(57)【要約】本願は、免疫細胞および他の細胞と、Ｂｓｔ２アンタゴニストを含む組成物と、を接触させることを含む、免疫細胞を他の細胞との結合から妨げる方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫細胞および／または他の細胞を、Ｂｓｔ２アンタゴニストを含む組成物に接触させることを含む、免疫細胞が他の細胞に結合することを抑制する方法。
【請求項２】
前記他の細胞が、免疫細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、脳細胞、脊髄細胞、末梢神経細胞、心臓細胞、骨格筋細胞、肺細胞、肝細胞、腎臓細胞、血管細胞、膵臓細胞、大腸および小腸細胞、胃細胞、食道細胞、鼻咽頭細胞、膜細胞または結合組織細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｂｓｔ２アンタゴニストがＢｓｔ２デコイである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｂｓｔ２デコイが、他の分子またはタンパク質に対する結合がＢｓｔ２タンパク質と同様である、または向上している、Ｂｓｔ２断片またはこの変異体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｂｓｔ２アンタゴニストが、安定化タンパク質に融合されたＢｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２デコイ−Ｆｃキメラのもしくは融合のコンストラクト、Ｂｓｔ２−デコイ−アルブミンキメラのもしくは融合のコンストラクト、またはペグＢｓｔ２−デコイ、あるいは他の安定化タンパク質に融合されたＢｓｔ２デコイである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｂｓｔ２アンタゴニストが、Ｂｓｔ２および／またはマウスＤａｍｐ１タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体または抗体様タンパク質ドメインである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｂｓｔ２アンタゴニストが化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫細胞および他の細胞が、炎症部位に位置しているか、または炎症からは遠い部位に位置しているが、炎症部位に対して炎症および免疫サイトカインまたは他の炎症性シグナルを伝達しうる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
組成物がさらに、細胞接着およびシグナル伝達を阻害する化合物または免疫抑制剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞接着を阻害する化合物が、ＩＣＡＭ１アンタゴニスト、またはＬＦＡアンタゴニストである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
抗炎症性活性を有するＢｓｔ２デコイ。
【請求項１２】
Ｂｓｔ２デコイ−免疫グロブリン  Ｆｃキメラ。
【請求項１３】
前記デコイが、免疫グロブリンのドメインに融合されている、請求項１１に記載のＢｓｔ２デコイ−Ｆｃ融合物。
【請求項１４】
Ｂｓｔ２および／またはＢｓｔ２のホモログに対して特異的なモノクローナル抗体。
【請求項１５】
２つのアームを含み、このうち１つのアームがＢｓｔ２またはこのホモログ以外のタンパク質に特異的である、請求項１４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１６】
前記ホモログがマウスＤａｍｐ１タンパク質である、請求項１４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１７】
モノクローナル抗体が結合しているＢｓｔ２発現細胞が、Ｂｓｔ２リガンド−Ｂｓｔ２相互作用またはＢｓｔ２−Ｂｓｔ２相互作用を阻害する、請求項１４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１８】
（ｉ）Ｂｓｔ２に結合する細胞を獲得し；
（ｉｉ）リガンドを発現している細胞からＢｓｔ２に結合するリガンドをスクリーニングし、これにより、Ｂｓｔ２に対するリガンドを単離する；
を含むＢｓｔ２に対するリガンドの単離方法。
【請求項１９】
破壊された遺伝子はマウスまたは胚形成期中のマウスの祖先に導入され、該破壊された遺伝子が同型であれば炎症関連疾患を示す、体細胞および生殖細胞が機能的に破壊されたＤａｍｐまたはＢｓｔ２遺伝子を含むトランスジェニックマウス。
【請求項２０】
Ｂｓｔ２遺伝子がマウスまたは胚形成期のマウスの祖先に導入される、体細胞および生殖細胞が完全にまたは部分的にＢｓｔ２遺伝子に置換されたＤａｍｐ遺伝子を含むトランスジェニックマウス。
【請求項２１】
炎症部位に対するＢｓｔ２アンタゴニストを含む組成物を投与することを有する、対象への炎症軽減方法。
【請求項２２】
必要とする対象に対してＢｓｔ２アンタゴニストを含む組成物を投与することを有する、炎症関連疾患兆候の対象を治療する方法。
【請求項２３】
組成物が他の抗炎症性化合物を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記疾患が：アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、喘息、敗血症、潰瘍性大腸炎、Ｉ型糖尿病、白内障、多発性硬化症、急性心筋梗塞、心臓麻痺、乾癬、接触性皮膚炎、変形性関節症、鼻炎、クローン病、自己免疫疾患、悪液質、急性膵炎、自己免疫性血管炎、自己免疫性およびウイルス性肝炎、遅延型過敏症、うっ血、冠動脈再狭窄、糸球体腎炎、移植片対宿主拒絶反応、ブドウ膜炎、角膜移植に関連する炎症性眼疾患、外傷性脳損傷、てんかん、出血、発作、鎌状赤血球病、ＩＩ型糖尿病、肥満、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、アトピー性皮膚炎、皮膚炎、学習／認識障害、神経変性疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、潰瘍性大腸炎、放射線による損傷、やけどまたは電気誘発性損傷、組織壊死および免疫細胞浸潤を引き起こす中毒、薬剤性障害、吸入剤誘発性障害、放射線被爆、肺の吸引誘発性障害、化学療法または放射線療法に起因する炎症、自己免疫疾患、狼瘡、シェーグレン症候群、多発性硬化症を含む脱髄疾患、多発性筋炎を含む炎症性筋疾患、強皮症、結節性多発動脈炎、サルコイドーシス、局所性および全身性骨化性筋炎、アルツハイマー病を含むアミロイド関連疾患、椎間板ヘルニア、脊髄および神経損傷、ライ症候群、細菌性およびウイルス性脳炎ならびに髄膜炎、プリオン関連疾患、ギラン・バレー症候群、狂犬病、ポリオ、脳出血、頭蓋内出血関連損傷、慢性疲労症候群、静脈血栓症、痛風、肉芽腫症、糸球体腎炎および間質性腎炎を含む腎炎、昆虫刺激アレルギー、アナフィラキシー、再生不良性貧血、骨髄損傷、多臓器不全、甲状腺炎、膵島炎、肝硬変（慢性および急性肝炎）、肺塞栓症、毒物性および薬剤性肝疾患、膵炎、虚血性腸疾患、急性呼吸窮迫症候群、および心膜炎から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
Ｂｓｔ２に結合する化合物を決定することを含む、Ｂｓｔ２が介する細胞−細胞結合の阻害に効果的な化合物のアッセイ方法。
【請求項２６】
宿主細胞中に組み換え技術でＢｓｔ２デコイを発現することを含む、Ｂｓｔ２デコイの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、内容が本明細書に参照により全体引用される２００６年６月２０日に出願された米国特許出願第１１／４７１，８５３号に対して優先権を主張する。
【０００２】
１．技術分野
本発明は、炎症時の細胞間接着を阻害する分子およびその使用に関する。本発明はまた、小分子と同じく炎症に関与する細胞間接着および細胞活性を阻害する際のデコイもしくはＢｓｔ２−結合抗体としてのＢｓｔ２タンパク質または、Ｂｓｔ２タンパク質断片の使用に関する。本発明は、またＢｓｔ２リガンドおよびＢｓｔ２リガンド阻害剤を探索する方法にも関する。本発明はまた、同様なものを含む組成物、ならびに炎症関連疾患の予防および治療方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．一般的背景および最新技術
炎症は、感染、傷または疾病から組織を保護するための生体の正常反応である。炎症反応は、感染した組織内の細胞によって化学物質が作られ、放出されることにより開始される。化学物質は、赤み、腫れ、痛み、熱および機能低下を引き起こす。炎症組織内の細胞は、炎症部位に対して白血球を誘発するシグナルを発する。白血球は、炎症部位中の血流から移動するために内皮細胞に接着しなければならない。また、白血球は、正常な特異的免疫反応が起こるように、抗原提示細胞に接着する必要があり、最終的には、溶解病原体感染細胞（ｌｙｓｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ）、ガン細胞等の適切な標的細胞に接着する必要がある。集合した白血球は、いかなる感染体または有害物質も除去し、傷害組織から損傷細胞の断片を取り除く。
【０００４】
浸潤白血球は、通常の炎症の際の組織再生および免疫反応において、侵入する微生物または死んだ細胞を飲み込むことによって、重要な役割を果たす。しかしながら、浸潤白血球は、病的な慢性炎症においては重大で致死的な状態を引き起こす。非自己（外来）としての自己細胞の異常認識、または持続的な炎症反応による過剰な炎症は、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、白内障、再かん流障害、感染性髄膜炎、関節リウマチ、喘息、敗血症、炎症性腸疾患および多発性硬化症を含む種々の炎症性疾患を引き起こす。
【０００５】
白血球および内皮細胞間の相互作用は以下のようである。
【０００６】
白血球は、血流中で循環する形態または特定の細胞に接着する形態で働くという二重の機能を有する。具体的には、接着した白血球は、内皮細胞と相互作用し、抗原提示細胞との細胞間接着を安定化し、または炎症部位もしくは感染部位に移動するためにエフェクター細胞として働く。正常な特異的免疫反応にとって、白血球は抗原提示細胞に接着する必要があり、最終的には、溶解病原体感染細胞（ｌｙｓｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ）、ガン細胞等の適切な標的細胞に接着する必要がある。白血球の大規模な侵入は、同種移植拒絶反応、皮膚感染、また損傷部位で起こり、変形性関節症のような変形性関節疾患、乾癬、多発性硬化症、喘息、関節リウマチ、接触性皮膚炎および炎症性腸疾患を含む種々の疾患でも観察される。
【０００７】
そのような疾患において、９５％を超える骨髄細胞が炎症部位に移動し、蓄積する。白血球は炎症反応の重要な物質であり、抗菌、分泌および食作用活性を発揮する。炎症が起こっている、または水溶性メディエーターを製造することによって、もしくは種々の細胞への特定の接着を通じて炎症が起こる必要がある組織に、それらは集まる。事実、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）またはグルココルチコイドのような抗炎症薬は、白血球の接着および流入を妨げることによって治療効果を発揮する。自己免疫疾患動物モデルでは、細胞間接着の阻害は、疾患または同種移植拒絶反応を好転させる、または防止する。最近の臨床研究によりＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１またはＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１相互作用を阻害するヒト化モノクローナル抗体が乾癬、多発性硬化症および炎症性腸疾患などの自己免疫疾患に対して顕著な効果と良好な安全性を有することが明らかとなった。
【０００８】
炎症関連疾患の発症の際の重要な特徴である、内皮細胞中への白血球の制御できない侵入は、白血球接着および内皮細胞表面への結合に始まる多段階プロセスによって起こる。内皮細胞表面への白血球の結合は、白血球および内皮細胞の表面に存在する細胞表面分子によって仲介される（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１：７６７−８０４、１９９３）。細胞表面分子は、血流からの白血球の移動の結果、過剰発現する。
【０００９】
白血球および内皮細胞間の相互作用は、多数の炎症性疾患において重要な因子である。例えば、肝血流障害（ｈｅｐａｔｉｃ  ｍｉｃｒｏｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）につながる、増加した白血球−内皮相互作用は肝不全の主要な一因として考えられている（Ｃｒｏｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．  Ｒｅｓ．  ６７：１８２−１９１、２００４）。例えば、アテローム性動脈硬化症は、典型的な炎症性疾患であり、Ｔリンパ球および活性化マクロファージなどの炎症性細胞の多くがアテローム性動脈硬化症部位に集中する。動脈内皮の個々の部分に単球が蓄積し、接着することがアテローム発生の際の初期の検出可能な事象であり、アテローム性動脈硬化症の発症の中心的特徴である（Ｒｏｓｓ、Ｎａｔｕｒｅ３６２：８０１−８０９、１９９３）。この領域において、インターフェロンガンマおよび腫瘍壊死因子アルファなどの、局所的な炎症反応を制御する炎症性サイトカインは豊富である。接着分子の多くは、単球表面で発現していて（Ｖａｌｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ８６：ＩＩＩ２０−２５、１９９２）、アテローム性動脈硬化症上にある内皮細胞が多くの血管リガンドを発現している（Ｐｏｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ、１４０：６６５−６７３、１９９２）。
【００１０】
内皮障壁を越える白血球の溢出は、関節リウマチなどの炎症性疾患の発症の際の重要な事象である。内皮細胞は、関節炎の基本的メカニズムに関与していて、それによって腫瘍壊死因子αおよびインターロイキン−１βのような炎症誘導サイトカインなどの種々の炎症メディエーターが内皮細胞を活性化する。これは、関節リウマチにおいて、内皮細胞接着分子の発現の上昇につながり、その結果、白血球および内皮細胞間の相互作用が増加する。血管内皮細胞への白血球の集合は、喘息の重要な段階でもある。
【００１１】
喘息患者の気道において、活性化好酸球、ＣＤ２５−陽性Ｔリンパ球および血中単球の表現型特性を有する未成熟マクロファージの数が上昇する。上皮細胞、マクロファージ、および他の浸潤細胞においてＨＬＡクラスＩＩの発現が上昇する（Ａｒｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１：３２３−３８２、１９９２）。
【００１２】
血液脳関門を横断する白血球の移動割合が増加することが、多発性硬化症における主要な兆候である。白血球および内皮細胞における、タイトジャンクションタンパク質間の相互作用は、生理条件下で中枢神経系への白血球溢出に寄与し、タイトジャンクションタンパク質の変化した発現が、多発性硬化症の病理学的な必須条件である（Ｗｏｒｔｈｙｌａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３：５６９−５７７、２００１）。
【００１３】
上述したように、内皮細胞への白血球の接着は、種々の疾患において重要であるので、細胞間接着の阻害は、多様な炎症および免疫疾患に対して治療方針を与える。分子生物学の観点からは、次の分子が炎症に関与することが知られている。
【００１４】
サイトカイン類：重大なバクテリア感染または外傷性障害に対する一般的な反応である全身性の炎症が初期損傷より末梢側の組織システムに影響を与える（Ｌｕｓｈ  ａｎｄ  Ｋｖｉｅｔｙｓ、Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ７：８３−１０１、２０００）。
【００１５】
感染組織から放出されるバクテリア産生物および他の炎症誘導メディエーター類が、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β、γインターフェロンおよびインターロイキン−６などの炎症誘導メディエーター類の形成を誘導する。敗血症においては、血管内皮の損傷がＴＮＦ−αおよびインターロイキン−１βの産生を促進する。これらのサイトカインは、直接内皮細胞に作用し、白血球接着を増強する（Ｐｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１８９３−１８９６、１９８６；Ｄｕｓｔｉｎ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０７：３２１−３３１、１９８８；Ｃｏｔｒａｎ  ａｎｄ  Ｐｏｂｅｒ、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１：２２５−２３５、１９８８）。これらのサイトカインはまた、血中および血管内皮中の血中好中球を活性化する（Ａｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、５９：７８３−８３６、１９９０）。例えば、ＴＮＦ−αは、オートクリンまたはパラクリン経路によってサイトカイン、ケモカインおよびプロテアーゼ群を誘導する（Ｇｈｅｚｚｉ  ａｎｄ  Ｃｅｒａｍｉ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９８：１−８．２００４）。インターロイキン−６は、接着分子の発現を通して単核−内皮細胞相互作用および炎症性損傷を誘導し、アテローム性動脈硬化症のプロセスが開始する。インターロイキン−６の血中濃度の上昇は、血管炎症およびアテローム性動脈硬化症の進行を伴う（Ｒａｄｅｒ、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４３：１１７９−１１８２、２０００）。インターロイキン−１７は、多数の炎症メディエーター類の発現を誘導し、好中球の分化、成熟および走化性に関与する（Ｗｉｔｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ６１：５６７−５７９、２００４）。インターロイキン−１７の増加したレベルは、気道炎症、関節リウマチ、腹腔内膿瘍および接着、炎症性腸疾患、同種移植拒絶反応、乾癬、ガンならびに多発性硬化症などの病理学的疾患に関連している。
【００１６】
細胞表面接着分子：複数の炎症性サイトカインは、細胞表面上の内皮細胞−リンパ球接着分子（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ＥＬＡＭｓ）の発現を誘発する（Ｎｏｒｔａｍｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２１：２６２９−２６３２、１９９１）。それらは２つのクラスに分けられる：ＩＣＡＭ−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）およびＥＬＡＭ−１（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）（Ｓｔａｕｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  ５２：９２５−９３３、１９８８）。種々のメディエーター類への反応において、血管内皮は、特異的な細胞表面糖タンパク質を発現する。血中白血球の結合および溢出は、特異的リガンドまたはカウンターレセプターとの相互作用によって達成される（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３、１９９４）。このプロセスに関与する分子としては、ＣＤ１８に対するリガンドとしてのＩＣＡＭ−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）、白血球表面上のグリコンジュゲート（ｇｌｙｃｏｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を認識するセレクチン、および同じファミリーである白血球インテグリン分子の他の一群と相互作用する、免疫グロブリン超分子群の一群が挙げられる（Ｐａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２６９：Ｈ１９５５−１９６４、１９９５；  Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０：３５１−３５８、２００３；  Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ  ８２：３２５３−３２５８、１９９３；  Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ  ａｎｄ  Ｎｅｌｓｏｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：３７９−３８７、１９９３）。白血球ローリング（ｒｏｌｌｉｎｇ）は、セレクチンによって制御され、内皮細胞上の白血球の移動および接着は、β２インテグリン、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８、ａＭｂ２、ＣＲ３）、およびＬＦＡ−１によって誘発される。Ｍａｃ−１およびＬＦＡ−１は、内皮細胞の表面上に発現しているカウンターレセプターであるＩＣＡＭ−１と相互作用する。
【００１７】
炎症治療に関連する先行技術には次のものが挙げられる。
【００１８】
米国特許第５３６７０５６号では、レセプターまたはリガンドとして、内皮細胞−白血球接着分子（ＥＬＡＭｓ）への結合を遮断する分子または分子断片の処理による、多形核白血球（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ；ＰＭＮｓ）の内皮細胞への結合阻害が記載されている。該特許には、ＥＬＡＭ発現を抑制するアンチセンスヌクレオチドおよびリボザイムの記載もある。該特許は、さらに、そのリガンドへのＥＬＡＭの結合を阻害する分子、ならびにＥＬＡＭおよびそのリガンドに対する抗体を同定する方法の記載もある。
【００１９】
米国特許第５８６３５４０号には、Ｔ細胞の活性化を抑制する十分な量で、ＣＤ４４タンパク質ペプチドまたはその誘導体を投与することによって、Ｔ細胞の活性化を抑制する方法が記載されている。また、ＣＤ４４を介する細胞接着または単球のＩＬ１産生を阻害する十分な量で、ＣＤ４４タンパク質ペプチドまたはその誘導体を投与することによって、ＣＤ４４を介する細胞接着またはＣＤ４４を介する単球のＩＬ１産生を阻害する方法も記載されている。さらに、薬もしくは細胞毒性薬に結合したＣＤ４４タンパク質ペプチドまたはその誘導体を投与することによる、薬または細胞毒性薬を炎症部位へ輸送する方法についての開示もある。
【００２０】
米国特許第５９１２２６６号には、細胞表面分子のβ２インテグリンファミリーによって介される細胞間接着の阻害が挙げられている。該特許は、細胞接着に関連する炎症および他の病的反応を阻害するまたは処置することに有用な薬剤組成物を開示している。該特許はまた、白血球およびリンパ球が細胞または組織損傷を起こしている病的状態を阻害するまたは処置する方法を開示している。
【００２１】
国際公開第０３０２６６９２号は、慢性関節炎および関節リウマチに罹患している患者における、ＣＤ３抗原複合体に対する抗体の治療的使用に関する。
【００２２】
欧州特許第１３０４３７９号は、ＣＤ１８抗原に結合可能な抗原−決定領域の一部または全てを含むヒト化抗ＣＤ１８抗体に関する。
【００２３】
米国特許第６６８９８６９号は、敗血症、および他の感染性または非感染性外傷の間の肺および他の器官への白血球の流入を阻害する際のヒト化抗ＣＤ１８抗体の使用を開示している。ヒト化抗−ＣＤ１８抗体は、内毒素性ショックまたは成人呼吸窮迫症候群に罹患している患者の肺および他の器官への白血球侵入の阻害に使用しうる。抗体は、喘息または血栓溶解療法後の白血球が介する再かん流傷害を治療するために投与しうる。また、抗体は、抗感染剤とともに投与される患者において、炎症を減ずるまたは治癒するために、あるいは抗癌化学療法を受けている患者に対する治療薬の投与を助けるために使用しうる。
【００２４】
米国特許第５８２１３３６号には、メディエーターまたは炎症メディエーターに対する前駆体である、分子量１６０ｋＤのポリペプチド、それらの変異体および断片などの誘導体、ならびにそれらの準備プロセスが開示されている。該特許には、ポリペプチドおよび誘導体をコードするヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列を含むベクター、ポリペプチドまたはこれらの誘導体に対する抗体ならびに抗体誘導体も開示されている。抗体および抗体誘導体を用いる、炎症性疾患およびホジキンリンパ腫の診断ならびに治療方法も開示されている。 
【発明の開示】
【００２５】
発明の要約
炎症は、白血球を含む免疫細胞を炎症部位にひきつけるためには、次のような少なくとも３つの連続的段階を必要とする：（１）リンパ球、多形核白血球、ナチュラルキラー細胞およびマクロファージなどの白血球を含む免疫細胞がサイトカインおよび／または細胞間相互作用によって活性化される；（２）凝集免疫細胞が、炎症部位に移動し、集合し、内皮細胞への接着を通じて内皮細胞へ関連したシグナルを伝達する；（３）Ｔリンパ球およびマクロファージが活性化され、インターロイキン−２のような分泌型サイトカインが炎症反応を増幅させるために活性化される。
【００２６】
本発明者らは、Ｂｓｔ２タンパク質が、炎症において重要な役割を果たす免疫細胞間の同種接着、または免疫細胞および内皮細胞間の異種接着を媒介することを見出し、さらにまたタンパク質のアンタゴニストが炎症の主要な３つの段階で作用し、炎症関連疾患の予防および治療に用いられ、本発明へとつながる。
【００２７】
一態様において、本発明は、免疫細胞および／または他の細胞をＢｓｔ２アンタゴニストを含む組成物と接触させることを含む、他の細胞へ免疫細胞が結合することを抑制する方法に向けられる。他の細胞は、免疫細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、脳細胞、脊髄細胞、末梢神経細胞、心臓細胞、骨格筋細胞、肺細胞、肝細胞、腎臓細胞、血管細胞、膵細胞、大腸および小腸細胞、胃細胞、食道細胞、鼻咽頭（nasoropharyngial）細胞、膜細胞または結合組織細胞でありうる。Ｂｓｔ２アンタゴニストは、Ｂｓｔ２デコイ（ｄｅｃｏｙ）でありうる。そして、Ｂｓｔ２デコイは、他の分子またはタンパク質に対する結合がＢｓｔ２タンパク質と比較して同様の、または向上しているＢｓｔ２断片またはそれらの変異体でありうる。さらに、Ｂｓｔ２アンタゴニストは、安定化タンパク質に融合しているＢｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２デコイ−Ｆｃのキメラまたは融合体、Ｂｓｔ２−デコイ−アルブミンのキメラまたは融合体、あるいはペグ（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）Ｂｓｔ２−デコイでありうる。さらにＢｓｔ２アンタゴニストは、Ｂｓｔ２および／またはマウスＤａｍｐ１タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体あるいは抗体様タンパク質ドメインでありうる。
【００２８】
本発明の他の態様において、Ｂｓｔ２アンタゴニストは化合物でありうる。さらに他の態様において、上述の方法において、炎症部位へ、炎症および免疫サイトカインまたは他の炎症性シグナルを伝達し得る限り、免疫細胞および他の細胞は、炎症部位または炎症から離れた部位のいずれに位置していてもよい。さらに、組成物は細胞接着またはシグナル伝達阻害剤あるいは免疫抑制剤を含んでいてもよい。好適な実施形態において、細胞接着阻害剤は、ＩＣＡＭ１アンタゴニスト、またはＬＦＡアンタゴニストである。
【００２９】
さらに他の実施形態において、本発明は、Ｂｓｔ２デコイ−Ｆｃキメラに関連する。好ましくは、デコイは免疫グロブリンのいかなるドメインに対しても融合しうる。特に、Ｂｓｔ２デコイは、ＩｇＧ重鎖Ｆｃのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域に融合しうる；ＩｇＧ  κ鎖−重鎖ジスルフィド結合を介して安定化しているＢｓｔ２融合タンパク質；または他のＢｓｔ２二量体を有さないＢｓｔ２デコイ−ＩｇＧ  Ｆｃ。
【００３０】
他の実施形態において、本発明は、Ｂｓｔ２および／またはＢｓｔ２のホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）に特異的なモノクローナル抗体に向けられる。ホモログは、マウスＤａｍｐ１タンパク質でありうる。さらに、モノクローナル抗体は、２つのアームを含み、そのうちの一はＢｓｔ２またはそのホモログ以外のタンパク質に特異的に結合する領域を含みうる。特に、モノクローナル抗体が結合しているＢｓｔ２発現細胞は、Ｂｓｔ２リガンド−Ｂｓｔ２相互作用またはＢｓｔ２−Ｂｓｔ２相互作用を阻害する。
【００３１】
さらに他の実施形態において、本発明は、
（ｉ）Ｂｓｔ２に結合する細胞を得る；
（ｉｉ）リガンドを発現する細胞から、Ｂｓｔ２に結合するリガンドをスクリーニングする：
を含むＢｓｔ２に対するリガンドを分離する方法に向けられる。
【００３２】
他の実施形態において、本発明は、トランスジェニックマウスに向けられ、その体細胞および生殖細胞機能的に破壊されたＤａｍｐまたはＢｓｔ２遺伝子を含み、この際、破壊された遺伝子は、マウスまたは胚形成期のマウスの祖先に導入され、破壊された遺伝子に対して同型接合性であれば炎症関連疾患を示す。
【００３３】
さらに他の実施形態において、本発明は、トランスジェニックマウスに向けられ、その体細胞および生殖細胞は、完全にまたは部分的にＢｓｔ２遺伝子で置換されたＤａｍｐ遺伝子を含み、この際、胚形成期にマウスまたはマウスの祖先にＢｓｔ２遺伝子が導入されている。
【００３４】
他の態様において、本発明は、炎症部位に対するＢｓｔ２アンタゴニストを含む組成物を投与することを有する、対象における炎症を軽減する方法に向けられる。
【００３５】
さらに、他の態様において、本発明は、必要とする対象に対するＢｓｔ２アンタゴニストを含む組成物を投与することを有する炎症関連疾患の兆候の対象を治療する方法に向けられる。組成物は、他の抗炎症性化合物を含んでいてもよい。そして、適用される疾患は、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、喘息、敗血症、潰瘍性大腸炎、Ｉ型糖尿病、白内障、多発性硬化症、急性心筋梗塞、心臓麻痺、乾癬、接触性皮膚炎、変形性関節症、鼻炎、クローン病、自己免疫疾患、悪液質、急性膵炎、自己免疫性血管炎、自己免疫性およびウイルス性肝炎、遅延型過敏症、うっ血（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ）、冠動脈再狭窄、糸球体腎炎、移植片対宿主拒絶反応、ブドウ膜炎、角膜移植に関連する炎症性眼疾患、外傷性脳損傷、てんかん、出血、発作、鎌状赤血球病、ＩＩ型糖尿病、肥満、加齢性黄斑変性症(AMD)、アトピー性皮膚炎、皮膚炎、学習／認識障害、神経変性疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、潰瘍性大腸炎、放射線による損傷、やけどまたは電気誘発性損傷（ｅｌｅｃｔｒｉｃｉｔｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｊｕｒｙ）、組織壊死および免疫細胞浸潤を引き起こす中毒、薬剤性障害、吸入剤誘発性障害（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｊｕｒｉｅｓ）、放射線被爆、肺の吸引誘発性障害（ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｊｕｒｙ）、化学または放射線療法に起因する炎症、自己免疫疾患、狼瘡、シェーグレン症候群（Ｓｃｈｏｇｒｅｎ  疾患）、多発性硬化症を含む脱髄疾患、多発性筋炎を含む炎症性筋疾患、強皮症、結節性多発動脈炎、サルコイドーシス、局所性および全身性骨化性筋炎、アルツハイマー病を含むアミロイド関連疾患、椎間板ヘルニア、脊髄および神経損傷、ライ症候群、細菌性およびウイルス性脳炎ならびに髄膜炎、プリオン関連疾患、ギラン・バレー症候群、狂犬病、ポリオ、脳出血、頭蓋内出血関連損傷、慢性疲労症候群、静脈血栓症、痛風、肉芽腫症、糸球体腎炎および間質性腎炎を含む腎炎、昆虫刺激アレルギー、アナフィラキシー、再生不良性貧血、骨髄損傷、多臓器不全、甲状腺炎、膵島炎、肝硬変（慢性および急性肝炎）、肺塞栓症、毒物性および薬剤性肝疾患、膵炎、虚血性腸疾患、急性呼吸窮迫症候群、または心膜炎でありうる。
【００３６】
さらに他の態様において、本発明は、Ｂｓｔ２に結合する化合物の決定を含む、Ｂｓｔ２を介する細胞−細胞結合の阻害に有効な化学化合物のアッセイ方法に向けられる。さらに、Ｂｓｔ２デコイは、宿主細胞中にリコンビナントで発現されうる。
【００３７】
本発明のこれらのおよび他の目的は、以下の発明の説明、これに添付される参照図およびこれに添付の特許請求の範囲からより完全に理解されるであろう。
【００３８】
図の簡単な説明
本発明は、下記に記載の詳細な説明、および説明の方法として示され、故に本発明はこれに限定されるものではない添付の図から、より深く理解されうるであろう。この際、
図１は、ヒトＢｓｔ２およびマウスＤａｍｐ１間の配列相同性を示すアミノ酸配列アラインメントである；
図２Ａ−２Ｂは、発現ベクター中のヒトＢｓｔ２デコイおよびマウスＤａｍｐ１デコイをクローニングする工程で用いられるＰＣＲプライマーの配置を示す；
図３Ａ−３ＢはヒトＢｓｔ２デコイおよびマウスＤａｍｐ１デコイの電気泳動分析の結果を示す；
図４は、Ｕ９３７細胞の同型凝集間のＢｓｔ２遺伝子の発現パターンを示す；
図５は、Ｕ９３７細胞の同型凝集の際のＢｓｔ２過剰発促進効果を示す；
図６Ａ−６Ｅは、Ｕ９３７細胞の同型凝集の際のＢｓｔ２デコイの効果を示す；
図７Ａ−７Ｇは、ヒト血管内皮（ＨＵＶＥＣ）細胞およびＵ９３７細胞間の細胞間接着の際のＢｓｔ２デコイの効果を示す；
図８Ａ−８Ｆは、ＨＵＶＥＣおよびＵ９３７細胞間の細胞間接着の際の用量依存的なＢｓｔ２デコイの効果を示す；
図９Ａ−９Ｇは、ＨＵＶＥＣおよびＵ９３７細胞間の細胞間接着の際のＢｓｔ２  ｓｉＲＮＡの効果を示す；
図１０Ａ−１０Ｂは、Ｊｕｒｋａｔ細胞の凝集時のＢｓｔ２過剰発現およびＪｕｒｋａｔ細胞中のインターロイキン−２  （ＩＬ−２）産生の効果を示す；
図１１Ａ−１１Ｉは、Ｊｕｒｋａｔ細胞凝集の際のＢｓｔ２デコイおよびＢｓｔ２  ｓｉＲＮＡの効果を示す；
図１２Ａ−１２Ｂは、Ｊｕｒｋａｔ細胞の凝集およびＩＬ−２産生におけるＢｓｔ２デコイの効果を示すグラフである；
図１３は、Ｂｓｔ２デコイ処理時の沈降した免疫細胞数の変化を示す；
図１４は、Ｂｓｔ２デコイ処理時の減少したサイトカインのレベルを示す；
図１５Ａ−１５Ｄは、ヒトＢｓｔ２およびマウスＤａｍｐ１間の機能的類似性を示す；
図１６Ａ−１６Ｄは、マウスのオボアルブミン誘発性喘息におけるＢｓｔ２デコイおよびマウスＤａｍｐ１デコイの阻害効果を示す；
図１７は、Ｂｓｔ２デコイのＰＥＧ−結合型の準備に用いられるＰＥＧ部分を示す；
図１８は、ＰＥＧ−結合Ｂｓｔ２デコイの向上した代謝低下を示す；
図１９は、炎症関連疾患におけるＢｓｔ２の発現および分布を示す；
図２０Ａ−２０Ｄは、Ｆｃ領域に融合したＢｓｔ２デコイの概略図を示す。Ａ、Ｂｓｔ２デコイ自身；Ｂ、ＩｇＧ重鎖Ｆｃのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分に融合したＢｓｔ２デコイ；Ｃ、自然に起こったＩｇＧ  κ鎖−重鎖ジスルフィド結合を通じて安定化されるＢｓｔ２融合タンパク質；Ｄ、Ｂｓｔ２デコイ−ＩｇＧ  Ｆｃは、他のＢｓｔ２二量体がなく発現された；
図２１Ａ−２１Ｄは、図２０のＢｓｔ２デコイ−ＩｇＧ  Ｆｃ  融合タンパク質の代表的ベクターマップである；
図２２は、ＰＣＲ−クローニングおよび融合戦略を示す；
図２３Ａ−２３Ｂは、精製されたＢｓｔ２デコイおよび他のＦｃ融合物のＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を示す。Ａ、アフィニティ精製した種々のＢｓｔ２融合タンパク質を表す、クマシーで染色された代表的ＰＡＧＥゲル（４〜１２％  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。Ｂ．サイズ排除クロマトグラフィー後のＰＡＧＥ；
図２４Ａ−２４Ｂは、Ｂｓｔ２コーティングプレート；およびＢ、ＢＳＡコーティングプレート上の免疫細胞に対するＢｓｔ２デコイの直接結合性を示す；
図２５は、Ｂｓｔ２デコイまたはＦｃ融合物の血漿中半減期を示す；
図２６は、Ｂｓｔ２デコイおよび細胞間の結合におけるＢｓｔ２デコイ−Ｆｃ融合物の阻害効果を示す；
図２７Ａ−２７Ｄは、喘息のマウスモデルにおけるＢｓｔ２デコイ−Ｆｃ融合物の効果を示す；
図２８Ａ−２８Ｂは、ヒト−マウスキメラＢｓｔ２マウスの作製を示す。Ａ．マウス（上、黒）およびヒト（下、グレー）のゲノム遺伝子座。エクソンは、長方形ボックスとして示される。膜貫通領域の終点は矢印で示され、開始メチオニン（ＡＴＧ）は星印で示される。エクソンをコードする全域の物理的距離は、ゲノム遺伝子座の下に示される。図は、一定縮尺では描かれていない。Ｂ．キメラヒト−マウスＢＳＴ２の作製戦略;
図２９Ａ−２９Ｅは、ＩＦＮγで刺激後の内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）および単球細胞（Ｕ９３７）間の異型凝集に内在性Ｂｓｔ２が必要であることを示す。Ａ、コントロール；Ｂ、ＩＦＮγ炎症刺激；Ｃ、ＩＦＮγ炎症刺激＋コントロールｓｉＲＮＡ；Ｄ、ＩＦＮγ炎症刺激＋Ｂｓｔ２  ｓｉＲＮＡ；Ｅ、Ａ−ＤのＢｓｔ２  ｓｉＲＮＡ結果の定量分析；
図３０は、Ｂｓｔ２  ｓｉＲＮＡ処理またはＩＣＡＭ１  ｓｉＲＮＡ処理が、ＩＦＮγ処理ＨＵＶＥＣにおいてＩＣＡＭ１発現またはＢｓｔ２発現のそれぞれに影響を与えないことを示す。ＲＴ−ＰＣＲ分析が行われた；
図３１Ａ−３１Ｇは、Ｂｓｔ２  ｓｉＲＮＡおよびＩＣＡＭ１  ｓｉＲＮＡの組合わせ処理を示し、異型接着アッセイにおける相加効果を示す。Ａ、コントロール；Ｂ、ＩＦＮγ炎症刺激；Ｃ、ＩＦＮγ炎症刺激＋コントロール  ｓｉＲＮＡ；Ｄ、ＩＦＮγ炎症刺激＋Ｂｓｔ２  ｓｉＲＮＡ；Ｅ、ＩＦＮγ炎症刺激＋ＩＣＡＭ１  ｓｉＲＮＡ；Ｆ、ＩＦＮγ炎症刺激＋ＩＣＡＭ１  ｓｉＲＮＡ＋Ｂｓｔ２  ｓｉＲＮＡ；Ｇ、Ａ−ＦからのＢｓｔ２  ｓｉＲＮＡおよびＩＣＡＭ１  ｓｉＲＮＡ結果の定量分析；
図３２Ａ−３２Ｍは、異型接着アッセイにおける抗−ＩＣＡＭ１またはＢｓｔ２デコイの用量依存反応を示す。Ａはコントロールを示す；Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦは、ＩＦＮγ炎症刺激＋ＩＣＡＭ−１抗体の増加していく投与量を示す；Ｇは、ＩＦＮγ炎症刺激＋コントロールＢＳＡを示す；Ｈは、ＩＦＮγ炎症刺激＋コントロールＩｇＧを示す；Ｉ、Ｊ、Ｋ、およびＬは、ＩＦＮγ炎症刺激＋ＢＳＴ２デコイの増加していく投与量を示す；Ｍは、Ａ−Ｌからの抗−ＩＣＡＭ１およびＢｓｔ２デコイの用量依存反応の結果の定量分析を示す；
図３３Ａ−３３Ｃは、Ｂｓｔ２デコイおよび抗−ＩＣＡＭの処理の組合わせが細胞接着において相加効果をもたらすことを示す。Ｂｓｔ２デコイ（１００ｎｇ／ｍｌ）および抗−ＩＣＡＭ１（１ｕｇ／ｍｌ）の準最適投与量が用いられた。細胞接着は、Ｂｓｔ２デコイおよび抗−ＩＣＡＭ１の双方が用いられたときコントロールレベルに対して完全に阻害された；
図３４は、サイトカイン処理後のＢｓｔ２ｍＲＮＡの相対的発現レベルを示す。Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＶＥＣ（ヒト血管内皮細胞）、ＨｅＬａまたはＣＡＳＭＣ（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ）を、示したように、血清、ＰＭＡ（１２または１８時間）、ＯＫＴ（１２または１８時間）、ＴＮＦ−α、インターフェロンγまたはＰＧＪ２で処理後、Ｂｓｔ２ｍＲＮＡレベル（ログ対数）を示した。Ｂｓｔ２ｍＲＮＡレベルは、リアルタイムＰＣＲで測定した;
図３５は、Ｂｓｔ２に対するリガンドを発現する細胞Ａと、タンパク質または化合物Ｙのレセプターを発現する細胞Ｂとの間の相互作用およびシグナル伝達を起こさせる方法の概略図を示す。Ｂｓｔ２デコイと、タンパク質または化合物Ｙとから構成される２種（ｂｉｖａｌｅｎｔ）融合タンパク質は、細胞ＡおよびＢ間の相互作用を起こさせるアダプターとして機能しうる。そうすることで、細胞Ａおよび細胞Ｂ間のシグナル伝達が向上しうる；
図３６は、Ｂｓｔ２／Ｄａｍｐ１デコイに対するファージクローンの結合を示す;
図３７Ａ−３７Ｂは、抗Ｂｓｔ２／Ｄａｍｐ１モノクローナル抗体（Ａ）重鎖可変領域；および（Ｂ）κ鎖可変領域を示す;および
図３８Ａ−３８Ｂは、ＰＡＧＥゲル上の、一時的に発現し、精製された抗Ｂｓｔ２モノクローナル抗体を示す。（Ａ）非還元条件下；（Ｂ）還元条件下。
【００３９】
図３９は、マウスのオボアルブミン誘発性喘息における抗Ｂｓｔ２／Ｄａｍｐ１モノクローナル抗体の処理時の沈降免疫細胞数の変化を示す。
【００４０】
好適な形態の詳細な説明
本願において、”ａ”および“ａｎ”は、対象の単数および複数を指すために用いられる。
【００４１】
本願では、“アンタゴニスト”または“ブロッカー”は、炎症を引き起こすタンパク質の活性を阻害する、遮断する、または低減する物質を指す。アンタゴニストの活性機構は、特に限定されるものではない。アンタゴニストの例としては、有機または無機化合物；タンパク質、炭水化物および脂質のような高分子化合物；および多数の化合物の混合物が挙げられる。例えば、“Ｂｓｔ２アンタゴニスト”または“Ｂｓｔ２ブロッカー”としては、炎症を起こす活性におけるＢｓｔ２タンパク質の活性を阻害する、遮断する、または低減する物質が挙げられる。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、“Ｂｓｔ２リガンド”または“Ｂｓｔ  Ｌ”は、Ｂｓｔ２に特異的に結合する分子を指す。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、タンパク質の“ホモログ”は、比較タンパク質に対する全体的な相同配列のレベルに関わらず、比較タンパク質と同等の活性または同等の特異的活性を有すると考えられているものである。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、“炎症性疾患”という用語は、悪影響に対する生体防御反応または感染反応から生じ、その結果、赤み、腫れ、圧痛、痛み、熱および機能障害のような症状をもつ状態（身体的、化学的および生物学的状態）となる、あらゆる疾患を指す。
【００４５】
“改変”という用語は、本明細書中で使用される場合、プロセスを示し、そのプロセスにおいては、非ペプチドポリマーがＢｓｔ２タンパク質、またはその断片に連結している。
【００４６】
“非ペプチドポリマー”という用語は、本明細書中で使用される場合、生体適合性ポリマーを指し、該ポリマー中では２以上の繰り返し単位が互いに連結している。非ペプチドポリマーの例としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、コポリ（エチレン／プロピレン）グリコール、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリウレタン、ポリホスファゼン、多糖、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルエチルエーテル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリマー脂質、キチン、ヒアルロン酸、およびヘパリンが挙げられる。好適な非ペプチドポリマーは、ポリエチレングリコールである。
【００４７】
”操作して連結される”（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）という用語は、本明細書中で使用される場合、核酸発現制御配列と、一般的な機能を起こさせるような方式で標的タンパク質をコードする第二の核酸配列との間の機能的連結を指す。例えば、プロモーターは、タンパク質をコードする核酸配列に操作して連結され、コード配列の発現に影響を与える。ベクターへの操作可能な連結は、当技術分野で周知の遺伝子組み換え技術を用いて準備され、当該技術分野で周知の酵素を用いて、部位特異的切断およびライゲーションを行うことができる。
【００４８】
“予防”という用語は、本明細書中で使用される場合、組成物の投与を通じて炎症性疾患を阻害する、または炎症性疾患の発生を遅延させる全ての働きを意味する。“治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）”、“治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）”および“治療（ｔｈｅｒａｐｙ）”という用語は、本明細書中で使用される場合、炎症性疾患に罹患しているヒトを楽にさせる、および手助けする全ての働き（治療的療法、予防的療法（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）および予防的療法（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ））を意味する。
【００４９】
“ｓｉＲＮＡ”という用語は、本明細書中で使用される場合、標的ｍＲＮＡの切断を通じてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導することができる短二本鎖ＲＮＡ分子を意味する。“特異的”または“に対して特異的”という用語は、本明細書中で使用される場合、細胞において他の遺伝子に影響を与えず、標的遺伝子のみ抑制することができることを意味する。本発明において、Ｂｓｔ２に特異的なｓｉＲＮＡ分子は、供給されている。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、“同等の”活性とは、参照活性に対して、客観的に定められたパラメーターを介して測定して表示された活性の約８０％を超えると看做される。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、“低分子量化合物またはモジュレーター”あるいは“化合物”は、炭水化物、ポリペプチド、核酸、または脂質のような生体分子から区別される化学化合物を指す。低分子量化合物またはモジュレーターとしては、特に限定されるものではないが、アンタゴニスト、アゴニスト、ペプチド模倣薬、阻害剤、リガンド、およびＢｓｔ２／Ｂｓｔ２Ｌ結合のための結合因子が挙げられる。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、“変異体”は、欠失、挿入、非同類置換または同類置換あるいはこれらの組合わせによって、タンパク質の野生型アミノ酸配列から異なる配列を有する、タンパク質またはその断片を指す。例えば、タンパク質およびペプチドにおいて、タンパク質またはペプチドの活性を概して変化させないアミノ酸の変換が当該分野で知られている（Ｈ．  Ｎｅｕｒａｔｈ、Ｒ．  Ｌ．  Ｈｉｌｌ、Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７９）。最も一般に起きる変換は、双方向で、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／ＧｌｕおよびＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【００５３】
“ベクター”という用語は、本明細書中で使用される場合、適切な宿主細胞内で興味あるタンパク質を発現させることができるベクターを表現し、宿主細胞内で発現されるように遺伝子挿入が操作可能に連結されている本質的調節因子を含む遺伝子構造を指す。 
【００５４】
Ｂｓｔ２タンパク質
