(57)【要約】本発明は、生きている生物において非侵襲性の撮像を可能にするＭＲＩ技術またはＰＥＴ技術、もしくは他の技術によって検出できる薬剤によって細胞をエクスビボで標識するための方法に関する。標識細胞は患者に再投与することができ、そして標識細胞の動きはＭＲＩ、ＰＥＴ、または他の技術によってインビボで追跡できる。一部では、開示の方法には、一連の細胞サンプルをエクスビボで標識して、標識と細胞との結合を測定することが含まれ、これにより各患者での標識細胞の適当量を決定できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者への投与が意図された細胞を標識することを評価するための方法であって、前記方法が：
ａ）実質的に同じ複数の細胞サンプルの細胞をインビボの造影試薬と接触させること；
ｂ）前記サンプル中の前記インビボの造影試薬を検出すること；ならびに
ｃ）前記インビボの造影試薬での細胞の標識を評価すること；
を含む前記方法。
【請求項２】
患者への投与が意図された細胞を標識することを評価するための方法であって、前記方法が：
ａ）実質的に同じ複数の細胞サンプルの細胞をインビボの造影試薬および代用試薬と接触させること；
ｂ）前記サンプル中の前記代用試薬を検出すること；ならびに
ｃ）前記代用試薬で細胞の標識を評価し、これにより前記インビボの造影試薬での細胞の標識を評価すること；
を含む前記方法。
【請求項３】
少なくとも２個の実質的に同じ細胞サンプルを互いに異なる所定の条件にさらし、そして前記方法は、異なる条件がインビボの前記造影試薬での細胞の標識に及ぼす効果を評価することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１０個の実質的に同じ細胞サンプルを互いに異なる所定の条件にさらす、請求項３記載の方法。
【請求項５】
自動化ハイスループット技術の使用により、前記細胞をインビボの造影試薬またはインビボの造影試薬および代用試薬と接触させる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
自動化ハイスループット技術を利用してインビボの造影試薬での前記細胞の標識を評価する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記インビボの造影試薬が核磁気共鳴技術によるインビボの検出に適した薬剤である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記インビボの造影試薬が、常磁性造影剤、超常磁性酸化鉄粒子、磁鉄鉱粒子、フルオロカーボン造影試薬、Ｇｄキレート、およびＭｎキレートからなる群より選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記インビボの造影試薬がＰＦＰＥ乳剤を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記インビボの造影試薬が、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）、γ線検出、またはＳＰＥＣＴ（単光子放射型コンピューター断層撮影法）からなる群より選択される非侵襲性の撮像技術による検出に適した薬剤である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記代用試薬が、蛍光タンパク質または発光タンパク質、蛍光アナログ剤または発光アナログ剤、蛍光色素または発光色素、比色剤、ならびに放射性医薬品からなる群より選択される、請求項２記載の方法。
【請求項１２】
前記インビボの造影試薬が代用試薬と安定的に結合して、デュアル造影試薬を形成する、請求項２記載の方法。
【請求項１３】
前記インビボの造影試薬が核磁気共鳴技術によるインビボの検出に適した薬剤である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記代用試薬が、蛍光タンパク質または発光タンパク質、蛍光アナログ剤または発光アナログ剤、蛍光色素または発光色素、比色剤、ならびに放射性医薬品からなる群より選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
互いに異なる前記所定の条件が、温度、大気組成、湿度、インビボの標識薬剤の培養液中濃度、インビボの標識薬剤への曝露時間、薬剤取り込み促進剤の濃度、および薬剤取り込み促進剤への曝露時間からなる群より選択される１またはそれ以上の局面について異なる、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
患者に投与する細胞用量の調整を可能にする前記インビボの造影試薬での細胞の標識条件を決定することをさらに含み、前記用量がインビボの造影試薬に関連する既知の安全性パラメーターに準拠して、インビボでの標識細胞の検出を可能にする適切な標識を提供する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者に細胞用量を投与することをさらに含み、前記用量がインビボの造影試薬に関連する既知の安全性パラメーターに準拠して、インビボでの標識細胞の検出を可能にする適切な標識を提供する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
生死判別試験、細胞数、細胞周期アッセイ、遊走アッセイ、および機能アッセイからなる群より選択される追加アッセイをさらに含む、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記患者が哺乳動物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記患者がヒトである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が前記患者にとって自己由来である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が前記患者にとって同種異系である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
細胞が、血液細胞、筋原細胞、骨髄細胞、末梢血細胞、臍帯血細胞、心筋細胞、軟骨細胞、免疫細胞、胎児の神経細胞、神経系前駆細胞、線維芽細胞、肝実質細胞、膵臓の膵島細胞、ケラチノサイト、および前述のいずれかの前駆細胞からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、胚性幹細胞、胚性幹細胞から培養した細胞、成体幹細胞、および成体幹細胞から培養された細胞からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記実質的に同じサンプルが、ドナーから得られた細胞のサンプルの各一部分である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記実質的に同じサンプルが、ドナーに由来する細胞から培養した細胞の各一部分である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
タンパク質代用試薬と安定的に結合したインビボの造影試薬を含む、細胞を標識するための組成物。
【請求項２８】
前記タンパク質代用試薬が、蛍光タンパク質、発光タンパク質、着色タンパク質、蛍光発生タンパク質、発光タンパク質、および色素生成タンパク質からなる群より選択される、請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
前記インビボの造影試薬での細胞の標識を評価することが、細胞に結合したインビボの造影試薬の量を定量することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３０】
前記インビボの造影試薬での細胞の標識を評価することが、細胞に結合した代用試薬の量を定量することを含む、請求項２記載の方法。
【請求項３１】
患者に安全で有用な用量の標識細胞を投与し、そしてインビボで前記標識細胞を検出する方法であって、前記方法は：
ａ）実質的に同じ複数の細胞サンプルの細胞をインビボの造影試薬と接触させること；
ｂ）前記サンプル中の前記インビボの造影試薬を検出すること；
ｃ）前記インビボの造影試薬での細胞の標識を評価すること；
ｄ）患者に投与する細胞用量の調製を可能にするインビボの造影試薬での前記細胞の標識条件を決定すること、ここで前記用量はインビボの標識薬剤に関連する既知の安全性パラメーターに準拠して、インビボでの標識細胞の検出を可能にする適切な標識を提供する；
ｅ）前記患者に細胞用量を投与すること；ならびに
ｆ）非侵襲性の撮像技術によってインビボの前記標識細胞を検出すること、
を含む、方法。
【請求項３２】
前記非侵襲性の撮像技術が核磁気共鳴技術である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
患者に安全で有用な用量の標識細胞を投与し、そしてインビボで前記標識細胞を検出する方法であって、前記方法は：
ａ）実質的に同じ複数の細胞サンプルの細胞をインビボの造影試薬および代用試薬と接触させること；
ｂ）前記サンプル中の前記代用試薬を検出すること；
ｃ）前記代用試薬で細胞の標識を評価し、これにより前記インビボの造影試薬での細胞の標識を評価すること；
ｄ）患者に投与する細胞用量の調製を可能にするインビボの造影試薬での前記細胞の標識条件を決定すること、ここで用量はインビボの標識薬剤に関連する既知の安全性パラメーターに準拠して、インビボでの標識細胞の検出を可能にする適切な標識を提供すること；
ｅ）前記患者に細胞用量を投与すること；ならびに
ｆ）非侵襲性の撮像技術によってインビボの前記標識細胞を検出すること、
を含む、方法
【請求項３４】
前記非侵襲性の撮像技術が核磁気共鳴技術である、請求項３３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願
本願は、２００６年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６０／７９２，２４２号の利益を請求する。米国仮特許出願第６０／７９２，２４２号の全開示が、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
背景
多くの生物学的過程は、動的で可動的な細胞集団によって行われる。例えば、免疫系の細胞が血流から炎症部位または感染部位まで集められて、罹患部分での免疫細胞の蓄積をもたらす。免疫細胞の顕著な浸潤が、自己免疫疾患、癌、および感染症に罹患した組織において起こる場合が多い。同様に、移植拒絶は、移植された組織に侵入し、そして破壊する宿主の免疫細胞によって媒介される。骨髄に由来する幹細胞が血流を通じて移動し、そして損傷を受けた組織の再生を助けるとの証拠が増えつつある。
【０００３】
典型的に、細胞の動きは、組織生検の組織学的解析によって得られる「スナップショット」においてのみモニターされる。しかし、組織のサンプリング過程によって細胞の挙動が変化する場合が多く、そして特定の組織や臓器からは限られた数の生検しか得ることができない。
【０００４】
したがって、研究者は、インビボで細胞をモニターするための様々な研究法を開発している。このような研究法としては、例えば、発光（蛍光、発光）、ポジトロン放出、γ線放射、放射性物質によっての他の粒子の発光を検出する技術、および核磁気共鳴技術（例えば、磁気共鳴画像法）による標識細胞の検出が挙げられる。核磁気共鳴、陽電子放射、および放射能に基づく技術は一般的に光画像技術よりも有用であるが、これは、これら後者では光学的に不透明な生物体内において深部構造を可視化する効果が比較的低いためである。
【０００５】
細胞または組織の投与に基づく治療法（例えば、骨髄移植片および固形臓器移植など）では、患者において画像診断を可能にするためにエクスビボで細胞を標識することが望ましい場合が多い。患者に標識細胞の塊を投与し、そして続いて患者においてこれらの細胞の位置を追跡することも診断状況において有用となりうる。標識することは、生物に標識を直接投与し、そして一定量の標識が対象の細胞と結合することを期待することによって実現できる。あるいは、対象の細胞をエクスビボで標識し、そして次に患者に投与できる。エクスビボ標識対インビボ標識での利点の中で、エクスビボ研究法は、選り抜きの細胞集団、特に治療または診断の目的で投与される細胞集団の特異的な標識を促進させる。エクスビボの標識システムの例は、例えば、特許文献１に記載されている。
【特許文献１】国際公開第２００５／０７２７８０号パンフレット
