(57)【要約】  アクネ菌を溶解することが可能な、そしてアクネ菌でない任意の細菌を溶解することが不可能なバクテリオファージであって、細菌中で溶原性を維持することが不可能なバクテリオファージが提供される。このようなバクテリオファージを含む薬学的組成物も提供される。
2009501018.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクネ菌（P. acnes）を溶解することが可能な、そしてアクネ菌でない任意の細菌を溶解することが不可能なバクテリオファージであって、細菌中で溶原性を維持することが不可能なバクテリオファージ。
【請求項２】
溶原性を維持するために必要な少なくとも１つの遺伝子を発現する能力を欠く、請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項３】
溶原性を維持するために必要な少なくとも１つの遺伝子の全部又は一部を欠くゲノムを有する、請求項２に記載のバクテリオファージ。
【請求項４】
溶原性を維持するファージの能力に影響を及ぼす非コード領域中の欠損を含むゲノムを有する、前記のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項５】
天然に存在する、前記のいずれか一項に記載の単離バクテリオファージ。
【請求項６】
アクネ菌の複数の菌株を溶解することが可能である、前記のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項７】
アクネ菌の少なくとも５菌株を溶解することが可能である、前記のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項８】
単離され、かつ、１０３６０９（寄託番号ＮＣＩＭＢ  ４１３５０）；１０３６７２（寄託番号ＮＣＩＭＢ  ４１３５１）；及び１８９４（寄託番号ＮＣＩＭＢ  ４１３４９）から選択される、前記のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項９】
寄託番号ＮＣＩＭＢ  ４１３４９で寄託されたバクテリオファージのゲノムと少なくとも８８％の配列同一性を有するゲノムを有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１０】
配列番号５のＤＮＡ配列を含むゲノム；配列番号５のＤＮＡ配列と少なくとも８８％の配列同一性を有するゲノム；又は配列番号５のＤＮＡ配列の機能的断片を含むゲノムを有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１１】
前記機能的断片が図４に示したオープンリーディングフレーム内から選択される、請求項１０に記載のバクテリオファージ。
【請求項１２】
前記機能的断片が配列番号８のＤＮＡ配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む、請求項１０に記載のバクテリオファージ。
【請求項１３】
前記機能的断片が配列番号８のＤＮＡ配列を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１４】
１８９４である、前記のいずれか一項に記載の単離バクテリオファージ。
【請求項１５】
寄託番号ＮＣＩＭＢ  ４１３５０で寄託されたバクテリオファージのゲノムと少なくとも８７％の配列同一性を有するゲノムを有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１６】
配列番号３のＤＮＡ配列を含むゲノム；配列番号３のＤＮＡ配列と少なくとも８７％の配列同一性を有するゲノム；又は配列番号３のＤＮＡ配列の機能的断片を含むゲノムを有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１７】
前記機能的断片が図２に示したオープンリーディングフレーム内から選択される、請求項１６に記載のバクテリオファージ。
【請求項１８】
前記機能的断片が配列番号６のＤＮＡ配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む、請求項１６に記載のバクテリオファージ。
【請求項１９】
前記機能的断片が配列番号６のＤＮＡ配列を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項２０】
１０３６０９である、請求項１〜８又は１５〜１９のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項２１】
寄託番号ＮＣＩＭＢ  ４１３５１で寄託されたバクテリオファージのゲノムと少なくとも８８％の配列同一性を有するゲノムを有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項２２】
配列番号４のＤＮＡ配列を含むゲノム；配列番号４のＤＮＡ配列と少なくとも８８％の配列同一性を有するゲノム；又は配列番号４のＤＮＡ配列の機能的断片を含むゲノムを有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項２３】
前記機能的断片が図３に示したオープンリーディングフレーム内から選択される、請求項２２に記載のバクテリオファージ。
【請求項２４】
前記機能的断片が配列番号７のＤＮＡ配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む、請求項２２に記載のバクテリオファージ。
【請求項２５】
前記機能的断片が配列番号７のＤＮＡ配列を含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項２６】
１０３６７２である、請求項１〜８又は２１〜２５のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項２７】
配列番号９のＤＮＡ配列を含まないゲノムを有する、前記のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項２８】
配列番号１０のＤＮＡ配列を含まないゲノムを有する、前記のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項２９】
配列番号１１のＤＮＡ配列を含まないゲノムを有する、前記のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項３０】
配列番号１２のＤＮＡ配列を含まないゲノムを有する、前記のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項３１】
配列番号１３のＤＮＡ配列を含まないゲノムを有する、前記１〜３０のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項３２】
マーカー分子を含むように改変された、前記のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項３３】
前記のいずれか一項に記載のバクテリオファージのゲノムのヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド。
【請求項３４】
配列番号３のヌクレオチド配列；又は配列番号３のＤＮＡ配列の機能的断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、該単離ポリヌクレオチドを含むバクテリオファージが請求項１〜７のいずれか一項に記載のバクテリオファージである単離ポリヌクレオチド。
【請求項３５】
配列番号３のＤＮＡ配列と少なくとも８７％の配列同一性を有する単離ポリヌクレオチドであって、該単離ポリヌクレオチドを含むバクテリオファージが請求項１〜７のいずれか一項に記載のバクテリオファージである単離ポリペプチド。
【請求項３６】
前記機能的断片が図２に示したオープンリーディングフレーム内から選択される、請求項３４に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３７】
前記機能的断片が配列番号６のＤＮＡ配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む、請求項３４に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３８】
前記機能的断片が配列番号６のＤＮＡ配列を含む、請求項３６又は３７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３９】
配列番号４のヌクレオチド配列；又は配列番号４のＤＮＡ配列の機能的断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、該単離ポリヌクレオチドを含むバクテリオファージが、請求項１〜７のいずれか一項に記載のバクテリオファージである単離ポリヌクレオチド。
【請求項４０】
配列番号４のＤＮＡ配列と少なくとも８８％の配列同一性を有する単離ポリヌクレオチドであって、該単離ポリヌクレオチドを含むバクテリオファージが、請求項１〜７のいずれか一項に記載のバクテリオファージである単離ポリヌクレオチド。
【請求項４１】
前記機能的断片が図３に示したオープンリーディングフレーム内から選択される、請求項３９に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４２】
前記機能的断片が配列番号７のＤＮＡ配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む、請求項３９に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４３】
前記機能的断片が配列番号７のＤＮＡ配列を含む、請求項４１又は４２に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４４】
配列番号５のヌクレオチド配列；又は配列番号５のＤＮＡ配列の機能的断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、該単離ポリヌクレオチドを含むバクテリオファージが請求項１〜７のいずれか一項に記載のバクテリオファージである単離ポリヌクレオチド。
【請求項４５】
配列番号５のＤＮＡ配列と少なくとも８８％の配列同一性を有する単離ポリヌクレオチドであって、該単離ポリヌクレオチドを含むバクテリオファージが請求項１〜７のいずれか一項に記載のバクテリオファージである単離ポリヌクレオチド。
【請求項４６】
前記機能的断片が図４に示したオープンリーディングフレーム内から選択される、請求
項４４に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４７】
前記機能的断片が配列番号８のＤＮＡ配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む、請求項４４に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４８】
前記機能的断片が配列番号８のＤＮＡ配列を含む、請求項４６又は４７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４９】
配列番号９の配列を含まない核酸配列を有する、請求項３３〜４８のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５０】
配列番号１０の配列を含まない核酸配列を有する、請求項３３〜４９のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５１】
配列番号１１の配列を含まない核酸配列を有する、請求項３３〜５０のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５２】
