(57)【要約】  本発明は、繊維状ファージの表面上で融合タンパク質を生成およびスクリーニングするための新規な技術を提供する。具体的には、２つのファージコートタンパク質の一方または他方のいずれかに融合した所定の一連のタンパク質配列を含む細胞およびファージライブラリーを作製するために、単一のベクターを用いることができる。この手法によって、それに続く、抗体、ペプチド、またはエピトープ結合領域等の、治療または診断上の有用性を有するタンパク質結合分子の、ファージディスプレイベースの選択の効率が単純化および改良される。
2009500030.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合するアミノ酸配列をコードするＤＮＡの双方向性クローニングのためのファージミドベクター。
【請求項２】
ａ）第一のＤＮＡリンカーをその５’末端に含む第一の機能性コートタンパク質をコードするＤＮＡ、および
ｂ）第一の機能性コートタンパク質と反対の転写の方向を有し、第二のＤＮＡリンカーをその５’末端に含む、第二の機能性コートタンパク質をコードするＤＮＡ
を含み、
第一および第二のＤＮＡリンカーが、ファージミドベクター中で前記リンカーの外側に存在しない少なくとも１つの、同一の、制限酵素のための部位を含む、ファージミドベクター。
【請求項３】
ＤＮＡリンカーが、機能性コートタンパク質をコードするＤＮＡの５’末端、および前記機能性コートタンパク質に融合し、これによって提示されるタンパク質配列をコードするＤＮＡの３’末端とともにインフレームで転写することができる、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
第一および第二のＤＮＡリンカーが、配列番号１および配列番号２から選択される配列を含む、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
第一および第二のＤＮＡリンカーが、配列番号４および配列番号５から選択される配列を形成する、請求項３に記載のベクター。
【請求項６】
ｃｐ３*ＤＤｃｐ８*（配列番号１０）を含む、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
前記ＤＮＡリンカーの１つによって前記機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合する少なくとも１つのタンパク質配列のクローニング、発現、および提示のためのＤＮＡカセットをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載のベクター。
【請求項８】
ＤＮＡリンカーによって２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合するタンパク質配列が、抗体、抗体断片、エピトープ、エピトープ結合領域、抗原、アレルゲン、生物活性ペプチド、酵素、酵素阻害剤、酵素触媒部位、ＤＮＡ結合タンパク質、単離されたタンパク質ドメイン、受容体のリガンド、受容体、増殖因子、サイトカイン、および目的のタンパク質配列の近接または重複する断片である、請求項７に記載のファージミドベクター。
【請求項９】
２つの機能性コートタンパク質をコードするＤＮＡが、修飾されたｃｐ３（ｃｐ３＊、配列番号６）およびｃｐ８（ｃｐ８＊、配列番号８）である、前記請求項のいずれかに記載のベクター。
【請求項１０】
ＤＤａカセット（配列番号１１）またはＤＤｂカセット（配列番号１２）を含む、請求項７に記載のベクター。
【請求項１１】
ライブラリーの各タンパク質配列がＤＮＡリンカーによって２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合しているファージまたは細胞ライブラリーを作製するための、請求項１から１０のいずれかに記載のベクターの使用。
【請求項１２】
ライブラリーの各タンパク質配列がＤＮＡリンカーによって２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合している、請求項１から１０のいずれかに記載のベクターを用いて得られるファージまたは細胞ライブラリー。
【請求項１３】
ＤＮＡリンカーによって２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合するタンパク質配列が、抗体、抗体断片、エピトープ、エピトープ結合領域、抗原、アレルゲン、生物活性ペプチド、酵素、酵素阻害剤、酵素触媒部位、ＤＮＡ結合タンパク質、単離されたタンパク質ドメイン、受容体のリガンド、受容体、増殖因子、サイトカイン、および目的のタンパク質配列の近接または重複する断片である、請求項１２に記載のファージまたは細胞ライブラリー。
【請求項１４】
２つの機能性コートタンパク質が、修飾ｃｐ３タンパク質（ｃｐ３＊タンパク質、配列番号７）および修飾ｃｐ８タンパク質（ｃｐ８＊タンパク質、配列番号９）である、請求項１２に記載のファージまたは細胞ライブラリー。
【請求項１５】
請求項１から１０のいずれかに記載のベクターを含む、ライブラリーの各タンパク質配列がＤＩＳリンカーによって２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合しているファージまたは細胞ライブラリーを作製するためのキット。
【請求項１６】
ａ）請求項２に記載のベクターのＤＮＡリンカーに対応するＤＮＡカセットを挿入すること、および
ｂ）得られたベクターで細菌細胞を形質転換すること
を含む、ライブラリーの各タンパク質配列がＤＮＡリンカーによって２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合しているファージまたは細胞ライブラリーを生成するための方法。
【請求項１７】
前記ＤＤカセットの挿入が、ＤＮＡカセットとＢｇＩＩで消化された前記ベクターとをライゲートすることによって得られる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
リガンド、細胞、または標的分子を結合、検出、中和、および／または変化させるための、請求項１６または１７のいずれかに記載の方法によって得られる組換えファージまたは融合タンパク質の使用であって、前記組換えファージまたは融合タンパク質が、単離された形態または混合物の形態である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ファージディスプレイライブラリーを作製するための、改良されたファージミドベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ファージディスプレイをベースとする技術により、それが別のタンパク質または任意の他の生物学的標的に結合することによって媒介される生物学的機能をもつポリペプチドを、クローニング、発現、選択、および加工（操作）するための手段が提供されている。親和性に基づく選択の繰り返しのプロセスによって、抗体、エピトープ、抗原、生物活性ペプチド、酵素阻害剤、酵素、ＤＮＡ結合タンパク質、単離されたタンパク質ドメイン、または受容体のリガンド等のタンパク質配列の、大きいライブラリーから単離された、関連性のあるクローンへの濃縮が可能になる。
【０００３】
他の技術と組み合わせて、ファージディスプレイ技術は、任意の種類の核酸含有物質から単離された配列から開始し、いくつかの型の生成物（抗体、酵素、ペプチド等）をもたらし、現代のバイオテクノロジーの多くの必要性を満たすことができる。最近、数名の著者が、種々のファージディスプレイ技術を用いて機能性タンパク質配列が得られるだけでなく、（診断において、免疫化のために、プロテオミクスにおいて、抗菌化合物(antibacterial compound)として、細胞形質転換において、産業的バイオテクノロジーのために、ナノテクノロジーにおいて、等の）多くの用途に組換えファージを直接用いることができることを報告した。
【０００４】
さらに、組換えファージの表面上で発現される可変重／軽鎖ヘテロ二量体（またはＦａｂ）および単鎖可変領域（またはｓｃＦｖ）等の幅広いレパートリーの抗体断片の構築、それに続く、抗原上を「パニング(panning)」することによる親和性に基づくファージの選択が、所望の親和性および特異性を有する抗体を得るための多用途の、かつ迅速な方法として開発されている。この選択プロセスは、続いて、選択されたファージの変異抗体のレパートリーを作製することによって最適化することができ、例えば、よりストリンジェントな条件下およびより高い親和性で抗原に結合する、子孫についてサンプリングすることができる。
【０００５】
ファージディスプレイ技術は、細菌細胞（具体的にはＦ−ｐｉｌｉを有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞）に感染し、相同性の高い、一本鎖ゲノムを有する、繊維状ファージ（Ｍ１３、ｆ１、またはＦｄ等）の小さい容量および適応性を利用する。多くの最近の論文（Sidhuら、2000年、Benhar、2001年、Sidhu、2001年、Szardenings、2003年、BradburyおよびMarks、2004年、HustおよびDubel、2004年、Manciniら、2004年、Piniら、2004年、ConradおよびScheller、2005年、HustおよびDubel、2005年、Silacciら、2005年、Smithら、2005年）および書籍（「Phage display:A practical Approach」、第266巻、ClacksonおよびLowman  Ｈ編、Oxford Univ.Press、2004年、「Phage Display:A laboratory Manual」、Burton  DRら、CSHL  Press、2001年）で概説されているように、多数のベクター、ライブラリー、およびディスプレイフォーマト（形式）が開発されている。
【０００６】
繊維状ファージの表面を形成するタンパク質配列（コートタンパク質と呼ばれる）は、融合タンパク質を形成しているそのＮまたはＣ末端にクローニングされた異種タンパク質配列を、多かれ少なかれ効率的に収容および提示することができる。この目的のために、種々のコートタンパク質（ｃｐ）、具体的にはマイナーコートタンパク質（コートタンパク質III/3、g3p、gIIIp、p3、pIII、cpIII、またはcp3とも名づけられている）およびメジャーコートタンパク質（コートタンパク質VIII/8、g8p、gVIIIp、p8、pVIII、cpVIII、またはcp8とも名づけられている）だけでなく、他のコートタンパク質cp6、cp7、およびcp9も用いられてきた（Gaoら、1999年、Huftonら、1999年、Kwasnikowskiら、2005年）。修飾されたファージタンパク質が存在するコピーの数によって、高価数（high valency:すなわち、cp8のようにファージタンパク質が多数のコピーで存在する場合）と低価数（すなわち、cp3、cp6、cp7、またはcp9のようにファージタンパク質が少数のコピーで存在する場合）のディスプレイを区別することができ、両方の手法によって、特定の標的に結合するタンパク質配列を選択する可能性が提供される。
【０００７】
コートタンパク質と、提示されるべきタンパク質との融合は、ファージベクターまたはファージミドベクターのいずれかを用いることによって行うことができ、特定の結合剤または標的を用いてスクリーニングすることができるライブラリーを提供する（O'Connellら、2002年）。両方の場合において、そのＮ末端にクローニングされて分泌／リーダー配列によって露出した異種タンパク質配列を有する融合タンパク質への転写および翻訳のために、コートタンパク質が修飾される。
【０００８】
ファージベクターを用いる場合、融合タンパク質をコードするＤＮＡが、ファージゲノムのコートタンパク質に直接クローニングされ、高いディスプレイレベルが可能になるが、異種配列のサイズおよびクローニング戦略は大きく制限される。このシステムのいくつかの変形が記載されており、ここで、同じコートタンパク質の、修飾された、および修飾されていない変異体の組合せが、同じファージベクター中に存在する。かかるベクターは、「88」、「33」、または「8+8」型として定義される（Enshell-Seijffersら、2001年、PetrenkoおよびSmith、2004年）。
【０００９】
ファージミドベクターを用いる場合、構築物はより小さく、細菌およびファージ細胞周期の両方の間に複製を引き起こすが、１つ（または少数）のコートタンパク質しか発現しない配列を含む。ファージミドベクターは、ファージの表面上で発現される配列のライブラリーを作製するために、組換えＤＮＡ技術によって、より容易に操作される。しかしながら、これらのベクターは、形質転換細菌細胞が、後に、ファージの正しい複製およびパッケージングを支持する完全なファージ（「ヘルパー」ファージ）に感染した場合にのみ、完全なファージを提供することができ、組換えファージの再感染およびそれに続く増幅に必要な野生型のコートタンパク質を供給する。
【００１０】
ファージディスプレイスクリーニングを行うために使用されるベクターおよび配列を最適化する可能性に関して広範な研究が行われ、別のものよりもあるコートタンパク質を使用することにおける、いくつかの制約（Makowski、1993年）または種々のコートタンパク質によって異種タンパク質配列が実際どのようにして提示されるのかの違い（Iannoloら、1995年、WeissおよびSidhu、2000年、Weissら、2000年、Rothら、2002年、Liら、2003年、HeldおよびSidhu、2004年)が同定された。
【００１１】
例えば、異なる特性を有する２つ以上のタンパク質配列（例えば、あるものは抗原を結合し、別のものは固体基質上に存在するリガンドまたは異なるエピトープ結合ペプチドを結合する）が、単一の二機能性ファージ（文献中、「デュアルディスプレイ」または「ダブルディスプレイ」ファージとも名づけられている）に提示された。各配列を、異なるコートタンパク質（または同じコートタンパク質の異なる変異体）とともに、モノもしくはバイシストロニック（cictronic）な変異体中に集合した同じファージミドベクター中の異なる転写単位にインフレームでクローニングすることによって、またはそれぞれが特定の融合コートタンパク質についての２つのファージミドベクターで細菌細胞を二重感染することによって、同様のファージを得ることができる（Bonnycastleら、1997年、MalikおよびPerham、1997年、Gaoら、1999年、Gaoら、2002年、Chenら、2004年、国際公開第98/05344号、国際公開第95/05454号、国際公開第01/25416号）。非常に効率的ではあるが、現在利用可能なファージディスプレイ技術は、依然として改良の余地があり、提示のためのコートタンパク質の選択は、依然として重要な課題である。
【００１２】
実際、システムの効率は、予め判定することができない特性である、他の特定のコートタンパク質配列よりはよいものを用いて、発現、提示、およびスクリーニングされるべきタンパク質配列の「適応度(fitness）」に、実質的に影響される。例えば、この目的のためにより頻繁に使用されるコートタンパク質を考慮すると、cp8は、cp8システムの多価性（multivalency）によって増強される結合能力のために、ペプチドまたは低親和性抗体を選択するのにより適切であるようである。対照的に、異種タンパク質配列がファージ表面上に存在しているコピー数が少ないことを考慮すると、cp3ベースのディスプレイは、高親和性抗体を選択するのにより適切であるようである。しかしながら、ライブラリー中の抗体の親和性が高度に可変性であり、その程度を予測するのが不可能であると仮定すると、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞膜周辺腔（ペリプラズマ空間）中のcp3/cp8ベースの融合タンパク質の原核生物またはファージミドベクターに含まれる配列を排除する組換え事象等の他の要因が、ディスプレイシステムに影響を及ぼし得る。
【００１３】
ファージディスプレイペプチドを考慮する場合により関連性のある同様の問題が、いくつかの論文において実証されており、この技術の可能性の完全な利用のために、提示される抗体／ペプチドレパートリーをコードするＤＮＡを含む同じ試料から開始する、少なくとも２つの異なるファージライブラリーを構築する必要性を明らかに示している。タンパク質配列を提示および選択するためのcp3およびcp8の使用についての文献から判断すると、タンパク質エピトープおよびペプチド（Rouschら、1998年、Zwickら、1998年、Addaら、1999年、GaoおよびZhong、1999年、Yipら、2001年、Al-bukhariら、2002年、O'Connor Kら、20051）、抗体（KretzchmarおよびGeiser、1995年）、または酵素（Verhaertら、1999年）について、種々の特性および／または配列が報告されている。さらに、それぞれが異なるファージミドで別々に作製された２つのファージライブラリーを混合すること（Jacobssonら、2003年）、またはあるコートタンパク質を用いて選択された配列を別のコートタンパク質を提示しているライブラリーに配列を再クローニングすること（Wangら、1997年）もまた、記載されている。機能性タンパク質配列もまた、特に方向付けられることなくランダムな配列がクローニングされるが、ベクターバックボーン内のクローニング部位の５’および３’領域に位置する調節およびコード配列によって一方向に実際に転写および翻訳されるファージディスプレイライブラリーを用いて同定された（ZelenetzおよびLevy、1990年、van Zonneveldら、1995年、StratmannおよびKang、2005年）。
【００１４】
いくつかの特許出願によって、cpVIIおよびcpIXの組み合わせ使用（国際公開第00/71964号）、ファージベクターへの制限酵素認識部位の付加（国際公開第03/093471号、国際公開第03/91425号）、重鎖および軽鎖配列が反対の転写方向に正面に位置する双方向性プロモーターの使用（Denら、1999年）、モノもしくはバイシストロニックな発現のために配置された配列をコードする種々の組合せ（Kirschら、2005年）、コートタンパク質への変異の導入（国際公開第02/103012号、国際公開第00/06717号）、またはライブラリー構築、発現、およびスクリーニングのための種々の手法（国際公開第98/20036号、国際公開第98/14277号、国際公開第97/35196号、国際公開第97/46251号、国際公開第97/47314号、国際公開第97/09446号、国際公開第03/029456号）等の、ファージディスプレイ技術の変形が開示されている。あるいは、多くの文献に、ファージミドへタンパク質配列を集合させるための部位特異的組換えに基づいたクローニングシステムが記載されている（国際公開第92/20791号、国際公開第95/021914号、国際公開第97/020923号、国際公開第00/31246号、国際公開第96/40714号、Tsurushitaら、1996年、SblatteroおよびBradbury、2000年）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、これらの文献のうち、２種のコートプロテインの一方または他方に融合した複数の異種タンパク質のディスプレイを可能とする単一ファージライブラリーを、異種タンパク質をコードするＤＮＡのライブラリーと単一のファージミドから開始して、どのようにして作製できるかを開示しているものはない。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の概要）
本発明は、単一のファージミドベクター、ならびに単一のクローニング及び形質転換工程を用いた、繊維状ファージの表面上の２つのコートタンパク質のいずれか一方と融合したタンパク質としてアミノ酸配列をクローニング、生成、およびスクリーニングする手段を提供する。
【００１７】
第一の実施形態において、本発明は、２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合するアミノ酸配列をコードするＤＮＡの双方向性クローニング(bidirectional cloning）のためのファージミドベクターを提供する。
【００１８】
第二の実施形態において、本発明は、
ａ）第一のＤＮＡリンカーをその５’末端に含む第一の機能性コートタンパク質をコードするＤＮＡ、および
ｂ）第一の機能性コートタンパク質と反対の転写の方向を有し、第二のＤＮＡリンカーをその５’末端に含む、第二の機能性コートタンパク質をコードするＤＮＡ
を含み、
第一および第二のＤＮＡリンカーが、ファージミドベクター中の前記リンカーの外側には存在しない、制限酵素のための少なくとも１つの同一の部位を含む、ファージミドベクターを提供する。
【００１９】
pDD（ダブルディスプレイのためのファージミド）として遺伝学的に定義されるかかるファージミドの例は、DISリンカー2（配列番号２および配列番号３）を形成するタンパク質リンカーをコードするＤＮＡ配列が続く場合がある、それぞれが近接したSpeI-BgII制限酵素認識部位（配列番号１）をそれらの５’末端に有するDISリンカーとも呼ばれる２つの分離したＤＮＡリンカーを含むものである。あるいは、それぞれが２つの鎖上下流および上流のタンパク質リンカーをコードする２つの異なるＤＮＡ配列の付加でDD-DISリンカー2（配列番号５）を形成することができる単一の配列（配列番号４）中に、SpeI-BgII制限酵素認識部位を組み合わせることができる。ＤＮＡリンカーは、機能性コートタンパク質をコードするＤＮＡの５’末端、並びに前記機能性コートタンパク質に融合し、これによって提示されるタンパク質配列をコードするＤＮＡの３’末端とともにインフレーム（in frame）で転写することができる。
【００２０】
第三の実施形態において、本発明は、ダブルディスプレイ発現カセット（DDカセット）を含むファージミドベクターを提供する。かかるベクターは、前記ＤＮＡリンカーによって前記機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合すべき少なくとも１つのタンパク質配列のクローニング、発現、および提示のためのＤＮＡカセットをさらに含む。
【００２１】
pDDベクター内でクローニングされた後、DDカセットは、DDカセットがクローニングされる方向に応じて２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかに作動可能に連結した状態になり、DDカセット内に存在する配列によってそのＮ末端に異種配列を含む融合タンパク質へのその転写および翻訳が可能になる。
