(57)【要約】  ヌクレオチド誘導体を合成する方法であって、目的の分子上のアジド官能基と、オリゴヌクレオチド上のアルキン官能基との間、又は目的の分子上のアルキン官能基と、オリゴヌクレオチド上のアジド官能基との間で、「クリックケミストリー」反応の助けを借りて、目的の分子が、オリゴヌクレオチド上にグラフトされる、ヌクレオチド誘導体を合成する方法。中間体分子、特に、アルキン官能基を有するオリゴヌクレオチド、グラフトされたオリゴヌクレオチド、アジド官能基を有するオリゴヌクレオチド、それらを含有するオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、並びに生物学的調査及び細胞標的化目的での、それらのグラフトされたオリゴヌクレオチドの使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＸＩＩＩ）：
【化１】
2009535323.tif 000053
（式中、
Ｘは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、炭素数１〜１２のアルカンジイルから選択され；主にＸは、Ｎ、Ｏから選択され；
ｍは整数、ｍ≧１であり；
Ｌは、以下のリスト：場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、直鎖、分枝又は環状の、炭素数１〜１２のアルカンポリイル官能基から選択され得るリンカーであり；
ｘは整数、３０≧ｘ≧１であり；
ｘ’は整数、３０≧ｘ’≧１であり；
Ｄは、Ｘと、トリアゾール環の４位炭素との間のリンカーであり；
Ｄ’は、Ｌと、トリアゾール環の４位炭素との間のリンカーであり；
ｙは、０、１又は２であり；
ｚ及びｚ’は整数、ｚ及びｚ’≧０、ｚ及びｚ’のうち少なくとも１個は≧１であり；
Ｂは、Ｈ、固体支持体又はタグから選択され；
オリゴヌクレオチドは、３’−末端、５’−末端又は配列内部のいずれかで置換され；
Ｒは目的の分子である）
である、分子。
【請求項２】
式（ＩＩＩ）：
【化２】
2009535323.tif 000054
（式中、
Ｘは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、炭素数１〜１２のアルカンジイルから選択され；主にＸは、Ｎ、Ｏから選択され；
ｍは整数、ｍ≧１であり；
Ｌは、以下のリスト：場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、直鎖、分枝又は環状の、炭素数１〜１２のアルカンジイル官能基から選択され得るリンカーであり；
ｘは整数、３０≧ｘ≧１であり；
Ｄは、Ｘと、トリアゾール環の４位炭素との間のリンカーであり；
ｙは、０、１又は２であり；
Ｂは、Ｈ、固体支持体又はタグから選択され；
オリゴヌクレオチドは、３’−末端、５’−末端又は配列内部のいずれかで置換され；
Ｒは目的の分子である）
である、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
Ｒが炭水化物及びその誘導体から成る群より選択される、請求項１又は２に記載の分子。
【請求項４】
Ｒが、−ＣＨ２−（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）ｒ−ＣＨ２−基（ｒは整数、ｒ≧１）が末端の一方にグラフトした単糖及び多糖から成る群より選択される、請求項３に記載の分子。
【請求項５】
Ｒがアミノ酸及びペプチドから成る群より選択される、請求項１又は２に記載の分子。
【請求項６】
Ｒが複数の蛍光タグから成る群より選択される、請求項１又は２に記載の分子。
【請求項７】
Ｄが、場合によって１つ又は数個の酸素架橋が介在する、炭素数１〜３６のアルカンポリイル基から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分子。
【請求項８】
Ｌが、
直鎖、分枝又は環状の、炭素数１〜１２のアルカンポリイル；
基  
【化３】
2009535323.tif 000055
（ｔは１、２、３、４、５、６から選択される整数）；
複素環（リボース環等）を含む、酸素を含む炭素数１〜１２のアルカンポリイルから選択されるリンカーである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分子。
【請求項９】
オリゴヌクレオチド鎖の１つ又は数個のリン酸官能基が、以下の種類の：
【化４】
2009535323.tif 000056
（式中、Ｌ’は炭素数１〜１２のアルカンジイル鎖である）
ホスホロアミデート基で置き換えられている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分子。
【請求項１０】
請求項１〜９に記載の分子を製造する方法であって、
Ｒと結合したアジド官能基を、オリゴヌクレオチドのアルキン置換ホスホジエステル誘導体と反応させる工程：
【化５】
2009535323.tif 000057
【化６】
2009535323.tif 000058
を含む、方法。
【請求項１１】
前記分子（Ｉ）又は前記分子（ＸＩＶ）が溶液で存在する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記分子（Ｉ）又は前記分子（ＸＩＶ）が、固体支持体上へのグラフトを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記反応がマイクロ波を印加して行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記反応が、室温を上回る温度で加熱して行われ、主に前記反応溶媒が、３０℃〜１００℃の温度に加熱される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記反応が、銅（Ｃｕ＋）触媒及びアスコルビン酸ナトリウムの存在下で実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
式（Ｉ）又は式（ＸＩＶ）のオリゴヌクレオチドが、他のヌクレオチド単位が鎖に付加され、且つ請求項１０に記載の別の工程が実施されるように、３’−置換され、前記方法が、オリゴヌクレオチド合成の別の工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
式（ＸＩＶ）：
【化７】
2009535323.tif 000059
（式中、
Ｘは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、炭素数１〜１２のアルカンジイル（−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−．．．等）から選択され；主にＸは、Ｎ、Ｏから選択され；
ｍは整数、ｍ≧１であり；
Ｌは、以下のリスト：場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、直鎖、分枝又は環状の、炭素数１〜１２のアルカンポリイル官能基から選択され得るリンカーであり；
ｘは整数、３０≧ｘ≧１であり；
ｘ’は整数、３０≧ｘ’≧１であり；
Ｄは、Ｘと、トリアゾール環（複数可）の４位炭素との間のリンカーであり；ｘの値に応じて、Ｄの価数は２以上であり；好ましくは、Ｄは、場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、炭素数１〜３６のアルカンポリイル基から選択され；
Ｘ及びＤの選択に応じて、ｙは０、１又は２であり；
Ｄ’は、Ｌと、トリアゾール環（複数可）の４位炭素との間のリンカーであり；
ｚ及びｚ’は整数、ｚ及びｚ’≧０、ｚ及びｚ’のうち少なくとも１個は≧１であり；
Ｂは、Ｈ、固体支持体又はタグから選択される）
である、分子。
【請求項１８】
式（Ｉ）：
【化８】
2009535323.tif 000060
（式中、
Ｘは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、炭素数１〜１２のアルカンジイルから選択され；主にＸは、Ｎ、Ｏから選択され；
ｍは整数、ｍ≧１であり；
Ｌは、以下のリスト：場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、直鎖、分枝又は環状の、炭素数１〜１２のアルカンジイル官能基から選択され得るリンカーであり；
ｘは整数、３０≧ｘ≧１であり；
Ｄは、Ｘとアルキン基（複数可）との間のリンカーであり；
ｙは０、１又は２であり；
Ｂは、Ｈ、固体支持体、又はタグから選択される）
である、請求項１７に記載の分子。
【請求項１９】
Ｄが、場合によって１つ又は数個の酸素架橋が介在する、炭素数１〜３６のアルカンポリイル基から選択され；
ｍが、１、２、３、４、５、６から選択される整数であり；
Ｌが、
直鎖、分枝又は環状の、炭素数１〜１２のアルカンポリイル；
基
【化９】
2009535323.tif 000061
（ｔは１、２、３、４、５、６から選択される整数）；
複素環（リボース環等）を含む、酸素を含む炭素数１〜１２のアルカンポリイルから選択されるリンカーである、請求項１７又は１８に記載の分子。
【請求項２０】
Ｘ＝Ｎであり、且つ式（Ｉ）又は式（ＸＩＶ）の分子が、以下の：ホスホネート（Ｖａ）又はホスホロアミダイト（Ｖｂ）を、オリゴヌクレオチド（ＩＶ）と、その３’末端若しくは５’末端又は配列内で反応させて、水素ホスホン酸ジエステル（ＩＶ）が得られる工程、及びその後の、化合物（ＶＩ）を、アルキンアミンの存在下、四塩化炭素で処理して、ホスホロアミデート（ＸＩＶ）又はホスホロアミデート（Ｉ）が得られる工程（第２の工程）：
【化１０】
2009535323.tif 000062
を含む方法によって製造される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
Ｘ＝Ｏであり、且つ式（ＸＩＶ）又は式（Ｉ）の分子が以下の：式（ＶＩＩ）、式（ＶＩＩａ）、式（ＶＩＩｂ）、式（ＶＩＩＩ）、式（ＩＸ）、又は式（ＩＸａ）のホスホロアミダイトを、前記オリゴヌクレオチド（ＩＶ）と反応させて、前記分子（ＸＩＶ）又は前記分子（Ｉ）が直接得られる工程を含む方法によって製造される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
式（ＸＶ）：
【化１１】
2009535323.tif 000063
（式中、
Ｘは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、炭素数１〜１２のアルカンジイルから選択され；主にＸは、Ｎ、Ｏから選択され；
ｍは整数、ｍ≧１であり；
Ｌは、以下のリスト：場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、直鎖、分枝又は環状の、炭素数１〜１２のアルカンポリイル官能基から選択され得るリンカーであり；
ｘは整数、３０≧ｘ≧１であり；
ｘ’は整数、３０≧ｘ’≧１であり；
Ｄは、Ｘと、トリアゾール環のＮ原子との間のリンカーであり；
Ｄ’は、Ｌと、トリアゾール環のＮ原子との間のリンカーであり；
ｙは、０、１又は２であり；
ｚ及びｚ’は整数、ｚ及びｚ’≧０、ｚ及びｚ’のうち少なくとも１個は≧１であり；
Ｂは、Ｈ、固体支持体又はタグから選択され；
オリゴヌクレオチドは、３’−末端、５’−末端又は配列内部のいずれかで置換され；
Ｒは目的の分子である）
である、分子。
【請求項２３】
式（ＸＩＩ）：
【化１２】
2009535323.tif 000064
（式中、
Ｘは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、炭素数１〜１２のアルカンジイルから選択され；主にＸは、Ｎ、Ｏから選択され；
ｍは整数、ｍ≧１であり；
Ｌは、以下のリスト：場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、直鎖、分枝又は環状の、炭素数１〜１２のアルカンジイル官能基から選択され得るリンカーであり；
ｘは整数、３０≧ｘ≧１であり；
Ｄは、Ｘと、トリアゾール環のＮ原子との間のリンカーであり；
ｙは、０、１又は２であり；
Ｂは、Ｈ、固体支持体又はタグから選択され；
オリゴヌクレオチドは、３’−末端、５’−末端又は配列内部のいずれかで置換され；
Ｒは目的の分子である）
である、請求項２２に記載の分子。
【請求項２４】
請求項２２又は２３に記載の式（ＸＶ）又は式（ＸＩＩ）の分子を製造する方法であって、以下：
【化１３】
2009535323.tif 000065
に示すような、Ｒと結合したアルキン官能基を、オリゴヌクレオチドのアジド置換ホスホジエステル誘導体と反応させる工程を含む、請求項２２又は２３に記載の式（ＸＶ）又は式（ＸＩＩ）の分子を製造する方法。
【請求項２５】
式（ＸＶＩ）：
【化１４】
2009535323.tif 000066
（式中、
Ｘは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、炭素数１〜１２のアルカンジイルから選択され；主にＸは、Ｎ、Ｏから選択され；
ｍは整数、ｍ≧１であり；
Ｌは、以下のリスト：場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、直鎖、分枝又は環状の、炭素数１〜１２のアルカンポリイル官能基から選択され得るリンカーであり；
ｘは整数、３０≧ｘ≧１であり；
ｘ’は整数、３０≧ｘ’≧１であり；
Ｄは、Ｘとアジド官能基との間のリンカーであり；
Ｄ’は、Ｌとアジド官能基との間のリンカーであり；
ｙは、０、１又は２であり；
ｚ及びｚ’は整数、ｚ及びｚ’≧０、ｚ及びｚ’のうち少なくとも１個は≧１であり；
Ｂは、Ｈ、固体支持体又はタグから選択される）
である、分子。
【請求項２６】
式（Ｘ）：
【化１５】
2009535323.tif 000067
（式中、
Ｘは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、炭素数１〜１２のアルカンジイルから選択され；主にＸは、Ｎ、Ｏから選択され；
ｍは整数、ｍ≧１であり；
Ｌは、以下のリスト：場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、直鎖、分枝又は環状の、炭素数１〜１２のアルカンジイル官能基から選択され得るリンカーであり；
ｘは整数、３０≧ｘ≧１であり；
Ｄは、Ｘとアジド官能基との間のリンカーであり；
ｙは、０、１又は２であり；
Ｂは、Ｈ、固体支持体又はタグから選択され；
オリゴヌクレオチドは、３’−末端、５’−末端又は配列内部のいずれかで置換される）
である、請求項２５に記載の分子。
【請求項２７】
治療すべき被験体における生物学的標的へオリゴヌクレオチドを運搬する（vectorisation）方法であって、炭水化物が、該生物学的標的に含まれる或る特定種類の細胞に対する特異性で選択され、且つ該炭水化物が、請求項１０又は２４に記載の方法によって該オリゴヌクレオチドと結合し、且つ得られる分子（ＩＩＩ）、分子（ＸＩＩＩ）、分子（ＸＩＩ）又は分子（ＸＶ）が治療すべき前記被験体に投与される、方法。
【請求項２８】
共有結合又は非共有結合で、請求項１に記載の式（ＸＩＩＩ）若しくは請求項２に記載の式（ＩＩＩ）で表される分子、又は請求項２３に記載の式（ＸＩＩ）若しくは請求項２２に記載の式（ＸＶ）で表される分子がグラフトした、固体支持体。
【請求項２９】
式（ＸＩＩＩ）若しくは式（ＩＩＩ）又は式（ＸＶ）若しくは式（ＸＩＩ）の分子のＲ基と、標的、とりわけ生物学的標的との間の相互作用を調査する方法であって、該方法が、請求項１に記載の式（ＸＩＩＩ）若しくは請求項２に記載の式（ＩＩＩ）に応答する分子、又は請求項２３に記載の式（ＸＩＩ）若しくは請求項２２に記載の式（ＸＶ）で表される分子がグラフトした固体支持体と、前記生物学的標的とを接触させる工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、であって、目的の分子上のアジド官能基と、オリゴヌクレオチド上のアルキン官能基との間、又は目的の分子のアルキン官能基と、オリゴヌクレオチド上のアジド官能基との間で、「クリックケミストリー」反応の助けを借りて、目的の分子をオリゴヌクレオチド上にグラフトする、ヌクレオチド誘導体を合成する方法に関する。
【０００２】
本発明の他の目的は、中間体分子、特に、アルキン官能基化オリゴヌクレオチド、アジド官能基化オリゴヌクレオチド、グラフトされたオリゴヌクレオチド、それらを含有するオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、並びに生物学的調査及びとりわけ細胞標的化目的でのそれらのグラフトされたオリゴヌクレオチドの使用である。
【背景技術】
【０００３】
オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの短鎖から成る分子であり、その数は１個〜約１００個の間で変化し得る。それらは、ゲノム研究及びバイオテクノロジーにとって重要な分子ツールである（Caruthers, M. H. Science 1985, 230, 281-285）。殆どの用途において、染料、又は他の生体分子（ペプチド（Zatsepin, T. S.; Turner, J. J.; Oretskaya, T. S.; Gait, M. J. Curr. Pharm. Des. 2005, 11, 3639-3654）若しくは炭水化物（Zatsepin, T. S.; Oretskaya, T. S. Chem. Biodiversity 2004, 1, 1401-1417）等）による標識が必要である。
【０００４】
オリゴヌクレオチドは、典型的には、ホスホロアミダイトケミストリーを使用して固体支持体上で合成される（Beaucage, S. L.; Caruthers, M. H. Tetrahedron Lett. 1981, 22, 1859-1862）。それらの炭水化物との複合化は、一方では、固相担持型炭水化物（Adinolfi, M.; De Napoli, L.; Di Fabio, G.; Iadonisi, A.; Montesarchio, D.; Piccialli, G. Tetrahedron 2002, 58, 6697-6704; D'Onofrio, J.; de Champdore, M.; De Napoli, L.; Montesarchio, D.; Di Fabio, G. Bioconjugate Chem. 2005, 16, 1299-1309）又は炭水化物ホスホロアミダイト（Adinolfi, M.; De Napoli, L.; Di Fabio, G.; Iadonisi, A.; Montesarchio, D.; Piccialli, G. Tetrahedron 2002, 58, 6697-6704; D'Onofrio, J.; de Champdore, M.; De Napoli, L.; Montesarchio, D.; Di Fabio, G. Bioconjugate Chem. 2005, 16, 1299-1309; Sheppard, T. L.; Wong, C. H.; Joyce, G. F. Angew. Chem., Int. Ed. 2000, 39, 3660-3663; Tona, R.; Bertolini, R.; Hunziker, J. Org. Lett. 2000, 2, 1693-1696; de Kort, M.; de Visser, P. C.; Kurzeck, J.; Meeuwenoord, N. J.; van der Marel, G. A.; Rueger, W.; van Boom, J. H. Eur. J. Org. Chem. 2001, 2075-2082; Dubber, M.; Frechet, J. M. J. Bioconjugate Chem. 2003, 14, 239-246)のいずれかを使用して固体支持体上で、また他方では、反応性炭水化物誘導体（Akasaka, T.; Matsuura, K.; Emi, N.; Kobayashi, K. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 260, 323- 328; Forget, D.; Renaudet, O.; Defrancq, E.; Dumy, P. Tetrahedron Lett. 2001, 42, 7829- 7832; Dey, S.; Sheppard, T. L. Org. Lett. 2001, 3, 3983-3986)を使用して溶液中で実施されている。それにもかかわらず、これらの戦略は、多段階の合成が必要であると共に、時間がかかる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
