(57)【要約】  （ｉ）ＴＮＦαをコードする第１核酸配列、（ｉｉ）ジフテリア毒素をコードする第２核酸配列、及び（ｉｉｉ）癌特異的プロモーターを含む少なくとも１個の追加の核酸配列を含み、前記ＴＮＦαをコードする配列及びジフテリア毒素をコードする配列が前記癌特異的プロモーターの発現制御の下にある核酸構築物。構築物システム並びにその方法及び使用も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＴＮＦαをコードする第１の核酸配列、
（ｉｉ）ジフテリア毒素をコードする第２の核酸配列、及び
（ｉｉｉ）癌特異的プロモーターを含む少なくとも１個の追加の核酸配列
を含み、前記ＴＮＦαをコードする配列及びジフテリア毒素をコードする配列が前記癌特異的プロモーターの発現制御の下にある核酸構築物。
【請求項２】
前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列が、リンカー核酸配列を介して転写的に連結されている請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
前記リンカー核酸配列が、ＩＲＥＳを含む又はプロテアーゼ切断認識部位をコードしている請求項２に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記ＴＮＦαが分泌型ＴＮＦαである請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記ＴＮＦαが非分泌型ＴＮＦαである請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記癌特異的プロモーターが、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２  Ｐ３及びＩＧＦ−２  Ｐ４からなる群から選択される請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記少なくとも１個の追加の核酸配列が、それぞれ独立して癌特異的プロモーターを含む２個の核酸配列を含み、一方で前記ＴＮＦαをコードする配列が１個の癌特異的プロモーターの前記発現制御の下にあり、前記ジフテリア毒素をコードする配列がもう１個の癌特異的プロモーターの発現制御の下にある請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項８】
前記２個の癌特異的プロモーターが同一である請求項７に記載の核酸構築物。
【請求項９】
（ａ）（ｉ）ＴＮＦαをコードする第１の核酸配列、
（ｉｉ）第１の癌特異的プロモーター配列を含む第２の核酸配列
を含み、前記ＴＮＦαをコードする配列が前記第１の癌特異的プロモーター配列の発現制御の下にある第１の核酸構築物、
（ｂ）（ｉ）ジフテリア毒素をコードする第３の核酸配列、
（ｉｉ）第２の癌特異的プロモーター配列を含む第４の核酸配列
を含み、前記ジフテリア毒素をコードする配列が前記第２の癌特異的プロモーター配列の発現制御の下にある第２の核酸構築物
を含む核酸構築物システム。
【請求項１０】
前記第１及び第２の癌特異的プロモーター配列がそれぞれ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２  Ｐ３及びＩＧＦ−２  Ｐ４からなる群から選択される請求項９に記載の核酸構築物システム。
【請求項１１】
前記第１及び第２の癌特異的プロモーター配列が同一である請求項９に記載の核酸構築物システム。
【請求項１２】
前記第１及び第２の癌特異的プロモーター配列が異なる請求項９に記載の核酸構築物システム。
【請求項１３】
その必要のある対象の癌を治療する方法であって、対象の癌細胞に請求項１から７までに記載の核酸構築物のうちのいずれかの治療有効量を投与し、それにより対象の癌を治療することを含む方法。
【請求項１４】
対象の癌を治療する方法であって、その必要のある対象の癌細胞に請求項９から１２までに記載の核酸構築物システムのうちのいずれかの治療有効量を投与し、それにより対象の癌を治療することを含む方法。
【請求項１５】
前記癌細胞がＴＮＦ−α又はジフテリア毒素に抵抗性である請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象を化学療法又は放射線療法で治療することをさらに含む請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１７】
活性成分として請求項１から７までに記載の核酸構築物のいずれか、及び薬剤的に許容可能な担体又は希釈剤を含む薬剤組成物。
【請求項１８】
活性成分として請求項９から１２までに記載の核酸構築物システムのいずれか、及び薬剤的に許容可能な担体又は希釈剤を含む薬剤組成物。
【請求項１９】
トランスフェクション剤をさらに含む請求項１７又は１８に記載の薬剤組成物。
【請求項２０】
癌治療のために同定された薬物を製造するための請求項１から７までに記載の核酸構築物のいずれかの使用。
【請求項２１】
癌治療のために同定された薬物を製造するための請求項９から１２までに記載の核酸構築物システムのいずれかの使用。
【請求項２２】
前記薬物が抗癌剤をさらに含む請求項２０又は２１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸構築物、薬剤組成物、及び癌治療のためのそのような構築物の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
新生組織形成は癌で起きる過程であり、それにより細胞増殖及び分化を調節する正常な制御機構が損なわれ、進行性の増殖が起きる。制御機構のこのような損傷により、腫瘍は身体の重要な部分で拡大し場所を占領してしまう。前記腫瘍が周辺組織に侵入し遠隔部位に運ばれる（転移）と、おそらく個人は死亡する。
【０００３】
癌治療の望ましい目標は、正常細胞へ有害な効果を及ぼさずに優先的に癌細胞を死滅させることである。この目標を達成しようとして、手術、放射線療法、及び化学療法を含む数種の方法がこれまで使われてきた。
【０００４】
手術は利用できる最初の癌治療であったが、いまだに癌の診断、病期診断、及び治療において主な役割を果たしており、初期癌の主要な治療法だろう。しかし、手術は特定の部位に限定された腫瘍を治療するには効果的な方法ではあるが、これらの腫瘍は、腫瘍領域の外側に微小転移性疾患があるので切除しても治癒できないことがある。転移の段階を示しているいかなる癌も、手術のみでは効果的に治療することはできない。
【０００５】
放射線療法は、限局した癌の制御のために使われるもう１つの局所的な（非全身性の）治療法である。多くの正常細胞は、細胞内修復能力が新生細胞よりも高く、放射線損傷に対する感受性が低くなっている。放射線療法は、新生細胞と正常細胞の間の、放射線による損傷に対する感受性のこの違い、及び、正常な器官が、部分的に損傷を受けているだけの場合には十分に機能し続けられる能力に頼っている。したがって、放射線療法の成功は、腫瘍を取り囲む組織の放射線療法に対する感受性に依拠している。放射線療法には、一部投与部位に依拠し並びに疲労、局所的皮膚反応、悪心、及び嘔吐を含む副作用が付随する。さらに、放射線療法は、変異原性、発癌性、及び催奇性であり、患者を二次性腫瘍を発症する危険にさらすことがある。
【０００６】
局所的温熱療法、光放射療法、及び組織内照射を含む他の種類の局所的療法が探求されてきた。残念ながら、これらの取り組みはまずまずの成功しか収めていない。
【０００７】
放射線療法及び手術などの局所的治療は、外科的手法又は高線量の放射線療法により到達できる身体の部分で腫瘍量を減少させる方法を提供する。しかし、もっと副作用の少ないもっと効果のある局所的療法が必要である。さらに、これらの治療法は、最終的に大半の癌患者に存在する広い播種性又は循環性腫瘍細胞の破壊には適用可能ではない。腫瘍細胞の転移と戦うためには、全身療法が使われる。
【０００８】
１つのそのような全身治療が化学療法である。化学療法は播種性悪性癌の主な治療法である。しかし、化学療法薬は、多くの一般的固形腫瘍を含む多くの癌型を治療するには、その有効性が限られている。この不首尾は、一部には、多くの腫瘍細胞の内在性の又は後天的な薬物抵抗性によるものである。化学療法薬の使用のもう１つの欠点は、その厳しい副作用である。これらの副作用には、骨髄抑制、悪心、嘔吐、脱毛、及び口内潰瘍がある。明らかに、化学療法薬が悪性腫瘍細胞を死滅させることができる効率を高め、同時に全身的な中毒作用を回避するための新しいアプローチが必要である。
【０００９】
遺伝子導入が癌のあらゆる細胞に到達する見込みはないので、ＤＮＡベースの治療アプローチは「バイスタンダー」効果の誘導を必要とすると考えられている。この目的のための興味深い新規のアプローチは、サイトカインＤＮＡベースの治療である。特に、ＴＮＦ−αの使用は、たとえば、経尿道切除後の膀胱腫瘍再発を防ぐための魅力のある戦略だと思われる。
【００１０】
ＴＮＦ−αは、直接腫瘍細胞細胞毒性を示し、血管新生阻害性を有し、樹状細胞及びＴ細胞などの免疫細胞を活性化することにより抗腫瘍免疫を増強する多機能性及び免疫調節性サイトカインである。ＴＮＦ−αの誘導は、ＴＣＣ再発の防止においてＢＣＧ免疫療法の効果に一部関与していると考えられており（１、２）、組換えサイトカイン療法は、原則として、膀胱癌に対して有効だと判明している（３）。しかし、ＴＮＦ−αタンパク質の全身送達は、用量規制毒性効果が過酷であるので、臨床的に限られた成功しか得られていない。
【００１１】
場合によって、毒素の腫瘍特異的発現と共に、腫瘍組織においてＴＮＦ−αを発現させる腫瘍特異的プロモーターと組み合わせた遺伝子送達アプローチの使用により、この限界は克服することができる。
【００１２】
Ｈ１９は、最初に同定されたヒト刷り込み非タンパク質コード遺伝子であり、母性対立遺伝子のみの発現を示す（Ｒａｃｈｍｉｌｅｗｉｔｚら、１９９２年；Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｔｙｃｋｏ、１９９２年）。Ｈ１９はマウスでも刷り込まれている（Ｂａｒｔｏｌｏｍｅｉら、１９９１年）。Ｈ１９は、マウス染色体７の領域と相同な、染色体１１の短腕、バンド１５．５上に位置付けられた（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｃｈら、１９９１年）。Ｈ１９は、タンパク質産物をコードしていない可能性が非常に高い遺伝子のグループに属している（Ｂｒａｎｎａｎら、１９９０年）。
【００１３】
種々の腫瘍の研究から、健常組織と比べた場合の、Ｈ１９遺伝子の再発現又は過剰発現は実証されている。さらに、異なる原因及び系統の癌では、対立遺伝子パターンの異常発現がいくつかのケースで観察された。Ｈ１９は、成熟のある段階での及び絨毛外栄養膜における生殖細胞を例外として、発生を通じて大半の組織で単一対立遺伝子発現を示すが、「刷り込みの緩和」又はＬＯＩと呼ばれるこの遺伝子の両対立遺伝子発現が、ますます多くの癌、たとえば、肝細胞癌、アルブミンＳＶ４０Ｔ抗原トランスジェニックラットの肝新生物、肺腺癌、食道癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、子宮頚部癌、膀胱癌、頭頚部扁平上皮癌、結腸直腸癌、子宮癌において、及び精巣胚細胞性腫瘍において発見されている。今日、ほぼ３０種類の癌が、ＬＯＩを伴うものも伴わないものも、健常組織と比べてＨ１９遺伝子の調節不全発現を示している。最近の総説として、（Ｍａｔｏｕｋら、２００５年）を参照されたい。