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、エクスビボでの細胞標識および患者への標識細胞の投与の安全性および信頼性を改善する方法論を提供する。
【０００７】
要約
一部では、開示は、過去に真価が認められていない技術的問題に関する記載を提供している：比較的均一な用量のインビボ造影剤を得ることの困難、ここで、このような薬剤は細胞をエクスビボで標識するために使用され、続いて患者に標識細胞を投与する。遺伝的等質性のために実験に一般に使用される動物を繁殖させて、そして標準的プロトコルに従って飼育する。したがって、細胞をエクスビボで標識するための１つのプロトコルが、同じ種類の実験動物の異なる個体からの細胞において一致した結果をもたらすと想定することは合理的な場合が多い。対照的に、実際の患者は、ヒトまたは非ヒト動物にかかわらず、遺伝的に異質であって、そして多様な生理的状態および複雑な要素を伴う。したがって、１つのプロトコルでは異なる患者からの細胞の均一標識を提供しない可能性がある。一部では、本明細書で開示された方法を使用して、標識条件を調整して、安全性パラメーターに応じた、そしてインビボで検出可能な標識細胞用量を得ることができる。
【０００８】
特定の局面では、開示は、インビボの造影試薬を用いてエクスビボで細胞を標識する際に使用する方法および組成物を提供する。特定の態様では、開示は、インビボの撮像剤を用いたエクスビボでの細胞の標識を評価するための方法を提供し、ここで、このような細胞は患者への投与を意図している。標識細胞を被験者に投与して、続いてインビボ（つまり、非侵襲性）撮像技術によって検出できる。インビボでの撮像技術の例としては、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）技術、γカメラ、ＳＰＥＣＴ（単光子放射型コンピューター断層撮影法）、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）技術が挙げられる。ＮＭＲ技術の例としては、磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）および局所の磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）が挙げられる。インビボでの撮像技術は一般的に非侵襲性の手順によって実施されるため、標識細胞は生きている被験体において１またはそれ以上の時間点で検出できる。標識細胞は、（恐らくは移植のレシピエントへの移植前に）被験体から摘出した組織外植片、器官および組織、人工的に作成した組織、および細胞を播種した種々の基質および構造などの細胞培養または核磁気共鳴技術を実施できる本質的に別の任意の環境でも検出できる。
【０００９】
特定の局面では、開示は、患者への投与が意図された細胞を標識することを評価するための方法を提供する。方法には、実質的に同じ複数の細胞サンプルの細胞とインビボの造影試薬とを接触させること；サンプル中のインビボの造影試薬を検出すること；およびインビボの造影試薬での細胞の標識を評価することが含まれる。別の局面では、方法には、実質的に同じ複数の細胞サンプルの細胞とインビボの造影試薬および代用試薬とを接触させること；サンプル中の代用試薬を検出すること；および代用試薬での細胞の標識を評価することにより、インビボの造影試薬での細胞の標識を評価することが含まれる。代用試薬は一般的に、インビボの造影試薬と同様の方法で細胞を標識することが期待される薬剤である。代理試薬はそれ自体がインビボの造影試薬でよいが、しかし、好ましい代用試薬はそれほど高価ではなく、時間がかからず、および／またはインビボの造影試薬を検出する手段よりも広範に利用可能な手段によって検出可能である。例えば、蛍光（または他の発光）検出装置は広く利用可能であって、そして一般的に磁気共鳴映像法またはＰＥＴスキャニングのための装置よりも必要な資本投資が少額であり、したがって、蛍光剤は代用試薬の好ましいカテゴリーである。代用試薬は、例えば、蛍光タンパク質または発光タンパク質、蛍光アナログ剤または発光アナログ剤、蛍光色素または発光色素、比色剤、および放射性医薬品からなる群より選択できる。インビボの造影試薬は代用試薬と安定的に結合して、デュアル造影（ｄｕａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ）試薬を形成する。好ましいデュアル造影試薬では、インビボの造影試薬は代用試薬に共有結合する。細胞サンプルに関して使用される「実質的に同じ」という用語は、各細胞サンプルに存在する細胞腫が非常に類似しており、当業者でさえ、異なるサンプルの細胞を標識する際の著しい違いが各サンプルの細胞での違いに帰するとは見なしえないことを示すことを意図している。本明細書で開示する方法を使用して、実質的に同じではない細胞サンプルを比較することもできる。この種類の方法では、サンプルの細胞成分は異なるが、実質的に同じ標識条件を利用することが有用となる場合が多い。細胞成分は異なりうるが、これは細胞が明らかに異なる種類（例えば、肝実質細胞および心筋細胞）であるため、もしく各サンプルの細胞が通常の細胞プールから得られ、異なる条件下で培養されていた、もしくは様々な分化プロトコルの下で前駆細胞または幹細胞から得られたためである。「評価すること」という用語は、評価される被験物質に関する量的、または、好ましくは量的な観察所見を意味しうる。好ましい態様では、細胞の標識の評価には、細胞１個当たりの平均標識量の測定、または実現される細胞の標識程度の別の統計的表示（例えば、平均値、中間値、標準偏差、または標識の上限範囲および下限範囲）が含まれる。細胞の標識の評価は、好ましくは、適当な標識条件および／または被験体への投与における標識細胞の適当量の選択を可能にする情報を得るために実施する。
【００１０】
実質的に同じ細胞サンプルのそれぞれを実質的に同じ条件で維持できる。この場合、本明細書で開示する方法は、標識の方法論のサンプル間での再現性を評価するのに有用である。実質的に同じ２またはそれ以上の細胞サンプルを互いに異なる条件にさらして（そして通常は、このような条件は実験者が事前に選択するが、無作為化試験または偶発試験の条件も検討される）、そしてこの場合、方法には、異なる条件がインビボの造影試薬での細胞標識に及ぼす効果の評価もさらに含むことができる。多くの場合、多数のサンプル、好ましくは少なくとも１０、２０、５０、１００、１，０００またはそれ以上のサンプルにおいて広範な異なる条件を試験することが望ましい。多数のサンプルを試験する場合、自動化システム、特に、９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレート、もしくはより多数のウェルを伴うプレートに適合する、自動化プレートローダーおよびプレートリーダーといった自動化ハイスループット技術が役立つであろう。このように、本明細書で開示する方法では、自動化ハイスループット技術の使用により、細胞をインビボの造影試薬と接触させることができる（もしくはインビボの造影試薬および代用試薬と接触させることができる）。さらに、自動化ハイスループット技術を利用して、インビボの造影試薬で細胞の標識を評価できる（適当な場合、代用試薬での標識の評価を含む）。
【００１１】
インビボの造影試薬は、任意の非侵襲性の撮像システムでの使用のために選択できる。特定の好ましい態様では、インビボの造影試薬は核磁気共鳴技術によるインビボの検出に適した薬剤である。
ビボ造影試薬は、例えば、常磁性剤、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）ナノ粒子、Ｆｅ（３）Ｏ（４）ナノ粒子、フルオロカーボン造影試薬、およびＧｄキレートまたはＭｎ  キレート（例えば、Ｇｄ−ＤＴＰＡ）からなる群より選択される。インビボの造影試薬は、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）、γ線検出、またはＳＰＥＣＴ（単光子放射型コンピューター断層撮影法）からなる群より選択される非侵襲性の撮像技術による検出に適した薬剤でよい。
【００１２】
本明細書で開示する方法を使用して、標識細胞の安全で検出可能な用量を選択できる。例えば、本明細書で開示する方法は、患者に投与する細胞用量の選択を可能にするインビボの造影試薬での細胞の標識条件を決定することをさらに含むことができ、ここで用量はインビボの造影試薬に関連する既知の安全性パラメーターに準拠して、インビボでの標識細胞の検出を可能にする適切な標識を提供する。同様に、本明細書で開示する方法は、患者に細胞用量を投与することをさらに含むことができ、ここで用量はインビボの造影試薬に関連する既知の安全性パラメーターに準拠して、インビボでの標識細胞の検出を可能にする適切な標識を提供する。
【００１３】
特定の局面では、方法には、追加アッセイにより細胞サンプルを試験することがさらに含まれる。追加アッセイでは、一般的に、標識手順の結果として変化した可能性のある生物学的特徴を評価することが意図される。
対象になりうる生物学的特徴としては、細胞数、細胞生存率、アポトーシス、細胞死、細胞増殖速度、有糸分裂へのエントリー、選択されたタンパク質および核酸（例えば、特定の細胞系統、細胞型、または細胞活性化状態を示すタンパク質および核酸）の発現、細胞運動性、化学誘因、代謝機能などが挙げられる。ある特定の態様では、追加アッセイは、生死判別試験、細胞数、細胞周期アッセイ、遊走アッセイ、および機能アッセイからなる群より選択できる。
【００１４】
本質的に、望まれる任意の細胞型を本明細書で開示する方法で使用できる。細胞は、治療目的または診断目的で、もしくは単にインビボでのこれらの細胞の局在の検出を可能にするために、患者、特に人間の患者への投与を意図することができる。細胞は、臨床条件に適当なように、患者に対して自己由来または同種でよいが、しかし、たいていの場合で、特定の遺伝子またはタンパク質発現の特徴に一致させるための努力がなされる。使用する細胞の例としては、血液細胞、筋原細胞、骨髄細胞、末梢血細胞、臍帯血細胞、心筋細胞、軟骨細胞、免疫細胞、胎児の神経細胞、神経系前駆細胞、線維芽細胞、肝実質細胞、膵臓の膵島細胞、ケラチノサイト、および前述のいずれかの前駆細胞が挙げられる。細胞は、胚性幹細胞、胚性幹細胞から培養した細胞、成体幹細胞、および成体幹細胞から培養された細胞からなる群より選択できる。一部の場合には、実質的に同じ細胞サンプルは、患者またはドナーから得られた、もしくは患者またはドナーから得られた細胞から培養された細胞のサンプルの各一部である。一部の場合には、実質的に同じ細胞サンプルは、それぞれ共通の細胞系からであるか、もしくは共通の細胞系に由来する。
【００１５】
特定の局面では、開示は、患者に安全で有用な用量の標識細胞を投与し、そしてインビボで前記標識細胞を検出する方法を提供する。このような方法には含まれる：
ａ）実質的に同じ複数の細胞サンプルの細胞をインビボの造影試薬と接触させること；
ｂ）サンプル中のインビボの造影試薬を検出すること；
ｃ）インビボの造影試薬での細胞の標識を評価すること；
ｄ）患者に投与する細胞用量の調整を可能にするインビボの造影試薬での細胞の標識条件を決定すること、ここで用量はインビボの標識薬剤に関連する既知の安全性パラメーターに準拠して、インビボでの標識細胞の検出を可能にする適切な標識を提供する；
ｅ）患者に細胞用量を投与すること；ならびに
ｆ）非侵襲性の撮像技術によってインビボの標識細胞を検出すること。好ましくは、非侵襲性の撮像技術は、核磁気共鳴技術、特にＭＲＩである。
【００１６】
特定の局面では、開示は、患者に安全で有用な用量の標識細胞を投与し、そしてインビボで前記標識細胞を検出する方法を提供し、方法には含まれる：
ａ）実質的に同じ複数の細胞サンプルの細胞をインビボの造影試薬および代用試薬と接触させること；
ｂ）サンプル中の代用試薬を検出すること；
ｃ）代用試薬で細胞の標識を評価し、これによりインビボの造影試薬での細胞の標識を評価すること；
ｄ）患者に投与する細胞用量の調製を可能にするインビボの造影試薬での細胞の標識条件を決定すること、ここで用量はインビボの標識薬剤に関連する既知の安全性パラメーターに準拠して、インビボでの標識細胞の検出を可能にする適切な標識を提供する；
ｅ）患者に細胞用量を投与すること；ならびに
ｆ）非侵襲性の撮像技術によってインビボの標識細胞を検出すること。好ましくは、非侵襲性の撮像技術は、核磁気共鳴技術、特にＭＲＩである。
【００１７】
特定の局面では、開示はデュアルモード造影試薬を提供する。デュアルモード造影試薬は、代用試薬と安定的に結合するインビボの造影試薬から成る。インビボの造影試薬は、代用試薬に共有結合または非共有結合しうる。デュアルモード造影試薬の代用剤部分は、例えば、以下の特性の１またはそれ以上を持つ色素または発現タンパク質でよい：蛍光性、発光性、有色、蛍光発生性、光発生性、および／または発色性。
