(57)【要約】本発明は、ＩＬ−６に結合する単量体ドメインまたはそれらの一部を含むポリペプチドを提供する。本発明の一部の実施形態において、このポリペプチドは、ＩＬ−６に結合する単量体ドメインを含み、この場合の単量体ドメインは、配列番号１および２（これらの配列式中のＸは、任意のアミノ酸であり、角型カッコ内アミノ酸は、指定位置での代替アミノ酸を示す）のいずれかを含む、ＬＤＬ受容体クラスＡ単量体ドメインである。一部の実施形態において、本ポリペプチドは、ＩＬ−６に結合する少なくとも２つの単量体ドメインを含む。
2009501517.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−６に選択的に結合する単量体ドメインを含み、該単量体ドメインが、以下の配列（配列番号１および２）：
【化１】
2009501517.tif 000105
（Ｘは、任意のアミノ酸であり、角型カッコ内のアミノ酸は、指定位置での代替アミノ酸を示す）
のいずれかを含むＬＤＬ受容体クラスＡ単量体ドメインである、ポリペプチド。
【請求項２】
【化２】
2009501517.tif 000106
を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
【化３】
2009501517.tif 000107
を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ＩＬ−６に選択的に結合する少なくとも１つ、且つ、６つ以下の単量体ドメインを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ＩＬ−６に選択的に結合する少なくとも２つの単量体ドメインを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ＩＬ−６に対する選択的結合特異性を有する第一単量体ドメインと、ＩＬ−６に対する選択的特異性を有する第二単量体ドメインとを含み、該第一単量体ドメインが、
【化４】
2009501517.tif 000108
を含み、該第二単量体ドメインが、
【化５】
2009501517.tif 000109
を含む、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
【化６】
2009501517.tif 000110
（ｎは、０と１００の間である）
（配列番号３）
を含む、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
以下の配列（配列番号５〜１３）：
【化７】
2009501517.tif 000111
のうちのいずれかを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
以下の配列（配列番号１４〜２２）：
【化８】
2009501517.tif 000112
のうちのいずれかを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ＩＬ−６に選択的に結合する３つの単量体ドメインを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、血液因子に対する選択的結合特異性を有する単量体ドメインをさらに含み、それにより、該ポリペプチドを動物に注射したとき、該ポリペプチドの血清半減期が、該血液因子結合単量体ドメインを欠くポリペプチドの血清半減期と比較して増加する、ポリペプチド。
【請求項１２】
前記血液因子が、血清アルブミン、免疫グロブリンまたは赤血球である、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
血液因子に対する選択的結合特異性を有する前記単量体ドメインが、免疫グロブリン（ＩｇＧ）に結合し、且つ血液因子に対する結合特異性を有する該単量体ドメインが、以下（配列番号２３および２４）
【化９】
2009501517.tif 000113
（Ｘは、任意のアミノ酸である）
から選択される配列を含むＬＤＬ受容体クラスＡ単量体ドメインである、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
血液因子に対する選択的結合特異性を有する前記単量体ドメインが、免疫グロブリン（ＩｇＧ）に結合し、且つ血液因子に対する結合特異性を有する該単量体ドメインが、以下の配列（配列番号２５）
【化１０】
2009501517.tif 000114
（Ｘは、任意のアミノ酸であり、角型カッコ内のアミノ酸は、単一位置での代替アミノ酸である）
から選択される配列を含むＬＤＬ受容体クラスＡ単量体ドメインである、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
血液因子に対する選択的結合特異性を有する前記単量体ドメインが、
【化１１】
2009501517.tif 000115
を含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記単量体ドメインが、３５と４５の間のアミノ酸である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記単量体が、
配列中のアミノ酸の少なくとも１０％が、システインである；かつ／または
アミノ酸の少なくとも２５％が、非天然アミノ酸である、
アミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１に記載のポリペプチドをコードしている、ポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００５年７月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／６９９，１３７号に対する優先権の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／６９９，１３７号は、全ての目的について、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の背景
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、免疫応答および炎症の調節において中心的な役割を有する。ＩＬ−６は、一定範囲の生物活性を有し、多様な数のターゲット細胞に対して内分泌、自己分泌およびパラクリン式にで作用する。主なＩＬ−６源は単球である。Ｔ細胞およびＢ細胞と共に線維芽細胞および内皮細胞、ケラチン細胞、メサンギウム細胞ならびに幾つかの腫瘍細胞が、ＩＬ−６を生産する。その合成は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＴＮＦ−βおよびインターフェロンによって誘導される。ＩＬ−６は、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３によって阻害される。従って、ＩＬ−６は、免疫調節および炎症ならびに自己免疫疾患において重要な役割を果たす。
【０００３】
ＩＬ−６は、Ｂリンパ球成熟の最終段階を刺激する能力を有し、それによってＢリンパ球は、成熟形質細胞に分化し、免疫グロブリン（Ｉｇ）を分泌する。加えて、ＩＬ−６は、ＩＬ−２受容体発現およびＩＬ−２生産の増加を通じてＴ細胞増殖および細胞傷害性Ｔ細胞分化を誘導する。ＩＬ−６は、他のサイトカインと相乗作用して骨髄幹細胞成熟を支援し、好中球活性化因子であり、ならびに巨核球からの血小板の生産を刺激する。最終マクロファージおよび破骨細胞分化の強力な誘導因子でもある。ＩＬ−６は、発熱の誘導ならびに急性期タンパク質、例えば血清アミロイドＡ、ＣＲＰ、アルファ１アンチトリプシン、フィブリノゲンおよびハプトグロブリン、の生産を含む、幾つかの活性をＩＬ−１およびＴＮＦと共有もしている。
【０００４】
ＩＬ−６は、幾つかのユニークな抗炎症作用を媒介する。ＩＬ−１とＴＮＦ−αの両方が、ＩＬ−６ばかりでなく互いの合成を誘導する場合、ＩＬ−６は、この上方調節性炎症カスケードを停止させ、ＩＬ−１およびＴＮＦ−α合成を阻害する。ＩＬ−６は、表皮ケラチン細胞およびメサンギウム細胞の増殖を誘導することができる細胞増殖因子としても重要であり、メサンギウム増殖性糸球体腎炎において能動的役割を有する。
【０００５】
ＩＬ−６の受容体（ＩＬ−６Ｒ）は、Ｉ型サイトカイン受容体スーパーファミリーに属し、２本の鎖、ＩＬ−６Ｒ（８０ｋＤａ糖タンパク）およびｇｐ１３０、から成る。ＩＬ−６Ｒは、リガンド特異的結合成分である一方で、ｇｐ１３０は、ＩＬ−６関連サイトカイン、例えば白血病抑制因子（ＬＩＦ）、毛様体神経向性因子、オンコスタチンＭ、およびＩＬ−１１、の細胞内シグナルの伝達に責任を負う共有受容体成分である。
【０００６】
受容体へのＩＬ−６の結合は、ｇｐ１３０の二量体化を招き、その結果、ｇｐ１３０関連キナーゼＪＡＫ１の活性化が生じ、その後、ｇｐ１３０のチロシンリン酸化が生じる。ｇｐ１３０が、いたるところで発現されるのに対し、ＩＬ−６Ｒは、より限定的である。ＩＬ−６Ｒとｇｐ１３０の両方が、可溶性の形態を有する。ＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６Ｒの複合体は、ｇｐ１３０のみを発現する細胞に対して作用することができる。これは、可溶性受容体の重要な前炎症メカニズムである可能性を秘めている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の簡単な概要
本発明は、ＩＬ−６に結合する（例えば、選択的に結合する）単量体ドメインを含むポリペプチドを提供する。一部の実施形態において、本ポリペプチドは、ＩＬ−６に結合する単量体ドメインを含み、この場合の単量体ドメインは、以下の配列：
【０００８】
【化１２】
2009501517.tif 000003
（これらの配列式中のＸは、任意のアミノ酸であり、角型カッコ内アミノ酸は、指定位置での代替アミノ酸を示す）
のいずれかを含む、ＬＤＬ受容体クラスＡ単量体ドメインである。
【０００９】
一部の実施形態において、本ポリペプチドは、
【００１０】
【化１３】
2009501517.tif 000004
を含む。
【００１１】
一部の実施形態において、本ポリペプチドは、
【００１２】
【化１４】
2009501517.tif 000005
を含む。
【００１３】
一部の実施形態において、本ポリペプチドは、ＩＬ−６に結合する少なくとも１つ、且つ、６つ以下の単量体ドメインを含む。
【００１４】
一部の実施形態において、本ポリペプチドは、ＩＬ−６に結合する少なくとも２つの単量体ドメインを含む。一部の実施形態において、本ポリペプチドは、ＩＬ−６に対する結合特異性を有する第一単量体ドメインと、ＩＬ−６に対する結合特異性を有する第二単量体ドメインを含み、この場合、前記第一単量体ドメインは、
【００１５】
【化１５】
2009501517.tif 000006
を含み、前記第二単量体ドメインは、
【００１６】
【化１６】
2009501517.tif 000007
を含む。
【００１７】
一部の実施形態において、本ポリペプチドは、
【００１８】
【化１７】
2009501517.tif 000008
（この配列式中のｎは、０と１００の間である）
を含む。一部の実施形態において、ｎは、３〜１５、１〜２０、０〜３０または０〜５０である。
【００１９】
一部の実施形態において、本ポリペプチドは、以下の配列（配列番号５〜１３）のいずれかを含む：
【００２０】
【化１８】
2009501517.tif 000009
【００２１】
【化１８Ａ】
2009501517.tif 000010
一部の実施形態において、本ポリペプチドは、以下の配列（配列番号１４〜２２）のいずれかを含む：
【００２２】
【化１９】
2009501517.tif 000011
一部の実施形態において、本ポリペプチドは、本明細書の中で表示するＩＬ−６結合単量体、二量体または三量体配列のうちの１つを含む。
【００２３】
一部の実施形態において、本ポリペプチドは、ＩＬ−６に結合する３つの単量体ドメインを含む。
【００２４】
一部の実施形態において、本ポリペプチドは、血液因子に対する結合特異性を有する単量体ドメインをさらに含み、それにより、そのポリペプチドが動物に注射されたとき、そのポリペプチドの血清半減期は、血液因子結合単量体ドメインを欠くポリペプチドの血清半減期と比較して増加される。一部の実施形態において、前記血液因子は、血清アルブミン、免疫グロブリンまたは赤血球である。
【００２５】
一部の実施形態において、血液因子に対する結合特異性を有する前記単量体ドメインは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）に結合し、ならびに血液因子に対する結合特異性を有するその単量体ドメインは、以下：
【００２６】
【化２０】
2009501517.tif 000012
（これらの配列中のＸは、任意のアミノ酸である）
から選択される配列を含むＬＤＬ受容体クラスＡ単量体ドメインである。
【００２７】
一部の実施形態において、血液因子に対して結合特異性を有する前記単量体ドメインは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）に結合し、ならびに血液因子に対して結合特異性を有するその単量体ドメインは、次の配列：
【００２８】
【化２１】
2009501517.tif 000013
（この配列中のＸは、任意のアミノ酸であり、角型カッコ内のアミノ酸は、単一位置における代替アミノ酸である）
を含むＬＤＬ受容体クラスＡ単量体ドメインである。
【００２９】
一部の実施形態において、血液因子に対して結合特異性を有する前記単量体ドメインは、
【００３０】
【化２２】
2009501517.tif 000014
を含む。
【００３１】
一部の実施形態において、前記単量体ドメインは、３５と４５の間のアミノ酸である。一部の実施形態において、前記単量体は、その配列中のアミノ酸の少なくとも１０％がシステインである、および／またはアミノ酸の少なくとも２５パーセントが非天然アミノ酸である、アミノ酸配列を含む。
【００３２】
本発明は、ＩＬ−６に結合する（例えば、選択的に結合する）ポリペプチドの特定方法も提供する。一部の実施形態において、本方法は、
ポリペプチドのライブラリーをＩＬ−６への親和性についてスクリーニングすること；および
ＩＬ−６に結合する少なくとも１つの単量体ドメインを含むポリペプチドを選択することを含み、この場合の単量体ドメインは、
非天然単量体ドメインであり；
少なくとも１つのジスルフィド結合を含み；および
イオンに結合する。
一部の実施形態において、選択されたポリペプチドは、
【００３３】
【化２３】
2009501517.tif 000015
【００３４】
【化２４】
2009501517.tif 000016
のうちの少なくとも１つを含むＬＤＬ受容体Ａドメイン単量体ドメインを含む。
【００３５】
一部の実施形態において、前記単量体ドメインは、その配列のアミノ酸の少なくとも１０％がシステインである、および／またはアミノ酸の少なくとも少なくとも２５％が非天然アミノ酸である、アミノ酸配列を含む。
【００３６】
一部の実施形態において、本方法は、
その選択されたポリペプチド内の単量体ドメインを第二の単量体ドメインに連結させて、多量体のライブラリー（各多量体は、少なくとも２つの単量体ドメインを含む）を形成すること；
その多量体のライブラリーをＩＬ−６に結合する能力についてスクリーニングすること；および
ＩＬ−６に結合する多量体を選択すること
をさらに含む。
【００３７】
一部の実施形態において、本方法は、
その選択されたポリペプチド内の単量体ドメインを第二の単量体ドメインに連結させて、多量体のライブラリー（各多量体は、少なくとも２つの単量体ドメインを含む）を形成すること；
その多量体のライブラリーを、ＩＬ−６以外のターゲット分子に結合する能力についてスクリーニングすること；および
そのターゲット分子に結合する多量体を選択すること
をさらに含む。
【００３８】
一部の実施形態において、本方法は、少なくとも１つの単量体ドメインを突然変異させ、それによって突然変異単量体ドメインを含むライブラリーを生じさせる段階をさらに含む。
【００３９】
一部の実施形態において、前記単量体ドメインのライブラリーを、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、または細胞表面ディスプレイとして表示される。
【００４０】
一部の実施形態において、本ポリペプチドは、少なくとも２つの単量体ドメインを含み、それらの単量体ドメインは、リンカーによって連結されている。一部の実施形態において、そのリンカーは、ペプチドリンカーである。一部の実施形態において、そのリンカーは、４から１２の間のアミノ酸長である。
【００４１】
一部の実施形態において、前記単量体ドメインは、その配列中のアミノ酸の少なくとも１０％がシステインである、および／またはアミノ酸の少なくとも２５％が非天然アミノ酸である、アミノ酸配列を含む。
【００４２】
本発明は、ＩＬ−６に結合する（例えば、選択的に結合する）単量体ドメインを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドも提供し、この場合の単量体ドメインは、
３０から５０のアミノ酸から成る非天然単量体ドメインであり；
少なくとも１つのジスルフィド結合を含む。
【００４３】
一部の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、以下の配列：
【００４４】
【化２５】
2009501517.tif 000017
のうちの１つを含むポリペプチドをコードしている。
【００４５】
一部の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、以下の配列（配列番号５〜１３）：
【００４６】
【化２６】
2009501517.tif 000018
【００４７】
【化２７】
2009501517.tif 000019
のうちの１つを含むポリペプチドをコードしている。
【００４８】
一部の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、以下の配列（配列番号１４〜２２）：
【００４９】
【化２８】
2009501517.tif 000020
【００５０】
【化２９】
2009501517.tif 000021
のうちの１つを含むポリペプチドをコードしている。
【００５１】
一部の実施形態において、ＩＬ−６に対する結合特異性を有する単量体ドメインをコードしているポリヌクレオチドは、細胞（例えば、細菌、植物または哺乳動物細胞）のコドン利用について最適化される。例えば、
【００５２】
【化３０】
2009501517.tif 000022
は、ＩＬ−６結合三量体
【００５３】
【化３１】
2009501517.tif 000023
をコードしている。しかし、
【００５４】
【化３２】
2009501517.tif 000024
【００５５】
【化３３】
2009501517.tif 000025
は、
【００５６】
【化３４】
2009501517.tif 000026
もコードしているポリヌクレオチドであるが、細菌の発現について最適化されたコドンを有した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
定義
別の指示がない限り、以下の定義が、当該技術分野における定義に取って代わる。
【００５８】
本明細書で用いる場合、配列モチーフ内のカッコの使用は、それらのカッコ内の位置が、存在することもあり、または不在であることもあることを示す（例えば、「（［ｅｋｑ］）」は、その位置が不在であること、またはＥ、ＫもしくはＱのいずれかが、その位置にある場合があることを示す）。１つより多くの「ｘ」がカッコ内で用いられているとき（例えば、「（ｘｘ）」）、各ｘは、可能な位置を表す。従って「（ｘｘ）」は、その位置（単数または複数）に０、１または２個のアミノ酸がある場合があることを示し、この場合、各アミノ酸は、任意のアミノ酸から独立して選択される。
【００５９】
用語「単量体ドメイン」または「単量体」は、同義で用いられ、本明細書ではタンパク質またはポリペプチドにおいて見出される個別の領域を指す。単量体ドメインは、隣接する天然アミノ酸配列の不在下、溶解状態で天然三次元構造を形成する。本発明の単量体ドメインは、多くの場合、ターゲット分子に結合するであろう。例えば、ターゲット分子に結合する三次元構造を形成するポリペプチドが、単量体ドメインである。本明細書で用いる用語「単量体ドメイン」は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含しない。
【００６０】
用語「ループ」は、一般に、その単量体ドメインタンパク質の足場構造の組立てによって環境に暴露される単量体ドメインの部分であって、ターゲット結合に関与する部分を指す。本発明は、一定の特徴、例えば、ジスルフィド結合の可能性、二次タンパク質構造間の架橋、および分子動力学（すなわち、柔軟性）によって特定される３つのタイプのループを提供する。前記３つのタイプのループ配列は、システイン規定ループ配列、構造規定ループ配列およびＢ因子規定ループ配列である。
【００６１】
本明細書で用いる用語「システイン規定ループ配列」は、同じファミリーの少なくとも１つの他の天然単量体ドメインに関して保存されている、システイン残基により各末端で結合されている天然単量体ドメインコーディング配列のサブ配列を指す。システイン規定ループ配列は、天然単量体ドメインの多数の配列アラインメント、その後の保存システイン残基を特定するための配列分析によって特定される。連続する保存システイン残基ペア各々の間の配列が、システイン規定ループ配列である。システイン規定ループ配列は、各末端に隣接するシステイン残基を含まない。システイン規定ループ配列を有する単量体ドメインとしては、ＬＤＬ受容体Ａ−ドメイン、ＥＧＦ様ドメイン、スシドメイン、フィブロネクチン１型ドメインなどが挙げられる。従って、例えば、ＬＤＬ受容体Ａ−ドメインの場合、コンセンサス配列、ＣＸ６ＣＸ４ＣＸ６ＣＸ５ＣＸ８Ｃ（配列番号３７）によって表され、この場合のＸ６、Ｘ４、Ｘ５およびＸ８は、各々、指定数のアミノ酸を含むシステイン規定ループ配列を表す。
【００６２】
用語「Ｂ因子規定ループ配列」は、Ｂ因子規定ループ内のアルファ炭素のＢ因子が、その全単量体ドメイン内の２５％最高アルファ炭素Ｂ因子の中にある、単量体ドメインコーディング配列の少なくとも３つのアミノ酸残基から成るサブ配列を指す。一般に、このサブ配列についての平均アルファ炭素Ｂ因子は、少なくとも約６５である。本明細書で用いる用語「Ｂ因子」（または「温度因子」もしくは「デバイ−ウォーラー因子」）は、Ｘ線散乱データから導出する。Ｂ因子は、電子密度を分散させる程度を説明する、各原子にまたは原子群についてのＸ線散乱用語にあてはめることができる因子であり、本発明の実施の際に利用されるＢ因子は、等方性である場合もあり、異方性である場合もある。用語「平均アルファ炭素Ｂ因子」は、
【００６３】
【化３５】
2009501517.tif 000027
を指し、この式中のｎは、そのループ内の残基の数に対応し、少なくとも３であり、ならびにＢ因子Ｃαｉは、そのループのアミノ酸残基ｉのアルファ炭素についてのＢ因子である。
【００６４】
用語「多量体」は、少なくとも２つの単量体ドメインを含むポリペプチドを示すために本明細書では用いている。多量体内の別個の単量体ドメインをリンカーによって互いに接続することができる。多量体は、コンビナトリアルモザイクタンパク質または組み換えモザイクタンパク質としても知られている。
【００６５】
用語「ファミリー」および「ファミリークラス」は、同義で、それらのアミノ酸配列に関する類似性に基づいて共にグループ化されるタンパク質を示すために用いている。これらの類似した配列は、タンパク質の機能および／またはタンパク質の三次元構造の維持に重要であるため、一般に、保存される。こうしたファミリーの例としては、ＬＤＬ受容体Ａ−ドメインファミリー、ＥＧＦ様ファミリーなどが挙げられる。加えて、同じターゲット分子に結合する関連配列を、共通の配列モチーフに基づいてファミリーに分けることもできる。
【００６６】
用語「リガンド」は、本明細書では「ターゲット分子」とも呼ばれ、単純な分子から複雑なターゲットにわたる多種多様な物質および分子を包含する。ターゲット分子は、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、またはポリペプチドドメインによる認識が可能な任意の他の分子であり得る。例えば、ターゲット分子としては、化学的化合物（すなわち、非生物学的化合物、例えば、有機分子、無機分子、または有機原子と無機原子の両方を有する分子など、しかし、ポリヌクレオチドおよびタンパク質は含まれない）、化学的化合物の混合物、空間的に局在する化合物のアレイ、生体高分子、バクテリオファージペプチドディスプレイライブラリー、ポリソームペプチドディスプレイライブラリー、生体材料（例えば、細菌、植物、真菌または動物（例えば哺乳動物）細胞または組織）から作られたエキス、タンパク質、毒素、ペプチドホルモン、細胞、ウイルスなどを挙げることができる。他のターゲット分子としては、例えば、全細胞、全組織、類縁または非類縁タンパク質の混合物、ウイルスまたは細菌株の混合物などが挙げられる。ターゲット分子は、本明細書の中で説明するスクリーニングアッセイに含めることによって定義することもでき、または特定のタンパク質相互作用の強化もしくは阻害によって定義することもできる（すなわち、２つの所定のポリペプチド間の結合性相互作用を選択的に阻害する薬剤）。
【００６７】
用語「リンカー」は、２つ以上の個別、別個の単量体ドメインを接続するまたはつなぐ部分または部分群を示すために本明細書では用いている。リンカーにより、個別、別個の単量体ドメインは、多量体内で互いに接続していても、別個のままでいることができる。リンカー部分は、一般的には、実質的に直線の部分である。適するリンカーとしては、ポリペプチド、ポリ核酸、ペプチド核酸などが挙げられる。適するリンカーとしては、炭素骨格内に組み込まれた１つ以上の酸素原子を有する、場合によっては置換されているアルキレン部分も挙げられる。一般に、リンカーの分子量は、約２０００ダルトン未満である。さらに一般的には、リンカーの分子量は、約１５００ダルトン未満であり、通常は約１０００ダルトン未満である。リンカーは、例えば、多量体内の個別、別個の単量体ドメイン各々が、別個の結合部位によって同じターゲット分子に結合する場合、それらの個別、別個の単量体ドメインが協働できるほど小さいこともある。例示的リンカーとしては、ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、またはアミノ酸もしくは他の非天然部分のポリペプチドが挙げられる。リンカーは、天然配列の一部分、その変異体、または合成配列であり得る。リンカーは、例えば、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、または両方の組み合わせを含むことができる。
【００６８】
用語「別個の」は、例えば他の単量体ドメインをはじめとする他の部分と複合したときでさえ、独立している、独立したままである部分の特性を示すために、本明細書では用いている。単量体ドメインは、認識することができ、タンパク質と区別することができる独立した特性を有するので、タンパク質内の別個のドメインである。例えば、ＬＤＬＲにおけるＡドメインのリガンド結合能力は、独立した特性である。別個の他の例としては、多量体内でリンカーにより互いに複合または接続しているときでさえ、独立したドメインが別個のままである、多量体内の別個の単量体ドメインが挙げられる。別個の特性のもう１つの例は、リガンドに対する多量体内の別個の結合部位である。
【００６９】
本明細書で用いる「定方向進化」は、ポリヌクレオチド変異体が再帰的プロセスで産生され、発現され、活性（例えば、結合活性を有するポリペプチド）についてスクリーニングされるプロセスを指す。このスクリーニングにおいて１つ以上の候補が選択され、その後、選択された候補をコードするポリヌクレオチドを使用してそのプロセスが繰り返されて、新たな変異体が産生される。定方向進化は、少なくとも２ラウンドの変異発生を伴い、３、４、５、１０、２０またはそれ以上のラウンドの変異発生および選択を含む場合もある。変異は、例えば、誤りがちのＰＣＲ、遺伝子組み換え法、化学的突然変異誘発などをはじめとする当業者には公知である任意の方法によって、発生させることができる。
【００７０】
用語「シャッフリング」は、非同一配列間の組み換えを示すために、本明細書では用いている。一部の実施形態において、シャッフリングとしては、相同組み換えよるまたは非相同組み換えによる、例えば、ｃｒｅ／ｌｏｘおよび／またはｆｌｐ／ｆｒｔシステムによる、クロスオーバーを挙げることができる。シャッフリングは、例えば、インビトロおよびインビボシャッフリング形式、インシリコシャッフリング形式、２本鎖テンプレートまたは１本鎖テンプレートのいずれかを利用するシャッフリング形式、プライマーに基づくシャッフリング形式、核酸フラグメンテーションに基づくシャッフリング形式、およびオリゴヌクレオチド媒介シャッフリング形式（これらのすべてが、非同一配列間の組み換え事象に基づくものであり、本明細書において下で詳細に説明または言及する）ならびに他の類似の組み換えに基づく形式を含む、様々な異なる形式を利用することにより行うことができる。本明細書で用いる用語「ランダム」は、２つ以上のアミノ酸から成り、確率またはランダムプロセスによって構築された、ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を指す。ランダムポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、フレームワークまたは足場モチーフを含むことがあり、これらは不変配列を含むことがある。
【００７１】
本明細書で用いる用語「擬似ランダム」は、制限された変異性を有し、そのため幾つかの位置における残基の変異度は制限されるが、いずれの擬似ランダム位置も少なくともある程度の残基変異が可能である、１セットの配列、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。
【００７２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では、同義で、アミノ酸数２以上のアミノ酸配列を指すために、用いている。
【００７３】
用語「アミノ酸」は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸に類似した様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝子コードによりコーディングされたもの、ならびに後々修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合しているα炭素、を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。こうした類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。「アミノ酸模倣体」は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸に類似の様式で機能する化学的化合物を指す。
【００７４】
「保存的アミノ酸置換」は、類似した側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリンおよびトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リシン、アルギニンおよびヒスチジンであり；ならびに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、システインおよびメチオニンである。保存的アミノ酸置換グループとしては、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンが挙げられる。
【００７５】
「核酸配列」というフレーズは、５’から３’末端を読み取ったデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド塩基の１本鎖もしくは２本鎖ポリマーまたはその類似体を指す。
【００７６】
用語「コードしている」は、１つ以上のアミノ酸をコードしているポリヌクレオチド配列を指す。この用語は、開始または停止コドンを必要としない。アミノ酸は、ポリヌクレオチド配列によって提供される６つの異なるリーディングフレームのうちのいずれか１つにコードされ得る。
【００７７】
用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与して転写を開始させる、転写の開始点から上流および／または下流に位置する領域または配列を指す。
【００７８】
「ベクター」は、宿主染色体に依存せずに宿主生物において複製が可能であるポリヌクレオチドを指す。ベクターの例としては、プラスミドが挙げられる。ベクターは、一般に、複製起点を有する。ベクターは、例えば、転写および翻訳ターミネーター、転写および翻訳開始配列、ならびに特定の核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含むことができる。
【００７９】
用語「組み換え体」は、例えば、細胞、核酸、タンパク質またはベクターに関して用いるとき、その細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然核酸もしくはタンパク質の改変によって修飾されていること、あるいはその細胞が、そのように修飾された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組み換え細胞は、天然（非組み換え体）形の細胞の中では見出せない遺伝子を発現し、または別様に異常に発現される、過小発現される、もしくはまったく発現されない天然遺伝子を発現する。
【００８０】
単量体または多量体に言及するときのポリペプチドに「特異的に（または選択的に）結合する」というフレーズは、タンパク質の不均一集団（例えば、細胞または組織分解産物）および他の生体物質におけるポリペプチドの存在の決定要因であり得る結合反応を指す。従って、抗体結合アッセイにおいて用いられる標準的な条件またはアッセイのもとで、指定単量体または多量体は、特定のターゲット分子にバックグラウンドより多く（例えば、バックグラウンドの２倍、５倍、１０倍またはそれ以上多く）結合し、そのサンプル中に存在する他の分子には有意な量で結合しない。
【００８１】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関連して、用語「同一の」または「同一性」パーセントは、同じである２つ以上の配列またはサブ配列を指す。「実質的に同一の」は、比較領域、または下記の配列比較アルゴリズムの１つを用いてもしくは手作業でのアラインメントおよび目視検査によって測定される指定領域、全体にわたって比較し、最大対応に対してアラインしたとき、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの指定の百分率（すなわち、指定領域全体にわたって、または指定されていないときには、全配列全体にわたって、６０％同一性、場合によっては、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一性）を有する２つ以上の核酸またはポリペプチド配列を指す。場合によっては、同一性または実質的同一性は、少なくとも約５０のヌクレオチドの長さである領域全体にわたって、または１００から５００もしくは１０００もしくはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の長さである領域全体にわたって、または指定されていない場合には配列長全体にわたって存在する。本発明は、ＩＬ−６結合配列を含むポリペプチドを提供し、この場合のＩＬ−６結合配列は、配列番号２７〜３３のいずれかを含む（しかし、これらに限定されない）、本明細書において提供する少なくとも１つのＩＬ−６結合配列と実質的に同一（例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一）である。
【００８２】
ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、２つの配列が、天然配列において見出されるのと同じ様式で連結されていない場合、第二の配列「とは異型」である。例えば、異型コード配列に動作可能に連結されたプロモーターは、いずれの天然対立遺伝子変異体との異なるコーディング配列とみなされる。多量体に関連して用いるときの用語「異種リンカー」は、その多量体が、自然界では互いに同じ関係で見出されることがないリンカーと単量体（例えば、それらは、非天然融合タンパク質を形成する）を含むことを示す。
【００８３】
タンパク質配列内の「非天然アミノ酸」は、比較領域が、クエリーされた（ｑｕｅｒｉｅｄ）単量体ドメインの長さである場合の、および本明細書において説明するようにＢＬＡＳＴ  ２．０を使用してＧｅｎＢａｎｋの非重複（「ｎｒ」）データベース内の天然配列と比較したときの、最低最少合計確率を有する天然ポリペプチドとのアラインメントにおいて、対応する位置で発生するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。
【００８４】
「配列同一性率」は、比較領域全体にわたって２つの最適にアラインされた配列を比較することにより決定され、この場合、比較領域内のポリヌクレオチド配列の一部が、２つの配列の最適なアラインメントのための基準配列（付加および欠失を含まないもの）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むこともある。この百分率は、両方の配列における同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が発生する位置の数を判定してマッチした位置の数を得、そのマッチした位置の数を、比較領域内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一率を得ることによって計算される。
【００８５】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関連して、用語「同一の」または「同一性」パーセントは、比較領域、または下記の配列比較アルゴリズムの１つを用いてもしくは手作業でのアラインメントおよび目視検査によって測定される指定領域、全体にわたって比較し、最大応答に対してアラインしたとき、同じである、または同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの指定百分率を有する、２つ以上の配列またはサブ配列を指す。そこで、こうした配列は、「実質的に同一」であると言われる。本発明は、ＩＬ−６に結合し、且つ、本明細書に記載する完全長配列のいずれかと実質的に同一の配列を含む、ポリペプチドを提供する。この定義は、試験配列の補体にも適用される。場合によっては、同一性は、少なくとも約５０のアミノ酸もしくはヌクレオチドの長さである領域全体にわたって、またはさらに好ましくは、７５〜１００のアミノ酸もしくはヌクレオチドの長さである領域全体にわたって存在する。
【００８６】
