(57)【要約】  本発明は、インスリンエステルと活性オリゴマーとの結合によって、ワンポット反応としてインスリン−オリゴマー複合体を製造する方法であって、脱ブロックおよび結合が同時に行われる方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワンポットにおいてインスリン−オリゴマー複合体を製造する方法であって、下記の工程を含んで成る方法：
（ｉ）インスリン先駆物質をペプチド転移する工程；
（ｉｉ）インスリンエステルの脱ブロック、およびオリゴマーとの結合を、ワンポットで同時に行う工程；
（ｉｉｉ）インスリン−オリゴマー複合体を得る工程。
【請求項２】
下記の工程をさらに含んで成る請求項１に記載の方法：
（ｉ）インスリン先駆物質を、クロマトグラフィーおよび析出によって精製する工程；
（ｉｉ）ペプチド転移を行って、インスリンエステルを得る工程；
（ｉｉｉ）ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて、インスリンエステルを精製する工程；
（ｉｖ）ホウ酸緩衝液中においてインスリンエステルをオリゴマーで処理して、脱ブロックおよび結合を同時に行う工程；
（ｖ）複合体を任意に精製する工程；
（ｖｉ）インスリン−オリゴマー複合体を得る工程。
【請求項３】
インスリン−オリゴマー複合体の調製が、インスリンエステルの脱ブロックおよびオリゴマーとの結合のワンポット法を含んで成る請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ホウ酸緩衝液中にインスリンエステルを含有する溶液への、アセトニトリルに溶解したオリゴマーの添加、および混合物のｐＨの増加を同時に行うことを含んで成る請求項１に記載のインスリン−オリゴマー複合体の製造法。
【請求項５】
ｐＨを約１１に増加させる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
インスリン先駆物質が、プロインスリンまたはミニプロインスリンである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
オリゴマーが、アルキル−ＰＥＧまたはその誘導体である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
オリゴマーが結合の前に活性化される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
結合に使用される活性オリゴマーがＣ１４Ｈ２３ＮＯ８である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
アルキル−ＰＥＧが、一般式−ＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＣＨ３で示される請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
インスリン−オリゴマー複合体が、インスリンＢ２９  Ｎε−オリゴマー複合体である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
インスリン−アルキルＰＥＧ複合体が、インスリンＢ２９  Ｎε−アルキルＰＥＧ複合体である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
複合体が、インスリンＢ２９  Ｎε−ＯＣ−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＯＣＨ３である請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、インスリンエステルと活性オリゴマーとの結合によって、ワンポット反応としてインスリン−オリゴマー複合体を製造する方法であって、脱ブロック（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）および結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）が同時に行われる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
膵島のβ細胞は、タンパク質分解の際に生物活性ポリペプチドインスリンを生じるプロインスリンとして既知の、インスリンの単鎖先駆物質を分泌する。インスリン分子は、種を超えて高度に保存され、ジスルフィド結合によって結合したアミノ酸の２つの鎖から一般に成る。天然ヒトインスリン分子（分子量５，８０７ダルトン）は、アミノ末端にグリシンを有する２１個のアミノ酸残基のＡ鎖、およびアミノ末端にフェニルアラニンを有する３０個のアミノ酸残基のＢ鎖を有する。インスリンは単量体として存在しうるか、または凝集して、二量体、または３個の二量体から形成される六量体になりうる。単量体は、受容体に結合する能力を有し、生物学的に活性な形態である。
【０００３】
