(57)【要約】  本発明は、マイコプラズマ感染を撲滅するためのワクチン、このようなワクチンで使用するためのマイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ、このようなワクチンを製造するためのマイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼの使用、このようなワクチンを調製するための方法、並びに前記ワクチンを予防接種された動物と完全細胞ワクチンで予防接種された動物又は野外感染に罹患した動物とを識別するための診断試験に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコプラズマ感染を撲滅するためのワクチンであり、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ又はその免疫原性断片と、及び医薬として許容される担体とを含むことを特徴とする前記ワクチン。
【請求項２】
マイコプラズマ感染を撲滅するためのワクチンであり、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ又はその免疫原性断片をコードする生組換え担体と、及び医薬として許容される担体とを含むことを特徴とする前記ワクチン。
【請求項３】
マイコプラズマ感染を撲滅するためのワクチンであり、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ又はその免疫原性断片をコードする生組換え担体を含む宿主細胞と、及び医薬として許容される担体とを含むことを特徴とする前記ワクチン。
【請求項４】
マイコプラズマ感染を撲滅するためのワクチンであり、機能的に連結されたプロモーターの制御下にある、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼをコードする遺伝子又はＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼの免疫原性断片をコードする前記遺伝子の一部と、及び医薬として許容される担体とを含むことを特徴とする前記ワクチン。
【請求項５】
マイコプラズマ感染を撲滅するためのワクチンであり、機能的に連結されたプロモーターの制御下にある、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼをコードする遺伝子又はＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼの免疫原性断片をコードする前記遺伝子の一部を含む宿主細胞と、及び医薬として許容される担体とを含むことを特徴とする前記ワクチン。
【請求項６】
同一の宿主に対して病原性である別の微生物又はウイルスに由来する１つ又はそれ以上の抗原、このような抗原に対する抗体又はこのような抗原をコードする遺伝情報をさらに含むことを特徴とする、請求項１から５に記載のワクチン。
【請求項７】
ウイルス又は微生物が、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、別のマイコプラズマ属種、特に、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、ブラキスピラ・ハイオディセンテリー、エシェリヒア・コリ、レプトスピラ属種、エリシペロスリクス・リューシオパシエ、ボルデテラ・ブロンキセプティカ、ブラキスピラ・ハイオディセンテリー、シゲラ種、サルモネラ・コレラエスイス、サルモネラ・チフィムリウム、サルモネラ・エンテリティディス、ヘモフィラス・パラスイス、ラウソニア、パスチュレラ・マルトシダ、ストレプトコッカス・スイス、アクチノバシラス・プリューロニューモニエ、スタフィロコッカス・ハイカス及びクロストリジウム・ペルフリンゲンスの群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
ウイルス又は微生物が、ウシヘルペスウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス、パラインフルエンザ３型ウイルス、ウシパラミクソウイルス、口蹄疫ウイルス、ウシ呼吸器多核体ウイルス、ブタサーコウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス、別のマイコプラズマ属種、パスツレラ・ヘモリティカ、スタフィロコッカス・オーレウス、エシェリヒア・コリ、レプトスピラ属種、スタフィロコッカス・ウベリス、タイレリア・パルバ、タイレリア・アニュラータ、バベシア・ボビス、バベシア・ビゲミナ、バベシア・メジャー、トリパノソーマ種、アナプラズマ・マージナーレ、アナプラズマ・セントラーレ及びネオスポラ・カニナムからなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載のワクチン。
【請求項９】
ウイルス又は微生物が、鶏痘ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（グンボロ）、マレック病ウイルス、ニワトリ貧血因子、トリレオウイルス、トルコ鼻気管炎ウイルス、ニワトリポックスウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、アヒルペストウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、産卵低下症候群ウイルス、伝染性喉頭気管ウイルス、シチメンチョウのヘルペスウイルス、別のマイコプラズマ属種、とりわけ、マイコプラズマ・ガリセプチカム又はマイコプラズマ・シノビアエ、ヘモフィルス・パラガリナルム（コリーザ）、オルニソバクテリウム・ライノトラキア、クロストリジウム・ペルフリンゲンス、サルモネラ、カンピロバクター種、Ｅ．コリ及びエイメリア種からなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載のワクチン。
【請求項１０】
ウイルス又は微生物が、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスパラミクソウイルス、クロストリジウム・ジフセリエ、クロストリジウム・テタニ、ボルデテラ・パーチュシス及びポックスウイルスからなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載のワクチン。
【請求項１１】
マイコプラズマ感染を撲滅するためのワクチンであり、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ又はその免疫原性断片に対する抗体と、及び医薬として許容される担体とを含むことを特徴とする前記ワクチン。
【請求項１２】
アジュバントを含むことを特徴とする、請求項１から１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ又はその免疫原性断片が、Ｍ．ボビス、Ｍ．ｓｐ．ボバイングループ７、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．カプリ、Ｍ．ペネトランス、Ｍ．ガリセプチカム、Ｍ．シノビエ、Ｍ．モービレ、Ｍ．パルモニス、Ｍ．ハイオニューモニエ、Ｍ．ニューモニエ、Ｍ．ジェニタリウム、Ｍ．ミコイデスＳ（ｍａｌｌ）Ｃ（ｏｌｏｎｙ）株Ａｆａｄｅ又はＭ．ミコイデスＳ（ｍａｌｌ）Ｃ（ｏｌｏｎｙ）株Ｌ２によってコードされるマイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼであることを特徴とする、請求項１から１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
ワクチンにおいて使用するためのマイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ又はその免疫原性断片。
【請求項１５】
マイコプラズマ感染を撲滅するためのワクチンを製造するための、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ又はその免疫原性断片の使用。
【請求項１６】
請求項１から１４に記載のワクチンを調製するための方法であり、請求項１に記載されているマイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ若しくはその免疫原性断片、請求項２に記載されている生組換え担体、請求項４に記載されている遺伝子若しくはその一部、請求項３及び５に記載の宿主細胞又は請求項１１に記載されているマイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ若しくはその免疫原性断片に対する抗体と、及び医薬として許容される担体とを混合することを含む、前記方法。
【請求項１７】
一方で請求項１から１４に記載のワクチンを用いた予防接種と、他方で完全細胞ワクチン又は野外感染を用いた予防接種とを識別するための診断検査であり、精製されたマイコプラズマのＬ−α−グリセロリンサノキシダーゼ又はその免疫原性断片を含むことを特徴とする前記検査。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、とりわけ、マイコプラズマ感染を撲滅するためのワクチン、このようなワクチンにおいて使用するためのマイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ、このようなワクチンを製造するためのマイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼの使用、このようなワクチンを調製するための方法、並びに前記ワクチンを予防接種された動物と完全細胞ワクチンで予防接種された動物又は野外感染に罹患した動物を識別するための診断試験に関する。
【背景技術】
【０００２】
進化の間に、病原性細菌は、それらの宿主との複雑な相互作用を発達させてきた。これは、しばしば、病原性島、プラスミド、トランスポゾン又はプロファージ上での病原性因子の獲得を伴い、これにより、細菌は、宿主内でコロニーを形成し、生存し、複製することが可能となる。これに対して、最小の自己複製生物であるマイコプラズマ種は、ゲノムを最小サイズへ減少させることによって、グラム陽性細菌から退行性に進化し、その結果、遺伝的資源を節約している。
【０００３】
マイコプラズマ種は、地球上で検出される最小の自己複製生物である。それらのゲノムは、マイコプラズマ・ジェニタリウムにおける５８０キロ塩基対（ｋｂ）（Ｆｒａｓｅｒ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：３９７−０３）からマイコプラズマ・ペネトランスにおける１３５８ｋｂ（Ｓａｓａｋｉ，Ｙ．  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０：５２９３−５３００）にわたる。これにより、遺伝的資源の劇的な節約がもたらされ、寄生性の生活様式が必要不可欠となる。病原性マイコプラズマ種は、主に、動物及びヒトに、非定型肺炎、泌尿生殖器感染症及び関節炎を引き起こす（Ｂａｓｅｍａｎ，Ｊ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｊ．Ｇ．  Ｔｕｌｌｙ，１９９７，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３：２１−３２，Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ａ．，ａｎｄ  Ｇ．  Ｆ．  Ｂｒｏｗｎｉｎｇ（ｅｄｓ．）．２００５．Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ，Ｕ．Ｋ．，Ｆｒｅｙ，Ｊ．  ２００２．Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ，ｐ．７３−９０．Ｉｎ  Ｓ．  Ｒａｚｉｎ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｈｅｒｒｍａｎｎ（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ．  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。ここでは、ヒト（例えば、Ｍ．ジェニタリウム、Ｍ．ニューモニエ）、ウシ種（例えば、Ｍ．ｓｐボバイングループ７）、ブタ（例えば、Ｍ．ハイオニューモニエ）又は家禽（例えば、ガリセプチカム）に感染する公知のマイコプラズマ種が存在するという事実のために、本明細書で動物という場合には、これが、とりわけ、ヒト、ウシ種、ブタ及び家禽を含むものと解釈されるべきことが強調される。病原性が、毒素、インベイシン及び細胞溶解素によって概ね決定される他の病原性細菌とは異なり、完全に配列決定された８つの種のゲノム配列分析によって明らかとなったところによれば、病原性マイコプラズマ種は、このような典型的な主要な病原性因子を有していないように見受けられる（Ｃｈａｍｂａｕｄ，Ｉ．  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：２１４５−２１５３，Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：３９７−４０３，Ｈｉｍｍｅｌｒｅｉｃｈ，Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：４４２０−４４４９，Ｊａｆｆｅ，Ｊ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ，２００４，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１４：１４４７−１４６１，Ｍｉｎｉｏｎ，Ｆ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：７１２３−７１３３，Ｐａｐａｚｉｓｉ，Ｌ．  ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４９：２３０７−２３１６，Ｓａｓａｋｉ，Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：５２９３−５３００，Ｗｅｓｔｂｅｒｇ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１４：２２１−２２７）。
