(57)【要約】  本発明は、アルツハイマー病および異常アミロイドベータ凝集に関連した他の状態の治療のための抗体の産生用の免疫原として使用される、アミロイドベータの安定化された架橋オリゴマーの、ほぼゼロの長さの二官能性架橋剤を使用する製造方法に関する。好ましい二官能性架橋剤は１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．可溶化Ａβ由来ペプチドの溶液を調製し、
ｂ．該溶液をほぼゼロの長さの二官能性架橋剤と一緒にして混合物を形成させ、
ｃ．該混合物を、架橋を引き起こすのに十分な時間および温度でインキュベートし、
ｄ．抗原として使用される、工程（ｃ）の架橋生成物を得る
ことを含んでなる、共有結合的に安定化された抗原の製造方法。
【請求項２】
二官能性架橋剤が１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
架橋生成物が１００ｋＤａ〜２００ｋＤａの質量範囲を有する、請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
架橋生成物が５％未満の単量体混入を伴う、請求項２記載の製造方法。
【請求項５】
架橋生成物を更に、免疫原として使用するためにアジュバントと共に製剤化する、請求項２記載の製造方法。
【請求項６】
アジュバントが、サポニンに基づくアジュバントである、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
製剤が医薬組成物として使用される、請求項５記載の製造方法。
【請求項８】
ａ．可溶化Ａβ由来ペプチドの溶液を調製し、
ｂ．該溶液を二官能性架橋剤と一緒にして混合物を形成させ、
ｃ．該混合物を、架橋を引き起こすのに十分な時間および温度でインキュベートし、
ｄ．抗原として使用される、工程（ｃ）の架橋生成物を得る
ことを含んでなる、Ａβのコンホメーションエピトープを有する共有結合的に安定化された抗原の製造方法。
【請求項９】
二官能性架橋剤が１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）である、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
架橋生成物が１００ｋＤａ〜２００ｋＤａの質量範囲を有する、請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
架橋生成物が５％未満の単量体混入を伴う、請求項９記載の製造方法。
【請求項１２】
架橋生成物を更に、免疫原として使用するためにアジュバントと共に製剤化する、請求項９記載の製造方法。
【請求項１３】
アジュバントが、サポニンに基づくアジュバントである、請求項１２記載の製造方法。
【請求項１４】
製剤が医薬組成物として使用される、請求項１２記載の製造方法。
【請求項１５】
ａ．可溶化Ａβ由来ペプチドの溶液を調製し、
ｂ．該溶液を二官能性架橋剤と一緒にして混合物を形成させ、
ｃ．該混合物を、架橋を引き起こすのに十分な時間および温度でインキュベートし、
ｄ．工程（ｃ）からの複数の架橋生成物を、該架橋生成物の質量に基づくクロマトグラフィー分離を用いて精製し、
ｅ．抗原として使用される、工程（ｄ）の精製産物を得る
ことを含んでなる、精製された共有結合的に安定化された抗原の製造方法。
【請求項１６】
二官能性架橋剤が１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）である、請求項１５記載の製造方法。
【請求項１７】
工程（ｄ）のクロマトグラフィー分離がアセトニトリルと水性バッファーとの１：１混合物および４５℃〜４８℃のカラム温度を更に含む、請求項１５記載の製造方法。
【請求項１８】
架橋生成物が１００ｋＤａ〜２００ｋＤａの質量範囲を有する、請求項１５記載の製造方法。
【請求項１９】
架橋生成物が５％未満の単量体混入を伴う、請求項１５記載の製造方法。
【請求項２０】
架橋生成物を更に、免疫原として使用するためにアジュバントと共に製剤化する、請求項１５記載の製造方法。
【請求項２１】
アジュバントが、サポニンに基づくアジュバントである、請求項２０記載の製造方法。
【請求項２２】
製剤が医薬組成物として使用される、請求項２０記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病および異常なアミロイドベータ凝集に関連した他の状態の治療のための抗体の産生用の免疫原として使用される、アミロイドベータの安定化された架橋オリゴマーの組成物および製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）由来のペプチド、すなわち、アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドは水溶液中で自己会合して、オリゴマー形態の複雑かつ不均一な混合物を形成する（Ｋｌｅｉｎ，Ｗ．Ｌ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：２１９−２２４（２００１））。アミロイド由来びまん性リガンド（ＡＤＤＬ）として公知のそのようなオリゴマーのクラスの１つが合成Ａβ４２ペプチドから製造されている（Ｃｈｒｏｍｙ，Ｂ．Ａ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：１２７４９−１２７６０（２００３））。これらの可溶性オリゴマーは、おそらく未だ特定されていない受容体媒介経路を介して、一括してアルツハイマー病（ＡＤ）として公知である神経毒性事象および症状に関連していると報告されている（Ｋｌｅｉｎ，Ｗ．Ｌ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．４１：３４５−３５２（２００２））。
【０００３】
ＡＤＤＬは、公開されている文献において、種々の方法で特徴づけられているが、最も一般的にはゲル電気泳動における泳動パターンおよび原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）によって特徴づけられている。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、Ａβ４２ペプチドの合成製造物からの単量体、二量体、三量体および時にはより高い質量のオリゴマーに対応する特徴的な種が観察される。ＡＤ病モデルにおける動物からの脳抽出物において同様の結果が観察されている。ＡＦＭは球状可溶性オリゴマーを伸長線維および原線維形態から明瞭に識別する。
