(57)【要約】  少なくとも1種の化合物を含む試料、好ましくは少なくとも1種の代謝産物を含む生物試料を特徴づける方法が提案される。第1のプロセスステップでは、少なくとも1つの時間分解分離技法(214)および少なくとも1つの質量分解分離技法(216)を使用して試料を分析することによって、第1の3次元データセットが生成される。このデータセットは、第1の測定範囲(420)をとる質量変量および第2の測定範囲(422)をとる時間変量の関数として、少なくとも1つの信号Iを含む。第2のプロセスステップでは、第1の測定範囲(420)が少なくとも2つの質量変量区間(424)に分割される。それぞれの質量変量区間(424)について、時間変量の関数である抽出信号が選択される。第3のプロセスステップでは、第2の測定範囲(422)が少なくとも1つの時間変量区間(426)に分割される。【選択図】図６
2009500617.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1種の化合物を含む試料を特徴づける方法であって、
a)少なくとも1つの時間分解分離技法(214)および少なくとも1つの質量分解分離技法(216)を使用して前記試料を分析することによって、第1の3次元データセットを生成するステップであって、
・前記第1のデータセットが、第1の測定範囲(424)をとる質量変量および第2の測定範囲(422)をとる時間変量の関数として、少なくとも1つの信号Iを含む
ステップと、
b)前記第1の測定範囲(420)を少なくとも2つの質量変量区間(420)に分割し、それぞれの質量変量区間(424)について、前記時間変量の関数である抽出信号を選択するステップと、
c)前記第2の測定範囲(422)を少なくとも1つの時間変量区間(426)に分割し、それぞれの時間変量区間(426)およびそれぞれの抽出信号について、少なくとも1つの特性値を選択するステップであって、それによって、それぞれの前記時間変量区間(426)およびそれぞれの前記質量変量区間(424)の関数として前記少なくとも1つの特性値を含む特性試料プロファイルが生成されるステップと
を含む方法。
【請求項２】
それぞれの質量変量区間(424)に対するステップb)の前記抽出信号が、以下の方法のうちの少なくとも1つによって選択される、請求項１に記載の方法。
・その質量変量区間(424)の全体にわたって前記信号Iを積分する方法
・その質量変量区間(424)の全体にわたって前記信号Iを加算する方法
・その質量変量区間(424)の全体にわたって前記信号Iを平均する方法
・その質量変量区間(424)の一方の区間境界の前記信号Iを選択する方法
・その質量変量区間(424)全体の前記信号Iの最大値または最小値を選択する方法
【請求項３】
それぞれの時間変量区間(426)に対するステップc)の前記少なくとも1つの特性値が、以下の方法のうちの少なくとも1つによって選択される、請求項１又は２に記載の方法。
・それぞれの時間変量区間(426)の全体にわたって前記抽出信号を積分する方法
・それぞれの時間変量区間(426)の全体にわたって前記抽出信号を加算する方法
・それぞれの時間変量区間(426)の全体にわたって前記抽出信号を平均する方法
・前記時間変量区間(426)の一方の区間境界の前記抽出信号を選択する方法
・前記時間変量区間(426)全体の前記抽出信号の最大値または最小値を選択する方法
【請求項４】
d)前記試料の前記特性試料プロファイルを、第2の試料の少なくとも1つの特性試料プロファイルおよび/または少なくとも1つの参照試料プロファイルと比較するステップ
をさらに含む、請求項１乃至３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップd)で、前記特性試料プロファイルの少なくとも1つの特性値が、前記少なくとも1つの第2の試料の少なくとも1つの対応する特性値および/または前記少なくとも1つの参照試料プロファイルの少なくとも1つの特性値と比較される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
・前記試料と前記第2の試料または前記参照試料とが同一でありそうかどうか、および/あるいは
・前記試料と前記第2の試料または前記参照試料とが、1種または数種の同一のまたは同様の化合物を含んでいそうかどうか
が判定される、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
ステップd)で、以下のアルゴリズムのうちの少なくとも1つが使用される、請求項４乃至６の何れか一項に記載の方法。
・パターン認識アルゴリズム
・統計的検定アルゴリズム
・多変量アルゴリズム
【請求項８】
前記試料と前記第2の試料または前記参照試料とが同一でありそうな場合、あるいは1種または数種の同一のまたは同様の化合物を含んでいそうな場合に、前記試料の前記第1の3次元データセットまたはその関連部分が、前記第2の試料または前記参照試料の第1の3次元データセットまたはその関連部分と比較される、請求項４乃至７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップc)で、それぞれの時間変量区間(426)内の前記抽出信号のピークを検出するために、ピーク検出アルゴリズムがさらに使用される、請求項１乃至８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも1つの時間分解分離技法(214)がクロマトグラフィーを含む、請求項１乃至９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記クロマトグラフィーが以下のうちの少なくとも1つを含む、請求項１０に記載の方法。
・ガスクロマトグラフィー
・液体クロマトグラフィー、好ましくは高速液体クロマトグラフィー
・細管電気泳動
・薄層クロマトグラフィー
・アフィニティクロマトグラフィー
【請求項１２】
前記少なくとも1つの質量分解分離技法(216)が質量分析法を含む、請求項１乃至１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記質量分析法が以下のうちの少なくとも1つを含む、請求項１２に記載の方法。
・扇形磁場質量分析法
・飛行時間質量分析法
・四重極質量分析法
・イオントラップ質量分析法
【請求項１４】
ステップb)の前記少なくとも2つの質量変量区間の長さΔmが、下式に従って選択され、
Rmz≦Δm<Lmz
Rmzが、前記少なくとも1つの質量分解分離技法(216)の質量ピーク幅を表し、Lmzが、前記第1の測定範囲(420)の全長を表す、請求項１乃至１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
Δmが、1原子質量単位(amu)となるように選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップc)の前記少なくとも1つの時間変量区間Δrt(426)が、下式に従って選択され、
Rrt≦Δrt≦Lrt
Rrtが、前記少なくとも1つの時間分解分離技法(214)のサイクル時間、または2つの異なるピークが分解可能な最小時間間隔を表す、請求項１乃至１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物が代謝産物である、請求項１乃至１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１乃至１７の何れか一項に記載の方法によって生成された試料プロファイルの少なくとも1つの特性値を含むデータベース。
【請求項１９】
請求項１乃至１７の何れか一項に記載の方法を実行するプログラムコード手段を含むコンピュータプログラムであって、前記方法が、前記コンピュータプログラムがコンピュータ(220)またはコンピュータネットワーク上で実行されている間に実行されるコンピュータプログラム。
【請求項２０】
前記プログラムコード手段が、コンピュータ(220)またはコンピュータネットワーク可読の記憶媒体上に記憶された、請求項１９に記載のコンピュータプログラム。
【請求項２１】
データ構造がその中に記憶された記憶媒体であって、コンピュータ(220)またはコンピュータネットワークの主記憶域および/あるいは作業用記憶域にロードされた後に、請求項１乃至１７の何れか一項に記載の方法を実行するように、前記データ構造が適合された記憶媒体。
【請求項２２】
プログラムコード手段を有するプログラム製品であって、前記プログラムコード手段がコンピュータ(220)またはコンピュータネットワーク上で実行された場合に、前記方法請求項の一項に記載の方法を実行するために、前記プログラムコード手段を記憶媒体上に記憶することができ、または前記プログラムコード手段が記憶媒体上に記憶されたプログラム製品。
【請求項２３】
