(57)【要約】  本発明は、改変抗体フラグメントの新しいクラスに関する。本発明は、１つ又は複数のエフェクター分子が結合している抗体フラグメントであって、重鎖（ＣＨＩ）及び軽鎖（ＣＬ）の定常領域間の天然の鎖間ジスルフィド結合が存在せず、重鎖（ＣＨＩ）及び軽鎖（ＣＬ）の定常領域が、一方が軽鎖定常（ＣＬ）領域にあり他方が重鎖定常（ＣＨＩ）領域にある工学的改変システイン対の間の鎖間ジスルフィド結合により連結していることを特徴とする抗体フラグメントを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ又は複数のエフェクター分子が結合している抗体フラグメントであって、重鎖（ＣＨ１）及び軽鎖（ＣＬ）の定常領域間の天然の鎖間ジスルフィド結合が存在せず、重鎖（ＣＨ１）及び軽鎖（ＣＬ）の定常領域が、一方が軽鎖（ＣＬ）定常領域中にあり他方が重鎖（ＣＨ１）定常領域中にある工学的改変システイン対の間の鎖間ジスルフィド結合により連結していることを特徴とする抗体フラグメント。
【請求項２】
工学的改変システイン対の位置が、軽鎖の１１６位と重鎖の１３８位、軽鎖の１１９位と重鎖の１２８位、又は軽鎖の２１０位と重鎖の１２９位から選択される請求項１に記載の抗体フラグメント。
【請求項３】
少なくとも１つのエフェクター分子が、抗体フラグメント中のシステインに結合している請求項１又は請求項２に記載の抗体フラグメント。
【請求項４】
重鎖（ＣＨ１）及び軽鎖（ＣＬ）の定常領域が、工学的改変システイン対の間の鎖間ジスルフィド結合により連結している抗体フラグメントであって、前記システイン対の位置が軽鎖の１１６位と重鎖の１３８位、軽鎖の１１９位と重鎖の１２８位、又は軽鎖の２１０位と重鎖の１２９位から選択されることを特徴とする抗体フラグメント。
【請求項５】
抗体フラグメントがＦａｂ又はＦａｂ’である請求項１から４までのいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
【請求項６】
天然の鎖間システインが、別のアミノ酸により置換されている請求項１から５までのいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
【請求項７】
天然の鎖間システインが、セリンにより置換されている請求項６に記載の抗体フラグメント。
【請求項８】
抗体フラグメントがＦａｂ’であり、エフェクター分子がヒンジ領域中のシステインに結合している請求項１、２又は３のいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
【請求項９】
エフェクター分子が鎖間システインのそれぞれに結合している請求項１、２又は３のいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
【請求項１０】
エフェクター分子がＰＥＧである請求項１から３までのいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
【請求項１１】
請求項１に記載の抗体フラグメントを作製する方法であって、
ａ）重鎖（ＣＨ１）及び軽鎖（ＣＬ）の定常領域が、一方が軽鎖（ＣＬ）定常領域中にあり他方が重鎖（ＣＨ１）定常領域中にある工学的改変システイン対の間の鎖間ジスルフィド結合により連結している抗体フラグメントを、抗体フラグメントのシステイン中に遊離のチオール基を作り出すことができる還元剤で処理すること、及び
ｂ）処理されたフラグメントをエフェクター分子と反応させること
を含む方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の抗体フラグメントを精製するステップ（ｃ）をさらに含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
還元剤が、非チオール還元剤である請求項１１又は請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体フラグメントに関し、より具体的には、１つ又は複数のエフェクター分子が結合している抗体フラグメント及びそれらの作製方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
抗体の可変領域の高い特異性と親和性とにより、抗体は、特にタンパク質：タンパク質の相互作用を調節するための理想的な診断及び治療用の物質となる。抗体フラグメントは、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）のような製品の近年の成功により示されるように、多用途の治療用物質であることが証明されている。Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２及びその他の抗体フラグメントにコードされている標的機能は、直接用いることができるか、又は細胞毒性剤、トキシン若しくはポリマー分子のような１つ又は複数のエフェクター分子にコンジュゲートさせて有効性を増大させることができる。例えば、これらのフラグメントはＦｃ領域を欠いているので、動物の中で短い循環半減期を有するが、このことはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなある種類のポリマーへのコンジュゲートにより改善できる。コンジュゲートされたＰＥＧのサイズの増大は、数分から数時間のレベルへ循環半減期を増加させることが示され、５ｋＤａ〜１００ｋＤａの範囲のＰＥＧを用いたＦａｂ’の改変が示されている（Ｃｈａｐｍａｎら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７、７８０〜７８３；Ｌｅｏｎｇら、２００１、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１６、１０６〜１１９；Ｃｈａｐｍａｎ、２００２、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４、５３１〜５４５）。ＣＤＰ８７０のようなＰＥＧ化された抗体フラグメントは、現在、臨床試験中であり、コンジュゲートさせたＰＥＧの効果は、循環半減期を治療のために許容されるレベルにする。
【０００３】
エフェクター分子は、アルデヒド糖を介すること、又はより一般的には例えば任意の遊離のアミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシ若しくはカルボキシ基のような抗体フラグメントに位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基を介することを含む、いくつかの異なる方法により抗体フラグメントに結合させることができる。エフェクター分子の結合部位は、ランダム又は部位特異的のいずれかであり得る。
【０００４】
ランダム結合は、しばしば、リシンのようなアミノ酸を介して行われ、このことにより、リシンの位置に応じて抗体フラグメント全体にわたっていくつかの部位にエフェクター分子が結合される。いくつかの場合においてこのことは成功しているが、結合されるエフェクター分子の厳密な位置及び数は制御できず、このことにより、例えば結合するものが少なすぎると活性の損失を、及び／又は例えばこれらが抗原結合部位を妨げると親和性の損失を導き得る（Ｃｈａｐｍａｎ、２００２、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４、５３１〜５４５）。結果として、エフェクター分子の制御された部位特異的結合は、通常、選択される方法である。
【０００５】
エフェクター分子の部位特異的結合は、最も一般的には、システイン残基への結合により達成される。なぜなら、このような残基は、抗体フラグメント中では比較的一般的ではないからである。抗体のヒンジは、部位特異的結合用に一般的である。なぜなら、ヒンジはシステイン残基を含み、抗原結合に関与しそうな抗体のその他の領域から離れているからである。適切なヒンジは、フラグメント中に天然に存在するか、又は組換えＤＮＡ技術を用いて創出してよい（例えば米国特許第５６７７４２５号；ＷＯ９８／２５９７１；Ｌｅｏｎｇら、２００１、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１６、１０６〜１１９；Ｃｈａｐｍａｎら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７、７８０〜７８３を参照されたい）。代わりに又はこれに加えて、部位特異的システインは、抗体フラグメント中に工学的に導入して、エフェクター分子の結合のために例えば表面に露出したシステインを創出してもよい（米国特許第５２１９９９６号）。
【０００６】
