(57)【要約】【課題】癌患者試料中の腫瘍関連抗原の存在を検出又は濃度を測定するためのＳＰＲシステム及びその使用方法を提供する。【解決手段】  ＳＰＲシステムは複数のチャンネルを有することができ、各チャンネルには腫瘍関連抗原の特異抗体が抗体として作用できるように固定化されており、複数の腫瘍関連抗原を同時に検出することが可能なようになっている。患者由来の生体試料を前記ＳＰＲシステムに適用した場合、各チャンネルに由来するＳＰＲシグナルのシフトを測定することによって、二種以上の腫瘍関連抗原の存在を検出することができる。前記ＳＰＲシステムは腫瘍関連糖鎖抗原の存在又は濃度を検出することができ、センサ表面にはグリコシルエピトープの特異抗体と共に、癌患者において該糖鎖抗原が結合したポリペプチドの特異抗体が固定されている。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の二種以上の腫瘍関連抗原の存在を検出するための方法であって、
複数のチャンネルを有し、各チャンネルは表面に腫瘍関連抗原の特異抗体が適宜固定化されている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システムを提示することと、
患者由来の生体試料を前記ＳＰＲシステムに適用することと、
前記チャンネルの各々に由来するＳＰＲシグナルのシフトを測定して、生体試料中の前記二種以上の腫瘍関連抗原の存在を検出すること、とを含む方法。
【請求項２】
前記二種以上の腫瘍関連抗原の内の少なくとも一種は、Ｌｅｘ、二量体Ｌｅｘ、シアリルＬｅｘ、シアリルＬｅａ、シアリルＴｎ、Ｔｎ、ジシアリルＬｃ４、シアリル二量体Ｌｅｘ及びＧａｌＮＡｃジシアロＬｃ４からなる群から選択される糖鎖抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数のチャンネルの各々は、さらに糖鎖抗原が結合したポリペプチドの特異抗体がその表面に適宜固定化されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記糖鎖抗原はシアリルＬｅｘであり、前記シアリルＬｅｘが結合したポリペプチドの特異抗体はハプトグロビンα２鎖である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記各抗体はＦａｂフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記生体試料は血清試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記患者は肺癌、乳癌、胃癌又は前立腺癌が疑われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記各抗体は自己組織化単分子層（ＳＡＭ）を介して前記表面に適宜固定化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記各チャンネルはセンシングエリア及びセルフリファレンシングエリアを有し、
前記センシングエリアには前記腫瘍関連抗原の特異抗体が適宜固定化されており、
前記セルフリファレンシングエリアには非特異的な結合事象や環境的変化を制御するように対照抗体が適宜固定化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＳＰＲシステムは、前記複数のチャンネルの光路を制御し且つ前記複数のチャンネルの各々におけるＳＰＲシグナルのシフトの逐次測定を可能とするデジタルウィンドウシステムを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
生体試料中の二種以上の腫瘍関連抗原の存在を検出するためのセルフリファレンシング型表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システムであって、
（ａ）複数のチャンネルを有するセンシング表面を有し、各チャンネルには腫瘍関連抗原の特異抗体が適宜固定化されているＳＰＲシステムと、
（ｂ）抗原が存在する場合にはセンサ表面上で抗原−抗体相互作用をもたらしてＳＰＲシグナルのシフトを生じさせる試料のフローをセンシング表面に適用するためのメカニズムとを有するＳＰＲシステム。
【請求項１２】
前記二種以上の腫瘍関連抗原の内の少なくとも一種は、Ｌｅｘ、二量体Ｌｅｘ、シアリルＬｅｘ、シアリルＬｅａ、シアリルＴｎ、Ｔｎ、ジシアリルＬｃ４、シアリル二量体Ｌｅｘ及びＧａｌＮＡｃジシアロＬｃ４からなる群から選択される糖鎖抗原である、請求項１１に記載のＳＰＲシステム。
【請求項１３】
前記複数のチャンネルの各々の表面には更に、糖鎖抗原が結合したポリペプチドの特異抗体が適宜固定化されている、請求項１２に記載のＳＰＲシステム。
【請求項１４】
糖鎖抗原はシアリルＬｅｘであり、前記シアリルＬｅｘが結合したポリペプチドの特異抗体はハプトグロビンα２鎖である、請求項１３に記載のＳＰＲシステム。
【請求項１５】
前記各抗体はＦａｂフラグメントである、請求項１１に記載のＳＰＲシステム。
【請求項１６】
前記腫瘍関連抗原の各々の存在は該システムの平行チャンネル上で検出され、各平行チャンネルはセンシングエリア及びセルフリファレンシングエリアを有し、各センシングエリアには前記腫瘍関連抗原の特異抗体が適宜固定化されており、各セルフリファレンシングエリアには非特異的な結合事象や環境的変化を制御するように対照抗体が適宜固定化されている、請求項１１に記載のＳＰＲシステム。
【請求項１７】
前記各腫瘍関連抗原の特異抗体は、１６−メルカプトヘキサデカン酸及び／又は１１−メルカプトウンデカノールを含むＳＡＭによってセンサ表面に固定されている、請求項１１に記載のＳＰＲシステム。
【請求項１８】
試料のフローを適用するための前記メカニズムは試料カセットを有し、前記試料カセットはセンサチップを挿入するための空間を有する、請求項１１に記載のＳＰＲシステム。
【請求項１９】
電圧が印加されると色が変化するエレクトロクロミック有機ポリマーを有するデジタルウィンドウシステムを用い、デジタルウィンドウシステムは前記複数のチャンネルの光路を制御することによって各チャンネルをオン又はオフ状態に保つ、請求項１１に記載のＳＰＲシステム。
【請求項２０】
各チャンネルからの反射光の強度はＣＣＤカメラ又はフォトダイオードアレイによってモニタリングされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
Ｈｅ−Ｎｅレーザ又はレーザ発光ダイオード（ＬＥＤ）から選択される単色光源を有する、請求項１１に記載のＳＰＲシステム。
【請求項２２】
偏光子、レンズ及びドーブ型又は半円筒状ガラスプリズムを更に有する、請求項１１に記載のＳＰＲシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者試料中の抗原の存在又は濃度を検出して疾患、特に癌の診断や予後判定を改善するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療の成功にはその早期発見が不可欠である。腫瘍関連抗原の多くは患者血清中で増加するため、診断用の標的として有用である。このような腫瘍関連抗原を癌の診断や予後判定に応用する種々の試みが行われている（ハコモリ，Ｓ．Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２，２５７−３３１，ｌ９８９；Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４９１，３６９−４０２，２００１）が、有効且つ広範囲に適用可能な試験を構築するには幾つかの障害がある。
【０００３】