少なくとも1種の化合物を含む試料を特徴づけるシステム(210)であって、請求項１乃至１７の何れか一項に記載の方法を実行する手段を含むシステム(210)。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも1種の化合物を含む試料、好ましくは生物試料を特徴づける方法に関する。この発明はさらに、本発明に基づく方法を実行する手段を含むシステム、コンピュータ手段、データベース手段など、試料を特徴づける手段を開示する。これらの方法および手段は特に、少なくとも1種の代謝産物を含む試料などの生物試料を特徴づけるのに適する。
【背景技術】
【０００２】
化学試料を分析し、かつ/または特徴づけることに関しては、多種多様な分析技法が当業者に知られている。それらの技法の中で、質量分析法(mass spectrometry)およびクロマトグラフィー(chromatography)は特に普及した例である。
【０００３】
質量分析法(MS)は、有機化学および無機化学の分野において、物質または分子を同定するために広く使用されている方法である。質量/電荷数(mass-to-charge-ratio:m/z)に従ってイオンが分離され、検出される。分離されたイオンの検出は、写真乾板法またはイオン電流を測定する電気的検出法を使用するなど、いくつかの技法を使用して実行することができる。文献においては、写真乾板を使用した検出のケースは、時に「マススペクトロスコピー(mass spectroscopy)」と呼ばれ、イオン電流の電気的検出を使用した後者のケースは、時に「質量分析法」と呼ばれる。とはいえ、以下では、両方の方法および他のイオン検出手段を使用する方法を「質量分析法」と呼ぶ。
【０００４】
質量分析計は一般に3つの主要な構成要素、すなわちイオンを発生させる手段(イオン源)、イオンを分離する手段(アナライザー)、およびファラデー箱、二次電子増倍管などのイオン検出器を含む。加えて、電子制御システム、コンピュータシステムおよび1つまたは複数の真空ポンプが、質量分析計の代表的な構成要素である。
【０００５】
化学試料の特徴づけおよび/または分析のいくつかのケースでは、2つ以上の特徴づけ技法を組み合わせることができる。したがって、近年は、質量分析法(MS)と他のいくつかの分析法との組合せがポピュラーとなっている。したがって、質量分析法を、ガスクロマトグラフィー(GC)および/または液体クロマトグラフィー(LC)などのクロマトグラフィーと組み合わせることができる。この組合せはしばしば、それぞれ「GCMS」または「LCMS」と呼ばれる。これらの実験法の組合せは例えば、クロマトグラフィーを使用して試料を分離し、続いて、分離された試料を質量分析法を使用して分析することを可能にする。したがって、非常に効率的な分析システムを設計することができる。このシステムは、簡単に言えば、分離された試料の複数の単一成分が少しずつ遅れて質量分析計の検出器に到着し、したがって試料の分析を単純にする。例えばイオン化、再編成、断片化などによって生み出され、質量分析計の中に同時に存在する分子の数、ならびに/あるいは分子および/またはイオンの種類が低減し、時間の関数としての質量スペクトルのピークおよびイオン強度のピークの分離、ならびにそれらのピークとある分析物(物質)との突合せが可能となり、または大幅に単純化される。
【０００６】
結果は一般に、単一ピークまたは複数のピークに対応する検出器信号のクロマトグラフィー強度ピークを、予め定義された方法を使用して積分することによって得られる。保持時間(試料の注入と対応する信号ピークとの間の経過時間)、および/または特定の保持時間において検出器によって検出される化合物の特性質量スペクトルなどの追加情報等、クロマトグラムまたは質量スペクトルの正確な信号を検出し、それらの信号を既知の化合物と突き合わせるための基準が使用される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
それにもかかわらず、2種類以上の成分が互いに近接して溶出し、それによってそれらの成分の保持時間の差が最小となり、したがってそれらの成分が同時にまたはほぼ同時に質量分析計に入るときには、質量分析法およびクロマトグラフィーを使用した分析は失敗する。さらに、化学試料中に存在する化合物の数が増加し、同時に、クロマトグラフィーによって不完全に分離された分析物の質量スペクトルの差異がわずかしかないか、または全くない場合には、結果の分析が困難または不可能になる。一般に、この状況は、廃水、有毒廃棄物、植物抽出物などの有機および生物組織を分析するときに、すなわち一般に1000を超える化合物が試料中に存在する場合に起こる。
【０００８】
さらに、得られるスペクトルはしばしば「純化されていない」。これらの不純物は例えば、クロマトグラフィー装置において使用されている毛管カラム(しばしばカラム材料の「ブリーディング」と呼ばれる効果)、イオンチェンバ(ion chamber)中の不純物、および/または試料の分解など試料の不適切な取扱いによって、生じる可能性がある。
【０００９】
これらの場合、参照スペクトルのライブラリまたはデータベースを探索し、それらの参照スペクトルを実験データと比較するコンピュータプログラムおよび方法はほとんど役に立たない。
【００１０】
クロマトグラフィーと質量分析法とを組み合わせた分析技法を使用することの他の大きな問題は、一連の大量の試料を評価するときに極めて大きくなる可能性がある実験データの量である。この問題は、文献、特に、代謝データベースを構築するなどの目的で生物試料中の代謝シグネチャ(signature)を研究しているプロジェクトの文献から知られている。このようなプロジェクトでは、生物試料を分析するためにLCMS(液体クロマトグラフィーと質量スペクトロメトリの組合せ)を頻繁に使用する。Par Jonsson et al: "Extraction, interpretation and validation of information for comparing samples in metabolic LC/MS data sets", Analyst, 2005, 130, 701-707には、多くの試料を比較するためのロバストで解釈可能な多変量モデルを作成することができる方法が記載されている。記載されたこの方法は、自動ピーク検出、アラインメント(alignment)、保持時間窓のセットオフ(setoff)、クロマトグラフィー次元の加算、および交代回帰(alternating regression)によるデータ圧縮を含む、代表的データセットの構築を含む。この方法は、それらのLC/MS代謝プロファイルに基づいて多数の試料を比較することを可能にする。
【００１１】
とはいえ、Jonsson他によって記載されたこの方法は、プロセスステップとして、アラインメント/ピーク検出ステップを必然的に含んでいる。LCMSデータのピーク検出が全てのケースで実行可能とはならず、一般に、得られたデータの高い不確実性を含むため、実際の生物試料の多くのケースにおいて、このことはデータの解釈に対する大きな欠点である。これは主に、生物試料のクロマトグラフィーデータのピーク密度が多くの場合に非常に高く、隣接したピークの分離がかなり困難であることに起因する。さらに、試料中の不純物または実験アーチファクトによってピークが「汚されてしまう」可能性もある。したがって、全てのピークが検出されるというわけではなく、場合によっては、追加の人為的ピークが検出されることさえある。したがって、1つの試料に対して得られた一組の変量が、他の全ての試料中の同じ代謝産物を表すとは限らない。
【００１２】
Par Jonsson et al: A Strategy for Identifying Differences in Large Series of Metabolomic Samples Analyzed by GC/MS", Analytical Chemistry, Vol. 76, No. 6, 2004, 1737-1745には、生物系中の代謝産物を同定し、定量する第2の方法が記載されている。この方法は、ベースライン補正、アラインメント、時間窓の決定、交代回帰、PLS-DA、および試料間の差を説明するクロマトグラム中の保持時間窓の識別を含む。交代回帰の使用はさらに、それぞれの保持時間窓の中の試料間で異なるm/z値によって提供される情報を保持する解釈可能なローディング(loading)を与える。この方法はさらに、それぞれの時間窓に対するそれぞれのm/zチャネルのクロマトグラムの全体強度を要約し、それぞれの時間窓に対する全体の質量スペクトルを与えることを含む。しかし、前記方法の欠点は、m/z情報が失われることである。具体的には、時間窓中の全てのm/zチャネルに対する全体の質量スペクトルは同一である可能性があるが、ある時間窓におけるそれぞれのチャネルのピークは異なる可能性がある。例えば、1つの試料分析に対して、ある時間窓における第1のm/zチャネルは高いピークを含むことができ、第2のm/zチャネルは低いピークを含むことができる。第2の試料分析では、その逆のピークが生じる可能性がある。したがって、このケースにおける試料は互いに異なるが、前述の方法を使用したときには、それらが同一に見える。
【００１３】
したがって、本発明の根底にある技術的課題は、試料を特徴づける手段および方法であって、それによって前述の欠点が回避される手段および方法を提供することである。
