＳ投与対照群と３Ｇ９投与群及びｓＴＧＦｂＲＩＩ−Ｉｇ群を含む実験的投与群のそれぞれとの一連の対比較で発現量の異なる遺伝子を検索した。このような対ＳＡＭ解析は、投与群と回復群についてそれらの各ＰＢＳ対照を使用して別個に行った。シグナル強度がＰＢＳ対照と投与群の何れかの間で２倍以上異なる有意に影響を受けたプローブセットを特定するために、得られた遺伝子リストを更なるフィルタリング段階にかけた。結果を表１７−１〜１７−６に要約する。上の選択基準を満たす遺伝子発現の有意な変化は、投与群の１０ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇサブグループに認められた（表１７−１及び１７−２）。選択したプローブセットの遺伝子発現のプロファイルは、１０ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇ  ３Ｇ９投与群における対応する遺伝子の発現レベルの強い両方向変化を示した（図６６）。
【０４６５】
遺伝子発現の統計的に有意な変化は、他の何れの投与サブグループにおいても、又回復群においても認められなかった（表１７−１及び１７−２）。しかし、ＭＭＰ１２、及びそれらの発現プロファイルとＭＭＰ１２のそれとの０．９５を超えるピアソン相関のために選択された２５の他の遺伝子は、３ｍｇ／ｋｇ  ３Ｇ９投与群において検出できる上向きの傾向を示した（図６７、表１７−７）。
【０４６６】
３Ｇ９による有意な影響を受けた遺伝子の機能アノテーションをＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）データベースを使用して行ったところ、これらの遺伝子と免疫応答及び免疫調節サイトカインシグナリングとの強い関連が示された（図６８）。同様に、仮想調節経路解析により、３Ｇ９により誘発された遺伝子発現の変化とサイトカイン、ＴＧＦ−β及びインターフェロンシグナリングの変化との関連が示唆された。これらの関連は、２つの最高のスコアのネットワークの構成の結果である（図６９Ａ、６９Ｂ）。
【０４６７】
２．  ＭＭＰ−１２転写物の定量的ＰＣＲ分析
ＭＭＰ−１２は、ｍｕ３Ｇ９投与マウスの肺における転写物の最大倍率のアップレギュレーションを示す（表１７−３）。ＭＭＰ−１２は、β６ヌルマウスの肺における最も高度にアップレギュレートされた転写物として以前に報告された。ＭＭＰ−１２発現とｍｕ３Ｇ９の投与との関係を更に解明するために、本発明者等はβ６ヌルマウスの肺から調製したＲＮＡを含むＭＭＰ−１２転写物の相対的レベルを定量的ＰＣＲにより分析した。ｍｕ３Ｇ９の投与は、１０及び３０ｍｇ／ｋｇで有意であった、ＭＭＰ−１２転写物の用量依存的増加をもたらした。ＭＭＰ−１２の発現の変化倍率は、それらの用量でβ６ヌルマウスで認められたものと同等であった。マイクロアレイ分析の上述した結果と同様に、ｑＰＣＲによるＭＭＰ−１２レベルは、３ｍｇ／ｋｇでは上昇傾向であったが、０．３及び１ｍｇ／ｋｇの用量では変化がなかった。
【０４６８】
３．  ｍｕ３Ｇ９を投与した正常マウスの肺のＢＡＬのタンパク質分析
ｍｕ３Ｇ９の投与に起因する肺における分子的変化を更に特定するために、本発明者等は０．１〜１０ｍｇ／ｋｇのｍｕ３Ｇ９の用量を４週間投与したマウスの他のコホートのＢＡＬ液中の６０種のタンパク質のレベルを分析した（表１７−８）。タンパク質の分析は、Ｒｕｌｅｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｉｎｃ．（米国テキサス州オースチン）においてｌｕｍｉｎｅｘ（多重タンパク質分析）アッセイにより行った。転写レベルの所見と一致して、肺炎症に関連した複数のタンパク質が１０ｍｇ／ｋｇの用量を投与したマウスのＢＡＬ液中で増加した（表１７−９）。更に、これらの変化の幾つかは３ｍｇ／ｋｇの用量においてもＡＮＯＶＡにより有意であった。しかし、パネルにおける何れのタンパク質も１  ｍｇ／ｋｇの用量まで増加しなかった。
【０４６９】
４．  放射線誘発性線維症モデルのＢＡＬ液タンパク質の分析
放射線誘発性肺線維症の減弱におけるｍｕ３Ｇ９の有効性は、上の実施例１５において述べた。それらの試験において採取したＢＡＬ液（ＢＡＬＦ）試料は、ｍｕ３Ｇ９を投与した正常マウスのＢＡＬＦに使用したのと同じマウスパネルを使用した多分析対象タンパク質プロファイリングにより分析した。２８週目（１３週間投与）及び３２週目（１７週間投与）時点のＢＡＬＦ分析をここで解析する。ＡＮＯＶＡにより判断したとき有意に変化したタンパク質を表１７−１１に要約する。正常マウスにおける転写物プロファイリング及びタンパク質結果と同様に、放射線線維症モデルにおいて変化しているタンパク質の大多数は、（３ｍｇ／ｋｇで一部は有意であり、全てが傾向を示すが）１０ｍｇ／ｋｇの用量でのみ有意性に達する。これらのタンパク質の大多数は、肺線維症に関連することが知られているサイトカイン又はケモカインである。１０ｍｇ／ｋｇ  ｍｕ３Ｇ９を投与した正常マウスにおいて２倍以上アップレギュレートされた２０種のタンパク質の内の１４種（表１７−１０）は、放射線モデルにおいても一貫してアップレギュレートされている。ｍｕ３Ｇ９の投与期間及び損傷／炎症状態が異なるにもかかわらず、正常マウスと照射マウスにおける所見の間の一致は顕著である。タンパク質の多くは放射線モデルにおけるより長い投与期間と一致したわずかに高い倍率のアップレギュレーションを示している（表１７−１２）が、全般的所見はこれらの２つの非常に異なる状況で一致している。更に、正常マウスと照射マウスとでベースラインレベルが異なる（放射線損傷はこれらのタンパク質の大部分をアップレギュレートする）にもかかわらず、これらの炎症マーカーがアップレギュレートされる用量範囲は正常マウスと照射マウスとで同じである。具体的には、それらは正常及び罹患マウスで３及び１０ｍｇ／ｋｇの用量でアップレギュレートされるが、１ｍｇ／ｋｇの用量ではされない（図７０で２８週目に４つの最も高度にアップレギュレートされたタンパク質により例証される）。従って、放射線モデルにおける薬物標的の発現がはるかにより高い（上の実施例１５を参照）にもかかわらず、ｍｕ３Ｇ９の投与に特異的なＢＡＬタンパク質の変化をもたらす用量は両状況で同じである。ｍｕ３Ｇ９によって誘導されるタンパク質の全てが炎症誘発及び／又は線維症誘発作用を有すると考えられているとは限らないことに注意することは重要である。例えば、ＣＸＣＬケモカインＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０はマウスモデルにおいて強力な抗線維症効力を示し、ＩＰ−１０又はその受容体が欠乏したマウスはブレオマイシンに対して過度の線維症反応を示す。しかし、１ｍｇ／ｋｇ用量のほぼ最大有効量でこのサイトカイン又は他のサイトカインの一貫した変化は認められず、従って、肺のサイトカイン環境のこれらの変化の何れかがｍｕ３Ｇ９の投与の有効性に必要であるということはあり得ない。
【０４７０】
正常マウスにおいてアップレギュレートされたが、放射線モデルにおいてはされなかったタンパク質は、ＡｐｏＡ１、フィブリノーゲン及びＴＩＭＰ−１等である。これらのタンパク質及び第４のタンパク質ヘパトグロブリンのレベルは、正常マウスと比べて照射マウスのＢＡＬ液中で増加しているが、ｍｕ３Ｇ９の投与により低下する（図７１）。従って、有効量でこれらのタンパク質のレベルが正常化することから、それらが２８週時点の有効性の代用マーカーとしての機能を果たす可能性があることが示唆される（図７２）。低用量で有意に変化したパネル上の唯一のタンパク質は、投与によって低下したもの、即ちＴＩＭＰ−１及びヘパトグロブリンであった。ＴＩＭＰ−１は、既知のＴＧＦ−β標的であり、線維症性疾患においてしばしば上昇する。そのダウンモジュレーションは、ｍｕ３Ｇ９の作用機序、即ち、αｖβＧ９媒介性ＴＧＦ−β活性化と一致している。
【０４７１】
【化８７】
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【０４７２】
【化８８】
