(57)【要約】  本発明は、水溶液中でポリフェノールを熱処理することによって得られる、フラバノール、プロシアニジン、およびそれらの誘導体などのポリフェノールを含む組成物、および、フラバノール、プロシアニジン、およびそれらの誘導体のエピマーを含む組成物、ならびにそれを利用したＮＯ応答性の疾病または障害の治療または予防上の処置に関する。本発明はまた、エピカテキンおよびカテキンの総量は変化せず、また新しい２量体が存在し、３量体よりも高度のオリゴマーが存在しない、改質されたモノマーまたはオリゴマーの特性を特徴とする、熱処理したカカオ粉末およびカカオ抽出物に関する。
2009501161.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱脂カカオ粉末１ｇあたり少なくとも約２５ｍｇの総カカオポリフェノール含量を有する、熱処理され、一部または完全に脱脂されたカカオ粉末であって、前記カカオポリフェノールが、(±)-カテキン、(±)-エピカテキン、およびそれらのプロシアニジン・オリゴマーを含み、エピカテキンのカテキンに対する比が約１より大きいのに対して約１である改質された単量体の性質を特徴とするカカオ粉末。
【請求項２】
前記総カカオポリフェノール含有量が約２０〜約５０ｍｇ／ｇであり、前記比が約０．４２に対して約１よりも大きいことを特徴とする請求項１記載のカカオ粉末。
【請求項３】
脱脂カカオ固形物に基づいて、１ｇあたり少なくとも約１０ｍｇの総カカオポリフェノール含量を有する熱処理されたカカオマスであって、前記カカオポリフェノールが、(±)-カテキン、(±)-エピカテキン、およびそれらのプロシアニジン・オリゴマーを含み、エピカテキンのカテキンに対する比が約１より大きいのに対して約１である改質された単量体の性質を特徴とするカカオマス。
【請求項４】
前記総カカオポリフェノール含有量が約１２〜約２５であり、前記比が約０．４２よりも大きいのに対して約１であることを特徴とする請求項３記載のカカオマス。
【請求項５】
熱処理されたカカオ抽出物であって、前記抽出物中の総カカオポリフェノール含有量が、乾燥抽出物１ｇあたり少なくとも約２００ｍｇであり、前記カカオポリフェノールが、(±)-カテキン、(±)-エピカテキン、およびそれらのプロシアニジン・オリゴマーを含み、エピカテキンのカテキンに対する比が約１より大きいのに対して約１である改質された単量体の性質を特徴とする抽出物。
【請求項６】
前記総カカオポリフェノール含有量が約２５０〜約５００ｍｇであり、前記比が約０．４２に対して約１であることを特徴とする請求項５記載の抽出物。
【請求項７】
熱処理された水分含有量の低いカカオ製品であって、
高ＣＰカカオ粉末、液体または乾燥の高ＣＰカカオ抽出物、高ＣＰカカオマス、およびそれらの混合物からなる群より選択されるカカオ成分を含み、
前記製品が、製品１ｇあたり少なくとも約６．０ｍｇの総カカオポリフェノール含有量を有し、前記カカオポリフェノールが、(±)-カテキン、(±)-エピカテキン、およびそれらのプロシアニジン・オリゴマーを含み、エピカテキンのカテキンに対する比が１より大きいのに対して１である改質された単量体の性質を特徴とするカカオ製品。
【請求項８】
前記製品が、約４９ｍｇまでの総カカオポリフェノール含有量を有することを特徴とする請求項７記載のカカオ製品。
【請求項９】
熱処理された水分含有量の高いカカオ製品であって、
高ＣＰカカオ粉末、液体または乾燥の高ＣＰカカオ抽出物、高ＣＰカカオマス、およびそれらの混合物からなる群より選択されるカカオ成分を含み、
前記製品が、製品１ｇあたり少なくとも約０．２ｍｇの総カカオポリフェノール含有量を有し、前記カカオポリフェノールが、(±)-カテキン、(±)-エピカテキン、およびそれらのプロシアニジン・オリゴマーを含み、エピカテキンのカテキンに対する比が１より大きいのに対して１である、改質された単量体の性質を特徴とする、
カカオ製品。
【請求項１０】
前記製品が、約５ｍｇまでの総カカオポリフェノール含有量を有することを特徴とする請求項９記載の製品。
【請求項１１】
エピカテキンおよびカテキンの総量が、前記カカオ粉末、カカオ抽出物、カカオマス、またはカカオ製品中に初めに存在する量と実質的に変わらないことを特徴とする、請求項１記載のカカオ粉末、請求項３記載のカカオマス、請求項５記載のカカオ抽出物、もしくは請求項７または９記載のカカオ製品。
【請求項１２】
同一のクロマトグラム条件下で既知の２量体Ｂ２およびＢ５と異なる溶離時間を有する４種類のさらなる２量体が存在することを特徴とする、請求項１記載のカカオ粉末、請求項３記載のカカオマス、請求項５記載のカカオ抽出物、もしくは請求項７または９記載のカカオ製品。
【請求項１３】
未発酵または発酵が不十分なカカオ豆から調製したカカオ粉末を、（−）−エピカテキンをエピマー化するのに十分な時間およびｐＨで、約３７℃〜約１９０℃で加熱することによって調製することを特徴とする請求項１記載のカカオ粉末。
【請求項１４】
未発酵または発酵が不十分なカカオ豆から調製したカカオマスを、（−）−エピカテキンをエピマー化するのに十分な時間およびｐＨで、約３７℃〜約１９０℃で加熱することによって調製されることを特徴とする請求項３記載のカカオマス。
【請求項１５】
乾燥カカオ抽出物を水または水性の有機溶媒中に溶解し、前記溶液を、約４．０〜約８．０のｐＨで約０．５分〜数日間、約３７℃〜約１９０℃で加熱することによって調製されることを特徴とする請求項５記載のカカオ抽出物。
【請求項１６】
水とカカオ粉末から実質的になるココア飲料であって、
前記飲料が、該飲料を調製するカカオ粉末とは対照的にエピカテキンよりもカテキンを多く含み、該飲料中のエピカテキンのカテキンに対する比がおおよそ１：３であるココア飲料。
【請求項１７】
前記飲料中の前記カテキンの大部分が（−）−カテキンであることを特徴とする請求項１６記載のココア飲料。
【請求項１８】
（−）−カテキンと、同一のクロマトグラム条件下で２量体Ｂ２およびＢ５と異なる溶離時間を有する２量体とを含むココア飲料を、ヒトまたは獣動物に投与することによる、血管系の疾患または障害の治療または予防方法であって、
前記血管系の疾患または障害が、アテローム性動脈硬化症、血栓症、高血圧症（例えば、初期、二次性および肺高血圧症など）、循環器疾患（ＣＶＤ）、冠動脈疾患（ＣＡＤ）（心筋虚血、心筋梗塞症、安定および不安定狭心症、急性閉塞または再狭窄を含む）、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）（例えば、糖尿病の血管合併症）、認知機能障害または認知障害および／または循環器系障害（脳についてのものも含む）、心臓麻痺、脳血管障害（脳梗塞、初期および／または再発性の一過性脳虚血発作、または、例えば冠動脈血管形成術または経皮冠動脈インターベンション後などの虚血性合併症を含む）、鬱血性心不全、腎不全、腎臓病、末梢血管障害、さらに具体的にはレイノー病などの末梢血管の血管収縮（例えば腕または脚の血管など）に関連する疾病および疾患、末梢動脈障害（ＰＡＤ）、間欠性跛行、脈管炎（例えば、微小血管の）、血管けいれん、静脈血栓症、静脈機能不全、重症虚血肢、急性虚血肢、アテローム塞栓症、および下肢動脈血行不全からなる群から選択されることを特徴とする治療または予防方法。
【請求項１９】
前記飲料がココア飲料であることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記飲料がココア飲料であり、前記血管系の疾患または障害が、アテローム性動脈硬化症、血栓症、高血圧症（例えば、初期、二次性および肺高血圧症など）、循環器疾患（ＣＶＤ）、冠動脈疾患（ＣＡＤ）（心筋虚血、心筋梗塞症、安定および不安定狭心症、急性閉塞または再狭窄を含む）、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）（例えば、糖尿病の血管合併症）、認知機能障害または認知障害および／または循環器系障害（脳についてのものも含む）、心臓麻痺、脳血管障害（脳梗塞、初期および／または再発性の一過性脳虚血発作、または、例えば冠動脈血管形成術または経皮冠動脈インターベンション後などの虚血性合併症を含む）、鬱血性心不全、腎不全、腎臓病、末梢血管障害、さらに具体的にはレイノー病などの末梢血管の血管収縮（例えば腕または脚の血管など）に関連する疾病および疾患、末梢動脈障害（ＰＡＤ）、間欠性跛行、脈管炎（例えば、微小血管の）、血管けいれん、静脈血栓症、静脈機能不全、重症虚血肢、急性虚血肢、アテローム塞栓症、および下肢動脈血行不全のからなる群から選択されることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本出願は、「血管系の健康改善用製剤(Formulations for Vascular Health Improvement)」として２００５年６月２９日に出願した、米国仮特許出願第６０／６９５，３６１号の優先権を主張する国際特許出願である。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ポリフェノール含有生成物を熱処理することによって得られる、フラバン−３−オール、プロシアニジンおよびそれらの誘導体といったポリフェノールを含む組成物、フラバン−３−オールとプロシアニジンのエピマーを含む組成物、ならびにそれを利用したＮＯ応答性の疾病または障害の治療および予防方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ポリフェノール類は、多様性に富む化合物群である（非特許文献１）。それらは、様々な植物で広く産生され、食物連鎖の一部に組み込まれているものもある。時には、それらは人間の食物の重要な化合物群を意味する。例えば、フラバノールとプロシアニジンは、一酸化窒素（ＮＯ）に効果があることが示されている（例えば、特許文献１）。ＮＯは、血小板凝集能、単球の接着性と走化性、および、アテロームの発生過程に決定的に関与する血管平滑筋組織の拡散を阻害することが知られている。産生が、阻害剤またはアテローム性動脈硬化症などの病理状態によって阻害されることにより、ＮＯの血中濃度が低下する場合、血管筋は適度には弛緩しない。 結果として生じる血管収縮が血圧を上昇させ、ある種の高血圧症に関与するであろう。高血圧症は、脳梗塞、心臓発作、心不全、および腎不全を含む血管系の疾患の主要原因である。
【０００４】
ＮＯ応答性の疾病または障害に悩む多数の人々のことを考慮すると、これらの病状を予防・治療する様々な治療法の発見には、大きな関心が寄せられている。出願人は、本明細書に記載される特定の化合物がこれらの用途に利用できることを見出している。
【特許文献１】米国特許第６，６７０，３９０号明細書
【非特許文献１】Ferriera et al, Tetrahedron, 48:10, 1743-1803, 1992