【０００４】
Ａβペプチド調製物は動的である、すなわち、それは絶えず会合および解離事象を受けて最終的にはより高次の凝集物を生成する、と一般に認識されている。ＡＤ患者の死後脳におけるアミロイド斑形態学の疫学的関連性は、その疾患がアミロイド線維の沈着に相関しているという説につながった。しかし、最近の研究は、関連する神経毒性および認知障害事象が斑沈着の非存在下で可溶性オリゴマーまたはＡＤＤＬによってもたらされることを示唆している（Ｋｉｒｋｉｔａｄｚｅ，Ｍ．Ｄ．ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．：６９：５６７−５７７（２００２））。脳内の主要ペプチド種であるＡβ４０およびＡβ４２は顕著に異なる凝集傾向を示し、Ａβ４０は主として単量体状態で存在する。トランスジェニック動物モデルにおけるＡβ４２レベルの上昇はＡＤ様症状の増強と相関するため、Ａβ４２の自己会合が神経毒性の原因事象であると考えられている。合成ペプチドでのインビトロ研究は、Ａβ４２がＡβ４０に比べて凝集しやすい性質のものであることを証明している（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｔ．ら，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：６９５：１４４−１４８（１９９３））。単量体Ａβ種は正常組織に存在するため、それらは、免疫系により一般には認識されない自己抗原とみなされる。上昇した濃度のＡβ４２の存在下の自己会合はオリゴマー形成を引き起こし、これらのオリゴマーの構造形態は現時点では公知ではないが、２以上の単量体ペプチドの相互作用が、もはや免疫系により自己として認識されない新たなコンホメーションエピトープ（ネオエピトープ）を生成しうるという可能性がある。したがって、そのようなコンホメーションエピトープに対する特異的な抗体応答はＡＤの治療のための能動性または受動性免疫アプローチにおいて防御として役立つものとなりうるであろう。
【０００５】
合成アミロイドペプチドの一定の調製物が毒性オリゴマーを含有するという観察（Ｋｌｅｉｎ，Ｗ．Ｌ．ら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ：２５：５６９−５８０（２００４））は、特異的な抗体応答を達成する免疫原の製造方法を可能にする。しかし、得られた調製物は、「そのまま」使用された場合には、所望の抗体応答を達成するための次善的なものに過ぎないかもしれない。すなわち、（１）そのような調製物の不安定性は、所望のサイズのオリゴマー集団を特定し標的化することを困難にする。なぜなら、この系は流動状態にあるからである。（２）かなりのレベルの単量体の存在が、有害な作用を引き起こしうる。なぜなら、この種は「自己」として認識され、量の多さがオリゴマー上の新たなコンホメーションエピトープの認識を妨げうるからである。そして、（３）高レベルの単量体は、単量体とオリゴマーとの間に共有されるエピトープに対する応答を誘導しうる。この最後者の筋書きにおいて、産生される抗体の大部分は全て、該分子の同一領域を認識するという点で、抗体応答は免疫優性エピトープに向けられうる。このことはＡβペプチドにも当てはまりうる。なぜなら、該分子のアミノ末端（残基１−１５）を認識するいくつかのモノクローナル抗体が報告されているからである。これは必ずしも有害なものでないかもしれないが、そのような受動投与抗体製剤の安全性レベルは、それらが毒性オリゴマー成分のみを認識し単量体自己抗原を認識しないならば、高められるであろう。実際、Ｐｆｅｉｆｅｒらは、Ａβの残基２−６を認識するモノクローナルＩｇＧ抗体の受動投与が、びまん性アミロイド問題の有意な軽減をもたらすが、脳アミロイド血管障害関連出血における２倍の増加をも引き起こすことを報告している（Ｐｆｅｉｆｅｒ，Ｍ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１３７９（２００２））。
【０００６】
本発明は、ＡＤ治療用抗体を産生させるための免疫原として使用するための、単量体Ａβペプチドを実質的に含有しない、Ａβ由来ペプチドの共有結合的に安定化されたオリゴマー形態の改良された製造方法に関する。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明の１つの実施形態はＡβ由来ペプチドの共有結合オリゴマー形態の製造方法を記載する。該ペプチドは完全長Ａβを含み、これはアミノ酸残基１−４０（Ａβ４０）（配列番号１）またはアミノ酸残基１−４２（Ａβ４２）（配列番号２）、およびそれらの置換またはトランケート化形態（配列番号３〜７）を含む。該ペプチド源は合成物、天然物、または組換え技術により製造されたものでありうる。そのような方法は、１００ｋＤａ〜２００ｋＤａの質量範囲の優勢なオリゴマー種を有する安定化されたオリゴマー形態を提供する。
【０００８】
本発明の更にもう１つの実施形態においては、該方法は、Ａβ４２の可溶性オリゴマー種のコンホメーションエピトープを有する免疫原を含む組成物を提供する。
【０００９】
本発明のもう１つの実施形態においては、一定の分子量（Ｍｗ）の集団が得られうるようＡβ由来ペプチドの共有結合オリゴマー形態を精製するための方法を提供する。この実施形態は、質量に基づいて集団が分離されるクロマトグラフィー分離工程（サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）と称される技術である）の使用を含む。
【００１０】
発明の詳細な説明
