(57)【要約】【課題】  血管新生を調節する方法等を提供すること。【解決手段】  本発明は、Ｇタンパク共役型受容体（ＧＰＣＲ：Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、すなわちＬｅｃｔｏｍｅｄｉｎ−３（ＬＥＣ３）、エンドセリン−１受容体（ＥＤＮＲＡ：Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及びＣ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ−４：Ｃ−Ｘ−Ｃ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４）の発現又は機能を高め又は弱めることにより血管新生を調節する方法を提供する。本発明は、また、血管新生関連の疾患の治療のために、ヒトを含め、脊椎動物、すなわち特定の哺乳動物におけるＧＰＣＲ依存の血管新生を抑制する方法及び促進する方法を提供する。本発明は、また、血管新生を促進し又は抑制する化合物を、ＬＥＣ３、ＥＤＮＲＡ又はＣＸＣＲ−４の全部又は一部との相互作用を通じて同定する方法を提供する。本発明は、さらに、これらのＧＰＣＲとＶＥＧＦの調節によって血管新生を調節する方法を提供する。【選択図】  図１３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下から選択されたポリヌクレオチドを備える単離された発現ベクターを動物に対して投与することを備える動物における血管新生を促進する方法：
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９及び配列番号１１、並びに、
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び配列番号１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列。
【請求項２】
配列番号１０のアミノ酸配列を備えるポリペプチドに高い親和力で特異的に結合する抗体。
【請求項３】
配列番号４のアミノ酸配列を備えるポリペプチドの細胞外部分に高い親和力で特異的に結合する抗体。
【請求項４】
前記抗体はモノクローナルである請求項２の抗体。
【請求項５】
前記抗体はポリクロナールである請求項２の抗体。
【請求項６】
前記抗体はモノクローナルである請求項３の抗体。
【請求項７】
前記抗体はポリクロナールである請求項３の抗体。
【請求項８】
ゼブラフィッシュＬＥＣ３、ＣＸＣＲ４又はＥＤＮＲＡの全部又は一部を生産する方法であって、
発現制御配列に操作可能に結合された配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１の配列を備える発現ベクターを備える宿主細胞を、ゼブラフィッシュＬＥＣ３、ＣＸＣＲ４又はＥＤＮＲＡの全部又は一部の発現に適した培養条件下で培養し、
前記ＬＥＣ３、ＣＸＣＲ４又はＥＤＮＲＡの全部又は一部を単離すること、
を備える方法。
【請求項９】
ＬＥＣ３、ＣＸＣＲ４及びＥＤＮＲＡの全部又は一部をコードする核酸配列を備える単離されたポリヌクレオチドと、薬学的に受容可能なキャリアとを備える治療用組成物。
【請求項１０】
前記核酸配列は配列番号４又は配列番号１０のポリペプチドをコードする請求項９の治療用組成物。
【請求項１１】
請求項３の抗体と薬学的に受容可能なキャリアとを備える治療用組成物。
【請求項１２】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び配列番号１２から成る群から選択された少なくとも１つのアミノ酸配列を備えるポリペプチドと、薬学的に受容可能なキャリアとを備える治療用組成物。
【請求項１３】
血管新生関連に疾病を治療する方法であって、当該治療を必要とする患者に対し、ＬＥＣ３の発現を抑制するポリヌクレオチドを血管新生を抑制するのに十分な量だけ投与することを備える方法。
【請求項１４】
該血管新生関連の疾病は、血管新生依存癌；良性腫瘍；慢性関節リウマチ；乾癬；視覚の血管新生疾病；オースラー・ウェバー症候群；心筋の血管新生；溶菌はん新血管新生；毛細管拡張症；血友病性関節症；線維血管腫；傷肉芽形成；腸管癒着、アテローム性動脈硬化、強皮症、過形成性瘢痕、猫ひっかき病及びヘリコバクターピロリ潰瘍から成る群から選択される請求項１３の方法。
【請求項１５】
該血管新生関連の疾病は、血管新生依存癌である請求項１３の方法。
【請求項１６】
前記血管新生関連の疾病は血管新生依存の腫瘍であって、前記ポリヌクレオチドは腫瘍退縮を引き起こすのに十分な量投与される請求項１３の方法。
【請求項１７】
必要とする動物の血管新生を促進する方法であって、動物に対し、ＬＥＣ３、ＣＸＣＲ４及びＥＤＮＲＡポリペプチドの全部又は一部をコードするポリヌクレオチドを有効量投与することを備える方法。
【請求項１８】
前記ＬＥＣ３、ＣＸＣＲ４又はＥＤＮＲＡポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び配列番号１２から成る群から選択されたアミノ酸配列を備える請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記ＬＥＣ３ポリペプチドは、配列番号４又は配列番号１０のアミノ酸配列を備える請求項１７の方法。
【請求項２０】
血管新生関連の疾病を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対し、ｌｅｃ３、ｃｘｃｒ４及びｅｄｎｒａの全部又は一部の発現を抑制する第１のポリヌクレオチドと、ｖｅｇｆの発現を抑制する第２のポリヌクレオチドとを投与することを備え、前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドは血管新生を抑制するのに十分なだけ提供される方法。
【請求項２１】
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１及びこれらの組合せから成る群から選択された核酸配列を備える請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６９、配列番号７１、配列番号６５、配列番号６３、配列番号７３、配列番号７５、配列番号６７及びこれらの組合せから成る群から選択された核酸配列を備える請求項２０の方法。
【請求項２３】
該血管新生関連の疾病は、血管新生依存癌である請求項２０の方法。
【請求項２４】
血管新生依存腫瘍の患者を治療する方法であって、当該治療を必要とする患者に対し、ｌｅｃ３、ｃｘｃｒ４及びｅｄｎｒａの全部又は一部の発現又は機能を抑制する第１の化合物と、ｖｅｇｆの発現又は機能を抑制する第２の化合物とを投与することを備え、前記第１の化合物及び前記第２の化合物は腫瘍退縮を引き起こすのに十分な量だけ提供される方法。
【請求項２５】
必要とする動物の血管新生を促進する方法であって、動物に対し、ＬＥＣ３、ＣＸＣＲ４及びＥＤＮＲＡポリペプチドの全部又は一部をコードする有効量の第１のポリヌクレオチドと、ＶＥＧＦポリペプチドをコードする有効量の第２のポリヌクレオチドとを投与することを備える方法。
【請求項２６】
前記ＬＥＣ３、ＣＸＣＲ４及び／又はＥＤＮＲＡポリペプチドは、配列番号６、配列番号１２並びに配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２から成る群から選択されたアミノ酸配列を備える請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記ＶＥＧＦポリペプチドは、配列番号６０、配列番号６２、配列番号７０、配列番号７２、配列番号６６、配列番号６４、配列番号７４、配列番号７６及び配列番号６８から成る群から選択されたアミノ酸配列を備える請求項２５の方法。
【請求項２８】
前記ＬＥＣ３ポリペプチドは配列番号４又は配列番号１０のアミノ酸配列を備え、前記ＶＥＧＦポリペプチドは配列番号６０、配列番号６２、配列番号７０、配列番号７２、配列番号６６、配列番号６４、配列番号７４、配列番号７６及び配列番号６８のアミノ酸配列を備える請求項２５の方法。
【請求項２９】
前記第２の化合物は、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体である請求項２４の方法。
【請求項３０】
前記第１の化合物は、ＬＥＣ３に特異的に結合する抗体である請求項２４の方法。
【請求項３１】
血管新生関連の疾病を治療する方法であって、当該治療を必要とする患者に対しＬＥＣ３、ＣＸＣＲ４及びＥＤＮＲＡの全部又は一部の機能を抑制する第１の化合物と、ＶＥＧＦの機能を抑制する第２の化合物とを投与することを備え、前記第１の化合物及び前記第２の化合物は血管新生を抑制するのに十分なだけ提供される方法。
【請求項３２】
前記第１の化合物は、ＬＥＣ３に特異的に結合する抗体である請求項３１の方法。
【請求項３３】
前記第２の化合物は、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体である請求項３１の方法。
【請求項３４】
前記抗体はＬＥＣ３タンパク質の少なくとも一部の細胞外部分に結合する請求項３２の方法。
【請求項３５】
ＬＥＣ３、ＣＸＣＲ４及び／又はＥＤＮＲＡ活性を抑制する化合物を同定する方法であって、試験化合物をＬＥＣ３、ＣＸＣＲ４及び／又はＥＤＮＲＡポリペプチドと接触させ、前記試験化合物がＬＥＣ３、ＣＸＣＲ４及び／又はＥＤＮＲＡ活性を抑制するかどうか判断することを備え、ＬＥＣ３、ＣＸＣＲ４及び／又はＥＤＮＲＡの活性を抑制する試験化合物は、ＬＥＣ３、ＣＸＣＲ４及び／又はＥＤＮＲＡのアンタゴニストであると同定される方法。
【請求項３６】
ＬＥＣ３、ＣＸＣＲ４及び／又はＥＤＮＲＡの前記生物活性は、ＬＥＣ３、ＣＸＣＲ４及び／又はＥＤＮＲＡに前記試験化合物を結合することにより測定される請求項３５の方法。
【請求項３７】
ＬＥＣ３、ＣＸＣＲ４及び／又はＥＤＮＲＡの前記生物活性は、モデル系における血管新生の抑制によって測定される請求項３５の方法。
【請求項３８】
前記モデル系は、ゼブラフィッシュ発生系である請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記モデル系は、トランスジェニック動物系である請求項３７の方法。
【請求項４０】
前記モデル系はインビトロ細胞系である請求項３７の方法。
【請求項４１】
ＬＥＣ３、ＣＸＣＲ４及び／又はＥＤＮＲＡの生物学的な機能を抑制する有効量の細胞浸透性ペプチドを細胞に投与することを備える血管新生を抑制する方法。
【請求項４２】
ＶＥＧＦの発現又は生物学的機能を抑制する化合物の投与をさらに備える請求項４１の方法。
【請求項４３】
被検者に対し、以下から成る群から選択された有効量の化合物を投与することを備える血管新生を促進する方法：
（ａ）  配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを備える単離された発現ベクター、
（ｂ）  配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６及び配列番号５８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を有するポリヌクレオチドを備える単離された発現ベクター、
（ｃ）  配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６及び配列番号５８のアミノ酸配列を備えるポリペプチド。
【請求項４４】
血管新生関連の疾病を治療する方法であって、当該治療を必要とする患者に対し、ＳＤＦ−１又はＥＴ−１に結合する抗体を血管新生を抑制するのに十分な量投与することを備える方法。
【請求項４５】
該血管新生関連の疾病は、血管新生依存癌；良性腫瘍；慢性関節リウマチ；乾癬；視覚の血管新生疾病；オースラー・ウェバー症候群；心筋の血管新生；溶菌はん新血管新生；毛細管拡張症；血友病性関節症；線維血管腫；傷肉芽形成；腸管癒着、アテローム性動脈硬化、強皮症、過形成性瘢痕、猫ひっかき病及びヘリコバクターピロリ潰瘍から成る群から選択される請求項４４の方法。
【請求項４６】
該血管新生関連の疾病は、血管新生依存癌である請求項４４の方法。
【請求項４７】
前記血管新生関連の疾病は血管新生依存の腫瘍であって、前記ポリヌクレオチドは腫瘍退縮を引き起こすのに十分な量投与される請求項４４の方法。
【請求項４８】
前記ＳＤＦ−１は、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８又は配列番号５０のアミノ酸配列を備える請求項４４の方法。
【請求項４９】
前記ＥＴ−１は、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６又は配列番号５８の、アミノ酸配列を備える請求項４４の方法。
【請求項５０】
網膜症を予防し又は治療する方法であって、目に対し、ＬＥＣ３、ＥＤＮＲＡ及びＣＸＣＲ４から成る群から選択されたタンパク質の発現又は機能を抑制するＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡポリペプチドを、血管新生を抑制するのに十分な量投与することを備える方法。
【請求項５１】
前記ポリヌクレオチドは、アンチセンス・オリゴヌクレオチド又はホスホラミダイト・モルホリノ・オリゴマーである請求項５０の方法。
【請求項５２】
前記ポリヌクレオチドの細胞吸収を促進するために、前記ポリヌクレオチドがペプチドに結合する請求項５１の方法。
【請求項５３】
前記網膜症は、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症又は末熟児網膜症である請求項５０の方法。
【請求項５４】
前記抗体は、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡポリペプチドに特異的に結合する抗体である請求項５０の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対するクロス・レファレンス）
本願は２００６年２月１４日になされた米国仮出願第６０／７７２，９９１号の利益を主張するものであり、これは参照により全体としてここに組み入れられる。
【０００２】
本発明は、３つのＧタンパク共役型受容体（ＧＰＣＲ：Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質及びそれらの血管新生に対する関係性に関する。具体的には、本願は、抗血管新生及び血管新生促進に関連した治療法のための、薬剤標的としての、Ｌｅｃｔｏｍｅｄｉｎ−３（ＬＥＣ３）、エンドセリン−１Ａ形受容体（ＥＤＮＲＡ：Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  Ａ）及びＣ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４：Ｃ−Ｘ−Ｃ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４）の役割に関する。
【背景技術】
【０００３】
血管新生とは、新しい血管が既存の血管から形成されるプロセスである。これには、内皮細胞の他、恐らくは平滑筋細胞や繊維芽細胞のような血管内に見られるその他の細胞型の、増殖、分化及び遊走が含まれる。このプロセスを変化させることは、活性化によるものであれ阻害化によるものであれ、癌、黄斑変性、関節リウマチ、アルツハイマー病、創傷治癒、アテローム性動脈硬化症及び乏血といった人間の疾患の治療にとって有益となりうる。
【０００４】
血管新生の阻害は、癌治療に対する強力で新規の手法を意味する。癌治療のためのこの方法の可能性をしっかりと実現するためには、抗血管新生活性のための化合物を迅速にスクリーニングできる分析法が不可欠である。充実性腫瘍は、生き延び、成長し、そして転移するために、血液からの十分な栄養素の供給を必要とする（非特許文献１、非特許文献２）。新規の血管は、血管新生として知られているプロセスである既存の血管からの新芽形成により、成長中の腫瘍を育てる。近年、血管新生は、癌をターゲットする新規なプロセスとして、かなりの注目を受けている。既に臨床試験において多くの薬剤が抗血管新生の働きを有していることが証明され、また、いくつかの新薬が特にその血管成長を抑止する能力のために開発されている（非特許文献３）。
【０００５】
網膜における異常な血管新生は、視力喪失の根本原因である加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症及び末熟児網膜症における主要な要因である。したがって、血管新生関連の病気の治療は、網膜の病理において特に重要である。
【０００６】
抗血管新生薬は、臨床応用において混合成功を収めた。多くの新規の化合物は、様々な腫瘍を治療することができる薬剤を同定するためにインビボでテストされる必要があるであろう。したがって、潜在的な抗血管新生化合物のスクリーニングに適しているインビボの分析法がますます重要となる。特許文献１は、高スループットの薬物スクリーニングのための可能性だけでなくインビボ環境の関連性も提供する、ゼブラフィッシュ（ダニオ・レリオ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ））を用いた分析法を提供する。この技術は、たとえば、血管において特に発現される緑リーフコーラル蛍光タンパク質（Ｇ−ＲＣＦＰ：ｇｒｅｅｎ  ｒｅｅｆ  ｃｏｒａｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ、非特許文献４）や赤蛍光タンパク質（ｄｓＲｅｄ２）のようなレポータータンパク質を発現する、ゼブラフィッシュのトランスジェニック系を生成することを含む。
【０００７】
ゼブラフィッシュは、脊椎形成に関する研究にとって格好のモデルとなっている。マウスと異なり、ゼブラフィッシュ胚は母親の外部で発育して透明で、分化する組織と器官の観察を容易にする。特に、ゼブラフィッシュの維管束系は詳細に記述されており、ゼブラフィッシュからヒトへ高度に保存されることが証明された。（非特許文献５、非特許文献６）。さらに、ゼブラフィッシュ胚は多くの血液供給なく数日間は生きることができるので、血管に欠陥がある胚に関する研究を促進する。ゼブラフィッシュ胚の中の体節間の血管は、腫瘍血管新生に非常に類似している血管新生的崩出によって形成し、また、このプロセスは、哺乳動物における血管成長に必要であると証明されているのと同一のタンパク質を必要とするようである。たとえば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ：ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）受容体チロシンキナーゼの阻害剤である抗血管新生化合物のＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４は、ゼブラフィッシュの血管の形成に影響を与えることが証明された（非特許文献７）。
【０００８】
現在、ゼブラフィッシュの血管を視覚化する方法には、血管内皮細胞マーカーのホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（非特許文献８、非特許文献９）、血管における内因性アルカリフォスファターゼ活性の検出及び循環している心臓血管系の細血管造影が含まれる。後者の技術は、生きているゼブラフィッシュの幼生の循環に蛍光性のビーズの注入を伴い（非特許文献１０）、完全な循環系における血管の視覚化に有用である。ＶＥＧＦ受容体をターゲットとするチロシンキナーゼ阻害剤の適用によりブロックされた体節間の血管の形成は、維管束系における蛍光性のタンパク質を発現するトランスジェニック魚において容易に視覚化可能であることが判明した。
【０００９】
ゼブラフィッシュは、血管新生の研究にとって優れたモデルである。当該技術分野には（所望の結果に応じて）血管新生を促進し又は抑制するように作用する標的を発見する必要性があり、ゼブラフィッシュ・モデルは血管新生促進療法及び抗血管新生療法のためのこれらの標的の有用性を実証するために用いることができる。
【００１０】
毒性は、薬剤開発時の失敗の主要な原因である。細胞培養において安全であると示された多くの薬剤が、動物研究において有毒であると証明されてきた。したがって、ゼブラフィッシュは初期の毒性スクリーニングのための有用な動物モデルであるが、人間の疾患の遺伝・生物学的な基礎をより忠実に模倣すると考えられる哺乳類系において更なる研究がしばしば必要となる。したがって、網膜症のような血管新生に関連した異常において有用である化合物のためのスクリーニングについての第２ステージとして、疾患に係る哺乳類モデルが必要である。
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開公報第２００４０１４３８６５号（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ他）
【非特許文献１】ハナハン・ディー＝ジェイ・フォルクマン（１９９６）Ｃｅｌｌ８６：３５３−３６４
【非特許文献２】リィー・シー・ワイ他（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔ．Ｒｅｖ．１９：７−１１
【非特許文献３】ローゼン・エル（２０００）Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ５（ｓｕｐｐｌ．ｌ）：２０−２７
【非特許文献４】マッツ・エム・ヴィー他（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９６９−９７３
【非特許文献５】イソガイ・エス他（２００１）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２３０（２）：２７８−３０１
【非特許文献６】ヴォーゲル・エイ・エム＝ビー・エム・ヴァインスタイン（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．１０（８）：３５２−３６０
【非特許文献７】チャン・ジェイ他（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ１：２５７−２６７
【非特許文献８】フーケット・ビー他（１９９７）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１８３：３７−４８
【非特許文献９】リャオ・ダブリュー他（１９９７）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２４：３８１−３８９
【非特許文献１０】ヴァインスタイン・ビー・エム他（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１１４３−１１４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
そこで、本発明は、上記必要ないし必要性を満たすことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの全部又は一部についての単離された核酸配列を用いて、血管新生を促進する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＣＸＣＲ４をコードする核酸は、配列番号１、配列番号７、又は配列番号３２のポリヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、ＬＥＣ３をコードする核酸は、配列番号３、又は配列番号９のポリヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、ＥＤＮＲＡをコードする核酸は、配列番号５、配列番号１１、配列番号１９又は配列番号３５のポリヌクレオチド配列を有する。本発明は、また、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの全部又は一部をコードするポリヌクレオチド並びに当該発明の方法で使用される他の脊椎種からのそれらのポーション、相同体及び断片を提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、たとえば、ヒト、マウス、ラット、及び雌牛のような種に由来する。
【００１４】
本発明は、また、単離されたゼブラフィッシュＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、このポリペプチドは、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６のアミノ酸配列をそれぞれ有する。本発明は、また、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡポリペプチド並びに当該発明の方法で使用される他の脊椎種からのそれらのポーション、相同体及び断片を提供する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、たとえば、ヒト、マウス、ラット、及び雌牛のような種に由来する。いくつかの実施形態において、ＣＸＣＲ４ポリペプチドは、配列番号２、配列番号８、又は配列番号３３のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＬＥＣ３ポリペプチドは、配列番号４、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２７、又は配列番号２８のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＥＤＮＲＡポリペプチドは、配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２３のアミノ酸配列を有する。
【００１５】