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【０４７３】
【化８９】
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【０４７４】
【化９０】
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【０４７５】
【化９１】
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【０４７６】
【化９２】
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【０４７７】
【化９３】
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【０４７８】
【化９４】
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【０４７９】
【化９５】
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【０４８０】
【化９６】
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【０４８１】
【化９７】
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【０４８２】
【化９８】
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【０４８３】
【化９９】
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【０４８４】
【化１００】
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【０４８５】
【化１０１】
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【０４８６】
【化１０２】
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【０４８７】
【化１０３】
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【０４８８】
【化１０４】
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【０４８９】
【化１０５】
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【０４９０】
【化１０６】
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【０４９１】
【化１０７】
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【０４９２】
【化１０８】
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【０４９３】
【化１０９】
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【０４９４】
【化１１０】
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【０４９５】
【化１１１】
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【０４９６】
【化１１２】
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【０４９７】
【化１１３】
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【０４９８】
【化１１４】
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【０４９９】
【化１１５】
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【０５００】
【化１１６】
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【０５０１】
【化１１７】
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【０５０２】
【化１１８】
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結論
正常マウスに対するｍｕ３Ｇ９投与の効果は、転写産物の発現量解析及びタンパク質の多項目同時解析の結果において特徴が見られる。
【０５０３】
（ａ）ｍｕ３Ｇ９高用量処置群における肺転写産物の発現量解析において、肺炎症に関連する多数の転写産物で有意な変動が見られる。この変動は、インテグリンβ６（αｖβ６）欠損マウスにおける転写産物の解析結果と一致する。また、ｍｕ３Ｇ９の作用機序により、標的遺伝子群において特異的に調節不全が起こり、肺におけるＴＧＦ−βシグナルの伝達が減少する。
【０５０４】
（ｂ）同様にタンパク質の発現解析結果においても、ｍｕ３Ｇ９の作用機序に関連するサイトカイン及びケモカインの一部に発現上昇が見られる。
【０５０５】
（ｃ）転写産物の発現差について有意な変動が見られるのは１０ｍｇ／ｋｇ群のみであるが、３ｍｇ／ｋｇ群においても、多数の転写産物で発現量の上昇傾向が見られる。タンパク質については、３ｍｇ／ｋｇ群の一部を除き、１０ｍｇ／ｋｇ群において有意な変動が見られる。タンパク質及び転写産物とも、１ｍｇ／ｋｇ群においては有意な変動はみられない。
【０５０６】
放射線誘発線維症モデルに対するｍｕ３Ｇ９投与の効果は、タンパク質の多項目同時解析において特徴が見られる。
【０５０７】
（ａ）正常マウスのｍｕ３Ｇ９高用量群で発現上昇が見られるサイトカイン及びケモカインの多くで、放射線誘発線維症モデルのｍｕ３Ｇ９高用量群においても同様に発現上昇が見られる。
【０５０８】
（ｂ）ｍｕ３Ｇ９の標的分子であるインテグリンαｖβ６の発現差がかなりあるにもかかわらず、放射線誘発線維症モデル及び正常マウスの各用量群において、肺炎症マーカーに同様の変化が見られる。即ち、３ｍｇ／ｋｇ群及び１０ｍｇ／ｋｇ群では上昇が見られるが、放射線誘発線維症モデルの最大有効量に近い１ｍｇ／ｋｇ群では上昇がみられない（実施例１５を参照）。
【０５０９】
線維症に関連するタンパク質の一部、特にＴＩＭＰ−１及びハプトグロビンにおいて、ｍｕ３Ｇ９有効用量での投与による正常化が、２８週の時点で見られる。
【０５１０】
【化１１９】
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【０５１１】
【化１２０】
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【０５１２】
【化１２１】
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【０５１３】
【化１２２】
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【０５１４】
【化１２３】
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【０５１５】
【化１２４】
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本発明は、理解の明瞭さのために説明及び実施例により十分に説明されてきたが、特定の変更及び改変が実施されることは当業者に明らかである。従って、この説明及び実施例は、添付の特許請求の範囲により表される本発明の適用範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０５１６】
本明細書で記載された文献、特許及び特許出願は、本発明の関連分野の当業者にとって例示的な技術であり、参考として刊行物、特許及び特許出願を個別に明記した場合と同程度の参考として本明細書で援用されている。
