(57)【要約】【課題】【解決手段】  本発明は配列ＩＤ番号１または２のペプチドを有する心筋および／または免疫学的疾患疾患に対する感受性を診断する方法、キットおよび治療薬とその使用に関連する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋及び／または免疫学的疾患に対する感受性を診断する方法であって、
ａ）少なくとも１つの細胞を含むテストサンプルを提供する工程と、
ｂ）配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドと前記細胞とを接触させる工程と、
ｃ）前記配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドと細胞カルシニューリンとの間の相互作用を決定する工程と
を有するものであり、
カルシニューリン及び前記配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドを含む複合体の主な核内局在が心筋及び／または免疫学的疾患の感受性を示すものである、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドは、化学的、生物学的、及び／または物理的に標識化されているものである。
【請求項３】
請求項１または２記載の方法において、前記心筋疾患は、肥大性心筋症、特に肥大性閉塞性心筋症、高血圧性心筋症、虚血性心筋症、拡張型心筋症、動脈狭窄、心臓発作からなるグループから選択されるものであり、更に、前記免疫学的疾患は移植拒絶反応及び免疫抑制からなるグループから選択されるものである。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法において、前記疾患は、Ｔ細胞に関連した疾患である。
【請求項５】
心筋及び／または免疫学的疾患の感受性を診断する配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドを含むキット。
【請求項６】
配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドを含む治療薬。
【請求項７】
配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドをコードした核酸を含む治療薬。
【請求項８】
少なくとも９０％、望ましくは少なくとも９５％、より望ましくは少なくとも９８％、更により望ましくは１００％同一性のある配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドを含む治療薬であって、前記ペプチドは実質的にカルシニューリンの細胞質から細胞核への転移を抑制するものである、治療薬。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載の治療薬であって、この治療薬は、更に、
薬理学的に許容される担体を含むものである。
【請求項１０】
配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドに対する抗体。
【請求項１１】
心筋及び／または免疫学的疾患の予防及び／または治療に対する薬剤の製造するのための配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドの使用。
【請求項１２】
請求項１１記載の使用において、前記心筋疾患は、肥大性心筋症、特に肥大性閉塞性心筋症、高血圧性心筋症、虚血性心筋症、拡張型心筋症、動脈狭窄、心臓発作からなるグループから選択されるものであり、更に、前記免疫学的疾患は移植拒絶反応及び免疫抑制からなるグループから選択されるものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋および／または免疫学的疾患に対する感受性を診断する方法、配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドを含むキットおよび治療薬とその使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
およそ４０ｋＤａ以上のタンパク質の核内外への動きは、核膜孔複合体（ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｒｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＮＰＣ）、核膜に埋め込まれている複数のサブユニット構造によって支配されている（Ｊａｎｓら、２０００年）。これらのタンパク質の活性を制御する転写因子及び酵素は、核局在シグナル／配列（ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｓ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ＮＬＳ）及び核外輸送シグナル（ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｏｒｔ  ｓｉｇｎａｌｓ：ＮＥＳ)を認識するタンパク質によって、核膜を横断して往復している。陽性に荷電したＮＬＳｓは、カリオフェリンとしても知られているインポーチンαおよび／またはβによって結合している。インポーチンは核膜孔複合体の細胞質側にカーゴを繋ぎ止め、核内にタンパク質が転移するのを促進している。エクスポーチンとも呼ばれるＣＲＭ１タンパク質は、核外輸送のためのＣＲＭ１非依存性メカニズムが存在する（Ｋｕｔａｙら、１９９７年）が、核外へのタンパク質の移行を仲介する（Ｆｏｒｎｅｒｏｄら、１９９７年）。核内及び核外輸送機構のＮＬＳまたはＮＥＳへの接近能力は、これらの制御配列への暴露または遮蔽をもたらすシグナル伝達現象によってしばしば指示される（Ｃｙｅｒｔら、２００１年）。これは標的タンパク質を直接修飾することによって、或いは関連因子の修飾を介して起こりうる。
【０００３】
カルシニューリン（ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ：ＣｎＡ）のシグナル伝達カスケードと活性化したＴ細胞の核因子（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：ＮＦ−ＡＴｃ）は細胞機能の重要なトランスデューサーである。ＮＦ−ＡＴｃは広範囲に存在する転写因子であるが、サイトカイン発現と病理的心筋肥大の発達に特に関連がある。転写因子とＤＮＡとの複合体の形成は転写過程において重要である。従って、転写因子が核内にとどまる時間は転写活性の主な決定因子である。ＮＦ−ＡＴｃの転写因子に加えて、ホスファターゼ  カルシニューリンも核に移行する（Ｂｕｒｋｈａｒｄら、２００５年；Ｆｒｅｙら、２０００年；Ｚｏｕら、２００１年；Ｓｈｉｂａｓａｋｉら、１９９６年）。従って、カルシニューリンはＮＦ−ＡＴｃを脱リン酸化するだけでなく、それを核内輸送させることに関与しており、更に脱リン酸化ＮＦ−ＡＴｃが核内に存在することは、ＮＦ−ＡＴｃの十分な転写活性を確保するのに重要である。持続的に高いＣａ２＋レベルを介してカルシニューリンが活性化されるという従来の理解は（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら、１９９６年；Ｄｏｌｍｅｔｓｃｈら、１９９７年）、カルシニューリンがＣ末端の自動抑制ドメインのタンパク質分解によって活性化され、これによりカルシニューリンの恒常的核転移がもたらされる（Ｂｕｒｋｈａｒｄら、２００５年）という発明者らの発見によって前進した。
【０００４】
カルシニューリンは免疫系を抑制することが知られており、いろいろな薬理学的組成物が商業的供給源から利用可能である。カルシニューリン抑制剤はシクロスポリン、タクロリムス（Ｐｒｏｔｏｐｉｃ（登録商標）、Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標））及びピメクロリムスのグループに属している。適応症は、２〜３例を挙げると、乾癬、アトピー性皮膚炎、リューマチ、アレルギーである。
【０００５】
Ｃｒａｗｆｏｒｄによる米国特許出願第２００３／００４５６７９号には、細胞内のカルシニューリン活性の抑制及び増強に有用な組成物について説明されている。そのような組成物にはペプチド、ペプチド類似体、及び総タンパクが含まれる。それらは心臓、脳、免疫系、及び発達異常などのカルシニューリン関連病態の治療に使用可能である。
【０００６】
全ての周知のカルシニューリン抑制剤は、高血圧、腎障害、及びウィルス感染と細菌感染のような強い副作用を示す。前記最後の二つの副作用は、抑制剤の一般的な免疫抑制の特性によるものである。このように、例えば、心筋疾患、乾癬、リューマチ、移植片対宿主反応及び移植拒絶反応のような免疫反応と免疫抑制、アレルギー、喘息、特に心臓喘息、気管支喘息、並びにアレルギー性喘息などのカルシニューリン関連の疾患を治療するための薬理学的組成物に対する需要が依然として存在している。
【０００７】
このような問題に対する解決方法は、本請求項によって特徴付けられる実施形態によって達成されており、更に以下に説明されている。  
【非特許文献１】Ｂｕｒｋａｒｄ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ.Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｓｕｓｔａｉｎｓ  ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ.Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１１,１０４５−５３（２００５）.