オリゴヌクレオチド骨格上に、種々の目的の分子をグラフトすることを可能にする方法（オリゴヌクレオチド骨格上に、複数の異なる目的の分子をグラフトすることが可能である）であって、当該方法により、目的の分子を、オリゴヌクレオチドの３’−末端若しくは５’−末端、又は配列内部のいずれかにグラフトすることが可能になる、方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、目的の分子上のアジド官能基と、オリゴヌクレオチドのホスホン酸ジエステル官能基（functionalization）上にグラフトされたアルキン官能基との間で「クリックケミストリー」反応を使用することにより、この目標の達成が可能になることを見出した。
【０００７】
本発明の第１の目的は、目的の分子Ｒがグラフトされたオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、当該方法は、図１Ａ及び図１Ｂに示すように、Ｒと結合したアジド官能基を、オリゴヌクレオチドのアルキン置換ホスホジエステル誘導体と反応させる工程を含む。
【０００８】
図１Ａにおいて、オリゴヌクレオチドは、式（Ｉａ）：
【０００９】
【化１】
2009535323.tif 000002
【００１０】
（式中、
Ｘは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、炭素数１〜１２のアルカンジイル（−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−．．．等）から選択され；主にＸは、Ｎ、Ｏから選択され；
ｍは整数、ｍ≧１であり；
Ｌは、以下のリスト：場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、直鎖、分枝又は環状の、炭素数１〜１２のアルカンジイル官能基から選択され得るリンカーであり；
ｘは整数、３０≧ｘ≧１であり；
Ｄは、Ｘとアルキン基（複数可）との間のリンカーであり；ｘの値に応じて、Ｄの価数は２以上であり；好ましくは、Ｄは、場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、炭素数１〜３６のアルカンポリイル基から選択され（図１２）；
Ｘ及びＤの選択に応じて、ｙは０、１又は２であり；
式（Ｉ）及び式（ＩＩＩ）において、Ｂは、Ｈ、固体支持体（アレイ、ポリマー、ビーズ）又はタグから選択される）
に応答する官能基でグラフトされる。
【００１１】
図１Ｂにおいて、オリゴヌクレオチドは、式（Ｉｂ）：
【００１２】
【化２】
2009535323.tif 000003
【００１３】
（式中、
Ｘは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、炭素数１〜１２のアルカンジイル（−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−．．．等）から選択され；主にＸは、Ｎ、Ｏから選択され；
ｍは整数、ｍ≧１であり；
Ｌは、以下のリスト：場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、直鎖、分枝又は環状の、炭素数１〜１２のアルカンポリイル官能基から選択され得るリンカーであり；
ｘは整数、３０≧ｘ≧１であり；
ｘ’は整数、３０≧ｘ’≧１であり；
Ｄは、Ｘとアルキン基（複数可）との間のリンカーであり；ｘの値に応じて、Ｄの価数は２以上であり；好ましくは、Ｄ’は、場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、炭素数１〜３６のアルカンポリイル基から選択され；
Ｄ’は、Ｌとアルキン基（複数可）との間のリンカーであり；ｘ’の値に応じて、Ｄ’の価数は２以上であり；好ましくは、Ｄ’は、場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、炭素数１〜３６のアルカンポリイル基から選択され；
ｚ及びｚ’は整数、ｚ及びｚ’≧０、ｚ及びｚ’のうち少なくとも１個は≧１であり；
Ｘ及びＤの選択に応じて、ｙは０、１又は２である
式（Ｉ）、式（ＩＩＩ）、式（ＸＩＩＩ）及び式（ＸＩＶ）において、Ｂは、Ｈ、固体支持体（アレイ、ポリマー、ビーズ）又はタグから選択される）
に応答する官能基でグラフトされる。
【００１４】
図１Ａの式（Ｉ）及び図１Ｂの式（ＸＩＶ）において、オリゴヌクレオチドはそれぞれ、官能基（Ｉａ）、官能基（Ｉｂ）によって、その３’−末端、その５’−末端又は配列内部のいずれかが置換される（官能基（Ｉａ）又は官能基（Ｉｂ）１個のＰ原子は、オリゴヌクレオチド鎖の一部である）。図１２に示す変形によれば、式（Ｉ）又は式（ＸＩＶ）のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド鎖の１つ又は数個のリン酸官能基が、以下の種類の：
【００１５】
【化３】
2009535323.tif 000004
【００１６】
（式中、Ｌ’は、炭素数１〜１２のアルカンジイル鎖である。）
ホスホロアミデート基で置き換えられているオリゴヌクレオチド誘導体であり得る。
【００１７】
この場合、式（Ｉａ）又は式（Ｉｂ）中のホスホジエステル基のＰ原子は、オリゴヌクレオチド鎖の一部ではないが、Ｐ−ＮＨ−Ｌ’−Ｏ−Ｐ結合を介してオリゴヌクレオチド 鎖と結合する。式（Ｉ）又は式（ＸＩＶ）のグラフトされたヌクレオチドは、溶液で存在するか（Ｂ＝Ｈ又はタグの場合）、又は末端の一方での固体支持体とのグラフトを含み得る（Ｂ＝固体支持体の場合）。
【００１８】
目的の分子Ｒは、アジド官能基でグラフトされる。
【００１９】
アジド官能基を有する目的の分子（ＩＩ）を、オリゴヌクレオチド誘導体（Ｉ）又はオリゴヌクレオチド誘導体（ＸＩＶ）と適切な量で接触させると、１，３−双極子環化付加が起こり、それぞれトリアゾール（ＩＩＩ）、トリアゾール（ＸＩＩＩ）が得られる。
【００２０】
この１，３−双極子環化付加は非常に化学選択的であり、アルキニル官能基とアジド官能基との間でしか起こらず、高収率である。得られる１，２，３−トリアゾールは高温及び水性条件で安定である。
【００２１】
目的の分子は、オリゴヌクレオチドとの縮合生成物を得ることを目的とする任意の分子 であり得る。例示目的で、炭水化物、ペプチド、脂質、オリゴヌクレオチド、ビオチン、フェロセニル化合物、蛍光タグ．．．が挙げられ得る。
【００２２】
好都合な目的の分子は、炭水化物であり、その各種誘導体が含まれる。オリゴヌクレオチド炭水化物複合体の重要性は、「化学と生物多様性（Chemistry and Biodiversity）」第１巻（2004）、1401-1417の中でT.S. Zatsepin及びT.S. Oretskayaによって強調されている。この総説も、それらの調製に関連した難点を強調し、この目的で既知の幾つかの方法を列記している。
【００２３】
炭水化物としては、単糖及び多糖並びにそれらの誘導体が挙げられる。単糖及びその誘導体としては、グルコース、フルクトース、マンノース、リボース、グリセルアルデヒド、リボース、エリトロース、トレオース、キシロース、アラビノース、リキソース、リブロース、キシルロース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、ラクトース、ガラクトース、タロース、ソルボース、タガトース、プシコース、ジヒドロキシアセトン、グルコサミン、Ｎ’−アセチルグルコサミン、グルクロン酸、シアル酸．．．が挙げられ得る。
【００２４】
多糖は、直鎖体又は分枝体の、同一又は異なる、単糖及び単糖誘導体の任意の組合せによって構築することができる。
【００２５】
末端の一方が、−ＣＨ２−（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）ｒ−ＣＨ２−Ｎ３基（ｒは整数、ｒ≧１、ｒ＝１、２、３、４、５、６．．．）でグラフトされた単糖又は多糖から成る分子（ＩＩ）が特に好ましい。
【００２６】
別種類の好都合な目的の分子Ｒは、アミノ酸及びペプチドから成る。特に、タグ（蛍光タグ等）も、本発明の方法を使用してオリゴヌクレオチド鎖上にグラフトすることができる、好都合な目的の分子である。図１８に、かかる変形を示す。この図では、ｍ＋２ヌクレオチド単位、フルオレセインがグラフトした５’−末端、及び４単位のホスホジエステル鎖を含む３’−末端（各単位は、２個のグアニジン残基を有するリンカーアームで置換される）を含むオリゴヌクレオチドの調製について説明している。
【００２７】
分子（ＩＩ）の調製は、ガラクトースの場合の図２に示すスキームに従って、実施することができる。
【００２８】
ペンタ−Ｏ−アセチルガラクトピラノシルを、ジエチルエーテル中ＢＦ３の存在下、ＨＯＣＨ２（ＣＨ２ＯＣＨ２）ｒＣＨ２Ｃｌ（式中、ｒは整数、ｒ≧１（ここではｒ＝２））と反応させる。次に、得られた塩化物をＮａＮ３及びｎＢｕ４ＮＩで処理することにより、所期のアジド誘導体を得る。図２に示す反応剤（reactive）の選択は限定するものではなく、ＨＯＣＨ２（ＣＨ２ＯＣＨ２）ｒＣＨ２Ｃｌの代わりに、ＨＯＣＨ２（ＣＨ２ＯＣＨ２）ｒＣＨ２ＯＴＳ又はＨＯＣＨ２（ＣＨ２ＯＣＨ２）ｒＣＨ２Ｉを、使用することができる。
【００２９】
この方法は、例示目的で示されている。アジド誘導体の任意の他の既知の製造方法が許容可能である。かかる反応の一覧は、Advanced Organic Chemistry, J. March, Wiley, 1985, p.l155に示されている。
【００３０】
図１Ａ及び図１Ｂに例示されているような、アジド誘導体（ＩＩ）をオリゴヌクレオチド（Ｉ）又はオリゴヌクレオチド（ＸＩＶ）と反応させる条件に関して、好都合な条件は以下の通りである。
【００３１】
分子（ＩＩ）は、適切な溶媒（水及び／又は有機）中に溶液で存在し、分子（Ｉ）又は分子（ＸＩＶ）は、溶液で存在するか、又は固体支持体（例えば、レジン又はガラス又はシリコン）にグラフトされる。主に反応は、マイクロ波を印加して行われる。
【００３２】
マイクロ波による活性化は、反応速度を著しく向上させる。室温を上回る温度での加熱も、反応速度にプラスの効果がある。主には、反応溶媒を３０℃〜１００℃の温度まで加熱する。しかしながら、室温でも反応は起こる。
【００３３】
反応は、例えば、ＣｕＳＯ４及びアスコルビン酸ナトリウムから生成することができる銅（Ｃｕ＋）触媒の存在下で実施される。
【００３４】
分子（ＸＩＶ）の特定の変形である、式（ＸＩＶ）及び式（Ｉ）の分子は、上記した方法における鍵中間体である。したがって、それらは、本発明の別の目的である。
【００３５】
【化４】
2009535323.tif 000005
【００３６】
式（Ｉ）及び式（ＸＩＶ）の変数は上記と同一である：
Ｘは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、炭素数１〜１２のアルカンジイル（−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−．．．等）から選択され；主にＸは、Ｎ、Ｏから選択され；
ｍは整数、ｍ≧１であり；
Ｌは、以下のリスト：場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、直鎖、分枝又は環状の、炭素数１〜１２のアルカンポリイル官能基から選択され得るリンカーであり；
ｘは整数、３０≧ｘ≧１であり；式（Ｉ）において、Ｌは、場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、直鎖、分枝又は環状の、炭素数１〜１２のアルカンジイル基から選択され；
ｘ’は整数、３０≧ｘ’≧１であり；
Ｄは、Ｘとアルキン基（複数可）との間のリンカーであり；ｘの値に応じて、Ｄの価数は２以上であり；好ましくは、Ｄは、場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、炭素数１〜３６のアルカンポリイル基から選択され；
Ｄ’は、Ｌとアルキン基（複数可）との間のリンカーであり；ｘ’の値に応じて、Ｄ’の価数は２以上であり；好ましくは、Ｄ’は、場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、炭素数１〜３６のアルカンポリイル基から選択され；
ｚ及びｚ’は整数、ｚ及びｚ’≧０、ｚ及びｚ’のうち少なくとも１個は≧１であり；
オリゴヌクレオチドは、１個〜１００個のヌクレオチド単位を含むヌクレオチド鎖である可能性があり（式（Ｉａ）又は式（Ｉｂ）の鎖は、３’−末端、５’−末端又は配列内部でグラフトされ、官能基（Ｉａ）又は官能基（Ｉｂ）の１個のＰ原子は、オリゴヌクレオチド鎖の一部である）；図１２に示す変形によれば、式（Ｉ）又は式（ＸＩＶ）のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド鎖の１つ又は数個のリン酸官能基が、以下の種類の：
【００３７】
【化５】
2009535323.tif 000006
【００３８】
（式中、Ｌ’は、炭素数１〜１２のアルカンジイル鎖である）
ホスホロアミデート基で置き換えられている、オリゴヌクレオチド誘導体である可能性があり；この場合、官能基（Ｉａ）又は官能基（Ｉｂ）中のホスホジエステル基のＰ原子は、オリゴヌクレオチド鎖の一部ではないが、Ｐ−ＮＨ−Ｌ’−Ｏ−Ｐ結合を介してオリゴヌクレオチド鎖と結合し；
Ｘ及びＤの選択に応じて、ｙは０、１又は２であり；
式（Ｉ）、式（ＩＩＩ）、式（ＸＩＶ）及び式（ＸＩＩＩ）において、Ｂは、Ｈ、固体支持体（アレイ、ポリマー、ビーズ）又はタグから選択される。
【００３９】
特に、式（Ｉ）及び式（ＸＩＶ）の分子において、好都合な変形は以下の通りである：
ｍは、１、２、３、４、５、６から選択される整数であり；
Ｌは、以下から選択されるリンカーである：
直鎖、分枝又は環状の、炭素数１〜１２のアルカンポリイル（式（Ｉ）の場合はジイル）；
基
【００４０】
【化６】
2009535323.tif 000007
【００４１】
（ｔは１、２、３、４、５、６から選択される整数）；
複素環（リボース環等）を含む、酸素を含む炭素数１〜１２のアルカンポリイル（式（Ｉ）の場合はジイル）から選択されるリンカーであり；
Ｄは、場合によって１つ又は数個の酸素架橋が介在する、炭素数１〜１２のアルカンポリイル基である。
【００４２】
以下に、例示目的でリンカーの例を示す。
【００４３】
【化７】
2009535323.tif 000008
【００４４】
リンカーの長さにより、目的の分子間の距離を調節する。
【００４５】
Ｄは、炭素数１〜１２のアルカンジイルのように２価であり得る。例えば、Ｄは、−ＣＨ２−であり得る。
【００４６】
Ｄは、デンドリマーが構築できるように、高価数であると共に、窒素と、数個のアルキン官能基との間で結合を作ることができる。
【００４７】
この場合の説明例として、
【００４８】
【化８】
2009535323.tif 000009
【００４９】
は、
【００５０】
【化９】
2009535323.tif 000010
【００５１】
（ｎは整数、ｎ≧１）、例えば、
【００５２】
【化１０】
2009535323.tif 000011
【００５３】
等であり得る。
【００５４】
多官能基化合物を得る別の可能性は、アミンを、リンカーを有するアルキンで２回置換することである。
【００５５】
例えば、
【００５６】
【化１１】
2009535323.tif 000012
【００５７】
は、
【００５８】
【化１２】
2009535323.tif 000013
【００５９】
（ｎは整数、ｎ≧１）、例えば、
【００６０】
【化１３】
2009535323.tif 000014
【００６１】
等であり得る。
【００６２】
【化１４】
2009535323.tif 000015
【００６３】
は、
【００６４】
【化１５】
2009535323.tif 000016
【００６５】
（ｕは整数）であり得る。
【００６６】
例示した変形の全ての組合せが可能である。
【００６７】
図１３、図１４、図１５及び図１６に、１個、２個又は３個のアルキン官能基を、ホスホエステル官能基又はホスホロアミデート官能基上に導入する方法を示す。図１７に、３個のアルキン官能基を含むホスホジエステル、又は４個のアルキン官能基を含むホスホロアミデートから得られる式（ＩＩＩ）及び式（ＸＩＩＩ）の分子の例を示す。
【００６８】
Ｂは、Ｈ又はタグ又はレジン又はガラス又はシリコンプラーク（plaque）、ビーズ、ポリマーであり得る。
【００６９】
図１Ａ及び図１Ｂに示した反応は、Ｂ＝Ｈ、又はＢ＝タグ、又はＢ＝固体支持体を用いて実施することができる。
【００７０】
Ｂ＝固体支持体を用いて実施する場合、必要に応じて、得られる生成物（ＩＩＩ）又は生成物（ＸＩＩＩ）を、適切な処理で固体支持体から切り離すことができる。
【００７１】
Ｒが炭水化物又は炭水化物誘導体の場合、図１Ａ又は図１Ｂに示した反応は、Ｒのヒドロキシル官能基を適切に保護して行われる。この保護は、１，３−環化付加の実施後に除去することができる。
【００７２】
図３に、この種類の変形を示す。この場合、目的の分子は、テトラアセチルガラクトシルである。
【００７３】
分子（Ｉａ）又は分子（Ｉｂ）がオリゴヌクレオチドと直接、又はリンカーアームを介してハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドをグラフトした固体支持体（ガラス、シリコン、ポリマー又はレジン）を含む分子アレイが、本発明の別の目的である。Ｂが固体支持体の場合、分子（Ｉ）及び分子（ＸＩＶ）に相当する。
【００７４】
Huisgenのアルキンとアジドとの間の１，３−双極子環化付加が非常に魅力的なのは、ほぼ定量的で、有機共溶媒を含む水中で実施することができ、多価の足場上で多重の環化付加を実施することができるからである（Wang, Q.; Chan, T. R.; Hilgraf, R.; Fokin, V. V.; Sharpless, K. B.; Finn, M. G. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 3192-3193）。さらに、この反応は、殆どの典型的な有機変換と直交している（orthogonal）ため、非常に化学選択的である。
【００７５】
「クリックケミストリー」は、溶液中でのオリゴヌクレオチドの蛍光標識（Seo, T. S.; Li, Z.; Ruparel, H.; Ju, J. J. Org. Chem. 2003, 68, 609-612）並びに最近では単層上のオリゴヌクレオチドの結合（Devaraj, N. K.; Miller, G. P.; Ebina, W.; Kakaradov, B.; Collman, J. P.; Kool, E. T.; Chidsey, C. E. D. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 8600-8601）及びＤＮＡ金属化（Burley, G. A.; Gierlich, J.; Mofid, M. R.; Nir, H.; Tal, S.; Eichen, Y.; Carell, T. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 1398-1399）に首尾良く応用されている。
