(57)【要約】  本発明は、ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス由来の１又は複数のタンパク質及び／又は抗原を認識する抗体の検出のためのキット、装置、及び方法に関する。かかる抗体は、ＰＲＲＳＶに感染した、又はその危険性のある被験者の体液中にあることもある。本発明は、有利にはＰＲＲＳＶの診断及び予防の両方に適用されうる。
2009501901.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＲＲＳウイルス感染細胞からＰＲＲＳウイルスタンパク質及び抗原を調製する方法であって、
ａ）ＰＲＲＳウイルス感染細胞集団を準備し；
ｂ）当該感染細胞を、無細胞ＰＲＲＳウイルスから単離して、細胞結合ＰＲＲＳウイルスタンパク質及び抗原を含む細胞を形成させ；そして
ｃ）界面活性剤含有溶液を用いて、工程ｂ）で単離した細胞からＰＲＲＳウイルスタンパク質及び抗原を抽出又は溶出すること、を含んで成る方法。
【請求項２】
前記細胞集団が、１０1.5組織培養感染量（ＴＣＩＤ）50／ｍｌ上清を生成するのに十分な時間ＰＲＲＳウイルスに感染している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞集団が、初期段階のＣＰＥを観察するのに十分な時間ＰＲＲＳウイルスに感染している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記界面活性剤含有溶液が０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記抽出又は溶出が４℃で約２時間〜約１５時間である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質及び抗原が、ＰＲＲＳウイルスエンベロープタンパク質又はＮタンパク質を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法によって調製されるＰＲＲＳウイルスタンパク質及び抗原。
【請求項８】
１又は複数の請求項７に記載のＰＲＲＳウイルスタンパク質及び抗原でコートされている少なくとも１つの表面を含んで成る診断装置。
【請求項９】
界面活性剤含有溶液を用いてＰＲＲＳウイルス感染細胞から抽出又は溶出された１又は複数のＰＲＲＳウイルスタンパク質及び抗原でコーティングされた少なくとも１つの表面を含んで成る診断装置。
【請求項１０】
前記１又は複数のＰＲＲＳＶタンパク質及び抗原が、ＰＲＲＳウイルスコードヌクレオキャプシドタンパク質及び／又はエンベロープタンパク質を含んで成る、請求項８又は９に記載の装置。
【請求項１１】
前記１又は複数のＰＲＲＳＶタンパク質及び抗原がＰＲＲＳウイルスコード糖タンパク質を含んで成る、請求項８又は９に記載の装置。
【請求項１２】
前記溶液が０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む、請求項９に記載の装置。
【請求項１３】
垂直免疫拡散酵素アッセイ（ＶＩＤＥＡ）法であって、
ａ）１又は複数の請求項７に記載のＰＲＲＳＶタンパク質及び抗原でコーティングされた少なくとも一つの表面であって、寒天又はアガロースの層で重層されている当該少なくとも１つの表面、を含んで成る診断装置を準備し；
ｂ）前記寒天又はアガロースの表面と、被験者由来の抗体含有サンプルを含んで成る多孔性材料とを接触させ；
ｃ）材料が前記サンプルから前記１又は複数の表面へと拡散するのに十分な期間であって、前記多孔性材料の除去の後任意に生じる期間前記装置をインキュベートし；そして
ｄ）前記寒天又はアガロースの除去の後前記ディッシュの表面にある抗体の存在を検出すること、
を含んで成る方法。
【請求項１４】
前記サンプルが血清サンプル又は全血サンプルである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記多孔性材料がろ紙ディスクである、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記被験者が、ＰＲＲＳウイルスに感染していることが疑われている、請求項１３、１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
水平免疫拡散酵素アッセイ（ＨＩＤＥＡ）法であって、
ａ）１又は複数の請求項７に記載のＰＲＲＳＶタンパク質及び抗原でコーティングされた少なくとも一つの表面であって、、寒天又はアガロースの層で重層されており、表面上に１又は複数のくぼみ(indentation)を含んで成る、当該少なくとも１つの表面、を含んで成る診断装置を準備し；
ｂ）１又は複数のくぼみと、被験者由来の抗体含有サンプルとを接触させ；
ｃ）材料が前記サンプルから前記１又は複数の表面へと拡散するのに十分な期間前記装置をインキュベートし；そして
ｄ）前記寒天又はアガロースの除去の後前記ディッシュの表面にある抗体の存在を検出すること、
を含んで成る方法を提供。
【請求項１８】
前記装置がディッシュである、請求項１３又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
表面をウイルスタンパク質及び／又は抗原でコーティングする方法であって、
ａ）１又は複数の請求項７に記載のＰＲＲＳウイルスタンパク質及び抗原を含む溶液を準備し；そして
ｂ）前記溶液と表面とを、前記タンパク質及び抗原が前記ディッシュの表面と吸着するのが可能な時間接触すること、を含んで成る方法。
【請求項２０】
表面をウイルスタンパク質及び／又は抗原でコーティングする方法であって、
ａ）ＰＲＲＳウイルス感染細胞から１又は複数のＰＲＲＳウイルスタンパク質及び抗原を含む溶液を準備すること、ここで、前記タンパク質及び抗原は界面活性剤溶液の使用によって前記細胞から抽出又は溶出されている；そして
ｂ）前記溶液と表面とを、前記タンパク質及び抗原が前記ディッシュの表面と吸着するのが可能な時間接触すること、
を含んで成る方法。
【請求項２１】
前記ディッシュがポリスチレン製である、請求項１９又は２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本願は、２００５年７月５日に出願した米国仮出願番号第１１／１７５，６０５号の利益を主張するものであり、当該出願は、引用によりその全体が完全に記載されているよう本明細書で援用される。
【０００２】
本発明は、１又は複数のブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）由来の１又は複数のタンパク質及び／又は抗原を認識する抗体を検出するためのキット、装置、及び方法に関する。当該抗体は、ＰＲＲＳＶに感染した、又はその危険性のある被験者の体液中にあることもある。本発明は、有利にはＰＲＲＳＶの診断及び予防の両方に適用されうる。
【背景技術】
【０００３】
米国の養豚産業における経済的損失の主な原因は、ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳＶ）ウイルス、又はＰＲＲＳＶにある。ＰＲＲＳＶは、ブタの生殖器疾患及び呼吸器障害の病原因子である。ＰＲＲＳＶに伴う経済的損失は、主に、それが妊娠中の雌ブタの流産及び育成ブタのブタ呼吸器病症候群（ＰＲＤＣ）に関与することに起因する。異なる抑制措置、例えばワクチンの使用及び管理の変更が実施されている。例えば、米国特許第５，６９０，９４０号を参照のこと。しかしながら、慣習的にワクチン接種が行われているにも拘らず、ＰＲＲＳＶの大流行が養豚場で発生することは珍しいことではない。