第一に、癌の早期発見には高感度な分析手段が必要である。例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、腫瘍関連タンパク抗原の一種であり、種々の腫瘍形成（例えば、胃腸癌や乳癌、肺癌）において診断や治療目的のための腫瘍マーカーとして用いられている［アキノら（Aquino et al.），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．４９，３８３−３９６，２００４] 。ＣＥＡは通常、成人非喫煙者には＜２．５ｎｇ／ｍＬ、喫煙者には＜５．０ｎｇ／ｍＬ存在する。従って、ＣＥＡを検出する最適な分析手段があれば、この濃度範囲において高感度で癌の発見が行えるはずである。
【０００４】
第二に、単一の腫瘍関連抗原では全ての診断には不十分である。単一の腫瘍は複数の腫瘍関連抗原を発現し（モザイク現象）、抗原発現パターンは癌の進行につれて変化する（ナカサキ，Ｈ．，ハコモリ，Ｓ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９，３６６２−９，１９８９）。ある人種においてより有効となり得る腫瘍関連抗原もある。例えば、黒人の集団ではＬｅ（ａ−ｂ−）遺伝子型の発生率が高いため、黒人の集団における腫瘍ではシアリルＬｅａ（ＳＬｅａ）抗原の発現は限定されている。
【０００５】
従って、一人の患者の血清中の複数の腫瘍関連抗原の存在の検出又は濃度を測定することも非常に望ましい。血清中の腫瘍関連抗原は従来、イムノアッセイ、特に、蛍光イムノアッセイや酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイによって検出されているが、このようなイムノアッセイにおいて、抗原−抗体複合体の量は標識された二次抗体によって測定する。このような従来技術を用いた場合、単一試料内で複数の抗原を検出することは技術的に困難であり、試験対象抗原の数に比例してこのような測定にかかる費用が増加する。
【０００６】
同様に、各患者試料について別々に試験を行うことも費用がかかるため、複数の患者試料をより効率的に試験するための方法やシステムが必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
被検体の存在を検出するための分析手段の一つとしては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサ［｛リードバーグら（Liedberg Ｂ. et al.），Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ＆ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  １０， ｉ−ｉｘ，１９９５｝；｛ホモラら（Homola et al.）， Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ  ５４，３〜１５，１９９９｝；｛カールスーンら（Karlsoon et al.），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，９９−１１０，１９９４｝］が挙げられる。ＳＰＲは金属と誘電体媒質との界面で生じる光学現象であり、金属表面上の薄い被検体層の厚さや屈折率の変化に対して敏感である。従って、ＳＰＲバイオセンサは、センサ表面におけるリガンドと被検体との相互作用に起因する屈折率の変化又はＳＰＲシグナルのシフトを測定することができる。
【０００８】
ＳＰＲシグナルのシフトはマトリックスに結合した分子の厚さに起因して生じ、大量の被検体がセンサ表面に結合することを必要とする。従って、ＳＰＲによる高感度検出は被検体層の厚さに依存することとなる。
【０００９】
ＳＰＲによる癌の検出に関しては、ＨＥＲ−２やＮＹ−ＥＳＯ−１等の抗原をセンサ表面に固定化して、患者試料中の腫瘍関連抗体を検出している［｛ラッセルら（Russel et al.），第２２５回ＡＣＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、ルイジアナ州ニューオーリンズ，３月２３〜２７日，２００３｝；｛カンパニョーロら（Campagnolo et al.），Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６１、２８３〜２９８、２００４｝］。
【００１０】
しかし、より低分子量の被検体、サイズ不明の被検体、及び／又は患者試料に比較的低濃度で存在する被検体がＳＰＲによって検出できることについては確認されていない。
【００１１】
これに関して、当初、種々の腫瘍関連抗原が、モノクローナル抗体によって明確にされ、エピトープの多くは後にスフィンゴ糖脂質として同定された。このような抗原は通常、分子量が２，０００〜４，５００Ｄａの範囲であるが、血清中でリポタンパク質や他のタンパク質と複合体を形成しているため、実際の分子量は不明であり、より高分子であると推定される。従って、血清中の抗原の質量や濃度に関する問題を考慮すると、スフィンゴ糖脂質エピトープが腫瘍関連糖鎖抗原のＳＰＲ分析に適しているかどうかは不明である。表１に数種類の腫瘍関連糖鎖抗原をまとめ、その構造を示す。
【００１２】
患者試料中に低濃度で存在する抗原や糖鎖抗原等の腫瘍関連抗原の存在の検出や濃度を測定するのに適した分析システムが必要である。また、簡便で且つ費用対効果が高く、複数の抗原又は複数の試料を同時に分析することができる診断システムは、癌の早期発見や患者の生存率の改善のために非常に重要である。
【００１３】
本発明の目的は、生体試料中の腫瘍関連抗原の存在又は濃度を検出するためのシステム及び方法を提供することである。
【００１４】
従って、本発明の一態様としてＳＰＲシステムを提供する。前記ＳＰＲシステムは、複数の抗原の同時検出が可能であり、複数のチャンネルを有し、各チャンネルには、腫瘍関連抗原の特異抗体を、抗体として作用できるように固定化（適宜固定化）する。患者由来の生体試料を前記ＳＰＲシステムに適用すると、各チャンネルに由来するＳＰＲシグナルのシフトを測定することによって二種以上の腫瘍関連抗原の存在を検出することができる。
【００１５】
本発明はその好ましい態様において、前記ＳＰＲシステムによって腫瘍関連糖鎖抗原の存在を検出する。特に好ましい実施形態においては、癌患者におけるグリコシルエピトープの特異抗体及び糖鎖抗原が結合しているポリペプチドの特異抗体をセンサ表面に固定化する。これらの抗体はＦａｂフラグメントであることが好ましい。
【００１６】
本発明はその更なる態様において、前記ＳＰＲシステムを用いて腫瘍関連抗原の存在を検出する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、患者試料中の抗原（例えば、血清中の腫瘍関連抗原）の存在を検出するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム、及びその使用方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明のＳＰＲシステムを用いれば、試料中の複数の腫瘍関連抗原の存在を検出又は濃度を測定することができる。或いは、本発明のＳＰＲシステムによって、多数の異なる試料中の単一抗原を検出し、分析費用を削減することができる。
【００１９】
本発明では、複数個の腫瘍関連抗原の存在を検出する際、又は複数の試料中の一抗原の存在を検出する際に、複数のチャンネルを有するＳＰＲシステムを用い、各チャンネルは腫瘍関連抗原の特異抗体を有しており、抗体はその表面に適宜固定化されている。生体試料を前記ＳＰＲシステムに適用し、各チャンネルに由来するＳＰＲシグナルのシフトを測定して腫瘍関連抗原の存在又は濃度を検出する。単一の腫瘍関連抗原の存在を検出又は濃度を測定することが疾患の診断や予後判定には不十分であることが多いという事実に鑑み、本発明のＳＰＲバイオセンサは、癌の進行度をモニタリングするための改良された方法及びシステムを提供する。
