(57)【要約】  本発明は、競合的アッセイフォーマットを使用して、抗感染薬ＩｇＧ、例えばヒト抗サイトメガロウイルス及びヒト抗トキソプラズマＩｇＧの結合活性を決定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）感染性因子由来の精製された少なくとも１つの抗原を溶液へ添加して液相抗原を作製する段階、及び前記精製された少なくとも１つの抗原を固相上へ被覆して固相抗原を作製する段階；
ｂ）第一のアッセイにおいて、前記感染性因子によって感染された疑いのある患者由来の検査試料を感染性抗原を含まない液相と接触させる段階、及び抗体／抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下で前記患者由来の検査試料を段階ａ）の前記被覆された固相と接触させる段階；
ｃ）段階ｂ）の前記被覆された固相を洗浄する段階；
ｄ）第二のアッセイにおいて、前記患者由来の検査試料を前記液相抗原と接触させる段階、及び抗体／抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下で前記患者由来の検査試料を前記固相抗原と接触させる段階；
ｅ）段階ｄ）の前記接触された固相抗原を洗浄する段階；
ｆ）前記第一及び第二のアッセイにおいて抗ＩｇＧ／抗体／抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下で、検出可能なシグナルを発生させることができるシグナル発生化合物へ付着された抗ＩｇＧ抗体を含むコンジュゲートを前記第一及び第二のアッセイへ添加する段階；
ｇ）前記第一及び第二のアッセイにおいて前記シグナル発生化合物によって発生されたシグナルを検出する段階；並びに
ｈ）前記第二のアッセイにおいて得られた前記シグナルと前記第一のアッセイにおいて得られた前記シグナルとの間の比を求める段階（前記比は、前記患者の試料中に存在するヒト抗感染性因子低結合活性ＩｇＧ抗体のレベルに比例する。）
を含む、前記感染性因子によって感染された疑いのある患者の試料中においてヒト抗感染性因子ＩｇＧ抗体の結合活性のレベルを決定する方法。
【請求項２】
前記感染性因子が、ウイルス、寄生生物、真菌及び細菌からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記患者の試料が、前記被覆された固相の添加前に溶液で前処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記固相が、多孔性材料、非多孔性材料、ラテックス粒子、磁気粒子、微粒子、ビーズ、メンブレン並びにマイクロタイターウェル及びプラスチックチューブからなる群から選択される、請求項１ないし３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
ａ）トキソプラズマ・ゴンディイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ；Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ）由来の精製された少なくとも１つの抗原を溶液へ添加して液相抗原を作製する段階、及び固相上へ前記精製された少なくとも１つの抗原を被覆して固相抗原を作製する段階；
ｂ）第一のアッセイにおいて、患者由来の検査試料を、トキソプラズマ・ゴンディイ抗原を含まない液相と接触させる段階、及び抗体／抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下で前記患者由来の検査試料を段階ａ）の前記被覆された固相と接触させる段階；
ｃ）段階ｂ）の前記被覆された固相を洗浄する段階；
ｄ）第二のアッセイにおいて、前記患者由来の検査試料を前記液相抗原と接触させる段階、及び抗体／抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下で前記患者由来の検査試料を前記固相抗原と接触させる段階；
ｅ）段階ｄ）の前記接触された固相抗原を洗浄する段階；
ｆ）前記第一及び第二のアッセイにおいて抗ＩｇＧ／抗体／抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下で、検出可能なシグナルを発生させることのできるシグナル発生化合物へ付着された抗ＩｇＧ抗体を含むコンジュゲートを前記第一及び第二のアッセイへ添加する段階；
ｇ）前記第一及び第二のアッセイにおいて前記シグナル発生化合物によって発生されたシグナルを検出する段階；並びに
ｈ）前記第二のアッセイにおいて得られた前記シグナルと前記第一のアッセイにおいて得られた前記シグナルとの間の比を決定する段階（前記比は、患者の試料中に存在するヒト抗トキソプラズマ低結合活性ＩｇＧ抗体のレベルに比例する。）
を含む、患者の試料中でヒト抗トキソプラズマ低結合活性ＩｇＧ抗体のレベルを測定する方法。
【請求項６】
ｉ）段階ｈ）の前記比に１００を乗じ、及び前記乗じた比を１００から減じて結合活性指数を求め、２０％未満の結合活性指数は、前記患者が低い結合活性トキソプラズマＩｇＧを有することを示し、５０％以上の結合活性指数は、前記患者が高い結合活性のトキソプラズマＩｇＧを有することを示し、及び２０％ないし４９％の結合活性指数は、前記患者がトキソプラズマＩｇＧ抗体の結合活性に関して不確定であることを示す段階
をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ｉ）段階ｈ）の前記比に１００を乗じ、及び前記乗じた比を１００から減じて結合活性指数を決定し、３０％未満の結合活性指数は、前記患者が低いトキソプラズマＩｇＧを有することを示し、４０％以上の結合活性指数は、前記患者が高い結合活性のトキソプラズマＩｇＧを有することを示し、及び３０％ないし３９％の結合活性指数は、トキソプラズマＩｇＧ抗体の結合活性に関して不確定であることを示す段階
をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
低い結合活性のトキソプラズマＩｇＧの結果は、前記患者が急性トキソプラズマ症を有し得又は有し得ないことを示し、及び高い結合活性のトキソプラズマＩｇＧの結果は、前記患者が検査前約４ヶ月以内に急性トキソプラズマ症を有さなかったことを示す、請求項６又は請求項７に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの前記精製された抗原が、Ｐ２２、Ｐ２４、Ｐ２５、Ｐ２８、Ｐ２９、Ｐ３０、Ｐ３５、Ｐ４１、Ｐ５４、Ｐ６６及びＰ６８からなる群から選択される、請求項５ないし８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者の試料が、前記被覆された固相の添加前に溶液で前処理される、請求項５ないし９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記固相が、多孔性材料、非多孔性材料、ラテックス粒子、磁気粒子、微小粒子、ビーズ、メンブレン並びにマイクロタイターウェル及びプラスチックチューブからなる群から選択される、請求項５ないし１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ａ）ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）由来の精製された少なくとも１つの抗原を溶液へ添加して液相抗原を作製する段階、及び固相上へ前記精製された少なくとも１つの抗原を被覆して固相抗原を作製する段階；
ｂ）第一のアッセイにおいて、患者由来の検査試料を、ＨＣＭＶ抗原を含まない液相と接触させる段階、及び抗体／抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下で前記患者由来の検査試料を段階ａ）の前記被覆された固相と接触させる段階；
ｃ）段階ｂ）の前記被覆された固相を洗浄する段階；
ｄ）第二のアッセイにおいて、前記患者由来の検査試料を、前記液相抗原と接触させる段階、及び抗体／抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下で前記患者由来の検査試料を前記固相抗原と接触させる段階；
ｅ）段階ｄ）の前記接触された固相抗原を洗浄する段階；
ｆ）前記第一及び第二のアッセイにおいて抗ＩｇＧ／抗体／抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下で、検出可能なシグナルを発生させることのできるシグナル発生化合物へ付着された抗ＩｇＧ抗体を含むコンジュゲートを前記第一及び第二のアッセイへ添加する段階；
ｇ）前記第一及び第二のアッセイにおいて前記シグナル発生化合物によって発生されたシグナルを検出する段階；並びに
ｈ）前記第二のアッセイにおいて得られた前記シグナルと前記第一のアッセイにおいて得られた前記シグナルとの間の比を求める段階（前記比は、前記患者の試料中に存在するヒト抗ＨＣＭＶ低結合活性ＩｇＧ抗体のレベルに比例する。）
を含む、患者の試料中でヒト抗サイトメガロウイルスＩｇＧ抗体結合活性のレベルを決定する方法。
【請求項１３】
ｉ）段階ｈ）の前記比に１００を乗じ、及び前記乗じた比を１００から減じて結合活性指数を決定し、４０％未満の結合活性指数は、前記患者が低い結合活性のＣＭＶＩｇＧを有することを示し、７０％以上の結合活性指数は、前記患者が高い結合活性のＣＭＶＩｇＧを有することを示し、及び４０％ないし６９％の結合活性指数は、ＣＭＶＩｇＧ抗体の結合活性に関して不確定であることを示す段階
をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｉ）段階ｈ）の前記比に１００を乗じ、及び前記乗じた比を１００から減じて結合活性指数を決定し、５０％未満の結合活性指数は、前記患者が低い結合活性のＣＭＶＩｇＧを有することを示し、６０％以上の結合活性指数は、前記患者が高い結合活性のＣＭＶＩｇＧを有することを示し、及び５０％ないし５９％の結合活性指数は、ＣＭＶＩｇＧ抗体の結合活性に関して不確定であることを示す段階
をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＭＶ低結合活性ＩｇＧの結果が、前記患者が一次ＣＭＶ感染を有することを示し、及びＣＭＶ高結合活性ＩｇＧの結果が、前記患者が非一次ＣＭＶ感染を有することを示す、請求項１３又は請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの前記精製された抗原が、ｐｐ３８、ｐｐ５３、ｐｐ６５、ｐ１３０及びｐｐ１５０からなる群から選択される、請求項１２ないし１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者の試料が、前記被覆された固相の添加前に溶液で前処理される、請求項１２ないし１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記固相が、多孔性材料、非多孔性材料、ラテックス粒子、磁気粒子、微小粒子、ビーズ、メンブレン並びにマイクロタイターウェル及びプラスチックチューブからなる群から選択される、請求項１２ないし１７の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗感染性因子ＩｇＧ抗体の結合活性、例えばヒト抗サイトメガロウイルス及びヒト抗トキソプラズマＩｇＧ抗体の結合活性を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トキソプラズマ・ゴンディイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）は、コシジア（Ｃｏｃｃｉｄｉａ）に分類される偏性細胞内寄生生物である。この寄生生物は、哺乳動物及び鳥類の両者に感染し、宿主の範囲が比較的広範である。この生物は、本来遍在性であり、３つの形態、すなわち急増虫体、被覆体及び胞嚢体で存在する（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，ＭｃＬｅｏｄ，Ｒ．，Ｄｅｓｍｏｎｄｓ，Ｇ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｅｔｕｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗｂｏｒｎ  Ｉｎｆａｎｔ（Ｊ．Ｓ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｏ．Ｋｌｅｉｎ，Ｅｄｓ．），ｐｐ．１４０−２６７，Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９５））。急性の感染中に見出される急増虫体は、全ての哺乳動物細胞に侵入することのできる侵襲型である。感染の急性段階後、ブラディゾイトと呼ばれる組織被覆体が宿主細胞内に形成され、宿主の生涯にわたって、宿主生物内で持続される。生肉又は生煮えの肉の摂取がブラディゾイトの摂取につながる可能性があり、ブラディゾイトは個体に感染して急性の感染をもたらし得るので、被覆体は、特にヒトにおいて感染の伝達に重要である。胞嚢体は、性的繁殖の段階に相当し、ネコ科の腸管の裏打ち中にのみ発生し、そこから糞便中に排泄される。
【０００３】
汚染された肉又はネコの糞便を通じて健常な成人にもたらされるトキソプラズマ・ゴンディイ感染はしばしば、無症候性である。妊娠中の女性及び免疫抑制性患者において、臨床的結果は非常に重大であり得る。妊娠中、特に最初の三半期中にもたらされるトキソプラズマ・ゴンディイによる急性感染は、知的障害及び胎児死亡を含む胎児及び新生児の重篤な合併症を生じる、出産されていない胎児への子宮内感染を生じ得る。免疫抑制性の個体における前述のトキソプラズマ・ゴンディイ感染又は急性感染の再発は、病原性であり得る。トキソプラズマ脳炎は、エイズ患者における罹患率及び死亡率の主要因である。トキソプラズマ感染は、子供及び成人における脈絡網膜炎の有意な原因であることも示されている。
【０００４】
トキソプラズマ・ゴンディイによる感染の診断は、血液又は体液からのトキソプラズマ・ゴンディイの単離、胎盤又は胎児の組織中での生物の存在の実証、特異的核酸配列（例えば、ＤＮＡプローブ）の検出による抗原の存在の実証、又は血清学的検査を使用する、感染に反応した宿主により合成されるトキソプラズマ・ゴンディイ特異的免疫グロブリンの検出によって確立され得る。
【０００５】
トキソプラズマ・ゴンディイ特異的抗体の検出及び抗体力価の決定は、トキソプラズマ症の診断において使用される重要なツールである。トキソプラズマ症の診断に関する最も広く使用される血清学的検査は、サビン・フェルドマン色素試験（Ｓａｂｉｎ，Ａ．Ｂ．ａｎｄ  Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｈ．Ａ．（１９４８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０８，  ６６０−６６３）、間接的血球凝集（ＩＨＡ）検査（Ｊａｃｏｂｓ，Ｌ．ａｎｄ  Ｌｕｎｄｅ，Ｍ．（１９５７）Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．４３，  ３０８−３１４）、ＩＦＡ検査（Ｗａｌｔｏｎ，Ｂ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９６６）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．１５，  １４９−１５２）、凝集検査（Ｆｏｎｄａｔｏｉｎ  Ｍｅｒｉｅｕｘ，Ｓｅｒｏｌｏｇｉｅ  ｄｅ  Ｉ’Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｉｑｕｅ  ｅｎ  Ｐａｒｔｉｃｕｌｉｅｒ  ａ  Ｓｏｎ  Ｄｅｂｕｔ：Ｍｅｔｈｏｄｅｓ  ｅｔ  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｄｅｓ  Ｒｅｓｕｌｔａｎｔｓ，Ｌｙｏｎ，１８２  ｐｐ．（１９７５））及びＥＬＩＳＡ（Ｎａｏｔ，Ｙ．ａｎｄ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．（１９８０）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１４２，  ７５７−７６６）である。ＥＬＩＳＡ検査は、最も早期に実施される一検査であり、トキソプラズマ特異的ＩｇＭ及びＩｇＧの検出用の多くの自動血清学的検査が市販されている。
【０００６】
感染した個体におけるＩｇＭ及びＩｇＧ抗体の検出のための最近の検査は、血清抗体を検出するための前記抗体の能力において幅広く異なり得る。それゆえ、市販のキットのうちで、アッセイ間に有意差が見られる。異なる市販のキット間で観察される差異は、主として、血清学的検査に使用される抗原の調製によって生じる。ほとんどのキットは、組織培養物中又はマウス中で増殖される急増虫体全体又は超音波処理された急増虫体の何れかを使用し、寄生生物外材料、例えば哺乳動物細胞、組織培養成分等を高い割合で含有する。精製され標準化された抗原、又は急増虫体抗原を調製するための標準的な方法が存在しないので、アッセイの感度及び特異性に関して、アッセイ間の差異が存在することによって異なるアッセイが異なる性能特徴を有することになることは驚くべきことではない。
【０００７】
