(57)【要約】  エンドセルラーゼ活性およびエキソセルラーゼ活性の両方を有し、スキャフォルディンおよび他のセルロソームタンパク質の非存在下でセルロースを分解することができる、クロストリジウム・サーモセラムの耐熱性セルラーゼ酵素が提供される。セルロース系材料を可溶性糖類に分解するための酵素の使用もまた提供される。【選択図】  図１
2009535038.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1に対し少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む精製耐熱性セルラーゼであって、前記セルラーゼはエンドグルカナーゼもしくはエキソグルカナーゼ活性またはそれらの組み合わせを示す前記セルラーゼ。
【請求項２】
セルラーゼが可溶型で活性である、請求項1記載のセルラーゼ。
【請求項３】
配列番号1に対し少なくとも約95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1記載のセルラーゼ。
【請求項４】
配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載のセルラーゼ。
【請求項５】
セルラーゼがβ-グルカナーゼ活性、セルラーゼ活性またはそれらの組み合わせを示す、請求項1記載のセルラーゼ。
【請求項６】
セルラーゼがエキソセルラーゼ活性を示す、請求項1記載のセルラーゼ。
【請求項７】
プロモーターに作動可能に連結された、請求項1記載のセルラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築物。
【請求項８】
プロモーターが異種プロモーターである、請求項7記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項９】
請求項7記載のポリヌクレオチド構築物を含む組換え宿主細胞。
【請求項１０】
請求項7記載のポリヌクレオチド構築物を含む組換え植物細胞。
【請求項１１】
請求項10記載の組換え植物細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項１２】
請求項1記載のセルラーゼを含む組成物。
【請求項１３】
β-グルコシダーゼ、α-アミラーゼもしくはグルコアミラーゼまたはそれらの組み合わせから選択される酵素をさらに含む、請求項12記載の組成物。
【請求項１４】
セルロース系材料と請求項1記載のセルラーゼを接触させることを含む、少なくとも1つのセルロース副産物の製造方法。
【請求項１５】
第1副産物がセロビオースである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
セロビオースとβ-グルコシダーゼを接触させてグルコースを生産することをさらに含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
β-グルコシダーゼが耐熱性である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
グルコースを醗酵させて第2副産物を生産することをさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
第2副産物がエタノール、乳酸またはアセトンである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
方法が、セルロース系材料とセルラーゼを約40℃〜約70℃の温度で接触させることを含む、請求項14記載の方法。
【請求項２１】
方法が、セルロース系材料とセルラーゼを約4.0〜約6.0のpHで接触させることを含む、請求項14記載の方法。
【請求項２２】
エタノールの製造方法であって、
a)セルロース系材料と請求項1記載のセルラーゼを接触させてセロビオースを生産し;
b)セロビオースとβ-グルコシダーゼを接触させてグルコースを生産し;
c)グルコースを醗酵させてエタノールを生産すること
を含む前記方法。
【請求項２３】
セルロース系材料が植物材料である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
植物材料が、木材、コーン、モロコシ、大麦、小麦、オートムギ、コメおよび綿からなる群から選択される、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
セルロース系材料が紙または織物である、請求項22記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国仮特許出願第60/745,976号(出願日:2006年4月28日)(参照によりその全体が本願に組み込まれる)による35USC119条に基づく優先権の利益を主張する。
【０００２】
序論
本発明は、一般に微生物学および酵素学の分野に関する。より具体的には、本発明はクロストリジウム・サーモセラムから精製される耐熱性セルラーゼおよび前記耐熱性セルラーゼの使用方法に関する。
【０００３】
微生物セルラーゼは、さまざまな特異性、切断パターンおよび操作パラメータを有する、膨大な範囲のタンパク質を意味する。セルロース分解酵素には、セルロース鎖の内部部位を切断するエンド型セルラーゼ、セルロース鎖の末端からフラグメントを切断するエキソ型セルラーゼおよび可溶性フラグメントを加水分解してグルコースにするβ-グルコシダーゼがある。セルラーゼの多様性は、7つのグリコシド加水分解酵素ファミリー(ファミリー1、5、6、7、9、10および48)におけるそれらの存在により示される。一般に、好気性菌により生産されるセルラーゼ分解酵素は可溶性であり、一方、嫌気性菌により生産されるものは、セルロソームと呼ばれる複数の成分からなる巨大な細胞外酵素複合体に結合している。
【０００４】