配列比較のために、一般に、１つの配列は、試験配列と比較する基準配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを用いるときには、試験配列および基準配列をコンピュータに入力し、必要な場合にはサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用することができ、または代替パラメータを指定することができる。その後、その配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメータに基づき、基準配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【００８７】
本明細書で用いる「比較領域」は、ある配列を同じ連続位置数の基準配列と、それら２つの配列を最適にアラインした後に比較することができる、２０から６００、通常は約５０から約２００、さらに通常は約１００から約１５０から成る群より選択される連続位置数のうちのいずれか１つのセグメントへの参照を包含する。比較のための配列のアラインメント方法は、当該技術分野において周知である。比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所的相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ（ウィスコンシン州、マディソン、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．のＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ））のコンピュータでの実施によって、または手作業でのアラインメントもしくは目視検査（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）参照）によって、行うことができる。
【００８８】
有用なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に個々に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手できる。このアルゴリズムは、第一に、データベース内列内の同じ長さのワードとアラインしたときに何らかの正の値の閾値スコアＴとマッチするかそれらを満たす照会配列中の長さＷの短いワードを特定することにより高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を特定することを必要とする。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記）。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含む、より長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。ワードヒットを、累積アラインメントスコアを増やすことができるところまで各配列に沿って両方向に拡大させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメータＭ（マッチする残基のペアについてのリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチする残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を用いて計算する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて、累積スコアを計算する。各方向のワードヒットの拡大は、累積アラインメントスコアが、その最大獲得値から量Ｘだけ低下したとき；累積データが、１つ以上の負のスコアの残基のアラインメントの累積に起因して０以下になったとき；またはいずれかの配列の端に達したとき、停止させる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータ、Ｗ、ＴおよびＺが、そのアラインメントの感度および速度を決める。ＢＬＡＳＴＩＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３のワード長、および１０の期待値（Ｅ）、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を用いる。
【００８９】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計学的解析も行う（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然によって発生する確率の指標となる。例えば、核酸は、その試験核酸を基準核酸と比較してその最小合計確率が約０．２未満、さらに好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、基準配列に類似していると見なされる。
【００９０】
発明の詳細な説明
Ｉ．序論
本発明は、ＩＬ−６に結合する非天然タンパク質に備えるものである。一般に、本発明のタンパク質は、ＩＬ−６に結合するドメインを含む。様々なポリペプチド足場を用いてこれらのドメインを特定して、多数のポリペプチド変異体を作製し、その後、ＩＬ−６に結合する変異体を選択することが容易にできる。従って、本発明は、ＩＬ−６に結合するタンパク質の選択に備えるものでもある。ＩＬ−６に結合するタンパク質は、例えば、自己免疫疾患および炎症性疾患、癌、代謝性／内分泌性疾患、心血管疾患ならびに神経疾患の治療に有用である。本発明のポリペプチドは、ＩＬ−６の検出および定量にも有用である。ＩＬ−６のアミノ酸配列は公知であり、配列番号１で表示される。
【００９１】
ＩＬ−６は、ＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）に結合することによって機能する。従って、一部の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＩＬ−６のその受容体への結合を阻害する、すなわち、拮抗薬として作用してＩＬ−６がＩＬ−６Ｒ結合する、および／またはＩＬ−６Ｒを活性化させることを防止する、少なくとも１つの単量体ドメインを含む。
【００９２】
本発明は、単一ドメインを含むポリペプチドに備えるものであるが、それらのドメインの多量体を合成し、使用することもできる。一部の実施形態では、多量体のすべてのドメインがＩＬ−６に結合する。これらの実施形態の一部では、各々のドメインが同一であり、ＩＬ−６の同じ部分（すなわち、「エピトープ」）に結合する。他の実施形態において、多量体内の少なくとも一部のドメインは、ＩＬ−６の異なる部分に結合する。さらに他の実施形態において、ポリペプチドの少なくとも一部のドメインは、ＩＬ−６以外の分子（単数または複数）（例えば、血清アルブミン、免疫グロブリンまたは赤血球などの血液因子）に結合する。
【００９３】
ＩＩ．単量体
単量体ドメインは、任意のサイズのポリペプチドであり得る。一部の実施形態において、単量体ドメインは、約２５から約５００、約３０から約２００、約３０から約１００、約３５から約５０、約３５から約１００、約９０から約２００、約３０から約２５０、約３０から約６０、約９から約１５０、約１００から約１５０、約２５から約５０、または約３０から約１５０のアミノ酸を有する。同様に、本発明の単量体ドメインは、例えば、約３０から約２００のアミノ酸、約２５から約１８０のアミノ酸、約４０から約１５０のアミノ酸、約５０から約１３０のアミノ酸、または約７５から約１２５のアミノ酸を含むことがある。単量体ドメインは、一般に、溶融状態で安定な配座を維持することができ、多くの場合、熱安定性であり、例えば、９５℃で少なくとも１０分間、結合親和性を失わずに安定している。時として、単量体ドメインは、独立してフォールディングして安定な配座になることがある。１つの実施形態において、この安定な配座は、イオン（例えば、金属またはカルシウムイオンなど）によって安定化される。この安定な配座は、場合によってはジスルフィド結合（例えば、少なくとも１つ、２つもしくは３つまたはそれ以上のスルフィド結合）を含有することがある。これらのジスルフィド結合は、場合によっては、２個のシステイン残基間で形成され得る。一部の実施形態において、単量体ドメインまたは単量体ドメイン変異体は、例示する配列と実質的に同一である。
【００９４】
Ａ．ＩＬ−６結合
一部の態様において、本発明は、ＩＬ−６ポリペプチドまたはその一部分に結合する（例えば、選択的に結合する）単量体ドメインを提供する。ポリペプチドの一部分とは、例えば、そのポリペプチドの少なくとも５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、またはそれ以上の連続するアミノ酸であり得る。一部の実施形態において、本発明の単量体は、１０−３Ｍより強い（例えば、１０−４Ｍなど）親和性でＩＬ−６に結合するであろう。一部の実施形態において、この親和性は、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍまたは１０−８Ｍより強い。
【００９５】
Ａドメイン足場を有する多数のＩＬ−６結合配列を作製した。実施例で詳細に説明するように、ＩＬ−６に結合する単量体ドメインの７つのファミリー（すなわち、ファミリー１〜７、または「Ｆａｍ  １〜７」）を特定した。これらのファミリーに基づく、作製したコンセンサスモチーフは、ＩＬ−６結合因子間に共通のアミノ酸残基を示す。コンセンサスがない位置（「Ｘ」という印を付ける）がいずれのアミノ酸であってもよいことは、当業者には理解されるであろう。一部の実施形態において、「Ｘ」位置のアミノ酸は、同じファミリーまたは異なるファミリーからの例示するＩＬ−６結合因子のうちの１つの類似位置にあるアミノ酸から選択されるであろう。
【００９６】
ファミリー１は、次のコンセンサスモチーフ（配列番号２７）を有する：
【００９７】
【化３６】
2009501517.tif 000028
ＩＬ−６ファミリー１モチーフを含む例示的配列は、実施例において表示する。ＩＬ−６結合単量体または多量体への言及は、実施例において例示する各ファミリー１配列を包含する。
【００９８】
ファミリー２は、次のコンセンサスモチーフ（配列番号２８）を有する：
【００９９】
【化３７】
2009501517.tif 000029
ＩＬ−６ファミリー２モチーフを含む例示的配列は、実施例において表示する。ＩＬ−６結合単量体または多量体への言及は、実施例において例示する各ファミリー２配列を包含する。
【０１００】
ファミリー３は、次のコンセンサスモチーフ（配列番号２９）を有する：
【０１０１】
【化３８】
2009501517.tif 000030
ＩＬ−６ファミリー３モチーフを含む例示的配列は、実施例において表示する。ＩＬ−６結合単量体または多量体への言及は、実施例において例示する各ファミリー３配列を包含する。
【０１０２】
ファミリー４は、次のコンセンサスモチーフ（配列番号３０）を有する：
【０１０３】
【化３９】
2009501517.tif 000031
ＩＬ−６ファミリー４モチーフを含む例示的配列は、実施例において表示する。ＩＬ−６結合単量体または多量体への言及は、実施例において例示する各ファミリー４配列を包含する。
【０１０４】
ファミリー５は、次のコンセンサスモチーフ（配列番号３１）を有する：
【０１０５】
【化４０】
2009501517.tif 000032
ＩＬ−６ファミリー５モチーフを含む例示的配列は、実施例において表示する。ＩＬ−６結合単量体または多量体への言及は、実施例において例示する各ファミリー５配列を包含する。
【０１０６】
ファミリー６は、次のコンセンサスモチーフ（配列番号３２）を有する：
【０１０７】
【化４１】
2009501517.tif 000033
ＩＬ−６ファミリー６モチーフを含む例示的配列は、実施例において表示する。ＩＬ−６結合単量体または多量体への言及は、実施例において例示する各ファミリー６配列を包含する。
【０１０８】
ファミリー７は、次のコンセンサスモチーフ（配列番号３３）を有する：
【０１０９】
【化４２】
2009501517.tif 000034
ＩＬ−６ファミリー７モチーフを含む例示的配列は、実施例において表示する。ＩＬ−６結合単量体または多量体への言及は、実施例において例示する各ファミリー７配列を包含する。
【０１１０】
本明細書で説明するように、単量体ドメインを連結させて、同じターゲットに結合する多量体を形成することができる。本発明は、ホモ多量体（すなわち、少なくとも２つの同一のモノマー）とヘテロ多量体（すなわち、同じターゲットに結合する異なるモノマー）の両方を含むポリペプチドを提供する。例示的二量体および三量体は、実施例において表示する。
【０１１１】
幾つかのＩＬ−６三量体ファミリーモチーフを、配列間の類似性に基づき特定した。実施例７参照。これらのファミリーに基づく、作製したコンセンサスモチーフは、ＩＬ−６三量体間に共通のアミノ酸残基を示す。コンセンサスがない位置（「Ｘ」という印を付ける）がいずれのアミノ酸であってもよいことは、当業者には理解されるであろう。一部の実施形態において、「Ｘ」位置のアミノ酸は、同じファミリーまたは異なるファミリーからの例示するＩＬ−６結合因子のうちの１つの類似位置にあるアミノ酸から選択されるであろう。
【０１１２】
例示的ＩＬ−６結合三量体としは、次のもの（配列番号２７０〜２７８）が挙げられる：
【０１１３】
【化４３】
2009501517.tif 000035
Ｂ．ＩｇＧ結合因子および血清半減期延長
本発明は、血液因子（例えば、血清アルブミン、免疫グロブリンまたは赤血球）に結合する（例えば、選択的に結合する）単量体ドメインをさらに提供する。一部の実施形態において、本発明の単量体は、１０−３Ｍ未満の親和性で結合するであろう（例えば、１０−３Ｍの親和性より強い結合）。一部の実施形態において、この親和性は、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍまたは１０−８Ｍ未満である。
【０１１４】
一部の実施形態において、本単量体ドメインは、免疫グロブリンポリペプチドまたはその一部分に結合する。
【０１１５】
免疫グロブリンに結合する単量体ドメインの２つのファミリー（すなわち、ＡドメインＩｇＧファミリー２および３）を特定した。
【０１１６】
ＩｇＧファミリー２は、次のコンセンサスモチーフ（配列番号２７９）を有する：
【０１１７】
【化４４】
2009501517.tif 000036
ＩｇＧファミリー２モチーフを含む例示的配列は、実施例において表示する。ＩｇＧ結合単量体または多量体への言及は、実施例において例示する各ファミリー２配列を包含する。
【０１１８】
ＩｇＧファミリー３は、次の２つのコンセンサスモチーフ（配列番号２８０および２８１）を有する：
【０１１９】
【化４５】
2009501517.tif 000037
ＩｇＧファミリー３モチーフを含む例示的配列は、実施例において表示する。ＩｇＧ結合単量体または多量体への言及は、実施例において例示する各ファミリー３配列を包含する。
【０１２０】
赤色血液細胞（ＲＢＣ）または血清アルブミン（ＣＳＡ）に結合する単量体ドメインは、米国特許公開第２００５／００４８５１２号に記載されており、例えば、米国特許第２８２〜２８５：
【０１２１】
【化４６】
2009501517.tif 000038
を含む。
【０１２２】
本発明は、例えば本発明の多量体または動物における関心のあるタンパク質を含む、タンパク質の血清半減期を延長するための方法を提供する。前記関心のあるタンパク質は、治療的、予防的または別様に望ましい機能性を有するいずれのタンパク質であってもよい。本方法は、半減期延長因子、例えば、血液担持分子または細胞、例えば血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、ＩｇＧ、赤血球など、に特異的に結合する結合性タンパク質として特定された単量体ドメインを先ず生じさせることを含む。その後、その半減期延長因子結合性単量体を、関心のあるタンパク質（例えば、ＩＬ−６または異なるターゲット）に対する結合親和性を有する別の単量体ドメインに共有結合させる。この複合体形成は、多量体および／またはタンパク質（単数もしくは複数）のタンパク質加水分解性分解および／または他の除去からその（それらの）多量体および／または結合タンパク質を保護し、それによってそのタンパク質および／または多量体の半減期を延長することで、半減期の延長をもたらす。本発明のこの用途の１つの変形としては、関心のあるタンパク質に共有結合させた半減期延長因子結合性単量体が挙げられる。関心のあるタンパク質としては、単量体ドメイン、単量体ドメインの多量体、または合成薬物が挙げられる。あるいは、上の方法を用いて免疫グロブリンまたは赤血球のいずれかに結合する単量体を作製し、半減期延長に使用してもよい。
【０１２３】
半減期延長因子結合性多量体は、一般に、少なくとも２つのドメイン、キメラドメイン、または突然変異誘発ドメイン（すなわち、ＩＬ−６に結合するものと血液担持分子または細胞に結合するもの）の多量体である。適するドメインとしては、本明細書に記載するものすべてが挙げられ、それらを、半減期延長因子への結合についてさらにスクリーニングし、選択する。半減期延長因子結合性多量体は、例えば、半減期延長因子結合活性について事前にスクリーニングした単量体ドメインを使用して、本明細書に記載する多量体の製造方法に従って作製される。分子の血清半減期は、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、４００、５００またはそれ以上の時間になるように延長することができる。
【０１２４】
半減期延長性単量体ドメインは、ターゲット分子（例えば、ＩＬ−６結合性）結合性単量体ドメインのＮ末端、Ｃ末端または両方に連結させることができる。ＩＬ−６およびＩｇＧに結合するポリペプチドの例示的配列としては、以下のもの（配列番号２８６〜３３９）が挙げられる：
【０１２５】
【化４７】
2009501517.tif 000039
【０１２６】
【化４８】
2009501517.tif 000040
【０１２７】
【化４９】
2009501517.tif 000041
【０１２８】
【化５０】
2009501517.tif 000042
【０１２９】
【化５１】
2009501517.tif 000043
【０１３０】
【化５２】
2009501517.tif 000044
Ｃ．単量体ドメインの考察
本発明の実施の際の使用に特に適する単量体ドメインは、ジスルフィド結合を含むシステインリッチなドメインである。本発明の実施の際に利用されるシステインリッチなドメインは、一般に、αらせん、βシートおよびβバレル構造を形成しない。一般に、ジスルフィド結合は、三次元構造へのそのドメインのフォールディングを促進する。通常、システインリッチなドメインは、少なくとも２つのジスルフィド結合、さらに一般的には少なくとも３つのジスルフィド結合を有する。一部の実施形態において、単量体ドメイン内のアミノ酸の少なくとも５、１０、１５または２０％がシステインである。
【０１３１】
ドメインは、任意の数の特徴を有することができる。例えば、一部の実施形態において、前記ドメインは、動物（例えば、ヒト）において低い免疫原性を有することがあり、または免疫原性を有さないことがある。ドメインは小さいサイズでありうる。一部の実施形態において、前記ドメインは、皮膚または他の組織に浸透するほど小さい。ドメインは、一定範囲のインビボ半減期または安定性を有することができる。
【０１３２】
本発明の実施の際の使用に適する実例となる単量体ドメインとしては、例えば、ＥＧＦ様ドメイン、クリングルドメイン、フィブロネクチンＩ型ドメイン、フィブロネクチンＩＩ型ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、ＰＡＮドメイン、Ｇｌａドメイン、ＳＲＣＲドメイン、クニツ／ウシ膵臓トリプシンインヒビタードメイン、カザール型セリンプロテアーゼインヒビタードメイン、トレフォイル（Ｐ型）ドメイン、フォン−ウィルブランド因子Ｃ型ドメイン、アナフィラトキシン様ドメイン、ＣＵＢドメイン、サイログロブリンＩ型リピート、ＬＤＬ−受容体クラスＡドメイン、スシドメイン、リンクドメイン、トロンボスポンジンＩ型ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、Ｃ型レクチンドメイン、ＭＡＭドメイン、フォン−ウィルブランド因子Ａ型ドメイン、ソマトメジンＢドメイン、ＷＡＰ型４ジスルフィドコアドメイン、Ｆ５／８  Ｃ型ドメイン、ヘモペキシンドメイン、ＳＨ２ドメイン、ＳＨ３ドメイン、ラミニン型ＥＧＦドメイン、Ｃ２ドメイン、および通常の当業者には公知の他のこうしたドメイン、ならびにそれらの誘導体および／または変異体が挙げられる。
【０１３３】
一部の実施形態において、適する単量体ドメイン（例えば、独自にフォールディングする能力を有するか、何らかの限られた補助を有するドメイン）は、Ｓｉｍｐｌｅ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＳＭＡＲＴ）（Ｓｈｕｌｔｚら、ＳＭＡＲＴ：ａ  ｗｅｂ−ｂａｓｅｄ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｂｉｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ，（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８（１）：２３１−２３４参照）またはＣＡＴＨ（Ｐｅａｒｌら、Ａｓｓｉｇｎｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｔｏ  ＣＡＴＨ，（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８（ｌ）：２７７−２８２参照）などのコンピュータ配列分析ツールによって定義されるβサンドイッチまたはβバレル三次元構造を有するタンパク質ドメインのファミリーから選択することができる。
【０１３４】
もう１つの実施形態において、本発明の単量体ドメインは、ＣＴＬＡ−４からのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、アンチカリンドメインおよびＩｇ様ドメイン以外のドメインを含む。これらのドメインの幾つかの態様は、２００１年９月７日発行のＬｉｐｏｖｓｅｋらによる「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」と題するＷＯ０１／６４９４２、１９９９年４月８日発行のＢｅｓｔｅらによる「Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ」と題するＷＯ９９／１６８７３、および２０００年１０月１２日発行のＤｅｓｍｅｔらによる「Ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ａｓ  ａ  ｓｃａｆｆｏｌｄ」と題するＷＯ００／６００７０に記載されている。
【０１３５】
上で説明したように、単量体ドメインは、場合によってはシステインリッチである。適するシステインリッチ単量体ドメインとしては、例えば、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン（「Ａ−ドメイン」）またはＥＧＦドメインが挙げられる。前記単量体ドメインは、負電荷残基のクラスターを有することもある。
【０１３６】
単量体ドメインの他の特徴としては、リガンドに結合する能力またはイオンに結合する能力（例えば、ＬＤＬ受容体Ａ−ドメインによるＣａ２＋結合）を挙げることができる。イオンに結合してそれらの二次構造を維持する単量体ドメインとしては、例えば、Ａドメイン、ＥＧＦドメイン、ＥＦ  Ｈａｎｄ（例えば、現在、カルモジュリンおよびトロポニンＣの中にみられるものなど）、カドヘリンドメイン、Ｃ型レクチン、Ｃ２ドメイン、アネキシン、Ｇｌａ−ドメイン、トロンボスポンジン３型ドメイン［これらのすべてがカルシウムに結合する］、およびジンクフィンガー（例えば、Ｃ２Ｈ２型Ｃ３Ｈ４型（ＲＩＮＧフィンガー）、インテグラーゼ亜鉛結合性ドメイン、ＰＨＤフィンガー、ＧＡＴＡジンクフィンガー、ＦＹＶＥジンクフィンガー、Ｂ−ボックスジンクフィンガー）［これらは亜鉛に結合する］が挙げられる。本発明を限定するつもりはないが、イオン結合は、二次構造の安定をもたらす一方で、一次配列に依存する非常に多数の結合配座に備える十分な柔軟性をもたらすと考えられる。
【０１３７】
本明細書において説明するように、単量体ドメインは、相同天然ドメインが結合できるターゲット以外のターゲットに結合する能力について選択することができる。従って、一部の実施形態において、本発明は、実質的に同一の天然ドメインが結合できるターゲットまたはクラスもしくはファミリーのターゲットタンパク質に結合しない単量体ドメイン（およびそうした単量体を含む多量体）を提供する。
【０１３８】
単量体ドメインの特徴としては、独自にフォールディングすることができることおよび安定な構造を形成することができることを挙げることができる。従って、本単量体ドメインの構造は、多くの場合、保存されるが、その単量体をコードしているポリヌクレオチド配列が保存される必要はない。例えば、Ａ−ドメイン構造は、Ａ−ドメインファミリーのメンバーの間で保存されるが、Ａ−ドメイン核酸配列はされない。従って、例えば、単量体ドメインは、そのシステイン残基およびカルシウムに対するその親和性によって、必須ではないがその核酸配列によって、Ａ−ドメインと分類される。図１および２参照。
【０１３９】
具体的に言うと、Ａ−ドメイン（時として「相補型リピート」または「ＬＤＬ受容体型もしくはクラスＡドメイン」と呼ばれる）は、約３０〜５０または３０〜６５のアミノ酸を含有する。一部の実施形態では、これらのドメインは、約３５〜４５のアミノ酸を含み、一部の事例では約３５〜４０のアミノ酸を含有する。３０〜５０のアミノ酸の中に、約６のシステイン残基が存在する。これらの６のシステインのうち、ジスルフィド結合は、一般に、次のシステインの間で見出される：Ｃ１とＣ３、Ｃ２とＣ５、Ｃ４とＣ６。このドメインのシステイン残基は、ジスルフィド結合して、小型の安定した機能的に独立した部分を形成する。図３参照。これらのリピートのクラスターは、リガンド結合性ドメインを構成し、ならびに特異的なクラスター形成は、リガンド結合に関する特異性をもたらすことができる。
【０１４０】
例示的Ａドメイン配列およびコンセンサス配列を図１および２に示す。Ａドメインの特定に有用な１つの代表的コンセンサス配列は、次のもの：
【０１４１】
【化５３】
2009501517.tif 000045
であり、この構造式中の角型カッコ内の残基は、１つの位置において可能な残基を示す。「Ｘ（＃）」は、残基の数を示す。これらの残基は、いずれのアミノ酸残基であってもよい。２つの数を含んでいるカッコは、その位置を占めることができるアミノ酸の範囲を指す（例えば、「［Ｄ，Ｅ］−Ｘ（１，５）−Ｃ」は、アミノ酸ＤＥの後に１、２、３、４または５個の残基があり、その後、Ｃがあることを意味する）。このコンセンサス配列は、第三のシステインで始まるＡドメインの部分を単に表している。第二のコンセンサスは、次の通りである：
【０１４２】
【化５４】
2009501517.tif 000046
。この第二コンセンサスは、６個すべてのシステイン残基にわたるアミノ酸残基を予測する。一部の実施形態において、Ａドメイン変異体は、上に記載した配列のうちのいずれかと実質的に同一である配列を含む。本発明のために、「ＬＤＬ受容体クラスＡ」への言及は、そのドメインの起源および結合特性を示すためのものではないことに留意しなければならない。
【０１４３】
追加の例示的Ａドメインとしては、次の配列が挙げられる：
【０１４４】
【化５５】
2009501517.tif 000047
（この配列式中、Ｃは、システインであり、Ｘｎ−ｍは、ｎとｍの間の数の、独立して選択されるアミノ酸を表し、および（Ｄ，Ｎ）は、その位置がＤまたはＮのいずれであってもよいことを示し、ならびにＣａ−Ｃｃ、Ｃｂ−ＣｅおよびＣｄ−Ｃｆは、ジスルフィド結合を形成する）。
【０１４５】
今日までに、少なくとも１９０の天然ヒトＡ−ドメインが、ｃＤＮＡ配列に基づいて特定されている。例えば、図６参照。天然Ａ−ドメインを含有する例示的タンパク質としては、例えば、相補成分（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９およびＩ因子）、セリンプロテアーゼ（例えば、エンテロペプチダーゼ、マトリプターゼおよびコリン）、膜貫通型タンパク質（例えば、ＳＴ７、ＬＲＰ３、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６）および細胞内受容体（例えば、ソルチリン関連受容体、ＬＤＬ−受容体、ＶＬＤＬＲ、ＬＲＰ１、ＬＲＰ２およびＡｐｏＥＲ２）が挙げられる。ＡドメインおよびＡドメイン変異体は、本発明を実施する際に単量体ドメインおよびそれらの変異体として容易に利用することができる。Ａドメインのさらなる説明は、以下の出版物およびそれらに引用されている参照文献において見出すことができる：ＨｏｗｅｌｌおよびＨｅｒｔｚ，Ｔｈｅ  ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ：ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １１：７４−８１；Ｈｅｒｚ（２００１），上記；Ｋｒｉｅｇｅｒ，Ｔｈｅ  “ｂｅｓｔ”  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｓ，ｔｈｅ  “ｗｏｒｓｔ”  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｓ：Ａ  ｔａｌｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，（１９９８）ＰＮＡＳ  ９５：４０７７−４０８０；ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＢｒｏｗｎ，Ｔｈｅ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｑｕａｒｔｅｔ，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９２：１３１０−１３１２；およびＭｏｅｓｔｒｕｐおよびＶｅｒｒｏｕｓｔ，Ｍｅｇａｌｉｎ−ａｎｄ  Ｃｕｂｉｌｉｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂｏｕｎｄ  Ｖｉｔａｍｉｎｓ，Ｌｉｐｉｄｓ，ａｎｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ｉｎ  Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａ，（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．２１：４０７−２８。
【０１４６】
多数の他のドメインのタイプも、ＩＬ−６結合単量体ドメインの作製に使用することができる。
【０１４７】
例示的ＥＧＦ単量体ドメインとしては、配列：
【０１４８】
【化５６】
2009501517.tif 000048
（この配列式中、
Ｃは、システインであり、Ｘｎ−ｍは、ｎとｍの間の数の、独立して選択されるアミノ酸を表し、および
Ｃａ−Ｃｃ、Ｃｂ−ＣｅおよびＣｄ−Ｃｆは、ジスルフィド結合を形成する）
を含む。
【０１４９】
下で説明する各ドメインは、例示的モチーフ（すなわち、足場）を用いる。一定の位置にｘという印を付けてあるが、これは、その位置をいずれのアミノ酸が占めてもよいことを示す。これらの位置は、多数の異なるアミノ酸の可能性を示し、それによって配列の多様性に対処し、従って、異なるターゲット分子に対する親和性に対処することができる。モチーフ内での角型カッコの使用は、１つの位置の中での交代可能なアミノ酸を示す（例えば、「［ｅｋｑ］」は、Ｅ、ＫまたはＱのいずれかが、その位置に存在し得ることを示す）。本明細書で用いる場合、配列モチーフ内のカッコの使用は、カッコ内のそれらの位置が、存在する場合もあり、または不在である場合もあることを示す（例えば、「［ｅｋｑ］」は、その位置が不在であること、またはＥ、ＫもしくはＱが、その位置に存在し得ることを示す）。１より多くの「ｘ」がカッコ内で使用されているとき（例えば、「（ｘｘ）」）、各ｘは、可能な位置を表す。従って、「（ｘｘ）」は、０、１または２個のアミノ酸がその（それらの）位置に存在し得ることを示し、この場合、各アミノ酸は、独立して、任意のアミノ酸から選択される。αは、例えばＷ、Ｙ、ＦまたはＬなどの、芳香族／疎水性アミノ酸を現し；βは、例えばＶ、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＭまたはＦなどの、疎水性アミノ酸を表し；χは、例えばＧ、Ａ、ＳまたはＴなどの、より小さな極性アミノ酸を表し；δは、例えばＫ、Ｒ、Ｅ、ＱまたはＤなどの、荷電アミノ酸を表し；εは、例えばＶ、Ａ、ＳまたはＴなどの、小さなアミノ酸を表し；ならびにφは、例えばＤ、ＥまたはＮなどの、負の電荷のアミノ酸を表す。
【０１５０】
適するドメインとしては、例えば、トロンボスポンジン１型ドメイン、トレフォイルドメインおよびサイログロブリンドメインが挙げられる。
【０１５１】
トロンボスポンジン１型（「ＴＳＰ１」）ドメインは、約３０〜５０または３０〜６５のアミノ酸を含有する。一部の実施形態において、これらのドメインは、約３５〜５５のアミノ酸を含み、一部の事例では約５０のアミノ酸を含む。それらの３５〜５５のアミノ酸の中に、一般に、約４から約６のシステイン残基が存在する。これらの６のシステインのうち、ジスルフィド結合は、一般に、次のシステインの間で見出される：Ｃ１とＣ５、Ｃ２とＣ６、Ｃ３とＣ４。このドメインのシステイン残基は、ジスルフィド結合して、ねじれたベータ鎖を含む小型の安定した機能的に独立した部分を形成する。これらのリピートのクラスターは、リガンド結合ドメインを構成し、ならびに特異的なクラスター形成は、リガンド結合に関する特異性をもたらすことができる。
【０１５２】
例示的ＴＳＰ１ドメイン配列およびコンセンサス配列は、次の通り（配列番号３４４〜３４９）である：
【０１５３】
【化５７】
2009501517.tif 000049
一部の実施形態において、トロンボスポンジン１型ドメイン変異体は、上に記載した配列のうちのいずれかと実質的に同一の配列を含む。
【０１５４】
今日までに、少なくとも１６７７の天然トロンボスポンジンドメインが、ｃＤＮＡ配列に基づいて特定されている。天然トロンボスポンジンドメインを含有する例示的タンパク質としては、例えば、相補経路におけるタンパク質（例えば、プロパージン、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８Ａ、Ｃ８ＢおよびＣ９）、細胞外基質タンパク質（例えば、ミンジン、Ｆ−スポンジン、ＳＣＯ−スポンジン）、スポロゾイト周囲表面タンパク質、およびマラリア病原中のＴＲＡＰタンパク質が挙げられる。トロンボスポンジン１型ドメインは、例えば、Ｒｏｓｚｍｕｓｚら、ＢＢＲＣ  ２９６：１５６（２００２）；Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：５７７７−８５（１９９５）；Ｓｃｈｕｌｔｚ−Ｃｈｅｒｒｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７３０４−７３１０（１９９５）；Ｓｃｈｕｌｔｚ−Ｃｈｅｒｒｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２６７８３−８（１９９４）；Ｂｏｒｋ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３２７：１２５−３０（１９９３）；およびＬｅｕｎｇ−Ｈａｇｅｓｔｅｉｊｎら、Ｃｅｌｌ  ７１：２８９−９９（１９９２）にさらに記載されている。
【０１５５】
本発明の実施の際の使用に適するもう１つの例示的単量体ドメインは、トレフォイルドメインである。トレフォイル単量体ドメインは、一般に、約３０〜５０または３０〜６５のアミノ酸である。一部の実施形態において、これらのドメインは、約３５〜５５のアミノ酸を含み、一部の事例では約４５のアミノ酸を含む。それらの３５〜５５のアミノ酸の中に、一般に、約６のシステイン残基が存在する。これらの６のシステインのうち、ジスルフィド結合は、一般に、次のシステインの間で見出される：Ｃ１とＣ５、Ｃ２とＣ４、Ｃ３とＣ６。
【０１５６】
今日までに、少なくとも１４９の天然トレフォイルドメインが、ｃＤＮＡ配列に基づいて特定されている。天然トレフォイルドメインを含有する例示的タンパク質としては、例えば、プロテインｐＳ２（ＴＦＦ１）、鎮痙ペプチドＳＰ（ＴＦＦ２）、腸トレフォイル因子（ＴＦＦ３）、腸スクラーゼ−イソマルターゼ、および上皮の保護による微生物感染に対する防御に関与し得るタンパク質（例えば、アフリカツメガエルｘＰ１、ｘＰ４、外皮ムチンＡ．１およびＣ．１）が挙げられる。トレフォイルドメインは、例えば、ＳａｎｄｓおよびＰｏｄｏｌｓｋｙ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５８：２５３−２７３（１９９６）；Ｃａｒｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１：２２０６−２２１０（１９９４）；ＤｅＡら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１：１０８４−１０８８（１９９４）；Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １８：２３９−２４３（１９９３）にさらに記載されている。
【０１５７】
例示的トレフォイルドメイン配列およびコンセンサス配列は、次の通り（配列番号３５０〜３５５）である：
【０１５８】
【化５８】
2009501517.tif 000050
本発明での使用に適するもう１つの例示的単量体ドメインは、サイログロブリンドメインである。サイログロブリン単量体ドメインは、一般に、約３０〜８５または３０〜８０のアミノ酸である。一部の実施形態において、これらのドメインは、約３５〜７５のアミノ酸を含み、一部の事例では約６５のアミノ酸を含む。それらの３５〜７５のアミノ酸の中に、一般に、約６のシステイン残基が存在する。これらの６のシステインのうち、ジスルフィド結合は、一般に、次のシステインの間で見出される：Ｃ１とＣ２、Ｃ３とＣ４、Ｃ５とＣ６。
【０１５９】
今日までに、少なくとも２５１の天然サイログロブリンドメインが、ｃＤＮＡ配列に基づいて特定されている。ＴｇのＮ末端セクションは、Ｔｇ  １型リピート  ＰＵＢＭＥＤ：３５９５５９９、ＰＵＢＭＥＤ：８７９７８４５として知られている、アミノ酸数約６５のドメインの１０のリピートを含有する。天然サイログロブリンドメインを含有する例示的タンパク質としては、例えば、ＨＬＡクラスＩＩ関連インバリアント鎖、ヒト膵臓癌マーカータンパク質、ニドジェン（エンタクチン）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、サキシフィリン、サケ（ｃｈｕｍ  ｓａｌｍｏｎ）卵システインプロテイナーゼ阻害剤、およびイクイスタチンが挙げられる。Ｔｈｙｒ−１および関連ドメインは、ＭＥＲＯＰＳプロテイナーゼ阻害剤ファミリーＩ３１、クランＩＸに属する。サイログロブリンドメインは、例えば、Ｍｏｌｉｎａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４０：１２５−１３３（１９９６）；Ｇｕｎｃａｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ  １８：７９３−８０３（１９９９）；ＣｈｏｎｇおよびＳｐｅｉｃｈｅｒ，ＤＷ２７６：５８０４−５８１３（２００１）にさらに記載されている。