【０００４】
かかる大流行は、バイオセキュリティー対策の不備が最も一般的な原因である。ＰＲＲＳＶに感染した、代替のための(replacement)未経産のブタ(gilt)を群れの中で検出することが不十分であるのは、バイオセキュリティーの不備が原因であった。これらの問題は、ＰＲＲＳＶ感染について単純且つ安価な試験方法が農場で利用可能であるならば回避可能なこともある。かかる方法は、また、雌ブタが順応段階で陰性な離乳ブタを生産するか否かを試験するのにも適用されうる。
【０００５】
ＰＲＲＳＶ抗体を試験するために、獣医は血液試料を採取し、そしてそれらを獣医学的な診断研究所に送るべきである。現在、ＥＬＩＳＡ、間接的蛍光抗体試験及びイムノペルオキシダーゼ単層アッセイが、抗ＰＲＲＳＶ抗体を検出するのに一般的な研究所での方法である。しかしながら、これらの方法は、高価な設備及び訓練された研究員の技術を必要とする。これらの技術を用いると、郵送の時間も含めて少なくとも３日は結果を得るのに必要とされる。更に、養豚家は、サンプルを採取し、そしてそれらを診断研究所に送る費用を負担しなければならない。現場ベースの、単純で迅速なＰＲＲＳＶ抗体の検出試験は、動物病院又は企業養豚家の研究所で非常に有用であろう。ＰＲＲＳＶワクチンを用いる疾患の根絶は、農家レベルでは定期的には成功していない。トータルデポピュレーション及びレポピュレーションのような方法は、農場での根絶に有効であることが示されている。しかしながら、かかる方法は全ての農場で使用することができず、実施するのに比較的費用がかかる。
【０００６】
更に、かかる方法は、ＰＲＲＳＶの検出に依存する。ＰＲＲＳＶの種によっては、核酸配列及びコードタンパク質が既述されている。組織試料、例えば肺組織を介してのＰＲＲＳＶの検出も開示されており（ＷＯ９６／０６６１９を参照のこと）、これはＰＲＲＳＶが優先的に肺胞マクロファージで複製するという観察と一致するものである。口鼻経路による感染の後、肺のマクロファージで複製したＰＲＲＳＶは、肺リンパ節に進入し、続いて、血流を介して異なる器官に進む。
【０００７】
本明細書で引用する文書は、いずれかが関連の従来技術であることを認めるものと意図されていない。日付についての声明又は文書の内容についての説明は全て、出願人に利用可能な情報に基づくものであり、当該文書の日付又は内容の正確性についての承諾を何ら構成するものではない。
【０００８】
本発明の簡単な説明
本発明は、ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス、又はＰＲＲＳＶによる被験者の感染を検出するためのキット、装置、及び方法に関する。当該検出は、１又は複数のＰＲＲＳＶコードタンパク質及び／又は当該タンパク質に対する抗体と結合する抗原を含む組成物の使用によって媒介される。従って、本発明は、「抗体捕捉」、続いて、当該抗体の検出、の原理に基づくものと考えられてもよい。当該抗体は、ＰＲＲＳＶに感染した被験者に存在するが、感染していない個体には存在しないものである。
【０００９】
１又は複数のＰＲＲＳＶコードタンパク質は、ヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質及び／又は１又は複数のウイルスエンベロープ（「Ｅ」）タンパク質を含むこともある。当該タンパク質はまた、ＰＲＲＳＶ感染細胞の表面に見られる糖タンパク質であってもよい。当該タンパク質はまた、被験者において検出される抗体であって、ＰＲＲＳＶタンパク質、すなわちＰＲＲＳＶを認識する抗体に対し使用されるＰＲＲＳＶ抗原であるとみなされてもよい。
【００１０】
ＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原は、有利には、抗ＰＲＲＳＶ抗体の検出に基づいて、早い時点でＰＲＲＳＶ感染を検出するために、本発明のキット、装置、及び方法で使用してもよい。かかる検出法は、上述のような少なくとも１つのＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原に対して早い時点で感染した被験者の抗体の存在に依拠する。
【００１１】
第一の観点において、本発明は、本明細書に記載のキット又は装置の調製又は使用における１又は複数のＰＲＲＳＶ発現タンパク質及び／又は抗原を含む組成物の使用方法を提供する。態様によっては、前記装置は、本発明の組成物でコートされているディッシュである。かかるディッシュの非限定的な例としては、種々のサイズのペトリ皿並びにマイクロタイタープレートのウェルがある。当該ディッシュは、前記組成物に含まれる１又は複数のＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原に対する抗体について診断試験する際に使用するためのものであってもよい。従って、前記装置は、前記組成物中の１又は複数のＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原に対する抗体の存在を検出するために使用されうる。検出されるべき抗体は、体液のサンプル中にあってもよく、そして抗体が存在する場合には、サンプルが採取された被験者中のＰＲＲＳＶ感染の指標としての役割を果たす。従って、前記装置は、ＰＲＲＳＶ感染の存在を診断する迅速な手段として使用されうる。
【００１２】
本発明のかかる装置の中心部は、前記組成物中に存在する１又は複数のＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原の固定型の存在である。ＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原は、直接、例えば、非限定的な例として、吸着（例えばコーティング）により又は装置表面への接合により、固定されうる。あるいは、当該タンパク質及び／又は抗原は、間接的に、例えば前記タンパク質及び／又は抗原と結合する物質の使用により、あるいは前記表面及び前記タンパク質又は抗原の両方と結合するリンカーの使用により固定されうる。従って、固定されたＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原は、前記タンパク質及び／又は抗原に対する抗体により結合して、前記タンパク質及び／又は抗原を含む固定型複合体を形成するための「捕捉物質」と考えられてもよい。固定された「捕捉物質」は、当然ながら、当該物質と結合する抗体を「捕捉」する物質として考えられうる。
【００１３】
前記複合体は、続いて、「検出物質」、例えば、本明細書に記載のように、前記複合体と結合する標識試薬の使用により検出されうる。複合体に結合した場合、「検出試薬」は、サンプル中の抗ＰＲＲＳＶ抗体の存在を示唆する。態様によっては、前記「検出試薬」は、前記抗体と結合する標識二次抗体であって、サンプル中に存在する場合には、前記複合体の一部として固定されているもの、である。抗ＰＲＲＳＶ抗体の存在は、サンプルを得た被験者のＰＲＲＳＶ感染を示すものとして使用されうる。抗ＰＲＲＳＶ抗体の不在は、感染していないことを示すであろう。当該サンプルは、好ましくは被験ブタ、又はＰＲＲＳＶに感染していると疑われている他の被験者であるが、ＰＲＲＳＶ又はＰＲＲＳＶ担体に感染しているとかもしれないあらゆる被験者が本発明の装置に使用されうる。
【００１４】