好熱性セルラーゼ生産微生物は単離同定されている。特に、70℃以上で生育可能であり、セルラーゼを生産する事が知られている好熱性細菌は、好気性菌(クラディバチルス・セロボランス(Caldibacillus cellovorans)、ロドサーマス・マリナス(Rhodothermus marinus)およびアシドサーマス・セルロリティカス(Acidothermus cellulolyticus))ならびに嫌気性菌(アネロセルム・テルモフィルム(Anaerocellum thermophilum)、カルジセルロシルプトル・サッカロリチクス(Caldicellulosiruptor saccharolyticus)、クロストリジウム・サーモセラム(Clostridium thermocellum)、フェルビドバクテリウム・イスランディクム(Fervidobacterium islandicum)、スピロヘータ・サーモフィラ(Spirochaetta thermophila)、サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritime)およびパイロコッカス・フリオサス(Pyrocccus furiosus))を共に含む。
【０００５】
多くの好熱性微生物がセルラーゼを生産する事実が知られているにもかかわらず、工業用途に適した耐熱性セルラーゼの供給元は依然として存在しない。入手可能な製品は、有効温度範囲20℃〜50℃を有する真菌セルラーゼの混合物である。セルラーゼに関する研究の多くが、真菌セルラーゼ系、特にトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)のセルロース分解系に焦点を合わせている。この複数成分酵素系は、酸処理セルロースから高収量のグルコースを生産する能力を含む多くの利点を有する。しかしながら、この生物からのセルラーゼ酵素は、高温(60℃を超える)において長期間安定ではなく、40℃未満の温度での使用を必要とする。部位特異的突然変異誘発またはT.リーゼイ(T. reesei)へのより耐熱性のエンドグルカナーゼのクローニングのいずれかによるセルラーゼ製品の耐熱性の改善においてある程度の成功が報告されている。しかしながら、この改善されたT.リーゼイ酵素製品は、デンプン液化において他の酵素と共に使用するには不適当なままであり、全成分の耐熱性が十分に強化されて、この製品がこれらの条件下で作用できることは考えずらい。T.リーゼイ酵素製品に関連するさらなる問題は、酵素の使用前にセルロース系材料の広範な前処理が必要なことである。十分な変換を行うためには、最初にセルロースを酸、高温蒸気、アンモニアまたは他の極端な処理条件で処理してセルロースの結晶構造を破壊する必要がある。これらの前処理はセルロース系材料に用いるには許容できるが、これらの前処理は、工業用途の中で特に、セルロース系材料からのバイオエタノールの生産に現在使われているプロセスにおいては実用的ではない。
【０００６】
可溶性セルロース分解酵素およびセルロソームを構成するセルラーゼの両方を生産する嫌気性好熱性菌であるクロストリジウム・サーモセラムは数十年間研究の対象になってきた。しかしながら、クロストリジウム・サーモセラムのセルラーゼの多くは、細胞結合性システムに正しく集合して不溶性セルロースを可溶性糖類に分解するさらなるスキャフォルディン(scaffoldin)タンパク質の存在を必要とする。米国特許第4,540,644号に記載されているように、これらのセルロソーム関連酵素は結晶セルロースおよび非結晶セルロースの両方に対して活性であるが、機能するにはカルシウムの使用を必要とし、最適活性を示すためにはジチオスレイトールなどの還元剤を必要とする。
【０００７】
発明の概要
本発明者は、クロストリジウム・サーモセラムから精製されたこれまでに特性化されていない可溶性耐熱性セルラーゼが、スキャフォルディンタンパク質を必要とせずにエンド-およびエキソ-グルカナーゼ活性の両方を示すことを見いだした。加えて、このセルラーゼは広い温度範囲で安定であり、高温が非耐熱性セルラーゼの使用を阻んでいる種々の産業応用における使用を可能にする。
【０００８】
よって、一側面において、本発明は配列番号1に対し少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む精製耐熱性セルラーゼを提供する。このセルラーゼは、エンドグルカナーゼまたはエキソグルカナーゼ活性を示し、あるいは両方の活性を示すこともできる。このセルラーゼは可溶型で活性である。他の側面において、本発明はプロモーターに作動可能に連結されたセルラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築物およびポリヌクレオチド構築物を含む組換え宿主細胞を提供する。
【０００９】
他の側面において、本発明は、耐熱性セルラーゼをコードするポリヌクレオチド構築物を含むトランスジェニック植物を提供する。
【００１０】
さらに他の側面において、本発明は、耐熱性セルラーゼを含む組成物を提供する。組成物のさらなる成分は、α-アミラーゼ、グルコアミラーゼおよびβ-グルコシダーゼの1以上を含むことができる。
【００１１】
さらに他の側面において、本発明は少なくとも1つのセルロース副産物の製造方法を提供する。本方法は、セルロース系材料とセルラーゼを接触させることを含む
【００１２】
他の側面において、本発明は、セルロース系材料とセルラーゼを接触させてセロビオースを生産し、セロビオースとβ-グルコシダーゼを接触させてグルコースを生産し、グルコースを醗酵させてエタノールを生産するステップを含むエタノールの製造方法を提供する。
【００１３】
実施形態例の詳細な説明
セルロース含有植物細胞壁は、グルコース、ペントースおよび他の低分子炭素化合物の豊富で再生可能な供給元を提供し、その多くは大きな商業的価値を有する。例えば、グルコースは、バイオエタノールの生産における酵母への供給原料として特に有用である。セルロース系材料の酵素的変換による他の商業的に有用な副産物は、化学品、例えばプラスチック、溶媒、化学中間体、フェノール、接着剤、フルフラール、脂肪酸、酢酸、カーボンブラック、ペンキ、染料、色素、インクおよび界面活性剤の製造、電力生産ならびに食物および飼料に使用できる。従って、セルロース系材料の微生物酵素処理の改善技術の開発に実質的な利益が存在する。本明細書において、“セルロース系材料”は、セルロース、セルロース誘導体、改変セルロース、またはそれらの組み合わせを含む材料である。
【００１４】