【００１４】
異所性起点のＨ１９過剰発現が、乳房上皮細胞に増殖性の利点を与えることも、軟寒天アッセイ及び数匹の重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおいて明らかにされた（Ｌｏｔｔｉｎら、２００２年）。絨毛癌由来細胞系（ＪＥＧ−３）、及び膀胱癌細胞系（Ｔ２４Ｐ）の細胞の注入により形成される腫瘍において、Ｈ１９レベルは、注入前の細胞でのＨ１９のレベルと比べると非常に高い（Ｒａｃｈｍｉｌｅｗｉｔｚら、１９９５年；Ｅｌｋｉｎら、１９９５年；Ｌｕｓｔｉｇ−Ｙａｒｉｖら、１９９７年）。
【００１５】
さらに、ある種の既知の発癌物質はＨ１９遺伝子の発現を上方調節する。Ｈ１９ＲＮＡレベルの劇的上昇が、喫煙者の気道上皮で、刷り込み（ＬＯＩ）の喪失なしで検出された（Ｋａｐｌａｎら、２００３年）。ＢＢＮ（Ｎ−ブチル−Ｎ−（４−ヒドロキシブチル）ニトロソアミン、膀胱の既知発癌物質）も、膀胱癌のラットモデルでＨ１９遺伝子の発現を誘発する（Ｅｌｋｉｎら、１９９８年；Ａｒｉｅｌら、２００４年）。同様に、ジエチルニトロソアミン（肝臓の既知発癌物質）は、肝細胞癌のマウスモデルでＨ１９の発現を誘発する（Ｇｒａｖｅｅｌら、２００１年）。
【００１６】
癌細胞におけるＨ１９遺伝子の特異的発現は、癌診断のための臨床応用におけるその使用を促してきた。
【００１７】
したがって、米国特許第５，９５５，２７３号は、本発明者に、Ｈ１９遺伝子の腫瘍特異的マーカーとしての使用を教示している。
【００１８】
ＰＣＴ国際公開第９５２４５０３号は、小児ウィルムス腫瘍における悪性腫瘍の存在／非存在を検出するのに有用な、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるＨ１９遺伝子プローブを使った悪性腫瘍の検出及びその類別を教示している。
【００１９】
ＰＣＴ国際公開第０４０２４９５７号は、標本中のＨ１９ＲＮＡの存在を検出することによる癌、又は残存癌細胞若しくは微小転移の存在の検出を教示している。
【００２０】
癌細胞において細胞傷害性薬物を特異的に発現するためのＨ１９プロモーターの使用は、転写調節配列（たとえば、Ｈ１９プロモーター）の制御の下での腫瘍細胞における異種配列、特に細胞傷害性産物をコードする遺伝子の特異的発現を教示するＰＣＴ国際公開第９９１８１９５号において提案されている。
【００２１】
今まで、癌特異的プロモーターの下でＴＮＦαとジフテリア毒素Ａを使った癌特異的遺伝子療法は、一度も提案されたことも試みられたこともなかった。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明の一態様によれば、
（ｉ）ＴＮＦαをコードする第１の核酸配列、
（ｉｉ）ジフテリア毒素をコードする第２の核酸配列、及び
（ｉｉｉ）癌特異的プロモーターを含む少なくとも１個の追加の核酸配列
を含み、前記ＴＮＦαをコードする配列及びジフテリア毒素をコードする配列が前記癌特異的プロモーターの発現制御の下にある核酸構築物が提供される。
【００２３】
下に記載する本発明の好ましい実施形態の追加の特徴によれば、前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列は、リンカー核酸配列を介して転写的に連結されている。
【００２４】
記載の好ましい実施形態のさらに追加の特徴によれば、前記リンカー核酸配列は、ＩＲＥＳを含む又はプロテアーゼ切断認識部位をコードしている。
【００２５】
記載の好ましい実施形態のさらに追加の特徴によれば、前記ＴＮＦαは分泌型ＴＮＦαである。
【００２６】
記載の好ましい実施形態のさらに追加の特徴によれば、前記ＴＮＦαは非分泌型ＴＮＦαである。
【００２７】
記載の好ましい実施形態のさらに追加の特徴によれば、前記癌特異的プロモーターは、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２  Ｐ３及びＩＧＦ−２  Ｐ４からなる群から選択される。
【００２８】
記載の好ましい実施形態のさらに追加の特徴によれば、前記少なくとも１個の追加の核酸配列は、それぞれ独立して癌特異的プロモーターを含む２個の核酸配列を含み、一方で前記ＴＮＦαをコードする配列が１個の癌特異的プロモーターの発現制御の下にあり、前記ジフテリア毒素をコードする配列がもう１個の癌特異的プロモーターの発現制御の下にある。
【００２９】
記載の好ましい実施形態のさらに追加の特徴によれば、前記２個の癌特異的プロモーターは同一である。
【００３０】
本発明の別の態様によれば、
（ａ）（ｉ）ＴＮＦαをコードする第１の核酸配列、
（ｉｉ）第１の癌特異的プロモーター配列を含む第２の核酸配列
を含み、前記ＴＮＦαをコードする配列が前記第１の癌特異的プロモーター配列の発現制御の下にある第１の核酸構築物、
（ｂ）（ｉ）ジフテリア毒素をコードする第３の核酸配列、
（ｉｉ）第２の癌特異的プロモーター配列を含む第４の核酸配列
を含み、前記ジフテリア毒素をコードする配列が前記第２の癌特異的プロモーター配列の発現制御の下にある第２の核酸構築物
を含む核酸構築物システムが提供される。
【００３１】
記載の好ましい実施形態のさらに追加の特徴によれば、前記第１及び第２の癌特異的プロモーター配列はそれぞれ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２  Ｐ３及びＩＧＦ−２  Ｐ４からなる群から選択される。
【００３２】
記載の好ましい実施形態のさらに追加の特徴によれば、前記第１及び第２の癌特異的プロモーター配列は同一である。
【００３３】
記載の好ましい実施形態のさらに追加の特徴によれば、前記第１及び第２の癌特異的プロモーター配列は異なる。
【００３４】
本発明のさらに別の態様によれば、その必要のある対象の癌を治療する方法であって、前記対象の癌細胞に核酸構築物のうちのいずれかの治療有効量を投与し、それにより対象の癌を治療することを含む方法が提供される。
【００３５】
本発明のさらに別の態様によれば、対象の癌を治療する方法であって、その必要のある対象の癌細胞に前記核酸構築物システムのうちのいずれかの治療有効量を投与し、それにより対象の癌を治療することを含む方法が提供される。
【００３６】
記載の好ましい実施形態のさらに追加の特徴によれば、前記癌細胞はＴＮＦ−α又はジフテリア毒素に抵抗性である。
【００３７】
記載の好ましい実施形態のさらに追加の特徴によれば、前記方法は、対象を化学療法又は放射線療法で治療することをさらに含む。
【００３８】
本発明の追加の態様によれば、活性成分として前記核酸構築物のいずれか、及び薬剤的に許容可能な担体又は希釈剤を含む薬剤組成物が提供される。
【００３９】
本発明のさらに追加の態様によれば、活性成分として前記核酸構築物システムのいずれか、及び薬剤的に許容可能な担体又は希釈剤を含む薬剤組成物が提供される。
【００４０】
記載の好ましい実施形態のさらに追加の特徴によれば、前記薬剤組成物は、トランスフェクション剤をさらに含む。
【００４１】
本発明のさらに追加の態様によれば、癌治療のために同定された薬物を製造するための前記核酸構築物のいずれかの使用が提供される。
【００４２】
本発明の追加の態様によれば、癌治療のために同定された薬物を製造するための前記核酸構築物システムのいずれかの使用が提供される。
【００４３】
記載の好ましい実施形態のさらに追加の特徴によれば、前記薬物は、抗癌剤をさらに含む。
【００４４】
本発明は、癌の治療に使用することができる核酸構築物を提供することにより、現在知られている配置の欠点に取り組み成功を収めている。
【００４５】
本明細書において使用の専門用語及び科学用語はすべて、他の形で定義されているのでなければ、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似する又は相当する方法及び材料を本発明の実施又は試験で使用することはできるが、適切な方法及び材料は以下に記載されている。対立する場合には、定義を含む本特許明細書が規制することになる。さらに、材料、方法、及び実施例は、説明に役立つのみであり、限定を意図するものではない。
【００４６】
本発明は、添付の図を参照して例として本明細書に記載されている。ここで図の詳細を具体的に参照して示される詳細は、例としてであり、本発明の好ましい実施形態の説明に役立つ考察のみを目的としており、本発明の原理及び概念的見地についてのもっとも有用で容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示されていることを強く主張する。この点に関して、本発明の構造的詳細を、本発明の基本的理解のために必要である以上に詳細に示す試みは行っておらず、図を使って行う説明が、本発明のいくつかの形が実際に具体化される方法を当業者に明らかにする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明は、癌の治療に使用することができる核酸構築物である。
【００４８】
本発明の原理及び作用は、図面及び付随する説明の参照により、さらによく理解されるであろう。
【００４９】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用を以下の説明で述べる又は実施例により例証する詳細に限定されないことを理解すべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり、又は種々の形で実施若しくは実行することができる。本明細書で用いる言葉遣い及び用語法は、説明のためであって、限定するものと見なすべきではないことも理解すべきである。
【００５０】
癌治療の主な障壁は選択性、すなわち、腫瘍細胞の増殖を阻害し、正常細胞の機能は影響を受けないままにしておく能力の問題である。したがって、癌の治療及び予防のためのより効果的な治療法が必要とされる。
【００５１】
癌治療における遺伝子治療の使用は、化学療法及び放射線療法などの他の治療的アプローチと同じ不利益を数多く与える。現在の最先端遺伝子治療戦略に関する問題には、治療遺伝子を標的細胞に特異的に送達することができないことがある。このために、設定標的ではない細胞に毒性がもたらされる。たとえば、ｐ５３遺伝子を操作すると、腫瘍細胞も正常細胞も増殖が抑制され、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の静脈内注射は、発熱及び高血圧などの臨床症状を伴った全身毒性を誘発する。
【００５２】
これらの問題を克服する試みが行われてきた。これには、遺伝子を所望の組織に導く組織特異的受容体の使用、熱又は電離放射線誘発性エンハンサー及びプロモーターの使用、並びに、遺伝子発現を特定の組織に制限して治療遺伝子の発現を時間的に及び空間的に制御された形で増強する組織特異的プロモーターの使用がある。この後者のアプローチの十分に裏付けられた例では、組換え構築物に前立腺特異抗原（ＰＳＡ）プロモーターを使用して、治療遺伝子の発現を前立腺組織に導いている（たとえば、米国特許第５，６４８，４７８号を参照されたい）。
