(57)【要約】  新規のＣＣケモカイン結合タンパク質をクリイロコイタマダニの唾液から単離する。本発明に従い調製される化合物は、抗炎症及び免疫調節化合物として、また、ＣＣケモカイン関連疾病の処置又は予防に使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号５により特定されるｅｖａｓｉｎ−４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
ｂ）配列番号６により特定される成熟ｅｖａｓｉｎ−４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
ｃ）ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）のタンパク質をコード化する核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸分子であって、ＣＣケモカインに結合するタンパク質をコード化する核酸分子によりコード化されるタンパク質；
ｄ）ａ）、ｂ）、ｃ）、又はｄ）のタンパク質とアミノ酸配列が少なくとも約７０％同一であり、ＣＣケモカインに結合するタンパク質；
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）のタンパク質の断片であって、ＣＣケモカインに結合する断片を含んでなるタンパク質；及び
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、又はｅ）のタンパク質の断片を含んでなるタンパク質であって、前記の断片又はタンパク質が免疫調節活性を有するタンパク質
からなる群より選択されるポリペプチド。
【請求項２】
ａ）配列番号５により特定されるｅｖａｓｉｎ−４のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｂ）配列番号６により特定される成熟ｅｖａｓｉｎ−４のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｃ）ａ）又はｂ）のタンパク質の断片であって、ＣＣケモカインに結合する断片を含んでなるタンパク質；
ｄ）ａ）又はｂ）のタンパク質の断片であって、免疫調節活性を有する断片を含んでなるタンパク質；
からなる群より選択される、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載のタンパク質の活性変異体であって、１又は２以上のアミノ酸残基が付加、欠失又は置換されてなるとともに、ＣＣケモカインに結合する、タンパク質の活性変異体。
【請求項４】
前記アミノ酸の付加、欠失、又は置換によって、哺乳類投与時における前記ポリペプチドの免疫原性が低減されてなる、請求項３のタンパク質の活性変異体。
【請求項５】
請求項１から４の何れか一項に記載のタンパク質と、前記タンパク質に作動式に連結された、１又は２以上のアミノ酸配列とを含んでなる融合タンパク質であって、前記アミノ酸配列が、膜結合タンパク質の細胞外ドメイン、免疫グロブリン定常領域、多量体化ドメイン、ヘテロ二量体タンパク質ホルモン、シグナルペプチド、搬出シグナル、及びタグ配列から選択される融合タンパク質。
【請求項６】
前記ポリペプチドが翻訳後修飾されることを特徴とする、請求項１から５の何れか一項に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記タンパク質がグリコシル化されることを特徴とする、請求項６記載のタンパク質。
【請求項８】
前記タンパク質が、活性画分、前駆体、塩、誘導体、抱合体、複合体の形態であり、又はＰＥＧ化されてなることを特徴とする、請求項１から７の何れか一項に記載のタンパク質。
【請求項９】
請求項１から７の何れか一項に記載のポリペプチドをコード化する核酸分子。
【請求項１０】
ａ）配列番号５により特定されるｅｖａｓｉｎ−４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコード化する核酸分子；
ｂ）配列番号６により特定される成熟ｅｖａｓｉｎ−４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコード化する核酸分子；
ｃ）ａ）又はｂ）の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸分子であって、ＣＣケモカインに結合するタンパク質をコード化する核酸分子；
ｄ）ａ）、ｂ）、又はｃ）の核酸分子によってコード化されるタンパク質とアミノ酸配列が少なくとも約７０％同一であるタンパク質であって、ＣＣケモカインと結合するタンパク質をコード化する核酸分子；
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）、又はｄ）の核酸分子によってコード化されるタンパク質の断片であって、ＣＣケモカインに結合する断片を含んでなるタンパク質をコード化する核酸分子；及び
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、又はｅ）の核酸分子の縮退変異体
からなる群より選択される、請求項９記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記核酸分子が、
ａ）配列番号５により特定されるｅｖａｓｉｎ−４のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｂ）配列番号６により特定される成熟ｅｖａｓｉｎ−４のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｃ）ａ）又はｂ）のタンパク質の断片であって、ＣＣケモカインに結合する断片を含んでなるタンパク質；
ｄ）ａ）又はｂ）のタンパク質の断片であって、免疫調節活性を有する断片を含んでなるタンパク質；
ｅ）ａ）又はｂ）のタンパク質の活性変異体であって、１又は２以上のアミノ酸残基が付加、欠失又は置換されるとともに、ＣＣケモカインに結合する変異体；及び
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、又はｅ）のタンパク質と、前記タンパク質に作動式に連結された１又は２以上のアミノ酸配列とを含んでなる融合タンパク質であって、前記アミノ酸配列が、膜結合タンパク質の細胞外ドメイン、免疫グロブリン定常領域、多量体化ドメイン、シグナルペプチド、搬出シグナル、及びタグ配列から選択される、融合タンパク質
からなる群より選択されるタンパク質をコード化する、請求項１０記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記ＣＣケモカインがＣＣＬ５及びＣＣＬ１１から選択されることを特徴とする、請求項９から１１の何れか一項に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記分子がＤＮＡ分子、特にｃＤＮＡ分子である、請求項９から１２の何れか一項に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記分子が配列番号３のＤＮＡ配列を含んでなる、或いは前記ＤＮＡ配列である、請求項９記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記分子が配列番号４のＤＮＡ配列を含んでなる、或いは前記ＤＮＡ配列である、請求項９記載の核酸分子。
【請求項１６】
請求項１０又は請求項１１に記載の核酸の断片を含んでなるオリゴヌクレオチドであって、少なくとも約２０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド、及び、少なくとも約５０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドからなる群より選択される、オリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項９から１５の何れか一項に記載の核酸分子を含んでなるクローニング又は発現ベクター。
【請求項１８】
前記核酸分子に作動式に連結されたプロモーター、特に組織特異的、構成的又は誘導性プロモーターを更に含んでなる、請求項１７記載の発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１７又は請求項１８に記載の発現ベクターで形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１から７の何れか一項に記載のタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞。
【請求項２１】
ポリペプチドを調製する方法であって、請求項１９又は請求項２０に記載の宿主細胞を、発現を許容又は促進する条件下で培養することを含んでなる方法。
【請求項２２】
前記タンパク質を精製することを更に含んでなる、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記タンパク質をヒト投与用に製剤することを更に含んでなる、請求項２１又は請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＣＣケモカイン結合タンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト動物であって、前記動物の細胞が、請求項９から１５の何れか一項に記載の単離又は組み換え核酸分子、或いは、請求項１７又は請求項１８に記載の発現ベクターを含有することを特徴とする動物。
【請求項２５】
請求項１から８の何れか一項に記載のポリペプチドに選択的に結合する抗体。
【請求項２６】
モノクローナル抗体である、請求項２５記載の抗体。
【請求項２７】
キメラ、ヒト化、又はヒト抗体、或いは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ、又はドメイン抗体等の抗体断片である、請求項２５又は請求項２６に記載の抗体。
【請求項２８】
請求項１から９の何れか一項に記載のポリペプチド、或いは、請求項１０から１９の何れか一項に記載の核酸、或いは、請求項２０又は請求項２１に記載の細胞と、医薬的に許容し得る希釈剤又は担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項２９】
薬剤に使用される、請求項１から８の何れか一項に記載のポリペプチド、又は、請求項２８記載の組成物。
【請求項３０】
哺乳類における免疫又は炎症性応答の調節に使用される、請求項１から８の何れか一項に記載のポリペプチド、又は、請求項２８記載の組成物。
【請求項３１】
動物のＣＣケモカイン関連疾患の処置又は予防に使用される、請求項１から８の何れか一項に記載のポリペプチド、又は、請求項２８記載の組成物。
【請求項３２】
請求項１から８の何れか一項に記載のポリペプチドの使用であって、哺乳類の免疫又は炎症性応答の調節用の医薬組成物の製造における活性成分としての使用。
【請求項３３】
前記の免疫又は炎症性応答が、ＣＣＬ５又はＣＣＬ１１によって生じることを特徴とする、請求項３２記載の使用。
【請求項３４】
前記の免疫又は炎症性疾患が、自己免疫疾患、感染、アレルギー性疾患、心血管疾患、代謝性疾患、胃腸疾患、神経系疾患、敗血症、移植拒絶反応関連疾患、又は線維症であることを特徴とする、請求項３２又は請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
請求項１から８の何れか一項に記載のポリペプチドの使用であって、寄生生物、ウイルス、又は細菌に対する哺乳類のワクチン接種用の医薬組成物の調製における使用。
【請求項３６】
請求項９から１５の何れか一項に記載の核酸分子によってコード化されるタンパク質の薬剤としての使用。
【請求項３７】
請求項９記載の核酸分子の使用であって、哺乳類の免疫又は炎症性応答の調節用組成物の調製における使用。
【請求項３８】
吸血性外部寄生生物に対して動物を免疫化する方法であって、請求項１から８の何れか一項に記載のポリペプチドを前記動物に投与することを含んでなる方法。
【請求項３９】
免疫又は炎症性応答の調節が必要な動物において前記調節を行なう方法であって、治療的に有効な量の請求項１から８の何れか一項に記載のポリペプチドを前記動物に投与することを含んでなる方法。
【請求項４０】
ＣＣケモカイン関連疾病の処置又は予防のための方法であって、請求項１から７の何れか一項に記載の有効量のポリペプチドを、それを必要とする対象に投与することを含んでなる方法。
【請求項４１】
ＣＣケモカイン又は類似体、ＣＣケモカイン結合タンパク質又は受容体、ＣＣケモカインとＣＣケモカイン結合タンパク質との相互作用、或いは前記相互作用のアンタゴニスト又はアゴニストを検出するためのキットであって、
検出用試薬と、少なくとも：
ａ）請求項９記載の核酸分子；
ｂ）請求項１６記載のオリゴヌクレオチド；
ｃ）請求項１から８の何れか一項に記載のポリペプチド；及び
ｄ）請求項２５から２７の何れか一項に記載の抗体；
からなる群より選択される化合物とを含んでなるキット。
【請求項４２】
インビトロ（in vitro）又はインビボ（in vivo）において、ＣＣケモカイン又は類似体、ＣＣケモカイン結合タンパク質又は受容体、ＣＣケモカインとＣＣケモカイン結合タンパク質との相互作用、或いは前記相互作用のアンタゴニスト又はアゴニストを検出する方法であって：
ａ）請求項９記載の核酸分子；
ｂ）請求項１６記載のオリゴヌクレオチド；
ｃ）請求項１から８の何れか一項に記載のポリペプチド；及び
ｄ）請求項２５から２７の何れか一項に記載の抗体；
からなる群より選択される化合物に、サンプルを接触させることを含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＣケモカインの新規アンタゴニスト、特にＣＣＬ５及びＣＣＬ１１のアンタゴニストに関し、更にはそれらの使用、特に抗炎症性又は免疫調節性化合物としての使用と、ＣＣケモカイン関連疾病の処置又は予防における使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは小型の分泌性、炎症促進性タンパク質であり、血液から損傷部位への白血球の指向性遊走を媒介する。ケモカインファミリーは、このファミリーのタンパク質を特徴づける保存システインの位置に応じて、Ｃ、ＣＣ、ＣＸＣ、ＣＸ3Ｃケモカインに構造上類別することができ、これらは一連の膜受容体に結合する（Baggiolini M. 等 (1997)）。これらの膜受容体（何れも七重螺旋状Ｇ−タンパク質共役受容体）によって、ケモカインが標的細胞に生理活性を発揮することが可能となる。かかる細胞はその状態及び／又は種類に応じて、特定の受容体の組み合わせを発現し得るからである。ケモカインの生理効果は、併起的な相互作用が複雑に統合された系の結果として生ずる。かかる受容体はリガンド特異性が重複する場合が多いため、単一の受容体が異なるケモカインに結合し得る。同様に、単一のケモカインが異なる受容体に結合し得る。
【０００３】
構造活性相関研究によれば、ケモカインは、受容体との主な相互作用部位を２箇所（即ち、可動性アミノ末端領域と、第２システインに続く高次構造的に剛性のループ）有することが示されている。ケモカインはそのループ領域によって受容体にドッキングするものと考えられ、この接触によって、受容体の活性化を生じさせるアミノ末端領域の結合が起こり易くなるものと考えられる。
【０００４】
通常、ケモカインは損傷部位で産生され、白血球の遊走及び活性化をひき起し、炎症、免疫、恒常性維持、造血、及び脈管形成の過程において基本的な役割を演じる。従って、これらの分子は、かかる過程に関連する疾患に治療介入する上で、好ましい対象候補であると考えられる。ケモカイン又はそれらの受容体を阻害することによって、白血球の成熟、動員、及び活性化、並びに脈管形成又は動脈硬化に関係する他の病理学的過程を低減することができる（Baggiolini M.(2001)）。
【０００５】
突然変異を阻害するケモカイン、抗体、及びペプチドと、受容体をブロックする小分子阻害薬とに加えて、効果的なケモカインアンタゴニストの探索は、ヒト又は哺乳動物の宿主と接触するとその宿主に影響を及ぼす強力な免疫調節活性を示す、一連のウイルスや他の生物体にも拡大されている。
【０００６】
サイトカイン、ケモカイン、及びそれらの受容体のウイルスによる模倣は、治療薬開発における免疫調節の方策を示している。最近では、吸血性節足動物（蚊、ブユ、及びダニなど）が発現する免疫調節因子が再検討されている（Gillespie, RD等(2001)）。
【０００７】
具体的には、ダニの唾液腺は、特に抗炎症、抗血液凝固、及び抗免疫活性を有する生理活性分子の複雑な混合物を産生する。その中には、ヒスタミンを調節し、免疫グロブリンに結合し、或いは別の補体カスケード又は他のプロテアーゼを阻害する生理活性タンパク質が含まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
大量の文献があるにもかかわらず、様々なダニの組織及び／又は種から作製されたライブラリーのランダム配列決定及びディファレンシャルスクリーニングによって同定されたｃＤＮＡ配列を列挙しているのは、僅かな論文のみに過ぎない。しかし、これら配列の大部分は生化学的又は機能的な特性決定がなされておらず、基本的な細胞機能に関与する既知のタンパク質（例えば、過去にダニ唾液腺において酵素活性又は抗体反応誘発に関する特性決定がなされたもの）との配列類似性のみに基づいて、多くの注釈が書き入れられている。特に、ＣＸＣケモカイン結合タンパク質として作用し、ＣＸＣケモカインアンタゴニストとして機能するダニタンパク質については、何ら示されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
驚くべきことに、クリイロコイタマダニ（Rhipicephalus sanguineus）の唾液に含まれるＥｖａｓｉｎ−４という新規なタンパク質が、ＣＣケモカインに結合してそれらの活性を阻害することが見出された。Ｅｖａｓｉｎ−４はクリイロコイタマダニのｃＤＮＡライブラリーからクローン化され、哺乳類細胞で発現された。このタンパク質、並びにその誘導体、断片、又は模倣剤は、例えば、哺乳類生物のＣＣケモカインのアンタゴニストとして、或いは、ワクチン接種用の標的やダニ及びダニ媒介病原体の駆除用の標的として、治療に用いることができる。
【００１０】
即ち、本発明の第１の態様は、ｅｖａｓｉｎ−４又はその断片若しくは類似体のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに関する。好ましい本発明のポリペプチドは、ＣＣケモカインに結合し、その生理活性を阻害することが好ましい。かかるポリペプチドの具体例としては、ｅｖａｓｉｎ−４又はその断片が挙げられる。
【００１１】
本発明の第２の態様は、上記定義のポリペプチドをコード化する核酸分子に関する。かかる核酸には、それらから単離されたオリゴヌクレオチドと、前記分子を含有するベクター、特に発現ベクターも含まれる。
【００１２】
本発明の第３の態様は、上記定義のポリペプチドに選択的に結合する抗体に存する。
【００１３】
本発明の第４の態様は、上記定義のポリペプチドを発現する宿主細胞及びトランスジェニック非ヒト動物、並びに、かかる細胞及びトランスジェニック非ヒト動物を作製する方法に関する。
【００１４】
本発明の第５の態様は、通常は組み換え技術を用いて、上記定義のポリペプチドを調製する方法である。
【００１５】
本発明の第６の態様は、上記定義のポリペプチド又は核酸分子と、医薬的に許容し得る担体又はビヒクルとを含んでなる医薬（ワクチン又は免疫原を含む）組成物である。
【００１６】
本発明の第７の態様は、上記定義のポリペプチド又は核酸分子の薬剤としての使用、特に、哺乳類の免疫又は炎症性応答を調節するための薬剤の調製における使用、並びに、対応する処置のための方法に関する。
【００１７】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるはずである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、ケモカイン活性を調節するための新規組成物及び方法を提供する。より具体的には、本発明は、ＣＣケモカイン結合特性を有し、ケモカイン作用の阻害に使用できる新規タンパク質を開示する。実施例は、ダニ唾液に由来するこのタンパク質が、組み換え形態として発現及び精製可能であるとともに、ＣＣケモカインに有効に結合することにより、その作用（例えば、ＣＣケモカインによって誘導される細胞の特異的走化性応答）を阻害し得ることを示している。
