(57)【要約】  ＣＤ１３３及びＣＤ２４マーカーの表面共発現性を示す腎臓由来の新規の細胞集団について述べる。この細胞は、幹細胞能を有し、管形成、脂質生成、骨形成及び神経発生分化を行い得るものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１３３及びＣＤ２４マーカーを共発現することを特徴とする腎幹細胞。
【請求項２】
前記マーカーは、ＣＤ１３３＋及びＣＤ２４＋であることを特徴とする請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
ボーマン嚢由来であることを特徴とする請求項１又は２に記載の腎臓細胞。
【請求項４】
ボーマン嚢の尿道の極に由来することを特徴とする請求項１又は２に記載の腎臓細胞。
【請求項５】
ボーマン嚢にごく近接した尿細管の部分に由来することを特徴とする請求項１又は２に記載の腎臓細胞。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載の腎幹細胞を有することを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載の腎臓細胞の単離方法であって、
異なる透過性を有するシーブを用いる標準的な分離方法により腎臓の糸球体を単離し；
得た糸球体の懸濁液を、２０％ＦＢＳを添加したＥＧＭ−ＭＶを含有するプラスティックディッシュで直接培養し、
培養下の糸球体に由来しＣＤ１３３及びＣＤ２４マーカーを発現する細胞を単離することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載の腎臓細胞の単離方法であって、コラゲナーゼで消化した全腎臓組織からの、ＣＤ１３３及びＣＤ２４を用いた免疫磁気分離によることを特徴とする方法。
【請求項９】
腎臓の障害を修復するための組成物の調製への、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の幹細胞集団の使用。
【請求項１０】
前記細胞は、管再生能を与えることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞は、脂肪細胞再生能を与えることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞は、骨再生能を与えることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞は、神経再生能を与えることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞及びその使用の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの成人臓器は、組織の一体性の保持及び修復工程に関連する多能性幹細胞を含有する。
【０００３】
修復後の腎臓組織の再生を行い得る腎幹細胞の利用能は、種々のタイプの腎障害の予防及び治療の可能性に関連して非常に重要である。事実、急性及び慢性の腎疾患は、その易学的関連性及び透析や移植などの置換処置に関連する高いコストに起因して、公衆衛生の緊急性を示す。
【非特許文献１】Ｒｏｍａｇｎａｎｉ  Ｐ．ら著、”ＣＤ１４＋ＣＤ３４ｌｏｗ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｒｅ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ”、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、２００５年、９７巻、ｐ．３１４−３２２
【非特許文献２】Ｂｏｑｕｅｓｔ  ＡＣら著、”Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ”、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、２００５年、１６巻、ｐ．１１３１−１１４１
【非特許文献３】Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ＭＦら著、”Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ”、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、２８４巻、ｐ．１４３−１４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＣＤ１３３及びＣＤ２４マーカーをその表面に共発現する腎幹細胞の利用を可能とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、多能性腎幹細胞を利用可能とすることにより、上記の問題の克服を可能とする。
【発明の効果】
【０００６】
事実、ＣＤ１３３及びＣＤ２４のマーカー（ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋）をその表面に共発現し得る腎細胞は、幹細胞能を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
