(57)【要約】  本発明は、非ステロイド性抗炎症薬ＮＳＡＩＤとして知られる化合物との併用により有益な治療効果が高まる病状における、ヒストン脱アセチル化酵素活性を有する酵素の阻害剤として作用する化合物の医学的使用に関する。このような病状には、癌、癌素因状態、炎症性および代謝性疾患が含まれる。本発明はまた、前記化合物を２種類の個別の薬剤の形態で別々に、または１回の投与単位に両方の薬剤を含有する投与形態で投与する、本明細書に記載の疾患の治療に臨床的に使用される薬剤の製造を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストン脱アセチル化酵素ＨＤＡＣ−２が疾患に罹患した組織において上方調節されていることを特徴とする疾患を治療または予防する薬剤を製造するための、ＮＳＡＩＤと併用されるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の使用。
【請求項２】
前記疾患に罹患した組織の少なくとも一部分が、（ａ）ＡＰＣ遺伝子内に少なくとも１つの変異を有する、または（ｂ）β−カテニン遺伝子内に、β−カテニンの機能の獲得もしくはβ−カテニンタンパク質の安定化すなわち半減期の長期化をもたらす少なくとも１つの変異を有する、または（ｃ）ｃ−ｍｙｃの上方調節もしくは機能の向上を示す、および／または（ｄ）ＨＤＡＣ−２の上方調節をもたらすＷｎｔ経路の変異もしくは改変を示す、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記疾患が、癌、癌素因状態または炎症性疾患をもたらす遺伝性疾患である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記遺伝性疾患が家族性腺腫性ポリポーシスである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
ＮＳＡＩＤがシクロオキシゲナーゼ阻害剤である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
ＮＳＡＩＤがシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
ＮＳＡＩＤが、サリチル酸系、アリールアルカン酸、２−アリールプロピオン酸、Ｎ−アリールアントラニル酸、メロキシカムおよびピロキシカムなどのオキシカム系、セレコキシブ、バルデコキシブ、ルミラコキシブ、エトリコキシブおよびロフェコキシブなどのコキシブ系、スルホンアニリド系、インドメタシン、スリンダク、アスピリン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ナプロキセンの薬剤およびその誘導体から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、式Ｉ
【化１】
2009501168.tif 000003
（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、直鎖または分枝鎖の飽和または不飽和脂肪族Ｃ３〜２５炭化水素鎖を示し、これは、任意に１つまたはいくつかのヘテロ原子を含んでいてよく、置換されていてもよく、Ｒ３は、ヒドロキシル、ハロゲン、アルコキシまたは任意にアルキル化されたアミノ基を示す）
の化合物または薬学的に許容され得るその塩である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
Ｒ１およびＲ２が、独立して、任意に１つの二重結合または三重結合を含む直鎖または分枝鎖のＣ３〜２５炭化水素鎖である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤がバルプロ酸または薬学的に許容され得るその塩である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、ヒドロキサム酸誘導体、ベンズアミド、ピロキサミドおよびその誘導体、ＨＤＡＣ阻害活性を示す微生物代謝物質、脂肪酸およびその誘導体、環状テトラペプチド、ペプチド性化合物、クラスＩＩＩのＨＤＡＣ阻害剤ならびにＳＩＲＴ阻害剤または薬学的に許容され得るその塩からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、ヒドロキサム酸誘導体（ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ＬＢＨ−５８９、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、ＣＢＨＡ、Ｇ２Ｍ−７０１、Ｇ２Ｍ−７０２、Ｇ２Ｍ−７０７、ピロキサミド、スクリプタイド、ＣＩ−９９４、ＣＧ−１５２１、クラミドシン、ビアリールヒドロキサメート、Ａ−１６１９０６、ビシクロアリール−Ｎ−ヒドロキシカルボキサミド、ＰＸＤ−１０１、スルホンアミドヒドロキサム酸など）、ＴＰＸ−ＨＡアナログ（ＣＨＡＰ）、オキサムフラチン、トラポキシン、デプデシン、アピジシン、ベンズアミド、（ＭＳ−２７−２７５およびＭＧＣＤ０１０３など）酪酸およびその誘導体、ピバネックス（酪酸ピバロイルオキシメチル）、トラポキシンＡ、デプシペプチド（ＦＫ−２２８）および関連するペプチド化合物、タセジナリンおよびＭＧ２８５６または薬学的に許容され得るその塩からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
前記疾患が、エストロゲン受容体依存性乳癌、エストロゲン受容体非依存性乳癌、ホルモン受容体依存性前立腺癌、ホルモン受容体非依存性前立腺癌、脳腫瘍、腎臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、尿生殖器の癌、胃腸の癌、子宮癌、卵巣癌、星状細胞腫、神経膠腫、皮膚癌、扁平上皮癌、ケラトアカントーマ、ボーエン病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、黒色腫、基底細胞癌、光線性角化症、魚鱗癬、ざ瘡、尋常性ざ瘡、肉腫、カポージ肉腫、骨肉腫、頭部および頚部の癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、白血病、リンパ腫および／または他の血液細胞癌である、請求項１〜１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記疾患が、甲状腺ホルモン抵抗性症候群、糖尿病、サラセミア、肝硬変、原虫感染、関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、あらゆる形態のリウマチ、変形性関節症、痛風性関節炎、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、インシュリン非依存性糖尿病、喘息、鼻炎、ブドウ膜炎、エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、慢性下痢、乾癬、アトピー性皮膚炎、骨疾患、線維増殖性疾患、アテローム性動脈硬化症、再生不良性貧血、ディジョージ症候群、グレーブズ病、癲癇、癲癇重積症、アルツハイマー病、うつ病、統合失調症、統合失調性感情障害、躁病、脳卒中、気分不調和性精神病性症状、双極性障害、情動障害、髄膜炎、筋ジストロフィー、多発性硬化症、激昂、心臓肥大、心不全、再灌流障害および／または肥満である、請求項１〜１２に記載の使用。
【請求項１５】
薬剤が、静脈内投与、筋肉投与、皮下投与、局所投与、経口投与、経鼻投与、腹腔内投与または坐剤投与によって適用される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
前記異なる薬剤化合物が、２種類の個別の薬剤の形態で、または1回の投与単位に両方の薬剤を含有する投与形態で投与される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
バルプロ酸または薬学的に許容され得るその塩、セレコキシブおよび少なくとも１種類の薬学的に許容され得る賦形剤または希釈剤を含む薬剤組成物。
【請求項１８】
第１の成分としてバルプロ酸または薬学的に許容され得るその塩、および第２の成分としてセレコキシブを含む薬剤キット。
【請求項１９】
バルプロ酸または薬学的に許容され得るその塩、スリンダクおよび少なくとも１種類の薬学的に許容され得る賦形剤または希釈剤を含む薬剤組成物。
【請求項２０】
第１の成分としてバルプロ酸または薬学的に許容され得るその塩、および第２の成分としてスリンダクを含む薬剤キット。
【請求項２１】
バルプロ酸または薬学的に許容され得るその塩、アスピリンおよび少なくとも１種類の薬学的に許容され得る賦形剤または希釈剤を含む薬剤組成物。
【請求項２２】
第１の成分としてバルプロ酸または薬学的に許容され得るその塩、および第２の成分としてアスピリンを含む薬剤キット。
【請求項２３】
バルプロ酸または薬学的に許容され得るその塩、イブプロフェンおよび少なくとも１種類の薬学的に許容され得る賦形剤または希釈剤を含む薬剤組成物。
【請求項２４】
第１の成分としてバルプロ酸または薬学的に許容され得るその塩、および第２の成分としてイブプロフェンを含む薬剤キット。
【請求項２５】
バルプロ酸または薬学的に許容され得るその塩、フェナム酸および少なくとも１種類の薬学的に許容され得る賦形剤または希釈剤を含む薬剤組成物。
【請求項２６】
第１の成分としてバルプロ酸または薬学的に許容され得るその塩、および第２の成分としてフェナム酸を含む薬剤キット。
【請求項２７】
バルプロ酸または薬学的に許容され得るその塩、ピロキシカムおよび少なくとも１種類の薬学的に許容され得る賦形剤または希釈剤を含む薬剤組成物。
【請求項２８】
第１の成分としてバルプロ酸または薬学的に許容され得るその塩、および第２の成分としてピロキシカムを含む薬剤キット。
【請求項２９】
ＰＸＤ１０１または薬学的に許容され得るその塩、セレコキシブおよび少なくとも１種類の薬学的に許容され得る賦形剤または希釈剤を含む薬剤組成物。
【請求項３０】
第１の成分としてＰＸＤ１０１または薬学的に許容され得るその塩、および第２の成分としてセレコキシブを含む薬剤キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非ステロイド性抗炎症薬ＮＳＡＩＤとして知られる化合物との併用により有益な治療効果が高まる病状における、ヒストン脱アセチル化酵素活性を有する酵素の阻害剤として作用する化合物の医学的使用に関する。このような病状には、癌、癌素因状態、炎症性および代謝性疾患が含まれる。本発明はまた、前記化合物を２種類の個別の薬剤の形態で別々に、または１回の投与単位に両方の薬剤を含有する投与形態で投与する、本明細書に記載の疾患の治療に臨床的に使用される薬剤の製造を含む。
【背景技術】
【０００２】
クロマチン制御と疾患