【００１９】
即ち、本発明の第１の態様は、ｅｖａｓｉｎ−４ポリペプチド、即ち、ｅｖａｓｉｎ−４のアミノ酸配列、或いはその断片又は類似体のアミノ酸配列を含んでなる任意のポリペプチドに存する。本発明のポリペプチドはＣＣケモカイン、特にＣＣＬ５（別名ＲＡＮＴＥＳ）及びＣＣＬ-１１（別名エオタキシン：eotaxin）に結合し、前記ケモカインの活性を阻害することが好ましい。具体的な本発明のポリペプチドは：
ａ）配列番号５により特定されるｅｖａｓｉｎ−４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
ｂ）配列番号６により特定される成熟ｅｖａｓｉｎ−４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
ｃ）ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）のタンパク質をコード化する核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸分子であって、ＣＣケモカインに結合するタンパク質をコード化する核酸分子によりコード化されるタンパク質；
ｄ）ａ）、ｂ）、ｃ）、又はｄ）のタンパク質とアミノ酸配列が少なくとも約７０％同一であり、ＣＣケモカインに結合するタンパク質；
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）のタンパク質の断片であって、ＣＣケモカインに結合する断片を含んでなるタンパク質；及び
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、又はｅ）のタンパク質の断片を含んでなるタンパク質であって、前記の断片又はタンパク質が免疫調節活性を有するタンパク質；
からなる群より選択される。
【００２０】
好ましい実施形態によれば、このタンパク質は：
ａ）配列番号５により特定されるｅｖａｓｉｎ−４のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｂ）配列番号６により特定される成熟ｅｖａｓｉｎ−４のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｃ）ａ）又はｂ）のタンパク質の断片であって、ＣＣケモカインに結合し、前記ケモカインの活性を阻害する断片を含んでなるタンパク質；
ｄ）ａ）又はｂ）のタンパク質の断片であって、免疫調節活性を有する断片を含んでなるタンパク質；
からなる群より選択される。
【００２１】
別の態様によれば、本発明は、上記定義のタンパク質の活性変異体であって、１又は２以上のアミノ酸残基が付加、欠失又は置換されており、ＣＣケモカインに結合して当該ケモカインの活性を阻害する変異体に関する。
【００２２】
本発明のポリペプチドは、成熟形であってもよい。成熟形は、１又は２以上の翻訳後修飾（グリコシル化、リン酸化、シグナルペプチド除去のためのエンド／エクソペプチダーゼによる修飾等）によって、或いは、配列コード化異種配列（検出及び／又は精製を改善するタグ又はドメイン等）のインフレーム付加によって得られる。例えば、ｅｖａｓｉｎ−４は、哺乳類及び昆虫の双方の細胞株において、組み換えヒスチジンタグ化タンパク質として、完全形及び成熟形で発現させることが可能である。
【００２３】
本発明のポリペプチド又はその対応する核酸は、組み換え又は合成のポリペプチド及び核酸等、単離型（例えば、その天然における環境下にない状態）であってもよい。
【００２４】
実施例は、ｅｖａｓｉｎ−４ポリペプチドがＣＣケモカイン、特にＣＣＬ５（別名ＲＡＮＴＥＳ）及びＣＣＬ１１（別名エオタキシン）に結合すること、それらの活性を阻害（例えば低減）するために使用し得ることを示している。この特性決定は、放射能標識ＣＣケモカインの使用を伴う生化学アッセイを利用して行なった。かかる活性ゆえに、本発明のｅｖａｓｉｎ−４ポリペプチドは、以下に論ずるような広範な治療的有用性を有する。
【００２５】
本発明との関係において、ポリペプチドの断片とは、前記ポリペプチド配列の少なくとも５、６、７、８、９又は１０の連続したアミノ酸残基を含んでなる任意の断片を指す。具体的な本発明の断片は、本明細書に開示されるｅｖａｓｉｎ−４タンパク質の１５、２０、２５、又はそれ以上のアミノ酸残基を含んでなる。好ましい断片は、全長タンパク質の生理活性のうち少なくとも１つ（例えば免疫原性又は免疫調節活性）を保持する。
【００２６】
これに関して、本発明との関係において「免疫調節活性」とは、インビトロ又はインビボで検出される任意の活性であって、免疫反応に正又は負の何れかの影響を及ぼす活性を意味する。かかる活性の例としては、免疫活性、免疫抑制活性、抗炎症活性、前／抗アポプトーシス活性、又は抗腫瘍活性が挙げられる。
【００２７】
或いは、断片は、哺乳動物に投与した場合に免疫活性を付与するものとして特定することも可能である。これらの断片は必要に応じて、（例えばダニ又はダニ媒介病原体に対する）免疫反応を亢進するために、適切な抗原特性、免疫原特性を有するべきである。かかる機能配列を候補ワクチン抗原として同定する方法や、更にはアジュバントと一緒に投与し、及び／又は、担体に架橋する方法に関して、文献には多くの例が示されている（Mulenga A.他（２０００年）、国際公開第０１／８０８８１号、国際公開第０３／０３０９３１号、国際公開第０１／８７２７０号）。Ｅｖａｓｉｎ−４において同定された特定の抗原又は抗原群は、動物における外寄生生物の感染又は疾患の予防又は低減に使用することができる。動物がその外寄生生物に自然暴露されることによって、その外寄生生物に対する動物の免疫が増強される（国際公開第９５／２２６０３号）。最後に、この断片は、スクリーニング又は診断用途において、完全タンパク質に対する抗体を産生するために使用することもできる。
【００２８】
上記定義のｅｖａｓｉｎ−４の特性について、本明細書ではこの配列の組み換え変異体を用いて例示したが、かかる特性は活性変異体でも維持され、更には増強される場合もある。この種の分子としては、前記配列の１又は２以上のアミノ酸残基が付加、欠失又は置換されてなる、天然又は合成の類似体が挙げられる。但し、後述の実施例に記載の手段によって測定した場合に、本発明の特徴となる生理活性と同じ生理活性を、同等か又はより高いレベルで示すことを条件とする。
【００２９】
特に「活性」という語は、かかる代替となる化合物において、Ｅｖａｓｉｎ−４のＣＣケモカイン結合及び免疫調節特性が維持され、更には増強されることを意味する。
【００３０】
活性変異体分子の作製は、部位特異的突然変異誘発法、コード化ＤＮＡ配列のレベルでのコンビナトリアル法（例えばＤＮＡシャフリング、ファージディスプレイ／選択等）、又はコンピューター支援設計試験、或いは他の適切な周知の手法のうち、任意の手法を用いて行なうことができる。これによって、実質的に対応する突然変異型又は短縮型のペプチド又はポリペプチドの有限群が得られる。当業者であればこれらの代替分子を、従来技術や後述の実施例における教示に基づいて、定型的な手法で取得及び試験することができる。
【００３１】
本発明によれば、これらの活性変異体における好ましい変化は、通常「保存的」又は「安全な」置換として知られる、重要でない残基における置換である。保存的アミノ酸置換は、その分子の構造及び生物学的機能が保存される程度に、十分に類似した化学的性質を有するアミノ酸による置換である。当然ながら、上記定義の配列は、その機能が変更されない限りにおいて、アミノ酸の挿入及び欠失を有していてもよい。具体的には、かかる挿入又は欠失が数個（例えば１０個未満、好ましくは３個未満）のアミノ酸しか伴わず、また、タンパク質又はペプチドの機能的高次構造にとって特に重要なアミノ酸を除去又は置換しない場合である。
【００３２】
天然のタンパク質の配列及び／又は構造に関する統計的及び物理化学的な検討に基づいて保存的アミノ酸置換の選択を可能とするモデルが、文献には多数示されている（Rogov SI.及びNekrasov AN.(2001)）。タンパク質設計実験によれば、アミノ酸の特定のサブセットを用いて、折り畳み式の活性タンパク質を生成することができること、更にはこれが、タンパク質構造内により容易に収容可能であり、且つ、機能的及び構造的なＥｖａｓｉｎ−４のホモログ及びパラログの検出に使用可能な、アミノ酸「同義」置換の分類に有用であることが示されている（Murphy LR.等(2000)）。置換用の同義アミノ酸基、並びに、より好ましい同義アミノ酸基は、表Ｉに定義されるものである。
【００３３】
但し、Ｅｖａｓｉｎ−４配列との関係においては、特定の残基がとりわけ重要である。例えば、ｅｖａｓｉｎ−４には、有意な相同性を示す既知のタンパク質が存在しない。更なるｅｖａｓｉｎ−４の特徴は、７個の潜在的なＮ結合グリコシル化部位と、９個のシステイン残基である。これらの残基は、正確な折り畳み及び／又は活性に重要である可能性があるので、代替のポリペプチドにおいても対応する位置に保存されることが好ましい。或いは、欠失又は置換されたシステイン又はグリコシル化部位を、タンパク質内の異なる位置に再建してもよい。
【００３４】
或いは、哺乳動物に投与した場合に上記ＣＣケモカイン結合タンパク質の免疫原性を低減するような配列変更から、Ｅｖａｓｉｎ−４の活性変異体を得ることもできる。この目的や、治療用タンパク質の安全且つ効果的な投与を可能にする他の機能最適化のために設計及び導入し得る配列変更の例は、特に非ヒト、非哺乳動物、又は非天然のタンパク質の場合について、文献に多数記載されている（Schellekens H.(2002)）。これらの分子を得るための技術的アプローチの例としては、定方向進化（Vasserot AP.等(2003)）、合理的設計（Marshall SA(2003)）、バイオインフォマティクス（Gendel SM.(2002)）、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの同定及び中和（国際公開第０３／１０４２６３号、第０３／００６０４７号、第０２／９８４５４号、第９８／５２９７６号、第０１／４０２８１号）、他のタンパク質配列との融合（国際公開第０２／７９４１５号、第９４／１１０２８号）、他の化合物との結合（国際公開第９６／４０７９２号）等が挙げられる。
【００３５】
活性ｅｖａｓｉｎ−４由来配列は、ｅｖａｓｉｎ−４の天然類似体又はオルソログであってもよい。これらは、特に他のダニ種、具体的にはマダニ（Ixodidae）科、より具体的にはクリイロコイタマダニが属するRhipicephalinae亜科に属するもの、更にはマダニ亜科（例えばマダニ（Ixodes scapularis）及びタネガタマダニ（Ixodes ricinus））やAmblyomminae亜科（例えばAmblyomma variegatum及びAmblyomma americanum）等の他の亜科から単離することができる。或いは、ヒト及びマウス等の哺乳動物でも、オルソログを同定することができる。
【００３６】
吸血性節足動物のゲノム及びトランスクリプトームについて入手可能な情報は限られており、その大部分はリボソーム及びミトコンドリアの配列に関連するもので、その保存に基づく系統発生関係の決定のために研究されたものである（Murrell A.等(2001)）。ダニのゲノムデータは部分的且つ暫定的な形式でしか入手できない（Ullmann AJ.等(2002)）が、マダニ類から抽出したゲノムＤＮＡを用いれば、ＣＣケモカイン結合タンパク質をコード化するダニ遺伝子について、更なる分析を行なうことが可能である。かかるゲノムＤＮＡは、特定の方法及び条件を適用することにより（Hill CA.及びGutierrez, JA.(2003)）、具体的には、既に実証されているように、唾液腺タンパク質における重要な多型の存在を検出するための方法及び条件を適用することにより（Wang H.等(1999)）、抽出することができる。これらの生物におけるゲノム及びタンパク質の配列は、その生理学及び生物学的理解にとって重要であり、宿主と寄生生物と寄生生物媒介病原体との関係に本発明のタンパク質が果たす役割を理解する上で、有用な情報を提供する（Valenzuela JG.(2002b)）。
【００３７】
本発明においてＥｖａｓｉｎ−４と相同のタンパク質について記載した、ＣＣケモカイン結合活性の生化学及び生理学的な特徴決定は、ダニ及びダニ媒介病原体の研究のために近年改良された任意の技術を適用することによって行なうことができる。かかる技術としては、２次元ゲル電気泳動（Madden RD.等(2004)）やＲＮＡ干渉（Aljamali MN.等(2003)）等が挙げられる。また、更なる検討によって、これらのタンパク質上におけるＣＣケモカイン認識部位及びＣＣケモカイン拮抗作用機序のマッピングや、関連する翻訳後修飾の同定を行なうことも可能である。
【００３８】
本発明の別の態様は、異種ドメインと作動式に連結された上記定義のＥｖａｓｉｎ−４ポリペプチドを含んでなる融合タンパク質である。異種ドメインとしては、例えば、膜結合タンパク質の細胞外ドメイン、免疫グロブリン定常部（Ｆｃ部）、多量体化ドメイン、搬出シグナル、及びタグ配列（アフィニティーによる精製を補助するもの、即ち、ＨＡタグ、ヒスチジンタグ、ＧＳＴ、ＦＬＡＡＧペプチド、又はＭＢＰなど）の中から選択し得る１又は２以上のアミノ酸配列が挙げられる。
【００３９】
融合タンパク質との関係において、「作動式に連結した」という表現は、Ｅｖａｓｉｎ−４ポリペプチドと付加アミノ酸の配列とが、ペプチド結合により直接、或いはスペーサー残基（例えばリンカー）を介して結合していることを示す。このようにすれば、融合タンパク質をコード化する核酸分子を宿主細胞で直接発現させることにより、組み換え法での融合タンパク質の産生が可能となる（これについては後に論じる）。また、必要であれば、産生／精製過程の最後に、又はインビボで、融合タンパク質に含まれる余分なアミノ酸配列を、例えば適切なエンドペプチダーゼ／エキソペプチダーゼによって除去することもできる（これについても後に論じる）。この異種部分を作動式に連結させる部位は、Ｅｖａｓｉｎ−４ポリペプチドのＮ末端部でもＣ末端部でもよい。
【００４０】
かかる部分及び／又はリンカーの設計、並びに融合タンパク質の作製、精製、検出、熟成、及び使用の方法及び方策については、文献において広く論じられている（Nilsson J.等の論文(1997)「Application of chimeric genes and hybrid proteins」、Methods Enzymol. Vol.326-328, Academic Press, 2000）。一般に、異種配列は、元のタンパク質の治療活性（例えばＣＣケモカイン結合）を実質的に損なうことなく、更なる特性を付与することを意図している。かかる更なる特性の例としては、精製手順の容易化、体液中での半減期の延長、結合部分の付与、細胞内タンパク質分解消化作用による成熟化、組み換え産生時の安定性、又は細胞外局在化が挙げられる。最後の特徴は、上記定義に含まれる特定の融合又はキメラタンパク質群を規定する上で、とりわけ重要である。かかる特徴によれば、ポリペプチドを容易に分離及び精製できる空間であって、ＣＣケモカインが通常活性な状態である空間に、ポリペプチドを局在化させることが可能となるからである。
【００４１】
Ｅｖａｓｉｎ−４ポリペプチドに融合されるこれらの配列のうち、１又は２以上の配列の選択は、上記タンパク質の組み換えタンパク質としての具体的な用途及び／又は精製プロトコルに応じて異なる。例えば、実施例ではＥｖａｓｉｎ−４の活性を試験するために、Ｅｖａｓｉｎ−４の検出及び精製を共に容易にするヒスチジンタグ配列を含有する融合タンパク質を用いた。これらの配列は、以下の３種類の基本的な異種配列群から選択することができる。
【００４２】
かかる配列の第１の群は、シグナルペプチド及び搬出シグナル等の組み換えＤＮＡ技術を用いたタンパク質の分泌及び精製を補助する配列（Rapoport TA.等(1996)）、或いは、アフィニティーによる精製を補助するタグ配列（ＨＡタグ、ヒスチジンタグ、ＧＳＴ、ＦＬＡＧ、又はＭＢＰ）からなる群である。
【００４３】
異種配列の第２の群は、タンパク質の安定性及び生理活性の向上を可能とする配列に代表されるものである。
【００４４】
タンパク質の半減期の延長を可能にする方策の典型例としては、ヒト血清アルブミンとの融合や、循環ヒト血清アルブミンとの結合を可能にするペプチド及び他の修飾配列（例えばミリストイル化による）との融合が挙げられる（Chuang VT.等(2002)、Graslund T.等(1997)、国際公開第０１／７７１３７号）。或いは、この付加的な配列によって、脳内など特定部位への局在化のための標的化を補助することもできる（国際公開第０３／３２９１３号）。
【００４５】
被験体に投与した場合の組み換えタンパク質の安定性を向上させる別の方法は、他のタンパク質から分離された、二量体、三量体等の形成を可能にするドメインを融合することによって、そのタンパク質の多量体を作製することである。本発明のポリペプチドの多量体化を可能にするタンパク質配列の例としては、ｈＣＧ（国際公開第９７／３０１６１号）、コラーゲンＸ（国際公開第０４／３３４８６号）、Ｃ４ＢＰ（国際公開第０４／２０６３９号）、Ｅｒｂタンパク質（国際公開第９８／０２５４０号）、又はコイルドコイルペプチド（国際公開第０１／００８１４号）等のタンパク質から分離されたドメインが挙げられる。
【００４６】
かかる融合タンパク質のよく知られた例としては、ヒト免疫グロブリンタンパク質の定常／Ｆｃ部に代表されるものが挙げられる。これは、ヒト免疫グロブリンによく見られる二量体化を可能にするものである。治療に役立つタンパク質及び免疫グロブリン断片を含んでなる融合タンパク質を作製するための方策が、文献には種々開示されている（国際公開第９１／０８２９８号、第９６／０８５７０、第９３／２２３３２号、第０４／０８５４７８、第０１／０３７３７号、第０２／６６５１４号）。例えば、成熟Ｅｖａｓｉｎ−４をコード化する核酸配列のクローン化は、その５’末端に元のＥｖａｓｉｎ−４シグナル配列（又は任意の他の適切なシグナル／搬出配列）をコード化する核酸配列が融合され、その３’末端にヒト免疫グロブリンλ重鎖ＩｇＧ１（国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）受託番号ＣＡＡ７５３０２、区分２４６−４７７）をコード化する核酸配列が融合された発現ベクターにより行なうことができる。得られたベクターを用いてＣＨＯ又はＨＥＫ２９３宿主細胞株を形質転換した上で、Ｎ末端にＥｖａｓｉｎ−４、Ｃ末端にＩｇＧ１配列を有する組み換え融合タンパク質を安定的に発現し、分泌するクローンを選択すればよい。このクローンはその後、産生の大規模化や、培養液からの組み換え融合タンパク質の精製に用いることができる。或いは、ヒト免疫グロブリンλ重鎖ＩｇＧ１の定常部及びＥｖａｓｉｎ−４をコード化する核酸の位置を逆にしてもよく、得られるタンパク質を、Ｅｖａｓｉｎ−４の元のシグナル配列又は任意の他の適切なシグナル／搬出配列を用いて発現させ、分泌させることもできる。この技術を用いて、あるＥｖａｓｉｎ−４−Ｆｃ融合タンパク質と、別の異なるＦｃ系融合タンパク質（例えば別のＣＣケモカインアンタゴニスト）とを発現する、２種類の異なるコンストラクトを同一の宿主細胞中で共発現させれば、ヘテロ二量体を産生することもできる（国際公開第００／１８９３２号）。
【００４７】
異種配列の更なる群は、Ｅｖａｓｉｎ−４が示す機能的活性に相乗作用を与え、又はこれを増幅し得る、更なる機能的活性を加える配列に代表されるものである。これらの配列は、膜結合タンパク質（例えばＣＣケモカイン受容体）の細胞外ドメインから分離され、或いは分泌タンパク質中に存在するものと推測されるが、ＣＣケモカインアンタゴニストと同様に活性である可能性があり、一般に免疫調節活性を有するはずである。
【００４８】