腎幹細胞の同定及び単離
抗ＣＤ２４及び抗ＣＤ１３３モノクローナル抗体を用いた共焦点顕微鏡により、２０の通常のヒト腎臓を検討した。腎臓胚前駆細胞の集団のマーカーであるＣＤ２４は、ボーマン嚢の体腔壁上皮細胞の細胞上及び尿細管上皮細胞の下位集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に選択的に発現されることが見出された。種々のヒト組織に由来する幹細胞を選択的に同定する抗ＣＤ１３３モノクローナル抗体は、ボーマン嚢の細胞及びまれな管状構造の下位集団を同定した（図１）。
【０００８】
ＣＤ２４及びＣＤ１３３の二重免疫蛍光により、この２つのマーカーが、糸球体の腎臓の極（ｐｏｌｅ）に多く位置し腎臓の極に近接した管の部分にしばしば伸びるボーマン嚢の細胞の下位集団を同定することが示された（図１）。また、上記と同じ細胞は、抗ＣＤ１０６モノクローナル抗体でも染色される。全体的に、これらの結果は、成人のヒト腎臓において、ボーマン嚢の上皮細胞及び管状細胞のまれな集団（ｒａｒｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）のレベルに細胞集団が存在することを示唆しており、ここでは、図１に示すように、幹細胞の異なるマーカーが共発現しており、以下、その種々の画像について、詳述する。すなわち：
【０００９】
ａ）成人ヒトの腎臓に由来するボーマン嚢の細胞において、ＣＤ２４（赤）及びＣＤ１３３（緑）の発現を示す二重免疫蛍光染色。この２つの染色パターンの重ね合わせにより、腎臓の極に局在する細胞の下位集団においてＣＤ２４及びＣＤ１３３が共発現することが示される（ＵＰ、バーは、５０μｍ）。Ｔｏ−ｐｒｏ−３の核対比染色（青）。
ｂ）ボーマン嚢の細胞におけるＣＤ２４（赤）及びＣＤ１３３（緑）の発現を示す、より高い倍率で検出した、二重蛍光染色。これらの２つの染色パターンの重ね合わせにより、細胞質及び糸球体（Ｇ）に対面する細胞膜上にＣＤ２４及びＣＤ１３３がともに局在していることが示される一方、ＣＤ２４のみが基底膜上に発現している（黄色、バーは、１０μｍ）。Ｔｏ−ｐｒｏ−３の核対比染色（青）。
ｃ）２つの異なる抗ＣＤ１３３モノクローナル抗体を用いたＣＤ１３３の検出。抗体２９３Ｃ３（赤）及び抗体ＡＣ１３３（緑）は、ボーマン嚢の細胞の同じ下位集団を染色する。両染色パターンを示す重ね合わせた画像は、同じ細胞の共染色を示す（黄色、バーは、５０μｍ）。Ｔｏ−ｐｒｏ−３の核対比染色（青）。
ｄ）糸球体におけるＣＤ２４（赤）、ＣＤ１３３（緑）及びＣＤ２９（青）の検出。ＣＤ２９の染色により、糸球体輸入細動脈（ＡＡ）の同定が可能となる。重ね合わせた画像が示すのは、ＣＤ２４及びＣＤ１３３が、血管の極の反対側上に局在した細胞の下位集団に選択的に共発現されたことである（黄色、バーは、５０μｍ）。
ｅ）嚢細胞におけるＣＤ２４（赤）、ＣＤ１３３（緑）及びＣＤ１０６（青）の発現を示す、より高い倍率での三重免疫蛍光染色。重ね合わせた画像が示すのは、細胞質及び糸球体（Ｇ）に向かい合う細胞膜上でのＣＤ２４及びＣＤ１３３の共局在であり、一方、ＣＤ２４及びＣＤ１０６（紫色）は、基底膜上に共発現されていた。ＣＤ２４、ＣＤ１３３及びＣＤ１０６の共発現の可視領域は、白で染色される（バーは、１０μｍ）。
【００１０】
ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞は、その後、形態的及び機能的特徴付けを検討するため、単離された。この目的のため、腎組織の皮質成分は、髄質成分から分離され、破砕される。糸球体は、異なる孔のシーブを用いた標準的な分離方法により単離された。ボーマン嚢のＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞の破壊を防ぐため、糸球体の懸濁液を消化しなかったが、２０％ＦＢＳを添加したＥＧＭ−ＭＶを有するプラスティック皿に直接培養した。培養糸球体に由来する細胞は、神経球（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）に類似する細胞集塊物を形成する能力について、検討され、その幹細胞の発現型について、図２の通り、共焦点顕微鏡及び細胞蛍光分析により、検討された。その種々の画像について、下記に詳述する。すなわち：
【００１１】
ａ）左側の第一のパネルは、培養状態のカプセル化された糸球体に由来する増殖細胞を示す（×４０）。レーザー共焦点顕微鏡で得た続く画像は、増殖集団がＣＤ２４を発現することを示す（緑）。Ｔｏ−ｐｒｏ−３の核対比染色（青）。重ね合わせた画像が示すのは、増殖細胞がかなりの量のＣＤ２４を発現することである（バーは、１００μｍ）。
ｂ）糸球体の増殖細胞に由来する集団において２つのマーカーが選択的に共局在することを示す、ＣＤ２４（赤）及びＣＤ１３３（緑）の発現を検出する二重免疫蛍光染色。Ｔｏ−ｐｒｏ−３の核対比染色（青）。重ね合わせた画像は、同じ細胞のＣＤ２４及びＣＤ１３３の染色強度を示す。（黄色。バーは、１００μｍ）。