【００５３】
ＰＣＴ国際公開第９９１８１９５号は、癌特異的プロモーター（たとえば、Ｈ１９プロモーター）の制御の下での腫瘍細胞における異種配列、特に細胞傷害性産物をコードする遺伝子の特異的発現を教示している。
【００５４】
本発明を実行に移す一方で、本発明者は、癌特異的Ｈ１９プロモーター配列の発現制御の下でのＴＮＦα及びジフテリア毒素Ａの標的された発現を利用して、同一物を発現している腫瘍の容積を相乗的に減少させることができることを明らかにした。これらの所見は、種々の腫瘍、特にこれらの毒素のそれぞれ単独に対して抵抗性のある腫瘍の治療におけるＴＮＦα及びジフテリア毒素Ａの標的された発現の利用を実証している。
【００５５】
図２ａ〜ｃ及び３で示し、並びにそれに続く実施例セクションの実施例１に記載するように、Ｈ１９−ＴＮＦα又はＨ１９−ＤＴＡ発現ベクターのいずれか一方の細胞へのトランスフェクションにより、ルシフェラーゼアッセイを使って決定される細胞増殖活性が阻害された。さらに、図４、５ａ〜ｉ、６ａ〜ｂでさらに示し、実施例１及び２に記載するように、Ｈ１９−ＴＮＦαとＨ１９−ＤＴＡ発現ベクターの同時投与、又はＨ１９プロモーターの転写制御の下でのＴＮＦαとＤＴＡの両方をコードする発現ベクター（ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ）の投与により、癌細胞増殖の阻害が増強された。最終的に、卵巣癌腫瘍の確立したモデルでのＴＮＦとＤＴＡ（ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ）の同時発現により、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖が著しく阻害された（図７ａ〜ｂ、それに続く実施例セクションでの実施例３）。
【００５６】
本治療法は、これら２種類の細胞傷害性薬物の腫瘍特異的発現は著しい安全性の利点を与える点で、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、４）に記載されているＴＮＦαとジフテリア毒素（ＤＴＸ）というタンパク質産物の同時投与より優れている。実際に、Ｍｏｒｉｍｏｔｏと共同研究者の教示は、ｉｎ  ｖｉｖｏで実施されたことは一度もなく、むしろ細胞特異的標的法の必要性を否定する組織培養設定で実施されていた。
【００５７】
したがって、本発明の一態様によれば、
（ｉ）ＴＮＦαをコードする第１の核酸配列、
（ｉｉ）ジフテリア毒素をコードする第２の核酸配列、及び
（ｉｉｉ）癌特異的プロモーターを含む少なくとも１個の追加の核酸配列
を含み、前記ＴＮＦα及びジフテリア毒素配列が前記癌特異的プロモーターの発現制御の下にある核酸構築物が提供される。
【００５８】
本明細書で使用されるように、「ＴＮＦα」又は（ＴＮＦα）とは、細胞死を促進する、又はＤＴＸと連携して働いて細胞死（当技術分野で公知の方法、たとえば、ＦＡＣＳ、ＭＴＴ及びチミジン取込みを使って測定可能である）を促進することもあるＴＮＦα（たとえば、哺乳動物のＴＮＦα）の少なくとも活性部分のことである。本発明に従って使用することができるＴＮＦα核酸配列の例には、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿０００５９４．２；ＮＴ＿００７５９２．１４；ＮＴ＿０８６６８８．１；ＡＢ０８８１１２．１；ＡＦ０４３３４２．１；ＡＦ０９８７５１．１；ＡＦ１２９７５６．１；ＡＪ２２７９１１．１；ＡＪ２４９７５５．１；ＡＪ２７０９４４．１；及びＡＬ６６２８０１．７があるが、これに限定されるものではない。配列番号４も参照されたい。
【００５９】
本発明のＴＮＦ−α配列は、非分泌型でも［細胞内又は膜結合の、たとえば、Ｃｏｒａｚｚａ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００４年、９月、１２７（３）、８１６頁〜２５頁を参照されたい］、分泌型でもよい。分泌型ＴＮＦ−αは、リーダー配列を含む［たとえば、配列番号４に記載する配列など。シグナル配列はコード配列（７６個のアミノ酸をコードする）の５’末端に位置している］。
【００６０】
Ｈ１９プロモーターの発現制御の下にある分泌型ＴＮＦα及び毒素を含む構築物を使って細胞にトランスフェクトする場合、前記毒素は細胞内で活性である可能性があるが、前記分泌型ＴＮＦαは細胞膜の近傍に残り、局所的に非常に効果的な濃度でＴＮＦ−α受容体に結合することが認められるであろう。理論に縛られることなく、非分泌型ＴＮＦαは、おそらく（たとえば、小胞体において）細胞内受容体に結合することにより細胞内シグナル伝達を活性化することが示唆される。
【００６１】
本明細書で使用するように、用語「ジフテリア毒素」（ＤＴ又はＤＴＸ）とは、細胞死を促進する、又はＴＮＦαと連携して働いて細胞死を促進することもあるジフテリア毒素の少なくとも活性部分のことである。ＤＴは２個のポリペプチドフラグメント、Ａ及びＢを含む［Ｚｄａｎｏｖｓｋａｉａ，Ｍ．Ｖ．；Ｚｄａｎｏｖｓｋｙ，Ａ．Ｇ．；Ｙａｎｋｏｖｓｋｙ，Ｎ．Ｋ．、「ジフテリア毒素ＮＡＤ親和性及びＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性は、アラニン又はフェニルアラニンに代わるトリプトファン１５３置換で低下する（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ  ＮＡＤ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ＡＤＰ  ｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｒｅ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ａｔ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  １５３  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｌａｎｉｎｅ  ｏｒ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）」、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０００年、第１５１巻、５５７頁〜５６２頁；Ｂｅｎｎｅｔ，Ｍ．Ｊ．；Ｃｈｏｅ，Ｓ．；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．、「二量体ジフテリア毒素の２．０オングストローム解析度での精密構造（Ｒｅｆｉｎｅｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ  ａｔ  ２．０  ａｎｇｓｔｒｏｍ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）」、Ｐｔｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４年、第３巻、１４４４頁〜１４６３頁］。フラグメントＡ（ＤＴＡ）は触媒ドメイン（Ｃ）からなり、フラグメントＢは受容体ドメイン（Ｒ）及び膜貫通ドメイン（Ｔ）で構成されている。前記Ｒドメインは、細胞表面のＨＢ−ＥＧＦ受容体に結合する受容体部分を含有する［Ｒａａｂ，Ｇｅｒｈａｒｄ；Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍｉｃｈａｅｌ「ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ＥＧＦ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）」Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）／Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９７年、１３３３、Ｆ１７９〜Ｆ１９９］。次に、前記結合した毒素はエンドサイトーシスにより細胞質に入る。次に、Ｔドメインとして知られる一連のＣ末端疎水性αシートは膜に埋め込まれ、Ｎ末端Ｃドメインは切断されて細胞質に移動する。Ｃドメインは、切断されると、活性酵素になり、タンパク質合成トランスロケーションペプチドＥＦ−２及びＮＡＤ＋からＡＤＰ−リボース−ＥＦ−２の構築を触媒する［「ニコチンアミドヌクレオチド講義（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｅｃｔｕｒｅｓ）」Ｏｎｌｉｎｅ．Ｉｎｔｅｒｎｅｔ．２００４年、１２月１２日、Ａｖａｉｌａｂｌｅ：ｈｔｔｐ：／／ｃｈｅｍ．ｃｈ．ｈｕｊｉ．ａｃ．ｉｌ／〜ｅｕｇｅｎｉｋ／ｎａｄ．ｐｄｆ］。単一のＣドメインは数時間内にＥＦ−２の細胞全体の供給量を使い、タンパク質合成を停止させ、細胞死をもたらすことができる。本発明は、前記毒素の組換え好ましくは細胞内発現を予想しているので、最小のＣドメインを使用してよい。本発明のこの態様の現在知られている好ましい実施形態によれば、前記毒素はジフテリアＡ鎖毒素である［ＤＴＡ、たとえば、配列番号１（核酸配列を表す）及び配列番号２（アミノ酸配列を表す）］。
【００６２】
本明細書で使用するように、「癌特異的プロモーター」とは、成熟した（すなわち、胎児の又は出生後の）対象の癌細胞のみで活性なすべてのプロモーター配列のことである。プロモーター配列の選択は、当然のことながら、選択されたプロモーターが活性であることを要求する標的癌細胞集団に依存するであろう（下を参照されたい）。典型的には、癌特異的プロモーターは、癌で発現されるゲノム的に刷り込まれた遺伝子の調節領域由来である。癌細胞で発現されるゲノム的に刷り込まれた遺伝子由来の調節領域には、Ｈ１９プロモーター及びエンハンサー、並びにＩＧＦ−２  Ｐ３及びＰ４プロモーターがあるが、これらに限定されるものではない。
【００６３】
本明細書には、ＴＮＦα及びＤＴＸ（すなわち、異種遺伝子）の腫瘍細胞特異的発現を導くのに利用することができるＨ１９調節配列が記載されている。これらＨ１９調節配列には、上流Ｈ１９プロモーター領域及び／又は下流Ｈ１９エンハンサー領域が含まれる。１つのＨ１９プロモーター領域のヌクレオチド配列は、配列番号１９に示されている。この８３１ヌクレオチド配列は、キャップ部位から−８３７から−７ヌクレオチドまで伸びている（Ｂｒａｎｎａｎら、１９９０年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌ．第１０巻、２８頁〜３６頁に記載されている）。コンセンサスＴＡＴＡ配列は、ヌクレオチド−２７から−３５までに存在している。２つのコンセンサスＡＰ２結合部位（８／９対応）は転写開始部位からほぼ−５００及び−４０ヌクレオチド上流に存在している。異種遺伝子のコード領域の上流に置かれると、ほぼ８３１塩基対の調節領域は、内在性Ｈ１９も発現する癌細胞における作動可能的に連結された異種遺伝子の発現を導くのに十分である。さらに、ヌクレオチド−８１９から＋１４間の別のＨ１９プロモーター領域（配列番号１９）も、癌細胞における作動可能的に連結された異種遺伝子の発現を導くのに十分である。
【００６４】