炎症時、Ｂｓｔ２は細胞間接着に寄与する。一態様において、本発明は、炎症時の免疫細胞の内皮細胞への細胞間接着および活性化、または免疫細胞同士の細胞間接着および活性化を阻害するために、Ｂｓｔ２（骨髄間質抗原−２（Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ａｎｔｉｇｅｎ−２））タンパク質のアンタゴニストを提供する。
【００５５】
本願発明者らは、（１）免疫細胞の凝集の際のＢｓｔ２の効果を調べるためのヒトＵ９３７単球細胞の同型凝集モデル、（２）免疫細胞および内皮細胞間の細胞間接着の際のＢｓｔ２の効果を調べるためのＵ９３７細胞およびＨＵＶＥＣ間異型凝集モデル、（３）Ｔリンパ球活性化の際のＢｓｔ２の効果を調べるための、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ−細胞モデルを用いた研究を通して、Ｂｓｔ２タンパク質が炎症部位に白血球が移動し、細胞と相互作用する細胞外マトリックス成分を認識し、細胞に接着する炎症プロセスに関与していることがわかった。本願発明者らは、さらにＢｓｔ２タンパク質のアンタゴニストが効果的にかような細胞間接着を阻害し、したがって効果的に炎症疾患を治療することができることをも見出した。Ｂｓｔ２タンパク質は、骨髄間質細胞で初めて同定され、細胞分化および増殖に関与していると考えられている。Ｂｓｔ２をコードするｃＤＮＡは、１９９５年にクローン化され、ＢＳＴ−２遺伝子は、ヒト染色体１９ｐ１３．２上に配置されていることが見出された（Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２６：５２７−５３４、１９９５）。Ｂｓｔ２遺伝子は、エクソンおよび４つのイントロンから構成される。Ｂｓｔ２は、１８０アミノ酸から構成される３０から３６−ｋＤのＩＩ型膜貫通タンパク質である（Ｏｈｔｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５８：５８３−５９１、１９９９）。ヒトＢｓｔ２遺伝子のマウスホモログであるＤａｍｐ１遺伝子は、ヒトＢｓｔ２遺伝子に対して４５％のＤＮＡ配列同一性を有し、図１に示されるように、ヒトＢｓｔ２に対して４０％未満のアミノ酸配列相同性を有する。Ｂｓｔ２タンパク質は、主に肝臓、肺、心臓および胎盤で発現し、膵臓、腎臓、骨格筋および脳では低いレベルで発現している。繊維芽細胞上で表面発現しているＢＳＴ−２は、ネズミの骨髄由来ｐｒｅ−Ｂ細胞の間質細胞依存性成長を加速する。この結果は、Ｂｓｔ２がｐｒｅ−Ｂ−細胞成長制御し、または関節リウマチにおけるＢ細胞活性化において重要な役割を果たすことを示唆している。Ｂｓｔ２はまた、口腔ガン、乳ガン、アデノーマおよび子宮頸ガンなどのある種のガンで過剰発現する。図１を参照する際、膜貫通領域の端は、示された配列に限定されないことに留意されたい。膜貫通領域は、領域のＮ−またはＣ−末端のどちらかにおいてプラスまたはマイナス５アミノ酸でありうる。
Ｂｓｔ２タンパク質については、Ｂｓｔ２タンパク質をコードする遺伝子の単離および発現（ＥＰ１０３３４０１）、Ｂｓｔ２タンパク質のガン診断における使用（ＷＯ０１／５７２０７およびＷＯ０１／５１５１３）が報告されている。Ｂｓｔ２タンパク質は、細胞質、膜貫通および細胞外ドメインの３つの領域に分けられ、細胞内領域は、細胞質および膜貫通領域を含む。
【００５６】
炎症性疾患
本発明の組成物は、Ｂｓｔ２過剰発現を含む全てのタイプの炎症性疾患の予防または治療に用いられうる。事実、Ｂｓｔ２は、喘息、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、慢性活動性胃炎、急性虫垂炎、および紅斑性狼瘡などの種々の炎症性疾患で過剰発現されていた（図１９）。したがって、本発明の組成物によって予防または治療しうる疾患としては、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、喘息、敗血症、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、急性心筋梗塞、心臓麻痺、乾癬、接触性皮膚炎、変形性関節症、鼻炎、クローン病、ＩＩ型糖尿病、糖尿病性神経障害、慢性閉塞性肺疾患、悪液質、急性膵炎、自己免疫性血管炎、自己免疫性およびウイルス性肝炎、遅延型過敏症、うっ血、冠動脈再狭窄、糸球体腎炎、移植片対宿主拒絶反応、ブドウ膜炎、角膜移植に関連しうる炎症性眼疾患、外傷性脳損傷、てんかん、出血または発作が挙げられる。Ｂｓｔ２ブロッカーは、鎌状赤血球病の治療にも有効でありうる。鎌状赤血球病では、再発性炎症および血管障害が起こる。他の細胞および内皮への白血球の接着は、鎌状赤血球病における血管閉塞に関与することが示された（Ｏｋｐａｌａ  Ｉ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００６、Ｊａｎ；１３（１）：４０−４）。さらに、炎症性経路の活性化が肥満関連インスリン抵抗に対するメカニズムとなりうるという考えが最近現れてきた（Ｒｏｙｔｂｌａｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｏｂｅｓ  Ｒｅｓ．２０００、８（９）：６７３−５；Ｓｔｒａｃｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６、２７１（５２４９）：６６５−８；Ｈｉｒｏｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ．２００２、４２０（６９１３）：３３３−６）。Ｂｓｔ２ブロッカーは、インスリン抵抗、ＩＩ型糖尿病および肥満に対して有益となりうる。
【００５７】
他の炎症関連疾患としては、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、アトピー性皮膚炎、皮膚炎、学習／認識障害、神経変性疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、潰瘍性大腸炎、放射線による損傷、やけどまたは電気誘発性損傷、組織壊死および免疫細胞浸潤を引き起こす中毒、薬剤性障害、吸入剤誘発性障害、放射線被爆、肺の吸引誘発性障害、化学療法または放射線療法に起因する炎症、狼瘡を含む自己免疫疾患、シェーグレン症候群、多発性硬化症を含む脱髄疾患、多発性筋炎を含む炎症性筋疾患、強皮症、結節性多発動脈炎、サルコイドーシス、局所性および全身性骨化性筋炎、アルツハイマー病を含むアミロイド関連疾患、椎間板ヘルニア、脊髄および神経損傷、ライ症候群、細菌性およびウイルス性脳炎ならびに髄膜炎、プリオン関連疾患、ギラン・バレー症候群、狂犬病、ポリオ、脳出血、頭蓋内出血関連損傷、慢性疲労症候群、静脈血栓症、痛風、肉芽腫症、糸球体腎炎および間質性腎炎を含む腎炎、昆虫刺激アレルギー、アナフィラキシー、再生不良性貧血、骨髄損傷、多臓器不全、甲状腺炎、膵島炎、肝硬変（慢性および急性肝炎）、肺塞栓症、毒物性および薬剤性肝疾患、膵炎、虚血性腸疾患、急性呼吸窮迫症候群、および心膜炎が挙げられる。
【００５８】
Ｂｓｔ２デコイ
Ｂｓｔ２タンパク質の可溶型あるいはその断片または変異体が、炎症を起こすためにＢｓｔ２を発現している免疫細胞が結合する分子または部位に完全に結合するデコイとして用いられうる。デコイとして用いられうるＢｓｔ２断片は、細胞間接着を阻害することによって炎症抑制効果を有する限り、特に限定されるものではないが、好ましくは細胞内ドメインの全体または部分を欠失しているＢｓｔ２タンパク質である。具体的実施形態として、Ｂｓｔ２タンパク質断片は、配列番号：１のアミノ酸配列を含むＢｓｔ２タンパク質である。Ｄａｍｐ１タンパク質断片は、配列番号：２のアミノ酸配列を含むＤａｍｐ１タンパク質断片である。Ｂｓｔ２タンパク質断片およびＤａｍｐ１タンパク質断片はＢｓｔ２によって引き起こされる細胞間接着を効果的に阻害することが見出された。
【００５９】
本発明のある態様において、マウスＤａｍｐ１はＢｓｔ２の代わりに用いられ、それらは交互に用いられうることと理解されるべきである。例えば、Ｂｓｔ２デコイが用いられるとき、Ｄａｍｐ１デコイのキメラを含むＤａｍｐ１デコイが用いられうると考えられる。Ｂｓｔ２とともにＤａｍｐ１およびその変異体が、対象における炎症の治療および軽減のために使用されうると考えられる。したがって、本明細書で示されるＢｓｔ２のいかなる特別な使用も、Ｄａｍｐ１にも同様に適用し、同様に請求されうる。
【００６０】
本発明の範囲には、Ｂｓｔ２タンパク質の野生型アミノ酸配列あるいはその断片または変異体を有するタンパク質、細胞間接着およびシグナル伝達を阻害することによって炎症抑制効果を有するタンパク質をコードすることができるＤＮＡおよびＲＮＡを含む。
【００６１】
さらに、本発明で提供されるタンパク質またはその断片は、天然糖鎖、天然型と比較して付加された糖鎖または天然型と比較して減少した糖鎖を有する形態であっても、あるいは脱グリコシル化された形態であってもよい。タンパク質の糖鎖の付加、減少、または除去は、化学的手法、酵素法、微生物を用いた遺伝子工学的手法のような常法によって達成されうる。遺伝子工学的手法には、Ｂｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２デコイ  Ｆｃの野生型配列で見出された、１または２以上の糖鎖の欠失、および／または天然タンパク質中に存在しない１または２以上の糖鎖付加部位の付加を含む。
【００６２】
Ｂｓｔ２デコイ／Ｂｓｔ２デコイ−Ｆｃ変異体
特に低分子量タンパク質が過剰に急速除去されると、治療効果が限定されうる。注入された治療用タンパク質は、内皮細胞または血液細胞上の血漿タンパク質またはレセプターに結合し、その結果、タンパク質の取り込みが起こる、血漿プロテアーゼによって処理されうる。血管での捕捉を逃れたタンパク質は、肝臓または腎糸球体で除去されうる。腎臓系において、タンパク質は、尿へと入り、体外へ排出される。糸球体障壁は、分子サイズおよび分子電荷の双方に基づいて、タンパク質を区別する（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９７８、２３４：Ｆ４５５）。したがって、分子サイズまたは負の電荷の増大は、腎クリアランスを減少しうる（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９７０、７４：４９５）。
【００６３】
インビボでの活性およびＢｓｔ２デコイ活性の持続を向上させるための一般的な戦略としては、ＰＥＧ化、クリアランスを減少させるための化学修飾、アルブミンへのタンパク質架橋結合、多重結合、組み換えＤＮＡ技術を用いたアルブミンへの直接融合、Ｆｃへの融合などが挙げられる。さらに、Ｂｓｔ２デコイまたはＢｓｔ２デコイ−Ｆｃのインビボ活性の向上および活性持続を延ばすための戦略として、糖鎖工学も適用可能である。追加のＮ−結合型オリゴ糖がコンセンサス配列（Ａｓｎ−Ｘ／Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、この際、Ｘはプロリン以外のアミノ酸）に付加される（Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ  Ｂ  ａｎｄ  Ｓｈａｎｎｏｎ  ＫＬ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９１、３０：４３７４）。Ｎ−結合型糖鎖は、Ｅｐｏ、Ｍｐｌリガンドなどのタンパク質または通常全体として糖鎖を欠くレプチンでさえ付加される。糖鎖工学により得られるタンパク質は、実質的にインビボ活性および活性の持続が向上することが示された（Ｅｌｌｉｏｔｔ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３、２１：４１４）。
【００６４】
Ｂｓｔ２Ｌに対する親和結合がより強いＢｓｔ２デコイ（Ｂｓｔ２デコイ−Ｆｃ）変異体を製造することができる。Ｂｓｔ２の二量体化ドメインは、Ｂｓｔ２のリガンド結合親和性の制御に関与しうる。Ｂｓｔ２の二量体化は、Ｂｓｔ２シグナル伝達に役割を果たすと考えられている。インターロイキン２、３、５、および６ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）に対するレセプターは、２つの異なるサブユニットを含む（Ｈａｔａｋｅｙａｍａ  Ｍ、ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８９、２４４（４９０４）：５５１−６；Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｔ、ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ．１９９１、６６（６）：１１６５−７４）。顆粒球コロニー刺激因子レセプター、プロラクチンレセプターおよび成長ホルモンレセプターのリガンド結合サブユニットは、ホモ二量体を形成する（Ｌａｒｓｅｎ  Ａ、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １９９０、１７２（６）：１５５９−７０、Ｋｅｌｌｙ  ＰＡ、ｅｔ  ａｌ．、Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇ  Ｈｏｒｍ  Ｒｅｓ．１９９３、４８：１２３−６４）。二量体化により、レセプターが高親和性となり、シグナル伝達経路の最初の段階が始まることが示されてきた  （Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＢＣ、ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９１、２５４（５０３３）：８２１−５；Ｎｉｃｏｌａ  ＮＡ、Ｍｅｔｃａｌｆ  Ｄ、Ｃｅｌｌ．１９９１、６７（１）：１−４）。
【００６５】
Ｂｓｔ２のホモ二量体化は、Ｂｓｔ２Ｌ（リガンド）により誘発されるシグナル伝達に役割を果たす可能性があるため、高親和性結合であるＢｓｔ２デコイ（Ｂｓｔ２デコイ−Ｆｃ）変異体は、潜在的な二量体化ドメイン内のアミノ酸残基の突然変異によって製造しうる。
【００６６】
Ｂｓｔ２のＳＭＡＲＴ分析は、９６−１５３（ヒトＢｓｔ２）（または１０２−１４９、ラットＢｓｔ２）のアミノ酸領域中、またはマウスＤａｍｐ１中の対応する領域中のコイルドコイル領域を予測する。Ｂｓｔ２のコイルドコイル領域は、Ｂｓｔ２二量体化に関与しうる。
【００６７】
Ｂｓｔ２二量体化ドメインの決定
サイトカインにより誘発されるＢｓｔ２の二量体化は、２つの異なってタグされたＢｓｔ２（ＨＡ−Ｂｓｔ２およびＢｓｔ２−Ｆｌａｇなど）がトランスフェクトされた安定化細胞中で、またはタグされたＢｓｔ２用の発現ベクターで一過性にトランスフェクションされた後の安定化細胞中で示されうる。Ｂｓｔ２の二量体化は、タグされたＢｓｔ２タンパク質の免疫共沈降によって示される。野生型Ｂｓｔ２レセプターの二量体化は、示されうる。Ｂｓｔ２の二量体化が確認された場合、二量体化に関する必須残基についての情報は、欠失解析、アラニンスキャニング変異分析、および／または部位特異的突然変異誘発法後に得ることができる。細胞外ドメイン全体またはコイルドコイルドメイン中に変異が形成されうる。野生型レセプターの二量体化が示される場合、二量体化に重要な残基の欠失または置換を含む変異体は共沈降されないであろう。Ｂｓｔ２を含む細胞に一過性にトランスフェクトされたとき、二量体化ドメインにおいて欠失または置換を含むＢｓｔ２変異体は、サイトカイン刺激後の炎症反応を遮断し、細胞−細胞接着を阻害するドミナントネガティブ変異体として機能しうる。Ｄａｍｐ１  −／−細胞（例えばＤａｍｐ１  −／−マウス胎児線維芽細胞）において安定的に発現されるとき、これらの変異体は、炎症反応または細胞-細胞接着を効果的に発揮することができない。
【００６８】
多様な欠失変異体、挿入変異体または置換変異体が、高親和性Ｂｓｔ２デコイまたはＢｓｔ２デコイ−Ｆｃとして使用されるためにスクリーニングされる。欠失、挿入または置換は、上述のように同定される細胞外ドメイン全体、コイルドコイルドメインまたは二量体化ドメインにおける標的変異部位に対して導入されうる。変異部位の位置は、例えばヒトＢｓｔ２、ラットＢｓｔ２およびマウスＤａｍｐ１中でホモロジーが低い領域中でありうる。標的アミノ酸残基の欠失、標的アミノ酸残基に隣接した１または２以上のアミノ酸残基の挿入、または標的アミノ酸残基の置換がなされうる。標的アミノ酸残基は、１または複数のアミノ酸残基でありうる。過度の欠失／挿入は、生物活性が完全に失われることになる可能性があるので、アミノ酸配列の欠失または挿入は、１−５連続残基からなされうる。
【００６９】
欠失、挿入または置換における標的アミノ酸残基としては、上述のように同定されるＢｓｔ２二量体化に重要な残基が挙げられる。影響のある他の部位としては、ヒトＢｓｔ２、ラットＢｓｔ２およびマウスＤａｍｐ１において、その部位中のアミノ酸残基が類似の、または同一であるものである。置換型突然変異生成のために、ランダム変異導入法が行われうる。
【００７０】
Ｂｓｔ２デコイ−またはＢｓｔ２デコイ−Ｆｃ変異体のスクリーニング
１．Ｂｓｔ２デコイ−またはＢｓｔ２デコイ−Ｆｃ変異体は、細胞−細胞接着アッセイを用いてスクリーニングされうる。高親和性の変異体は、親Ｂｓｔ２デコイまたはＢｓｔ２デコイ−Ｆｃタンパク質より、より効果的に細胞−細胞接着を阻害する。
【００７１】
２．Ｂｓｔ２デコイ−Ｆｃの変異体は、本明細書で記述されるように、固相吸着アッセイを用いてスクリーニングされる。プレートは抗Ｆｃ抗体でコートされ、Ｂｓｔ２デコイ−Ｆｃ変異体でインキュベートされる。Ｂｓｔ２Ｌ用の細胞株源（実施例２９−１参照、インビトロでＢｓｔ２Ｌが豊富な細胞源の同定欄）またはＵ９３７細胞（実施例２０参照）は、次いで、３Ｈ−チミジンで放射性標識され、ウェルに添加される。Ｂｓｔ２Ｌを分離、確認（実施例２８−３４参照）した後、Ｂｓｔ２Ｌ用の発現ベクターがトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞は放射性標識され、またアッセイ用に用いられうる。固定化の後、放射性標識された細胞の接着性が測定される。
【００７２】
３．本明細書で記載される方法により、当該技術分野の当業者が、タンパク質の精製を必要とすることなく、高い結合親和性で変異体を同定することができる。変異原Ｂｓｔ２ＰＣＲプライマーは、細胞外ドメイン、コイルドコイルドメインもしくは二量体化ドメイン中の選択されたアミノ酸残基またはいかなる任意のアミノ酸のランダム変異導入法のために設計されうる。突然変異をコードするＰＣＲ産物は、設計されたＢｓｔ２発現ベクター中でサブクローンされる。ＣＯＳ７細胞は、変異Ｂｓｔ２  ｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトされる。この方法では、細胞外ドメイン、コイルドコイルドメインまたは二量体化ドメイン中に変異を含むＢｓｔ２変異体は、パンニング用にトランスフェクションされた細胞の表面上に発現する。精製されたＢｓｔ２Ｌでコートされたパンニングプレートに対して、細胞は添加されうる。Ｂｓｔ２Ｌに対して高い親和性を有するＢｓｔ２デコイを発現する細胞は、次いで、ＦＩＴＣ−ラベルされたヒトＢｓｔ２Ｌ−Ｆｃを用いて、間接免疫蛍光法またはＦＡＣＳ分析によってスクリーニングされ、次いで二次抗体染色が行われる。プレートに接着した細胞からプラスミドＤＮＡが回収され、濃縮の次のサイクル用に用いられる。Ｂｓｔ２デコイまたはＢｓｔ２デコイ−Ｆｃは、選択的変異配列を含むように改変される。選択的変異を含むＢｓｔ２デコイまたはＢｓｔ２デコイ−Ｆｃは、機能的検証のための細胞−細胞接着アッセイで試験される。
Ｂｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２デコイＦｃタンパク質、Ｂｓｔ２Ｌ、これらのタンパク質の部分またはこれらのタンパク質の変異体の製造
本発明の範囲には、哺乳類、昆虫、真菌、植物または細菌起源の宿主細胞中に発現させるための、Ｂｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２デコイＦｃタンパク質、Ｂｓｔ２Ｌ、これらのタンパク質の部分またはこれらのタンパク質の変異体用の発現ベクターを構築する方法およびこれらのタンパク質の精製方法を含む。Ｂｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２デコイＦｃまたはＢｓｔ２Ｌには、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、霊長類および他の動物由来のＢｓｔ２およびＢｓｔ２Ｌホモログ起源のものも含まれる。組み換えタンパク質製造用の発現ベクターの構築のために、各発現システム用にコドン最適化されたヌクレオチド配列を有するＢｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２デコイＦｃ、Ｂｓｔ２Ｌまたはこれらの変異体の対応する遺伝子または断片を化学的に合成することが必要とされる。哺乳類、昆虫（バキュロウィルス、シュナイダー細胞）、菌、植物またはバクテリア細胞におけるのＢｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２デコイＦｃまたはＢｓｔ２Ｌ発現用に設計された発現ベクターは、プラスミドまたはウイルス中に存在しうる宿主細胞−特異的ベクター中の宿主細胞−特異的プロモーターの近傍で、Ｂｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２デコイＦｃまたはＢｓｔ２ＬをコードするＤＮＡ断片を挿入することにより構築される。これらのタンパク質は、哺乳類、昆虫、菌、植物またはバクテリア細胞中で標識された融合タンパク質として発現されうる。標識は、短いタンパク質配列であり、これは抗体または特異的に改変された固体支持体に対して高い結合親和性を有する。標識（タグ）としては、必ずしも限定されるものではないが、ヒスチジン、Ｆｌａｇ、Ｖ５、ＧＳＴおよびＨＡタグが挙げられる。標識されたＢｓｔ２デコイは、カラムまたはビーズような固体支持体への標識の親和性に基づいて精製される。液体クロマトグラフのような追加の工程が、全てのＢｓｔ２−関連タンパク質の純度を上げるために用いられうる。
【００７３】
Ｂｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイまたはＢｓｔ２Ｌのタンパク質あるいは断片は、所望により、Ｎ末端アミンのアセチル化、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化、セリン、スレオニンまたはチロシン残基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジンのα−アミノ基のメチル化、グルタミニルおよびアスパラギニル残基の脱アミド、プロリンおよびリシンの水酸化、ビオチン化、パルミチル化、硫酸化、ファルネシル化などによって改変されてもよい。
【００７４】
細胞間接着を阻害することによって炎症抑制効果を有する、Ｂｓｔ２またはＢｓｔ２Ｌタンパク質、Ｂｓｔ２デコイ、これらの断片、あるいはこれらの変異体は、天然に分離または合成されうる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９−２１５６、１９６３）、またはＤＮＡ配列に基づいて組み換え方法によって準備されうる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ．  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ、２ｎｄ  Ｅｄ．、１９８９）。遺伝子組み換え技術が用いられる場合、Ｂｓｔ２またはＢｓｔ２Ｌタンパク質、これらの断片またはこれらの変異体をコードする核酸を適切な発現ベクターに挿入し、発現ベクターを宿主細胞へ転換し、目的のタンパク質を発現させるために宿主細胞を培養し、生産されたタンパク質を培養から回収することによって、目的のタンパク質を得ることができる。
【００７５】
１．組み換えＢｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２デコイＦｃ、Ｂｓｔ２Ｌ、これらのタンパク質の部分または変異体の準備
組み換えタンパク質に基づくアプローチを成功させるためには、大量生産用にスケールアップできる生物学的に活性なタンパク質を製造する必要がある。上述のＢｓｔ２関連タンパク質のネイティブ遺伝子配列と発現ホストの野生型遺伝子配列との間のコドン使用頻度の相性が重視すべき重要な事項である。
【００７６】
Ｂｓｔ２デコイおよびＢｓｔ２デコイＦｃタンパク質の治療的有用性に加えて、Ｂｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２デコイＦｃ、Ｂｓｔ２Ｌ、これらのタンパク質の部分またはこれらのタンパク質の変異体の組み換えタンパク質が、抗Ｂｓｔ２抗体または抗Ｂｓｔ２Ｌ抗体の変異体をスクリーニングするために必要とされる。
【００７７】
組み換えＢｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、およびＢｓｔ２デコイＦｃタンパク質は、また結合相互作用に関与するＢｓｔ２Ｌを同定するためのアッセイで用いられる。Ｂｓｔ２Ｌは、Ｂｓｔ２自身、または他のタンパク質、ペプチドまたは分子でありうる。
【００７８】
Ｂｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２デコイＦｃおよびＢｓｔ２Ｌ、これらの部分および変異体は、Ｂｓｔ２−Ｂｓｔ２Ｌ相互作用のペプチドまたは低分子量阻害剤またはアゴニストをスクリーニングするために用いられうる。そのようなスクリーニングアッセイとしては、ハイスループットタンパク質-タンパク質結合アッセイ、セルベースアッセイ、イムノアッセイまたは低分子量薬候補を同定するのに適した化学ライブラリーの生化学スクリーニングアッセイが挙げられる。
【００７９】
組み換えＢｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２Ｌ、これらの部分および変異体は、また組み換えタンパク質に基づいたワクチンアプローチにも有用でありうる。
【００８０】
１−１．哺乳類細胞中のＢｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２デコイＦｃ、Ｂｓｔ２Ｌ、これらのタンパク質の部分またはこれらのタンパク質の変異体（種々のＢｓｔ２関連タンパク質）の発現
多数の哺乳類発現ベクターおよび宿主細胞システムが市販で入手可能である。哺乳類 発現システムは、実施例４で述べられている。
【００８１】
１−２．バキュロウィルス中の種々のＢｓｔ２関連タンパク質の発現
哺乳類細胞に加えて、グリコシル化Ｂｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２Ｌおよび他のＢｓｔ２関連タンパク質は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２、Ｓｆ９のような昆虫細胞および植物細胞を含む無脊椎動物細胞由来であってもよい。バキュロウィルス発現用に、対応するＢｓｔ２またはＢｓｔ２Ｌ配列が、エピトープ標識した、例えばポリ−ｈｉｓ標識されたバキュロウィルス発現ベクターの上流で融合される。Ｂｓｔ２デコイＦｃは、他の標識なしで用いられるかもしれない。多くのバキュロウィルス発現ベクターは、市販で入手可能である。ウイルス感染およびタンパク質発現は、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｏｘｆｏｒｄ：  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）によって記されているように行われる。組み換えバキュロウィルスは、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎを用いてＳｆ９細胞（ＡＴＣＣ）中にＢｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイバキュロウィルスベクターおよびＢａｃｕｌｏＧｏｌｄウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を同時遺伝子導入することによって作製される。２８℃で４〜５日インキュベーション後、放出されるウイルスは集められ、増幅用に用いられる。
【００８２】
ポリ−ｈｉｓ標識されたＢｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイまたはＢｓｔ２Ｌは、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィーによって精製される（Ｒｕｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ、３６２：１７５、１９９３）。Ｂｓｔ２デコイＦｃの精製は、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムクロマトグラフィーを用いて行うことができる。
【００８３】
１−３．ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）中の種々のＢｓｔ２関連タンパク質の発現
ピチア・パストリスは、ハンドリングが容易である培地中で厳格に制御された誘導発現を行うことが容易であると同時に、外来遺伝子のクローニングが容易であるという点で、大腸菌と多数の類似点を有している単細胞真核生物である（Ｋｏｃｋｅｎ、Ｃ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６７：４３−４９．  １９９９）。真核生物であるため、ピチア・パストリスは、例えば、タンパク質の適切な折り畳みを可能とするジスルフィド結合を形成することができるなど、いくつかの翻訳後修飾を行うことができ、ピチアは、タンパク質をグリコシル化できる可能性があることも知られている（Ｙａｄａｖａ  ＡおよびＯｃｋｅｎｈｏｕｓｅ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：４９６１、２００３）。
【００８４】
種々のＢｓｔ２関連タンパク質の遺伝子は、ピチアのコドン使用頻度用に最適化されたヌクレオチド配列を用いて化学的に合成される。例えばゼオシン選択性プラスミドであるＰｉｃＺα（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などのピチア・パストリスの構成材は、ピチア・パストリス中でのＢｓｔ２関連タンパク質のクローニングおよび発現に用いられる。該プラスミドは、タンパク質を分泌経路に向けるためのサッカロマイセス・セレヴィシ由来のα接合因子（α−ｍａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）に融合している、ピチア・パストリス由来のアルコールオキシダーゼ１プロモーターを含む。メタノール誘導下、タンパク質は、アルコールオキシダーゼ１プロモーターの制御下で発現し、培地中に分泌される。
【００８５】
種々のＢｓｔ２関連タンパク質のＰｉｃＺα発現ベクターを作成した後、大腸菌  ＸＬ−１  ｂｌｕｅ  細胞を作成物で形質転換し、ＰＣＲおよび制限酵素の消化によるインサート用にゼオシン耐性クローンが選択される。陽性クローンは、ピチア・パストリスを形質転換するために用いられる。形質転換混合物は、ゼオシンを含む酵母−ペプトン−デキストロース−ソルビトールプレート上に塗布される。発現用に、陽性クローンは、約２４時間、緩衝化グリセロール培地中で培養する。細胞はペレット化され、さらに２４時間、１％メタノールを含むフレッシュな培地で誘導される。種々のＢｓｔ２関連タンパク質を検出するため、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットにより、発現されているか上清を試験する。ピチアにより発現されたタンパク質は、培地上清から精製される。
【００８６】
１−４．酵母中の種々のＢｓｔ２関連タンパク質の発現
コドン最適化された配列を用いて、細胞内生産または分泌用に酵母発現ベクターが作製される。分泌のために、酵母のα因子分泌シグナル／リーダー配列であるＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡを用いて、選択されたプラスミド中にＢｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２Ｌ、これらのタンパク質の部分または変異体をコードするＤＮＡのクローンが作られうる。酵母細胞は、発現プラスミドで形質転換されることができ、選択された発酵培地中で培養されうる（Ｈｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：３８２９、１９７９）。酵母上清は、ＴＣＡ沈降、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマジーブルー染色によって分析される。組み換えＢｓｔ２関連タンパク質は、選択カラムクロマトグラフ法を用いて濃縮された上清から分離されうる。
【００８７】
１−５．大腸菌中でのＢｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイの発現
ある条件下で、上述のＢｓｔ２関連タンパク質のうち、大腸菌中で製造されうるものもある。しかしながら、大腸菌中で製造された全ての可溶性タンパク質が、正しく折りたたまれるものではなく、間違って折りたたまれたタンパク質が、封入体形中で不溶性の凝集体を形成しうることが知られている（Ｃａｒｒｉｏ、Ｍ．Ｍ．、ａｎｄ  Ａ．Ｖｉｌｌａｖｅｒｄｅ．  ２００２．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９６：３−１２）。
【００８８】
大腸菌システムでの発現用に選択されたＢｓｔ２関連タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、適切な制限酵素部位を含むＰＣＲプライマーを用いて増幅される。多種の発現ベクターが市販で入手可能である。ベクターは、制限酵素で消化され、脱リン酸化される。ＰＣＲで増幅された配列は、次いでベクター中にライゲーションされる。ライゲーション混合物は、次いで大腸菌株の形質転換のために用いられる。形質転換されたものが選択され、プラスミドＤＮＡが分離される。選択されたクローンは、液体培地中で生育され、次いでラージスケールでの培養のために用いられ、その間発現プロモーターが働く。細胞ペレットは、可溶化することができ、次いで、可溶化されたＢｓｔ２関連タンパク質は、ポリ−ｈｉｓ配列およびエンテロキナーゼ切断部位を含むベクターからタンパク質が発現される場合、例えば金属キレートカラムを用いて精製される。
【００８９】
２．ペプチド合成による、Ｂｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２デコイ  Ｆｃ、Ｂｓｔ２Ｌ、これらのタンパク質の部分または変異体の準備  
Ｂｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２デコイ  Ｆｃ、Ｂｓｔ２Ｌ、これらの種々の部分または変異体は、固相法または固相および液相法の組合わせによって、直接的なペプチド合成によって製造されうる（Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、（１９６９）；Ｂａｒｌｏｓ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．１９９１；３７：５１３−５２０；Ｂａｂｉｋｅｒ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．１９７８；４３：４１９６−４１９９）。Ｂｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２Ｌまたは変異体の全長を製造するために、これらのＢｓｔ２関連タンパク質の種々の部分は、化学的に個々に合成され、化学的手法または酵素学的手法を用いて組み合わせられてもよい。ペプチド合成法は、またこれらのタンパク質の改変体(例えば、リン酸化体)を製造することにも有用である。
【００９０】
ペプチドは、アミノ酸のＬ体またはＤ体を用いて合成されうる。特に、哺乳類プロテアーゼおよびペプチダーゼは、Ｄ−アミノ酸から合成されたペプチドを分解できない。Ｄ体Ｂｓｔ２デコイまたはＤ体Ｂｓｔ２デコイの種々のタンパク質は、小さいサイズであるにもかかわらず、インビボで非常に安定であり、飲水でまたは食べ物への混合、噴霧剤、および／またはパッチで投与されうる。
【００９１】
細胞間接着または相互作用および免疫細胞活性化を阻害することにより炎症抑制効果を有する、本発明で提供されるＢｓｔ２タンパク質またはその断片は、単量体形、または多量体形でありうる。多量体は、当該技術分野で周知の多様な方法により形成され、多量体の形成方法は、特に限定されるものではない。
【００９２】
多量体は、限定されるものではないが、２量体、３量体、４量体、５量体、６量体などでありうる。例えば、多量体は、３量体形成を誘導するイソロイシンジッパー（ＩＬＺ）配列、または１２量体形成を誘導する界面活性タンパク質−Ｄ（ＳＰ−Ｄ）などの多量体形成を誘導する配列を用いて準備されてもよい。または、多量体は、それぞれが単量体で製造され、例えばリンカーを用いて、２以上のポリペプチドを接合することによって準備されうる。
【００９３】
多量体は、Ｂｓｔ２タンパク質またはその断片のパラレル構造またはアンチパラレル構造、あるいはパラレルおよびアンチパラレル構造の組合わせを形成し得る。Ｂｓｔ２は、ホモダイマーとして機能すると考えられているが、ホモダイマー中の各モノマーの方向は不明である。Ｂｓｔ２タンパク質またはその断片のアンチパラレル構造を含む多量体に対する発現ベクターの構築のため、アンチパラレル構造化されたＢｓｔ２タンパク質またはその断片用のコード配列が、コドン最適化されたヌクレオチド配列を用いて化学的に合成される。発現ベクター中で、各Ｂｓｔ２タンパク質（または断片）ユニットは、合成リンカーによって結合されうる。合成リンカーとしては、Ｇｌｙ／Ｓｅｒ−リッチ合成リンカー（Ｂｅｒｅｚｏｖ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．、２００１、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４４：２５６５）またはフレキシブルＧｌｙリンカー（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１００９２、１９９９）が挙げられる。Ｂｓｔ２断片ユニットが、ペプチド合成を通じて直接的に合成されるに足るほど小さい場合、Ｌ体およびＤ体の多量体が製造されうる。
【００９４】
細胞間接着、もしくは相互作用および免疫細胞活性化を阻害することにより炎症抑制効果を有するＢｓｔ２タンパク質、またはその断片は、非−ペプチドポリマーによって修飾されうる。
【００９５】
さらに詳細な態様では、アンタゴニストとして、細胞間接着もしくは相互作用および免疫細胞活性化を阻害することにより炎症抑制効果を有する、非ペプチドポリマー修飾Ｂｓｔ２タンパク質またはその断片が挙げられる。
【００９６】
Ｂｓｔ２タンパク質、またはそれらの断片と非ペプチドポリマーとの結合としては、共有結合および水素結合、イオン相互作用、ファンデルワールス力および疎水性相互作用などの全てのタイプの非共有結合が挙げられる。好ましくは、ポリマーは、特異的な反応基を通じてタンパク質と結合する。ポリマーの特定的な反応基の例としては、アルデヒド基、プロピオン酸アルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、ケトン基、ビニルスルホン基、チオール基、ヒドラジド基、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）基、ニトロフェニル炭酸塩（ＮＰＣ）基、トリシレート（ｔｒｙｓｙｌａｔｅ）基、イソシアネート基、およびスクシンイミド誘導体が挙げられる。非ペプチドポリマーは、ポリペプチドの反応基、例えばＮ末端、Ｃ末端および／またはアミノ酸残基の側鎖（例えば、リシン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基の側鎖）と反応する。
【００９７】
細胞間接着、もしくは相互作用および免疫細胞活性化を阻害することにより炎症抑制効果を有する、Ｂｓｔ２タンパク質は、非ペプチドポリマーと、モル比で１：１〜１：１０、好ましくは１：１〜１：２で結合されうる。Ｂｓｔ２タンパク質、またはその断片が、２以上の非ペプチドポリマーによって修飾されている場合、非ペプチドポリマーは、同一であっても異なっていてもよい。タンパク質は、非ペプチドポリマーによる修飾により、インビボ安定性および代謝性を向上させる。
【００９８】
さらに他の態様において、本発明は、上述したように、細胞間接着もしくは相互作用および免疫細胞活性化を阻害することにより炎症抑制効果を有する、Ｂｓｔ２タンパク質またはその断片；細胞間接着を阻害することにより炎症抑制効果を有する、非ペプチドポリマーで修飾されたＢｓｔ２タンパク質またはその断片の中から選択される１またはそれ以上を含む、炎症性疾患の予防または治療用組成物を提供する。
【００９９】
本発明の組成物は、ヒト、およびＢｓｔ２の投与によって炎症性疾患が阻害されうる、または軽減されうる、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、アンテロープ、イヌおよびネコのような家畜に適用されうる。これに関連して、本願発明者らは、ヒトＢｓｔ２およびマウスＤａｍｐ１が機能的類似性を有し、異なる起源と同様に、同じ起源を有する細胞に作用することを見出した。
【０１００】
さらに他の態様において、本発明は、細胞間接着もしくは相互作用および免疫細胞活性化を阻害することにより炎症抑制効果を有する、Ｂｓｔ２タンパク質またはその断片から選択される１またはそれ以上のタンパク質を患者に投与することを含む、炎症性疾患を予防するまたは治療する方法に関する。
【０１０１】
Ｆｃ融合によるデコイタンパク質の安定化
抗体のＦｃ部へのデコイＢｓｔ２の融合を述べる。より有利な投与スケジュールを斟酌すれば、得られた融合体は、デコイＢｓｔ２タンパク質の治療的効果を延長させることができた。アルブミンへの融合は、低分子量タンパク質の血中半減期を延ばすことも示されている。抗体のＦｃ部へのＢｓｔ２デコイの融合のように、アルブミンへのＢｓｔ２デコイの融合は、Ｂｓｔ２デコイの血中半減期を増加しうる。
【０１０２】
Ｂｓｔ２デコイを含む、多くの有力な治療タンパク質は、４０ｋＤａよりも小さく、それ故、糸球体濾過による腎クリアランスの影響を受けやすい。これらの小タンパク質は、まれにしか完全な調合薬を形成しない。血中半減期をより長くするためのタンパク質の再設計は、重要な医療および商業的なゴールである。タンパク質は、注射により一般的には投与されなければならないため、タンパク質投与の頻度が最小化する治療タンパク質とすることが好ましい。
【０１０３】
一般的には、タンパク質の効果的な分子量は、タンパク質の精製を補助する、アルブミンまたは抗体のＦｃ領域のような異種キャリアータンパク質への融合によって、増加しうる（Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．１９８９  Ｆｅｂ  ９；３３７（６２０７）：５２５−３１；Ｙｅｈ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１９０４−１９０８、１９９２）。得られたキメラタンパク質がＢｓｔ２デコイの生物活性の少なくとも１を保持することを可能とする限り、異種配列はどんな配列であってもよい。
【０１０４】
Ｂｓｔ２は、細胞表面上にホモダイマーとして存在すると考えられている（Ｏｈｔｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  １９９９、２５８（３）：５８３−９１）。また、Ｂｓｔ２は、その活性のためには二量体化を必要とするとも考えられている。したがって、２量体、３量体およびそれ以上の多量体を形成するために、Ｂｓｔ２デコイ単量体の結合を促進する異種配列が準備される。４０ｋＤａ未満の分子量を有する小タンパク質を用いたＦｃキメラタンパク質の構築は、血中半減期の劇的な延長をもたらす（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＣＴ  ＷＯ００／４０６１５、２０００）。Ｂｓｔ２デコイ−Ｆｃは、ヒトＢｓｔ２の細胞外ドメインおよびヒトＩｇＧのＦｃ領域で構成される組み換えキメラ融合タンパク質である。Ｂｓｔ２デコイ−Ｆｃは、２量体として、ある程度は多量体として製造された。
【０１０５】
ラットＢｓｔ２デコイ−Ｆｃ
ラットＢｓｔ２は、ヒトＢｓｔ２およびマウスＤａｍｐ１に対して、それぞれ４４％および７０％のアミノ酸相同性を有する（Ｋｕｐｚｉｇ  ｔ  ａｌ．、２００３、Ｔｒａｆｆｉｃ  ４（１０）：６９４）。推定コイルドコイルドメインは、ヒトＢｓｔ２タンパク質中のアミノ酸９６−１５３（または１０２−１４９）の領域内ならびにラットＢｓｔ２タンパク質およびマウスＤａｍｐ１タンパク質の対応する領域内に存在する。
【０１０６】
マウスＤａｍｐ１デコイが、ヒト内皮細胞およびヒト単球Ｕ９３７細胞間の細胞−細胞相互作用を阻害するという観察、およびヒトＢｓｔ２デコイが、マウス喘息モデルにおいて機能するという観察は、Ｂｓｔ２デコイおよびＢｓｔ２デコイ−Ｆｃが異種間で機能することを示す。マウスＤａｍｐ１デコイ（Ｆｃ融合物）、ラットＢｓｔ２デコイ（Ｆｃ融合物）またはヒトＢｓｔ２デコイ（Ｆｃ融合物）タンパク質の効果は、種の壁なく、マウス、ラット、ウサギ、イヌまたは霊長類などのどんな動物モデルにおいても、相互に研究しうる。あるいは、ウサギ、イヌまたは霊長類からのＢｓｔ２ホモログ由来のデコイＦｃ融合物を用いることができる。マウスにおける抗体処理のために、抗マウスＤａｍｐ１抗体またはラット抗Ｄａｍｐ１抗体を用いることができる。ラット、ウサギ、イヌまたは霊長類における抗体処理のために、これらの動物由来のＢｓｔ２ホモログに特異的な抗体を用いることができる。マウスＤａｍｐ１に対するモノクローナル抗体パネルを作製するための一手段は、Ｄａｍｐ１−／−マウスを用いることである。Ｄａｍｐ１−／−（ノックアウト）マウスは、公知の相同的組み換え法により作製される。
【０１０７】
ラット抗Ｄａｍｐ１モノクローナル抗体は、ラットハイブリドーマ技術を用いて製造されうる（Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、ハイブリドーマ．１９８３、２（３）：３５５−８．）。同様に、ラットにおける抗体処理は、マウス抗ラットＢｓｔ２モノクローナル抗体を用いて行われうる。
【０１０８】
Ｄａｍｐ１−／−（ノックアウト）マウス構成
Ｄａｍｐ１−／−マウスは、相同的組み換え法によって作製される。上述したように、マウス抗Ｄａｍｐ１モノクローナル抗体は、Ｄａｍｐ１−／−マウスを用いて得られる。さらに、Ｄａｍｐ１−／−マウスは、疾患モデルがＢｓｔ２ブロッカー（Ｂｓｔ２（Ｄａｍｐ１）デコイ、抗−Ｂｓｔ２（Ｄａｍｐ１））を用いて追跡されうる情報を生むために有用である。前臨床研究用に精製タンパク質薬を製造することは費用負担が非常に高いため、多数の疾患モデルを試験することは困難である。一方、動物モデルに用いられる疾患誘導処理、例えば関節炎モデルのためのコラーゲンまたはアジュバント処理、喘息のためのオボアルブミン処理、または動物モデルにおいて通常用いられる他の処理など、がコストをかけることなく容易に行われうる。種々の疾患誘導処理の後、Ｄａｍｐ１−／−および野生型マウスにおける兆候および疾患の進行の重度性を比較することによって、どの疾患モデルがＢｓｔ２ブロッカーで追跡されうるかについての価値ある情報を得ることができる。この方法で、Ｂｓｔ２ブロッカーを用いてより多くの処理オプションが生み出されうる。
【０１０９】
組織特異的Ｄａｍｐ１−／−（ノックアウト）マウス
Ｄａｍｐ１またはＢｓｔ２のドミナント・ネガティブタンパク質のトランスジェニック発現、あるいは上述したような単純Ｄａｍｐ１−／−（ノックアウト）は、ヒト疾患または炎症／自己免疫経路に関連しうるが、特別な細胞型中のＤａｍｐ１の欠失は、Ｄａｍｐ１／Ｂｓｔ２の遺伝子機能を研究し、Ｂｓｔ２の遺伝子機能を推定することに有益である。広く用いられているＣｒｅｌｏｘＰシステムのような部位特異的リコンビナーゼ−システム（Ｌａｓｋｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：５８６０、１９９６；Ｏｒｂａｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：６８６１、１９９２）を用いてもよい。このシステムにおいて、２つのトランスジェニックマウスラインが組織特異的Ｄａｍｐ１ノックアウトを促進するために必要とされる。第一のマウスラインは、最適な組織特異的プロモーターの制御下、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する。現在は、４０〜５０近くのＣｒｅラインが入手可能であり、Ｃｒｅラインの入手可能性および多様性は増加している。第二のラインは、Ｄａｍｐ１の周囲にｌｏｘＰ部位を有する。異系交配の後、Ｄａｍｐ１遺伝子は、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する細胞から除去される。Ｄａｍｐ１遺伝子の１または双方が、例えばＤａｍｐ１遺伝子の投与感受性を調べるために、対象とされうる。