上述のような急増虫体抗原を採用する血清学的検査に関する制限、及び感染の開始の決定に関する根深い問題を考えると、分子生物学によって得られる精製された組換え抗原は、精製及び標準化されることができる魅力的な代替物である。文献において、多くのトキソプラズマ遺伝子が、クローニングされ、適切な宿主中で発現され、免疫反応性の組換えトキソプラズマ抗原を生じている。例えば、Ｔｏｘｏ  Ｐ２２（ＳＡＧ２）、Ｐ２４（ＧＲＡ１）、Ｐ２５、Ｐ２８（ＧＲＡ２）、Ｐ２９（ＧＲＡ７）、Ｐ３０（ＳＡＧ１）、Ｐ３５（ＧＲＡ８）、Ｐ４１（ＧＲＡ４）、Ｐ５４（ＲＯＰ２）、Ｐ６６（ＲＯＰ１）及びＴｏｘｏ  Ｐ６８抗原が記載されている（Ｐｒｉｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ  ４３，  ９７−１０６；Ｃｅｓｂｒｏｎ−Ｄｅｌａｕｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，  ７５３７−７５４１；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅ  ９９，  １２７−１３２；Ｐｒｉｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．３４，３−１３；Ｂｏｎｈｏｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４６，  １４１１−１４２１；Ｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１，  ３５８４−３５９１；Ｋｎａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）欧州特許出願第４３１５４１Ａ２号；Ｃａｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１０５，  ２５−３７；Ｍｅｖｅｌｅｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．５６，  ２２７−２３８；Ｓａａｖｅｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７，  １９７５−１９８２；欧州特許出願第７５１１４７号）。
【０００８】
さらに、血清の単一試料中のＩｇＧ抗体が存在するということは、感染が生じたときに、患者が感染したことを確立するのに十分であるが、いつ感染が生じたかを示すものではない。しかしながら、米国において、妊娠中の女性において系統的な血清学的スクリーニングプログラムがないのに対し、フランス及びオーストリア等の国々では、最初に検査されるとき、血清陰性である女性において、妊娠期間を通じて規則正しい間隔で血清が得られている。米国において、女性が最近感染し、それにより胎児が危険な状態にあったかどうかに関する決定はしばしば、血清の単一試料中での結果からなされる。しかしながら、妊娠中の女性が、妊娠期間直前又は妊娠期間中に感染したかどうかを、できる限り正確に決定することは重大な意味を持つ。このため、妊娠中の女性においてＩｇＧ抗体が存在することによって、感染が妊娠中に又は過去にもたらされたかどうかの決定を試行するための血清学的検査がさらに実施されることがしばしばである（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｏｒｄ．Ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）。推奨されるさらなる血清学的検査のうち、ＩｇＭ抗体の存在を示すものは、最も頻繁に使用される。しかしながら、ＩｇＭ抗体は、初期感染後１年を超えて検出可能を保ち得るので、最近もたらされた感染を証明するために、これらの抗体の実証を使用することはできない（Ｌｉｅｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３５：１７４−７８（１９９７）；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３５：３１１２−１５（１９９７）；Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １８：８５３−６２（１９９４））。妊娠中の女性において最近もたらされた感染に関する正確な診断が、母親及びその胎児の両者の臨床上の管理に重要であるので、より優れた診断法に対する探索が継続されている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｏｒｄ．Ｅｄ．，Ｊ．Ｓ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ；Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，上述）。
【０００９】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、ヘルペスウイルス群の一員であり、遍在性の媒介物であり、多くの異なる臨床状況においてヒトに影響を及ぼす疾病の広範な範囲の原因である。健常な成人においてはほとんど病原性がないが、（ＨＩＶ感染者及び移植患者等の）免疫無防備状態の個体における多くの疾病と関連している。さらに、ＨＣＭＶは、先天性の感染の最も普遍的な原因であり、全ての生児出生の約１％で生じる（Ｂｒｉｔｔ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  Ａｌｆｏｒｄ，Ｃ．Ａ．（１９９６）Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，Ｉｎ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２４９３−２５２３；Ｓｔａｇｎｏ，Ｓ．（１９９５）Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ．Ｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｅｔｕｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗｂｏｒｎ  Ｉｎｆａｎｔ  （４ｔｈ  ｅｄｓ．）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ａｎｄ  Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．Ｏ．（ｅｄｓ．），Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，３１２−３５３）。妊娠中の女性におけるＨＣＭＶ感染は、無症候性であり、又は非特異的症状を伴うので、血清学及びウイルス学を含む研究方法が、ＨＣＭＶ感染を診断するのに使用されている。
【００１０】
ＨＣＭＶ感染の診断は、多様な体液中でウイルスを直接実証することによって、又は血清学を通じて間接的に得ることができる。医師が、母系性のＨＣＭＶ感染を併発している可能性を秘めた妊娠の危険を正確に評価するために、ＨＣＭＶ一次感染とＨＣＭＶ非一次感染とを識別することは重要である。妊娠の最初の三半期におけるＨＣＭＶ一次感染の子宮内感染（約４０％）は、胎児の死亡を含む胎児の有意な損傷を生じる可能性を有する（Ｂｏｐｐａｎａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．１１，  ９３−９９）。ＨＣＭＶの非一次子宮内感染は、非常に低い割合（約０．２ないし１％）で生じ、発達中の新生児では、一般的に無症候性ではあるが、必ずしも常に無症候性であるとは限らない（Ｂｏｐｐａｎａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｅｄｉａｔｒ．１０４，  ５５−６０）。
【００１１】
患者におけるＨＣＭＶ一次感染の診断は、ＨＣＭＶ特異的ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体に対する抗体陽転が検出される場合に確認される。しかしながら、妊娠中の女性においてＨＣＭＶ一次感染に利用可能な治療の選択肢が現在存在しないので、ＨＣＭＶ特異的抗体に対する抗体陽転は、妊娠前にまれにしか検出されなく、また、妊娠中の女性は、日常的にＨＣＭＶ抗体について検査されない。ＨＣＭＶ特異的ＩｇＭの検出は、活発なＨＣＭＶ感染又は最近のＨＣＭＶ感染のマーカーとして使用されており（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２６，  ６５４−６６１）、その検出は、市販検査間の一致度が乏しいために広範に異なる（Ｌａｚｚａｒｏｔｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．６，  ２１６−２１８）。不運なことに、ＨＣＭＶの一次感染中及び非一次感染中の両者で、ＨＣＭＶ特異的ＩｇＭが産生され得る、それゆえ、この検査は、さらなる臨床検査及び経過観察を必要とする潜在的な先天性ＨＣＭＶ感染に対してリスクがある妊娠を標識するためのマーカーとして機能するに過ぎない。
【００１２】
妊娠中の女性におけるトキソプラズマ特異的ＩｇＭ抗体及びＨＣＭＶ特異的ＩｇＭ抗体の検出のための血清学的検査は、先天性感染のリスクを有する妊娠のためのマーカーとして機能する。しかしながら、これらの検査は、急性トキソプラズマ症と慢性トキソプラズマ症とを、又はＨＣＭＶ一次感染と非一次感染とをそれぞれ識別することは不可能である。最初の三半期の間の急性母系性トキソプラズマ症又はＨＣＭＶ母系性一次感染が、胎児の損傷に関して最大の危険を有するので、母系性感染が発育中の胎児及び新生児に及ぼす危険及び潜在的な影響をより正確に評価するために、さらなる検査が必要とされる。特に、母系性感染が妊娠期間中にもたらされたかどうか、又は感染が幾分過去に、すなわち受胎前に生じたかどうかの決定において役立ち得る検査が必要とされる。感染が受胎前に生じた場合、母系性免疫は、子宮内で発育中の胎児を保護するのに十分であり、さらなる検査又は介入は必要とされない。他方で、感染が妊娠期間中に生じた場合には、産科カウンセリングが、妊娠中の女性に与えられ、急性トキソプラズマ症と疑われた場合、寄生生物の子宮内感染を防止するために、治療介入が開始され得る。
【００１３】
ＩｇＧ抗体の機能的結合親和性又は結合活性は、体液性免疫反応の成熟としても知られる動物の免疫化後の時間とともに、漸次亢進することが知られている（Ｉｎｏｕｙｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０，  ５２５−５２９）。従来の親和性アッセイ、例えばスキャッチャード分析を使用する平衡透析は、大きく複雑な微生物、ウイルス及び寄生生物の抗原によって惹起されるポリクローナル反応の測定に適していない（Ｈｅｄｍａｎ，Ｋ．ａｎｄ  Ｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｓ．Ａ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２７，  ２８８−２９２）。競合的結合アッセイは、ワクチン接種後の抗体親和性及び先天性ＨＩＶ感染に対する母系性保護免疫を評価するために使用されてきた（Ｄｅｖｅｙ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０６，  １１９−１２５；Ｄｅｖａｓｈ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，  ３４４５−３４４９）。しかしながら、急性感染と過去にもたらされた感染を識別する競合的結合アッセイは記されていない。
【００１４】
さらに、カオトロピック試薬を利用するＩｇＧ結合活性アッセイが診断レベルで使用され、ＨＣＭＶ（Ｂｏｄｅｕｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｖｉｒｏｌ．９，  ９−１６）、トキソプラズマ・ゴンディイ（Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６７，  ６９１−６９７）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（Ｓｕｌｉｇｏｉ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０，  ４０１５−４０２０）、パルボウイルスＢ１９（Ｇｒａｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．４４，  １１−２３）、ヘルペスウイルス６及び７（Ｗａｒｄ，Ｋ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９，  ９５９−９６３）、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型肝炎ウイルス（Ｒｏｑｕｅ−Ａｆｏｎｓｏ，Ａ．−Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２，  ５１２１−５１２４；Ｔｈｏｍａｓ，Ｈ．Ｉ．Ｊ．（１９９７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．５１，  １８９−１９７；Ｗａｒｄ，Ｋ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．４３，  ３６７−３７２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．−Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．６６，  ４０−４８）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）（Ｗｅｉｓｓｂｒｉｃｈ，Ｂ．（１９９８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．５４，  １４５−１５３）、アクチノバチルス・アクチノミセタムコミタンス（若年性歯周菌）（Ｏ’Ｄｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１，  ２９５−３０１）、２型単純ヘルペスウイルス（Ａｓｈｌｅｙ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｓｅｘｕａｌ．Ｔｒａｎｓｍｉｔｔ．Ｄｉｓ．３１，  ５０８−５１５）、重度急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）（Ｃｈａｎ，Ｐ．Ｋ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９２，  １６６−１６９）、肝蛭症（肝吸虫）（Ａｂｏｕ−Ｂａｓｈａ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅａｓｔ．Ｍｅｄｉｔｅｒｒ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｊ．６，  ９１９−９２５）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）（Ｇａｓｓｍａｎ，Ｃ．Ｇ．ａｎｄ  Ｂａｕｅｒ，Ｇ．（１９９７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．５１，  ２４２−２５１）、風疹（Ｈｅｄｍａｎ，Ｋ．ａｎｄ  Ｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｓ．Ａ．（１９８９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．２７：２８８−２９２）、ライム病（Ｒａｕｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３３，  ８０９−８１１）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）（Ｅｒｉｋａ，Ｏ．(２００４)Ｒｅｖｉｓｔａ  ｄｏ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  ｄｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  ｄｅ  Ｓａｏ  Ｐａｕｌｏ  ４６，  １６５−１６８）、デングウイルス（Ｆｉｃｋ，ｄｅ  Ｓｏｕｚａ  Ｖ．Ａ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２，  １７８２−１７８４）、住血吸血症（血液吸虫）（Ｊ．Ｅｇｙｐｔ．Ｓｏｃ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．３２，  ９７９−９８５）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（歯周炎）（Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄ．Ｒｅｓ．���２，  ３１−３９）、アスペルギルス・ウンブロサス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｍｂｒｏｓｕｓ）（農夫肺病）（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９５，  １６２−１６５）、プーマラウイルス（Ｈｅｄｍａｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｌａｎｃｅｔ  ３３８，  １３５３−１３５６）、及びブルセラ症（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｒｅｖｉｓｔａ  Ｍｅｄｉｃａ  ｄｅ  Ｃｈｉｌｅ  １２３，  ８１９−８２２）を含む多様な感染性因子に関して、急性感染（低い結合活性のＩｇＧ抗体が主として存在）と過去にもたらされた感染（高い結合活性のＩｇＧ抗体が主として存在）を識別することが可能である。