上記のように、これら融合タンパク質に含まれる更なる配列は、必要であれば、例えば産生又は精製過程の終りに、又はインビボで、例えば適切なエンドペプチダーゼ／エキソペプチダーゼによって除去してもよい。例えば、所望のタンパク質を異種配列からインビボ又はインビトロで酵素分離するのに使用可能なエンドペプチダーゼ（カスパーゼなど）の認識部位を、組み換えタンパク質に含まれるリンカー配列によって提示してもよい。或いは、発現されるタンパク質配列が開始メチオニンを有しない場合（例えばその配列が、シグナルペプチドのないタンパク質の成熟配列のみをコード化する場合）、本発明のタンパク質を宿主細胞内で、開始メチオニンを用いて正確に発現させることができる。その後、この更なるアミノ酸を、得られた組み換えタンパク質中に保持しておいてもよく、文献に開示の方法に従って、メチオニンアミノペプチダーゼ等のエキソペプチダーゼで除去してもよい（Van Valkenburgh HA.及びKahn RA.(2002)、Ben-Bassat A(1991)）。
【００４９】
本発明のポリペプチドの更なる変異体又は類似体は、ペプチド模倣体（別名ペプチドミメティクス）の形態で得られる。これは、ペプチド又はポリペプチドの性質が、アミノ酸側鎖、アミノ酸キラリティ、及び／又はペプチド骨格のレベルで化学修飾されたものである。これらの変更は、精製、効能、及び／又は薬物動態の特徴が改善されたアンタゴニストを提供することを意図している。例えば、被験体への注入後にペプチドがペプチダーゼ開裂の影響を受け易いという問題がある場合、特に敏感なペプチド結合を非開裂性ペプチド模倣体で置換することにより、治療薬としてより安定な、ひいてはより有用なペプチドを提供することができる。同様に、Ｌ−アミノ酸残基の置換は、タンパク質分解に対するペプチドの感受性を低減し、最終的にはペプチドよりも他の有機化合物に類似したものにする標準的な方法である。また、アミノ末端保護基、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル、アセチル、テイル（theyl）、スクシニル、メトキシスクシニル、スベリル、アジピル、アゼライル、ダンシル、ベンジルオキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル、メトキシアゼライル、メトキシアジピル、メトキシスベリル、及び２，４−ジニトロフェニル等も有用である。更に、効能の増強、活性の長期化、精製の容易化、及び／又は半減期の延長を可能にする他の修飾が、本技術分野では多数知られている（国際公開第０２／１０１９５号、Villain M.他(2001)）。ペプチド模倣体に含まれるアミノ酸誘導体用の好ましい代替「同義」基としては、表IIに規定するものが挙げられる。「アミノ酸誘導体」とは、遺伝的にコード化される２０種の天然アミノ酸の何れとも異なるアミノ酸又はアミノ酸様化学物質を意味する。具体的には、このアミノ酸誘導体は、置換又は非置換のアルキル部分（直鎖状、分枝鎖状、又は環状の何れでもよい）を有していてもよく、また、１又は２以上のヘテロ原子を有していてもよい。アミノ酸誘導体は新規に作製したものでもよく、また、商業的供給源から調達したものでもよい（Calbiochem-Novabiochem AG, Switzerland、Bachem, USA）。ペプチド模倣体（並びに非ペプチド模倣体）の合成及び開発の手法は、本技術分野では周知である（Hruby VJ.及びBalse PM.(2000)、Golebiowski A.等(2001)）。タンパク質の構造及び機能を探索及び／又は改良するべく、インビボ及びインビトロ双方の翻訳系を用いてタンパク質に非天然のアミノ酸を導入するための方法論についても、文献に種々開示されている（Dougherty DA.(2000)）。
【００５０】
下記で考察するように、本発明のポリペプチドは、組み換え技術及び化学合成技術を含む、本技術分野で周知の任意の手順によって調製することができる。
【００５１】
本発明の更なる態様は、上記定義のポリペプチドをコード化する核酸分子、即ち、ｅｖａｓｉｎ−４、或いはその断片又は類似体のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに存する。具体的な本発明の核酸分子は：
ａ）配列番号５により特定されるｅｖａｓｉｎ−４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコード化する核酸分子；
ｂ）配列番号６により特定される成熟ｅｖａｓｉｎ−４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコード化する核酸分子；
ｃ）ａ）又はｂ）の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸分子であって、ＣＣケモカインに結合するタンパク質をコード化する核酸分子；
ｄ）ａ）、ｂ）、又はｃ）の核酸分子によってコード化されるタンパク質とアミノ酸配列が少なくとも約７０％同一であるタンパク質であって、ＣＣケモカインと結合するタンパク質をコード化する核酸分子；
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）、又はｄ）の核酸分子によってコード化されるタンパク質の断片であって、ＣＣケモカインに結合する断片を含んでなるタンパク質をコード化する核酸分子；及び
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、又はｅ）の核酸分子の縮退変異体；
からなる群より選択される。
【００５２】
特に、この核酸分子は：
ａ）配列番号５により特定されるｅｖａｓｉｎ−４のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｂ）配列番号６により特定される成熟ｅｖａｓｉｎ−４のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｃ）ａ）又はｂ）のタンパク質の断片であって、ＣＣケモカインに結合する断片を含んでなるタンパク質；
ｄ）ａ）又はｂ）のタンパク質の断片であって、免疫調節活性を有する断片を含んでなるタンパク質；
ｅ）ａ）又はｂ）のタンパク質の活性変異体であって、１又は２以上のアミノ酸残基が付加、欠失又は置換されるとともに、ＣＣケモカインに結合する変異体；及び
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、又はｅ）のタンパク質と、前記タンパク質に作動式に連結された１又は２以上のアミノ酸配列とを含んでなる融合タンパク質であって、前記アミノ酸配列が、膜結合タンパク質の細胞外ドメイン、免疫グロブリン定常領域、多量体化ドメイン、シグナルペプチド、搬出シグナル、及びタグ配列から選択される融合タンパク質；
からなる群より選択されるタンパク質をコード化する。
【００５３】
本発明との関連において「縮退変異体」とは、遺伝子コードの縮退に起因する核酸配列であって、基準となる核酸と同じアミノ酸配列をコード化する全ての核酸配列を指す。
【００５４】
更に、「核酸分子」という語は、種々の種類の核酸を包含する。例としては、制限されるものではないが、デオキシリボ核酸（例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、合成ＤＮＡ等）、リボ核酸（例えばＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。好ましい実施形態によれば、核酸分子は、二重鎖ＤＮＡ分子等のＤＮＡ分子、通常はｃＤＮＡである。
【００５５】
主要な態様が、実施例に開示されたＥｖａｓｉｎ−４のＤＮＡ及びタンパク質の配列を対象とする場合、具体的な実施形態としては、一連のＥｖａｓｉｎ−４関連配列が挙げられる。例としては、中程度にストリンジェントな条件下（５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の予洗浄液、及び５０℃、５×ＳＳＣ、一晩のハイブリダイゼーション条件）において、ｅｖａｓｉｎ−４をコード化するＤＮＡ配列とハイブリダイズする能力があり、且つＣＣケモカイン結合タンパク質をコード化する、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列等が挙げられる。
【００５６】
例えば、本発明は、ｅｖａｓｉｎ−４を発現するクリイロコイタマダニのｃＤＮＡの配列（配列番号３）、及び、関連するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ、配列番号４）を提供する。
【００５７】
他の好ましい実施形態によれば、ｅｖａｓｉｎ−４配列は、ｅｖａｓｉｎ−４と少なくとも約７０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０％のアミノ酸配列が同一のタンパク質をコード化するＤＮＡ分子である。この値は任意の専用プログラム、例えばＦＡＳＴＡ（Pearson WR.(2000)）によって計算することができる。断片又は部分配列の場合には、断片内に存在するｅｖａｓｉｎ−４部分に関して、その値を計算する。
【００５８】
別の好ましい実施形態として、上記定義の核酸分子の配列の断片を含んでなる、或いはかかる配列の一領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドがある。かかるオリゴヌクレオチドは通常、そのヌクレオチド長が５個から１００個の間であり、例えば、ヌクレオチド長が少なくとも約２０個のオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド長が少なくとも約３０個のオリゴヌクレオチド、及び、ヌクレオチド長が少なくとも約５０個のオリゴヌクレオチドからなる群より選択し得る。これらのオリゴヌクレオチドは、ｅｖａｓｉｎ−４コード化転写物中の非コーディング／コーディング配列及びサンプル中の関連配列の（例えばＰＣＲ又はサザンブロット法による）検出に、或いはｅｖａｓｉｎ−４の組み換え変異体の作製及びサブクローン化に使用することができる。
【００５９】
更なる態様では、上記定義の核酸分子を、クローニングベクター又は発現ベクターに含入させてもよい。これに関連して、本発明の特定の実施形態は、上記定義の核酸分子と作動式に結合したプロモーター、特に、組織特異的、構成的プロモーター、又は調節性（例えば誘発性）プロモーターを含んでなる発現ベクターに存する。このベクターは、更なる任意の調節エレメント、例えばターミネーター、エンハンサー、複製起点、選択マーカー等を含んでいてもよい。このベクターは、プラスミド、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、ファージ、人工染色体等の何れであってもよい。
【００６０】
特定の実施形態によれば、このベクターは、
ａ）本発明のＤＮＡ、及び
ｂ）発現カセット
を含んでなるものでもよい。ここで、上記ＤＮＡ（ａ）は、配列（ｂ）に含まれる組織特異的、構成的、又は誘発性プロモーターと作動式に連結される。
【００６１】
任意により、コーディング核酸（即ち配列（ａ））が開始メチオニンのコドンを含有しない場合（例えばその配列が、タンパク質の成熟配列のみを（シグナルペプチド抜きで）コード化する場合）、そのベクター又は発現カセットが、開始メチオニンを適切に発現し得るよう、かかる配列の５’にクローン化されたＡＴＧ配列を含有していてもよい。その後、この更なるアミノ酸は、得られた組み換えタンパク質内に残存させておいてもよく、文献に開示の方法に従ってメチオニンアミノペプチダーゼ等の酵素を用いて除去してもよい（Van Valkenburgh HA.及びKahn RA.(2002)、Ben-Bassat A.(1991)）。
【００６２】
このベクターによれば、実験又は治療の何れの理由でも、組織培養の条件下のみならずインビボでも、本発明のタンパク質の発現が可能となる。例えば、本発明のタンパク質を過剰発現する細胞を動物モデルにトランスフェクトして（例えば封入して）、そのタンパク質の常時投与の生理学的効果を確認してから、最終的にその細胞をヒトに適用することが可能となる。或いは、レトロウイルス媒介遺伝子移入のために、或いは動物におけるベクター又は単離ＤＮＡコーディング配列の導入及び発現を内因性プロモーターの制御下で可能にする任意の他の技術のために、このベクターを使用することができる。この手法によれば、本発明のタンパク質が構成的に、又は調節下で（例えば特定の細胞内で、及び／又は、特定の化合物による誘導に引き続いて）発現されるトランスジェニック非ヒト動物の産生が可能となる。同様の手法は、他の非哺乳動物のケモカイン結合タンパク質にも応用され、様々な発生的及び病理学的効果を示してきた（Jensen KK.等(2003)）。
【００６３】
本発明の別の態様は、上記に示したクローニング又は発現ベクターにより形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞である。これらのベクターは、本発明のポリペプチドの調製過程で使用することができる。この点に関して、本発明の一態様は、上述のｅｖａｓｉｎ−４ポリペプチドの調製方法であって、上記定義の組み換え細胞を、発現を許容又は促進する条件下で培養する工程と、上記定義のｅｖａｓｉｎ−４ポリペプチドを回収する工程とを含んでなる方法である。更なる処理を考慮した場合、ベクターがこのポリペプチドを細胞外空間分泌タンパク質として発現すれば、タンパク質の培養細胞からの回収及び精製がより容易になる。
【００６４】
ベクターや原核又は真核の宿主細胞を用いた組み換えタンパク質のクローン化及び産生について教示する著書や概説は多数存在する。例としては、Oxford University Pressにより出版されたシリーズ「A Practical Approach」の幾つかの巻（「DNA Cloning 2: Expression Systems」(1995)、「DNA Cloning 4: Mammalian Systems」(1996)、「Protein Expression」(1999)、「Protein Purification Techniqueｓ」(2001)）が挙げられる。具体的に、これらの例は、クリイロコイタマダニｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによってｅｖａｓｉｎ−４をコード化するＤＮＡ配列が同定された後、対応する組み換えタンパク質を得るためにＯＲＦを適合させ、修飾し、更には発現ベクターに挿入する方法を示している。
【００６５】
一般に、これらのベクターはエピソーム型ベクターでも、非相同／相同組込み型ベクターでもよい。これらは任意の適切な手段（形質転換、トランスフェクション、結合、プロトプラスト融合、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿法、直接マイクロインジェクション等）によって、適切な宿主細胞内に導入し、宿主細胞を形質転換することができる。具体的なプラスミド、ウイルス、又はレトロウイルスベクターを選択する上で重要な因子としては、ベクター含有受容細胞をベクター非含有受容細胞から識別・選択する際の容易さ、特定の宿主におけるベクターの所望のコピー数、及び、様々な種の宿主細胞間でベクターを「往復させる（shuttle）」能力を所望するか否か等が挙げられる。これらのベクターは、本発明の分離タンパク質又はそれらを含んでなる融合タンパク質が、原核又は真核の宿主細胞内で、適切な転写開始／停止調節配列の制御下において発現することを許容するものである必要がある。かかる調節配列としては、前記細胞内で構成的に活性であるか、誘導可能であるものが選択される。次いで、かかる細胞群内で実質的に濃縮された細胞株を分離することにより、（ＨＥＫ２９３及びＴＮ５細胞株を用いた実施例で示すように）安定な細胞株を得ることができる。
【００６６】
真核生物の宿主細胞（例えば酵母、昆虫、又は哺乳動物の細胞）の場合、その宿主の性質に応じて、様々な転写及び翻訳調節配列を使用することができる。かかる配列は、高レベル発現性の特定の遺伝子に関連する調節シグナルを有する、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、サルウイルス等のウイルス源から得られたものでもよい。例としては、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーター等が挙げられる。遺伝子の発現を調節できるように、抑制及び活性化を可能にする転写開始調節シグナルを選択してもよい。導入されたＤＮＡによって安定的に形質転換される細胞は、発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能にする１又は２以上のマーカーの導入によっても選択することができる。また、このマーカーによって、栄養要求性宿主に対する光合成能の付与や、殺生物剤（例えば抗生物質や、銅等の重金属）に対する抵抗性等の付与も可能である。選択マーカー遺伝子は、発現するＤＮＡ遺伝子に直接連結してもよく、コトランスフェクションによって同一の細胞内に導入してもよい。また、本発明のタンパク質の最適合成に、更なる要素が必要な場合もある。
【００６７】
組み換え産生用の宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。特に好適な原核細胞としては、組み換えによるバクテリオファージ、プラスミド、又はコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（枯草菌（Bacillus subtillis）や大腸菌（E. coli）など）が挙げられる。真核生物の宿主細胞、例えばヒト、サル、マウス、及びチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）の細胞等の哺乳動物の細胞は、適切な折り畳みや適切な部位でのグリコシル化等、タンパク質分子に対する翻訳後修飾を可能にするという点で好ましい。別の真核生物の宿主細胞としては、酵母発現ベクターを用いて形質転換した酵母細胞が挙げられる。酵母細胞によっても、グリコシル化等の翻訳後ペプチド修飾を行なうことができる。強力なプロモーター配列と高コピー数のプラスミドとを用いた、酵母内で所望のタンパク質の産生に利用可能な数々の組み換えＤＮＡの方策が存在する。酵母は、クローン化された哺乳動物遺伝子産物中のリーダー配列を認識し、リーダー配列を有するペプチド（即ちプレペプチド）を分泌する。
【００６８】
組み換えポリペプチドを長期間、高収量で産生するには、安定した発現が好ましい。例えば、関心のあるポリペプチドを安定的に発現する細胞株を、ウイルスの複製起点及び／又は内因性発現エレメントを含有し得る発現ベクターと、同一又は別のベクター上の選択マーカー遺伝子とを用いて形質転換すればよい。ベクターの導入後、選択培地に切り替える前に、細胞を富化培地中で１〜２日間成長させてもよい。選択マーカーの目的は、選択に対する抵抗性を付与することであり、その存在によって、導入された配列を首尾よく発現させる細胞の成長及び回収が可能になる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンを、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖させればよい。その後、かかる細胞群において実質的に濃縮された細胞株を分離すれば、安定な細胞株を得ることができる。
【００６９】
本発明の組み換えポリペプチドの高収量生産の特に好ましい方法としては、米国特許第４，８８９，８０３号に記載のように、メトトレキセートのレベルの連続的増加を用いた、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ細胞中でのＤＨＦＲ増幅による方法が挙げられる。得られるポリペプチドはグリコシル化形態であってもよい。
【００７０】
発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は本技術分野で公知であり、例えば米国基準菌株保有機構（ＡＴＴＣ）から多数の不死化細胞株が入手可能である。例としては、これらに限定されるものではないが、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）、Ｈｅｌａ、幼児ハムスターの腎臓（ＢＨＫ）、サルの腎臓（ＣＯＳ）、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、ボーズ（Bowes）黒色腫及びヒト肝細胞性癌腫（例えばＨｅｐ Ｇ２）細胞、並びに幾つかの他の細胞株が挙げられる。バキュロウイルス系では、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系用の材料が、特にInvitrogenからキットの形態で市販されている。