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、熱処理されたフラバノール（単量体）とプロシアニジン（オリゴマー）、および／またはフラバノールとプロシアニジンのエピマー、これらの化合物を含む組成物、ならびにＮＯ応答性の疾病または障害の治療・予防方法に関する。
【０００６】
１つの態様では、本発明は、本発明にかかる化合物またはそれらの誘導体をＮＯ応答性の疾病または障害に効果的な量で含む、医薬品、食品、食品添加物、または栄養補助食品に関する。組成物は、随意的に、さらなる治療薬または健康に良い薬剤を含んでも差し支えなく、あるいは、別の治療薬または健康に良い薬剤と併用して投与しても構わない。上記組成物、ＮＯ応答性の疾病／障害の治療または予防に用いるラベルおよび／または使用説明書を収容している包装された製品もまた、本発明の範囲内にある。
【０００７】
１つの態様では、本発明は、（−）−カテキンを含む飲料を、それを必要としている被験者に投与することによって、血管系の疾患または障害を治療または予防する方法を提供し、その際、被験者はヒトまたは獣動物である。（−）−カテキンは、単量体化合物として、あるいは、本明細書で構造式Ｅｎと定義されるオリゴマー化合物および／または本明細書で構造式Ａｎと定義されるオリゴマー化合物を熱処理して得られる化合物の構成成分であるモノマー単位として、飲料中に存在して差し支えない。典型的には、飲料はココアまたはチョコレート含有飲料、もしくはチョコレート風味飲料である。
【０００８】
別の態様では、本発明は、本発明にかかる化合物を効果的な量で投与することによる、ヒトまたは獣動物などの哺乳類におけるＮＯ応答性の疾病または障害を予防または治療する方法に関する。
【０００９】
さらに別の態様では、本明細書に記載される化合物を調製する方法を提供する。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は、（±）−カテキンと（±）−エピカテキン、およびそれらのプロシアニジン・オリゴマーを含み、脱脂粉末に対する総ＣＰ含有量が少なくとも１５ｍｇ／ｇであり、熱処理されていない高ＣＰカカオ粉末と比較して、単量体とオリゴマーの改質されたＨＰＬＣ特性を有する、熱処理され、一部または完全に脱脂された高ＣＰカカオ粉末に関する。
【００１１】
本発明はまた、乾燥カカオ抽出物に対する総ＣＰ含量が、少なくとも１７５ｍｇ／ｇであり、また、熱処理されていないカカオ抽出物と比較して、改質された特性を有する、乾燥または液体の、熱処理された高ＣＰカカオ抽出物に関する。
【００１２】
さらに別の態様では、本発明は、熱処理されていないカカオ製品と比較して、改質された特性を有する、ココア飲料などの熱処理されたカカオ製品に関する。製品は、カカオ粉末、液体または乾燥カカオ抽出物、および／またはカカオマス（チョコレートリカー）などの高ＣＰカカオ成分を有する。製品が低水分含量である場合、その製品は、製品に対して、少なくとも約６ｍｇ／ｇの総カカオポリフェノール（ＣＰ）を含む。製品は、カテキン１に対するエピカテキンの比が１以上であることが好ましい。製品が、飲料などの高水分含量製品の場合、その製品は、製品に対し約０．２ｍｇ／ｇの総カカオポリフェノールを含む。
【００１３】
改質された特性を有する高ＣＰカカオ粉末、高ＣＰカカオ抽出物、高ＣＰカカオ製品を、一部または完全に脱脂したカカオ粉末の水分散液、もしくは、未発酵または発酵が不十分なカカオ豆から調製した乾燥カカオ抽出物を、加熱することにより調製する。カカオ成分は、約３７℃〜約２００℃で、（−）−エピカテキンをエピマー化するのに十分な時間およびｐＨで、例えば、約０．５分〜数日間、加熱されることが好ましい。それらは、約７２℃〜約１６０℃で約１分〜約６．０時間、加熱されることが好ましい。 それらは、約１００℃〜約１４０℃で約１分〜約４時間、加熱されることがさらに好ましい。 
本明細書中に引用するすべての特許、特許出願および引用文献を、参照することにより本明細書中に援用する。一致しない場合には、本明細書の開示が適用される。
【００１４】
本発明は、熱処理されたフラバノール（単量体）およびプロシアニジン（オリゴマー）、および／またはフラバノールとプロシアニジンのエピマー、こういった化合物を含む組成物、およびＮＯ応答性の疾病または障害の治療・予防方法に関する。
【００１５】
最新の命名法に従い、本明細書では、「フラバノール」という用語は、例えばカテキン、エピカテキンなどの単量体を称する。カテキンとエピカテキンのオリゴマーは、プロシアニジンと称される。しかしながら、本発明の開示の目的には、これらの用語は同義的に用いて差し支えない。さらには、当然のことながら、本明細書におけるポリフェノールについての言及は、フラバノールとプロシアニジンの組合せ、またはそれらについて個別に、適用される。
【００１６】
本発明は、第１化合物と、下記構造式Ａｎを有する第２化合物、もしくは医薬品的に認容可能なそれらの塩または誘導体（例えば、酸化生成物、メチル誘導体、グルクロン酸誘導体）を熱処理することによって入手し、または入手可能な第１化合物を効果的な量で含む組成物に関し：
【化１】
2009501161.tif 000003
【００１７】
ここで、
ｎは、２〜１８の整数であり、
ＲとＸはそれぞれ、αまたはβ型の立体化学を有し、
Ｒは、ＯＨ、Ｏ−糖またはＯ−没食子酸塩であり、
Ｃ−４、Ｃ−６、Ｃ−８置換基は、それぞれＸ、Ｚ、Ｙであり、モノマー単位の結合は、Ｃ−４、Ｃ−６またはＣ−８で生じ、
Ｃ−４、Ｃ−６またはＣ−８のいずれも別のモノマー単位と結合しない場合は、各Ｘ、ＹまたはＺは、水素または糖であり、
前記糖は、随意的に、例えばエステル結合を介してなど、いずれかの位置でフェノール部分に置換される。
【００１８】
本明細書では、「熱処理によって得られた化合物」、「熱処理によって入手できる化合物」または「化合物は熱処理される」という語句は、化合物が水の存在下、十分な時間で十分に加熱され、化合物の化学構造および／または機能に改変を生じさせた／させることを意味する。温度が低いほど、変化を生じさせるのに要する加熱の時間が長くなる。例えば、変化を、加熱温度を周囲温度から１４０℃まで上昇させ、ｐＨを約３．８〜約７まで上昇させ、および／または加熱時間を増大させることによって、最大化させてもよい。平衡に到達させるためには、温度および／またはｐＨを上昇させる必要がある。こういった温度および時間は、少なくとも４０℃であり、少なくとも５０℃であることがより好ましく、少なくとも１０時間であり、少なくとも２４時間であることがより好ましく、少なくとも４８時間であることがさらに好ましいであろう。もしくは、少なくとも６０℃、少なくとも７０℃、少なくとも８０℃、少なくとも９０℃、少なくとも１００℃、少なくとも１１０℃、または、少なくとも１２０℃で、それぞれ、少なくとも５分、もしくは少なくとも１０分、１５分、または２０分間であろう。例えば、化合物は、１２０度で１０分間、処理されて構わない。別の熱処理の例を実施例１に記載する。他の温度／時間／ｐＨの組合せもまた効果的であり、当業者は、本明細書が提供する指針を用いて、必要以上の実験をすることなくそれらを決定するであろう。ＨＰＬＣ／ＭＳ分析などの既知の技術を、例えば実施例１に記載されるような化合物の変化のモニタに用いてもよい。
【００１９】
上記構造式中のモノマー単位は、４→６および４→８の連結による結合でも構わない。（４→８）の連結のみのオリゴマーは直鎖状であり、少なくとも１つの（４→６）結合が存在する場合は、分岐鎖オリゴマーとなる。非天然の連結（６→６）、（６→８）、（８→８）のうち少なくとも１つを含む熱処理されたオリゴマーもまた、本発明の範囲にある。このような連結を有するオリゴマーは、米国特許第６，１５６，９１２号明細書に記載のように調製して差し支えなく、ここに参照することより、本明細書に援用する。
【００２０】
糖は、グルコース、ガラクトース、ラムノース、キシロース、およびアラビノースからなる群より選択されて差し支えない。糖は、単糖もしくは二糖であることが好ましい。フェノール部分は、コーヒー酸、ケイヒ酸、クマリン酸、フェルラ酸、没食子酸、ヒドロキシ安息香酸およびシナピン酸からなる群より選択される。
【００２１】
誘導体の例として、エステル、酸化生成物、メチル誘導体、グルクロン酸化生成物が挙げられる。酸化生成物は、米国特許第５，５５４，６４５号明細書に記載のように調製して差し支えなく、ここに参照することより、本明細書に援用する。例えば没食子酸とのエステルなどのエステルは、米国特許第６，４２０，５７２号明細書に記載のように調製してよく、ここに参照することより、本明細書に援用する。３’Ｏ−メチル−、４’Ｏ−メチル−、および３’Ｏ，４’Ｏ−ジメチル−誘導体などのメチル誘導体は、例えば、クレン-オリーブ（Cren-Olive）らの2002, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 821-830に記載のとおりに調製して差し支えない。グルクロン酸化生成物は、ユー(Yu)らの"A novel and effective procedure for the preparation of glucuronides." Organic Letters, 2(16) (2000) 2539-41およびスペンサー(Spencer)らの2001, Free Radical Biol. Med. 31(9),1139-46に記載のとおりに調製して差し支えない。
【００２２】
連結、糖、フェノール部分、および誘導体に関する上記の開示は、本明細書に開示されるすべての化合物に適用可能であるが、簡潔な記載とするため、ここでは繰り返さない。
【００２３】
本明細書に記載される構造式ＡｎまたはＥｎの化合物に関しては、これら化合物の例として、整数ｎが３〜１８、２〜１２、３〜１２、２〜５、４〜１２、５〜１２、３〜１０、４〜１０、または５〜１０の化合物が挙げられる。ｎが２である化合物ＡｎまたはＥｎもまた、本発明の範囲内にある。
【００２４】
１つの実施の形態では、本発明は第１化合物、および、構造式Ａｎを有する第２化合物を熱処理することにより入手し、または入手可能な第１化合物、またはそれらの医薬品的に認容可能な塩または誘導体（酸化生成物、メチル誘導体、グルクロン酸誘導体を含む）を効果的な量で含む組成物に関し：
【化２】
2009501161.tif 000004
【００２５】
ここで、
ｎは、２〜１８の整数であり、
ＲおよびＸはそれぞれ、αまたはβ型の立体化学を有し、
Ｒは、ＯＨであり、
Ｃ−４、Ｃ−６、Ｃ−８の置換基は、それぞれＸ、Ｚ、Ｙであり、モノマー単位の結合は、Ｃ−４、Ｃ−６、Ｃ−８で生じ、
Ｃ−４、Ｃ−６、Ｃ−８のいずれも別のモノマー単位と結合しない場合、各Ｘ、Ｙ、Ｚは水素である。
【００２６】
ある実施の形態では、化合物は、熱処理されたプロシアニジンの２量体または３量体、すなわち、構造式Ａｎにおいて、ｎ＝２またはｎ＝３である。熱処理する前のこれら２量体または３量体のモノマー単位は、すべて（−）−エピカテキンである。これら２量体の例として、（−）−エピカテキン−（４β→８）−（−）−エピカテキンおよび（−）−エピカテキン−（４β→６）−（−）−エピカテキンがある。