ヒトＨ１９遺伝子の下流エンハンサー領域は、増強されたレベルの腫瘍細胞特異的発現を与えるために、場合によってＨ１９プロモーター／異種遺伝子構築物に加えることができる（配列番号２０〜２２）。エンハンサー配列から予想されるように、下流エンハンサーは、Ｈ１９プロモーターの制御の下にある異種遺伝子のコード領域から下流に（内在性Ｈ１９遺伝子のＨ１９エンハンサーの方向に対して）逆方向又は順方向のいずれかに置かれるとその効果を発揮することができる。さらに、図６、７Ａ、７Ｂ及び８Ａ〜８Ｃに示される配列（配列番号２０〜２２）を含有するこのエンハンサーのフラグメントも遺伝子発現を促進するのに使用してよい。
【００６５】
ＩＧＦ−１遺伝子の発現は、肺癌及び乳癌に付随してきた。ＩＧＦ−１プロモーター配列の例には、ヒトＩＧＦ−１遺伝子配列のヌクレオチド１から１６３０間の核酸配列がある（ジェンバンク受託番号Ｍ１２６５９Ｍ７７４９６；Ｒｏｔｗｅｉｎら、１９８６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６１巻、４８２８頁〜４８３２頁）。
【００６６】
ＩＧＦ−２遺伝子産物は３個の異なるプロモーター領域のうちの１つ（Ｐ３及びＰ４）を使って発現される。Ｐ３プロモーターは肝細胞癌に関係付けられてきた。刷り込みＰ４プロモーター（ＩＧＦ−２遺伝子のヌクレオチド配列  −５４６から＋１０２（ジェンバンク受託番号ＮＣ＿００００１１））及びＰ３プロモーター（ＩＧＦ−２遺伝子のヌクレオチド配列  −１２２９から＋１４０）はヒト膀胱癌細胞で活性化されており、作動可能的に連結された異種遺伝子の発現を腫瘍細胞に導くのに使用される可能性があることも発見されている。ＩＧＦ−２  Ｐ３及びＰ４プロモーターは、Ｈ１９エンハンサー又はその活性フラグメントと組み合わせて使用してもよい。
【００６７】
癌細胞で発現されるゲノム的に刷り込まれた及び刷り込まれていない遺伝子由来のこれらの調節配列は、所望の腫瘍特異的発現を得るために必要な最小調節配列を定義するためにさらに明確に描写することができる。たとえば、前記プロモーター領域は、付加、置換、又は欠失により改変し、腫瘍特異的発現機能の保持をアッセイしてもよい。Ｈ１９下流エンハンサーの種々の部分は、Ｈ１９プロモーターからの転写を増強する能力を個々に試験してもよい。
【００６８】
調節配列の変化を、当業者に公知の種々の化学的及び酵素的方法を使って生じさせることができる。たとえば、制限部位により限定される配列の領域を欠失させることができる。オリゴヌクレオチド依存性変異誘発を用いて限定された形で配列を改変する且つ／又は配列内の特定の領域に制限部位を導入することができる。さらに、欠失変異体を、Ｂａｌ３１などのＤＮＡヌクレアーゼ又はＥｘｏＩＩＩ及びＳ１ヌクレアーゼを使って作製することができる。調節配列の徐々に大きくなる欠失は、前記ＤＮＡをヌクレアーゼと共に時間を延ばしながらインキュベートすることにより作製される（変異誘発技術の概説は実施例セクションの後の参考文献を参照されたい）。
【００６９】
改変された配列は、適切な宿主細胞における異種コード配列の腫瘍特異的発現を導くその能力を評価される。腫瘍特異的発現を導く能力を保持するいかなる改変された調節配列も、さらに使用するために本発明の核酸構築物に組み込まれることは本発明の範囲内である。
【００７０】
本明細書で使用するように、用語「発現制御の下にある」とは、ＴＮＦα遺伝子又はジフテリア毒素のコード配列の、その発現パターン（空間的及び時間的発現パターンを含む）を調節するためにそこに作動可能的に連結されている癌特異的プロモーター配列からの転写のことである。
【００７１】
本明細書で使用するように、用語「作動可能的に連結された」とは、ＴＮＦα遺伝子又はジフテリア毒素コード配列が、前記異種遺伝子の発現を調節配列に導かせるような形で調節配列（すなわち、プロモーター）に連結されるように、ＴＮＦα遺伝子又はジフテリア毒素コード配列の位置を決めることである。
【００７２】
本明細書で使用するように、用語「核酸配列」とは、ＲＮＡ配列、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列及び／又は複合性ポリヌクレオチド配列（たとえば、上記の配列の組合せ）の形で単離され提供される核酸配列のことである。
【００７３】
本明細書で使用するように、用語「相補的ポリヌクレオチド配列」とは、逆転写酵素又はその他のあらゆるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使ってメッセンジャーＲＮＡの逆転写から得られる配列のことである。そのような配列は、続いてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使ってｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで増幅させることができる。
【００７４】
本明細書で使用するように、用語「ゲノムポリヌクレオチド配列」とは、染色体に由来する（から単離される）配列のことであり、したがって、前記配列は染色体の近接部分を表す。
【００７５】
本明細書で使用するように、用語「複合性ポリヌクレオチド配列」とは、少なくとも部分的に相補的な、及び少なくとも部分的にゲノム的な配列のことである。複合性配列は、本発明のポリペプチドをコードするのに必要ないくつかのエキソン配列はもちろん、それらの間に挿入されるいくつかのイントロン配列も含むことができる。前記イントロン配列は、他の遺伝子を含むいかなる供給源のものでもよく、典型的には保存されたスプライシングシグナル配列を含むであろう。そのようなイントロン配列は、シス作用性発現調節エレメントをさらに含んでいてもよい。
【００７６】
上記のすべての核酸配列（及び、さらに後述するようなさらに多くの核酸配列）は、少なくとも１個の核酸構築物に連結される。
【００７７】
本発明の核酸構築物は、好ましくは哺乳動物細胞発現に適している。
【００７８】
ＴＮＦα及びＤＴＸの転写は、単一の癌特異的プロモーター配列に支配されていてよい。この場合、ＴＮＦα及びＤＴＸコード配列は、リンカー核酸配列を介して転写的に連結されていてよい。
【００７９】
そのようなリンカー核酸配列は、ＴＮＦα及びＤＴＸが、切断されると２個の別個のポリペプチドを産生する単一のポリペプチドとして翻訳されるように、プロテアーゼ切断認識部位をコードしていてよい。しかし、この場合、細胞内プロテアーゼにより認識される部位を使うように措置が講じられる。
【００８０】
選択的転写リンクは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列の使用により実現してよい。バイシストロニックベクターの使用は、以下に続く実施例セクションの実施例１に記載されている。バイシストロニックベクターは、たとえば、Ｍｉｌｌｅｇｅｎ社、Ｑ−ＢｉｏＧｅｎｅ社（たとえば、ｐＡｄｅｎｏ  Ｖａｔｏｒ（商標）−ＣＭＶ５−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ及びｐＡｄｅｎｏ  Ｖａｔｏｒ（商標）−ＣＭＶ５−ＩＲＥＳ−ＢＦＰ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社（たとえば、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ及びｐＩＲＥＳ２ｈｙｇ）から容易に入手可能である。
【００８１】
２個のプロモーターベクターは選択的に構築してもよい［たとえば、Ｋｙｕｎｇ−Ｊｉｎ  Ｋｉｍ（２００４年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ第１３巻、１６９８頁〜１７０３頁を参照されたい］。この場合、プロモーター配列は、同一でも異なっていてもよい。異なるプロモーター配列を使用する場合（たとえば、単一遺伝子の又は異なる遺伝子の異なる調節配列）、同期化した発現をほぼ類似するレベルで与える配列を使用するように措置が講じられる。転写アッセイ（たとえば、ルシフェラーゼリポーターアッセイ）を使って、そのような配列を選択してもよい（さらに下の遺伝子発現アッセイを参照されたい）。
【００８２】
本発明は、その好ましい配置が、
（ａ）（ｉ）ＴＮＦαをコードする第１の核酸配列、
（ｉｉ）第１の癌特異的プロモーター配列を含む第２の核酸配列
を含み、前記ＴＮＦαをコードする配列が前記第１の癌特異的プロモーター配列の発現制御の下にある第１の核酸構築物、
（ｂ）（ｉ）ジフテリア毒素をコードする第３の核酸配列、
（ｉｉ）第２の癌特異的プロモーター配列を含む第４の核酸配列
を含み、前記ジフテリア毒素をコードする配列が前記第２の癌特異的プロモーター配列の発現制御の下にある第２の核酸構築物
を含む核酸構築物システムも企図している。
【００８３】
１対１の割合が現在好ましいが、第１の核酸構築物と第２の核酸構築物間の割合は１対１とは異なっていることもあり、経験的に決めてよい。
【００８４】
本発明の核酸構築物（本明細書では「発現ベクター」とも呼ばれる）又は構築物システムは、このベクターを原核生物、真核生物、又は好ましくは両方における複製及び組込みに適したものにする追加の配列を含んでいてよい（たとえば、シャトルベクター）。さらに、典型的なクローニングベクターは、転写及び翻訳開始配列、転写及び翻訳ターミネーター、並びにポリアデニル化シグナルも含有していてよい。
【００８５】
エンハンサーエレメントは、連結した相同の又は異種のプロモーターから、最大１０００倍転写を刺激することができる。エンハンサーは転写開始部位の下流又は上流に置かれると活性である。ウイルス由来の多くのエンハンサーエレメントは広い宿主範囲を有し、種々の組織で活性である。たとえば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは多くの細胞型に適している。本発明に適している他のエンハンサー／プロモーターの組合せには、ポリオーマウイルス又はヒト若しくはマウスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のエンハンサー／プロモーターの組合せ、並びに、マウス白血病ウイルス、マウス若しくはラウス肉腫ウイルス、及びＨＩＶなどの種々のレトロウイルス由来の末端反復配列（ＬＴＲ）が含まれる。Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．及びＳｈｅｎｋ，Ｔ．、編者（１９８３年）、“Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、を参照されたい。この文献は参照により本明細書に組み込まれているものとする。本発明のこの態様に従って使うことのできるＨ１９エンハンサー配列には、米国特許第６，３０６，８３３号に記載の配列（配列番号２０〜２２）があるが、これに限定されるものではない。
【００８６】
発現ベクターの構築において、プロモーターは好ましくは、（ＴＮＦαの、又はジフテリア毒素の）異種転写開始部位から、自然環境での転写開始部位からとほぼ同じ距離に位置している。しかし、当技術分野で公知のように、この距離のある程度の変動は、プロモーター機能を失うことなく調整することができる。
【００８７】