【非特許文献２】Ｃｙｅｒｔ，Ｍ．Ｓ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６，２０８０５−８（２００１）．
【非特許文献３】Ｄｏｌｍｅｔｓｃｈ，Ｒ．Ｅ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．Ｓ．，Ｇｏｏｄｎｏｗ，Ｃ．Ｃ．&  Ｈｅａｌｙ，Ｊ．Ｉ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｃａ２＋  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｍｐｌｉｔｕｄｅ  ａｎｄ  ｄｕｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８６，８５５−８（１９９７）．
【非特許文献４】Ｆｏｒｎｅｒｏｄ，Ｍ．，Ｏｈｎｏ，Ｍ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｍ．&  Ｍａｔｔａｊ，Ｉ．Ｗ．ＣＲＭ１  ｉｓ  ａｎ  ｅｘｐｏｒｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｏｒｔ  ｓｉｇｎａｌｓ．Ｃｅｌｌ  ９０，１０５１−６０（１９９７）．
【非特許文献５】Ｆｒｅｙ，Ｎ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｊ．Ａ．&Ｏｌｓｏｎ，Ｅ．Ｎ．Ｃａｌｓａｒｃｉｎｓ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ  ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７，１４６３２−７（２０００）．
【非特許文献６】Ｈａｌｌｈｕｂｅｒ  Ｍ，Ｂｕｒｋａｒｄ  Ｎ，Ｗｕ  Ｒ，Ｂｕｃｈ  ＭＨ，Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ  Ｓ，Ｈｅｉｎ  Ｌ，Ｎｅｙｓｅｓ  Ｌ，Ｓｃｈｕｈ  Ｋ，Ｒｉｔｔｅｒ  Ｏ．  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｉｍｐｏｒｔ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００６；９９：６２６−３５
【非特許文献７】Ｈｏｇａｎ，Ｐ．Ｇ．&Ｒａｏ，Ａ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｏｒｔ？  Ｎａｔｕｒｅ  ３９８，２００−１．（１９９９）．
【非特許文献８】Ｊａｎｓ，Ｄ．Ａ．，Ｘｉａｏ，Ｃ．Ｙ．&Ｌａｍ，Ｍ．Ｈ．Ｎｕｃｌｅａｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：  ａ  ｋｅｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐｏｉｎｔ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ？  Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２２，５３２−４４（２０００）．
【非特許文献９】Ｋｕｔａｙ，Ｕ．，Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｆ．Ｒ．，Ｋｏｓｔｋａ，Ｓ．，Ｋｒａｆｔ，Ｒ．&  Ｇｏｒｌｉｃｈ，Ｄ．Ｅｘｐｏｒｔ  ｏｆ  ｉｍｐｏｒｔｉｎ  ａｌｐｈａ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｆａｃｔｏｒ．Ｃｅｌｌ  ９０，１０６１−７１（１９９７）．
【非特許文献１０】ＭｃＫｉｎｓｅｙ，Ｔ．Ａ．，Ｚｈａｎｇ，Ｃ．Ｌ．，Ｌｕ，Ｊ．&Ｏｌｓｏｎ，Ｅ．Ｎ．Ｓｉｇｎａｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｍｕｓｃｌｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０８，１０６−１１（２０００）．
【非特許文献１１】Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎ，Ｌ．Ｆ．&Ｐａｓｃｈａｌ，Ｂ．Ｍ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｉｍｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｏｒｔ．Ｔｒａｆｆｉｃ  ６，１８７−９８（２００５）．
【非特許文献１２】Ｒｉｔｔｅｒ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｒｔ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０５，２２６５−９．（２００２）．
【非特許文献１３】Ｒｉｔｔｅｒ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．ＡＴ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｅＮＯＳ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ−ＮＦ−ＡＴ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｆａｓｅｂ  Ｊ  １７，２８３−５．（２００３）．
【非特許文献１４】Ｓｈｉｂａｓａｋｉ，Ｆ．，Ｐｒｉｃｅ，Ｅ．Ｒ．，Ｍｉｌａｎ，Ｄ．&ＭｃＫｅｏｎ，Ｆ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｋｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＮＦ−ＡＴ４．Ｎａｔｕｒｅ  ３８２，３７０−３．（１９９６）．
【非特許文献１５】Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｌ．Ａ．，Ｃｌｉｐｓｔｏｎｅ，Ｎ．Ａ．，Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．，Ｎｏｒｔｈｒｏｐ，Ｊ．Ｐ．&Ｃｒａｂｔｒｅｅ，Ｇ．Ｒ．Ｒａｐｉｄ  ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ  ｏｆ  ＮＦ−ＡＴ  ｉｎ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａ２＋  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８３，８３７−４０．（１９９６）．
【非特許文献１６】Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＢＪ，Ｄａｉ  ＹＳ，Ｂｕｅｎｏ  ＯＦ，Ｐａｒｓｏｎｓ  ＳＡ，Ｘｕ  Ｊ，Ｐｌａｎｋ  ＤＭ，Ｊｏｎｅｓ  Ｆ，Ｋｉｍｂａｌｌ  ＴＲ，Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎ  ＪＤ．Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ／ＮＦＡＴ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００４；９４：１１０−８．