配列番号１２の配列を含まない核酸配列を有する、請求項３３〜５１のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５３】
配列番号１３の配列を含まない核酸配列を有する、請求項３３〜５２のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５４】
請求項３３〜５３のいずれか一項で定義される単離ポリヌクレオチドの配列と相補的である核酸配列を有する単離ポリヌクレオチド。
【請求項５５】
請求項３３〜５４のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド、及びマーカー分子をコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項５６】
請求項３３〜５５のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド。
【請求項５７】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の少なくとも１つのバクテリオファージ及びアジュバント、担体又はビヒクルを含む組成物。
【請求項５８】
２つ以上の異なるバクテリオファージを含む、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
前記２つ以上の異なるバクテリオファージの各々が請求項１〜３２のいずれか一項に記載のバクテリオファージである、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
請求項３３〜５５のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド及び／又は請求項５６に記載の単離ポリペプチド、並びにアジュバント、担体又はビヒクルを含む組成物。
【請求項６１】
経口投与、静脈内投与又は局所投与に適した形態である、請求項５７〜６０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６２】
抗生物質、抗にきび薬、抗アクネ菌薬、抗炎症薬及び抗脂漏薬から選択される少なくとも１つのさらなる作用物質をさらに含む、請求項５７〜６１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６３】
にきびの予防又は治療に用いるための請求項５７〜６２のいずれか一項に記載の組成物であって、少なくとも１つのバクテリオファージの各々が有効量で存在する、請求項５７〜６２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６４】
にきびの予防又は治療に用いるための請求項５７〜６３のいずれか一項に記載の組成物であって、前記単離ポリヌクレオチド及び／又は前記単離ポリペプチドが有効量で存在する組成物。
【請求項６５】
にきびの予防又は治療のための薬剤の調製における請求項１〜３２のいずれか一項に記載の少なくとも１つのバクテリオファージの使用。
【請求項６６】
前記薬剤が２つ以上の異なるバクテリオファージを含む、請求項６５に記載の使用。
【請求項６７】
前記２つ以上のバクテリオファージの各々が請求項１〜３２のいずれか一項に記載のバクテリオファージである、請求項６６に記載の使用。
【請求項６８】
にきびの予防又は治療のための薬剤の調製における請求項３３〜５５のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド及び／又は請求項５６に記載の単離ポリペプチドの使用。
【請求項６９】
前記薬剤が経口投与、静脈内投与又は局所投与に適した形態である、請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７０】
前記薬剤が抗生物質、抗にきび薬、抗アクネ菌薬、抗炎症薬及び抗脂漏薬から選択される少なくとも１つのさらなる作用物質を含む、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７１】
にきびを予防又は治療する方法であって、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の有効量の少なくとも１つのバクテリオファージをこのような予防又は治療を必要とする個体に投与することを包含する方法。
【請求項７２】
にきびを予防又は治療する方法であって、請求項３３〜５５のいずれか一項に記載の有効量の単離ポリヌクレオチド及び／又は請求項５６に記載の単離ポリペプチド、及び／又は請求項５７〜６４のいずれか一項に記載の組成物をこのような予防又は治療を必要とする個体に投与することを包含する方法。
【請求項７３】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の有効量の少なくとも１つのバクテリオファージを個体に投与することを包含する個体の外観を改善する方法。
【請求項７４】
請求項３３〜５５のいずれか一項に記載の有効量の単離ポリヌクレオチド及び／又は請求項５６に記載の単離ポリペプチド、及び／又は請求項５７〜６４のいずれか一項に記載の組成物を個体に投与することを包含する、個体の外観を改善する方法。
【請求項７５】
前記個体がヒト個体である、請求項７１〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
アクネ菌を溶解することが可能な、そしてアクネ菌でない任意の細菌を溶解することが不可能な、そして細菌中で溶原性を維持することが不可能なバクテリオファージを単離する方法であって、
ａ）皮膚表面から細菌の試料を取得すること、
ｂ）プロピオニバクテリアを溶解するバクテリオファージを前記試料から単離すること、
ｃ）前記バクテリオファージを試験して、該バクテリオファージが少なくとも１つのアクネ菌株を溶解することが可能か否かを判定すること、
ｄ）前記バクテリオファージを試験して、該バクテリオファージが非アクネ菌株を溶解することが可能か否かを判定すること、
ｅ）前記バクテリオファージを試験して、該バクテリオファージがアクネ菌株中で溶原性を維持することが可能か否かを判定すること、及び
ｆ）工程（ｃ）、工程（ｄ）及び工程（ｅ）においてアクネ菌を溶解することが可能であり、そしてアクネ菌でない任意の細菌を溶解することが不可能であり、そして細菌中で溶原性を維持することが不可能であることが示されたバクテリオファージを単離することを包含する方法。
【請求項７７】
アクネ菌を溶解することが可能な、アクネ菌でない任意の細菌を溶解することが不可能な、そして細菌中で溶原性を維持することが不可能なバクテリオファージを同定する方法であって、
ａ）アクネ菌を前記バクテリオファージに曝露し、且つ、前記細菌が溶解されることを決定すること、
ｂ）アクネ菌でない細菌のうちの少なくとも３つの異なる種を前記バクテリオファージに曝露し、且つ、前記細菌が溶解されないことを決定すること、及び
ｃ）前記バクテリオファージが細菌中で溶原性を維持することが不可能であることを決定すること
を包含する方法。
【請求項７８】
請求項７６又は７７に記載の方法を用いて単離されるか又は同定されるバクテリオファージ。
【請求項７９】
請求項７６又は７７に記載の方法を用いて取得可能であるか又は同定可能であるバクテリオファージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バクテリオファージ及びその使用に関する。特に、本発明はにきびの治療のための組成物中でのその使用に関するが、これに限定されるわけではない。
【背景技術】
【０００２】
にきび（Acne Vulgaris）は、皮膚の最も一般的な疾患の１つであり、そして極端に外観を損なう場合は、時として、若者の人格発達に関する深刻な結果を有し、結果として、社会的及び経済的問題を生じる。にきびに罹患した青年は、にきびに罹患していない人と比較して、より高レベルの不安、より大きな社会的抑制、並びに攻撃増大を示す。皮膚疾患の中で、にきびは自殺の原因の第二位である。
【０００３】
にきびは専らヒトの疾患であり、顔面、胸部及び背中のヒト皮脂濾胞の独特の状態である。自発的退行が一般的で、完治まで約１５年を要する。しかしながら症例の約５％において、にきびは２５歳を過ぎても存続し、４０及び５０代まで及ぶ。症候が早く始まるほど、疾患の経過は重症になる。疾患の罹患は男性と女性とでの如何なる選択も反映しないが、通常、経過は男性において、より重症である。
【０００４】
個体における疾患の開始は思春期に入るのと一致し、そして皮脂分泌率におけるアンドロゲン駆動性上昇及びアクネ菌（プロピオニバクテリウム・アクネ（Propionibacterium acnes（P. acnes)）による皮脂濾胞のコロニー形成増大と関連する。近年のデータは、個体病変の開始は、ケラチン生成細胞の過剰増殖によるというよりむしろ、主に炎症性である、ということを示す。
【０００５】
一般的意見とは反対に、衛生状態及び食生活は、にきびの病因にほとんど又は全く影響を及ぼさない。にきびは、摩擦（生地素材によって引き起こされるにきび（acne mechanica））（Shalita AR (1983) Cosmetics and Toiletries 98: 57-60）及び毛穴目詰まり化粧品（化粧品によるにきび（acne cosmetica））（Mills O.H. & Kilgman A.M. (1988) Dermatol. Clin. 1: 365-370）のような外部因子により悪化され得る。アクネ菌はヒト皮膚の定住菌であり、天然皮膚フローラの主要部分を構成する。疾患の主要因子としてのアクネ菌に関連した多数の状況証拠がある；アクネ菌による皮膚のコロニー形成増大は疾患の開始と関連する；重症にきびを有する患者は正常個体より有意にアクネ菌に対して感作される；患者の全体的免疫学的状態は、同一年齢のにきびに罹患していない個体と比較して、高められる；上首尾の抗生物質治療は、皮膚上のアクネ菌の密度を低減する；そして抗生物質療法の失敗は、患者の皮膚上の抗生物質耐性アクネ菌の存在に関連する。
【０００６】
にきびに関する最新治療は、疾患に寄与する種々の因子に集中している。要するに、抗にきび治療としては、レチノイド及びアゼライン酸（局所治療）及びイソトレチノイン（経口治療）が挙げられる；抗アクネ菌治療としては、ベンゾイルペルオキシド、アゼライン酸、エリスロマイシン、テトラサイクリン、並びにクリンダマイシン（局所治療）及びテトラサイクリン、エリスロマイシン、ミノサイクリン及びトリメトプリム（経口治療）が挙げられる；そして抗炎症治療としては、テトラサイクリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン及びニコチンアミド（局所治療）、並びにテトラサイクリン、ミノサイクリン、トリメトプリム及びイソトレチノイン（経口治療）が挙げられる；そして抗脂漏治療としては、スピロノラクトン（局所治療）、並びにダイアネット（商標）及びイソトレチノイン（経口治療）が挙げられる。
【０００７】
にきびのより一般的な軽症及び中等度症例は、通常は局所的に、抗生物質で治療される
。にきびに対する抗生物質の使用を上回って出現する問題が漸増しているが、この場合、治療は長期間、いくつかの症例では２〜３年まで継続する。問題は２つに分けられる。第一に、にきび療法に関するそれらの効能低減という結果を伴う世界的な抗生物質耐性アクネ菌の出現である。第二のそしておそらくはより重要なのは、患者の皮膚上の片利共生的ミクロフローラ、主にコアグラーゼ陰性ブドウ球菌及びコリネバクテリアにおける抗生物質耐性遺伝子プール漸増の選択である。これらの耐性遺伝子は、関連種、例えば黄色ブドウ球菌（これは病院及び共同体環境における主要な日和見病原体である）に水平移動され得る。したがってにきびの治療に用いられる場合、延長された治療期間に亘って抗生物質の使用を制限するあらゆる努力が必要とされる。にきびのための抗生物質療法を売り込むための認可を得ることは、特に困難になってきている。