クロマチンの局所的リモデリングは、遺伝子の転写活性化における主要な工程の１つである。転写性タンパク質をＤＮＡの鋳型と接触させるためには、ＤＮＡのヌクレオソームパッケージングに動的な変化を生起させる必要がある。クロマチンのリモデリングおよび遺伝子転写に影響を与える最も重要な機構の１つは、ヒストンおよびその他の細胞性タンパク質のアセチル化による翻訳後修飾ならびにそれに続くクロマチン構造の変化である（Ｄａｖｉｅ，１９９８，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  ８，１７３−８；Ｋｏｕｚａｒｉｄｅｓ，１９９９，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  ９，４０−８；ＳｔｒａｈｌおよびＡｌｌｉｓ，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，４１−４）。ヒストンの高アセチル化が生起した場合、疎水性アセチル基によって生じたＤＮＡに対する静電気的引力および立体障害に変化が生じ、ヒストンとＤＮＡとの相互作用の不安定になる。その結果、ヒストンのアセチル化によりヌクレオソームが破壊され、ＤＮＡは転写装置に接近可能となる。アセチル基の除去によって、ヒストンがＤＮＡおよび隣接するヌクレオソームに対してより強固に結合することが可能となり、したがって、転写が抑制されたクロマチン構造を維持することが可能になる。アセチル化は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）活性を有する一連の酵素により媒介される。逆に、アセチル基は、特定のヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）酵素によって除去される。これらの機構の破壊は転写の誤調節を引き起こし、自己免疫性、炎症性、または腫瘍化や腫瘍進行などの過剰増殖性の障害を含む、様々なヒトの疾患の原因となる可能性がある。
【０００３】
さらに、転写因子のような他の分子は、アセチル化状態に依存してその活性および安定性を変える。たとえば、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）に関連した融合タンパク質であるＰＭＬ−ＲＡＲは、ｐ５３の脱アセチル化および分解を媒介することによりｐ５３を阻害し、これによってＡＰＬ芽細胞がｐ５３依存性の癌サーベイランス経路を潜り抜けることが可能となる。造血前駆細胞においてＰＭＬ−ＲＡＲが発現すると、ｐ５３が媒介する転写活性化が抑制されることになり、遺伝毒性ストレス（Ｘ線、酸化的ストレス）に引き起こされるｐ５３依存性アポトーシスから保護される。しかしながら、ｐ５３の機能は、ＨＤＡＣ阻害剤の存在下では再設定され、この阻害剤はｐ５３阻害の根底にある機構としてのＰＭＬ−ＲＡＲによるＨＤＡＣのｐ５３への活発な動員に関与している（Ｉｎｓｉｎｇａら，２００４年２月，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１−１１）。したがって、ｐ５３のアセチル化のような、ヒストンと異なるタンパク質のアセチル化が、ＨＤＡＣ阻害剤の抗腫瘍活性において不可欠な役割を果たしている。
【０００４】
核内受容体とヒストン脱アセチル化酵素
核ホルモン受容体は、リガンド依存性転写因子であり、遺伝子発現の正および負の制御を通じて発生および恒常性を制御している。これらの調節プロセスにおける異常が、多くの疾患の原因の根底にあり、癌の発生に重要な役割を果たす。Ｔ３Ｒ、ＲＡＲおよびＰＰＡＲを含む多くの核内受容体は、リガンド非存在下でＮ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴのようなコリプレッサー物質と相互作用することができ、これによって転写を阻害することができる。さらに、Ｎ−ＣｏＲはまた、アンタゴニスト占有プロゲステロンおよびエストロゲン受容体と相互作用することが報告されている。非常に興味深いことに、Ｎ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴは、ｍＳｉｎ３タンパク質およびヒストン脱アセチル化酵素をも含む大きなタンパク質複合体内に存在することが示されている（ＰａｚｉｎおよびＫａｄｏｎａｇａ，１９９７；Ｃｅｌｌ  ８９，３２５−８）。したがって、核内受容体がリガンドに誘導されて抑制から活性化へと切り替わることは、拮抗する酵素活性を有するコリプレッサーとコアクチベーター複合体との交換を反映している。
【０００５】
核内受容体による遺伝子調節
ＨＤＡＣ活性を有するこのようなコリプレッサー複合体は、核内受容体による抑制を媒介するだけでなく、Ｍａｄ−１、ＢＣＬ−６およびＥＴＯなどのさらなる転写因子と相互作用する。これらのタンパク質の多くは、細胞の増殖および分化の障害において主要な役割を果たしている（ＰａｚｉｎおよびＫａｄｏｎａｇａ，１９９７，Ｃｅｌｌ  ８９，３２５−８；ＨｕｙｎｈおよびＢａｒｄｗｅｌｌ，１９９８，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １７，２４７３−８４；Ｗａｎｇ，Ｊ．ら，１９９８，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，１０８６０−５）。たとえばＴ３Ｒは、当初はウイルス性癌遺伝子ｖ−ｅｒｂＡとの相同性に基づいて同定されたが、これは、野生型受容体とは対照的に、リガンドに結合するのではなく、転写の構成的リプレッサーとして機能する。さらに、ＲＡＲにおける変異は、多くのヒトの癌、特に、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）および肝細胞癌と関連している。ＡＰＬ患者では、染色体転座の結果生じたＲＡＲ融合タンパク質は、前骨髄球性白血病タンパク質（ＰＭＬ）または前骨髄球性ジンクフィンガータンパク質（ＰＬＺＦ）のいずれかを含む。いずれの融合タンパク質もコリプレッサー複合体の成分と相互作用できるが、レチノイン酸を添加するとＰＭＬ−ＲＡＲからコリプレッサー複合体が解放されるが、一方でＰＬＺＦ−ＲＡＲは構成的に相互作用する。これらの知見は、レチノイン酸による治療後にＰＭＬ−ＲＡＲ  ＡＰＬ患者では完全な寛解が達成されるのに対して、ＰＬＺＦ−ＲＡＲ  ＡＰＬ患者では反応が極めてであった理由を説明するものである（Ｇｒｉｇｎａｎｉら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，８１５−８；Ｇｕｉｄｅｚら，１９９８，Ｂｌｏｏｄ  ９１，２６３４−４２；Ｈｅら，１９９８，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １８，１２６−３５；Ｌｉｎら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，８１１−４）。
【０００６】
最近、レチノイン酸での治療後に幾度か再発を経験したことがあるＰＭＬ−ＲＡＲ患者がＨＤＡＣ阻害剤であるフェニルブチレートによる治療を受け、その結果白血病が完全に寛解している（Ｗａｒｒｅｌｌら，１９９８，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９０，１６２１−１６２５）。
【０００７】
ヒストン脱アセチル化酵素のタンパク質ファミリー
ヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）およびヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の動員は、細胞の増殖および分化に重要な役割を果たす多くの遺伝子の動的調節における主要な要素であると考えられている。ヒストンＨ３およびＨ４のＮ末端テールの高アセチル化は遺伝子の活性化と相関し、脱アセチル化は転写の抑制を媒介する。その結果、多くの疾患が、転写因子に影響する変異によって引き起こされる遺伝子発現の変化と関連している。ＰＭＬ−ＲＡＲ、ＰＬＺＦ−ＲＡＲ、ＡＭＬ−ＥＴＯ、およびＳｔａｔ５−ＲＡＲなどの白血病融合タンパク質による異常な抑制は、この点における原型的な例である。これらの事例のすべてにおいて、染色体転座により、転写アクチベーターは、ＨＤＡＣの動員による造血分化に重要な標的遺伝子を構成的に抑制するリプレッサーに変換される。同様の事象が、他の多くのタイプの癌の発病の原因となっている可能性は大いにあり得る。同じことが自己免疫性、炎症性または過剰増殖性の障害にも当てはまるという証拠が増えている。
【０００８】
哺乳動物のヒストン脱アセチル化酵素は、３つのサブクラスに分けることができる（ＧｒａｙおよびＥｋｓｔｒｏｅｍ、２００１）。ＨＤＡＣ１、２、３および８は、酵母ＲＰＤ３タンパク質相同体であり、クラスＩを構成する。ＨＤＡＣ４、５、６、７、９および１０は、酵母Ｈｄａ１タンパク質に関連しており、クラスＩＩを構成する。最近、酵母Ｓｉｒ２タンパク質の哺乳類相同体がいくつか同定され、これらはＮＡＤ依存性のある脱アセチル化酵素の第３のクラスを構成している。さらに、ＨＤＡＣ１１は、クラスＩＩのＨＤＡＣの構造的特徴を有するクラスＩヒストン脱アセチル化酵素として分類されている。これらのＨＤＡＣはすべて、細胞内で、過剰な多タンパク質複合体のサブユニットとして存在しているようである。特に、クラスＩおよびクラスＩＩのＨＤＡＣは、転写因子に対するＨＤＡＣの動員に必要とされる架橋因子として機能する転写コリプレッサーｍＳｉｎ３、Ｎ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴと相互作用することが示されている。
【０００９】
ＨＤＡＣ阻害剤を用いた治療
最近、ＨＤＡＣ阻害の原理を用いて癌患者の全身性臨床治療を開発するためのさらなる臨床研究が開始された。これまでに、近縁酪酸誘導体であるＰｉｖａｎｅｘ（Ｔｉｔａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を単独療法として用いた第ＩＩ相臨床試験が終了し、病期ＩＩＩ／ＩＶの非小細胞肺癌における活性が示されている（Ｋｅｅｒら，２００２，ＡＳＣＯ，Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．１２５３）。さらに多くのＨＤＡＣ阻害剤が同定されており、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）およびＳＡＨＡ（Ａｔｏｎ  Ｐｈａｒｍａ  Ｉｎｃ．）は、第ＩＩ相臨床試験において試験されたヒドロキサム酸の構造クラスに属するものである（Ｍａｒｋｓら，２００１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １，１９４−２０２）。別のクラスは、環状テトラペプチドを含み、たとえばＴ細胞リンパ腫の治療を目的とした第ＩＩ相試験に使用され好結果を得たデプシペプチド（ＦＲ９０１２２８−Ｆｕｊｉｓａｗａ）などが挙げられる（Ｐｉｅｋａｒｚら，２００１，Ｂｌｏｏｄ  ９８，２８６５−８）。さらに、ベンズアミドのクラスに関連した化合物であるＭＳ−２７−２７５（Ｍｉｔｓｕｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は現在、血液悪性疾患の患者を治療する第Ｉ相試験において試験中である。
【００１０】
ＨＤＡＣ阻害剤バルプロ酸
バルプロ酸（ＶＰＡ；２−プロピル−ペンタン酸）は、異なる分子作用機構に依存する多様な生物活性を有している。
−  ＶＰＡは抗癲癇薬である。
