(57)【要約】本発明の方法は、免疫組織化学技法による、組織切片中のシグナル伝達活性の測定に関する。受容体シグナル伝達経路の１つ以上のエフェクター分子の発現レベルだけでなく、対象の受容体の発現レベルが測定される。さらに、受容体の発現と細胞内区画中のエフェクター分子の発現レベルとの合算比は、予後における重要性を有することが明らかになった。一実施形態において、本方法は、１）対象の細胞受容体タンパク質を検出するための試薬、２）少なくとも１つのシグナル伝達エフェクター分子を検出するための試薬、を使用して組織切片を染色する手順、ならびに染色した切片を分析し、相対量の受容体タンパク質およびエフェクター分子を定量化する手順を含む。
2009536355.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織切片中のシグナル伝達経路活性を測定する免疫組織化学法であって、
ａ）細胞受容体タンパク質を検出するための試薬で前記組織切片を染色する手順と；
ｂ）前記細胞受容体タンパク質に関連する前記シグナル伝達経路の一員であるエフェクター分子を検出するための第２の試薬で前記組織切片を染色する手順と；
ｃ）光学顕微鏡を使用して、前記組織切片中の前記染色細胞受容体タンパク質、および前記組織切片中の前記染色エフェクター分子の高解像度デジタル画像を得る手順と；
ｄ）前記デジタル画像を分析して、前記組織切片中に存在する前記細胞受容体タンパク質量、および前記組織切片中に存在するエフェクター分子量を定量化する手順と、
を含み、
それによって前記組織切片中の前記シグナル伝達活性を測定する、方法。
【請求項２】
前記組織切片が癌の疑いのある１または複数の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組織切片が固定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組織切片を顕微鏡スライドに付着させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞受容体タンパク質が上皮成長因子受容体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞受容体タンパク質がＥＧＦＲである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記エフェクター分子が、Ｇｒｂ２、Ｒａｓ、ＥＲＫ、ＡＫＴ、ｐＡＫＴ、ＧＳＫ３、ｐＧＳＫ３、ｅＩＦ２Ｂ、ＮＦｋＢ、ＣＲＥＢ、ＪＡＫ、およびＳＴＡＴからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記エフェクター分子が、ＡＫＴ、ＥＲＫ、およびＳＴＡＴからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の試薬が全エフェクター分子発現量を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２の試薬がリン酸化エフェクター分子発現量を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記エフェクター分子がエンドエフェクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
細胞内区画中の前記エフェクター分子を定量化する手順もさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞内区画が、細胞核および細胞質からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記シグナル伝達活性が、特異的な予後転帰について測定したシグナル伝達活性ともさらに相関関係にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記シグナル伝達活性が、特異的な治療転帰について測定したシグナル伝達活性ともさらに相関関係にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
組織切片中のシグナル伝達経路活性を測定する免疫組織化学法であって、
ａ）細胞受容体タンパク質を検出するための試薬で前記組織切片を染色する手順と；
ｂ）前記細胞受容体タンパク質に関連する前記シグナル伝達経路の一員であるエフェクター分子を検出するための第２の試薬で前記組織切片を染色する手順と；
ｃ）細胞内区画を標識化するための第３の試薬で前記組織切片を染色する手順と；
ｄ）顕微鏡を使用して、
ｉ）前記組織切片中の染色細胞受容体タンパク質；
ｉｉ）前記組織切片中の前記染色エフェクター分子；および
ｉｉｉ）前記標識化細胞内区画
の高解像度デジタル画像を得る手順；
ｅ）前記デジタル画像を分析して、
ｉ）前記組織切片中に存在する前記細胞受容体タンパク質；
ｉｉ）前記組織切片中の前記エフェクター分子；および
ｉｉｉ）前記細胞内区画中に存在する前記エフェクター分子
の定量的量を測定する手順と；
ｆ）互いに関連性のある前記細胞受容体、前記エフェクター分子および前記細胞内区画中の前記エフェクター分子の前記定量的量を分析する手順と、
を含み、
それによって前記組織切片中の前記シグナル伝達活性を測定する、方法。
【請求項１７】
前記細胞内区画が、核および細胞質からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
手順６が、核中のエフェクター分子量に対する細胞質中のエフェクター分子量の比を測定する手順を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
組織切片中のシグナル伝達経路活性を測定する免疫組織化学法であって、
ａ）細胞受容体タンパク質を検出するための試薬で前記組織切片を染色する手順と；
ｂ）それぞれが前記細胞受容体タンパク質に関連する前記シグナル伝達経路の一員である複数のエフェクター分子の１つ以上を検出するための１つ以上の追加の試薬で前記組織切片を染色する手順と；
ｃ）細胞内区画を定義するための標識で前記組織切片を染色する手順と；
ｄ）光学顕微鏡を使用して、
ｉ）前記組織切片中の前記染色細胞受容体タンパク質；
ｉｉ）前記組織切片中の１つ以上の前記染色エフェクター分子；および
ｉｉｉ）前記標識化細胞内区画
の高解像度デジタル画像または複数の高解像度デジタル画像を得る手順と；
ｅ）前記デジタル画像を分析して、
ｉ）前記組織切片中に存在する前記細胞受容体タンパク質；
ｉｉ）前記組織切片中に存在する１つ以上の前記エフェクター分子；および
ｉｉｉ）前記細胞内区画中に存在する１つ以上の前記エフェクター分子
の定量的量を測定する手順と；
ｆ）互いに関連性のある前記細胞受容体、１つ以上の前記エフェクター分子、および前記細胞内区画中の１つ以上の前記エフェクター分子の前記定量的量を分析する手順と、
を含み、
それによって前記組織切片中の前記シグナル伝達活性を測定する、方法。
【請求項２０】
２つ以上のエフェクター分子が染色および分析される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
３つ以上のエフェクター分子が染色および分析される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
手順６が、核中のエフェクター分子量に対する、細胞質中の各エフェクター分子量の比を測定する手順を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
複数のエフェクター分子の比が、受容体タンパク質との関連において組み合わされる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
組織切片のＥＧＦＲシグナル伝達プロファイルを測定する方法であって、
（ａ）（ｉ）ＥＧＦＲを検出するための試薬；
（ｉｉ）ＥＧＦＲエフェクター分子を検出するための第２の試薬；および
（ｉｉｉ）細胞内区画を検出するための第３の試薬
で前記組織切片を染色する手順と；
（ｂ）顕微鏡を使用して、
（ｉ）ＥＧＦＲ；
（ｉｉ）ＥＧＦＲエフェクター分子；および
（ｉｉｉ）細胞内区画
の高解像度デジタル画像を得る手順と；
（ｃ）前記デジタル画像を分析して、
（ｉ）ＥＧＦＲ；
（ｉｉ）前記細胞内区画中に存在するＥＧＦＲエフェクター分子；および
（ｉｉｉ）前記細胞内区画外に存在するＥＧＦＲエフェクター分子
の量を定量化する手順と；
（ｄ）手順ｃ（ｉｉ）で測定した量に対する、手順ｃ（ｉｉｉ）で測定した量のエフェクター比を測定する手順と；
（ｅ）前記ＥＧＦＲ量と対照検体の発現レベルとを比較する手順と；
（ｆ）手順（ｄ）の比と対照検体中の同手順の比とを比較する手順と、
を含む、方法。
【請求項２５】
ＥＧＦＲ発現腫瘍の予後状態を測定する方法であって、請求項１に記載の方法を含み、（ｉ）高いＥＧＦＲレベルと、対照エフェクター比よりも低い比とを有する腫瘍が、予後不良を示し；（ｉｉ）高いＥＧＦＲレベルと、対照エフェクター比よりも高い比を有する腫瘍が、より予後良好であることを示し；（ｉｉｉ）低いＥＧＦＲレベルと、対照エフェクター比よりも低い比を有する腫瘍が、予後良好を示す、方法。