ｃ）ボーマン嚢の細胞の初代培養は、ＣＤ２４、ＣＤ１３３、ＣＤ１０６、ＣＤ１０５及びＣＤ４４を発現する約１００％の細胞を有する均一な集団を示す。代表的な培養のフローサイトメトリーによる分析についても示す。
ｄ）ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋のボーマン嚢の細胞に由来する初代培養は、第一の２つのパネルにおけるフローサイトメトリーで示すように、ＣＤ３５やＥＭＡ−１などの腎臓の系統マーカーを発現しない。共焦点顕微鏡で示すように、同じ細胞は、ＴＨＧ（第三のパネル）及びＬＴＡ（第四のパネル）を発現しない（バーは、１００μｍ）。
ｅ）「リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ」による上皮細胞、尿細管細胞、メサンギウム細胞、有足細胞、平滑筋細胞ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞及びＨＥＫ細胞の培養におけるＯｃｔ−４のｍＲＮＡのレベルの測定。結果は、５の異なるドナーに由来する初代培養で行った三重測定の平均±標準偏差で示す。
ｆ）「リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ」による上皮細胞、尿細管細胞、メサンギウム細胞、有足細胞、平滑筋細胞ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞及びＨＥＫ細胞の培養におけるＢｍｌ−１のｍＲＮＡのレベルの測定。結果は、５の異なるドナーに由来する初代培養で行った三重測定の平均±標準偏差で示す。
【００１２】
単離細胞は、ＣＤ２４及びＣＤ１３３の両方を発現したが、種々の造血細胞（ＣＤ３４、ＣＤ４５）、上皮細胞（ＣＤ３１、ＣＤ３４）、有足細胞又は尿細管細胞（ＥＭＡ−１、Ｌｏｔｕｓ  Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  Ｂｉｆｌｏｒｕｓ、アルカリフォスファターゼ）のマーカーを発現しない（図２）。
【００１３】
単離細胞の幹細胞特性をより良好に定義付けるため、幹細胞の自己修復能の保持及び細胞老化の防止に重要なその他の転写因子であるＢｍｌ−１の発現とともに、典型的な胚幹細胞マーカーであるＯｃｔ−４の発現を検討した。その結果、ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞の幹細胞特性を示した（図２）。また、これは、幹細胞の転写因子Ｏｃｔ−４及びＢｍｌ−１を培養下で発現する腎臓由来細胞の集団についての最初の記述である。
【００１４】
ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞もまた幹細胞の機能特性を示すかどうかを検討するため、この細胞を、培養下、ＣＦＤＡ−ＳＥでラベル化し、２０％ＦＢＳを添加したＥＧＭ−ＭＶ中で播種した。増殖に関するデータで示されたのは、ＣＤ１３３及びＣＤ２４のマーカーの組合せを発現しないその他の腎臓細胞と比較してこの細胞の増殖能がさらに高いことであった。
【００１５】
事実、ＣＤ２４−ＣＤ１３３−細胞（つまり、ＣＤ１３３及びＣＤ２４を発現しない細胞）を、結合組織を分解し、特に免疫磁気法（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）などの免疫学的方法により分離して、酵素法（例えば、コラゲナーゼ）で消化した成人腎臓の皮質組織から調製した。その後、これらの細胞を、上記の培地に播種し、細胞が接着した後、細胞蛍光分析により評価した。ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞が、ＣＤ２４−ＣＤ１３３−細胞と１：１の比率で同じ培養ディッシュに異なる培地で播種された場合、ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞とＣＤ２４−ＣＤ１３３−細胞との比率は、培養１０日後に、約９：１に変化した（図３）。ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞培養が幹細胞の機能特徴を有するという事実をさらに検証するため、糸球体に由来する培養下のこの細胞を、剥離させ、フィブロネクチンでコートした「マルチウェル」プレートにおける限界希釈により、単一の細胞をクローン化した。免疫磁気分離法により、フィブロネクチンでコートした「マルチウェル」プレート中での限界希釈によりクローン化して得たＣＤ２４−ＣＤ１３３−細胞を、コントロールとして用いた：単一細胞を有するウェルのみ検討した。コロニー形成能は、糸球体培養から得たＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞で４１．３±１４％であり、ＣＤ２４−ＣＤ１３３−細胞では、２．１±１．９％であった。なお、ＣＤ２４−ＣＤ１３３−細胞に由来するまれなクローン（ｒａｒｅ  ｃｌｏｎｅ）は、ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞による若干の汚染に由来するものである。
【００１６】
ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋培養細胞が種々の細胞型に分化する能力を評価するため、異なるドナーに由来する個々のＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞クローンを、管形成分化、脂肪細胞分化、骨形成分化及び神経分化を惹起する条件下で培養した。
【００１７】
管形成分化は、ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞クローンを、ＳｉｎｇｌｅＱｕａｔｅｓ（ヒドロコルチゾン、ｈＥＧＦ、ＦＢＳ、エピネフリン、インスリン、トリヨードチロニン、トランスフェリン及びゲンタマイシン／アンフォテリシンＢ）を含有し、５０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ロッキーヒル、ＮＪ）を添加した市販のＲＥＢＭ培地中で３０日間培養して行った。
【００１８】
ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞クローンの骨形成分化、脂肪細胞分化及び神経分化は、上述の通り誘導した。骨形成誘導に関しては、１０％のウマ血清を添加し、１００ｎＭのデキサメタゾン、５０μＭのアスコルビン酸及び２ｍＭのβ−グリセロリン酸（全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含有するα−ＭＥＭ培地中で、ＰＥＣ  ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞を培養した。培地は、３週間に渡って、週２回交換した。脂肪細胞分化に関しては、１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、１μＭのデキサメタゾン、０．５μＭの１−メチル−３−イソブチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、１０μｇ／ｍＬのインスリン及び１００μＭのヨードメタシン（全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含有するＤＭＥＭ  ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ（ｈｇ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）中でＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞をインキュベートした。７２時間後、培地を、１０μｇ／ｍＬのインスリンを含有する、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭｈｇに変更し、２４時間培養した。これらの処理は、３回繰り返した。その後、細胞を、１０％ＦＢＳ及び１０μｇ／ｍＬのインスリンを有するＤＭＥＭｈｇ中でさらに１週間保持した。神経分化に関しては、培地は、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及び２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含有する１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭｈｇに置き換えた。５日後、細胞を洗浄し、５μｇ／ｍＬのインスリン、２００μＭのインドメタシン及び０．５ｍＭのＩＢＭＸを添加し、ＦＢＳを有さないＤＭＥＭ中で５時間インキュベートした。アリザリンレッド、オイルレッドＯ又はアルカリフォスファターゼの染色は、上記の通り行った（非特許文献１〜３参照）
【００１９】
管形成分化は、アルカリフォスファターゼ、アミノペプチダーゼＡ（初期は近位尿細管の上皮細胞で発現したもの）、チアジド−感受性Ｎａ−Ｃｌ共輸送体（初期は遠位尿細管の上皮細胞で発現したもの）、ＥＭＡ−１、Ｌｏｔｕｓ  Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  Ｂｉｆｌｏｒｕｓ並びにアクアポリン１及び３などの完全に分化した腎臓の尿細管上皮細胞の特徴マーカーの取得を検討することに基づいて、示された。これらのマーカーは、共焦点顕微鏡、細胞蛍光分析及び定量的ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの同定により、検出された（図４）。
【００２０】
結果を図４に示し、各画像の説明を以下に詳述する。
【００２１】
ａ）管形成分化を惹起する培地中での培養前（０日）及び培養後（３０日）におけるＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞のアルカリフォスファターゼ組織染色の代表的な顕微鏡写真。元の倍率：それぞれ、×６５、×８０及び×３２０。
ｂ）管形成分化を惹起する培地中での培養前（０日）及び培養後（３０日）における、共焦点顕微鏡で検討したＬＴＡ染色（緑）。Ｔｏ−ｐｒｏ−３ブルーの核対比染色（バーは、１００μｍ）。