【０００８】
これらの治療からの副作用は、ありふれている。軽症刺激性皮膚炎は、事実上すべての局所療法と関連する（Cunliffe W.J., (2001) Pharmaceut. J. 267: 749-752）。抗生物質の経口経過は、それらが処方される状態にかかわらず副作用を有し、これらはしばしば特異性の欠如に起因しており、身体の多数の部位における細菌フローラの多くを（後日）不均衡にする。これは、耐性フローラが繁殖する空間を後に残し、その結果、例えば女性における膣カンジダ症を引き起こす。レチノイド治療は、多数の副作用を有する：それは催奇物質であり；口唇炎、顔面皮膚炎及び結膜炎を引き起こし；二次皮膚感染をもたらし；そして気分変動及びうつ病に関連した。
【０００９】
したがって、アクネ菌を特異的に標的にするにきび療法のための新規の手法を開発する必要がある。
【００１０】
細菌性疾患の治療又は予防のためにバクテリオファージ（天然細菌ウイルス）を用いるという考え方は、１９１７年にFelix d'Herelleにより、ファージ（「バクテリオファージ」及び「ファージ」という単語は、この明細書全体を通して互換的に用いられる）の発見後、比較的直ぐに実現された。バクテリオファージが細菌宿主に特異的に感染し、迅速にそれを殺害し得るという事実は、これがヒトにおける細菌感染を制御する潜在的に非常に有効な方法である、ということがd'Herelleに示唆された（再検討のためには、"Felix d'Herelle and the Origins of Molecular Biology" William C. Summers (Yale University Press, ISBN 0-300-07127-2)参照）。この可能性は、抗生物質時代の到来のため、決して十分には実現されなかったが、ファージ療法は、それ以来、ソビエト連邦及び東欧の旧国家において、多くの症例で上首尾に遂行されてきた。
【００１１】
薬剤耐性の出現、並びに新規抗生物質開発及び新規ワクチン開発の困難は、治療の代替的方法を見出す必要性が高まっていることを目立たせている。
【００１２】
国際公開番号ＷＯ０３／０８０８２３は、溶原バクテリオファージを突然変異化し、そしてファージのカクテルを産生することにより療法に用いるための候補バクテリオファージを生成する方法を開示する。この開示は、溶原性ファージを特異的に選択し、何らかの細菌に関して、それらが溶菌ファージより多数であり、したがって単離がより容易である、ということを述べている。次に、以下でさらに考察されるように、療法としての溶原性ファージに関連した問題を回避するために、ファージは溶菌性ｖｉｒ突然変異体を産生するように突然変異化されなければならない。アクネ菌の取り扱いが記述されている。
【００１３】
欧州特許第０４１４３０４号は、細菌、例えばアクネ菌を殺菌するためのバクテリオファージの使用に関する。アクネ菌の多菌株を溶解することが可能な、そしてさらにアクネ菌でない細菌を溶解することが不可能な、そして細菌中で溶原性を維持することが不可能なバクテリオファージについての開示はない。
【００１４】
Jong等（Med. Microbiol. Immunol. 161 (1975) 263-271）は、アクネ菌ファージの単離を記載する。該論文は、ファージの分類に集中し、アクネ菌の多菌株を溶解することが可能な、そしてさらにアクネ菌でない細菌を溶解することが不可能な、そして細菌中で溶原性を維持することが不可能なバクテリオファージについて開示していない。
【００１５】
Puhvel & Reisner（Amer. Soc. Microbiol. 72 (1972) V201）は、アクネ菌の溶原性ファージ耐性菌株の生成に関する要約である。
【００１６】
国際公開番号ＷＯ０１／５１０６６は、特に免疫無防備状態患者における、感染又は敗血症の危険を低減するためのバクテリオファージの使用に関する。この開示された方法は、免疫無防備状態患者において疾患を引き起こすそれらの機会を低減するために、身体の天然細菌フローラの種々の成員の数的低減又は排除を達成することを目指す。これは、治癒というより特異的な危険の低減であり、特に、ある種の癌、ＡＩＤＳ及び嚢胞性繊維症のような症状を悪化させ、また、移植患者の状態を悪化させる感染に関する。アクネ菌の治療についての記述はなされていない。
【００１７】
米国特許第６１２１０３６号は、少なくとも２つのファージを含有する精製宿主特異的非毒性広宿主範囲バクテリオファージ調製物に関する。当該文献は、有効的なファージ療法の特徴のうちのいくつか（即ちそれは、安全であり、広範な宿主範囲を有し、そして大部分の細菌株を殺菌すべきである）を記載し、そして適切なファージのこのような調製物を用いて、アクネ菌感染を治療し得た、ということを示す。しかしながら、ファージがこの目的に適切であるか否か、或いはこのような安全な、溶菌性の、広範な宿主範囲のファージがアクネ菌のために存在することについての開示はなされていない。
【００１８】
国際公開番号ＷＯ０２／０７７４２は、異なる宿主特異性を有する別のファージからのテイル（tail：尾部）タンパク質コード遺伝子をクローニングすることにより、ファージに関するより広い宿主範囲を強化する方法を開示することを意図としている。当該文献は、ファージ療法の見地から広範な特異性が望ましいということを示すが、天然ファージ変異体から選択するというよりむしろ、二重のテイルファイバー型を有する、したがって対応する二重宿主特異性を有するハイブリッドバクテリオファージの合成構築物を記載している。この特異性は、仮定的に、異なる種菌株だけでなく、一種内のそして異なる属内でも異なる細菌に感染する可能性があるファージの工学処理に本発明を適用するように拡大される。しかしながら、大腸菌の２つの異なる菌株に感染する能力を有するハイブリッドファージが作製された、ということを示す結果を超える、この可能性に関する証拠はない。ヒトにおける遺伝子療法のために適切に修飾されたファージの適用も意図される。にきびの治療のための特定ファージ（修飾又は非修飾の）は開示されていない。単一宿主種特異性を有するが、多菌株特異性を有するアクネ菌バクテリオファージについての記述はない。
【００１９】
米国特許公開番号２００５／００３２０３６は、特にシュードモナス（Pseudomonas）及びブドウ球菌株についての言及において、広宿主範囲感染及び溶解を最適化するために、ファージコレクションにより分類し、そしてファージカクテルの組成を確定する方法を記載している。にきびファージ療法の分野に関連した開示はなされていない。
【００２０】
国際公開番号ＷＯ２００５／００９４５１は、特に緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）感染の治療における、そして特にバイオフィルム内の細菌の治療における、特に伝統的化学抗生物質との組合せ療法の一部としてのバクテリオファージの使用に関する。それは、任意の所定の感染の治療のための療法的価値を有するのに十分に広い宿主特異性を有するファージを見出すことの難しさを記載しており、同時的であれ、別々であれ、逐次的であれ、療法のための多バクテリオファージ型の使用を主張している。当該文献はまた、より
広範な特異性又はより大きな感染能力を有するファージを産生するための遺伝子操作法により、ファージにおけるより大きな毒性が人工的に誘導され得る、ということも示す。バイオフィルム形成を特徴としないアクネ菌についての記述はない。
【００２１】
米国特許公開番号２００４／０２４１８２５は、バクテリオファージを遺伝子標識し（例えばＰＣＲにより検出されて、ファージの同定を可能にし得るＤＮＡの非機能的伸長による）、非交差反応バクテリオファージを同定する（標的宿主に対するファージを単離し、そしてこれから、非病原性、非標的宿主の５％より多くに感染しないバクテリオファージを単離するための多段階プロセス）ためのいくつかの方法、及び、最後に、宿主細菌による遺伝子修飾に対して耐性であるファージを選択するための方法（バクテリオファージの一試料で細菌に感染し、子孫ファージを単離し、元のバクテリオファージと子孫の制限消化パターンを比較して、遺伝子修飾を示す任意の差異を同定することを包含する）を開示している。この開示中に包含されるのは、一療法に用いるのに適した候補バクテリオファージを同定するに際しての難しさである。アクネ菌へのこの方法の応用は記載されていない。
【００２２】
セントラルコネチカット州立大学のMichael Davisの研究グループによるいくつかの会議の発表は、広宿主範囲特異性を有する溶菌性ファージを同定するための計画を略記している（Vieira T. and Davis M.A. (1999) Viruses as Therapeutic Agents for Treating
Bacterial Infections. Poster presentation on April 24, 1999 at the 53rd Annual Eastern Colleges Science Conference, Sacred Heart University, Fairfield CT；Jedrzkiewicz B. and Davis M.A. (2000) Combating the Antibiotic Resistance Crisis: Therapeutic Use of Bacteriophages (Viruses) for Treating Acne, A Bacterial Disease. Poster presentation on April 1, 2000 at the 54th Annual Eastern Colleges Science Conference, Wagner College, Staten Island NY；Hany C. et al., (2001) The Use of Bacteriophage to Treat Acne, A Bacterial Disease. Poster presentation on March 31, 2001 at the 55th Annual Eastern Colleges Science Conference, Wilkes University, Wilkes-Barre PA；Armack S. et al. (2002) Bacteriophage Therapy For The Treatment Of The Bacterial Disease Acne. Poster presentation on April 27, 2002 at the 56th Annual Eastern Colleges Science Conference, Niagara University, Niagara NY；Aminti K. et al. (2003) Bacteriophage Therapy For The Disease Acne: Identification And Purification Of Candidate Bacteriophage. Poster presentation on April
12, 2003 at the 57th Annual Eastern Colleges Science Conference, Ithaca College, Ithaca NY；Geronimo J. et al (2004) Bacteriophage Therapy For the Skin Disease
Acne. Poster presentation on April 2, 2004 at the 58th Annual Eastern Colleges Science Conference, Manhattan College, Riverdale NY）。このようなファージの特異的特性に、又は特異的ファージ単離物に関連した開示はなされていない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明の第一の態様によれば、アクネ菌を溶解することが可能な、そしてアクネ菌でない任意の細菌を溶解することが不可能な、並びに細菌中で溶原性を維持することが不可能なバクテリオファージが提供される。