【非特許文献１７】Ｗｕ，Ｈ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃａｌｐａｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ  ｉｎ  ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９，４９２９−４０（２００４）．
【非特許文献１８】Ｚｈｕ，Ｊ．&ＭｃＫｅｏｎ，Ｆ．ＮＦ−ＡＴ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｒｍ１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｘｐｏｒｔ  ｂｙ  ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９８，２５６−６０．（１９９９）．
【非特許文献１９】Ｚｏｕ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４，１０２−８（２００１）．
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は心筋および／または免疫学的疾患に対する感受性を診断する方法を対象としており、（ａ）少なくとも１つの細胞を含むテストサンプルを提供する工程と、（ｂ）配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドと細胞とを接触させる工程と、（ｃ）配列ＩＤ番号１または２と細胞内のカルシニューリンとの間の相互作用を決定する工程とを有しており、カルシニューリン及び配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドを含む複合体が主に核内に局在化することにより、心筋および／または免疫学的疾患の感受性が示される。
【０００９】
さらに本発明は心筋および／または免疫学的疾患を診断するための配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドを有するキットを対象としている。
【００１０】
本発明はまた、配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドと、配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドまたはこの配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドと少なくとも９０％の同一性をもつペプチドをコードしている核酸とを含む治療薬に関する。前記ペプチドは、カルシニューリン及びその誘導体が細胞の細胞質から核へ転移、輸送、または組み換えられるのを実質的に抑制する。
【００１１】
さらに本発明は、配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドに対する抗体を対象としている。
【００１２】
さらに本発明はまた、心筋および／または免疫学的疾患の予防および／または治療するための治療薬を製造するための、配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドの使用も対象としている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明者は驚いたことにカルシニューリン（配列ＩＤ番号２）の核局在シグナルに似たペプチドが細胞質から核へのカルシニューリンの移行をうまく防ぐのを発見した。いかなる理論にもとらわれることなく、ＮＬＳペプチド（配列ＩＤ番号２）がインポーチンに結合し、それによってカルシニューリンとインポーチンとの複合体形成が防がれると信じられている。しかしながら、カルシニューリンとインポーチンとの複合体形成はカルシニューリンを核に輸送するのに必要であり、核では、カルシニューリンが持続的に存在するために、カルシニューリンがＮＦ−ＡＴｃと共に活性化された転写因子として作用する。ＮＬＳペプチド（配列ＩＤ番号２）は効果的に複合体形成を抑制し、そのためカルシニューリンが核へ入るのを阻害する。自動抑制ドメイン（ａｕｔｏ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｄｏｍａｉｎ：ＡＩＤ）はカルシニューリンの触媒活性を阻害するのみでなく、核局在シグナルも遮蔽する。カルシニューリンの立体構造変化に続いてＣａ２＋による活性化を介したＡＩＤの除去、或いは自動抑制ドメインのタンパク質分解によりＡＩＤが除去されると、核局在シグナルの暴露及び結果としてカルシニューリンの核転移がもたらされる。
【００１４】
配列ＩＤ番号５〜１０の配列（実施例のセクションを参照）はまた配列ＩＤ番号１に似た挙動をすることが証明されており、本発明において同様に使用可能である。
【００１５】
心筋疾患及び免疫学的疾患はＮＦ−ＡＴｃ下流の標的の転写パターンの変化を伴っている。従って、ＮＬＳペプチドは心筋及び／または免疫学的疾患の感受性を評価する診断手段として使われる可能性がある。
【００１６】
第１の態様によると、本発明は心筋及び／または免疫学的疾患の感受性を診断する方法を対象としており、
ａ）少なくとも一つの細胞を含むテストサンプルを提供する工程と、
ｂ）前記細胞と配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドとを接触させる工程と、
ｃ）配列ＩＤ番号１、２、５〜１０と細胞内のカルシニューリンの間の相互作用を決定する工程とを含み、カルシニューリン及び配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドを含む複合体の主な核の局在は心筋及び／または免疫学的疾患の感受性を示すものである。
【００１７】
本願明細書において使用される感受性という用語は、心筋及び／または免疫学的疾患の発達の素因及び可能性を意味する。疾患という用語は機能障害、機能不全、病気、病状を意味する。ペプチドという用語は関連する直鎖ペプチド、環状ペプチド、ペプチド類似体、誘導体、及びその塩を含む。環状ペプチドが特に望ましい。環状ペプチドを形成するペプチドは頭尾結合（ｈｅａｄ  ｔｏ  ｔａｉｌ）によって、頭部が側鎖の一つに結合することによって、または尾部が側鎖の一つに結合することによって、閉環していてもよい。前記ペプチドは、カルシニューリンが細胞の核に入るのを防ぐ能力を有するものである限り、あらゆる修飾が使用可能である。本発明のペプチドは、より多くのアミノ酸を含む構造に組み入れられることも可能であり、好ましくは当該ペプチドは約６０個のアミノ酸を含み、より好ましくは３０〜４０個のアミノ酸、最も好ましくは２０〜３０個のアミノ酸を含む。
【００１８】
当該テストサンプルは動物、特に哺乳動物、好ましくはヒトから、より好ましくは心筋及び／または免疫学的疾患の感受性があると疑われる患者から得られるものである。
【００１９】
同様に、配列ＩＤ番号１、２、５〜１０は、さらに、心筋疾患、免疫学的疾患、乾癬、リウマチ、移植片対宿主反応及び移植拒絶反応のような免疫反応と免疫抑制、アレルギー、喘息、特に心臓喘息、気管支喘息、並びにアレルギー性喘息など、カルシニューリン関連疾患を診断する方法に使われる。
【００２０】