ポリアデニル化配列も、ＴＮＦα／毒素ｍＲＮＡ翻訳の効率を高めるために発現ベクターに加えることができる。２個の別個の配列エレメント、すなわち、ポリアデニル化部位から下流に位置するＧＵ−又はＵ−が豊富な配列、及び前記部位の１１〜３０ヌクレオチド上流に位置している高度に保存された６ヌクレオチド、すなわちＡＡＵＡＡＡの配列が、正確で効率的なポリアデニル化には必要である。本発明に適した終結及びポリアデニル化シグナルには、ＳＶ４０由来のものがある。
【００８８】
すでに記載した実施形態に加えて、本発明の発現ベクターは典型的に、クローン化した核酸の発現レベルを増やす又は組換えＤＮＡを坦持する細胞の同定を容易にすることを目的とする他の特殊化したエレメントを含有してよい。たとえば、いくつかの動物ウイルスは、許容的な細胞型でウイルスゲノムの染色体外複製を促進するＤＮＡ配列を含有している。これらのウイルスレプリコンを有するプラスミドは、適切な因子がプラスミド上に坦持される遺伝子、又は宿主細胞のゲノムと一体の遺伝子のいずれか一方により供給される限り、エピソーム的に複製される。
【００８９】
本発明の発現ベクターは、真核生物レプリコンを含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。真核生物レプリコンが存在する場合、前記ベクターは適切な選択可能なマーカーを使って真核細胞で増幅することができる。前記ベクターが真核生物レプリコンを含まない場合は、エピソーム的増幅は可能ではない。代わりに、組換えＤＮＡが工学的に改変された細胞のゲノムに組み込まれ、そこでプロモーターは所望の核酸の発現を指示する。
【００９０】
哺乳動物発現ベクターの例には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能なｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、及びｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａ社から入手可能なｐＣＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社から入手可能なｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、及びｐＢＫ−ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から入手可能なｐＴＲＥＳ、並びにその誘導体があるが、これらの発現ベクターに限定されるものではない。これらは、本発明の構築物のベクター骨格として働いてよい。
【００９１】
レトロウイルスなどの真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含有する発現ベクターも使用することができる。ＳＶ４０ベクターには、たとえば、ｐＳＶＴ７及びｐＭＴ２がある。ウシパピローマウイルス由来のベクターには、ｐＢＶ−１ＭＴＨＡがあり、エプスタインバーウイルス由来のベクターには、ｐＨＥＢＯ及びｐ２Ｏ５がある。他の例となるベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、及び、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は真核細胞における発現に効果的であると示されている他のプロモーターの指示の下でタンパク質の発現をさせる他のあらゆるベクターがある。これらは、本発明の構築物のベクター骨格として働いてよい。
【００９２】
上記のように、ウイルスは、多くの場合、宿主防御機構を回避するように進化してきた非常に特殊化した感染病原体である。典型的には、ウイルスは特定の細胞型に感染し増殖する。ウイルスベクターの標的特異性は、その自然の特異性を利用して、あらかじめ定まった細胞型を特異的に標的にし、それにより組換え遺伝子を感染した細胞に導入する。したがって、本発明が利用するベクターの種類は、形質転換される細胞型に依存することになる。形質転換される細胞型に従って適切なベクターを選択する能力は、通常の技術力をもつ当業者の能力の十分範囲内にあり、したがって、選択上考慮すべき点の概要は本明細書では与えていない。たとえば、骨髄細胞は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）を使って標的にすることができ、Ｌｉａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ら（２００４年）．「バキュロウイルスベクターを使った哺乳動物腎臓細胞への高効率遺伝子移入（Ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ）」．Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  第１４９巻、５１頁〜６０頁、が記載するように、腎臓細胞は、バキュロウイルスオートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）マルチプル核多核体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）に存在する異種プロモーターを使って標的にしてもよい。
【００９３】
組換えウイルスベクターは、ラテラル感染及び標的特異性などの利点を与えるために、本発明の遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ発現に有用である。ラテラル感染は、たとえば、レトロウイルスの生活環に内在的であり、１個の感染細胞が、出芽し隣接する細胞に感染する多くの子孫ビリオンを産生する過程である。そのために、その大部分に最初のウイルス粒子がはじめには感染しなかった広域の細胞に急速に感染する。これは、感染病原体が娘子孫を通じてのみ伝播する垂直型感染とは対照的である。ラテラルに伝播することができないウイルスベクターも作製することができる。この特徴は、所望の目的が、特定の遺伝子を限局的な数の標的細胞のみに導入することである場合には有用になりうる。
【００９４】
本発明の発現ベクターを細胞に導入するには種々の方法が利用できる。そのような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（１９８９年、１９９２年）、Ａｕｓｕｂｅｌら、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９年）、Ｃｈａｎｇら、“Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ”、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．（１９９５年）、Ｖｅｇａら、“Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  Ｍｉｃｈ．（１９９５年）、“Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ”、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．（１９８８年）、及びＧｉｌｂｏａら、［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４（６）：５０４頁〜５１２頁、１９８６年］に一般に記載されており、たとえば、安定的又は一過的なトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、及び組換えウイルスベクターによる感染がある。さらに、ポジティブ−ネガティブ選択法は米国特許第５，４６４，７６４号及び米国特許第５，４８７，９９２号を参照されたい。
【００９５】
現在好ましいｉｎ  ｖｉｖｏ核酸移入技術（すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子治療）には、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及び脂質ベースのシステムなど、ウイルス又は非ウイルス構築物でのトランスフェクションがある。プラスミドＤＮＡは、たとえば、カチオン性ポリマー、カチオン性リポソーム（たとえば、リポフェクチン、Ｄ．Ｄ．Ａ．Ｂ．などのコレステロール誘導体、及びカチオン性リン脂質）の助けを借りて、又は、誘導体化して（たとえば、抗体コンジュゲートして）ポリリシンコンジュゲート、グラミシジンＳ、人工的ウイルスエンベロープ若しくは他のそのような細胞内担体の助けを借りて、及び裸の遺伝子構築物の直接注入、エレクトロポレーション、又はｉｎ  ｖｉｖｏで実施されるＣａＰＯ４共沈、他にもポリエチレンジアミンベースの非ウイルス遺伝子送達システム（現在好ましい）の助けを借りて送達することができる。癌遺伝子治療のための核酸移入及び発現システムに関する最新の概説には、Ｌｕｎｇｗｉｔｚ（２００５年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．６０（２）：２４７頁〜６６頁；Ａｉｇｎｅｒ（２００６年）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５４：１２頁〜２５頁；ＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒとＷｏｎｇ（２００６年）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１９９５〜２００６；及びＷｏｌｆｆ（２００５年）Ａｃｔａ  Ｍｙｏｌ．２４：２０２頁〜８頁がある。
【００９６】
言及したように、（上に記載した）本発明の核酸構築物を使って、細胞死の誘発が治療的に有利な、癌などの過剰増殖性疾患を治療することができる。
【００９７】
したがって、本発明の別の態様によれば、対象の癌の治療法が提供される。前記方法は、その必要がある対象の癌細胞に治療有効量の上記核酸構築物及び／又は核酸構築物システムを投与し、それにより対象の癌を治療することにより達成される。
【００９８】
用語「その必要がある対象」とは、哺乳動物被検体、好ましくは癌と診断されたあらゆる年齢のヒト対象のことである。
【００９９】
用語「治療する」とは、病態（たとえば、癌疾患）の進行を阻害する又は停止する且つ／又は病態の縮小、寛解、若しくは退行を引き起こすことである。当業者は、種々の方法論及びアッセイ法を使って病態の進行を評価することができること、同様に、種々の方法論及びアッセイ法を使って病態の縮小、寛解、又は退行を評価してもよいことを理解するであろう。好ましくは、用語「治療する」とは、癌疾患に付随する症状を軽減する又は減少させることである。好ましくは、治療は、癌に付随する症状を治療する、たとえば、実質的に除去する。
【０１００】
好ましくは本発明の核酸構築物で治療する癌には、小児固形腫瘍、ウィルムス腫瘍、肝芽腫、胚性横紋筋肉腫、胚細胞腫瘍及び絨毛性腫瘍、精巣胚細胞性腫瘍、卵巣の未熟型奇形腫、仙尾骨部腫瘍、絨毛癌、胎盤部トロホブラスト腫瘍、上皮成人腫瘍、膀胱癌、肝細胞癌、卵巣癌、子宮頚癌、肺癌、乳癌、頭頚部扁平上皮癌、食道癌、神経原性腫瘍、星状細胞腫、神経節芽細胞腫、神経芽細胞腫があるが、これらの癌に限定されるものではない。好ましくは、腫瘍は膀胱癌である。
【０１０１】