「検出物質」とは、例えば十分な凝集により目に見える粒子標識との接合により、直接的な検出を、可能にするよう標識されうる。あるいは、当該物質は、例えば検出可能な物質上の活性に基づいて検出される酵素に対する接合により、あるいは検出可能な生成物を生成するように、間接的な検出のために標識されうる。当然のことながら、「検出物質」は、本発明の複合体と結合する、標識又は未標識の「一次」結合物質と結合する「二次物質」であってもよい。
【００１５】
本発明の装置は、本発明の装置内にコントロールの部位又はコントロールの領域を含んでもよく、これは、ＰＲＲＳＶ抗体が、装置にかけられたサンプル中に存在していたか否かに関係なく、当該装置が適切に機能していることを確認するものである。かかるコントロールは、サンプル中に存在する別の分子又は高分子部分の検出に基づいてもよい。
【００１６】
使用する装置のフォーマットに拘束されることなく、ＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原、並びにそれらを含んで成る本発明の組成物はまた、ＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原に対する抗体を検出する方法において使用してもよい。かかる方法は、被験者、例えばＰＲＲＳＶに感染していることが疑われている個体由来の体液中のかかる抗体を検出するために設計してもよい。当該方法は、サンプル、又はその希釈物を、ＰＲＲＳＶコードタンパク質及び／又は抗原と接触させ、そして当該サンプル中に、前記タンパク質及び／又は抗原と結合する任意の抗体があるか否かを決定すること、を含んで成る。ＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原に対する抗体の結合は複合体を形成し、これは検出されて当該抗体の存在を示唆することがあり、その結果、前記サンプルを得た被験者のＰＲＲＳＶ感染の存在が示唆されうる。当該サンプルは、好ましくは被験ブタ由来であるが、ＰＲＲＳＶ又はＰＲＲＳＶ担体に感染していると思われるあらゆる被験者が本発明に関して使用されうる。
【００１７】
本発明の実施に使用されうる体液の範囲は、ＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原に対する抗体が検出可能に存在しうる任意の液体を含む。限定しないが、例えば、被験者の身体から分泌されるもの、例えば血液、血清、血漿、唾液、涙液、粘液、鼻汁、及び膣分泌物がある。かかる液体の希釈物は、当然ながら、本発明の実施におけるサンプルとして使用されうる。態様によっては、ＥＤＴＡ又は他の二価陽イオンキレート剤を含む希釈剤が、被験者由来の体液サンプルと１：１の比率で使用される。血清又は血漿のサンプルを用いる態様においては、希釈は省略してもよい。
【００１８】
前記サンプルは、好ましくは、感染を示す症候の存在に起因して、ＰＲＲＳＶに感染していることが疑われる個体に由来する。あるいは、本発明の方法は、動物、例えば、農場の動物のルーチンなスクリーニングの一部として、感染した個体の迅速な同定及び単離を可能にするために使用してもよい。当該方法はまた、具体的な事例において、例えば、ある場所から別の場所への動物の運搬又は輸送の前に、感染の同定を可能にし、そして感染の拡大を防ぐために使用してもよい。本発明の多くの態様において、被験体はブタであり、そのため、サンプルはブタの体液又は分泌物のものであってもよい。本発明による使用のためにサンプルを得ることができるブタの非限定的な例には、雄ブタ、未経産ブタ、経産ブタ(sow)、肥育ブタ(fattener)、幼ブタ(nusery)及び哺乳子ブタ(suckling pig)が含まれる。ブタは、生まれてから死ぬまでのあらゆる年齢に及んでいてもよい。限定しないが、例えば、約３０〜約４０、４１〜約５０、又は５１〜６０日齢以上のブタが本発明の実施に使用されうる。
【００１９】
態様によっては、前記方法は、垂直免疫拡散酵素アッセイ (vertical immunodiffusion enzyme assay) （ＶＩＤＥＡ）ベースのフォーマットである。当該フォーマットは、固定化ＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は酵素を利用するものであり、これは、抗ＰＲＲＳＶ抗体を含む、又は含むことが疑われるサンプルから透水性バリアによって分離される。当該サンプルは、多孔性材料を介して前記バリアに提示され、そして当該サンプル中の抗ＰＲＲＳＶ抗体は、前記透水性バリアを通過して拡散し、ＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原と接触する。抗体とタンパク質／抗原との接触は、複合体の形成をもたらし、これはその後検出されてサンプル中の抗体の存在を示す。当該検出は、複合体が存在する領域の形態でなされてもよい。態様によって、透水性バリアは寒天又はアガロースである。
【００２０】
他の態様において、当該方法は水平免疫拡散酵素アッセイ (horizontal immunodiffusion enzyme assa)（ＨＩＤＥＡ）ベースのフォーマットである。当該フォーマットは、固定化ＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原を利用する点で上述のＶＩＤＥＡのものと類似している。ＨＩＤＥＡフォーマットは、抗ＰＲＲＳＶ抗体を含む、又は含むことが疑われるサンプルから、透水性バリアにより固定化タンパク質／抗原を分離することを含む。当該サンプルは、抗ＰＲＲＳＶ抗体が透水性バリアを通過してＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原と接触するように、直接バリアに提示される。拡散は、サンプルの接触点から当該バリアへと、外側に広がる。抗体とタンパク質／抗原との接触は、複合体の形成をもたらし、これは、検出されることでサンプル中の抗体の存在を示唆することもある。当該検出は、複合体が存在する円又は環の形態でなされてもよい。態様によっては、透水性バリアは寒天又はアガロースである。
【００２１】
本発明の種々の観点は、北アメリカ株と抗原的に関連している全てのＰＲＲＳＶ株との関連での使用が考慮される。従って、本発明は、より一般的には、任意のＰＲＲＳＶウイルスのタンパク質に基づくと考えることができる。
【００２２】
更に、かかる装置の製造に関連する方法が提供される。従って、本発明の追加の観点は、本明細書に記載のキット、装置及び方法の構成要素を調製する方法に関連する。本発明は、感染細胞からＰＲＲＳＶタンパク質を調製する方法を含む。態様によっては、前記タンパク質は、タンパク質の大部分、又は全部が感染細胞と会合したままである場合に、感染後の早い時点で収集される。別の言い方をすれば、ＰＲＲＳＶコードタンパク質の大部分又は全部が、感染細胞内にあるか、あるいは感染細胞の細胞膜と会合している。かかる状態のもとでは、もしあるとしたら比較的少ない数の、ＰＲＲＳＶ粒子が細胞の外側の細胞外環境に存在する。
【００２３】
別の観点は、第一の結合物質、例えば、限定しないが、ＰＲＲＳＶのＮタンパク質及び／又は１又は複数のエンベロープタンパク質を、上述の装置の少なくとも一面に固定化する方法を提供する。
【００２４】