【００２２】
修飾cp3（modified cp3: cp3*、配列番号６）および修飾cp8（modified cp3: cp8*、配列番号８）と呼ばれる２つの機能性コートタンパク質をコードするＤＮＡを含むpDDベクターによって、同様のファージミドが提供される。かかるベクターの例は、cp3*DDcp8*（配列番号１０）、DDaカセット（配列番号１１）、またはDDbカセット（配列番号１２）を含むものである。
【００２３】
DDカセットは、例えば選択マーカー遺伝子、細菌の代謝を変化させる遺伝子、または２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合した異種タンパク質配列と相互作用するタンパク質配列をコードする、１つまたは複数のさらなる遺伝子を含んでもよい。かかるさらなる遺伝子は、DDカセットが挿入される方向から独立して転写および翻訳され、任意の方向に方向付けることができる。
【００２４】
第四の実施形態において、本発明は、前記ライブラリーの各タンパク質配列がDISリンカーによって２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合しているファージまたは細胞ライブラリーを作製するための、上記で定義されたベクターの使用を提供する。
【００２５】
第五の実施形態において、本発明は、上記で定義されたベクターを用いて得られる、前記ライブラリーの、各タンパク質配列がDISリンカーによって２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合している、ファージまたは細胞ライブラリーを提供する。
【００２６】
２つの機能性コートタンパク質の例には、修飾cp3タンパク質（cp3*タンパク質、配列番号７）および修飾cp8タンパク質（cp8*タンパク質、配列番号９）が含まれる。
【００２７】
ライブラリーは、いずれの型のベクター中でもクローニングすることができるDDカセットを、あるいはpDDベクター中ですでにクローニングされているDDカセットを、用いて作製することができる。後者の場合、DDカセット中で構築されたライブラリーは、DDカセットの双方向性クローニングを得るために、DISリンカー内で切断する制限酵素での消化、および適合する末端を提供する酵素で切断されたpDDベクターとのライゲーションに供されるべきである。
【００２８】
細胞ライブラリー中のファージミドを、細菌の複製開始点を使用して複製することができるので、pDDベクターのライブラリーは、次いで、細菌細胞中に維持することができる。あるいは、ライブラリーは、かかる細菌細胞をヘルパーファージに感染させることによってファージライブラリーとして複製することができ、ファージミドを含み、DISリンカーによって２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合して、それらの表面上で異種タンパク質配列を発現する組換えファージの形態で、精製することができる。
【００２９】
第六の実施形態において、本発明は、上記で定義されたベクターを含む、ライブラリーの各タンパク質配列がDISリンカーによって２つの機能性コートタンパク質配列の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合している、ファージまたは細胞ライブラリーを作製するためのキットを提供する。
【００３０】
第七の実施形態において、本発明は、
ａ）２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合するアミノ酸配列をコードするＤＮＡの双方向性クローニングのためにファージミドベクターのDISリンカーに対応させてDDカセットを挿入すること、および
ｂ）得られたベクターで細胞を形質転換すること
を含む、ライブラリーの各タンパク質配列がDISリンカーによって２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合している、ファージまたは細胞ライブラリーを生成するための方法を提供する。
【００３１】
前記DDカセットの挿入は、DDカセットと、BgIIで消化されて適合する末端を有するベクターとを、ライゲートすることによって得ることができる。
【００３２】
本発明の方法によって得られる組換えファージ、ならびに融合タンパク質は、単離された形態、または混合物の形態で、リガンド、細胞、または標的分子を、結合、検出、中和、および／または変化させるために使用することができる。組換えファージ、または融合タンパク質のこの活性は、in vivoおよび／またはin vitroで検出することができる。
【００３３】
全ての実施形態において、DISリンカーによって２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合した異種タンパク質配列は、抗体、抗体断片、エピトープ、エピトープ結合領域、抗原、アレルゲン、生物活性（bioactive）ペプチド、酵素、酵素阻害剤、酵素触媒部位（enzymatic catalytic site）、ＤＮＡ結合タンパク質、単離されたタンパク質ドメイン、受容体のリガンド、受容体、増殖因子、サイトカイン、および目的のタンパク質配列の近接（contiguous）または重複する断片であってもよい。
【００３４】
単離された組換えＤＮＡおよびタンパク質配列ならびに他の方法および使用を含む、本発明のさらなる実施形態を、以下の説明において提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
（発明の詳細な説明）
本発明の基礎にある技術的問題は、配列を単一もしくは２つのいずれかのファージミドベクター中で２度クローニングすることなく、および／または細菌細胞に２度感染することなく、繊維状ファージにおいて２つの代替的ファージコートタンパク質のいずれか一方との融合タンパク質として発現および提示されるアミノ酸配列の発現を可能にする単純かつ効率的なシステムを、どのようにして確立するかということである。
【００３６】
この技術的問題の解決法は、組換えファージの２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合させるべきアミノ酸配列をコードするＤＮＡの双方向性クローニングを可能にするファージミドベクターを構築することによって達成される。
【００３７】
遺伝学的にpDD（ダブルディスプレイのためのファージミド）として定義される、このベクターの基本的要素は、
ａ）第一のＤＮＡリンカーをその５’末端に含む第一の機能性コートタンパク質をコードするＤＮＡ、および
ｂ）第一の機能性コートタンパク質と反対の転写の方向を有し、第二のＤＮＡリンカーをその５’末端に含む、第二の機能性コートタンパク質をコードするＤＮＡ
であり、ここで第一および第二のＤＮＡリンカーは、ファージミドベクター中で前記リンカーの外側には存在しない、少なくとも１つの、同一な、制限酵素のための部位を含む。
【００３８】
本発明のベクターに含まれるべき特定のＤＮＡリンカー配列は、以下、「DISリンカー」（提示および挿入部位リンカー）として示される。同一の、制限酵素のための部位は、かかる酵素で消化されて単純なライゲーション反応に供されたときに、機能性コートタンパク質の５’末端を互いに、またはその先端に同じ部位を有するＤＮＡ断片の挿入に、適合させるよう意図されている（平滑または単鎖の相補的３’／５’末端による）。
【００３９】
さらに、ＤＩＳリンカーは、機能性コートタンパク質をコードするＤＮＡの５’末端、および前記機能性コートタンパク質に融合し、これによって提示されるべきタンパク質配列をコードするＤＮＡの３’末端とともにインフレームで転写することができるように消化されるべきである。したがって、機能性コートタンパク質および提示されるべきタンパク質配列は、結果として、ＤＩＳリンカーによってコードされるタンパク質リンカーによって分離される。このタンパク質リンカーにより、機能性コートタンパク質および提示されるべきタンパク質は配列の両方の特性を質的に変化（例えば、その長さまたはリガンドに対するその親和性によって）させるべきではない。
【００４０】
同様のリンカーが、文献中でファージミドベクターについて開示されており、制限酵素認識部位の型および位置に関して本発明の要件に適合させることができる。例（図１および６）は、Gly4Serリンカーをコードするさらなる配列、形成するDISリンカー２（配列番号２および配列番号３）と組み合わせることができる、２つの制限酵素認識部位（配列番号１）を含む、ＤＩＳリンカーを示す。特に好ましいリンカーは、リンカーの地点で融合タンパク質に高い程度の可動性を提供するものである。例示的かつ好ましいリンカーは、式(Gly4Ser)nを有し、式中ｎは１〜５である。ＦａｂまたはＳｃｆｖに適合させられたリンカーが、文献中で同定されている（Henneckeら、１９９８年）。ファージミドベクター中の２つのDISリンカーは、単純に適合する（すなわち、１つまたは複数の同一な制限酵素認識部位を有する）か、または同一（すなわち、実施例中のように、同一なリンカー配列も有する）であってもよい。
【００４１】
DISリンカーおよび機能性コートタンパク質配列をコードするＤＮＡ配列の配置は、実施例中および図中に示される種々の基準および状況に従って達成することができる。本発明のファージミドは、可変の長さおよび特性を有するＤＮＡ配列によって分離される２つのＤＩＳリンカーを含んでもよく、２つのDISリンカーはまた、DD-DISリンカー２について示されるように、共通の制限酵素認識部位によって互いに直接連結されてもよい（図１６、配列番号４および配列番号５）。
【００４２】
DISリンカーを定義するものと同様な制限酵素認識部位を含む、アダプター／リンカー配列で修飾されたコートタンパク質が、従来技術において開示されている（国際公開第04/078937号、国際公開第03/091425号、国際公開第02/088315号、国際公開第９９／２９８８８号）。しかしながら、これらの文献には、２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかに融合したタンパク質配列の双方向性クローニングを得るために、ファージミドベクターへの２つのDISリンカーの組合せおよび物理的配置を開示しているものはない。
【００４３】
さらに、ベクター中で反対の方向にクローニングされたDISリンカーおよび対応する機能性コートタンパク質の存在（すなわち、それぞれ異なる鎖から転写されている）によって、前記ＤＩＳリンカーの１つによって前記機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合する少なくとも１つのタンパク質配列のクローニング、発現、および提示のためのＤＮＡカセットをさらに含むファージミドベクターの構築が可能になる。
【００４４】
前記DISリンカーの１つによって前記機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合する少なくとも１つのタンパク質配列のクローニング、発現、および提示を可能にする特定のＤＮＡカセットを、以下、ダブルディスプレイ発現カセット（DDカセット）として示す。DDカセットを作製することができる種々の形態を、図１４に示す。
【００４５】
ベクター内に存在するDISリンカーに共通する制限酵素認識部位によってpDDベクター内でクローニングされた後、DDカセットは、DDカセットがクローニングされている方向によって、２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかに作動可能に連結した状態になり、DDカセット内に存在する配列およびDISリンカーによって、Ｎ末端に異種配列を含む融合タンパク質への転写および翻訳が可能になる。
【００４６】
実際、機能性コートタンパク質をコードする各ＤＮＡセグメントは、相違するセンス（divergent sense）の転写はあるが適切なプロモーターなしで、pDDベクター中に組み込まれており、転写および翻訳されるために、DDカセットによって提供されることができるプロモーター（および、欠けている場合は、５’末端で融合する開始ＡＴＧ含有タンパク質配列）の正しい挿入を必要とする。DDカセットを挿入することができる２つの反対方向を考慮すると、これは、DDカセットを含む各pDDベクターにおいて、機能性コートタンパク質の１つのみについて達成される（図１５）。
【００４７】
統計的に、DDカセットが一方のセンスまたは他方に挿入される機会は等しく、同時に、ライゲーション混合物中で得ることができる各DDカセットのいくつかのコピーがある。したがって、pDDベクターおよび同じDDカセット（かつクローニングされている異種タンパク質配列について異なる）に基づくいくつかのＤＮＡ断片で構築されたライブラリーが、一方または他方の方向にクローニングされた各DDカセットを有する少なくとも一対のpDDベクターを含むと予想される。したがって、本発明の方法に従って構築されるライブラリーを形成する細胞組換えファージの集団は、潜在的に、２つの形式（すなわち、一方または他方の機能性コートタンパク質に融合した）で異種タンパク質配列のレパートリーを表す。
【００４８】
「機能性コートタンパク質」は、ファージのコートに挿入されることができ、前記ファージの表面上でそのＮ末端で融合した異種配列を提示することができる、繊維状ファージのコートタンパク質の全体または一部として意図されるべきである。コートタンパク質は、cp3、cp7、cp8、またはcp9を含む、いずれかの繊維状ファージによってコードされるもの（例えば、M13、fl、およびfd）の１つであってもよい。
【００４９】
修飾cp3（cp3*、配列番号６および配列番号７）および修飾cp8（cp8*、配列番号８および配列番号９）と呼ばれる２つの機能性コートタンパク質をコードするＤＮＡでの実施例に示されるように、本発明のファージミドにクローニングされた機能性コートタンパク質の第一および第二の配列の両方は、５’末端（図１および６）に、それらの正しい発現に必要な配列を含まない。適切な調節配列とともに、提示される異種配列の挿入後にのみ、第一または第二いずれかの機能性コートタンパク質が、かかる異種配列を提示する融合タンパク質に実際に転写および翻訳される。
【００５０】
実施例はまた、cp3*およびcp8*をコードするＤＮＡを反対の方向に直接クローニングして、共通の制限酵素認識部位によって互いに連結させ、cp3*DDcp8*と呼ばれる得られる配列に含まれるDD-DISリンカー２を形成することができることを示す（図１６、配列番号１０）。
【００５１】
これらのタンパク質の天然の機能性変異体は公知であり、機能性コートタンパク質と同程度活性のある天然のコートタンパク質の特定の変異体は、実施例に開示されている。多数の非天然コートタンパク質変異体もまた、異種タンパク質配列の提示におけるそれらの特性について、発現および試験されている（Iannoloら、1995年、Gao Cら、1999年、Petrenkoら、2002年、Weissら、2003年、WeissおよびSidhu、2000年、HeldおよびSidhu、2004年、Kwasnikowskiら、2005年）。それらのＮ末端で融合したタンパク質の提示を可能にするコートタンパク質配列のこれらの代替的非天然および天然の変異体のいずれかを、本発明のベクター中で、機能性コートタンパク質として用いることができる。
【００５２】
さらに、機能性コートタンパク質はまた、正しい発現および提示活性に影響を及ぼさない位置に位置するべきである、１つまたは複数の短い異種配列（一般に「タグ」配列と呼ばれる）を含んでもよい。機能性コートタンパク質のこれらの変異体は、上記で定義されたようなアミノ酸配列の１つ、およびタンパク質提示活性を有意に損なうことなくさらなる特性を提供するアミノ酸配列を含む。かかるさらなる特性の例によって、融合タンパク質の、より容易な検出手順、さらなる結合部分、または翻訳後修飾（例えば、リン酸化、細胞内タンパク質分解消化）が提供される。
【００５３】
部分、リガンド、およびリンカーの設計、ならびに融合タンパク質の構築、精製、検出および使用のための方法および戦略は、文献中で広範に議論されている（Nilssonら、1997年、「Applications of chimeric genes and hybrid proteins」Methods Enzymol.第326〜328巻、Academic Press、2000年、国際公開第01/77137号）。
【００５４】
かかるさらなるタンパク質配列は、DISリンカー内、一方もしくは両方の機能性コートタンパク質内、またはDISリンカーと一方もしくは両方の機能性コートタンパク質のＮ末端領域と間で、ファージミドベクター中に位置することができる。さらに、このさらなる配列は、本発明のファージミド中に存在する一方のみまたは両方の機能性コートタンパク質配列に対応して配置することができるか、または一方から他方のコートタンパク質において異なっていてもよい。この手法は、異種タンパク質配列が特定の機能性コートタンパク質に融合するように機能性ディスプレイカセット（ダブルディスプレイ発現カセット、またはDDカセット）が挿入されている、本発明の方法に従って作製されたライブラリー中のファージ全ての検出および単離を助けることができる。
【００５５】
したがって、特定の基質、酵素、または抗体によって検出または固定することができる、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧ、ｃ−Ｍｙｃ、ＨＡタグ、タンパク質分解部位、または任意の他の短いタグ配列等の配列を含むことが特に重要である。種々のタグ（単一または正確な組合せで）が、ファージミドベクター中に存在して、融合タンパク質のin vivoおよび／もしくはin vitroの同定、またはその精製を助けてもよい。種々のタグ配列が、種々のコートタンパク質について試験されている（Nakashimaら、2000年）。タグはまた、水性二相分配（Bandmannら、2002年）または蛍光媒介検出（Morinoら、2001年）を可能にすることができる。コートタンパク質上での提示を向上させることができるプロリンに富むテザーについて示されているように、同様のさらなる配列が、コートタンパク質と、提示されるべき異種配列との間のテザー（tehter）として作用してもよい（Nakayamaら、１９９６年）。
【００５６】
用語「異種タンパク質配列」は、この配列が、それぞれの天然に生じる繊維状ファージのアミノ酸またはヌクレオチド配列として天然に生じないことを示す。融合タンパク質に関連して、異種配列は、それぞれの天然のポリペプチドと同じポリペプチド配列中に生じない。所望とされるタンパク質配列は、典型的には、少なくとも５つのアミノ酸を含む。
【００５７】
修飾cp3タンパク質（cp3*タンパク質、配列番号７）および修飾cp8タンパク質（cp8*タンパク質、配列番号９）での実施例に示されるように、「第一」および「第二」の機能性コートタンパク質は、機能性コートタンパク質の２つの異なる配列として意図されるべきである。これらは、同じまたは異なるファージに由来するべきであり、それぞれは、前記ファージの表面上に異種配列を提示することができることが公知である異なるコートタンパク質、または２つの異なる様式で配列のレベルで修飾された同じコートタンパク質に、相当するべきである（例えば、短い、および長いバージョン、天然および変異のバージョン、タグおよび非タグバージョン、２つの、異なってタグされた配列、等）。
【００５８】
２つの機能性コートタンパク質をコードするＤＮＡは、ファージミドベクターpDDを２つの部分：
ａ）バックボーン、すなわち、２つの機能性コートタンパク質のそれぞれをコードし、細菌およびファージにおける複製に必要な最小の要素を含むＤＮＡの３’末端の間に含まれる領域、ならびにおそらく選択マーカーのための第一の遺伝子等の追加可能な遺伝子、
ｂ）DDカセットがDISリンカーによって、クローニングされているか、またはクローニングされることができる、機能性コートタンパク質をコードする各ＤＮＡの５’末端のDISリンカーの５’末端の間に含まれる領域
に物理的に分割する（図１５参照）。
【００５９】
文献によって、実施例に記載されているベクター中に含まれるColE1およびf1(+)開始点等の細菌およびファージにおける複製に必要な最小の要素の多くの例が提供されている。
【００６０】
ディスプレイカセットの内容は、前記ＤＩＳリンカー中に存在する制限酵素認識部位内にクローニングされた配列によって判定される。ファージミドベクターが、提示されるべきいかなる配列も欠いている場合（「空のベクター」）、ディスプレイカセットは（図１５）
ａ）単に非存在であって、共通の制限酵素認識部位の適合する末端によって単一のものにおいて融合している２つのDIS部位であってもよく、
ｂ）非必須の非コードＤＮＡ配列（一般に、「スタッファー」（stuffer）配列と呼ばれる）からなってもよく、
ｃ）その５’および３’末端に位置する２つのスタッファーＤＮＡ配列によって２つのDISリンカーから分離した第二の選択マーカー遺伝子（バックボーン中に含まれるものと異なる）の遺伝子を含んでもよい。
【００６１】
「選択マーカー遺伝子」は、前記遺伝子を発現する細胞の陽性または陰性の選択を可能にするタンパク質をコードする遺伝子として意図されるべきである。本発明に関連して、遺伝子は、例えば、抗生物質に対する、ファージミドベクターで形質転換された細菌細胞の耐性を可能にするタンパク質をコードして、ベクターの維持を助けてもよい。システムの各要素（すなわち、バックボーン、ディスプレイカセット、およびダブルディスプレイ発現カセット）についての特定の選択マーカーの選択によって、所望のファージミドベクターを含む細菌を単離するための適切な選択基準を適用する機会が与えられる。典型的な細菌の薬物耐性遺伝子は、アンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン／カナマイシン、ゼオシン、またはクロラムフェニコールに対する耐性を与えるものである。
【００６２】
第二のＤＮＡ配列に「作動可能に連結された」第一のＤＮＡ配列は、２つのＤＮＡ配列が、第一のＤＮＡ配列（通常、非調節または調節可能なプロモーターまたは別の転写調節部位を含む）が、測定可能な程度で、第二のＤＮＡ配列（例えば、完全または部分的に完全な、遺伝子のオープンリーディングフレーム）の転写を可能にするか、または変更するように、連結されていることが意図されるべきである。シグナル配列に作動可能に連結されて、DDカセットの特定の末端に向いたプロモーター配列の存在によって、転写がカセットからpDDバックボーンに向けられ、DDカセットの挿入を可能にする要素の対称性と比較した、DDカセットの機能性非対称性が判定される。
【００６３】
異種タンパク質配列を提示するためのpDDベクターの使用は、クローニングおよび／またはＰＣＲ手順によって作製された適切なＤＤカセットでの、「空の」ベクターにおけるディスプレイカセットの置換によって可能になる。