天然及び工学的改変システインがエフェクター分子の部位特異的結合のために用いられている抗体フラグメントの例が、最近、記載されている（ＷＯ２００５００３１６９、ＷＯ２００５００３１７０及びＷＯ２００５００３１７１を参照されたい）。これらのフラグメントの全てにおいて、重鎖及び軽鎖（ＣＨ１及びＣＬ）の定常領域間の天然の鎖間ジスルフィド結合は、存在しない。なぜなら、鎖間システインがエフェクター分子の結合部位として用いられているか、又は鎖間システインを別のアミノ酸に置換してこれらのシステインへのエフェクター分子の結合を避けているからである。これらのフラグメントは、エフェクター分子の結合部位として用いるための工学的改変システインも含んでよい。ある例において、これらの工学的改変システインは、抗体フラグメント出発物質の重鎖及び軽鎖の定常領域間のジスルフィド結合を形成する工学的改変システイン対である。しかし、これらのジスルフィド結合は、エフェクター分子がこれらのシステインに一旦結合すると失われる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、天然の鎖間ジスルフィド結合ではない工学的改変鎖間ジスルフィド結合により抗体フラグメントの重鎖及び軽鎖が連結している、代替の抗体フラグメント−エフェクター分子コンジュゲートを提供する。この工学的改変鎖間ジスルフィド結合は、強い還元剤を用いた場合でさえもエフェクター分子の結合の間、維持される。本発明は、システイン対をうまく工学的に改変して、還元剤及びエフェクター分子がほとんど接近できないように十分に埋め込まれたジスルフィド結合を導入することができる抗体の軽鎖：重鎖界面中の部位も提供する。
【０００８】
これらのフラグメントの特定の利点は、工学的改変鎖間システイン間のジスルフィド結合が、エフェクター分子結合の間に無傷のままであることにある。
【０００９】
よって、本発明によると、１つ又は複数のエフェクター分子が結合している抗体フラグメントであって、重鎖（ＣＨ１）及び軽鎖（ＣＬ）の定常領域間の天然の鎖間ジスルフィド結合が存在せず、重鎖（ＣＨ１）及び軽鎖（ＣＬ）の定常領域が、一方が軽鎖定常（ＣＬ）領域中にあり他方が重鎖定常（ＣＨ１）領域中にある工学的改変システイン対の間の鎖間ジスルフィド結合により連結していることを特徴とする抗体フラグメントを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書において用いられる場合、用語「天然の鎖間ジスルフィド結合」は、天然に存在する生殖細胞系抗体遺伝子においてコードされる重鎖及び軽鎖の定常領域のシステインの間に存在する鎖間ジスルフィド結合のことをいう。特に、天然の鎖間システインは、天然に存在する抗体において互いにジスルフィドで連結している軽鎖の定常領域（ＣＬ）のシステイン及び重鎖の第一の定常領域（ＣＨ１）のシステインである。このようなシステインの例は、典型的には、Ｋａｂａｔら、１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡにより定義されるような、ヒトＩｇＧ１の軽鎖の２１４位及び重鎖の２３３位、ヒトＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の重鎖の１２７位、ヒトＩｇＤ及びＩｇＡ２Ｂの重鎖の１２８位に見出し得る。これらのシステインの厳密な位置は、抗体フラグメントに欠失、挿入及び／又は置換のような任意の改変が行われると、天然に存在する抗体のものから変動してよいことが認識されるだろう。
【００１１】
本発明の抗体フラグメントにおいて、天然の鎖間ジスルフィド結合は存在しない。天然の鎖間ジスルフィド結合は、鎖間システインに１つ又は複数のエフェクター分子が結合するので、存在しなくてよい。例えば、ＷＯ２００５００３１７０及びＷＯ２００５００３１７１に記載されるフラグメントを参照されたい。よって、本発明のある実施形態において、エフェクター分子が、抗体フラグメントのＣＬの天然の鎖間システイン及びＣＨ１の天然の鎖間システインに結合するので、天然の鎖間ジスルフィド結合は存在しない。ある実施形態において、エフェクター分子が結合するＣＬの鎖間システインは、軽鎖の２１４位にあり、エフェクター分子が結合するＣＨ１の鎖間システインは、重鎖の２３３位にある。
【００１２】
別の実施形態において、天然の鎖間ジスルフィド結合は、鎖間システインがセリンのような別のアミノ酸で置換されているので、本発明の抗体フラグメント中に存在しない。天然の鎖間システインがセリンで置換されている抗体フラグメントは、ＷＯ２００５００３１６９に記載されている。
【００１３】
本発明の抗体フラグメントにおいて、重鎖及び軽鎖の定常領域は、軽鎖定常領域（ＣＬ）中の工学的改変システインと、重鎖定常領域（ＣＨ１）中の工学的改変システインとの間の鎖間ジスルフィド結合により連結される。本明細書において用いられる場合、用語「工学的改変システイン」は、天然の生殖細胞系抗体配列においてはシステインが存在しない位置で抗体フラグメント配列に導入されたシステインのことをいう。典型的には、工学的改変システインは、その位置にて通常見い出される別のアミノ酸を置換する。システインは、典型的には、重鎖定常領域（ＣＨ１）中のシステインと軽鎖定常領域（ＣＬ）中のシステインとからなるシステイン対として工作される。システイン対は、抗体フラグメントの重鎖と軽鎖との間にジスルフィド結合が形成されることを可能にする。
【００１４】
工学的改変システインについての適切な位置は、重鎖及び軽鎖の定常領域にシステインを工学的に導入し、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロッティングのような本明細書に記載される方法を用いてエフェクター分子の結合の前後のシステイン間のジスルフィド結合の存在を試験することにより、当業者により経験的に決定できる。当業者は、ジスルフィド架橋の導入のための部位を予測するコンピュータプログラム又は構造の視覚的な検分と組み合わせた抗体Ｘ線結晶構造のような（例えば米国特許出願第２００３０１２５２３２号を参照されたい）当該技術において利用可能な情報を用いて、システイン残基の導入のために適するであろう可能性のある位置を同定できる。ジスルフィド結合は、タンパク質を試して安定化すること、及びジスルフィド対を形成するかについてシステインアミノ酸の構造的及び近傍の要件を研究することの両方のために、いくつかのモデルタンパク質の中に工学的に導入されている（Ｄａｎｉら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．２００３  ｖ６  ｐｌ８７〜１９３において概説されている）。新規なジスルフィド結合形成システインの導入のために有用である可能性がある部位を同定するために用いられるであろうコンピュータソフトウェアも、創出されている（Ｄａｎｉら、２００３）。Ｄａｎｉらによる参照タンパク質データセットの分析は、タンパク質表面に近い比較的可動性の領域にある位置を選択することが望ましいことを示した。このことにより、タンパク質構造が、著しいエネルギー的な不利益をこうむることなく弛緩できることが確実になる。抗体Ｉｇ折り畳みに基づく変異形は、最も顕著には「ｄｓＦｖ」としてのＦｖ領域にジスルフィド結合を導入することにより（Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９：１３６２〜１３６７）、ロイシンジッパーにより二量体化されたｓｃＦｖ「ミニ抗体」の安定化のために（Ｐａｃｋ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ  １９９２  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：１５７９〜１５８４）、及びｓｃＦｖドメインの二量体化のために（ＭｃＣａｒｔｎｅｙら、１９９４  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ８：３０１〜３０４）、安定化されている。ＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインも、所望のＦｃヘテロ二量体化を助けるために、６つの位置にシステインを導入されている（Ｍｅｒｃｈａｎｔら、１９９８  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７〜６８１）。
【００１５】
天然のジスルフィドの物理的特性は、詳細に記載され（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ  １９９９  ｖ１２  ｐ５３５〜５４８）、硫黄−硫黄の距離は約２．０２Åで最適であり、２．００〜２．０４Åの非常に狭い好適範囲である。Ｃα−Ｃα距離は、約５．８Åで最適であるが、その範囲は約４．８〜６．４Åのより広い幅である。ジスルフィド結合は、Ｃα及びＣβ原子に関してまっすぐでないことも知られている：ＣβＳＳ角度は約１０５°であるが、ＣαＣβＳ角度は約１１５°である。ある実施形態において、残基は、好ましくは２．０〜１０Åの範囲、より好ましくは４．８〜６．４Åの範囲、さらにより好ましくは最適な約５．８Åに近いそれらのＣα−Ｃα距離に基づいて選択してよい。別の実施形態において、理論的Ｃα−Ｃα距離の範囲の外の対も考慮してよい。なぜなら、結晶構造が多立体配座タンパク質の単独の静的立体配座を表すこと、並びに全てのタンパク質及び二量体タンパク質及び特にそれらのポリペプチド領域は柔軟且つ可動性であり、よってより大きい又はより小さい理論的Ｃα−Ｃα距離に順応し得ることの両方が知られているからである。さらに、ｃカッパ：ＣＨ１界面上の位置を試験してもよい。なぜなら、まさに中央位置の位置は、溶媒に曝露されにくいからである。