インスリンポリペプチドは、体内におけるブドウ糖の輸送、利用および貯蔵を調節する役割を担う主要なホルモンである。インスリン産生が不十分またはインスリンへの受容体の感受性が減少する結果としての炭水和物代謝欠陥は、生物学的疾患である糖尿病を生じる。糖尿病は、増加した血糖レベル（高血糖）の結果として、ブドウ糖を利用する正常な能力を損なう。ブドウ糖が血中に蓄積すると共に、過剰レベルの糖が尿に排泄される（糖尿）。糖尿病の他の症状は、尿の量および頻度の増加、口渇、かゆみ、空腹、体重減少および虚弱を包含する。治療せずに放置した場合、糖尿病は、ケトン症、次に、吐気および嘔吐を伴うアシドーシスを誘発する。毒性生成物が蓄積し続けると共に、患者は糖尿病性昏睡に落ち入り、これは患者の死につながる。２つの型の糖尿病が存在する。Ｉ型は、インスリン依存性真性糖尿病、またはＩＤＤＭである。ＩＤＤＭは、以前は、「若年発症性真性糖尿病」と呼ばれていた。ＩＤＤＭにおいては、インスリンが膵臓から分泌されず、外部源から供給しなければならない。ＩＩ型または成人発症性糖尿病は、通常、食餌療法によって調節できるが、進行した場合には、インスリンが必要とされる。
【０００４】
バンチング（Ｂａｎｔｉｎｇ）らは、糖尿病の犬において膵臓からの活性抽出物を使用して、糖尿病治療のためのインスリンの使用を開示している：「真性糖尿病の治療における膵臓抽出物（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ）」（Ｃａｎ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．Ｊ．，１２：１４１−１４６（１９２２））。同年に、膵臓抽出物での糖尿病患者の治療は、劇的な救命臨床向上を与えている。
【０００５】
従来、ヒトにおける糖尿病の治療において、ほぼ専らウシおよびブタのインスリンが使用されてきた。組換え技術の進歩によって、発酵によるヒトインスリンの工業規模の製造が可能になった。さらに、天然ヒトインスリンに匹敵する生物活性を有する遺伝子改変インスリン類似体が、病気治療のために開発された。
【０００６】
しかし、糖尿病の治療は、一般に、インスリンの定期的注射を必要とする。インスリン注射の不便さにより、非注射経路による投与のためにインスリンを配合する努力がなされている。そのような開示は、下記の開示を包含する：米国特許第４３３８３０６号（キタオ（Ｋｉｔａｏ）ら）は、インスリンの直腸投与用の、インスリンおよび８〜１４個の炭
素原子を有する脂肪酸およびその非毒性塩の医薬組成物を開示し；米国特許第４５７９７３０号（キドロン（Ｋｉｄｒｏｎ）ら）は、インスリンの経口投与用の、胆汁酸またはそのアルカリ金属塩を含有するエンテロコート（ｅｎｔｅｒｏｃｏａｔｅｄ）インスリン組成物を開示し；米国特許第５２８３２３６号（キオウ（Ｃｈｉｏｕ）ら）は、高分子量ポリペプチドの全身吸収を補助する浸透促進剤、ならびに目からのインスリンの全身送達のためのペプチダーゼ阻害剤を含有するインスリン組成物であって、薬剤が鼻涙管に入り、循環に吸収されるインスリン組成物を開示し：米国特許第５６５８８７８号（バックストロム（Ｂａｃｋｓｔｒｏｍ）ら）は、インスリンおよび下気道におけるインスリンの吸収を促進する炭素鎖長１０（即ち、カプリン酸ナトリウム）、１２（ラウリン酸ナトリウム）または１４（ミリスチン酸ナトリウム）の飽和脂肪酸のナトリウム塩を開示し；米国特許第５８５３７４８号（ニュー（Ｎｅｗ）ら）は、インスリンの経口投与用の、インスリン、胆汁酸塩または胆汁酸、および腸のｐＨを７．５〜９に調節するのに使用される炭酸イオンまたは炭酸水素イオンを含有する腸溶性組成物を開示している。米国特許第６２００６０２号（ワッツ（Ｗａｔｔｓ）ら）は、錠剤、カプセル剤またはペレット剤が近位結腸に到達するまでにインスリンおよび吸収促進剤が放出するのを防止する剤皮中に、６〜１６個の炭素原子を有する脂肪酸およびその塩の混合物または中鎖脂肪酸のモノ／ジグリセリドの混合物を含有する吸収促進剤ならびに分散剤を含有するインスリン結腸送達用のインスリン薬剤送達組成物を開示している。
【０００７】
経口投与によってインスリンを送達する努力がなされている。糖尿病患者における正常血糖を達成するためのインスリン経口投与に伴う課題は、薬学および医学文献に詳しく記載されている。胃腸管における消化酵素は、インスリンを急速に分解し、それによって生物学的に不活性な分解生成物を生じる。例えば、経口投与されたインスリンは、胃において、酵素的タンパク質分解および酸性分解を受ける。腸における残存は、過剰のタンパク質分解によって妨げられる。管腔において、インスリンは、胃および膵臓酵素、エキソ−およびエンドペプチダーゼならびに刷子縁ペプチダーゼを包含する種々の酵素によって分解される。インスリンがこの酵素攻撃に生き残ったとしても、インスリンが生体内でその受容体に到達する前に越えなければならない生物学的関門が、インスリンの経口投与を制限すると考えられる。例えば、インスリンは低い膜透過性を有し、管腔から血流に移動する能力に限界があると考えられる。
【０００８】