近年の「自家製」及び市販のＩｇＧ結合活性アッセイは、カオトロピック試薬（例えば、尿素、ジエチルアミン、チオシアン酸塩、グアニジウム等）の使用を採用し、高い結合活性の抗体と低い結合活性の抗体を識別する（米国特許第６，３７２，４２６Ｂ１号；Ｈｅｄｍａｎ，Ｋ．ａｎｄ  Ｓｅｐｐａｌａ，Ｉ．（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８，  ２１４−２２１；Ｈｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４，  ７３６−７４０；Ｔｈｏｍａｓ，Ｈ．Ｉ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｏｒｇａｎ−Ｃａｐｎｅｒ，Ｐ．（１９８８）Ｅｐｉｄｅｍ．Ｉｎｆ．１０１，  ５９１−５９８；Ｔｈｏｍａｓ，Ｈ．Ｉ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｏｒｇａｎ−Ｃａｐｎｅｒ，Ｐ．（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３１，  ２１９−２２８；Ｍｏｎｔｏｙａ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０，  ２５０４−２５０８；Ｐｆｒｅｐｐｅｒ，Ｋ．−Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂｏｒａ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，  ９７７−９８２；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３，  １５７０−１５７４；Ｂａｃｃａｒｄ−Ｌｏｎｇｅｒｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂｏｒａ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８，  ４２９−４３１参照）。カオトロピック試薬は、患者の試料へ添加され、「固相抗原」との温置の間に低い結合活性の抗体が「固相抗原」へ結合するのを阻害することが可能である。あるいは、カオトロピック剤は、患者の試料を「固相抗原」と温置した後、「固相抗原」を洗浄するために使用されることが可能である。次に、低い結合活性のＩｇＧ抗体が、カオトロピック試薬によって「固相抗原」から除去される。結合活性アッセイにおけるシグナルの比は、（試料へ添加され、又は「固相抗原」を洗浄するために使用される）カオトロピック試薬の存在下及び不在下でシグナル発生化合物を含有する抗ヒトＩｇＧコンジュゲートを使用して求められ、患者の試料中に存在する高い結合活性のＩｇＧのレベルに比例している。しかしながら、カオトロピック試薬は、自動イムノアッセイ機器プラットフォームに対して有害であり、又は腐食性であり得、他のアッセイを相互に汚染し、これにより異常な結果を生じ得る。その結果、カオトロピック試薬を利用しない自動ＩｇＧ結合活性イムノアッセイが近年、極めて必要とされている。
【００１５】
本明細書で参照される全ての特許及び刊行物は、その全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【発明の開示】
【００１６】
発明の要旨
本発明は、感染性因子によって罹患したと疑われる患者においてヒト抗感染薬であるＩｇＧ抗体の結合活性のレベルを決定する方法を含む。本方法は、ａ）感染性因子由来の精製された少なくとも１つの抗原を溶液へ添加して液相抗原を作製する段階、及び固相上へ前記精製された少なくとも１つの抗原を被覆して固相抗原を作製する段階；ｂ）第一のアッセイにおいて、前記感染性因子によって感染された疑いのある患者由来の検査試料を感染性抗原を含まない液相と接触させる段階、及び抗体／抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下で、前記患者由来の検査試料を段階ａ）の前記被覆された固相と接触させる段階；ｃ）段階ｂ）の前記被覆された固相を洗浄する段階；ｄ）第二のアッセイにおいて、前記患者由来の検査試料を前記液相抗原と接触させる段階、及び抗体／抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下で前記患者由来の検査試料を前記固相抗原と接触させる段階；ｅ）段階ｄ）の前記接触した固相抗原を洗浄する段階；ｆ）前記第一及び第二のアッセイにおいて抗ＩｇＧ／抗体／抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下で、検出可能なシグナルを発生させることのできるシグナル発生化合物へ付着した抗ＩｇＧ抗体を含むコンジュゲート（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を前記第一及び第二のアッセイへ添加する段階；ｇ）前記第一及び第二のアッセイにおいて前記シグナル発生化合物によって発生したシグナルを検出する段階；及びｈ）前記第二のアッセイにおいて得られた前記シグナルと前記第一のアッセイにおいて得られた前記シグナルとの間の、前記患者の試料中に存在するヒト抗感染性因子低結合活性ＩｇＧ抗体のレベルに比例する比を決定する段階を含む。感染性因子は、例えば、ウイルス、寄生生物、真菌又は細菌であり得る。さらに、患者の試料は、被覆された固相の添加前に溶液で前処理され得る。また、固相は、例えば、多孔性材料、非多孔性材料、ラテックス粒子、磁気粒子、微粒子、ビーズ、メンブレン、マイクロタイターウェル又はプラスチックチューブであり得る。
【００１７】
さらに、本発明は、患者においてヒト抗トキソプラズマ低結合活性ＩｇＧ抗体のレベルを決定する方法を包含する。本方法は、ａ）トキソプラズマ・ゴンディイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ；Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ）から精製された少なくとも１つの抗原を溶液へ添加して液相抗原を作製する段階、固相上へ該精製された少なくとも１つの抗原を被覆して固相抗原を作製する段階；ｂ）第一のアッセイにおいて、該患者由来の検査試料をトキソプラズマ・ゴンディイ抗原を含まない液相と接触させる段階、及び抗体／抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下で該患者由来の検査試料を段階ａ）の該被覆された固相と接触させる段階；ｃ）段階ｂ）の該被覆された固相を洗浄する段階；ｄ）第二のアッセイにおいて、該患者由来の検査試料を該液相抗原と接触させる段階、及び抗体／抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下で該患者由来の検査試料を該固相抗原と接触させる段階；ｅ）段階ｄ）の該接触した固相抗原を洗浄する段階；ｆ）該第一及び第二のアッセイにおいて抗ＩｇＧ／抗体／抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下で検出可能なシグナルを発生させることのできるシグナル発生化合物へ付着した抗ＩｇＧ抗体を含むコンジュゲートを該第一及び第二のアッセイへ添加する段階；ｇ）該第一及び第二のアッセイにおいて該シグナル発生化合物によって発生したシグナルを検出する段階；及びｈ）該第二のアッセイにおいて得られた該シグナルと該第一のアッセイにおいて得られた該シグナルとの間の、患者の試料中に存在するヒト抗トキソプラズマ・ゴンディイ低結合活性ＩｇＧ抗体のレベルに比例する比を決定する段階を含む。本方法はさらに、ｉ）段階ｈ）の該比に１００を乗じ、及び該乗じた比を１００から減じて結合活性指数を決定し、３０％未満の結合活性指数は、該患者が低いトキソプラズマ・ゴンディイＩｇＧを有することを示し、４０％以上の結合活性指数は、該患者が高い結合活性のトキソプラズマ・ゴンディイＩｇＧを有することを示し、及び３０％ないし３９％の結合活性指数は、トキソプラズマ・ゴンディイＩｇＧ抗体の結合活性に関して不確定であることを示す段階を含み得る。あるいは、本方法はさらに、ｉ）結合活性指数を決定するために、段階ｈ）の該比に１００を乗じ、及び該乗じた比を１００から減じ、２０％未満の結合活性指数は、該患者が低いトキソプラズマ・ゴンディイＩｇＧを有することを示し、５０％以上の結合活性指数は、該患者が、高い結合活性のトキソプラズマ・ゴンディイＩｇＧを有することを示し、及び２０％ないし４９％の結合活性指数は、トキソプラズマ・ゴンディイＩｇＧ抗体の結合活性に関して不確定であることを示す段階を含み得る。（「不確定な」結果は、不確かであり、別の試料が（例えば、第一検査の２ないし３週間後に）患者から採取され、本明細書に記載されている方法を使用して検査されることを必要とするものである。前記結果は、低い結合活性でも高い結合活性でもないＩｇＧの結果である。さらに、「不確定な」結果は、「境界線」、「境界領域」、「平均」又は「中程度の」結果ともいわれ得る。）低い結合活性のトキソプラズマＩｇＧの結果は、患者が急性トキソプラズマ症を有し得又は有し得ず、及び高い結���活性のトキソプラズマＩｇＧの結果は、患者が検査前約４ヶ月以内に急性トキソプラズマ症を有さなかったことを示す。
【００１８】
本方法における「精製された少なくとも１つの抗原」とは、例えば、Ｐ２２、Ｐ２４、Ｐ２５、Ｐ２８、Ｐ２９、Ｐ３０、Ｐ３５、Ｐ４１、Ｐ５４、Ｐ６６及びＰ６８であり得る。（精製又は単離された抗原は、組換え手段によって、合成手段によって調製され得、又は生物のゲノムの転写及び翻訳後にトキソプラズマ・ゴンディイから抽出され得る。）さらに、患者の検査試料は、被覆された固相の添加前の溶液で前処理され得る。また、固相は、例えば、多孔性材料、非多孔性材料、ラテックス粒子、磁気粒子、微粒子、ビーズ、メンブレン、マイクロタイターウェル又はプラスチックチューブであり得る。
【００１９】
さらに、本発明は、患者においてヒト抗サイトメガロウイルスＩｇＧ抗体の結合活性のレベルを決定する方法を含む。本方法は、ａ）ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）から精製された少なくとも１つの抗原を溶液へ添加して液相抗原を作製する段階、及び固相上へ前記精製された少なくとも１つの抗原を被覆して固相抗原を作製する段階；ｂ）第一のアッセイにおいて、患者由来の検査試料をＨＣＭＶを含まない液相と接触させる段階、及び抗体／抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下で前記患者由来の検査試料を段階ａ）の前記被覆された固相と接触させる段階；ｃ）段階ｂ）の前記被覆された固相を洗浄する段階；ｄ）第二のアッセイにおいて、該患者由来の検査試料を前記液相抗原と接触させる段階、及び抗体／抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下で前記患者由来の検査試料を前記固相抗原と接触させる段階；ｅ）段階ｄ）の前記接触された固相抗原を洗浄する段階；ｆ）前記第一及び第二のアッセイにおいて抗ＩｇＧ／抗体／抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下で検出可能なシグナルを発生させることのできるシグナル発生化合物へ付着した抗ＩｇＧ抗体を含むコンジュゲートを該第一及び第二のアッセイへ添加する段階；ｇ）前記第一及び第二のアッセイにおいて前記シグナル発生化合物によって発生したシグナルを検出する段階；及びｈ）該第二のアッセイにおいて得られた該シグナルと該第一のアッセイにおいて得られた前記シグナルとの間の比を求める段階（前記比は、患者の試料中に存在するヒト抗感染性因子低結合活性ＩｇＧ抗体のレベルに比例する。）を含む。本方法はさらに、ｉ）段階ｈ）の該比に１００を乗じ、及び該乗じた比を１００から減じて結合活性指数を決定する段階、５０％未満の結合活性指数は、該患者が低い結合活性のＣＭＶＩｇＧを有することを示し、６０％以上の結合活性指数は、該患者が高い結合活性のＣＭＶＩｇＧを有することを示し、及び５０％ないし５９％の結合活性指数は、ＣＭＶＩｇＧ抗体の結合活性に関して不確定であることを示す段階を含み得る。あるいは、本方法はさらに、ｉ）段階ｈ）の該比に１００を乗じ、及び該乗じた比を１００から減じて結合活性指数を決定する段階、４０％未満の結合活性指数は、該患者が低い結合活性のＣＭＶＩｇＧを有することを示し、７０％以上の結合活性指数は、該患者が高い結合活性のＣＭＶＩｇＧを有することを示し、及び４０％ないし６９％の結合活性指数は、ＣＭＶＩｇＧ抗体の結合活性に関して不確定であることを示す段階を含み得る。（この場合も先と同様に、「不確定な」結果は、不確かであり、別の試料が（例えば、第一検査の２ないし３週間後に）患者から採取され、本明細書に記載の方法を使用して検査されることを必要とするものである。前記結果は、低い結合活性でも高い結合活性でもないＩｇＧの結果である。さらに、「不確定な」結果は、「境界線」、「境界領域」、「平均」又は「中程度の」結果ともいわれ得る。）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の低い結合活性のＩｇＧの結果は、患者がＣＭＶに一次感染していることを示し、ＣＭＶの高い結合活性のＩｇＧの結果は、患者がＣＭＶに非一次感染していることを示す。
【００２０】
本方法の「精製された少なくとも１つの抗原」とは、例えば、ｐｐ３８、ｐｐ５３、ｐｐ６５、ｐ１３０又はｐｐ１５０であり得る。（精製又は単離された抗原は、組換え手段によって、合成手段によって調製され得るか又は、生物のゲノムによりコードされるタンパク質の転写及び翻訳後にトキソプラズマ・ゴンディイから抽出され得る。）さらに、患者の試料は、被覆された固相の添加前の溶液で前処理され得る。この場合も先と同様、固相は、例えば、多孔性材料、非多孔性材料、ラテックス粒子、磁気粒子、微粒子、ビーズ、メンブレン、マイクロタイターウェル又はプラスチックチューブであり得る。
【００２１】
本明細書で参照された全ての米国特許及び刊行物は、その全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【００２２】
発明の詳細な説明
ヒト抗ＣＭＶ及びヒト抗トキソプラズマＩｇＧ抗体の結合活性の決定のためのカオトロピック剤を使用する公知のアッセイの問題点は、上に記載されている。これに対して、本発明の方法は、カオトロピック試薬を使用しない。特に、本発明の方法は、急性の感染中に産生される低結合活性のＩｇＧ抗体が、「液相抗原」に対して低い親和性を有し、「固相抗原」に対して高い親和性を有するという発見を利用する。これに対して、慢性的な感染中に産生される高い結合活性のＩｇＧ抗体は、患者の試料の最適な希釈を含む最適なアッセイ条件下で、「液相抗原」に関して優先的な親和性を有する。従って、本発明の方法は、低い結合活性の抗体と高い結合活性の抗体とを識別するために、「固相抗原」及び同一の「液相抗原」に対する低い結合活性及び高い結合活性の抗体の親和性の相違を使用し、これにより急性感染と過去にもたらされた感染（すなわち、慢性感染、非急性感染又は非一次感染）とを診断レベルで区別する。使用の点において、本発明の結合活性アッセイは、妊娠中の女性におけるＣＭＶ感染の診断を補助するために、又は妊娠中の女性におけるトキソプラズマ症の診断を補助するために使用され得る。
【００２３】
本発明において「抗体の結合活性」とは、各ＩｇＧ分子に存在する２つのＦａｂドメイン及び各ＩｇＧ分子が結合する抗原の結合親和性の合計として定義される。
【００２４】
「液相抗原」とは、溶液内で同じく自由に移動する抗体へ結合する１つ又はそれ以上のエピトープを含む、溶液中の抗原として定義される。これに対して、「固相抗原」とは、溶液中の抗体を捕捉することが可能である１つ又はそれ以上のエピトープを含む、固相へ付着された抗原として定義される。
【００２５】
「固相」とは、多孔性又は非多孔性材料、ラテックス粒子、磁気粒子、微粒子（米国特許第５，７０５，３３０号参照）、ビーズ、メンブレン、及びマイクロタイターウェル又はプラスチックチューブであり得る。所望であれば、固相材料の選択及び抗原を標識する方法は、望ましいアッセイフォーマットの性能特性に基づいて決定される。
【００２６】
「低い結合活性の抗体」とは、感染０ヶ月後と４ヶ月後との間で産生される抗体として定義される。「高い結合活性の抗体」とは、感染４ヶ月より後に産生される抗体として定義される。感染の経過の間、感染に応じて産生されるＩｇＧ抗体の全体的な結合活性は、経時的に増加する。
【００２７】
結合活性アッセイに関する「結合活性指数」とは、患者の試料中に存在する高い結合活性のＩｇＧ抗体の割合の１００倍として定義される。
【００２８】
本発明の方法を使用して検査され得る生物学的液体の例には、全血、血漿、血清、脳髄液、唾液、涙、鼻洗浄液又は組織及び細胞の水性抽出物が含まれる。
【００２９】
「感染性因子」とは、感受性宿主において疾病を発症できる生物（例えば、細菌、真菌、ウイルス又は寄生物）として定義される。
【００３０】