【００１６】
好ましくは、ｃカッパ又はｃラムダの工学的改変軽鎖システインは、ヒトＩｇＧ１のＣＬの１１６位、１１９位又は２１０位の任意の１つで導入される。好ましくは、重鎖システインは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ１の１３８位、１２８位又は１２９位の任意の１つで導入される。ある実施形態において、鎖間ジスルフィド結合は、ＣＬの１１６位での工学的改変システインとＣＨ１の１３８位での工学的改変システインとの間にある。別の実施形態において、鎖間ジスルフィド結合は、ＣＬの１１９位での工学的改変システインとＣＨ１の１２８位での工学的改変システインとの間にある。別の実施形態において、鎖間ジスルフィド結合は、ＣＬの２１０位での工学的改変システインとＣＨ１の１２９位での工学的改変システインとの間にある。
【００１７】
本発明は、本発明の抗体−エフェクター分子コンジュゲートの作製のために有用な中間体も提供する。よって、本発明は、重鎖（ＣＨ１）及び軽鎖（ＣＬ）の定常領域が、工学的改変システイン対の間の鎖間ジスルフィド結合により連結している抗体フラグメントであって、システイン対の位置が軽鎖の１１９位と重鎖の１３８位、軽鎖の１１９位と重鎖の１２８位、又は軽鎖の２１０位と重鎖の１２９位から選択されることを特徴とする抗体フラグメントも提供する。
【００１８】
ともにヒトのアイソタイプであるカッパ及びラムダの軽鎖の間、及び種、特にヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ラクダ科及びサメの間での配列及び構造の類似性が高いので、これらの抗体配列において、類似の残基位置を同定し、システインに変異させ得ることが当業者には理解されるだろう。
【００１９】
本発明の抗体フラグメントは、抗体の可変及び定常領域をコードするＤＮＡの操作及び再発現を含む組換えＤＮＡ技術を用いることにより作製してよい。標準的な分子生物学的技術を用いて、所望によりアミノ酸又はドメインをさらに改変、付加又は欠失させてよい。可変又は定常領域への任意の変更が、本明細書において用いる用語「可変」及び「定常」領域に包含される。好ましくは、ＰＣＲを用いて重鎖（ＣＨ１）及び軽鎖（ＣＬ）の定常領域中に工学的改変システイン残基を導入する。適切なＰＣＲプライマーを設計するための方法は、当該技術において公知であり、抗体ＣＨ１及びＣＬドメインの配列は、容易に入手可能である（Ｋａｂａｔら、上記）。代わりに、システインは、Ｗｈｉｔｅ編、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３）に記載されるような部位特異的突然変異誘発を用いて導入してよい。
【００２０】
本発明において用いるための抗体フラグメント出発物質は、可変（ＶＨ／ＶＬ）及び定常（ＣＨ／ＣＬ）領域を含む任意の重鎖及び軽鎖の対であってよい。好ましくは、抗体フラグメントは、Ｆａｂ又はＦａｂ’又はＷＯ２００５００３１７０に記載されるような切断型Ｆａｂフラグメントである。
【００２１】
本発明において用いるためのＦａｂ’フラグメントは、天然又は改変されたヒンジ領域を有してよい。天然のヒンジ領域は、抗体分子のＣＨ１ドメインと通常は結合するヒンジ領域である。改変されたヒンジ領域は、天然ヒンジ領域とは長さ及び／又は組成が異なる任意のヒンジである。このようなヒンジは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ又はヤギのヒンジ領域のような任意の適切な種からのヒンジ領域を含むことができる。その他の改変ヒンジ領域は、ＣＨ１ドメインのものとは異なるクラス又はサブクラスの抗体に由来する完全ヒンジ領域を含んでよい。つまり、例えば、クラスγ１のＣＨ１ドメインを、クラスγ４のヒンジ領域に結合させてよい。代わりに、改変ヒンジ領域は、天然ヒンジ、又は反復の各単位が天然ヒンジ領域に由来する反復単位の一部分を含んでよい。さらなる代替において、天然ヒンジ領域は、１つ若しくは複数のシステイン又はその他の残基をアラニンのような中性残基に変換することにより、或いは適切な位置の残基をシステイン残基に変換することにより、変更してよい。このような手段により、ヒンジ領域中のシステイン残基の数は、増加又は減少させてよい。さらに、軽鎖の鎖間システインからのヒンジシステインの距離、ヒンジのシステイン間の距離、及び柔軟性のようなヒンジの特性に影響し得るヒンジ中のその他のアミノ酸の組成のようなヒンジのその他の特徴を制御でき、例えばヒンジにグリシンを導入して回転の柔軟性を増加させてよいか、又はプロリンを導入して柔軟性を低減させてよい。代わりに、荷電又は疎水性の残基の組合せをヒンジに導入して、多量体化特性を与えてよい。その他の改変ヒンジ領域は、完全に合成であってよく、長さ、組成及び柔軟性のような所望の特性を有するように設計してよい。いくつかの改変ヒンジ領域は、例えば米国特許第５６７７４２５号、ＷＯ９９１５５４９、ＷＯ９８２５９７１及びＷＯ２００５００３１７１にすでに記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【００２２】
本発明の抗体フラグメント出発物質は、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、並びに例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むそれらのサブクラスを含む任意の抗体アイソタイプに由来してよい。好ましくは、本発明の抗体フラグメントは、ＩｇＧ１に由来する。抗体フラグメント出発物質は、例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトを含む任意の種から得られてよい。抗体フラグメントの部分は、１より多い種から得られてよく、例えば抗体フラグメントはキメラであってよい。ある例において、定常領域はある種からであり、可変領域は別の種からである。別の例において、抗体フラグメントの可変領域は、組換えＤＮＡ工学技術を用いて創出される。このような工学的改変された種類は、例えば天然抗体のアミノ酸配列での挿入、欠失又は変更により天然抗体可変領域から創出されたものを含む。この種類の具体例は、少なくとも１つのＣＤＲと、場合によって、第一の抗体からの１つ又は複数のフレームワークアミノ酸と、第二の抗体からの可変領域ドメインの残りとを含む工学的改変可変領域ドメインを含む。
【００２３】
本発明の組換え抗体フラグメントは、宿主細胞中で一旦産生されると、当該技術において知られる任意の適切な方法を用いて抽出及び精製してよい。適切な精製方法は、限定されないが、サイズ排除、疎水性相互作用クロマトグラフィー、プロテインＡ、Ｇ又はＬ親和性クロマトグラフィー及びイオン交換を含む。
【００２４】
組換え抗体フラグメントを創出及び製造する方法は、当該技術において公知である（例えばＢｏｓｓら、米国特許第４８１６３９７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第６３３１４１５号；Ｓｈｒａｄｅｒら、ＷＯ９２／０２５５１；Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、３８３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３２２、３２３；Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５５８５０８９号；Ａｄａｉｒ、ＷＯ９１／０９９６７；Ｍｏｕｎｔａｉｎ及びＡｄａｉｒ、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ、１０、１〜１４２；Ｖｅｒｍａら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５〜１８１を参照されたい）。
【００２５】