【００２７】
熱処理に用いられる２量体または３量体もしくは他のオリゴマーを、単離・精製により、または当技術分野で既知の方法で合成することにより調製して差し支えなく、あるいは、例えばフラバノールおよび／または他のプロシアニジンとの混合物として扱っても良い。これら混合物は、例えば、植物の抽出物（例えばカカオ抽出物）、植物源（例えばココア）から単離された２量体または他のオリゴマー画分、もしくは、カカオ粉末などのココア材料でもよい。カカオ抽出物は、例えば、米国特許第５，５５４，６４５号明細書に記載のように調製して差し支えなく、カカオ粉末は、当技術分野で既知のように調製して差し支えなく、フラバノール／プロシアニジンをある程度保有するカカオ粉末については、米国特許第６，０１５，９１３号明細書に記載のように調製してよい。精製された個々の２量体、２量体混合物または合成化合物を熱処理する場合、それらの純度は、例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％であって構わない。上記純度は、構造式Ａｎの化合物、本明細書に記載されているその塩および誘導体に用いて差し支えない。
【００２８】
実施例１に開示される２量体（例えば図４を参照）、および、例えばココアまたはチョコレート飲料などの飲料のようなこれら２量体を含む組成物もまた、本発明の範囲内にある。図４を参照すると、５７７ｍ／ｚの擬分子イオンの抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）は、処理済の飲料において検出された２量体を示している。新しい２量体の溶離時間は、１２．６、１４．５（最大ピーク）、１６．９、１８．８、および２２．６分である。上記分離に効果的に使用されるＨＰＬＣ法は、次のとおりである：
固定相：ハイパーシル(Hypersil) ＯＤＳ １００×４．６ｍｍ 粒径５μｍ
移動相Ａ：０．１％ ＨＯＡｃ／水
移動相Ｂ：０．１％ ＨＯＡｃ／ＭｅＯＨ
流速：１．０ｍｌ／分
2009501161.tif 000005
【００２９】
熱処理された（＋）−カテキンと（−）−エピカテキン、およびそれらの誘導体（没食子酸誘導体を除く）、ならびに、例えばココアまたはチョコレート飲料などの飲料等、フラバノールを含む組成物もまた、本発明の範囲内にある。
【００３０】
本発明は、さらに、次の構造式Ｅｎを有する化合物、およびその化合物を効果的な量で含む組成物、もしくはそれらの医薬的に認容可能な塩または誘導体を含む組成物（酸化生成物、メチル誘導体、グルクロン酸誘導体を含む）に関し：
【化３】
2009501161.tif 000006
【００３１】
ここで、
ｎは、２〜１８の整数であり、
ＲおよびＸはそれぞれ、αまたはβ型の立体化学を有し、
Ｒは、ＯＨ、Ｏ−糖またはＯ−没食子酸塩であり、
Ｃ−４、Ｃ−６、Ｃ−８の置換基はそれぞれＸ、Ｚ、Ｙであり、モノマー単位の結合はＣ−４、Ｃ−６またはＣ−８で生じ、
Ｃ−４、Ｃ−６またはＣ−８のいずれも別のモノマー単位と結合しない場合は、各Ｘ、ＹまたはＺは、水素または糖であり、
前記糖は、随意的に、例えばエステル結合でなど、いずれかの位置においてフェノール部分で置換され、
少なくともモノマー単位の１つが次の構造式：
【化４】
2009501161.tif 000007
【００３２】
を有する。
【００３３】
構造式Ａｎの化合物では、上記構造式中のモノマー単位は、上述の連結によって結合されてもよい。上記構造式Ａｎの化合物では、糖、フェノール部分、誘導体は、上記のとおりである。
【００３４】
別の実施の態様では、本発明は、構造式Ｅｎを有する化合物またはそれらの医薬品的に認容可能な塩または誘導体（酸化生成物、メチル誘導体、グルクロン酸誘導体を含む）、その化合物を効果的な量で含む組成物に関し：
【化５】
2009501161.tif 000008
【００３５】
ここで、
ｎは、２〜１８の整数であり、
ＲおよびＸはそれぞれ、αまたはβ型の立体化学を有し、
Ｒは、ＯＨであり、
Ｃ−４、Ｃ−６、Ｃ−８の置換基は、それぞれＸ、Ｚ、Ｙであり、モノマー単位の結合は、Ｃ−４、Ｃ−６、Ｃ−８で生じ、
Ｃ−４、Ｃ−６またはＣ−８のいずれも別のモノマー単位と結合しない場合、各Ｘ、Ｙ、Ｚは水素であり、
少なくともモノマー単位の１つが次の構造式：
【化６】
2009501161.tif 000009
【００３６】
を有する。
【００３７】
構造式Ｅｎの化合物の例として、整数ｎが３〜１８、２〜１２、３〜１２、２〜５、４〜１２、５〜１２、４〜１０、または５〜１０の化合物が挙げられる。いくつかの実施の形態では、化合物は、エピマーの形態中に少なくとも１つのモノマー単位を有するプロシアニジンの２量体または３量体である。ある実施の形態では、化合物Ｅｎは、２量体または３量体、すなわち、ｎ＝２またはｎ＝３である。
【００３８】
例えば、本発明は、次の構造式Ｅｎを有する化合物またはそれらの医薬品的に認容可能な塩または誘導体（酸化生成物、メチル誘導体、グルクロン酸誘導体を含む）、およびその化合物を効果的な量で含む組成物に関し：
【化７】
2009501161.tif 000010
【００３９】
ここで、
ｎは２であり、
ＲおよびＸはそれぞれ、αまたはβ型の立体化学を有し、
Ｒは、ＯＨ、Ｏ−糖またはＯ−没食子酸塩であり、
Ｃ−４、Ｃ−６、Ｃ−８の置換基は、それぞれＸ、Ｚ、Ｙであり、モノマー単位の結合は、Ｃ−４、Ｃ−６またはＣ−８で生じ、
Ｃ−４、Ｃ−６またはＣ−８のいずれも別のモノマー単位と結合しない場合は、各Ｘ、ＹまたはＺは、水素または糖であり、
前記糖は、随意的に、例えばエステル結合によって、いずれかの位置がフェノール部分に置換され、
少なくともモノマー単位の１つが（−）−カテキンである。
【００４０】
別の例では、本発明は、構造式Ｅｎを有する化合物またはそれらの医薬品的に認容可能な塩または誘導体（酸化生成物、メチル誘導体、グルクロン酸誘導体を含む）、およびその化合物を効果的な量で含む組成物に関し：
【化８】
2009501161.tif 000011
【００４１】
ここで、
ｎは２であり、
ＲおよびＸはそれぞれ、αまたはβ型の立体化学を有し、
Ｒは、ＯＨであり、
Ｃ−４、Ｃ−６、Ｃ−８の置換基は、それぞれＸ、Ｚ、Ｙであり、モノマー単位の結合は、Ｃ−４、Ｃ−６、Ｃ−８で生じ、
Ｃ−４、Ｃ−６またはＣ−８のいずれも別のモノマー単位と結合しない場合、各Ｘ、Ｙ、Ｚは水素であり、
少なくともモノマー単位の１つが（−）−カテキンである。
【００４２】
当技術分野で既知のように、エピマーとは、例えば２以上の不斉炭素原子のうちの１つなど、２以上の四面体の立体中心の１つのみが逆配置になっているジアステレオ異性体のことである。本明細書に記載される化合物の種類については、エピマーは、不斉炭素中心Ｃ−２およびＣ−３のうちの１つが逆転した立体配置を有している。
【００４３】
本明細書では、エピマーという用語は、Ｃ−２の炭素原子の立体化学がβとなるように、環のＣ−２炭素原子が反転している化合物に適用する。天然に存在するフラバノールおよびプロシアニジンでは、典型的に、Ｃ−２炭素原子がαの立体化学を有する。
【００４４】
本発明は、フラバノールの（＋）−カテキンおよび（−）−カテキンの炭素２（Ｃ−２）エピマー、すなわち、（＋）−カテキンおよび（−）−カテキン、ならびにそれらの誘導体（例えば、メチル誘導体、グルクロン酸誘導体、および没食子酸を除く酸化生成物）およびそれらの化合物を含む組成物も包含している。
【００４５】
使用方法
本明細書に記載されるいずれかの化合物および／または組成物について、本願に記載される方法を実施して差し支えない。
【００４６】
本明細書では、「血管系の疾病または障害」とは、心臓および脳を含む脈管系に影響を及ぼす疾病または障害のことをいう。これらの状態の例として、アテローム性動脈硬化症、血栓症、高血圧症（例えば、二次性および肺高血圧症など）、循環器疾患（ＣＶＤ）、冠動脈疾患（ＣＡＤ）（心筋虚血、心筋梗塞症、安定および不安定狭心症、急性閉塞または再狭窄を含む）、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）（例えば、糖尿病の血管合併症）、認知機能障害または認知障害および／または循環器系障害（脳についてのものも含む）、心臓麻痺、脳血管障害（脳梗塞、初期または再発性の一過性脳虚血発作、または、例えば冠動脈血管形成術または経皮冠動脈インターベンション後などの虚血性合併症を含む）、鬱血性心不全、腎不全、腎臓病、末梢血管障害、さらに具体的にはレイノー病などの末梢血管の血管収縮（例えば腕または脚の血管など）に関連する疾病および疾患、末梢動脈障害、間欠性跛行、脈管炎（例えば、微小血管の）、血管けいれん、静脈血栓症、静脈機能不全、リンパ腺機能不全、重症虚血肢、急性虚血肢、アテローム塞栓症、および下肢動脈血行不全が挙げられる。
【００４７】
「ＮＯ応答性の疾病または障害」とは、ＮＯでの治療に反応を示す健康状態のことをいう。これらの状態の例として、限定はしないが、ＮＯ媒介性またはＮＯ依存性の疾病および障害が挙げられ、その疾病／障害の病理は、ＮＯ経路の機能異常に起因する。例えば、病状として、高血圧症（例えば原発性、二次性、肺高血圧症など）、循環器系疾患、冠動脈疾患、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）（例えば糖尿病の血管合併症）、鎌状赤血球貧血、認知機能障害または認知障害、および／または循環器系障害（脳についてのものも含む）、心臓麻痺、脳梗塞、鬱血性心不全、腎不全、腎臓病が挙げられる。高血圧は、心臓麻痺、脳梗塞、鬱血性心不全、腎不全の危険性を増大させることから、血管緊張を低下させる上記化合物を単独または他の血管系（心臓血管を含む）を保護する薬剤と共に使用して、これらの病状を抑制することができる。特に好ましい被験者として、高血圧症と、糖尿病、肥満症、悪影響を与える脂質状態（例えば高濃度コレステロール）および／または喫煙者の組合せが挙げられ、それら患者では、心臓麻痺と脳梗塞の危険性が数倍に増加する。一般に、少なくとも１つの循環器系疾患の危険因子（米国心臓病協会で認識されるような）を有する被験者に対して、本明細書に記載の治療をしても差し支えない。
【００４８】
本明細書では、「治療」は、例えば、疾患の進行を遅らせ、生存期間を延長し、死亡の危険性を低下し、および／または疾病のパラメーターをある程度改善させることによって、循環器系疾患などの現存の病状を改善することを意味する。
【００４９】
「予防する」という用語は、病気の発症の低減を含めた、病気の発現に関する危険性を低下させることを意味する。
【００５０】
本明細書では、「血管系を保護または治療する薬剤」という用語は、脈管系の治療または保護に効果的な本発明にかかる化合物以外の薬剤のことをいう。これらの薬剤の例として、抗血小板治療薬（例えばアスピリンなどのＣＯＸ阻害剤）、ＮＯ調節剤、コレステロール低減剤（例えば、ステロール、スタノール）がある。