−  ＶＰＡは催奇形性である。妊娠中に抗癲癇薬として使用した場合、ＶＰＡは、生まれる子供の数パーセントにおいて出生異常（神経管閉鎖異常および他の奇形）を誘発する。マウスでは、ＶＰＡは、適量を投与した場合、マウス胎児多数において催奇形性を示す。
−  ＶＰＡは、核内ホルモン受容体（ＰＰＡＲδ）を活性化する。いくつかのさらなる転写因子もまた脱抑制されるが、有意に脱抑制されない因子もある（グルココルチコイド受容体、ＰＰＡＲα）。
−  ＶＰＡは、肝毒性を引き起こすことがあるが、これは、補酵素Ａでの代謝が不十分なエステルに依存する。
−  ＶＰＡは、ＨＤＡＣ阻害剤である。
−  ＶＰＡは、ＨＤＡＣ−２のプロテアソーム分解を誘導する。
【００１１】
ＶＰＡ誘導体の使用により、異なる活性が異なる分子作用機構によって媒介されることを解明することができた。優先的に催奇形または優先的に抗癲癇性のいずれかである化合物が単離できることから、催奇形性および抗癲癇活性は、異なる作用様式に従ったものである（Ｎａｕら，１９９１，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．６９，３１０−３２１）。ＰＰＡＲδの活性化は、催奇形性と厳密に相関していることが判明しており（Ｌａｍｐｅｎら，１９９９，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１６０，２３８−２４９）、ＰＰＡＲδの活性化および催奇形性がいずれもＶＰＡが有する同一の分子活性を必要とすることが示されている。また、Ｆ９細胞の分化は、Ｌａｍｐｅｎら，１９９９によって示され、また分化マーカーの解析によって実証（Ｗｅｒｌｉｎｇら，２００１，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５９，１２６９−１２７６）されているように、ＰＰＡＲδの活性化および催奇形性と厳密に相関している。ＰＰＡＲδ活性化は、ＶＰＡおよびその誘導体のＨＤＡＣ阻害活性によって引き起こされることが示された（ＷＯ０２／０７７２２Ａ２；ＷＯ０３／０２４４４２Ａ２）。さらに、確立されたＨＤＡＣ阻害剤であるＴＳＡが、ＰＰＡＲδを活性化し、ＶＰＡと同じ型のＦ９細胞分化を誘導することが示された。これらの結果から、ＰＰＡＲδの活性化だけでなく、Ｆ９細胞分化およびＶＰＡまたはＶＰＡ誘導体の催奇形性の誘導もまたＨＤＡＣ阻害によって引き起こされるものと結論付けられる。
【００１２】
ＨＤＡＣ−２の選択的プロテアソーム分解促進におけるＶＰＡの活性は、ＨＤＡＣの酵素活性阻害剤としての活性とは異なっているが、それは、十分に特徴付けられたＨＤＡＣ阻害剤トリコスタチンＡとＭＳ−２７−２７５とがいずれもＨＤＡＣ−２の分解に影響を与えないためである（Ｋｒａｅｍｅｒら，２００３，２２（１３），３４１１−３４２０）。
【００１３】
抗癲癇活性および鎮静活性は、異なる構造活性関係に従うものであり、したがって、ＨＤＡＣ阻害とは異なるＶＰＡ１次活性に依存することは明らかである。肝毒性の機構は十分に理解されておらず、ＶＰＡ−ＣｏＡエステルの形成と関連しているかどうかはわかっていない。しかしながら、ＨＤＡＣ阻害は、ＣｏＡエステル形成を必要としないように思われる。
【００１４】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としてのバルプロ酸
ＶＰＡは、癲癇の治療に使用する薬剤として開発されてきた。したがって、ＶＰＡは、全身的、経口、または静脈内に使用され、血液脳関門を通過して脳組織内の癲癇標的領域に達して抗癲癇の使命を果たす。さらに、ＶＰＡは、多くの異なる型のヒトの癌の治療に、単剤として、または個々に顕著に異なる作用様式に基づく他のさまざまな抗腫瘍治療剤と併用で使用した場合、ＨＤＡＣ活性を有する特定の組の酵素を阻害し、それによって分化および／またはアポトーシスを誘導することによって、有益な効果を有することが示されている（ＷＯ０２／０７７２２Ａ２、ＥＰ１１７０００８；ＷＯ０３／０２４４４２Ａ２、ＥＰ１２９３２０５Ａ１）。悪性疾患、自己免疫疾患または他の炎症性もしくは過剰増殖性障害を治療または予防するためにも、ＶＰＡは、全身、経口または静脈内に投与され得る。さらに、ＶＰＡは、ヒト皮膚に効果的に浸透し、したがって、自己免疫疾患、ヒトの皮膚の炎症性または過剰増殖性疾患、たとえば、乾癬およびヒト皮膚癌の局所的治療または予防のために使用した場合、皮膚に局所投与して、有益な効果を発揮することが示された（ＥＰ出願番号０３０１４２７８．０）。
【００１５】
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）とその使用
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、アラキドン酸のプロスタグランジンおよびトロンボキサンへの代謝における主要な酵素であるシクロオキシゲナーゼ酵素の阻害剤である。最近、シクロオキシゲナーゼ酵素が２つのアイソフォームであるＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２を含むことが見出された。ＣＯＸ−１は、ほとんどの組織で構成的に発現され、そこで生理学的機能に寄与している。ＮＳＡＩＤによるＣＯＸ−１の阻害は、これらの薬剤に共通した毒性、たとえば、胃潰瘍形成および出血と関連付けられてきた。ＣＯＸ−２は、炎症部位および一部の腫瘍（たとえば、限定されないが、結腸腺腫、結腸癌および結腸直腸癌、乳房、肺および前立腺の腫瘍）でサイトカインおよび増殖因子に応答して誘導される誘導酵素である。
ＣＯＸ阻害剤は、さまざまな疾患および状態、たとえば、痛み、関節リウマチなどの炎症性疾患を治療するため、また、たとえば家族性腺腫症（ＦＡＰ）を患う患者において、腸ポリープ成長の阻害のためにも使用されている。疫学的研究では、ＮＳＡＩＤを長期にわたって摂取した人の結腸直腸腺腫および癌腫の割合が予想よりも低いことが示されている。
【００１６】
これら広く使用されているＮＳＡＩＤのクラスとして、アスピリン、サリチル酸メチル、ジクロフェナク［Ｖｏｌｔａｒｅｎ（登録商標）、Ｎｕ−Ｄｉｃｌｏ（登録商標）、Ｃａｔａｆｌａｍ（登録商標）］、メクロフェナム酸塩［Ｍｅｃｌｏｍｅｎ（登録商標）］、メフェナム酸［Ｐｏｎｓｔｅｌ（登録商標）］、メロキシカム［Ｍｏｂｉｃ（登録商標）］、ナブメトン［Ｒｅｌａｆｅｎ（登録商標）］、ナプロキセン［Ａｌｅｖｅ（登録商標）、Ａｎａｐｒｏｘ（登録商標）、Ｎａｐｒｏｓｙｎ（登録商標）、Ｎａｐｒｅｌａｎ（登録商標）、Ｎａｘｅｎ（登録商標）、Ｎｏｖｏ−Ｎａｐｒｏｘ（登録商標）、Ｓｙｎｆｌｅｘ（登録商標）］、オキサプロジン［Ｄａｙｐｒｏ（登録商標）］、フェニルブタゾン［Ｃｏｔｙｌｂｕｔａｚｏｎｅ（登録商標）、Ａｌｋａ  Ｂｕｔａｚｏｌｉｄｉｎｅ（登録商標）］、ピロキシカム［Ｆｅｌｄｅｎｅ（登録商標）、Ｎｕ−Ｐｉｒｏｘ（登録商標）］、スリンダク［Ｃｌｉｎｏｒｉｌ（登録商標）、Ｎｏｖｏ−Ｓｕｎｄａｃ（登録商標）］、テノキシカム［Ｍｏｂｉｆｌｅｘ（登録商標）］、ジフルニサル［Ｄｏｌｏｂｉｄ（登録商標）］、チアプロフェン酸［Ａｌｂｅｒｔ  Ｔｉａｆｅｎ（登録商標）、Ｓｕｒｇａｍ（登録商標）］、トルメチン［Ｔｏｌｅｃｔｉｎ（登録商標）］、エトドラク［Ｌｏｄｉｎｅ（登録商標）］、フェノプロフェン［Ｎａｌｆｏｎ（登録商標）］、フロクタフェニン［Ｉｄａｒａｃ（登録商標）］、フルルビプロフェン［Ａｎｓａｉｄ（登録商標）、Ｆｒｏｂｅｎ（登録商標）］、イブプロフェン［Ａｄｖｉｌ（登録商標）、Ｄｏｌｇｅｓｉｃ（登録商標）、Ｅｘｃｅｄｒｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｐｒｉｌ（登録商標）、Ｈａｌｔｒａｎ（登録商標）、Ｉｂｉｆｏｎ（登録商標）、Ｉｂｒｅｎ（登録商標）、Ｉｂｕ（登録商標）、Ｉｂｕｐｒｉｎ（登録商標）、Ｉｂｕｐｒｏｈｍ（登録商標）、Ｍｅｄｉｐｒｅｎ（登録商標）、Ｍｉｄｏｌ（登録商標）、Ｍｏｔｒｉｎ（登録商標）、Ｎｕｐｒｉｎ（登録商標）、Ｐａｍｐｒｉｎ（登録商標）、Ｑ−Ｐｒｏｆｅｎ（登録商標）、Ｒｕｆｅｎ（登録商標）、Ｔｒｅｎｄａｒ（登録商標）］、インドメタシン［Ｉｎｄｏｃｉｎ（登録商標）、Ｉｎｄｏｃｉｄ（登録商標）］、ケトプロフェン［Ｏｒｕｄｉｓ（登録商標）、Ｏｒｕｖａｉｌ（登録商標）、Ａｃｔｒｏｎ（登録商標）、Ｒｈｏｄｉｓ（登録商標）］、ニメスリド［Ａｕｌｉｎ（登録商標）］である。いくつかのＮＳＡＩＤ（コキシブ系と称する）は、Ｃｏｘ−２酵素活性を選択的に阻害し、このサブクラスには、セレコキシブ［Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標）、Ｃｅｌｅｂｒａ（登録商標）、Ｏｎｓｅｎａｌ（登録商標）］、ロフェコキシブ［Ｖｉｏｘｘ（登録商標）、Ｖｉｏｘｘ  Ｄｏｌｏｒ（登録商標）、Ｃｅｏｘｘ（登録商標）］、バルデコキシブ［Ｂｅｘｔｒａ（登録商標）、Ｖａｌｄｙｎ（登録商標）］、パレコキシブ［Ｄｙｎａｓｔａｔ（登録商標）、Ｒａｙｚｏｎ（登録商標）］、ルミラコキシブ［Ｐｒｅｘｉｇｅ（登録商標）］、エトリコキシブ［Ａｒｃｏｘｉａ（登録商標）］、デラコキシブ、チルマコキシブ、ロベナコキシブ（ｒｏｂｅｎａｃｏｘｉｂ）、フィロコキシブ（ｆｉｒｏｃｏｘｉｂ）およびシミコキシブ（ｃｉｍｉｃｏｘｉｂ）が含まれる。
【００１７】
しかしながら、２００４年１２月、最も多く処方されている関節リウマチおよび変形性関節症の鎮痛剤であるセレブレックス（登録商標）（セレコキシブ、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）に対し、セレブレックス（登録商標）の２つの５年薬剤治験のうち１つをモニターしていた安全性委員会は、予備データから、この薬剤を多量に摂取していた患者において、心臓障害または脳卒中のリスクがいくぶん増加していることを見出した。この所見により、研究は中止に至った。
【００１８】
以前に、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．もまた、臨床試験で同様の副作用が得られた後、ＣＯＸ−２阻害薬剤Ｖｉｏｘｘ（登録商標）の販売を中止した。
【００１９】
上述のように、ＣＯＸ酵素は、体内で種々の重要な機能を調節しているプロスタグランジンのレベルを調節する。ある型のプロスタグランジンは、たとえば、胃粘膜と呼ばれる保護液で胃の内側を覆うのを補助する。この保護液の産生が減退すると、一部の人は、胃潰瘍発症のリスクにさらされる。
【００２０】
ＣＯＸ−２は、体内のアラキドン酸をプロスタグランジンに変換する。また、癌細胞では、ＣＯＸ−２レベルも上昇し、プロスタグランジンの産生を誘発する。プロスタグランジンは、腫瘍細胞と結合して、新たな血管の生成に関与する遺伝子をオンにする補助を行うことにより、細胞の急速な成長を補助する。
【００２１】
また、ＮＳＡＩＤ、プロスタグランジン（ＰＧ）、増殖およびアポトーシス間の関係が、たとえばＣＯＸを発現してＰＧを合成する結腸腺癌細胞において、調査された。たとえば、ＰＧ産生ＨＴ−２９結腸癌細胞は、ＣＯＸ阻害剤スリンダクおよびピロキシカムによって成長阻害された。結腸直腸癌は、西洋諸国で２番目に多い癌であり、浸潤および／または転移が起こると、しばしば死に至る。現在では、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に加えて結腸癌浸潤もまた、シクロオキシゲナーゼ−２（Ｃｏｘ−２）酵素によって産成されるプロスタグランジンに誘導されると考えられている。