【００６４】
「ダブルディスプレイ発現カセット」（DDカセット）は、線状断片の２つの末端の一方に位置し、バックボーン中に存在する一方または他方の機能性コートタンパク質のＮ末端で提示されるタンパク質配列をコードする、開始ＡＴＧ含有リーダー配列に作動可能に連結された少なくとも誘導可能および構成的（constitutive）プロモーター領域をさらに含む、ファージミドベクターのDISリンカー中に存在する（かつ一般に前記カセット中の残りの部分にない）制限酵素認識部位と適合する５’および３’末端を有する線状ＤＮＡ断片として意図されるべきである。
【００６５】
図１４に示されるように、通常１つまたは複数の制限酵素のための部位によって分離された、異なる機能を有するＤＮＡセグメントの非対称な並置（asymmetric juxtaposition）によって、DDカセットが形成される。この非対称な配置は、ベクターのバックボーンへの方向でカセットから転写が開始する特定の方向に関与する。DDカセットがpDDベクターにクローニングされる場合、この転写によって、DISリンカーによってpDDベクター中の機能性コートタンパク質をコードするＤＮＡに提示されるべき配列をコードするＤＮＡの融合が可能になる。
【００６６】
LacZプロモーターおよびPelBシグナル配列の制御下でペプチドおよびタンパク質を発現するための２つのDDカセットが、DDaカセット（図１７、配列番号１１）およびＤＤｂカセット（図１８、配列番号１２）の名前で実施例中に提供される。特定のカセットは、これらの配列を含むベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子の型に関して本質的に異なる。したがって、抗生物質耐性を使用すると、獲得された耐性に基づいて、pDDベクター（または任意の他のベクター）がDDカセットを含んでいるクローンを選択することが可能である。
【００６７】
機能性リーダー／シグナル配列は、ＰｅｌＢ（軟腐病菌（Erwinia carotovora）由来、実施例に記載されている）、MalE4、PhoA4、LamB4、およびLpp4等の、原核生物遺伝子を細胞膜周辺腔（ペリプラズム）に配置するためのいくつかのタンパク質分解遺伝子において、同定されるものである。改良されたリーダー配列もまた、同定されている（Strobelら、2003年）。
【００６８】
融合タンパク質のDDカセット媒介発現は、リーダー配列によって提示され、DDカセット内で前記タンパク質配列をコードする開始ＡＴＧ含有リーダー配列の５’に作動可能に連結されたプロモーター（細菌中で構成的または誘導可能）の存在によって可能になる。このプロモーターの５’末端は、スタッファーＤＮＡ配列によって、１つまたは複数のさらなる遺伝子を含んでもよいDDカセットの他方の末端から分離している。
【００６９】
文献によって、提示されるタンパク質の発現を向上させるための、および特定の使用のために本発明のベクターを適合させるのに使用することができる、ベクター設計および培養条件の両方をどのようにして最適化するかに関する、多くの比較例が提供されている（「Phage display:A practical Approach」、第266巻、ClacksonおよびLowman H編、Oxford Univ.Press、2004年、「Phage Display:A laboratory Manual」、Burton DRら、CSHL Press、2001年、CorisdeoおよびWang、2004年、Kirschら、2005年、Sidhuら、2000年、Benhar、2001年、Sidhu、2001年、Szardenings、2003年、BradburyおよびMarks、2004年、HustおよびDubel、2004年、Manciniら、2004年、Piniら、2004年、ConradおよびScheller、2005年、HustおよびDubel、2005年、Silacciら、2005年、Smithら、2005年）。
【００７０】
DISリンカーの間またはDDカセット中のスタッファーＤＮＡは、クローニングおよび／または提示プロセスに影響を及ぼしても及ぼさなくてもよい１つまたは複数のさらなる遺伝子（すなわち、タンパク質に自律的に転写および翻訳されることができるＤＮＡ配列）等の、DDカセット中で有するのに望ましい場合があるさらなる要素を含んでもよい。例えば、さらなる選択マーカー遺伝子（クローニングの前に存在する場合、バックボーン中および空のベクターのディスプレイカセット中に含まれるものと異なる）が、DDカセットに組み込まれて、正しいDDカセットを含むファージミドベクターの選択を可能にしてもよい。
【００７１】
あるいは、さらなる遺伝子が、繊維状ファージの別の異なる機能性コートタンパク質、細菌細胞の代謝もしくは生理を変更するタンパク質（BothmannおよびPluckthun、1998年）、またはDISリンカーによって機能性コートタンパク質に融合した提示されるべきタンパク質と相互作用するか、もしくはその活性を変更させる、タンパク質をコードしてもよい。この後者の場合の例は、細菌細胞中で一旦発現されると機能性コートタンパク質に融合した免疫グロブリン重鎖のセグメントとヘテロ二量体化して、ファージの表面上に完全な抗原結合部位を形成することができる、免疫グロブリン軽鎖遺伝子によって表される。このように発現されることができる他のヘテロ二量体化パートナーは、いくつかの受容体タンパク質に特有なものである。しかしながら、DDカセット中のかかるさらなる完全な遺伝子は、それらの発現を誘導可能なプロモーター系の制御下に置くことができるが、DDカセットが挿入される方向から独立して転写および翻訳されるよう意図される。
【００７２】
DDカセットを、pDDベクターを含むいずれかの型のベクター中で、作製、クローニング、維持、および修飾することができる。DDカセットが本発明のファージミド中にクローニングされるとき、または別の型のベクターに挿入されるとき、DDカセット中にクローニングされる要素は、種々の様式で配置することができ（Hoetら、2005年、Kirschら、2005年、Schoonbroodtら、2005年）、さらに細菌中でCre/Loxベースのシステムを利用してシャッフルすることもできる（SblatteroおよびBradbury、2000年）。本発明のファージミドベクターによって、ベクター中に存在する２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかを含む融合タンパク質の転写可能および翻訳可能な配列からなる発現単位の構築が可能になる。したがって、その３’末端で機能性コートタンパク質をコードするＤＮＡを有するモノまたはバイシストロニックな転写産物の発現を駆動することができる、プロモーター、リボソーム結合部位（必要な場合）、開始コドン、およびリーダー／分泌配列が、DDカセットによって提供される。DDカセットはまた、可溶性タンパク質として異種配列の発現を確立するのに十分な配列を含んでもよい。
【００７３】
用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによって転写が開始されることができる配列をいう。例示的原核プロモーターとしては、ポリメラーゼ結合部位、および場合により、シグマ因子の部位が挙げられる。プロモーターは、構成的（すなわち、常に活性がある）または調節可能（すなわち、ある条件下でのみ活性がある）であってもよい。大腸菌（E.coli）において、プロモーターは、長さが３０〜５０塩基対の間である。調節可能プロモーターは、グルコース、ラクトース、IPTG、cAMP、トリプトファン、または他の小分子等の、調節性化学物質に応答することができる。プロモーターは、リプレッサーおよび／または活性化因子によって調節することができ、培養条件を変化させること（例えば、温度、ｐＨ、栄養分等を変化させること）によっても調節することができる。
【００７４】
本発明の双方向性クローニングおよび提示プロセスを得るための、ファージミドベクター中およびDDカセット中のDISリンカーの制限酵素認識部位の根本的な重要性を考慮すると、それらの数は、ＤＮＡの事前の配列決定および／または消化によって、具体的にはDDカセットにおいて（しかし必要な場合、pDDバックボーンにおいても）、確定されるべきである。さらなる望ましくない部位が存在する場合、（実施例中に示されるような）ＰＣＲ変異誘発等の技術によって、元々のＤＮＡに関連する活性を質的に変化させることなく、これらの部位の修飾が可能になる。
【００７５】
ファージミドベクター中に含まれ、機能性コートタンパク質、DISリンカー、または機能性ディスプレイカセットによって発現されるタンパク質をコードするＤＮＡ配列の最適化は、コドン使用頻度が細菌細胞に最も適切であるＤＮＡ配列を選択することによって達成することができる（Rodiら、2002年）。配列を発現する生物に従ってコドン適応および最適化を得るために適用されるソフトウエアおよび基準が利用可能であり、一旦正しい異種配列が検出されると、ファージミドベクター自体または他の発現ベクターへのクローニングに潜在的に危険な制限酵素認識部位を欠くＤＮＡ配列を選択するのを助ける（Groteら、2005年）。
【００７６】
ファージミドベクターの構造および２つのDISリンカーに並置された２つの機能性コートタンパク質の反対の方向を考慮すると、所望のDDカセットをもつ空のベクター（または別のDDカセット）中のＤＮＡカセットの置換は、２つの等しく可能な配置に組み込まれることができるファージミドベクターの２つのDISリンカー中ならびにDDカセットの５’および３’末端中にのみ存在する制限酵素認識部位によって可能になる。したがって、提示されるべきタンパク質（複数可）は、DISリンカーによってコードされるタンパク質配列を用いて、前記コートタンパク質の一方または他方とともにインフレームで連結および発現することができる。
【００７７】
したがって、本発明は、単一の空のベクターおよび単一のDDカセットから開始して、細菌細胞培養物を形質転換するのに使用することができる２つの異なるディスプレイファージミドベクターを作製するための手段を提供する。得られた組換えファージのさらなる使用に応じて、一方または他方のいずれかの融合タンパク質を発現するpDDベクターを含む形質転換細胞の混合物を含むことのような、単一のクローニングおよび形質転換工程によって得られた細胞培養物を維持することが適切である。あるいは、元々の混合された細胞培養物中の単一のクローンを分析して（例えば、プラスミドＤＮＡ抽出、それに続くＤＮＡ配列決定および／または制限分析によって）、所望の方向を有する２つの型のpDDベクターの一方のみを含む特定のクローンを別々に同定および増殖させることができる。
【００７８】
さらに、ファージミドベクター（空の、またはすでにDDカセットを含んでいる）中の選択マーカー遺伝子の選択および位置によって、特定の培養条件を適用して、所望のファージミドベクターを含む細菌クローンを選択することが可能になる。
【００７９】
一旦本発明が理解されると、少なくとも２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかに融合したタンパク質配列のクローニング、発現、および提示を可能にするDDカセットを含む、多種多様なファージミドベクターを作製することができる。具体的には、DDカセットの挿入のためのモジュラー構造および代替的様式によって、単一のクローニングおよび形質転換プロセスで作製された単一のファージライブラリー中で２つの異なるコートタンパク質上に潜在的に提示される同じタンパク質を有するという利点とともに、一般にファージディスプレイシステムに基づいたスクリーニングアッセイに必要なように、タンパク質配列の大きなライブラリーを提示することが可能になる。この手法は、例えばcp3またはcp8において融合タンパク質を発現する組換えファージの場合（KretzschmarおよびGeiser、1995年、Wangら、1997年、Rouschら、1998年、Zwickら、1998年、Addaら、1999年、Verhaertら、1999年、Yipら、2001年、Al-bukhariら、2002年、Jacobssonら、2003年、O'Connor Kら、2005年）において、文献中に開示されている技術において今まで必要とされたクローニングおよび／または形質転換工程を繰り返すことなく、ファージライブラリー中で関連のある配列を同定する機会を相当に増大させることができる。したがって、DDカセットの双方向性クローニングを可能にするファージミドベクターで細菌細胞を形質転換することによって、改良されたファージディスプレイライブラリー、およびより高いレベルの多様性を得ることができる。
【００８０】
この範囲で、ＤＤカセットは、シグナル／リーダー配列と、pDDベクターのDISリンカーにおける挿入のために使用される部位と、の間の正しいフレーム中で提示される配列をクローニングするための適切な制限酵素認識部位を含む。異なる組換えファージにおいて１種を超える配列が提示されなければならない場合（ペプチドまたは抗体のレパートリーで通常起こるように）、クローニングされるべきＤＮＡ断片の一団が、かかる制限酵素認識部位によってDDカセット内にライゲートされ、対応する二重のファージミドの一団を生じる（すなわち、一方または他方のいずれかの機能性コートタンパク質をコードするＤＮＡに作動可能に連結した各ＤＮＡ断片を有する）。pDDベクターにすでにクローニングされたDDカセット中でライブラリーが構築される場合（すなわち、特定の機能性コートタンパク質とともにインフレームで）、かかるライブラリーは、DISリンカー内で切断する制限酵素での消化、および酵素で切断されたpDDベクターとのライゲーションに供されて、DDカセットの所望の双方向性クローニングを得るために、適合する末端を提供するべきである。
【００８１】
「形質転換細胞」は、細胞にとって外来性であって任意の方法（例えば、エレクトロポレーション、化学的形質転換、またはファージ感染を含む感染）によって導入することができる自己複製するＤＮＡを含む、細胞である。
【００８２】
本発明は、単一のDDカセットの双方向性クローニングのための単一のファージミドベクターを利用することならびに単一のDISリンカーベースのクローニングおよび形質転換工程を適用することによって、２つのコートタンパク質の一方または他方のいずれかに融合したライブラリー中に各単一のタンパク質配列が存在する、ファージディスプレイライブラリーを作製するための、キットおよび方法を提供する。キットは、DDカセットの双方向性クローニングのための唯一のファージミドベクター、またはpDDベクターと適合し、ｃＤＮＡ／ゲノム配列の正しいクローニングを可能にするDDカセットを作製するためのベクターおよびプライマー、ＰＣＲ増幅産物、または機能性コートタンパク質を用いて提示されるタンパク質配列をコードする任意の他の二本鎖合成ＤＮＡを含んでもよい。
【００８３】
前記ライブラリーの各タンパク質配列が２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合している細胞またはファージライブラリーを作製するための方法は、
（ａ）２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合するべきアミノ酸配列をコードするＤＮＡの双方向性クローニングのためのファージミドベクターのＤＮＡリンカーに対応してDDカセットを挿入すること、および
（ｂ）得られたベクターで細菌細胞を形質転換すること
を含む。
【００８４】
これらの工程は、繊維状ファージの表面上でいずれかの特定のアミノ酸配列をクローニングおよび発現するための方法にも、特にかかるアミノ酸配列の存在をライブラリー中に検出することが望ましい場合はいつでも、適用されよう。
【００８５】
実施例に記載されているもののようなDISリンカーを使用する場合、DDカセットの挿入は、DDカセットと、BgIIで消化されて適合する末端を有するベクターとを、ライゲートすることによって得ることができる。
【００８６】
本発明のベクターおよび方法を用いて得られるライブラリーは、概説に一般に開示されている技術（Manciniら、2004年、Piniら、2004年、Rhynerら、2004年）またはより適切な戦略および形式を選択するための最近の論文に記載されている改良された方法（Louら、2001年、Vanherckeら、2005年）を用いて、選択または「パニング」することができる。
【００８７】
本発明は、ファージ複製開始点およびファージ非依存性開始点の両方を含む、新規なファージミドベクターを提供する。ファージミドは、完全な組のファージ遺伝子、例えばファージ粒子を生成するのに十分な数の遺伝子を含まない。ファージミドを内部に有する細胞は、細胞が、ファージミド中に存在しない要求性のファージ遺伝子を保有する「ヘルパー」ファージに感染したときに、ファージミドゲノムを含むファージ様粒子を生成することができる。ファージミドベクターは、細菌細胞に感染するために、ヘルパーファージを必要とする。
【００８８】
実施例に開示されているものとは別に、他の適切なヘルパーファージを、それらの使用を支持する細菌培養条件および大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）株とともに、文献中で同定することができる（Rondotら、2001年、Baekら、2002年、Intasaiら、2003年、Kramerら、2003年、Soltesら、2003年、Ravnら、2004年）。一般に、ヘルパーファージは、ＤＤカセットが挿入される方向が何であれ、組換えファージの１つの型のみの感染および増殖を可能にする（すなわち、特定の機能性コートタンパク質にのみ融合したタンパク質を提示する）のが望ましいのでなければ、組換えファージの感染および増殖を支持するべきである。
【００８９】
DDカセット中に含まれ、DISリンカーによってpDDベクター中に存在する一方または他方のいずれかの機能性コートタンパク質配列のＮ末端に融合すべき配列は、リガンドまたは抗体（Fab、ScFV、および任意の他のエピトープ結合断片または誘導体を含む）、エピトープ、エピトープ結合領域、抗原、アレルゲン、生物活性ペプチド、酵素、酵素阻害剤、酵素触媒部位、ＤＮＡ結合タンパク質、単離されたタンパク質ドメイン、受容体のリガンド、受容体、増殖因子、サイトカイン、および目的のタンパク質配列の近接もしくは重複する断片等の標的分子と相互作用することが公知の任意の目的の配列であってもよい。
【００９０】
提示されるタンパク質が、（ｆａｂを形成する免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域等の）２つの異なるタンパク質配列によって形成されるものである場合、配列の１つが、機能性コートタンパク質に融合するべきDDカセット中にクローニングされるが、他方は同様にDDカセット内でも、またはpDDベクターのバックボーン中で、完全な別々の遺伝子によってクローニングおよび自律的に発現される。
【００９１】
DDカセットは、予め他のベクター、ｃＤＮＡライブラリー、もしくはゲノムライブラリーが、または化学合成のいずれかによって生じた核酸からクローニングおよび／または増幅された機能性コートタンパク質に融合するＤＮＡ配列の正しい転写および翻訳を可能にするべきである。具体的には、ＤＮＡは、哺乳動物タンパク質等の、およびより好ましくはヒトタンパク質、またはヒト病原体（例えば、ウイルス）についての、治療または診断上の目的を有するタンパク質をコードするべきである。ヒトタンパク質をコードするＤＮＡの供給源は、任意のヒト細胞および組織であってもよいが、（抗体または抗原等の）免疫性関連タンパク質を同定するためのファージディスプレイ技術の広範な使用を考慮すると、ヒトＤＮＡおよびｃＤＮＡの好ましい供給源は、診断もしくは治療上の目的を有する抗原を発現している細胞（例えば癌細胞）または（腫瘍浸潤リンパ球（tumors-infiltrating lymphocytes)、末梢血リンパ球(total peripheral blood lymphocytes)、循環記憶Ｂ細胞(circulating memory B cells)等の）血液、骨髄、扁桃腺、もしくは癌から単離することができる抗体産生細胞のいずれかである。これらの細胞は、特定の個体（未処理または抗原曝露）から単離することができ、任意の適切な基準（例えば、ＩｇＧアイソタイプを有する抗体を発現している、または表面上にＣＤ２７を発現している、Ｂ細胞）によって予め選択することができる。
【００９２】
本発明に従って調製されたファージミドベクターは、２つのコートタンパク質の一方または他方のいずれかに融合したファージまたは細胞ライブラリーにおいて、細胞または組織に由来するｃＤＮＡライブラリーにおいてコードされるもの等の、多数のタンパク質配列を同時に発現させることに利用でき、双方向性クローニングプロセスによって判定された２つの可能なコンフォメーションの一方における種々のタンパク質をよりよく発現および／またはよりよく提示することができることを利点としている。さらに、コートタンパク質自体に対する抗体を用いて、ファージを検出することができる（Denteら、1994年、Bhardwajら、1995年）。
【００９３】
本発明のベクターを使用して、ＳＩＰにおけるように、異種タンパク質配列の相互作用によって媒介されることができる、２つの、異なって分化したコートタンパク質の間の複合体の形成を含む、他のより複雑な戦略を再現することもできる（Henneckeら、1998年、CebeおよびGeiser、2000年）。あるいは、本発明のベクターを適合させて、一方または他方のいずれかの機能性コートタンパク質へのあるカテゴリーのタンパク質配列の提示を得ることができる「地形（landscape）」組換えファージ（Petrenkoら、2002年）または二機能性ファージ（Gaoら、1999年、Chenら、2004年）を作製することができる。
【００９４】
本発明の方法に従って生成されるファージのライブラリーは、ファージに適用可能なことが公知である任意のスクリーニングアッセイを用いてスクリーニングすることができる。例えば、複合体構造中に、および特に標的同定／検証のために生理学的または治療的に関連のある配置（例えば、in vivoまたはin vitroで癌細胞または内皮に結合する）で存在する標的に接着するファージを同定するために、ファージを、可溶性もしくは固定化された（例えば、プレート上またはビーズ上に）精製された抗原に曝露するか、または細胞全体、組織、もしくは動物に曝露してもよい。これらの抗原に対してなされるファージの選択は、ポジティブ選択（すなわち、特定のリガンドに結合する分子を検出するための）またはネガティブ選択（すなわち、あるリガンドに結合するファージを排除するための）と見なすことができる。
【００９５】