【０００４】
ＰＣＲ法の導入以来、マイコプラズマ感染症の診断は著しく改善され、数個のマイコプラズマ種において、抗原性の可変性が詳しく研究されてきたが、現在のところ、病原性マイコプラズマが、宿主細胞に損傷、炎症及び疾病を引き起こす分子的機序及びエフェクターに関する知識は殆ど得られていない。従って、これらの望ましくない効果を予防することを特に目標とするワクチンの開発は、極めて必要とされている。
【０００５】
宿主細胞の損傷、炎症及び疾病を回避又は減弱させる、マイコプラズマ感染を撲滅するためのワクチンを提供することは本発明の１つの目的である。
【０００６】
驚くべきことに、新規の主要病原性因子が、マイコプラズマにおける細胞傷害の重要な原因であることが見出された。この病原性因子は、Ｈ２Ｏ２などの有毒な副産物及びその他の付随する反応性酸素種（ＲＯＳ）からなるように見受けられた。Ｈ２Ｏ２／ＲＯＳの形成は、グリセロールの代謝に関与する酵素である、酵素マイコプラマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ（ＧｌｐＯ）の活性と直接関係し得ることを示すことができた。
【０００７】
さらに予想外のことに、マイコプラズマ感染によって引き起こされる組織損傷の唯一の原因ではないとしても、Ｈ２Ｏ２／ＲＯＳの形成が中心的な原因であることを示すことができた。これは、今回、初めて、マイコプラズマの主な病原性因子が確定されたことを意味している。
【０００８】
マイコプラズマ中のグリセロール代謝経路は、容易に影響又は変化を受けることができず、従って、Ｈ２Ｏ２／ＲＯＳは、マイコプラズマ自体のグリセロール代謝経路の修飾を通じて容易に変化することができない。従って、非マイコプラズマ種での状況とは異なり、生きた弱毒化されたマイコプラズマを開発する経路は、より実効可能性が低いように思われる。
【０００９】
しかしながら、驚くべきことに、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼと反応性を示す抗体は、感染された動物の組織に、ほとんど又は全く損傷を与えない程度まで、Ｈ２Ｏ２／ＲＯＳの産生を抑制できることが、ここに見出された。これは、以下に説明されているように、とりわけ、サブユニットワクチンでの予防接種に道を開く。
【００１０】
全ての非マイコプラズマ細菌では、これらの細胞中のカタラーゼが、形成後、Ｈ２Ｏ２を直ちに分解するので、グリセロリン酸オキシダーゼ活性を有する酵素が細胞内に見出されるという事実に鑑みれば、これは、さらに驚くべきことである。このような場合には、グリセロリン酸オキシダーゼに対して誘導された抗体は、従って、細菌の中に入ることができないので、全く効果を有しない。全ての非マイコプラズマ細菌とは異なり、おそらくは、カタラーゼが欠如している結果、マイコプラズマは、細胞外Ｈ２Ｏ２の産生をもたらすように、進化の間に、細胞内腔から膜へ、そのマイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼを移動させたことがここに見出された。従って、これは、細菌にとって有害でないが、感染された宿主の組織にとっては有害となる。これは、マイコプラズマの場合には、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼに対する抗体が（他の細菌とは反対に）、細胞外Ｈ２Ｏ２を放出する酵素の活性を予想外に妨害することを説明し得る。
【００１１】
マイコプラズマの酵素である、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼは、公知の全てのマイコプラズマ種の中に存在する。Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼに対して行われる全てのさらなる参照は、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼを表す。以下の表１には、マイコプラズマ種、Ｍ．ｓｐ．ボバイングループ７（Ｍ．ｓｐ．  ｂｏｖｉｎｅ  ｇｒｏｕｐ  ７）、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．カプリ（Ｍ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｃａｐｒｉ）、Ｍ．ペネトランス（Ｍ．ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、Ｍ．ガリセプチカム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、Ｍ．モービレ（Ｍ．ｍｏｂｉｌｅ）、Ｍ．パルモニス（Ｍ．ｐｕｌｍｏｎｉｓ）、Ｍ．ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｍ．ニューモニエ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｍ．ジェニタリウム（Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）の株において、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼをコードする遺伝子のＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ受託番号が示されている。さらに、実施例には、マイコプラズマ種、Ｍ．ミコイデスＳ（ｍａｌｌ）Ｃ（ｏｌｏｎｙ）株Ａｆａｄｅ及びＬ２の株において、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼをコードする遺伝子のＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号が示されている。
【００１２】
酵素マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼは、全ての公知のマイコプラズマ種の中に存在するという事実のために、マイコプラズマ感染を駆除するための、より具体的には、宿主細胞の損傷、炎症及び疾病を回避又は減弱するための、本タンパク質に対する抗体を産生するためのその使用は、マイコプラズマ種に関わらず、一般的に適用可能であることが明らかとなった。
【００１３】
マイコプラズマに対する抗体を産生するための原理は、以下の実施例に説明されている。家畜の多大な喪失を招く重度の感染性疾患である伝染性ウシ胸膜肺炎（ＣＢＰＰ）の発病因子であるマイコプラズマ・ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣは、マイコプラズマの病原性の分子的基礎を調査するためのモデルとした使用された。Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣは、宿主細胞と接近して生息する、１２１１ｋｂのゲノムサイズを有する細胞外病原体である（Ｗｅｓｔｂｅｒｇ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１４：２２１−２２７）。モデルとして、この種を使用することの合理性は、この種の高い病原性及びＣＢＰＰの発病因子として明らかに確立されている事実である。さらに、この重いウシの病気は、現在、ＣＢＰＰの発生に苦しむ国で、家畜の生産に対して著しい社会経済的な重要性を有している。さらに、この伝染病が存在しない国は、再発生する感染の脅威に継続的に曝されている。
【００１４】
マイコプラズマ感染を撲滅するために、より具体的には、宿主細胞損傷、炎症及び疾病を回避又は減弱するために、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼに対する抗体を使用することが可能であることが、ここに確立されたので、次の段階は、インビボ及びインビトロで、抗体を産生するために、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼを使用することである。マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼのインビボでの使用の例は、ワクチンでの使用である。このようなワクチンは、投与されると、マイコプラズマに対する抗体を誘導する。これは、以下でさらに詳しく考察されている。マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼのインビボ又はインビトロでの使用の例は、ワクチン中で使用するための抗体を産生するための使用である。このようなワクチンも、以下で考察されている。別のワクチンは、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ（の免疫原性部分）をコードする遺伝子又はその一部を担持する生組換え担体及びマイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ（の免疫原性部分）をコードする遺伝子又はその一部を含むＤＮＡワクチンを基礎とするワクチンである。
【００１５】
様々なマイコプラズマ種において、酵素マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼをコードする配列が公知であるので、十分な量で酵素マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼを取得することが、ここに可能となる。これは、例えば、これらのタンパク質をコードする遺伝子を発現するための発現系を使用することによって行うことが可能である。
【００１６】
マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ（の免疫原性部分）をコードする遺伝子又はその一部を発現させるために必要不可欠であるのは、遺伝子がプロモーターの制御下にあるように、遺伝子に機能的に連結された十分なプロモーターである。これは、例えば、標準的な分子生物学の技術を用いて達成することが可能である。（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２００１．ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−５７７−３）。プロモーターの選択が、タンパク質発現のための宿主細胞として使用される細胞中で遺伝子転写を誘導することが可能な全ての真核、原核又はウイルスプロモータに拡張することは、当業者に自明である。機能的に連結されたプロモーターは、それらが連結された核酸の転写を制御することが可能なプロモーターである。このようなプロモーターは、マイコプラズマプロモーター、例えば、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼをコードする遺伝子のインビボ発現に関与するプロモーター（但し、このプロモーターは、発現のために使用される細胞中で機能的である。）とすることが可能である。プロモーターは、異種のプロモーターとすることも可能である。宿主細胞が細菌である場合には、使用され得る有用な発現調節配列には、Ｔｒｐプロモーター及びオペレーター（Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８，４０５７，１９８０）；ｌａｃプロモーター及びオペレーター（Ｃｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７５，６１５，１９７８）；外膜タンパク質プロモーター（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｇｅ，Ｍ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１，７７１−７７５，１９８２）；バクテリオファージλプロモーター及びオペレーター（Ｒｅｍａｕｔ，Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，４６７７−６８８，１９８３）；α−アミラーゼ（Ｂ．スブチリス）プロモーター及びオペレーター、終結配列並びに選択された宿主細胞と適合性が有るその他の発現増強及び調節配列が含まれる。宿主細胞が酵母である場合、有用な発現調節配列には、例えば、α−接合因子が含まれる。昆虫細胞の場合、バキュロウイルスのポリヘドリン又はｐ１０プロモーターを使用することが可能である（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，２１５６−６５，１９８３）。宿主細胞が哺乳動物起源である場合、有用な発現調節配列の例には、ＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，５２４−５２７，１９８３）又はメタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９６，３９−４２，１９８２）又は熱ショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４９４９−５３，１９８５）が含まれる。
【００１７】
細菌、酵母、真菌、昆虫及び哺乳動物の細胞発現系は、極めて頻繁に使用される系である。このような系は、本分野において周知であり、一般に、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）、Ｎｏｖａｇｅｎ（ｗｗｗ．ｍｅｒｃｋｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ）又はＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．４０３０  Ｆａｂｉａｎ  Ｗａｙ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９４３０３−４６０７，ＵＳＡを通じて商業的に入手可能である。これらの発現系に次いで、寄生生物を基礎とした発現系が、極めて魅力的な発現系である。このような系は、例えば、公開番号２７１４０７４のフランス特許出願及びＵＳ  ＮＴＩＳ公開番号ＵＳ  ０８／０４３１０９（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒｓ，Ｗ．：Ｐｕｂｌｉｃ．Ｄａｔｅ  １  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９３）に記載されている。
【００１８】