好ましい実施形態では、前記配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドは化学的、生物学的、及び／または物理学的に標識されている。ペプチドを標識する例はストレプトアビジン−ビオチン標識、蛍光標識、抗体による標識及び放射性標識のような色素である。
【００２１】
さらなる好ましい実施形態によると、心筋疾患は、肥大性心筋症、特に肥大性閉塞性心筋症、高血圧性心筋症、虚血性心筋症、拡張型心筋症、動脈狭窄、心臓発作からなるグループから選択される。前記免疫学的疾患は、移植拒絶反応及び免疫抑制からなるグループから選択される。本発明のＮＬＳペプチドの方法を用いることにより、ステント移植後の再狭窄を防ぐことも可能である。
【００２２】
特に好ましい実施形態において、前記疾患はＴ細胞関連疾患である。Ｔ細胞関連疾患の具体的な例はリューマチ性関節炎及びその形態、乾癬、乾癬性関節炎、全身性ループスエリテマトーデス、血管炎、他の混合性結合組織疾患、シェーグレン症候群、ブドウ膜炎、潰瘍性大腸炎及びクローン病のような炎症性腸疾患、内因性／外因性喘息、移植片対宿主反応及び移植拒絶反応（臓器拒絶の予防及び慢性的拒絶の治療）である。
【００２３】
Ｔ細胞に関する診断目的もまた含まれる。前記ペプチドは患者からのＴ細胞の活性状態をテストする診断キットに使われる可能性がある。これは、例えば移植された臓器を有する免疫抑制状態の患者の病態進行または治療の成功をモニターするのに使用されても良い。
【００２４】
第２の態様において、本発明は心筋及び／または免疫学的疾患の感受性を診断するために、配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドを含むキットを提供する。同様に配列ＩＤ番号１、２、５〜１０は、心筋疾患、免疫学的疾患、乾癬、リューマチ、移植片対宿主反応及び移植拒絶反応のような免疫反応と免疫抑制、アレルギー、喘息、特に心臓喘息、気管支喘息、並びにアレルギー性喘息のような、さらなるカルシニューリン関連疾患を診断するキットに使われる。
【００２５】
別の態様において、本発明は配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドを含む治療薬及び配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドをコードしている核酸を含む治療薬に関連する。
【００２６】
核酸という用語は、本願明細書において用いられる場合、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ分子、ｍＲＮＡのようなＲＮＡ分子、ヌクレオチド類似体及び誘導体、そのフラグメント及相同体によって生成されたＤＮＡ及びＲＮＡの類似体を含む。核酸は一本鎖または二本鎖であってもよいが、二本鎖ＤＮＡ分子がより好ましい。
【００２７】
もう一つの態様において、本発明は配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドの少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは少なくとも９８％、更に好ましくは１００％同一性のペプチドを含む治療薬を、前記ペプチドは、カルシニューリンが細胞の細胞質から核に転移するのを実質的に抑制する。保存されたアミノ酸置換基は本開示の範囲に及ぶ。配列ＩＤ番号２のペプチドは１、５、及び７の位置で３つのリシンアミノ酸（Ｋ）を含む。全てのリシン残基（Ｋ）がアラニン（Ａ）によって置換されている場合、前記ペプチドはカルシニューリンが核に入るのをもはや抑制しない。しかしながら、前記ペプチドは、カルシニューリンが細胞質から細胞の核に転移するのを阻害する能力を妨げる限り、個々のリシン残基は置換されていても良い。
【００２８】
好ましい実施形態において、当該治療薬はさらに、充填剤や賦形剤のような薬理学的に許容できる担体を含む。前記ペプチドの様々な用途形態が可能である。クリーム及び軟膏は局所投与することができる。ステント技術では、前記ペプチドはステントを被覆するのに使用可能であり、その後、それを必要とする患者に挿入される。冠動脈ステントが特に好ましい。また血管内ポンプ、特にミニポンプは患者にペプチドを送達させるのに使用可能である。
【００２９】
さらなる態様において、本発明は配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドに対する抗体を対象としている。
【００３０】
別の態様において、本発明は、心筋及び／または免疫学的疾患の予防及び／または治療するための治療薬の製造のための配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドの使用の範囲に及ぶ。
【００３１】
好ましい実施形態において、前記心筋疾患は、肥大性心筋症、特に肥大性閉塞性心筋症、高血圧性心筋症、虚血性心筋症、拡張型心筋症、動脈狭窄、心臓発作からなるグループから選択される。免疫学的疾患は移植拒絶反応及び免疫抑制からなるグループから選択される。
【００３２】
更に別の態様において、本発明は、心筋疾患、免疫学的疾患、乾癬、リューマチ、移植片対宿主反応及び移植拒絶反応のような免疫反応と免疫抑制、アレルギー、喘息、特に心臓喘息、気管支喘息、並びにアレルギー性喘息のようなカルシニューリン関連疾患の予防及び／または治療するための治療薬の製造のための配列ＩＤ番号１、２、５〜１０のペプチドの使用を目的としている。
【００３３】
本発明をより完全に理解することは、以下の実施例を参照にすることによって得られる。以下の実施例は説明する目的のみで提供されるものであり、当該発明の範囲を限定する意図を有するものではない。
【００３４】
実施例
Ａ）材料と方法
以下の材料と方法を使用した。
【００３５】
細胞培養
ウィスター系ラットの新生児ラット心筋細胞を以前に説明したように分離した（Ｒｉｔｔｅｒら、２００３年）。細胞は最小必須培地／１％ＦＣＳに再懸濁した。培養前播種後、上清を含んだ心筋細胞を回収し、細胞は最小必須培地中、一穴当たり１Ｘ１０６細胞密度で６穴プレートに播種した。心筋細胞のための前記培地は５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）を含有させて、線維芽細胞の成長を抑制させた。トロポニンＴの免疫組織学的染色によって定期的に測定した場合、心筋細胞培養物における線維芽細胞の混入は４％から７％であった。ＨｅＬａ細胞はＤＭＥＭ／５％ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ）で培養した。調製後４８時間後、細胞は１０ｎｍｏｌ／ＬアンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）で刺激した。細胞は刺激後２４時間で回収した。各々の濃度は以下の通りであった。ＡｎｇＩＩ：１０μＭ、カルペプチン：１０μＭ、ＮＬＳペプチドとコントロールペプチド：１μＭ。
【００３６】
カルシニューリン（ＣｎＡ）活性
ＮＦ−ＡＴｃレポータープラスミドにＩＩ−２プロモーターを含ませて、続いてルシフェラーゼを含ませた。ルシフェラーゼ活性は製造者のプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ）にに従って測定した。ＣｎＡホスファターゼ活性は特定のＣｎＡリン基質に対する効果を測定する市販のキット（ＣｎＡキットアッセイ、Ｂｉｏｍｏｌ）を使って測定した。遊離型ＰＯ４はマラカイトグリーン色素によって示した。このキットの使用は以前に説明されている（Ｒｉｔｔｅｒら、２００２年）。