本発明の抗体フラグメントは、一般的に、抗原に選択的に結合することができる。抗原は、例えば細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞又は腫瘍細胞のような細胞上の細胞表面抗原のような任意の細胞結合抗原であってよいか、或いは可溶性抗原であってよい。抗原は、例えば受容体及び／又はそれらに対応するリガンドのような疾患又は感染の間にアップレギュレートされる抗原のような任意の医療的に関連する抗原でもあってよい。細胞表面抗原の具体例は、例えばＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン若しくはＬ−セレクチンのようなβ１インテグリンのようなインテグリンのような接着分子、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、胎児性癌抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、並びにＶＥＧＦ、並びに適切であればそれらの受容体を含む。可溶性抗原は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６又はＩＬ−１７のようなインターロイキン、例えば呼吸系発疹ウイルス又はサイトメガロウイルス抗原のようなウイルス抗原、ＩｇＥのような免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ又はインターフェロンγのようなインターフェロン、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦのようなコロニー刺激因子、及びＰＤＧＦ−α及びＰＤＧＦ−βのような血小板由来増殖因子、並びに適切であればそれらの受容体を含む。
【００２６】
本明細書で用いられる場合、エフェクター分子の用語は、例えば抗腫瘍剤、薬剤、トキシン（例えば細菌又は植物起源の酵素活性トキシン及びそれらのフラグメント、例えばリシン及びそれらのフラグメント）、例えば酵素のような生物活性タンパク質、その他の抗体又は抗体フラグメント、合成又は天然に存在するポリマー、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらのフラグメントのような核酸及びそれらのフラグメント、放射性核種、特に放射性ヨウ素、放射性同位体、キレート化された金属、ナノ粒子及び蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分析により検出され得る化合物のようなレポーター基を含む。
【００２７】
具体的な抗腫瘍剤は、ナイトロジェンマスタード（例えばクロラムブシル、メルファラン、メクロレタミン、シクロスホファミド又はウラシルマスタード）及びそれらの誘導体、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、ブスルファン又はシスプラチンのような例えばアルキル化剤のような細胞傷害性及び細胞増殖抑制性物質；メトトレキセート、フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルオロ酢酸又はフルオロクエン酸のような代謝拮抗物質；ブレオマイシン（例えばブレオマイシンサルフェート）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン（例えばマイトマイシンＣ）、アクチノマイシン（例えばダクチノマイシン）、プリカマイシン、カリケラマイシン及びその誘導体、又はエスペラマイシン及びその誘導体のような抗生物質；エトポシド、ビンクリスチン又はビンブラスチン及びそれらの誘導体のような有糸分裂阻害剤；エリプチシンのようなアルカロイド；タキシシン−Ｉ又はタキシシン−ＩＩのようなポリオール；アンドロゲン（例えばドロモスタノロン又はテストラクトン）、プロゲスチン（例えば酢酸メゲストロール又は酢酸メドロキシプロゲステロン）、エストロゲン（例えばジメチルスチルベストロールジホスフェート、ポリエストラジオールホスフェート又はエストラムスチンホスフェート）、又は抗エストロゲン（例えばタモキシフェン）のようなホルモン；ミトキサントロンのようなアントラキノン；ヒドロキシウレアのような尿素；プロカルバジンのようなヒドラジン；或いはダカルバジンのようなイミダゾールを含む。
【００２８】
キレート化された金属は、２〜８（境界含む）の配位数を有する２又は３正電荷の金属のキレートを含む。このような金属の具体例は、テクネチウム（Ｔｃ）、レニウム（Ｒｅ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、鉛（Ｐｂ）、ビスマス（Ｂｉ）、インジウム（Ｉｎ）、ガリウム（Ｇａ）、イットリウム（Ｙ）、テルビウム（Ｔｂ）、ガドリニウム（Ｇｄ）及びスカンジウム（Ｓｃ）を含む。一般的に、金属は、好ましくは放射性核種である。具体的な放射性核種は、９９ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５８Ｃｏ、６０Ｃｏ、６７Ｃｕ、１９５Ａｕ、１９９Ａｕ、１１０Ａｇ、２０３Ｐｂ、２０６Ｂｉ、２０７Ｂｉ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８８Ｙ、９０Ｙ、１６０Ｔｂ、１５３Ｇｄ、Ｌｕ１７７及び４７Ｓｃを含む。
【００２９】
キレート化された金属は、例えば非環状又は環状ポリアミン、ポリエーテル（例えばクラウンエーテル及びその誘導体）；ポリアミド；ポルフィリン；及び炭素環式誘導体のような任意の適切な多配座キレート化剤でキレート化された上記の種類の金属の１つであってよい。
【００３０】
一般的に、キレート化剤の種類は、用いる金属に依存する。しかし、本発明によるコンジュゲートにおいて特に有用なキレート化剤のある群は、非環状又は環状のポリアミン、特に例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸及びその誘導体のようなポリアミノカルボン酸、並びに例えば環状トリアザ及びテトラアザ誘導体（例えば国際特許明細書ＷＯ９２／２２５８３に記載されるもの）のようなマクロ環状アミン；並びにポリアミド、特にデスフェリオキサミン及びその誘導体である。
【００３１】
その他のエフェクター分子は、タンパク質、ペプチド及び酵素を含む。対象の酵素は、限定されないが、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼを含む。対象のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドは、限定されないが、免疫グロブリン、アルブミン、アブリン、リシンＡ、シュードモナスエキソトキシン又はジフテリアトキシンのようなトキシン、インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子又は組織プラスミノゲン活性化因子のようなタンパク質、例えばアンジオスタチン若しくはエンドスタチンのような血栓剤又は抗血管新生剤、或いはリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）又はその他の増殖因子及び免疫グロブリンのような生物学的応答調節剤を含む。
【００３２】
その他のエフェクター分子は、例えば診断に有用な検出可能な物質を含んでよい。検出可能な物質の例は、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射活性核種、陽電子放射金属（陽電子放射断層撮影用）、及び非放射活性常磁性金属イオンを含む。一般的に、診断薬用の抗体にコンジュゲートさせ得る金属イオンについて米国特許第４７４１９００号を参照されたい。適切な酵素は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼを含む。適切な補欠分子団は、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンを含む。適切な蛍光物質は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド及びフィコエリスリンを含む。適切な発光物質は、ルミノールを含む。適切な生物発光物質は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンを含む。適切な放射活性核種は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃを含む。
【００３３】
エフェクター分子として用いるための合成又は天然に存在するポリマーは、例えば、置換されていてもよい直鎖又は分岐鎖のポリアルキレン、ポリアルケニレン若しくはポリオキシアルキレンポリマー、或いは例えばラクトース、アミロース、デキストラン若しくはグリコーゲンのようなホモ−若しくはヘテロ−多糖類のような分岐又は非分岐の多糖類を含む。
【００３４】
上記の合成ポリマーに存在してもよい具体的な任意選択の置換基は、１つ又は複数のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基を含む。合成ポリマーの具体例は、置換されていてもよい直鎖又は分岐鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）又はその誘導体、特にメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体のような置換されていてもよいポリ（エチレングリコール）を含む。
【００３５】