【００２０】
本発明のＳＰＲシステム及び方法は、患者試料中に非常に低濃度で存在する被検体、例えば、患者試料中に約１ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬの範囲で存在する被検体の存在の検出及び／又は濃度を測定するのに好適である。従って、本発明によって、例えば、患者血清中のＣＥＡ（通常、約２．５〜５ｎｇ／ｍＬで存在）を効率良く且つ簡便に検出することが可能となる。
【００２１】
更に、本発明によって、癌に関連する糖鎖抗原の検出、例えば、Ｌｅｘ、二量体Ｌｅｘ、シアリルＬｅｘ、シアリルＬｅａ、シアリルＴｎ、Ｔｎ、ジシアリルＬｃ４、シアリル二量体Ｌｅｘ及びＧａｌＮＡｃジシアロＬｃ４（表１参照）から選択される糖鎖抗原の検出が可能となる。これらの抗原は、肺癌や乳癌、胃腸癌、結腸癌、前立腺癌等の癌（表２参照）と関連している。このような糖鎖抗原に特異的で適切な抗体は入手可能であり、それらも表１にまとめてある。
【００２２】
【表１】
2009515142.tif 000002
【００２３】
腫瘍関連糖鎖エピトープはそれ自身のみでは高感度ＳＰＲ分析に被検体に適さない。しかし、このような抗原は、特異的なキャリアタンパク質に結合し、糖タンパク質やリポ糖タンパク質として血清中に存在している。従って、本発明の好ましい実施形態においては、腫瘍関連糖鎖抗原の特異抗体を含むＳＰＲチャンネルは、さらに、そのＳＰＲチャンネル表面に、癌患者の糖鎖抗原を結合しているキャリアポリペプチドの特異抗体が適宜固定化されている。従って、糖鎖抗原を検出するためのチャンネルは、二種の抗体を含んでいるのが好ましい。二種の抗体のうち１つはポリペプチドに対する抗体であり、もう１つはグリコシルエピトープに対する抗体である。センサ表面に結合している抗体はＦａｂフラグメントであるのが好ましい。こうして、ＳＰＲシステムにおいて、腫瘍関連糖鎖抗原の優れた検出が行われる。
【００２４】
例えば、好ましい実施形態においては、本発明のＳＰＲシステム及び方法によって、シアリルＬｅｘの存在が検出又は濃度が測定される。シアリルＬｅｘは、元来スフィンゴ糖脂質として同定された、十分に確立された腫瘍関連抗原であり（表１参照）、分子量が１７ｋＤａのバンドとして肺癌患者血清のウェスタン分析において特異的に観察される（図２参照）。この１７ｋＤａのタンパク質はハプトグロビンα２鎖と同定されている（表２参照）。
【００２５】
【表２】
2009515142.tif 000003
【００２６】
従って、一実施形態において、本発明のＳＰＲシステム及び方法は、シアリルＬｅｘのグリコシルエピトープの特異抗体（例えば、ＳＮＨ３）と共に、ハプトグロビンα２鎖の特異抗体を用い、検出感度を大幅に高める。
【００２７】
ハプトグロビンβ鎖に結合するＮ−結合型フコシル化グリカン複合体も膵臓癌を診断するための良好なマーカーであり（オクヤマら、「フコシル化ハプトグロビンは膵臓癌の新しいマーカーである。オリゴ糖構造の詳細な分析及びフコシル化のための可能なメカニズム」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １１８：２８０３−２８０８，２００６）、本発明は、フコシルエピトープ及びハプトグロビンβ鎖に対する抗体を用いるＳＰＲシステムを包含する。フコシルエピトープの構造はオクヤマによって開示されており、この開示内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【００２８】
本発明では、センサ表面に固定されたＩｇＧモノクローナル抗体を用いるのが好ましく、モノクローナル抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）を用いるのがより好ましい。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の各サブタイプが好ましい（表１参照）。腫瘍関連糖鎖抗体の場合、抗糖鎖抗体の多くはＩｇＭアイソタイプである。従って、対応するＩｇＧ抗体を産生する必要があり得る（フクシ  Ｙ．ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５９（１６）：１０５１１〜７，１９８４）。
【００２９】
本発明のある実施形態においては、試料をまず分離精製手段に付して総タンパク質量当りの標的抗原の量を少なくとも一部増大させ、ＳＰＲ分析の精度をより高めることができる。これは、血清が非特異的ＳＰＲ変化を潜在的に惹起するタンパク質成分を大量に且つ多数有しているからである。
【００３０】
本発明のＳＰＲシステムでは、金担体を有するセンサ表面を用い、センサ表面に直接、又は結合層（linking layer)、例えば、自己組織化単分子層（self-assembled monolayer)（ＳＡＭ）を介して抗体が適宜固定化されているのが好ましい。炭素長１１〜１８のアルカンチオールは金表面上に安定な単分子層を自発的に形成するため、ＳＡＭの好ましい成分である。また、末端に水酸基を有するＳＡＭは擬似タンパク質のような抵抗性を有しており好ましい［リら（Li et al.），Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １９，３２６６〜３２７１，２００２］。一実施形態においては、ＳＡＭは１６−メルカプトヘキサデカン酸又は１６−メルカプトヘキサデカン酸と１１−メルカプトウンデカノールとの混合物から成る。
【００３１】
結合層は、平面、すなわち二次元表面、例えば、自己組織化単分子層であってもよく、例えばデキストランから成る三次元マトリックス［カールスーンら（Karlsoon et al.），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，９９−１１０，１９９４］であってもよい。平面（二次元表面）の利点としては、単分子層成分を調節することによって空間及び配向特性をより効果的に制御できることが挙げられる［バムダッド（Bamdad Ｃ），Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７５，１９８９−１９９６，１９９８］。
【００３２】
種々のＳＰＲ配置が知られており、本発明で用いることができる。
【００３３】
ＳＰＲの角度調節モードにおいては、光の波長を一定に保ち、入射角を変化させる。クレッチマン配置においては、回転ステージを用いて角度走査を行うことができる。具体的には、センシングセル（プリズム、金膜にセンシング層をコートしたスライドガラス、及びフローセル）を回転テーブル上に静置し、ｐ−偏向単色光で入射する。その後、テーブルの外部に置かれた検出器によって、反射光線の強度をモニタリングする。
【００３４】
可動部分を最小限とするために、「扇型（fan-type）」ＳＰＲバイオセンサを用いることができるが、このセンサでは、単一入射角の平行光線をスキャンする代わりに、光の「扇」が金属膜上の一点を様々な角度で同時に入射する。これによって、複数の反射率−入射角プロファイルを同時に得ることができる。この種の構成の利点は、角度走査を行わずにリアルタイムでＳＰＲシフトを得ることができることである。
【００３５】
典型的なＳＰＲシステムでは、図３に示すように、Ｈｅ−Ｎｅレーザやレーザダイオード等の単色光源、偏光子、レンズ、及びドーブガラスプリズムや半円筒状ガラスプリズム等のプリズムを用いる。
【００３６】
ＳＰＲ角、すなわち、反射光の強度が最小となる入射角は、検出器、フォトダイオードアレイ又はＣＣＤカメラによってモニタリングする。反射光強度対画像画素数は検出器用ソフトウェアによって記録することができる。静止画像と映像の両方を記録することができる。映像の場合、例えば、１秒当り１フレーム撮ることができる。画像画素数は、水と１０％エタノールを標準物質として用い、計算によって角度に換算することができる。