【００３７】
プラスミド
アミノ末端のＥＧＦＰを含んでいるカルシニューリンＡβのエピトープタグをもつ誘導体は哺乳類発現ベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて作った。カルシニューリン変異体のクローニングにはヒトカルシニューリンＡβの一方向性をもってクローン化したｃＤＮＡを含む哺乳類発現ベクターｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６を使した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。続いて、変異体をＰＣＲによって増幅し、ＸｂａＩ及びＸｈｏＩで消化させ、記載したプラスミドＣｎＡβ１〜４１５、ＣｎＡβ１〜４２５、ＣｎＡβ１〜４４５、ＣｎＡβ１〜４６５、ＣｎＡβ１〜４８５、及びＣｎＡβ１７１〜１９０のＸｂａＩ及びＸｈｏＩ部位にクローン化した。これらの切断された変異体のために、異なる逆向きのオリゴヌクレオチドをその後に続くＮ末端結合部位を考慮して設計した。カルシニューリンの前記Ｎ末端に結合したフォワードプライマーは、ＣｎＡ（１７１〜１９０）変異体とは別に、各プラスミドと同一であった。この誘導体に対して、プライマーは各々アミノ酸１７１の上流及びアミノ酸１９０の下流に結合する。二つの内部変異体ＣｎＡβ（Δ４２０〜４３４）及びＣｎＡβ（Δ４２０〜４４５）は２段階戦略を使ってｐＥＧＦＰ−Ｃ３のＸｂａＩ及びＸｈｏＩ部位でクローン化した。アミノ酸４２０〜４３４及びアミノ酸４２０〜４４５の短い部分を欠失させるために、２つのフラグメントを増幅した。これらの２つのフラグメントのライゲーション後、結果として得られた全フラグメントはｐＥＧＦＰ−Ｃ３のＸｂａＩ及びＸｈｏＩ部位でクローン化した。ＦＬＡＧタグのついたカルシニューリン誘導体はＬｕｄｗｉｇ  Ｎｅｙｓｅｓ（マンチェスター大学、心臓学部門：Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ）のグループによって快く提供いただいた。
【００３８】
免疫蛍光及び免疫沈降法
カルシニューリンの細胞内分布は免疫蛍光染色によって測定した。蛍光染色で用いた一次抗体は他で説明されている（Ｂｕｒｋｈａｒｄら、２００５年）。２次抗体はＣｙ３標識ヒツジ抗ウサギＩｇＧまたはＣｙ２結合マウス抗ヤギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）であった。
【００３９】
結果
本発明者のグループは、カルシニューリンの翻訳後修飾、自動抑制ドメイン（ＡＩＤ）の特異的なタンパク質分解がその活性と強い核転移を導くということを証明した（Ｂｕｒｋｈａｒｄら、２００５年）。カルパインを介したＣ末端ＡＩＤの切断及び心筋肥大に関連する原因がヒト心筋組織で証明された。
【００４０】
当該発明では本発明者が罹患心筋の異なる動物モデルでＣｎＡの顕著な核転移を証明している。野生型マウスでＣｎＡの顕著な細胞質内分布が観察され、一方大動脈結紮又は心筋梗塞を受けたマウスでは肥大した心筋での強いＣｎＡの核内局在が観察された。
【００４１】
これは細胞培養モデルのカルシニューリンの核内輸送の観察と一致している（Ｂｕｒｋｈａｒｄら、２００５年；Ｆｒｅｙら、２０００年；Ｚｏｕら、２００１年；Ｚｈｕら、１９９９年）。しかしながら、核内のカルシニューリンの役割は以前に研究されておらず、核内輸送及び核外輸送に至る正確なメカニズムは分かっていない。
【００４２】
アンギオテンシン刺激後の可逆的なカルシニューリン核内局在化
核内へのＣｎＡ輸送が慢性的な現象なのか或いは急性反応なのかを調べるために、本発明者はＣｎＡ往復の経時変化を調べた。全長ＣｎＡβをコードしたＧＦＰでタグをしたカルシニューリンプラスミドを新生児ラット心筋細胞にトランスフェクトした。細胞は１０μＭのＡｎｇＩＩで刺激した。共焦点顕微鏡により２時間後のカルシニューリンの核内輸送の開始が明らかにされた。ＡｎｇＩＩ刺激４時間後のＣｎＡは顕著に核内にあった。６時間後ＧＦＰ−カルシニューリンシグナルの強度は核内で最高であった。同様に培養液からＡｎｇＩＩを除去してから２時間後、細胞質及び核においてＣｎＡは一様に分布し、４時間後ＣｎＡは核周囲に局在していた。刺激除去後６時間ではカルシニューリンは再び完全に細胞質に局在した。ＣｎＡの恒常的活性化及びそれによりＣｎＡが持続的核内輸送を引き起こすカルパインを介したタンパク質分解されないように、全ての実験は膜透過性のカルパイン抑制剤の存在下で行われた（Ｂｕｒｋｈａｒｄら、２００５年）。カルシニューリンは心筋細胞で病理的な刺激に対して非常に感受性が高く、初期刺激後、２、３時間以内に反応を誘発され得る。
【００４３】
ＮＬＳペプチド変異体構築
タンパク質の核への輸送はインポーチンによって結合した核局在シグナル／配列（ＮＬＳ）に依存しており、カーゴタンパク質とインポーチンとの複合体はその後核に輸送される。核内輸送に必要とされるカルシニューリンの領域を決定するために、異なるＧＦＰまたはＦＬＡＧのタグをつけたカルシニューリン欠失変異体（図１）について、核に入ったもの及び細胞質に残ったものを調べて選別した。一般的に自動抑制ドメインの欠失により核転移が引き起こされ、更に（推定上のＮＬＳ内の）開始アミノ酸１７３領域の欠失によりカルシニューリンが核に入るのが妨げられた。ＣｎＡの触媒サブユニットがアミノ酸３３３まで伸びている場合には、変異体２〜１７３及び３〜１４３は触媒ホスファターゼ活性を減少させたかもしれない。従って、理論的には、転移しなかったのは減少したホスファターゼ活性の結果である可能性はある。しかしながら、以前の研究では、触媒的に不活性なＣｎＡ変異体もまた核に転移することが証明されている（Ｓｈｉｂａｓａｋｉら、１９９６年）。他のタンパク質の既知のＮＬＳと配列を比較することにより、配列１７１〜１９０に対する推定上のＮＬＳ領域をさらに明らかにすることが可能であった。この１７１〜１９０フラグメントをＧＦＰ骨格に融合させると、結果としてＧＦＰ／ＮＬＳ融合タンパク質の核への転移がおこり、一方純粋なＧＦＰ骨格は細胞質内に残存した。全長ＣｎＡは細胞質に存在しているが、ＡｎｇＩＩ刺激後、触媒サブユニットから、及びおそらく推定ＮＬＳから自動抑制ドメインを除去することにより、ＣｎＡは核に転移する。対照的に欠失変異体２〜１７３及び３〜１４３はいずれも推定ＮＬＳが欠けており、ＡｎｇＩＩ刺激に関わらずもっぱら細胞質に残ったままであった。
【００４４】
カルシニューリン変異体とインポーチンとの相互作用
インポーチンβ１は異なるカーゴタンパク質のＮＬＳに結合することが示されている（Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎら、２００５年）。機能的に定義されたＮＬＳが物理的にインポーチンβ１と相互作用するかどうかを決定するために、ＣｎＡ変異体とインポーチンβ１との相互作用を評価した。免疫共沈降実験によって証明されたように、インポーチンβ１は全長カルシニューリン、並びに欠失変異体１−４１５に対しても優れた親和性を示した。具体的には、ＧＦＰとインポーチンβ１とから成る融合タンパク質の１７１〜１９０フラグメントと免疫沈降する能力を根拠として、前記相互作用ドメインが領域１７１〜１９０に位置づけされている。しかしながら、欠失変異体１−１７３及び１−１４３はいずれも完全にインポーチンβ１とＣｎＡとの間の相互作用を消失させた。これらのデータは機能解析によって同定されたＮＬＳはまたインポーチンβ１とカルシニューリンとの間の相互作用を仲介していることを示している（図２）。