【請求項２６】
前記細胞内区画が核であり、前記細胞内区画外の領域が細胞質である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも２つのＥＧＦＲ下流エフェクター分子のエフェクター比を定量化し、前記比を平均化して前記シグナル伝達指数を得る、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＥＧＦＲ下流エフェクター分子が、Ａｋｔｌ、Ｅｒｋ、およびＳｔａｔ３からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
Ａｋｔｌ、ＥＲＫ、およびＳＴＡＴ３を含む３つのＥＧＦＲエフェクター分子のエフェクター比を定量化し、前記比を平均化して前記シグナル伝達指数を得る、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
ＥＧＦＲを発現する腫瘍の予後状態を測定する方法であって、請求項２８に記載の方法を含み、（ｉ）高いＥＧＦＲレベルと、対照シグナル伝達指数よりも低い指数を有する腫瘍が、より予後不良であることを示し；（ｉｉ）高いＥＧＦＲレベルと、対照シグナル伝達指数より高い指数を有する腫瘍が、より予後良好であることを示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（背景）
受容体チロシンキナーゼのシグナル伝達、および他の受容体介在シグナル伝達経路は典型的に、リガンド結合、受容体活性化、シグナルを増幅またはネットワーク化する細胞質中のシグナル伝達中間タンパク質のリン酸化、シグナル伝達タンパク質のサブセットの核への転座を含む経路を介して進行した後、転座されたタンパク質または他の核の補因子のいずれかによって転写が活性化される。
【０００２】
ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のＨＥＲファミリーの一員である。各ＲＴＫは、リガンド結合ドメイン、単一膜貫通領域、および細胞質チロシンキナーゼ含有ドメインを有する。活性化は典型的に、正常な生理学的条件下で、受容体のホモまたはヘテロ二量化、キナーゼドメインの活性化、リン酸化、およびＲａｓ／ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ、ＰＬＣγ、およびＳＴＡＴといった、成長、増殖および／または生存に関与する下流シグナル伝達経路の活性化を可能にする、修飾ドメインのドッキング部位の生成などの機序を含めた、ＲＴＫリガンドの時間的および空間的な両発現によって制御される。ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１シグナル伝達経路の調節異常は、膀胱、脳、胸、結腸、食道、頭部、腎臓、肺、卵巣、頚部、膵臓、前立腺および胃を含めた多くの腫瘍の発症および増殖に関与することが知られている（例えば、Ｍａｒｍｏｒ，Ｍ．Ｄ，Ｋ．Ｂ．Ｓｋａｒｉａ，ａｎｄ  Ｙ．Ｙａｒｄｅｎ．２００４．Ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ＥｒｂＢ／ＨＥＲ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．５８：９０３‐９１３；Ｏｌａｙｉｏｙｅ，Ｍ．Ａ．，Ｒ．Ｍ．Ｎｅｖｅ，Ｈ．Ａ．Ｌａｎｅ，ａｎｄ  Ｎ．Ｅ．Ｈｙｎｅｓ．２０００．Ｔｈｅ  ＥｒｂＢ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｎｅｔｗｏｒｋ：ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．ＥＭＢＯＪ．１９：３１５９‐３１６７；Ｒｉｅｓｅ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｄ．Ｆ．Ｓｔｅｒｎ．１９９８．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ＥＧＦ  ｆａｍｉｌｙ／ＥｒｂＢ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ．２０：４１‐４８；Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．２００４．Ｃｏｍｍｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｖｉａ  ＥＧＦ  ａｎｄ  ＦＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３０６：１５０６‐１５０７；およびＹａｒｄｅｎ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｍ．Ｘ．Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ．２００１．Ｕｎｔａｎｇｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ＥｒｂＢ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２：１２７‐１３７を参照）。
【０００３】
ＥＧＦＲを標的とするモノクローナル抗体Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）は、結腸直腸癌治療において米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の認可を得ている。さらに、ＥＧＦＲを標的とするＩｒｅｓｓａおよびＴａｒｃｅｖａという２個の小分子は、非小細胞肺癌においてＦＤＡの認可を得ている。ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｎｃ．は、患者の生検においてＥＧＦＲを検出することができる、ＦＤＡ承認済みのコンパニオン診断を提供する。例えば、この試験は、ＥＧＦＲを標的とした治療法に好意的に反応すると考えられる患者の同定に有用である可能性がある。しかし、経験により、現在使用可能なＥＧＦＲ診断検査は、ＥＧＦＲを標的とした療法による治療に対する患者の反応に十分な相関関係がないことが明らかにされている。
【０００４】
特許文献１およびではそれぞれ、個々の患者がＥＧＦまたはＥＧＦＲ阻害剤を用いた治療に反応するかどうかを予測したり、または治療に反応しているかどうかを特定したりするのに有用である場合がある、１つまたは別の分子マーカー（全核ＥＲＫと比較したｐＥＲＫまたは全細胞質ＥＲＫを含んでもよい）のアッセイが教示されている。本方法では、ＥＧＦまたはＥＧＦＲ阻害剤で治療する被験体の治療前後の生検が必要となる。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／００９４０６８号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００７／００５９７８５号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
受容体および経路エフェクター分子の発現レベルが十分なレベルの精度を達成することを同アッセイで判定することが必要となる可能性がある対象の受容体に特に関連するシグナル伝達経路活性化状態を測定する方法が必要とされている。
【０００６】
また、複数の可能性ある経路を評価する受容体に関連するシグナル伝達経路活性化状態を同アッセイで測定する方法も必要とされている。
【０００７】
また、治療後生検を必要としないアッセイも必要されている。リン酸化タンパク質の不安定性は、組織切除と固定（または凍結）の間の短い虚血時間中であっても、リン酸化タンパク質の検出に厳密に基づくアッセイの臨床的有用性を制限する場合がある。そのため、リン酸化エフェクター分子の正確な検出に依存することなくシグナル伝達経路活性化状態を測定する代替法、特に日常の臨床診療時にまたは適切な特異的検出試薬が入手できない場合に不安定であると判明した分子のための代替法を考案することも必要されている。
【０００８】
また、受容体発現およびシグナル伝達経路活性化状態に基づく予後情報を提供することができる方法も必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様において、本発明は、組織切片中のシグナル伝達経路活性を測定する免疫組織化学アッセイ法を特徴とする。一実施形態において、本方法は、１）対象の細胞受容体タンパク質を検出するための試薬、２）少なくとも１つのシグナル伝達エフェクター分子を検出するための試薬、を使用して組織切片を染色する手順、ならびに染色した切片を分析し、相対量の受容体タンパク質およびエフェクター分子を定量化する手順を含む。一実施形態においては、２つのエフェクター分子の発現レベルを検出し、別の実施形態においては、３つのエフェクター分子の発現レベルを検出する。さらに、細胞質と比較した、核中のエフェクター分子発現レベルの比を測定することにより、シグナル伝達活性を測定してもよい。本発明の特定の実施形態においては、受容体発現レベルと組み合わせた、３個の下流エフェクター分子の細胞質と核の発現比が、予後における重要性を有した。
