(57)【要約】  本発明はコラーゲン類似組み換えタンパク質を製造するための酵母細胞に関する。本発明は、さらに、前記タンパク質の製造に使用する部品のキットまたは共発現システムと、前記組み換えタンパク質および前記組み換えタンパク質から作った糸の製造方法に関する。さらに、本発明は、前記方法によって得られるタンパク質または糸およびそれらの技術と医学の様々な分野における使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン類似組み換えタンパク質、好ましくはイガイ類足糸組み換えタンパク質を製造する酵母細胞であって、次に掲げる要素で形質転換された酵母細胞。
ａ）前記コラーゲン類似組み換えタンパク質をコードする、第一の発現ベクター；および、
ｂ）プロリル−４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）をコードする核酸を含む、第二の発現ベクター。
【請求項２】
請求項１に記載の酵母細胞であって、前記Ｐ４Ｈの配列にシグナル配列が連結されており、前記酵母細胞の小胞体へ、前記配列が効率良く輸送される酵母細胞。
【請求項３】
請求項２に記載の酵母であって、前記シグナル配列がＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（配列番号１０）のｍａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  １（ＭＦａ）である酵母。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項以上に記載の酵母細胞であって、好ましくはＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、またはＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａである酵母細胞。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項以上に記載の酵母細胞であって、前記第一の発現ベクターが、１つ以上の制御因子をさらに含む酵母細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の酵母細胞であって、前記制御因子が、恒常性または誘導性のプロモーターから選択されたプロモーターを含む酵母細胞。
【請求項７】
請求項６に記載の酵母細胞であって、前記プロモーターがＧＰＤ、ＧＡＬ４、ＣＵＰ１、ＭＥＴ２５、ＧＡＬ１、またはＧＡＬ１−１０から選択される酵母細胞。
【請求項８】
前記請求項のいずれか１項以上に記載の酵母細胞であって、前述の発現ベクターがプラスミドである酵母細胞。
【請求項９】
前記請求項のいずれか１項以上に記載の酵母細胞であって、前記コラーゲン類似組み換えタンパク質が、エラスチン若しくはシルクフィブロインに隣接した１つ以上のコラーゲンドメイン断片から成る、またはそれを含む、イガイ類足糸組み換えタンパク質である酵母細胞。
【請求項１０】
前記請求項のいずれか１項以上に記載の酵母細胞であって、前記コラーゲンドメイン断片がイガイ類に由来するもので、好ましくはＭ． ｅｄｕｌｉｓ、Ｍ． ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ、Ｍ． ｃａｌｉｆｏｒｎｉａｎｓ、またはＧｅｕｋｅｒｉａ ｄｅｍｉｓｓａである酵母細胞。
【請求項１１】
前記請求項のいずれか１項以上に記載の酵母細胞であって、前記イガイ類足糸組み換えタンパク質が、ＣｏｌＰ前駆体および／若しくはＣｏｌＤ前駆体またはそれらの変異体の断片１つ以上から成る、またはそれを含む、酵母細胞。
【請求項１２】
前記請求項のいずれか１項以上に記載の酵母細胞であって、前記組み換えタンパク質が、配列番号３および／若しくは４、またはそれらの変異体のアミノ酸配列から成る、またはそれを含む、酵母細胞。
【請求項１３】
前記請求項のいずれか１項以上に記載の酵母細胞であって、前記組み換えタンパク質において、それぞれのアミノ酸配列のシグナル配列が、酵母特異的なシグナル配列、好ましくはＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｍａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  １（ＭＦａ）に置換された、酵母細胞。
【請求項１４】
前記請求項のいずれか１項以上に記載の酵母細胞であって、Ｐ４Ｈがヒトまたはイガイ類のＰ４Ｈである、酵母細胞。
【請求項１５】
次に示す構成要素を含むタンパク質を含む組み換えコラーゲンの製造に用いる、部品のキットまたは共発現システム。
ａ）請求項１〜１４のいずれか一つ以上により定義される第一の発現ベクター；および
ｂ）請求項１〜１４のいずれか一つ以上により定義される第二の発現ベクター；
【請求項１６】
コラーゲン類似組み換えタンパク質、好ましくはイガイ類足糸タンパク質を製造する方法であって、次の工程を含む方法。
ａ）酵母細胞を提供する工程；
ｂ）前記酵母細胞を、請求項１〜１４のいずれか１項以上で定義される第一および第二の発現ベクター若しくは請求項１５に記載の共発現システムで形質転換する工程；
ｃ）適切な条件下で、前記酵母細胞から前記コラーゲン類似組み換えタンパク質、好ましくはイガイ類足糸組み換えタンパク質を発現させる工程；および、
ｄ）前記組み換えタンパク質を回収する工程。
【請求項１７】
イガイ類足糸組み換えタンパク質から糸を製造する方法であって、次に示す工程を含む方法。
ａ）請求項１６で製造された組み換えタンパク質の提供；および、
ｂ）適切な方法によって前記タンパク質を（電気的に）紡績、または型どりをする工程。
【請求項１８】
請求項１６の方法で製造可能なタンパク質または請求項１７に記載の方法で製造可能な糸。
【請求項１９】
バイオテクノロジーおよび／または医学の分野での、請求項１８に記載のタンパク質・糸の使用。
【請求項２０】
創傷治癒または保護システムの製造のための、請求項１８に記載のタンパク質／糸の使用。
【請求項２１】
縫合材料を製造するための請求項２０の使用。
【請求項２２】
前記縫合材料が神経外科または眼科の外科術での使用を意図された、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
代替材料、好ましくは人工の軟骨または腱の材料を製造するための請求項１８に記載のタンパク質／糸の使用。
【請求項２４】
請求項１８に記載のタンパク質／糸を使って製造することができる、創傷治癒または保護システム、縫合材料、代替材料、好ましくは人工の軟骨若しくは腱の材料。
【請求項２５】
請求項１８に記載のタンパク質／糸を含む、化粧品、医薬品送達媒体、布地、織物、紙製品、皮革製品、自動車の部品、または航空機の部品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン類似組み換えタンパク質を製造するための酵母細胞に関する。本発明は、さらに、前記タンパク質の製造に用いる、部品のキットまたは共発現システム、ならびに前記組み換えタンパク質およびそれから作られる糸を製造する方法に関する。さらに、本発明は、前記方法によって得ることのできるタンパク質または糸およびそれらの技術や医学の多様な分野における使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
海産のイガイ類は、潮間帯の乱流の生息地に見られる。ここで、海産のイガイ類は、風と波にさらされる岩に群生することにたいへん成功しているといえる。前記の成功は、岩の堅い表面に自身を固定する独特の固定手段に、部分的には原因がある。前記固定手段の一部には、「足糸」または「イガイシルク」として知られる繊維状の構造がある。イガイ類は、前記足糸で岩あるいは堅い表面に付着することによって、絶え間なく打ち付ける波を耐え抜くために必要な固着力を得ている。
【０００３】
イガイ類足糸は、ごく小さな腱に似た短い糸の束を形成する細胞外マトリックスから完全に成り立っている［２］。足糸は、一方の端で柔らかいゴムと似ておりもう一方の端では堅いナイロンに似ているという普通でない力学特性を示し、前記特性は継ぎ目無く漸進的な変化として現れる［４］。足糸は、弾性をも有する。すなわち、前記足糸は、かなりの変形に対しても断裂せずに耐えることができ、ストレスが除かれると元の状態に復帰できる［５］。末端側の端では、足糸は、岩にある接着性のプラークによって固定されている。基部側の端では、足糸は、いわゆる足糸の幹というイガイ類の足の根元に繋ぎ止められている部分に連結されている（図３参照）。
【０００４】
海産のイガイ類の足糸は、弾性を持つ繊維であり、エネルギーを吸収・散逸する優れた能力を持つ。吸収された全エネルギーの７０％までもが足糸内で散逸される。イガイ属（Ｍ． ｅｄｕｌｉｓとＭ． ｇａｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ）においては、それぞれの新しい足糸は、数センチの長さ、０．１センチ未満の直径という寸法を持っており、押出鋳込という反応に似た過程で、足の腹溝中において約５分以内で産生される［３］。
【０００５】
形態学的には、足糸は４つの部分に分割される（基部側から末端側に）。すなわち、根元、幹、糸、およびプラークまたはパッドである。さらに、糸は外観によってさらに基部と末端部に再分割できる。すなわち、末端部は滑らかで堅く、基部は柔らかく比較的弱い。
【０００６】
足糸は、弾性を持つ。ヤング率は低く（１０〜５００ＭＰａの範囲内）、伸張性は２００％にも達し、復元能がある。エラスチン、レジリン、およびアブダクチンのような他のタンパク質エラストマーと同様に、イガイ類足糸は極めて丈夫である。丈夫であることとエネルギー解消性は、どちらも固定具に必須の特性である。周期的なストレス−張力の解析に供された繊維のエネルギー散逸は、吸収された全エネルギーに関連して標準化され、ヒステリーシス若しくはヒステリーシス率として報告されることがしばしばある。
【０００７】
一本の糸に対するストレス−張力のサイクルは、糸の末端部と基部で別々の機械的貢献に分割されてきた。上述したように、前記の部位では、末端部がより強く、堅く、振動吸収に優れているが、基部がより柔らかく、より弱く、より低いが相当のヒステリーシスを持つ。
【０００８】
足糸の機械的特性は、時間あるいは張力依存的挙動によりさらに複雑になる。降伏点を越えて引っ張られた時、末端部は図式的にはストレスをやわらげることが示されている。すなわち、２回目の周期での最初の係数は最初の周期での係数（５００−８０ＭＰａ）の約２０％に減少するのである。最初の周期の係数の完全な回復は緩やかであり、例えば２４時間以上ということがあったが、１時間以内に相当の部分的回復が起こり得る（元々の値の３０％）。周期的な負荷により、堅さを変化させる傾向は基部にも見られる。この場合、張力を受けて堅さを増し、最初の係数である３５ＭＰａから漸近的に５０ＭＰａに近づくが、これは約４０％の増加である。
【０００９】
ＭＡＳＣＯＬＯおよびＷＡＩＴＥ（１９８６年）はイガイ類の足糸中の化学物質勾配を最初に同定した。ペプシンで糸を処理すると、ＣｏｌＰおよびＣｏｌＤと呼ばれる２つのペプシン耐性のコラーゲン断片でそれぞれ分子量が５０ｋＤａおよび６０ｋＤａであるものが同定された。ＣｏｌＰは基部領域に主に見られ、末端部にはほとんど見られなかった。一方、末端部ではＣｏｌＤの量が増加し、約１００％になった（ＬＵＣＡＳら、２００２年；ＱＩＮおよびＷＡＩＴＥ、１９９５年）。前記足糸の中には、前記イガイ類の足の中と同様に、糸の構造の構築に役割を担うコラーゲン類似タンパク質がさらに存在する。このさらに別のタンパク質は、ＣｏｌＮＧ（ＮＧ＝Ｎｏ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ、勾配無し）と呼ばれ、ＣｏｌＤおよびＣｏｌＰとは違って、糸全体にわたって均一に存在している。ＣｏｌＮＧの生理学的な役割は、糸にある二つの他のコラーゲンの間のアダプターであると考えられている（ＱＩＮおよびＷＡＩＴＥ、１９９８年）。