【００７６】
しかしながら、オリゴヌクレオチドに応用された、先行技術である「クリックケミストリー」では、アジド官能基を有するオリゴヌクレオチドが使用されるが、１個のアジド官能基しか、オリゴヌクレオチド、即ち、アルキンホスホロアミダイトオリゴヌクレオチド、又はアルキン基が基本環上に置換したヌクレオチドの５’末端に導入することができなかった。
【００７７】
先行技術にはどこにも、オリゴヌクレオチドのアルキンホスホエステル誘導体を使用して、アジドで置換された目的の分子との１，３−環化付加を行うことについて、記述も示唆もされていない。オリゴヌクレオチドのアジドホスホエステル誘導体を使用して、アルキンで置換された目的の分子との１，３−環化付加を行うことについて、教示も示唆もされていない。
【００７８】
この方法は、３’−末端、５’−末端又は配列自体内部での置換を含む、置換オリゴヌクレオチドの合成には極めて効率的である。
【００７９】
式（ＸＩＶ）又は式（Ｉ）の３’−置換オリゴヌクレオチドの場合、目的のアジド置換分子（ＩＩ）との反応の後に、オリゴヌクレオチド合成の別の工程が続き得る。別の、場合によっては異なる、目的のアジド置換分子をオリゴヌクレオチド鎖にグラフトすることができるように、他のヌクレオチド単位が鎖に付加され、その単位上でアルキン官能基化を実施することができる。
【００８０】
本発明によれば、Ｘ＝Ｎの場合、式（ＸＩＶ）、とりわけ式（Ｉ）の分子は、以下の工程を含む方法で調製され、図４に示すことができる。
【００８１】
ホスホネート（Ｖａ）又はホスホロアミダイト（Ｖｂ）は、オリゴヌクレオチド（ＩＶ）と、３’末端若しくは５’末端又は配列内部で反応し、水素ホスホン酸ジエステル（ＩＶ）を与える（式中、Ｌ、ｍ、Ｂは、上記と同一の意味である）。
【００８２】
かかるArbuzov反応又はArbuzov様反応は、Meyer A. et al., Tetrahedron Letters, 2004, 45(19), 3745-3748及びFerreira F. et al., Journal of Organic Chemistry, 2005, 70(23), 9198-9206に開示されている。
【００８３】
次に、第２の工程において、化合物（ＶＩ）を、アルキルアミンの存在下、四塩化炭素で処理することにより、ホスホロアミデート（Ｉ）が得られる。
【００８４】
本発明の変形によれば、Ｘ＝Ｏの場合、式（ＸＩＶ）、とりわけ式（Ｉ）の分子は、以下の工程を含む方法で製造することができる：
式（ＶＩＩ）、とりわけ式（ＶＩＩａ）及び式（ＶＩＩｂ）、又は式（ＶＩＩＩ）、式（ＩＸ）、又は式（ＩＸａ）のホスホロアミダイト（図５）を、オリゴヌクレオチド（ＩＶ）と反応させることにより、分子（Ｉ）が直接得られる。
【００８５】
上記で開示した、式（ＸＩＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の分子は、本発明の別の目的である。
【００８６】
【化１６】
2009535323.tif 000017
【００８７】
【化１７】
2009535323.tif 000018
【００８８】
それらは、末端の一方に、又は鎖配列自体の中に少なくとも１個のホスホジエステル鎖置換を有するオリゴヌクレオチド鎖を含み、１つ又は数個の目的の分子Ｒがトリアゾール中間基を介してホスホネート基上にグラフトされている。それらは、固体支持体と結合してもよく、又は溶液で存在してもよい。式（ＸＩＩＩ）又は式（ＩＩＩ）の１つの分子において、異なるＲ置換基は、ホスホジエステル鎖全体にわたって同一でもよく、又は異なっていてもよい。主に、Ｒは炭水化物誘導体であり、Ｒが、−ＣＨ２−（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）ｒ−ＣＨ２−基（ｒは整数、ｒ＝１、２、３、４、５、６、．．．）が末端の一方にグラフトした単糖又は多糖から成る、分子が特に好ましい。
【００８９】
式（ＸＩＩＩ）及び式（ＩＩＩ）において、Ｘは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、炭素数１〜１２のアルカンジイル（−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−．．．等）から選択され；主にＸは、Ｎ、Ｏから選択され；
ｍは整数、ｍ≧１であり；
Ｌは、以下のリスト：場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、直鎖、分枝又は環状の、炭素数１〜１２のアルカンポリイル官能基から選択され得るリンカーであり；式（ＩＩＩ）において、Ｌは、場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、直鎖、分枝又は環状の、炭素数１〜１２のアルカンジイル基であり；
ｘは整数、３０≧ｘ≧１であり；
ｘ’は整数、３０≧ｘ’≧１であり；
Ｄは、Ｘと、トリアゾール環（複数可）の４位炭素との間のリンカーであり；ｘの値に応じて、Ｄの価数は２以上であり；好ましくは、Ｄは、場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、炭素数１〜３６のアルカンポリイル基から選択され；
Ｘ及びＤの選択に応じて、ｙは０、１又は２であり；
Ｄ’は、Ｌと、トリアゾール環（複数可）の４位炭素との間のリンカーであり；ｘ’の値に応じて、Ｄ’の価数は２以上であり；好ましくは、Ｄ’は、場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、炭素数１〜３６のアルカンポリイル基から選択され；
ｚ及びｚ’は整数、ｚ及びｚ’≧０、ｚ及びｚ’のうち少なくとも１個は≧１であり；
式（ＸＩＩＩ）及び式（ＩＩＩ）において、Ｂは、Ｈ、固体支持体（アレイ、ポリマー、ビーズ）又はタグから選択される。
【００９０】
オリゴヌクレオチドは、１個〜１００個のヌクレオチド単位を含むヌクレオチド鎖である可能性がある（式（Ｉａ）又は式（Ｉｂ）の鎖は、３’−末端、５’−末端又は配列内部でグラフトされ、官能基（Ｉａ）又は官能基（Ｉｂ）の１個のＰ原子は、オリゴヌクレオチド鎖の一部である）。図１２に示す変形によれば、式（ＩＩＩ）又は式（ＸＩＩＩ）のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド鎖の１つ又は数個のリン酸官能基が、以下の種類の：
【００９１】
【化１８】
2009535323.tif 000019
【００９２】
（式中、Ｌ’は、炭素数１〜１２のアルカンジイル鎖である）
ホスホロアミデート基で置き換えられているオリゴヌクレオチド誘導体であり得る。この場合、ホスホジエステル基のＰ原子はオリゴヌクレオチド鎖の一部ではないが、Ｐ−ＮＨ−Ｌ’−Ｏ−Ｐ結合を介してオリゴヌクレオチド鎖と結合する。
【００９３】
グラフトされた式（ＸＩＩＩ）及び式（ＩＩＩ）のヌクレオチドは、溶液で存在するか（Ｂ＝Ｈ又はタグの場合）、又は末端の一方で固体支持体にグラフトされ得る（Ｂ＝固体支持体の場合）。
【００９４】
特に、式（ＸＩＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の分子において、好都合な変形は以下の通りである：
ｍは、１、２、３、４、５、６から選択される整数であり；
Ｌは、
直鎖、分枝又は環状の、炭素数１〜１２のアルカンポリイル（式（ＩＩＩ）ではジイル）；
基
【００９５】
【化１９】
2009535323.tif 000020
【００９６】
（ｔは１、２、３、４、５、６から選択される整数）；
複素環（リボース環等）を含む、酸素を含む炭素数１〜１２のアルカンポリイル（式（ＩＩＩ）ではジイル）から選択されるリンカーであり；
Ｄは、場合によって１つ又は数個の酸素架橋が介在する、炭素数１〜１２のアルカンポリイル基である。
【００９７】
概して、既知の様式でオリゴヌクレオチド鎖の５’−末端に導入される蛍光基のように、他の既知の置換基をこの構造に付加することができる。
【００９８】
本発明の別の目的は、上記式（ＸＩＩＩ）及び式（ＩＩＩ）で表されるような分子が、共有結合又は非共有結合でグラフトした固体支持体から成る、式（ＸＩＩＩ）、とりわけ式（ＩＩＩ）の分子アレイである。
【００９９】
図６は、本発明による、３’−置換オリゴヌクレオチドを製造する方法を示す。当該方法によれば、ｍ個のリンカーがグラフトされるホスホネートの配列を、レジン又は任意の固体支持体と結合し、続いてｍ個のリンカーホスホネート基を付加する。四塩化炭素とプロパルギルアミンとの反応により、対応するホスホロアミデートが得られ、アルキン官能基と、アジドがグラフトした炭水化物との１，３−環化付加により、対応するトリアゾールが得られる。次にオリゴヌクレオチドの担持型合成、及びホスホロアミダイト法によるカップリングにより、３’−置換オリゴヌクレオチドが得られる。
【０１００】
３個の異なる炭水化物を用いてこの方法を反復することにより、図７に示す分子が得られるようになる。
【０１０１】
図１９の変形は、１個のヌクレオチドがホスホジエステル鎖を有する（ｚ＝０且つｚ’＝１の場合）、式（ＸＩＶ）の分子及び式（ＸＩＩＩ）の分子を示す。
【０１０２】
図１９は、ビス−２，２−サッカリジル−１，３−プロパンジオールホスホジエステル足場に基づき、迅速且つ容易にペンタエリスリチル核酸（ＰｅＮＡ）を得るためのフレキシブルな合成アプローチを提示する。その合成は、固体支持体上でのオリゴヌクレオチドホスホロアミダイトケミストリー及びマイクロ波を利用したクリックケミストリーの組合せに基づいた。ＰｅＮＡは、ＵＶ分析によるグリコシル化ＰｅＮＡの濃度決定用のタグとして、シュード３’−末端（pseudo-3'-end）に、ヌクレオチドを１個だけ包含していた。固体支持体上でＤＮＡ様合成を使用して数回カップリングしたホスホロアミダイトジアルキン構成単位を使用して、プロパルギル化ＰｅＮＡを都合よく調製した。
【０１０３】
本発明の別の目的は、目的の分子Ｒがグラフトしたオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、当該方法は、図２０Ａ及び図２０Ｂに表すように、Ｒと結合したアルキン官能基を、オリゴヌクレオチドのアジド置換ホスホジエステル誘導体と反応させる工程を含む。
【０１０４】
図２０Ａにおいて、式（ＸＶＩ）の分子を、アルキン官能基を有する目的の分子（ＸＩ）と反応させることにより、上記で説明したのと同一条件でのクリックケミストリー反応によって分子（ＸＶ）が得られる。
【０１０５】
図２０Ｂにおいて、式（Ｘ）の分子を、アルキン官能基を有する目的の分子（ＸＩ）と反応させることにより、上記で説明したのと同一条件でのクリックケミストリー反応によって分子（ＸＩＩ）が得られる。
【０１０６】
本発明の別の目的は、式（ＸＶ）又は式（ＸＩＩ）の分子を製造する方法であって、当該方法は、図２０Ａ及び図２０Ｂに示すように、Ｒと結合したアルキン官能基を、オリゴヌクレオチドのアジド置換ホスホジエステル誘導体と反応させる工程を含む。
【０１０７】
以下に示す、式（Ｘ）、式（ＸＩＩ）、式（ＸＶＩ）及び式（ＸＶ）の分子が本発明の別の目的である：
【０１０８】
【化２０】
2009535323.tif 000021
【０１０９】
【化２１】
2009535323.tif 000022
【０１１０】
可変部Ｌ、Ｘ、Ｄ、Ｂ、Ｒ、ｍ、ｘ、ｙは、式（Ｉ）及び式（ＩＩＩ）のものと同一である：
Ｘは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、炭素数１〜１２のアルカンジイル（−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−．．．等）から選択され；主にＸは、Ｎ、Ｏから選択され；
ｍは整数、ｍ≧１であり；
Ｌは、以下のリスト：場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、直鎖、分枝又は環状の、炭素数１〜１２のアルカンポリイル官能基から選択され得るリンカーであり；式（Ｘ）及び式（ＸＩＩ）において、Ｌは、場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、直鎖、分枝又は環状の、炭素数１〜１２のアルカンジイル官能基であり；
ｘは整数、３０≧ｘ≧１であり；
ｘ’は整数、３０≧ｘ’≧１であり；
Ｄは、Ｘと、アジド基（複数可）（式（Ｘ））又はトリアゾール環の１個のＮ原子（式（ＸＩＩ））との間のリンカーであり；ｘの値に応じて、Ｄの価数は２以上であり；好ましくは、Ｄは、場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、炭素数１〜３６のアルカンポリイル基から選択され；
Ｘ及びＤの選択に応じて、ｙは０、１又は２であり；
Ｄ’は、Ｌと、アジド基（複数可）（式（ＸＶＩ））又はトリアゾール環の１個のＮ原子（式（ＸＶ））との間のリンカーであり；ｘ’の値に応じて、Ｄ’の価数は２以上であり；好ましくは、Ｄ’は、場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、炭素数１〜３６のアルカンポリイル基から選択され；
ｚ及びｚ’は整数、ｚ及びｚ’≧０、ｚ及びｚ’のうち少なくとも１個は≧１であり；
式（Ｘ）、式（ＸＩＩ）、式（ＸＶＩ）及び式（ＸＶ）において、Ｂは、Ｈ、固体支持体（アレイ、ポリマー、ビーズ）又はタグから選択される。
【０１１１】
図２０Ａ及び図２０Ｂの式（Ｘ）及び式（ＸＶＩ）において、オリゴヌクレオチドは、３’−末端、５’−末端又は配列内部のいずれかがホスホネート鎖で置換される（１個のＰ原子がオリゴヌクレオチド鎖の一部である）。図１２に示すものと同様の変形によれば、式（Ｘ）又は式（ＸＩＶ）のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド鎖の１つ又は数個のリン酸官能基が、以下の種類の：
【０１１２】
【化２２】
2009535323.tif 000023
【０１１３】
（式中、Ｌ’は、炭素数１〜１２のアルカンジイル鎖である）
ホスホロアミデート基で置き換えられている、オリゴヌクレオチド誘導体であり得る。
【０１１４】
この場合、ホスホジエステル鎖末端のＰ原子は、オリゴヌクレオチド鎖の一部ではないが、Ｐ−ＮＨ−Ｌ’−Ｏ−Ｐ結合を介してオリゴヌクレオチド鎖と結合する。
【０１１５】
式（Ｘ）、式（ＸＩＩ）、式（ＸＩＶ）及び式（ＸＶ）のグラフトされたヌクレオチドは、溶液で存在するか（Ｂ＝Ｈ又はタグの場合）、又は末端の一方での固体支持体とのグラフトを含み得る（Ｂ＝固体支持体の場合）。
【０１１６】
目的の分子Ｒは、アルキン官能基でグラフトされる。
【０１１７】
アルキン官能基を有する目的の分子（ＸＩ）を、オリゴヌクレオチド誘導体（ＸＶＩ）又はオリゴヌクレオチド誘導体（Ｘ）と適切な量で接触させると、１，３−双極子環化付加が起こり、それぞれトリアゾール（ＸＶ）、トリアゾール（ＸＩＩ）が得られる。
【０１１８】
この１，３−双極子環化付加は非常に化学選択的であり、アルキニル官能基とアジド官能基との間でしか起こらず、高収率である。得られる１，２，３−トリアゾールは、高温及び水性条件で安定である。
【０１１９】
目的の分子は、オリゴヌクレオチドとの縮合生成物を得ることを目的とする、任意の分子であり得る。例示目的で、炭水化物、ペプチド、脂質、オリゴヌクレオチド、ビオチン、フェロセニル化合物、蛍光タグ．．．が挙げられ得る。
【０１２０】
ホスホロアミダイト基上にアジド官能基を直接導入することが不可能であるのは、Ｐ原子がStaudinger反応によってアジド官能基と反応するからである。結果的に、図２１に示す別の戦略を設計して、分子（Ｘ）、分子（ＸＩＩ）、分子（ＸＶＩ）及び分子（ＸＶ）が得られたが、これには、ホスホロアミダイト基上にＢｒ原子（又は別の脱離基）を導入すること、ヌクレオチド鎖を伸長すること、及びその後のＢｒ原子をアジド官能基で置換することが含まれる。
【０１２１】
図２２は、いくつかのＢｒ置換ホスホロアミダイト誘導体、及びそれらをヌクレオチドにグラフトする方法を示す。
【０１２２】
本発明の別の目的は、共有結合又は非共有結合で、それぞれ式（Ｘ）、式（ＸＩＩ）、式（ＸＶＩ）又は式（ＸＶ）の、上記で示した分子がグラフトした固体支持体から成る、式（Ｘ）、式（ＸＩＩ）、式（ＸＶＩ）又は式（ＸＶ）の分子アレイである。
【０１２３】
式（ＩＩＩ）、式（ＸＩＩＩ）、式（ＸＩＩ）又は式（ＸＶ）に応答する分子で置換された固体支持体（ガラスプラーク、ガラスビーズ又はシリコーンプラーク、レジン又はポリマー等）は、本発明の別の目的である。とりわけＲが炭水化物又は炭水化物誘導体の場合、かかる分子アレイは、炭水化物と他の分子との相互作用の研究を目的とする。炭水化物は生物学的プロセスにおいて非常に重要であり、他の分子とのその相互作用の研究は、生物学的メカニズムの理解及び新たな潜在的薬物の設計にとって非常に重要である。炭水化物グラフトを含む分子アレイを製造する方法は殆どなく、それら全てが満足なわけではない。Ｂ＝固体支持体である、式（ＩＩＩ）、式（ＸＩＩＩ）、式（ＸＩＩ）又は式（ＸＶ）の分子はそれ自体で、かかる分子アレイを構成する。
【０１２４】
別の変形によれば、本発明の固体支持体はまた、オリゴヌクレオチドが各マイクロリアクタに共有結合で固定されたオリゴヌクレオチドマイクロアレイであり得る。異なるヌクレオチド配列の異なるスポットは、式（ＩＩＩ）、式（ＸＩＩＩ）、式（ＸＩＩ）又は式（ＸＶ）（式中、Ｂは、Ｈ又はタグである）に応答する分子が保有する相補的配列と特異的にハイブリダイズする。Watson-Crick型のＨ結合は、マイクロアレイと結合したヌクレオチドと、式（ＩＩＩ）、式（ＸＩＩＩ）、式（ＸＩＩ）又は式（ＸＶ）の分子との間に構築される。
【０１２５】
本発明のマイクロアレイを使用して、式（ＩＩＩ）、式（ＸＩＩＩ）、式（ＸＩＩ）又は式（ＸＶ）の分子のＲ基と、標的、とりわけ生物学的標的との間の相互作用を調査することができる。本発明は、式（ＩＩＩ）、式（ＸＩＩＩ）、式（ＸＩＩ）又は式（ＸＶ）の分子のＲ基と、標的、とりわけ生物学的標的との間の相互作用を調査する方法にも関し、当該方法は、式（ＩＩＩ）、式（ＸＩＩＩ）、式（ＸＩＩ）又は式（ＸＶ）の分子がグラフトした固体支持体と生物学的標的とを接触させる工程を含む。
【０１２６】
本発明の方法により、簡単で且つ効率的に、炭水化物アレイが得られるようになる。とりわけ、ＤＮＡアレイから出発して、ホスホジエステル合成の反応、その後のリン上でのアルキン官能基の導入及びアジドがグラフトされた炭水化物又は炭水化物誘導体を用いた「クリック反応」は、炭水化物アレイを得るための簡単な一連の操作である。
【０１２７】
式（ＩＩＩ）、式（ＸＩＩＩ）、式（ＸＩＩ）又は式（ＸＶ）の分子は、オリゴヌクレオチドの生物学的標的への運搬にも使用することができる。目的の分子（炭水化物等）は、意図する標的と結合したヌクレオチドの輸送を補助するように、或る特定の種類の細胞に対する特異性で選択することができる。より具体的には、本発明は、治療すべき被験体における生物学的標的へのオリゴヌクレオチドを運搬する方法に関し、炭水化物が、生物学的標的に含まれる或る特定種類の細胞に対する特異性で選択され、且つ当該炭水化物が、本発明の方法によってオリゴヌクレオチドと結合し、且つ得られる分子（ＩＩＩ）、分子（ＸＩＩＩ）、分子（ＸＩＩ）又は分子（ＸＶ）が治療すべき被験体に投与される。
【実施例】
【０１２８】
実験の部
序論
