(57)【要約】  本発明はアミリンペプチド及び食事関連インスリンペプチドを含む非経口的投与のための可溶性製薬学的組成物と高血糖症等の治療用の前記組成物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミリンペプチド及び食事関連インスリンペプチドを含む、非経口的投与のための可溶性製薬学的組成物。
【請求項２】
前記製薬学的組成物又は前記製薬学的組成物の再構成された溶液のｐＨが約ｐＨ６．５から約ｐＨ９．０である、請求項１に記載の製薬学的組成物。
【請求項３】
前記食事関連インスリンペプチドがヒトインスリンであり、ヒトインスリンのアナログ、ヒトインスリンの誘導体又はヒトインスリンアナログの誘導体である、請求項１又は２に記載の製薬学的組成物。
【請求項４】
前記食事関連ヒトインスリンアナログがヒトインスリンB28Dである、請求項３に記載の製薬学的組成物。
【請求項５】
前記食事関連ヒトインスリンアナログがヒトインスリンB3K,B29Eである、請求項３に記載の製薬学的組成物。
【請求項６】
前記食事関連ヒトインスリンアナログがヒトインスリンB28K,B29Pである、請求項３に記載の製薬学的組成物。
【請求項７】
前記食事関連インスリンペプチドの濃度が約１．２ｍｇ／ｍＬから約５．６ｍｇ／ｍＬ  の範囲である、請求項１から６の何れか一に記載の製薬学的組成物。
【請求項８】
前記アミリンペプチドがアミリン、アミリンアナログ又はアミリンアゴニストである、請請求項１から７の何れか一に記載の製薬学的組成物。
【請求項９】
前記アミリンペプチドが 25,28,29Ｐｒｏ-h-アミリンである、請求項１から８の何れか一に記載の製薬学的組成物。
【請求項１０】
前記アミリンペプチドが位置２４及び２６でメチル化されたヒトアミリンである、請求項１から８の何れか一に記載の製薬学的組成物。
【請求項１１】
前記インスリンペプチドがヒトインスリンB28Dであり、前記アミリンペプチドが25,28,29Ｐｒｏ-h-アミリンである、請求項１から９の何れか一に記載の製薬学的組成物。
【請求項１２】
前記インスリンペプチドがヒトインスリンB3K,B29Eであり、前記アミリンペプチドが 25,28,29Ｐｒｏ-h-アミリンである、請求項１から９の何れか一に記載の製薬学的組成物。
【請求項１３】
前記インスリンはヒトインスリンB28K,B29Pであり、前記アミリンペプチドが 25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンである、請求項１から９の何れか一に記載の製薬学的組成物。
【請求項１４】
前記製薬学的組成物又は前記製薬学的組成物の再構成された溶液のｐＨが約ｐＨ２．５から約ｐＨ４．５である、請求項１及び３から１３の何れか一に記載の製薬学的組成物。
【請求項１５】
前記食事関連ヒトインスリンアナログがインスリンA21G,B28D,desB30である、請求項１から３、７から１０及び１４の何れか一に記載の製薬学的組成物。
【請求項１６】
前記食事関連ヒトインスリンアナログがインスリンA21G,B28E,desB30である、請求項１から３、７から１０及び１４の何れか一に記載の製薬学的組成物。
【請求項１７】
亜鉛及び／又はカルシウムを含む、請求項１から１６の何れか一に記載の製薬学的組成物。
【請求項１８】
前記製薬学的組成物が保存料を含む、請求項１から１７の何れか一に記載の製薬学的組成物。
【請求項１９】
前記製薬学的組成物がバッファーを含む、請求項１から１８の何れか一に記載の製薬学的組成物。
【請求項２０】
前記製薬学的組成物が等張剤を含む、請求項１から１９の何れか一に記載の製薬学的組成物。
【請求項２１】
更に安定化剤を含む、請求項１から２０の何れか一に記載の製薬学的組成物。
【請求項２２】
更に界面活性剤を含む、請求項１から２１の何れか一に記載の製薬学的組成物。
【請求項２３】
前記界面活性剤がアニオン性である、請求項２２に記載の製薬学的組成物。
【請求項２４】
前記アニオン性界面活性剤がグリセロホスホグリセロール誘導体である、請求項２３に記載の製薬学的組成物。
【請求項２５】
前記グリセロホスホグリセロール誘導体がジミルストイル誘導体である、請求項２４に記載の製薬学的組成物。
【請求項２６】
前記グリセロホスホグリセロール誘導体が1,2-ジミルストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-rac-(1-グリセロール)（ＤＭＰＧ）である、請求項２４に記載の製薬学的組成物。
【請求項２７】
界面活性剤が０．１ｍＭと１０ｍＭの間の濃度で添加される、請求項２２から２６の何れか一に記載の製薬学的組成物。
【請求項２８】
高血糖症の治療用である、請求項１から２７の何れか一に記載の製薬学的組成物。
【請求項２９】
請求項１から２８の何れか一に記載の製薬学的組成物の有効量の非経口的投与を含む、高血糖症の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は製薬学的組成物の分野に関する。より詳細には、本発明は２つの異なる薬学的に活性なペプチドを含む製薬学的組成物に関する。
【０００２】
（発明の背景）
糖尿病は、グルコースを利用する能力が部分的に又は完全に失われる代謝性疾患である。全人口の約５％が糖尿病に苦しみ、この病気は蔓延している。１９２０年代のインスリンの導入以来、絶え間ない努力が糖尿病の治療を改良するために行われてきた。糖尿病に苦しむ人々は、数十年にもわたって、長期間の治療を受けるので、安全で便利で生活の質を改善するインスリン製剤に対する大きな要求がある。
【０００３】
糖尿病の治療では、インスリン製剤の多くの種類、例えば、レギュラーインスリン、イソフェンインスリン（指定ＮＰＨ）、インスリン亜鉛懸濁液（セミレンテ（登録商標）、レンテ（登録商標）、ウルトラレンテ（登録商標）等）及び二相性イソフェンインスリンなどが、提案され、使用されている。市販されているインスリン製剤のあるものは、作用の速い発現によって特徴づけられており、別の製剤は比較的遅い発現を有するが多少とも延長された作用を示す。即効性インスリン製剤は通常インスリン溶液であり、一方遅延作用型のインスリン製剤はインスリンを結晶に及び／又は亜鉛塩のみの添加によって又はプロタミンの添加によって又は両方の組合せによって沈殿したアモルファス型に含む懸濁剤であってもよい。
【０００４】
通常、インスリン製剤は皮下注射によって投与される。患者にとって重要なものは、インスリン製剤の作用プロファイルであり、それは注射からの時間の機能としてグルコース代謝におけるインスリンの作用である。  このプロファイルは、とりわけ、作用の発現のための時間、最大値、及び総持続時間が重要である。様々な作用プロファイルを有するインスリン製剤の多様性が、患者により望まれ、要求されている。
【０００５】
ヒトインスリンは、それぞれ２１及び３０アミノ酸残基を含む、いわゆるＡ鎖及びＢ鎖である２つのポリペプチド鎖からなる。Ａ鎖及びＢ鎖は２つのシステインジスルフィド架橋により相互に連結する。多くの他種のインスリンは類似の構造を有するが、同じ場所に同じアミノ酸残基を含まないようである。最近十年の間に、多くのヒトインスリンアナログが開発された。それらは、作用の特別なプロファイル、すなわち即効性又は遅延作用性のために設計されている。
【０００６】
糖尿病の治療において興味の他のペプチドはアミリンである。ヒトアミリンは３７アミノ酸長のペプチドで、その使用を面倒な薬とさせる物理化学的特徴を有する。特に、体外で繊維状構造をとる傾向があり、沈殿のために効果のないものとなる。市場には現在、３つのアミノ酸が位置２５、２８及び２９でそれぞれプロリンに置換された、ヒトアミリン（プラムリンチド）のアナログを含むシムリンと呼ばれる製剤がある。これは、繊維化する傾向を実質的に改善する。しかしながら、プラムリンチドでさえも、中性ｐＨの溶液中で保存することは難しく、そのため酸性溶液中で提供される（すなわち、シムリン）。
【０００７】
糖尿病に関するアミリンの作用は、体重を低下させ、胃内容排出を遅くし、食後のグルコースプロファイルをなだらかにすることにつながる食物摂取の減少、及び過剰な糖尿病性グルカゴン放出の減少である(A. Young, Amylin: Physiology and Pharmacology, アカデミック出版(2005年))。概して、アミリンの作用は、標的臓器に直接的であることよりも、むしろＣＮＳ受容体により介在される。
シムリンはインスリンの補助薬として認可されている。臨床試験は、インスリン単独による治療と比較して、ＨｂＡ１ｃを０．３−０．６のオーダーで改善し、食後の血中グルコースプロファイルをなだらかに浅くさせ、体重を減少させることを明らかにしている。シムリンは、現在、毎日３回、離れた注射部位に、別個の注射として投与される。これに加えて、もし患者が日に３回のインスリン注射も使用するならば、日に計６回の注射をとなる。
【０００８】
シムリン治療は、副作用として吐き気により制限される。吐き気は投与量に比例するが、時間により減少する傾向がある。シムリンの薬物動態プロファイルは、一日を通して血漿レベルにかなり大きな変動を導く。シムリンがＣｍａｘに達するには、皮下注射後約２０分を要し、血漿ｔ１／２は２０分のオーダーにある。結局は、実質的な副作用なしに、薬物動態学的血漿レベルを維持するためにシムリンの毎日３回以上の注射が必要であることになる。毎日３回の注射によっても、シムリンはアミリンの天然の放出をうまく模倣することはない。注射されたシムリンプロファイルの１−１１／２時間の持続時間とは対照的に、アミリンは３−６時間近い持続時間を有する食事に関連したピークとして放出される。アミリンはまた、相当な基底レベルを有するが、シムリンによっては模倣されない(A. Young, Amylin: Physiology and Pharmacology, アカデミック出版(2005年))。
グルコース代謝に応答して患者のペプチドの生理学的プロファイルをよりよく模倣し、毎日の注射の回数を抑えることを可能にするために、安定な溶液中にアミリンペプチド及び食事関連インスリンペプチドを組合わせた製薬学的組成物の提供が有用である。
【０００９】
（発明の概要）
本発明の目的の一つは、アミリンペプチド及び食事関連インスリンペプチドを含む、非経口的投与のための可溶性製薬学的組成物の提供である。発明の更なる目的は、アミリンペプチド及び食事関連インスリンペプチドを含む、非経口的投与のための可溶性製薬学的組成物の有効量の非経口的投与を含む、高血糖症の治療方法の提供である。
【００１０】
（定義）
以下は、明細書で使用する用語のいくつかの詳細な説明である。
ここで使用する「有効量」なる用語は、患者の治療が、治療しない場合と比較して効果的となるために十分な投薬量を意味する。
ここで使用する「医薬」なる用語は、薬学的に活性な化合物を患者に投与するのに適した製薬学的組成物を意味する。
ここで使用する「製薬学的組成物」なる用語は、活性化合物又はその塩を、任意にバッファー、保存料又は等張剤のような薬学的賦形剤と共に含有する製品を意味し、該製薬学的組成物は、患者に製薬学的組成物を投与することによって、疾患又は障害を治療、予防又は重症度を軽減するために使用される。従って、製薬学的組成物は、当技術分野では製剤処方としても知られている。
【００１１】
ここで使用する「可溶性製薬学的組成物」なる用語は、組合わせた組成物中で、実質的に可溶であるアミリンペプチド及び実質的に可溶である食事関連インスリンペプチドを意味する。従って、あらかじめ溶かした可溶性製薬学的組成物は実質的に可溶であり、再構成される可溶性製薬学的組成物は、規定の再構成液に一度溶かされているので、実質的に可溶である。再構成される製薬学的組成物のｐＨは、室温で規定の再構成液中で再構成によって製造される再構成された組成物において測定される。
【００１２】
ここで使用する「薬学的に許容可能な」なる用語は、通常の製薬学的用途に適していること、すなわち患者に有害事象のような重大な副作用を起こさせないことを意味する。
ここで使用する「バッファー」なる用語は、製薬学的組成物で、化学反応のために、さもなければ、経時的におこるような組成物のｐＨの変化の傾向を減らす製薬学的組成物中の化合物を指す。バッファーは、リン酸ナトリウム、ＴＲＩＳ、グリシン及びクエン酸ナトリウムのような化学薬品を含む。
ここで使用する「保存料」なる用語は、微生物の活動（増殖及び代謝）を防止又は遅くするために製薬学的組成物に加える化合物を指す。薬学的に許容可能な保存料の例は、フェノール、ｍ-クレゾール、及びフェノールとｍ-クレゾールの混合物である。
【００１３】
ここで使用する「等張剤」なる用語は、浸透圧をヒト血漿のそれに近づけるために製薬学的組成物の浸透圧を修正する役割をする製薬学的組成物中の化合物を指す。等張剤はＮａＣｌ、グリセロール、マンニトールなどを含む。
ここで使用する「安定化剤」なる用語は、ペプチドを安定化するため、すなわち保存期間及び／又は該組成物の使用時間を増大するために製薬学的組成物に含まれるペプチドに加える化学薬品を指す。製剤処方に使用される安定化剤の例は、Ｌ-グリシン、Ｌ-ヒスチジン、アルギニン、ポリエチレングリコール、及びカルボキシメチルセルロースである。
【００１４】
ここで使用する「界面活性剤」なる用語は、例えば「Surfactants and Polymers in Aqueous Solution（第２版）」（K. Holmberg, B. Lindma等）に記載されているような、水溶性（親水性）の部分、頭部、脂溶性（親油性）の部分（尾部）を含む任意の分子又はイオンを指す。界面活性剤は、好ましくは、親水基が水（親水性の相）に対して向かい、親油基が油又は疎水性の相（すなわち、ガラス、空気、油など）に向かう、界面を集める。ミセルを形成し始める界面活性剤における濃度は、臨界ミセル濃度又はＣＭＣとして知られている。さらに、界面活性剤は液体の表面張力を下げる。界面活性剤は、両親媒性化合物としても知られている。「洗剤」なる用語は、一般に界面活性剤に使われる同義語である
【００１５】
ここで使用する「疾患の治療」なる用語は、発病した疾患、病気又は障害を有する患者の管理及び治療を意味する。治療の目的は疾患、病気又は障害と闘うことである。治療は疾患、病気又は障害を除去するために、加えて疾患、病気又は障害に不随する症状又は合併症を緩和するために活性化合物を投与することを含む。