【００７１】
或いは、本発明のポリペプチドは、人工合成によって調製することもできる。これに関して、化学合成技術の例としては、固相合成と液相合成とが挙げられる。固相合成としては、例えば、合成対象となるペプチドのカルボキシ末端に当たるアミノ酸を有機溶媒に不溶性の保持体に結合させるとともに、２つの反応（即ち、アミノ基を有するとともに、適切な保護基で保護された側鎖官能基を有するアミノ酸を、カルボキシ末端からアミノ末端へと１つずつ順に縮合させる反応、並びに、樹脂に結合しているアミノ酸や、ペプチドのアミノ基の保護基に結合しているアミノ酸を遊離させる反応）を交互に反復することにより、ペプチド鎖を伸長させる方法が挙げられる。固相合成法は、使用する保護基の種類に応じて、ｔＢｏｃ法とＦｍｏｃ法とに大別される。一般に使用される保護基として、アミノ基についてはｔＢｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）、Ｃｌ−Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル）、Ｂｒ−Ｚ（２−ブロモベンジルオキシカルボニル）、Ｂｚｌ（ベンジル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、Ｍｂｈ（４，４′−ジメトキシジベンズヒドリル）、Ｍｔｒ（４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｔｏｓ（トシル）、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）、及びＣｌ２−Ｂｚｌ（２，６−ジクロロベンジル）が、グアニジノ基についてはＮＯ2（ニトロ）及びＰｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）が、水酸基についてはｔＢｕ（ｔ−ブチル）が挙げられる。所望のポリペプチドの合成後、これを脱保護反応に供し、固体保持体から分離する。かかるペプチド切断反応は、Ｂｏｃ法の場合はフッ化水素又はトリフルオロメタンスルホン酸、またＦｍｏｃ法の場合はＴＦＡを用いて行なうことができる。ｅｖａｓｉｎ−４と同等のサイズの完全合成タンパク質が、文献に開示されている（Brown A.等(1996)）。
【００７２】
本発明のポリペプチドは、所望の使用及び／又は製法によって、他の好ましい代替形態として生産し、処方し、投与し、又は一般的に使用することができる。本発明のタンパク質に対して、例えば実施例に示すグリコシル化等の翻訳後修飾を行なってもよい。
【００７３】
一般に、本発明のタンパク質は、活性な画分、前駆体、塩、誘導体、抱合体、又は複合体の形態で得ることができる。
【００７４】
上述したように、「活性な」又は「生物学的に活性な」という語は、かかる代替化合物がｅｖａｓｉｎ−４のＣＣケモカイン結合特性及び／又は免疫調節特性を維持し、更には強化し得ることを意味する。
【００７５】
「画分」という語は、化合物自体のポリペプチド鎖の任意の断片を単独で、或いは関連分子や前記化合物に結合する残基（例えば糖又はリン酸の残基）との組み合わせで指す。かかる分子は、合成時及び／又は更なる加工段階において、一次配列を通常は変更しない他の修飾、例えばインビトロでのペプチドの化学的誘導体化（アセチル化又はカルボキシル化）によって、またタンパク質の翻訳後修飾、例えばリン酸化（ホスホチロシン、ホスホセリン、又はホスホトレオニン残基の導入）によって、或いは（グリコシル化に影響を及ぼす酵素、例えば哺乳動物のグリコシル化酵素又は脱グリコシル化酵素に、ペプチドを曝すことによる）グリコシル化の結果として得られたものでもよい。特に、ダニの唾液において特徴付けられたｅｖａｓｉｎ−４は、グリコシル化されたものであった。この修飾は、適切な修飾用酵素を用いてインビボで行なってもよく、組み換え産生用の適切な宿主細胞を選択することによってインビトロで行なってもよい。
【００７６】
「前駆体」とは、細胞又は身体への投与前又は投与後の代謝的及び酵素的プロセシングによって、本発明の化合物に変換され得る化合物である。
【００７７】
本明細書において「塩」という語は、本発明のペプチド、ポリペプチド、又はそれらの類似体のカルボキシル基の塩及びアミノ基の酸付加塩の両方を指す。カルボキシル基の塩は、本技術分野で公知の手段で形成することができ、例としては、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄（III）、又は亜鉛の塩等の無機塩と、トリエタノールアミン、アルギニン又はリシン、ピペリジン、プロカイン等のアミン等の有機塩基により形成される塩とが挙げられる。酸付加塩の例としては、塩酸や硫酸等の鉱酸による塩と、酢酸やシュウ酸等の有機酸による塩とが挙げられる。かかる塩は何れも、本発明のペプチド及びポリペプチド又はそれらの類似体と実質上同様の活性を有することが望まれる。
【００７８】
本明細書で用いられる「誘導体」という語は、そのアミノ酸部分の側鎖に存在する官能基、或いはアミノ末端基やカルボキシ末端基に存在する官能基から、周知の方法により調製し得る誘導体を指す。かかる誘導体としては、例えばカルボキシル基のエステル又は脂肪族アミドと、遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体又は遊離水酸基のＯ−アシル誘導体とが挙げられ、例えばアルカノイル又はアロイル基等のアシル基によって形成される。
【００７９】
本発明のタンパク質は、放射性標識、ビオチン、蛍光標識、細胞毒性薬、及び薬物送達物質の中から選択される分子を含んでなる活性な抱合体又は複合体の形態であってもよい。有用な抱合体又は複合体は、本技術分野で公知の分子及び方法を用いて、様々な理由において作製することができる。かかる理由としては、例えば、ＣＣケモカインや他のタンパク質（放射性又は蛍光標識、ビオチン）との相互作用、治療効果（細胞毒性薬）の検出を可能にする、或いは、薬物送達効果の点からポリエチレングリコール及び他の天然又は合成ポリマー等の薬品を改良する等が挙げられる（Harris JM.及びChess RB.(2003)、Greenwald RB.等(2003)、Pillai O.及びPanchagnula R.(2001)）。これに関して、本発明は、本明細書に開示するように、化学的に修飾されたポリペプチド及びタンパク質、即ちポリマーと連結されたポリペプチド又はタンパク質を意図している。このポリマーは通常、抱合体が生理的環境等の水性環境中で沈殿しないように、水溶性である。好適なポリマーの例としては、単一の反応性基（例えばアシル化用の活性エステルや、アルキル化用のアルデヒド）を有するように修飾されたものが挙げられる。これによって、重合度を制御することができる。反応性アルデヒドの例としては、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、又はモノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ、又はそれらのアリールオキシ誘導体が挙げられる（例えば、米国特許第５，２５２，７１４号参照）。このポリマーは分枝していてもよく、非分枝でもよい。更に、ポリマー混合物を用いて抱合体を作製することもできる。治療に使用される抱合体は、医薬的に許容し得る水溶性ポリマー部分を含んでなるものでもよい。好適な水溶性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ＰＥＧ、モノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−ＰＥＧ、アリールオキシ−ＰＥＧ、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ＰＥＧ、トレシルモノメトキシＰＥＧ、ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ビス−スクシンイミジルカーボナートＰＥＧ、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロース、又は他の炭水化物系ポリマーが挙げられる。好適なＰＥＧの分子量としては、約６００から約６０，０００の間、例えば５，０００、１２，０００、２０，０００、及び２５，０００等が挙げられる。また、抱合体は、かかる水溶性ポリマーの混合物を含んでなるものでもよい。例として、本発明のｅｖａｓｉｎ−４ポリペプチド又は変異体を、ＰＥＧにより修飾することができる。これは「ＰＥＧ化」として知られる手法である。ＰＥＧ化は、本技術分野で公知のＰＥＧ化反応によって行なうことができる（例えば欧州特許第０ １５４ ３１６号参照）。例えば、ＰＥＧ化は、反応性ポリエチレングリコール分子とのアシル化反応又はアルキル化反応によって行なうことができる。別の手法として、活性化ＰＥＧの縮合、即ち、ＰＥＧの末端水酸基又はアミノ基を活性化リンカーで置換することによって、抱合体を形成することもできる（例えば、米国特許第５，３８２，６５７号参照）。ＰＥＧは直鎖状でも分枝鎖状でもよい。これによってタンパク質の安定化、半減期の延長、或いは生理活性の向上を達成し得る。
【００８０】
これらのｅｖａｓｉｎ−４由来化合物の作製は、内部又は末端に位置する適切な残基の部位特異的修飾に続いて行なうこともできる。ポリマー結合には、かかる結合を受容し易い側鎖（即ち、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、ヒスチジン等の、官能基を有するアミノ酸側鎖）を有する残基を用いることができる。或いは、ポリマーが結合される側鎖を有する別のアミノ酸で、これらの部位の残基を置換してもよい。
【００８１】
例えば、直接のＰＥＧ化を可能にするべく、組み換えＤＮＡ技術により、或いは酵素の働きにより、追加のシステインを成熟タンパク質配列のＮ又はＣ末端に付加してもよい。或いは、グリコシル化部位に相当する残基の置換によって、システインをタンパク質中に導入することもできる。
【００８２】
別の態様によれば、本発明は、本発明のタンパク質と選択的に結合する抗体に関する。
【００８３】
本明細書で用いられる「抗体」という語は、以下で更に説明するように、モノクローナル及びポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、二重特異性又は多重特異性抗体、並びに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）又はドメイン抗体等の抗体断片を包含する。
【００８４】
本発明との関連において「選択的」結合という語は、抗体が標的のポリペプチド又はエピトープに対して優先的に、即ち、他の何れの抗原又はエピトープとの何れの結合よりも高い親和力で、結合することを指す。換言すれば、標的ポリペプチドとの結合は、他の抗原との非特異的結合と区別することが可能である。本発明に係る抗体は、標的ポリペプチド又はエピトープに対して１０6Ｍ-1以上、好ましくは１０7Ｍ-1以上、より好ましくは１０8Ｍ-1以上、最も好ましくは１０9Ｍ-1以上の結合親和力（Ｋａ）を示すことが好ましい。抗体の結合親和力は、当業者であれば、例えばスキャッチャード分析（Scatchard G.(1949)）によって容易に求めることができる。
【００８５】
本発明の抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、或いは実質的に同じ抗原特異性を有するそれらの断片又は誘導体であってもよい。
【００８６】
齧歯類、霊長類、及びウマ類を含む様々な種からポリクローナル抗体を調製する方法は、例えばVaitukaitis等(1971)に報告されている。ポリクローナル抗体は、例えば、免疫剤（及び所望によりアジュバント）を哺乳動物に１回又は複数回注入することにより、産生することができる。通常、免疫剤及び／又はアジュバントは、複数回の皮下又は腹膜内注射により哺乳動物に注入される。免疫剤としては、前述した配列番号５、６、１７、１８のポリペプチド又は変異体、或いはそれらの融合タンパク質が挙げられる。その免疫剤を、免疫されるその哺乳動物において免疫原性があることが知られているタンパク質と結合させることが有用な場合もある。かかる免疫原性タンパク質の例としては、これらに限定されるものではないが、スカシ貝（keyhole limpet）ヘモシアニン、血清アルブミン、ウシのチログロブリン、及びダイズトリプシン阻害薬が挙げられる。使用し得るアジュバントの例としては、フロイント完全アジュバントやＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコラート）が挙げられる。注射を繰り返し行なってもよい。血液サンプルを回収し、免疫グロブリン又は血清を分離する。
【００８７】
或いは、抗体はモノクローナル抗体であってもよい。本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」という語は、実質上均一な抗体集団（即ち、集団を構成する個々の抗体が、自然発生し得る少量の変異体を除いて同一である集団）から得られる抗体を意味する。モノクローナル抗体は極めて特異性が高く、単一の抗原部位を対象とする。その修飾語である「モノクローナル」とは、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の性質を指すものであって、何れか特定の方法によって抗体を産生する必要があるものと解釈すべきではない。
【００８８】
モノクローナル抗体を産生する方法は、例えばKohler等（Nature 256(1975)495）に開示されている。これは引用により本明細書内に組み込まれる。
【００８９】
ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿主動物を、一般には免疫剤（この免疫剤は通常、先に述べた配列番号５、６のポリペプチド又は変異体、或いはそれらの融合タンパク質を含むことになる）で免疫化して、この免疫剤と特異的に結合するであろう抗体を産生するか、又は産生し得るリンパ球を引き出す。或いは、このリンパ球をインビトロで免疫化してもよい。一般に、ヒト起源の細胞が望ましい場合は、末梢血のリンパ球（「ＰＢＬ」）を使用し、非ヒト哺乳動物源が望ましい場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞を使用する。次いで、ポリエチレングリコール等の適切な融合剤を用い、リンパ球を不死化細胞株と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する（Goding(1986)）。不死化細胞株は、一般的には形質転換された哺乳動物細胞、特に齧歯類、ウシ、及びヒト起源の骨髄腫細胞である。通常はラット又はマウスの骨髄腫細胞株が使用される。このハイブリドーマ細胞を適切な培地中で培養すればよいが、かかる培地は、融合されていない不死化細胞の成長又は生存を阻害する１又は２以上の物質を含有することが好ましい。例えば、親細胞が酵素、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培地は通常、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有する培地（「ＨＡＴ培地」）であり、これらの物質がＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を妨げることになる。好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの発現を支え、且つＨＡＴ培地等の培地に対して感受性を有するものである。より好ましい不死化細胞株はネズミの骨髄腫株であり、例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Center、及び、バージニア州マナサスのAmerican Type Culture Collectionから得ることができる。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異型骨髄腫の細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体産生用に報告されている。
【００９０】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養されている培地に、免疫化するペプチドに対するモノクローナル抗体が存在するかどうかをアッセイすればよい。ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法によって、或いはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）や酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ結合アッセイによって定量することが好ましい。かかる技術やアッセイは、本技術分野では公知である。
【００９１】
所望のハイブリドーマ細胞が同定されたら、そのクローンを限界希釈法によりサブクローン化し、標準的な方法により成長させる（Goding、上記）。この目的に適した培地としては、例えばダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）及びＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。或いは、ハイブリドーマ細胞をインビボで、哺乳動物の腹水で成長させてもよい。
【００９２】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィー等の通常の免疫グロブリン精製手順によって、培地又は腹水から分離又は精製することができる。
【００９３】
また、組み換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載の方法によって、モノクローナル抗体を作製することもできる。本発明のモノクローナル抗体をコード化するＤＮＡは、通常の手順を用いて（例えば、ネズミ抗体の重鎖及び軽鎖をコード化する遺伝子と特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に分離し、配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好適な供給源となる。分離後のＤＮＡを発現ベクターに導入してもよい。次いでこの発現ベクターを、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は通常は免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫等の宿主細胞にトランスフェクトさせ、組み換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成物を得る。
【００９４】
また、「モノクローナル抗体」は、Clackson等(1991)に記載の技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから分離することもできる。
【００９５】
これら抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体を調製するための方法は、本技術分野では周知である。例えば、一つの方法としては、免疫グロブリンの軽鎖と修飾重鎖の組み換え発現を伴うものが挙げられる。この重鎖は一般にＦｃ領域内の任意の点で切断され、これにより重鎖の架橋が防止される。或いは、架橋を防ぐために関連したシステイン残基を別のアミノ酸残基で置換するか、又は欠失させる。
【００９６】
インビトロ法も一価抗体の調製に適している。抗体の断片、特にＦａｂ断片を産生するための抗体の消化は、本技術分野で周知の定型的な技術を用いて達成することができる。
【００９７】
また、例えばWard等(1989)に開示のように、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーの選択によって抗体を作製してもよい。
【００９８】