【００１４】
この技術的課題は、特許請求の範囲および本明細書に記載された実施形態によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって、本発明は、この方法を実行する方法、ならびにコンピュータプログラム、記憶媒体、この方法を実行するシステム、データベースなどのこの方法を実行する手段に関する。この方法は、少なくとも1種の化合物を含む試料を特徴づけることを可能にする。
【００１６】
本明細書で使用される用語「試料」は、人工試料、生物試料または環境試料を指す。人工試料は、予め選択された少なくとも1種の化合物を含み、または予め選択された少なくとも1種の化合物からなる試料である。この予め選択された少なくとも1種の化合物を他の化合物と混合して、人工試料を得ることができる。さらに、前記化合物は、in vitroで（体外で）実施されたさまざまな化学反応の結果として得ることもできる。したがって、本発明に基づくこの少なくとも1種の化合物を、化学反応によって得られた1種または数種の生成物であって、以下で説明する方法によって特徴づける対象である1種または数種の生成物とすることができる。さらに、少なくとも1種の化合物を含む試料は、生物源または環境源からも得ることができる。各種給源からの生物試料は通常、複数の化合物を含む。したがってそれらは、分析および特徴づけが難しい複雑な試料である。本明細書で使用される生物試料には、生物体から得られた試料など、生物源からの試料が含まれる。明細書で使用される生物体には、動物(ヒトを含む)、植物、細菌、菌類およびウイルスが含まれる。細菌、ウイルスまたは菌類の試料は、それらを含む培養物の形態で提供されることが好ましい。このような培養物を提供し、このような培養物を得る方法は当技術分野ではよく知られている。植物からの試料は、葉、幹、花などの植物の部分から、または種子から得ることができる。さらに、この用語は、一次細胞または細胞培養物を含む。動物からの試料には、血液、血漿、血清、尿、脊髄液などの体液の試料、あるいは、細胞、組織または器官から、例えば生検によって得られた試料が含まれる。さらに、この用語には、一次細胞または細胞培養物が含まれる。さらに、本発明に基づく試料は環境試料を含む。環境試料は、自然界の適当な任意の位置から得ることができる。環境試料は、自然界の前記位置に存在する少なくとも1種の化合物を含むことが好ましい。環境試料は、有機化合物、無機化合物、生物体など、前記位置に見られる複数の化合物を含むことが好ましい。前述の試料は、本発明の方法によって特徴づけられる前に、前処理されていることが好ましい。前記前処理は、化合物を放出させまたは分離するために必要な処理、過剰の物質または不要物を除去するために必要な処理、あるいは化合物分析に適した形態の化合物を得るために必要な処理を含むことができる。例えば、本発明の方法において、質量分析法に結合されたガスクロマトグラフィーが使用される場合には、前記ガスクロマトグラフィーの前に化合物を誘導体にする必要がある。適当かつ必要な前処理は、本発明の方法を実施するために使用される手段によって異なり、そのような前処理は当業者によく知られている。前述のように前処理された試料も、本発明に基づいて使用される用語「試料」に含まれる。
【００１７】
本明細書で使用される用語「少なくとも1種の化合物」は、単一化合物を含む試料、すなわち本質的に前記単一化合物からなる試料、あるいは複数の化合物を含む試料、すなわち、好ましくは少なくとも5、10、50、100、500、1000、2000、3000、5000または10,000種の異なる化合物を含む試料を指す。本発明に基づく化合物は、生物体などの生物物質である化合物、および生物体などの生物物質によって構成された化合物を含む、全てのクラスの有機または無機化合物を包含する。本発明に基づく化合物は小分子化合物であることが好ましく、代謝産物であることがより好ましい。代謝産物は、代謝経路の酵素の基質、該経路の中間体または代謝経路によって得られる生成物などの小分子化合物である。代謝経路は当技術分野ではよく知られており、種間で異なることがある。好ましくは前記経路が、少なくとも、クエン酸回路、呼吸鎖、光合成、光呼吸、解糖、糖新生、ヘキソース一リン酸経路、酸化的ペントースリン酸経路、脂肪酸の産生およびβ酸化、尿素回路、アミノ酸生合成経路、タンパク質分解経路、例えばプロテアソーム分解など、アミノ酸分解経路、あるいは脂質、ポリケチド(例えばフラボノイドおよびイソフラボノイドを含む)、イソプレノイド(例えばテルペン、ステロール、ステロイド、カロテノイド、キサントフィルを含む)、炭水化物、フェニルプロパノイドおよびその誘導体、アルカロイド、ベンゼノイド、インドール、インドール-硫黄化合物、ポルフィリン、アントシアン、ホルモン、ビタミン、補因子、例えば補欠分子族、電子担体など、リグニン、グルコシノラート、プリン、ピリミジン、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびその関連分子、例えばtRNA、microRNA、mRNAなどの生合成または分解を含む。これに従って、小分子代謝産物は、以下の化合物クラスからなることが好ましい:アルコール、アルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、エステル、アミン、イミン、アミド、シアン化物、アミノ酸、ペプチド、チオール、チオエステル、リン酸エステル、硫酸エステル、チオエーテル、スルホキシド、エーテル、あるいは以上の化合物の組合せまたは誘導体。これらの代謝産物中の小分子は、通常の全ての機能、器官機能あるいは動物の成長、発育または健康のために必要な一次代謝産物であることができる。さらに、小分子代謝産物は、必須の生態機能を有する二次代謝産物、例えば生物体が環境に適応することを可能にする代謝産物を含む。さらに、代謝産物は、前記一次および二次代謝産物だけに限定されず、さらに人工小分子化合物をも包含する。前記人工小分子化合物は、投与されまたは生物体によって摂取された、先に定義した一次または二次代謝産物ではない外因性小分子に由来する。人工小分子化合物は例えば、動物の代謝経路によって、薬物から得られた代謝産物である。代謝産物にはさらに、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペチド、オリゴヌクレオチドおよびRNA、DNAなどのポリヌクレオチドが含まれる。より好ましくは代謝産物は、50Daから30,000Da(ダルトン)の分子量を有し、最も好ましくは30,000Da未満、20,000Da未満、15,000Da未満、10,000Da未満、8,000Da未満、7,000Da未満、6,000Da未満、5,000Da未満、4,000Da未満、3,000Da未満、2,000Da未満、1,000Da未満、500Da未満、300Da���満、200Da未満、100Da未満の分子量を有する。最も好ましくは、本発明に基づく代謝産物は50から1,500Daまでの分子量を有する。
【００１８】
後に示される表現「特徴づける」は、この特定の試料を特徴づける特性試料プロファイルを生成するなどの異なる目標および/または結果を有する多種多様な手段を含むことが好ましい。したがって、「特徴づける」は、この個々の試料に固有のデータセットを生成することを含むことが好ましい。さらに、表現「特徴づける」は、その試料とその他の試料との間の類似性および/または相違に関する情報を生成するために、その試料を、参照試料および/または組成が既知の試料などのその他の試料と比較することを含むことが好ましい。この比較はさらに、その試料中のある特定の化合物の存在に関する情報の生成を含むことができる。この特徴づけはさらに、その試料の特性試料プロファイルを、データベースに記憶された既知の化合物のプロファイルなどの参照プロファイルと比較することを含むことができる。さらに、例えば統計情報または他の情報を得るために、従来技術から知られている分析法、特に生命情報科学(bioinformatics)から知られている方法を使用して、特性試料プロファイルをさらに処理することもでき、このことも、表現「特徴づける」の意味に含まれる。
【００１９】
以下に記載される方法は、いくつかのプロセスステップを含む。とはいえ、これらのプロセスステップは、記載された順序で必ず実行されなければならないというわけではない。プロセスステップは、並行してまたは繰り返し実行することができ、かつ/あるいは、以下に記載されていない他のプロセスステップを追加することができる。
【００２０】
第1のプロセスステップでは、少なくとも1種の化合物を含む試料を特徴づける第1の3次元データセットが生成される。「3次元」データセットセットは、データセットの次元を必ずしも3に限定しない。したがって、追加のプロセスパラメータまたは実験結果あるいは追加情報を追加するなどによって、別の「次元」を追加してもよい。したがって、この次元は3次元よりも高くすることができる。
【００２１】