治療すべき癌の種類が、使用する癌特異的プロモーターの種類を指示することになる。基本的に、選択された癌特異的プロモーターは、癌細胞において活性である（好ましくは、高発現を媒介する）べきである。
【０１０２】
遺伝子発現アッセイを実行して、癌細胞における癌特異的プロモーターの活性化を決定してよい。これらには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、及びｉｎ  ｓｉｔｕアッセイ法が含まれていてよい（米国特許第６，３０６，８３３号を参照されたい）。Ｉｎ  ｓｉｔｕは、すなわち、核酸精製の必要がないように、バイオプシー又は切除術から得られる患者組織の組織切片（固定された及び／又は冷凍した）に直接にという意味である。上記の試薬などの核酸試薬は、そのようなｉｎ  ｓｉｔｕ法のためのプローブ及び／又はプライマーとして使用してよい（たとえば、Ｎｕｏｖｏ，Ｇ．Ｊ．、１９９２年、“ＰＣＲ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨークを参照されたい）。
【０１０３】
細胞型又は腫瘍が、異種遺伝子に作動可能的に連結された特定の調節領域を含有する発現構築物を特異的に活性化することができるかどうかを判断する代替方法は、そのような発現構築物を実際に前記細胞にトランスフェクトすることである。これらの目的のために、マーカー遺伝子は調節配列の下流に位置している。前記マーカー遺伝子産物のアッセイで結果が陽性であれば、前記細胞又は細胞系が前記調節領域からの発現を活性化することができることが明らかになる。
【０１０４】
これらの技術を使って、例となるＨ１９発現が活性化された腫瘍型は、下の表１に収載している。
【表１】
2009508516.tif 000002
【０１０５】
したがって、以上の癌は本発明の方法によって治療可能である。実際、Ｈ１９発現を活性化するいかなる腫瘍も本発明の方法によって治療してよい。
【０１０６】
さらに、上述の技術を用いて、ＩＧＦ−１、並びにＩＧＦ−２  Ｐ３及びＰ４プロモーターを活性化する腫瘍を決定してよい。そのような腫瘍も、本発明の方法によって治療可能である。たとえば、ＩＧＦ−２は、ウィルムス腫瘍、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫及び肝芽腫などの小児腫瘍で活性化されている。
【０１０７】
ＤＴＸ又はＴＮＦα治療に抵抗性である癌は、ＤＴＸとＴＮＦ両方での併用療法の相乗効果が、そのような種類の抵抗性腫瘍においても細胞死滅を媒介すると期待されるので、なおさら好ましくは、本発明に従って治療してよいことが認識されるであろう。
【０１０８】
用語「治療的に有効な量」とは、病態（たとえば、癌）の症状を予防し、軽減し、若しくは寛解させる、又は治療中の対象の生存を延長するのに効果がある本発明の核酸構築物及び／又は核酸構築物システムの量のことである。
【０１０９】
言及するように、本発明の核酸構築物及び／又は核酸構築物システムの治療的に有効な量が、上文に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子治療法のいずれかを使ってその必要がある対象の癌細胞に投与される。
【０１１０】
ＴＮＦαの半減期は短い（２０〜３０分）が、本発明の構築物の細胞傷害活性が確実に癌性細胞のみに作用する（正常な健常細胞には作用しない）よう措置が講じられる。
【０１１１】
本発明の核酸構築物は、それ自体を、又は核酸構築物が薬剤的に許容可能な担体と混合されている薬剤組成物の一部として対象に提供することができる。
【０１１２】
本明細書で使用するように、「薬剤組成物」とは、本明細書に記載する１個又は複数個の活性成分と、生理学的に適切な担体及び賦形剤などの他の化学成分との調製物のことである。薬剤組成物の目的は、化合物の生物への投与を促進することである。
【０１１３】
好ましくは、前記薬剤組成物は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ−Ｃｈｏｌなどのトランスフェクション剤も含むことができる［Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎら、「癌研究（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」，１４（１）：５４頁〜６５頁（１９９６年）］。トランスフェクション剤の好ましい例は、ポリ（エチルアミン）（ＰＥＩ）である。
【０１１４】
本明細書において、用語「活性成分」とは、その生物学的効果を説明可能である核酸構築物（複数可）調製物のことである。
【０１１５】
以下、互換的に使用してもよい用語「生理学的に許容可能な担体」及び「薬剤的に許容可能な担体」とは、生物に著しい刺激を与えることがなく、投与された化合物の生物活性及び特性を抑制しない担体又は希釈剤のことである。アジュバンドはこれらの用語の下に含まれる。薬剤的に許容可能な担体に含まれる成分の１つは、たとえば、有機媒体でも水媒体でも広い範囲の溶解性を有する生体適合性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でよい（Ｍｕｔｔｅｒら、（１９７９年）。
【０１１６】
本明細書では、用語「賦形剤」とは、活性成分の投与をさらに促進するために薬剤組成物に添加される不活性物質のことである。賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類及びデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、並びにポリエチレングリコールがあり、制限がない。
【０１１７】
薬物の製剤及び投与の技術は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ、最新版に見える。この文献は参照により本明細書に組み込まれているものとする。
【０１１８】
適切な投与経路には、たとえば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に、筋肉注射、皮下注射及び髄内注射の他に髄腔注射、直接脳室注射、静脈注射、腹腔注射、鼻腔注射、動脈注射、（膀胱への）小胞注射、若しくは眼内注射を含む経鼻送達、腸送達、又は、非経口送達がある。
【０１１９】
代わりに、調製物を全身的ではなく局所的な形で、たとえば、前記調製物を患者の身体の特定領域への直接注入を介して、又は、膀胱、子宮等などの体腔への直接投与により、投与してもよい。
【０１２０】
本発明の薬剤組成物は、当技術分野で公知の製法により、たとえば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠製造、粉状化、乳化、カプセル化、エントラッピング、又は凍結乾燥工程により製造してよい。
【０１２１】
本発明に従って使用するための薬剤組成物は、前記活性成分の、薬剤的に使用することができる調製物への加工を促進する賦形剤及び補助剤を含む１個又は複数個の薬剤的に許容可能な担体を使って、従来の方法で製剤してもよい。適切な製剤は選択される投与経路に依存する。
【０１２２】
注射のためには、本発明の活性成分は水溶液に、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩緩衝液などの生理的に適合性の緩衝液に処方してもよい。経粘膜投与のためには、透過するバリヤーに適した浸透剤が処方で使用される。そのような浸透剤は当技術分野で公知である。
【０１２３】
鼻孔吸入による投与のためには、本発明に従って使用するための活性成分は、適切な噴霧剤、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン又は二酸化炭素を使った加圧パック又はネブライザーからエアゾールスプレー方式の形で都合よく送達される。加圧エアゾールの場合には、投与単位は、定量を送達するバルブを提供することにより決定してよい。ディスペンサーで使用するための、前記化合物の混合粉末及びラクトース又はデンプンなどの適切な粉末ベースを含有する、たとえばゼラチン製のカプセル及びカートリッジを製剤してよい。
【０１２４】
本明細書に記載の調製物は、たとえば、ボーラス注入又は持続注入による、非経口投与用に製剤してよい。注射用の製剤は、単位用量の形で、たとえば、場合によって、保存剤を添加したアンプル又は多数回使用容器で提示してもよい。前記組成物は、油性又は水性溶媒中の懸濁液、溶液、又は乳濁液でもよく、懸濁剤、安定剤、及び／又は分散剤などの製剤化剤を含有してもよい。
【０１２５】
非経口投与用の薬剤組成物は、前記活性調製物の水溶液を水溶性の形で含んでいる。さらに、前記活性成分の懸濁液は、適切な油性又は水性注射懸濁液として調製してもよい。適切な親油性溶剤又は溶媒には、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル、トリグリセリド、又はリポソームなどの合成脂肪酸エステルがある。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランなどの物質を含有してよい。場合によって、前記懸濁液は、前記活性成分の溶解性を高めて高濃度の溶液の調製を可能にする適切な安定剤又は作用物質を含有していてもよい。
【０１２６】
代わりに、前記活性成分は、適切な賦形剤、たとえば、無菌で発熱物質のない水性溶液との構成のために、使用前は粉末の形でもよい。
【０１２７】
本発明の調製物は、たとえば、ココアバター又は他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を使って、坐剤又は保持浣腸剤などの直腸組成物に製剤してもよい。
【０１２８】
本発明に照らして使用するのに適した薬剤組成物には、前記活性成分が本来の目的を達成するのに効果的な量で含有される組成物がある。さらに具体的には、治療有効量とは、疾病の症状を予防する、軽減する、若しくは寛解させる、又は治療中の対象の生存を延長するのに効果的な活性成分の量を意味する。
【０１２９】
治療有効量の決定は十分当業者の能力の範囲内である。
【０１３０】
本発明の方法において使用されるいかなる調製物でも、治療有効量又は投与量は、はじめはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイから評価することができる。たとえば、投与量は動物モデルで処方することができ、そのような情報を使ってヒトにおいて有用な投与量をさらに正確に決定することができる。
【０１３１】
本明細書に記載の活性成分の毒性及び治療効果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、細胞培養物又は実験動物での標準的な薬学的方法により決定することができる。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータは、ヒトにおいて使用するための投与量の範囲を処方するのに使うことができる。前記投与量は、用いる剤形及び利用する投与経路によって変わってよい。正確な製剤、投与経路、及び投与量は、患者の容態を考慮して個々の医者が選択することができる。［たとえば、Ｆｉｎｇｌら、（１９７５年）“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”、Ｃｈ．１  ｐ．１を参照されたい］。