【００１０】
別の態様において、本発明は、記載の方法を実施するのに有用なキットを特徴とする。
【００１１】
ＥＧＦＲ発現レベル、ならびに核中の少なくとも１つのＥＧＦＲ下流エフェクター分子量の、細胞質中の少なくとも１つのＥＧＦＲ下流エフェクター分子量に対する比に関する腫瘍の分析により、特定の腫瘍におけるＥＧＦＲシグナル伝達経路の活性レベルが得られる。この重要な情報は、例えば（ａ）患者の予後分類、（ｂ）薬物反応の予測、（ｃ）生体特異的療法（例えば、ＥＧＦＲまたはＨＥＲファミリーシグナル伝達を標的とする薬剤などあるがこれらに限定されない）を受ける患者の選択、（ｄ）薬剤への応答者の同定および／または薬物耐性の同定に有用である可能性がある。複数のＥＧＦＲ下流エフェクター分子を定量化し、かつ核／細胞質比を平均化することで、差異（例えば、固定条件などによる）を標準化し、単一マーカーの定量的測定を介して達成できる分類力を上回る分類力を提供することができる。
【００１２】
他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲に基づいて明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
定義
便宜上、本発明を詳細な説明を行う前に、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語をここで定義する。単数形（「ａ」「ａｎ」、および「ｔｈｅ」）は、文脈で特に明記されない限り、複数の言及を含む。
【００１４】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、すべての抗体、例えば、いずれかのアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど）を含むものとして意図され、さらに脊椎動物（特に哺乳類）のタンパク質と特異的に反応するそれらの断片も含むものとして意図される。抗体は、従来の技法を使用して断片化することができ、断片は、すべての抗体に関して上述したのと同じ方法で有用性をスクリーニングすることができる。したがって、本用語は、特定のタンパク質と選択的に反応することができる抗体分子のタンパク分解により切断された部分または組み換えにより調製された部分のセグメントを含む。タンパク分解断片および／または組換え断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、およびペプチドリンカーによって結合した、Ｖ［Ｌ］および／またはＶ［Ｈ］ドメインを含む一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が含まれる。ｓｃＦｖは、共有結合または非共有結合で結合し、２個以上の結合部位を有する抗体を形成してもよい。本発明は、抗体および組換え抗体のポリクローナル、モノクローナル、または他の精製された製剤を含む。本発明のバイオマーカーの検出に使用される抗体は、標識抗体であってもよい。標識抗体は、検出用の蛍光ラベルを含んでもよい。
【００１５】
「バイオマーカー」という用語は、例えば、存在、濃度、活性、リン酸化状態、細胞内局在性プロファイル、および／または転座状態が測定されるタンパク質を含めた、組織中の細胞のいずれかの成分を指してもよい。「バイオマーカー」とは、ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲ下流エフェクター分子を含めたＥＧＦＲシグナル伝達経路の一員であるタンパク質を指してもよい。
【００１６】
「切点」という用語は、データが分割される地点を指す。例えば、患者群を、切点ｘで、高バイオマーカー発現群（ｘ以上）と低バイオマーカー発現群（ｘ以下）とに分割してもよい（例えば、Ｃａｍｐ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｘ‐ｔｉｌｅ：ａ  ｎｅｗ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅ‐ｂａｓｅｄ  ｃｕｔ‐ｐｏｉｎｔ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ９．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：７２５２‐７２５９を参照）。
【００１７】
本明細書で提供する方法に基づく「薬剤」には、標的シグナル伝達経路に対する薬剤の効果が調査中であるか、既知であり、薬剤への反応が予測される適切な患者群の特定に使用されている、特に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＰＮＡ、リボザイム、抗体、小分子、リガンドを含めた、タンパク質、核酸などが含まれる。「薬剤」という用語には、治療候補を含む天然または合成化合物が含まれる。
【００１８】
「エフェクター分子」という語句は、細胞シグナル伝達経路におけるいずれかの分子を指す。「エンドエフェクター分子」という語句は、細胞質と核の間で転座することができる細胞シグナル伝達経路におけるいずれかの分子を指す。好ましいエフェクター分子には、以下が含まれる：胸腺腫ウイルス性癌遺伝子１（Ａｋｔｌ、Ａｋｔ、ＰＫＢ／Ａｋｔ、またはＰＫＢα；ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＬ５５７３２として提供されるヒトタンパク質配列）、シグナル伝達および転写３の活性剤または急性期応答因子（Ｓｔａｔ３；ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＫ１７１９６として提供されるヒトタンパク質配列）、ならびにマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ３（ＭＡＰＫ３またはＥｒｋｌ；ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＨ１３７５４として提供されるヒトタンパク質配列）、Ｇｒｂ２、Ｒａｓ、ｍＴＯＲ、ＧＳＫ３、ｅＩＦ２Ｂ、ＮＦｋＢ、ＣＲＥＢ、ＪＡＫ。ＥＧＦＲ下流エフェクター分子は、いずれかの所与の期間にリン酸化しても、しなくてもよい。
【００１９】
「ＥＧＦＲまたは上皮細胞成長因子受容体」とは、ＨＥＲ１またはＥｒｂＢ‐１が、上皮細胞成長因子ファミリーの細胞表面受容体の一員であることも指す。ヒトＥＧＦＲタンパク質は、配列が参考として本明細書で明示的に援用される、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿９５８４３９およびＮＰ＿９５８４４１において示されている。
【００２０】
「シグナル伝達プロファイル」とは、特定の腫瘍および少なくとも１つのエフェクター分子の発現レベルに対する受容体発現レベルの組み合わせを指す。好ましい実施形態において、シグナル伝達プロファイルは、特定の腫瘍のＥＧＦＲ発現レベルと、少なくとも１つの下流エフェクター分子の平均核／細胞質比とを組み合わせたものである。
【００２１】
「ＥＧＦＲを標的とする治療」とは、被験体中のＥＧＦＲを標的とする薬剤を指し、例としては、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）、Ｉｒｅｓｓａ、およびＴａｒｃｅｖａが含まれるが、これらに限定されない。
【００２２】
「患者」または「被験体」とは、ヒトまたはヒト以外の動物のいずれかを意味してもよい。
【００２３】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」とは、例えば、核酸のコード配列によりコードされる可能性のある遺伝子産物を指す場合は、本明細書で交換可能に使用される。
【００２４】
「シグナル伝達指数」とは、少なくとも１つの受容体下流エフェクター分子の平均核／細胞質比を指す。
【００２５】
「シグナル伝達電位」とは、腫瘍細胞シグナル伝達経路の相対活性を指す。活性化シグナル伝達経路を有する腫瘍は、より侵襲的であると考えられ、患者生存期間を減少させる。逆に、不活性シグナル伝達経路を有する腫瘍は、侵襲的ではないと考えられ、患者生存期間を増加させる。
【００２６】
「小分子」とは、約２０００ｋＤａ未満の分子量を有する組成物を指す。小分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣薬、炭水化物、脂質、または他の有機（炭素含有）もしくは無機分子であってもよい。本説明を基にすれば当業者は理解すると思われるが、生物活性を調整する化合物を同定するために、化学および／または生物学的混合物のライブラリ、多くの場合、真菌、細菌、または藻類の抽出物を、本発明のアッセイのいずれかでスクリーニングしてもよい。
【００２７】
「細胞内局在性プロファイル」とは、細胞内部位、例えば、細胞核または細胞質中の受容体下流エフェクター分子のレベルを指す。好ましい実施形態において、細胞内局在性プロファイルは、細胞質中のエンドエフェクター分子のレベルと比較した、核中のエンドエフェクター分子のレベルである。細胞内局在性プロファイルは、比（または対数比）で表現してもよい。