第1の3次元データセットは、少なくとも1つの時間分解分離技法(time resolved separation technique)および少なくとも1つの質量分解分離技法(mass resolved separation technique)を使用して、試料を分析することによって生成される。したがって、「生データ」セットと呼ぶこともできる第1のデータセットは、第1の測定範囲をとる質量変量(例えば第3の次元)、および第2の測定範囲をとる時間変量(例えば第1の次元)の関数として、少なくとも1つの信号I(例えば第2の次元)を含む。
【００２２】
少なくとも1つの時間分解分離技法は、時間変量の関数として実験信号を生成する1つまたは複数の実験技法を含むことが好ましい。したがって、先にすでに指摘したように、この少なくとも1つの時間分解分離技法は、少なくとも1つのクロマトグラフィー技法を含むことが好ましい。一般に、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー(好ましくは高速液体クロマトグラフィー(HPLC))、薄層クロマトグラフィー、および/またはアフィニティクロマトグラフィーなど、任意のクロマトグラフィー技法を使用することができる。あるいはまたは加えて、細管電気泳動などの他の時間分解実験技法を使用してもよい。さらに、時間分解は、実験装置への試料の遅延注入または時間変動(time-varying)注入など、他の方法によって得ることもできる。他の好ましい技法はイオン移動度(ion mobility)を含む。時間変動実験信号を生成する多数の実験技法が実行可能であり、かつ当業者に知られており、それらは表現「時間分解分離技法」に含まれる。表現「分離技法」は、試料を複数の物理部分に物理的に分離する実験技法に必ずしも限定されず、少なくとも1種の化合物を含む部分などのいくつかの部分が試料中に存在することを、時間変量に従属した信号を生成することによって実験者に示すという意味を含むこともできる。
【００２３】
時間変量は、第一に、プロセス時間などの時間、例えば実験装置の部分であるコンピュータの内部クロック時間とすることができる。このケースでは、時間分解分離技法が時間の関数として信号を生成する。本発明によれば好ましいと予想されるクロマトグラフィーが使用される場合には、時間変量が保持時間であることが好ましい。とはいえ、表現「時間変量」は、実験または測定の進捗を指示する基本的に任意の変量に一般化することができる。したがって、例えば、表現「時間変量」は、特性「速度」を使用することによってプロセス時間に変換することができる位置変量をも含むことができる。したがって、例えばクロマトグラフィーカラムを使用しているときには、ある化合物の位置(例えばカラム内の特定の着色によって指示される)を、カラム内の溶媒の速度に依存するピーク内の溶媒の位置と比較するなどによって、その化合物の位置を時間に変換することができる。さらに、カラム材料の固定相の温度、極性、化学的性質なども影響を及ぼすことを理解されたい。既知の周期性を有するプロセスのサイクル数など、実験または測定の進捗を指示する他のタイプの「時間変量」が実行可能であり、それらは含まれなければならない。
【００２４】
同様に、少なくとも1つの質量分解分離技法は、さまざまな種類の1つまたは複数の実験技法を含むことができる。質量分解分離技法は質量分析法を含むことが好ましい。一般に、扇形磁場質量分析法、飛行時間質量分析法、四重極質量分析法および/もしくはイオントラップ質量分析法、またはこれらの任意の組合せ、あるいは他の質量分解分離技法との組合せなど、知られている全ての質量分析法を使用することができる。表現「時間変量」と同様に、表現「質量変量」は質量だけに限定されず、例えば、質量/電荷数m/zおよび/または質量から得られる他の変量を含むことができる。
【００２５】
クロマトグラフィー技法などの時間分解分離技法および質量分析法などの質量分解分離技法は当業者に知られており、この開示の中ではさらに詳細には説明しない。
【００２６】
第1の測定範囲および第2の測定範囲は、例えば、それぞれの分離技法に対して使用される実験構成のそれぞれの測定範囲全体とすることができる。あるいは、それぞれの構成の測定範囲全体の一部分、または測定範囲全体の複数の単一部分としてもよい。
【００２７】
本発明に基づく方法の第2のプロセスステップでは、質量分解分離技法の測定範囲である第1の測定範囲が、少なくとも2つの質量変量区間に分割される。以下では、これらの少なくとも2つの質量変量区間の長さを、Δmと称する。これらの少なくとも2つの区間の長さは等しいことが好ましい。とはいえ、第1の測定範囲を分割する別の方法を選択してもよく、その場合には、区間の長さがΔm1、Δm2、...、または一般にΔmiであり、iが、それぞれの質量変量区間の識別番号を表す。
【００２８】
少なくとも1つの質量変量区間の長さΔm(または、第1の測定範囲が均等に分割されない場合には最短区間の長さ)は、質量ピーク幅Rmzよりも大きいかまたはそれに等しくなるように選択されることが好ましい。質量ピーク幅Rmzは、その少なくとも1つの質量分解分離技法の質量の正確さ(測定質量と理論質量の差)の文脈においても判断されなければならない。四重極機器および飛行時間機器に対する質量ピーク幅の定義は、強度の半値幅(FWHM)である。2つ以上の質量分解分離技法が使用される場合には、Rmzが、それらの複数の質量分解分離技法の最小質量ピーク幅でなければならない。
【００２９】
さらに、少なくとも1つの質量変量区間の長さΔmは、第1の測定範囲Lmzの全長よりも短くなるように選択されることが好ましい。このことは、第1の測定範囲の分割が均等でない場合であっても、全ての質量変量区間に対してあてはまる。
【００３０】
好ましい一実施形態では、Δm(または少なくとも1つの長さΔmi)が、0.01から5原子質量単位(amu)の範囲にあるように選択される。第1の測定範囲Lmzの全長は1amuよりも大きいことが好ましい。多くの場合、1原子質量単位となるように、少なくとも1つの質量変量区間の長さΔmを選択することが特に好ましい。先に指摘したとおり、表現「原子質量単位」はさらに、電気素量を含んでもよいことに留意されたい。したがって、例えば質量分析法を使用するときには、区間の長さΔmが、1原子質量単位/電気素量(amu/z)であることが好ましい。
【００３１】
第1の測定範囲を少なくとも2つの多変量区間に分割する第2のプロセスステップはさらに、それぞれの質量変量区間について、抽出信号(extracted signal)を選択することを含む。この抽出信号は時間変量の関数である。したがって、質量変量および時間変量の関数として複数の信号Iを含む第1の3次元データセットは、少なくとも2つの質量変量区間のそれぞれに対して1つの、時間変量だけの複数の関数に縮約される。
【００３２】
一般に、それぞれの質量変量区間に対応する抽出信号は、それぞれの質量変量区間内の第1のデータセット(最初はまだ3次元である)が時間変量だけの1つの関数に縮約されるいくつかの方法によって選択することができる。次元を低減させるデータ圧縮法の多くは当業者に知られている。とはいえ、それぞれの質量変量区間に対する抽出信号は、以下の方法のうちの少なくとも1つによって選択されることが好ましい。
【００３３】
・(それぞれの)質量変量区間の全体にわたって信号Iを積分する方法
・質量変量区間の全体にわたって信号Iを加算する方法
・質量変量区間の全体にわたって信号Iを平均する方法
・質量変量区間の一方の区間境界の信号Iを選択する方法
・質量変量区間全体の信号Iの最大値または最小値を選択する方法
質量変量区間の区間境界間の所定の点の信号Iを選択する方法など、抽出信号を選択する他の方法も実行可能である。抽出信号を選択するのにどの方法を使用するのかは通常、いくつかの因子に依存する。多くの場合、積分法または加算法を使用することが特に好ましい。Iが連続信号である場合には積分が好ましく、信号Iが複数の離散値を含む場合には加算が好ましい。
【００３４】
したがって、元は3次元の第1のデータセットは、少なくとも2つの質量変量区間のそれぞれに対して1つ、少なくとも2つの複数の抽出信号に縮約される。この開示の全体を通じて、表現「関数」は、連続関数だけに限定されず、離散関数および不連続関数(例えば重心データ)を含むこともあることを理解されたい。
【００３５】
この第2のプロセスステップを実行した後、したがって少なくとも2つの複数の抽出信号を生成した後、第3のプロセスステップでは、少なくとも1つの時間分解分離技法の測定範囲である第2の測定範囲が、少なくとも1つの時間変量区間(time variable interval)に分割される。10個の時間変量区間など、2つ以上の時間変量区間が使用されることが好ましい。
【００３６】
以下、この少なくとも1つの時間変量区間の長さをΔrtと称する。少なくとも2つの質量変量区間の長さの場合と同様に、少なくとも1つの時間変量区間への第2の測定範囲の分割は、等しい時間変量区間を生成することによって実行されることが好ましい。とはいえ、第2の測定範囲の分割は均等でなくてもよい。
【００３７】