例えば、ワクチン接種の目的のために、又は抗体を産生させるためにタンパク質が使用される場合には、しかしながら、完全なタンパク質を使用する必要はない。タンパク質に対する免疫応答を誘導することが可能なタンパク質の断片（そのままの状態であるか、又は、例えばＫＬＨなどの担体に連結されている。）、いわゆる、免疫原性断片を使用することも可能である。「免疫原性断片」とは、宿主中で免疫反応を誘導する能力をなお保持する、すなわち、Ｂ細胞又はＴ細胞エピトープを含む完全長タンパク質の断片であると理解される。この時点で、抗原性断片（決定因子）をコードするＤＮＡ断片を容易に同定するために、様々な技術が利用可能である。Ｇｅｙｓｅｎら（Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ  ８４／０３５６４，Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ  ８６／０６４８７，ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ＮＲ．４，８３３，０９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３９９８−４００２（１９８４），Ｊ．  Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．１０２，２５９−２７４（１９８７））によって記載された方法、いわゆるＰＥＰＳＣＡＮ法は、タンパク質の免疫学的に重要な領域であるエピトープの検出のための、実行が容易で、迅速な、十分に確立された方法である。本方法は、世界中で使用されており、従って、当業者に周知である。この（経験的な）方法は、Ｂ細胞エピトープの検出のために特に適している。また、何れかのタンパク質をコードする遺伝子の配列が与えられれば、現在公知であるエピトープとの配列的及び／又は構造的な一致に基づき、コンピュータアルゴリズムは、免疫学的に重要なエピトープとして、具体的なタンパク質断片を指定することが可能である。これらの領域の決定は、Ｈｏｐｐ及びＷｏｏｄｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３８２４８−３８２８（１９８１））に従う親水性基準とＣｈｏｕ及びＦａｓｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４７：４５−１４８（１９８７）ａｎｄ  ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ４，５５４，１０１）に従う二次構造要因の組み合わせに基づいている。同様に、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙの両親媒性基準の補助を得て、コンピュータによって、配列からＴ細胞エピトープを予測することが可能である（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５，１０５９−１０６２（１９８７）  ａｎｄ  ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＮＴＩＳ  ＵＳ  ０７／００５，８８５）。要約された概説は、共通原理に関するＳｈａｎ  Ｌｕ：Ｔｉｂｔｅｃｈ  ９：２３８−２４２（１９９１）、マラリアエピトープに関するＧｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：１０５９−１０６２（１９８７）、概説として、Ｌｕ；Ｖａｃｃｉｎｅ  １０：３−７（１９９２），ＨＩＶ−エピトープに関するＢｅｒｚｏｗｓｋｙ；Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ５：２４１２−２４１８（１９９１）に見出される。
【００１９】
従って、本発明の第一の実施形態は、マイコプラズマ感染を撲滅するためのワクチンであり、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ又はその免疫原性断片と、及び医薬として許容される担体とを含む前記ワクチンに関する。
【００２０】
これらの遺伝子の発現産物に基づくこのようなワクチンは、以下に記載されているように、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ又はその免疫原性断片を、医薬として許容される担体と混合することによって容易に作製することが可能である。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、ワクチンにおいて使用するためのマイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ又はその免疫原性断片に関する。
【００２２】
さらに別の実施形態は、マイコプラズマ感染を撲滅するためのワクチンを製造するための、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ又はその免疫原性断片の使用に関する。
【００２３】
マイコプラズマ感染に対する予防接種のための別の極めて魅力的なアプローチは、医薬として許容される担体と一緒に、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ又はその免疫原性断片をコードする遺伝子又はその断片を含む生組換え担体（ＬＲＣ）を使用することによるものである。これらのＬＲＣは、さらなる遺伝子情報（この場合には、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ又はその免疫原性断片をコードする遺伝子又はその断片）がクローニングされた微生物又はウイルスである。このようなＬＲＣに感染した動物は、担体の免疫原に対してのみならず、遺伝子コードが、ＬＲＣ中にさらにクローニングされているタンパク質（例えば、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ）の免疫原性部分に対しても免疫原性応答を産生する。細菌のＬＲＣの例として、本分野で公知の弱毒化されたサルモネラ株は、魅力的に使用することが可能である。生組換え担体寄生生物が、とりわけ、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ａ．Ｎ．（Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２８：１１２１−１１３０（１９９８））によって記載されている。また、ＬＲＣウイルスは、核酸を標的細胞中に輸送する手段として使用し得る。生組換え担体ウイルスは、ベクターウイルスとも称される。ベクターとしてしばしば使用されるウイルスは、ワクシニアウイルス（Ｐａｎｉｃａｌｉ  ｅｔ  ａｌ；  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：４９２７（１９８２）、ヘルペスウイルス（Ｅ．Ｐ．Ａ．  ０４７３２１０Ａ２）及びレトロウイルス（Ｖａｌｅｒｉｏ，Ｄ．  ｅｔ  ａｌ；  ｉｎ  Ｂａｕｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｄｉｃｋｅ，Ｋ．Ａ．，Ｌｏｔｚｏｖａ，Ｅ．  ａｎｄ  Ｐｌｕｚｎｉｋ，Ｄ．Ｈ．（Ｅｄｓ．），Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ｔｏｄａｙ−  １９８８．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ｐｐ．９２−９９（１９８９））である。
【００２４】
本分野で周知の、インビボ相同組換えの技術は、本発明の挿入された核酸の発現を宿主細胞中で誘導することが可能な組換え核酸を、選択した細菌、寄生生物又はウイルスのゲノム中に導入するために使用することが可能である。
【００２５】
従って、本発明のさらに別の実施形態は、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼを又はその免疫原性断片コードする生組換え担体と、及び医薬として許容される担体とを含む、マイコプラズマ感染を撲滅するためのワクチンに関する。
【００２６】
機能的に連結されたプロモーターの調節下にある、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ又はその免疫原性断片をコードする遺伝子又はその断片を含む宿主細胞を、本酵素の生産のために使用できることが明らかである。酵素をワクチンとして使用する前に、まず、宿主細胞から酵素を抽出する必要は存在しない。すなわち、宿主細胞は、そのまま使用することも可能である。宿主細胞が、酵素を発現するＬＲＣを含む場合も、同じことが当てはまる。その例は、ウイルス又は細菌のＬＲＣを含む真核細胞である。従って、同じく、本発明の別の実施形態は、機能的に連結されたプロモーターの調節下にある、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ又はその免疫原性断片をコードする遺伝子又はその断片を含む宿主細胞に関する。この形態は、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ又はその免疫原性断片をコードする遺伝子又はその断片を含む生組換え担体を含有する宿主細胞にも関する。宿主細胞は、ｐＢＲ３２２として細菌を基礎としたプラスミド又はｐＧＥＸとして細菌の発現ベクター又はバクテリオファージと組み合わせた、細菌、例えば、エシェリヒア・コリ、バシラス・スブチリス及びラクトバシラス種起源の細胞であり得る。宿主細胞は、真核細胞起源の宿主細胞、例えば、酵母特異的ベクター分子と組み合わせた酵母細胞、又はベクター若しくは組換えバキュロウイスルと組み合わせた、昆虫細胞のようなより高等な真核細胞（Ｌｕｃｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ；  Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７−５５（１９８８））、例えば、Ｔｉ−プラスミドを基礎としたベクター若しくは植物ウイルスベクター（Ｂａｒｔｏｎ，Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ；  Ｃｅｌｌ  ３２：１０３３（１９８３））と組み合わせた植物細胞、同じく、適切なベクター若しくは組換えウイルスを有するＨｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はクランデルネコ腎臓細胞のような哺乳動物細胞でもあり得る。例えば、腸上皮、又は例えば呼吸器上皮に感染するサルモネラ担体又はウイルス担体を基礎とする、酵素又はその免疫原性断片を発現することが可能な上記生組換え担体を基礎とする本発明のワクチンは、マイコプラズマの感染の天然経路をよりよく模倣する点で、サブユニットワクチンを上回る利点を有する。さらに、免疫化のために、組換え担体の少量が必要であるに過ぎないので、それらの自己増殖は有利である。
【００２７】
予防接種の効率的な別の方法は、当該抗原をコードするＤＮＡを用いた直接の予防接種である。タンパク質をコードするＤＮＡを用いた直接の予防接種は、多くの異なるタンパク質において成功を収めている。（例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ  ２：２０−２６（１９９３）に概説されているとおり。）。予防接種のこの方法も、マイコプラズマ感染に対して哺乳動物を予防接種するために極めて魅力的である。従って、本発明の本実施形態のさらに別の形態は、マイコプラズマ感染を撲滅するためのワクチンであり、機能的に連結されたプロモーターの制御下にある、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼをコードする遺伝子又はＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼの免疫原性断片をコードする前記遺伝子の一部と、及び医薬として許容される担体とを含む前記ワクチンに関する。
【００２８】
ＤＮＡワクチンは、例えば、無針注射装置を用いて、皮内適用を通じて容易に投与することが可能である。投与のこの方法は、予防接種すべき動物の細胞中にＤＮＡを直接送達する。１と１００μｇの間の範囲にあるμｇのＤＮＡの量は、極めて優れた結果を与える。
【００２９】
上記ワクチンは全て、活性な予防接種に貢献する。すなわち、宿主の免疫系は、これらのタンパク質に対する抗体を作製するために、酵素又はその免疫原性断片によって引き起こされる。あるいは、このような抗体は、以下に記載されているように、例えば、ウサギの中で作製することが可能であり、又は抗体産生細胞株から得ることが可能である。次いで、このような抗体は、宿主動物に投与することが可能である。予防接種のこの方法（受動予防接種）は、動物が既に感染しており、天然の免疫応答を惹起させる時間が存在しない場合に選択される予防接種である。これは、免疫無防備状態の動物を予防接種するための好ましい方法でもある。マイコプラズマに対する投与された抗体は、これらの事例において、細菌に直接結合することが可能である。これは、マイコプラズマの増殖を直ちに減少させ、又は停止させるという利点を有する。従って、本発明の本実施形態の１つの別の形態は、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ又はその免疫原性断片に対する抗体と、及び医薬として許容される担体とを含むワクチンに関する。
【００３０】
本実施形態のさらに別の形態において、本発明のワクチンは、同一の宿主に対して病原性である別の生物又はウイルスに由来する１つ又はそれ以上の抗原、このような抗原に対する抗体又はこのような抗原をコードする遺伝情報をさらに含む。
【００３１】
好ましい組み合わせワクチンが、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼに次いで、マイコプラズマ完全細胞調製物を含むワクチンであることは言うまでもない。このような組み合わせワクチンは、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼの有害な効果のみならず、他のマイコプラズマ関連タンパク質に対しても保護を誘導する。
【００３２】