インスリンのような医薬活性ペプチドを、ポリエチレングリコールの多分散混合物、またはポリエチレングリコール含有ポリマーの多分散混合物と結合させて、薬剤−オリゴマー複合体の多分散混合物を与えている；米国特許第４１７９３３７号（デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら）は、ポリペプチド、例えばインスリンを、種々のポリエチレングリコール、例えば、ユニオンカーバイドによって供給されているＭＰＥＧ−１９００およびＭＰＥＧ−５０００と結合させることを開示している。米国特許第５５６７４２２号（グリーンウォールド（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ））は、生物活性求核試薬と、ポリエチレングリコール、例えば、数平均分子量５，０００ダルトンを有するｍ−ＰＥＧ−ＯＨ（ユニオンカーバイド）との結合を開示している。
【０００９】
ポリペプチド、例えばインスリンと、ポリエチレングリコール改質糖脂質ポリマーおよびポリエチレングリコール改質脂肪酸ポリマーとの結合が、米国特許第５３５９０３０号（エクーリベ（Ｅｋｗｕｒｉｂｅ）ら）に開示されている。
【００１０】
米国特許第６０１１００８号（ドーム（Ｄｏｍｂ）ら）は、酸化感受性物質の水溶性多糖複合体の製造法を開示し、該方法は下記の工程を含んで成る：過ヨウ素酸酸化によって多糖を活性化してジアルデヒドを得；（ｂ）ジアルデヒドを妨害陽イオンおよび副生成物から精製し；（ｃ）シッフ塩基形成によって、物質を精製ジアルデヒドにカップリングして、複合体を形成する。任意に、還元物質によって、工程（ｃ）の複合体をアミン複合体
に還元してもよい。ｐＨ８．９の純酸化ＡＧ（アラビノガラクタン）のホウ酸緩衝溶液中で、４℃で一晩インスリンと反応させることによって、アミンまたはイミン結合によってインスリンを酸化ＡＧ（アラビノガラクタン）に結合させる。透明溶液をセルロース透析によって透析し、溶液を凍結乾燥して、白色固形物１１５ｍｇを得ている。
【００１１】
米国特許第６０２２５２４号（マイサノ（Ｍａｉｓａｎｏ）ら）において、ＤＴＰＡの溶液中で、Ｇｄ−ＤＴＰＡをブタインスリンと結合させ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加熱および攪拌によって調製し、次に、それを室温で冷却し、１１．７３ｇのＮＨＳ（０．１０２ｍｏｌ）の溶液と共に添加し、次に、１９．６ｇのＮ，Ｎ‘−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．０９７ｍｏｌ）のＤＭＳＯ（４００ｍＬ）溶液と共に滴下する。混合物を１６時間攪拌し、次に、濾過し、濾液を５０℃および５Ｐａでの蒸発によって濃縮して、約１６０ｍＬの量の濃厚油状物を得る。
【００１２】
米国特許第６３０９６３３号（エクーリベら）は、トリエチルアミンおよびＤＭＳＯの存在下、室温でインスリンとラウリン酸ＰＥＧ５との結合のための、固体インスリンの使用を開示している。反応をＨＰＬＣによって３０分おきに監視する。複合体を分取ＨＰＬＣによって精製する。
【００１３】
米国特許第６８２８２９７号（エクーリベら）は、亜鉛または亜鉛不含ヒトインスリンを活性オリゴマーとの結合に使用し、Ｂ２９改質ＰＥＧ７−ヘキシル−インスリンを精製することによって、ＰＥＧ７−ヘキシル−インスリンを製造する方法を開示している。ジメチルスルホキシドおよびトリエチルアミン中のインスリンを、２２±４℃で活性オリゴマーと反応させる。粗反応混合物を透析するかまたは濾過して（ｄｉｆｉｌｔｅｒｅｄ）、有機溶媒および低分子量不純物を除去し、酢酸アンモニウム緩衝液と交換し、凍結乾燥し；それを、さらに、０．５％トリエチルアミン／０．５％リン酸緩衝液（ＴＥＡＰ  Ａ）で平衡化したＲＰ−ＨＰＬＣに付した。ＴＥＡＰ  ＡおよびＴＥＡＰ  Ｂ（８０％アセトニトリルおよび２０％ＴＥＡＰ  Ａ）溶媒系を使用する勾配流でカラムを溶離した。複合体を含有する画分を溜め、溶離緩衝液および溶媒を、酢酸アンモニウム緩衝液に対する透析またはダイアフィルトレーションによって除去し、凍結乾燥して、ＰＥＧ７−ヘキシル−インスリン、Ｂ２９モノ複合体（ｍｏｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（純度＞９７％）の白色粉末を得た。
【００１４】
現在、存在する先行技術は、複合インスリン製造の出発物質として純インスリン粉末または結晶の使用を開示し、それにおいて、使用されるインスリンは生物学的に活性な形態である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は不活性エステル形態のインスリンとオリゴマーとの結合を促進し、インスリンエステルの脱ブロックおよびオリゴマーへの結合が、ワンポット反応として同時に行われる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、インスリン複合体の製造をより簡単化し、かつ経済的にし、生物学的に活性な形態の純インスリンを得るために数段階の精製を行わなくてよい。出発物質は、インスリン先駆物質を含有する発酵ブロスである。インスリン先駆物質を含有するブロスを、陽イオン交換精製、フェノールおよびＺｎＣｌ２での結晶化、凍結乾燥およびペプチド転移の組合せ工程に付して、インスリンエステルを得る。インスリンエステルを、一般式−ＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＣＨ３のオリゴマー、より好ましくは分子式Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ８の活性オリゴマー（ＣＡＳ．ｎｏ．６２２４０５−７８−１）との