本発明者によりクロストリジウム・サーモセラムからこれまで報告されていない酵素が精製され、セルラーゼ活性を示すことが見いだされた。従って、一実施形態において、本発明は、配列番号1のアミノ酸配列を有する精製耐熱性セルラーゼを提供する。本明細書においては、配列番号1に示される495アミノ酸の特異的配列からなるセルラーゼを“Cth10H6”と呼ぶ。このセルラーゼは約57kDaの予測分子量を有する。
【００１５】
本発明の精製セルラーゼは耐熱性である。本明細書において、耐熱性セルラーゼを含む“耐熱性”酵素は、その酵素を適切な媒体中、60℃で60分間インキュベートするとき、酵素活性の少なくとも70%が保持されることを意味する。本発明の精製セルラーゼは、可溶型で、すなわちセルロソームまたは関連タンパク質、例えばスキャフォルディンとの会合とは無関係に活性を示す。明らかなように、本明細書記載のセルラーゼは、任意の研究または商業環境下で有用であることができ、それらの潜在的用途によって限定されない。
【００１６】
本明細書において、用語"精製された"は、そのネイティブ状態において通常付随する成分を実質的または本質的に含まない材料のことを言う。ポリペプチド種の純度は、一般的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学手法を用いて測定される。調製物中に存在する優性種であるポリペプチドが実質的に精製される。用語"精製された"は、ポリペプチドを含有する調製物が、例えばクマシーブルー(Coomassie Blue)R-250を用いる染色により検出される電気泳動ゲルにおいて本質的に1本のバンドを生じうることを意味する。適切には、本発明のセルラーゼは、少なくとも約85%純粋であり、より適切には少なくとも約95%純粋であり、最も適切には少なくとも約99%純粋である。  
【００１７】
本発明の精製セルラーゼは、配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して、適切には少なくとも約80%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、より適切には少なくとも約85%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、より適切には少なくとも約90%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、より適切には少なくとも約95%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、最も適切には少なくとも約98%または99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する。Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997) のアルゴリズムを用いて同一性％を決定できる。このアルゴリズムはBLASTPプログラムに組み込まれており、このプログラムは、当該技術分野で公知のように、参照ポリペプチドと相同性を示すアミノ酸配列を得るために使用できる。明らかなように、本発明は、保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有するセルラーゼも含む。このような置換は当該分野で公知である。
【００１８】
Cth10H6は、セルラーゼおよびβ-グルカナーゼと高いアミノ酸相同性を示す。BLASTPを用いる研究により、Cth10H6はアシドサーマス・セルロリティカスのエンドセルラーゼのB鎖と相同性を示すことが明らかとなった(350アミノ酸に対する34%アミノ酸同一性および49%アミノ酸類似性)。Cth10H6はまた、C.サーモセラム(C. thermocellum)のドッケリンドメインに対してある程度の相同性、すなわちCth10H6のアミノ酸440-495の領域における約40%アミノ酸同一性および約65%アミノ酸類似性を示した。BLASTを用いる研究により、Cth10H6のN末端領域においても、いくつかのβ-グルカナーゼに対する相同性、すなわち約150アミノ酸に対して約20%アミノ酸同一性と約45%類似性が見いだされた。BLASTPを用いる保存されているドメインの研究により、Cth10H6は、該タンパク質のアミノ酸12-355領域においてセルラーゼに対する類似性を有し、アミノ酸11-380領域においてエンドグルカナーゼに対する類似性を有することが明らかにされた。相同性情報は、Cth10H6がセルラーゼおよびβ-グルカナーゼ活性の両方を有する新規タンパク質であることを示唆した。Cth10H6の活性に実質的に影響を与えないアミノ酸置換または欠失などの保存的修飾に適しうるCth10H6の領域は、配列番号1の位置1-8、18-22、53-60、81-89、124-133、173-180、225-240、283-295、318-227、335-343、368-382、385-393、399-412および414-443の1以上におけるものを含むことができる。置換をより受け入れることができるアミノ酸ペアは当該技術分野で公知であり、例えば、French and Robson, J. of Mol. Evolution 19(2):171-175 (1983), Protein Engineering A Practical Approach, A.R. Rees, M.J.E. Sternberg, and R. Wetzel, editors, Oxford University Press, Oxford, 1992 およびDirected Enzyme Evolution Screening and Selection Methods, F.H. Arnold and G. Georgiou, editors, Humana Press, Totowa, NJ 2003 に記載されている(参照によりその開示の全体が本願に組み込まれる)。Cth10H6の活性に実質的に影響を与えることなく他の置換を行うこともできる。アミノ酸欠失または置換を行う方法は当該分野で公知であり、例えばProtein Engineering A Practical Approach, A.R. Rees, M.J.E. Sternberg, and R. Wetzel,  editors, Oxford University  Press, Oxford, 1992 およびDirected Enzyme Evolution Screening and Selection Methods, F.H. Arnold and G. Georgiou, editors, Humana Press, Totowa, NJ 2003 に記載されている。置換/修飾により製造されるポリペプチドは、本明細書に記載の実施例に従って、粗調製物または精製物においてセルラーゼ活性についてスクリーニングすることができる。