「コンジュゲート」又は「指示試薬」は、「シグナル発生化合物」又は「標識」へ付着された抗体又は抗抗体を含む。この「シグナル発生化合物」又は「標識」は、それ自体検出可能であり、又は１つ若しくはそれ以上のさらなる化合物と反応して、検出可能な産物を生じ得る（例えば、米国特許第６，３９５，４７２号参照）。シグナル発生化合物の例には、色素原、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ及び１４Ｃ）、蛍光化合物（例えば、フルオレセイン又はローダミン）、化学発光化合物（例えば、アクリジニウム）、粒子（可視性又は蛍光性）、核酸、複合体形成剤、又は酵素等の触媒（例えば、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びリボヌクレアーゼ）が含まれる。酵素の使用（例えば、アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼ）の場合、発色基質、蛍光基質又は発光基質の添加によって、検出可能なシグナルが発生する。時間分解型蛍光、内部反射型蛍光、増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）及びラマン分光法等の他の検出系も有用である。
【００３１】
本発明の「溶液」とは、０℃と３７℃との間の水性液体として定義される。例には、緩衝液及び希釈剤が含まれる。
【００３２】
上述のように、本発明の一方法は、ヒト抗ＨＣＭＶＩｇＧ抗体の結合活性の決定に関する競合的抗原フォーマットである。第一に、固相上へ被覆される場合、溶液中でヒト抗ＨＣＭＶＩｇＧ抗体に結合することができるＨＣＭＶ抗原が調製され得る。このウイルス抗原は、臨床単離物から又はＨＣＭＶ系ＡＤ１６９、Ｔｏｗｎｅ若しくはＴｏｌｅｄｏの市販のストックから得られたＨＣＭＶを有する組織培養物中での哺乳動物細胞の感染（Ｔｒｉｎｃａｄｏ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．６１，  ４８１−４８７；Ｃｈｅｅ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４，  １２５−１６９；Ｌｅｈｎｅｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９，  ２４９４−２５０２）後に、感染した細胞からウイルスを精製することによって調製されることが可能である。あるいは、固相上へ被覆される場合、溶液中でヒト抗ＨＣＭＶＩｇＧ抗体に結合することができる精製された組換えＨＣＭＶ抗原が調製されることが可能である。これらの組換えＨＣＭＶ抗原には、ｐｐ３８（ＵＬ８０ａ）、ｐｐ５２（ＵＬ４４）、ｐｐ６５（ＵＬ８３）、ｐ１３０（ＵＬ５７）、ｐｐ１５０（ＵＬ３２）が含まれ得るが、これらに限定されるわけではない（Ｍａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｉａｇｎ．１，  １９−２９；米国特許第６，０７４，８１７号）。
【００３３】
次に、精製されたＨＣＭＶウイルス可溶化液、合成抗原又は組換え抗原を溶液（例えば、緩衝抗原希釈剤）中へ希釈し（「液相抗原」）、また、固相上へ被覆する（「固相抗原」）。次に、結合活性指数を求めるために、競合的抗原結合活性アッセイフォーマットにおいて２つのアッセイを実施する。（ＨＣＭＶ可溶性抗原を含まない）本発明のアッセイ第１番において、患者の試料を試料溶液（例えば、希釈剤）で希釈し、ＨＣＭＶ抗原を含有しない緩衝抗原溶液（例えば、希釈剤）とともに、及びＨＣＭＶ抗原で被覆された固相とともに温置する。あるいは、希釈された試料を、ＨＣＭＶ抗原を含有しない溶液（例えば、緩衝抗原希釈剤）で「前処理」した後、ＨＣＭＶ抗原を被覆された固相を添加することが可能である。本アッセイにおいて、低い結合活性及び高い結合活性の両者のヒト抗ＨＣＭＶＩｇＧ抗体は、「固相抗原」へ結合する。並行して、本発明のアッセイ第２番において（可溶性ＨＣＭＶ抗原）、患者の試料を試料溶液（例えば、希釈剤）で希釈し、ＨＣＭＶ抗原を含有する緩衝抗原溶液（例えば、希釈剤）とともに、及びＨＣＭＶ抗原で被覆された固相とともに温置する。あるいは、ＨＣＭＶ抗原を含有する緩衝抗原溶液で、希釈された試料を「前処理」した後、ＨＣＭＶ抗原を被覆された固相を添加することが可能である。本アッセイにおいて、低い結合活性のヒト抗ＨＣＭＶＩｇＧ抗体は、「固相抗原」に結合するのに対し、高い結合活性のヒト抗ＨＣＭＶＩｇＧ抗体は、「液相抗原」に結合する。患者の試料を（可溶性ＨＣＭＶ抗原を有し、又は有さない）緩衝抗原溶液及びＨＣＭＶ抗原で被覆された固相とともに温置した後、洗浄段階が実施され、固相ＨＣＭＶ抗原に結合していないヒトＩｇＧ抗体を除去する。アッセイ第１番において、ＨＣＭＶに特異的ではないヒトＩｇＧ抗体のみが除去される。アッセイ第２番において、洗浄段階は、ＨＣＭＶに特異的ではないヒトＩｇＧ抗体、及び「液相抗原」に結合したヒト抗ＨＣＭＶＩｇＧ高結合活性抗体を除去する。その後両アッセイにおいて、シグナル発生化合物を含有する抗ヒトＩｇＧコンジュゲートを添加し、得られたシグナルは、固相に結合したヒト抗ＨＣＭＶＩｇＧの量に比例する。一次抗体温置後の洗浄段階が、高い結合活性のヒト抗ＨＣＭＶＩｇＧを除去するので、アッセイ第１番におけるシグナルを上回る、アッセイ第２番において得られたシグナルの比は、試料中に存在するヒト抗ＨＣＭＶ低結合活性ＩｇＧのレベルに比例する。これは、得られたシグナルの比が、試料中に存在するヒト抗ＨＣＭＶ高結合活性ＩｇＧのレベルに比例する、カオトロピックな結合活性のアッセイフォーマットとは対照的である。これは、カオトロピックな結合活性のアッセイ洗浄段階が、低い結合活性のＩｇＧ抗体を除去するのに対し、本発明の競合的抗原フォーマットが、高い結合活性のＩｇＧ抗体を除去するという事実による。結合活性アッセイに関する「結合活性指数」が、患者の試料中に存在する高い結合活性のＩｇＧ抗体の比の１００倍として定義されるので、競合的抗原結合活性のアッセイの結果は、次のように計算上転換される。
【００３４】
【数１】
2009515169.tif 000002
【００３５】
さらに、上述のように、本発明の別の方法は、ヒト抗トキソプラズマＩｇＧ抗体の結合活性の決定に関する競合的抗原フォーマットである。第一に、固相上へ被覆される場合、溶液中でヒト抗トキソプラズマＩｇＧ抗体に結合することのできるトキソプラズマ・ゴンディイ抗原が調製されなければならない。この寄生生物抗原は、臨床的単離物から、又はマウス若しくは、ＲＨ、ＢＫ又はＣ−５６の系の市販のストックから得られたトキソプラズマ・ゴンディイを有する組織培養物中の哺乳動物細胞を感染させた（Ｒｅｉｔｅｒ−Ｏｗｏｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｕｌｌ．Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇ．７７，  ９２９−９３５）後、マウス又は感染した細胞から寄生物抗原を精製することによって調製されることが可能である。あるいは、固相上へ被覆される場合、溶液中でヒト抗トキソプラズマＩｇＧ抗体に結合することのできる精製された組換えトキソプラズマ・ゴンディイ抗原が調製されることが可能である。これらの組換えトキソプラズマ・ゴンディイ抗原には、Ｐ２２（ＳＡＧ２）、Ｐ２４（ＧＲＡ１）、Ｐ２５、Ｐ２８（ＧＲＡ２）、Ｐ２９（ＧＲＡ７）、Ｐ３０（ＳＡＧ１）、Ｐ３５（ＧＲＡ８）、Ｐ４１（ＧＲＡ４）、Ｐ５４（ＲＯＰ２）、Ｐ６６（ＲＯＰ１）、Ｐ６８が含まれるが、これらに限定されるわけではない（Ｐｒｉｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ  ４３，  ９７−１０６；Ｃｅｓｂｒｏｎ−Ｄｅｌａｕｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，  ７５３７−７５４１；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅ  ９９，  １２７−１３２；Ｐｒｉｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．３４，  ３−１３；Ｂｏｎｈｏｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４６，  １４１１−１４２１；Ｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１，  ３５８４−３５９１；Ｋｎａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）欧州特許出願公開第４３１５４１号；Ｃａｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１０５，  ２５−３７；Ｍｅｖｅｌｅｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．５６，  ２２７−２３８；Ｓａａｖｅｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７，  １９７５−１９８２；欧州特許出願第７５１１４７号）。次に、精製された寄生生物、合成又は組換えトキソプラズマ・ゴンディイ抗原を溶液（例えば、緩衝抗原希釈剤）中へ希釈し（「液相抗原」）、また、固相上へ被覆する（固相抗原）。次に、結合活性指数を決定するため、競合的抗原結合活性アッセイフォーマットにおいて２つのアッセイを実施する。（トキソプラズマ・ゴンディイ可溶性抗原を含まない）アッセイ第１番において、患者の試料を試料溶液（例えば、希釈剤）で希釈し、トキソプラズマ・ゴンディイ抗原を含有しない緩衝抗原溶液（例えば、希釈剤）とともに、及びトキソプラズマ・ゴンディイ抗原で被覆された固相とともに温置する。あるいは、トキソプラズマ・ゴンディイ抗原を含有しない緩衝抗原溶液で、希釈された試料を「前処理」した後、トキソプラズマ・ゴンディイ抗原を被覆された固相を添加することが可能である。本アッセイにおいて、低い結合活性及び高い結合活性の両者のヒト抗トキソプラズマＩｇＧ抗体は、「固相抗原」へ結合する。並行して、アッセイ第２番（可溶性トキソプラズマ・ゴンディイ抗原）において、患者の試料を試料溶液（例えば、希釈剤）で希釈し、トキソプラズマ・ゴンディイ抗原を含有する緩衝抗原溶液（例えば、希釈剤）とともに、及びトキソプラズマ・ゴンディイ抗原で被覆された固相とともに温置する。あるいは、トキソプラズマ・ゴンディイ抗原を含有する緩衝抗原溶液（例えば、希釈剤）で、希釈された試料を「前処理」した後、トキソプラズマ・ゴンディイ抗原を被覆された固相を添加することが可能である。本アッセイにおいて、低い結合活性のヒト抗トキソプラズマＩｇＧ抗体は、「固相抗原」に結合するのに対し、高い結合活性のヒト抗トキソプラズマＩｇＧ抗体は、「液相抗原」に結合する。患者の試料を（可溶性ＨＣＭＶ抗原を有するか又は有さない）緩衝抗原溶液及びトキソプラズマ・ゴンディイ抗原で被覆された固相とともに温置した後、洗浄段階を実施し、固相トキソプラズマ・ゴンディイ抗原に結合していないヒトＩｇＧ抗体を除去する。アッセイ第１番において、トキソプラズマ・ゴンディイに特異的ではないヒトＩｇＧ抗体のみが除去される。アッセイ第２番において、洗浄段階は、トキソプラズマ・ゴンディイに特異的ではないヒトＩｇＧ抗体、及び「液相抗原」に結合したヒト抗トキソプラズマＩｇＧ高結合活性抗体を除去する。その後両アッセイにおいて、シグナル発生化合物を含有する抗ヒトＩｇＧコンジュゲートを添加し、得られたシグナルは、固相に結合したヒト抗トキソプラズマＩｇＧの量に比例する。一次抗体温置後の洗浄段階が、高い結合活性のヒト抗トキソプラズマＩｇＧを除去するので、アッセイ第１番におけるシグナルを上回る、アッセイ第２番において得られたシグナルの比は、試料中に存在するヒト抗トキソプラズマ低結合活性ＩｇＧのレベルに比例する。これは、得られたシグナルの比が、試料中に存在するヒト抗トキソプラズマ高結合活性ＩｇＧのレベルに比例する、カオトロピックな結合活性のアッセイフォーマットとは対照的である。これは、カオトロピックな結合活性アッセイの洗浄段階が、低い結合活性のＩｇＧ抗体を除去するのに対し、本発明の競合的抗原フォーマットが、高い結合活性のＩｇＧ抗体を除去するという事実による。結合活性アッセイに関する「結合活性指数」が、患者の試料中に存在する高い結合活性のＩｇＧ抗体の比の１００倍として定義されるため、競合的抗原結合活性のアッセイの結果は、次のように計算上転換される。
【００３６】
【数２】
2009515169.tif 000003
【００３７】
上述のように、ＣＭＶ一次感染中に又は急性トキソプラズマ症の間に産生された低い結合活性のＩｇＧ抗体が、「液相抗原」に対して低い結合親和性を有するが、「固相抗原」（例えば、抗原で被覆された微粒子又はマイクロタイタープレート）に対しては高い結合親和性を有する。これに対して、ＣＭＶ非一次感染中に又は慢性トキソプラズマ症中に産生された高い結合活性のＩｇＧ抗体は、「液相抗原」を優先的に結合するが、「固相抗原」を結合しないが、ただし、「液相抗原」は、対象患者の試料中に存在する高い結合活性の抗ＣＭＶ又は抗トキソプラズマＩｇＧ抗体を全て結合するのに十分な量で存在する。この条件は、アッセイにおいて必要とされる患者の試料を希釈することによって満たされる。
【００３８】
上述の競合的抗原フォーマットにおけるＣＭＶ及びトキソプラズマＩｇＧ結合活性アッセイが、目的どおり実施されるのを確実にするために、高い結合活性及び低い結合活性のＩｇＧを含有するＣＭＶ及びトキソプラズマのためのアッセイ特異的対照は、結合活性アッセイの妥当性を評価するために周期的に実施される。これらの対照を作製するため、源となる血漿は、対照作製のために得られなければならない。ＣＭＶ及びトキソプラズマに関する高い結合活性のＩｇＧ源となる血漿は、一般的な集団におけるこれらの疾病に関する血清有病率により容易に得ることが可能であり、すなわち、健常者のＣＭＶ又はトキソプラズマ免疫個体は、高い結合活性のＩｇＧ対照を作製するのに使用されることが可能である高い結合活性のＩｇＧを含有する血漿を提供することが可能である。これに対して、血漿が低い結合活性のＩｇＧを含有するＣＭＶ又はトキソプラズマ感染の急性相にある患者は、健常でないであろうから、低い結合活性のＩｇＧ対照の作製のために患者の血漿を提供することはできないであろう。さらに、感染の急性相は比較的短く、ＣＭＶ及びトキソプラズマに関する感染の発生率は比較的低く、これらの重要なアッセイの妥当性の対照の作製に必要なＣＭＶ及びトキソプラズマに関する低い結合活性のＩｇＧ血漿の適切な量を調達することを特に困難なものにしている。上述のＣＭＶ及びトキソプラズマ結合活性アッセイが、有効なアッセイ結果を提供するために患者の試料の適切な希釈を必要とするので、高い力価の高結合活性ＩｇＧを含有する高結合活性ＩｇＧの対照は、正確な希釈範囲へと対照を希釈しない希釈プロトコールにおいて実施される場合に、低い結合活性の対照を「擬似する」ことが可能である。それゆえ、本発明の別の態様は、ＣＭＶ及びトキソプラズマに関する「模擬」低結合活性ＩｇＧ対照の開発であり、その中で、低結合活性対照に関する代替的なプロトコールの希釈において実施される場合、該対照のＩｇＧ力価は、低結合活性ＩｇＧの結果をもたらす「液相抗原」による「ブロッキング」を克服する。
【００３９】
本発明は、以下の非限定的実施例を用いて説明され得る。
【実施例１】
【００４０】
一般的な方法論
材料及び源
トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（トリス）、トリスＨＣｌ、塩化ナトリウム、ＥＤＴＡ、ショ糖、キノロン（Ａ５６６２０）、Ｎｉｐａｓｅｐｔ（アルキルパラベンナトリウム）、ＰｒｏＣｌｉｎ３００、Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、水酸化ナトリウム、塩酸、ＣＡＰＳ、ＣＨＡＰＳ、アジ化物、２−（Ｎ−モロオフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、常磁性ポリスチレン微粒子、ＣＭＶ抗原プール、消泡剤、トリトンＸ−４０５、トリトンＸ−１００、塩化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、リゾチーム、ベンゾナーゼ、塩化マグネシウム、マルトース、ウシアルブミン画分Ｖ、仔ウシ血清、ポリソルベート２０、塩酸サラフロキサシン、トゥイーン２０、カーネーション無脂肪粉乳、マウス免疫グロブリンＩｇＧ、アンモニウム沈殿したＣＫＳ抗原、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、ＣＭＶＩｇＧ陽性高結合活性再石灰化ヒト血漿、トキソプラズマＩｇＧ陽性高結合活性再石灰化ヒト血漿、ＣＭＶＩｇＧ陰性再石灰化ヒト血漿、仔ヒツジ血清、酵母抽出物、トリプトン、グリセリン、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、アンピシリン、脱泡剤（Ｄｅｆｏａｍｅｒ）Ｍａｚｕ  ＤＦ−６０、水酸化アンモニウム、カザミノ酸、６Ｎ硫酸、６Ｎ塩酸、６Ｎ水酸化ナトリウム、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ９）、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース高速流スラリー、アミローススラリー、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）抗ヒトＩｇＧアクリジニウム標識したコンジュゲート濃縮物、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ライン希釈剤、プレトリガー溶液、トリガー溶液、及びＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）物品は、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）から得た。Ｒａｄｉｍ  ＣＭＶＩｇＧ結合活性キットは、Ｒａｄｉｍ  ＳｐＡ（Ｒｏｍｅ，Ｉｔａｌｙ）から購入した。ＶｉｄａｓトキソプラズマＩｇＧ結合活性キットは、ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＳＡ（Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。ヒト抗トキソプラズマＰ３０ＩｇＧモノクローナル抗体は、Ｃｅｌｌｉａｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）から得た。ｐＭＡＬ（商標）タンパク質融合及び精製システムは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から購入した。ＤＮＡのイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）への形質転換のため、及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）の精製のため、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓのプロトコールに従った。ＥＰＩＣＵＲＩＡＮ  Ｃｏｌｉ（商標）ＸＬ−１  ＢＬＵＥ（ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｔｈｉ−１  ｈｓｄＲ１７  ｓｕｐＥ４４  ｒｅｌＡ１  ｌａｃ［Ｆ’ｐｒｏＡＢ  ｌａｃＩｑ  ＺＤＭ１５  Ｔｎ１０（Ｔｅｔｒ）］）超形質転換受容性イー・コリ細胞を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から得た。