本発明の他の観点において、本発明の装置を含んで成るキット又は本明細書に記載の方法を実施するためのキットが提供される。追加の観点には、本発明により提供される１又は複数の方法の実施における使用のための組成物及び製品がある。かかる組成物の非限定的な齢には、本発明のキット又は装置の調製における使用ためのものが含まれる。限定しないが、キットには、本明細書に開示した方法の使用のための、本発明の１又は複数の組成物又は物質、あるいは本発明の１又は複数の装置を含んで成るものが含まれる。
【００２５】
本発明の１又は複数の態様の詳細は、添付図及び以下の記載において説明する。本発明の他の特徴、目的及び利点は、図面及び詳細な説明、並びに特許請求の範囲から自明であろう。
【００２６】
定義
本明細書で使用する場合、ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳＶ）ウイルス、又はＰＲＲＳＶという用語は、ＰＲＲＳ、ミステリーブタ病 (Mystery Swine Disease) （ＭＳＤ）、以前「青耳症候群」として知られていたブタの不妊・呼吸症候群（ＳＩＲＳ）、ブタの伝染性流産・呼吸器症候群（ＰＥＡＲＳ）、ワバッシュ(Wabashu)症候群、ミステリーブタ病 (Mystery Pig Disease) （ＭＰＤ）、ブタペスト、英国における青色流産病 (blue abortion disease)又は青耳病、オランダにおける青い流産 (abortus blau)、ドイツでのSeuchenhafte Spaetabort der Schweine、及びヘコヘコ病を指す。
【００２７】
ＰＲＲＳＶタンパク質は、ＰＲＲＳＶゲノムがコードする、そして／あるいはＰＲＲＳＶ感染又はＰＲＲＳＶライフサイクルの結果としてのみ生成されるあらゆるポリペプチドを指す。従って、ＰＲＲＳＶ特異的で、且つ、その結果、ＰＲＲＳＶ感染細胞によってコードされておらず、又は発現されていないポリペプチドは、この用語の範囲内にある。ＰＲＲＳＶ感染細胞によってコードされているが、ＰＲＲＳＶ感染及び／又はライフサイクルの不在下で発現しない内因性ポリペプチドは意図していない。しかしながら、ＰＲＲＳＶ感染及び／又はライフサイクルの結果としてのみ発現した内因性ポリペプチドはかかる用語の範囲内にある。当該用語はまた、二次及び／又は三次構造の変化に起因するポリペプチドの別の形態、例えば、非限定的な例として、部分的又は実質的なタンパク質変性から生じるもの、を含む。従って、前記ポリペプチドの変性形態はかかる用語の範囲内にある。
【００２８】
ＰＲＲＳＶ抗原は、抗ＰＲＲＳＶ抗体によって認識されているＰＲＲＳＶポリペプチドの任意の部分又はフラグメントを指す。態様によっては、当該部分又はフラグメントは、会合部分、例えば、限定しないが、糖部分、リン酸塩部分、又は脂質部分を有するペプチドであってもよい。あるいは、当該部分又はフラグメントは、非ペプチド部分と何ら会合していないペプチドであってもよい。
【００２９】
本発明の実施形態の詳細な説明
本発明は、検出抗ＰＲＲＳＶ抗体を対象とするキット、装置、及び方法に関する。当該検出は、１又は複数のＰＲＲＳＶコードタンパク質及び／又は前記タンパク質に対する抗体に結合する抗原の使用に基づく。かかる抗体は、ＰＲＲＳＶに感染した被験者には存在するが、感染していない個体には存在しないものである。本発明は、捕捉した抗体が検出される、「抗体捕捉」アッセイとして考えられてもよい。本発明はまた、抗ＰＲＲＳＶ抗体の検出に基づく免疫拡散を提供するものと考えることもできる。
【００３０】
本発明は、ＰＲＲＳＶの構造タンパク質、例えばヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質、膜（Ｍ）結合タンパク質、そして少なくとも４個のエンベロープ（Ｅ）タンパク質を使用してＰＲＲＳＶに感染した被験者における抗体を検出することが可能であるという認識に一部基づくものである。別の言い方をすれば、本発明は、これらのタンパク質、及び／又はそれらの抗原性部分に対する抗体が、ＰＲＲＳＶに感染した被験者に存在し、その結果、その抗体の検出が被験者がＰＲＲＳＶに感染しているということを示唆するのに有利な手段をもたらすという発見に一部基づいている。
【００３１】
本発明はまた、ある条件及びプロトコールを使用することで、他のＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原と比較して高濃度のＥタンパク質を含む、ＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原の組成物を得ることが可能であるという発見に一部基づくものである。従って、本発明は、ＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原を、それらに感染した細胞から調製する方法を含む。当該タンパク質及び／又は抗原は、タンパク質の大部分、又は全部が感染細胞と結合したままである場合に、あるいは、他の方法で本発明の細胞結合ウイルス成分（ＣＡＶＣ）の一部となっている場合に、感染後の早い時点で収集される。別の言い方をすれば、ＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原の大部分、又は全部が、感染細胞内にあるか、あるいは感染細胞の細胞膜と結合している。かかる状態のもとでは、もしあるとしたら比較的少ない数の、ＰＲＲＳＶ粒子が細胞の外側の細胞外環境に存在する。本発明は、比較的短期間に感染した細胞が、本発明の検出方法に使用するのに適したＰＲＲＳＶコードタンパク質を十分量産生することができるという予測できない発見に一部基づいている。ＰＲＲＳＶ粒子の産生及び／又は細胞外環境へのそれらの放出、の前の早い時点からのＣＡＶＣの調製も、感染ウイルス粒子が夾雑物として存在しない点で高い安全性という利点を有する。
【００３２】
感染細胞は、ＰＲＲＳＶに増殖的に感染することができるあらゆるものであってもよい。限定しないが、例としては、in vitro又はin vivoのいずれかのブタ細胞がある。in vitro細胞の非限定的な例には、ＰＲＲＳＶに感染しているブタ被験者由来の初代細胞がある。in vivoの非限定的な例には、口鼻経路を介してＰＲＲＳＶに感染し、続いて、ＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原の調製のために収集されるブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）である。別の非限定的な例には、サル細胞系ＭＡＲＣ−１４５を用いるものである。当該方法によって産生されるＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原には、ＰＲＲＳＶ  Ｎ、Ｍ及びＥタンパク質のうちの少なくとも１つが挙げられる。これらのタンパク質の組み合わせは、本発明の細胞から調製することも可能である。態様によっては、調製されたタンパク質／抗原は、Ｎ及びＭタンパク質と比較して高い比率のＥタンパク質を有する。
【００３３】