【００１９】
本発明の精製セルラーゼは、適切には、エンドグルカナーゼ活性、エキソグルカナーゼ活性、またはそれらの組み合わせを示す。本発明のセルラーゼにより示されるエンドグルカナーゼ活性は、適切には、β-グルカナーゼ、セルラーゼおよび/またはエンドキシラナーゼ活性を含む。本発明のセルラーゼにより示されるエキソグルカナーゼ活性は、適切にはエキソセルラーゼ活性を含む。本発明の精製セルラーゼは、不溶性セルロース、可溶性セルロース誘導体もしくはβ-グルカン、またはそれらの組み合わせを基質として用いる活性を示す。明らかなように、セルラーゼの活性は、当該技術分野で公知の任意の方法により測定できる。例えば、エンドまたはエキソグルカナーゼ活性は、酵素と市販の蛍光性試験用基質をインキュベートし、自動化された方法または直接可視化を用いて蛍光を検出することにより測定できる。また、例えば、市販の発色アッセイを用いて還元糖を測定することにより酵素活性を測定できる。他の代替方法として、オリゴマーの糖類をモノマーの糖類に加水分解し、ついでそれを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定することができる。適切には、耐熱性セルラーゼを含む耐熱性酵素は、前記酵素を適切な媒体中、60℃で60分間インキュベートするとき、活性の少なくとも約70%、活性の少なくとも約75%、活性の少なくとも約80%、活性の少なくとも約85%、活性の少なくとも約90%または活性の少なくとも約95%を保持する。
【００２０】
本発明はまた、本発明のセルラーゼの製造に有用なDNA構築物を提供する。このDNA構築物は、プロモーターに作動可能に連結された、本明細書記載のポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む。本明細書において、プロモーターは、転写開始点近傍の発現調節配列(expression control sequence)を含む。プロモーターは、場合により、転写開始点とは非連続的であることができる遠位エンハンサーまたはリプレッサー因子を含むことができる。プロモーターは、“異種”プロモーター、すなわちコード配列とは本来関連しないプロモーターであることができる。プロモーターは構成的または誘導性であることができる。"構成的"プロモーターは、大部分の環境条件下または発生的条件下で活性なプロモーターである。"誘導性"プロモーターは、環境制御下または発生制御下にあるプロモーターである。
【００２１】
例えば、植物における構成発現のためには、35S-CaMV、トウモロコシユビキチン1(maize ubiquitin 1)およびイネアクチン1(rice actin 1)プロモーターを用いることができる(Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294, Christensen et al., 1992, Plant Mo. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165)。植物器官特異的プロモーターは、種子、ジャガイモ塊茎および果実などの貯蔵シンク組織、例えば、(Edwards and Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303)または分裂組織などの代謝シンク組織(Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878)からのプロモーター、コメからのグルテリン、プロラミン、グロブリンもしくはアルブミンプロモーターなどの種子特異的プロモーター(Wu et al., 1998, Planr and Cell Physiology 39: 885-889)、Vicia fabaからのレグミンB4および未知の種子タンパク質遺伝子からのVicia fabaプロモーター(Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711)、種子油体タンパク質からのプロモーター(Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941)、ブラシカ・ナプス(Brassica napus)からの貯蔵タンパク質napAプロモーターもしくはcruAプロモーターまたは当該技術分野で公知の任意の他の種子特異的プロモーターを含むことができる。
【００２２】
例えば、細菌または他の細胞における発現のためには、PLプロモーター、tacプロモーター、trpプロモーターおよびtrcプロモーターなどの誘導性プロモーターが適切であることができる。細菌宿主における発現を含む、Cth10H6セルラーゼをコードするDNA配列の転写の制御のための適切なプロモーターの他の例は、大腸菌(E. coli)のlacオペロン、ストレプトミセス・セリカラー・アガラーゼ遺伝子(Streptomyces coelicolor agarase gene) dagA、バチルス・リケニホルミス・α-アミラーゼ 遺伝子(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)(amyL)、バチルス・ステアロサーモフィラス・マルトジェニックアミラーゼ遺伝子(Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)(amyL)、バチルス・アマイロリケファシエンス・α-アミラーゼ遺伝子(Bacillus amiyloliquefaciens alpha-amylase gene)(amyQ)ならびにバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)のxylAおよびxylB遺伝子のプロモーターの1以上を含むことができる。