更に、本発明の抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体を含んでいてもよい。非ヒト（例えばネズミ）抗体のヒト化形態としては、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又は非ヒト免疫グロブリンから得られる最小の配列を含有するそれらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）2、又は抗体の他の抗原結合サブ配列）が挙げられる。ヒト化抗体としては、受容体の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基を、望ましい特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、又はウサギ等の非ヒトの種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置換したヒト免疫グロブリン（受容抗体）が挙げられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒトの残基によって置換される。
【００９９】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、本技術分野では周知である。ヒト化は、基本的にはWinter及び共同研究者の方法（Jones等、Nature, 321:522-525 (1986)）に則って、齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することにより行なうことができる。従って、かかる「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、無傷のヒト可変ドメインは実質的に全く、非ヒトの種由来の対応する配列による置換を受けていない。
【０１００】
また、ヒト抗体は、本技術分野で公知の様々な技術を用いて作製することもできる。例としては、ファージディスプレイライブラリーが挙げられる（Hoogenboom及びWinter(1991)）。同様に、ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されているトランスジェニック動物（例えばマウス）に、ヒト免疫グロブリン座を導入することによって作製することができる。抗原暴露に伴いヒト抗体の産生が観察され、それは遺伝子の再配列、作製、及び抗体レパトアを含め、あらゆる点でヒトに見られるものに極めて類似している。この手法は、例えば米国特許第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号に記載されている。
【０１０１】
また、本発明は、異種部分と連結された抗体を含んでなる免疫抱合体に関する。異種部分としては、細胞毒性薬、標識、薬物、又は他の治療薬が挙げられ、これらは共有結合か否かによらず、直接又はカップリング剤やリンカー等の使用により連結される。細胞毒性薬としては、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素的に活性な毒素、又はそれらの断片）、或いは放射性同位元素（即ち放射性抱合体）が挙げられる。
【０１０２】
使用可能な酵素的に活性な毒素及びそれらの断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性の活性断片、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（momordica charantia）阻害薬、クルシン（curcin）、クロチン（crotin）、サボンソウ（saponaria officinalis）阻害薬、ゲロニン（gelonin）、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、及びトリコセセンス（tricothecenes）が挙げられる。放射性抱合抗体の産生には様々な放射性核種が利用できる。例としては212Ｂｉ、131Ｉ、131Ｉｎ、90Ｙ、及び186Ｒｅが挙げられる。
【０１０３】
別の実施形態によれば、この抗体を「受容体」（ストレプタビジン等）と結合させて、腫瘍プレターゲティングに利用してもよい。この場合、抗体−受容体抱合体を患者に投与し、続いて除去薬（clearing agent）を用いて非結合抱合体を循環から除去し、次いで細胞毒性薬（例えば放射性ヌクレオチド）に結合した「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
【０１０４】
更に、本発明の抗体又は抗体断片を、本技術分野で方法の手法や本明細書に記載の方法を用いてＰＥＧ化することもできる。また、本明細書に開示の抗体を、イムノリポソームとして製剤してもよい。循環時間の改善されたリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０１０５】
また、本発明は、無傷の抗体の一部分、好ましくは無傷の抗体の抗原結合領域又は可変部を含んでなる「抗体断片」に関する。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）2、及びＦｖ断片；ダイアボディー；線状抗体；単鎖抗体分子；モノボディー；ダイアボディー；ラクダ化（camelized）モノボディー；抗体断片から形成されるドメイン抗体及び多重特異的抗体が挙げられる。
【０１０６】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含有する最小の抗体断片である。この領域は、非共有結合により強固に結合した１個の重鎖及び１個の軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置により、各可変ドメインの３個のＣＤＲが相互に作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体表面の抗原結合部位を規定することになる。これら６個のＣＤＲが全体として、抗体に抗原結合特異性を付与することになる。但し、単一の可変ドメイン（即ち、抗原特異的な３個のＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）であっても、抗原を認識し、結合する能力を有するが、全結合部位と比べて親和性は低い。
【０１０７】
また、Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ断片がＦａｂ′断片と異なる点は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が追加されている点であり、かかる残基には抗体ヒンジ領域由来の１又は２以上のシステインが含まれる。本明細書においてＦａｂ′−ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ′の呼称である。Ｆ（ａｂ′）2抗体断片は元来、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ′断片対として産生された。その他の抗体断片の化学的結合も知られている。脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は何れも、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、明確に区別される２つの型（κ及びλと呼ばれる）の何れかに分類される。
【０１０８】
「単鎖抗体分子」は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含んでなり、それらのドメインが単一のポリペプチド鎖に存在する抗体断片である。Ｆｖポリペプチドは更に、単鎖抗体分子が抗原結合に望ましい構造を形成し得るよう、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを有することが好ましい。
【０１０９】
「ダイアボディー」という語は、２つの抗原結合部位を有する小型の抗体断片を指す。この断片は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を、同一のポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内に含んでなる。同一鎖上にあるこれら２つのドメインが対合しないよう、十分に短いリンカーを使用することによって、これらのドメインを別の鎖の相補ドメインと強制的に対合させ、２つの抗原結合部位を生じさせる。ダイアボディーについては、例えば欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第９３／１１１６１号に、より詳しく記載されている。
【０１１０】
本明細書で用いられる「モノボディー」という語は、重鎖可変ドメインを有し、軽鎖可変ドメインのない抗原結合分子を意味する。モノボディーは、軽鎖の不在下でも抗原と結合することができ、通常はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３と名付けられた３個のＣＤＲ領域を有する。重鎖ＩｇＧモノボディーは、ジスルフィド結合によって連結された２つの重鎖抗原結合分子を有する。重鎖可変ドメインは、１又は２以上のＣＤＲ領域、好ましくはＣＤＲＨ３領域を含んでなる。
【０１１１】
「ラクダ化モノボディー」は、ラクダ科の動物から得られるモノボディー又はその抗原結合部分を指す。ラクダ科に含まれる動物は、２つの蹄と革状の足底とを有する脚を有する。ラクダ科の動物としては、ラクダ類、ラマ類、及びアルパカ類が挙げられる。ラクダ類（ヒトコブラクダ（Camelus dromedaries）及びフタコブラクダ（Camelus bactrianus））の血清由来のＩｇＧ様物質を分析すると、しばしば可変軽鎖ドメインの欠落が見られることが報告されている。これは、ＶＨドメイン（３つのＣＤＲループ）単独でも、十分な抗体特異性及び親和性が得られることを示唆している。
【０１１２】
本発明には単一ドメイン抗体も含まれる。単一ドメイン抗体（別名ドメイン抗体又はｄＡｂｓ）は、ヒト抗体の重鎖（ＶＨ）又は軽鎖（ＶＬ）の何れかの可変部に対応する抗体の最小の機能的結合単位である。ドメイン抗体は分子量約１３ｋＤａ、即ち完全抗体の十分の一未満の大きさである。通常の抗体とは対照的に、ドメイン抗体は、細菌、酵母、及び哺乳動物の細胞系でも十分に発現する。更に、ドメイン抗体の多くは安定性が高く、広範な医薬品の調合条件及び製造工程に従わせるための凍結乾燥又は熱変性等の過酷な条件に曝された後でも、活性を保持する。
【０１１３】
本発明のタンパク質は、程度の差こそあれ、精製した形態で提供してもよい。
【０１１４】
具体的に、本発明の天然、合成、又は組み換えアンタゴニストの精製は、この目的のために知られている方法の何れか（即ち、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動等を伴う任意の従来法）によって行なうことができる。本発明のタンパク質の精製に優先的に使用し得る更なる精製手順としては、標的タンパク質に結合するモノクローナル抗体又は親和性基を用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。かかるモノクローナル抗体又は親和性基は、カラム内のゲルマトリックス上に形成、固定化される。タンパク質を含有する不純調製物をカラムに通過させる。タンパク質はヘパリンによって、或いは特異的抗体によってカラムと結合するのに対し、不純物はそのまま通過する。洗浄後、ｐＨ又はイオン強度を変えることによって、タンパク質をゲルから溶出させる。或いは、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）を用いてもよい。溶離は、タンパク質精製用に一般に使用される水−アセトニトリル系溶媒を用いて行なうことができる。本発明のタンパク質の精製済み調製物とは、本明細書で用いる場合、上記タンパク質が（乾燥重量で）少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％の調製物を意味する。
【０１１５】
本発明の別の態様は、上記定義のｅｖａｓｉｎ−４ポリペプチドを（タンパク質の形態で、或いは上述した他の形態で）活性成分として含んでなるとともに、適切な希釈剤又は担体を含んでなる医薬組成物である。
【０１１６】
本発明の別の態様は、上記定義のｅｖａｓｉｎ−４ポリペプチドをコード化する核酸分子、或いは対応するベクター又は組み換え宿主細胞と、適切な希釈剤又は担体とを含んでなる医薬組成物である。
【０１１７】
本発明の更なる態様は、対象における免疫反応の調節用薬剤の製造における、上記定義のｅｖａｓｉｎ−４ポリペプチド、或いはそれをコード化する核酸の使用に関する。
【０１１８】
これらの組成物は薬剤、特に哺乳動物における免疫又は炎症性応答を調節するための薬剤、より具体的には抗炎症性化合物として使用することができる。
【０１１９】
一般的に、ＣＣケモカインが多数のヒト及び獣医学の疾病に関与していることを考慮すると、本発明のＣＣケモカイン結合タンパク質は、ＣＣケモカインのアンタゴニストとして、動物におけるＣＣケモカイン関連疾病の治療及び予防に使用することができる。ＣＣケモカイン関連疾病の非網羅的なリストには、炎症性疾患、自己免疫疾患、免疫病、感染症、アレルギー性疾患、心血管疾患、代謝性疾患、胃腸疾患、神経系疾患、敗血症、移植による拒絶反応に関連する疾患、又は線維性症候群が含まれる。これら疾患の例としては、限定されるものではないが、関節炎、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎、乾癬、慢性関節リウマチ、再狭窄、敗血症、変形性関節症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性硬化症、強皮症、多発性筋炎、糸状体腎炎、線維症、アレルギー性又は過敏性症候群、皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、線維腫、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、敗血性ショック、ウイルス感染、癌、子宮内膜症、移植、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、心臓及び腎臓再潅流傷害、及びアテローム性動脈硬化症が挙げられる。
【０１２０】
本発明のタンパク質又は特異的断片は、哺乳動物における免疫又は炎症性応答を調節するための医薬組成物、例えば抗炎症性組成物の製造において、活性成分として使用することができる。或いは、本発明のタンパク質又は特異的断片は、寄生生物、ウイルス、又は細菌に対する哺乳動物の予防接種用の医薬組成物の製造において、活性成分として使用することができる。かかる医薬組成物を調製するための工程は、ｅｖａｓｉｎ−４を医薬的に許容し得る希釈剤又は担体と混合するステップを含んでなる。
【０１２１】
本発明のタンパク質を活性成分として含有する医薬組成物を用いれば、インビボでＣＣケモカインを結合させ、対応する細胞表面の受容体とＣＣケモカインとの結合を遮断し、その結果として抗炎症効果等の潜在的な治療効果を生じさせることが可能となる。また、本発明のタンパク質を活性成分として含有する医薬組成物を用いれば、ウイルス、細菌、又は寄生生物に存在するＣＣケモカイン類似体を結合することにより、これらのウイルス、細菌、又は寄生生物が細胞内に侵入するのを阻止することもできる。ウイルス、細菌、又は寄生生物に対する哺乳動物の予防接種用の医薬組成物は、活性成分として本発明のタンパク質の断片を含んでいてもよい。上に示した組成物は、更に追加の免疫抑制剤又は抗炎症性物質を含んでいてもよい。
【０１２２】
医薬組成物は、活性成分としての本発明のタンパク質に加えて、医薬的に許容し得る適切な希釈剤、担体、生物学的適合性ビヒクル、並びに動物への投与に適した添加剤（例えば生理的塩類溶液）を含んでいてもよい。また、最終的には、活性化合物の医薬的に使用可能な調製剤への加工を容易にする補助剤（ビヒクル、安定剤、又はアジュバント等）を含んでいてもよい。医薬組成物の製剤は、投与方式の要請を満たす任意の許容し得る方法で処方し得る。例えば、薬物送達用の生体適合材料及び他のポリマーの使用、並びに特定の投与方式を有効にする様々な方法及びモデルが、文献に開示されている（Luo B.及びPreswich GD.(2001)、Cleland JL.等(2001)）。
【０１２３】
「医薬的に許容し得る」とは、活性成分の生物学的活性の有効性を妨げず、且つ、投与される宿主にとって有毒でない任意の担体を包含する意味である。例えば、非経口投与の場合、塩類溶液、デキストロース溶液、血清アルブミン、及びリンガー液等のビヒクルに活性成分を溶解させた注射用の単位剤形に処方することができる。また、担体は、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール、及び石油、動物、植物、又は合成起源の油を含めた様々な油（落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油）から選択することもできる。
【０１２４】
当業者であれば、所望の活性成分の血中濃度を達成するために、容認される何れの投与方式を使用及び決定してもよい。例えば投与は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹膜内、鼻腔内、経皮的、直腸、経口、又は頬内経路等の様々な非経口経路によって行なうことができる。また、本発明の医薬組成物は、ポリペプチドを所定の速度で長時間投与するために、蓄積注射、浸透流ポンプ等の持続又は制御放出剤形で投与してもよいが、正確な用量での単回投与に適した単位剤形で投与することが好ましい。
【０１２５】
非経口投与は、ボーラス投与で行なってもよく、時間をかけて徐放灌流により行なってもよい。非経口投与用の製剤としては、滅菌した水性又は非水性溶液、懸濁液、及び乳化液が挙げられる。これらは本技術分野で周知の補助剤又はビヒクルを含有していてもよく、また、定型的な方法に従って調製することができる。加えて、活性化合物の懸濁液を適切な油性注射用懸濁液として投与することもできる。好適な親油性溶媒又はビヒクルとしては、脂肪油類、例えばゴマ油や、合成脂肪酸エステル類、例えばゴマ油の合成脂肪酸エステルや、合成脂肪酸エステル類、例えばオレイン酸エチル又はトリグリセリド類が挙げられる。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、及び／又はデキストラン）を含有していてもよい。また、懸濁液は任意により、安定剤を含有していてもよい。医薬組成物には注射による投与に適した溶液が含まれ、かかる溶液は約０．０１から９９．９９パーセント、好ましくは約２０から７５パーセントの活性化合物を、ビヒクルと共に含有する。
【０１２６】
当然ながら、投与される用量は、受容者の年齢、性別、健康状態、及び体重、併用治療を行なう場合はその種類、治療の頻度、更には所望する効果の性質に依存することになる。その用量は（当業者であれば理解し、決定し得るように）個々の対象に合わせて決定される。各治療に必要な総用量は、多回投与により投与してもよく、単回投与により投与してもよい。本発明の医薬組成物は単独で投与してもよいが、対象となる病状（又は対象となる病状に関連する他の症状）に対する他の治療薬と組み合わせて投与してもよい。活性成分の１日投与量は通常、１日当たり体重１キログラム当たり０．０１から１００ミリグラムの範囲である。普通は１日当たり１キログラム当たり１から４０ミリグラムを分割量又は持続放出形態で投与するのが、所望の結果を得る上で効果的である。二回目以降の投与における用量は、同一個体に投与された最初又は以前の用量と比べて、同一でもよく、少なくてもよく、多くてもよい。
【０１２７】
本発明の別の態様は、本発明のＤＮＡによってコード化されるタンパク質の薬剤としての使用、具体的には哺乳動物の免疫又は炎症性応答の調節用の組成物の調製における使用である。
【０１２８】
本発明の更なる態様は、動物を吸血性の外寄生生物に対して免疫化する方法、又は免疫又は炎症性応答の調節が必要な動物においてかかる調節を行なう方法であって、前記動物に本発明のタンパク質を、免疫反応を調節するのに十分な期間及び条件の下で投与することを含んでなる方法である。