【００２２】
したがって、多くの細胞について、プロスタグランジンの合成と細胞成長の制御との関連付けが確立しており、たとえば、上皮増殖因子依存性増殖がＣＯＸ阻害剤であるインドメタシンにより阻害されるＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞においても示されている。
【００２３】
また、１世紀以上にわたって痛みおよび炎症の制御に使用されているアスピリンは、疫学的研究により、１９８０年代初頭にその長期使用と結腸直腸癌の減少とが関連付けられている。ほぼ同時期に、ＮＳＡＩＤスリンダクに反応して結腸直腸腺腫が退行することを示す最初の報告が出された。その後数年間に、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）酵素を阻害する他のＮＳＡＩＤの使用が、乳房、前立腺および肺の組織を含む多くの組織における癌リスクの低減と関連付けて考えられるようになった。
【００２４】
今日、ＣＯＸ−２ならびにプロスタグランジン合成経路の上流および下流酵素の過剰発現は、多様な癌および一部の腫瘍発生前病変で証明されている。自己分泌または傍分泌経路を通じたプロスタグランジンとその受容体との直接相互作用による生存細胞の増加および新脈管形成の刺激が、シクロオキシゲナーゼ酵素による発癌促進機能の根底にある分子機構として提案されている（概説については、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２００４  Ｎｏｖ  ８；２１５（１）：１−２０．  Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ：ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｚｈａ  Ｓ，Ｙｅｇｎａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  Ｖ，Ｎｅｌｓｏｎ  ＷＧ，Ｉｓａａｃｓ  ＷＢ，Ｄｅ  Ｍａｒｚｏ  ＡＭ．を参照のこと）。
【００２５】
また最近、この点に関し、シクロオキシゲナーゼＣＯＸ−２が一部の肺癌の分子的病因に関与している可能性が、前臨床試験によって示された。利用可能な研究の大部分が、非小細胞肺癌におけるその関与を指摘している。高レベルのＣＯＸ−２を発現する非小細胞肺癌を有する患者の生存は、著しく低減される。選択的ＣＯＸ−２阻害剤セレコキシブを用いたヒトの治療により、非小細胞肺癌を有する患者における化学療法の抗腫瘍効果が増大する。ＣＯＸ−２は、腫瘍に関する新脈管形成の一部の特性を調節することが示されている（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４  Ｊｕｎ  １５；１０（１２  Ｐｔ  ２）：４２６６ｓ−４２６９ｓ．Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒｏｗｎ  ＪＲ，ＤｕＢｏｉｓ  ＲＮ．）。
【００２６】
また、いくつかの研究により、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の発現は、進行性乳癌のパラメータ（たとえば、大きな腫瘍サイズ、陽性腋窩リンパ節転移およびＨＥＲ２−陽性腫瘍状態）と関連していることが示唆されている。マウスおよびラットにおける乳腺腫瘍の研究では、中等度から高度のＣＯＸ−２発現が、非特異的および特異的ＣＯＸ−２阻害剤による治療に対して感受性を示す乳腺腫瘍の発生と関連していることが示された（Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００４  Ａｐｒ；３１（２  Ｓｕｐｐｌ  ７）：２２−９．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣＯＸ−２  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．Ａｒｕｎ  Ｂ，Ｇｏｓｓ  Ｐ．）。
【００２７】
ＣＯＸ−２はまた、前立腺癌、特に、高悪性度の前立腺上皮内腫瘍および癌の上皮細胞においても高度に発現される。選択的ＣＯＸ−２阻害剤を用いたヒト前立腺癌細胞株の治療により、インビトロおよびインビボのいずれにおいてもアポトーシスが誘導されることが示された。インビボの結果はまた、ＣＯＸ−２阻害剤が、腫瘍微細血管密度および新脈管形成を減少させることを示している。ＣＯＸ−２阻害剤は、強力な血管形成因子である血管内皮増殖因子の低酸素上方調節を抑制し得る。したがって、これらの結果は、ＣＯＸ−２阻害剤が、前立腺の癌において有効な化学抗癌剤および治療用薬剤として供され得ることを示す（Ｕｒｏｌｏｇｙ．２００１  Ａｕｇ；５８（２  Ｓｕｐｐｌ  １）：１２７−３１．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｋｉｒｓｃｈｅｎｂａｕｍ  Ａ，Ｌｉｕ  Ｘ，Ｙａｏ  Ｓ，Ｌｅｖｉｎｅ  ＡＣ）。
【００２８】
ＨＤＡＣ阻害剤とＮＳＡＩＤとの併用
ＷＯ０３／０３９５９９Ａ１には、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤とヒストン脱アセチル化酵素阻害剤との併用、および前癌状態の結腸病変または結腸癌または他の悪性腫瘍の治療におけるその使用が一般的に開示されている。
【００２９】
本出願の発明者らは、驚くべきことに、ＨＤＡＣ阻害剤とＣＯＸ酵素阻害剤との併用が、ヒストン脱アセチル化酵素ＨＤＡＣ−２の上方調節を特徴とする疾患の治療において特に有効であることを見出した。さらに、この併用により、同じくＣＯＸ酵素によって調節される、たとえばプロスタグランジンの分泌のような下流の生物学的事象に予期せぬ相乗的阻害がもたらされることがわかった。
【００３０】
したがって、本発明は、疾患に罹患した組織におけるヒストン脱アセチル化酵素ＨＤＡＣ−２の上方調節により定義される疾患を治療または予防するための薬剤を製造するための、ＮＳＡＩＤと併用されるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の使用に関する。
【００３１】
さらに、本発明は、治療を必要とする個体に、有効量のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と有効量のＮＳＡＩＤとを投与することを含む、ＨＤＡＣ−２の上方調節を特徴とする疾患の治療または予防のための方法に関する。
【００３２】
本発明の別の態様は、疾患の治療または予防のための薬剤を製造するための、ＮＳＡＩＤと併用されるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の使用であり、ヒストンの高アセチル化の誘導が有益な効果を有し、治療される個体の少なくとも１つの組織がヒストン脱アセチル化酵素ＨＤＡＣ−２の上方調節を示すことを特徴とする。前記疾患が腫瘍である場合、前記組織は、通常、腫瘍組織である。
【００３３】
前記疾患に罹患した組織におけるＨＤＡＣ−２の上方調節は、異なる変異の結果であるか、またはこれと関連したものであり得る。ＡＰＣ機能の欠如をもたらすＡＰＣ変異、またはβ−カテニンの機能の獲得をもたらすβ−カテニン変異により、ＨＤＡＣ−２レベルの上昇が起こり得る。同様に、ｃ−ｍｙｃの上方調節または機能の向上は、ＨＤＡＣ−２の上方調節を引き起こし得る。一般的に、Ｗｎｔ経路の変異および改変は、ＨＤＡＣ−２の上方調節を引き起こし得る。したがって、前記疾患に罹患した組織は、ＡＰＣ遺伝子内に少なくとも１つの変異を有し得る。あるいはまた、前記疾患に罹患した組織は、β−カテニン遺伝子内に少なくとも１つの変異を有し、これにより、β−カテニン機能の獲得またはβ−カテニンタンパク質の安定化すなわち半減期の長期化がもたらされる。また別の実施形態では、前記疾患に罹患した組織は、ｃ−ｍｙｃの上方調節または機能の向上を示す。さらにまた別の実施形態では、前記疾患に罹患した組織は、ＨＤＡＣ−２上方調節をもたらすＷｎｔ経路の変異および／または改変を示す。
【００３４】
好ましい実施形態においては、前記疾患に罹患した組織は、ＡＰＣ遺伝子に少なくとも１つの変異を、およびβ−カテニン遺伝子に少なくとも１つの変異を有する。別の実施形態においては、前記疾患に罹患した組織は、ＡＰＣ遺伝子に少なくとも１つの変異を、およびβ−カテニン遺伝子に少なくとも１つの変異を、ならびにｃ−ｍｙｃの上方調節または機能の向上を有する。
【００３５】
用語「組織」は、本明細書で用いる場合、個体由来の生物学的材料を表す。用語「組織」は、個体から得られた細胞を含む。語句「疾患に罹患した」は、細胞または組織が、対応する健常個体の細胞または組織と異なっている状況を指す。たとえば、細胞または組織は、制御されていない細胞分裂を示したり、健常個体の対応する細胞には存在しない遺伝子変異を有したり、または炎症の徴候を示したりする。任意の第１のステップにおいて、組織材料は、個体から生検材料を得ることにより提供され得る。
【００３６】
治療すべき疾患に罹患した組織におけるＨＤＡＣ−２の上方調節は、健常個体の対応する組織におけるＨＤＡＣ−２レベル（タンパク質またはｍＲＮＡ）と比べて、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、最も好ましくは少なくとも５０％である。用語「上方調節」は、ＨＤＡＣ−２タンパク質および／またはＨＤＡＣ−２ｍＲＮＡの量をいう。好ましくは、タンパク質およびｍＲＮＡのいずれもが上方調節される。
【００３７】
疾患に罹患した組織がヒストン脱アセチル化酵素ＨＤＡＣ−２の上方調節を示すか否か、または上方調節の程度は、ＨＤＡＣ−２の量および／または発現を測定することにより決定できる。たとえば、ＨＤＡＣ−２タンパク質の量は、ＨＤＡＣ−２指向抗体を用いた免疫測定によって決定できる。このような免疫測定は、当業者には公知である。ＨＤＡＣ−２指向抗体は、Ｋｒａｅｍｅｒら（２００３）ＥＭＢＯ  Ｊ．２２，３４１１−３４２０に開示されており、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｚｙｍｅｄ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈおよびその他の企業など、種々の供給元から得ることができる。
【００３８】
当技術分野で一般に知られているウエスタンブロッティングを使用してよい。細胞材料または組織を均質化し、変性剤および／または還元剤を用いて治療し、試料を得る。試料は、ポリアクリルアミドゲル上に負荷し、タンパク質を分離した後、膜に移すか、または直接固相上にスポットしてもよい。次いで、抗体を試料と接触させる。１回以上の洗浄工程の後、結合した抗体を、当技術分野で知られた手法を用いて検出する。タンパク質のゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングが、Ｇｏｌｅｍｉｓ，“Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ  ２００２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎ．Ｙ．に記載されている。