【００１０】
ペプシンによって切断された断片ＣｏｌＤおよびＰはいわゆるコラーゲン前駆体ＰおよびＤに由来する。Ｍ． ｅｄｕｌｉｓ由来のどちらのＣｏｌ前駆体も（すなわちＤもＰも）共通の基礎構造によって特徴付けられる。それは中央部のコラーゲンヘリックスであり、種々の異なるフランキング領域に隣接しており、それぞれがヒスチジンとＤＯＰＡが豊富な末端によって終結している（図１参照）。
【００１１】
足糸のコラーゲンが集まって繊維になる機構は、足糸の生化学の中でも難しい側面であった。コラーゲンがクロスリンクによって安定化するのはよく認識されたことである。しかし、その化学はまだよく理解されていない。２つの明確なクロスリンクの可能性がある。コラーゲンユニット中での金属錯体形成反応と共有結合形成である［８，９］。足糸中に鉄、銅、ニッケル、亜鉛が豊富に含まれていること、足糸タンパク質のいずれの末端にも金属に結合するヒスチジンリッチな配列があることから、金属錯体形成については示唆されていた。さらに、全てのＣｏｌ前駆体の両末端ではＤＯＰＡが存在する。ペプチジルＤＯＰＡは優れた金属結合部位を提供し、ペプチジルＤＯＰＡ−Ｆｅ（III）のキレート化合物は海産の接着プラークｍｅｆｐ−１で報告されている［１０］。さらに、足糸繊維からＥＤＴＡにより金属イオンを除いたところ、繊維に与えられた強さが減少することが報告された。共有結合でのクロスリンクもまた観察されている。前記クロスリンクは一般にチロシン、ＤＯＰＡ、およびシステイン間での酸化カップリングによって形成される。早い流れと通気の条件でストレスを与えた足糸を使った研究で、酸化によって生じる第一の産物は５，５’−ｄｉＤＯＰＡであることが分かった［１１］。酸化したＤＯＰＡにリジンがマイケル型で付加されるというような他のあり得るカップリング産物は見つからなかった［７］。
【００１２】
「正常な」コラーゲンと同様に、それぞれのイガイ類コラーゲンは２０アミノ酸残基からなるシグナル配列を持っており、それによってα鎖は小胞体内部に間違いなく輸送される。そこで３つの同一のα鎖は集まってホモ三量体を形成する。ＣｏｌＤのα鎖、すなわちＣｏｌＤ前駆体のペプシンによる分解産物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上では６０ｋＤａの分子量、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法では４７ｋＤａの分子量である（ＱＩＮら、１９９７年）。ＣｏｌＰのα鎖、すなわちＣｏｌＰ前駆体のペプシンによる分解産物は、それぞれ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥで）５５ｋＤａおよび（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで）４０ｋＤａである（ＣＯＹＮＥら、１９９７年）。α鎖の前駆体はＣｏｌＤ前駆体およびＣｏｌＰ前駆体と呼ばれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析によると９５および９７ｋＤａであり、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法での解析ではそれぞれ７５および８０ｋＤａであった（ＣＯＹＮＥら、１９９７年；ＱＩＮら、１９９７年）。どちらのコラーゲンもコラーゲンタイプIからIIIに典型的な性質を持っている。どちらも３４％以上の量のグリシンを有し、コラーゲンドメイン中ではプロリンとヒドロキシプロリンが合わせて２０％含まれる。
【００１３】
フランキング領域は他の構造タンパク質、例えばエラスチン（ＣｏｌＰ前駆体）およびシルクフィブロイン（ＣｏｌＤ前駆体）と完全に対応している。このような構造上の作りは、イガイ類の足糸の機械的挙動に対して説明を与えてくれる。この理由により、新しい技術上の応用への基礎単位としてこのような極めて自然な素材を用いるために、組み換え技術によって基本的なイガイ類足糸コラーゲンを製造することは特に妥当なことであろう。
【００１４】
明確な性質を持つ素材の開発、特にストレスまたは過負荷の後に自身を再形成する能力を持った素材の開発は、長い間材料科学において高い興味の対象であった。複合的な構造は、技術の分野、特に電子部品、装置、エネルギー変換器、およびその他の材料の分野で興味を獲得している。異なる機械的特性を持つ材料を組み合わせることによって、構造上の境界面が形成され、新しい技術上の問題点が生じる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、多くの応用に関して、進歩した構造を提供し、材料全体の負荷を減らすことがたいへん望ましい。
【００１６】
さらに、イガイ類のコラーゲンを医学において利用・応用することは、生体への適合性の潜在的な高さのために、非常に興味の持てることである。これに基づき、医学上の移植や組織が、高い程度の免疫適合性を持つようになるかもしれない。イガイ類の組み換えコラーゲンを製造することは、興味深く重要な技術上の問題であり、イガイ類コラーゲンの技術的応用が構想されるであろう前に解決しなければいけない問題である。
【００１７】
それゆえ、高められた性質、特に高収率ならびに高い強度および柔軟性として発現される改良された性能を持つ組み換えイガイ類足糸タンパク質を提供することは本発明の基礎となる目的である。段階的な構造を提供するための基盤となる基礎単位の特別の準備によって、要求される応用に特に適したイガイ類組み換え足糸タンパク質を提供することは、本発明のさらなる目的である。さらに、公知の真核生物の発現システムで簡便に発現させることのできる、組み換えイガイ類足糸タンパク質をコードする発現ベクターを提供することも本発明の目的である。さらに、改良された紙、織物、および皮革製品を提供することも本発明の目的である。さらなる目的として、新しいタンパク質、そして、バイオテクノロジー、医学、薬学、食用、美容、電子装置、およびその他の商業的な目的のために使う球体、ナノフィブリル、ヒドロゲル、糸、泡、フィルムなどの、組み換えイガイ類足糸タンパク質を基盤とするさらなる材料を提供するということがある。コラーゲン類似タンパク質、特にイガイ類足糸タンパク質を高い量と質で発現することのできる宿主細胞を提供するということも本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
以上の目的は、独立クレームの主題によって解決されている。好ましい実施形態は、従属クレームに表れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
現在に至るまで、組み換えイガイ類足糸タンパク質の発現は示されたことがなかった。このことは少なくとも部分的には、これらのタンパク質を発現させ、そこから糸を作るという複雑な過程に依るところがあったと考えられる。コラーゲンの生体での合成が複雑であるので、組み換えコラーゲンを発現させるどの試みの結果でも予測可能性が低く、そのため、前記の試みの結果、不適切に折りたたまれたタンパク質ができたり、収率が低かったり、最悪の場合全くコラーゲンが発現しないということになったと思われる。
【００２０】
本発明では、正しく折りたたまれたコラーゲン類似タンパク質、特にイガイ類足糸タンパク質を多量に得ることのできる宿主細胞システムを提供する。
【００２１】
本発明は、特に、次に掲げる側面と実施形態に関する。
【００２２】
第一の側面によると、本発明は、組み換えコラーゲン類似タンパク質、特にイガイ類足糸タンパク質を製造するための酵母細胞であって、次に掲げる要素で形質転換した酵母細胞を提供する。
ａ）前記組み換えコラーゲン類似タンパク質をコードする第一の発現ベクター；および、
ｂ）プロリル−４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）をコードする核酸を含む、第二の発現ベクター。
【００２３】
本発明者らは、コラーゲンの生体内での合成が複雑であるので、コラーゲン類似タンパク質の組み換えでの合成のために、いくつかの点を考慮しなければいけないということを見いだした。最も重要なことは、小胞体内でのプロリル−４−ヒドロキシラーゼによるプロリンからヒドロキシプロリンへの翻訳後修飾である。プロリル−４−ヒドロキシラーゼは、四量体の酵素であり、α−ＰＨ（＝Ｐ４ＨＡ）とＰＤＩ（＝Ｐ４ＨＢ）の２つのサブユニットから構成される（ＢＵＬＬＥＩＤら、２０００年）。この理由により、本発明では、原核生物での発現システム、例えば細菌での発現システムを使用しなくても良い。
【００２４】
酵母は、一方では、コラーゲンの合成に必要な細胞のコンパートメント化を提供するが、しかしもう一方では、コラーゲンの合成に必要な酵素であるプロリル−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）を欠いている。その点を別にすると、酵母は組み換えコラーゲンの望ましい発現システムであるだろう。なぜならば、酵母の培養は、大量の発現システムの場合でも、比較的実現が容易であり、組み換えタンパク質の収量が他の発現システムに比べて優れているからである。したがって、酵母での発現により、コラーゲン類似組み換えタンパク質、特にイガイ類足糸タンパク質を効率よく（そしてまた経済的に）製造することができると考えられる。しかし、上述のような酵母細胞の欠点のために、上記のタンパク質を酵母細胞で発現することは現在まで達成できないでいた。
【００２５】
本発明者らは、Ｐ４Ｈを発現していない酵母細胞でも、ヒトＰ４Ｈサブユニットを組み換えによって産生することができ、正しく折りたたむことができる、ということを示すことができた。その点とは別に、それらの酵母菌株は、ヒトＰ４Ｈの両方のサブユニットを共発現することによってイガイ類足糸タンパク質を合成することが可能になり、折りたたまれ安定なコラーゲンが形成されるということが示された。
【００２６】
面白いことに、両方のＰ４Ｈサブユニットの遺伝子を共発現することは、酵母で安定な３重らせんを形成させるのに十分であり、他にさらなる酵素、折りたたみ促進因子、またはコラーゲン特異的なシャペロンは必要ではない。なぜなら、例えばＨｓｐ４７、言い換えれば酵母に本来備わっているシャペロンは十分に活性があるためである。酵母で組み換えにより産生したヒトコラーゲンは同量のヒドロキシプロリンを保持し、さらに、他の多くの特性でも天然のコラーゲンと比較して同様であった。
【００２７】
酵母の小胞体内での効率良い輸送により、共発現されたＰ４Ｈサブユニットのシグナル配列は重要な役割を演じる。局在化を最高に充足することは、好ましい実施形態で、ヒトの配列を酵母のシグナル配列、例えばＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのフェロモンであるｍａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  １（ＭＦａ）に置換することで達成できるＭＦａシグナル配列で修飾されたＰ４Ｈサブユニットは効果的に小胞体の内腔に輸送された。
【００２８】
より好ましくは、前記シグナル配列が、配列番号１０に依るＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｍａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  １（ＭＦａ）である。
【００２９】
酵母細胞として、好ましくはＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ，Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ，またはＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａを使っても良い。