【００３７】
本発明のＳＰＲシステムは、試料（例えば、患者の血清試料）をセンサ表面に流すことが可能である。試料は、センサチップを挿入するための空間を有する試料カセットを用いてセンサ表面に適用される（図３）。
【００３８】
本発明は、前記ＳＰＲシステム用の市販キットに用いる使い捨てユニットも提供する。この使い捨てユニットは、本明細書に記載の抗体が固定されたセンサチップである。センサチップは、試験対象の患者試料を保持する試料カセットに簡単に挿入することができる。
【００３９】
使い捨てセンサチップにおいては、複数のチャンネルの各々のセンシング表面に異なる抗原の特異抗体を固定して、単一試料中の複数の被検体を検出するようにしてもよく、或いは、全てのチャンネルのセンシング表面に同一の抗体を固定して、複数の試料中の同一の被検体を検出するようにしてもよい。
【００４０】
被検体の濃度が低い試料の場合、対象となる相互作用によって生じるシグナルのシフトが環境変動に起因する変化よりも小さくなり得る。従って、本発明のＳＰＲバイオセンサは、ＳＰＲシグナルを多少シフトさせ得る非特異的な結合事象や環境的変化（例えば、溶液や温度の変化）を制御できるものであることが好ましい。
【００４１】
この好ましい実施形態においては、前記ＳＰＲシステムはセルフリファレンシング型であり、患者試料中の非常に低濃度（１０ｎｇ／ｍＬ以下）の抗原の存在を検出するのに適している。セルフリファレンシング型ＳＰＲシステムは非特異的な結合反応や環境的変化を制御する（図４）。
【００４２】
セルフリファレンシング型ＳＰＲシステムは、一又は二以上のチャンネルを有するセンサ表面を有し、それぞれのチャンネルは帯状パターン化した表面を有する。帯状パターンの一個の帯状領域（「センシングエリア」と称する）には対象となる抗原に対する抗体が一以上固定されており、そして、少なくとも一個の付加的な帯状領域（「リファレンシングエリア」と称する）により環境的変化及び／又は非特異的結合を制御することが可能となる。例えば、リファレンシングエリアにはセルフリファレンシング型対照抗体（例えば、マウスＩｇＧ（図４及び５）やそのフラグメント）を固定してもよい。一個のチャンネルには一を超えるリファレンシングエリアを設けることにより、さらに制御することができる。例えば、個々のリファレンシングエリアは、センシング表面のみ、非抱合型ＳＡＭ、或いは該表面に結合した対照抗体を用いてＳＰＲシグナルを測定できる。
【００４３】
セルフリファレンシング型システムを有する複数のチャンネルに試料を適用し、全てのチャンネルからのＳＰＲシグナルを逐次的に記録すると、ＳＰＲシステムは、環境的影響や非特異的影響に起因するシフトを差し引くことにより、興味ある対象物の相互作用に特異なＳＰＲシグナルシフトを検出することができる。具体的には、ＳＰＲシステムによって、センシングエリア及びリファレンシングエリア上でのＳＰＲシグナルのシフトが同時に検出され、センシングエリア上でのＳＰＲシグナルのシフトからリファレンシングエリア上でのＳＰＲシグナルのシフトが差し引かれる（図６Ａ及び６Ｂ）。２００５年７月１５日出願の米国仮特許出願（発明の名称「セルフリファレンシング及びデジタルウィンドウシステムに基づく表面プラズモンバイオセンサの設計」）も参照のこと。
【００４４】
本発明のＳＰＲシステムは、複数のチャンネルの入射光を制御することによって各チャンネルをオン又はオフ状態に保つために、光源とプリズムとの間に設置するデジタルウィンドウシステムを更に追加することができる（図７）。
【００４５】
デジタルウィンドウとは、パターンを有するエレクトロクロミック（ＥＣ）材料デバイスであり、透明電極、電圧が印加されると色が変化するカソードＥＣ材料、電解質及び対電極から成る。帯状パターン化したデジタルウィンドウの場合、光の通過を制御することによって各チャンネルをオン又はオフ状態に制御することができる。ＳＰＲ装置と組合せると、デジタルウィンドウを用いて干渉を排除することによって、各チャンネルにおける抗体−抗原相互作用が逐次的に検出される。
【００４６】
デジタルウィンドウシステムの構造及び使用については米国特許第６，７４７，７８０号に開示されており、該特許の全開示内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【実施例】
【００４７】
［実施例１］単一の原発性ヒト腫瘍の異なる遺伝子座で発現する複数の抗原（「モザイク現象」）
図１は、腫瘍の一遺伝子座が一個のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって染色され、第二の遺伝子座が異なるｍＡｂによって染色され、第三の遺伝子座が異なるｍＡｂ等によって染色されていることを示す。このようなモザイクパターンは分化や腫瘍進行の段階に応じて変化し得る。このことから、単一癌患者由来の試料中に複数の抗原の存在を検出することが重要であり、ＳＰＲ分析が癌の診断や予後判定に特に望ましいことが分かる。
【００４８】
図１、パネルＩ。原発性結腸癌の例。（Ａ）ヘマトキシリン／エオシン染色。（Ｂ）ｍＡｂ  ＳＨ１によるＬｅｘ染色。（Ｃ）ｍＡｂ  ＦＨ６によるシアリル二量体Ｌｅｘ染色。（Ｄ）ｍＡｂ  ＴＫＨ２によるシアリルＴｎ染色。腫瘍部分全体はＳＨ１によって染色された。一部領域は強く染色された（領域ｂ）が、他の領域は比較的弱く染色された（領域ａ）（右図、Ｂ）。ＳＨ１によって弱く染色された一部領域（ａ）はＴＫＨ２によって強く染色されたが、ＳＨ１によって強く染色された一部領域（ｂ）はＴＫＨ２によって染色されなかった（左図及び右図、Ｄ）。細胞膜におけるＦＨ６による散発性強染色を伴うびまん性陽性染色（Diffuse positive staining）が観察された（左図、Ｃ）。
【００４９】
図１、パネルＩＩ。原発性胃癌の例。（Ａ）ヘマトキシリン／エオシン染色。（Ｂ）過ヨウ素酸塩／シッフ試薬によるシアル酸染色。（Ｃ）ｍＡｂ  ＳＨ１によるＬｅｘ染色。（Ｄ）ｍＡｂ  ＦＨ４による二量体Ｌｅｘ染色。（Ｅ）ｍＡｂ  ＦＨ６によるシアリル二量体Ｌｅｘ染色。（Ｆ）ｍＡｂ  ＴＫＨ２によるシアリルＴｎ染色。スケッチ（右図）は、領域ａ、ｂ及びｃを定めるＦＨ６及びＴＫＨ２の染色パターンを示す。腫瘍部分全体は過ヨウ素酸塩／シッフ試薬及びＳＨ１によって強く染色された。ＦＨ６とＴＫＨ２との間に明確な染色相補性が見られた。すなわち、領域ａ（右図）はＦＨ６によって強く染色されたが、ＴＫＨ２によって染色されなかった。一方、領域ｂ及びｃ（右図）はＴＫＨ２によって強く染色されたが、ＦＨ６によって染色されなかった。ＦＨ４による弱いびまん性染色が見られた。
【００５０】
図１、パネルＩＩＩ。十分に分化した胃癌。（Ａ）ヘマトキシリン／エオシン染色。（Ｂ）ｍＡｂ  ＦＨ４による二量体Ｌｅｘ染色。（Ｃ）ｍＡｂ  ＴＫＨ２によるシアリルＴｎ染色。スケッチ（下図）は、領域ａ、ｂ及びｃを定めるＦＨ４及びＴＫＨ２の染色パターンを示す。領域ａはＳＨ１によって強く染色された（図示せず）が、ＦＨ４（下図、Ｂ）及びＦＨ６によっても染色された。一方、領域ｃはＴＫＨ２によって強く染色された（下図、Ｃ）が、ＦＨ６によって染色されず、ＳＨ１によって弱く染色された（図示せず）。
【００５１】
［実施例２］小型ＳＰＲバイオセンサシステム
クレッチマン配置における角度調節式小型ＳＰＲバイオセンサシステムの一例を図３に示す。Ｈｅ−Ｎｅレーザ又はレーザダイオードは単色光源として用いる。偏光子によってｐ偏光を通過させることができ、レンズを用いて光線を調整する。ドーブ型又は半円筒状のガラスプリズムはクレッチマン減衰全反射（ＡＴＲ）カプラとして用いる。反射光は高分解能フォトダイオードアレイ又はＣＣＤカメラに焦点が合わせられる。デジタルウィンドウは照明アーム内に設置され、センサチップ上のあるチャンネルに光線を照らすことができる。試料カセット内には使い捨てセンサチップが静置され、センサチップを保持するカセットは試料ホルダ内に挿入される。屈折率マッチング液又はセンサチップとプリズムとの間に設けたポリマー膜によってセンサチップがプリズム上に装着されている。