架橋は、オリゴマー構造体を安定化するため及びペプチド調製物の免疫原性を増加させるための確立された技術である。１つの一般的なアプローチは、グルタルアルデヒドのような化学架橋剤を使用するものである（Ｌｅ  Ｖｉｎｅ，Ｈ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，１６：７５５−７６４（１９９５））。このアプローチはオリゴマータンパク質のサブユニット構造の決定に使用されているが、それは、ペプチドに適用された場合にはいくつかの欠点を有する。グルタルアルデヒドは長さゼロの架橋剤ではなく、したがって、それは、架橋された種の構造体内に追加的なリンカーを導入し、これは天然構造を乱す可能性がある。Ａβ４２オリゴマーの場合、これは、与えられたオリゴマー内ではなく隣接オリゴマー間の架橋を引き起こしうる（Ｂｉｔａｎ，Ｇ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３５１７６−３５１８４（２００１））。グルタルアルデヒドは、ある条件下、自己重合およびリシン修飾のような多数の望ましくない副作用にも寄与しうる（同誌）。より最近の報告は、Ａβオリゴマー化の研究における未修飾タンパク質の光誘導性架橋（ｐｈｏｔｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＩＣＵＰ））の使用を記載している（Ｂｉｔａｎ，Ｇ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３５１７６−３５１８４（２００１）；Ｂｉｔａｎ，Ｇ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：３３０−３３５（２００３）；Ｂｉｔａｎ，Ｇ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４８８２−３４８８９（２００３）；ならびにＢｉｔａｎ，Ｇ．およびＴｅｐｌｏｗ，Ｄ．Ｂ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３７：３５７−３６４（２００４））。米国特許第６，６１３，５８２号に示されているＰＩＣＵＰ法は、該構造体内で接近しているアミノ酸残基（主として芳香族残基、ＨｉｓまたはＭｅｔ）を共有結合架橋するために光誘導性フリーラジカルメカニズムを用いるものである。それは比較的短い反応時間を用いるが、該方法は光の入力および強度のパラメータに対して非常に感受性である。さらに、体積および濃度の変化は最終産物組成に劇的な影響（例えば、存在する低次オリゴマーおよび単量体種の比率の変化）を及ぼしうる。現在までの報告は、生成される種が一般にはより低次のもの（すなわち、二量体ないし八量体）であることを示している（同誌）。
【００１１】
本発明は、サイズ排除クロマトグラフィーにより特異的に単離される、ほぼゼロの長さの二官能性架橋剤である１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）を使用する、Ａβ由来ペプチドの共有結合オリゴマー形態の製造方法を含む。実施例１に記載のプロトコール従い製造されるオリゴマー種は１００ｋＤａ〜２００ｋＤａの平均分子量を有し、最小限度の単量体混入（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）を伴う（すなわち、未組込み単量体の比率は５％未満である）。
【００１２】
ＤＦＤＮＢは、その２つのフッ素置換基を介して求核芳香族置換により第一級アミンと反応して、アリールアミン誘導体を与える。自己会合性ペプチド種を架橋するためには、以下のいくつかの理由により、ほぼゼロの長さの試薬の選択が重要である：（１）それは、既に接近している残基（すなわち、天然構造において接近している残基）のみが反応することを保証する；（２）そのような試薬は、不安定化またはコンホメーション改変効果を有しうる、構造体内への外的スペーサー原子の導入を最小限に抑える；および（３）小さく疎水性であるという該試薬の性質はペプチドオリゴマーの疎水性内部へのより良好な透過を可能にしうる。この場合、Ａβ架橋のためにＤＦＤＮＢを選択した。なぜなら、架橋原子間の伸長距離が５オングストローム未満であり、架橋の強度が他のアミン反応性試薬の場合より高かったからである（Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．Ｓ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１０：１２９３−１３０４（２００１））。ゼロまたはほぼゼロの長さの他の架橋剤、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）および４−フェニル１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＤ）が公知であり、Ａβのようなペプチドを架橋するために使用されうるが、本出願人は、どちらの物質も、ＤＦＤＮＢの場合のようには、特許請求されている方法の最小限度の混入および最適なサイズを有するオリゴマー種を与えないことを見出した。
【００１３】
化学的架橋は、光誘導性架橋と比較して、前者で達成されうる制御の度合および方法の大規模化の可能性の点で、もう１つの利点をもたらす。二官能性試薬で得られる反応の度合は、本質的に反応性であるものの、濃度、反応時間および温度の変化により修飾されうる。光架橋の場合、主要パラメータは、再現可能な様態で制御し規模変化させることがより困難な光強度および持続時間である。さらに、光架橋に固有のフリーラジカルメカニズムは、より高い質量の種を生成させるために要求される、より長い反応時間の場合に特に、ペプチド構造に望ましくない影響を及ぼしうる（Ｂｉｔａｎ，Ｇ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３５１７６−３５１８４（２００１））。したがって、当業者は、本明細書におけるアミロイド由来ペプチドの架橋のためにＤＦＤＮＢを使用することには、必ずしも目を向けないであろう。
【００１４】
本発明のＡβ由来ペプチドには、完全長Ａβに由来する任意のペプチドが含まれ、これらには、３９〜４３アミノ酸の長さを含むＡβ形態が含まれる。Ａβの完全長配列はＫａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：７７３−７７６（１９８７）に記載されている。本発明のＡβ由来ペプチドには、残基１−４２を含むペプチド（Ａβ４２）または残基１−４０を含むペプチド（Ａβ４０）、および野生型配列からの１以上の突然変異、保存的置換または改変を含むペプチド、あるいはそれらのトランケート化形態が含まれるが、これらに限定されるものではない。該配列は、天然または非天然に生じるアミノ酸を含有することが可能であり、末端修飾、例えば（１）インビトロ安定化のために導入されるアセチル化またはアミド化、（２）化学的コンジュゲート化、例えばシステイン化、マレイミド化およびブロモアセチル化（これらに限定されるものではない）のための反応性基の導入、および（３）スペーサー連結、例えばアミノヘキサン酸、ポリエチレングリコール誘導体およびポリ酢酸もしくは多塩基アミノ酸反復（これらに限定されるものではない）の導入を含みうる。Ａβ由来ペプチドは合成物、天然に由来するもの、または当業者に公知の組換え技術により製造されたものでありうる。以下は、特許請求されている方法において使用されうるＡβ由来ペプチド配列の具体例である。