【０１６０】
例示的サイログロブリンドメイン配列およびコンセンサス配列は、次の通り（配列番号３５６〜３６０）である：
【０１６１】
【化５９】
2009501517.tif 000051
本発明において使用することができるもう１つの例示的単量体ドメインは、ラミニン−ＥＧＦドメインである。ラミニン−ＥＧＦドメインは、一般に、約３０〜８５または３０〜８０のアミノ酸である。一部の実施形態において、これらのドメインは、約４５〜６５のアミノ酸を含み、一部の事例では約５０のアミノ酸を含む。それらの４５〜６５のアミノ酸の中に、一般に、約８のシステイン残基が存在し、これらが相互作用して４つのジスルフィド結合を形成する。ラミニンは、細胞接着、増殖、移動および分化を媒介する基底膜の主要非膠原成分である。これらは、別個であるが、関連したアルファ、ベータおよびガンマ鎖から成る。これらの３本の鎖は、１つの長い腕と３つの短い球形の腕から成る十字形分子を形成する。この長い腕は、３本すべての鎖による寄与を受け、且つ、鎖間ジスルフィド結合によって架橋された、多重らせん構造から成る。
【０１６２】
例示的ラミニンＥＧＦドメイン配列およびコンセンサス配列は、次の通り（配列番号３６１〜３６３）である：
【０１６３】
【化６０】
2009501517.tif 000052
一部の実施形態において、本単量体ドメインは、Ｎｏｔｃｈ／ＬＮＲ単量体ドメイン、ＤＳＬ単量体ドメイン、Ａｎａｔｏ単量体ドメイン、インテグリンベータ単量体ドメイン、およびＣａ−ＥＧＦ単量体ドメインである。
【０１６４】
一部の実施形態において、Ｃａ−ＥＧＦ単量体ドメインは、次の配列（配列番号３６４）を含む：
【０１６５】
【化６１】
2009501517.tif 000053
一部の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ／ＬＮＲ単量体ドメインは、次の配列（配列番号３６５）を含む：
【０１６６】
【化６２】
2009501517.tif 000054
一部の実施形態において、ＤＳＬ単量体ドメインは、次の配列：
【０１６７】
【化６３】
2009501517.tif 000055
（配列番号３６６）を含む。
【０１６８】
Ａｎａｔｏ単量体ドメインは、次の配列（配列番号３６６）：
【０１６９】
【化６４】
2009501517.tif 000056
（配列番号３６７）を含む。
【０１７０】
一部の実施形態において、インテグリンベータ単量体ドメインは、次の配列（配列番号３６８）：
【０１７１】
【化６５】
2009501517.tif 000057
（「ｘ」は任意のアミノ酸である）を含む。
【０１７２】
一部の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ／ＬＮＲ単量体ドメインのＣ１−Ｃ５、Ｃ２−Ｃ４およびＣ３−Ｃ６は、ジスルフィド結合を形成し、ならびにＤＳＬ単量体ドメインのＣ１−Ｃ５、Ｃ２−Ｃ４およびＣ３−Ｃ６は、ジスルフィド結合を形成する。
【０１７３】
一部の実施形態において、Ｃａ−ＥＧＦ単量体ドメインは、次の配列：
【０１７４】
【化６６】
2009501517.tif 000058
（配列番号３６９）を含む。
【０１７５】
一部の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ／ＬＮＲ単量体ドメインは、次の配列：
【０１７６】
【化６７】
2009501517.tif 000059
（配列番号３７０）を含む。
【０１７７】
一部の実施形態において、ＤＳＬ単量体ドメインは、次の配列：
【０１７８】
【化６８】
2009501517.tif 000060
（配列番号３７１）を含む。
【０１７９】
一部の実施形態において、Ａｎａｔｏ単量体ドメインは、次の配列：
【０１８０】
【化６９】
2009501517.tif 000061
（配列番号３７２）を含む。
【０１８１】
一部の実施形態において、インテグリンベータ単量体ドメインは、次の配列：
【０１８２】
【化７０】
2009501517.tif 000062
（配列番号３７３）を含み；αは、ｗ、ｙ、ｆおよびｌから選択され；βは、ｖ、ｉ、ｌ、ａ、ｍおよびｆから選択され；χは、ｇ、ａ、ｓおよびｔから選択され；δは、ｋ、ｒ、ｅ、ｑおよびｄから選択され；εは、ｖ、ａ、ｓおよびｔから選択され；ならびにφは、ｄ、ｅおよびｎから選択される。
【０１８３】
一部の実施形態において、Ｃａ−ＥＧＦ単量体ドメインは、次の配列：
【０１８４】
【化７１】
2009501517.tif 000063
（配列番号３７４）を含む。
【０１８５】
一部の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ／ＬＮＲ単量体ドメインは、次の配列：
【０１８６】
【化７２】
2009501517.tif 000064
（配列番号３７５）を含む。
【０１８７】
一部の実施形態において、ＤＳＬ単量体ドメインは、次の配列：
【０１８８】
【化７３】
2009501517.tif 000065
（配列番号３７６）を含む。
【０１８９】
一部の実施形態において、Ａｎａｔｏ単量体ドメインは、次の配列：
【０１９０】
【化７４】
2009501517.tif 000066
（配列番号３７７）を含む。
【０１９１】
一部の実施形態において、インテグリンベータ単量体ドメインは、次の配列：
【０１９２】
【化７５】
2009501517.tif 000067
（配列番号３７８）を含む。
【０１９３】
一般に、これらの単量体ドメインをコードしているポリヌクレオチドを利用して、発現により単量体ドメインを作製する。単量体ドメインをコードしている核酸は、様々な異なる源に由来し得る。単量体ドメインのライブラリーは、天然単量体ドメイン、改変単量体ドメイン（すなわち、単量体ドメイン変異体）、またはこれらの組み合わせをコードしている多数の異なる核酸を発現させることによって作製することができる。例えば、アミノ酸の足場は定常的なままである（例えば、ＬＤＬ  Ａ受容体ドメイン、ＥＧＦドメイン）が、その足場内の介在アミノ酸は、ランダムに作製されたアミノ酸を含むライブラリーを、設計することができる。
【０１９４】
本発明は、選択されたもしくは所望のリガンドまたはリガンドの混合物に結合する単量体ドメインを特定する方法を提供する。一部の実施形態では、単量体ドメインを特定し、所望の特性（例えば、結合親和性）について選択し、その後、単量体ドメインを多量体にする。例えば、図４参照。これらの実施形態には、所望の特性（例えば、特異的結合特性）を有するドメインの選択を結果としてもたらす任意の方法を用いることができる。例えば、これらの方法は、各核酸が単量体ドメインをコードしている多数の異なる核酸を生じさせること；それらの多数の異なる核酸を翻訳し、それによって多数の異なる単量体ドメインを生じさせること；それらの多数の異なる単量体ドメインを所望のリガンドまたはリガンドの混合物の結合についてスクリーニングすること；ならびに所望のリガンドまたはリガンドの混合物に結合する多数の異なる単量体ドメインのメンバーを特定することを含むことがある。
【０１９５】
単量体ドメインは、天然である場合もあり、または改変されている（非天然変異体である）場合もある。用語「天然」は、対象を自然界で見出すことができることを示すために、本明細書では用いる。例えば、天然単量体ドメインは、ヒト単量体ドメイン、または場合によっては、異なる種もしくは源、例えば哺乳動物、霊長類、齧歯動物、魚類、鳥類、爬虫類、植物など、に由来するドメインを包含し得る。天然単量体ドメインは、多数の方法によって、例えば、ＤＮＡまたはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって、得ることができる。
【０１９６】
本発明の単量体ドメインは、天然ドメインである場合もあり、または非天然変異体である場合もある。本発明の実施の際に利用される単量体ドメインのライブラリーは、天然単量体ドメイン、非天然単量体ドメイン変異体、またはこれらの組み合わせを含有し得る。
【０１９７】
単量体ドメイン変異体としては、祖先ドメイン、キメラドメイン、ランダム化ドメイン、突然変異ドメインなどを挙げることができる。例えば、先祖ドメインは、系統発生的分析に基づくものであり得る。キメラドメインは、１つ以上の領域が、同じファミリーの他のドメインからの対応する領域によって置換されているドメインである。例えば、キメラドメインは、同じファミリーの多数の関連ドメインからのループ配列を組み合わせて、潜在的に低減された免疫原性を有する新たなドメインを形成することによって、構築することができる。当業者は、ランダムなアミノ酸配列を作るのではなく、同じファミリーの様々な関連ドメインからのループ領域を組み合わせることによってドメインへの結合が修飾された単量体を構築することの免疫学的利点がわかるであろう。例えば、ヒトＬＤＬ受容体クラスＡ−ドメインにおいて自然に発生するループ配列またはさらに多数のループ配列を組み合わせることにより変異体ドメインを構築することによって得られるドメインは、新たな結合特性を含むことはあるが、暴露されるすべてのループはヒト起源のものであるため、免疫原性タンパク質配列を含むことは一切ない。内因性の状況でのループアミノ酸配列のこの組み合わせは、本発明のすべての単量体構築に適用するするこができる。従って、本発明は、ヒトタンパク質に由来するキメラ単量体ドメインのライブラリーの作製方法を提供し、この方法は、ヒトタンパク質の少なくとも２つの異なる天然変異体の各々からの少なくとも１つのループに対応するループ配列を生じさせること（この場合のループ配列は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列である）；およびループ配列を共有結合させて、少なくとも２つの異なるキメラ配列のライブラリーを作製すること（この場合、各キメラ配列は、少なくとも２つのループを有するキメラ単量体ドメインをコードしている）を含む。一般に、前記キメラドメインは、少なくとも４つのループ、通常は少なくとも６つのループを有する。上で説明したように、本発明は、一定の特徴、例えば、ジスルフィド結合、二次タンパク質構造間の架橋、および分子動力学（すなわち、柔軟性）についての可能性によって特定される３つのタイプのループを提供する。前記３つのタイプのループ配列は、システイン規定ループ配列、構造規定ループ配列およびＢ因子規定ループ配列である。
【０１９８】
ランダム化ドメインは、１つ以上の領域がランダム化されているドメインである。ランダム化は、配列多様性の天然分布に基づく完全ランダム化または場合によっては部分的ランダム化に基づくものであり得る。
【０１９９】
本発明は、ＩＬ−６に結合する１つまたは複数の単量体ドメインを含む１つ以上のポリペプチドをコードしている組み換え核酸も提供する。例えば、このポリペプチドは、ＥＧＦ様ドメイン、クリングルドメイン、フィブロネクチンＩ型ドメイン、フィブロネクチンＩＩ型ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、ＰＡＮドメイン、Ｇｌａドメイン、ＳＲＣＲドメイン、クニツ／ウシ膵臓トリプシンインヒビタードメイン、カザール型セリンプロテアーゼインヒビタードメイン、トレフォイル（Ｐ型）ドメイン、フォン−ウィルブランド因子Ｃ型ドメイン、アナフィラトキシン様ドメイン、ＣＵＢドメイン、サイログロブリンＩ型リピート、ＬＤＬ−受容体クラスＡドメイン、スシドメイン、リンクドメイン、トロンボスポンジンＩ型ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、Ｃ型レクチンドメイン、ＭＡＭドメイン、フォン−ウィルブランド因子Ａ型ドメイン、ソマトメジンＢドメイン、ＷＡＰ型４ジスルフィドコアドメイン、Ｆ５／８  Ｃ型ドメイン、ヘモペキシンドメイン、ＳＨ２ドメイン、ＳＨ３ドメイン、ラミニン型ＥＧＦ様ドメイン、Ｃ２ドメイン、およびこれらのうちの１つ以上の変異体から成る群より選択される非天然ドメインを含むように選択することができる。もう１つの実施形態において、天然ポリペプチドは、Ｐｆａｍデータベースおよび／またはＳＭＡＲＴデータベースにおいて見出される単量体ドメインをコードしている。
【０２００】
本発明の方法によって生産される組成物をはじめとする本発明のすべての組成物、例えば単量体ドメインおよび／または免疫ドメイン、ならびにそれらの多量体およびライブラリーは、場合によっては親和性材料のマトリックスに結合させることができる。親和性材料の例としては、ビーズ、カラム、固体支持体、マイクロアレイ、試薬−支持体の他のプールなどが挙げられる。
【０２０１】
ＩＩＩ．多量体
多量体を作製するための方法は、本発明の１つの特徴である。多量体は、少なくとも２つの単量体ドメインを含む。例えば、本発明の多量体は、２から約１０の単量体ドメイン、２から約８の単量体ドメイン、約３から約１０の単量体ドメイン、約７の単量体ドメイン、約６の単量体ドメイン、約５の単量体ドメインまたは約４の単量体ドメインを含むことがある。一部の実施形態において、本多量体は、３または少なくとも３の単量体ドメインを含む。一部の実施形態において、本多量体は、２、３、４、５、６、７または８以下の単量体ドメインを有する。単量体ドメインサイズの可能な範囲を考慮すると、本発明の多量体は、例えば、１００ｋＤ未満、９０ｋＤ未満、８０ｋＤ未満、７０ｋＤ未満、６０ｋＤ未満、５０ｋＤ未満、４０ｋＤ未満、３０ｋＤ未満、２５ｋＤ未満、２０ｋＤ未満、１５ｋＤ未満、１０ｋＤ未満であり得、またはより小さいもしくはより大きい場合もある。一部の事例において、単量体ドメインは、関心のあるターゲット分子（例えば、ＩＬ−６）への結合について事前に選択されている。一部の実施形態において、本発明の多量体は、ＩＬ−６（または、例えば、ＨＳＡもしくはＩｇＧなどの血液因子）に１０−３Ｍ未満の親和性で結合するであろう（すなわち、１０−３Ｍの親和性より強く結合する）。一部の実施形態において、この親和性は、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満である。一部の実施形態において、多量体の親和性は、その多量体内のそれぞれの単量体ドメインの親和性の合計より強い（または小さい）であろう。
【０２０２】
一部の実施形態において、各単量体ドメインは、１つのターゲット分子（例えば、ＩＬ−６）に特異的に結合する。これらの実施形態のうちの一部において、各単量体は、ターゲット分子上の（エピトープに類似している）異なる位置に結合する。同じターゲット分子に結合する多数の単量体ドメインは、各々の個々の単量体の親和性と比較して多量体のターゲット分子に対する改善された親和性を生じさせる結合活性効果をもたらす。一部の実施形態において、多量体は、単量体ドメイン単独の結合活性の少なくとも約１．５、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００または１０００倍の結合活性を有する。一部の実施形態において、多量体の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上（例えば、すべて）の単量体が、イオン、例えばカルシウムまたは別のイオン、に結合する。多量体は、単量体ドメインの様々な組み合わせを含むことがある。例えば、単一の多量体において、選択単量体ドメインは、同じである場合もあり、または異なる場合もある。加えて、選択単量体ドメインが、同じ単量体ドメインファミリーからの様々な異なる単量体ドメインを含む場合もあり、または異なるドメインファミリーからの様々な単量体ドメインを含む場合もあり、または場合によっては両方の組み合わせを含む場合もある。例えば、単量体ドメインは、ＩＬ−６結合性単量体ドメインのファミリー１〜７から選択することができる。一部の実施形態において、単量体ドメインの少なくとも１つが、ＩＬ−６結合性単量体ドメインのファミリー３および／または５から選択される。例示的ＩＬ−６結合性二量体および三量体（それぞれ、２つまたは３つのＩＬ−６結合性単量体から成る）は、実施例において列挙する。
【０２０３】
本発明の実施で作製される多量体は、次のもののいずれかであり得る：
（１）ホモ多量体（同じドメインの多量体、すなわち、Ａ１−Ａ１−Ａ１−Ａ１）；
（２）同じドメインクラスの異なるドメインのヘテロ多量体、例えば、Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４。例えば、ヘテロ多量体としては、Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４が特定のＬＤＬ−受容体クラスＡドメインの異なる非天然変異体である多量体、またはＡ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４のうちの幾つかが、ＬＤＬ−受容体クラスＡドメインの天然変異体である多量体が挙げられる。
【０２０４】
（３）異なる単量体ドメインクラスからのドメインのヘテロ多量体、例えば、Ａ１−Ｂ２−Ａ２−Ｂ１。例えば、この場合、Ａ１およびＡ２は、ＬＤＬ−受容体クラスＡからの異なる単量体ドメイン（天然または非天然のいずれか）であり、ならびにＢ１およびＢ２は、クラスＥＧＦ様ドメインからの２つの異なる単量体ドメイン（天然または非天然のいずれか）である。
【０２０５】
もう１つの態様において、本多量体は、異なるターゲット分子（例えば、血清アルブミン、免疫グロブリンまたは赤血球などの血液因子）に対する特異性を有する単量体ドメインを含む。例えば、一部の実施形態において、本発明の多量体は、ＩＬ−６に結合する１、２、３またはそれ以上の単量体ドメインと、第二のターゲット分子に結合する少なくとも１つの単量体ドメインとを含む。例示的ターゲット分子としては、例えば、多量体の血清半減期を延長する血清分子（例えば、免疫グロブリンまたは血清アルブミン）が挙げられる。多量体の血清半減期を延長する例示的分子としては、例えば、赤色血液細胞（すなわち、赤血球）、ＩｇＧ、および血清アルブミン、例えばＨＳＡが挙げられる。例示的多量体としては、例えば、ＩＬ−６結合性単量体ドメイン（および場合によっては２、３、４またはそれ以上のＩＬ−６結合性ドメイン）のファミリー３および／またはファミリー５からの単量体ドメイン、ならびに免疫グロブリン結合性単量体ドメインのファミリー２または３からの単量体ドメインが挙げられるだろう。
【０２０６】
本発明の実施の際に利用される多量体ライブラリーは、ホモ多量体、同じ単量体クラスからの異なる単量体ドメイン（天然もしくは非天然）のへテロ多量体、または異なる単量体クラスからの単量体ドメイン（天然もしくは非天然）のへテロ多量体、またはこれらの組み合わせを含有し得る。
【０２０７】
本明細書に記載するような単量体ドメインは、免疫ドメイン含有へテロ多量体（すなわち、少なくとも１つの免疫ドメイン変異体と１つの単量体ドメイン変異体とを有する多量体）にも容易に利用される。従って、本発明の多量体は、少なくとも１つの免疫ドメイン、例えば、ミニボディー、単一ドメイン抗体、１本鎖可変領域フラグメント（ＳｃＦｖ）、またはＦａｂフラグメント；ならびに少なくとも単量体ドメイン、例えば、ＥＧＦ様ドメイン、クリングルドメイン、フィブロネクチンＩ型ドメイン、フィブロネクチンＩＩ型ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、ＰＡＮドメイン、Ｇｌａドメイン、ＳＲＣＲドメイン、クニツ／ウシ膵臓トリプシンインヒビタードメイン、カザール型セリンプロテアーゼインヒビタードメイン、トレフォイル（Ｐ型）ドメイン、フォン−ウィルブランド因子Ｃ型ドメイン、アナフィラトキシン様ドメイン、ＣＵＢドメイン、サイログロブリンＩ型リピート、ＬＤＬ−受容体クラスＡドメイン、スシドメイン、リンクドメイン、トロンボスポンジンＩ型ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、Ｃ型レクチンドメイン、ＭＡＭドメイン、フォン−ウィルブランド因子Ａ型ドメイン、ソマトメジンＢドメイン、ＷＡＰ型４ジスルフィドコアドメイン、Ｆ５／８  Ｃ型ドメイン、ヘモペキシンドメイン、ＳＨ２ドメイン、ＳＨ３ドメイン、ラミニン型ＥＧＦ様ドメイン、Ｃ２ドメイン、またはこれらの変異体を有することがある。
【０２０８】
ドメインを連結させて多量体を形成する前にドメインを選択する必要はない。一方、多量体に連結させる前に、ターゲット分子に結合する能力についてドメインを選択することができる。従って、例えば、多量体は、１つのターゲット分子に結合する２つのドメインと第二のターゲット分子に結合する第三のドメインを含む場合がある。
【０２０９】
本発明の多量体は、次の特質を有することができる：多価、多重特異性、１本鎖、熱安定性、延長された血清および／または貯蔵量半減期。さらに、単量体ドメインの少なくとも１つ、１つより多くもしくはすべてが、イオン（例えば、金属イオンもしくはカルシウムイオン）に結合する場合もあり、少なくとも１つ、１つより多くもしくはすべての単量体ドメインが、ＬＤＬ受容体Ａドメインおよび／もしくはＥＧＦ様ドメインに由来する場合もあり、単量体ドメインの少なくとも１つ、１つより多くもしくはすべてが、非天然である場合もあり、ならびに／または単量体ドメインの少なくとも１つ、１つより多く、もしくはすべてが、単量体ドメイン当たり１、２、３もしくは４つのジスルフィド結合を含む場合もある。一部の実施形態において、本多量体は、少なくとも２つ（または少なくとも３つ）の単量体ドメインを含み、この場合、少なくとも１つの単量体ドメインは、非天然単量体ドメインであり、それらの単量体ドメインは、カルシウムに結合する。一部の実施形態において、本多量体は、少なくとも４つの単量体ドメインを含み、この場合、少なくとも１つの単量体ドメインは、非天然であり、ならびに
ａ．各単量体ドメインは、３０〜１００の間のアミノ酸であり、単量体ドメインの各々が、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む；または
ｂ．各単量体ドメインは、３０〜１００の間のアミノ酸であり、細胞外タンパク質に由来する；または
ｃ．各単量体ドメインは、３０〜１００の間のアミノ酸であり、タンパク質ターゲットに結合する。
【０２１０】
一部の実施形態において、本多量体は、少なくとも４つの単量体ドメインを含み、この場合、少なくとも１つの単量体ドメインは、非天然であり、ならびに
ａ．各単量体ドメインは、３５〜１００の間のアミノ酸である；または
ｂ．各ドメインは、少なくとも１つのジスルフィド結合を含み、ヒトタンパク質および／もしくは細胞外タンパク質に由来する。
【０２１１】
一部の実施形態において、本多量体は、少なくとも２つの単量体ドメインを含み、この場合、少なくとも１つの単量体ドメインは、非天然であり、ならびに各ドメインは、
ａ．２５〜５０のアミノ酸長であり、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む；または
ｂ．２５〜５０のアミノ酸長であり、細胞外タンパク質に由来する；または
ｃ．２５〜５０のアミノ酸長であり、タンパク質ターゲットに結合する；または
ｄ．３５〜５０のアミノ酸長である。
【０２１２】
一部の実施形態において、本多量体は、少なくとも２つの単量体ドメインを含み、この場合、少なくとも１つの単量体ドメインは、非天然であり、ならびに
ａ．各単量体ドメインは、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む；または
ｂ．少なくとも１つの単量体ドメインは、細胞外タンパク質に由来する；または
ｃ．少なくとも１つの単量体ドメインは、ターゲットタンパク質に結合する。
【０２１３】
特定される単量体ドメインおよび／または多量体は、生物活性を有することがあり、これは、選択されたまたは所望のリガンドに対する特異的結合親和性を少なくとも含むことを意味し、一部の事例では、他の化合物の結合を遮断する能力、代謝経路を刺激または阻害する能力、シグナルまたはメッセンジャーとして作用する能力、細胞活性を刺激または阻害する能力などをさらに含むであろうことを意味する。一部の実施形態において、本発明の単量体ドメインは、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６受容体に結合する。一部の実施形態において、これらの単量体ドメインは、ＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結合を遮断する、またはＩＬ−６受容体を活性化させる。
【０２１４】
単一のリガンドを使用することもあり、または場合によっては、様々なリガンドを使用して、単量体ドメインおよび／もしくは多量体を選択することもある。本発明の単量体ドメインは、単一のリガンドに結合することもあり、または様々なリガンドに結合することもある。本発明の多量体は、単一のリガンドのための多数の個別の結合部位を有することがあり、または場合によっては、様々なリガンドのための多数の結合部位を有することがある。
【０２１５】
一部の実施形態において、本発明の多量体は、同じまたは異なる多量体に結合して、凝集体を形成する。凝集は、例えば、２つの単量体ドメイン上の疎水性ドメインの存在によって媒介されることがあり、その結果、２つの単量体ドメイン間に非共有結合性相互作用が形成される。あるいは、凝集は、別の多量体内の単量体ドメインに対する結合特異性を有する多量体内の１つ以上の単量体ドメインによって助長されることがある。凝集体は、単量体ドメインまたは多量体上の親和性ペプチドの存在に起因して形成することもある。凝集体は、単一の多量体より多くのターゲット分子性結合ドメインを含有することがある。
【０２１６】
細胞表面ターゲットと第二のターゲット（例えば、ＩＬ−６）の両方に対する親和性を有する多量体は、結合活性効力増大に対処することができる。一部の事例では、相互作用の間隔および結合価を（自己組立てにより）最適化する際、膜の流動性のほうがタンパク質リンカーより融通が利く場合もある。一部の事例では、多量体は、２つの異なるターゲット、異なる細胞上の各々、または細胞上の１つと多数の結合部位を有する分子上のもう１つ、に結合するであろう。
【０２１７】
一部の実施形態では、本発明の単量体または多量体を別のポリペプチドと連結させて、融合タンパク質を形成する。当該技術分野における任意のポリペプチドを融合パートナーとして使用することができるが、それは、その融合パートナーが多量体を形成する場合に有用でなければならない。例えば、本発明の単量体または多量体は、例えば、抗体の以下の位置または位置の組み合わせに融合することができる：
１．場合によってはリーダーペプチドの直ぐ後でドメイン開始の前の、ＶＨ１および／もしくはＶＬ１ドメインのＮ末端位置（フレームワーク領域１）；
２．ＶＨ１もしくはＶＬ１ドメインに代わる、ＣＨ１もしくはＣＬ１ドメインのＮ末端位置；
３．場合によってはＣＨ１ドメインの後でヒンジ内のシステイン残基の前の、Ｈ鎖のＮ末端位置（Ｆｃ−融合）；
４．ＣＨ３ドメインのＮ末端位置；
５．短いリンカーにより最後のアミノ酸残基に場合によっては付いている、ＣＨ３ドメインのＣ末端位置；
６．ＣＨ３ドメインに代わる、ＣＨ２ドメインのＣ末端位置；
７．鎖間ジスルフィドを形成するシステインの場合によっては後の、ＣＬ１もしくはＣＨ１ドメインのＣ末端位置；または
８．ＶＨ１もしくはＶＬ１ドメインのＣ末端位置。図７参照。
【０２１８】
一部の実施形態では、本発明の１つ以上の単量体または多量体ドメインを、薬剤として有用な分子（例えば、タンパク質、核酸、有機小分子など）に連結させる。例示的薬学的タンパク質としては、例えば、サイトカイン、抗体、ケモカイン、増殖因子、インターロイキン（例えば、ＩＬ−６）、細胞表面タンパク質、細胞外ドメイン、細胞表面受容体、細胞毒などが挙げられる。例示的小分子薬剤としては、毒素または薬学的物質が挙げられる。一部の実施形態において、金属を本発明のポリペプチドに結合させることができる。これは、例えば、造影剤、例えばＭＲＩ用の造影剤として、有用であり得る。
【０２１９】
一部の実施形態では、本単量体または多量体を選択して、組織特異的または疾病特異的ターゲットタンパク質に結合させる。組織特異的タンパク質は、動物の１つまたは幾つかの特定の組織において、他の組織と比較して排他的にまたは有意に高いレベルで発現されるタンパク質である。
【０２２０】
一部の実施形態では、ターゲットタンパク質に結合する単量体または多量体を薬学的タンパク質または小分子に連結させるので、結果として生じる複合体または融合体は、そのターゲットタンパク質（例えば、ＩＬ−６）を発現する特定の組織または疾病関係細胞（単数または複数）をターゲットにする。こうした複合体または融合体において使用するための単量体または多量体は、最初に、ターゲットタンパク質への結合について選択することができ、そしてその後、他の非ターゲット細胞または組織における結合を低減または排除することが望まれる場合には、（骨髄への、または薬物毒性の下限を設定する他の組織へのターゲッティングを避けるために）他の細胞または組織に対する負の選択により、選択することができる。その薬剤を感受性組織から離しておくことにより、治療領域を増大させて、より高い用量を安全に投与することができる。もう１つの代案では、単量体または多量体のライブラリーを動物に注射し、その後、関心のある特定の組織または細胞に結合する単量体または多量体を単離することによって、インビボパニングを行うことができる。
【０２２１】
上で説明した融合タンパク質は、薬学的タンパク質と本単量体または多量体の間のリンカーペプチドも包含し得る。ペプチドリンカー配列を利用して、例えば、それらのポリペプチド成分を、各ポリペプチドがフォールディングして確実にその二次および三次構造になれる十分な距離だけ離すことができる。融合タンパク質は、一般に、化学的コンジュゲーションをはじめとする標準的な技法を用いて作製することができる。融合タンパク質は、標準的な技法により発現システムにおいて組み換えタンパク質として発現させることもできる。
【０２２２】
本発明の多量体または単量体ドメインは、当該技術分野において公知の任意の方法にしたがって生産することができる。一部の実施形態において、誘導性プロモーターの転写制御下の、ポリペプチドをコードしているプラスミドを含む大腸菌を使用して、タンパク質を発現させる。それらの細菌を回収した後、超音波処理または均質化によってそれらを溶解し、遠心分離によって不純物を除去することができる。ポリペプチドは、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース溶離（６ｘＨｉｓ（配列番号３７９）標識されている場合）またはＤＥＡＥセファロース溶離（標識されていない場合）を用いて精製し、透析によってリフォールディングすることができる。ミスフォールディングしたタンパク質は、ヨード酢酸で遊離スルフヒドリルをキャッピングすることにより、中和することができる。Ｑセファロース溶離、ブチルセファロースフロースルー、ＳＰセファロース溶離、ＤＥＡＥセファロース溶離、および／またはＣＭセファロース溶離を用いて、ポリペプチドを精製することができる。等価のアニオンおよび／またはカチオン交換精製段階を利用することもできる。
【０２２３】
一部の実施形態では、熱溶解を用い、一般にはその後、大部分のタンパク質が復元しないように急速に冷却することによって、単量体または多量体を精製する。本発明のタンパク質の熱安定性のため、所望のタンパク質が、熱によって変性することはないであろうし、従って、精製段階によって高い純度を得ることができるであろう。一部の実施形態では、細菌細胞から本単量体または多量体を精製するために連続フロー式加熱プロセスを用いる。例えば、細菌の溶解を生じさせる温度（例えば、約６５〜１００摂氏度）に設定した水浴に沈めたステンレス鋼コイルに細胞懸濁液を通してもよい。溶解した溶出液は、冷却浴に進めて急速な冷却を達成し、変性した大腸菌タンパク質の復元を防止する。大腸菌タンパク質は、変性し、復元を防止されるが、単量体または多量体は、それらの足場の類希なる安定性のため、これらの条件下で変性しない。加熱時間は、流量およびコイル長を調整することによって制御する。このアプローチは、活性タンパク質を、代替アプローチと比較して高い収率および類希なる高い純度（例えば、＞８０％）で生じさせ、ならびに臨床材料の大規模生産に適応させることができる。
一部の実施形態では、本発明の単量体または多量体の製造後、ヨード酢酸を含む溶液中でそれらのポリペプチドを保管して、ジスルフィド結合連鎖のスクランブリングを防止する。一部の実施形態では、０．１〜１００ｍＭ（例えば、１〜１０ｍＭ）のヨード酢酸を保管用の溶液に含める。所望される場合には、個体に投与する前にそのヨード酢酸を除去することができる。
【０２２４】
一部の実施形態では、本発明の単量体または多量体を含むポリペプチドを、例えば、タンパク質の安定性のために、それ自体に（Ｃ末端をＮ末端に）連結させる。
【０２２５】
ＩＶ．リンカー
単量体ドメインをリンカーによって接続して、多量体を形成することができる。例えば、リンカーは、多量体内の別個、個別の単量体ドメイン各々の間に配置することができる。
【０２２６】
選択された単量体ドメインのリンカーによる接続は、当該技術分野において公知の様々な技法を用いて遂行することができる。例えば、選択された単量体ドメインをコードしているポリヌクレオチドのコンビナトリアルアセンブリを、制限消化および再ライゲーションによって、ＰＣＲに基づく自己プライミング型オーバーラップ反応によって、または他の組み換え法によって達成することができる。リンカーは、単量体に、その単量体が、ターゲット多量体に結合するその能力について特定される前に取り付けてもよいし、またはその単量体が、ターゲット多量体に結合するその能力について選択された後に取り付けてもよい。
【０２２７】
リンカーは、天然である場合もあり、合成である場合もあり、または両方の組み合わせである場合もある。例えば、合成リンカーは、例えば配列とサイズの両方の点で、ランダム化されたリンカーであり得る。１つの態様において、前記ランダム化リンカーは、完全ランダム化された配列を含むこともあり、または場合によっては、前記ランダム化リンカーは、天然リンカー配列に基づくこともある。前記リンカーは、例えば、非ポリペプチド部分、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどを含むことがある。
【０２２８】
リンカーは、堅い場合もあり、または柔軟である場合もあり、または両方の組み合わせである場合もある。リンカーの柔軟性は、リンカーとリンカーが相互作用する単量体ドメイン、両方の組成の関数であり得る。リンカーは、２つの選択単量体ドメインを接続し、それらの単量体ドメインを別個、個別の単量体ドメインとして維持する。リンカーは、それらの別個、個別の単量体ドメインを協働させることができ、さらに、別個の特性、例えば、多量体内の同じリガンドのための多数の別個の結合部位、または例えば多量体内の異なるリガンドのための多数の別個の結合部位、を維持することができる。
【０２２９】
２つ以上の単量体ドメイン（すなわち、ポリペプチド鎖）をつなぐこととなる特定の事例のための適するリンカーの選択は、例えば、それらの単量体ドメインの性質、ポリペプチド多量体が結合すべきターゲットの構造および性質、ならびに／またはタンパク質分解および酸化に対するそのペプチドリンカーの安定性などを含む様々な要因に依存し得る。
【０２３０】
本発明は、所望の単量体ドメイン／変異体が特定されてしまってからのリンカーの選択を最適化する方法を提供する。一般に、単量体ドメインの組成に関しては固定されているが、リンカーの組成および長さの点では可変的である組成を有する多量体のライブラリーは、上で説明したように、容易に作製およびスクリーニングすることができる。
【０２３１】
リンカーについてのより詳細な考察は、例えば、米国特許公開第２００５／００４８５１２号において見出すことができる。
【０２３２】
Ｖ．ターゲット分子に対する親和性を有する単量体または多量体の特定
当業者は、所望の特性（例えば、結合親和性）を有する単量体ドメインを容易に特定することができる。これらの実施形態には、所望の特性（例えば、特異的結合特性）を有するドメインの選択をもたらす任意の方法を用いることができる。例えば、それらの方法は、各核酸が単量体ドメインをコードしている多数の異なる核酸を生じさせること；それらの多数の異なる核酸を翻訳し、それによって多数の異なる単量体ドメインを生じさせること；それらの多数の異なる単量体ドメインを所望のリガンドまたはリガンドの混合物の結合についてスクリーニングすること；ならびにその所望のリガンドまたはリガンド混合物に結合する多数の異なる単量体ドメインのメンバーを特定することを含む。
【０２３３】
加えて、任意の突然変異誘発法、例えば、部位特異的突然変異誘発およびランダム突然変異誘発（例えば、化学的突然変異誘発）を用いて、例えば単量体ドメインライブラリーのための、単量体ドメインを生産することができる。一部の実施形態では、誤りがちのＰＣＲを利用して、変異体を作製する。追加の方法としては、多数の天然単量体ドメインにおける保存アミノ酸をアラインすることによる、多数の天然単量体ドメインのアラインメント；および保存アミノ酸を維持し、それらの保存アミノ酸の周囲にアミノ酸を挿入して、周囲からアミノ酸を欠失させて、または周囲のアミノ酸を改変して、非天然単量体ドメインを作製することによる、非天然単量体ドメインの設計が挙げられる。一部の実施形態において、前記保存アミノ酸は、システインを含む。もう１つの実施形態において、前記挿入段階は、ランダムアミノ酸を利用し、または場合によっては、前記挿入段階は、天然単量体ドメインの部分を利用する。理想的には、前記部分は、同じファミリーからのドメインからのループをコードしいているものであり得る。アミノ酸は、合成オリゴヌクレオチドを用いて、またはシャッフリングによって、または制限酵素に基づく組み換え法によって、挿入または交換する。本発明のヒトキメラドメインは、最小限免疫原性が望まれる治療用途に有用である。本発明は、ヒトキメラドメインのライブラリーの作製方法を提供する。ヒトキメラ単量体ドメインライブラリーは、上で説明したように、ヒト単量体ドメインの異なる変異体からのループ配列を組み合わせることによって構築することができる。組み合わせるループ配列は、配列規定ループ、構造規定ループ、Ｂ因子規定ループ、またはこれらのうちのいずれか２つ以上の組み合わせであり得る。
【０２３４】
あるいは、ヒトキメラドメインライブラリーは、ループレベルと比較して、アミノ酸レベルで天然ヒト単量体ドメインを修飾することによって作製することができる。一部の実施形態では、免疫原性の可能性を最小限にするために、同じファミリーのヒト単量体ドメインからのタンパク質配列において自然に発生する残基のみを利用して、キメラ配列を作る。これは、単量体ドメインの同じファミリーからの少なくとも２つのヒト単量体ドメインの配列アラインメントを生じさせること、ヒト単量体ドメイン間で異なる、ヒト単量体ドメイン配列内の対応する位置にあるアミノ酸残基を特定すること、２つ以上のヒトキメラ単量体ドメインを作製すること（この場合、各ヒトキメラ単量体ドメイン配列は、単量体ドメインの同じファミリーからの２つ以上のヒト単量体ドメインからの残基にタイプおよび位置の点で対応するアミノ酸残基から成る）によって達成することができる。ヒトキメラ単量体ドメインのライブラリーをターゲット分子への結合についてスクリーニングすること、およびそのターゲット分子に結合するヒトキメラ単量体ドメインを特定することにより、ヒトキメラ単量体ドメインのライブラリーを利用して、関心のあるターゲットに結合するヒトキメラ単量体ドメインを特定することができる。初期配列アラインメント段階において利用される適切な天然ヒト単量体ドメイン配列としては、本明細書において説明する天然単量体ドメインのうちのいずれかに対応するものが挙げられる。