ｃ）管形成分化を惹起する培地中での培養前（０日）及び培養後（３０日）における、共焦点顕微鏡で検討したＴＨＧ発現（緑）。Ｔｏ−ｐｒｏ−３ブルーの核対比染色（バーは、１００μｍ）。
ｄ）異なる管状セグメントのマーカーを共発現する細胞、及び近位又は遠位尿細管マーカーを発現する細胞の、同じクローンにおける共存在を示す、ＬＴＡ（緑）及びＴＨＧ（赤）の二重染色（バーは、１００μｍ）。
ｅ）管形成分化を惹起する培地中で３０日培養した後の管マーカー（ｔｕｂｕｌａｒ  ｍａｒｋｅｒ）に関する、ＲＴ−ＰＣＲによる、分化前の同じ細胞で得た値と比較した、増加したｍＲＮＡレベルの測定。カラムは、５０の異なるクローンの分化後に得た平均値±標準偏差を示す。
ｆ）左：共焦点蛍光画像の代表的な顕微鏡写真。写真は、アンジオテンシンＩＩ（１μＭ）の添加前及び添加後の４８８ｎｍの励起波長におけるものを記録した（バーは、２０μｍ）。右：検討した各１０の異なるクローンの５の個々の細胞において記録した蛍光強度の時間変化動態。
【００２２】
脂肪細胞分化は、細胞の形態的特徴を取得し、且つオイルレッドＯによる脂質胞の陽性染色により、示された。さらに、定量的ＲＴ−ＰＣＲで、アジポネクチンのｍＲＮＡレベルが急激に増加した（図５）。骨形成分化は、細胞クローンの、アルカリフォスファターゼの陽性のコロニーの形成能により評価した；分化中、これらのコロニーは、カルシウムリッチの細胞沈殿物を検出するアリザリンレッド染色で示されるように、ミネラル化された小節に変化した。骨形成は、Ｒｕｎｘ２のｍＲＮＡ発現の分析により、さらに証明された。脂肪細胞形成及び骨形成分化で得た結果を図５に示し、各画像について、以下に詳述する。
【００２３】
ａ）左：骨形成分化を惹起する培地中でのＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞のインキュベーション前（０日）及びインキュベーション後（２１日）におけるアリザリン及びアルカリフォスファターゼの組織染色の代表的な顕微鏡写真（×１００）。右：同じ培地中でのインキュベーション前（０日）及びインキュベーション後（２１日）におけるＲｕｎｘ２のｍＲＮＡレベルの測定。カラムは、５０の異なるクローンで得た平均値±標準偏差を示す。
ｂ）左：骨形成分化を惹起する培地中でのＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞のインキュベーション前（０日）及びインキュベーション後（２１日）におけるオイルレッドＯの組織染色の代表的な顕微鏡写真（×２００）。差し込み図：高い倍率（×３２０）で検討した若干の分化した細胞。右：同じ培地中でのインキュベーション前（０日）及びインキュベーション後（２１日）におけるアジポネクチンのｍＲＮＡレベルの測定。カラムは、５０の異なるクローンで得た平均値±標準偏差を示す。
【００２４】
神経分化は、神経様の形態の取得、並びに、タウ蛋白、微小管結合タンパク質（ＭＡＰ−２）、神経特異的エノラーゼ、ネスティン、コレステロールアセチルトランスフェラーゼ、β−チューブリンＩＩＩ及びニューロフィラメント２００の、ｍＲＮＡ及び蛋白レベルでの高い発現に基づいて示された。さらに、電気生理学的検討により、得た神経細胞が、図６に示すように、神経様特徴を有する、電位依存性カルシウム及びナトリウムチャネルの存在を示した。各画像について、以下に詳述する。
【００２５】
ａ）共焦点顕微鏡で評価した、神経分化を惹起する培地中でのＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞のインキュベーション前における、神経マーカーであるＮＦ２００、ＮＦＭ、ＣｈＡＴ及びＭＡＰ−２の不存在。Ｔｏ−ｐｒｏ−３の核対比染色（バーは、１００μｍ）。代表的な実験を示す。
ｂ）同じ培地中での細胞の分化後の、神経マーカーであるＮＦ２００、ＮＦＭ、ＣｈＡＴ及びＭＡＰ−２の強発現。Ｔｏ−ｐｒｏ−３の核対比染色（バーは、１００μｍ）。代表的な実験を示す。
ｃ）代表的な実験のより高い倍率での図であって、神経分化を惹起する条件下で培養したＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞における典型的な神経形態の取得及びＣｈＡＴ染色（緑）（バーは、１００μｍ）。
ｄ）神経形成を惹起する条件下で細胞を培養した後の異なる神経マーカーのｍＲＮＡレベルの増加を「リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ」により測定したものであって、神経分化前の同じ細胞から得た値と比較した。カラムは、５０の異なるクローンから得た平均値±標準偏差を示す。
ｅ〜ｈ）ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞に由来するニューロンにおけるＣａ２＋及びＮａ＋の電流
【００２６】