その発明は、また、単離されたゼブラフィッシュ・ペプチド・リガンド、ＣＸＣＲ４受容体のための間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１ないしＣＸＣＬ１２）及びＥＤＮＲＡ受容体のためのエンドセリン−１（ＥＴ−１ないしＥＴＡ）を提供する。いくつかの実施形態において、そのポリペプチドは、配列番号３７（ＳＤＦ−１：ＮＰ＿９５４６３７）及び配列番号３９（ＥＴ−１：ＮＰ＿００１９４６）のアミノ酸配列をそれぞれ有する。これらのＳＤＦ−１及びＥＴ−１タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号３８（ＮＭ＿１９９１６８）及び配列番号４０（ＮＭ＿００１９５５）である。本発明は、また、ＳＤＦ−１及びＥＴ−１ポリペプチド並びに当該発明の方法で使用される他の脊椎種からのそれらのポーション、相同体及び断片を提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、たとえば、ヒト、マウス、ラット、及び雌牛のような種に由来する。いくつかの実施形態において、ＣＸＣＲ４のためのペプチドＳＤＦ−１リガンドは、配列番号４２（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）についてのＮＰ＿０００６００）、配列番号４４（ＮＰ＿０６８３５０、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、マウス）、配列番号４６（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット）についてのＮＰ＿０７１５１３）、配列番号４８＿（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ（鶏）についてのＮＰ＿９８９８４１）、配列番号５０（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ（豚）についてのＮＰ＿００１００９５８０）のアミノ酸配列を有する。これらのＣＸＣＲ４タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）について）、配列番号４３（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）について）、配列番号４５（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット）について）、配列番号４７（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ（鶏）について）、及び配列番号４９（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ（豚）について）である。本発明は、また、動物における血管新生を促進する方法を提供する。ＥＤＮＲＡのためのペプチドＥＴ−１リガンドは、配列番号３９（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）についてＮＰ＿００１９４６）、配列番号５２（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）についてＮＰ＿０３４２３４）、配列番号５４（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット）についてＮＰ＿０３６６８０）、配列番号５６（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ（ウシ）についてＮＰ＿８５１３５３）、及び配列番号５８（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ（豚）についてＮＰ＿９９９０４７）のアミノ酸配列を有する。これらのＥＴ−１リガンドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号４０（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）について）、配列番号５１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）についてＮＰ＿０３４２３４）、配列番号５３（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット）について）、配列番号５５（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ（ウシ）について）、及び配列番号５７（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ（豚）について）である。いくつかの実施形態において、その方法は、動物に対して、ＣＸＣＲ４のための効果的な量のペプチド・リガンドＳＤＦ−１を、また、ＥＤＮＲＡ受容体の活性化のための効果的な量のＥＴ−１��投与し、これによって、血管新生を促進することを備える。加えて、リガンドＳＤＦ−１及びＥＴ−１に対する抗体は、それらのそれぞれの受容体ＣＸＣＲ４及びＥＤＮＲＡに対する内因性リガンドの生物学的利用性をブロックするために恐らく用いることができ、これにより、抗血管新生のためにＣＸＣＲ４及びＥＤＮＲＡの活性化をブロックする目的で用いることができる。これは、癌を治療するための抗血管新生療法にとって腫瘍血管におけるＶＥＧＦのその受容体Ｆｌｋ−Ｉに対する生物学的利用性をブロックするために、抗ＶＥＧＦ抗体であるＡｖａｓｔｉｎにとっての同様のシナリオとなるであろう（参照：Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．，Ｈｉｌｌａｎ，Ｋ．Ｊ．＆Ｎｏｖｏｔｎｙ，Ｗ．（２００５）“Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（Ａｖａｓｔｉｎ），ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ”Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３３：３２８−３３５）。
【００１６】
本発明は、また、オーファンＧＰＣＲ、ＬＥＣ３受容体のための内因性で人工的なペプチド・リガンドを単離する方法を提供する。ＬＥＣ３がオーファンＧＰＣＲとして分類されているので、この受容体のための既知の内因性リガンドは存在しない。しかしながら、我々は、ＬＥＣ３受容体に結合する高親和性ペプチド配列を単離するために、コンビナトリ・ペプチド・ファージ・ライブラリをスクリーニングすることを提案する。一度ペプチド配列が同定されれば、我々は、ＬＥＣ３受容体に対して、より高い親和性、機能的なブロッキング又は増強作用を備えたペプチド・クローンの追加的な変異体を生成してスクリーニングすることができる。この同定されたリコンビナント・ペプチドは、ＬＥＣ３受容体に対して機能的ブロッキング又は増強作用の何れかを有することができるので、それぞれ、血管新生を阻害するか（抗血管新生）又は誘発（血管新生促進）するために利用することができる。いくつかの実施形態において、当該方法は、動物に対して、ＬＥＣ３受容体にとってのこのリコンビナント・ペプチド・リガンドを効果的な量だけ投与することを備える。どれが受容体の活性化又は不活性化に導くかは、そのペプチド・リガンド上のアミノ酸の態様に左右される。したがって、本発明はまた、動物において、抗血管新生の又は血管新生を促進する方法のそれぞれを提供する。
【００１７】
本発明は、また、動物における血管新生を促進する方法を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は、動物に対し、効果的な量のＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡポリペプチドを、単独で又は混合して投与することを備える。細胞膜バリアの通過を容易にするために、そのポリペプチドは種々の効果的な送達試薬と結合していてもよい。このＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡポリペプチドは、任意の脊椎のあるＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡポリペプチドであってよい（すなわち、任意の種に由来するものであってよい）。いくつかの実施形態において、ＣＸＣＲ４ポリペプチドは、配列番号２、配列番号８、又は配列番号３３のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＬＥＣ３ポリペプチドは、配列番号４、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２７、又は配列番号２８のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＥＤＮＲＡポリペプチドは、配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２３のアミノ酸配列を有する。
【００１８】
本発明の他の実施形態において、血管新生を促進する方法は、血管新生を必要とする動物に対して、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチドをコードする効果的な量のポリヌクレオチドを、単独で又は組み合わせて、投与することを含む。このポリヌクレオチドは、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチドの何れをコードするものであってもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１の核酸配列を備える。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７の核酸配列を備える。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号３２の核酸配列を備える。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号３の核酸配列を備える。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号９の核酸配列を備える。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号５の核酸配列を備える。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列を備える。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１９の核酸配列を備える。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号３５の核酸配列を備える。
【００１９】
その発明は、また、必要とする動物に対して血管新生を促進する方法を提供し、動物に対し、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチドをコードする効果的な量の第１のポリヌクレオチドと、ＶＥＧＦポリペプチドをコードする効果的な量の第２のポリヌクレオチドと、を投与することを備える。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦポリペプチドは、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４及び配列番号７６から成る群から選択されたアミノ酸配列を備える。
【００２０】
本発明は、また、動物における血管新生を抑制する方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、動物に対して、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３、ＥＤＮＲＡポリペプチドの全部又は一部の発現を抑制するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、すなわちホスホラミダイト・モルホリノ・オリゴヌクレオチド（ＰＭＯ：ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）のようなポリヌクレオチドを、効果的な量だけ投与することを備える。ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡのポリペプチドは、任意の脊椎動物のＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡのポリペプチドであってもよい（ヒト、マウス、雌牛、ラット、ゼブラフィッシュその他のすべての脊椎動物を含む。）。細胞の中へのＰＭＯの効率的な吸収を改善するために、アルギニン・リッチ・ペプチドのようなペプチドをＰＭＯに加えてもよい（Ｍｏｕｌｔｏｎ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｔｏ  Ａｒｇｉｎｉｎｅ−Ｒｉｃｈ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１５：２９０−２９９）。いくつかの実施形態において、ＣＸＣＲ４ポリペプチドは、配列番号２、配列番号８、又は配列番号３３のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＬＥＣ３ポリペプチドは、配列番号４、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２７、又は配列番号２８のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＥＤＮＲＡポリペプチドは、配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２３のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＣＸＣＲ４をコードする核酸は、配列番号１、配列番号７、又は配列番号３２のポリヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、ＬＥＣ３をコードする核酸は、配列番号３５又は配列番号９のポリヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、ＥＤＮＲＡをコードする核酸は、配列番号５、配列番号１１、配列番号１９又は配列番号３５のポリヌクレオチド配列を有する。
【００２１】
本発明は、また、血管新生関連の疾患の治療を必要とする患者に対して、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡの発現を抑制するポリヌクレオチドを血管新生を抑制するのに十分な量だけ、すなわち抗ＶＥＧＦのような療法と化学療法とを任意に組み合わせたレジメンの効果を強化する量だけ、投与することを備える血管新生関連の疾患を治療する方法を提供する。血管新生関連の疾患には、血管新生依存癌；良性腫瘍；慢性関節リウマチ；乾癬；視覚の血管新生疾病；オースラー・ウェバー症候群；心筋の血管新生；溶菌はん新血管新生；毛細管拡張症；血友病性関節症；線維血管腫；傷肉芽形成；腸管癒着、アテローム性動脈硬化、強皮症、過形成性瘢痕、猫ひっかき病及びヘリコバクターピロリ潰瘍が含まれるが、これらに限定されるものでない。
【００２２】
そのため、当該方法は、ポリヌクレオチド、修飾されたポリヌクレオチドを投与することにより血管新生依存性腫瘍の患者を治療することを含む。これらの投与は、それは細胞や組織の中へのポリヌクレオチドの効果的な送達を可能にし、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡの発現を抑制する賦形剤とともに、癌状態の腫瘍の退縮ないし安定化をもたらすのに十分な量だけ、すなわち任意の療法を組み合わせたレジメンの効果を強化する量だけ投与することを含む。ポリヌクレオチド又は修飾されたポリヌクレオチドは、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、モルホリノ・オリゴヌクレオチド、又はＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡをコードする核酸に限定的にハイブリッドするリボザイムであってもよい。本発明は、また、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡとそれらのリガンドとの相互作用を抑制し又は下流のエフェクタ機能を不全にさせるために、細胞浸透性のペプチドで、被検者を治療する方法を提供する。本発明に係る当該方法は、さらにＶＥＧＦ活性の細胞浸透性ペプチド抑制を含んでいてもよい。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本発明は、血管新生関連の疾患の治療を必要とする患者に対して、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡの発現を抑制する第１の試薬と、ＶＥＧＦの発現を抑制する第２の試薬と、を投与することを備える血管新生関連の疾患を治療する方法を提供する。そこでは、第１試薬と第２試薬は、血管新生を抑制するためにともに相乗的に作用する。第１試薬は、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡをコードするポリヌクレオチドに向けられたポリヌクレオチドを備えてもよい（ＲＮＡｉｓ、ｓｉＲＮＡｓ、ｍｉＲＮＡｓ、被修飾核酸、ＰＮＡ、又はモルホリノ・オリゴヌクレオチド若しくはリボザイムなどのようなアンチセンス分子を含む。）。いくつかの実施形態において、第１試薬は、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及びそれらの組合せから成る群から選択される配列を有する。
【００２４】
アンチセンス・モルホリノあるいは他のｓｉＲＮＡのためのターゲットとされた配列の小さな部位のみを限定するのに簡単なように、それはそうではありません。翻訳に係るブロッキング・アンチセンス・モルホリノ・オリゴは、ＡＴＧ開始コドンの５’未翻訳領域から２５ｂｐ下流のどこにおいても作用する。また、スプライシング抑制アンチセンス・モルホリノ・オリゴは、エキソン／イントロン境界間で作用する。したがって、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡ遺伝子の何れのエキソン／イントロン境界も、標的配列である。したがって、翻訳ブロックアンチセンスのためのＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡのｍＲＮＡ転写の任意の領域、また、抑制をスプライスするためのＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡ遺伝子の任意のゲノム領域を用いることができる。第２試薬は、ＶＥＧＦをコードするポリヌクレオチドに向けられたポリヌクレオチドを備えてもよい（アンチセンス分子、ＲＮＡｉｓ、ｓｉＲＮＡｓ、ｍｉＲＮＡｓ、被修飾核酸、ＰＮＡｓ、モルホリノ・オリゴヌクレオチド、リボザイムなどを含む。）。いくつかの実施形態において、第１試薬は配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及びそれの組合せから成る群から選択される配列を有する。ヒトのＶＥＧＦ受入番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）はＮＭＪ３０３３７６（Ｕｎｉｇｅｎｅクラスタ：Ｈｓ．７３７９３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｇｅｎｅ  ＩＤ：ＥＮＳＧ０００００１１２７１５））である。いくつかの実施形態において、血管新生関連の疾患は、腫瘍あるいは癌の進行と関連する。
【００２５】
ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡ及び／又はＶＥＧＦの作用を分裂させるオリゴヌクレオチドを設計するために、ＲＮＡ発現の抑制に所望の影響を有するであろう配列を予測するための本発明の属する技術領域で既知の種々のコンピュータに基づいたアルゴリズムを用いてもよい。そのようなアルゴリズムの一例には  Ｓｆｏｌｄが含まれるが、これに限られるものでない。Ｓｆｏｌｄは、ｓｆｏｌｄ．ｗａｄｓｗｏｒｔｈ，ｏｒｇ．というドメイン・アドレスの下にあるワールド・ワイド・ウェブ上のＳｆｏｌｄのウェブサーバ上で入手可能である。このアルゴリズムは、Ｄｉｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：Ｗ１３５−Ｗ１４１にも記載されている。
【００２６】
いくつかの実施形態において、第１試薬は、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡ、及びＶＥＧＦの発現又は作用を抑制するコンビナトリアル・ケミストリからの小さな分子、天然の化合物又は合成化合物である。そのような化合物は本発明の属する技術分野において既知のものであってもよいし、また、ここに記述されたスクリーニング法を用いて同定されてもよい。そのような化合物は、たとえば、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡの発現、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡの翻訳後修飾を抑制してもよいし、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡのアロステリックな構成を変化させてもよいし、あるいは受容体ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３およびＥＤＮＲＡに対する内因性リガンドの結束と競合してもよい。
【００２７】
本発明は、血管新生関連の疾患の治療を必要とする患者に対して、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡの機能又は発現を抑制する第１の化合物と、ＶＥＧＦ信号の発現又は機能を抑制する第２化合物と（その受容体と下流シグナリング分子とを含む。）、を投与することを備える血管新生関連の疾患を治療する方法をさらに提供する。前記第１化合物及び前記第２化合物は、血管新生を抑制するのに十分な量だけ提供される。いくつかの実施形態において、ＣＸＣＲ４の機能を抑制する化合物は、ＣＸＣＲ４と特異的に結合する抗体である。
【００２８】
本発明に係る特定の実施形態において、本発明は、必要とする患者に対して、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡの発現又は作用を抑制する第１化合物と、ＶＥＧＦの発現又は作用を抑制する第２の化合物と（コンビナトリアル・ケミストリからの天然化合物、合成化合物又は小さな分子を含む。）、を投与することを備える血管新生依存の腫瘍を有する患者を治療する方法を提供する。前記第１化合物及び前記第２化合物は、腫瘍退縮を引き起こすのに十分な量だけ提供される。いくつかの実施形態において、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡの発現又は作用を抑制する化合物は、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡポリペプチドをコードする配列を備える核酸に特異的にハイブリッドするアンチセンス、モルホリノ・オリゴヌクレオチド、又はリボザイムのようなポリヌクレオチドである。他の実施形態において、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡの発現又は作用を抑制する化合物は、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡポリペプチドと特異的に結合する抗体である。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦの発現か作用を抑制する化合物は、ＶＥＧＦポリペプチドをコードする配列を備える核酸に特異的にハイブリッドするアンチセンス、モルホリノ・オリゴヌクレオチド、又はリボザイムのようなポリヌクレオチドである。他の実施形態において、ＶＥＧＦの作用を抑制する化合物は、特異的にＶＥＧＦポリペプチドと結合する抗体である。いくつかの実施形態において、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡ及び／又はＶＥＧＦの発現及び／又は作用を抑制する化合物は、ポリヌクレオチドと抗体の組合せである。
【００２９】
本発明に係る別の特定の方法において、治療を必要とする患者の目に対して、血管新生関連のタンパク質の発現を抑制するポリヌクレオチドを、血管新生を抑制するのに十分な量だけ投与することによって、網膜症を予防するか又は治療するための方法が提供される。そのタンパク質は、たとえば、ＬＥＣ３、ＥＤＮＲＡ及びＣＸＣＲ４である。当該方法は、アンチセンス・オリゴヌクレオチド又はホスホラミダイト・モルホリノ・オリゴマーのようなポリヌクレオチドの投与を含んでいてもよい。そのようなアンチセンス・オリゴヌクレオチドやＰＭＯは、ポリヌクレオチドの細胞吸収を促進するためにペプチドにコンジュゲートされていてもよい。他の実施形態において、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡの発現又は作用を抑制する方法は、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及び／又はＥＤＮＲＡポリペプチドと特異的に結合する抗体である。これらの方法は、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症又は末熟児網膜症のような網膜症を予防するか又は治療するのに有用である。オリゴヌクレオチドとＰＭＯの配列は、この明細書のどこか他の箇所に血管新生を抑制するために記載されたものであってもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
腫瘍発病の際に重大なステップである、新規の血管の形成（すなわち血管新生）にとって不可欠な、３つの薬物混入可能な標的が同定された。これらの遺伝子のうちのいずれか１つを抑制することにより、脊椎動物のモデル生体であるゼブラフィッシュにおける血管新生が妨げられる。小さく、透明で、急成長しているゼブラフィッシュは、血管新生と関係する人間の疾患を研究するための先導的な脊椎動物モデルになる期待を与えてくれる。ゼブラフィッシュ・モデルを用いる血管新生に関するこのインビボ研究からの結果は、血管新生における重要な役割を有する３つのＧタンパク共役型受容体（ＧＰＣＲ）を明らかにし、抗癌治療のための方法を提供する。
【００３１】
ＧＰＣＲは、過去２０年にわたって、市場に出ているすべての薬剤標的の約５０％を占めた。トップ５０のベストセラーとなった薬剤標的ＧＰＣＲの３０％超には、アレルギー、統合失調症及び双極性障害、胸やけ及び高血圧のための周知の薬物が含まれる。このように、血管新生にとって不可欠なＧＰＣＲの発見は、病的の血管新生を調節するための薬剤混入可能な標的を我々が利用することを可能にし、癌と戦うための創薬プロセスを促進する。機能が血管新生のために不可欠である重要な３つの分子を同定した。これらの分子は、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体型４（ＣＸＣＲ４）、Ｌｅｃｔｏｍｅｄｉｎ−３（ＬＥＣ３）及びエンドセリン−１受容体（ＥＤＮＲＡ）である。まず、インビボ脊椎動物モデルとしてゼブラフィッシュを用いて、ヒト血管内皮細胞及びゼブラフィッシュ血管系においてこれらの遺伝子が発現することを実証した。次に、逆遺伝ツールを用いて、これらの遺伝子の各々の標的とされたノックダウンが動物モデルにおける血管新生を抑制した。
【００３２】
本発明は、ゼブラフィッシュ（及び他の脊椎動物種、特にヒト）ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡのためのポリヌクレオチド及びポリペプチドを提供する他、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡセンス・ポリヌクレオチド及びアンチセンス・ポリヌクレオチドを用いて動物における血管新生を促進する方法および抑制する方法をも提供する。
【００３３】
本明細書で参照されるＧｅｎＢａｎｋデータベース配列への受入番号を含め、参照される業績、特許、特許出願、及び科学文献は、当業者の知識を確認するものであり、各々が引用によって組み入れられるべく具体的かつ個別的に示されるのと同程度に、引用により全体としてここに組み入れられる。ここで引用される文献と本明細書の特定の教示との間に矛盾がある場合には、後者の利益になるように解決されることとする。
【００３４】
種々の定義が本文書を通してなされる。殆どの語は、当業者によってそれらの語に帰せられる意味を有する。以下において又は本書類の他の箇所において具体的に定義される語は、全体として本発明の文脈において与えられ、当業者によって典型的に理解されるような意味を有する。ある語又は熟語の技術的に理解される定義と、その語又は熟語について本明細書において具体的に教示される定義との間に矛盾が生じた場合には、後者の利益になるように解決されることとする。本明細書に使用される見出しは便宜上のものであり、限定するものとして解されるべきでない。
【００３５】
当業者には既知である組み換えＤＮＡ技術の一般原理を記述している標準的な参考業績には、Ａｕｓｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２Ｄ  ＥＤ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９５；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｅｄ．，ＤＩＲＥＣＴＥＤ  ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１が含まれる。当業者には既知であるゼブラフィッシュを用いる研究のための一般原理及びプロトコルを記述している標準的な業績には、ＴＨＥ  ＺＥＢＲＡＦＩＳＨ  ＢＯＯＫ：Ａ  ＧＵＩＤＥ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＵＳＥ  ＯＦ  ＺＥＢＲＡＦＩＳＨ（ＤＡＮＩＯ  ＲＥＲＩＯ），Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，２０００が含まれるが、これに限定されるものでない。
【００３６】