【０２３５】
本発明のヒト単量体変異体ライブラリーのドメインは（ループを変えることによって作製されるものであっても、単一アミノ酸残基を変えることによって作製されるものであっても）、通常の当業者には公知の方法によって作成することができる。これらのライブラリーの作製に特に適する方法は、ＷＯ０１／２３０４１に記載されているような、スプリット−プール形式およびトリヌクレオチド合成形式である。
【０２３６】
一部の実施形態において、本発明の単量体ドメインは、
候補タンパク質配列を提供すること：
その候補タンパク質配列をヒトタンパク質配列のデータベースと比較すること；
そのデータベースからのヒトタンパク質配列の部分に対応するその候補タンパク質配列の部分を特定すること；および
その候補タンパク質配列とそのデータベースからのヒトタンパク質配列との対応度を判定すること
によって潜在的免疫原性についてスクリーニングされる。
【０２３７】
一般に、前記データベースからのいずれのヒトタンパク質配列とも殆ど対応しない候補タンパク質と比較して、前記タンパク質候補配列と前記データベースからの１つ以上のヒトタンパク質配列との対応度が大きいほど、予測される免疫原性の可能性は低い。候補タンパク質をスクリーニングするための本発明の方法の実施の際の使用に適するヒトタンパク質配列のデータベースは、ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂのｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉで見つけることができる（加えて、以下のウェブサイトを用いて、短い、ほぼ正確なマッチを検索することができる：ｃｂｉ．ｎｈｎ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＣＭＤ＝Ｗｅｂ＆ＬＡＹＯＵＴ＝ＴｗｏＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）＆ＡＵＴＯ＿ＦＯＲＭＡＴ＝Ｓｅｍｉａｕｔｏ＆ＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳ＝５０＆ＡＬＩ  ＧＮＭＥＮＴ＿ＶＩＥＷ＝Ｐａｉｒｗｉｓｅ＆ＣＬＩＥＮＴ＝ｗｅｂ＆ＤＡＴＡＢＡＳＥ＝ｎｒ＆ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮＳ＝１００＆ＥＮ  ＴＲＥＺ＿ＱＵＥＲＹ＝（ｎｏｎｅ）＆ＥＸＰＥＣＴ＝１０００＆ＦＯＲＭＡＴ＿ＯＢＪＥＣＴ＝Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＆ＦＯＲＭＡＴ＿ＴＹ  ＰＥ＝ＨＴＭＬ＆ＮＣＢＩ＿ＧＩ＝ｏｎ＆ＰＡＧＥ＝Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ＆ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｎ＆ＳＥＲＶＩＣＥ＝ｐｌａｉｎ＆Ｓ  ＥＴ＿ＤＥＦＡＵＬＴＳ．ｘ＝２９＆ＳＥＴ＿ＤＥＦＡＵＬＴＳ．ｙ＝６＆ＳＨＯＷ＿ＯＶＥＲＶＩＥＷ＝ｏｎ＆ＷＯＲＤ＿ＳＩＺＥ＝７＆ＥＮＤ＿ＯＦ＿ＨＴＴＰＧＥＴ＝Ｙｅｓ＆ＳＨＯＷ＿ＬＩＮＫＯＵＴ＝ｙｅｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ）。この方法は、例えばキメラ単量体ドメインなどキメラタンパク質におけるクロスオーバー配列が、免疫原性事象を生じさせる可能性が高いかどうかを判定する際に特に有用である。クロスオーバー配列が、そのヒトタンパク質配列データベース内で見つけられる配列の一部分に対応する場合、そのクロスオーバー配列は、免疫原性事象を生じさせる可能性が低いと考えられる。
【０２３８】
そのデータベースからのヒトタンパク質配列の部分（複数）に関係する情報を用いて、ヒト様キメラタンパク質のタンパク質ライブラリーを設計することができる。こうしたライブラリーは、天然ヒトタンパク質内に存在する「クロスオーバー配列」に関係する情報を用いることによって作製することができる。用語「クロスオーバー配列」は、少なくとも１つの天然ヒトタンパク質においてそれをそっくりそのまま見つけられる配列であって、その配列の部分を２つ以上の天然タンパク質において見つけられる配列を、本明細書では指す。従って、後述の２つ以上の天然タンパク質の組み換えは、キメラタンパク質を生じさせることとなり、その配列のキメラ部分は、別の天然タンパク質において見つけられる配列に実際に対応する。クロスオーバー配列は、２つの連続するアミノ酸残基位置のキメラ接合部を含有し、その第一アミノ酸位置は、第一および第二天然ヒトタンパク質配列において見つけられるが、第三天然ヒトタンパク質配列では見つけられない、タイプおよび位置の点で同一のアミノ酸残基によって占められている。その第二アミノ酸位置は、第二および第三天然ヒトタンパク質配列において見つけられるが、第一天然ヒトタンパク質配列では見つけられない、タイプおよび位置の点で同一のアミノ酸残基によって占められている。言い換えれば、この「第二」天然ヒトタンパク質配列は、上で説明したように、クロスオーバー配列がそっくりそのまま出現する天然ヒトタンパク質に対応する。
【０２３９】
一部の実施形態において、ヒト様キメラタンパク質のライブラリーは、タンパク質の同じファミリーからのタンパク質に対応する、データベースからのヒトタンパク質配列を特定すること；タンパク質の同じファミリーからのヒトタンパク質配列を、基準タンパク質配列に対してアラインすること；同じファミリーの異なるヒトタンパク質配列に由来するサブ配列のセットを特定すること（この場合、各サブ配列は、異なる天然ヒトタンパク質配列に由来する少なくとも１つの他のサブ配列と一定範囲の同一性を共有する）；第一、第二および第三サブ配列からキメラ接合部を特定すること（この場合、各サブ配列は、異なる天然ヒトタンパク質配列に由来し、ならびにキメラ接合部は、２つの連続するアミノ酸残基位置を含み、その第一アミノ酸位置は、第一および第二天然ヒトタンパク質配列に共通の、しかし第三天然ヒトタンパク質配列とは共通でない、アミノ酸残基が占められており、その第二アミノ酸位置は、第二および第三天然ヒトタンパク質配列に共通のアミノ酸残基によって占められている）；および各々が、前記サブ配列セットからの２つ以上のサブ配列に配列の点で対応し、各々が、それらの特定されたキメラ接合部の１つ以上を含む、ヒト様キメラタンパク質分子を作製することによって作製される。
【０２４０】
従って、例えば、前記第一天然ヒトタンパク質配列が、Ａ−Ｂ−Ｃであり、前記第二が、Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅであり、および前記第三が、Ｄ−Ｅ−Ｆである場合には、キメラ接合部は、Ｃ−Ｄである。あるいは、前記第一天然ヒトタンパク質配列が、Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｇであり、前記第二が、Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆであり、および前記第三が、Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄである場合には、キメラ接合部は、Ｄ−Ｅである。ヒト様キメラタンパク質分子は、様々な方法で作製することができる。例えば、キメラ接合部をコードしている配列を含むオリゴヌクレオチドを、上記のサブ配列セットからの２つ以上のサブ配列に配列の点で対応するオリゴヌクレオチドと組み換えて、ヒト様キメラタンパク質およびそのライブラリーを作製することができる。天然ヒトタンパク質をアラインするために使用される基準配列は、天然ヒトタンパク質の同じファミリーからの配列であるか、そのファミリー内のキメラまたは他の変異体である。
【０２４１】
天然単量体ドメインのフラグメントをコードしている核酸を、（例えば、キメラ的にまたは酵素的に生産されたフラグメントを使用することにより）混合および／または組み換えて、完全長の、修飾された単量体ドメインを作製することもできる。前記フラグメントおよび単量体ドメインを、ドメインをコードしている核酸またはそれらのフラグメントを操作することによって、組み換えることもできる。例えば、単量体ドメインのフラグメントをコードしている核酸構築物のライゲーションを用いて、改変された単量体ドメインを作製することができる。
【０２４２】
改変された単量体ドメインは、単量体ドメインをコードしているポリヌクレオチドの所定の部位へのライゲーションによって、その時、挿入されるポリペプチド配列の保存、ランダム、擬似ランダム、または被定義配列をコードしている合成オリゴヌクレオチド（例えば、オーバーラッピングオリゴヌクレオチド）のコレクションを生じさせることによって、作製することもできる。同様に、１つ以上の単量体ドメインの配列多様性は、部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異、擬似ランダム突然変異、規定カーネル突然変異、コドンに基づく突然変異などで単量体ドメイン（単数または複数）を突然変異させることによって拡大することができる。結果として生じた核酸分子を、クローニングおよび増幅用の宿主において増殖させることができる。一部の実施形態において、それらの核酸は、シャッフリングされる。
【０２４３】
本発明は、単量体ドメインをコードしている多数の核酸を組み換え、結果として生じたライブラリーを、所望のリガンドまたはリガンドの混合物に結合する単量体ドメインなどについてスクリーニングする方法も提供する。選択された単量体ドメイン核酸は、例えば、選択された配列と実質的に同一の野生型または天然配列と戻し交配させることによるなど、天然配列をコードしている（すなわち、結合に対する実質的な機能的効果を有さない）ポリヌクレオチド配列とのシャッフリングにより、戻し交配させて、天然のような機能の単量体ドメインを生じさせることもできる。一般には、戻し交配中に二次選択を適用して、特性、例えばリガンドへの結合、を確保する。
【０２４４】
一部の実施形態において、単量体ライブラリーは、シャッフリングによって作成される。こうした事例では、単量体ドメインを単離し、シャッフリングして、単量体ドメインをコードしている核酸配列のコンビナトリアル組み換えを行う（組み換えは、単量体ドメイン間もしくは内、または両方で行うことができる）。その第一段階は、所望の特性、例えば一定のリガンドに対する親和性、を有する単量体ドメインの特定を含む。組み換え中に保存アミノ酸を維持しながら、単量体ドメインをコードしている核酸配列を組み換えることができ、または組み換え、多量体に接続することができる。
【０２４５】
本発明の有意な利点は、既知のリガンドまたは未知のリガンドを使用して、単量体ドメインおよび／または多量体を選択できることである。関心のある単量体ドメインまたは関心のある多量体を単離するために、リガンド構造に関する事前情報を必要としない。特定された単量体ドメインおよび／または多量体は、生物活性を有することあり、これは、選択されたまたは所望のリガンドに対する特異的結合親和性を少なくとも含むことを意味し、一部の事例では、他の化合物の結合を遮断する能力、代謝経路を刺激または阻害する能力、シグナルまたはメッセンジャーとして作用する能力、細胞活性を刺激または阻害する能力などをさらに含むであろう。単量体ドメインは、その受容体に対する天然リガンドがまだ特定されていない受容体（オーファン受容体）に対するリガンドとして機能するように作製することができる。これらのオーファンリガンドは、それらが結合する受容体を遮断するように、または活性化するように作ることができる。
【０２４６】
単量体ドメインおよび／もしくは多量体を選択するために、単一のリガンドが使用されることもあり、または場合によっては、様々なリガンドが使用されることもある。本発明の単量体ドメインは、単一のリガンドに結合することもあり、または様々なリガンドに結合することもある。本発明の多量体は、単一のリガンドのための多数の個別の結合部位を有することがあり、または場合によっては、様々なリガンドのための多数の結合部位を有することもある。
【０２４７】
一部の実施形態において、本多量体または単量体は、多数の（２、３、またはそれ以上の）異なる種からのタンパク質に結合する能力についてスクリーニングされる。例えば、ヒトおよび霊長類オルソログタンパク質をスクリーニングし、それによって、ヒトと霊長類の両方からのタンパク質（例えば、ＩＬ−６、ＩｇＧまたは他の血清半減期延長因子もしくは他のタンパク質）に結合するポリペプチドを作製し、それによって、ヒトにおいて使用するための霊長類での毒物学分析を容易にすることができる。
【０２４８】
本発明は、本発明の方法によって生産される組成物も包含する。例えば、本発明は、本発明の方法によって生産される単量体ドメインを含むライブラリー（単数および／または複数）から選択または特定された単量体ドメインを包含する。
【０２４９】
本発明は、単量体ドメインのライブラリー、および単量体ドメインをコードしている核酸のライブラリーも提供する。前記ライブラリーは、例えば、単量体ドメインをコードしている約１００、２５０、５００、もしくはそれ以上の核酸を含むことがあり、または前記ライブラリーは、例えば、単量体ドメインをコードしている約１００、２５０、５００、もしくはそれ以上のポリペプチドを含むことがある。ライブラリーは、同じシステインフレームを含有する単量体ドメイン、例えば、Ａ−ドメインまたはＥＧＦ様ドメインを含むこともある。
【０２５０】
一部の実施形態において、変異体は、単量体ドメイン（例えば、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン）の同じファミリーからの２つ以上の異なる配列を組み換えることによって作製される。あるいは、異なるファミリーからの２つ以上の異なる単量体ドメインを組み合わせて、多量体を形成することができる。一部の実施形態において、前記多量体は、以下のファミリークラスのうちの少なくとも１つの単量体または単量体変異体から形成される：ＥＧＦ様ドメイン、クリングルドメイン、フィブロネクチンＩ型ドメイン、フィブロネクチンＩＩ型ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、ＰＡＮドメイン、Ｇｌａドメイン、ＳＲＣＲドメイン、クニツ／ウシ膵臓トリプシンインヒビタードメイン、カザール型セリンプロテアーゼインヒビタードメイン、トレフォイル（Ｐ型）ドメイン、フォン−ウィルブランド因子Ｃ型ドメイン、アナフィラトキシン様ドメイン、ＣＵＢドメイン、サイログロブリンＩ型リピート、ＬＤＬ−受容体クラスＡドメイン、スシドメイン、リンクドメイン、トロンボスポンジンＩ型ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、Ｃ型レクチンドメイン、ＭＡＭドメイン、フォン−ウィルブランド因子Ａ型ドメイン、ソマトメジンＢドメイン、ＷＡＰ型４ジスルフィドコアドメイン、Ｆ５／８  Ｃ型ドメイン、ヘモペキシンドメイン、ＳＨ２ドメイン、ＳＨ３ドメイン、ラミニン型ＥＧＦ様ドメイン、Ｃ２ドメイン、およびこれらの誘導体。もう１つの実施形態において、前記単量体ドメインおよび異なる単量体ドメインは、Ｐｆａｍデータベースおよび／またはＳＭＡＲＴデータベースにおいて見つけられる１つ以上のドメインを含むことがある。上の方法によって生産されるライブラリー、そのライブラリーの１つ以上のメンバーを含む１つ以上の細胞、およびそのライブラリーの１つ以上のメンバーを含む１つ以上のディスプレイも本発明に包含される。
【０２５１】
場合によっては、単量体ドメインをコードしている核酸文字列のデータセットを、例えば、単量体ドメインをコードしている第一文字列と異なる単量体ドメインをコードしている１つ以上の文字列とを混合し、それによって、本明細書に記載するものを含む単量体ドメインをコードしている核酸文字列のデータセットを生じさせることによって、作製することができる。もう１つの実施形態において、前記単量体ドメインおよび異なる単量体ドメインは、Ｐｆａｍデータベースおよび／またはＳＭＡＲＴデータベースにおいて見つけられる１つ以上のドメインを含むことがある。これらの方法は、単量体ドメインをコードしている第一文字列および異なる単量体ドメインをコードしている１つ以上の第二文字列をコンピュータに挿入すること、ならびにそのコンピュータにおいてそれらの多量体文字列（単数もしくは複数）またはライブラリーを作製することをさらに含むことがある。
【０２５２】
前記ライブラリーは、所望の特性、例えば、所望のリガンドまたはリガンドの混合物の結合について、スクリーニングすることができる。例えば、単量体ドメインのライブラリーのメンバーを、既知もしくは未知のリガンドまたはリガンドの混合物への結合について表示させ、事前にスクリーニングすることができる。その後、それらの単量体ドメイン配列を突然変異させる（例えば、組み換える、化学的に改変する、など）または別様に改変することができ、そしてそれらの新たな単量体ドメインを、改善された親和性でのそのリガンドまたはリガンド混合物への結合について再びスクリーニングすることができる。それらの選択された単量体ドメインを組み合わせてまたは接続して多量体を形成し、その後、それらを、そのリガンドまたはリガンドの混合物に対する改善された親和性もしくは結合活性または改変された特異性についてスクリーニングすることもできる。改変された特異性は、その特異性、例えば多数の関連ウイルスの結合、を広げることを意味することもあり、または場合によっては、改変された特性は、特異性、例えばリガンドの特定領域内での結合、を狭めることを意味することもある。結合活性を計算するために利用できる多数の方法があることは、当業者にはわかるであろう。例えば、Ｍａｍｍｅｎら、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．３７：２７５４−２７９４（１９９８）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６１：１４９−１５８（１９９８）参照。
【０２５３】
ＶＩ．ＩＬ−６に結合する単量体ドメインの選択
ＩＬ−６に結合することができる薬剤についてのスクリーニングにより、予備スクリーニングを行うことができる。そう特定された薬剤の少なくとも一部は、ＩＬ−６修飾因子（例えば、拮抗薬または作動薬）である可能性が高いからである。前記結合アッセイは、ＩＬ−６タンパク質（またはそのフラグメント）と１つ以上の試験薬剤（すなわち、本発明の単量体または多量体）を接触させること、ならびにそのタンパク質および試験薬剤が結合複合体を形成するために十分な時間放置することを、通常、含む。多数の確率されている分析技術のうちのいずれを用いて、いずれの形成された結合複合体を検出してもよい。タンパク質結合アッセイとしては、免疫組織化学的結合アッセイ、フローサイトメトリーまたは他のアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。こうしたアッセイに利用されるＩＬ−６タンパク質は、自然に発現されることがあり、クローニングすることができ、または合成することができる。類似の方法を用いて、ＩｇＧに結合する単量体ドメインまたは多量体を特定することができる。
【０２５４】
本発明のスクリーニング法は、インビトロまたは細胞ベースのアッセイとして行うことができる。細胞ベースのアッセイは、ＩＬ−６を発現する任意の細胞において行うことができる。細胞ベースのアッセイは、薬剤の結合またはその薬剤によるＩＬ−６の活性の修飾についてスクリーニングするために、ＩＬ−６受容体を含有する全細胞または細胞画分を必要とし得る。本発明の方法に従って使用することができる例示的細胞タイプとしては、例えば、任意の哺乳動物細胞、ならびに真菌細胞（酵母を含む）および細菌細胞が挙げられる。細胞は、初代細胞であってもよいし、または腫瘍細胞であってもよいし、または他のタイプの不朽細胞であってもよい。勿論、ＩＬ−６は、ＩＬ−６を内因的に含有しない細胞において発現させることができる。さらに、ＩＬ−６の膜結合変種を細胞の表面で外因的に発現させ、それによって、フローサイトメトリーまたは他の結合、スクリーニングもしくは選択方法に備えることができる。
【０２５５】
ＩＬ−６活性アッセイを用いて、ＩＬ−６の修飾因子（拮抗薬または作動薬）を特定することもできる。これらの実施形態では、１つ以上の試験薬剤を、ＩＬ−６を発現する細胞または外因性ＩＬ−６を加えた細胞と接触させ、その後、ＩＬ−６の活性について試験する。例示的ＩＬ−６活性としては、細胞増殖、炎症応答または分化が挙げられる。例えば、Ｎａｋａ，Ｔ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．４：Ｓ２３３−Ｓ２４２（２００２）参照。他の実施形態では、下流分子事象をモニターして、シグナリング活性を判定することもできる。例えば、ＩＬ−６シグナル伝達は、主として次の２つの経路によって媒介される：ＪＡＫ−ＳＴＡＴ（ヤーヌスファミリーチロシンキナーゼ−シグナル伝達因子および転写活性化因子）経路およびＲａｓマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路（この活性化は、市販のキットおよび当業者には公知の方法を用いて容易にモニターすることができる）。例えば、Ｎａｋａ，Ｔ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．４：Ｓ２３３−Ｓ２４２（２００２）参照。
【０２５６】
一部の実施形態において、活性アッセイは、特定された拮抗薬単量体または多量体（すなわち、ＩＬ−６のＩＬ−６Ｒへの結合を防止するもの）に作動薬活性がないこと（すなわち、それらが、ＩＬ−６または別の作動薬の不在下ではＩＬ−６Ｒを活性化しないこと）を確認するためにも用いられる。
【０２５７】
上述のスクリーニング法のいずれかによって最初に特定される薬剤をさらに試験して、見掛けの活性を確認することができる。こうした研究は、適する動物モデルを用いて行うことができる。こうした方法の基本形式は、最初のスクリーニング中で特定されたリード化合物を、ヒトのためのモデルとしての役割を果たす動物に投与すること、およびその後、ＩＬ−６が実際に修飾されるかどうか、および／または疾病もしくは状態が改善されるかどうかを判定することを含む。確認研究に利用される動物モデルは、一般に、任意の種類の哺乳動物である。適する動物の具体例としては、霊長類、マウスおよびラットが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５８】
ＩＬ−６に結合する単量体ドメインについてのドメインライブラリーからの選択は、様々な手順によって遂行することができる。例えば、所望の特性を有する（例えば、ＩＬ−６またはＩｇＧに結合する）単量体ドメインを特定する１つの方法は、各核酸が単量体ドメインをコードしている多数の核酸の翻訳、それら多数の核酸によってコードされているポリペプチドのスクリーニング、および例えば所望のリガンドまたはリガンドの混合物に結合する、単量体ドメインの特定、その結果、選択単量体ドメインの生産を含む。各々の核酸によって発現された単量体ドメインを、当該技術分野において公知の方法（すなわち、パンニング、親和性クロマトグラフィー、ＦＡＣＳ分析）によって、リガンドに結合するそれらの能力について試験することができる。
【０２５９】
上で述べたように、単量体ドメインの選択は、ＩＬ−６もしくはそのフラグメントなどのリガンドまたは他のターゲット分子（例えば、脂質、炭水化物、核酸など）への結合に基づくものであり得る。場合によっては、他の分子がターゲット、例えばＣａ＋２などのイオン、と共にこれらの方法に含まれることもある。
【０２６０】
本発明の単量体ドメインを、リガンドに結合するその能力に基づき選択する場合、その選択基準としては、遅い解離速度（これは、通常、高い親和性を予測させる）に基づく選択が挙げられる。リガンドの結合価は、選択された単量体ドメインの平均結合親和性を制御することによって変えることもできる。リガンドは、例えば、競合化合物を含めることにより、希釈により、または当業者には公知の他の方法により、様々な密度で表面または基質に結合させることができる。所定のリガンドの高い密度（結合価）を利用して、比較的親和性の低い単量体ドメインを富化することができ、これに対して低い密度（結合価）は、より高い親和性の単量体ドメインを優先的に富化させることができる。
【０２６１】
様々なレポーティングディスプレイベクターまたはシステムを用いて、本発明の単量体ドメインおよび／または多量体をコードしている核酸を発現させること、ならびに所望の活性について試験することができる。例えば、ファージディスプレイシステムは、単量体ドメインをファージ表面で融合タンパク質として発現させるシステムである（ウィスコンシン州、ミルウォーキーのＰｈａｒｍａｃｉａ）。ファージディスプレイは、糸状バクテリオファージの表面での単量体ドメインをコードしているポリペプチド配列の、一般にはバクテリオファージコートタンパク質との融合体としての、提示を含む。
一般に、これらの方法において、各ファージ粒子または細胞は、天然ファージまたは細胞タンパク質配列に加えて単一の種の被表示ポリペプチドを表示する個々のライブラリーメンバーとしての役割を果たす。ファージＤＮＡに、融合タンパク質（その一部分が多数の核酸によってコードされている）の転写が生じる部位で、核酸をクローニングする。核酸分子を含有するファージをその細胞内での複製および転写に付す。融合タンパク質のリーダー配列が、そのファージ粒子のチップへのその融合タンパク質の輸送を指図する。このようにして、その核酸によって部分的にコードされている融合タンパク質は、上で説明したまたは下で説明する方法によって検出および選択を行うためのファージ粒子上に表示される。例えば、ファージライブラリーをＩＬ−６またはそのフラグメントなどの所定のリガンドと共にインキュベートして、リガンドに結合する融合タンパク質配列を提示するファージ粒子を、その所定のリガンドに結合するポリペプチド配列を提示しないものと差別的に分割することができる。例えば、この分離は、その所定のリガンドを固定化することによって生じさせることができる。その後、その固定されたリガンドに結合しているファージ粒子（すなわち、ライブラリーメンバー）を回収し、その選択されたファージ副次集団を後続の親和性富化およびファージ複製ラウンドのために複製して増幅させる。数ラウンドの親和性富化およびファージ複製の後、こうして選択されたファージライブラリーメンバーを単離し、表示されたポリペプチド配列をコードしているヌクレオチド配列を決定し、それによって、所定のリガンドに結合するポリペプチドの配列（単数または複数）を特定する。こうした方法は、ＰＣＴ特許公報第９１／１７２７１号、同第９１／１８９８０号、同第９１／１９８１８号および同第９３／０８２７８号にさらに記載されている。
【０２６２】
他のディスプレイシステムの例としては、リボソームディスプレイ、ヌクレオチド連結ディスプレイ（例えば、米国特許第６，２８１，３４４号、同第６，１９４，５５０号、同第６，２０７，４４６号、同第６，２１４，５５３号、および同第６，２５８，５５８号参照）、ポリソームディスプレイ、細胞表面ディスプレイなどが挙げられる。細胞表面ディスプレイとしては、様々な細胞、例えば、大腸菌、酵母および／または哺乳動物細胞が挙げられる。細胞をディスプレイとして使用するとき、核酸、例えば、ＰＣＲ増幅、その後の消化によって得られた核酸を細胞に導入し、翻訳する。場合によっては、本発明の単量体ドメインまたは多量体をコードしているポリペプチドを、例えば注入によって、その細胞に導入することができる。
【０２６３】
本発明の単量体および多量体ライブラリーは、所望のリガンド（例えば、ＩＬ−６）またはリガンドの混合物の結合などの所望の特性についてスクリーニングすることができる。例えば、単量体ドメインのライブラリーのメンバーを表示させ、既知または未知のリガンドまたはリガンドの混合物への結合について事前にスクリーニングすることができる。その後、それらの単量体ドメイン配列を突然変異誘発する（例えば、組み換える、化学的に改変るなど）または別様に改変することができ、そしてそれらの新たな単量体ドメインを、改善された親和性でのそのリガンドまたはリガンドの混合物への結合について、再びスクリーニングすることができる。それらの選択された単量体ドメインを組み合わせてまたは接続して多量体を形成し、その後、それらを、そのリガンドまたはリガンドの混合物に対する改善された親和性もしくは結合活性または改変された特異性についてスクリーニングすることもできる。改変された特異性は、その特異性、例えば多数の関連リガンドの結合、を広げることを意味することもあり、または場合によっては、改変された特性は、特異性、例えばリガンドの特定領域内での結合、を狭めることを意味することもある。結合活性を計算するために利用できる多数の方法があることは、当業者にはわかるであろう。例えば、Ｍａｍｍｅｎら、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．３７：２７５４−２７９４（１９９８）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６１：１４９−１５８（１９９８）参照。
【０２６４】
変異を生じさせる段階および所望の特性についてスクリーニングする段階を繰り返して（すなわち、再帰的に行って）、結果を最適化できることは、当業者にはわかるであろう。例えば、ファージディスプレイライブラリーまたは他の同様の形式でのライブラリーの初期スクリーニングを比較的低いストリンジェンシーで行い、それによって、ターゲット分子と会合している粒子を可能な限り多く選択することができる。その後、それらの選択された粒子を単離し、単量体または多量体をコードしているポリヌクレオチドをそれらの粒子から単離することができる。その後、これらの配列から追加の変異を生じさせ、その後、より高い親和性でスクリーニングすることができる。
【０２６５】
本発明のすべての組成物、例えば、単量体ドメインならびにそれらの多量体およびライブラリーは、場合により、親和性材料のマトリックスに結合させることがある。親和性材料の例としては、ビーズ、カラム、固体支持体、マイクロアレイ、他の試薬−支持体プールなどが挙げられる。
【０２６６】
比較的大きなターゲットに結合することができる多量体が望まれる場合、それらは、「ウォーキング」選択法によって作製することができる。この方法は、単量体ドメインのライブラリーを生じさせること、およびその単量体ドメインのライブラリーを第一のターゲット分子への親和性についてスクリーニングすることによって行われる。そのターゲットに結合する少なくとも１つの単量体が特定されたら、その単量体を新たなライブラリーに、または元の単量体ドメインライブラリーの残りのメンバー各々に共有結合させる。その後、多量体（二量体）のこの新たなライブラリーを、増加した親和性でターゲットに結合している多量体についてスクリーニングし、増加した親和性でターゲットに結合している多量体を特定することができる。「ウォーキング」単量体選択法は、相加的に作用することができる、またはリンカー長の制約からすると互いに相乗的に作用することさえできる単量体から成る多量体を組み立てる方法をもたらす。このウォーキング技術は、高い親和性で大きなターゲットタンパク質に結合することができる多量体を選択または組み立てる際に非常に有用である。このウォーキング法を繰り返して、より多くの単量体を付加させ、それによって、互いに連結した２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上の単量体を含む多量体を生じさせることができる。
【０２６７】
一部の実施形態において、選択される多量体は、２つより多くのドメインを含む。こうした多量体は、例えば、各々の新たなドメインの付加を個々に試験し、それらのドメインの効果を逐次的な様式で試験する、段階的様式で、作製することができる。例えば、図５参照。代替実施形態では、ドメインを連結させて、２つより多くのドメインを含む多量体を形成し、より小さな多量体がどのように結合するか、または代替的に、各ドメインがどのように結合するかを事前に知らずに、結合について選択する。
【０２６８】
本発明の方法は、単量体または多量体を発生させる方法も含む。全単量体にわたって、または異なる単量体の部分（複数）を利用して、ドメイン内組み換えを単量体に導入して、新たな組み換え単位を形成することができる。ドメイン内組み換え（例えば、異なる単量体の多量体へのもしくは多量体間での組み換え）またはモジュール（例えば、多量体内の多数の単量体）の組み換えを達成することができる。ライブラリー内組み換えも考えられる。
【０２６９】
単量体または多量体を発生させるための方法は、例えば、次の段階のうちのいずれかまたはすべてを含むことがある：各核酸が単量体ドメインをコードしている多数の異なる核酸を生じさせること；それらの多数の異なる核酸を翻訳し、多数の異なる単量体ドメインを生じさせること；それらの多数の異なる単量体ドメインを所望のリガンド（例えば、ＩＬ−６）またはリガンドの混合物の結合についてスクリーニングすること；所望のリガンドまたはリガンドの混合物に結合する多数の異なる単量体ドメインのメンバーを特定し、選択された単量体ドメインを得ること；それらの選択された単量体ドメインを少なくとも１つのリンカーと接続して、少なくとも１つの多量体を形成させること（この場合、前記少なくとも１つの多量体は、前記の選択単量体ドメインのうちの少なくとも２つと前記少なくとも１つのリンカーとを含む）；および所望のリガンドまたはリガンドの混合物に対する、前記選択単量体ドメインと比較して、改善された親和性もしくは結合活性または改変された特異性について、前記少なくとも１つの多量体をスクリーニングすること。
【０２７０】
単量体または多量体のいずれかに変異を導入することもできる。単量体を改善する例としては、結果として生じる増幅産物に（例えば、シャッフリングまたは他の組み換え法によって）変異を導入する条件下で単量体の２つ以上（例えば、３つ、４つ、５つまたはそれ以上）の部分を、別々に増幅し、それによって、その単量体の異なる部分についての変異体のライブラリーを合成する、ドメイン内組み換えが挙げられる。両方のＰＣＲフラグメントを共同で有する「中間」または「オーバーラップ」配列内に中間プライマーの５’末端を配置することにより、結果として生じる「左」側および「右」側ライブラリーをオーバーラップＰＣＲによって組み合わせて、元の単量体プールの新規変異体を作製することができる。その後、これらの新たな変異体を所望の特性についてスクリーニングする、例えば、ターゲットに対してパンニングするまたは機能効果についてスクリーニングする、ことができる。「中間」プライマー（単数または複数）は、その単量体の任意のセグメントに対応するように選択することができ、ならびに一般に、その単量体内の足場または１つ以上のコンセンサスアミノ酸（例えば、Ａドメインにおいて見出されるものなどのシステイン）に基づくであろう。
【０２７１】
同様に、単量体レベルでの変異の導入およびその後の単量体変異体ライブラリーの組み換えによって、多量体を作ることができる。より大規模に、所望の特性を有する多量体（単体またはプール）を組み換えて、より長い多量体を形成することができる。一部の事例では、単量体にまたはリンカーに変異を（一般には合成的に）導入して、ライブラリーを形成する。これは、例えば、２つの異なるターゲットに結合する２つの異なる多量体を用いて達成することができ、それによって、最終的には、１つのターゲットに結合する部分と第二のターゲットに結合する部分を有する多量体を選択する。
【０２７２】
ドメイン間の長さおよび組成が異なるリンカーを挿入することにより、追加の変異を導入することができる。これにより、ドメイン間の最適なリンカーを選択することができる。一部の実施形態では、リンカーの最適な長さおよび組成が、ドメインの最適な結合を可能にするであろう。一部の実施形態では、特定の結合親和性（単数または複数）を有するドメインを異なるリンカーによって連結し、結合アッセイで最適なリンカーを選択する。例えば、ドメインを所望の結合特性について選択し、その後、様々なリンカーを含むライブラリーにする。その後、そのライブラリーをスクリーニングして最適なリンカーを特定することができる。あるいは、ターゲット分子結合に対するドメインまたはリンカーの効果がわからない多量体ライブラリーを形成することができる。
【０２７３】
本発明の方法は、多数の単量体ドメインを供給することによる１つ以上の選択された多量体の作製も含む。多数の単量体ドメインを所望のリガンドまたはリガンドの混合物の結合についてスクリーニングする。その所望のリガンドまたはリガンドの混合物に結合する前記多数のドメインのメンバーを特定し、それによって、所望の親和性を有するドメインを得る。特定されたドメインを少なくとも１つのリンカーと接続して多量体（この場合、各多量体は、前記選択ドメインのうちの少なくとも２つと、前記少なくとも１つのリンカーとを含む）を作製し、それらの多量体を、前記所望のリガンドまたはリガンド混合物に対する、前記選択ドメインと比較して改善された親和性もしくは結合活性または改変された特異性についてスクリーニングし、それによって、１つ以上の選択された多量体を特定する。
【０２７４】
多量体ライブラリーは、一部の実施形態では、リコンビナーゼに基づくアプローチで２つ以上のライブラリーまたは単量体または多量体を組み合わせることによって、作製することができ、この場合、各ライブラリーメンバーは、組み換え部位（例えば、ｌｏｘ部位）を含む。分子的に多岐にわたるライブラリーメンバーの、より大きなプールは、原則として、所望の特性、例えば、より高いターゲット結合親和性および機能的活性を有する、より多くの変異体を有する。大腸菌に形質転換することができるファージベクターにおいてライブラリーを構築するとき、ライブラリーのサイズ（１０９〜１０１０）は、大腸菌の形質転換効率によって制限される。リコンビナーゼ／組み換え部位システム（例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステム）およびインビボ組み換えを活用して、大腸菌の形質転換効率によるサイズの制限を受けないライブラリーを作製することができる。
【０２７５】
例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを使用して、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、またはそれより大きい多様性を有する二量体ライブラリーを作製することができる。一部の実施形態では、１つのナイーブ単量体ライブラリーのための宿主としての大腸菌と、第二のナイーブ単量体ライブラリーを有する糸状ファージとを使用する。この場合のライブラリーサイズは、感染性ファージ（あるライブラリーを有するもの）の数および感染可能な大腸菌細胞（別のライブラリーを有するもの）の数によってのみ制限される。例えば、１０１２より多くのファージでの１０１２の大腸菌細胞（ＯＤ６００＝１で１Ｌ）の感染は、１０１２ほどもの二量体の組み合わせを生じさせ得る。
【０２７６】