【００１８】
本開示の他の局面は、以下の記述から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
詳細な説明
１．概観
本開示は、インビボでの検出のための細胞のインビトロ標識のパラメーターの迅速かつ効率的な最適化を可能にする過程について記載している。ここで、「インビボ検出剤」は、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）技術、γカメラ、ＳＰＥＣＴ（単光子放射型コンピューター断層撮影法）、またはＮＭＲ技術（例えば、ＭＲＩまたはＭＲＳ）によってヒトまたは他の哺乳動物において検出される薬剤と理解されるであろう。「ＭＲＩ標識」または「インビボの造影試薬」は、核磁気共鳴技術（例えば、ＭＲＩまたはＭＲＳ）を使用して検出できる任意の常磁性造影剤または１９Ｆトレーサー薬剤（例えば、ペルフルオロポリエーテル乳剤）であると理解される。「撮像」と「検出」は同義と理解される。
【００２０】
この過程は、例えば、広範な細胞療法（例えば、免疫療法、リンパ球、幹細胞、組織移植片など）、および細胞投与後にヒト患者または動物において細胞を非侵襲性に追跡するためのインビボの磁気共鳴技術を利用する診断と併用できる。この過程を使用して、実際の治療前に、インビトロでインビボの造影試薬の細胞用量を標準化して、同種または自己由来の細胞の細胞取り込み特性における個々の被験者でのばらつきを説明できる。ここで、我々は、ある方法で細胞表面に結合する、もしくは細胞内に取り込まれる細胞と接触するインビボの造影試薬の量として、「細胞用量」または「細胞用量」と呼ぶ。あるいは、この過程を使用して、未試験の細胞型の細胞標識パラメーターを迅速に評価できる。一部の態様では、この過程によって、細胞量を測定するための高価で複雑な核磁気共鳴計測手段（例えば、ＮＭＲ、ＭＲＩ、ＭＲＳ）の必要性が除外される。好ましい態様では、この過程では、ハイスループット並列組織培養調製物、代用試薬、および光学的方法を利用した迅速または自動化細胞量読み出しを利用する。任意に、細胞用量の定量化に加えて、同じ組織培養調製物中において、インサイチューでの細胞生存率、表現型、免疫学的機能などの他の細胞特性を分析することもできる。
【００２１】
細胞療法の効果的な開発および実施には、非侵襲性に撮像するための、もしくは細胞移植後の細胞を検出するための手段が必要となる。特定のクラスのインビボの造影試薬によって、投与前の細胞にタグを付ける、もしくは標識して、被験体（つまり、ヒト患者または動物）への送達後にそれらを非侵襲性に可視化できる（国際公開広報第２００５０７２７８０号，Ｇｒａｎｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，Ｍａｇｎ  Ｒｅｓｏｎ  Ｍｅｄ．Ｏｃｔ；５４（４）：７８９−９７；ａｎｄ  Ｐｉｎｔａｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｍｅｄ  Ｔｅｃｈ（Ｂｅｒｌ）．Ｊｕｎ；５０（６）：１７４−８０）。被験体への投与前に、細胞に送達される薬剤の一貫した安全用量（つまり、質量）を確保するために、対象となる特定の細胞、または特定の患者を対象とした細胞のインビトロでの標識またはインキュベーションの条件を最適化させる。例えば、医療従事者が自己リンフォカイン活性化リンパ球を使用した悪性腫瘍の治療を計画している場合、培養したリンパ球を生理的条件下で超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）ナノ粒子（Ｐｉｎｔａｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｍｅｄ  Ｔｅｃｈ（Ｂｅｒｌ）．Ｊｕｎ；５０（６）：１７４−８０）またはフルオロケミカル乳剤（国際公開広報第２００５０７２７８０号）などのインビボの造影試薬と最初に接触させることができる。この接触は、手術可能な薬剤の細胞用量を与えうる。続いて、これによって、患者への投与後、開業医が非侵襲性のＭＲＩを使用して非侵襲性に治療用細胞を追跡することが可能になりうる。
【００２２】
細胞の標識過程を標準化することを試みる場合、異なる治療用細胞または診断用細胞、ならびに特に患者またはドナーから直接得た細胞、もしくは患者またはドナーから得た細胞から培養した細胞が、同種または自己由来を問わず、標識過程に対して異なる反応を有するという問題に直面しうる。標識薬剤の取り込み機序は、例えば、エンドサイトーシス、マクロピノサイトーシス、形質移入によって支援された取り込み、受容体によって媒介されるエンドサイトーシスなど、あるいはこれらの機序の任意の組合せでよい。このように、細胞に対する一貫した安全量を実現するための標識インキュベーションパラメーター（例えば、培養液に加える薬剤濃度および／または薬剤とのインキュベーション時間）を迅速に調整する方法が必要となる。いくつかの理由から、特定種類の治療計画のための一定の標準化された細胞用量が重要である；これらとして以下が挙げられる：
（ｉ）過剰標識による細胞に対する明らかな毒性のリスクを最小限にすること；（ｉｉ）標識不足および偽陰性ＭＲＩ読み出し（つまり、通常、スキャンで現われうる個数の標識細胞を含む領域内でのシグナルまたはコントラストの非存在）を最小限にすること；ならびに（ｉｉｉ）ＭＲＩ／ＭＲＳ読み出しに基づく、体内での対象となる特定領域（例えば、転移部分）内での標識細胞の個数を推定する、もしくは定量化する際の必須の第一段階。
【００２３】
例えば、フルオロケミカルトレーサー細胞標識の場合、１９Ｆシグナルの変化を一貫して定量化する性能が臨床的に貴重であり；これらの読み出しを利用して、例えば、体内の特定部位に細胞の送達または輸送効率を推定できる。例えば、細胞内フルオロケミカルトレーサー薬剤技術（国際公開広報第２００５０７２７８０号）の特徴は、標識細胞を含む特定の対象領域での全１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳシグナルを定量化するためのその潜在能力である。全１９Ｆシグナルは、シグナルを示す領域内での標識細胞の個数と直接関連している。
【００２４】
あるいは、常磁性造影剤が標識を含む場合、細胞を含むと考えられる領域内におけるコントラストまたは核磁気共鳴の緩和時間（つまり、Ｔ１、Ｔ２、および／またはＴ２＊）に関連する変化を定量化する能力は、対象の領域内での細胞濃度を反映する可能性があり、そしてこれは生物学的または臨床的意義を持ちうる。
【００２５】
移植された、もしくは所望の領域に移動した治療用細胞の個数を評価する能力は、別の方法では、治療の有効性を予測して、例えば、追加の追跡治療または手順を指示するために利用できる。対象領域内の標識細胞の個数を推定または定量化するために、最終的に被験体に投与される、集団の細胞１個当たりの平均標識用量を最初に調整するか、もしくはいずれかの方法で制御する必要がある。例えば、特定の表現型について選択された細胞型の場合でさえ、個々のばらつきが起こりうる。このばらつきは様々な理由（例えば、細胞の健康状態、遺伝的差異、前処理など）に起因しうるが、そして次にこれは標識細胞の性能に影響を与えうる。
【００２６】
類似の細胞型の個別標識に加えて、異なる細胞型または未試験細胞型の標識における細胞培養パラメーターを迅速に評価する能力が非常に有用である。一般的に、細胞療法用に検討されるが、別の方法ではＭＲＩを利用したインビボ輸送試験の対象と異なる細胞型は、異なる先天性の薬剤取り込み能力を有する。例えば、一部の細胞は食作用が高く、培養中で粒子性標識薬剤を容易に取り込むが、他の細胞型は、例えば、形質移入薬剤またはペプチド類を介した補助がない場合、これらの薬剤を取り込まない。細胞の取り込み機序にかかわらず、一連の組織培養パラメーターを決定するための迅速ハイスループット研究法を持ち、特定の細胞型を最適に標識することが有用である。この過程との関連で、「最適に標識する」とは、細胞に結合した十分な標識薬剤が存在し、細胞をインビボの撮像技術によって検出できるが、しかし、標識細胞の投与時に細胞または患者に対する明らかな細胞毒性または他の有害効果が存在するほどには多量ではないことを意味する。未試験である細胞型の標識の最適化のための最初の出発点は、標識が特性付けされた過去に試験された細胞型に使用されたパラメーターでよい。例えば、過去にリンパ球を標識するためのパラメーターを決定し、そして今度は樹状細胞などの異なる細胞型の適当なパラメーターを決定しようとする場合、リンパ球のパラメーターを出発点として使用して、新たな一連の最適パラメーターを決定するための迅速またはハイスループット研究法を持つことが有用になりうる。
【００２７】
２．インビボの検出技術
本明細書に記載の通り、核磁気共鳴技術を使用して、標識細胞の集団を検出できる。「検出する」という用語は、特に核磁気共鳴技術によって、標識された分子または細胞の有無を確認するための任意の取り組みを含むように使用される。「検出する」という用語は、定量的測定および二次元または三次画像の作成を含むより洗練された測定を含むことも意図される。例えば、ＭＲＩを使用して、このような細胞の画像を作成できる。多くの場合、標識細胞は生きた被験体に投与できる。細胞の投与後、被験体の一部または被験体の全体をＭＲＩで検査して、ＭＲＩデータセットを作成できる。本明細書で使用する「データセット」という用語は、被験物質の磁気共鳴プロービング中に収集された生データならびに処理された、変換された、もしくは生データから抽出された情報を含むように意図される。処理された情報の例としては、被験物質の２次元または３次元画像表示が挙げられる。抽出された情報の他の例は、被験物質中の造影試薬または１９Ｆシグナルの量または濃度を示すスコアである。例えば、１９Ｆシグナルの信号雑音比（ＳＮＲ）を測定し、そして標識細胞の存在量を計算するために使用できる。この種類のデータは、例えば、特に標識細胞に関連する脾臓または別の臓器などの被験体の１つの領域で収集できる。標識細胞を被験体以外との関連で試験できる。培養中の標識細胞を試験することが望まれうる。特定の態様では、標識細胞を組織サンプルまたは組織培養に適用する、もしくはこれらの中で作成させることができ、したがって標識細胞をこれらの関連で撮像することもできる。例えば、臓器、組織、または移植された他の細胞性物質を造影試薬と接触させて、被験体においてこのような移植片の移植前に標識細胞を作成できる。
【００２８】
一般に、本発明の標識剤は、従来のＭＲＩ検出システムでの使用向けに設計される。ＭＲＩの最も一般的な実施では、被験物質に含まれる移動水の分子内での水素原子核（プロトン、１Ｈ）が認められる。本明細書で開示される標識を検出するために、代替核１９Ｆが検出される場合が多い。１９Ｆ  ＭＲＩは、１Ｈと比較して、若干低い内因性の感受性が持つのみである；相対感度は約０．８３である。いずれも＋１／２のスピンを持つ。１９Ｆの天然での同位体存在度は１００％であり、これは１Ｈでの９９．９８５％と同程度である。検出の背後にある物理的原理および像形成は１Ｈ  ＭＲＩおよび１９Ｆ  ＭＲＩのいずれでも同じである。被験物質は広い静磁場に置かれる。電界は、電界方向に沿って１Ｈ核または１９Ｆ核に結合した磁気モーメントを整列させる傾向がある。共鳴的にエネルギーを吸収する磁場の強さに比例する特徴的周波数であるラーモア周波数でのパルス高周波（ＲＦ）放線によって核は平衡から乱される。ＲＦを取り除くと直ぐに、核は受信機アンテナで過渡電圧を誘発して；この過渡電圧は核磁気共鳴（ＮＭＲ）シグナルを構成する。空間情報は、大きな静磁場に重ね合わせられた傾斜磁場の選択的な適用によってＮＭＲシグナルの周波数および／または位相のいずれにおいてもコード化される。過渡電圧は一般的にデジタル化され、そして次にこれらのシグナルは、例えば、コンピューターを使用することによって処理されて、画像を出すことができる。
【００２９】
一定の磁場強度では、１９Ｆのラーモア周波数は、１Ｈと比較して、ほんのわずかだけ低い（−６％）。それで、ハードウェアおよびソフトウェアのいずれでも、１９Ｆデータを得るために従来のＭＲＩスキャナーを適応させることが簡単である。１９Ｆ検出は、ＭＲＩ、ＭＲＳ、または他の技術などの異なる種類の磁気共鳴スキャンと連結させることができる。典型的に、１９Ｆ画像に対して比較するために１Ｈ  ＭＲＩ画像を得ることが望ましい。生体系または他の生物学的組織において、プロトンＭＲＩは被験物質の画像を提供し、そして１９Ｆ画像で検出された標識細胞の解剖学的関係を定義することを可能にする。本発明の好ましい態様では、同じセッション中に１９Ｆおよび１Ｈの両方に関するデータが収集されて；被験体はこれらの取得中に動かさないようにして、２つのデータセットが空間登録内にあることをより良く保証する。正常では、１９Ｆおよび１Ｈのデータセットをいずれか一方の順に連続取得する。あるいは、ＭＲＩ機器のハードウェアおよび／またはソフトウェアに対する適当な改変により、両方のデータセットを同時に取得して、例えば、撮像時間を節約できる。蛍光検出またはＰＥＴなどの他の撮像技術を１９Ｆ  ＭＲＩと結合させることができる。これは、フルオロカーボン造影試薬が蛍光部分と誘導体化されている、もしくはＰＥＴの場合、薬剤が１８Ｆと１９Ｆの両同位体を取り込む場合に特に望ましい。
