(57)【要約】  基板上に、生物学的分子を固定化する方法は、(i) 実質的に3-次元のポリシランポリマーを、基板に、共有結合によって結合する工程；及び(ii) 該ポリマー上に及び/又はその内部に生物学的分子を結合する工程を含む。この方法は、更に該基板(又は化学的保護層)を、放射線感受性物質の層で被覆する工程、該基板を、放射線源に暴露する工程、及び該基板を、第一の種の生物学的分子の存在下で、インキュベートする工程を含むこともできる。
2009515138.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的分子を、基板上に固定化する方法であって、前記方法が、以下の工程、
(i) 実質的に3-次元のポリシランポリマーを、基板に、共有結合によって結合する工程、及び
(ii) 前記ポリマー上に及び/又はその内部に生物学的分子を結合する工程、
を含むことを特徴とする、上記固定化方法。
【請求項２】
前記方法が、前記基板表面の選択された「ターゲット」領域に、ポリシランポリマーを生成する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記基板を、先ず放射線感受性物質で被覆する、請求項1又は2記載の方法。
【請求項４】
前記放射線感受性物質が、ノボラック(NovolacTM)をベースとするフォトレジスト層を含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
適当な温度にて、十分な時間に渡り、前記基板を加熱することによって、硬化を行う、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
上部に、最終的に前記生物学的分子を固定化する、前記基板の領域(即ち、前記ターゲット領域)が、放射線に暴露することによって、前記基板を覆っている前記放射線感受性物質に変化される、請求項3〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記基板の露光されたターゲットサイトを、「その場での」重合反応に付す、請求項1〜6のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記重合反応が、有機シランモノマーの重合を含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記有機シランモノマーが、以下の式で表されるものである、請求項8記載の方法：
【化１】
2009515138.tif 000006
【化２】
2009515138.tif 000007
ここで、R1、R2、R3、及びR4の少なくとも一つが、少なくとも一つの脱離基を含み、かつ少なくとも一つのR1、R2、R3、及びR4が、求核基である。
【請求項１０】
前記重合反応が、3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)の重合を含む、請求項7〜9のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記重合反応を、アルカリ性溶媒中で行う、請求項7〜10のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶媒が、8を越えるpKa値を持つ、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記溶媒が、トリエチルアミン(TEA)を含む、請求項11又は12記載の方法。
【請求項１４】
前記基板が、乾燥され、超音波処理され、次いで硬化される、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリシランポリマーが、複数のシランモノマーからなり、前記モノマーが、共有結合によって、実質的に前記基板の面に沿って拡がっており(2D)、更に前記基板の面から、実質的に遠ざかるように拡がっており(3D)、その結果、シラン分子が、前記基板と直接的に又は間接的に結合している、他のシラン分子と共有結合によって結合している、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリマーが、少なくとも150nmなる厚みを持つ、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
前記工程(ii)が、前記基板を、結合すべき前記生物学的分子を適当な濃度で含む、適当な緩衝溶液中でインキュベートする工程を含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
前記工程(ii)において、前記生物学的分子が、前記方法における工程(i)によって製造した前記ポリシランポリマー上に、及びその内部に、吸収及び/又は吸着されている、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
前記生物学的分子が、核酸分子、アミノ酸、抗体、ペプチド、タンパク質、酵素、全細胞、又は細胞の一部、ウイルス、ファージ、又は微生物、又は細胞内小器官、又はウイルス粒子を含む、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
前記基板が、任意の固体表面、例えばガラス、金属、例えば金、銀、プラチナ、パラジウム等を含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
前記基板が、酸化珪素を含む、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法が、前記基板に前記ポリシランポリマーを結合する、前記工程(i)に先立って、前記基板を予め官能化する段階を含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
前記予め官能化する段階が、前記放射線感受性物質を適用する前、又はその後に行われる、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記方法における前記工程(ii)が、前記基板上に形成された、前記ポリシランポリマーに、複数の異なる種の生物学的分子を結合する工程を含む、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
前記異なる種が、別々の隔置された位置あるいは一緒に混在する位置において、前記基板と結合している、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
前記工程(i)に引続いて、前記ポリマーを化学的保護層で覆い、前記保護層が、望ましからぬその後の化学的な処理から、前記ポリマーを保護するのに適したものである、請求項24又は25記載の方法。
【請求項２７】
前記化学的保護層が、ゼラチンを含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
前記化学的保護層が、約100nm〜500nmなる範囲の厚みを持つ、請求項26又は27記載の方法。
【請求項２９】
前記方法が、前記基板(又は前記化学的保護層)を、放射線感受性物質の層で被覆する工程を含む、請求項24〜28のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
前記放射線感受性物質が、前記化学的保護層を覆っている場合には、次いで前記基板を、放射線源に暴露する、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
前記基板を、第一の種の生物学的分子の存在下でインキュベートする、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
前記生物学的分子を、前記ポリマーに結合した後、前記方法が、前記基板を化学的保護層で被覆する段階を含む、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
前記基板を放射線に暴露して、前記放射線感受性物質の選択されたターゲット領域を除去する、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
前記基板を、第二の種の生物学的分子の存在下でインキュベートする、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
前記第二の種の生物学的分子が、前記第一の種の生物学的分子とは異なっている、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
前記ポリシランポリマーに対する生物学的分子のパターニング及び結合段階を、「n」回繰返すことによって、「n」個の異なる生物学的分子を、前記基板上の前記ポリマーと選択的に結合する、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
前記方法が、あらゆる残留する放射線感受性物質、及びあらゆる残留する化学的に耐性の物質を、前記基板から除去する工程からなる、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
前記方法が、前記基板の表面を、適当な遮断剤で遮断して、非-特異的なタンパク質の吸着/吸収を防止する工程を含む、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
前記遮断剤が、PBS中のBSAを含む、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
請求項1〜39のいずれか1項に記載の方法によって得ることのできる、固定化された生物学的分子を含む基板。
【請求項４１】
前記基板が、任意のデバイスの基板表面を、生物学的な実体で官能化する必要がある、前記デバイスとして又はその製造において使用される、請求項40記載の基板。
【請求項４２】
請求項1〜39のいずれか1項に記載の方法によって得ることのできる、基板を含むことを特徴とする、デバイス。
【請求項４３】
前記デバイスが、医学デバイス、インプラント、バイオリアクタ、タンパクカプセル、又はバイオセンサである、請求項42記載のデバイス。
【請求項４４】
請求項1〜39のいずれか1項に記載の方法を利用することを特徴とする、バイオセンサの製造方法。
【請求項４５】
前記バイオセンサが、MEMSバイオセンサである、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
前記バイオセンサが、トランスデューサを含み、これが、マスレゾネータである、請求項44又は45記載の方法。
【請求項４７】
前記バイオセンサが、生物学的ターゲット被検成分の存在を、円形ディスクレゾネータの振動モードにおいて生成される、振動数シフトを測定することによって検出するのに適したものである、請求項44又は45記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、支持基板表面上に、生物学的分子を固定化する方法に関する。本発明は、このような方法によって製造した、固定化された生物学的分子を上部に有する表面、及びその使用にも及ぶ。本発明は、デバイス表面を、生物学的な実体により官能化する必要のある、例えば医療デバイス及びインプラント等の前記デバイスに係る。特に、排他的ではないが、本発明は、化学的又は生物学的な被検体分子の存在を検出するのに使用できる、バイオセンサの製造方法、並びにこのような方法によって製造したバイオセンサに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
小型化分析システムを製造するためのたゆまぬ努力が、バイオセンサの製造において考察されている、シリコン微細化製造技術へと導いた。バイオセンサは、シリコン支持基板からなり、その基板には、そのセンサによって検討すべき、ターゲット被検体の特性に応じて、特定の種の生物学的分子又は様々な異なる種の生物学的分子が結合される。例えば、そのバイオセンサの支持基板に結合された前記生物学的分子は、DNA分子の特定の配列、タンパク質、抗体、酵素、又は全細胞等であり得る。あるいはまた、その支持体表面に結合した、DNA分子、タンパク質、抗体、酵素、又は細胞等の様々な異なる種を持つ、バイオセンサも存在する。
【０００３】
一例として、該バイオセンサによって検討すべき該生物学的な分子(即ち、その被検体分子)が、特定の抗原である場合、そのバイオセンサの該基板は、これと結合した抗体を持つことができ、該抗体各々は、相互に同一の特定の構造を有し、またその各々は、その特定のターゲット抗原被検体分子に対して、免疫特異性を示す。これらの抗体は、そのバイオセンサが効果的に機能するために、極めてサイト-特異的な配列で、その支持基板と結合している。その抗体で被覆された該バイオセンサは、次にそのターゲット抗原被検体を含有する溶液に暴露され、その結果として、その抗原は該バイオセンサ上の抗体と結合する。この結合事象は、幾つかの方法で検出できる。圧電式バイオセンサの場合、そのバイオセンサの特定の領域への、被検体の結合によって引起される質量の変化は、そのバイオセンサの当該領域の共鳴周波数における変化を引起す。従って、この共鳴周波数における変化は、そのセンサに対して適用された質量の値を、またその結果としての、その被検体抗原の質量を計算するのに使用できる。このようなバイオセンサは、共鳴質量センサとして公知であり、その一例は、特許出願PCT/GB02/00237号に記載されている。
【０００４】
任意の生物学的に一体的に組込まれたデバイス、例えばバイオセンサの開発における主な限界は、生物学的分子、例えば抗体、DNA配列、細胞、又は酵素等を、高度の正確さで、サイト-特異的様式で、規定されたターゲット表面に固定化し、結果としてその生物学的な種を、高い密度にて、また高度にその生物学的活性を維持した状態で、固定化する能力にあることが、理解されよう。バイオセンサのサイズが極めて小さいことから、このようにして固定化される生物学的分子の量並びに活性を最大にすることが、このようなデバイスの感度を保証する上で、必須となる。更に、極めて高い精度にて、該ターゲット表面上にその生物学的分子を固定化しもしくは「パターン化」可能であることが、重要な要件の一つである。更に、数種の異なる型の生物学的分子を、その支持基板の選択された領域上にパターン化する能力は、多重-被検体検出デバイスの開発にとって、主な課題となる。強固な、再現性ある、またクリーンルーム及び製造工程と両立する、このような特徴を持つ方法を開発する能力は、依然従来技術における課題の一つとなっている。
【０００５】
支持基板に生物学的分子を固定化するために、一般に利用されている技術の一つは、固体基板上への、該生物学的分子の微細接触印刷(micro-contact printing)法に基く、「ソフトリトグラフィー技術(soft lithography technique)」として知られている。ソフトリトグラフィーは、先ずポリジメチルシロキサン(PDMS)を用いてエラストマースタンプを製造することを含むが、該スタンプは生物学的分子の溶液でインキ付けされて、配座的な接触を介して、固体支持基板に、対象とする特徴を転写する。この簡単な手順によって、タンパク質の単層を、その所定の表面に直接パターン化でき、あるいはアンカー分子のパターン化された単層、例えば金の上の官能化されたチオール、又は酸化珪素上の官能化されたシランと、選択的に反応させることができる。これらの方法に係るひとつの問題点は、該インキ付けされたスタンプでは、製造方法において著しい複雑さを含む、該表面との正確な心だしを行う必要がある点にある。その上、固定化された生物学的分子の量は、1単層を越えることができず、このことは、小型化生体認識デバイスにとって、高い感度を達成する上で、かなり重大なハンディキャップとなる。もう一つの方法が、Salloum等によって提案されている(Biomacromolecules, 2004, 5:1089-1096)が、この文献において該著者らは、タンパク質と共に配合できる、「高分子電解質の単層」(PEMU)の薄層を、静電相互作用に基いて生成した。この研究の主な目的は、該3-次元PEMU内に固定化した生体分子の量が、その厚みに伴って増大することを明らかにすることにあった。しかし、静電相互作用によって築かれた、このような3-次元構造の主な限界は、使用した溶媒の性質、並びに塩濃度、pH及び極性に対する、該構造の高い感受性にある。この強健性の欠如は、静電相互作用に基くこれら分子の構造を、製造工程とは相容れないものとしている。
【０００６】
ソフトリトグラフィー技術と並行して、レジストリトグラフィーに基く幾つかの方法が、同様に、固体基板に生体分子をパターニングするために、一般に利用されている。これらの、所謂「リフト-オフ」リトグラフィー技術は、生体分子を固定化すべき、該基板表面に、レジストと呼ばれる放射線感受性物質を適用する工程を含む。次いで、該レジストを、予め規定された波長における放射線に暴露し、結果的に該レジストの特定の領域を該基板から除去し、該基板下部の該ターゲット領域を露出状態にする。この放射線は、パターン化した「マスク」を使用するか、あるいは例えば電子-ビーム(e-ビーム)暴露による、マスクレスリトグラフィー法を利用して、該レジストの予め規定された領域に照射する。これは、当分野においては、レジスト「リトグラフィー」又は「パターニング」として知られている。高解像度でパターニングするためには、該レジストを、高周波数の放射線、例えばUV輻射線、X-線輻射、又はe-ビームに暴露する。一旦該レジストのターゲット領域を除去した後、次に該生体分子を、該基板の該露光部分に固定化することができる。