【００５１】
よって、本発明は、（i）血管系の疾病または障害の治療または予防方法、または（ii）ＮＯ応答性の疾病または障害の治療または予防方法、または（iii）本明細書に記載のいずれかの化合物（例えば構造式ＡｎまたはＥｎの化合物、またはそれらの医薬的に認容可能な塩または誘導体（酸化生成物、メチル誘導体、グルクロン酸誘導体を含む））を、効果的な量で治療を必要とする被験者に投与することによる、抗血小板の治療方法に関する。
【００５２】
例えば、上記方法は、ｎが２である構造式Ａｎの化合物のいずれかを投与することによって実践して差し支えない。
【００５３】
本発明にかかる化合物は、他の血管／心臓の保護薬、および／またはＮＯ調節剤との併用療法への使用にも適している。これら薬剤の例は当業者にとって明らかであろうし、例えばＢ型プロシアニジンおよびＡ型プロシアニジンが挙げられる。これら化合物は本発明にかかる化合物との混合剤として、または別々に投与して構わない。
【００５４】
Ａ型プロシアニジンは、天然由来もしくは合成によって調製して差し支えない。例えばＡ型プロシアニジンは、ルー(Lou)らのPhytochemistry, 51: 297-308 (1999)またはカーチェシー(Karchesy)とヘミングウェイ(Hemingway)のAgric, Food Chem., 34:966-970 (1986)に記載されるように、ピーナツの皮から単離してもよく、ここにそれぞれの該当箇所を引用することにより本明細書に援用する。上記化合物の他の供給源としては、例えば、ここにそれぞれの該当箇所を引用することにより本明細書に援用する、フー(Foo)らのJ. Nat. Prod., 63: 1225-1228、プライア(Prior)らのJ. Agricultural Food Chem., 49(3): 1270-76 (2001) に記載されるクランベリー、ここにそれぞれの該当箇所を引用することにより本明細書に援用するゴムカズラ(Ecdysanthera utilis)（Lie-ChwenらのJ. Nat. Prod., 65:505-8 (2002)）、セイヨウトチノキ(Aesculus hippocastanum) (米国特許第4,863,956号明細書) が挙げられる。ここにそれぞれの該当箇所を引用することにより本明細書に援用する、近藤らのTetrahedron Lett, 41: 485 (2000)に記載される中立条件下で、１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）ラジカルを使用した酸化を経て、Ｂ型のプロシアニジンからＡ型の化合物を得てもよい。
【００５５】
天然および合成のＢ型プロシアニジンの入手方法は、当技術分野で周知であり、例えば、ロマンツィク(Romanczyk)らの米国特許第６，６７０，３９０号明細書、ロマンツィクらの米国特許第６，２０７，８４２号明細書、ロマンツィクらの米国特許第６，４２０，５７２号明細書、およびロマンツィクらの米国特許第６，１５６，９１２号明細書に記載されている。
【００５６】
本発明の方法は、ヒトまたはイヌ、ネコ、ウマなどの獣動物に用いて差し支えない。
【００５７】
したがって、次の用途は本発明の範囲内にある。（i）血管系の疾病または障害の治療または予防、または（ii）ＮＯ応答性の疾病の治療または予防、または（iii）抗血小板の治療用の薬品、食品、栄養補給食品または栄養補助食品の製造における、本明細書に記載のいずれかの化合物、それらの医薬品的に認容可能な塩または誘導体の利用。本明細書に引用する特定の状態のすべてが、これら用途の範囲内にある。
【００５８】
上記方法に使用する効果的な量は、本明細書が提供する指針および当技術分野における一般常識を利用する当業者によって決定されて構わない。例えば、効果的な量は、哺乳動物の体内（例えば、血液）で生理的に適切な濃度を達成するなどであって差し支えない。これら生理的に適切な濃度は、少なくとも約２０ナノモル（ｎＭ）であって差し支えなく、少なくとも約１００ｎＭであることが好ましく、少なくとも５００ｎＭであることがさらに好ましい。１つの実施の形態では、ヒトなどの哺乳動物の血中濃度は、少なくとも約１マイクロモルに到達する。本明細書で定義される構造式Ａｎの化合物は、約５０ｍｇ／日から約１０００ｍｇ／日で投与されて差し支えなく、約１００〜１５０ｍｇ／日から約９００ｍｇ／日が好ましく、約３００ｍｇ／日から約５００ｍｇ／日が最も好ましい。しかしながら、上記の量よりも多く使用しても差し支えない。
【００５９】
化合物は、急性投与しても差し支えなく、または治療／予防投与は、投薬計画、すなわち、例えば毎日、１ヶ月毎、２ヶ月に１回、半年に１回、年１回などの効果的な期間で、あるいは、必要に応じて、熟練した開業医がこういった期間を決定するなど、他の投薬計画に基づいて継続されてもよい。投薬は、少なくとも治療／予防の効果が現れるのに必要とされる期間、継続されて構わない。組成物は、哺乳動物の体内における効果的な化合物の濃度を維持するため、毎日投与されるのが好ましく、例えば朝晩など、１日に２、３回投与されることが最も好ましい。最も有益な結果を得るためには、組成物は、少なくとも約３０日、もしくは少なくとも約６０日間投与されて差し支えない。これらの投薬計画を周期的に繰り返しても良い。本明細書が提供する指針および当技術分野における一般常識に基づいて、当業者は、急性および／または慢性投与に適した化合物を選択することができる。例えば、単回投与および／または投与直後（例えば投与の２時間後）に効果を示す化合物は、即時の急性期反応が必要な場合に使用されて構わない。反復投与後に効果が現れる化合物は、それに応じて使用して差し支えない。よって、こういった投与（例えば、急性、慢性）に適合する投薬形態は、本発明の範囲内にある。
【００６０】
治療に必要とされる最小限の投薬量または上記治療方法に用いる最適な投薬量を決定するためのアッセイもまた、本発明の範囲内にある。実施例に記載の方法、または本明細書で引用する疾病または障害の治療への化合物の有効性を予測する既知の他の用量反応法(dose response method)を用いても構わない。少なくとも治療に効果的な最少の投薬量、または最適な量を輸送するのに適合する投薬形態も本発明の範囲内にある。
【００６１】
組成物および剤形
本発明は、医薬品、食品、食品添加物、栄養補助食品として処方されて構わない、本明細書記載の組成物に関する。
【００６２】
本明細書では、「医薬品(pharmaceutical)」とは、薬効のある薬(medicinal drug)のことである。メリアム・ウェブスター・カレッジ英英辞典(Merriam- Webster's Collegiate Dictionary)第１０版（１９９３）を参照。医薬品を薬剤(medicament)と称してもよい。本明細書では、「栄養補助食品」は、次の食品成分を１種類以上有するまたは含む食物の補給を目的とする製品（タバコ以外）である：ビタミン、ミネラル、ハーブまたは他の植物、アミノ酸、１日の総摂取量を増やすことによって食品を補うことを目的とする、ヒトに用いられる食品中の物質、または濃縮物、代謝産物、構成物質、抽出物またはそれら成分の組合せ。「食品」は、成長、修復、生命過程を維持し、エネルギーを与える生命体の体内に利用される、タンパク質、炭水化物および／または脂肪を含む物質である。食品は、また、ミネラル、ビタミン、香辛料などの補助的な物質を含んでもよい。メリアム・ウェブスター・カレッジ英英辞典第１０版（１９９３）を参照。食品という用語には、ヒトまたは動物の消費に適合した飲料が含まれる。「食品添加物」は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の21 C.F.R. 170.3(e)(l)によって定義されており、直接添加物および間接添加物を含む。
【００６３】
組成物は、基材、希釈剤、または賦形剤を含んでもよい。
【００６４】
使用目的に応じて、ヒトまたは獣動物の用途、食品、食品添加物、栄養補助食品または医薬品用途に適するように、基材、希釈剤、または賦形剤を選択して差し支えない。組成物は、随意的に、さらなるがん治療薬および／または心臓血管治療薬を含んでもよい。組成物は、年齢、性別、体重、遺伝的特徴、個々の被験者または患者の状態、および、投薬経路などの要因を考慮して、こういった追加的な薬剤と共に併用投与または連続投与することができる。
【００６５】
ヒトまたは獣動物用の本発明にかかる組成物の例として、例えばカプセル、錠剤、丸薬などの固形剤または液剤などの経口投薬用の食用組成物、ならびに、噛み砕けるタイプの固形剤またはドリンク剤（例えば、ココアまたはチョコレート風味の固形または液体の組成物）、懸濁液、シロップ剤、またはエリキシル剤などの、例えば、口、鼻、肛門、膣などの開口部への投与用の液体製剤（ココアまたはチョコレート風味の組成物を含む）、および、滅菌懸濁液または乳濁液などの、非経口、皮下、皮内、筋肉または静脈内投与（例えば注入投与(injectable administration)）用の製剤が挙げられる。しかしながら、組成物中の活性成分は、血流に投与された場合に血中タンパク質が沈殿することで凝固が起こるなど、タンパク質と複合体を形成するであろう。熟練した技術者は、このことを考慮すべきである。これら組成物では、活性カカオ抽出物を、滅菌水、生理食塩水、グルコース、ＤＭＳＯ、エタノールなどの適切な基材、希釈剤または賦形剤と混合して差し支えない。
【００６６】
本発明にかかる化合物は、例えば、天然由来（例えば、テオブロマ(Theobroma)属、ヘルラニア(Herrania)属）のプロシアニジンなど、異なる供給源に由来した熱処理化合物、または合成的に調製されたものから調製されて差し支えない。
【００６７】
本発明に用いられる出発物質（フラバノールおよびプロシアニジン）の調製方法は、当技術分野で周知である（例えば、ここに引用することにより本明細書に援用される、米国特許第５，５５４，６４５号、同第６，４２０，５７２号、同第６，１５６，９１２号、同第６，４７６，２４１号、および同第６，８６４，３７７号の各明細書）。ポリフェノールは、例えばカカオ豆などの天然供給源、または別の天然供給源のポリフェノール、あるいは合成的に調製されたポリフェノールであって差し支えない。当業者は、利用可能性またはコストに基づき、天然または合成ポリフェノールを選択して構わない。
【００６８】
フラバノールおよび／またはプロシアニジン誘導体もまた、出発物質として有用である。これらとして、没食子酸エステル（例えば没食子酸エピカテキンおよび没食子酸カテキン）など、単量体またはオリゴマーのエステル、例えば上記構造式のＸ、Ｙおよび／またはＺの位置が、単糖または二糖部分（例えばβ−Ｄ−グルコース）などの糖部分で誘導体化された化合物、グリコシル化された単量体およびオリゴマーならびにそれらの混合物、結腸フローラの代謝によって生成するプロシアニジンの酵素開裂生成物を除く硫酸化、グルクロン酸化、およびメチル化された形態などのプロシアニジン単量体およびオリゴマーの代謝産物が挙げられる。