ここで用いられるように、「単離される」とは、物質がその最初の環境（たとえば、それが自然に存するのであれば、自然環境）から除去されることを意味する。たとえば、生きている動物中に現れる自然に存在しているポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていないが、自然システム中に共存する物質の全部又は一部から単離された同一のポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であってもよく、及び／又はそのようなポリヌクレオチド若しくはポリペプチドは組成物の一部であってもよく、そしてそのようなベクター若しくは組成物がその自然環境の一部でない場合にはなお単離されてもよい。
【００３７】
「精製された」又は「十分に精製された」ポリヌクレオチド又はポリペプチドとは、生来の（又は野生型の）核酸又はポリペプチドが自然に随伴する他の細胞成分から、及び／又は他の不純物（たとえば、アガロースゲル）から十分に分離されることをいう。精製されたポリペプチド又はタンパク質は、サンプルの約６０％〜９９％ｗ／ｗ以上を備え、約９０％、約９５％、又は約９８％の純度であってもよい。
【００３８】
ここで用いられる「約」とは、基準値の＋／−１０％を指す。
【００３９】
ここで用いられるように、「バリアント」核酸又はアミノ酸配列とは、たとえば、関心のある配列のイソ型、種変異体、対立遺伝子変異体、及びフラグメントを含む、相同体を指す。「相同性ヌクレオチド配列」若しくは「相同性アミノ酸配列」、又はその変異体とは、基準配列、又は機能的ドメインをコードしているか若しくは有するその部分若しくはフラグメントに関して、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％、より好ましくは１００％のパーセンテージ同一性（ポリヌクレオチドに関する場合）又は相同性（ポリペプチドに関する場合）によって特徴付けられる配列を指す。
【００４０】
ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡアンチセンス・オリゴヌクレオチドなど、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡアンタゴニストの「治療学的有効量」という用語は、疾病状態（たとえば、腫瘍に適用される場合、腫瘍）において、または全身的に投与される場合は、血漿において、治療学的に有効なレベルを達成かつ維持して、血管新生を抑制する（癌に適用される場合、癌細胞の増殖を抑制する）ように計算された量を意味する。たとえば、インビトロで、癌細胞、例えばＫＳ細胞の約５０％以上の増殖を抑制するのに十分な治療学的量である。もちろん、治療学的用量は、インビトロでの癌細胞増殖の抑制における各ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡアンタゴニストの効力、ならびに腫瘍組織及び／又は血漿において身体によるＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡアンタゴニストの排除又は代謝の速度により変化するであろう。また治療学的用量は、治療の任意の組合せ療法、たとえば抗ＶＥＧＦ及び化学療法の効力を増進するであろうＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡアンタゴニストの量に適合する。
１．  ポリヌクレオチド
Ａ．  脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡ
【００４１】
本発明は、ゼブラフィッシュＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡをコードするポリヌクレオチドを提供し、また、本発明の方法における使用のための他の脊椎動物由来のＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡをコードするポリヌクレオチドを提供する。ここで使用されるように、「ポリヌクレオチド」とは核酸分子を指し、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、混合ポリマー、組み換え核酸、それらのフラグメント及びバリアントなどを含む。本発明において有用なポリヌクレオチドのフラグメントは、基準ポリヌクレオチドの少なくとも１０、好ましくは少なくとも１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、又は１００個の連続するヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む。本発明のポリヌクレオチドは、自然に存在するポリヌクレオチドでも、自然に存在しないポリヌクレオチドでもよい。ここで使用される「合成されたポリヌクレオチド」とは、酵素的方法とは別に、純粋に化学的方法によって作成されたポリヌクレオチドを指す。したがって、「完全に」合成されたＤＮＡ配列は全体的に化学的手段によって作成され、そして「部分的に」合成されたＤＮＡは、得られるＤＮＡの一部分のみが化学的手段によって作成されたＤＮＡを包含する。本発明のポリヌクレオチドは一本鎖でも二本鎖でもよい。本発明のポリヌクレオチドは、化学的に修飾されていてもよく、当業者には容易に理解できるように、非天然ヌクレオチド塩基又は誘導ヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。そのような修飾は、たとえば、標識、メチル化、類似体による１又は２以上のヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間の修飾、たとえば非荷電の結合（たとえば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）、荷電結合（たとえば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、ペンダント部（たとえば、ポリペプチドなど）、インターカレータ（たとえば、アクリジン、ソラレンなど）、キレータ、アルキレータ、及び修飾結合（たとえば、α−アノマー核酸など）を含む。また、水素結合及び他の化学的相互作用を介して指定された配列に結合する能力においてポリヌクレオチドを模倣する合成分子が含まれる。そのような分子は当該技術分野において既知であり、たとえば、ペプチド結合が分子の骨格においてホスフェート結合を置換している分子を含む。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２（ヒトＣＸＣＲ４）、配列番号４（ヒトＬＥＣ３）及び配列番号６（ヒトＥＤＮＲＡ）のポリペプチド配列をコードするそれらを含む。いくつかの実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号１（ヒトＣＸＣＲ４）、配列番号４（ヒトＬＥＣ３）及び配列番号６（ヒトＥＤＮＲＡ）の核酸配列を備える。ポリヌクレオチドは、同類的であっても非同類的であってもアミノ酸置換をもたらす突然変異を含有してもよい。突然変異は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発などの標準技術によって、本発明の核酸配列中に導入することができる。同類アミノ酸置換は、１個又は２個以上の予想される非必須アミノ酸残基においてなされてもよい。「同類アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基により置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（たとえば、リジン、アルギニン、及びヒスチジン）、酸性側鎖（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。このように、予想される非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基により置換される。あるいはまた、突然変異は、コーディング配列の全部又は一部にそって、たとえば飽和変異によってランダムに導入することができ、得られる突然変異体は活性を保持する変異体を同定するために生物学的活性についてスクリーニングすることができる。突然変異に続いて、コードされているタンパク質が、当該技術分野において既知のいずれかの組み換え技術によって発現されてもよく、タンパク質の活性が決定できる。
【００４３】
ヌクレオチド配列は、左から右へ、５’〜３’方向において、一本鎖のみによって提示される。ヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｄｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される方式で表される。
【００４４】
本発明のいくつかの実施態様では、突然変異は、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡタンパク質の翻訳後修飾又は生物学的活性を有意には変えないであろう。
Ｂ．  発現ベクター
【００４５】
本発明の他の態様は、ゼブラフィッシュＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡポリペプチド、又はその誘導体、フラグメント、類似体若しくは同族体をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。ここで使用されるように、「ベクター」との用語は、結合先の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは付加されるＤＮＡセグメントが結合できる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの他のタイプは、ウイルスベクターであり、この場合、付加されるＤＮＡセグメントはウイルスゲノム中に結合できる。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的に複製することができる（たとえば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（たとえば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入に際し宿主細胞のゲノム中に組込まれ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが操作可能に結合された遺伝子の発現を指導することができる。そのようなベクターは、ここでは「発現ベクター」として言及される。一般に、組換えＤＮＡ技術における有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態で存在する。本明細書では、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターのもっとも普通に使用される形態物であるので、交換可能に使用することができる。しかしながら、本発明は、発現ベクターのそのような他の形態、たとえばウイルスベクター（たとえば、複製能欠陥レトロウイルス及びアデノ随伴ウイルス）を含むことを意図しており、これらは等価の機能を果たす。
【００４６】
本発明の組換え発現ベクターは本発明の核酸を含み、これは宿主細胞での核酸の発現のために適当な形態をしている。これは、組換え発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選ばれ、発現される核酸配列に操作可能に結合される１又は２以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「操作可能に結合される」とは、対象となるヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で（たとえば、インビトロの転写／翻訳システムにおいて又はベクターが宿主細胞に導入される場合の宿主細胞において）調節配列に結合されることを意味することが意図されている。「調節配列」との用語は、プロモータ、エンハンサ及び他の発現制御要素（たとえば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図されている。そのような調節配列は、たとえば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）において記述されている。調節配列は、多くの宿主細胞類においてヌクレオチド配列の構成的発現を指導する配列、及びある種の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指導する配列（たとえば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現レベルのようなファクターに依存してもよいことは、当業者によって理解されよう。本発明の発現ベクターは宿主細胞中に導入され、それによって、いかなる脊椎動物種からもここに記載されるような核酸によってコードされた、融合タンパク質又はペプチドを含むタンパク質又はペプチド（たとえば、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡポリペプチド、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡの変異形態物、融合タンパク質など）を生産することができる。いくつかの実施態様では、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡは哺乳動物から得られる。いくつかの他の実施態様では、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡはマウスまたはラットから得られる。いくつかの他の実施態様では、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡはヒトから得られる。いくつかの他の実施態様では、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡはゼブラフィッシュから得られる。ヒト及びゼブラフィッシュＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡのアミノ酸配列の比較が図２、図４及び図７において示される。
【００４７】
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞又は真核細胞における脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡの発現のために設計することができる。たとえば、ゼブラフィッシュＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡは、細菌細胞、たとえば大腸菌、（バクロウイルス発現ベクターを用いる）昆虫細胞、酵母細胞又は哺乳動物細胞において発現可能である。適当な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）においてさらに議論されている。また、組換え発現ベクターは、たとえば、Ｔ７プロモータ調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写及び翻訳されてもよい。
【００４８】
原核生物におけるタンパク質の発現は、多くの場合、融合タンパク質か非融合タンパク質の発現を指導する構成的プローモータ又は誘導プロモータを含有するベクターにより大腸菌において実施される。融合ベクターは、そこにコードされたタンパク質、普通には組換えタンパク質のアミノ末端に、多数のアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは、典型的には、３つの目的：（１）組換えタンパク質の発現を増強すること；（２）組換えタンパク質の溶解度を増大すること；及び（３）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を助けること、に役立つ。しばしば、融合発現ベクターでは、タンパク質分解的切断部位が融合部分及び組換えタンパク質の連結点に導入されて、融合部分からの組み換えタンパク質の分離と、それに続く融合タンパク質の精製を可能にする。そのような酵素及びそれらの同族の認識配列は、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ、トロンビン及びエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターは、標的組換えタンパク質に、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はプロテインＡを融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ．）及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を含む。
【００４９】
適当な誘導性非融合大腸菌発現ベクターには、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ６９：３０１−３１５）及びｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）ｐｐ．６０−８９）が含まれる。
【００５０】
大腸菌における組換えタンパク質発現を最大化する１つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力の損傷された宿主細菌においてタンパク質を発現することである。参照、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８。他の戦略は、各アミノ酸のための個々のコドンが大腸菌において優先的に利用されるものであるように、発現ベクター中に挿入される核酸の核酸配列を変えることである（Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のそのような変更は、標準ＤＮＡ合成技術によって実施することができる。
【００５１】
他の実施態様では、脊椎動物のＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡ発現ベクターは酵母発現ベクターである。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，（１９８２）Ｃｅｌｌ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｅｃｈｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、及びｐｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が含まれる。
【００５２】
また、脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡは、バクロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞において発現することができる。培養昆虫細胞（たとえば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）ＳＦ９細胞）におけるタンパク質の発現のために利用できるバクロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｒｌｏｇｙ１７０：３１−３９）を含む。
【００５３】
さらに他の実施態様では、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）が含まれる。哺乳動物において使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしばウイルスの調節要素によって提供される。たとえば、典型的に使用されるプロモータは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス及びシミアンウィルス４０から得られる。プロモータの代表例には、限定されるものではないが、ＬＴＲ又はＳＶ４０プロモータ、大腸菌、ｌａｃ又はｔｒｐ、λファージＰＬプロモータ及び原核細胞若しくは真核細胞又はそれらのウイルスにおいて遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモータが含まれる。原核細胞及び真核細胞の両方のための他の適当な発現系は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章及び第１７章を参照。多数の適当なベクター及びプロモータは当業者には既知であり、市販されている。次のベクターが例として提供される；細菌：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；真核生物：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかしながら、他のプラスミドやベクターも、それらが宿主において複製可能かつ生存可能である限り使用することができる。さらに、完全な哺乳動物の転写単位及び選択可能なマーカーが原核生物のプラスミド中に挿入されてもよい。次いで、得られるベクターが細菌において増幅され、その後培養哺乳動物細胞中にトランスフェクトされる。この種のベクターの例には、ｐＴＫ２、ｐＨｙｇ及びｐＲＳＶｎｅｏが含まれる。
【００５４】
他の実施態様では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞種において優先的に核酸の発現を指導することができる（たとえば、組織特異的調節要素が核酸を発現するために使用される。）。組織特異的調節要素は当該技術分野において既知である。適当な組織特異的調節要素の非限定的な例には、アルブミンプロモータ（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、類リンパ特異的プロモータ（Ｃａｌａｍｅ  ａｎｄ  Ｅａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞受容体（Ｗｉｎｏｔｏ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｏｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３）及び免役グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ３３：７４１−７４８）のプロモータ、ニューロン特異的プロモータ（たとえば、神経フィラメントプロモータ；Ｂｙｍｅ  ａｎｄ  Ｒｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモータ（Ｅｄｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：９１２−９１６）及び乳腺特異的プロモータ（たとえば、乳漿プロモータ；米国特許第４，８７３，３１６号公報及び欧州特許出願公開第２６４，１６６号公報）が含まれる。また、発生上調節されるプロモータには、たとえば、マウスｈｏｘプロモータ（Ｋｅｓｓｅｌ  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３７４−３７９）及びα−フェトプロテインプロモータ（Ｃａｍｐｅｓ  ａｎｄ  Ｔｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）が包含される。適当なベクター及びプロモータの選択は、当業者の水準内で周知である。
【００５５】
また発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネータを含有してもよい。また、ベクターは発現を増幅するための適当な配列を含んでもよい。さらに、いくつかの実施態様では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特徴、たとえばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）又は真核細胞培養のためのネオマイシン（ＮＥＯ）耐性、あるいは大腸菌におけるテトラサイクリン（ＴＥＴ）又はアンピシリン（ＡＭＰ）耐性を提供するために、１種以上の選択可能なマーカー遺伝子を含有する。
【００５６】
さらに、本発明は、アンチセンス方向において発現ベクター中にクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含んでなる組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡのｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にする様式で調節配列に操作可能に連結される。種々の細胞種におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を指導する、アンチセンス方向においてクローン化された核酸に操作可能に連結される調節配列、たとえばウイルスプロモータ及び／又はエンハンサが選ばれてもよく、あるいはアンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的又は細胞種特異的発現を指導する調節配列が選ばれてもよい。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高効率調節領域の制御下で生産される組換えプラスミド、ファージミド又は弱毒ウイルスの形態で存在してもよく、この活性はベクターが導入される細胞種によって決定することができる。アンチセンス遺伝子を用いる遺伝子発現の調節の議論では、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）：２２−２５を参照。
Ｃ．  アンチセンス・オリゴヌクレオチド
【００５７】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、動物及びヒトにおける疾病状態の処置において治療学的部分として使用されてもよい。リボザイムを含むアンチセンス・オリゴヌクレオチ  ド薬物は、ヒトに安全かつ有効に投与されており、そして多くの臨床試行が現在進行中である。かくして、オリゴヌクレオチドが、細胞、組織及び動物、特にヒトの処置のための処置法において有用であるように構成することができる有用な治療手段になり得ることが確立される。
【００５８】
本発明の文脈上、「オリゴヌクレオチド」との用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）若しくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はそれらの擬似物のオリゴマー若しくはポリマーを指す。この用語は、自然に存在する核酸塩基、糖及びヌクレオシド間（骨格）共有結合からなるオリゴヌクレオチド並びに類似に機能する自然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような改変又は置換オリゴヌクレオチドは、所望の特性、たとえば細胞の取込み増進、核酸標的に対する親和力増進及びヌクレアーゼの存在下での安定性増大のために、しばしば本来の形態物以上に好適である。
【００５９】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドが本発明によって熟考されるが、限定されるものではないが下記のようなオリゴヌクレオチド擬似物を含む、他のオリゴマーのアンチセンス化合物もまた含まれる。本発明によるアンチセンス化合物は、好ましくは、約８〜約５０個の核酸塩基（すなわち、約８〜約５０個の連結ヌクレオシド）を含む。いくつかの実施態様では、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは約８〜約１５個の核酸塩基を含む。他の実施態様では、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは約１６〜約２５個の核酸塩基を含む。他の実施態様では、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは約２０〜約３０個の核酸塩基を含む。他の実施態様では、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは約２５〜約３５個の核酸塩基を含む。他の実施態様では、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは約３０〜約４５個の核酸塩基を含む。他の実施態様では、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは約４０〜約５０個の核酸塩基を含む。アンチセンス化合物には、標的核酸にハイブリダイズし、そしてその発現を調節する、リボザイム、エクスターナルガイド（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｇｕｉｄｅ）配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド（オリゴザイム）、及び他の短い触媒ＲＮＡ又は触媒オリゴヌクレオチドを含む。