【００２８】
本明細書で使用される「組織試料」とは、生体内組織から得られる生物学的試料、例えば、生検を指す。好ましい実施形態において、組織試料は腫瘍である。組織試料は、細針生検試料などの患者由来試料である「臨床試料」となることが多い。「組織試料」には、組織切片、例えば、冷凍または固定腫瘍から採取した切片が含まれてもよい。組織試料は、例えば、膀胱、脳、胸、子宮、頸部、結腸、直腸、食道、口、頭部、皮膚、腎臓、肺、卵巣、首、膵臓、前立腺、精巣、肝臓、および胃の腫瘍から得ることができるが、これらに限定されない。組織試料は、組織アレイ上に存在してもよければ、あるいはすべての組織切片を含んでもよい。「均一に一致した」組織試料とは、同種の組織試料（すなわち、同じ種類の被験体から得られた同種の腫瘍から得られた同種の細胞を含む）である。「均一に一致した」組織試料は、本明細書で提供する方法で基準プロファイルを提供するのに使用することができる。
【００２９】
「腫瘍」とは、例えば、これらの細胞膜上で上皮成長因子受容体を発現する細胞を含む場合がある、組織の異常増殖を指す。腫瘍は、例えば、膀胱、脳、胸、子宮、頸部、結腸、直腸、食道、頭、皮膚、腎臓、肺（非小細胞肺癌を含む）、卵巣、首、膵臓、前立腺、精巣、肝臓、および胃に存在してもよい。
【００３０】
概要
本発明は、免疫組織化学法により、組織切片中の受容体シグナル伝達経路中の受容体分子および１つ以上の下流エフェクター分子をアッセイすることで、経路の活性化状態を測定し、予後情報を得ることができるという発見に基づくものである。より具体的には、本発明は、組織切片中のシグナル伝達経路の活性化を測定する免疫組織化学法であって、
１）細胞受容体タンパク質を検出するための試薬で組織切片を染色する手順と；
２）細胞受容体タンパク質のシグナル伝達経路の一員であるエフェクター分子を検出するための第２の試薬で組織切片を染色する手順と；
３）顕微鏡を使用して、組織切片中の染色細胞受容体タンパク質ならびに組織切片中の染色エフェクター分子の高解像度デジタル画像を得る手順と；
４）デジタル画像を分析して、組織切片中に存在する細胞受容体タンパク質の量および組織切片中に存在するエフェクター分子量を定量化する手順と、
を含み、
それによって組織切片中のシグナル伝達活性を測定する方法に関する。
【００３１】
本発明の特定の実施形態は、比較的高レベルのＥＧＦＲを発現するが、比較的低シグナル伝達指数（すなわち、少なくとも１つの下流エフェクター分子に関して、核シグナルに対して細胞質シグナルがより高い）を有する腫瘍を有する患者は、生存率が最も低いという驚くべき発見に基づいている。理論により拘束されるわけではないが、エフェクター分子の核レベルに比べてエフェクター分子の全細胞質レベルがより高い腫瘍細胞は、より多くの分子を活性化に使用できることから、より高いシグナル伝達電位を有すると考えられる。この仮説の裏づけとして、Ｅｒｋｌ／２の核内蓄積が一時的であり、核Ｅｒｋ１／２が細胞質に素早く再局在化され、次回の刺激を待つことが明らかにされている（Ａｄａｃｈｉ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｏｒｔ  ｏｆ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ（ＥＲＫ）ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ａ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ（ＭＥＫ）‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４８：８４９‐８５６）。
【００３２】
これらの発見に基づいて、本発明は、腫瘍のシグナル伝達プロファイル（すなわち、発現した受容体の相対量およびシグナル伝達指数（細胞質中で発現したエフェクター量に対する、核中で発現した各下流エフェクター量の相対比）を測定するための方法およびキットを特徴とする。腫瘍のシグナル伝達プロファイルを測定する方法は、腫瘍から得られた組織試料、および少なくとも１つの受容体エフェクター分子中の受容体レベルを測定する手順を含む。例えば、ＥＧＦＲの定量化に加えて、腫瘍のＥＧＦＲシグナル伝達プロファイルを測定する方法は、組織切片中の少なくとも１つのＥＧＦＲ下流エフェクター分子の核および細胞質レベルを測定する手順も含む。リン酸化または非リン酸化タンパク質のいずれかを測定してもよい。例として、細胞質中の全下流エフェクター分子のレベルを測定すると同時に、核区画中の全下流エフェクター分子のレベルを測定してもよい。あるいは、細胞質中の全ｐ‐エフェクター分子、および核中の全ｐ‐エフェクター分子を測定してもよい。
【００３３】
次いで、腫瘍組織中の少なくとも１つのＥＧＦＲ下流エフェクター分子の核および細胞質レベルを互いに比較して、被験体の腫瘍中の少なくとも１つのＥＧＦＲ下流エフェクター分子の相対位置（細胞質または核）を特定する。一態様において、本方法は、Ｅｒｋ、ＡＫＴ、Ｓｔａｔ３、および／または他のＥＧＦＲ下流エフェクター分子が、試料中の腫瘍細胞の細胞質中により局在するか、または試料中の腫瘍細胞の核中により局在するかを特定する手順を含む。特定の生物学的マーカーの相対位置を特定するいずれの適切な方法を、本方法で使用してもよい。一態様において、試料中の少なくとも１つの下流エフェクター分子の受容体レベル、ならびに核および細胞質のレベルを特異的に測定し、測定した核レベルと細胞質レベルの比（核／細胞質比）を算出して、相対位置を特定し、受容体レベルとの関連において使用する。別の実施形態においては、試料中の少なくとも１つの下流エフェクター分子の相対位置を特定するために「シグナル伝達指数」を算出し、受容体レベルとの関連において使用してもよい。例として、シグナル伝達指数を、１つ以上のＥＧＦＲ下流エフェクター分子の算出した核／細胞質レベル比の平均（３または別の数値）の対数変換として表してもよい。
【００３４】
次いで、少なくとも１つのＥＧＦＲ下流エフェクター分子の相体位置を、単比、シグナル伝達指数、または他の形態で表現されたかにかかわらず、既知の患者の層別化から特定されたパラメータの基準と比較する。基準は実験により特定してもよければ、あるいは既存のデータセットから事前に定義された値であってもよい。組織試料中の少なくとも１つのＥＧＦＲ下流エフェクター分子が、基準に比べると、核区画よりも細胞質区画により局在すると特定され、基準に比べると、局在性の差異が有意である場合、腫瘍が比較的高いＥＧＦＲ発現レベル（上述の通り）を有すると特定されるならば、腫瘍は侵襲的であると考えられる。しかし、組織試料中の少なくとも１つのＥＧＦＲの下流エフェクター分子が、基準に比べると、核区画よりも細胞質区画により局在すると特定され、腫瘍が比較的低いＥＧＦＲ発現レベル（上述の通り）を有すると特定され、基準に比べると、局在性の差異が有意である場合、腫瘍は比較的非侵襲的であると考えられる。さらに、組織試料中の少なくとも１つのＥＧＦＲ下流エフェクター分子が、基準に比べると、細胞質区画よりも核区画により局在すると特定され、腫瘍が比較的低ＥＧＦＲ発現レベル（上述の通り）を有すると特定され、基準に比べると、局在性の差異が有意である場合、腫瘍は同様に比較的非侵襲的であると考えられる。そして組織試料中の少なくとも１つのＥＧＦＲ下流エフェクター分子が、基準に比べると、細胞質区画より核区画に局在すると特定され、腫瘍も比較的高いＥＧＦＲ発現レベル（上述の通り）を有すると特定され、基準に比べると、局在性の差異が有意である場合、腫瘍は比較的中等度に非侵襲的であると考えられる。
【００３５】
ＥＧＦＲおよび下流エフェクター分子は、当該技術分野で既知のいずれかの適切な手段で測定してもよい。シグナル活性化の評価では、比の構成に起因する非正規分布に合わせて調節するのに、シグナル伝達指数の対数を使用することができる。
【００３６】
組織標本：  組織試料は生体から入手し、これには細胞および細胞外物質が含まれる。組織試料は、ヒト、またはヒト以外の動物から採取してもよい。組織試料は、いずれの臓器からも得ることができ、このような臓器の病状を含んでいてもよい。針生検などの既知の手順を使用して、腫瘍生検などの組織試料を得ることができる（Ｋｉｍ，Ｃ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：３８７９‐３８８２（１９９２））；Ｂｉｓｗａｓ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５９０：５８２‐５８３（１９９０））；Ｂｉｓｗａｓ，Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：２２２８‐２２３３（１９９１）を参照）。組織は、ＥＧＦＲおよび下流エフェクタータンパク質（例えば、ＥｒｋおよびＡＫＴ）の正確な検出および定量化を可能にする方法で処理するものとする。組織試料を、組織マイクロアレイフォーマットで調製および切断してもよければ、あるいは全組織切片を含んでもよい。切片は典型的には顕微鏡スライド上で調製される。例えば、パラフィン包埋ホルマリン固定検体を調製し、コアを検体の分離領域から採取し、各コアをレシピエントブロックへ配列し、既述の通りに（例えば、Ｋｏｎｅｎｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ‐ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ，（１９８７）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：８４４‐７）切片を切断および処理してもよい。個体の組織試料を分析する場合には、組織または細胞を被験体から除去した後で、特にタンパク質発現におけるいずれかの変化、生理学的処理、または分解を予防することが重要である場合がある。発現レベルの変化は、以下の摂動、例えば、リポ多糖体（ＩＰＳ）または他の試薬での熱ショックまたは活性化を急激に変化させることが知られている。さらに、組織および細胞内のＲＮＡおよびタンパク質を、素早く分解させてもよい。したがって、被験体から得た組織は、理想的には直ちに固定または凍結される。組織標本はまた、薬剤投与量範囲または毒性試験において、異種移植腫瘍試料、特に動物から得られた異種移植腫瘍試料を含んでもよい。