【０１１０】
組織特異的、誘導Ｄａｍｐ１−／−（ノックアウト）マウス
疾患におけるＤａｍｐ１遺伝子機能の生理的関連性は、組織特異性に加えて、さらに、時間的制御を必要としうる。組織特異的Ｃｒｅリコンビナーゼの誘導発現を達成する一つの方法は、ＣｒｅのＣ末端に変異エストロゲンレセプター（ＥＲ）リガンド−結合ドメインを融合することによるＣｒｅで調整されたステロイドレセプターリガンドの使用である。これらの融合タンパク質は、合成エストロゲンアンタゴニスト４−ＯＨタモキシフェンによって誘導され、内因性のβ-エストラジオールに非感受性である。３つの異なる変異エストロゲンレセプター、マウスＥＲＴＭ（Ｄａｎｉｅｌｉａｎ  ＰＳ、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：１３２３、１９９８）、ヒトＥＲＴ（Ｌｏｇｉｅ  ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：５９４０、１９９５）およびヒトＥＲＴ２（Ｆｅｉｌ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３７：７５２、１９９７）が入手可能である。組織特異的プロモーターの制御下にＣｒｅＥＲを置くことにより、組織特異的で、タモキシフェンにより誘導される形で、Ｄａｍｐ１ノックアウトシステムを作成することができる。第二のトランスジェニックラインは、Ｄａｍｐ１の周囲にｌｏｘＰ部位を有する。異系交配の後、Ｄａｍｐ１遺伝子は、タモキシフェンで誘導される形で、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現させる細胞から除去される。
【０１１１】
その他のアプローチでは、テトラサイクリン感受性システムが用いられうる。テトラサイクリンは、テトラサイクリン転写活性タンパク質であるｔＴＡ、またはリバーステトラサイクリン転写活性タンパク質であるｒｔＴＡに結合する。これらの複合体は、Ｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）に結合することにより、Ｄａｍｐ１発現を抑制または活性化する。組織特異的様でＤａｍｐ１のＴｅｔ−誘導性ノックアウトを得るために、３つのトランスジェニックマウスが必要とされる。最初のラインでは、組織特異的プロモーター／エンハンサーの制御下で、ｔＴＡまたはｒｔＴＡタンパク質を発現させる。第二のラインは、Ｔｅｔ−オペレタープロモーター（ｔｅｔＯ）およびＣｒｅ−リコンビナーゼを有する。ｔＴＡまたはｒｔＴＡ、および飲水で運搬されるテトラサイクリンの存在下でのみ、ｔｅｔＯプロモーターは活性化され、Ｃｒｅリコンビナーゼが発現する。第三のラインは、Ｄａｍｐ１の側にｌｏｘＰ部位を有する。そして、Ｃｒｅリコンビナーゼは、組織特異的で、Ｔｅｔで誘導される形でＤａｍｐ１遺伝子を切り出す。
【０１１２】
ｓｈＲＮＡを用いてＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）を経たトランスジェニックＤａｍｐ１またはＢｓｔ２ノックダウン動物
マウス以外の他の種に遺伝子ノックアウト技術を適用することが困難であるため、マウスまたは他の動物において、それぞれ、Ｄａｍｐ１またはＢｓｔ２の発現を沈黙（ｓｉｌｅｎｃｅ）させることに、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が用いられうる。トランスジェニック動物におけるＤａｍｐ１またはＢｓｔ２ｓｉＲＮＡの短い断片を用いることにより、マウスにおけるＤａｍｐ１遺伝子または他の動物におけるＢｓｔ２ホモログを沈黙させることができる。ＲＮＡ干渉を用いた組織特異的Ｄａｍｐ１またはＢｓｔ２ノックダウンは、機能損失モデルを作成する代替アプローチとなりうる。
【０１１３】
ＲＮＡ干渉は、沈黙される遺伝子配列に相補的な小さい二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって媒介される、配列特異的で、転写後の遺伝子サイレンシングである。配列特異的なメッセンジャーＲＮＡを分解するメディエーターは、より長いｄｓＲＮＡｓから切り出されることによって得られる、２１−および２２−ヌクレオチド低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）である（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３、２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４、２００１）。これらのｓｉＲＮＡｓは、多タンパク質ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体中に組み込まれる。アンチセンス鎖が、サイレンシング複合体をその相補的な標的ｍＲＮＡに導き、その結果切断が起きる。細胞内のＤｉｃｅｒと呼ばれる二本鎖特異的ＲＮａｓｅが、短いヘアピンＲＮＡ構造（ｓｈＲＮＡ）を処理することができ、その結果、ミクロＲＮＡを生成させることが示されている。翻訳を阻害することによって、ミクロＲＮＡは、効果的に遺伝子発現を沈黙させ、たった一つのベクターを用いて、遺伝子を標的化することを可能とする。ｓｈＲＮＡシステムは、遺伝子発現を安定的に抑えるトランスジェニック動物を作成するために用いられうる。
【０１１４】
Ｄａｍｐ１またはＢｓｔ２ｓｉＲＮＡ：Ｄａｍｐ１またはＢｓｔ２ｓｉＲＮＡは、図９で用いられたヒトＢｓｔ２ｓｉＲＮＡの対応する配列を組み込むことにより、設計されてもよいし、ｓｉＲＮＡｓは新たに設計されてもよい。Ｄａｍｐ１（Ｂｓｔ２）ｓｈＲＮＡを作成するための潜在的Ｄａｍｐ１（Ｂｓｔ２）−ｓｉＲＮＡ配列を選択するために、Ｄａｍｐ１（Ｂｓｔ２）に対する異なるｓｉＲＮＡに加えて、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−Ｄａｍｐ１（Ｂｓｔ２）融合材料をＣｏｓ−７細胞のような哺乳類細胞に同時遺伝子導入する。Ｄａｍｐ１（Ｂｓｔ２）−ＧＦＰ融合タンパク質の発現およびノックダウンは、免疫ブロット法によって分析される。
【０１１５】
Ｄａｍｐ１（Ｂｓｔ２）−ｓｈＲＮＡ発現ベクターの構成：ｐｏｌ  ＩＩＩおよびｐｏｌ  ＩＩプロモーターの双方が、哺乳類細胞および動物中の遺伝子発現のノックダウン用の短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を合成するために用いられる。ｓｈＲＮＡ発現ベクターの構成用に、次いで、ｓｈＲＮＡ発現プラスミド中に上述で選択されるようなｓｉＲＮＡの最も効果的なもののクローンを作成し、そのプラスミド中の短いＤａｍｐ１（Ｂｓｔ２）配列のセンスおよびアンチセンス鎖が、Ｄａｍｐ１（Ｂｓｔ２）−ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列として、例えばＵ６プロモーターの制御下でヘアピン構造中で転写され、二本鎖特異的ＲＮａｓｅである細胞内Ｄｉｃｅｒによって、機能的ｓｉＲＮＡへと処理される。ｓｈＲＮＡ発現ベクターは、Ａｍｂｉｏｎ（オースティン、テキサス州、米国）製のｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  １．０−Ｕ６のようなｓｈＲＮＡ発現プラスミド中に、対応するＤＮＡオリゴヌクレオチドのクローンを作成することによって作成される。オリゴヌクレオチドは、Ｄａｍｐ１（Ｂｓｔ２）のセンスおよびアンチセンス配列ならびに７塩基対ループにわたり、アニールされた生産物は、適切な制限酵素部位を含む。この二本鎖は、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  １．０−Ｕ６中にライゲートされる。このベクターは、次いで、哺乳類細胞中に内因性にｓｈＲＮＡを発現するために用いられる。コントロールＲＮＡｉベクターは、マウスまたはヒトゲノム中の既知の配列に対して限られた相同性を有するｓｉＲＮＡを発現する配列を挿入することによって構築される。
【０１１６】
Ｄａｍｐ１またはＢｓｔ２−ｓｈＲＮＡを発現するトランスジェニック動物の作成：前核注入法、Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．２００６；２（１）：ｅ１０）を用いることにより、ヒトユビキチンＣ  プロモーターのようなヒトＰｏｌ  ＩＩプロモーターから転写されたｓｈＲＮＡがマウス中の遺伝子サイレンシングを媒介することができることを示しうる。トランスジェニックマウスは、受精卵への線形化された材料（ｔｈｅ  ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）の前核注入により作成される。同様に、単純な前核注入によるトランスジェニックマウスの作成のために、Ｄａｍｐ１−またはＢｓｔ２ｓｈＲＮＡが連結している組織特異的プロモーターのどんな種類を用いてもよい。
【０１１７】
あるいは、Ｄａｍｐ１−またはＢｓｔ２ｓｈＲＮＡを発現しているアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（Ａ．  Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．ｇｅｎｅｔ．１０（２００１）、ｐｐ．３０７５−３０８１）またはレンチウイルスベクター（Ｇｏｌｄｉｎｇ  ＭＣ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００６  Ａｐｒ  ４；１０３（１４）：５２８５−９０）が、動物中にトランス遺伝子を運搬することに用いられうる。
【０１１８】
Ｂｓｔ２、Ｂｓｔ２Ｌ、Ｂｓｔ２またはＢｓｔ２Ｌの部分あるいは変異を発現しているトランスジェニック動物
Ｂｓｔ２またはＢｓｔ２Ｌの全長（またはその部分）を過剰発現しているトランスジェニック動物（マウスまたはラット）は、抗−Ｂｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２デコイ  Ｆｃおよび抗−Ｂｓｔ２Ｌなどの治療的に有用な試薬の開発およびスクリーニングに有用である。トランスジェニックラインは、誘導的、組織特異的、または組織特異的／誘導的方法で、Ｂｓｔ２またはＢｓｔ２Ｌタンパク質を構成的に発現するために設計されうる。
【０１１９】
Ｂｓｔ２またはＢｓｔ２Ｌ（またはその部分）を発現するトランスジェニック動物は、Ｂｓｔ２またはＢｓｔ２Ｌの過剰発現に関連する病的状態を表しうる。これらの動物は、Ｂｓｔ２ブロッカーで治療することができ、Ｂｓｔ２またはＢｓｔ２Ｌトランス遺伝子を産生する未処理動物と比較して、病的状態の発生率が低減し、治療的有用性を示す。Ｂｓｔ２（Ｄａｍｐ１）またはＢｓｔ２Ｌ（Ｄａｍｐ１  Ｌ）のドミナント・ネガティブ種（野生型タンパク質の機能を阻害するもの）が同定される場合、これらのタンパク質のドミナント・ネガティブ型を発現するトランスジェニック動物は、疾患進行を阻害するかどうかを試験するために作製されうる。ヒトＢｓｔ２のドミナント・ネガティブタンパク質を発現するトランスジェニック動物は、疾患進行の試験前に、Ｂｓｔ２ノックインマウスと交配されうる。
【０１２０】
トランス遺伝子発現カセットは、コザックコンセンサス配列を有する転写ユニットを含み、Ｂｓｔ２またはＢｓｔ２Ｌ、これらのタンパク質の部分または変異体のエクソン、終止コドン（ｐｏｌｙ−Ａ−ｔａｉｌ）およびトランス遺伝子の発現を制御する調節要素をコードする。多数の組織特異的プロモーター／エンハンサーが文献において入手可能である。一過性発現を制御するためのテトラサイクリンまたはタモキシフェン誘導性システムを有する誘導システムは、市販で入手可能である（上記、「組織特異的Ｄａｍｐ１−／−（ノックアウト）マウス」の欄参照）。トランスジェニックマウスまたはラットを作製する方法は、慣用となっている（米国特許第４，７３６，８６６号および第４，８７０，００９号）。
【０１２１】
Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２デコイ−ＦｃおよびＢｓｔ２デコイ−アルブミン融合体を発現するトランスジェニック動物
Ｂｓｔ２またはＤａｍｐ１（またはその部分）の細胞外ドメイン、あるいはＦｃ断片またはアルブミンに融合しているＢｓｔ２またはＤａｍｐ１（またはその部分）の細胞外ドメインを発現するトランスジェニック動物は、病的状態下、Ｂｓｔ２デコイ（Ｆｃ）の治療効果を評価することに有用でありうる。これらのタンパク質を発現するトランスジェニックマウスは、病的状況下、単剤療法または併用療法におけるＢｓｔ２デコイ（Ｆｃ）タンパク質の治療効果を評価するために、Ｂｓｔ２を発現するノックインマウスと交配されうる。トランスジェニックラインは、誘導的、組織特異的、または組織特異的／誘導的方法で、これらのタンパク質を構成的に発現するために設計されうる。
【０１２２】
ノックインマウス−ヒト−マウスキメラＢｓｔ２マウスの作製
ヒトＢｓｔ２およびマウスＤａｍｐ１／ラットＢｓｔ２間のアミノ酸配列相同性は、広範ではないため、ネズミまたはラット免疫、炎症性疾患モデル中では、抗ヒトＢｓｔ２抗体パネルの効果を試験することができない。この問題を克服する一つの方法は、ヒトＢｓｔ２、この場合、ヒト−マウスキメラＢｓｔ２を発現するノックインマウスを作製することである。ノックインマウスは、ヒトで置換されたＤａｍｐ１の全長コーディング領域またはヒトＢｓｔ２の細胞外ドメインで置換され、その結果キメラタンパク質となるＤａｍｐ１の細胞外ドメインを有していてもよい。ヒトＢｓｔ２を発現するトランスジェニックマウスは、この目的のために用いられうるが、過剰発現システムは、Ｂｓｔ２ブロッカーの効果を試験するための理想的システムではない。ヒト−マウスキメラＢｓｔ２を生理的濃度で発現させるノックインアプローチは、トランスジェニックアプローチに取って代わる。ヒト−マウスキメラＢｓｔ２を発現するノックインマウスは、標準的なノックイン相同的組み換えプロトコールに従って行われ、図２８で示されるような例示された構築物を用いて実行されうる。ノックインマウスは、免疫−炎症性状態を誘発するために処理される。抗ヒトＢｓｔ２抗体が投与される。
【０１２３】
これらのマウスは、標的マウスタンパク質に対する種々のラット抗体とともに抗ヒトＢｓｔ２抗体またはＢｓｔ２デコイ−Ｆｃを用いる併用療法の効果を試験するためにも有用である。例えば、ヒトＢｓｔ２を発現するノックインマウスは、関節炎を誘発するためにコラーゲンで処理されてもよく（Ａｎｄｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６、６３（４）：２８２−９）、次いでラット抗−マウスＴＮＦＲ（ＴＮＦαレセプターＩまたはＩＩ）（Ａｂｃａｍ）、ラット抗−マウスＩＬ−６レセプター（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、ラット抗−マウスＩＬ−１レセプター（Ａｂｃａｍ）またはネズミＣＴＬＡ４−Ｉｇ（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）の単剤、２剤、３剤または４剤と組み合わせて、ヒトＢｓｔ２デコイ−Ｆｃまたは抗−ヒトＢｓｔ２で処理されてもよい。ネズミＣＴＬＡ４−Ｉｇは、ラット中のＴ細胞反応を阻害することが示されている（Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２：２２３）。
【０１２４】
Ｂｓｔ２ブロッカーの効果を試験するための動物疾患モデル
Ｂｓｔ２ブロッカーの効果を試験するための有用な動物疾患モデルとしては、特に限定されるものではないが；ラットまたはマウスのコラーゲン誘発性関節炎モデル（Ｗｅｂｂ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６、２６（１０）：２３２０−８；Ａｎｄｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６、６３：２８２）、ラットまたはマウスのアジュバント誘発性関節炎モデル（Ｈａｒｕｎａ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２００６、５４（６）：１８４７−１８５５；  Ｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．２００５  Ｓｅｐ；２５（２）：９３−１０１）、オボアルブミン誘発性喘息モデル（Ｓｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００６、６（７）：１０５３−６０）、変形性関節症モデル（Ａｖｅｒｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２００４  Ｏｃｔ；３１（１０）：２０１３−２０）、移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）モデル（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ、２００６、１０７：２９９３−３００１；Ｂａｌｉｇａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１９９４、５８（１０）：１０８２−９０）、ＮＯＤ（非肥満性糖尿病：ｎｏｎ−ｏｂｅｓｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ）マウスまたはＢＢ（ＢｉｏＢｒｅｅｄｉｎｇ）ラットにおける１型糖尿病モデル（Ｙａｎｇ  Ｙ、Ｓａｎｔａｍａｒｉａ  Ｐ．Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ．２００６、１１０（６）：６２７−３９）、虚血／再かん流モデル  （Ａｒｕｍｕｇａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００６  Ｊｕｎ；１２（６）：６２１−３）、敗血症ショックモデル（Ｍｏｔｏｂｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ  Ｒｅｓ．２００６、２０（５）：３５９−６３）、自己免疫ブドウ膜炎モデル（Ｙｉｌｍａｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．２００５、３０（９）：７５５−６２）、多発性硬化症のための動物モデルであるマウスにおける実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）（Ｍｕｊｔａｂａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５，１７５（８）：５０７７−８６）、ラットの脳塞栓症モデル（Ｃｈａｐｍａｎ  ＤＦ、発作．２００１，３２（３）：７４８−５２）、クローン病および炎症性腸疾患のためのマウス結腸炎モデル（Ｙｅｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００６，１１６（５）：１３１０−６）、自己免疫またはウイルス性肝炎のためのコンカナバリンＡ−誘発性肝障害モデル（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００６  Ｊｕｎ；４３（６）：１２１１−９）、乾癬モデル（Ｇｕｄｊｏｎｓｓｏｎ  ＪＥ、Ｅｌｄｅｒ  ＪＴ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．２００６，１４（１）：２−４）、およびウサギの角膜同種移植拒絶反応モデルが挙げられる（Ｓｈｉｒａｏ  Ｅ、Ｄｅｓｃｈｅｎｅｓ  Ｊ、Ｃｈａｒ  ＤＨ．Ｃｕｒｒ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．１９８６、５（１１）：８１７−２２）。ＡＭＤを研究するための動物モデルは知られている（Ｄｉｔｈｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ２００１，１１９（１１）：１６４３−９；Ｃｏｕｓｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．２００２、７５（５）：５４３−５３）。
【０１２５】
Ｂｓｔ２の阻害は、既に起こっているアテローム性動脈硬化症を安定化することにより、アテローム性動脈硬化症の初期加速を抑制しうる。この仮説は、ストレプトゾトシンで処理された（糖尿病）ａｐｏＥ欠損マウスまたはＬＤＬレセプターノックアウトマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で試験されることができる（Ｂｕｃｃｉａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００２、１０６（２２）：２８２７）．Ｃｓａｋｙ  Ｋ．  Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．２００２、７５（５）：５４３−５３）。ＩＩ型糖尿病の多くの患者は、アテローム性動脈硬化症を患っている。ＩＩ型糖尿病およびアテローム性動脈硬化症におけるＢｓｔ２ブロッカーの効果は、ａｐｏＥ欠損ｄｂ／ｄｂ二重変異マウスで試験されうる。
【０１２６】
Ｂｓｔ２活性阻害が抗体を介した自己免疫疾患の治療に有益であるかどうかという概念は、Ｌｉｎｓｌｅｙ  ＰＳ、Ｗａｌｌａｃｅ  ＰＭ、Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｊ、Ｇｉｂｓｏｎ  ＭＧ、Ｇｒｅｅｎｅ  ＪＬ、Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ  ＪＡ、Ｓｉｎｇｈ  Ｃ、Ｔｅｐｐｅｒ  ＭＡ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９２、２５７（５０７１）：７９２−５に記載されているように、ヒツジの赤血球細胞およびキーホールリンペットヘモシアニンに対する抗体反応を測定することによって初めは試験される。
【０１２７】
他の自己免疫疾患モデルとしては、ラットにおけるループス様症候群（Ｆｉｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９４、２６５（５１７６）：１２２５−７）および糸球体腎炎モデル（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９４、２４（６）：１２４９−５４．）が挙げられる。ドナー特異性移植耐性は、膵島細胞異種移植片を受容した糖尿病マウスを用いて試験される（Ｌｅｎｓｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９２、２５７（５０７１）：７５１）。耐性はまた、血管新生化ネズミ心臓同種移植片モデル（Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、１９９６、３８１（６５８１）：４３４−８；Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１９９５、５９（３）：４５０）およびマウスの皮膚同種移植拒絶反応モデル（Ｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．１９９４、２６（６）：３１５１−４）および腎移植モデル（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ  ＩＡ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．２００２、１３（２）：５１９−２７）においても示されうる。
【０１２８】
併用療法
免疫、炎症性疾患は、免疫、炎症性シグナル伝達の複雑なネットワークによって媒介される複雑な疾患である。これらの事象は、互いに密接に連関しているが、基礎をなす細胞および分子プロセスは、相当に異なる場合がある。したがって、免疫−炎症性疾患の完全寛解には、組み合わせの治療が必要とされる。通常、種々の炎症性プロセスに影響を与える能力が変化しうる併用療法が単剤療法よりも優れていることが示されてきた。
【０１２９】
Ｂｓｔ２ブロッカーを用いた併用療法に対する考えは、実施例（実施例２５および実施例２６）のように、インビトロでのＩＣＡＭ１（細胞間接着分子）を用いた細胞−細胞接着アッセイで試験される。免疫、炎症性経路に重要な多数の遺伝子を制御することが示されていて、多数の炎症、免疫疾患への関与が広く研究されているので、ＩＣＡＭ１が選択された。
【０１３０】
ＩＣＡＭ１は、白血球で発現しているインテグリンサブファミリーのメンバーであるリンパ球機能関連抗原、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８）の標的細胞カウンターレセプターである。これらの２つの分子間の相互作用は、細胞内免疫反応を引き起こすために不可欠である。ＩＣＡＭ−１は、同種移植された組織の急性拒絶において役割を果たすとも考えられている。ＩＣＡＭ１およびＬＦＡ１は、抗原提示細胞およびＴ細胞間の細胞−細胞相互作用に関与している。ＡＰＣ（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ；  抗原提示細胞）上のＩＣＡＭ１は、Ｔ細胞上のそのレセプターであるＬＦＡ１に結合することができ、Ｔ細胞上のＩＣＡＭ１は、ＡＰＣ上のＬＦＡ１に結合することができる（Ｍａｃｋａｙ  ＣＲ、Ｉｍｈｏｆ  ＢＡ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ、１９９３、１４：９９）。従前は接着分子であると考えられていたいくつかの分子が、Ｔ細胞活性化に対する共刺激シグナル（例えば、ＬＦＡ３、ＬＦＡ１およびＩＣＡＭ１）を発することもできるという考えを支持する証拠が増えている（Ｍａｃｋａｙ  ＣＲ  Ｉｍｈｏｆ  ＢＡ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ、１９９３、１４：９９）。共刺激分子は、増殖の開始および増進をもたらすさらなるシグナルをＴ細胞に与える（Ｓｔｅｉｎｍａｎ  ＲＭ  Ｙｏｕｎｇ  ＪＷ．１９９１、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：３６１）。
【０１３１】
循環器疾患に対する併用療法
循環器疾患に対する併用療法は、スタチン、ＡＣＥ阻害剤、βブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、レオ・プロ、クロピドグレル、およびレニン−アンギオテンシン阻害剤とともに行われうる。内皮細胞機能障害は、アテローム性動脈硬化症、高血圧、および血管平滑筋細胞増殖などの循環器疾患に関連している。Ｂｓｔ２発現は、ＴＮＦα、インターフェロンγおよびヒスタミンのような炎症性サイトカインによって誘導され、このことが、Ｂｓｔ２が循環器疾患に関与しうることを示す。したがって、単剤療法として、またはスタチン、ＡＣＥ阻害剤、βブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、レオ・プロ、クロピドグレル、およびレニン−アンギオテンシン阻害剤を含む従来の治療法との組合わせで、Ｂｓｔ２の阻害が、循環器疾患の治療を向上しうる。
【０１３２】
さらに、Ｂｓｔ２は、平滑筋細胞において、炎症性サイトカインによって誘導される。平滑筋細胞の増殖は、アテローム性動脈硬化症血管、典型的には冠動脈の直径を増加させる手順である、血管形成の成功率を減少させうる。Ｂｓｔ２の阻害は、平滑筋細胞増殖を減少させ、血管形成の成功率を増加させうる。
【０１３３】
関節リウマチに対する併用療法
ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＴＮＦα、ＩＬ６もしくはＩＬ１のブロッカーを用いる関節リウマチに対する併用療法。関節リウマチ（ＲＡ）は、慢性滑膜炎、骨侵食および軟骨破壊によって特徴付けられる複雑性炎症性疾患である。炎症性サイトカインの一つである、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）の遮断は、臨床試験において、効果的に関節炎プロセスを阻害する。しかしながら、ＲＡの兆候および症状の完全寛解は、ＴＮＦαブロッカー単独ではめったに達成されず、いくつかの炎症性経路がＴＮＦαと独立して働きうることを示す。炎症の臨床的兆候は何ら反応を示さない多くの患者において、ＴＮＦα遮断が骨侵食を阻むことが示されてきた。骨におけるＴＮＦαの効果は、疾患の兆候および症状における臨床反応から独立するものである。関節の炎症、骨侵食および軟骨破壊においてのＴＮＦαの相対的役割は、それ故、異なるものでありうる。
【０１３４】
ＴＮＦα、インターロイキン−１（ＩＬ−１）の主要な標的分子の遮断は、ＲＡに数々の効果を表してきた。ＩＬ−１レセプターアンタゴニストの単剤療法は、大部分の患者において関節炎の臨床的兆候および症状を解消しなかったが、ＩＬ−１は、軟骨損傷に効果を表してきた。ＲＡの兆候および症状の完全寛解は、どんな単剤療法、ＴＮＦ阻害によってでさえ、ほとんど達成されないが、実験モデルにおけるＴＮＦα／ＩＬ−１、ＴＮＦα／ＲＡＮＫＬまたはＴＮＦα／ＩＬ−１／ＲＡＮＫＬの併用阻害の予備結果は、そのような処理が相加効果を有しうることを示した。これらの結果は、関節リウマチ治療のために、２以上の炎症性経路の複合阻害を用いる論理的根拠を強める。
【０１３５】
最近、抗−ＩＬ６または細胞障害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）が、関節炎の治療用に有益であることも示されている。Ｂｓｔ２遺伝子のプロモーター領域は、インターロイキン−６（ＩＬ−６）反応遺伝子発現を媒介するＳＴＡＴ３に対する結合部位を有し、これはＢｓｔ２の発現がＩＬ６−ＳＴＡＴ３経路により制御されうることを示す（Ｏｈｔｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９、２５８（３）：５８３−９１）。ＩＬ６の下流標的であるＢｓｔ２のブロックは、ＲＡ治療に有益である可能性がある。
【０１３６】
細胞障害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）は、Ｔ細胞活性化後に上昇されるＴ細胞レセプターである。多くの場合、Ｔ−細胞レセプター（ＴＣＲ）のみのシグナルは、最適な免疫反応を引き起こすためには不十分であり、第二の、共刺激シグナルが、Ｔ細胞が反応する閾値を越えるためには必要とされる。このＴＣＲシグナルの増強は、Ｔ細胞上のＣＤ２８により提供され、この増強は抗原産生細胞上に発現しているＢ７によって、誘発されうる．一旦活性化されると、Ｔ細胞が、同じＢ７分子にまた結合することができる、第二のレセプターであるＣＴＬＡ−４を発現する。ＣＤ２８と比較すると、ＣＴＬＡ−４は、Ｔ−細胞反応を阻害する。
【０１３７】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇは、ヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメインおよびヒトＩｇＧのＦｃ領域から構成される、組み換えキメラ融合タンパク質である（Ａｂａｔａｃｅｐｔ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）。ＣＴＬＡ４−Ｉｇは、ＡＰＣ（抗原提示細胞）Ｂ７分子に結合し、Ｔ細胞上のＣＤ２８レセプターとのその相互作用を遮断し、したがってＴ細胞上のＣＤ２８との共刺激相互作用を遮断する（Ｌｉｎｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９１、１７４（３）：５６１−９）。ＣＴＬＡ４−Ｉｇは、関節リウマチの治療に効果的であることが示されてきた（Ｍｏｒｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００６、５（３）：１８５−６）。したがって、Ｂｓｔ２ブロッカーと、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、またはＴＮＦα、ＩＬ６もしくはＩＬ１のブロッカーとの併用療法は、関節炎治療に有益でありうる。
【０１３８】
ラットコラーゲン誘発性関節炎モデルまたはラットアジュバント誘発性関節炎モデルを用いてもよい。マウス抗ラットＢｓｔ２抗体、ヒトＢｓｔ２デコイ−Ｆｃ、ラットＢｓｔ２デコイ−ＦｃまたはマウスＤａｍｐ１デコイ−Ｆｃは、マウス抗−ラットＴＮＦＲ、−ラットＩＬ６レセプターもしくは−ラットＩＬ１レセプターモノクローナル抗体、またはネズミＣＴＬＡ４−Ｉｇと組み合わせて試験されうる。Ｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９３、８０（１）：５６−６１）によって報告されているように作製されるネズミＣＴＬＡ４−Ｉｇは、他の研究によって示されているように、ラットモデルにおいて用いられることができる（Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ２００２、２（３）：２２３−８）。マウスＣＴＬＡ４−Ｉｇは、マウスＣＴＬＡ−４遺伝子の細胞外部分およびヒトＩｇＧ１の定常領域のキメラ遺伝子から作製されうる。ヒトＣＴＬＡ４−Ｉｇ（Ａｂａｔａｃｅｐｔ、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｓｑｕｉｂｂ）は、コラーゲン誘発性関節炎のラットモデルにも用いられうる。
【０１３９】
ヒトＢｓｔ２を発現するノックインマウスもまた用いられうる。ノックインマウスは、関節炎状態を引き起こすために、コラーゲンまたはアジュバントで処理され、次いで、ラット抗−マウスＴＮＦαレセプター（Ａｂｃａｍ）、−マウスＩＬ６レセプター（Ｇｅｎｚｙｍｅ）もしくは−マウスＩＬ１レセプター（Ａｂｃａｍ）モノクローナル抗体、またはマウスＣＴＬＡ４−Ｉｇと組み合わせて、抗ヒトＢｓｔ２抗体またはヒトＢｓｔ２デコイ−Ｆｃで処理される。抗−Ｂｓｔ２処理は、また、炎症性要素も有している、関節炎、変形性関節症のより一般的な病型の治療に用いられてもよい。
【０１４０】
喘息に対する併用療法
喘息に対する、特にテオフィリン、グルココルチコイド、ＴＮＦαブロッカーまたは抗−ＩＣＡＭ１との併用療法について述べる。喘息の病理学的特徴の多くの記述としては、気管支平滑筋拡張／収縮、粘膜浮腫および粘膜下組織中上皮基底膜および炎症性細胞、特に好酸球の肥大が挙げられる。これらの事象は続いて起こり、喘息の病理学的特徴へとつながると考えられている。喘息の現在の治療法としては：抗コリン作用薬、ステロイド、アデノシン競合アゴニスト（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ａｇｏｎｉｓｔ）ならびに長時間および短時間作用型β２アゴニストが挙げられる。これらの従来の治療と、Ｂｓｔ２ブロッカーとの併用療法は、喘息に有益でありうる。さらに、我々の遺伝子発現統計データは、インターフェロンγのような炎症刺激後に、平滑筋細胞において、Ｂｓｔ２が高度に誘導されることを示している（図３４）。これらのデータは、Ｂｓｔ２が平滑筋細胞生理に関与していて、喘息治療の間、従前特徴付けられていた抗炎症反応に加えて、Ｂｓｔ２ブロッカーがさらなる有益な効果を表す可能性を示している。これらの理由から、従来の喘息治療法とＢｓｔ２ブロッカーとの併用療法は、相加効果を有する。
【０１４１】
喘息が次第により重症となる、または患者がテオフィリン療法に反応しない場合、患者はコルチコステロイドを用いて治療される。Ｂｓｔ２ブロッカーおよびコルチコステロイドの併用療法は、コルチコステロイドの投与量を減らすことができ、それ故その副作用を減らすことができる。
【０１４２】
ラットまたは霊長類のオボアルブミン誘発性喘息モデルにおけるＩＣＡＭ１、α４インテグリンおよびＴＮＦαの役割が示されてきた（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９７、１７（６）：７５７−６６）。ＩＣＡＭ１、ＴＮＦαおよび／またはα４インテグリンブロッカーと、阻害との組み合わせは、喘息治療において効果的でありうる。ネズミまたはラットモデルを用いた前臨床研究用に、マウス抗ラットＩＣＡＭ１抗体、ラット抗マウスＩＣＡＭ１抗体、マウス抗ラットＴＮＦＲ抗体、ラット抗マウスＴＮＦＲ抗体、マウス抗ラットα４インテグリン抗体およびラット抗マウスα４インテグリン抗体は市販されている。ネズミまたはラットモデルを用いた前臨床研究用に、マウス抗ラットＩＣＡＭ１抗体、ラット抗マウスＩＣＡＭ１抗体、マウス抗ラットＴＮＦＲ抗体、ラット抗マウスＴＮＦＲ抗体、マウスまたはラット抗ＴＮＦα抗体、マウス抗ラットα４インテグリン抗体およびラット抗マウスα４インテグリン抗体は市販されている。
【０１４３】
自己免疫性肝炎に対する併用療法
自己免疫性肝炎（ＡＩＨ）に対する、特にコルチコステロイドとの併用療法について述べる。自己免疫性肝炎は、慢性、進行性の肝疾患である。可能性のあるトリガー因子としては、ウイルス、他の自己免疫疾患および薬が挙げられる。治療していない患者における自己免疫性肝炎の自然な経過は、予後不良を示し、しばしば肝硬変および肝不全に進行する。ＡＩＨは、自然退行することはめったにない。
【０１４４】
発症に寄与する分子機構としては、自己抗原、細胞接着分子およびサイトカインに対する自己抗体反応、および血管形成の発生が挙げられる（Ｍｅｄｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｌｉｍｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００３、１７（１）：１−１６）。ＡＩＨに罹患している患者では、細胞間接着因子−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）（ｓＩＣＡＭ−１）、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ｓＶＣＡＭ−１）、（ｓ）Ｅ−セレクチン、（ｓ）Ｐ−セレクチンおよび可溶性インターロイキン−２レセプター（ｓＩＬ−２Ｒ）、ＩＬ４、ＬＦＡ１、ＬＦＡ３、ＴＧＦβの血清レベルの上昇が起こる（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．１９９５、７（５）：４５５−６０）。慢性ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎、Ｔ細胞媒介免疫機構は、組織損傷の発症に重要な役割を果たす（Ｂｒｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｓｒ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ  Ｊ．  ２０００、２  Ｓｕｐｐｌ：７４−８０）。
【０１４５】
ＡＩＨ患者に対する選択治療は、単剤療法として、またはアザチオプリンとの組み合わせで、グルココルチコイドである（Ｃｚａｊａ  ＡＪ、Ｄｒｕｇｓ  ５７：４９−６８、１９９９、Ｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｑ  Ｊ  Ｍｅｄ．  １９７２、４０：１５９；Ｍｕｒｒａｙ−Ｌｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｌａｎｃｅｔ、１９７３、Ｉ：７３５−７）。コルチコステロイドは、初期治療の間は、肝硬変の発生を減らすが、５〜１０年内に、９０％を超える患者で治療にもかかわらず肝硬変に進行する（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９８４、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ８７：１２２２−７）。
【０１４６】
コルチコステロイドでの治療は、よく知られている、用量依存性副作用と関係する（Ｓｕｍｍｅｒｓｋｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｕｔ  １６：８７６−８３、１９７５、Ｃｚａｊａ  ＡＪ、Ｉｎ：  Ｋｒａｗｉｔｔ  ＥＬ、Ｗｉｅｓｎｅｒ  ＲＨ、ｅｄｓ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９９１：１４３−６６）。高血糖作用および高血圧もしばしば起こる。したがって、肝疾患によって引き起こされる糖尿病患者および代謝性骨疾患の患者には、特別な注意が払われなければならない。
【０１４７】
コルチコステロイドと、抗−Ｂｓｔ２またはＢｓｔ２デコイとの併用療法は、疾患の緩和を維持することに有益である。この組み合わせは、コルチコステロイドの投与量を減らすことができ、それ故、その副作用を減らすことができ、高投与量でのコルチコステロイドの投与よりもよい結果をもたらす。
【０１４８】
抗−Ｂｓｔ２またはＢｓｔ２デコイの使用は、Ｄａｍｐ１−／−マウス、ラット抗−マウスＤａｍｐ１またはヒト−、ラット−もしくはマウスＢｓｔ２（Ｄａｍｐ１）デコイ−Ｆｃを用いて作製されうるマウス抗Ｄａｍｐ１抗体を用いるマウスにおけるコンカナバリンＡ−誘発性肝障害モデル（Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００６、３４５（１）：８５−９２）、あるいはマウス抗−ラットＢｓｔ２またはヒト−、ラット−もしくはマウスＢｓｔ２（Ｄａｍｐ１）デコイ−Ｆｃを用いたラットにおけるチオアセトアミド誘発性肝硬変モデル（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．２００６、２１（２）：３５８−６６）のようなモデルを用いて調べることができる。
【０１４９】
移植に対する併用療法
移植に対する、特にシクロスポリン、ラパマイシン、または抗ＬＦＡ１抗体との併用療法について述べる。接着分子は、移植拒絶反応に非常に関与していることが示されていて、標的とされる干渉治療に対する明らかな分子候補である。接着分子は、同種移植片への宿主白血球の運搬を制御することによって、同種移植拒絶反応の細胞機構に影響を与える。同種移植片への細胞の運搬は、循環白血球および血管内皮間の接着分子レセプターリガンド対の結合によって媒介される。同種移植片内では、接着分子は、標的細胞のＴ細胞認識にも関与しうる。
【０１５０】
免疫抑制剤のシクロスポリンまたはラパマイシンが、移植医学において、効果があるカルシニューリン阻害剤として用いられる。しかしながら、カルシニューリン阻害剤で治療した患者は、腎不全につながる腎臓への毒性効果を起こす場合がある（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１９９５，１４：Ｓ２２７；  Ｖｉｔｋｏ  Ｓ、Ｖｉｋｌｉｃｋｙ  Ｏ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．  ２００４、３６（２  Ｓｕｐｐｌ）：２４３Ｓ−２４７Ｓ）。他の副作用としては、神経毒性、高カリウム血症および高血圧が挙げられる。
【０１５１】
閾値下の、もしくは中等量のシクロスポリンまたはラパマイシンとのＢｓｔ２デコイあるいは抗−Ｂｓｔ２の併用療法は、腎毒性の低下に対して有益な免疫抑制効果を有する。
【０１５２】
Ｂｓｔ２ブロッカーの効果を試験するための移植動物モデルとしては、マウスの皮膚同種移植拒絶反応モデル（Ｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．１９９４、２６（６）：３１５１−４）、移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）モデル（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ、２００６、１０７：２９９３−３００１；  Ｂａｌｉｇａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１９９４、５８（１０）：１０８２−９０）、ウサギの角膜同種移植拒絶反応モデル（Ｓｈｉｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．  １９８６、５（１１）：８１７−２２）、膵島細胞異種移植片モデル（Ｌｅｎｓｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９２、２５７（５０７１）：７５１）、ネズミの心臓同種移植モデル（Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、１９９６、３８１（６５８１）：４３４−８；Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１９９５、５９（３）：４５０）および腎移植モデルが挙げられる。
【０１５３】
前臨床研究用に、モデルに応じて、シクロスポリンまたはラパマイシンの異なる投与量と組み合わせて、マウス抗−Ｄａｍｐ１、ラット抗−マウスＤａｍｐ１、マウス抗−ラットＢｓｔ２、ヒト−、ラット−、マウスＢｓｔ２（Ｄａｍｐ１）デコイ−Ｆｃが用いられる。移植臓器の生着率およびＴ細胞活性化／増殖について調べられる。
【０１５４】
多発性硬化症に対する併用療法
多発性硬化症に対する、特にα４インテグリンブロッカーとの併用療法について述べる。多発性硬化症（ＭＳ）は、推定される自己免疫炎症性の原因を有する中枢神経系（ＣＮＳ）の一般的な脱髄性および炎症性疾患である。内皮細胞への活性化Ｔ細胞の接着を遮断する抗体が、多発性硬化症斑という炎症性特徴を減ずることができる。現在の治療としては、α４インテグリンに対するモノクローナル抗体（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）、インターフェロンβおよびガラティラメル（Ｒｏｐｐｅｒ  ＡＨ、２００６、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３５４：９６５；  Ｒｕｄｉｃｋ  ＲＡ、ｅｔ  ａｌ．、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００６，３５４（９）：８９９−９１０．）が挙げられる。
【０１５５】
α４インテグリンに対するモノクローナル抗体との抗−Ｂｓｔ２またはＢｓｔ２デコイの併用療法は有益である可能性がある。抗−Ｄａｍｐ１抗体、Ｄａｍｐ１−／−マウスを用いて作製されることができるマウス抗−マウスＤａｍｐ１、ラット抗−マウスＤａｍｐ１またはヒト−、ラット−もしくはマウスＢｓｔ２（Ｄａｍｐ１）デコイ−Ｆｃを用いたマウスの実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルを用いて、ラット抗−マウスα４インテグリン（Ａｂｃａｍ）を併用した、抗−Ｂｓｔ２またはＢｓｔ２デコイの使用を調べることができる。
【０１５６】
組織損傷を最小限にするための併用療法
組織損傷は、虚血、出血、外傷、腫れ、やけど、または化学物質、毒素もしくは薬への曝露の結果として起こりうる。組織損傷への炎症性反応の結果としての細胞死が、しばしば組織損傷を増加させる。Ｂｓｔ２を阻害することによって、組織損傷は最小限となりうる。例えば、グルココルチコイドのようなステロイドが、発作後の脳損傷を最小限にするために用いられる。発作の間、または直後に、ステロイドと組み合わせてＢｓｔ２を遮断すれば、最終的な脳損傷の拡大を最小限にしうる。同様に、心筋梗塞の間、または直後に、Ｂｓｔ２を遮断すれば、心臓損傷の拡大を減らしうる。
【０１５７】
クローン病に対する併用療法 
クローン病に対する、特に抗α４インテグリン抗体との併用療法について述べる。クローン病は、結腸の重大なヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）１−誘発性炎症で特徴付けられる慢性衰弱性疾患である。Ｂｓｔ２アンタゴニストの役割は、結腸炎のマウスモデルを用いて試験されうる（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００６  Ｊｕｎ；１３０（６）：１７０７−２０）。炎症性腸疾患に対して、抗α４インテグリン抗体との併用療法が有益である可能性がある。