ここで使用する「疾患の予防」なる用語は、疾患の臨床的発症より前に疾患の発病の危険性について個人を管理及び治療することとして定義される。予防の目的は疾患、病気又は障害の発病と闘うことであり、疾患、病気又は障害の発病を予防又は遅らせるために、又は症状又は合併症の発症を予防又は遅らせるために活性化合物を投与することを含む。
【００１６】
ここで使用する「アナログ」なる用語は、ペプチドの一以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されているか及び／又は一以上のアミノ酸残基がペプチドから欠失しているか及び／又は一以上のアミノ酸残基がペプチドに付加されている改変されたペプチドを意味するペプチドを指す。発明の一態様において、そうようなアミノ酸残基の付加又は欠失はペプチドのＮ末端及び／又はペプチドのＣ末端で起こってもよい。一実施態様において、アナログは天然ペプチドに比べて８より少ない修飾（置換、欠失、付加）を含む。一実施態様において、アナログは天然ペプチドに比べて７より少ない修飾（置換、欠失、付加）を含む。一実施態様において、アナログは天然ペプチドに比べて６より少ない修飾（置換、欠失、付加）を含む。一実施態様において、アナログは天然ペプチドに比べて５より少ない修飾（置換、欠失、付加）を含む。一実施態様において、アナログは天然ペプチドに比べて４より少ない修飾（置換、欠失、付加）を含む。一実施態様において、アナログは天然ペプチドに比べて３より少ない修飾（置換、欠失、付加）を含む。一実施態様において、アナログは天然ペプチドに比べて２より少ない修飾（置換、欠失、付加）を含む。一実施態様において、アナログは天然ペプチドに比べて、一つの修飾（置換、欠失、付加）を含む。
【００１７】
一実施態様において、修飾は置換である。別の実施態様において、修飾は欠失である。別の実施態様において、修飾は付加である。
ここでペプチドに関連して使用する「誘導体」なる用語は、少なくとも一つの置換が親タンパク質又はそのアナログに存在しない、化学的に修飾された親タンパク質又はそのアナログを意味し、すなわち共有結合的に修飾された親タンパク質である。典型的な修飾は、アミド、糖、アルキル基、アシル基、エステル、ＰＥＧ化及びその類である。ヒトインスリンの誘導体の例はトレオニンメチルエステルB30ヒトインスリン及びＮεB29-テトラデカノイルｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリンである。
【００１８】
ここで使用する「インスリンペプチド」なる用語は、ヒトインスリン及び、そのアナログ又は誘導体のような化学的に修飾されたヒトインスリンのいずれかを指す。
ここで使用する「ヒトインスリン」なる用語は、その構造及び特性がよくわかっているヒトホルモンである。ヒトインスリンはシステイン残基間のジスルフィド架橋によって連結した２つのポリペプチド鎖、すなわちＡ鎖とＢ鎖を有する。Ａ鎖は２１アミノ酸のペプチドであり、Ｂ鎖は３０アミノ酸のペプチドであり、２つの鎖は３つのジスルフィド架橋（１つはＡ鎖の位置６及び１１のシステインの間にあり、２つめはＡ鎖の位置７のシステインとＢ鎖の位置７のシステインの間にあり、３つめはＡ鎖の位置２０のシステインとＢ鎖の位置１９のシステインの間にある）によって連結されている。
【００１９】
インスリン分子の変異は、鎖（Ａ又はＢ）、位置、天然アミノ酸と置換するアミノ酸の一文字コードを示す上付文字で表される。「ｄｅｓＢ３０」によって、Ｂ３０アミノ酸を欠いている天然インスリンＢ鎖又はそのアナログを意味する。従って、ヒトインスリンA21G,B28D,desB30はＡ鎖の位置２１がグリシンに変異し、Ｂ鎖の位置２８がアスパラギン酸に変異し、及びＢ鎖の位置３０が欠失したヒトインスリンのアナログである。
ここで使用する「食事関連インスリンペプチド」なる用語は、糖尿病の標準モデル、例えばブタにおける「薬物動態的消失及び／又は出現」において、８時間より少ない時間−作用を有するインスリンペプチドを意味する。
【００２０】
好ましくは、食事関連ヒトインスリンは約５時間より少ない時間−作用を有する。
好ましくは、食事関連インスリンは、０時間から約４時間の範囲の時間−作用を有する。好ましくは、食事関連インスリンはアクラピッド（Ａｃｔｒａｐｉｄ）（登録商標）、ノバログ（Ｎｏｖｏｌｏｇ）（登録商標）、フマログ（Ｈｕｍａｌｏｇ）（登録商標）及びアピドラ（Ａｐｉｄｒａ）（登録商標）の市販の製薬学的組成物で観察されるものと類似の時間−作用を有する。インスリンの時間−作用に関する「約」なる用語について、＋又は−３０分を意味する。
【００２１】
ここで使用する「アミリンペプチド」なる用語は、アミリン、そのアナログ又は誘導体、又はアミリンアゴニストであるペプチドを意味する。生物学的に活性なアミリンアゴニストはペプチド結合を介してＣ末端残基の酸性基に結合するアミド基を有してもよい。
ヒトアミリンのアナログ（ｈ−アミリン）は、複数残基が同じアミノ酸に変化した場合は天然のアミノ酸と置換したアミノ酸の３文字コードが続く上付文字の位置によって表される。従って、プラムリンチドは、ヒトアミリンの位置２５、２８及び２９が全てプロリンに変化していることを示す25,28,29Ｐｒｏ-h-アミリンで表される。「ｄｅｓ-１Ｌｙｓ」によって、位置１のリジンが欠失していることを意味し、例えばｄｅｓ-１Ｌｙｓ18Ａｒｇ25, 28Ｐｒｏ-h-アミリンは、位置１のリジンが欠失し、位置１８のアミノ酸がアルギニンに変化し、位置２５と２８の２つのアミノ酸がどちらもプロリンに変化しているヒトアミリンアナログである。
【００２２】
ここで使用する「等電点」なる用語は、ペプチドのような高分子の全体の正味の電荷がゼロであるｐＨ値を意味する。ペプチドには、多くの荷電基が存在し得、等電点では、これら電荷の全ての合計がゼロである。等電点を超えるｐＨでは、ペプチドの全体の正味の電荷は負であり、等電点より低いｐＨ値ではペプチドの全体の正味の電荷は正である。
【００２３】
ここで使用する「再構成された」なる用語は、活性な薬剤成分を含有する固体材料に水を加えることによって形成された水性組成物を意味する製薬学的組成物を指す。再構成のための製薬学的組成物は、満足のいく保存期間を有する液体組成物を製造できない時に使用される。再構成された製薬学的組成物の例は、凍結乾燥した組成物に水を加えた場合に生じる溶液である。該溶液はしばしば非経口的投与のためのものであるので、注射用の水が固体材料の再構成に典型的には使用される。
【００２４】
ここで製薬学的組成物中のペプチドの濃度に関して使用する「約」なる用語は、プラス又はマイナス１０％を意味する。それ故、濃度「約５ｍｇ／ｍＬインスリン」は、４．５ｍｇ／ｍＬインスリンから５．５ｍｇ／ｍＬインスリンの濃度を意味する。一実施態様において、「約」なる用語は、例えその用語がないとしても、正確な値又は範囲を含む、それに対応する値又は範囲である。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
一態様において、発明は、アミリンペプチド及び食事関連インスリンペプチドを含む、非経口的投与のための可溶性製薬学的組成物に関する。
発明の更なる態様において、該製薬学的組成物又は該製薬学的組成物の再構成された溶液のｐＨは約ｐＨ６．５から約ｐＨ９．０である。発明の更なる態様において、該製薬学的組成物又は該製薬学的組成物の再構成された溶液のｐＨは約ｐＨ６．８から約ｐＨ８．０である。発明の更なる態様において、該製薬学的組成物又は該製薬学的組成物の再構成された溶液のｐＨは約ｐＨ７．０から約ｐＨ７．８である。発明の更なる態様において、該製薬学的組成物又は該製薬学的組成物の再構成された溶液のｐＨは約ｐＨ７．２から約ｐＨ７．６である。
【００２６】
発明の別の態様において、製薬学的組成物は溶液である。発明の別の態様において、製薬学的組成物は固体である。発明の別の態様において、製薬学的組成物はバッファー又は注射用の水のような水性溶液である。発明の別の態様において、製薬学的組成物は注射又は注入による投与に適している。発明の更なるの態様において、製薬学的組成物は皮下投与に適している。発明の別の態様において、製薬学的組成物は筋肉内投与に適している。発明の別の態様において、製薬学的組成物は静脈内投与に適している。
【００２７】
本発明の更なる実施態様は、４時間より少ない時間作用を有する食事関連インスリンペプチドである製薬学的組成物に関する。
別の態様において、本発明は該食事関連インスリンペプチドがヒトインスリン、ヒトインスリンのアナログ、ヒトインスリンの誘導体又はヒトインスリンアナログの誘導体である製薬学的組成物に関する。
【００２８】
発明の一実施態様において、該食事関連インスリンペプチドはヒトインスリンである。発明の更なる実施態様においてにおいて、該食事関連インスリンペプチドはヒトインスリンアナログである。発明の更なる実施態様において、該食事関連インスリンペプチドはヒトインスリンアナログの誘導体である。
【００２９】
発明の一実施態様において、該製薬学的組成物又は該製薬学的組成物の再構成された溶液のｐＨは約ｐＨ２から約ｐＨ４．５である。発明の更なる実施態様において、該製薬学的組成物又は該製薬学的組成物の再構成された溶液のｐＨは約ｐＨ２．５から約ｐＨ４．０である。発明の更なる実施態様において、該製薬学的組成物又は該製薬学的組成物の再構成された溶液のｐＨは約ｐＨ３．０から約ｐＨ４．０である。
【００３０】
別の実施態様において、インスリンアナログ及び誘導体は、EP0792290（ノボ・ノルデイスク・エー／エス）、EP0214826及びEP0705275 （ノボ・ノルデイスク・エー／エス）、 US5504188 (エリ・リリー)、EP0368187 (アベンティス)、米国特許第5750497号及び6011007号、EP375437及びEP383472に開示されたものの中から選択され、そのようなインスリンには、限定されるものではないが、インスリングルリシン（アピドラ（登録商標）としても知られている、ヒトインスリンとは位置Ｂ３のアスパラギンがリジンに置き換わっていること、位置Ｂ２９のリジンがグルタミン酸に置き換わっていることによって異なる）、ヒトインスリンB28K, B29P(フマログ（登録商標）)、及びヒトインスリンB28D (インスリンアスパート(ノボログ（登録商標）))が含まれうる。
【００３１】
発明の別の態様において、インスリンアナログは、ヒトインスリンアナログのヒトインスリンA21G, B28D, desB30のようなWO2004/080480に開示されている酸性安定化インスリンアナログから選択される。発明の一実施態様において、食事関連インスリンペプチドはヒトインスリンA21G, B28D, des B30である。発明の別の実施態様において、食事関連インスリンペプチドはA21G, B28E, des B30である。インスリンA21G, B28D, desB30 のようなインスリンアナログのＡ２１Ｇ変異は、酸性ｐＨにおいてインスリンアナログの化学的安定性を与えるが、それはこの位置の天然のアスパラギンは酸性ｐＨにおいて脱アミド化を受けやすいためである。Ｂ２８Ｄ変異は、インスリンを単量体の状態にするので、食事関連インスリンとして有用である。発明の一態様において、食事関連インスリンペプチドは、酸性の脱アミド化に対して安定化されたインスリンペプチドを与える変異を含む。発明の一態様において、インスリンペプチドはＡ２１Ａｓｎの、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ又はＨｉｓへの変異を含む。発明の別の態様において、食事関連インスリンペプチドはＡ２１Ａｓｎの、Ｇｌｙ又はＡｌａへの変異を含む。発明のまた更なる態様において、食事関連インスリンペプチドは、ペプチド結合を介してＡ２１Ａｓｎに結合する少なくとも一つのアミノ酸を含む。発明のまた更なる態様において、食事関連インスリンペプチドは、ペプチド結合を介してＡ２１Ａｓｎに結合する２つのアミノ酸を含む。発明の別の態様において、食事関連インスリンペプチドは、ペプチド結合を介してＡ２１Ａｓｎに結合する１つのアミノ酸を含む。
発明の実施態様において、食事関連インスリンペプチドは、酸安定化インスリンアナログであり、酸安定化インスリンアナログを含む製薬学的組成物又は該製薬学的組成物の再構成された溶液のｐＨが、好適な実施態様において約ｐＨ２から約ｐＨ４．５である。発明の更なる実施態様において、製薬学的組成物又は該製薬学的組成物の再構成された溶液のｐＨは、約ｐＨ２．５から約ｐＨ４．０である。発明の更なる実施態様において、製薬学的組成物又は該製薬学的組成物の再構成された溶液のｐＨは、約ｐＨ３．０から約ｐＨ４．０である。
【００３２】
発明の一実施態様において、該ヒトインスリンアナログはヒトインスリンB28Dである（ＡｓｐB28-ヒトインスリンとしても知られている）。発明の別の実施態様において、該ヒトインスリンアナログはヒトインスリンB28K, B29P である（ＬｙｓB28,ＰｒｏB29-ヒトインスリンとしても知られている）。発明の別の実施態様において、該ヒトインスリンアナログはヒトインスリンB3K, B29E である（ＬｙｓB3,ＧｌｕB29-ヒトインスリンとしても知られている）（インスリングルリシン）。発明の別の実施態様において、該ヒトインスリンアナログはヒトインスリンdesB30 である（ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリンとしても知られている）。
【００３３】
発明の別の実施態様において、該食事関連インスリンペプチドの該製薬学的組成物中の濃度は約１．６ｍｇ／ｍＬから約５．６ｍｇ／ｍＬ、又は約２．６ｍｇ／ｍＬから約４．６ｍｇ／ｍＬ、又は約３．２ｍｇ／ｍＬから約４．０ｍｇ／ｍＬの範囲である。発明の別の実施態様において、該食事関連インスリンペプチドの濃度は約１．２ｍｇ／ｍＬから約５．６ｍｇ／ｍＬである。
発明の別の実施態様において、該食事関連インスリンペプチドの濃度は約１ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬ、又は約２．５ｍｇ／ｍＬから約８．７５ｍｇ／ｍＬ、約３．５ｍｇ／ｍＬから約８．７５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬから約８．７５ｍｇ／ｍＬである。
【００３４】
発明の別の実施態様において、製薬学的組成物は２つのインスリンペプチドを含む。
発明の一態様において、アミリンペプチドはアミリン、アミリンアナログ又はアミリンアゴニストである。