【００３０】
第一の発現ベクターは、好ましくは、一つ以上の制御エレメントをさらに含む。発現ベクターは酵母細胞内での発現に適したものでなければならない。
【００３１】
好ましくは、前記制御エレメントは、恒常的若しくは誘導性のプロモーター、とりわけ、ＧＰＤ，ＧＡＬ４，ＣＵＰ１，ＭＥＴ２５，ＧＡＬ１若しくはＧＡＬ１−１０のうちから選ばれたプロモーターを含む。
【００３２】
以後の実施形態においては、発現ベクターはプラスミドである。
【００３３】
好ましくは、コラーゲン類似組み換えタンパク質は、イガイ類足糸組み換えタンパク質で、エラスチン若しくはシルクフィブロインに隣接した１つ以上のコラーゲンドメイン断片から成る、または前記断片から構成される。
【００３４】
前記イガイ類足糸組み換えタンパク質は、１つ以上の種類の基礎単位を含む。その基礎単位は、形成されたタンパク質に異なる特性をもたらす。すなわち上述したように、エラスチンおよびシルクフィブロインはある機械的特性を持っており、その特性によって、イガイ足糸の機械的挙動に説明を与え、またそのために組み換えにより製造したイガイ類足糸タンパク質のデザインについても説明を与える。
【００３５】
したがって、前記断片は、ただ１種類の断片だけとして使用でき、あるいは、別法として、組み換えタンパク質は２つ以上の異なる断片を含んでも良い。例えば、高い弾力性が必要であれば、エラスチンに隣接したコラーゲン断片だけを含む、または主に含んでも良い。もし、高い堅さや強さが必要であれば、シルクフィブロインに隣接したコラーゲン断片を含んでも良い。さらに他の好ましい別法としては、両方の種類の断片の混合を含んでも良い。例えば、ある領域からもう一方の領域まで勾配を形成するような方法である。したがって、タンパク質／糸は特定の適応した構成、すなわち、高い弾性を持つ部分と高い堅さを持つ部分を有するように形成させることができる。
【００３６】
「隣接する」という言葉は、エラスチン（またはシルクフィブロイン）はコラーゲンドメインの両側に位置するということを意味する。
【００３７】
上述の断片は、天然由来のものであっても良い。例えば、前記断片は、イガイ属、好ましくはＭ． ｅｄｕｌｉｓ，Ｍ． ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ，Ｍ． ｃａｌｉｆｏｒｎｉａｎｓまたはＧｅｕｋｅｒｉａ ｄｅｍｉｓｓａから得られたものであって良い。
【００３８】
好ましい実施形態によると、本発明のイガイ類足糸組み換えタンパク質は、ＣｏｌＰ前駆体および／若しくはＣｏｌＤ前駆体若しくはそれら前駆体の変異体の断片を１つ以上含み、または前記断片から構成される。前記断片は上記で概要を述べている。両方のＣｏｌ（つまりＤとＰ）前駆体はＭ． ｅｄｕｌｉｓ由来のものであり、それを特徴付けるのは共通の基盤構造である。共通の基盤構造とは、異なるフランキング領域に隣接する中央のコラーゲンヘリックスであり、前記フランキング領域はそれぞれヒスチジンとＤＯＰＡを豊富に含む末端で終結している（図１参照）。前記フランキング領域は、既知の構造タンパク質、すなわちエラスチン（ＣｏｌＰ前駆体）およびシルクフィブロイン（ＣｏｌＤ前駆体）と完全に対応している。
【００３９】
ＣｏｌＰ前駆体とＣｏｌＤ前駆体の配列は、それぞれの核酸から翻訳される。したがって、ここで以後アミノ酸について言及する際は常に、前記アミノ酸はＣｏｌＰ前駆体とＣｏｌＤ前駆体について述べており、それらの配列はここで前述したような技術上の種々の応用に使われる。ここで第一に述べた核酸配列は、ＣｏｌＰ前駆体とＣｏｌＤ前駆体をコードする配列に関する。
【００４０】
さらなる実施形態によると、本発明の組み換えタンパク質は、配列番号３および／若しくは４またはそれらの変異体の断片を１つ以上含むか、または前記断片から構成される。前記配列番号はＣｏｌＰ前駆体とＣｏｌＤ前駆体の配列を反映する。
【００４１】
上述したように、本発明は、前記アミノ酸配列の変異体をも含む。例えば、前記変異体は、上述したアミノ酸配列と比較して、１つ以上の置換、挿入および／または欠失を含んでいても良い。
【００４２】
特に、タンパク質の変異体で、例えば配列の欠失、挿入、および／または置換のあるもので、いわゆるサイレント変異を起こすものは、本発明の一部と考えられる。
【００４３】
前記のアミノ酸の置換は、好ましくは、１つのアミノ酸を構造的および／または化学的に似た特性を持つ似たアミノ酸に置換すること、すなわち保存的なアミノ酸置換の結果起こったものであることである。
【００４４】
アミノ酸の置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性（両親和性）の性質の相似性を基礎として行うことができる。疎水性のアミノ酸の例としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。極性、中性のアミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む。正に荷電した（塩基性の）アミノ酸は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンを含む。負に荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸とグルタミン酸を含む。
【００４５】
「挿入」または「欠失」は通常は１から５つのアミノ酸の範囲である。変異体の許容される程度は、組み換えＤＮＡ法を用いたポリペプチド分子へのアミノ酸の挿入、欠失、または置換の組織的な適用で実験的に決定できる。結果として生じた変異体は、その特性、特にその機械的特性を試験することができる。
【００４６】
ここで使われている「変異体」という言葉は、ＣｏｌＰ前駆体とＣｏｌＤ前駆体の上述したアミノ酸配列、すなわち元来のイガイ類のシグナル配列を構成していた最初の１９アミノ酸が他のシグナル配列に置換されたアミノ酸配列をも含むことに留意されたい。ここで述べる好ましい例は、イガイ類シグナル配列のシグナル配列ａｌｐｈａ  ＭＦ（配列番号１０、「ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶ  ＬＦＡＡＳＳＡＬＡ」）による置換である。このシグナル配列は、特に酵母で前記核酸を発現させるのに適している。
【００４７】
本発明は、上で定義された組み換えタンパク質をコードする、単離された核酸をも提供する。「単離された」という言葉は、ここで核酸に関して使われる場合、由来となる生物種の天然に存在するゲノム配列上において（一方は５’末端でもう一方は３’末端で）直接近接している双方の配列と直接近接していない、天然に存在する核酸を表す。
【００４８】
例えば、単離された核酸は、なんの制限もなく、天然に存在するゲノム配列上で前記組み換えＤＮＡ分子と通常直接隣接している核酸の配列のうち一つが除去されているか存在しない、いかなる長さの組み換えＤＮＡ分子であっても良い。
【００４９】
したがって、単離された核酸は、ベクター、自律的に複製するプラスミド、ウイルス（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）中に、または原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み入れられた組み換えＤＮＡと同様に他の配列とは独立に分離した分子（例えば、ＰＣＲまたは制限酵素処理で産生されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）として存在する組み換えＤＮＡを、なんの制限もなく含む。さらに、単離された核酸は、核酸配列のハイブリッドまたは融合物の一部の組み換えＤＮＡ分子を含んでも良い。
【００５０】
「単離された」という言葉は、天然に存在しない核酸もまた含む。なぜなら、天然に存在しない核酸配列は、自然界には見いだせず、天然に存在するゲノム配列中に直接隣接した配列が無いからである。例えば、人工的に作られた核酸のような天然に存在しない核酸は、単離された核酸と考えられる。人工的な核酸は、一般的な分子クローニングまたは化学的核酸合成技術を使って作ることができる。単離された、天然に存在しない核酸は、他の配列と独立であって良いし、または、ベクター、自律的に複製するプラスミド、ウイルス（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）、もしくは原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み入れられていても良い。さらに、天然に存在しない核酸は、核酸配列のハイブリッドまたは融合物の一部である核酸配列を含んでいても良い。
【００５１】
例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー中、あるいは制限酵素処理したゲノムＤＮＡを含むゲル断片中にある、数百から数百万の他の核酸分子の中に存在する核酸は、単離された核酸とは考えられないということは、当業者にとっては明白であろう。
【００５２】
上述のアミノ酸をコードする核酸は、イガイ類足糸組み換えタンパク質の成熟型または未成熟型のアミノ酸配列をコードする核酸配列であっても良い。
【００５３】
好ましい実施形態では、単離された核酸は、配列番号１および／若しくは２またはそれらの変異体の核酸を含むか、または前記核酸から構成される。これらの変異体が中程度にストリンジェント若しくはストリンジェントな条件で配列番号１若しくは２を含む核酸とハイブリダイズするか、または前記変異体が配列番号１若しくは２の核酸配列と同一の、若しくは機能的に同等のアミノ酸をコードする遺伝子コードの縮重による核酸の変化を含む場合には、前記変異体は配列番号１若しくは２と比べて、１つ以上の置換、挿入、および／若しくは欠失を持つものとして定義される。
【００５４】
上述したように、本発明は、最初の１９のアミノ酸（シグナル配列）をコードする核酸が置換された、好ましくは酵母のシグナル配列であるＭＦａ（配列番号１０）が置換された前記核酸の変異体をも含む。
【００５５】
ここで用いるハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとは、ポリ核酸二本鎖が安定な条件を指す。当業者には明らかなように、二本鎖の安定性は、ナトリウムイオン濃度と温度の関数である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９年）を参照。）。ハイブリダイスの際に用いるストリンジェンシーのレベルは、当業者によって容易に変化させることができる。
【００５６】
ストリンジェントな洗浄条件とは、０．２×ＳＳＣ（０．０３Ｍ  ＮａＣｌ，０．００３Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７）／０．１％  ＳＤＳで６５℃という条件を指す。より短い断片では、例えば３０塩基数以下のオリゴヌクレオチドでは、ハイブリダイゼーションの温度は６５℃以下であり、例えば５０℃であり、好ましくは５５℃以上であるが、６５℃以下である。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの温度は、核酸のサイズまたは長さのそれぞれとそれらの塩基組成に依存し、経験のある技術者によって実験的に決定されることとなる。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの温度は例えば４２℃であり、洗浄条件は０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで４２℃である。
【００５７】
本発明で用いるＰ４Ｈは、好ましくはヒトまたはイガイ類のＰ４Ｈである。
【００５８】
第二の側面では、次に掲げる構成要素を含む、部品のキットまたは共発現システムを提供する：
ａ）ここで定義した第一の発現ベクター；そして
ｂ）上記で定義した第二の発現ベクター。
【００５９】