【００４１】
培地、緩衝液及び一般的な試薬
「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ(登録商標)ＣＭＶＩｇＧ結合活性微粒子希釈剤」及び「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性前処理１緩衝液」は、４．４４ｇ／Ｌトリス、２．６５ｇ／Ｌトリス−ＨＣｌ、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、３ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、１００ｇ／Ｌショ糖、０．０１ｇ／Ｌキノロン（Ａ５６６２０）、１ｇ／Ｌ  Ｎｉｐａｓｅｐｔ（アルキルパラベンナトリウム）、１ｇ／Ｌ  ＰｒｏＣｌｉｎ３００、１０ｇ／Ｌ  ＢＳＡを含有し、水酸化ナトリウム又は塩酸でｐＨを８．４に調整された。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ(登録商標)ＣＭＶＩｇＧ結合活性微粒子被覆緩衝液」は、２２．１４ｇ／Ｌ  ＣＡＰＳ、４．３８ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、１ｇ／Ｌ  ＣＨＡＰＳ、１ｇ／Ｌアジ化物を含有し、水酸化ナトリウム又は塩酸でｐＨを１１．０に調整された。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性微粒子濃縮緩衝液」は、２Ｌの「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性微粒子被覆緩衝液」、３Ｌの５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２）、０．２ＬのＣＭＶ抗原被覆された微粒子、及び１Ｌの「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性アッセイ微粒子希釈剤」を含有した。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性微粒子バルク」は、０．１Ｌの「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ微粒子濃縮物」、０．９Ｌの「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性微粒子希釈剤」、及び０．１ｍＬ消泡剤を含有した。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ(登録商標)ＣＭＶＩｇＧ結合活性コンジュゲート希釈剤」は、９．８ｇ／Ｌ  ＭＥＳ、２９ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｇ／Ｌ  ＢＳＡ、３０ｍＬ／ＬトリトンＸ−４０５、１０ｍＬ／Ｌキノロン（Ａ５６６２０）、１ｇ／Ｌ  Ｎｉｐａｓｅｐｔ（アルキルパラベンナトリウム）を含有し、水酸化ナトリウム又は塩酸でｐＨを６．６に調整した。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性コンジュゲートバルク」は、「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性コンジュゲート希釈剤」中に、０．０３ないし０．０６ｍｇ／Ｌ  ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）抗ヒトＩｇＧコンジュゲート濃縮物、０．０５ｍＬ/Ｌ消泡剤を含有した。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性前処理２ブロッカー」は、４．４４ｇ／Ｌトリス、２．６５ｇ／Ｌトリス−ＨＣｌ、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、３ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、１００ｇ／Ｌショ糖、０．０１ｇ／Ｌキノロン（Ａ５６６２０）、１ｇ／Ｌ  Ｎｉｐａｓｅｐｔ（アルキルパラベンナトリウム）、１ｇ／Ｌ  ＰｒｏＣｌｉｎ３００、１０ｇ／Ｌ  ＢＳＡ、３３．３ないし１００ｍＬ/Ｌ  ＣＭＶ抗原プールを含有し、水酸化ナトリウム又は塩酸でｐＨを８．４に調整された。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ高結合活性対照」は、ＣＭＶＩｇＧ陽性高結合活性再石灰化血漿（結合活性指数の範囲＝７０ないし１００％）、ＣＭＶＩｇＧ陰性再石灰化血漿、１ｇ／Ｌアジ化物、及び１５ｍＬ／Ｌの９．５％ＰｒｏＣｌｉｎ９５０を含有した。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ低結合活性対照」は、ＣＭＶＩｇＧ陽性低結合活性再石灰化血漿（結合活性指数の範囲＝１０ないし３０％）、Ｃ��ＶＩｇＧ陰性再石灰化血漿、１ｇ／Ｌアジ化物、及び１５ｍＬ／Ｌの９．５％ＰｒｏＣｌｉｎ９５０を含有した。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性バックグラウンド標準物質」は、０．２５Ｌ／Ｌ  ＣＭＶＩｇＧ陰性再石灰化血漿、０．７５Ｌ／Ｌ仔ヒツジ血清、１５ｍＬ／Ｌの９．５％ＰｒｏＣｌｉｎ９５０、及び１ｇ／Ｌアジ化物を含有した。「ＭＢＰ接種培地」は、２４ｇ／Ｌ酵母抽出物、１２ｇ／Ｌトリプトン、５ｍＬ／Ｌグリセリン、１．７ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、１１．４ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム、０．０５ｇ／Ｌアンピシリンを含有した。「ＭＢＰ発酵培地」は、２４ｇ／Ｌ酵母抽出物、１２ｇ／Ｌトリプトン、１０ｍＬ／Ｌグリセリン、１．７ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、１１．４ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム、０．０５ｇ／Ｌアンピシリン、０．５ｍＬ／Ｌ脱泡剤Ｍａｚｕ  ＤＦ−６０を含有した。「ＣＫＳ発酵培地」は、２４ｇ／Ｌ酵母抽出物、１２ｇ／Ｌトリプトン、１５ｍＬ／Ｌグリセリン、１．７ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、１１．４ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム、１０ｇ／Ｌカザミノ酸、０．０５ｇ／Ｌアンピシリン、０．５ｍＬ／Ｌ脱泡剤Ｍａｚｕ  ＤＦ−６０を含有した。「ＭＢＰ溶解緩衝液」は、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．０５％トリトンＸ−１００、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有した。
【００４２】
「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性微粒子希釈剤」は、２．１１ｇ／Ｌトリス、１１．４３ｇ／Ｌトリス−ＨＣｌ、８ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、３．７２ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、１３２．５ｇ／Ｌショ糖、０．００５ｇ／Ｌキノロン（Ａ５６６２０）、１ｇ／Ｌ  Ｎｉｐａｓｅｐｔ（アルキルパラベンナトリウム）、１８ｍＬ／Ｌポリソルベート２０、１０２．５ｇ／Ｌ仔ウシ血清を含有し、水酸化ナトリウム又は塩酸でｐＨを７．５に調整された。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性前処理１緩衝液」は、２．１３ｇ／Ｌトリス、１１．４６ｇ／Ｌトリス−ＨＣｌ、９．８７ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、４．６５ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、０．００５ｇ／Ｌキノロン（Ａ５６６２０）、１ｇ／Ｌ  Ｎｉｐａｓｅｐｔ（アルキルパラベンナトリウム）、０．０１％消泡剤、０．１ｇ／ＬマウスＩｇＧを含有し、水酸化ナトリウム又は塩酸でｐＨを７．５に調整された。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性前処理２ブロッカー」は、２．１３ｇ／Ｌトリス、１１．４６ｇ／Ｌトリス−ＨＣｌ、９．８７ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、４．６５ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、０．００５ｇ／Ｌキノロン（Ａ５６６２０）、１ｇ／Ｌ  Ｎｉｐａｓｅｐｔ（アルキルパラベンナトリウム）、０．０１％消泡剤、０．１ｇ／ＬマウスＩｇＧ、５０ないし２００ｍｇ／ＬのｒｐＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１を含有し、水酸化ナトリウム又は塩酸でｐＨを７．５に調整された。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性微粒子被覆緩衝液」は、５０ｍＭ  ＭＥＳ、０．０００５％トリトンＸ−１００、ｐＨ６．２を含有した。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性コンジュゲート希釈剤」は、９．８ｇ／Ｌ  ＭＥＳ、２９ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｇ／Ｌウシアルブミン画分Ｖ、３０ｍＬ／ＬトリトンＸ−４０５、１０ｍＬ／Ｌキノロン（Ａ５６６２０）、１ｇ／Ｌ  Ｎｉｐａｓｅｐｔ（アルキルパラベンナトリウム）、０．８ｇ／Ｌアジ化ナトリウムを含有し、水酸化ナトリウム又は塩酸でｐＨを６．６に調整した。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性コンジュゲートバルク」は、「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性コンジュゲート希釈剤」中に、０．０１５ないし０．０９ｍｇ／Ｌ  ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）抗ヒトＩｇＧコンジュゲート濃縮物、１ｍＬ/Ｌ消泡剤を含有した。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標)トキソプラズマＩｇＧ結合活性アッセイ特異的希釈剤」は、２．１３ｇ／Ｌトリス、１１．４３ｇ／Ｌトリス−ＨＣｌ、９．８７ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、３００ｍＬ／Ｌ仔ウシ血清、４．６５ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、１ｇ／Ｌ  Ｎｉｐａｓｅｐｔ(アルキルパラベンナトリウム)、０．００５ｇ/Ｌ塩酸サラフロキサシン、１．８ｍＬ／Ｌトゥイーン２０、１０ｇ／Ｌカーネーション無脂肪粉乳、１００ｍｇ／Ｌ  ＭＢＰ可溶化液、１００ｍｇ／Ｌ  ｒｐＣＫＳ（硫酸アンモニウムで沈殿）、１００ｍｇ／ＬマウスＩｇＧ、１ｍＬ／Ｌ消泡剤を含有し、水酸化ナトリウム又は塩酸でｐＨを７．５に調整された。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマ高結合活性対照」は、トキソプラズマＩｇＧ陽性抗結合活性再石灰化血漿（結合活性指数の範囲＝６０ないし１００％）、トキソプラズマＩｇＧ陰性再石灰化血漿、１ｇ／Ｌアジ化物、及び１５ｍＬ／Ｌの９．５％ＰｒｏＣｌｉｎ９５０を含有した。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ低結合活性対照」は、ヒト抗トキソプラズマＰ３０  ＩｇＧ低結合活性モノクローナル抗体（結合活性指数の範囲＝１０ないし２０％）、ＢＳＡ１０ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌアジ化物、及び１５ｍＬ／Ｌの９．５％ＰｒｏＣｌｉｎ９５０を含有した。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性バックグラウンド標準物質」は、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ライン希釈剤を含有した。
【実施例２】
【００４３】
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性アッセイ試薬キット、標準物質、対照、及びアッセイソフトウェアの作製
段階Ａ：微粒子上へのＣＭＶウイルス抗原の被覆及び微粒子バルク試薬の作製
常磁性ポリスチレン微粒子を「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性微粒子被覆緩衝液」で１回洗浄した後、被覆緩衝液中で１％の終濃度に再懸濁した。ＣＭＶ抗原プールを室温で解凍し、３０％のポーズ振幅の６×５秒間の突発波で超音波処理した後、５００×ｇで３０分間遠心分離し、残留細胞細片からウイルスを分離した。被覆緩衝液１Ｌあたり約１ないし２５ｍＬのウイルス抗原上清の濃度で微粒子を含有する被覆緩衝液へウイルス抗原上清を添加し、撹拌しながら３０分間温置した。ウイルス抗原を被覆した微粒子を５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２）で３回洗浄し、「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性微粒子濃縮緩衝液」中で１％固体の終濃度に再懸濁し、２ないし８℃で保存した。次に、微粒子濃縮物を「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性微粒子希釈剤」で１：１０に希釈し、消泡剤を添加し、「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性微粒子バルク」試薬を試薬瓶中へ充填し、２ないし８℃で保存した。
【００４４】
段階Ｂ：コンジュゲートバルク試薬の作製
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）抗ヒトＩｇＧアクリジニウム標識されたコンジュゲートを「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性コンジュゲート希釈剤」中で３０ないし６０ｎｇ／ｍＬの終濃度に希釈して「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性コンジュゲートバルク」を生じさせた後、試薬瓶中へ充填し、２ないし８℃で保存した。
【００４５】
段階Ｃ：前処理１緩衝液の作製
実施例１における調製法を使用して「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性前処理１緩衝液」を調製した後、試薬瓶中へ充填し、２ないし８℃で保存した。
【００４６】
段階Ｄ：前処理２ブロッカーの作製
実施例１における調製法を使用して「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性前処理２ブロッカー」を調製した後、試薬瓶中へ充填し、２ないし８℃で保存した。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ試薬パック」は、実施例２Ａないし２Ｄに記載されている試薬として定義される。