【０１５８】
メタボリック症候群に対する併用療法
メタボリック症候群に対する、特にメトホルミン、ＴＺＤ、スタチン、ＮＳＡＩＤ、ＡＣＥ阻害剤およびアンジオテシンレセプターブロッカーとの併用療法について述べる。
【０１５９】
最近、炎症性経路の活性化が、肥満関連インスリン抵抗性のメカニズムとなりうるという考えが現れてきている。α腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−が、肥満げっ歯類からの脂肪組織および血液中で上昇し、ＴＮＦαの阻害がインシュリン感受性を向上させる。インターロイキン（ＩＬ）−６および単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１）が、インスリン抵抗性も引き起こし、ＴＮＦα、ＩＬ−６およびＩＬ−８の上昇したレベルが、糖尿病およびインスリン抵抗性患者において、報告されている（Ｒｏｙｔｂｌａｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｏｂｅｓ  Ｒｅｓ．２０００、８（９）：６７３−５；Ｓｔｒａｃｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．２００２、８７（１０）：４６０２−６；Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６、２７１（５２４９）：６６５−８；Ｓａｒｔｉｐｙ  Ｐ、Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ  ＤＪ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００３，１００（１２）：７２６５−７０；Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９５，９５（５）：２４０９−１５）。さらに、インスリン抵抗性患者において、炎症マーカーであるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の上昇したレベルが観察される（Ｖｉｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＪＡＭＡ．１９９９、２８２（２２）：２１３１−５）。さらに、肥満げっ歯類において、高投与量のサリチル酸塩の処置によって、炎症性経路の主要なキナーゼであるＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）が阻害され、耐糖能異常およびインスリン抵抗性を食止めることができる（Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１、２９３（５５３５）：１６７３−７）。
【０１６０】
インスリン抵抗性は、内皮機能障害を促進することができ、抗−ＴＮＦα遮断は、内皮機能の急速な回復をもたらす。全身性炎症、インスリン抵抗性、および内皮機能障害は、循環器疾患の進行に関与している。内皮は、血管恒常性の維持に関与している。生理条件下で、血管緊張、血流、膜流動性を維持することによって、内皮は役割を果たす。メタボリック症候群で起こる内皮機能不全は、ＴＮＦ−αのような炎症性サイトカインの影響の結果である。したがって、メタボリック症候群は、例えば虚血性心血管系イベント、インスリン抵抗性および高い死亡率の増加を引き起こす内皮機能不全に伴って起こる慢性炎症状態であると考えられる。したがって、炎症性状態の阻害を可能とする治療が、その結果としてメタボリック症候群に起因する心血管リスク、ＩＩ型糖尿病および脂質異常症を最小限にすると考えられる。
【０１６１】
次の薬剤が、広くメタボリック症候群の治療に用いられる：メトホルミンおよびチアゾリジンジオン（ＴＺＤ）のような経口抗糖尿病剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤およびアンジオテンシンレセプターブロッカー（ＡＲＢｓ）のような抗高血圧剤および脂肪低下スタチン剤、ならびに非ステロイド系抗炎症性剤（ＮＳＡＩＤ）。ＩＩ型糖尿病およびアテローム性動脈硬化症の発生を減少させ、および／または発現を遅らせることが示されているこれらの薬剤は、明らかな抗炎症性特性を有することが示されている。
【０１６２】
メトホルミンは、エネルギー恒常性および代謝的付加の制御において中心的な役割を果たすAMPKを活性化することが示されている。メトホルミンは、また用量依存的に腫瘍壊死因子(TNF)-α誘発性NF-κB活性化およびTNF-α誘発IκBキナーゼ活性(IKK)を阻害する。さらに、メトホルミンは、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１(VCAM1)、E-セレクチン、細胞間接着分子-1(ICAM1)、および単球走化性タンパク質-1(MCP1)のような種々の炎症性および細胞接着性分子のTNF-α-誘発遺伝子発現を弱める。アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤およびアンジオテンシンレセプターブロッカー（ＡＲＢｓ）は、炎症マーカーを減少させ、ＩＩ型糖尿病の進行のリスクを減少させる。インスリン感作剤である、チアゾリジンジオン類（ＴＺＤｓ）は、ＩＩ型糖尿病の治療に広く用いられるペルオキシゾーム増殖剤活性化レセプターγ（ＰＰＡＲγ）の選択的リガンドである。ＰＰＡＲｓは、転写因子の核ホルモンレセプタースーパーファミリーの一つで、脂質および糖質代謝を含むエネルギー代謝ならびに炎症に関連する種々の病理生理学的過程における重要な調節因子である。ＰＰＡＲγは、脂肪組織に豊富に発現していて、ＰＰＡＲγシグナル伝達経路は、ＮＦ−κＢの阻害によって抗炎症性効果を発揮することが報告されている。これらの結果と一致して、インビトロおよびインビボ研究の双方が、ＴＺＤ類が抗炎症性特性を有するという証拠を提供する。ＴＺＤ類がマクロファージ活性化を阻害し、マクロファージおよび単球における炎症性サイトカイン発現および放出を減少させる。インビボでは、ＴＺＤ類の処理により、循環している単核細胞核ＮＦ−ｋＢ量が減少し、一方、同じ細胞内で、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、ＩＬ６、接着分子であるＶＣＡＭ−１およびＰ−セレクチンならびに単球のような炎症性メディエーターを阻害する、ＮＫ−ｋＢ阻害剤であるＩｋＢの発現が増加する。
【０１６３】
Ｂｓｔ２リガンド（Ｂｓｔ２Ｌ）
レセプタータンパク質、Ｂｓｔ２の細胞外ドメインから構成されるＢｓｔ２デコイは、インビトロで、同型および異型細胞−細胞相互作用を阻害する。既知のどんなレセプターの細胞外ドメインもそのリガンドと相互作用するドメインであるので、Ｂｓｔ２デコイにより媒介される細胞−細胞相互作用の阻害は、以下のことを示す；１）Ｂｓｔ２に対して自然に生ずるリガンド（Ｂｓｔ２Ｌ）が存在する、２）Ｂｓｔ２およびＢｓｔ２Ｌ間の相互作用は、細胞−細胞接着に必要である、そして３）Ｂｓｔ２デコイは、自然に生ずるＢｓｔ２Ｌと相互作用し、接着アッセイにおいて、Ｂｓｔ２Ｌを無効化することによって、細胞−細胞相互作用を阻害しなけらばならず、それ故、免疫炎症性反応を負に制御する。
【０１６４】
Ｂｓｔ２デコイが、Ｕ９３７のＨＵＶＥＣへの接着を阻害するという結果は、Ｂｓｔ２Ｌが未刺激のＵ９３７細胞の細胞表面上に存在することを示す。Ｂｓｔ２デコイが活性化Ｔ細胞または活性化Ｕ９３７細胞の同型凝集を阻害するという別の結果は、活性化前後の双方で、Ｔ細胞および／またはＵ９３７細胞の表面上にＢｓｔ２Ｌが発現しうることを示唆する。Ｔ細胞またはＵ９３７細胞の活性化後、Ｂｓｔ２Ｌ発現が亢進しうる。したがって、Ｂｓｔ２Ｌは、例えば、Ｔ細胞活性化状態またはＬＰＳ刺激状態のような活性化の前または後のいずれかで、Ｕ９３７細胞（または他の単球セルライン）、Ｔ細胞、または初代造血細胞において発現しうる。Ｂｓｔ２Ｌは、Ｂ細胞、樹枝状細胞、内皮細胞または線維芽細胞においても発現しうる。
【０１６５】
Ｂｓｔ２Ｌはタンパク質または分子でありうる。Ｂｓｔ２Ｌは、膜タンパク質または可溶性タンパク質でありうる。多くの異なるＢｓｔ２Ｌタンパク質または分子が存在し、Ｂｓｔ２レセプターの異なる結合特異性および機能的特性を示す可能性がある。Ｂｓｔ２は、ホモダイマーを形成することが知られているので、Ｂｓｔ２自身がＢｓｔ２の潜在的な機能性リガンドでありうるとも考えられている。炎症細胞上のＢｓｔ２は、浸潤された白血球および免疫細胞を認識する。全てのＢｓｔ２Ｌタンパク質または分子が、互いの機能的または結合特性の点で、全く無関係である可能性はある。したがって、Ｂｓｔ２デコイ（Ｂｓｔ２デコイ−Ｆｃ）の治療標的ならびに炎症性状態の予防および／または治療のための治療材料の続いての開発を達成するために、それらが炎症または免疫反応における律速段階を媒介しているかどうかの機能的特性は、徹底的に試験されなければならない。炎症性経路における律速段階には存在しない他のＢｓｔ２Ｌタンパク質または分子は、異なる疾患プロセスにおける他の重要な経路を媒介しうる。
【０１６６】
Ｂｓｔ２Ｌが抗炎症性分子との相互作用への標的でありうるので、Ｂｓｔ２Ｌの存在の証明は本発明の重要な特徴である。Ｂｓｔ２Ｌに対する抗体は、種々の免疫および炎症性疾患の治療用の治療抗体となりうる。Ｂｓｔ２Ｌの細胞外ドメインのＦｃへのキメラ分子も同様に有益である。Ｂｓｔ２Ｌが、例えば、Ｔ細胞活性化に対するＴ細胞共刺激（または阻害）シグナル伝達に関与している可能性がある。Ｂｓｔ２ＬはＢｓｔ２へ結合するが、Ｂｓｔ２Ｌは、共刺激または共阻害シグナルを媒介する、Ｔ細胞または抗原提示細胞上の多数の他のレセプターと相互作用しうる。これらの新しいレセプター群のアゴニストもしくはアンタゴニスト抗体またはＦｃ融合タンパク質は、種々の免疫、炎症性疾患の治療のためのタンパク質治療剤となりうる。
【０１６７】
さらに、Ｂｓｔ２Ｌを用いることによって、直接結合アッセイまたは結合競合アッセイが、Ｂｓｔ２デコイ−（Ｆｃ）変異体またはＢｓｔ２の低分子量モジュレーターのスクリーニングに用いられる。これらのアッセイにより、発明者は、Ｂｓｔ２−Ｂｓｔ２Ｌ相互作用を阻害するまたは増加させるＢｓｔ２デコイ変異体またはＢｓｔ２の低分子量モジュレーターを選抜することができる。
【０１６８】
抗−Ｂｓｔ２Ｌ抗体
Ｂｓｔ２Ｌ（マウスＤａｍｐ１Ｌ）の投与が、免疫、炎症反応を増強する場合、種々の免疫、炎症性疾患を治療するために、抗−Ｂｓｔ２Ｌを作製することが理にかなっている。抗−Ｂｓｔ２抗体および抗−Ｂｓｔ２Ｌ抗体の併用療法もまた考えられる。
【０１６９】
抗−Ｂｓｔ２抗体
従来のＩｇＧ抗体は、２つの抗原に結合することができる２価である。この結合可能性は、それらの機能的親和性を大幅に増加させ、多くの細胞表面レセプターおよび抗原上の保持時間を長くさせる。抗−Ｂｓｔ２抗体は、免疫、炎症反応をそれぞれ阻害するまたは増加させる、アンタゴニストまたはアゴニスト抗体でありうる。アンタゴニストおよびアゴニスト抗−Ｂｓｔ２抗体の双方が、下記の多くの異なる抗−Ｂｓｔ２抗体形式の例で得られうる。
【０１７０】
１．本発明の抗−Ｂｓｔ２抗体は、ヒト化モノクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体でありうる。ネズミ抗体の小さな部分が、免疫グロブリン分子のＦｃ部のみがヒトであるキメラ抗体、または免疫グロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）だけがネズミであり分子の９０〜９５％がヒトであるヒト化抗体を創るヒト免疫グロブリン分子につぎ足される場合、抗原性ネズミモノクローナル抗体（ｍＡｂ）はヒト親和（ｆｒｉｅｎｄｌｙ）になる。一つの点において、ＨｕＭＡｂ−マウス（ＧｅｎＰｈａｒｍ−Ｍｅｄａｒｅｘ）またはＸｅｎｏマウス（Ａｂｇｅｎｉｘ、Ｉｎｃ．）技術のような従来の方法を用いることによって、完全なヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニックマウス中で作製されうる。ヒト化抗体としては、ヒト免疫グロブリンが挙げられ、その中の受容者のＣＤＲ由来残基は、所望の特性、親和性および生物学的機能を有するマウス、ラットまたはウサギのようなヒトではない種のＣＤＲ由来残基に置換されている。
【０１７１】
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、１９９１、２２７：３８１、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１、２２２：５８１）のような技術を用いても製造されうる。非ヒト抗体をヒト化するための方法も周知である。ヒト化は、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、１９８６、３２１：５２２；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、１９８８、３３２：３２３；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８、２３９：１５３４に記載されているように、ヒト抗体の対応する配列に対するげっ歯類のＣＤＲ配列またはＣＤＲｓを置換することによってＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の方法に従って行うことができる。かようなヒト化抗体は、キメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。典型的には、ヒト化抗体は、ＣＤＲ残基がげっ歯類抗体中の類似部位由来の残基によって置換されている抗体である。
【０１７２】
２．本発明の抗−Ｂｓｔ２抗体は、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）であってもよい。軽鎖なしで機能する重鎖抗体は、アメリカテンジクザメ（ｎｕｒｓｅ  ｓｈａｒｋｓ）、テンジクザメ（ｗｏｂｂｅｇｏｎｇ  ｓｈａｒｋｓ）およびラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）では自然と起こる（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ＡＳ．  ｅｔ  ａｌ．１９９５、Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：１６８；Ｎｕｔｔａｌｌ  ＳＤ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１、３８：３１３；Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．１９９３、Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６）。それらの抗原結合部位は、単一ドメインである、ＶｈＨドメインにまでなる。重鎖抗体の可変領域は、分子質量がわずか１５ｋＤａである最も小さい完全に機能的な抗原結合断片であるので、この部分はナノボディと呼ばれる。
【０１７３】
ナノボディは、治療抗体の新たな部類となりうる。ナノボディは、小さく、非常に安定で、大量生産が容易で、多価のまたは多特異的なタンパク質への変換が容易であるという点で、従来の抗体と較べて優れた特性を有する。ナノボディは、非注入法によって投与されうる。したがって、ナノボディは、小さいサイズ、安定性および低分子の薬物動態学を有しつつ、結合親和性、および抗体特異性を与える。
【０１７４】
ナノボディの小さいサイズは、浸透が重要である腫瘍のように妨害された位置、または従来の抗体への接近ができない領域における抗原をそれらが標的とするのを適切にする。抗−Ｂｓｔ２ナノボディは、インビトロの診断イムノアッセイおよびインビボの撮像適用に有用でありうる。抗−Ｂｓｔ２ナノボディは血液脳関門を越えることが可能であり、それ故脳中に治療ナノボディを運ぶことができる。
【０１７５】
抗−Ｂｓｔ２ナノボディは、ファージディスプレイ技術を用いて得られうる。記述されているように、ナノボディライブラリは、免疫されたヒトコブラクダから構築される（Ｃｏｎｒａｔｈ  ＫＥ．  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００１、４５：２８０７）。ファージディスプレイライブラリーは、次いでマイクロタイタープレート上にコートされたヒトＢｓｔ２のパンニングに用いられる。豊富なクローンの選択が、ＥＬＩＳＡによって行われ、クローンの配列が決定される。陽性クローンからタンパク質が精製される。
【０１７６】
３．本発明の抗Ｂｓｔ２抗体は、二重特異性抗体でありうる。二重特異性抗体は、二重標的特異性を有する、モノクローナル抗体、好ましくはヒトまたはヒト化抗体である。二重特異性抗体は、異なる特異性を有する２つの抗体の可変領域の組み換えから得られる；二重特異性抗体は、したがって、それらの親抗体の双方の抗原に結合することができる。抗−Ｂｓｔ２の場合、結合特異性の一つはＢｓｔ２に対するものであり、その他は、Ｂｓｔ２Ｌ、または、例えば、炎症または自己免疫状態下でＢｓｔ２を発現している同じ細胞の表面上のＴ細胞もしくは他の炎症性タンパク質のレセプターなどの他の細胞表面タンパク質に対するものでありうる。これらの二重特異性抗Ｂｓｔ２抗体は、アンタゴニストまたはアゴニスト抗体として機能しうる。
【０１７７】
二重特異性抗体の作製方法は周知である（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  Ｊ、１９９１、１０：３６５５；国際公開第９３／０８８２９号；Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｍｏｌｏｇｙ、１９８６、１２１：２１０；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７）。簡単に、所望の結合特異性を有する抗体可変領域は、免疫グロブリンの定常領域に融合している。この融合体は、免疫グロブリン重鎖定常領域（ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の部分）を含み、好ましくは第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を含む。免疫グロブリン重鎖融合体および免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが、別々の発現ベクターに挿入され、同時遺伝子導入される。
【０１７８】
４．本発明の抗Ｂｓｔ２抗体は、一本鎖可変領域断片抗体（ｓｃＦＶ）でありうる。組み換えアプローチは、一本鎖可変領域断片抗体（ｓｃＦｖ）の開発へと導く。単量体のｓｃＦｖは、分子質量が約３０ｋＤａに過ぎず、Ｇｌｙ／Ｓｅｒ−リッチ合成リンカーによって連結される単一のＶＬ−ＶＨ対として、多様なシステムにおいて発現している（Ｂｅｒｅｚｏｖ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．、２００１、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４４：２５６５）。バクテリアまたは真核細胞中で発現される場合、ｓｃＦｖは、親抗体の対応する領域と同様の構造に折り畳まれる。Ｆａｂの親和性に相当する親和性を保持することが示された（Ｋｏｒｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２２１：１５１）。ＳｃＦｖは、治療剤としての潜在性を高めるためのヒト化のような種々の遺伝的改変および融合タンパク質の生産をしやすい。例えば、Ｃ５補体成分に結合するヒト化ｓｃＦｖであるＰｅｘｅｌｉｚｕｍａｂは、冠動脈バイパスグラフト手術中の心筋梗塞を減らすことが示されている（Ｖａｒｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００４、ＪＡＭＡ  ２９１：２３１９）。
【０１７９】
一つのまたは異なる細胞上の２つの異なるレセプターに結合する二重特異性抗体を作製するため、異なる特異性を有するＳｃＦｖを互いに連結させることもできる。抗−Ｂｓｔ２の場合、抗−Ｂｓｔ２ｓｃＦｖおよび抗−Ｂｓｔ２Ｌ  ｓｃＦｖ；あるいは、抗−Ｂｓｔ２ｓｃＦｖおよび、例えば、炎症または自己免疫状態下でＢｓｔ２を発現している同じ細胞表面上のＴ細胞もしくは他の炎症性タンパク質のレセプターなどの他の細胞表面タンパク質；を含む二重特異性抗体様分子であってもよい。
【０１８０】
ファージディスプレイ法は、抗−Ｂｓｔ２ｓｃＦｖを作製するのに用いられうる。この方法では、抗体可変領域ｃＤＮＡの幅広いレパートリーが、Ｂ細胞およびＶＨの組合わせから回収され、ＶＬはフィラメント状バクテリオファージの表面上にｓｃＦｖの形態で発現している。ｓｃＦｖを発現しているファージは、抗原コートプレートからパンニングされる。抗−Ｂｓｔ２ｓｃＦｖに対する親和性は、構築物のＣＤＲを突然変異させ、パンニング操作を繰り返すことにより向上する。
【０１８１】
５．本発明の抗Ｂｓｔ２抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ２二重特異性抗体、Ｆａｂ３三重特異性抗体、２価ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、３価三量体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、または４価四量体（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）でありうる。
【０１８２】
６．本発明の抗−Ｂｓｔ２抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって述べられているような、ハイブリドーマ法を用いて準備される（Ｎａｔｕｒｅ、１９７５、２５６：４９５）。免疫抗原に対して結合特異性を持つ抗体を産生するリンパ球が産生されるように、マウス、ラット、ハムスターまたは他の宿主動物を免疫抗原で免疫性を与える。他のアプローチとしては、インビトロでリンパ球に免疫性を与えてもよい。
【０１８３】
Ｂｓｔ２に対するモノクローナル抗体
免疫治療の使用は、疾患のタンパク質標的が決定されている場合には、最近ではよく知られているようになってきている。治療抗体によってもたらされる高い特異的ターゲッティングは、比較的高投与量であっても、実質的に何の副作用を引き起こさない。これはまた、抗体の天然固有の血清安定性を利用するものであり、長持間作用する治療分子の基盤をなしている。
【０１８４】
抗体治療は、相互排他的ではない２つのカテゴリーの一つに一般的には分類される。第一のカテゴリーは、抗体の可変領域(標的タンパク質認識部)に依存する。抗体によって認識される特異的エピトープによって、抗体が、標的タンパク質の他のタンパク質への結合を阻害し(抑制性またはアンタゴニスト効果)、標的タンパク質を介する細胞-細胞 相互作用を阻害する、またはシグナル伝達を終結させる；または、二量化依存性レセプターシグナル伝達またはレセプター依存性リガンド擬態の場合のように、必要とされる第二タンパク質を欠き、標的タンパク質との結合の結果として、抗体が、人工的シグナルを産生する(活性性またはアゴニスト効果)。第二のカテゴリーは、あるとすれば、どの免疫エフェクター機能が、免疫エフェクター細胞上に存在する同種Ｆｃレセプターとの抗体Ｆｃ部の結合の結果として活性化されるかを決定する、抗体の定常領域（Ｆｃ部）に依存する。標的細胞表面上の特異的標的タンパク質の存在により、エフェクター機能による分解のために、その細胞は標的化される。
【０１８５】
Ｂｓｔ２特異性が高い抗体を開発することによって、我々は、細胞−細胞接着を妨げ、疾患−特異的炎症反応を阻害する治療タンパク質として作用することができるという点で、デコイＢｓｔ２分子と多くの特性を共有する治療抗体を作製することができた。
【０１８６】
粘膜免疫系の病理学的機構を取り扱う場合、抗体が経口または経鼻投与されうる。抗原暴露後に耐性が優先的に誘発され、調節Ｔ細胞の誘導が経口耐性の一次機構であるので、粘膜免疫系は独特である。経口投与された抗体は、腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）によって急速に取り込まれることができ、そこで抗体は、その免疫効果を働かせる。抗体の経口投与により、Ｔ細胞の調節機構を高めるのに弱いが効果的なシグナルが伝播するように、腸内のＴ細胞にシグナルを伝達することができる。ＣＤ３特異的抗体の経口投与は、実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）モデルにおいて示されている。これらの研究により、ＣＤ３特異的抗体のＦｃ部は必要とされないことが示された。ＣＤ３特異的抗体のＦ（ａｂ’）２断片の経口投与により、ＥＡＥが抑制された。
【０１８７】
抗体工学
１．抗体工学
いったん治療抗Ｂｓｔ２抗体が利用可能となれば、次の段階は、抗原結合ドメイン（親和性成熟、安定性）を設計し、エフェクター機能（抗体依存性細胞障害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞障害活性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＣＤＣ）、およびクリアランス率）を変えることである。抗Ｂｓｔ２抗体の効能を向上させる別の方法は、抗体−毒素複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔｏｘｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、二重特異性抗体を追求すること、および／またはＦｃＲ（Ｆｃレセプター）多型を研究することである。
【０１８８】
抗Ｂｓｔ２抗体は、Ｂｓｔ２が結合している細胞に結合後、Ｂｓｔ２およびＢｓｔ２Ｌ間の相互作用を阻害し、その結果、細胞内シグナルの介入をもたらす。抗体工学のためには、アポトーシスのために細胞間シグナルを導く、インターナリゼーション後に細胞に毒素を運ぶ、または細胞を殺すエフェクター機能を用いるために抗Ｂｓｔ２抗体がクロスリンクする場合には、抗Ｂｓｔ２抗体の特性を明らかにすることが重要である。抗−Ｂｓｔ２の全てのこれらのパラメータは、自己免疫／炎症性状態の治療において重要である。
【０１８９】
１−１．抗原結合ドメインの設計を通じての抗Ｂｓｔ２抗体の改良
１−１−１．抗−Ｂｓｔ２のＦ（ａｂ）断片
ＲｅｏＰｒｏ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）の場合のように、急速なクリアランスまたは短い半減期が必要とされる場合には、抗−Ｂｓｔ２のＦ（ａｂ）断片が用いられうる。小さいサイズであるため、Ｆ（ａｂ）断片は、固形組織により浸透しうる。Ｆ（ａｂ）断片は、哺乳類細胞よりも大腸菌において作製されうる。２価で全長の抗Ｂｓｔ２抗体によるＢｓｔ２の架橋結合は、標的細胞のアポトーシスを引き起こしうる。治療される疾患によって、そのようなアポトーシスが好都合であるか、有害であるかどちらかである。全長の抗Ｂｓｔ２抗体によるＢｓｔ２の架橋結合が有害である場合には、Ｆ（ａｂ）の使用が有益でありうる。
【０１９０】
１−１−２．親和性成熟
免疫グロブリン遺伝子の体細胞超変異は、インビボの高親和性抗体の作製においては重要であるが、体細胞超変異は免疫後にのみ起こる。したがって、非免疫ドナーからのファージディスプレイライブラリーにおいて、高親和性抗体は、めったに発見されない。インビトロ親和性成熟は、そのようなライブラリーからの抗体の改良にしばしば必要とされる。抗Ｂｓｔ２抗体がファージライブラリー、ハイブリドーマまたは他の技術由来であるかどうかにかかわらず、抗体親和性は、向上が必要とされうる。親和性は、相互作用の効果的な阻害に対して重要であるだけではなく、投与量の低減および費用対効果に対しても重要である。
【０１９１】
しかしながら、抗体親和性に関しては、最も強い結合を有する抗Ｂｓｔ２抗体が、最もよい選択であるとは限らないであろう。ある抗体は、Ｂｓｔ２に強く結合するかもしれないが、Ｂｓｔ２上のＢｓｔ２Ｌ結合部位を部分的にしかカバーしていないかもしれず、一方、別の抗体は、Ｂｓｔ２にあまり強く結合しないかもしれないが、適確にＢｓｔ２Ｌ結合部位をカバーするかもしれない。後者がよりよい選択となりうる。抗Ｈｅｒ２抗体を用いたＡｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．による研究（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：４７５０、２００１）において、最も高い親和性の抗体は、固形組織／腫瘍への最適な浸透を示さなかった。高親和性ｓｃＦｖ断片は、腫瘍周辺に留まっており、一方、中程度の親和性の抗体が、腫瘍中に浸透した。治療疾患によって、機能が損なわれた組織への浸透性が、抗Ｂｓｔ２抗体親和性成熟に対する潜在的な関心事となりうる。
【０１９２】
１−１−２−１．親和性成熟の一般的方法
親和性成熟において（Ｌｅｖｉｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ、Ｍｏｌ．ＢｉｏＳｙｓｔ．２：４９、２００６）、ＣＤＲ中の残基は、変異を用いて変えられ、得られた変異抗体は、結合および効果の向上のために選択される。いくつかの親和性成熟の方法が公表されてきた。これらの方法としては、ファージを経た親和性成熟（Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ８９：３５７６、１９９２；Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９３、２３４、５６４）、リボソームディスプレイ（Ｌｉｐｏｖｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２９０（２００４）、ｐｐ．５１−６７）、酵母表面ディスプレイ（Ｇｒａｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１７（２００４）、ｐｐ．２９３−３０４）、エラープローンＰＣＲ（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１７（２００４）、ｐｐ．８４７−８６０）、突然変異誘発バクテリア株（Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０：３５９、１９９６）、段階的集中突然変異誘発（ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｆｏｃｕｓｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ９５：６０３７、１９９８）および飽和突然変異誘発（Ｎｉｓｈｉｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１２８１３、２０００；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２、１９９５；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：５６８、１９９９）が挙げられる。他の技術は、特異的変異体の限定的収集を作製するための、アラニンスキャニング（ａｌａｎｉｎｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇ）または部位特異的突然変異誘発法をしばしば用いる。
【０１９３】
１−１−２−２．Ｌｏｏｋ−Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＬＴＭ）法を通じての親和性成熟
最近、Ｒａｊｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｒｅｎ、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）が、酵母ディスプレイシステムを用いた抗体を最適化するためのＬｏｏｋ−Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＬＴＭ）技術を開発した。ＬＴＭは、抗Ｂｓｔ２抗体の親和性成熟に適用しうる。ＬＴＭは、Ｂｓｔ２デコイ（またはＢｓｔ２デコイ−Ｆｃ）の高親和性変異体のスクリーニングにも有用である。抗Ｂｓｔ２抗体の親和性成熟用に、Ｒａｊｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．に従った方法を下記に簡単に記述する。
【０１９４】
ＬＴＭは、多次元変異誘発法であり、迅速な親和性向上を目的として、各々のＣＤＲに対する全ての位置で１つのアミノ酸変異をもたらす。ＬＴＭにおいて、標的とされる位置は、野生型残基か、主な側鎖の化学的性質−小さい（Ａ）、求核（Ｓ、Ｈ）、疎水性（Ｌ、Ｐ）、芳香族（Ｙ）、酸性（Ｄ）、アミド（Ｑ）、または塩基性（Ｋ）；を表す９つのアミノ酸の中の一つのどちらかで置換される。ＬＴＭは、ＣＤＲ内に１つの変異のシリーズを作製し、そこで各々の野生型は、９つの選択されたアミノ酸の中の一つで置換される。
【０１９５】
初めに、抗−Ｂｓｔ２ｓｃＦｖコンストラクトは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および大腸菌の双方のために最適化されたコドンを用いて、オーバーラップＰＣＲによって組み立てられ、酵母ディスプレイベクター中にサブクローン化される。この最初のコンストラクトが、続いての抗−Ｂｓｔ２ＬＴＭライブラリー用のテンプレートとなる。抗−Ｂｓｔ２ＬＴＭライブラリーコンストラクション用に、各々のＣＤＲの位置で１つの標的アミノ酸置換を有する突然変異ＣＤＲをコードするために、個々のＣＤＲオリゴヌクレオチドが合成される。ＬＴＭ−置換ＣＤＲ断片を増幅するために、ＬＴＭオリゴヌクレオチド混合物を含むＰＣＲが用いられる。３重ＣＤＲライブラリーにおいて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対するオリゴヌクレオチドが、３つの突然変異ＣＤＲ（ＶＨおよびＶＬ領域の双方用）を有するライブラリーを製造するために組み合わせられる。対応する抗体ライブラリーは、次いで酵母細胞表面上に提示される。
【０１９６】
陽性選択の後、Ｂｓｔ２に対してより高い親和性結合をもたらすクローンの配列が決定され、それらの有益な変異がマッピングされる。向上した結合のための相乗的変異を同定するため、有益なコンビナトリアル変異のライブラリーが、混合縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）ＤＮＡプローブによって作製される。選択されたアミノ酸変異および野生型アミノ酸をコードする縮重オリゴヌクレオチドが合成され、これらのライブラリーを製造するために集められる。陽性クローン選択用に、Ｂｓｔ２（またはＢｓｔ２デコイ）はビオチニル化される。細胞は、ビオチニル化されたＢｓｔ２とともにインキュベートされ、ストレプトアビジンビーズに結合される。ビオチニル化されたＢｓｔ２（またはＢｓｔ２デコイ）で酵母細胞を標識化するパルス・チェイス戦略およびラベルされていないＢｓｔ２（またはＢｓｔ２デコイ）での追跡（ｃｈａｓｅ）が、ビオチニル化されたＢｓｔ２（またはＢｓｔ２デコイ）に対してより強い結合を示すクローンの選択に用いられる。これらのクローンは、ＦＡＣＳにより分類されうる。幾巡かの選択の後、より高い親和性を与える変異を得ることができる。次いで、全てのｓｃＦｖが、発現ベクター中にサブクローン化され、大腸菌中に分泌される。ｓｃＦｖ抗体の結合親和性が、ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴システム（ＢＩＡｃｏｒｅ、スイス）を用いて測定される。
【０１９７】
１−１−３．親和性成熟なしの高親和性抗体
Ｄｙａｘ社のＨｏｅｔらが、自然に起こる重鎖ＣＤＲ３およびヒトドナーから得られる軽鎖配列の組合わせならびに重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２中の抗原接触部位中に合成多様性を有するヒトＦ（ａｂ）ライブラリーを構築してきた。ＤｙａｘＦ（ａｂ）ライブラリーを用いて、４つのヒト薬剤標的への結合のために選択されたＦ（ａｂ）は、認可された治療抗体より高い親和性を示した（Ｈｏｅｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３：３４４、２００５）。かようなＦ（ａｂ）ライブラリーは、親和性成熟の必要性を回避する高親和性抗Ｂｓｔ２抗体を作製する効果的な方法を提供しうる。
【０１９８】
１−１−４．種々のドメインでのＡｓｎ−結合グリコシル化の除去
抗体可変領域におけるＡｓｎ−結合グリコシル化は、抗原結合に影響を与えうる（Ｌｅｉｂｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３３８：５２９、１９９９）。Ａｓｎ−結合グリコシル化が、抗Ｂｓｔ２抗体の可変領域において観察され、糖質が抗体の結合または生物活性に必要とされない場合、ＡｓｎをＡｌａ、Ｇｌｎまたは他のアミノ酸へ変えることによって可変領域中のＡｓｎが除去されうる。
【０１９９】
ＣＤＲ中のＡｓｎ−ＧｌｙまたはＡｓｐ−Ｇｌｙ配列が、イソアスパラギン酸を形成して、自然的異性化を起こすことが報告されている（Ｃａｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１８９７、１９９６）。イソアスパラギン酸の形成は、抗体の結合を弱体化するまたはなくす可能性がある。抗Ｂｓｔ２抗体中のＣＤＲがこれらの配列を含む場合、ＡｓｎまたはＡｓｐをＡｌａ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕで置換することがよいであろう。これらの置換が、抗体結合および効果を維持しうるかどうかを決定することができる。
【０２００】
メチオニンが酸化され、これが結合を阻害する場合、ＣＤＲ中のメチオニンの存在も同様に問題となりうる。抗Ｂｓｔ２抗体の場合であれば、メチオニンを他のアミノ酸で置換することを検討することができる。
【０２０１】
１−１−５．抗原結合ドメインの変異による抗−Ｂｓｔ２の安定性の増大
抗−Ｂｓｔ２の安定性は、Ａｎｇａｌらによって示されているように安定性に影響を与える特別な残基を変えて、不安定なｓｃＦｖからより安定な骨格上にＣＤＲを移す（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５、１９９３）；または、Ｓｃｈｕｕｒｍａｎらによって示されているようにジスルフィド結合の導入を経てＶＨ−ＶＬ接合部を変える（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：１、２００１）ことによって得られうる。
【０２０２】
１−２．Ｆｃエンジニアリングによる抗Ｂｓｔ２抗体の改良
標的に結合し、かつその機能に作用することができなければならない低分子量薬とは異なり、治療抗体は、標的に結合し、エフェクター機能：抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）および食作用を通して、標的を攻撃するように免疫システムを指向することができる。しかしながら、リガンド−レセプター相互作用を阻害することによって機能するモノクローナル抗体は、抗Ｂｓｔ２抗体の場合、エフェクター機構を利用することなく機能しうる（Ａｇｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３（２００５）、ｐｐ．２５３４−２５４３；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ７（２００４）、ｐｐ．３３５−３４５）。
【０２０３】
にもかかわらず、抗Ｂｓｔ２抗体の作用において、エフェクター機能を増強することは有益でありうる。例えば、自己免疫、炎症性状態、特に関節リウマチの治療用の全てのＣＤ２０指向モノクローナル抗体治療は、エフェクター機能により、一時的なＢ細胞の枯渇となる。インフリキシマブ（抗−ＴＮＦα）もまた、インビボでのＴＮＦαに対する結合に続いて、ＣＤＣおよびＡＤＣＣをもたらすことが知られている（Ｓｃａｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１９９５）。
【０２０４】
抗Ｂｓｔ２抗体にとって、ＡＤＣＣ、ＣＤＣの活性化および／または続いての標的細胞の破壊が疾患の治療に対して有益であるか、または有害であるかを決定することは重要である。抗−Ｂｓｔ２の治療機能におけるＡＤＣＣおよびＣＤＣの効果を評価する１つの方法は、ＦｃγＲノックアウトマウスにおいて抗Ｂｓｔ２抗体の効果を試験することである。
【０２０５】
１−２−１．エフェクター機能が有利であるか、または有害であるかを決定するためのＢｓｔ２ノックインＦｃγＲノックアウト（二重変異体）の使用
ＡＤＣＣおよび食作用は、活性化および阻害活性の双方；補体系（例えばＣ１ｑ、Ｃ３、Ｃ４など）におけるタンパク質との相互作用を通じたＣＤＣ；および新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）に対する抗体の結合を通じての半減期／クリアランス率に密接に関連しているＦｃγレセプター（ＦｃγＲ）群との相互作用を介して媒介される。抗Ｂｓｔ２抗体の作用機構におけるＦｃγＲ（および潜在的ＡＤＣＣ）の役割は、ＦｃレセプターであるＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩの活性を欠いている、共通γ鎖（ＦｃγＲ  −／−）を欠いたマウス（Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ７６：５１９、１９９４）、およびＦｃγＲＩＩＢを欠いたマウス（Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３７９：３４６、１９９６）を用いることによって調べることができる。
【０２０６】
ＦｃγＲノックアウトと交配したＢｓｔ２ノックインマウスを用いてもよい。Ｂｓｔ２ノックインをＣ５７Ｂｌ／６マウスで作製する場合、例えば、ＦｃγＲ欠失株をＣ５７Ｂｌ／６に交配させ、同系株を得るために、戻し交配する。次いで、この同系株をＢｓｔ２ノックインマウスとつがわせ、ＦｃγＲ−／−／Ｂｓｔ２／Ｂｓｔ２およびＦｃγＲＩＩＢ−／−／Ｂｓｔ２／Ｂｓｔ２マウスを作製する。この二重変異体マウスには、疾患誘導できる処置が行われる。マウスは、次いで抗Ｂｓｔ２抗体で処理される。
【０２０７】
１−２−２．エフェクター機能および／または安定性の増強による抗−Ｂｓｔ２活性の向上
治療効果のために、抗Ｂｓｔ２抗体がＡＤＣＣを用いる場合、（ＦｃγＲおよび／または補体に対する結合が向上することにより）エフェクター機能を向上させるために、ＩｇＧ  Ｆｃを設計することが、治療抗体に対する価値ある強化となりうる。結合の向上は、Ｆｃ中の残基を変化させること（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１、２００１）、Ｆｃ中の保存された糖からのフコース部分の除去（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３、２００２；Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３４６６、２００３）および多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）Ｆｃ（Ｓｃａｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：７３、２００４）によって達成されてきた。
【０２０８】
１−２−２−１．Ｆｃ中のアミノ酸改変による
ヒトＩｇＧ中のアミノ酸残基の改変は、ＦｃγＲ結合およびエフェクター機能を高めることが示されてきた。そのような研究の多くは、ヒンジ（２１６−２３０残基）およびより下位のヒンジ領域（２３１−２３６残基）に焦点を合わせた。近年、ヒトＦｃＲＩ、ＦｃＲＩＩＡ、ＦｃＲＩＩＢ、ＦｃＲＩＩＩＡ、およびＦｃＲｎレセプターに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位の総合的なマップが公表された（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１、２００１およびその中の参考文献）。この研究において、ＦｃＲＩＩＩＡに対する結合が向上している精選されたＩｇＧ１変異体は、ＡＤＣＣにおいて顕著な増強を示した。特定のＩｇＧ１残基の改変によって、Ｃ１ｑ結合を向上させうることも報告されてきた（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６（２００１）、ｐｐ．２５７１−２５７５）。
【０２０９】
新生児のＦｃレセプター（ＦｃＲｎ）は、治療モノクローナル抗体のクリアランス率において役割を果たす（Ｌｅｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｂｌｕｍｂｅｒｇ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５（２００５）、ｐｐ．５−９）。免疫グロブリン超分子群メンバーであるＦｃγＲと比べて、ＦｃＲｎは、α２−ミクログロブリンと非共有結合で結合しているγ鎖を含むＭＨＣクラスＩと構造的に関連している（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ７  （２００１）、ｐｐ．８６７−８７７）。
【０２１０】
Ｓｈｉｅｌｄｓらによって作製された情報が、エフェクター機能を高めるためにＦｃγＲに対する結合が向上した抗−Ｂｓｔ２変異体を設計する助けとなるだろう。ＦｃＲｎに対する親和性を変えることにより、抗−Ｂｓｔ２の半減期を向上しうる。
【０２１１】
１−２−２−２．エフェクター機能を増強するための抗Ｂｓｔ２抗体の脱フコシル化
抗Ｂｓｔ２抗体のエフェクター機能を向上させる一つの方法は、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７で、グリコシル化（フコシル化またはシアル化）を変えることによる。
【０２１２】
ＩｇＧのグリコシル化は、全てのＦｃγレセプターに対する結合に必須である（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｕｎｄ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．８２：５７、２００２）。ヒトＩｇＧにおいて、Ａｓｎ２９７に結合している糖質が、Ｆｃ領域において見出されている。この複合糖質は、ＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）およびマンノースを含むコアオリゴ糖から構成される。このコアは、また、Ｎ−アセチルグルコサミンの一端または両端で、ガラクトース、フコース、ＧｌｃＮＡｃ、および／またはガラクトース−シアル酸のような種々のさらなる付加単糖類を含む。３０を超える異なる共有結合付加グリカン類が、この一つのグリコシル化部位で見つかっている（Ｒｏｕｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１３：１１３、１９９８）。
【０２１３】
フコース部の存在または欠陥は、ＦｃγＲに対する結合において重要な役割を果たすことが示されてきている。インビトロで、脱フコシル化されたモノクローナル抗体のＦｃγＲに対する結合が顕著に増加し、ＡＤＣＣが増加することが示された（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２００２）、ｐｐ．２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７６  （２００３）、ｐｐ．  ３４６６−３４７３；Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０：１５１０、２００５；Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４（２００４）、ｐｐ．２１２７−２１３３）。
【０２１４】
続いて、設計されたチャイニーズハムスター卵巣細胞ラインが確立され、そのラインではα−１，６−フコース転移酵素がノックアウトされている（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６７（２００４）、ｐｐ．６１４−６２２）。ＧｌｙＡｒｔ社（チューリヒ）およびＢｉｏＷａ社（プリンストン、ニュージャージー州）は、フコシル化が低減した抗体を作製するためにセルラインを設計する技術を開発した。このセルラインで製造された抗体は、フコースを欠き、脱フコシル化された抗体は、インビトロにおいてＡＤＣＣの増強を示した（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４：２１２７、２００４）。