【００３０】
ＭＲＩ検査は、当技術分野で公知の任意の適当な方法論に従って実施できる。多くの異なる種類のＭＲＩパルスシーケンス、またはデータ収集を統合するためにＭＲＩ装置で利用される一連の使用法、およびシグナルプロセッシング技術（例えば、フーリエ変換および投射復元法）が、長年にわたり、画像データを収集し、そして処理するために開発されてきた（例えば、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｄ．Ｄ．Ｓｔａｒｋ  ａｎｄ  Ｗ．Ｇ．  Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｍｏｓｂｙ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ  １９９９参照）。本発明の薬剤および方法は、生ＮＭＲシグナルの特定の任意の撮像パルスシーケンスまたは処理方法にも結合されない。例えば、本発明に適用できるＭＲＩとして、広く、スピンエコー、刺激エコー、グラディエントエコー、自由誘導減衰撮像、およびその任意の組合せが包含される。迅速撮像技術では、２ライン以上のインク空間またはｋ空間の大きいセグメントが各励起シグナルから得られ、１９Ｆ（または１Ｈ）データを得るために非常に適してもいる。迅速撮像技術の例としては、迅速スピンエコー研究法（例えば、ＦＳＥ、ｔｕｒｂｏ  ＳＥ、ＴＳＥ、ＲＡＲＥ、またはＨＡＳＴＥ）、エコープラナー撮像（ＥＰＩ）、結合グラディエントエコー、およびスピンエコー技術（例えば、ＧＲＡＳＥ）、スパイラル撮像、およびバースト撮像が挙げられる。新しい、そして改善されたパルスシーケンスおよびシグナルプロセッシング方法の開発は連続的に進化している分野であり、そして当業者はそれらの解剖学的関係において１９Ｆ標識細胞を撮像する多数の方法を考案することができる。
【００３１】
核磁気共鳴技術の別の例として、ＭＲＳを使用して、局所の組織または器官内においてフルオロカーボン標識細胞の存在を検出できる。通常、ＭＲＳ方法が従来のＭＲＩスキャナーにおいて実施される。
【００３２】
３．インビボの造影試薬および製剤
一部の態様では、インビボの造影試薬は、常磁性薬剤、超常磁性酸化鉄粒子、磁鉄鉱粒子、フルオロカーボン（例えば、ＰＦＰＥ）、およびＧｄまたはＭｎキレートを含みうるインビボの造影試薬である。磁鉄鉱、Ｆｅ３Ｏ４は、Ｆｅ（ＩＩ）原子と２個のＦｅ（ＩＩＩ）原子から成る．
特定の態様では、被験方法で使用されたインビボの造影試薬は、フルオロカーボン、つまり、少なくとも１個の炭素−フッ素結合を含む分子である。１９Ｆ原子によって、本明細書で開示する造影試薬は１９Ｆ  ＭＲＩおよびＭＲＳ技術などの他の核磁気共鳴技術によって検出できる。特定の好ましい態様では、フルオロカーボン造影試薬が以下の特性の１またはそれ以上を有する：
１）耐えられる細胞毒性；
２）化学シフトによるアーチファクトを最小にするために、理想的には単一の狭い共鳴を持つ、単純な１９Ｆ  ＮＭＲスペクトラム；
３）各分子内に多数のＮＭＲと等価のフッ素原子を伴い、高感度；
４）食細胞に限定されず、多くの細胞型の効率的な標識を可能にするように製剤される。
【００３３】
例示的な化合物としては、アリールまたはヘテロアリールトリフルオロメチルスルホン酸エステル（トリフレート）またはスルホンアミド（トリフラミド）、フッ化エチルアルコールのエステル
（２，２，２−トリフルオロエタノール、ペルフルオロ−ター−ブタノール、および２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロパノール）、ペルフルオロアルカン酸（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏａｌｋａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）のエステルおよびアミド（トリフルオロ酢酸、エルフルオロテトラデカン酸（ｅｒｆｌｕｏｒｏｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、およびノナフルオロペンタン酸（ｎｏｎａｆｌｕｏｒｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）など）、ペルフルオロアルカン（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏａｌｋａｎｅ）のエーテルなど。好ましくは、造影試薬は、炭素に結合した複数のフッ素、例えば、炭素に結合した５個より多い、１０個より多い、１５個より多い、または２０個より多いフッ素を含む。好ましくは、少なくとも４個、少なくとも８個、少なくとも１２個、または少なくとも１６個のフッ素がほぼ同等のＮＭＲ化学シフトを持つ。
【００３４】
特定の態様では、造影試薬は、ペルフルオロ−１５−クラウン−５、ペルフルオロ−１８−クラウン−６、ペルフルオロ−１２−クラウン−４などのペルフルオロクラウンエーテルであり、本明細書ではサイクリックペルフルオロポリエーテル（サイクリックＰＦＰＥ）とも呼ばれる。これらの分子の１９Ｆ核が、類似の、または同じＮＭＲ共鳴を持ち、化学シフト画像アーチファクトが低下した、もしくは非存在下でより高い信号雑音比画像をもたらす点でこのような化合物は有利である。大環状ペルフルオロ−１５‐クラウン−５エーテルは特に好ましい特徴を持つ。それは親油性でも親水性でもなく、これはペルフルオロポリエーテルでは典型的であり、そして水溶液中に乳化される。典型的な乳剤は、水溶液中で安定性な小微粒子（直径１０−５００ｎｍ）であり、そして細胞によって取り込まれることができる。当業者であれば、他のフッ化化合物、特に各フッ素原子が類似の化学的環境にあるフッ素化合物が、望ましい特性を持つことを認識するであろう。ペルフルオロ−ター−ブタノール、１，３，５トリス（トリフルオロメチル）ベンゼン、ヘキサフルオロアセトン、ポリ（トリフルオロメチルエチレン）、およびペルフルオロシクロヘキサンのエステルは、同じ、またはほぼ同じラーモア周波数を持つ１９Ｆ共鳴を伴う多数のフッ素原子を持つ化合物の例である。
【００３５】
特定の態様では、造影試薬はポリマーである。特定の態様では、造影試薬は、線形ペルフルオロポリエーテル（線形ＰＦＰＥ）、例えば、−［Ｏ−ＣＦ２（ＣＦ２）ｘＣＦ２］ｎ−の繰り返し単位を含む構造またはその一部を持つ化合物である、もしくはそれを含み、ここでｘは０〜１０、好ましくは０〜３の整数であり、そしてｎは２〜１００、好ましくは４〜４０の整数である。例えば、ペルフルオロ線形ポリエチレンオキシドはＥｘｆｌｕｏｒ  Ｃｏｒｐ．（Ｒｏｕｎｄ  Ｒｏｃｋ，ＴＸ）から得ることができる。いずれか一方または両方の末端（または、分枝ポリマーの場合には複数の末端）を追加の所望の機能性を提供する部分で誘導体化できる。
【００３６】
例えば、造影試薬がＡ−Ｂ−Ｃの化学式を持つことができ、ここでＡそして／あるいはＣは官能基でよく、そしてＢは−［Ｏ−ＣＦ２（ＣＦ２）ｘＣＦ２］の繰り返し単位を含み、ここでｘは０〜１０、好ましくは０〜３の整数であり、そしてｎは２〜１００、好ましくは４〜４０の整数である。官能基（例えば、特定の所望の機能を付与する非フッ化単量体）について以下でさらに考察している。
【００３７】
線形ペルフルオロポリエーテルは、平均的な化学式を持つ組成物として記載することもできる：
ＸＯ（Ｙ−Ｏ）ｎＺ、
ここでＹは
【００３８】
【化１】
2009533061.tif 000002
からなる群より選択され、
ここでｎは８〜３０の整数であり；
ＸおよびＺは同じであり、そして官能基で誘導体化された前述のいずれかの他、ペルフルオロアルキル、ペルフルオロエーテル、フルオロアシル、カルボキシルで終端させたフルオロアルキル、アミドまたはエステル、メチロール、酸塩化物、アミド、アミジン、アクリル酸塩およびエステルからなる群より選択される。
【００３９】
ペルフルオロ二酸をペルフルオロジハロカーボン（ｄｉｈａｌｏｃａｒｂｏｎ）（１，４−ジヨードオクタフルオロブタンなど）と反応させることにより、完全フッ素化ポリマーを形成させることができ、フッ化単量体（任意に、非フッ化でありうる官能基）を他の単量体と反応させて、造影試薬として有用なハイブリッド・ポリマーを形成させることができる。様々な異なる非フッ化単量体を使用して、ポリマー全体の化学的および物理的特性を変化させて、そして特定の用途のために造影試薬を調整できる。例えば、高親油性の造影試薬は脂肪細胞および他の脂肪組織内に濃縮する可能性があり、高親水性の造影試薬は循環系またはリンパ系の撮像に有用となりうる。
【００４０】
対象の別のＰＦＰＥ組成物は、様々な末端基で誘導体化される線形ＰＦＰＥである。線形化合物は、様々な種類の官能基など、末端に様々な機能部分を結合できるという利点を持つ。これらの線形化合物の１９Ｆ  ＮＭＲスペクトラムは一般的に大環状化合物よりも複雑であるが、しかし、２つ十分に分離させたＮＭＲシグナルを伴うＰＦＰＥも使用できる。この場合、より小さな共鳴に適用される１またはそれ以上の非共鳴飽和パルスを取り込むＭＲＩパルスシークエンスを使用して、化学シフトによるアーチファクトを除くことが望まれうる。
【００４１】
特定の態様では、線形ペルフルオロポリエーテルは、一端、または好ましくは両端で、比較的親水性な部分で誘導体化できる。例えば、親水性部分はポリエテレングリコールでよく、これにより中心で各末端および疎水性領域に水溶性領域を伴う３ブロック・コポリマーを形成する。水性環境中で混合させた場合、この種類の造影試薬はミセルを形成して、ＰＦＰＥ中心は水溶性被膜で囲まれる傾向がある。広範な分子量のアミノ‐ＰＥＧブロックが市販されている。
【００４２】
特定の態様では、本発明は細胞による取り込みに適した造影試薬の製剤に提供する。ＰＦＰＥなどのフルオロカーボン造影試薬を含む乳剤は、好ましくは適切な細胞取り込みを可能にする粒径分布を持つ。例えば、平均粒径が一般的に１０ｎｍから５００ｎｍの範囲内にあり、そして好ましくは３０ｎｍから１５０ｎｍの範囲または約３５０ｎｍから５００ｎｍの範囲内にある。任意に、粒子の２５％、５０％、７５％またはそれ以上も選択された範囲内にある。
【００４３】
粒径が、例えば、光散乱技術によって、またはＥＭ顕微鏡写真を使用した乳濁液粒子を可視化することによって評価できる。大半の幹細胞などの比較的少量の細胞質を持つ特定の細胞型では、好ましい粒径は直径１０−５０ｎｍの範囲内にある。細胞に使用する乳剤は、好ましくは広範囲の温度で安定でなければならない。例えば、冷温、２−１０℃の範囲内、そして好ましくは４℃で乳剤を保存し、そして次に室温（例えば、１８℃から２８℃、そしてより典型的には、２０℃から２５℃）に乳剤を暖めることが望ましい場合が多い。細胞の標識後、乳剤は約３７℃の温度を経験する。したがって、好ましい乳剤は、冷蔵温度から体温に及ぶ温度で所望の粒径の範囲を保持する。界面活性物質は、水相内に大量のＰＦＰＥを持ち込む安定した乳剤を形成するように設計できる。さらに、それは最も短い可能なインキュベーション時間に乳剤粒子の細胞内送達を増加させる特性を持つことができる。ＰＦＰＥ細胞内充填量を増やすことで標識細胞に対する感受性が改善される。さらに、インキュベーション時間を減らすことは、一次細胞培養物で作業する際に重要になりうるが、これは細胞表現型が経時的に変化しうるためである。細胞内取り込み効率は細胞型に依存する。例えば、マクロファージおよび樹状細胞がほぼ全ての微粒子を形質膜陥入するのに対して、対象の他の細胞型は弱い食作用を持ちうるのみである。いずれの場合も、界面活性物質内に陽イオン性脂質を取り込むことによって、ペプチド類（例えば、オリゴ−Ａｒｇ９およびＴＡＴ様ペプチド類）を使用することによって、もしくは特異的の細胞表面分子に標的とする抗体を取り込むことによって、取り込み効率を実質的に引き上げることができる。
【００４４】