少なくとも1つの時間変量区間の長さ(または、均等分割でない場合には最も短い時間変量区間の長さ)は、少なくとも1つの時間分解分離技法のサイクル時間(またはその技法の最小サイクル時間)、あるいはその少なくとも1つの時間分解分離技法を使用して2つの異なるピークが分解可能な最小時間間隔よりも大きいかまたは等しくなるように、選択されることが好ましい。したがって、サイクル時間(1回の測定に対応する時間)が100ミリ秒の時間分解分離技法が使用される場合、この少なくとも1つの時間変量区間は、100ミリ秒以上となるように選択される。あるいは、少なくとも1つの時間分解分離技法を使用して信号の2つの異なるピークが分解可能である最小分解時間が、1秒であることが分かっている場合、少なくとも1つの時間変量区間Δrtは、1秒以上となるように選択することができる。この最小時間間隔は、定義されたスペーシング(spacing)上のピークのライニングアップ(lining-up)において分解することができるピークの数を反映するピークキャパシティ(peak capacity)ncから計算することができ、これは、当業者に知られており、例えばL.S. Ettre: "Grundbegriffe und Gleichungen der Gaschromatographie", Huthig, Heidelberg, 1995, page 103-104に記載されている。ピークキャパシティは下式から計算される。
【数１】
2009500617.tif 000003
【００３８】
例えば、Lrt:クロマトグラフィー全測定範囲=6分
tM:クロマトグラフィーシステムのホールドアップ時間=0.5分。
【００３９】
tR:あるクロマトグラフィーピークの保持時間=1.0分
w:あるピークのピークベースのクロマトグラフィーピーク幅=0.1分
とすると、nc=25.8が得られる。したがって最小区間は6分/25.8=14秒である。
【００４０】
同様に、少なくとも1つの時間変量区間(または、これらの区間の最長区間)は、第2の測定範囲の全長よりも小さいかまたは等しくなるように選択されなければならない。
【００４１】
続いて、第3のプロセスステップの中で、それぞれの時間変量区間およびそれぞれの抽出信号について、少なくとも1つの特性値が選択される。この特性値は、それぞれの時間変量区間内のそれぞれの抽出信号を特徴づけるために選択され、したがって、前述のそれぞれの質量変量区間に対する抽出信号の選択と同様に、抽出信号の次元を、時間変量の関数から少なくとも1つの特性値に低減させる。抽出信号のこの選択に関しては、次元を低減させるいくつかの方法を使用することができ、それらは当業者に知られている。これらのデータ圧縮法は、以下の方法のうちの1つを含むことが好ましい。
【００４２】
・時間変量区間の全体にわたって抽出信号を積分する方法
・時間変量区間の全体にわたって抽出信号を加算する方法
・時間変量区間の全体にわたって抽出信号を平均する方法
・時間変量区間の一方の区間境界の抽出信号を選択する方法
・時間変量区間全体の抽出信号の最大値または最小値を選択する方法。
【００４３】
それぞれの質量変量区間に対する抽出信号の選択の場合と同様に、積分が最も好ましい。本発明によれば、少なくとも1つの特性値を生成するのには、積分を使用することが特に有用であることが分かった。具体的には、このような特性値は、情報として非常に優れ、試料に対して固有であることが分かった。したがって、それに基づく試料比較は非常に信頼できる。
【００４４】
このように、それぞれの時間変量区間およびそれぞれの抽出信号について少なくとも1つの特性値を選択することによって、特性試料プロファイルが生成される。少なくとも1種の化合物を含む試料を特徴づけるこの特性試料プロファイルは、それぞれの時間変量区間およびそれぞれの質量変量区間の関数として、少なくとも1つの特性値を含む。したがって、少なくとも2つの質量変量区間が使用され、少なくとも1つの時間変量区間が使用されるため、特性試料プロファイルは、それぞれの質量変量区間に対して1つ、少なくとも2つの特性値を含む。したがって、この特性試料プロファイルは、それぞれの時間変量区間およびそれぞれの質量変量区間に対して少なくとも1つ、少なくとも2次元の特性値マトリックスであることができる。したがって、少なくとも1種の化合物を含む試料を特徴づける第1のデータセット(「生データ」)は、特性試料プロファイルに縮約される。
【００４５】
前述の実施形態の1つに開示された本発明に基づく方法は、従来技術から知られている方法に優るいくつかの利点を提供する。したがって、この方法は、知られている多くの方法の欠点である、先に指摘したピーク検出の必要性を回避する。従来技術の方法においてしばしば使用されるスペクトル中のピークの位置および高さの代わりに、例えば時間変量区間の積分を使用することができる。したがって、時間のかかるピーク検出アルゴリズムが不要となり、前述のピーク検出の不確実性が回避される。
【００４６】
さらに、第1のデータセット(「生データ」)からスタートしたデータ量を、特性試料プロファイルを生成することによって、かなり低減させることができる。これは、例えばデータベースに特性試料プロファイルを記憶する記憶空間の低減を可能にする。さらに、このデータ量のかなりの低減は、それらのそれぞれの特性試料プロファイルを比較することによって2つ以上の異なる試料を比較することなどを目的としたデータの追加の処理をより容易にすることができる。追加の利点は、以下に示される追加の説明の中で明白になるであろう。
【００４７】
試料をさらに特徴づけるために、少なくとも1種の化合物を含む試料を特徴づける特性試料プロファイルをさまざまな方法で使用することができる。したがって、その試料の特性試料プロファイルを、第2の試料の少なくとも1つの特性試料プロファイルおよび/または少なくとも1つの参照試料プロファイルと比較するプロセスステップを追加することによって、本発明に基づく方法を拡張することができる。この第2の試料および/または参照試料は、既知の組成を有する、または少なくとも1つの既知の特性を有する試料である。前記試料は実試料または仮想試料である。仮想試料は単に、比較目的に適した形式、例えばマトリックス形式で記憶されたその試料の情報である。特性試料プロファイルを比較するこのステップは、当業者に知られているさまざまな方法で実行することができる。したがって、この比較は、(例えば市販の)データ解析アルゴリズムを使用することによって実行することができ、例えば、この1つまたは複数の試料の他のパラメータを考慮して実行することができる。したがってさらに、少なくとも1種の化合物を含むその試料に関する情報を、特性試料プロファイルと組み合わせて記憶することができる。この情報は、試料調製、試料の前処理、試料間の相互関係などに関する情報を含むことができる。表現「比較する」は、特定の1つの時間変量区間および特定の1つの質量変量区間に対する少なくとも1つの特性値と、第2の試料および/または参照試料の特性試料プロファイルの対応する特性値との比較など、その試料と第2の試料および/または参照試料の特性試料プロファイルのそれぞれの特性値の1対1の比較を含むことができる。したがって、特性値間の差および/または特性値の比を生成することができる。あるいはまたは加えて、対応する特性値の商、または値を比較する他の任意のアルゴリズムを形成することができる。この比較に使用される第2の試料または参照試料に応じて、ある試料が第2の試料または参照試料と同一であるのか、あるいはそれとは異なるのかを、ある統計的確率で、判定することができる。したがって用語「同一」は、互いに比較された特性値の識別の統計的な同一性の程度を指す。必要な変更を加えれば同じことが用語「異なる」にもあてはまる。
【００４８】
この比較を、少なくとも1種の化合物を含む試料と第2の試料または参照試料とが同一でありそうかどうか、あるいは1種または数種の同一のまたは同様の化合物を含んでいそうかどうかを判定するために実行することができる。この判定は、定性的および/または定量的に実行することができる。したがって、これらの試料が同一でありそうかどうか、あるいは1種または数種の同一のまたは同様の化合物を含んでいそうかどうかを判定することができ、かつ/あるいは、1種または数種の同一のまたは同様の化合物が同定された場合には、試料内のこれらの化合物の量比を決定することができる。多数の試料を特徴づけるときなど、多くの場合に、統計情報が得られる。
【００４９】