多量体の選択は、単量体ドメインの特定について上で述べたものを含む様々な技法を用いて遂行することができる。他の選択法としては、例えば、リガンドに対する選択された単量体ドメインと比較して改善された親和性もしくは結合活性または改変された特異性に基づく選択が挙げられる。例えば、選択は、特定の細胞タイプへの、または関連した細胞または細胞タイプ（例えば、異なるウイルスセロタイプ）のセットへの選択的結合に基づく場合がある。その後、例えばリガンドの結合活性について、選択された特性の最適化を、本発明において述べるような、ドメインの組み換え、ならびに個々の単量体ドメインもしくはリンカードメインのアミノ酸配列またはそうしたドメインをコードするヌクレオチド配列の操作によって、達成することができる。
【０２７７】
多量体を特定するための１つの方法は、多量体の表示によって遂行することができる。単量体ドメインと同じように、多量体は、上で説明したような様々なディスプレイシステム、例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ポリソームディスプレイ、ヌクレオチド連結ディスプレイ（例えば、米国特許第６，２８１，３４４号、同第６，１９４，５５０号、同第６，２０７，４４６号、同第６，２１４，５５３号、および同第６，２５８，５５８号参照）、および／または細胞表面ディスプレイを用いて、場合によっては発現または表示させることができる。細胞表面ディスプレイとしては、大腸菌、酵母または哺乳動物細胞を挙げることができるが、これらに限定されない。加えて、多数の結合部位を有する多量体のディスプレイライブラリーを、１つのリガンドに対するまたは多数のリガンドに対する結合活性もしくは親和性または改変された特異性ついてパンニングすることができる。
【０２７８】
ツーハイブリッドスクリーニングアッセイを用いて、酵母細胞におけるターゲット結合活性について単量体または多量体をスクリーニングすることもできる。このタイプのスクリーニングでは、スクリーニングされる単量体または多量体ライブラリーを、そのライブラリーの各単量体または多量体と酵母転写活性化因子フラグメント（すなわち、Ｇａｌ４）との融合タンパク質の形成を指図するベクターにクローニングする（ＤＮＡ結合ドメイン）。「ターゲット」タンパク質をコードしている配列を、そのターゲットと前記Ｇａｌ４タンパク質の残部との融合タンパク質を生産することとなるベクターにクローニングする。第三のプラスミドは、Ｇａｌ４の結合部位のＤＮＡ配列の下流にレポーター遺伝子を含有する。ターゲットタンパク質に結合することができる単量体は、それでＧａｌ４活性化ドメインを招来し、そうして機能的Ｇａｌ４タンパク質を再構成する。レポーター遺伝子の上流の結合部位に結合したこの機能的Ｇａｌ４タンパク質により、レポーター遺伝子が発現されることとなり、単量体または多量体がターゲット結合タンパク質として選択されることとなる。（Ｃｈｉｅｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：９５７８；Ｆｉｅｌｄｓ  Ｓ．およびＳｏｎｇ  Ｏ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５）。ライブラリースクリーニングのためのツーハイブリッドシステムの使用は、米国特許第５，８１１，２３８号にさらに記載されている（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓ．Ｃ．およびＨｕｎｔ  Ｓ．Ｗ．（１９９３）ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１７：１５５；Ｄｕｒｆｅｅら（１９９３）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌ．７：５５５；Ｙａｎｇら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：６８０；Ｌｕｂａｎら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７３：１０６７；Ｈａｒｄｙら（１９９２）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌ．６：８０１；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０；およびＶｏｊｔｅｋら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７４：２０５も参照）。本発明を実施するためのもう１つの有用なスクリーニングシステムは、大腸菌／ＢＣＣＰ相互作用式スクリーニングシステム（Ｇｅｒｍｉｎｏら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）９０：９９３；Ｇｕａｒｅｎｔｅ  Ｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）９０：１６３９）である。
【０２７９】
他の変型としては、これらの分子の単量体ドメイン、多量体またはライブラリーを、異なる結合特異性を有するリガンドまたは化合物の多彩性について同時にスクリーニングすることができるような、多数の結合性化合物の使用が挙げられる。多数の予め決められたリガンドまたは化合物を、単一のライブラリーで付随的にスクリーニングすることができ、または多数の単量体ドメインもしくは多量体に対して逐次的にスクリーニングすることができる。１つの変型では、各々が別のビーズ（またはビーズの部分集合）上にコードされている多数のリガンドまたは化合物を、適する結合条件下でこれらの分子の単量体ドメイン、多量体またはライブラリーと混合し、インキュベートすることができる。その後、多数のリガンドまたは化合物を含むビーズのコレクションを用いて、親和性選択により、選択単量体ドメイン、選択多量体またはライブラリーメンバーを単離することができる。一般に、その後の親和性スクリーニングラウンドは、同じビーズ混合物を含む場合もあり、その部分集合を含む場合もあり、または個々のリガンドもしくは化合物を１つもしくは２つしか含有しないビーズを含む場合もある。このアプローチは、効率的なスクリーニングをもたらし、ラボラトリーオートメーション法、バッチ処理法およびハイスループットスクリーニング法と両立できる。
【０２８０】
もう１つの実施形態において、多量体は、各リガンドが異なる標識を含む多数のリガンドを結合する能力について、同時にスクリーニングすることができる。例えば、各リガンドを異なる蛍光標識で標識し、多量体または多量体ライブラリーと同時に接触させることができる。その後、所望の親和性を有する多量体を、所望の標識に連結した標識の存在に基づき（例えば、ＦＡＣＳソーティングにより）特定する。
【０２８１】
単量体ドメインまたは多量体のいずれか（便宜上、以下の論考では「親和性作用因子」と呼ぶ）のライブラリーは、多数の異なる形式で多数のリガンドに対して同時にスクリーニング（すなわち、パンニング）することができる。例えば、多数のリガンドを、単純混合物において、アレイにおいてスクリーニングすること、細胞もしくは組織上に表示させること（例えば、細胞もしくは組織は、本発明の単量体ドメインもしくは多量体が結合できる多数の分子を提示する）、および／または免疫することができる。場合によっては、酵母またはファージディスプレイシステム上で親和性作用因子のライブラリーを表示させることができる。同様に、所望される場合には、酵母またはファージディスプレイシステム内でリガンド（例えば、ｃＤＮＡライブラリー内にコードされているもの）を表示させることができる。
【０２８２】
最初に、その親和性作用因子を多数のリガンドに対してパンニングする。場合により、結果として生じた「ヒット」をリガンドに対して１回以上パンニングして、結果として生じる親和性作用因子集団を富化させる。
【０２８３】
所望される場合には、個々の親和性作用因子および／またはリガンドの素性を決定することができる。一部の実施形態において、親和性作用因子をファージで表示させる。初期スクリーニングにおいて結合していると特定された親和性作用因子を第一の部分と第二の部分に分ける。その第一の部分を細菌に感染させ、使用するファージのタイプに依存してプラークまたは細菌コロニーを生じさせる。発現されたプラークを固定し、その後、下で説明するように選択されたファージに表示されたリガンドでプローブする。
【０２８４】
第二の部分は、ビーズにカップリングさせるか、別様に固定し、その固定された第二の部分に、元の混合物中のリガンドの少なくとも一部を含有するファージディスプレイライブラリーを接触させる。その後、その第二の部分に結合しているファージを溶離し、上の段落で説明した固定されたファージに接触させる。ファージ−ファージ相互作用を（例えば、リガンド発現ファージに対して特異的なモノクローナル抗体を使用して）検出し、得られたファージポリヌクレオチドを単離することができる。
【０２８５】
一部の実施形態では、親和性作用因子−リガンドペアの素性を決定する。例えば、親和性作用因子とリガンドの両方をファージまたは酵母上に表示させ、そのペアからのＤＮＡを単離し、塩基配列を決定することができる。一部の実施形態では、リガンドおよび親和性作用因子に対して特異的なポリヌクレオチドを増幅する。各反応のための増幅プライマーは、相補的である５’配列を含むことができるので、結果として生じる増幅産物が融合され、それによって、親和性作用因子の少なくとも一部分とリガンドの少なくとも一部分とをコードしているポリヌクレオチドを含むハイブリッドポリヌクレオチドが形成される。結果として生じるハイブリッドは、親和性作用因子またはリガンド（例えば、ｃＤＮＡにコードされた）ポリヌクレオチドライブラリーをプローブして、親和性作用因子とリガンドの両方を特定するために用いることができる。
【０２８６】
上で説明した方法を「ウォーキング」と併用して、リガンド混合物中のリガンドに各々が結合している多数の多量体を同時に作製および特定することは容易にできる。これらの実施形態では、親和性作用因子（単量体ドメインまたは多量体）の第一のライブラリーを多数のリガンドに対してパンニングし、溶離された親和性作用因子を親和性作用因子の第一または第二のライブラリーに連結させて、多量体親和性作用因子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９またはそれ以上の単量体を含むもの）のライブラリーを形成し、その後、それを多数のリガンドに対してパンニングする。この方法を反復して、より大きな多量体親和性作用因子を作製し続けることができる。単量体ドメインの数の増加は、特定のターゲットに対する増大した親和性および結合活性増大を生じさせることができる。例えば、本発明者らは、ＣＤ２８に結合する単量体ドメインの三量体が、二量体より高い親和性を有し、そしてまた二量体が、単一ＣＤ２８結合単量体ドメインのみより高い親和性を有することを発見した。勿論、各段階で、場合によってはパンニングを繰り返して、有意な結合因子を富化させる。一部の事例では、単量体の末端への組み換え部位（例えば、ｌｏｘ部位）の挿入、およびリコンビナーゼ媒介事象による単量体ライブラリーの組み換えによって、ウォーキングを助長することとなる。
【０２８７】
上の方法の選択多量体は、例えば、それらの選択多量体の組み換えまたはシャッフリング（多量体間もしくは内または両方で組み換えを行うことができる）およびそれらの選択多量体の突然変異などによって、さらに操作することができる。これは、改変された多量体を生じさせ、その後、前記の選択多量体と比較して強化された特性を有するメンバーをスクリーニングおよび選択し、それによって、選択された改変多量体を生産することができる。
【０２８８】
本明細書での説明に鑑みて、次のプロセスをたどることは明らかである。天然または非天然単量体ドメインを組み換えることができ、または変異体を形成することができる。場合により、最初にまたは後で、それらのドメインを、それらが予定されている宿主において免疫原性である可能性が低い配列について選択する。場合によっては、組み換えドメインを含むファージライブラリーを所望の親和性についてパンニングする。ファージによって発現された単量体ドメインまたは多量体を、ターゲットに対するＩＣ５０についてスクリーニングすることもできる。ヘテロメリック多量体を選択することもでき、またはホモメリック多量体を選択することもできる。選択されたポリペプチドを、例えばヘテロまたはホモ多量体ターゲットを含む任意のターゲットへのそれらの親和性について選択することもできる。
【０２８９】
上に示したまたは下で示す方法によって生産されるリンカー、多量体または選択多量体は、本発明の特徴である。多量体を含むライブラリー、例えば、本発明の方法によって生産されたまたは本発明の方法によって選択された約１００、２５０、５００またはそれ以上のメンバーを含むライブラリー、を提供する。一部の実施形態には、前記ライブラリーのメンバーを含む１つ以上の細胞も含まれる。組み換えポリペプチドのライブラリー、例えば、約１００、２５０、５００またはそれ以上の異なる組み換えポリペプチドを含むライブラリー、も本発明の特徴である。
【０２９０】
本発明の組成物を親和性材料、例えば組み換えポリペプチド、のマトリックスに結合させることができる。親和性材料の例としては、例えば、ビーズ、カラム、固体支持体および／またはこれらに類するものが挙げられる。
【０２９１】
ＶＩＩ．治療的および予防的処置方法
本発明は、上で説明した１つ以上の核酸またはポリペプチド（または薬学的に許容される賦形剤と１つ以上のそうした核酸もしくはポリペプチドとを含む組成物）を、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、ヒツジを含む哺乳動物、または非哺乳類脊椎動物、例えば鳥類（例えば、ニワトリもしくはカモ類）、魚類、または非脊椎動物をはじめとする被験者に、インビボまたはエクスビボで投与することによって、疾病または疾患を治療的にまたは予防的に処置する方法も含む。
【０２９２】
本発明のＩＬ−６結合性単量体ドメインまたは多量体を含むポリペプチドをはじめとする、ＩＬ−６拮抗薬は、多数の人間の疾病の治療に有用である。例示的ＩＬ−６結合性ドメインとしては、次のものを含む（しかし、これらに限定されない）、本明細書において開示する特定の配列が挙げられる：
【０２９３】
【化７６】
2009501517.tif 000068
【０２９４】
【化７７】
2009501517.tif 000069
ＩＬ−６の拮抗薬が改善に役立つ例示的な人間の疾病としては、例えば、
自己免疫および炎症性疾患（例えば、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、スティル病、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エステマトーデス、ループス腎炎、多発性硬化症、変形性関節炎、カルトルマン病、敗血症およびギラン・バレー症候群）、
癌（例えば、多発性骨髄腫、腎細胞癌、乳癌、他の充実性腫瘍（結腸、膵臓、胃などのもの）リンパ腫、白血病）、
代謝性／内分泌性疾患（例えば、ＩＩ型糖尿病（インスリン抵抗性）；骨粗しょう症；脂質代謝異常（アテローム硬化症、冠状動脈疾患などの予防および／または治療の一部として、高密度リポタンパク、ＨＤＬを増加させる）、老化防止、肝疾患（例えば、肝線維症））；
心血管疾患（例えば、冠動脈疾患）；
肺疾患（例えば、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺線維症、喘息））；および
神経疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、卒中）
が挙げられる。
【０２９５】
一部の態様において、本発明の単量体または多量体は、上に挙げた病気のうちの１つの治療に用いられる少なくとも１つの他の分子と共に、個体に投与される。前記他の分子は、本単量体もしくは多量体と共に１つの調合物に調合することができ、または本単量体もしくは多量体の投与と同時に、もしくは前にもしくは後に投与することができる。
【０２９６】
一部の実施形態では、ＩＬ−６に結合する本発明の単量体または多量体を含むポリペプチドを使用して、個体における高密度脂質（ＨＤＬ）を増加させる。前記個体は、心疾患の家族歴を有する、またはそうでなければ高コレステロール、高ＬＤＬレベルもしくは低ＨＤＬレベルの不健康効果によるリスクがある個体であり得る。ＩＬ−６は、脂質代謝の重要な媒介因子である。これは、コレステロールレベルがＩＬ−６ノックアウトマウスでは上昇するが、ＩＬ−６トランスジェニックマウスではコレステロールレベルが低下することによって証明される。ヒト抗ＩＬ−６抗体は、総コレステロールレベル、ＬＤＬレベルおよびトリグリセリドレベルを有意に上昇させる（ｐ＝＜０．００１）。ＨＤＬも有意に上昇する（Ｐ＝＜．００１）。ＬＤＬは、ヒト化抗ＩＬ−６Ｒ抗体（ＭＲＡ）で用量依存的に１２〜２３％上昇する。ＨＤＬは、同じ抗ＩＬ−６Ｒ抗体で用量依存的に〜２６％上昇する。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（２００３）；Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（２００４）参照。
【０２９７】
一部の実施形態では、ＩＬ−６に結合する本発明の単量体または多量体を含むポリペプチドを、ＬＤＬレベルを低下させる薬物と併用で投与する。スタチン、樹脂（コレスチラミン、コレスチポール、コレスバラム）およびニコチン酸が、ＬＤＬレベルを低下させる薬物の例である。例示的スタチンとしては、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９８】
本発明の１つの態様において、エクスビボ法では、被験者についての関心のある１つ以上の細胞または細胞集団（例えば、腫瘍細胞、腫瘍組織サンプル、臓器細胞、血液細胞、皮膚、肺、心臓、筋肉、脳、粘膜、肝臓、腸、脾臓、胃、リンパ系、頚部、膣、前立腺、口、舌などの細胞）をその被験者から得るか、除去し、疾病、疾患または他の状態の予防的または治療的処置に有効である量の本発明の選択単量体ドメインおよび／または多量体と接触させる。その後、それらの接触させた細胞を、被験者に、それらを得た部位に、または治療する被験者における関心のある別の部位（例えば、上で定義したものを含む）に戻すか送達する。所望される場合には、それらの接触させた細胞を、標準的な周知のグラフト化技術を用いてその被験者の関心のある組織、器官もしくは系の部位（上で説明したすべてのものを含む）にグラフトさせることができ、または例えば、標準的な送達もしくは輸注技術を用いて血液もしくはリンパ系に送達することができる。
【０２９９】
本発明は、被験者についての関心のある１つ以上の細胞または細胞の集団を、疾病、疾患または他の状態の予防的または治療的処置に有効な量の本発明の選択単量体ドメインおよび／または多量体と直接または間接的に接触させるインビボ法も提供する。直接接触／投与形式の場合、一般に、本選択単量体ドメインおよび／または多量体は、局所投与、注入（例えば、針もしくは注射器の使用による）またはワクチンもしくは遺伝子ガン送達（組織、器官または皮膚の部位に押し込む）をはじめとする、様々な形式のうちのいずれかによって、治療すべき細胞または関心のある組織部位（例えば、腫瘍細胞、腫瘍組織サンプル、臓器細胞、血液細胞、皮膚、肺、心臓、筋肉、脳、粘膜、肝臓、腸、脾臓、胃、リンパ系、頚部、膣、前立腺、口、舌などの細胞）に、直接投与または形質転換される。本選択単量体ドメインおよび／または多量体は、例えば、筋肉内的に、真皮内的に、皮下的に、経口的に、腹腔内的に、鞘内的に、静脈内的に送達することができ、または体腔内に配置することができ（例えば、外科手術中のことを含む）、あるいは吸入または経膣もしくは直腸内投与によって送達することができる。例示的送達としては、例えば、経口送達（口腔内もしくは腸内摂取／送達）、在宅注射（例えば、約１．４ｍＬ容量もしくはそれ以下で調合されるもの）、経皮摂取／送達、皮下移植可能なポンプ、肺摂取／送達（全身性もしくは非全身性）、血液脳関門摂取／送達、および／または経鼻摂取／送達が挙げられる。
【０３００】
経口送達用の設計アプローチとしては、例えば、本単量体または多量体に粘膜ペプチドトランスポーター、例えばＰｅｐＴ１、ＰｅｐＴ２、ＨＰＴ１、ＡＢＣ−ファミリー、に対する結合親和性を含めること；本単量体もしくは多量体への転座ドメイン（緑膿菌外毒素ＡからのＰＥ３８もしくはＰＥ４０）の追加；またはトランスフェリン受容体などの血液脳関門トランスポーターに対する結合親和性を含めることが挙げられる。
【０３０１】
経上皮送達の４つの主要メカニズムは、
−  経細胞的：拡散により細胞を通して：主として、小分子によって用いられる
−  傍細胞的：デスモソーム／閉鎖帯を通して細胞周囲に：主として、親水性ペプチドによって用いられる
−  トランスサイトーシス：飲細胞運動により小胞内部の細胞を通して
−  担体またはトランスポーター媒介型、そのトランスポーター／担体に結合する分子用
である。
【０３０２】
もう１つのアプローチでは、本単量体または多量体は、細胞表面上の受容体または細胞を横断して血清に能動的に輸送される小胞（薬物のみを担持するもの）内の受容体に結合するように設計される。こうした受容体は、トランスポーターと呼ばれる。１つのこうした受容体は、血清への肺および腸管送達に利用され得る新生児免疫グロブリンＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）である。もう１つの受容体は、トランスフェリン受容体であり、これは、血液脳関門を横断して脳脊髄液に輸送することができる。あるいは、本単量体または多量体は、肺および腸管輸送のために新生児Ｆｃ受容体に結合するように設計される。この方法は、最終薬物製品をｐＨ応答型放出用に設計作製することを含む。
【０３０３】
上記に鑑みて、幾つかの戦略が可能である。公知トランスポーター（例えば、ＰｅｐＴ１、ＨＰＴ−１、ＰｅｐＴ２、ＡＢＣファミリー、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＭＤＲ）に結合する単量体または多量体を特定することができる。他の有用な結合因子は、（例えば、Ｃａｃｏ２細胞による１４Ｃ−セファレキシン取り込みを利用する取り込み遮断アッセイを用いて）Ｃａｃｏ２細胞に結合する単量体または多量体を特定することにより、特定することができる。例えば、Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ，Ｊ．ら，Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  ５８：１４２−１５１（２００４）；Ｌｏｗ，Ｓ．Ｃ．ら，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ−ａｄｖａｎｃｅ  ａｃｃｅｓｓ  Ａｐｒｉｌ  ７  ２００５；Ｌｅｅ，Ｖ．Ｊ．Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ  ２９（２００１）；Ｒｕｂａｓ，Ｗ．ら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｄ．８５：１６５−１６９（１９９６）；Ｙａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ら，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６：１３３１−１３４３（１９９９）；Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｃ．Ｇ．ら，Ｇｕｔ  ５２：１７８８−１７９９（２００３）；Ｃｌｅｌａｎｄ，Ｊ．Ｌ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：２１２−２１９（２００１）；Ｎｉｅｌｓｅｎ，ＣＵ．およびＢｒｏｄｉｎ，Ｂ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ４：３７３−３８８（２００４）；Ｋｕｎｔａ，Ｊ．Ｒ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ５：１０９−１２４（２００４）参照。
【０３０４】
もう１つのアプローチでは、多量体のファージライブラリーを、哺乳動物の口腔に適用することができ、その哺乳動物の血清中のファージまたはそのファージからのＤＮＡを回収して、良好な送達因子である配列について富化させることができる。経口輸送されることがわかっている天然ドメインまたはペプチドを本発明の単量体または多量体と融合させることもできる。さらにもう１つの代案では、ファージディスプレイされたドメインを、適切な体液（鼻のもの、腸管のものなど）または精製プロテアーゼに対する耐性について選択する。
【０３０５】
インビボ間接的接触／投与形式では、一般に、本選択単量体ドメインおよび／または多量体を、治療を助長することができる１つ以上の細胞または細胞の集団に本発明のポリペプチドを直接接触または投与することにより、治療すべき細胞または関心のある組織部位（例えば、皮膚細胞、臓器系、リンパ系、または血液細胞系など）に間接的に投与または移入する。例えば、関心のある部位（例えば、体内の組織、臓器、関心のある細胞または血液もしくはリンパ系）へのその選択単量体ドメインおよび／または多量体の送達が行われ、有効な予防的または治療的処置が生じるために十分な量の本選択単量体ドメインおよび／または多量体と血液もしくはリンパ系、皮膚または臓器の細胞を接触させることによって、被験者の体内の腫瘍細胞を治療することができる。こうした接触、投与または移入は、上で説明した投与経路または方式のうちの１つ以上を用いることによって、一般に、行われる。
【０３０６】
もう１つの態様において、本発明は、被験者についての関心のある１つ以上の細胞または関心のある細胞の集団（例えば、腫瘍細胞、腫瘍組織サンプル、臓器細胞、血液細胞、皮膚、肺、心臓、筋肉、脳、粘膜、肝臓、腸、脾臓、胃、リンパ系、頚部、膣、前立腺、口、舌などの細胞）をその被験者から得または除去し、前記１つ以上の細胞または細胞の集団と、疾病、疾患または他の状態の予防的または治療的処置に有効である関心のある生物活性ポリペプチド（例えば、選択単量体ドメインおよび／または多量体）をコードしている本発明の核酸配列を含むポリヌクレオチド構築体とを接触させることによって形質転換させる、エクスビボ法を提供する。前記１つ以上の細胞または細胞の集団は、十分な量の前記ポリヌクレオチド構築物および前記核酸配列の発現を制御するプロモーターと接触させるので、前記ポリヌクレオチド構築物（およびプロモーター）の前記細胞（単数または複数）への取込みが発生し、ならびに選択単量体ドメインおよび／または多量体をコードしている、疾病、疾患または状態の予防的または治療的処置に有効な量の生物活性ペプチドを生産するために十分な、本発明のターゲット核酸配列の発現が生じる。前記ポリヌクレオチド構築物は、本発明の核酸配列の発現を制御するプロモーター配列（例えば、ＣＭＶプロモーター配列）、および／あるいは、所望される場合には、本発明の別のポリペプチド、サイトカイン、アジュバントもしくは共刺激分子または関心のある他のポリペプチドのうちの少なくとも１つ以上をコードしている１つ以上の追加のヌクレオチド配列を含むことがある。
【０３０７】
トランスフェクション後、それらの形質転換細胞を、被験者に、それらを得た組織部位もしくは系に、またはその被験者の治療すべき別の部位（例えば、腫瘍細胞、腫瘍組織サンプル、臓器細胞、血液細胞、皮膚、肺、心臓、筋肉、脳、粘膜、肝臓、腸、脾臓、胃、リンパ系、頚部、膣、前立腺、口、舌などの細胞）に戻す、送達するまたは移入する。所望される場合には、それらの細胞を、標準的な周知のグラフト化技術を用いてその被験者における関心のある組織、皮膚、臓器もしくは身体器官にグラフトさせることができ、または標準的な送達もしくは輸注技術を用いて血液もしくはリンパ系に送達することができる。形質転換細胞のこうした送達、投与、移入は、上で説明した投与経路または方式のうちの１つ以上を用いることによって一般に行われる。ターゲット核酸の発現は、自然に発生し、または（より詳細に下で説明するように）誘導することができ、その部位または組織系における疾病または状態の治療に十分、且つ、有効な量のコードされたポリペプチドが発現される。
【０３０８】
もう１つの態様において、本発明は、被験者についての関心のある１つ以上の細胞または細胞の集団（例えば、上で説明した細胞および細胞系および被験者を含む）を、被験者の体内で、前記細胞（単数または複数）または細胞の集団と、疾病、疾患または他の状態の予防的または治療的処置に有効である関心のある生物活性ポリペプチド（例えば、選択単量体ドメインおよび／または多量体）をコードしている本発明の核酸配列を含むポリヌクレオチド構築体とを接触させること（または上で説明した投与経路または方式のうちの１つ以上を用いて前記細胞（単数または複数）または細胞の集団に投与もしくは移入すること）によって形質転換させる、インビボ法を提供する。
【０３０９】
前記ポリヌクレオチド構築物は、（例えば、上で説明した投与経路または方式のうちの１つ以上を用いる直接接触により）疾病または疾患に罹患している細胞（単数または複数）に直接投与または移入することができる。あるいは、前記ポリヌクレオチド構築物を疾病または疾患に罹患している細胞（単数または複数）に間接的に投与または移入することができ、これは、前記ポリヌクレオチド構築物（およびプロモータ）の前記細胞（単数または複数）への取り込みが発生し、疾病、疾患または状態の予防的または治療的処置に有効な量の生物活性ペプチドを生産するために十分な本発明のターゲット核酸配列発現が生じるような、生物活性ポリペプチドをコードしている核酸配列およびその核酸配列の発現を制御するプロモーターを含むポリヌクレオチド構築物の十分な量と、罹病していない細胞（単数または複数）または他の罹病細胞とを、上記投与経路または方式のうちの１つ以上を用いて先ず直接接触させること、およびそれによって、ポリヌクレオチド構築物または得られた発現ポリペプチドが、その被験者の体の最初の送達部位、系、組織または臓器から（例えば、血液またはリンパ系により）その被験者の罹病部位、組織、臓器または系に自然にまたは自動的に移入することによる。ターゲット核酸の発現は、自然に発生し、または発現されるポリペプチドの量が、その部位または組織系における疾病または状態を治療するために十分、且つ、有効であるように、（より詳細に下で説明するように）誘導することができる。前記ポリヌクレオチド構築物は、核酸配列の発現を制御するプロモーター配列（例えば、ＣＭＶプロモーター配列）、および／または、所望される場合には、本発明の別のポリペプチド、サイトカイン、アジュバントもしくは共刺激分子または関心のある他のポリペプチドのうちの少なくとも１つ以上をコードしている１つ以上の追加のヌクレオチド配列を含むことがある。
【０３１０】
上で説明したインビボおよびエクスビボ治療方法の各々において、賦形剤と本発明のポリペプチドまたは核酸とを含む組成物を投与または送達することができる。１つの態様では、薬学的に許容される賦形剤と本発明のポリペプチドまたは核酸とを含む組成物を、疾病または疾患の治療に有効な量で、上で説明したような被験者に投与または送達する。
【０３１１】
もう１つの態様では、上で説明したインビボおよびエクスビボ治療方法各々において、細胞（単数もしくは複数）または被験者に投与されるポリヌクレオチドの量は、被験者の１つ以上の細胞への前記ポリヌクレオチドの取り込みが発生し、免疫原（例えば、抗原）によって誘導される免疫応答をはじめとする被験者における免疫応答を強化するために有効な量の生物活性ポリペプチドを生産するために十分な、前記核酸配列の発現が生じるような量である。もう１つの態様では、そうした方法各々について、細胞（単数もしくは複数）または被験者に投与されるポリペプチドの量は、免疫原（例えば、抗原）によって誘導されるものをはじめとする被験者における免疫応答を強化するために十分な量であり得る。
【０３１２】
さらにもう１つの態様において、ポリヌクレオチド構築物（またはポリヌクレオチド構築物を含む組成物）を使用して、被験者に生理活性ポリペプチドを送達するインビボまたはインビボ治療法における、そのポリヌクレオチド構築物の発現は、誘導可能オンおよびオフ遺伝子発現システムを使用することによって誘導することができる。こうしたオンおよびオフ遺伝子発現システムの例としては、それぞれ、Ｔｅｔ−Ｏｎ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍおよびＴｅｔ−Ｏｆｆ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（こうしたシステム各々の詳細な説明については、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｃａｔａｌｏｇ  ２０００，ｐｇ．１１０−１１１参照）が挙げられる。他の制御可能または誘導可能オンおよびオフ遺伝子発現システムは、当業者には公知である。こうしたシステムを用いて、ポリヌクレオチド構築物のターゲット核酸の発現を、正確、可逆的、且つ、定量的な様式で調節することができる。ターゲット核酸の遺伝子発現は、例えば、ターゲット核酸を含むポリヌクレオチド構築物を含有する安定な被トランスフェクト細胞を関心のある組織部位、臓器または系に送達もしくは移入または接触させた後に、誘導することができる。こうした系は、ターゲット核酸の発現を遅らせること、または正確に制御すること（例えば、手術の完了および／または手術後の治癒のための時間を与えること；ターゲット核酸を含むポリヌクレオチド構築物が治療すべき部位、細胞、系または組織に到達するための時間を与えること；その構築物で形質転換されたグラフト含有細胞が、それがスプライシングされていたまたは付いていた組織または臓器に組み込まれる時間を与えることなど）が有利である治療方法および形式において、特に有益である。
【０３１３】
ＶＩＩＩ．追加の多量体用途
本発明の多量体の可能な用途は多岐にわたっており、親和性作用因子が望まれるあらゆる用途を含む。
【０３１４】
一部の事例では、単量体または多量体のペアが、同じターゲットに結合させるために（すなわち、サンドイッチ系アッセイでの使用のために）選択される。マッチした単量体または多量体ペアを選択するために、一般に、２つの異なる単量体または多量体が、ターゲットタンパク質に同時に結合できる。こうしたペアを特定するための１つのアプローチは、以下を含む：
（１）ターゲットタンパク質に結合させるために予め選択されたファージまたはタンパク質混合物を固定すること；
（２）固定されたファージまたはタンパク質にターゲットタンパク質を接触させ、洗浄すること；
（３）結合したターゲットにファージまたはタンパク質混合物を接触させ、洗浄すること；および
（４）固定されたファージまたはタンパク質を溶離せずに、結合したファージまたはタンパク質を溶離すること。
【０３１５】
本発明の多量体または単量体ドメインの１つの用途は、検出または他の親和性に基づくアッセイにおいて抗体または他の親和性作用因子に代わることである。従って、一部の実施形態において、単量体ドメインまたは多量体は、混合物中のターゲット以外の成分に結合する能力を基準にして選択される。この一般的なアプローチとしては、そのアッセイ中のサンプルの組成の模倣を含む、そのアッセイの条件に酷似した条件下での親和性選択の実施を挙げることができる。従って、選択の１つの段階は、ターゲットリガンドを含まない混合物に単量体ドメインまたは多量体を接触させること、およびその混合物に結合する任意の単量体ドメインまたは単量体を基準にして選択することを含む。従って、あるアッセイにおけるサンプル（血清、血液、組織、細胞、尿、精液など）を意味するこれらの混合物（抗体、単量体ドメインまたは多量体を用いて枯渇させることができる、ターゲットリガンド不在のもの）は、遮断薬として使用することができる。こうしたサブトラクションは、例えば、それらのターゲットに結合するが、他の血清タンパク質および非ターゲット組織にはしない、薬学的タンパク質を作るために、有用である。
【０３１６】
例えば、本発明は、選択単量体ドメインまたは多量体が２つのタンパク質、例えばＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒ、の間の相互作用を遮断する、拮抗薬を作るための用途において、用いることができる。一部の実施形態では、ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒに結合することによりこの相互作用を防止する単量体を特定することができる。例えば、図９参照。場合によっては、本発明は、作動薬を作製することができる。例えば、２つの異なるタンパク質、例えば酵素および基質、に結合する多量体は、例えば酵素的活性および／または基質変換をはじめとするタンパク質機能を強化することができる。
【０３１７】
一部の実施形態において、単量体ドメインは、リガンド阻害、リガンドクリアランスまたはリガンド刺激のために使用される。これらの方法における可能なリガンドとしては、例えば、ＩＬ−６が挙げられる。
【０３１８】
受容体へのリガンド結合の阻害が望まれる場合、リガンド（例えば、ＩＬ−６）に、そのリガンドがそのリンガンドの受容体と接触する部分で結合し、またはその受容体に、その受容体がそのリガンドに結合、接触する部分で結合し、それによって、リガンド−受容体相互作用を防止する単量体ドメインが選択される。この単量体ドメインは、場合により、所望される場合には、半減期延長因子に連結させることができる。
【０３１９】
リガンドクリアランスは、体液中での可溶性リガンドの半減期の修飾を指す。サイトカインに対する抗体は、その抗体の血清半減期がサイトカインの血清半減期よりはるかに長い（２〜３週間対数時間）ため、サイトカインのクリアランスを一般には防止する。これは、血清中のサイトカインの濃度の大きな上昇を生じさせる。ＩＬ−６の場合、これは、７００倍であると報告されている（ｖａｎ  Ｚａａｎｅｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８，１４４１−１４４８（１９９６））。ＩＬ−６の大部分は、抗体に結合され、従って、不活性である。しかし、増加したＩＬ−６レベルは、一部の環境では安全性の問題を生じることがある。一部の環境下（例えば、低ｐＨまたは高ｐＨを有する区画では）および一定の組織（例えば、Ａｂの侵入を防止するが、ＩＬ−６の侵入を防止しないフィルター）では、Ｌ−６は抗体から離れることができ、その高レベルの活性ＩＬ−６が深刻な安全性の問題になるからである。
【０３２０】
１つの代替アプローチは、総ＩＬ−６濃度の増加があまり顕著にならないように、抗体より短い血清半減期を有する阻害剤を使用することであろう。本発明の単量体および多量体は、多くの抗体の２〜３週間の半減期よりはるかに短い、６０〜１８０時間のヒト血清半減期を有する（サルのデータからの異種間物差し法（ａｌｌｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｃａｌｉｎｇ）によって判定）。
【０３２１】
従って、一部の実施形態において、ＩＬ−６は、そのＩＬ−６阻害剤複合体が腎臓によって浄化されるほど小さいような方法で阻害される。腎臓は、約４５〜５０ｋＤのカットオフを有し、それより小さい分子のみを通過させる、分子サイズのフィルターである。サイトカイン−阻害剤複合体のサイズを３５〜４０ｋＤより下に保つことができるならば、有効な腎臓クリアランスが期待される。大部分のサイトカインは、約１８〜２０ｋＤのサイズであるので、阻害剤は、１５〜２０ｋＤ未満でなければならない。本発明の１８ｋＤのＩＬ−６三量体多量体は、この要件を満たすが、３倍大きいＩｇドメインに基づく足場タンパク質は、一般に、この要件を満たさない。