【００５２】
［実施例３］ＳＰＲバイオセンサを用いたＣＥＡの検出
本実施例のＳＰＲシステムは角度調節法（angle interrogation technique) に基づくものであり、角分解能は０．００２°である。後述のように、このＳＰＲシステムでは、早期癌で典型的な濃度のＣＥＡを検出することができる。
【００５３】
回転ステージを有するシステムを先ずセットアップし、脱イオン水とバッファーの絶対ＳＰＲ角を定めた。次に、入射アーム内のレンズ系を調整し、可動部分を有さない「扇型」ＳＰＲシステムを構築し、抗体と抗原との相互作用をリアルタイムで観察した。多機能化によって、抗ＣＥＡ抗体をセンシング金膜上に固定化した。固定化抗体と溶液由来抗原との結合事象は、フォトダイオードアレイ及びＰＣシステムによってモニタリングした。
【００５４】
１．ＳＰＲ光学系の構成
クレッチマン配置における角度調節式光学系を図３Ｂに示す。Ｈｅ−Ｎｅレーザ（０．５ｍＷ、ユニフェーズ社）は単色光源（波長：６３２．８ｎｍ）として用いる。偏光子（エドムンド社）によってｐ偏光を通過させることができる。空間フィルタ（エドモンド社）によって光径を広げる。ドーブタイプガラスプリズム（ＢＫ７、ｎＤ＝１．５１５、ソーラボ社）はクレッチマン減衰全反射カプラとして用いる。反射光は高分解能フォトダイオードアレイ（１０２４画素、ハママツ）に集光される。本構成一式は光学テーブル上に設置される。
【００５５】
２．化学薬品及び物質
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）はＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ,  Ｉｎｃ．から購入し、抗ＣＥＡ抗体はＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（マサチューセッツ州スワンプスコット）から入手し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びマウスＩｇＧはシグマ社から入手した。１６−メルカプトヘキサデカン酸、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノ−プロピル）カルボジイミド、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及びクロロトリメチルシランはアルドリッチ社から入手した。ポリジメチルシロキサンエラストマーキット（Ｓｙｌｇａｒｄ１８４；ダウコーニング社、米国）は分析グレードであった。他の化学薬品は全て分析試薬グレードの市販品であった。脱イオン蒸留水（１８ＭΩ）はラブコンコ社製水精製システムを用いて得た。
【００５６】
３．フロー系
フロー系はシリンジポンプ、小型フローセル及びテフロンチューブで構成した。化学的に不活性で容易に成形し得る、マイクロチャンネル構造を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）エラストマーがフローセルとして機能した。ＰＤＭＳフローセルをセンサチップの金表面に装着し、溶液が容易に通過してセンサ表面上で反応が行えるようにした。
【００５７】
ＰＤＭＳフローセルの調製及び金属層の電子ビーム蒸着のためのフォトリソグラフィー作業は、ワシントン大学（ＵＷ）にあるワシントン技術センター内で行った。簡単に言うと、ＰＤＭＳマイクロチャンネルは、２Ｄマイラーマスクパターンからフォトリソグラフィーによって得た３Ｄシリコンウェハマスターから複製によって加工した。マイラーマスクはＵＷ出版サービスセンターで印刷した。マスクは２Ｄパターンの複数の平行チャンネル（幅：５００μｍ、長さ：２．０ｃｍ）を有し、各チャンネルは両端に円形の貯留部（reservoirs）（直径：１．５ｍｍ）を有していた。Ｓｉウェハ上への３Ｄパターンの形成は、ネガ型フォトレジスト（ＳＵ−８  ５０、マイクロケム社）を３０００ｒｐｍで３０秒間スピンコートした後、３６５ｎｍのＵＶ光に曝露（ＡＢＭアライナ）して行った。レプリカの形成は、ＰＤＭＳ硬化剤とプレポリマーの１：１０混合物（Ｓｙｌｇａｒｄ１８４、ダウコーニング社）を真空下で脱気した後、マスターに注ぎ込んで厚さ約３〜５ｍｍの層を形成して行った。３ＤＳｉマスターにＰＤＭＳを注ぐ前に、クロロトリメチルシラン数滴をマスターの周囲に数分間静置し、ＰＤＭＳレプリカが容易に剥離できるようにした。次に、ＰＤＭＳを室温で２４時間硬化させた後、Ｓｉウェハから剥離した。穴あけ器でＰＤＭＳから各チャンネルの円形端部を切り抜くことによって貯留部を形成した。
【００５８】
４．センサチップの設計及び調製
ガラス板上に蒸着した金薄膜をＳＰＲセンサチップ用基材として用いた。顕微鏡用ガラス板（２５ｍｍ×７５ｍｍ×１．０ｍｍ）を金薄膜用基板として用いた。スライドガラスは水とエタノールで洗い流し、ピラニア溶液（３０％Ｈ２Ｏ２、７０％Ｈ２ＳＯ４）に２時間浸漬することによって十分に洗浄した。次に、スライドガラスを脱イオン水と無水エタノールで洗浄し、窒素流で乾燥させた後、電子ビーム金属蒸着用真空チャンバ内の回転カルーセル上に静置した。先ず、スライドガラス上に３ｎｍのクロム接着層を蒸着し、次に、クロム層上に金を５０ｎｍ蒸着した。金属蒸着は約１×１０−６Ｔｏｒｒの減圧下で行い、金属蒸着物の厚さは石英バランサ（ＣＨＡ６００電子ビーム蒸着装置）でモニタリングした。
【００５９】
金表面の機能化には図３Ｃに示すような三工程を伴う。第一に、１６−メルカプトヘキサデカン酸（ＭＨＡ）の単分子層を金膜上に自己組織化させた。金膜でコートしたスライドガラスを１ｍＭのＭＨＡエタノール溶液に２４時間入れて自己組織化単分子層を形成した後、脱イオン水とエタノールで洗浄し、過剰で結合の弱い分子を除去した。第二に、２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と５０ｍＭのＮ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）の溶液によってＭＨＡのカルボニル基を活性化した。次に、第一アミンカップリングによってＭＨＡの自己組織化単分子層に抗ＣＥＡ抗体を固定化した。１６−メルカプトヘキサデカン酸ＳＡＭの末端カルボキシル基（図３Ｃのステップ１）を反応性の酸無水物基に転化（図３Ｃのステップ２）した後、抗体の第一アミンと反応させた（図３Ｃのステップ３）。
【００６０】
典型的な固定化反応のプロファイルは、図３Ｃのパネル（ｂ）に示すようなＳＰＲセンサグラム（角度と時間との関係）として観察される。注入手順は次の通りである。（ａ）ＥＤＣ／ＮＨＳ：６０分間、（ｂ）ＰＢＳ溶液：１０分間、（ｃ）２０μｇ／ｍＬのＣＥＡ抗体ＰＢＳ溶液：３０分間、（ｄ）１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）：１０分間、（ｅ）２０ｍＭのＨＣｌ：１０分間、（ｆ）ＰＢＳ溶液：１０分間、（ｇ）１０μｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原ＰＢＳ溶液：３０分間、（ｈ）ＰＢＳ溶液：１０分間。１０ｍＭのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）をキャリア溶液として用いた。
【００６１】
５．ＳＰＲ測定手順
光学系、フロー系、センサチップ及びデータ分析系を含むＳＰＲバイオセンサアセンブリ全体を図３Ｂに示す。ドーブプリズム上に屈折率マッチング液を塗布し、プリズム上にＳＰＲセンサチップを静置した。シリンジポンプを用い、５０μＬ／分又は５μＬ／分の流量で被検体溶液を流した。室温は２０℃に維持した。
【００６２】