ブタ病原性のマイコプラズマ種に対する保護用のマイコプラズマワクチンが作製される場合には、このような生物及びウイルスは、好ましくは、仮性狂犬病ウイルス（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、ブタインフルエンザウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、ブタパルボウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐａｒｖｏ  ｖｉｒｕｓ）、伝染性胃腸炎ウイルス（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、別のマイコプラズマ属種、特に、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ブラキスピラ・ハイオディセンテリー（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、レプトスピラ属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ）、エリシペロスリクス・リューシオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ボルデテラ・ブロンキセプティカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ブラキスピラ・ハイオディセンテリー（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ．）、サルモネラ・コレラエスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、ヘモフィラス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、ラウソニア（Ｌａｕｗｓｏｎｉａ）、パスチュレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）、アクチノバシラス・プリューロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、スタフィロコッカス・ハイカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ）及びクロストリジウム・ペルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の群から選択される。
【００３３】
ウシ病原性のマイコプラズマ種に対する保護用のマイコプラズマワクチンが作製される場合には、このような生物及びウイルスは、好ましくは、ウシヘルペスウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ウシウイルス性下痢症ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｄｉａｒｒｈｏｅａ  ｖｉｒｕｓ）、パラインフルエンザ３型ウイルス（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｔｙｐｅ  ３  ｖｉｒｕｓ）、ウシパラミクソウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、口蹄疫ウイルス（Ｆｏｏｔ  ａｎｄ  Ｍｏｕｔｈ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、ウシ呼吸器多核体ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ）、ブタサーコウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ）、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ）、別のマイコプラズマ属種、パスツレラ・ヘモリティカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、レプトスピラ属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．）、スタフィロコッカス・ウベリス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）、タイレリア・パルバ（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ｐａｒｖａ）、タイレリア・アニュラータ（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ａｎｎｕｌａｔａ）、バベシア・ボビス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ）、バベシア・ビゲミナ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｉｇｅｍｉｎａ）、バベシア・メジャー（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍａｊｏｒ）、トリパノソーマ種（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、アナプラズマ・マージナーレ（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｍａｒｇｉｎａｌｅ）、アナプラズマ・セントラーレ（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｃｅｎｔｒａｌｅ）及びネオスポラ・カニナム（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｎｕｍ）の群から選択される。
【００３４】
家禽病原性のマイコプラズマ種に対する保護用のマイコプラズマワクチンが作製される場合には、このような生物及びウイルスは、好ましくは、鶏痘ウイルス（Ｆｏｗｌｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）、伝染性気管支炎ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、伝染性ファブリキウス嚢病（グンボロ）（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｂｕｒｓａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  （Ｇｕｍｂｏｒｏ））、マレック病ウイルス（Ｍａｒｅｋ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｖｉｒｕｓ）、ニワトリ貧血因子（Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ａｎａｅｍｉａ  ａｇｅｎｔ）、トリレオウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｒｅｏｖｉｒｕｓ）、トルコ鼻気管炎ウイルス（Ｔｕｒｋｅｙ  Ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ニワトリポックスウイルス（Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｐｏｘｖｉｒｕｓ）、トリ脳脊髄炎ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、アヒルペストウイルス（Ｄｕｃｋ  Ｐｌａｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ）、ニューキャッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、産卵低下症候群ウイルス（Ｅｇｇ  Ｄｒｏｐ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ）、伝染性喉頭気管ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｌａｒｙｎｇｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、シチメンチョウのヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ  Ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｔｕｒｋｅｙｓ）、別のマイコプラズマ属種、とりわけ、マイコプラズマ・ガリセプチカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）又はマイコプラズマ・シノビアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｎｏｖｉａｅ）、ヘモフィルス・パラガリナルム（コリーザ）（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  （Ｃｏｒｙｚａ））、オルニソバクテリウム・ライノトラキア（Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ）、クロストリジウム・ペルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、カンピロバクター種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、Ｅ．コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）及びエイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）種の群から選択される。
【００３５】
ヒト病原性のマイコプラズマ種に対する保護用のマイコプラズマワクチンが作製される場合には、このような生物及びウイルスは、好ましくは、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、ムンプスパラミクソウイルス（ｍｕｍｐｓ  ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、クロストリジウム・ジフセリエ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、ボルデテラ・パーチュシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、別のマイコプラズマ属種及びポックスウイルス（ｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）の群から選択される。
【００３６】
好ましくは、上記マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ又はその免疫原性断片は、以下のマイコプラズマのいずれか：Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、Ｍ．ｓｐ．ボバイングループ７（Ｍ．ｓｐ  ．ｂｏｖｉｎｅ  ｇｒｏｕｐ  ７）、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．カプリ（Ｍ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｓｐ．  Ｃａｐｒｉ）、Ｍ．ペネトランス（Ｍ．ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、Ｍ．ガリセプチカム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、Ｍ．シノビエ（Ｍ．ｓｙｎｏｖｉａｅ）、Ｍ．モービル（Ｍ．ｍｏｂｉｌｅ）、Ｍ．パルモニス（Ｍ．ｐｕｌｍｏｎｉｓ）、Ｍ．ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｍ．ニューモニエ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｍ．ジェニタリウム（Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、Ｍ．ミコイデスＳ（ｍａｌｌ）Ｃ（ｏｌｏｎｙ）株Ａｆａｄｅ（Ｍ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ  Ｓ（ｍａｌｌ）  Ｃ（ｏｌｏｎｙ）  ｓｔｒａｉｎ  Ａｆａｄｅ）又はＭ．ミコイデスＳ（ｍａｌｌ）Ｃ（ｏｌｏｎｙ）株Ｌ２（Ｍ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ  Ｓ（ｍａｌｌ）  Ｃ（ｏｌｏｎｙ）  ｓｔｒａｉｎ  Ｌ２）、特に、Ｍ．ボビス、Ｍ．ハイオニューモニエ、Ｍ．ガリセプチカム又はＭ．シノビエ、より具体的には、Ｍ．ボビス又はＭ．ハイオニューモニエによってコードされるマイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼである。
【００３７】
本発明の全てのワクチンは、医薬として許容される担体を含む。医薬として許容される担体は、例えば、無菌水又は無菌生理的塩溶液とすることができる。より複雑な形態において、担体は、例えば緩衝液であり得る。
【００３８】
ワクチンを調製するための方法は、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ若しくはその免疫原性断片、上記生組換え担体、上記遺伝子若しくはその一部、上記宿主細胞又はマイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ若しくはその免疫原性断片に対する抗体と、及び医薬として許容される担体とを混合することを含む。従って、本発明の別の実施形態は、マイコプラズマ感染を撲滅するためのワクチンの調製方法であり、上記マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ若しくはその免疫原性断片、上記生組換え担体、上記遺伝子若しくはその一部、上記宿主細胞又は上記マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ若しくはその免疫原性断片に対する抗体と、及び医薬として許容される担体とを混合することを含む、前記方法に関する。
【００３９】