【００４７】
段階Ｅ：バックグラウンド標準物質の作製
実施例１における調製法を使用して「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性バックグラウンド標準物質」を調製した後、試薬瓶中へ充填し、２ないし８℃で保存した。
【００４８】
段階Ｆ：対照の作製
実施例１における調製法を使用して「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ高結合活性対照」及び「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ低結合活性対照」を調製した後、試薬瓶中へ充填し、２ないし８℃で保存した。
【００４９】
段階Ｇ：アッセイソフトウェアの作製
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器においてＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性アッセイを実施するために必要とされるアッセイソフトウェアは、アッセイを実施する前のＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器に搭載されるべきＣＤ−ＲＯＭに提供される。アッセイソフトウェアは、以下に記載され、及び図１に示されるアッセイを実施するために、ピペッティング、分注、及び混合の段階を調節する。
【実施例３】
【００５０】
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性アッセイの操作
段階Ａ：ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器の設定及び試薬パックの搭載
操作者は、ＣＤ−ＲＯＭからアッセイソフトウェアを読み込むことによって、アッセイを実施するためのＡＲＣＨＩＴＥＧＴ（登録商標）機器を設定する（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）。アッセイを実施するために必要とされるソフトウェアは、アッセイ第１番及びアッセイ第２番の２つのアッセイファイルを含有する。アッセイ第１番及びアッセイ第２番は、以下に示される結合活性指数を算出するため、各試料に関して実施されなければならない。操作者は、次式に従って結合活性指数を算出するＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器ユーザーインターフェイスを使用するさらなるアッセイファイルも設定する。
【００５１】
【数３】
2009515169.tif 000004
【００５２】
「試料ＲＬＵ」は、相対的光単位（ＲＬＵ）において表される患者の試料のアッセイ結果として定義され、「標準物質ＲＬＵ」は、「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性バックグラウンド標準物質」を使用するＲＬＵにおけるアッセイ結果として定義され、「アッセイ第２番」は、試料、対照、又は標準物質を「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性前処理２ブロッカー」で前処理するアッセイとして定義され、「アッセイ第１番」は、試料、対照、又は標準物質を「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性前処理１緩衝液」で前処理するアッセイとして定義され、「結合活性指数」は、試料中に存在するヒト抗ＨＣＭＶ高結合活性ＩｇＧのレベルに比例する。５０％未満の結合活性指数値を有する試料は、低い結合活性のＣＭＶＩｇＧを含有し、６０％以上のものは、高い結合活性のＣＭＶＩｇＧを含有し、５０ないし５９％の間のものは、ＣＭＶＩｇＧ抗体の結合活性に関して不確定である。
【００５３】
操作者は、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器に「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ試薬パック」を次のとおり搭載する。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性前処理１緩衝液」は、位置第１番、色コード黄色へ搭載され、「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性微粒子バルク」は、位置第２番、色コードピンクへ搭載され、「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性コンジュゲートバルク」は、位置第３番、色コード黒へ搭載され、及び「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性前処理２ブロッカー」は、位置第５番、色コードピンクへ搭載される。
【００５４】
段階Ｂ：ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性検査の秩序化
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性検査を実施する前に、操作者は、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧアッセイからＡＵ／ｍＬで表される各試料のＣＭＶＩｇＧ力価を基にしたアッセイ第１番及び第２番に関する適切な希釈プロトコールを次のとおり、すなわち、希釈プロトコール第１番、５ないし１６ＡＵ／ｍＬ、希釈プロトコール第２番、１６ないし５０ＡＵ／ｍＬ、希釈プロトコール第３番、５０ないし１５０ＡＵ／ｍＬ、希釈プロトコール第４番、１５０ないし５００ＡＵ／ｍＬと選択しなければならず、ＣＭＶＩｇＧ力価が５００ＡＵ／ｍＬを超える試料に関して、試料は１０ＡＵ／ｍＬの力価に手動で希釈され、希釈プロトコール第１番が実施される。次に、試料を機器に負荷する。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性バックグラウンド標準物質」は、アッセイの較正のために機器へ負荷され、及び「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ高結合活性対照」及び「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ低結合活性対照」は、アッセイの結果が有効であることを確実にするために負荷される。
【００５５】
段階Ｃ：ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性アッセイに関する記述
操作者の要求する希釈プロトコールに依存して、アッセイ第１番及び第２番に各試料約１０ないし７２μＬが必要である。アッセイ第１番及び第２番に関する次の段階は、前処理段階以外、同一である。ピペッティングプローブは、各アッセイに必要な試料の量を吸引し、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ライン希釈剤による適切な試料希釈を実施する。アッセイ第２番に関する前処理段階において、ピペッティングプローブは、液相中に存在するＨＣＭＶウイルス抗原を含有し、ヒト抗ＨＣＭＶ高結合活性ＩｇＧに結合する「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性前処理２ブロッカー」を、希釈された試料中へ分注する。アッセイ第１番に関する前処理段階において、ピペッティングプローブは、緩衝液のみを含有する「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性前処理１緩衝液」を、希釈された試料中へ分注する。前処理された試料を７分間温置する。ピペッティングプローブは、「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性微粒子バルク」５０μＬを「前処理された試料」中へ分注し、試料を１８分間温置する。低結合活性のヒト抗ＨＣＭＶＩｇＧ抗体は、アッセイ第２番においてＨＣＭＶウイルス抗原で被覆された固相に結合するのに対し、高結合活性及び低結合活性のヒト抗ＨＣＭＶＩｇＧ抗体は、アッセイ第１番においてＨＣＭＶウイルス抗原で被覆された固相に結合する。微粒子をＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ライン希釈剤で洗浄した後、ピペッティングプローブが、「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性コンジュゲートバルク」５０μＬを分注し、微粒子をコンジュゲートとともに４分間温置される。微粒子をＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ライン希釈剤で再度洗浄した後、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）プレトリガー及びトリガー試薬で処理される。得られた化学発光シグナルをＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器によって読み取り、各試料に関してＲＬＵを表示し、アッセイ第１番及びアッセイ第２番に関して保存する。操作が完了した後、機器は、アッセイ第１番及びアッセイ第２番に関して各試料から「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性バックグラウンド標準物質」ＲＬＵを減じる。上述のとおり結合活性指数を算出し、次のアルゴリズムに従って、結合活性指数の結果の隣に結果の解釈も表示する。５０％未満の結合活性指数値を有する試料が低い結合活性のＣＭＶＩｇＧを含有し、６０％以上が、高い結合活性のＣＭＶＩｇＧを含有し、５０ないし５９％の間が、ＣＭＶＩｇＧ抗体の結合活性に関して不確定である。
【実施例４】
【００５６】
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性アッセイの評価
段階Ａ：検査のためのヒト血清
血清３群をこの評価において検査した。第１群（ｎ＝２５６）は、無作為の血液ドナー血清（ｎ＝１２６）並びにＣＭＶＩｇＭ抗体に関して陰性であり、ＣＭＶＩｇＧ抗体に関して陽性である妊娠中の女性（ｎ＝１３０）からなり、第２群（ｎ＝３５）は、抗体陽転（ｎ＝２）によって、又はＣＭＶＩｇＭ抗体及び低結合活性ＣＭＶＩｇＧの存在（ｎ＝１）によって示されるＨＣＭＶ一次感染を有する３名の個体由来の連続採血からなり、第３群（ｎ＝３７）は、抗体陽転（ｎ＝１８）によって、又はＣＭＶＩｇＭ抗体及び低結合活性ＣＭＶＩｇＧの存在（ｎ＝２）によって示されるＨＣＭＶ一次感染を有する２０名の妊娠中の女性由来の連続採血からなった。
【００５７】
段階Ｂ：ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性アッセイとＲａｄｉｍ  ＣＭＶＩｇＧ結合活性アッセイとの性能比較及び臨床データ
Ｒａｄｉｍ  ＣＭＶＩｇＧ結合活性アッセイ（Ｒａｄｉｍ  ＳｐＡ，Ｒｏｍｅ，Ｉｔａｌｙ）は、二つ組で実施される２回のＣＭＶＩｇＧアッセイからなり、２つのＣＭＶＩｇＧアッセイのうちの１つにおける一次抗体温置後の尿素によるカオトロピックな洗浄段階を組み込むことによって、低い結合活性を含有する検体と高い結合活性を含有する検体を識別する。光学密度（Ｏ．Ｄ．）を使用して、製造元のパッケージ挿入物にしたがって、Ｒａｄｉｍ  ＣＭＶＩｇＧ結合活性アッセイ（Ｒａｄｉｍ  ＳｐＡ，Ｒｏｍｅ，Ｉｔａｌｙ）に関する結合活性指数を算出した。
【００５８】
【数４】
2009515169.tif 000005
【００５９】
Ｒａｄｉｍパッケージ挿入物（Ｒａｄｉｍ  ＳｐＡ，Ｒｏｍｅ，Ｉｔａｌｙ）に従って、本アッセイに関する結果を解釈した。
【００６０】
第１群（ＣＭＶＩｇＭ−  ＩｇＧ＋）由来の試料を使用して、結合活性アッセイの臨床的特異性を評価した。この集団が、ＨＣＭＶに対して免疫性であり、活発なＨＣＭＶ感染を有していないため、ＣＭＶＩｇＭに関して陰性であり、ＣＭＶＩｇＧに関して陽性である試料は、高い結合活性のＩｇＧを含有すべきである。第１群由来の試料による結果を以下の表１に示す。
【００６１】
【表１】
2009515169.tif 000006
【００６２】
表１からわかるように、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）及びＲａｄｉｍ結合活性アッセイ（Ｒａｄｉｍ  ＳｐＡ，Ｒｏｍｅ，Ｉｔａｌｙ）の試料の結果は、非常に一致しており、すなわち、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）アッセイにおける低い結合活性及び高い結合活性を有する試料の結果はそれぞれ、Ｒａｄｉｍアッセイ（Ｒａｄｉｍ  ＳｐＡ，Ｒｏｍｅ，Ｉｔａｌｙ）において相当する低い結合活性及び高い結合活性の結果も有する。両アッセイは、高い臨床的特異性も示し、すなわちＣＭＶＩｇＭに関して陰性であり、ＣＭＶＩｇＧ抗体に関して陽性であるほぼ全ての試料が、高い結合活性のＣＭＶＩｇＧを含有していた。
【００６３】
第２群及び第３群由来の試料を使用して、結合活性アッセイの臨床的感度を評価した。試料は、ＨＣＭＶ一次感染を有する個体由来であった。臨床的感度の評価のために４ヶ月間のカットオフを選択し、妊娠期間の最初の三半期（妊娠３ヶ月）の間、妊娠中の女性においてＨＣＭＶ一次感染を排除するための結合活性アッセイの能力に基づいている。第２群及び第３群由来の試料による結果を表２に示す。
【００６４】
【表２】
2009515169.tif 000007
【００６５】
表２からわかるように、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）及びＲａｄｉｍ結合活性アッセイ（Ｒａｄｉｍ  ＳｐＡ，Ｒｏｍｅ，Ｉｔａｌｙ）は、互いによく一致しており、すなわち、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）アッセイにおける低い結合活性及び高い結合活性を有する試料の結果はそれぞれ、Ｒａｄｉｍアッセイ（Ｒａｄｉｍ  ＳｐＡ，Ｒｏｍｅ，Ｉｔａｌｙ）において相当する低い結合活性及び高い結合活性の結果も有する。両アッセイは、良好な臨床的感度も示す。結合活性の成熟化の速度は、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）アッセイによって低い結合活性であり、Ｒａｄｉｍアッセイ（Ｒａｄｉｍ  ＳｐＡ，Ｒｏｍｅ，Ｉｔａｌｙ）によって不確定な（ｎ＝８）又は高い（ｎ＝３）結合活性である１１個の試料によって示されたように、Ｒａｄｉｍアッセイ（Ｒａｄｉｍ  ＳｐＡ，Ｒｏｍｅ，Ｉｔａｌｙ）に比べ、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）アッセイに関してより低いように見える。これらのデータに基づいて、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性アッセイは、ＨＣＭＶ一時感染の検出に対してより感受性がある。
【００６６】
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）結合活性アッセイの結果とＲａｄｉｍ  ＣＭＶＩｇＧ結合活性アッセイ（Ｒａｄｉｍ  ＳｐＡ，Ｒｏｍｅ，Ｉｔａｌｙ）の結果との間の相関は、第１群ないし第３群由来の試料（ｎ＝２１５）にわたって評価され、ｒ＝０．８８の相関係数が得られた。これは、次の２つの理由のため、驚くべき予期せぬ結果であった。第一に、結合活性アッセイは定性的であり、それゆえ定量的な一致は、必ずしも期待されず、第二に、前記結合活性アッセイは、非常に異なるアッセイフォーマットを使用し、すなわち、競合的抗原フォーマットは、患者の試料から高い結合活性のＩｇＧを選択的に除去するのに対し、カオトロピックなフォーマットは、洗浄段階において低い結合活性のＩｇＧを除去する。
【００６７】
他のＣＭＶＩｇＧ結合活性アッセイのカオトロピックなフォーマットを上回る、本発明のＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性の競合的抗原フォーマットに関する幾つもの利点がある。第一に、カオトロピックな試薬は、アッセイを実施するのに必要ではない。カオトロピック試薬は、自動イムノアッセイ機器プラットフォームに対して有害又は腐食性である可能性があり、他のアッセイと相互汚染し、それにより異常な結果を生じ得る。第二に、結合活性指数が、感染性因子に対する抗ヒトＩｇＧ濃度によってある程度影響を受けることが公知である（Ｈｅｄｍａｎ，Ｋ．ａｎｄ  Ｓｅｐｐａｌａ，Ｉ．，上述）。カオトロピックな試薬を採用する従来のほとんどの結合活性アッセイは、この効果を補償しないのに対し、本発明は、適切な範囲で試料を希釈する一連の希釈プロトコールを利用し、従って、結合活性指数の結果が患者の試料中に存在する抗ＩｇＧ力価によって複雑にされることがないことを確実にする。最終的に、本発明の競合的抗原フォーマットは、ＨＣＭＶに一次感染した患者由来の検体のより良好な検出を示した。
【実施例５】
【００６８】
ＭＢＰ可溶化液及びｒｐＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１の作製