乳剤の特性は、主に、それ自体の造影試薬の特性、使用される界面活性物質および／または溶媒の性質、および処理（例えば、超音波処理など）によって制御することができる。ＰＦＰＥ乳剤を形成するための方法は、米国特許第５，３３０，６８１号および第４，９９０，２８３号に広範囲に記載されている。濃縮水溶液中の多価アルコールおよびサッカライドなどのポリ水酸化化合物（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｅｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の連続相が効果的でありうる。以下の多価アルコールおよびサッカライドは特に効果的であることが判明している：グリセロール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、グルコース、フルクトース、サッカロース、マルチトール、グリセロールの二量体化合物（ジ−グリセロールまたはビス（２，３−ジ−ヒドロキシプロピル）エーテル）、グリセロールおよびテトラグリセロールとしての糖類およびグリセロール縮合物としての固形の水溶性ポリ水酸化化合物。乳剤中の分散は、陽イオン性、陰イオン性、両性および非イオン性界面活性剤を含む従来の界面活性物質の存在下で実施することができ、イオン性界面活性剤が好ましい。適当な界面活性物質の例としては、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸（スルホコハク酸ヘミエステル）、ココヤシ−両性カルボキシグリシン酸、セチルリン酸カリウム、アルキル−ポリオキシエチレン−エーテルカルボン酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウムカリウム、アルキルアミドプロピルベタイン、セチルステアリン酸エトキシ化アルコール、およびソルビタン−エトキシレート（２０）−モノオレエートＴｗｅｅｎ２０が挙げられる。熱力学方程式を使用して、所望の粒径および安定度を持つ乳剤を与える造影試薬の混合物を予測する試みができ、様々な混合物を実際に試験することが最も効果的であることが一般的に受け入れられている。混合物の乳化は簡単で迅速であり、広範囲の併用を迅速に試験して、本明細書で開示される方法に適した乳剤をもたらす組み合わせを特定できるようにする。
【００４５】
特定の態様では、インビボの造影試薬は、ＰＥＴ技術、γカメラ、またはＳＰＥＣＴに適した薬剤である。
【００４６】
４．代用試薬
蛍光検出を可能にする造影試薬は、特に様々な用途で有用である。例えば、蛍光標識によって、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの蛍光ベースの細胞選別機序の使用が可能になる。細胞選別は、例えば、標識の成功した細胞集団を濃縮するために望ましい。これは、標識がよりまれな細胞集団を対象とする場合に特に有用でありうる。代用試薬はデュアルモード薬剤でよく、そしてこれは、それらが生きている被験体に移植された後に、標識細胞を見いだし、そして特性付けする際にさらに有用である。この用途では、細胞の生検を行うことができ、または、一定期間にわたり存在した後、被験体から他の手段によって回収できる。そして次に、回収した細胞の生物学的解析を実施できる。例えば、ＦＡＣＳ分析を回収した細胞に実施して、ここでは蛍光ＰＦＰＥ標識について細胞を陽性選択後、（異なるカラー蛍光プローブを使用して）特異的な細胞表面マーカーの発現について細胞を分析して、移植後に起こる細胞表現型の変化を研究することができる。蛍光標識は、特に３次元共焦点蛍光顕微鏡を使用して、細胞の蛍光顕微鏡にも使用できる。
【００４７】
一部の態様では、代用試薬はインビボの造影試薬から作られている蛍光アナログである。この薬剤は、容易に検出可能な蛍光特性を示すことを除き、実際のインビボの造影試薬として好ましくは類似の、もしくはほとんど同じ化学的および物理的特性（例えば、効果的な電子電荷、分子量、立体的サイズ、立体構造など）を持つ。あるいは、インビボで検出可能であって、そして蛍光部分も含んでいるという点で、「デュアルモード」である薬剤を使用することができうる。例えば、ＰＦＰＥナノ粒子薬剤の場合、蛍光部分は乳化前にＰＦＰＥまたは界面活性物質分子に結合させることができる（国際公開広報第２００５０７２７８０号参照、全体として参照により組み入れられる）。蛍光部分としては、フルオレセイン、リサミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、フィコエリトリン、ローダミン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＦｌｕｏｒＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、およびＡｌｅｘａ  ｄｙｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を染める。蛍光部分としては、フルオレセイン、ｂｅｎｚｏｘａｄｉｏａｚｏｌｅ、クマリン、エオシン、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、ｐｙｒｉｄｙｌｏｘａｚｏｌｅ、およびローダミンの誘導体が挙げられる。これらおよび多くの他の例示的な蛍光部分は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）で見ることができる。追加の蛍光部分には、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能な「量子ドット」製品などの蛍光ナノ結晶が含まれる。このようなナノ結晶は、適当な発光スペクトル（例えば、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ）を持つ半導体コア、基礎をなすコア材（例えば、ＺｎＳ）に効率的に結合させることができる非放出性で透明な比較的非反応性の物質からなる殻、ならびに望ましい溶解度（例えば、水溶液、生理的溶液中での溶解度）および本明細書に記載のフルオロカーボンへの付着のための可能な反応基を提供するコーティングによって構築できる。あるいは、蛍光部分は、ＰＦＰＥ乳剤粒子の表面上の界面活性物質にしっかり結合する色素（例えば、ＤｉＩまたはＤｉＯなどの親油性色素）でよい。
【００４８】
ＰＥＴ撮像に適した検出部分を使用して、核磁気共鳴技術によってそしてＰＥＴ技術によって検出可能なデュアルモード造影試薬を作り出すこともできる。例えば、１８Ｆ同位体はＰＥＴ検出方法のための強力な標識である。フルオロカーボン造影試薬は１８Ｆ同位体と１９Ｆ同位体の混合物からなり、これによってＭＲＩ／ＭＲＳおよびＰＥＴに適したデュアルモード標識を提供する。１８Ｆおよび１９Ｆを別々の単量体で加えて、混合コポリマーを形成でき、もしくは１８Ｆ部分を線状ポリエーテルの一方の端、または大半の他の官能基を付加させる位置に位置付けることもできる。１８ＦはＮＭＲシグナルを持たず、そのため、例えば、ＮＭＲ線幅を減少させる、ＮＭＲスペクトラムを単純化する、もしくは核磁気共鳴技術によって得られる読み出しに有害効果を及ぼす共鳴からの化学シフトを軽減させる傾向がありうる位置に付加できる。また、フルオロカーボン造影試薬の分子は、１１Ｃ、１５Ｏ、および１３Ｎなど効果的なＰＥＴプローブである他の放射性同位体を取り込むことができる。当業者は、本明細書から判断して、本発明の造影試薬の、末端基に取り込まれる、もしくは、例えば、付加できる多くの他のＰＥＴ検出可能な機能基を考案できる。
【００４９】
常磁性薬剤に関しては、いくつかの種類の蛍光アナログが知られており、そして文献（Ｖｅｎａｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．Ｏｃｔ  ５；７５（２）：１２８−３９）に記載されている。例えば、ユウロピウムおよびテルビウムなどの特定のランタニドは蛍光特性を持つことが知られており、そしてＥｕ−ＤＴＰＡ、Ｅｕ−ＤＯＴＡ、Ｔｂ−ＤＴＰＡ、Ｔｂ−ＤＯＴＡなどのキレート複合体（Ｅｌｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，ＡＪＮＲ  Ａｍ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌ．Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；１０（６）：１１３７−４４）として通常のＭＲＩ活性ガドリニウム（Ｇｄ）の代わりにこれらの金属を用いることによってアナログインビボ造影試薬を合成できる。デュアルモード常磁性薬剤は、例えば、ローダミン、フルオレセイン、またはシアニン部分とＧｄ−またはＦｅ−ベースＭＲＩ／ＭＲＳ薬剤と複合体を形成させることで合成させることもできる（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｒａｄｉｏｌ．Ｓｅｐ；３５（９）：５６４−７０）。好ましい態様では、読み出し前に、細胞と結合しない過剰の標識（つまり、浮遊液に残る標識）を標準的方法によって洗い、そして細胞を新鮮な培養液またはバッファーに再度浸す；これによりウェルから「バックグラウンド」蛍光シグナルが除去される。
【００５０】
一部の態様では、発光染料［例えば、トリス（２，２’−ビピリジル）ジクロロルテニウム（ＩＩ）ヘキサハイドレートおよびプラチナ・オクタエチルプルフィリン・ケトン］は上記のいずれかの方法において代用試薬から成る。また、このような染料は細胞送達のためにポリジメチルシロキサン（ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｓｉｌｏｘａｎｅ）のようなシリカネットワーク内で化学処理してよい。
あるいは、インビボの造影試薬を、付加されているか、あるいは光学的に見ることのできるレポーターをコード化する核酸配列に接触、付加、または特定の方法で結合させることができる。例示的な光学的レポーターとしては、限定はされないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および関連する誘導体（ＹＦＰ、  ＢＦＰなど）または様々なルシフェラーゼが挙げられる。これらのレポーターを含むプラスミド、または他の任意の核酸シャトルを特定の方法でインビボの造影試薬と結合させることができる。例えば、光学的レポーターを含むプラスミドを造影試薬もコーティングする形質移入薬剤内に取り込ませることができる。さらなる例として、核酸シャトルを様々な手段でＰＦＰＥナノ粒子の表面を覆う界面活性物質に付着させることができる。オリゴヌクレオチドをナノ粒子（Ｇｌｙｎｏｕ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ａｕｇ  １５；７５（１６）：４１５５−６０）およびタンパク質にも（Ａｂｒａｈａｍｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．Ｊｕｎ  １５；１９（１１）：１５４９−５７）直接結合させることができる直接のＤＮＡまたはタンパク質のタグによって、標的部分、ハイブリダイゼーション、または当業者に公知の他の手段によってレポーターにさらに結合させることが可能になりうる。
【００５１】
生理的温度での細胞のインキュベーション時に、細胞はレポーター遺伝子産物を生成する。続いて、適当な波長で培養１ウェル当たりでレポーターによって発せられた光量は、インキュベーション期間中に１ウェル当たりに細胞が取り込んだ標識薬剤粒子の数に比例する。このようにして、１ウェル当たりに細胞が取り込んだ平均標識薬剤を測定する。遺伝的にコードされるレポーターとして使用することの利点は、取り込みの読み出し前での洗い段階を利用する必要がない点であり；細胞内に取り込まれた細胞外核酸レポーターは、光学的に不活発であり、つまり、レポーター遺伝子産物に適当な波長で検出できる光を生成しない。第二に、遺伝的にコードされるレポーターとして使用することによって、患者または被験体において使用される実際のインビボの造影試薬と類似の蛍光アナログまたはデュアルモード薬剤を造成する、もしくは製造する必要はない。
【００５２】
あるいは、標識細胞に結合する場合、光学的吸収度またはカラースペクトルを調整する代用試薬を構築できる。これらの薬剤は比色定量薬剤であると理解される。例えば、βガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）をコード化する核酸ベースのレポーター遺伝子を使用できる。同様に、核酸蛍光プローブ（上記）に関する記載の通り、プラスミド、またはβ−Ｇａｌを含む任意の他の遺伝子担体を特定の方法でＭＲＪ／ＭＲＳ標識薬剤に結合させることができる。生理的温度での標識薬剤および細胞のインキュベーション時に、標識している薬剤複合体が取り込まれた後、細胞は外来性酵素β−Ｇａｌを生成する。そして次に、各ウェル内の細胞を標準的な化学的方法（つまり、Ｘ−Ｇａｌブルー染色）を利用して染色でき；分析する１ウェル当たりの細胞標識の程度をその比色定量変化の検出よって分析する。同様に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの他の酵素またはジゴキシゲニンなどの市販の抗体によって認識される部分は、標識薬剤に結合させることができる。