【００４５】
ペプチド競合アッセイ
ＣｎＡにおいて同定したＮＬＳがカルシニューリンの核内輸送に重要であることをさらに証明するために、インポーチンβ１／ＣｎＡ結合を妨げるペプチド競合アッセイを使用した。カルシニューリンの推定上のＮＬＳ配列を有するペプチド（ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＫＱＥＣＫＩＫＹＳＥＲＶ−配列ＩＤ番号１）を合成し、培養液に加えた（最初の１５文字は膜透過性を増加させるためのＮ末端の延長を示す。ＮＬＳ配列は下線が引かれている）。しかしながら、膜透過性を促進する前記ペプチドは重要でなく、１１及び１４の位置のロイシン残基の代わりに２つのアラニン残基を有する別の膜のアンカーもまた使用できる（ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＡＡＬＡＡ−配列ＩＤ番号４）。コントロール実験ではノンセンスペプチド（ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＡＱＥＣＡＩＡＹＳＥＹＶ−配列ＩＤ番号３）を使用した。合成ＮＬＳペプチドを追加するとＣｎＡに対するインポーチンβ１の結合ドメインが飽和され、インポーチンβ１に対するＣｎＡ結合が妨げられた。この相互作用の抑制はカルシニューリン核内輸送を抑制した。非抑制コントロールペプチドはカルシニューリン／インポーチン結合を妨げなかった。従って、ＣｎＡの核転移は抑制されなかった。また、免疫共沈降アッセイ（図３）で証明されたように、ＮＬＳペプチドはカルシニューリンとインポーチンβ１との相互作用を消失させた。
【００４６】
核外輸送コントロール配列
核外輸送をコントロールするＣｎＡの配列を同定するために、ＣｎＡのＮ末端ＧＦＰタグを持つ連続したカルボキシ末端切断変異体を作製し、共焦点蛍光顕微鏡で調べた。実験はカルパイン抑制剤の存在下で行い、カルパインによる自動抑制ドメイン（ＡＩＤ）の切断の誘発が阻止され、更にカルシニューリンの機能的完全性が確認された。細胞をＡｎｇＩＩで１２時間刺激することにより、ＣｎＡの核への侵入が得られ、その後前記刺激は除去され、核外輸送が促進された。前記刺激が除去された後、全長ＣｎＡ（アミノ酸１〜５２４）をトランスフェクト心筋細胞の細胞質に完全に再度局在化させた。延長した欠失変異体（１〜４１５）はこれ以上核を出ることはできなかった。
【００４７】
これらの結果はＣ末端からアミノ酸４１５の領域の配列が核外輸送を制御していることを証明していた。これらの発見と既知のＮＥＳ部位の配列比較とは一致しており、アミノ酸４２０〜４３４が欠けているＣｎＡ変異体は刺激除去後もっぱら核に残っていた。カルパイン切断部位（４２４）はこの変異体で欠失していたため、カルパイン抑制はこの結果に影響しなかった。
【００４８】
カルシニューリン配列（Ｗｕら、２００４年）の異なる切断部位はカルパインで説明されているように、本発明者はＮＥＳ配列（４２３〜４３４）が実際にカルパイン切断部位を含んでいるかどうかについて調べた。従って前記ＮＥＳドメインが欠けたＧＦＰタグのついたカルシニューリン変異体をさらなる実験に使用した。プラスミドをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、この欠失変異体を発現しているこれらの細胞の可溶化液をカルパインＩとインキュベートした。ウェスタンブロット分析を用いることにより、全長ＣｎＡはカルパインによりタンパク質が分解され、一方ＣｎＡΔ４２３〜４３４はカルパインを介したタンパク質分解に耐性があるということが証明された（図４）。
【００４９】
カルシニューリンの核外輸送のメカニズム
核膜を横切って往復する多くのタンパク質はＣＲＭ１を使って輸出シャトルとして同定された。それらの一部は肥大促進作用を与えるＮＦ−ＡＴｃのような転写因子である。その他のものは、転写抑制因子ＨＤＡＣ５のような心筋肥大成長を抑制する対抗制御経路の中で作用する（ＭｃＫｉｎｓｅｙら、２０００年）。ＣｎＡ核外輸送はＣＲＭ１によって介在されるかどうかについて対応するために、ＣＲＭ１特異的な抑制剤レプトマイシンＢ（ｌｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  Ｂ：ＬＭＢ）を使って実験を行った。全長ＣｎＡのアゴニスト依存性核内輸送がＡｎｇＩＩ刺激によってえられた。カルペプチンはＣｎＡのタンパク質分解を防ぐために加えられた。ＣＲＭ１を介した移行を妨げるためのＬＭＢの添加は実際にＣｎＡの核外輸送を抑制した。同時に、これらの発見はＬＭＢがＣｎＡの核外輸送を阻害することによってＣｎＡを心筋細胞の核に閉じ込めることを証明するものである。これはＣｎＡの核−細胞質往復がアミノ酸４２３〜４３４の間のＮＥＳにつながっていて、ＣＲＭ１によって介されているという仮説を支持するものである。
【００５０】
カルシニューリンの核内蓄積
病理的心筋肥大の生体内での研究は、アミノ酸４２４でのカルシニューリン自動抑制ドメインのタンパク質分解が、ＡＩＤ（アミノ酸４６８〜４９０）及びＮＥＳ（４２３〜４３４）の両方を欠いている、恒常的に活性のあるカルシニューリン変異体を結果としてもたらすということを示した。ＡＩＤの欠損及びＮＥＳの破壊がＣｎＡの強い核内蓄積に関与しているか否かを決定するため、ＮＥＳの欠失をもつＧＦＰタグのついたＣｎＡ変異体の核内外輸送の特性を調べた。細胞はＣｎＡΔ４２３〜４３４でトランスフェクトした。この場合にはカルシニューリンが細胞質に残った。ＡｎｇＩＩでトランスフェクトした細胞を刺激すると続いてＣｎＡ核への転移が結果としておこった。これらの結果をもとに、本発明者は、ＡＩＤはＣｎＡの触媒活性を阻害するだけでなく、ＮＬＳの遮蔽すると結論づけた。カルシニューリンの立体構造的変化とその後のＣａ２＋による活性化を介するＡＩＤの除去または自動抑制ドメインのタンパク質分解により、ＮＬＳの暴露及び結果的なＣｎＡの核内輸送が導かれる。
【００５１】
その後、培養液からＡｎｇＩＩ刺激剤を除去すると、結果としてＣｎＡΔ４２３〜４３４変異体は核に残ったが、ＮＥＳを欠失しているためＣＲＭ１がＣｎＡと相互作用し、ＣｎＡを細胞質に戻すことが不可能であった。ＣｎＡのＣ末端部分の欠損は、したがって、核内及び核外輸送の両方のレベルにおいて、ＣｎＡの核往復を制御するようである。ＡＩＤの消失はインポーチンβ１を介する輸入を促進し、ＮＥＳの欠損はＣＲＭ１を媒介したメカニズムを経由した核外輸送を妨げる。
【００５２】
カルシニューリンＮＬＳに相当するペプチドがＣｎＡ核内輸送を抑制し、更にＣｎＡの全体的な構造を維持した。核へのカルシニューリン輸送の抑制はＮＦ−ＡＴｃ転写活性状態に重要である。このペプチドはしたがって心筋肥大を抑制する手段として有用である。
【００５３】
心筋肥大のマーカー