−９０ｍＶの電位及び１−ｓのインパルスで記録した代表的な電流は、１０ｍＶで増加させる−８０〜５０ｍＶのスケールで適用した。データは、異なるサンプリング時間（最初の１００ｍ秒で５０μ秒、残りの時間で１ｍ秒）で取得し、Ｌ型Ｃａ２＋の電流ＩＣａの速く且つ遅い現象並びに時間動態を検知した；明瞭性のため、−６０ｍＶ、−４０ｍＶ、−２０ｍＶ、０ｍＶ、２０ｍＶ、３０ｍＶ及び４０ｍＶでのみ電流のトレースを行った。ｆ：ＩＣａ−Ｖ曲線は、電流ピークで同定した（ｎ＝２６）。ｇ：Ｎａ＋電流ＩＮａの時間動態；−６０ｍＶ、−４０ｍＶ、−３０ｍＶ、−２０ｍＶ、−１０ｍＶ、０ｍＶ、２０ｍＶ及び３０ｍＶでのみ電流のトレースを行った；赤線は、ＴＴＸ（１μＭ）の存在下で０ｍＶにおいて誘導したＩＮａを示す。ｈ：ＩＮａ−Ｖ曲線は、電流ピークで同定した（ｎ＝２６）。ｆ及びｈ：データ上で重ね合わせた連続線は、活性化関数（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｕｎｃｔｉｏｎ）：Ｉａ（Ｖ）＝Ｇｍａｘ（Ｖ−Ｖｒｅｖ）／｛１＋ｅｘｐ［（Ｖａ−Ｖ）／ｋａ］｝を示す。ここで、Ｇｍａｘは、最大コンダクタンスであり、Ｖｒｅｖは、ポテンシャルのみかけ反転（ａｐｐａｒｅｎｔ  ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）であり、Ｖａは、コンダクタンスの最大値の半分の増加を誘導する電位であり、ｋａは、傾斜因子である。ｉ：−９０ｍＶの電位で惹起されたＩＮａの不活性化；前もったインパルス（−９０ｍＶ）のないトレース及び−７０ｍＶ、−６０ｍＶ、−３０ｍＶ、−４０ｍＶ及び−３０ｍＶの前もったインパルスでのトレースを行った。ｊ：ＩＮａで標準化した不活性化曲線、データに重ね合わせた連続線は、不活性化関数：Ｉｈ（Ｖ）＝１／｛１＋ｅｘｐ［−（Ｖｈ−Ｖ）／ｋｈ］｝を示す。ここで、Ｖｈは、半分の最大電流を惹起する電位であり、ｋｈは、不活性化に関する傾斜因子である。比較のため、右に報告した曲線は、活性化に関連するものである。
【００２７】
本発明によると、ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞は、コラゲナーゼで消化した腎臓組織の全体から免疫磁気分離による精製によっても単離され、ＣＤ２４−ＣＤ１３３−細胞についても、同様に行われた。
【００２８】
この場合、興味ある細胞は、ＣＤ１３３及びＣＤ２４又はその逆について、上述の通り得た細胞懸濁液の生成により得られた。このように、ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞の全てを実質的に得ることができる。この種々の方法により得た集団は、ボーマン嚢の細胞、並びにＣＤ１３３及びＣＤ２４を発現するまれな腎臓尿細管に由来する細胞の混合集団からなる。全体的に、ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋の細胞集団は、腎臓に存在する細胞の全体の約０．５〜９％に相当し、個々で変化する。上記の全ての実験は、上述した免疫磁気分離の種々の方法で得たＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋集団で繰り返され、腎臓は、ＣＤ１３３及びＣＤ２４のマーカーの共発現で特徴付けられる、再生能及び増幅能を有する成人の幹細胞の集団を含有し、これは、ボーマン嚢の尿路の極（ｕｒｉｎａｒｙ  ｐｏｌｅ）にほぼ由来し、腎臓の尿細管細胞に非常に部分的に由来することが確認された。
【００２９】
さらに、本発明は、ＣＤ１３３＋及びＣＤ２４＋マーカーを発現可能で且つ管形成能、脂肪細胞形成能、骨形成能及び神経再生能を有する、腎臓の幹細胞を含有する、治療用途の組成物に関する。
【００３０】
また、本発明は、腎臓の障害を修復するのに有用な組成物の調製への、上記の細胞の使用に関する。
【００３１】
ＳＣＩＤマウスにおける急性尿細管壊死のモデルは、本願出願人によって同定され成人ヒト腎臓から単離した幹細胞が障害を受けた腎臓組織を再生し得るかを検討するために使用された。このモデルは、筋融解及び溶血を引き起こす高張グリセロールの筋肉内注射を包含し、結果として、重篤な尿細管障害及び急性の腎不全をもたらす。尿細管障害は、注射後３日目でピークとなり、その後約１０日で急速に退行する。誘導された障害の程度は、ヒアリンの管状円筒の形成、近胃尿細管からの刷子縁の消失、及び尿細管上皮細胞の扁平化を示す、尿細管上皮細胞の壊死の程度を示す、ヘマトキシリン／エオシン染色により評価された。
【００３２】
３日目及び４日目において、８匹のマウスのグループに、１．５×１０６のＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞を尾静脈から接種する一方、他の８匹のマウスのグループに、生理食塩水を接種し、第三の８匹のマウスのグループに、１．５×１０６のＣＤ２４−ＣＤ１３３−細胞を、それぞれ、同じ手法で接種した。障害を受けた細管におけるＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋幹細胞の統合は、蛍光色素ＰＫＨ２６（赤）でラベル化した細胞を用いて示され、同時に、ＬＴＡ及び”Ｄｏｌｉｃｈｏｌｕｓ  Ｂｉｆｌｏｒｕｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ”を用いて近位及び遠位尿細管を同時にラベル化することにより示された。さらに、尿細管構造における幹細胞の集団の統合は、一般的な上皮細胞マーカーとしてヒト細胞及びサイトケラチンに特異的なＨＬＡ−Ｉ抗原を使用する免疫組織法により、確認された。最後に、メスのＳＣＩＤマウスに接種したヒト男子のドナーに由来する腎臓細胞を検知するのに、Ｙ染色体用のＦＩＳＨ法を使用した。これら３つの方法の全ての結果により、注入されたＳＣＩＤマウスの腎臓尿細管において選択的にＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞の統合が示された。図７に示すように、生理食塩水を注射したマウス又はＣＤ２４−ＣＤ１３３−のヒト腎臓細胞を注射したマウスでは、統合は示されなかった。各画像について、以下に詳述する。