従って、本発明は、ＰＲＲＳウイルス感染細胞からＰＲＲＳウイルスタンパク質及び抗原を調製する方法であって、ａ）ＰＲＲＳウイルス感染細胞集団を準備し；ｂ）当該感染細胞を、無細胞ＰＲＲＳウイルスから単離して、細胞結合ＰＲＲＳウイルスタンパク質及び抗原を含む細胞を形成させ；そしてｃ）項目ｂ）で単離した細胞からＰＲＲＳウイルスタンパク質及び抗原を抽出又は溶出すること、を含んで成る方法、を提供する。無細胞ウイルスが全く存在しない場合、項目ｂ）は、単に、前記方法に干渉しうる他の材料、例えば細胞に使用する培地から細胞を単離する役割へと修飾することも可能である。項目ｂ）は、当業界で知られている任意の手段によって、例えば、遠心を用いることで、除去又は廃棄される細胞のペレット及び上清を生成させることにより、あるいは膜濾過を用いることで、上清を除去し、そして細胞を維持することで実施してもよい。項目ｃ）は、任意に、緩衝液中での細胞の再懸濁によって実施される。態様によっては、抽出又は溶出は、界面活性剤を含む溶液を用いることで行われ、そのため、細胞を再懸濁するために使用される緩衝液は界面活性剤を含んでもよい。
【００３４】
他の態様においては、上清１ｍｌ当たり僅かな量乃至検出不可能な量の感染単位を生成するのに十分な時間、ＰＲＲＳウイルスに感染した細胞集団を使用することを含んで成る。限定しないが、例としては、１０1.5組織培養感染量（ＴＣＩＤ）50／ｍｌ未満である。前記方法で使用する細胞集団は、任意に、ＣＰＥを観察するために、十分な時間ＰＲＲＳウイルスに感染していてもよい。当然のことながら、ＣＰＥ、又はＣＰＥの初期段階が観察されるのに十分長時間感染している細胞も本発明の実施に使用されうる。
【００３５】
追加の態様において、本発明は、ＰＲＲＳウイルスタンパク質及び抗原を、ＰＲＲＳウイルスに感染したブタの肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）細胞から調製する方法を提供する。当該方法は、ＰＲＲＳウイルスを口鼻から接種したブタの肺胞で得られたＰＡＭ細胞集団から、前記タンパク質及び抗原を調製することを含んで成ることもある。ＰＲＲＳウイルスタンパク質及び抗原は、上述のように、細胞から抽出又は溶出してもよい。従って、当該細胞は、抽出緩衝液中で再懸濁されうる。態様によっては、抽出又は溶出は、界面活性剤含有溶液を用いて行われ、そのため、細胞を再懸濁するために使用されうる緩衝液は、界面活性剤を含むことがある。
【００３６】
界面活性剤含有溶液は、ＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原を抽出又は溶出するのに適しているものであればいずれのものでもよい。非限定的な例の１つとして、非イオン性界面活性剤、例えばポリ（エチレングリコール）ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）、又はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の使用がある。本発明の態様によっては、界面活性剤は、溶液中約０．５％の濃度であり、例えば約０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液である。
【００３７】
本発明はまた、ＰＲＲＳウイルス感染細胞からＰＲＲＳウイルスタンパク質及び抗原を調製する方法を提供する。かかる方法は、前記タンパク質及び抗原を、in vitro及びin vivoの方法により調製した細胞集団から調製することを含んで成る。in vitroの方法の場合、ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）細胞又はＭＡＲＣ−１４５系の細胞が培養され、そして当該細胞がＰＲＲＳＶの感染後に収集される。細胞培養系を用いないin vivoの方法の場合、ＰＡＭ細胞は、ＰＲＲＳウイルスを口鼻的に接種した後、ブタの肺胞から得られる。抗原の収率は、異なるＰＲＲＳＶ単離物を用い、ウイルス接種後異なる日数で比較され、そして最高の抗原の収率のための最適な条件を比較試験で予め決定した。
【００３８】
本発明は、当然のことながら、本明細書で開示された方法のいずれかによって調製された、単離されたＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原を含む組成物を含む。当該組成物は、ＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原が使用されるあらゆる目的のために使用してもよい。非限定的な例としては、前記タンパク質／抗原に対する抗体を調製するための使用；ＰＲＲＳＶタンパク質の参照マーカーとしての使用；及び免疫原性組成物としての使用、例えばワクチン製剤の場合、任意に、免疫反応を生成するために動物に投与される適当なアジュバントと併用される。前記組成物の追加の非限定的な例には、前記タンパク質／抗原が可溶性／凍結乾燥（フリーズドライ）の形態にある組成物が含まれる。
【００３９】
態様によっては、前記組成物は、表面、例えば本発明の装置の表面をコーティングするのに適した溶液状態にある。かかる溶液は、前記タンパク質をペトリ皿の底の上にコーティングするのを可能にする。限定しないが、例として、ｐＨ９．６の０．０６Ｍ炭酸緩衝溶液で希釈したＰＲＲＳＶタンパク質／抗原溶液がある。前記溶液を使用して、ディッシュ又はウェルの表面、例えば、それぞれポリスチレン又はガラス製のペトリ皿又はマルチウェルプレートの表面にコーティングすることもできる。非吸着性の材料は、任意に、タンパク質／抗原を含まない緩衝溶液中での１又は複数の洗浄の後、廃棄することもできる。当該コーティングは、種々の温度で、例えば２５℃未満で、種々の時点で実施されうる。態様によっては、コーティングは、４℃又はおよそ４℃で約７２時間行ってもよい。
【００４０】
従って、本発明はまた、表面をウイルスタンパク質及び／又は抗原でコーティングする方法であって、ａ）本明細書に記載のとおり調製した１又は複数のＰＲＲＳウイルスタンパク質及び抗原を含む溶液を準備し；そしてｂ）前記溶液と表面とを、前記タンパク質及び抗原が前記ディッシュの表面と吸着するのが可能な時間接触すること、を含んで成る方法、を提供する。態様によっては、前記タンパク質及び／又は抗原は、本明細書に記載のとおり、界面活性剤含有溶液の使用によりＰＲＲＳＶ感染細胞から抽出又は溶出した。追加の態様において、コーティングされるべき表面は、ポリスチレン又はガラスあるいは類似の材料から作られる。当該表面は、好ましくはエタノールで洗浄され、これは続いて蒸発される。
【００４１】
ＰＲＲＳＶタンパク質／抗原の溶液は、きれいな表面に適用され、そして約２時間〜約４時間乃至一晩吸着させられる。タンパク質／抗原は、タンパク質／抗原を表面に吸着させるのを促進するために、約０．０１〜０．００１％の至適濃度に、好ましくは炭酸水素−炭酸ナトリウムコーティング緩衝液中で希釈されうる。コーティング緩衝液は、好ましくは約０．０１Ｍ〜０．１Ｍ（ｐＨ９〜１０）の間で、１リットル当たり約０．８４〜８．４ｇのＮａＨＣＯ3及び１リットル当たり０．１１〜１０．６ｇのＮａ2ＣＯ3を含むはずである。コーティング期間の後、過剰な溶液は廃棄され、又は他の方法により除去される。コーティングされた表面は、蒸留水又はタンパク質／抗原を含まない緩衝液で洗浄してもよい。ＰＲＲＳＶタンパク質及び／又は抗原によるコーティングに続いて、任意に、ブロッキング剤、例えば、限定しないが、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いたコーティングを行ってもよい。当該コーティングは、種々の温度、例えば約３７℃で、種々の時点で行ってもよい。態様によっては、コーティングは、３７℃又は約３７℃で約１時間でもよい。ブロッキング剤の適用後、溶液は除去され、そして、任意に１又は複数の水又はブロッキング剤を含まない緩衝液を含んで成る洗浄液で洗浄される。
【００４２】