【０３２２】
もう１つの代案では、そのターゲット分子（例えば、ＩＬ−６）に結合していないときには、腎臓によって浄化されないであろう球状タンパク質の流動力学的ストークス半径を有する（例えば、４５ｋＤ、５０ｋＤ、５５ｋＤより大きい）が、そのターゲット分子（例えば、ＩＬ−６）に結合すると、腎臓によって浄化されるであろう球状タンパク質の流動力学的ストークス半径を有する（例えば、５５ｋＤ、５０ｋＤ、４５ｋＤまたは４０ｋＤ未満）、本発明の多量体を設計することができる。こうした多量体は、一般に、少なくとも３、４、５、６、７、８またはそれ以上の単量体ドメインを含むので、これらの多量体は、そのターゲット分子に結合していないとき、そのターゲット分子に結合したときより有意に大きいストークス半径を形成する。こうした多量体は、例えば、１）大きすぎて腎臓を通過できない球状タンパク質と２）腎臓を通過できるほどの小ささの球状タンパク質の沈降係数を決定し、その後、ターゲット分子不在下で１）に類似した沈降係数を有するが、ターゲット分子存在下では２）に類似した沈降係数を有する多量体を選択することにより、容易に選択することができる。
【０３２３】
あるいは、本明細書の他の箇所で論じているように、半減期延長因子に結合する第一の単量体ドメインと、リガンドのそのリガンドの受容体に結合していない部分に結合している第二の単量体ドメインとを含む多量体を使用して、そのリガンドの半減期を増加させることができる。
【０３２４】
もう１つの実施形態において、リガンドに結合する第一の単量体ドメインとその受容体に結合する第二の単量体ドメインとを含む多量体を使用して、その受容体に対するそのリガンドの有効な親和性を増加させることができる。
【０３２５】
もう１つの実施形態において、受容体に結合する少なくとも２つの単量体を含む多量体を使用して、それら２つの受容体をその多量体への両方の結合により近接させ、それによってそれらの受容体を活性化する。
【０３２６】
本発明の可能性のある用途のさらなる例としては、薬物結合（例えば、ターゲティングのための放射性ヌクレオチドへの結合、薬物の半減期延長のための薬学的結合、過量摂取による症状の治療および嗜癖セラピーのための制御された物質結合）、免疫機能の修飾（例えば、ＣＴＬＡ−４のような受容体に結合することによる免疫原性遮断、ＣＤ８０のような受容体に結合することによる免疫原性強化、またはＦｃ型の結合による補体活性化）および特殊送達（例えば、リンカー切断による遅速放出、電子輸送ドメイン、二量体化ドメイン；または細胞侵入ドメイン、ＦｃＲなどのクリアランス受容体、粘膜貫通輸送用のｐｌｇＲなどの経口送達受容体、およびトランスフェリンＲなどの血液脳輸送受容体への特異的結合）が可能である、単量体ドメインおよびそれらの多量体が挙げられる。
【０３２７】
さらなる実施形態では、単量体または多量体を検出可能な標識（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５など）に連結させることができ、またはレポーター遺伝子産物（例えば、ＣＡＴ、ルシフェラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ＧＦＰなど）に連結させることができる。
【０３２８】
ＩＸ．単量体ドメインおよび／または多量体核酸およびポリペプチドのさらなる操作
上で述べたように、本発明のポリペプチドは、改変することができる。これらのポリペプチドをコードしている修飾または改変された核酸配列を作製するための手順を生じさせる様々な多様性の説明は、本明細書に、および本明細書に引用されている参照文献に、記載されている。
【０３２９】
本発明のもう１つの態様は、核酸をコードしている単量体ドメイン、選択単量体ドメイン、多量体および／または選択多量体のクローニングおよび発現を含む。従って、当該技術分野では周知の発現システムを用いて、多量体ドメインを単一タンパク質として合成するとができる。単量体ドメイン、選択単量体ドメイン、多量体および／または選択多量体などの核酸の発現に関連したベクター、プロモーターおよび多数の他の一般的な原理の使用を含む、ここで有用な分子生物学的技術を記載している一般的なテキストとしては、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９９年まで増補）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」））が挙げられる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑ−レプリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術（例えば、ＮＡＳＢＡ）を含む、核酸をコードしている単量体ドメインおよび多量体の特定、単離およびクローニングに有用な、インビトロ増幅法による当業者向けの十分な技術の例は、Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，およびＡｕｓｕｂｅｌ、ならびにＭｕｌｌｉｓら（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（編集、Ｉｎｎｉｓら）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）；Ａｒｎｈｅｉｍ  ＆  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）Ｃ＆ＥＮ  ３６−４７；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３，８１−９４；（Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ  ８６，１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ  ８７，１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ  ３５，１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１，１０７７−１０８０；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８，２９１−２９４；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，（１９８９）Ｇｅｎｅ  ４，５６０；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８９，１１７，およびＳｏｏｋｎａｎａｎおよびＭａｌｅｋ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３−５６４において見つけられる。増幅された核酸の、改善されたインビトロクローニング法は、Ｗａｌｌａｃｅら、米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。４０ｋｂ以下のＰＣＲアプリコンが作製される、ＰＣＲによる大きな核酸の改善された増幅法は、Ｃｈｅｎｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６８４−６８５およびその中の参照文献にまとめられている。本質的にはいずれのＲＮＡも、逆転写酵素およびポリメラーゼを使用する制限消化、ＰＣＲ発現および塩基配列決定に適する２本鎖ＤＮＡに変換できることは、当業者には理解されるであろう。Ａｕｓｕｂｅｌ，ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＢｅｒｇｅｒ，すべて上記、参照。
【０３３０】
本発明は、宿主細胞への本発明のベクターの導入、ならびに組み換え法による本発明の単量体ドメイン、選択単量体ドメイン、多量体および／または選択多量体の生産にも関する。例えばクローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターを用いて、宿主細胞を遺伝子操作する（すなわち、形質導入、形質転換またはトランスフェクトする）。前記ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。その遺伝子操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化するため、形質転換体を選択するため、または関心のある単量体ドメイン、選択単量体ドメイン、多量体および／もしくは選択多量体遺伝子（単数または複数）を増幅させるために、適宜修飾された従来の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に用いられたものであり、当業者には明らかであろうし、また、例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋおよびこの中で引用されている参照文献をはじめとする本明細書で引用する参照文献で明らかとなろう。
【０３３１】
上で述べたように、本発明のポリペプチドは、非動物細胞、例えば、植物、酵母、真菌、細菌などにおいて生産することもできる。実際、全体をとおして注記しているように、ファージディスプレイは、こうしたポリペプチドを生産するための特に適切な技法である。Ｓａｍｂｌｏｏｋ、ＢｅｒｇｅｒおよびＡｕｓｕｂｅｌに加えて、細胞培養に関する詳細は、Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ（ｅｄｓ）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびＡｔｌａｓおよびＰａｒｋｓ（ｅｄｓ）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬにおいて見つけることができる。
【０３３２】
本発明は、薬理特性を改善するため、免疫原性を低下させるため、または細胞もしくは組織への多量体および／もしくは単量体ドメインの（例えば、血液脳関門を通した、もしくは皮膚を通した）輸送を助長するための、単量体ドメイン、免疫ドメインおよび／または多量体の改変も含む。これらのタイプの改変は、様々な修飾（例えば、糖基の付加またはグリコシル化）、ＰＥＧの付加、一定のタンパク質（例えば、ＨＳＡまたは他の血清タンパク質）に結合するタンパク質ドメインの付加、細胞への、細胞からのおよび細胞を通した移動または輸送をシグナリングするタンパク質フラグメントまたは配列の付加を含む。さらなる成分を多量体および／または単量体ドメインに付加させて、その多量体および／または単量体ドメインの特性を操作することもできる。例えば、公知受容体に結合するドメイン（例えば、Ｆｃ受容体に結合するＦｃ領域タンパク質ドメイン）、毒素（単数もしくは複数）または毒素の一部、多量体または単量体ドメインを活性化するために、場合によっては切り離すことができるプロドメイン、レポーター分子（例えば、緑色蛍光タンパク質）、レポーター分子に結合する成分（例えば、放射線量法用の放射性核種、ビオチンもしくはアビジン）または修飾の組み合わせを含めて、様々な成分を付加させることもできる。
【０３３３】
Ｘ．動物モデル
本発明のもう１つの態様は、単量体または多量体ドメインの免疫原性を試験するための具体的な非ヒト動物モデルの開発である。こうした非ヒト動物モデルを産生する方法は、レシピエント非ヒト動物の少なくとも一部の細胞に、タンパク質の同じファミリーからの多数のヒトタンパク質をコードしている遺伝子を含むベクターを導入することを含み、この場合、前記遺伝子は、ベクターを導入する少なくとも一部の細胞において機能しうるプロモーターに各々動作可能に連結されるので、前記タンパク質の同じファミリーからの多数のヒトタンパク質を発現することができる遺伝子修飾された非ヒト動物が得られる。
【０３３４】
本発明の実施の際に利用される適切な非ヒト動物としては、ヒト以外のすべての脊椎動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジなど）が挙げられる。一般に、タンパク質の１つのファミリーの多数のメンバーは、そのファミリーの少なくとも２つのメンバー、通常は少なくとも１０のファミリーメンバーを含む。一部の実施形態において、前記多数は、タンパク質のそのファミリーのすべての既知メンバーを含む。使用することができる例示的遺伝子としては、例えば、ＬＤＬ受容体クラスＡ−ドメインファミリー、ＥＧＦ様ドメインファミリーならびに本明細書に記載する他のドメインファミリーのメンバーなどの、単量体ドメインをコードしているものが挙げられる。
【０３３５】
本発明の非ヒト動物モデルは、その非ヒト動物モデルによって発現されるタンパク質の同じファミリーに由来する単量体または多量体ドメインの免疫原性についてスクリーニングするために使用することができる。本発明は、上で説明した方法に従って作られる非ヒト動物モデル、ならびにその体細胞および生殖細胞が、タンパク質の同じファミリーからの多数のヒトタンパク質（例えば、本明細書において説明する単量体ドメイン）をコードしているＤＮＡ分子を含有および発現する、トランスジェニック非ヒト動物（この場合、前記ＤＮＡ分子は、前記トランスジェニック非ヒト動物に胚性段階で導入されたものであり、ならびに前記ＤＮＡ分子は、そのＤＮＡ分子が導入された細胞の少なくとも一部ではプロモーターに動作可能に各々連結されている）を包含する。
【０３３６】
ＬＤＬ受容体クラスＡ−ドメイン由来の結合性タンパク質のスクリーニングに有用なマウスモデルの一例を下で説明する。野生型ヒトＬＤＬ受容体クラスＡ−ドメイン単量体をコードしている遺伝子クラスターを、ＰＣＲを用いてヒト細胞から増幅させる。２００の異なるＡ−ドメインのほぼすべてを、各々約７ｋｂのたった３つの独立したＰＣＲ増幅反応で増幅させることができる。その後、これらのフラグメントを使用して、上で説明した方法に従ってトランスジェニックマウスを産生させる。このトランスジェニックマウスは、ヒトＡ−ドメインを「自己」として認識し、従って、Ａ−ドメインに関してヒトの「個性」を模倣するである。個々のＡ−ドメイン由来単量体または多量体を、これらのマウスにおいて、それらのマウスにＡ−ドメイン由来単量体または多量体を注入し、その後、生じた免疫応答（または応答の欠如）を分析することによって、試験した。マウスを試験して、それらがマウス抗ヒト応答（ＭＡＨＲ）を発現したかどうかを判定する。ＭＡＨＲの発生をもたらさない単量体および多量体は、ヒトに投与されたとき、免疫原性でない可能性が高い。
【０３３７】
歴史的に、トランスジェニックマウスにおけるＭＡＨＲ試験は、そのただ１つのタンパク質がトランスジェニックであるマウスにおいて個々のタンパク質を試験するために用いられている。対照的に、上で説明した方法は、ヒトタンパク質の全ファミリーを「自己」と認識するモデルであって、多種多様な結合活性および使用が、各々、可能な非常に多数の変異タンパク質を評価するために使用することができる、非ヒト動物モデルを提供する。
【０３３８】
ＸＩ．キット
本方法に必要な成分（一般には、非混合形態）およびキット成分（パッケージング材料、それらの成分および／または方法を用いるための説示、それらの成分を保持するための１つ以上の容器（反応管、カラムなど））を含むキットは、本発明の１つの特徴である。本発明のキットは、多量体ライブラリー、または単一のタイプの単量体もしくは多量体、例えば、本明細書において説明するＩＬ−６および／もしくはＩｇＧ結合ドメイン、を含むポリペプチドを含有し得る。キットは、ターゲット分子の結合の促進に適する試薬、例えば、検出できるように標識された分子をはじめとする、検出を助長する緩衝剤または試薬、も含むことがある。単量体ドメインなどのリガンド結合を較正するための標準物質も本発明のキットに含めることができる。
【０３３９】
本発明は、商業的に価値がある結合アッセイおよびそれらのアッセイを実施するためのキットも提供する。本発明のアッセイの一部は、１つ以上のリガンドを利用して、単量体ドメイン、免疫ドメインおよび／または多量体の結合を検出する。単量体ドメインおよび／または多量体へのリガンド（単数または複数）の結合を検出するためのこうしたアッセイは、当該技術分野における任意の公知の方法、例えば、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡法、プラズモン共鳴などに基づく。
【０３４０】
前記アッセイに基づくキットも提供する。本キットは、一般に、容器および１つ以上のリガンドを含む。本キットは、アッセイを行うための説明書、追加の検出試薬、緩衝剤、またはこれらの成分のいずれかの使用のための説示などを場合によっては含む。あるいは、キットは、本発明の単量体ドメインおよび／または多量体の発現のための、細胞、ベクター（例えば、発現ベクター、本発明のポリペプチドを含む分泌ベクター）を含むことがある。
【０３４１】
さらなる態様において、本発明は、本明細書中の任意の方法もしくはアッセイを実施するための、本明細書中の任意の組成物、単量体ドメイン、免疫ドメイン、多量体、細胞、細胞培養物、器具、器具要素またはキットの使用を提供するものであり、および／または本明細書中の任意のアッセイもしくは方法を実施するための任意の器具もしくはキットの使用を提供するものであり、および／または本明細書中の細胞、細胞培養物、組成物もしくは他の特徴の治療用調合物としての使用を提供するものである。本明細書において説明する治療のための治療用調合物としての本明細書中のすべての成分の製造も提供する。
【０３４２】
ＸＩＩ．総合システム
本発明は、単量体ドメイン、選択単量体ドメイン、多量体および／または選択多量体ならびにそうしたポリペプチドをコードしている核酸に対応する文字列を含む、コンピュータ、コンピュータ読取可能媒体および総合システムを提供する。こうした配列は、シリコ・リコンビネーション法によってまたは標準的な配列アラインメントもしくはワード処理ソフトウェアによって操作することができる。
【０３４３】
例えば、本明細書における総合システムでは、様々なストリンジェンシーおよび文字列長の種々のタイプの類似性および検討事項を検出し、認識することができる。例えば、生体高分子の配列の比較分析用、ワード処理の際のスペルチェック用、および様々なデータベースからのデータ検索用の多数の相同性決定法を設計した。天然ポリヌクレオチドにおける４つの主要核酸塩基の間の二重らせん対状補体相互作用を理解した上で、相補的相同ポリヌクレオチド列のアニーリングを刺激するモデルは、本明細書中の配列に対応する文字列に対して一般に行われる配列アラインメントまたは他のオペレーション（例えば、ワード処理操作、配列またはサブ配列文字列を含む図の構成、アウトプットテーブルなど）の基礎として使用することもできる。配列類似性を計算するためのＧＯを有するソフトウェアパッケージの一例は、ＢＬＡＳＴであり、これは、本明細書中の配列に対応する文字列をインプットすることによって本発明に適応させることができる。
【０３４４】
ＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９０）Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで利用可能）を通して公的に入手できる。このアルゴリズムは、第一に、データベース配列内の同じ長さのワードとアラインしたときに何らかの正の値の閾値スコアＴとマッチするまたはそれらを満たす、照会配列中の長さＷの短いワードを特定することにより、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を特定することを必要とする。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記）。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含む、より長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。その後、ワードヒットを、累積アラインメントスコアを増やすことができるところまで各配列に沿って両方向に拡大させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメータＭ（マッチする残基のペアについてのリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチする残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を用いて計算する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて、累積スコアを計算する。各方向のワードヒットの拡大は、累積アラインメントスコアが、その最大獲得値から量Ｘだけ低下したとき；累積データが、１つ以上の負のスコアの残基のアラインメントの累積に起因して０以下になったとき；またはいずれかの配列の端に達したとき、停止させる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータ、Ｗ、ＴおよびＺが、そのアラインメントの感度および速度を決める。ＢＬＡＳＴＩＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いる（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）。
【０３４５】
有用な配列アラインメントアルゴリズムの追加の例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、漸進的ペアワイズ・アラインメントを用いて関連配列群から多数の配列アラインメントを作成する。アラインメントを作成するために使用されるクラスタリング関係を示す樹形曲線をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０の漸進的アラインメント法の単純化を用いる。用いられる方法は、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３によって記載された方法に類似している。このプログラムは、例えば、５，０００文字の最大長の配列を３００以下アラインすることができる。多重アラインメント手順が２つの最大類似配列のペアワイズ・アラインメントで始まって、２つのアラインされた配列のクラスターを生成する。その後、このクラスターを、次の最大関連配列またはアラインされた配列のクラスターに、アラインすることができる。配列の２つのクラスターを、２つの個々の配列のペアワイズ・アラインメントの単純な延長によって、アラインすることができる。一連の漸進的ペアワイズ・アラインメントによって、最終アラインメントが達成される。このプログラムを用いて、クラスタリング関係のデンドログラムまたは分木表現をプロットすることもできる。配列比較領域についての特定の配列およびそれらのアミノ酸またはヌクレオチド座標を指定することにより、このプログラムを実行する。例えば、単量体ドメインファミリー内の保存アミノ酸を決定するために、またはあるファミリー内の単量体ドメインの配列を比較するために、本発明の配列またはコーディング核酸をアラインして、構造−機能情報を生じさせる。
【０３４６】
１つの態様では、コンピュータシステムを用いて、本単量体ドメインに対応する文字列の「イン・シリコ」配列組み換えまたはシャッフリングを行う。様々なこうした方法が、１９９９年２月５日出願のＳｅｌｉｆｏｎｏｖおよびＳｔｅｍｍｅｒによる「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒ  Ｓｔｒｉｎｇｓ，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｄｅｓｉｒｅｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」（米国特許出願番号６０／１１８８５４）ならびに１９９９年１０月１２日出願のＳｅｌｉｆｏｎｏｖおよびＳｔｅｍｍｅｒによる「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒ  Ｓｔｒｉｎｇｓ，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｄｅｓｉｒｅｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」（米国特許出願番号０９／４１６，３７５）に記載されている。簡単に言うと、遺伝子オペレーターを遺伝子アルゴリズムにおいて使用して、例えば、突然変異、組み換え、死などのような遺伝的事象を模倣することにより、所与の配列を変化させる。例えば、前記‘３７５出願に記載されているように、配列を最適化するための多次元分析をコンピュータシステムで行うこともできる。
【０３４７】
デジタルシステムは、オリゴヌクレオチド合成装置に、例えば遺伝子再構成もしくは組み換えに用いられる、オリゴヌクレオチドを合成するように、または（例えば、適切な注文用紙を印刷することにより、もしくはインターネット上のオーダーフォームにリンクすることにより）市場の供給業者にオリゴヌクレオチドを注文するように、命令することもできる。
【０３４８】
このデジタルシステムは、（例えば、組み換え体、例えば本明細書にあるような組み換え単量体ドメイン、の配列またはアラインメントに基づく）核酸合成を制御するための出力要素を含むこともあり、すなわち、本発明の総合システムは、オリゴヌクレオチド合成装置またはオリゴヌクレオチド合成制御装置を場合によっては含む。このシステムは、あるアラインメントの下流で発生する他のオペレーション、または例えばアッセイに関して上で特に言及したような、本明細書中の配列に対応する文字列を用いて行われる他のオペレーションを含むことができる。
【実施例】
【０３４９】
以下の実施例は、例証のために提供するものであり、特許請求の範囲に記載する本発明を限定するために提供するものではない。
【０３５０】
実施例１
本実施例は、単量体ドメインの選択および多量体の作成を説明するものである。
【０３５１】
単量体ドメインの特定するためならびにそれらの選択された単量体ドメインおよび手順から多量体の作成するための出発原料は、様々なヒトおよび／または非ヒト配列のいずれに由来するものであってもよい。例えば、所望のリガンドまたはリガンドの混合物に対して特異的に結合している選択単量体ドメインを生産するために、一定のリガンドに結合する単量体ドメインのファミリーから１つ以上の単量体ドメイン遺伝子を選択する。それらの１つ以上の単量体ドメイン遺伝子をコードしている核酸配列を、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって得ることができ、または場合によっては、オーバーラッピングオリゴヌクレオチドを使用して合成生産することができる。
【０３５２】
最も一般的には、その後、これらの配列を、発現およびスクリーニングのために細胞表面ディスプレイフォーマット（すなわち、細菌、酵母または哺乳動物（ＣＯＳ）細胞表面ディスプレイ；ファージディスプレイ）にクローニングする。組み換え配列を、それらを発現し、その細胞表面上に表示する適切な宿主細胞に、トランスフェクト（形質導入または形質転換）する。例えば、それらの細胞は、標識した（例えば、蛍光標識した）所望のリガンドで染色することができる。染色された細胞をフローサイトメトリーによってソートし、選択単量体ドメインをコードしている遺伝子を（例えば、プラスミド単離、ＰＣＲまたは増幅およびクローニングによって）陽性細胞から回収する。この染色およびソーティングのプロセスは、（例えば、所望の富化レベルが達成されるまで、所望のリガンドの濃度を徐々に減少させながら）何回も繰り返すことができる。あるいは、所望のリガンドまたはリガンドの混合物に結合する細胞を特定するために用いることができる当該技術分野では公知の任意のスクリーニングまたは検出法を利用することができる。
【０３５３】
細胞に結合する所望のリガンドまたはリガンドの混合物から回収された、選択単量体ドメインをコードしている遺伝子は、本明細書にまたは引用参照文献に記載されている任意の方法に従って、場合によっては組み換えることができる。この多様化ラウンドにおいて生産された組み換え配列を、その後、同じまたは別の方法によってスクリーニングして、所望のリガンドまたはターゲットリガンドに対する改善された親和性を有する組み換え遺伝子を特定する。場合によっては、所望の親和性が達成されるまでこの多様化および選択プロセスを繰り返す。
【０３５４】
例えば、ＤＮＡライゲーションまたは場合によってはＰＣＲに基づく自己プライミング型オーバーラップ反応による、選択単量体ドメインをコードしている核酸配列のコンビナトリアル組立てによって、本方法により選択された選択単量体ドメイン核酸をリンカー配列により互いに接続して多量体を作製することができる。その後、それらの多量体をコードしている核酸配列を、発現およびスクリーニングのために細胞表面ディスプレイフォーマット（すなわち、細菌、酵母または哺乳動物（ＣＯＳ）細胞表面ディスプレイ；ファージディスプレイ）にクローニングする。組み換え配列を、それらを発現し、その細胞表面上に表示する適切な宿主細胞に、トランスフェクト（形質導入または形質転換）する。例えば、それらの細胞を、標識した（例えば、蛍光標識した）所望のリガンドまたはリガンドの混合物で染色することもできる。染色された細胞をフローサイトメトリーによってソートし、選択された多量体をコードしている遺伝子を（例えば、ＰＣＲまたは増幅およびクローニングによって）陽性細胞から回収する。陽性細胞は、所望のリガンドまたはリガンドの混合物に対する、選択単量体ドメイン（単数または複数）と比較して、改善された結合活性もしくは親和性または改変された特異性を有する多量体を含む。この染色およびソーティングのプロセスは、（例えば、所望の富化レベルが達成されるまで、所望のリガンドの濃度を徐々に減少させながら）何回も繰り返すことができる。あるいは、所望のリガンドまたはリガンドの混合物に結合する細胞を特定するために用いることができる当該技術分野では公知の任意のスクリーニングまたは検出法を利用することができる。
【０３５５】
細胞に結合する所望のリガンドまたはリガンドの混合物から回収された、選択多量体をコードしている遺伝子は、本明細書にまたは引用参照文献に記載されている任意の方法に従って、場合によっては組み換えることができる。この多様化ラウンドにおいて生産された組み換え配列を、その後、同じまたは別の方法によってスクリーニングして、所望のリガンドまたはターゲットリガンドに対する改善された結合活性もしくは親和性または改変された特異性を有する組み換え遺伝子を特定する。場合によっては、所望の結合活性もしくは親和性または改変された特異性が達成されるまでこの多様化および選択プロセスを繰り返す。
【０３５６】
実施例２
この実施例は、より大きな多様性のライブラリーを生じさせるためのインビボタンパク質内組み換えを説明するものである。
【０３５７】
オーソログ遺伝子ｌｏｘＰ部位に隣接した、単量体をコードしているプラスミドベクター（ｐＣＫ由来のベクター；下記参照）を、ファージベクターを用いて、その適合性ｌｏｘＰ部位を介して、Ｃｒｅ依存的様式で組み換えた。それらの組み換えファージベクターを、その組み換え構築物に特異的なプライマーを使用してＰＣＲによって検出した。ＤＮＡ塩基配列決定は、正しい組み換え産物が作製されたことを示した。
【０３５８】
試薬および実験手順
ｐＣＫ−ｃｒｅ−ｌｏｘ−単量体−ｌｏｘＰ。このベクターは、２つの特に適切な特徴を有する。第一に、これは、Ｐｌａｃの制御下の、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼＣｒｅをコードしている、ｃｒｅ遺伝子を有する。Ｃｒｅは、そのＰＣＲ産物の末端にＸｂａＩ（５’）およびＳｆｉＩ（３’）を組み込むｃｒｅ特異的プライマーで（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓからの）ｐ７０５−ｃｒｅからＰＣＲ増幅させた。この産物をＸｂａＩおよびＳｆｉＩで消化し、ｐＣＫの同一部位、ｂｌａ−、ｐＣＫ１１０９１９−ＨＣ−ＢｌａのＣｍＲ誘導体（ｐＡＣＹＣ  ｏｒｉ）、にクローニングして、ｐＣＫ−ｃｒｅを生じさせた。
【０３５９】
第二の特徴は、Ｃｒｅによって触媒される部位特異的ＤＮＡ組み換えに必要な２つのオーソログｌｏｘＰ部位、ｌｏｘＰ（野生型）およびｌｏｘＰ（ＦＡＳ）、に隣接したナイーブＡドメインライブラリーである。例えば、Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．Ｗ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５０５：４６７−４７３（２００１）参照。これらの部位が互いに組み換わることは滅多にない。ｌｏｘＰ部位を逐次的にｐＣＫ−ｃｒｅに組み込んだ。ｌｏｘＰ（ＷＴ）と消化ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎＤＩＩＩ消化ｐＣＫへのライゲーションを可能にするＥｃｏＲＩおよびＨｉｎＤＩＩＩ−適合性オーバーハングとを有する、５’−リン酸化オリゴヌクレオチドｌｏｘＰ（Ｋ）およびｌｏｘＰ（Ｋ＿ｒｃ）を互いにハイブリダイズし、標準的なライゲーション反応（Ｔ４リガーゼ；１６Ｃで一晩）でｐＣＫ−ｃｒｅにライゲートした。
【０３６０】
得られたプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩで消化し、ｌｏｘＰ（ＦＡＳ）ならびにＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩ−適合性オーバーハングを有する、ハイブリダイズされた５’−リン酸化オリゴｌｏｘＰ（Ｌ）およびｌｏｘＰ（Ｌ＿ｒｃ）にライゲートした。ライブラリー構築物を作成するために、ｐＣＫ−ｃｒｅ−ｌｏｘ−Ｐ（ｗｔ）−ｌｏｘＰ（ＦＡＳ）の大規模精製（Ｑｉａｇｅｎ  ＭＡＸＩ  ｐｒｅｐ）をＱｉａｇｅｎのプロトコルに従って行った。そのＱｉａｇｅｎ精製プラスミドを、さらなる精製のためにＣｓＣｌ勾配遠心に付した。その後、この構築物をＳｐｈＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、消化されたナイーブＡドメインライブラリーインサート（これは、既存のＡドメインライブラリープールのＰＣＲ増幅によって得た）にライゲートした。設計により、ｌｏｘＰ部位および単量体は、イン・フレームになり、それによって、ｌｏｘＰをコードしているリンカーを有する単量体が生じる。このライブラリーは、下で詳述するインビボ組み換え手順で用いることができる。
【０３６１】
ｆＵＳＥ５ＨＡ−単量体−ｌｏｘ−ｌｏｘベクター。このベクターは、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｓｉｔｈの研究室（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）からのｆＵＳＥ５の誘導体である。その後、免疫検出アッセイのためにＨＡタグを有するようにそれを修飾した。ｌｏｘＰ部位を逐次的にｆＵＳＥ５ＨＡに組み込んだ。ｌｏｘＰ（ＷＴ）、一連の停止コドンならびにＸｍａＩおよびＳｆｉＩ−適合性オーバーハングを有する、５’−リン酸化オリゴヌクレオチドｌｏｘＰ（Ｉ）およびｌｏｘＰ（Ｉ）＿ｒｃを互いにハイブリダイズし、ＸｍａＩおよびＳｆｉＩで消化されたｆＵＳＥ５ＨＡに、標準的なライゲーション反応（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｔ４リガーゼ；１６Ｃで一晩）でライゲートした。
【０３６２】
次に、その得られたファージベクターをＸｍａＩおよびＳｐｈＩで消化し、ハイブリダイズされたオリゴｌｏｘＰ（Ｊ）およびｌｏｘＰ（Ｊ）＿ｒｃ（これらは、ｌｏｘＰ（ＦＡＳ）、ならびにＸｍａＩおよびＳｐｈＩと適合性のオーバーハングを有する）にライゲートした。この構築物をＸｍａＩ／ＳｆｉＩで消化し、その後、事前に切断された（Ｘｍａｌ／ＳｆｉＩ）ナイーブＡドメインライブラリーインサート（ＰＣＲ産物）にライゲートした。停止コドンは、ｌｏｘＰ部位の間に位置し、それによって、ｇＩＩＩの発現が防止され、その結果として感染性ファージの生産が防止される。
【０３６３】
その後、そのライゲートされたベクター／ライブラリーを、下で詳述するようなｆＵＳＥ５ＨＡ−単量体−ｌｏｘ−ｌｏｘファージのレスキューを可能にするｇＩＩＩ発現プラスミドを有する大腸菌宿主に形質転換する。
【０３６４】
ｐＣＫ−ｇＩＩＩ。このプラスミドは、そのネイティブのプロモーターの制御下のｇＩＩＩを有する。これは、プライマーｇＩＩＩＰｒｏｍｏｔｅｒ＿ＥｃｏＲＩおよびｇＩＩＩＰｒｏｍｏｔｅｒ＿ＨｉｎＤＩＩＩでのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのｇＩＩＩおよびそのプロモーターのＰＣＲ増幅によって構築した。この産物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎＤＩＩＩで消化し、ｐＣＫ１１０９１９−ＨＣ−Ｂｌａの同じ部位にクローニングした。ｇＩＩＩはその固有のプロモーターの制御下にあるので、ｇＩＩＩ発現は、おそらく構成的である。ｐＣＫ−ｇＩＩＩを大腸菌ＥＣ１００（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）に形質転換した。
【０３６５】
インビボ組み換え手順。要約すると、この手順は、次の基本段階を含む：ａ）プラスミドからの大腸菌宿主発現ｇＩＩＩでのｆＵＳＥ５ＨＡ−単量体−ｌｏｘ−ｌｏｘライブラリーの感染的生産（すなわち、レスキュー）；ｂ）第二ライブラリー（ｐＣＫ）のクローニングおよびＦ＋ＴＧ１大腸菌への形質転換；ｃ）レスキューされたｆＵＳＥ５ＨＡ−単量体−ｌｏｘ−ｌｏｘファージライブラリーでの、第二ライブラリーを有する培養物の感染。
【０３６６】
ａ．ファージベクターのレスキュー。ｐＣＫ−ｇＩＩＩを有するエレクトロコンピテント細胞を標準的なプロトコルによって作製した。これらの細胞は、４ｘ１０８／μｇ  ＤＮＡの形質転換頻度を有し、ならびにｆＵＳＥ５ＨＡ−ｌｏｘ−ｌｏｘベクターとナイーブＡドメインライブラリーインサートの大規模ライゲーション（〜５μｇ  ベクターＤＮＡ）でそれらの細胞をエレクトロポレートした。〜７０μＬ細胞／キュベットでの個々のエレクトロポレーション（１００ｎｇ  ＤＮＡ／エレクトロポレーション）の後、９３０μＬの温かいＳＯＣ培地を添加し、それらの細胞を、３７Ｃで１時間、振盪しながら回復させた。次に、テトラサイクリンを０．２μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加し、それらの細胞を〜４５分間、３７Ｃで振盪した。この培養物のアリコートを取り出し、１０倍系列希釈し、プレーティングして、得られたライブラリーサイズ（１．８ｘ１０７）を判定した。残りの培養物を２ｘ５００ｍＬの２ｘＹＴ（ｐＣＫ−ｇＩＩＩおよびｆＵＳＥ５ＨＡ系ベクターについて選択するためにそれぞれ２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールおよび２０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有）で希釈し、３０Ｃで一晩、増殖させた。
【０３６７】
レスキューされたファージを、標準的なＰＥＧ／ＮａＣｌ沈降プロトコルを用いて回収した。力価は、約１ｘ１０１２形質導入単位／ｍＬであった。