【００６９】
本発明の化合物を、Ｃ−２原子の立体化学がαのフラバノール、プロシアニジンまたはそれらの誘導体から、Ｃ−２原子の周りが回転することによってＣ−２原子の立体化学がβになるように、熱処理（水溶液中）して調製してもよい。この手法は、特に、例えば（−）−エピカテキンおよび（＋）−カテキンなど、フラバノールのエピマーの調製に適している。
【００７０】
フラバノールのエピマーの調製は、次のスキーム１：
2009501161.tif 000012
【００７１】
にしたがって（および、ここに開示を引用することにより本明細書に援用される、Freudenberg, K. and Purrmann, L. (1924). Raumisomere Catechin IV. Liebig's Annalen, 437, 472-85; Fredenberg, K., Bohme, L. and Purrmann, L. (1922). Raumisomere Catechin II. Ber. Dscht. Chem. Ges., 55, 1734-47に記載のとおりに）、実施してもよい。
【００７２】
温度が低く、曝露が長くなると、エピマー化が生じる。例えば、こういった温度および時間は、少なくとも４０℃、さらに好ましくは少なくとも５０℃で、少なくとも１０時間、さらに好ましくは少なくとも２４時間、またはさらに好ましくは少なくとも４８時間であって差し支えなく、もしくは、少なくとも６０℃、少なくとも７０℃、少なくとも８０℃、少なくとも９０℃、少なくとも１００℃、少なくとも１１０℃、または少なくとも１２０℃で、それぞれ、少なくとも５分、あるいは、少なくとも１０分、１５分または２０分間であって構わない。例えば、化合物は、１２０℃で１０分間、または１２０℃で２０分間、処理されて差し支えない。他の温度／時間の組合せもまた効果的であり、当業者は、当技術分野における一般知識および本明細書が提供する指針を用いて、必要以上の実験をせずにこれらを決定して差し支えない。ＨＰＬＣ／ＭＳ分析などの既知の技術を、反応の成功をモニタするのに利用してもよい。
【００７３】
エピマー化された化合物を、例えば、天然由来（例えば、テオブロマ(Theobroma)属、ヘルラニア(Herrania)属）または合成により調製された（当技術分野で周知のように得られる。米国特許第５，５５４，６４５号、同第６，４２０，５７２号、同第６，１５６，９１２号、同第６，４７６，２４１号、および同第６，８６４，３７７号の各明細書を参照）プロシアニジンなど、別の供給源に由来する熱処理化合物から調製して、または、商業的供給源からフラバノールを購入することにより調達して差し支えない。
【００７４】
フラバノールのエピマーを出発物質として、プロシアニジンのエピマーを、米国特許第６，４２０，５７２号、同第６，１５６，９１２号、同第６，４７６，２４１号、および同第６，８６４，３７７号の各明細書、ならびに国際公開第０４/０３０４４０号パンフレット（ここにこれらの開示を引用することにより本明細書に援用される）に記載の方法に従って調製して差し支えない。
【００７５】
例えば、以下の出発物質をプロシアニジンのエピマーの合成に利用してもよい：
【化９】
2009501161.tif 000013
【００７６】
４β−８連結（表１に記載）を有するプロシアニジン・エピマーを、次に、以下のスキームに従って調製して差し支えない（ベンジル化、ヒドロキシエトキシル化、カップリング、および脱ベンジル化の各工程は、先に引用した米国特許明細書に記載されているとおりである）。出発物質に応じて手法を選択し、様々な組合せのエピマー化プロシアニジンを調製して差し支えない。
【００７７】
2009501161.tif 000014
【００７８】
2009501161.tif 000015
【００７９】
2009501161.tif 000016
【００８０】
2009501161.tif 000017
【００８１】
当業者は、当技術分野における知識および本明細書の指針を利用して、本発明にかかる化合物の他の調製方法を想定するであろう。
【００８２】
本明細書に記載の化合物を含む食品、および随意的に、別の心臓／血管保護薬は、ヒトまたは獣動物用に適していて差し支えなく、ペットフードも含まれる。
【００８３】
食品は、菓子類などの水分含量の低い食品、またはココア飲料のような水分含量の高い食品であって構わない。典型的には、タンパク質が２５％まで、好ましくは５〜２０％、最も好ましくは１〜１５％含まれ、脂肪が６０％まで、好ましくは１〜５０％、最も好ましくは５〜４５％含まれ、炭水化物が７０％まで、好ましくは１〜６０％、最も好ましくは５〜５０％含まれる。一部の食品では、必ずしもタンパク質、脂肪、および炭水化物を含むとは限らないであろう。食品の水分活性は、約０．２〜０．９５であり、０．４〜約０．５が好ましい。
【００８４】
食品は、ブラックチョコレート、低脂肪チョコレートおよびチョコレート・コーティングされている飴を含む、ミルク、スウィート、およびセミスウィートチョコレートなどの、米国同一性規格（SOI）および非米国同一性規格（non-SOI）のチョコレートなどの菓子類であって構わない。他の例として、焼き菓子（例えば、ブラウニー、ベークドスナック、クッキー、ビスケット）、香辛料、グラノーラ・バー、トフィーチュー（toffee chew）、食事代替バー(meal replacement bar)、スプレッド、シロップ、混合粉末飲料、ココア、チョコレートで風味付けされた飲料、プリン、餅、混合米、香味ソース(savory sauce)などが挙げられる。必要に応じて、食品にチョコレートまたはココアの風味付けをしてもよい。食品は、例えばピーナツ、クルミ、アーモンド、ヘーゼルナッツなどのナッツ類を含んでいる、チョコレートおよびグラノーラ・バーなどのキャンディー・バーであって差し支えない。
【００８５】
(−)−カテキンおよび／または本明細書に記載される２量体を含む、ココア飲料などの飲料もまた、本発明の範囲内にある。例えば飲料に、 (−)−カテキンに対する(−)−エピカテキンの比が、例えば少なくとも１：２もしくは少なくとも１：３など、(−)−エピカテキンよりも(−)−カテキンを多く含めることができる。
【００８６】
カカオ材料
熱処理されたカカオ材料は、高ＣＰ食品に利用される。水分含量の低い製品の場合、それらの製品には、製品１ｇあたりのカカオポリフェノールが、少なくとも約６ｍｇ含まれ、約８ｍｇ含まれることが好ましく、約１０ｍｇがさらに好ましく、製品中のエピカテキンのカテキンに対する比は１より大きいのに対して１である。それらには、製品１ｇあたりのカカオポリフェノールが少なくとも約１０ｍｇ含まれることが好ましく、約１２ｍｇがさらに好ましく、約１４ｍｇが最も好ましく、製品中のエピカテキンのカテキンに対する比は０．６６より大きいのに対して１である。それらには、製品１ｇあたりのカカオポリフェノールが少なくとも約１２ｍｇ含まれることが好ましく、約１４ｍｇがさらに好ましく、約１６ｍｇが最も好ましく、製品中のエピカテキンのカテキンに対する比は０．５４より大きいのに対して１である。それらには、製品１ｇあたりのカカオポリフェノールが少なくとも約１３ｍｇ含まれることがさらになお好ましく、約１５ｍｇがさらに好ましく、約１７ｍｇが最も好ましく、製品中のエピカテキンのカテキンに対する比は０．４２より大きいのに対して１である。
【００８７】
高ＣＰカカオ材料は、（±）−カテキンと（±）−エピカテキン、およびそれらのプロシアニジン・オリゴマーを含む、熱処理され、一部または完全に脱脂された高ＣＰカカオ粉末であって、脱脂カカオ粉末１ｇあたりの総ＣＰ含有量が少なくとも２５ｍｇ、好ましくはカカオポリフェノールが約１２〜約２５ｍｇ含まれる。
【００８８】
製品が飲料などの水分含有量の高い食品の場合、それらには、製品１ｇあたりの総カカオポリフェノールが、少なくとも約０．２ｍｇ含まれ、０．２〜０．４ｍｇ含まれることが好ましく、０．４〜０．８ｍｇ含まれることがさらに好ましく、０．８〜１．２ｍｇ含まれることが最も好ましい。
【００８９】
水分含有量の高い食品におけるカテキンに対するエピカテキン含有量は、製品のカカオポリフェノール含有量に応じて変化する。典型的には、約０．２〜０．４ｍｇを含む製品では、１より大きいのに対して１の比を有し、約０．４〜０．８ｍｇを含む製品では、０．４２に対して１の比を有し、約０．８〜１．２ｍｇを含む製品では、約０．５４に対して約１の比を有し、約１〜１．２ｍｇ以上を含む製品では、約０．６６に対して約１の比を有する。
【００９０】
材料には、乾燥カカオ抽出物１ｇあたりの総ＣＰ含有量が、少なくとも約２００ｍｇ、好ましくは約２５０〜約５００ｍｇ、最も好ましくは約３５０〜約５００ｍｇである、乾燥または液体の熱処理された高ＣＰカカオ抽出物も含まれる。抽出物は、熱処理されていないカカオ抽出物と比べて、性質が改質されている。成分には、熱処理されていないココア飲料製品に比べて、改質された性質を有するココア飲料などの熱処理されたカカオ製品も含まれる。製品は、カカオ粉末、および／または、液体または乾燥のカカオ抽出物および／またはカカオマスなどの高ＣＰカカオ材料を含む。製品が、飲料などの水分含量の高い製品の場合、製品には、製品１ｇあたりの総カカオポリフェノールが、少なくとも約０．２ｍｇ含まれる。カカオポリフェノール含有量は、約０．２〜５ｍｇが好ましく、約０．６〜約２．０ｍｇがさらに好ましく、約０．６〜約２．０ｍｇが最も好ましい。
【００９１】
この高ＣＰカカオ粉末、カカオ抽出物、カカオ製品では、エピカテキンとカテキンの総量は熱処理によっては実質的に変化しないが、（−）−カテキンに対する（＋）−カテキンの比は、カカオ固形物で９０：１０から４：９６へと、カカオ抽出物で９０：１０から３４：６６へと変化する。興味深いことに、（＋）−エピカテキンに対する（−）−エピカテキンの比は、熱処理によっても変わらないか、わずかに変わるのみである。
【００９２】
改質された性質を有する高ＣＰカカオ粉末、高ＣＰカカオ抽出物、および高ＣＰカカオ製品は、好ましくは未発酵または発酵が不十分なカカオ豆から調製された、一部または完全に脱脂されたカカオ粉末または乾燥ココアの水分散液を加熱することにより調製される。カカオ材料またはカカオ製品は、（−）−エピカテキンをエピマー化するのに十分な時間、ｐＨおよび温度で加熱される。典型的には、材料または製品は、ｐＨが約３．８〜約８、温度が約３７℃〜約２００℃で、約０．５分〜数日間、加熱される。それらは、ｐＨが約５〜約７．５、温度が約７２℃〜約１６０℃で、約１分〜約６時間、加熱されるのが好ましい。それらは、ｐＨが約６〜約７．４、温度が約１００℃〜約１４０℃で、約１〜約４時間、加熱されるのが最も好ましい。
【００９３】
材料はまた、熱処理されたカカオマスを含んでもよい。カカオマスは、脱脂されたカカオ・リカー１ｇに対するカカオポリフェノールを、少なくとも約１０ｍｇ、好ましくは約２０〜約５０ｍｇ、さらに好ましくは約１３〜約１７ｍｇ含む。