前記の部品のキットまたは共発現システムは、酵母細胞でイガイ類足糸組み換えタンパク質を発現するために有効に用いても良い。
【００６０】
さらに別の側面では、コラーゲン類似組み換えタンパク質、特にイガイ類足糸タンパク質を製造する方法を、次の工程を含むものとして開示する：
ａ）上記で定義された酵母細胞を提供する工程；
ｂ）前記酵母細胞を発現ベクターまたは上記で説明した共発現システムで形質転換する工程；
ｃ）前記宿主細胞から適切な条件下で組み換えタンパク質を発現する工程；および
ｄ）前記タンパク質を回収する工程。
【００６１】
さらに、イガイ類足糸組み換えタンパク質から糸を製造する方法を提供する。その方法は次の工程を含む：
ａ）上述の方法にしたがって製造した組み換えタンパク質を提供する工程、および、
ｂ）前記タンパク質を紡績するかまたは鋳型に入れて適切な方法で糸にする工程。
【００６２】
前記紡績は好ましくは電気紡績によって行う。電気紡績とは、連続した、直径ナノメートルの繊維を作るために静電気力を用いる技術である。広く様々な種類の天然および人工の重合体が、溶液および融解相から電気紡績されてきており、高度な表面素材が要求される各種応用分野（濾過膜およびバイオメディカル用品）にとって興味の対象である。
【００６３】
本発明のさらなる側面には、上記の方法の一つによって得られるタンパク質若しくは糸がある。
【００６４】
本発明のタンパク質／糸は、好ましくはバイオテクノロジーおよび／または医学の分野での応用を見いだす。
【００６５】
例えば、前記タンパク質／糸は、創傷治癒もしくは保護システム、または縫合材料の製造に用いても良い。さらに、前記タンパク質／糸は、好ましくは、代替材料、好ましくは人工の軟骨若しくは腱の材料の製造に用いても良い。
【００６６】
加えて、本発明の糸／タンパク質は、医用接着薄片、皮膚移植片、代用靱帯、そして外科用メッシュのような医療機器の製品や、衣服用布地、防弾チョッキの裏地、容器用布地、バッグ、あるいは財布のストラップ、ケーブル、ロープ、接着性の結合物質、非接着性の結合物質、固定用の物質、自動車のカバーや部品、飛行機の資材材料、全天候性の材料、曲げやすい仕切り材料、スポーツ用品のような広い範囲の産業上、商業上の製品、および、事実上、抗張力、弾力性が望ましい特性である繊維や布地のほとんど全ての用途に、用いることができる。
【００６７】
ドライスプレーコーティング、ビーズ様の粒子などの、他の形での安定した繊維製品の適応性と使用、あるいは他の構成物と混合しての使用も、本発明によって企図されている。
【００６８】
本発明のイガイ類足糸タンパク質の好ましい応用は、紙の製造と加工だけでなく、衣類用布地（織物）と皮革、自動車カバーと部品、飛行機資材の材料の製造と加工にもある、ということは明確に指摘しておく。
【００６９】
本発明のイガイ類足糸組み換えタンパク質は、セルロース、ケラチン、コラーゲン製品に加えても良く、したがって、本発明は、セルロースおよび／またはケラチンおよび／またはコラーゲンおよび本発明のタンパク質を含む、紙またはスキンケアおよびヘアケアの製品にも関する。紙、スキンケア、ヘアケアの製品で、本発明のタンパク質が取り入れられているものは、改良された特性を示し、特に抗張力または抗引き裂き力において改良されている。
【００７０】
さらに、本発明のイガイ類足糸組み換えタンパク質は、織物や皮革製品のコーティングとして使用しても良く、それによってコーティングした製品に安定性、持続性を与える。特に、前記タンパク質は、皮革製品のコーティングに適性を示す。なぜなら、この場合、皮なめしと皮なめしの環境への良くない影響が回避、あるいは少なくとも減少できるからである。
【００７１】
本発明は、前記イガイ類足糸タンパク質を含む製品、例えば、創傷治癒もしくは保護システム、縫合材料、代替材料、好ましくは人工軟骨もしくは腱の材料、化粧品、医薬品送達媒体、布地、織物、紙製品、皮革製品、自動車の部品、または航空機の部品にも関する。一般的に言って、球体、ナノフィブリル、ヒドロゲル、泡、フィルム等の、イガイ類足糸組み換えタンパク質を基盤とした材料にも本発明は関する。
【００７２】
特に別に定義が無い限り、ここで用いられている全ての技術上そして科学上の用語は、本発明の関係する技術の当業者に共通に理解されるのと同じ意味を持っている。ここで言及された全ての出版物、特許出願書類、特許、そして他の典拠は、全体として参考事項として取り込まれている。対立があった際には、定義も含め、本明細書が支配する。さらに、例は、説明のためだけであり、制限を意図したものではない。
【００７３】
ここで、本発明を、さらに、以下に示すような、実施例とそれに付属する図によって説明する。
【００７４】
図１は、イガイ類足糸コラーゲンの一般的な構造を示したものである。
図２は、末端側から基部側に向かった方向での足糸の一連のＳＥＭ画像を示す。印を付けた部分は、それぞれ下で拡大している。ａ）末端部、ｂ）中央部、ｃ）基部。
図３は、イガイ類足糸の構造を示す。
図４は、足糸を用いて堅い表面に接着したイガイ類を示したものである。
図５（Ａ）は、糸の中でのＣｏｌ前駆体の分布である。（Ｂ）は、フランキング領域を持つコラーゲンのサブユニットの概略図である。菱形で示す末端領域は、ヒスチジンに富む領域である。ＤＯＰＡはＹで示している。（Ｃ）は、同一軸上にあるコラーゲンと隣接した軸上にあるコラーゲン前駆体のクロスリンクによる相互作用のモデル図である。
図６は、Ｐ４Ｈコンストラクトの略図である。
図７は、それぞれの発現プラスミドに直ぐ組み込めるようになっている、αＭＦシグナル配列を作るためのオリゴヌクレオチドの略図である。
図８は、α−ＰＨのクローニング戦略である。
図９は、ベクター地図である。
【実施例】
【００７５】
［イガイ類足糸コラーゲンタンパク質の酵母での発現］
一般に、コラーゲンの合成は複雑な生化学的過程を反映する。その過程は、例えば、小胞体内で、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）により、それぞれのコラーゲンの特定のプロリンを４−ヒドロキシプロリンにする翻訳後修飾を必要とする。脊椎動物ではα２β２四量体であるＰ４Ｈは、コラーゲンの合成において中心的な役割を果たす。Ｐ４Ｈによって生じる４−ヒドロキシプロリン残基は、新しく合成されたコラーゲンポリペプチド鎖が三重らせんのコラーゲン分子となるための折りたたみに必須である［１３］。
【００７６】
（ヒトプロリル−４−ヒドロキシラーゼ発現コンストラクト）
Ｐ４Ｈのコンストラクトのためには、Ｐ４Ｈの２つのサブユニットであるα−ＰＨとＰＤＩのための遺伝子に隣接する酵母ベクターの内部にシグナル配列をクローニングする必要がある。両遺伝子は、ガラクトースの存在下で誘導される両方向性のプロモーター（Ｇａｌ１／１０）の制御のもとに置かれている（図６参照）。シグナル配列は、Ｐ４Ｈサブユニットの小胞体への移動のために必要である。小胞体でＰ４Ｈは集合して元来の四量体になることができる。最高効率での局在化は、ヒトのシグナル配列がｍａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  α−ＭＦの酵母自身のシグナル配列に置換されて達成される［１２］。これに関連して図６を参照のこと。
【００７７】
α−ＰＨ（シグナル配列無し）の遺伝子は、ＨｅｐＧ２肝臓細胞のｃＤＮＡライブラリー（ドイツ、ミュンヘンのＧＳＦのＡｄａｍｓｋｉ教授から提供を受けた）からＰＣＲで増幅される。一方、βサブユニット（ＰＤＩ）（シグナル配列無し）のｃＤＮＡはＥ． Ｃｏｌｉクローニングベクター（イギリス、マンチェスター大学のＮｅｉｌ  Ｂｕｌｌｅｉｄ教授から提供を受けた）から増幅される。それぞれの遺伝子に対して、それぞれのαＭＦシグナル配列が、２種類の一本鎖オリゴヌクレオチドに基づいて人工的に導入される。オリゴＡとＢはある程度計画されており（図７参照）、アニーリング後に二本鎖ＤＮＡを直接的にそれぞれのベクターにクローニングすることができる。
【００７８】
α−ＰＨのクローニング戦略を例示する（図８）。ＰＤＩのｃＤＮＡのクローニングは同一の方法で成される。２つの異なる酵母ベクターが用いられる。すなわち、ｐＲＳ３１５（ＣＥＮ、シングルコピー数のプラスミドを表す）とｐＲＳ４２５（２μ、マルチコピープラスミドを表す）であって、両方とも両方向性のＧａｌ１／１０プロモーターを含み、一つのプラスミドから両方のサブユニットを同時に発現させることができる。
【００７９】
（ＣｏｌＤ前駆体とＣｏｌＰ前駆体の組み換えでの合成）
イガイ類足糸の２つの主要なタンパク質因子であるＣｏｌＤ前駆体とＣｏｌＰ前駆体の組み換えでの合成は本発明の一例である。Ｅ． Ｃｏｌｉクローニングベクター中のＣｏｌＰ前駆体とＣｏｌＤ前駆体のｃＤＮＡは、Ｗａｉｔｅ教授（アメリカ合衆国、ＵＣＳＢ）から入手した。ｃＤＮＡはＰＣＲで増幅し、異なる酵母発現ベクターにクローニングする。ベクターは、アクティベーター（恒常的プロモーターのＧＰＤか誘導性プロモーターのＧＡＬ４のどちらか）の選択だけでなく、細胞ごとのコピー数が異なる。また、元々のシグナル配列も、最高効率での局在化のために、酵母のαＭＦのシグナル配列に置換する。
【００８０】
（組み換え合成の間におけるＣｏｌＰとＣｏｌＤの検出）
イガイ類コラーゲンの組み換えによる効率の良い合成を試験するには、イガイ類コラーゲンに対するポリクローナル抗体が利用できることが必要である。ヒトコラーゲンタイプI〜IIIに対するポリクローナル抗体を使った予備試験によると、イガイ類足糸の化学的に変性したコラーゲンに対してはごく弱い交差活性しか持っていないことが示された。この交差活性は、組み換えによる合成の間に存在するレベルのコラーゲンを検出するのに十分ではない。したがって、イガイ類コラーゲンに対する抗体を作製する必要がある。抗体を作製することができるようになるために、精製した天然のイガイ類コラーゲンが必要である。新鮮なイガイから足糸を抽出して、いくつかのクロマトグラフィー法（とりわけ逆相クロマトグラフィー）を用いて精製する。
【００８１】
ＣｏｌＤ前駆体とＣｏｌＰ前駆体の両方を含む、精製タンパク質サンプルを用いてウサギを免疫し、抗体を作製する。
【００８２】
（組み換えコラーゲンの生物物理学的解析）
ＣｏｌＰ前駆体／ＣｏｌＤ前駆体の個々のタンパク質をキャラクタライズし、自己重合して繊維を形成する効率を評価するために多様な物理的方法を用いることができる。前記方法には、遠紫外線および近紫外線による円偏光二色性分光分析（ＣＤ）、静的・動的光散乱、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、電子顕微鏡（ＥＭ）、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、ならびに流動場分画法（ＦＦＦ）が含まれる。
【００８３】
（個々のＣｏｌＰ前駆体とＣｏｌＤ前駆体の評価）
ＣＤやＦＴＩＲは、ＣｏｌＰ前駆体とＣｏｌＤ前駆体の二次構造、三次構造を決定するために用いられる。前記タンパク質の化学的、温度的な安定性もまた多様な条件下で試験することができる。コラーゲン形成に関与するタンパク質の形に関するデータは、光散乱、ＡＦＭ、ＴＥＭによって提供される。
【００８４】
（繊維形成の速度と効率の評価）
イガイ類足糸コラーゲンの二次、三次構造は、ＣＤやＦＴＩＲで解析される。ＡＦＭやＥＭは集合した凝集体や繊維の四次構造や形態に関して情報をもたらす。マトリックスの無い一相クロマトグラフィーであるＦＦＦは、コラーゲン集合の間に形成される異なる種類の種を評価するのに用いられる。ＦＦＦは、マトリックスの無いクロマトグラフィー技術なので、溶解した異なる巨大分子、特に他の古典的なクロマトグラフィー技術では分離できない繊維を分離することができる。
【００８５】
集合の過程での動きは、ＣＤやＦＴＩＲでも調査され、繊維形成の間の二次、三次構造の変化をモニタリングすることによって時間の関数として調べることができる。さらに、静的光散乱、動的光散乱、低速度撮影ＡＦＭによって、リアルタイムでタンパク質の集合をモニターすることができる。