ＳＰＲ角（即ち、反射光の強度が最小となる入射角）はフォトダイオードアレイによってモニタリングした。検出器に内蔵のソフトウェアによって反射光の強度を記録した後、ＭＡＴＬＡＢで編集したプログラムを用いてデータを処理した。
【００６３】
６．ＣＥＡの検出
上述のように調製したセンサ表面上に一連の濃度の癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を流した。ＳＰＲ角は時間の関数として記録し、図８に示す。ＣＥＡ濃度の上昇に伴い、ＳＰＲ角はより大きい角度へシフトした。０．０１７°、０．０２６°、０．０３８°及び０．０７７°のＳＰＲ角のシフトはそれぞれ、ＣＥＡ濃度１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬに相当する。
【００６４】
シグナルのシフトが特異的な抗体−抗原相互作用に起因することを確認するため、ＢＳＡ及びマウスＩｇＧを対照試薬として用いた。
【００６５】
１００ｎｇ／ｍＬのＣＥＡ抗原溶液をセンサチャンネルに導入した場合、抗ＣＥＡ抗体を固定化した表面ではＳＰＲ角が０．０１７°シフトしたのに対し、マウスＩｇＧを固定化した表面ではＳＰＲ角のシフトが見られなかった。ＢＳＡを用いた第二の対照実験の結果を図９に示す。純粋なＰＢＳ溶液を流した後、１０ｎｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液を導入し、非特異的吸着について試験した。屈折率変化に起因する小さなシフトは見られたが、純粋なＰＢＳ溶液で洗浄後、シグナルはベースラインに戻った。このように、ＢＳＡはＣＥＡ抗体には結合しない。１０ｎｇ／ｍＬのＣＥＡ溶液を同じ表面に導入した場合、０．０２５°のシフトが見られ、ＰＢＳ溶液で洗浄後、シグナルは安定した。
【００６６】
７．濃度１ｎｇ／ｍＬのＣＥＡの検出
ＣＥＡの正常値の範囲は、成人非喫煙者においては＜２．５ｎｇ／ｍＬ、喫煙者の場合には＜５．０ｎｇ／ｍＬであるため、濃度約２．５ｎｇ／ｍＬのＣＥＡを検出することが必要である。上述と同様の手順を用い、濃度１ｎｇ／ｍＬのＣＥＡを検出した。結果を図１０に示すが、０．００８°の角シフトが見られた。
【００６７】
［実施例３］セルフリファレンシング型ＳＰＲシステムの基本概念とアセンブリ
図３に示すように、ＳＰＲバイオセンサによって、リガンドと対応する被検体との相互作用（例えば、抗体と抗原との相互作用）に起因する屈折率の変化がモニタリングされる。屈折率の変化によってＳＰＲシグナルがシフトする。しかし、非特異的結合や環境的変化（例えば、溶液や温度の変化）によってもＳＰＲシグナルはシフトする。抗原の濃度が低い試料の場合、シグナルのシフトが環境変動に起因する変化よりも小さくなり得る。ＳＰＲバイオセンサにおける正確なリファレンシングによって環境的影響を排除することができる。
【００６８】
図４Ｂには、ブーザーら（Boozer et al.）が開示したセルフリファレンシング型のビアコアＸバイオセンサとＴａ２Ｏ５の覆層を有するデュアルチップを示す。ブーザーら（Boozer et al.），多段階で組み立てたセルフリファレンシング型表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサのための表面機能化，Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ  ９０：２２〜３０（２００３）。その全開示内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【００６９】
ビアコアＸＳＰＲバイオセンサにおいては、一方のチャンネルをリファレンシングチャンネルとして用い、他方をセンシングチャンネルとして用いる。しかし、感度の上昇に伴い、環境因子からの干渉が増加する。従って、一チャンネルにリファレンシング表面と共にセンシング表面を設けて、センシング表面及びリファレンシング表面の両方に由来するＳＰＲシグナルを同時に、且つ同一環境条件下で測定できることが好ましい。
【００７０】
金をセンシング表面として用い、Ｔａ２Ｏ５の覆層をリファレンシング表面として用いる波長調節式セルフリファレンシング型ＳＰＲバイオセンサを用いることができる。しかし、金にＴａ２Ｏ５を析出付着させるには多少の時間と労力を要するため、センシングエリア及びリファレンシングエリアの両方の基板として金を用いるのが好ましく、この場合、調製がより迅速且つ容易になる。
【００７１】
図４Ｃは、金コートガラス板上のマイクロフローセル及びマクロフローセルの配置を示しており、マイクロフローセルとマクロフローセルとの寸法の違い（図示の寸法は変わり得る）及び側面図による金表面の変化について強調している。
【００７２】
図４Ｄは、本発明のＳＰＲシステムの一例を調製する各ステップ、即ち（１）マイクロフローセルによる帯状パターン化したリファレンシング表面の調製、（２）露出した金表面上でリファレンシング物質間の自己組織化単分子層の形成、及び（３）抗体／抗原相互作用試験のためのマクロフローチャンネルへの変化を示す。
【００７３】
図４Ｅは、センシング及びリファレンシングの材質の構造を示す。リファレンシング表面上にはマウスＩｇＧ、センシング表面上には抗腫瘍抗体が固定化されており、センシング表面及びリファレンシング表面に由来するＳＰＲシグナルの同時シフトに基づいて抗原−抗体結合を検出する。
【００７４】
図４Ｆはリファレンシング表面及びセンシング表面の例を示す。抗体は、金表面上に直接、又は結合層（例えば、オリゴ（酸化エチレン）末端アルカンチオール）を介して吸着させることができる。或いは、抗体は、メルカプトアルカン酸から成る結合層上に固定化することができる。一実施形態におけるリファレンシング表面は結合層のみから構成することができる。
【００７５】
［実施例４］センサチップの形成及びセンシング表面の調製
帯状パターンのセンシングエリア及びリファレンシングエリアを有するセンサチップは、複数のチャンネルを有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）フローセルと位置合わせをする。各チャンネルにおいては、各種ＩｇＧ  ｍＡｂ（センシング物質）及びマウスＩｇＧ（リファレンシング物質）が金表面に直接、又はＳＡＭを介して固定されている。腫瘍関連抗原に対する典型的なＩｇＧ  ｍＡｂとしては、抗Ｔｎ（ＣＵ１；ＩｇＧ３）や抗シアリルＴｎ（ＴＫＨ２；ＩｇＧ１）、抗シアリルＬｅｘ（ＳＮＨ３；ＩｇＧ３）、抗シアリルＬｅａ（ＮＫＨ１； ＩｇＧ１）、抗ジシアリルＬｃ４（ＦＨ９；ＩｇＧ２ａ）が挙げられる（表１）。
【００７６】
マイクロ流路チャンネルはポリジメチルシロキサンポリマー（ＰＤＭＳ）で形成した。簡単に言うと、ＰＤＭＳマイクロチャンネルは、２Ｄマイラーマスクパターンからフォトリソグラフィーによって得た３Ｄシリコンウェハマスターから複製によって形成した。
【００７７】
マイラーマスクはワシントン大学出版サービスセンターで印刷した。マスクは２Ｄパターンの複数の平行チャンネル（幅：５００μｍ、長さ：２．０ｃｍ）を有し、各チャンネルは両端に円形の貯留部を有していた。
【００７８】
Ｓｉウェハ上への３Ｄパターンの形成は、ネガ型フォトレジスト（ＳＵ−８  ５０、マイクロリソグラフィーケミカル社、マサチューセッツ州ニュートン）を５０００ｒｐｍで２０秒間スピンコートした後、３６５ｎｍのＵＶ光に曝露して行った。３Ｄシリコンマスターを数滴のクロロトリメチルシラン（シグマ−アルドリッチ社、ミズーリ州セントルイス）でシラン化し、ＰＤＭＳレプリカがＳｉマスターから容易に剥離できるようにした。
【００７９】
レプリカの形成は、ＰＤＭＳ硬化剤とプレポリマーの１：１０混合物（Ｓｙｌｇａｒｄ１８４、ダウコーニング社、ミシガン州ミッドランド）を真空下で脱気した後、マスターに注ぎ込んで厚さ約０．５〜１ｍｍの層を形成して行った。次に、ＰＤＭＳを７０℃で少なくとも１時間硬化させた後、Ｓｉウェハから剥離した。穴あけ器でＰＤＭＳから各チャンネルの端部を円形に切り抜くことによって貯留部を形成した。