ここで使用する場合「アミリン」は米国特許第５１２４３１４号及び５２３４９０６号に記載されたもののような化合物を指し、その両者とも引用によって明細書に組み込む。この用語は、膵臓のβ細胞からインスリンと共分泌される、アミリンとして参照される３７アミノ酸のヒトペプチドホルモンを含むが、これに限定されるものではない。ヒトアミリンは以下のアミノ酸配列を有する：Ｌｙｓ-Ｃｙｓ-Ａｓｎ-Ｔｈｒ-Ａｌａ-Ｔｈｒ-Ｃｙｓ-Ａｌａ-Ｔｈｒ-Ｇｌｎ-Ａｒｇ-Ｌｅｕ-Ａｌａ- Ａｓｎ-Ｐｈｅ-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｈｉｓ-Ｓｅｒ-Ｓｅｒ-Ａｓｎ-Ａｓｎ-Ｐｈｅ-Ｇｌｙ-Ａｌａ-Ｉｌｅ-Ｌｅｕ-Ｓｅｒ-Ｓｅｒ-Ｔｈｒ-Ａｓｎ-Ｖａｌ-Ｇｌｙ-Ｓｅｒ-Ａｓｎ-Ｔｈｒ-Ｔｙｒ（配列番号１）。従って、構造式は、２つのＣｙｓ残基間のジスルフィド架橋及びペプチド結合を介してＣ末端アミノ酸に結合するアミド基を有するＬｙｓ-Ｃｙｓ-Ａｓｎ-Ｔｈｒ-Ａｌａ-Ｔｈｒ-Ｃｙｓ-Ａｌａ-Ｔｈｒ-Ｇｌｎ-Ａｒｇ-Ｌｅｕ-Ａｌａ- Ａｓｎ-Ｐｈｅ-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｈｉｓ-Ｓｅｒ-Ｓｅｒ-Ａｓｎ-Ａｓｎ-Ｐｈｅ-Ｇｌｙ-Ａｌａ-Ｉｌｅ-Ｌｅｕ-Ｓｅｒ-Ｓｅｒ-Ｔｈｒ-Ａｓｎ-Ｖａｌ-Ｇｌｙ-Ｓｅｒ-Ａｓｎ-Ｔｈｒ-Ｔｙｒ-ＮＨ２（配列番号１）である。この用語は、他の哺乳類の主に存在する、及び単離可能な形態のアミリンの変異型も含む。天然に存在するアミリンに対して、この用語は単離された、精製された、又はその他の天然にはない形態の該化合物を含む。
【００３５】
アミリンの「アゴニスト」は、インビトロ又はインビボでアミリンの１以上の効果（又は活性）を模倣する化合物を指す。アミリンの効果は、アミリンによって活性化された又は非活性化された１以上の受容体に、直接的に又は間接的に、相互作用又は結合する能力を含み、例えば、WO2004/037168の実施例２及び３にそれぞれ記載されている受容体結合アッセイ及びヒラメ筋アッセイである。好ましくは、アミリンアゴニストはカルシトニンではなく、ここで使用する場合、ヒトペプチドホルモンカルシトニン及びラット、サーモン１０及びウナギ（アミノスベリン酸ウナギカルシトニンを含む）のような、その種変異体を指す。
【００３６】
アミリンの「アナログ（analog）」（又は「analogue」又は「アゴニストアナログ」）は、構造においてアミリンに類似であり（例えば、１以上の天然又は非天然アミノ酸又はペプチド模倣薬で置換することによって、アミリンの本来のアミノ酸配列から誘導されたもの）、インビトロ又はインビボでアミリンの効果を模倣する化合物をさす。発明の有用なアミリンアナログは、EP289287に記載されているもののようなアミリンの断片をも含み、この内容は引用によってここに組み込まれる。
【００３７】
好ましいアミリンアゴニストは、配列番号１と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は９９％アミノ酸配列の同一性を有し、且つアミリン活性を有する化合物である。本発明のアミリンペプチドは、アミリンそれ自体が例えば食物摂取の減少のような生物学的反応を引き出すために相互作用し得るアミリン受容体又は他の受容体と結合すること又はさもなければ直接的に又は間接的に相互作用することができる。発明の化合物は、例えば「方法」の節のアミリン受容体アッセイによって測定される、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭより大きい親和性で、より好ましくは０．１０ｎＭより大きい親和性で、アミリン受容体に結合し得る。
【００３８】
アミリンアナログは、配列番号１の少なくとも１以上のアミノ酸位置において、挿入、欠失及び／又は置換を有するアミリンを含む。アミノ酸の挿入、欠失又は置換の数は、少なくとも１、２、３、４、５、６、１０、１５、２０、２５、又は３０である。挿入又は置換は、天然又は非天然アミノ酸、合成アミノ酸、ペプチド模倣剤、又は他の化合物であり得る。
【００３９】
アミリンの「誘導体」は、Ｎ-メチル化アミリンのような化学的に修飾されたアミリンを指す。発明の一態様において、アミリンペプチドはYan等（PNAS, vol. 103, no. 7, p. 2046-2051, 2006）に記載されているような位置２４及び２６がＮ-メチル化されたアミリンである。発明の使用に意図される典型的なアミリンアゴニストアナログは米国特許第５６８６４１１号、第６１１４３０４号及び第６４１０５１１号を含み、それらはここに引用をもってその全てが組み込まれる。
【００４０】
具体的な化合物は、限定されるものではないがｄｅｓ-１Ｌｙｓ-h-アミリン、 28Ｐｒｏ-h-アミリン、 25,28,29Ｐｒｏ-h-アミリン、18Ａｒｇ25,28Ｐｒｏ-h-アミリン、及びｄｅｓ-1Ｌｙｓ18Ａｒｇ25,28Ｐｒｏ-h-アミリンを含み、全ては処置された試験動物においてインビボでアミリン活性を示す（例えば、高血糖症が続く著しい高乳酸血症を引き起こす）。アミリンの活性の特徴を有することに加えて、発明の好ましい化合物のあるものは、ヒトアミリンと比較した場合、より所望の可溶性及び安定性の特性を有することも見いだされている。
【００４１】
これらの化合物の例は 25Ｐｒｏ26Ｖａｌ28, 29Ｐｒｏ-h-アミリン、25,28,29Ｐｒｏ-h-アミリン、及び 18Ａｒｇ25, 28Ｐｒｏ-h- アミリンである。 
発明の一態様において、該アミリンペプチドはヒトアミリンである。発明の一態様において、該アミリンペプチドは25,28,29Ｐｒｏ- h-アミリン (プラムリンチド)である。発明の更なる態様において、該アミリンペプチドは位置２４及び２６においてメチル化されたヒトアミリンである。
発明の一態様において、該アミリンペプチドの濃度は約０．０５ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬ又は約０．１ｍｇ／ｍＬから約４ｍｇ／ｍＬ、又は約０．４ｍｇ／ｍＬから約１．２ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００４２】
発明の一態様において、該食事関連インスリンペプチドがヒトアミリンであり、該アミリンペプチドは25,28,29Ｐｒｏ- h-アミリンである。発明の更なる態様において、該アミリンペプチドの濃度は約０．０５ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬの範囲であり、ヒトインスリンの濃度は約３．２ｍｇ／ｍＬから約４．０ｍｇ／ｍＬの範囲である。
発明の別の態様において、該インスリンペプチドはヒトインスリンB28Dであり、該アミリンペプチドは25,28,29Ｐｒｏ- h-アミリンである。発明の更なる態様において、 25 ,28 29Ｐｒｏ- h-アミリンの濃度は約０．０５ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬの範囲であり、ヒトインスリンB28Dの濃度は約０．３ｍｇ／ｍＬから約４．０ｍｇ／ｍＬの範囲である。発明のまた更なる態様において、25, 28 ,29Ｐｒｏ- h-アミリンの濃度は約０．１ｍｇ／ｍＬから約４ｍｇ／ｍＬの範囲であり、ヒトインスリンB28Dの濃度は約０．３６ｍｇ／ｍＬから約３．８ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００４３】
発明の別の態様において、該インスリンペプチドはヒトインスリンB3K,B29Eであり、該アミリンペプチドは25,28,29Ｐｒｏ- h-アミリンである。発明の更なる態様において、ヒトインスリンB3K,B29Eの濃度は約０．３６ｍｇ／ｍＬから約４．０ｍｇ／ｍＬの範囲である。
発明の別の態様において、該インスリンペプチドはヒトインスリンB28K,B29Pであり、該アミリンペプチドは25,28,29Ｐｒｏ- h-アミリンである。発明の更なる態様において、ヒトインスリンB28K,B29Pの濃度は約０．３６ｍｇ／ｍＬから約４．０ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００４４】
一態様において、本発明は更に亜鉛及び／又はカルシウムを含む製薬学的組成物である。一態様において、本発明は更に亜鉛を含む製薬学的組成物である。一態様において、本発明は更にカルシウムを含む製薬学的組成物である。一実施態様において、インスリンペプチドに対する亜鉛のモル比は１／６から１／２（モル／モル）であり、好ましくは３／１２から５／１２（モル／モル）である。発明の更なる実施態様において、インスリンペプチドに対するカルシウムのモル比は１／１２から５／１２（モル／モル）であり、好ましくは１／６から１／３（モル／モル）であり、例えば３／１２から５／１２（モル／モル）である。  
【００４５】
発明の製薬学的組成物は化学的に安定であり、所望のｐＨに可溶である。「既定のｐＨで可溶」によって、発明の組成物中のインスリンペプチド及び／又はアミリンペプチドが組成物のｐＨにおいて完全に溶けていることを意味し、ここで発明の組成物中に含まれるインスリンペプチド及び／又はアミリンペプチドが組成物が溶けているか否かを測定する方法は当技術分野で知られている。
【００４６】
一実施態様において、製薬学的組成物は３０，０００ｇで２０分間遠心に供されてもよく、その後ＲＰ−ＨＰＬＣによって上清中のインスリンペプチド及び／又はアミリンペプチド濃度が測定されてよい。この濃度は、組成物の作成に本来使用したものと、実験誤差の範囲で、インスリンペプチド及び／又はアミリンペプチド濃度と等しいならば、インスリンペプチド及び／又はアミリンペプチドは発明の組成物中に完全に溶解している。
【００４７】
別の実施態様において、発明の組成物中のインスリン及び／又はアミリンペプチドの溶解度は、組成物が含まれる容器を目で確認することによって、簡単に測定できる。溶液が目視により透明であって、特別な物質が容器の側部／下部に浮遊又は沈殿してないならば、インスリン及び／又はアミリンペプチドは可溶である。
別の実施態様において、発明の組成物中のインスリン及び／又はアミリンペプチドの物理的安定性は、タンパク質製剤の物理的安定性の評価のためにＴｈＴフィブリレーションアッセイによって測定することができる。
【００４８】
発明の一実施態様において、発明に係る製薬学的組成物は「物理的に安定」な製薬学的組成物である。この前後関係で使用される「物理的に安定」なる用語は、アミリンペプチド及び食事関連ペプチドが組合わせた組成物中で互いに不安定化しないことを意味し、製薬学的組成物は、少なくともアミリンペプチド及び食事関連ペプチドのみの安定性と同じほど物理的に安定である。物理的に安定性は、「方法」のＴｈＴフィブリレーションアッセイで記載したように測定される。
【００４９】
当然ながら、熟練の当業者であれば、発明の組成物中のインスリン及び／又はアミリンペプチドの溶解度は組成物とそのｐＨだけでなく、溶解度を測定する前に組成物が保存されていた温度及び時間によっても影響をうけることを理解する。例えば、４５℃の温度における発明の組成物の保管は溶解度が観察されるｐＨ値の範囲を狭くするが、４５℃で観察される発明の組成物からのインスリン及び／又はアミリンペプチドのいくらかの沈殿は組成物の温度を低くすることによって戻し得る。従って、例えば組成物がｐＨ５−６の間の所与のｐＨにおいて、４℃で透明な溶液（すなわち、可溶性）であるならば、この沈殿は、後で組成物を４℃に保存したときに再溶解する。
【００５０】
発明の一実施態様において、該製薬学的組成物は保存料を含む。一実施態様において、該保存料はフェノール、ｍ-クレゾール又はそれらの混合物から選択される。
発明の更なる実施態様において、該製薬学的組成物はバッファーを含む。一実施態様において、該バッファーはリン酸、ＴＲＩＳ、ＢＩＣＩＮＥ及びＨＥＰＥＳのようなグッド緩衝液、グリシン、グリシルグリシン、クエン酸又はそれらの混合物からなる群から選択される。
【００５１】
発明の更なる実施態様において、該製薬学的組成物は等張剤を含む。一実施態様において、該等張剤は塩ではない。更なる実施態様において、該等張剤はトレハロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、プロピレングリコール又はそれらの混合物からなる群から選択される。
発明の更なる実施態様において、該製薬学的組成物は安定化剤を含む。一実施態様において、該安定化剤はＬ-ヒスチジン、イミダゾール及びＬ-アルギニンからなる群から選択される。一実施態様において、該安定化剤はポリエチレングリコールである。
【００５２】
発明の更なる実施態様において、該製薬学的組成物は界面活性剤である。挙げることができる界面活性剤の例は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤及び双性イオン界面活性剤である。
発明の一態様において、界面活性剤はアニオン性界面活性剤である。
発明の一態様において、製薬学的組成物はその臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）よりも高い濃度でアニオン性界面活性剤を含む。
【００５３】