本発明のワクチンは、好ましい提示において、アジュバントも含有し得る。一般に、アジュバントは、非特異的様式で、宿主の免疫応答を強化する物質を含む。様々な多数のアジュバントが、本分野において公知である。アジュバントの例は、フロイントの完全及び不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、ＱｕｉｌｌＡ（Ｒ）、鉱物油、例えばＢａｙｏｌ（Ｒ）又はＭａｒｋｏｌ（Ｒ）、植物油及びＣａｒｂｏｐｏｌ（Ｒ）（ホモポリマー）又はＤｉｌｕｖａｃ（Ｒ）Ｆｏｒｔｅである。ワクチンは、いわゆる「ビヒクル」も含み得る。ビヒクルとは、それに対する共有結合なしに、ポリペプチドが付着する化合物である。しばしば使用されるビヒクル化合物は、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又は酸化アルミニウム、シリカ、カオリン及びベントナイトである。
【００４０】
抗原がビヒクル中に部分的に埋め込まれている、このようなビヒクルの特殊な形態は、いわゆるＩＳＣＯＭである（ＥＰ  １０９．９４２，ＥＰ  １８０．５６４，ＥＰ  ２４２．３８０）。さらに、ワクチンは、１つ又はそれ以上の適切な界面活性化合物又は乳化剤、例えばＳｐａｎ又はＴｗｅｅｎを含み得る。しばしば、例えば、分解し易いポリペプチドを分解から保護して、ワクチンの保存寿命を延長させるために、又は凍結乾燥効率を改善するために、ワクチンは安定化剤と混合される。有用な安定化剤は、とりわけ、ＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ；  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ５９：５０９（１９５０）、炭水化物、例えば、ソルビトール、マニトール、トレハロース、デンプン、スクロース、デキストラン又はグルコース、アルブミン又はカゼイン又はこれらの分解産物などのタンパク質及びアルカリ金属リン酸塩などの緩衝液である。さらに、ワクチンは、生理的に許容される希釈剤中に懸濁され得る。アジュバント化し、ビヒクル化合物又は希釈剤を添加し、ポリペプチドを乳化し、又は安定化させる別の方法も、本発明において具体化されることは言うまでもない。
【００４１】
本発明のワクチンは、タンパク質の１及び１００μｇの間の量で、極めて適切に投与することが可能であるが、より少量を使用することが原理的に可能である。免疫学的には極めて適切であるが、１００μｇを超える用量は、商業的な理由で、より魅力的でない。
【００４２】
上記ＬＲＣウイルス及び細菌などの、弱毒化された生組換え担体に基づくワクチンは、感染中に自身を増幅するので、ずっと少ない用量で投与することが可能である。従って、極めて適切な量は、それぞれ、細菌及びウイルスに対して、１０３と１０９ＣＦＵ／ＰＦＵの間の範囲である。
【００４３】
多くの投与方法を使用することが可能である。経口適用は、労力を要しないので、投与の極めて魅力的な方法である。経口投与の好ましい方法は、胃の高度に酸性環境を通過した後にのみ崩壊するカプセル中にワクチンを包装することであり、これは、本分野において公知であり、頻繁に使用されている。また、ワクチンは、胃のｐＨを一時的に増大させるために、本分野で公知の化合物と混合することが可能である。例えば、ワクチンの筋肉内適用による、全身適用も適切である。この経路が採用される場合には、全身適用のために本分野で公知の標準的な手法が非常に適している。
【００４４】
マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼに基づくワクチンも、マーカーワクチンとして極めて適切である。マーカーワクチンは、例えば、野生型感染によって誘導される抗体パネルとは異なる、特徴的な抗体パネルに基づいて、予防接種された動物と野外感染した動物との識別を可能とするワクチンである。精製されたマイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼに基づくワクチンは、本タンパク質に対する抗体を誘導するのみであるが、生きた野生型、生きた弱毒化又は不活化された完全なマイコプラズマに基づくワクチン及び野外感染は、細菌のタンパク質の全て又はほとんどに対して抗体を誘導する。これは、明らかに、極めて異なる抗体パネルを与える。精製されたマイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼを含むウェル及び別のマイコプラズマのタンパク質を含むウェルを有する単純なＥＬＩＳＡ検査は、動物から得た血清を試験し、動物が、本発明のワクチンで予防接種されたか、又はマイコプラズマ野外感染に罹患しているかどうかを識別するのに十分である。精製されたマイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼを含むワクチンを予防接種された動物は、マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ以外の他のマイコプラズマのタンパク質に対する抗体を有しない。しかしながら、マイコプラズマでの野外感染に遭遇した動物は、全ての免疫原性マイコプラズマタンパク質に対する抗体を有しており、従って、他の非マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼタンパク質に対する抗体も有する。
【００４５】
従って、本発明の別の実施形態は、一方で本発明のワクチンを用いた予防接種と、他方で完全細胞ワクチンを用いた予防接種又は野外感染とを識別するための診断検査に関し、このような検査は、精製されたマイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ又はその免疫原性断片を含み、別個に、別の非Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼタンパク質を含む。
【００４６】
上に特定されているように発現された本発明のポリペプチド又はその免疫原性断片は、ポリクローナル、単一特異的又はモノクローナル（又はその誘導体）であり得る抗体を産生するために使用することが可能である。ポリクローナル抗体が望まれる場合には、ポリクローナル血清を作製及び加工するための技術が本分野において周知である（例えば、Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｔｅｒ，ｅｄｓ．Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）。本発明のポリペプチド（又はそのバリアント若しくは断片）に対して反応性の本発明のモノクローナル抗体は、本分野でも公知の技術によって、近交系マウスを免疫することによって調製することが可能である（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−９７，１９７５）。
【００４７】
本発明の抗体の大規模な作製方法も、本分野において公知である。このような方法は、ファージディスプレイのために、繊維状ファージ中に、本発明のタンパク質をコードする遺伝情報（の断片）をクローニングすることに基づいている。このような技術は、とりわけ、ｈｔｔｐ：／／ａｘｉｍｔ１．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／〜ｒｅｋ／ａｅｐｐｈａｇｅ．ｈｔｍｌの「ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ」の「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐａｇｅ」並びにＣｏｒｔｅｓｅ，Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）  ｉｎ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．１２：２６２−２６７．，Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．  ＆  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（１９９４）  ｉｎ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．１２：１７３−１８３，Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）  ｉｎ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００７−１６０１０，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）  ｉｎ  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５及びＬｉｔｔｌｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．Ａｄｖ．１２：５３９−５５５による概説論文に記載されている。続いて、ｃａｍｅｌｉｄ重鎖抗体を発現するｃａｍｅｌｉｄ発現ライブラリーをスクリーニングするために、前記ファージを使用する。（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｌａｕｗｅｒｅｙｓ，Ｍ．，Ｊｏｕｒｎ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｒｅｃｏｇｎ．  １２：１３１−１４０（１９９９）  ａｎｄ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４１４：５１２−５２６（１９９７））．所望の抗体を発現するライブラリーから得られた細胞は複製され、続いて、抗体の大規模発現のために使用することが可能である。
【００４８】
実施例
【実施例１】
【００４９】
株、細胞、増殖条件及びＤＮＡ抽出。
【００５０】
別段の記載がなければ、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣ株Ａｆａｄｅ（Ｆａｒｃｈａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ’Ｄｊａｍｅｎａ，Ｃｈａｄで、１９６８年に単離された高度に病原性の野外株）を、病原性研究のために使用した。この株は、天然及び実験条件下で、ＣＢＰＰを引き起こす。別段の記載がある場合には、活性なグリセロール取り込み系ＧｔｓＡＢＣを欠く、より病原性が低い株であるＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣ株Ｌ２を使用した。さらに、標準株ＰＧＩ並びにアフリカ及び欧州の発生に由来する１０個の他の株も、遺伝子分析のために、本研究で使用した。マイコプラズマの培養物は、１０８から１０９コロニー形成単位／ｍＬ（ｃｆｕ／ｍＬ）の密度になるようにマイコプラズマブロス培地中で、又は固体マイコプラズマ寒天培地（Ａｘｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔ．  Ｇｅｎｉｓ  ｌ’Ａｒｇｅｎｔｉｅｒｅ，Ｆｒａｎｃｅ）上で増殖させた。生きたＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣの増殖及び取り扱いは、ＢＬ３封じ込め安全標準を満たす生物学的安全性研究室の中で行った。ＤＮＡ抽出は、以前に記載したとおり行った（Ｃｈｅｎｇ，Ｘ．，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４１：３２２１−３２２８）。遺伝子操作及びサブクローニングについては、エシェリヒア・コリ株ＤＨ５α［Ｆ−φ８０ｄｌａｃＺデルタＭ１５デルタ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ｄｅｏＲｒｅｃＡ１ｅｎｄＡ１ｈｓｄＲ１７（ｒＫ−、ｍＫ＋）ｐｈｏＡｓｕｐＥ４４λ−ｔｈｉ−１ｇｙｒＡ９６ｒｅｌＡ１］及びＢＬ２１（ＤＥ３）［Ｆ’ｄｃｍ  ｏｍｐＴｈｓｄＳ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌλ（ＤＥ３）］を使用した。組換えポリヒスチジンＮ及びＣ末端融合タンパク質の発現のために、ｐＥＴＨＩＳ−１発現ベクター（Ｓｃｈａｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１４５：２１０５−２１１６）を使用した。
【００５１】
ＥＣａＮＥｐ細胞は、地元の食肉処理場から得られた胎児から調製し、２４ウェルマイクロタイタープレート中の、７％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及びペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）が補充されたＥＭＥ−Ｅａｒｌｅ培地中に維持し、加湿された５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で、２×１０５細胞／ウェルの集密度で使用した。ＦＣＳ及び細胞培地は、Ｓｅｒｏｍｅｄ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。細胞は、ＰＣＲを使用してマイコプラズマによる汚染について、又は免疫染色を用いてＢＶＤウイルスによる汚染について、定型的にスクリーニングした。
【００５２】
ＰＣＲ増幅、サザンブロット及びＤＮＡ配列分析。
【００５３】
ｇｌｐＯ特異的ＤＮＡプローブは、標準的なＰＣＲ条件を使用し（Ｃｈｅｎｇ，Ｘ．，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４１：３２２１−３２２８）、オリゴヌクレオチドプライマーｇｌｐＯ ＥｃｏＲＩ Ｎ
【００５４】
【化１】
2009500007.tif 000002
及びｇｌｐＯ ＮｏｔＩ Ｃ
【００５５】
【化２】
2009500007.tif 000003
を用いて、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（Ｄｉｇ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒｏｔｋｒｅｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の存在下でＰＣＲによって構築した。マイコプラズマから得たゲノムＤＮＡの抽出及びサザンブロット分析は、以前に記載されたとおりに行った（Ｐｉｌｏ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９２：３７−４８）。