ペプチドが関連したＣｎＡの核内輸送の抑制に対応して、ホスフォターゼ活性、転写活性、タンパク質合成、細胞サイズ、及びＣｎＡ心筋肥大のマーカーを調べた。ホスファターゼ活性はカルシニューリン（ｃａｎ）に特異的な基質（ＲＩＩ）を使って調べた（Ｒｉｔｔｅｒら、２００２年）。心筋細胞をＡｎｇＩＩ（１０μＭ）で刺激し、ＮＬＳペプチドまたはノンセンスコントロールペプチド存在下でＣｎＡホスファターゼ活性を測定した。全ＣｎＡホスファターゼ活性はインポーチンβ１のＣｎＡ  ＮＬＳへ接近するのを抑制することによって影響されなかった（２８９±１７％対２７３±１１％、ｎ＝８、ｐ＝有意差なし）。対照的に、ＣｎＡ／ＮＦ−ＡＴｃシグナル経路の転写活性はＮＬＳペプチドによって有意に減少した（４６３±１１％対１２３±８％、ｎ＝８、ｐ<０．０５）（図５Ａ上）。同様に、タンパク質合成（７０７±２１％対１３３±１２％、ｎ＝８、ｐ<０．０５）、細胞サイズ（１１９１±９１μｍ対７２８±６５％、ｎ＝８、ｐ<０．０５）（図５Ｂ）、及び脳ナトリウム利尿ペプチド発現（ｂｒａｉｎ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ：ＢＮＰ）（１６３±１１％対８８±８％、ｎ＝８、ｐ<０．０５）（図５Ｃ）によって証明されているように、心筋肥大はＮＬＳペプチドによって抑制された。ＣｎＡの核内輸送がＮＬＳペプチドによって用量依存的に阻害されていた場合、ＮＦ−ＡＴｃルシフェラーゼレポータープラスミドの転写活性は減少した（図５Ｄ）。
【００５４】
これらのデータは十分なＣｎＡホスファターゼ活性に関わらず、ＣｎＡは有効な転写複合体を形成することができないことを示した。活性化したカルシニューリン自身は肥大を誘発するのに十分ではないように思われる。ＣｎＡ／ＮＦ−ＡＴｃの十分な転写活性は核内のカルシニューリンの存在下においてのみ可能である。このようにカルシニューリンの核内輸送は有効なＮＦ−ＡＴｃ転写複合体形成の必要条件である。
【００５５】
Ｔ細胞実験
本発明者はホスファターゼカルシニューリンとインポーチン（インポーチンβ１）との相互作用の抑制はカルシニューリンの核転移を妨げるという証拠を上記に提示した。これはカルシニューリン／ＮＦ−ＡＴシグナルカスケードの活性化を抑制した（Ｈａｌｌｈｕｂｅｒら）。上記実験は単離した心筋細胞または不死化細胞株の細胞培養で行った。
【００５６】
本発明者は、ここから、Ｔ細胞及びマウスの生体内実験にまで拡大させた。図６において、本発明者は、カルシニューリン／インポーチン相互作用の競合的ペプチド抑制の具体的なアプローチを使ったＴ細胞機能抑制を示す。阻害ペプチドが有意にリンパ球の活性化を妨げた。
【００５７】
図７において、本発明者は、生体内のデータを示す。生体内使用のために、カルシニューリンの核局在シグナル（ＮＬＳ）を模倣した前記阻害ペプチドは膜透過性を増加させるためにペプチド延長して、Ｎ末端及びＣ末端のプロテアーゼのタンパク質分解に耐える環状ペプチドとして合成した。このペプチドはマウスに腹腔内注入によって２５ｍｇ／ｋｇ体重／日の濃度で１日２回投与した。前記マウスは浸透圧ミニポンプ移植処置し、アンギオテンシンＩＩまたはコントロールして生理用食塩水のいずれかを放出させた。心臓／体重比及び肥大の分子マーカーの発現で証明されているように、アンギオテンシンＩＩによって心筋肥大が引き起こされた。前記阻害ペプチドによって心筋肥大の成長を妨げることができた。本発明者は、生体内で阻害ペプチドがカルシニューリンの核への移行を抑制することを示したが、細胞レベルでも証明することができた。
【００５８】
同様な結果がＮＦＡＴルシフェラーゼレポータートランスジェニックマウスでもみられた（マウスは実験のためにＷｉｌｋｉｎｓらから受け取った）。アンギオテンシンＩＩ処置をしたマウスにおいてＮＬＳペプチドを投与すると、ルシフェラーゼ活性が抑制され、したがってこの動物モデルでＮＬＳペプチドの有効性が証明された。
【００５９】
前記に示されたデータから、カルシニューリン／インポーチン相互作用を抑制すること、並びにその結果カルシニューリン核移行が抑制されることは、カルシニューリン／ＮＦ−ＡＴシグナル経路が抑制されるという有望な概念であると結論付けられる。最初に生体内データ及びリンパ球での概念的証拠が提供されている。ＮＬＳペプチドは、カルシニューリンシグナリングが抑制されているさらなる病態における治療手段として使用され、心筋肥大、リウマチ疾患での免疫抑制、または臓器移植においてドナー臓器の拒絶反応の抑制などの治療に有望である。更なる治療分野は乾癬、腸炎、喘息などのアレルギー疾患又は経皮的な治療介入の後の冠状血管の再狭窄である。
【００６０】
さらなる代替的な核局在シグナル及び膜アンカー
上述した証拠はホスファターゼカルシニューリンとそのインポーチン（インポーチンβ１）との相互作用の抑制がカルシニューリンの核移行を妨げるということを示している。これはカルシニューリン／ＮＦ−ＡＴシグナリングカスケードの活性化を抑制した（Ｈａｌｌｈｕｂｅｒら、２００６年）。以前の実験は単離した心筋細胞または不死化細胞株の細胞培養において行った。
【００６１】
本発明者は、ここから、実験を生体内データに拡大させた。具体的には、本発明者は心エコー検査によって示されたように、阻害ペプチドがＡｎｇＩＩ処置マウスで心筋肥大を妨げることを示すことができた（図８）。
【００６２】
本発明者はまたペプチド（ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＡＡＬＡＡＫＱＥＣＫＩＫＹＳＥＲＶ  配列ＩＤ番号５）との特異性を分析した。理論的にカルシニューリンＮＬＳを模倣したこのペプチドはインポーチンの結合部位を飽和させて、したがって他の転写因子に対するインポーチン機能も完全に阻害する可能性がある。しかしながらこのペプチドはインポーチンβ１も使用する選択された転写因子（例えばｃＪｕｎ、ＧＡＴＡ４、ＮＦＡＴ２及びＥＲＨ１／２）の移入を阻害しなかった（図９）。
【００６３】
本発明者は理論的にカルシニューリン／インポーチン相互作用を抑制する能力に対するタンパク質分解により抵抗性のある異なるアミノ酸、すなわち以下のアミノ酸を試した。
−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＡＡＬＡＡＫＱＥＡＫＩＫＹＳＥＲＶ（配列ＩＤ番号６）
−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＡＡＬＡＡＫＱＥＣＫＩＫＹＡＥＲＶ（配列ＩＤ番号７）
−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＡＡＬＡＡＫＱＥＡＫＩＫＹＡＥＲＶ（配列ＩＤ番号８）
−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＡＡＬＡＡＫＡＥＣＫＩＫＹＳＥＲＶ（配列ＩＤ番号９）
−ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＡＡＬＡＡＫＡＥＡＫＩＫＹＳＥＲＶ（配列ＩＤ番号１０）
これらのペプチドは全て同じ影響をもち、それらは免疫共沈降実験で証明されたようにカルシニューリン／インポーチン相互作用を阻害する。
【００６４】
結論
本発明者のデータは、ＣＲＭ１はＮＦ−ＡＴｃだけでなく、核膜を横切ってカルシニューリンも輸出することを示している。前記カルシニューリン／ＮＦ−ＡＴｃシグナリングカスケード転写活性を中断するために、ＣＲＭ１がまずカルシニューリンを輸出することが必要とされており、それによって２番目にＣＲＭ１はＮＦ−ＡＴｃのＮＥＳに接近できるようになり、続いて核外輸送へと進む。アミノ酸４２４におけるカルパインによるカルシニューリンのタンパク質分解により心筋肥大においてこのメカニズムは妨げられており、ＮＥＳを含む自動抑制ドメインの欠失がもたらされる。このシナリオでは、輸出タンパク質ＣＲＭ１にアクセスすることはできないため、カルシニューリンは核に残る。
【００６５】