オリゴヌクレオチドの多重標識に関する汎用アプローチを開発した。第１に、Ｈ−ホスホン酸モノエステル誘導体としての３個のリンカーを、固相担持型Ｔ１２上で縮合して、プロパルギルアミン存在下で酸化したＨ−ホスホン酸ジエステル結合を導入した。第２に、図８に示すように、Ｃｕ（Ｉ）の存在下、マイクロ波を利用して、１，３−環化付加、いわゆる「クリックケミストリー」によって、３個のガラクトシルアジド誘導体を、固相担持型の３個のアルキン修飾Ｔ１２と複合化した。
【０１２９】
本発明により、１つ又はいくつかの炭水化物誘導体を固相担持型オリゴヌクレオチドに繋ぐ、包括的で、簡単で、頑強で且つ汎用的な戦略を考案し、実施した（図９）。アルキンとアジドとの間の１，３−双極子環化付加、いわゆる「クリック」ケミストリー（Kolb, H. C.; Finn, M. G.; Sharpless, K. B. Angew. Chem., Int. Ed. 2001, 40, 2004-2021; Bock, V. D.; Hiemstra, H.; van Maarseveen, J. H. Eur. J. Org. Chem. 2006, 51-68）を利用して、炭水化物残基をオリゴヌクレオチド骨格と結合させた。マイクロ波による活性化は、標準的な条件に比べて、反応速度を著しく向上させた。固相担持型反応は、中にはホスホロアミデートの加水分解が観察されたものもあった同様な溶液相条件と比較して、純度に関して良好な結果を与えた。
【０１３０】
Huisgenのアルキンとアジドとの間の１，３−双極子環化付加が非常に魅力的なのは、ほぼ定量的で、有機共溶媒を含む水中で実施することができ、多価の足場上で多重の環化付加を実施することができるからである（Wang, Q.; Chan, T. R.; Hilgraf, R.; Fokin, V. V.; Sharpless, K. B.; Finn, M. G. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 3192-3193）。さらに、この反応は、殆どの典型的な有機変換と直交しているため、非常に化学選択的である。
実験項
１−固相担持型Ｔ１２（２）の合成：固相担持型Ｔ１２を、市販のチミジンスクシニルＣＰＧ固体支持体（５００Ａ）上で、標準的なホスホロアミダイトケミストリーを使用して、ＤＮＡ合成機（ABI、３８１Ａ）を使用して合成した。次に、１（１５モル当量、６０ｍＭ  Ｃ５Ｈ５Ｎ／ＣＨ３ＣＮ、１：１、ｖ／ｖ溶液）を、Ｈ−ホスホネートケミストリーサイクルを使用して、活性剤としての塩化ピバロイル（２００ｍＭ  Ｃ５Ｈ５Ｎ／ＣＨ３ＣＮ、１：１、ｖ／ｖ溶液）及び脱トリチル化工程用の３％ジクロロ酢酸／ＣＨ２Ｃｌ２溶液を用いてカップリングした。
【０１３１】
２−アミド酸化の基本手順：固相担持型オリゴヌクレオチド（１μｍｏｌ）を、２本のシリンジを前後に使用して、１０％のプロパルギルアミン（１００μＬ）のＣＣｌ４／Ｃ５Ｈ５Ｎ（９００μＬ、１：１、ｖ／ｖ）溶液で３０分間処理した。ＣＰＧビーズをＣ５Ｈ５Ｎ（１ｍＬ）及びＭｅＣＮ（３×２ｍＬ）で洗浄した後、窒素をフラッシュして乾燥させた。
【０１３２】
３−Ｃｕ（Ｉ）触媒１，３−双極子環化付加の基本手順：固相担持型オリゴヌクレオチド（０．５μｍｏｌ）に、保護ガラクトシルアジド４（１０当量、５μｍｏｌ、５０ｍＭ  ＭｅＯＨ溶液１００μＬ）、ＣｕＳＯ４（０．４当量、０．２μｍｏｌ、４０ｍＭ  Ｈ２Ｏ溶液５μＬ）、新たに調製したアスコルビン酸ナトリウム（２当量、１μｍｏｌ、５０ｍＭ  Ｈ２Ｏ溶液２０μＬ）及び水（７５μＬ）を加えた。密封管中の得られた調製物を、１００Ｗ、予混合時間３０秒に設定したマイクロ波合成機Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ（商標）（Biotage製）で処理した。溶液を除去し、ＣＰＧビーズを、Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨ（２ｍＬ、１：１、ｖ／ｖ）及びＭｅＯＨ（１ｍＬ）で洗浄した後、乾燥した。
【０１３３】
４−脱保護の基本手順：ビーズを密封バイアルに入れ、室温で４時間、濃アンモニア水溶液（１ｍＬ）で処理した。ビーズを濾過により除去し、溶液を蒸発させた。残渣を引き続く分析用に水に溶解した。
【０１３４】
【化２３】
2009535323.tif 000024
【０１３５】
スキームＳ１．ＤＭＴｒ保護Ｈ−ホスホネート１の調製
［４−（ジメトキシトリチルオキシメチル）シクロヘキシル］メタノール１ａ
１，４−シクロヘキサンジメタノール（シス及びトランスの混合物）（２．８８ｇ、２０ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（２×２５ｍＬ）と共沸させた後、ピリジン（２５ｍＬ）に溶解した。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（５．０８ｇ、１５ｍｍｏｌ）を、３０分かけて３回に分けて加え、混合物を室温で３時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、シロップ状残渣をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）に溶解した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×５０ｍＬ）及びブライン（２×５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させた。残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（Ｅｔ３Ｎを０．５％含有するＣＨ２Ｃｌ２中のＭｅＯＨ  ０％から５％）で精製することにより、１ａ（４．０２ｇ、４５％）を淡黄色オイルとして得た。
【０１３６】
Ｒｆ＝０．７０（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９５：５、ｖ／ｖ）。
【０１３７】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ１．０２−１．９３（４ｍ、１１Ｈ）、２．９４−３．０３（ｍ、２Ｈ）、３．４７−３．５１（ｍ、２Ｈ）、３．８５（ｓ、６Ｈ）、６．８５−７．５０（ｍ、１３Ｈ）。
【０１３８】
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）：δ２５．５、２６．０、２９．１、２９．７、３６．２、３８．１、３８．８、４０．７、５５．２、６６．０、６６．２、６８．６、６８．７、１１３．０、１１３．２、１２６．６、１２７．７、１２７．８、１２９．２、１３０．１、１３６．１、１３６．８、１４５．５、１５８．４、１５８．７。
【０１３９】
ＨＲＦＡＢ（ポジティブモード、ニトロベンジルアルコール）ｍ／ｚ：Ｃ２９Ｈ３４Ｏ４に対する計算値［Ｍ］＋  ４４６．２４５７、実測値４４６．２４３５。
トリエチルアンモニウム［４−（ジメトキシトリチルオキシメチル）シクロヘキシル］メチルヒドロゲンホスホネート１
１ａ（８９３ｍｇ、２ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（２×１０ｍＬ）と共沸した後、ピリジン（１０ｍＬ）及びＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）に溶解した。２−クロロ−１，３，２−ホスホリン−４−オン（Marugg, J. E.; Tromp, M.; Kuyl-Yeheskiely, E.; van der Marel, G. A.; van Boom, J. H. Tetrahedron Lett. 1986, 27, 2661-2664）（５０６ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を２時間撹拌した。１Ｍ  ＴＥＡＢ（２０ｍＬ）を加え、ＣＯ２の気泡が発生しなくなるまで溶液を撹拌した。有機層を分離し、水層をＣＨ２Ｃｌ２（２×２０ｍＬ）で抽出した。有機層を集め、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させた。残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（Ｅｔ３Ｎを１％含有するＣＨ２Ｃｌ２中のＭｅＯＨ  ０〜５％）で精製することにより、１（５５０ｍｇ、４５％）を無色オイルとして得た。
【０１４０】
Ｒｆ＝０．１５（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／Ｅｔ３Ｎ  ８９：３：８、ｖ／ｖ／ｖ）。
【０１４１】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ０．８２−１．７３（ｍ、１９Ｈ）、２．９４（ｍ、６Ｈ）、２．７５−２．８４（ｍ、２Ｈ）、３．５１−３．５８（ｍ、２Ｈ）、３．６３、３．６５（２ｓ、６Ｈ）、６．６８−７．３４（ｍ、１３Ｈ）。
【０１４２】
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）：δ８．５、２５．７、２５．９、２９．２、２９．６、３６．０、３６．４、３８．６、３８．９、４５．３、５５．１、５５．２、６６．４、６６．６、６８．６、６９．２、１１２．９、１１３．１、１２６．５、１２７．０、１２７．６、１２７．７８、１２７．８３、１２８．２、１２９．２、１３０．０、１３０．１、１３６．６７、１３６．７０、１４５．４、１５８．３、１５８．６。
【０１４３】
３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ、８０ＭＨｚ）：δ７．３２、７．６０（２ｓ、Ｐ）。
【０１４４】
ＨＲＦＡＢ（ネガティブモード、ニトロベンジルアルコール）ｍ／ｚ：Ｃ２９Ｈ３４Ｏ６Ｐ１に対する計算値［Ｍ−Ｅｔ３ＮＨ］−  ５０９．２０９６、実測値５０９．２０９２。
【０１４５】
【化２４】
2009535323.tif 000025
【０１４６】
スキームＳ２．ガラクトシルアジド４の調製
１−クロロ−３，６−ジオキサオクト−８−イル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド４ａ
２−［２−（２−クロロエトキシ）エトキシ］エタノール（２．８０ｍＬ、１９．２ｍｍｏｌ）及びパーアセチル化Ｄ−ガラクトース（５ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２溶液（５０ｍＬ）を０℃で冷却した後、ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ（８．１２ｍＬ、６４．０ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で２４時間撹拌した後、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３００ｍＬ）に注いだ。水層をＣＨ２Ｃｌ２（２×２００ｍＬ）で抽出した。有機層を集め、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、減圧下で蒸発させた。油状残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＰＥからＰＥ／ＥｔＯＡｃ  ３：２）で精製することにより、４ａ（Wang, J.; Zhang, B.; Fang, J.; Sujino, K.; Li, H.; Otter, A.; Hindsgaul, O.; Palcic, M. M.; Wang, P. G. J. Carbohydr. Chem. 2003, 22, 347-376）（２．９３ｇ、６１％）を淡黄色オイルとして得た。
【０１４７】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δ１．９９、２．０５、２．０７、２．１５（４ｓ、４×３Ｈ）、３．６０−３．７０（ｍ、８Ｈ）、３．７１−３．８２（ｍ、３Ｈ）、３．８４−４．０２（ｍ、２Ｈ）、４．０６−４．２２（ｍ、２Ｈ）、４．５８（ｄ、１Ｈ、Ｊ１，２＝８．０Ｈｚ）、５．０２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ３，４＝３．４Ｈｚ、Ｊ３，２＝１０．４Ｈｚ）、５．２２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ２，１＝８．０Ｈｚ、Ｊ２，３＝１０．４Ｈｚ）、５．３９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ４，５＝０．９Ｈｚ、Ｊ４，３＝３．４Ｈｚ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、７５ＭＨｚ）：δ２０．６、２０．７、２０．８、２１．０、４２．７、６１．２、６７．０、６８．７、６９．０、７０．３、７０．５８、７０．６１、７０．６３、７０．８、７１．３、１０１．３、１６９．４、１７０．１、１７０．２、１７０．４。
１−アジド−３，６−ジオキサオクト−８−イル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド４
４ａ（３．８５ｇ、７．７１ｍｍｏｌ）、アジ化ナトリウム（２．５１ｇ、３８．５８ｍｍｏｌ）及びｎＢｕ４ＮＩ（５．７ｇ、１５．４３ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液を、９０℃で２４時間撹拌した。溶液を室温に冷却した後、ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で希釈した。有機層を水（３×２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、減圧下で蒸発させた。油状残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＰＥからＰＥ／ＥｔＯＡｃ  １：１）で精製することにより、４（３．２９ｇ、８５％）を淡黄色オイルとして得た。
【０１４８】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δ１．９９、２．０４、２．０７、２．１５（４ｓ、４×３Ｈ）、３．４０（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．０Ｈｚ）、３．６０−３．８２（ｍ、９Ｈ）、３．８８−４．０２（ｍ、２Ｈ）、４．０８−４．２０（ｍ、１Ｈ）、４．５９（ｄ、１Ｈ、Ｊ１，２＝７．９Ｈｚ）、５．０２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ３，４＝３．４Ｈｚ、Ｊ３，２＝１０．５Ｈｚ）、５．２１（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ２，１＝７．９Ｈｚ、Ｊ２，３＝１０．５Ｈｚ）、５．３９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ４，５＝０．７Ｈｚ、Ｊ４，３＝３．４Ｈｚ）。
【０１４９】
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、７５ＭＨｚ）：δ２０．３、２０．４、２０．５、２０．８、５０．４、６１．１、６６．８、６８．６、６８．８、６９．８、７０．１、７０．４、７０．４、７０．５、７０．７、１０１．１、１６９．２、１６９．９、１７０．０、１７０．１。
【０１５０】
ＨＲＦＡＢ（ポジティブモード、チオグリセロール）ｍ／ｚ：Ｃ２０Ｈ３２Ｎ３Ｏ１２に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］＋  ５０６．１９８６、実測値５０６．１９６８。［α］Ｄ＝＋１．４（ｃ＝１、ＣＨ２Ｃｌ２）。
トリガラクトシル化Ｔ１２＊  ６：
本発明者らは、最初に、十分に確立したホスホロアミダイトケミストリーを使用して、固体支持体上でシアノエチル保護ドデカチミジン（Ｔ１２＊）を調製した（Beaucage, S. L.; Caruthers, M.H. Tetrahedron Lett. 1981, 22, 1859-1862）。次に、Ｈ−ホスホン酸モノエステル１を使用して、３個のＨ−ホスホン酸ジエステル結合を導入することにより、修飾担持型オリゴヌクレオチド２（図８）を得た。プロパルギルアミン存在下でのＣＣｌ４によるアミド酸化により、アルキン官能基を有するオリゴヌクレオチド３（３個のプロパルギルホスホロアミデート結合を有する）を得た。アリコートをアンモニア水溶液で処理し、ＨＰＬＣ／ＭＳで分析して、これらの合成工程（即ち、３個のＨ−ホスホネートカップリング及びアミド酸化）の効率を求めた。第１のＨ−ホスホネートカップリングは完全ではなかった（８６％〜９４％）が、その一方、引き続く２個のカップリングはより高収率であった。得られた混合物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析によって求められるように、３（〜７５％）、未反応のＴ１２（〜１４％）、並びにプロパルギル基を１個有する中間体（〜３％）及びプロパルギル基を２個有する中間体（〜４％）から構成された。
【０１５１】
次に、オリゴヌクレオチド３を使用して、アジド誘導体４による１，３−双極子環化付加を最適化した。反応は、室温でゆっくりと進行するため、マイクロ波（ＭＷ）の下で実施して、反応時間を短縮した。マイクロ波による活性化の下での幾つかの反応条件を、６０℃〜１００℃の範囲の温度及び６０分〜１５分の反応時間に関して調査した（表１）。水／メタノール中、ＣｕＳＯ４／アスコルビン酸ナトリウムの存在下、アルキン残基に対して３．３モル当量のアジドを用い、３価のアルキンオリゴヌクレオチド３と１価のアジド４との間の環化付加を実施することにより（Rostovtsev, V. V.; Green, L. G.; Fokin, V. V.; Sharpless, K. B. Angew. Chem., Int. Ed 2002, 41, 2596-2599）、固相担持型保護トリガラクトシル化オリゴヌクレオチド５を得た。引き続いて５をアンモニア水溶液で処理することにより、完全に脱保護されたトリガラクトシル化Ｔ１２  ６溶液を得た。環化付加の割合を、粗物質のＨＰＬＣ／ＭＳ分析によって求めた（図１０）。主ピーク（ＲＴ〜２０分）は、所期のトリガラクトシル化Ｔ１２  ６に相当し、〜１８分の幅広いピークは、ジアルキンＴ１２から形成されたジガラクトシル化Ｔ１２に相当し、〜１６分の２個のピークはモノアルキンＴ１２から形成されたモノガラクトシル化Ｔ１２に相当し、〜１５分のピークはＴ１２である。ＨＰＬＣピークの分裂は、ジアステレオ異性体の存在に起因するものであり、その理由は、ホスホロアミデート結合のリン原子がキラルであるからである。純粋なトリガラクトシル化Ｔ１２  ６を、ＨＰＬＣによって容易に単離し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで特性化した。
【０１５２】
環化付加の結果を表１にまとめる。モノ環化付加物及びビス環化付加物を生じる１個及び２個のアルキンに関する不純物は考慮しなかったが、同一効率で進行した。シアノエチル保護基に対する環化付加がこれらの条件下で観察されなかったことは、指摘する価値がある。
【０１５３】
【表１】
2009535323.tif 000026
【０１５４】
第１の試行を、１００℃で２０分間、ＭＷによる活性化を用いて実施し（エントリー１）、所望のトリアゾールへの、３個のアルキン残基全ての完全転化を観察した。７５℃、次いで６０℃へと温度を低下させても、２０分以内に反応が完結した（エントリー２及び３）。にもかかわらず、温度を６０℃に保ち、時間を１５分に減らすと、転化が完結せず、ＨＰＬＣ／ＭＳによって、アルキン残基が１個残存した１６％のジガラクトシル化Ｔ１２が検出された（エントリー４）。最後に、ＭＷによる活性を用いないと７時間後であっても反応が完結に達しなかった（７３％）（エントリー５）。