米国特許第５，６４３，７５８号に記載されているイー・コリマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合及び精製システムは、イー・コリにおける可溶性融合タンパク質の産生及び精製に有用であることが見出されている。プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２ＸをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．から入手し、供給元のプロトコールを称して、イー・コリ超形質転換受容性細胞ＥＰＩＣＵＲＩＡＮ  Ｃｏｌｉ（商標）ＸＬ−１  ＢＬＵＥ中へ形質転換した。その後、ＭＢＰ可溶化液の作製のためにこの系を使用した。米国特許出願第１０／２６３，１５３号に記載されているｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１構築物を含有するＥＰＩＣＵＲＩＡＮ  Ｃｏｌｉ（商標）ＸＬ−１  ＢＬＵＥイー・コリ系を、精製されたｒｐＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０の生成に使用した。米国特許第６，３２９，１５７Ｂ１号に記載されているＣＫＳ−ＴｏｘｏＰ３５−ＣＫＳ構築物を含有するＥＰＩＣＵＲＩＡＮ  Ｃｏｌｉ（商標）ＸＬ−１  ＢＬＵＥイー・コリ系を、精製されたｒｐＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３５タンパク質の生成に使用した。
【００６９】
段階Ａ：ＭＢＰ可溶化液の調製
「ＭＢＰ接種培地」を有するフラスコ中へ、プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２Ｘを含有するイー・コリ系を接種し、振盪しながら３７℃で、Ｏ．Ｄ．が６００ｎｍで０．８ないし１．２になるまで増殖させた。この培養物を使用して、「ＭＢＰ発酵培地」を含有する１０Ｌの発酵槽に接種し、５００ｒｐｍで撹拌し、１５ｓｌｐｍで通気し、３４５ｍｂａｒの圧力で、３７℃で増殖させた。Ｏ．Ｄ．が６００ｎｍで６．０ないし８．０になるまで発酵培養物を増殖した後、５０ｍｇ／ＬのＩＰＴＧで誘導した。誘導４時間後、ＰＢＳに対する透析濾過により発酵槽収穫物を濃縮し、２ないし８℃で１４，０００×ｇで２５分間遠心分離した。発酵槽の細胞ペーストを一定分量に分注した後、可溶化液を調製するまで−７０℃で保存した。
【００７０】
細胞ペーストを解凍し、０．２ｍＬ／Ｌベンゾナーゼ溶液、６．２ｇ／Ｌ塩化マグネシウム、及び２ｇ／Ｌリゾチームを含有する、細胞ペースト１ｇあたり１０ｍＬの「ＭＢＰ溶解緩衝液」へ移し、均質化した。ＰＭＳＦ溶液を添加し（１ｍＬ／細胞ペーストｇ）、均質化し、振盪しながら３７℃で６０分間温置した。次に、冷蒸留水の等容積を添加し、振盪しながら３７℃で１５分間温置した。溶解された細胞ペーストを２ないし８℃、１５，０００×ｇで４５分間遠心分離した。上清を回収し、０．２μフィルターによる濾過で清澄化し、−７０℃で保存した。
【００７１】
段階Ｂ：ｒｐＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１の精製
「ＭＢＰ接種培地」を有するフラスコ中へ、プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１を含有するイー・コリ系を接種し、振盪しながら３６℃で、Ｏ．Ｄ．が６００ｎｍで０．８ないし１．２になるまで増殖した。この培養物を使用して、「ＭＢＰ発酵培地」を含有する１０Ｌの発酵槽に接種し、５００ｒｐｍで撹拌し、１５ｓｌｐｍで通気し、３４５ｍｂａｒの圧力で、３６℃で増殖させた。Ｏ．Ｄ．が６００ｎｍで６．０ないし８．０になるまで発酵培養物を増殖させた後、５０ｍｇ／ＬのＩＰＴＧで誘導した。誘導４時間後、ＰＢＳに対する透析濾過により発酵槽収穫物を濃縮し、２ないし８℃で１４，０００×ｇで２５分間遠心分離した。発酵槽細胞ペーストを一定分量に分注した後、タンパク質を精製するまで−７０℃で保存した。
【００７２】
細胞ペーストを解凍し、０．２ｍＬ／Ｌベンゾナーゼ溶液、６．２ｇ／Ｌ塩化マグネシウム、及び２ｇ／Ｌリゾチームを含有する、細胞ペースト１ｇあたり１０ｍＬの「ＭＢＰ溶解緩衝液」へ移し、均質化した。ＰＭＳＦ溶液を添加し（１ｍＬ／細胞ペーストｇ）、均質化し、振盪しながら３７℃で６０分間温置した。次に、冷蒸留水の等容積を添加し、振盪しながら３７℃で１５分間温置した。溶解された細胞ペーストを２ないし８℃、１５，０００×ｇで４５分間遠心分離した。上清を回収し、０．２μフィルターによる濾過で清澄化した。
【００７３】
次に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡで平衡化されたＤＥＡＥセファロース高速流カラムへ、前記上清を適用した。この緩衝液でカラムを広範囲に洗浄した後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡで溶出し、溶出されたピークのプールを２ないし８℃で１２ないし２４時間保存した。
【００７４】
ＤＥＡＥカラムからのピークをプールしたタンパク質画分を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡで平衡化されたアミロース樹脂カラムへ適用した。この緩衝液でカラムを広範囲に洗浄した後、ｒｐＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０タンパク質を５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭマルトース、０．２％アジ化物で溶出した。溶出されたピークプールを回収し、０．２μフィルターによる濾過で清澄化し、微粒子被覆まで−７０℃で保存した。
【実施例６】
【００７５】
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性アッセイ試薬キット、標準物質、対照、及びアッセイソフトウェアの作製
段階Ａ：微粒子上へのｒｐＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０抗原の被覆及び微粒子バルク試薬の作製
ｒｐＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１抗原を大気温で解凍し、５０ｍＭリン酸塩、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭマルトース、０．２％アジ化物、ｐＨ７．５中で１ｍｇ／ｍＬの終濃度に希釈し、抗原を再び折り畳むため、３７℃で５日間温置した。次に、抗原を２ないし８℃で１日間保存した後、微粒子を被覆した。
【００７６】
常磁性ポリスチレン微粒子を「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性微粒子被覆緩衝液」で２回洗浄した後、被覆緩衝液中で１．３３％の終濃度に再懸濁した。次に、再び折り畳まれたｒｐＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１抗原を、洗浄された微粒子へ１００μｇ／ｍＬのタンパク質終濃度で添加し、１５ないし３０℃で１０分間混合した。次に、ＥＤＡＣを微粒子被覆反応物へ、１ｍｇ／ｍＬの終濃度で添加し、１５ないし３０℃で３０分間混合しながら温置した。１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を微粒子被覆反応物へ、０．１Ｍの終濃度になるまで添加し、１５ないし３０℃でさらに３０分間混合した。次に、被覆された微粒子を５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．２）で洗浄して、結合していない抗原、反応物質を除去し、「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性微粒子希釈剤」中で１％固体の終濃度になるまで再懸濁した。０．１％固体の終濃度になるよう微粒子濃縮物を「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性微粒子希釈剤」で希釈することによって、「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性微粒子バルク試薬」を調製した後、試薬瓶中へ充填し、２ないし８℃で保存した。
【００７７】
段階Ｂ：コンジュゲートバルク試薬の作製
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）抗ヒトＩｇＧアクリジニウム標識されたコンジュゲートを「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性コンジュゲート希釈剤」中で１５ないし９０ｎｇ／ｍＬの終濃度に希釈して「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性コンジュゲートバルク」を生じさせた後、試薬瓶中へ充填し、２ないし８℃で保存した。
【００７８】
段階Ｃ：前処理１緩衝液の作製
実施例１における調製法を使用して「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性前処理１緩衝液」を調製した後、試薬瓶中へ充填し、２ないし８℃で保存した。
【００７９】
段階Ｄ：前処理２ブロッカーの作製
実施例１における調製法を使用して「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性前処理２ブロッカー」を調製した後、試薬瓶中へ充填し、２ないし８℃で保存した。
【００８０】
段階Ｅ：アッセイ特異的希釈剤の作製
実施例１における調製法を使用して「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性アッセイ特異的希釈剤」を調製した後、試薬瓶中へ充填し、２ないし８℃で保存した。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ試薬パック」は、実施例６Ａないし６Ｅに記載されている試薬として定義される。
【００８１】
段階Ｆ：バックグラウンド標準物質の作製
実施例１における調製法を使用して「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性バックグラウンド標準物質」を調製した後、試薬瓶中へ充填し、２ないし８℃で保存した。
【００８２】
段階Ｇ：対照の作製
実施例１における調製法を使用して「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ高結合活性対照」及び「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ低結合活性対照」を調製した後、試薬瓶中へ充填し、２ないし８℃で保存した。
【００８３】
段階Ｈ：アッセイソフトウェアの作製
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器においてＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性アッセイを実施するために必要とされるアッセイソフトウェアは、アッセイを実施する前のＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器に搭載されるべきＣＤ−ＲＯＭに提供される（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）。アッセイソフトウェアは、以下に記載され、及び図２に示されるアッセイを実施するために、機器において必要な流れで全ての試薬のピペッティング、分注、及び混合の段階を調節する。
【実施例７】
【００８４】
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性アッセイの評価
段階Ａ：ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器の設定及び試薬パックの搭載
操作者は、ＣＤ−ＲＯＭからアッセイソフトウェアを読み込むことによって、アッセイを実施するためのＡＲＣＨＩＴＥＧＴ（登録商標）機器を設定する。アッセイを実施するために必要とされるソフトウェアは、アッセイ第１番及びアッセイ第２番の２つのアッセイファイルを含有する。アッセイ第１番及びアッセイ第２番は、以下に示される結合活性指数を算出するため、各試料に関して実施されなければならない。操作者は、次式に従って結合活性指数を算出するＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器ユーザーインターフェイスを使用するさらなるアッセイファイルも設定する。
【００８５】
【数５】
2009515169.tif 000008
【００８６】
「試料ＲＬＵ」は、相対的光単位（ＲＬＵ）において表される患者の試料のアッセイ結果として定義され、「標準物質ＲＬＵ」は、「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性バックグラウンド標準物質」を使用するＲＬＵにおけるアッセイ結果として定義され、「アッセイ第２番」は、試料、対照、又は標準物質を「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性前処理２ブロッカー」で前処理するアッセイとして定義され、「アッセイ第１番」は、試料、対照、又は標準物質を「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性前処理１緩衝液」で前処理するアッセイとして定義され、「結合活性指数」は、上述の式によって定義され、試料中に存在するヒト抗トキソプラズマ高結合活性ＩｇＧのレベルに比例する％で表される。３０％未満の結合活性指数値を有する試料は、低い結合活性のトキソプラズマＩｇＧを含有し、４０％以上のものは、高い結合活性のトキソプラズマＩｇＧを含有し、３０ないし３９％の間のものは、トキソプラズマＩｇＧ抗体の結合活性に関して不確定である。
【００８７】
操作者は、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器に「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ試薬パック」を次のとおり搭載する。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性アッセイ特異的希釈剤」は、位置第１番、色コード黄色へ搭載され、「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性微粒子バルク」は、位置第２番、色コードピンクへ搭載され、「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性コンジュゲートバルク」は、位置第３番、色コード黒へ搭載され、「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性前処理１緩衝液」は、位置第４番、色コード黄色へ搭載され、及び「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性前処理２ブロッカー」は、位置第５番、色コードピンクへ搭載される。
【００８８】
段階Ｂ：ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性検査の秩序化
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性検査を実施する前に、操作者は、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧアッセイからＩＵ／ｍＬで表される各試料のトキソプラズマＩｇＧ力価を基にしたアッセイ第１番及び第２番に関する適切な希釈プロトコールを次のとおり、すなわち希釈プロトコール第１番、３ないし２０ＩＵ／ｍＬ；希釈プロトコール第２番、２１ないし２００ＩＵ／ｍＬ；希釈プロトコール第３番、２０１ないし２０００ＩＵ／ｍＬを選択しなければならず、トキソプラズマＩｇＧ力価が２０００ＩＵ／ｍＬの試料に関しては、１０ＩＵ／ｍＬの力価へ試料を手動で希釈し、希釈プロトコール第１番を実施する。希釈プロトコール第１番、３ないし２０ＩＵ／ｍＬ；希釈プロトコール第２番、２１ないし２００ＩＵ／ｍＬ；希釈プロトコール第３番、２０１ないし２０００ＩＵ／ｍＬ；例えば、トキソプラズマＩｇＧ力価が２０００ＩＵ／ｍＬの場合、１０ＩＵ／ｍＬの力価へ試料を手動で希釈し、希釈プロトコール第１番を実施する。次に、試料を機器に負荷する。「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性バックグラウンド標準物質」は、アッセイの較正及び「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ高結合活性対照」のために機器へ負荷され、「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ低結合活性対照」は、アッセイの結果が有効であることを確実にするために負荷される。
【００８９】
段階Ｃ：ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性アッセイに関する記述 