【００３９】
固形腫瘍の薄片などの組織材料を固定しかつ透過化した後に、免疫組織化学を使用してもよい。次いで、抗体を試料とともにインキュベートし、１回以上の洗浄工程の後、結合した抗体を検出する。この手法は、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ  １９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎ．Ｙ．に概説されている。
【００４０】
好ましい実施形態において、ＨＤＡＣ−２タンパク質の量はＥＬＩＳＡにより測定する。さまざまな形式のＥＬＩＳＡが想定される。一形式では、抗体をマイクロタイタープレートなどの固相で固定化した後、非特異的結合部位をブロックして、試料とインキュベートする。別の形式では、試料をまず固相と接触させ、試料中に含有されるＨＤＡＣ−２タンパク質を固定化する。ブロックおよび任意選択の洗浄後、固定化した試料と抗体とを接触させる。ＥＬＩＳＡ手法は、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ  １９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎ．Ｙ．に記載されている。
【００４１】
あるいはまた、ＨＤＡＣ−２のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量は、当業者に知られた核酸手法によって測定できる。好ましくは、ハイブリダイゼーション手法および／またはＰＣＲ手法が使用される。ノーザンブロッティング手法は、試料中のＨＤＡＣ−２ＲＮＡの量を測定するために使用できる。好ましい実施形態において、ＲＴ−ＰＣＲが使用される。当業者は、ＨＤＡＣ−２のヌクレオチド配列に基づいて、これらの方法において使用するに適したプライマーおよび／またはプローブを設計することができる。ヌクレオチド配列ならびにＨＤＡＣ−２の量および／または発現を測定するに適した方法は、ＷＯ２００４／０２７４１８Ａ２に記載されている。
【００４２】
本発明の使用または方法の一態様によれば、ＨＤＡＣ−２の上方調節を特徴とする疾患を個体が有するか否かを調べるために、診断工程を実行してもよい。この診断工程は、組織試料中のＨＤＡＣ−２核酸またはタンパク質の量または発現を測定することが含み得る。組織試料がＨＤＡＣ−２の上方調節を示す場合、組織を採取した個体は、本発明の使用または方法に従って治療可能である。
【００４３】
したがって、本発明による併用治療の前に、ｍＲＮＡなどのＨＤＡＣ−２核酸またはタンパク質の量もしくは発現を測定する工程を実施してもよい。任意に、前記試料中のＨＤＡＣ−２核酸またはタンパク質の量もしくは発現が健常個体由来の参照試料と比較して有意に、少なくとも１０、２５または５０％高い場合に、個体を選択してよい。
【００４４】
さらに、ＡＰＣ遺伝子またはβ−カテニン遺伝子に変異が存在するか否かを測定し得る。さらに、当技術分野で知られた方法に従って、ｃ−ｍｙｃの上方調節または機能の向上の有無を決定し得る。
【００４５】
ヒトの癌におけるいくつかのβ−カテニン変異が、Ｐｏｌａｋｉｓ（２０００）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４：１８３７−１８５１の表１（第１８４０頁を参照のこと）に開示されている。これらの変異は、引用により本明細書に組み込まれる。本発明の一実施形態において、治療する疾患は、その疾患に罹患した組織におけるこれらβ−カテニン変異の少なくとも１つを特徴とするものである。
【００４６】
ＡＰＣ遺伝子における変異は文献に広く記載されており、しばしば、胃腸の癌、たとえば、胃、十二指腸、結腸および直腸の癌の発生と関連付けられており、ＡＰＣ遺伝子を結腸における発癌性のゲートキーパーとしている（ＢｅｈｒｅｎｓおよびＬｕｓｔｉｇ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４８：４７７−４８７，２００４；ならびにそこに挙げられた参考文献）。さらに、ＡＰＣ変異はまた、さらなる種々の癌（ＢｅｒｏｕｄおよびＳｏｕｓｓｉ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（１）：１２１−４，１９９６）、たとえば、膵癌（ＦｌａｎｄｅｒｓおよびＦｏｕｌｋｅｓ，Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．３３：８８９−８９８，１９９６）、甲状腺癌（Ｋｕｒｉｈａｒａら；Ｔｈｙｒｏｉｄ  １４（１２）：１０２０−９，２００４）、肺癌（Ｏｈｇａｋｉら；Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２０７（２）：１９７−２０３，２００４）、腎臓癌（Ｐｅｃｉｎａ−Ｓｌａｕｓら，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３６（２）：１４５−５１，２００４）、黒色腫（Ｗｏｒｍら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３（３０）：５２１５−２６，２００４；Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １００（５）：５４９−５６，２００２）でも見出される。さらにまた、ＦＡＰおよびターコット症候群患者におけるＡＰＣ変異は、髄芽細胞腫、甲状腺乳頭癌、肝芽腫および類腱腫（Ｌｙｎｃｈら，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．４６（１１）：２３２５−３２，２００１）ならびに脳腫瘍（Ｓｕｎａｈａｒａら，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  ５８（７）：１４８４−９，２０００；Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３２（１３）：８３９−４７，１９９５）の発生と関連付けられている。これらの文献の開示およびそこに記載された変異は、引用により本明細書に組み込まれる。
【００４７】
好ましくは、治療または予防する疾患は、癌に至る遺伝性疾患である。前記疾患はさらに、癌または炎症性疾患であり得る。特に好ましい実施形態において、癌に至る遺伝性疾患は家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）である。
【００４８】
本発明の一態様は、炎症性疾患を治療または予防するための薬剤を製造するための、ＮＳＡＩＤとの併用でのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の使用である。
【００４９】
治療または予防する疾患は、エストロゲン受容体依存性乳癌、エストロゲン受容体非依存性乳癌、ホルモン受容体依存性前立腺癌、ホルモン受容体非依存性前立腺癌、脳腫瘍、腎臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、尿生殖器癌、胃腸癌、子宮癌、卵巣癌、星状細胞腫、神経膠腫、皮膚癌、扁平上皮癌、ケラトアカントーマ、ボーエン病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、黒色腫、基底細胞癌、光線性角化症、魚鱗癬、ざ瘡、尋常性ざ瘡、肉腫、カポージ肉腫、骨肉腫、頭部および頚部の癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、白血病、リンパ腫および／または他の血液細胞癌であり得る。
【００５０】
別の態様では、前記疾患は、関節リウマチ、甲状腺ホルモン抵抗性症候群、糖尿病、サラセミア、肝硬変、原虫感染、リウマチ様脊椎炎、あらゆる形態のリウマチ、変形性関節症、痛風性関節炎、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、インシュリン非依存性糖尿病、喘息、鼻炎、ブドウ膜炎、エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、慢性下痢、乾癬、アトピー性皮膚炎、骨疾患、線維増殖性疾患、アテローム性動脈硬化症、再生不良性貧血、ディジョージ症候群、グレーブズ病、癲癇、癲癇重積症、アルツハイマー病、うつ病、統合失調症、統合失調性感情障害、躁病、脳卒中、気分不調和性精神病性症状、双極性障害、情動障害、髄膜炎、筋ジストロフィー、多発性硬化症、激昂、心臓肥大、心不全、再灌流障害および／または肥満である。
【００５１】
併用治療に使用するＮＳＡＩＤはシクロオキシゲナーゼ阻害剤であってもよく、好ましくはシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤である。本発明による好ましいＮＳＡＩＤは、サリチル酸系、アリールアルカン酸、２−アリールプロピオン酸、Ｎ−アリールアントラニル酸、メロキシカムおよびピロキシカムなどのオキシカム系、セレコキシブ、バルデコキシブ、ルミラコキシブ、エトリコキシブおよびロフェコキシブなどのコキシブ系、スルホンアニリド系、インドメタシン、スリンダク、アスピリン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ナプロキセンの薬剤およびその誘導体である。
【００５２】
本明細書で用いる場合、用語「ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤」は、ヒストン脱アセチル化酵素活性を有する酵素のヒストン脱アセチル化酵素活性を阻害できる物質を表す。
【００５３】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の阻害活性は、当業者に知られたインビトロ免疫測定によって測定できる（ＷＯ０３／００１４０３）。ＩＣ５０値は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の阻害活性の尺度とみなすことができる。低いＩＣ５０値は阻害活性が高いことを示し、高いＩＣ５０値は阻害活性が低いことを示す。本発明に従って使用されるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、好ましくは、少なくとも１種類のヒストン脱アセチル化酵素に関して１ｍＭ未満、より好ましくは５００μＭ未満のＩＣ５０値を有する。
【００５４】
好ましい実施形態によれば、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、ヒストン脱アセチル化酵素または選択した脱アセチル化酵素のサブセットを優先的に阻害できる。用語「優先的に阻害する」は、本明細書で用いる場合、所与のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤によって第１の群のヒストン脱アセチル化酵素が第２の群のヒストン脱アセチル化酵素よりも強力に阻害される状態をいう。通常、第１の群のヒストン脱アセチル化酵素を優先的に阻害するヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、前記第１の群のヒストン脱アセチル化酵素に関して８００μＭ未満、好ましくは５００μＭ未満のＩＣ５０値を有する。第２の群のヒストン脱アセチル化酵素に関するＩＣ５０値は、通常、８００μＭより大きく、好ましくは１ｍＭより大きい。