【０１５５】
同様に、３個のアルキンホスホロアミデート結合を有するＴ１２ホスホジエステルに対して、溶液中で環化付加反応を実施し、ＭＷ下で７５℃、２０分、又はＭＷなしで１８時間以内に完結した。にもかかわらず、１個のホスホロアミデートのＰ−Ｎ結合の加水分解が観察され、対応するホスホジエステル（１３％（ＭＷ下）及び２０％（ＭＷなし））が得られた。反応を、ＭＷによる活性化の下、１００℃で６０分間実施しても、固相担持型オリゴヌクレオチド５の分解は全く観察されなかった。
【０１５６】
結論として、本発明者らは、ＭＷによる活性化の下、６０℃、２０分間の、アルキンを有するオリゴヌクレオチド３とアジド官能基を有するガラクトシド４との非常に効率的なクリックカップリングを観察した。反応は、同様の条件下、固体支持体上又は溶液中で実施することができた。固相担持型マイクロ波利用クリックケミストリーの主な利点は：１）オリゴヌクレオチド骨格内の任意の場所（即ち、３’−末端若しくは５’−末端又はオリゴヌクレオチド配列内）への、いくつかのアルキンの導入（Laurent, A.; Naval, M.; Debart, F.; Vasseur, J. J.; Rayner, B. Nucleic Acids Res. 1999, 27, 4151-4159）；２）各Ｈ−ホスホン酸ジエステル官能基間に異なるジオール型リンカーを使用しての各アルキン間の距離の調節；３）固体支持体上又は溶液中で、オリゴヌクレオチドを用いて環化付加を実施することができること；４）過剰のアジド誘導体の使用及び回収；５）このアプローチを使用する、オリゴヌクレオチドとの各種アジドの複合化；６）迅速且つ高収率な複数の１，３双極子環化付加及びホスホロアミデート結合の加水分解がないことである。
変形：
オリゴ糖上に１回又は２回グラフトすることができる、以下のジアルキンホスホロアミダイトを用いて、変形を実施した。
【０１５７】
【化２５】
2009535323.tif 000027
【０１５８】
四量体を合成し（図１１）、クリックケミストリーによってアジド糖との複合体を形成した。
【０１５９】
次に、オリゴヌクレオチドを伸長し、ＣＹ３でマークした。
分子アレイの調製：
本発明によれば、ＤＮＡチップ（ＤＮＡディスプレイ）は、混合ＤＮＡ／オリゴ糖分子に対するアドレスツール（addressing tool）として使用される。本発明者らは、ソーダ石灰ガラスのエッチングによってマイクロリアクタを作製する。表面を官能基化及び活性化して、ＮＨＳエステルで活性化された表面を作り出す。各種類のオリゴヌクレオチドを、各マイクロリアクタに共有結合で固定する。異なるヌクレオチド配列の異なるスポットは、オリゴ糖が保有する相補配列と特異的にハイブリダイズする。
【０１６０】
上記実施例に示すように、オリゴ糖部分及びオリゴヌクレオチドを有するキメラ分子を、異なる価数のサッカライド及び異なるスペーサーを用いて合成した。それらを、ＨＰＬＣで分析し、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦで特徴付けした。
結果：
最大３個のガラクトース分子を有するキメラ分子を、２個又は３個のＴＥＧ単位又は１，４−ジメチルシクロヘキサンを含むスペーサーを用いて合成した。平均粗度３ｎｍの、直径７００μｍ、深さ１００μｍの６００のマイクロリアクタをガラススライド上で加工した。
【０１６１】
オリゴヌクレオチドを、アミド結合を介して固定し、固体支持体上でのハイブリダイゼーションによって、キメラ分子を局所的に繋げた。レクチン認識アッセイを実施した後、蛍光をスキャンした。
ポリアルキン官能基を有するホスホエステル又はホスホロアミデート誘導体の調製
【０１６２】
【化２６】
2009535323.tif 000028
【０１６３】
Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−ペンタエリスリトール（７）
ペンタエリスリトール（２．７ｇ、２０ｍｍｏｌ）を、乾燥ピリジン（３×１０ｍＬ）中で共沸させることによって乾燥した後、乾燥ピリジン（１２０ｍＬ）に溶解した。ジメトキシトリチルクロリド（５．４２ｇ、１６ｍｍｏｌ）を溶液に加え、反応を室温で１６時間撹拌した。反応をメタノール（２ｍＬ）でクエンチし、１０分間撹拌した後、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３００ｍＬ）に注いだ。水層をＣＨ２Ｃｌ２（３×１５０ｍＬ）で抽出した。有機層を集め、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、蒸発させた。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  ９９：１から９４：６、ｖ／ｖ）で精製することにより、モノ−ジメトキシトリチル化ペンタエリスリトール７（２．２ｇ、３０％）を淡黄色のフォームとして得た。Ｒｆ＝０．５０（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９：１、ｖ／ｖ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ２．３６（ｂｒ  ｓ、３Ｈ）、３．１０（ｓ、２Ｈ）、３．６５（ｂｒ  ｓ、６Ｈ）、３．７１（ｓ、６Ｈ）、６．７４−７．３１（ｍ、１３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）：δ４５．３、５３．５、５５．２、６３．９、６４．６、８６．５、１１３．３、１２７．０、１２８．０、１３０．０、１３５．６、１４４．６、１５８．６。
【０１６４】
Kim, S. J.; Bang, E.-K.; Kim, B. H. Synlett 2003, 1838-1840に記載。
【０１６５】
【化２７】
2009535323.tif 000029
【０１６６】
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２，２−ビス−プロパルギルオキシメチル−１，３−プロパンジオール（８）
水素化ナトリウム（１．１６ｇ、２９．１ｍｍｏｌ、油中６０％）を、０℃でモノジメトキシトリチル化ペンタエリスリトール７（２．２ｇ、４．８ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（３０ｍＬ）溶液に加えた。反応を１０分間撹拌した後、プロパルギルブロミド（３．３ｍＬ、２９．１ｍｍｏｌ、８０％トルエン溶液）を室温で加えた。得られた乳状溶液を、室温でさらに３時間撹拌した。溶液をＣＨ２Ｃｌ２（８０ｍＬ）で希釈し、有機層を冷水（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、蒸発させた。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  ９９．５：０．５から９７：３、ｖ／ｖ）で精製することにより、ビス−プロパルギル化ペンタエリスリトールのジメトキシトリチル化体２（２．２ｇ、８９％）を淡黄色のフォームとして得た。Ｒｆ＝０．４５（シクロヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２／Ｅｔ３Ｎ、７：２：１、ｖ／ｖ／ｖ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ２．３５（ｍ、３Ｈ）、３．０５（ｓ、２Ｈ）、３．４８−３．６０（ｍ、６Ｈ）、３．７０（ｓ、６Ｈ）、４．０２（ｓ、４Ｈ）、６．７３−７．２６（ｍ、１３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）：δ１１．７、４５．１、４６．３、５３．５、５５．２、５８．７、６２．３、６５．３、７０．３、７４．５、８６．０、１１３．０、１１３．１、１２６．７、１２７．８、１２８．２、１２９．２、１３０．１、１３６．０、１４５．０、１５８．４。ＨＲＦＡＢＭＳ（ポジティブモード、ニトロベンジルアルコール）ｍ／ｚ：Ｃ３２Ｈ３４Ｏ６に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］＋  ５１４．２３５５、実測値５１４．２３６５。
【０１６７】
【化２８】
2009535323.tif 000030
【０１６８】
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−２，２−ビス−プロパルギルオキシメチル−３−｛Ｏ−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホロアミダイト］−１，３−プロパンジオール（９）
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２，２−ビス−プロパルギルオキシメチル−１，３−プロパンジオール８（６８０ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（１１３ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を、無水アセトニトリルと共沸することによって３回乾燥し、次に無水ＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬ）に溶解させた後、２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（５０３μＬ、１．５８ｍｍｏｌ）を室温で加えた。得られた混合物を室温で３時間撹拌した後、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈した。有機層をブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、蒸発させた。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（シクロヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２  １００／０から８０／２０、Ｅｔ３Ｎを４％含む）で精製することにより、ホスホロアミダイト９（８００ｍｇ、８５％）をオイルとして得た。Ｒｆ＝０．６０（シクロヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２／Ｅｔ３Ｎ、７：２：１、ｖ／ｖ／ｖ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ＭＨｚ）：δ１．１５−１．２４（ｍ、１２Ｈ）、２．４０（ｍ、２Ｈ）、２．５４（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．５Ｈｚ）、３．１５（ｂｒ  ｓ、２Ｈ）、３．４５−３．７４（ｍ、１０Ｈ）、３．８１（ｓ、６Ｈ）、４．０９−４．１２（ｍ、４Ｈ）、６．７６−７．４９（ｍ、１３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）：δ２０．３、２０．４、２４．６、２４．６、２６．９２、２６．９３、２９．７、３０．２、３０．３、４３．０、４３．１、４３．５、４５．５、４５．６、４６．３、５３．４、５５．２、５８．２、５８．４、５８．６、５８．７、６１．２、６２．２、６２．４、６９．４、７４．１、７４．２、８０．０、８５．６、１１２．９、１１７．７、１２６．６、１２７．６、１２８．３、１３０．３、１３６．３、１４５．３、１５８．３。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣＮ３、８０ＭＨｚ）：δ１４８．６。ＨＲＦＡＢＭＳ（ポジティブモード、ニトロベンジルアルコール）ｍ／ｚ：Ｃ４１Ｈ５２Ｏ７Ｎ２Ｐ１に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］＋  ７１５．３５１２、実測値７１５．３５２２。
【０１６９】
【化２９】
2009535323.tif 000031
【０１７０】
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−２，２−ビス−プロパルギルオキシメチル−３−Ｏ−（Ｈ−ホスホネートモノエステルトリエチルアンモニウム）−１，３−プロパンジオール（１０）
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２，２−ビス−プロパルギルオキシメチル−１，３−プロパンジオール（８）（５１４ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（３×５ｍＬ）中で共沸して乾燥した後、乾燥ピリジン（６ｍＬ）に溶解した。亜リン酸ジフェニル（１．４ｍＬ、７ｍｍｏｌ）を加え、溶液を室温で６０分間撹拌した。次に、混合物を冷却し（５℃）、水及びトリエチルアミンの溶液（５ｍＬ、１：１、ｖ／ｖ）を加えた。得られた溶液を室温で４５分間撹拌した。生成物を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を含有する分液漏斗に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で蒸発乾固させた。残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィで、Ｅｔ３Ｎを４％含有するＣＨ２Ｃｌ２中のメタノール量を増加させて（０％から７％）精製した。
【０１７１】
５３０ｍｇ、７８％。
【０１７２】
Ｒｆ：０．３０  ＣＨ２Ｃｌ２、ＭｅＯＨ、Ｅｔ３Ｎ（９２．５：５：２．５、ｖ／ｖ／ｖ）。
【０１７３】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ、４００ＭＨｚ）：δ１．２２（ｔ、７．３Ｈｚ、９Ｈ、ＣＨ３−ＣＨ２）、２．７３（ｓ、３Ｈ、ＨＣ）、２．９７（ｑ、７．３Ｈｚ、６Ｈ、ＣＨ３−ＣＨ２）、３．０４（ｓ、２Ｈ、ＣＨ２ＯＤＭＴｒ）、３．５５（ｓ、４Ｈ、ＣＨ２−Ｏプロパルギル）、３．７３（ｄ、６．２Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ２ＯＰ）、３．７９（ｓ、６Ｈ、ＯＣＨ３）、４．１０（ｄ、２．４Ｈｚ、４Ｈ、ＯＣＨ２Ｃ）、６．５６（ｄ、ＪＨＰ＝５９８Ｈｚ、１Ｈ、ＨＰ）、６．８７−７．４８（ｍ、１３Ｈ、芳香環）。
【０１７４】
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ、１００ＭＨｚ）：δ７．９５、４５．３、５４．９、５８．３、６１．４、６２．３、６９．１、７４．８、８０．０、８５．５、１１２．９、１２６．７、１２７．８、１２８．１、１３０．１、１３６．２、１４５．５、１５８．６。
【０１７５】
３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣＮ３、８０ＭＨｚ）：δ７．１。
【０１７６】
ＨＲＦＡＢＭＳ（ネガティブモード、ニトロベンジルアルコール）ｍ／ｚ：Ｃ３２Ｈ３４Ｏ８Ｐ１に対する計算値［Ｍ−Ｈ］−、５７７．１９９１、実測値５７７．１９７５。
【０１７７】
【化３０】
2009535323.tif 000032
【０１７８】
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−２，２−ビス−プロパルギルオキシメチル−３−Ｏ−（スクシニック−ＬＣＡＡ  ＣＰＧ）−１，３−プロパンジオール（１１）
（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ  ５００Å、８０メッシュ〜１２０メッシュ、８０μｍｏｌ／ｇ〜９０μｍｏｌ／ｇ）
ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（１．００ｇ）、１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２，２−ビス−プロパルギルオキシメチル−１，３−プロパンジオール８（０．１１４ｇ、０．２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（０．１９１ｇ、１ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．０１２ｇ、０．１ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（０．１ｍｌ）を、室温で４８時間、乾燥ピリジン（５ｍｌ）中で振盪した。次に、ペンタクロロフェノール（１３５ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１０時間振盪した。ピペリジン（５ｍＬ）を加え、５分振盪した後、固体支持体を濾過で除き、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、乾燥した。標準的なＣａｐ  Ａ溶液及びＣａｐ  Ｂ溶液によるキャッピング工程を２時間行い、固体支持体を濾過で除き、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、乾燥した。トリチルアッセイからは、４０μｍｏｌ／ｇの負荷量が示唆された。
１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタン系統
【０１７９】
【化３１】
2009535323.tif 000033
【０１８０】
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−ヒドロキシメチル−２−メチル−１，３−プロパンジオール（１６）
７と同一のプロトコル。
【０１８１】
１．９ｇ、５６％。
【０１８２】
Ｒｆ＝０．２８（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、１９：１、ｖ／ｖ）。
【０１８３】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ０．８７（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、２．４２（ｂｒ  ｓ、２Ｈ、ＯＨ）、３．１６（ｓ、２Ｈ、ＤＭＴｒＯ−ＣＨ２−）、３．６９（ｄ、２Ｈ、ＡＢｓｙｓｔＪ＝２５．２Ｈｚ、−ＣＨ２ａＯＨ）  ３．６４（ｄ、２Ｈ、ＡＢｓｙｓｔＪ＝２５．２Ｈｚ、−ＣＨ２ｂＯＨ）、３．８２（ｓ、６Ｈ、ＯＣＨ３）、６．７９−７．４９（ｍ、１３Ｈ、芳香環）。
【０１８４】
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）：δ１７．４、４１．１、５５．２、６７．２、６８．２、８６．３、１１３．３、１２６．９、１２８．０、１３０．０、１３５．８、１４４．７、１５８．５。
【０１８５】
ＨＲＦＡＢＭＳ（ポジティブモード、ニトロベンジルアルコール）ｍ／ｚ：Ｃ２６Ｈ３０Ｏ５に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］＋  ４２２．２０９３、実測値４２２．２０９８。
【０１８６】
【化３２】
2009535323.tif 000034
【０１８７】
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−プロパルギルオキシメチル−２−メチル−１，３−プロパンジオール（１７）