操作者の要求する希釈プロトコールに依存して、各試料約５ないし８０μLがアッセイ第１番及び第２番に必要とされる。アッセイ第１番及び第２番に関する次の段階は、前処理段階以外、同一である。ピペッティングプローブは、各アッセイに必要な試料の量を吸引し、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ライン希釈剤による適切な試料希釈を実施する、アッセイ第２番に関する前処理段階において、ピペッティングプローブは、液相中に存在するｒｐＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１抗原を含有し、ヒト抗トキソプラズマ高結合活性ＩｇＧに結合する「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性前処理２ブロッカー」を、希釈された試料中へ分注する。アッセイ第１番に関する前処理段階において、ピペッティングプローブは、緩衝液のみを含有する「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性前処理１緩衝液」を、希釈された試料中へ分注する。前処理された試料を７分間温置する。ピペッティングプローブが、９０μＬの「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性アッセイ特異的希釈剤」及び「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性微粒子バルク」を前処理反応物２３μＬ中へ分注し、試料を１８分間温置する。低結合活性のヒト抗トキソプラズマＩｇＧ抗体が、アッセイ第２番においてｒｐＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１抗原で被覆された固相に結合するのに対し、高結合活性及び低結合活性のヒト抗トキソプラズマＩｇＧ抗体は、アッセイ第１番においてｒｐＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１抗原で被覆された固相に結合する。微粒子をＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ライン希釈剤で洗浄した後、ピペッティングプローブが、「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性コンジュゲートバルク」５０μＬを分注し、微粒子をコンジュゲートとともに４分間温置する。微粒子をＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ライン希釈剤で再度洗浄した後、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）プレトリガー及びトリガー試薬で処理する。得られた化学発光シグナルをＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器によって読み取り、各試料に関してＲＬＵを表示し、アッセイ第１番及びアッセイ第２番に関して保存する。操作が完了した後、機器は、アッセイ第１番及びアッセイ第２番に関して各試料から「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性バックグラウンド標準物質」ＲＬＵを減じ、上述のとおり結合活性指数を算出する。次のアルゴリズムに従って、結合活性指数の結果の隣に結果の解釈も表示する。３０％未満の結合活性指数値を有する試料が低い結合活性のトキソプラズマＩｇＧを含有し、４０％以上が、高い結合活性のトキソプラズマＩｇＧを含有し、３０ないし３９％の間が、トキソプラズマＩｇＧ抗体の結合活性に関して不確定である。
【実施例８】
【００９０】
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性アッセイの評価
段階Ａ：検査のためのヒト血清
血清２群をこの評価において検査した。第１群（ｎ＝１３８）は、トキソプラズマＩｇＭ抗体に関して陰性であり、トキソプラズマＩｇＧ抗体に関して陽性であるフランス出身の無作為な個体からなり、第２群（ｎ＝２３）は、抗体陽転によって示される急性トキソプラズマ症を有する２名の個体由来の連続採血からなり、第３群（ｎ＝２４）は、トキソプラズマＩｇＧ抗体に関して陽性である選択された個体からなった。
【００９１】
段階Ｂ：ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性アッセイとＶｉｄａｓトキソプラズマＩｇＧ結合活性アッセイとの性能比較及び臨床データ
ＶｉｄａｓトキソプラズマＩｇＧ結合活性アッセイ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＳＡ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）は、二つ組で実施される２回のトキソプラズマＩｇＧアッセイからなり、２つのトキソプラズマＩｇＧアッセイのうちの１つにおける一次抗体温置後の尿素によるカオトロピックな洗浄段階を組み込むことによって、低い結合活性を含有する検体と高い結合活性を含有する検体を識別する。相対的蛍光値（ＲＦＶ）を使用して、製造元のパッケージ挿入物にしたがって、ＶｉｄａｓトキソプラズマＩｇＧ結合活性アッセイ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＳＡ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）に関する結合活性指数を算出した。
【００９２】
【数６】
2009515169.tif 000009
【００９３】
Ｖｉｄａｓパッケージ挿入物（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＳＡ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）に従って、本アッセイに関する結果を解釈した。
【００９４】
第１群（トキソプラズマＩｇＭ−  ＩｇＧ＋）由来の試料を使用して、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性アッセイの臨床的特異性を評価した。この集団が、トキソプラズマ・ゴンディイに対して免疫性であり、活発なトキソプラズマ・ゴンディイ感染を有していないため、トキソプラズマＩｇＭに関して陰性であり、トキソプラズマＩｇＧ抗体に関して陽性である試料は、高い結合活性のＩｇＧを含有すべきである。第１群由来の試料による結果を以下の表３に示す。
【００９５】
【表３】
2009515169.tif 000010
【００９６】
表３からわかるように、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性アッセイは、高い臨床的特異性を示し、すなわち、トキソプラズマＩｇＭに関して陰性であり、トキソプラズマＩｇＧ抗体に関して陽性であるほぼ全ての試料は、高い結合活性のトキソプラズマＩｇＧを含有した。
【００９７】
第２群及び第３群由来の試料を使用して、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性アッセイとＶｉｄａｓトキソプラズマＩｇＧ結合活性アッセイ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＳＡ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）との間の一致及び相関を評価した。これらの試料は、抗体陽転によって示される急性トキソプラズマ症を有する個体由来、及び選択されたトキソプラズマＩｇＧ陽性個体由来であった。第２群及び第３群由来の試料による結果を表４に示す。
【００９８】
【表４】
2009515169.tif 000011
【００９９】
表４からわかるように、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）及びＶｉｄａｓ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＳＡ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）アッセイは、互いによく一致しており、すなわち、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）アッセイにおける低い結合活性及び高い結合活性を有する試料の結果はそれぞれ、Ｖｉｄａｓアッセイ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＳＡ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）において相当する低い結合活性及び高い結合活性の結果も有する。ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）結合活性アッセイ結果とＶｉｄａｓトキソプラズマＩｇＧ結合活性アッセイ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＳＡ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）結果との間の相関は、第２群及び第３群由来の試料（ｎ＝４７）にわたって評価され、ｒ＝０．９７の相関係数が得られた。これは、次の２つの理由のため、驚くべき予期せぬ結果であった。第一に、結合活性アッセイは定性的であり、それゆえ定量的な一致は必ずしも期待されず、第二に、前記結合活性アッセイは、非常に異なるアッセイフォーマットを使用し、すなわち、競合的抗原フォーマットは、患者の試料から高い結合活性のＩｇＧを選択的に除去するのに対し、カオトロピックなフォーマットは、洗浄段階において低い結合活性のＩｇＧを除去する。
【０１００】
他のトキソプラズマＩｇＧ結合活性アッセイのカオトロピックなフォーマットを上回る、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性の競合的抗原フォーマットに関する幾つもの利点がある。第一に、カオトロピックな試薬は、アッセイを実施するのに必要ではない。カオトロピック試薬は、自動イムノアッセイ機器プラットフォームに対して有害であるか又は腐食性である可能性があり、他のアッセイを相互汚染し、それにより異常な結果を生じ得る。第二に、結合活性指数は、感染性因子に対する抗ヒトＩｇＧ濃度によってある程度影響を受けることが公知である（Ｈｅｄｍａｎ，Ｋ．ａｎｄ  Ｓｅｐｐａｌａ，Ｉ．，上述）。カオトロピックな試薬を採用する従来のほとんどの結合活性アッセイは、この効果を補償しないのに対し、本発明は、適切な範囲で試料を希釈する一連の希釈プロトコールを利用し、従って、結合活性指数の結果が患者の試料中に存在する抗ＩｇＧ力価によって影響を受けないようにする。
【０１０１】
抗体の結合活性の決定に関して、カオトロピックな方法と、本発明の競合的抗原法との間にかなりの一致があることを考えると、本発明の方法のさらなる適用が可能である。例えば、ＨＣＭＶ及びトキソプラズマ・ゴンディイに加え、カオトロピックな方法は、多くの感染性疾患に関して急性感染と過去にもたらされた感染を識別するのに有用である。本明細書に記載される競合的抗原法は、カオトロピックな方法が記載されていなかったものを含む多様な疾病に関する急性感染と慢性感染を識別するために診断レベルで使用されることも可能であると考えられる。さらに、ＨＣＭＶに関して示されるような競合的抗原法は、カオトロピックな試薬の使用と関連した欠点及び危険を付随せずに、カオトロピック法を上回る優れたアッセイ性能を提供し得る。
【実施例９】
【０１０２】
ＣＭＶ及びトキソプラズマに関する「模擬された」低結合活性対照
段階Ａ：検査のための対照
実施例１に記載されている「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ高結合活性対照」は、高い力価（約２００ＡＵ／ｍＬ）及び高い結合活性のＣＭＶＩｇＧ（結合活性指数約９０％）を含有している。実施例１に記載されている「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ高結合活性対照」は、高い力価（約７００ＩＵ／ｍＬ）及び高い結合活性のトキソプラズマＩｇＧ（結合活性指数約７０％）を含有している。
【０１０３】
段階Ｂ：「模擬されたＣＭＶＩｇＧ低結合活性対照」
実施例３に記載されているＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性アッセイは、４つの自動希釈プロトコールを有する。すなわち、希釈プロトコール第１番、５ないし１６ＡＵ／ｍＬ、希釈プロトコール第２番、１６ないし５０ＡＵ／ｍＬ、希釈プロトコール第３番、５０ないし１５０ＡＵ／ｍＬ、希釈プロトコール第４番、１５０ないし５００ＡＵ／ｍＬである。約２００ＡＵ／ｍＬを含有する「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ高結合活性対照」は通常、有効な結合活性結果を得るために、希釈プロトコール第４番で実行されるべきである。希釈プロトコール第１番ないし第４番で、この対照を実行すると、次の結果を得た。
【０１０４】
【表５】
2009515169.tif 000012
【０１０５】
表５からわかるように、「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ高結合活性対照」は、正確な希釈プロトコール第４番の代わりに、プロトコール第１番において不正確に実行される場合、低い結合活性のＩｇＧ対照を「模擬する」。プロトコール第１番における希釈因子は、この高い力価の高い結合活性の対照に対して不十分であり、その結果、高い力価のＩｇＧが「液相抗原」による「ブロッキング」を克服し、それにより「固相抗原」に結合する。それゆえ、ＣＭＶＩｇＧに関する「模擬された」低い結合活性の対照は単純に、「固相抗原」に対する高結合活性ＩｇＧの結合を生じるような様式で、対照を「過小希釈する」希釈プロトコールで高い結合活性の対照を実行することによって得られることが可能である。
【０１０６】
段階Ｃ：「模擬されたトキソプラズマＩｇＧ低結合活性対照」
実施例７に記載されているＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性アッセイは、３つの自動希釈プロトコールを有する。すなわち、希釈プロトコール第１番、３ないし２０ＩＵ／ｍＬ、希釈プロトコール第２番、２１ないし２００ＩＵ／ｍＬ、希釈プロトコール第３番、２０１ないし２０００ＩＵ／ｍＬである。約７００ＩＵ／ｍＬを含有する「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ高結合活性対照」は通常、有効な結合活性結果を得るために、希釈プロトコール第３番で実行されるべきである。希釈プロトコール第１番ないし第３番で、この対照を実行すると、次の結果を得た。
【０１０７】
【表６】
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【０１０８】
表６からわかるように、「ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ高結合活性対照」は、正確な希釈プロトコール第３番の代わりに、プロトコール第１番において不正確に実行される場合、低い結合活性のＩｇＧ対照を「模擬する」。プロトコール第１番における希釈因子は、この高い力価の高い結合活性の対照に対して不十分であり、その結果、高い力価のＩｇＧが「液相抗原」による「ブロッキング」を克服し、それにより「固相抗原」に結合する。それゆえ、トキソプラズマＩｇＧに関する「模擬された」低い結合活性の対照は単純に、「固相抗原」に対する高結合活性ＩｇＧの結合を生じるような様式で、対照を「過小希釈する」希釈プロトコールで高い結合活性の対照を実行することによって得られることが可能である。
【０１０９】
カオトロピックな方法は、「模擬された」低い結合活性の対照を使用することは不可能である。従って、本発明の競合的抗原結合活性アッセイは、カオトロピックな方法を上回る幾つもの異なる利点を有する。第一に、高い結合活性のＩｇＧ血漿は、調達するのが比較的簡単であり、従って、「模擬された」低結合活性のＩｇＧアッセイ対照は、結合活性アッセイの妥当性をモニターするのに利用可能である。第二に、特に、疾病の血清有病率及び発生率が低い場合、すなわち、対象疾病に関する低結合活性ＩｇＧ患者の試料又は血漿が、新たな結合活性検査を展開する個体に対して利用可能ではないか又は有害である場合、競合的抗原フォーマットを使用する公知の及び新たな感染性疾患のための結合活性アッセイを開発することが、カオトロピックなフォーマットよりも簡単である。新たに生じる出現する病原体に関する診断検査、特に結合活性アッセイの急速な開発は、未感染の個体に対して感染を容易に伝達し得る疾病の急性相において個体を診断、治療、及び検疫するための補助として使用されることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１は、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＭＶＩｇＧ結合活性アッセイのための、アッセイ番号１及びアッセイ番号２の操作の模式図である。
【図２】図２は、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）トキソプラズマＩｇＧ結合活性アッセイのための、アッセイ番号１及びアッセイ番号２の操作の模式図である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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