【０００７】
しかし、このような方法を利用する従来技術の一般的方法に係る問題の一つは、該基板と共有結合により結合する、生体分子の量が、一層の単分子層を越えることはめったにない点にある。更に、レジスト物質を利用する、上記した公知の「リフトーオフ」リトグラフィー技術に基く、タンパク質パターニング手順は、同一の表面上に2以上の型の生体分子をパターニングしようとする場合に、重大な問題に直面する。この問題は、該レジスト物質を現像し、かつ除去するのに用いた有機溶媒が、全体的に多くの生物学的な物質と相容れないものであるという事実にある。従って、生体分子を固定化する方法を、リトグラフィー法に組込むことは、重大な問題を残す。従って、従来のレジストの使用に基づくリトグラフィー法においては、2以上の型の生体分子のパターンが、同一の表面上に必要とされる場合には、生物学的な分子の固定化及びレジストのパターニング手順が、これらの非-相溶性にも拘らず、共用しなければならないという事実のために、重大な制限が、見出されている。
【０００８】
Sorribas等(Biomaterials, 2002, 23:893-900)は、生物学的分子の単層をスクロース層内に包埋させて、第一の生体分子を、該フォトレジストの洗浄段階から保護することにより、担体上に1種を越える生体分子をパターニングする際の問題を克服しようと試みた。この手順を用いることにより、該著者等は、二種の生物学的分子種の、担体表面上でのパターニングを達成しようとした。しかし、その実験において、彼等は、唯一つのフォトリトグラフィー手順のみを使用し、該第二の生体分子によって引出される特徴が、該第一の生体分子のパターニング後に残された自由空間の全てを占有していた。結果として、該第一の生体分子によって引出される特徴は、該第二の生体分子の特徴を否定してしまい、このことは、この方法の融通性を著しく制限してしまう。
【０００９】
公知の固定化技術の更なる制限は、多くの用途にとって、これらの方法が、定量的又は定性的に十分な、生体分子の該表面への固定化を可能としないことにある。バイオセンサにとって、このことは、準最適な感度しか持てないことを意味し、またターゲット被検体を検出又は測定する際に、その精度を低下する。この制限は、該基板表面と共有結合により結合した、生物学的分子の高い秩序性を持つ単分子層の形成を好ましいものとする、固定化方法を利用することが、著しく望ましいと考えられることからもたらされる。このことは、該表面に対して、再現性のよい、しかも強固な結合を達成するために必要であると考えられる。しかし、単分子層形成手順を含むこの方法の利用により、該担体基板上に、生物学的に活性な状態で、該生物学的分子を、十分に高い濃度にて固定化することが常に可能となるわけではない。該支持基板上には、制限された、生物学的分子を固定化することのできる領域のみが存在するばかりでなく、共有結合又は直接的な吸着によって、該基板に該生物学的分子を結合する行為は、しばしばその固有の活性を低下し、あるいはその全体的な喪失さえも結果する。
【００１０】
例えば、生物学的分子の固定化用の、酸化珪素基板を官能化するための、アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)の使用が、文献において既に議論されている。該官能化反応は、溶媒、例えばアセトン、エタノール、又はメタノールの存在下で、該基板をAPTESに暴露して、シランの薄い単一の単分子層を形成することにより行われ、該単分子層は、該基板の表面に沿った、2次元平面に形成される。該シランの単分子層は、該基板に共有結合によって結合し、また後に生物学的な分子が、共有結合によって結合することのできる、「架橋剤」として機能する。しかし、該表面への強固かつ十分に規定された結合方法を与えるにも拘らず、共有結合によって、該生物学的分子と該シラン架橋剤単分子層との結合に係る、一つの顕著な問題は、該生物学的分子の活性の量が、実質上低下する傾向がある点にある。これは、該生物学的分子の幾分かの割合が、結合の際に、該シラン架橋剤と共有結合を形成するために、該分子の元の構造を失うからである。更に、APTES溶媒として一般的に使用される該有機溶媒は、レジストに基くリトグラフィー技術とは非-相溶的である。というのは、該有機溶媒が、数秒以内にレジストを溶解するからである。
【発明の開示】
【００１１】
従って、従来技術に係る問題を克服し、また支持基板上に生物学的分子を固定化するための改善された方法を提供し、結果として該生物学的分子を、強固で再現性ある様式で、該基板と結合し、また該分子を、高濃度にて、活性を保持した状態で、固定化することが、本発明の様々な態様の目的である。本発明の更なる目的は、正確な様式で該生体分子を配置したい場合に、該方法を、リトグラフィー等の、パターニングするための高い分解能を持つ方法と相容れるものとすることである。更に、本発明の別の目的は、生体巨大分子によって官能化する必要のあるデバイス、例えば医療デバイスを製造するために、このような方法を利用すること、及び生物学的な、又は化学的な種に対する、改良されたセンサを提供することにある。
本発明者等は、支持基板上に活性な生物学的分子を固定化するための、サイト-特異性を改善することが可能であるか否かを理解することを望んだ。本発明者等は、これまで、該基板の面を横切る、極めて薄い2-次元(水平)のシラン単分子層を製造するためにのみ使用されていた、アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)の使用について検討した。このシラン単層は、生物学的分子該基板上部表面との共有結合のための、架橋剤として機能する。
【００１２】
本発明の第一の局面によれば、生物学的分子を、基板上に固定化する方法を提供するものであり、該方法は、以下の工程を含む：
(i) 実質的に3-次元のポリシランポリマーを、基板に共有結合により結合する工程；及び
(ii) 該ポリマー上に及び/又はその内部に生物学的分子を結合する工程。
ここで、該用語「3-次元のポリシランポリマー」によって、我々は、複数のシランモノマーを含む架橋されたポリマー構造を意味し、該構造は、共有結合によって、該基板の面又はその表面に沿って拡がっており(2D)、また更に該基板の面から、実質的に遠ざかるように拡がっており(3D)、結果としてシラン分子は、該基板と直接的に又は間接的に結合している、他のシラン分子と共有結合によって結合する。
該「基板」なる用語によって、我々は、該ポリシランポリマー及びその結果としての生物学的分子を結合することのできる、任意の適当な表面を意味する。
【００１３】
該「生物学的分子」なる用語によって、我々は、生物学的活性及び/又は特異性を持つ任意の有機分子、例えば生きた生物由来の巨大分子を意味する。例えば、該生物学的分子は、一本鎖でも二本鎖でもよい、核酸分子(例えば、DNA、RNA又は任意のこのような化学的代替物、例えばPNA等)、アミノ酸、抗体、ペプチド、タンパク質、酵素を含むことができる。該生物学的分子は、全細胞、又は細胞の一部、ウイルス、ファージ、又は微生物、又は細胞内小器官、又はウイルス粒子等を含むことができる。有利には、全て本明細書において使用される、該用語「生物学的分子」、「生体分子」、「生物学的要素」及び「生体要素」とは、互換的に使用される。
基板表面に生物学的分子を固定化する従来の技術は、アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)を使用して、該基板を横切る2-次元のシラン単分子層を形成する工程を含んでおり、従って該単分子層は、該基板の面に平行な方向にのみ広がっている。これは、該APTESのシラン化反応中に、トルエン、アセトン、メタノール、エタノール等の有機溶媒又は水を使用することによって達成される。これらの一般的に利用されている方法は、非-アルカリ性条件の使用を含む。該2Dシラン単分子層は、該基板との共有結合による架橋剤として機能し、該基板には、生物学的分子が、共有結合により結合することができ、あるいは該基板は、静電相互作用によって該分子を直接吸着することができる。これは、該ターゲット生体分子の、高度に規定された、再現性のある捕獲を達成するのに必要であると考えられる。
【００１４】
本発明者等は、該基板と共有結合的に結合し、結果としてその表面に対する、強固な結合方法を与え、また高度に規定された構造を有し、更に再現性の高い方法で実施できる、3-次元ポリシランポリマーの製造が可能であるか否かを理解しようとして、従来技術の教示に逆らってみようとした。これが可能であれば、該ポリマー構造内に及びその上に、非-共有結合式に生体分子を固定化することが可能であろう。一態様において、本発明者等は、基板に対する、単一の型又は単一の種の生物学的分子の固定化を検討した。これを、ここにおいて、「モノ-タンパク」法と呼び、また実施例1において説明する。もう一つの態様において、本発明者等は、支持基板に対して、2又はそれ以上の型又は種の生物学的分子の固定化をも検討した。これを、ここでは「多重-タンパク」法と呼び、また実施例2において説明する。これらのモノ-タンパク法及び多重-タンパク法は、タンパク自体に限定されるのではなく、ここで定義するような任意の生物学的分子、例えば核酸、酵素、細胞等の固定化にも拡張できるものと理解すべきである。
【００１５】
APTESの、正確な条件の下で、重合により、3-次元構造を形成し、かつその2-官能特性のために、ポリマーネットワークを形成する能力は、文献には、常に、このような用途にとって望ましからぬものであるとして、提示されている。これは、アミノシランモノマーの重合反応が、周知の通り、制御することが極めて難しく、結果として該生体分子の効果的な共有結合のための、十分に明確にされ、かつ高い再現性を示す、表面の生成を妨害するからである。例えば、該ポリマーが、該基板と十分に結合することができず、また逆の脱着過程において、該固定化された物質の大半を失うことなしに、生物学的分子をポリマーネットワーク内に効果的に維持することが、困難であると考えられるからである。該固定化された生物学的分子の生物学的活性を維持することは、極めて重要なことである。従って、従来技術によって教示された方法は、広範なAPTESの重合の発生を、具体的には、非-アルカリ性溶媒、主にトルエンを使用することにより、防止するように設計された。
【００１６】
驚いたことに、本発明者等は、構造上極めて規則的であり、しかも該基板と共有結合によって結合している、3-次元ポリシランポリマーネットワークを生成することが可能であることを見出した。その上、より一層驚いたことに、本発明者等は、極めてサイト-特異的な様式で、極めて高い濃度の生物学的分子を、該ポリシランポリマーネットワーク内に固定化できることを見出した。このことは、幾つかの理由から、全く予想外のことであった。先ず、本発明者等は、ポリシランポリマーが、生物学的分子を、このような高い濃度にて、効果的に吸収するものとは、予想しなかった。これは、本発明者等が、該ポリマーネットワークが、多孔質であり、従ってその内部に生体分子を吸収するのに適していることを、予想しなかったからである。第二に、化学的な環境に暴露された生体分子の相互作用の複雑さのために、静電相互作用及び水素結合が、生体分子の活性構造の多くに関して、十分に非-劣化性であることが知られていたとしても、該生体分子が、このように活性な状態で、該ポリマーと結合しているであろうことを、全く予測できなかった。上記の如く、これは、特に有利である。
【００１７】
従って、本発明の方法は、従来技術に係る問題点を解決し、簡単で、耐久性のある、かつ新規な手順を記載する。この手順は、極めて高い精度で、又は解像度にて、支持基板上に、生物学的分子を、3-次元的に固定化することを可能とする。本発明の方法は、該基板の実質的に全表面を横切る、ポリシランポリマーを製造する工程を含むことができる。しかし、好ましくは、本発明の方法は、該基板表面の選択された「ターゲット」領域に、ポリシランポリマーを製造する工程を含む。これは、「リフト-オフ」レジストに基くリトグラフィー技術を利用することによって、達成できる。
「リフト-オフ」レジストに基くリトグラフィー技術は、当業者には公知であり、その利用する工程を、図1に示した。先ず、当分野において「レジスト」と呼ばれる、放射線感受性の物質で、該基板を被覆することができる。該放射線感受性物質は、予め規定した波長における、閾値レベルの放射線で照射され、その際に、該放射線感受性物質は、該基板から除去され、該基板のターゲット領域を露出させるであろう。これは、当分野において「レジストリトグラフィー」又は「パターニング」として公知である。高解像度のレジストパターニングを行うためには、放射線感受性物質は、高周波数の放射線、例えばUV輻射線、X-線輻射、又はe-ビームに暴露される。該基板から該放射線感受性物質を除去するために必要とされる、該閾値レベルの放射線は、使用する物質の型に依存する。
【００１８】
本発明の方法において使用することのできる、適当な放射線感受性物質の例は、ポリメチルメタクリレートを主成分とするレジスト(PMMA)、水溶性ポリ(メチルアクリルイミドグリコレートメチルエーテル) (ポリ(MAGME))又はポリ(モノ-イソボルニル-2-(4-ビニルベンジル)マロネート)を主成分とするレジストを含む。しかし、好ましい放射線感受性物質は、ノボラック(登録商標)を主成分とするフォトレジスト層を含み、これはUVに対して、高い解像度で感受性を示す。
該基板を、適当な放射線感受性物質で被覆する方法は、当業者には公知である。例えば、該物質は、市販のレジストを、好ましくは均一に該基板表面全体に、噴霧することによって、該基板上に適用することができる。
しかし、該物質は、該基板上に、例えば実施例において記載される方法を利用して、回転塗布することができる。回転塗布に引続き、該基板を覆っている、該放射線感受性物質を、次に硬化することができる。この硬化は、該基板を適当な温度まで、十分な期間に渡り、例えば95℃を越える温度にて、数分間、あるいは室温にて、数日間に渡り加熱することによって、実施することができる。
【００１９】
最終的に、該生物学的分子を固定化する該基板表面上の領域(即ち、ターゲット領域)は、好ましくは放射線に暴露することによって、後に好ましくは該基板を覆っている該放射線感受性物質に転写される。これは、標準的なリトグラフィー技術、例えばリトグラフィー用のマスクを使用して、又はマスクレスリトグラフィー技術を利用して、達成することができる。これら技術は両者共に、当業者には公知である。例えば、該基板を覆っている該放射線感受性物質は、該物質が感受性であり、該ターゲットサイトに相当する、所定位置における該物質を除去することのできる、所定波長を持つ放射線(例えば、UV)に暴露することができる。これは、該基板上の該ターゲット領域を露出させるが、該基板上の所定位置における放射線感受性物質の、非-ターゲットサイト領域を残す。次いで、該基板の該露出したターゲットサイトは、好ましくは「その場での」重合反応に掛けられる。これは、本発明の第一の局面による方法の、好ましい工程(i)に相当する。
該用語「その場での重合反応」によって、我々は、該基板上の該露出したターゲットサイトの所定位置に、ポリマーを直接形成することを意味する。
【００２０】
本発明の方法に従う、該重合反応中に起る化学反応は、求核置換反応であることが好ましい。求核置換反応は、当業者には公知であり、また図18に示したように、求核基(N)、求電子基(E)及び脱離基(L)を含む。該求核基(N)は、電子に富み、電子に欠乏している該求電子基(E)を攻撃して、これらの間に共有結合を生成する。
本発明によるこの重合反応は、好ましくは2-官能性の有機シランモノマーの重合を含むことができる。該「2-官能性」なる用語によって、我々は、該分子の構造が、他の同様な分子と反応して、共有結合によって架橋されたポリマーのネットワークを生成し得ることを意味する。
好ましい有機シランモノマーは、同一の分子上に、少なくとも一つの求核基を含むことができる。適当な求核基は、アミン、チオール、チオシアネート、シアネート又はアルコレートを含むことができる。
好ましいモノマーは、好ましくは該珪素原子と結合した、少なくとも一つの脱離基を含むことができる。適当な脱離基は、アルコキシ基、ハロゲン原子、又はシラザンを含むことができる。適当なハロゲン原子は、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素を包含する。
該有機シランモノマーは、以下の式で表すことができる：
【００２１】
【化１】
2009515138.tif 000003
【００２２】
【化２】
2009515138.tif 000004
【００２３】