【０１３２】
治療する状態の重症度及び応答性によって、投薬は、数日から数週間続く治療中、又は治療が達成されるまで、又は病状の減少が実現されるまで、１回の投与でも複数回の投与でもよい。
【０１３３】
投与される組成物の量は、当然のことながら、治療中の対象、苦痛の重症度、投与の方法、処方医師の判断等に依存することになる。
【０１３４】
適合性の医薬担体に製剤された本発明の調製物を含む組成物は、指示された状態の治療のために調製し、適切な容器に入れ、及びラベルを付けてもよい。
【０１３５】
治療効果を改良するために、本発明の核酸構築物での治療は、他の抗癌療法と、後者がそのような癌の治療に効果がないと証明されたとしても、併用してもよい。
【０１３６】
したがって、本発明の核酸構築物を使って、単独で又は癌に対する他の確立した若しくは実験的治療レジメンと併用して癌を治療することができる。そのような併用療法の相乗活性は、そのような治療の効果的臨床用量を著しく減少させ、それにより前記治療の壊滅的なことが多いマイナスの副作用及び高コストを減少させる潜在能力を有することが認識されるであろう。
【０１３７】
本発明と併用するのに適した癌治療のための治療法には、化学療法、放射線療法、光線療法及び光線力学療法、手術、栄養療法、切除療法、併用される放射線療法と化学療法、ブラチオセラピー、陽子線療法、免疫療法、細胞療法、及び陽子線ラジオサージカル療法があるが、これらの療法に限定されるものではない。
【０１３８】
抗癌剤
本発明の構築物と同時投与することができる抗癌剤には、アシビシン（Ａｃｉｖｉｃｉｎ）；アクラルビシン；塩酸アコダゾール（Ａｃｏｄａｚｏｌｅ）；アクロニン；アドリアマイシン；アドゼレシン（Ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ）；アルデスロイキン（Ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）；アルトレアミン（Ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）；アンボマイシン（Ａｍｂｏｍｙｃｉｎ）；酢酸アメタントロン（Ａｍｅｔａｎｔｒｏｎｅ）；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール（Ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン（Ａｓｐｅｒｌｉｎ）；アザシチジン；アゼテパ（Ａｚｅｔｅｐａ）；アゾトマイシン（Ａｚｏｔｏｍｙｃｉｎ）；バチマスタト（Ｂａｔｉｍａｓｔａｔ）；ベンゾデパ（Ｂｅｎｚｏｄｅｐａ）；ビカルタミド（Ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）；塩酸ビスアントレン（Ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；ビスナフィドジメシラート（Ｂｉｓｎａｆｉｄｅ  Ｄｉｍｅｓｙｌａｔｅ）；ビゼレシン（Ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）；硫酸ブレオマイシン；ブレキナル（Ｂｒｅｑｕｉｎａｒ）ナトリウム；ブロピリミン（Ｂｒｏｐｉｒｉｍｉｎｅ）；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド（Ｃａｒａｃｅｍｉｄｅ）；カルベチマー（Ｃａｒｂｅｔｉｍｅｒ）；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼレシン（Ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）；セデフィンゴール（Ｃｅｄｅｆｉｎｇｏｌ）；クロラムブシル；シロレマイシン（Ｃｉｒｏｌｅｍｙｃｉｎ）；シスプラチン；クラドリビン（Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）；クリスナトール（Ｃｒｉｓｎａｔｏｌ）メシラート；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン（Ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ）；デキソルマプラチン（Ｄｅｘｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）；デザグアニン（Ｄｅｚａｇｕａｎｉｎｅ）；デザグアニンメシラート；ジアジクオン（Ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；デセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン（Ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン（Ｄｕａｚｏｍｙｃｉｎ）；エダトレキセート（Ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）；塩酸エフロルニチン；エルサミトルシン（Ｅｌｓａｍｉｔｒｕｃｉｎ）；エンロプラチン（Ｅｎｌｏｐｌａｔｉｎ）；エンプロメート（Ｅｎｐｒｏｍａｔｅ）；エピプロピジン（Ｅｐｉｐｒｏｐｉｄｉｎｅ）；塩酸エピルビシン；エルブロゾール（Ｅｒｂｕｌｏｚｏｌｅ）；塩酸エソルビシン（Ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸ナトリウム；エタニダゾール（Ｅｔａｎｉｄａｚｏｌｅ）；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン（Ｅｔｏｐｒｉｎｅ）；塩酸ファドロゾール（Ｆａｄｒｏｚｏｌｅ）；ファザラビン（Ｆａｚａｒａｂｉｎｅ）；フェンレチニド（Ｆｅｎｒｅｔｉｎｉｄｅ）；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）；フルオロウラシル；フルロシタビン（Ｆｌｕｒｏｃｉｔａｂｉｎｅ）；ホスキドン（Ｆｏｓｑｕｉｄｏｎｅ）；ホストリエシン（Ｆｏｓｔｒｉｅｃｉｎ）ナトリウム；ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）；塩酸���ムシタビン；ヒドロキシ尿素；塩酸イダルビシン（Ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）；イホスファミド；イルモフォジン（Ｉｌｍｏｆｏｓｉｎｅ）；インターフェロンα−２ａ；インターフェロンα−２ｂ；インターフェロンα−ｎ１；インターフェロンα−ｎ３；インターフェロンβ−１ａ；インターフェロンγ−１ｂ；イプロプラチン（Ｉｐｒｏｐｌａｔｉｎ）；塩酸イリノテカン（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）；酢酸ランレオチド（Ｌａｎｒｅｏｔｉｄｅ）；レトロゾール（Ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）；酢酸ロイプロリド；塩酸リアロゾール（Ｌｉａｒｏｚｏｌｅ）；ロメトレキソル（Ｌｏｍｅｔｒｅｘｏｌ）ナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン（Ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；マソプロコル（Ｍａｓｏｐｒｏｃｏｌ）；メイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル（Ｍｅｎｏｇａｒｉｌ）；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ（Ｍｅｔｕｒｅｄｅｐａ）；ミチンドミド（Ｍｉｔｉｎｄｏｍｉｄｅ）；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトジリン（Ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎ）；ミトマルシン（Ｍｉｔｏｍａｌｃｉｎ）；マイトマイシン；ミトスペル（Ｍｉｔｏｓｐｅｒ）；ミトタン（Ｍｉｔｏｔａｎｅ）；塩酸ミトザントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール（Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）；ノガラマイシン（Ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）；オルマプラチン（Ｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）；オキシスラン（Ｏｘｉｓｕｒａｎ）；パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）；ペガスパルガーゼ（Ｐｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ）；ペリオマイシン（Ｐｅｌｉｏｍｙｃｉｎ）；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）；プロメスタン（Ｐｌｏｍｅｓｔａｎｅ）；ポルフィマー（Ｐｏｒｆｉｍｅｒ）ナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；プロマイシン；塩酸プロマイシン；ピラゾフリン（Ｐｙｒａｚｏｆｕｒｉｎ）；リボプリン；ログレチミド（Ｒｏｇｌｅｔｉｍｉｄｅ）；サフィンゴル（Ｓａｆｉｎｇｏｌ）；塩酸サフィンゴル；セムスチン；シムトラゼン（Ｓｉｍｔｒａｚｅｎｅ）；スパルホサートナトリウム；スパルソマイシン（Ｓｐａｒｓｏｍｙｃｉｎ）；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン（Ｓｔｒｅｐｔｎｉｇｒｉｎ）；ストレプトゾシン；スロフェヌル（Ｓｕｌｏｆｅｎｕｒ）；タリソマイシン（Ｔａｌｉｓｏｍｙｃｉｎ）；タキソール；テコガラン（Ｔｅｃｏｇａｌａｎ）ナトリウム；テガフル；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン（Ｔｅｍｏｐｏｒｆｉｎ）；テニポシド（Ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン（Ｔｉｒａｐａｚａｍｉｎｅ）；塩酸トポテカン（Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）；クエン酸トレミフェン（Ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）；酢酸トレストロン（Ｔｒｅｓｔｏｌｏｎｅ）；リン酸トリシリビン（Ｔｒｉｃｉｒｉｂｉｎｅ）；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリ���（Ｔｒｉｐｔｏｒｅｌｉｎ）；塩酸ツブロゾール（Ｔｕｂｕｌｏｚｏｌｅ）；ウラシルマスタード；ウレデパ（Ｕｒｅｄｅｐａ）；バプレオチド（Ｖａｐｒｅｏｔｉｄｅ）；ベルテポルフィン（Ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン（Ｖｉｎｅｐｉｄｉｎｅ）；硫酸ビングリシネート（Ｖｉｎｇｌｙｃｉｎａｔｅ）；硫酸ビンレウロシン（Ｖｉｎｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）；酒石酸ビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）；硫酸ビンロシジン（Ｖｉｎｒｏｓｉｄｉｎｅ）；硫酸ビンゾリジン（Ｖｉｎｚｏｌｉｄｉｎｅ）；ボロゾール（Ｖｏｒｏｚｏｌｅ）；ゼニプラチン（Ｚｅｎｉｐｌａｔｉｎ）；ジノスタチン；塩酸ゾルビシンがあるが、これらの抗癌剤に限定されるものではない。追加の抗悪性腫瘍薬には、Ｃｈａｐｔｅｒ５２、“Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ”（Ｃａｌａｂｒｅｓｉ，Ｐ．及びＣｈａｂｎｅｒ，Ｂ．Ａ．）、並びに、それに加えて、Ｇｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第８版，１９９０年，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）の序論ｐｐ．１２０２頁〜１２６３頁に開示された抗悪性腫瘍薬がある。