【００１５】
【化１】
2009500325.tif 000002
前記配列のすべてにおいて、Ａｈａは「６−アミノヘキサン酸」を意味し、Ａｃは「Ｎ−末端アセチル化」を意味し、Ｎは「Ｎ末端」を意味し、Ｃは「Ｃ末端」を意味する。
【００１６】
特許請求されている本発明の方法は、架橋Ａβ由来ペプチド間に生じる化学結合が共有結合性となり通常の生理的条件下で不可逆的となるよう行われる。「共有結合」および「共有結合的に安定化」なる語は、特許請求されている本発明の架橋方法に付されたそのような種が通常の生理的条件下で単量体形態に戻らないことを意味する。そのような結合の切断は、通常、高温での酸または塩基加水分解（例えば、６Ｎ  ＨＣｌ、１００℃、２０時間）のような過酷な条件を要する。これは、Ａβペプチドがとることが知られている非共有結合性の自己会合性種の場合とは対照的である。
【００１７】
二官能性架橋剤としてＤＦＤＮＢを使用する、共有的に安定化されたオリゴマーの製造のための本発明の方法は、該本発明方法が、既に報告されているものより広い質量範囲を含むオリゴマー種の製造を可能にし、得られるオリゴマー調製物から単量体種が除去される方法を可能にする点で、先行技術の方法に比べて好ましい。本発明方法により製造される優勢形態はサイズ排除クロマトグラフィー分画後に変性ゲル電気泳動による測定で１００ｋＤａ〜２００ｋＤａの範囲の分子量を有し、ゲルデンシトメトリーにより示されるとおり５％未満の単量体混入を伴う。
【００１８】
本発明のもう１つの実施形態においては、ゼロまたはほぼゼロの長さの二官能性架橋剤でのＡβ由来ペプチドの架橋による共有的に安定化されたオリゴマーの製造方法は、オリゴマー性Ａβ種の、オリゴマーを好むエピトープを有する免疫原の製造方法を含む。いずれの理論にも束縛されるものではないが、このようにして製造された免疫原は、哺乳類における免疫化に使用された場合、神経毒性作用を引き起こすＡβの形態に、より向けられた抗体を与える。
【００１９】
さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、一定の分子量（Ｍｗ）の集団が得られうるよう、架橋された種を精製するための方法を含む。架橋反応の制御は、ある程度は、得られる種の質量分布を制限しうるが、中間的な質量の種の制御を維持しながら反応を全ての単量体の消費の方向へ駆動させることは可能ではないであろう。すべての単量体をオリゴマーへ変換するのに必要な長い反応時間において、２００ｋＤａを超える架橋物質の比率が有意に上昇するであろう。サイズ分画を用いることにより、中間的な質量のオリゴマーの生成に最適な時間において架橋を終結させることが可能であり、残留混入単量体が精製除去される。このプロセスは、質量に基づいて集団が分離されるクロマトグラフィー分離工程（サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）と称される技術）よりなる。この方法の主な利点は、オリゴマーを共有的に架橋するために、非共有結合種の場合よりストリンジェントな分離条件が用いられうることである。アミロイドペプチドの固有の性質により、架橋種自体が或る程度の自己会合を受けると認識される。しかし、これらの種は、単独での又は組合された、化学的変性剤の使用、生物学的界面活性剤の使用、上昇した温度の使用および溶媒の使用を含む（これらに限定されるものではない）解離条件下で分離されうる。そのような処理は非共有結合相互作用を破壊すると予想されるが、共有結合架橋を破壊しないであろう。イオン交換、逆相および疎水性相互作用を含む（これらに限定されるものではない）他のクロマトグラフィー分離技術が同様の目的に利用されうると認識される。本発明の好ましい実施形態においては、ＳＥＣ法はアセトニトリルと水性バッファーとの１：１混合物の使用および約４５℃〜４８℃の温度を含む。
【００２０】
特許請求されている方法の共有的に安定化されたオリゴマーは、特有かつ新規の抗体の産生のための免疫原としてのペプチド抗原製剤の製造のために使用されうる。自己会合性ペプチドオリゴマーの共有結合架橋は、単量体ペプチド上には見出されない推定ネオエピトープが提示されうるよう一定の構造においてそれらの種を安定化すると予想される。これらの架橋オリゴマーを免疫原としてマウスまたは他の哺乳類種において使用した場合、標準的な方法により高度免疫血清からモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生させ、オリゴマー反応性特異性に関してスクリーニングすることが可能である。これらのｍＡｂは、Ａβペプチドの可溶性オリゴマーを特異的に標的化するアミロイドーシスに対する受動的治療計画の基礎を形成するであろう。より詳しくは、これらの免疫原により産生されるｍＡｂはＡＤの治療計画の一部として使用されうるであろう。受動免疫製剤の場合、精製された架橋オリゴマーを濾過滅菌し、選択された適当な免疫刺激性アジュバント、例えばアルミニウムヒドロキシホスファート、またはサポニンに基づくアジュバント、例えばＩＳＣＯＭＡＴＲＪＸ（登録商標），ＣＳＬ  Ｌｔｄ．，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａと共に製剤化することが可能である。そのようなワクチン製剤の製造方法は当業者に公知であろう。本発明の方法は、動物試験で成功すれば、ヒト臨床試験用の物質を製造するためにｃＧＭＰ指針に基づいて実施されうるであろう。
【００２１】