【００５３】
特定の態様では、放射性代用試薬が使用される。例えば、ＳＰＩＯ薬剤では放射性５７Ｆｅまたは５９Ｆｅ、またはＰＦＰＥトレーサー薬剤タイプでは１８Ｆを取り込むインビボの造影試薬アナログを作製することによる。インキュベーション期間および過剰の（つまり、未結合の）薬剤を除去する洗い段階後、１ウェル当たりの単位時間での放射性崩壊イベントの数は、細胞によって取り込まれたビボ造影試薬の量に比例している。放射性標識は、デュアルモード薬剤であるか、もしくはインビボの造影試薬に間接的に結合させることができる。
【００５４】
５．細胞型
本明細書に方法は、原核細胞および真核細胞の両方、および好ましくは哺乳動物細胞を含む、広範な細胞に使用できる。細胞調製物の技術としては、細胞培養、クローニング、核移植、遺伝子改変および封入が挙げられる。細胞は、好ましくは、ドナーから得られ、そして患者への投与が意図される細胞である。患者は、多くの場合、ドナーでありうる。細胞は、ドナーから得られた一次細胞または二次細胞の培養物でよく、しかし、一般的に本明細書で「ドナーから得られた細胞からの培養された」を指す細胞は、細胞株を作成するために使用されてきた細胞、または繰り返し培養させてドナーから得られた細胞とは実質的に異なる細胞を生じさせてきた細胞ではない。これらの後者の細胞型は、「細胞株」という用語に含まれる。
【００５５】
適当な哺乳動物細胞の部分的な表には、血液細胞、筋原細胞、骨髄細胞、末梢血細胞、臍帯血細胞、心筋細胞（およびその前駆細胞）、軟骨細胞（軟骨細胞）、樹状細胞、胎児神経組織、神経細胞の前駆細胞、線維芽細胞、肝実質細胞（肝細胞）、膵臓の膵島細胞、ケラチノサイト（皮膚細胞）、および幹細胞が含まれる。一部の態様では、細胞は組織移植片を構成する。特定の好ましい態様では、使用される細胞は分画された免疫細胞集団である。認められる免疫細胞の亜群には、リンパ球、Ｂリンパ球（Ｆｃ受容体、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ１９＋、ＣＤ２１＋）、ヘルパーＴリンパ球（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８−）、細胞溶解Ｔリンパ球（ＣＤ３＋、ＣＤ４−、ＣＤ８＋）、ナチュラルキラー細胞（ＣＤ１６＋）、単球、中性親和性およびマクロファージを含む単核食細胞群、および樹状細胞が含まれる。対象となりうる他の細胞型としては、好酸球および好塩基性細胞が挙げられる。
【００５６】
細胞は、自己由来（つまり、同じ個人から得られた）または同系（つまり、同系同腹仔または一卵性双生児などの遺伝的に同じ個体から得られた）でよいが、同種細胞（つまり、同じ種の遺伝的に異なる個人から得られた細胞）も検討される。それほど好ましくはないが、トランスジェニックブタからの細胞などの異種（つまり、宿主とは異なる種から得られた）細胞も投与できる。ドナー細胞が異種である場合、細胞は、同じ目、より好ましくは同じ上科または科の種の個体から得られることが好ましい（例えば、宿主が人である場合、細胞は、霊長類、より好ましくはヒト上科のメンバーから得られることが好ましい）。
【００５７】
細胞は、医学的かつ倫理的に適当である場合、出生前（例えば、胚または胎児）、乳児（例えば、ヒトの誕生から約３歳まで）、小児（例えば、ヒトの約３歳から約１３歳まで）、青年（例えば、ヒトの約１３歳から約１８歳まで）、若年成人（例えば、ヒトの約１８歳から約３５歳まで）、成人（ヒトの約３５歳から約５５歳まで）、または高齢者（例えば、ヒトの約５５歳以上）を含む、ドナー個人の発育の任意の段階から得ることができる。
【００５８】
特定の態様では、標識される細胞は幹細胞である。幹細胞治療は、高線量照射および／または化学療法薬によるがん治療における切除療法の一部として一般に使用される。切除療法では、一般的に、造血幹細胞、または例えば、末梢血、臍帯血、または骨髄から得ることができる造血幹細胞を含む細胞集団が使用される。この細胞型、またはその一部分を標識して、インビボで追跡して、適当な部位での生存および移植をモニターできる。他の幹細胞型が多種多様な疾患に対する治療薬としてますます魅力的となっている。
【００５９】
例えば、細胞は、マウス胚性幹細胞、または別のモデル動物からのＥＳ細胞でよい。このような細胞の標識は、任意に、胚性幹細胞による薬物療法を開発するための前臨床研究プログラムの一部として、マウスに投与される細胞の運命を追跡するのに有用になりうる。マウス胚性幹細胞の例としては、Ｍ．Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ９，２５２３（１９９５）に記載のＪＭｌ  ＥＳ細胞、およびＧ．Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，Ｐ．Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ５，１５１３（１９９１）に記載のＲＯＳＡ株、および米国特許第６，１９０，９１０号に記載のマウスＥＳ細胞が挙げられる。
【００６０】
他の多くのマウスＥＳ株が  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から入手可能である。ヒト胚性幹細胞の例としては、以下の供給元を通して利用可能な細胞が挙げられる：
Ａｒｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＣｙＴｈｅｒａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．（Ａｔｈｅｎｓ，Ｇｅｏｒｇｉａ）、ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、Ｇｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｇｏｔｅｂｏｒｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｇｏｔｅｂｏｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｍａｒｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｍａｒｉａ  Ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  （Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ），ＭｉｚＭｅｄｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ−Ｓｅｏｕｌ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｔａｔａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｂａｎｇａｌｏｒｅ，Ｉｎｄｉａ）、Ｐｏｃｈｏｎ  ＣＨＡ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）、Ｒｅｌｉａｎｃｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ）、ＲｅＮｅｕｒｏｎ（Ｓｕｒｒｅｙ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）、ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，  Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｔｅｃｈｎｉｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｈａｉｆａ，Ｉｓｒａｅｌ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、およびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ａｌｕｍｎｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）加えて、胚性幹細胞の例は、以下の米国特許出願公開第６，２４５，５６６号、第６，２００，８０６号、第６，０９０，６２２号、第６，３３１，４０６号、第６，０９０，６２２号、第５，８４３，７８０号、第２００２００４５２５９号、第２００２００６８０４５号に記載されている。好ましい態様では、ヒトＥＳ細胞は国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）が提供する承認済みの細胞株リストから選択され、ｈｔｔｐ：／／ｅｓｃｒ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．からアクセスできる。特定の好ましい態様では、胚性幹細胞株は、Ｄｒ．Ｊ．Ｔｈｏｍｓｏｎ（Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から得られるＷＡ０９株、ならびにいずれも現在ＮＩＨに登録されているＵＣ０１株およびＵＣ０６株からなる群より選択される。
【００６１】
特定の態様では、開示される方法で使用される幹細胞は、神経または神経内分泌に由来する幹細胞、中枢神経系（例えば、米国特許第６，４６８，７９４号、第６，０４０，１８０号、第５，７５３，５０６号、第５，７６６，９４８号参照）、神経堤（例えば、米国特許第５，５８９，３７６号、第５，８２４，４８９号参照）、嗅球または末梢神経組織（例えば、米国特許出願公開第２００３０００３５７４号、第２００２０１２３１４３号、第２００２００１６００２号、およびＧｒｉｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２２（２）：４３７−４５参照）、脊髄（例えば、米国特許第６３６１９９６号、第５８５１８３２号参照）、もしくは副腎、脳下垂体、または特定の腸の部分などの神経内分泌系（例えば、米国特許第６１７１６１０号、およびＫｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１８９６１−６７に記載のＰＣ１２細胞参照）に由来する幹細胞である。好ましい態様では、神経幹細胞は末梢組織または容易に治癒する組織から得られ、これによって移植用の自己細胞集団を提供する。
【００６２】
造血幹細胞または間葉幹細胞は、開示されている特定の方法に使用できる。最近の研究では、容易に分離される骨髄由来造血幹細胞（ＨＳＣ）および間葉幹細胞（ＭＳＣ）が、過去に認められているよりも広範な分化能を持つことが示唆されている。精製ＨＳＣは、血中の全ての細胞を生じるだけでなく、通常は、肝実質細胞のように内胚葉由来の細胞を発生させることもできる（Ｋｒａｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃｅｌｌ  １０５：３６９−７７；Ｌａｇａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ６：１２２９−３４）。同様に、末梢血および臍帯血に由来するＨＳＣは、有用な範囲の発生能を提供することが予測される。ＭＳＣは同様に多分化能を持つと思われ、例えば神経細胞マーカーを発現できる子孫細胞を生成する（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１４３−７；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １７４：１１−２０）。造血幹細胞の例としては、米国特許第４，７１４，６８０号、第５，０６１，６２０号、第５，４３７，９９４号、第５，９１４，１０８号、第５，９２５，５６７号、第５，７６３，１９７号、第５，７５０，３９７号、第５，７１６，８２７号、第５，６４３，７４１号、第５，０６１，６２０号に記載の細胞が挙げられる。
【００６３】
間葉幹細胞の例としては、米国特許第５，４８６，３５９号、第５，８２，７３５号、第５，９４２，２２５号、第５，９７２，７０３号に記載の細胞、ＰＣＴ公開番号：国際公開広報第００／５３７９５号、国際公開広報第００／０２６５４号、国際公開広報第９８／２０９０７号に記載の細胞、およびＰｉｔｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ａｎｄ  Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．に記載の細胞が挙げられる。
【００６４】