結合に付して、複合インスリンを得る。最も好ましいインスリン−オリゴマー複合体は、インスリン−ＯＣ−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＯＣＨ３であり、これは以下にＩＮ  １０５とも称される。この方法による複合インスリンの全製造コストは、最小限にされる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の要旨
本発明は、ワンポット反応において、インスリンエステルと活性オリゴマーとの結合によってインスリン−オリゴマー複合体を製造する方法であって、脱ブロックおよび結合をホウ酸緩衝液中で同時に行う方法に関する。アセトニトリルに溶解した活性オリゴマーを、インスリンエステル含有溶液に添加し、混合物のｐＨを約１１に上昇させる。
【００１８】
詳細な説明
本発明は、インスリン−オリゴマー複合体の製造のためのワンポット反応法であって、インスリンエステルの脱ブロックおよび結合を同時に行うことを含んで成る反応法を開示する。
【００１９】
インスリン−オリゴマー複合体を、さらに、精製し、凍結乾燥して、乾燥粉末を得る。
下記の工程を含んで成るインスリン−オリゴマー複合体をワンポットで製造する方法：
（ｉ）インスリン先駆物質をペプチド転移する工程；
（ｉｉ）インスリンエステルの脱ブロック、およびオリゴマーとの結合を、ワンポットで同時に行う工程；
（ｉｉｉ）インスリン−オリゴマー複合体を得る工程。
【００２０】
下記の工程をさらに含んで成る方法：
（ｉ）インスリン先駆物質を、クロマトグラフィーおよび析出によって精製する工程；
（ｉｉ）ペプチド転移を行って、インスリンエステルを得る工程；
（ｉｉｉ）ＲＰ−ＨＰＬＣを用いてインスリンエステルを精製する工程；
（ｉｖ）ホウ酸緩衝液中においてインスリンエステルをオリゴマーで処理して、脱ブロックおよび結合を同時に行う工程；
（ｖ）複合体を任意に精製する工程；
（ｖｉ）インスリン−オリゴマー複合体を得る工程。
【００２１】
インスリン−オリゴマー複合体の製造が、インスリンエステルの脱ブロックおよびオリゴマーとの結合のワンポット法を含んで成る方法。
【００２２】
アセトニトリルに溶解したオリゴマーを、ホウ酸緩衝液中にインスリンエステルを含有する溶液に添加すること、および混合物のｐＨを上昇させることを同時に行うことを含んで成る、インスリン−オリゴマー複合体の製造法。
【００２３】
ｐＨを約１１に上昇させる該方法。
インスリン先駆物質が、プロインスリンまたはミニプロインスリンである該方法。
【００２４】
オリゴマーが、アルキル−ＰＥＧまたはその誘導体である該方法。
結合の前にオリゴマーを活性化する該方法。
【００２５】
結合に使用される活性オリゴマーがＣ１４Ｈ２３ＮＯ８である該方法。
アルキル−ＰＥＧが、一般式−ＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＣＨ３で示される該方法。
【００２６】
インスリン−オリゴマー複合体が、インスリンＢ２９  Ｎε−オリゴマー複合体である該方法。
【００２７】
インスリン−アルキルＰＥＧ複合体が、インスリンＢ２９  Ｎε−アルキルＰＥＧ複合体である該方法。
【００２８】
複合体が、インスリン−ＯＣ−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＯＣＨ３である該方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
インスリン遺伝子を含有する組換え酵母の発酵
１００マイクロリットルのグリセロール保存培養を、２５０ｍＬ振とうフラスコ中の５０ｍＬの最少グリセロール（ＭＧＹ）培地に添加することによって、インスリン遺伝子を含有する組換え酵母の接種源を調製する。ＭＧＹ培地は、酵母窒素源基礎培地（ＹＮＢ）、グリセロール、リン酸緩衝液およびＤ−ビオチンを含有する。種フラスコ（ｓｅｅｄ  ｆｌａｓｋｓ）を、３０℃、２４０±１０において、１５±５ＯＤ（６００ｎｍにおける光学密度）に達するまで培養する。
【００３０】