【００２４】
このようなファージは、１つの種内の広範囲の細菌株に感染する能力を有するが、絶対的種特異性を有する。これは、有効的なファージ療法の開発における最も重要な、そして通常は達成不可能な目標の１つである。さらに、本発明によるバクテリオファージは純粋に溶菌性であり、即ち、静止期にはバクテリオファージ生活環の溶原期に入ることができない。バクテリオファージの溶原期は有効的な療法の作成においては望ましくなく、そして調節的観点からも許容可能でない。
【００２５】
有益には、このようなバクテリオファージは、にきびの治療に用いられ得る。全身的に送達されるか、経口的か又は局所的に送達されるかにかかわらず、ファージ療法の使用において、副作用は報告されていないし、又は予測されない。バクテリオファージはアクネ菌に対して特異的であり、したがって影響を受けていない皮膚フローラの他の成員を残して、潜在的に有害なフローラの過剰増殖の機会を低減する。したがって正常常在ミクロフローラの防御性は保持される。にきびの治療へのファージ療法手法の特異性は、ミクロフローラの他の成員に現れる薬剤耐性の可能性も排除する。他の抗菌治療は、細菌を排除する広範な筆触（brush stroke）手法を提供し、したがって適切な条件下で、アクネ菌においてだけでなく、病原性能力を有するその他の重要な共生生物、例えば黄色ブドウ球菌においても薬剤耐性を発現する機会を提供する。バクテリオファージ治療のさらなる利点は、それが自己調節性であるという点であり、宿主アクネ菌細胞の集団が減少するにつれ、バクテリオファージ数は低減する。さらに、このようなバクテリオファージは一般的な予防手段として用いられる。非処方化粧品（例えば洗顔料等）中の抗生物質の使用は、安全性及び抗生物質耐性の問題に関する多くの理由のために望ましくない。実際、耐性の発生を低減するための抗生物質の使用を制限するための強力な議論が存在する。バクテリオファージの特異性は、それがこれらの状況に広範に用いるのに適しており、そしてにきびの予防のための一般的な衛生状態の常套手段の一部として用いられ得るということを意味する。さらに、バクテリオファージの使用は、抗生物質に対して耐性になった細菌株に対してさえ有効であり得る。
【００２６】
上記のように、アクネ菌を溶解することが可能であるが、溶原性を維持することが不可能なバクテリオファージの使用は、バクテリオファージが細菌内で休眠中であり得ないという利点を有し、細菌を溶解し、それゆえ細菌を死滅させるに違いない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
好ましくはバクテリオファージは、溶原性を維持するために必要な少なくとも１つの遺伝子を発現する能力を欠く。「発現する能力を欠く」という用語は、例えば１つ又は複数の点突然変異或いはゲノムの全体的又は部分的欠失の結果として、バクテリオファージが溶原性を維持するために必要な十分に機能的なタンパク質産物を産生する能力を欠くということを示すように意図される。さらに好ましくはファージは、溶原性を維持するために必要な少なくとも１つの遺伝子の全部又は一部を欠くゲノムを有する。代替的には、又は付加的には、ファージは、それにもかかわらず、溶原性を維持するファージの能力に影響を及ぼし得る非コード領域におけるゲノムに欠陥（例えば突然変異、挿入又は欠失）をもち、これらは例えばゲノム組込み部位（一箇所又は複数個所）（例えば／ａｔｔ／部位）における、又はレプレッサー結合部位における欠陥で有り得る。ファージは、好ましくは天然であり、そして単離され、人工突然変異がバクテリオファージに導入される必要がないという付加的利点を有する。このような突然変異は、除外される一方、バクテリオファージが投与される個体に有害であり得る潜在的に未知の結果を有し得る。ファージが人工突然変異を含有するか、又はそうでなければ天然でない場合、ファージは単離状態で得られることがさらに好ましい。
【００２８】
好ましい実施形態では、本発明のこの態様によるバクテリオファージは、アクネ菌の複数の菌株を溶解することが可能である。例えば本発明のこの態様によるバクテリオファージは、アクネ菌の５菌株、好ましくは少なくとも１０菌株、さらに好ましくは少なくとも１６菌株又は少なくとも１７菌株、又は少なくとも１８菌株、又は少なくとも１９菌株、又は少なくとも２０菌株を溶解し得ることが可能である。最も好ましくは、バクテリオファージは少なくとも２１菌株を溶解することが可能である。
【００２９】
好ましくは、本発明のこの態様によるバクテリオファージは、単離され、本明細書中に
後述されるように特徴付けられるファージから選択される：１０３６０９；１０３６７２及び１８９４。
【００３０】
バクテリオファージの以下の単離物は、ブダペスト条約の条項下で、産業、海洋、及び食品の細菌の国立コレクション（The National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria）（ＮＣＩＭＢ）（Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, United Kingdom）に、以下の寄託番号で寄託されている：寄託番号ＮＣＩＭＢ  ４１３３２（単離物ＰＡ６）；寄託番号ＮＣＩＭＢ  ４１３３４（単離物１８７４）；寄託番号ＮＣＩＭＢ  ４１３３３（単離物１８７８）；寄託番号ＮＣＩＭＢ  ４１３３５（単離物１９０５）；寄託番号ＮＣＩＭＢ  ４１３４９（単離物１８９４）；寄託番号ＮＣＩＭＢ  ４１３５０（単離物１０３６０９）；寄託番号ＮＣＩＭＢ  ４１３５１（単離物１０３６７２）。宿主細菌アクネ菌ＡＴ１も、ＮＣＩＭＢ  ４１３３６として寄託された。
【００３１】
バクテリオファージは、配列番号３のＤＮＡ配列を含むゲノム、又は配列番号３のＤＮＡ配列と少なくとも８７％の配列同一性、さらに好ましくはその配列と少なくとも８８％の配列同一性、さらに好ましくはその配列と少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくはその配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するゲノムを有し得る。代替的には又はさらに、バクテリオファージは、配列番号３のＤＮＡ配列の機能的断片を含むゲノムを有し得る。例えば機能的断片は、図２に示したオープンリーディングフレーム内から選択され得る。代替的には、機能的断片は、図６のＤＮＡ配列と少なくとも９５％の配列同一性、好ましくはその配列と少なくとも９６％の配列同一性、さらに好ましくはその配列と少なくとも９７％の配列同一性、最も好ましくはその配列と少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含み得る。好ましい一実施形態では、機能的断片は、図６のＤＮＡ配列を含む。
【００３２】
代替的には、バクテリオファージは、配列番号４のＤＮＡ配列を含むゲノム、又は配列番号４のＤＮＡ配列と少なくとも８８％の配列同一性、さらに好ましくはその配列と少なくとも８９％の配列同一性、さらに好ましくはその配列と少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくはその配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するゲノムを有し得る。代替的には又はさらに、バクテリオファージは、配列番号４のＤＮＡ配列の機能的断片を含むゲノムを有し得る。例えば機能的断片は、図３に示したオープンリーディングフレーム内から選択され得る。代替的には、機能的断片は、配列番号７のＤＮＡ配列と少なくとも９５％の配列同一性、好ましくはその配列と少なくとも９６％の配列同一性、さらに好ましくはその配列と少なくとも９７％の配列同一性、最も好ましくはその配列と少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含み得る。好ましい一実施形態では、機能的断片は、配列番号７のＤＮＡ配列を含む。
【００３３】
さらなる代替物では、バクテリオファージは、配列番号５のＤＮＡ配列を含むゲノム、又は配列番号５のＤＮＡ配列と少なくとも８８％の配列同一性、さらに好ましくはその配列と少なくとも８９％の配列同一性、さらに好ましくはその配列と少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくはその配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するゲノムを有し得る。代替的には又はさらに、バクテリオファージは、配列番号５のＤＮＡ配列の機能的断片を含むゲノムを有し得る。例えば機能的断片は、図４に示したオープンリーディングフレーム内から選択され得る。代替的には、機能的断片は、配列番号８のＤＮＡ配列と少なくとも９５％の配列同一性、好ましくはその配列と少なくとも９６％の配列同一性、さらに好ましくはその配列と少なくとも９７％の配列同一性、最も好ましくはその配列と少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含み得る。好ましい一実施形態では、機能的断片は、配列番号８のＤＮＡ配
列を含む。
【００３４】
代替的には、又は付加的には、機能的断片は、
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ１と少なくとも６３％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ２と少なくとも９１％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ３と少なくとも９１％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ４と少なくとも９１％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ５と少なくとも８９％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ６と少なくとも９２％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ７と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ８と少なくとも９４％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ９と少なくとも９５％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ１０と少なくとも９１％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ１１と少なくとも９３％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ１２と少なくとも９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ１３と少なくとも９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ１４と少なくとも９１％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ１５と少なくとも９３％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ１６と少なくとも９４％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ１７と少なくとも９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ１８と少なくとも６７％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ１９と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ２０と少なくとも８８％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ２１と少なくとも８６％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ２２と少なくとも９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ２３と少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ２４と少なくとも９３％、９５％又