その後、例えば細菌、植物、酵母、または哺乳動物細胞における大規模な組換え生成のために、特定のリガンドに対するその結合に基づいて、異種配列がクローニング、発現、および特異的に単離されている、選択されたファージミドベクターを細菌細胞から抽出し、配列決定し、ＰＣＲ増幅し、および／または別の適切なベクターに再クローニングすることができる。
【００９６】
提示される配列が機能性ダブルディスプレイカセットによって正しくクローニングおよび発現されることができる形式で一旦提供されると、本発明のベクター、方法、およびライブラリーを、ファージディスプレイの公知の使用のいずれかに適合させることができる。配列は、大きいｃＤＮＡ／ＥＳＴライブラリーに由来してもよく、または関連のあるオープンリーディングフレームもしくはタンパク質ドメインおよび配列のファミリーを同定するためにスクリーニングされるゲノム／プロテオームワイドライブラリーに由来してもよい（Rosanderら、2002年、Jacobssonら、2003年、Faixら、2004年）。選択が生物学的活性のための適切なアッセイまたは計算機モデル化と合わせられた場合、抗体に加えて、ファージディスプレイ技術を用いて、生物活性ペプチド選択を検出することができる（Pastorら、2004年、Falcianiら、2005年）。
【００９７】
ファージによって発現されるペプチド配列モチーフによってアレルゲン、抗イディオタイプ、ＢもしくはＴ細胞エピトープ、またはワクチンの定義が可能になるように、バクテリオファージによって提示された非ランダムまたはランダムペプチドのライブラリーをスクリーニングして、抗体を特異的に結合するペプチドを発現しているファージを選択することができる（Zhongら、1997年、Daviesら、2000年、De Berardinisら、2000年、Goletzら、2002年）。あるいは、「サンドイッチ」アッセイは、ファージ上の可変鎖のみのクローニングおよび発現に基づくが、可変軽鎖および重鎖複合体の抗原駆動型の安定化を利用するために、抗原および一方の可変鎖が溶液中に提供される（Watanabeら、2002年）。
【００９８】
ファージのさらなる操作は、種々の理由のために、選択プロセスの間に行うことができる。例えば、ファージを発現している抗体および抗原の混合物を、溶液中でインキュベートすることができ、免疫複合体が、セファロースビーズに結合したプロテインＧまたはプロテインＡとともに沈殿する。次いで、生成されるプラークの数を判定することによって沈殿したファージを定量することが可能なように、沈殿したファージを、大腸菌（E.Coli）の感染を誘導するため、またはＥＬＩＳＡによって相互作用を測定するために、用いることができる（Al-bukhariら、2002年）。
【００９９】
ライブラリーが供される細胞全体または組織を用いることによって、ファージディスプレイ技術を用いて、発現およびスクリーニングされるタンパク質配列の生物学的活性の、より一般的な分析を行うことができる。次いで、関連のある組換えファージが、腫瘍細胞を含む特定の特性を有するヒト細胞の表面等の複合体構造へのそれらの結合（または結合がないこと）に基づいて選択され、新規なマーカーおよび治療標的の同定を助ける（Edwardsら、2000年、LandonおよびDeutscher、2003年、Mutuberriaら、2004年、ShuklaおよびKrag、2005年）。あるいは、相互作用はまた、細胞へのファージの結合だけでなく、その内在化にも関連があり、この特異的活性を有する細胞特異的ペプチドまたは抗体の同定を可能にする（LegendreおよびFastrez、2002年、Floreaら、2003年Elrickら、2005年）。
【０１００】
特異的リガンドとの相互作用の検出は、通常のパニング方法を適用することによって、または蛍光ベースの分光法もしくは顕微鏡法（Lagerkvistら、2001年、Jayeら、2004年）、ホスファターゼ反応（Hanら、2004年）、または他のハイスループット技術（Pausら、2003年、Rhynerら、2004年、Steukersら、2006年）等の、提示されるタンパク質とその結合パートナーとの間の相互作用の評価のためのより精巧な生物物理学的な技術を適用することによって、行うことができる。一般に、抗体断片を提示する多くのライブラリーについて示されているように、それらの中でクローニングされた、より多くの異なる配列を有するライブラリーにおいて、標的に対してより高い親和性を有するタンパク質が見出されているので、パニング手法の成功はまた、スクリーニングされるライブラリーの大きさによる（HustおよびDubel、2005年）。
【０１０１】
一般に、本発明の方法によって得られる組換えファージまたは融合タンパク質は、リガンド、細胞、または標的分子を、結合、検出、中和、および／または変化させるために、直接用いることができ、ここで前記組換えファージまたは融合タンパク質は、単離された形態または混合物の形態である。
【０１０２】
本発明のファージミドベクターにクローニングおよび配置された選択されたコートタンパク質の一方または他方のいずれかとの融合タンパク質として提示される１つまたは複数のタンパク質配列が１つまたは複数のパニングサイクルの後に一旦選択されると、関連のある組換えファージおよび関連のあるＤＮＡ配列を、当該分野で公知の方法（例えば、制限酵素を用いてファージミドベクターから分離する、直接配列決定する、および／またはＰＣＲによって増幅する）に従って、単離および特徴付けすることができる。次いで、Oxford University Press発行の「A Practical Approach」のシリーズの何冊か（「DNA Cloning 2:Expression Systems」、1995年、「DNA Cloning 4:Mammalian Systems」、1996年、「Protein Expression」、1999年、「Protein Purification Techniques」、2001年）を含む、どのようにして組換えタンパク質をクローニングおよび生成するかに関する多くの書籍および総説に記載されているように、これらの配列を、原核または真核宿主細胞へのさらなる修飾および／または発現のための、より適切なベクターに移すことができる。
【０１０３】
一旦適したエピソームの、または非相同的もしくは相同的に組み込むベクターに挿入された、提示および選択されるタンパク質配列をコードするＤＮＡ配列を、任意の適した手段（形質転換、トランスフェクション、結合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接のマイクロインジェクション等）によって、適切な宿主細胞に導入して、それらを形質転換することができる。特定のプラスミドまたはウイルスベクターの選択における重要な因子としては、ベクターを含まないレシピエント細胞から、ベクターを含むレシピエント細胞を認識および選択することができる容易さ、特定の宿主における、所望されるベクターのコピー数、ならびに異なる種の宿主細胞の間でベクターを「往復させる」ことができることが望ましいかどうか、が挙げられる。
【０１０４】
ベクターは、転写開始／終止調節配列の制御下で、原核または真核宿主細胞における融合タンパク質の発現を可能にするべきであり、これらは前記細胞中で構成的に活性があるか、または誘導可能であるよう選択される。次いで、かかる細胞が実質的に豊富になった細胞系を単離して、適した細胞系を提供することができる。真核宿主（例えば、酵母、昆虫または哺乳動物細胞）について、宿主の性質に応じて、異なる転写および翻訳調節配列を採用してもよい。これらは、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サルウイルス等のウイルスの供給源に由来してもよく、ここで調節シグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子と関連がある。例は、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーター等である。遺伝子の発現を調節することができるように、抑制および活性化を可能にする転写開始調節シグナルを選択してもよい。発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする１つまたは複数のマーカーも導入することによって、導入されたＤＮＡによって安定して形質転換されている細胞を選択することができる。マーカーはまた、栄養要求性宿主への光合成栄養、殺生物剤耐性、例えば抗生物質または銅等の重金属を提供してもよい。選択可能なマーカー遺伝子を、発現されるＤＮＡ遺伝子配列に直接連結させるか、またはコトランスフェクションによって同じ細胞に導入することができる。さらなる転写調節要素もまた、最適な発現に必要な場合がある。
【０１０５】
宿主細胞は、原核または真核のどちらでもよい。真核宿主、例えばヒト、サル、マウス等の哺乳動物細胞、昆虫（バキュロウイルスベースの発現系を用いる）およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞が、タンパク質分子に正しい折りたたみまたは正しい部位での糖鎖付加を含む翻訳後修飾を提供するので、好ましい。酵母細胞もまた、糖鎖付加を含む翻訳後ペプチド修飾を行うことができる。酵母において所望のタンパク質の生成に利用することができる強力なプロモーター配列および多くのコピー数のプラスミドを利用するいくつかの組換えＤＮＡ戦略が存在する。酵母は、クローニングされた哺乳動物遺伝子生成物においてリーダー配列を認識し、リーダー配列を有するペプチド（すなわち、プレペプチド）を分泌する。組換えポリペプチドの、長期間の高収量の生成、安定した発現が好ましい。例えば、同じまたは別々のベクター上にウイルスの複製開始点および／または内在性発現要素および選択可能なマーカー遺伝子を含んでもよい発現ベクターを用いて、目的のポリペプチドを安定して発現する細胞系を形質転換してもよい。ベクターの導入の後、濃縮された培地中で１〜２日間細胞を増殖させてから選択培地に切り替えてもよい。選択可能なマーカーの目的は、選択に耐性を付与するものであり、その存在によって、導入された配列をうまく発現している細胞の増殖および回収が可能になる。安定して形質転換されている細胞の耐性クローンは、細胞型に適切な組織培養技術を用いて増殖することができる。かかる細胞が実質的に濃縮されている細胞系は、次いで単離して安定した細胞系を提供することができる。
【０１０６】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は当該分野で公知であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、サル腎臓（ＣＯＳ）、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ  ２９３、Ｐｅｒ．Ｃ６、Ｂｏｗｅｓメラノーマおよびヒト肝細胞癌（例えばＨｅｐ  Ｇ２）細胞ならびにいくつかの他の細胞系を含むがこれらに限定されない、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞系が挙げられる。バキュロウイルス系において、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための物質は、キット形態で市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって商業化されている）。
【０１０７】
免疫グロブリン可変鎖、具体的にはヒト免疫グロブリン可変鎖を発現するファージの場合、重要な修飾は、選択されたＦａｂまたはｓｃＦｖの、好ましいアイソタイプおよび定常領域を有する完全な免疫グロブリンタンパク質への転換である。この種の修飾によって、例えば、ファージディスプレイライブラリー由来単鎖ＦｖまたはＦａｂから構築された全てのアイソタイプの全長ヒトモノクローナル抗体を生成すること、ならびに哺乳動物または昆虫細胞において発現させることが可能になる（Amesら、1995年、Mahlerら、1997年、Persicら、1997年、Boelら、2000年、Liangら、2001年、Guttieriら、2003年）。次いで、本発明のベクターおよび方法を用いて選択されたタンパク質を、例えばマルトース結合タンパク質等の別のディスプレイ足場（display scaffold）への融合（Zwickら、1998年）または単離された組換えタンパク質としてではなく組換えタンパク質の混合物としてのそれらの発現および選択（Sharonら、2005年、Meijerら、2006年）を可能にする他のベクター中でクローニングおよび発現することができる。本発明に従って提示および選択されたペプチド（および１００アミノ酸未満のタンパク質）の場合、これらの配列は、固相合成および液相合成等の化学的合成技術を用いて生成されるのに十分短い。固相合成として、例えば、合成されるペプチドのカルボキシ末端に対応するアミノ酸が、有機溶媒中に不溶性の支持体に結合され、それらのアミノ基および適切な保護基で保護された側鎖官能基を有するアミノ酸がカルボキシ末端からアミノ末端の順で１つずつ縮合されるものと樹脂またはペプチドのアミノ基の保護基に結合したアミノ酸が放出されるものとの交互の反応の繰り返しによって、このようにしてペプチド鎖が伸長する。精製されたペプチドは、合成の間に導入された他の化学基も含むか、またはこれらは、さらに修飾されてデンドリマーを形成することもできる（Piniら、2005年）。
【０１０８】
組換えタンパク質の精製は、この目的のための公知の方法の任意のもの、すなわち、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動法等を含む任意の従来の手順によって行うことができる。本発明のタンパク質を精製するために好ましく使用することができるさらなる精製手順は、標的タンパク質に結合し、生成されてカラム内に含まれるゲルマトリックス上に固定されたモノクローナル抗体またはアフィニティーグループを用いた、アフィニティークロマトグラフィーである。タンパク質を含む不純な調製物はカラムを通過する。ヘパリン、プロテインＡ、プロテインＧ、または特異的抗体によって、タンパク質はカラムに結合するが、不純物は通過する。洗浄の後、ｐＨまたはイオン強度の変化によって、タンパク質をゲルから溶出させる。あるいは、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いることができる。溶出は、タンパク質精製に一般的に採用される水−アセトンベースの溶媒を用いて行うことができる。
【０１０９】
本発明の方法によって同定されたファージ提示タンパク質配列は、免疫検出、Ｔ細胞／ＭＨＣ関連活性の研究（Matsushitaら、2001年、Zhaoら、2001年、Kurokawaら、2002年、Liら、2005年）、および生物学的に活性のある抗体またはタンパク質のＢまたはＴ細胞エピトープマッピング（Bugliら、2001年、Dromeyら、2004年、Di Niroら、2005年）等のいくつかの他の適用を提供することができる。本発明の方法に従って作製されたコンビナトリアルライブラリーはまた、各ファージにおいてタンパク質の配列変異体を発現させ、次いでファージをスクリーニングして、受容体、リガンド、抗原、または酵素基質に対するより高い親和性を有する融合タンパク質変異体を発現しているものを同定することによってタンパク質操作に使用することもでき（Heinisら、2001年、SchooltinkおよびRose-John、2005年）、防御または病原性ヒト抗体の検出に使用することもできる（Ditzel、2000年）。あるいは、これらの変異体は、タンパク質分解に対するそれらの安定性に基づいて選択することができる（BaiおよびFeng、2004年）。ファージディスプレイ技術はまた、脂肪酸（Gargirら、2002年）、植物ホルモン（Suzukiら、2005年）、ＤＮＡ（Nilssonら、2000年）、またはグリカン（van de Westerloら、2002年、Ravnら、2004年）等の非タンパク質標的を認識するタンパク質を特徴付けするために使用することもできる。
【０１１０】
実施例は、レアカット制限酵素認識部位（rare cutting restriction enzyme site）およびＧｌｙ４Ｓｅｒベースの配列を含むＤＩＳリンカー２を用いてＮ末端で増幅および変異されている２つのコートタンパク質（ｃｐ３およびｃｐ８）をコードするＤＮＡ配列を利用することによって、本発明のファージディスプレイ技術を確立するための構築物および実験の設計を説明している。Ｎ末端修飾ｃｐ３およびｃｐ８タンパク質（ｃｐ３*およびｃｐ８*）を別々に発現するファージミドベクターが作製されている。ｃｐ３*またはｃｐ８*ＤＮＡコード配列のいずれかのＮ末端で融合した異種配列（ヒトＦａｂのペプチド）を正しく発現している細胞および組換えファージの生成が実証されている。修飾ファージタンパク質−ペプチド融合タンパク質の発現は、ファージ生成、集合および感染性に影響を及ぼさない。融合ペプチドおよび抗体の結合特性に基づいて行われた、修飾タンパク質を発現するファージの親和性選択が効率的であることを実証して、システムは検証されており、細胞膜周辺腔におけるＦａｂ分子の正しい集合が示されている。
【０１１１】
ＤＩＳリンカーで修飾されたコートタンパク質配列を、pBluescript由来の足場に適切な方向で挿入することができる。この基本的なｐＤＤベクターは、提示される配列（ペプチドまたは抗体可変領域）および抗生物質耐性マーカーを含むＤＤカセットとライゲートされており、これらの配列が２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合している組換えｐＤＤベクターの選択を可能にしている。
【０１１２】
本発明の他の特性および利点は、以下の詳細な実施例から、より明らかになるであろう。本発明のさらなる実施形態は、本明細書中に記載されている特性の任意の組合せを含むことができる。本願全体で引用されている全ての参考文献、係属中の特許出願および公開された特許の内容は、参照によって明確に援用される。
【実施例】
【０１１３】
実施例１
タンパク質およびペプチドを提示するための、繊維状ファージコートタンパク質３（ｃｐ３*）をコードするＤＩＳリンカー２修飾ＤＮＡ配列の調製および発現
ａ）材料および方法
Ｍ１３ヘルパー二本鎖ＤＮＡの生成
市販のバクテリオファージＭ１３ヘルパー（ＶＣＳＭ１３、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）を、その二本鎖複製形態ＤＮＡを単離するための供給源として使用した。２ｍｌのＬＢ培地に、Ｆ’エピソームを保有する細菌株（大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＸＬ１Ｂｌｕｅ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）の５０μｌの培養物を、１×１０11個のバクテリオファージ粒子と混合した。混合物を、一定して振とうしながら、３７℃で４〜５時間インキュベートした。次いで、混合物を１２０００ｘｇで５分間遠心分離して、感染した細菌をペレット化した。上清を除去した後、細菌ペレットを、Ｑｉａｇｅｎミニプレップキットを用いた標準的なＤＮＡ抽出プロトコルにおいて使用し、１％アガロースゲル電気泳動法において分析した。
【０１１４】
ＤＩＳリンカー２Ｎ末端修飾ｃｐ３タンパク質（ｃｐ３*タンパク質）をコードする遺伝子の生成
プライマーｃｐ３*ＦＷおよびｃｐ３*ＲＷ（配列番号１３および配列番号１４、表１）を用いて、ｃｐ３*をコードする遺伝子を生成するためのＰＣＲ反応を行った。５０ｐｇの鋳型ＤＮＡおよび３００ｍＭの各プライマーを用いて、製造業者の使用説明書に従って、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ＰＣＲ増幅を行った。使用したＰＣＲ条件は、９５℃で２分間（１サイクル）；９５℃で２０秒間、６３℃で３０秒間、７２℃で４０秒間（３５サイクル）であった。ＰＣＲ増幅の後、２．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）をＰＣＲ反応に加え、増幅された断片の３’末端に温度依存的に単一のデオキシアデニンの付加を可能にするために、これを７２℃でさらに２０分間インキュベートした。１．５％アガロースゲル中でＰＣＲ産物を電気泳動し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。
【０１１５】
次いで、製造業者の使用説明書に従って、３’末端に付加された単一のデオキシアデニンによって、ｃｐ３*遺伝子をｐＧＥＭ  Ｔ−Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にライゲートした。ライゲーション混合物を用いて、エレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞を形質転換した。翌日、１０個の白色のコロニーを取り出し、４ｍｌのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス（ＬＢ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８９年）に接種し、一定して振とうしながら３７℃で一晩インキュベートした。翌日、２ｍｌの細菌上清を、ミニプレップＱｉａｇｅｎキットを用いたプラスミドＤＮＡ抽出／精製に使用した。次いで、制限エンドヌクレアーゼ酵素によって、ｃｐ３*遺伝子を保有しているｐＧＥＭ  Ｔ−Ｅａｓｙプラスミドを分析した。ｃｐ３*をコードする遺伝子の正しいヌクレオチド配列を検証するために、１つのクローンを選択し、配列決定し、ヌクレオチド配列中の変異Ａ523からＧ523がアミノ酸置換Ｓｅｒ175からＧｌｙ175を生じることを同定した。
【０１１６】
基本的ｐＲＩＢベクター
基本的ｐＲＩＢベクターは、ファージ複製開始点（Ｆ１（＋））、塩基対３〜４５９）、プラスミド複製開始点（ＣｏｌＥ１、塩基対１０３２〜１９７２）、およびアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐr、塩基対１９７５〜２８３２）を含む、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ５２３２８）中に存在する要素を含む。
【０１１７】