【００３７】
定量化：  ＥＧＦＲを定量化し、下流エフェクター分子を定量化および局在化するいずれの適切な方法も、本方法で使用してもよい。１つの好ましい方法では、免疫組織化学法、細胞または組織抗原などの特異的タンパク質を検出するためのモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用した免疫酵素反応に基づく染色法が使用される。典型的には、免疫組織化学プロトコルは、少なくとも以下の手順のいくつかを含む：１）抗原回収（例えば、圧力調理、プロテアーゼ治療、マイクロ波、適切な緩衝液中での加熱などによる）；２）１次抗体の適用および洗浄；３）１次抗体に結合する標識２次抗体（しばしば手順５での検出を可能にする２次抗体複合体）の適用、および洗浄；４）増幅手順を含んでもよく；５）検出試薬の適用（例えば、クロマジェン、蛍光標識分子、またはアッセイに必要なレベルもしくは感度を達成するための適切なダイナミックレンジを有するいずれかの分子）；６）対比染色を使用してもよく；ならびに７）タンパク質の存在を、定性または定量分析用に可視化する（ヒトの眼または自動解析システムのいずれかに対して）、検出システムを使用した検出。対象のタンパク質を検出するための種々の免疫酵素染色法が、当該技術分野で既知である。例えば、免疫酵素的相互作用は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、もしくはＤＡＢ、ＡＥＣ、もしくはＦａｓｔ  Ｒｅｄなどの異なる色原体などの種々の酵素；またはＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒなどの蛍光標識などを使用して可視化することができる。対比染色は、このような染料が他の検出試薬と同等であり、可視化法を使用する限りは、Ｈ＆Ｅ、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔを含んでもよい。当該技術分野で既知の通り、染色シグナルを強化するために、増幅試薬を使用してもよい。例えば、チラミド試薬を使用してもよい。本発明の染色法は、当業者に明らかであるであろう、自動化、半自動化、または手動システムを含めたいずれかの適切な方法またはシステムを使用して達成してもよい。
【００３８】
受容体タンパク質および下流エフェクター分子のレベルは、当業者に理解されるであろう適切な特異抗体を使用して分析することができる。全タンパク質レベル、または具体的にはリン酸化タンパク質レベルを測定してもよい。
【００３９】
本発明の方法は、当業者にとって明らかになるであろう、自動システム、定量的ＩＨＣ、および条件によっては好ましくない半定量的ＩＨＣ、ならびに手動方法を含めた、免疫組織化学分析のための適切な方法またはシステムを使用して達成してもよい。本明細書で使用される「定量的」免疫組織化学法は、抗原または他のタンパク質などの特定のバイオマーカーの存在を同定および定量化するためにＩＨＣ染色組織を走査およびスコアリングする方法（自動化されてもよい）を指す。試料に付けるスコアは、試料の免疫組織化学染色の強度または吸光度（ＯＤ）の数値であってもよく、試料中に存在する標的バイオマーカーの量を表す。定量的測定は、相対的であってもよければ、あるいは絶対的であってもよい。例えば、ＩＨＣアッセイにおける対照検体は、同じ対照検体から得られたＥＬＩＳＡ結果と相関関係があり、したがって組織検体中のバイオマーカーの絶対濃度を測定するための検量線を生じる場合がある。スコアは、単位面積で分割された染色強度もしくはＯＤ、または染色細胞の割合を表してもよい。本明細書で使用される半定量的免疫組織化学法とは、例えば、訓練を受けたオペレーターが結果を数値（例えば、０、１＋、２＋または３＋）で評価する、それぞれのヒトの眼の免疫組織化学結果のスコアリングを指す。最も好ましいのは、連続したスケールの結果をもたらす定量的免疫組織化学法である。
【００４０】
免疫組織化学法との使用に適した、種々の自動化された試料処理、走査および分析システムが、当該技術分野で既知である。このようなシステムには、自動染色および顕微鏡走査、コンピュータ化された画像解析、連続切片比較（試料の方向およびサイズにおける差異の制御）、デジタル報告書作成、ならびに試料の保管および追跡（組織切片が配置されるスライドなど）が含まれてもよい。免疫染色試料を含めた細胞および組織の定量分析を行うために従来の光、蛍光、または共焦点顕微鏡とデジタル画像処理システムとを組み合わせた、細胞画像システムが市販されている。例えば、ＣＡＳ‐２００  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．）；ＢＬＩＳＳ  ａｎｄ  ＩＨＣｓｃｏｒｅ  ｏｆ  Ｂａｃｕｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（米国イリノイ州ロンバード）；ＡＣＩＳ  ｏｆ  Ｃｌａｒｉｅｎｔ，Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州サンフアンキャピストラノ）；ｉＶｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  ＧｅｎｏＭｘ  ｏｆ  ＢｉｏＧｅｎｅｘ（米国カリフォルニア州サンラモン）；ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ｏｆ  Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国カリフォルニア州ビスタ）；Ａｒｉｏｌ  ＳＬ‐５０  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国カリフォルニア州サンノゼ）；ＬＳＣ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  ｏｆ  ＣｏｍｐｕＣｙｔｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）；およびＡＱＵＡ（登録商標）ｏｆ  ＨｉｓｔｏＲｘ  Ｉｎｃ．（米国コネティカット州ニューヘーブン）を参照されたい。
【００４１】
特定の実施形態において、染色組織切片中の受容体タンパク質および下流エフェクター分子バイオマーカーの発現レベル（および／またはリン酸化などの修飾）は、例えば、単位面積当たりに発現する分子数に正比例する数値を導き出す細胞内区画内のタンパク質発現の定量的測定を可能にする、ＡＱＵＡ（登録商標）技術を使用して測定される（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｃａｍｐ，Ｒ．Ｌ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｇ．Ｇ．＆Ｒｉｍｍ，Ｄ．Ｌ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８，１３２３‐７（２００２）、ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／１２０８４号を参照）。細胞内区画は、形態学的に定義された区画、または分子的に定義された区画を含むことができる。細胞内区画は、細胞膜、細胞質、核、リソソーム、ＥＲ、およびゴルジ体などであってもよい。
【００４２】
バイオマーカーの発現を定量的に測定する方法は、細胞内のバイオマーカーの細胞内部位、および細胞の選択細胞内区画内の全タンパク質量またはリン酸化タンパク質量を特定する手順を含んでもよい。ＡＱＵＡ（登録商標）技術は、これらの目的の両方を達成する方法の例である。組織中のバイオマーカーの定量化にＡＱＵＡ（登録商標）技術を使用する本発明の方法の実施形態を、以下の実施例で説明する。
【００４３】
受容体タンパク質と下流エフェクター分子との関係を表すのに、種々の方法を使用してもよい。
【００４４】