本明細書において用いる場合、「誘導体」は、例えばヨードアセトアミドのようなα−ハロカルボン酸若しくはエステルのような例えばチオール選択性反応基、例えばマレイミドのようなイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドマレイミドなどの反応性誘導体を含むことを意図する。反応性の基は、ポリマーに直接又はリンカー部分を介して連結してよい。このような基の残基が、抗体フラグメントとポリマーとの間の連結基として生成物の一部分を形成する場合があることが認識されるだろう。
【００３６】
ポリマーのサイズは、所望により変動してよいが、通常５００Ｄａ〜１００，０００Ｄａ、好ましくは５，０００〜４０，０００Ｄａ、より好ましくは１０，０００〜４０，０００Ｄａ及び２０，０００〜４０，０００Ｄａの範囲の平均分子量である。ポリマーサイズは、特に、例えば腫瘍のようなある組織に局在化する能力、又は循環半減期を延長する能力のような生成物の意図する使用に基づいて選択してよい（概説として例えばＣｈａｐｍａｎ、２００２、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４、５３１〜５４５を参照されたい）。つまり、例えば、腫瘍の治療における使用のために生成物が循環から出て組織に浸透することを意図する場合、例えば約５，０００Ｄａの分子量を有する低分子量ポリマーを用いることが有利であろう。生成物が循環中に残る使用のために、例えば２０，０００Ｄａ〜４０，０００Ｄａの範囲の分子量を有するより高い分子量ポリマーを用いることが有利であろう。
【００３７】
特に好ましいポリマーは、ポリ（エチレングリコール）、若しくは特にメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体のような、特に約１０，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａの範囲の分子量のポリアルキレンポリマーを含む。
【００３８】
本発明のポリマーは、市販で得てよい（例えばＮｉｐｐｏｎ  Ｏｉｌ  ａｎｄ  Ｆａｔｓ；Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから）か、又は通常の化学的手順を用いて市販で入手可能な出発物質から調製してよい。
【００３９】
エフェクター分子は、抗体フラグメントを直接又はカップリング剤を介してエフェクター分子に連結する標準的な化学的又は組換えＤＮＡの手順を用いて結合させてよい。このようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートさせる技術は、当該技術において公知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、第２版、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、１９８７、ｐｐ．６２３〜５３；Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２：１１９〜５８及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９９、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、８３、６７〜１２３を参照されたい）。具体的な化学的手順は、例えば国際特許明細書ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ９０／０９１９５、ＷＯ８９／０１４７６、ＷＯ９９１５５４９及びＷＯ０３０３１５８１に記載されるものを含む。代わりに、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、連結は、例えば欧州特許明細書第３９２７４５号に記載されるような組換えＤＮＡ手順を用いて達成してよい。
【００４０】
エフェクター分子は、本発明の抗体フラグメントに、例えば任意の遊離のアミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシ又はカルボキシ基のような抗体フラグメント中に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基を介して結合させてよい。このようなアミノ酸は、抗体フラグメント中に天然に存在してよいか、又は組換えＤＮＡ法を用いてフラグメント中に工学的に導入してよい。例えば米国特許第５２１９９９６号を参照されたい。好ましくは、エフェクター分子は、天然に又は工学改変により抗体フラグメント中に位置するシステイン残基のチオール基を介して共有結合する。結合のための適切な天然システインは、本明細書中の上記のようなＣＨ１とＣＬの鎖間システイン、及びヒンジ領域中のシステインを含む。共有結合は、一般的に、ジスルフィド結合、チオール−エーテル結合又は特に硫黄−炭素結合であろう。チオール基が結合点として用いられる場合、マレイミド、ピリジルジチオ、ビニルスルホン、ヨードアセチル、ブロモアセチル及びシステイン誘導体のような例えばチオール選択的誘導体のような適切な活性化エフェクター分子を用いてよい。
【００４１】
抗体フラグメントに２つ以上のエフェクター分子が結合する場合、これらは同一又は異なっていてよく、抗体フラグメントに異なる部位で結合してよいことが認識されるであろう。２つ以上のエフェクター分子が、抗体フラグメントに例えば分岐の接続構造により単独部位で結合して２つ以上のエフェクター分子を連結して結合の単独部位を提供してよいことも認識されるであろう。
【００４２】
本発明の好ましい態様において、抗体フラグメントに結合する少なくとも１つのエフェクター分子は、ポリマー分子、好ましくはＰＥＧ又はその誘導体である。一般的なポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分の結合については、“Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、１９９２、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；“Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、１９９７、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ及び“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”、１９９８、Ｍ．Ａｓｌａｍ及びＡ．Ｄｅｎｔ、Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋが参照される。
【００４３】
好ましくは、本発明の抗体フラグメントに結合する全てのエフェクター分子はＰＥＧであり、各分子はマレイミド基を介して抗体フラグメント中の１つ又は複数のチオール基に共有結合する。ＰＥＧは、５００Ｄａ〜１００，０００Ｄａ、好ましくは５，０００〜４０，０００Ｄａ、より好ましくは１０，０００〜４０，０００Ｄａ及び２０，０００〜４０，０００Ｄａの範囲の平均分子量の任意の直鎖又は分岐の分子であってよい。分岐のＰＥＧ分子を結合させるために、リシン残基を好ましくはマレイミド基に共有結合させる。リシン残基の各アミン基には、好ましくは、メトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーを結合させる。ある例において、リシンに結合する各ポリマーの分子量は、約２０，０００Ｄａであり、ポリマー分子全体の合計分子量は、よって、約４０，０００Ｄａである。
【００４４】
エフェクター分子が結合してよい適切なシステインは、存在する場合、天然の鎖間システイン、ヒンジ領域中のシステイン及び表面のような抗体フラグメント中の任意の場所に工学的に導入されるその他のシステインを含む。
【００４５】
本発明のこの態様による具体的なフラグメントは、
（ｉ）抗体フラグメントがＦａｂ’フラグメントであり、エフェクター分子がヒンジに結合しているもの。
（ｉｉ）抗体フラグメントが、ＣＬの天然の鎖間システイン及びＣＨ１の天然の鎖間システインが別のアミノ酸、好ましくはセリンで置換されているＦａｂ’フラグメントであり、エフェクター分子がヒンジに結合しているもの。
（ｉｉｉ）抗体フラグメントが、エフェクター分子が天然の鎖間システインのそれぞれに結合しているＦａｂフラグメント又は切断型Ｆａｂフラグメントであるもの。
（ｉｖ）抗体フラグメントがＦａｂ’フラグメントであり、エフェクター分子がＣＬの天然の鎖間システイン及びＣＨ１の天然の鎖間システイン並びにヒンジ領域のシステインに結合しているもの
を含む。
【００４６】
本発明の抗体フラグメント−エフェクター分子コンジュゲートは、当該技術において知られる任意の適切な方法を用いて作製してよい。抗体フラグメントにおけるエフェクター分子結合の少なくとも１つの部位がシステインである実施形態において、該システインは好ましくは還元されて、エフェクター分子結合に適する遊離のチオール基を作り出す。本発明による改変抗体フラグメントは、よって、少なくとも１つの反応性システイン残基を含有する本明細書に記載される抗体フラグメントを、エフェクター分子、好ましくはチオール選択的活性化エフェクター分子と反応させることにより作製してよい。