【００５５】
好ましい実施形態において、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、クラスＩヒストン脱アセチル化酵素を優先的に阻害できる。この第１の実施形態によれば、クラスＩヒストン脱アセチル化酵素はクラスＩＩヒストン脱アセチル化酵素よりも強力に阻害される。この第１の実施形態において、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、ヒストン脱アセチル化酵素ＨＤＡＣ１、２、３および８に関して通常８００μＭ未満、好ましくは５００μＭ未満のＩＣ５０値を有する。また、このヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は通常、クラスＩＩ酵素ＨＤＡＣ４、５、６、７、９および１０に関して８００μＭより大きい、好ましくは１ｍＭより大きいＩＣ５０値を有する。特定の実施形態において、使用するヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、ＨＤＡＣ−２を、その他のヒストン脱アセチル化酵素よりも強力に阻害する。本発明に従って使用するヒストン脱アセチル化酵素は、ＨＤＡＣ−２に関して８００μＭ未満、好ましくは５００μＭ未満のＩＣ５０値を有することが最も好ましい。
【００５６】
好ましくは、本発明に従って使用するヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、これを用いて治療される細胞において、ＨＤＡＣ−２タンパク質またはｍＲＮＡのレベルを下方調節できる。これは、Ｋｒａｅｍｅｒら（２００３）ＥＭＢＯ  Ｊ．２２，３４１１−３４２０（その開示は引用により本明細書に組み込まれる）に記載のようにして測定できる。下方調節は、少なくとも１０％、または少なくとも２５％、または少なくとも５０％であってよい。
【００５７】
本発明の併用治療で使用するヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、式Ｉ
【化１】
2009501168.tif 000002
（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、直鎖または分枝鎖の飽和または不飽和脂肪族Ｃ３〜２５炭化水素鎖を示し、これは、任意に１つまたはいくつかのヘテロ原子を含んでいてもよく、置換されていてもよく、Ｒ３は、ヒドロキシル、ハロゲン、アルコキシまたは任意にアルキル化されたアミノ基を示す）
の化合物または薬学的に許容され得るその塩であってよい。好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、独立して、直鎖または分枝鎖のＣ３〜２５炭化水素鎖であり、これは任意に、二重結合または三重結合を１つ含む。
【００５８】
最も好ましくは、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、バルプロ酸または薬学的に許容され得るその塩である。
【００５９】
本発明の他の態様において、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、ヒドロキサム酸誘導体、ベンズアミド、ピロキサミドおよびその誘導体、ＨＤＡＣ阻害活性を示す微生物代謝物質、脂肪酸およびその誘導体、環状テトラペプチド、ペプチド性化合物、クラスＩＩＩのＨＤＡＣ阻害剤ならびにＳＩＲＴ阻害剤または薬学的に許容され得るその塩からなる群より選択され得る。
【００６０】
ヒドロキサム酸誘導体は、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ＬＢＨ−５８９、ＭＧＣＤ０１０３、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、ＣＢＨＡ、Ｇ２Ｍ−７０１、Ｇ２Ｍ−７０２、Ｇ２Ｍ−７０７、ピロキサミド、スクリプタイド、ＣＩ−９９４、ＣＧ−１５２１、クラミドシン、ビアリールヒドロキサメート、Ａ−１６１９０６、ビシクロアリール−Ｎ−ヒドロキシカルボキサミド、ＰＸＤ−１０１、スルホンアミドヒドロキサム酸、ＴＰＸ−ＨＡアナログ（ＣＨＡＰ）、オキサムフラチン、トラポキシン、デプデシン、アピジシン、ベンズアミド、ＭＳ−２７−２７５，酪酸およびその誘導体、ピバネックス（酪酸ピバロイルオキシメチル）、トラポキシンＡ、デプシペプチド（ＦＫ−２２８）および関連するペプチド化合物、タセジナリンおよびＭＧ２８５６または薬学的に許容され得るその塩などの化合物であってよい。
【００６１】
本発明の好ましい一実施形態は、本明細書において先に定義した疾患を予防または治療するための薬剤を製造するための、セレコキシブ（たとえば、セレブレックス（登録商標）として市販）（または他のコキシブ系））との併用でのバルプロ酸の使用である。最も好ましくは、バルプロ酸は、ＦＡＰ治療用のセレコキシブと併用で使用される。
【００６２】
本発明の別の好ましい実施形態は、本明細書において先に定義した疾患を予防または治療するための薬剤を製造するための、スリンダク（または他のアリールアルカン酸）との併用でのバルプロ酸の使用である。最も好ましくは、バルプロ酸は、ＦＡＰ治療用のスリンダクとの併用で使用される。
【００６３】
本発明の別の好ましい実施形態は、本明細書において先に定義した疾患を予防または治療するための薬剤を製造するための、アスピリン（または他のサリチル酸系）との併用でのバルプロ酸の使用である。最も好ましくは、バルプロ酸は、アスピリンとの併用で使用される。
【００６４】
本発明の別の好ましい実施形態は、本明細書において先に定義した疾患を予防または治療するための薬剤を製造するための、イブプロフェン（または他の２−アリールプロピオン酸）との併用でのバルプロ酸の使用である。最も好ましくは、バルプロ酸は、ＦＡＰ治療用のイブプロフェンとの併用で使用される。
【００６５】
本発明の別の好ましい実施形態は、本明細書において先に定義した疾患を予防または治療するための薬剤を製造するための、フェナム酸（または他のＮ−アリールアントラニル酸）との併用でのバルプロ酸の使用である。最も好ましくは、バルプロ酸は、ＦＡＰ治療用のフェナム酸との併用で使用される。
【００６６】
本発明の別の好ましい実施形態は、本明細書において先に定義した疾患を予防または治療するための薬剤を製造するための、ピロキシカム（または他のオキシカム系）との併用でのバルプロ酸の使用である。最も好ましくは、バルプロ酸は、ＦＡＰ治療用のピロキシカムとの併用で使用される。
【００６７】
特定の態様において、本発明は、（ａ）バルプロ酸または薬学的に許容され得るその塩および（ｂ）セレコキシブを含む複合薬、たとえば、複合製剤または薬剤組成物に関する。別の特定の態様において、本発明は、（ａ）バルプロ酸または薬学的に許容され得るその塩および（ｂ）スリンダクを含む複合薬、たとえば、複合製剤または薬剤組成物に関する。別の特定の態様において、本発明は、（ａ）バルプロ酸または薬学的に許容され得るその塩および（ｂ）アスピリンを含む複合薬、たとえば、複合製剤または薬剤組成物に関する。別の特定の態様において、本発明は、（ａ）バルプロ酸または薬学的に許容され得るその塩および（ｂ）イブプロフェンを含む複合薬、たとえば、複合製剤または薬剤組成物に関する。別の特定の態様において、本発明は、（ａ）バルプロ酸または薬学的に許容され得るその塩および（ｂ）フェナム酸を含む複合薬、たとえば、複合製剤または薬剤組成物に関する。別の特定の態様において、本発明は、（ａ）バルプロ酸または薬学的に許容され得るその塩および（ｂ）ピロキシカムを含む複合薬、たとえば、複合製剤または薬剤組成物に関する。
【００６８】
活性成分（ａ）および（ｂ）は、同時、並行、個別または逐次使用のために、遊離形態または薬学的に許容され得る塩の形態で存在し得る。複数の部分から成るキットの複数の部分は、同時または時間をずらして投与されてよく、すなわち、複数の部分から成るキットの任意の部分について、異なる時点で、および等しいかまたは異なる時間間隔をおいて、投与されてよい。
【００６９】
本発明による薬剤は、静脈内投与、筋肉投与、皮下投与、局所投与、経口投与、経鼻投与、腹腔内投与または坐剤投与によって適用され得る。
【００７０】
異なる薬剤化合物は、２種類の個別の薬剤の形態で、または1回の投与単位に両方の薬剤を含有する投与形態で投与され得る。異なる薬剤化合物は、同時または時間をずらして投与されてよく、すなわち、複合薬の任意の化合物について、異なる時点で、および等しいかまたは異なる時間間隔をおいて、投与されてよい。
【００７１】
驚くべきことに、ＮＳＡＩＤおよびヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の用量が、これらの化合物をそれぞれ単独で使用する場合と比べて、有意に低減され得ることが見出された。
【００７２】
したがって、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤との併用で使用する場合におけるＮＳＡＩＤの好ましい用量は、推奨または認可用量の３０〜６０％まで、より好ましくは６０〜８０％まで、より好ましくは８０〜９０％まで低減され得る。
【００７３】
特定の一態様において、本発明は、（ａ）バルプロ酸または薬学的に許容され得るその塩および（ｂ）セレコキシブを含む複合薬、たとえば、複合製剤または薬剤組成物に関し、この場合、治療のためのセレコキシブの１日量は１００〜６００ｍｇであり、バルプロ酸または薬学的に許容され得るその塩の１日量は体重１ｋｇ当り１０〜６０ｍｇである。より好ましくは、セレコキシブの１日量は２００〜５００ｍｇであり、バルプロ酸または薬学的に許容され得るその塩の１日量は体重１ｋｇ当り２０〜４５ｍｇである。最も好ましくは、これらの複合薬はＦＡＰの治療のために使用される。
【００７４】
別の特定の態様において、本発明は、（ａ）ＰＸＤ１０１または薬学的に許容され得るその塩および（ｂ）セレコキシブを含む複合薬、たとえば、複合製剤または薬剤組成物に関し、この場合、治療のためのセレコキシブの１日量は１００〜６００ｍｇであり、ＰＸＤ１０１の１日量は３００ｍｇ〜１０ｇである。より好ましくは、セレコキシブの１日量は２００〜５００ｍｇであり、ＰＸＤ１０１の１日量は５００ｍｇ〜５ｇである。最も好ましくは、これらの複合薬はＦＡＰの治療のために使用される。
【００７５】
本発明の別の実施形態において、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の好ましい用量は、ＮＳＡＩＤとの併用で使用する場合、前記薬剤の推奨または認可用量の３０〜６０％まで、より好ましくは６０〜８０％まで、より好ましくは８０〜９０％まで低減され得る。
【００７６】