ここで、R1、R2、R3、及びR4の少なくとも一つは、少なくとも一つの脱離基を含み、かつ少なくとも一つのR1、R2、R3、及びR4は、求核基である。好ましくは、R1、R2、R3、及びR4の2又は3個は、脱離基である。適当な脱離基の例は、アルコキシ基、ハロゲン原子、シラザン又はヒドロキシル基を含む。適当な求核基の例は、アミン、チオール、チオシアネート、シアネート又はアルコレートを含む。
該求核基におけるスペーサR'は、飽和又は不飽和基であり得る。該スペーサR'は、脂肪族又は芳香族のものであり得る。該スペーサR'の長さは、C1-C10の範囲内であり得る。該求核基において言及している、該二級アミンの式における置換基R''は、飽和又は不飽和基であり得る。該置換基R''の長さは、C1-C10の範囲内であり得る。上記式Iに示された該脱離基の、部分的に明らかにされた式において、置換基Ri、Rii及びRiiiは、例えばアルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、ハロゲン原子、であり得るが、これらの例は網羅的なものではない。
好ましくは、該重合反応は、アルコキシシラン及び/又はアミノシランモノマーの重合を含む。適当なアルコキシシランモノマーは、C1-C10のシラン、又はC1-C10のオキシシランを含むことができる。例えば、該モノマーは、メトキシシラン、エトキシシラン、又はプロポキシシランを含むことができる。
しかし、最も好ましい態様において、該重合反応は、3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)、即ち(CH3CH2O)3Si(CH2)3NH2の重合を含むことができる。このAPTESの式は、以下の式IIで表される：
【００２４】
【化３】
2009515138.tif 000005
【００２５】
APTESの重合反応を、模式的に図3に示す。該求核基は、一級アミノ基であり、また該求電子基は、珪素原子である。ある原子が、他の原子と共有することのできる共有結合の数は、その原子価で指定され、珪素の場合には、その原子価は4である。このことは、該一級アミン(即ち、該求核基)が、該珪素原子(即ち、求電子性中核基)と一個の共有結合を分合い、従ってこの原子は、脱離基と呼ばれる他の基と結合している、既存の共有結合を切断する必要がある。この反応の終了時点において、該求電子基と共有結合によって結合された該脱離基は、該求核基によって置換されている。該APTESの重合反応において、APTES分子の少なくとも一つのエトキシ基が、好ましくは他のAPTES分子の少なくとも一つの一級アミノ基によって置換されている。
本発明の方法において使用する、APTESの濃度は、0.1％-20％(v/v)の範囲内であり得る。しかし、好ましいAPTESの濃度は、0.2-10％(v/v)なる範囲、より好ましくは0.5-5％(v/v)なる範囲、及び最も好ましくは1-3％(v/v)なる範囲にある。
【００２６】
好ましくは、該重合反応は、実質的にアルカリ性(又は塩基性)の条件下で実施される。例えば、該重合反応は、有機溶媒であり得る、アルカリ性溶媒中で行われる。該溶媒は、強塩基性であり、また8を越えるpKa値を持つことのできるものであることが好ましい。好ましくは、該pKa値は、9、10、又は11よりも大きく、また最も好ましくは12よりも高い。
好ましくは、該溶媒は、ヒドロキシル基を含まないものである。これは、ヒドロキシル基が、求核性であり、またヒドロキシル基を含む溶媒は、該重合反応を妨害するからである。
適当な溶媒は、ベンジルアミン、n-ブチルアミン、ジエチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミン、エチレンジアミン、メチルアミン、トリエチルアミン、又はトリメチルアミンを含むことができる。最も好ましい態様において、該溶媒は、トリエチルアミン(TEA)を含む。該重合反応における溶媒として使用されるTEAのpKa値は、好ましくは11以上である。好ましくは、TEA(≧約98％)の溶液を、該重合反応で使用する。
【００２７】
最も効果的な「その場で」行われる重合に関連して、該レジストをパターン化した基板は、好ましくは該有機シランモノマー及び塩基の存在下に、少なくとも1時間、より好ましくは少なくとも2時間、及びより一層好ましくは少なくとも5時間、維持される。該重合反応は、15〜80℃なる範囲の温度下で実施することができる。しかし、好ましくは該重合反応は、室温(21℃)にて起る。最も好ましくは、該重合反応は、好ましくは約21℃における、実質的に純粋なトリエチルアミン中での、約2％(v/v)のAPTES(アミノプロピルトリエトキシシラン)の使用を含む。
好ましくは、放射線感受性物質を使用している場合には、該基板上に残留する、任意の放射線感受性物質又は任意の非-共有結合的に結合した分子は、その後、当業者には公知の手順によって除去することができる。例えば、該基板を、好ましくは気流中で、乾燥することができる。次いで、該基板を、適当な溶媒、例えばアセトン中で、該物質を除去するのに十分な時間に渡り、超音波処理することができる。約5分間で十分であり、またこの操作は、該基板から、実質的に該放射線感受性物質の残部を除去することを可能とする。しかし、この段階では、該重合反応が、完全に完了してはいないものと理解すべきである。従って、好ましくは該基板を、引続き硬化することができる。この硬化段階は、該基板を十分な時間に渡り、適当な温度にて加熱することによって達成することができる。例えば、該基板を、約120℃又はそれ以上の温度にて、少なくとも約1〜3時間加熱することができる。
【００２８】
該硬化段階中、蒸発によって、あらゆる残留有機シランを、該基板から除去する。該硬化段階中の高い温度は、該化学系が、該重合反応を引起し、好ましくは該基板上でのポリシランポリマーの生成をもたらすのに必要とされる、活性化エネルギーを獲得することを可能とする。該重合反応の例を図3に示す。好ましくは、この重合反応は、基板表面とシランモノマーとの間の共有結合の生成を含む。従って、該重合反応の結果として、架橋されたポリシランポリマーネットワークが生成され、該ネットワークは、該第一局面の方法の段階(i)におけるように、該基板表面と共有結合によって結合している。更に、好ましくは、該重合反応は、隣接するシランモノマー間の、シロキサン結合の形成を含み、該結合は、シロキサンによって形成され、側方への縮合が、該基板の面から遠ざかるように展開する。
従って、本発明の方法の好ましい段階(i)は、実質的に3-次元の配向で、即ち該基板の面に対して実質的に平行(2-次元の面)に、また更に該基板の面を実質的に横断し、あるいは該面から遠ざかるように(3-次元)、該ポリシランポリマーを該基板に対して結合することを含む。
【００２９】
本発明者等は、驚いたことに、該方法における段階(i)の該重合反応の様々なパラメータを僅かに調節することにより、該基板と結合したポリシランポリマーの厚みを変えることが可能であり、一方でその均一な構造(及び結果的に生体分子を保持する能力)、及び該基板表面上に正確に配置する能力を依然として維持し得ることを見出した。該重合反応の時間を、数分〜12時間なる範囲内で変えることによって、また更にアセトン中での超音波処理段階の時間を変えることによって、該ポリマーを、数nm〜数μmなる範囲の厚みで製造することができる。当業者は、該ポリシランポリマーの厚みを測定する方法については熟知しており、該厚みは、例えば表面プロフィロメトリー(profilometric)技術又は原子間力顕微鏡(AFM)を使用して測定される。
【００３０】
適当には、該ポリマーの厚みは、少なくとも10nm、より相応しくは少なくとも25nm、より一層相応しくは少なくとも50nm、及び最も相応しくは少なくとも1種の100nmなる値である。本発明者等は、このような厚みを持つポリマーが、本発明の方法の段階(ii)において、引続き該ポリマーに、生体分子を結合する上で有用性を持つことを見出した。しかし、本発明者等は、該ポリマーに結合される生体分子の濃度を、該ポリシランポリマーの厚みをより一層厚くすることによって、更に高めることが可能であることを見出した。従って、好ましくは該ポリマーの厚みは、少なくとも150nm、より好ましくは少なくとも200nm、及びより一層好ましくは少なくとも500nmである。
従って、本発明者等は、驚いたことに、高濃度の生体分子を、該ポリシランポリマーに結合することにより、該基板と結合する、効果的な技術を工夫した。本発明者等は、如何なる仮説にも何ら拘泥するつもりはないが、従来技術(該基板上に形成された該ポリシラン層が、確実に2-次元単分子層であることを教示している)の教示とは全く対照的に、本発明の第一の局面による該方法においては、該基板上に形成された該ポリシランポリマー層が厚いほど、良好である。これは、該ポリマーと生体分子との結合が、改善されているからである。
【００３１】
従って、固定化すべき生体分子の最大量を、該ポリマーに結合することが必要である場合には、該基板上の該ポリマーの厚みを、少なくとも750nm、より好ましくは、少なくとも1,000nm、より一層好ましくは少なくとも1,500nm、及び最も好ましくは少なくとも2,000nmとすることが好ましい。事実、本発明者等は、厚み数μm(3〜10μmなる範囲)のポリマーを生成することが、後の、これと生体分子との結合にとって最も有利であるものと考えている。
該基板上での該ポリシランポリマーの製造に続き、次に生物学的分子を、本発明の方法の上記段階(ii)に従って、該ポリマーと接触させる。本発明の方法の該段階(i)によって、該基板と結合した該ポリマーの製造後、該段階(ii)は、該ポリマーと該生物学的分子とを接触させる工程を含む。例えば、本発明の方法の段階(ii)は、好ましくは該基板を、適当な濃度にて、結合すべき生物学的分子を含有する、適当な緩衝溶液中で、インキュベートする工程を含む。適当な緩衝溶液の例は、アセテートバッファー、HEPES(N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸)、MES(2-(N-モルホリノ)-エタンスルホン酸)、MOPS(3-(N-モルホリノ)-プロパンスルホン酸)、TRIS(トリス(ヒドロキシメチル)アミノエタン)、PIPES(ピペラジンーN,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)、又はカーボネートバッファーを含むことができる。
【００３２】
しかし、好ましいバッファーは、リン酸緩衝生理塩水(PBSバッファー)を含む。該バッファー中の該生物学的分子の適当な濃度は、結合すべき生物学的分子の型及び濃度に依存し、また当業者には公知であろう。しかし、一例として、典型的な酵素の適当な濃度は、約10〜約100μg/mLなる範囲内にある。
該基板と、該生物学的分子とを、十分な時間、適当な温度にて接触させて、該生物学的分子と該ポリシランポリマーとを結合させる。好ましくは、該生体分子は、本発明の方法の該段階(ii)において、該ポリシランポリマー上に及びその内部に、吸収及び/又は吸着される。好ましくは、該生体分子は、該ポリマー上に及びその内部に吸収及び吸着される。また、インキュベート時間及び温度は、該結合すべき生物学的分子型に大きく依存するであろう。一例として、適当なインキュベート時間は、約10分〜約5時間なる範囲内であり得る。最も好ましいインキュベート時間は、約1時間であり得る。該インキュベート温度は、約21℃〜約37℃なる範囲内であり得る。該生物学的分子と接触させた後、該基板を次に、例えば更なるバッファー溶液(如何なる生物学的分子をも含まない)及び/又は水で濯ぐことができる。次いで、該基板を、使用前に冷蔵庫(4℃)内で保存することができる。
【００３３】
該生物学的分子は、一本鎖又は二本鎖であり得る、核酸分子(例えば、DNA、RNA等)、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、酵素、抗体、又は細胞等を含むことができる。本発明者等は、該基板表面に、数種の異なる型又は種の生物学的分子を固定化することの効能を検討し、該方法が如何に良好に作用するかをテストした。考察すべき、このような生物学的要素の例は、酵素、抗体、及び核酸(DNA)分子を含んでいた。
結果的に、該段階(ii)において結合すべき生物学的分子は、酵素を含むことができ、この場合、ポリマーを含む該基板を、酵素を含むバッファー溶液中に維持することもできる。酵素の例として、本発明者等は、蛍光染料のフルオレセインイソチオシアネート(FITC)で標識された、ホースラディッシュパーオキシダーゼ(HRP)を使用した。本発明の方法の該段階(i)によって、該基板に結合された該ポリマーの調製に続く、該段階(ii)は、適当な濃度にて該生体分子を含む適当なバッファー溶液中で、該基板をインキュベートする工程を含む。好ましいバッファーは、PBS溶液を含む。該バッファー中の該生体分子の適当な濃度は、該生体分子の型に依存し、また当業者には公知であろう。しかし、一例として、典型的な酵素、例えばホースラディッシュパーオキシダーゼの、適当な濃度は、約100μg/mLである。
【００３４】
該基板を、該酵素を含有するバッファー中で、十分な時間及び適当な温度にてインキュベートし、該酵素と該ポリマーとを結合させることができる。一例として、適当なインキュベート時間は、約1時間であり得る。該インキュベート温度は、室温(約21℃)であり得る。該酵素を含有するバッファー中でインキュベートした後、該基板を次に、例えば更なるバッファー溶液(如何なる生物学的分子をも含まない)及び/又は水で濯ぐことができる。
該段階(ii)において結合すべき該生物学的分子は、抗体であり得、この場合、該ポリシランを含む該基板は、抗体を含むバッファー溶液中に維持することができる。抗体の適当な濃度は、約10μg/mLであり得る。この基板を、約1時間、約37℃なる期間に渡り、インキュベートすることができる。次いで、約5分間に渡り、洗浄用バッファー又は水と共に該サンプルを穏やかに振とうすることによって、該過剰量の抗体を、除去することができる。洗浄用バッファーの一例は、0.05％のトライトン(Triton) X100を含有するPBSを含む。次いで、該基板表面を、好ましくは抗体遮断溶液で処理する。適当な遮断溶液の例は、0.5％のBSAを含むPBSである。この遮断処理は、37℃にて約1時間行うことができ、その後更に濯ぎ、また場合により更に洗浄することもできる。
【００３５】
該段階(ii)において結合すべき該生物学的分子は、核酸であり得、この場合、該ポリマーを含む該基板は、核酸を含むバッファー溶液中に維持することができる。一例として、ローダミンレッド染料で標識し得るDNA配列は、DNA-含有バッファー溶液から該ポリマーに直接吸収及び/又は吸着させることができる。DNAの適当な濃度は、約0.3μMであり得る。
本発明者等は、該ポリシランポリマーと該生物学的分子との結合段階(本発明の方法の該段階(ii))が、吸収(即ち、該生物学的分子が、該ポリマー内に侵入し、該生物学的分子と該ポリマー自体との間の、比較的弱い静電相互作用によって、その内部に収容されている)及び/又は吸着(即ち、該生物学的分子が、該ポリマーの表面に弱い力で結合されている)のいずれかの現象を含み得ることを見出した。本発明者等は、該ポリシランポリマーが、その架橋された3-次元多孔質構造内に及びその上に、該生物学的分子を吸収する能力を持つことを知った時には、全く驚いた。
【００３６】
如何なる仮説にも拘泥するつもりはないが、本発明者等は、該生物学的分子が、図3に示したように、該ポリマーの架橋されたシランモノマー間に形成された、間隙又は空間内に吸収されるものと考えている。本発明者等は、該生物学的分子が、弱い静電的な相互作用によって(共有結合ではなく)、該ポリマー構造内に維持されているので、該分子は、驚くほど有効な程度に、その生物学的な活性を維持しているものと信じる。更に、本発明の方法を使用した場合、該生物学的分子と該ポリマー、及び結果として該基板との結合に係る分解能は極めて高く、即ち約1μmまでであり、また高い鮮鋭度を持つe-ビームリトグラフィーと組合わせた場合には、数百nm程度まで、改善することが可能であろう。上記の重合工程は、「その場で」起るので、著者等は、該ポリマーパターンの解像度が、該レジスト上でのリトグラフィー段階中に生成される、特徴のみによって制限されるものと信ずる。e-ビームリトグラフィーの場合に、該レジストは、電子ビームに暴露され、該ビームが、該レジストの表面上に所定の特徴を描き、その分解能を、UVに基くフォトリトグラフィー技術の値とほぼ匹敵する、nmスケールにまで、劇的に改善する。
【００３７】
本発明の方法は、事実上任意の基板表面上に、生物学的分子を固定化するのに利用できることが理解されよう。例えば、第一の局面の方法は、医療デバイスの表面、及びインプラント等の、任意の表面上に、生物学的分子を固定化するのに利用でき、ここで該表面は、生物学的な実体によって、官能化する必要があるものである。従って、例えば該基板は、任意の固体表面、例えばガラス、金属、例えば金、銀、プラチナ、パラジウム等を含むことができる。しかし、本発明者等は、特にバイオセンサの開発に興味があり、該センサは、酸化ケイ素基材表面を含むことのできる、ターゲット被検体分子を検討するために使用できる。従って、該基板が、酸化珪素を含むものであることが最も好ましい。即ち、本発明の方法は、表面を、高濃度の活性な巨視的生体種で官能化することが望ましい、小型化された分析装置、例えばバイオセンサ、又は移植可能な医療デバイスを包含する、任意の系の製造において利用できる。