アニオン性界面活性剤は：ケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸ナトリウム塩、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、デオキシコール酸メチルエステル、ジギトニン、ジギトキシゲニン、N,N-ジメチルドデシルアミンＮ-オキシド、ドキュセートナトリウム、グリコケノデオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸水和物、グリコデオキシコール酸一水和物、グリコデオキシコール酸ナトリウム塩、グリコデオキシコール酸ナトリウム塩、グリコリトコール酸３硫酸二ナトリウム塩、グリコリトコール酸エチルエステル、N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩、N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩、N-ラウロイルサルコシン、N-ラウロイルサルコシン、ドデシル硫酸リチウム、ルゴール、1-オクタンスルホン酸ナトリウム塩、1-オクタンスルホン酸ナトリウム塩、1-ブタンスルホン酸ナトリウム、1-デカンスルホン酸ナトリウム、1-ドデカンスルホン酸ナトリウム、1-ヘプタンスルホン酸ナトリウム、1-ヘプタンスルホン酸ナトリウム、1-ノナンスルホン酸ナトリウム、1-プロパンスルホン酸ナトリウム一水和物、2-ブロモエタンスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム水和物、雄牛又は羊の胆液、コール酸ナトリウム水和物、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ヘクサン硫酸ナトリウム、オクチル硫酸ナトリウム、ペンタン硫酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム塩、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム塩一水和物、タウロリトコール酸３硫酸二ナトリウム塩、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウム塩、トリズマ（Trizma）（登録商標）ドデシルサルフェイト、ＤＳＳ（ドキュセートナトリウム、ＣＡＳ登録番号 [577-11-7]）、ドキュセートカルシウム（ＣＡＳ登録番号[128-49-4]）、ドキュセートカリウム（ＣＡＳ登録番号 [7491-09-0]）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム又はラウリル硫酸ナトリウム）、ドデシルホスホコリン（FOS-コリン-12）、デシルホスホコリン（FOS-コリン-10）、ノニルホスホコリン(FOS-コリン-9)、ジパルミトイルホスファチジン酸、カプリル酸ナトリウム、及び／又はウルソデオキシコール酸の群から選択されうる。
【００５４】
発明の一態様において、アニオン性界面活性剤はグリセロリン酸グリセロールである。発明の一態様において、グリセロリン酸グリセロール誘導体はジミリストイル誘導体であり、例えば1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-rac-(1-グリセロール)である。発明の一態様において、ジミリストイル誘導体は０．１ｍＭと１０ｍＭの間、好ましくは０．５ｍＭと５ｍＭの間、好ましくは０．５ｍＭと３ｍＭの間の濃度で加えられる。発明の一態様において、該グリセロリン酸グリセロール誘導体は、CAS番号 67232-80-8のような1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-rac-(1-グリセロール) (ＤＭＰＧ)である。
【００５５】
発明の一態様において、界面活性剤はカチオン性界面活性剤である。
カチオン性界面活性剤は：臭化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザイルコニウム、塩化ベンザイルコニウム、塩化ベンジルジメチルヘクサデシルアンモニウム、塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、 テトラクロロよう素酸ベンジルトリメチルアンモニウム、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、臭化ドデシルエチルジメチルアンモニウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化エチルヘクサデシルジメチルアンモニウム、臭化エチルヘクサデシルジメチルアンモニウム、臭化ヘクサデシルトリメチルアンモニウム、臭化ヘクサデシルトリエチルアンモニウム、臭化ヘクサデシルトリメチルアンモニウム、ポリオキシエチレン(10)-N-タロウ-1,3-ジアミノプロパン、臭化トンゾニウム、及び／又は臭化トリメチル（テトラデシル）アンモニウムの群から選択し得る。
【００５６】
発明の一態様において、界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。
非イオン性界面活性剤は：ＢｉｇＣＨＡＰ、ビス（ポリエチレングリコールビス［イミダゾイルカルボニル］）、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドであるブロックコポリマー、ポロキサマーのようなブロックコポリマー、ポロキサマー１８８及びポロキサマー４０７、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、Ｂｒｉｊ（登録商標）５６、Ｂｒｉｊ（登録商標）７２、Ｂｒｉｊ（登録商標）７６、Ｂｒｉｊ（登録商標）９２Ｖ、Ｂｒｉｊ（登録商標）９７、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８Ｐ、クレモフォール（登録商標）ＥＬ、デカエチレングリコールモノドデシルエステル、N-デカノイル-N-メチルグルカミン、n-デカノイル-N-メチルグルカミン、アルキルポリグルコシド、エトキシ化ヒマシ油、ヘプタエチレングリコールモノデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、ヘクサエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘクサエチレングリコールモノヘクサデシルエーテル、ヘクサエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ヘクサエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、イゲパルCA-630、イゲパルCA-630, メチル-6-O-(N-ヘプチルカルバモイル)-ベータ-D-グルコピラノシド、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、N-ノナノイル-N-メチルグカミン、N-ノナノイル-N-メチルグカミン、オクタエチレングリコールモノデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノヘクサデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、オクチル-ｂ-Ｄ-グルコピラノシド、ペンタエチレングリコールモノデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘクサデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘクシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクチルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールエーテルＷ-１、ポリオキシエチレン１０トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン１００ステアレ-ト、ポリオキシエチレン２０イソヘクサデシルエーテル、ポリオキシエチレン２０オレイルエーテル、ポリオキシエチレン４０ステアレ-ト、ポリオキシエチレン５０ステアレ-ト、ポリオキシエチレン８ステアレ-ト、ポリオキシエチレンビス(イミダゾイルカルボニル)、ポリオキシエチレン２５  プロピレングリコールステアレ-ト、キラヤ樹皮からのサポニン、Ｓｐａｎ（登録商標）２０、Ｓｐａｎ（登録商標）４０、Ｓｐａｎ（登録商標）６０、Ｓｐａｎ（登録商標）６５、Ｓｐａｎ（登録商標）８０、Ｓｐａｎ（登録商標）８５、タージトール１５-Ｓ-１２型、タージトール１５-Ｓ-３０型、タージトール１５-Ｓ-５型、タージトール１５-Ｓ-７型、タージトール１５-Ｓ-９型、タージトールＮＰ-１０型、タージトールＮＰ-４型、タージトールＮＰ-４０型、タージトールＮＰ-７型、タージトールＮＰ-９型、テトラデシル-ｂ-Ｄ-マルトシド、テトラエチレングリコールモノデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノドデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、トリエチレングリコールモノデシルエーテル、トリエチレングリコールモノドデシルエーテル、トリエチレングリコールモノヘクサデシルエーテル、トリエチレングリコールモノオクチル  エーテル、トリエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、ＴｒｉｔｏｎＣＦ-２１、ＴｒｉｔｏｎＣＦ-３２、ＴｒｉｔｏｎＤＦ-１２、ＴｒｉｔｏｎＤＦ-１６、ＴｒｉｔｏｎＧＲ-５Ｍ、ＴｒｉｔｏｎＱＳ-１５、ＴｒｉｔｏｎＱＳ-４４、ＴｒｉｔｏｎＸ-１００、ＴｒｉｔｏｎＸ-１０２、ＴｒｉｔｏｎＸ-１５、ＴｒｉｔｏｎＸ-１５１、ＴｒｉｔｏｎＸ-２００、ＴｒｉｔｏｎＸ-２０７、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ-１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ-１１４、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ-１６５溶液、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ-３０５溶液、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ-４０５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ-４５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ-７０５-７０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮＲ４０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６５、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８１、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８５、チロキサポール、スフィンゴリン脂質(スフィンゴミエリン)、ソルトールＨＳ１５（マクロゴール１５ヒドロキシステアレートとしても知られている)、ｄ-アルファ-コハク酸トコフェリルポリエチレングリコール１０００(ビタミンＥＴＰＧＳ又はＴＰＧＳとしても知られている)、及びフィンゴ糖脂質(セラミド、ガングリオシド)、リン脂質、及び/又はｎ-ウンデシルβ-Ｄ-グルコピラノシドの群から選択し得る。
【００５７】
発明の一態様において、界面活性剤は双性イオン界面活性剤である。
双性イオン界面活性剤は：ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、3-(デシルジメチルアンモニオ)プロパンスルホン酸内塩、3-(ドデシルジメチルアンモニオ)プロパンスルホン酸内塩、3-(ドデシルジメチルアンモニオ)プロパンスルホン酸内塩、3-(N,N-ジメチルミリスチルアンモニオ)プロパンスルホン酸、3-(N,N-ジメチルオクタデシルアンモニオ)プロパンスルホン酸、3-(N,N-ジメチルオクチルアンモニオ)プロパンスルホン酸内塩、3-(N,N-ジメチルパルミチルアンモニオ)プロパンスルホン酸, N-アルキル-N,N-ジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホン酸、3-cholamido-1-プロピルジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホン酸, ドデシルホスホコリン、ミリストイル リゾホスファチジルコリン、両性洗浄剤3-12 (N-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホン酸)、両性洗浄剤3-10(3-(デシルジメチルアンモニオ)プロパンスルホン酸内塩)、両性洗浄剤3-08(3-(オクチルジメチルアンモニオ)プロパンスルホン酸)、グリセロリン脂質、(レシチン、ケファリン、ホスファチジルセリン)、グリセロ糖脂質(ガラクトピラノシド)、アルキル、アルコキシル、(アルキルエステル)、リゾホスファチジル及びホスファチジルコリンのアルコキシ(アルキルエーテル)- 誘導体、例えば、リゾホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリンのラウロイル及びミリストイル誘導体、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及びコリン、エタノールアミン、ホスファチジン酸、セリン、スレオニン、グリセロール、イノシトール、リゾホスファチジルセリン及びリゾホスファチジルスレオニンである極性頭部基の修飾、アシルアルニチン及び誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンのＮｂｅｔａ-アシル化誘導体、又はリジン又はアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンと中性又は酸性アミノ酸の何れか組合わせを含むジペプチドのＮｂｅｔａ-アシル化誘導体、 中性アミノ酸と２つの荷電アミノ酸の何れか組合わせを含むトリペプチドのＮｂｅｔａ-アシル化誘導体、又はイミダゾリン誘導体、長鎖脂肪酸及びそれらの塩Ｃ６-Ｃ１２  (例えば、オレイン酸酸及びカプリル酸）の群から選択される界面活性剤、N-ヘクサデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホン酸, アニオン性(アルキル-アリール-スルホン酸) 一価の界面活性剤、パルミトイルリゾホスファチジルリゾホスファチジル-L-セリン、リゾリン脂質(例えば、エタノールアミン、コリン、セリン又はスレオニンの1-アシル-sn-グリセロ-3-リン酸エステル)、又はこれらの混合物の群から選択し得る。
【００５８】