【００２３】
用語 "作動可能に連結された(operably connected)"は、調節配列(プロモーターなど)と第2核酸配列の間の機能的連関であって、前記調節配列が第2配列に相当する核酸の転写を制御する前記機能的連関のことをいう。Cth10H6のコード配列は配列番号2で示される。
【００２４】
本発明のセルラーゼを製造するために、適切には、宿主細胞、例えば大腸菌または当該技術分野で公知の他の適切な宿主にポリヌクレオチド構築物を導入することができる。他の適切な宿主細胞は、真菌細胞、例えば酵母または糸状菌細胞を含むことができる。ポリヌクレオチド構築物の宿主細胞への導入方法は、発現系として当該分野で公知である。ベクターを用いて宿主細胞内にポリヌクレオチド構築物を導入して宿主細胞の細胞質に保持させることもできるし、あるいは宿主細胞のゲノムにポリヌクレオチド構築物を組み込むこともできる。
【００２５】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は組換え植物細胞である。適切には、本発明のセルラーゼを発現するトランスジェニック植物を作製するために組換え植物細胞を用いることができる。明らかなように、セルロース系材料を含有する植物によるセルラーゼの発現は、トランスジェニック植物からのセルロース副産物の製造方法における処理ステップを除くことができる。適切には、反応混合物内でトランスジェニック植物細胞の機械的または化学的破壊によりセルラーゼを放出させることができ、例えば細菌発現系においてまず酵素を発現し、ついで精製することを必要とせずに、セルロースをセロビオースに加水分解することが可能となる。最も適切には、トランスジェニック植物の増殖特性は、セルラーゼの発現により悪影響を受けない。このことは、細胞または組織特異的プロモーター、例えば種子貯蔵タンパク質のプロモーターを用い、特定の細胞または組織に導入遺伝子をターゲッティングすることにより達成できる。米国特許第7,033,627号に記載されているように、種子においてポリヌクレオチド構築物を発現させることができ、あるいは米国特許第6,680,426号に記載されているように、葉緑体においてポリヌクレオチド構築物を発現させることができる。これらの特許は、参照によりその全体が本願に組み込まれる。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本発明のセルラーゼを組成物中に含むことができる。セルラーゼを含む組成物は、場合により、植物材料を処理するのに有用なさらなる酵素、例えばβ-グルコシダーゼ、α-アミラーゼおよびグルコアミラーゼを含むことができる。場合により、このような組成物中に用いる酵素の一部または全部は耐熱性であることができる。例えば、耐熱性β-グルコシダーゼは当該分野で公知であり、例えばZverlow VV et al., Microbiology, 143: 3537-3542 (1997); Kengen et al., Eur. J. Biochem. 213:305-312; Wang X et al., J. Bacteriol. 185(4): 4248-55 (2003); Wright RM et al., Appl. and Env. Microbiol., 58(11): 3455-3465 (1992); and Breves, R et al., Appl. および Env. Microbiol., 63(10): 3902-10 (1997) を参照のこと(それらの開示は、その全体が参照により本願に組み込まれる)。
【００２７】
本発明はまた、セルロース副産物の製造方法も提供する。本方法は、本発明のセルラーゼとセルロース系材料を接触させて第1副産物を生産するステップを含む。適切には、第1副産物はセロビオースである。本方法は、場合により、β-グルコシダーゼとセロビオースを接触させて可溶性糖類を生産するステップを含む。適切には、β-グルコシダーゼは耐熱性である。適切には、β-グルコシダーゼの作用により生産される可溶性糖類はグルコースである。さらなる選択可能なステップにおいて、グルコースを醗酵して第2副産物が生産される。適切には、第2副産物はエタノール、乳酸またはアセトンである。当業者は本方法のステップの適切な反応条件を決定できる。しかしながら、いくつかの実施形態において、本発明のセルラーゼとセルロース系材料を接触させるステップは、約40℃〜約70℃の温度で実施される。より適切には、温度は約50℃〜約65℃である。最も適切には、温度は約60℃〜約65℃である。いくつかの実施形態において、本発明のセルラーゼとセルロース系材料を接触させるステップは、約4.0〜約6.0のpHで行われる。より適切には、pHは約4.5〜約5.0である。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態は、エタノールの製造方法を提供する。本方法における第1ステップは、セロビオースを生産するのに十分な条件下で本発明のセルラーゼとセルロース系材料を接触させることである。適切には、条件は、約40℃〜約70℃、より適切には約50℃〜約65°C、最も適切には、約60℃〜約65°Cの温度および約4.0〜約6.0、より適切には約4.5〜約5.0のpHを含む。インキュベーションの持続時間は、セルロース材料中のセルロースの量、セルラーゼの量および他の要素によって異なり、通常の最適化により当業者により決定されうる。適切には、本発明のセルラーゼは、セルロース/セルロース系材料1グラム当たり少なくとも約0.5mg、少なくとも約1mg、少なくとも約2mg、少なくとも約5mgまたは少なくとも約10mg用いられる。適切には、本発明のセルラーゼは、セルロース/セルロース系材料1グラムに対して約150mg未満、約100mg未満、約50mg未満、約30mg未満または約20mg未満用いられる。