【０１２９】
本発明の別の態様は、ＣＣケモカイン関連疾患を治療又は予防する方法であって、本発明の化合物の有効量の投与を含んでなる方法である。
【０１３０】
「有効量」とは、その疾患の経過及び重症度に影響を及ぼし、かかる病状の縮小又は寛解をもたらすのに十分な活性成分量を意味する。有効量は、投与経路及び患者の状態に応じて異なる。
【０１３１】
「ＣＣケモカイン関連疾患」という表現は、過剰又は非制御のＣＣケモカインの産生に起因し、大量の単核細胞／マクロファージ／好中球／Ｔ細胞浸潤を伴う疾患であって、ｅｖａｓｉｎ−４の投与によって有益な効果が得られ得る任意の疾患を指す。かかる慢性、急性、又は遺伝性疾患の非網羅的なリストは上に示されている。
【０１３２】
本発明のＣＣケモカインアンタゴニスト及び関連する試薬の治療用途は、哺乳動物の細胞、組織、及びモデルを利用したインビボ又はインビトロアッセイによって（安全性、薬物動態、及び有効性の見地から）評価し得る。アッセイ法の非限定的なリストには、カルシウム動員、脱顆粒、炎症促進性サイトカインの上方調節、プロテアーゼの上方調節、インビボ又はインビトロでの細胞動員の阻害が含まれる。
【０１３３】
本発明の更なる態様は、本発明のＣＣケモカイン結合タンパク質に関連して開示された化合物の何れかを含有する試験キットである。例えば、ＣＣケモカイン又は類似体、或いはＣＣケモカイン結合タンパク質又は受容体、或いはＣＣケモカインとＣＣケモカイン結合タンパク質との相互作用、或いは上記相互作用のアンタゴニスト又はアゴニストを検出するためのキットであって、検出用試薬と、本発明のＣＣケモカイン結合タンパク質に由来する
ａ）核酸分子（例えばＤＮＡ）、
ｂ）オリゴヌクレオチド、
ｃ）ポリペプチド、及び
ｄ）抗体
からなる群より選択される化合物とを少なくとも含んでなるキットである。
【０１３４】
これらのキットは、インビトロ又はインビボに適用可能な方法において使用することができる。この場合、サンプルを上記化合物の何れかと接触させる。かかる化合物は標識してもよく、固体支持体に固定化してもよい。
【０１３５】
本発明について、特定の実施形態を参照しながら説明したが、本説明の内容には、当業者が特許請求の範囲の意味及び目的を越えることなく実施可能な、あらゆる修正及び置換が含まれる。
【実施例】
【０１３６】
以下、実施例を用いて本発明を説明するが、これらは何ら本発明を限定するものと解してはならない。実施例では以下に指定される図を参照する。
【０１３７】
実施例１：ＣＣケモカイン結合活性に関するクリイロコイタマダニｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング及びｅｖａｓｉｎ−４のクローニング
【０１３８】
材料及び方法
ａ．クリイロコイタマダニ ｃＤＮＡライブラリーの構築及びｅｖａｓｉｎ−３を発現する制御プラスミドの構築
【０１３９】
１００匹の成虫のダニ（クリイロコイタマダニ）から唾液腺を採取し、直ちに氷冷RNAlater(商標)溶液（Ambion）に入れ、使用するまで保存した。TRIzol(商標)法（Invitrogen）を用い、メーカーの説明書に従って全ＲＮＡを抽出した。SMART ｃＤＮＡライブラリー構築キット（Clontech）を用いて、ファージミドベクターλＴｒｉｐＩＥＸ２中でｃＤＮＡライブラリーを構築した。このｃＤＮＡを、ベクターとの連結反応に先立って、ChromaSpin 400カラム（Clontech）により、メーカーの説明書に従ってサイズ分画した。ライブラリー中のクローン化ｃＤＮＡ挿入断片のサイズは約０．６ｋｂから１．５ｋｂの範囲であり、挿入断片の頻度は約８０％であった。
【０１４０】
ｐＴｒｉｐＩＥＸ２中のクリイロコイタマダニ唾液腺ｃＤＮＡライブラリー由来のｃＤＮＡ挿入断片を制限酵素ＳｆｉＩで切除し、哺乳動物細胞発現ベクターｐＥＸＰ−ｌｉｂ（Clontech）中にサブクローン化した。ｐＥＸＰ−ｌｉｂベクターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の主要な極初期プロモーター／エンハンサーとそれに続くマルチクローニング部位、脳心筋ウイルス（ＥＣＭＶ）のリボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、ピューロマイシン耐性をコード化する遺伝子（ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）、及びウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルを含んでなる発現カセットを含有する。このマルチクローニング部位は、２つの別個のＳｆｉ Ｉ部位（インターパリンドローム配列が異なるＳｆｉ ＩＡ及びＳｆｉ ＩＢ）を含有する。これによって、ｐＴｒｉｐＩＥＸ２ベクターからｐＥＸＰＩＩへのｃＤＮＡ挿入断片の定方向サブクローン化が可能となる。
【０１４１】
制御タンパク質ｅｖａｓｉｎ−３（配列番号１）をコード化するｃＤＮＡ（配列番号２）を、上述のｐＥＸＰ−ｌｉｂにクローニングして、ｐＥＸＰ−ｌｉｂ ｅｖａｓｉｎ−３を形成し、このタンパク質を発現させた。
【０１４２】
ｂ．ｃＤＮＡライブラリースクリーニング
【０１４３】
ヒト胎児腎臓細胞２９３（ＨＥＫ２９３細胞、ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＣ−１５７３）を、ＤＭＥＭ−Ｆ１２ Ｎｕｔ Ｍｉｘ、熱不活性化１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン−スプレプトマイシンの溶液中に維持した。トランスフェクションの２４時間前に、細胞を９６ウェルフォーマットの細胞培養プレートに、約５０％のコンフルーエンスとなるように蒔種した。
【０１４４】
ｐＥＸＰ−ｌｉｂ中のクリイロコイタマダニ唾液腺ｃＤＮＡライブラリーを、約２７０のｃＤＮＡクローンを含有する１００のプールに分画した。これらのプールの小スケール培養物（５ｍｌ）からプラスミドミニプレップＤＮＡを単離し、GenePorter2トランスフェクションキット（Gene Therapy Systems）を使用して、メーカーのプロトコルに従ってＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトさせた。ｅｖａｓｉｎ−３をコード化するｃＤＮＡを含有するｐＥＸＰ−ｌｉｂプラスミドを、同様にＨＥＫ２９３にトランスフェクトさせた。
【０１４５】
トランスフェクションから３日後に、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの培地を収穫した。条件培地を遠心分離して細胞デブリを除去し、上清を架橋アッセイに使用した。
【０１４６】
架橋実験のために、２０μｌの条件培地サンプルを９６ウェルプレート（Costar）に移した。放射線標識したＣＣケモカイン（125Ｉ−ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ又は125Ｉ−ＣＣＬ１１／エオタキシンの何れか）を加えて、最終濃度を０．２３ｎＭとし、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。二重に調製した陽性対照（ｅｖａｓｉｎ−３）含有サンプルの２０μｌのアリコットに、125Ｉ−ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８を加えた。３μｌのＢＳ３架橋試薬（２５ｍＭ）を各サンプルに（但し、複製ｅｖａｓｉｎ−３上清の方のみに）加え、攪拌しながら更に１時間培養した。この時間の後、１０×サンプルバッファー（１０％ＳＤＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％グリセロール、０．２％（ｗ／ｗ）ブロモフェノールブルー、１ＭのＤＴＴを含有する１２５ｍＭトリス塩基（ｐＨ６．８））５μｌを各ウェルに加えて架橋反応を停止した。次いで、これらのサンプルを５分間煮沸し、１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Invitrogen NuPAGE、カタログ番号NP0301BOX）を用いて電気泳動した。電気泳動後、ゲルをサランラップ(商標)で密閉し、Ｋ型ストレージホスホイメージングスクリーン（storage phosphoimaging screen）（Biorad）に３〜１６時間暴露した。イメージングスクリーンの走査は、Biorad Personal FX phosphoimagerを用いて１００μｍの分解能で行なった。
【０１４７】
結果
ダニクリイロコイタマダニの唾液が、ＩｇＧ及びサイトカイン産生の抑制（Matsumoto K.等(2003)）又はＴ細胞の増殖（Ferreira BR.及びSilva JS.(1998)）等の免疫調節活性を有することは示されているが、ＣＣ又はＣＸＣケモカインに対する特異的な活性については知られていない。しかし、他のダニ種の唾液ではケモカイン結合活性が検出されている（Hajnicka等(2005)）。
【０１４８】
クリイロコイタマダニのＣＣケモカイン結合活性をＤＮＡ／タンパク質配列レベルで検出するために、クリイロコイタマダニの唾液腺からｃＤＮＡライブラリーを作製した。このライブラリーからのｃＤＮＡのプールを用いて、ＨＥＫ２９３にトランスフェクトさせた。
【０１４９】
この系で、ＨＥＫ２９３細胞は分泌タンパク質をコード化するｃＤＮＡを発現し、培地中に分泌する。この上清を、放射線標識ＣＣケモカイン（125Ｉ−ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ又は125Ｉ−ＣＣＬ１１／エオタキシン）への結合を見る架橋アッセイによって直接、試験することができる。放射線標識ＣＣケモカイン／ＣＣケモカイン結合タンパク質に架橋試薬を加えると、これら二つの分子が共有結合で連結され、タンパク質複合体が安定化する。得られた複合体は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びそれに続くオートラジオグラフィーによって可視化される、本来のケモカインの分子量から複合体の分子量へのバンドシフトとして同定することができる。この架橋法は極めて感度が高く、ナノグラムの量のタンパク質を検出可能である（図２）。
【０１５０】
陽性対照として、ＣＸＣＬ８に特異的に結合することが知られているｅｖａｓｉｎ−３をトランスフェクトされたＨＥＫ細胞由来の条件培地を並行して試験した。陰性対照として、偽トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からの条件培地を用いた。架橋アッセイで陽性シグナルを生じさせたｃＤＮＡプールを、ＣＣケモカイン結合活性の原因である単一のトランスフェクトされたｃＤＮＡが同定できるようになるまで、スクリーニング及び逆重畳の周回に供した。得られたｃＤＮＡをｅｖａｓｉｎ−４と名付けた（図１）。
【０１５１】
ｅｖａｓｉｎ−４の全長ｃＤＮＡ（配列番号３、図１）は、１２７のアミノ酸からなるタンパク質（配列番号５）をコード化するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ；配列番号４）を有する。このタンパク質配列はシグナルペプチド配列（アミノ酸１〜１７）を有し、これが切断されて、１１０のアミノ酸からなる成熟タンパク質（配列番号６）が生じるものと予測される。Ｅｖａｓｉｎ−４と有意な同一性を示す他の公知のタンパク質は存在しなかった。ｅｖａｓｉｎ−４の更なる特徴は、７つの潜在的Ｎ結合グリコシル化部位及び９つのシステイン残基である。
【０１５２】
実施例２：トランスフェクトされたＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞の培養上清からの切断型６ＨＩＳタグ化ｅｖａｓｉｎ−４（Δ６ｅｖａｓｉｎ−４）の精製
【０１５３】
材料及び方法
ａ．Gateway商標クローニング法を用いた、６つのヒスチジンからなる（６Ｈｉｓ）タグをＮ末端に有するΔ６ｅｖａｓｉｎ−４ ｃＤＮＡの、発現ベクターｐＤＥＳＴ８及びｐＥＡＫ１２ｄへのサブクローニング
【０１５４】
ｅｖａｓｉｎ−４の全長アミノ酸配列は、予測によれば、１７のアミノ酸からなるシグナルペプチドを有し、理論上はこれが切断されて、１１０のアミノ酸からなる成熟タンパク質を生じる。生化学的特性決定用に組み換えｅｖａｓｉｎ−４を作製するために、一連のＰＣＲ反応によってｃＤＮＡコンストラクトを構成した。このＰＣＲでは、ｕＰＡのシグナルペプチド（配列番号７）を、５つのアミノ酸からなる可動性リンカー配列（ＧＳＰＮＳ）に融合し、更に、第２の可動性リンカー（ＧＳＰＮＳ）及びカスパーゼ８切断部位（ＬＥＴＤ）によって、全長ｅｖａｓｉｎ−４のアミノ酸２４〜１２７をコード化する配列から分離された、６ヒスチジンタグ配列を続けた。５アミノ酸リンカー配列及び６ＨＩＳタグの最初の３つのヒスチジンをコード化する配列を３’末端に有するＵＰＡのシグナルペプチドを作製するために、ＰＣＲ反応（ＰＣＲ１）に供した。この反応液は、２μｌ（５０ｎｇ）のプラスミドｐＥＡＫ１２ｄ−ＰＡＣ＿ｕｐａ−ＳＰ−ｈＩＬ１８ＢＰ−６Ｈｉｓ（図４）、３μｌのｄＮＴＰｓ（５ｍＭ）、１０μｌの１０×Ｐｆｘポリメラーゼバッファー、１μｌのＭｇＳＯ4（５０ｍＭ）、各々１．５μｌの遺伝子特異的プライマー（１０μＭ）ｓｐＵＰＡ−ＰＣＲ１Ｆ（配列番号１２）及びｓｐＵＰＡ−ＧＳＰＮＳＲ（配列番号１３）、並びに０．５μｌのPlatinum Pfx ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen）を含有し、最終量を５０μｌとした。増幅条件としては、初回変性工程を９４℃で４分間；９４℃で３０秒、４８℃で３０秒、及び６８℃で１分間を９サイクル；９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、及び６８℃で１分間を２０サイクル；６８℃で１０分間を１サイクル、更に４℃の保持サイクルを実施した。得られたＰＣＲ産物を１×ＴＡＥバッファー（Invitrogen）中１．５％アガロースゲルで可視化し、増幅産物をQIAquick ＰＣＲ精製キット（QIAGEN）を用いて精製した。このＰＣＲ産物（産物１、配列番号８）を３０μｌのＥＢバッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）で溶出した。
【０１５５】
ＰＣＲ２では、リンカー配列SPNS及びカスパーゼ８切断部位配列ＬＥＴＤを５’末端に有する成熟ｅｖａｓｉｎ−４コード化配列（アミノ酸２４〜１２７をコード化）を、ＰＣＲ反応混合液中で作製した。かかるＰＣＲ反応混合液は、５０μｌ中に、２μｌのｐＥＸＰ−Ｌｉｂ−Ｅｖａｓｉｎ−４（図５）（５０ｎｇ）、３μｌのｄＮＴＰ（５ｍＭ）、１０μｌの１０×Ｐｆｘポリメラーゼバッファー、１μｌのＭｇＳＯ4（５０ｍＭ）、各１．５μｌの遺伝子特異的プライマー（１０μＭ）ＳＰＮＳ−ＬＥＤＴ−Ｅｖａｓｉｎ−４Ｆ（配列番号１４）及びＥｖａｓｉｎ−４ＰＣＲ１Ｒ（配列番号１５）、並びに０．５μｌのPlatinum ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ （Invitrogen）を含有する。増幅条件は、ＰＣＲ１について上述した条件と同様とした。得られたＰＣＲ産物（産物２、配列番号９） を１×ＴＡＥバッファー（Invitrogen）中１．５％アガロースゲルで可視化し、増幅産物を、QIAquickＰＣＲ精製キット（QIAGEN）を用い、メーカーの説明書に従って、５０μｌＥＢバッファーで溶出して精製した。
【０１５６】
ＰＣＲ３では、５’の６ＨＩＳタグ配列をＰＣＲ産物２の５’末端に付加することにより、５アミノ酸リンカー及びカスパーゼ８切断部位配列が６ＨＩＳタグ配列により５’末端に結合したｅｖａｓｉｎ−４（アミノ酸２４〜１２７）をコード化するｃＤＮＡを生成した。反応混合物は、最終量５０μｌ中に、１０μｌの産物２、３μｌのｄＮＴＰ（５ｍＭ）、１０μｌの１０×Ｐｆｘポリメラーゼバッファー、１μｌのＭｇＳＯ4（５０ｍＭ）、各１．５μｌの遺伝子特異的プライマー（１０μＭ）６Ｈ−ＧＳＰＮＳ−Ｅｖａｓｉｎ−４Ｆ（配列番号１６）及びＥｖａｓｉｎ−４ＰＣＲ１Ｒ（配列番号１５）、並びに０．５μｌのPlatinum Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen）を含有する。ＰＣＲ３増幅条件としては、初回変性工程を９４℃で４分間；９４℃で３０秒、４８℃で３０秒、及び６８℃で１分間を９サイクル；９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、及び６８℃で１分間を２０サイクル；６８℃で１０分間を１サイクル、及び４℃の保持サイクルを実施した。得られたＰＣＲ産物（産物３、配列番号１０）を１×ＴＡＥバッファー（Invitrogen）中１．５％アガロースゲルで可視化し、QIAquick ＰＣＲ精製キット（QIAGEN）を用いて上述のように精製し、３０μｌのＥＢバッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）で溶出した。
【０１５７】
ＰＣＲ４では、ＰＣＲ１及びＰＣＲ３からのＰＣＲ産物をアニールし、増幅することにより、５’末端にGateway attB1配列、インフレームｕＰＡシグナルペプチド、リンカー、６ＨＩＳタグ、リンカー、及びカスパーゼ８切断部位が結合し、３’末端に停止コドンとGateway attB2配列が結合したｅｖａｓｉｎ−４（アミノ酸２４〜１２７）コード化配列を作製した（図３）。反応混合物（最終量５０μｌ中）は、９μｌのＰＣＲ産物１、３μｌのＰＣＲ産物３、３μｌのｄＮＴＰ（５ｍＭ）、１０μｌの１０×Ｐｆｘポリメラーゼバッファー、１μｌのＭｇＳＯ4（５０ｍＭ）、各１.５μｌのGatewayコンバージョンプライマー（１０μＭ）ｅｖａｓｉｎ４ＰＣＲ２Ｆ（配列番号１７）及びｅｖａｓｉｎ４ＰＣＲ２Ｒ（配列番号１８）、並びに０．５μｌのPlatinum ＰｆｘＤＮＡ ポリメラーゼを含有する。ＰＣＲ４反応の条件としては：９４℃で４分間；９４℃で３０秒、４８℃で３０秒、及び６８℃で１分間を９サイクル；９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、及び６８℃で１分を２０サイクル、６８℃で１０分間を１サイクル、及び、４℃の保持サイクルを実施した。得られたＰＣＲ産物（ＰＣＲ産物４、配列番号１１）を、メーカーの説明書に従って、１×ＴＡＥバッファー（Invitrogen）中１．５％ アガロースゲルで可視化し、予測分子質量に相当する泳動距離のバンドをQIAquickゲル抽出キット（QIAGEN）を用いてゲルから精製し、５０μｌのＥＢバッファーで溶出した。
【０１５８】
Gatewayクローニング法の第２段階は、Gateway修飾ＰＣＲ産物のGatewayエントリーベクターｐＤＯＮＲ２２１へのサブクローン化を伴う。５μｌの精製ＰＣＲ４産物を、１．５μｌのｐＤＯＮＲ２２１ベクター（０．１μｇ／μｌ）、２μｌのＢＰバッファー、及び１．５μｌのＢＰクロナーゼ（BP clonase）酵素混合物（Invitrogen）と混合し、最終体積を１０μｌとして、室温で１時間インキュベートした。１μｌ（２μｇ／μｌ）のプロテイナーゼＫを加えて反応を停止し、３７℃で更に１０分間インキュベートした。この反応物のアリコート（１μｌ）を用いて、以下の手順で電気穿孔することにより、大腸菌（E.Coli）ＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換した。即ち、ＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテント細胞（Invitrogen）の２０μｌアリコートを氷上で解凍し、ＢＰ反応混合物１μｌを加えた。この混合物を冷却した０．１ｃｍ電気穿孔キュベットに移し、BioRad Gene-Pulser(商標)を用いてメーカーのプロトコルに従って細胞に電気穿孔した。電気穿孔後直ちに、予め室温としたＳＯＣ培地（１ｍｌ）を加えた。この混合物を１５ｍｌスナップキャップ管に移し、振盪（２２０ｒｐｍ）しながら３７℃で１時間インキュベートした。次いでこの形質転換混合物のアリコート（１０μｌ及び１００μｌ）を、カナマイシン（４０μｇ／ｍｌ）を含有するＬ−ブイヨン（ＬＢ）プレート上に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１５９】