【０２１５】
１−２−２−３．エフェクター機能を増強するための抗Ｂｓｔ２抗体におけるＦｃシアル化改変
Ｆｃレセプターは、フコースおよびシアル酸残基の双方のＩｇＧの存在を感知する。最近の研究により、抗体活性のためのＩｇＧおよびＦｃレセプターの相互作用を決定する際に、Ａｓｎ２９７部位でのＦｃシアル酸が重要であることが示され（Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：６７０、２００６）、さらに免疫反応におけるグリコシル化の役割を支持する。ＩｇＧのＡｓｎ２９７に結合しているグリカンのシアル化は、ＦｃγＲ群に対する結合親和性の減少、およびインビボにおける細胞毒性の減少をもたらす。
【０２１６】
抗Ｂｓｔ２抗体におけるシアル化改変は、抗Ｂｓｔ２抗体の有効性を向上させるのに有益でありうる。抗−Ｂｓｔ２活性におけるシアル酸の影響は、ノイラミニダーゼ処理された、シアル化（ａｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）抗Ｂｓｔ２抗体およびシアル酸含有抗Ｂｓｔ２抗体を用いて、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を行うことによって調べることができる。シアル酸含量が豊富な抗Ｂｓｔ２抗体は、レクチンアフィニティクロマトグラフィーによって、得ることができる。活性化または抑制性ＦｃγＲに対する、シアル化（ａｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）−およびシアル酸−含有抗Ｂｓｔ２抗体の結合活性は、初めに比較されなければならない。これらの抗体は、ＦｃγＲに対する結合親和性において相違を示しうるが、Ｂｓｔ２に対する結合親和性においては何ら相違がないであろう。インビボでのシアル化（ａｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）（ノイラミニダーゼ−処理）抗Ｂｓｔ２抗体の効果は、次いで、動物モデルを用いて試験され、シアル化抗Ｂｓｔ２抗体または通常の、未処理抗Ｂｓｔ２抗体の効果と比較される。ＩｇＧオリゴ糖の配列は、糖転移酵素またはグリコシダーゼのレベルによって決定されるので、抗Ｂｓｔ２抗体におけるシアル化改変は、細胞工学によって達成されうる。
【０２１７】
１−２−２−４ゼンコア（Ｘｅｎｃｏｒ）社のＦｃ変異体の抗−Ｂｓｔ２Ｆ（ａｂ）への付加
ゼンコア社のような新たなＦｃ変異体の抗−Ｂｓｔ２Ｆ（ａｂ）への付加は、抗−Ｂｓｔ２の効能を高めうる。
【０２１８】
ゼンコア社（モンロビア、カリフォルニア州）のＬａｚａｒらは、免疫システムによる反応を高めるか、または減じるＦｃ領域におけるアミノ酸を改変するために、コンピューター設計アルゴリズムおよびハイスループットタンパク質スクリーニングの組み合わせを用いた（Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  １０３：４００５、２００６）。ゼンコア社は、最適化されたＦｃγＲ親和性および特異性を有するＦｃ変異体のシリーズを設計してきた。ゼンコア社の新しいＦｃを、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）（ハーセプチン；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国）およびリツキシマブ（リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）に付加させたとき、インビトロアッセイにおいて約５００倍抗体の効果が向上し；改変されたリツキシマブもまたサルモデルにおいてより効能があった。
【０２１９】
１−２−３．エフェクター機能をなくすことによる抗−Ｂｓｔ２活性の向上
状況により、治療する疾患によっては、抗Ｂｓｔ２抗体のエフェクター機能が不必要である、または有害ですらある。例えば、Ｔ細胞へと標的化された抗−ＣＤ３（Ｘｕ、Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００（２０００）、ｐｐ．１６−２６；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５  （２０００）、ｐｐ．６２０５−６２１３；Ｂｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３（１９９３）、ｐｐ．４０３−４１１）および抗−ＣＤ４（Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９８（２００１）、ｐｐ．１６４−１７４）は、Ｔ細胞枯渇または活性化をもたらすＦｃγＲ−産生細胞に対するモノクローナル抗体の結合により、有害な副作用を示した。抗−ＣＤ３の場合、ＦｃγＲへの結合が減じるように設計された変異体は、問題を軽くした（Ｈｅｒｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４（２００５）、ｐｐ．１７６３−１７６９；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１１（２００５）、ｐｐ．４６５−４７１）。
【０２２０】
１−２−３−１．抗−Ｂｓｔ２のためのＩｇＧ４またはＩｇＧ２の使用
抗−Ｂｓｔ２のエフェクター機能が必要とされないとき、２つのサブクラスは、補体結合が不十分である、または補体結合を欠くので、ヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４を用いることができる（Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５、１１６（４）：７３１）。ＩｇＧ４による補体活性化の欠如が一貫して報告されているので、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の使用の間で選択する場合は、ＩｇＧ４がよりよい選択となると考えられる。しかしながら、特定のサブクラスの抗体が、エフェクター機能の効果において等価ではない可能性がある（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１（２００４）、ｐｐ．５２７−５３８）。
【０２２１】
１−２−３−２．抗Ｂｓｔ２抗体からのＡｓｎ２９７結合グリコシル化の除去
ＦｃのＡｓｎ２９７に付加された糖質の欠如により、ある場合においては、エフェクター機能が減ぜられることが報告された（Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（１９８５）、ｐｐ．４０７−４１５）。さらに、１型糖尿病におけるグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅ）抗−ＣＤ３の第二相臨床試験の最近のレポート（Ｋｅｙｍｅｕｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５２（２００５）、ｐｐ．  ２５９８−２６０８）が、裏付けを示した。
【０２２２】
１−２−３−３．ＦｃＲに対する結合を減少させるための抗−Ｂｓｔ２Ｆｃにおける残基の変異
Ｓｈｉｅｌｄｓらによって開示されているヒトＩｇＧ１上の結合部位の総合的な地図を用いると（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１、２００１およびその中の参考文献）、ＦｃγＲまたはＦｃＲＮに対する結合が減じている抗−Ｂｓｔ２変異体を設計することが可能となりうる。
【０２２３】
１−２−３−４．エフェクター機能を減じるための抗−Ｂｓｔ２のＦｃヒンジ変異体
エフェクター機能が抗Ｂｓｔ２抗体にとって有利ではない場合、抗−Ｂｓｔ２のヒンジ変異体が追及される。ＩｇＧサブクラス間のヒンジ領域の交換により、ヒンジがＦｃγＲおよびＣ１ｑ結合にとって重要であることが示された。ヒンジ（Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ）またはヒンジ外（Ａｓｐ２６５Ａｌａ）における特定変異により、ＦｃγＲに対する結合が減ずることが示された（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）、ｐｐ．６５９１−６６０４；Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９（１９９５）、ｐｐ．１１５−１１９；Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８６（１９９５）、ｐｐ．３１８−３２４；Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６（２０００）、ｐｐ．４４３−４４６）。減弱されたエフェクター機能を有するヒンジ変異抗−ＣＤ３モノクローナル抗体は、現在臨床試験中である（Ｈｅｒｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４（２００５）、ｐｐ．１７６３−１７６９；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１１（２００５）、ｐｐ．４６５−４７１）。
【０２２４】
１−３．二重特異性抗体の作製による抗−Ｂｓｔ２の改良
同じ細胞上に発現している炎症性疾患に対するＢｓｔ２および他の薬剤標的を標的化する二重特異性抗体が、ＡＤＣＣおよびＣＤＣをより効果的に導く。そのような二重特異性Ｂｓｔ２抗体が、一つの抗原を標的化する抗体よりもより効果がある。上皮細胞増殖因子レセプターおよびインスリン様成長因子レセプターを標的化する二重特異性抗体が、一つの抗原を標的化する抗体よりもより効果があることが報告された（Ｌｕ  Ｄ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：２８５６、２００４）。
【０２２５】
１−４．毒性物質を有する抗体複合体の作製による抗Ｂｓｔ２の改良
抗体の力を向上させる他の方法は、抗体を毒素または放射性リガンドに結合させることによる。抗体は、細胞上の標的に結合し、毒素を内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）、運搬し、細胞を殺す。これらの毒素は、カテプシンのような細胞内酵素によって切られるリンカーを用いることによって、抗体に付加される。薬剤およびリンカーの双方の選択が重大である。細胞外でリンカーが切られると、毒素が血流中に放出される。Ｂｓｔ２に結合後に内在化する抗Ｂｓｔ２抗体は、毒素の標的運搬に必要とされる。ある抗Ｂｓｔ２抗体は、Ｂｓｔ２に対して強く結合するかもしれないが、内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）に最適であるエピトープにおいてそうではないかもしれない。このため、最も効果的に内在化される抗Ｂｓｔ２抗体を選択するためには、スクリーニング技術の開発が必要である。内在化が向上した抗体のスクリーニング方法が開発されてきている（Ｍａｒｋｓ  ＪＤ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：２０１、２００４；Ｎｅｖｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８０（２００１）、ｐｐ．２７４−２７９；Ｈｅｉｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２４８（２００１）、ｐｐ．１７−３０）。
【０２２６】
１−５．ＦｃＲ多型による抗Ｂｓｔ２抗体の改良
ＦｃＲ多型は、自己免疫疾患、感染性疾患、循環器疾患、アテローム性動脈硬化症および移植生態学を含む多数の疾患において重要な役割を果たすようである（ｖａｎ  Ｓｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ６１（２００３）、ｐｐ．１８９−２０２；Ｋａｒａｓｓａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．５８（２００４）、ｐｐ．２８６−２９１；Ｋａｓｔｂｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ４４（２００５）、ｐｐ．１２９４−１２９８；ｖａｎ  Ｓｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（２００５）、ｐｐ．１５７−１６４；Ｂｒｏｕｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９０（２００４）、ｐｐ．１１９２−１１９８；Ｇｒｕｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ１０４（２００４）、ｐｐ．２７９１−２７９３；Ｇａｖａｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ１８０（２００５）、ｐｐ．２７７−２８２；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９２（２００４）、ｐｐ．  １２７３−１２７６；Ｐａｗｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．３６（２００４）、ｐｐ．１３１１−１３１３）。
【０２２７】
患者のＦｃγＲ多型が、ガンに対するリツキシマブ（抗−ＣＤ２０）（Ｃａｒｔｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ９９（２００２）、ｐｐ．７５４−７５８；Ｃａｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １０４（２００４）、ｐｐ．２６３５−２６４２；Ｔｒｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３（２００５）、ｐｐ．４７４−４８１；Ｇｈｉｅｌｍｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．１６（２００５）、ｐｐ．１６７５−１６８２）、全身性エリテマトーデスに対するリツキシマブ（Ａｎｏｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４８（２００３）、ｐｐ．４５５−４５９）、および慢性リンパ性白血病に対するアレムツズマブ（抗−ＣＤ５２）（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ  １０５（２００５）、ｐｐ．２８９−２９１）のような治療用モノクローナル抗体への反応に影響を与えることも報告されてきている。
【０２２８】
したがって、ＦｃγＲ多型が役割を果たしうる疾患において、ＦｃγＲに対する結合が高められた、または減じられた抗Ｂｓｔ２抗体の設計は、治療抗−Ｂｓｔ２モノクローナル抗体の新たな分類を付与しうる。
【０２２９】
肝細胞拡張
Ｂｓｔ２は、また造血細胞の成長および分化を促進するための細胞成長および増殖に役割を果たすとも考えられている。骨髄間質細胞抗原および接着タンパク質として、Ｂｓｔ２は、他の肝細胞の造血および分化において重要な細胞−細胞相互作用の主要な役割を果たしうる。
【０２３０】
インビボにおける多数の造血細胞成長および分化は、多様な成長因子を製造する間質細胞との直接的接触を必要とし、あるシステムにおいては、間質細胞および造血細胞間の直接的接触が、細胞成長および分化に必要とされる（Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈａｅｍａｔｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓ．３２：１７２、１９８９）。したがって、骨髄間質細胞および骨髄間質細胞抗原は、細胞生存およびアポトーシスの重要な調節因子である。
【０２３１】
骨髄は、肝細胞の種々の型を含む。全ての血液細胞の前駆体である造血肝細胞および間充織幹細胞がこれらの中に含まれる。間充織幹細胞は、多数の異なる細胞型；骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、腱細胞（ｔｅｎｄｏｃｙｔｅｓ）、神経系細胞および骨髄の間質細胞に分化形質転換する。Ｂｓｔ２は、間充織幹細胞の分化もまた制御しうる。
【０２３２】
増殖およびアポトーシスを制御する際の間質細胞の重要性は、さらに白血病細胞などのガン細胞の細胞生存およびアポトーシスの制御において実証される。例えば、白血病細胞を骨髄間質細胞とインキュベートすると、ＡＭＬ白血病は、化学療法誘発性アポトーシスから保護されることが示された（Ｇａｒｒｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２９：４４８、２００１；  Ｋｏｎｏｐｌｅｖａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １６：１７１３、２００２）。最近の研究により、化学療法誘発性アポトーシスから白血病細胞を保護する、白血病細胞への骨髄間質細胞の調節作用をＢｓｔ２が直接的に媒介することが示された（Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ  １０７：１５７０、２００６）。化学的感受性におけるそのようなＢｓｔ２の役割と一致して、タモキシフェン抵抗性乳癌細胞において、Ｂｓｔ２が上昇することが報告され（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ４：１５１、２００５）、異なるガンにおけるＢｓｔ２の潜在的な複数の機能が示されている。これらの研究の全てが、Ｂｓｔ２が複数の機能を媒介する多機能タンパク質であることを示す。
【０２３３】
Ｂｓｔ２アゴニスト、Ｂｓｔ２ペプチド模倣薬およびＢｓｔ２リガンドは、肝細胞の大量準備用に、インビトロでの肝細胞成長／増殖を刺激するために用いられうる。生体外で増幅した肝細胞は、移植用に用いられうる。例えば、インビトロで培養された間充織幹細胞は、放射線および／または化学療法後に損傷した骨髄微環境を立て直すことによって、造血肝細胞移植の強化用に用いられうる。
【０２３４】
Ｂｓｔ２アゴニスト、Ｂｓｔ２ペプチド模倣薬およびＢｓｔ２リガンドは、遺伝子治療用に間充織幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増幅に用いられうる。遺伝子導入および治療用の媒体として間充織幹細胞は有望であると考えられている。培養された間葉細胞は、移植後に骨髄に存在し、分化し、無傷タンパク質を生産する。
【０２３５】
Ｂｓｔ２の低分子量モジュレーター
本発明の他の態様は、種々の免疫／炎症性疾患の予防治療用のＢｓｔ２の低分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ：ｍ．ｗ．）モジュレーターを提供する。Ｂｓｔ２モジュレーターは、細胞内のＢｓｔ２の機能および活性に影響を与えることができ、Ｂｓｔ２−Ｂｓｔ２Ｌ相互作用およびシグナル伝達を制御またはこれらに影響を与えることができる。さらに、Ｂｓｔ２モジュレーターが、細胞内のＢｓｔ２によって制御される、または細胞内のＢｓｔ２と相互作用する下流の標的および分子に作用しうる。
【０２３６】
低分子量化合物にとって主要な因子は、高親和性の阻害剤または活性剤を製造するために、低分子量分子がＢｓｔ２／Ｂｓｔ２Ｌ相互作用を十分に妨害する、または増強することができるほどに、Ｂｓｔ２およびＢｓｔ２Ｌ間の界面相互作用が十分に小さいかどうかである。レセプターおよびリガンドのタンパク質−タンパク質相互作用は、通常大きな界面相互作用を必要とする。しかしながら、これらの多数の残基のうち、非常に小さな領域中のごくわずかな残基が結合活性に寄与しうる。変異研究により、多くの場合、タンパク質−タンパク質相互作用は、フットプリント（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）が低分子量分子によってカバーされるよりも顕著には大きくない“ホットスポット”と呼ばれる、接触残基の小さなセットによって駆動されることが示されている（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  Ｔ、Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９５；２６７：３８３−３８６；  ＤｅＬａｎｏ  ＷＬ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．２００２；１２：１４−２０．Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９６；９３：１−６）。
【０２３７】
小さなエピトープを通じて、Ｂｓｔ２がＢｓｔ２Ｌに結合する場合、低分子量リガンドを見出す可能性は良好でありうる。
【０２３８】
Ｂｓｔ２のアンタゴニストおよびアゴニストモジュレーター
Ｂｓｔ２モジュレーターとしては、アンタゴニスト、アゴニスト、ペプチド模倣薬、阻害剤、リガンド、および結合因子が挙げられる。アンタゴニストとしては、細胞のＢｓｔ２−Ｂｓｔ２Ｌ相互作用および／またはＢｓｔ２下流シグナル伝達経路におけるＢｓｔ２タンパク質の機能および／または活性を中和する、抑制する（ｉｎｈｉｂｉｔ）、低減する（ｒｅｄｕｃｅ）、阻害する（ｂｌｏｃｋ）、抑制する（ｓｕｐｐｒｅｓｓ）、減少する（ｄｉｍｉｎｉｓｈ）、減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）、または除去する（ｅｌｉｍｉｎａｔｅ）化合物、材料、あるいは薬剤が挙げられる。Ｂｓｔ２のアゴニストモジュレーターとしては、細胞のＢｓｔ２−Ｂｓｔ２Ｌ相互作用および／またはＢｓｔ２下流シグナル伝達経路におけるＢｓｔ２タンパク質の機能および／または活性を作用する（ａｇｏｎｉｚｅ）、増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）、刺激する、増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｅ）、増加させる（ａｕｇｍｅｎｔ）、または増幅する化合物あるいは薬剤が挙げられる。
【０２３９】
Ｂｓｔ２モジュレーターの利用
抗Ｂｓｔ２抗体およびＢｓｔ２デコイ（Ｆｃ）は、免疫／炎症性疾患において治療的役割を有しうるが、Ｂｓｔ２リガンドに結合するＢｓｔ２を阻害するために顕著な親和性を有する低分子量阻害剤もまた種々の免疫／炎症性疾患の治療用に治療的には価値がある。
【０２４０】
免疫／炎症性疾患に加えて、Ｂｓｔ２のアンタゴニストモジュレーターは、またあるタイプのガン治療に重要である。Ｇｅ  Ｙらによる最近の研究で例示されているように、Ｂｓｔ２は、白血病細胞生存につながる、骨髄間質細胞および白血病細胞のようなガン細胞の間の相互作用に関与しうる（Ｂｌｏｏｄ  １０７：１５７０、２００６）。前立腺ガンまたは乳ガンのようなある種のガンにおける腫瘍進行および侵入に対するガン細胞との間質細胞相互作用にも、Ｂｓｔ２は重要な役割も果たす。
【０２４１】
Ｂｓｔ２アゴニスト、Ｂｓｔ２ペプチド模倣薬およびＢｓｔ２リガンドは、ＨＩＶ患者または免疫低下患者を含む免疫不全の患者の治療に対して治療的に重要でありうる。Ｄ型アミノ酸で合成されるＢｓｔ２ペプチド模倣薬は、インビボで安定である。これらの安定なペプチドは、Ｌ型模倣薬と比較してより大きな治療的可能性を有しうる。
【０２４２】
Ｂｓｔ２アゴニスト、Ｂｓｔ２ペプチド模倣薬およびＢｓｔ２リガンドは、貧血症または骨そしょう症を含む骨疾患の治療においても役割を果たしうる。造血システムは、造血肝細胞（ＨＳＣ）の維持および分化を可能にする支持的間質環境からの助けを必要とする。しかしながら、これらの間質細胞クローンのごく限定された数だけが、サイトカインの補給なしに造血を補助する。Ｂｓｔ２アゴニスト、Ｂｓｔ２ペプチド模倣薬およびＢｓｔ２リガンドは、造血の促進に有用でありうる。
【０２４３】
Ｂｓｔ２アゴニスト、Ｂｓｔ２ペプチド模倣薬およびＢｓｔ２リガンドは、放射線および／または化学療法後に損傷した骨髄細胞の治療にも用いられうる。骨髄微環境の回復によって、これらのＢｓｔ２モジュレーターは、化学療法または放射線治療を受けているガン患者の治療に有用でありうる。
【０２４４】
１．Ｂｓｔ２モジュレーターに対するハイスループット・スクリーニング（ＨＴＳ）法
モジュレーターのスクリーニングに対して、Ｂｓｔ２および／またはＢｓｔ２Ｌの既知の特性に基づいて、以下のいくつかのハイスループット・スクリーニング（ＨＴＳ）法が設計されている。ＨＴＳ法によって同定されたヒット化合物は、さらに下記に示されるようないくつかの第二アッセイによって評価される。
【０２４５】
１−１．蛍光熱（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｔｈｅｒｍａｌ）シフトアッセイを用いた、Ｂｓｔ２への直接的結合の検出によるＢｓｔ２阻害剤のハイスループット・スクリーニング
Ｂｓｔ２に結合する大部分の小分子は、例えばＢｓｔ２Ｌ結合部位またはＢｓｔ２−Ｂｓｔ２二量体形成に重要な二量化部位などのＢｓｔ２上の機能的領域または部位に対する選択的または高親和性結合に起因して、ある方法でＢｓｔ２活性を調節する。Ｂｓｔ２またはＢｓｔ２ペプチドに結合することができる小分子の同定のための、スクリーニングおよび小分子検出アッセイは、熱（ｔｈｅｒｍａｌ）シフトアッセイを用いて設計されうる。熱シフトアッセイ用に、必要とされるのは、精製Ｂｓｔ２タンパク質および化学ライブラリーである。蛍光に基づく（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ）熱シフトアッセイは、インビボでのＢｓｔ２リガンドが未知である場合に、とりわけ有用であろう。
【０２４６】
分子がＢｓｔ２の機能または活性に作用する、または調節するかどうかを決定するため、この技術によって決定される薬剤または結合分子は、さらに第二のスクリーニングアッセイの欄で本明細書で述べられているような方法により、分析されうる。
【０２４７】
１−１−１．熱シフトアッセイ
Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏらの米国特許第６，０２０，１４１号および６，０３６，９２０号；  Ｊ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ、２０００、Ｇｅｎ．Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ、２０（８）；Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｉｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ６：４２９、２００１；Ｌｏ  ＭＣ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３３２：１５３、２００４において述べられているように、蛍光に基づく熱シフトアッセイ（３−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、３ＤＰ、Ｅｘｔｏｎ、Ｐａ．）は、化合物ライブラリーから標的タンパク質の阻害剤を同定するための一般的な手法である。Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏらは、ハイスループット薬剤スクリーニングのための蛍光に基づく熱シフトアッセイ装置について記述している。
【０２４８】
このアッセイにおいて、タンパク質熱変性を観察するため、環境感受性蛍光色素（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｌｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｙｅ）を用いて、化合物非存在下で得られるものと比較して、化合物存在下で得られる変性温度（ΔＴｍ）のシフトから、リガンド−結合親和性は評価される。
【０２４９】
タンパク質変性を観察するため、Ｓｙｐｒｏ  ｏｒａｎｇｅ（サイプロオレンジ）のような蛍光色素が用いられる。Ｓｙｐｒｏ  ｏｒａｎｇｅは、環境感受性色素である。変性工程によりタンパク質の疎水性領域が露出し、その結果、タンパク質−変性遷移を観察するために用いられる蛍光が大きく増加する。
【０２５０】
化合物ライブラリーのハイスループット・スクリーニング用のマイクロプレート型の中で小型化された蛍光に基づく熱シフトアッセイを遂行するために、完全に自動化された器機が、Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏらによって設計および作製された（Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ  ６：４２９、２００１）。
【０２５１】
熱シフトアッセイは、Ｌｏらによって記載されているように（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３３２：１５３、２００４）、元々はＰＳＲ用に設計されたｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）中で行ってもよい。システムは、急速な温度コントロールのための加熱／冷却装置およびマイクロプレートのウェル中の蛍光変化の同時画像用の電荷結合素子（ＣＣＤ）検出器を含む。反応物は、Ｂｓｔ２（約１ｕＭ）、Ｓｙｐｒｏ  ｏｒａｎｇｅ、化合物（０、１０、５０、１００ｕＭ）、および緩衝材を含む。プレートは、０．５℃／分の加熱速度で２５から８９℃に加熱される。蛍光強度は、Ｅｘ／Ｅｍ：４９０／５３０ｎｍで測定される。蛍光画像データは、Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏらによって述べられている方程式によって分析される（Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ  ６：４２９、２００１）。蛍光強度を方程式に当てはめることによって、各々のウェルに対する遷移の温度中心点、Ｔｍ、が得られる。
【０２５２】
１−２．デュアルルシフェラーゼアッセイシステムを用いた、Ｂｓｔ２−ＮＦｋＢ経路を検出することによるＢｓｔ２モジュレーターのハイスループット・スクリーニング
Ｂｓｔ２過剰発現は、哺乳類細胞においてＮＦｋＢ活性化をもたらす（Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：３３０７、２００３）。炎症性経路におけるＢｓｔ２の詳細なシグナル伝達機構は依然知られていないが、Ｍａｔｓｕｄａらによる先の報告では、Ｂｓｔ２過剰発現および活性化が、ＮＦｋＢ応答要素を通じたＮＦｋＢを介する転写の活性化につながることが示されている。
【０２５３】
Ｂｓｔ２のこの特性を用いて、ハイスループットデュアルルシフェラーゼアッセイ（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン州、Ｐａｇｕｉｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  Ｎｏｔｅｓ  １６：２２、２００６）が、Ｂｓｔ２阻害または活性化をルシフェラーゼレポーター遺伝子転写の制御と連結することによって、Ｂｓｔ２モジュレーターのスクリーニングのために設計されている。
【０２５４】
１−２−１．ＨＴＳデュアルルシフェラーゼアッセイおよび安定な細胞ラインに対するＤＮＡコンストラクト
このアッセイにおいて、第一のプラスミドが、例えば、ホタルルシフェラーゼの上流のタンデムＮＦｋＢ応答要素に連結されているホタルルシフェラーゼおよびハイグロマイシン（プロメガ）のような選択マーカーを発現するために構築されている。第二のプラスミドは、Ｂｓｔ２および内部コントロールとしてのレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼのような他のルシフェラーゼ−（ネオマイシンのような）選択マーカー融合体（プロメガ）を発現する。デュアルレポータールシフェラーゼBst2アッセイ法は、レニラルシフェラーゼを用いて、自動制御を有する。各々のサンプルで、ホタルルシフェラーゼ活性は、レニラルシフェラーゼ活性を用いて、標準化される。
【０２５５】
哺乳類細胞およびレポーターコンストラクトがトランスフェクトされた細胞および二重トランスフェクトされた安定細胞ラインが、次いでハイスループット・スクリーニングアッセイ用に得られる。空ベクターを発現しているコントロール安定細胞ラインも得られる。Ｂｓｔ２発現安定細胞は、Ｍａｔｓｕｄａらによる研究において報告されているように、レニラルシフェラーゼ−ネオマイシン融合体の空ベクターを含むコントロール安定細胞よりも高いルシフェラーゼ活性を示すであろう（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：３３０７、２００３）。
【０２５６】
１−２−２．ＨＴＳデュアルレポータールシフェラーゼＢｓｔ２活性
スクリーニングアッセイは、各々の化合物（通常１０ｕＭまたはより高い濃度）を用いて、３８４ウェル型の中で行われる。１０，０００細胞／ウェルが蒔かれる。ウェルの半分が化合物で刺激され、半分は擬似刺激される。細胞は、数時間後に採取される。ルシフェラーゼ活性は、Ｄｕａｌ  Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ）を用いて決定され、ルミノメーター（ｌｕｍｉｎｏｍｉｔｏｒ）定量化される。ＮＦｋＢ−ホタルルシフェラーゼ／Ｂｓｔ２選択（ｓｃｒｅｅｎ）のサンプルプレートからの結果が得られる。ヒットは、非誘導コントロールの平均より３から４倍の阻害または活性化を超えるレポーター発現として決定されうる。コントロール安定細胞から得られるコントロールルシフェラーゼ価は、最も高いレベルの阻害を示すであろう。全てのアッセイは、クアドロプリケートで行われる。誘導または阻害は、ホタル（ＮＦｋＢ）−刺激されたＬＵの平均／擬似刺激されたＲＬＵの平均として算出される。
【０２５７】
１−２−３．ヒットを確認するための滴定実験
二重にトランスフェクトされた安定ＮＦｋＢ応答要素／Ｂｓｔ２細胞ラインが、９６ウェルプレート中に１０，０００細胞／ウェルで蒔かれる。各々の化合物は、連続的に１：２に希釈され、クアドロプリケート中のウェルに添加される。アンタゴニストまたはアゴニストで数時間細胞をインキュベートし、採取し、Ｄｕａｌ  Ｇｌｏアッセイシステム（プロメガ）を用いて分析される。ルシフェラーゼ活性は、ＧｌｏＭａｘ９６マイクロプレートルミノメーター（プロメガ）で測定される。
【０２５８】
１−３．デュアルルシフェラーゼアッセイを用いてＢｓｔ２プロモーター／ｌｕｃの発現を観察することによるＢｓｔ２発現モジュレーターのハイスループット・スクリーニング
低分子量治療剤を同定するためのレポーターコンストラクトを含むプロモーターを用いた前例は多数ある。例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７のプロモーターは、プロモーターに結合することができ、レポーター遺伝子の発現を増加させる小分子を探索するためのβガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼのどちらかのレポーター分子と融合される。
【０２５９】
マイクロアレイを用いた実験から、ＢＳＴ２（インターフェロンγ、ＴＮＦα、ヒスタミン、など）を誘導することができる治療的に重要な分子は数多く存在することは明らかである。さらに、文献調査から、いくつかの他の分子もまた同様である可能性があることは明らかである。さらに、（Ｂｌｏｏｄ  １０７：１５７０、２００６；Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：３３０７、２００３；Ｇｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ８４：１９２２、１９９４）Ｂｓｔ２遺伝子のプロモーター領域が分析されてきている。多くの重要な部位が、ＡＭＬ、ＧＡＴＡ１、ＳＴＡＴおよびＡＰ１に見出された。これらの研究の全てが、細胞内のＢｓｔ２機能または活性の重要な制御機構であることを示す。
【０２６０】
ＨＴＳ分析は、Ｂｓｔ２遺伝子中の制御配列に結合する化合物を同定するために設計されることができる。Ｂｓｔ２プロモーター領域（約１ｋｂまたはそれ以上）は、ルシフェラーゼ遺伝子の上流に融合される。このアッセイ後に選択される化合物は、Ｂｓｔ２遺伝子発現のレベルを調節しうる。第二のスクリーニングアッセイにおいて、化合物は、Ｂｓｔ２の細胞−細胞接着および炎症性機能に関して、阻害または刺激活性のために選択される。
【０２６１】
１−３−１．ＤＮＡコンストラクトおよび安定細胞ライン
Ｇｅらによって報告されているように（Ｂｌｏｏｄ  １０７：１５７０、２００６）、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩに対する制限酵素部位を含むフォワード（５’−ｔｔｃａｃｇｃｔａｇｃｃｃｃｃｔｔｔｇｃａｇａｔｇａａｇａａａｃａｇｇｃｔｃａｇａ−３’（配列番号：７５））およびリバース（５’−ｔｔｃａｃｃｔｃｇａｇｇｃａｇｇａｇａｔｇｇｇｔｇａｃａｔｔｇｃｇａｃａｃｔｃ−３’（配列番号：７６））プライマーを用いて、転写開始部位の上流７５９ｂｐおよびエクソン１の２１１ｂｐにわたるＢｓｔ２プロモーター領域がＰＣＲで増幅される。Ｂｓｔ２プロモーターのより長い断片を含むＤＮＡベクターを構築するために、１ｋｂまたはそれ以上のＢｓｔ２プロモーター領域がＰＣＲ増幅される。増幅された生産物は、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化され、ホタルルシフェラーゼを発現するレポーター遺伝子ベクターの対応する部位につなげられる。このコンストラクトは、ルシフェラーゼアッセイを用いて、ハイスループット・スクリーニング用に用いられる。
【０２６２】
１−３−２．Ｂｓｔ２プロモーター／ルシフェラーゼ融合コンストラクトを用いたＨＴＳデュアルレポータールシフェラーゼアッセイ
ＨＴＳ様式では、哺乳類細胞が３８４ウェルプレートのウェルに添加され、Ｆｕｇｅｎｅ６試薬（ロシュ）を用いて、Ｂｓｔ２レポーター遺伝子コンストラクトおよび内部コントロールレニラルシフェラーゼレポーター遺伝子がコトランスフェクトされる。ルシフェラーゼ活性は、デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ）を用いて分析され、標準化される。
【０２６３】
１−４．蛍光偏光技術を用いたＢｓｔ２−Ｂｓｔ２相互作用を検出することによる、Ｂｓｔ２モジュレーターのハイスループット・スクリーニング
Ｂｓｔ２は、ホモダイマーとして細胞表面上に存在すると考えられている（Ｏｈｔｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  １９９９、２５８（３）：５８３−９１）。Ｂｓｔ２は、活性化のためには、二量体化を必要とするとも考えられている。これと一致して、Ｂｓｔ２デコイタンパク質（Ｂｓｔ２の細胞外ドメイン）は二量体として発現し、分泌された（図３、パネルＢ参照）。
【０２６４】
さらに、Ｂｓｔ２の細胞外ドメインは、Ｂｓｔ２二量体化において役割を果たす予測コイルドコイル領域を含む。全てのこれらの結果は、Ｂｓｔ２がＢｓｔ２と相互作用することを示す。
【０２６５】
Ｂｓｔ２のホモ二量体化のこの特性を用いて、相互作用を阻害することができるＢｓｔ２モジュレーターのためのハイスループット競合Ｂｓｔ２結合アッセイが下記に示されるように考案されている。
【０２６６】
このスクリーニング方法は、タンパク質−タンパク質相互作用の研究にとって最も敏感なハイスループット方法の一つである、蛍光偏光の技術（Ｒｏｅｈｒｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１６０５６、２００４）、およびＨｙｐｅｒＣｙｔフローサイトメトリープラットホームを利用する。この方法において、蛍光標識されたＢｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２コイルドコイル（Ｂｓｔ２ＣＣ）またはこれらのタンパク質の断片が、偏光によって励起される。小分子の存在下で、蛍光標識されたＢｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２ＣＣまたはこれらのタンパク質の断片からのＢｓｔ２の分離は、ＨＴＳ様式での結合競合アッセイによって検出されうる。
【０２６７】
１−４−１．ＨｙｐｅｒＣｙｔ
ＨｙｐｅｒＣｙｔは、従来用いられてきた自動化ハイスループットフローサイトメトリー（ＨＴＦＣ）分析プラットフォームであり、これにより、細胞サンプルがマイクロプレートから急速に吸引され、フローサイトメーターに運搬される（Ｅｄｗａｒｄｓ  ＢＳ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ６８：１３０１、２００５；Ｙｏｕｎｇ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  １０：  ３７４−３８２；Ａｒｎｏｌｄ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＳＴＫＥ  （２００６）２００６：ｐ１３）。このスクリーニングアプローチにより、従来の蛍光プレートリーダーでは適さない非洗浄同種型において行われるために、ハイスループットタンパク質−タンパク質相互作用アッセイを行うことができる。ＨＴＦＣスクリーニング用のＨｙｐｅｒＣｙｔプラットフォームは、リード化合物ライブラリーをスクリーニングするために用いられる、強固で、敏感で、そして高い定量的手法であることが示されてきている（Ｒａｍｉｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．、（２００３）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ５３Ａ：５５−６５；Ｋｕｃｋｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、（２００１）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ４４：８３−９０）。
【０２６８】
１−４−２．フルオレセイン標識されたＢｓｔ２試薬、組み換えＢｓｔ２タンパク質および安定な細胞ライン
フルオレセイン標識されたＢｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２ＣＣまたはこれらのタンパク質の断片が準備される。Ｂｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイまたはＢｓｔ２デコイＦｃ組み換えタンパク質が発現され、精製される。Ｂｓｔ２を発現している安定な細胞ラインが作製される。Ｂｓｔ２に対して結合した後に内在化しないＢｓｔ２変異体を同定することができる場合、野生型Ｂｓｔ２の代わりに、Ｂｓｔ２モジュレーターのスクリーニングのための安定な細胞ラインを作製するためにこの変異体を用いることができる。
【０２６９】
１−４−３．Ｂｓｔ２−Ｂｓｔ２相互作用の検出によるＨＴＳ蛍光偏光アッセイ
蛍光偏光アッセイは、細胞膜Ｂｓｔ２もしくは精製Ｂｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイまたはＢｓｔ２デコイＦｃへの結合に対して、蛍光のＢｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２ＣＣまたはこれらのタンパク質の断片と競合するテスト化合物の能力を測定する。
【０２７０】
ハイスループットアッセイ用に、化学ライブラリーが３８４ウェル型中でスクリーニングされる。コントロールウェルは、標識されていないＢｓｔ２タンパク質またはバッファーのみを含む。標識されていないＢｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２ＣＣまたはこれらのタンパク質の断片が、蛍光標識されたＢｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２ＣＣまたはこれらのタンパク質の断片の結合を完全に阻害する濃度の１００倍より高い濃度で添加される。バッファーだけを含む他のコントロールもまた準備される。これらのポジティブおよびネガティブコントロールの蛍光偏光度を０％および１００％のＢｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２ＣＣまたはこれらのタンパク質の断片の回収阻害とする。
【０２７１】
ウェルへの添加は連続して以下のようである：１）テスト化合物およびコントロール試薬（通常１０ｕＭおよびそれ以上）；２）Ｂｓｔ２安定細胞（１０７細胞／ｍｌ）；３）（４℃でインキュベーション後）フルオレセイン標識されたＢｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２ＣＣまたはこれらのタンパク質の断片。追加の４℃でのインキュベーション後、プレートは、ＨｙｐｅｒＣｙｔプラットフォームを用いたフローサイトメトリーによって分析される。
【０２７２】
他のフォーマットでは、ハイスループット分析は精製Ｂｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイまたはＢｓｔ２デコイＦｃを用いて行うことができる。ＨＴＳのセットアップの前に、Ｂｓｔ２の結合定数およびスクリーニング濃度が決定される。Ｋｄ値は、蛍光標識されたＢｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２ＣＣまたはこれらのタンパク質の断片に対する、Ｂｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイまたはＢｓｔ２デコイＦｃタンパク質の連続希釈の結合後に決定される。結合は、プレートリーダーを用いた蛍光偏光（励起４８５ｎｍ、発光５３０ｎｍ）を使って測定する。ＳｉｇｍａＰｌｏｔのようなプログラムを用いてデータを分析し、Ｋｄ値が決定される。Ｋｄ値の決定後、テスト化合物をウェルに添加する。Ｂｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイまたはＢｓｔ２デコイＦｃタンパク質が添加され、蛍光標識されたＢｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２ＣＣまたはこれらのタンパク質の断片が添加される。標識されていないＢｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２ＣＣもしくはこれらのタンパク質の断片の過剰量、またはバッファーのみを用いるポジティブおよびネガティブコントロールが準備される。蛍光偏光および蛍光強度がプレートリーダーを用いて測定される。
【０２７３】
Ｅｄｗａｒｄｓ  ＢＳらの研究において述べられているように（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ６８：１３０１、２００５）、蛍光ペプチド結合のテスト化合物阻害が算出される：１００×［１−（ＭＦＩテスト−ＭＦＩ阻害）／（ＭＦＩ非阻害−ＭＦＩ阻害）］、ここで、ＭＦＩは、テスト化合物を含むウェル、阻害コントロールウェルおよび非阻害コントロールウェル中の細胞の平均蛍光強度である。
【０２７４】
最初のスクリーニングの後、競合結合アッセイを用いた用量反応分析によって、化合物のＩＣ５０値が決定される。
【０２７５】
１−５．蛍光偏光技術を用いたＢｓｔ２−Ｂｓｔ２Ｌ相互作用の検出によるＢｓｔ２モジュレーターのハイスループット・スクリーニング
１−５−１．Ｂｓｔ２Ｌ発現細胞
下記に述べるＨＴＳアッセイは、Ｂｓｔ２Ｌ発現細胞または精製Ｂｓｔ２ＬまたはＢｓｔ２Ｌ断片を必要とする。Ｂｓｔ２Ｌ発現細胞の１つは、我々の実験で示されているように（図．６、７および２４）、Ｕ９３７細胞である。Ｂｓｔ２デコイが、インターフェロンγ−処理したＨＵＶＥＣへのＵ９３７の接着を阻害するという観察は、Ｂｓｔ２Ｌが未刺激のＵ９３７細胞の細胞表面に存在することを示す（図７）。Ｂｓｔ２デコイが、活性化Ｔ細胞（図１２）または活性化Ｕ９３７細胞（図６）の同型凝集を阻害するという他の観察は、Ｂｓｔ２Ｌが活性化の前後双方でＴ細胞および／またはＵ９３７細胞の表面上に発現しうることを示唆する。これらの結果を支持するように、精製Ｂｓｔ２デコイタンパク質へのＵ９３７細胞の直接結合が示されている（図２４）。