【００８６】
タンパク質集合に伴って起こる構造上の変化を調査するために、蛍光色素も用いることができる。いくつかの色素の蛍光特性は、３−クロロ−６−メトキシ−９  アミノアクリジンやアミノナフタレンスルホン酸のＮ−ベンジル誘導体のように、タンパク質環境の極性に伴って変化する。したがって、コラーゲンをこれらの色素でラベルすることは、集合の過程を調べるために用いられる。
【００８７】
［コラーゲンの集合とクロスリンクにおける金属の役割の調査］
（ＤＯＰＡとチロシンのクロスリンクにおけるＧＧＨの役割）
ＧＧＨのアミノ酸配列は、ＣｏｌＰ前駆体とＣｏｌＤ前駆体の両方のカルボキシ末端で観察されている。トリペプチドである、ＮＨ２−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−ＣＯＯＨ（ＧＧＨ）は、酢酸ニッケル［Ｎｉ（ＯＡｃ）２］と酸化モノペルオキシフタル酸マグネシウム［ＭＭＰＰ］の存在下で、溶液中の結合したタンパク質のクロスリンクを媒介する［１８，１９］。さらに、ペプチドは、ニッケル中心にとって好ましい調和的環境を提供し、推定上のＮｉ（III）中間体は接近可能なチロシンの芳香環から電子を引き抜き、プロトンを失った後にチロシンのラジカルが生じる（図５参照）、と考えられている。前記の強く活性化されたラジカル中間体は、近傍のチロシンに結合し、クロスリンクされた付加化合物が生じる。
2009515540.tif 000002
チロシンクロスリンクの機構
【００８８】
イガイ類コラーゲンのカルボキシ末端にあるＧＧＨの役割は、活性触媒であるＮｉ−ＧＧＨを形成するために、Ｎｉ（II）に結合することである可能性がある。この複合体は、チロシンやＤＯＰＡの大気中での酸化をゆっくりと触媒し、クロスリンクを形成させることができる。触媒の近くにチロシンおよび／またはＤＯＰＡが存在すると、酸化のレートは有意に上昇する。この仮説を試験するため、ＧＧＨ配列を遺伝的に欠失または修正して、ニッケルとの結合を不可能にすることができる。クロスリンクと集合のレートは上述した方法で観察できる。
【００８９】
（コラーゲンでクロスリンクを形成するためのチロシンの化学的酸化）
ルテニウム（III）トリス（ビピリジル）ジカチオン［Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋］と過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）のような電子受容体の存在下で［１８，２０，２１］可視光を照射すると、接触するタンパク質間で非常に効率の良いクロスリンクが誘導される。この過程はたいへん効率が良く、その機構はＮｉ／ＧＧＨ／ＭＭＰＰの場合と似ていると考えられている。ＣｏｌＰ前駆体および／またはＣｏｌＤ前駆体の自己集合で形成された繊維は、ＡＰＳの存在下で［Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋］とともに光照射に供する。このことにより、足糸コラーゲン中のチロシン／ＤＯＰＡのクロスリンクが増加し、機械的特性の異なった繊維が形成され、前記特性は上述した物理化学的キャラクタリゼーションによって評価されることになる。
【００９０】
（さらなる例と配列）
イガイ類ＣｏｌＰ前駆体とＣｏｌＤ前駆体のＤＮＡ配列を下記に示す。両方のＣｏｌ前駆体（ＰとＤ）のｃＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔクローニングベクターに組み込んだ。出発材料を確認するために、両方のｃＤＮＡを完全にシーケンスし、スタンダードなプライマーとしてＴ７とＳＰ６を用い、内部プライマーとしてｐｒｅＣｏｌ（ＰまたはＤ）−Ｔ７／１とＳＰ６／１をそれぞれ用いた。得られたＤＮＡ配列は、出版されたヴァージョンにおける両方のＣｏｌ前駆体の配列とは異なっており、それに応じて比較を行った。
【００９１】
ＣｏｌＰ前駆体（配列番号１）
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ａａｇｇａｃｃａａｃ  ａｇｇａｇｃａｃａａ  ｇｇａｃｃａｇｃｃｇ  
ｇｔｃｃａｇｃｃｇｇ  ａｃｃａｔｃａｇｇａ  ｇａａｃａａｇｇａｃ  
ｃａｇｇａｇｇｇｇａ  ａａｇａｇｇａｇｇｃ  ｃａｇｇｇａｃｃａｃ  
ａａｇｇａｇｃｔｇａ  ａｇｇａｃｃａａｇｔ  ｇｇａｃｃａｇｃａｇ  
ｇａｃｃａａｇａｇｇ  ａｃｃａｇｃａｇｇａ  ｔｃａｃａａｇｇａｃ  
ｃａａｇｔｇｇｔｇａ  ａｃｇｃｇｇａｇａａ  ｃｃａｇｇａｇｃａｃ  
ｃａｇｇｔａａａａａ  ａｇｇａｃｃａａａｔ  ｇｇａｇａｃｃｇａｇ  
ｇａａａｃｃａａｇｇ  ａｔｃａｃｃａｇｇａ  ｇｃａｃｃａｇｇｃａ  
ａａａａｃｇｇａｇｃ  ａｃｇａｇｇａａａｔ  ａｇａｇｇａｔｃａａ  
ｇａｇｇａａｇｃａａ  ｃｇｇａｔｃａｃｃｃ  ｇｇｃａｇａｔｃａｇ  
ｇａｔｃａｃｃａｇｇ  ａａｇｃｃｇａｇｇａ  ａａａｃｃａｇｇａｃ  
ｃａｃａａｇｇａｃｃ  ａｃａｔｇｇａｃｃａ  ａｇａｇｇａｇｃａａ  
ｇａｇｇａｔｃａｃｃ  ａｇｇａｃａａａａａ  ｇｇａｃｃａｃｇｔｇ  
ｇａｇａｃｃａａｇｇ  ａｇｃａｃｃａｇｇｔ  ｇｔｔａｔｔｃｇｔａ  
ｔｔｇｔｔａｔｃｇａ  ｔｇａｃｃａｇａｇａ  ａｃａｇｇａｃｃａｇ  
ａａｇｔｔｇｃａｇａ  ａｔｔｃｃｃａｇｇａ  ｔｔｔｇｇｔｇｇａｔ  
ｔｃｇｇａｇｇａｇｃ  ｔｔｃａｇｃｔａａｃ  ｇｃａｇｃａａｇｔｔ  
ｃａｇｃａａａｔｇｃ  ａｔｔｔｇｃｔｇｇｔ  ｇｇａｃｃｃｇｇｔｇ  
ｇｔｔｃｃｇｃｔｇｇ  ａｇｃａｇｇｔｔｃａ  ｔｃａｔｃａｇｇａｇ  
ｃｔａａｃｇｃａａａ  ｃｇｃａｇｇｔｇｇａ  ｔｔｃｃｃａｔｔｃｇ  
ｇａｇｇａｇｇａｃｃ  ａｔｔｃｇｇａｇｇａ  ｇｃａｇｇａｇｇｔｇ  
ｇｔｃｃｃｇｇａｇｃ  ａｇｃａｇｇａｇｇｃ  ｃｃａｇｇａｇｇａｇ  
ｃａｇｇａｇｇｃｃｃ  ａｇｇａｇｇａｇｔａ  ｇｇａｇｇａｇｇａｇ  
ｔｔｇｇａｇｇｔｇｇ  ａｃｃａｇｇａｇｇａ  ｇｔａｇｇａｇｇｔｇ  
ｇａｇｔａｇｇａｇｇ  ｔｇｇａｃｃａｇｇａ  ｇｇａｇｔａｇｇａｇ  
ｇｔｇｇａｃｃａｇｇ  ａｇｇａｇｃａｇｇａ  ｃｃａｇｇａｇｇａｇ  
ｃａｇｇａｇｇａｔｔ  ｔｇｇａｃｃａｇｇａ  ｇｇａｇｃａｇｇａｇ  
ｇａｔｔｔｇｇｔｇｇ  ａｔｔｔｇｇａｇｇａ  ｇｇａｔｃｔａｇｃｇ  
ｃｔｇｇａｇｃａｔｃ  ａｔｃａｔｃａｇｇａ  ｔｃａｇｃａｔｃｔｇ  
ｃａｔｃｔａａｃｇｇ  ｔｇｇａｃｃａｔｔｃ  ｇｇａｇｔａｃｔｃａ  
ａｔｇｔａｇｇａｃｃ  ｃｇｇａｇｇｔａｇａ  ａｔｃｇｇｔｇｇｔｇ  
ｇａａｇｃｇｃａｔｃ  ａｇｃａｔｃｔｇｃａ  ｇｃａｔｃｔａｇａｇ  
ｃａｃａｔｇｃａｃａ  ｃｇｃｔｔｔｔｇｇｔ  ｇｇｔｃｔｃｇｇａｇ  
ｇｇｇｇａａｇｔｇｃ  ｃｔｃａｇｃｔｇｇｔ  ａｇｔｃａｔｔｃｃｔ  
ｃａｔｃｔａｇｃｔｃ  ａｃａｃｔｃａｔｔｔ  ｇｇｃｇｇａｃａｃｇ  
ｔａｔｔｃｃａｃａｇ  ｔｇｔｇａｃｃｃａｔ  ｃａｔｇｇａｇｇｔｃ  
ｃａｔｃａｃａｔｇｔ  ｔｔｃａａｇｃｇｇａ  ｇｇｔｃａｃｇｇａｇ  
ｇｔｃａｔｇｇａｇｇ  ａｇｇｔｃｃａｔａｃ  ａａａｃｃｔｇｇａｔ  
ａｔｔａａ
【００９２】
遺伝子コードの縮重のために、全ての塩基置換がアミノ酸置換になるわけではない。そのため、ＤＮＡ配列をアミノ酸配列に翻訳し、比較した。出版された配列（ＣＯＹＮＥら、１９９７年）［ｇｉ：２３８６６７５］、（変種ｐ３８（ＣＯＹＮＥおよびＷＡＩＴＥ、２０００年））と、シーケンシング（配列決定）によって得られたＣｏｌＰ前駆体の配列とのアラインメントをここに示す。データベース上の配列は配列番号９に相当し、シーケンシングしたＣｏｌＰ前駆体の配列は配列番号３に相当する。
【００９３】
2009515540.tif 000003
2009515540.tif 000004
【００９４】
ＣＯＹＮＥおよびＷＡＩＴＥは、ＣｏｌＰ前駆体のｃＤＮＡ配列における特定の部分的領域において、異なるＣｏｌＰ前駆体の変種（Ｐ２２，Ｐ３３，Ｐ３８）が存在することを既に示していた（ＣＯＹＮＥおよびＷＡＩＴＥ、２０００年）。もし変種Ｐ２２におけるこれらの短い既知の配列領域を現在のＣｏｌＰ前駆体のＤＮＡ配列と比較すると、１００％の一致が達成できる。
【００９５】
ＣｏｌＤ前駆体  （配列番号２）
ａｔｇｇｔｃｔａ  ｃａａａｃｔｃｃｔｇ  ａｃｃｇｔｇｔｇｔｃ  
ｔｔｇｔａｇｃａｔｃ  ｔｃｔｔｃｔａｇａｇ  ａｔｔｔｇｃｔｔａｇ  
ｃｔｇａｃｔａｔａａ  ｃｇｇｃａａｃａａａ  ｃａｇｔａｔｇｇｃｇ  
ｇｃａｇａｔａｃｇｇ  ｃａａｃａｇａｔａｃ  ｇｇａａａｃｇｇｔｔ  
ｔａｇｇａｇｇｃｇｇ  ｔａａｔｇｇｔｇｇｔ  ｇｃａｇｇａｇｃｃｇ  
ｔａｇｃｃｃａｔｇｃ  ｃｃａｔｇｃｃｃａｔ  ｇｃｃｃａｔｇｃｃａ  
ｇｔｇｃｃｇｇａｇｃ  ａａａｃｇｇａａｇａ  ｇｃａａｇａｇｃａｃ  
ａｔｇｃａｃｇａｇｃ  ｃｔｔｇｇｃｃｃａｔ  ｇｃａｃａｔｇｃｃｇ  
ｇｔｇｇｔｇｇｃｇｃ  ｔｇｃａｃａｔｇｇａ  ｃａｃｃｃａｇｇａｔ  
ｔｃｃｃａｇｔｔｇｇ  ｔｇｇｔａｇｃｇｃａ  ａｇｃｇｃａｇｃｃｇ  
ｃａｃｇａｇｃａｇｃ  ａｇｃａｃｇａｇｃａ  ｔｃａｇｃａｇｇａｇ  
ｇａｔｔａｇｇｔｇｇ  ａｔｔｃｇｇａｔｃａ  ｇｃａｇｃａｇｃｃａ  
ａｔｇｃａｇｃａｇｃ  ａｇｃａｇｃａａｇａ  ｇｃａｇｇａｇｃａｇ  
ｇａｔｔｔｇｇｔｇｇ  ａｔｔｃｇｇｔｇｇａ  ｔｔａｇｇａｇｇａｔ  
ｔｃｇｇａｇｇａｃｔ  ｃｇｇａｇｇａｇｔｔ  ｇｇｃｇｇｔｃｃａｇ  
ｇｔｃａａｃｃａｇｇ  ａｃａｔｇｃｃｇｇｔ  ａａａｃａｃｇｇａａ  
ｃｃｇｃａｇｇａｇｃ  ａｇｃａｇｇｃａａａ  ｇｃａｇｇａｃｇｔｃ  
ｃａｇｇａｃｃａｔｇ  ｔｇｇａｇａｔａｇａ  ｇｇｇｇｃａｃｃａｇ  
ｇａｇｔａｃｃａｇｇ  ｃａａａｃａａｇｇａ  ｃｃａｇｔａｇｇａｇ  
ｇａｃａａｇｇａｃｃ  ａｇｃａｇｇａｃｃａ  ｃｇａｇｇａｃｃａｃ  
ｇａｇｇａｇａｔｇａ  ａｇｇａｃｃａｇｔｔ  ｇｇａｃｃａａａｇｇ  
ｇｃｇａａｃｃａｇｇ  ａｇｃａａｇａｇｇａ  ｇｃｔｇａｔｇｇｔａ  
ａａｃｃａｇｇａｇａ  ｃａａａｇｇａｃｃｔ  ｇａｔｇｇａｇａａａ  
ｃｃｇｇａｃｃａｃａ  ａｇｇａｃｃａｇｃｔ  ｇｇａｃｃａａａｇｇ  
ｇａｃａａｇｔａｇｇ  ａｇａｃｃａａｇｇｃ  ａａａｃｃａｇｇａｇ  
ｃａａａｇｇｇａｇａ  ａａｃｃｇｇａｇａｔ  ｃａａｇｇａｇｃａｃ  
ｇａｇｇｔｇａａｇｃ  ａｇｇａａａｇｇｃｃ  ｇｇｃｇａａｃａａｇ  
ｇａｃｃａｇｇａｇｇ  ｃａｔｃｃａａｇｇａ  ｃｃａａａｇｇｇａｃ  
ｃａｇｔａｇｇａｇｇ  ａｃａａｇｇａｃｃａ  ｇｃａｇｇａｃｃａｇ  
ｃｃｇｇａｃｃａｃｔ  ｃｇｇａｃｃａｃａａ  ｇｇａｃｃａａｔｇｇ  
ｇｔｇａａｃｇａｇｇ  ａｃｃａｃａａｇｇａ  ｃｃａａｃａｇｇａｔ  
ｃａｇａａｇｇａｃｃ  ａｇｔｔｇｇａｇｃａ  ｃｃａｇｇａｃｃａａ  
ａｇｇｇａｔｃａｇｔ  ｃｇｇａｇａｃｃａａ  ｇｇａｇｃａｃａａｇ  
ｇａｇａｃｃａａｇｇ  ａｇｃａａｃｔｇｇｃ  ｇｃｔｇａｔｇｇｃａ  
ａａａａｇｇｇａｇａ  ａｃｃａｇｇａｇａｇ  ａｇａｇｇａｃａａｃ  
ａａｇｇａｇｃａｇｃ  ａｇｇａｃｃａｇｔｃ  ｇｇｃｃｇａｃｃａｇ  
ｇａｃｃａａｇａｇｇ  ａｇａｔａｇａｇｇａ  ｇｃａａａｇｇｇａａ  
ｔｔｃａａｇｇａａｇ  ｃｃｇａｇｇａｃｇａ  ｃｃａｇｇｔｇｇｔａ  
ｔｇｇｇｔａｇａｃｇ  ａｇｇａａａｃｃｇｔ  ｇｇａｔｃｃｃａａｇ  
ｇａｇｃａｇｔａｇｇ  ａｃｃａｃｇａｇｇａ  ｇａａａｃｔｇｇｃｃ  
ｃａｇａｃｇｇｔａａ  ｃｃａａｇｇａｃａａ  ｃｇｔｇｇａｇａａｃ  
ａａｇｇａｇｃａｃｃ  ａｇｇａｇｔｔａｔｃ  ａｃｃｃｔｔｇｔｃａ  
ｔｔｇａａｇａｃｃｔ  ｃａｇａａｃａｇｃｃ  ｇｇａｇｔａｇａａａ  