【００９４】
本発明にかかる化合物を随意的に別のＮＯ−調節剤または心臓／血管治療薬と共に含む医薬品を、経口、舌下、頬内、経鼻、直腸、静脈内、非経口、局所など様々な方法で投与して差し支えない。当業者は、構造式Ａｎの化合物、および随意的に別の心臓／血管保護薬の輸送を最大にするのに適した投与形態を決定できるであろう。よって、各種の投与に適した投薬形態は本発明の範囲内にあり、錠剤、カプセル、ゼラチンカプセル（ジェルキャップ）、大量投薬または単位投薬用の粉末または顆粒、乳濁液、懸濁液、ペースト、クリーム、ゲル、泡またはゼリーなど、固形、液体および半固体の投薬形態を含む。徐放性の投薬形態もまた、本発明の範囲内にある。適切な医薬的に認容可能な基材、希釈剤、または賦形剤は、一般に、当技術分野で知られており、当業者によって容易に決定することができる。例えば錠剤は、効果的な量のポリフェノール含有組成物および随意的にソルビトール、ラクトース、セルロース、または第二リン酸カルシウムなどの基材を含んで差し支えない。
【００９５】
ココアフラバノールおよび／またはプロシアニジン（および随意的に別のＮＯ調整剤、または心臓／血管治療薬）を含む栄養補助食品を、当技術分野で既知の方法を用いて調製して差し支えなく、例えば、第二リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、硝酸カルシウム、ビタミン、およびミネラルなどの栄養素を含んでもよい。
【００９６】
本発明にかかる組成物（例えば、食品、栄養補助食品、医薬品）および本発明にかかる化合物の存在を示し、および／または心臓／血管の問題を治療する目的で、または本明細書に記載される予防治療として、組成物の用途を示すラベルを含む包装された製品などの製造品もまた、本発明の範囲内にある。ラベルおよび／または使用説明書は、本願に記載される用途のいずれの方法を参照しても構わない。
【００９７】
本発明は、本明細書に記載される組成物のいずれかを含む製品を製造し、組成物を包装して製品とし、本明細書に記載される用途のいずれかの組成物／製品の用途を指導または宣伝する方法に関する。このような指示、指導または宣伝には、広告も含まれる。
【００９８】
少なくとも１つの本発明にかかる化合物、および少なくとも１つの追加的な化学療法薬および／または心臓／血管薬（すなわち、本発明にかかる化合物以外）を含む併用療法の用途に適合した製品（包装された製品またはキット）もまた、本発明の範囲内にあり、ここで、化学療法薬および／または心臓／血管薬は、別包装で、または本発明にかかる化合物と混合して提供されて差し支えない。
【００９９】
以下の手順は、高ＣＰ製品の調製および試験に用いられた。
【０１００】
試料の調製
実施例１では、飲料を、凍結乾燥し、アセトン／水／酢酸混合液（ＣＨ２ＣＯＣＨ３：Ｈ２０：ＨＯＡｃ＝７９．５：２０：０．５１）で２回抽出し、５０℃で１５分間、超音波で分解し、５８３．３／ｓ(35000rpm)で６分間、遠心分離した。減圧下または真空下で、集めた上清から溶媒を回収し、凍結乾燥した。得られた物質を位相ＨＰＬＣ解析に用いた。
【０１０１】
実施例３および４では、ココア飲料の試料の調製を修正し、水分含量の高い製品の分析をより良い状態で提供した。試料の調製は、３２〜３５ｇの飲料を取り、それを定量的に１００ｍｌ容量フラスコに移し、０．５ｍｌの氷酢酸を加え、アセトンを加えることから構成された。この手法により、７０：２９．５：０．５のアセトン：水：酢酸(v/v/v)からなる他のカカオ試料に使用する抽出溶媒と遜色ない溶液が生じる。飲料試料は、分析前に脱脂されなかった。飲料中の水分は、抽出溶媒の水分画分を作成するのに用いられた。
【０１０２】
順相クロマトグラフィー−ＨＰＬＣ／ＭＳ分析〜アダムソン(Adamson)らの方法
実施例１では、アダムソンらの公表されている順相ＨＰＬＣ法(J. Agric. Food Chem., 1999, 47 pp. 4184-4186)を用いた。条件は次のとおりであった：
ａ）カラム：Phenomenex Lichrosphereシリカ  
サイズ：２５ｃｍ×４．６ｍｍ
粒径：５μｍ
孔隙サイズ：１００Å
ｂ）移動相：
Ａ．ジクロロメタン
Ｂ．メタノール
Ｃ．水：酢酸（１：１）
勾配条件：
初期：                   ８２％Ａ／１４％Ｂ／４％Ｃ
時間＝３０分             ６７．６％Ａ／２８．４％Ｂ／４％Ｃ
時間＝５０分             ５３．２％Ａ／４２．８％Ｂ／４％Ｃ
時間＝５１分             １０％Ａ／８６％Ｂ／４％Ｃ
時間＝５６分             ８２％Ａ／１４％Ｂ／４％Ｃ
再平衡化−７分
ｃ）流速：１．０ｍｌ／分
ｄ）カラム温度：３７℃
ｅ）注入量：５．０ｍｌ
ｆ）検出：蛍光：励起波長２７６ｎｍ：発光波長−３１６ｎｍ
順相クロマトグラフィー〜ジオール法
他の実施例に用いられた順相クロマトグラフィーは、一般にジオール法と称されるハロゲンを使用しない(halogen free)方法であった。本方法は、Ｍ.Ａ.ケルム(M. A. Kelm)らの"High Performance Liquid Chromatography Separation and Purification of Cacao (Theobroma cacao L.) Procyanidins According to Degree of Polymerization Using a Diol Stationary Phase" (J. Agr. & Food Chem. 2006 Mar 8;54(5):1571- 6)に開示されている。
【０１０３】
条件は、次のとおりであった：
分析的順相ＨＰＬＣ法
名称：CPDIOL-3.M 
カラム： Intersil Diol 250×4.6mm 
移動相Ａ  ９８：２     アセトニトリル：酢酸 
移動相Ｂ  ９５：３：２ メタノール：Ｈ２Ｏ：酢酸
流速：
2009501161.tif 000018
【０１０４】
使用したカラムは２５０×４．６ｍｍ，i.d.，５μｍのDevelosil diol（Phenomenex社（アメリカ合衆国カリフォルニア州トランス）製）であった。二成分の移動相は、（Ａ）ＣＨ３ＣＮ：ＨＯＡｃ（９８：２，v/v）および（Ｂ）ＣＨ３ＯＨ：Ｈ２Ｏ：ＨＯＡｃ（９５：３：２）で構成された。分画は、３０℃、流速１．０ｍｌ／分で、次に示すように、直線的勾配で行われた：０〜３５分，０〜４０％Ｂ；３５〜４５分，４０％Ｂ 定組成；４５〜４６分，４０〜０％Ｂ，０％Ｂで４分保持。溶離液は、励起２７６ｎｍおよび発光３１６ｎｍでの蛍光検出によってモニタされた。
【０１０５】
逆相高圧液体クロマトグラフィー〜Ｃ１８法
フォトダイオードアレイ、蛍光検出器と一体となったAgilent 1100 LC機器および四重極(quadrapole)ＭＳが、単量体およびプロシアニジンの分離および検出、ならびに未発酵のカカオ豆、カカオ抽出物、加熱調理されていない、および加熱調理されたカカオ粉末、およびココア飲料中のエピカテキンのカテキンに対する比の決定に用いられた。Hypersil ODS（Ｃ１８、１００×４．６ｍｍ、５μｍ）カラムが用いられた。移動相は、Ａ（１％酢酸／水）およびＢ（０．１％酢酸／メタノール）から成り、直線的な勾配を用いて、１０〜２５％Ｂ（v/v）を２０分間、次に、１０分間でＢを１００％まで増加させ、１００％Ｂを１０分間保った。流速は１．０ｍｌ／分に設定した。カラム温度は２０℃に設定した。ＵＶ検出器を２８０ｎｍに設定してピーク強度を記録し、ＵＶスペクトルは２００〜６００ｎｍについて記録した。イオン化技術は、電気スプレイ（ＥＳＩ）で行い、質量スペクトルデータはすべて陰イオンの形態で取得した。定量的な作業として、このクロマトグラフィーおよびＦＬＤ検出を用いて、較正曲線を確立した。溶離液は、励起２７６ｎｍおよび発光３１６ｎｍでの蛍光検出によってモニタされた。
【０１０６】
分取用高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）〜ジオール法
分取用ＨＰＬＣ法を実施例５の単量体および２量体の画分の物理的分離に用いた。個々のフラバン−３−オール単量体および／またはプロシアニジン・オリゴマーの分離および溶離のための改良法は、（Ａ）単量体および／またはオリゴマーを含む液体を、極性結合したジオール固定相に導入し、（Ｂ）重合度に基づき、個々の単量体および／またはオリゴマーを分離し、カラムに２成分の移動相ＡおよびＢを通し、（Ｃ）単量体および２量体の画分を拭くむ個々の画分を溶離する、各工程を有してなる。
【０１０７】
固定相は、約３μｍ〜約１０μｍの粒径を有する。分取用のジオールカラムを、次のやや修正された条件とともに用いた：
移動相Ａ：９９：９  アセトニトリル：酢酸
移動相Ｂ：９５：４：１  メタノール：水：酢酸
カラム：Devosil 100DIOL−10 
流速：５５ｍｌ／分
2009501161.tif 000019
【実施例】
【０１０８】
実施例１：ココア飲料のプロシアニジン化学のＬＣＭＳ研究および大動脈環アッセイにおける飲料画分の試験
本実施例は、２種類のココア飲料（異なる方法にしたがって調製）およびそれらの各カカオ粉末の液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）について述べる。単量体、２量体、３量体に着目した質的な違いを、様々な試料について評価した。大動脈輪アッセイは、飲料抽出物を出発物質として用いた、機能性画分／化合物の確認に用いられた。
【０１０９】
２種類の飲料を、次の方法に従って調製した。
【０１１０】
キーレイ(Kealey)らの米国特許第６，０１５，９１３号明細書に記載の方法に従って調製した高ポリフェノールカカオ粉末を、両方の飲料の調製に使用した。
【０１１１】
カカオ粉末およびそれらの単量体、２量体、３量体の代表的なＨＰＬＣ特性を図１、２、３、５に示す。
【０１１２】
ココア飲料Ａは、次のように調製された：（i）カカオ粉末を８０℃で２０分間、水と混合し（この工程は粉末中に残存する胞子を復元し、ＵＨＴの間に破壊する）、（ii）その混合物を１４０℃で６〜７秒間、ＵＨＴ処理にさらし、（iii）混合物を８５ｍｌの容器に詰め、水の最高温度である１１５℃で１０分間（総処理時間１９分）、最大圧力の２．６×１０５Ｐａ(2.6bar)でレトルトにかけた。熱伝達を補助するため、回転を適用した。本明細書に記載される機能的および／または構造的効果を達成できる処理の変動のいずれもが利用可能である。
【０１１３】
ココア飲料Ｂは次のように調製された。高ポリフェノール、粉ミルク、砂糖、増粘剤、乳濁剤、混合ビタミン、バニラフレーバー、容器に入った飲料水（２２℃）を、周囲温度で混合し、高圧ポンプを用いて均質化し、ＵＨＴ処理（１６０℃で１５秒）し、無菌包装した。この飲料の調製に用いられる典型的な装置として、ウォーキシャ(Waukesha)容積移送式ポンプを通る連絡配管を備えたBreddo Likwifier （Division of American Ingredients Co.社（アメリカ合衆国ミズーリ州カンザスシティ）製)、およびSilverson 275/400ミキサー（Silverson Machines 社（イギリス、チェシャムバックス、ウォーターサイド）製)が挙げられる。得られた飲料には、約１７０ｍｇのフラバノールおよびプロシアニジンが含まれていた。