【０２７６】
Ｂｓｔ２Ｌタンパク質およびヌクレオチド配列が同定されているとき、精製Ｂｓｔ２Ｌもしくはこれらの断片、またはＢｓｔ２Ｌが安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞もしくはＣＯＳ細胞をＵ９３７細胞の代わりに用いることができる。
【０２７７】
１−５−２．Ｂｓｔ２−Ｂｓｔ２Ｌ相互作用の検出によるＨＴＳ蛍光偏光アッセイ
精製Ｂｓｔ２デコイ（またはＢｓｔ２）およびＢｓｔ２Ｌ発現Ｕ９３７細胞（またはどんなＢｓｔ２Ｌ発現細胞）の相互作用を用いて、Ｂｓｔ２モジュレーターをスクリーニングするためのハイスループット結合競合アッセイが下記に示されるように設計される。
【０２７８】
このＨＴＳアッセイは、Ｕ９３７細胞のようなＢｓｔ２Ｌ−発現細胞上の膜Ｂｓｔ２Ｌからの、蛍光標識されたＢｓｔ２またはＢｓｔ２デコイの移動に基づく。蛍光偏光アッセイは、膜Ｂｓｔ２Ｌまたは精製Ｂｓｔ２Ｌ（または断片）への結合に対する、テスト化合物の蛍光Ｂｓｔ２またはＢｓｔ２デコイと競合できる能力を測定する。
【０２７９】
ハイスループットアッセイ用に、ウェルへの添加は、連続して次のようである：
テスト化合物はウェルに最初に添加され、次いでＵ９３７細胞が添加される。インキュベーション後、蛍光標識されたＢｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイまたはこれらの断片が添加される。追加の４℃でのインキュベーション後、プレートは、ＨｙｐｅｒＣｙｔプラットフォームを用いたフローサイトメトリーによって分析される。
【０２８０】
他のフォーマットでは、ＨＴＳアッセイは、精製Ｂｓｔ２Ｌまたはこれらの断片、および蛍光標識されたＢｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイまたはこれらの断片を用いて行うことができる。テスト化合物がウェルに添加され、Ｂｓｔ２ＬまたはＢｓｔ２Ｌ断片が添加され、そして蛍光標識されたＢｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイまたはこれらの断片が次いで添加される。ポジティブおよびネガティブコントロールが、Ｂｓｔ２−Ｂｓｔ２Ｌ相互作用の検出のためのＨＴＳ蛍光偏光アッセイ中で上述したように準備される。蛍光偏光および蛍光強度が、プレートリーダーを用いて測定される。
【０２８１】
他のフォーマットでは、このハイスループットアッセイは、精製Ｂｓｔ２またはＢｓｔ２デコイおよび蛍光標識されたＢｓｔ２Ｌペプチドを用いて行うことができる。テスト化合物がウェルに添加され、Ｂｓｔ２またはＢｓｔ２デコイタンパク質が添加され、そして蛍光標識されたＢｓｔ２Ｌペプチドが添加される。ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールが準備される。蛍光偏光および蛍光強度が、プレートリーダーを用いて測定される。
【０２８２】
１−６．蛍光偏光技術を用いたＢｓｔ２−Ｂｓｔ２ペプチド模倣薬間の相互作用の検出による、Ｂｓｔ２モジュレーターのハイスループット・スクリーニング
１−６−１．Ｂｓｔ２ペプチド模倣薬
Ｂｓｔ２に高い親和性で結合する小ペプチドは、Ｂｓｔ２のペプチド模倣薬として働くことができる。そのようなペプチドは、下記に示すようなファージディスプレイ法による同定されうる。Ｂｓｔ２モジュレーターのためのハイスループット結合競合アッセイは、蛍光偏光技術を用いたＢｓｔ２およびＢｓｔ２ペプチド模倣薬間の相互作用の検出により考案されている。
【０２８３】
１−６−２．ファージディスプレイ法による、Ｂｓｔ２に高い親和性で結合するＢｓｔ２ペプチド模倣薬の単離
Ｂｓｔ２の細胞外ドメインに高い親和性で結合するＢｓｔ２ペプチド模倣薬は、ファージディスプレイ法によってスクリーニングされうる。ペプチドの膨大なライブラリーが、ファージディスプレイベクター中のコンビナトリアル合成のオリゴヌクレオチドのクローニング複合混合物を通して作製されうる。発現したペプチドがファージコートタンパク質への融合として提示されるところの線状ファージディスプレイシステムが、ペプチドリガンドの発見に効果的である（Ｄｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：４０４、１９９０；Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２０：８２１、１９９１；Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６、１９９０）。
【０２８４】
ファージプールは、Ｂｓｔ２デコイタンパク質で被覆されたビーズまたはコントロールビーズでインキュベートされ、陽性プールは磁気分離法により選択される。結合活性を有するペプチドを回収するために、Ｂｓｔ２デコイビーズ上のファージ粒子の集団のアフィニティ精製が用いられる。各々捕捉されたファージのＤＮＡの適切な部位をシークエンスすることによって、Ｂｓｔ２デコイに結合するペプチドの一次配列が定まる。Ｂｓｔ２ペプチド模倣薬は、炎症反応を刺激する活性を有するＢｓｔ２ペプチド模倣薬を選択するために、さらに機能的アッセイでスクリーニングされる。
【０２８５】
１−６−３．Ｂｓｔ２に結合するＢｓｔ２ペプチド模倣薬の能力の確認
選択されたペプチドが、Ｂｓｔ２に結合する能力を有するかどうかは、固定化Ｂｓｔ２デコイまたはＢｓｔ２デコイＦｃタンパク質に対する、Ｕ９３７細胞のような標識化されたＢｓｔ２Ｌ発現細胞の結合アッセイにおいて確認される。Ｂｓｔ２ペプチド模倣薬の異なる濃度が、結合競合を測定するために、この結合アッセイに添加される。
【０２８６】
他のフォーマットにおいて、結合アッセイは、固定化された、Ｕ９３７細胞のようなＢｓｔ２Ｌ発現細胞、およびプローブとしてのＢｓｔ２デコイＦｃまたはビオチニル化されたＢｓｔ２デコイを用いて準備されうる。
【０２８７】
他のフォーマットにおいて、Ｂｓｔ２Ｌタンパク質が同定される場合、固定化されたＢｓｔ２デコイまたはＢｓｔ２デコイＦｃに対する、１２５Ｉ−標識されたＢｓｔ２Ｌの結合アッセイが行われうる。 
【０２８８】
１−６−４．生物学的アッセイにおけるＢｓｔ２ペプチド模倣薬活性の確認
Ｂｓｔ２ペプチド模倣薬の生物学的機能は、多くの異なるアッセイにおいて評価されうる。そのようなアッセイの１つは、以下のようである：ＨＵＶＥＣにＢｓｔ２に対する発現ベクターまたは空ベクターをトランスフェクションする。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＢｓｔ２ペプチド模倣薬またはコントロールペプチドで処理する。炎症性メディエーターおよび接着分子の遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲによって分析し、これらの遺伝子のタンパク質発現を免疫ブロット法によって測定する。Ｂｓｔ２ペプチド模倣薬は、Ｂｓｔ２−発現ＨＵＶＥＣにおいて炎症反応を刺激する。
【０２８９】
１−６−５．Ｂｓｔ２ペプチド模倣薬を用いた蛍光偏光技術でのＢｓｔ２モジュレーターのハイスループット・スクリーニング
ＨＴＳ分析は上述で述べたものと同様の方法で行われる。簡単に述べると、Ｂｓｔ２ペプチド模倣薬は、蛍光標識される。哺乳類細胞にＢｓｔ２に対する発現ベクターが安定的に導入される。Ｂｓｔ２に結合した後に内在化しないＢｓｔ２変異体が既知である場合、このＢｓｔ２変異体は、Ｂｓｔ２モジュレーターをスクリーニングするために哺乳類細胞にトランスフェクションされる。
【０２９０】
ＨＴＳアッセイ用に、テスト化合物は、ウェルに添加される。Ｂｓｔ２発現安定細胞が添加され、次いで蛍光標識されたＢｓｔ２ペプチド模倣薬が添加される。蛍光偏光および蛍光強度が、上記のプレートリーダーで測定される。
【０２９１】
他のフォーマットにおいて、精製Ｂｓｔ２またはＢｓｔ２デコイは、Ｂｓｔ２発現安定細胞の代わりに用いられうる。ヒットが正しいかを確認するために、化合物の用量依存反応を測定する。
【０２９２】
２．ハイスループット・スクリーニング後にヒットを確認するための第二アッセイ
最初のヒットは、薬剤発見過程におけるプロファイリング分析のシリーズを用いて確認される必要がある。第二のアッセイによるヒットの確認は、低分子量化合物による阻害または活性化が生物学的関連性を有するかどうかを決定するためである。本明細書で述べられた第二のアッセイは、ヒット化合物を実証するために用いられうる可能性がある代替的なアッセイのほんの２、３の例である。
【０２９３】
２−１．Ｂｓｔ２−Ｂｓｔ２Ｌ結合アッセイによるヒットの確認
低分子量化合物の活性は、ＥＬＩＳＡフォーマットにおける化合物濃度の機能として、Ｂｓｔ２−Ｂｓｔ２Ｌ相互作用によって測定される。ビオチニル化されたＢｓｔ２デコイ（またはＢｓｔ２デコイＦｃ）は、ストレプトアビジンがコートされた（または抗−Ｆｃ抗体がコートされた）９６−ウェルプレートのウェル中に固定化される。選択されたリード化合物の連続希釈物を、Ｂｓｔ２Ｌおよび（可能な場合には）コントロールとしてＢｓｔ２デコイに結合しないＢｓｔ２Ｌ変異体の溶液に添加し、固定化されたＢｓｔ２デコイとともにインキュベートする。結合しないＢｓｔ２Ｌはプレートから洗浄する。結合したＢｓｔ２Ｌは、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗−Ｂｓｔ２Ｌ抗体で測定され、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ用の比色反応を行われる。
【０２９４】
２−２．Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴技術を用いたＢｓｔ２−Ｂｓｔ２Ｌ結合アッセイによるヒットの確認  
Ｂｓｔ２−Ｂｓｔ２Ｌ結合は、溶液競合型におけるＢｉａｃｏｒｅの表面プラズモン共鳴技術を用いて分析されうる。各々の化合物の濃度シリーズは、組み換えＢｓｔ２Ｌとともにインキュベートされ、次いで捕捉された組み換えＢｓｔ２デコイとともにチップ表面上へと注入される。結合が平衡状態で測定され、最大結合のパーセンテージとして算出される。
【０２９５】
２−３．グルタチオンＳ−トランスフェラーゼプルダウンアッセイによるヒットの確認
ＧＳＴ−Ｂｓｔ２デコイタンパク質は、大腸菌において発現され、精製される。放射性標識（３５Ｓ）−Ｂｓｔ２Ｌは、ＴＮＴ  Ｔ７転写／翻訳システムを用いることによって得ることができる。ヒット化合物の連続希釈物をＤＭＳＯ中で準備する。各濃度のヒット化合物１ｕｌをチューブに添加する。ビーズ含有ＧＳＴ−Ｂｓｔ２デコイタンパク質が添加される。放射性標識された−Ｂｓｔ２Ｌが次いで添加され、インキュベートされる。プルダウンアッセイは、メーカーの説明書に従って行われる。
【０２９６】
２−４．蛍光標識された細胞を用いた細胞−細胞接着アッセイによるヒットの確認
細胞接着アッセイは、Ｅｄｗａｒｄｓらによって述べられているように行われる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ６８：１３０１、２００５）。Ｂｓｔ２細胞（Ｂｓｔ２を発現している安定細胞）は、赤色蛍光Ｆｕｒａ−Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、Ｂｓｔ２Ｌ細胞（Ｂｓｔ２Ｌ発現安定細胞またはＵ９３７細胞が用いられうる）は、緑色蛍光５、６−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識され、実験中氷上で維持される。Ｂｓｔ２細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）３００μｌおよびＢｓｔ２Ｌ細胞（３×１０６細胞／ｍｌ）３００μｌを、テスト化合物（最終１００μＭ）存在下または非存在下で、５分間３７℃で別々にインキュベートする。次いで、細胞を混合し、フローサイトメーターで分析し、その間、細胞懸濁液は、マグネチックマイクロスターラーバーで３７℃、３００ｒｐｍで連続的に攪拌する。細胞接着の基礎レベルを決定するために９０秒の攪拌の後、化合物を異なる濃度で添加する。Ｂｓｔ２細胞は、フローサイトメーター中の２つのフラクション中に溶解している：均一に赤色蛍光である一重項および赤／緑共−蛍光（緑色蛍光Ｂｓｔ２Ｌ細胞に接着する赤色蛍光Ｂｓｔ２細胞）を含む共役。各示された時点で、接着Ｂｓｔ２細胞のパーセンテージが、１００×（共役数）／（共役数＋一重項数）として算出される。
【０２９７】
２−５．ルシフェラーゼレポーターアッセイによるヒット確認
Ｂｓｔ２アンタゴニストまたはアゴニスト活性は、ルシフェラーゼレポーターの上流に複数のＮＦｋＢ部位を有するプラスミドである（ＮＦｋＢ）ｎ−ｌｕｃを用いたルシフェラーゼレポーターアッセイにより確認することができる。２９３Ｔ細胞に（ＮＦｋＢ）ｎ−ｌｕｃおよびＢｓｔ２に対する哺乳類発現ベクターをトランスフェクションする。４８時間後、細胞を選択された化合物の種々の濃度で処理する。６時間のインキュベーションの後、ルシフェラーゼアッセイを行い、発光をルミノメーターを用いて測定する。
【０２９８】
２−６．転写アッセイによるヒットの確認
転写アッセイは、細胞内環境の炎症性経路におけるＢｓｔ２−媒介シグナル伝達を小分子が阻害または増大させるかどうかを決定する。１つのそのようなアッセイは以下のようである。ＨＵＶＥＣにＢｓｔ２用の発現ベクターまたは空ベクターをトランスフェクションする。トランスフェクションの４８時間後、細胞をヒット化合物の種々の濃度で処理する。炎症性メディエーターおよび接着分子の遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲにより分析し、これらの遺伝子のタンパク質発現を、免疫ブロット法またはＥＬＩＳＡによって確認する。
【０２９９】
Ｂｓｔ２および血管形成
血管形成は、新たな毛細血管の成長である。炎症は血管形成を促進することができ、新たな血管はまた組織炎症を増強する。したがって、血管形成および炎症は、共依存のプロセスであるが（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １１：４５７、１９９７）、一方、血管形成および炎症はまた、互いに独立しても起こりうる。特に、慢性炎症は、血管成長を刺激することができる。血管形成は、胚形成、傷害後の組織回復、成長および女性生殖サイクルに必要とされる。血管形成はまた、ガンおよび乾癬、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、変形性関節症、喘息および肺線維症などの種々の慢性炎症性疾患の病理に関与している。例えば血管形成は、直径２−３ｍｍを超える多くの固形腫瘍の成長をサポートするために必要とされる。最近の研究により、血管形成阻害剤が腫瘍進行を阻害することが示されている。さらに、ガンは、血管形成阻害剤の使用が効果を生じうる唯一の疾患ではない。血管形成は、加齢性黄斑変性症および糖尿病性網膜症に重要な役割を果たす。血管が網膜に浸潤し、網膜を濁らせ、最終的には破壊する場合、これらの疾患は、失明を引き起こす。実際、血管ブロッカー（抗体、低分子量化合物）が、６５を超える人の失明の主な原因である加齢性黄斑変性症に対する最新で、最も効果的な治療である。血管形成阻害剤は、炎症を減少させる可能性があり、慢性炎症阻害剤は、血管成長の刺激が炎症性細胞に由来する血管形成を阻害することが期待されうる（Ｓｔｏｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０３：４７、１９９９）。Ｂｓｔ２が血管形成を誘導し、Ｂｓｔ２ブロッカーが、血管新生を阻害する抗血管新生活性を有する可能性がある。
【０３００】
運搬
運搬（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）に関しては、静脈内、筋肉内および腹腔内注射のような従来の投与経路に加えて、Ｂｓｔ２ブロッカーは、経皮添付および放出制御法により投与されうる。注射よりも長い時間にわたりＢｓｔ２阻害剤を放出するほど長期にわたり、カプセル化された、あるいは分解するまたは空になることができる固体マトリクスに結合したＢｓｔ２阻害剤を注入することによって、Ｂｓｔ２デコイまたはＢｓｔ２結合抗体のようなＢｓｔ２阻害剤の放出制御は、局所的にまたは全身的に達成されうる。Ｂｓｔ２阻害剤は、また、皮膚疾患または外傷を治療するためにクリームまたは軟膏の形で局所で適用されうる。
【０３０１】
本発明の組成物は、薬剤的に効果的な量で投与されうる。“薬剤的に効果的な量”という用語は、本明細書中で使用される場合、医療で適用される理にかなったリスク対効果比に相応である疾患治療に十分な量を指す。組成物の効果的な投与量は、疾患のタイプ、疾患の重症度、患者年齢および性別、薬剤活性、薬剤感受性、投与時間、投与経路、薬剤の排出比、治療の持続期間、組成物と併用される薬剤；および医薬の分野で知られている他の因子によって決定される。本発明の組成物は、単一の治療剤として投与されてもよいし、他の治療剤と併用して投与されてもよく、また連続して投与されても、従来の治療剤と同時に投与されてもよい。この投与は、１回投与でも複数投与でもよい。あらゆる因子を考慮すると、何ら副作用をもたらすことなく、最大の効果を与えることができる最小投与量で投与を行うことが重要であり、投与量は、本分野の当業者によって予め決定されうる。
【０３０２】
本発明は、本明細書で記載された具体的な実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際、本明細書で記載されたものに加えて、本発明の種々の改良は、前述の記載および添付された図から当業者にとって明白であろう。そのような改良も、添付の特許請求の範囲内である。下記の実施例は、本発明の説明のために提供されるものであって、限定のために提供されるものではない。
【実施例】
【０３０３】
実施例
実施例１−細胞培養
ヒト単球細胞系Ｕ９３７（ＡＴＣＣ，Ｕ．Ｓ；Ｃａｔ．ＣＲＬ−１５９３．２）を、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）及び１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（Ｇｉｂｏ−ＢＲＬ）が補充されたＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中で、懸濁培養した。
【０３０４】
ヒト臍帯静脈内皮細胞系ＨＵＶＥＣ（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｕ．Ｓ．；Ｃａｔ．ＣＣ−２５１７Ａ）を、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で、１０％  ＦＢＳが補充されたＥＧＭ−２培地（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｕ．Ｓ．）中で継代培養した。下記実施例では、細胞を、１６時間、１０％  ＦＢＳに代えて、０．５％  ＦＢＳで前処理した。所定の条件に従って、細胞を、所定の時間、ヒト組換えインターフェロン−γ（１０ｎｇ／ｍｌ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｕ．Ｓ．）及びＰＭＡ（１ｎｇ／ｍｌ，Ｃａｍｂｉｏｃｈｅｍ）または培地で前処理した。
【０３０５】
マウス単球細胞系ＷＥＨＩ−２７４．１（ＡＴＣＣ，Ｃａｔ．ＣＲＬ−１６７９）、およびマウス内皮細胞系ＳＶＥＣ  ４−１０（ＡＴＣＣ，Ｃａｔ．ＣＲＬ−２１８１）を、ヒトの細胞系と同じ方法に従って、培養し、前処理した。
【０３０６】
ヒトＴリンパ球細胞系Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ，ＴＩＢ１５２  ｃｌｏｎｅ）を、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で、１０％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン及び１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中で、懸濁培養した。
【０３０７】
ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．１１６１９−０１２）を用いて、タンパク質の発現及び精製を行なった。ＣＨＯ−Ｓ細胞を、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で、１０％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン及び１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンが補充されたＦ１２／ＨＡＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中で、懸濁培養した。
【０３０８】
実施例２−ヒトＢｓｔ２遺伝子及びマウスＤａｍｐ１遺伝子のクローニング
ヒスチジンで標識されたＢｓｔ２の発現ベクターを、下記のようにして構築した。ヒトＢｓｔ２遺伝子の全長ｃＤＮＡ（ＮＭ００４３３５）を、Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＵＳＡ）によって合成し、５０μｌの容積で、Ｐｆｕ  ｕｌｔｒａ  ＨＦ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物を、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩを用いてｐＣＭＶ  ＨＡベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中にクローニングした。
【０３０９】
Ｂｓｔ２及びＤａｍｐ１のデコイを発現するためのベクターを、下記のようにして構築した。図２は、デコイをクローニングするのに使用されるＰＣＲプライマーの位置を示すものである。ヒトＢｓｔ２タンパク質の細胞外領域をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲで得、発現後の細胞外への分泌を促進するためにｔＰＡ（組織プラスミノゲン活性化因子）のシグナル配列ＰのＮ末端に融合した。また、このＤＮＡ断片を、タンパク質の発現レベルを測定しかつタンパク質を精製しやすくするために、６−ヒスチジン標識のＣ末端に融合した。Ｂｓｔ２デコイは、Ｃ末端に１１個のアミノ酸残基を含まず、また、膜貫通領域及び細胞質領域を含まなかった。ＰＣＲ産物を、最終濃度が０．８％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ）で処理し、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化し、さらにｐＣＤＮＡ  ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。別の実験では、ヒトＢｓｔ２デコイのヌクレオチド配列のコドンを、哺乳動物での発現系に対して最適化し、ＤＮＡ断片を化学合成した。
【０３１０】
マウスＤａｍｐ１遺伝子の全長ｃＤＮＡ（ＮＭ  １９８０９５）を、マウス肝臓から単離したｍＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲによって得た。ＲＴ−ＰＣＲ産物を、 ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化して、ｐＣＤＮＡ  ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ヒトＢｓｔ２とマウスＤａｍｐ１とのアミノ酸配列相同性分析によって、デコイ領域を決定した。その結果、配列番号：１の可溶性Ｂｓｔ２断片を発現するベクター及び配列番号：２の可溶性Ｄａｍｐ１断片を発現する別のベクターが得られた。
【０３１１】
実施例３−リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ(Real-time quantitative RT-PCR)
特定の遺伝子の細胞内発現レベルを、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）及びＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎアッセイキットを用いたリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。使用したプライマー及びプローブは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて設計した。
【０３１２】
１０ｎｇの１本鎖ｃＤＮＡを反応管に入れ、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用いてｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ（５０μｌ）を行なった。目的とするｃＤＮＡの相対量を、比較サイクル閾値(comparative cycle threshold)（ＣＴ）法を用いて算出した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。
【０３１３】
相対レベルの特定遺伝子Ａを、コントロールサンプル（トランスフェクトしていない細胞）に比した変化として、表わした。すべての値は、トランスフェクトした細胞中の正常化遺伝子Ｂ（ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子）に対して、２−ＣＴ（Ｃｔ１−Ｃｔ０，Ｃｔ１＝Ｃｔ１Ａ−Ｃｔ１Ｂ，Ｃｔ０＝Ｃｔ０Ａ−Ｃｔ０Ｂ）算出法を用いて、得た。各値は、３連で各サンプルから得た。上記実験を行い、Ｂｓｔ２遺伝子及びインターフェロン−２の発現を定量した。
【０３１４】
実施例４−可溶性Ｂｓｔ２タンパク質断片またはＤａｍｐ１タンパク質断片の発現および精製
上記したようにして調製した可溶性Ｂｓｔ２タンパク質断片またはＤａｍｐ１タンパク質断片を発現するために、ベクターＤＮＡを、特定の動物細胞中に一時的にあるいは永久に導入した。以下のようにして、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿によって、一時的なトランスフェクションを行なった。トランスフェクションの２４時間前に、７×１０６個の２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を１５０ｍｍの細胞培養皿に播種して培養した。トランスフェクションの１時間前に、培地を、２％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）が補充されたＩＭＤＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）と交換した。７５μｇ  ＤＮＡ及び２５０ｍＭ  カルシウムを含む１．５ｍｌ  ＴＥバッファー（１ｍＭ  Ｔｒｉｓ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ  ８．０）を、１．５ｍｌ  ＨＥＰＥＳバッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１４０ｍＭ  ＮａＣｌ，１．４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ  ７．０５）と混合し、室温で約１分間インキュベートして、前培養細胞に添加した。細胞を、３７℃で６時間、ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。ＤＮＡ／カルシウム溶液を除去した後、細胞に血清を含まない培地を再供給して、さらに７２時間以上培養した後、培地を回収した。別途、永久細胞系を、以下のようにして、リポフェクタミン及び選択マーカーとしてのジヒドロ葉酸レダクターゼを用いて確立した。トランスフェクションの４８時間前に、１．３５×１０６個のＣＨＯ−ＤＵＫＸ−Ｂ１１（ｄｈｆｒ−）細胞（ＡＴＣＣ）を、１００ｍｍの細胞培養皿に播種して、１０％  ＦＢＳが補充されたＩＭＤＭ培地で培養した。１８μｇ  ＤＮＡを含む血清を含まないＩＭＤＭ培地  ０．６ｍｌを、５４μｌ  リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む血清を含まないＩＭＤＭ培地  ０．６ｍｌと混合し、室温で４５分間、インキュベートした。ＤＮＡ／リポフェクタミン混合物に、８．８ｍｌの血清を含まないＩＭＤＭ培地を補充し、前培養細胞に添加した。細胞を、３７℃、６時間、ＣＯ２インキュベータでインキュベートした。培地を、選択培地、即ち、１０％透析ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ培地と交換した。一時的に発現したタンパク質を分析するために、細胞を７２時間以上さらに培養した。次に、培地を回収して、０．２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通した。得られたＢｓｔ２デコイタンパク質を、抗Ｂｓｔ２ポリクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅ）または抗ヒスチジン抗体（Ｒｏｃｈｅ）を用いた免疫ブロッティングによって分析した。
【０３１５】
可溶性Ｂｓｔ２タンパク質断片またはＤａｍｐ１タンパク質断片を大量に発現、精製するために、Ｂｓｔ２またはＤａｍｐ１発現ベクターを安定して導入したホスト細胞系を、以下のようにして、生産細胞系として選択した。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子が欠失しているＣＨＯ細胞に、発現ベクターをトランスフェクトした。発現ベクターはｄｈｆｒ遺伝子を持っているので、ジヒドロ葉酸レダクターゼを選択マーカーとして使用した。４８時間後、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、１×１０３細胞／ウェルの密度で９６ウェル細胞培養プレートに播種し、２０ｎＭ  メトトレキサート（ＭＴＸ）を含む培地で培養して、ＤＨＦＲ遺伝子を増幅した。２週間後、培地を回収して、抗Ｂｓｔ２抗体を用いたＥＬＩＳＡを行い、クローンのＢｓｔ２デコイタンパク質の発現レベルを比較した。高い発現レベルを示すクローンを、選択して、３００ｎＭまでＭＴＸ濃度を徐々に上げて暴露し、遺伝子の増幅を完了した。その後、培地を各クローンから集め、最も高い発現レベルを示す生産細胞系を最終的に選択するために、ＥＬＩＳＡ及び免疫ブロッティングを行なった。Ｂｓｔ２デコイタンパク質は血清を含まない条件下で培地中に生産されるので、発現したタンパク質を、Ｃ末端に付加された６−ヒスチジン標識を用いて集められた培地から精製した。タンパク質の精製は、カラム、ＮＴＡ  キレートアガロースＣＬ−６Ｂ（Ｐｅｐｔｒｏｎ  Ｉｎｃ．）を用いてＮＴＡキレートクロマトグラフィーによって行なった。電気泳動及びＥＬＩＳＡによって、精製タンパク質の純度を分析し、ＢＣＡ法（Ｂｉｏｒａｄ，ＵＳＡ）及び紫外分光光度法によって、精製タンパク質の量を測定した。
【０３１６】
上記したようにして精製された、ヒトＢｓｔ２デコイ及びマウスＤａｍｐ１デコイを、４〜２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図３、パネルＡ）。１％  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びＮ−グリコシダーゼＦ（Ｓｉｇｍａ）の処理によって、Ｂｓｔ２デコイが２量体糖タンパク質になった（図３、パネルＢ）。下記実施例の結果は、調製したデコイのうち、配列番号：１のアミノ酸配列を有する可溶性Ｂｓｔ２タンパク質断片及び配列番号：２のアミノ酸配列を有する可溶性Ｄａｍｐ１タンパク質断片を用いて、得られた。
【０３１７】
実施例５−Ｕ９３７細胞の同型凝集に関するＢｓｔ２タンパク質の効果の評価
実施例５−１−Ｕ９３７細胞の凝集中のＢｓｔ２の発現レベルの変化
ヒトＵ９３７単球細胞の凝集中のＢｓｔ２タンパク質の発現レベルを試験した。１×１０６個のＵ９３７細胞を、２４時間、ＰＭＡ（２ｎｇ／ｍｌ）及びＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）で処理して、Ｕ９３７細胞の同型細胞凝集を誘導し、位相差倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  １Ｘ７１，ｓｔａｔｅ，ＵＳＡ）下で同型細胞凝集の程度を観察した。細胞凝集の程度を測定するために、形成した細胞凝集の大きさを、Ａｄｏｂｅ’ｓ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア、ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．０を用いて、画素の明暗度(pixel intensity)として測定した。図に示される標準偏差値を、任意に選択した６つの凝集体の平均値から算出した。その後、すべての使用した細胞を回収し、全ＲＮＡを単離して、配列番号：３及び４の１対のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを行い、Ｂｓｔ２の発現レベルを評価した。
【０３１８】
【表１】
2009536952.tif 000002
【０３１９】
Ｕ９３７細胞をＰＭＡ及びＬＰＳで処理して同型凝集を誘導してから１時間後、細胞内Ｂｓｔ２発現は約３倍に増加した。この増加レベルは２４時間維持した。これらの結果から、Ｂｓｔ２遺伝子の発現はＵ９３７細胞の同型凝集中に増加することが示される（図４）。
【０３２０】
実施例５−２−Ｕ９３７細胞の同型凝集に関するＢｓｔ２タンパク質の効果
Ｂｓｔ２遺伝子の発現の増加がＵ９３７細胞の同型凝集に必須であるか否かを決定するために、Ｂｓｔ２タンパク質が過剰発現した際の細胞凝集を評価した。
【０３２１】
上記条件下で予め培養した、１×１０６個のＵ９３７細胞を、９６ウェルの細胞培養皿（ＮＵＮＣ）に播種して、２４時間、ＰＭＡ（２ｎｇ／ｍｌ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）及びＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で処理した。次に、この細胞について、位相差倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  １Ｘ７１，ｓｔａｔｅ，ＵＳＡ）下で同型細胞凝集の程度を観察した。
【０３２２】
Ｂｓｔ２タンパク質自体はＵ９３７細胞の凝集を誘導しなかったが、ＰＭＡ／ＬＰＳ処理はＵ９３７細胞の同型凝集を刺激した。Ｂｓｔ２の一時的な過剰発現で、ＰＭＡ／ＬＰＳで刺激されたＵ９３７細胞の同型凝集は、約４倍増加した（図５）。これらの結果から、Ｂｓｔ２発現は活性化単球性白血球の同型凝集を促進することが示される。
【０３２３】
実施例５−３−Ｂｓｔ２デコイを用いたＵ９３７細胞の同型凝集の阻害
Ｂｓｔ２遺伝子の発現の増加がＵ９３７細胞の同型凝集に必須であるか否かを確認するために、Ｂｓｔ２タンパク質の作用を抑制した際の細胞凝集を評価した。
【０３２４】
Ｕ９３７細胞を、ＰＭＡ及びＬＰＳで予め処理して、細胞凝集を誘導し、ＣＨＯ−Ｓ細胞中で一時的に発現したＢｓｔ２デコイを含む培地（デコイ培地）の連続希釈液で処理した。Ｂｓｔ２デコイでは、Ｂｓｔ２デコイを発現しないＣＨＯ−Ｓ細胞の培養物（コントロール培地）に比して、５０％、ＰＭＡ及びＬＰＳで誘導されたＵ９３７細胞凝集が減少したことが分かった（図６）。これらの結果から、Ｂｓｔ２デコイはＵ９３７細胞の同型凝集を阻害することが示される。
【０３２５】
実施例６−２種の異なる細胞型間の異型凝集に関するＢｓｔ２タンパク質の効果の評価
実施例６−１−Ｂｓｔ２デコイを用いたＵ９３７及びＨＵＶＥＣｓ間の凝集の阻害
ＨＵＶＥＣｓ（１〜５×１０４細胞／ｍｌ）を１２ウェルの細胞培養皿に播種した。１日後、培地を０．５％  ＦＢＳを含む低血清培地に交換して、細胞を、２４時間、最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌのインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で前処理した。次に、このようにして前処理されたＨＵＶＥＣｓを、３７℃で４時間、Ｕ９３７細胞（２×１０６細胞／ｍｌ，５００μｌ）と一緒に培養した。この共培養物をリン酸バッファーで３回または４回洗浄し、残った細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定して、顕微鏡で観察した。
【０３２６】
Ｕ９３７細胞では、Ｂｓｔ２デコイを含む培地を培養物に添加すると、ＩＦＮ−γで処理したＨＵＶＥＣｓへの結合の減少が示された。Ｂｓｔ２デコイを含まないコントロール培地では、Ｕ９３７細胞は効率よくＩＦＮ−γで処理したＨＵＶＥＣｓに結合し、異型細胞凝集を形成した。コントロール培地またはアルブミンの処理は、細胞凝集に影響を及ぼさなかった（図７）。図７では、「正常培地」である、ＩＦＮ−γで前処理しないＨＵＶＥＣｓはＵ９３７細胞に結合しなかった。これに対して、ＩＦＮ−γで処理したＨＵＶＥＣｓはＵ９３７細胞に結合し、異型細胞凝集を形成した。ＩＦＮ−γで前処理した培養物から得られた、Ｂｓｔ２デコイタンパク質を含む培地で処理されたＨＵＶＥＣｓは、Ｕ９３７細胞による凝集の減少を示した。基礎培地またはアルブミンの処理は、細胞凝集に影響を及ぼさなかった（図７）。図７では、「正常培地」はＦＢＳ含有一般培地を示し、「コントロール培地」はＢｓｔ２デコイタンパク質を発現しない細胞の培養液を示す。加えて、異型細胞凝集は、Ｂｓｔ２デコイの濃度に依存するようにして、阻害される（図８）。
【０３２７】
実施例６−２−Ｂｓｔ２  ｓｉＲＮＡを用いたＵ９３７及びＨＵＶＥＣｓ間の凝集の阻害
Ｂｓｔ２に特異的に作用する様々なｓｉＲＮＡ分子を構築した（ＱＩＡＧＥＮ）。全２３個のＢｓｔ２に特異的なｓｉＲＮＡ分子を構築した。
【０３２８】
配列番号：５の配列によってコードされるＢｓｔ２  ｍＲＮＡに相補的である、アンチセンスＲＮＡ鎖、及び当該アンチセンス鎖に相補的なセンスＲＮＡ鎖から構成されるｓｉＲＮＡを用いて、下記試験結果を得た。
【０３２９】
ＨＵＶＥＣｓに、Ｂｓｔ２の発現ベクターをトランスフェクトし、ＩＦＮ−γを用いてあるいはＩＦＮ−γを用いずに処理した後、Ｂｓｔ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。この細胞について、Ｕ９３７細胞接着性を評価した。
【０３３０】
【表２】
2009536952.tif 000003
【０３３１】
細胞外で発現したＢｓｔ２は、ＩＦＮ−γを用いてあるいはＩＦＮ−γを用いずに処理したＨＵＶＥＣｓへのＵ９３７細胞の結合性を促進した。Ｂｓｔ２  ｓｉＲＮＡ処理によって、Ｕ９３７細胞接着性は減少した（図９）。トランスフェクトしていないＨＵＶＥＣｓ及びＵ９３７細胞間の細胞接着性に関するＢｓｔ２  ｓｉＲＮＡの阻害効果を示す図２９に示されるデータと合わせると、これらの結果から、Ｂｓｔ２はＨＵＶＥＣ−Ｕ９３７接着に関与することが示唆される。
【０３３２】
実施例７−Ｔリンパ球の同型凝集及び凝集の活性に関するＢｓｔ２タンパク質の効果の評価
実施例７−１−Ｔリンパ球の同型凝集及びＩＬ−２生産に関するＢｓｔ２過剰発現の効果
ヒトＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を、下記のようにして、同型細胞凝集を形成するように誘導し、活性化した。
【０３３３】
Ｊｕｒｋａｔ細胞（５×１０５細胞／ｍｌ）を、４℃で２０分間、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３：１０μｇ／ｍｌ，ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共にインキュベートした後、３７℃で１時間、抗マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体（２５μｇ／ｍｌ，Ｚｙｍｅｄ）と共にインキュベートしたところ、細胞凝集が起こり、この細胞を、インターロイキン−２（ＩＬ−２）を生産するように、活性化、誘導した（図１０及び１１）。同様の方法に従って、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の過剰発現を誘導したところ、効果はなかった。これに対して、Ｊｕｒｋａｔ細胞にＢｓｔ２を過剰発現するベクターをトランスフェクトして、活性化するように誘導すると、同型細胞凝集が増加した（図１０、パネルＡ）。Ｔ細胞活性化時のＩＬ−２  ｍＲＮＡレベルを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定した（実施例３）。ＩＬ−２  ｍＲＮＡの発現は、ＧＦＰ過剰発現に比して、Ｂｓｔ２過剰発現下で約２倍、上昇していた（図１０、パネルＢ）。
【０３３４】
実施例７−２−Ｔリンパ球の同型凝集及びＩＬ−２生産に関するＢｓｔ２デコイ及びＢｓｔ２  ｓｉＲＮＡの効果
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、活性化の３０分前に、Ｂｓｔ２デコイで前処理し、抗ＣＤ３モノクローナル抗体を用いて活性化し、さらに細胞凝集の阻害について評価した。この細胞を、相対量のＢｓｔ２デコイを含む動物細胞培養液の連続希釈液で処理した。凝集体の大きさを、非処理群の凝集体の大きさに対する割合として表わした。
【０３３５】
活性化条件下でのＢｓｔ２デコイによる前処理によって、Ｊｕｒｋａｔ細胞の凝集が有意に低減した。加えて、Ｊｕｒｋａｔ細胞の活性化によって３倍増加した発現は、Ｂｓｔ２デコイ処理によって基礎レベルにまで再度減少した（図１１及び１２）。
【０３３６】
ここで示されたデータから、Ｂｓｔ２は炎症及び免疫に重要であることが示される。Ｂｓｔ２機能を遮断すると、炎症により誘発する病気を軽減する可能性がある。ＡＩＤＳ患者や免疫不全の患者等の免疫障害のある患者では、免疫シグナルの増加は有益であろう。Ｂｓｔ２デコイ及びタンパク質あるいは化合物であってもよい他の分子Ｙから構成される２価の融合タンパク質は、相互作用を促進し、Ｂｓｔ２リガンドを発現する細胞とＹに対するレセプターを発現する他の細胞との間のシグナルを伝達するアダプターとして作用することが可能である。図３５を参照。
【０３３７】
実施例８−喘息のマウスモデルにおけるＢｓｔ２デコイの細胞の評価
実施例８−１−マウスにおける喘息の誘導
喘息のマウスモデルを、オボアルブミンでマウス（Ｃ５７Ｂ６、８週齢）を感作することによって作製した。詳細には、マウスを、まず、オボアルブミンを鼻腔内に注射することによって、５日間連続で感作した。３週間後、マウスを、再度、５日間連続して、オボアルブミンで鼻腔内に感作した。２回目の感作を行なってから１週間後、マウスの鼻腔内に、２４時間毎３回、オボアルブミンをチャレンジして、喘息を誘導した。ここで、Ｂｓｔ２デコイを、オボアルブミンで感作する３０分前にマウスの静脈内に注射し、さらに最初の感作及び最後のオボアルブミンの注射の３０分前にマウスに注射した。最後の注射から３日後、血清サンプル、肺組織などをマウスから集めた。
【０３３８】
実施例８−２−Ｂｓｔ２デコイで誘導される沈降免疫細胞の数の変化
オボアルブミンで感作されかつＢｓｔ２デコイで処置されたマウスでは、全浸潤細胞数及び各細胞型（好中球、好酸球及びリンパ球）の数が、気管支肺胞洗浄液で顕著に減少した（図１３）。
【０３３９】
実施例８−３−サイトカイン生産に関するＢｓｔ２デコイの効果
Ｂｓｔ２またはＤｍａｐ１デコイを、オボアルブミンで感作及びチャレンジすることによって誘導された喘息のマウスモデルに注射し、サイトカイン（インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）及びインターロイキン−１３（ＩＬ−１３））の発現レベルを、以下のようにして測定した。気管支肺胞洗浄後、肺組織をマウスから切除し、肺組織からタンパク質を単離した。サイトゾルタンパク質を、ＮＰ−４０を含む溶解バッファーを用いて単離した。単離したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、湿潤転写法（ｗｅｔ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）によってＰＶＤＦ膜に移した。ブロットを、それぞれの数種の１次抗体（抗ＩＬ−４抗体（Ｓｅｔｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．）、抗ＩＬ−５抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｉｎｃ．）、抗ＩＬ−１３抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｉｎｃ．）、及び抗アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．））の１：１０００倍希釈液中でインキュベートした。ＥＣＬ試薬を用いて、ＨＲＰ−共役２次抗体（抗ウサギＨＲＰ共役ＩｇＧ）で、結合した１次抗体を検出した。ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３等のサイトカインのレベルが、オボアルブミンで感作及びチャレンジすることによって誘導された喘息もちのマウスの肺組織で上昇していることが分かった。また、オボアルブミンで感作した喘息マウスにＢｓｔ２デコイタンパク質を注射すると、サイトカインレベルは、デコイタンパク質の投与量の増加に従って減少した。これらの結果から、Ｂｓｔ２デコイタンパク質は喘息の治療効果があることが示される（図１４）。
【０３４０】
実施例９−ヒトＢｓｔ２タンパク質とマウスＤａｍｐ１タンパク質との機能の類似性の評価
ヒトＢｓｔ２タンパク質とマウスＤａｍｐ１タンパク質とは約３５％のアミノ酸類似性がある。この点について、これらの２種のタンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞−細胞接着アッセイやｉｎ  ｖｉｖｏでのマウス喘息モデルにおいて機能類似性を示すか否かを試験した。ヒトＢｓｔ２及びマウスＤａｍｐ１タンパク質について、実施例６に記載されるのと同様の方法に従って、ＩＦＮ−γで処理したＨＵＶＥＣｓ及びＵ９３７細胞間の接着に関する阻害効果を試験した。
【０３４１】
実施例１０−抗Ｂｓｔ２ポリクローナル抗体の調製
ＣＨＯ−Ｓ細胞で発現した精製Ｂｓｔ２及びＤａｍｐ１デコイタンパク質を、１：１の割合でＲｉｂｉアジュバントと混合し、これを２週間の間隔でウサギに注射した。免疫処置中、血液サンプルを集めて、抗体の産生について試験した。３回免疫処理した後、血清サンプルをウサギから得た。抗Ｂｓｔ２ポリクローナル抗体を、Ｂｓｔ２タンパク質が固定化担体に結合したカラムを用いてアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。
【０３４２】
実施例１１−Ｂｓｔ２デコイの代謝の改善を目的としたＰＥＧ−共役形態の調製
実施例１１−１−ＰＥＧ−共役形態の調製
２種のＰＥＧ、即ち、（１）アルデヒドＰＥＧ及び（２）スクシンイミジルカーボネートＰＥＧ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ  ＰＥＧ）によってＰＥＧ共役を行なった（図１７）。まず、アルデヒドＰＥＧ共役を以下のようにして行なった。１ｍｇのＢｓｔ２デコイタンパク質を、０．１ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ  ７．５）中で透析し、３０倍モル比の（ｍＰＥＧ１２０００−ＯＣＨ２ＣＯＧｌｙ−Ｇｌｙ）２（２，４−ジアミノ酪酸）−ＰＥＧ’−ＮＨＳと混合した後、攪拌しながら２時間、室温でインキュベートした。別途、カーボネートＰＥＧ共役について、１ｍｇのＢｓｔ２デコイタンパク質を、０．１ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ  ５．０）中で透析した後、２０倍モル比のスクシンイミジルカーボネートＰＥＧと混合した後、攪拌しながら２時間、室温でインキュベートした。反応終了後、ＰＥＧと共役したＢｓｔ２デコイをサイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて単離、精製し、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ  ７．４）で透析した。