【００５６】
ＤＮＡ配列決定は、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ  ＡＢ３１００遺伝子分析装置及びＴａｑ色素デオキシターミネータサイクル配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）を用い、オリゴヌクレオチドプライマーｇｌｐＯ ＥｃｏＲＩ Ｎ及びｇｌｐＯ ＮｏｔＩ Ｃを用いて、並びにｇｌｐＯ内部プライマーを用いるプライマーウォーキングによって行った。ＤＮＡ及び推測されたアミノ酸配列は、ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムＰＲＯＳＩＴＥ（Ｂａｉｒｏｃｈ，Ａ．，Ｐ．  Ｂｕｃｈｅｒ，ａｎｄ  Ｋ．  Ｈｏｆｍａｎｎ．  １９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：１８９−１９６）を用いて分析した。ＧｅｎＢａｎｋ及びＥＭＢＬデータベース中の配列との配列比較は、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）を用いて行った。タンパク質の分析は、プログラムＭｏｔｉｆ  Ｓｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｈｉｔｓ．ｉｓｂ−ｓｉｂ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｉｔｓ ｍｏｔｉｆｓｃａｎ）及びＴＭｐｒｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＴＭＰＲＥＤ ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）及び「ｔｏｐｐｒｅｄ」ソフトウェア（ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．  １９９２，Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  ２２５：４８７−９４）を用いることによって実施した。
【実施例２】
【００５７】
組換えＧｌｐＯのクローニング、部位指定突然変異誘発及び発現。
【００５８】
それぞれ、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩに対する制限部位を含有するプライマーｇｌｐＯ ＥｃｏＲＩ Ｎ及びｄ  ｇｌｐＯ ＮｏｔＩ Ｃを用いて、まず、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣ株ＡｆａｄｅのｇｌｐＯ遺伝子を増幅した。さらに、プライマーｇｌｐＯ ＮｏｔＩ Ｃは、変異されたＴＧＧＴｒｐコドンを含んだ。（適切なヌクレオチド置換を有する）プライマー対ｇｌｐＯ ｍｕｔ１Ｌ
【００５９】
【化３】
2009500007.tif 000004
を用いるオーバーラップ伸長ＰＣＲ法（Ｂｒａｍａｎ，Ｊ．，Ｃ．  Ｐａｐｗｏｒｔｈ，ａｎｄ  Ａ．  Ｇｒｅｅｎｅｒ．  １９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３１−４４）を用いて、ｇｌｐＯ遺伝子中の他の２つのマイコプラズマ特異的ＴＧＡＴｒｐコドンを、ＴＧＧＴｒｐコドンと置換した。ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ切断部位を隣接させることによって、ＰＣＲ産物をｐＥＴＨＩＳ−１中にクローニングした。他のタンパク質に対して以前に記載されたように、発現及びポリヒスチジン尾部が付着された融合タンパク質のＮｉ２＋キレートクロマトグラフィーを用いた精製のために、ＤＮＡ配列決定によって構築物を分析し、Ｅ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）中に導入した（Ｓｃｈａｌｌｅｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４５：２１０５−２１１６）。
【実施例３】
【００６０】
血清、ポリクローナル抗体、イムノグロブリン精製及びＦａｂ調製。
【００６１】
アフリカンＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣ株Ａｆａｄｅを用いた、管理された実験的感染から得たウシ血清は、Ａｂｄｏ及び共同研究者によって詳しく記載されている（Ａｂｄｏ，Ｅ．−Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１０９−１２２）。組換えＧｌｐＯに対して誘導されたポリクローナル単一特異的血清は、アジュバント１０（Ｇｅｒｂｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ，Ｇａｉｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）５００μＬと混合された、ＰＢＳ緩衝液ｐＨ８．０（５０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ８．０，１４０ｍＭＮａＣｌ）５００μＬ中の精製された、組換えポリヒスチジン尾部が付加されたタンパク質ＧｌｐＯ１６０μｇでウサギを皮下免疫化した後、２及び４週目に、タンパク質４０及び２０μｇで強化免疫することによって取得した。最後の強化免疫から１０日後に、ウサギから採血した。血液試料から抗血清を調製し、−２０℃で保存した。
【００６２】
製造業者によって指示されたとおり、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、ウサギ抗ＧｌｐＯ血清及び同じウサギの前血清から得られた免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）画分を精製した。製造業者の指示書に従い、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｆａｂ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）を用いて、Ｆａｂ断片の調製を行った。ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４に対して、Ｆａｂ断片を一晩透析し、次いで、フィルター滅菌した。Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．１９７６，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４．）を用いて、タンパク質濃度を測定した。リポタンパク質ＬｐｐＣに対して誘導された単一特異的ウサギ血清は、以前に記載されている（Ｐｉｌｏ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．３４：７６１−７７５．）。
【実施例４】
【００６３】
イムノブロット分析、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４分配及び増殖阻害試験
マイコプラズマから得た総抗原は、以前に記載したとおり調製した（Ｆｌｅｕｒｙ，Ｂ．  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｊ．  Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：２８１４−２８２２）。１：２０００希釈のウシ血清及び１：１０００希釈のウサギ単一特異的血清抗ＧｌｐＯを用いて、イムノブロッティングを行った。
【００６４】
ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４分配法（Ｂｏｒｄｉｅｒ，Ｃ．  １９８１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１６０４−１６０７）により、固定相培養から得られたＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣ総抗原を疎水性及び親水性画分へ分割した。ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４界面活性剤相及び水相から得た試料を、ＧｌｐＯに対して誘導された単一特異的ポリクローナル抗体及びＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣに対して誘導されたウシ血清を用いたイムノブロッティングによって分析した。
【００６５】
希釈されていない補体除去された（ｄｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ）単一特異的ウサギ抗ＧｌｐＯ血清、精製されたＩｇＧ又は抗ＧｌｐＯＩｇＧのＦａｂ断片５及び１０μＬを、マイコプラズマ含有寒天培地上に滴加し、３７℃で４日間プレートを温置することによって、増殖阻害試験を行った。Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣに対する血清を陽性対照として使用し、ＬｐｐＱに対する単一特異的ウサギ血清を陰性対照として使用した。以前に記載されているように、光学顕微鏡下で増殖阻害の観察を実施した（Ｐａｐａｚｉｓｉ，Ｌ．  ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４９：２３０７−２３１６，Ｐｏｖｅｄａ，Ｊ．  Ｂ．，ａｎｄ  Ｒ．  Ｎｉｃｈｏｌａｓ，１９９８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０４：１０５−１１１）。
【実施例５】
【００６６】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）及び免疫金標識
電子顕微鏡のために、予めポリ−Ｌ−リジンで被覆された、金又は白金がスパッタリングされたカバーガラス上のマイコプラズマブロス培地中で、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣを３７℃で５日間培養した。３７℃のＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４で、細胞を３回洗浄し、室温で３０分間、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中に固定した。ＰＢＳで洗浄した後、０．２Ｍグリシン及び１％ＢＳＡが補充されたＰＢＳ緩衝液中、室温で１５分間、カバーガラスをブロッキングし、その後、４℃で一晩、１％ＢＳＡが補充されたＰＢＳ中、１：１００又は１：５０希釈されたウサギ血清抗ＧｌｐＯから得られたＩｇＧとともにカバーガラスを温置した。次いで、ＰＢＳで１０分間、試料を洗浄し、室温で９０分間、ＰＢＳ中に１：５０希釈された、１５ｎｍのコロイド状金が抱合されたヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｒｄｉｆｆ，ＵＫ）で標識した。０．１Ｍカコジル酸塩緩衝液ｐＨ７．４でカバーガラスを洗浄し、標準的なプロトコールに従って、ＳＥＭのために加工した。要約すれば、０．１３Ｍカコジル酸塩緩衝液ｐＨ７．４中の０．１１％ルテニウムレッドを加えた１．３３％ＯｓＯ４中で１５分間、試料をオスミウム酸染色し、０．１Ｍカコジル酸塩緩衝液で洗浄し、増加するエタノール系列を通じて脱水し、ヘキサメチルジシラザンの蒸発によって乾燥させた（Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【００６７】
５ｋＶの加速電圧、８ｍｍの作動距離及び５０，０００から１００，０００倍までの拡大で、二次電子シグナル及び対応する後方散乱された電子シグナルを、高解像度電解放出走査型電子顕微鏡ＤＳＭ９８２Ｇｅｍｉｎｉ（Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で調べた。
【００６８】
対照実験は、一次抗体の省略、並びに、それぞれウサギ抗カルシトニン抗体の使用（Ａｎａｗａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｚｕｒｉｃｈ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及びウサギ前免疫血清の使用を含んだ。
【実施例６】
【００６９】
Ｈ２Ｏ２産生の定量及び阻害アッセイ
Ｈ２Ｏ２産生を測定するために、約５×１０８ｃｆｕ／ｍＬの密度になるまで、３７℃で３日間、マイコプラズマ培養培地中でＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣの株を増殖させた。４℃で１０分間、８０００×ｇで培養物を遠心し、温置培地（６７．６ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．３，１４０ｍＭ  ＮａＣｌ，７ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で１回洗浄し、１０９ｃｆｕ／ｍＬの密度で、予め加温された３７℃の温置培地中に再懸濁し、１ｍＬの分取試料中に分けて、３７℃で１時間温置した。Ｈ２Ｏ２産生を誘導するために、１００μＭの最終濃度（ウシ血清中での生理的濃度）で、マイコプラズマ懸濁液にグリセロールを添加した。グリセロールの添加から０、１、２、５、１０、２０及び１２０分後に、以前に記載されたように（Ｖｉｌｅｉ，Ｅ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｊ．  Ｆｒｅｙ，２００１，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：８５−９２）、過酸化物試験（Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、Ｈ２Ｏ２の産生を測定した。マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼＧｌｐＯを阻害するために、０．２６μｇ／ｍＬから２．６μｇ／ｍＬまでの濃度での温置に続いて、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄することによって、ＧｌｐＯに対して誘導されたＩｇＧの精製されたＦａｂ断片でマイコプラズマを前処理した。Ｈ２Ｏ２産生の誘導後に、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣ細胞の生存性を評価するために、アッセイの終了時に、反応アッセイの分取試料をマイコプラズマ寒天プレート上に播種し、３７℃で増殖させた。