先に指摘したとおり、少なくとも1種の化合物を含む試料と第2の試料および/または参照試料との比較のために、いくつかのアルゴリズムを使用することができる。これらのアルゴリズムは当業者に知られている。とはいえ、このアルゴリズムが、パターン認識アルゴリズムおよび/または統計的検定アルゴリズムおよび/または多変量アルゴリズム、例えば、主成分分析(Principal Component Analysis:PCA)、単純成分分析(Simple Component Analysis:SCA)、独立成分分析(Independent Component Analysis:ICA)、主成分回帰(Principal Component Regression:PCR)、部分最小2乗法(Partial Least Square:PLS)、PLS判別分析(PLS Discriminant Analysis:PLS-DA)、サポートベクターマシン(Support Vector Machine:SVM)、ニューラルネットワーク(Neural Network)、ベイズネットワーク(Bayesian Network)、ベイズ学習ネットワーク(Bayesian Learning Network)、ミューチュアルインフォメーション(Mutual Information)、バックプロパゲーションネットワーク(Backpropagation Network)、対称フィードフォーワードネットワーク(symmetrical Feed-Forward Network)、自己編成マップ(Self-Organizing Map:SOM)、ジェネティックアルゴリズム(Genetic Algorithm)、階層的またはK-平均クラスタリング(Hierarchical or K-Mean Clustering)、分散分析(Anova)、スチューデントのt検定(Student's t-Test)、クラスカル-ウォリス検定(Kruskal-Wallis Test)、マン-ホイットニー検定(Mann-Whitney Test)、チューキー-クレイマー検定(Tukey-Kramer Test)またはシューのベスト検定(Hsu's Best Test)を含むことが好ましい。
【００５０】
少なくとも1種の化合物を含む試料と第2の試料および/または参照試料との特性試料プロファイルの前述の比較は、特性試料プロファイルの生成の詳細によっては、かなり「粗い(crude)」可能性がある。したがって、少数の時間変量区間および/または質量変量区間だけしか選択されない場合、第1のデータセット(「生データ」)は、少数の特性値だけを含む試料プロファイルまでかなり縮約される。したがって、少なくとも1種の化合物を含む試料との第2の試料および/または参照試料との特性試料プロファイルの比較が、これらの試料が同一でありそうであること、あるいは1種または数種の同一のまたは同様の化合物を含んでいそうであることの第1の指示だけを与える場合がある。この情報を、試料を予備的に選択しまたは予備的に突き合わせ、あるいは試料内のある種の既知の化合物を同定する第1のステップとして使用することができる。
【００５１】
とはいえ、特性試料プロファイルの記載された比較の後により詳細な比較ステップを追加することによって、本発明に基づく方法をさらに「改良する」ことができる。したがって、後続の一ステップにおいて、その試料の第1の3次元データセットまたはその関連部分を、第2の試料または参照試料の第1の3次元データセットと比較することができる。データセットの関連部分は、それに基づいて特性値を決定することができ、またはその特性値を表すデータのサブセットを指す。したがって、これらの試料が同一でありそうかどうか、かつ/あるいは1種または数種の同一のまたは同様の化合物を含んでいそうかどうかについてさらに解明することができる。したがって、特性試料プロファイルのこの比較を使用して、多数の試料(例えば数千の試料)を、参照試料とは一致していそうにない、または参照試料とは異なっていそうな小さな試料群にまで低減させることができる。続いて、試料をさらに特徴づけるために、生データのより詳細な比較を実行することができる。
【００５２】
少なくとも1種の化合物を含む試料の生データと第2の試料および/または参照試料とが比較されるこのより詳細な比較ステップでは、少なくとも1種の化合物を含む試料と第2の試料および/または参照試料とをさらに比較するために、追加のパラメータを使用することができる。したがって、試料の調製に関する前述の情報および/または試料の起源に関する情報、あるいは他の情報を使用することができる。さらに、それぞれの時間間隔内の抽出信号のピークまたは生データ内のピークを検出しかつ/またはその妥当性を検証するために、ピーク検出および/または妥当性検証アルゴリズムを使用することができる(例えばChemStation(米Agilent  Technologies社)またはAMDIS(米NIST社)などの市販プログラム)。ピークは、使用可能なデータベースとの比較によって決定することもできる。このケースでは、ピーク検出アルゴリズムが「二次」情報源としてしか使用されないため、ピーク検出アルゴリズムの欠点はあまり問題とはならない。したがって、少なくとも1種の化合物を含む試料ならびに第2の試料および/または参照試料の抽出信号のピークを追加情報として使用して、試料をさらに比較することができる。
【００５３】
したがって、本発明の前述の実施形態の1つに基づく方法は、「予備的突合せ」ステップおよびその後の任意のより詳細な試料比較ステップを使用することによって、多数の試料の迅速な比較を可能にする。したがって、多くの試料を比較するのに必要な時間がかなり短縮され、大規模なハードウェア資源の必要性が最小限に抑えられる。
【００５４】
さらに、本発明は、前述の実施形態の1つに基づく方法によって生成された少なくとも1つの特性試料プロファイルを含むデータベースを含む。このデータベースは、単一のデータベースおよび/または互いにリンクされたいくつかのデータベースの組合せとすることができる。先に指摘したとおり、このデータベースは、試料や試料の前処理などに関する情報、ならびに実験方法に関する情報、例えば少なくとも1つの時間分解分離技法および少なくとも1つの質量分解分離技法の手段およびパラメータに関する情報などの、追加情報およびパラメータを含むことができる。さらに、このデータベースは、いくつかの試料をリンクする情報(例えば、一群の生物試料が同じ地域の集団から採集されたものであるといった情報)または他の関係情報などの関係情報を含むことができる。
【００５５】
本発明はさらに、前述の実施形態の1つに基づく方法を実行するプログラムコード手段を含むコンピュータプログラムであって、この方法が、コンピュータプログラムがコンピュータまたはコンピュータネットワーク上で実行されている間に実行されるコンピュータプログラムに関する。具体的には、このプログラムコード手段は、コンピュータまたはコンピュータネットワーク可読の記憶媒体上に記憶することができる。
【００５６】
さらに、本発明は、データ構造がその中に記憶された記憶媒体であって、コンピュータまたはコンピュータネットワークの主記憶域および/あるいは作業用記憶域にロードされた後に、前述の実施形態の1つに基づく方法を実行するように、データ構造が適合された記憶媒体に関する。本発明はさらに、プログラムコード手段を有するコンピュータプログラム製品であって、プログラムコード手段がコンピュータまたはコンピュータネットワーク上で実行された場合に、前述の実施形態の1つに基づく方法を実行するために、プログラムコード手段を記憶媒体上に記憶することができ、またはプログラムコード手段が記憶媒体上に記憶されたプログラム製品を含む。この文脈では、コンピュータプログラム製品が、売買可能な製品としてのプログラムを指す。これは一般に、紙上またはコンピュータ可読記憶媒体上など、任意の形態で存在することができ、コンピュータネットワークを介して分散させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
本発明の追加の詳細および特徴は、従属請求項と組み合わせられた好ましい実施形態の以下の説明から明らかとなる。それらの実施形態の中で、それぞれの特徴は、単独でまたは他の特徴と組み合わせて実現することができる。本発明は、それらの実施形態に限定されない。
【００５８】
好ましい実施形態は図に概略的に示されている。これらの図の中の同一の参照符号は、同一の要素、あるいは機能的に同様のまたは機能的に対応する要素を表す。
【００５９】
図1には、少なくとも1種の化合物を含む試料を特徴づける方法の例示的な好ましい一実施形態が示されている。この方法は、少なくとも1種の化合物を含む試料を特徴づけるシステム210を使用して実行することができ、システム210の例示的な好ましい一実施形態が図2に示されている。以下では、図1に記載の方法のプロセスステップを、図2に記載のシステム210に関して説明する。
【００６０】
第1のプロセスステップ(図1のステップ110)では、試料を分析することによって、第1の3次元データセットを生成する。この第1のプロセスステップ110は、試料調製、生データの測定、データベースへの記憶など、多数のサブステップを含む。試料調製は、図2に記載のシステム210中に、参照符号212によって記号的に示されている。以下では、少なくとも1種の化合物を含む試料が生物試料であり、前記化合物が代謝産物であると仮定する。したがって例えば、試料は、ラット集団の1匹の個体ラットの尿試料である。
【００６１】
試料は以下のように調製する:沈降によって血漿からタンパク質を分離した。残った血漿を、極性の水相と親油性の有機相とに分画した。その後、四重極質量分析システム216に結合された液体クロマトグラフィーシステム214に試料を挿入する。したがって、試料は、最初に、液体クロマトグラフィー(LC)である時間分解分離技法を使用して分離され、続いて、質量分析法である質量分解分離技法によって分離される。システム214、216はともに、コンピュータシステム220によって制御され(参照符号218)、コンピュータシステム220は、質量分析システム216および液体クロマトグラフィーシステム214を制御し、実験データおよびシステムパラメータを読み出す(参照符号222)。