【００３８】
該基板が、金等の金属を含む場合、本発明の方法は、これに該ポリシランポリマーを結合する、該段階(i)の実施に先立って、該基板の予備-官能化用の段階を含むことができる。放射線感受性物質を該基板上に塗布し得る、本発明の方法の一態様によれば、該予備-官能化用の段階は、該放射線感受性物質を適用する前又はその後に、行うことができる。例えば、アミノ基を持つ層を、硫黄含有分子、例えばシスタミン又はシステアミン内に含めることができる。このようなアミノジスルフィド又はアミノチオールは、金の上に化学的に収着され、また極めて緻密で組織化された単分子層を形成することが知られている。これは、該重合反応のための、開始点として、有機シランとの反応のために使用できる。
【００３９】
要約すれば、本発明者等は、高精度のリトグラフィーパターニング技術を用いて、基板上への、ある型の生物学的分子の固定化(即ち、結合)を検討した。該基板への該生物学的分子の結合は、3-次元配向で、即ち該支持基板の面に対して平行な方向に、かつ該基板の面を実質的に横断するように達成される。該ポリシランポリマーが、先ず本発明の方法の該段階(i)において、該基板上に形成される。アセトンを用いて放射線感受性物質(存在する場合には)を除去した後、該生物学的分子を、本発明の方法の該段階(ii)において、スポンジ状の3-次元ポリシランポリマー構造内及びその上に、物理的に吸着及び/又は吸収させる。該基板の背景及びリトグラフィーによって形成された化学的なパターンが、同一の平坦な寸法を分け合っている、技術公知技術のパターニング技術とは対照的に、本発明の第一の局面による方法を用いて選択的にパターン化された、生物学的分子の量は、驚いたことに、パターンを持たない領域に特異的に吸着されることのない、単分子層に含まれる該生体分子よりも、数オーダー高いレベルにある。
【００４０】
該「その場での」重合反応は、2-官能性の有機シランに基くものであり、該有機シランは、高度に塩基性の条件下で、先ず該酸化珪素表面と反応し、次いで該溶液由来のアミノシラン分子と反応する。本発明の方法における、溶媒としてのトリエチルアミン(TEA)等の有機塩基の使用は、この化学的な工程(該重合反応)を高効率にし、かつ標準的なバイオセンサの製造において最も一般的に使用される、ノボラックを主成分とする群のレジストを包含する、多数のレジストと完全に相溶性とする。有利には、該重合反応は、極めて穏やかな条件下で、室温にて及び大気圧下で行われる。該シリコン表面において一旦パターン化されると、該ポリマーは、水性媒体中で、極めて安定となり、またその3-次元構造内に又はその上に、生物学的分子を吸収する高い能力を示す。
【００４１】
実施例において説明するように、該ポリシランポリマーの構造及びこれと結合した生物学的分子は、操作型電子顕微鏡(SEM)、原子間力顕微鏡(AFM)及び共焦点顕微鏡によって特徴付けられている。数種の異なる型の生物学的要素、例えばDNA、タンパク質、酵素及び抗体が、1μの解像度で、シリコン表面上に首尾良くパターン化されている。このような高い解像度は、該基板支持体上に、該生物学的分子を、直接配置するのに極めて有利である。その上、この生物学的なパターニング技術の融通性は、シリコンの微細加工技術に制限されるものではない。というのは、その全手順が、金の表面にも適用されているからである。
更に、もう一つの態様において、正に単一の型のあるいは種の生物学的分子を、該基板に固定化するために、本発明者等は、また、高度に正確なパターニング技術を利用して、2以上の型又は種の生物学的分子を、該基板に結合することが可能であるか否かを検討した。また、これは図2との関連で、実施例において説明する。これは、2以上の型の生物学的分子が、表面上で必要とされるような状況において有用である。
従って、本発明の第一の局面に従う該方法の段階(ii)は、該基板上に形成された、該ポリシランポリマーに、複数の異なる種の生物学的分子を結合する工程を含む。該異なる種は、別々の隔置された位置、又は一緒に混在した状態で、該基板に結合することができる。
【００４２】
本発明者等は、複数の異なる種の生物学的分子の基板への結合が、例えば多重-被検体バイオセンサの製造における有用性を持つであろうと確信する。実施例1に記載したような、その第一の態様として、該複数の生物学的分子の該基板への結合は、また3-次元配向状態で、即ち該支持基板の面に対して平行な、かつまた該基板の面を横断するように実現される。
本発明の方法の第一の局面の、第一の態様におけるように、第二の態様の該段階(i)は、該基板上での、実質的に3-次元のポリシランポリマーの製造工程を含む。該ポリマーは、該基板の表面全体に、あるいは予め規定したターゲットサイトに結合することができる。この段階に引続き、該ポリマーを、好ましくは化学的な保護層で被覆される。ここで該保護層は、望ましからぬ後の化学的な処理から、該ポリマーを保護するのに適している。適当な化学的保護層の例は、スクロース、又は寒天ゲル等のヒドロコロイド、セルロース、ジェランガム、ペクチン又はカラギーナンを包含し、これらは熱可逆性ゲルである。しかし、好ましい化学的保護層は、ゼラチンを含む。該化学的保護層は、適当な手段、例えば、実施例2に記載するように、適当な濃度(例えば、50μg/mL)のゼラチン溶液の存在下で、該基板の回転塗布を行うことにより、該ポリシランポリマー上に被覆することができる。
【００４３】
該化学的保護層の厚みは、該ポリシランポリマー上で、約1nm〜1,000nmなる範囲、より好ましくは約10nm〜750nmなる範囲、より一層好ましくは約100〜500nmなる範囲、及び最も好ましくは約200〜400nmなる範囲にある。本発明者等は、以下に説明するように、このような厚みが、望ましからぬ後の化学的な処理から、ポリシランポリマーを保護するのに最適なものであることを見出した。
次いで、本発明の方法は、好ましくは該基板を(又は該化学的保護層)を、好ましくは標準的なリトグラフィー技術を利用して、放射線感受性物質の層で被覆する工程を含む。好ましい方法を、ここで説明する。一旦、該放射線感受性物質が、該化学的保護層を覆ったら、次に該基板を好ましくは標準的なエッチング技術を用いて、放射線源に暴露する。例えば、マスク又はマスクレスリトグラフィー技術を利用して、該放射線感受性物質をエッチングし、あるいはパターニングすることができる。レジスト現像段階が、該基板の予め規定された領域から、該放射線感受性物質を除去して、該基板上に存在するポリマーの第一のターゲット領域を露出させるために必要とされる。その際に、該生物学的分子が、固定化されることになる。
【００４４】
追加の現像段階を、該レジストパターニング工程において、好ましくは温水を用いて(約37℃にて約1分間)実施する。有利には、この工程は、該ポリシランポリマーが、次の段階のために露出される、限定された領域を生成する。該次工程においては、生物学的分子が、該ポリマーに結合される。
本発明の方法は、次に該基板と生物学的分子の第一の種とを接触させる工程を含む。好ましくは、該基板を、生物学的分子の第一の種の存在下で、インキュベートする。この方法が、該ポリマーと結合される特定の生物学的分子に限定されるものではないことが理解されよう。例えば、該生物学的分子は、核酸分子(例えば、DNA、RNA等)、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、酵素又は細胞等を含むことができる。好ましくは、該インキュベート工程を、適当な温度にて、適当なバッファー中で行って、該生物学的分子を、該ポリマー上の該ターゲット領域に結合する。
該生物学的分子の、該ポリマーへの結合に続き、該方法は、好ましくは該基板を再度化学的な保護層で被覆する工程を含む。好ましくは、該化学的保護層は、該基板を、以後の化学的な処理から保護し、また好ましくは上記段階において使用したものと同一である。従って、好ましい化学的保護層は、ゼラチン製である。この化学的保護層は、該基板上に回転塗布することができる。
【００４５】
好ましくは、該基板を、再度放射線に暴露して、該放射線感受性物質の選択されたターゲット領域を除去する。例えば、以前に、該放射線感受性物質のターゲット領域を除去するために、UV輻射を使用した場合、この工程においてもUV輻射を、該物質の除去のために使用する。上記と同様に、このリトグラフィー工程は、マスクを使用し、もしくは使用せずに行うことができる。次の現像段階の後、該ポリマーの第二のターゲット領域を露光し、第二の種の生物学的分子を自由に吸収できるようにする。好ましくは、該第二の種の生物学的分子は、該第一の種の生物学的分子とは異なるものである。例えば、前者は、異なる核酸分子の配列(例えば、DNA、RNA等)、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、酵素又は細胞等であり得る。あるいはまた、該第二の種の生物学的分子は、全く異なる型の分子であっても良い。例えば、該第一の種の生物学的分子が、核酸であり、かつ該第二の種の生物学的分子が、タンパク質であり得、以下同様である。
【００４６】
次いで、更なる化学的に耐性(耐薬品性)の層の被膜を、該基板上に塗布することができる。従って、該ポリシランポリマーに対する生物学的分子のパターニング及び結合する段階を、「n」回繰り返すことによって、「n」個の異なる生物学的分子を、該基板上の該ポリマー上に選択的に結合することができる。本発明の方法の次工程は、あらゆる残留する放射線感受性物質及びあらゆる残留する耐薬品性物質を除去することからなる。これは、例えば該サンプルを、引続きアセトン及び温水に浸すことにより達成できる。
この方法の最終工程は、該基板表面を、適当な遮断剤、例えば0.5％のBSAを含むPBSで遮断して、非-特異的なタンパク質の吸収/吸着を防止することを含む。
【００４７】
従って、3-次元的に、1種の生物学的分子を該基板に結合する、該第一の態様に引続き、該第二の態様は、該基板に複数の種の生物学的分子を結合する工程を含む。従来のレジストリトグラフィーにおいて、2以上の型の生物学的分子のパターンを、同一の支持基板に形成する必要がある場合、重大な限界が見つかった。これは、生体分子の固定化及びレジストのパターニング手順が、これらの非-相溶的特長にも拘らず、共存関係になければならないという事実による。従って、驚いたことに、本発明者等は、この問題を回避する一つの解決策が、該新たにパターン化した生体分子を、その上に回転塗布した薄いゼラチン層(これは、あらゆる化学的な処理に対する保護層として機能する)で孤立化させ又は保護することであることを見出した。この手順は、例えば多重-被検体バイオセンサの製造における、感受性の高い生物学的分子の取り扱いを、完全に標準的な微細加工法と相容れるものとする。3-次元生物学的分子パターニング技術とゼラチン保護手順との組合せは、強固な多重-生体分子パターニング手順を作り出し、結果的に多数の多岐に渡る生物学的分子の、支持基板に対するサイト-選択的な固定化を、理論的には制限のないものとする。
【００４８】
本発明は、上記の第一の局面による方法を利用して製造した基板にも関連する。
従って、本発明の第二の局面によれば、該第一の局面に従う方法により得ることのできる、固定化された生物学的分子を含む基板が提供される。
該基板は、デバイスの支持表面を、生物学的な実体により官能化する必要のある、あらゆるデバイスとして、又はその製造において利用できる。
従って、第三の局面において、本発明は、該第一の局面に従う方法により得ることのできる、基板を含むデバイスを提供する。
例えば、該デバイスは、医療デバイス、又はインプラント、あるいは例えばバイオリアクタ、又はタンパク質カプセルであり得る。しかし、該デバイスは、好ましくはバイオセンサである。
従って、更なる局面において、本発明は、該第一の局面に従う方法の利用を含む、バイオセンサの製造方法を提供し、該センサにおいて、該基板はバイオセンサである。
【００４９】
バイオセンサは、分析デバイスであるものと理解すべきであり、これは生物学的に感受性の要素(生物学的分子)及び物理的又は化学的なトランスデューサ(基板)を含み、また該デバイスは、与えられた環境内における特定の化合物(被検体)の存在を選択的かつ定量的に検出するのに適したものである。バイオセンサの型とは無関係に、特定の生物学的な認識による如何なる変化も、該トランスデューサで捉えることができるように、該生体分子を固定化する必要がある。従って、該バイオセンサの製造中に、該トランスデューサ上の該生物学的分子の位置を制御でき、またその活性を該固定化工程中、確実に維持することが重要となる可能性がある。
小型化バイオセンサの一例は、櫛形電極(IDE)であり、その製造は、ミクロンスケールの鮮鋭度又は解像度で、金電極又はシリコン間隙のいずれかに、生物学的分子を結合することからなる。バイオセンサのもう一つの例は、微細-電気機械装置(MEMS)を含み、これは一体化された、マイクロメータスケールの機械的な部品を有する小型化電子デバイスからなる。該バイオセンサの特定の領域に、生物学的分子をサイト-選択的に固定化する能力が、その製造において極めて重要となる。
【００５０】
結果として、バイオセンサを製造するためには、本発明の方法を利用して、基板の生物学的な官能化を実施できることが好ましい。該バイオセンサは、MEMSバイオセンサであり得る。このようなバイオセンサの一例は、特許出願PCT/GB02/00237に記載されており、これを、参考としてここに組入れる。該バイオセンサは、トランスデューサを含むことができ、該トランスデューサは、マスレゾネータ又は円板型レゾネータであり得る。該バイオセンサは、生物学的ターゲット被検体の存在を検出するのに適したものであり得る。これは、該円板型レゾネータの振動モードにおいて発生する、振動数シフトを測定することにより達成できる。該円板型レゾネータの選択された領域を、捕獲/認識種によって変性して、該ターゲット被検体の特異的な結合用のサイトを提供することができる。例えば、適当な捕獲/認識種は、抗体等の生物学的分子を含むことができる。該ターゲット被検体(例えば、抗原)によって作られた付加的な質量の空間的な分布は、該レゾネータの線対称の質量分布を乱す可能性がある。
【００５１】
線対称の(完全な)円板のモードは、対として発生し、また各対は、共通の固有振動数を分合っているものと理解すべきである。これは、モードの縮退と呼ばれている性質である。付随的な質量が、不均一に該バイオセンサに堆積した場合、(該ターゲット被検体が、該捕獲/認識種によって捕獲された場合)、該モード対は、最早この共通の振動数を分け合うことはなく、また該モードの共鳴振動数は、付随的な質量(即ち、該被検体の質量)の量に比例して、「分割」される。従って、この振動数の分割の大きさは、問題としている該被検体の測定値を与える。
【００５２】
該分子の認識は、該アッセイ系の任意の成分の標識さえも必要とせず、従って有利には、該バイオセンサは、高価なシグナル質問器技術(例えば、フルオリメトリー(fluorimetry))を組込む必要がない。更に、該円板型レゾネータは、伝統的に、共鳴質量センサ(例えば、温度及び誘発される応力によって引起される効果)をもたらす問題によって影響を受けない。というのは、これら2つのモードは、等しく影響を受けるからである。即ち、本発明の方法を利用して製造したバイオセンサは、直接的な検出に対する多大な期待をもたらし、また数学的なモデル化からの予測並びに予備的なデバイスのテストにおいて得られた、振動数分割の再現性は、0.01ng/cm2なる大きさの、表面への付加量が、このデバイスによって測定可能であることを立証している。このことは、共鳴構造を基本とする既存の質量センサ(例えば、石英微量天秤)よりも2-位数まで、良好な質量感度を達成できるという予測と一致する。このようなセンサは、高い精度で、該センサ表面に、高濃度にて生物学的に活性なタンパク質を固定化する必要があることを、実証している。
【００５３】
ここに記載した特長全て(全ての従属請求項、要約書及び図面を包含する)、及び/又は開示された任意の方法並びに工程の全段階は、任意の組合せで、上記局面のいずれかと結合することができるが、但しこのような特徴及び/又は段階の少なくとも幾つかが、相互に排他的である組合せを除く。
本発明を、より一層よく理解するために、また本発明の態様が、実際にどのように実施できるかを示すために、例として、添付図面を参照することができる。
【実施例】
【００５４】
本発明者等は、かなり高い精度で、かつサイト-特異的な様式で、支持基板上に、官能性の生物学的分子(例えば、タンパク質、酵素、抗体、DNA分子等)を、効果的に結合する、本発明の方法の効能を検討した。この方法は、生物学的分子を利用する、バイオセンサ及び他の小型分析装置の製造に適用できる。
実施例1は、単一の型の又は単一の種の生物学的分子又は生体分子(即ち、特定の規定された配列を持つ、ある種の抗体、酵素又はDNA分子)の、支持基板に対する固定化に付き説明する。これは、「モノ-タンパク質」法と呼ばれる。3Dモノ-タンパク質のパターニングのために使用する、手順の概観は、実施例1に記載されており、またこの場合には、図1を参考にしている。実施例1a-1cは、該3Dモノ-タンパク質のパターニング工程の各段階を、更に詳細に説明している。