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−ヒドロキシメチル−２−メチル−１，３−プロパンジオール１６（６２０ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（６ｍＬ）に溶解し、水素化ナトリウム（油中６０％、５９０ｍｇ、１４．７ｍｍｏｌ）を加えた。１０分間撹拌した後、プロパルギルブロミド（８０％トルエン溶液、６５０ｍＬ、５．９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。次に、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）及び水２ｍＬを加えた。有機層を水（２×１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。蒸発後、残渣をフラッシュクロマトグラフィで、トリエチルアミンを１％含有するシクロヘキサン中の酢酸エチルの量を増加させて（１０％から５０％）精製した。
【０１８８】
５００ｍｇ、７４％。
【０１８９】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ＭＨｚ）：δ０．９５（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、２．５８（ｔ、１Ｈ、ＣＣＨ）、２．６０（ｂｒ  ｓ、１Ｈ、ＯＨ）、３．０３（ｄ、ＡＢｓｙｓｔＪ＝２０．７Ｈｚ、１Ｈ、ＣＨ２ａＯ−プロパルギル）、３．１３（ｄ、ＡＢｓｙｓｔＪ＝２０．７Ｈｚ、１Ｈ、ＣＨ２ｂＯ−プロパルギル）、３．５８−３．６（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２ＯＨ）、３．６５（ｓ、２Ｈ、ＤＭＴｒＯ−ＣＨ２−）、３．８２（ｓ、６Ｈ、ＯＣＨ３）、４．１８（ｄｄ、Ｊ＝０．９Ｈｚ及び１．４Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ２−ＣＣＨ）、６．８５−７．５４（ｍ、１３Ｈ、芳香環）。
【０１９０】
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）：１７．８、４０．８、５５．２、５８．７、６６．５、６８．９、７４．３、７４．５、７９．７、８６．０、１１３．２、１２６．７、１２７．８、１２８．１、１２９．１、１３０．１、１３６．０、１４５．０、１５８．４。
【０１９１】
ＨＲＦＡＢＭＳ（ポジティブモード、ニトロベンジルアルコール）ｍ／ｚ：Ｃ２９Ｈ３２Ｏ５に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］＋  ４６０．２２５０、実測値４６０．２２４８。
【０１９２】
【化３３】
2009535323.tif 000035
【０１９３】
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−２−プロパルギルオキシメチル−２−メチル−３−｛Ｏ−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホロアミダイト］−１，３−プロパンジオール（１８）
１７（３２５ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）から出発して９と同一のプロトコルを適用し、４２２ｍｇ、９２％を得た。
【０１９４】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ＭＨｚ）：δ１．００−１．２１（ｍ、１５Ｈ、ＣＨ３）、２．４２（ｂｓ、１Ｈ、ＣＣＨ）、２．５３−２５９（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、−ＣＨ２ＣＮ）、３．０３（ｓ、２Ｈ、ＯＣＨ２ＤＭＴｒ）、３．４３−３．７９（ｍ、８Ｈ、ＯＣＨ２−、ＣＨ、ＣＨ２ＯＰ、ＣＨ２Ｏプロパルギル）、３．８２（ｓ、６Ｈ、ＯＣＨ３）、４．１１−４．１８（ｂｓ、２Ｈ、ＯＣＨ２ＣＣ）、６．８３−７．４９（ｍ、１３Ｈ）。
【０１９５】
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）：δ１７．８、２０．３、２４．５、２４．６、４１．２、４１．３、４３．２、４３．３、５３．３、５５．２、５８．３、５８．５、５８．６、５８．７、６５．２、６６．５、６６．６、６６．７、７２．８、７２．９、７３．９、８０．２、８５．７、１１３．０、１１７．４、１２６．５、１２７．６、１２８．４、１３０．２、１３６．５、１４５．３、１５８．５。
【０１９６】
３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣＮ３、８０ＭＨｚ）：δ１４８．６、１４８．７。
【０１９７】
ＨＲＦＡＢＭＳ（ポジティブモード、ニトロベンジルアルコール）ｍ／ｚ：Ｃ３８Ｈ５０Ｎ２Ｏ６Ｐ１に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］＋  ６６１．３３８３、実測値６６１．３３８３。
【０１９８】
【化３４】
2009535323.tif 000036
【０１９９】
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−２−プロパルギルオキシメチル−２−メチル−３−Ｏ−（Ｈ−ホスホネートモノエステルトリエチルアンモニウム）−１，３−プロパンジオール（１９）
１７から出発して１０と同一のプロトコル。
【０２００】
Ｒｆ：０．３０  ＣＨ２Ｃｌ２、ＭｅＯＨ、Ｅｔ３Ｎ（９２．５：５：２．５、ｖ／ｖ／ｖ）。
【０２０１】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ、３００ＭＨｚ）：１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ＭＨｚ）：δ１．００（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、２．７５（ｓ、１Ｈ、ＣＣＨ）、３．０３（ｓ、２Ｈ、ＯＣＨ２ＤＭＴｒ）、３．４３−３．７９（ｍ、８Ｈ、ＯＣＨ２−、ＣＨ２ＯＰ、ＣＨ２Ｏプロパルギル）、３．７９（ｓ、６Ｈ、ＯＣＨ３）、４．１１（ｂｓ、２Ｈ、ＯＣＨ２ＣＣ）、６．５８（ｄ、ＪＨＰ＝５９５Ｈｚ、１Ｈ、ＨＰ）、６．８７−７．４７（ｍ、１３Ｈ）。
【０２０２】
３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣＮ３、８０ＭＨｚ）：δ２．４。
【０２０３】
【化３５】
2009535323.tif 000037
【０２０４】
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−２−プロパルギルオキシメチル−２−メチル４−３−Ｏ−（コハク酸−ＬＣＡＡ  ＣＰＧ）−１，３−プロパンジオール（２０）
１１と同一のプロトコル。ＬＣＡＡ  ＣＰＧ  ５００Åでは、負荷量３２．２μｍｏｌ／ｇ、ＬＣＡＡ  ＣＰＧ  １０００Åでは、負荷量３０．１μｍｏｌ／ｇ。
【０２０５】
【化３６】
2009535323.tif 000038
【０２０６】
Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−トリス−Ｏ−プロパルギルペンタエリスリトール（１２）
水素化ナトリウム（２００ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ、油中６０％）を、乾燥ＴＨＦ（８ｍｌ）に溶解した１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２，２−ビス−プロパルギルオキシメチル−１，３−プロパンジオール（８）（５１４ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）に加え、０℃で冷却した。反応を１０分間撹拌した後、プロパルギルブロミド（０．５７ｍＬ、５．０ｍｍｏｌ、８０％トルエン溶液）を加えた。得られた乳状溶液を５５℃で４０時間加熱した。溶液をＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬ）で希釈し、有機層を冷水（３０ｍＬ）、飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、蒸発させた。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（シクロヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２／Ｅｔ３Ｎ  ８０：１８：２から７５：２２：２、ｖ／ｖ／ｖ）で精製することにより、トリス−プロパルギル化ペンタエリスリトール１２（４８０ｍｇ、８６％）を得た。Ｒｆ＝０．４５１（シクロヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２／Ｅｔ３Ｎ、６：４：１、ｖ／ｖ／ｖ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ＭＨｚ）：δ２．５０（ｔ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、３Ｈ、ＨＣ）、３．１２（ｓ、２Ｈ、ＣＨ２−ＯＤＭＴｒ）、３．５７（ｓ、６Ｈ、−ＣＨ２Ｏプロパルギル）、３．８２（ｓ、６Ｈ、ＣＨ３Ｏ−）、４．０９（ｓ、６Ｈ、Ｏ−ＣＨ２−ＣＣＨ）、６．８２−７．５０（ｍ、１３Ｈ、芳香環）。
【０２０７】
【化３７】
2009535323.tif 000039
【０２０８】
Ｏ−トリス−プロパルギル−ペンタエリスリトール（１３）
Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−トリス−Ｏ−プロパルギルペンタエリスリトール（１２）（４８０ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（７：３、ｖ／ｖ）溶液に、１０％のパラ−トルエンスルホン酸のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（７：３、ｖ／ｖ）溶液４ｍＬを加え、溶液を３０分間撹拌した。次に、ポリビニルピリジン（polyvinylpiridine）１．６ｇを加え、不均一な無色の混合物を１５分間撹拌した。レジンを濾過により除去し、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（７：３、ｖ／ｖ）１５ｍＬで洗浄した。蒸発後、オイルをシリカゲルクロマトグラフィで、シクロヘキサン中の酢酸エチルの量を増加させて（０％から５０％）精製した。
【０２０９】
１００ｍｇ、４７％。
【０２１０】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ＭＨｚ）：δ２．５０（ｔ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、３Ｈ、ＨＣ）、３．５９（ｓ、６Ｈ、−ＣＨ２Ｏプロパルギル）、３．７２（ｓ、２Ｈ、ＣＨ２ＯＨ）、４．１６（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、６Ｈ、Ｏ−ＣＨ２−ＣＣＨ）。
【０２１１】
【化３８】
2009535323.tif 000040
【０２１２】
Ｏ−トリス−プロパルギル−Ｏ−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホロアミダイト］−ペンタエリスリトール（１４）
１３（１００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）から出発して、９と同一のプロトコルを適用した。
【０２１３】
１２０ｍｇ、７９％。Ｒｆ：０．６５（シクロヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２／Ｅｔ３Ｎ、７４：２５：１、ｖ／ｖ／ｖ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ１．１８−１．２０（ｄｄ、Ｊ＝１．９Ｈｚ及び６．８Ｈｚ、１２Ｈ、ＣＨ３−）、２．４１（ｔ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、３Ｈ、ＨＣ）、２．６５（ｔｄ、Ｊ＝１．９Ｈｚ及び６．５Ｈｚ、２Ｈ、−ＣＨ２ＣＮ）、３．５３（ｓ、６Ｈ、−ＣＨ２Ｏプロパルギル）、３．５５−３．６７（ｍ、４Ｈ、Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ、３．８１−３．８９（ｍ、ＣＨ２ＯＰ）、３．７２（ｓ、２Ｈ、ＣＨ２ＯＨ）、４．１３（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、６Ｈ、Ｏ−ＣＨ２−ＣＣＨ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ２０．４、２４．６、２４．７、４３．２、４５．２、５８．３、５８．４、５８．７、６２．３、６８．６、７４．２、８０．０、１１７．７。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣＮ３、８０ＭＨｚ）：δ１５０．０。ＨＲＦＡＢＭＳ（ポジティブモード、ニトロベンジルアルコール）ｍ／ｚ：Ｃ２０Ｈ３１Ｏ４Ｎ１Ｐ１に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］＋  ３８０．１９９１、実測値３８０．１９７５。
【０２１４】
【化３９】
2009535323.tif 000041
【０２１５】
１，３−Ｏ−ビス−プロパルギル−２−［Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）オキシメチル］−２−メチル−１，３−プロパンジオール（２１）
１６から出発して１２と同一のプロトコル。
【０２１６】
【化４０】
2009535323.tif 000042
【０２１７】
１，３−Ｏ−ビス−プロパルギル−２−ヒドロキシメチル−２−メチル−１，３−プロパンジオール（２２）
２１から出発して１３と同一のプロトコル。
【０２１８】
【化４１】
2009535323.tif 000043
【０２１９】
１，３−Ｏ−ビス−プロパルギル−２−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホロアミダイト］オキシメチル］−２−メチル−１，３−プロパンジオール（２３）
２２から出発して１４と同一のプロトコル。
【０２２０】
【化４２】
2009535323.tif 000044
【０２２１】
１，３−Ｏ−ビス−プロパルギル−２−（ホスホン酸モノエステルトリエチルアンモニウム）］オキシメチル］−２−メチル−１，３−プロパンジオール（２４）
２２から出発して１９と同一のプロトコル。
【０２２２】
【化４３】
2009535323.tif 000045
【０２２３】
Ｏ−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホロアミダイト］４−プロピン−１−オール（２５）
４−プロピン−１−オール（１５１ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．５７ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル中で２回共沸した。残渣を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（１５４ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を加えた。室温で５時間撹拌した後、溶液をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍｌ）で希釈し、溶液をブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させることにより、淡黄色オイルを得た。化合物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィで、Ｅｔ３Ｎを５％含有するシクロヘキサン中のＣＨ２Ｃｌ２を増加させて精製した。
【０２２４】
３５０ｍｇ、６８％。
【０２２５】
Ｒｆ：０．４８（シクロヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２／Ｅｔ３Ｎ、５：４：１、ｖ／ｖ／ｖ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ＭＨｚ）：δ１．２０（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１２Ｈ、ＣＨ３−）、１．８４（ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＣＨ２ＣＣＨ）、１．９６（ｔ、Ｊ＝２．７Ｈｚ、１Ｈ、ＣＣＨ）、２．３２（ｔｄ、Ｊ＝２．７Ｈｚ及び７．１Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ２−ＣＣＨ）、２．６５（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ２ＣＮ）、３．５５−３．８８（ｍ、６Ｈ、ＰＯ−ＣＨ２及びＣＨＭｅ２）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ１５．１、２０．４、２４．６、３０．１、４３．０、５８．３、６１．９、６８．５、８３．７、１１７．６。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣＮ３、８０ＭＨｚ）：δ１４８．８。
【０２２６】
【化４４】
2009535323.tif 000046
【０２２７】
４−プロピン−１−オールテトライソプロピルホスホロジアミダイト（２７）
４−プロピン−１−オール（９５μＬ、１．０ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（２７８ｍＬ、２ｍｍｏｌ）の無水ジエチルエーテル（２．５ｍｌ）溶液に、ビス（ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィン（２６７ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。溶液をジエチルエーテル：トリエチルアミン（９：１、ｖ／ｖ、１０ｍｌ）で希釈し、塩を濾過によって除去し、洗浄した。溶液を半分まで蒸発させて、シクロヘキサンを加えた。シクロヘキサンを残しつつジエチルエーテルを蒸発によって除去した。溶液をシリカゲルカラム（２５ｇ）にアプライし、化合物を、Ｅｔ３Ｎを６％含有するシクロヘキサンを使用して精製した。
【０２２８】
２８０ｍｇ、８９％。
【０２２９】
Ｒｆ：０．６０（シクロヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２／Ｅｔ３Ｎ、６：３：１、ｖ／ｖ／ｖ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ＭＨｚ）：δ１．２０（ｄｄ、Ｊ＝１０．４Ｈｚ及び１３．０Ｈｚ、２４Ｈ、ＣＨ３−）、１．８３（ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＣＨ２ＣＣＨ）、１．９５（ｔ、Ｊ＝２．６Ｈｚ、１Ｈ、ＣＣＨ）、２．３２（ｔｄ、Ｊ＝２．６Ｈｚ及び７．１Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ２−ＣＣＨ）、３．４４−３．７７（ｍ、６Ｈ、ＰＯ−ＣＨ２及びＣＨＭｅ２）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ、４００ＭＨｚ）：δ１４．９、２３．４、２４．１、３０．５、４４．２，６２．４，６８．７、８３．９、１１７．１。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣＮ３、８０ＭＨｚ）：δ１２５．０。
【０２３０】
【化４５】