発明の一態様において、界面活性剤はアルキルポリグルコシドである。ここで使用する時「アルキルポリグルコシド」なる用語は、マルトシド、サッカリド等のような１以上のグルコシド部分によって置換されたＣ５-２０-アルキル、-アルケニル又は-アルキニルの直鎖型又は分枝型に関する。これらのアルキルポリグルコシドの実施態様はＣ６-１８-アルキルポリグルコシドを含む。これらのアルキルポリグルコシドの具体的実施態様はＣ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８及びＣ２０アルキル鎖のような偶数の炭素鎖を含む。グルコシド部分の具体的実施態様はピラノシド、グルコピラノシド、マルトシド及びスクロースを含む。発明の実施態様において、６より少ないグルコシド部分がアルキル基に結合する。発明の実施態様において、５より少ないグルコシド部分がアルキル基に結合する。発明の実施態様において、４より少ないグルコシド部分がアルキル基に結合する。発明の実施態様において、３より少ないグルコシド部分がアルキル基に結合する。発明の実施態様において、２より少ないグルコシド部分がアルキル基に結合する。アルキルポリグリコシドの具体的な実施態様はn-デシルβ-D-グルコピラノシド、デシルβ-D-マルトピラノシド、ドデシルβ-D-グルコピラノシド、n-ドデシルβ-D-マルトシド、テトラデシルβ-D-グルコピラノシド、デシルβ-D-マルトシド、ヘクサデシルβ-D-マルトシド、デシルβ-D-マルトトリオシド、ドデシルβ-D-マルトトリオシド、テトラデシルβ-D-マルトトリオシド、ヘクサデシルβ-D-マルトトリオシド、n-ドデシル-スクロース、n-デシル-スクロース、スクロースモノカプレート、スクロースモノラウレート、スクロースモノミリステート及びスクロースモノパルミテートのようなアルキルグリコシドである。
発明の一態様において、界面活性剤はテトラデシル-β-D-マルトシド又は n-ドデシルβ-D-マルトシドである。
【００５９】
発明の一態様において、界面活性剤はポロキサマーである。発明の更なる態様において、該界面活性剤はポロキサマー１８８である。発明の更なる態様において、該界面活性剤はポロキサマー４０７、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー２３７、ポロキサマー３３１及びポロキサマー３３８からなる群から選択される。発明の更なる態様において、該界面活性剤はポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）である。発明の更なる態様において、該界面活性剤はポリソルベート８０である。発明の更なる態様において、該界面活性剤はソルトールＨＳ１５である。発明の更なる態様において、該界面活性剤はｄ-アルファ-コハク酸トコフェリルポリエチレングリコール１０００である。発明の更なる態様において、該界面活性剤はテトラデシル-β-D-マルトシドである。
【００６０】
発明の一態様において、該界面活性剤の濃度は約５ｍｇ／Ｌから約５０ｇ／Ｌである。発明の更なる態様において、該界面活性剤の濃度は約１０ｍｇ／Ｌから約３０ｇ／Ｌである。発明の更なる態様において、該界面活性剤の濃度は約２０ｍｇ／Ｌから約３０００ｍｇ／Ｌである。発明の更なる態様において、該界面活性剤の濃度は約３０ｍｇ／Ｌから約５００ｍｇ／Ｌである。発明の更なる態様において、該界面活性剤の濃度は約５０ｍｇ／Ｌから約２００ｍｇ／Ｌである。
【００６１】
発明の一態様において、該界面活性剤は０．１ｍＭと１０ｍＭの間、好ましくは０．５ｍＭと５ｍＭの間、好ましくは０．５ｍＭと３ｍＭの間の濃度で加えられる。
発明の一態様において、製薬学的組成物は２つの異なる界面活性剤を含む。発明の一態様において、該界面活性剤はポリキサマー１８８及びポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ-２０）である。発明の一態様において、２つの異なる界面活性剤の少なくとも一つはアニオン性界面活性剤である。
【００６２】
発明の一態様において、製薬学的組成物はプロタミン塩を更に含み、ここで該プロタミン塩は０．２５ｍＭより大きい濃度で該組成物中に存在し、且つ該組成物は約７．０より小さいｐＨを有する。発明の組成物において、プロタミン塩が含まれる製薬学的組成物又は該製薬学的組成物の再構成された溶液のｐＨは、一態様において約ｐＨ３．０から約６．０であり、更なる態様において約ｐＨ４．０から約５．５であり、更なる態様において約ｐＨ４．０から約５．０であり、更なる態様において約ｐＨ３．０から約４．０であり及びまた更なる態様において約ｐＨ４．０から約５．５である。
【００６３】
プロタミン塩が含まれる発明の組成物において、プロタミン塩はプロタミン硫酸塩以外のプロタミン塩であり、限定されるものではないが、プロタミンの酢酸塩、臭化物塩、塩酸塩、カプリル酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ＨＣＯ３塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、ギ酸塩、硝酸塩、クエン酸塩、リン酸１水素塩、リン酸２水素塩、酒石酸塩又は過塩素酸塩、又は何れか２つのプロタミン塩の混合物が含まれる。ここで使用する「プロタミン」は核酸と塩のような組合わせで精子細胞に存在する強力に塩基性のタンパク質の一群の一般名称をさす。通常、使用されるプロタミンは、例えばサケ（サルミン）、ニシン（クルペイン）、チョウザメ（スツリン）、サワラ又はマグロ（thynnine）から得られ、プロタミンの塩の幅広く多様なものが市販されている。当然ながら、具体的なプロタミンのペプチド組成はそれを取った魚の種、属又は科によって変化することは理解される。プロタミンは通常、４つの主要な構成要素、すなわち、約３０−３２残基のうち約２１−２２がアルギニンである一本鎖ペプチドからなる。Ｎ末端は４つの主要な構成要素のそれぞれでプロリンであり、他のアミノ基が配列中に存在しないので、特殊な塩によるプロタミンの化学的修飾はこの状況で均一になることが期待される。
【００６４】
一実施態様において、本発明で使用されるプロタミン塩はサケ由来である。
別の実施態様において、本発明で使用されるプロタミン塩はニシン由来である。
別の実施態様において、本発明で使用されるプロタミン塩はニジマス由来である。
別の実施態様において、本発明で使用されるプロタミン塩はマグロ由来である。
別の実施態様において、本発明で使用されるプロタミン塩は、プロピオン酸塩、乳酸塩、ギ酸塩、硝酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、カプリル酸塩、リン酸１水素塩、リン酸２水素塩のプロタミンからなる群から選択される。
別の実施態様において、本発明で使用されるプロタミン塩は、プロピオン酸塩、乳酸塩、ギ酸塩、硝酸塩、酢酸塩のプロタミンからなる群から選択される。
別の実施態様において、本発明で使用されるプロタミン塩は、酢酸塩のプロタミンである。
【００６５】
プロタミン塩が含まれる発明の組成物には、界面活性剤が更に含まれうる。発明の一態様において、該界面活性剤はポロキサマー１８８である。発明の更なる態様において、該界面活性剤はポロキサマー４０７、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー２３７、ポロキサマー３３１及びポロキサマー３３８からなる群から選択される。発明の更なる態様において、該界面活性剤はポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）である。発明の更なる態様において、該界面活性剤はポリソルベート８０である。発明の更なる態様において、該界面活性剤はソルトールＨＳ１５である。発明の更なる態様において、該界面活性剤はｄ-アルファ-コハク酸トコフェリルポリエチレングリコール１０００である。発明の更なる態様において、該界面活性剤はテトラデシル-β-D-マルトシドである。
【００６６】
更なる実施態様において、発明の組成物に含まれるプロタミン塩が２つの異なる塩の混合物である場合、一つの塩はプロタミンのクエン酸塩となり、他方はプロタミンのプロピオン酸塩、乳酸塩、ギ酸塩、硝酸塩、酢酸塩となる。発明の組成物に含まれるプロタミン塩が２つの異なる塩の混合物である時、２つの異なる塩の間のモル比は０．１：１から１：１であり得る。
【００６７】
更なる実施態様において、発明の組成物にプロタミン塩が含まれる場合、食事関連インスリンはヒトインスリン、ヒトインスリンB28D、ヒトインスリンB28K,B29P、及びインスリングルリシンからなる群から選択される。更なる実施態様において、食事関連インスリンペプチドはヒトインスリンである。更なる実施態様において、食事関連インスリンペプチドはヒトインスリンB28Dである。更なる実施態様において、食事関連インスリンペプチドはヒトインスリンB28K,B29Pである。
【００６８】
一実施態様において、発明の組成物中のインスリンペプチドに対するプロタミン塩のモル比は、約０．５から約１００である。
別の実施態様において、発明の組成物中のインスリンペプチドに対するプロタミン塩のモル比は、約０．５から約１０である。
別の実施態様において、発明の組成物中のインスリンペプチドに対するプロタミン塩のモル比は、約０．５から５である。
別の実施態様において、発明の組成物中のインスリンペプチドに対するプロタミン塩のモル比は、約１から３である。
【００６９】
別の態様において、発明はアミリンペプチド及び食事関連インスリンペプチドを含む製薬学的組成物の有効量の非経口的投与による高血糖症の治療方法に関する。
別の態様において、本発明は発明はアミリンペプチド及び食事関連インスリンペプチドを含む製薬学的組成物の有効量の非経口的投与を含む、過食症又は多食症の治療に関する。
別の態様において、本発明は発明はアミリンペプチド及び食事関連インスリンペプチドを含む製薬学的組成物の有効量の非経口的投与を含む、２型糖尿病、耐糖能異常、１型糖尿病、肥満症、高血圧症、Ｘ症候群、脂質異常症、認知症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞症、冠状動脈性心臓病、他の心臓血管疾患、脳梗塞、炎症性腸症候群、消化不良及び胃潰瘍の治療に関する。
【００７０】
別の態様において、本発明はアミリンペプチド及び食事関連インスリンペプチドを含む製薬学的組成物の有効量の非経口的投与を含む、２型糖尿病の病気の進行を遅延又は予防する方法に関する。
別の態様において、本発明はアミリンペプチド及び食事関連インスリンペプチドを含む製薬学的組成物の有効量の非経口的投与を含む、食物摂取を減少させ、β細胞アポトーシスを減少させ、β細胞機能及びβ細胞量を増大し、及び／又はβ細胞に対するグルコース感受性を回復する方法に関する。
【００７１】
更なる態様において、本発明は誘導体の薬学的に必要な量のＧＬＰ-１又はＧＬＰ-１の誘導体をそれを必要とする患者に投与すること更に含む、上記の状態の何れかを治療する方法に関する。別の実施態様において、本発明の組成物と組合わせて使用されるＧＬＰ-１の誘導体はＧＬＰ-１(1-37)、exendin-4(1-39)、それらのインスリン分泌促進断片、それらのインスリン分泌促進アナログ及びそれらのインスリン分泌促進誘導体をさす。ＧＬＰ-１(1-37)のインスリン分泌促進断片は、全配列がＧＬＰ-１(1-37)配列に見いだせるインスリン分泌促進であり、少なくとも１つの末端のアミノ酸が欠失している。ＧＬＰ-１(1-37)のインスリン分泌促進断片の例は、ＧＬＰ-１(1-37)の位置１−６の残基が欠失したＧＬＰ-１(7-37)、及びＧＬＰ-１(1-37)の位置１−６及び３７の残基が欠失したＧＬＰ-１(7-36)である。exendin-4(1-39)のインスリン分泌促進断片の例はexendin-4(1-38) 及びexendin-4(1-31)である。化合物のインスリン分泌促進の特性は、当技術分野でよく知られているインビボ又はインビトロアッセイで側定されうる。例えば、化合物は動物に投与され時間によるインスリン濃度を観察されうる。ＧＬＰ-１(1-37)及びexendin-4(1-39)のインスリン分泌促進アナログは、アミノ酸残基の１以上が他のアミノ酸残基と交換されており、及び／又は１以上のアミノ酸残基が欠失し、及び／又は１以上のアミノ酸が付加されたそれぞれの分子を指し、ただし該アナログはインスリン分泌促進であるか、インスリン分泌促進化合物のプロドラックであるかのいずれかである。ＧＬＰ-１(1-37)のインスリン分泌促進アナログの例は、例えば、位置８のアラニンがメチオニンに置き換わり位置１から６のアミノ酸残基が欠失したＭｅｔ8-ＧＬＰ-１(7-37)、及び位置３４のバリンがアルギニンに置き換わり、位置１から６のアミノ酸残基が欠失したＡｒｇ34-ＧＬＰ-１(7-37)である。exendin-4(1-39)のインスリン分泌促進アナログの例は、位置２及び３のアミノ酸残基がそれぞれセリン及びアスパラギン酸に置き換わったＳｅｒ2Ａｓｐ3-exendin-4(1-39) である（この特殊なアナログは当技術分野でexendin-3として知られている）。ＧＬＰ-１(1-37)、exendin-4(1-39)及びそれらのアナログのインスリン分泌促進誘導体はこれらのペプチドの誘導体であると当技術分野の熟練したものがみなすものであり、すなわち親ペプチド分子には存在しない少なくとも一つの置換を有するが、ただし該誘導体はインスリン分泌促進であるか、インスリン分泌促進化合物のプロドラックであるかのいずれかであるものである。置換基の例は、アミド、糖、アルキル基、親油性置換基である。ＧＬＰ-１(1-37)、exendin-4(1-39)及びそれらのアナログのインスリン分泌促進誘導体の例は、ＧＬＰ-１(7-36)-アミド, Ａｒｇ34,  Ｌｙｓ26(Ne-(g-Ｇｌｕ(Na-ヘクサデカノイル)))-ＧＬＰ-１(7-37) 及びＴｙｒ31-exendin-4(1-31)-アミドである。ＧＬＰ-１(1-37)、exendin-4(1-39)、それらのインスリン分泌促進断片、それらのインスリン分泌促進アナログ及びそれらのインスリン分泌促進誘導体の更なる例はWO98/08871、WO99/43706、US5424286 及びWO00/09666に記載されている。
【００７２】
本発明に係る製薬学的組成物が、注射（例えばペン型又はシリンジを介する）によって投与される場合、典型的には日に３回投与され、好ましくは食事前である。より多い注射量は患者にとって不快であるので、各投与は約５００μＬより少ないか、又は約２００μＬより少ないことが好ましい。本発明に係る製薬学的組成物がポンプによって投与される場合、典型的には、連続的に投与されるか、又は日に少なくとも１０回又はそれより多いような非連続的投与である。
【００７３】