【００６２】
LC部分は、米Agilent Technologies社の市販LCMSシステムで実施した。極性抽出物に関しては、このシステムに抽出物10μlを流量200μl/分で注入する。クロマトグラフィーの間、分離カラムは15℃に維持した。脂質抽出物に関しては、このシステムに抽出物5μlを流量200μl/分で注入する。分離カラムは30℃に維持した。
【００６３】
質量分析は、ターボイオンスプレー源を有するApplied Biosystems社のAPI 4000三重四重極(triple quadrupole)機器で実行した。極性抽出物に関しては、この機器が、イオンスプレー設定-4000V、ガス1 35psi、ガス2 30psi、カーテンガス20psiおよび温度600℃の陰イオンモードで測定する。この機器は、高速プロファイルモードで1秒間に100〜1000amuのフルスキャンモードでスキャンしており、質量依存デクラスタリング(declustering)ポテンシャルは、-30Vから出発して-100vまでである。脂質抽出物に関しては、この機器が、イオンスプレー設定5500V、ガス1 25psi、ガス2 50psi、カーテンガス25psiおよび温度400℃の陽イオンモードで測定する。この機器は、高速プロファイルモードで1秒間に100〜1000amuのフルスキャンモードでスキャンしており、質量依存デクラスタリング(declustering)ポテンシャルは、20Vから出発して110vまでである。
【００６４】
このように、システム210を使用することによって、それぞれの試料に対して、質量/電荷数m/zおよび液体クロマトグラフィーシステム214の保持時間の関数である信号(強度、カウント(count))を含む第1の3次元データセットが生成される。
【００６５】
生物試料の第1の3次元データセットの一例が図4に示されている。この生データは、水平面から立ち上がったいくつかの強度ピーク410を含むことが分かる。図4に記載のデータの軸が図3に記号的に示されている。軸セット412は、保持時間軸414(「rt」で示されている)を含む。この軸の単位は分である。軸セット412はさらに、「m/z」で示された質量/電荷軸416を含む。この軸の単位は原子質量単位(amu)であり、これは実際には、「1原子質量単位/電気素量」を意味する。直交軸セット412の第3の軸は、図4に「I」で示された信号軸418である。この例では信号軸418の単位がカウントである。
【００６６】
したがって、信号Iは、保持時間rtおよび質量/電荷数m/zの関数である。このケースでは信号Iが、(MS質量分析法の)1測定サイクルごとに1つの信号データ点を含む離散関数である。とはいえ、図4に示されているように、実験サイクルは測定範囲全体に対して十分に小さく、そのため、信号Iは、離散ステップを示すというよりもむしろ「滑らかな」信号である。それでも、信号Iは実際には離散関数であることに留意しなければならず、このことは、用語「積分」を使用するときには、実際には離散データ点の加算を意味していることを意味する。
【００６７】
さらに、図3には、この質量分析法の測定範囲を示す第1の測定範囲420が示されている。さらに、クロマトグラフィーの測定範囲を示す第2の測定範囲422も示されている。したがって、質量分析法は、例えば100原子質量単位/電気素量からり1000原子質量単位/電気素量まで、例えば0.2原子質量単位/電気素量の離散ステップで実行することができる。同様に、第2の測定範囲422は、0.1分から6分までの範囲とすることができ、離散測定ステップ(サイクル時間)は1、2または3秒とすることができ、1秒が最も好ましい。
【００６８】
図3にさらに示されているように、第1の測定範囲420および第2の測定範囲422は、(この例では)等しい区間424、426に分割される。一般に、長さΔm/zが1原子質量単位である質量変量区間（mass variable interval）424が好ましく、6分の第2の測定範囲に対しては、好ましい約5から24個の時間変量区間（time variable interval）426が得られるおおよそΔrt=15から80秒の時間変量区間426が好ましく(ZEITINTERVALL BREITER DEFINIEREN, 5 TIMESLICES sind 72 seconds pro slice)、Δrt=15から20秒がより好ましい。好ましくは、1から20個の時間変量区間426が使用される。先に言及したとおり、質量/電荷軸416および保持時間軸414の他の分割実施形態も可能である。
【００６９】
第2のプロセスステップ(図1のステップ112)では、図4に記載の生データのそれぞれの質量変量区間424について、抽出信号(抽出イオンクロマトグラムではしばしばXICと呼ばれる)を選択する。言い換えると、このステップは、特定の質量変量区間424および特定の1つの保持時間rtに特定の1つの強度を割り当てるために、その特定の1つの質量変量区間Δm/z424内の全ての生データを圧縮することを含む。これは例えば、それぞれの質量変量区間424の保持時間ごとに、信号Iの全ての強度信号を加算することによって実行することができる。したがって、例えば、図3の参照符号の付いた質量変量区間424が、i番目の質量変量区間である場合、このi番目の質量変量区間424の抽出信号XICiは以下のとおりである。
【数２】
2009500617.tif 000004
【００７０】
上式で、「Δm/z, i」は、i番目の質量変量区間の全体にわたって加算することを表す。したがって、元の第1の3次元データセットI(rt, m/z)は、保持時間だけの関数である複数の2次元抽出信号XICiまで縮約される。抽出信号XICiの数は質量変量区間424の数に一致する。例えば、100〜1000amu/zの測定範囲に対して、1原子質量単位/電気素量の質量変量区間Δm/zが使用される場合、amu/z=100-101に対する1つの抽出信号XIC、amu/z=101〜102に対する1つの抽出信号、...、最後に、m/z=999〜1000amu/zに対する1つの抽出信号がある。前述のとおり、それぞれの質量変量区間424に対する抽出信号XICiを得るために、積分または加算の代わりに、例えば平均化、最大化、最小化などの他の方法を使用してもよい。
【００７１】
図5には、抽出信号XICiの一例が示されている。見て分かるとおり、垂直XIC軸は、図3のI軸418の場合と同様、単位「カウント」を有する。抽出信号510は、この例では分で与えられた保持時間rt(水平軸)の関数である。
【００７２】
次のプロセスステップ、図1のステップ114では、図5の保持時間軸を、図5では「TS1」、「TS2」、...、「TS5」によって記号的に示された時間変量区間426に分割する。保持時間軸414に対する第2の測定範囲422が全体で6分であるこの例では、長さがそれぞれ72秒の5つの時間変量区間が分離されている。これらの時間変量区間426はしばしば「タイムスライス」と呼ばれる。
【００７３】
第2の測定範囲422を時間変量区間426に分割した後、図1のプロセスステップ414の追加のサブステップにおいて、抽出信号XICiのそれぞれの時間変量区間426に対応する特性値を選択する。図6にはこのプロセスが記号的に示されている。この例示的な実施形態では、この特性値が、j番目の時間変量区間の全体にわたって抽出信号XICiを単純に積分することによって選択される。先に言及したとおり、関数XICiは実際には離散関数であるので、この「積分」は実際は加算である。
【数３】
2009500617.tif 000005
【００７４】
上式で、ci,jは、i番目の質量変量区間424およびj番目の時間変量区間426に対応する特性値を表す。したがって、プロセスステップ414の結果、特性値ci,jのマトリックスが生成され、このマトリックスは、少なくとも1種の化合物を含む試料を特徴づける特性試料プロファイルであり、元の生データセット(すなわち信号I)の「縮約されたデータセット」である。
【００７５】
以下の任意のプロセスステップ、図1のステップ116では、図6の抽出信号XICiから追加のパラメータを得ることができる。あるいはまたは加えて、前述の方法に従って生成された特性パラメータci,jを、例えば正規化または他の任意の変換によって変換してもよい。一例として、図6に示された抽出信号XICiの特性パラメータci,1が、図6の黒い領域によって記号的に示されている。この領域は、最初の時間変量区間TS1における図6の抽出信号XICi510の下側の領域である。この領域は、図2に示された実験システム210の設定に強く依存するため、これを例えば、信号の全高に関して正規化してもよい。したがって、ステップ116では、特性パラメータci,jを生成する式(2)を使用することによって得られる面積を、時間変量区間426内の最も高いピーク512の高さで割ることができる。したがって、特性パラメータci,jの代わりに、特性パラメータci,jをピーク512の高さで割ったものである新しい特性パラメータci,j′を使用することができる。それによって、特性パラメータは「正規化され」、実験システム210の実験設定からほぼ独立する。