発酵培地は、オルト−リン酸、硫酸カルシウム二水和物、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム七水和物、水酸化カリウム、グリセロール、微量の塩およびＤ−ビオチンを含有する。微量の塩およびＤ−ビオチンを除く全ての前記成分を添加し、１２１〜１２４℃で１時間にわたって加圧滅菌することによって発酵槽を調製する。硫酸銅五水和物、ヨウ化ナトリウム、硫酸マンガン一水和物、モリブデン酸ナトリウム二水和物、ホウ酸、塩化コバルト六水和物、塩化亜鉛、硫酸第一鉄七水和物の溶液を濾過滅菌することによって微量の塩溶液を調製する。ビオチン溶液も濾過滅菌する。発酵槽に接種し、３０℃、ｐＨ５．５、気流０．５  ｌｐｍおよびＤＯ  ３０で操作する。バッチ段階（ｂａｔｃｈ  ｐｈａｓｅ）の後に、グリセロール供給（５０％ｗ／ｗ、水と共に）を開始して、バイオマスを形成する。５０％グリセロールｗ／ｗを調製し、１２１〜１２４℃で３０分間にわたって加圧滅菌し、次に、微量の塩およびビオチン溶液を１２ｍＬ／Ｌの割合で添加する。グリセロール供給量は、２０±５ｇ／時まで徐々に増加される。いったん３００〜４００ｇ／Ｌのバイオマスに達したら、温度を２０〜２５℃に下げ、ｐＨを３．５〜６．５に変化させ、メタノール供給を開始する。メタノールは、濾過滅菌され、微量の塩およびビオチン溶液を１２ｇ／Ｌの割合で添加する。メタノール供給量は、消費に基づいて、２５±５ｇ／時まで増加される。メタノール供給中に、酵母抽出物およびペプトン供給物を０．２〜０．５ｇ／時の速度で添加する。発酵を１２日間まで継続する。
【００３１】
ブロスからのプロインスリンの精製
インスリン先駆物質を含有するブロス９００ｍｇを、酢酸によってｐＨ４．０に調整し、５０ｍＭ酢酸と前平衡させた陽イオン交換樹脂に通した。カラムを５０ｍＭ酢酸で洗浄し、５０ｍＭ酢酸および１Ｍ  ＮａＣｌで溶離した。生成物８５５ｍｇを得、これを水で１：３に希釈し、６ｍｇ／ｍＬに濃縮した。その溶液に、フェノール（１．２５ｍｇ／Ｌ）、および５％（ｗ／ｖ）貯蔵物（ｓｔｏｃｋ）の５％（ｖ／ｖ）ＺｎＣｌ２を添加した。溶液のｐＨを１Ｎ  ＮａＯＨで５．２に調整した。溶液を４℃で一晩保持した。固体懸濁物（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を遠心分離し、形成されたペレットを凍結乾燥した。その段階での回収は９０％であった。
【００３２】
プロインスリンのペプチド転移およびエステル化
３０〜７０％Ｎ−Ｎジメチルホルムアミドを含有するＤＭＦ３０ｍＬに、乾燥先駆物質粉末４００ｍｇを溶解させた。トレオニンブチルエステル７２４ｍｇをその溶液に添加した。溶液のｐＨを、３Ｎ酢酸で６．５に調整した。反応を、トリプシン５５ｍｇの添加に
よって開始させた。反応を１時間ごとに監視し、４時間後に３Ｎ酢酸５ｍＬで停止し、その際に、インスリン先駆物質のインスリンエステルへの変換は７４％であった。この段階の収率は、生成物変換に関して６８％であった。
【００３３】
得られた生成物を、前記のように、ｐＨ６．０で析出し、インスリンエステル２２８ｍｇを回収した。インスリンエステルの結晶ペレットを、２５０ｍＭ酢酸に溶解させた。濾過した物質をＣ８クロマシル（Ｋｒｏｍａｓｉｌ）マトリックスに通し、純度９５％のインスリンエステルをアセトニトリル勾配から回収した。ＰＲＨＰＬＣの終了時に、生成物１４９ｍｇを回収した。
【００３４】
そのようにして得たインスリンエステルを、以下の実施例（限定するものとみなすべきでない）に記載のように、インスリン複合体の製造に使用する。
【実施例】
【００３５】
実施例１
実施例２のように得られるＲＰ溶出液（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｏｌ）５ｍＬを取り、１Ｍホウ酸緩衝液１．２ｍＬを反応混合物に添加し；反応混合物のｐＨを１１に上昇させ、反応混合物を２４℃で３時間攪拌した。脱ブロックを監視し、それが終了した際に、アセトニトリル３００μＬに溶解した活性オリゴマー（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ８）０．５ｍｇを反応混合物に添加した。反応のｐＨを７．５に低下させることによって、反応を停止した。収率は４４％であり、クロマトグラフィー純度は２８％であった。大部分の生成物は未変換のままであった。
【００３６】
実施例２
ＲＰ溶出液５ｍＬを出発物質として取り、１Ｍホウ酸緩衝液１．２ｍＬを反応混合物に添加し；反応混合物のｐＨを１１に上昇させ、反応混合物を２４℃で３時間攪拌した。脱ブロックを監視し、それが終了した際に、活性オリゴマー（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ８）２．５ｍｇをアセトニトリル３００μＬに溶解し、反応混合物に添加した。反応のｐＨを７．５に低下させることによって、反応を停止した。収率は６３％であり、クロマトグラフィー生成物純度は５６％であった。
【００３７】
実施例３
ＲＰ溶出液５ｍＬを出発物質として取り、１Ｍホウ酸緩衝液１．２ｍＬを反応混合物に添加し；反応混合物のｐＨを１１に上昇させ、反応混合物を２４℃で３時間攪拌した。脱ブロックを監視し、それが終了した際に、活性オリゴマー（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ８）１０ｍｇをアセトニトリル３００μＬに溶解させた。全ての組からの試料を、１０分および１時間において分析した。収率は１８％であり、クロマトグラフィー生成物純度は１１％であった。ほとんどの場合、二結合（ｄｉｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）生成物が観察された。