適切には、インキュベーションの持続時間は、少なくとも約4時間、少なくとも約8時間、少なくとも約12時間、少なくとも約18時間または少なくとも約24時間である。適切には、インキュベーションの持続時間は、約144時間未満、約132時間未満、約120時間未満、約108時間未満または約96時間未満である。適切には、インキュベーションは少なくとも約40℃、少なくとも約45℃、少なくとも約50℃、少なくとも約55℃または少なくとも約60℃で行われる。適切には、インキュベーションは、約85℃未満、約80℃未満、約75℃未満、約70℃未満または約65℃未満で行われる。本方法の第2ステップにおいて、第1ステップにおいて生産されるセロビオースは、グルコースを生産するのに十分な条件下でβ-グルコシダーゼと接触させられる。第3ステップは、エタノールを生産するのに十分な条件下でグルコースを醗酵させることを含む。当業者は第2および第3ステップのための適切な条件を決定できる。
【００２９】
適切には、エタノールの製造方法において、セルロース材料は植物材料である。植物材料は、場合により木材、コーン、モロコシ（sorghum）(ミロ)、大麦、小麦、オートムギ、コメまたは綿である。植物材料は、紙または織物であることもできる。
【００３０】
実施例
本発明の理解をさらに深めるために以下の実施例が提供される。使用される特定の材料および条件は、本発明をさらに例示するものであって、添付の特許請求の範囲の妥当な範囲を限定するものではない。
【００３１】
実施例1
材料および方法
クロストリジウム・サーモセラム培養物は、Dr. Paul Weimer(USDA Agricultural Research Service, U.S. Dairy Forage Research Center, University of Wisconsin, Madison, WI)から提供を受けた。DNAライブラリーの作製のために、遠心分離により培養物を濃縮した。SDSおよびプロテイナーゼKの組み合わせを用いて細胞濃縮物を溶解し、フェノール/クロロホルム抽出を用いてゲノムDNAを精製した。ゲノムDNAを沈殿させ、RNアーゼで処理して残存する混入RNAを取り除き、流体せん断(hydrodynamic shearing) (HydroShear装置、GeneMachines, San Carlos, CA)によりフラグメント化して2〜4kbのフラグメントを作製した。フラグメントをアガロースゲルで精製し、末端を修復し、lacプロモーターベクターであるpEZSeq(Lucigen, Middleton, WI)に連結した。
【００３２】
推定上のセルラーゼを発現するために、C.サーモセラムライブラリーをエレクトロコンピテント大腸菌細胞(Lucigen)にトランスフォームした。各コロニーを採取し、96ウェルブロックで増殖させた。培養物のアリコートを遠心分離で採取し、CELLYTIC IIB試薬(Sigma)を用いて溶解した。0.2%AZCL-HE-セルロース(Megazyme)を含有する50mM酢酸緩衝液(pH5.8)0.200ml中、70℃で溶解物のセルラーゼ活性をアッセイした。
【００３３】
Kenealy et al., Biotechnology Letters 25: 1619-1623 (2003)(参照により本願に組み込まれる)に記載されているように、2,2-ビシンコニン酸を用い、セルロースから放出される還元糖の量を測定することにより、セルラーゼ活性をさらに特徴づけた。AZCL標識およびアゾ標識不溶性基質(Megazyme)を用いてエンド活性の基質特異性を測定した。4-メチルウンベリフェリル-β-D-セロビオシド、4-メチルウンベリフェリル-β-D-キシロピラノシド、4-メチルウンベリフェリル-β-D-グルコピラノシドおよび5-ブロモ-6-クロロ-3-インドリル-β-D-グルコピラノシド(Magenta-β-D-グルコピラノシド)を用いてエキソ活性の基質特異性を測定した。
【００３４】
実施例2
Cth10H6の同定
クロストリジウム・サーモセラムDNAライブラリーのセルロース分解活性のスクリーニング中に、これまで報告されていないエンドグルカナーゼ(Cth10H6と称する)を見いだした。クローンの培養物10mlの抽出物を用いて、クローニングされた酵素を特徴付けた。クローニングされた酵素は、不溶性β-グルカン基質(AZCL-大麦β-グルカン、Megazyme)に強い活性を示し、色素結合セルロース基質および可溶性セルラーゼ基質である4-メチルウンベリフェリル-β-D-セロビオシドに対して弱い活性を示す。
【００３５】
DNAインサートの末端の配列決定により、C.サーモセラムゲノムの遺伝子産物を同定できた。この遺伝子は、配列番号1に示される予測配列を有する推定上の57kDaタンパク質をコードする。配列番号1は、in vivoで切断されるリーダー配列を持たない、完全長機能性Cth10H6タンパク質を示す。32アミノ酸リーダー配列を含む完全長Cth10H6翻訳産物は配列番号5で示される。翻訳産物である配列番号5のコード配列は、配列番号6で示される。
【００３６】
実施例3
Cth10H6のクローニング
鋳型プラスミドDNA50ナノグラムを用い、発現プライマーCTH10H6 L: CCGAACAATGACGACTGGCTGCATGTTGAAGGT(配列番号 3) およびCTH10H6 R: TCTTCTCTGCGGCCGCTTATATTGGTATTTTAAGCACTTTCCTCT (配列番号4)を用いてセルラーゼ遺伝子を増幅した。Cth10H6の完全長翻訳産物のアミノ酸32と33との間のコンセンサスシグナル配列切断部位で開始するようにN末端プライマーを設計した。増幅したPCR産物を酵素Not1で消化し、Not1平滑末端化フラグメントを作製し、pTACST3 NotI平滑ベクター(Lucigen)にクローニングした。ついで連結産物で10G F’コンピテント細胞(Lucigen)を形質転換し、カナマイシンプレート上で形質転換クローンを選択した。pTACST3 NotI平滑ベクターには、N末端に9アミノ酸(MTQDPSRVG(配列番号7))アフィニティタグを導入した。Cth10H6の活性へのアフィニティタグの影響を決定するためにPETベクターへのクローニングもまた行った。このアフィニティタグはCth10H6の活性に影響を示さないことが見いだされた。8つの形質転換細胞を採取し、培養物50ml中で生育させた。これらのうち、4つが活性酵素を生産した。実施例1に記載されているように活性クローンを同定し、遠心分離で細胞塊を回収した。