【００６０】
当該技術分野において既知であるように、ヌクレオシドは塩基−糖の組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は正常には複素環式塩基である。そのような複素環式塩基の２種のもっとも普通の種類はプリン及びピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むそれらのヌクレオシドでは、リン酸基は糖の２’，３’又は５’ヒドロキシル部分のいずれかに結合することができる。オリゴヌクレオチドの形成では、リン酸基は隣接するヌクレオシドを他のヌクレオシドに共有結合して、直線状ポリマー化合物を形成する。順に、この直線状ポリマー構造物のそれぞれ末端がさらに連結されて、環状構造物が形成されてもよいが、開放された直線状構造物が一般に好適である。オリゴヌクレオチド構造物において、リン酸基は通常、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格の形成に向けられる。ＲＮＡ及びＤＮＡの通常の結合又は骨格は、３’〜５’ホスホジエステル結合である。
【００６１】
本発明において有用な好適なアンチセンス化合物の特定の例は、修飾骨格又は非天然のヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドを含む。本明細書で定義されるように、修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドは、骨格中にリン原子を保持するもの、及び骨格中にリン原子を有しないものを含む。本明細書の目的のためには、また、当該技術分野において時々引用されるように、それらのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有しない修飾オリゴヌクレオチドもまたオリゴヌクレオチドであると考えることができる。
【００６２】
いくつかの実施態様では、修飾オリゴヌクレオチド骨格は、たとえば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、正常な３’−５’結合を有するセレノホスフェート及びボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、及び１個以上のヌクレオチド間結合が３’〜３’，５’〜５’又は２’〜２’結合である反転極性を有するそれらのものを含む。反転極性を有する好適なオリゴヌクレオチドは、３’−大多数ヌクレオチド間結合における単一の３’〜３’結合、すなわち、塩基性であってもよい単一の反転ヌクレオシド残基（核酸塩基が失われているか、又はその代わりにヒドロキシル基を有する）を含む。
【００６３】
他の好適なオリゴヌクレオチド擬似物では、両糖及びヌクレオシド間の結合、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が、新規の基により置換される。塩基単位は、適当な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのそのようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されたオリゴヌクレオチド擬似物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）として言及される。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、骨格、特にアミノエチルグリシン骨格を含有するアミドにより置換される。核酸塩基は保有され、そして骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許は、限定されるものではないが米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；及び同第５，７１９，２６２号を含み、これらの各々は引用によって本明細書に組み入れられる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１４９７−１５００において見出される。
【００６４】
改変されたオリゴヌクレオチドはまた、１又は２個以上の置換糖部分を含有していてもよい。
【００６５】
さらなる改変は、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’又は４’炭素原子に結合されて、二環式糖部分を形成するＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（ＬＮＡ）を含む。結合は、好ましくは、２’酸素原子と４’炭素原子を架橋しているメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基［式中、ｎは１又は２である］であり、そしてそれの調製はＷＯ９８／３９３５２およびＷＯ９９／１４２２６に記述されている。
【００６６】
他の改変は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。２’−改変は、アラビノ（ｕｐ）位置又はリボ（ｄｏｗｎ）位置に存在してもよい。好適な２’−アラビノ改変は２’−Ｆである。類似の改変もまた、オリゴヌクレオチドにおける他の位置、具体的には３’末端ヌクレオチドにおける糖の３’位又は２’−５’結合オリゴヌクレオチド及び５’末端ヌクレオチドの５’位において作成されてもよい。またオリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖擬似物を有してもよい。
【００６７】
また、オリゴヌクレオチドは核酸塩基（しばしば、当該技術分野では単に「塩基」と呼ばれる）改変物又は置換物を含む。ここで使用されるように、「未改変」ないし「自然の」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、及びピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。改変核酸塩基は、他の合成及び自然の核酸塩基、たとえば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシン及びピリミジン塩基の他のアルキル誘導体、６−アゾ  ウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−ヒドロキシル及び８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン及び３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンを含む。さらなる改変核酸塩基は、三環式ピリミジン、たとえばフェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−ｃｌａｍｐｓ、たとえば置換フェノキサジンシチジン（たとえば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）を含む。また改変核酸塩基は、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環式化合物、たとえば７−デアザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリミジン及び２−ピリドンにより置換されるものを含んでもよい。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、ＴＨＥ  ＣＯＮＣＩＳＥ  ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ  ＯＦ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ，ｐａｇｅｓ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｊ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ１５，ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されるものを含む。これらの核酸塩基の���るものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和力を増大するために特に有用である。これらは、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン及びＮ−２，Ｎ−６及びＯ−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換物は、０．６〜１．２℃だけ核酸二重らせんの安定性を増強することが示され（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｄｓ．，ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、そしてより特別には、２’−Ｏ−メトキシエチル糖改変と組み合わされた場合、現在、好適な塩基置換物である。
【００６８】
本発明のオリゴヌクレオチドの他の改変は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分配又は細胞取込みを増進する１又は２個以上の部分又は結合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）をオリゴヌクレオチドに化学的に結合することを伴う。本発明の化合物は、官能基、たとえば第１又は第２ヒドロキシル基に共有結合された結合基を含んでもよい。本発明の結合基は、インターカレータ、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的性質を増進する基、及びオリゴマーの薬動学的性質を増進する基を含む。典型的な結合基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フォラシン、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、ローダミン、クマリン及び染料を含む。本発明の文脈上、薬力学的性質を増進する基は、オリゴマーの取込みを改良し、分解に対するオリゴマーの抵抗性を増進し、及び／又はＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。本発明の文脈上、薬動学的性質を増進する基は、オリゴマーの取込み、分配、代謝又は排泄を改良する基を含む。結合部分は、限定されるものではないが、脂質部分、たとえばコレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．４：１０５３−１０６０）、チオエーテル、たとえばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．３：２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：５３３−５３８）、脂肪族鎖、たとえばドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２５９：３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ７５：４９−５４）、リン脂質、たとえばジーヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルーアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３６：３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：３７７７−３７８３）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１４：９６９−９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３６：３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１２６４：２２９−２３７）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｏ．Ｔｈｅｒ．２７７：９２３−９３７）を含む。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、活性薬物物質、たとえば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナミン酸（ｆｌｕｆｅｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、ベンゾチアジアジド、クロロチアジアジド、ジアゼピン、インドメチシン、バルビタール酸塩、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤又は抗生物質に結合されてもよい。
【００６９】
所与の化合物の全ての位置について均一に改変されることは必ずしも必要でなく、事実、１を超える前記改変を、オリゴヌクレオチド内の単一の化合物又は単一のヌクレオチドにおいてさえ組み入れてもよい。また本発明はキメラ化合物であるアンチセンス化合物を含む。本発明の文脈上、「キメラの」アンチセンス化合物ないし「キメラ」は、各々が少なくとも１個のモノマー単位、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドから作成された、２個以上の化学的に異なる領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性の増大、細胞取り込みの増大及び／又は標的核酸への結合親和力の増大をオリゴヌクレオチドに与えるようにオリゴヌクレオチドが改変される、少なくとも１つの領域を含有する。オリゴヌクレオチドのさらなる領域が、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂できる酵素のための基質として働いてもよい。例を挙げれば、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重らせんのＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のオリゴヌクレオチド抑制の効力を大きく増進する。結果的に、同じ標的領域へハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドに比較して、キメラオリゴヌクレオチドが使用される場合、匹敵する結果が、しばしば、より短いオリゴヌクレオチドを用いて得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、日常的にはゲル電気泳動によって検出でき、必要であれば当該技術分野において既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって検出できる。
【００７０】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、前記のような２個以上のオリゴヌクレオチド、改変オリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチド擬似物の複合体構造物として形成されてもよい。そのような化合物もまたハイブリッド又はギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）として当該技術分野において言及されている。
【００７１】
本発明に従って使用されるアンチセンス化合物は、便利かつ日常的には、周知の固相法という技術により作成されてもよい。そのような合成の機器は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を含むいくつかの販売元によって販売されている。当該技術分野において既知のそのような合成のための任意の他の手段が、追加的又は代替的に使用されてもよい。ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチドを調製するために類似技術を使用することは周知である。
【００７２】
本発明のアンチセンス化合物はインビトロで合成され、そして生物学的起源のアンチセンス組成物、又はアンチセンス分子のインビボ合成を指導するように設計された遺伝ベクター構築物を含まない。また本発明の化合物は、取込み、分配及び／又は吸収を助けるために、たとえば、リポソーム、受容体標的分子、経口、肛門、局所又は他の調合物として、他の分子、分子構造物又は化合物の混合物とともに、混合、カプセル化、結合又は他に会合されてもよい。
Ｄ．モルホリノ改変オリゴヌクレオチド
【００７３】
アンチセンス技術の具体的形態はモルホリノ・オリゴヌクレオチドである（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．ａｎｄ  Ｄ．Ｗｅｌｌｅｒ（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｃｕｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．７：１８７−１９５；Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ，Ａ．ａｎｄ  Ｓ．Ｃ．Ｅｋｋｅｒ（２０００）  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２６：２１６−２２０；Ｙａｎ，Ｙ−Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２９：５０６５−５０７９）。モルホリノ・オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡと比較して変更された骨格結合をもつ非イオン性のＤＮＡ類似体であるが、相補的配列をもつＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対に従う。典型的には、モルホリノは少なくとも長さ約１８〜２５の核酸塩基であり、ある実施態様では、モルホリノは少なくとも長さ約２５〜３０の核酸塩基であり、さらに別の実施態様では、モルホリノは少なくとも長さ約３０〜３５かそれ以上の核酸塩基である。脊椎動物の発生を研究するための道具としてのモルホリノの長さは、Ｅｋｋｅｒ  Ｓ．Ｃ．（２０００）Ｙｅａｓｔ１７：３０２−３０６による最近の説に十分記述されており、この開示は引用によって本明細書に組み入れられる。
【００７４】
モルホリノは、ＲＮアーゼＨの基質にならず、分解されないＲＮＡ−モルホリノハイブリッドを形成する。Ｅｋｋｅｒ及び共同研究者等は、蛍光標識されたモルホリノ・オリゴヌクレオチドが球体期（ｓｐｈｅｒｅ  ｓｔａｇｅ）のゼブラフィッシュ胚中に注入でき、そして均質な分配を達成することを報告している。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のために開始コドンに対して標的化されたモルホリノオリゴマーはＧＦＰ発現をブロックしたが、これに対して、ＧＦＰに相補的である対照オリゴマーはブロックしなかった。これにより、モルホリノオリゴマーが、配列に特異的な様式で遺伝子発現を明瞭にブロックできることが確認された。またＥｋｋｅｒ及び共同研究者等は、数種の内因性ゼブラフィッシュ遺伝子の抑制を報告した。
【００７５】
本発明は、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリヌクレオチドの５’非翻訳領域又はＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリヌクレオチドのスプライス部位を標的とするモルホリノ改変オリゴヌクレオチドを提供する。そのようなモルホリノ改変オリゴヌクレオチドは、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの発現を抑制するのに有効であり、これらの改変オリゴヌクレオチドにより処置された動物における血管新生を妨害する。
【００７６】
モルホリノは高度に無極性である。したがって、改変された又は未改変のモルホリノオリゴは、細胞／組織中にモルホリノオリゴの送達を促進する任意の既知の送達担体／ベクターと組み合わせて投与されてもよい。
【００７７】
モルホリノ（及び他のオリゴヌクレオチド）は、また、細胞の吸収を促進するために、Ｍｏｕｌｔｏｎ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１５：２９０−２９９に記載されているように、アルギニン・リッチ・ペプチドと結合させてもよい。これは、参照により、全体としてここに取り入れられる。
Ｅ．細胞への核酸の送達：
【００７８】
本発明の核酸構築物は当該技術分野において既知の任意の手段によって送達されてもよい。ある実施態様では、核酸はエクスビボ手段を用いて細胞中に送達される。他の実施態様では、核酸はインビボ手段を用いて細胞中に送達される。
【００７９】
エクスビボ遺伝子療法では、細胞は、実験操作前に宿主生物、たとえばヒトから除去される。これらの細胞が次に、当該技術分野において周知の方法を用いてインビトロで核酸をトランスフェクトされる。次いで、これらの遺伝的に操作された細胞が宿主生物中に再導入される。一方、インビボの遺伝子治療アプローチは宿主生物から標的細胞を除去することを必要としない。むしろ、核酸は、試薬、たとえばリポソーム又はレトロウイルスと複合され、続いて既知の方法を用いて生物内の標的細胞に投与されてもよい。たとえば、Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３７：１４７６、１９８７；Ｇｅｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：１８０を参照。
【００８０】
細胞をトランスフェクトするための数種の異なる方法を、エクスビボ又はインビボいずれかの遺伝子治療アプローチのために使用することができる。既知のトランスフェクション法は、標的細胞中に選ばれた核酸を送達するように使用される作用物に従って分類されてもよい。これらのトランスフェクション作用物は、ウイルス依存性、脂質依存性、ペプチド依存性、及び直接トランスフェクション（「裸ＤＮＡ」）アプローチを含む。トランスフェクションのために使用される他のアプローチは、カルシウム共沈及びエレクトロポレーションを含む。
【００８１】
ウイルスアプローチは、宿主細胞を感染させるために遺伝的に工作されたウイルスを使用し、それによって、外因性核酸により細胞を「トランスフェクトする」。既知のウイルスベクターには、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス及びレトロウイルスを含む、この例が既に開示されている組み換えウイルスが存在する。そのような組換え体は、プロモータ又はエンハンサ要素の制御下で異種の遺伝子を担持でき、そしてベクターで感染された宿主細胞においてそれらの発現を惹起することができる。ワクシニア及び他の種類の組換えウイルスは、Ｍａｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：３によって概説されている。また、Ｋｏｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｈｕｎ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：１９も参照されたい。
【００８２】
非ウイルスベクター、たとえばリポソームもまた遺伝子治療において核酸送達のための媒介物として使用されてもよい。ウイルスベクターに比較して、リポソームは安全であり、比較的高い能力を有し、比較的低い毒性であり、種々の核酸に基づく分子を送達でき、そして比較的非免疫原性である。参照、Ｆｅｌｇｅｒ，Ｐ．Ｌ．ａｎｄ  Ｒｉｎｇｏｌｄ，Ｇ．Ｍ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３３７：３８７−３８８。これらのベクターの中では、カチオン性リポソームが、インビトロの哺乳動物細胞トランスフェクションの媒介におけるそれらの有効性に因りもっとも研究されている。リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）として既知の１つの技術は、核酸及び細胞へのトランスフェクションを促進するカチオン性脂質から作成されるリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）を使用する。脂質／核酸複合体は、原形質又はエンドソーム膜を融合するか、さもなくば破壊し、そして細胞中に核酸を移送する。リポフェクションは、典型的には、リン酸カルシウムトランスフェクション法よりも細胞へのＤＮＡの導入において一層効率的である。Ｃｈａｎｇｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｆｏｃｕｓ１０：６６。
【００８３】
１つの既知タンパク質依存のアプローチは、核酸と混合されたポリリジンの使用を伴う。ポリリジン／核酸複合体は、次いで侵入のために標的細胞に曝露される。参照、たとえば、Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｓｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ３８９：２３９；Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１４６５。
【００８４】
「裸のＤＮＡ」トランスフェクションアプローチは、核酸がインビボで直接投与される方法を伴う。参照、Ｇｅｒｍａｎらへの米国特許第５，８３７，６９３号。核酸の投与は、筋肉又は皮膚のような、器官における組織の間質空間中への注入、血流中、所望の体腔中への直接導入によって、あるいはまた吸入によって実施できる。これらの所謂「裸のＤＮＡ」アプローチでは、核酸は注入されるか、さもなくばいかなる補助剤もなしに動物と接触される。体組織、たとえば骨格筋又は皮膚中へ直接、遊離の（「裸の」）プラスミドＤＮＡの注入がタンパク質の発現をもたらすことが報告されている。参照、Ｕｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１７４５−１７４９；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：４１５７−４１６０；Ｒａｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：９５１９−９５２３。
【００８５】
エレクトロポレーションは別のトランスフェクション法である。参照、Ｓｚｏｋａ，Ｊｒ．らへの米国特許第４，３９４，４４８号及びＨａｕｓｅｒへの米国特許第４，６１９，７９４号。種々の動物及び植物細胞への短い高電圧電気パルスの印加は、原形質膜にナノメーターサイズの孔の形成をもたらす。ＤＮＡは、これらの小孔を通して又は孔の閉鎖を伴う膜構成成分の再分配の結果として細胞原形質中に直接侵入できる。
２．  宿主細胞
【００８６】
本発明の他の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」との用語は、ここでは交換可能に使用される。そのような用語は特定の細胞のみならず、またそのような細胞の子孫又は潜在的子孫を指す。ある種の改変が、突然変異又は環境の影響によって後続世代において起きるかもしれないので、そのような子孫は、実際に、親細胞と同一でなくてもよいが、尚もここで使用される用語の範囲内に含まれる。
【００８７】