シグナル伝達経路活性は、受容体タンパク質発現レベルと下流エフェクター分子または分子の発現レベルとの関係によって表現してもよい。この関係を、受容体／エフェクター比、受容体と複数のエフェクターの比で、個別にまたは組み合わせて（例えば、最適な切点に基づく、平均、中間値、中央値、もしくは測定の組み合わせ、またはクラスター測定）表してもよい。さらに、受容体タンパク質の発現レベルは、特定の細胞内区画内の下流エフェクター分子発現レベル（例えば、受容体とエフェクター細胞質の発現、または受容体とエフェクター核の発現）に関連してもよい。一実施形態において、受容体タンパク質発現レベルは、各区画内のエフェクター発現比（すなわち、細胞質／核比）に関連する。多くの受容体分子は、これらの活性化シグナルを複数の経路を介して伝達することから、受容体発現レベルを、１つ以上の可能経路を表す複数のエフェクター分子と組み合わせることが望ましい場合がある。例えば、受容体サブユニットのチロシンリン酸化を引き起こす、リガンド結合ホモ二量体またはヘテロ二量体上のＥＧＦＲがある。ＳｒｃファミリーおよびＡｂｌファミリーの細胞内チロシンキナーゼは、ＥＧＦＲ受容体をチロシンリン酸化し、１）ＲＡＳ／ＥＲＫ経路、２）ホスファチジルイノシトール  ３‐キナーゼ（ＰＩ３ｋ）経路、３）Ｊａｎｕｓキナーゼ／シグナル伝達物質および転写の活性化因子（ＪＡＫ／ＳＴＡＴ）経路を含めた、下流シグナル伝達系の活性化をもたらすＳｒｃ相同性２（ＳＨ２）ドメインを介して、タンパク質が結合できるようにすることができる。経路は、特に特定の癌の細胞生存を促進するように協調的に機能すると考えられる。そのため、ＥＧＦＲシグナル伝達の活性化状態を測定するためには、アッセイは、ＥＲＫ経路、ＰＩ３ｋ経路、および／またはＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路から得られた、ＥＧＦＲおよびエフェクター分子（全エフェクター分子および／またはリン酸化エフェクター分子）を含んでもよい。ＥＲＫ経路エフェクター分子には、Ｇｒｂ２、ＲＡＳ、ＲＡＦ１、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２が含まれる。ＰＩ３ｋ経路エフェクター分子には、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、７０ｓ６ｋ、ｅＩＦ４Ｂ、４Ｅ‐ＢＰＩ、ＧＳＫ３、ｅＩＦ２Ｂ、ＮＦｋＢ、およびＣＲＥＢが含まれる。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路エフェクター分子には、ＪＡＫとＳＴＡＴが含まれる（Ａｓｎａｇｈｉ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ  ２００４，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｓ  ５０：５４５‐５４９；Ｈｅｎｓｏｎ  Ｅ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ  ２００６  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇ．；Ｊｏｒｒｉｓｓｅｎ  Ｒ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ  ２００３  Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２８４：３１‐５３；Ｋｉｓｓｅｌｅｖａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ  ２００２  Ｇｅｎｅ  ２８５：１‐２４；Ｌｉｚｃａｎｏ  Ｊ．Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏ．１２：２３６‐２３８；Ｎａｉｒ  Ｐ．２００５  Ｃｕｒｒ  Ｓｃｉ．８８：８９０‐８９８；Ｙａｒｄｅｎ  Ｙ  ２００１  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３７：Ｓ３‐Ｓ８を参照）。特定の実施形態において、ＥＧＦＲシグナル伝達活性アッセイは、特に１つ以上の経路（すなわち、ＥＲＫ、ＡＫＴおよび／またはＳＴＡＴ）のエンドエフェクター分子の発現を測定する。本発明の特��の実施形態において、経路が活性化されている場合、これらの分子は細胞質から核へ転座することから、これらのエンドエフェクター分子の細胞質および核レベルが測定される。さらに、特定の実施形態において、ＥＧＦＲシグナル伝達活性アッセイは、細胞質と核ＡＫＴ、ＥＲＫおよび／またはＳＴＡＴ発現レベルの比の測定を含む。さらに別の実施形態においては、細胞質と核エフェクター発現の比を平均化して、シグナル伝達指数を得る。
【００４５】
本発明は、前述の方法を実施するためのキットを提供する。特定の実施形態において、キットは、バイオマーカーに対する抗体、および適切な試薬を含んでもよい。試薬には、遮断試薬、１次抗体、２次抗体、増幅系、検出試薬（色原体、フルオロフォアなど）、稀釈緩衝液、洗浄溶液、封入溶液、対比染色、またはそのいずれかの組み合わせが含まれてもよい。前述の方法の手動操作または部分的もしくは全体的に自動化された操作のいずれかのために、キットの構成要素を包装してもよい。キットを含む他の実施形態において、本発明は、本発明の組成物、および場合により使用説明書を含むキットを企図する。このようなキットは、例えば、画像処理、患者群の階層化、診断、予後、治療法決定の指導、および他の用途を含めた種々の用途を有してもよい。
【００４６】
核および細胞質中のＥＧＦＲおよび少なくとも１つのエフェクター分子の定量化は、適切な抗体を使用して分析することができる。ＥＧＦＲに対する抗体（ＰｈａｒｍＤｘ  Ｋｉｔ；ＤＡＫＯ、米国カリフォルニア州カーペンテリアなど）は市販されている。Ａｋｔｌに対する抗体（マウスモノクローナル、クローン２Ｈ１０；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国マサチューセッツ州デンバーなど）、およびＥｒｋｌ／２（マウスポリクローナルｌ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国マサチューセッツ州デンバーなど）も市販される。Ｓｅｒ（４７３）ｐｈｏｓｐｈｏ‐ＡＫＴに特異的な抗体も市販される（例えば、Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２００２  Ｏｃｔｏｂｅｒ；２８３（４）：Ｅ７８４‐９３を参照）。ｐ‐ｅｒｋｌおよびｐ‐ｅｒｋ２と反応する抗体も市販される（例えば、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国カリフォルニア州サンタクルーズ；米国特許第６，００１，５８０号も参照）。その他の抗体はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃａｔａｌｏｇ，２００６‐２００７）から市販される。適切な抗体に対するその他の販売元も、当該技術分野で既知である。特定の実施形態において、バイオマーカーの発現レベル（および／またはリン酸化などの修飾）は、パネル中の各バイオマーカーのＡＱＵＡ（登録商標）技術スコアを測定することにより、例えば、ＡＱＵＡ（登録商標）技術により自動化された病理学システムを使用することにより、測定する。ＡＱＵＡ（登録商標）技術（自動定量分析用）は、ｉｎ  ｓｉｔｕタンパク質発現の絶対測定の分析法である。本方法は、単位面積当たりに発現する分子数に正比例する数値を導き出す細胞内区画内タンパク質発現の測定を可能にする。
【００４７】
本方法については、焦点外光サブトラクションイメージング法の詳細を含めて、いずれも全体が参考として本明細書で援用される、Ｃａｍｐ，Ｒ．Ｌ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｇ．Ｇ．＆Ｒｉｍｍ，Ｄ．Ｌ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｕｂｃｃｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ８，１３２３‐７（２００２））；および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／１２０８４号に記載されている。ＡＱＵＡ（登録商標）は、ｉｎ  ｓｉｔｕタンパク質発現の絶対測定の分析法である。本方法は、例えば単位面積当たりに発現する分子数に正比例する数値を導き出す細胞内区画内タンパク質発現の測定を可能にする。すなわち、例えば、Ａｋｔの測定では、腫瘍の領域を特定し、かつ基質および他の非腫瘍物質を分析から除去するための１つのチャンネル内で得られたケラチン染色画像を使用して、組織が「マスク」される。あるいは、ＥＧＦＲ染色画像を腫瘍マスクの作成に使用してもよい。２次チャネル内で得られたＤＡＰＩ染色画像を、腫瘍染色の比較に使用し、核および細胞質区画を定義する。Ａｋｔの発現強度は、３次チャンネルを使用してＡｋｔ染色を検出することにより測定する。２次エフェクター分子（例えば、ＥｒｋまたはＳＴＡＴ２）の発現強度は、４次チャンネル中の２次エフェクター分子を検出することにより測定する。特異的な細胞内区画に対するＡＱＵＡスコアは、ピクセル数で分割された区画に割り当てられたそのピクセルのサブセットの強度を使用して作成してもよい。このスコアは、細胞内区画の単位面積当たりのＡｋｔ分子数に正比例しており、このスコアを標準化し、既知レベルのＡｋｔタンパク質発現を伴う細胞株で得られたスコアの検量線を使用して絶対値を特定してもよい。本方法は、全体が参考として本明細書で援用される、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｐａｐｅｒ（Ｃａｍｐ，Ｒ．Ｌ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｇ．Ｇ．＆Ｒｉｍｍ，Ｄ．Ｌ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８，１３２３‐７（２００２））；および２００２年２月１日に出願され、国際特許第０２／０８６４９８号として公開された、米国特許出願第１０／０６２，３０８号に記載されている。