得られたカナマイシン耐性コロニー６つの培養物５ｍｌから、Qiaprep Turbo 9600ロボットシステム（Qiagen）を用いて、プラスミドミニプレップ（mini-prep）ＤＮＡを調製した。BigDye Terminator system（Applied Biosystemsカタログ番号4336919）を用い、メーカーの説明書に従って、プラスミドＤＮＡ（２００〜５００ｎｇ）を、２１Ｍ１３及びＭ１３ＲｅｖプライマーとともにＤＮＡシークエンシングに供した。配列決定反応物を、Montage SEQ 96 クリーンアッププレート（Milliporeカタログ番号LSKS09624）を用いて精製し、次いでApplied Biosystems 3700 ＤＮＡシークエンサーで分析した。
【０１６０】
次いで、適切な配列（ｐＤＯＮＲ２２１−ｓｐＵＰＡ−６Ｈ−Ｅｖａｓｉｎ−４、図６）を含有する１つのクローンから得られたプラスミド溶出液（１．５μｌ又は約１００ｎｇ）を用いて、１．５μｌのｐＤＥＳＴ８ベクター又は１．５μｌのｐＥＡＫ１２ｄベクター（０．１μｇ／μｌ）、２μｌのＬＲバッファー、及び１．５μｌのＬＲクロナーゼ（LR clonase：Invitrogen）を含有する最終体積１０μｌの組み換え反応物を調製した。混合物を室温で１時間インキュベートした。プロテイナーゼＫ（２μｇ）を加えて反応を停止し、３７℃で更に１０分間インキュベートした。各反応物のアリコート（１μｌ）を用いて、以下の手順で電気穿孔を行なうことにより、大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換した。即ち、ＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテント細胞（Invitrogen）のアリコート２０μｌを氷上で解凍し、ＬＲ反応混合物１μｌを加えた。混合物を冷却した０．１ｃｍ電気穿孔キュベットに移し、BioRad Gene-Pulser(商標)を用いて、メーカーが推奨するプロトコルに従って細胞に電気穿孔した。電気穿孔後直ちに、予め室温まで温めたＳＯＣ培地（１ｍｌ）を加えた。混合物を１５ｍｌスナップキャップ管に移し、振盪（２２０ｒｐｍ）しながら３７℃で１時間インキュベートした。次いで、この形質転換混合物のアリコート（１０μｌ及び１００μｌ）を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬ−ブイヨン（ＬＢ）プレート上に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１６１】
各形質転換物から３コロニーを５０μｌの滅菌水に懸濁させた。次いで、２５μｌのアリコットをＰＣＲ増幅に供した。５０μｌの反応混合物に、２μｌのｄＮＴＰ（５ｍＭ）、５μｌの１０×AmpliTaqポリメラーゼバッファー（１５ｍＭＭｇＳＯ4含有）、各２.５μｌのベクター特異的プライマー（１０μＭ）（ｐＥＡＫ１２ｄベクターについてはｐＥＡＫ１２Ｆ（配列番号２１）及びｐＥＡＫ１２Ｒ（配列番号２２）、ｐＤＥＳＴ８ベクターについてはｐＤＥＳＴ８Ｆ（配列番号２３）及びｐＤＥＳＴ８Ｒ（配列番号２４））、並びに０.５μｌのAmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen）を含有させた。ＰＣＲ反応としては、９６℃で２分間の初回変性工程；９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で３０秒を３５サイクル実施した。得られたＰＣＲ産物を１×ＴＡＥバッファー（Invitrogen）中１．５％アガロースゲルで可視化し、各コンストラクトについて適切なサイズの挿入物を含有するコロニーを選択し、ＤＮＡ精製に供した。プラスミドミニプレップＤＮＡは、５μｌの懸濁コロニーQiaprep Bio Robot 8000（Qiagen）を接種した５ｍｌの終夜培養物から調製した。ｐＥＡＫ１２ｄベクター（図７）のプラスミドＤＮＡ（２００〜５００ｎｇ）は、ｐＥＡＫ１２Ｆ（配列番号２１）及びｐＥＡＫ１２Ｒプライマー（配列番号２２）を用いたＤＮＡシークエンス決定に供した。ｐＤＥＳＴ８ベクター（図８）のプラスミドＤＮＡ（２００〜５００ｎｇ）は、上述のように、ｐＤＥＳＴ８Ｆ（配列番号２３）及びｐＤＥＳＴ８Ｒプライマー（配列番号２４）を用いたＤＮＡシークエンス決定に供した。
【０１６２】
プラスミドマキシプレップ（maxi-prep）ＤＮＡは、配列確認済ｐＥＡＫ１２ｄ＿Ｅｖａｓｉｎ−４−ＨＩＳクローンの培養物５００ｍｌから、Qiagen Plasmid MEGA キット（QIAGEN）を用いて、メーカーの説明書に従って調製した。プラスミドＤＮＡを滅菌水（又は１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５）に濃度１μｇ／μｌとなるよう再懸濁し、−２０℃で保存した。プラスミドミニプレップＤＮＡは、配列確認済ｐＤＥＳＴ８＿＿Ｅｖａｓｉｎ−４−ＨＩＳクローンの培養物５ｍｌから、Qiaprep Turbo 9600 roboticシステム（Qiagen）を用いて、上述のように調製した。
【０１６３】
ｃ．ＨＥＫ２９３細胞で発現された組み換えΔ６ｅｖａｓｉｎ−４の精製
【０１６４】
ｐＥＡＫ１２ｄ−ｓｐＵＰＡ−６Ｈｉｓ−Ｅｖａｓｉｎ−４（図７）によるトランスフェクションの６日後に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞から細胞培養上清（５００ｍｌ）を収穫し、２倍量の５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５、０．６ＭのＮａＣｌ及び８．７％（体積／体積）のグリセロール含有）で希釈した。サンプルを０.２２μｍの膜フィルターで濾過した後、次いで、Akta Purifier システム（Amersham）により、Ｎｉ2+イオンを充填した５ｍｌの金属キレートアフィニティーカラムHiTrap Chelating（Amersham）に、１００ｍＭ Ｎｉ（II）ＳＯ4（Ｆｌｕｋａ番号７２２８０）溶液を用いて、４℃で２ｍｌ／分でローディングした。このカラムを、０．６Ｍ ＮａＣｌ、８．７％グリセロール（Ｆｕｌｋａカタログ番号４９７８１）、及び２０ｍＭイミダゾール（Ｆｕｌｋａ番号５６７４９）を含有する５カラム体積（ＣＶ）の５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）で、５ｍｌ／分で洗浄することにより、非特異的に結合した物質を除去した。０．６Ｍ ＮａＣｌ、８．７％グリセロール、及び４００ｍＭイミダゾール（Ｆｕｌｋａカタログ番号５６７４９）を含有する２ＣＶの５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）により、カラムを５．０ｍｌ／分で５ｍｌの各画分中に溶出した。溶出タンパク質ピークを、５リットルの５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８.０）で１６時間透析して脱塩し、Freeze-dryer mobile 12EL（Virtis）を用いて凍結乾燥し、−２０℃で保存した。
【０１６５】
ｄ．組み換えΔ６ｅｖａｓｉｎ−４のウエスタンブロット及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
【０１６６】
ウエスタンブロット分析については、カラム溶出液を４×サンプルバッファー（ブロモフェノールブルーを、１２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ６．８。２０％グリセロール、１０％ＳＤＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１００ｍＭ ＤＴＴ含有）と混合）で１：３に希釈し、９５℃で５分間煮沸した。サンプル及びＨｉｓタグ化分子量標準（カタログ番号：LC5606；Invitrogen）を、ＭＥＳバッファー中１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル流路により、２００Ｖで３５分間電気泳動した。電気泳動したタンパク質に、トランスファーバッファー（３９ｍＭグリシン、４８ｍＭトリス塩基、及び２０％メタノール。ｐＨ８．３）中で２９０ｍＡの定電流をかけ、室温で１時間かけて、０．４５μｍニトロセルロース膜（カタログ番号：LC2001；Invitrogen）にエレクトロトランスファーした。この膜を、ロッカープラットホーム上で、２０ｍｌブロッキング溶液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び５％粉乳含有ＰＢＳ）中、室温で１時間インキュベートしてブロックした。次いでこの膜を、一次抗ヒスチジンタグ抗体を含有する溶液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び２．５％粉乳含有ＰＢＳで１：１０００に希釈）１５ｍｌ中で振盪しながら室温で２時間インキュベートした。使用した一次抗体は、ＨｉｓプローブＨ−１５（sc-803、Santa Cruz Biotechnology）又はＨｉｓプローブＧ−１８（sc-804、Santa Cruz Biotechnology）である。この膜を洗浄バッファー（ＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗い流し、洗浄バッファーを３回交換して洗浄（各１０分間）した。次いでこの膜を、ＨＲＰ結合二次抗体（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、２．５％粉乳含有ＰＢＳで１：３０００に希釈）中で振盪しながら室温で２時間インキュベートした。この膜を上述と同様にして再洗浄した。最後にこの膜をブロット乾燥し、抗体の染色をＥＣＬ(商標)Western Blotting Detection Reagentsキット（カタログ番号；RPN2106：Amersham Pharmacia）を用いて、メーカーの説明書に従って可視化した。
【０１６７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析については、１００ｍＭ ＤＴＴを含有する２×サンプルバッファー（Invitrogen）でカラム溶出液を１：１に希釈し、５分間煮沸した。サンプル及び分子量標準（Benchmark Protein Ladder；Invitrogen）を、ＭＥＳバッファー中１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル流路を用いて、２００Ｖで３５分間電気泳動した。電気泳動後のタンパク質を、Simply Blue SafeStain（Invitrogen）を用いて、メーカーの説明書に従って染色し、ゲルを蒸留水で５分間３回洗い流し、室温で１時間染色し、１時間水洗した。
【０１６８】
結果
組み換えΔ６ｅｖａｓｉｎ−４を作製するために、予測される成熟タンパク質配列のアミノ酸２４〜１２７を、ＯＲＦの５’末端に６Ｈｉｓタグ配列を有するとともに、予測される天然ｅｖａｓｉｎ−４のシグナルペプチド配列に換えて、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）のシグナルペプチド配列（図３）をインフレームに導入した状態で、哺乳類細胞発現ベクターpEAK１２d又は昆虫細胞発現ベクター（pDEST８）にサブクローン化した。組み換えΔ６ｅｖａｓｉｎ−４は、pEAK１２d-spUPA-６His-Ｅｖａｓｉｎ−４（図７）でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３EBNA細胞培養上清から、Ni2+-アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。精製タンパク質を分離したSDS-PAGEゲルをクマシー・ブルー染色したところ、Δ６ｅｖａｓｉｎ−４が発現され、種々の翻訳後修飾形態の混合物として精製されたことが示された。この翻訳後修飾は、昆虫細胞で発現された別のダニタンパク質に見られたように、おそらくはグリコシル化によるものと思われる（Alarcon-Chaidez FJ et al., 2003）。実際に、このタンパク質はスメアなバンドとして現われ、ＨＥＫ２９３で発現された組み換えタンパク質の場合、平均分子量は約３０〜４０Ｋｄであった（図９）。ＨＥＫ２９３からの種々の精製工程において存在する組み換えΔ６ｅｖａｓｉｎ−４を、ウエスタンブロット分析し、更にクマシー・ブルー染色した。精製された成熟タンパク質のＮ末端を配列決定したところ、配列ＧＳＰＮＳＨＨＨがＮ末端を形成することが確認された。
【０１６９】
実施例３：インビトロ及びインビボにおける組み換えΔ６ｅｖａｓｉｎ−４のＣＣケモカインに対する阻害活性の特性決定
【０１７０】
材料及び方法
ａ．受容体結合アッセイ
【０１７１】
平衡競合受容体結合アッセイ（equilibrium competition receptor binding assay）を用いて、ケモカイン／ケモカイン受容体相互作用に対する組み換えΔ６ｅｖａｓｉｎ−４の阻害特性を求めた。結合実験は、ヒトＣＣＲ１又はＣＣＲ５（ＣＨＯ／ＣＣＲ１又はＣＨＯ／ＣＣＲ５）を安定的に発現するＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）トランスフェクタントから調製した膜を用いて行なった。ＨＥＫ２９３細胞から精製した組み換えΔ６ｅｖａｓｉｎ−４を、０．１ｍｇ／ｍｌで、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファー（１ｍＭ ＣａＣｌ2、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 及び０．５％ＢＳＡ含有）に懸濁させ、９６ウェルプレート（F96 certified maxisort immunoplate, NUNC）中で、１１段階の４倍希釈液を調製した。１×ＰＢＳ中に５０ｍｇ／ｍｌで４℃で保存したWheatgermシンチレーション近接アッセイビーズ（Amersham）を上記培地で１０ｍｇ／ｍｌに希釈し、膜を同じ培地で８０μｇ／ｍｇに希釈した。２μｇ／ウェルのＣＨＯ／ＣＣＲ１又はＣＣＲ５膜、２５０μｇ／ウェルのビーズ、０．１ｎＭの［125Ｉ］−ＲＡＮＴＥＳ（Amershamカタログ番号：IM249）、及び２５μｌの組み換えΔ６ｅｖａｓｉｎ−４の段階希釈液を、９６ウェルの透明な平底プレート（Corning）の各ウェルに、最終量が１００μｌとなるように加え、組み換えタンパク質の最終濃度範囲を３５０μＭから０.０８ｐＭの範囲とした。次いで、混合物を振盪しながら室温で３時間インキュベートし、β−シンチレーションカウンター（Wallac）を用いて放射能活性を計数した。結果及び図１０参照。
【０１７２】
ｂ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による結合分析
【０１７３】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、組み換えΔ６ｅｖａｓｉｎ−４によるケモカイン結合の親和力及び動態を直接測定した。Δ６ｅｖａｓｉｎ−４をｐＨ４の１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（Biacore）中に５０μｇ／ｍｌとなるように懸濁させ、Biacore アミンカップリングキット（Biacore）による標準的なアミン結合化学によって、CM4チップ（Biacore）上に直接固定化し、Biacore3000 systemを用いて８００応答単位（ＲＵ）のレベルとした。タンパク質の不在下で化学カップリング反応を行なう対照として、ブランク細胞を調製した。実験は２５℃、３０μｌ／分で、ＨＢＳ−Ｐランニングバッファー（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、及び０．００５％界面活性剤P20）（Biacore）を用いて行なった。何れの結合実験でも、ケモカインはランニングバッファー中に０．１μｇ／ｍｌで懸濁させ、０．２２μｍフィルターを通して濾過した。３分間の注入時間に続いて、注入後の解離時間を２．５分間とした。チップを５０ｍＭグリシンバッファー（ｐＨ２．５）で３０秒間再生させた。何れの実験でも、ケモカインをランダムな順序で三重に注入した。
【０１７４】
分析に当たっては、ランニングバッファバッファー単独に由来するセンソグラムに加えて、ブランク細胞由来のセンソグラムを結合から減算し、系のノイズを除去した。結果及び図１１参照。
【０１７５】
ｃ．インビボでのケモカイン媒介性白血球動員の阻害
【０１７６】
Ｃ５７Ｂｌ６マウスに、ビヒクル（saline）又はｅｖａｓｉｎ−４を、１及び１０μｇ／マウスで皮下（s.c.）に投与した。その４５分後、１００ｎｇのＣＣ１１／エオタキシンを、マウスの胸膜腔内に投与した。２４時間後にマウスを屠殺し、浸潤白血球の総数をNeubauerチャンバーを用いて計数した。染色サイトスピンスライド上で鑑別計数（Differential counts）を行なった。各実験群の動物は３〜４頭とした。結果及び図１２を参照。
【０１７７】
結果
Δ６ｅｖａｓｉｎ−４のケモカイン結合特性を、受容体結合アッセイ及び表面プラズモン共鳴により検討した。
【０１７８】
受容体結合アッセイが示すところによれば、哺乳類細胞（ＨＥＫ２９３細胞）で発現されたΔ６ｅｖａｓｉｎ−４は、ヨウ素化ＲＡＮＴＥＳのＣＣＲ１及びＣＣＲ５への結合を阻害する能力を有し、そのＩＣ50値はそれぞれ７及び３ｎＭであった（図１０Ａ及びＢ）。
【０１７９】
ＳＰＲ分析によれば、Δ６ｅｖａｓｉｎ−４は、ケモカインファミリーの幾つかのメンバーへの結合能を有することが示された（図１１ＡからＬ）。
【０１８０】
更に、Δ６ｅｖａｓｉｎ−４の阻害活性は、エオタキシン／ＣＣＬ１１を胸膜腔内へ１及び１０μｇ／マウスの用量で投与することにより誘導される白血球動員を、Δ６ｅｖａｓｉｎ−４が阻害する能力を有することからも確かめられた（図１２）。動員される細胞の総数が減少した（図１２Ａ）のに加えて、各種の細胞型を列挙したところ、好酸球数には有意な減少が見られた（図１２Ｂ）が、動員単核細胞数の減少はより小さかった（図１２Ｃ）。
【０１８１】
実施例４：ｅｖａｓｉｎ−４の全長成熟アミノ酸配列のＮ末端に６ＨＩＳタグを有する発現コンストラクトの、ＨＥＫ２９３／ＥＢＮＡ細胞での発現のための生成
【０１８２】
プラスミドpDONR２２１-spUPA-６H-Ｅｖａｓｉｎ−４（図６）に部位特異的突然変異を誘発し、全長ｅｖａｓｉｎ−４配列のアミノ酸１８〜２３（WLSTKC）をコード化する配列を再建した。ＰＣＲ反応は、（最終量５０μｌ中）２μｌ（２０ｎｇ）のプラスミドｐＤＯＮＲ２２１−ｓｐＵＰＡ−６Ｈｉｓ−Ｅｖａｓｉｎ−４、１μｌのｄＮＴＰ混合液、５μｌの１０×反応バッファー、各２μｌの遺伝子特異的プライマー（６２．５μＭ）６Ｈｉｓ−ＷＬＳＴＫＣ−Ｅｖａｓｉｎ−４Ｆ及び６Ｈｉｓ−ＷＬＳＴＫＣ−Ｅｖａｓｉｎ−４Ｒ（配列番号２６及び２７）、及び１μｌのPfu Ultra HF ＤＮＡポリメラーゼを含有する反応液を用いて４重に、メーカーの説明書に従って行なった。ＰＣＲ反応としては、９５℃で３０秒の初回変性工程の後；９５℃で３０秒、５５℃で１分間及び６８℃で４分間を１８サイクル；６８℃で７分間を１サイクル、及び４℃の保持サイクルを実施した。
【０１８３】
部位特異的突然変異誘発法の第２段階は、新規合成した突然変異含有ＤＮＡ（挿入体）を選択するため、ＰＣＲ産物を（メチル化及び半メチル化ＤＮＡに特異的な）Dpn1エンドヌクレアーゼで処理し、親のメチル化プラスミドＤＮＡを消化することを含む。The ＰＣＲ産物を、メーカーの説明書に従って、１μｌのDpn1制限酵素（１０Ｕ／μl）と共に、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１８４】