【００３８】
実施例４
ＲＰ溶出液５ｍＬを出発物質として取り、１Ｍホウ酸緩衝液１．２ｍＬを反応混合物に添加し；ｐＨを１０．５に調整し、５時間保持した。いったん脱ブロックが終了したら、活性オリゴマー（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ８）２．５ｍｇをアセトニトリル３００μＬに溶解し、添加した。アリコートを取り、分析した。収率は５８％であり、クロマトグラフィー純度は５１％であった。
【００３９】
実施例５
ＲＰ溶出液５ｍＬを出発物質として取り、１Ｍホウ酸緩衝液１．２ｍＬを反応混合物に添加し；ｐＨを１０．７５に調整し、４時間保持した。いったん脱ブロックが終了したら、活性オリゴマー（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ８）２．５ｍｇをアセトニトリル３００μＬに溶解
し、添加した。アリコートを取り、分析した。収率は６１％であり、クロマトグラフィー純度は５３％であった。
【００４０】
実施例６（同時脱ブロックおよび結合）
ＲＰ溶出液５ｍＬを出発物質として取り、１Ｍホウ酸緩衝液１．２ｍＬを反応混合物に添加し；ｐＨを１１に調整し、アセトニトリル３００μＬに溶解した活性オリゴマー（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ８）４ｍｇを添加した。脱ブロックおよび結合が同時に行われてから１０分、１時間、２時間、３時間後に、試料を分析した。収率は６４％であり、クロマトグラフィー純度は５８％であった。
【００４１】
実施例７（同時脱ブロックおよび結合）
ＲＰ溶出液５ｍＬを出発物質として取り、１Ｍホウ酸緩衝液１．２ｍＬを反応混合物に添加し；ｐＨを１１に調整し、アセトニトリル３００μＬに溶解した活性オリゴマー（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ８）２．５ｍｇを添加した。脱ブロックおよび結合が同時に行われてから１０分、１時間、２時間、３時間後に、試料を分析した。３時間後の収率は７５％であり、生成物純度は７３．４％であった。
【００４２】
脱ブロックを１時間、２時間および３時間継続し、各時点で結合を開始し、各場合に、脱ブロックおよび結合の両方が終了するまで継続させた。
【００４３】
各５ｍＬのＲＰ溶出液を、４つの各試験管に取った。１Ｍホウ酸緩衝液１．２ｍＬを反応混合物に添加した。ｐＨを１１に調整した。第１試験管に活性オリゴマー（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ８）２．５ｍｇを０時で添加した。第２試験管において、脱ブロックを１時間継続させ、同量の活性オリゴマー（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ８）を反応混合物に添加した。第３試験管において、脱ブロックを２時間継続させ、活性オリゴマー（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ８）２．５ｍｇを２時間後に添加した。第４試験管において、脱ブロックを３時間継続し、次に、同量の活性オリゴマー（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ８）を添加した。分析クロマトグラフィーによって確認して結合が終了したと考えられるまで、各試験管において結合を継続させた。工程の収率、およびインスリン複合体の純度パーセントを、分析クロマトグラフィーによって監視した。
【００４４】
【表１】
2009500396.tif 000002
【００４５】
実施例８
ホウ酸緩衝液３６ｍＬ中のＲＰＨＰＬＣ溶出液１５０ｍＬをｐＨ８．７で取った。１０ｍＬの１０Ｎ  ＮａＯＨを添加することによってｐＨを１１に上昇させ、反応混合物を２５℃で３時間保持した。アセトニトリル９ｍＬに溶解した活性オリゴマー（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ８）１３５ｍｇを反応混合物に添加して、結合反応を開始させた。１時間後、氷酢酸
の添加によって反応混合物のｐＨを７．５に低下させることによって、結合反応を停止した。脱ブロックおよび結合の収率は、この反応において６１％であり、生成物の純度は６２％であった。
【００４６】
実施例９
濃度８．４ｍｇ／ｍＬのＲＰ溶出液９７５ｍＬを取り、１Ｍホウ酸緩衝液２３４ｍＬをｐＨ８．２で添加した。１０Ｎ  ＮａＯＨでｐＨを１１に調整した。アセトニトリル５８．５ｍＬに溶解した活性オリゴマー（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ８）９７５ｍｇを反応混合物に添加し、脱ブロックおよび結合工程を共に開始させた。