さらなる３つの要素が、このベクターに含まれる発現カセットに含まれる。第一の要素は、リーダー配列（５’末端のＰｅｌＢ）とともにインフレームで、終止コドンで終わる断片としてクローニングされる、ＬａｃＺオペロンのプロモーター（配列番号２３）、ＡＴＧ含有リーダー配列ＰｅｌＢ（配列番号２４および配列番号２５）、およびタンパク質配列（例えば、免疫グロブリン軽鎖）をコードするＤＮＡの挿入を可能にする、ＳａｃＩ−ＸｂａＩクローニング部位を含む。第二の要素は、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣＡＴ）である。第三の要素は、リーダー配列（５’末端のＰｅｌＢ）、および終止コドンを含む機能性コートタンパク質（例えば、ｃｐ３*）をコードするＤＮＡ配列（３’末端で）とともにインフレームで、ＳｐｅＩ−ＮｈｅＩクローニング部位を用いてクローニングすることができる、Ｌａｃ  Ｚオペロンのプロモーター（配列番号２３）、ＡＴＧ含有リーダー配列ＰｅｌＢ、タンパク質配列（例えば、免疫グロブリン重鎖上の可変領域）をコードするＤＮＡの挿入を可能にする、ＸｈｏＩ−ＳｐｅＩクローニング部位を含む。空のベクターにおいて、ＳａｃＩ−ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ−ＮｈｅＩ、およびＸｈｏＩ−ＳｐｅＩクローニング部位は、クローニング工程の間に置換される適合する末端を有するＤＮＡスタッファー断片によって分離されている。例えば、スタッファーＤＮＡ配列は、ＳａｃＩ−ＸｂａＩクローニング部位に、かかる制限酵素認識部位と適合する単鎖末端を有する２つのオリゴヌクレオチド（ＬＣスタッファーＦＷおよびＬＣスタッファーＲＷ、配列番号２６および配列番号２７、表１）をアニーリングすることによって得られる合成断片をライゲートすることによって、挿入することができる。
【０１１８】
ｃｐ３*および関連する融合タンパク質の発現のための、ｐＲＩＢ１ベクターの構築
ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙから切除されたｃｐ３*をコードするＳｐｅＩ−ＮｈｅＩ断片が上述のＳｐｅＩ−ＮｈｅＩクローニング部位にライゲートされているｐＲＩＢ基本的ベクターを用いて、ｐＲＩＢ１−ｃｐ３*ベクターを構築した。ライゲーション混合物を用いて、エレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞を形質転換し、翌日、１０個のコロニーを取り出し、４ｍｌのＬＢブロスに接種し、一定して振とうしながら３７℃で一晩インキュベートした。翌日、２ｍｌの細菌懸濁液を、ミニプレップＱｉａｇｅｎキットを用いたプラスミドＤＮＡ抽出／精製に使用した。次いで、正しいｃｐ３*方向を検証するために、制限エンドヌクレアーゼ酵素によって、修飾ｃｐ３*遺伝子を保有するプラスミドを分析した。
【０１１９】
ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩで二重消化して、インフルエンザウイルス赤血球凝集素由来のエピトープをコードし（ＨＡタグ配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ適合末端を有する二本鎖合成ＤＮＡ配列とライゲートしたｐＲＩＢ１−ｃｐ３*から開始して、ｐＲＩＢ１−ＨＡｃｐ３*ベクターを構築した。１μＭの濃度でオリゴヌクレオチド（ＨＡタグリンカーＦＷおよびＨＡタグリンカーＲＷ、表１の配列参照、配列番号１７および配列番号１８）を混合し、それらを９５℃で５分間変性させることによって、ＨＡタグリンカーを得た。次いで、特異的アニーリングを得るために、オリゴヌクレオチド混合物を９５℃の予め温めた水に移し、室温で冷ました。ＸｈｏＩ−ＳｐｅＩ二重消化ｐＲＩＢ１−ｃｐ３*およびＨＡタグリンカーによって構成されたライゲーション混合物を用いて、エレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞を形質転換した。翌日、１０個のコロニーを取り出し、４ｍｌのＬＢに接種し、一定して振とうしながら３７℃で一晩放置した。翌日、２ｍｌの細菌懸濁液を、ミニプレップＱｉａｇｅｎキットを用いたプラスミドＤＮＡ抽出／精製に使用し、次いで、ＨＡタグの存在を検証するために、制限エンドヌクレアーゼ酵素によって分析した。ｃｐ３*とともにインフレームで融合したＨＡタグを有する、所望の特性を示す１つのクローンを選択し、発現実験に使用した。
【０１２０】
ファージディスプレイライブラリーからＣ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質に対するその親和性について単離されたヒトモノクローナル組換えＦａｂの重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列（ｅ４４と呼ばれるがｅ８と同一である）を用いて、ｐＲＩＢ１−ｅ４４ｃｐ３*ベクターを構築した（Ｂｕｒｉｏｎｉら、１９９８年ｂ）。ＸｈｏＩ−ＳｐｅＩおよびＸｂａＩ−ＳａｃＩクローニング部位をそれぞれ用いて、ｅ４４重鎖および軽鎖をｐＲＩＢ１−ｃｐ３*にクローニングした。所望の特性を示し、したがってｃｐ３*とともにインフレームで融合したｅ４４重鎖およびＸｂａＩ−ＳａｃＩ部位の間にクローニングされたｅ４４軽鎖を有する形質転換大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）クローンを、発現実験に使用した。非修飾ｃｐ３配列を用いて、同様に対照ベクター（ｐＲＩＢ−ｅ４４ｃｐ３）を構築した（ＤＩＳリンカー２なし）。
【０１２１】
文献中（Ｂｕｒｉｏｎｉら、１９９７年、Ｂｕｒｉｏｎｉら、１９９８年）で入手可能なファージミドに基づいて、Ｎ末端に融合したｆａｂ（ｅ４４）またはペプチド（ＨＡタグ）ありまたはなしで、ｃｐ３をコードする対照ｐＲＩＢプラスミドを作製（およびｐＲＩＢ−ｃｐ３、ｐＲＩＢ−ＨＡｃｐ３、ｐＲＩＢ−ｅ４４ｃｐ３と名づけた）した。
【０１２２】
ｐＲＩＢ１−ｃｐ３*ベースのプラスミドを用いた、ＨＡｃｐ３*およびｅ４４ｃｐ３*発現の分析
アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含む１０ｍｌのスーパーブロス（ＳＢ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８９年）に、適切な大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＸＬ１Ｂｌｕｅクローン（ｐＲＩＢ１−ｃｐ３*、ｐＲＩＢ１−ＨＡｃｐ３*、ｐＲＩＢ１−ｅ４４ｃｐ３*、またはｐＲＩＢ１−ｅ４４ｃｐ３を含む）を接種し、ロータリーシェイカー中、３７℃で８時間増殖させた。この時点で、増殖している細菌に、イソプロピルチオ−β−Ｄガラクトシド（ＩＰＴＧ、１ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｓｉｇｍａ、ミシガン州セントルイス）を加え、さらに３０℃で一晩インキュベートした。次いで、細胞を遠心分離によって採取し、１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８９年）中に再懸濁し、凍結−解凍処理（３７℃および−８０℃の３サイクル、各工程１５分間）に供した。細胞残屑（残渣）を、微小遠心において、室温で、１５０００ｇでの遠心分離によって、ペレット化し、上清を用いてタンパク質含有量を定量した。２０μｇの全タンパク質を１２％アクリルアミドゲル（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８９年）にロードし、電気泳動によって分離した。再溶解したタンパク質をニトロセルロース膜に移し、次いでこれを、１０％乳を含むＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ）との第一の１時間のインキュベーションによってブロックした。次いで、膜を洗浄し、ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有５％乳中の、１：１０００希釈した抗ＨＡタグ抗体（ＨＡ．１１、Ｃｏｖａｎｃｅ）または１：１００００希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、Ｓｉｇｍａ）に結合したヤギ抗ヒトＦａｂとともに、インキュベートした。第二の１時間のインキュベーションの後、ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０で膜を３回洗浄した。Ｆａｂ検出のために、膜を、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた、増強された化学発光検出に、直接供した。ＨＡタグ検出のために、膜を、ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０中のホースラディッシュペルオキシダーゼン結合した抗マウス（１：１０００希釈）とともに、さらに１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０での３回の洗浄の後、膜を、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた、増強された化学発光検出に供した。
【０１２３】
ｂ）結果
Ｎ末端をトランケートし、ＤＩＳリンカー２を制限エンドヌクレアーゼ部位ＳｐｅＩおよびＳｆｉＩ（５’末端で、１２アミノ酸配列をコードする）ならびに終止コドンの後のＮｈｅＩ制限酵素認識部位（３’で、図１）とともに組み込む、ｃｐ３をコードする天然のＭ１３遺伝子の配列を、ＰＣＲ増幅によって修飾した。ＢＡＣ７６６１８としても公知であり、エンテロバクテリア（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）ファージＭ１３  ｃｐ３タンパク質のアミノ酸２１６〜４２４（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ受託番号Ｐ６９１６８）を含むこの変異体は、元々のシグナル配列およびさらなるＮ末端構造要素を欠くが、ｐＦＣＡＨ−Ｅ８ｄ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＢ０９６１０７）等のこの範囲のために使用されるファージミドにおいて示されるように、依然として正しく融合タンパク質を提示することができる。
【０１２４】
次いで、こうして得られたｃｐ３*タンパク質（２２１アミノ酸、図２）をコードする、Ｎ末端を修飾されたｃｐ３（ｃｐ３*）をコードするＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ  Ｔ−Ｅａｓｙにライゲートし、配列決定した。増幅されたセグメントは、本特許出願において試験されるようなタンパク質の配置または活性に対する影響を有さないアミノ酸置換Ｓｅｒ175からＧｌｙ175を生じるヌクレオチド配列中に、変異Ａ523からＧ523を含む。
【０１２５】
基本的なｐＲＩＢベクターは、プラスミドおよびファージ増幅に十分な周知のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ベクター中に存在する要素、ならびに抗生物質耐性遺伝子を含む。このベクターは、さらなるマーカー遺伝子（クロラムフェニコール耐性遺伝子）および２つの転写単位とともに、発現カセットをさらに含む。両方の転写単位は、ｌａｃオペロンのプロモーター、ＡＴＧ含有リーダー配列ＰｅｌＢ、およびタンパク質配列をコードするＤＮＡの挿入を可能にする特異的クローニング部位を含む。具体的には、かかる部位の一方によって、組換えファージの表面上の異種タンパク質配列（例えば、ｃｐ３*）を発現するために使用される機能性コートタンパク質をコードするＤＮＡ配列との融合が可能になる。
【０１２６】
次いで、得られたｐＲＩＢ１−ｃｐ３*を、十分特徴付けられたペプチド抗原（ＨＡタグ）、またはｅ４４と呼ばれ、ＨＣＶタンパク質Ｅ２に結合するとして特徴付けられている（Ｂｕｒｉｏｎｉら、１９９８年ａ）、ヒトＦａｂのいずれかをコードするＤＮＡがｃｐ３*とともにインフレームで融合している、一連のｐＲＩＢ１ベクターを作製するために使用した（図３）。次いで、対応する対照ファージミドｐＲＩＢ１−ｃｐ３*およびｐＲＩＢ−ｅ４４と比較して、得られたベクターｐＲＩＢ１−ＨＡｃｐ３*およびｐＲＩＢ１−ｅ４４ｃｐ３*（図４）を用いて、ファージディスプレイ適用のために、ｃｐ３*特性を特徴付けた。
【０１２７】
ｐＲＩＢ１−ｃｐ３*、ｐＲＩＢ１−ＨＡｃｐ３*、ｐＲＩＢ−ｅ４４ｃｐ３またはｐＲＩＢ１−ｅ４４ｃｐ３*を含む細菌クローンで調製した全タンパク質抽出物のウエスタンブロットによって、ｃｐ３*ベースの融合タンパク質の発現を検証し、抗ＨＡタグ（図５Ａ）または抗ヒトＦａｂ（図５Ｂ）で分析した。ウエスタンブロットから、ｐＲＩＢ１−ｃｐ３*ベクターを用いて、ｃｐ３*との融合タンパク質として、細菌においてＨＡタグおよびｅ４４  ｆａｂの両方が正しく発現していることが示される。
【０１２８】
ｃ）結論
ＤＩＳリンカー２で修飾されたｃｐ３タンパク質配列（ｃｐ３*）をファージミドベクターにおいてクローニングおよび発現させて、細菌におけるｃｐ３*ベースの融合タンパク質の正しい発現を可能にすることができる。
実施例２
タンパク質およびペプチドを提示するための、繊維状ファージコートタンパク質８（ｃｐ８*）をコードするＤＩＳリンカー２修飾ＤＮＡ配列の調製および発現
ａ）材料および方法
ＤＩＳリンカー２  Ｎ末端修飾ｃｐ８タンパク質（ｃｐ８*タンパク質）をコードする遺伝子、ｃｐ８*ベースの融合タンパク質を発現する関連のあるベクターの生成、およびそれらの分析
市販のバクテリオファージＭ１３ヘルパーから開始するｃｐ８*の生成およびクローニング戦略は、ｃｐ３*について実施例１で示されたものと同一である。プライマーｃｐ８*ＦＷおよびｃｐ８*ＲＷ（配列番号１５および配列番号１６、表１）を用いて、ＰＣＲを行った。使用したＰＣＲ条件は、９５℃で２分間（１サイクル）；９５℃で２０秒間、６３℃で３０秒間、７２℃で４０秒間（３５サイクル）であった。取扱説明書に従って、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ＰＣＲ増幅を行った。使用したＤＮＡ鋳型（ＶＣＳＭ１３から得られる）およびプライマー濃度は、ｃｐ３*ＰＣＲ増幅について記載されたものと同じであった。ＰＣＲ増幅の後、２．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼを加え、７２℃でさらに２０分間反応をインキュベートした。１．５％アガロースゲル中でＰＣＲ産物を電気泳動し、遺伝子抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。
【０１２９】
次いで、修飾ｃｐ８*遺伝子をｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクターにライゲートし、次いで、正しいｃｐ８*配列を検証するために、制限エンドヌクレアーゼ酵素によってクローンを分析し、配列決定した。
【０１３０】
ＳｐｅＩ−ＮｈｅＩで消化して、ＳｐｅＩ−ＮｈｅＩ消化で切除されたｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ由来のｃｐ８*とライゲートしたｐＲＩＢ１−ｃｐ３*を用いて、ｐＲＩＢ２−ｃｐ８*ベクターを構築した。ライゲーション混合物を用いて、実施例１に示されるように、エレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞を形質転換した。結果として、ｐＲＩＢ２−ｃｐ８*から開始し、ｐＲＩＢ１−ＨＡｃｐ３*およびｐＲＩＢ１−ｅ４４ｃｐ３*について上述されたのと同じクローニング戦略を用いて、ｐＲＩＢ２−ＨＡｃｐ８*およびｐＲＩＢ２−ｅ４４ｃｐ８*も作製した。
【０１３１】
ＨＡｃｐ３*およびｅ４４ｃｐ３*について上述されているように、ＨＡｃｐ８*およびｅ４４ｃｐ８*を検出するための全細胞抽出物分析に関するウエスタンブロットを行った。
【０１３２】
ｂ）結果
ｃｐ８のＮ末端をＤＩＳリンカー２で修飾し、関連するファージミドベクターを作製するための手法は、ｃｐ３を修飾するために用いたものと同じである（実施例１参照）。エンテロバクテリア（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）ファージＭ１３  ｃｐ８タンパク質のアミノ酸２４〜７３を含むこの変異体（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ受託番号Ｐ６９５４１）は、元々のシグナル配列のみを欠く。ｃｐ８をコードするＭ１３遺伝子の配列を、ＰＣＲ増幅によって修飾し（ｃｐ８*、６２アミノ酸、図６Ａ）、次いでｐＲＩＢ２−ｃｐ８*ベクター、およびＨＡタグを含むｃｐ８*ベースの融合タンパク質（図７）またはヒトＦａｂ  ｅ４４がクローニングされている一連のベクターを構築するのに使用される、ＰＣＲ産物（図６Ｂ）を作製した。
【０１３３】
ｐＲＩＢ２−ＨＡｃｐ８*、ｐＲＩＢ２−ｅ４４ｃｐ８*を含むか、またはいかなるファージミドベクターも含まない細菌クローンで調製した、全タンパク質抽出物のウエスタンブロットによって、ｃｐ３*ベースの融合タンパク質と同様に、ｃｐ８*ベースの融合タンパク質の発現を検証し、抗ＨＡタグ（図８Ａ）または抗ヒトＦａｂ抗体（図８Ｂ）で分析した。ウエスタンブロットによって、ＨＡタグおよびｅ４４  Ｆａｂの両方が、ｐＲＩＢ２−ｃｐ８*ベクターを用いて、ｃｐ８*との融合タンパク質として、細菌において、正しく発現されていることが示される。
【０１３４】
ｃ）結論
ＤＩＳリンカー２で修飾されたｃｐ８タンパク質配列（ｃｐ８*）を、ファージミドベクター中でクローニングおよび発現させて、細菌において、ｃｐ８*ベースの融合タンパク質の正しい発現を可能にすることができる。
実施例３
ペプチドまたは抗体に融合したｃｐ３*またはｃｐ８*を提示しているファージの機能的検証
ａ）材料および方法
ファージミドの増幅
文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８９年）に記載されているように、以下の方法を行った。エレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞に、５０ｎｇのファージミドベクター（ｐＲＩＢ１−ｃｐ３、ｐＲＩＢ−ＨＡｃｐ３、ｐＲＩＢ−ｅ４４ｃｐ３、ｐＲＩＢ１−ｃｐ３*、ｐＲＩＢ１−ＨＡｃｐ３*、ｐＲＩＢ１−ｅ４４ｃｐ３*、ｐＲＩＢ２−ｃｐ８*、ｐＲＩＢ２−ＨＡｃｐ８*、またはｐＲＩＢ２−ｅ４４ｃｐ８*）をエレクトロポレーションした（０．２ｃｍ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐｕｌｓｅｒキュベット、２．５Ｋｖ）。
【０１３５】
室温で、各キュベットを１ｍｌ、および次いで２ｍｌのＳＯＣ培地（塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、トリプトン２０．０ｇ／Ｌ、酵母エキス５．０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ  ２．５ｍＭｏｌ、ｐＨはＮａＯＨで７．０に調節、オートクレーブの後、使用の直前に１ｌの培地について５ｍｌの２Ｍ  ＭｇＣｌ２無菌溶液および２０ｍｌの１Ｍ無菌グルコース溶液を加えた）で、直ちに洗い流した。３ｍｌ培養物を５０ｍｌポリプロピレンチューブに移し、２５０ｒｐｍ、３７℃で１時間振とうした。各培養物からの１μｌおよび１０μｌを回収し、形質転換効率を計算した。これらを、アンピシリン（Ａｍｐ、１００μｇ／ｍｌ）およびテトラマイシン（Ｔｅｔ、１０μｇ／ｍｌ）を加えたＬＢ寒天プレートに播種し、播種したものを３７℃で一晩インキュベートした。各チューブの残った内容物を、４μｌの低濃度Ａｍｐ（２０μｇ／ｍｌ）および４０μｌのＴｅｔ（１０μｇ／ｍｌ）を加えた２０ｍｌのＳＢを含む瓶に移し、２５０ｒｐｍ、３７℃で１時間、インキュベートおよび振とうした。ＳＢ＋５０μｌの高濃度Ａｍｐ（５０μｇ／ｍｌ）＋２００μｌのＴｅｔ（１０μｇ／ｍｌ）で各培養物を１００ｍｌにし、３７℃でさらに１時間インキュベートした。
【０１３６】
ヘルパーファージ重感染
ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、１０12プラーク形成単位［ｐｆｕ］）を、３７℃、２５０ｒｐｍで２時間さらにインキュベートした各液体培養物に加えた。カナマイシン（７０μｇ／ｍｌ）を加え、培養物を、２５０ｒｐｍ、３０℃で一晩インキュベートおよび振とうした。
【０１３７】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介ファージ沈殿
各培養物由来の５０ｍｌの細菌を、ＪＡ１０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）における４０００ｒｐｍ（２７００ｇ）で、４℃で３０分の遠心分離によって、ペレット化した。各上清を、１０ｍｌの２０％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール、重量８０００、Ｓｉｇｍａ）／２．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を含む清潔なチューブに移した。チューブを穏やかに３〜４回反転させることによって、溶液を徹底的に混合した。次いで、混合物を氷上で少なくとも３０分間インキュベートした。１５０００ｒｐｍ、４℃で４０分間遠心分離することによって、各ファージ試料をペレット化した。ペレットを乱さないよう注意しながら、上清を廃棄した。１ｍｌピペッターで吸引することによって、残りの上清を除去した。ペレットは、１ｍｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１００ｍｌのＰＢＳに１ｇのウシ血清アルブミンを溶解させ、ｐＨをｐＨ７．４に調節する）中に再懸濁し、これを１．５ｍｌチューブに移した。
【０１３８】
再懸濁されたファージでのＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞感染
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅの１つのコロニーを、Ｔｅｔ（１０μｇ／ｍｌ）を加えられた３０ｍｌのＳＢを含む１００ｍｌ瓶に接種し、培養物を３７℃でインキュベートした。対数増殖期中期（ｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）（ＯＤ600＝約０．６）の細菌培養物由来の２ｍｌに、１μｌの各ファージ（１：１００希釈）（ｉｉｉ）を感染させ、細胞を３７℃で２０分間、インキュベートおよび振とうした。各感染した培養物をＳＢで１０ｍｌ（ｉｉ）にし、それを１：１０００希釈（ｉ）した。各培養物からの１０μｌおよび１００μｌを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＴｅｔ（１０μｇ／ｍｌ）を加えたＬＢ寒天プレートに播種した。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。