コーティング後、透水性バリア層がコート表面に適用される。当該バリアは、乾燥後に透水性バリアを遅れて形成する溶液として適用することができる。非限定的な例としては、寒天及び／又はアガロースの溶液であって、乾燥すると、ゲル様材料から構成される透水性バリアを形成するもの、がある。従って、融解した寒天又はアガロース層を適用し、固化させてもよい。寒天層の深さは必須ではなく、少なくとも約１．５ｍｍ、好ましくは約２ｍｍ〜約１０ｍｍに変化してもよい。当該層は、約０．７５〜１．５％、好ましくは約１％の溶液に適用される。
【００４３】
直径６０ｍｍのポリスチレン製のペトリ皿を用いる非限定的な例として、４ｍｌの０．６％アガロース／ＰＢＳが本明細書に記載のＶＩＤＥＡベースの方法に使用される。６ｍｌの同溶液はＨＩＤＥＡベースの方法に使用される。当該溶液は、例えば４℃で、一晩固化される。そのようにコーティングされる装置は、抗ＰＲＲＳＶ抗体の検出のための診断キットの全部又は一部として使用することもできる。例えば４℃で、加湿器内で、最大４ヶ月保存してもよい。
【００４４】
本明細書に記載のコート表面を有する装置は、抗ＰＲＲＳＶ抗体の検出のための診断キットの全部又は一部として使用されうる。従って、本発明はまた、ＰＲＲＳウイルスに対する抗体を検出する方法であって、ａ）血液又は血清試料を被験者から回収し；ｂ）前記試料と、本明細書に記載のようにコーティングされた装置の透水性バリアとを接触させ；ｃ）前記試料をインキュベートして、抗体のような分子が透水性バリアを通過して拡散し、そして前記装置をコーティングするのに使用したタンパク質／抗原と結合するようにし；ｄ）透水性バリアを除去し、そして任意に、前記装置を洗浄して未結合抗体を除去し；ｅ）抗体が前記タンパク質／抗原に結合することによって形成した複合体を検出すること、を含んで成る方法、を提供する。工程ｂ）の装置に関して、非限定的な１つの例として、（１）水平な支持表面を有するディッシュ；（２）ＰＲＲＳＶタンパク質／抗原の前記表面上に吸着されたコーティング；及び（３）前記コーティングに重層されている寒天層を含んで成る、ディッシュ試験プレートである装置がある。
【００４５】
項目ｅ）に関し、前記方法は、形成した複合体と結合する検出物質の適用により実施されることもある。限定しないが、一例として、サンプル中に存在しうる抗体と結合する二次抗体との併用がある。限定しないが、かかる二次抗体の例には、特定の動物、例えばマウス、ラット、ヤギ、ウサギ等に由来するものであって、試験されるサンプル中の抗体のＦｃ部分を認識するもの、がある。
【００４６】
二次抗体は、その検出を容易にするための標識とコンジュゲートされることもある。このコンジュゲーションは、抗体に別の部分を接合させることで当該抗体を修飾する。当該部分は、好ましくは検出可能な標識、例えば直接検出可能な標識、例えば放射性同位体、蛍光標識（非限定的な例として、Ｃｙ３及びＣｙ５）又は粒子標識、である。粒子標識の非限定的な例として、ラテックス粒子、金属ゾル、及びコロイド状の金属粒子がある。あるいは、前記標識は、間接的な検出のためのものでもよい。非限定的な例としては、酵素があり、例えば、限定しないが、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、及び西洋ワサビペルオキシダーゼがある。他の非限定的な例として、別の分子と結合した分子、例えば限定しないが、ビオチン、親和性ペプチド、又は精製タグがある。好ましくは、前記標識は共有結合している。
【００４７】
態様によっては、二次抗体は、抗ブタ免疫グロブリンとコンジュゲートした酵素であって、約３０〜約６０分間当該複合体中の抗体と結合させられるもの、である。結合後、未結合の二次抗体は、１又は複数の任意の洗浄によって除去されうる。酵素は、任意の適当な酵素、例えば酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で使用される酵素、例えばペルオキシダーゼであってもよい。ペルオキシダーゼは、アミノサリチル酸と過酸化水素、又はｐ−フェニレンジアミンと過酸化水素が反応した場合に、紫色を生成する。アルカリホスファターゼは、ジニトロフェニルホスフェートと反応した場合、黄色を生成する。ベータ−ガラクトシダーゼは、Ｏ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシドと反応して紫色を呈する。
【００４８】
酵素結合型の二次抗体の非限定的な例に続いて、結合型の二次抗体の検出による複合体の検出は、前記酵素により、反応時に検出可能なシグナルを生成する、限定しないが、例えば色を産生する基質を含む寒天溶液を重層することで媒介されうる。態様によっては、検出可能なシグナルは、目視で、例えば肉眼で観察可能なものである。前記シグナルは、ポジティブコントロール（既知の抗ＰＲＲＳＶ抗体であって、コート表面と結合するものを含む）及び／又はそのような抗ＰＲＲＳＶ抗体を含まないネガティブコントロールの使用により観察される呈色反応と比較してもよい。
【００４９】
本発明の態様によっては、特に本明細書に記載のＶＩＤＥＡにおいては、サンプルは収集され、そして多孔性材料、例えば、限定しないが、ろ紙又はろ紙ディスクに適用される（又はそれらによって収集される）。非限定的な例としてのろ紙ディスクの使用により、当該ディスクは透水性バリア上に水平に置かれ、分子がディスクからバリアを通過してコート表面に拡散するのが可能となる。当該表面では、本発明のＰＲＲＳＶタンパク質／抗原と結合する分子（例えば抗体）は、タンパク質／抗原と複合体を形成する。従って、サンプル由来の分子は、コート表面に固定化され始める。態様によっては、拡散及び複合体形成の機関は、室温（２５℃）又は約３７℃のいずれかで約２〜約３時間である。
【００５０】
複合体の形成後、透水性バリアが取り除かれる。寒天又はアガロースのバリアを含んで成る態様によっては、寒天又はアガロースの層は、任意の洗浄により剥がされてもよい。
【００５１】
本発明の方法は、本明細書に記載のような、サンプルの抗ＰＲＲＳＶ抗体と結合したＰＲＲＳＶタンパク質／抗原を含んで成る複合体の形成に基づく。抗ＰＲＲＳＶ抗体は、当該複合体の検出し易さを改善するために検出されうる。サンプルからのＰＲＲＳＶタンパク質／抗原と抗ＰＲＲＳＶ抗体の複合体の検出は、サンプルを得た被験者におけるＰＲＲＳＶ感染の存在を示唆する。
【００５２】
本発明は更に、垂直免疫拡散酵素アッセイ（ＶＩＤＥＡ）法であって、ａ）本明細書に記載のような１又は複数のＰＲＲＳＶタンパク質及び抗原でコーティングされた少なくとも一つの表面であって、本明細書に記載のように透水性バリアで重層されている表面を含んで成る診断装置を準備し；ｂ）前記バリアの表面と、被験者由来の抗体含有サンプルを含んで成る多孔性材料とを接触させ；ｃ）材料が前記サンプルから前記１又は複数の表面へと拡散するのに十分な期間であって、前記多孔性材料の除去の後任意に生じる期間前記装置をインキュベートし；そしてｄ）透水性バリアの除去の後前記ディッシュの表面にある抗体の存在を検出すること、を含んで成る方法を提供する。態様によって、前記多孔性材料はろ紙ディスクである。
【００５３】