【００３３】
ａ）ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ、左）又はファロイジン（緑、右）で染色した正常なマウスの腎臓組織を示す伝統的な顕微鏡図（バーは、５０μｍ）。
ｂ）Ｈ＆Ｅ染色（左）又はファロイジン染色（右）により示した、グリセロールの筋肉内注射後に観察された尿細管の壊死の障害であって、後者では、刷子縁の消失及び上皮細胞の扁平化を示す（緑、バーは、５０μｍ）。
ｃ）ヒトＣＤ２４−ＣＤ１３３−腎臓細胞を注射した急性腎不全のＳＣＩＤマウスの腎臓部分を示す代表的な顕微鏡写真；ＬＴＡ染色では、共焦点顕微鏡により、赤に染色した細胞がないことを示している（バーは、２０μｍ）。
ｄ）共焦点顕微鏡で示した、ＰＫＨ２６−ラベル（赤）で処理し、ＬＴＡ（緑）で染色したＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞を注射した急性腎不全のマウスの腎臓部分を示す代表的な顕微鏡写真。小型の矢印は、多くの赤い細胞の存在を示し、大型の矢印は、近位尿細管を示す（バーは、２０μｍ）。
ｅ）ｄ）における腎臓部分のより高い倍率の写真であって、近位尿細管構造の再生を示す（バーは、２０μｍ）。
ｆ）ＰＫＨ２６−ラベル（赤）で処理し２つの尿細管構造の基底表面上でＤＢＡ染色した（緑）、ＰＥＣ  ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞を注入した急性腎不全のＳＣＩＤマウスから得た他の腎臓部分のより高い倍率の写真であって、コレクター尿細管構造（ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ  ｔｕｂｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の再生を示す（矢印）。ＰＫＨ２６で染色されるがコレクターダクト（ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ  ｄｕｃｔ）マーカーであるＤＢＡでは染色されないその他の尿細管構造が見出される（バーは、２０μｍ）。
ｇ）グリセロールで誘導した急性腎不全（ＡＲＦ）のＳＣＩＤマウスの腎臓における、サイトケラチン（青）及びヒトクラスＩのＨＬＡ抗原（赤）の二重免疫組織染色。左パネル：ＣＤ２４−ＣＤ１３３−細胞を注射したマウスに由来の腎臓部分の尿細管における赤のシグナルの欠如；中央及び右パネル：ＰＥＣ  ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞を注入した後グリセロールで誘導した急性腎不全（ＡＲＦ）のＳＣＩＤマウスに由来する、サイトケラチンを発現する尿細管（青）におけるヒトクラスＩのＨＬＡ抗原（赤、矢印）の陽性染色細胞。
ｈ）ＦＩＳＨ法によるＹ染色体の検出であって、生理食塩水で染色したコントロールマウス（左パネル）、及びヒト男子腎臓から得たＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞を注射したメスマウスの腎臓（赤、中央及び右パネル）（バーは、２０μｍ）。
【００３４】
腎臓におけるこの集団の同定、及びその修復能の提示は、腎臓病態の治療に関して、再生医療の領域で非常に含蓄がある。
【００３５】
最後に、ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋の多能性の腎臓幹細胞集団のｉｎ  ｖｉｖｏでの修復能及び腎機能の続く回復について、２つの異なる実験的手法により、評価した。事実、ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞で処理したマウス及び生理食塩水を注入したマウスの両方で、グリセロール注射後の種々の時間において、高窒素血症を測定した。生理食塩水を注射したマウスと比較すると、ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞で処理したマウスでは、グリセロール注射後１４日目で、腎障害を誘導する前の同じマウスで測定した値に対してほぼ完全に有意に低い高窒素血症の値が得られた。さらに、グリセロール注射後１４日目の同じマウスにおいて”α−ＳＭＡ”染色により、線維化領域の存在を評価した。ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞を注射したマウスの群では、図８に示すように、生理食塩水を注射したマウス群と比較して、有意に線維化領域の程度が低いことを示した。各図について、以下に詳述する。