2009535323.tif 000047
【０２３１】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−［（４−プロピニル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホロアミダイト］チミジン（２８）
無水５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−チミジン（５４４．５、１ｍｍｏｌ）及び無水ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（８６ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を、無水ＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬ）に溶解し、４−プロピン−１−オールテトライソプロピルホスホロジアミダイト（３７７ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を加えた。３時間撹拌した後、溶液を酢酸エチル（８０ｍＬ）で希釈し、溶液をブライン（２×１５０ｍｌ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させた。化合物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィで、Ｅｔ３Ｎを６％含有するシクロヘキサン中のＣＨ２Ｃｌ２量を増加させて（１４％から４４％）精製した。
【０２３２】
６５０ｍｇ、８５％。
【０２３３】
Ｒｆ：０．５０（シクロヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２／Ｅｔ３Ｎ、５：４：１、ｖ／ｖ／ｖ）。
【０２３４】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ＭＨｚ）：δ１．０７（ｄ、Ｊ＝６．７、３Ｈ、ＣＨ３−）、１．１８（ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、９Ｈ、ＣＨ３）、１．４３（ｂｓ、３Ｈ、ＣＨ３Ｔ）、１．７０−２．０３（ｍ、３Ｈ、ＣＣＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２ＣＣＨ）、２．２０−２．３６（ｍ、４Ｈ、Ｈ２’、Ｈ２’’、ＣＨ２−ＣＣＨ）、３．５０−３．７１（ｍ、６Ｈ、Ｈ５’、Ｈ５’’、Ｏ−ＣＨ２）、３．８１（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ３）、４．１７−４．２２（ｍ、１Ｈ、Ｈ４’）、４．６５−４．６８（ｍ、１Ｈ、Ｈ３’）、６．４３−６４５（ｍ、１Ｈ、Ｈ１’）、６．８３−７．４５（ｍ、１３Ｈ、芳香環）、７．６８（ｄ、１Ｈ、Ｈ６）、８．５０（ｂｓ、１Ｈ、ＮＨ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ、４００ＭＨｚ）：δ１１．７、１５．１、２３．０、２４．５、２６．９、３０．０、４０．３、４３．１、５５．３、６１．９、６３．２、６８．７、８３．７、８４．８、８５．５、８５．９、８６．９、１１１．２、１１３．３、１２７．２、１２８．０、１２８．２、１３０．２、１３５．３、１３５．５、１３５．７、１４４．３、１５０．４、１５８．７、１６３．９。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣＮ３、８０ＭＨｚ）：δ１４８．３及び１４８．７。
【０２３５】
【化４６】
2009535323.tif 000048
【０２３６】
１−Ｏ−［（４−プロピニル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホロアミダイト］−４−Ｏ−（ジメトキシトリチルオキシメチル）シクロヘキシル］メタノール（２９）
４−（ジメトキシトリチルオキシメチル）シクロヘキシル］メタノール（３３２ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）から出発して２８と同一のプロトコルにより、４５０ｍｇ、９２％を得た。
【０２３７】
Ｒｆ：０．１７（シクロヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２／Ｅｔ３Ｎ、７：２：１、ｖ／ｖ／ｖ）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ＭＨｚ）：δ１．１７−１．２２（ｄ、１２Ｈ、ＣＨ３）、１．４６−１．８３（ｍ、１３Ｈ、ＣＣＨ、シクロヘキサン、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、２．２９−２．３４（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＣＣ）、２．８９−２．９２（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２−ＤＭＴｒ）、３．３２−３．７７（ｍ、６Ｈ、ＣＨＭｅ２、ＣＨ２−シクロヘキサン、ＯＣＨ２ＣＨ２−）、３．８２（ｓ、６Ｈ、ＣＨ３Ｏ）、６．８３−７．５０（ｍ、１３Ｈ、芳香環）、１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ、４００ＭＨｚ）、１４．５、２４．０、２５．４、２５．９、２６．７、２９．１、２９．５、３０．１、３６．０、３６．７、３８．６、３９．５、４２．６、４２．７、５４．９、６１．４、６１．６、６６．０、６８．６、６８．９、８３．９、８５．４、１１２．９、１１７．３、１２６．６、１２７．７、１２８．１、１３０．０、１３６．６、１４５．７、１５８．５、３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣＮ３、８０ＭＨｚ）：δ１４７．１。
【０２３８】
【化４７】
2009535323.tif 000049
【０２３９】
Ｏ−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホロアミダイト］６−ブロモ−ヘキサン−１−オール（３１）
６−ブロモヘキサノール（３２５ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）から出発して２５と同一のプロトコルにより、４００ｍｇ、６０％を得た。
【０２４０】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ＭＨｚ）：δ１．１７−１．２１（ｄ、１２Ｈ、ＣＨ３）、１．４４−１．８８（ｍ、８Ｈ、ＣＨ２）、２．６２−２．６９（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＣＮ）、３．３９−３．８７（ｍ、８Ｈ、ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２Ｂｒ、ＣＨＭｅ２）、３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣＮ３、８０ＭＨｚ）：δ１４８．５ｐｐｍ。
【０２４１】
【化４８】
2009535323.tif 000050
【０２４２】
６−ブロモ−ヘキサン−１−オールテトライソプロピルホスホロジアミダイト（３２）
６−ブロモ−ヘキサノール（２７１．６ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）から出発して２７と同一のプロトコルにより、４１０ｍｇ、９０％を得た。
【０２４３】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ＭＨｚ）：δ１．１６−１．２０（ｄｄ、２４Ｈ、ＣＨ３）、１．４２−１．４７（ｍ、４Ｈ、ＣＨ２）、１．５６−１．６５（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ）、１．８５−１．９２（ｍ、２Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨ２）、３．３９−３．６２（ｍ、８Ｈ、ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２Ｂｒ、ＣＨＭｅ２）、３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣＮ３、８０ＭＨｚ）：δ１２５．３ｐｐｍ。
【０２４４】
【化４９】
2009535323.tif 000051
【０２４５】
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）３’−Ｏ−［（６−ブロモヘキシル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホロアミダイト］チミジン３３
５’−（ジメトキシトリチルオキシメチル）チミジン（３００ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）から出発し、６−ブロモ−ヘキサン−１−オールテトライソプロピルホスホロジアミダイト（３２）を使用して、２８と同一のプロトコルにより、３７７ｍｇ、８２％を得た。
【０２４６】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ＭＨｚ）：δ１．４−１．２０（ｍ、１２Ｈ、ＣＨ３）、１．３６−１．８８（ｍ、９Ｈ、ＣＨ３Ｔ、−ＣＨ２−）、２．５０−２．６５（ｍ、２Ｈ、Ｈ２’Ｈ２’’）、３．３５−３．７（ｍ、８Ｈ、Ｈ５’Ｈ５’’、ＣＨＭｅ２、ＣＨ２）、３．８１（ｓ、６Ｈ、ＣＨ３Ｏ−）、４．１７−４．２２（ｍ、１Ｈ、Ｈ４’）、４．６１−４．６９（ｍ、１Ｈ、Ｈ３’）、６．４０−６．４６（ｍ、１Ｈ、Ｈ１’）、６．８３−７．６７（ｍ、１４Ｈ、Ｈ６、芳香環）、３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣＮ３、８０ＭＨｚ）：δ１４７．８及び１４８．３。
ペンタエリスリチル核酸（ＰｅＮＡ）
ビス−２，２−サッカリジル−１，３−プロパンジオールホスホジエステル足場に基づくＰｅＮＡを、以下のスキームに従って調製した：
合成は、固体支持体上でのオリゴヌクレオチドホスホロアミダイトケミストリー及びマイクロ波を利用したクリックケミストリーの組合せに基づいた。ＰｅＮＡは、ＵＶ分析によるグリコシル化ＰｅＮＡの濃度決定用のタグとして、シュード３’−末端に、ヌクレオチドを１個だけ包含していた。固体支持体上でＤＮＡ様合成を使用して複数回カップリングしたホスホロアミダイトジアルキン構成単位を使用して、プロパルギル化ＰｅＮＡを都合よく調製した（図２４）。次に、本発明者らが先に報告した手順（（ａ）Bouillon, C. et al., J. Org. Chem. 2006, 71, 4700-4702；（ｂ）Meyer, A. et al., Tetrahedron Lett. 2006 47, 8867-8871）に従って、１，３−双極子環化付加により、炭水化物部分（図２３）を、そのアジド誘導体から導入し（（ａ）Kolb, H. C. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2004-2021；（ｂ）Calvo-Flores, F. G. et al., F. Org. Lett. 2000, 2, 2499-2502；（ｃ）Perez-Balderas, F. et al., Org. Lett. 2003, 5, 1951-1954；（ｄ）Chen, Q. et al., Carbohydr. Ｒes. 2005, 340, 2476-2482；（ｅ）Chittaboina, S. et al., Tetrahedron Lett. 2005, 46, 2331-2336；（ｆ）Giguere, D. et al., Chem. Commun. 2006, 2379-2381；（g）Fernandez-Megia, E. et al., R. Macromolecules 2006, 39, 2113-2120；（ｈ）Tejlera, J. et al., Carbohydr. Res. 2006, 341, 1353-1362）、所望のＰｅＮＡ糖クラスターを生成した。固相担持型オリゴヌクレオチド自動合成により、プロパルギル残基の数を制御した、プロパルギル化ＰｅＮＡの迅速且つ効率的な調製が可能となる。過剰量の試薬を使用して、各サイクルでそれら洗浄して除去することにより、定量的収率を達成することができる。固体支持体上でのクリックケミストリーは、アジド炭水化物誘導体による迅速且つ効率的な多重標識のための有効な方法である。最後に、固体支持体からの切り出しは、随伴するグリコシル化ＰｅＮＡの脱保護によって達成され、さらに精製することなく使用される。シュード３’−末端に導入されたチミジン残基により、最終溶液中に存在する物質の定量が可能となる。
【０２４７】
４個、６個、８個、及び１０個の炭水化物残基を有するマンノシル化ＰｅＮＡ及びフコシル化ＰｅＮＡを、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）及び緑膿菌のレクチン（ＰＡ−ＩＩＬ）に対する潜在的リガンドとして合成した。これら２個のレクチンはそれぞれ、マンノース及びフコースと結合するレクチンである。ＣｏｎＡは、Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ由来のマメ科植物のレクチンであり、４個のマンノース／グルコース結合部位を有する四量体から成り、現在ではタンパク質−炭水化物相互作用を研究するモデル系と考えられている。最近では、リガンドに対するμｍｏｌでの親和性を示す一連のバクテリアレクチンが同定されている。中でも、ＰＡ−ＩＩＬは、抗生物質に対する耐性の上昇を示す、免疫抑制患者及び嚢胞性線維症患者にとっては生命にかかわる日和見菌である、緑膿菌で同定されている。ＰＡ−ＩＩＬは、フコースに対する高い親和性、並びに他の単糖及びオリゴ糖との相互作用に関してよく特性化されている、フコース結合レクチンである。レクチンは四量体であり、多価リガンドに由来する高い結合活性により、細菌感染症に対する抗付着療法のために目的のこれらの化合物を作製することができる。
実験項
構成単位の実験的調製
自動合成では、次の構成要素と反応させるために、各官能基を選択的に活性化することができる、直交的に保護された多官能基足場が必要である。ペンタエリスリトールを、簡単な反応スキームを通じて容易に脱対称化することができる四官能分子として選択した。ジメトキシトリチルクロリドによるペンタエリスリトールのモノ保護により、トリオール７が得られた（図１４）。大過剰のプロパルギルブロミドを使用する７のアルキル化によりビス−プロパルギル化アルコール８を好収率で得た。ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリドで活性化した２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイトとアルコール８の反応により、所期のホスホロアミダイト９を得た。この分子には、マスクされたアルコール、及びＤＮＡ様の鎖伸長に関するホスホロアミダイト部分、並びに［３＋２］−環化付加反応を使用する炭水化物のアジド誘導体とのさらなる複合化のための２個のプロパルギル残基が存在している（（ａ）Bouillon, C; Meyer, A.; Vidal, S.; Jochum, A.; Chevolot, Y.; Cloarec, J.-P.; Praly, J.-P.; Vasseur, J.-J.; Morvan, F. J. Org. Chem. 2006, 71, 4700-4702；（ｂ）Meyer, A., Bouillon, C, Vidal, S., Vasseur, J. J., and Morvan, F. Tetrahedron Lett. 2006 47, 8867-8871）。
【０２４８】
アジド炭水化物合成は、プロパルギル残基上でのクリックケミストリーによるそれらの複合化に必要である。糖のアノマー配置の制御は、レクチンとの最適且つ選択的な結合にとってきわめて重要であることが多い。α−Ｄ−マンノシド又はα−Ｌ−フコシド誘導体の調製には、Ｏ−アシル又はFischerの立体選択的グリコシル化法をそれぞれ選択した（図２３）。
【０２４９】
ルイス酸による活性化の下でのクロロトリエチレングリコールによるマンノースパーアセテートのグリコシル化により、塩素化１，２−トランスマンノシド３６を得た。引き続くクロログリコール部分のアジド化により、対応するα−Ｄ−マンノシド誘導体３７を得た。Fischerの条件下でのＬ−フコースのグリコシル化により、アノマーの混合物（α／β  ３／１）が得られ、これを直接パーアセチル化してＬ−フコシド３８を得た。この時点で各アノマーの分離はできなかった。引き続く６のアジド化により、同一のα／β配分を有する、対応するアジド誘導体３９を得た。各アノマーをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ後に純粋に単離した。
ＰｅＮＡの固相担持型合成
ジアルキンホスホロアミダイト構成単位９を、市販の固相担持型チミジンから出発してカップリングし、ＤＮＡ合成機でホスホロアミダイト伸長サイクルにかけた。ポリグリコシル核酸のシュード３’−末端に存在するチミジンを、ＨＰＬＣ分析、及び溶液中の物質の濃度決定用のＵＶタグとして使用した。チミジン官能基を有するビーズを、オリゴヌクレオチドの合成に使用される、標準的な一連の脱トリチル化、ベンジルチオテトラゾール活性化によるホスホロアミダイトカップリング、酸化、及びキャッピングに付した（図２４）。このサイクルを、２回、３回、４回及び５回繰り返して、それぞれオリゴアルキン核酸４０ａ〜４０ｄを得た。伸長後、α−Ｄ−マンノシドアジド誘導体３７又はα−Ｌ−フコシドアジド誘導体３９のいずれかを使用して、１，３−双極子環化付加を固体支持体上で実行し、それぞれ完全に保護されたグリコシル化ＰｅＮＡ  ４１ａ〜４１ｄ又は４２ａ〜４２ｄを得た。濃アンモニア水溶液を使用する、保護基（即ち、アセテート及びシアノエチル）のアミノ分解並びに随伴する固体支持体からの切断により、完全に脱保護されたグリコシル化ＰｅＮＡ  ４３ａ〜４３ｄ及び４４ａ〜４４ｄ溶液を高純度及び好収率で得た。各糖クラスターをＨＰＬＣで分析し、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析（補足情報を参照）で特性化した。溶液中の利用可能な物質の量を、チミジンの吸光係数に基づき、２６０ｎｍでのＵＶ測定によって求めた。
１−クロロ−３，６−ジオキサオクト−８−イル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（３６）