【図面の簡単な説明】
【０５１７】
【図１】図１は、αｖβ６に対する精製されたキメラ化された３Ｇ９変異型の結合ＥＬＩＳＡ試験である。可溶性αｖβ６でコーティングしたプレートをマウス３Ｇ９抗体に由来する精製ハイブリドーマ（ｍ３Ｇ９）、精製されたキメラ３Ｇ９抗体（ｃｈ３Ｇ９）又は軽鎖の第１ＣＤＲ中のＮ−連結グリコシル化部位内にＮからＳへの置換を含有する精製キメラ３Ｇ９抗体（ｃｈ３Ｇ９Ｓ）の何れかと共に培養した。洗浄緩衝液で洗浄した後、プレートをパーオキシドコンジュゲート抗マウスＩｇＧ（ハイブリドーマ誘導物質に対して）又は抗ヒトＩｇＧ（キメラ抗体に対して）と共に培養し、その後洗浄緩衝液で洗浄した。プレートをＴＭＢ溶液で発色させ、反応を硫酸で停止させ、プレートリーダーを使用してＡ４５０で試験した。キメラ３Ｇ９抗体の２形態の間には検出可能な有意差はなかった。
【図２】図２は、Ｅａｓｙ  Ｔｉｔｅｒ  Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用したトランスフェクトされた２９３Ｅ細胞由来の３Ｇ９ヒト化変異型の発現を示す結果である。一過性にトランスフェクトした２９３Ｅ細胞由来の上澄みを、Ｅａｓｙ  Ｔｉｔｅｒ法により製造元のプロトコル（Ｐｉｅｒｃｅ）に従って抗体力価について試験した。ヒト化３Ｇ９抗体の種々の変異型の発現を分析した。軽鎖型１を含有する３Ｇ９の変異型は発現が乏しいのに対し、軽鎖型２を含有する変異型はより高いレベルで発現されている。高度なヒト化ほど発現が高くなる傾向がある。
【図３】図３は、フローサイトメトリー試験により測定したαｖβ６インテグリン発現ＳＷ４８０細胞へのｈｕ−３Ｇ９抗体変異型のＦＡＣＳ分析の結果を示す。ＳＷ４８０細胞をトリプシン処理により回収し、洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。次に２ｘ１０５細胞を指定したトランスフェクション体上澄みを含有するＦＡＣＳ緩衝液中１時間氷上で培養し、その力価をＥａｓｙ  Ｔｉｔｅｒ法により製造元のプロトコル（Ｐｉｅｒｃｅ）に従って測定した。インキュベーションの後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、フィコエリスリンコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を含有するＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、３０分間氷上で培養した。次に細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液２００μＬ中に再懸濁した。標識された二次抗体の結合はフローサイトメトリーでモニタリングした。試験した全てのヒト化型は少なくともキメラ３Ｇ９と同程度にＳＷ４８０細胞に結合した。軽鎖型２を含有する変異型はキメラ３Ｇ９の活性を有意に超過した。抗リンホトキシンベータ受容体抗体ＨｕＢＨＡ１０を陰性対照として使用した。
【図４】図４は、ＦＤＣＰ１−β６細胞へのｈｕ−３Ｇ９抗体型２〜５の結合のＦＡＣＳ分析を示す。ＦＡＣＳ分析は、ＳＷ４８０細胞の代わりにＦＤＣＰ１−β６細胞を使用した以外、図３に記載した通り実施した。完全ヒト化変異５型（Ｈ３／Ｌ５）は、全ての他のヒト化型よりも有意に良好にＦＤＣＰ１−β６に結合した。
【図５】図５は、ＦＤＣＰ１−β６細胞への精製したｈｕ−３Ｇ９抗体型２〜５の結合のＦＡＣＳ分析を示す。ＦＡＣＳ分析は、精製した３Ｇ９ヒト化変異型を使用しながら図４に記載した通り実施した。完全ヒト化変異５型（Ｈ３／Ｌ５）は、全ての他のヒト化型よりも有意に良好にＦＤＣＰ１−β６に結合した。
【図６】図６は、αｖβ６への精製ｈｕ−３Ｇ９抗体型２〜５の結合の結合ＥＬＩＳＡ試験である。結合ＥＬＩＳＡは、図１に記載した通り実施した。ヒト化３Ｇ９５型（Ｈ３／Ｌ５）は、抗体の他の誘導体よりもわずかに良好にαｖβ６に結合したように観察された。
【図７】図７は、αｖβ６への精製ｈｕ−３Ｇ９抗体型２〜５の結合の阻害ＥＬＩＳＡ試験である。プレートをＬＡＰ０．３μｇ／ｍＬ又はＬＡＰ−Ｆｃ融合タンパク質２．５μｇ／ｍＬの何れかでコーティングし、一晩４℃で培養した。コーティング溶液を除去し、プレートを阻害し、洗浄し、カルシウム及びマグネシウムの存在下、図面の凡例に示す通り、ビオチニル化αｖβ６及び３Ｇ９誘導体の混合物と共に培養した。プレートを再度洗浄し、エキストラビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）と共に培養した。結合したタンパク質はＴＭＢ基質を使用して検出し、その後Ａ４５０でプレートリーダー中で検出した。ヒト化３Ｇ９５型（Ｈ３／Ｌ５）は抗体の他の誘導体よりもわずかに良好にＬＡＰへのαｖβ６の結合を阻害したように観察された。
【図８】図８は、精製ｈｕ−３Ｇ９抗体型２〜５の細胞接着試験の結果を示す。マイクロプレートを一晩４℃にて５０μＬ／ウェルの０．５μｇ／ｍＬＬＡＰでコーティングした。次にプレートを洗浄し、阻害した。ＦＤＣＰ１−β６細胞（５×１０６細胞／ｍＬ）を培養フラスコから脱着させ、蛍光染料（Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ［米国オレゴン州ユージーン］）で標識し、試験緩衝液に再懸濁した。プレートをカルシウム及びマグネシウムの存在下、上述の精製抗体及び標識ＦＤＣＰ１−β６細胞と共に培養した。プレートを洗浄し、プレート上に捕獲された細胞による蛍光を記録した。パーセント結合は全細胞の蛍光を結合細胞のものと比較することにより測定した。ヒト化３Ｇ９５型（３Ｈ／５Ｌ）は抗体の他の誘導体よりもわずかに良好にＬＡＰへのαｖβ６発現細胞の結合を阻害したように観察された。
【図９】図９は、ｐＫＪＳ１９５のプラスミドマップ及び３Ｇ９５型軽鎖配列の模式図である。このプラスミドは３Ｇ９５型軽鎖（ＬＶ５）及びネオマイシン耐性遺伝子を含有する。軽鎖発現カセットはヒトＣＭＶ最初期プロモーター及び第１のイントロン（小欠失含有）並びにヒト成長ホルモンポリアデニル化配列を含有する。
【図１０】図１０は、ｐＫＪＳ１８９のプラスミドマップ及び３Ｇ９重鎖３型の配列の模式図である。このプラスミドは、３Ｇ９重鎖３型（ＨＶ３）及びデヒドロフォレート還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子を含有する。重鎖発現カセットはヒトＣＭＶ最初期プロモーター及び第１のイントロン（小欠失含有）並びにヒト成長ホルモンポリアデニル化配列を含有する。ｄｈｆｒ発現カセットはＳＶ４０初期プロモーター及びＳＶ４０ポリアデニル化配列を含有する。
【図１１】図１１は、ｐＫＪＳ１９６のプラスミドマップ及びアグリコシル３Ｇ９重鎖３型の配列の模式図である。このプラスミドは、アグリコシル３Ｇ９重鎖３型（ａ−ＨＶ３）及びｄｈｆｒ遺伝子を含有する。このコンストラクトは重鎖定常領域におけるＮ連結グリコシル化部位を消失させるＮ３１９Ｑ置換以外はｐＫＪＳ１８９と同一である。
【図１２】図１２は、Ｅａｓｙ  Ｔｉｔｅｒ試験（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してＣＨＯ細胞に一過性にトランスフェクトしたｈｕ−３Ｇ９ＣＨＯ発現ベクターの組立及び発現の結果を示す。Ｅａｓｙ  Ｔｉｔｅｒ試験は製造元のプロトコルに従って図２に記載する通り実施した。野生型（Ｈ３／Ｌ５）及びアグリコシル（ａ−Ｈ３／Ｌ５）ヒト化３Ｇ９５型ベクターをＣＨＯ細胞に一過性にトランスフェクトし、効率的な組立及びこれらの細胞からのヒト化３Ｇ９の分泌を明らかにした。両方の形態のｈｕ３Ｇ９抗体は等しく組み立てられ、ＣＨＯ細胞内で発現された。
【図１３】図１３は、記載した原発腫瘍部位からリンパ節（図１３Ａ〜１３Ｄ）又は肺（図１３Ｅ〜１３Ｆ）の何れかに転移した特定のヒト癌腫におけるαｖβ６発現（陰影部）のレベルを示す顕微鏡写真の合成図である。
【図１４】図１４は、記載した原発腫瘍部位から記載した転移腫瘍部位に転移した特定のヒト癌腫におけるαｖβ６発現（陰影部）のレベルを示す顕微鏡写真の合成図である。