【０３４３】
実施例１１−２−Ｂｓｔ２デコイのｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性に関するＰＥＧ−共役形態の促進効果
実施例１１−１で調製された、ＰＥＧ共役形態のＢｓｔ２デコイを、７週齢のオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの尾静脈に０．４〜２ｍｇ／ｋｇの投与量で注射した。ネガティブコントロール群には、等量の生理食塩水を注射した。また、等量のＢｓｔ２デコイタンパク質をポジティブコントロールとして用いた。血液サンプルを、薬剤投与前、ならびにカニューレを用いて頸静脈から薬剤を投与してから２分、５分、１０分、３０分、１時間、２時間、６時間、１２時間及び２４時間後に、集めた。集めた血液サンプルをＥＬＩＳＡによって分析した。９６ウェルのプレートを、４℃で８時間以上、抗Ｂｓｔ２デコイ抗体（ＰＢＳ中で１００ｎｇ／ｍｌ）で被覆し、３７℃で２時間、ＰＢＳ中でアルブミンで遮断した。このプレートを、３７℃で２時間、ラットの血清またはＢｓｔ２デコイ（標準サンプル）の適当な希釈液と反応させた。次に、プレートを、３７℃で２時間、Ｂｓｔ２デコイのＣ末端に付加したヒスチジン標識を認識するモノクローナル抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼと共役したｍＡｂ，Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｃ．）と反応させた。よく洗浄した後、プレートをペルオキシダーゼ基質で処理し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。標準サンプルを用いて、血中に存在するＰＥＧ共役Ｂｓｔ２デコイの定量を行なった（図１８）。図１８中、「２０１Ｂ−Ｈ」はヒトＢｓｔ２デコイサンプルを示し、「２０１Ｂ−ＨＰ」はアルデヒドＰＥＧ共役ヒトＢｓｔ２デコイサンプルを示す。
【０３４４】
実施例１２−炎症関連疾患におけるＢｓｔ２の発現および分布
様々な炎症疾患の患者の組織を、Ｂｓｔ２の発現及び分布を調べるために得た。得られた組織としては、喘息患者の肺組織、アテローム性動脈硬化症患者の動脈、乾癬患者の皮膚病変部、クローン病患者の腸組織、潰瘍患者の腸／結腸組織、慢性活動性胃炎患者の胃組織、および急性虫垂炎患者の盲腸組織がある。各組織を典型的な炎症の表現型を示す代表的な病巣として選択した。
【０３４５】
喘息では、肺組織を１０％ホルムアルデヒド中で固定し、組織をパラフィン中に包埋することによって調製された、肺組織のパラフィンブロックを、１．５μｍの厚みの切片とし、ガラススライドにのせた。このスライドを、ヘマトキシリン及びエオシンで染色して、アレルゲン及び薬剤の投与による肺組織の変化を調べた。実施例１０で調製されたポリクローナル抗体を用いて、組織染色(histostaining)を行なった。他の組織を同様にして調製した。正常組織と比べると、炎症関連疾患では、Ｂｓｔ２タンパク質が過剰に発現していた。Ｂｓｔ２は、免疫細胞、血管内皮細胞、及び他の細胞型で検出された（図１９）。
【０３４６】
実施例１３−細胞培養
実施例１に記載されるのと同様にして、細胞培養を行なった。
【０３４７】
実施例１４−ヒトＢｓｔ２デコイ及びＢｓｔ２デコイＦｃ融合物の発現ベクターの構築
融合構築物を、発現ベクターｐＣＤＮＡ  ３．１または他の市販のｄｈｆｒベクターに基づいて調製した。
【０３４８】
図２０は、Ｂｓｔ２デコイ及び他のＦｃ融合物の概略図を示すものである。これらは、可能性のある融合タンパク質の代表的な概略図である。図２０を参照すると、図２０ＡはＢｓｔ２デコイ自体を示し、図２０Ｂは、各融合タンパク質のヘッドにＢｓｔ２デコイの２量体が形成するように、Ｂｓｔ２デコイの別発現を有するＩｇＧ重鎖Ｆｃのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分に融合したＢｓｔ２デコイを示す。図２０Ｃは、Ｂｓｔ２−κ融合物が、天然のＩｇＧκ鎖−重鎖のジスルフィド結合を介して安定化した各融合タンパク質のヘッドにＢｓｔ２デコイの２量体を安定して形成できるように、Ｂｓｔ２−ＩｇＧ  Ｆｃ融合物と協調して発現する形態を示す。図２０Ｄは、Ｂｓｔ２デコイ−ＩｇＧ  Ｆｃが、他のＢｓｔ２の２量体化のカウンターパートなしで発現する形態を示す。融合物のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分の２量体化は、ＩｇＧ  Ｆｃ部分がこれらの鎖の間の天然のジスルフィド結合により発現する毎に起こる。
【０３４９】
図２１は、上記したＢｓｔ２デコイ−ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質のベクターマップを示す。ＩｇＧ１及びＩｇＧ２  Ｆｃ融合物の発現ベクターを表す代表的な発現ベクターが示される。図２１Ａは、Ｂｓｔ２デコイ（ｄＢｓｔ２）を示す。このＢｓｔ２デコイの発現ベクターは、デコイタンパク質の出発点の５’側にＸｂａＩ部位を、Ｎ末端のｔＰＡシグナルペプチド及びＣ末端のＨｉｓ−標識で次に３’末端のＢａｍＨＩ部位でＰＣＲ−クローニングすることによって構築された；この挿入物を、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで切断したｐｃＤＮＡ３．１中にクローニングした。図２１Ｂは、ｄＢｓｔ２−ＩｇＧ１Ｆｃ融合物を示す。ＩｇＧ１重鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域を、ＰＣＲ−クローニングし、５’側  ＸｈｏＩ及び３’側  ＮｏｔＩ部位でＢｓｔ２デコイのＣ末端に融合した；この挿入物を、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断したｐｃＤＮＡ３．１中にクローニングした。図２１Ｃは、ｄＢＳＴ−κ融合物を示す。ＩｇＧのκ軽鎖の定常領域を、ＰＣＲ−クローニングし、５’側  ＸｈｏＩ及び３’側  ＮｏｔＩ部位でＢｓｔ２デコイのＣ末端に融合した；この挿入物を、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断したｐｃＤＮＡ３．１中にクローニングした。（ｄ）ｄＢＳＴ−ＩｇＧ２ＨＣ融合物。ＩｇＧ２重鎖のヒンジＣＨ２−ＣＨ３領域を、ＰＣＲ−クローニングし、５’側  ＸｈｏＩ及び３’側  ＮｏｔＩ部位でＢｓｔ２デコイのＣ末端に融合した；この挿入物を、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断したｐｃＤＮＡ３．１中にクローニングした。
【０３５０】
実施例１５−ベクターの構築
ヒスチジン標識Ｂｓｔ２デコイの発現ベクターを、以下のようにして構築した。
【０３５１】
免疫グロブリン遺伝子断片を、ＰＣＲによって以下のヒト血液細胞ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からクリーニングした：ヒトＩｇＧ１重鎖のＦｃ領域（ヒンジ、ＣＨ１及びＣＨ２領域）（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｎｏ：ＢＣ０８９４１７．，プライマー１、２）、ヒト免疫グロブリンκ鎖の定常領域（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｎｏ：ＢＣ０６７０９２，プライマー３、４）、およびヒトＩｇＧ２重鎖の定常領域（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｎｏ：ＡＪ２９４７３１，プライマー５、６）。断片のクローニングに使用されたＰＣＲプライマーの配列は下記のとおりである。
【０３５２】
【表３】
2009536952.tif 000004
【０３５３】
実施例１６−ヒトＢｓｔ２デコイ−Ｆｃ融合構築物（ＩｇＧ１、２、および４）
ヒトＢｓｔ２デコイ−Ｆｃ融合物の３種の異なる構築物を、発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ヒトＢｓｔ２タンパク質の細胞外領域をコードするＤＮＡをＰＣＲによって得、これを、発現後の細胞外分泌を促進するように、ｔＰＡのシグナルペプチド配列のＮ末端で融合した。また、Ｂｓｔ２細胞外断片を、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のＩｇＧ１  Ｆｃ領域またはκ鎖の定常領域にＣ末端で融合した。重複したＰＣＲ産物をＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで消化して、ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。これらの融合断片を、オーバーラップＰＣＲ(overlap PCR)によって作製し、プライマーは下記のとおりであり、「ｐｃＤＮＡ−ｄＢＳＴ２−ＩｇＧ１Ｆｃ」、「ｐｃＤＮＡ−ｄＢＳＴ２−ｋａｐｐａ」、および「ｐｃＤＮＡ−ｄＢＳＴ−ＩｇＧ２ＨＣ」またはｐｃＤＮＡ−ｄＢＳＴ２−ＩｇＧ４Ｆｃと称した。
【０３５４】
実施例１７−ＰＣＲクローニングおよび融合ストラテジー
ＰＣＲクローニングおよび融合ストラテジーを図２２に示す。下記プライマーを使用した。
【０３５５】
【表４】
2009536952.tif 000005
【０３５６】
実施例１８−可溶性デコイ−Ｆｃ融合タンパク質の発現
可溶性Ｂｓｔ２デコイ−Ｆｃ融合タンパク質を、実施例４に記載されるのと同様にして一時的なトランスフェクション後に調製した。Ｂｓｔ２デコイ及びＢｓｔ２デコイＦｃ融合タンパク質を発現する安定した細胞系を、実施例４に記載されるのと同様にして確立した。大量発現及び精製を、実施例４に記載されるのと同様にして行なった。
【０３５７】
実施例１９−精製Ｂｓｔ２デコイおよび他のＦｃ融合物のＰＡＧＥ
Ｆｃ融合タンパク質を培地から精製した。限外濾過で濃縮した後、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭａｂＳｅｌｅｃｔ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）を含む、２段階クロマトグラフィー法を使用した。
【０３５８】
Ｆｃ融合タンパク質を、ＰＢＳ緩衝液（１．０６ｍＭリン酸二水素カリウム、１５５．１７ｍＭ塩化ナトリウム、２．９７ｍＭリン酸水素２ナトリウム、ｐＨ  ７．４）で予め平衡化したプロテインＡ充填カラムに載せた。このカラムを過剰量のＰＢＳで洗浄して、混入物質を除去した。結合抗体を、段階勾配(step gradient)を用いて５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ等の、低ｐＨ緩衝液によって溶出し、等容の１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．０）で中和した。
【０３５９】
次のサイズ排除クロマトグラフィーステップを用いて、免疫グロブリンのマルチマーを除去した。精製抗体マルチマー混合物を、予めＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムに載せた。５０ｃｍ／ｈ〜１５０ｃｍ／ｈの範囲の速度から、バッファーの直線的な流量を選択した。
【０３６０】
図２３は、アフィニティ精製後の様々なＢｓｔ２融合タンパク質を示すクマシーで染色した代表的なＰＡＧＥゲル（４〜１２％勾配ゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を示す。図２３Ｂは、分子量の大きいマルチマー形態が適当なサイズ排除クロマトグラフィーによって除去できることを示す。
【０３６１】
実施例２０−免疫細胞へのＢｓｔ２デコイの直接結合性
平底の９６ウェルプレートを、３７℃で２時間、重炭酸ナトリウム（１００ｍＭ，ｐＨ  ９．５）と共にＢｓｔ２デコイで被覆した。このプレートを、ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）で洗浄し、２５℃で１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共にインキュベートした。１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）でリンスした後、Ｕ９３７細胞（１×１０６／ｍｌ）を、各Ｂｓｔ２被覆ウェルに添加した。３７℃で２時間インキュベートした後、非結合細胞を、ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で２回緩やかに洗浄することによって除去し、結合細胞を２０分間２％パラホルムアルデヒドで固定し、洗浄し、０．５％クリスタルバイオレットで染色した。２５℃で３０分後、プレートをＰＢＳで洗浄して、結合細胞を計測した。
【０３６２】
図２４は、Ｕ９３７細胞へのＢｓｔ２デコイの直接結合性を示す。Ｕ９３７細胞は、ＢＳＡではなくＢｓｔ２デコイを含むウェルに結合した。
【０３６３】
実施例２１−Ｂｓｔ２デコイ−Ｆｃ融合物の血漿中の半減期
図２５は、Ｂｓｔ２デコイまたはＦｃ融合物の血漿中の半減期を示す。様々な安定化ＩｇＧ  Ｆｃ領域に融合したＢｓｔ２デコイタンパク質は、Ｂｓｔ２デコイ単独と比較した２種のＢｓｔ２デコイ−ＩｇＧ１融合物に関する代表的な薬物動態プロットで示されるように、血清安定性の上昇を示した。
【０３６４】
Ｂｓｔ２デコイまたは他のＦｃ融合物の血漿中の半減期を測定するために、ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙのオス）に、静脈内カテーテルを外科的に移植した。その後の期間中、カテーテルを輸液ポンプにつなげた。タンパク質サンプルを、凝固の危険性を低減するためにヘパリン化生理食塩水を流したカテーテルにより１分間にわたって手で輸注した。輸注終了時を時間０と称した。血液サンプル（０．４ｍｌ）を、様々な時点でカテーテルから採取した。血漿を遠心で分離し、Ｂｓｔ２デコイまたは他のＦｃ融合タンパク質の血漿中の濃度を測定するためにサンドイッチＥＬＩＳＡを行なった。９６ウェルプレートのウェルを、５０ｍＭカーボネートバッファー（ｐＨ  ９．２）中でウサギ抗ＢＳＴ２ポリクローナル抗体の５μｇ／ｍｌで被覆し（１００μｌ／ウェル）、１％  ＢＳＡ／ＰＢＳで遮断した。標準曲線の直線範囲に入るように希釈された各血漿サンプルを、２５℃で９０分間、インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、ウェルを、室温で１時間、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：５０，０００希釈、Ｆｃ特異的、Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ−０１７０）と共にインキュベートした後、ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）で処理した。プレートを、プレートリーダーで４５０ｎｍで読み、データを４パラメーター曲線適合プログラム(four-parameter curve-fitting program)を用いて分析した。各異なるタンパク質に関する標準曲線では、各精製タンパク質標準物質を、適当な濃度で１％ＢＳＡ、１％ラット免疫前血清の溶液中で使用した。
【０３６５】
実施例２２−Ｂｓｔ２デコイと細胞との結合でのＢｓｔ２デコイ−Ｆｃ融合物の阻害
Ｂｓｔ２デコイ−ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質は、Ｂｓｔ２デコイ被覆細胞培養皿へのＵ９３７細胞の結合を濃度に依存して阻害することを示すことから、Ｂｓｔ２デコイ−ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質が有効であることが分かる。
【０３６６】
ＢＳＴ２デコイと細胞との結合性におけるＦｃ融合タンパク質の拮抗阻害を以下のようにして測定した。平底の９６ウェルプレートを、３７℃で２時間、重炭酸ナトリウム（１００ｍＭ，ｐＨ  ９．５）を用いてＢｓｔ２デコイ（５０μｇ／ｍｌ）で被覆した。このプレートを、ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）で洗浄し、２５℃で１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共にインキュベートした。１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）でリンスした後、Ｕ９３７細胞（１×１０６／ｍｌ）を、各Ｂｓｔ２被覆ウェルに添加した。添加前に、細胞を、予め、３７℃で２時間、ＢＳＴ２デコイ−Ｆｃ融合タンパク質とインキュベートした。結合細胞を、実施例２０に記載されるのと同様にして計測した。
【０３６７】
実施例２３−喘息のマウスモデルへのＢｓｔ２デコイ−Ｆｃ融合物の効果
喘息のマウスモデルを実施例８−１に記載されるのと同様にして作製した。
【０３６８】
免疫細胞浸潤へのＢｓｔ２デコイ−Ｆｃ融合物の効果を、実施例８−２に記載されるのと同様にして評価した。オボアルブミンで感作したマウスをＢｓｔ２デコイで処置したところ、全浸潤細胞数が減少し、特に、マクロファージ以外の好中球、好酸球及びリンパ球の数が気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）中で減少した（図２７）。
【０３６９】
ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３の発現を、Ｂｓｔ２デコイまたはＢｓｔ２デコイＦｃ融合タンパク質を注射した後、実施例８−３に記載されるのと同様にして、マウス喘息モデルで測定した。これらのサイトカインレベルが減少していたことから、Ｂｓｔ２デコイタンパク質は喘息に治療効果があることが示唆された（データ示さず）。
【０３７０】
実施例２４−ヒト−マウスキメラＢｓｔ２マウスの作製
ヒト−マウスキメラＢｓｔ２マウスを、図２８に例示されるようなタイプの構築物を用いて作製した。マウス胚幹（ＥＳ）細胞または他のマウス細胞での相同組み換えに使用するために、マウスＢＳＴ２（ＤＡＭＰ−１）の細胞外ドメイン及びＣ末端を、ヒトＢＳＴ２の細胞外ドメイン及びＣ末端に置換したターゲットベクターを示す。適当な相同組み換えとしては、（ｘ）で示される隣接するアーム(flanking arm)での相同組み換えがあり、適当な相同組み換えがなされた細胞は選択に対して耐性を有する（例えば、ネオマイシンまたはＧ４１８または他の選択マーカーが使用される）。適当な相同組み換えがなされた細胞は、具体的なマーカーの一例である、ネオマイシン（Ｇ４１８）での選択後、サザンブロット法またはＰＣＲでクリーニングすることによって選択される。他の選択マーカーを使用してもよい。ターゲットベクター中の、ネオマイシン、または他のマーカーを除くことを目的として、キメラマウスを作製する前にＣｒｅリコンビナーゼの発現ベクターで組み換えＥＳ細胞をトランスフェクトしてもよい、あるいはＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウスとキメラマウスを交配してもよい。キメラマウスは、ノックアウト、ノックインまたは他の型の形質転換マウスを作製するための標準的な技術により組み換えＥＳ細胞を用いて作製することができる。ヒト−マウスキメラＢＳＴ２の細胞外部分はヒトＢＳＴ２の細胞外ドメインと同じであるため、マウスを前臨床試験でヒトＢＳＴ２抗体を試験するのに使用できる。他の選択肢としては、本明細書に記載されるのと同様のストラテジーを用いて、この図に示されるような細胞外ドメインのコーディング領域のみならず、ヒトＢＳＴ２遺伝子のコーディング領域でマウスＢＳＴ２遺伝子の全コーディング領域を置換することがある。
【０３７１】
実施例２５−ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの併用療法を目的とする実験方法
ＨＵＶＥＣｓを、６時間、Ｂｓｔ２  ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたあるいは当該トランスフェクションを行なわないで、１２ウェルプレートで培養した後、２４時間、ＩＦＮγであるいはＩＦＮγなしで処理した。実験によっては、細胞をＢｓｔ２デコイまたはマウス抗ヒトＩＣＡＭ１抗体を含む未精製培地（ｃｒｕｄｅ  ｍｅｄｉａ）で処理した。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した後、Ｕ９３７細胞を２×１０６細胞／ｍｌで血清を含まない培地に再懸濁した。２００μｌのＵ９３７細胞をＨＵＶＥＣｓに最終容積が１ｍｌになるように添加することで、アッセイを開始した。３７℃で４時間後、非結合のＵ９３７細胞を、プレートをＰＢＳで３回洗浄することによって除去した。結合細胞を、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドを添加することによって固定し、結合細胞を様々な視野で顕微鏡下で計測した。Ｅｘｃｅｌですべての統計学的な分析を行ない、統計学的な有意性をＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定で評価した。実験によっては、ＲＮＡサンプルを、ＩＦＮγおよび／またはｓｉＲＮＡｓで処理した後、ＨＵＶＥＣｓから得、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析を行なった。
【０３７２】
実施例２６−結果
図２９から、内因性のＢｓｔ２がＩＦＮγで刺激した後の内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及び単球（Ｕ９３７）間の異型凝集に必要であることが示される。内因性Ｂｓｔ２の遮断が異型凝集の阻害に重要であることを示すために、ＨＵＶＥＣをＢｓｔ２  ｓｉＲＮＡで処理して、ＩＦＮγ処理（１０ｎｇ／ｍｌ、２４時間）前にＢｓｔ２の内因性発現を抑制した。図３０から、Ｂｓｔ２  ｓｉＲＮＡ処理またはＩＣＡＭ１  ｓｉＲＮＡ処理は、それぞれ、ＩＦＮγ処理したＨＵＶＥＣでのＩＣＡＭ１発現またはＢｓｔ２発現に作用しないことが示される。ＲＴ−ＰＣＲ分析を行なった。
【０３７３】
図２９及び３０に示されるように、Ｂｓｔ２及びＩＣＡＭ１双方が細胞接着に関与すると考えられるものの、これらの２つのタンパク質が重複経路でまたは独立した非重複経路でクロストークし、機能するかについては不明である。抗接着分子療法では、冗長経路で機能する２種の接着タンパク質の併用阻害は、非重複経路で機能する２種のタンパク質を用いた場合に比して有効性が低い可能性がある。ＩＣＡＭ１  ｓｉＲＮＡをＢｓｔ２  ｓｉＲＮＡ反応に添加すると（Ｂ＋Ｉ  ｓｉＲＮＡ）、ＩＣＡＭ１  ｓｉＲＮＡはＢｓｔ２発現をさらに減少させないことから、ＩＣＡＭ１はＢｓｔ２発現に必要ではないことが示唆される。同様にして、Ｂｓｔ２  ｓｉＲＮＡをＩＣＡＭ１  ｓｉＲＮＡが仲介する反応に添加すると（Ｉ＋Ｂ  ｓｉＲＮＡ）、ＩＣＡＭ１発現はさらに減少しないことから、Ｂｓｔ２はＩＣＡＭ１発現に必要ではないことが示唆される。これらのデータから、Ｂｓｔ２及びＩＣＡＭ１は非重複経路を介して細胞接着を仲介する可能性があることが示される。
【０３７４】
図３１から、Ｂｓｔ２  ｓｉＲＮＡ及びＩＣＡＭ１  ｓｉＲＮＡによる併用療法が異型接着アッセイで相加効果を示すことが示される。さらに、図３２は、異型接着アッセイにおける抗ＩＣＡＭ１またはＢｓｔ２デコイの用量依存的応答、および抗ＩＣＡＭ１及びＢｓｔ２デコイの用量依存的応答の定量分析を示す。
【０３７５】
図３１中のｓｉＲＮＡ実験に基づいて、マウス抗ヒトＩＣＡＭ１抗体またはＢｓｔ２デコイの存在下で、細胞接着アッセイを行なった。Ｂｓｔ２デコイを含む馴化培地を使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、Ｈｉｓ標識Ｂｓｔ２デコイ及びタンパク質標準物質のバンド強度を比較することによって、未精製細胞上清中のＢｓｔ２デコイの量をおおよそ評価した。
【０３７６】
図３３から、Ｂｓｔ２デコイ及び抗ＩＣＡＭの併用処置が細胞接着において相加効果を示すことが示される。準最適量のＢｓｔ２デコイ（１００ｎｇ／ｍｌ）及び抗ＩＣＡＭ１（１μｇ／ｍｌ）を使用した。細胞接着は、Ｂｓｔ２デコイ及び抗ＩＣＡＭ１双方を使用すると、コントロールレベルにまで完全に阻害された。
【０３７７】
図２９〜３３に示される結果から、Ｂｓｔ２ブロッカー及び他の免疫・炎症性メディエーターのブロッカーによる併用処置は多くの免疫性炎症性疾患の治療に有益である可能性があることが示唆される。ＢＳｔ２ブロッカーと一緒に使用されるこのようなブロッカーとしては、ＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＴＮＦα、ＩＬ６、ＩＬ１、ＬＦＡ１、α４インテグリン、ＩＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１のブロッカーが挙げられる。加えて、Ｂｓｔ２デコイ−Ｆｃまたは抗Ｂｓｔ２と、免疫性炎症性応答を抑制するシクロスポリンまたはグルココルチコイドとの併用処置は、それぞれ、移植状態またはコルチコステロイド処置を必要とする多くの疾患に有益である可能性があることが示唆される。
【０３７８】
ラットまたはマウスモデルにおける前臨床試験では、上記したラットまたはマウスタンパク質（ＴＮＦＲ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ１Ｒ、ＬＦＡ１、α４インテグリン、ＩＣＡＭ１、ＶＣＡＭ１）の多くに対するラットまたはマウスモノクローナル抗体は市販されている（Ａｂｃａｍまたは他の会社）。ＣＴＬＡ４−Ｉｇは、社内で製造しなければならないかもしれない。モノクローナル抗体が市販されていないあるいはモノクローナル抗体を使用することが望ましくない場合のタンパク質ターゲットでは、相当するタンパク質ターゲット、例えば、ＴＮＦＲ−Ｆｃ（可溶性ＴＮＦＲ１）、の可溶性レセプターデコイタンパク質を動物モデルで併用療法に使用してもよい。
【０３７９】
実施例２７−Ｂｓｔ２がそれ自身のリガンドである可能性
Ｂｓｔ２は、活性後にホモ二量体を形成することで知られている。それと一致し、Ｂｓｔ２デコイは、二量体またはそれより多いマルチマーとして発現するようである。このＢｓｔ２の二量体化特性は、Ｂｓｔ２が細胞間相互作用においてそれ自身のリガンドとしての役目をしうる可能性を示唆している。
【０３８０】
この可能性を試験するために、Ｕ９３７細胞を、抗Ｂｓｔ２抗体にインキュベートし、該抗体で処理されたＵ９３７細胞を、インターフェロン処理後ＨＵＶＥＣに添加する。他の実施例においては、Ｕ９３７細胞を、Ｂｓｔ２  ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡで処理し、このｓｉＲＮＡで処理したＵ９３７セルをインターフェロン処理後、ＨＵＶＥＣに添加した。
【０３８１】
仮に、Ｕ９３７細胞上のＢｓｔ２が細胞間相互作用に要求されていたら、抗Ｂｓｔ２またはＢｓｔ２  ｓｉＲＮＡで処理したＵ９３７細胞は、ＨＵＶＥＣに結合し得ない。これらの結果は、Ｕ９３７細胞上のＢｓｔ２がＢｓｔ２Ｌタンパク質の１つとしてのＢｓｔ２を同定するための接着のためＨＵＶＥＣ上のＢｓｔ２に相互作用することを示している。
【０３８２】
実施例２８−ゲノム野生型完全長ｃＤＮＡ（ＧＦＣ）アレイと蛍光光度法を使ったＢｓｔ２  Ｌの同定
Ｂｓｔ２  Ｌは、ＧＦＣ−アレイ（ゲノム野生型完全長  ｃＤＮＡ  アレイ）（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使ってスクリーンすることができる。ＧＦＣ−アレイは、使い捨ての３８４ウェルプレートにアレイ（アレイ）した哺乳類発現ベクター  ｐＣＭＶｓｐｏｒｔ６  （ＧＩＢＣＯ）のトランスフェクションレディ（トランスフェクションレディ）ｃＤＮＡ  プラスミドのセットである。それぞれのウェルは、一本鎖の凍結乾燥されたｃＤＮＡを６２．５ｎｇ、様々な細胞にリバーストランスフェクションするために最適化された濃度を含む。リバーストランスフェクションは、２４，０００を超えるトランスフェクションレディ完全長ヒト  ｃＤＮＡクローンを含む。ＧＦＣアレイはまた、膜貫通タンパクアレイおよび創薬遺伝子（エンザイム遺伝子／どの薬剤がレセプターの標的となるか）のようなヒト遺伝子アレイのサブセットを与える。
【０３８３】
これら２つのサブセットアレイ（またはホールセットアレイ）は、Ｂｓｔ２  デコイ  Ｆｃへの結合活性をスクリーンしうる。端的に言うと、ハイスループットトランスフェクション法によって、個々の遺伝子は、２９３Ｔ、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞またはその他の哺乳類細胞のようなヒト細胞にトランスフェクトされる。Ｆｕ遺伝子６（Ｒｏｃｈｅ）を含む血清−フリー培地２０μｌを、ディスティンクト  ｃＤＮＡ６２．５ｎｇを含む３８４−ウェルプレートのそれぞれのウェルに添加する。２９３Ｔ、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞または他の哺乳類細胞を含む２０％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ培地の４０マイクロリットルをそれぞれのウェルに播種する。
【０３８４】
５％  ＣＯ２の３７°Ｃで４８時間後、最適化された量のＢｓｔ２  デコイ  Ｆｃをそれぞれのウェルに添加し、ＦＩＴＣで標識された抗Ｆｃ抗体で標識する。蛍光は、マイクロプレート蛍光光度法（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ）（３８４  ウェル  フォーマット）を使用して分析する。陽性を示すそれぞれのウェルをＢｓｔ２  デコイ  Ｆｃ  およびコントロールＦｃの両方で再試験する。ＧＦＣ−アレイでスクリーニングした後、それぞれの陽性ウェルを、特定のｃＤＮＡ  プラスミドと標準トランスフェクションして確認する。ＧＦＣ−アレイ中のすべてのｃＤＮＡは、ＯｒｉＧｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）でそれぞれ利用することができる。
【０３８５】
実施例２９−発現クローニングによるＢｓｔ２  Ｌの単離
発現クローニング法は、プラスミドｃＤＮＡ発現ライブラリーと比較するためにＢｓｔ２Ｌのための大量のインビトロ細胞源を同定することが要求される。このｃＤＮＡ発現ライブラリを、パンニング法によりＢｓｔ２  デコイＦｃまたはビオチニル化Ｂｓｔ２  デコイを使って、Ｂｓｔ２  Ｌのためにスクリーニングする。
【０３８６】
実施例２９−１−Ｂｓｔ２Ｌのための大量のインビトロ細胞源（細胞源）の同定
組み換え  Ｂｓｔ２  デコイ−Ｆｃ融合タンパク質は、表面でＢｓｔ２Ｌを大量に発現する推定細胞株または初代細胞を同定するために使用される。様々な細胞株および初代造血細胞をスクリーニングする。使用可能なＢｓｔ２  Ｌのための細胞源は、制限されないが、ヒトＵ９３７細胞、マウス  ＲＡＷ  ２６４．７細胞、初代造血細胞、Ｂ細胞、樹枝状細胞、内皮細胞および線維芽細胞のようなＴ細胞、単核白血球／マクロファージ細胞株を含む。マウスおよびラット細胞株は、ラットＢｓｔ２デコイ−Ｆｃ融合タンパク質およびマウス  Ｄａｍｐ１  デコイ−Ｆｃ融合タンパク質をそれぞれ使用したウェルとしてサーチされる。ヒト  Ｂｓｔ２  デコイおよびマウス  Ｄａｍｐ１  デコイは、図１５および図２７に示すように、細胞接着アッセイおよびインビボオボアルブミン−誘起ぜんそくモデル中で、交互に機能するため、この細胞源株は、使用された細胞株または初代細胞の種に関わらず、マウス  Ｄａｍｐ１  デコイ−Ｆｃおよびヒト  Ｂｓｔ２  デコイ−Ｆｃ融合タンパク質の両方によってスクリーニングされうる。
【０３８７】
ＦＩＴＣ−で標識したヒトＢｓｔ２デコイ−Ｆｃまたはマウス  Ｄａｍｐ１  デコイ−Ｆｃ融合タンパク質で、染色し、次いで、例えば，ヤギＦ（ａｂ’）抗ヒトＩｇＧ二次抗体で二次抗体染色された後、細胞株または初代細胞は、間接免疫蛍光法またはＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別装置）分析によって、Ｂｓｔ２Ｌの存在のためにスクリーニングされる（Ｓｍｉｔｈ  ＣＡ，  Ｇｒｕｓｓ  ＨＪ，  Ｄａｖｉｓ  Ｔ，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  １９９３，  ｃｅｌｌ  ７３，  １３４９−１３６０）。次いで、細胞はＦＡＣＳで分析される。
【０３８８】
実施例２９−２−ＦＩＴＣ−で標識したＢｓｔ２  デコイ−ＦｃのＦＡＣＳ分析を通じた  Ｂｓｔ２  Ｌ  細胞源  の検証
上記のように標識された源細胞株は、コントロールＩｇと比較して、ＦＩＴＣ−で標識したＢｓｔ２  デコイ−Ｆｃに有意で特定の結合を示す。二次抗体単体および精製されたヒト  ＩｇＧ  Ｆｃ  単体は細胞源株の表面に結合しない。これらの結果は、デコイ−Ｆｃの結合は、プローブのＦｃ部ではなく、Ｂｓｔ２またはＤａｍｐ１  デコイ部分に起因していることを示している。さらなる結合特異性を説明するためには、結合は、関係のないコントロールタンパク質ではなく、非結合Ｂｓｔ２デコイによって抑制されるべきである。
【０３８９】
実施例２９−３−１２５Ｉ−Ｂｓｔ２  デコイ（Ｆｃ）によるＢｓｔ２Ｌの可視化を通じたＢｓｔ２  Ｌ細胞源の検証
検証のため、細胞源を過剰の非放射性の  Ｂｓｔ２  デコイ  タンパク質の存在下または非存在下、１２５Ｉ標識の−Ｂｓｔ２デコイまたはＢｓｔ２  デコイ  Ｆｃでインキュベートする。ラクトペルオキシダーゼ法によるヨウ素化の、記載がある（Ｕｒｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：２８７０−２８７７）。次いで、細胞は、架橋剤［ビス（スルホスクシンイミジル）スベリン酸塩］でインキュベートする。
【０３９０】
タンパク質は、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  カクテルで可溶化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにさらし、オートラジオグラフィーで可視化する。細胞株源を見つけ、（実施例２９−１、２９−２および２９−３）に記載のように評価する際、最も明るく染色した細胞源のＦＡＣＳ分析による多くのサイクルの後、数多くのＢｓｔ２  Ｌを発現する変異細胞株を得ることが可能であろう。
【０３９１】
実施例２９−４−パンニングのための細胞株源由来のプラスミド  ｃＤＮＡ  発現ライブラリーの設計
Ｂｓｔ２  Ｌの単離のために、ｃＤＮＡ発現ライブラリーは、上記で同定、確認されたＢｓｔ２  Ｌ細胞源から設計する。指向性（直接的）オリゴ−ｄＴ  プライムドプラスミド  ｃＤＮＡ  ライブラリーは、細胞源ｍＲＮＡによって設計され、哺乳類の発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲートする。
【０３９２】
このライブラリーを１０００クローンのプールに分け、それぞれのプールのプラスミドＤＮＡを得る。ＳｅｅｄおよびＡｒｕｆｆｏ（Ｓｅｅｄ  Ｂ，Ａｒｒｕｆｏ  Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８７，８４：３３６５）の方法およびＬａｃｅｙら（ｃｅｌｌ，９３：１６５，１９８８）の修飾によって、個々のプール由来のＤＮＡをＣＯＳ７細胞にトランスフェクトする。約４８〜７２時間後、約１時間、ヒトＢｓｔ２  デコイ−Ｆｃ  融合物で染色し、洗浄し、パラホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドに固定する。培養物は、アルカリホスファターゼ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ  特異的）抗体などの酵素結合の二次抗体で処理し、免疫複合体を例えば、アルカリホスファターゼ活性をアッセイすることによって検出する。１つの陽性プールを選択し、プラスミド  ＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ形質転換用に調製する。Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換体を、次の濃縮サイクルのために使用する。このサイクルを繰り返すことで、Ｂｓｔ２  Ｌ  タンパク質をエンコードする特有のｃＤＮＡを多く濃縮し、一本鎖ｃＤＮＡクローンを産出することができる。次いで、選択されたプラスミド  ＤＮＡをＣＯＳ７細胞にトランスフェクトし、ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメイン、ヒト  Ｂｓｔ２  デコイ−Ｆｃ融合タンパク質または関係のないＦｃ融合タンパク質のいずれかで免疫染色し、次いでＦＩＴＣ−共役二次抗体と免疫染色する。この段階で、ヒト  Ｂｓｔ２−Ｆｃ融合タンパク質のみ細胞源に結合しうる。これらの結果は、細胞源（または細胞株）がＢｓｔ２  Ｌをエンコードし、細胞表面上でＢｓｔ２  をディスプレーすることを示す。
【０３９３】
他のアプローチにおいては、パンニングプレートを抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ多クローン性抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）でコートし、次いでＢｓｔ２  デコイ−Ｆｃでコートする。ウシ血清アルブミンでブロッキングすることは必須でありうる。次いで、上記の通りＣＯＳ７細胞を、プレートに添加し、接着細胞は、ＥＧＴＡおよびＥＤＴＡと処理することによって懸濁する。パンニング法の残りは上記と同様である。
【０３９４】
実施例２９−５−プローブおよびパンニングとしてのビオチニル化Ｂｓｔ２デコイを使った発現クローニングを通じたＢｓｔ２  Ｌの単離
他のアプローチにおいては、もし細胞源が非常に高いレベルのＢｓｔ２  Ｌを含む場合、Ｂｓｔ２  Ｌ  は、Ｈａｒａｄａらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  １９９０，ＵＳＡ  ８７：８５７）に従うことによってプローブとしてビオチニル化  Ｂｓｔ２  デコイを使って単離できる。この方法においては、ビオチニル化  Ｂｓｔ２  デコイをＢｓｔ２  Ｌを発現する細胞に架橋し、Ｂｓｔ２  Ｌ−発現細胞を抗ビオチン抗体−コートプレート上でパンニングすることによって濃縮することができる。架橋が必須であることが報告されており、それは、架橋なしでは細胞がパンニングプレートに結合しないからでありうる。ｃＤＮＡ  ライブラリーの設計とＣＯＳ７細胞への一過性トランスフェクションは、上記の通り行う（実施例２９−４参照）。４８−７２時間後、細胞は、５  ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳとインキュベートすることによって分離する。ビオチニル化  Ｂｓｔ２  デコイを添加し、細胞と架橋する。架橋された細胞は、抗ビオチン抗体プラスミドでコートされたパンニングプレートに添加する。ＤＮＡは、プレートに結合した細胞から回収され、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換するために用いられる。増幅されたプラスミドＤＮＡは、それが一本鎖クローンを産出するまで、次の濃縮のサイクルのため使用される。次いで、これらのクローンの１によりトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞は、特異的に１２５Ｉ−標識Ｂｓｔ２デコイに結合するであろう。
【０３９５】
実施例２９−６−パンニング後、Ｂｓｔ２  Ｌ  の完全長ｃＤＮＡの単離
発現クローニングにおいて、パンニング後に得られたＤＮＡ挿入物は短く切断されたｃＤＮＡでありうるため、完全長  ｃＤＮＡクローニングは必須である（実施例２９−４および２９−５  参考）。
【０３９６】
市販のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）は、上記手順から選択された短いｃＤＮＡをプローブとして最初に使用することによってサーチする。Ｂｓｔ２Ｌの完全長  ｃＤＮＡは、短いｃＤＮＡをプローブとして使用する細胞源株からｃＤＮＡ  ライブラリーをスクリーンすることによって得られる。細胞源株由来のｍＲＮＡのノーザンブロット分析は、Ｂｓｔ２  Ｌ転写を示しうる。市販のノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）はまた、転写を可視化するために用いられうる。
【０３９７】
完全長  ｃＤＮＡを得た後、ヌクレオチド配列決定を行う。シグナル・ペプチド配列、ポテンシャル（ポテンシャル）キナーゼ  ドメイン、または他の興味深いドメインをサーチする。もしシグナル・ペプチドがヌクレオチド配列中で検出されたら、Ｂｓｔ２  Ｌが培地に放出されているか試験される。Ｂｓｔ２  Ｌは、Ｃ−末端でエピトープ標識し（例えば、血球凝集素）、２９３Ｔ細胞は、Ｂｓｔ２  Ｌ−ｔａｇ  （ＨＡ）のために発現ベクターとトランスフェクトする。細胞抽出物または熟成された培地のウエスタンブロット法は、抗ｔａｇ  （ＨＡ）抗体でプローブされる。熟成された培地に放出された場合、細胞抽出物で観察されるよりも小さいバンドが熟成された培地で検出される。可溶性タンパク親和性精製および可溶性タンパクのＮ−末端配列分析は、切断部位を示す。
【０３９８】
実施例３０−大量の動物組織源（または細胞株）からのラット  Ｂｓｔ２  ＬまたはＤａｍｐ１  Ｌの直接精製およびＢｓｔ２  Ｌへの相同性探索
しかしながら、細胞株（または細胞培養）源は、便利ではなく、または非常に高価であり、生化学的特性および精製のための十分な試料を与えることができない。よって、動物由来の代替組織源を追究しうる。ラット−、イヌ−、ウサギ−Ｂｓｔ２  ＬまたはＤａｍｐ１  Ｌのような動物Ｂｓｔ２Ｌは、あとに続くヒト相同性探索のために最初に同定されうる。ラット、イヌ、ウサギ、マウスまたは他の動物中の大量の組織源を同定した後、動物Ｂｓｔ２  Ｌは、直接精製法を使って同定されうる。この方法の第一段階は、動物中のＢｓｔ２  Ｌの大量のインビボ組織源を同定することである。いずれの動物種を使用しても、下記に記載の方法はラットを使用して説明する。
【０３９９】
ラット組織中のＢｓｔ２−特異的結合活性の分布（分布）は、１２５Ｉ−Ｂｓｔ２  デコイ−ＢＳＡまたはＲＳＡ（ラット血清アルブミン）の取り込み研究によって調査する（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １７４：５１５，１９９１）。下記の方法、糖化最終産物（ＲＡＧＥ）のためのレセプターの単離に使用される方法の修飾は、結合プローブとして１２５Ｉ−Ｂｓｔ２デコイ−ＲＳＡとともに説明される。一旦、取り込み研究がＢｓｔ２  Ｌの主要部位を説明した場合、Ｂｓｔ２  デコイ−ＢＳＡ  セファロース  ４Ｂ  カラムを使った親和性精製段階を含む直接精製は、可溶化され、分画された膜タンパクを使って行う。すべてのカラム分画は、固相Ｂｓｔ２  デコイ  結合アッセイによって結合活性を分析することにより行われる（下記参照）。精製の最終段階で、タンパク質のバンドを除外し、アミノ酸配列分析のために電子溶離を行う。ヒト相同物がサーチされ、後でクローンにされうる。
【０４００】
実施例３０−１−ＢＳＴ２  デコイ  結合活性のインビボ組織分布
１２５Ｉ−標識された  Ｂｓｔ２  デコイ−ＲＳＡ（ラット血清アルブミン）または−ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の離隔を測定することによって、Ｂｓｔ２  Ｌ  のインビボ動物組織源を同定することができる。組織分布研究のため、Ｂｓｔ２−ＲＳＡまたはＢｓｔ２−ＢＳＡで修飾したホルムアルデヒドは、ホルムアルデヒドでＲＳＡまたはＢＳＡをインキュベートすることによる他の研究（Ｈｏｒｉｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６１：４９６２，１９８６）に記載の方法の通り調製する。次いで、タンパク質を放射性ヨウ化する。同様に、通常のＲＳＡまたはＢＳＡを比較比活性度（特異的活性）までヨウ素化する。生まれたて（Ｆｒｅｓｈｌｙ  ｄｒａｗｎ）のラットを５１Ｃｒで標識し、血液関連放射能に関連する組織を補正することを許容する。
【０４０１】
ラット組織におけるＢｓｔ２−特異的結合活性の分布は、１２５Ｉ−Ｂｓｔ２−ＲＳＡ（ＢＳＡ）の取り込み研究によって試験する。１２５Ｉ−Ｂｓｔ２−ＲＳＡ（ＢＳＡ）または１２５Ｉ−ｎｏｒｍａｌ  ＲＳＡ（ＢＳＡ）のいずれかを５１Ｃｒ−標識されたＲＢＣ（赤血球細胞）と共にラットの静脈内に注射する。血液のアリコートを数回のインターバルでドラウンし、様々な臓器を除去し、放射能を照射する。臓器におけるＢｓｔ２  リガンド  取り込みの特異性は、標識されたＢｓｔ２の投与前に、動物に過剰なラベル化していないＢｓｔ２−ＲＳＡ（ＢＳＡ）を注射することによって評価する。ＲＢＣを水に溶解し、タンパク質を２０％  ＴＣＡに沈殿させる。組織・血液アイソトープ率は、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３６：８１３（１９８７）に記載の公式によって計算する。全臓器カウントは、血液に関連するカウントに補正される。
【０４０２】
Ｂｓｔ２−ＲＳＡ（ＢＳＡ）の組織内蓄積は、過度に認識されていないＲＳＡ（ＢＳＡ），の前注射によって、影響されず、その一方で、過度に認識されていないラットの前処置は、臓器において、Ｂｓｔ２−ＲＳＡ（ＢＳＡ）の蓄積を減らす。Ｂｓｔ２−ＲＳＡ（ＢＳＡ）の取り込みは、標識されていないコンペティターを伴い、あるいは、伴わず、他の主な臓器で、少ないまま保持される。これらの基準があった場合、この臓器は、Ｂｓｔ２−結合タンパク質の単離に、リッチなポテンシャル源として示される。
【０４０３】
実施例３０−２固相結合アッセイおよびリガンドブロッティングアッセイを通じたＢｓｔ２  Ｌのインビボ組織源の確認
取り込み研究によって、ＢＳＴ２  デコイ  タンパク質隔離の主要部位と、Ｂｓｔ２  Ｌのポテンシャル組織源を示すと、組織の細胞膜タンパク質は、組織または臓器に特異的な標準プロトコルによって調製される。組織抽出物の結合活性は、下記記載のような固相結合アッセイおよび１２５Ｉ−Ｂｓｔ２  デコイとのリガンドブロッティングアッセイによって説明しうる。これらのアッセイによって、Ｂｓｔ２  Ｌのインビボ組織源の確認と評価をする。
【０４０４】
固相結合アッセイ
固相結合アッセイは、組織からＢｓｔ２の単離を促進することが要求される。界面活性剤で可溶化した細胞膜タンパク質をニトロセルロースに固定化し、１２５Ｉ−Ｂｓｔ２  デコイ−ＲＳＡまたは１２５Ｉ−Ｂｓｔ２  デコイ−Ｆｃに特異的に結合活性のあるリガンドにプローブする。このリガンドは、飽和されている状態で用量依存的に１２５Ｉ−Ｂｓｔ２  デコイと結合し、結合は、Ｂｓｔ２の抗体および／または標識されていないＢｓｔ２  デコイ−ＦｃもしくはＢｓｔ２  デコイによって阻害される。トランスフェクトされた細胞中のＢｓｔ２  Ｌの発現はまた、飽和されている状態で用量依存的に、細胞が１２５Ｉ−Ｂｓｔ２  デコイに結合することを許容する。他の臓器からの様な界面活性剤で可溶化した細胞膜調合液を使って、同じ固相Ｂｓｔ２結合アッセイは、Ｂｓｔ２Ｌのインビボ源を確認するように挙動しうる。
【０４０５】
同定された組織源からＢｓｔ２  Ｌを可視化するためのリガンドブロッティングアッセイ
同定された組織源からＢｓｔ２  Ｌ  バンドを可視化するためのリガンドブロッティングアッセイが行われる。Ｂｓｔ２Ｌの同定された組織源から得られるタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動的に分離し、１２５Ｉ−ＢＳＴ２−ＢＳＡ（またはＢｓｔ２  デコイ  Ｆｃ）でインキュベートされたニトロセルロース細胞膜にし、リガンド結合は、オートラジオグラフィーによって評価される。
【０４０６】
実施例  ３０−３−インビボ組織源の可溶化した細胞膜調合液からのＢｓｔ２  Ｌの直接精製