ｇｃｃｃｃｇｔａｇａ  ａａｃｃｔｔｔｇａｃ  ｇｃａｇｇａｇｃａｇ  
ｇａａｃｃｇｇｔｇｇ  ａｃｃａｇｃａｃｃａ  ｇｇａｇｔａｇｇａｇ  
ｃａｇｃａｇｃａａｃ  ａｇｃａｇｇａｇｃａ  ｔｔｔｇｃａｇｇａｇ  
ｃａｇｇａｃｃａｇｇ  ａｇｇａｇｃｔａａｔ  ｇｃａｇｇａｇｇａａ  
ａｃｇｃａｇｃｃｇｃ  ａｇｇａｇｃａｇｇａ  ｃｃａｇｇａｇｔａｇ  
ｇａｃｃａｇｇａｇｇ  ａｃｔｃｇｇａｇｇａ  ｃｔａｇｇａｇｇａｃ  
ｔｔｇｇｔｇｃａｇｇ  ｔｇｇａｃｔｃｇｇａ  ｇｇｔｇｇａｃｔｃｇ  
ｇｃｇｇｔｇｇａｃｔ  ｃｇｇａｇｇａｔｔａ  ｇｇａｇｇａｇｃａｇ  
ｇａｇｇｔｔｔａｇｇ  ｔｇｇｔｇｇａｃｔｃ  ｇｇａｇｇａｔｔａｇ  
ｇａｇｇａｇｇｔｔｔ  ａｇｇｔｇｇｔｇｇａ  ｃｔｃｇｇａｇｇｔｔ  
ｔａｇｇａｇｇｔｇｇ  ａｇｃａｇｇａｇｇａ  ｇｃａｇｇａｇｇｃｇ  
ｃａｇｇａｇｃａｇｇ  ａｇｇａａａｃｇｇｔ  ｇｇａｇｃａｇｇａｇ  
ｃａｇｇａｇｇａｇｃ  ａｇｇａｇｇａａａｃ  ｇｇｔｇｇａｇｇａｔ  
ｃａｇｃｃｇｃａｇｃ  ａｃｇａｇｃａｇｃａ  ｇｃａｃａａｇｃａｇ  
ｃａｇｃａｇｃａｇｃ  ａｇｇａｇｇａａａｃ  ｇｇｔｇｇａｇｃａｇ  
ｃａｃａａｇｃａｇｃ  ａｇｃａｃａａｇｃａ  ｇｃａｇｃａｔｃａｇ  
ｃａｇｃａｇｃａａａ  ｔｔｃａｇｇａｃｔｔ  ｇｇａｇｃａｇｇａｇ  
ｃａｇｃａａｇａｇｃ  ａｇｃａｇｃａｔｃａ  ｇｃａｇｃｃｇｃｔａ  
ｇａｇｃａａｃｃｇｔ  ａｇｃａｇｇａｃａｔ  ｇｇａａｇｔｇｇａａ  
ｃｃｇｃｃｇｃａｇｃ  ａｇｃａｇｃｃａａｃ  ｇｃａｇｃｃｇｃａｃ  
ａａｇｃａｃａｔｇｃ  ａｇｃａａｃａｃｇａ  ｇｇａｃａａｇｇａｇ  
ｇａｔｃａｃａｃｇｃ  ａｃａｃｇｃｔｇｃｃ  ｇｃｃｇｃａｇｃｔｃ  
ａｃｇｃａｇｃｃｇｃ  ａａｇｔａｇｃｇｔａ  ａｔｃｃａｔｇｇｔｇ  
ｇｔｇａｃｔａｔｃａ  ｃｇｇａａａｃｇａｔ  ｇｃｃｇｇｃｔａｔｃ  
ａｃａａａｃｃａｇｇ  ａｔａｔｔａａ
【００９６】
下記では、出版された配列（ＱＩＮら、１９９７年）［ｇｉ：２７７２９１４］とＣｏｌＤ前駆体のシーケンシングから得られた配列全体とのアラインメントを示している。ＤＮＡ配列は、翻訳してタンパク質の配列としている。データベースの配列は、配列番号８であり、シーケンスによって得られた配列は配列番号４であることについて言及しておく。
【００９７】
2009515540.tif 000005
2009515540.tif 000006
【００９８】
両方の配列には大きな違いがある。用いられたＣｏｌＤ前駆体の配列は出版された配列よりも２５０アミノ酸ぶん短い。コラーゲンドメイン中の主要な部分のアミノ酸が失われている。したがって、現在明らかにされたＣｏｌＤ前駆体遺伝子は、現在に至るまで出版されておらず、ＣｏｌＤ前駆体遺伝子の未知のヴァージョンである。コラーゲンドメインの切断により、タンパク質全体においてシルクフィブロインドメインの量が増し、それによってタンパク質全体の挙動が異なるということを言及しておく。
【００９９】
［Ｐ４Ｈの発現コンストラクト］
下記において、ＳａｃＩＩからＡｐａＩまでの領域にあるＰ４Ｈのプラスミド発現後におけるＤＮＡ配列を二重鎖として示している。ＭＦａ／Ｐ４Ｈ融合コンストラクトの始まりと終わりはどちらも印刷されている。使用した制限酵素部位は下線で示している。
【０１００】
配列番号７
2009515540.tif 000007
2009515540.tif 000008
2009515540.tif 000009
2009515540.tif 000010
【０１０１】
タンパク質の配列
ＭＦａ−Ｐ４ＨＡ  （配列番号５）
ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶ  ＬＦＡＡＳＳＡＬＡＨ  ＰＧＦＦＴＳＩＧＱＭ  
ＴＤＬＩＨＴＥＫＤＬ  ＶＴＳＬＫＤＹＩＫＡ  ＥＥＤＫＬＥＱＩＫＫ  
ＷＡＥＫＬＤＲＬＴＳ  ＴＡＴＫＤＰＥＧＦＶ  ＧＨＰＶＮＡＦＫＬＭ  
ＫＲＬＮＴＥＷＳＥＬ  ＥＮＬＶＬＫＤＭＳＤ  ＧＦＩＳＮＬＴＩＱＲ  
ＰＶＬＳＮＤＥＤＱＶ  ＧＡＡＫＡＬＬＲＬＱ  ＤＴＹＮＬＤＴＤＴＩ  
ＳＫＧＮＬＰＧＶＫＨ  ＫＳＦＬＴＡＥＤＣＦ  ＥＬＧＫＶＡＹＴＥＡ  
ＤＹＹＨＴＥＬＷＭＥ  ＱＡＬＲＱＬＤＥＧＥ  ＩＳＴＩＤＫＶＳＶＬ  
ＤＹＬＳＹＡＶＹＱＱ  ＧＤＬＤＫＡＬＬＬＴ  ＫＫＬＬＥＬＤＰＥＨ  
ＱＲＡＮＧＮＬＫＹＦ  ＥＹＩＭＡＫＥＫＤＶ  ＮＫＳＡＳＤＤＱＳＤ  
ＱＫＴＴＰＫＫＫＧＶ  ＡＶＤＹＬＰＥＲＱＫ  ＹＥＭＬＣＲＧＥＧＩ  
ＫＭＴＰＲＲＱＫＫＬ  ＦＣＲＹＨＤＧＮＲＮ  ＰＫＦＩＬＡＰＡＫＱ  
ＥＤＥＷＤＫＰＲＩＩ  ＲＦＨＤＩＩＳＤＡＥ  ＩＥＩＶＫＤＬＡＫＰ  
ＲＬＳＲＡＴＶＨＤＰ  ＥＴＧＫＬＴＴＡＱＹ  ＲＶＳＫＳＡＷＬＳＧ  
ＹＥＮＰＶＶＳＲＩＮ  ＭＲＩＱＤＬＴＧＬＤ  ＶＳＴＡＥＥＬＱＶＡ  
ＮＹＧＶＧＧＱＹＥＰ  ＨＦＤＦＡＲＫＤＥＰ  ＤＡＦＫＥＬＧＴＧＮ  
ＲＩＡＴＷＬＦＹＭＳ  ＤＶＳＡＧＧＡＴＶＦ  ＰＥＶＧＡＳＶＷＰＫ  
ＫＧＴＡＶＦＷＹＮＬ  ＦＡＳＧＥＧＤＹＳＴ  ＲＨＡＡＣＰＶＬＶＧ  
ＮＫＷＶＳＮＫＷＬＨ  ＥＲＧＱＥＦＲＲＰＣ  ＴＬＳＥＬＥ  
【０１０２】
ＭＦａ−Ｐ４ＨＢ  （配列番号６）
ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶ  ＬＦＡＡＳＳＡＬＡＤ  ＡＰＥＥＥＤＨＶＬＶ  
ＬＲＫＳＮＦＡＥＡＬ  ＡＡＨＫＹＬＬＶＥＦ  ＹＡＰＷＣＧＨＣＫＡ  
ＬＡＰＥＹＡＫＡＡＧ  ＫＬＫＡＥＧＳＥＩＲ  ＬＡＫＶＤＡＴＥＥＳ  
ＤＬＡＱＱＹＧＶＲＧ  ＹＰＴＩＫＦＦＲＮＧ  ＤＴＡＳＰＫＥＹＴＡ  
ＧＲＥＡＤＤＩＶＮＷ  ＬＫＫＲＴＧＰＡＡＴ  ＴＬＰＤＧＡＡＡＥＳ  
ＬＶＥＳＳＥＶＡＶＩ  ＧＦＦＫＤＶＥＳＤＳ  ＡＫＱＦＬＱＡＡＥＡ  
ＩＤＤＩＰＦＧＩＴＳ  ＮＳＤＶＦＳＫＹＱＬ  ＤＫＤＧＶＶＬＦＫＫ  
ＦＤＥＧＲＮＮＦＥＧ  ＥＶＴＫＥＮＬＬＤＦ  ＩＫＨＮＱＬＰＬＶＩ  
ＥＦＴＥＱＴＡＰＫＩ  ＦＧＧＥＩＫＴＨＩＬ  ＬＦＬＰＫＳＶＳＤＹ  
ＤＧＫＬＳＮＦＫＴＡ  ＡＥＳＦＫＧＫＩＬＦ  ＩＦＩＤＳＤＨＴＤＮ  
ＱＲＩＬＥＦＦＧＬＫ  ＫＥＥＣＰＡＶＲＬＩ  ＴＬＥＥＥＭＴＫＹＫ  
ＰＥＳＥＥＬＴＡＥＲ  ＩＴＥＦＣＨＲＦＬＥ  ＧＫＩＫＰＨＬＭＳＱ  
ＥＬＰＥＤＷＤＫＱＰ  ＶＫＶＬＶＧＫＮＦＥ  ＤＶＡＦＤＥＫＫＮＶ  
ＦＶＥＦＹＡＰＷＣＧ  ＨＣＫＱＬＡＰＩＷＤ  ＫＬＧＥＴＹＫＤＨＥ  
ＮＩＶＩＡＫＭＤＳＴ  ＡＮＥＶＥＡＶＫＶＨ  ＳＦＰＴＬＫＦＦＰＡ  
ＳＡＤＲＴＶＩＤＹＮ  ＧＥＲＴＬＤＧＦＫＫ  ＦＬＥＳＧＧＱＤＧＡ  
ＧＤＤＤＤＬＥＤＬＥ  ＥＡＥＥＰＤＭＥＥＤ  ＤＤＱＫＡＶＫＤＥＬ  
【０１０３】
ＭＦａの配列（配列番号１０）
ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶ  ＬＦＡＡＳＳＡＬＡ  
【０１０４】
参考文献
１．  Ｙｏｎｇｅ，  Ｍ．  （１９６２）．  Ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｙｓｓｕｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｖａｌｖｉａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｍａｒ．  Ｂｉｏｌ．  Ａｓｓ．  Ｕ．  Ｋ．  ４２，  １１３−１２５．
２．  Ｑｉｎ，  Ｘ．−Ｘ．，  Ｃｏｙｎｅ，  Ｋ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｗａｉｔｅ，  Ｊ．Ｈ．  （１９９７）．  Ｔｏｕｇｈ  ｔｅｎｄｏｎｓ．  Ｍｕｓｓｅｌ  ｂｙｓｓｕｓ  ｈａｓ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｗｉｔｈ  ｓｉｌｋ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７２，  ３２６２３−３２６２７．
３．  Ｗａｉｔｅ，  Ｊ．Ｈ．  （１９９２）．  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．  １９，  ２７．
４．  Ｑｉｎ，  Ｘ．−Ｘ．，  ａｎｄ  Ｗａｉｔｅ，  Ｊ．Ｈ．  （１９９５）．  Ｅｘｏｔｉｃ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｇｒａｄｉｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｙｓｓｕｓ  ｏｆ  ｈｔ  ｅＭｕｓｓｅｌ  Ｍｙｔｉｌｕｓ  Ｅｄｕｌｉａ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９８，  ６３３−６４４．
５．  Ｖａｃｃａｒｏ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｗａｉｔｅ，  Ｊ．Ｈ．  （２００１）．  Ｙｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｐｏｓｔ−Ｙｉｅｌｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  Ｍｕｓｓｅｌ  Ｂｙｓｓａｌ  Ｔｈｒｅａｄ：  Ａ  Ｓｅｌｆ−Ｈｅａｌｉｎｇ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍａｔｅｒｉａｌ．  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２，  ９０６−９１１．
６．  Ｃｏｙｎｅ，  Ｋ．Ｊ．，  Ｑｉｎ，  Ｘ．−Ｘ．，  ａｎｄ  Ｗａｉｔｅ，  Ｊ．Ｈ．  （１９９７）．  Ｅｘｔｅｎｓｉｂｌｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎ  ｍｕｓｓｅｌ  ｂｙｓｓｕｓ：  ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．  Ｃ．）  ２７７，  １８３０−１８３２．
７．  Ｗａｉｔｅ，  Ｊ．Ｈ．，  Ｑｉｎ，  Ｘ．−Ｘ．，  ａｎｄ  Ｃｏｙｎｅ，  Ｋ．Ｊ．  （１９９８）．  Ｔｈｅ  ｐｅｃｕｌｉａｒ  ｃｏｌｌａｇｅｎｓ  ｏｆ  ｍｕｓｓｅｌ  ｂｙｓｓｕｓ．  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７，  ９３−１０６．
８．  Ｃｏｏｍｂｓ，  Ｔ．Ｌ．，  ａｎｄ  Ｋｅｌｌｅｒ，  Ｐ．Ｊ．  （１９８１）．  Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｂｙｓｓａｌ  ｔｈｒｅａｄｓ  ａｓ  ａｎ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｌ  ｉｏｎｓ．  Ａｑｕａｔ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  １９８１，  ２９１−３００．
９．  Ｓｗａｎｎ，  Ｃ．Ｐ．，  Ａｄｅｗｏｌｅ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｗａｉｔｅ，  Ｊ．Ｈ．  （１９９８）．  Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｍａｎｇａｎｅｓｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｒｅｉｓｓｅｎｉｄ  ｂｙｓｓａｌ  ｔｈｒｅａｄｓ．  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  Ｐａｒｔ  Ｂ：  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１９Ｂ，  ７５５−７５９．