宿主細胞は任意の原核細胞又は真核細胞であってもよい。たとえば、脊椎動物のＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチドは細菌細胞、たとえば大腸菌、昆虫細胞、酵母又は哺乳動物細胞（たとえば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はＣＯＳ細胞）において発現することができる。他の適当な宿主細胞は当業者には既知である。
【００８８】
ベクターＤＮＡは慣用の形質転換又はトランスフェクション技術を介して原核細胞又は真核細胞中に導入できる。ここで使用されるように、「形質転換」及び「トランスフェクション」との用語は、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション又はエレクトロポレーションを含む、宿主細胞中に外来核酸（たとえば、ＤＮＡ）を導入するための種々の技術的に認識された技術を指すことを意図している。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするための適当な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）及び他の実験室マニュアルにおいて見出すことができる。
【００８９】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションでは、使用される発現ベクター及びトランスフェクション技術に応じて、小部分の細胞しか、それらのゲノム中に外来ＤＮＡを組込むことができないことが知られている。これらの組込み体を同定し、選択するためには、安定なマーカー（たとえば、抗生物質に対する耐性）をコードしている遺伝子が、一般に、関心のある遺伝子とともに宿主細胞中に導入される。種々の選択可能なマーカーは、薬物、例えばＧ４１８、ハイグロマオシンおよびメトトレキセートに対する耐性を付与するものを含む。選択可能なマーカーをコードしている核酸が、脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡをコードしている同じベクターにおいて宿主細胞中に導入できるか、または別々のベクターにおいて導入することができる。導入された核酸により安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定することができる（たとえば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込まれた細胞は、他の細胞が死滅するのに対して生残するであろう）。
【００９０】
培養物における本発明の宿主細胞、たとえば原核又は真核宿主細胞が脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチドを生産する（すなわち、発現する）ために使用できる。したがって、本発明は、さらに、本発明の宿主細胞を用いて脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡポリペプチドを生産する方法を提供する。一実施態様では、本方法は、脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチドが生産されるような適当な培地において、本発明の宿主細胞（脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡをコードしている組換え発現ベクターが導入された）を培養することを含む。その他の実施態様では、本方法は、さらに、培地又は宿主細胞から脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡを単離することを含む。
３．  トランスジェニック動物：
【００９１】
また、本発明の宿主細胞は、非ヒト・トランスジェニック動物を作成するために使用することができる。たとえば、一実施態様では、本発明の宿主細胞は、脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡをコードしている配列が導入された受精卵母細胞又は胚性幹細胞である。そのような宿主細胞は、次に、内因性の脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ配列が変更されているそれらのゲノム又は相同の組換え動物中に、外因性の脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ配列が導入された非ヒト・トランスジェニック動物を作成するために使用できる。そのような動物は、脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの機能及び／又は活性を研究するため、及び脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ活性のモジュレータを同定及び／又は評価するために有用である。ここで使用されるように、「トランスジェニック動物」は非ヒト動物であり、ある実施態様では、動物は魚であり、他の実施態様では、動物は哺乳動物（たとえば、ラット又はマウスのような齧歯類）であり、この場合、動物の１個以上の細胞がトランスジーンを含む。トランスジェニック動物の他の例は、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などを含む。トランスジーンは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組み込まれた外因性ＤＮＡであり、そしてこれが成熟動物のゲノム中に留まって、トランスジェニック動物の１種以上の細胞タイプ又は組織においてコードされた遺伝子産物の発現を指導する。ここで使用されるように、「相同の組換え動物」は非ヒト動物、たとえば哺乳動物（たとえば、マウス）であり、この動物では、内因性ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ遺伝子は、内因性遺伝子と、動物の細胞、たとえば、動物の発生前の動物の胚性細胞中に導入された外因性ＤＮＡとの間の相同組み換えによって変更されている。
【００９２】
本発明のトランスジェニック動物は、受精卵母細胞の雄性前核中に、たとえば、ミクロインジェクション、レトロウイルス感染によって脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡをコードしている核酸を導入し、偽妊娠のメス養育動物において卵母細胞を生育させることによって生産することができる。配列番号１（ヒトＣＸＣＲ４）、配列番号３（ヒトＬＥＣ３）、配列番号５（ヒトＥＤＮＲＡ）、配列番号７（ダニオＣＸＣＲ４）、配列番号９（ダニオＬＥＣ３）、配列番号１１（ダニオＥＤＮＲＡ）の脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡｃＤＮＡ配列又は人工的構築物を、非ヒト動物のゲノム中にトランスジーンとして導入することができる。いくつかの実施形態では、脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの変異体が導入されるが、この変異体では、脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡは１個以上のドメインを欠如しているか、又は野生型配列の相同染色体による置換物を有する。あるいはまた、脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ遺伝子の相同染色体が脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡｃＤＮＡに対するハイブリダイゼーション（詳細は前記）に基づいて単離され、そしてトランスジーンとして使用されてもよい。また、イントロン配列及びポリアデニル化シグナルがトランスジーンに含まれてトランスジーンの発現効率が増強されてもよい。組織特異的調節配列が操作可能に脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡトランスジーンに連結されて、特定の細胞に対して脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチドの発現を指導してもよい。胚の操作及びミクロインジェクションを介するトランスジェニック動物、特にマウスのような動物の作成方法は、当該技術分野において慣用になっており、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号及び同第４，８７３，１９１号；及びＨｏｇａｎ  １９８６，Ｉｎ：ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ  ＴＨＥ  ＭＯＵＳＥ  ＥＭＢＲＹＯ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．において記述されている。同様の方法は他のトランスジェニック動物の作成のために使用される。トランスジェニック創始動物は、そのゲノムにおける脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡトランスジーンの存在及び／又は動物の組織又は細胞における脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡｍＲＮＡの発現に基づいて同定することができる。トランスジェニック創始動物は、次いで、トランスジーンを担持しているさらなる動物の繁殖のために使用できる。さらに、脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡをコードしているトランスジーンを担持するトランスジェニック動物は、他のトランスジーンを担持している他のトランスジェニック動物とさらに交配させられてもよい。
【００９３】
相同組換え動物を創成するために、欠失、付加又は置換が導入されて脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ遺伝子が変更された、たとえば機能的に破壊された、脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ遺伝子の少なくとも一部分を含有するベクターが調製される。脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ遺伝子は、配列番号１（ヒトＣＸＣＲ４）、配列番号３（ヒトＬＥＣ３）、配列番号５（ヒトＥＤＮＲＡ）、配列番号７（ダニオＣＸＣＲ４）、配列番号９（ダニオＬＥＣ３）、配列番号１１（ダニオＥＤＮＲＡ）のｃＤＮＡであってもよい。次いで、脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡは、哺乳動物、又は他の脊椎動物のゲノム中に導入されてもよい。一実施態様では、ベクターは、相同組み換えにおいて、内因性脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ遺伝子が機能的に破壊されるように設計される（すなわち、機能的タンパク質をもはやコードしていない；また「ノックアウト」ベクターと呼ばれる）。
【００９４】
また、ベクターは、相同組換えにおいて、内因性の脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ遺伝子が突然変異されるか、又は他の方法で変更されて、内因性脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチドの発現が変えられるが、なお機能的タンパク質をコードしているように設計されてもよい（たとえば、上流の調節領域が変更されて、内因性脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチドの発現が変えられてもよい）。相同組換えベクターでは、脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ遺伝子の変更部分は、その５’及び３’末端においてさらなる脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ遺伝子の核酸に隣接されて、そのベクターに担持された外因性脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ遺伝子と、胚性幹細胞における内因性脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ遺伝子との間に相同組換えを生じさせる。さらなる隣接する脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ核酸は、内因性遺伝子との成功裏の相同組換えのために十分な長さを有する。典型的には、隣接するＤＮＡ（両５’および３’末端における）の数キロベースがベクターに含まれる。参照、たとえば、相同組換えベクターの記述について、Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ５１：５０３。ベクターは胚性幹細胞系中に（たとえば、エレクトロポレーションによって）導入され、そして導入された脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ遺伝子が内因性脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ遺伝子と相同的に組み換えられた細胞が選ばれる（参照、たとえば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ６９：９１５）。トランスジェニック非ヒト動物を作成する方法は当該技術分野において周知である（マウスについては、参照、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４４３８−４２；米国特許第４，７３６，８６６号、同４，８７０，００９第号、同第４，８７３，１９１号、同第６，１２７，５９８号；Ｈｏｇａｎ，Ｂ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；相同組換えについては、参照、Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２８８−１２９２；Ｊｏｙｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３３８：１５３−１５６；粒子衝撃については、参照、米国特許第４，９４５，０５０号；ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）については、参照、Ｒｕｂｉｎ  ａｎｄ  Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２１８：３４８−５３、米国特許第４，６７０，３８８号；トランスジェニック昆虫については、参照、Ｂｅｒｇｈｍｍｅｒ  Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ４０２：３７０−３７；ゼブラフィッシュについては、参照、Ｌｉｎ  Ｓ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３６：３７５−３８３０；魚、両生類及び鳥については、参照、Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ，（１９９１）Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ４７：３９７−９０５；ラ��トについては、参照、Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９９０）Ｃｅｌｌ６３：１０９９−１１１２；胚性幹（ＥＳ）細胞については、参照、ＴＥＲＡＴＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡＳ  ＡＮＤ  ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ，  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；家畜については、参照、Ｐｕｒｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２８１−１２８８；非ヒト動物クローンについては、参照、Ｗｉｌｍｕｔ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ３８５：８１０−８１３、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ９７／０７６６８号及び第ＷＯ９７／０７６６９号；調節されたトランスジーン発現のためのリコンビナーゼ系については、参照、Ｌａｋｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：６２３２−６２３６；米国特許第４，９５９，３１７号（ｃｒｅ．ｌｏｘＰについて）及びＯ’Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１：１３５１−１３５５；米国特許第５，６５４，１８２号（ＦＬＰ／ＦＲＴについて））。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系がトランスジーンの発現を調節するために使用される場合、両Ｃｒｅリコンビナーゼと選ばれたタンパク質をコードしているトランスジーンを含有する動物が要求される。そのような動物は、「二重の」トランスジェニック動物の構築をとおして、たとえば、２種のトランスジェニック動物、選ばれたタンパク質をコードしているトランスジーンを含有する一方と、リコンビナーゼをコードしているトランスジーンを含有する他方との交配によって提供できる。
【００９５】
本発明は、また、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡトランスジーンの優性阻害及び構成活性の突然変異体形式を提供する。これらの突然変異体トランスジーンは、これらのＧＰＣＲ及び治療可能性に関する研究を可能にする。いくつかの実施形態において、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの優性阻害突然変異体形式をコードする核酸配列を備える発現ベクターが非ヒトの胚又は細胞に導入され、また、その結果生じるトランスジェニック動物又は細胞は対象ＧＰＣＲの優性阻害発現を有する。
【００９６】
優性阻害突然変異は、たとえば部位特異的変異誘発法により（当該技術分野において既知の任意の手段により）、優性阻害効果を与えるタンパク質配列のある領域へ導入されてもよい。たとえば、限定する趣旨ではないが、ハムスターα１アドレナリン受容体におけるアミノ酸位置３０３（Ｆ３０３ＧとＦ３０３Ｎ）でのフェニルアラニンが、このＧＰＣＲの優性阻害効果を与えることに関係していることが証明された（Ｃｈｅｎ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ（２０００）ＥＭＢＯ  Ｊ．１９（１６）：４２６５−４２７１）。ＧＰＣＲタンパク質のこの領域は高度に保存されるので、したがって、それは保存配列を備えたＧＰＣＲのための同様の優性阻害受容体を生成するであろう（Ｃｈｅｎ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ（２０００）ＥＭＢＯ  Ｊ．１９（１６）：４２６５  ａｔ  ｐａｇｅ  ４２７０）。この領域は、たとえばＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３、ＥＤＮＲＡ並びにハムスターα１アドレナリン受容体、ヒスタミン（Ｈ１）、ドーパミン（Ｄ２）、ムスカリン（Ｍ３）、及びアンジオテンシンＩＩ（ＡＴ１）の中に実際に保存される。したがって、図１６において箱で囲まれている、特にフェニルアラニンに対するこの領域に対する突然変異は、優性阻害突然変異体を生成するのに有用である。Ｄｏｓｉｌ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ１８（１０）：５９８１−５９９１によって発見されたように、ＧＰＣＲの細胞外ドメインにおける更なる突然変異は、ＧＰＣＲの細胞外ドメインのカルボキシル末端領域に対して、又はＬｅａｖｉｔｔ  Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６１（６）：９１７−９３２によって報告されたのと相似の領域において閉じる。
【００９７】
いくつかの実施形態において、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡをコードする核酸配列を備える発現ベクターは、ＧＰＣＲタンパク質の構成的発現を駆動するプロモータに操作可能に結合される。これらの配列は非ヒト胚へ導入され、得られるトランスジェニック動物は対象ＧＰＣＲの構成的発現を有する。構成的プロモータは当該技術分野において周知であり、限定事項でないが、ＳＶ４０、サイトメガロウィルス・プロモータ（たとえば、ＣＭＶ５）、ヒトＣＭＶエンハンサ／鶏ｂ−アクチン・プロモータ、マウスｐｇｋプロモータ、及びヒト・ユビキチンＣプロモータを含む。
【００９８】
他の実施形態において、他のＧＰＣＲについての文献に記載されているのと同様の方法により、構成的に活性なタンパク質へと繋がるアミノ酸配列の中に置換を有するために、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡタンパク質は部位特異的変異誘発法によって変化される。限定するものでないが、たとえば次のものがある：Ｖｉｓｃｈｅｒ  Ｈ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２７（１）：５６−６３；  Ｍｉｕｒａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（１８）：１８２３７−１８２４４；Ｌａｄｄｓ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５（２）：４８２−４９７；Ｚｈａｎｇ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１６（２）：５６２−５７２；Ｃｏｔｅｃｃｈｉａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ１（２）：３１１−３１６；Ｂｅｈａｎ  Ｄ．Ｐ．ａｎｄ  Ｄ．Ｔ．Ｃｈａｌｍｅｒｓ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ４（５）：５４８−５６０；Ｐａｒｎｏｔ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．１３（８）：３３６−３４３；及びＥｇａｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６１：１３６−１３９。
【００９９】
いくつかの実施形態において、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの発現を駆動する使用されたプロモータは、組織特異的かもしれない。これは、動物の選択された組織におけるＧＰＣＲの構成的発現を可能にする。そのような構成的に発現されたＧＰＣＲは、治療可能性の評価のためのＧＰＣＲ活性を調節する化合物のためにスクリーニングに有用である。また、組織特異的プロモータは当該技術分野において周知であり、限定事項でないが、ニューロンにおける高い発現を促進するニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）；ニューロンにおける高い発現を促進するチューブリンα１（Ｔ−α１）；星状細胞における高い発現を促進する神経膠線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；心筋細胞における高い発現を促進するミオシンＬ鎖−２（ＭＬＣ２）；内皮細胞における高い発現を促進するプレプロエンドテリン−１（ＥＴ−１）；内皮細胞における高い発現を促進するｔｉｅ（ｔｉｅ）；血管平滑筋細胞において高い発現を促進するＳＭ２２ａ（ＳＭ２２ａ）；肝細胞における高い発現を促進するα１抗トリプシン（α１−ＡＴ）；肝細胞における高い表現を促進するアルブミン（ＡＬＢ）；ステロイド産生細胞において高い発現を促進する側鎖分裂酵素（ＳＣＣ）；及び腎の近位の尿細管細胞において高い発現を促進する腎臓アンドロゲン応答タンパク質（ＫＡＰ）を含む。
【０１００】
本発明はまた、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡ２、融合タンパク質を提供するが、そこでは、融合タンパク質パートナーをおおざっぱに又は組織学的に視覚化することができる。簡単には、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡと視覚化又は容易に同定可能なタンパク質との枠内接合部を有する発現構成物が生産される。そのような融合タンパク質は、たとえば、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）及び当該技術分野において周知の他のものを含む。そのような構成物は、動物（たとえば相同組換えにより）又は細胞（種々のトランスフェクション技術を通じて）へ導入され、Ｇタンパク質、細胞内局在性、これらのＧＰＣＲ標的の生理的で、病態生理学上の且つメタボリックな変化のような他のシグナリング分子との間の分子の相互作用を研究するために有用である。
【０１０１】
本発明は、また、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡプロモータによって駆動されるＧＦＰ蛍光性リポータ構成物を提供する。そのような構成物は、たとえばＧＦＰのようなリポータに、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡプロモータを操作可能に結合することにより生成される。そのような構成物は、これらのＧＰＣＲの発現についての薬学的ないし遺伝的な調節の研究を促進するために、（たとえば相同組換えによる）動物に又は（種々のトランスフェクション技術を通じて）細胞に導入されてもよい。たとえばＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡのためのプロモータの制御の下でＧＦＰを発現するトランスジェニックのゼブラフィッシュは、これらのＧＰＣＲの発現レベルを調節することができる、治療薬剤や遺伝子変更因子を同定するために、大規模の薬剤スクリーニング又は遺伝子スクリーニングを促進するのに有用である。ＣＸＣＲ４のためのプロモータは、当該技術分野において既知であり、たとえば、Ｈａｖｉｖ  Ｙ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．３（６）：６８７−６９１；Ｍｏｒｉｕｃｈｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ１５（９）：８２１−８２７；Ｍｏｒｉｕｃｈｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１０）：５９８６−５９９２；また、Ｃａｒｕｚ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４２６（２）：２７１−２７８；Ｍｏｒｉｕｃｈｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９（９）：４３２２−４３２９において見出される。ＥＤＮＲＡのためのプロモータも当該技術分野において既知であり、たとえば、Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（２６）：１５９９３−１５９９９及びＹａｍａｓｈｉｔａ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２６  Ｓｕｐｐｌ３：Ｓ２６−２８に記載されている。
４．  脊椎動物のポリペプチド
【０１０２】