【００４７】
よって、本発明は、１つ又は複数のエフェクター分子が結合した抗体フラグメントであって、重鎖（ＣＨ１）及び軽鎖（ＣＬ）の定常領域間の天然のジスルフィド結合が存在せず、重鎖（ＣＨ１）及び軽鎖（ＣＬ）の定常領域が、一方が軽鎖定常（ＣＬ）領域中にあり他方が重鎖定常（ＣＨ１）領域中にある工学的改変システイン対の間の鎖間ジスルフィド結合により連結していることを特徴とする抗体フラグメントを作製する方法をさらに提供し、この方法は、
ａ）重鎖定常領域と軽鎖定常領域とが、軽鎖（ＣＬ）定常領域中の工学的改変システインと重鎖（ＣＨ１）定常領域中の工学的改変システインとの間の鎖間ジスルフィド結合により連結している抗体フラグメントを、重鎖及び／又は軽鎖の定常領域並びに／或いは存在する場合はヒンジのシステイン中に遊離のチオール基を作り出すことができる還元剤で処理すること、及び
ｂ）処理されたフラグメントをエフェクター分子と反応させること
を含む。
【００４８】
追加のエフェクター分子は、抗体フラグメント中の任意の場所、特に定常領域及び／又は存在する場合はヒンジに結合してよい。抗体フラグメント中のシステインに結合させる２つ以上のエフェクター分子が存在する場合、これらは同時又は方法を繰り返すことにより逐次的に結合させてよい。好ましくは、２つ以上のエフェクター分子を抗体フラグメント中のシステインに結合させる場合、これらは同時に結合させる。
【００４９】
本発明の方法は、上記の還元方法の前及び／又は後の、アミノ及びイミノ基のような例えばその他の利用可能なアミノ酸側鎖を介する以前に記載されるような任意の適切な方法を用いて、さらなるエフェクター分子を抗体フラグメントに結合させる１つ又は複数のステップにも拡張される。
【００５０】
本発明の改変抗体フラグメントの作製に用いるための還元剤は、本発明の抗体フラグメント中の利用可能なシステインを還元して、エフェクター分子結合のための遊離のチオールを生成できる任意の還元剤である。好ましくは、還元剤は、存在する場合はＣＬの鎖間システインとＣＨ１の鎖間システインとの間の天然の鎖間ジスルフィド結合を、これらのシステインへのエフェクター分子の結合を可能にするために還元する。好ましくは、還元剤は、工学的改変システイン間の鎖間ジスルフィド結合を還元しない。抗体フラグメントを還元剤で処理した後に生成される遊離のチオールの数を決定することにより、適切な還元剤を同定してよいことは、当業者には明らかであろう。遊離のチオールの数を決定する方法は、当該技術において知られており、例えばＬｙｏｎｓら、１９９０、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３、７０３を参照されたい。本発明において用いられる還元剤は、当該技術において広く知られており、例えばＳｉｎｇｈら、１９９５、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２５１、１６７〜７３に記載されるものである。具体例は、還元グルタチオン（ＧＳＨ）、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、β−メルカプトエチルアミン（β−ＭＡ）、及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）のようなチオールベースの還元剤を含む。本発明の抗体フラグメントを還元するその他の方法は、Ｌｅａｃｈら、１９６５、Ｄｉｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｈｅｍ，４、２３〜２７に記載される方法のような電解法、Ｅｌｌｉｓｏｎら、２０００、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２８（２）、３２４〜３２６に記載される方法のような光還元法を用いることを含む。しかし、好ましくは、本発明において用いる還元剤は、抗体フラグメント中の１つ又は複数のチオールを遊離させ得る非チオールベースの還元剤である。好ましくは、非チオールベースの還元剤は、抗体フラグメント中の天然の鎖間チオールを遊離させることができる。本発明において用いるために好ましい還元剤は、トリアルキルホスフィン還元剤（Ｒｕｅｇｇ  ＵＴ及びＲｕｄｉｎｇｅｒ，Ｊ．、１９７７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、４７、１１１〜１２６；Ｂｕｒｎｓ  Ｊら、１９９１、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ、５６、２６４８〜２６５０；Ｇｅｔｚら、１９９９、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７３、７３〜８０；Ｈａｎ及びＨａｎ、１９９４、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２０、５〜１０；Ｓｅｉｔｚら、１９９９、Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２６、１２６５〜１２７３；Ｃｌｉｎｅら、２００４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４３、１５１９５〜１５２０３）であり、その具体例は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリスブチルホスフィン（ＴＢＰ）、トリス−（２−シアノエチル）ホスフィン、トリス−（３−ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）、及びトリス−（２−ヒドロキシエチル）ホスフィンを含む。最も好ましくは、本発明において用いるための還元剤は、ＴＣＥＰ又はＴＨＰのいずれかである。本発明において用いるための還元剤の濃度は、例えば還元剤の濃度を変動させ、生成される遊��のチオールの数を測定することにより経験的に決定できることは、当業者には明らかであろう。典型的には、本発明において用いるための還元剤は、例えば２〜１０００倍モル濃度過剰のような抗体フラグメントに対して過剰に用いられる。好ましくは、還元剤は、２、３、４、５、１０、１００又は１０００倍過剰で用いられる。ある実施形態において、還元剤は、２と５ｍＭの間で用いられる。
【００５１】
上記の方法のステップ（ａ）及び（ｂ）の反応は、例えば酢酸塩又はリン酸塩のような水性緩衝溶液のような溶媒中で、例えば約ｐＨ４．５〜約ｐＨ８．５、典型的にはｐＨ４．５〜８、適切にはｐＨ６〜７のような中性付近のｐＨで一般的に行ってよい。反応は、例えば約５℃〜約７０℃、例えば室温のような任意の適切な温度で一般的に行ってよい。溶媒は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＣＤＴＡ又はＤＴＰＡのようなキレート化剤を場合によって含有してよい。好ましくは、溶媒は、１と５ｍＭの間、好ましくは２ｍＭのＥＤＴＡを含有する。代わりに又はこれに加えて、溶媒は、クエン酸、シュウ酸、葉酸、ビシン、トリシン、トリス又はＡＤＡのようなキレート化緩衝剤であってよい。エフェクター分子は、一般的に、抗体フラグメントの濃度に関して過剰の濃度で用いられる。典型的には、エフェクター分子は、２〜１００倍モル濃度過剰、好ましくは５、１０又は５０倍過剰である。
【００５２】
必要である場合、所望の数のエフェクター分子を含有し、工学的改変システイン間の鎖間ジスルフィドを保持する所望の生成物は、イオン交換、サイズ排除、プロテインＡ、Ｇ若しくはＬ親和性のクロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィーのような例えばクロマトグラフィー技術のような通常の手段により、任意の出発物質又はエフェクター分子を結合させる方法の間に生じた他の生成物から分離してよい。よって、本発明の方法は、１つ又は複数のエフェクター分子が結合し、工学的改変鎖間ジスルフィドが保持されている抗体フラグメントを精製する追加のステップ（ｃ）を場合によってさらに含んでもよい。
【００５３】
本発明による抗体フラグメントは、いくつかの疾患若しくは障害の検出又は治療において有用であり得る。このような疾患又は障害は、例えば細菌感染のような感染疾患の一般的な見出しの下に記載されるもの；真菌感染；例えばリウマチ性関節炎、変形性関節炎、炎症性腸疾患のような炎症性疾患／自己免疫性；癌；例えば喘息、湿疹のようなアレルギー性／アトピー性疾患；例えば嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血のような先天性疾患；例えば乾癬のような皮膚疾患；例えば多発性硬化症のような神経疾患；例えば臓器移植拒絶、移植片対宿主疾患のような移植；及び例えば糖尿病のような代謝性／特発性疾患を含む。
【００５４】