１０．  Ｔａｙｌｏｒ，  Ｓ．Ｗ．，  Ｃｈａｓｅ，  Ｄ．Ｂ．，  Ｅｍｐｔａｇｅ，  Ｍ．Ｈ．，  Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｍ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｗａｉｔｅ，  Ｊ．Ｈ．  （１９９６）．  Ｆｅｒｒｉｃ  Ｉｏｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ａ  ＤＯＰＡ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓ．  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，  ７５７２−７５７７．
１１．  Ｓｕｎ，  Ｃ．，  Ｖａｃｃａｒｏ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｗａｉｔｅ，  Ｊ．Ｈ．  （２００１）．  Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｆｉｂｅｒｓ．  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ８１，  ３５９０−３５９５．
１２．  Ｍｙｌｌｙｈａｒｊｕ，  Ｊ．，  Ｎｏｋｅｌａｉｎｅｎ，  Ｍ．，  Ｖｕｏｒｅｌａ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ，  Ｋ．Ｉ．  （２０００）．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｉ−ＩＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．  ２８，  ３５３−３５７．
１３．  Ｐｒｏｃｋｏｐ，  Ｄ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ，  Ｋ．Ｉ．  （１９９５）．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６４，  ４０３−４３４．
１４．  Ｏｌｓｅｎ，  Ｄ．Ｒ．，  Ｌｅｉｇｈ，  Ｓ．Ｄ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｒ．，  ＭｃＭｕｌｌｉｎ，  Ｈ．，  Ｏｎｇ，  Ｗ．，  Ｅｒｎｅｓｔ，  Ｔ．，  Ｃｈｉｓｈｏｌｍ，  Ｇ．，  Ｂｉｒｋ，  Ｄ．Ｅ．，  Ｂｅｒｇ，  Ｒ．Ａ．，  Ｈｉｔｚｅｍａｎ，  Ｒ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｔｏｍａｎ，  Ｐ．Ｄ．  （２００１）．  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｙｐｅ  １  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  Ｎｅｗ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｒｉｍｅｒｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６，  ２４０３８−２４０４３．
１５．  Ｓｃｈｅｉｂｅｌ，  Ｔ．  （２００４）．  Ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋｓ：  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ａｓｓｅｍｂｌｙ，  ｓｐｉｎｎｉｎｇ，  ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  ３，  Ｎｏ  ｐｐ．  ｇｉｖｅｎ．
１６．  Ｈｕｅｍｍｅｒｉｃｈ，  Ｄ．，  Ｓｃｈｅｉｂｅｌ，  Ｔ．，  Ｖｏｌｌｒａｔｈ，  Ｆ．，  Ｃｏｈｅｎ，  Ｓ．，  Ｇａｔ，  Ｕ．，  ａｎｄ  Ｉｔｔａｈ，  Ｓ．  （２００４）．  Ｎｏｖｅｌ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｓｐｉｄｅｒ  Ｄｒａｇｌｉｎｅ  Ｓｉｌｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １４，  ２０７０−２０７４．
１７．  Ｈｕｅｍｍｅｒｉｃｈ，  Ｄ．，  Ｈｅｌｓｅｎ，  Ｃ．Ｗ．，  Ｑｕｅｄｚｕｗｅｉｔ，  Ｓ．，  Ｏｓｃｈｍａｎｎ，  Ｊ．，  Ｒｕｄｏｌｐｈ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｉｂｅｌ，  Ｔ．  （２００４）．  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｐｉｄｅｒ  Ｄｒａｇｌｉｎｅ  Ｓｉｌｋｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３，  １３６０４−１３６１２．
１８．  Ｂｒｏｗｎ，  Ｋ．Ｃ．，  ａｎｄ  Ｋｏｄａｄｅｋ，  Ｔ．  （２００１）．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．  Ｍｅｔａｌ  Ｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ３８，  ３５１−３８４．
１９．  Ｆａｎｃｙ，  Ｄ．Ａ．，  Ｄｅｎｉｓｏｎ，  Ｃ．，  Ｋｉｍ，  Ｋ．，  Ｘｉｅ，  Ｙ．，  Ｈｏｌｄｅｍａｎ，  Ｔ．，  Ａｍｉｎｉ，  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｋｏｄａｄｅｋ，  Ｔ．  （２０００）．  Ｓｃｏｐｅ，  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｏｔｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｍｅｔａｌ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７，  ６９７−７０８．
２０．  Ｂｕｒｄｉｎｅ，  Ｌ．，  Ｇｉｌｌｅｔｔｅ，  Ｔ．Ｇ．，  Ｌｉｎ，  Ｈ．−Ｊ．，  ａｎｄ  Ｋｏｄａｄｅｋ，  Ｔ．  （２００４）．  Ｐｅｒｉｏｄａｔｅ−Ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  ＤＯＰＡ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２６，  １１４４２−１１４４３．
２１．  Ｋｉｍ，  Ｋ．，  Ｆａｎｃｙ，  Ｄ．Ａ．，  Ｃａｒｎｅｙ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｋｏｄａｄｅｋ，  Ｔ．  （１９９９）．  Ｐｈｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｐａｌｌａｄｉｕｍ  Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２１，  １１８９６−１１８９７．
【０１０５】
追加の参考文献
Ｂｒａｋｅ，  Ａ．Ｊ．  （１９９０）  Ａｌｐｈａ−ｆａｃｔｏｒ  ｌｅａｄｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｙｅａｓｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８５：  ４０８−２１
Ｂｕｌｌｅｉｄ，  Ｎ．Ｊ．，  Ｊｏｈｎ，  Ｄ．Ｃ．  ＆  Ｋａｄｌｅｒ，  Ｋ．Ｅ．  （２０００）  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．  ２８：  ３５０−３
Ｃｏｙｎｅ，  Ｋ．Ｊ．  ＆  Ｗａｉｔｅ，  Ｊ．Ｈ．  （２０００）  Ｉｎ  ｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｏｖｅｔａｉｌｓ  ｉｎ  ｍｕｓｓｅｌ  ｂｙｓｓｕｓ：  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｔｈｒｅａｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｔｅｍ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  ２０３：  １４２５−３１  
Ｋｅｉｚｅｒ−Ｇｕｎｎｉｎｋ，  Ｉ．，  Ｖｕｏｒｅｌａ，  Ａ．，  Ｍｙｌｌｙｈａｒｊｕ，  Ｊ．，  Ｐｉｈｌａｊａｎｉｅｍｉ，  Ｔ．，  Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ，  Ｋ．Ｉ．  ＆  Ｖｅｅｎｈｕｉｓ，  Ｍ．  （２０００）  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｐｅｒｌｙ  ｆｏｌｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ．  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．  １９：  ２９−３６  
Ｌｕｃａｓ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｖａｃｃａｒｏ，  Ｅ．  ＆  Ｗａｉｔｅ，  Ｊ．Ｈ．  （２００２）  Ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，  ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｂｙｓｓｕｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓ  ａｎｄ  Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  ２０５：  １８０７−１
Ｍａｓｃｏｌｏ，  Ｊ．Ｍ．  ＆  Ｗａｉｔｅ，  Ｊ．Ｈ．  （１９８６）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｒａｄｉｅｎｔｓ  ｉｎ  ｂｙｓｓａｌ  ｔｈｒｅａｄｓ  ｏｆ  ｓｏｍｅ  ｍａｒｉｎｅ  ｂｉｖａｌｖｅ  ｍｏｌｌｕｓｃｓ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｚｏｏｌ．  ２４０：  １−７  
Ｑｉｎ，  Ｘ．Ｘ．  ＆  Ｗａｉｔｅ，  Ｊ．Ｈ．  （１９９８）  Ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎｏｕｓ  ｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｕｓｓｅｌ  ｂｙｓｓａｌ  ｔｈｒｅａｄｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：  １０５１７−２２  
Ｓｉｋｏｒｓｋｉ  Ｒ．Ｓ．  ＆  Ｈｉｅｔｅｒ  Ｐ．  （１９８９）  Ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｙｅａｓｔ  ｈｏｓｔ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２２，  １９−２７