輸入は常に輸出に先立つように、核内輸送タンパク質インポーチンβ１のペプチド結合の競合によるＣｎＡ核内輸送の抑制は、過度のＮＦ−ＡＴｃ転写活性の有害な効果を消失させる、より洗練されたアプローチを提示する。したがって病理的心筋肥大に対する新しい治療薬としてＮＬＳペプチドは有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、カルシニューリン（ＣｎＡ）の核局在シグナル（ＮＬＳ）の同定を示した図である。緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）及びＦＬＡＧタグをつけたＣｎＡ欠失変異体の略図が与えられている。細胞内局在化が示されている（ｃ＝主として細胞質内；ｎ＝主として核内）。ＮＬＳは核局在シグナル、ＮＥＳは核外輸送配列、ＣｎＢはカルシニューリンＢ結合ドメイン、ＣａＭはカルモジュリン結合ドメイン、ＡＩＤは自動抑制ドメイン、数字はＣｎＡβアミノ酸配列に対応しており、ＥＧＦＰ及びＦＬＡＧはタグを示している。
【図２】図２は、カルシニューリン（ＣｎＡ）のインポーチンβ１との相互作用を示した図である。様々な欠失変異体をＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。ＧＦＰタグをつけた全長のＣｎＡ及びＧＦＰ−ＮＬＳ融合タンパク質の免疫沈降反応はＧＦＰ抗体を用いて行った。ＦＬＡＧタグをつけたＣｎＡ２−１７３及びＣｎ３−１４３変異体はＦＬＡＧ抗体とともに沈降した。免疫的検出はインポーチンβ１抗体を用いて行った。免疫共沈降によって示したように全長のカルシニューリンはインポーチンβ１と相互作用し、一方ＮＬＳが欠失した切断されたＣｎＡの変異体はインポーチンと免疫共沈降しなかった。
【図３】図３は、前述のＧＦＰタグをつけたＣｎＡ変異体をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞の結果を示した図である。ＣｎＡ／インポーチン複合体の免疫沈降はインポーチンβ１抗体を用いて行い、ＧＦＰ抗体で検出した。ＮＬＳペプチド（配列ＩＤ番号２）の追加はカルシニューリンのインポーチンβ１との相互作用を消失させた。
【図４】図４は、カルシニューリン（ＣｎＡ）の核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を示した図である。ＮＥＳが欠失したＣｎＡ（Δ４２０−４３４）はカルパインによるタンパク質分解に抵抗性であった。ＧＦＰタグをつけた全長のＣｎＡ及びＣｎＡ（Δ４２０−４３４）はＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。全細胞可溶化液はカルパインＩとともに３０分インキュベートし、その可溶化液は５％ゲルに流した。ＧＦＰによるウェスタンブロット解析によって全長ＣｎＡのタンパク質分解が明らかにされた。
【図５Ａ】図５は、カルシニューリン（ＣｎＡ）核内輸送抑制の機能的結果を示した図である。新生児ラット心筋細胞をＣｎＡのＮＬＳ配列を模倣したペプチド（配列ＩＤ番号２）とともにインキュベートし、ＡｎｇＩＩ（１００μＭ）で刺激した。前記ペプチドはＣｎＡ／インポーチンβ１結合能力を飽和させた。従って、ＣｎＡの核内輸送は妨げられた。対照実験はノンセンスペプチド（配列番号３）によって行った。図５Ａ上部は、ＣｎＡに特異的なリン基質を使って測定したＣｎＡのフォスファターゼ活性が、合成ＮＬＳペプチド（配列ＩＤ番号２）によって影響されないことを示した図である。図５Ａ下部は、カルシニューリン／ＮＦ−ＡＴｃ複合体の転写活性が抑制ＮＬＳペプチド（配列ＩＤ番号２）によって抑制されたことを示した図である。転写活性はＮＦ−ＡＴｃルシフェラーゼレポータープラスミドと共に調べた。
【図５Ｂ】図５は、カルシニューリン（ＣｎＡ）核内輸送抑制の機能的結果を示した図である。新生児ラット心筋細胞をＣｎＡのＮＬＳ配列を模倣したペプチド（配列ＩＤ番号２）とともにインキュベートし、ＡｎｇＩＩ（１００μＭ）で刺激した。前記ペプチドはＣｎＡ／インポーチンβ１結合能力を飽和させた。従って、ＣｎＡの核内輸送は妨げられた。対照実験はノンセンスペプチド（配列番号３）を用いて行った。図５Ｂはタンパク質合成（図５Ｂ上部）及び細胞の大きさ（６００倍拡大）（図５Ｂ下部）によって示したように、心筋肥大の発達は抑制ＮＬＳペプチド（配列ＩＤ番号２）によっても抑制されたことを示した図である。
【図５Ｃ】図５は、カルシニューリン（ＣｎＡ）核内輸送抑制の機能的結果を示した図である。新生児ラット心筋細胞をＣｎＡのＮＬＳ配列を模倣したペプチド（配列ＩＤ番号２）とともにインキュベートし、ＡｎｇＩＩ（１００μＭ）で刺激した。前記ペプチドはＣｎＡ／インポーチンβ１結合能力を飽和させた。従って、ＣｎＡの核内輸送は妨げられた。対照実験はノンセンスペプチド（配列番号３）を用いて行った。図５Ｃは、肥大の分子マーカーである、Ｂタイプナトリウム利尿ペプチド（Ｂ−ｔｙｐｅ  ｎａｕｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ：ＢＮＰ）が、抑制ＮＬＳペプチド（配列ＩＤ番号２）の使用によって抑制されることを示した図である。
【図５Ｄ】図５Ｄは、カルシニューリン（ＣｎＡ）核内輸送抑制の機能的結果を示した図である。新生児ラット心筋細胞をＣｎＡのＮＬＳ配列を模倣したペプチド（配列ＩＤ番号２）とともにインキュベートし、ＡｎｇＩＩ（１００μＭ）で刺激した。前記ペプチドはＣｎＡ／インポーチンβ１結合能力を飽和させた。従って、ＣｎＡの核内輸送は妨げられた。コントロール実験はノンセンスペプチド配列番号３）を用いて行った。図５Ｄは、配列ＩＤ番号２のＮＬＳペプチドで処置した場合、ＮＦ−ＡＴｃ転写活性が用量依存的に減少することを示した図である。より高い濃度（アスタリスクによって示されている、>１μＭ）では、その数値が処置していない心筋細胞のバックグラウンドレベルより低いため、毒性効果が生じる可能性がある（ｃｔｒ＝コントロール）。
【図６】図６は、抗原刺激として脾臓樹状細胞で刺激したＴ細胞を示した図である。棒グラフはタンパク質合成（Ｈ３−チミジン取り込み）を示した図である。Ｔ細胞を刺激し（脾臓ＤＣ）、同時に阻害ペプチド（ＮＬＳ）で処置した場合のタンパク質合成は有意に抑制された。
【図７Ａ】図７Ａは、ＡｎｇＩＩとともに４週間処置したマウスの心臓重量の増加を抑制した阻害ペプチド（ＮＬＳ）を示した図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、マウスを肥大刺激アンギオテンシンとともに４週間処置し、肥大の分子マーカーであるβ−ＭＨＣの発現増加が生じたことを示した図である。ＮＬＳペプチドは生体内で心筋肥大の発達を抑制させ、従ってこのマーカーの発現を防いだ。
【図８】図８は、ＡｎｇＩＩとともに浸透圧ミニポンプを移植したマウスの処置を示した図である。この処置により左心室拡張が引き起された（左心室拡張終末期径、ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｅｎｄ  ｄｉａｓｔｏｌｉｃ  ｄｉａｍｅｔｅｒ：ＬＶＥＤＤ）。マウスをＮＬＳペプチドで処置した場合には、拡張を防ぐことができた。コントロールペプチドは左心室拡張を防ぐことができなかった。
【図９】図９は、フェニレフリンで刺激された心筋細胞において、選択された転写因子（ｃＪＵＮ、ＥＲＫ１／２、ＡＴＡ４、ＮＦＡＴ２）の核への蓄積を防がなかった阻害ペプチド（ＮＬＳ）を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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