【００７６】
図7には、比較のため、本発明の方法に対立するものとして、「伝統的な」ピーク検出アルゴリズムが示されている。図7に示されているように、ピーク検出アルゴリズムを使用するためには、まず第1に、ピーク512を検出しなければならない。このピーク検出アルゴリズムの例では、その後、時間変量区間TS1の最も高いピーク512を積分することによって特性値を得る。積分の境界としては、最も高いピーク512に隣接する最小値が使用される。見て分かるとおり、これらの積分境界は、最も高いピーク512に隣接するピークの性質に強く依存し、したがって、図7に記載の方法の不確実性はかなり高い。さらに、多くの場合、特に、隣接するピークが非常に近いときには、積分境界がはっきりしないため、ピーク512の積分が完全に失敗する可能性がある。これは、特性試料プロファイルの「欠測値」につながる。図6に示された本発明に基づく方法を使用すると、「欠測値」の危険がかなり低減され、それぞれの試料の第1の3次元データセットの完全な評価が可能になる。さらに、図6に示された本発明に基づく方法はピークに限定されない。このことは、「肩状部分(shoulder)」、「丘状部分(hill)」などの抽出信号XIC 510の他の特徴が、特性値ci,jに寄与することを意味する。
【００７７】
図1のプロセスステップ118、120および122は、前述の方法によって生成された特性試料プロファイルを評価する追加のステップを示す。したがって、ステップ118では、統計的評価(ステップ118)によっていくつかの試料を解析し、かつ/または結合することができる。この任意のプロセスステップでは、例えば試料の中央値、平均値、標準偏差(SD)、相対標準偏差(RSD)または他の統計値を生成することができ、そのデータを、例えば対数変換によって変換してもよい。したがって、いくつかの試料の統計情報を得るために、それらの試料を比較し、かつ/または結合することができる。
【００７８】
任意のプロセスステップ120(図1)では、多数の試料のある特性値の分布を視覚化するために、統計データを視覚化することができる。したがって、例えば、所定の「許容」偏差を超えて平均値から外れた試料および/または特性値をデータセットから除外することができる。図8および9は、無処理のラットおよび投薬されたラット(異なるいくつかの処理)の48個の血漿試料に対するこのような品質管理の結果を示す。図8には、多変量異常値を定義する限界としてホテリング(Hotelling)のT2楕円(信頼区間0.95)を用いた主成分分析のスコアが示されている。このケースでは楕円の外側に入る試料はない。すなわち、この検定に基づくと、明らかな多変量異常値はない。図9には、試料分離に対する異なる変量の寄与を調べるため、図8と同じ主成分分析において使用された9005個の変量に対するローディングが視覚化されている。試料の統計的分離に強い影響を有する変量は、大きな絶対値によって特徴づけられる。これらの変量は、分類子として使用する候補であり、したがって、追加の統計的分析においてはそれらに焦点を合わせることができる。
【００７９】
他の任意のプロセスステップ、図1のステップ122では、1つまたは複数の試料の特性値の以前のプロセスステップの統計的結果が、参照値、例えば(実または仮想)参照試料の参照値と比較される。したがって、例えば、ある特性値間の比(先に指摘したとおり、例えば複数の試料の平均値とすることができる)を生成することによって、この1つまたは複数の試料内のある化合物の存在、不在または量の可能性を得ることができる。したがって、この1つまたは複数の試料の定量および/または定性分析を実行することができる。図10および11はステップ122の結果の例を示す。無処理のラットおよび投薬されたラットの血漿試料のデータ(2種類の異なる投薬、図8の分析で使用された処理のサブセット、33の試料に対して結果が視覚化された)を、分散分析から得られた変量の予備的選択(52変量)(ステップ118の一部;注:あるいは、図9に示されたローディング情報を、以前に提案された変量の予備的選択に対して使用することもできる)に基づく主成分分析(PCA)にかけた。図10に示されているように、全ての3つの異なる処理を分離することができ、この分離を推進するキーとなる変量を識別することができる(図11)。
【００８０】
前述の比較によって得られる結果は、ある試料が参照試料と同一であるかどうかを示している。しかし、この分析は、場合によっては単に第1の推定しか与えないことがあり、正確な試料組成が定量的および/または定性的に決定される追加のステップがさらに必要である。このような比較は、メタボロミクス(metabolomics)において、例えば外因性の影響の結果である代謝変化の調査のために使用されることが好ましい。有利には、本発明の方法を使用して、潜在的な薬物、潜在的に有毒な化合物など、生物体のメタボローム(metabolome)を引き起こす化合物の高スループットスクリーニングを評価することができる。前記高スループットスクリーニングでは、例えば薬物開発のための適当な候補を決定するため、または有毒な化合物を識別するために、数千の化合物がスクリーニングされる。包括的なメタボローム分析は、時間効率的かつ/または費用効率的な方法では取り扱うことができない、例えば互いに比較することができない莫大な量のデータを産み出すであろう。本明細書に記載された方法は、次元が低減された相対的に複雑でないデータセットを使用することによって、メタボロームを引き起こす適当な候補を予備的に選択することを可能にする。前記予備的選択は、時間が掛からず、費用効果がよい方法で実行することができる。予備的に選択された候補は次いで、所望の特性に関してさらに調べることができる。
【００８１】
それぞれの試料の特性値などの前述のプロセスステップの結果を、図2のコンピュータシステム220に記憶することができる。このコンピュータシステム220は別個のいくつかのコンピュータを含むことができ、1つまたは複数のデータベースを含むことができる。したがって、実験システム214、216を制御するコンピュータおよび実験データを評価する別のコンピュータを使用することができる。したがって、前述のプロセスステップによって得られた実験データを、別のコンピュータシステム上で評価することができる。
【００８２】
この明細書の全体を通じて引用された全ての参照文献は、本明細書に記載された特定の開示内容に関して、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】本発明に基づく方法の好ましい一実施形態を示す図である。
【図２】図1に記載の方法を実行するシステムの好ましい一実施形態の概略構成を示す図である。
【図３】少なくとも1種の化合物を含む試料を特徴づける第1の3次元データセットの座標系を示す図である。
【図４】第1の3次元データセットの一例を示す図である。
【図５】特定の1つの質量変量区間に対応する抽出信号の一例を示す図である。
【図６】図5に記載の例の最初の時間変量区間の特性値の生成を示す図である。
【図７】従来技術に基づくピーク積分アルゴリズムの一例を示す図である。
【図８】プロセスステップ120の一部としての品質管理の第1の例:試料レベルを示す図である。
【図９】プロセスステップ120の一部としての品質管理の第2の例:変量レベルを示す図である。
【図１０】プロセスステップ122の一部としての多変量解析の第1の例、変量(スライス)の分散分析予備選択に基づく主成分分析(PCA)の結果の3次元可視化を示す図である。この分析は、異なる投薬を受けたラット:非処理対照ラット(四面体)、処理-1(球体)、処理-2(立方体)の血漿に基づき、軸は、第1の3つのスコア/主成分(t-l、t-2およびt-3)を表す。
【図１１】プロセスステップ122の一部としての多変量解析の第2の例、図10に示された分析に対応するローディングの3次元可視化を示す図である。軸は、第1の3つのローディング(p-1、p-2およびp-3)を表す。
【符号の説明】
【００８４】
110  第1の3次元データセットの生成
112  抽出信号の選択
114  時間変量区間の分割および特性値の選択
116  追加のパラメータの生成
118  統計的評価
120  ボックスプロット
122  ヒット選択
210  試料を特徴づけるシステム
212  試料調製
214  液体クロマトグラフィーシステム
216  質量分析システム
218  制御
220  コンピュータシステム
222  読出し
410  ピーク
412  軸セット
414  保持時間軸
416  質量/電荷軸
418  信号軸
420  第1の測定範囲
422  第2の測定範囲
424  質量変量区間
426  時間変量区間
510  抽出信号XIC(rt)
512  最も高いピーク
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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