これらの薬剤の既に知られた副作用プロフィールに鑑み、また、起こり得る副作用を挙げたこのリストに心臓毒性および脳卒中の潜在リスク増大をも追加する最近のデータが存在することから、特に長期使用または常用が必要とされる場合には、これらの薬剤の用量レベルを引き下げることが必要とされる。これは実際に、他の治療的アプローチとＣＯＸ阻害剤の使用とを組み合わせた新規な治療方法によって達成でき、副作用を低減させながら少なくとも同等の治療上の成功を維持するか、または患者の利益をさらに増しつつ、ＣＯＸ阻害薬剤の用量を引き下げることが可能となる。
【００７７】
本発明において、発明者らは、ＨＤＡＣ阻害剤が、ＣＯＸ−２の発現を下方調節し、これによって細胞によるプロスタグランジン分泌を阻害し得ることを示すデータを提示する。これはすなわち、このようなＨＤＡＣ阻害剤の抗癌特性に寄与し得る。しかしながら、最も重要なことであるが、本発明において発明者らはＨＤＡＣ阻害剤とＣＯＸ酵素阻害剤とを併用することにより、驚くべきことに、同じくＣＯＸ酵素によって調節されるプロスタグランジン分泌など下流の生物学的事象において、予期せぬ相乗的阻害が生じることを示す。これらの相乗的活性は、一部はＣＯＸ阻害剤によって引き起こされる酵素的阻害によるものであり、第２に、ＣＯＸ遺伝子発現の下方調節によるものである。しかしながら、いずれの機構にも同じ標的構造が関与するため、この説明は、観察される相乗的効果、特に、動物における最も関連の深いインビボ試験系で見られる前記効果を説明するには不十分であることが予測される。したがって、おそらくヒストン脱アセチル化酵素阻害活性と関連しているさらなる驚くべき活性が、このような有益な相乗的効果をもたらす原因となっていると結論付けなければならない。ここで、これらの所見は、癌または炎症性疾患を患う患者に対し、ＣＯＸ阻害剤とともにＨＤＡＣ阻害剤を用いる併用治療に基づいた新規な治療法の選択肢を提供するために、ヒト臨床的試験に移すことができる。
【００７８】
また、この併用相乗的活性に基づき、ＨＤＡＣ阻害剤との併用で使用される場合、ＮＳＡＩＤの用量を減少させ得ることが予測され、その結果、これらのＮＳＡＩＤの使用に関連する副作用が減少し得る。
【００７９】
したがって、家族性腺腫ポリポーシス（ＦＡＰ）の場合と同様、ＨＤＡＣ阻害剤とＮＳＡＩＤとの併用により、腸ポリープ成長およびポリープ負荷の相乗的低減が予測される。その結果、ＦＡＰ患者に対する現在のケア標準、すなわち、予防的結腸切除（腸の外科的除去）が、可能性として数年間、延期され得る。また、これらの患者の個々のポリープは最終的に結腸癌に進行するため、この進行が抑制および遅延され得る。
【００８０】
さらに、本発明は、さまざまな（たとえば、限定されないが、結腸、乳房、肺および前立腺の癌を含む）癌適応症を治療するためのＨＤＡＣ阻害剤とＣＯＸ阻害剤との併用を包含する。
【００８１】
また、ＨＤＡＣ阻害剤の抗炎症性活性に基づいて、これらを抗炎症作用性ＣＯＸ阻害剤との併用で使用することができ、炎症性疾患において付加的またはさらに相乗的な治療効果得るために両方の阻害概念を組み合わせた新規な治療の選択肢が与えられる。
【実施例】
【００８２】
実施例１
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤によるＣＯＸ−２のＲＮＡおよびタンパク質発現の下方調節
Ｃｏｘ−２の発現は、ＨＤＡＣ阻害剤によって下方調節される（図１および２）。これは、ＨＤＡＣ阻害性化合物バルプロ酸（ＶＰＡ、ＴＳＡ、Ｇ２Ｍ−７０１、Ｇ２Ｍ−７０２およびＧ２Ｍ−７０７）の場合（Ｇ２Ｍ−７０１、Ｇ２Ｍ−７０２およびＧ２Ｍ−７０７の詳細については、ＷＯ２００４／００９５３６Ａ１を参照のこと）、ＲＮＡおよびタンパク質レベルで、いくつかの系、たとえば、Ａ−５４９ヒト肺上皮癌細胞、ＳＫ−Ｍｅｌ黒色腫細胞、ＨＴ−２９結腸癌細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞、ＴＨＰ−１単球および一次ヒトリンパ球およびマクロファージなどにおいて示された。同時に解析したＣｏｘ−１レベルは、図１に示されるように、影響されていない。対照的に、ＣＯＸ−２阻害剤セレコキシブ（図２）は、ＣＯＸ−２の発現を改変しない。
【００８３】
成長培地へ２０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡを３日間添加することにより、ＴＨＰ−１細胞の分化を誘導した。接着細胞を、６ウェルプレートの各ウェル当り５×１０５細胞の密度で播種し、１ｍＭのＶＰＡまたは１０μＭのＧ２Ｍ−７０７とともに一晩インキュベートした（図１Ａ）。次いで、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳの添加により、６時間かけてＣｏｘ−２発現を誘導した。ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ製のＲＮｅａｓｙキットを用い、製造業者の使用説明書に従って調製した。１μｇのＲＮＡを２０μｌの容量で用いて逆転写を行った。記載の遺伝子に対して特異的プライマーを使用した各ＰＣＲ反応につき、１μｌを使用した。ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−６の下方調節に加え、両ＨＤＡＣ阻害剤によるＣＯＸ−２ＲＮＡの下方調節もまた観察されたが、ＣＯＸ−１ＲＮＡの下方調節は観察されなかった（図１Ａ）。
【００８４】
また、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを、それぞれ投与量３０ｍｇ／ｋｇ／日（患者１）または１２０ｍｇ／ｋｇ／日のＶＰＡ（患者２）で治療された患者の末梢血リンパ球から単離したＲＮＡを用いて行った。図１Ｂは、ＶＰＡ治療によるＣｏｘ−２の下方調節を明白に示しているが、対照遺伝子ＧＡＰＤＨの下方調節は見られない。
【００８５】
図２に、ＨＤＡＣ阻害剤によるタンパク質レベルでのＣｏｘ−２の調節を種々の細胞型で示す。ここで、Ａ５４９細胞およびＳＫ−Ｍｅｌ黒色腫細胞は、ＣＯＸ−２の構成的発現を示し、さらなる誘導は見られなかった。ＨＴ−２９結腸癌細胞では、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを用いた４時間の治療によってＣｏｘ−２の発現が誘導された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞およびＴＨＰ−１単球では、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳをＣｏｘ−２発現の誘導物質として、それぞれ１６時間または６時間使用した。ＨＤＡＣ阻害剤による治療は、７２時間（Ａ−５４９）、４８時間（ＳＫ−Ｍｅｌ）、誘導１６時間前に開始（ＴＨＰ−１細胞）、または誘導３０分前に開始して（ＨＴ２９およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞で）行った。
細胞は、２４ウェルプレートの各ウェル当り５×１０４〜１×１０５細胞の密度で播種した。成長培地を除去し、各ウェル当り２００μｌのＬａｅｍｍｌｉ試料バッファを添加することにより溶解を行った。６０μｌを８％アクリルアミドゲル上に負荷し、不連続的電気泳動に供した。ＰＶＤＦ膜上にブロットしたタンパク質を、ヤギ抗Ｃｏｘ−２抗体（Ｓｔ．Ｃｒｕｚ，ｓｃ１７４７）またはマウス抗汎アクチン（ｐａｎ−ａｃｔｉｎ）抗体（Ａｂ−５，ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）でプローブ検索した。すべての系において、ＨＤＡＣ阻害剤によるＣｏｘ−２タンパク質の下方調節が観察されたが、対照タンパク質アクチンの下方調節は観察されなかった（図２）。
【００８６】
実施例２
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤およびそのＣＯＸ酵素阻害剤（ＮＳＡＩＤ）との併用によるプロスタグランジン分泌の阻害
ＨＤＡＣ阻害剤によるＣｏｘ−２タンパク質レベルの阻害もまた、いくつかの系において、分泌プロスタグランジンの下方調節をもたらす。このプロスタグランジンの減少は、図３に示すように、Ｃｏｘ−２阻害剤セレコキシブ（Ｃｅｌ）と同じレベルに達する。
【００８７】
ＨＴ−２９結腸癌細胞では、Ｃｏｘ−２の発現は、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで４時間治療することによって誘導され、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞では、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳをＣｏｘ−２発現の誘導物質として１６時間使用した。ＨＤＡＣ阻害剤およびＣｏｘ阻害剤での治療は、誘導前に３０分間（ＨＴ−２９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）または溶解前に１６時間（Ａ５４９）行った。上清み中のプロスタグランジンレベルを、Ｃａｙｍａｎ製のプロスタグランジンＥ２ＥＩＡキットを用い、製造業者の使用説明書に従って解析した。バーは２つの値の平均を示し、誤差バーはその２つの値の範囲を示している（図３）。
【００８８】
ＨＤＡＣ阻害剤は、図４に示すように、ＴＨＰ−１単球およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞において、Ｃｏｘ阻害剤セレコキシブによるプロスタグランジン分泌低減を促進することさえある。ＴＨＰ−１単球では、プロスタグランジンレベルがセレコキシブによって既に抑制された後であっても、ＨＤＡＣ阻害剤であるＧ２Ｍ−７０７およびＴＳＡが前記レベルをさらに低減させることがある。プロスタグランジン分泌におけるこの阻害促進は相乗的なものとみなされるべきであるが、それは、セレコキシブとＨＤＡＣ阻害剤とを併用すると、阻害活性の１つのみを付与した場合に示されるものよりも格段に著しいプロスタグランジン分泌の阻害が得られるからである。したがって、これらのＨＤＡＣ阻害剤のＨＤＡＣ阻害機能は、驚くべきことに、これらの相乗効果をもたらすこれまで知られていなかった機構によって、プロスタグランジン分泌の下方調節におけるＣＯＸ阻害機能を支持するように思われる。また、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞では、ＨＤＡＣ阻害剤であるＶＰＡは、セレコキシブによるプロスタグランジン分泌の抑制を用量依存的に促進し得た。同時に、Ｃｏｘ−２タンパク質レベルが上述のように低減した。
【００８９】
詳細には、細胞を、２４ウェルプレートの各ウェル当り７．５×１０４の密度で播種した。Ｃａｙｍａｎ製のプロスタグランジンＥ２ＥＩＡキットを用い、製造業者の使用説明書に従って、１：３に希釈した上清みの２重解析を行った。バーは２つの値の平均を示す。成長培地を完全に除去し、各ウェル当り２００μｌのＬａｅｍｍｌｉ試料バッファを添加することにより、細胞抽出物を調製した。次いで、６０μｌを８％アクリルアミドゲル上に負荷し、不連続的電気泳動に供した。ＰＶＤＦ膜上にブロットしたタンパク質を、ヤギ抗Ｃｏｘ−２抗体（Ｓｔ．Ｃｒｕｚ，ｓｃ１７４７）またはマウス抗汎アクチン（この対照タンパク質の発現を解析するため）抗体（Ａｂ−５，ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）でプローブ検索した。