本発明は、また、脊椎動物のＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡポリペプチドを提供する。ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡポリペプチド、その変異体、フラグメント及び抗原部分は、いかなる脊椎動物種から得られてもよい。ある実施態様では、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡポリペプチドはマウス又はラットから得られる。他の実施態様では、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡポリペプチドはヒトから得られる。他の実施態様では、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡポリペプチドは魚、たとえばゼブラフィッシュから得られる。いくつかの実施形態において、ＣＸＣＲ４ポリペプチドは、配列番号２、配列番号８、又は配列番号３３のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＬＥＣ３ポリペプチドは、配列番号４、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２７、又は配列番号２８のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＥＤＮＲＡポリペプチドは、配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２３のアミノ酸配列を有する。
【０１０３】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」との用語は、ここでは交換可能に使用される。「ポリペプチド」は、特定の長さを指すことなくアミノ酸のポリマーを指す。本発明のポリペプチドは、ペプチドフラグメント、誘導体及び融合タンパク質を含む。ペプチドフラグメントは、好ましくは、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００個のアミノ酸を有する。本発明の若干のペプチドフラグメントは生物学的に活性である。生物学的活性は、免疫原性、リガンド結合及び参照ペプチドに関連する活性を含む。本発明の免疫原性ペプチド及びフラグメントは、エピトープ特異的免疫応答を生成し、ここで、「エピトープ」はペプチドの免疫原性決定基を指し、そして好ましくは、少なくとも３、５、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、４５又は５０個のアミノ酸を含有する。本発明の若干の免疫原性ペプチドはそのペプチドに特異的な免疫応答を生じる。本発明のポリペプチドは、自然に存在するペプチド及び自然には存在しないペプチドを含む。この用語は、改変ポリペプチド（この場合、そのような改変の例は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、カルボン酸化、ユビキチン化、標識化などを含む）、類似体（例えば自然に存在しないアミノ酸、置換結合など）及び機能的擬似物を含む。ポリペプチドを標識する種々の方法は当該技術分野において周知であり、そして放射性アイソトープ、たとえば３２Ｐ又は３５Ｓ、標識されたアンチリガンド（たとえば、抗体）に結合するリガンド、蛍光団、化学発光剤、酵素及びアンチリガンドを含む。
【０１０４】
ここで使用されるように、「アミノ酸」との用語は、アミノ基及びカルボキシル基の両方を含有する分子をいう。ある実施態様では、アミノ酸は、それらの立体異性体及びラセミ化合物を含む、α−、β−、γ−又はδ−アミノ酸である。ここで使用されるように、「Ｌ−アミノ酸」との用語は、α−炭素の周囲にＬ立体配置を有するα−アミノ酸、すなわち、Ｌ−立体配置を有する一般式ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＮＨ２）−（側鎖）のカルボン酸を指す。「Ｄ−アミノ酸」との用語は、同様に、α−炭素の周囲にＤ−立体配置を有する一般式ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＮＨ２）−（側鎖）のカルボン酸を指す。Ｌ−アミノ酸の側鎖は、自然に存在する部分及び自然に存在しない部分を含む。自然に存在しない（すなわち、非天然）アミノ酸側鎖は、たとえば、アミノ酸類似体における自然に存在するアミノ酸側鎖の代わりに使用される部分である。アミノ酸置換体は、たとえば、それらのカルボニル基、その酸素又はカルボニル炭素、又はそれらのアミノ基、又はそれらの側鎖部分に存在する官能基をとおして結合されてもよい。
【０１０５】
アミノ酸配列は、右から左へ、アミノ（Ｎ）〜カルボキシ（Ｃ）方向において示される。Ｎ−末端α−アミノ基及びＣ−末端β−カルボキシ基は配列において描かれない。アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される方式で表されるか、又はアミノ酸は、それらの３文字コード指名によって表される。
【０１０６】
本発明は、また、細胞透過性ペプチドの使用を意図する。細胞透過性ペプチドは、ニューロン変性（Ｂｏｒｓｅｌｌｏ  Ｔ，ａｎｄ  Ｃ．Ｂｏｎｎｙ（２００４）“Ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｉａｂｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０（５）：２３９−４４）及びＡｂｅｔａｌ−４０原線維発生（Ｇｏｒｄｏｎ  Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）“Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ａｂｅｔａｌ−４０  ｆｉｂｒｉｌｌｏｇｅｎｅｓｉｓ”Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．６０（１）：３７−５５）を含む種々の経路の機能を抑制するように設計された。細胞透過性ペプチドを設計する方法は当該技術分野において既知であり、そして例えば、Ｄｕ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）“Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ”Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．５１：（３）：２３５−２４３において記述されている。ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３若しくはＥＤＮＲＡ及び／又はＶＥＧＦ由来の細胞透過性ペプチドもまた、被験者における血管新生を抑制し、そして血管新生関連の疾病及び血管新生依存性腫瘍を処置するために本発明の方法において使用されてもよい。どのペプチドがそのような目的のために有用であるかを決定するために、ここで記述されるスクリーニング手法が使用されて、日常的に、機能的な細胞透過性ペプチドをスクリーニングすることができる。
５．  脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡを特異的に認識する種々の抗体
【０１０７】
本発明は、脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３若しくはＥＤＮＲＡ、又はエピトープが配列番号２、配列番号８、配列番号３３、配列番号４、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２７、配列番号２８、配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２３のアミノ酸配列の少なくとも一部分を含む脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３若しくはＥＤＮＲＡのフラグメントを、特異的に認識するＣＤＲ配列を含む化合物を含む、抗体（例えば、モノクローナル及びポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、二価／二重特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体及び相補性決定部（ＣＤＲ）をグラフトされた抗体）を提供する。
【０１０８】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖを含む、抗体フラグメントもまた、本発明によって提供される。本発明の抗体を記述するために使用される場合、「に対して特異的」との用語は、本発明の抗体の可変部が、排他的に脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡを認識し、かつ結合することを示す（すなわち、脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡと他のＧＰＣＲファミリーメンバーとの間に局限される配列の同一性、相同性又は類似性の可能な存在にもかかわらず、結合親和力における測定可能な差異のために他の異なるＧＰＣＲから脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡを区別することができる）。「高い結合親和力」は、約５ｘ１０−８Ｍを超える、好ましくは約５ｘ１０−８Ｍ〜約５ｘ１０−１２Ｍの結合親和力を指し、ある実施態様では、結合親和力は約５ｘ１０−９Ｍ〜約５ｘ１０−１１Ｍであり、ある実施態様では、結合親和力は約５ｘ１０−７Ｍ〜約５ｘ１０−８Ｍであり、ある実施態様では、結合親和力は約５ｘ１０−８Ｍ〜約５ｘ１０−９Ｍであり、ある実施態様では、結合親和力は約５ｘ１０−９Ｍ〜約５ｘ１０−１０Ｍであり、ある実施態様では、結合親和力は約５ｘ１０−１０Ｍ〜約５ｘ１０−１１Ｍである。
【０１０９】
また、特異的抗体は、抗体の可変部の外側、特に分子の定常部における配列との相互作用を介して他のタンパク質（たとえば、黄色ブドウ球菌プロテインＡ又はＥＬＩＳＡ技術における他の抗体）と相互作用してもよいことが理解できる。本発明の抗体の結合特異性を決定するスクリーニングアッセイは周知であり、かつ当該技術分野において日常的に実施されている。そのようなアッセイの包括的な議論については、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８．Ｃｈａｐｔｅｒ６、参照。抗体が脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡに対して特異的であれば、脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡのフラグメントを認識し、結合する抗体もまた考慮される。本発明の抗体は、当該技術分野において周知であり、かつ日常的に実施されるいかなる方法を用いても作成することができる。
【０１１０】
ポリクローナル抗体の生産では、種々の適当な宿主動物（たとえば、ウサギ、ヤギ、マウス又は他の哺乳動物）が、生来のポリペプチド、またはその合成変異体、または前者の誘導体を注射することによって免疫化されてもよい。適当な免疫原性調製物は、たとえば、組換え技術により発現された脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチド、又は化学的に合成された脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチドを含んでもよい。調製物はアジュバントをさらに含む。免疫学的応答を増強するために使用される種々のアジュバントは、限定されるものではないが、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ（完全及び不完全）、金属ゲル（たとえば、水酸化アルミニウム）、界面活性剤（たとえば、リゾレシチン、プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｏｌ）、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノールなど）、ヒト・アジュバント、たとえばＢａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ及びコリネバクテリウム・パルブム、又は類似の免疫刺激剤を含む。必要であれば、脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡに対向される抗体分子は、哺乳動物（たとえば、血液から）から単離でき、さらに周知の技術、例えばＩｇＧ画分を得るためのプロテインＡクロマトグラフィーによって精製できる。
【０１１１】
ここで使用されるように、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」との用語は、脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの特定のエピトープと免疫反応することが可能な抗原結合部位の１種のみを含有する抗体分子の集団を指す。したがって、モノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応する特定の脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチドに対する単一の結合親和力を表す。特定のＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチド、又はその誘導体、フラグメント、類似体又は同族体に対向されるモノクローナル抗体の調製のためには、連続細胞系培養による抗体分子の生産のために提供するいかなる技術が利用されてもよい。そのような技術は、限定されるものではないが、ハイブリドーマ技術（参照、Ｋｏｈｌｅｒ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５  Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７）；トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（参照、Ｋｏｚｂｏｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ４：７２）およびヒトモノクローナル抗体を生産するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（参照、Ｃｏｌｅ，ｅｔ  ａｌ，．１９８５  Ｉｎ：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）を含む。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施において利用されてもよく、ヒトハイブリドーマを使用することによって（参照、Ｃｏｔｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：２０２６−２０３０）又はインビトロにおいてエプスタイン・バールウイルスによるヒトＢ細胞の形質転換によって（参照、Ｃｏｌｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｉｎ：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）生産されてもよい。
【０１１２】
本発明によれば、いくつかの技術を、脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチドに特異的な一本鎖の抗体の生産のために適用できる（参照、たとえば、米国特許第４，９４６，７７８号）。さらに、いくつかの方法を、Ｆａｂ発現ライブラリの構築のために適用でき（参照、例えば、Ｈｕｓｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５−１２８１）、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチド、又はその誘導体、フラグメント、類似体又は同族体に対する所望の特異性をもつモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効率的な同定が可能になる。非ヒト抗体は、当該技術分野における周知の技術によって「ヒト化」することができる。参照、たとえば、米国特許第５，２２５，５３９号。ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチドに対するイディオタイプを含有する抗体フラグメントは、限定されるものではないが、（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって生産されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成されるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパイン及び還元剤による抗体分子の処理によって生成されるＦａｂフラグメント；並びに（ｉｖ）Ｆｖフラグメントを含む、当該技術分野において既知の技術によって生産されてもよい。
【０１１３】
さらに、組換え抗脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ抗体、たとえば標準の組換えＤＮＡ技術を用いて作成できる、ヒト及び非ヒトの両部分を含んでなる、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、本発明の範囲内にある。そのようなキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、たとえば、国際出願番号ＰＴＣ／ＵＳ８６／０２２６９；欧州特許出願番号第１８４，１８７号；欧州特許出願番号第１７１，４９６号；欧州特許出願番号第１７３，４９４号；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；米国特許第５，２２５，５２９号；欧州特許出願番号第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ  ｅｔａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１４：４４６−４４９；Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５３３−１５５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｈｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：２１４；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；及びＢｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記述される方法を用いる、当該技術分野において既知の組換えＤＮＡ技術において生産することができる。
【０１１４】
一実施態様では、所望の特異性をプロセスする抗体のスクリーニング方法は、限定されるものではないが、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び当該技術分野において既知の他の免疫学的に媒介される技術を含む。ある特定の実施態様では、ゼブラフィッシュＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチドの特定のドメインに特異的である抗体の選択は、脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチドのフラグメントに結合して、そのようなドメインをプロセスするハイブリドーマの生成によって容易になる。脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチド、又はその誘導体、フラグメント、類似体又は同族体におけるＩｇ様ドメインに特異的である抗体もまたここに提供される。
【０１１５】
抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＬＥＣ３抗体又は抗ＥＤＮＲＡ抗体は、脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチドの局在性及び／又は定量に関する当該技術分野において既知の方法において使用されてもよい（たとえば、適当な生理学的サンプルにおける脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチドのレベルの測定における使用、診断方法における使用、ポリペプチドの造影における使用などのために）。一定の実施態様では、抗体由来の結合ドメインを含有する脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチド、又はその誘導体、フラグメント、類似体又は同族体に関する抗体は、薬理学的に活性のある化合物（以下、「治療剤」）として利用される。
【０１１６】
抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＬＥＣ３抗体又は抗ＥＤＮＲＡ抗体（たとえば、モノクローナル抗体）は、標準技術、たとえばアフィニティークロマトグラフィー又は免疫沈降によってゼブラフィッシュＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡを単離するために使用することができる。抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＬＥＣ３抗体又は抗ＥＤＮＲＡ抗体は、細胞からの天然のＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ及び宿主細胞において発現された組換え体として生産される脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの精製を容易にすることができる。さらに、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＬＥＣ３抗体又は抗ＥＤＮＲＡ抗体は、脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチドの発現の量及びパターンを評価する目的で、脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチド（たとえば、細胞溶解物における）を検出するために使用できる。抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＬＥＣ３抗体又は抗ＥＤＮＲＡ抗体は、臨床試験手法の部分として組織におけるタンパク質レベルを追跡するために、たとえば、特定の治療法の効能を決定するために診断的に使用することができる。検出は、検出可能な物質に抗体を結合（すなわち、物理的に連結すること）させることによって容易にすることができる。検出可能な物質の例は、種々の酵素、補欠分子基、蛍光材料、発光材料、生物発光材料および放射性材料を含む。適当な酵素の例は、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼを含み；適当な蛍光材料の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリンを含み；発光材料の例はルミノールを含み；生物発光材料の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びアセクォリン（ａｃｅｑｕｏｒｉｎ）を含み、そして適当な放射性材料の例は、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、硫黄−３５又はトリチウムを含む。さらに、本発明の抗体は、毒物、例えば放射性アイソトープ、タンパク質毒素及び化学毒物に複合されてもよい。そのような毒物は、限定されるものではないが、鉛−２１２、ビスマス−２１２、アスタチン−２１１、ヨウ素−１３１、スカンジウム−４７、レニウム−１８６、レニウム−１８８、イットリウム−９０、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、臭素−７７、インジウム−１１１、ホウ素−１０、アクチニド、リシン、アドリアマイシン、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）及び５−フルオロウラシルを含む。
【０１１７】
ＬＥＣ３は細胞表面受容体であるので、ＬＥＣ３に対する抗体には特別の有用性がありうる。したがって、抗体はＬＥＣ３の外部環上で作用しうる。抗体は、細胞の外部表面上に存するであろうと予測された推定アミノ酸配列に由来する単離されたペプチドに対して、上昇されていてもよい（図３Ａ−Ｂを参照）。細胞の外部表面上に存するであろうと予測されたＬＥＣ３ポリペプチド配列の部分は、配列番号１６のアミノ酸１−８０６と；配列番号１６のアミノ酸８６１−８６８と；配列番号１６のアミノ酸９３０−９４７と；配列番号１６のアミノ酸１０２６−１０２８と；を含む。
６．  薬剤組成物
【０１１８】
ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡ核酸分子、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡポリペプチド（タンパク質の細胞透過性改変バージョンを含む）並びに抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＬＥＣ３抗体及び抗ＥＤＮＲＡ抗体（ここでは「有効成分」としても参照される）、及びその誘導体、フラグメント、類似体及び同族体は、投与のために適当な治療学的に有効な量において薬剤組成物中に組み入れることができる。そのような組成物は、典型的には、核酸分子、タンパク質又は抗体及び製薬学的に許容され得る担体を含む。ここで使用されるように、「薬剤学的に許容され得る担体」は、製薬学的投与に適合する、いずれか及び全ての溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤などを含むことを意図している。適当な担体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、当該分野における標準的参考テキストの最新版に記述されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。そのような担体又は賦形剤の好適な例は、限定されるものではないが、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液及び５％ヒト血清アルブミンを含む。リポソーム及び非水性媒質、たとえば不揮発油がまた使用されてもよい。製薬学的活性物質のためのそのような媒質及び作用物の使用は当該技術分野においては周知である。いずれか慣用の媒質又は作用物が活性化合物と適合しない限りそれを除いて、組成物におけるその使用が考えられる。補足的な活性化合物がまた組成物中に組み入れられてもよい。
【０１１９】
本発明の薬剤組成物は、その意図される投与経路に適合するように調合される。投与経路の例は、非経口的、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（たとえば、吸入）、経皮（局所的）、経粘膜及び肛門投与を含む。非経口、皮内又は皮下適用のために使用される液剤又は懸濁剤は次の成分を含む：無菌希釈剤、たとえば注射用の水、無菌食塩水、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗菌剤、たとえばベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、たとえばアスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、たとえばエチレンジアミン四酢酸；バッファー、たとえば酢酸、クエン酸又はリン酸塩、及び等張性調節用作用物、たとえば塩化ナトリウム又はデキストロース。ｐＨは、酸又は塩基、たとえば塩酸又は水酸化ナトリウムにより調節することができる。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器又はガラス又はプラスチック製の多用量バイアル中に封入することができる。
【０１２０】