【０１３９】
ファージＣＦＵ判定
コロニーが最適なサイズであるときに（プレート上で明確に見える）、それらを計数し、式（Ｉ）：
（計数されたコロニー／播種した体積）×１０3（ｉ）×１０4（ｉｉ）×１０2（ｉｉｉ）
を用いてｃｆｕ／μｌを計算した。
【０１４０】
ファージ−抗原結合アッセイ
９６ウェル高結合能力ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中の一連の２つのウェルを、０．３μｇの異なる試験タンパク質：市販のネズミ抗ＨＡタグモノクローナル抗体（ＨＡ．１１、Ｃｏｖａｎｃｅ、２５μｌのＰＢＳ中に溶解させる）、またはＥＣＢバッファー（Ｅｎｖコーティングバッファー、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム、ｐＨ８．６）中に溶解している、文献中（Ｌｅｓｎｉｅｗｓｋｉら、１９９５年）に記載されているように調製した組換えＥ２タンパク質でコーティングした。５０μｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳを加えることによって、陰性対照のためのウェルを調製した。プレートを４℃で一晩インキュベートした。１８０μｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳを加えることによってコーティング反応をブロックし、３７℃で２時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルからＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を吸引し、７０μｌの再懸濁したファージ（ファージミドベクターｐＲＩＢ１−ＨＡｃｐ３*、ｐＲＩＢ１−ｅ４４ｃｐ３*、ｐＲＩＢ２−ｅ４４ｃｐ８*、ｐＲｉｂ２−ＨＡｃｐ８*について上記で提供されたプロトコルを用いて作製した）を各ウェルに加え、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。ウェルの内容物を吸引し、別々のチューブ（ＩＮＰＵＴと名づける）に移し、４℃で保存した。プレートを、予め５６℃に温めたＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０（０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ）で、１０回洗浄した。次いで、各ウェルを５０μｌのパニング溶出バッファー（０．１Ｍ  ＨＣｌ  ｐＨ２．２）で溶出した。同じ抗原を有する両方のウェルの内容物を混合し（ＯＵＴＰＵＴと名づける）、１２μｌのパニング中和バッファー（１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ９．１）を含む清潔なチューブに移した。
【０１４１】
試料の組を収集した。
【０１４２】
組１：
抗ＨＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ１−ＨＡｃｐ３*
抗ＨＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ２−ＨＡｃｐ８*
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ１−ＨＡｃｐ３*
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ２−ＨＡｃｐ８*
Ｅ２に対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ１−ＨＡｃｐ３*
Ｅ２に対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ２−ＨＡｃｐ８*
組２：
Ｅ２に対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ１−ｅ４４ｃｐ３*
Ｅ２に対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ−ｅ４４ｃｐ３
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ１−ｅ４４ｃｐ３*
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ−ｅ４４ｃｐ３
組３：
Ｅ２に対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ−ｅ４４ｃｐ３
Ｅ２に対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ２−ｅ４４ｃｐ８*
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ−ｅ４４ｃｐ３
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ２−ｅ４４ｃｐ８*
上述のＩＮＰＵＴおよびＯＵＴＰＵＴファージに感染した対数増殖期中期（ＯＤ600＝約０．６）の細菌培養物由来の２ｍｌを使用して、ＯＵＴＰＵＴおよびＩＮＰＵＴファージを定量した。感染細胞を、３７℃で２０分間インキュベートおよび振とうした。細胞に全てのｏｕｔｐｕｔおよび１μｌのＩＮＰＵＴ（１：１００希釈）（ｉｉｉ）を感染させた。各感染培養物を、ＳＢで１０ｍｌ（ｉｉ）にし、各培養物由来の以下の体積を、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＴｅｔ（１０μｇ／ｍｌ）を加えたＬＢ寒天プレートに播種した：１０μｌおよび１００μｌのＩＮＰＵＴ感染培養物１：１０００希釈（ｉ）１μｌ、および希釈していない１０μｌのＯＵＴＰＵＴ感染培養物。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。
【０１４３】
コロニーが最適なサイズであるときに、それらを計数し、ＩＮＰＵＴファージについての以下の式（ＩＩ）：
（計数されたコロニー／播種した体積）×１０3（ｉ）×１０4（ｉｉ）×１０2（ｉｉｉ）
に従って、ファージｃｆｕ／μｌを計算した。
【０１４４】
ＯＵＴＰＵＴファージについての最適なサイズのコロニーを計数し、以下の式（ＩＩＩ）：
（計数されたコロニー／播種した体積）×１０4（ｉｉ）
を用いてファージｃｆｕ／μｌを計算した。
【０１４５】
ｂ）結果
ｃｐ３*またはｃｐ８*ベースの融合タンパク質を発現する組換えファージが細胞に感染して異種タンパク質を提示する効率の比較分析を行った。
【０１４６】
エレクトロポレーション効率は、全ての実験における両方の形質転換反応（対応する陽性対照、ｃｐ３ベースのベクターを用いる）で同じであった。ｐＲＩＢ１−ｃｐ３*、ｐＲＩＢ１−ＨＡｃｐ３*、およびｐＲＩＢ１−ｅ４４ｃｐ３*ベクターで得られたｃｆｕ／μｌ値は、陽性対照ファージと同じであり、ｃｐ３*における配列修飾が、ファージタンパク質の正しい発現をもたらす正しいファージ集合に影響を及ぼさなかったことが実証された（図９）。この証拠を、ｐＲＩＢ２ベースのベクターについても確認した（図１０）。
【０１４７】
ＥＬＩＳＡプレート上に固定された（抗体またはウイルスタンパク質等の）特定の結合剤に対してｃｐ３*またはｃｐ８*ベースのファージをパニングした場合の濃縮および選択を評価するために、より機能的なアッセイを行った。
【０１４８】
陰性対照タンパク質（ＢＳＡ、ＨＣＶのＥ２タンパク質）に関して、ＨＡタグに対する市販のモノクローナル抗体を用いて、ｐＲＩＢ１−ＨＡｃｐ３*およびｐＲＩＢ２−ＨＡｃｐ８*ファージの高い濃縮が得られ、ｃｐ３*またはｃｐ８*に融合したＨＡタグを有するファージがペプチドを正しく提示しており、特定の結合剤に対して効率的に選択することができることが実証された（図１１）。
【０１４９】
ＨＣＶのＥ２タンパク質（ｅ４４  Ｆａｂによって特異的に認識される抗原）を用いて、ｐＲＩＢ２−ｅ４４ｃｐ３*またはｐＲＩＢ１−ｅ４４ｃｐ８*ファージの同様のレベルの濃縮が得られ、ここでも、ファージが抗体を正しく提示しており、正しい抗原に対して効率的に選択することができることが確認された（図１２）。対照抗原（ＢＳＡ）と比較した場合、ｅ４４ｃｐ３*を発現するファージは、ｅ４４ｃｐ３を発現するファージのものに匹敵する、特異的抗原に対する選択性を示したが、ｅ４４ｃｐ８*は、おそらく価数の高いｃｐ８タンパク質上で発現される他のｆａｂについて観察される公知の非特異的結合効果のためにより効率が低いことが示された。
【０１５０】
ｃ）結論
組換えファージの表面上での、タンパク質の提示、ならびにペプチドおよび抗体断片を含む特定の結合剤の同定のために、ｃｐ３*およびｃｐ８*発現ファージミドベクターを使用することができる。
【０１５１】
実施例４
ｐＤＤ−ｃｐ３*ｃｐ８*、およびｐＤＤ−ｃｐ３*ｃｐ８*に適合するＤＤカセットの構築
ａ）材料および方法
ｐＤＤ−ｃｐ３*ｃｐ８*バックボーンの構築
ＳｆｉＩは、低効率で、ＤＩＳリンカー２中のその単一の部位を切断することができるが、ベクターはまた、同じＳｆｉＩコア配列（ＧＣＣｎｎｎｎｎＧＧＣ、図１３Ａ参照）を認識する、ＢｇＩＩと名づけられた別の制限酵素で線状化することもできる。
【０１５２】
しかしながら、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ＳＫ＋）中に２つの他のＢｇＩＩ部位がすでに存在するので、元々のＤＮＡ配列中に存在する２つのＢｇＩＩ部位を除去するために、Ｍｕｔ  ＢｇＩＩＡ  ＦＷおよびＲＷ（配列番号２８および配列番号２９、表１）ならびにＭｕｔ  ＢｇＩＩＢ  ＦＷおよびＲＷ（配列番号３０および配列番号３１、表１）と名づけられた２組のプライマーを用いた２回の部位特異的変異誘発において、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ＳＫ＋）の元々の配列を修飾した。ＰｖｕＩＩおよびＳａｐＩ制限酵素認識部位の間に含まれるＭＣＳおよびＬａｃＺ配列を含む０．５ｋｂ断片を欠失させること、ならびにこれらの部位の間で、適合する末端（一方の側では平滑であり、他方の側では単鎖５’末端に配列ＡＧＣを有する）を保有する２つのオリゴヌクレオチド（ｐＤＤリンカーＦＷおよびｐＤＤリンカーＲＷ、配列番号３２および配列番号３３、表１）をアニーリングすることによって得られた合成リンカーをライゲートすることによって、得られたベクター（ｐＢＳ−δＢｇＩＩ）を修飾した。４℃で一晩のインキュベーションの後、１０μｌのライゲーション混合物を、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＸＬ−１  Ｂｌｕｅコンピテント細胞を形質転換するために用いた。翌日、１０個のコロニーを取り出し、合成リンカーの存在を検証するために、ミニプレップ（mini prep）ＤＮＡ抽出に使用した。正しい制限パターンを示す１つのクローンを選択し、配列決定し、ｐＢＳ−ＤｄδＢｇＩと名づけた。
【０１５３】
このプラスミドを、ｐＤＤ−ｃｐ３*ｃｐ８*バックボーンの生成に使用した。この範囲で、ｐＢＳ−ＤＤδＢｇＩを、ＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで消化し、関連のある制限酵素認識部位（具体的にはＳｐｅＩ）および適合する末端を保有する、ｐＤＤリンカー２と呼ばれる合成リンカー（配列番号３４）とライゲートした。ｐＤＤリンカー２  ＦＷおよびＲＷ（配列番号３５および配列番号３６、表１）を用いて、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩのＰＣＲ増幅によって、合成ｐＤＤリンカー２を作製した。ＰＣＲ増幅の後、ｐＤＤリンカー２を、ＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで消化し、ｐＢＳ−ＤＤδＢｇＩにクローニングした。得られたライゲーション混合物を、４℃で一晩インキュベートし、次いで、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞を形質転換するのに使用した。翌日、１０個のコロニーを取り出し、ＳｐｅＩ部位を保有するｐＤＤリンカー２の正しい挿入を検証するために、ミニプレップＤＮＡ抽出に使用した。
【０１５４】
ｐＲＩＢ１−ｃｐ３*およびｐＲＩＢ２−ｃｐ８*から得られたが、望ましくない制限酵素認識部位を排除するために部位特異的変異誘発によって予め修飾されているｃｐ３*およびｃｐ８*をコードするＤＮＡ配列を用いてｐＤＤ−ｃｐ３*ｃｐ８*を作製するために、かかるプラスミド（ｐＢＳ−ＤＤδＢｇＩ２と呼ばれる）を使用した。実際、これらの配列中に元々存在するＤＩＳリンカー２は、コードされるアミノ酸（グリシン）を変化させることなく、ＳｆｉＩ部位に含まれるものに加えて、ＢｇＩＩ制限酵素認識部位を含む。ここでｃｐ３*ｄＢｇＩ（配列番号３９）およびｃｐ８*ｄＢｇＩ（配列番号４０）と呼ばれるｃｐ３*およびｃｐ８*をコードするＤＮＡを生じるプライマーδＢｇＩＩリンカーＦＷおよびＲＷ（配列番号３７および配列番号３８、表１）を用いて、ｃｐ３*およびｃｐ８*において、ＣからＡの置換（ＤＩＳリンカー２の２７位において、配列番号２）を除去した。また、プライマーｃｐ８*ＦＷ  ｎｅｗおよびｃｐ８*ＲＷ（配列番号３９および配列番号４０、表１）を用いて、ｃｐ８*ｄｂｇＩの、５’にＥｃｏＲＩを挿入した。
【０１５５】
ｐＢＳ−ＤＤδＢｇＩ２プラスミドを、まずＳｐｅＩおよびＮｈｅＩで消化し、次いで、適合する末端を保有するｃｐ３*ｄＢｇＩＩ断片とライゲートした。得られたライゲーション混合物を４℃で一晩インキュベートし、次いで、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞を形質転換するのに使用した。翌日、１０個のコロニーを取り出し、ｃｐ３*ｄＢｇＩの正しい挿入を検証するために、ミニプレップＤＮＡ抽出に使用した。１つの陽性クローンから抽出されたプラスミドを、次いで、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩで消化し、適合する末端を保有するｃｐ８*ｄＢｇＩＩ断片とライゲートした。翌日、１０個のコロニーを取り出し、ｃｐ８*ｄＢｇＩの正しい挿入を検証するために、ミニプレップＤＮＡ抽出に使用し、ｐＤＤ−ｃｐ３*ｃｐ８*をもたらした。
【０１５６】
ＣＡＴを発現するＤＤカセット（ＤＤａカセット）の構築
ＢｇＩｕｐｄ  ＦＷおよびＲＷ（配列番号４３および配列番号４４）を用いた１回の部位特異的変異誘発によってＳａｃＩおよびＸｂａＩクローニング部位の５’にＢｇＩＩ部位を挿入するために、ベクターｐＲＩＢ１−ＨＡｃｐ３*をまず修飾した。ｐＲＩＢ１−ＤＤａと名づけられる、得られたプラスミドを、ＢｇＩＩで消化し、このカセットを保有する断片（配列番号１１）を、ＢｇＩＩで消化したｐＤＤ−ｃｐ３*ｃｐ８*にライゲートした。得られたライゲーション混合物を４℃で一晩インキュベートし、次いで、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を加えたＬＢ寒天プレート上で増殖させた大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞を形質転換するのに使用した。翌日、１０個のコロニーをランダムに取り出し、ＮｈｅＩおよびＸｂａＩ消化によって、一方または他方のいずれかの方向でのＤＤａカセットの挿入、結果としてＣＡＴ耐性を発現しているベクターｐＤＤａ−ｃｐ３*およびｐＤＤａ−ｃｐ８*を検証するために、ミニプレップＤＮＡ抽出に使用した。
【０１５７】
ゼオシンに対する耐性を発現するＤＤカセット（ＺＥＯ、ＤＤｂカセット）の構築
ｐＳＶＺｅｏプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来のプライマーＺｅｏ  ＦＷおよびＲＷ（配列番号４５および配列番号４６、表１）を用いて、ゼオシン耐性遺伝子をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片をｐＧＥＭＴｅａｓｙにクローニングした。遺伝子中にＢｇＩＩ部位が存在したので、プライマーＺｅｏδＢｇＩ  ＦＷおよびＲＷ（配列番号４７および配列番号４８、表１）を用いて、１回の部位特異的変異誘発を行った。次いで、修飾されたＺＥＯ遺伝子を、ＳｔｕＩおよびＸｂａＩで消化し、ｐＤＤａ−ｃｐ３*の対応する部位にクローニングし、ｐＤＤｂ−ｃｐ３*を得た。ｐＤＤｂ−ｃｐ３*をＢｇＩＩで消化し、２つの断片を再ライゲートすることによって、対応するｐＤＤｂ−ｃｐ８*ベクターを得た。一方または他方の方向でＤＤｂカセットに対応するＢｇＩＩ断片を有するクローンを、ランダムに選択されたコロニーから抽出されたプラスミドＤＮＡのＮｈｅＩおよびＸｂａＩ消化によって同定した。ゼオシン（１０μｇ／ｍｌ）を添加した、細菌細胞のための通常の培地中で、プラスミドｐＤＤｂ−ｃｐ３*およびｐＤＤｂ−ｃｐ８*を含むクローンを選択した。
【０１５８】
市販のキット（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ番号２００５１８）を使用して、全ての構築物において、部位特異的変異誘発を行った。これらのプライマーは、酵素消化または配列決定によって容易に調べることができ、ベクターの他の特性を変化させない、関連のある部位において、単一のヌクレオチド置換を誘導する。プラスミドＤＮＡ抽出および消化、ＤＮＡ断片精製およびライゲーション、ならびに細胞形質転換のための他の技術は、文献中に記載されているように行った。
【０１５９】
ミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、プラスミドＤＮＡ抽出を行った。ライゲーション混合物を用いて、取り出しおよび特徴付けに十分なコロニーを有するために、エレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞を形質転換した。
【０１６０】
ｂ）結果
上記の前の実施例から、ＤＩＳリンカー（具体的にはＤＩＳリンカー２）の挿入による２つの機能性コートタンパク質の配列における修飾が依然として完全に機能的なコートタンパク質を提供することが示される。ｃｐ３*およびｃｐ８*をコードする配列は、図１３に要約した戦略に従って、本発明のファージミドベクター（ｐＤＤ）中に組み込むことができる。
【０１６１】
ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ＳＫ＋）ベクターを修飾し、反対方向に位置してそれらの５’末端がＤＤ−ＤＩＳリンカー（ＤＤ−ＤＩＳリンカー２）によって分離されている、ｃｐ３*およびｃｐ８*の連続的クローニングを可能にする合成リンカーを導入することによって、基本的なベクターｐＤＤ−ｃｐ３*ｃｐ８*を作製した。クローニングプロセスを有効にする構築の間に、特定の制限酵素認識部位を付加または欠失させた。
【０１６２】
ベクターｐＤＤ−ｃｐ３*ｃｐ８*（図１３）は、ＢｇＩＩ線状化ベクターと適合し、他の要素を含でもよい５’および３’末端を有するＤＤカセットがどの方向であるかに応じて、ｃｐ３*（ｐＲＩＢ１系列のベクターと概念的に同一なプラスミドになる）またはｃｐ８*（ｐＲＩＢ２系列のベクターと概念的に同一なプラスミドになる）のいずれかとの融合タンパク質として提示されるタンパク質配列の双方向性クローニングに進むための、バックボーンベクターである。
【０１６３】
このプラスミドは、ｃｐ３*またはｃｐ８*含有融合タンパク質のいずれかとしてタンパク質を発現するためにＤＤカセットを挿入することができるバックボーンを表す。完全なＤＩＳリンカーを備えたカセットの一方の末端がｐＤＤバックボーン中の２つの機能性コートタンパク質の一方とのインフレームでの配列の融合および転写を媒介することができるように異なる型の配列を非対称に組み合わせることによって、ＤＤカセットを形成することができる（図１４）。配列の残りの部分によって、ＤＤカセットの挿入される方向によらない、他の機能を提供することができる。
【０１６４】
ＤＤカセットの挿入がマーカー遺伝子の欠失または付加と関連し、ＤＤカセットが挿入されているクローンの選択を容易にするように、スタッファーＤＮＡまたはマーカー遺伝子を挿入することによって、基本的なベクターｐＤＤ−ｃｐ３*ｃｐ８*（および一般に、図１４、１５、および１６に示される、ＤＤ−ＤＩＳリンカーによって分離した機能性コートタンパク質コード配列の同じ組立てを示すすべてのベクター）を、さらに修飾することができる（図１５）。
【０１６５】
ｐＲＩＢ１−ＨＡｃｐ３”から開始し、ＢｇＩＩ部位を挿入し、ＨＡを、提示されるべきタンパク質配列をクローニングするのに使用するＤＩＳリンカーの近くの位置でスタッファーＤＮＡとして維持して、ＤＤａおよびＤＤｂカセットと呼ばれる２つの型のＤＤカセット（図１７および１８）を生成した。２つのカセットは、融合タンパク質を転写するために使用されるプロモーターの５’末端と、ＤＤカセット中の任意の他の目的の配列（例えば、ｆａｂを発現するときの軽鎖の可変領域）をクローニングするのに使用される制限酵素認識部位の対の間に位置する、マーカー遺伝子に関して異なる。このマーカー遺伝子（ＣＡＴまたはＺＥＯ）を、ＤＤカセット中の他の転写単位と同じ方向（すなわち、融合タンパク質を発現するためにＤＩＳリンカーが形成されているＤＤカセットの末端を指す）で、ＤＤカセットにクローニングすることができるか、または反対の方向を有してもよい（他のプロモーターからの読み過ごし転写活性（read-through transcriptional activity）を避ける利点がある）。
【０１６６】
カセットを限定する制限酵素認識部位（すなわち、ＢｇＩＩ）を使用することによってＤＤａカセットおよびＤＤｂカセットをｐＤＤベクターから切断し、同じ酵素で切断されたｐＤＤベクター中にＤＤカセットが再度ライゲートされる場合、ＤＤカセットは、ライゲーション混合物で形質転換された各クローンに、一方がカセットの内部で切断し、他方がバックボーン内で切断する２つの酵素の組合せでの消化として、２つの可能な方向の一方で挿入される（図１９）。この結果から、ベクターを配列決定することなくどのようにして挿入事象を分析することができるか、およびスクリーニング手順の前または間にどのようにしてグループ分けすることもできるかが、示される。
【０１６７】
ＤＤａおよびＤＤｂカセットを、それらをｐＤＤまたは任意の他のベクターにクローニングするときに、ライブラリーを構築するために使用することができる。しかしながら、ＢｇＩＩでの消化、および適合する末端を有するｐＤＤベクターとのライゲーションは、所望の特性を有するライブラリーを有するために役立つ。