本発明は更に、水平免疫拡散酵素アッセイ（ＨＩＤＥＡ）法であって、ａ）本明細書に記載のような１又は複数のＰＲＲＳＶタンパク質及び抗原でコーティングされた少なくとも一つの表面であって、本明細書に記載のように透水性バリアで重層されているが、サンプルを受け取るために、表面上に１又は複数のくぼみ(indentation)を含んで成る表面を含んで成る診断装置を準備し；ｂ）１又は複数のくぼみと、被験者由来の抗体含有サンプルとを接触させ；ｃ）材料が前記サンプルから前記１又は複数の表面へと拡散するのに十分な期間前記装置をインキュベートし；そしてｄ）透水性バリアの除去の後前記ディッシュの表面にある抗体の存在を検出すること、を含んで成る方法を提供する。態様によって、１乃至多数の小さい直径の穴が透水性バリアから打ち抜かれ、試験サンプルのウェルとして機能するくぼみが形成される。当該ウェルは、直径約１〜４ｍｍであってもよく、例えば、寒天コーティングを貫通する。７個の３ｍｍの円形のウェルを有する鋳型を、ＨＩＤＥＡのための各試験ディッシュの寒天上にパンチされた穴に対して使用することは、非限定的な例である。
【００５４】
ＶＩＤＥＡとＨＩＤＥＡの両態様において、サンプルは血清サンプルであるか全血サンプルである。当該方法は、ＰＲＲＳＶに感染していると思われる、あるいはＰＲＲＳウイルスに感染していることが疑われる種々の動物及び／又は被験者由来のサンプルに適用されうる。前記診断装置は、ディッシュ、プレート、又はプレートのウェルであってもよい。ポジティブ及びネガティブコントロールの両方は、試験サンプルのそれぞれと一緒に実行されうる。同量のコントロール血清が、試験装置上の他のウェル内に据えられる。
【００５５】
プレートのインキュベーション後、寒天ゲル層は剥がされ、そしてプレートは洗浄され、これは、例えば洗浄緩衝液、例えば、限定しないが、Ｔｗｅｅｎ  ２０／リン酸緩衝生理食塩水を用いて行われる。プレートは、洗浄緩衝液よりもむしろ、蒸留水又は水道水を用いて洗浄されうる。洗浄により、未結合（非特異的）抗体並びに他の夾雑物が除去される。
【００５６】
ＶＩＤＥＡ及びＨＩＤＥＡフォーマットの両方に、抗原−抗体反応の使用による複合体の形成が含まれ、これは検出物質、例えば二次抗体を用いて当該複合体と結合させることにより、例えば当該複合体の抗体部分と結合させることにより検出されうる。前記検出物質は、約３０分〜約２時間室温で複合体と接触状態で保持されうる。当該プレートは、例えば、非限定的な例として、緩衝洗浄溶液を用いて洗浄することで、未結合コンジュゲートが除去される。洗浄液は、シリンジ又はピペットを用いて試験プレートの縁からゆっくりと添加し、そして廃棄することもできる。これは任意に最大３回以上繰り返される。
【００５７】
検出物質をインキュベートしている間、寒天又はアガロースコーティングが調製される。非限定的な例として、寒天の１％溶液、好ましくは１％寒天／リン酸緩衝生理食塩水が融解され、そしてコンジュゲートの酵素のための基質が取り込まれる。態様によっては、触媒が必要に応じて取り込まれる。非限定的な例として、酵素がペルオキシダーゼである場合、１％寒天溶液は、約０．０５〜０．１０％の５−アミノサリチル酸を基質として、そして約０．００２〜約０．０１％の過酸化水素を触媒として含んでもよい。役０．０８％の基質及び約０．００５％の触媒の使用も使用されうる。寒天は、洗浄した表面に注ぎ入れられ、そして固化させられる。
【００５８】
二次抗体の酵素との呈色反応は、寒天支持層内で生じる。当該反応は、酵素−基質反応による可視化に役立つ。濃い紫色の円形の領域の直径は、ＨＩＤＥＡについて測定され、そしてその存在又は不在あるいは色濃度がＶＩＤＥＡの場合記録され、抗体量が決定された。
【００５９】
ＨＩＤＥＡの場合、円形の領域又は環の形態で発色する。当該環は、基質反応を約５〜約３０分以内に測定するのに十分なほど濃い。より長期間存続している場合、当該環はより濃くなるが、拡大しない。生成される環の直径は、血中に存在する特定の抗体の量（すなわち、ウイルス中和価）に関連する。濃い色をした円形の領域の直径が測定され、そしてこれを使用して標準ウイルス中和試験抗体価と関連付けられる。決定した値は、試験プレートのサンプルウェルのサイズ及び使用するサンプルのサイズに関連している。代表的な環の値及び／又は描写の表は、本発明の各装置と一緒に、又は本発明の各キットと一緒に含めてもよい。
【００６０】
ＶＩＤＥＡ及びＨＩＤＥＡフォーマットの両方の表面にある抗体の存在の検出は、当該表面上のＰＲＲＳＶタンパク質／抗原と結合した抗体を検出することを意図されている。当該検出は、本明細書に記載の任意の手段、例えば、標識二次抗体の使用によって実施されうる。他の非限定的な手段には、酵素−基質反応を介した抗原−抗体反応の可視化が含まれるが、当該反応由来の呈色反応の存在又は濃さを使用して、抗ＰＲＲＳＶ抗体の量（（定量的又は半定量的）あるいは存在（定性的）が示される。
【００６１】
ＰＲＲＳＶタンパク質／抗原並びに当該タンパク質／抗原を含んで成る組成物、方法、及び装置は、周知の手順に従い製造されるキットの調製に適している。本発明は、そのため、本明細書に記載のＰＲＲＳＶタンパク質／抗原を含んで成るキット、あるいはそれらを含んで成る組成物又は装置であって、本明細書で開示した１又は複数の方法において使用するためのもの、を提供する。かかるキットは、任意に、本発明の方法においてそれらの使用に関する識別的記載又は標識又は指示を更に含んで成る。かかるキットは容器を含んで成ることもあり、これらはそれぞれ、前記方法で利用される１又は複数の種々の試薬（典型的には濃縮形態のもの）又は装置を一緒に含まれていてもよい。
【００６２】
本発明の装置を含んで成るキットは、本発明の方法における装置に使用するために１又は複数の追加の試薬又は機器の一部を更に含んで成ることもある。封入体のための追加の材料の非限定的な例は、サンプルの希釈溶液、希釈剤のバイアル、及びサンプルの輸送のための点滴器、である。他の非限定的な例には、ＶＩＤＥＡフォーマットに使用するための多孔性材料及び二次抗体がある。
【００６３】
ここに本発明を広く説明してきたが、以下の実施例の参照を通じてより容易に理解されるであろう。当該実施例は、本発明は例示目的で示すものであり、特に断りのない限り、本発明を限定するものとして意図されていない。
【実施例】
【００６４】
実施例１：ＰＲＲＳＶタンパク質及びディッシュの調製
ＰＲＲＳＶタンパク質は、ＰＲＲＳＶ株を使用してin vitro又はin vivoで感受性細胞に接種し、そして感染細胞を、細胞結合ウイルス成分を調製するのに最適な時間で収集することで調製されうる。in vitroでの方法の場合、抗原は、細胞培養系により、あるいは組換え技術の使用により調製されうる。あるいは、ＰＲＲＳＶ感染ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）細胞は、ＰＲＲＳＶによる口鼻からの接種に従い、そして肺（肺胞）を洗浄することでブタから得ることができる。
【００６５】
細胞は、遠心によってペレット化され、そして上清は除去又は廃棄した。ペレットは任意に洗浄してもよい。細胞ペレットは、０．０５Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．０２５Ｍ  のＥＤＴＡ緩衝液であって、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むもの、において、ひとまとまりの細胞の５〜１０倍の容積で懸濁した。混合物は４℃で２〜１５時間攪拌し、そして１０，０００ｇで１時間遠心した。上清はＰＲＲＳＶ抗原として使用した。当該抗原は非感染性であるため、ウイルスの拡散の危険性なしに広範に使用することが可能である。
【００６６】