【図１５】図１５は、原発子宮内膜癌の腫瘍（図１５Ａ、１５Ｃ）において、及び該当リンパ節の転移（図１５Ｂ、１５Ｄ）において観察されたαｖβ６発現（陰影部）のレベルを示す顕微鏡写真の合成図である。
【図１６】図１６は、ヒト乳房腫瘍試料中で観察されたαｖβ６発現（陰影部）のレベルを示す顕微鏡写真の合成図である。図１６Ａ：上皮内腺管癌（ＤＣＩＳ）を有する患者由来の原発腫瘍試料における発現。図１６Ｂ：浸潤性乳房癌腫を有する患者由来の原発腫瘍試料における発現。
【図１７】図１７は、３人の異なる患者由来の原発及び転移の膵臓腺管腺癌腫瘍の該当試料において観察されたαｖβ６発現（陰影部）のレベルを示す顕微鏡写真の合成図である。図１７Ａ〜１７Ｃ：３人の異なる患者由来の原発腫瘍試料における発現。図１７Ｄ〜１７Ｆ：これらの同じ３患者由来の該当リンパ節転移における発現。図１７Ｇ〜１７Ｈ：３患者のうち２人より得られた正常膵臓組織における発現。
【図１８】図１８は、５人の異なる患者由来の原発及び転移の膵臓腺癌腫瘍の該当試料において観察されたαｖβ６発現（陰影部）のレベルを示す顕微鏡写真の合成図である。図１８Ａ〜１８Ｅ：５人の異なる患者由来の原発腫瘍試料における発現、３人は腺扁平上皮癌として特徴付けられる腫瘍を有し（図１８Ａ〜１８Ｃ）、２人は低分化を特徴とする腫瘍を有する（図１８Ｄ〜１８Ｅ）。図１８Ｆ〜１８Ｊ：これらの同じ５患者由来の該当リンパ節転移における発現。図１８Ｋ〜１８Ｌ：５患者のうち２人より得られた正常膵臓組織における発現。
【図１９】図１９は、ヒト膵臓癌のＢｘＰＣ−３マウス異種移植片モデルにおける腫瘍成育を抑制する抗αｖβ６モノクローナル抗体（３Ｇ９）の能力を示す。図１９Ａ：ンαｖβ６モノクローナル抗体（３Ｇ９）による免疫組織化学試験により染色された異種移植片腫瘍の切片の顕微鏡写真。図１９Ｂ：αｖβ６ｍＡｂ３Ｇ９投与中のＢｘＰＣ−３異種移植片腫瘍生育曲線（▲）、可溶性ＴＧＦｂＲＩＩ−Ｆｃ−Ｉｇ融合タンパク質（▼）、又はビヒクルＰＢＳ（■）。図１９Ｃ：試験終了時（第６６日）における個体別腫瘍サイズの散布図。
【図２０】図２０は、β６を発現しているＶＢ６細胞（β６でトランスフェクト）により、そして擬似トランスフェクト細胞による経マトリックス遊走、浸潤及びマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）生成に対する抗αｖβ６モノクローナル抗体（３Ｇ９）及び可溶性ＴＧＦ−β受容体抗体フラグメントコンジュゲート（ｓＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃ）の作用を示す一連の棒グラフである。図２０Ａ及び２０Ｂ：細胞外マトリックスを通過する細胞の遊走（図２０Ａ）又は浸潤（図２０Ｂ）。“Ｕｎｔ”：未投与細胞；“３Ｇ９”：１０μｇ／ｍＬ３Ｇ９抗−αｖβ６モノクローナル抗体投与細胞；“ｓＴＧＦｂＲ−Ｆｃ”：１０μｇ／ｍＬ可溶性ＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃコンジュゲート投与細胞。白棒：β６インテグリン（ＶＢ６細胞）でトランスフェクト去れこれを発現している細胞；黒棒：β６インテグリンを発現していない擬似トランスフェクト細胞（Ｃｌ細胞）。図２ＯＣ：未投与（白棒）、１０μｇ／ｍＬ３Ｇ９投与（斜線）又は１０μｇ／ｍＬｓＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃコンジュゲート投与（黒棒）のＣｌ又はＶＢ６細胞によるＭＭＰ９の生成（ｎｇ／ｍＬ）。
【図２１】図２１は、ＬＩＭ１８６３異種移植片モデルにおける支質内に浸潤している腫瘍細胞上のαｖβ６発現（陰影部）を示す免疫組織化学的切片の顕微鏡写真である。連続切片に対する抗ヒトケラチン染色（図示なし）により、これらの細胞がヒト上皮（即ちＬＩＭ１８６３）腫瘍に由来することが確認された。
【図２２Ａ】図２２Ａ〜２２Ｆは、ＬＩＭ１８６３異種移植片モデルにおける腫瘍生育及び支質浸潤に対するαｖβ６ｍＡｂ３Ｇ９及び組換え可溶性ＴＧＦｂＲＩＩ−Ｆｃ−Ｉｇ融合タンパク質の作用を示す。図２２Ａ：αｖβ６ｍＡｂ３Ｇ９（▲）、可溶性ＴＧＦｂＲＩＩ−Ｆｃ−Ｉｇ融合タンパク質（▼）又はビヒクルＰＢＳ（■）投与中のＬＩＭ１８６３異種移植片腫瘍成育曲線。図２２Ｂ：試験終了時（第５２日）における個体別腫瘍サイズの散布図。図２２Ｃ：全腫瘍切片に渡るαｖβ６陽性域の定量。図２２Ｄ〜２２Ｆ：各記載処置群から採取された腫瘍における代表的αｖβ６染色を示す顕微鏡写真。
【図２２Ｂ】図２２Ａ〜２２Ｆは、ＬＩＭ１８６３異種移植片モデルにおける腫瘍生育及び支質浸潤に対するαｖβ６ｍＡｂ３Ｇ９及び組換え可溶性ＴＧＦｂＲＩＩ−Ｆｃ−Ｉｇ融合タンパク質の作用を示す。図２２Ａ：αｖβ６ｍＡｂ３Ｇ９（▲）、可溶性ＴＧＦｂＲＩＩ−Ｆｃ−Ｉｇ融合タンパク質（▼）又はビヒクルＰＢＳ（■）投与中のＬＩＭ１８６３異種移植片腫瘍成育曲線。図２２Ｂ：試験終了時（第５２日）における個体別腫瘍サイズの散布図。図２２Ｃ：全腫瘍切片に渡るαｖβ６陽性域の定量。図２２Ｄ〜２２Ｆ：各記載処置群から採取された腫瘍における代表的αｖβ６染色を示す顕微鏡写真。
【図２２Ｃ】図２２Ａ〜２２Ｆは、ＬＩＭ１８６３異種移植片モデルにおける腫瘍生育及び支質浸潤に対するαｖβ６ｍＡｂ３Ｇ９及び組換え可溶性ＴＧＦｂＲＩＩ−Ｆｃ−Ｉｇ融合タンパク質の作用を示す。図２２Ａ：αｖβ６ｍＡｂ３Ｇ９（▲）、可溶性ＴＧＦｂＲＩＩ−Ｆｃ−Ｉｇ融合タンパク質（▼）又はビヒクルＰＢＳ（■）投与中のＬＩＭ１８６３異種移植片腫瘍成育曲線。図２２Ｂ：試験終了時（第５２日）における個体別腫瘍サイズの散布図。図２２Ｃ：全腫瘍切片に渡るαｖβ６陽性域の定量。図２２Ｄ〜２２Ｆ：各記載処置群から採取された腫瘍における代表的αｖβ６染色を示す顕微鏡写真。
【図２２Ｄ】図２２Ａ〜２２Ｆは、ＬＩＭ１８６３異種移植片モデルにおける腫瘍生育及び支質浸潤に対するαｖβ６ｍＡｂ３Ｇ９及び組換え可溶性ＴＧＦｂＲＩＩ−Ｆｃ−Ｉｇ融合タンパク質の作用を示す。図２２Ａ：αｖβ６ｍＡｂ３Ｇ９（▲）、可溶性ＴＧＦｂＲＩＩ−Ｆｃ−Ｉｇ融合タンパク質（▼）又はビヒクルＰＢＳ（■）投与中のＬＩＭ１８６３異種移植片腫瘍成育曲線。図２２Ｂ：試験終了時（第５２日）における個体別腫瘍サイズの散布図。図２２Ｃ：全腫瘍切片に渡るαｖβ６陽性域の定量。図２２Ｄ〜２２Ｆ：各記載処置群から採取された腫瘍における代表的αｖβ６染色を示す顕微鏡写真。
【図２２Ｅ】図２２Ａ〜２２Ｆは、ＬＩＭ１８６３異種移植片モデルにおける腫瘍生育及び支質浸潤に対するαｖβ６ｍＡｂ３Ｇ９及び組換え可溶性ＴＧＦｂＲＩＩ−Ｆｃ−Ｉｇ融合タンパク質の作用を示す。図２２Ａ：αｖβ６ｍＡｂ３Ｇ９（▲）、可溶性ＴＧＦｂＲＩＩ−Ｆｃ−Ｉｇ融合タンパク質（▼）又はビヒクルＰＢＳ（■）投与中のＬＩＭ１８６３異種移植片腫瘍成育曲線。図２２Ｂ：試験終了時（第５２日）における個体別腫瘍サイズの散布図。図２２Ｃ：全腫瘍切片に渡るαｖβ６陽性域の定量。図２２Ｄ〜２２Ｆ：各記載処置群から採取された腫瘍における代表的αｖβ６染色を示す顕微鏡写真。
【図２２Ｆ】図２２Ａ〜２２Ｆは、ＬＩＭ１８６３異種移植片モデルにおける腫瘍生育及び支質浸潤に対するαｖβ６ｍＡｂ３Ｇ９及び組換え可溶性ＴＧＦｂＲＩＩ−Ｆｃ−Ｉｇ融合タンパク質の作用を示す。図２２Ａ：αｖβ６ｍＡｂ３Ｇ９（▲）、可溶性ＴＧＦｂＲＩＩ−Ｆｃ−Ｉｇ融合タンパク質（▼）又はビヒクルＰＢＳ（■）投与中のＬＩＭ１８６３異種移植片腫瘍成育曲線。図２２Ｂ：試験終了時（第５２日）における個体別腫瘍サイズの散布図。図２２Ｃ：全腫瘍切片に渡るαｖβ６陽性域の定量。図２２Ｄ〜２２Ｆ：各記載処置群から採取された腫瘍における代表的αｖβ６染色を示す顕微鏡写真。
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｄは、マウス３Ｇ９ｍＡｂ又は対照ｍＡｂを投与した種々の細胞系統の蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）分析から得られたヒストグラムであり、ＮＨＰαｖβ６発現細胞系統に対するｍ３Ｇ９の結合のレベルを示す（Ａ、Ｖｅｒｏ；Ｂ、ＬＬＣ−ＭＫ２；Ｃ、１２ＭＢｒ６；Ｄ、４ＭＢｒ５）。