【０１１４】
両方の飲料の抽出物およびそれら個々のカカオ粉末を、図７に示すように調製した。要約すれば、飲料を凍結乾燥し、アセトン／水／酢酸の混合液（ＣＨ３ＯＨ：Ｈ２Ｏ：ＨＯＡｃ＝７９．５：２０：０．５）で２回抽出し、５０℃で１５分間、超音波で分解し、５８．３／ｓ（3500rpm）で６分間、遠心分離にかけ、減圧下または真空下で回収した上清から溶媒を除去し、凍結乾燥した。得られた物質をＨＰＬＣ分析に使用した。
【０１１５】
ＬＣＭＳ結果
各飲料からの抽出物およびそれらの個々のカカオ粉末をＮＰおよびＲＰ−ＬＣＭＳ調査にかけた。試験試料のＮＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを図１および２に表す。
【０１１６】
図１を参照すると、ココア飲料ＡのＮＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、飲料を調製したカカオ粉末で観察されるものとは、著しく異なっていた。カカオ粉末は、単量体〜１０量体の個々の群を含むが（図１、上部パネル)、ココア飲料ＡのＮＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、大部分が単量体〜３量体であった（図１、下部パネル)。
【０１１７】
よって、ココア飲料Ａでは、エピカテキンおよびカテキンのピーク面積は、カカオ粉末と比較して、逆転されていた。すなわち、ココア飲料Ａは、カテキンよりもエピカテキンを多く含むカカオ粉末とは対照的に、エピカテキンよりもカテキンを多く含んでいた。典型的には、カカオ粉末では、（＋）−カテキンに対する（−）−エピカテキンの比は約９：１である。それに対して、ココア飲料Ａに見られるエピカテキンのカテキンに対する比はおおよそ１：３であり、キラル分離は、カテキンの大部分が（−）−カテキンであり、（−）−カテキンに対する（＋）−カテキンの比は約１：４４であることを示した。（＋）−エピカテキンは観察されなかった。
【０１１８】
図２を参照すると、ココア飲料Ｂもまた、それから調製されたカカオ粉末よりもカテキンを多く含むが、ココア飲料Ｂに見られるエピカテキンのカテキンに対する比は、おおよそ１：１であった。
【０１１９】
２量体における差異もまた、かなり明らかである。図１および２に示す抽出イオンクロマトグラム（EIC）は、これらのピークと２量体の同一性を示唆している（ｍ／ｚ５７７）。ココア飲料ＡおよびＢの調製に使用したカカオ粉末のＥＩＣ（図３および５）は、ココア中に典型的な２量体が存在することを示している（Ｂ２およびＢ５の２量体）。図４および６を参照すると、２量体Ｂ５のピークは、両方の飲料において、ほとんど消滅している。しかしながら、最も重要なことに、ココア飲料Ａは、出発ココア物質には見られなかった多くの２量体（〜４−５量体）を含んでいた（図４）。最も注目に値するのは、その分解パターン（示されていない）が他のＢ型２量体と一致する、１４．５分の大きいピークである。ココア飲料Ｂもまた、小さいけれども、さらなる２量体のピークを含んでいた。
【０１２０】
大動脈輪アッセイ結果
ココア飲料Ａ抽出物について、スキーム１に示される分画に誘導されたバイオアッセイを行った。画分９６Ａ〜９６Ｅを以下に記載のとおり試験した。５つの画分（９Ａ〜９Ｅ）を、分取用のＲＰ ＨＰＬＣを用いて生物活性画分９６Ｅから入手し、アッセイを待った。画分９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅを、それぞれ、プロシアニジンなし／Ｂ型３量体／Ａ型３量体、Ｂ型３量体（主成分）／Ｂ型四量体（微量成分）、Ｂ型２量体（主成分）／Ｂ型３量体（微量成分）、Ｂ型２量体／Ｂ型３量体、およびＢ型３量体で構成されていると、ＬＣＭＳで暫定的に特徴付けた。
【０１２１】
Karim M., McCormick K., Kappagoda CT.の"Effects of Cocoa Procyanidins on Endothelium Dependent Relaxation", Journal of Nutrition 2000; 130:2105S-2108Sに記載のように、大動脈輪培養物を得た。大動脈輪を１０ｍｌの酸素を豊富に含んだクレプス緩衝液(oxygenated Krebs' buffer)にマウントし、一定に保ち、最初にノルエピネフリン（１０−６Ｍ）で輪をあらかじめ収縮させ、次に内皮細胞活性(endothelium viability)についてアセチルコリン（１０−６Ｍ）を用いて試験した。次に、輪を洗浄し、基準張力まで戻した。基準に戻るとすぐに、輪をノルエピネフリン（１０−６Ｍ）で収縮させた。収縮が定常状態になったら輪にカタラーゼ（４００Ｕ／ｍｌ）を与え、安定化させるためさらに時間をおいた後、試験化合物の累積濃度（１０ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌ）を加えた。別の２つの輪も、時間的対照（アセチルコリン、１０−９Ｍ〜１０−４Ｍ）および媒体対照（エタノールまたはＤＭＳＯ）として試験した。Ｎω−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）の効果を適切にするため、カタラーゼおよび試験化合物を加える前に、ＮＯＳ阻害剤を加えた（１０−５Ｍ）。さらに、内皮依存性の弛緩の試験のため、試験化合物を加える前に、選び出された輪の内皮を剥離した。
【０１２２】
大動脈輪の弛緩を張力の低下（ｇ）として測定し、ノルエピネフリンに対する収縮応答の百分率として表した。すべての薬物濃度は、組織バスバッファ(tissue bath buffer)中の最終濃度として表されている。グループ・データは、ｎ実験の±ＳＥＭとして表される。
【０１２３】
アセチルコリンは、１０−６Ｍの最大弛緩を達成した。ＤＭＳＯは、高濃度で（５０％または１００％ＤＭＳＯで８００〜１０００μｌ）弛緩反応を生じた。これらは、試験化合物の４００μｇ／ｍｌおよび５００μｇ／ｍｌの投与による濃度である。試験化合物のすべてが５００μｇ／ｍｌ（ｎ＝１）での弛緩反応を生じ、これは対応する媒体対照と同様か劣っており、結果として、この用量の試験化合物によって得られる弛緩は、反応を生じないとみなされた。１０μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌの範囲の濃度では、５０％または１００％ＤＭＳＯ（ｎ＝２）媒体対照のどちらにおいても、顕著な弛緩は観察されなかった。残りの実験（ｎ＝２）では、試験化合物は５０％エタノールで調製された。容器に媒体対照として等量の５０％エタノールを与えた場合には、弛緩反応は観察されなかった。
【０１２４】
次の結果には、５０％ＤＭＳＯ中で調製された試験化合物を用いた１つの実験および５０％エタノールを用いた２つの実験が含まれる。ＭＫ−１３１２−９６Ｅのみが、２００μｇ／ｍｌの最終実験槽濃度(final bath concentration)で顕著な最大弛緩反応を生じさせた（３３．６％±３．０，ｎ＝３；ｐ＜０．０５，ボンフェローニの補正を伴う分散分析(ANOVA)）。また、ＭＫ−１３１２−９６Ｅの最大弛緩反応とアセチルコリンの最大弛緩反応（学生のｔ−検定）との間に顕著な差異はなかった。ＭＫ−１３１２−９６Ｄは、２００μｇ／ｍｌの実験槽濃度において弛緩反応（２０．３％，±８．７，ｎ＝３）を生ずるように見受けられたが、この効果は、統計的に有意ではなかった。ＭＫ−１３１２−９６Ａ（１００％ＤＭＳＯに化合物を溶解）、ＭＫ−１３１２−９６Ｂ、ＭＫ−１３１２−９６Ｃでは反応しなかった。内皮が剥離されるか、試験化合物を加える前にＬ−ＮＡＭＥを与えられた容器では、これらの化合物の弛緩反応はすべて無効か、顕著に阻害された。
【０１２５】
結論として、ＭＫ−１３１２−９６Ｅは、一酸化窒素が介在するこのインビトロでの急性内皮機能障害(acute endothelium function)モデルでは、内皮依存性の弛緩反応を生ずることが可能である。
【０１２６】
上記のバイオアッセイおよび分画法は、純粋な活性化合物または化合物群が分離されるまで、繰り返される。ＮＭＲおよびＭＳは、生理活性化合物の構造解明の達成に利用される。
【０１２７】
実施例２：一部が脱脂された高ＣＰカカオ粉末におけるプロシアニジン化学のＬＣＭＳ検査
高ＣＰカカオ粉末（５０ｇ）を、水冷式の冷却器を備えた１Ｌの丸底フラスコ内で、５００ｍｌの脱イオン水（ｐＨ５．３）に懸濁した。マントル・ヒーター(heat mantel)を熱源として使用し、混合物を還流した。試料を、３０分、７．７５時間、２４時間置いた。加熱調理していない高ＣＰカカオ粉末の順相ＨＰＬＣ／ＦＬＤでのトレースを図１０に示す。分離はジオール法によって行った。図１１は、加熱調理済みの高ＣＰカカオ粉末の順相ＨＰＬＣトレースを示す（アダムソンらの方法）。図１２Ａ〜Ｄは、加熱調理前および３０分、７．７５時間、２４時間加熱調理後のトレースを示す。
【０１２８】
処理前の高ＣＰカカオ粉末の総ＣＰ含有量は、〜５７ｍｇ／ｇまたは〜６％であった。ＣＰ含有量は、内部標準のクロマトグラフ測定系を利用して測定した。測定されたポリフェノールは、単量体〜１０量体である。一旦加熱調理されたものの総ＣＰ含有量は３０ｍｇ／ｇに低減した。このデータから決定される単量体の含有量は、加熱調理されていない高ＣＰカカオ粉末中に存在する単量体で１３．７９ｍｇ／ｇ（１．４質量％単量体）であり、単量体の量は加熱調理後も変化せず、１５．８ｍｇ／ｇ(１．６質量％)の量であったことを示している。
【０１２９】
逆相ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８）を用いた評価法もまた、行われた。較正曲線を標準として、確立させた。加熱調理されていない高ＣＰカカオ粉末の単量体の量を、順相の条件下で決定される量と適正に一致させた。対照として、加熱処理された高ＣＰカカオ粉末から、単量体画分を分取用のジオールカラムを用いて分離した。加熱処理された高ＣＰカカオ粉末から分離した精製画分の逆相分析は、エピカテキンおよびカテキンのきれいなトレースを示した。加熱調理されていない、および加熱調理された高ＣＰカカオ粉末中のカテキンおよびエピカテキン含有量を、表１に示す。
【表１】
2009501161.tif 000020
【０１３０】
実施例３：エピカテキンのカテキンに対する比の調査