ＰＲＲＳＶタンパク質／抗原の約ｐＨ９．６の０．０６Ｍ炭酸緩衝液中での希釈は、比較試験により予め決定した。抗原は、ポリスチレン製のペトリ皿（直径６０ｍｍ）上に、４℃で７２時間吸着させることでコーティングした。吸着されなかった抗原は廃棄し、そしてディッシュはブロッキング剤（例えば、１％ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）／リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）とともに１時間３７℃でインキュベートした。ＢＳＡの除去後、ＨＩＤＥＡの場合は６ｍｌ、ＶＩＤＥＡの場合は４ｍｌの０．６％アガロース／ＰＢＳをペトリ皿に重層した。寒天は、４℃で一晩固化された。ＨＩＤＥＡの場合、鋳型を用いて、７個の３ｍｍの円形のウェルが各試験の寒天上に打ち抜かれた。ＶＩＤＥＡの場合、ウェルのないディッシュが使用された。試験ディッシュの全てを４℃の加湿器内に最大４ヶ月保存した。
【００６７】
実施例２：ＶＩＤＥＡ
試験プレートは、ペトリ皿の底にウイルス抗原をコーティングし、続いて、上述のとおり通常の方法で寒天ゲルを重層することで調製した。使用においては、ろ紙ディスクをブタ由来の試験血清に浸し、そして試験プレートの寒天上に据えた。当該ディスクの平面性は、試験血清のようなサンプルの中身が概して一方向に寒天を通過してコート表面に移動するように、ほぼ二次元の出発領域を示す。
【００６８】
ゲルは、インキュベーション期間後に剥がされ、そしてディッシュは３回５〜８ｍｌの洗浄溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で洗浄された。ＰＢＳで希釈した３ｍｌの市販のペルオキシダーゼコンジュゲート型のウサギ抗ブタＩｇＧ（１〜２μｇ／ｍｌ）を４５分間２５℃で適用した。ディッシュを再び３回洗浄溶液で洗浄した後、５ｍｌの１％寒天／基質及（５−アミノサリチル酸）及びＨ2Ｏ2をそれぞれ０．０８％及び０．００５％の濃度で含有するＰＢＳをディッシュ上に重層した。その存在又は不在あるいは色濃度は、ＶＩＤＥＡの場合記録された。
【００６９】
１つの実験において、インキュベーションは、寒天が剥がされてから約２〜３時間２５又は３７℃で実施された。ペルオキシダーゼ反応の結果は、呈色反応を示す陽性サンプルに基づき、約５〜１０分後に決定された。既知のＥＬＩＳＡ  Ｓ／Ｐ比又はＰＲＲＳウイルス感染の病歴を有する種々の血清サンプルは、未処理の動物由来のサンプルと一緒に試験した。ＶＩＤＥＡの感度及び特異性は、ＥＬＩＳＡに関して評価した。以下の表１は、種々のブタ血清についてのＶＩＤＥＡの結果及び想到のＥＬＩＳＡ  Ｓ／Ｐ比を要約する。アッセイ結果間の一致率を括弧内に示す。ＶＩＤＥＡは、ブタ血清について１００％の特異性を示し、ＥＬＩＳＡにおいて陰性であることが明らかとなった。２５℃で約３時間のインキュベーションは、ＥＬＩＳＡと比較した場合、全てのサンプルについて１００％の一致率を示した。
【００７０】
【表１】
2009501901.tif 000003
【００７１】
抗原−抗体反応は、わずかに２時間程度で生じたが、抗体価が低い場合には、短いインキュベーション期間では偽陰性として観察されることがあり、より長期間かけることが有益なようである。ＶＩＤＥＡとＥＬＩＳＡ  Ｓ／Ｐ比の高い相関関係は、抗ＰＲＲＳウイルス抗体を検出するためのアッセイとしてＶＩＤＥＡの能力を示すものである。標準的なカットオフ値である０．４未満のＥＬＩＳＡ  Ｓ／Ｐ比との相関関係は、ＶＩＤＥＡがＥＬＩＳＡと同等の感度を有しうることを示唆している。
【００７２】
実施例３：ＨＩＤＥＡ
コート表面及び透水性バリアを有する本発明の装置を使用する。ここで、当該バリアの材料は、それが１又は複数のくぼみを当該バリアの表面において規定するように修飾される。アガロースを非限定的な例として用い、１又は複数のウェルをアガロース内に作ってもよい。
【００７３】
各ウェルは、０．０１５ｍｌの試験血清で充填した。装置は約１２〜約２４時間室温（２５℃）でインキュベートすることで抗体を拡散させ、そして抗原−抗体反応を起こさせた。前記装置の更なる使用は、２４時間のインキュベーション時間実施された。
【００７４】
ゲルは、インキュベーション期間後に剥がされ、そしてディッシュは３回５〜８ｍｌの洗浄溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で洗浄された。ＰＢＳで希釈した３ｍｌの市販のペルオキシダーゼコンジュゲート型のウサギ抗ブタＩｇＧ（１〜２μｇ／ｍｌ）を４５分間２５℃で適用した。ディッシュを再び３回洗浄溶液で洗浄した後、５ｍｌの１％寒天／基質及（５−アミノサリチル酸）及びＨ2Ｏ2をそれぞれ０．０８％及び０．００５％の濃度で含有するＰＢＳをディッシュ上に重層した。濃い紫色の円形の領域の直径は、ＨＩＤＥＡの場合、反応の５〜３０分後に測定された（ｍｍ）。表２及び３は、異なる条件下で試験した１４の血清の異なる直径を示す。７ｍｍ未満の直径は、ＨＩＤＥＡにおいて陰性であるとみなされる。ＥＬＩＳＡ陰性血清の幾つかは陽性な結果を示し、これはＨＩＤＥＡについてより良い感度を示唆している。表３の結果は、ＨＩＤＥＡの高い再現性を示唆している。
【００７５】
表２．室温（２５℃）での種々のインキュベーション時間を用いた場合の、異なるＥＬＩＳＡ  Ｓ／Ｐ比を有するブタ血清
【表２】
2009501901.tif 000004
＊  ＨＩＤＥＡの直径（ｍｍ）；７ｍｍ超は陽性
＊＊  ０．４超のＥＬＩＳＡ  Ｓ／Ｐ比は陽性である。
【００７６】
表３．室温（２５℃）での種々のインキュベーション時間を用いた場合の、異なるＥＬＩＳＡ  Ｓ／Ｐ比を有する７つのブタ血清についてのＨＩＤＥＡ直径の再現性
【表３】
2009501901.tif 000005
ａ＆ｂ．各血清サンプルは、再現性のために２回ＨＩＤＥＡによって試験される。
＊  ＨＩＤＥＡの直径（ｍｍ）；７ｍｍ超は陽性
＊＊  ０．４超のＥＬＩＳＡ  Ｓ／Ｐ比は陽性である。
【００７７】
本明細書で引用する全ての引用文献は、既に具体的に援用されているか否かに関係なく、それらの全てが本明細書に援用される。本明細書で使用する場合、単数形で表されている用語は、それぞれ単数形及び複数形を含むことが意図される。
【００７８】
本発明はここに十分に説明されたが、当業者にとって、本発明が、パラメーター、濃度、及び条件について広範な均等の範囲内で、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、且つ過度の実験無しに実施することができることは自明であろう。本発明はその具体的な態様に関連して説明されているが、更に修飾することができることも理解されよう。本願は、通常、本発明の原理に従い、且つ本発明が属する分野の技術において既知の又は慣習的な方法となっているような、そしてこれまでに説明された本質的な特徴に適用されうるような、本発明の開示から逸脱するようなものを含むあらゆる本発明の変更、使用、又は適応を網羅することが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、２つの免疫拡散酵素アッセイ（ＩＤＥＡ）の略図である。垂直（ＶＩＤＥＡ）及び水平（ＨＩＤＥＡ）の態様は、位置１，２，及び３がそれぞれ陽性、陰性、及び陽性な結果をどう示すかという説明と一緒に示す。
【図１】
2009501901.tif 000006
【国際調査報告】
2009501901.tif 000007
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