は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ２５と少なくとも８７％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ２６と少なくとも６３％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ２７と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ２８と少なくとも７８％、８０％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ２９と少なくとも６６％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；及び／又は
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ３０と少なくとも８７％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列
のうちの１つ又は複数のＤＮＡ配列を含み得る。
【００３５】
好ましくは機能的断片は、配列番号３、配列番号４及び配列番号５のすべての間に保存されるＤＮＡ配列を含む。
【００３６】
バクテリオファージは、寄託番号ＮＣＩＭＢ  ４１３４９で寄託されたバクテリオファージのゲノムと少なくとも８８％の配列同一性、好ましくは少なくとも８９％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するゲノムを有し得る。
【００３７】
バクテリオファージは、寄託番号ＮＣＩＭＢ  ４１３５０で寄託されたバクテリオファージのゲノムと少なくとも８７％の配列同一性、好ましくは少なくとも８８％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するゲノムを有し得る。
【００３８】
バクテリオファージは、寄託番号ＮＣＩＭＢ  ４１３５１で寄託されたバクテリオファージのゲノムと少なくとも８８％の配列同一性、好ましくは少なくとも８９％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するゲノムを有し得る。
【００３９】
「配列同一性」という用語は、本明細書中で用いる場合、２つの配列の大きい方にも見出され得るものと比較される２つの配列の小さい方に存在するヌクレオチドのパーセンテージとして算定され、ヌクレオチドは、好ましくは、両配列中で同一順序で整列される。例えばデフォルトのパラメーター設定を用いて、Ｂｌａｓｔ分析ツール（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）の使用により、配列間の配列同一性のレベルを当業者は容易に確定し得る。好ましくは比較されている２つの配列の短い方の長さは、２つの配列の長い方の長さの少なくとも６０％、さらに好ましくはその長さの少なくとも７０％、さらに好ましくはその長さの少なくとも８０％、さらに好ましくはその長さの少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。最も好ましい実施形態では、比較される配列は同一長である。
【００４０】
「機能的断片」という用語は、本明細書中で用いる場合、全長配列自体と実質的に同一の機能性を有する全長配列の一部分を示す。例えば、バクテリオファージゲノムの機能的断片が参照される場合、これは、断片が、バクテリオファージ中に含有されると、本発明によるバクテリオファージ、即ちアクネ菌を溶解することが可能な、そしてアクネ菌でない任意の細菌を溶解することが不可能なバクテリオファージであって、細菌中で溶原性を維持することが不可能なバクテリオファージを生じるということを示す。好ましくは機能
的断片のサイズは、全長配列のサイズの少なくとも３０％、さらに好ましくはそのサイズの少なくとも４０％、さらに好ましくはそのサイズの少なくとも５０％、さらに好ましくはそのサイズの少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％である。
【００４１】
好ましい一実施形態では、バクテリオファージは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３で示されるヌクレオチド配列のうちの１つ又は複数を含まないゲノムを有する。理論に束縛されるものではないが、本発明によるバクテリオファージの特性（即ちバクテリオファージはアクネ菌を溶解することが可能であり、そしてアクネ菌でない任意の細菌を溶解することが不可能であり、そして細菌中で溶原性を維持することが不可能である）は、バクテリオファージのゲノム由来のこれらの配列のうちの１つ又は複数が存在しないことに関連し得る。
【００４２】
好ましくはバクテリオファージは単離され、そして１０３６０９、１０３６７２及び１８９４として特徴付けられる本明細書中のものから選択される。
【００４３】
本発明の第一の態様によるバクテリオファージは、マーカー分子を含むように修飾され得る。「マーカー分子」という用語は、本明細書中で用いる場合、ビオチン、ｈｉｓ−タグ又は、例えばバクテリオファージを単離するために使用可能な抗体のように結合相手により認識可能な標識と言ったマーカー又はタグを包含するよう意図されるがこれらに限定されない。アフィニティー精製法に用いるのに適したマーカーとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、ＳｃＦｖ及びレクチンが挙げられる。バクテリオファージの他の修飾は、例えばＰＥＧ（ポリエチレングリコール）接合体又はポリシアル酸接合体の使用を含めた、ファージの抗原性を低減するために為され得る。修飾は、細菌宿主に対するファージの致死性を増強する分子の付加も包含する。例は、Westwater C. et al. (2003)（Antimicrob. Agents Chemotherapeutics 47: 1301-1307）で与えられている。その他の適切なマーカー及び修飾は、当業者に既知である。マーカー分子はＤＮＡレベルで組み込まれ得るか、又はファージ表面に化学的に付着され得る。
【００４４】
本発明の第二の態様によれば、本発明の第一の態様によるバクテリオファージのゲノムのヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチドが提供される。代替的には、又は付加的には、ポリヌクレオチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５又はその相補的配列のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み得るか、又は配列番号３、配列番号４又は配列番号５のうちのいずれか１つのＤＮＡ配列の機能的断片を含み得る。バクテリオファージが本発明の第二の態様によるポリヌクレオチドを含む場合、それは本発明の第一の態様によるバクテリオファージの特性を有する。
【００４５】
好ましくはポリヌクレオチドは、配列番号３のＤＮＡ配列と少なくとも８７％の配列同一性、好ましくはその配列と少なくとも８８％の配列同一性、さらに好ましくはその配列と少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくはその配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。
【００４６】
代替的な好ましい一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４のＤＮＡ配列と少なくとも８８％の配列同一性、好ましくはその配列と少なくとも８９％の配列同一性、さらに好ましくはその配列と少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくはその配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。
【００４７】
さらなる代替的な好ましい一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５のＤＮＡ配列と少なくとも８８％の配列同一性、好ましくはその配列と少なくとも８９％の配列同一性、さらに好ましくはその配列と少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくはその配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。
【００４８】
機能的断片は、図２、図３又は図４のいずれかに示されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、即ち（それぞれ）配列番号３、配列番号４又は配列番号５内のＯＲＦのうちの１つ又は複数から選択され、この境界は、以下の表５で定義される。代替的には、機能的断片は、配列番号６、配列番号７及び配列番号８から選択されるＤＮＡ配列のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性、好ましくはそれらの配列のいずれか１つと少なくとも９６％の配列同一性、さらに好ましくはそれらの配列のいずれか１つと少なくとも９７％の配列同一性、最も好ましくはそれらの配列のうちのいずれか１つと少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含み得る。さらに好ましい一実施形態では、機能的断片は、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のＤＮＡ配列を含む。
【００４９】
代替的には、又は付加的には、機能的断片は、