【０３６８】
ｂ．第二ライブラリーのクローニングおよび大腸菌宿主への形質転換。ライゲートされたｐＣＫ／ナイーブＡドメインライブラリーを、約１０８の予想ライブラリーサイズを有する細菌Ｆ＋宿主にエレクトロポレートした。振盪を伴う３７Ｃでの１時間の長い回復期間の後、エレクトロポレートされた細胞を２ｘＹＴ（加えて、２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール）で、ＯＤ６００  〜０．０５に希釈し、３７Ｃで対数増殖期中期まで増殖させ、その後、ｆＵＳＥＨＡ−単量体−ｌｏｘ−ｌｏｘによって感染させた。
【０３６９】
ｃ．レスキューされたｆＵＳＥ５ＨＡ−単量体−ｌｏｘ−ｌｏｘファージライブラリーでの第二ライブラリーを有する培養物の感染。組み換え体の作製を最大にするためには、培養物中の大腸菌の高い感染率（＞５０％）が望ましい。大腸菌の感染力は、Ｆ線毛の発現および増殖条件を含む多数の要因に依存する。大腸菌バックグラウンドＴＧ１（Ｆ’を保有）およびＫ９１（Ｈｆｒ株）は、組み換え系のための宿主である。
【０３７０】
【化７８】
2009501517.tif 000070
実施例３
この実施例は、ＥＧＦ系単量体ライブラリーの構築を説明するものである。
【０３７１】
ＣａＥＧＦドメインライブラリー、Ｅ３、は、次のパターン：
【０３７２】
【化７９】
2009501517.tif 000071
を有するアミノ酸数３６〜４３のタンパク質ドメインをコードしている。
【０３７３】
下の表（配列番号３９１〜４２０）は、ヒトカルシウム結合性ＥＧＦドメインの天然の多様性に基づくライブラリーにおけるアミノ酸がコードされている各々の位置について説明するものである：
【０３７４】
【化８０】
2009501517.tif 000072
単量体カルシウム結合性ＥＧＦドメインをコードしているＤＮＡ配列のライブラリー、Ｅ３、は、Ｓｔｅｍｍｅｒら、Ｇｅｎｅ  １６４：４９−５３（１９９５）に記載されているようなアセンブリＰＣＲによって作製した。このＰＣＲ反応において使用したオリゴヌクレオチドは、２つのグループ、１および２の中のものである。それらは：
【０３７５】
【化８１】
2009501517.tif 000073
グループ１および２のオリゴヌクレオチドの独立したＰＣＲの後、グループ１のＰＣＲフラグメントをＢｐｍＩで消化し、グループ２のＰＣＲフラグメントをＢｓｒＤＩで消化した。消化産物を、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋカラムを使用して精製し、その後、互いにライゲートした。その後、そのライゲートされたＤＮＡを、２つのプライマーを使用してＰＣＲで増幅した。これらは：
【０３７６】
【化８２】
2009501517.tif 000074
であった。
【０３７７】
それらのＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋカラムで精製し、ＳｆｉＩで消化した。その消化産物をＱｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋカラムで精製した。それらのＤＮＡフラグメントを、ファージディスプレイベクターｆｕｓｅ５−ＨＡ（Ｇ４Ｓ）４［イン・フレームＨＡ−エピトープおよび柔軟なグリシン、セリンリンカーを有するｆｕｓｅ５の誘導体］のＳｆｉＩ制限部位にライゲートした。そのライゲーション混合物を、ＴｒａｎｓｆｏｒＭａｘ（商標）ＥＣ１００（商標）エレクトロコンピテント大腸菌細胞にエレクトロポレートした。形質転換された大腸菌細胞を、２０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有する２ｘＹＴ培地中、３７℃で一晩増殖させた。得られたライブラリーは、２Ｘ１０９の独立したクローンを含有した。ＰＥＧ沈降法により、培養基からファージ粒子を精製した。そのファージの力価は、１．３Ｘ１０１２／ｍＬであった。２４の個々のクローンの配列を決定し、これらは、ライブラリー設計と一致した。
【０３７８】
実施例４
この実施例は、ＥＧＦ系単量体ライブラリーの構築を説明するものである。
【０３７９】
ドメイン内最適化のために組み換えを用いることができる。例えば、互いに関連している単一ドメインの２つ以上のセグメントを組み換えるＰＣＲオーバーラップ反応を用いることができる。説明したのと同じ方法で２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のフラグメントオーバーラップ反応を用いることができる。この組み換えプロセスには多くの応用がある。１つの応用は、事前に選択された数百のクローンの大きなプールの、配列情報なしでの組み換えである。各々のオーバーラップが作用するために必要なのは、各々のクローン内の同じ位置に存在する（比較的）定常な配列の１つの既知領域だけである（固定部位アプローチ）。Ａドメインについては、一般に、これらのクローンは、５つすべてのシステイン間セグメントにわたって分布している２０〜２５個のアミノ酸がランダム化されたライブラリーから誘導されたものであろう。ドメイン内組み換え法は、ランダムフラグメンテーションに基づく標準的なＤＮＡ組み換え（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１（１９９４））、および組み換えるべきすべてのクローン内に固定オーバーラップ部位を必要としないＤＮＡ配列相同性に基づく組立てにより、配列に関連がある単量体ドメインのプールに対して行うこともできる。
【０３８０】
このプロセスのもう１つの応用は、多数の独立したナイーブ（パンニングされていないことを意味する）ライブラリーを作成し、これらの各々におけるシステイン間ループのうちの１つだけをランダム化して、各ライブラリーにおける異なるループをランダム化することである。ターゲットに対して個別にこれらのライブラリーをパンニングした後、選択されたクローンを組み換える。パンニングされた各ライブラリーから、ランダム化されたセグメントのみをＰＣＲによって増幅し、その後、多数のランダム化セグメントを組み合わせて１つのドメインの形にし、シャッフリングされたライブラリーを作り、それを増大した効力についてパンニングおよび／またはスクリーニングする。このプロセスは、配列が判っている少数のクローンをシャッフリングするために用いることもできる。
【０３８１】
いずれの共通配列をクロスオーバー点として用いてもよい。Ａドメインまたは他のシステイン含有単量体については、システイン残基がクロスオーバーのための理論位置である。しかし、コンピューターモデリングなど、最適なクロスオーバー部位を決定するため方法は他にもある。あるいは、最高エントロピーを有する残基、または最小数の分子内接触も、クロスオーバーに良好な部位であり得る。
【０３８２】
ランダム化されたシステイン間ループを有するタンパク質から成るライブラリーを作成する例示的方法を下に提供する。この例では、上で説明した別個のループ、別個のライブラリーアプローチとは対照的に、多数のシステイン間ループを同じライブラリー内で同時にランダム化する。
【０３８３】
次のパターンを有するアミノ酸数３９〜４５のタンパク質ドメインをコードしているＡドメインＮＮＫライブラリーを構築した：
【０３８４】
【化８３】
2009501517.tif 000075
この場合、
Ｃ１〜Ｃ６：システイン；
Ｘ（ｎ）：各位置に任意の残基を有するｎ個のアミノ酸の配列；
Ｅ１〜Ｅ３：グルタミン；
Ｆ：フェニルアラニン；
Ｒ１〜Ｒ２：アルギニン；
Ａ：アラニン；
Ｇ１〜Ｇ４：グリシン；
Ｉ：イソロイシン；
Ｐ：プロリン；
Ｓ１〜Ｓ３：セリン；
Ｗ：トリプトファン；
Ｖ：バリン；
Ｄ１〜Ｄ５：アスパラギン酸；および
Ｃ１−Ｃ３、Ｃ２−Ｃ５およびＣ４−Ｃ６は、ジスルフィドを形成する。
【０３８５】
このライブラリーは、Ｓｔｅｍｍｅｒら、Ｇｅｎｅ  １６４：４９−５３（１９９５）に記載されているようなアセンブリＰＣＲにより、チロシンコドン（ＴＡＴ）または可変非保存コドン（ＮＮＫ）を含有するＤＮＡ配列のライブラリーを作製することによって構築した。ネイティブＡドメイン足場、およびライブラリーＡ１を構築するために用いた設計（前に記載したもの）と比較して、このアプローチは、１）これらの潜在的に重要な残基をランダム化するのではなく、より多くの既存残基を適所に保持し、ならびに２）システイン間残基の平均数を天然ＡドメインまたはＡ１ライブラリーのものを超えて延長するように、全２０のアミノ酸の可変長のアミノ酸の列（ＮＮＫコドン）を挿入する。おそらく、チロシンが成すことができる非常に多数の異なる接触のため、チロシンは、抗体結合部位で過剰に提示されることが判明したので、オリゴヌクレオチドにチロシンコドンを含めることによりチロシン残基の比率を増加させた。このＰＣＲ反応に用いられるオリゴヌクレオチドは、（配列番号４６０〜４８６）：
【０３８６】
【化８４】
2009501517.tif 000076
このライブラリーは、各プールが４００ｐｍｏｌのＤＮＡを含有するオリゴヌクレオチドの４つのプールの混合物を使用する、１０サイクルのＰＣＲ増幅の初期ラウンドによって構築した。プール１は、オリゴヌクレオチド１〜９を含有し、プール２は、１０〜１７を含有し、プール３は、１８のみを含有し、およびプール４は、１９〜２７を含有した。プール１および４を使用する追加の８サイクルのＰＣＲによって、完全に組み立てられたライブラリーを得た。ライブラリーフラグメントをＸｍａＩおよびＳｆｉＩで消化した。ＤＮＡフラグメントを、ファージディスプレイベクターｆｕｓｅ５−ＨＡ（イン・フレームＨＡ−エピトープを有するｆｕｓｅ５の誘導体）の対応する制限部位にライゲートした。そのライゲーション混合物を、ＴｒａｎｓｆｏｒＭａｘ（商標）ＥＣ１００（商標）エレクトロコンピテント大腸菌細胞にエレクトロポレートして、２Ｘ１０９の個々のクローンのライブラリーを生じさせた。形質転換された大腸菌細胞を、２０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有する２ｘＹＴ培地中、３７℃で一晩、増殖させた。ＰＥＧ沈降によってその培養基からファージ粒子を精製し、１．１Ｘ１０１３／ｍＬの力価を決定した。２４のクローンの配列を判定し、それらはこのライブバリー設計の期待値と一致した。
【０３８７】
実施例５
この実施例は、単量体および／またはターゲットへの結合のためのリンカーを最適化することによる多量体の最適化を説明するものである。
【０３８８】
ターゲットへの多量体の結合を最適化する１つのアプローチは、単量体、多量体およびリンカーの最適化を含む。先ず、単量体のライブラリーを、ターゲット（例えば、ＩＬ−６）への結合についてパンニングする。しかし、一部の単量体は、互いにはるかに離れているターゲット上の位置で結合することができるので、これらの部位に結合するドメインをリンカーペプチドによって接続する必要はない。従って、単量体の最適化前に、これらの単量体からのホモまたはヘテロ三量体の大きなライブラリーを作り、スクリーニングすることは、有用である。これらの三量体ライブラリーは例えばファージを用いて、スクリーニングすることができ、（一般には、単量体の大きなプールから作られたヘテロ三量体の場合）、または別々に作製しアッセイすることができる（例えば、ホモ三量体の場合）。この方法によって、最良の三量体が特定される。これらのアッセイは、ターゲットへの結合アッセイ、または機能的タンパク質もしくは細胞ベースのアッセイでの多量体の作動薬もしくは拮抗薬効力判定を含むことがある。
【０３８９】
その後、第二段階として、単一の最良三量体の単量体ドメインを最適化する。ヘテロ多量体も合成できるが、ホモ多量体は、１つのドメイン配列しか存在しないので、最適化が最も容易である。ホモ多量体については、単量体と比較した多量体による結合の増加が、結合活性効果である。
【０３９０】
ドメイン配列それ自体の最適化（例えば、組み換えまたはＮＮＫランダム化による）およびファージパンニングの後、それらの改善された単量体を使用して、二量体とリンカーライブラリーを構築する。リンカーライブラリーは、例えば、ＮＮＫ組成および／または可変配列長を有するリンカーから、形成することができる。
【０３９１】
このリンカーライブラリーのパンニング後、最良のクローン（例えば、阻害に関する効力または他の機能的アッセイによって判定される）を、多数（例えば、２、３、４、５、６、７、８など）の配列が最適化されたドメインと長さおよび配列が最適化されたリンカーとから成る多量体に転化させる。
【０３９２】
実施例６
この実施例は、Ａドメインの構造分析を説明するものである。
【０３９３】
事実上すべてのタンパク質と同じように、Ａ−ドメインの全表面のうちの小部分だけが、単一ターゲットへの結合に関与する。このドメインの溶解構造に基づき、所与のターゲットへの結合に協力できる可能性が高い隣接残基位置を特定することができる。この場合、隣接残基のこうしたグループを構造的カテゴリーと呼ぶ。一例として、４つのこうしたカテゴリーを、Ａ−ドメイン構造の試験を通して特定した（Ｔｏｐ、Ｂｏｔｔｏｍ、Ｌｏｏｐ  １およびＬｏｏｐ  ２と呼ぶ）。所与のカテゴリー内の多様性のみを許すライブラリーを設計することにより、ライブラリーによって許される理論配列空間を有意に低減することができ、これにより、物理的ライブラリーによる理論空間の、より良好な有効範囲が得られる。さらに、ＴｏｐおよびＢｏｔｔｏｍカテゴリーなどの非オーバーラップカテゴリーの場合、異なるターゲットに対して選択された半ドメイン配列を組み合わせて、それらの選択ターゲットに同時にまたは代替的に結合することができる単一の配列の形にすることができる。いずれの場合も、ドメインの半分のみを占める結合部位を作ることにより、大きさとしては半分であり、且つ、半分の数の免疫原性エピトープを有する分子を造ることができ、免疫原性のリスクを低減することができる。
【０３９４】
Ａ−ドメイン位置の構造的分類
Ｘとして示す高多様性位置を有するカノニカルＡ−ドメイン配列（配列番号４８７）を下に示す。Ｔｏｐ、Ｂｏｔｔｏｍ、Ｌｏｏｐ  １またはＬｏｏｐ  ２カテゴリーに属する位置は、星で示す。
【０３９５】
【化８５】
2009501517.tif 000077
実施例７
この実施例は、ヒトＩＬ−６に結合する単量体または多量体についてのスクリーニングを説明するものである。
【０３９６】
固体支持体（例えば、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート）上または溶液（例えば、Ｄｙｎａｌストレプトアビジン）中で数ラウンド、ファージライブラリーをパンニングした。（ａ）ＩＬ−６に結合する個々のファージクローンの最高頻度と（ｂ）結合陽性ファージクローン間の高い配列多様性とを有するアウトプットファージプールを、タンパク質スクリーニングのために選択した。
【０３９７】
Ｉ．ラウンド１（ＭａｘｉｓｏｒｐプレートまたはＣｙｎａｌビーズ）
１．ターゲットのコーティング
Ａ．プレートのコーティング：ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２で希釈した１００ｍＬ／ウエルの５μｇ／ｍＬ  ヒトＩＬ−６（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；担体なし）を使用して、６つのウエル／ライブラリーをＩＬ−６で直接被覆した。ビオチン化形のヒトＩＬ−６を使用するときには、プレートを、振盪しながら１時間、室温で、ストレプトアビジンでプレコーティングした。加えて、１つの陰性対照ウエル／ライブラリーをＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２のみでコーティングした。プレコーティングが完了した後、ＩＬ−６（＋ビオチン）を添加し、それらのプレートを１．５時間、室温で振盪しながらインキュベートした。
【０３９８】
Ｂ．ビーズのコーティング：２０μＬのＤｙｎａｌストレプトアビジン（Ｍ−２８０；Ｄｙｎａｌ  ＡＳＡ）を、５００μＬのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２中で、５μｇのビオチン化ＩＬ−６と共にインキュベートし、エッペンドルフ管の中で室温で１時間、回転させた。陰性対照として、ターゲットを伴わない２０μＬのＤｙｎａｌストレプトアビジンを５００μＬのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２中インキュベートし、室温で１時間、回転させた。ターゲットを添加する前にＤｙｎａｌビーズをＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２で少なくとも２回洗浄し、ビーズをばらでコーティングしたことに留意すること。
【０３９９】
２．ブロッキング
Ａ．プレートのブロッキング：コーティング溶液を除去し、ウエルを２００μＬ／ウエルのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２で１回洗浄した。ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２中の２５０μＬ／ウエルの１％  ＢＳＡ（プロテアーゼなし）を添加し、１時間、室温で振盪しながらインキュベートした。代替試薬（例えば、カゼインまたはミルク）をブロッキングに使用することもできる。
【０４００】
Ｂ．ビーズのブロッキング：コーティング溶液を除去し、ビーズをＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２で２回洗浄した。５００μＬの１％  ＢＳＡ（プロテアーゼなし）をＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２に添加し、１時間、室温で回転させた。上で述べたように、代替ブロッキング試薬を使用することもできる。
【０４０１】
３．洗浄
Ａ．プレートの洗浄：２００μＬ／ウエルのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２でウエルを３回洗浄して、過剰なターゲットを除去した。
【０４０２】
Ｂ．ビーズの洗浄：１０００μＬのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２でビーズを３回洗浄して、過剰なターゲットを除去した。各洗浄後、数分間、ビーズを磁石で集めるようにして、ビーズの損失を回避した。
【０４０３】
４．ファージ付加
Ａ．プレートへのファージ付加：約１０００のライブラリー等価物（Ａ１ドメインナイーブファージライブラリー）を、ファージ付加用バッファー（ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２中、１％脱脂粉乳／０．２％  ＢＳＡ（プロテアーゼなし）または他の適するブロッキング剤）に添加し、室温で２時間、振盪しながらインキュベートした。２〜３ランドで、合計１００μＬの回収したファージを、ファージ付加用バッファーで希釈した７つのウエル（６つのターゲット＋１つの陰性対照）に付加させた。
【０４０４】
Ｂ．ビーズへのファージ付加：約１０００のライブラリー等価物（Ａ１ドメインナイーブファージライブラリー）を、ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２中、５００μＬの１％脱脂分有＋１００μＬの１％  ＢＳＡ（プロテアーゼなし）に添加し、室温で２時間、回転させながらインキュベートした。２〜３ラウンドで、合計１００μＬの回収したファージをビーズに付加させた。
【０４０５】
５．洗浄
Ａ．プレートの洗浄：プレートは、１０分間にわたって２００μＬ／ウエルのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０で８から１２回、洗浄した。
【０４０６】
Ｂ．ビーズの洗浄：ビーズは、３０〜４５分間にわたって、８００μＬのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０で８〜１２回、洗浄した。回収したビーズ上に洗浄用バッファーを直接施与することにより、または（攪拌混合によらず）ピペットで吸い上げ、出すことによってビーズの再懸濁を助長した。あるいは、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ装置（Ｔｈｅｒｍｏ  ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ）または等価物を、ビーズ洗浄に使用することもできる。
【０４０７】
ストリンジェント洗浄（任意）の条件
ａ．３７℃で、８００μＬのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０；
ｂ．室温で、８００μＬのＴＢＳ［４５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０；
ｃ．ビーズを通常は６〜８回洗浄し、その後、１μｇの非標識ＩＬ−６を１時間、室温または３７℃で付加させた。この洗浄後に結合したままであったファージを溶離／感染用に確保した；
ｄ．１％ミルク／０．２％  ＢＳＡ／１ｍＭ  尿素を伴うまたは伴わない／３７℃（高ストリンジェンシー）。
【０４０８】
６．競合（任意）：
Ａ．プレートに関する競合：ファージを、室温で１時間、ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２中、１００μＬ／ウエルの２０μｇ／ｍＬ（２μｇ／ウエル）のｓＩＬ−６Ｒ＋７．５ｕｇ  ｇｐ１３０と共に、振盪しながらインキュベートした。ｓＩＬ−６Ｒ／ｇｐ１３０溶離物を、ＢｌｕｅＫａｎ  Ｋ９１大腸菌の感染用に確保した。
【０４０９】
Ｂ．ビーズに関する競合：ファージを、室温で１時間、５００μＬのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２中、２０μｇのｓＩＬ−６Ｒおよび７５ｕｇのｇｐ１３０と共に、振盪しながらインキュベートした。ｓＩＬ−６Ｒ／ｇｐ１３０溶離物をＢｌｕｅＫａｎ  Ｋ９１大腸菌の感染用に確保した。
【０４１０】
７．ファージの溶離
Ａ．プレートからの溶離：ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２中の１０ｍｇ／ｍＬトリプシン（１００μＬ／ウエル）を添加し、それらのプレートを３７℃で３０分間、振盪しながらインキュベートした。
【０４１１】
Ｂ．ビーズからの溶離：１００μＬの１０ｍｇ／ｍＬ  トリプシン  ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２をビーズに添加し、その後、それらを３７℃（エッペンドルフラック内）で３０分間、振盪しながらインキュベートした。
【０４１２】
Ｃ．代替溶離／感染：ＯＤ６００  〜０．５で２００μＬの対数増殖期ＢｌｕｅＫａｎ  Ｋ９１大腸菌細胞を、（プレートについては）各ウエルに、または吸引したビーズに、添加した。振盪することなく、３０分間、３７℃で、感染を進行させた。次に、その２００μＬ容量をプールし、〜３ｍＬの２ｘＹＴ／０．２μｇ／ｍＬ  テトラサイクリンに添加し、１５分間、３７℃で振盪した。
【０４１３】
８．感染：（プレートおよびビーズについて同じプロトコル）
適切な容積の対数増殖期ＢｌｕｅＫａｎ  Ｋ９１大腸菌（２ｘＹＴ／４０μｇ／ｍＬ  カナマイシン中）をＯＤ６００  〜０．５から０．６に増殖させた。その培養物がＯＤ６００に達したら、使用前にそれを氷上に配置したが、一般に、この氷上での時間は、最小限にした。
【０４１４】
Ａ．５０ｍＬの滅菌コニカル管内で、溶離ファージを５ｍＬの対数増殖期ＢｌｕｅＫａｎ  Ｋ９１大腸菌培養物と混合し、振盪せずに３７℃で２５分間、インキュベートした。それらの滅菌コニカル管は、通気を助長するためにＡｉｒＰｏｒｅテープ（Ｑｉａｇｅｎ）でカバーした。
【０４１５】
Ｂ．テトラサイクリンを０．２μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加し、１５分間、３７℃で振盪した。
【０４１６】
Ｃ．１０μＬアリコートを力価決定用にサンプリングし、２ｘＹＴで１０倍（１０−１から１０−６）系列希釈し、２ｘＹＴ／２０μｇ／ｍＬ  テトラサイクリンプレート上に８μＬ／希釈スポットでプレーティングし、３０℃または３７℃で一晩、インキュベートした。１０−２〜１０−４希釈の残量をプレーティングして、後のファージＥＬＩＳＡのための個々のコロニーを得た。
【０４１７】
Ｄ．感染した５ｍＬ培養物を５０ｍＬの２ｘＹＴ／２０μｇ／ｍＬ  テトラサイクリンで、〜１０倍希釈し、３０℃で一晩、飽和するまで、振盪しながらインキュベートした。
【０４１８】
９．インプットファージの力価決定を、現行のパンニングラウンドで用いた（プレートおよびビーズについて同じプロトコル）
Ａ．回収したファージの１００倍系列希釈液（１０−２〜１０−１０）を２ｘＹＴで作った。
【０４１９】
Ｂ．ＯＤ６００  ０．５〜０．６で１００μＬ／ウエルの対数増殖期ＢｌｕｅＫａｎ  Ｋ９１大腸菌培養物を９６ウエル・ポリプロピレンプレートの６つのウエルに添加した。
【０４２０】
Ｃ．１００μＬのＢｌｕｅＫａｎ  Ｋ９１大腸菌が入っているウエルに１０μＬの希釈ファージを添加した。
【０４２１】
Ｄ．ファージ／細胞混合物を３７℃で２５分間、振盪せずにインキュベートし、それらのプレートは、通気を可能にするためにＡｉｒＰｏｒｅ（Ｑｉａｇｅｎ）でカバーした。
【０４２２】
Ｅ．テトラサイクリンを０．２μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加し、それらのプレートを１５分間、３７℃で振盪した。
【０４２３】
Ｆ．８μＬの各希釈液（１０−２〜１０−１０）を、乾燥２ｘＹＴ寒天／２０μｇ／ｍＬ  テトラサイクリンプレート上にプレーティングした。
【０４２４】
Ｇ．プレートを３０℃または３７℃で一晩、インキュベートした。
【０４２５】
１０．ファージの回収（プレートおよびビーズについて同じプロトコル）
Ａ．一晩培養したものを、使い捨て５０ｍＬ管で、２５分間、７０００ｒｐｍで遠心分離して、細胞をペレット化した。
【０４２６】
Ｂ．１／５容量の２０％  ＰＥＧ／１５％  ＮａＣｌストックを培養上清に添加することにより、標準的なＰＥＧ／ＮａＣｌファージ沈降手順を行った。それを、繰り返し転倒させ、４５分から１時間、氷上でインキュベートすることによって、十分に混合した。
【０４２７】
Ｃ．その培養物を７０００ｒｐｍで４０分間、遠心分離して、ファージをペレット化し、上清を廃棄した。
【０４２８】
Ｄ．そのファージペレットを１ｍＬのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２に再び懸濁させ、エッペンドルフ管に移し、１３Ｋ  ｒｐｍで少なくとも２分間、遠心分離して、不溶物質をペレット化した。
【０４２９】
Ｅ．上清を新たな管に移し、１／５容量のＰＥＧ／ＮａＣｌを添加し、混合し、氷上で〜５分間、インキュベートした。
【０４３０】
Ｆ．その後、その混合物を１３０００ｒｐｍで少なくとも２分間、遠心分離し、上清を廃棄した。ペレット化され、精製されたファージを１ｍＬ以下のＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２に再び懸濁させ、４℃で保管した。
【０４３１】
ＩＩ．ラウンド２およびラウンド３パンニング
第二および第三ラウンドパンニング条件は、上で説明したラウンド１と、一般に、同じであったが、コーティングされたターゲット（すなわち、ＩＬ−６）の量を後続のラウンド各々について２から４倍減少させ、後続の各パンニングラウンドではプレート（またはビーズ）を２〜４回追加で洗浄した。
【０４３２】
ＩＩＩ．任意のドメイン内組み換え
ファージディスプレイで選択されたファージのプール内の単量体配列を次の手順で組み換えた。このプロセスは、所与のプール（単数または複数）内の出発単量体コレクションの半々の混合物に由来するハイブリッド単量体を生じさせる。Ａ１−ドメインに基づくファージライブラリーについては、プライマーペアＳＨＦ１（ＡＴＴＡＴＧＣＣＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＴＣ；配列番号４８８）／ＳＨＢオーバーラップ（ＣＧＣＣＧＴＣＧＣＡＡ；配列番号４８９）およびＳＨＦオーバーラップ（ＴＴＧＣＧＡＣＧＧＣＧ；配列番号４９０）／Ｂ３（ＴＣＧＧＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＡＴＧ；配列番号４９１）を使用して、前記の単量体の半分２つをＰＣＲ増幅した。前記２つの半分をＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）で互いに融合させた。次に、融合されたハイブリッドのコーディング配列を、プライマーＳＨＦ２（ＣＣＧＧＡＴＴＡＴＧＣＣＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＡ；配列番号４９２）およびＳＨＢ４（ＡＡＣＡＧＴＴＴＣＧＧＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣ；配列番号４９３）によって増幅した。精製されたＰＣＲ産物をＳｆｉＩ（ＮＥＢ）によって消化し、ＳｆｉＩ消化ｆＵＳＥ５ＨＡファージベクターとライゲートして、組み換えられた単量体ライブラリーを作製した。組み換えられたライブラリーをＩＬ−６に対して少なくともさらに２ラウンド、パンニングし、下で説明するようにスクリーニングした。組み換えられた単量体の特性付けからのデータは、表１および２にある。
【０４３３】
ＩＶ．パンニングアウトプットの分析（プレートおよびビーズについて同じプロトコル）
ファージＥＬＩＳＡ：分析すべき各アウトプット「ファージプール」について（適用可能な場合、一般にはラウンド２、３および４）、独立したクローンを、Ｃｏｓｔａｒ  ９６ウエル・ポリプロピレン製ディープウエル型プレート内で増殖させた１ｍＬ（２ｘＹＴ／２０μｇ／ｍＬ  テトラサイクリン）培養物に接種した。接種用チップを中に入れたままにして、プレートを一晩、３７℃で振盪した。３６００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって細胞をペレット化した。培養上清を確保し、下で説明するとおりＥＬＩＳＡを行った。
【０４３４】
非ビオチン化ＩＬ−６（０．１μｇ／ウエル）をＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに直接コーティングした。しかし、ビオチン化ＩＬ−６、９６ウエルＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートは、ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２で希釈した、５０μＬ／ウエルの５０μｇ／ｍＬ（２．５μｇ／ウエル）ストレプトアビジンで、先ず、コーティングした。それらのプレートを３７℃で１時間、振盪しながらインキュベートした。プレートを２００μＬ／ウエルのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２で３回洗浄した。ウエルを２００μＬ／ウエルの１％  ＢＳＡ（フラクションＶ）でブロックし、カバーをしたプレートを室温で１時間、振盪しながらインキュベートした。そのプレートをＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２で３回洗浄した。次に、９６ウエルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを、ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２で希釈した１００μＬ／ウエルの１μｇ／ｍＬ（０．１μｇ／ウエル）ビオチン化ＩＬ−６または１００μＬ／ウエルのバッファーのみ（陰性対照）でコーティングした。プレートを室温で１時間、振盪しながらインキュベートした。プレートをＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２で３回洗浄した。次に、３０μＬの各ファージ上清を、７０μＬの１％ミルク／０．２％  ＢＳＡ／ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０の存在下で、ウエルに添加する。カバーをしたプレートを、室温で１．５時間、振盪しながらインキュベートした。
【０４３５】
プレートをＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄した。次に、ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２＋０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０で１：５０００希釈した１００μＬ／ウエルのα−Ｍ１３−ＨＲＰモノクローナル抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を添加した。プレートを４℃で１時間、振盪しながらインキュベートした。プレートを冷ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。１：１希釈した１００μＬ／ウエルのＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２混合物（Ｐｉｅｒｃｅ）をＥＬＩＳＡ発色のために添加した。
【０４３６】
最強ＯＤ６５０シグナルが〜１．０に達するまで反応物が青色になるようにした。１００μＬ／ウエルの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、陽性ウエルは、青色から黄色に色が変化した。反応を停止させたら、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアを使用してＥＬＩＳＡプレートリーダーでそれをＯＤ４５０で読み取った。
【０４３７】
ファージＥＬＩＳＡ陽性のファージプールは、それらが（ａ）ｈＩＬ−６に結合する個々のファージクローンの高い頻度および（ｂ）結合陽性ファージクローン間の高い配列多様性を有した場合、発現ベクターへのサブクローニング用に選択した。これらの基準を満たすプールを、下で略述するプロセスでのタンパク質スクリーニング用に選択した。所与のファージプールからの単量体または多量体配列を発現ベクター、ｐＥｖｅ、にサブクローニングするために、約１０８〜１０１０のファージを、次のような２５サイクルのＰＣＲによって増幅した：
ＰＣＲレシピ
０．５〜１μＬ  精製ファージ
５μＬ  １０Ｘ  バッファー
８μＬ  ２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ
５μＬ  １０ｕＭ  ＶＳ−Ｆｏｒプライマー（５’−ＡＴＣＡＴＣＴＧＧＣＣＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＡＣＣＣＧＴＡＴＧＡＴＧＴＴＣＣＧＧＡ−３’；配列番号４９４）
５μＬ  １０ｕＭ  ＥｖｅＮｕｔプライマー（５’−ＡＡＡＡＧＧＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＴＣＴＧＣＡＡＴＧＡＣ−３’；配列番号４９５）
２６μＬ  Ｈ２Ｏ
０．５μＬ  ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（１単位）（Ｔａｋａｒａ）
サイクル：２５Ｘ［９４℃／１０秒、−４５℃／３０秒、−７２℃／３０秒］
ＰＣＲ産物を分析のために３％アガロースゲル上で泳動させた。単量体または多量体産物（約２００ｂｐ）をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、Ｓｆｉ  Ｉ（ＮＥＢ）で消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムで再び精製し、その後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を使用してＳｆｉ  Ｉ消化ベクター、ｐＥｖｅ、にライゲートした。そのライゲート産物をエレクトロコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌に形質転換し、４０μｇ／ｍＬのカナマイシンが入っている２ｘＹＴプレートにプレーティングした。一晩、増殖させた後、約６０００の個々のクローンを２ｘＹＴ／カナマイシンに接種し、一晩、増殖させた。陽性および陰性対照もそれらのプレートに含めた。
【０４３８】
Ｖ．１ｍＬ細胞溶解産物中の何千もの単量体タンパク質のスクリーニング
１ｍＬ加熱溶解物のタンパク質生産（第１日）：個々のクローンを、５００μＬ／ウエルの２ｘＹＴ／４０μｇ／ｍＬ  カナマイシンが入っている９６ウエルＣｏｓｔａｒディープウエル型プレートのウエルに接種した。培養物を、３７℃で、３００ｒｐｍで振盪しながら、（ウエルの中に接種用チップを入れたままで）一晩、増殖させた。このプロセスにより、細胞溶解産物レベルで何千もの個々の軽度精製単量体をスクリーニングできた。
【０４３９】
（第２日）１００μＬの一晩、培養したものを、１ｍＬ／ウエルの２ｘＹＴ／４０μｇ／ｍＬ  カナマイシン＋１ｍＭ  ＣａＣｌ２が入っている新たな９６ウエルＣｏｓｔａｒディープウエル型プレートに接種した。（その一晩、培養したものの残りは、２５％最終グリセロール濃度の添加によりアーカイブし、その後、後々の使用のために、−８０℃で保管した。）プレートをＡｉｒＰｏｒｅ  Ｔａｐｅ（Ｑｉａｇｅｎ）でカバーし、培養物を、〜０．８から１．０のＯＤ６００が達成されるまで、３７℃、３７５ｒｐｍで振盪しながら増殖させた。所望のＯＤ６００が達成されたら、３７℃、３７５ｒｐｍで振盪しながら、培養物を１ｍＭのＩＰＴＧで３時間、誘発した。その後、それらの誘発された培養物が入っているプレートを、１５分間、３６００ｒｐｍで、４℃で遠心分離して、細胞をペレット化した。上清を除去し、廃棄し、残存細胞ペレットを、１００μＬのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／１ｍＭ  ＣａＣｌ２に再び懸濁させた。再び懸濁させた細胞を９６ウエル・ディープウエル型プレートから９５ウエル・ポリプロピレンＰＣＲプレートに移し、ＰＣＲ機において５分間、６５℃で加熱した。その後、それらの加熱された／溶解された細胞を、１５分間、３６００ｒｐｍで、４℃で遠心分離した。遠心分離後、タンパク質生産は完了し、タンパク質溶解物は、結合ＥＬＩＳＡおよび／または競合ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイによる一次スクリーニングでの特性付けの準備が整った。
【０４４０】