実施例2は、2以上の異なる型のあるいは種の生物学的分子又は生体分子(即ち、異なる規定された配列を持つ、異なった抗体、酵素又はDNA分子)の、ある型の支持基板に対する固定化に付き説明する。これは、「多重-タンパク質」法と呼ばれる。
【００５５】
物質及び方法
全ての実験は、酸化珪素ウエハから切出した、1×1cm2のチップについて行った。この材料が、該生物学的分子を固定化するための、基板表面を構成した。あらゆる変更に先立って、該シリコンの表面を、沸騰しているピラニア溶液(H2SO4/H2O2, 7:3)で1時間処理して、清浄化し、脱イオン(DI)水で徹底的に濯いだ。
ここで説明するように、ポリマーネットワークパターニングのために、アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)及びトリエチルアミン(TEA)を、夫々シグマ-アルドリッチ(Sigma-Aldrich)社及びフルカ(Fluka)社から購入した。
数種の生物学的要素(生体分子)を、該酸化珪素基板上に直接パターン化し、あるいはまた特定の識別物質の結合後に、生物学的分子を顕在化するために使用した。これらの生物学的分子は、以下のものを含んでいた：未標識のヒトIgG(h-IgG)；マウスIgG(m-IgG)；フルオレセイン染料FITCで標識した抗-ヒトIgG(抗-h-IgG-FITC)；フィコエリトリンレッドで標識した抗-マウスIgG(抗-m-IgG-R-Phy)；FITCで複合化したホースラディッシュパーオキシダーゼ(HRP-FITC)；ニシンの精液DNA；及びウシ血清アルブミン(BSA)。これらは、全てシグマ-アルドリッチにより精製され、かつ提供された。
【００５６】
DNA配列は、MWGによって提供された。その一本鎖DNAプローブは、12炭素原子を含むスペーサを含み、また20個の塩基で構成されていた。これらDNAプローブは、未標識であるか、あるいはローダミンレッド染料で標識されていた。その相補的な又は非-相補的なDNAストランドは、20個の塩基で構成され、また両者ともFITCによって標識されていた。
A型のゼラチンを、該多重-タンパク質パターン化手順(実施例2)において使用し、これは豚起源(約175ブルーム)のものであり、またシグマ-アルドリッチから購入した。
実施例1：3-次元(3D)モノ-タンパク質パターニング手順の概観
本発明者等は、一つの型又は一つの種の生物学的要素又は生体分子(即ち、モノ-タンパク質)の、酸化ケイ素支持基板への結合又は固定化に付き、高精度のパターニング法を利用して検討した。該生体分子の該基板への結合は、3-次元配向で、即ち該支持基板の面に対して平行で、かつまた該基板の面を実質上横断するような配向で、達成される。
【００５７】
この3-次元モノ-タンパク質パターニングのために使用される段階を、図1に示す。該酸化ケイ素基板表面を、先ずノボラックを主成分とするレジスト層で被覆する。興味ある特徴(即ち、生物学的分子を結合することになる、該基板の特定の領域)を、リトグラフィーマスク(図示せず)から、UV光の照射及び化学的現像によって、該レジストに転写して、図1(a)に示すような特徴を生成する。これらの標準的なリトグラフィー段階は、当業者には周知であろう(Kane, R.S.等, Biomaterials, 1999, 20:2363-2376; Blawas, A.S.等, Biomaterials, 1998, 19:595-609; Wilson, D.S.等, Curr. Op. Chem. Biol., 2002, 6:81-85)。
第二に、該シリコン基板表面の新たに露光した領域を、次に図1(b)に示すように、「その場」でのアミノシラン重合工程によって化学的に変性する。この重合工程は、アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)及びトリエチルアミン(TEA)を使用し、また実施例1bに詳しく記載されている。
第三に、残留しているフォトレジスト材料を、次に、図1(c)に示すように、アセトン中での超音波照射によって、該基板から除去する。
第四に、一旦約3時間に渡り、120℃なる温度に暴露して、該重合工程を終了し、また該シリコン基板と結合させた、該パターン化されたポリシランポリマーネットワークは、図1(d)に示すように、3-次元構造で、該基板中に、及び同様にその上に、生物学的分子を吸着し及び吸収する準備が整っている。
【００５８】
実施例1a：フォトリトグラフィー
フォトリトグラフィー法を、高度にサイト-特異的な様式で使用して、図1(a)に示す如く、該基板表面に放射線感受性フォトレジスト材料を適用した。モノ-タンパク質及び多重-タンパク質パターニング手順(実施例2に記載される)両者に関連して、ポジ型のノボラックを主成分とするフォトレジスト(ミクロポジット(Microposit) SPR 220/7)を、該酸化珪素支持基板ウエハ上に、3500rpm、120秒間、加速1000rpm/sにて回転塗布した。次に、これを、ホットプレート上で95℃にて5分間、軽く焼付けて、実質的に該基板表面全体に拡がる、厚み7μmのフォトレジスト材料の環構成の層を生成した。
【００５９】
一旦、該フォトレジストを、ホットプレート上で95℃にて5分間、軽く焼付けし、次に該基板ウエハを、UVを放出する広帯域の水銀ランプで、フォトリトグラフィーマスクを介して、18秒間露光した。適当なマスクの設計及びその使用は、リトグラフィーに馴染みのある当業者には公知であり、また(水銀ランプによって)該UV輻射に暴露された際に、予め設計されたパターンを持つUV輻射が、該フォトレジスト材料上のマスクを通過するように予め準備されているであろう。同様に、例えば一連のミラーを用いるマスクレスリトグラフィーを用いて、該基板上の該フォトレジスト材料を、サイト-特異的に露光できるものと理解すべきである。該放射線に暴露した後、TMAHを主成分とする現像剤(ミクロポジット(Microposit) MF-26A、0.26N)の、60秒間の2サイクルを利用して、該基板を現像する。現像は水で停止させ、次いで該フォトレジストをパターン化した基板ウエハを、気流中で乾燥させた。フォトリトグラフィーの結果は、該基板ウエハの上部表面を横切る、フォトレジスト材料の高度に正確なパターンを生成することにある。これは、今やダイと呼ぶことができ、図1(a)に示されている。
【００６０】
実施例1b：ポリマーネットワークパターン
一度該フォトレジスト材料を、該基板上にパターン化した後、重合反応を、図1(b)に示すように行った。発生する「その場での」重合反応に関連して、フォトレジストをパターン化した該ダイは、少なくとも5時間、室温にて、純粋なトリエチルアミンに分散させた、2％(v/v)APTES(アミノプロピルトリエトキシシラン)溶液中に放置した。この重合反応中、ポリシランポリマーネットワーク構造が、該フォトレジスト材料の表面及び直接フォトレジスト材料で覆われた領域間の、露出した酸化ケイ素基板の両者の上に、図1(b)に示すように形成される。
次いで、該ダイを気流中で乾燥させ、また分5間アセトン中で超音波処理して、図1(c)に示すように、該フォトレジスト材料を除去した。この段階において、該重合反応は完了しておらず、また該ダイは、120℃で少なくとも3時間、硬化する必要がある。この硬化工程中に、蒸発によって残留するアミノシランを除去し、また該シロキサンの横方向の縮合及び該架橋重合工程両者を、図1(c)に示すように行うことができる。
【００６１】
該重合反応式の一例を、図3に示す。図3(a)を参照すると、該酸化珪素基板ウエハが図示されており、これは、該基板から横方向に伸びている一連のヒドロキシル基(-OH)を有する。図3(b)を参照すると、相互に及び該酸化珪素基板との間に、共有結合によるシロキサン結合を形成している、多数のアミノプロピルトリエトキシシラン分子が示されている。この重合反応の結果は、図3(c)に示すように、該基板と結合した、3-次元の、共有結合したアミノシロキサンポリマーネットワークの製造である。
図1(c)に示された、該パターン化されたポリマーネットワークの特徴付けは、表面プロフィロメトリー、走査型電子顕微鏡(SEM)、共焦点顕微鏡及び原子間力顕微鏡(AFM)を利用して実施した。該アミノシロキサンポリマーネットワークの厚みは、該有機ポリマーの屈折率を1.465であると考えて、光学表面プロフィラー(ジゴニュービュー(Zygo NewView) 5020)を用いて測定した(Vandenberg, E.T.等, J. Colloids. & Interf. Sci., 1991, 147: 103-118)。しかし、該輪郭像における該屈折率の寄与は、自動スパッタコーター技術(アガーオートマチック(Agar Automatic) A2890、アガー社(Agar Ltd.)により、該サンプル全体に薄い金の層(10-20nmなる厚み)をスパッタリングすることによって、回避した。該ポリマーネットワークの自己蛍光発光挙動は、共焦点レーザー走査型顕微鏡(レルカ(Lerca) TCS SP2 UV、ライカマイクロシステムズ(Leica Microsystems)ハイデルベルグ)を用いることにより、そのトポグラフィーの特徴付けを可能とする。該シランポリマーネットワークの構造的な形態学も、従来のSEM(ジェミニエレクトロンオプチックス(Gemini electron optics) LEO エレクトローネンミクロスコピー(Elektronen mikroskopie) Gmb)を使用して演繹され、ここで該サンプルは、予め薄い金層(厚み8nm)で被覆して、該ポリマーを電気的に導電性とされ、またタッピングモードAFM(マルチモードスキャンニングプローブマイクロスコープ(Multimode Scanning Probe Microscope)、ナノスコープ(Nanoscope) IVコントローラ)を使用して、該形態を演繹した。
【００６２】
実施例1c：該ポリシランポリマーネットワーク上での、生物学的分子の吸収/吸着
該シランポリマーネットワークの製造に引続き、生物学的分子(例えば、抗体の特定の種)を、該シリコン基板ウエハに添加し、結果として該分子をそこに吸収させ、またこれに吸着させた。特定の識別物質の結合後の、高度に特異的なタンパク質のパターニングを明らかにするために、数種の生物学的要素(生体分子)を、直接パターン化し、あるいは使用した。このような生物学的要素の例は、酵素、抗体及びDNA分子を含んでいた。具体的なその例は、未標識のヒトIgG(h-IgG)；マウスIgG(m-IgG)；蛍光染料FITCで標識した抗-ヒトIgG(抗-h-IgG-FITC)；フィコエリトリンレッドで標識した抗-マウスIgG(抗-m-IgG-R-Phy)；該染料FITCで複合化したホースラディッシュパーオキシダーゼ(HRP-FITC)を含んでいた。
【００６３】
(i) 酵素の吸収/吸着
酵素の一例として、本発明者等は、蛍光染料、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)で標識したホースラディッシュパーオキシダーゼを使用した。該パターン化された上及びその内部へのHRP-FITCの吸収の場合には、先ずポリマーネットワークでパターン化された基板サンプルを、実施例1bにおいて既に詳しく説明したような手順を用いて、製造した。次いで、この基板を、タンパク質PBS溶液(100μg/mL)と共に1時間室温にてインキュベートした。次に、HRP-FITCサンプルを、連続的にPBS及びDI水で濯いだ後、蛍光顕微鏡下で分析した。これらのサンプルは、冷蔵庫内(4℃)で保存し、またフルオレセイン染料の分解を回避するために、光から保護した場合には、数週間安定であることが示された。一サンプルを24時間PBS溶液中に維持したが、蛍光強度の顕著な喪失は観測されず、このことは、該吸収されたHRPの安定性が高いことを立証している。
【００６４】
(ii) 抗体の吸収/吸着
イムノアッセイ実験(即ち、抗体実験のために)、該ポリマーネットワークをパターン化した基板サンプルを、「抗体プローブ」PBS溶液(10μg/mL)中に、37℃にて1時間維持した。該サンプルを、洗浄バッファー（PBS中0.05％のTriton X100)と共に、5分間に渡り穏やかに振とうすることによって、過剰量の該抗体を除去した。次に、該基板サンプルの表面を、遮断溶液(PBS中、0.5％のBSA)で、37℃にて1時間処理し、再度洗浄溶液で5分間濯いだ。最後に、このサンプルを、穏やかに振とうしつつ、室温にて1時間、抗原溶液(10μg/mL)中でインキュベートした後、最後の洗浄段階を行った。例えば、使用する該抗体が、マウスIgG(m-IgG)であった場合、使用する該抗原は、フィコエリトリンレッドで標識した抗-マウスIgG(抗-m-IgG-R-Phy)であった。同様に、使用する該抗体が、未標識のヒトIgG(h-IgG)であった場合、使用する該抗原は、蛍光染料FITCで標識した抗-ヒトIgG(抗-h-IgG-FITC)であった。該パターン化された抗体の特異性を制御するために、ヒトIgGを吸収したサンプルは、抗-マウスIgGと共にインキュベート状態に維持した。この抗体の固定化の特徴は、吸収過程にあり、そこでは、弱い相互作用、例えば静電相互作用、水素結合及びファンデルワールス力が作用している。
【００６５】
(iii) DNA分子の吸収/吸着
該オリゴDNAプローブを、pH9.6の炭酸塩バッファー中で調製した0.3μM溶液から、ポリマーをパターン化したサンプルに吸収させた。この吸収は、室温にて30分間維持した。ハイブリッド化実験のために、該DNAで変性したサンプルを、洗浄バッファー(PBS中、0.05％のTriton X100)中に、穏やかに振とうしつつ、5分間浸漬させた。該DNA-プローブで被覆されたサンプルを、遮断溶液(PBS中の、100μg/mLのニシン精液DNA)中に、室温にて、1時間浸漬することにより、オリゴプローブが配合されなかったポリマーの全領域を、遮断した。FITCで標識した相補的及び非-相補的DNAのハイブリッド化を、対応する2μM DNA溶液中での、37℃、2時間の、該遮断したプローブサンプルのインキュベートにより行った。該変性サンプルを、洗浄バッファー中で5分間穏やかに振とうすることにより洗浄し、また脱イオン水で濯いだ。
酸化珪素サンプル上にパターン化した該ポリシランポリマーネットワークへの、酵素、及びDNAの吸収/吸着を、該ラベルの励起/発光波長に対応するフィルタを備えた、蛍光顕微鏡(Fluorescent Microscope; オリンパス(Olympus) BX2 ライトマイクロスコープシステム(Light Microscope System))を使用して追跡した。吸収された抗-h-IgG-FITC(10μg/mL、37℃にて1時間)と共に実施する共焦点顕微鏡観察実験のために、ポリマーのパターン化は必要とされず、また全ガラス表面を、ポリマーネットワークの厚い層(約2μm)で変性した。この方法は、該厚いポリマー層内に吸収された、有用な該FITC-標識抗体のXZ断面の撮像を可能とした。
【００６６】
実施例2：3-次元多重-タンパク質パターニング手順
本発明者等は、同様に2以上の型の生体要素又は生体分子(即ち、多重-タンパク質技術)を、高度に正確なパターニング技術を利用して、酸化ケイ素支持基板上に結合することを検討した。実施例1と同様に、該複数の生物学的分子の、該基板への結合は、3-次元配向で、即ち該支持基板の面に対して平行で、かつまた該基板の面を横断するような配向で、達成される。この手順のために使用する方法論は、図2に示されている。
図2(a)及び図2(b)を参照すると、該酸化ケイ素基板の全表面は、実施例1(a)(段階1)において詳述したものと同様な実験条件を使用して、該ポリシランポリマーネットワークによって、化学的に変性されている。次いで、この基板表面を、ゼラチンの薄い層(200-400nmなる厚み)で被覆する(段階2)。これは、フォトレジスト層(厚み7μm)を用いて、図2(b)に示したように、ゼラチン溶液(50μg/mL-1/DI水)を回転塗布することにより得られる。
【００６７】
次いで、図2(c)に示したように、古典的なフォトリトグラフィー技術工程を実施するが、そこでは該基板は、フォトレジスト被膜が与えられ(段階3)、またマスク(マスクレスリトグラフィー技術も同様に効果的であることを理解すべきである)を介して、UV輻射線現に暴露される(段階4)。しかし、特別な現像工程が、温水を用いて行われ(37℃にて1分間)、制限された領域が生成され、そこでは、該ポリシランポリマーネットワークが、該溶液の界面に露出する(段階5)。図2(d)に示したように、次に生物学的な要素(BE1)を添加し、該ポリマー上に吸着させる(段階6)。次いで、これを、薄い回転塗布されたゼラチン層で覆い、以下の化学的な処理からこれを防御する(段階7)。