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ１と少なくとも６３％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ２と少なくとも９１％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ３と少なくとも９１％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ４と少なくとも９１％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ５と少なくとも８９％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ６と少なくとも９２％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ７と少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ８と少なくとも９４％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ９と少なくとも９５％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ１０と少なくとも９１％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ１１と少なくとも９３％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ１２と少なくとも９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ１３と少なくとも９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ１４と少なくとも９１％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ１５と少なくとも９３％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ１６と少なくとも９４％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ１７と少なくとも９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ１８と少なくとも６７％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ１９と少なくとも８０％、９０％、
９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ２０と少なくとも８８％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ２１と少なくとも８６％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ２２と少なくとも９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ２３と少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ２４と少なくとも９３％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ２５と少なくとも８７％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ２６と少なくとも６３％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ２７と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ２８と少なくとも７８％、８０％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ２９と少なくとも６６％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；及び／又は
配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のＯＲＦ３０と少なくとも８７％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列
のうちの１つ又は複数のＤＮＡ配列を含み得る。
【００５０】
ポリヌクレオチドは、図２、図３又は図４のいずれかに示されたオープンリーディングフレームのうちの１つ又は複数を含み得る。
【００５１】
好ましくはポリヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３で示される配列のうちの１つ又は複数を含まない核酸配列を有する。理論に拘束されるものではないが、本発明の第二の態様によるポリヌクレオチドを含有するバクテリオファージの特性（即ちバクテリオファージはアクネ菌を溶解することが可能であり、そしてアクネ菌でない任意の細菌を溶解することが不可能であり、そして細菌中で溶原性を維持することが不可能である）は、本発明の第二の態様によるポリヌクレオチド由来のこれらの配列のうちの１つ又は複数が存在しないことに関連し得る。
【００５２】
ポリヌクレオチドはさらに、マーカー分子をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【００５３】
本発明の第三の態様によれば、本発明の第二の態様によるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドが提供される。
【００５４】
本発明の第四の態様によれば、本発明の第一の態様による少なくとも１つのバクテリオファージ及びアジュバント、担体又はビヒクルを含む組成物が提供される。
【００５５】
好ましくは組成物は、にきびの予防又は治療に用いるため、又は哺乳類（好ましくはヒト）の外観を改善するために用いるためのものであり、バクテリオファージは有効量で存在する。
【００５６】
「治療」（及び「治療すること」、「治療する」等の同義語）という用語は、本明細書中で用いる場合、にきびの症候の発生の低減又は排除を示すように意図される。例えば症
候は、顔面上の可視的な印、例えば丘疹（直径５ｍｍ未満の小隆起紅斑）、浅在性膿疱及び深在性病変（直径５ｍｍより大きい結節及び膿疱）を包含する。深在性病変は、瘢痕をもたらし得る。
【００５７】
組成物は、好ましくはバクテリオファージの２つ以上の異なる単離物を含む。バクテリオファージの２つ以上の単離物の各々は、本発明の第一の態様によるバクテリオファージであり得る。
【００５８】
付加的には、又は代替的には、組成物は、本発明の第二の態様による単離ポリヌクレオチド又は本発明の第三の態様による単離ポリペプチドを含み得る。組成物が、にきびの予防若しくは治療のため、又は哺乳類（好ましくはヒト）の外観を改善するために用いる場合、単離ポリヌクレオチド及び／又は単離ポリペプチドは有効量で存在する。
【００５９】
組成物は、経口投与、静脈内投与又は局所投与に適した形態であり得る。例えば組成物は、経口投与に適した形態であり得るし、そして液体、粉末又は錠剤であり得る。代替的には組成物は、静脈内投与に適した形態であり得るし、そして液体又は液体中に溶解可能な固体であり得る。さらに代替的には、組成物は局所投与に適した形態であり得るし、そしてクリーム、溶液、粉末、スプレー、エーロゾル、カプセル、固体又はゲルの形態であり得るか、又は固体表面に結合され得る。組成物はまた、洗顔料、石鹸、塗布スティック、化粧品または包剤の一部を構成し得る。
【００６０】
組成物中に含有される本発明によるバクテリオファージ、ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、リポソーム、カプセル、担体粒子、又は実際は、組成物内の別個の微小環境中にバクテリオファージ、ポリヌクレオチド若しくはポリペプチドを保持する任意のその他の方法内又はその一部であり得る。代替的には、バクテリオファージ、ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、組成物に直接的に付加され、例えばバクテリオファージは凍結乾燥形態で付加され得る。
【００６１】
本発明のこの態様による組成物は、抗生物質、抗にきび薬、抗アクネ菌薬、抗炎症薬及び抗脂漏薬から選択される少なくとも１つのさらなる作用物質を含み得る。
【００６２】
組成物は、薬学的組成物又は化粧品組成物であり得る。
【００６３】
本発明の第五の態様によれば、にきびの予防又は治療のための薬剤の調製における本発明の第一の態様による少なくとも１つのバクテリオファージの使用が提供される。
【００６４】
薬剤は、バクテリオファージの２つ以上の異なる単離物を含み得る。バクテリオファージの２つ以上の単離物の各々は、本発明の第一の態様によるバクテリオファージであり得る。付加的には、又は代替的には、薬剤は、本発明の第二の態様による単離ポリヌクレオチド又は本発明の第三の態様による単離ポリペプチドを含み得る。薬剤は、抗生物質、抗にきび薬、抗アクネ菌薬、抗炎症薬及び抗脂漏薬から選択される少なくとも１つのさらなる作用物質を含み得る。
【００６５】
薬剤は、経口投与、静脈内投与又は局所投与に適した形態であり得る。例えば薬剤は、経口投与に適した形態であり得るし、そして液体、粉末又は錠剤であり得る。代替的には薬剤は、静脈内投与に適した形態で有り得るし、そして液体又は液体中に溶解可能な固体であり得る。さらに代替的には、薬剤は局所投与に適した形態であり得るし、そしてクリーム、溶液、粉末、スプレー、エーロゾル、カプセル、固体又はゲルの形態であり得るか、又は固体表面に結合され得る。薬剤はまた、洗顔料、石鹸、塗布スティック、化粧品、包帯の一部を構成し得る。
【００６６】
本発明の第六の態様によれば、にきびを予防又は治療する方法であって、有効量の本発明の第一の態様による少なくとも１つのバクテリオファージ及び／又は有効量の本発明の第二の態様による単離ポリヌクレオチド及び／又は有効量の本発明の第三の態様による単離ポリペプチド及び／又は有効量の本発明の第四の態様による組成物をこのような予防又は治療を必要とする個体に投与することを包含する方法が提供される。
【００６７】
本発明の第七の態様によれば、個体の外観を改善する方法であって、有効量の本発明の第一の態様によるバクテリオファージ及び／又は有効量の本発明の第二の態様による単離ポリヌクレオチド及び／又は有効量の本発明の第三の態様による単離ポリペプチド及び／又は有効量の本発明の第四の態様による組成物を個体に投与することを包含する方法が提供される。好ましくは個体は、ヒト個体である。方法は、非治療性化粧方法である。
【００６８】
本発明の第八の態様によれば、アクネ菌を溶解することが可能な、そしてアクネ菌でない任意の細菌を溶解することが不可能な、そして細菌中で溶原性を維持することが不可能なバクテリオファージを単離する方法であって、以下の：
ａ）皮膚表面から細菌の試料を獲得すること、
ｂ）プロピオニバクテリアを溶解するバクテリオファージを試料から単離すること、
ｃ）バクテリオファージを単離して、当該バクテリオファージが少なくとも１つのアクネ菌株を溶解することが可能か否かを判定すること、
ｄ）バクテリオファージを試験して、当該バクテリオファージが非アクネ菌株を溶解することが可能か否かを判定すること、
ｅ）バクテリオファージを試験して、当該バクテリオファージがアクネ菌株中で溶原性を維持することが可能か否かを判定すること、及び
ｆ）工程（ｃ）、工程（ｄ）及び工程（ｅ）においてアクネ菌を溶解することが可能であり、そしてアクネ菌でない任意の細菌を溶解することが不可能であり、そして細菌中で溶原性を維持することが不可能であることが示されたバクテリオファージを検出すること
を包含する方法が提供される。
【００６９】
本発明の第九の態様によれば、アクネ菌を溶解することが可能な、そしてアクネ菌でない任意の細菌を溶解することが不可能な、そして細菌中で溶原性を維持することが不可能なバクテリオファージを同定する方法であって、以下の：
ａ）アクネ菌をバクテリオファージに曝露し、且つ、細菌が溶解されることを確定すること、
ｂ）アクネ菌でない細菌のうちの少なくとも１つの種をバクテリオファージに曝露し、且つ、細菌が溶解されないことを確定すること、及び
ｃ）バクテリオファージが細菌中で溶原性を維持することが不可能であることを確定すること
を包含する方法が提供される。
【００７０】
好ましくは、工程（ｂ）では、アクネ菌でない細菌の少なくとも３つの種、さらに好ましくは少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個又は少なくとも５０個の異なる細菌株が、バクテリオファージに曝露される。
【００７１】
本発明の第十の態様によれば、本発明の第八の態様又は本発明の第九の態様による方法を用いて単離されるか又は同定されるバクテリオファージが提供される。