ＩＬ−６タンパク質ＥＬＩＳＡ：９６ウエルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを、ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／１ｍＭ  ＣａＣｌ２で希釈した１００μＬ／ウエルの１μｇ／ｍＬ（０．１μｇ／ウエル）ＩＬ−６（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングし、それらのプレートを４℃で一晩、または室温（ＲＴ）で１．５時間、振盪しながらインキュベートした。ウエルをからにし、その後、２００μＬ／ウエルの１％  ＢＳＡ（フラクションＶ）／ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／１ｍＭ  ＣａＣｌ２でブロックした。カバーをしたプレートを室温で１時間、振盪しながらインキュベートした。そのプレートをＴＢＳ［ｐＨ７．５］／１ｍＭ  ＣａＣｌ２で３回、洗浄した。１ｍＬの溶解産物調製試料からのタンパク質を、それらのウエルに、ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／１ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．１％  ＢＳＡ／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０で１：１０希釈した単点濃度として、ウエル当たり１００μＬの最終量まで添加した。カバーをしたプレートを室温で１．５時間、振盪しながらインキュベートした。そのプレートをＴＢＳ［ｐＨ７．５］／１ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０で３回、洗浄した。ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／１ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．１％  ＢＳＡ／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０で１：２０００希釈した１００μＬ／ウエルの抗ＨＡ−ＨＲＰ検出抗体（Ｒｏｃｈｅ）を添加した。カバーをしたプレートを室温で１時間、振盪しながらインキュベートした。そのプレートを、ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／１ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０で３回、洗浄した。１：１希釈した１００μＬ／ウエルのＴＭＢ／Ｈ２ＳＯ４混合物を添加した。最強シグナルのＯＤ６５０が〜１．０に達するまで、色が青色になるようにした。１００μＬ／ウエルの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４でその反応を停止させた。停止させたら、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いてプレートをＯＤ４５０で読み取った。
【０４４１】
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ  ＩＬ−６／Ｆｃビオチン化（ｂｎ）ＩＬ−６均質競合アッセイ：すべてのアッセイ成分をＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ  Ｂｕｆｆｅｒ：ＮａＯＨを伴う４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％  ＢＳＡ（ｗ／ｖ）、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、で希釈した。白色、３８４ウエル、換算容量、Ｇｒｅｉｎｅｒマイクロタイターアッセイプレートへの３回の添加を行ったが、添加と添加の間にインキュベーション時間はなかった。第一に、単量体または非標識組み換えヒトＩＬ−６（ｒｈＩＬ−６、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（陽性対照として）をそのプレートに４μＬ／ウエルで添加した。１ｍＬの加熱溶解調製試料からの単量体をそれらのウエルに単一濃度（未希釈［すなわち、１：４の最終アッセイ希釈］または１：１００以下の希釈［１：４００の最終アッセイ希釈］のいずれか）で添加した。陽性対照として、単量体タンパク質の代わりに、４μＬ／ウエルの非標識ｒｈＩＬ−６を、１２点濃度曲線が４００ｎＭで始まり（すなわち、１００ｎＭの最終アッセイ濃度）、そしてその後１：４系列希釈、その後、バッファーのみの場合の最終点を有するように、そのプレートに添加した。第二に、２ｕＬ／ウエルのｂｎ−ｒｈＩＬ−６を１ｎＭ（すなわち、０．２５ｎＭの最終アッセイ濃度）をそのプレートに添加した。このアッセイの残りの部分は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎビーズが感光性であるので、やわらかな光または緑色を除いた光の中で行ったことに留意すること。第三に、２８ｎＭ（７ｎＭの最終濃度）のＩＬ−６Ｒと、１．６ｎＭ（０．４ｎＭの最終濃度）のｇｐ１３０Ｆｃと、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎストレプトアビジン「ドナービーズ」およびプロテインＡ「アクセプタービーズ」（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）（両方とも、４０μｇ／ｍＬに希釈したもの（すなわち、１０μｇ／ｍＬの最終濃度））との、２μＬ／ウエルの混合物を、そのプレートに添加した。その後、そのアッセイプレートをトップシールでカバーし、〜３０秒間、８００ｒｐｍでスピンダウンした。その後、そのプレートを暗所、室温で、一晩、インキュベートし、翌日、Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｌａｔｅリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で読み取った。
【０４４２】
ＶＩ．ファージディスプレイで選択された単量体の多量体化および組み換え
ｐＥｖｅにサブクローニングした単量体（ｐＥｖｅ／単量体）を次の様式で多量体化した。ｐＥｖｅ／単量体プラスミド（個々にまたはプールで）をＢｓｒＤＩまたはＢｐｍＩ（ＮＥＢ）のいずれかで消化した。〜１．１ｋｂ  ＢｓｒＤＩおよび〜２．９  ＢｐｍＩフラグメントを１％アガロースゲルから単離し、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムで精製した。２つのフラグメントの各々のプールを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を使用してライゲートし、その後、そのライゲート産物をＱｕｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムで精製した。上のファージサブクローニングのセクションで説明したプライマーＶＳ−ＦｏｒおよびＥｖｅＮｕｔを使用して、多量体コーディング配列をそのライゲート産物からＰＣＲ増幅した。それらのＰＣＲ産物を精製し、ＳｆｉＩ（ＮＥＢ）で消化し、その後、ｐＥｖｅとライゲートし、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌に形質転換した。この方法は、出発単量体の種々の組み合わせから成る二量体を作り出した。この方法を用いて、三量体などの他の多量体を作製することもできる。三量体を作製する場合、ｐＥｖｅ／二量体（例えば、上の実施例におけるもの）およびｐＥｖｅ／単量体（出発コレクション）のプールが、出発材料である。それらを上のように処理した。「ウォーキングライブラリー」の作製のための下で説明するものに類似した分子生物学的手順を用いて、多量体を作製することもできる。すべての場合、上のように、タンパク質を発現させ、精製し、スクリーニングした。
【０４４３】
ナイーブモノマーライブラリーの完全提示でのファージディスプレイ選択単量体（すなわち、選択単量体）のライゲーションにより、「ウォーキングライブラリー」と呼ばれるさらなるライブラリーを作製した。これらのライブラリーは、次の様式で構築した。ＰＣＲを用いて、２つの別の反応で増幅させた：ａ）選択単量体のコーディング配列とｐＥＴＦ（ＡＣＣＣＧＴＡＴＧＡＴＧＴＴＣＣＧＧＡＴＴＡ；配列番号４９６）／ｐＥＴＢ２ｒ（ＧＡＴＧＴＡＴＴＣＧＧＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＡＴＧＡＣ；配列番号４９７）；およびｂ）単量体ライブラリー内のナイーブ単量体のコーディング配列と２１ｎｅｗ１（ＧＡＡＡＴＴＣＡＣＣＴＣＧＡＡＡＧＣＡＡ；配列番号４９８）／２３（ＡＴＧＧＧＴＴＣＣＴＡＴＴＧＧＧＣＴ；配列番号４９９）。〜２００ｂｐの産物を３％アガロースゲルから単離し、Ｑｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムで精製した。上の（ａ）および（ｂ）からの各産物を別の反応においてＢｓｒＤＩまたはＢｐｍＩ（ＮＥＢ）のいずれかで消化した。ＢｐｍＩ消化単量体は、ＢｓｒＤＩ消化単量体にライゲートすることができるオーバーハングを有する。精製された消化産物を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を使用して、互いにライゲートした。ＢｓｒＤＩ切断ナイーブ単量体とＢｐｍＩ切断選択単量体のライゲーションは、Ｃ末端選択単量体に融合したＮ末端ナイーブ単量体から成るウォーキング二量体ライブラリーを生じさせる。ＢｐｍＩ切断ナイーブ単量体とＢｓｒＣＩ切断選択単量体のライゲーションは、Ｎ末端選択単量体に融合したＣ末端ナイーブ単量体から成るウォーキング二量体ライブラリーを生じさせる。プライマーｐＥＴＦ／ｐＥＴＢ２ｒを使用して、このライゲーションからのライゲートされた二量体のコーディング配列をＰＣＲ増幅し、それらの精製された産物をＳｆｉＩで消化し、その後、ＸｍａＩで消化した。それらの消化産物は、１０８〜１０９の固有メンバーを一般に有するファージディスプレイ二量体「ウォーキングライブラリー」の作製のために、ファージベクターｆＵＳＥ５ＨＡにライゲートした。三量体（またはより大きな多量体）「ウォーキングライブラリー」は、同様の仕方で作製することができるが、出発材料は、二量体（またはそれより大きいもの）とナイーブモノマーである。ウォーキングライブラリーを、上で説明したように、ＩＬ−６に対してパンニングし、スクリーニングした。
【０４４４】
ＶＩＩ．結合および競合アッセイにおける精製単量体の特性付け
タンパク質を加熱タンパク質溶解物レベルで特性付けしたら、さらなる特性付けに最良のモノマーを選択した。個々のクローンのより大きな規模の培養物を作製し、６ｘＨｉｓ（配列番号３７９）タグを有する単量体を、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂によって精製した。これらのニッケル精製単量体を結合ＥＬＩＳＡおよびＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ競合アッセイでアッセイした。精製単量体の特性付けからのタンパク質配列データおよび生化学的データは、表１および２にある。
タンパク質精製  ＮｉＮＴＡに対して５００ｍＬ培養物：（第１日）３ｍＬの２ｘＹＴ  ＋４０μｇ／ｍＬのカナマイシンが入っている１５ｍＬ培養管に、適切な「一次ヒットウエル」にアーカイブされたグリセロールストックを接種した。培養物を一晩、３００ｒｐｍで、３７℃で振盪した。
（第２日）２ｍＬの一晩、培養したものを、５００ｍＬの２ｘＹＴ＋４０μｇ／ｍＬのカナマイシンが入っている１Ｌエルレンマイヤー振盪フラスコに接種した。培養物を、約０．８〜１．０のＯＤ６００に達するまで、３７５ｒｐｍ、３７℃で振盪しながら増殖させた。所望のＯＤ６００に達したら、３７５ｒｐｍで振盪しながら培養物を１ｍＭの最終濃度のＩＰＴＧで３時間、誘発した。３時間の誘発後、５００ｍＬの培養物を清浄な／オートクレーブ処理したＳｏｒｖａｌｌ管に移し、８分間、８０００ｒｐｍで、４℃で遠心分離して、細胞をペレット化した。
【０４４５】
細胞をペレット化したら、上清を除去し、廃棄し、２０ｍＬの超音波処理用バッファー（１０％スクロース／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ［ｐＨ７．５］／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．２ｍＭ  ＣａＣｌ２）を各管に添加した。そのペレットを、目に見えるクランプがなくなるまで、１０ｍＬ血清ピペットで超音波処理用バッファーに再懸濁させ、その後、その再懸濁細胞（〜３０ｍＬ）を３５ｍＬ  Ｏａｋｒｉｄｇｅ  Ｔｕｂｅに移し、８分間、〜１６電力出力で超音波処理した。超音波処理後、超音波処理された細胞が入っているそれらの温かいＯａｋｒｉｄｇｅ  Ｔｕｂｅを氷／水浴内に、〜１０分間配置して、冷却した。冷却したら、その管を３０分間、１８，０００ｒｐｍで、４℃で遠心分離して、溶解した細胞をペレット化した。
【０４４６】
溶解した細胞が入っている管を遠心分離している間、ＮｉＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で洗浄して、エタノールを除去した。３ｍＬの１：１希釈ＮｉＮＴＡ樹脂／タンパク質を使用した（すなわち、実際には、１．５ｍＬの樹脂／タンパク質を使用した）。３ｍＬの樹脂／水混合物各々を、適切なラベル（タンパク質ＩＤを伴う）を付けた透明な５０ｍＬスクリューキャップ付きの管に添加した。超音波処理細胞をペレット化した後、タンパク質上清を除去し、１．５ｍＬの洗浄したＮｉＮＴＡ樹脂が入っている５０ｍＬ管に添加した。室温で０．５時間、穏やかに揺動させることによって、タンパク質をＮｉＮＴＡ樹脂に結合させた。ＮｉＮＴＡ樹脂とのインキュベーション後、タンパク質に結合したＮｉＮＴＡを伴う５０ｍＬ管を１０分間、〜１５００ｒｐｍで遠心分離した。上清を穏やかに流し出して廃棄した。
【０４４７】
１ｍＬのＮｉＮＴＡ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ［ｐＨ７．５］、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、２０ｍＭイミダゾール）を、樹脂が入っている５０ｍＬ管に添加し、渦攪拌して再び懸濁させ、その後、その混合物を、真空マニホールドに取り付けられたカラムにピペットで移すことによって、ＮｉＮＴＡ樹脂＋結合タンパク質を、適切なラベルを貼った１５ｍＬ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈカラムに移した。ＮｉＮＴＡ樹脂＋結合タンパク質を少なくとも１０カラム容量（１５ｍＬ）のＮｉＮＴＡ洗浄用バッファーで洗浄した。ＮｉＮＴＡ樹脂＋結合し洗浄されたタンパク質が入っている１５ｍＬカラムを、透明な１５ｍＬのスクリューキャップ付き捕集管に移し、４ｍＬのＮｉ溶離用バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ［ｐＨ７．５］、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、２００ｍＭイミダゾール）を各カラムに添加して、その１５ｍＬ捕集管にタンパク質を溶出させた。その後、重力によってそれを溶離した。
【０４４８】
溶離したタンパク質は、カセットに負荷するために１８．５ゲージ針および５ｍＬ注射器を使用して、スライド−Ａ−ライザーカセット（適切なＭＷカットオフ−単量体については、３．５ｋＤａカットオフを用い、二量体および三量体ついては１０ｋＤａカットオフを用いた）に移した。溶離タンパク質が入っているスライド−Ａ−ライザーを、レドックス試薬（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ［ｐＨ７．５］、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２５ｍＭ  ２−ヒドロキシエチルジスルフィド）が入っている透析用バッファー中に一晩、入れておいた。
【０４４９】
（第３日）一晩、透析したタンパク質が入っているスライド−Ａ−ライザーカセットを、レドックスを有さない透析用バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ［ｐＨ７．５］、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）に移した。３時間の透析後、さらに３時間にわたって、スライド−Ａ−ライザーカセットを、レドックスを有さない新たなＴＢＳ／ＣａＣｌ２に移した。第二の透析変更後、１８．５ゲージ針および５ｍＬ注射器を使用して、タンパク質をスライド−Ａ−カセットから取り出し、タンパク質を、適切なラベルを貼った１５ｍＬポリプロピレン管に、０．２マイクロメートルのシリンジフィルターを使用するフィルタリングにより、移した。
Ａｌｐｈａ  Ｓｃｒｅｅｎ競合アッセイにおいて「最良阻害剤」または結合ＥＬＩＳＡにおいて「最良結合因子」として選択された、抗ＩＬ−６  ＮｉＮＴＡ精製タンパク質を、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアニオン交換によってさらに精製して、不純物を除去した。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製：１ｍＬのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ−Ｆｌｏｗ  Ｒｅｓｉｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１５ｍＬ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈカラムに添加した。１５カラム容量（または１５ｍＬ）の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ［ｐＨ７．５］、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２で樹脂を平衡させた。２ｍＬ（〜５ｍｇ）の濾過されたＮｉＮＴＡ精製タンパク質を樹脂に添加し、重力によってタンパク質を樹脂に結合させた。９６ウエルプレートの第一カラムへのフロースルーを回収した。タンパク質を負荷したカラムを１５ｍＬ捕集管に移し、樹脂／結合タンパク質を１０カラム容量（または１０ｍＬ）の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ［ｐＨ７．５］、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２で洗浄した。洗浄したら、タンパク質のＮａＣｌ勾配溶出を開始した。ＮａＣｌ濃度は、次のような勾配で変化させた：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ［ｐＨ７．５］、１ｍＭ  ＣａＣｌ２のベースに対して、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、および最終的に１ＭのＮａＣｌ。画分を１ｍＬ刻みで９６ウエルのディープウエル型ポリプロピレンプレートに回収した−２ｍＬ／画分。タンパク質を含有する画分をＢｒａｄｆｏｒｄによって検査し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析した。次の変更を伴う、上で説明した結合ＥＬＩＳＡおよび競合アッセイで、画分を検査した。５００ｍＬ  ＮｉＮＴＡ精製調製試料またはＮｉＮＴＡ＋Ｑ−セファロース精製調製試料からのタンパク質を、１２点濃度曲線が１：５から１：１００の最初の希釈で始まり、そしてその後１：４系列希釈、その後、バッファーのみの場合の最終点を有するように、そのプレートに添加した。
【０４５０】
ＩＬ−６結合性タンパク質＆二量体
以下は、配列相同性によって特定し、グループ分けしたＩＬ−６結合性単量体の概要を提供するものである。７つのファミリーがあり、同じファミリーのメンバーは、関連した配列を有する。
【０４５１】
この情報は、以下のように要約することができる。角型カッコ（「［］」）内の配列は、単位位置での代替アミノ酸を示す。下のコンセンサス配列は、疑問符（「？」）を含む。これらは、存在する場合もあり、または不在である場合もある位置を示す。
【０４５２】
【化８６】
2009501517.tif 000078
各ＩＬ−６結合性ファミリーの詳細が次に続く。配列（またはダッシュ（「−」））は、単にアラインメントのためのものである。各行は、１つの連続単量体ドメインを表す。
【０４５３】
【化８７】
2009501517.tif 000079
【０４５４】
【化８８】
2009501517.tif 000080
【０４５５】
【化８９】
2009501517.tif 000081
【０４５６】
【化９０】
2009501517.tif 000082
【０４５７】
【化９１】
2009501517.tif 000083
ＩＬ−６結合性二量体は、次のもの（配列番号６２７〜７８１）を含むものだった。二量体は、ファミリーにより系統立てられない。
【０４５８】
【化９２】
2009501517.tif 000084
【０４５９】
【化９３】
2009501517.tif 000085
【０４６０】
【化９４】
2009501517.tif 000086
【０４６１】
【化９５】
2009501517.tif 000087
【０４６２】
【化９６】
2009501517.tif 000088
【０４６３】
【化９７】
2009501517.tif 000089
【０４６４】
【化９８】
2009501517.tif 000090
【０４６５】
【化９９】
2009501517.tif 000091
以下は、関連した配列のファミリーによってリストされたＩＬ−６結合性三量体のリストである。単量体のファミリーメンバーが、三量体のファミリーメンバーとは関係がないことに留意すること。
【０４６６】
【化１００】
2009501517.tif 000092
【０４６７】
【化１０１】
2009501517.tif 000093
【０４６８】
【化１０２】
2009501517.tif 000094
以下（配列番号２８６〜３３９）は、ＩｇＧ結合性単量体ドメインに連結したＩＬ−６に結合する三量体（三量体中の各単量体がＩＬ−６に結合する）を含む配列を表す。２つのリンカーのうちの１つによって隔てられた、２つの抗ＩｇＧドメインのうちの１つをＮ末端に有する９個の三量体（９ｘ２ｘ２＝３６の四量体）を含む。Ｃ末端に２つの抗ＩｇＧドメインのうちの１つを有する９個の三量体もリストするが、これらの構築物（９ｘ２＝１８個の四量体）についてはリンカー多様性を調査しなかった。
【０４６９】
【化１０３】
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【０４７０】
【化１０４】
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【０４７１】
【化１０５】
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【０４７２】
【化１０６】
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【０４７３】
【化１０７】
2009501517.tif 000099
実施例８
この実施例は、ＩＬ−６結合性三量体によるＩＬ−６誘発細胞増殖の阻害を実証する実験を説明するものである。
【０４７４】
ＴＦ−１、ＧＭ−ＣＳＦ依存性ヒト赤白血病細胞系統、は、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−２００３）から購入した。ＩＬ−６は、ＴＦ−１細胞増殖の強力な刺激因子である。ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒおよび／またはｇｐ１３０阻害剤の効能を判定するためのＴＦ−１細胞の使用は、当該技術分野では十分に確率されている。
【０４７５】
ＴＦ−１細胞は、増殖培地（５０ｕＭ  ２−ＭＥ、抗生物質−抗真菌剤を補足したＲＰＭＩ  １６４０）、１０％  ＦＢＳおよび５ｎｇ／ｍＬ  ｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ）中で保存した。アッセイ前、ＴＦ−１細胞を洗浄し、一晩、増殖培地＋１％ＦＢＳおよびＬｅｕｋｉｎｅ中で培養した。その後、アッセイ前に、ＴＦ−１細胞を、Ｌｅｕｋｉｎｅを伴わない増殖培地＋１％ＦＢＳで、３回洗浄した。
【０４７６】
抗ＩＬ−６モノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ  ６７０８−１１１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｔｓｔｅｎｓ、およびＣｌｏｎｅ  ＭＱ２−１３Ａ５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはＮ末端にＩｇＧ結合ドメインをさらに含む抗ＩＬ−６三量体（これは、他の実験では、ＩＬ−６結合への影響を示さなかった）の系列希釈物を、増殖培地＋１％  ＦＢＳで作製し、５％  ＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベータにおいて、４５分間、固定濃度のｒｈＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓからの０．２ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。
【０４７７】
３７℃、５％  ＣＯ２の加湿インキュベータにおいて、４０時間、９６ウエル平底プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で、２００ｕＬ／ウエルの最終容量で、抗ＩＬ−６阻害剤−ｈＩＬ−６混合物の存在下または不在下、ＴＦ−１細胞（１ｘ１０４／ウエル）を培養した。細胞を、１６時間の最終培養中に、１ｕＣｉ／ウエルの［３Ｈ］−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でパルス標識した。半自動セルハーベスター（Ｔｏｍｔｅｃ，Ｉｎｃ．）でプレートを回収し、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ−ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｗａｌｌａｃ−Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して［３Ｈ］−チミジン組み込みを測定した。結果は、三重反復試験ウエルからの平均ｃｐｍとして表示する。
【０４７８】
対照実験により、ＴＦ−１細胞増殖の刺激についてのｒｈＩＬ−６のＥＣ５０として０．２ｎｇ／ｍＬを決定した。
【０４７９】
抗ＩＬ−６三量体阻害ＴＦ−１細胞増殖は、０．２ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−６により、０．８ピコモルの濃度で最大の５０％に誘導された。
【０４８０】
このアッセイは、ヒト細胞を使用するインビトロバイオアッセイにおいて、単量体または多量体を抗ＩＬ−６活性についてスクリーニングする手段を提供する。被験多量体または単量体のＩＣ５０値を決定することにより、最適な分子を特定し、それらの生物活性に基づき格付けすることができる。
【０４８１】
実施例９
この実施例は、ＩＬ−６発現性ヒト細胞系統への単量体結合を実証する実験を説明するものである。
【０４８２】
単量体は、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグを含むように構築した。これにより、その単量体を一次サイトメトリー検出剤として使用することができ、二次検出剤としては蛍光標識抗ＨＡ二次抗体を使用した。
【０４８３】
２９３ＦＴヒト胚性腎細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をｐＤｉｓｐｌａｙベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるＣＤ２３−ＩＬ−６融合で一時的にトランスフェクトし、その結果、ＩＬ−６の細胞表面発現が生じた。
【０４８４】
９個の三量体を、２９３ＦＴ／ＣＤ２３−ＩＬ−６細胞に結合する能力について試験した。トランスフェクトされていない２９３ＦＴ細胞、ならびにＪｕｒｋａｔ、ＨｕＴ７８、ＡｒｅｎｔＡＲ、Ｕ２６６−ＢＬ、Ｒａｊｉ、ＲＰＭＩ８２２６およびＤａｕｄｉ細胞系統を、陰性対照として使用した。
【０４８５】
単量体結合を判定するために、２．５Ｘ１０５個の細胞を、３０分間、氷上で、１００ｕＬ  ＦＡＣＳ染色用バッファー（ＰＢＳ  ｐＨ７．４、５％ウシ胎仔血清、０．０１％アジ化ナトリウム）中の１０ｕＭ  ＩＬ−６三量体で染色した。４ｍＬの氷冷ＦＡＣＳ染色用バッファーで細胞を１回、洗浄し、その後、１００ｕＬのＦＡＣＳ染色用バッファー＋０．２ｕｇのＦＩＴＣコンジュゲート抗ＨＡモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に再び懸濁させ、氷上で３０分間、インキュベートした。細胞を４ｍＬの氷冷ＦＡＣＳ染色用バッファーで１回洗浄し、その後、２００ｕＬのＦＡＣＳ染色用バッファーに再び懸濁させ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。データを収集し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。各細胞＋ＩＬ−６三量体についての幾何平均蛍光を決定し、その細胞系統＋ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＨＡモノクローナル抗体のみについての幾何平均蛍光に対して正規化した。
【０４８６】
抗ＩＬ−６三量体は、２９３ＦＴ／ＣＤ２３−ＩＬ−６細胞に対してのみ有意な結合を示し、試験した他のいずれの細胞系統に対する結合も検出されなかった。
【０４８７】
このアッセイは、ＩＬ−６結合特異性について単量体または多量体をスクリーニングする手段を提供する。他の細胞表面タンパク質に勝るＩＬ−６に対する特異性は、治療薬の開発における重要な要因であり得、ならびに最適な分子をスクリーニングおよび選択するために使用することができる。
【０４８８】
実施例１０
この実施例は、抗ＩＬ−６単量体のインビトロ結合親和性を測定するために設計された実験を説明するものである。
【０４８９】
実験は、Ｂｉｏｃｏｒｅ  １０００  ＳＰＲ機で行った。すべての実験のためのランニングバッファは、１ｍＭのＣａＣｌ２を追加したＨＢＳ−Ｐ（Ｂｉａｃｏｒｅ）であった。
【０４９０】
ヒトＩＬ−６の〜２００ＲＵをＣＭ５チップのフローセルに、その製造業社のプロトコルに従って、ＮＨＳ／ＥＤＣカップリングおよびエタノールアミンブロッキングを用いて、コンジュゲートさせた。
【０４９１】
実施例９において使用したＩＬ−６結合三量体の系列希釈物を前記ランニングバッファで調製し、ＩＬ−６コンジュゲートフローセルに注入した。模擬的カップリング済フローセルでのフローイングから生じるシグナルをそのデータから減算して、バルクシフト効果を最小にした。１：１ラングミュア結合モデルを用い、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて、データを分析した。
【０４９２】
１：１結合モデルへのデータの独立したヒットにより、ｋｏｎ＝１．９５ｘ１０６ｓ−１、ｋｏｆｆ＝４．９３ｘ１０−４Ｍ−１ｓ−１、ＫＤ＝２．５３ｘ１０−１０Ｍの値を得た。
【０４９３】
このアッセイは、ＩＬ−６結合親和性について単量体または多量体をスクリーニングする手段を提供する。ＩＬ−６への親和性は、潜在的生物活性の指標として用いることができ、最適な分子をスクリーニングおよび選択するために用いることができる。
【０４９４】
実施例１１
この実施例は、マウスにおける抗ＩＬ−６三量体のインビボ活性を証明するために設計した実験を説明するものである。
【０４９５】
週齢８週の雌ＣＤ−１マウスをすべての実験に用いた。
【０４９６】
最適なＩＬ−６用量（１００ｕＬのＰＢＳ、１％マウス血清中、６００ｎｇ／マウス、腹腔内注射）およびＩＬ−６注射後、犠牲にするまでの時間（６時間）を、用量滴定、および心内穿刺により犠牲にしたマウスから回収した血清中の血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）の測定によってあらかじめ決定した。
【０４９７】
ＳＡＡは、ＥＬＩＳＡにより、その製造業社（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）の説示に従って測定した。すべての実験は、治療群当たり３匹のマウスを含み、各マウスについて二重反復ＳＡＡ測定を行った。
【０４９８】
三量体用量は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、２６０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２中で調製し、各用量は、マウス１匹当たり２００ｕＬの容量を有した。すべての単量体調製物が、ＬＡＬ終点法（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄｅ）によって測定して４ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシンを含有した。
【０４９９】
三量体用量、対照モノクローナル抗体（抗ＩＬ−６もしくはマウスＩｇＧ１、２００ｕＬ中、マウス１匹当たり５００ｕｇ）またはビヒクルのみを、尾静脈経由で注入した。１時間後、６００ｎｇのＩＬ−６、２００ｎｇのＩＬ−１、またはビヒクルのみ（ＰＢＳ、１％マウス血清）を腹腔内注射した。この第二の注入の６時間後、マウスを犠牲にし、血清を回収した。血清は、出荷用に冷凍し、分析するまで保管した。
【０５００】
抗ＩＬ−６三量体は、ヒトＩＬ−６による急性期タンパク質誘導を完全に排除した。対照的に、抗ＩＬ−６三量体は、ヒトＩＬ−１による急性期タンパク質誘導に対する影響を示さなかった。これは、その阻害効果が特異的であることを示している。抗ＩＬ−６三量体の阻害効果が用量依存的であることも判明した。これらの結果は、抗ＩＬ−６三量体が、インビボ設定でＩＬ−６の生物学的機能を特異的に阻害できることを示している。
【０５０１】
実施例１２
この実施例は、Ａドメイン足場に基づく追加のＩＬ−６結合配列の作製を説明するものである。
ＩＬ−６へのＥＬＩＳＡ結合により、およびまたＴＦ１細胞アッセイにおいて生物活性により測定して、以下の配列（配列番号８５５〜９２８）を結合ＩＬ−６として特定した：
【０５０２】
【化１０８】
2009501517.tif 000100
【０５０３】
【化１０９】
2009501517.tif 000101
【０５０４】
【化１１０】
2009501517.tif 000102
【０５０５】
【化１１１】
2009501517.tif 000103
明瞭さおよび理解を目的としてかなり詳細に上記発明を説明してきたが、本開示を読むことにより、本発明の真の範囲から逸脱することなく形態および細部に様々な変更を施すことができることは、当業者には明らかであろう。例えば、上で説明したすべての技術、方法、組成物、装置およびシステムは、様々な組み合わせで用いることができる。本出願に引用されているすべての出版物、特許、特許出願または他の文献は、個々の出版物、特許、特許出願または他の文献各々が、あらゆる目的で参照により取り入れられていると、個々に示されているのと同程度に、あらゆる目的でそれら全体が参照により取り入れられている。ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１３２５７およびＰＣＴ／ＵＳ０３／３５６６４および米国特許公開第２００５／００８９９３２号は、それら全体が参照により本明細書に取り入れられている。
配列番号１−ＩＬ−６処理アミノ酸配列
【０５０６】
【化１１２】
2009501517.tif 000104
【図面の簡単な説明】
【０５０７】
【図１】図１は、保存システインを明示するための様々なＬＤＬ−受容体クラスＡドメインからの部分アミノ酸配列（配列番号３８〜５０）のアラインメントを略図で図解する。フォールディングしたドメインの３つのジスルフィド結合におけるシステインの連結性を、コンセンサス配列（配列番号５１）を用いて略図で図解する。このコンセンサス配列内の、側鎖がカルシウム結合に寄与する残基を、アスタリスクで指摘する。
【図２】図２は、パネルＡは、Ａドメインの一例を略図で図解するものである。パネルＡは、約４０アミノ酸長のＡドメイン（配列番号５２）における保存アミノ酸を略図で図解するものである。保存システイン残基をＣによって示し、保存負電荷アミノ酸を、マイナス（「−」）記号を伴う円によって示す。「Ｈ」を伴う円は、保存疎水性残基を示す。パネルＢは、リンカーによってつながれた２つのフォールディングしたＡドメインを略図で図解するものである。パネルＢは、２つのカルシウム結合部位、Ｃａ＋２を伴う黒い円、およびフォールディングした各Ａドメイン内の３つのジスルフィド結合、合計６つのスルフィド結合も示している。
【図３】図３は、阻害剤、プロテアーゼ、プロテアーゼ複合体、ビタミン−担体複合体、リポタンパク代謝に関与するタンパク質、非ヒトリガンド、抗生物質、ウイルスおよびその他を含む、ＬＤＬ−受容体ファミリーの天然メンバーによって認識される幾つかのリガンドを示す。
【図４】図４は、リガンドに結合する単量体ドメインを特定し、選択された単量体ドメインを単離し、それらの選択単量体ドメインを様々な組み合わせで接続することによってそれらの選択単量体ドメインの多量体を作り、それらの多量体をスクリーニングして、リガンドに結合する１つより多くの単量体を含む多量体を特定するための一般図式を略図で図解する。
【図５】図５は、もう１つの選択戦略（ガイド付き選択）の略図である。適切な結合特性を有する単量体ドメインを、単量体ドメインのライブラリーから特定する。その後、その特定された単量体ドメインを、単量体ドメインの別のライブラリーからの単量体ドメインに連結させて、多量体のライブラリーを形成する。その多量体ライブラリーをスクリーニングして、ターゲットに同時に結合する単量体ドメインのペアを特定する。その後、多量体において最適な結合特性が得られるまで、このプロセスを繰り返すことができる。
【図６】図６は、Ａドメインのアラインメントを図示する（配列番号５３〜２６９）。図の一番上の小文字（ａ〜ｑ）は、保存残基を示す。
【図７】図７は、様々な可能な抗体−単量体または多量体の配座を図解する。一部の実施形態において、単量体または多量体は、抗体のＦａｂフラグメントを置換する。
【図８】図８は、半減期延長分子に結合する少なくとも１つの単量体ドメインと１つまたは場合によっては２つ以上のターゲット分子に結合する他の単量体ドメインとを含む本発明の多量体の可能な配座を図示する。この図では、２つの単量体ドメインが２つの第一ターゲット分子に結合する。場合によっては、この２つの単量体ドメインは、１つの第一ターゲット分子上の異なる部位に結合することがある（図示なし）。
【図９】図９は、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を防止する本発明のポリペプチドの可能な設計を示す。
【図１０】図１０は、ＩｇＧに結合する単量体のサルにおける血清半減期を図解する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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