図2(e)に示したように、該シリコン表面は、別のフォトレジストリトグラフィーマスクを用いて、再度UVに暴露され(段階8)、再度現像され(段階9)、また該ポリマーネットワークの新たな領域が、別の生物学的要素(BE2)を自由に吸収する(段階10)。次いで、更なるゼラチン被膜を付加する(段階11)。これらのパターニング/タンパク質吸収サイクルをn回繰り返すことによって、n個の異なる生物学的要素を、該シリコン表面に選択的にパターン化することができる。以下の段階は、該サンプルを連続的にアセトン及び水に浸すことによって、連続的に残留するフォトレジスト(段階12)及びゼラチン(段階13)を除去することからなる。最後に、表面のバックグラウンドを、PBS中の、0.5％のBSA溶液で遮断して、タンパク質の非-特異的な吸着/吸収を防止する(段階14)。
【００６８】
実施例3：結果及び議論
実施例3.1：バックグラウンド
厳密に、APTES単分子層を、酸化珪素上で、水平(2D)に重合するために必要な条件は、Vandenberg等, J. Colloids. & Interf. Sci., 1991, 147:103-118によって記載されている。これは、0.4％APTES溶液が該シリコン基板と反応するように残留している場合には、乾燥アセトン中で、室温にて1時間反応させることによって達成される。このような反応において、該基板上に形成されるAPTES層の厚みは、該サンプルを200℃にて24時間硬化させた後には、0.7nm以下である。しかし、該反応時間を24時間まで延長し、また該硬化工程を、空気中で24時間行った場合には、38nmという最大のAPTESフィルム厚を達成することができた。しかし、この38nmなる厚みのAPTES層は、水に24時間暴露した場合には、最早安定ではない。
同一の研究において、該著者は、トルエンを水又は有機溶媒、例えばトリクロロエチレン、キシレン、アセトン、エタノール又はクロロホルムに変えた場合のフィルムの厚みを比較したが、これらの値は、200℃にて24時間硬化した後には、僅かに0.5と1.4nmとの間で変動する。酸化珪素上での、APTESのシラン化の標準的なプロトコールは、トルエン、アセトン、エタノール、エタノール、水又はこれらの混合物中に希釈した、0.4％〜5％のAPTESとの間で、室温における30秒〜24時間に及ぶ反応からなる。これら全ての場合において、該APTESの厚みは、該基板上に、APTESの単なる単分子層又は薄いフィルムとして共有結合していると宣言した場合には、9nmを越えることはない。
【００６９】
本発明の図1及び2に記載されている、タンパク質のパターニング手順における新規な概念は、フォトレジスト材料で覆われた、該パターン化された酸化珪素基板表面と、該基板の平坦なバックグラウンド表面との間の、該3-次元のポリシランポリマーネットワークのサイト-選択的な識別力に基くものである。従って、該フォトリトグラフィー技術によって生成した、間隙内部で起るAPTESの「その場での」重合は、本発明の方法の重要な特徴の一つである。
実施例3.2：ポリマーネットワークの3-次元パターン
従来技術とは対照的に、本発明者等は、求核特性を持たない高度に塩基性(アルカリ性)の有機溶媒、例えばTEAを使用したが、これはAPTESが、該シリコン表面上に第一の単分子層(水平な2D重合)を形成する分子と、該溶液由来の分子(垂直な3D方向の重合)との間に、シロキサン結合を確立することを可能とし、結果として、図3に示したように、使用した実験条件に依存して、200nm〜数μmなる範囲の厚みを持つ、シロキサンポリマーを与える。
【００７０】
更に、該化学的な方法は、従来のノボラックを主成分とするフォトレジストと完全に相容れるものであるから、このフォトリトグラフィー技術によって作られるあらゆるパターン化製品は、該「その場での」重合工程用のマスクとして使用できる。図4を参照すると、あるバイオセンサの酸化珪素基板上にパターン化されたポリシランポリマーの、一連の顕微鏡写真が示されている。図4(a)を参照すると、該バイオセンサ上のフォトレジスト物質の4つのセグメントの位置が示されている。フォトレジストの断面形状の径は、60μmである。図4(b)を参照すると、その場での重合に引続きポリシランポリマーにより形成された、暗色の領域及び該レジスト物質の除去が示されている。図4(c)を参照すると、該ポリマーネットワーク中にパターン化された、一連の径3μmのドットが示されている。これは、本発明の方法の、高度にサイト特異的な様式で、極めて小さな規模にて、パターニングすることの有効性を示している。
パターン化された該ポリマーネットワークの厚みは、光学的なプロフィラーを用い、また該ポリマーの屈折率の値として1.465を使用して評価した。図5を参照すると、該酸化珪素基板上にパターン化した該ポリマーネットワークのSEM像が示されている。SEMの撮像を助けるために、該サンプルを、先ず金で被覆した(傾斜角85度、加速電圧：10kV)。SEM技術は、該バイオセンサ基板上の該ポリマーネットワークの厚みが、図5(b)に示すように、200nmであることを確認した。
【００７１】
このポリマーの厚み(200nm)と、APTES単分子層に関する文献値(0.7nm)とを比較すると、単分子層の数で表すと、該ポリマーネットワークは、APTESの286層の単分子層と「理想的に等価」であるものを推定することができる。該ポリマー構造は、垂直軸に沿って、相互に共有結合により結合した、数表層の単分子層で構成される規則的な構造にまで、過度に単純化することはできないものと理解されよう。それにも拘らず、本発明者等は、該ポリマーの厚みの測定が、重要な問題であると信じるが、その理由は、このことが、該シリコン表面上の、厚いポリマーネットワークパターンの存在を立証しているからであり、このパターンは、これまで決して達成されることはなかった。これは、3-次元タンパク質パターニングを実現するのに必要とされる、第一の条件である。本発明者等は、AFM、共焦点顕微鏡及びSEM等の技術を利用して、該ポリマーネットワークの構造を、推定した。SEM及びAFMの画像から、該ポリマー表面のトポグラフは、その形態学的な構造が、球状のポリマー単位の集積によって形成され、その寸法が、その径で表して、数十nm〜数μmなる範囲にあることを示唆した。
【００７２】
図6を参照すると、該バイオセンサの基板に関するSEM像が示されている。図6(a)において、このセンサは、金で被覆されてはおらず(傾斜角：30度；加速電圧：10kV)、また比較的大きな球状のポリシランポリマーが、より平滑なポリマーバックグラウンドと結合していることが明らかである。より高い倍率において、図6(b)及び6(c)においては、該大きな球状のポリマーが、より小さな球形の、一緒に架橋された(共有結合した)ポリマー物質で構成されていることを明確に理解することができる。これらの観測は、図7に示した原子間力顕微鏡写真とかなり一致している。この図においては、個々のポリマー球を見ることができる。
【００７３】
本発明の方法の好ましい一態様においては、該ポリシラン重合反応の初期の段階において、該重合過程は、該シリコン表面及び該溶液の本体内で、同時に起る。該重合反応中に、塊状重合によって作られる核及びドットが、該ポリマー表面と共有結合的に反応し始めて、そのサイズは、時間の経過に伴って増大し続ける。結果として、該基板の表面上に、見えるように結合する、ポリマーの該ドットが生成される。該反応のメカニズムを、分子レベルで制御することが比較的困難であるにも拘らず、2つの反応は、この「その場での」重合工程を、例えば生物学的分子を、バイオセンサの基板に固定化する際に、高度に規定された微細な特徴と完全に相容れるものとする。第一に、該ミクロンサイズのポリマードットは、該反応溶液中で、数秒間に渡り、該サンプルを超音波処理に掛けることにより、該ポリマーバックグラウンドから、容易に除去される。第二に、該表面のポリマーと反応して、該ポリマーバックグラウンドを生成する、該ポリマードットのサイズは、該フォトレジストマスクのサイズ及び形状により調節される。
【００７４】
図4(c)に示したような、径3μmの球形の特徴について得られる高い解像度は、該重合工程の、図1(a)に示したような、フォトリトグラフィー現像後に得られる、フォトレジスト層内に生成された、自由空間を満たす能力を確認するものである。付随的なイメージを、共焦点顕微鏡法で生成するが、ここではポリマーネットワークを、ガラススライドの清浄な表面全体に生成した。該ポリマーの厚みは、該サンプルの垂直方向の断面を撮像することによって評価し、またその値が約8μmであることを見出した。図8に示した顕微鏡写真は、この厚みのあるポリマーネットワークのトポグラフィーが、フィラメント状の構造を持つことを明らかにしている。本発明者等は、このことが、ポリマーの厚みがある値を超えると、溶液内に生成するポリマードットが、縦軸に沿って凝集を起こすことを示唆しているものと信じる。更に、本発明者等は、如何なる仮説にも拘泥するつもりはないが、該シリコン表面上の該ポリマーネットワークの厚みが、ポリマー厚み/表面の比のある限界値を越えると、物理的な束縛のために、該フォトレジストパターニングのサイズに依存する可能性があるものと考える。例えば、該フォトリトグラフィー段階の後、該基板の露出領域が幅1μmのラインである場合、その後に得られるポリマーの厚みは、該ラインが幅100μmを持つ場合よりも、低いものと予想することができる。
【００７５】
生物学的分子を酸化珪素基板上に固定化することに加えて、本発明者等は、またこのポリマーネットワークのパターニングが、同様に他の表面、例えば金の表面にも適合し得るものであることを示した。しかし、このような場合において、該金の表面は、シスタミン等の、アミノ化された硫黄-含有分子の自己集積型の単分子層で、先ず変性する必要がある。第一段階において、該シスタミンの分子は、高度に自己集積型の様式で、該金の表面に化学的に吸着して、その第一アミノ基を該溶液側に向けて露出する必要がある。これらは高度に求核性であるから、これらの第一アミノ基は、同様な方法で、該酸化珪素表面に含まれるシラノール基を作用させ、また該金表面が、完全にAPTES単分子層で覆われるまで、APTES分子との求核置換により反応することができる。その後、APTESモノマーの重合が、該基板-溶液界面において起り、該金表面における有機シランポリマーの生成へと導かれる。
【００７６】
実施例3.3：生物学的要素の3-次元パターニング
本発明者等は、シリコン基板上のポリシランポリマーネットワークにより、生物学的要素の3-次元パターニングが実施でき、またその構造上及びその内部への該生物学的分子の吸収が可能となることを示した。数種の型の生物学的分子を、所定の手順に従って、該シリコン表面上に順次パターニングしている。該手順は、水で濯ぐ前に、該サンプルの表面を、限られた期間に渡り、該生体分子を含有する溶液で覆う工程を含む。吸着及び吸収された生体分子の位置は、蛍光標識で複合化したタンパク質を用いる蛍光顕微鏡法によって追跡した。
【００７７】
図9を参照すると、該シリコン基板上にパターン化された該ポリマーネットワーク内に吸収された生体分子(a, b, c, d)の蛍光顕微鏡写真が示されている。他の図面と同様に、該ポリシランネットワークのパターニングは、MEMSバイオセンサの形状で行われ、これは、興味ある該生物学的要素によってパターン化する必要がある。高度に規定されたタンパク質パターンは、図9に示されており、そこでは該シリコン表面の識別の効率は、存在しないバックグラウンドシグナルによって立証される。図9(b)及び図9(d)を参照すると、該パターン化された領域の生物学的な官能化は、直接見ることができる。というのは、蛍光標識が、該生体要素と直接結合しているからである。酵素(FITC-HRP)を、ポリシランポリマー構造内に吸収させた。該酵素(FITC-HRP)及びDNAプローブ(ローダミンレッドDNA)両者を、該シリコン表面(これは、質量センサプラットフォームを模倣する)上に正確に配置するが、その残留する活性又は選択性に関する情報はない。
【００７８】
図9(a)及び図9(c)において、識別特異性は、該ポリマーネットワーク中に固有の抗体(IgG)を吸収し、次いで該表面を該標識抗原(FITC-抗-IgG)に暴露することによって、該パターンに与えられる。従って、特異的な抗体/抗原の生物学的な相互作用は、該抗体で変性されたサンプルの、フルオレセイン-標識した抗原溶液中でのインキュベート後に、可視化された。これら両者の場合において、蛍光シグナルの多くは、抗体と抗原との間の生物学的な識別過程によるものであり、該ポリマーネットワーク内への、標識された抗原の非-特異的な吸収の寄与は、極めて僅かである。
非-特異的な吸着の防止が、あらゆる免疫-検出装置における主な課題であることを考慮して、本発明者等にとって、このタンパク質パターニング技術と、日常的なイムノ-アッセイ手順との相溶性をチェックすることが、特に重要となった。この実験により得た結果は、図10に示されているが、この図は、(1)ヒトIgGで変性されていないが、FITC-抗-ヒトIgGで変性されている；(2) ヒトIgG及び次いでFITC-抗-ラットIgGで変性されている；(3) ヒトIgG及び次いでFITC-抗-ヒトIgGで変性されている、パターン化されたポリマーネットワークの顕微鏡写真を示すものである。図10(c)に示されている高い特異性は、BSAによる遮断及び界面活性剤洗浄段階を基本とする標準的な手順が、このタンパク質パターニング戦略と十分な相溶性を持つことを明確に示しており、該手順の生物学的な選択性をも改善するものである。
【００７９】
本発明者等は、更なる実験を行って、図10の抗体と同様な方法で、DNAプローブの特異性が、該ポリシランネットワーク内で維持されていることを立証した。これらの結果を図11に示したが、非-相補的FITC-標識したDNAの非-特異的吸着による蛍光応答が、該相補的FITC-標識したDNAが、該吸収されたプローブとハイブリッド化された際に得られる、強い蛍光と比較して、極めて弱いものである。これらの結果は、洗浄並びに遮断段階を基本とするDNAハイブリッド化の標準的な手順が、該DNAプローブ-被覆ポリマーに対する高い特異性を維持するために利用できることを立証している。
上に示され、かつ議論された結果から、本発明者等は、該生物学的分子のパターニング手順が、ミクロンスケールで、シリコン基板表面上に生物学的分子を、サイト-選択的に固定化するのに十分に効果的であるものと信じる。それにも拘らず、この生体分子のパターニングが、3-次元構造で起こっているという事実は、以下のような、より強力な技術の利用によって立証された。
【００８０】
ガラススライドを、上で議論したように、厚いポリマーネットワークにより変性し、フルオレセイン-標識抗体の溶液中でインキュベートした。該タンパク質が該3-次元ポリマー構造内のどの程度の深さまで固定化されているか(即ち、侵入深さ)をチェックするために、共焦点顕微鏡法が最も適した方法であることを、本発明者等は見出した。図12を参照すると、該ポリマーネットワーク内に吸収されたFITC-HRPの垂直方向の断面が示されている。図12に示されたように、この垂直方向の断面(x-z軸によって表示)の分析は、該ポリマー構造に、十分な該フルオレセイン-標識タンパク質が挿入されていることを明らかにした。従って、これらの実験結果によって、本発明者等は、シリコン表面上に容易にパターン化することのできる、生物学的な3-次元構造を生成する、該ポリマー構造の能力を明らかにした。
【００８１】
実施例3.4：3-次元及び平面タンパク質パターニング間の比較研究
多数の公知のタンパク質パターニング法が、アミノシラン、例えばAPTESを、標準的な「リフト-オフ」手順を介して導入することによって、シリコン基板の選択された領域の官能化に基いている。しかし、これら従来法の全てにおいて、その化学的な識別は、該シリコン表面に隣接して、またその近傍においてのみ発生する。従って、本発明者等は、このような方法を、「平面タンパク質パターニング」又は「2D」法と呼ぶ。これら従来技術の全ては、該シリコン表面上にAPTES単分子層を生成するために提示した。この理由のために、該従来技術の全ては、正にAPTESが、「垂直方向に重合する」、即ち該基板の面から離れるように重合する能力を阻害する意図を持って、トルエン、アセトン、エタノール又はメタノール等の有機溶媒の使用を開示している。しかし、使用されたこれら有機溶媒の中で、トルエンのみが、3-次元タンパク質のパターニング手順において利用可能であることを、本発明者等は見出した。このことは、他の溶媒全てが、ノボラックを主成分とするフォトレジストに対する正に良溶媒として機能し、従って該シリコン表面上でパターン化された該フォトレジストマスクを、即座に溶解し、結果的にこのフォトリトグラフィー段階の実施を不可能にするからである。
【００８２】
従って、本発明者等は、異なるトルエン溶液を用いて得たAPTES層の厚みと、有機溶媒としてトリエチルアミン(TEA)を使用した場合に生成する該ポリマーネットワークの厚みを比較することを決心した。生物学的物質の該3-次元パターニングと、同様にAPTES化学特性に基く標準的な「リフト-オフ」タンパク質パターニング手順とを比較するために(Wieringa, R.H. PhD論文, グロニンゲン大学(University of Groningen), 2000(Dec.), 第2章；Weiping, Q.等, J. Colloids & Interf. Sci., 1999, 214:16-19; Weiping, Q.等, Mat. Sci. & Engin. C 1999, 8-9:475-480; Zhang, G.J.等, Sens. Actuat. B 2004, 97:243-248; Zang, C.X.等, (8th International Conference on Electronic Materials (IUMRS-ICEM), 2002, Xi'an, China; Zheng, J.等, Langmuir, 2000, 16:4409-4412; Britland, S.等, Biotechnol. Prog., 1992, 8:155-160; Wang, Z.H.等, Colloids & Surfaces B, 2004, 34:173-177; Heiney, P.A.等, Langmuir, 2000, 16:2651-2657)、幾つかの化学的なプロトコールに従って、露出した該シリコン表面を、APTESによってシラン化した。