本発明は、単離可能であり（すなわち単量体を含有せず）動物での免疫化に使用されうるＡβ由来ペプチドの共有的に安定化されたオリゴマー形態を製造するための改良された手段を提供する。未修飾タンパク質の光誘導性架橋（ＰＩＣＵＰ）の公知方法はＡＤＤＬの有効な架橋をもたらすことが示されているが（Ｂｉｔａｎ，Ｇ．Ｊ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３５１７６−３５１８４（２００１））、現在までの報告は、得られる種が一般には低次のもの、すなわち、二量体ないしほぼ八量体であることを示している。さらに、ゲル分析は、これらの調製物中に有意な比率の単量体が尚も存在することを示している。免疫学的動物研究に一般に要求される物質の量はかなりの量であるが、ＰＩＣＵＰでの既に記載されている大規模化の問題はこのアプローチの有用性を制限する。さらに、ＰＩＣＵＰの場合のバッチ間の再現性は、非常に短い反応時間および入力照明強度のようなパラメーターに対する該方法の前記感受性により制限される。本発明の場合、ＤＦＤＮＢを使用する化学的架橋は、バッチ間の一貫性の改善、より低いレベルの単量体混入およびより低いストリンジェンシーの製造条件（例えば、必要な反応時間）により、バルク量の物質の製造に向けた大規模化の可能性に関する明白な利点を有する。
【００２２】
ＤＦＤＮＢでの架橋により、生成するオリゴマー種は、標準的な生理的条件下で単量体へ戻れ得ないよう安定化される。化学的架橋反応における反応条件の操作は種々の範囲のＭｗ形態を与えうることが当業者に公知である。例えば、反応時間を延長すること、試薬に対する架橋試薬のモル濃度を増加させること、または反応温度を増加させることは、より高い質量の種の生成に有利となりうる。本発明の重要な観点は、これらの種をＳＥＣにより分離することが可能であり、単量体を欠くオリゴマープールを作製することが可能であることである。これは重要な考慮事項である。なぜなら、既に記載されているとおり、単量体をオリゴマーへ完全に変換するために架橋反応を延長すると、所望の質量範囲外の物質が高い比率で生じ、これは実際に所望の種の収率を低下させるからである。
【００２３】
短いポリペプチド配列が、免疫原として単独で使用された場合、一般に抗原性に乏しいことは、確立された見解である（Ｐｅｒｅｌｓｏｎ，Ａ．Ｓ．およびＷｉｅｇｅｌ，Ｆ．Ｗ．，Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．，４０：１４７９−１４８３（１９８１）；Ｄｉｎｔｚｉｓ，Ｒ．Ｚ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３：１２３９−１２４４（１９８９））。そのようなペプチドの高力価免疫応答誘導能は、単量体種を架橋することにより又はコンジュゲート化［すなわち、該ペプチドをより大きな生体分子（これはほとんどの場合、担体タンパク質である）に共有結合によりカップリングさせること］により著しく増強されうる。したがって、本発明の架橋されたアミロイド由来ペプチドは、そのような増強された免疫原性を免疫原に付与すると予想される。
【００２４】
自己抗原に対する寛容障壁に打ち勝ち応答を誘導するためには大量の抗原を複数回投与する必要があるという見解を考慮すると、天然アミロイドペプチドは弱い免疫原性を有するに過ぎないことを文献報告は示唆している（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７９：５９５−６０５（２００１）：Ｋａｙｅｄ，Ｒ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：４８６−４８９（２００３））。さらに、マウスとヒトとのような種の間でさえ、Ａβ配列間の類似性は、マウスにおいて投与された場合、ヒトペプチドに対する高力価ＩｇＧ優性応答を妨げる。低いＩｇＧ力価が誘導される場合、適切なアフィニティを有する抗体の潜在的プールが有意に制限される限り、これらの低い抗体応答は、治療用モノクローナル抗体を特定するのに望ましくない。さらに、所望の応答はオリゴマー種に対するものであるため、単量体の非存在下で安定化オリゴマーを得るための方法は、所望の応答を得る最高の可能性をもたらすであろう。本明細書に記載の本方法は、そのような免疫原において使用するための所望の成分を提供するであろう。活性化ペプチドの初期製剤化がオリゴマー製造工程を含む場合には、ペプチド−担体コンジュゲートに関して同様の方法が予想されうる。この場合、これは、ＡＤＤＬ製造プロトコールに従いペプチドを製造することにより達成される。
【００２５】
アミロイドペプチドまたはＡＤＤＬの天然調製物で免疫化する際の欠点、例えば、（１）自己寛容に打ち勝つことの困難性による乏しい免疫応答の生成、（２）自己抗原に対する免疫応答を生成する有害な作用の可能性、および（３）そのような調製物におけるオリゴマー安定性の欠如（これらに限定されるものではない）が当業者に認識されるであろう。（１）および（２）は相反するものに思えるかもしれないが、それらは概ね関連している。前記のとおり、アミロイドペプチドに対する応答を増強するために、免疫増強性担体タンパク質に対するコンジュゲート化および／または架橋が用いられうる。しかし、該応答が主として、可溶性単量体と毒性オリゴマーとの間で共有されうる免疫優性エピトープに対するものである場合、オリゴマー特異性は全く得られず、それどころか、今度は該ペプチドの通常の形態が免疫系により認識されうるため自己免疫作用が生じうる。いずれの理論にも拘束されるものではないが、オリゴマーＡＤＤＬ種が、ＡＤに関連した急性神経毒性種である場合には、これらの形態に特異的な抗体は前記の欠点を克服しうるはずであり、免疫応答を誘導し及び／又は投与するための、より安全な手段を提供しうるはずである。本発明は、より特異的な免疫原としての提供のための、これらのオリゴマー種を安定化し単離するための手段を提供する。
【００２６】
実施例
【実施例１】
【００２７】
Ａβ由来ペプチドの製造
ペプチド配列（配列番号１および２）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）から入手し、または社内で合成した（配列番号３〜７）。社内で合成したＡβ由来ペプチドに関しては、製造業者（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により提供されたＦｍｏｃ化学プロトコールを用いるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動ペプチド合成装置による固相合成によりペプチドを製造した。合体後、樹脂に結合したペプチドを脱保護し、９４．５％  トリフルオロ酢酸、２．５％  １，２−エタンジチオール、１％  トリイソプロピルシランおよび２．５％  Ｈ２Ｏの混合物を使用して該樹脂から切断した。２時間の処理の後、該反応を濾過し、濃縮し、得られた油をエチルエーテルでトリチュレーションした。固体生成物を濾過し、５０％  酢酸／Ｈ２Ｏに溶解し、凍結乾燥させた。部分的に純粋な該生成物の精製を、Ｃ−１８支持体上で０．１％  ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／アセトニトリル勾配を用いるＲＰＨＰＬＣにより行った。画分を分析用ＨＰＬＣにより評価した。純粋な画分（＞９８％）をプールし、凍結乾燥させた。アミノ酸分析および質量分析により同一性が証明された。