【００３７】
実施例4
Cth10H6の精製
実施例3において製造された4つの培養物からの細胞を50mMトリス-HCl(pH8.0)に再懸濁し、プールし、超音波処理で溶解した。遠心分離で溶解物を清澄化し、65℃で20分間熱処理することにより大腸菌タンパク質を沈殿させた。熱処理した溶解物を遠心分離により清澄化し、50mMトリス-HCl(pH8.0)で平衡化した15ml Qセファロースファーストフローカラム(GE Amersham)にかけた。このカラムを50mMトリス-HCl(pH8.0)50mlで洗浄し、0〜500mM NaCl濃度勾配50mMトリス-HCl(pH8.0)200mlでCth10H6を溶出した。活性画分をプールし、1.0mlに濃縮し、50mMトリス-HCl(pH8.0)で平衡化したセファクリルS-100高分解能カラム(GE Amersham)150mlにかけた。活性画分をプールし、1.0mlに濃縮して解析研究を行った。
【００３８】
精製タンパク質のセルラーゼとの一致を検証するためにネイティブゲル電気泳動を用いた。15%アクリルアミドまたは4〜20%濃度勾配アクリルアミドゲルのいずれかを用い、1Xおよび3X濃度で電気泳動を行った。電気泳動終了後、1mM4-メチルウンベリフェリル-β-D-セロビオシドを含有する50mM酢酸緩衝液(pH5.8)中、60℃で60分間ゲルをインキュベートした。セルラーゼの活性を示すために、紫外光下でゲルを撮影し(図1、左パネル)、ついでクマシーブリリアントブルー(Coomassie Brilliant Blue)R-250で染色し、脱染色した(図1、右パネル)。図1に示される結果は、プールし、精製した活性酵素がセルラーゼ活性を示したことを示している。図1において、各パネルにおいて‘A’と印をつけたレーンの対は1X(左)および3X(右)での清澄化した大腸菌溶解物を示し、各パネルにおいて‘B’と印をつけたレーンの対は、1X(左)および3X(右)での熱処理し、清澄かした溶解物を示し、各パネルにおいて‘C’と印をつけたレーンの対は1X(左)および3X(右)でのQセファロース濃縮物を示し、各パネルにおいて‘D’と印をつけたレーンの対は、1X(左)および3X(右)でのセファクリルS-100濃縮物を示す。
【００３９】
セルラーゼの純度およびサイズを検証するためにSDS変性ゲル電気泳動を用いた。4〜20%濃度勾配アクリルアミドゲルで電気泳動を行った。図2に示す結果は、全画分におけるおおよそ57kDaのバンドを示している。図2において、‘S’と印をつけたレーンは、Promega Broad Range分子量マーカーを示し、‘A’と印をつけたレーンの対は、1X(左)および3X(右)での清澄化した大腸菌溶解物を示し、‘B’と印をつけたレーンの対は、1X(左)および3X(右)での熱処理し清澄かした溶解物を示し、‘C’と印をつけたレーンの対は、1X(左)および3X(右)でのQセファロース濃縮物を示し、‘D’と印をつけたレーンの対は、1X(左)および3X(右)でのセファクリルS-100濃縮物を示す。
【００４０】
実施例5
Cth10H6の解析
セルロース結合能
セルロース100mg(Sigma310697またはC6429)を、酵素タンパク質10μgを含有する50mM酢酸緩衝液(pH5.8)1.00mlと共に室温で3時間インキュベートした。遠心分離でセルロースを除き、残った可溶性酵素を、0.2%AZCL-HE-セルロースを含有する50mM酢酸緩衝液(pH5.8)0.50ml中でアッセイした。最初の酵素量の1%未満はセルロースに結合せず、セルロース製品間で結合における差異は見いだされなかった。
【００４１】
温度およびpH最適条件
0.2%AZCL-β-グルカンおよび酵素タンパク質1.0μgを含有する50mM酢酸緩衝液(pH5.8)0.50ml中でCth10H6の温度最適条件を決定した。Thermomixer R(Eppendorf)を用い、1000rpmで20分間アッセイを行った。遠心分離により管を清澄化し、ELx800プレートリーダー(Bio-Tek)を用いて吸光度値を測定した。Cth10H6は65℃において鋭い温度最適条件を示した。酵素の活性は70℃においてこの最大値の20%未満まで低下した。
【００４２】
0.2%AZCL-HE-セルロースおよび酵素タンパク質1.0μgを含有する50mM酢酸緩衝液0.50ml中でCth10H6のpH最適条件を測定した。Thermomixer R(Eppendorf)を用い、1000rpmで30分間アッセイを行った。遠心分離により管を清澄化し、BIO-TEK ELx800プレートリーダーを用いて吸光度値を測定した。Cth10H6はpH4.0〜6.0で活性を示し、pH4.5〜5.0で最大活性を示した。
【００４３】
セルラーゼ比活性
実施例4に従って精製され、図1のレーンDで示されるCth10H6の比活性は、基質として20μm微結晶セルロース粉末(310697としてSigmaから市販されている)の10%懸濁液を用い、1000rpmで撹拌されているThermomixer R(Eppendorf)を用いて60℃、pH4.5で測定した。グルコースを標準とし、Pierce BCA試薬を用いて還元糖を測定した。0.6マイクロモル還元当量/分/mgタンパク質の値が得られた。同様に、基質としてカルボキシメチルセルロースナトリウム塩(C4888としてSigmaから市販されている)の1.0%溶液を用いてCth10H6の比活性を測定した。36マイクロモル還元当量/分/mgタンパク質の値が得られた。
【００４４】
エンドグルコナーゼ特異性
0.2%不溶性基質(下記の表1の通り)および酵素タンパク質1.0μgを含有する50mM酢酸緩衝液(pH5.8)0.50ml中でCth10H6のエンドグルコナーゼ特異性を測定した。Thermomixer R(Eppendorf, Westbury, NY)中、60℃、1000rpmで20分間アッセイを行った。遠心分離で管を清澄化し、ELx800プレートリーダー(Bio-Tek)を用いて吸光度値を測定した。