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｂは、ＮＨＰαｖβ６発現細胞系統に対するマウス３Ｇ９の結合のレベルを示す滴定曲線である（Ａ、１２ＭＢｒ６；Ｂ、４ＭＢｒ５）。
【図２５】図２５は、ＬＡＰへのＮＨＰαｖβ６発現細胞系統の接着を示す棒グラフである（Ａ、１２ＭＢｒ６；Ｂ、４ＭＢｒ５）。
【図２６】図２６Ａ〜２６Ｂは、ＬＡＰへのＮＨＰαｖβ６発現細胞系統の接着のｍ３Ｇ９による抑制を示す滴定曲線である（Ａ、１２ＭＢｒ６；Ｂ、４ＭＢｒ５）。
【図２７】図２７は、ヒト及び霊長類のαｖβ６発現細胞系統による潜伏性ＴＨＦβの活性化を示す棒グラフである。
【図２８】図２８は、ＳＷ４８０β６及び４ＭＢｒ５細胞系統におけるｍ３Ｇ９によるＴＧＦβ活性化の抑制を示す滴定曲線である。
【図２９】図２９は、ヒト腎疾患におけるαｖβ６免疫染色を示す一連の顕微鏡写真である。（Ａ）αｖβ６ｍＡｂ（赤）及び全サイトケラチンｍＡｂ（緑）で免疫染色した凍結ヒト腎切片。（Ｂ）αｖβ６ｍＡｂで免疫染色したパラフィン包埋ヒト腎切片。
【図３０Ａ】図３０は、Ｃｏｌ４Ａ３＋／−及びＣｏｌ４Ａ３−／−マウス腎のαｖβ６免疫染色を示す。図３０Ａ：αｖβ６ｍＡｂ（赤）及び全サイトケラチンｍＡｂ（緑）で免疫染色した７週齢のＣｏｌ４Ａ３＋／−マウス及びＣｏｌ４Ａ３−／−マウス由来の凍結腎切片の顕微鏡写真。図３０Ｂ：αｖβ６ｍＡｂで免疫染色した４〜８週齢のＣｏｌ４Ａ３＋／−及びＣｏｌ４Ａ３−／−マウス由来のパラフィン包埋腎切片。図３０Ｃ：４、７及び８週齢のＣｏｌ４Ａ３＋／−及びＣｏｌ４Ａ３−／−マウス（ｎ＝３）由来の腎におけるαｖβ６免疫染色の定量を示す棒グラフ。
【図３０Ｂ】図３０は、Ｃｏｌ４Ａ３＋／−及びＣｏｌ４Ａ３−／−マウス腎のαｖβ６免疫染色を示す。図３０Ａ：αｖβ６ｍＡｂ（赤）及び全サイトケラチンｍＡｂ（緑）で免疫染色した７週齢のＣｏｌ４Ａ３＋／−マウス及びＣｏｌ４Ａ３−／−マウス由来の凍結腎切片の顕微鏡写真。図３０Ｂ：αｖβ６ｍＡｂで免疫染色した４〜８週齢のＣｏｌ４Ａ３＋／−及びＣｏｌ４Ａ３−／−マウス由来のパラフィン包埋腎切片。図３０Ｃ：４、７及び８週齢のＣｏｌ４Ａ３＋／−及びＣｏｌ４Ａ３−／−マウス（ｎ＝３）由来の腎におけるαｖβ６免疫染色の定量を示す棒グラフ。
【図３０Ｃ】図３０は、Ｃｏｌ４Ａ３＋／−及びＣｏｌ４Ａ３−／−マウス腎のαｖβ６免疫染色を示す。図３０Ａ：αｖβ６ｍＡｂ（赤）及び全サイトケラチンｍＡｂ（緑）で免疫染色した７週齢のＣｏｌ４Ａ３＋／−マウス及びＣｏｌ４Ａ３−／−マウス由来の凍結腎切片の顕微鏡写真。図３０Ｂ：αｖβ６ｍＡｂで免疫染色した４〜８週齢のＣｏｌ４Ａ３＋／−及びＣｏｌ４Ａ３−／−マウス由来のパラフィン包埋腎切片。図３０Ｃ：４、７及び８週齢のＣｏｌ４Ａ３＋／−及びＣｏｌ４Ａ３−／−マウス（ｎ＝３）由来の腎におけるαｖβ６免疫染色の定量を示す棒グラフ。
【図３１Ａ】図３１は、αｖβ６ｍＡｂ結合の特異性を示す。図３１Ａ：ＮＩＨ３Ｔ３及びＮＩＨ３Ｔ３ｂ６細胞へのαｖβ６ｍＡｂ（３Ｇ９、８Ｇ６、８Ｂ６）、抗αｖβ６（ＲＭＶ−７）、陰性対照ｍＡｂ（１Ｅ６及びＭＯＰＣ２１）及びアイソタイプ対照（ラットＩｇＧ１）の結合のフローサイトメトリー分析。図３１Ｂ：抗αｖβ６ｍＡｂ（ヒト／マウスキメラ３Ｇ９）によるＣｏｌ４Ａ３−／−及びＣｏｌ４Ａ３−／−；β６−／−腎切片の免疫染色。図３１Ｃ：抗αｖポリクローナル抗体によるＣｏｌ４Ａ３−／−及びＣｏｌ４Ａ３−／−；β６−／−腎切片の免疫染色。
【図３１Ｂ】図３１は、αｖβ６ｍＡｂ結合の特異性を示す。図３１Ａ：ＮＩＨ３Ｔ３及びＮＩＨ３Ｔ３ｂ６細胞へのαｖβ６ｍＡｂ（３Ｇ９、８Ｇ６、８Ｂ６）、抗αｖβ６（ＲＭＶ−７）、陰性対照ｍＡｂ（１Ｅ６及びＭＯＰＣ２１）及びアイソタイプ対照（ラットＩｇＧ１）の結合のフローサイトメトリー分析。図３１Ｂ：抗αｖβ６ｍＡｂ（ヒト／マウスキメラ３Ｇ９）によるＣｏｌ４Ａ３−／−及びＣｏｌ４Ａ３−／−；β６−／−腎切片の免疫染色。図３１Ｃ：抗αｖポリクローナル抗体によるＣｏｌ４Ａ３−／−及びＣｏｌ４Ａ３−／−；β６−／−腎切片の免疫染色。
【図３１Ｃ】図３１は、αｖβ６ｍＡｂ結合の特異性を示す。図３１Ａ：ＮＩＨ３Ｔ３及びＮＩＨ３Ｔ３ｂ６細胞へのαｖβ６ｍＡｂ（３Ｇ９、８Ｇ６、８Ｂ６）、抗αｖβ６（ＲＭＶ−７）、陰性対照ｍＡｂ（１Ｅ６及びＭＯＰＣ２１）及びアイソタイプ対照（ラットＩｇＧ１）の結合のフローサイトメトリー分析。図３１Ｂ：抗αｖβ６ｍＡｂ（ヒト／マウスキメラ３Ｇ９）によるＣｏｌ４Ａ３−／−及びＣｏｌ４Ａ３−／−；β６−／−腎切片の免疫染色。図３１Ｃ：抗αｖポリクローナル抗体によるＣｏｌ４Ａ３−／−及びＣｏｌ４Ａ３−／−；β６−／−腎切片の免疫染色。
【図３２Ａ】図３２は、種々の投与によるＣｏｌ４Ａ３−／−腎のＳＭＡ免疫染色。図３２Ａ：３週齢〜８．５週齢まで投与したＣｏｌ４Ａ３−／−マウス及び未投与の齢該当Ｃｏｌ４Ａ３＋／−マウスについて腎の免疫染色ＳＭＡ（赤）及びラミニン（緑）を示す。核処置群の代表的切片の免疫染色（皮質及び髄質）を示す（群当たりｎ＝８）。図３２Ｂ及び３２Ｃ：未投与のＣｏｌ４Ａ３＋／−マウス及び３週齢〜７週齢まで、又は３週齢〜８．５週齢まで種々の薬剤を投与したＣｏｌ４Ａ３−／−マウスの腎におけるＳＭＡ定量。総画像サイズと相対比較した皮質（３２Ｂ）及び髄質（３２Ｃ）のパーセント陽性染色を示す。各処置群のＮ値は散布図で示す（陰性対照ｍＡｂである投与１Ｅ６に処置群を比較した場合＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。
【図３２Ｂ】図３２は、種々の投与によるＣｏｌ４Ａ３−／−腎のＳＭＡ免疫染色。図３２Ａ：３週齢〜８．５週齢まで投与したＣｏｌ４Ａ３−／−マウス及び未投与の齢該当Ｃｏｌ４Ａ３＋／−マウスについて腎の免疫染色ＳＭＡ（赤）及びラミニン（緑）を示す。核処置群の代表的切片の免疫染色（皮質及び髄質）を示す（群当たりｎ＝８）。図３２Ｂ及び３２Ｃ：未投与のＣｏｌ４Ａ３＋／−マウス及び３週齢〜７週齢まで、又は３週齢〜８．５週齢まで種々の薬剤を投与したＣｏｌ４Ａ３−／−マウスの腎におけるＳＭＡ定量。総画像サイズと相対比較した皮質（３２Ｂ）及び髄質（３２Ｃ）のパーセント陽性染色を示す。各処置群のＮ値は散布図で示す（陰性対照ｍＡｂである投与１Ｅ６に処置群を比較した場合＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。
【図３２Ｃ】図３２は、種々の投与によるＣｏｌ４Ａ３−／−腎のＳＭＡ免疫染色。図３２Ａ：３週齢〜８．５週齢まで投与したＣｏｌ４Ａ３−／−マウス及び未投与の齢該当Ｃｏｌ４Ａ３＋／−マウスについて腎の免疫染色ＳＭＡ（赤）及びラミニン（緑）を示す。核処置群の代表的切片の免疫染色（皮質及び髄質）を示す（群当たりｎ＝８）。図３２Ｂ及び３２Ｃ：未投与のＣｏｌ４Ａ３＋／−マウス及び３週齢〜７週齢まで、又は３週齢〜８．５週齢まで種々の薬剤を投与したＣｏｌ４Ａ３−／−マウスの腎におけるＳＭＡ定量。総画像サイズと相対比較した皮質（３２Ｂ）及び髄質（３２Ｃ）のパーセント陽性染色を示す。各処置群のＮ値は散布図で示す（陰性対照ｍＡｂである投与１Ｅ６に処置群を比較した場合＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。
【図３３】図３３Ａ及び３３Ｂは、コラーゲン１α１（図３３Ａ）及びコラーゲン１α２（図３３Ｂ）のｍＲＮＡレベルのＴａｑｍａｎ分析を示す散布図である。ＲＮＡは７週齢の未投与及び投与Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウス及び７週齢の未投与Ｃｏｌ４Ａ３＋／＋マウスの腎から単離した。