【実施例２】
【００２８】
Ａβ４２ペプチドの化学的架橋
本実施例はＡβ４２（配列番号２）の化学的架橋を記載する。該ペプチドを−７０℃での貯蔵から取り出し、室温で平衡化させた。２２ｍｇの該ペプチド粉末をポリプロピレンチューブ内に計り取り、２．２ｍＬの１，１，１，３，３，３ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）で可溶化した。該ペプチド溶液を３７℃の水浴内で１時間インキュベートし、ついで２ｍｇ（２００ｍｌ）の保持物（ｒｅｔａｉｎ）に小分けした。該ペプチド保持物を、ドライアイス／エタノール浴を使用して凍結させ、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗｅｓｔ  Ｐａｌｍ  Ｂｅａｃｈ，ＦＬ）内に配置して、該ペプチドから溶媒を蒸発させた。該乾燥ペプチドを−７０℃で保存した。
【００２９】
Ａβ４２の４つの２ｍｇ保持物（合計８ｍｇ）を解凍した。各保持物に、１．２５ｍＬの２５ｍＭ  ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）バッファーを加え、チューブを低速のボルテックスミキサー上に配置して１０〜１５分間攪拌した。該可溶化ペプチドをプールし、さらに５．４ｍＬのホウ酸バッファーを加えて、総容量を１０．４ｍＬ（０．７７ｍｇ  ペプチド／ｍＬ）とした。該溶液を反転により混合し、１．０ｍｌの２０ｍＭ  １，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＢＮ）（５０％  エタノール／５０％  水中）を加え、該溶液を再び反転により混合した。架橋反応を室温で１０．５〜１２．５分間進行させた。３００μＬの５０ｍＭ  ジチオトレイトールを加えることにより反応をクエンチした。
【００３０】
あるいは、オリゴマーＡＤＤＬ調製物の架橋種を製造するために、該反応を用いた。ＨＦＩＰ乾燥ペプチド（Ａβ４２）（８ｍｇ）を３５４．４μＬのＤＭＳＯ中で可溶化し、断続的にボルテックスしながら１０．０４ｍＬの２５ｍＭ  ホウ酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．５）にこの溶液を徐々に加えた。該ペプチド溶液を４℃で２４時間インキュベートしてＡＤＤＬを形成させ、ついで前記のとおりに架橋した。
【実施例３】
【００３１】
架橋Ａβ４２ペプチドのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分離
本実施例は種々の分子量のＡβ４２の架橋オリゴマーのクロマトグラフィー分離を記載する。９９６フォトダイオードアレイ検出器（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）に接続されたＡｌｌｉａｎｃｅ  ２６９０  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）上で該クロマトグラフィーを行った。サイズ排除カラムは、該ＳＥＣカラムの前に直列に配置されたＴＳＫ  ＰＷＨガードカラム（２１．５ｍｍ×７．５ｃｍ）（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）を伴うＴＳＫゲルＧ３０００ＰＷ（２１．５ｍｍ×６０ｃｍ）であった。該カラムの周囲に包まれサーモリン（Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ）タイプ４５５００入力コントローラー（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｄｕｂｕｑｕｅ  ＩＯ）により制御されたサーモリン（Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ）可撓性電子加熱テープ（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｄｕｂｕｑｕｅ  ＩＯ）を使用して、該ＳＥＣカラムを４５〜４８℃に加熱した。可撓性温度センサーを備えたデジタル温度計（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）により該温度をモニターした。該反応をクエンチした直後に架橋ペプチドに対してクロマトグラフィーを行った。手動注射器を使用して中空の１２ｍＬサンプルループを介して該カラム上に該架橋ペプチドをローディングした。移動相はアセトニトリルと２５ｍＭ  トリシン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）バッファーとの１：１混合物よりなるものであり、それを１．５ｍＬ／分の速度で送り出した。方法の開発の過程で、温度上昇および水性：有機移動相の使用の両方が、最終プールから単量体ペプチドを効率的に除去するのに決定的に重要であることが見出された。吸光度を２１５および２８０ｎｍでモニターした。Ｆｒａｃ−１００フラクションコレクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して、１画分／分の速度で画分を１３×１００ｍｍガラスチューブ内に集めた。ＤＭＳＯ（１５μＬ）を各画分に加え、該画分をボルテックスした。該画分をＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器（Ｔｈｅｍｏ−Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗｅｓｔ  Ｐａｌｍ  Ｂｅａｃｈ，ＦＬ）内に２〜３分間配置してアセトニトリルを除去し、ついで４℃で保存した。１０〜２０％  トリシンゲルを使用する変性／還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥを該ＳＥＣ画分に対して行った。Ｓｉｌｖｅｒ  Ｘｐｒｅｓｓ染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して該ゲルを染色した。１００ｋＤａ〜２００ｋＤａの質量範囲のオリゴマーおよび該ゲルによる非常に少量の単量体を含有する画分をプールした。Ｎ２ガスの気流を使用して残留アセトニトリルを除去した。市販のＢｒａｄｆｏｒｄまたはビシンコチン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ＢＣＡ）アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、タンパク質濃度を測定した。