【実施例７】
【００７０】
細胞毒性活性の評価
周密状態に達するまで、胚性ウシ鼻上皮細胞（ＥＣａＮＥｐ細胞）（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｅ．  Ｐｅｔｅｒｈａｎｓ，１９９９，Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８０：１１４７−１１５５）を、２４ウェルプレート中で増殖させた。アッセイの前に、培地を除去し、補充物を含まないＭＥＭ−Ｅａｒｌｅ培地２００μＬによって、又は１００Ｍグリセロールを補充したＭＥＭ−Ｅａｒｌｅ培地によって置き換えた。次いで、５０マイコプラズマ／細胞の感染効率（ＭＯＩ）で、ＥＣａＮＥｐ細胞を感染させた。ＧｌｐＯ活性を遮断するために、０．２６μｇ／ｍＬの抗ＧｌｐＯＦａｂ断片でＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣを前処理した。０．７５％クリスタルバイオレット、０．２５％ＮａＣｌ、１．７５％ホルムアルデヒド及び５０％エタノールでの固定及び染色後に、生きたＥＣａＮＥｐ細胞を計数し、感染後の様々な時点で、位相差顕微鏡下で写真を撮影した。ＬｐｐＣはグリセロール代謝と相関しないので、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣの膜リポタンパク質ＬｐｐＣに対して誘導されたポリクローナルＩｇＧから得られる精製されたＦａｂ断片を対照として使用した。ＥＣａＮＥｐ細胞との接触前に、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣの増殖中に産生されたＨ２Ｏ２が、ウシ細胞に対して有害であるかどうかを測定するために、０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）を通して、グリセロールの存在下で増殖されたＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣの培養物の上清をろ過し、ＥＣａＮＥｐ細胞に添加した。ＥＣａＮＥｐ細胞の生存性は、トリパンブルー排除によって評価した。
【実施例８】
【００７１】
ＥＣａＮＥｐ細胞中のＨ２Ｏ２及びその他のＲＯＳによって引き起こされた酸化的ストレスの検出
ＥＣａＮＥｐ細胞中の細胞内ＲＯＳによる酸化的ストレスを評価するために、５（及び６）−クロロメチルー２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセタート−アセチルエステル（ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）の酸化を使用した。この色素は細胞の中に入り、ＲＯＳによる細胞内酸化後に蛍光シグナルを産生する。以下の修飾を用いて、細胞毒性活性の評価に使用したものと同じ条件を用いた。対照として、Ｈ２Ｏ２及びＲＯＳによる酸化を防ぐために、ＥＣａＮＥｐ細胞を含有するウェルの半分を、３０ｍＭＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）で処理した。次いで、１０μＭＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡとともに、ＥＣａＮＥｐ細胞を１時間温置し、ＭＥＭ−Ｅａｒｌｅ培地で１回洗浄した。次いで、グリセロールの存在下又は不存在下において、５００マイコプラズマ／細胞のＭＯＩで細胞を感染させた。ＧｌｐＯ活性を遮断するために、０．２６μｇ／ｍＬの抗ＧｌｐＯＦａｂ断片でＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣを前処理した。対照として、１５０μＭから４．４ｍＭにわたるＨ２Ｏ２溶液で、細胞を２０分間処理した。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ３００顕微鏡を用いた蛍光顕微鏡法によって、マイコプラズマでの感染から２０分後に、細胞内Ｈ２Ｏ２及びＲＯＳをモニターした。ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡを含む全ての工程（この化学物質の取り扱いを含む。）が、暗所で行われたことに注目されたい。
【００７２】
ヌクレオチド配列受託番号。
【００７３】
Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣ株Ａｆａｄｅ及びＬ２から得られたｇｌｐＯのヌクレオチド配列に対するＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、それぞれ、ＡＪ５８１５６６及びＡＪ５８１５６４である。マイコプラズマｓｐ．ボバイングループ７株ＰＧ５０及びＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．カプリ株ＰＧ３から得られたｇｌｐＯ遺伝子の配列は、それぞれ、ＡＪ５８１５６５及びＡＪ５８１５６７の受託番号で寄託された。
【実施例９】
【００７４】
ｇｌｐＯ遺伝子の遺伝的及び機能的分析
Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣから得られたｇｌｐＯ遺伝子は、３７８アミノ酸ポリペプチドのＧｌｐＯをコードしており、４２．７ｋＤａの予想分子量及び８．１４のｐＩを有する。本遺伝子は、３つのＴＧＡＴｒｐコドンを含有する。本タンパク質は、アミノ酸位置８から３６に推定ＦＡＤ結合部位を有し、表面露出されているように見受けられる。ＴＭｐｒｅｄは、アミノ酸６から２５及び１４０から１５７にわたる２つの顕著な膜貫通領域を同定した。高度に病原性の株Ａｆａｄｅ中において、ｇｌｐＯ遺伝子の後には、遺伝子ｇｌｐＫ（推定グリセロールリン酸キナーゼ）及びｇｌｐＦ（推定グリセロール促進物質因子）が続く。標準株ＰＧ１についても、同じ遺伝子配置が観察される。ｇｌｐＯに対する遺伝子プローブを用いたゲノムＤＮＡのサザンブロット分析は、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣ株Ａｆａｄｅ、Ｌ２、標準株ＰＧＩ並びに分析されたアフリカ及び欧州での発症から得られた１０個の他の株中に、ｇｌｐＯが存在することを示した（データは図示せず。）。単一特異的抗ＧｌｐＯＩｇＧを用いた総抗原のイムノブロット分析は、別個の４５ｋＤａタンパク質バンドを明らかにし、検査されたＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣの全ての株中に、ｇｌｐＯ遺伝子の発現を確認した（データは図示せず。）。Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣ株Ａｆａｄｅ及び株Ｌ２から得られたＧｌｐＯのアミノ酸配列は、標準株ＰＧＩ（４８）のＧｌｐＯのものと同一であることが明らかとなり、様々なマイコプラズマ種のグリセロール−３−リン酸脱水素酵素と類似性を示した（表１）。
【００７５】
ゲノム配列分析は、マイコプラズマがカタラーゼ及びジスムターゼ活性を欠如することを予測する。細胞質のＧｌｐＯ活性は、細胞内Ｈ２Ｏ２毒性を誘導し、次いで、細胞内Ｈ２Ｏ２毒性がマイコプラズマ自体に対して有害であるので、本発明者らは、本酵素が表面膜に存在しているに違いないという仮説を立てた。「ｔｏｐｐｒｅｄ」ソフトウェアを用いた、（表１に列記されている）様々な病原性マイコプラズマ種由来のＧｌｐＯ又は相同的酵素の配列分析によって膜貫通構造が明らかとなり、これらの酵素のドメインが表面に位置すると予想された。Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣの細胞表面にＧｌｐＯが存在することの直接的な証拠は、単一特異的ウサギ抗ＧｌｐＯ血清から得られるＩｇＧを用いた免疫金標識後の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって得られた（図１ａ−ｄ）。マイコプラズマの膜中にＧｌｐＯが存在することを確認するために、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣの総タンパク質を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４相分配に供した。抗ＧｌｐＯ血清は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４相中の４５ｋＤａタンパク質（ＧｌｐＯ）（これは、水相には存在しない。）と強く反応し、ＧｌｐＯがＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣの内在性膜タンパク質であることを示している（図１ｅ）。この株で実験的に感染されたウシから得たウシ血清を用いた、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣのＴｒｉｔｏｎＸ−１１４抽出物のイムノブロット分析は、ＧｌｐＯとともにゲル上を同時に移動するＧｌｐＯ特異的バンドを４５ｋＤａの場所に明らかにし（データは示さず。）、ウシのＣＢＰＰ感染中に、ＧｌｐＯが血清転換に関与することを示している。
【００７６】
マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼとしてのＧｌｐＯの機能を確認するために、本発明者らは、単一特異的抗ＧｌｐＯＩｇＧのＦａｂ断片の存在下又は不存在下で、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣの純粋培養物にグリセロールを添加した後、Ｈ２Ｏ２の産生を測定した。図１ｆに示されているように、中指数関数期の増殖相にある培養物に１００μＭグリセロールを添加することによって、直ちに、増殖培地中へＨ２Ｏ２が放出されて、１０分後に１５０μＭに達し、この濃度は、最長２時間保持された（図１ｆ）。０．２６μｇ／ｍＬの最小濃度の、単一特異的ポリクローナル抗ＧｌｐＯ抗体又は抗ＧｌｐＯＩｇＧのＦａｂ断片で、マイコプラズマ懸濁液を前処理すると、Ｈ２Ｏ２の放出を特異的に遮断することができたが、対照抗体として使用された抗ＬｐｐＣＩｇＧのＦａｂ断片によっては遮断できなかった（図１ｆ）。ＬｐｐＣは、グリセロール代謝とは関係していない、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣの表面リポタンパク質である。グリセロールの補充後に、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣの培養物にカタラーゼを添加することによって、１μＭの濃度（これは、本アッセイの検出レベルである。）を下回るまで、培地中のＨ２Ｏ２レベルが低下した。抗ＧｌｐＯ抗体又は抗ＧｌｐＯＦａｂ断片の添加なし又は添加ありで、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣの世代時間は３．３時間であった。さらに、抗ＧｌｐＯ抗体は、血清滴下増殖阻害試験において効果を有しなかった（データは示さず。）。１００μＭグリセロールの存在下で、２時間増殖され、１５０μＭＨ２Ｏ２を産生した純粋培養物は、３．２時間の世代時間を示したのに対して、グリセロールが添加されなかった対照培養物は、３．３時間の世代時間を有した。このため、マイコプラズマの生存性は、グリセロールによって誘導されたＨ２Ｏ２の産生によって影響を受けなかった。
【実施例１０】
【００７７】
ウシ上皮細胞に対するＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣの細胞毒性
グリセロール代謝から生じるＨ２Ｏ２及び関連のＲＯＳの産生が、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣの病原性に寄与しているかどうかを評価するために、本発明者らは、様々な条件下で、胚性仔ウシ鼻上皮（ＥＣａＮＥｐ）細胞に対する細胞毒性を分析した（図２）。図２ｂに示されているように、５０マイコプラズマ／細胞の感染効率でのＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣ株ＡｆａｄｅによるＥＣａＮＥｐ細胞の感染は、培地中のグリセロールの不存在下で、感染から１時間後に弱い細胞毒性効果をもたらすに過ぎなかった。しかしながら、グリセロールの生理的濃度の存在下で、マイコプラズマでＥＣａＮＥｐ細胞の感染を行った場合には、多くのＥＣａＮＥｐ細胞が表面から剥離され、続いて、完全な溶解を起こした（図２ｃ）。Ｈ２Ｏ２産生を付随的に遮断する０．２６μｇ／ｍＬの濃度の抗ＧｌｐＯＦａｂ断片でマイコプラズマを前処理すると、この細胞毒性効果を遮断することが可能であった。これらの条件下で、ＥＣａＮＥｐ細胞は、感染から１時間後に形態的変化を示さなかった（図２ｄ）。グリセロールを含有する培地中で増殖されたＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣの細胞毒性は、対照として使用された抗ＬｐｐＣＦａｂ断片によって阻害されなかった（図２ｅ）。活性なグリセロール輸送体ＧｔｓＡＢＣに対する遺伝子を欠如し、Ｈ２Ｏ２のごく少量を産生するより病原性が低い株（Ｌ２）を用いると、グリセロールの存在下でＥＣａＮＥｐ細胞を感染させたときに、弱い細胞毒性効果が観察されるのみであった（図２ｆ）。対照実験において、グリセロール、抗ＧｌｐＯＦａｂ若しくは抗体ＬｐｐＣＦａｂ断片のみ又は組み合わせを添加しても、ＥＣａＮＥｐ細胞に影響を及ぼさなかった（データは図示せず。）。細胞毒性実験の速度論（図２ｇ）は、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣで感染されたＥＣａＮＥｐ細胞へのグリセロールの添加後に、細胞毒性の誘導が急速に起こり、２時間後には、７５％の死亡率に達することを示している。より高い感染効率（５００マイコプラズマ／細胞）では、グリセロールの添加から３０分後に、細胞の完全な死亡率に達した。抗ＧｌｐＯＦａｂでのマイコプラズマの前処理は、観察期間全体にわたって、細胞の死亡を完全に阻害した（図２ｇ）。添加されたグリセロールの不存在下で、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣでのＥＣａＮＥｐ細胞の感染は、弱い細胞毒性効果を示すに過ぎず（図２ｇ）、これも抗ＧｌｐＯＦａｂによって阻害することが可能であり、従って、細胞又は培地中へのグリセロールの残留量によるものであり得る。興味深いことに、約１５０μＭＨ２Ｏ２を含有するグリセロールの存在下で増殖されたＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣ培養物のろ過された上清又は細胞培養物への１５０μＭＨ２Ｏ２の添加は、１時間の曝露後に、ＥＣａＮＥｐ細胞に対して目に見える細胞毒性効果を有しなかった。外来Ｈ２Ｏ２のＥＣａＮＥｐ細胞培養物への添加によって誘導された細胞毒性は、まず、４．４ｍＭの濃度で達成され、細胞の多くが、曝露の１時間後に死滅した。この濃度は、グリセロールの存在下での、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣの増殖培地中で測定された濃度より３０倍高い。