幹細胞株は、好ましくは、齧歯目（例えば、マウスまたはラット）、霊長類（例えばサル、チンパンジー、またはヒト）、ブタ、および反すう動物（例えば、ウシ、ヒツジ、およびヤギ）などの哺乳動物から、そして特にヒトから得られる。特定の態様では、幹細胞は、自己由来の材料またはＨＬＡ型の一致する材料から得られる。例えば、幹細胞は、膵臓ホルモン生成細胞を必要とする被験者（例えば、インスリン産生細胞を必要とする糖尿病患者）から得ることができ、そして培養させて、自己由来インスリン生成細胞を作成できる。幹細胞の他の材料は、筋組織からの幹細胞、皮膚（真皮または表皮）からの幹細胞、および脂肪からの幹細胞など、被験体から容易に得られる。
【００６５】
一部の好ましい態様では、ヒトに投与するための細胞は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）または他国の同等の管理局が定めた適正組織診療指針に従う必要がある。このような細胞株を開発する方法には、ドナー試験、および非ヒト細胞および製品への曝露の回避が含まれうる。
【００６６】
ドナー（任意に、患者はドナーである）から得られた細胞は、送達される細胞の目的によって決められる通りに、非分画細胞または分画細胞として投与できる。投与前に細胞を分画することで、特定の細胞型を濃縮できる。分画方法は当技術分野において周知の方法であって、そして一般的にポジティブ選択（つまり、特定の特性に基づく細胞の保持）およびネガティブ選択（つまり、特定の特性に基づく細胞の除去）のいずれも含む。当業者には明らかなように、ポジティブ選択およびネガティブ選択に使用される特定の特性（例えば、表面マーカー）は、所望の細胞集団に依存する。細胞の選択／濃縮において使用する方法には、免疫親和性技術または密度遠心法が含まれうる。当技術分野において周知の通り、免疫親和性技術は様々な形を取ることができるが、しかし、一般的に、特定種類の分離技術との併用で抗体または抗体誘導体が利用される。分離技術は、一般的に、抗体が結合した細胞と抗体が結合しなかった細胞の物理的分離をもたらすが、一部の場合、抗体が結合した細胞を殺す分離技術をネガティブ選択に利用できる。
【００６７】
使用するために選んだ細胞の選択／濃縮のために、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）、パニング、免疫磁気分離、免疫親和性クロマトグラフィ、抗体媒介性の補体結合反応、免疫毒素、密度勾配分離などを含む、任意の適当な免疫親和性技術を利用できる。免疫親和性過程における処理後、所望の細胞（ポジティブ選択の場合には免疫親和性薬剤に結合した細胞、そしてネガティブ選択の場合には免疫親和性薬剤に結合しなかった細胞）を回収し、そして追加回数の免疫親和性選択／濃縮にかけるか、もしくは患者への投与のために取っておく。
【００６８】
免疫親和性選択／濃縮は、典型的に、所望の細胞型を含む細胞調製物を抗体または抗体由来の親和性薬剤（例えば、所与の表面マーカーに特異的な抗体）とインキュベートさせること、次に結合した親和性薬剤を利用して、抗体が結合した細胞または結合していない細胞を選択することで行われる。選択過程には、一般的に、結合した親和性薬剤の存在または非存在に依存して単一細胞を含む小滴を異なる容器に方向付けることによって（ＦＡＣＳ）、固相基質に結合した抗体を（直接的または間接的に）利用することによって（パニング、免疫親和性クロマトグラフィ）、もしくは磁場を利用して磁気親和性薬剤を介して磁気粒子に結合した細胞を回収することによって（免疫磁気分離）達成できる、物理的分離が含まれる。交互に、望ましくない細胞は、親和性薬剤によって結合された細胞に細胞毒性傷害をもたらす親和性薬剤を使用して調製物から除去できる。細胞毒性傷害は、親和性薬剤によって活性化させることができ（例えば、補体結合反応）、もしくは親和性薬剤（例えば、リシンＢ鎖などの免疫毒素）によって標的赤血球に局在化させることができる。
【００６９】
６．細胞の標識方法
造影試薬または代用試薬により細胞を標識するために、様々な方法を利用できる。一般に、造影試薬が細胞に結合するように、細胞は造影試薬と接触させて置かれる。条件は、細胞生存率を維持するように設計された標準的な細胞培養条件である場合が多い。「結合した（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」という用語は、インビボまたはインビトロを問わず、造影試薬が細胞の位置に関する有用な情報を提供できるように、造影試薬と細胞が十分な時間にわたり十分に近い物理的近接内にとどまるようにするための任意の方法を含むことが意図される。例えば、食作用、液相エンドサイトーシス、受容体媒介性エンドサイトーシス、陽イオン部分の付加、トランスフェクション、エレクトロポレーション、または界面活性物質媒介性の細胞内侵入後に造影試薬は細胞内に局在化できる。樹状細胞、マクロファージ、およびＴ細胞などの免疫細胞は高い食作用を持ち、そして本明細書および他の試験で示されるデータによって、このような細胞および他の食細胞型が容易に標識されることが実証される。
【００７０】
造影試薬を細胞膜に挿入させるか、もしくは細胞の細胞外構成成分を共有結合または非共有結合させることができる。例えば、本明細書に記載の特定の線形フルオロカーボンを誘導体化させて、１またはそれ以上の標的部分に付着させることができる。標的部分を選択することで、造影試薬と標識する細胞の結合を促進させることができる。標的部分は、細胞膜内にフルオロカーボンの非特異的な挿入を起こす（例えば、疎水性アミノ酸配列もしくはパルミトイル部分またはミリストイル部分などの他の疎水性部分）、もしくは細胞内への非特異的侵入を促進させるように設計できる。受容体リガンドの場合と同様に、標的部分は細胞表面成分に結合できる。標的部分は特異的結合対のメンバーでありうるが、ここでパートナーは細胞表面成分である。標的部分は、例えば、受容体のリガンド、もしくはモノクロナル抗体またはポリクロナール抗体などの抗体、または免疫グロブリンの可変部分を含む様々なポリペプチド結合剤（例えば、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体、ヒト化抗体、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ）でよい。
【００７１】
多く態様では、細胞によって取り込まれるように、造影試薬の乳剤と細胞を接触させることで細胞を標識する。食細胞および非食細胞のいずれもこのような方法によって標識できる。
【００７２】
細胞標識では、造影試薬は、少なくとも３つのモダリティの１またはそれ以上において利用できる：１）任意の共有結合または他の結合による会合形成なしに標的細胞によって内在化される、または別の方法では吸収される造影試薬；２）標的細胞に共有結合的に付着する造影試薬；および３）標的細胞に存在する分子に結合する、抗体またはリガンドなどの分子に結合された造影試薬。
【００７３】
第１の種類の造影試薬としては、細胞によって取り込まれる、そして、好ましくは、実質的な時間、例えば、細胞内での半減期が少なくとも１時間、少なくとも４時間、少なくとも約１日間、少なくとも約３日間、またはさらに少なくとも約１週間にわたり分解されることなく細胞内で維持されるペルフルオロクラウンエーテルおよび他のＰＦＰＥが挙げられる。明白な理由から、造影試薬は、標識に使用する濃度で、通常の細胞機能に干渉しない、もしくは、細胞毒性を示さないことが好ましい。本明細書で示される通り、ペルフルオロポリエーテルは標識細胞に最小限の毒性効果を示す。
【００７４】
第２の種類の造影試薬としては、露出したチオール基、アミノ基、および／またはヒドロキシル基など、細胞表面の求核部分と反応する求電子化合物が挙げられる。したがって、マレイミド、アルキルヨウ化物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）またはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）エステル（ＮＨＳエステルまたはスルフォ−ＮＨＳエステル）、アシルスクシニミドなどの造影試薬は、細胞表面で共有結合を形成できる。
【００７５】
タンパク質結合に使用する他の技術を細胞表面タンパク質に対する結合造影試薬に適用できる。このような結合への追加の研究法については、Ｍｅａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１：２−１２を参照すること。
【００７６】
第３の種類の造影試薬は、第２の種類の造影試薬を細胞自体ではなく、細胞標的リガンドまたは抗体である官能基と反応させることで調製できる。対象の用途のために、適当なリガンドおよび抗体を選択できる。例えば、造血細胞を選択的に標的とするリガンドを本明細書に記載の造影試薬で標識させて、注射などによって患者に投与できる。
【００７７】
あるいは、造影試薬は、アンテナペディアタンパク質、ＨＩＶ転写活性化（ＴＡＴ）タンパク質、マストパラン、メリチン、ボンボリチン（ｂｏｍｂｏｌｉｔｔｉｎ）、デルタヘモリジン、パルダキシン、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エキソトキシンＡ、クラトリン、ジフテリア毒素、Ｃ９補体タンパク質、もしくは、これらのいずれかのフラグメントなど、無差別な内在化ペプチドに結合させることができる。エクスビボでこの無差別な分子と処理された細胞は、造影試薬を吸収する。このような標識細胞を哺乳動物などの動物に移植した場合、造影試薬を使用して、インビボの撮像技術によって移植細胞を可視化および／または追跡できる。
【００７８】
一態様では、内在化ペプチドは、ショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質またはそのホモログから得られる。ホメオ蛋白アンテナペディアのアミノ酸６０個の長さのホメオドメインは、生体膜を介して転位することが示されており、そしてそれが結合した異種ポリペプチドの転位を促進させることができる。例えば、Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：１０４４４−１０４５０、およびＰｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １０２：７１７−  ７２２を参照すること。このタンパク質のアミノ酸１６個という短い破片が、内部移行を促進させるのに十分であることが示されている。Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１８１８８−１８１９３を参照すること。
【００７９】
もう１つの内在化ペプチドの例は、ＨＩＶトランス活性化因子（ＴＡＴ）タンパク質である。このタンパク質は４つの領域に分けられるように見える（Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：３５５１−３５６１）。精製ＴＡＴタンパク質は組織培養中の細胞によって取り込まれ（Ｆｒａｎｋｅｌ  ａｎｄ  Ｐａｂｏ，（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５５：１１８９−１１９３）、そしてＴＡＴの３７−６２番目の残基に対応するフラグメントなどのペプチドは、インビトロで細胞によって迅速に取り込まれる（Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５５：１１７９−１１８８）。強塩基性の領域は内在化および核への内在化部分の標的を媒介する（Ｒｕｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１−８）。強塩基性の領域内に存在する配列を含むペプチドまたはアナログは、内在化および細胞内環境へのそれらの薬剤の標的化を補助するフッ化造影試薬に結合させることができる。
【００８０】
一部の態様では、造影試薬はリポソームを介して宿主細胞内に導入される。リポソームは、封入された脂質二重層または集合体の作成によって形成される様々な単層状および多層状脂質賦形剤を含む一般名称である。リポソームは、一般的にリン脂質、ならびに、一般的に水生組成物を含む内部媒体を含む二分子膜を伴う小胞構造を持つことを特徴としうる。ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、およびＤＭＲＩＥなどの陽イオン性脂質で作られる陽イオン性リポソームは、ＤＮＡと複合体を形成する。これらの複合体は細胞表面と結合し、そしてエンドソームに内在化する。真核細胞内への発現ベクターの送達のためのリポソーム複合体の調製および使用は周知であり、そしてリポソーム調製物のための脂質は市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）。一般的に、細胞にリポソーム複合体を投与することには、標的細胞と複合体とを接触させることが含まれる。