【実施例４】
【００３２】
動物免疫化および免疫原性研究のための架橋生成物の製剤化
本実施例は動物免疫化および免疫原性研究のための生成物の製剤化を記載する。化学的に架橋されたＡβ４２ペプチドの高分子量オリゴマーのＳＥＣプールを２５ｍＭ  トリシン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）バッファー中に、最終タンパク質濃度が２００μｇ／ｍＬとなるよう製剤化した。また、該ＳＥＣプールを前記のとおりに製剤化し、ついで穏やかにボルテックスしながら、水酸化アルミニウムを、最終的なミョウバン濃度が４５０μｇ／ｍＬとなるよう加えた。各免疫化ごとに新たに製剤を調製し、注射までは２〜８℃で保存した。
【００３３】
マウスにおける該化学的架橋Ａβ４２ペプチドの免疫原性を評価するために、およびＡβ４２ペプチド特異的モノクローナル抗体を得るために、研究を開始した。ミョウバン中またはフロイントアジュバント中に製剤化された２０ｍｃｇの架橋Ａβ４２抗原で雌Ｂａｂｌｅ／ｃマウス（１０匹／群）を筋肉内に免疫化した。該免疫化は４週間隔で合計５回の注射を含むものであった。血液サンプルを注射の２週間後に集め、Ａβ４２抗原に対する抗体価に関して測定した。モノクローナル抗体の産生のためには、脾細胞を該免疫化動物から単離し、それを標準的な方法によりＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させる。得られたハイブリドーマを酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により特異的モノクローナル抗体の産生に関してスクリーニングする。
【実施例５】
【００３４】
ＯＭＰＣへのＡβペプチドの化学コンジュゲート化
本実施例は、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｅｓ）Ｂ型の精製外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）への、ヒトＡβ（１−４２）に由来するペプチドの化学コンジュゲート化を示す。該カップリングの化学的本質は、マレイミド誘導体化ペプチドと該膜複合体のチオール誘導体化タンパク質との反応である。前記の修飾アミロイドペプチド（配列番号６および７）を前記のとおりに合成し、コンジュゲート化に使用した。これらのペプチドは、アミノ酸残基１−８の反転体およびそれに続く天然の９−４２アミロイド前駆体タンパク質配列（免疫優性１−１０アミノ酸残基領域から免疫応答を逸らすことを目的としたもの）を含有するものであった。Ｎ末端ペプチドに関しては、マレイミド官能基をＡｈａスペーサーの第一級アミンに直接的に結合させ、一方、Ｃ末端結合に関しては、それを末端リシン残基のε−アミン上に配置した。ＯＭＰＣ含有溶液の全ての操作は、標準的な無菌技術に従う層流環境中で行った。
【００３５】
Ａ．ＯＭＰＣのチオール化
精製無菌ＯＭＰＣをＭｅｒｃｋ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎから入手し、試薬Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン（ＮＡＨＴ，Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、その表面の利用可能なリシン残基の部分においてチオール化した。水中のＯＭＰＣ（１１７ｍｇ）を２８９，０００×ｇ、４℃で６０分間の遠心分離によりペレット化し、上清を捨てた。窒素分散（スパージ）活性化バッファー（０．１１Ｍ  ホウ酸ナトリウム，ｐＨ１１）を該遠心管に加え、該ペレットをガラス攪拌棒で取り除いた。上清をガラスＤｏｕｎｃｅホモジナイザーに移し、３０ストローク（行程）で再懸濁させた。該遠心管を洗浄し、洗液を３０ストロークでドゥーンス（ｄｏｕｎｃｅ）処理した。再懸濁化ペレットおよび洗液を、１０ｍｇ／ｍＬのＯＭＰＣ濃度となるよう、清潔な容器内で一緒にした。固体ＤＴＴおよびＥＤＴＡを窒素分散活性化バッファーに溶解し、０．１０６ｍｇ  ＤＴＴ／ｍｇ  ＯＭＰＣおよび０．５７ｍｇ  ＥＤＴＡ／ｍｇ  ＯＭＰＣの比で反応溶液に充填した。穏やかに混合した後、ＮＡＨＴを窒素分散水に溶解し、０．８９ｍｇ  ＮＡＨＴ／ｍｇ  ＯＭＰＣの比で反応に仕込んだ。遮光条件下、室温で３時間、反応を進行させた。完了時に、ＯＭＰＣを前記のとおりにペレット化し、窒素分散コンジュゲート化バッファー（２５ｍＭ  ホウ酸ナトリウム，ｐＨ８．５、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）中、Ｄｏｕｎｃｅ均一化により６ｍｇ／ｍＬで再懸濁させて、ペレットを洗浄した。最終再懸濁のために、ＯＭＰＣを前記のとおりにペレット化し、窒素分散コンジュゲート化バッファー中、Ｄｏｕｎｃｅ均一化により１０ｍｇ／ｍＬで再懸濁させた。最終的な低速遠心分離を１，０００×ｇ、４℃で５分間行って凝集生成物を除去した。アリコートを取り出して、エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイによる遊離チオール測定に付し、該バルク生成物を、使用するまで、暗所の氷上で保存した。測定されたチオール含量は０．２〜０．３μｍｏｌ／ｍＬであった。
【００３６】
Ｂ．ＯＭＰＣへのペプチドのコンジュゲート化