【００８３】
一連の同様にフォトレジストでパターン化したサンプルを、室温にて、5時間、a) トルエン；b) 10％のTEAを含有するトルエン；c) TEAで希釈した2％のAPTESで処理した。これら全てのサンプルを、アセトン中で、5分間超音波処理し、次いで空気流中で乾燥した。各溶媒から得られるAPTES層(重合されていても、重合されていなくても)の厚みを、表面プロフィラーによる測定によって算出した。該APTESシラン化反応に対して、異なる3種の溶媒を用いて行ったこの比較研究は、該サンプルを、HRP-FITC溶液(100μg/mL、1時間、室温)中でインキュベートして、様々にAPTESで変性した表面を、タンパク質吸着/吸収能力について比較することにより実施した。
【００８４】
図13を参照すると、フォトレジストマスクで被覆されたシリコン表面を、a) トルエン中の2％APTES；b) 10％のTEAを含有するトルエン中の2％APTES；c) TEA中の2％APTESで化学的に処理することによって得た、シリコン表面上にパターン化された十字型のバイオセンサの顕微鏡写真が示されている。図13(a)又は(b)の顕微鏡写真を参照すると、該APTESシラン化反応を、純粋なトルエン又はトルエン/TEA(9:1, V/V)混合物を用いて行った場合には、肉眼視できるパターンは存在せず、このことは、該シリコン表面には、厚いポリマー層が何等存在しないことを反映している。図13の蛍光顕微鏡写真において、溶媒としてトルエン及びトルエン/TEAを用いて得た該タンパク質パターンは、事実上バックグラウンドから識別不可能であり、不十分に画成されたパターンを与えた。しかし、対照的に、APTESをTEAで希釈した場合に得られた結果は、該3-次元タンパク質パターニングが、如何に劇的にサイト-選択的に固定化されたタンパク質の量を改善し、図13(c)に示したように、該パターン化された領域と、該平坦なバックグラウンドとの間に極めて高いコントラストを生じることを、明確に示した。
【００８５】
図14を参照すると、シリコン表面に形成されたAPTESフィルムの厚みが、該シラン化反応において使用した溶媒に依存することを示す、グラフが示されている。表面プロフィロメトリーによる、APTES層の評価は、該ポリマーネットワークの厚みが、図14に示したように、それぞれ、トルエン、トルエン/TEA及び100％TEAに対しては3nm、0nm、及び192nmであることを明らかにした。このことは、TEAが、該重合反応に関する最も適した溶媒であることを示した。
種々のAPTESでパターン化した表面を、フルオレセイン-標識したタンパク質溶液と共にインキュベートした場合に、APTESの厚みと、吸着/吸収されたタンパク質の量との間の関係が、明らかになった。図15を参照すると、FITC-HRP溶液中での、APTESでパターン化した酸化珪素表面のインキュベート後に得られた、顕微鏡写真が示されている。図13との関連で上記したように、APTESのパターニングを、幾つかの化学的な条件を用いて試みた：a) トルエン中の2％APTES；b) 10％のTEAを含有するトルエン中の2％APTES；c) TEA中の2％APTES。図15の蛍光顕微鏡写真において、溶媒としてトルエン及びトルエン/TEAを用いて得た該タンパク質パターンは、事実上バックグラウンドから識別不可能であり、極めて不十分に画成されたパターンを与えた。しかし、これとは対照的に、APTESをTEAで希釈した場合に得られた結果は、該3-次元タンパク質パターニングが、如何に劇的にサイト-選択的に固定化されたタンパク質の量を改善し、図15(c)に示したように、該パターン化された領域と、該平坦なバックグラウンドとの間に極めて高いコントラストを生じることを、明確に示した。
【００８６】
実施例3.4：多重-タンパク質パターニング法
単一のシリコン表面の複数の選択された領域に、幾つかのタンパク質をパターニングする能力は、バイオセンサ等の多重-被検体検出デバイスの出現にとって主要な課題である。最も評判の良い方法は、一般的に、固体基板上への、タンパク質のマイクロ-コンタクト印刷に基く、ソフトリトグラフィー技術である。しかし、該技術の成功にも拘らず、該表面に物理的に吸着し、あるいは共有結合により結合したタンパク質の量は、殆ど一単分子層を越えるものではない。従来の「リフト-オフ」技術に基くタンパク質のパターニング技術と関連して、該技術は、同一表面上に、2種以上のタンパク質をパターニングしなければならない場合に、重大な問題と直面する。この問題は、該フォトレジストを現像し、また除去するために使用する有機溶媒とアルカリ溶液とが、殆どの生物学的な物質と非-相溶性であるという事実にある。従って、生物学的な要素の、フォトリトグラフィー工程への組入れは、大きな課題を残している。
【００８７】
上において議論した、Sorribas等は、この問題を、該生体要素の単分子層を、スクロース層内に包埋させることによって解決することを提案した。この手順を用いることによって、彼らは、2-生体分子のパターニングを達成した。しかし、その第一のタンパク質によって描かれた特徴は、該第二のものを否定するものであり、結果的にこの工程の多様性を大幅に制限した。この点に関して、本発明による該3-次元タンパク質パターニング法は、極めて効果的な代替法である。該3-次元多重-タンパク質パターニングに関する方法論は、図2に示されている。このパターニング法全体は、公知のレジストリトグラフィー技術に基くものであるので、本発明の方法の主要な点は、タンパク質とクリーンルーム環境との間の固有の非-相溶性を回避することである。該ポリマーネットワークに新たに吸収される該生物学的分子を、保護層として機能し得る、ポリマーでこれを覆うことによって、該リトグラフィー工程から隔離することが目的となる。該リトグラフィー工程から、該生物学的分子を保護するための種々のポリマーの適合性は、知られていなかった。
【００８８】
本発明者等は、驚いたことに、ゼラチンが、以下の主な2つの理由から、良好な候補であることを見出した：
(i) 水溶性のポリペプチドで構成されるこの天然のゲルは、良好なフィルム-形成特性を持ち、また温水で全く容易に除去でき；
(ii) 予備的な実験結果では、回転塗布されたゼラチンは、シリコン上に均一な薄い層を与えた。
図16を参照すると、ジゴニュービュー(Zygo Newview) 5020装置を用いて得た、シリコン上に回転塗布された薄いゼラチン層の表面のプロフィールが示されている。可視化を助けるために、該サンプル上に薄い金の層をスパッタリングした後、該ゼラチン層の厚みを、表面プロフィロメトリーによって評価し、216nmであることが分かった。
【００８９】
該ゼラチン層の、保護層としての有効性をチェックするために、抗体パターニングによって製造したサンプルを、薄いゼラチン層で更に覆い、その後該サンプルを5分間アセトンに暴露した。次いで、該ゼラチンを除去し、その表面をBSAで遮断し、また該サンプルを、フルオレセイン-標識した抗原の溶液中でインキュベートした。これらの結果を図17に示す。図17(b)を参照すると、該抗体をパターン化した基板と、アセトンとの直接的な接触が、該抗体の構造を不可逆的に損傷し、その活性の劇的な喪失をもたらすことが示されている。しかし、図17(c)及び(d)に示すように、該ゼラチン層は、該パターン化された抗体を、該有機溶媒のアセトンから首尾よく隔離し、特異的な識別結合の発生を可能としている。
従って、本発明者等は、該基板上に吸収/吸着された該生物学的分子に及ぼす、ゼラチン層のこの保護作用は、任意の従来のトリトグラフィー製造法と、生物学的な物質の操作とを組合わせる、新たな可能性を明らかにする。例えば、ゼラチン保護層と、3-次元生体分子パターニングとの組合せは、多重-タンパク質パターニングのための簡単な手順をもたらし、ここでは、全ての段階が、クリーン-ルーム内で行われる。結果として、従来技術の方法とは違い、この方法を用いて、シリコン表面上にパターン化される、異なる生物学的要素の数は、該リトグラフィー技術の解像度及び表面積のみによって制限され、また上記のような固定化方法によっては制限されない。
【００９０】
実施例4：nmスケールでの生物学的要素の3-次元パターニング
図1を参照しつつ説明した方法を利用して、高度に画成されたナノメータースケールの生物学的なパターニングを、達成することができる。e-ビームでパターン化されたシリコンダイを、ナショナルセンターオブマイクロエレクトロニクス(National Center of Microelectronics) (CNM-バルセロナ(Barcelona), スペイン)から入手したが、これは、該シリカ上に被覆された、電子ビーム感受性レジスト材料(ポリメチルメタクリレート(PMMA))を使用して、標準的なe-ビーム「リフト-オフ」手順によって製造した。このダイは、文字寸法200mmラインを持つ、高度に規定された文を含んでいた(図19Aを参照のこと)。
このダイを、純トリエチルアミン中の2％(v/v)APTES溶液に、室温にて、2時間浸した。このダイを、次に空気流中で乾燥させ、アセトン中で超音波処理し、過剰量のポリマー及び該フォトレジストを除去した。次に、このパターン化したポリマーを、120℃にて3時間硬化させた。この段階で、該ポリマーネットワークは、極めて高い鮮明度で、該基板表面上に、ナノメータースケールでパターニングされた(図19Bを参照のこと)。
【００９１】
次の、このダイを、3分間に渡り、FITC-標識したDNA溶液(0.3μM)中でインキュベートし、次いで脱イオン水で洗浄した。
この手順を用いて、高度に規定された文章を、DNAによって「書込み」、その際の文字寸法は、200nmラインであった(図19Cを参照のこと)。
結論：
本発明による該3-次元生物学的分子パターニング法は、従来のソフト-リトグラフィー技術及び上記した「リフト-オフ」を基本とするリトグラフィー技術について一般に見られる重大な問題点及び主な限界に対する価値ある解決策をもたらす。シリコンの選択領域の化学的な識別が、該基板表面(即ち、2D)の近傍においてのみ行われる、従来技術とは全く対照的に、本発明は、高度に規定された、3-次元ネットワークパターンを生成し、これは平坦なバックグラウンドによって包囲された、該基板表面から、外方向に広がっている。
【００９２】
該シランポリマーネットワークの、その表面だけでなく、更にその構造内部にまで、生物学的分子を吸収する能力は、3-次元パターニングを生じる。これは、従来法と比較して、サイト-選択的に固定化された生体分子数を、数桁大きなレベルまで増大する。その上、該結合した生体分子は、その活性を維持している。本発明の方法の、この莫大な可能性は、使用の単純さ、強固さ及び様々な生物学的な要素(酵素、抗体、細胞又はDNA)に関する多様性によるものであり、該要素は、潜在的に基板表面上にパターン化することができる。更に、該固定化は、広範囲に及ぶ固体基板(例えば、シリコン、ガラス及び金等)について利用することができる。
更に、本発明の方法は、該生物学的なパターンの上にゼラチンの薄層を堆積する工程を含み、該薄層は、後のパターニングの1ラウンド中の、任意の化学的な攻撃に対する保護層として機能する。この簡単な手順は、完全にクリーン-ルーム環境内で日常的に利用されている、標準的なリトグラフィー技術と、生物学的要素とを、相容れるものとする。最後に、生体要素を、上記の3-次元パターニング法と組合された、リトグラフィー工程に組入れる能力は、多重-タンパク質パターニング法の工夫へと導き、理論的には制限のない数のタンパク質が、ミクロンスケールで固定化される。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】本発明の一態様に従う、3-次元タンパク質パターニング法を、模式的に表す図である。
【図２】本発明の一態様に従う、3-次元多重-タンパク質パターニング法を、模式的に表す図である。
【図３】酸化珪素上で、APTES重合工程を行うために提案された、合成反応経路を示す図である。
【図４】a) フォトレジストパターニング、ここで径60μmの十字形を除く、全シリコン表面は、フォトレジストで覆われている；b) 「その場での」重合及びフォトレジストの除去後、パターン化されたポリマーネットワーク、ここで高度に規定されたポリマーパターニングは、肉眼視可能である(暗色領域)；c) ポリマーネットワークにおける、径3μmのドットパターンの顕微鏡写真である。
【図５】酸化珪素上にパターン化されたポリマーネットワークの、走査型電子顕微鏡像である。ポリマーの厚みは約200nmである。このサンプルは、金で被覆されており、傾斜角は85度であり、また加速電圧は10kVである。倍率：(a) 1,000X及び(b) 35,000X。
【図６】走査型電子顕微鏡像であり、夫々a) 環境SEM、金被膜なし、傾斜角：85度、加速電圧：10kV、倍率：1,500X；b)及びc) 従来のSEM、サンプルは金で被覆、加速電圧：10kV、倍率：b) 689X、c) 6,130Xなる条件の下で得た。
【図７】原子間力顕微鏡(AFM)法によって得た、シリコン上にパターン化されたポリマーネットワークの表面を示す図である。
【図８】ガラススライド表面上に被覆された、厚いポリマーネットワークの共焦点顕微鏡写真を示す。
【図９】シリコン表面上にパターン化されたポリマーネットワーク内に吸収されたタンパク質(a, b, c及びd)の蛍光顕微鏡写真を示す。a)及びc) IgG及び次にFITC-抗-IgG；b) FITC-HRP及びd) ローダミンレッド-標識したDNA配列。十字型の径：60μm；ドットの径：3μm。
【図１０】a) 1) ヒトIgGではなく、FITC-抗-ヒトIgGによって；2) ヒトIgGにより、次いでFITC-抗-ラットIgGによって；3) ヒトIgGにより、次いでFITC-抗-ヒトIgGによって変性した、パターン化されたポリマーネットワークの蛍光顕微鏡写真を示す。
【図１１】未標識の20-塩基DNAプローブで変性され、またFITCで標識した非-相補的DNA配列又はFITCで標識した相補的DNA配列のいずれかとインキュベートした、パターン化されたポリマーサンプルの、蛍光顕微鏡写真を示す。
【図１２】共焦点顕微鏡によって得られた、ポリマーネットワーク内に吸収されたFITC-HRPの垂直方向の断面を示す図である。
【図１３】a) トルエン中の2％APTES；b) 10％のTEAを含有するトルエン中の2％APTES；c) TEA中の2％APTESで、フォトレジストマスクで被覆されたシリコン表面を、化学的に処理することによって得た、シリコン表面上にパターン化された十字型の顕微鏡写真である。全ての該化学的条件に対し、室温にて5時間なる反応時間を使用。十字型の径：10μm。
【図１４】該シラン化反応において使用した溶媒に依存する、シリコン表面上に形成されたAPTESフィルムの厚みを、グラフで示したものである。実験条件：室温にて5時間。これらのサンプル全体は、化学的な変性後、アセトン中で超音波処理された。APTES層の厚みは、表面プロフィロメトリーにより、また屈折率値として1.465を使用して評価した。
【図１５】FITC-HRP溶液中での、APTESでパターン化した酸化珪素表面のインキュベート後に得られた、顕微鏡写真である。図12に示したように、APTESのパターニングは、幾つかの化学的な条件を用いて試みた：a) トルエン中の2％APTES；b) 10％のTEAを含有するトルエン中の2％APTES；c) TEA中の2％APTES。十字型の径：60μm。
【図１６】ジゴニュービュー(Zygo Newview) 5020装置を用いて得た、シリコン上に回転塗布された薄いゼラチン層の表面のプロフィールを示す。
【図１７】ヒトIgGで変性した、パターン化されたポリマーネットワークの蛍光顕微鏡写真であって、a) パターン化されたIgGは、ゼラチン層によって保護されていないが、アセトンに暴露されておらず；b) パターン化されたIgGは、ゼラチン層によって保護されていないが、アセトンに5分間暴露されており；c) パターン化されたIgGは、ゼラチン層によって保護されているが、アセトンに暴露されておらず；d) パターン化されたIgGは、ゼラチン層によって保護されており、しかもアセトンに5分間暴露されている。最後の工程において、フルオレセイン(FITC)で標識された抗-ヒトは、活性ヒトIgGの存在を明らかにするために使用した。
【図１８】求核置換を模式的に示す図である。ここには、求核基(N)、求電子基(E)及び脱離基(L)が示されている。