【００４８】
組織中のバイオマーカーの定量化にＡＱＵＡ（登録商標）技術を使用する、本発明の方法の例示的な実施形態を、以下の実施例で説明する。バイオマーカー発現を定量的に測定する方法は、細胞内のバイオマーカーの細胞内部位、ならびに細胞のバイオマーカー量またはリン酸化状態を測定する手順を含んでもよい。ＡＱＵＡ（登録商標）技術は、これらの両方の目的を達成する方法の一例である。
【実施例】
【００４９】
本発明を以下の実施例によって詳細に説明するが、これらの実施例はいかなる方法によっても限定的なものとして解釈してはならない。本発明の実施では、特に記載がない限り、当該技術分野の範囲内に含まれる、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技法が活用される。このような技法については、文献で詳細に説明されている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，１９８５）；およびＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）を参照）。
【００５０】
ＥＧＦＲシグナル伝達プロファイルを得る方法
材料および方法
組織マイクロアレイ設計および処理
エール大学病理部のアーカイブから入手できる、非小細胞肺癌の２１３症例からパラフィン包埋ホルマリン固定検体（１９９６〜２００３年）を得た。ｉｎ  ｓｉｔｕ病変および正常上皮から離れた各腫瘍試料の浸潤癌領域をマーキングし、０．６ｍｍのコアを２個採取した。各コアを、１ｍｍ間隔のグリッドのレシピエントブロックに配列し、厚さ５ミクロンの切片を既述の通り切断および処理した（Ｋｏｎｏｎｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．１９９８  Ｔｉｓｓｕｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ‐ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．４，８４４‐８４７）。
【００５１】
免疫組織化学
簡潔に言うと、事前に切断し、パラフィンでコーティングした組織マイクロアレイスライドを、プロテイナーゼＫ（ＥＧＦＲ、ＰｈａｒｍＤｘキット、ＤＡＫＯ、米国カリフォルニア州カーピンテリア）、またはｐＨ６．０のクエン酸塩中での１０分間の圧力調理（その他すべての１次抗体については、以下を参照）によって、脱パラフィン化および抗原回収した。スライドを、０．１Ｍトリス緩衝食塩水（ｐＨ８．０）（ＢＳＡ／ＴＢＳ）中で室温にて６０分間、０．３％のウシ血清アルブミンで事前にインキュベートした。次いで、スライドを、ＥＧＦＲ（ＰｈａｒｍＤｘキット、原液を使用；ＤＡＫＯ、米国カリフォルニア州カーピンテリア）、Ａｋｔｌ（マウスモノクローナル、クローン２Ｈ１０、１：２００で希釈；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国マサチューセッツ州デンバー）、Ｅｒｋ１／２（マウスポリクローナル、１：１００で希釈；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国マサチューセッツ州デンバー）、またはＳｔａｔ３（ウサギのモノクローナル、クローン１２４Ｈ６、１：５００で希釈；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国マサチューセッツ州デンバー）、および４℃にて一晩ＢＳＡ／ＴＢＳ中で希釈したパンサイトケラチン（マウスまたはウサギのポリクローナル、１：１００で希釈、ＤＡＫＯ、米国カリフォルニア州カーピンテリア）に対する１次抗体でインキュベートした。スライドを、３×１０分間、０．０５％のＴｗｅｅｎ‐２０を含む１Ｘ  ＴＢＳで洗浄した。対応する２次抗体を、室温にて１時間ＢＳＡ／ＴＢＳに加えた。これらは、抗サイトケラチン（Ａｌｅｘａ  ４８８に結合したヤギ抗ウサギ；１：１００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州ユージーン）に対するフルオロフォアに直接結合するおよび／または抗チミジル酸シンターゼ（ＤＡＫＯ、米国カリフォルニア州カーピンテリア）に対するホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合する抗体のいずれかまたは両方を含んだ。スライドを、３×１０分間、０．０５％のＴｗｅｅｎ‐２０を含むＴＢＳで再度洗浄した。スライドを、ＤＡＢと同様に、ＨＲＰにより活性化され、ＨＲＰにより結合した２次抗体に直ちに隣接する多くの共有結合したＣｙ‐５染料が沈着する蛍光性クロマジェン（Ｃｙ‐５‐チラミド、ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、米国マサチューセッツ州ボストン）でインキュベートした。放出ピークが、組織自己蛍光の緑色からオレンジ色のスペクトルのかなり外側にあることから、Ｃｙ‐５（赤）を使用した。自動分析用のスライドに、Ａｎｔｉｆａｄｅ  ＤＡＰＩ含有封入剤（ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州ユージーン）を使用してカバースリップを被せた。
【００５２】
画像収集
画像収集は既述の通りに行った（Ｃａｍｐ  ＲＬ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．８（１１）：１３２３‐１３２７）。すなわち、自動ｘｙｚステージ動作を備えたＴＥ２００倒立蛍光顕微鏡にＮｉｋｏｎ  Ｓｕｐｅｒ‐Ｆｌｕｏｒ１０倍レンズを介して付属の水冷式Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｅｓ  ｓｅｒｉｅｓ  ３００カメラを取り付けた、Ｄｅｌｔａｖｉｓｉｏｎプラットフォームおよびソフトウェア（ＳｏｆｔＷｏｒｘ２．５；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ、米国ワシントン州イサクアー）を使用して、マイクロアレイ画像を得た。マイクロアレイの低出力画像を、約７ミクロンの解像度で、マイクロアレイの複数（約１５００）の低解像度画像（６４×６４ピクセル）を使用し、一緒にステッチした。ＤＡＰＬのシグナルを使用して、検体コア（ヒストスポット）を同定した。次いで、各ヒストスポットの座標を記録した。その後、各ヒストスポットの単色の高解像度（１０２４×１０２４ピクセル、０．５ミクロンの解像度）画像を、焦点面、およびヒストスポットから８ミクロン下方の両方で取得し、画像スタックにビットマップとして記録した。０〜１０２４のダイナミックレンジを使用して画像を得たが、０〜２５５のダイナミックレンジを有する８ビットのｔｉｆｆ画像として、保存および分析した。
ＡＱＵＡ（登録商標）分析（ＲＥＳＡ／ＰＬＡＣＥアルゴリズム）