ペプチドの機能性マレイミド含量はモル比で１：１であると推定された。十分なペプチドを秤量して全チオールに対して等しいモル量のマレイミドを得た。各コンジュゲート化において標的化される全ＯＭＰＣタンパク質は約１５ｍｇであった。ペプチドをＤＭＳＯに２０ｍｇ／ｍＬで再懸濁させ、２５ｍＬ  ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中に５ｍｇ／ｍＬで希釈した。ペプチド溶液を、穏やかにボルテックスしながらチオール化ＯＭＰＣにゆっくりと加えた。該反応を遮光し、混合せずに室温で１４時間インキュベートした。残留遊離ＯＭＰＣチオール基を２倍モル過剰のＮ−エチルマレイミドで室温で３時間クエンチした。該コンジュゲート化法の全体にわたり、平行して、チオール化ＯＭＰＣのみの対照を使用した。クエンチが完了したら、コンジュゲートおよび対照を１００，０００Ｄａ分子量のカットオフの透析ユニットに移し、少なくとも５回交換する２０ｍＭ  ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）バッファーに対して徹底的に透析した。透析が完了したら、サンプルを１５ｍｌのポリプロピレン遠心管に移し、１，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離して凝集物を除去した。アリコートを分析用に取り出し、該バルクを４℃で保存した。
【００３７】
Ｃ．分析
ローリー（Ｌｏｗｒｙ）アッセイの変法により全タンパク質を測定し、コンジュゲートおよび対照のサンプルを定量的アミノ酸分析（ＡＡＡ）により分析した。ＯＭＰＣに対するペプチドのモル比を、新生ペプチド−ＯＭＰＣ結合の酸加水分解に際して遊離される特有の残基であるＳ−デカルボキシエチルホモシステイン（ＳＤＣＥＨＣ）の定量から決定した。該ペプチド配列には存在しないためＯＭＰＣタンパク質に特有のものである加水分解安定性残基から、ＯＭＰＣ比濃度を決定した。ＳＤＣＥＨＣの１モル当たりにペプチドが１モルだとすると、ＳＤＣＥＨＣ／ＯＭＰＣの比はペプチド／ＯＭＰＣ含量と等価となった。ペプチド分子量および平均ＯＭＰＣ質量（４０，０００，０００Ｄａ）を用いて、この比からペプチドの質量ローディングを計算することが可能であろう。
【００３８】
該コンジュゲート化の共有結合性を、４〜２０％  Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により定性的に確認した。この場合、クーマシー染色コンジュゲートのバンドにおいて、対照と比較して移動度における上方へのシフトが認められた。
【実施例６】
【００３９】
架橋Ａβオリゴマーを検出するためのアッセイ
本実施例は、本発明において特許請求されている方法により製造される架橋Ａβオリゴマーを検出するためのアッセイを示す。以下に記載のアッセイは、同時に出願された出願であるＭｉｎｇ  Ｔａｉｎ  Ｌａｉら，Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／６９５，５２７に記載されており、それを、完全に記載されているのと同等に本明細書中に組み入れることとする。
【００４０】
Ａ．ＥＬＩＳＡプレートの調製
Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ  ＥＬＩＳＡプレートを、コーティングバッファー（５０ｍＭ  炭酸水素Ｎａ，ｐＨ９．６）中の１００μｌの５μｇ／ｍｌの６Ｅ１０抗体（Ｓｉｇｎｅｔ  Ｌａｂｓ，Ｄｅｄｈａｍ，ＭＡ）（ストック＝１ｍｇ／ｍｌ）を９６ウェルプレートの各ウェルに加えることによりコーティングする。得られたプレートを薄い粘着フィルムで覆って蒸発およびサンプル容量の減少を防ぎ、ついでそれを４℃でゆっくりと一晩振とうした。翌日、該プレートをＰＢＳ−Ｔ（正規ＰＢＳ中の０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄した。ついで該ウェルを、ＰＢＳを含有する２００μｌのＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋで少なくとも１時間ブロッキングした。
【００４１】
Ｂ．アッセイプロトコール
Ａβ架橋オリゴマー標準体であるＡβ４２対照、および評価すべきサンプル（１００μＬ）を、予めコーティングされたプレートに加え、ついで５０μｌの６Ｅ１０−ＡＰ（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ中の０．３％  Ｔｗｅｅｎ中で１：５００希釈）を加える。得られたプレートを、振とうしながら４℃で一晩インキュベートし、翌日、２００μｌのＰＢＳ−Ｔで５回洗浄する。アルカリホスファターゼ基質（１００μＬ）を該プレート上の各ウェルに導入して反応を開始させる。室温（ＲＴ）で３０分間のインキュベーションの後、発光検出能を有する標準的な多モードリーダー（旧Ａｎａｌｙｓｔ，ＬＪＬ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ；現在はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎａｌｙｓｔ  ＧＴ  ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  ｒｅａｄｅｒ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で該サンプルを測定した。適当なモデル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌにおける直線もしくは２次フィットまたはＪＭＰにおける３次スプラインフィット）に対する標準曲線データのフィットに基づき、各サンプルの架橋Ａβオリゴマー濃度を計算した。統計的に有意にバックグラウンドまたは単量体対照レベルを超える値を架橋Ａβオリゴマー関連シグナルとみなした。
【００４２】
このアッセイは、ＥＬＩＳＡ検出形態を用いて例示されているが、このアッセイは、Ｍｉｎｇ  Ｔａｉｎ  Ｌａｉら（前記）に記載のＥＣＬまたはＡＬＰＨＡスクリーン形態を用いて行うことも可能であると当業者は認識するであろう。
【配列表】
2009500325000001.app
【国際調査報告】
2009500325.tif 000003
2009500325.tif 000004
2009500325.tif 000005