【００８１】
一部の態様では、造影試薬の細胞標的は、包括的な受容体標的ポリマー・ナノコンテナ・プラットフォームによって達成される（Ｂｒｏｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．Ｆｅｂ  ２；１０２（２）：４７５−８８）。
【００８２】
７．ハイスループット技術
ａ．最適な標識パラメーターを決定するための方法
標準的な無菌組織培養法を使用して、標識試薬を対象の細胞に結合させることができる。一部の態様では、対象の細胞は、細胞サンプルから採取される細胞を含む複数のサブサンプルである。一部の態様では、サンプルはヒト患者などの被験体由来である。
【００８３】
異なる条件下で複数の標識実験を実施するために、本発明の方法はマルチウェル組織培養プレート（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製のポリスチレンプレート、ポリプロピレンプレート、ポリカーボネートプレートなど、または同等の複数の培養バイアルまたはチューブ）の使用に依存する。マルチウェル組織培養プレートは、例えば、２、４、６、８、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６個の個々のウェルを含むことができ、それぞれが被験物質を含む。好ましい態様では、各ウェルには培養液中に同じ個数の対象の細胞（つまり、被験物質）がある。例えば、１枚のマルチウェルプレートには、特定の細胞型の被験物質、または最終的に細胞療法の手順を受ける特定の患者由来の細胞が含まれる。任意に、各培養ウェルには、異なる個数の細胞、異なる種類の細胞、または異なる患者由来の細胞が含まれる。培養液は、大量のイオン、微量元素、糖類、アミノ酸、ビタミン、コリン、イノシトール、血清、ペプチドホルモンまたはホルモン様増殖因子、および抗生物質からなりうる。
【００８４】
次に、標識薬剤を細胞を含む各ウェルに加えた。細胞がウェル内に沈着した直後に、この段階は実施される。任意に、細胞をウェル内に「播種した」後に標識薬剤を様々な時間（例えば、１５分、１時間、４時間、１２時間、２４時間など）に加えて、恐らくはウェル底への細胞付着を可能にする。任意に、この待ち時間中に、マルチウェルプレートを生理的温度付近の組織培養インキュベーター内に保存できる。好ましい態様では、培養液中の標識試薬の濃度は、任意のプレート内の異なるウェル内で系統的に変えられる。例えば、薬剤濃度は列または段にわたり漸増させることができ、ここで任意の列または段の濃度は同じである。所与の列または段内のウェル間におけるこの濃度の冗長性を利用して、統計的分散の測定値の他、特定の薬剤濃度に接触させた細胞の平均挙動を作成することができる。多くの他の異なる配列（例えば、クラスタリング、格子、ランダム）によって、ウェル間の濃度の冗長性を実現することもできる。任意に、個々の各ウェルは異なる所定の薬剤濃度を持つ。
【００８５】
通常、細胞および薬剤をウェルに加えた後、プレートを組織培養インキュベーター内に置く。多くの場合、組織培養インキュベーターによって細胞の生理的環境が維持され；標準的な培養条件は加湿された５％  ＣＯ２と９５％空気の雰囲気中での３７℃であるが、しかし、細胞型に依存して異なる温度および大気条件を利用できる。
【００８６】
インキュベーション環境の管理を利用して、例えば、温度の経時変化（例えば、３７℃から４℃）を制御することにより、もしくはエンドサイトーシスや他の取り込み機序を調節できる追加物質を培養液に加えることによって、標識の取り込みを調節できる（例えば、Ｆａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔ．Ｊａｎ  ９；５８０（ｌ）：１５５−６０；Ｋｒｅｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．；１３９：３７１−８２）。組織培養方法は当技術分野において十分に確立されている［Ｈｅｌｇａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）］。
【００８７】
ｂ．検出方法
特定の態様では、本開示では、細胞の被験物質に結合する標識薬剤の量を検出するためのハイスループット機器が使用される。上記では、細胞に結合できる様々な種類の代用試薬が記載された。ウェル内の検出された薬剤の量は、特定の条件での薬剤充填の程度に関連しうる。本発明の好ましい態様では、１ウェル当たり、またはサンプルチューブについて薬剤量を分析することを目的として定量機器を使用する。さらに、迅速性、経済性、および／または精度のために、これらの測定を自動化または半自動化することが好ましい。使用されるアナログまたはデュアルモード薬剤のクラスに依存して（上記）、光吸収剤、蛍光染料、遺伝子にコード化される蛍光剤、発光剤、およびルシフェラーゼまたは比色剤と使用されるマルチウェルプレートまたは複数のサンプルチューブ分光光度計と共に使用できる、この目的のために使用できる多くの種類の市販機器が存在する（例えば、Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｆ−４５００  ａｎｄ  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＢＲ−９７４１Ｂ）。シンチレーションカウンターを放射性同位元素と共に使用できる（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｗａｌｌａｃ，  ａｎｄ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）。
【００８８】
薬剤標識情報を読み出すために使用できる装置の追加例は、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．が開発した装置（ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標），ＫｉｎｅｔｉｃＳｃａｎ（登録商標）およびｃｅｌｌＷｏＲｘ）または同等の装置などのハイスループットまたはハイコンテント自動顕微鏡システム（米国特許第６７７５５６７号および米国特許出願第２００３０１０３６６２号）、ハイスループットおよび／または自動化蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）装置（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  ＤｉｃｋｓｏｎおよびＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、およびハイスループット・マイクロリットルスケール細胞分析装置（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）である。
【００８９】
８．追加アッセイ
細胞における造影試薬の取り込みを評価することに加えて、同じマルチウェルまたはマルチサンプルの調製物を使用して、他の生物学的特性および標識手順の結果としての細胞に対する変化を分析できる。総細胞数、ＭＴＴ、全二本鎖ＤＮＡ、トリパンブルー排除などの特性、ハイスループット自動化微鏡法、免疫染色アッセイが標識に続く。これらのような補助アッセイを利用して、例えば、標識過程が細胞に対して明らかに有毒というわけではない、もしくは何らかの方法で有害であることを確認できる。これらのアッセイは、ＭＲＩ／ＭＲＳ標識量を読み出すために使用される同じプレートまたはチューブにおいてインサイチューで実施できる。例えば、標識後にウェル内において細胞計数を実施でき、これはマルチウェルプレートの各ウェル内において自律細胞計数を実施できる自動顕微鏡を使用して、細胞死の量を示すことができる。
【００９０】
細胞を標識することの影響を評価するために実施できる補助アッセイの追加例としては、細胞周期アッセイ（例えば、ＤＮＡ含量分析、ＢｒｄＵ取り込みアッセイ、または細胞周期マーカーの検出）、遊走アッセイ、および細胞型特異的な機能アッセイが挙げられる。
【００９１】
当業者は、マルチウェルプレート内において標識細胞に実施できる関連する生物学的情報を提供する多数の他の種類のインビトロアッセイを想到できる。アッセイは、標識過程や関連する操作と無関係である、患者への治療送達用の細胞を調製するための通常のプロトコルの一部であるアッセイを含むこともできる。
【００９２】
例証
ここでは本発明の一般的な記載がなされており、以下の実施例を参照してより容易に理解でき、当業者が上記の教示および以下の実施例から分かるように、本発明の特定の局面および態様の例示目的でのみ含まれ、そして本発明を限定することを意図していない。
【実施例】
【００９３】
実施例１  代用薬剤の使用分析
これらの方法の実施可能性の例として、蛍光ＭＲＩデュアルモード薬剤を合成できるか否か、非蛍光バージョンとして類似の特性を持つ細胞を標識するために使用できるか否か、ならびに蛍光強度と細胞の１９Ｆ含量の間に相関関係があるか否かについて分析する。従って、標識細胞用に開発される組織培養プロトコルでは、ＰＦＰＥナノ粒子の蛍光および非蛍光バージョンのいずれでも使用できる。さらに、細胞標識プロトコル開発および／またはバリデーションの一部として重要パラメーターであるＦｃのインビトロ測定において、蛍光アナログまたはデュアルモード薬剤を使用できる。例えば、高価な１９Ｆ  ＮＭＲ機器よりもむしろ安価な蛍光光度計を使用して、Ｆｃにより測定された平均細胞負荷量を評価でき、そして非蛍光バージョンのＰＦＰＥを使用して、その後のインビボ実験においてＦｃの結果を使用できる。
【００９４】
線形ＰＦＰＥ分子をＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ色素およびＡｌｅｘａ６４７などの市販の染料に結合させる。ＰＦＰＥ−染料結合体および非結合型ＰＦＰＥの混合された混合物を使用して乳剤が作成される。物質は、非蛍光バージョンとして同程度の大きさの小粒径を示し、蛍光特性は維持され、物質が用量依存的な蛍光強度を示し、蛍光スペクトラムはＰＦＰＥへの結合の影響を受けず、そして標識細胞が非標識の同党物と同じ細胞負荷特性を呈することが期待される。
【００９５】
デュアルモード薬剤で標識された細胞は、１９Ｆ  ＮＭＲによって測定された取り込み量と線形相関を示すことが期待される。従って、適当な蛍光キャリブレーションスタンダードを用いて、蛍光測定値のみに基づいてＰＦＰＥ負荷量および試薬（つまり、Ｆｃ）の細胞用量を測定できる。そして次に、この測定値を使用して、対象の細胞の一貫した負荷量を実現することができ、そしてＦｃパラメーターは、上記の１９Ｆ  ＭＲＩ／ＭＲＳを使用したインビボでの細胞定量の補助として使用される。
【００９６】
実施例２  蛍光代用薬剤での細胞標識の評価
１９Ｆ  ＮＭＲによって測定された取り込み量と線形相関を示すデュアルモード薬剤または他の代用薬剤を使用して、出願の方法によるハイスループットフォーマットにおいて過去に未試験の細胞型および患者のサンプルにおける細胞標識を評価する。
【００９７】
細胞を３８４ウェルプレートフォーマットに播種し、そして毒性を生成しない最も効果的な標識用量を特定するために、培養液に添加する薬剤濃度を変化させる。既知の細胞を標識するためのパラメーターが出発点として使用される。細胞の蛍光標識はハイスループット自動顕微鏡を使用して分析される。トリパンブルー排除などの標識試薬の毒性を調べるための他のアッセイも実施される。ＭＲＩによって分析される、インビボの造影試薬を使用した対照実験も実施される。
【００９８】
代用薬剤およびインビボのＭＲＩ薬剤によって細胞内での同等の投薬情報が明らかになることが期待される。結果に基づき、新しい細胞型または患者のサンプルでの有効量が、その後のインビボ実験のために選ばれる。
【００９９】
参照による援用
本明細書において言及する全ての発表論文および特許は、個々の各発表論文または特許が具体的かつ個別に参照により組み入れられるように示されるがごとく、参照によりその全体が明細書に組み入れられる。矛盾がある場合、本明細書における定義を含めた本出願によって調整される。
【０１００】
同等物
対象となる発明の具体的な態様が本明細書において明確に開示されており、上記の明細書は例示であり、限定はしていない。本明細書および以下の特許請求の範囲の検討時に、当業者であれば本発明の多くのバリエーションを容易に想到できる。本発明の全ての範囲は、特許請求の範囲およびその同等物の全範囲、ならびに明細書およびそのバリエーションを参照して決定されるべきである。
【国際調査報告】
2009533061.tif 000003
2009533061.tif 000004
2009533061.tif 000005