Ｔｏｍａｎ，  Ｐ．Ｄ．，  Ｃｈｉｓｈｏｌｍ，  Ｇ．，  ＭｃＭｕｌｌｉｎ，  Ｈ．，  Ｇｉｅｒｅ，  Ｌ．Ｍ．，  Ｏｌｓｅｎ，  Ｄ．Ｒ．，  Ｋｏｖａｃｈ，  Ｒ．Ｊ．，  Ｌｅｉｇｈ，  Ｓ．Ｄ．，  Ｆｏｎｇ，  Ｂ．Ｅ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｒ．，  Ｄａｎｉｅｌｓ，  Ｇ．Ａ．，  Ｂｅｒｇ，  Ｒ．Ａ．  ＆  Ｈｉｔｚｅｍａｎ，  Ｒ．Ａ．  （２０００）  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｒｉｍｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｆｏｕｒ−ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：  ２３３０３−９  
Ｖａｕｇｈｎ，  Ｐ．Ｒ．，  Ｇａｌａｎｉｓ，  Ｍ．，  Ｒｉｃｈａｒｄｓ，  Ｋ．Ｍ．，  Ｔｅｂｂ，  Ｔ．Ａ．，  Ｒａｍｓｈａｗ，  Ｊ．Ａ．  ＆  Ｗｅｒｋｍｅｉｓｔｅｒ，  Ｊ．Ａ．  （１９９８）  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １７：  ５１１−８
Ｖｕｏｒｅｌａ，  Ａ．，  Ｍｙｌｌｙｈａｒｊｕ，  Ｊ．，  Ｎｉｓｓｉ，  Ｒ．，  Ｐｉｈｌａｊａｎｉｅｍｉ，  Ｔ．  ＆  Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ，  Ｋ．Ｉ．  （１９９７）  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｌｙｌ  ４−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ：  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｔｅｔｒａｍｅｒ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｌｙｌ  ４−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １６：  ６７０２−１２
Ｗａｉｔｅ，  Ｊ．Ｈ．，  Ｖａｃｃａｒｏ，  Ｅ．，  Ｓｕｎ，  Ｃ．  ＆  Ｌｕｃａｓ，  Ｊ．Ｍ．  （２００２）  Ｅｌａｓｔｏｍｅｒｉｃ  ｇｒａｄｉｅｎｔｓ：  ａ  ｈｅｄｇｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｓｔｒｅｓｓ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｒｉｎｅ  ｈｏｌｄｆａｓｔｓ？  Ｐｈｉｌｏｓ．  Ｔｒａｎｓ．  Ｒ．  Ｓｏｃ．  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ．  Ｓｃｉ．  ３５７：  １４３−５３
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図１は、イガイ類足糸コラーゲンの一般的な構造を示したものである。
【図２】図２は、末端側から基部側に向かった方向での足糸の一連のＳＥＭ画像を示す。印を付けた部分は、それぞれ下で拡大している。ａ）末端部、ｂ）中央部、ｃ）基部。
【図３】図３は、イガイ類足糸の構造を示す。
【図４】図４は、足糸を用いて堅い表面に接着したイガイ類を示したものである。
【図５】図５（Ａ）は、糸の中でのＣｏｌ前駆体の分布である。（Ｂ）は、フランキング領域を持つコラーゲンのサブユニットの概略図である。菱形で示す末端領域は、ヒスチジンに富む領域である。ＤＯＰＡはＹで示している。（Ｃ）は、同一軸上にあるコラーゲンと隣接した軸上にあるコラーゲン前駆体のクロスリンクによる相互作用のモデル図である。
【図６】図６は、Ｐ４Ｈコンストラクトの略図である。
【図７】図７は、それぞれの発現プラスミドに直ぐ組み込めるようになっている、αＭＦシグナル配列を作るためのオリゴヌクレオチドの略図である。
【図８】図８は、α−ＰＨのクローニング戦略である。
【図９ａ】図９ａは、ベクター地図である。
【図９ｂ】図９ｂは、ベクター地図である。
【図９ｃ】図９ｃは、ベクター地図である。
【図９ｄ】図９ｄは、ベクター地図である。
【図１】
2009515540.tif 000011
【図２】
2009515540.tif 000012
【図３】
2009515540.tif 000013
【図４】
2009515540.tif 000014
【図５】
2009515540.tif 000015
【図６】
2009515540.tif 000016
【図７】
2009515540.tif 000017
【図８】
2009515540.tif 000018
【図９ａ】
2009515540.tif 000019
【図９ｂ】
2009515540.tif 000020
【図９ｃ】
2009515540.tif 000021
【図９ｄ】
2009515540.tif 000022
【配列表】
2009515540000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月17日(2007.9.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン類似組み換えタンパク質、好ましくはイガイ類足糸組み換えタンパク質を製造する酵母細胞であって、次に掲げる要素で形質転換された酵母細胞。
ａ）前記コラーゲン類似組み換えタンパク質をコードする、第一の発現ベクター；および、
ｂ）プロリル−４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）をコードする核酸を含む、第二の発現ベクター。
前記コラーゲン類似組み換えタンパク質は、イガイ類エラスチン若しくはイガイ類シルクフィブロインドメインに隣接したイガイ類コラーゲンドメインを１つ以上含む、またはそれらから成る、イガイ類足糸組み換えタンパク質である。
【請求項２】
請求項１に記載の酵母細胞であって、前記Ｐ４Ｈの配列にシグナル配列が連結されており、前記酵母細胞の小胞体へ、前記配列が効率良く輸送される酵母細胞。
【請求項３】
請求項２に記載の酵母であって、前記シグナル配列がＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（配列番号１０）のｍａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  １（ＭＦａ）である酵母。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項以上に記載の酵母細胞であって、好ましくはＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、またはＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａである酵母細胞。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項以上に記載の酵母細胞であって、前記第一の発現ベクターが、１つ以上の制御因子をさらに含む酵母細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の酵母細胞であって、前記制御因子が、恒常性または誘導性のプロモーターから選択されたプロモーターを含む酵母細胞。
【請求項７】
請求項６に記載の酵母細胞であって、前記プロモーターがＧＰＤ、ＧＡＬ４、ＣＵＰ１、ＭＥＴ２５、ＧＡＬ１、またはＧＡＬ１−１０から選択される酵母細胞。
【請求項８】
前記請求項のいずれか１項以上に記載の酵母細胞であって、前述の発現ベクターがプラスミドである酵母細胞。
【請求項９】
前記請求項のいずれか１項以上に記載の酵母細胞であって、前記コラーゲンドメイン断片がイガイ類に由来するもので、好ましくはＭ． ｅｄｕｌｉｓ、Ｍ． ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ、Ｍ． ｃａｌｉｆｏｒｎｉａｎｓ、またはＧｅｕｋｅｒｉａ ｄｅｍｉｓｓａである酵母細胞。
【請求項１０】
前記請求項のいずれか１項以上に記載の酵母細胞であって、前記イガイ類足糸組み換えタンパク質が、ＣｏｌＰ前駆体および／若しくはＣｏｌＤ前駆体またはそれらの変異体の断片１つ以上から成る、またはそれを含む、酵母細胞。
【請求項１１】
前記請求項のいずれか１項以上に記載の酵母細胞であって、前記組み換えタンパク質が、配列番号３および／若しくは４、またはそれらの変異体のアミノ酸配列から成る、またはそれを含む、酵母細胞。
【請求項１２】
前記請求項のいずれか１項以上に記載の酵母細胞であって、前記組み換えタンパク質において、それぞれのアミノ酸配列のシグナル配列が、酵母特異的なシグナル配列、好ましくはＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｍａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  １（ＭＦａ）に置換された、酵母細胞。
【請求項１３】
前記請求項のいずれか１項以上に記載の酵母細胞であって、Ｐ４Ｈがヒトまたはイガイ類のＰ４Ｈである、酵母細胞。
【請求項１４】
次に示す構成要素を含むタンパク質を含む組み換えコラーゲンの製造に用いる、部品のキットまたは共発現システム。
ａ）請求項１〜１３のいずれか一つ以上により定義される第一の発現ベクター；および
ｂ）請求項１〜１３のいずれか一つ以上により定義される第二の発現ベクター；
【請求項１５】
イガイ類足糸組み換えタンパク質を製造する方法であって、次の工程を含む方法。
ａ）酵母細胞を提供する工程；
ｂ）前記酵母細胞を、請求項１〜１３のいずれか１項以上で定義される第一および第二の発現ベクター若しくは請求項１４に記載の共発現システムで形質転換する工程；
ｃ）適切な条件下で、前記酵母細胞から前記コラーゲン類似組み換えタンパク質、好ましくはイガイ類足糸組み換えタンパク質を発現させる工程；および、
ｄ）前記組み換えタンパク質を回収する工程。
【請求項１６】
イガイ類足糸組み換えタンパク質から糸を製造する方法であって、次に示す工程を含む方法。
ａ）請求項１５で製造された組み換えタンパク質の提供；および、
ｂ）適切な方法によって前記タンパク質を（電気的に）紡績、または型どりをする工程。
【請求項１７】
請求項１５の方法で製造可能なタンパク質または請求項１７に記載の方法で製造可能な糸。
【請求項１８】
バイオテクノロジーおよび／または医学の分野での、請求項１７に記載のタンパク質・糸の使用。
【請求項１９】
創傷治癒または保護のシステムの製造のための、請求項１７に記載のタンパク質／糸の使用。
【請求項２０】
縫合材料を製造するための請求項１９の使用。
【請求項２１】
前記縫合材料が神経外科または眼科の外科術での使用を意図された、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
代替材料、好ましくは人工の軟骨または腱の材料を製造するための請求項１７に記載のタンパク質／糸の使用。
【請求項２３】
請求項１７に記載のタンパク質／糸を使って製造することができる、創傷治癒または保護のシステム、縫合材料、代替材料、好ましくは人工の軟骨若しくは腱の材料。
【請求項２４】
請求項１７に記載のタンパク質／糸を含む、化粧品、医薬品送達媒体、布地、織物、紙製品、皮革製品、自動車の部品、または航空機の部品。
【国際調査報告】
2009515540.tif 000023
2009515540.tif 000024