【００４７】
アリコートを２時間および３時間において取り、ＨＰＬＣで分析して反応プロフィールを監視した。氷酢酸の添加によって反応混合物のｐＨを７．５に低下させることによって、結合を３時間後に停止した。収率は６８％であり、生成物純度は６９％であった。
【００４８】
実施例１０（生成物回収）
最終結合生成物を、２５０ｍＭ酢酸で希釈して、２．５ｍｇ／ｍＬの濃度にした。物質をクロマシルＣ８  ＲＰ  ＨＰＬＣカラムに装填し、アセトニトリル勾配で溶離した。溶出液は、純度９６．７％を有するＩＮ１０５を含有し、この段階の回収率は７２％であった。
【００４９】
ＲＰＨＰＬＣカラムから溶出した精製ＩＮ１０５を、冷却条件下にｐＨ５．２においてフェノールおよびＺｎＣｌ２で結晶化した。最終結晶化ペレットを遠心分離によって収集した。収集した結晶ペレットを凍結乾燥し、乾燥ＩＮ１０５精製結晶として収集した。
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月13日(2006.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワンポットにおいてインスリン−オリゴマー複合体を製造する方法であって、下記の工程を含んで成る方法：
（ｉ）インスリン先駆物質をペプチド転移する工程；
（ｉｉ）インスリンエステルの脱ブロック、およびオリゴマーとの結合を、ワンポットで同時に行う工程；
（ｉｉｉ）インスリン−オリゴマー複合体を得る工程。
【請求項２】
下記の工程をさらに含んで成る請求項１に記載の方法：
（ｉ）インスリン先駆物質を、クロマトグラフィーおよび析出によって精製する工程；
（ｉｉ）ペプチド転移を行って、インスリンエステルを得る工程；
（ｉｉｉ）ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて、インスリンエステルを精製する工程；
（ｉｖ）ホウ酸緩衝液中においてインスリンエステルをオリゴマーで処理して、脱ブロックおよび結合を同時に行う工程；
（ｖ）複合体を任意に精製する工程；
（ｖｉ）インスリン−オリゴマー複合体を得る工程。
【請求項３】
ホウ酸緩衝液中にインスリンエステルを含有する溶液への、アセトニトリルに溶解したオリゴマーの添加、および混合物のｐＨの増加を同時に行うことを含んで成る請求項１に記載のインスリン−オリゴマー複合体の製造法。
【請求項４】
ｐＨを約１１に増加させる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
インスリン先駆物質が、プロインスリンまたはミニプロインスリンである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
オリゴマーが、アルキル−ＰＥＧまたはその誘導体である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
オリゴマーが結合の前に活性化される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
結合に使用される活性オリゴマーがＣ１４Ｈ２３ＮＯ８である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アルキル−ＰＥＧが、一般式−ＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＣＨ３で示される請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
インスリン−オリゴマー複合体が、インスリンＢ２９  Ｎε−オリゴマー複合体である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
インスリン−アルキルＰＥＧ複合体が、インスリンＢ２９  Ｎε−アルキルＰＥＧ複合体である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
複合体が、インスリンＢ２９  Ｎε−ＯＣ−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＯＣＨ３である請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
実施例１
ＲＰ溶出液５ｍＬを出発物質として取り、１Ｍホウ酸緩衝液１．２ｍＬを反応混合物に添加し；反応混合物のｐＨを１１に上昇させ、反応混合物を２４℃で３時間攪拌した。脱ブロックを監視し、それが終了した際に、アセトニトリル３００μＬに溶解した活性オリゴマー（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ８）０．５ｍｇを同じポット中の反応混合物に添加した。反応のｐＨを７．５に低下させることによって、反応を停止した。収率は４４％であり、クロマトグラフィー純度は２８％であった。大部分の生成物は未変換のままであった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