発明の一実施態様において、治療方法は製薬学的組成物の有効量の投与を含み、それは３０μＬ／日から約６００μＬ／日であり、例えば約６０μＬ／日から約３６０μＬ／日である。発明の別の実施態様において、方法はポンプによる投与のための製薬学的組成物を含む。発明の別の実施態様において、方法は該製薬学的組成物の非連続的な量を送るポンプによる投与を含む。発明の別の実施態様において、方法は該製薬学的組成物の非連続的な量を送るポンプによる投与を含み、ここで該製薬学的組成物の非連続的な量はパルス間の時間より少ない時間のパルス投与によるものである。
【００７４】
別の態様において、本発明はアミリンペプチド及び食事関連インスリンペプチドを含む非経口的投与のための製薬学的組成物の製造におけるアミリンペプチド及び食事関連インスリンペプチドの使用に関する。発明の一実施態様において、その使用は皮下注射による投与のための製薬学的組成物を含む。発明の別の実施態様において、その使用はポンプによる投与のための製薬学的組成物を含む。発明の別の実施態様において、その使用は製薬学的組成物の非連続的な量を送るポンプによる投与を含む。発明の別の実施態様において、その使用は該製薬学的組成物の非連続的な量を送るポンプによる投与を含み、ここで該製薬学的組成物の非連続的な量は脈間の間隔より少ない時間の間隔のための脈の用量によるものである。
【００７５】
別の態様において、本発明はアミリンペプチド及び食事関連インスリンペプチドを含む非経口的投与による高血糖症の治療のための製薬学的組成物の製造におけるアミリンペプチド及び食事関連インスリンペプチドの使用に関する。
別の態様において、本発明は高血糖症の治療に使用する、発明に係る製薬学的組成物に関する。別の態様において、本発明は、過食症又は多食症の治療のための製薬学的組成物の製造におけるアミリンペプチド及び食事関連インスリンペプチドの使用に関する。
【００７６】
発明の更なる実施態様
１．アミリンペプチド、及び食事関連インスリンペプチドを含む非経口的投与のための可溶性製薬学的組成物。
２．該製薬学的組成物又は該製薬学的組成物の再構成された溶液のｐＨが約ｐＨ６．５から約ｐＨ９．０である、実施態様１に規定の製薬学的組成物。
３．該製薬学的組成物又は該製薬学的組成物の再構成された溶液のｐＨが約ｐＨ６．８から約ｐＨ８．０である、実施態様１に規定の製薬学的組成物。
４．該製薬学的組成物又は該製薬学的組成物の再構成された溶液のｐＨが約ｐＨ７．０から約ｐＨ７．８である、実施態様１に規定の製薬学的組成物。
５．該製薬学的組成物又は該製薬学的組成物の再構成された溶液のｐＨが約ｐＨ７．２から約ｐＨ７．６である、実施態様１に規定の製薬学的組成物。
６．組成物が溶液である、実施態様１−５の何れか一に規定の製薬学的組成物。
７．組成物が固体である、実施態様１−５の何れか一に規定の製薬学的組成物。
８．バッファー又は注射用水のような水性溶液で再構成される、実施態様７に規定の製薬学的組成物。
９．注射又は注入による投与に適した、実施態様１−８の何れか一に規定の製薬学的組成物。
【００７７】
１０．食事関連インスリンペプチドが４時間より小さい時間作用を有する、実施態様１−９の何れか一に規定の製薬学的組成物。
１１．食事関連インスリンペプチドがヒトインスリン、ヒトインスリンのアナログ、ヒトインスリンの誘導体又はヒトインスリンアナログの誘導体である、実施態様１−１０の何れか一に規定の製薬学的組成物。
１２．食事関連インスリンペプチドがヒトインスリンである、実施態様１１に規定の製薬学的組成物。
１３．食事関連インスリンペプチドがヒトインスリンアナログである、実施態様１１に規定の製薬学的組成物。
１４．該食事関連ヒトインスリンアナログがヒトインスリンB28Dである、実施態様１３に規定の製薬学的組成物。
１５．該食事関連ヒトインスリンアナログがヒトインスリンB28K,B29Pである、実施態様１３に規定の製薬学的組成物。
１６．該食事関連ヒトインスリンアナログがヒトインスリンB3K,B29Eである、実施態様１３に規定の製薬学的組成物。
１７．該食事関連ヒトインスリンアナログがヒトインスリンdesB30である、実施態様１３に規定の製薬学的組成物。
１８．該食事関連インスリンペプチドがヒトインスリンアナログの誘導体である、実施態様１３に規定の製薬学的組成物。
１９．該食事関連インスリンペプチドの濃度が約１．６ｍｇ／ｍＬから約５．６ｍｇ／ｍＬ、又は約２．６ｍｇ／ｍＬから約４．６ｍｇ／ｍＬ、又は約３．２ｍｇ／ｍＬから約４．０ｍｇ／ｍＬの範囲である、実施態様１−１８の何れか一に規定の製薬学的組成物。
２０．該食事関連インスリンペプチドの濃度が約１ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬ、又は約２．５ｍｇ／ｍＬから約８．７５ｍｇ／ｍＬ、約３．５ｍｇ／ｍＬから約８．７５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬから約８．７５ｍｇ／ｍＬである、実施態様１−１８の何れか一に規定の製薬学的組成物。
【００７８】
２１．２つの異なるインスリンペプチドを含む、実施態様１−２０の何れか一に規定の製薬学的組成物。
２２．該アミリンペプチドはアミリン、アミリンアナログ又はアミリンアゴニストである、実施態様１−２１の何れか一に規定の製薬学的組成物。
２３．該アミリンペプチドはヒトアミリンである、実施態様１−２２の何れか一に規定の製薬学的組成物。
２４．該アミリンペプチドは25,28,29Ｐｒｏ- h-アミリンである、実施態様１−２３の何れか一に規定の製薬学的組成物。
２５．該アミリンペプチドは位置２４及び２６がメチル化されたヒトアミリンである、実施態様１−２４の何れか一に規定の製薬学的組成物。
２６．該食事関連インスリンペプチドがヒトアミリンであって、該アミリンペプチドが25,28,29Ｐｒｏ- h-アミリンである、実施態様１−２４の何れか一に規定の製薬学的組成物。
２７．該アミリンペプチドの濃度は約０．０５ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬ又は約０．１ｍｇ／ｍＬから約４ｍｇ／ｍＬ、又は約０．４ｍｇ／ｍＬから約１．２ｍｇ／ｍＬの範囲である、実施態様１−２６の何れか一に規定の製薬学的組成物。
２８．該アミリンペプチドの濃度が約０．０５ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬの範囲であり、ヒトインスリンの濃度が約３．２ｍｇ／ｍＬから約４．０ｍｇ／ｍＬの範囲である、実施態様１−２７の何れか一に規定の製薬学的組成物。
２９．該インスリンペプチドはヒトインスリンB28Dであり、該アミリンペプチドは25,28,29Ｐｒｏ- h-アミリンである、実施態様１−２８の何れか一に規定の製薬学的組成物。
３０． 25, 28,29Ｐｒｏ- h-アミリンの濃度が約０．０５ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬの範囲でありヒトインスリンB28Dの濃度が約０．３ｍｇ／ｍＬから約４．０ｍｇ／ｍＬの範囲である、実施態様２９に規定の製薬学的組成物。
３１．25, 28,29Ｐｒｏ- h-アミリンの濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬから約４ｍｇ／ｍＬの範囲でありヒトインスリンB28Dの濃度が約０．３６ｍｇ／ｍＬから約３．８ｍｇ／ｍＬの範囲である、実施態様３０に規定の製薬学的組成物。
３２．該インスリンペプチドがヒトインスリンB3K, B29Eであり、該アミリンペプチドは25,28,29Ｐｒｏ- h-アミリンである、実施態様１−３１の何れか一に規定の製薬学的組成物。
３３．ヒトインスリンB3K, B29Eの濃度が約０．３６ｍｇ／ｍＬから約４．０ｍｇ／ｍＬの範囲である、実施態様３２に規定の製薬学的組成物。
【００７９】
３４．亜鉛及び／又はカルシウムを含む、実施態様１−３３の何れか一に規定の製薬学的組成物。
３５．インスリンペプチドに対する亜鉛のモル比が１／６から１／２（モル／モル）であり、好ましくは３／１２から５／１２（モル／モル）である、実施態様３４に規定の製薬学的組成物。
３６．インスリンペプチドに対するカルシウムのモル比が３／１２から５／１２（モル／モル）であり、好ましくは１／６から１／３（モル／モル）である、実施態様３４に規定の製薬学的組成物。 
３７．該製薬学的組成物が保存料を含む、実施態様１−３６の何れか一に規定の製薬学的組成物。
３８．該保存料がフェノール、ｍ-クレゾール又はそれらの混合物から選択される、実施態様１−３７の何れか一に規定の製薬学的組成物。
３９．該製薬学的組成物はバッファーを含む、実施態様１−３８の何れか一に規定の製薬学的組成物。
４０．該バッファーがリン酸、ＴＲＩＳ、ＢＩＣＩＮＥ及びＨＥＰＥＳのようなグッド緩衝液、グリシン、グリシルグリシン、クエン酸又はそれらの混合物からなる群から選択される、実施態様３９に規定の製薬学的組成物。
４１．該製薬学的組成物が等張剤を含む、実施態様１−４０の何れか一に規定の製薬学的組成物。
４２．該等張剤が塩ではない、実施態様４１に規定の製薬学的組成物。
４３．該等張剤がトレハロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、プロピレングリコール又はそれらの混合物からなる群から選択される、実施態様４１に規定の製薬学的組成物。
４４．該製薬学的組成物が安定化剤を含む、実施態様１−４３の何れか一に規定の製薬学的組成物。
４５．該安定化剤がＬ-ヒスチジン、イミダゾール及びＬ-アルギニンからなる群から選択される、実施態様４４に規定の製薬学的組成物。
４６．該安定化剤がポリエチレングリコールである、実施態様４４に規定の製薬学的組成物。
【００８０】
４７．該製薬学的組成物が界面活性剤を含む、実施態様１−４６の何れか一に規定の製薬学的組成物。
４８．該界面活性剤がポリキサマーである、実施態様４７に規定の製薬学的組成物。
４９．該界面活性剤がポリキサマー１８８である、実施態様４８に規定の製薬学的組成物。
５０．該界面活性剤がポロキサマー４０７、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー２３７、ポロキサマー３３１及びポロキサマー３３８からなる群から選択される、実施態様４８に規定の製薬学的組成物。
５１．該界面活性剤がポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ-２０）である、実施態様４７に規定の製薬学的組成物。
５２．該界面活性剤がポリソルベート８０である、実施態様４７に規定の製薬学的組成物。
５３．該界面活性剤がソルトールＨＳ１５である、実施態様４７に規定の製薬学的組成物。
５４．該界面活性剤がｄ-アルファ-コハク酸トコフェリルポリエチレングリコール１０００である、実施態様４７に規定の製薬学的組成物。
５５．該界面活性剤はテトラデシル-β-D-マルトシド又はn-ドデシル-β-D-マルトシドである、実施態様４７に規定の製薬学的組成物。
５６．該界面活性剤の濃度が約５ｍｇ／Ｌから約５０ｇ／Ｌである、実施態様４７−５５の何れか一に規定の製薬学的組成物。
５７．該界面活性剤の濃度が約１０ｍｇ／Ｌから約３０ｇ／Ｌである、実施態様４７−５６の何れか一に規定の製薬学的組成物。
５８．該界面活性剤の濃度が約２０ｍｇ／Ｌから約３０００ｍｇ／Ｌである、実施態様４７−５７の何れか一に規定の製薬学的組成物。
５９．該界面活性剤の濃度は約３０ｍｇ／Ｌから約５００ｍｇ／Ｌである、実施態様４７−５８の何れか一に規定の製薬学的組成物。
６０．該界面活性剤の濃度は約５０ｍｇ／Ｌから約２００ｍｇ／Ｌである、実施態様４７−５９の何れか一に規定の製薬学的組成物。
６１．製薬学的組成物が２つの異なる界面活性剤を含む、実施態様４７−６０の何れか一に規定の製薬学的組成物。
【００８１】
６２．ポリキサマー１８８及びポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ-２０）を含む、実施態様６１に規定の製薬学的組成物。
６３．更にプロタミン塩を含み、該プロタミン塩が０．２５ｍＭより大きい濃度で該製剤中に存在し、且つ該製剤が約７．０より小さいｐＨを有する、実施態様１に規定の製薬学的組成物。
６４．製薬学的組成物又は該製薬学的組成物の再構成された溶液のｐＨが約ｐＨ３．０から約６．０である、実施態様６３に規定の製薬学的組成物。
６５．製薬学的組成物又は該製薬学的組成物の再構成された溶液のｐＨが約ｐＨ４．０から約５．５である、実施態様６３に規定の製薬学的組成物。
６６．製薬学的組成物又は該製薬学的組成物の再構成された溶液のｐＨが約ｐＨ４．０から約５．０である、実施態様６３に規定の製薬学的組成物。
６７．製薬学的組成物又は該製薬学的組成物の再構成された溶液のｐＨが約ｐＨ３．０から約４．０である、実施態様６３に規定の製薬学的組成物。
６８．製薬学的組成物又は該製薬学的組成物の再構成された溶液のｐＨが約ｐＨ４．０から約５．５である、実施態様６３に規定の製薬学的組成物。
６９．インスリンに対するプロタミン塩のモル比が、約０．５から約１００である、実施態様６３−６８の何れか一に規定の製薬学的組成物。。
７０．インスリンに対するプロタミン塩のモル比が、約０．５から約１０である、実施態様６９に規定の製薬学的組成物。
７１．インスリンに対するプロタミン塩のモル比が、約０．５から約５である、実施態様７０に規定の製薬学的組成物。
７２．プロタミン塩が、プロタミンのプロピオン酸塩、乳酸塩、ギ酸塩、硝酸塩、酢酸塩、クエン酸塩からなる群から選択される、実施態様６３−７１の何れか一に規定の製薬学的組成物。
７３．プロタミン塩がクエン酸プロタミンである、実施態様７２に規定の製薬学的組成物。
７４．実施態様６３−７１の何れか一で更に規定の、実施態様１−６２の何れか一に規定の製薬学的組成物。
【００８２】
７５．該界面活性剤がポロキサマー１８８である、実施態様７４に規定の製薬学的組成物。
７６．該界面活性剤がポロキサマー４０７、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー２３７、ポロキサマー３３１及びポロキサマー３３８からなる群から選択される、実施態様７４に規定の製薬学的組成物。
７７．該界面活性剤がポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）である、実施態様７４に規定の製薬学的組成物。
７８．該界面活性剤がポリソルベート８０である、実施態様７４に規定の製薬学的組成物。