【０１６８】
結論
その後にプラスミドＤＮＡ抽出／精製方法を用いてクローンからのｐＤＤベースの中間体ベクターの配列決定および／または消化が容易に続くことができる一連のクローニング工程によって、ｐＤＤベクターおよび適合するＤＤカセットを作製することができる。
【０１６９】
これらのｐＤＤベクターおよびＤＤカセットが一旦作製されると、これらを、可能な方向の一方または他方でクローニングされた配列のライブラリーを作製するために使用することができる。例えば、このようにして作製されたＦａｂライブラリーは、重鎖断片がｃｐ３*またはｃｐ８*と融合タンパク質として生成および提示されている、代替的な組換えファージを含むはずである。ＨＡタグペプチド、または抗原由来の他のペプチドも同様である。
【０１７０】
ファージ表面上の２つのコートタンパク質のいずれか一方に連結した抗体断片、ペプチド、または他のタンパク質の構築およびダブルディスプレイのために、上記で概説したベクターを効率的に使用して、二重のクローニング、形質転換、および感染手順なしに、２つの形態で提示される配列の同時のスクリーニングを可能にすることができる。
【０１７１】
本発明の手法によって、発現および／または提示効率が融合したコートタンパク質の内容に依存する抗体または他のタンパク質配列をクローニングする可能性が増大する。さらに、異なる組合せの選択システムの使用（「空の」およびＤＤカセット含有ファージミドベクターに特異的である）によって、正しい構造および配列を有するクローンの同定が容易になる。
実施例５
ペプチドまたは抗体に融合したｃｐ３*またはｃｐ８*を提示するｐＤＤベースの組換えファージの機能的検証
ａ）材料および方法
図１および文献中（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８９年）に記載されているように、ファージミドの増幅、ヘルパーファージ重感染、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介ファージ沈殿、再懸濁したファージでのＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞感染、ファージＣＦＵ判定、ファージ−抗原結合アッセイ、およびファージｃｆｕ／μｌの計算を行った。
【０１７２】
細胞選択の条件に関して、上述のようにＴｅｔを使用したが、アンピシリンを、ｐＤＤ誘導体を含む実験においてはクロラムフェニコール（Ｃａｆ、２０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）で、ｐＤＤａ誘導体を含む実験においてはゼオシン（Ｚｅｏ、１０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌ）で、置換した。
【０１７３】
エレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を、５０ｎｇのファージミドベクター（ｐＲＢ３２、ｐＲＩＢ１−ＨＡｃｐ３*、ｐＲＩＢ２−ＨＡｃｐ８*、ｐＲＩＢ１−ｅ４４ｃｐ３*、ｐＲＩＢ２−ｅ４４ｃｐ８*、ｐＤＤａ−ＨＡｃｐ３*、ｐＤＤａ−ＨＡｃｐ８*、ｐＤＤａ−ｅ４４ｃｐ３*、ｐＤＤａ−ｅ４４ｃｐ８*、ｐＤＤｂ−ＨＡｃｐ３*、ｐＤＤｂ−ＨＡｃｐ８*、ｐＤＤｂ−ｅ４４ｃｐ３*、ｐＤＤｂ−ｅ４４ｃｐ８*）でエレクトロポレーションした（０．２ｃｍ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｐｕｌｓｅｒキュベット、２．５Ｋｖ）。
【０１７４】
以下の組の試料を収集した：
組１：
抗ＨＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤａ−ＨＡｃｐ３*
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤａ−ＨＡｃｐ３*
抗ＨＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤａ−ＨＡｃｐ８*
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤａ−ＨＡｃｐ８*
抗ＨＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ１−ＨＡｃｐ３*
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ１−ＨＡｃｐ３*
抗ＨＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ２−ＨＡｃｐ８*
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ２−ＨＡｃｐ８*
抗ＨＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＢ３２
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＢ３２
組２：
Ｅ２に対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤａ−ｅ４４ｃｐ３*
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤａ−ｅ４４ｃｐ３*
Ｅ２に対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤａ−ｅ４４ｃｐ８*
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤａ−ｅ４４ｃｐ８*
Ｅ２に対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ１−ｅ４４ｃｐ３*
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ１−ｅ４４ｃｐ３*
Ｅ２に対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＢ３２
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＢ３２
組３：
抗ＨＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤａ−ＨＡｃｐ３*
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤａ−ＨＡｃｐ３*
抗ＨＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤｂ−ＨＡｃｐ３*
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤｂ−ＨＡｃｐ３*
抗ＨＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ１−ＨＡｃｐ３*
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ１−ＨＡｃｐ３*
抗ＨＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤａ−ＨＡｃｐ８*
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤａ−ＨＡｃｐ８*
抗ＨＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤｂ−ＨＡｃｐ８*
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤｂ−ＨＡｃｐ８*
抗ＨＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ２−ＨＡｃｐ８*
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ２−ＨＡｃｐ８*
組４：
Ｅ２に対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤａ−ｅ４４ｃｐ３*
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤａ−ｅ４４ｃｐ３*
Ｅ２に対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤｂ−ｅ４４ｃｐ３*
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤｂ−ｅ４４ｃｐ３*
Ｅ２に対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ１−ｅ４４ｃｐ３*
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ１−ｅ４４ｃｐ３*
Ｅ２に対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤａ−ｅ４４ｃｐ８*
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤａ−ｅ４４ｃｐ８*
Ｅ２に対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤｂ−ｅ４４ｃｐ８*
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＤＤｂ−ｅ４４ｃｐ８*
Ｅ２に対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ２−ｅ４４ｃｐ８*
ＢＳＡに対するＯＵＴＰＵＴ  ｐＲＩＢ２−ｅ４４ｃｐ８*
ｂ）結果
ｐＤＤに基づき、ｃｐ３*またはｃｐ８*ベースの融合タンパク質を発現する組換えファージを、ｐＲＩＢ１およびｐＲＩＢ２ベースの組換えファージを機能的に比較したのと同じ手法に従って分析した。
【０１７５】
第一の組の実験は、まずｐＤＤ−ｃｐ３*ｃｐ８*と、ＣＡＦ選択マーカーを発現するＤＤカセットとの組合せ（ｐＤＤａ型ファージミド）によって、ｃｐ３*またはｃｐ８*上でのペプチドおよびｆａｂの正しい発現および選択が可能になることを検証するよう意図した（図２０）。次いで、第二の組の実験は、ｐＤＤ−ｃｐ３*ｃｐ８*と、ＣＡＦ（ｐＤＤａ型ファージミド）またはＺＥＯ（ｐＤＤｂ型ファージミド）選択マーカーのいずれかを発現するＤＤカセットとの組合せによっても、ｃｐ３*またはｃｐ８*上でのペプチドおよびｆａｂの正しい発現および選択が可能になることを検証するよう意図した（図２２）。
【０１７６】
エレクトロポレーション効率は、全ての実験において、両方の形質転換反応（対応する陽性対照、ｃｐ３ベースのベクターを用いる）について同じであった。ｐＲＩＢ１ベース、ｐＲＩＢ２ベース、ｐＤＤａベース、およびｐＤＤｂベースのベクターで得られたｃｆｕ／μｌ値は、同様であり（約１０8〜１０9）、ＺＥＯまたはＣＡＴ選択マーカーのいずれかを含むｐＤＤベースのファージミドが作製された場合に、中間体ファージミドｐＲＩＢ１およびｐＲＩＢ２を用いてｃｐ３およびｃｐ８に導入された修飾も、正しいファージ集合に影響を及ぼさないことが実証された。
【０１７７】
タンパク質または抗体をかかるファージの標的として使用する場合、ここでも、ＣＡＦまたはＺＥＯベースのＤＤカセットを含むファージミドの間のいかなる関連のある差もなしで、特定のｐＤＤベースの組換えファージの高い濃縮が得られる。この特性はｃｐ３*またはｃｐ８*のいずれかを用いてペプチドを発現しているｐＤＤファージミド中で、再現性良く見られるが、これは、高度に特異的なＦａｂを発現するｐＤＤファージミドにｃｐ８*が用いられる場合、有意に低く、依然として、文献中ならびに前述のｐＲＩＢ１およびｐＲＩＢ２ファージミドについて得られた結果が確認される。
【０１７８】
ｃ）結論
ｐＤＤ−ｃｐ３*ｃｐ８*ファージミドを、ＣＡＦまたはＺＥＯのいずれかを、組換えファージの表面上でｃｐ３*またはｃｐ８*ベースの融合タンパク質の形態でタンパク質配列を発現および選択するための選択マーカーとして含む、ＤＤカセットと組み合わせることができる。
実施例６
ｐＤＤベースのライブラリーを用いて選択される配列を発現するための、ｐＤＤ適合性ベクターの構築
ａ）材料および方法
ヒト骨髄由来のｃＤＮＡライブラリーを調製し、このライブラリーを、文献（Ｂｕｒｉｏｎｉら、１９９８年ａ、「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｂｕｒｔｏｎ  ＤＲら、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、２００１年）に従って、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の可変領域をコードするＤＮＡを増幅するＰＣＲ反応の鋳型として使用した。
【０１７９】
ＰＣＲプライマーを、３’末端で部分的に消化し、それらの５’末端をＤＤｂカセットにクローニングするのに必要な制限酵素認識部位を、それらの５’末端に含ませた。軽鎖に特異的な増幅産物を、まず、ＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化し、アガロースゲルから精製した。５μｇのｐＤＤｂ−ＨＡｃｐ３*を、ＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化し、得られたベクターバックボーンをゲル精製し、脱リン酸化し、軽鎖をコードする適合するＤＮＡセグメントとのライゲーション混合物の調製に使用した。４℃で一晩のインキュベーションの後、ＤＮＡ混合物を沈殿させ、２０μｌの水に再懸濁し、コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞をエレクトロポレーションによって形質転換するために使用した。次いで、細胞を、３ｍｌのＳＯＣ中、３７℃で１時間インキュベートした。クローンの数を定量するために、１０および１００μｌの培養物を播種した。次いで、細菌培養物の残りの部分を、アンピシリン（１０μｇ／ｍｌ）、（ゼオシン１０μｇ／ｍｌ）、およびテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を含む１０ｍｌのＳＢに希釈した。３７℃で１時間のインキュベーションの後、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、ゼオシン（５０μｇ／ｍｌ）、およびテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を含む１００ｍｌのＳＢ培地に細胞を希釈し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を採取し、ＤＮＡ精製および抽出に使用した。
【０１８０】
軽鎖を保有する、得られたｐＤＤｂベースのライブラリーを、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩで消化し、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩで予め消化されて、アガロースゲルから精製された、元々の増幅産物から回収した重鎖の挿入に使用した。上述のようにエレクトロポレーションによってコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞を形質転換するために、ライゲーション反応を用いた。
【０１８１】
次いで、軽鎖および重鎖を保有する、得られたｐＤＤｂベースのライブラリーを、ＢｇＩＩで消化し、断片を、同じベクター中で再ライゲートした。ライブラリーの一部（アリコート）を、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）およびゼオシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天上に播種した。１０4〜１０5個程度のクローンで、ライブラリー中のクローンの数を評価した。プレートからコロニーをランダムに選択し、培養物中で一晩増殖させ、ミニプレップＤＮＡ抽出／精製（その後に、上述のようなＮｈｅＩおよびＸｂａＩでの消化ならびにアガロースゲルにおける分析が続く）およびウエスタンブロット（上述のように、検出のために、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ヒトＦａｂを使用する）におけるタンパク質分析の両方に使用した。
【０１８２】
結果
ヒト骨髄細胞由来のＤＮＡライブラリーを、ＨＡタグをＸｈｏＩ−ＳｐｅＩの間にスタッファーＤＮＡとして有するｐＤＤｂベクター内にすでにクローニングされているＤＤｂカセットへのいずれかのＩｇＧ１由来の軽鎖および重鎖のクローニングに使用した。
【０１８３】
軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを、このベクター中で連続的にクローニングし、スタッファーＤＮＡを排除し、得られたライブラリーを、２つの可能な方向のいずれか一方でＤＤｂカセットを再挿入する範囲で、ＢｇＩＩで消化し、再ライゲートして、このようにして、重鎖がｃｐ３*またはｃｐ８*との融合タンパク質として発現されるｐＤＤｂベースのライブラリーを作製した。
【０１８４】
ゼオシン（ＤＤｂカセット中のマーカー遺伝子のために、細胞がこれに対して耐性を有する）存在下で増殖している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体のコロニーをランダムに選択し、ＤＮＡおよびタンパク質の両方のレベルで分析した（図２２）。かかるクローンは、抽出されたプラスミドＤＮＡの制限分析によって示されるように、可能な方向の一方または他方のいずれかに方向付けられたＤＤｂカセットを有し、重鎖がｃｐ８*またはｃｐ３*に連結されているヒトｆａｂ融合タンパク質を発現する。ｃｐ８*への重鎖の融合を可能にする方向に方向付けられたＤＤｂカセットを有するクローンが、ｃｐ３*への重鎖の融合を可能にする方向に方向付けられたＤＤｂカセットを有するクローンと比較して、より高いレベルで生成される、より小さい組換えタンパク質を発現するので、分子量および発現のレベルの差は、制限分析の結果と一致する。
【０１８５】
結論
ＤＤｂカセットは、重鎖がｃｐ３*またはｃｐ８*含有融合タンパク質のいずれかとして発現されるヒトｆａｂのライブラリーを作製するために使用されている。このライブラリーは、単純にＤＩＳリンカーにおける制限酵素認識部位で消化され、再度ライゲートされた、ｐＤＤベースのプラスミドに基づく単一のライブラリーを用いることによって獲得された。
【０１８６】
この基本的なプロセスはまた、任意の型のプラスミド内のＤＤカセット中でクローニングされた配列のライブラリーにも適用することができ、次いで、本実施例において、または図１５に簡潔に要約される他の状況において例示されているように、ｐＤＤベースのベクターに移すことができる。
【０１８７】
ファージディスプレイおよび親和性選択による、ベクターについてのｐＤＤベースのシステムにおける関連のある配列を同定するためのプロセス全体を、概説することができる（図２３）。ＤＤカセット中にクローニングされる、ｐＤＤベクターと、分析される配列のライブラリーとの適切な組合せから開始して、ライゲーションおよび形質転換工程によって、２つの型の融合タンパク質（例えば、ｃｐ３*またはｃｐ８*のいずれかを含む）をコードする、正しい抗生物質の組合せを適用することによって選択可能な細胞ライブラリーが提供される。次いで、ヘルパーファージ感染によって、スクリーニングされるタンパク質が、単一のｐＤＤベクターを用いて作製される同じライブラリー中で混合された２つの集団のファージ上で発現される、組換えファージのライブラリーを同時に生成することが可能になる。次いで、ｃｐ３*またはｃｐ８*のいずれかとの融合タンパク質として発現および提示される、関連のあるタンパク質およびペプチドを、単離、配列決定、および特徴付けするために、文献中に報告されている手法を用いて、このライブラリーをスクリーニングすることができる。
【０１８８】
【表１】
2009500030.tif 000003
【０１８９】
参考文献
【０１９０】
【表２】
2009500030.tif 000004
【０１９１】
【表３】
2009500030.tif 000005
【０１９２】
【表４】
2009500030.tif 000006
【０１９３】
【表５】
2009500030.tif 000007
【０１９４】
【表６】
2009500030.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【０１９５】
【図１】ｃｐ３*ＤＮＡ（配列番号６）およびタンパク質（配列番号７）のＤＮＡおよびタンパク質配列のアラインメントを示す図である。５’末端で、制限酵素認識部位ＳｐｅＩおよびＳｆｉＩ（囲み、配列番号１）ならびにＧｌｙ４Ｓｅｒリンカー（合計１２アミノ酸）をコードする配列を含むＤＩＳリンカー２（下線、配列番号２および配列番号３）が、コートタンパク質ｃｐ３のエンテロバクテリア（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）ファージＭ１３のアミノ酸２１６〜４２４（タンパク質配列ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ受託番号Ｐ６９１６８、ヌクレオチド配列ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＣ＿００３２８７、断片２２２４〜２８５３は元々の終止コドンを含む）をコードするＤＮＡ断片の５’とインフレームで融合している。３’末端で、終止コドン（下線）のすぐ下流に、ＰＣＲによってＮｈｅＩ部位（囲み）が付加されている。ヌクレオチドＡ523からＧ523への置換（Ｓｅｒ175からＧｌｙ175への置換をもたらす）もまた囲まれている。
【図２】プライマーｃｐ３*ＦＷ（配列番号１３）およびｃｐ３*ＲＷ（配列番号１４）を用いて得られたｃｐ３*ＤＮＡ増幅産物を示し、およそ６８０ｂｐのバンドとして現れた、アガロースゲル電気泳動を示す図である。
【図３】はオリゴヌクレオチドＨＡタグリンカー（HA tag linker）ＦＷ（配列番号１７）およびＨＡタグリンカーＲＷ（配列番号１８）のアニーリングに起因するＨＡタグリンカーの配列を示す図である。一方がＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）に適合し、他方がＳｐｅＩ（ＡＣＴＡＧＴ）制限酵素認識部位に適合する一本鎖の５’末端に下線をひく。（Ｂ）はＨＡｃｐ３*ＤＮＡ（配列番号１９）およびタンパク質（配列番号２０）配列のＤＮＡおよびタンパク質配列のアラインメントを示す図である。２５８アミノ酸タンパク質配列を生じる、ＰｅｌＢリーダー配列（配列番号２５）およびＨＡタグに融合した２２１アミノ酸ｃｐ３*配列結果。