【００７８】
Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣでの感染又はグリセロールの添加後に、細胞内Ｈ２Ｏ２及び他のＲＯＳによって引き起こされたＥＣａＮＥｐ細胞中で酸化的ストレスをモニターするために、本発明者らは、ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡでＥＣａＮＥｐ細胞を前処理し、蛍光顕微鏡によって、この化合物の細胞内酸化を検出した（図３）。ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡの酸化によるエステル基の切断が、高度に蛍光性のジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）誘導体の形成を細胞中にもたらすが、酸化されていないＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡは非蛍光である。図３ｃからｄ中に示されているように、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣでのＥＣａＮＥｐ細胞の感染は、グリセロールの添加から２０分後に、ＥＣａＮＥｐ細胞中に蛍光の強い誘導をもたらし、細胞内Ｈ２Ｏ２又はＲＯＳの存在を反映している。これに対して、グリセロールの添加なしの感染されたＥＣａＮＥｐ細胞中には、蛍光は検出されなかった（図３ａ−ｂ）。ＥＣａＮＥｐ細胞の感染前に、抗ＧｌｐＯ抗体でマイコプラズマを処理すると、ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡの細胞内酸化は起こらなかった（図３ｅ−ｆ）。さらに、ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡの細胞内酸化は、細胞培地にグリセロールを添加する前に、抗酸化剤ＮＡＣでＥＣａＮＥｐ細胞を処理することによって遮断された（図３ｇ−ｈ）。グリセロールの添加から１０分後に、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣによって放出された濃度に対応する濃度である１５０μＭの外来Ｈ２Ｏ２を添加すると、ＥＣａＮＥｐ細胞の細胞内酸化は起こらなかった。細胞毒性の誘導の場合と同様、ＥＣａＮＥｐ細胞中での細胞内ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡの酸化を達成するために、４．４ｍＭ外来Ｈ２Ｏ２の濃度が必要であった（図３ｉ−ｊ）。
【００７９】
結論
本発明において、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣのＧｌｐＯは、ＥＣａＮＥｐ細胞に対する細胞毒性において中心的な役割を果たす膜タンパク質として同定された。グリセロールの生理的濃度の存在下で、１０９ｃｆｕ／ｍｌの密度のＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣは、最大１５０μＭまで、培地中にＨ２Ｏ２の比較的大量を放出する。Ｈ２Ｏ２のこの量は、グルコースの存在下で増殖されたマイコプラズマ（ちょうど５０％、Ｈ２Ｏ２産生を刺激すると報告された。）によって産生される量と比べると、約２０倍である。グリセロールの生理的濃度の存在下で、ＥＣａＮＥｐ細胞をＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣに曝露すると、Ｈ２Ｏ２が、まず、それらのサイトゾル中に検出され、続いて、細胞死が起こった。本発明者らは、マイコプラズマによって培地中へ放出されたＨ２Ｏ２濃度と、ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＣＡ酸化及び細胞死を引き起こすために必要とされる濃度との間に、顕著な齟齬を認めた。従って、１５０μＭＨ２Ｏ２を含有するろ過されたマイコプラズマの増殖培地又はＥＣａＮＥｐ細胞への１５０μＭ外来Ｈ２Ｏ２の添加は、サイトゾル中での検出可能なＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ酸化をもたらさず、１時間以内の細胞死ももたらさなかった。このことは、毒性化合物を宿主細胞に首尾よく誘導するためには、マイコプラズマと宿主細胞間の密接な接触が必要であることを示している。この文脈において、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣ、及び、さらには、多くの他の病原性マイコプラズマは、それらの宿主細胞に強固に付着するが、貫通はしないことに注目すべきである。さらに、ＥＣａＮＥｐ細胞に対して、グリセロールによって誘導される細胞毒性効果を得るためには、グリセロールの活発な取り込みが必要である。グリセロールの活発な取り込みに必要とされるＧｔｓＡＢＣ輸送体を欠如し、著しくより低い速度で、１／１０未満のＨ２Ｏ２を産生するＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣの欧州株Ｌ２は、同一の実験条件下で、ＥＣａＮＥｐ細胞に対して、弱い細胞毒性効果を有するに過ぎなかった。株Ｌ２によるグリセロールの残りの取り込みは、グリセロール促進物質因子と推定されるＧｌｐＦによって媒介される、より低効率の輸送体経路を用いて行われると考えられる。
【００８０】
我々の結果に基づいて、本発明者らは、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣによる真核細胞への細胞損傷を引き起こすための以下のモデルを提案する（図４）。間質液中に存在するグリセロールは、高活性のＡＢＣグリセロール輸送体（ＧｔｓＡ、ＧｔｓＢ及びＧｔｓＣ）を介して活発に取り込まれ、続いて、グリセロール−３−リン酸へリン酸化される。次いで、これは、ＧｌｐＯによって、Ｏ２の存在下でＤＨＡＰへと酸化され、これは解糖系に入り、Ｈ２Ｏ２の一分子を産生する。マイコプラズマの宿主細胞膜との緊密な接触によって促進されて、Ｈ２Ｏ２及び付随するＲＯＳは宿主細胞に入る。宿主細胞内では、Ｈ２Ｏ２及びＲＯＳは、細胞傷害の強力な媒介物質及び炎症性プロセスの誘導物質として作用する。これらは、組織細胞を直接障害し、又は宿主細胞遺伝子発現（例えば、ＮＦ−κＢの活性化を介して、又はＦｅｎｔｏｎ反応を介して、炎症促進性遺伝子）を誘導することによって、宿主を損傷すると予想される（Ｃｒｉｃｈｔｏｎ，Ｒ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｊ．  Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９１：９−１８）。興味深いことに、マイコプラズマは、貪食細胞中で呼吸性バーストを誘導することが以前に示されており、宿主によって生成されたＲＯＳが、組織損傷に対してさらに寄与し得ることを示唆する。
【００８１】
Ｈ２Ｏ２及びＲＯＳは、ＮＦ−κＢを活性化することも可能であり、このようにすることによって、真核生物宿主中で、多様な免疫及び炎症促進性遺伝子の発現を誘導し、これは、マイコプラズマによって引き起こされる気道感染において特に重要な可能性がある機序である。
【００８２】
マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ又はマイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼに対する抗体に基づくワクチンは、Ｈ２Ｏ２及びＲＯＳの産生を首尾よく抑制し、このようにすることによって、本ワクチンは、宿主細胞の損傷、炎症及び疾病を予防する。
【００８３】
【表１】
2009500007.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼの位置及び活性。ａ−ｄ、それぞれ、抗ＧｌｐＯから得られたＩｇＧ（ａ，ｂ）及び免疫前血清（ｃ、ｄ）とともに温置されたＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣ株Ａｆａｄｅの免疫金標識を示す走査型電子顕微鏡写真。二次電子顕微鏡写真は、細胞表面（ａ，ｃ）を示しており、後方散乱された電子顕微鏡写真は、１５ｎｍのコロイド状金が抱合された二次抗体（ｂ，ｄ）を明らかにする。スケールバー、５００ｎｍ。ｅ、ＧｌｐＯ抗血清を用いた、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣ株ＡｆａｄｅのＴｒｉｔｏｎＸ−１１４分画された総抗原のイムノブロット分析。レーン１、界面活性剤相、タンパク質２０μｇ；レーン２、水相、タンパク質２０μｇ；Ｓｔｄ、分子量標準、ｆ、１００μＭグリセロールの添加後における、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣ株Ａｆａｄｅの過酸化水素産生。示されているデータは、５つの独立した測定の平均値である。各測定値の標準偏差は、平均値の５％以下であった。三角及び実線、処理されていないＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣ；十字及び破線、抗ＧｌｐＯＩｇＧ由来のＦａｂ断片で前処理されたＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣ；四角及び点線、抗ＬｐｐＣ由来のＦａｂ断片で前処理されたＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣ。
【図２】ＥＣａＮＥｐ細胞に対するＭ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣの細胞毒性（ａ−ｆ）及び細胞生存性アッセイ（ｇ）。ａ、ＥＣａＮＥｐ細胞（対照）；ｂ、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣ株Ａｆａｄｅでの感染から１時間後のＥＣａＮＥｐ；ｃ、グリセロール（１００μＭ）の存在下における、株Ａｆａｄｅでの感染から１時間後のＥＣａＮＥｐ；ｄ、抗ＧｌｐＯＩｇＧ由来のＦａｂ断片で前処理された株Ａｆａｄｅでの、グリセロール（１００μＭ）の存在下における感染から１時間後のＥＣａＮＥｐ；ｅ、抗ＬｐｐＣＩｇＧ由来のＦａｂ断片で前処理された株Ａｆａｄｅでの、グリセロール（１００μＭ）の存在下における感染から１時間後のＥＣａＮＥｐ；ｆ、グリセロール（１００μＭ）の存在下における、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣ株Ｌ２（活性なグリセロール取り込み系を欠く。）で感染されたＥＣａＮＥｐ細胞。全ての実験で、感染効率は、５０マイコプラズマ／細胞であった。ｇ、５０マイコプラズマ／細胞の感染効率で、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣ株Ａｆａｄｅに感染させた後の様々な時点における生きたＥＣａＮＥｐ細胞。三角及び太い実線、１００μＭグリセロールの存在下での、株Ａｆａｄｅによる感染；十字及び点線、抗ＧｌｐＯＦａｂ断片（０．２６μｇ／ｍＬ）で前処理された株ＡｄａｄｅＳＣによる、１００μＭグリセロールの存在下での感染；四角及び破線、グリセロールなしの株Ａｆａｄｅ感染；ダイヤモンド及び細い実線、ＥＣａＮＥｐ細胞のみ（対照）。
【図３】５００マイコプラズマ／細胞の感染効率で、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣ株Ａｆａｄｅに感染されたＥＣａＮＥｐ細胞又はＨ２Ｏ２で処理されたＥＣａＮＥｐ細胞中の細胞内Ｈ２Ｏ２及びＲＯＳの検出。ＥＣａＮＥｐ細胞の位相差顕微鏡写真（ａ、ｃ、ｅ、ｇ及びｉ）及び蛍光顕微鏡写真（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ及びｊ）；グリセロールの不存在下における、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣ株Ａｆａｄｅでの感染から２０分後（ａ，ｂ）；グリセロールが補充された培地中で、株Ａｆａｄｅに感染（ｃ、ｄ）；グリセロールが補充された培地中において、抗ＧｌｐＯＩｇＧ由来のＦａｂ断片で前処理された株Ａｄａｄｅで感染（ｅ、ｆ）；Ｎ−アセチル−Ｌ−システインで前処理され、次いで、グリセロールを加えた培地中、株Ａｄａｄｅで感染（ｇ、ｈ）；４．４ｍＭＨ２Ｏ２が補充された培地中で、２０分間温置（ｉ、ｊ）。
【図４】Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣによって宿主細胞炎症を誘発するためのモデル。ＧｔｓＡＢＣ：活性なグリセロール輸送体及びリン酸化系；ＧｌｐＦ：グリセロール促進物質因子；ＧｌｐＫ：グリセロールキナーゼ；Ｇ３Ｐ：グリセロール−３−リン酸；ＤＨＡＰ：ジヒドロキシアセトンリン酸；ＧｌｐＯ：マイコプラズマのＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ。太い矢印は、Ｍ．ミコイデスｓｕｂｓｐ．ミコイデスＳＣの主要な病原性経路を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009500007.tif 000011
2009500007.tif 000012
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