【図３４】図３４は、遅延ｍＡｂ投与によるＳＭＡ免疫染色Ｃｏｌ４Ａ３−／−腎を示す散布図の対である。未投与８．５週齢Ｃｏｌ４Ａ３＋／−；未投与６週齢Ｃｏｌ４Ａ３−／−；未投与８．５週齢Ｃｏｌ４Ａ３−／−；及び６週齢〜８．５週齢に１Ｅ６及び３Ｇ９を投与された８．５週齢Ｃｏｌ４Ａ３−／−。Ｎ値は散布図で示す。＊＝ｐ＜０．０００５、処置群を陰性対照１Ｅ６投与Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウスと比較。＊＊＝ｐ＜０．０２、処置群を未投与６週齢Ｃｏｌ４Ａ３−／−マウスと比較。
【図３５】図３５は、７週齢のＣｏｌ４Ａ３−／−マウスの腎における遺伝子発現及びモジュレーションのパターンを示す。ｐ＜０．０１における野生型（ＷＴ）及び未投与Ａｌｐｏｒｔ（ＵＮ）群の間の２倍超の変動について選択された３９５ＧｅｎｅＣｈｉｐプローブセットを示す。熱マップのコラムは個々の実験群に関する相対的な遺伝子発現レベルのパターンを示す。各コラムは５匹のマウスの単一の実験群に関する３９５の正規化平均プローブセットシグナル強度値を示す。実験条件に全体に渡って遺伝子発現が変化することは着色棒により示される着色変動において反映される。二次元ヒエラルヒークラスタリングを実施することにより、実験群間の関係（樹状図で示す）を調べた。
【図３６】図３６Ａ〜３６Ｄは、Ｃｏｌ４Ａ３−／−腎における腎疾患に関連するαｖβ６依存性遺伝子の機能的アノテーションを示す棒グラフである。野生型と比べてＡｌｐｏｒｔ腎において過剰又は過少発現される遺伝子に対応するプローブセットの一覧に対し、別個にＩｎｇｅｎｕｉｔｙＰａｔｈｗａｙｓ分析（ＩＰＡ）を実施した。ＩＰＡのために使用した一覧はＡｌｐｏｒｔと野生型の群の間で有意（２倍超、ｐ＜０．０１）な変動について当初選択されていた３９５のプローブセットのサブセットとした。７週齢のマウスのＡｌｐｏｒｔ腎における遺伝子の過剰発現（Ａ、Ｂ）及びダウンモジュレーション（Ｃ、Ｄ）に関連する生物学的機能（Ａ、Ｃ）及び標準的な経路（Ｂ、Ｄ）の順位付け一覧を示す。
【図３７】図３７Ａ〜３７Ｃは、Ｃｏｌ４Ａ３−／−腎において差次的に発現され、αｖβ６ｍＡｂ投与を阻害することによりモジュレートされた遺伝子のサブセット及びネットワーク分析の模式図である。図３７Ａ：プローブセット一覧のベン図。ベン図の円の面積、その和集合及び積集合は対応する一覧におけるプローブセット数に比例する。図３７Ｂ、３７Ｃ：αｖβ６阻害ｍＡｂ３Ｇ９（図３７Ｂ）及び８Ｇ６（図３７Ｃ）により有意（投与及びナイーブのＡｌｐｏｒｔ腎の間で２倍超の変動）に影響を受けたプローブセットの一覧から推論された最高得点の調節ネットワーク。ネットワークの端縁はノードとして示され、その細胞局在化に従って配置された遺伝子内の相互作用の方向を示す。
【図３８】図３８は、ＴＧＦ−β１発現の免疫組織化学的及びＴａｑｍａｎ分析を示す。図３８Ａ：ＴＧＦ−β１発現について免疫染色された指定の薬剤を投与したＣｏｌ４Ａ３＋／−及びＣｏｌ４Ａ３−／−マウス由来の腎切片。各処置群の代表切片について染色を示す。図３８Ｂ：処置群におけるＴＧＦ−β１ｍＲＮＡレベルのＴａｑｍａｎ分析。
【図３９】図３９は、腎におけるコラーゲン発現に関するトリクローム染色を示す。１０週齢のＣｏｌ４Ａ３＋／＋；β６＋／＋、Ｃｏｌ４Ａ３−／−；β６＋／＋、及びＣｏｌ４Ａ３−／−；β６−／−マウスの染色。腎の皮質（図３９Ａ）及び髄質（図３９Ｂ）の領域について代表的な組織切片を示す。
【図４０Ａ】図４０Ａ及び４０Ｂは、３Ｇ９投与の用量滴定によるＳＭＡ免疫染色を示す散布図である。３〜７週齢において週３回、指定の用量のｍｕ３Ｇ９又は１０ｍｇ／ｋｇのｍｕ１Ｅ６（ＩｇＧ対照）を投与した後の腎の糸球体（皮質）（図４０Ａ）及び間質（髄質）（図４０Ｂ）の領域について、ＳＭＡ免疫染色の定量的分析を示す。皮質のＥＤ５０＝０．４ｍｇ／ｋｇ；髄質のＥＤ５０＝０．３ｍｇ／ｋｇ。水平線は平均値を示す。
【図４０Ｂ】図４０Ａ及び４０Ｂは、３Ｇ９投与の用量滴定によるＳＭＡ免疫染色を示す散布図である。３〜７週齢において週３回、指定の用量のｍｕ３Ｇ９又は１０ｍｇ／ｋｇのｍｕ１Ｅ６（ＩｇＧ対照）を投与した後の腎の糸球体（皮質）（図４０Ａ）及び間質（髄質）（図４０Ｂ）の領域について、ＳＭＡ免疫染色の定量的分析を示す。皮質のＥＤ５０＝０．４ｍｇ／ｋｇ；髄質のＥＤ５０＝０．３ｍｇ／ｋｇ。水平線は平均値を示す。
【図４１】図４１は、正常腎及びＵＵＯ後の腎における免疫組織学的分析のαｖβ６発現を示す一連の顕微鏡写真である。図４１Ａ：正常未傷害腎；図４１Ｂ：ＵＵＯ後７日；図４１Ｃ：ＵＵＯ後１０日；図４１Ｄ：ＵＵＯ後１４日。
【図４２】図４２は、照射後１８週においてαｖβ６アップレギュレーションが起こることを示す一連の顕微鏡写真である。１４Ｇｙを照射したＣ５７ＢＬ／６マウスを指定の時点において屠殺し、肺切片を抗β６抗体で染色した。
【図４３】図４３は、線維症の域においてアップレギュレートされたαｖβ６発現が持続することを示す対の顕微鏡写真である。肺切片を図１と同様にβ６発現について染色した。切片は１４Ｇｙ照射後２４時間（左）又は２７時間（右）に屠殺したマウスより得た。両方の切片とも、高レベルのαｖβ６を発現している多くの上皮細胞を伴った線維性の患部を示す。隣接する非線維性の上皮では、αｖβ６発現は２４週まで高いレベルが維持されたが、２７週までには著明さが大きく低減している。
【図４４】図４４は、Ｉｔｇｂ６−／−マウスが放射線誘導肺線維症から保護されていることを示す一連の顕微鏡写真である。Ｉｔｇｂ６＋／＋及びＩｔｇｂ６−／−マウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）を１４Ｇｙ胸部照射に曝露した。２７週間後、マウスを屠殺し、左肺をＭａｓｓｏｎのトリクロームで染色した。代表的な肺を示し；全体で２１／２３のＩｔｇｂ６＋／＋マウスが顕著な線維症を有していたのに対し、１７匹のＩｔｇｂ６−／−マウスの何れも線維症を有していなかった。
【図４５】図４５は、ヒドロキシプロリンにより測定した場合、Ｉｔｇｂ６−／−マウスが放射線誘導線維症から保護されていることを示す棒グラフである。照射Ｉｔｇｂ６＋／＋肺のコラーゲン含有量は未照射のＩｔｇｂ６＋／＋肺及び照射及び未照射のＩｔｇｂ６−／−肺のものより有意に高い（照射Ｉｔｇｂ６＋／＋の場合はｐ＜０．０３、各群につきＮ＝５〜６）。
【図４６】図４６は、αｖβ６インテグリンの非存在は肺照射後の生存に影響しないことを示す折れ線グラフである。Ｉｔｇｂ６＋／＋及びＩｔｇｂ６−／−マウスの群に１４Ｇｙを照射した。２群に関する生存曲線に有意差はなかった（ＷＴ＝Ｉｔｇｂ６＋／＋、ＫＯ＝Ｉｔｇｂ６−／−）。
【図４７】図４７は、照射後２６週において屠殺した３Ｇ９、可溶性ＴＧＦβＲ又は対照ＡｂをＩＰ投与されたマウスにおける肺線維症測定を示す散布図である。肺線維症は１ｍｇ／ｋｇ／週の３Ｇ９を投与されたマウスにおいて予防されている。各点は個々のマウスを示し、棒は平均を示す。０．３ｍｇ／ｋｇ群と対照群との間には線維症に差はなかった。１ｍｇ／ｋｇ群は対照より有意に低値の線維症であった。１０ｍｇ／ｋｇ及び可溶性ＴＧＦβ受容体群は低値の線維症を示したが、対照群との差は有意ではなかった。
【図４８】図４８は、（照射後２６週において屠殺した）３Ｇ９、可溶性ＴＧＦβＲ又は対照ＡｂをＩＰ投与された全マウス（照射後２０〜２６週における屠殺されたマウス、瀕死状態のマウス及び死亡状態で発見されたマウス）における肺線維症測定を示す散布図である。データは図４７と同様に示した。０．３ｍｇ／ｋｇ群と対照群との間には線維症に差はなかった。１ｍｇ／ｋｇ群、１０ｍｇ／ｋｇ及び可溶性ＴＧＦβ受容体群は対照より有意に低値の線維症であった。
【図４９】図４９は、照射後２６週において屠殺した３Ｇ９、可溶性ＴＧＦβＲ又は対照ＡｂをＩＰ投与されたマウスのＢＡＬ分画細胞計数を示す棒グラフである。
【図５０】図５０は、ＩＰ３Ｇ９抗体注射を受けた１４Ｇｙ照射マウスは対照と同様の生存性を有したことを示す折れ線グラフである。複合分析として全群に対して生存分析を実施した（ｐ＝０．０８８、Ｃ＝対照、０．３＝０．３ｍｇ／ｋｇ、１＝ｌｍｇ／ｋｇ、ＳｏＩＲ＝可溶性ＴＧＦβ受容体、１０＝１０ｍｇ／ｋｇ）。
【図５１】図５１は、３Ｇ９（１、３、６又は１０ｍｇ／ｋｇ）を毎週ＳＣ投与されたマウスにおける肺線維症測定を示す棒グラフである。全マウス（死亡／瀕死発見マウス及び屠殺マウス）、２８〜３２週に屠殺したマウス、及び死亡／瀕死発見マウスに関する別個の結果を示す。全抗体群と比べて対照群において有意に増大した線維症が存在する（全投薬ｖｓ対照でｐ＜０．０５）。