【００７２】
本発明の第十一の態様によれば、本発明の第八の態様又は本発明の第九の態様による方
法を用いることにより獲得されるか又は同定されるバクテリオファージが提供される。
【００７３】
これより、本発明の実施形態が添付の図１〜図８を参照して例示目的で記載される。
【実施例】
【００７４】
実験材料及び方法
１．  材料
強化クロストリジウム寒天（ＲＣＡ；Ｏｘｏｉｄ  ＣＭ１５１（Oxoid Ltd., Basingstoke, UK））
ＴＹＧ培養液（１％（ｗ／ｖ）トリプトン（Ｏｘｏｉｄ  Ｌ４２）；０．５％（ｗ／ｖ）酵母抽出物（Ｏｘｏｉｄ  Ｌ２１）；０．２５％（ｗ／ｖ）グルコース）
トップアガロース（１００ｍｌのｄＨ2Ｏに加え、加熱、融解し、４５℃に冷却し、３ｍｌ容積に分注し、オートクレーブ処理する０．７ｇの低融点アガロース）
ＳＭ緩衝液（５００ｍｌのｄＨ2Ｏ中に溶解し、オートクレーブ処理する、２．９２ｇのＮａＣｌ；１ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；２５ｍｌの１Ｍトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）；０．０５ｇのゼラチン）
【００７５】
２．バクテリオファージ及び細菌コレクション
２．１  試料採取方法
Leeds General Infirmaryの皮膚科に通院している患者から、スクリーニングに用いられるアクネ菌の菌株及びファージ単離物を得た（アクネ菌ＮＣＴＣ７３７及びＤＳＭ１６３７９を除く）。この方法は、Williamson P. & Kligman A.M. (1965) （J. Invest. Dermatol. 45: 498-503）に記載された方法を基礎にしている。
ａ）皮膚の表面に滅菌金属環を載せ、くっきりと跡が残る位しっかり押し付ける；
ｂ）環中に洗浄液（７５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．９））１ｍｌをピペット注入する；
ｃ）滅菌テフロン棒で１分間、皮膚の表面を穏やかに擦る；
ｄ）この洗浄液を滅菌ボトルに移し取り、別の１ｍｌの滅菌洗浄液と取り替える；
ｅ）擦り手順を反復し、次に洗浄液を取り出して、最初の試料とともにプールする；
ｆ）６μｇ／ｍｌのフラゾリドン（ブドウ球菌の増殖を阻害するが、プロピオニバクテリアの増殖を阻害しない）を含有するＲＣＡ上に試料の連続希釈液をプレート化（又はスパイラルプレート）を行い、３４℃で７日間、嫌気的にインキュベートする；
ｇ）個々の細菌コロニー又はバクテリオファージプラークを回収し（下記の方法２．２を用いて）、そしてバクテリオファージプラークに関して再画線（細菌）又は下記の方法（「ファージストックの調製−溶解物」）により増殖する。
【００７６】
２．２  ファージストックの調製−プラーク選定
ａ）上記のようにファージ含有細菌をプレート化し、２４〜４８時間インキュベートする；
ｂ）ガラス製パスツールピペットを用いて、ねじ蓋付きバイアル中の１ｍｌのＳＭ緩衝液中に単一プラークからの寒天の２〜３個のプラグを選定する；
ｃ）４℃で保存する。
【００７７】
２．３  ファージストックの調製−溶解物
ａ）上記のようにファージ含有細菌をプレート化し、２４〜４８時間インキュベートする；
ｂ）５ｍｌのＳＭ緩衝液をプレートの上に載せ、時々かき回しながら室温で１時間放置する；
ｃ）滅菌チューブ（プラスチック製一般的チューブ又はファルコンチューブ）中に緩衝液をピペット注入し、次にトップアガロースをプレートから擦り取ってチューブ中に入
れる；
ｄ）４℃で１０分間、５０００ｒｐｍ超で遠心分離する；
ｅ）上清を取り出して、滅菌濾過（０．２μｍフィルター）する；
ｆ）分取して、４℃で保存する。
【００７８】
３．  宿主範囲試験
３．１  アクネ菌バクテリオファージのプレート化
ａ）７０℃水浴中でトップアガロースを融解し、次に４４℃に冷却する；
ｂ）卓上型遠心分離機中で１０分間、５０００ｒｐｍでアクネ菌の培養物を遠心分離する；
ｃ）ＳＭ緩衝液中でＯＤ600が２．５になるまで細胞を再懸濁する；
ｄ）微小遠心分離管中のファージの分取液（通常５〜１０μｌ）にアクネ菌１００μｌを付加し、簡単に混合して、次に３４℃で１５分間インキュベートする；
ｅ）３ｍｌのトップアガロース中にアクネ菌／ファージ混合物を静かにピペット注入して、反転混合する；
ｆ）乾燥ＲＣＡプレート上に注いで、回して表面を被覆する；
ｇ）凝固させて、３４℃で２４〜４８時間、嫌気的にインキュベートする。
【００７９】
３．２  アクネ菌バクテリオファージ感染性検定
ａ）７０℃湯浴中でトップアガロースを融解し、次に４４℃に冷却する；
ｂ）卓上型遠心分離機中により５０００ｒｐｍで１０分間、アクネ菌の培養物を遠心分離する；
ｃ）ＳＭ緩衝液中でＯＤ600が２．５になるまで細胞を再懸濁する；
ｄ）３ｍｌのトップアガロースにアクネ菌１００μｌを付加し、振盪して混合する；
ｅ）乾燥ＲＣＡプレート上に注いで、かき回して表面を被覆する；
ｆ）アガロースを凝固させて、次にプレートを再び１５〜２０分間乾燥させる；
ｇ）プレート上に５μｌの各ファージをスポッティングする；
ｈ）スポットを吸込ませて、３４℃で４８時間、嫌気的にインキュベートする。
【００８０】
ファージのハイスループットスクリーニングのために、マルチポイント・イノキュレーターを用いて、プレートの表面にファージスポットを塗布し得る。
【００８１】
３．３  他の非アクネ菌種に対するバクテリオファージの感染性検定
上記の方法を用い、アクネ菌を他の種と置き換えて、細菌の他の種に対してもバクテリオファージ株を試験した。試験した細菌種は、プロピオニバクテリウム・グラヌロサム（Proplonibacterium granulosum）、プロピオニバクテリウム・アビダム(Proplonibacterium avidum)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)及びコリネバクテリウム・ボビス（Corynebacterium bovis）であった。
【００８２】
３．４  ボランティアの皮膚から単離直後のアクネ菌に及ぼすバクテリオファージ１０３６７２の感染性検定
ボランティアの背中上の天然アクネ菌数は、約１０6ｃｆｕ／ｃｍ2（「ｃｆｕ」は「コロニー形成単位」を意味する）であることが既知であった。スクラブ・ウォッシュ試料を、上記方法２．１に記述したようにボランティアの背中から採取した。小分画を取って、開始アクネ菌数（１０5ｃｆｕ／ｃｍ2）を確定した。アクネ菌を増殖させるために、残りの試料に対し、２×ＴＹＧ培養液が１：２になるように希釈した（１×最終ＴＹＧ濃度）。次にこれをＴＹＧ中でさらに希釈して、１（原液）〜１０-3の範囲の１０倍希釈液を得た。各希釈の２つの試料を分取して、６：１のファージ：細胞比でファージ１０３６７２を一方に付加し（最終濃度１０6ｐｆｕ／ｍｌ、「ｐｆｕ」は「プラーク形成単位」を意味する）、そして対照としてＳＭを他方に付加した。次にこれらを、３４℃で４８時間、
嫌気的にインキュベートした。
【００８３】
インキュベーション後、各試料を１〜１０-2まで１０倍希釈し、濾過して、１０ｍＭ硫酸アンモニウム第一鉄（ＦＡＳ）（これは、遊離ファージを不活性化し得る、この状況では、遊離ファージの繰越し（擬陽性結果を生じ得る）を防止するために用いられる化合物）で処理した。フィルターをＲＣＡ＋フラゾリドンプレート（ＲＣＡＦ）上でプレート化し、３４℃で６日間、嫌気的にインキュベートした。この期間の終了時に、フィルター上のコロニー数を計数することによりコロニー形成単位数（／ｃｍ3）を確定し、この数字を用いて、元の未希釈試料中のｃｆｕを算定した。
【００８４】
４．  非溶原性アクネ菌バクテリオファージの同定
以下のように、バクテリオファージを溶原性及び重複感染免疫試験に付した。ファージをアクネ菌ＡＴ１の層上にスポッティングしてプラークを生じ、これらを、プラーク内の細菌の増殖を可能にするのに十分な時間インキュベートし、このような細菌は、ファージ感染に対する耐性を発現した。耐性は、細菌細胞の表面（例えば受容体）上の変化により、又は内部的に（例えば制限酵素により）発現し得る。しかしながら溶原性は、「重複感染免疫」と呼ばれるプロセスで関連ファージに耐性を付与する。リソゲンにより発現されるレプレッサータンパク質は、取り込みファージが増殖に必要なタンパク質を合成するのを阻止する。レプレッサータンパク質は、細胞中に移入する任意の相同ファージＤＮＡに対して同一機能を正確に遂行して、同様にファージの産生を阻止する。これは、レプレッサーが結合し得るように、移入ＤＮＡがリソゲンに関連する場合にのみ起こる。
【００８５】
混濁プラークの中央を選定し、画線して、ファージ（溶原性であり得るし、そうでないこともある）による感染に対して明らかに耐性である細菌の単一コロニーを得た。この段階で、上記の耐性のメカニズムが獲得されていたか否かを知る方法はなかった。単一コロニーを選定し、トリプトン／酵母抽出物／グルコース（ＴＹＧ）培養液中で増殖させた後、強化クロストリジウム（ＲＣＡ）プレート上のトップアガロース中のマット状の層としてプレート化した。第一に、自発性プラーク形成を同定したが、これは、溶原性ファージによる初期感染の結果としてのファージ溶原性を示した。第二に、ファージを層上にスポッティングして、溶原性及び／又は耐性の指標である同一又は他のファージに対する重複感染免疫を調べたが、これは、細菌が特定ファージによる感染に対して免疫性でない限りプラークを形成するためであった。上記のように、それらが同一ファージ単離物による反復感染に対して免疫性である場合、これは、細胞中の溶原性ファージ中のこのファージの存在を示唆する。同様に、それらが別のファージ単離物による感染に対して免疫性である場合、これは、細胞中の溶原性ファージ中の第一のファージの存在を示唆する。このような溶原性を示さないファージは、本発明の実施態様に用いるのに適しているとみなされる。
【００８６】
ファージが溶原性になり得るか否かを同定する代替的方法は、例えばファージレプレッサーＤＮＡに対して特異的なプライマーを用いるＰＣＲ検出であり、この場合、陽性ＰＣＲ結果は、ファージレプレッサーＤＮＡの存在、したがって問題となるバクテリオファージが溶原性になる能力を有したことを示す。レプレッサー遺伝子の非存在は溶原性を回避する一方法であるが、溶原性ファージを溶菌性ファージに変換する他の欠失としては、組込み機構の他の部分を除去する任意のもの、即ちファージでコードされたインテグラーゼタンパク質、並びに宿主ＤＮＡ中への挿入（ａｔｔ部位）のために必要とされるＤＮＡ配列が挙げられる。これらの遺伝子又は部位を不活性化する任意の種類のエラー（error）は、所望の溶菌性ファージの表現型、例えば遺伝子／部位の全体的又は部分的除去、並びに機能的不活性化点突然変異（一箇所又は複数）を達成する。代替的には、ＰＣＲベースの方法は、対象のバクテリオファージに曝露された細胞中のライゲーションしたｃｏｓ部位を検出し得る。別の方法は、標識ファージＤＮＡを用いて細菌ゲノム中のリソゲンをプ
ローブするサザンブロッティングである。これらの及びその他のこのような方法は、容易に当業者の能力内であって、当業者等は、ファージが溶原性になり得るか否か、したがってそれが本発明の範囲内であるか否かを確実に同定するために、このような方法にどのように接近するかを明らかに理解している。
【００８７】
５．  ＤＮＡシーケンシング
以下の方法を用いて、バクテリオファージＤＮＡを抽出し、精製した：
ａ）ファージのプレート溶解物を調製する（１０ｍｌ）
ｂ）ＮａＣｌを１Ｍになるまで、そしてＰＥＧ８０００を１０％（ｗ／ｖ）になるまで付加して、徐々に溶解する
ｃ）氷上で３０分間インキュベートして、ファージを沈殿させる
ｄ）４℃で１０分間、１０，０００ｇで遠心分離することにより、ファージを回収する
ｅ）１ｍｌのＳＭ緩衝液中に再懸濁する
ｆ）等容積のクロロホルムを付加し、３０秒間ボルテックスする