【００８０】
本発明のＳＰＲシステムのセンシング表面は次のように調製することができる。
【００８１】
１００μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ／ＰＢＳ溶液を２００μｍのＰＤＭＳマイクロチャンネルに流量０．０１ｍＬ／分で流す。ＰＤＭＳを除去した後、金表面上に付着したマウスＩｇＧの縞が見られる。
【００８２】
ω−メルカプト脂肪酸の単分子層を金膜上で自己組織化させる。例えば、１６−メルカプトヘキサデカン酸（ＭＨＡ）と１１−メルカプトウンデカノール（ＭＵＯ）の混合物を用いることができる。金膜でコートしたスライドガラスを１ｍＭのＭＨＡとＭＵＯ（モル比＝１：９）のエタノール溶液に２４時間入れて自己組織化単分子層を形成した後、脱イオン水とエタノールで洗浄し、過剰で結合の弱い分子を除去する。
【００８３】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とＮ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）の溶液によってＭＨＡのカルボキシル基を活性化する。次に、第一アミンカップリングによってＭＨＡの自己組織化単分子層に抗体を固定化する。センサ表面に被検体溶液が流れると、特異的な抗原−抗体相互作用が生じ、その結果、ＳＰＲシグナルが変化する。
【００８４】
［実施例５］シアリルＴｎ抗原の検出
ａ．基板としてのスライドガラス上への金膜の調製。ガラス板上に蒸着した金薄膜をＳＰＲセンサチップ用基材として用いた。顕微鏡用ガラス板（２５ｍｍ×３７．５ｍｍ×１．０ｍｍ）を金薄膜用基板として用いた。スライドガラスは先ず水とエタノールで洗い流し、「ピラニア溶液」（３０％Ｈ２Ｏ２、７０％Ｈ２ＳＯ４）に２時間浸漬することによって十分に洗浄した後、脱イオン水と無水エタノールで洗浄し、窒素流を吹付けて乾燥させた後、電子ビーム金属蒸着用真空チャンバ内の回転カルーセル上に静置した。先ず、スライドガラス上に３ｎｍのクロム接着層を蒸着し、次に、このクロム層上に金を５０ｎｍ蒸着した。金属蒸着は約１×１０−６Ｔｏｒｒの減圧下で行い、金属蒸着物の厚さは石英バランサ（ＣＨＡ６００電子ビーム蒸着装置）でモニタリングした。
【００８５】
ｂ．金表面上の帯状パターンへのマウスＩｇＧ（リファレンシング物質）の吸着。セルフリファレンシング実験を行うため、リファレンシング物質とセンシング物質を金表面上に帯状パターンに固定化した。本実施例においては、マウスＩｇＧをリファレンシング物質として用い、マイクロフローセルパターニング方法を用いて金表面上にマウスＩｇＧの帯状パターンを得た。幅２００μｍ、厚さ５０μｍ、長さ２ｃｍのチャンネル群を有するＰＤＭＳマイクロフローセルを金膜上に静置し、１００μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ／ＰＢＳ溶液を注入し、流量０．０１ｍＬ／分でチャンネルを通過させた。図５Ａに示すように、ＳＰＲ角のシフトが見られた。
【００８６】
図５Ａは、２００μｍマイクロチャンネルによるＡｕ表面上へのマウスＩｇＧのパターニングを示す。（ａ）において、垂直のバーはマウスＩｇＧを注入する前のＳＰＲ角を示す。（ｂ）において、垂直のバーはマウスＩｇＧを金表面上に吸着させた後のＳＰＲ角を画像で示す。（ｃ）においては、画像の画素数に対する強度の曲線を示す。各曲線はマウスＩｇＧ吸着前後に相当する。（ｄ）においては、時間に対するＳＰＲ角のシフトのセンサグラムを示す。
【００８７】
マウスＩｇＧを金表面上に吸収させた後、ＰＤＭＳマイクロフローセルを除去し、次いで、センサチップを水とエタノールで洗浄した。
【００８８】
ｃ．金表面上のセンシングエリアの機能化。金表面のセンシングエリアの機能化は二ステップを伴う。第一に、１６−メルカプトヘキサデカン酸（ＭＨＡ）の単分子層を金膜上で自己組織化させる。１ｍＭの１６−メルカプトヘキサデカン酸（ＭＨＡ）と１１−メルカプトウンデカノール（ＭＵＯ）（モル比＝１：９）のエタノール溶液にセンサチップを２４時間静置し、図３Ｃのステップ２で示すように金膜上のマウスＩｇＧ間のスペースに自己組織化単分子層を形成した後、脱イオン水とエタノールで洗浄し、過剰で結合の弱い分子を除去した。第二に、０．０５ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と０．２ＭのＮ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）の溶液で１時間、ＭＨＡのカルボニル基を活性化した。第二のステップは幅１ｃｍのＰＤＭＳマクロフローセル内で行った。ＮＨＳ／ＥＤＣ溶液の流量は０．０１ｍＬ／分であった。
【００８９】
ｄ．結合層上へのＴＫＨ２抗体の固定化。第一アミンカップリングによってＭＨＡ自己組織化単分子層上にＴＫＨ２抗体（ＩｇＧ３、表１参照）を固定化した。２０μｇ／ｍＬのＴＫＨ２抗体ＰＢＳ溶液を流量０．０１ｍＬ／分でフローセル内に注入した。ＰＢＳ溶液は、同じ流量０．０１ｍＬ／分でバッファーとして抗体注入前後にチャンネル内へ注入した。図６Ａは、ＴＫＨ２抗体がセンサチップを通過した際の時間に対するＳＰＲ角のシフトを示す。センシングエリアでは０．２１０°のＳＰＲ角のシフトが見られたが、リファレンシングエリアではシフトが殆ど見られなかった。
【００９０】
パターンを有する表面上へのＴＫＨ２抗体の吸着を示す図５Ｂも参照する。（ａ）及び（ｂ）には、それぞれセンシングエリア及びリファレンシングエリアに由来する測定値を示す［（ａ）抗体注入前、（ｂ）抗体吸着後］。（ｃ）は抗体注入前後のセンシングエリアにおけるＳＰＲ曲線を示す。（ｄ）は抗体注入前後のリファレンシングエリアにおけるＳＰＲ曲線を示す。センシングエリアではシフトが大きいが、リファレンシングエリアでは明らかなシフトが見られない。
【００９１】
ｅ．シアリルＴｎ抗原の検出。１００ｎｇ／ｍＬのシアリルＴｎ抗原を含む被検体ＰＢＳ溶液を調製し、上述のように固定化したＴＫＨ２抗体を有するセンサ表面上に流した。高濃度の腫瘍関連抗原シアリルＴｎがヒツジ顎下腺ムチンに存在することが知られている（ケルドセンら（Kjeldsen et al.），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４８：２２１４〜２０  １９８８）。このムチンは既報のようにヒツジ顎下腺から調製した（ヒルら（Hill ＨＤ et al.)，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：３７９１〜８、１９７７）。シアリルＴｎ抗原を含む被検体をセンサ表面上に流した際、図６Ａ（ｂ）に示すように、ＳＰＲ角のシグナルを時間の関数として記録した。センシングエリアにおける角シフト（１）からリファレンシングエリアにおける角シフト（２）を差し引くことによって、特異的な抗原−抗体相互作用に起因する純粋なシグナル変化がＳＰＲ角の変化０．０３５°となった。
【００９２】
［実施例６］癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の検出
リファレンシングパターンを調製し、センシングエリアを機能化するための手順ａ〜ｃは実施例５の場合と同様であった。
【００９３】
ｄ．結合層上への抗ＣＥＡ抗体の固定化。第一アミンカップリングによってＭＨＡ自己組織化単分子層上に抗ＣＥＡ抗体を固定化した。２０μｇ／ｍＬの抗ＣＥＡ抗体ＰＢＳ溶液を流量０．０１ｍＬ／分でフローセル内に注入した。ＰＢＳ溶液は、同じ流量０．０１ｍＬ／分でバッファーとして抗体注入前後にチャンネル内へ注入した。図６Ｂ（ａ）は、抗ＣＥＡ抗体がセンサチップを通過した際の時間に対するＳＰＲ角のシフトを示す。センシングエリアでは０．３８０°のＳＰＲ角のシフトが見られたが、リファレンシングエリアではシフトが殆ど見られなかった。
【００９４】