Dpn1消化反応のアリコット（１μｌ）を用いて、熱ショックにより、以下の手順で大腸菌XL-10 blue細胞を形質転換した。即ち、XL-1 blueコンピテント細胞（Stratagene）の５０μｌアリコットを氷上で解凍し、１μｌのDpn1反応混合物を加えた。混合物を氷上で３０分間インキュベートし、細胞に４２℃で４５秒の熱ショックを加えた。続いて、細胞を氷浴に２分間移した。その後、NZY培地（０．５ｍｌ）（４２℃に予熱）を加えた。混合物を１５ｍｌのスナップキャップチューブに移し、攪拌（２２０ｒｐｍ）しながら３７℃で１時間インキュベートした。続いて、形質転換混合物のアリコット（２５０μｌ）をＬブロス（ＬＢ）プレート（アンピシリン（１００μg／ｍｌ）含有）に接種し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１８５】
得られたコロニーのうち６０から５ｍｌの培養物を取得し、Qiaprep Turbo 9600ロボットシステム（Qiagen）を用いてプラスミドミニプレップＤＮＡを調製した。プラスミドＤＮＡ（２００〜５００ｎｇ）を、２１Ｍ１３及びＭ１３Ｒｅｖプライマーと共に、BigDyeTerminatorシステム（Applied Biosystemsカタログ番号4336919）により、メーカーの説明書に従ってＤＮＡ配列決定に供した。配列決定用の反応液を、Montage SEQ 96クリーンアッププレート（Milliporeカタログ番号LSKS09624）を用いて精製した後、Applied Biosystems 3700 ＤＮＡシークエンサーを用いて分析した。
【０１８６】
適切な挿入配列（ｐＤＯＮＲ２２１−ｓｐＵＰＡ−Ｅｖａｓｉｎ−４ＦＬ、図１４）を含有する１のプラスミドの突然変異ＯＲＦ（図１３）を、組み換え反応液中のｐＥＡＫ１２ｄ又はｐＤＥＳＴに移送した。前記反応液は、１．５μｌ又は約１００ｎｇのプラスミド溶出液、１．５μｌのｐＤＥＳＴ８ベクター又はｐＥＡＫ１２ｄベクターの何れか（０．１μｇ／μｌ）、２μｌのＬＲバッファー、及び１．５μｌのＬＲクロナーゼ（Invitrogen）を含有し、最終量は１０μｌであった。反応混合物を室温で１時間インキュベートした後、プロテイナーゼＫ（２μｇ）を加えて反応を停止し、３７℃で更に１０分間インキュベートした。各反応液のアリコット（１μｌ）を用いて、電気穿孔法により、以下の手順で大腸菌DH10B細胞に形質転換した。即ち、DH10Bエレクトロコンピテント細胞（Invitrogen）の２０μｌのアリコットを氷上で解凍し、１μｌのLR反応混合液を加えた。混合物を冷蔵の０.１ｃｍ電気穿孔法キュベットに移送し、BioRad Gene-Pulser(商標)を用いて、メーカーの推奨するプロトコルに従って細胞に電気穿孔した。電気穿孔法の直後に、予め室温としたSOC培地（１ｍｌ）を加えた。混合物を１５ｍｌのスナップキャップチューブに移し、振盪（２２０ｒｐｍ）しながら３７℃で１時間インキュベートした。続いて、形質転換混合物のアリコット（１０μｌ及び１００μｌ）をＬブロス（ＬＢ）プレート（アンピシリン（１００μg／ｍｌ）含有）に蒔種し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１８７】
各形質転換当たり５つのコロニーをコロニーＰＣＲで分析した。コロニーを５０μｌの滅菌水に懸濁させ、２５μｌのアリコットをＰＣＲに供する。ＰＣＲ液は（最終量５０μｌ中）２μｌのｄＮＴＰ（５ｍＭ）、５μｌの１０×AmpliTaqポリメラーゼバッファー（１５ｍＭ ＭｇＳＯ4含有）、各２．５μｌのベクター特異的プライマー（１０μＭ）（ｐＥＡＫ１２ｄベクター用にｐＥＡＫ１２Ｆ及びｐＥＡＫ１２Ｒ、及び、ｐＤＥＳＴ８ベクター用にｐＤＥＳＴ８Ｆ及びｐＤＥＳＴ８Ｒ）、及び、０.５μｌのAmpliTaq ＤＮＡ ポリメラーゼ（Invitrogen）を含有する。ＰＣＲ反応としては、９６℃で２分間の初回変性工程の後；９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で３０秒を３５サイクル実施した。得られたＰＣＲ産物を１×ＴＡＥバッファー（Invitrogen）中１.５％アガロースゲルで可視化し、適切な挿入物を含有する１つのコロニーを選択してＤＮＡ精製に供した。各ベクターにサブクローン化された懸濁コロニー５μｌを接種した培養物５ｍｌから、Qiaprep Bio Robot 8000（Qiagen）を用いてプラスミドミニプレップＤＮＡを調製し、−２０℃で保存した。
【０１８８】
種々の（サブ）クローニング工程に使用したプライマー配列を表IIIに挙げる。
【０１８９】
結果
組み換えｅｖａｓｉｎ−４ＦＬを作製するために、プラスミドｐＤＯＮＲ２２１−ｓｐＵＰＡ−６Ｈ−Ｅｖａｓｉｎ−４（図６）に対して部位特異的突然変異を誘発し、全長ｅｖａｓｉｎ−４配列のアミノ酸１８〜２３（ＷＬＳＴＫＣ）をコード化する配列を再建した（図１４）。得られたｃＤＮＡ配列は、５’末端から順に、５アミノ酸の可動性リンカー配列（ＧＳＰＮＳ）に融合したｕＰＡのシグナルペプチド配列、続いて６ヒスチジンタグ配列、第２の可動性リンカー（ＧＳＰＮＳ）、カスパーゼ８切断部位（ＬＥＴＤ）配列、続いてｅｖａｓｉｎ−４のアミノ酸１８〜１２７をコード化するｃＤＮＡ配列（配列番号２５）を含有していた。その後、このｃＤＮＡ配列を、哺乳類細胞発現ベクターｐＥＡＫ１２ｄ（図１５）、又は、昆虫細胞発現ベクターｐＤＥＳＴ８（図１６）に、Gatewayクローニングシステムを用いて、組み換えによりサブクローン化した。
【０１９０】
結論
従って、ｅｖａｓｉｎ−４はＣＣケモカイン結合特性を有する新規のタンパク質であり、ケモカインの作用を阻害する能力を有すると結論付けられる。このタンパク質は、抗炎症化合物としてヒト用の医薬に有用に適用できるほか、（ダニ媒介性感染物質を含む）ダニの寄生作用に関連する医学及び獣医学的適応にも使用できる。本発明のタンパク質に基づく分子であって、かかるタンパク質の機能と干渉する分子は、ダニの生活環を中断し、外寄生生物やその病原体を抑制し、或いはダニの疾患原因生物を伝播する能力を低下させる可能性がある。
【０１９１】
【表１】
2009526535.tif 000002
【０１９２】
【表２】
2009526535.tif 000003
【０１９３】
【表３】
2009526535.tif 000004
【０１９４】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０１９５】
【図１】ｅｖａｓｉｎ−４ ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳を含む。SIGNALJ アルゴリズムで予測したシグナル配列（アミノ酸１〜１７）に下線を付す。予測されるポリアデニル化部位を囲み線で示す。成熟タンパク質に存在するシステイン残基を強調表示する。潜在的なＮ結合グリコシル化部位を太字で記す。
【図２】（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのオートラジオグラフ。125Ｉ標識ＣＣケモカイン ＣＣＬ１１／エオタキシンを、組み換えｅｖａｓｉｎ−４でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の培養上清と、クロスリンカーＢＳ３を用いて架橋させることにより形成された複合体を示す。レーン１、125Ｉ−ＣＣＬ１１／エオタキシンに架橋されたウイルス性ＣＣケモカイン結合タンパク質（ｐ３５）（陽性対照）；レーン２、ＢＳ３の不在下で125Ｉ−エオタキシンとインキュベートしたウイルス性ＣＣケモカイン結合タンパク質（ｐ３５）；レーン３、125Ｉ−ＣＸＣＬ８／ＩＬ-８と架橋されたｅｖａｓｉｎ−３トランスフェクタントからのＨＥＫ２９３細胞培養上清（陽性対照）；レーン４、125Ｉ−ＣＣＬ１１／エオタキシン及びＢＳ３と架橋された非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞培養上清（陰性対照）；レーン５及び６、ＣＣＬ１１／エオタキシン及びＢＳ３とインキュベートされた陰性プールからのＨＥＫ２９３細胞培養上清；レーン７、125Ｉ−ＣＣＬ１１／エオタキシン及びＢＳ３とインキュベートされたプール１０．７からのＨＥＫ２９３細胞培養上清。（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのオートラジオグラフ。125Ｉ標識ＣＣケモカインＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳを、組み換えｅｖａｓｉｎ−４でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の培養上清と、クロスリンカーＢＳ３を用いて架橋させることにより形成された複合体を示す。レーン１、125Ｉ−ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳに架橋されたウイルス性ＣＣケモカイン結合タンパク質（ｐ３５）（陽性対照）；レーン２、ＢＳ３の不在下で125Ｉ−ＲＡＮＴＥＳとインキュベートしたウイルス性ＣＣケモカイン結合タンパク質（ｐ３５）；レーン３、125Ｉ−ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８と架橋されたｅｖａｓｉｎ−３トランスフェクタントからのＨＥＫ２９３細胞培養上清（陽性対照）；レーン４、125Ｉ−ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ及びＢＳ３と架橋された非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞培養上清（陰性対照）；レーン５及び６、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ及びＢＳ３とインキュベートされた陰性プールからのＨＥＫ２９３細胞培養上清；レーン７、125Ｉ−ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ及びＢＳ３とインキュベートされたプール１０．７からのＨＥＫ２９３細胞培養上清。
【図３】５’末端にｕＰＡシグナルペプチド配列（アミノ酸１〜２０）、５アミノ酸リンカー配列（ＧＳＰＮＳ）及び６ヒスチジンタグが隣接し、３’末端に停止コドンが隣接する、ｅｖａｓｉｎ−４ＯＲＦ（Δ６ｅｖａｓｉｎ−４）のアミノ酸２４〜１２７をコード化するGatewayクローニングシステム適合ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び翻訳。矢印はｃＤＮＡに用いたＰＣＲプライマーの位置及び方向を示す（プライマー配列は表IIIに挙げる）。開始及び停止コドンは太字で示す。予測されるシグナルペプチド配列は斜字体で示す。
【図４】ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子（ＵＰＡ）のシグナルペプチド配列を増幅するためのテンプレートとして用いたｐＥＡＫ１２ｄ−ＰＡＣ＿ｕｐａ−ＳＰ−ｈＩＬ１８ＢＰ−６Ｈｉｓ−Ｖ１ベクターのマップである。
【図５】ｅｖａｓｉｎ−４のｃＤＮＡを増幅するためのテンプレートとして用いたｐＥＸＰ−Ｌｉｂ−Ｅｖａｓｉｎ−４ベクターのマップである。
【図６】ｐＤＯＮＲ２２１−ｓｐＵＰＡ−６Ｈｉｓ−Ｅｖａｓｉｎ−４（Gatewayエントリーベクター）のマップである。
【図７】ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３／ＥＢＮＡ）細胞におけるΔ６ｅｖａｓｉｎ−４の産生のためのGateway発現ベクターである、ｐＥＡＫ１２ｄ−ｓｐＵＰＡ−６Ｈｉｓ−Ｅｖａｓｉｎ−４のマップである。
【図８】ＴＮ５（昆虫）細胞におけるΔ６ｅｖａｓｉｎ−４の発現のためのGateway発現ベクターである、ｐＤＥＳＴ８−ｓｐＵＰＡ−６Ｈｉｓ−Ｅｖａｓｉｎ−４のマップである。
【図９】Ａ）Ｎｉ2+親和性クロマトグラフィーを用いてＨＥＫ２９３細胞から精製したΔ６ｅｖａｓｉｎ−４を示す、クマシー・ブルー染色１０％ＳＤＳポリアクリルアミド（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルである。レーン１、分子量マーカー；レーン２及び３、Ｎｉ2+親和性カラムからの溶出後の組み換えΔ６ｅｖａｓｉｎ−４画分。Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからニトロセルロース膜へのトランスファー後のウエスタンブロット分析。マウス抗６Ｈｉｓ抗体を第１抗体として、ウサギ抗マウス抗体を第２抗体として用い、化学発光により検出した。
【図１０】平衡的競合結合アッセイにおける、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳのＣＣＲ５（Ａ）及びＣＣＲ１（Ｂ）への結合の、Δ６ｅｖａｓｉｎ−４による阻害。ＩＣ５０値は、ＣＣＲ５については３ｎＭ、ＣＣＲ１については７ｎＭであった。
【図１１Ａ】ＣＭ４チップに固定化されたΔ６ｅｖａｓｉｎ−４に結合したケモカインの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。ＣＣＬ２６／エオタキシン−３。
【図１１Ｂ】ＣＭ４チップに固定化されたΔ６ｅｖａｓｉｎ−４に結合したケモカインの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。Ｅ６６Ａ−ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ。
【図１１Ｃ】ＣＭ４チップに固定化されたΔ６ｅｖａｓｉｎ−４に結合したケモカインの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３。
【図１１Ｄ】ＣＭ４チップに固定化されたΔ６ｅｖａｓｉｎ−４に結合したケモカインの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ。
【図１１Ｅ】ＣＭ４チップに固定化されたΔ６ｅｖａｓｉｎ−４に結合したケモカインの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ。
【図１１Ｆ】ＣＭ４チップに固定化されたΔ６ｅｖａｓｉｎ−４に結合したケモカインの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。ＣＣＬ１／Ｉ−３０９。
【図１１Ｇ】ＣＭ４チップに固定化されたΔ６ｅｖａｓｉｎ−４に結合したケモカインの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α。
【図１１Ｈ】ＣＭ４チップに固定化されたΔ６ｅｖａｓｉｎ−４に結合したケモカインの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。マウスＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α。
【図１１Ｉ】ＣＭ４チップに固定化されたΔ６ｅｖａｓｉｎ−４に結合したケモカインの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。ＣＣＬ２２／ＭＤＣ。
【図１１Ｊ】ＣＭ４チップに固定化されたΔ６ｅｖａｓｉｎ−４に結合したケモカインの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。ＣＸＣＬ１１／Ｉ−ＴＡＣ。
【図１１Ｋ】ＣＭ４チップに固定化されたΔ６ｅｖａｓｉｎ−４に結合したケモカインの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。ＣＣＬ１６／ＨＣＣ−４。
【図１１Ｌ】ＣＭ４チップに固定化されたΔ６ｅｖａｓｉｎ−４に結合したケモカインの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。Δ６ｅｖａｓｉｎ−４への結合が観察されなかったケモカインについて得られた重畳センソグラム：ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ−４、ＸＣＬ１／リンフォタクチン、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＣＣＬ２１／ＳＬＣ、ＣＣＬ１５／ＨＣＣ−２、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ１α,、ＣＸＣＬ８／ＩＬ８、ＣＸＣＬ１／Ｇｒｏ−α及びＣＸ３ＣＬ１／フラクタルカイン。
【図１２Ａ−Ｂ】インビボでの細胞動員阻害。ＣＣＬ１１／エオタキシン投与の４５分間前にΔ６ｅｖａｓｉｎ−４をマウス胸膜腔内に投与。２４時間後に細胞動員を測定。Ａ、動員された細胞の総数；Ｂ、動員された好酸球の数。ＣＣＬ１１／エオタキシンによる動員数を黒色バーで示し、１又は１０μｇのΔ６ｅｖａｓｉｎ−４による阻害をハッチ付バーで示す。
【図１２Ｃ】インビボでの細胞動員阻害。ＣＣＬ１１／エオタキシン投与の４５分間前にΔ６ｅｖａｓｉｎ−４をマウス胸膜腔内に投与。２４時間後に細胞動員を測定。Ｃ、動員された単核細胞の数。ＣＣＬ１１／エオタキシンによる動員数を黒色バーで示し、１又は１０μｇのΔ６ｅｖａｓｉｎ−４による阻害をハッチ付バーで示す。
【図１３】５’末端にｕＰＡシグナルペプチド配列（アミノ酸１〜２０）、５アミノ酸リンカー配列（ＧＳＰＮＳ）、６ヒスチジンタグ、第２の５アミノ酸リンカー配列、及びカスパーゼ８切断部位配列（ＬＥＴＤ）が隣接し、３’末端に停止コドンが隣接する、ｅｖａｓｉｎ−４ＯＲＦ（ＦＬ ｅｖａｓｉｎ−４）のアミノ酸１８〜１２７をコード化する、Gatewayクローニングシステム適合ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び翻訳。矢印は、ｃＤＮＡの作成に使用したＰＣＲプライマーの位置及び方向を示す（プライマー配列は表IIIに挙げる）。開始及び停止コドンを太字で示す。予測されるシグナルペプチド配列を斜字体で示す。
【図１４】Gatewayエントリーベクターである、ｐＤＯＮＲ２２１−ｓｐＵＰＡ−６Ｈｉｓ−Ｅｖａｓｉｎ−４ＦＬベクターのマップである。
【図１５】ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３／ＥＢＮＡ細胞）における発現用のGateway発現ベクターである、ｐＥＡＫ１２ｄ−ｓｐＵＰＡ−６Ｈｉｓ−Ｅｖａｓｉｎ−４ＦＬのマップである。
【図１６】ＴＮ５（昆虫）細胞における発現用のGateway発現ベクターである、ｐＤＥＳＴ８−ｓｐＵＰＡ−６Ｈｉｓ−Ｅｖａｓｉｎ−４ＦＬのマップである。
【図１】
2009526535.tif 000005
【図２】
2009526535.tif 000006
【図３】
2009526535.tif 000007
【図４】
2009526535.tif 000008
【図５】
2009526535.tif 000009
【図６】
2009526535.tif 000010
【図７】
2009526535.tif 000011
【図８】
2009526535.tif 000012
【図９】
2009526535.tif 000013
【図１０】
2009526535.tif 000014
【図１１Ａ】
2009526535.tif 000015
【図１１Ｂ】
2009526535.tif 000016
【図１１Ｃ】
2009526535.tif 000017
【図１１Ｄ】
2009526535.tif 000018
【図１１Ｅ】
2009526535.tif 000019
【図１１Ｆ】
2009526535.tif 000020
【図１１Ｇ】
2009526535.tif 000021
【図１１Ｈ】
2009526535.tif 000022
【図１１Ｉ】
2009526535.tif 000023
【図１１Ｊ】
2009526535.tif 000024
【図１１Ｋ】
2009526535.tif 000025
【図１１Ｌ】
2009526535.tif 000026
【図１２Ａ−Ｂ】
2009526535.tif 000027
【図１２Ｃ】
2009526535.tif 000028
【図１３】
2009526535.tif 000029
【図１４】
2009526535.tif 000030
【図１５】
2009526535.tif 000031
【図１６】
2009526535.tif 000032
【配列表】
2009526535000001.app
【国際調査報告】
2009526535.tif 000033
2009526535.tif 000034
2009526535.tif 000035