ｇ）４℃で１５分間、３０００ｇで遠心分離する
ｈ）ファージを含有する上層を滅菌チューブに取り出す
ｉ）プロテイナーゼＫを５０μｇ／ｍｌになるまで、そしてＳＤＳを０．５％（ｗ／ｖ）になるまで付加して、５６℃で１時間インキュベートする
ｊ）冷却し、次にフェノール：クロロホルムで２回、クロロホルムで１回抽出する
ｋ）２容積のエタノールでＤＮＡを析出させる
ｌ）パスツールピペットを用いて、ＤＮＡを１ｍｌの７０％（ｖ／ｖ）エタノールに移す
ｍ）１２，０００ｇで２分間の遠心分離によりＤＮＡを取り出し、上清を捨てて、ＴＥ緩衝液又はｄＨ2Ｏ中にＤＮＡを再溶解する。
【００８８】
シーケンシングは、Lark Technologies Inc.（Houston, Texas）により実行された。ＰＡ６、１０３６０９、１０３６７２及び１８９４  ＤＮＡを上記と同様に調製し、次に、各バクテリオファージに関する全長ゲノム配列を得るためクローンをシーケンシングする、ショットガンライブラリーを調製するために用いた。
【００８９】
６．  ＯＲＦ分析
マークボロドフスキー生物情報学グループ（Mark Borodovsky's Bioinformatics Group）（Georgia Institute of Technology, Atlanta, Georgia）により提供される遺伝子予測プログラムの一ファミリーであるＧｅｎｅＭａｒｋ（商標）により利用可能なソフトウエアを用いて、いくつかのバクテリオファージ単離物中のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を分析した。ＯＲＦ分析ツールは、そこでは、以下に記載されるコンピューター計算方法を用いて考え得る遺伝子を同定する発見的手法を用いる：Besemer J. and Borodovsky M. (1999) Nucl. Acids Res. 27: 3911-3920。このプログラムは、インターネットで見出され得る：http://opal.biology.gatech.edu/GeneMark/heuristic#hmm2.cgi
【００９０】
Ｂｌａｓｔ分析ツール（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を用いたデータ比較により、遺伝子産物機能を確定した。
【００９１】
結果
Ｉ．  ストックしたアクネ菌株に対するバクテリオファージの試験
年齢、起源及び薬剤耐性プロファイルにおけるそれらの多様性に関して選択された２１個のアクネ菌株のパネルに対して、４６個の独立したバクテリオファージ単離物のコレクションを試験した（表１に列挙）。
【００９２】
【表１】
2009501018.tif 000003
【００９３】
各細菌株を溶解する各バクテリオファージの能力を試験して、各ファージの宿主特異性の幅の指標を得た。表２における結果は、概して、全ファージが広範な特異性を有していたということを示す。このうち、１４個が、試験した全菌株に感染し得た：ＰＡ６、１０３６０９、１０３６２５、１０３６２９、１０３６６４、１０３６７２、１０３７１５、１８６９、１８７４、１８７８、１８９４、１９０５、１９０９及びＰ３７Ｐ。
【００９４】
【表２−１】
2009501018.tif 000004
【表２−２】
2009501018.tif 000005
【００９５】
これらの菌株のうち、試験したプロピオニバクテリウム・グラヌロサム、プロピオニバクテリウム・アビダム、表皮ブドウ球菌及びコリネバクテリウム・ボビスに感染する能力を示したものはなかった。
【００９６】
ＩＩ．  ボランティアの皮膚から単離されたアクネ菌に対するバクテリオファージＰＡ６、１０３６０９、１０３６２５、１０３６２９、１０３６６４、１０３６７２、１０３７１５、１８６９、１８７４、１８７８、１８９４、１９０５、１９０９及びＰ３７Ｐの試験
広範な特異性を有することが上で示された１４個の菌株を、ボランティアの皮膚から単離された３１個の追加のアクネ菌株に対してさらに試験した。バクテリオファージはすべて、表３に示すように、これらの追加の菌株に対する溶菌活性を示した：
【００９７】
【表３】
2009501018.tif 000006
【００９８】
ＩＩＩ．  非溶原性アクネ菌バクテリオファージの同定
上記の方法４に略記したように溶原性活性に関してファージをスクリーニングした。上記の表３に列挙した広範な宿主範囲のファージのうちの３つは、上記の方法４に略記したように、これらの実験において溶原性又は耐性の徴候を全く示さなかった。結果を表４に示す。それらはファージ１８９４、１０３６０９及び１０３６７２であった。
【００９９】
【表４】
2009501018.tif 000007
【０１００】
ＩＶ．  ＤＮＡシーケンシング
バクテリオファージＰＡ６、１０３６０９、１０３６７２及び１８９４の各々に関するゲノムを、上記の方法５に略記したようにシーケンシングした。各々に関する配列は、配列番号１（ＰＡ６）、配列番号３（１０３６０９）、配列番号４（１０３６７２）及び配列番号５（１８９４）で示される。
【０１０１】
Ｖ．  バクテリオファージゲノムのＯＲＦ分析
ＰＡ６ゲノム内のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の分析、及びＢｌａｓｔデータベース分析ツールを用いた予測タンパク質配列のその後の分析は、種々の潜在的遺伝子及び強調された考え得る機能を同定した（図１に示した分析の要約）。ファージゲノムの５’末端は、その構造遺伝子の多くがファージコート及びファージテール（phage coat
and tail）を含む宿主に対して出現する。残りの遺伝子の中で注目すべきは、アクネ菌ゲノムそれ自体の中の他のリシン及びアミダーゼタンパク質と相同性を共有する潜在的リシン（ＯＲＦ２０）である。この遺伝子のＤＮＡ配列は配列番号２であり、配列番号１のヌクレオチド１５３７１〜１６２３３に見られ得る。
【０１０２】
１０３６０９、１０３６７２及び１８９４のゲノムに関して同様の分析を実行した。図２（１０３６０９）、図３（１０３６７２）、図４（１８９４）及び表５に要約を示す。さらにまた、各場合のＯＲＦ２０は、潜在的リシンをコードする。この遺伝子に関するＤＮＡ配列は、配列番号６（ファージ１０３６０９、配列番号３のヌクレオチド１５４４２〜１６２９６）、配列番号７（ファージ１０３６７２、配列番号４のヌクレオチド１５３８２〜１６２４５）及び配列番号８（ファージ１８９４、配列番号５のヌクレオチド１５４１６〜１６２７３）で示される。各バクテリオファージ株に関する各ＯＲＦに対する境界を、表５に示す。レプレッサータンパク質はこれらのファージ株における配列相同性分析からは明らかでなく、これは、表４に示した結果により支持されるように、これらが純溶菌性ファージであり、溶原性を維持できないことを示す。したがってこれは、これらのファージ株がファージ療法のための候補としてこの点で理想的であるということを確証している。
【０１０３】
【表５Ａ】
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【０１０４】
【表５Ｂ】
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【０１０５】
３つのバクテリオファージ間のＯＲＦにおけるＤＮＡ配列の配列同一性（％）を、表６に示す：
【０１０６】
【表６】
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【０１０７】
図５は、１０３６０９、１０３６７２及び１８９４間の配列相同性分析の結果を示し、類似性レベル１．０とは、１００％同一性を示し、類似性は３つの配列間の差の性質及び数に従って下がる。この分析は、これら３つのファージすべての間の全体的な配列同一性が８６．１％であるということを実証している。
【０１０８】
図６は、これら３つのファージと、細菌中で溶原性を維持することが不可能であるという所望の特質を示さないバクテリオファージであるＰＡ６との間の同様の分析の結果を示す（結果は上記ＩＩＩ節を参照）。この分析は、これら４つすべてのファージ間の全体的な配列同一性が８０．１％であるということを実証している。１８９４とＰＡ６との間の全体的な配列同一性は８７．４％であり、１０３６０９とＰＡ６との間は８６．８％であり、１０３６７２とＰＡ６との間は８７．３％である。
【０１０９】
図６は、３つのファージ１０３６０９、１０３６７２及び１８９４のＤＮＡ配列をＰＡ６の配列と比較した場合、低いか又は０％の配列同一性の２つの領域が存在するということを明白に示している。図７及び図８は、これが、他の３つのファージのいずれにも存在しないＰＡ６中のヌクレオチド配列の存在の結果であるということを示す。
【０１１０】
図７及び図８に示した配列によるヌクレオチド配列番号付けを参照すると、ＰＡ６のヌクレオチド１９８０４〜１０８４３は配列番号９として示され、ＰＡ６のヌクレオチド１９８７６〜１９９０１は配列番号１０として示され、ＰＡ６のヌクレオチド１９９１３〜１９９６９は配列番号１１として示され、ＰＡ６のヌクレオチド１９９７９〜２００５４は配列番号１２として示され、そしてＰＡ６のヌクレオチド２６２４２〜２６６２０は配列番号１３として示される。
【０１１１】
理論に拘束されるものではないが、これらのＤＮＡ挿入物はゲノムの非ＯＲＦ領域中のＰＡ６に存在するが、このような大きな付加的ＤＮＡ挿入物の存在は、ゲノムの全体的構造に及ぼす作用を有し、そして例えばＯＲＦ領域の発現の効力に作用し得る。
【０１１２】
ＶＩ．  抗アクネ菌治療としてのバクテリオファージ１０３６７２の利用
上記の方法３．４に略記したように、ボランティアの皮膚からの細菌の単離直後にアクネ菌に対して、バクテリオファージ１０３６７２を試験した。結果は、表７に示すとおりである：
【０１１３】
【表７】
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【０１１４】
これは明らかに、患者の皮膚から直接単離されたアクネ菌に対するバクテリオファージの効力を示し、そして直接的ににきびの治療方法内であれ、またこのような方法における使用のための薬剤中の成分としてであれ、抗アクネ菌薬としてのこのようなバクテリオファージの有用性を実証している。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】指示された種々のＯＲＦの推定機能を有するＰＡ６ゲノム中のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配置を示す図である。
【図２】指示された種々のＯＲＦの推定機能を有する１０３６０９ゲノム中のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配置を示す図である。
【図３】指示された種々のＯＲＦの推定機能を有する１０３６７２ゲノム中のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配置を示す図である。
【図４】指示された種々のＯＲＦの推定機能を有する１８９４ゲノム中のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配置を示す図である。
【図５】ファージ１０３６７２、１０３６０９及び１８９４のＤＮＡ配列アラインメントのグラフを示す図である。
【図６】ＰＡ６対１０３６７２、１０３６０９及び１８９４のＤＮＡ配列アラインメントのグラフを示す図である。
【図７】バクテリオファージ株１０３６０９、１０３６７２、１８９４及びＰＡ６のＤＮＡ配列の一部分のアラインメントを示す図である。
【図８】バクテリオファージ株１０３６０９、１０３６７２、１８９４及びＰＡ６のＤＮＡ配列のさらなる部分のアラインメントを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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