【図１】
2009515138.tif 000008
【図２】
2009515138.tif 000009
【図３】
2009515138.tif 000010
【図４】
2009515138.tif 000011
【図５】
2009515138.tif 000012
【図６】
2009515138.tif 000013
【図７】
2009515138.tif 000014
【図８】
2009515138.tif 000015
【図９】
2009515138.tif 000016
【図１０】
2009515138.tif 000017
【図１１】
2009515138.tif 000018
【図１２】
2009515138.tif 000019
【図１３】
2009515138.tif 000020
【図１４】
2009515138.tif 000021
【図１５】
2009515138.tif 000022
【図１６】
2009515138.tif 000023
【図１７】
2009515138.tif 000024
【図１８】
2009515138.tif 000025
【図１９】
2009515138.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月27日(2008.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的分子を、基板上に固定化する方法であって、前記方法が、以下の工程、
(i) 3-次元のポリシランポリマーを、基板に、共有結合によって結合する工程、及び
(ii) 吸収及び/又は吸着により、前記ポリマー上に及び/又はその内部に生物学的分子を結合する工程、
を含むことを特徴とする、上記固定化方法。
【請求項２】
前記方法が、前記基板表面の選択された「ターゲット」領域に、ポリシランポリマーを生成する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記基板を、先ず放射線感受性物質で被覆する、請求項1又は2記載の方法。
【請求項４】
前記放射線感受性物質が、ノボラック(NovolacTM)をベースとするフォトレジスト層を含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
適当な温度にて、十分な時間に渡り、前記基板を加熱することによって、硬化を行う、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
上部に、最終的に前記生物学的分子を固定化する、前記基板の領域(即ち、前記ターゲット領域)が、放射線に暴露することによって、前記基板を覆っている前記放射線感受性物質に変化される、請求項3〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記基板の露光されたターゲットサイトを、「その場での」重合反応に付す、請求項1〜6のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記重合反応が、有機シランモノマーの重合を含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記有機シランモノマーが、以下の式で表されるものである、請求項8記載の方法：
【化１】
2009515138.tif 000027
【化２】
2009515138.tif 000028
ここで、R1、R2、R3、及びR4の少なくとも一つが、少なくとも一つの脱離基を含み、かつ少なくとも一つのR1、R2、R3、及びR4が、求核基である。
【請求項１０】
前記重合反応が、3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)の重合を含む、請求項7〜9のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記重合反応を、アルカリ性溶媒中で行う、請求項7〜10のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶媒が、8を越えるpKa値を持つ、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記溶媒が、トリエチルアミン(TEA)を含む、請求項11又は12記載の方法。
【請求項１４】
前記基板が、乾燥され、超音波処理され、次いで硬化される、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリシランポリマーが、複数のシランモノマーからなり、前記モノマーが、共有結合によって、実質的に前記基板の面に沿って拡がっており(2D)、更に前記基板の面から、実質的に遠ざかるように拡がっており(3D)、その結果、シラン分子が、前記基板と直接的に又は間接的に結合している、他のシラン分子と共有結合によって結合している、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリマーが、少なくとも150nmなる厚みを持つ、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
前記工程(ii)が、前記基板を、結合すべき前記生物学的分子を適当な濃度で含む、適当な緩衝溶液中でインキュベートする工程を含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
前記工程(ii)において、前記生物学的分子が、前記方法における工程(i)によって製造した前記ポリシランポリマー上に、及びその内部に、吸収及び/又は吸着されている、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
前記生物学的分子が、核酸分子、アミノ酸、抗体、ペプチド、タンパク質、酵素、全細胞、又は細胞の一部、ウイルス、ファージ、又は微生物、又は細胞内小器官、又はウイルス粒子を含む、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
前記基板が、任意の固体表面、例えばガラス、金属、例えば金、銀、プラチナ、パラジウム等を含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
前記基板が、酸化珪素を含む、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法が、前記基板に前記ポリシランポリマーを結合する、前記工程(i)に先立って、前記基板を予め官能化する段階を含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
前記予め官能化する段階が、前記放射線感受性物質を適用する前、又はその後に行われる、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記方法における前記工程(ii)が、前記基板上に形成された、前記ポリシランポリマーに、複数の異なる種の生物学的分子を結合する工程を含む、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
前記異なる種が、別々の隔置された位置あるいは一緒に混在する位置において、前記基板と結合している、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
前記工程(i)に引続いて、前記ポリマーを化学的保護層で覆い、前記保護層が、望ましからぬその後の化学的な処理から、前記ポリマーを保護するのに適したものである、請求項24又は25記載の方法。
【請求項２７】
前記化学的保護層が、ゼラチンを含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
前記化学的保護層が、約100nm〜500nmなる範囲の厚みを持つ、請求項26又は27記載の方法。
【請求項２９】
前記方法が、前記基板(又は前記化学的保護層)を、放射線感受性物質の層で被覆する工程を含む、請求項24〜28のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
前記放射線感受性物質が、前記化学的保護層を覆っている場合には、次いで前記基板を、放射線源に暴露する、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
前記基板を、第一の種の生物学的分子の存在下でインキュベートする、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
前記生物学的分子を、前記ポリマーに結合した後、前記方法が、前記基板を化学的保護層で被覆する段階を含む、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
前記基板を放射線に暴露して、前記放射線感受性物質の選択されたターゲット領域を除去する、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
前記基板を、第二の種の生物学的分子の存在下でインキュベートする、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
前記第二の種の生物学的分子が、前記第一の種の生物学的分子とは異なっている、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
前記ポリシランポリマーに対する生物学的分子のパターニング及び結合段階を、「n」回繰返すことによって、「n」個の異なる生物学的分子を、前記基板上の前記ポリマーと選択的に結合する、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
前記方法が、あらゆる残留する放射線感受性物質、及びあらゆる残留する化学的に耐性の物質を、前記基板から除去する工程からなる、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
前記方法が、前記基板の表面を、適当な遮断剤で遮断して、非-特異的なタンパク質の吸着/吸収を防止する工程を含む、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
前記遮断剤が、PBS中のBSAを含む、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
請求項1〜39のいずれか1項に記載の方法によって得ることのできる、固定化された生物学的分子を含む基板。
【請求項４１】
前記基板が、任意のデバイスの基板表面を、生物学的な実体で官能化する必要がある、前記デバイスとして又はその製造において使用される、請求項40記載の基板。
【請求項４２】
請求項1〜39のいずれか1項に記載の方法によって得ることのできる、基板を含むことを特徴とする、デバイス。
【請求項４３】
前記デバイスが、医学デバイス、インプラント、バイオリアクタ、タンパクカプセル、又はバイオセンサである、請求項42記載のデバイス。
【請求項４４】
請求項1〜39のいずれか1項に記載の方法を利用することを特徴とする、バイオセンサの製造方法。
【請求項４５】
前記バイオセンサが、MEMSバイオセンサである、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
前記バイオセンサが、トランスデューサを含み、これが、マスレゾネータである、請求項44又は45記載の方法。
【請求項４７】
前記バイオセンサが、生物学的ターゲット被検成分の存在を、円形ディスクレゾネータの振動モードにおいて生成される、振動数シフトを測定することによって検出するのに適したものである、請求項44又は45記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成21年1月21日(2009.1.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
【図１】本発明の一態様に従う、3-次元タンパク質パターニング法を、模式的に表す図である。
【図２】本発明の一態様に従う、3-次元多重-タンパク質パターニング法を、模式的に表す図である。
【図３】酸化珪素上で、APTES重合工程を行うために提案された、合成反応経路を示す図である。
【図４】a) フォトレジストパターニング、ここで径60μmの十字形を除く、全シリコン表面は、フォトレジストで覆われている；b) 「その場での」重合及びフォトレジストの除去後、パターン化されたポリマーネットワーク、ここで高度に規定されたポリマーパターニングは、肉眼視可能である(暗色領域)；c) ポリマーネットワークにおける、径3μmのドットパターンの顕微鏡写真である。
【図５】酸化珪素上にパターン化されたポリマーネットワークの、走査型電子顕微鏡像である。ポリマーの厚みは約200nmである。このサンプルは、金で被覆されており、傾斜角は85度であり、また加速電圧は10kVである。倍率：(a) 1,000X及び(b) 35,000X。
【図６】走査型電子顕微鏡像であり、夫々a) 環境SEM、金被膜なし、傾斜角：85度、加速電圧：10kV、倍率：1,500X；b)及びc) 従来のSEM、サンプルは金で被覆、加速電圧：10kV、倍率：b) 689X、c) 6,130Xなる条件の下で得た。
【図７】原子間力顕微鏡(AFM)法によって得た、シリコン上にパターン化されたポリマーネットワークの表面を示す図である。
【図８】ガラススライド表面上に被覆された、厚いポリマーネットワークの共焦点顕微鏡写真を示す。
【図９】シリコン表面上にパターン化されたポリマーネットワーク内に吸収されたタンパク質(a, b, c及びd)の蛍光顕微鏡写真を示す。a)及びc) IgG及び次にFITC-抗-IgG；b) FITC-HRP及びd) ローダミンレッド-標識したDNA配列。十字型の径：60μm；ドットの径：3μm。
【図１０】a) 1) ヒトIgGではなく、FITC-抗-ヒトIgGによって；2) ヒトIgGにより、次いでFITC-抗-ラットIgGによって；3) ヒトIgGにより、次いでFITC-抗-ヒトIgGによって変性した、パターン化されたポリマーネットワークの蛍光顕微鏡写真を示す。
【図１１】未標識の20-塩基DNAプローブで変性され、またFITCで標識した非-相補的DNA配列又はFITCで標識した相補的DNA配列のいずれかとインキュベートした、パターン化されたポリマーサンプルの、蛍光顕微鏡写真を示す。
【図１２】共焦点顕微鏡によって得られた、ポリマーネットワーク内に吸収されたFITC-HRPの垂直方向の断面を示す図である。
【図１３】a) トルエン中の2％APTES；b) 10％のTEAを含有するトルエン中の2％APTES；c) TEA中の2％APTESで、フォトレジストマスクで被覆されたシリコン表面を、化学的に処理することによって得た、シリコン表面上にパターン化された十字型の顕微鏡写真である。全ての該化学的条件に対し、室温にて5時間なる反応時間を使用。十字型の径：10μm。
【図１４】該シラン化反応において使用した溶媒に依存する、シリコン表面上に形成されたAPTESフィルムの厚みを、グラフで示したものである。実験条件：室温にて5時間。これらのサンプル全体は、化学的な変性後、アセトン中で超音波処理された。APTES層の厚みは、表面プロフィロメトリーにより、また屈折率値として1.465を使用して評価した。
【図１５】FITC-HRP溶液中での、APTESでパターン化した酸化珪素表面のインキュベート後に得られた、顕微鏡写真である。図12に示したように、APTESのパターニングは、幾つかの化学的な条件を用いて試みた：a) トルエン中の2％APTES；b) 10％のTEAを含有するトルエン中の2％APTES；c) TEA中の2％APTES。十字型の径：60μm。
【図１６】ジゴニュービュー(Zygo Newview) 5020装置を用いて得た、シリコン上に回転塗布された薄いゼラチン層の表面のプロフィールを示す。
【図１７】ヒトIgGで変性した、パターン化されたポリマーネットワークの蛍光顕微鏡写真であって、a) パターン化されたIgGは、ゼラチン層によって保護されていないが、アセトンに暴露されておらず；b) パターン化されたIgGは、ゼラチン層によって保護されていないが、アセトンに5分間暴露されており；c) パターン化されたIgGは、ゼラチン層によって保護されているが、アセトンに暴露されておらず；d) パターン化されたIgGは、ゼラチン層によって保護されており、しかもアセトンに5分間暴露されている。最後の工程において、フルオレセイン(FITC)で標識された抗-ヒトは、活性ヒトIgGの存在を明らかにするために使用した。
【図１８】求核置換を模式的に示す図である。ここには、求核基(N)、求電子基(E)及び脱離基(L)が示されている。
【図１９】図１９Ａは、文字寸法200mmラインを持つ、高度に規定された文を含むダイを示す。図１９Ｂは、ナノメータースケールでパターニングされた基板表面を示す。図１９Ｃは、DNAによる「書込み」を示す。
【国際調査報告】
2009515138.tif 000029
2009515138.tif 000030
2009515138.tif 000031