本発明による抗体フラグメントは、治療及び／又は診断における使用のために処方されてよく、本発明のさらなる観点によると、我々は、重鎖（ＣＨ１）及び軽鎖（ＣＬ）の定常領域の間の天然の鎖間ジスルフィド結合が存在せず、重鎖（ＣＨ１）及び軽鎖（ＣＬ）の定常領域が、一方が軽鎖定常（ＣＬ）領域にあり他方が重鎖定常（ＣＨ１）領域にある工学的改変システイン対の間の鎖間ジスルフィド結合により連結していることを特徴とする、１つ又は複数のエフェクター分子が結合している抗体フラグメントを、１つ又は複数の医薬的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体とともに含む医薬組成物を提供する。
【実施例】
【００５５】
ここでは、本発明を、一例として説明するにすぎない。
【００５６】
目的は、ジスルフィド結合を形成することを示し得る工学的改変システイン対を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロッティングを用いることにより同定することであった。システイン対は、ヒトｃカッパ：ＣＨ１界面の単結晶構造を用いて同定した。目的は、Ｃα−Ｃα距離が約５．８Åの最適に近い残基を見い出すことであったが、約２．０〜１０Åの範囲内の残基も同定した。理論的Ｃα−Ｃα距離の範囲外の対も考慮した。なぜなら、結晶構造が多立体構造タンパク質の単独の静的立体構造を表すこと、及び全てのタンパク質及び二量体タンパク質及びその特定のポリペプチド領域が柔軟且つ可動性であり、よってより大きい又はより小さい理論的Ｃα−Ｃα距離に順応し得ることが知られているからである。さらに、ｃカッパ：ＣＨ１界面上のいくつかの位置を試験した。なぜなら、まさに中央位置の位置が、溶媒に曝露されにくいからである。
【００５７】
単独のヒト化Ｆａｂ’フレームワーク（ｇ１６５）を、モデルＦａｂ’タンパク質として実施例を通じ用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる比較のために３つの対照構築物を用いた。
ｉ）天然の鎖間ジスルフィドシステイン及び単独のヒンジチオールを含有する、ＬＣ−Ｃ  ＨＣ−Ｃ，ヒンジ−ＣＡＡと表される野生型γ１Ｆａｂ’。このタンパク質は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの間に約５０ｋＤａのバンドとして泳動され、用いられる条件に応じて、還元によりエフェクター分子の結合のために１、２又は３つ（通常１又は３つ）のシステインを提供できる。
ｉｉ）天然の鎖間ジスルフィドシステインがセリンに変異されているが単独のヒンジチオールは保持しているＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ，ヒンジ−ＣＡＡと表される「Δ−インター」γ１Ｆａｂ’。このタンパク質は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて２つの２５ｋＤａのバンドとして泳動され、還元によりエフェクター分子の結合のために１つのシステインだけを提供する。
ｉｉｉ）重鎖の天然の鎖間システインがセリンに変異されているが軽鎖の天然の鎖間システインと単独ヒンジチオールとは保持しているＬＣ−Ｃ  ＨＣ−Ｓ，ヒンジ−ＣＡＡと表される「ドッグテイル」γ１Ｆａｂ’。「ドッグテイル」Ｆａｂ’は、ｃカッパとヒンジとの間の鎖間ジスルフィド結合を効率的に形成することが観察されているので、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの間に約５０ｋＤａのバンドとして観察され、還元によりエフェクター分子の結合のために２つのシステインを提供できる。
【００５８】
Ｆａｂ’分子を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生させ、標準的な方法を用いて精製した（例えばＨｕｍｐｈｒｅｙｓら、２００２、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、２６、３０９〜３２０を参照されたい）。ＰＣＲ突然変異誘発を用いて、ＣＬ及びＣＨ１の鎖間システインをセリンに変更し、抗体フラグメント中のその他の部位でシステインをコードするコドンを導入した。
【００５９】
（実施例１）
ｇ１６５  ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ，ヒンジ−ＣＡＡ  Ｆａｂ’及びｇ１６５  ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ，ヒンジ−ＳＡＡ  Ｆａｂ’中の工学的改変鎖間ジスルフィド結合の形成
システインをコードするコドンを、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、「Δ−インター」γ１  ｇ１６５  Ｆａｂ’（ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ，ヒンジ−ＣＡＡ）に導入した。「Δ−インター」γ１  ｇ１６５  Ｆａｂ’の軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）は非共有結合しているので、新しいジスルフィド結合の形成は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでＦａｂ’試料を泳動し、抗ｃカッパ及び抗ＣＨ１試薬を用いてイムノブロッティング検出を行うことにより、単純に分析できた。小規模発現及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により有用であると同定された３つのシステイン対を、より大規模で発現させて、精製、試験的還元及び修飾を可能にした。さらに、チオール含有ヒンジ領域が高度に柔軟であり、工学的改変ｃカッパシステインとジスルフィド結合を形成し得ることが知られているので、無効なヒンジを有するＦａｂ’、すなわちＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ，ヒンジ−ＳＡＡと表されるものにおいてもこれらの４つの変異形を構築した。よって、これらの「ヒンジ−ＳＡＡ」変異形において形成される任意のジスルフィド結合は、導入されたｃカッパ及びＣＨ１の変異のみによるものであり得た。
【００６０】
システイン対１〜７を、ヒトｃカッパ：ＣＨ１結晶構造の分析により同定した。対８は、ＩｇＭ、ＩｇＧ２、３及び４においてシステインであると見い出された位置にＣＨ１システインを導入して、「偽γ４  Ｆａｂ」を作製するものであった。同様の変異は以前に作製されている：ともにＩｇＧ１を「ＩｇＧ４様」になるように変換したもの（Ｄｏｒａｉら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２  ２９：１４８７〜１４９１）、及び逆に、ＩｇＧ３を「ＩｇＧ１様」になるように変更したもの（Ｂｒｅｋｋｅら、１９９３．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１４１９〜１４２５）である。変更されたアミノ酸及びそれらのＫａｂａｔ数を、表１に示す。作製されたプラスミドを表２に示す。
【００６１】
表１−変異させたアミノ酸
【表１】
2009501773.tif 000002
【００６２】
表２−プラスミド
【表２】
2009501773.tif 000003
【００６３】
ｃカッパ：ＣＨ１システイン対が導入されたｇ１６５  ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ，ヒンジ−ＣＡＡ  Ｆａｂ’の大腸菌小規模発現のペリプラスム抽出物の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのイムノブロットを、抗カッパ及び抗ＣＨ１試薬を用いて検出した。導入されたシステイン対の全てが、精製Ｆａｂ’標準物質と同じ移動度の共有結合したｃカッパ：ＣＨ１（Ｆａｂ’）タンパク質をいくらか形成していることが観察された。いくつかの構築物を用いてタンパク質溶解の増加が観察され、このことは、導入されたジスルフィドが、ペリプラスムにおけるＦａｂ’の折り畳みの割合又は物理的安定性に変化をもたらしたことを示唆した。３つの構築物が、ジスルフィドの形成、収率及び最小限のタンパク質溶解の最良のバランスを有していると観察された：ｐＤＰＨ２９５  ｇ１６５  Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ，ヒンジ−ＣＡＡ  Ｆ１１６Ｃ：Ａ１３８Ｃ、ｐＤＰＨ２９７  ｇ１６５  Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ，ヒンジ−ＣＡＡ  Ｐ１１９Ｃ：Ｓ１２８Ｃ及びｐＤＰＨ３００  ｇ１６５  Ｆａｂ’ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ，ヒンジ−ＣＡＡ  Ｎ２１０Ｃ：Ｋ１２９Ｃである。