７９．該界面活性剤がソルトールＨＳ１５である、実施態様７４に規定の製薬学的組成物。
８０．該界面活性剤がテトラデシル-β-D-マルトシドである、実施態様７４に規定の製薬学的組成物。
８１．該界面活性剤がテトラデシル-β-D-マルトシドである、実施態様７４に規定の製薬学的組成物。
８２．食事関連インスリンがヒトインスリン、ヒトインスリンB28D、ヒトインスリンB28K, B29P、及びインスリングルリシンからなる群から選択される、実施態様６３−８１の何れか一に規定の製薬学的組成物。
８３．食事関連インスリンペプチドがヒトインスリンである、実施態様８２に規定の製薬学的組成物。
８４．食事関連インスリンアナログがヒトインスリンB28Dである、実施態様８２に規定の製薬学的組成物。
８５．食事関連インスリンアナログがヒトインスリンB28K, B29Pである、実施態様８２に規定の製薬学的組成物。
【００８３】
８６．実施態様１−８５の何れか一に規定の製薬学的組成物の有効量の非経口的投与を含む高血糖症の治療方法。
８７．該製薬学的組成物の有効量が例えば約６０μＬ／日から約３６０μＬ／日のような約３０μＬ／日から約６００μＬ／日である、実施態様８６に規定の方法。
８８．投与が皮下注射による、実施態様８６−８７の何れか一に規定の方法。
８９．投与がポンプによる、実施態様８６−８８の何れか一に規定の方法。
９０．投与が、該製薬学的組成物の非連続的な量を送るポンプによる、実施態様８６−８９の何れか一に規定の方法。
９１．該製薬学的組成物の非連続的な量はパルス間の時間より少ない時間のパルス投与によるものである、実施態様９０の何れか一に規定の方法。
９２．実施態様１−８５の何れか一に規定の製薬学的組成物の製造における食事関連インスリンペプチド及びアミリンペプチドの使用。
９３．製薬学的組成物が皮下注射用である、実施態様９２に規定の方法。
９４．投与がポンプによる、実施態様９２−９３の何れか一に規定の方法。
９５．投与が、該製薬学的組成物の非連続的な量を送るポンプによる、実施態様９２−９４の何れか一に規定の方法。
９６．該製薬学的組成物の非連続的な量はパルス間の時間より少ない時間のパルス投与によるものである、実施態様９５の何れか一に規定の方法。
９７．高血糖症の治療のための実施態様１−８５の何れか一に規定の製薬学的組成物の製造におけるインスリンペプチド及びアミリンペプチドの使用。
９８．過食症及び多食症の治療のための実施態様１−８５の何れか一に規定の製薬学的組成物の製造におけるインスリンペプチド及びアミリンペプチドの使用。
【００８４】
上記に開示された特徴は、別々でも、任意に組み合わされても、その多様な形態にある本発明を実現するための資料となる。
本願明細書において引用される出版物、特許出願、特許を含む全ての文献は、他の場所で特定に文献が出典明示により別個に援用されているかにかかわらず、本願明細書にあたかも各文献が個々に特定に出典明示により援用されたかのように参照文献として組み込まれ、この全体がここに完全に効力を有する。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的にのみ使用されており、いかなる方法であっても、本発明を限定するものとは解釈されない。
全ての可能なその変形態様における上述の要素のあらゆる組合せが、別の定義がここに示され、又は前後関係から明らかに矛盾していない限り、本発明に含まれる。
【００８５】
本発明で記載されて使用されている「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び類似指示対象なる用語は、ここで示され、文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、単数形及び複数形の双方をカバーすると解釈される。
ここでの値の範囲の記載は、ここで他の定義が示されない限りは、その範囲に入るそれぞれ別個の値に個々に言及することの省略法であることを単に意図しており、それぞれ別個の値は、ここで個々に記載されているかの如く明細書中に導入される。特に明記しない限り、ここで提供される全ての正確な値は、対応する近似値の代表例である(例えば、特定の要因又は測定値に関して提供される全ての正確な例示的値は、適切な場合は、「約」により修飾される、対応する近似測定値を提供するとみなすことができる)。
ここで記載される全ての方法は、別の定義がここで示されるか又は前後関係から明らかに矛盾していない限り、任意の適切な順序で実施することができる。
【００８６】
ここで提供される任意の及び全ての実施例、又は例示的言語(例えば、「等」)の使用は、単に、本発明をより解明することを意図したものであり、特に示さない限りは、本発明の範囲を制限するものではない。明細書におけるいずれの言語も、本発明の実施に必須の任意の請求項に記載されていない要素を示すと解釈すべきものではない。
ここでの特許公報の引用及び導入は便宜上のものであって、このような特許公報の正当性、特許性及び／又は執行可能性についての見解を示すものではない。
この発明は、適応される法律により許容されるよう、ここに提案された態様及び／又は請求項に列挙された主題事項の全ての修正及び等価事項を含む。
【００８７】
特に明記せず、文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、成分又は成分類に関して、「含有する」、「有する」、「含む」又は「含める」等の用語を使用する、本発明の任意の側面又は実施態様のここでの記載は、特定の成分又は成分類「からなる」、「本質的になる」、又は「実施的に含有する」といった本発明の類似した側面又は実施態様を支持することを意図したものである(例えば、特定の成分を含有するここに記載の組成物は、特に明記しない又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、その成分からなる組成物を記載するものと理解すべきである)。
この発明は、適応される法律により許容されるよう、ここに提案された態様及び／又は請求項に列挙された主題事項の全ての修正及び等価事項を含む。
本発明は、以下の代表的方法及び実施例によりさらに例証されるが、それにより、本発明の範囲を限定するものとは解釈はされない。
【００８８】
（方法）
ＴｈＴフィブリレーションアッセイ
ペプチドの低い物理的安定性はアミロイド繊維形成を導くことがあり、サンプル中に規則正しい糸状の高分子構造として観察され、最終的にゲル形成に結果としてなる。ＴｈＴフィブリレーションアッセイの適用において、小分子指標プローブを使用した。チオフラビンＴ（ＴｈＴ）は繊維結合時に、はっきりと見える蛍光の標識を有する(Naiki等、(1989) Anal. Biochem. 177, 244-249; LeVine (1999) Methods. Enzymol. 309, 274-284)。繊維形成の時間経過は以下の式で図１０に示すＳ字状の曲線によって記載できる。
2009530249.tif 000002
上式中、Ｆは時間ｔにおけるＴｈＴ蛍光である。定数ｔ０は最大蛍光の５０％に達するために必要な時間である。繊維形成を記述する２つの重要なパラメーターは、ｔ０−２τによって算出される時間のずれ及び見かけの速度定数ｋａｐｐ＝１／τである。
ペプチドの部分的に折り畳まれた中間体の形成はフィブリレーションの一般的開始機構として示唆されている。少数のそれら中間体は、更なる中間体が集まり得るテンプレートを形成する核となり、フィブリレーションが進む。時間のずれは核の臨界の量ができる間隔に対応し、見かけの速度定数は繊維そのものが形成される速度である。
【００８９】
（サンプル調整）
サンプルは各アッセイの前に新しく調整した。各サンプル組成物は説明に記載する。サンプルのｐＨは濃縮ＮａＯＨ及びＨＣｌＯ４の適切な量を使用して所望の値に調節した。チオフラビンＴはＨ２Ｏ中の原液から、最終濃度１ｍＭまでサンプルに加えた。２００ｍｌのサンプルのアリコートは、９６ウェルのマイクロタイタープレート(パッカード オプティプレートO-96、ホワイトポリスチレン)に入れた。通常、（一回の試験条件に対応する）各サンプルの８つのレプリカはウェルの一列においた。プレートはスコッチパッド（キアゲン社）でシールした。
（インキュベーション及び蛍光測定）
所定の温度でのインキュベーション、振盪、ＴｈＴ蛍光発光の測定は、フルオロスカンアセントＦＬ 蛍光プレートリーダー (サーモラボシステム社)で行った。温度は３７℃に調節した。軌道振盪は提示する全データで９６０ｒｐｍ、振幅１ｍｍに調節した。蛍光測定は４４４ｎｍフィルターを通した励起を使用して、４８５ｎｍフィルターを通して発光を測定して行った。各ランはプレートを１０分間、アッセイ温度に置いて開始した。プレートは所望の期間の２０分毎に計測した。各測定の間、プレートは記載のとおり振盪し、熱した。
【００９０】
（データー処理）
測定ポイントは更なる処理のためマイクロソフトエクセル形式に保存し、曲線の描画及び調節はグラフパッドプリズムを使用して行った。線維がない時のＴｈＴからのバックグラウンドの発光は無視できる程度だった。データポイントは典型的に、８サンプルの平均であり、標準偏差誤差の棒とともに示した。実験間のフィブリレーションの相対的測定を確保するために、同じ実験で得られたデータだけ（すなわち、同じプレートのサンプル）を同じグラフに掲載する。
データセットは式１に当てはめ得る。しかしながら、完全なＳ字状曲線は、この場合は、測定時間の間、常には達成されないので、ＴｈＴ蛍光として発現されるフィブリレーションの程度は８サンプルの平均として集計しさまざまな時間ポイントの標準偏差と共に示した。
【００９１】
（タンパク質の溶解度）
ペプチド及びタンパク質の溶解度は溶液のｐＨに依存する。しばしば、タンパク質又はペプチドは、正味荷電がゼロである、その等電点 (ｐＩ)において、及び／又はその付近で沈殿する。低ｐＨ（すなわち、ｐＩより低い）において、タンパク質及びペプチドは典型的には正に帯電しており、ｐＩより高いｐＨに置いてはそれらは負に帯電する。
インスリンとアミリン分子の両方を含む混合物の共製剤化の必要条件は、製剤の製剤化及び患者への製剤を投与（例えば、皮下注射による）の両方に適した所定のｐＨにおいて両ペプチドが十分な濃度で可溶な状態にあることである。
ｐＨに対する溶解度の曲線は以下のように測定した。式を用意し、アリコートを所望の範囲のｐＨ値に ＨＣｌＯ４及びＮａＯＨの添加によって調整した。これらのサンプルは２−３日間、室温に平衡化のために静置した。その後サンプルは遠心した。各サンプルの少量のアリコートは、溶液のタンパク質の濃度を測定するための逆相ＨＰＬＣ分析のために引き抜いた。各サンプルのｐＨは遠心後に測定し、各タンパク質の濃度は各サンプルの測定したｐＨに対して描いた。
【００９２】
（アミリン受容体結合アッセイ）
受容体結合アッセイのために、下に記載するアミリン3(a)/CRE-luc細胞由来のメンブレンを使用した。トレーサーはＮ末端のチロシンに１２５Ｉを有するＴｙｒ-プラムリンチドである。SPA-WGAビーズ(GE ヘルスケアRPNQ0001)は、５０ｍＭのＨｅｐｅｓと５ｍＭのＭｇＣｌ２と５ｍＭのＥＧＴＡと０．０２５％Ｔｗｅｅｎ-２０を含むバッファー（ｐＨ７．４）中で、メンブレン、トレーサー及びアミリンアナログの希釈系列と共に、９６ウェルオプティプレートでインキュベートした。室温における２時間のインキュベーション後、プレートは遠心し、Ｔｏｐｃｏｕｎｔｅｒの上でカウントした。ＥＣ５０は受容体親和性の測定として算出した。
【００９３】
（アミリン・ルシフェラーゼアッセイ）
１．アミリンアッセイの概要
アミリンによるアミリン受容体の活性化（カルシウム受容体及び活性修飾ペプチドＲＡＭＰの共発現）はｃＡＭＰの細胞内濃度の増大を導くことは以前公開されている(Poyner DR等、2002年、Pharmacological Reviews 54(2)：233-246)。それ故、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）の多重コピーを含むプロモーターにおいて転写が活性化される。従って、アミリン受容体も発現するＢＨＫ細胞に導入したＣＲＥルシフェラーゼレポーター遺伝子に使用により、アミリン活性の測定が可能である。
アミリンによる。
【００９４】
２．アミリン3(a)/CRE-luc細胞株の構築
ＢＨＫ５７０細胞株は、ヒトカルシトニン受容体（CTa）及びＣＲＥ応答ルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定にトランスフェクトした。細胞株は、標準的な方法を使用して、ＲＡＭＰ-３を更にトランスフェクトした。メトトレキサート、ネオマイシン、及びハイグロマイシンは、それぞれルシフェラーゼ、カルシトニン受容体、及びＲＡＭＰ-３の選択マーカーである。
【００９５】
３．アミリン・ルシフェラーゼアッセイ
活性アッセイを実施するために、ＢＨＫアミリン3(a)//CRE-luc 細胞を白色９６ウェル培養プレートに、約２０，０００細胞／ウェルの密度でまく。細胞は１００μｌの増殖培地(１０％のＦＢＳと１％のPen/Strep、１ｍＭのＮａ-ピルベート、２５０のｎＭのメトトレキサート、５００μｇ／ｍｌのネオマイシン及び４００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを有するＤＭＥＭ)中である。
３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベーション後、増殖培地は５０μｌ／ウェルのアッセイ培地に交換する(ＤＭＥＭ（フェノールレッド無）、Ｇｌｕｍａｍａｘ（登録商標）、１０％のＦＢＳ及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７.４）。更に５０μｌ／ウェルのアッセイバッファー中のスタンダート又はサンプルを加える。３７℃及び５％ＣＯ２で４時間インキュベーション後、スタンダート又はサンプルのアッセイ培地を取り除き、１００μｌ／ウェルのＰＢＳに置き換える。さらに、１００μｌ／ウェルのＬｕｃＬｉｔｅ（登録商標）を加える。プレートはシールし、室温で３０分間インキュベートする。最終的にＳＰＣ（単光子計数法）モードでＴｏｐＣｏｕｎｔｅｒ(パッカード）上で発光を測定する。
【実施例】
【００９６】
以下の実施例では、上述のＴｈＴフィブリレーションアッセイを製剤の物理的安定性の評価に使用し、溶解度は上述の溶解度法によって測定する。
（実施例１）