【図５２】図５２は、照射後２８又は３２週において屠殺した３Ｇ９又は対照ＡｂをＳＣ投与されたマウスのＢＡＬ分画細胞計数を示す棒グラフである。３、６及び１０ｍｇ／ｋｇの３Ｇ９投薬は好中球及びリンパ球の両方の有意に増大したパーセンテージをもたらした（全比較につきｐ＜０．０５）。
【図５３】図５３は、対照ｖｓ３Ｇ９投与マウスにおけるＢＡＬ細胞の出現を示す一連の顕微鏡写真である。正常肺胞マクロファージが対照のサイトスピンに観察される。１ｍｇ／ｋｇの３Ｇ９を投与したマウスに由来するＢＡＬ細胞は対照と同様である。３ｍｇ／ｋｇの用量において、多くの大型の泡状のマクロファージが顕在化している。（同様のマクロファージはＩｔｇｂ６−／−マウスにおいても観察される）。より高用量（６ｍｇ／ｋｇ及びここで示す１０ｍｇ／ｋｇ）においては、増大した数の好中球（矢尻）及びリンパ球並びに一部の細胞破砕物が著明となっている。
【図５４】図５４は、照射後２８週において屠殺したマウスコホートに関するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す折れ線グラフである。
【図５５】図５５は、照射後３２週において屠殺したマウスコホートに関するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す折れ線グラフである。
【図５６】図５６は、照射後３２週まで生存したマウスと比較した場合に照射後２９〜３２週に死亡したマウスにおいてＲＶ／ＬＶ質量比が増大していることを示す棒グラフである。マウスの心臓をホルマリンに固定した。右心室（ＲＶ）を左心室＋隔壁（ＬＶ）から分離し、組織を計量した。同じ系統の７匹の未照射マウスを対照として使用した。棒は平均±ＳＤを表す。照射マウスに関するデータは、全マウス（１Ｅ６対照抗体又は他の用量の３Ｇ９を投与）、対照抗体１Ｅ６投与マウス、及び何れかの用量の３Ｇ９を投与したマウスにつき示す。マウスの数は以下の通り、即ち：未照射マウス、Ｎ＝７；１Ｅ６投与マウスｍ：生存Ｎ＝１０、死亡Ｎ＝５；３Ｇ９投与マウス：生存、Ｎ＝８、死亡Ｎ＝９であった。ＲＶ／ＬＶ比は生存したマウスにおいては未照射対照との有意差はなかった。これとは対照的に、未照射マウスと比べて死亡マウス（全マウス及び１Ｅ６及び３Ｇ９サブセット）においてＲＶ／ＬＶ比は有意に増大していた（Ｐ＜０．０２）。更に、生存したマウスの同等な群と比べて死亡マウス（全マウス及び１Ｅ６及び３Ｇ９サブセット）においてＲＶ／ＬＶ比は有意に増大していた（Ｐ＜０．０００７）。
【図５７】図５７は、対照抗体（１Ｅ６）、左、又は抗αｖβ６抗体（３Ｇ９、１ｍｇ／ｋｇ／週）、右、を投与した死亡状態発見マウス由来の肺を示す顕微鏡写真の対である。肺胞壁における赤血球非存在の末梢域が観察される。この外観は灌流の消失と合致している。
【図５８】図５８は、ヒト肺疾患においてαｖβ６発現が強力にアップレギュレートされることを示す、ヒト肺疾患におけるαｖβ６の発現を示す一連の顕微鏡写真である。ヒト及びマウスの肺のパラフィン組織切片をαｖβ６特異的抗体で免疫染色することにより正常（図５８Ａ）及び疾患：特発性肺線維症（図５８Ｂ）、広汎性間質性肺疾患（図５８Ｃ）及び広汎性間質性肺疾患（図５８Ｄ）の肺における発現の相対的レベルを可視化した。染色は表１６−１（実施例１６）において後述する４１人の異なる患者の試料中において観察されたアップレギュレーションのレベルの代表例である。
【図５９】図５９は、ブレオマイシン誘導肺線維症のマウスモデルにおいてαｖβ６発現が強力にアップレギュレートされることを示す、ブレオマイシン肺線維症におけるαｖβ６の発現を示す一連の顕微鏡写真である。マウス肺のパラフィン組織切片をαｖβ６特異的抗体で免疫染色することによりブレオマイシン滴注肺における発現の相対的レベルを可視化した。
【図６０】図６０は、ブレオマイシン投与ＳＶ１２９マウスにおける肺のヒドロキシプロリン含有量に対するｍｕ３Ｇ９投与の作用を示す一連の棒グラフである。記載した種々の投与期間に関して示す最初の３つの実験では、各マウスに４ｍｇ／ｋｇのｍｕ３Ｇ９（阻害αｖβ６ｍＡｂ）、１Ｅ６（対照ＩｇＧ１）を投与した。第４の実験では、ブレオマイシン投与後１５〜６０日に週当たり３回、各マウスに４ｍｇ／ｋｇのｍｕ３Ｇ９（阻害αｖβ６ｍＡｂ）、４Ｂ４（非阻害αｖβ６ｍＡｂ）又は８Ｇ６（第２の阻害αｖβ６ｍＡｂ）を投与した。エラーバーは標準誤差を示す。群平均及び標準偏差は実施例１６の付録Ａに示す。
【図６１】図６１は、ブレオマイシン投与Ｃ５７Ｂ１６マウスにおけるコラーゲン含有量（組織形態学的検査）に対するｍｕ３Ｇ９投与の作用を示す一連の棒グラフである。マウスに週当たり３投薬のｍｕ３Ｇ９（阻害αｖβ６ｍＡｂ）、８Ｇ６（第２の阻害αｖβ６ｍＡｂ）、８Ｂ３（非阻害αｖβ６ｍＡｂ）、１Ｅ６（対照ＩｇＧ１ｍＡｂ）又はｓＴＧＦｂＲ（ＴＧＦ−β阻害に関する可溶性ＴＧＦ−β受容体陽性対照）を投与した。示した最初の３実験（図６１Ａ、６１Ｂ及び６１Ｃ）においては、ブレオマイシン攻撃前１日からマウスに投与し、第１４日に安楽死させた。最初の２つの実験（図６１Ａ及び６１Ｂ）では、各薬剤の用量は４ｍｇ／ｋｇとし、第３の実験（図６１Ｃ）では、ｍｕ３Ｇ９の用量を図示する通り変動させた。第４の実験（図６１Ｄ）では、ブレオマイシン攻撃後１４日からマウスに投与し、第２８日に安楽死させた。組織学的切片をトリクローム染色し、画像化し、青色染色（コラーゲン含有）組織の面積をＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアを使用して全組織面積のパーセンテージとして計算した。エラーバーは標準誤差を示す。群平均及び標準偏差は実施例１６の付録Ｂに示す。＊＝ＡＮＯＶＡによりＰＢＳ処置群と有意差有り。
【図６２】図６２は、コラーゲンレポーターマウスを使用したブレオマイシン肺線維症におけるｍｕ３Ｇ９を示す棒グラフである。ブレオマイシンをコラーゲン−ルシフェラーゼレポーターマウス内に気管内滴注した。マウスには、ＰＢＳ、５ｍｇ／ｋｇの可溶性ＴＧＦｂＲＩＩ−Ｉｇ又は０．１、０．３、１．０、３及び１０ｍｇ／ｋｇの用量のｍｕ３Ｇ９を２週間、週一回、ブレオマイシン傷害の前日から投与した。ｍｕ３Ｇ９４ｍｇ／ｋｇを週３回投与したマウスの別の群も設けた（３ｘ４ｍｇ／ｋｇ）。シャムマウスには気管内食塩水滴注し、ＰＢＳを投与した。肺ルシフェラーゼ含有量を第１４日に測定した。エラーバーは標準誤差を示す。群平均及び標準偏差は実施例１６の付録Ｃに示す。＊＝ＡＮＯＶＡによりＰＢＳ処置群と有意差有り。
【図６３】図６３は、ブレオマイシン攻撃マウスにおける主要なＢＡＬ細胞の集団に対するｍｕ３Ｇ９の低有効性用量の作用を評価するための経時変化を示す一連の折れ線グラフである。マウスには第０日に肺内にブレオマイシンを滴注した。マウスには第−１日及び第＋６日において、ＰＢＳ、０．３、１．０及び３．０ｍｇ／ｋｇのｍｕ３Ｇ９、又は１．０ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧ１（１Ｅ６）を投与した。第２、５、８及び１１日にマウスを屠殺し、肺を採取し、総ＢＡＬ細胞数を評価した。マクロファージ、好中球及びリンパ球の集団をサイトスピンの分画染色により分析した。群平均及び標準偏差は実施例１６の付録Ｃに示す。
【図６４】図６４は、ブレオマイシン攻撃マウスにおける第５日の主要なＢＡＬ細胞の集団に対するｍｕ３Ｇ９の高用量の作用を示す一連の棒グラフである。マウスには第０日に肺内にブレオマイシンを滴注した。マウスには第−１日、第＋１日及び第＋３日において、ＰＢＳ、４、２０及び４０ｍｇ／ｋｇのｍｕ３Ｇ９、又は２０及び４０ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧ１ｍＡｂ（１Ｅ６）を投与した。第５日にマウスを屠殺し、肺を採取し、総ＢＡＬ細胞数を評価した。マクロファージ、好中球及びリンパ球の集団をサイトスピンの分画染色により分析した。群平均及び標準偏差は実施例１６の付録Ｄに示す。＊＝ｐ＜０．０５ではＰＢＳ投与のブレオマイシン攻撃対照に対して有意であるが１Ｅ６ＩｇＧ１ｍＡｂを投与した対照に対しては有意でない。