ｅ．癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の検出。抗体を固定化したセンサ表面上に１０ｎｇ／ｍＬのＣＥＡのＰＢＳ被検体溶液を流した。図６Ｂ（ｂ）に示すように、ＳＰＲ角のシグナルを時間の関数として記録した。センシングエリアにおける角シフト（１）からリファレンシングエリアにおける角シフト（２）を差し引くことによって、特異的な抗原−抗体相互作用に起因する純粋なシグナルの変化が０．０３４°のＳＰＲ角の変化となった。
【００９５】
［実施例７］正常被験者及び癌患者由来血清試料中シアリルＬｘ抗原のウェスタンブロット分析
２５マイクログラムのタンパク質を含む血清を、種々の分子量の標準リファレンスタンパク質を用いたＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。その後、ＰＶＤＦ膜を用いたウェスタンブロット分析を行った。膜上に移動したタンパク質は、（ｉ）クーマシーブリリアントブルー染色（図２、左パネル）、及び（ｉｉ）抗シアリルＬｅｘモノクローナル抗体ＳＮＨ３による染色（図２、右パネル）によって検出した。肺癌患者由来の血清において分子量が１７ｋＤａのバンドはＳＮＨ３によって強く染色されたが、正常被験者由来の血清における同一のバンドはＳＮＨ３によって染色されなかったか、或いは僅かに染色されるにすぎなかった。他のタンパク質バンドについてはいずれも、癌患者と正常被験者とを比較して血清において基本的に同じであった。
【００９６】
［実施例８］ハプトグロビンα及びβ鎖と結合する腫瘍関連グリコシルエピトープ
腫瘍関連抗原を定めるモノクローナル抗体を用い、正常な被験者及び種々の段階の各種癌患者由来の血清についてウェスタンブロット分析を行った。Ｌは肺癌、Ｂは乳癌、Ｇは胃癌、Ｃは結腸癌、Ｍは前立腺癌を示す。分子量が１７ｋＤａのハプトグロビンα２鎖のみが抗シアリルＬｅｘモノクローナル抗体ＳＮＨ３で強く染色された。
【００９７】
本明細書に引用した全ての特許、論文及び他の参考文献は、それらの全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】単一の原発性ヒト腫瘍の異なる遺伝子座で複数の抗原が発現することを示す図。
【図２】正常被験者及び肺癌患者由来の血清中の抗シアリルＬｅｘ（ＳＮＨ３）についてのウェスタンブロット分析を示す図。
【図３】典型的なＳＰＲバイオセンサシステムを示す。図３Ａは、使い捨てセンサチップを設けた試料カセットを有する小型ＳＰＲバイオセンサを示す図。
【図４】セルフリファレンシング型ＳＰＲシステムの概念及びアセンブリを示す図。
【図５】セルフリファレンシング型ＳＰＲバイオセンサにおける金表面でのマウスＩｇＧ及びＴＫＨ２抗体のプラズモン吸収を示す図。
【図６】ＴＫＨ２抗体とシアリルＴｎ抗原との相互作用に対するセルフリファレンシング図（図６Ａ）、及び抗ＣＥＡ抗体とＣＥＡ抗原との相互作用に対するセルフリファレンシング図（図６Ｂ）を示す図。
【図７】米国特許第６，７４７，７８０号に開示のデジタルウィンドウシステムを示す図。
【図８】濃度１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬのＣＥＡの検出を示すＳＰＲセンサグラム。
【図９】（１）対照分子としてＢＳＡ及び非特異的なマウスＩｇＧを用いた際のＣＥＡと抗ＣＥＡ抗体との特異結合の確認、及び（２）ＢＳＡを対照分子として用いた対応するＳＰＲセンサグラムを示す図。
【図１０】濃度１ｎｇ／ｍＬのＣＥＡを検出するＳＰＲセンサグラムを示す図。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図２】
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【図３−１】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年3月28日(2008.3.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の抗原の存在を検出するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システムであって、
前記抗原の特異抗体が固定化されているセンシングエリア及び前記抗原の特異抗体が固定化されていないリファレンシングエリアが各々１以上表面に存在する帯状型チャンネルを複数有するＳＰＲセンサと、
前記生体試料を導入して前記チャンネルの前記センシングエリア及び前記リファレンシングエリアに当該生体試料を接触させるフローセルと、
前記センシングエリア及び前記リファレンシングエリアに由来するＳＰＲシグナルのシフトを前記チャンネル毎に測定する測定手段とを具備し、
前記各チャンネルの前記センシングエリアのＳＰＲシグナルのシフトと前記リファレンシングエリアのＳＰＲシグナルのシフトの差に基づいて、前記チャンネル毎に前記生体試料中の抗原の存在を検出することを特徴とするＳＰＲシステム。
【請求項２】
糖鎖抗原の特異抗体が固定化されている前記センシングエリアには、さらに糖鎖抗原が結合したポリペプチドの特異抗体が固定化されていることを特徴とする請求項１に記載のＳＰＲシステム。
【請求項３】
生体試料中の抗原の存在を検出するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システムに用いられるセンサチップであって、前記抗原の特異抗体が固定化されているセンシングエリア、及び前記抗原の特異抗体が固定化されていないリファレンシングエリア各々１以上が表面に存在する帯状型チャンネルを複数有することを特徴とするセンサチップ。
【請求項４】
生体試料中の腫瘍関連抗原の存在を検出するための検出方法であって、
前記腫瘍関連抗原の特異抗体が固定化されているセンシングエリア及び前記腫瘍関連抗原の特異抗体が固定化されていないリファレンシングエリアが各々１以上表面に存在する帯状型チャンネルを複数有するＳＰＲセンサと、前記生体試料を導入して前記チャンネルの前記センシングエリア及び前記リファレンシングエリアに当該生体試料を接触させるフローセルと、前記センシングエリア及び前記リファレンシングエリアに由来するＳＰＲシグナルのシフトを前記チャンネル毎に測定する測定手段とを具備するＳＰＲシステムを用い、
前記生体試料を前記フローセルに流した後、前記センシングエリア及び前記リファレンシングエリアに由来するＳＰＲシグナルのシフトを前記チャンネル毎に測定し、前記各チャンネルの前記センシングエリアのＳＰＲシグナルのシフトと前記リファレンシングエリアのＳＰＲシグナルのシフトの差に基づいて、前記チャンネル毎に前記生体試料中の腫瘍関連抗原の存在を検出することを特徴とする腫瘍関連抗原の存在の検出方法。
【請求項５】
前記腫瘍関連抗原は１種以上であり、前記腫瘍関連抗原のうち少なくとも１つは、Ｌｅｘ、二量体Ｌｅｘ、シアリルＬｅｘ、シアリルＬｅａ、シアリルＴｎ、Ｔｎ、ジシアリルＬｃ４、シアリル二量体Ｌｅｘ及びＧａｌＮＡｃジシアロＬｃ４からなる群から選択される糖鎖抗原であることを特徴とする請求項４に記載の腫瘍関連抗原の存在の検出方法。
【請求項６】
糖鎖抗原の特異抗体が固定化されている前記センシングエリアには、さらに糖鎖抗原が結合したポリペプチドの特異抗体が固定化されていることを特徴とする請求項４又は５に記載の腫瘍関連抗原の存在の検出方法。
【請求項７】
前記糖鎖抗原はシアリルＬｅｘであり、前記糖鎖抗原が結合したポリペプチドの特異抗体はハプトグロビンα２鎖であることを特徴とする請求項６に記載の腫瘍関連抗原の存在の検出方法。
【請求項８】
前記抗体は、Ｆａｂフラグメントであることを特徴とする請求項４〜７の何れかに記載の腫瘍関連抗原の存在の検出方法。
【国際調査報告】
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