２−［２−（２−クロロエトキシ）エトキシ］エタノール（３．６６ｍｌ、２５．２ｍｍｏｌ）及びパーアセチル化Ｄ−マンノース（６．５６ｇ、１６．８ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍｌ）溶液を０℃で冷却した後、ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ（１０．６ｍＬ、８４ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で２４時間撹拌した後、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３００ｍＬ）に注いだ。水層をＣＨ２Ｃｌ２（２×２００ｍＬ）で抽出した。有機層を集め、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、蒸発させた。油状残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＰＥからＰＥ／ＥｔＯＡｃ  ３：２）で精製することにより、３６（３．１４ｇ、３７％）を淡黄色オイルとして得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δ１．９６、２．０１、２．０８、２．１３（４ｓ、４×３Ｈ、４×ＣＨ３ＣＯ）、３．５８−３．８２（ｍ、１２Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ）、４．００−４．１３（ｍ、２Ｈ、Ｈ−５、Ｈ−６）、４．２５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ６’，５＝５．１Ｈｚ、Ｊ６’，６＝１２．３Ｈｚ、Ｈ−６’）、４．８５（ｄ、１Ｈ、Ｊ１，２＝１．６Ｈｚ、Ｈ−１）、５．２２−５．３６（ｍ、３Ｈ、Ｈ−２、Ｈ−３、Ｈ−４）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、７５ＭＨｚ）：δ２０．６、２０．７、２０．８、２１．０（４ｓ、４×ＣＨ３ＣＯ）、４２．７（ＣＨ２Ｃｌ）、６２．３（Ｃ−６）、６６．０、６８．３、６９．０、６９．５（４ｓ、Ｃ−２〜Ｃ−５）、６７．３、７０．０、７０．５６、７０．６３、７１．３（５ｓ、５×ＣＨ２Ｏ）、９７．６（Ｃ−１）、１６９．６、１６９．８、１７０．０、１７０．６（４ｓ、４×ＣＨ３ＣＯ）。［α］Ｄ＝＋４２（ｃ＝１／ＣＨ２Ｃｌ２）。ＥＳＩＭＳ（ポジティブモード）ｍ／ｚ：５２１［Ｍ＋Ｎａ］＋。ＨＲＥＳＩＭＳ（ポジティブモード）ｍ／ｚ：Ｃ２０Ｈ３１Ｃｌ１Ｏ１２Ｎａ１に対する計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋  ５２１．１４０２、実測値５２１．１４０３。
１−アジド−３，６−ジオキサオクト−８−イル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（３７）
３６（２．９ｇ、５．８ｍｍｏｌ）、アジ化ナトリウム（１．８９ｇ、２９．１ｍｍｏｌ）及びｎＢｕ４ＮＩ（４．３ｇ、１１．６ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液を、９０℃で２４時間撹拌した。溶液を室温に冷却した後、ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で希釈した。有機層を水（３×２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、蒸発させた。油状残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＰＥからＰＥ／ＥｔＯＡｃ  １：１）で精製することにより、３７（２．５４ｇ、８６％）を淡黄色オイルとして得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δ１．９６、２．０２、２．０８、２．１３（４ｓ、４×３Ｈ、４×ＣＨ３ＣＯ）、３．３７（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．０Ｈｚ、ＣＨ２Ｎ３）、３．６０−３．７２（ｍ、９Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、３．７４−３．８４（ｍ、１Ｈ、ＯＣＨ２）、４．００−４．１５（ｍ、２Ｈ、Ｈ−５、Ｈ−６）、４．２７（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ６’，５＝５．１Ｈｚ、Ｊ６’，６＝１２．４Ｈｚ、Ｈ−６’）、４．８５（ｄ、１Ｈ、Ｊ１，２＝１．５Ｈｚ、Ｈ−１）、５．２０−５．３７（ｍ、３Ｈ、Ｈ−２、Ｈ−３、Ｈ−４）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、７５ＭＨｚ）：δ２０．６２、２０．６３、２０．７、２０．８（４ｓ、４×ＣＨ３ＣＯ）、５０．６（ＣＨ２Ｎ３）、６２．３（Ｃ−６）、６６．０、６８．３、６９．０、６９．５（４ｓ、Ｃ−２〜Ｃ−５）、６７．２、６９．９７、７０．０２、７０．６、７０．７（５ｓ、５×ＣＨ２Ｏ）、９７．６（Ｃ−１）、１６９．６、１６９．８、１７０．０、１７０．６（４ｓ、４×ＣＨ３ＣＯ）。［α］Ｄ＝＋３４（ｃ＝１／ＣＨ２Ｃｌ２）。ＥＳＩＭＳ（ポジティブモード）ｍ／ｚ：５２８［Ｍ＋Ｎａ］＋。ＨＲＥＳＩＭＳ（ポジティブモード）ｍ／ｚ：Ｃ２０Ｈ３１Ｎ３Ｏ１２Ｎａ１に対する計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋  ５２８．１８０５、実測値５２８．１８０１。
１−アジド−３，６−ジオキサペント−８−イル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコピラノシド（３９）
Ｌ−フコース（１ｇ、６．１ｍｍｏｌ）及び２−［２−（２−クロロエトキシ）エトキシ］エタノール（３ｍＬ、２０．６ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で５分間撹拌した後、ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ（１．５４ｍＬ、１２．２ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を１００℃で５時間撹拌すると、溶液は黄色から暗褐色へと変化した。次に、粗混合物をピリジン（３５ｍＬ）に注いだ後、無水酢酸（７ｍＬ）を０℃で加えた。溶液を室温で４８時間撹拌した後、氷水（１００ｍＬ）に注ぎ、水層をＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）で抽出した。有機層を、水（１００ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、蒸発乾固し、トルエン（４×３０ｍＬ）と共沸した。油状残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２からＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ  ４：１）で精製することにより、中間体１−クロロ−３，６−ジオキサペント−８−イル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−Ｌ−フコピラノシド３８（７１８ｍｇ）を無色オイル、アノマーのα／β（３：１）混合物として得た。３８（７１８ｍｇ、１．６３ｍｍｏｌ）、アジ化ナトリウム（１．０６ｇ、１６．３ｍｍｏｌ）及びｎ−テトラブチルアンモニウムヨージド（３００ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液を、９０℃で１６時間撹拌した。溶液を水（１００ｍＬ）で希釈し、水層をＣＨ２Ｃｌ２（２×１５０ｍＬ）で抽出した。有機層を集め、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、蒸発乾固した。油状残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ヘキサン／ＣＨＣｌ３からヘキサン／ＣＨＣｌ３／アセトン  ２：１：１）で精製することにより、３９（４４１ｍｇ、１６％）を淡黄色オイルとして得た。αアノマーの第１の収量（１１３ｍｇ）を得た後、アノマーのα／β混合物の２個のさらなる収量２２６ｍｇ及び１０２ｍｇ（それぞれ４：１及び１：１の比）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δ１．１３（ｄ、３Ｈ、Ｊ６，５＝６．６Ｈｚ、Ｈ−６）、１．９８、２．０７、２．１６（３ｓ、３×３Ｈ、３×ＣＨ３ＣＯ）、３．４０（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、ＣＨ２Ｎ３）、３．６０−３．８５（ｍ、１１Ｈ、ＯＣＨ２、Ｈ−５）、４．２３（ｑ、１Ｈ、Ｊ５，６＝６．６Ｈｚ、Ｈ−５）、５．１０−５．１７（ｍ、２Ｈ）、５．３０（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ２，１＝１．１Ｈｚ、Ｊ２，３＝３．４Ｈｚ、Ｈ−２）、５．３４−５．４０（ｍ、１Ｈ）。
プロパルギル化ＰｅＮＡ（４０ａ〜４０ｄ）の自動合成の基本手順
市販のＬＣＡＡ−ＣＰＧ固相担持型５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−チミジン（５００Å）及びホスホロアミダイト９を用いた標準的なホスホロアミダイトケミストリーを使用して、プロパルギル化ＰｅＮＡ  ４０ａ〜４０ｄの合成をＤＮＡ合成機（３８１Ａ、ABI）で１μｍｏｌスケールで実施した。シュードオリゴヌクレオチド鎖伸長サイクルは以下の通りであった：６０秒間、トリクロロ酢酸（３％ＣＨ２Ｃｌ２溶液）を用いて脱ジメトキシトリチル化を実施した；６０秒間、ベンジルチオテトラゾール（０．３Ｍアセトニトリル溶液）で活性化した３６（０．０９Ｍアセトニトリル溶液、１８モル当量）を用いてカップリングを実施した；２０秒間、Ｉ２（ＴＨＦ／ピリジン／水  ９０：５：５、ｖ／ｖ／ｖ中０．１Ｍ）を用いて酸化を実施し、続けて１６秒間、Ｃａｐ  Ａ（Ａｃ２Ｏ（ピリジン／ＴＨＦ中）１：１：８、ｖ／ｖ／ｖ）及びＣａｐ  Ｂ（１０％  Ｎ−メチル−イミダゾールＴＨＦ溶液）の１：１溶液を用いてキャッピングを実施した。
グリコシル化ＰｅＮＡ（４３ａ〜４３ｄ及び４４ａ〜４４ｄ）合成の基本手順
固相担持型プロパルギル化ＰｅＮＡ  ４０ａ〜４０ｄを、マイクロ波バイアルに移し、アジド炭水化物誘導体３７又は３９（０．６Ｍ  ＭｅＯＨ溶液、アルキンに対して５モル当量）、ＣｕＳＯ４（０．１Ｍ水溶液、アルキンに対して０．２モル当量）、アスコルビン酸ナトリウム（０．２５Ｍ水溶液、アルキンに対して１モル当量）を加え、溶液を水及びＭｅＯＨで満たし、最終容量２００μＬの水／ＭｅＯＨ（１／１）を得た。バイアルを密封した後、６０℃で３０分間、マイクロ波を照射することにより、それぞれ４１ａ〜４１ｄ又は４２ａ〜４２ｄを得た。室温で２時間、ビーズを濃アンモニア水溶液で処理することにより、それぞれオリゴＧＮＡ  ４３ａ〜４３ｄ又は４４ａ〜４４ｄを得た。グリコシル化ＰｅＮＡの濃度を、チミジンの吸光係数（ε２６０ｎｍ＝８７００Ｌ・ｍｏｌ−１・ｃｍ−１）に基づき２６０ｎｍでのＵＶ測定によって求め、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析で特徴付けした（表２）。
【０２５０】
【表２】
2009535323.tif 000052
【図面の簡単な説明】
【０２５１】
【図１】本発明の第１の目的は、目的の分子Ｒがグラフトされたオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、当該方法は、図１Ａ及び図１Ｂに示すように、Ｒと結合したアジド官能基を、オリゴヌクレオチドのアルキン置換ホスホジエステル誘導体と反応させる工程を含む。図１Ａの式（Ｉ）及び図１Ｂの式（ＸＩＶ）において、オリゴヌクレオチドはそれぞれ、官能基（Ｉａ）、官能基（Ｉｂ）によって、その３’−末端、その５’−末端又は配列内部のいずれかが置換される（官能基（Ｉａ）又は官能基（Ｉｂ）１個のＰ原子は、オリゴヌクレオチド鎖の一部である）。
【図２】分子（ＩＩ）の調製は、ガラクトースの場合の図２に示すスキームに従って、実施することができる。
【図３】図３に、この種類の変形を示す。この場合、目的の分子は、テトラアセチルガラクトシルである。
【図４】本発明によれば、Ｘ＝Ｎの場合、式（ＸＩＶ）、とりわけ式（Ｉ）の分子は、以下の工程を含む方法で調製され、図４に示すことができる。
【図５】式（ＶＩＩ）、とりわけ式（ＶＩＩａ）及び式（ＶＩＩｂ）、又は式（ＶＩＩＩ）、式（ＩＸ）、又は式（ＩＸａ）のホスホロアミダイト（図５）を、オリゴヌクレオチド（ＩＶ）と反応させることにより、分子（Ｉ）が直接得られる。
【図６】図６は、本発明による、３’−置換オリゴヌクレオチドを製造する方法を示す。
【図７】３個の異なる炭水化物を用いてこの方法を反復することにより、図７に示す分子が得られるようになる。
【図８】図８に示すように、Ｃｕ（Ｉ）の存在下、マイクロ波を利用して、１，３−環化付加、いわゆる「クリックケミストリー」によって、３個のガラクトシルアジド誘導体を、固相担持型の３個のアルキン修飾Ｔ１２と複合化した。
【図９】本発明により、１つ又はいくつかの炭水化物誘導体を固相担持型オリゴヌクレオチドに繋ぐ、包括的で、簡単で、頑強で且つ汎用的な戦略を考案し、実施した（図９）。
【図１０】環化付加の割合を、粗物質のＨＰＬＣ／ＭＳ分析によって求めた（図１０）。
【図１１】四量体を合成し（図１１）、クリックケミストリーによってアジド糖との複合体を形成した。
【図１２】図１２に示す変形によれば、式（Ｉ）又は式（ＸＩＶ）のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド鎖の１つ又は数個のリン酸官能基が、前記［化３］のホスホロアミデート基で置き換えられているオリゴヌクレオチド誘導体であり得る。
【図１３】図１３、図１４、図１５及び図１６に、１個、２個又は３個のアルキン官能基を、ホスホエステル官能基又はホスホロアミデート官能基上に導入する方法を示す。
【図１４】図１３、図１４、図１５及び図１６に、１個、２個又は３個のアルキン官能基を、ホスホエステル官能基又はホスホロアミデート官能基上に導入する方法を示す。
【図１５】図１３、図１４、図１５及び図１６に、１個、２個又は３個のアルキン官能基を、ホスホエステル官能基又はホスホロアミデート官能基上に導入する方法を示す。
【図１６】図１３、図１４、図１５及び図１６に、１個、２個又は３個のアルキン官能基を、ホスホエステル官能基又はホスホロアミデート官能基上に導入する方法を示す。
【図１７】図１７に、３個のアルキン官能基を含むホスホジエステル、又は４個のアルキン官能基を含むホスホロアミデートから得られる式（ＩＩＩ）及び式（ＸＩＩＩ）の分子の例を示す。
【図１８】ジアルキンホスホロアミダイト、標準的なヌクレオシドホスホロアミダイト、及びフルオレセインホスホロアミダイトを使用するオリゴヌクレオチド合成
【図１９】図１９の変形は、１個のヌクレオチドがホスホジエステル鎖を有する（ｚ＝０且つｚ’＝１の場合）、式（ＸＩＶ）の分子及び式（ＸＩＩＩ）の分子を示す。
【図２０】本発明の別の目的は、目的の分子Ｒがグラフトしたオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、当該方法は、図２０Ａ及び図２０Ｂに表すように、Ｒと結合したアルキン官能基を、オリゴヌクレオチドのアジド置換ホスホジエステル誘導体と反応させる工程を含む。  図２０Ａにおいて、式（ＸＶＩ）の分子を、アルキン官能基を有する目的の分子（ＸＩ）と反応させることにより、上記で説明したのと同一条件でのクリックケミストリー反応によって分子（ＸＶ）が得られる。  図２０Ｂにおいて、式（Ｘ）の分子を、アルキン官能基を有する目的の分子（ＸＩ）と反応させることにより、上記で説明したのと同一条件でのクリックケミストリー反応によって分子（ＸＩＩ）が得られる。  本発明の別の目的は、式（ＸＶ）又は式（ＸＩＩ）の分子を製造する方法であって、当該方法は、図２０Ａ及び図２０Ｂに示すように、Ｒと結合したアルキン官能基を、オリゴヌクレオチドのアジド置換ホスホジエステル誘導体と反応させる工程を含む。
【図２１】図２１に示す別の戦略を設計して、分子（Ｘ）、分子（ＸＩＩ）、分子（ＸＶＩ）及び分子（ＸＶ）が得られたが、これには、ホスホロアミダイト基上にＢｒ原子（又は別の脱離基）を導入すること、ヌクレオチド鎖を伸長すること、及びその後のＢｒ原子をアジド官能基で置換することが含まれる。
【図２２】図２２は、いくつかのＢｒ置換ホスホロアミダイト誘導体、及びそれらをヌクレオチドにグラフトする方法を示す。
【図２３】α−Ｄ−マンノシド又はα−Ｌ−フコシド誘導体の調製には、Ｏ−アシル又はFischerの立体選択的グリコシル化法をそれぞれ選択した（図２３）。
【図２４】固体支持体上でＤＮＡ様合成を使用して複数回カップリングしたホスホロアミダイトジアルキン構成単位を使用して、プロパルギル化ＰｅＮＡを都合よく調製した（図２４）。  チミジン官能基を有するビーズを、オリゴヌクレオチドの合成に使用される、標準的な一連の脱トリチル化、ベンジルチオテトラゾール活性化によるホスホロアミダイトカップリング、酸化、及びキャッピングに付した（図２４）。
【図１】
2009535323.tif 000068
【図２】
2009535323.tif 000069
【図３】
2009535323.tif 000070
【図４】
2009535323.tif 000071
【図５】
2009535323.tif 000072
【図６】
2009535323.tif 000073
【図７】
2009535323.tif 000074
【図８】
2009535323.tif 000075
【図９】
2009535323.tif 000076
【図１０】
2009535323.tif 000077
【図１１】
2009535323.tif 000078
【図１２】
2009535323.tif 000079
【図１３】
2009535323.tif 000080
【図１４】
2009535323.tif 000081
【図１５】
2009535323.tif 000082
【図１６】
2009535323.tif 000083
【図１７】
2009535323.tif 000084
【図１８】
2009535323.tif 000085
【図１９】
2009535323.tif 000086
【図２０】
2009535323.tif 000087
【図２１】
2009535323.tif 000088
【図２２】
2009535323.tif 000089
【図２３】
2009535323.tif 000090
【図２４】
2009535323.tif 000091
【手続補正書】
【提出日】平成21年1月26日(2009.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２２】
式（ＸＶ）：
【化１１】
2009535323.tif 000092
（式中、
Ｘは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、炭素数１〜１２のアルカンジイルから選択され；主にＸは、Ｎ、Ｏから選択され；
ｍは整数、ｍ≧１であり；
Ｌは、以下のリスト：場合によって１つ又は数個の酸素（−Ｏ−）、窒素（−ＮＨ−、−Ｎ＝）若しくは硫黄（−Ｓ−）架橋又はホスホジエステル［−Ｏ−（Ｏ−）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−］架橋が介在する、直鎖、分枝又は環状の、炭素数１〜１２のアルカンポリイル官能基から選択され得るリンカーであり；
ｘは整数、３０≧ｘ≧１であり；
ｘ’は整数、３０≧ｘ’≧１であり；
Ｄは、Ｘと、トリアゾール環のＮ原子との間のリンカーであり；
Ｄ’は、Ｌと、トリアゾール環のＮ原子との間のリンカーであり；
ｙは、０、１又は２であり；
ｚ及びｚ’は整数、ｚ及びｚ’≧０、ｚ及びｚ’のうち少なくとも１個は≧１であり；
Ｂは、Ｈ、固体支持体又はタグから選択され；
オリゴヌクレオチドは、３’−末端、５’−末端又は配列内部のいずれかで置換され；
Ｒは目的の分子である）
である、分子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
【化２０】
2009535323.tif 000093
【国際調査報告】
2009535323.tif 000094
2009535323.tif 000095
2009535323.tif 000096