【００６４】
ｃカッパ：ＣＨ１システイン対が導入されたｇ１６５  ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ，ヒンジ−ＳＡＡ  Ｆａｂ’の大腸菌小規模発現のペリプラスム抽出物の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのイムノブロットも、抗カッパ及び抗ＣＨ１試薬を用いて検出した。ヒンジシステインのセリンへの変異は、ｃカッパとヒンジとの間のジスルフィド形成又はヒンジシステインによるＣＨ１システインの遮断のいずれの可能性も除く。ジスルフィド結合形成は、抗ＣＨ１試薬を用いて検出したときの約５０ｋＤａのＦａｂバンドの存在により証明されるように、まだ観察された。抗ｃカッパ試薬を用いる検出により、いくつかの違い、特にヒンジを−ＳＡＡに変異させた際の対６における高分子量バンドの二重線の消滅が示され、このことは、対６で見い出されるＮ２１０Ｃ  ｃカッパ変異が、ヒンジシステインとのジスルフィド形成のために一部分が利用可能であることを示唆する。
【００６５】
（実施例２）
ｇ１６５  ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ，ヒンジ−ＣＡＡ  Ｆａｂ’の熱安定性及びｉｎ  ｖｉｖｏジスルフィド形成
培養細胞ペレットのペリプラスム抽出物を、３０℃、５０℃又は６５℃において、１０ｍＭのＮＥＭの存否において一晩撹拌した後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロッティングにより分析した。ｃカッパ：ＣＨ１システイン対が導入されたｇ１６５  ＬＣ−Ｓ  ＨＣ−Ｓ，ヒンジ−ＣＡＡ  Ｆａｂ’（対１、３及び６）を発現する大腸菌培養物のペリプラスム抽出物の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのイムノブロットを、抗ＣＨ１試薬を用いて検出した。試験した３つの変異体（対１、３及び６）について、６５℃までの一晩のインキュベーションで全て安定であることが見い出され、このことは、約５０ｋＤａのバンドが安定ジスルフィド結合により形成されたことと、変異がＦａｂの全体的な構造を完全には不安定化しなかったことの両方を証明した。一晩の温度での抽出中に、遊離のチオールを不可逆的に遮断する１０ｍＭのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を含有させたことは、形成されたジスルフィド結合の量又は安定性に影響しなかった。このことは、ＬＣ−ＨＣジスルフィド形成の大部分が抽出の前に発生しており、大腸菌のペリプラスム内でｉｎ  ｖｉｖｏにて発生した可能性が最も高いことを示唆する。
【００６６】
無傷の鎖間ジスルフィド結合の存在により与えられた熱安定性についてのさらなる証拠を、表３に示す。Ｆａｂ’を、３０℃及び５５℃での大腸菌培養物から抽出し、プロテインＧクロマトグラフィーにより精製した。生成されたＦａｂの５５〜１００％は、より高い温度での一晩のインキュベーションに耐えることができ、このことは、ペリプラスムのＦａｂ’中のこの割合で、無傷のジスルフィド結合が存在したことを示唆した。
【００６７】
表３−大腸菌培養物からのｇ１６５  Ｆａｂ’の精製
【表３】
2009501773.tif 000004
【００６８】
（実施例３）
ｇ１６５「偽γ４」Ｆａｂ’中の鎖間ジスルフィド結合の形成
ＩｇＧ１は、これらが上側のヒンジ中のＣＨ１システイン（Ｋａｂａｔ＃２３３）を用いて軽鎖に結合するが、ＩｇＧ４のようなその他の全てはＣＨ１配列中のよりＮ末端側のシステイン（Ｋａｂａｔ＃１２７）を用いる点において、抗体構造のなかでも独特である。対８を作製するために、γ１  ＦａｂのＣＨ１システインをセリンに変異させ（Ｃ２３３Ｓ）、次いで補うためのＳ１２７Ｃ変異を作製した。γ１  Ｆａｂ’結晶構造において、計算されたＣα−Ｃα距離は１２．６５Åであり、これはジスルフィド結合形成のための通常の範囲を大きく越えていた。これに対して、天然のγ１  ｃカッパ−ＣＨ１ジスルフィドのＣα−Ｃα距離は５．３２Åである。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルは、これらの観察にもかかわらず、ＬＣ−ＨＣジスルフィド結合の形成が、これらの位置でのこれらの２つのシステイン間でかなり効率的であったことを示した。ヒンジ−ＣＡＡ及びヒンジ−ＳＡＡの変異形の比較は、このジスルフィド結合にヒンジシステインが関与しないことを示唆した。いくらかのＬＣ二量体も観察された。
【００６９】
これらの観察結果は、ｃカッパのＣ末端が、１２．６５Åのスパンのいくらかをより確かな５〜７Åに低減させるのに十分に可動性であり柔軟であることを示唆する。
【００７０】
（実施例４）
強い還元剤及び弱い還元剤を用いたシステイン反応性エフェクター分子での工学的改変システイン対を含有する抗体フラグメントの改変
ＰＥＧ−マレイミドは、新規なシステイン対の溶媒の近づきやすさを証明するのに適切な試薬である。２０ｋＤａのＰＥＧのような著しく余分な分子質量の付加は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて容易に検出される。タンパク質ドメインの中又はその間に深く埋め込まれたジスルフィド結合は、溶媒により運ばれる還元剤が接近できない。
【００７１】
０．１Ｍリン酸塩  ２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ６．０緩衝液中で室温にて１時間の５ｍＭ  β−ＭＡを用いる還元の影響を試験した。全てのＦａｂ’は還元の間、１．４ｍｇ／ｍｌであり、還元剤はＰＤ１０脱塩カラムを用いて除去し、その後、Ｆａｂ’濃度は約０．８ｍｇ／ｍｌであった。２０ｋＤａ  ＰＥＧ−マレイミドを５×過剰（ｍｇ／ｍｇ）で加え、約６Ｍ過剰となった。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、得られたフラグメントを分析した。共有結合したポリペプチドは、２０ｋＤａの複数のＰＥＧ鎖の付加により改変されない限りは、約５０ｋＤａのバンドとして泳動された。Δ−インター対照構築物で見い出されるもののような非共有結合したポリペプチド又はジスルフィド結合が還元されたものは、約２５ｋＤａの分かれたバンドとして泳動される。対照のフラグメントは、予測されたように、穏やかなβ−ＭＡ還元及びＰＥＧ化に従ってふるまった。「ドッグテイル」Ｆａｂ’において見い出される鎖間ジスルフィド結合は、還元及びＰＥＧ化の後に大部分が無傷であったが、わずかな割合の「ドッグテイル」Ｆａｂ’はＬＣ及びＨＣに還元され、これらはそれぞれＰＥＧ化された。Δ−インター対照Ｆａｂ’は、予測されたように、ヒンジ上でモノＰＥＧ化された。代表的Ｆａｂ’対照もヒンジ上でモノＰＥＧ化され、天然の鎖間ジスルフィドは無傷のままであった。新しい工学的改変ジスルフィド対形成の３つ全ては、穏やかなβ−ＭＡ還元に耐えることができ、ヒンジでモノＰＥＧ化された無傷の工学的改変鎖間ジスルフィドを有するＦａｂ’が生成した。ｐＤＰＨ２９７（対３）及びｐＤＰＨ３００（対６）の精製タンパク質調製物も、そのいくらかがＰＥＧ化された非共有結合ＬＣ及びＨＣをいくらか含有していた。このような物質は、サイズ排除クロマトグラフィーのような当該技術での標準的な方法を用いて、所望の改変Ｆａｂ’フラグメントから容易に精製して除くことができる。
【００７２】
より強い還元条件も試験し、この場合は１０ｍＭのＴＣＥＰを還元剤として用いた（その他の条件は同じままであった）。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、代表的Ｆａｂ’が、予測されたように、このタンパク質の大部分が実質的に還元され、ＰＥＧ化されてモノＰＥＧ化ＬＣ及びジＰＥＧ化ＨＣをもたらすようにふるまった。ｐＤＰＨ２９５（対１）、ｐＤＰＨ２９７（対３）及びｐＤＰＨ３００（対６）によりコードされる工学的改変抗体フラグメントの還元及びＰＥＧ化は、ヒンジでモノＰＥＧ化された無傷の鎖間ジスルフィドを有するＦａｂ’を生成した。これは、これらのジスルフィド対の水性環境からの閉鎖性が改善されたことのさらなる証明である。ＰＥＧ化されていない遊離の重鎖及び軽鎖、並びにＰＥＧ化された遊離の重鎖及び軽鎖の両方も部分的に観察された。このような物質は、サイズ排除クロマトグラフィーのような当該技術での標準的な方法を用いて、所望の改変Ｆａｂ’フラグメントから容易に精製して除くことができる。
【００７３】
（実施例５）
抗原結合親和性に対する新規なジスルフィド結合の影響
Ｆａｂ’フラグメントの抗原結合親和性は、わずかな構造の混乱により影響され得る。ｇ１６５  Ｆａｂ’の抗原についての結合親和性は、対１、３及び６の作製に含まれたタンパク質の工学的改変により影響されなかった。
【国際調査報告】
2009501773.tif 000005
2009501773.tif 000006
2009501773.tif 000007