【００３６】
ａ）生理食塩水（赤線）又はＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞（黒線）を受けたグリセロールで処理されたマウスにおいて、種々の間隔で血中窒素レベル（ＢＵＮ）を測定した。カラムは、平均値±標準偏差を示す。各点、ｎ＝８；全８０匹のマウス。同じ時間におけるグリセロール＋生理食塩水に対して、＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１。
ｂ）健常マウス（白）、生理食塩水で処理したマウス（うすい灰色）及びＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞で処理したマウス（暗い灰色）の１４日における血中窒素レベル（ＢＵＮ）の比較。
ｃ）α−ＳＭＡ（緑）の存在用で染色された、生理食塩水で処理したマウスに由来する腎臓の代表的な顕微鏡写真。核は、Ｔｏ−ｐｒｏ−３で染色した（バーは、１００μｍ）。
ｄ）α−ＳＭＡ（緑）の存在用で染色された、ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞で処理したマウスに由来する腎臓の代表的な顕微鏡写真。核は、Ｔｏ−ｐｒｏ−３で染色した（バーは、１００μｍ）。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】幹細胞マーカーであるＣＤ１３３及びＣＤ２４の共発現を示し、且つヒト成人腎臓のボーマン嚢における細胞の下位集団を同定する。
【図２】ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞の単離及び特徴付けに関連する。
【図３】ＣＤ２４−ＣＤ１３３−細胞と比較した、ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞の増殖能を示す。
【図４】ボーマン嚢に由来するＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞から得たクローンの尿細管上皮細胞への分化を示す。
【図５】ボーマン嚢に由来するＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞から得たクローンの骨芽細胞及び脂肪細胞への分化を示す。
【図６】ボーマン嚢に由来するＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞から得たクローンによる、神経表現型及び機能特性の取得を示す。
【図７】急性腎不全（ＡＲＦ）に罹患したＳＣＩＤマウスの腎臓に移植したヒト腎臓由来のＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞、及び異なるタイプの管状細胞の発生を示す。
【図８】ＣＤ２４＋ＣＤ１３３＋細胞が、グリセロールで処理したマウスを、腎臓の構造及び機能の悪化から防ぐことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年2月28日(2008.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１３３＋及びＣＤ２４＋マーカーを共発現することを特徴とする腎幹細胞。
【請求項２】
当該細胞は、ボーマン嚢由来であることを特徴とする請求項１に記載の腎臓細胞。
【請求項３】
請求項１乃至２のいずれか一項に記載の腎幹細胞を有することを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項１乃至２のいずれか一項に記載の腎臓細胞の単離方法であって、
異なる透過性を有するシーブを用いる標準的な分離方法により腎臓の糸球体を単離し；
得た糸球体の懸濁液を、２０％ＦＢＳを添加したＥＧＭ−ＭＶを含有するプラスティックディッシュで直接培養し、
培養下の糸球体に由来しＣＤ１３３及びＣＤ２４マーカーを発現する細胞を単離することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の腎臓細胞の単離方法であって、コラゲナーゼで消化した全腎臓組織からの、ＣＤ１３３及びＣＤ２４を用いた免疫磁気分離によることを特徴とする方法。
【請求項６】
腎臓の障害を修復するための組成物の調製への、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の幹細胞集団の使用。
【請求項７】
前記細胞は、管再生能を与えることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
腎臓の常在細胞の異なる種類を修復するための、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の幹細胞集団。
【国際調査報告】
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