【図４】（Ａ）はＰｅｌＢリーダー／分泌配列に作動可能に連結した２つのＬａｃＺプロモーター（ＬａｃＺｐ）を含む、ファージミドベクターｐＲＩＢ１−ｃｐ３*（Ａ）、ｐＲＩＢ１−ＨＡｃｐ３*（Ｂ）、およびｐＲＩＢ１−ｅ４４ｃｐ３*（Ｃ）の略図である。ＬａｃｚＰ−ＰｅｌＢセグメントは、ｃｐ３*のみ（Ａ中）、ＨＡタグをさらに含んだｃｐ３*（ＨＡ、Ｂ中）もしくはｅ４４重鎖（ｅ４４ＨＣ、Ｃ中）配列、またはｅ４４軽鎖（ｅ４４ＬＣ、Ｃ中）とともにインフレームで融合している。アンピシリン（Ａｍｐr）およびクロラムフェニコール耐性（ＣＡＴ）遺伝子、ならびにクローニング部位および複製開始点（origin）等の、他の関連のある要素を示す。
【図５】（Ａ）はｐＲＩＢ１系のベクターで形質転換された大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＸＬ１Ｂｌｕｅ由来の全細胞抽出物に関するウエスタンブロットを示す図である。（Ａ）はｐＲＩＢ１−ｃｐ３*（陰性対照）またはｐＲＩＢ１−ＨＡｃｐ３*で形質転換された細菌細胞中で抗ＨＡタグ抗体（anti-HA tag）を用いて検出されたＨＡタグの発現を示す図である。（Ｂ）はｐＲＩＢ１−ｅ４４ｃｐ３（陽性対照）またはｐＲＩＢ１−ｅ４４ｃｐ３*で形質転換された細菌細胞中で抗ヒトＦａｂ抗体（anti-Human Fab）を用いて検出されたｅ４４  Ｆａｂの発現を示す図である。ｅ４４重鎖のバンドは、ＤＩＳリンカー２によってコードされる配列の付加のために、わずかにより高い。軽鎖（light chain）の量は、このタンパク質の発現が、重鎖（heavy chain）に融合するコートタンパク質の大きさによって制限されないので、より多い。
【図６】はｃｐ８*のＤＮＡおよびタンパク質配列のアラインメント（配列番号８および配列番号９）を示す図である。５’末端で、制限酵素認識部位ＳｐｅＩおよびＳｆｉＩ（囲み、配列番号１）ならびにＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーをコードする配列（全体で１２アミノ酸について）を含むＤＩＳリンカー２（下線、配列番号２および配列番号３）が、エンテロバクテリア（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）ファージ（タンパク質配列ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ受託番号Ｐ６９５４１、ヌクレオチド配列ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＣ＿００３２８７、断片１３７０〜１５２２は元々の終止コドンを含む）コートタンパク質ｃｐ８のアミノ酸２４〜７３をコードするＤＮＡ断片の５’とともにインフレームで融合している。３’末端で、終止コドン（下線）直後に、ＰＣＲによってＮｈｅＩ部位が付加されている。（Ｂ）はプライマーｃｐ８*ＦＷ（配列番号１５）およびｃｐ８*ＲＷ（配列番号１６）を用いることによって得られたｃｐ８*ＤＮＡ増幅産物を示し、およそ２００ｂｐのバンドとして現れた、アガロースゲル電気泳動を示す図である。
【図７】ＨＡｃｐ８*（配列番号２１および配列番号２２）のＤＮＡおよびタンパク質配列のアラインメントを示す図である。９９アミノ酸タンパク質配列を生じる、ＰｅｌＢリーダー配列（配列番号２５）およびＨＡタグに融合した６２アミノ酸ｃｐ８*配列結果。
【図８】ｐＲＩＢ２系のベクターで形質転換された大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＸＬ１Ｂｌｕｅ由来の全細胞抽出物に関するウエスタンブロットを示す図である。（Ａ）は形質転換されていない（陰性対照：control）、またはｐＲＩＢ２−ＨＡｃｐ８*で形質転換された（成熟（mature)および未成熟(immature）形態のＨＡｃｐ８*を区別することができる）細菌細胞中で、抗ＨＡタグ抗体を用いて検出されたＨＡタグの発現を示す図である。（Ｂ）は形質転換されていない（陰性対照：control）またはｐＲＩＢ２−ｅ４４ｃｐ８*で形質転換された細菌細胞中で、抗ヒトＦａｂ抗体を用いて検出されたｅ４４  Ｆａｂの発現を示す図である。
【図９】通常のｃｐ３（陽性対照、ｐＲＩＢ−ｃｐ３を用いる）、更には、そのまま（ｐＲＩＢ１−ｃｐ３*を用いる、Ａ）、ＨＡタグに融合した（ｐＲＩＢ−ＨＡｃｐ３を用いる、およびｐＲＩＢ１−ＨＡｃｐ３*を用いる、Ｂ）、またはｅ４４  Ｆａｂに融合した（ｐＲＩＢ−ｅ４４ｃｐ３を用いる、およびｐＲＩＢ１−ｅ４４ｃｐ３*を用いる、Ｃ）などのｃｐ３*を発現するファージ（phage）について測定した１μｌあたりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）を比較した、ＤＩＳリンカー２修飾コートタンパク質を提示する組換えファージの生成を示す図である。
【図１０】ｅ４４ｃｐ８*（ｐＲＩＢ２−ｅ４４ｃｐ８*を用いる、Ａ）、ｃｐ８*（ｐＲＩＢ２−ｃｐ８*を用いる、Ｂ）、またはＨＡｃｐ８*（ｐＲＩＢ２−ＨＡｃｐ８*を用いる、Ｃ）を発現するものと比較して、そのままの（ｐＲＩＢ−ｃｐ３を用いる）またはｅ４４  ｆａｂに融合した（ｐＲＩＢ−ｅ４４ｃｐ３を用いる）などの陽性対照、通常のｃｐ３を発現するファージについて測定した１μｌあたりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）を比較した、ＤＩＳリンカー２含有コートタンパク質を提示する組換えファージの生成を示す図である。
【図１１】結合剤としてのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、抗ＨＡタグ抗体（抗ＨＡ）、またはＣ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質（Ｅ２）に対する、ＨＡ−ｃｐ３*（ｐＲＩＢ１−ＨＡｃｐ３*を用いる、Ａ）またはＨＡ−ｃｐ８*（ｐＲＩＢ２−ＨＡｃｐ８*を用いる、Ｂ）を発現する組換えファージを用いたパニング実験を示す図である。Ｙ軸は、手順の最後に溶出したファージの値を、結合剤（binding agent）に対して示す（ＯＵＴＰＵＴファージ（phage OUTPUT）、文中の式ＩＩＩに従って計算される、ｃｆｕ／μｌで）。
【図１２】結合剤としてのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはＣ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質（Ｅ２）に対する、ｅ４４−ｃｐ３またはｅ４４−ｃｐ３*（ｐＲＩＢ２−ｅ４４ｃｐ３*を用いる、Ａ）およびｅ４４−ｃｐ８*（ｐＲＩＢ２−ｅ４４ｃｐ８*を用いる、Ｂ）を発現する組換えファージを用いたパニング実験を示す図である。Ｙ軸は、手順の最後に溶出したファージの値を、結合剤に対して示す（ＯＵＴＰＵＴファージ、文中の式ＩＩＩに従って計算される、ｃｆｕ／μｌで）。
【図１３】（Ａ）はさらなる操作のために必要な制限酵素認識部位を含むｐＤＤリンカーがクローニングされているｐＢＳ−ＤＤδＢｇＩファージミドベクターの構造を示す図である。（Ｂ）は図式的に示された、ｐＢＳ−ＤＤリンカー２（ｐＢＳ−ＤＤδＢｇＩ由来）をｐＤＤｃｐ３*ｃｐ８*へと修飾するためのクローニング戦略を示すフローチャートである。ＤＤ−ＤＩＳリンカー２は、反対方向にクローニングされた２つの修飾コートタンパク質配列をコードするＤＮＡの５’末端を渡る。
【図１４】ＤＤカセットおよびそれらの要素の略図である（同じ縮尺ではない）。（Ａ）はＤＤカセット中の、一般的な制限酵素のための単一の部位（ＳＲＥ）またはＤＩＳリンカーに特異的な制限酵素のための単一の部位（ＤＩＳ−ＳＲＥ）を含むＤＮＡ要素の基本的特徴および配置を示す図である。（Ｂ）は機能性コートタンパク質との融合タンパク質として単一のペプチドまたは機能性タンパク質を発現するための、ＤＤカセット中のＤＮＡ要素、ＢｇＩＩおよびＳｐｅＩ部位、ＳＲＥ、ならびにマーカー遺伝子の特徴および配置を示す図である。（Ｃ）は重鎖の可変領域が機能性コートタンパク質との融合タンパク質として発現され軽鎖の可変領域が同じＤＤカセット内の別々の遺伝子によって発現されるＦａｂを発現するための、ＤＤカセット中のＤＮＡ要素、ＢｇＩＩおよびＳｐｅＩ部位、ＳＲＥ、およびマーカー遺伝子の特徴および配置を示す図である。（Ｄ）はリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の後に始まるものが機能性コートとの融合タンパク質として発現される単一の転写産物中で２つの配列を発現するための、ＤＤカセット中のＤＮＡ要素、ＢｇＩＩおよびＳｐｅＩ部位、ＳＲＥ、およびマーカー遺伝子の特徴および配置を示す図である。機能性コートタンパク質との融合タンパク質として発現されていないマーカーまたは他の遺伝子のそれぞれの位置および数、ならびにＳＲＥの位置および数は、純粋に例であって、ＤＤカセットの特定の使用に適合させることができる。各略図の上部の矢印は、ＤＤカセットからベクターのバックボーンを指す転写の方向、およびＤＤカセットがｐＤＤベクターにクローニングされる場合、ＤＩＳリンカーによって融合する機能性コートタンパク質が存在する場所を示す。
【図１５】空の場合種々の配列を含んでもよい、ｃｐ３*およびｃｐ８*を含む本発明のファージミドベクター（ｐＤＤ−ｃｐ３*ｃｐ８*）の原型の構造（例えば、単純なＤＤ−ＤＩＳリンカー、スタッファーＤＮＡ（stuffer DNA）、またはマーカー遺伝子（marker gene））を示す図である。どのような空のベクターが使用されても、ＤＤカセットの挿入は、一方がｃｐ８*との融合タンパク質を提示するための遺伝子を含み（ｐＤＤ−Ｆｕｓｃｐ８*）他方がｃｐ３*との融合タンパク質を提示するための遺伝子を含む（ｐＤＤ−Ｆｕｓｃｐ３*）、２つの形態のｐＤＤベクターを提供する。これらの組換え遺伝子は、より太い線で示される。
【図１６】ｃｐ３*をコードするＤＮＡ配列（ＤＤ−ＤＩＳリンカー２の５’、対応するタンパク質配列は下記のアンチセンス鎖である）およびｃｐ８*をコードするＤＮＡ配列（ＤＤ−ＤＩＳリンカー２の３’、対応するタンパク質配列はセンス鎖に示される）と連結した二重のＢｇＩＩ部位および単一のＳｐｅＩ部位によって形成される配列（配列番号４）を含むＤＤ−ＤＩＳリンカー２（配列番号４）を表すｃｐ３*ＤＤｃｐ８*（配列番号１０）の配列を示す図である。この配列は、図１４および１５のｐＤＤ−ｃｐ３*ｃｐ８*に含まれる。
【図１７】関連のある制限酵素認識部位、（ＤＤカセット中で構成的に発現される）ＳａｃＩとＸｂａＩとの間でクローニングされる配列（ＤＤカセット中で構成的に発現される）およびＸｈｏＩとＳｐｅＩとの間でクローニングされる配列（ＤＤカセットがＤＩＳリンカーによって機能性コートタンパク質に融合する場合ＤＤカセット中で構成的に発現される）のための２つの異なるＬａｃＺプロモーター（ＬａｃＺｐ）およびＰｅｌＢ開始コドン、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣＡＴ）開始および終止コドン、ならびにＰｅｌＢ配列とＤＩＳリンカーとの間でスタッファーＤＮＡとして使用されるＨＡタグを有する、図１５中で設計されたもの等のｐＤＤベクターまたはｐＤＤ−ｃｐ３*ｃｐ８*と適合する、例示的ＤＤカセット（ＤＤａカセット、配列番号１１）の配列を示す図である。ＣＡＴ遺伝子はまた、反対方向にクローニングしてもよい。
【図１８】ＳａｃＩとＸｂａＩの間にクローニングされる配列（ＤＤカセット中で構成的に発現される）およびＸｈｏＩとＳｐｅＩの間にクローニングされる配列（ＤＩＳリンカーによってＤＤカセットが機能性コートタンパク質に融合したときにＤＤカセット中で構成的に発現される）のための関連のある制限酵素認識部位、２つの異なるＬａｃＺプロモーター（ＬａｃＺｐ）およびＰｅｌＢ開始コドン、ゼオシン耐性遺伝子（ＺＥＯ）開始および終止コドン、ならびにＰｅｌＢ配列とＤＩＳリンカーの間でスタッファーＤＮＡとして使用されるＨＡタグを有する、図１５で設計されたもの等のｐＤＤベクターまたはｐＤＤ−ｃｐ３*ｃｐ８*と適合する例示的ＤＤカセット（ＤＤｂカセット、配列番号１２）の配列を示す図である。ＺＥＯ遺伝子はまた、反対方向にクローニングしてもよい。
【図１９】ＤＤａおよびＤＤｂカセットにおいて、ＢｇＩＩ制限酵素認識部位を用いてＤＤａ（Ａ）またはＤＤｂ（Ｂ）カセットがクローニングされ、ＮｈｅＩ（ベクター中のｃｐ３*の３’末端で切断する）およびＸｂａＩ（機能性コートタンパク質に連結していないＢｇＩＩ制限酵素認識部位の近くに位置する）で消化されている、ランダムに選択されたｐＤＤ−ｃｐ３*ｃｐ８*クローンの制限分析を示す図である。ＤＮＡマーカー（Ｍ）と比較して、カセットがｃｐ３*とともにインフレームで挿入されたクローン（clone）から抽出されたプラスミドＤＮＡは、カセットがより短いｃｐ８*配列（パネルＡ中のクローン２、５、および６、パネルＢ中のクローン１、３、および５）とともにインフレームで挿入されているものよりも類似した長さ（パネルＡ中のクローン１、３、および４、パネルＢ中のクローン２、４、および６）を有する２つの断片を表す。これは、ｃｐ３*配列の、ｃｐ８*に比べてより大きい大きさによる。
【図２０】ｃｐ３*またはｃｐ８*に融合したＨＡペプチド（パネルＡ）またはｅ４４  ｆａｂ（パネルＢ）を提示している組換えファージを用い、抗ＨＡペプチド抗体（抗ＨＡ、パネルＡ）またはＣ型肝炎ウイルスＥ２組換えタンパク質（Ｅ２、パネルＢ）を結合剤として用いてパニングした、パニング実験を示す図である。両方の場合において、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を陰性結合剤として用いた。ＣＡＦ遺伝子を発現するＤＤカセットを含むｐＤＤ−ｃｐ３*ｃｐ８*ファージミド、およびｐＲＩＢ１ベースのベクター（ｃｐ３*陽性対照のために）またはｐＲＩＢ２ベースのベクター（ｃｐ８*陽性対照のために）のいずれかを用いて、ペプチドおよびｆａｂを発現させた。ｃｐ３のみを発現するｐＲＩＢベクターを、陰性対照として提供する。Ｙ軸は、手順の最後に溶出するファージの値を、結合剤に対して示す（ＯＵＴＰＵＴファージ、文中の式ＩＩＩに従って計算する）。
【図２１】ｃｐ３*またはｃｐ８*に融合したＨＡペプチド（パネルＡ）またはｅ４４  ｆａｂ（パネルＢ）を提示している組換えファージを用い、抗ＨＡペプチド抗体（抗ＨＡ、パネルＡ）またはＣ型肝炎ウイルスＥ２組換えタンパク質（Ｅ２、パネルＢ）を結合剤として用いてパニングした、パニング実験を示す図である。両方の場合において、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を陰性結合剤として用いた。ＣＡＦまたはＺＥＯのいずれかを発現するＤＤカセットを含むｐＤＤ−ｃｐ３*ｃｐ８*ファージミドを選択マーカーとして用いて、ペプチドおよびｆａｂを発現させた。ｐＲＩＢ１ベースのベクター（ｃｐ３*陽性対照のために）またはｐＲＩＢ２ベースのベクター（ｃｐ８*陽性対照のために）もまた用いた。Ｙ軸は、手順の最後に溶出するファージの値を、結合剤に対して示す（ＯＵＴＰＵＴファージ、文中の式ＩＩＩに従って計算する）。
【図２２】ｐＤＤｂベースの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライブラリーからランダムに選択されたクローンの制限（Ａ）およびウエスタンブロット（Ｂ）分析を示す図である。各クローンを同定する番号を（Ａ）の上部に示し、これを（Ｂ）で維持した。ウエスタンブロットを調製するときに、同じ制限パターンを有するクローン（図１９参照）を互いにとっておいた。
【図２３】本発明のベクターを用いたライブラリーの調製および組換えファージの選択のためのプロセスを概説するフローチャートである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年10月3日(2007.10.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合すべきアミノ酸配列をコードするＤＮＡをクローニングすることにより、繊維性ファージの２つのコートタンパク質のいずれか一方に融合したタンパク質としてのアミノ酸配列を発現する２つのファージミドを生成するためのファージミドベクターであって、
前記ファージミドベクターが、
ａ）第一のＤＮＡリンカーをその５’末端に含む第一の機能性コートタンパク質をコードするＤＮＡ、および
ｂ）第一の機能性コートタンパク質と反対の転写の方向を有し、第二のＤＮＡリンカーをその５’末端に含む、第二の機能性コートタンパク質をコードするＤＮＡ
を含み、
前記２つのファージミドが単一のクローニング及び形質転換で得られ、
前記第一および第二のＤＮＡリンカーが、ファージミドベクター中の前記リンカーの外側には存在しない、制限酵素のための少なくとも１つの同一の部位を含み、
前記第一および第二のＤＮＡリンカーが、機能性コートタンパク質をコードするＤＮＡの５’末端、並びに前記機能性コートタンパク質に融合し、これによって提示されるタンパク質配列をコードするＤＮＡの３’末端とともにインフレーム（in frame）で転写することができる
ファージミドベクター。
【請求項２】
第一および第二のＤＮＡリンカーが、配列番号１および配列番号２から選択される配列を含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
第一および第二のＤＮＡリンカーが、配列番号４および配列番号５から選択される配列を形成する、請求項１に記載のベクター。
【請求項４】
ｃｐ３*ＤＤｃｐ８*（配列番号１０）を含む、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
前記ＤＮＡリンカーの１つによって前記機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合する少なくとも１つのタンパク質配列のクローニング、発現、および提示のためのＤＮＡカセットをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載のベクター。
【請求項６】
ＤＮＡリンカーによって２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合するタンパク質配列が、抗体、抗体断片、エピトープ、エピトープ結合領域、抗原、アレルゲン、生物活性ペプチド、酵素、酵素阻害剤、酵素触媒部位、ＤＮＡ結合タンパク質、単離されたタンパク質ドメイン、受容体のリガンド、受容体、増殖因子、サイトカイン、および目的のタンパク質配列の近接または重複する断片である、請求項５に記載のファージミドベクター。
【請求項７】
２つの機能性コートタンパク質をコードするＤＮＡが、修飾されたｃｐ３（ｃｐ３*、配列番号６）およびｃｐ８（ｃｐ８*、配列番号８）である、前記請求項のいずれかに記載のベクター。
【請求項８】
ＤＤａカセット（配列番号１１）またはＤＤｂカセット（配列番号１２）を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のベクター。
【請求項９】
ライブラリーの各タンパク質配列がＤＮＡリンカーによって２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合しているファージまたは細胞ライブラリーを作製するための、請求項１から８のいずれかに記載のベクターの使用。
【請求項１０】
ライブラリーの各タンパク質配列がＤＮＡリンカーによって２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合している、請求項１から９のいずれかに記載のベクターを用いて得られるファージまたは細胞ライブラリー。
【請求項１１】
ＤＮＡリンカーによって２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合するタンパク質配列が、抗体、抗体断片、エピトープ、エピトープ結合領域、抗原、アレルゲン、生物活性ペプチド、酵素、酵素阻害剤、酵素触媒部位、ＤＮＡ結合タンパク質、単離されたタンパク質ドメイン、受容体のリガンド、受容体、増殖因子、サイトカイン、および目的のタンパク質配列の近接または重複する断片である、請求項１０に記載のファージまたは細胞ライブラリー。
【請求項１２】
２つの機能性コートタンパク質が、修飾ｃｐ３タンパク質（ｃｐ３*タンパク質、配列番号７）および修飾ｃｐ８タンパク質（ｃｐ８*タンパク質、配列番号９）である、請求項１１に記載のファージまたは細胞ライブラリー。
【請求項１３】
ライブラリーの各タンパク質配列がＤＩＳリンカーによって２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のいずれかのＮ末端で融合しているファージまたは細胞ライブラリーを作製するためのキットであって、
ａ）請求項２〜８のいずれかに記載のベクター、
ｂ）請求項２〜８のいずれかに記載のベクターに適合したＤＤカセットを生成し、機能性コートタンパク質を用いて提示すべきタンパク質配列をコードするＤＮＡのクローニングを可能とするベクター及びプライマー
を有するキット。
【請求項１４】
ライブラリーの各タンパク質配列はＤＮＡリンカーによって２つの機能性コートタンパク質の一方または他方のＮ末端に融合している、ファージまたは細胞ライブラリーを製造するための方法であって、
ａ）請求項２に記載のベクターのＤＮＡリンカーに対応するＤＮＡカセットを挿入すること、および
ｂ）得られたベクターで細菌細胞を形質転換すること
を含む製造方法。
【請求項１５】
前記ＤＤカセットの挿入が、ＤＮＡカセットとＢｇＩＩで消化された前記ベクターとをライゲートすることによって得られる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
リガンド、細胞、または標的分子を結合、検出、中和、および／または変化させるための、請求項１４または１５のいずれかに記載の方法によって得られる組換えファージまたは融合タンパク質の使用であって、前記組換えファージまたは融合タンパク質が、単離された形態または混合物の形態である、使用。
【請求項１７】
請求項１０または１１に記載のファージまたは細胞ライブラリーの、抗原、抗体、リガンド、細胞に特異的に結合する該ライブラリーにクローニングされ、発現したタンパク質配列を選択するための、使用。
【国際調査報告】
2009500030.tif 000032
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2009500030.tif 000034
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