Ｃ１８ ＨＰＬＣの手法を用いて、エピカテキンのカテキンに対する比を測定した。試験を行った様々なカカオ製品には、未発酵のカカオ豆、２種類の高ＣＰカカオ抽出物、加熱調理されていない、および加熱調理された高ＣＰカカオ粉末、およびココア飲料Ａが含まれる。カカオ抽出物Ａは、水性エタノール（２５％水／７５％エタノール，v/v）で未発酵のカカオ豆を抽出することにより調製された。カカオ抽出物Ｂは、水性アセトン（２０％水／８０％エタノール，v/v）で未発酵のカカオ豆を抽出することにより調製された。比を表２に示す。
【表２】
2009501161.tif 000021
【０１３１】
例えば、カカオ抽出物などの熱処理されていない製品ではエピカテキン含有量はカテキン含有量よりも大きく、これは、未発酵のカカオ豆と一致する。高ＣＰカカオ粉末では、エピカテキンのカテキンに対する比は７９：２１である。ココア飲料Ａなどの高度に加工された試料では、エピカテキンのカテキンに対する比は〜３５：６５に達する。ココア飲料Ａは、調製の間にいくつかの高温処理を受けた(実施例１を参照)。この〜３５：６５というエピカテキンのカテキンに対する比は、エピマー化反応の間のこれら２種類のジアステレオマーの熱力学的な平衡である（カテキンが、元来、より安定な形態である)。よって、加工度が、エピカテキンのカテキンへの転化度に、ある種の洞察を提供している。加工度が小さいか未加工の場合のエピカテキンのカテキンに対する比は〜９５：５である。加工、特に高温処理がさらに進むと、比は、加熱調理されていない高ＣＰカカオ粉末のように、〜８０：２０にシフトする。加工度が高い場合、その比は平衡点に達する。
【０１３２】
実施例４：キラル含有量の調査
立体異性体の比を決定するため、キラル・クロマトグラフィーを行った。(+/-)−カテキンの比を、ある一連のクロマトグラフの条件下で得、(+/-)−エピカテキンの比を、別の一連のクロマトグラフの条件下で得た。
【０１３３】
様々なカカオ試料中に見られるエピカテキンおよびカテキンを、立体化学構造についてさらに分析した。キラル含有量を表３に示す。
【表３】
2009501161.tif 000022
【０１３４】
カテキンは、カカオ豆中の微量成分であり、（＋）−カテキンの（−）−カテキンに対する天然の比は、９０：１０である。カテキンでは、豆中の優勢な型は（＋）−カテキンである。２種類のカカオ抽出物では、比はカカオ豆のデータとは異なり、(+/-)−カテキンは、約４０：６０の比に変化する。すなわち、（−）−立体異性体が増加する。おそらく、その転化が立体特異的であることから、（−）−カテキンの供給源は、（−）−エピカテキンの（−）−カテキンへの転化である。優勢な型が（−）−カテキンとなるまで、さらなる加工によって転化が促進される。ココア飲料Ａなどの高度に加工されたカカオ試料では、（−）−カテキンが優勢な型になるまで、加工によってその含有量が高められる。これは、ココア飲料Ａを調製する熱処理条件の下、（−）−カテキンが（−）−エピカテキンの転化によって生じることから、予想された転化反応と一致する。（−）−エピカテキンは、微量の被加工物質において観察される唯一の異性体である。立体異性体、（＋）−エピカテキンは、高度に加工されたカカオ試料ではごく少量観察される。これは、（＋）−エピカテキンが（＋）−カテキンから生成されると予想され、（＋）−エピカテキンが、より不安定な立体異性体であるという事実と一致する。立体異性体の比を決定するため、キラル・クロマトグラフィーを行った。(+/-)−カテキンの比を、ある一連のクロマトグラフ条件下で取得し、(+/-)−エピカテキンの比を、別の一連のクロマトグラフ条件下で取得した。
【０１３５】
加工された物質中、すなわち、加熱調理された高ＣＰカカオ粉末およびココア飲料Ａ中に、様々な量で存在する、４種類すべての立体異性体についての結果を示す。
【０１３６】
実施例５：単量体および２量体の分離
全部で１．０２ｇの高ＣＰカカオ粉末を１５ｍｌの７５：２５（アセトニトリル：酢酸＝９９：１）：（メタノール：水：酢酸＝９５：４：１）溶液に溶解し、５８．３／ｓ（3500rpm）で５分間遠心分離し、０．４５μｍのフィルタで濾過した。数回のＨＰＬＣ操作を行い、加熱処理されたカカオ粉末を精製した（操作１：注入２．０ｍｌ、操作２：注入５．０ｍｌ、操作３：注入５．０ｍｌ、操作４：注入４．０ｍｌ）。〜１２．４分で溶離したすべての単量体ピークおよび〜２７．５分で溶離したすべての２量体ピークを合わせて、減圧濃縮し、凍結乾燥した。単量体および２量体の収量は、それぞれ６ｍｇと４ｍｇであった。試料を、続く分析的な分離に適した移動相に溶解した。図１３は加熱調理された高ＣＰカカオ粉末から分離された単量体画分のトレースを示す。
【０１３７】
実施例６：加熱調理されていない高ＣＰカカオ粉末、加熱調理された高ＣＰカカオ粉末、および合成（−）−エピカテキン−（４β，８）−（−）−カテキン２量体の比較
１ｍｇ未満の合成（−）−エピカテキン−（４β，８）−（−）−カテキン２量体を、脱イオン水中に１０％エタノールおよび０．１％酢酸を含む混合液に溶かした。２量体は、天然のＢ２の２量体、すなわち、（−）−エピカテキン−（４β，８）−（−）−エピカテキンのエピマー２量体である。
【０１３８】
全部で０．３ｇの加熱調理された高ＣＰカカオ粉末を、２ｍｌの脱イオン水中に１０％エタノールおよび０．１％酢酸を含む混合液に溶かし、５分間超音波で分解し、７５．０／ｓ（4500rpm）で５分間遠心分離し、４５μｍのフィルタで濾過した。次に、２００μｌの試料をＬＣ／ＭＳ分析に用いた。
【０１３９】
全部で０．３ｇの加熱調理された高ＣＰカカオ粉末を、２ｍｌの脱イオン水中に１０％エタノールおよび０．１％酢酸を含む混合物に溶かし、５分間超音波で分解し、７５．０／ｓ（4500rpm）で５分間遠心分離し、４５μｍのフィルタで濾過した。次に、２００μｌの試料を取り、１ｍｇ未満の合成（−）−エピカテキン−（４β，８）−（−）−カテキンを加えた。
【０１４０】
全部で０．３３ｇの加熱調理されていない高ＣＰカカオ粉末を、２ｍｌの脱イオン水中に１０％エタノールおよび０．１％酢酸を含む混合物に溶かし、５分間超音波で分解し、７５．０／ｓ（4500rpm）で５分間遠心分離し、０４５μｍのフィルタで濾過した。２００μｌの試料をＬＣ／ＭＳ分析に用いた。
【０１４１】
基本標準資料（ＭＳＤ）の設定は、イオン化モード：ＡＰＩ−ＥＳ、モード：スキャン、極性：陰性、質量幅：１００〜１５００、フラグメンター(Fragmentor)：７０、閾値：１５０、ステップ間隔：０．２０、毛細血管電圧 (Capillary voltage)：３０００、乾燥ガス：１０Ｌ／分、噴霧器圧力３．４５×１０５Ｐａ(50psig)、乾燥ガス温度：３４５℃であった。
【０１４２】
ＨＰＬＣ分析は、２量体の領域で顕著な変化があったことを示した。図１４Ａ〜１４Ｄを参照。２量体Ｂ２のこれら条件下での保持時間は、１２．７分であり、２量体Ｂ５では２４．５分、エピマー化されたＢ２の２量体では６．８分であった。図１４Ａ〜Ｄは、合成エピマー化Ｂ２の２量体（Ａ）、加熱処理されていない高ＣＰカカオ粉末（Ｂ）、加熱処理された高ＣＰカカオ粉末（Ｃ）、および強化された、加熱処理された高ＣＰカカオ粉末（Ｄ）の逆相分離のトレースを示す。加熱処理された高ＣＰカカオ粉末では、２量体Ｂ５がほとんど消え、２量体Ｂ２がまだ存在し、保持時間〜６．８分に新しい２量体が存在している。合成エピマー化Ｂ２の２量体で強化したものでは、同一のピークの領域で増加を示した（１４Ｄ参照）。
【０１４３】
２量体画分を、分取用のジオールカラムを用いて加熱調理された高ＣＰカカオ粉末から分離した。予想どおり、単量体を示したこの精製画分のＲＰ−ＨＰＬＣ／ＦＬＤおよびＭＳ（単一イオン・モニタモード，ｍ／ｚ＝５７７）のトレースは、ここには示さなかった。しかしながら、新しい２量体は、明確に示された。新しい２量体は、これらのクロマトグラフ条件下において、Ｂ２、Ｂ５およびエピマー化Ｂ２とは一致しない保持時間を持つ。Ｂ２とＢ５の２量体のエピマーの可能性の考察には、さらなる６種類の異性体が含まれ、新しい２量体がカカオ中に通常存在するＢ２とＢ５の２量体のエピマーの可能性がある。
【０１４４】
本発明は、ある特定の実施形態に関して述べてきたが、当然のことながら、多くの修正および変更が、本発明から離れることなく当業者によって成しうるであろう。したがって、忠実な精神および本発明の範囲内であろうこれら修正および変化のすべてを対象とすることが、添付の特許請求の範囲において意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図１は、ココア飲料Ａおよびその飲料の調製に用いたカカオ粉末のＮＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳデータを表す。
【図２】図２は、ココア飲料Ｂおよびその飲料の調製に用いたカカオ粉末のＮＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳデータを表す。
【図３】図３は、ココア飲料Ａの調製に用いたカカオ粉末のＮＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳデータおよび単量体、２量体、および３量体のＥＩＣを表す。
【図４】図４は、ココア飲料ＡのＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳデータおよび単量体、２量体、および３量体のＥＩＣを表す。
【図５】図５は、ココア飲料Ｂの調製に用いたカカオ粉末のＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳデータおよび単量体、２量体、および３量体のＥＩＣを表す。
【図６】図６は、ココア飲料ＢのＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳデータおよび単量体、２量体および３量体のＥＩＣを表す。
【図７】図７は、ココア飲料Ａの画分によるバイオアッセイのスキームを表す。
【図８】図８は、あらかじめ収縮させた大動脈輪における試験化合物が媒介する、用量依存性の弛緩を表す。
【図９】図９は、あらかじめ収縮させた大動脈輪におけるココア飲料Ａの画分の効果を表す。
【図１０】図１０は、加熱調理していない高ＣＰカカオ粉末のＮＰ−ＨＰＬＣ／ＦＬＤデータを表す。
【図１１】図１１は、加熱調理した高ＣＰカカオ粉末のＮＰ−ＨＰＬＣ／ＦＬＤデータを表す。
【図１２】図１２Ａ〜Ｄは、３０分間、７．７５時間、２４時間に亘り、加熱調理した高ＣＰカカオ粉末のＮＰ−ＨＰＬＣ／ＦＬＤデータを表す。
【図１３】図１３は、加熱調理した高ＣＰカカオ粉末から分画した単量体画分のＨＰＬＣデータを表す。
【図１４】図１４Ａ〜Ｄは、合成的にエピマー化したＢ２２量体（Ａ）、加熱調理していない高ＣＰカカオ粉末（Ｂ）、加熱調理した高ＣＰカカオ粉末（Ｃ）および、強化された加熱調理した高ＣＰカカオ粉末（Ｄ）のＲＰ−ＨＰＬＣデータを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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