注射用途のために適当な製薬学的組成物は、無菌の水性液剤（ここでは水溶性）または分散剤、及び無菌の注射用液剤又は分散剤の即席調製のための無菌散剤を含む。静脈内投与では、適当な担体は、生理学的食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）又はリン酸バッファー食塩水（ＰＢＳ）を含む。すべての場合において、組成物は無菌であらねばならず、そして容易に注射可能である程度に流体でなければならない。それは、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、そして細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に対して防御されなければならない。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適当な混合液を含有する溶媒又は分散媒質であってもよい。適当な流動性は、たとえば、レシチンのようなコーティングの使用、分散剤の場合に要求される粒径の維持及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用防御は、種々の抗菌及び抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、たとえば、糖、マンニトールのようなポリアルコール、ソルビトール及び塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の遅延吸収は、吸収を遅らせる作用物、たとえばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含むことによってもたらされる。
【０１２１】
無菌の注射用液剤は、要求される先に列挙された成分の１種又は組合せ物を含む適当な溶媒中に要求される量において活性化合物（たとえば、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３若しくはＥＤＮＲＡポリペプチド又は抗ＣＸＣＲ４、抗ＬＥＣ３若しくは抗ＥＤＮＲＡ抗体）を組み入れ、続いての無菌ろ過によって調製できる。一般に、分散剤は  、基剤の分散媒質及び先に列挙されたものからの要求される他の成分を含有する無菌媒質中に活性化合物を組み入れることによって調製される。無菌注射用液剤の調製のための無菌散剤の場合には、調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、これらは、予め無菌濾過された溶液から、有効成分に加えて任意のさらに所望の成分の粉末を生成する。
【０１２２】
経口組成物は、一般に、不活性な賦形剤及び食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセル中に封入されるか又は錠剤に圧縮することができる。経口的治療投与の目的では、活性化合物は添加物とともに組み入れられ、そして錠剤、トローチ剤又はカプセル剤の形態で使用することができる。また経口組成物は、口内洗浄液としての使用のために流体担体を用いて調製されてもよく、この場合、流体担体中の化合物は、経口的に適用され、ウガイをして吐き出されるか又は飲み下される。製薬学的に適合する結合剤及び／又は補助材料は組成物の一部として含まれてもよい。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは任意の次の成分又は類似の性質をもつ化合物を含有してもよい：結合剤、たとえば微結晶セルロース、トラガカントガム又はゼラチン；添加物、たとえば澱粉又はラクトース、崩壊剤、たとえばアルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ又はコーンスターチ；滑沢剤、たとえばステアリン酸マグネシウム又はＳｔｅｒｏｔｅｓ；滑り剤、たとえばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、たとえばスクロース又はサッカリン；又は香味剤、たとえばペパーミント、サリチル酸メチル又はオレンジフレーバ。
【０１２３】
吸入による投与では、化合物は、適当な噴射剤、たとえば二酸化炭素のような気体を含有する加圧容器又はディスペンサ、又はネブライザーからのエアゾル噴霧の形態で送達される。
【０１２４】
また、全身投与は、経粘膜又は経皮手段によるものであってもよい。経粘膜又は経皮投与のためには、透過されるべきバリヤーに適する浸透剤が調合物において使用される。そのような浸透剤は、一般に当該技術分野において既知であり、たとえば、経粘膜投与では、洗剤、胆汁塩及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻内噴霧剤又は坐剤の使用によって達成できる。経皮投与では、活性化合物は、当該技術分野において一般に既知の軟膏剤、膏薬、ゲル剤又はクリーム剤に調合される。
【０１２５】
また化合物は、坐剤（たとえば、ココアバター及び他のグリセリドのような慣用の坐剤基剤を用いて）又は直腸送達のための保持浣腸剤の形態で調製されてもよい。
【０１２６】
一実施態様では、活性化合物は、たとえばインプラント及び微小内包送達システムを含む徐放性調合物などの、身体からの急速な排除に対して化合物を保護するであろう担体とともに調製される。生体分解性、生体適合性ポリマー、たとえばエチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸が使用されてもよい。そのような調合物の製造方法は、当業者には明らかである。また材料はＡｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販品を得ることができる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を含有する感染細胞に対して標的化されたリポソームを含む）もまた、製薬学的に許容され得る担体として使用できる。これらは、たとえば、米国特許第４，５２２，８１１号に記述されるような当業者に既知の方法に従って製造することができる。
【０１２７】
投与の容易さ及び用量の均一性のために用量単位形態物において経口又は非経口組成物を調合することは特に得策である。ここで使用されるような用量単位形態物は、処置される被験者のために単位用量として適合された物理的に区別された単位物を指し；  各単位物は、要求される製薬学的担体と合わせて所望される治療効果を生じるように計算された活性化合物の予定量を含有する。本発明の用量単位形態物に関する詳細は、活性化合物の独特な特性及び達成されるべき特定の治療効果、並びに個人の処置のためにそのような活性化合物を調合することの技術上固有の制約によって指示され、そしてそれらに直接依存する。
【０１２８】
本発明の核酸分子はベクター中に挿入され、そして遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、たとえば、静脈内注射、局所投与（参照、米国特許第５，３２８，４７０号）又は定位注射（参照、たとえば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３０５４−３０５７）によって被験者に送達できる。遺伝子治療ベクターの薬剤調製物は、許容できる賦形剤中に遺伝子治療ベクターを含むか、又は遺伝子送達担体が包埋されている徐放性マトリックスを含むことができる。あるいはまた、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞からインタクトに生産できる、たとえばレトロウイルスベクターの場合は、薬剤調製物は、遺伝子送達システムを生産する１種以上の細胞を含むことができる。
【０１２９】
薬剤組成物は、投与についての指示書とともに、容器、包装物又はディスペンサ中に包含されてもよい。
７．  血管新生を調節する方法
【０１３０】
血管新生に関連する疾病は、治療剤の開発のための薬物標的として、本発明の脊椎動物ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡタンパク質を用いて診断及び処置することができる。血管新生に関連する疾病は、限定されるものではないが、たとえば、固形腫瘍、白血病などの血液を発生起源とする腫瘍、及び腫瘍転移物を含む、血管新生依存性のがん；良性腫瘍、たとえば血管腫、聴覚性神経腫、神経線維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫；リウマチ様関節炎；乾癬；眼の新脈管形成疾患、たとえば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、皮膚潮紅；オースラー・ウェバー症候群；心筋血管新生；プラーク新生新脈管形成；末梢血管拡張症；血友病性関節；線維性血管腫；創傷肉芽を含む。ある実施態様では、最終目的は被験者における新脈管形成を促進することである。かくして、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３若しくはＥＤＮＲＡ又はその生産物は、限定されることなく、創傷治癒を促進し、血管移植手術における内皮形成を促進し、そして心筋梗塞後の血管損傷を治癒するように内皮形成を促進するために使用することができる。
【０１３１】
本発明は、動物における血管新生を調節する方法を提供する。ある実施態様では、当該方法は血管新生を促進する。ある実施態様では、当該方法は血管新生を抑制する。
Ａ．  血管新生の促進
【０１３２】
本発明のある実施態様では、血管新生はＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの発現を増強することによって細胞において促進される。本発明の方法では、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡをコードしている核酸配列は、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの増強された発現を促進するように細胞に投与される。核酸配列は、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ核酸分子が生物活性を有するＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡをコードしていれば、いかなるＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡであってもよい（すなわち、いかなる種から得られてもよい）。ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡをコードしているポリヌクレオチドはここに記述されるような発現ベクターの一部であってもよい。細胞及び動物中に核酸を導入する方法は当該技術分野において既知である。ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡをコードしている使用されてもよいポリヌクレオチドは、限定されるものではないが配列番号１、配列番号７、配列番号３２、配列番号３、配列番号９、配列番号５、配列番号１１、配列番号１９又は配列番号３５を含む。ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの発現の量は、プロモータの強さ、及び適当な系のために選ばれる組織特異的因子によって指導されてもよい。一般に、発現量は血管新生が促進されるようなものでなければならない  。生物学的経路を活性化するためには、ある実施態様ではＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ単独で十分であるが、他の実施態様ではＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの２つ以上が用いられる。したがって、本発明は、また、血管新生の促進のためのＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡの２つ以上の同時発現を備える。同時発現は、当該技術分野において既知の任意の手段によって達成することができる。２つのポリペプチドをコードしている核酸は、同じ発現ベクター中に組み込まれてもよく、別々の発現ベクターにおいて存在してもよい。細胞へのベクターのトランスフェクションは同時でも連続であってもよい。２種のサブユニットの発現は、一方又は両方のポリペプチドの制御発現を可能にするために、同じ調節要素又は異なる調節要素の制御下に存在してもよい。また、いずれか又は両ポリペプチドの発現は構成的であるように作成されてもよい。
Ｂ．  抗血管新生
【０１３３】
本発明のある実施態様では、血管新生は、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの発現を減少させるか、又はＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの機能を抑制することによって細胞において抑制される。血管新生は、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡに対して標的化される化合物、たとえば天然又は合成の低分子を含む化学化合物、アンチセンスＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ分子又はＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡに対する抗体の使用をとおして抑制されてもよい。血管新生を抑制するポリヌクレオチドは、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリヌクレオチドに結合し、そしてＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの発現又はＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡＲＮＡの正確なスプライシングを抑制するそれらである。ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ発現を抑制するアンチセンス分子の例は、限定するものでないが、５’−ｃｇｃｃｃｇａｔｃｔｃａｔｃｔａｃａｇａａａｇａｇ−３’（配列番号２４）（ゼブラフィッシュ遺伝子に対するＭＯ−ＬＥＣ３（スプライシング抑制のためのアンチセンス））；５’−ｔａａｇｃｃａｔｃｔｃｔａａａａｇａｃｔｔｃｔｃｃ−３’（配列番号２５）（ゼブラフィッシュ遺伝子に対するＭＯ−ＣＸＣＲ４ａ（翻訳ブロッキングのためのアンチセンス））；５’−ｇｃｃａｔｔｇｃａｇａａｃａｃｔｇｇｃｃｇｃｔｃｔ−３’（配列番号２６）（ゼブラフィッシュ遺伝子に対するＭＯ−ＥＤＮＲＡ（翻訳ブロッキングのためのアンチセンス））、を含む。
【０１３４】
ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの機能を抑制するために投与されてもよい化合物は、天然又は合成の低分子を含む化学化合物、特異的にＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡを結合するポリクローナル及びモノクローナル抗体を含む。被験者に投与された場合、抗体が被験者の細胞によって産生されるＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡを特異的結合するならば、抗体はいかなる既知のＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡを結合する抗体であってもよい。
Ｃ．  抗血管新生併用療法
【０１３５】
本発明の他の実施態様では、血管新生は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の発現及び／又は機能の調節と組み合わせて、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの発現及び／又は機能を操作することによって調節される。ある実施態様では、血管新生は、ＶＥＧＦをコードしている核酸と組み合わせて、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡをコードしている核酸を投与することによって刺激される。ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ及びＶＥＧＦ核酸は、単一の発現ベクター又は別々の発現ベクターにおいて存在してもよい。ＶＥＧＦ及びＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ核酸は同時又は別々に投与されてもよい。他の実施態様では、血管新生は、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの発現又は機能を低下させる化合物及びＶＥＧＦの発現又は機能を低下させる化合物を投与することによって抑制される。ある実施態様では、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの発現を低下させる化合物はアンチセンス・オリゴヌクレオチドである。他の実施態様では、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの発現を低下させる化合物はＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡに対向されるモルホリノである。ある実施態様では、ＶＥＧＦの発現を低下させる化合物はアンチセンス・オリゴヌクレオチドである。他の実施態様では、ＶＥＧＦの発現を低下させる化合物はＶＥＧＦに対向されるモルホリノである。ある実施態様では、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの機能を抑制する化合物は抗ＣＸＣＲ４、抗ＬＥＣ３又は抗ＥＤＮＲＡポリクローナル又はモノクローナル抗体である。ある実施態様では、ＶＥＧＦの機能を抑制する化合物は抗ＶＥＧＦポリクローナル又はモノクローナル抗体である。参照、たとえば、Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．，Ｈｉｌｌａｎ，Ｋ．Ｊ．＆Ｎｏｖｏｔｎｙ，Ｗ．（２００５）“Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（Ａｖａｓｔｉｎ），ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ”Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｒｎｍｕｎ．３３３：３２８−３３５。
【０１３６】
ＶＥＧＦはクローン化されかつ配列決定されており、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄを含む多くの異なるＶＥＧＦが既知である。（ＶＥＧＦ生物学のレビューについては、Ｔａｍｍｅｌａ，Ｔ．，Ｅｎｈｏｌｍ，Ｂ．，Ａｌｉｔａｌｏ，Ｋ．，Ｐａａｖｏｎｅｎ，Ｋ．（２００５）“Ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ”Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．６５：５５０−５６３を参照。）生物学的に活性なＶＥＧＦを生産するいかなるＶＥＧＦをコードしている核酸が使用されてもよい。たとえば、限定されるものではないが、使用されてもよいＶＥＧＦをコードしている核酸は、ヒトＶＥＧＦ（配列番号５９）、（タンパク質：配列番号６０）、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ（配列番号６１）（タンパク質：配列番号６２）、ヒトＶＥＧＦ−Ｃ（配列番号６９）（タンパク質：配列番号７０）、ヒトＶＥＧＦ−Ｄ（配列番号７１）（タンパク質：配列番号７２）；マウスＶＥＧＦ−Ａ（配列番号６５）（タンパク質：配列番号６６）、マウスＶＥＧＦ−Ｂ（配列番号６３）（タンパク質：配列番号６４）、マウスＶＥＧＦ−Ｃ（配列番号７３）（タンパク質：配列番号７４）、マウスＶＥＧＦ−Ｄ（配列番号７５）（タンパク質：配列番号７６）；ゼブラフィッシュＶＥＧＦ（配列番号６７）（タンパク質：配列番号６８）などのＶＥＧＦコーディング核酸を含む。
【０１３７】
ある実施態様では、ＶＥＧＦの発現及び／又は機能はアンチセンス配列を投与することによって抑制される。アンチセンス配列は、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡアンチセンス配列について記述された一般的性質を有する。特定の実施態様では、たとえば、アンチセンス配列は、配列番号７７及び配列番号７９配列標的ゼブラフィッシュＶＥＧＦの配列を有する。ヒトＶＥＧＦ配列は、受入番号：ＮＭ＿００３３７６，Ｕｎｉｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ：Ｈｓ．７３７９３（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｇｅｎｅ  ＩＤ：ＥＮＳＧ０００００１１２７１５）の下で見い出される。
【０１３８】
ある実施態様では、ＶＥＧＦ機能は、抗ＶＥＧＦポリクローナル又はモノクローナル抗体の投与によって抑制される。抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の例は、ＡＶＡＳＴＩＮＴＩＮ（商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及びＢｉｏＣａｒｔａ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏｓ．０９−０６−１６４６０及び０９−０６−１１３３５を含む。ＶＥＧＦシグナル伝達経路はまた、ＶＥＧＦシグナル伝達を破壊する当該技術分野において既知のいかなるチロシンキナーゼ阻害剤、又は当該技術分野において既知のＶＥＧＦについてのいかなる他の種類の阻害剤によって抑制されてもよい。これらの阻害剤は、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの発現又は活性を調節するためのここに記述される戦略と組み合わせて使用されてもよい。
【０１３９】
ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ及びＶＥＧＦの機能を抑制するための実施態様では、機能又は生物学的活性を抑制するために使用される化合物は、低分子化合物、ポリヌクレオチド（たとえば、アンチセンス及びモルホリノ、リボザイムなど）；ＶＥＧＦ及びＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡに対する抗体；ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡと他の受容体（上流の受容体）、Ｇタンパク質パートナー及び下流のエフェクタとの相互作用をブロックする細胞透過性ペプチド；及びこれらのアプローチの組合せを含む。
８．  血管新生を促進し又は抑制する化合物のスクリーニング：
【０１４０】
本発明のその他の態様は、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３若しくはＥＤＮＲＡ又はＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡをコードしている核酸分子を試験化合物と接触させ、試験化合物がＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３若しくはＥＤＮＲＡ又はＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３若しくはＥＤＮＲＡをコードしている核酸分子を結合するか否かを決定することを含んでなる、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３若しくはＥＤＮＲＡ又はＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３若しくはＥＤＮＲＡをコードしている核酸分子の何れかに結合する化合物を同定する方法に関する。
【０１４１】
結合は、限定されるものではないがゲル−シフトアッセイ、ウエスタン・ブロット、放射能標識競合アッセイ、ファージに基づく発現クローニング、クロマトグラフィーによる同時分画、共沈、架橋、相互作用トラップ（ｔｒａｐ）／２−ハイブリッド解析、サウスウエスタン解析、ＥＬＩＳＡなどを含む、当該技術分野において既知のいかなる結合アッセイによっても決定することができ、これらは、たとえば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．に記述されている。そのような試験において使用されるＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３若しくはＥＤＮＲＡポリペプチド又はポリヌクレオチドは、溶液中で遊離であっても、固体支持体に接着されていても、細胞内に局在していても、細胞画分と会合されていてもよい。本発明の一実施態様では、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡに対して適当な結合親和力を有する化合物の高処理能スクリーニング（「ＨＴＳ」）が用いられる。多数の試験化合物が固定されたＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡに曝露されてもよい。結合されたＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡが、次に当該技術分野において周知の方法によって検出される。
【０１４２】
標的タンパク質のリガンドを同定するその他の方法は、Ｗｉｅｂｏｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６９：１６８３−１６９１（１９９７）において記述されている。この技術は、標的タンパク質への結合について溶液相において同時に２０〜３０の作用物の組み合わせライブラリをスクリーニングする。フィルタ上に保持されている標的タンパク質に特異的に結合する作用物は、続いて標的タンパク質から遊離され、ＨＰＬＣ及び空気圧によるエレクトロスプレー（イオンスプレー）イオン化質量分光法によって分析される。この手法は、標的タンパク質に対する最大親和力をもつライブラリ構成成分を選択し、かつ低分子ライブラリのために特に有用である。
【０１４３】
本発明の他の実施態様は、抗体に基づく競合スクリーニングアッセイの使用を含む。一実施態様では、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡに結合する特異的な中和抗体が、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡへの結合について試験化合物と特異的に競合する。この方式では、抗体は、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡとともに１種以上の抗原決定基を共有するいずれかのペプチドの存在を決定するために使用することができる。そのような結合の研究は、標識された抗体及び／又は標識された試験化合物を使用してもよい。そのような手法の例は、たとえば、Ｌｉｎ，Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ４１（１０）：２１２７−２１３１において見出すことができる。
【０１４４】
本発明のその他の態様は、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの生物学的活性を調節する（すなわち、増大させ又は減少させる）化合物を同定する方法に対向される。そのような方法は、試験化合物とＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡを接触させ、化合物が、試験化合物の不在下でのＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの活性に比較して、ポジティブ（アゴニスト）又はネガティブ（アンタゴニスト）な方式でＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの生物学的活性に影響を与えるか否かを決定することを含む。
【０１４５】