【００９０】
実施例３
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とＣｏｘ−２阻害剤との併用使用によるインビボ腺腫成長の相乗的阻害
ＶＰＡで治療を行うことにより、ＡＰＣｍｉｎマウスモデルにおいて腺腫の数が有意に低減される。このモデルにおいてＣｏｘ−２阻害剤であるセレコキシブを使用することにより、同様の結果が得られた。しかし、このモデルにおいて両方の薬剤を同時に使用する併用療法では、腺腫数の相乗的低減が観察された。ここでもまた、ＶＰＡの二重活性、すなわちＣｏｘ−２タンパク質レベルを下方調節するその能力、およびそのＨＤＡＣ阻害機能が、従来のＣｏｘ−２阻害剤とともに用いた場合に観察された相乗的な治療効果に関与することが強く主張される（図５Ａ）。
【００９１】
１群あたり１５匹（対照群）、１７匹（ＶＰＡ群）、１３匹（セレコキシブ群）または５匹（併用治療群）の動物の平均値を、標準誤差バーとともに示す。Ｐ＜０．０５（２標本ｔ検定；対照対ＶＰＡ治療およびセレコキシブ治療、ならびに単独療法対併用療法治療動物。
【００９２】
図５ｂは、ＶＰＡおよびセレコキシブ単独での治療後、ならびに両方の薬剤による併用治療後のＡＰＣｍｉｎマウス（結腸癌の発生に至る遺伝性疾患である家族性腺腫性ポリポーシスの動物モデル）の肝臓抽出物中プロスタグランジンレベルを示す。ここで、いずれの薬剤もプロスタグランジンレベルを同程度に減少させることが示された。両方の薬剤を併用療法にて同時に使用することにより、プロスタグランジン分泌がさらに減少した。プロスタグランジン分泌のこの抑制促進は付加的なものであり、ここでもまた、腺腫成長の低減において観察された相乗効果が、単にプロスタグランジン分泌の阻害を妨害することにより説明されるだけでなく、むしろ、ＶＰＡの二重活性、（ｉ）ＨＤＡＣ酵素阻害剤としての作用、および（ｉｉ）その後のプロスタグランジンレベル低減を伴うＣｏｘ−２の発現を下方調節するその能力、に帰属しているはずであることが主張される。
【００９３】
２匹（対照群）、４匹（ＶＰＡ群）および５匹（セレコキシブおよび併用群）の動物の平均値を、標準偏差とともに示す。
【００９４】
詳細には、７〜１６週齢の性別適合ヘテロ接合型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＡＰＣｍｉｎ／＋マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）を、未治療のままにするか、それぞれＶＰＡもしくはセレコキシブまたはその両方の薬剤で治療するかのいずれかとした。対照動物にはＰＢＳを注射（ｉ．ｐ．）した。ＶＰＡは、そのナトリウム塩の等張性水溶液として４週間注射（ｉ．ｐ．）（２×４００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）し、セレコキシブは、動物に対し、その飼料とともに１２５０ｐｐｍ（０．１２％）で４週間随意に与えた。併用群には、ＶＰＡ群およびセレコキシブ群それぞれの単独治療群と同じ投与量を４週間与えた。犠死の際、腸管全体を縦方向に開き、１０％リン酸緩衝ホルムアルデヒド中で２４時間固定した後、５０％エタノール中で３日間エタノール固定した。マウスが受けた治療について知らされていない２名の独立した観察者による解剖顕微鏡下でのポリープの数および大きさの測定前に、０．１％メチレンブルー中で１分間の染色を行ない、ポリープのコントラストを増大させた。
【００９５】
シクロオキシゲナーゼ活性を、肝組織において記載（Ｒｅｕｔｅｒら，２００２；ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ２：１９）のようにしてエクスビボで評価した。簡単には、マウスを、ビヒクルまたは薬剤の最終投与の３時間後に安楽死させ、肝臓組織試料（約１００ｍｇ）を採取した。次いで試料を、１ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ７．４）を入れたマイクロ遠心分離管内に入れ、ハサミを用いて１５秒間細かく刻んだ。次いで、試料を振とう水浴中３７度で２０分間インキュベートした。インキュベーション期間後、試料を９０００×ｇで３０秒間遠心分離し、上清みを回収した。上清みを液体窒素中でフラッシュ凍結し、その後のプロスタグランジンＥ２含量測定のために−８０度で保存した。上清みを１：２０に希釈後、市場で入手可能な競合酵素免疫測定（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いてＰＧＥ２濃度の２重測定を行った。
【００９６】
実施例４
ＨＤＡＣ阻害剤は、コラーゲン誘導関節リウマチ（ＣＩＡ）の治療モデルにおいて臨床的重症度スコアを低減させる。
Ｃｏｘ−２は、炎症の過程において中心的であることが知られている（Ｄｕｂｏｉｓ  Ｒ．ら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １２，１０６３−１０７３（１９９８））。これは、炎症メディエータＴＮＦ−αによって速やかに上方調節され、ＣＯＸ酵素によって産生されるプロスタグランジンにより、免疫監視がさらに抑制される。したがって、ＣＯＸ酵素の阻害およびその後のプロスタグランジン産生の減少によって、最終的に炎症性症状の緩和がもたらされ、こうしてその緩和効果が利用される。しかしながら、これは、炎症過程の原因に対し効果的に作用するわけではない。近年では、むしろ炎症性疾患の原因療法の探求により、中心的炎症メディエータとしてのＴＮＦ−αを標的とした新規な治療が開発されている。
最近、ＨＤＡＣ阻害剤が抗炎症活性を示すことが見出された（ＨＤＡＣ阻害剤がＴＮＦ−αを含む炎症性サイトカインの発現を下方調節する図１もまた参照のこと）。したがって、ＨＤＡＣ阻害剤と抗炎症作用を有するＣｏｘ−阻害剤とを併用使用することが提案可能であり、炎症性疾患を治療する場合、付加的またはさらに相乗的な治療上の利益を得るために両方の阻害概念を組み合わせた新規な治療の選択肢が可能となる。ここで特に、上述のように、ＨＤＡＣ阻害剤の二重機構、すなわち、ＨＤＡＣ阻害活性およびＣｏｘ−２発現を下方調節することによりプロスタグランジンレベルを減少させる能力は、この仮定につながる。
【００９７】
ＨＤＡＣ阻害剤の可溶性ＴＮＦ−α分泌阻害能力をインビボで評価するため、３Ｈ１マウスの急性ＬＰＳ誘導型炎症モデルを使用した。マウスに、ＬＰＳのｉ．ｐ．注射の１時間前に、試験物質をｉ．ｐ．注射した。ＬＰＳ刺激の１時間後に血液試料を採取し、血清中のＴＮＦ−αレベルを、ＴＮＦ−αＥＬＩＳＡ免疫測定を用いて測定した。図６（下パネル）に示されるように、ＶＰＡおよびＧ２Ｍ−７０７による前治療の結果、対照マウスと比べ、絶対ＴＮＦ−α血清レベルの６０％低減がもたらされた。
【００９８】
この実験により、ＨＤＡＣ阻害剤が、インビボでＴＮＦ−αレベルの強力な阻害剤であり、Ｃｏｘ−２およびＴＮＦ−αレベルの低減に応答する炎症性疾患を治療するために使用できることは明白である。
【００９９】
詳細には、１マウス当り５０μｇのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）で炎症を誘導する１時間前に、ＶＰＡ（４００ｍｇ／ｋｇ／日、ｎ＝８）、Ｇ２Ｍ−７０１（１ｍｇ／マウス／日、ｎ＝４）、Ｇ２Ｍ−７０７（１ｍｇ／マウス／日、ｎ＝４）または２００μｌのＰＢＳ（対照、ｎ＝８）で、マウスを治療した。ＬＰＳ治療の１時間後、心臓穿刺によって血液を採取し、血清を単離した。血清を、Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ製ＴＮＦ−αサンドイッチＥＬＩＳＡモジュールを用いて試験した。この免疫測定は、製造業者のマニュアル記載の通りに行った。ＡＢＴＳを基質として使用し、測定は、波長４０５ｎｍの９６ウェルプレートリーダーを用いて行った。４０５ｎｍにおける絶対ＯＤレベルを示す。
【０１００】
治療用インビボ炎症モデルにおけるこのＨＤＡＣ阻害剤の抗炎症有効性を評価するために、ＶＰＡおよびＧ２Ｍ−７０７を、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）を発症したマウスに適用した。
【０１０１】
図６（上パネル）は、関節リウマチ（ＲＡ）のこのようなモデルにおけるＶＰＡまたはＧ２Ｍ−７０７での治療の結果を示す。いずれの薬剤も、対照群と比べて、臨床的重症度スコア（合計スコア）を効果的に低減し、その効果は治療過程を通じて維持された。ＲＡ用に臨床使用されるコルチコステロイド剤であるプレドニゾロンを、この研究における陽性対照として使用した。各データ点は、それぞれ、９匹（ＶＰＡ群）、８匹（Ｇ２Ｍ−７０７群）または４匹（プレドニゾロン群）の動物の平均を表す。Ｐ＜０．０５（２標本ｔ検定；対照対ＶＰＡ治療および対照対プレドニゾロン治療動物）。
【０１０２】
詳細には、この治療用ＣＩＡモデルでは、７週齢のＤＢＡ／１雌マウスを、１００μｇのニワトリＩＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）を用いてＣＦＡ中で免疫性を与えた。関節炎の発症は免疫付与の２１〜２８日後に始まり、６週後には発症率９３％に達した。重症度は中等度から高度であり、未治療動物で平均スコア１０．３（最大スコア１５）に達した。これらのマウスは、確立されたスコアリングシステムを用いて関節炎の徴候について毎日観察した。関節炎の徴候が最初に見られたとき、その罹患マウスをいずれかの治療群に割り当てた。これらマウスを１５日間、ビヒクル対照または２×４００ｍｇ／ｋｇ／日のＶＰＡのｉ．ｐ．または２×１ｍｇ／マウス／日のＧ２Ｍ−７０７のｉ．ｐ．または２×２０ｍｇ／ｋｇ／日のプレドニゾロンのｉ．ｐ．で治療した。関節炎の臨床的重症度をそれぞれの足の外観に基づいて評価し、０〜４の等級で主観的に評定した。それぞれの足のスコアを合計し、最大重症度スコアは１６となった。スコアリングシステムは次の通り、０：関節炎なし、１：足の発赤および指１〜２本の腫脹、２：足全体の軽度から中程度の腫脹、３：足全体の広範な腫脹、４：足全体の極度の腫脹および硬直の開始、とした。疾患の発症後、前記動物を週に３回ずつスコアリングした。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】ＨＤＡＣ阻害剤によるＣｏｘ−２発現の下方調節を示す図である。
【図２】ＨＤＡＣ阻害剤によるＣｏｘ−２発現の調節を種々の細胞型で示す図である。
【図３】ＨＤＡＣ阻害剤とＣｏｘ阻害剤との併用によるプロスタグランジンの下方調節を種々の細胞型で示す図である。
【図４】ＨＤＡＣ阻害剤とＣｏｘ阻害剤との併用によるプロスタグランジンの下方調節を種々の細胞型で示す図である。
【図５】ＨＤＡＣ阻害剤とＣｏｘ阻害剤との併用による腺腫数の低減およびプロスタグランジンの下方調節を示す図である。
【図６】ＶＰＡおよびＧ２Ｍ−７０７による治療の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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