実施例２
ＲＰ溶出液５ｍＬを出発物質として取り、１Ｍホウ酸緩衝液１．２ｍＬを反応混合物に添加し；反応混合物のｐＨを１１に上昇させ、反応混合物を２４℃で３時間攪拌した。  脱ブロックを監視し、それが終了した際に、活性オリゴマー（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ８）２．５ｍｇをアセトニトリル３００μＬに溶解し、同じポット中の反応混合物に添加した。反応のｐＨを７．５に低下させることによって、反応を停止した。収率は６３％であり、クロマトグラフィー生成物純度は５６％であった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
実施例３
ＲＰ溶出液５ｍＬを出発物質として取り、１Ｍホウ酸緩衝液１．２ｍＬを反応混合物に添加し；反応混合物のｐＨを１１に上昇させ、反応混合物を２４℃で３時間攪拌した。脱ブロックを監視し、それが終了した際に、活性オリゴマー（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ８）１０ｍｇをアセトニトリル３００μＬに溶解し、同じポット中の反応混合物に添加した。全ての組からの試料を、１０分および１時間において分析した。収率は１８％であり、クロマトグラフィー生成物純度は１１％であった。ほとんどの場合、二結合（ｄｉｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）生成物が観察された。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
実施例４
ＲＰ溶出液５ｍＬを出発物質として取り、１Ｍホウ酸緩衝液１．２ｍＬを反応混合物に添加し；ｐＨを１０．５に調製し、５時間保持した。反応混合物の同じポット中でいったん脱ブロックが終了したら、活性オリゴマー（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ８）２．５ｍｇをアセトニトリル３００μＬに溶解し、添加した。アリコートを取り、分析した。収率は５８％であり、クロマトグラフィー純度は５１％であった。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
実施例５
ＲＰ溶出液５ｍＬを出発物質として取り、１Ｍホウ酸緩衝液１．２ｍＬを反応混合物に添加し；ｐＨを１０．７５に調製し、４時間保持した。反応混合物の同じポット中でいったん脱ブロックが終了したら、活性オリゴマー（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ８）２．５ｍｇをアセトニトリル３００μＬに溶解し、添加した。アリコートを取り、分析した。収率は６１％であり、クロマトグラフィー純度は５３％であった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
実施例６（同時脱ブロックおよび結合）
ＲＰ溶出液５ｍＬを出発物質として取り、１Ｍホウ酸緩衝液１．２ｍＬを反応混合物に添加し；ｐＨを１１に調製し、アセトニトリル３００μＬに溶解した活性オリゴマー（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ８）４ｍｇを添加した。脱ブロックおよび結合が同じポット中で同時に行われてから１０分、１時間、２時間、３時間後に、試料を分析した。収率は６４％であり、クロマトグラフィー純度は５８％であった。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
実施例８
ホウ酸緩衝液３６ｍＬ中のＲＰＨＰＬＣ溶出液１５０ｍＬをｐＨ８．７で取った。１０ｍＬの１０Ｎ  ＮａＯＨを添加することによってｐＨを１１に上昇させ、反応混合物を２５℃で３時間保持した。アセトニトリル９ｍＬに溶解した活性オリゴマー（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ８）１３５ｍｇを反応混合物に添加して、同じポット中で結合反応を開始させた。１時間後、氷酢酸の添加によって反応混合物のｐＨを７．５に低下させることによって、結合反応を停止した。脱ブロックおよび結合の収率は、この反応において６１％であり、生成物の純度は６２％であった。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
実施例９
濃度８．４ｍｇ／ｍＬのＲＰ溶出液９７５ｍＬを取り、１Ｍホウ酸緩衝液２３４ｍＬをｐＨ８．２で添加した。１０Ｎ  ＮａＯＨでｐＨを１１に調製した。アセトニトリル５８．５ｍＬに溶解した活性オリゴマー（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ８）９７５ｍｇを反応混合物に添加し、脱ブロックおよび結合工程を同じポット中で共に開始させた。
【国際調査報告】
2009500396.tif 000003
2009500396.tif 000004