ある実施態様では、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡの発現又は生物学的活性を調節する化合物は、試験化合物が、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリペプチドを発現するか又はＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡポリヌクレオチドを有する、細胞とともにインキュベートされ、そして試験化合物がＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ発現又は生物学的活性に及ぼす効果を決定する、インビトロの細胞アッセイにおいて同定されてもよい。ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ活性のモジュレータは、血管新生を伴う疾病の処置において治療学的に有用であろう。インビトロで生物学的活性のＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ発現を調節するとして同定された化合物は、関連する有効な活性を確認するためにインビボにおいてさらに試験されてもよい。
【０１４６】
本発明によって考慮される試験化合物は、天然生産物及び／又は組合せ化学合成からの合成生成物を含む、化学ライブラリからの化合物を含む。そのような化合物は、ランダムペプチド、オリゴヌクレオチド又は有機分子を含んでもよい。
【０１４７】
ある実施態様では、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡプロモータに指導されるＧＦＰトランスジーンを担持しているトランスジェニックゼブラフィッシュは、化合物、低分子又は遺伝子生産物が、ＧＦＰの発現の変更をもたらす、ＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３又はＥＤＮＲＡ遺伝子のプロモータに及ぼす調節活性を有するか否かを検出するために使用される。活性の増大又は減少は、生存ゼブラフィッシュ内で生成された蛍光シグナルによって検出できるので、その結果、生物学的に活性のある薬物、低分子及び遺伝子生産物をスクリーニングするためのインビボモデルを提供する。
【０１４８】
本スクリーニング法によって同定された化合物は、単独で、又はＶＥＧＦを促進し若しくは抑制する化合物と組み合わせて、血管新生を促進し又は抑制するために本発明の方法において使用されてもよい。
【０１４９】
次に示す実施例は、本発明を具体的に説明するためにのみあり、いかなる点においても本発明を限定するものと考えてはならない。
実施例
実施例１
【０１５０】
保存魚：ダニオ・レリオ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）：Ｆｌｏｒｉｄａ野生種（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）及びＬｏｎｇｆｉｎ種（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈａｔｃｈｅｒｉｅｓ，Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ  Ｂｅａｃｈ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。
【０１５１】
ゼブラフィッシュのアンチセンスＣＸＣＲ４、ＬＥＣ３及びＥＤＮＲＡモルホリノ・オリゴヌクレオチド（Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ，ＬＬＣ，Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ，Ｏｒｅｇｏｎにて合成）は、次に示す配列を有した：ＣＸＣＲ４翻訳抑制アンチセンス・モルホリノ：５’−ｔａａｇｃｃａｔｃｔｃｔａａａａｇａｃｔｔｃｔｃｃ−３’（配列番号２５）；ＬＥＣ３スプライシング・アンチセンス・モルホリノ：５’−ｃｇｃｃｃｇａｔｃｔｃａｔｃｔａｃａｇａａａｇａｇ−３’（配列番号２４）；ＥＤＮＲＡ翻訳抑制アンチセンス・モルホリノ：５’−ｇｃｃａｔｔｇｃａｇａａｃａｃｔｇｇｃｃｇｃｔｃｔ−３’（配列番号２６）．
【０１５２】
ＬＥＣ３については、スプライス部位にわたるヒトＬｅｃ３タンパク質の部分は、以下に示されるとおり同定された：
ヒトＬｅｃ３（ないしＬａｔｒｏｐｈｉｌｉｎ  ３と呼ばれる）タンパク質、ＮＰ＿０５６０５１、１２４０  ａａ（配列番号４（太字体アミノ酸及びアンダーラインを引かれたアミノ酸はゼブラフィッシュ・エキソンに対応する隣接するエキソンである）＞ｇｉ、｜１４１４９６７７｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０５６０５１．１｜Ｌｅｃ３又はｌａｔｒｏｐｈｉｌｉｎ３［ヒト］
【０１５３】
【表１】
2009526861.tif 000003
【０１５４】
ヒトＬｅｃ３の中のスプライス部位にわたるタンパク質の部分は、ゼブラフィッシュＬｅｃ３配列の同一の部分と比較され、高い相同を有していることが判明した（以下では保存的置換は「＋」として示される）：
【０１５５】
【表２】
2009526861.tif 000004
【０１５６】
ゼブラフィッシュＬｅｃ３の相補的ＤＮＡ（配列番号２９）及びアミノ酸（配列番号１０）配列のアライメントは、イントロン、エキソン及びスプライスされた部分を示す：
【０１５７】
【表３】
2009526861.tif 000005
【０１５８】
スプライス抑制モルホリノは、２つのエキソンのスプライシングを抑制するために設計された。以下では、１つのエキソン（太字）と隣のエキソン（アンダーライン）とを示すゼブラフィッシュＬｅｃ３ゲノムＤＮＡ配列が示されている。モルホリノ・ターゲット化配列の配列は、大文字イタリック体で示されている。
【０１５９】
【表４】
2009526861.tif 000006
【０１６０】
したがって、ターゲットとされた領域についてのモルホリノは、イタリック体で示された配列の逆相補、すなわち５’−ｃｇｃｃｃｇａｔｃｔｃａｔｃｔａｃａｇａａａｇａｇ−３’（配列番号２４）である。
【０１６１】
ＣＸＣＲ４翻訳抑制モルホリノについては、翻訳開始部位にわたるようにモルホリノを設計した。モルホリノのためのターゲットとされた配列を、太字体で下記に示す（開始メチオニンは、大文字で示されている）：
ゼブラフィッシュＣＸＣＲ４ａ（配列番号３２）ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１３１８８２）及び翻訳（配列番号３３）（１．．５６番目の５’ＵＴＲ；５７−１１３９番目の読取枠、開始コドンは大文字、太字体＝モルホリノ・ターゲット化配列）：
【０１６２】
【表５】
2009526861.tif 000007
【０１６３】
したがって、ターゲットとされた領域のためのモルホリノは、太字体で示された配列の逆相補、すなわち５’−ｔａａｇｃｃａｔｃｔｃｔａａａａｇａｃｔｔｃｔｃｃ−３’（配列番号２５）である。
【０１６４】
ＥＤＮＲＡ翻訳抑制モルホリノについては、翻訳開始部位にわたるようにモルホリノを設計した。モルホリノのためのターゲットとされた配列は、太字体で下記に示される（開始メチオニンは、大文字で示されている）：
ゼブラフィッシュＥＤＮＲＡポリヌクレオチド（配列番号３５）（ａｃｃ．＃ＣＫ１４１６４８）及び翻訳産物（配列番号１２）：（１．．２４２番目の５’ＵＴＲ；２４３−６７７番目の読取枠、開始コドンは大文字、太字体＝モルホリノにターゲットとされた配列）
【０１６５】
【表６】
2009526861.tif 000008
【０１６６】
したがって、ターゲットとされた領域のためのモルホリノは、太字体で示される配列の逆相補、すなわち５’＿ｇｃｃａｔｔｇｃａｇａａｃａｃｔｇｇｃｃｇｃｔｃｔ−３’（配列番号２６）である。
ｍＲＮＡ及びモルホリノ・アンチセンス・オリゴのミクロ注入：
【０１６７】
キャップ構造のセンスＲＮＡは、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ及びｍＭＥＳＳＡＧＥｍＭＡＣＨＩＮＥ系（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて合成された。ｍＲＮＡ又はモルホリノ・アンチセンス・オリゴのミクロ注入では、ゼブラフィッシュ胚は、早期１細胞期の卵黄中に０．２５〜０．５ｎｌを注射され、続いて、２８．５℃で０．３ｘＤａｎｉｅａｕ’ｓ培地においてインキュベートされた。胚は、それらが蕾状期又は受精後２４時間に達するまで上記条件下で維持され、次いで、ＲＮＡ調製のために回収されるか、又はホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために４％パラホルムアルデヒドにおいて固定された。
Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション：
【０１６８】
ｆｌｋインサイチュー構築物は、Ｄｒ．Ｂｒａｎｔ  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ（Ｌａｗｓｏｎ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７（１１）：１３４６−  １３５１）によって親切に提供された。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は、Ｌｅｕｎｇ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３０（６）：３６３９−３６４９から改変された。簡単に言えば、胚が、６８℃で一夜ハイブリダイズされ、次いで６６％Ｈｙｂ／３３％２ＸＳＳＣにより３０分間洗浄され、次いで３３％Ｈｙｂ／６６％２ＸＳＳＣによって６８℃で３０分間、次いで２ＸＳＳＣによって６８℃で１５分間、続いて０．２ＸＳＳＣによって６８℃で１時間洗浄された。ハイブリダイズされたプローブは、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ染色（Ｒｏｃｈｅ）によって検出された。カラー染色後、胚は１００％エタノール中で１時間洗浄された。
ゼブラフィッシュｌｅｃ３、ｃｘｃｒ４及びｅｄｎｒａ遺伝子の同定
【０１６９】
第一歩として、我々は、ゼブラフィッシュ胚の成長中の血管系において特異的に発現されたｌｅｃ３、ｃｘｃｒ４及びｅｄｎｒａを同定しようと努めた。ゼブラフィッシュ配列データベースをプローブするためにヒト及び／又はマウスのタンパク質配列を用いて、我々はゼブラフィッシュｌｅｃ３、ｃｘｃｒ４及びｅｄｎｒａ遺伝子を同定した（配列番号は、それぞれ、９、７及び１１）。ゼブラフィッシュｌｅｃ３、ｃｘｃｒ４及びｅｄｎｒａ遺伝子の発現パターンは、胚発生の過程で非常に動的であった（図９から図１１）。ｌｅｃ３は１ｄｐｆゼブラフィッシュ胚の背動脈に発現した。そこは、体節間血管が受胎後２４時間及び２８時間時に血管新生の崩出によって形成される場所である（図１２）。
【０１７０】
同様に、ｃｘｃｒ４ａが１ｄｐｆの発生中の血管に発現した。ｃｘｃｒ４ａは、受胎後２８時間ゼブラフィッシュ胚の背動脈、体節間血管及び頭蓋血管に発現した（図１３）。
【０１７１】
ｅｄｎｒａの発現は、軸血管系及び発生中の血管において見られた。ｌｅｃ３のように、ｅｄｎｒａは、受胎後２４時間及び２８時間ゼブラフィッシュ胚において体節間血管が血管新生の崩出によって形成される場所である背動脈に発現した（図１４）。
ゼブラフィッシュｌｅｃ３、ｃｘｃｒ４およびｅｄｎｒａの標的化ノックダウンは血管新生を抑制する
【０１７２】
血管新生におけるｌｅｃ３、ｃｘｃｒ４及び／又はｅｄｎｒａが担うであろう役割を明らかにするために、我々はゼブラフィッシュ胚においてモルホリノアンチセンス・ノックダウン法を用いた（Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ  Ａ．ａｎｄ  ＳＣ  Ｅｋｋｅｒ（２０００）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２６：２１６−２２０）。ゼブラフィッシュ胚に注入されると、血管内皮細胞の分子マーカーによって明らかにされるように、モルホリノは血管新生の欠損を誘発した（以下を参照）。
【０１７３】
これらの体節間血管は、背側大動脈及び主静脈からの血管新生崩出によって発達し、そのプロセスは腫瘍の血管新生に非常に類似する（Ｂｅｒｇｅｒｓ  Ｇ，ａｎｄ  ＬＥ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ，Ｃａｎｃｅｒ３：４０１−４１０）ので、体節間血管は特に興味深い。
ｌｅｃ３、ｃｘｃｒ４及びｅｄｎｒａノックダウン表現型の分子解析
【０１７４】
ｌｅｃ３、ｃｘｃｒ４及びｅｄｎｒａノックダウン胚における血管新生欠損の性質を試験するために、我々は、ＶＥＧＦＲ−２受容体（Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ）をコードしている内皮の特異的マーカーｆｌｋ１を使用して、発生する血管系を可視化した（Ｌｉａｏ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２４：３８１−３８９）。１ｄｐｆの対照胚のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって示されるように、ｆｌｋ１転写物は、頭蓋血管、軸血管系（背側大動脈及び主静脈を含む）において、そしてより重要には、背側大動脈から発芽する体節間血管において豊富に発現した（図８）。同期におけるｌｅｃ３、ｃｘｃｒ４及びｅｄｎｒａノックダウン胚のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析は、背側大動脈及び主静脈に沿ってｆｌｋ１転写物の発現を表し、これは、軸血管系に沿った内皮細胞分化が欠損してなかったことを示している。しかしながら、ｌｅｃ３、ｃｘｃｒ４及びｅｄｎｒａノックダウン胚は、軸血管系から発芽する体節間血管の非常に低下した染色を示したので（図１２乃至図１４）、この欠損が血管新生プロセスに特異的であったことを示唆している。
ｃｘｃｒ４、ｌｅｃ３及びｅｄｎｒａはｖｅｇｆ経路と発生的に相互作用する
【０１７５】
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、胚及び腫瘍の血管新生のための主要な媒介物質である（Ｔａｍｍｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ｌｅｃ３、ｃｘｃｒ４及びｅｄｎｒａノックダウン表現型は、ｖｅｇｆノックダウン胚のそれと驚くべき類似性を共有しており（Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｙｅａｓｔ１７：２９４−３０１；Ｃｈｉｌｄｓ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２９：９７３−９８２）、これは、それらが、共通の又は収斂する経路において機能するかもしれないことを示唆する。ゼブラフィッシュ・モデルを用いて、我々は、ＧＰＣＲがｖｅｇｆシグナリングと相互作用し、ＧＰＣＲとＶＥＧＦの両方が血管新生における共通の又は収斂する経路において機能する場合があることを発見した。ここで、我々は、ホールアニマルモデルにおける血管新生プロセスを規制するｃｘｃｒ４ａ依存経路及びｖｅｇｆ依存経路間の新規な相乗的相互作用を実証するために、ある実例を提供する（図１５）。いずれのモルホリノ単独の有効以下の用量では、血管新生に及ぼす影響はなかった（図１５Ｅ−Ｆ、ｖｅｇｆノックダウン；図１５Ｃ−Ｄ、ｃｘｃｒ４ａノックダウン）。しかしながら、同じ用量におけるｖｅｇｆ及びｃｘｃｒ４ａの両方の同時抑制は、ゼブラフィッシュ・モデルにおける血管新生崩出のプロセスを有意に除去した（図１５Ｇ−Ｈ）。我々の所見は、病的な血管新生を相乗的にブロックするためにこのＧＰＣＲ依存経路とＶＥＧＦ依存経路を同時にターゲットとすることについての新規の契機を提供し、これは癌と戦うためにより安全でより効果的な治療のレジメンへと導くであろう。
実施例２
網膜症のための抗血管新生療法
【０１７６】
最近、酸素に誘発された網膜症のマウス・モデルが、ヒト疾患、末熟児網膜症（ＲＯＰ：ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ  ｏｆ  ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）、未熟児に影響を与える網膜の、新たに導管化する疾患の要点を再現するために用いられた。我々の研究室において開発された新規な抗血管新生の化合物をテストするためにこのマウス・モデルを使用することは、他の種に比べていくつかの重要な利点を提供する：（１）酸素に誘発された網膜症のマウス・モデルは、網膜における血管の発達異常へと導く、非常に有効で高度に再現可能な方法であり；（２）網膜は眼底検査によって異常な血管の成長をモニタリングすることができるのでこのプロセスを調べるための優れた器官であり、また、網膜の血管系全体は平らに設けられた網膜の組織標本において観察することができ；さらには、（３）網膜に対する限定的な送達は、これらの新規な抗血管新生の化合物の有効性が評価されることを可能にし、同時に、網膜に対するこれらの化合物の任意の潜在的毒性を制限することができる。
酸素誘発された網膜症のマウス・モデル
【０１７７】
このモデルは早熟のヒト状態網膜症のための範例として役立つ。生後Ｐ７日に、最大２までの、種雌と彼女らの一腹子をシール容器内の動物容器に入れ、酸素と圧縮空気を混合して最終酸素濃度を７５％±２％にして換気した（ＰｒｏＯｘ１１０Ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｉｏｓｐｈｅｒｉｘ，Ｌｔｄ）。このように過剰酸素に対して晒すことで、網膜における血管の成長が阻止される。生後Ｐ１２日に、その動物たちを室内気に戻した。室内気に戻すことで、相対的に低酸素の状態に起因して、網膜において新規の血管の成長（新血管新生）が誘発される。網膜における酸素誘発された変化を観察するために、これらの動物は酸素への露出に先立って、Ｐ７でナトリウム・ペントバルビタールの致死量（１２０ｍｇ／ｋｇ）注射によって葬られ；Ｐ１２で、直ちに酸素露出が続き；そしてＰ１７で、これが最大の網膜血管新生の時間である。一方の一腹子からの目は網膜における異常な血管成長を確認するために組織学的解析のために処理され、他方で、もう一方の一腹子からの目は網膜における形質発現変化を同定するためにＲＮＡとタンパク質の分析のために処理された。この試験を、結果の再現性を評価するために３度繰り返した。
蛍光性ホスホラミダイト・モルホリノ・オリゴマー（ＰＭＯ）の吸収
【０１７８】
網膜細胞への、蛍光性のラベルが付けられたＰＭＯだけの、あるいはペプチドと結合したＰＭＯ（ＰＭＯ−ｐｅｐ）の吸収について、比較を行った。生後Ｐ１２日に、新生児のハツカネズミの一方の目にＰＭＯの眼内注射を単独で、あるいは反対側の目にＰＭＯ−ｐｅｐをした。注射の３時間後に、ナトリウム・ペントバルビタールの致死量（１２０ｍｇ／ｋｇ）の注射によって動物を安楽死させた。蛍光顕微鏡法によって注入された物質の位置を視覚化するために目の凍結切片を準備した。この試験を、結果の再現性を評価するために３度繰り返した。この研究の結果は、ペプチド対合がＰＭＯのみと比較して、送達利点を与えるかどうかを示すであろう。
ＰＭＯとＰＭＯ対合の有効性
【０１７９】
ｌｅｃ３、ｅｄｎｒａ又はｃｘｃｒ４発現のＰＭＯの及びＰＭＯｐｅｐの依存抑制の有効性を評価して酸素誘発された網膜症のマウス・モデルにおける網膜血管新生を抑えるために、研究を行った。上述したように、新生児のハツカネズミを７５％の酸素に対して５日間露出することによって、網膜症を創出することができる。酸素露出が終了する日である生後Ｐ１２日に、両側性の網膜症を備えたこれらのハツカネズミに、ｌｅｃ３、ｅｄｎｒａ又はｃｘｃｒ４を標的とするＰＭＯ又はＰＭＯ−ｐｅｐの眼内注射を一方の目にする。眼内注射自体が新血管新生をある程度抑制することができるので、これらのハツカネズミに対してさらに６塩基ミスマッチ、対照ＰＭＯ又はＰＭＯ−ｐｅｐの眼内注射を反対側の目にする。最大の新血管新生の期間に対応する生後Ｐ１７日では、これらのハツカネズミは安楽死させられ、彼らの目は組織学的解析のために処理される。新血管新生の、乏血の及び正常血管系の領域は処置を知らされていなかった観察者によって定量される。処置の有効性は、治療された目と対照目における新血管新生の領域間の差分として測定されるであろう。ｌｅｃ３、ｅｄｎｒａ又はｃｘｃｒ４の標的化ノックダウンが生理学的な血管新生を妨げずに、病的な新血管新生を抑制することができるという発見は、これらの遺伝子を様々な血管関連の網膜症のための潜在的な治療上の標的であると同定するであろう。
ｖｅｇｆを備えた併用療法
【０１８０】
網膜血管新生を抑えるために、ｖｅｇｆとともにｇｎｇ２、ｌｅｃ３、ｅｄｎｒａ若しくはｃｘｃｒ４のＰＭＯ依存の抑制の相対的な有効性、又はｇｎｇ２、ｌｅｃ３、ｅｄｎｒａ若しくはｃｘｃｒ４／ｖｅｇｆ発現を比較するための研究を行った。これらの試験は、上述されたように実行されよう。ｇｎｇ２、ｌｅｃ３、ｅｄｎｒａ又はｃｘｃｒ４の標的化ノックダウンがｖｅｇｆの対応するノックダウンと同じくらいに、あるいはそれ以上に効果的であるという発見は、薬剤開発のための別の潜在的な標的を同定するであろう。すべての網膜症がｖｅｇｆ経路に対して同様の依存性を示すとは限らないので、これは重要となる。したがって、薬剤開発のための追加的な標的が同定されることで、様々な患者及び網膜障害に対する治療上の選択肢を拡張するであろう。同様に、ｖｅｇｆとともにｌｅｃ３、ｅｄｎｒａ又はｃｘｃｒ４を同時にノックダウンすることは何れか一方の処置だけに比して大きな有効性と低い副作用を提供するという発見は、処置オプションの最適化を可能にするであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】図１は、ＣＸＣＲ４（配列番号１３）の膜構造を示す。凡例：Ｏ、アミノ酸外側薄膜；Ｍ、膜貫通性アミノ酸；ｉ、アミノ酸内側薄膜隔室。
【図２】図２は、ヒト（配列番号１５）とゼブラフィッシュ（配列番号１４）のＣＸＣＲ４間の保持されたアミノ酸の対比を示す。
【図３Ａ】図３Ａ及び図３Ｂは、ヒトのＬＥＣ３の膜構造を示す（配列番号１６）。凡例：Ｏ、アミノ酸外側薄膜；Ｍ、膜貫通性アミノ酸；ｉ、アミノ酸内側薄膜隔室。
【図３Ｂ】図３Ａ及び図３Ｂは、ヒトのＬＥＣ３の膜構造を示す（配列番号１６）。凡例：Ｏ、アミノ酸外側薄膜；Ｍ、膜貫通性アミノ酸；ｉ、アミノ酸内側薄膜隔室。
【図４】図４は、ヒト（配列番号１８）とゼブラフィッシュ（配列番号１７）のＬＥＣ３間の保持されたアミノ酸の対比を示す。
【図５】図５は、ゼブラフィッシュＥＤＮＲＡの核酸（配列番号１９）及び推定されたアミノ酸（配列番号２０）の配列のアライメントを示す。
【図６】図６は、ヒトＥＤＮＲＡの膜構造を示す（配列番号２１）。凡例：Ｏ、アミノ酸外側薄膜；Ｍ、膜貫通性アミノ酸；ｉ、アミノ酸内側薄膜隔室。
【図７】図７は、ヒト（配列番号２３）とゼブラフィッシュ（配列番号２２）のＥＤＮＲＡ間の保持されたアミノ酸の対比を示す。
【図８】図８は、成長途中の血管におけるＣＸＣＲ４の発現及びそのイセンシャルな機能を示す。
【図９】図９は、受胎１日後（ｄｐｆ：ｄａｙ−ｐｏｓｔｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）のゼブラフィッシュ胚の背動脈におけるｌｅｃｔｏｍｅｄｉｎ−３（ｌｅｃ３）の発現を示す。ゼブラフィッシュｌｅｃ３に対してｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びＲＮＡプローブを用いることにより、我々は、受胎後２４時間及び２８時間（ｈｐｆ：ｈｏｕｒ−ｐｏｓｔｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）ゼブラフィッシュ胚において血管新生の崩出により体節間血管が形成される背動脈にｌｅｃ３が発現することを明らかにする（スケールバーは１００ｕｍである）。
【図１０】図１０は、１ｄｐｆでの成長途中の血管におけるＣ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体型４（ｃｘｃｒ４ａ）の発現を示す。ゼブラフィッシュｃｘｃｒ４ａに対してｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びＲＮＡプローブを用いることにより、我々は、受胎後２８時間ゼブラフィッシュ胚における背動脈、体節間血管及び頭蓋血管にｃｘｃｒ４ａが発現することを明らかにする。凡例：ｄ．ａ、背動脈；ｃ．ｖ、頭蓋血管；ｓ．ｖ、萌出血管。（スケール・バーは１００ｕｍである）。
【図１１】図１１は、軸血管系及び成長中の血管におけるエンドセリン−１受容体（ｅｄｎｒａ）の発現を示す。ゼブラフィッシュｅｄｎｒａに対してｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びＲＮＡプローブを用いることにより、我々は、受胎後２４時間及び２８時間ゼブラフィッシュ胚において血管新生の崩出により体節間血管が形成される背動脈にｅｄｎｒａが発現することを明らかにする。（スケール・バーは１００ｕｍである）。凡例：ｃ．ｖ、頭蓋血管；ａ．ｖ、軸血管系。
【図１２】図１２は、ｆｌｋ−１マーカーを用いて、ターゲットとされたｌｅｃ３のノックダウンが体節間血管の血管新生の崩出を乱すことを示す。ゼブラフィッシュ胚においてモルホリノ・アンチセンス・オリゴを用い、ターゲットとされたｌｅｃ３のノックダウンは、血管内皮特有マーカーｆｌｋ−１によって明らかにされるとおり体節間血管の血管新生の崩出を乱す。凡例：ＩＳ、体節間血管。（スケール・バーは１００ｕｍである）。
【図１３】図１３は、ターゲットとされたｃｘｃｒ４ａのノックダウンが、萌出する血管におけるｆｌｋ−１発現を特異的にブロックすることを示す。ゼブラフィッシュ胚においてモルホリノ・アンチセンス・オリゴを用い、ターゲットとされたｃｘｃｒ４ａのノックダウンは、血管内皮特有マーカーｆｌｋ−１によって明らかにされるとおり体節間血管の血管新生の崩出を乱す。凡例：ＩＳ、体節間血管。（スケール・バーは１００ｕｍである）。
【図１４】図１４は、ｆｌｋ−１マーカーを用いて、ターゲットとされたｅｄｎｒａのノックダウンが体節間血管の血管新生の崩出を乱すことを示す。ゼブラフィッシュ胚においてモルホリノ・アンチセンス・オリゴを用い、ターゲットとされたｅｄｎｒａのノックダウンは、血管内皮特有のマーカーｆｌｋ−１によって明らかにされるとおり体節間血管の血管新生の崩出を乱す。凡例：ＩＳ、体節間血管。（スケール・バーは１００ｕｍである）。
【図１５】図１５は、ｆｌｋ−１マーカーを用いて、血管新生のためのＣＸＣＲ４及びＶＥＧＦ依存経路による相乗的抑制を示す。Ａ及びＢ：野生型対照（Ｂ、高倍率）；Ｃ及びＤ：有効量以下の投与でのターゲットとされたｃｘｃｒ４ａのノックダウンは（Ｄ、高倍率）、体節間血管（ＩＳ）の萌出に対して何らの効果を示さなかった；Ｅ及びＦ：有効量以下の投与でのターゲットとされたｖｅｇｆのノックダウンは（Ｆ、高倍率）、体節間血管（ＩＳ）の萌出に対して何らの効果を示さなかった；Ｇ及びＨ：ゼブラフィッシュ胚においてモルホリノ・アンチセンス・オリゴによりｃｘｃｒ４ａ及びｖｅｇｆの両方を共同ターゲットとすることは（Ｈ、高倍率）、血管内皮特有マーカーｆｌｋ−１によって明らかにされるとおり体節間血管の血管新生の崩出に対して相乗的な抑制を示した。スケール・バーは１００ｕｍである。
【図１６】図１６は、フェニルアラニンがグリシン（Ｇ）又はアスパラギン（Ｎ）と置き換えられる場合、優性阻害効果を示すハムスター・アドレナリン受容体（α１Ｂ−ＡＲ）に同族の種々のＧＰＣＲ領域の配列対比を示す（Ｃｈｅｎ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）ＥＭＢＯ  Ｊ．１９（１６）：４２６５−４２７１）。示されているのは、次のものからの同属領域である；ヒトＣＸＣＲ４（配列番号８０）；ヒトＬＥＣ３（配列番号８１）；ヒトＥＤＮＲＡ（配列番号８２）；ハムスターα１Ｂ−ＡＲ（配列番号８３）；ハムスターα２Ｃ２−ＡＲ（配列番号８４）；ハムスターβ２−ＡＲ（配列番号８５）；ハムスターＨ１（配列番号８６）；ハムスターＤ２（配列番号８７）；ハムスターＭ３（配列番号８８）；ハムスターＡＴ１（配列番号８９）；ハムスター・ロドプシン（配列番号９０）。保持されたフェニルアラニン（ハムスターα１Ｂ−ＡＲのＰｈｅ３０３）が箱に入れられる。
【図１】
2009526861.tif 000009
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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