ＡＱＵＡ（登録商標）分析は既述の通りに行った（Ｃａｍｐ  ＲＬ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．８（１１）：１３２３‐１３２７）。すなわち、腫瘍を周囲の基質および／または白血球と区別するマーカー（サイトケラチン）の画像を閾値化することにより、腫瘍に特異的なマスクを作成した。これにより二元性マスクが作成される（各ピクセルは「オン」または「オフ」のいずれかである）。閾値レベルを数枚の画像の抜取検査により検証した後、残りの画像については自動化した。その後のすべての画像操作には、マスク領域から得た画像情報のみが含まれる。次いで、区画に特異的な標識と標的マーカーから、２つの画像（１つは焦点画像、もう１つは遠距離画像）を撮影する。焦点外画像の割合を、２つの画像のピクセル毎の分析に基づいて、焦点画像から減算する。全体の減算度は、各細胞内区画に対するユーザ定義の割合に基づく。ほとんどの用途の場合、これは実験的に全シグナルの４０％に設定され、全マイクロアレイから得た画像では一定のままとなる。したがって、ＲＥＳＡはすべての焦点外情報を削除する。このアルゴリズムは、高染色度領域と低染色度の隣接域との間でインターフェースが増強するという追加の利点を有し、隣接区画のピクセルのより正確な配置を可能にする。区画に特異的な標識とは対照的に、標的シグナルのＲＥＳＡ減算は一定で、全体の画像強度には基づいていない。これにより、同量の減算が全検体の標的シグナルにより生じるようになる。最後に、ＰＬＡＣＥアルゴリズムは、画像中の各ピクセルを特異的な細胞内区画に割り当てる。ユーザ定義の信頼度（通常９５％）の範囲内までの区画に正確に割り当てることができないピクセルは破棄する。これは、１つの区画から別の区画へのマーカーのスピルオーバーを最小限にする、２個の区画に特異的なマーカーから得たシグナル比を測定することにより、反復的に達成される。核および細胞膜ピクセル強度が類似しすぎるために正確に割り当てることができないピクセルは無効にする（通常、全ピクセルの８％未満を含む）。第３区画（細胞質）は、排除（非細胞膜、非核）により定義することができる。各ピクセルを細胞内区画に割り当てる（または上述の通りに排除する）と、各位置中のシグナルが合算される。このデータを保管し、その後、全シグナルの割合として、あるいは区画領域当たりの平均シグナル強度として表すことができる。スコアは１〜１０００のスケールで表す。
【００５３】
データ解析
マスク領域（自動化）別といった、１０％未満の腫瘍を含むヒストスポットを、次の解析から排除した。本発明者等の以前の研究では、２つのヒストスポットの平均から得たスコアが、全組織切片から得たスコアと９５％を超える確率で一致することが実証されている（Ｃａｍｐ，ＲＬ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ  ８０：１９４３‐１９４９）。各患者の腫瘍を、これらの分析の２つの独立した組織コアで表し、その後、各患者のＡＱＵＡ（登録商標）スコアを平均化した。さらに、発現の不均一性（ピアソンのＲ値０．４未満は実験誤差と考えられ、０．４〜０．７は不均一な発現と考えられ、０．７超は均一な発現と考えられる）だけでなく、実験の再現性の基準として調査した各マーカーの回帰分析を行った。各バイオマーカーのピアソンのＲ値は、以下の通りである：ＥＧＦＲ、０．７８；Ａｋｔｌ、０．４４；Ｅｒｋｌ／２、０．５５、およびＳｔａｔ３、０．６９。独立した生存率解析を行うために、既述の通りにＸ‐ｔｉｌｅ（登録商標）を使用して最適な切点を選択した（Ｃａｍｐ，ＲＬ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｘ‐ｔｉｌｅ：ａ  ｎｅｗ  ｂｉｏ‐ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅ‐ｂａｓｅｄ  ｃｕｔ‐ｐｏｉｎｔ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０（２１）：７２５２‐７２５９）。Ｍａｎｔｅｌ‐Ｃｏｘのｌｏｇ‐ｒａｎｋスコアは最適な切点の選択に統計的に十分厳密ではないことから、Ｍｏｎｔｅ‐ｃａｒｌｏシミュレーションを使用した。さらに統計的に厳密にするために、最適な切点をコホートの３分の１（訓練群）に特定し、コホートの残りの３分の２（検証群）に適用した。非監視および監視下での階層的クラスター分析は、Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して行い、クラスターの可視化にＴｒｅｅＶｉｅｗ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して表示した（スタンフォード大学Ｅｉｓｅｎ研究室）。その後、生存率解析を、ＳＰＳＳ  ｖｌ４．０１（ＳＰＳＳ，Ｉｎｃ．、米国イリノイ州シカゴ）およびＲ（ＧＮＵ、米国マサチューセッツ州ボストン）を使用して行った。
【００５４】
結果
生存率解析
ＡＱＵＡ（登録商標）分析によるＥＧＦＲ発現試験では、ＥＧＦＲを発現するＮＳＣＬＣ腫瘍の上位２５％（相対的なＡＱＵＡ（登録商標）スコア１２に相当；ヒストグラム（挿入紙、図１）を参照）に、疾患特異的３年生存率の統計的に有意な２５％の減少が見られることが明らかになった（図１）。
【００５５】
ＥＧＦＲ経路の主要な下流シグナル伝達エフェクター（Ａｋｔｌ、Ｅｒｋｌ／２、およびＳｔａｔ３）のＡＱＵＡ（登録商標）分析では、Ａｋｔｌではなく、Ｅｒｋｌ／２およびＳｔａｔ３の全発現が全体生存率の減少に有意な効果があったことが明らかになった（データ図示なし）。
【００５６】
細胞内区画間での発現、特に、各マーカーの核／細胞質発現比の定量評価には、ＡＱＵＡ（登録商標）分析を使用した。各マーカーの比はそれぞれ生存率と相関しなかった。エフェクター分子Ａｋｔｌ、Ｅｒｋｌ／２、およびＳｔａｔ３の核／細胞質発現比は、特定の経路が活性化されていることを示すことが予測された。
【００５７】
階層的クラスター分析
上流受容体ＥＧＦＲ機能として個々の下流エフェクターの予側力を評価するため、ＥＧＦＲ発現により検体をグループ化し、主要な下流エフェクター（Ａｋｔｌ、Ｅｒｋ１／２、およびＳｔａｔ３）の核／細胞質比における傾向を調査することにより、監視下による階層的クラスター分析を行った。図２Ａから明らかなように、４つの主要な腫瘍群が認められた（図２Ａ）。第１群の腫瘍は、下流エフェクターの高核／細胞質比を伴う低ＥＧＦＲ発現を有した。第２群は、高核／細胞質比を伴う高ＥＧＦＲ発現を有した。第３群の腫瘍は、低核／細胞質比を伴う低ＥＧＦＲ発現を有し、第４群は、低核／細胞質比を伴う高ＥＧＦＲ発現を有した。Ｋａｐｌａｎ‐Ｍｅｉｅｒ生存率解析では、これらの群間で生存率に有意差が見られなかったことが実証された（図２Ｂ）。
【００５８】
シグナル伝達指数
階層的クラスター分析で認められた４群は、１）最適な切点（図３Ａ）、ならびに２）ＥＧＦＲ発現の平均（Ｚ‐スコア＝０；図４Ａ）切点、および下流エフェクター分子の平均核／細胞質比（「シグナル伝達指数」と呼ぶ）に基づくより厳密なグループ化に基づいて、分析を促進した。図３Ｂおよび図４Ｂは、シグナル伝達指数だけでは、全体生存率との間に有意な相関関係が見られないことを示している。しかし、ＥＧＦＲ発現をシグナル伝達指数と組み合わせることにより、最適な切点分析に基づいた全４群間での疾患特異的３年生存率に有意差が認められ（図３Ｃ；ｐ＝０．００８）、「シグナル伝達指数」が低く、高いＥＧＦＲを表す群（Ｃ群）が全体生存率が最も低かった。中間値が切点として使用された別の分析（図４Ｃ）では、群間で全体生存率に有意差が見られ（ｐ＝０．０２８）、Ｃ群（高ＥＧＦＲ、低シグナル伝達指数）が他の群に比べて、全体生存率の減少とより有意な相関関係があることが示された（ｐ＝０．００４）。
【００５９】
参考文献
国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の公開データベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から得た、本明細書で言及するいずれかのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対応する受託番号は、全体が参考として援用される。本出願全体を通じて引用される全引用文献の内容は、参考として本明細書で明示的に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】生存期間（数ヶ月単位）に対する累積生存率を描画するグラフである。
【図２】（図２Ａ）ＥＧＦＲの平均ＡＱＵＡ（登録商標）技術スコア、ならびにＡｋｔｌ、Ｅｒｋｌ／２およびＳｔａｔ３の平均シグナル伝達指数（ＳＱ）によってグループ化した検体によって行われた、監視下での階層的クラスター分析結果を描画する図である。４つの主要な腫瘍群が認められた。（図２Ｂ）Ｋａｐｌａｎ‐Ｍｅｉｅｒ生存プロットが、これらの４群間での生存率に有意差が見られなかったことを実証する図である。
【図３】（図３Ａ）ＥＧＦＲ発現、および平均核／細胞質比のＸ‐ｔｉｌｅによって最適な切点で分割された生存率解析（上記の図２で表されるよりも厳密なグループ化）を示す図である。（図３Ｂ）ＳＱ単独では全体生存率とそれほど有意な相関関係がないことを示す図である。（図３Ｃ）ＥＧＦＲ発現をＳＱと組み合わせることにより、全４群の疾患特異的３年生存率に有意差（ｐ＝０．００８）が認められたことを実証する図である。
【図４】（図４Ａ）ＥＧＦＲ発現の平均スコア（Ｚ‐スコア＝０）、および平均核／細胞質比によって分割された生存率解析を示す図である。高ＥＧＦＲおよび低シグナル伝達指数を有する患者は、最悪の予後を有する。（図４Ｂ）ＳＱ単独では、全体生存率と有意な相関関係がないことを示す図である。（図４Ｃ）ＥＧＦＲ発現をＳＱと組み合わせることによって、全４群の疾患特異的３年生存率に有意差（ｐ＝０．０２８）が認められたことを実証する図である。Ａ〜Ｄ群は図３に示す群とは異なる。
【図５】細胞の細胞膜上のＥＧＦＲ、ならびに細胞質および核中の下流エフェクターＡｋｔ、Ｅｒｋ、およびＳｔａｔ３を図示する図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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