【００４５】
表1 Cth10H6のエンドグルカナーゼ活性
2009535038.tif 000003
【００４６】
エキソグルコナーゼ特異性
10mM基質(下記の表2の通り)および酵素タンパク質1.0μgを含有する50mM酢酸緩衝液(pH5.8)0.50ml中で、または10mM基質を含有する寒天平板に酵素を直接スポットすることによりCth10H6のエキソグルコナーゼ特異性を測定した。両方法で同じ結果が得られた。液体アッセイは、Thermomixer R (Eppendorf, Westbury, NY)を用い、60℃、1000rpmで120分間行った。管およびプレートを手持ちUVランプを用いて試験し、陰性対照および陽性対照と比較した。
【００４７】
表 2 Cth10H6のエキソグルカナーゼ活性
2009535038.tif 000004
【００４８】
予言的実施例6
形質転換菌からのCth10H6の生産
抗生物質耐性タンパク質であるカナマイシンホスホトランスフェラーゼをコードし、B.ステアロサーモフィラス・α-アミラーゼ(B. stearothermophilus alpha-amylase)プロモーター配列、B.ステアロサーモフィラス・α-アミラーゼリーダー配列、成熟B.ステアロサーモフィラス・α-アミラーゼの最初の7N末端アミノ酸をコードする配列に続いてCth10H6をコードするポリヌクレオチドを含むpUB110プラスミドにより従来のコンピテント細胞法を用いてバチルス・ズブチリスの培養物を形質転換する。20μg/mlのカナマイシンおよび1%セルロースを含有するプレート上で陽性の形質転換細胞を選択する。以下の振盪フラスコ培地で形質転換細胞を培養する:
シード培養のための、以下を含有する振盪フラスコ培地を作製する(g/L):
【００４９】
Bio Springer酵母抽出物 6.0
Cargill大豆粉 45.0
K2HPO4 3.25 
KH2PO4 1.875 
Corn Productsコーンシロップ1632* 60.0 
*別々に滅菌し、冷却後加える；接種前に各フラスコに20μg/mlのカナマイシンを加える。
【００５０】
培地150ml/500mlフラスコを用い、37℃および180rpmで振盪フラスコを運転する。
【００５１】
培地4.0リットルを用い、7.5リットルNew Brunswickファーメンターで醗酵を行う。ファーメンター培地は以下を含む(g/L):
【００５２】
Bio Springer 酵母抽出物 3.5 
Cargill 大豆粉 25.0 
K2HPO4 0.6 
MgSO4 1.875 
MnCl2 0.1 
CaCl2 1.0 
FeSO4 0.05 
デキストロース* 40.0 
*別々に滅菌し、冷却後加える；接種前に各ファーメンターに20μg/mlのカナマイシンを加える。
【００５３】
ファーメンターに1.6g/l-hr.でデキストロースを供給し、アンモニア添加によりpHを6.8〜6.9に維持する。37℃、0.5vvmの通気下で72〜94時間醗酵を行い、セルラーゼタンパク質を得る。珪藻土による濾過により醗酵物を清澄化し、清澄化濾液を元の容量の1/10まで限外濾過する。
【００５４】
予言的実施例7
Cth10H6を用いるエタノールの生産
実施例6に従って生産されたCth10H6とセルロース系材料(硬材廃材、粒径<0.1mmに粉砕)と混合する。水を加えてセルロース系材料を30%乾燥物質に調節し、酸または塩基を加えて、このスラリーのpHを5.0に調節する。酵素10mg/セルロース系材料1グラムでCth10H6を加える。酵素1.0mg/セルロース系材料1グラムで耐熱性キシラナーゼを加え、酵素10mg/セルロース系材料1グラムで耐熱性β-グルコシダーゼを加える。材料を60℃に熱し、スクリュー押出機を用いて48〜96時間持続して混合する。反応終了後、混合物を30℃に冷却し、1.0g/Lの量で乾燥醸造酵母を加える。30℃で72時間アルコール醗酵を行う。醗酵後、生成したエタノールを大気圧下で蒸留して回収する。
【００５５】
本発明の任意の方法または組成物の任意の実施形態は、本発明の任意の他の方法または組成物に使用できることが具体的に考慮される。
【００５６】
本明細書および添付の特許請求の範囲においては、文脈により明確に否定されない限り、単数形"a""an"および"the"は複数の指示対象を含む。従って、例えば、“a polynucleotide(ポリヌクレオチド)”を含む組成物への言及は、2以上のポリヌクレオチドの混合物を含む。用語“or”は、一般に、文脈により明確に否定されない限り、その意味において“および/または”を含んで用いられることにも留意すべきである。
【００５７】
本明細書に記載の任意の数値は、低い値から高い値までのすべての値を含むということもまた特に了解される。すなわち、列挙された最低の数値と最大の数値との間の数値のすべての可能な組み合わせが、本願において明確に述べられていると考慮されるべきである。例えば、範囲が1%〜50%であると述べられている場合、2%〜40%、10%〜30%または1%〜3%などの数値が本明細書において明確に列挙されているものとする。
【００５８】
すべての出版物、特許および特許出願は、各出版物または特許出願のそれぞれが具体的かつ個別的に参照により示されるように、同じ範囲を参照することにより本明細書に明確に組み込まれる。本開示と、組み込まれた特許、出版物および引用文献との間に矛盾が存在する場合、本開示が優先される。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】実施例に記載されているように発現および精製された酵素のセルラーゼ活性を示すネイティブゲルの写真である。
【図２】実施例に記載されているように、セルラーゼの発現および単離中に回収されたタンパク質の分離を示すSDS-PAGEゲルの写真である。
【図１】
2009535038.tif 000005
【図２】
2009535038.tif 000006
【配列表】
2009535038000001.app
【国際調査報告】
2009535038.tif 000007