図１はｐＨに対する、アミリンアナログ  プラムリンチド25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンとインスリンペプチドA21G,B28D,desB30の混合物の可溶性を示す。全試料は０．２ｍＭの酢酸亜鉛と１６ｍＭのｍ-クレゾールと１６ｍＭのフェノールを含んでいた。ｐＨに対する25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンの溶液中の濃度は、左側のＹ軸を使用して、黒色の線及びシンボルでプロットした；ｐＨに対するインスリンアナログの溶液中の濃度は右側のＹ軸を使用して、薄灰色の線及びシンボルでプロットした。その沈殿ゾーンにおいて、25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンはインスリンアナログと共沈殿した。ｐＨ３．８未満及びｐＨ７．５より上において、両方のペプチドの実質的な量がアナログ類のこの特定な混合に可溶であった。これにより、インスリンA21G,B28D,desB30と25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンの両方の治療学的に意味のある用量の共製剤が可能である。
（実施例２）
インスリンA21G,B28D,desB30とプラムリンチド（25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリン）を含む混合物の物理的安定性はＴｈＴフィブリレーションアッセイを使用して評価した。これは図２に示す。全３つの製剤は１７４ｍＭのグリセロールと１６ｍＭのフェノールと３０ｍＭの酢酸ナトリウムを含み、ｐＨ３．５に調節された。これらの条件下で、これはＴｈＴ蛍光シグナルを何ら示されなかったので、25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンはアッセイ時間を通してフィブリレーションに関して不活性だった。インスリンアナログ単独が約４．５時間の時間のずれでフィブリル化された。インスリンアナログと25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンの両方の混合物はｍインスリンアナログ単独による製剤と同じＴｈＴ反応（同じ約４．５時間の時間のずれを含めて）を示した。従って、混合物は最も安定でない成分（インスリンアナログ）と同じ物理的安定性なので、相乗の不安定効果はなかった。このことは、これらの条件下のインスリンアナログと25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンの安定な共製剤を可能にする。
（実施例３）
図３はｐＨに対するアミリンアナログ25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンとインスリンA21G, B28E, desB30の混合物の溶解度を示す。インスリンアナログは特許出願WO2004/080480に記載されている。Ｂ２８Ｅ突然変異はインスリンを単量体の状態にし、従って食事関係インスリンとして有用である。全試料は０．２ｍＭの酢酸亜鉛と１６ｍＭのｍ-クレゾールと１６ｍＭのフェノールを含む。ｐＨに対する25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンの溶液中の濃度は、左側のＹ軸を使用して、黒色の線及びシンボルでプロットした；ｐＨに対するインスリンアナログの溶液中の濃度は右側のＹ軸を使用して、薄灰色の線及びシンボルでプロットした。その沈殿ゾーンにおいて、25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンはインスリンアナログと共沈殿した。ｐＨ３．５未満及びｐＨ７．７より上において、両方のペプチドの実質的な量がアナログ類のこの特定な混合に可溶であった。これにより、インスリンA21G, B28E, desB30と25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンの両方の治療学的に意味のある用量の共製剤が可能である。
（実施例４）
インスリンA21G, B28E, desB30と25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンを含む混合物の物理的安定性はＴｈＴフィブリレーションアッセイの使用によって評価した。これは図４に示す。全３つの製剤は１７４ｍＭのグリセロールと１６ｍＭのｍ-クレゾールと３０ｍＭの酢酸ナトリウムを含み、ｐＨ３．５に調節された。これらの条件下で、25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンはアッセイ時間を通してフィブリレーションに関して不活性だった。インスリンアナログ単独及びインスリンアナログと25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンの混合物が同一の時間のずれ（約６時間）でフィブリレーションを開始した。従って、混合物は最も安定でない成分（インスリンアナログ）と同じ物理的安定性なので、相乗の不安定効果はなかった。このことは、これらの条件下のインスリンアナログと25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンの安定な共製剤を可能にする。このことは、酸性のｐＨ、例えばｐＨ３．５における、２つのペプチドの安定な混合製剤を可能にする。
（実施例５）
図５はｐＨに対する、０．６ｍＭのインスリンB28Dと０．２ｍＭのＺｎ(Ａｃ)２と０．１５ｍＭの25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンの混合物の溶解度を示す。ｐＨに対する25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンの溶液中の濃度を左側のＹ軸を使用して、黒色の線及びシンボルでプロットした；ｐＨに対するインスリンアナログの溶液中の濃度は右側のＹ軸を使用して、薄灰色の線及びシンボルでプロットした。生理的ｐＨにおける共沈殿にもかかわらず、やや高いｐＨにおいて、25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンとインスリンB28D の両方の有意な量を溶液中に有することが可能であった。これにより、生理的ｐＨよりも少し高いｐＨ、例えばｐＨ８．０において製剤化された、臨床的に意味のある用量のインスリンB28D と25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンの同時送達が可能である。
（実施例６）
図６は、０．６ｍＭのインスリンB28Dと０．２ｍＭのＺｎ(Ａｃ)２と０．１ｍＭの25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンと１６ｍＭのフェノールと１６ｍＭのｍ-クレゾールと３０００ｐｐｍのポロキサマー-１８８の混合物の溶解度を示す。ｐＨに対する、25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンの溶液中の濃度は左側のＹ軸を使用して、黒色の線及びシンボルでプロットした；ｐＨに対するインスリンアナログの溶液中の濃度は右側のＹ軸を使用して、薄灰色の線及びシンボルでプロットした。ｐＨが天然のｐＨからｐＨ８．０に増加した時に、両ペプチドの溶解度は増加した。これにより、生理的ｐＨよりも少し高いｐＨ、例えばｐＨ８．０において製剤化された、臨床的に意味のある用量のインスリンB28Dと25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンの同時送達が可能である。界面活性剤ポロキサマー-１８８の存在はこのような共製剤の物理的安定性を増加するかもしれない。
（実施例７）
この実施例では、インスリンB28Dと25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンの両方を含む混合物の物理的安定性におけるリン脂質の効果を調べた。これは図７に示す。両製剤は、０．６ｍＭのインスリンB28Dと５０μＭの25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンと０．３ｍＭのＺｎ(Ａｃ)２と１７４ｍＭのグリセロールと３０ｍＭのフェノールと８ｍＭのグリシルグリシンｐＨ７．４を含む。界面活性剤の添加なしの試料は、約４時間の時間のずれの後、フィブリレーションが開始されたことを示す有意なＴｈＴ蛍光シグナルを示した。1,2-ジミルストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-rac-(1-グリセロール)（ＤＭＰＧ）、CAS no. 67232-80-8、の５ｍＭまでの添加は、この時間のずれを２５時間より多く有意に増加させた。これは、インスリンB28Dと25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンの共製剤は、アニオン性リン脂質ミセルの存在下で、製剤の物理的安定性を増加する可能性を示す。
（実施例８）
ＤＭＰＧリン脂質の添加は、また、インスリンB28Dと25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンの両方の安定性を増加させた。図８は、０．６ｍＭのインスリンB28Dと０．２ｍＭのＺｎ(Ａｃ)２と１００μＭの25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンと３０ｍＭのフェノールと３ｍＭのＤＭＰＧの混合物の溶解度を示す。ｐＨに対する25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンの溶液中の濃度は、左側のＹ軸を使用して、黒色の線及びシンボルでプロットした；ｐＨに対するインスリンアナログの溶液中の濃度は右側のＹ軸を使用して、薄灰色の線及びシンボルでプロットした。ＤＭＰＧの効果はとても顕著だった。インスリンB28D と25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンの両方の完全溶解がすでにｐＨ６より上で観察された。これは、許容可能な注射容量で及び生理的ｐＨにおいて、治療学的に意味のある用量の製剤及び皮下注射を可能にする。さらに、ＤＭＰＧを加えたインスリンB28D と25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンの混合製剤は実施例７及び９に図示するようにフィブリレーションに対して安定であることが期待される。
（実施例９）
インスリンB28D と25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンとＤＭＰＧを含む混合物の物理的安定性は、ＴｈＴフィブリレーションアッセイを使用して評価した。これは図９に示す。両製剤９Ａ及び９Ｂは、０．６ｍＭのインスリンB28Dと０．３ｍＭのＺｎ(Ａｃ)２と１００μＭの25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリンと１７４ｍＭのグリセロールと３０ｍＭのフェノールと８ｍＭのグリシルグリシンｐＨ７．４を含む。製剤９Ａは、更に１．０ｍＭのＤＭＰＧを含み、製剤９Ｂは更に３．０ｍＭのＤＭＰＧを含む。製剤９Ａ（１．０ｍＭのＤＭＰＧを含む）は、フィブリレーションの開始前に、約２．５時間の時間のずれを有したが、製剤９Ｂ（３．０ｍＭのＤＭＰＧを含む）は約２２時間の時間のずれを有した。このことは、ＤＭＰＧはインスリンB28D −25,28,29Ｐｒｏ-ｈ-アミリン共製剤の物理的安定性を増加したこと、及びフィブリレーションの発生前の時間のずれは３．０ｍＭのＤＭＰＧの存在下で有意に延長されたことを示した。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１はアミリンアナログプラムリンチド(25,28,29Ｐｒｏ-h-アミリン)とインスリンA21G,B28D,desB30の混合物のｐＨに対する可溶性を図示する。
【図２】図２はＴｈＴフィブリレーションアッセイを使用した、インスリンA21G,B28D,desB30とプラムリンチド (25,28,29Ｐｒｏ- h-アミリン)の混合物の物理的安定性を図示する。
【図３】図３はアミリンアナログプラムリンチド(25,28,29Ｐｒｏ-h-アミリン)とインスリンA21G,B28E,desB30の混合物のｐＨに対する可溶性を図示する。
【図４】図４はＴｈＴフィブリレーションアッセイを使用した、インスリンA21G,B28E,desB30とプラムリンチド (25,28,29Ｐｒｏ- h-アミリン)の混合物の物理的安定性を図示する。
【図５】図５は０．６ｍＭのインスリンB28Dと０．２ｍＭのＺｎ(Ａｃ)２と０．１５ｍＭのプラムリンチド (25,28,29Ｐｒｏ- h-アミリン)の混合物のｐＨに対する可溶性を図示する。
【図６】図６は０．６ｍＭのインスリンB28Dと０．２ｍＭのＺｎ(Ａｃ)２と０．１ｍＭのプラムリンチド (25,28,29Ｐｒｏ- h-アミリン)と１６ｍＭのフェノールと１６ｍＭのｍ-クレゾールと３０００ｐｐｍのポロキサマー-１８８の混合物の可溶性を図示する。
【図７】図７はインスリンB28D とプラムリンチド (25,28,29Ｐｒｏ- h-アミリン)の混合物の物理的安定性に対するリン脂質の効果を図示する。
【図８】図８は０．６ｍＭのインスリンB28Dと０．２ｍＭのＺｎ(Ａｃ)２と１００μＭのプラムリンチド (25,28,29Ｐｒｏ- h-アミリン)と３０ｍＭのフェノールと３ｍＭの1,2-ジミルストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-rac-(1-グリセロール)（ＤＭＰＧ）の混合物の可溶性を図示する。
【図９】図９はＴｈＴフィブリレーションアッセイを使用した、インスリンB28Dとプラムリンチド (25,28,29Ｐｒｏ- h-アミリン)とＤＭＰＧの混合物の物理的安定性を図示する。
【図１０】図１０は繊維形成のための時間的経過がＳ字形カーブで記載できることを図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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