【図６５Ａ】図６５は、ハムスターにおいては多重用量のブレオマイシンモデルにおけるｍｕ３Ｇ９の作用が欠如していることを示す。ハムスターには第０、７及び１４日に肺内にブレオマイシン（ＢＬ）又は食塩水（ＳＡ）を滴注した。第０日よりハムスターにＰＢＳ、ｍｕ３Ｇ９（Ａｂ１）又は対照ＩｇＧ１（１Ｅ６）を投与した。追加の群では、第７日（Ａｂ２）及び第１４日（Ａｂ３）にｍｕ３Ｇ９を投与した。全抗体とも５ｍｇ／ｋｇの用量で週当たり３回投与した。生存ハムスターは第２８日に屠殺し、肺を採取し、ヒドロキシプロリン含有量（図６５ＡＡ）及び脂質の過酸化（図６５Ｂ）について評価した。エラーバーは標準誤差を示す。多重用量ブレオマイシン試験中を通して生存したマウス（図６５Ｃ）。ＰＢＳ又はＩｇＧ投与対照群と比較した場合に、ｍｕ３Ｇ９投与ハムスターの生存性に有意差はなかった。群平均及び標準偏差は実施例１６の付録Ｃに示す。
【図６５Ｂ】図６５は、ハムスターにおいては多重用量のブレオマイシンモデルにおけるｍｕ３Ｇ９の作用が欠如していることを示す。ハムスターには第０、７及び１４日に肺内にブレオマイシン（ＢＬ）又は食塩水（ＳＡ）を滴注した。第０日よりハムスターにＰＢＳ、ｍｕ３Ｇ９（Ａｂ１）又は対照ＩｇＧ１（１Ｅ６）を投与した。追加の群では、第７日（Ａｂ２）及び第１４日（Ａｂ３）にｍｕ３Ｇ９を投与した。全抗体とも５ｍｇ／ｋｇの用量で週当たり３回投与した。生存ハムスターは第２８日に屠殺し、肺を採取し、ヒドロキシプロリン含有量（図６５ＡＡ）及び脂質の過酸化（図６５Ｂ）について評価した。エラーバーは標準誤差を示す。多重用量ブレオマイシン試験中を通して生存したマウス（図６５Ｃ）。ＰＢＳ又はＩｇＧ投与対照群と比較した場合に、ｍｕ３Ｇ９投与ハムスターの生存性に有意差はなかった。群平均及び標準偏差は実施例１６の付録Ｃに示す。
【図６５Ｃ】図６５は、ハムスターにおいては多重用量のブレオマイシンモデルにおけるｍｕ３Ｇ９の作用が欠如していることを示す。ハムスターには第０、７及び１４日に肺内にブレオマイシン（ＢＬ）又は食塩水（ＳＡ）を滴注した。第０日よりハムスターにＰＢＳ、ｍｕ３Ｇ９（Ａｂ１）又は対照ＩｇＧ１（１Ｅ６）を投与した。追加の群では、第７日（Ａｂ２）及び第１４日（Ａｂ３）にｍｕ３Ｇ９を投与した。全抗体とも５ｍｇ／ｋｇの用量で週当たり３回投与した。生存ハムスターは第２８日に屠殺し、肺を採取し、ヒドロキシプロリン含有量（図６５ＡＡ）及び脂質の過酸化（図６５Ｂ）について評価した。エラーバーは標準誤差を示す。多重用量ブレオマイシン試験中を通して生存したマウス（図６５Ｃ）。ＰＢＳ又はＩｇＧ投与対照群と比較した場合に、ｍｕ３Ｇ９投与ハムスターの生存性に有意差はなかった。群平均及び標準偏差は実施例１６の付録Ｃに示す。
【図６６】図６６は、実験投与により有意に影響を受けるものとして発見された遺伝子に関する正規化されたシグナル強度のプロファイルを示す。マウスには５ｍｇ／ｋｇのｓＴＧＦｂＲＩＩ−Ｉｇ（ｓＲ）又はＰＢＳ又は０．３〜３０ｍｇ／ｋｇの特定用量のｍｕ３Ｇ９を第１、８、１５及び２２日に投与し、第２９日（回復期無し）又は第７８日（７週間回復期）に安楽死させた。ＲＮＡを投与マウスの肺から調製し、転写産物を分析した。
【図６７】図６７は、処置群における３ｍｇ／ｋｇの３Ｇ９で上昇傾向を示す遺伝子に関する遺伝子発現のプロファイルを示す。マウスには５ｍｇ／ｋｇのｓＴＧＦｂＲＩＩ−Ｉｇ（ｓＲ）又はＰＢＳ又は０．３〜３０ｍｇ／ｋｇの特定用量のｍｕ３Ｇ９を第１、８、１５及び２２日に投与し、第２９日（回復期無し）又は第７８日（７週間回復期）に安楽死させた。ＲＮＡを投与マウスの肺から調製し、転写産物を分析した。
【図６８】図６８は、ｍｕ３Ｇ９により有意に影響を受ける遺伝子のＩＰＡアノテーションを示す対の棒グラフである。
【図６９Ａ】図６９Ａ及び６９Ｂは、マウス肺におけるｍｕ３Ｇ９により影響を受ける調節ネットワークを模式的に示すネットワークマップである。
【図６９Ｂ】図６９Ａ及び６９Ｂは、マウス肺におけるｍｕ３Ｇ９により影響を受ける調節ネットワークを模式的に示すネットワークマップである。
【図７０】図７０は、ｍｕ３Ｇ９投与に対するＭＭＰ−１２転写産物の用量応答を示す棒グラフである。
【図７１】図７１は、正常及び照射マウスにおけるＢＡＬ液タンパク質レベルの一連の散布図である。
【図７２】図７２は、２８週において、照射誘導線維症によりアップレギュレートされる、及びｍｕ３Ｇ９投与によりダウンレギュレートされるタンパク質を示す一連の散布図である。
【０５１８】
（配列表）
【０５１９】
【化１２５】
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【０５２０】
【化１２６】
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【０５２１】
【化１２７】
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【０５２２】
【化１２８】
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【０５２３】
【化１２９】
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【０５２４】
【化１３０】
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【０５２５】
【化１３１】
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【０５２６】
【化１３２】
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【０５２７】
【化１３３】
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【０５２８】
【化１３４】
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【０５２９】
【化１３５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３３】
2009500041.tif 000180
【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
2009500041.tif 000194
【図４７】
2009500041.tif 000195
【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
2009500041.tif 000198
【図５１】
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【図５２】
2009500041.tif 000200
【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５Ａ】
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【図６５Ｂ】
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【図６５Ｃ】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９Ａ】
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【図６９Ｂ】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【配列表】
2009500041000001.app
【国際調査報告】
2009500041.tif 000224
2009500041.tif 000225
2009500041.tif 000226
2009500041.tif 000227
2009500041.tif 000228