上記の通り、Ｂｓｔ２  Ｌのインビボ組織源の同定および確認後、Ｂｓｔ２  Ｌの直接精製は、Ｂｓｔ２  Ｌ  活性をモニタリングするように固相  Ｂｓｔ２  デコイ  結合  アッセイ（実施例３０−２  参照）を使って行うことができる。動物組織（実施例３０−１）またはＢｓｔ２  Ｌ  細胞源株（ヒトまたは他の種）（実施例２９−１）からの細胞膜調合液を使用する。カラムクロマトグラフィーおよび親和性クロマトグラフィーを含む様々な精製工程を使うことができる。ＤＥＡＥカラムまたはセファデックスカラムのような１または２のクルード精製工程後、親和性精製のためにＢｓｔ２（Ｂｓｔ２  デコイ）−ＢＳＡ  セファロース  ４Ｂ  カラムを採用することが好ましい。親和性カラムに結合したタンパク質を溶離し、濃縮し、１２５Ｉ−Ｂｓｔ２（Ｂｓｔ２  デコイ）−ＢＳＡ結合活性の分析をする。続いて、準備の電気泳動法を行う。タンパク質バンドを除去し、Ｎ−末端アミノ酸配列分析のために電気泳動溶出を行う。ヒト相同物は、ラット、イヌまたはウサギ  Ｂｓｔ２  Ｌ  配列またはマウス  Ｄａｍｐ１Ｌ配列に基づいて同定することができる。
【０４０７】
実施例３１−酵母２−ハイブリッド系を通じたＢｓｔ２Ｌの単離
Ｂｓｔ２  Ｌは、酵母Ｓ．セレヴィシエ中のＧＡＬ４転写活性化因子の再構成に依存する酵母２−ハイブリッド系を使って単離する（Ｆｉｅｌｄｓ  Ｓ  ａｎｄ  Ｓｏｎｇ  ＯＫ，  １９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６）。例えば，活性ヒトＴ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から得られる市販のライブラリーは、市販の酵母  ２−ハイブリッドキットを使ってＢｓｔ２の細胞外のドメインを含む餌でスクリーニングできる。
【０４０８】
実施例３２−インビトロ結合アッセイを通じた単離されたＢｓｔ２  Ｌの検証
上記単離されたＢｓｔ２  Ｌ（実施例２８−３１）は、特異的にＢｓｔ２（Ｂｓｔ２  デコイ）インビトロに結合する。Ｂｓｔ２（Ｂｓｔ２  デコイ）−Ｂｓｔ２  Ｌ相互作用は、たくさんの異なるアッセイによって決定することができ、このようなアッセイの様々な実施例は、下記に記載の通りである。ある態様においては、ＣＯＳ７細胞は、完全長  ｃＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトされ、過度に標識されていない  Ｂｓｔ２  デコイ（Ｂｓｔ２  デコイ−Ｆｃ）または関連のないタンパク質（関連のないタンパク質−Ｆｃ）の存在下または非存在下、１２５Ｉ−標識されたＢｓｔ２  デコイ−Ｆｃの様々な濃度でインキュベートされる。
【０４０９】
標識されていない  Ｂｓｔ２  デコイ  （Ｂｓｔ２  デコイ  Ｆｃ）は、完全に放射性標識  Ｂｓｔ２  デコイ−Ｆｃの結合を阻害する。これらの結果は、物学的に活性なＢｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイまたはＢｓｔ２デコイ−Ｆｃに特異的に結合するＢｓｔ２  Ｌを示唆しうる。続いて、結合データは、上記述べたとおり、細胞ごとの親和性と部位の数を決定するために分析される（Ｍｕｎｓｏｎ  ＰＪ，Ｒｏｄｂａｒｄ  Ｄ，１９８０，Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｌ  １０７：２２０−２３９）。
【０４１０】
他の態様において、Ｂｓｔ２−Ｂｓｔ２Ｌ  相互作用は、ＦＡＣＳ分析によって決定できる。２９３  細胞、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞は、一過性にＢｓｔ２  Ｌとトランスフェクトされる。２４−４８時間後、細胞は、１時間組み換えたビオチニル化Ｂｓｔ２  デコイ  Ｆｃとインキュベートされる。細胞はさらにフィコエリトリン−共役ストレプトアビジン  （Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）と３０分インキュベートされ、蛍光活性細胞分類（ＦＡＣＳ）で分析される。
【０４１１】
他の態様では、Ｂｓｔ２−Ｂｓｔ２  Ｌ  相互作用は、免疫共沈降アッセイによって決定されうる。精製された  Ｂｓｔ２  Ｌは、Ｂｓｔ２デコイＦｃによってインキュベートされ、タンパク質Ａセファロースで免疫沈降される。沈殿物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって溶解され、抗Ｂｓｔ２  Ｌで免疫ブロットすることによって可視化される。
【０４１２】
他の態様では、組み換えＢｓｔ２  Ｌが産生され、例えばＥ．ｃｏｌｉおよび１２５Ｉ−標識されたＢｓｔ２  Ｌは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、Ｂｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイまたはＢｓｔ２  デコイ−Ｆｃの野生型、欠失変異体およびノンレデューシング（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ）後のナイロンフィルターに固定したコントロールタンパク質にさらされる。１２５Ｉ−標識されたＢｓｔ２  Ｌは、Ｂｓｔ２タンパク質を認識する。このアッセイは、Ｂｓｔ２−Ｂｓｔ２  Ｌ  インビトロの直接的な結合を確認する。Ｂｓｔ２、Ｂｓｔ２  デコイまたはＢｓｔ２  デコイＦｃタンパク質の様々な欠失変異体が採用される際、Ｂｓｔ２Ｌに結合するＢｓｔ２の結合ドメインもまた決定される。
【０４１３】
実施例３３−単離されたＢｓｔ２  Ｌのインビトロ機能
組み換えＢｓｔ２  Ｌにより処理された細胞は、炎症反応を導きうる。ＨＵＶＥＣＳを含む細胞は、組み換えＢｓｔ２  Ｌ、インターフェロン・ガンマを含む炎症性サイトカインまたはＢｓｔ２  Ｌおよびサイトカインの組み合わせにより処理される。
【０４１４】
これらの細胞のサイトカイン産生およびこれらの細胞へのＵ９３７接着を測定する。Ｂｓｔ２単独または炎症性サイトカインとの組み合わせは、炎症反応をエンハンスし、細胞−細胞接着し、Ｂｓｔ２デコイまたはＢｓｔ２  デコイ−Ｆｃは、インビトロでこれらの硬化を阻害することが期待される。同様に、Ｔ細胞活性および増殖アッセイは、Ｂｓｔ２  Ｌのインビトロ機能試験に使える。これらのデータは、Ｂｓｔ２  Ｌが直接的に細胞間相互作用の媒介をし、Ｂｓｔ２およびＢｓｔ２  Ｌは、免疫炎症反応の主要調節因子であることを示唆する。これらのアッセイは、ラットまたはマウス細胞を使って、ヒトＢｓｔ２  Ｌがラットまたはマウス系で機能するか調べるために継続することができる。これらのデータは、Ｂｓｔ２  Ｌが直接的に細胞間相互作用を媒介し、Ｂｓｔ２およびＢｓｔ２  Ｌが免疫−炎症反応の主要調節因子であることを示唆する。
【０４１５】
実施例３４−単離されたＢｓｔ２  Ｌのインビボ機能
マウスまたはラットに、組み換え  Ｂｓｔ２Ｌ、Ｄａｍｐ１Ｌまたはラット  Ｂｓｔ２  Ｌを注射する。注射の後、サイトカイン放出のようなインビボ炎症パラメーターを評価する。Ｂｓｔ２  Ｌ（Ｄａｍｐ１Ｌ）注射が炎症性の反応を引き起こすことが予想される。これらの炎症反応は、Ｂｓｔ２（Ｄａｍｐ１）デコイＦｃまたは抗Ｂｓｔ２（Ｄａｍｐ１）抗体注射によって阻害される。他のアプローチでは、抗Ｂｓｔ２  Ｌ抗体はまた、抗炎症効果を示す。かような抗Ｂｓｔ２  Ｌ抗体は、Ｂｓｔ２−Ｂｓｔ２  Ｌ相互作用を阻害する他の治療薬として使用できる。
【０４１６】
実施例３５−Ｂｓｔ２  リガンドの生化学的および生物学的特性
単離されたＢｓｔ２  Ｌは、以下の生物学的基準を満たす。
【０４１７】
完全長  Ｂｓｔ２  Ｌ  タンパク質  ＣＯＳ７細胞の結合特性の測定は、完全長ｃＤＮＡを含む発現ベクターとトランスフェクトされ、様々な濃度の１２５Ｉ−標識されたＢｓｔ２  デコイ−Ｆｃでインキュベートされ、細胞結合の放射能が測定される。過度に認識されていない  Ｂｓｔ２またはＢｓｔ２  デコイ−Ｆｃであって、関連のないタンパク質または関連のないタンパク質−Ｆｃとの競争は、放射性標識Ｂｓｔ２デコイ−Ｆｃの結合を完全に阻害する。これらの結果は、Ｂｓｔ２  Ｌが物学的に活性なＢｓｔ２、Ｂｓｔ２デコイまたはＢｓｔ２デコイ−Ｆｃに特異的に結合することを示唆する。結合データを分析し、Ｍｕｎｓｏｎ  ＰＪ，  Ｒｏｄｂａｒｄ  Ｄ，１９８０，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｌ  １０７：２２０−２３９に記載のような、細胞ごとの親和性と部位の数を決定する。
【０４１８】
プローブとしての１２５Ｉ−標識されたＢｓｔ２  Ｌを使ったＢｓｔ２のリガンド−結合ドメインの決定
組み換えＢｓｔ２  Ｌが産生され、例えば，Ｅ．ｃｏｌｉおよび１２５Ｉ−標識されたＢｓｔ２  Ｌは、Ｃｈｅｎらの文献（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２８７４−２８７８）に記載のように、Ｂｓｔ２またはＢｓｔ２デコイ−Ｆｃおよびノンレデューシング（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ）後のナイロンフィルターに固定したコントロールタンパク質にさらされる。
【０４１９】
実施例３６−Ｂｓｔ２／Ｄａｍｐ１配向Ｆａｂライブラリーの構築
ＣＨＯ細胞中で発現するヒト  Ｂｓｔ２−デコイまたはマウスＤａｍｐ１−デコイタンパク質は、Ｂｓｔ２／Ｄａｍｐ１抗原に特異的な抗体タイターの飽和まで、アジュバント（ＲＩＢＩ’ｓまたはＦｒｅｕｎｄ’ｓ  非完全／完全）の適量の注射によって、ウサギ（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ）に接種した。接種されたウサギの抗体タイターは、デコイタンパク質のＣ−末端でヒスチジン標識を認識する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−共役抗Ｈｉｓ抗体を使った酵素免疫測定法によって決定した。
【０４２０】
Ｆａｂ−ファージ提示法ライブラリーの調合液のために、総ＲＮＡを、ＴＲＩ試薬を使って接種したウサギの骨髄および脾臓  から調製した。Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡは、オリゴ（ｄＴ）プライミング  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使ったＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍを使って合成した。それぞれのウサギ由来のｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡをＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使って、１回目のＰＣＲを行い、ウサギのＶＬコーディング配列の増幅のため１０プライマーの組み合わせおよびウサギのＶＨコーディング配列の増幅のための４プライマーの組み合わせを使用した。ヒトＣκおよびＣＨ１コーディング配列は、Ｆａｂから増幅した。アンチセンスのプライマーは、ヒトＣｋへのウサギのＶＬおよびＶＨコーディング配列と、ＣＨ１コーディング配列とを融合するために設計されたハイブリッドウサギの／ヒト配列から構成される。２回目のＰＣＲでは、１回目の可変領域  ウサギのＶＨは、ヒトコンスタントＣＨ１とオーバーラップし、１回目の可変領域ウサギのＶＬは、ヒトコンスタントＣκとオーバーラップした。３回目のＰＣＲでは、キメラの軽鎖産生物およびキメラの重鎖フラグメントをオーバーラップ延長ＰＣＲによって結合した。
【０４２１】
【表５−１】
2009536952.tif 000006
【０４２２】
【表５−２】
2009536952.tif 000007
【０４２３】
【表６】
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【０４２４】
ＳｆｉＩとダイジェストした結果のＰＣＲ産生物は、ファージミッドベクターｐＣｏｍｂ３Ｘ（遺伝子バンク  ＡＦ２６８２８１）にライゲートし、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／Ｆ’にトランスフォームした。ヘルパーファージＶＳＣＭ１３の吸収後、続いてＰＥＧおよびＮａＣｌを添加した後、ファージライブラリーを一晩培養した培地から得た。
【０４２５】
実施例３７−抗Ｂｓｔ２または抗Ｄａｍｐ１抗体のＦａｂライブラリーのパンニング
トータル４回目のパンニングを行った。Ｂｓｔ２およびＤａｍｐ１への高い親和性抗体クローンのために、得られたキメラのＦａｂファージライブラリーを使ったダイナルビーズ（ＤＹＮＡＬ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１４３．０１）パンニング法を使用した。
【０４２６】
ダイナルビーズ  Ｍ２７０  エポキシを３７℃で６〜２４時間Ｂｓｔ２  デコイ、Ｄａｍｐ１デコイまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でコーティングした。Ｂｓｔ２デコイでコートしたビーズは、ＰＢＳ（１．０６ｍＭ  第１リン酸カリウム、１５５．１７ｍＭ  塩化ナトリウム、２．９７ｍＭ  第二リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）とＰＢＳ中で０．５％トゥイーンで洗浄し、ＰＢＳ中で０．５％ＢＳＡを懸濁した。非特異的結合の除去のため、Ｂｓｔ２  ファージライブラリーをＢＳＡでコートしたビーズで、事前のインキュベートを行った。事前の洗浄を行ったファージプールは、室温で２時間Ｂｓｔ２−ビーズでインキュベートし、非特異的結合ファージの除去のため磁気分離法によって数回ＰＢＳ中で０．５％  トゥイーン２０で洗浄した。特異的結合ファージは、１０分間  ２回、０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム  （ｐＨ３．０、０．４５ｍｌ）のインキュベーションによって溶離し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ９．５、０．１ｍｌ）を添加して中和した。溶離したファージは、対数的に成長するＸＬ１−Ｂｌｕｅ  Ｆ’にインフェクトし、一晩ヘルパーファージＶＳＣＭ１３によって増幅した。ファージは、４％  ＰＥＧおよび３％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）で沈殿によって調製し、ＰＢＳバッファ中で１％  ＢＳＡおよび０．０２％  ＮａＮ３で懸濁させた。それぞれの回数のアウトプットファージプールを抗ＨＡ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ  Ｎｏ  ２  ０１３  ８１９）．を使用してファージ  ＥＬＩＳＡでモニターした。Ｄａｍｐ１  デコイ特異的ファージプールは、上記のＢｓｔ２  特異的なものと同じプロトコルで選択した。
【０４２７】
実施例３８−Ｂｓｔ２とＤａｍｐ１との両方に特異的な抗体のＦａｂ  ライブラリーのスクリーニング
Ｂｓｔ２およびＤａｍｐ１の両方とクローンに反応する選択のため、一本鎖ファージクローンは、３０ｇ／ｍｌ  テトラサイクリン、５０ｕｇ／ｍｌカルベニシリンおよび１％  グルコースを含む２ｘＹＴ培養液中で接種し、３７℃で一晩培養した。培養浮遊物は、９６  ディープウェルプレート上で、３０ｇ／ｍｌ  テトラサイクリン、５０ｇ／ｍｌ  カルベニシリン  ２ｘＹＴを含む培養液で準培養し、ヘルパーファージ  ＶＳＣＭ１３およびカナマイシンを使って増幅した。一晩培養後、ファージ浮遊物は、３０００ｒｐｍで３０分、遠心分離で得、ＥＬＩＳＡフォーマット中のＢｓｔ２／Ｄａｍｐ１結合アッセイで使用した。９６ウェル  マキシソーププレート（Ｎｕｎｃ）上のそれぞれのウェルは、一晩  ４℃でＢｓｔ２  デコイまたはＤａｍｐ１デコイ１ｇでコートし、３７℃、２時間、ＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で５％  ＢＳＡのインキュベーションで阻害した。続いて、ファージ浮遊物１００μｌを１時間３７℃で添加した。それぞれのウェルは、ＴＢＳ（７．４ｐＨ）中で０．０５％  トゥイーン２０で洗浄し、３７℃１時間西洋ワサビペルオキシダーゼ共役抗ＨＡ抗体１００μｌとともに添加した。上記洗浄後、２００ｌ  ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン  二塩酸塩、０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）溶液を添加し、その後、停止液としての３Ｍ  硫酸（５０μｌ）を５０ｕｌ添加した。結果を図３６に示す。
【０４２８】
実施例３９−選択した抗体の発現
上記で得られた陽性ファージ  クローンは、ＤＮＡシークエンシングによって分析し、配列アラインメントに基づいて選択した。図３７参照。
【０４２９】
全体的なＩｇＧ１フォーム中の発現のために、それぞれのファージ  Ｆａｂ  ＤＮＡ  フラグメントは、ｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来の発現ベクター  ｐＣＤＨおよびｐＣＤＫにクローニングした。ｐＣＤＨは、完全長  ＩｇＧ重鎖の発現の中間クローニングベクターである。ＥｃｏＲ１およびＮｏｔ１の制限酵素で消化した後、ｐｃＤＮＡ３．１のＥｃｏＲ１、Ｎｏｔ１部位にクローニングされたプライマーＲ１−ＣＨ１及びＣＨ３−Ｎｏｔ１を用いて、全血細胞のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅した。分泌型全長ＩｇＧ重鎖は、ｔＰＡシグナルを第１ＰＣＲすることによってオーバーラップＰＣＲクローニングを通じて、重鎖可変領域にｔＰＡ５’のための分泌シグナルを融合することによって、再構築した。
【０４３０】
上述で用いられたライブラリーからのプライマーＲ１−ｔＰＡ５およびｔＰＡ３を用いて、ｔＰＡシグナルペプチドに対して最初のＰＣＲを行い、Ｈｅａｖｙ＿ＣＨ１＿Ｒｅｖおよび可変領域に特異的なプライマー（Ｒａ＿Ｈｖ＿Ｆｗ１からＲａ＿Ｈｖ＿Ｆｗ９）を用いて、Ｆａｂ断片を発現するために用いられるファジェミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）由来の可変領域およびＣＨ１に対してＰＣＲを行うことによる、オーバーラップＰＣＲクローニングを通じて、重鎖可変領域に対してｔＰＡ５’に対する分泌シグナルを融合することによって、分泌型全長ＩｇＧ重鎖が構築された；これらの２つのＰＣＲ断片は、次いでプライマーＲ１−ｔＰＡ５およびＨｅａｖｙ＿ＣＨ１＿Ｒｅｖを用いたオーバーラップＰＣＲ反応物を通じて融合され、ＥｃｏＲ１およびＡｇｅ１で消化され、同じ酵素で消化されたｐＣＤＨ中にクローン化された。
【０４３１】
ｐＣＤＫは、プライマーＨ３−ｌｉｇｈｔおよびｌｉｇｈｔ−Ｘｂａ１を用いた軽鎖をクローニングするＰＣＲ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩでのＰＣＲ生産物の消化、および同じ酵素で消化したｐｃＤＮＡ３．１中にクローニングすることによって作製されるｌｇＧ軽鎖の発現用媒介ベクターである。上述で用いられたライブラリーからのプライマーＲ３−ｔＰＡ５およびｔＰＡ３を用いて、ｔＰＡシグナルペプチドに対して最初のＰＣＲを行い、可変領域（Ｒａ＿Ｋｐ＿Ｆ１から６およびＲａ＿Ｋｐ＿Ｒｖａからｄ）に対する特異的プライマー対を用いて、Ｆａｂ断片を発現するために用いられるファジェミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）由来の可変領域およびＣＫに対してＰＣＲを行うことによる、オーバーラップＰＣＲクローニングを通じて、軽鎖可変領域に対してｔＰＡ５’に対する分泌シグナルを融合することによって、分泌型全長ＩｇＧ軽鎖が構築された；これらの２つのＰＣＲ断片は、次いでプライマーＨ３−ｔＰＡ５および特異的軽鎖３’プライマーを用いたオーバーラップＰＣＲ反応物を通じて融合され、ＨｉｎＤＩＩＩおよびＢｓｉＷＩで消化され、同じ酵素で消化されたｐＣＤＫ中にクローン化された。
【０４３２】
【表７−１】
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【０４３３】
【表７−２】
2009536952.tif 000010
【０４３４】
全ＩｇＧ１フォームにおける発現のため、それぞれのファージ  Ｆａｂ  ＤＮＡ  フラグメントを、発現ベクター  ｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。上記選択した単クローン抗体（ｍＡｂ，ＩｇＧ１）を発現させるために、ベクターＤＮＡを一過的または安定的に哺乳類細胞に導入した。一過性トランスフェクションを以下の通り、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）を沈殿させることによって行った。トランスフェクションの１日前に２９３Ｔ（ＡＴＣＣ）７×１０６細胞を蒔き、１５０−ｍｍ細胞培養プレート上で培養した。トランスフェクションの１日前に培地を２％胎児のウシ血清（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を添加したＩＭＤＭ媒体（Ｃａｍｂｒｅｘ）と交換した。
【０４３５】
１．５ｍｌに７５μｇ  ＤＮＡおよび２５０ｍＭカルシウムを含む、バッファ（１ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を等体積のＨＥＰＥＳバッファ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０５）と混合した。混合物を、室温で約１分インキュベートし、事前に培養した細胞に適用した。細胞を３７°Ｃで６時間ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。
【０４３６】
ＤＮＡ／カルシウム溶液を除去した後、細胞を無血清培地に添加し、さらに７２時間以上培養し、培地を採取した。それぞれのｍＡｂを、タンパク質親和性クロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ）を使用して培養した培地から精製した。培養した培地を、ＰＢＳバッファ（１．０６ｍＭ  第１リン酸カリウム，１５５．１７ｍＭ  塩化ナトリウム、２．９７ｍＭ  第二リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）と平衡のタンパク質−充填カラムに予めロードした。カラムを、約２０カラム体積のコンタミを除去すべくＰＢＳバッファで洗浄した。結合抗体を、段階的な勾配を使用した５０ｍＭ  グリシン−ＨＣｌのような低いｐＨのバッファで溶離し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）と同等の体積で中和した。精製されたタンパク質サンプルを４−２０％ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ（４−２０％  ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でゲル電気泳動を行った。ゲル中の精製されたタンパク質の図３８を参照。
【０４３７】
実施例４０−比較結合アッセイ（インビトロ）
ＢＳＴ２  デコイおよび細胞間の結合でＢｓｔ２またはＤａｍｐ１に特有なｍＡｂｓの比較抑制を実施例２２のように測定した。
【０４３８】
実施例４１−ぜんそくのマウスモデル上のｍＡｂｓの効果
ぜんそくのマウスモデルを実施例８−１に記載のように準備した。免疫細胞浸潤上の抗Ｂｓｔ２／Ｄａｍｐ１抗体の効果を実施例８−２に記載のように評価した。オボアルブミンが感作したマウスおよびそれぞれのｍＡｂで処置したマウスにおいて、抗Ｂｓｔ２／Ｄａｍｐ１  抗体の処理後、浸潤性細胞の総数は気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）において増加した（図３９）。抗Ｄａｍｐ１  抗体２−１５は有意に、免疫細胞浸潤を阻害しなかった。可能性の１つは、２−１５単クローン抗体がＤａｍｐ１デコイに強く結合し、ポテンシャル  Ｄａｍｐ１Ｌ結合部位に正確にカバーしないことである。
【０４３９】
実施例４２−炎症状態を測定する診断法
Ｂｓｔ２  ｍＲＮＡ発現は、炎症状態で減少する。目的物から単離された細胞および組織中の定量ＰＣＲ  リアルタイムＰＣＲまたはノーザンブロットを使ったＢｓｔ２  ｍＲＮＡ  ｌｅｖｅｌの測定は、これらの細胞および組織の炎症状態の有益な情報を産出する。Ｂｓｔ２に特有な抗体を使った免疫ブロッティングまたは代替として、細胞膜上でＢｓｔ２と結合することができる蛍光で−標識された抗体を使った、免疫蛍光顕微鏡およびＦＡＣＳ（蛍光活性細胞分別機）を使った疫ブロッティングによるＢｓｔ２タンパク質の測定はまた、これらの細胞の炎症状態に関する情報を産出することができる。頻繁にＢｓｔ２のような細胞膜タンパク質が固着され、体の中で循環する可溶性のＢｓｔ２  フラグメントを生む。体の中で循環する血清および尿などのＢｓｔ２は、放射性免疫的アッセイ（ＲＩＡ）およびＥＬＩＳＡのような一般的に使用されている方法を使って、Ｂｓｔ２  フラグメントを循環するために特有な抗体で定量できる。Ｂｓｔ２フラグメントを循環するための定量化は、ホストの炎症状態を反映し、診断および治療目的に有用でありうる。本明細書中引用したすべての引用は、明細書全体で参考として取り入れられる。
【０４４０】
当業者は、少なくとも日常の実験を認識し、探究でき、本明細書中で記載された発明の実施形態と同等のものを有する。このような同等のものは、本クレームの範囲内に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０４４１】
【図１】図１は、ヒトＢｓｔ２およびマウスＤａｍｐ１間の配列相同性を示すアミノ酸配列アラインメントである。
【図２】図２Ａ−２Ｂは、発現ベクター中のヒトＢｓｔ２デコイおよびマウスＤａｍｐ１デコイをクローニングする工程で用いられるＰＣＲプライマーの配置を示す。
【図３】図３Ａ−３ＢはヒトＢｓｔ２デコイおよびマウスＤａｍｐ１デコイの電気泳動分析の結果を示す。
【図４】図４は、Ｕ９３７細胞の同型凝集間のＢｓｔ２遺伝子の発現パターンを示す。
【図５】図５は、Ｕ９３７細胞の同型凝集の際のＢｓｔ２過剰発促進効果を示す。
【図６】図６Ａ−６Ｅは、Ｕ９３７細胞の同型凝集の際のＢｓｔ２デコイの効果を示す。
【図７】図７Ａ−７Ｇは、ヒト血管内皮（ＨＵＶＥＣ）細胞およびＵ９３７細胞間の細胞間接着の際のＢｓｔ２デコイの効果を示す。
【図８】図８Ａ−８Ｆは、ＨＵＶＥＣおよびＵ９３７細胞間の細胞間接着の際の用量依存的なＢｓｔ２デコイの効果を示す。
【図９】図９Ａ−９Ｇは、ＨＵＶＥＣおよびＵ９３７細胞間の細胞間接着の際のＢｓｔ２  ｓｉＲＮＡの効果を示す。
【図１０】図１０Ａ−１０Ｂは、Ｊｕｒｋａｔ細胞の凝集時のＢｓｔ２過剰発現およびＪｕｒｋａｔ細胞中のインターロイキン−２（ＩＬ−２）産生の効果を示す。
【図１１】図１１Ａ−１１Ｉは、Ｊｕｒｋａｔ細胞凝集の際のＢｓｔ２デコイおよびＢｓｔ２  ｓｉＲＮＡの効果を示す。
【図１２】図１２Ａ−１２Ｂは、Ｊｕｒｋａｔ細胞の凝集およびＩＬ−２産生におけるＢｓｔ２デコイの効果を示すグラフである。
【図１３】図１３は、Ｂｓｔ２デコイ処理時の沈降した免疫細胞数の変化を示す。
【図１４】図１４は、Ｂｓｔ２デコイ処理時の減少したサイトカインのレベルを示す。
【図１５】図１５Ａ−１５Ｄは、ヒトＢｓｔ２およびマウスＤａｍｐ１間の機能的類似性を示す。
【図１６】図１６Ａ−１６Ｄは、マウスのオボアルブミン誘発性喘息におけるＢｓｔ２デコイおよびマウスＤａｍｐ１デコイの阻害効果を示す。
【図１７】図１７は、Ｂｓｔ２デコイのＰＥＧ−結合型の準備に用いられるＰＥＧ部分を示す。
【図１８】図１８は、ＰＥＧ−結合Ｂｓｔ２デコイの向上した代謝低下を示す。
【図１９】図１９は、炎症関連疾患におけるＢｓｔ２の発現および分布を示す。
【図２０】図２０Ａ−２０Ｄは、Ｆｃ領域に融合したＢｓｔ２デコイの概略図を示す。Ａ、Ｂｓｔ２デコイ自身；Ｂ、ＩｇＧ重鎖Ｆｃのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分に融合したＢｓｔ２デコイ；Ｃ、自然に起こったＩｇＧ  κ鎖−重鎖ジスルフィド結合を通じて安定化されるＢｓｔ２融合タンパク質；Ｄ、Ｂｓｔ２デコイ−ＩｇＧ  Ｆｃは、他のＢｓｔ２二量体がなく発現された。
【図２１−１】図２１Ａ−２１Ｂは、図２０のＢｓｔ２デコイ−ＩｇＧ  Ｆｃ  融合タンパク質の代表的ベクターマップである。
【図２１−２】図２１Ｃ−２１Ｄは、図２０のＢｓｔ２デコイ−ＩｇＧ  Ｆｃ  融合タンパク質の代表的ベクターマップである。
【図２２】図２２は、ＰＣＲ−クローニングおよび融合戦略を示す。
【図２３】図２３Ａ−２３Ｂは、精製されたＢｓｔ２デコイおよび他のＦｃ融合物のＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を示す。Ａ、アフィニティ精製した種々のＢｓｔ２融合タンパク質を表す、クマシーで染色された代表的ＰＡＧＥゲル（４〜１２％  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。Ｂ．サイズ排除クロマトグラフィー後のＰＡＧＥ。
【図２４】図２４Ａ−２４Ｂは、Ｂｓｔ２コーティングプレート；およびＢ、ＢＳＡコーティングプレート上の免疫細胞に対するＢｓｔ２デコイの直接結合性を示す。
【図２５】図２５は、Ｂｓｔ２デコイまたはＦｃ融合物の血漿中半減期を示す。
【図２６】図２６は、Ｂｓｔ２デコイおよび細胞間の結合におけるＢｓｔ２デコイ−Ｆｃ融合物の阻害効果を示す。
【図２７】図２７Ａ−２７Ｄは、喘息のマウスモデルにおけるＢｓｔ２デコイ−Ｆｃ融合物の効果を示す。
【図２８】図２８Ａ−２８Ｂは、ヒト−マウスキメラＢｓｔ２マウスの作製を示す。Ａ．マウス（上、黒）およびヒト（下、グレー）のゲノム遺伝子座。エクソンは、長方形ボックスとして示される。膜貫通領域の終点は矢印で示され、開始メチオニン（ＡＴＧ）は星印で示される。エクソンをコードする全域の物理的距離は、ゲノム遺伝子座の下に示される。図は、一定縮尺では描かれていない。Ｂ．キメラヒト−マウスＢＳＴ２の作製戦略。
【図２９】図２９Ａ−２９Ｅは、ＩＦＮγで刺激後の内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）および単球細胞（Ｕ９３７）間の異型凝集に内在性Ｂｓｔ２が必要であることを示す。Ａ、コントロール；Ｂ、ＩＦＮγ炎症刺激；Ｃ、ＩＦＮγ炎症刺激＋コントロールｓｉＲＮＡ；Ｄ、ＩＦＮγ炎症刺激＋Ｂｓｔ２  ｓｉＲＮＡ；Ｅ、Ａ−ＤのＢｓｔ２  ｓｉＲＮＡ結果の定量分析。
【図３０】図３０は、Ｂｓｔ２  ｓｉＲＮＡ処理またはＩＣＡＭ１  ｓｉＲＮＡ処理が、ＩＦＮγ処理ＨＵＶＥＣにおいてＩＣＡＭ１発現またはＢｓｔ２発現のそれぞれに影響を与えないことを示す。ＲＴ−ＰＣＲ分析が行われた。
【図３１】図３１Ａ−３１Ｇは、Ｂｓｔ２  ｓｉＲＮＡおよびＩＣＡＭ１  ｓｉＲＮＡの組合わせ処理を示し、異型接着アッセイにおける相加効果を示す。Ａ、コントロール；Ｂ、ＩＦＮγ炎症刺激；Ｃ、ＩＦＮγ炎症刺激＋コントロール  ｓｉＲＮＡ；Ｄ、ＩＦＮγ炎症刺激＋Ｂｓｔ２  ｓｉＲＮＡ；Ｅ、ＩＦＮγ炎症刺激＋ＩＣＡＭ１  ｓｉＲＮＡ；Ｆ、ＩＦＮγ炎症刺激＋ＩＣＡＭ１  ｓｉＲＮＡ＋Ｂｓｔ２  ｓｉＲＮＡ；Ｇ、Ａ−ＦからのＢｓｔ２  ｓｉＲＮＡおよびＩＣＡＭ１  ｓｉＲＮＡ結果の定量分析。
【図３２−１】図３２Ａ−３２Ｍは、異型接着アッセイにおける抗−ＩＣＡＭ１またはＢｓｔ２デコイの用量依存反応を示す。Ａはコントロールを示す；Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦは、ＩＦＮγ炎症刺激＋ＩＣＡＭ−１抗体の増加していく投与量を示す；Ｇは、ＩＦＮγ炎症刺激＋コントロールＢＳＡを示す；Ｈは、ＩＦＮγ炎症刺激＋コントロールＩｇＧを示す；Ｉ、Ｊ、Ｋ、およびＬは、ＩＦＮγ炎症刺激＋ＢＳＴ２デコイの増加していく投与量を示す。
【図３２−２】Ｍは、Ａ−Ｌからの抗−ＩＣＡＭ１およびＢｓｔ２デコイの用量依存反応の結果の定量分析を示す。
【図３３】図３３Ａ−３３Ｃは、Ｂｓｔ２デコイおよび抗−ＩＣＡＭの処理の組合わせが細胞接着において相加効果をもたらすことを示す。Ｂｓｔ２デコイ（１００ｎｇ／ｍｌ）および抗−ＩＣＡＭ１（１ｕｇ／ｍｌ）の準最適投与量が用いられた。細胞接着は、Ｂｓｔ２デコイおよび抗−ＩＣＡＭ１の双方が用いられたときコントロールレベルに対して完全に阻害された。
【図３４】図３４は、サイトカイン処理後のＢｓｔ２ｍＲＮＡの相対的発現レベルを示す。Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＶＥＣ（ヒト血管内皮細胞）、ＨｅＬａまたはＣＡＳＭＣ（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ）を、示したように、血清、ＰＭＡ（１２または１８時間）、ＯＫＴ（１２または１８時間）、ＴＮＦ−α、インターフェロンγまたはＰＧＪ２で処理後、Ｂｓｔ２ｍＲＮＡレベル（ログ対数）を示した。Ｂｓｔ２ｍＲＮＡレベルは、リアルタイムＰＣＲで測定した。
【図３５】図３５は、Ｂｓｔ２に対するリガンドを発現する細胞Ａと、タンパク質または化合物Ｙのレセプターを発現する細胞Ｂとの間の相互作用およびシグナル伝達を起こさせる方法の概略図を示す。Ｂｓｔ２デコイと、タンパク質または化合物Ｙとから構成される２種（ｂｉｖａｌｅｎｔ）融合タンパク質は、細胞ＡおよびＢ間の相互作用を起こさせるアダプターとして機能しうる。そうすることで、細胞Ａおよび細胞Ｂ間のシグナル伝達が向上しうる。
【図３６】図３６は、Ｂｓｔ２／Ｄａｍｐ１デコイに対するファージクローンの結合を示す。
【図３７−１】図３７Ａは、抗Ｂｓｔ２／Ｄａｍｐ１モノクローナル抗体重鎖可変領域を示す。
【図３７−２】図３７Ｂは、抗Ｂｓｔ２／Ｄａｍｐ１モノクローナル抗体κ鎖可変領域を示す。
【図３８】図３８Ａ−３８Ｂは、ＰＡＧＥゲル上の、一時的に発現し、精製された抗Ｂｓｔ２モノクローナル抗体を示す。（Ａ）非還元条件下；（Ｂ）還元条件下。
【図３９】図３９は、マウスのオボアルブミン誘発性喘息における抗Ｂｓｔ２／Ｄａｍｐ１モノクローナル抗体の処理時の沈降免疫細胞数の変化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2009536952.tif 000023
【図１４】
2009536952.tif 000024
【図１５】
2009536952.tif 000025
【図１６】
2009536952.tif 000026
【図１７】
2009536952.tif 000027
【図１８】
2009536952.tif 000028
【図１９】
2009536952.tif 000029
【図２０】
2009536952.tif 000030
【図２１−１】
2009536952.tif 000031
【図２１−２】
2009536952.tif 000032
【図２２】
2009536952.tif 000033
【図２３】
2009536952.tif 000034
【図２４】
2009536952.tif 000035
【図２５】
2009536952.tif 000036
【図２６】
2009536952.tif 000037
【図２７】
2009536952.tif 000038
【図２８】
2009536952.tif 000039
【図２９】
2009536952.tif 000040
【図３０】
2009536952.tif 000041
【図３１】
2009536952.tif 000042
【図３２−１】
2009536952.tif 000043
【図３２−２】
2009536952.tif 000044
【図３３】
2009536952.tif 000045
【図３４】
2009536952.tif 000046
【図３５】
2009536952.tif 000047
【図３６】
2009536952.tif 000048
【図３７−１】
2009536952.tif 000049
【図３７−２】
2009536952.tif 000050
【図３８】
2009536952.tif 000051
【図３９】
2009536952.tif 000052
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月27日(2008.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｓｔ２アンタゴニストを含む、免疫細胞の他の細胞への結合抑制剤。
【請求項２】
前記他の細胞が、免疫細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、脳細胞、脊髄細胞、末梢神経細胞、心臓細胞、骨格筋細胞、肺細胞、肝細胞、腎臓細胞、血管細胞、膵臓細胞、大腸および小腸細胞、胃細胞、食道細胞、鼻咽頭細胞、膜細胞または結合組織細胞である、請求項１に記載の抑制剤。
【請求項３】
前記Ｂｓｔ２アンタゴニストがＢｓｔ２デコイである、請求項１に記載の抑制剤。
【請求項４】
前記Ｂｓｔ２デコイが、他の分子またはタンパク質に対する結合がＢｓｔ２タンパク質と同様である、または向上している、Ｂｓｔ２断片またはこの変異体である、請求項３に記載の抑制剤。
【請求項５】
前記Ｂｓｔ２アンタゴニストが、安定化タンパク質に融合されたＢｓｔ２デコイ、Ｂｓｔ２デコイ−Ｆｃキメラのもしくは融合のコンストラクト、Ｂｓｔ２−デコイ−アルブミンキメラのもしくは融合のコンストラクト、またはペグＢｓｔ２−デコイ、あるいは他の安定化タンパク質に融合されたＢｓｔ２デコイである、請求項１に記載の抑制剤。
【請求項６】
前記Ｂｓｔ２アンタゴニストが、Ｂｓｔ２および／またはマウスＤａｍｐ１タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体または抗体様タンパク質ドメインである、請求項１に記載の抑制剤。
【請求項７】
前記Ｂｓｔ２アンタゴニストが化合物である、請求項１に記載の抑制剤。
【請求項８】
前記免疫細胞および他の細胞が、炎症部位に位置しているか、または炎症からは遠い部位に位置しているが、炎症部位に対して炎症および免疫サイトカインまたは他の炎症性シグナルを伝達しうる、請求項１に記載の抑制剤。
【請求項９】
さらに、細胞接着およびシグナル伝達を阻害する化合物または免疫抑制剤を含む、請求項１に記載の抑制剤。
【請求項１０】
前記細胞接着を阻害する化合物が、ＩＣＡＭ１アンタゴニスト、またはＬＦＡアンタゴニストである、請求項９に記載の抑制剤。
【請求項１１】
抗炎症性活性を有するＢｓｔ２デコイ。
【請求項１２】
Ｂｓｔ２デコイ−免疫グロブリン  Ｆｃキメラ。
【請求項１３】
前記デコイが、免疫グロブリンのドメインに融合されている、請求項１１に記載のＢｓｔ２デコイ−Ｆｃ融合物。
【請求項１４】
Ｂｓｔ２および／またはＢｓｔ２のホモログに対して特異的なモノクローナル抗体。
【請求項１５】
２つのアームを含み、このうち１つのアームがＢｓｔ２またはこのホモログ以外のタンパク質に特異的である、請求項１４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１６】
前記ホモログがマウスＤａｍｐ１タンパク質である、請求項１４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１７】
モノクローナル抗体が結合しているＢｓｔ２発現細胞が、Ｂｓｔ２リガンド−Ｂｓｔ２相互作用またはＢｓｔ２−Ｂｓｔ２相互作用を阻害する、請求項１４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１８】
（ｉ）Ｂｓｔ２に結合する細胞を獲得し；
（ｉｉ）リガンドを発現している細胞からＢｓｔ２に結合するリガンドをスクリーニングし、これにより、Ｂｓｔ２に対するリガンドを単離する；
を含むＢｓｔ２に対するリガンドの単離方法。
【請求項１９】
破壊された遺伝子はマウスまたは胚形成期中のマウスの祖先に導入され、該破壊された遺伝子が同型であれば炎症関連疾患を示す、体細胞および生殖細胞が機能的に破壊されたＤａｍｐまたはＢｓｔ２遺伝子を含むトランスジェニックマウス。
【請求項２０】
Ｂｓｔ２遺伝子がマウスまたは胚形成期のマウスの祖先に導入される、体細胞および生殖細胞が完全にまたは部分的にＢｓｔ２遺伝子に置換されたＤａｍｐ遺伝子を含むトランスジェニックマウス。
【請求項２１】
Ｂｓｔ２アンタゴニストを含む、炎症軽減剤。
【請求項２２】
Ｂｓｔ２アンタゴニストを含む、炎症関連疾患治療剤。
【請求項２３】
組成物が他の抗炎症性化合物を含む、請求項２１に記載の軽減剤または２２に記載の炎症関連疾患治療剤。
【請求項２４】
前記疾患が：アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、喘息、敗血症、潰瘍性大腸炎、Ｉ型糖尿病、白内障、多発性硬化症、急性心筋梗塞、心臓麻痺、乾癬、接触性皮膚炎、変形性関節症、鼻炎、クローン病、自己免疫疾患、悪液質、急性膵炎、自己免疫性血管炎、自己免疫性およびウイルス性肝炎、遅延型過敏症、うっ血、冠動脈再狭窄、糸球体腎炎、移植片対宿主拒絶反応、ブドウ膜炎、角膜移植に関連する炎症性眼疾患、外傷性脳損傷、てんかん、出血、発作、鎌状赤血球病、ＩＩ型糖尿病、肥満、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、アトピー性皮膚炎、皮膚炎、学習／認識障害、神経変性疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、潰瘍性大腸炎、放射線による損傷、やけどまたは電気誘発性損傷、組織壊死および免疫細胞浸潤を引き起こす中毒、薬剤性障害、吸入剤誘発性障害、放射線被爆、肺の吸引誘発性障害、化学療法または放射線療法に起因する炎症、自己免疫疾患、狼瘡、シェーグレン症候群、多発性硬化症を含む脱髄疾患、多発性筋炎を含む炎症性筋疾患、強皮症、結節性多発動脈炎、サルコイドーシス、局所性および全身性骨化性筋炎、アルツハイマー病を含むアミロイド関連疾患、椎間板ヘルニア、脊髄および神経損傷、ライ症候群、細菌性およびウイルス性脳炎ならびに髄膜炎、プリオン関連疾患、ギラン・バレー症候群、狂犬病、ポリオ、脳出血、頭蓋内出血関連損傷、慢性疲労症候群、静脈血栓症、痛風、肉芽腫症、糸球体腎炎および間質性腎炎を含む腎炎、昆虫刺激アレルギー、アナフィラキシー、再生不良性貧血、骨髄損傷、多臓器不全、甲状腺炎、膵島炎、肝硬変（慢性および急性肝炎）、肺塞栓症、毒物性および薬剤性肝疾患、膵炎、虚血性腸疾患、急性呼吸窮迫症候群、および心膜炎から選択される、請求項２２に記載の治療剤。
【請求項２５】
Ｂｓｔ２に結合する化合物を決定することを含む、Ｂｓｔ２が介する細胞−細胞結合の阻害に効果的な化合物のアッセイ方法。
【請求項２６】
宿主細胞中に組み換え技術でＢｓｔ２デコイを発現することを含む、Ｂｓｔ２デコイの製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２２】
【表５−２】
2009536952.tif 000053
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６１】
１−３−１．ＤＮＡコンストラクトおよび安定細胞ライン
Ｇｅらによって報告されているように（Ｂｌｏｏｄ  １０７：１５７０、２００６）、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩに対する制限酵素部位を含むフォワード（５’−ｔｔｃａｃｇｃｔａｇｃｃｃｃｃｔｔｔｇｃａｇａｔｇａａｇａａａｃａｇｇｃｔｃａｇａ−３’（配列番号：９７））およびリバース（５’−ｔｔｃａｃｃｔｃｇａｇｇｃａｇｇａｇａｔｇｇｇｔｇａｃａｔｔｇｃｇａｃａｃｔｃ−３’（配列番号：９８））プライマーを用いて、転写開始部位の上流７５９ｂｐおよびエクソン１の２１１ｂｐにわたるＢｓｔ２プロモーター領域がＰＣＲで増幅される。Ｂｓｔ２プロモーターのより長い断片を含むＤＮＡベクターを構築するために、１ｋｂまたはそれ以上のＢｓｔ２プロモーター領域がＰＣＲ増幅される。増幅された生産物は、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化され、ホタルルシフェラーゼを発現するレポーター遺伝子ベクターの対応する部位につなげられる。このコンストラクトは、ルシフェラーゼアッセイを用いて、ハイスループット・スクリーニング用に用いられる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０９】
Ｂｓｔ２及びＤａｍｐ１のデコイを発現するためのベクターを、下記のようにして構築した。図２は、デコイをクローニングするのに使用されるＰＣＲプライマーの位置を示すものである。ヒトＢｓｔ２タンパク質の細胞外領域をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲで得、発現後の細胞外への分泌を促進するためにｔＰＡ（組織プラスミノゲン活性化因子）のシグナル配列ＰのＮ末端に融合した。また、このＤＮＡ断片を、タンパク質の発現レベルを測定しかつタンパク質を精製しやすくするために、６−ヒスチジン標識のＣ末端に融合した。Ｂｓｔ２デコイは、Ｃ末端に２１個のアミノ酸残基を含まず、また、膜貫通領域及び細胞質領域を含まなかった。ＰＣＲ産物を、最終濃度が０．８％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ）で処理し、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化し、さらにｐＣＤＮＡ  ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。別の実験では、ヒトＢｓｔ２デコイのヌクレオチド配列のコドンを、哺乳動物での発現系に対して最適化し、ＤＮＡ断片を化学合成した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３０】
【表２】
2009536952.tif 000054
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４９】
図２１は、上記したＢｓｔ２デコイ−ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質のベクターマップを示す。ＩｇＧ１及びＩｇＧ２  Ｆｃ融合物の発現ベクターを表す代表的な発現ベクターが示される。図２１Ａは、Ｂｓｔ２デコイ（ｄＢｓｔ２）を示す。このＢｓｔ２デコイの発現ベクターは、デコイタンパク質の出発点の５’側にＸｂａＩ部位を、Ｎ末端のｔＰＡシグナルペプチド及びＣ末端のＨｉｓ−標識で次に３’末端のＢａｍＨＩ部位でＰＣＲ−クローニングすることによって構築された；この挿入物を、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで切断したｐｃＤＮＡ３．１中にクローニングした。図２１Ｂは、ｄＢｓｔ２−ＩｇＧ１Ｆｃ融合物を示す。ＩｇＧ１重鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域を、ＰＣＲ−クローニングし、５’側  ＸｈｏＩ及び３’側  ＮｏｔＩ部位でＢｓｔ２デコイのＣ末端に融合した；この挿入物を、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断したｐｃＤＮＡ３．１中にクローニングした。図２１Ｃは、ｄＢＳＴ２−κ融合物を示す。ＩｇＧのκ軽鎖の定常領域を、ＰＣＲ−クローニングし、５’側  ＸｈｏＩ及び３’側  ＮｏｔＩ部位でＢｓｔ２デコイのＣ末端に融合した；この挿入物を、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断したｐｃＤＮＡ３．１中にクローニングした。（ｄ）ｄＢＳＴ２−ＩｇＧ２ＨＣ融合物。ＩｇＧ２重鎖のヒンジＣＨ２−ＣＨ３領域を、ＰＣＲ−クローニングし、５’側  ＸｈｏＩ及び３’側  ＮｏｔＩ部位でＢｓｔ２デコイのＣ末端に融合した；この挿入物を、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断したｐｃＤＮＡ３．１中にクローニングした。
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2009536952.tif 000055
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３７−１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３７−１】
2009536952.tif 000056
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３７−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３７−２】
2009536952.tif 000057
【国際調査報告】
2009536952.tif 000058