【０１３９】
本発明の組成物は、必要に応じて、前記活性成分を含有する１つ又は複数の単位剤形を含有してよいＦＤＡ認可キットなどのパック又はディスペンサーデバイスで提示してよい。前記パックは、たとえば、ブリスター包装などの金属製又はプラスチック製のホイルを含んでいてよい。前記パック又はディスペンサーデバイスには、投薬指示書が添付されていてよい。前記パック又はディスペンサーには、医薬品の製造、使用、又は販売を規制する政府機関により処方された形で容器に添付されている注意も取り付けられていてよく、その注意は、政府機関が前記組成物の形態又はヒトへの若しくは獣医学的な投与を認可したことを反映したものである。たとえば、そのような注意は、米国食品医薬品局によって処方薬として認可された標識化についてでもよいし、承認された製品挿入物についてでもよい。
【０１４０】
本発明の追加の目標、利点、及び新規の特徴は、限定的であることを意図しない以下の例を検討すれば当技術分野の通常の技術を持つ当業者に明らかになるであろう。さらに、上文に描写する及び特許請求の範囲において請求する本発明の種々の実施形態及び態様はそれぞれ、以下の例において実験的に支持される。
【実施例】
【０１４１】
ここで、上の説明と共に本発明を非限定的な形で例証する以下の例について言及する。
【０１４２】
一般に、本明細書で使用の命名法及び本発明で使用する実験方法には、分子技術、生化学技術、微生物学技術、及び組換えＤＮＡ技術がある。そのような技術は、文献において完全に説明されている。たとえば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９年）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９年）；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８年）；Ｗａｔｓｏｎら、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら（ｅｄｓ）“Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１〜４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８年）、米国特許第４，６６６，８２８号；米国特許第４，６８３，２０２号；米国特許第４，８０１，５３１号；米国特許第５，１９２，６５９号；米国特許第５，２７２，０５７号に記載の方法、“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，ＶｏｌｕｍｅｓＩ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４年）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”ＶｏｌｕｍｅｓＩ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｄ（１９９４年）；Ｓｔｉｔｅｓら、（ｅｄｓ），“Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４年）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０年）；利用できる免疫アッセイ法は特許及び科学文献に広範に記載されている。たとえば、米国特許第３，７９１，９３２号；米国特許第３，８３９，１５３号；米国特許第３，８５０，７５２号；米国特許第３，８５０，５７８号；米国特許第３，８５３，９８７号；米国特許第３，８６７，５１７号；米国特許第３，８７９，２６２号；米国特許第３，９０１，６５４号；米国特許第３，９３５，０７４号；米国特許第３，９８４，５３３号；米国特許第３，９９６，３４５号；米国特許第４，０３４，０７４号；米国特許第４，０９８，８７６号；米国特許第４，８７９，２１９号；米国特許第５，０１１，７７１号及び米国特許第５，２８１，５２１号；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４年）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ��Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５年）；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，Ｅｄｓ．（１９８４年）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６年）；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６年）；“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４年）ａｎｄ“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌ．１〜３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０年）；Ｍａｒｓｈａｋら、“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６年）を参照されたい。これらの文献はすべてが、参照により本明細書に完全に記載されているものとして組み込まれているものとする。他の一般的参考文献は本文書の至る所に提供されている。その中の手順は当技術分野においては公知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。その中に含まれる情報はすべて参照により本明細書に組み込まれているものとする。
【０１４３】
一般的な材料及び実験方法。
細胞。
Ｔ２４Ｐ（ＡＴＣＣ受託番号ＨＴＢ−４）、Ｈｅｐ３Ｂ（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−８０６４）、ＴＯＶ−１２２Ｄ（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１１７３１）、ＥＳ−２（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１９７８）、ＳＫ−ＯＶ３（ＡＴＣＣ受託番号ＨＴＢ−７７）Ｌ３．６ＰＬ［Ｂｒｕｎｓ  ＣＪ，Ｈａｒｂｉｓｏｎ  ＭＴ，Ｋｕｎｉｙａｓｕ  Ｈ，Ｅｕｅ  Ｉ，Ｆｉｄｌｅｒ  ＩＪ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．１９９９年４月；１（１）：５０頁〜６２頁  「ヌードマウスにおける同所移植を使うことによるヒト膵臓腺癌由来転移性変異体のｉｎ  ｖｉｖｏ選択及び特徴付け（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ）」］、ＨＰＡＣ（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ２１１９）、Ｐａｎｃ１０．０５（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ２５４７、ＭＢＴ２マウス膀胱癌細胞系の高度転移性変異体のＴ−５０（ＭＢＴ２−ｔ５０）は、Ｄｒ．Ｏ．Ｍｅｄａｌｉａ（Ｓａｃｋｌｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｔｅｌ  Ａｖｉｖ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）により提供された。
【０１４４】
プラスミド。
Ｈ１９−ＤＴＡ−ＫＡＮＡ構築物（ＧｅｎｅＡｒｔ  ＧｍｂＨ  Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ  Ｄ−９３０５３）；ＬｕｃＳＶ４０構築物Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ．
【０１４５】
Ｈ１９−ＴＮＦα発現ベクターの構築。
ＴＮＦα（ＴＮＦα）のＨ１９−ＤＴＡ−ＫＡＮＡ構築物へのサブクローン化は、前記ＤＴＡ配列（配列番号１）をＴＮＦαの配列（配列番号４）と取り換えることにより実施した。手短に言えば、ヒトＴＮＦα遺伝子及び隣接する制限部位を合成オリゴヌクレオチドから組み立て、ＫｐｎＩ及びＳａｃＩ制限部位を使って標準的クローニングベクター（ｐＰＣＲｓｃｒｉｐｔ）にクローン化した。前記ＴＮＦα読取り枠（配列番号３）は、ＢｓｐＨＩ及びＸｂａＩ制限酵素を使って切除し、ＮｃｏＩ及びＸｂａＩ制限酵素で消化したＨ１９−ＤＴＡ  ＫＡＮＡベクターにサブクローン化した。コンピテント細菌のトランスフェクション後、単一コロニーを部位特異的ＰＣＲにより分析した。前記プラスミドＤＮＡは１つの陽性クローンから精製した。最終構築物（図１ａに図式的に示している。構築物配列は配列番号７に記載している）は、ＳＶ４０  ポリＡ［ＡＡＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴＡＴＡＡＴＧ（配列番号５）］及びＡｍ５［ＧＣＴＣＡＧＧＴＣＴＣＴＧＧＧＧＡＡＣＴＣＣＴＣＴＣＴＣＴＧＧＧＧＧＧＡＴＧＧＡＧＡＧＣＧＴＡＴＧＴＴＡＧＴＡＣ（配列番号６）］プライマーを使って塩基配列決定により検証した。
【０１４６】
ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡプラスミドの構築。
２個の遺伝子エレメントＩＲＥＳ及びＴＮＦα読取り枠のプラスミドｐＨ１９−ＤＴＡ−ＫＡＮＡへの導入はその後に続くクローン化段階により実施した。
【０１４７】
（ｉ）ＥＣＭＶ由来ＩＲＥＳ配列は、鋳型としてプラスミドｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、及び一対のオリゴヌクレオチドを使ってＰＣＲ増幅により作製し、ＮｃｏＩ（５’）［５’−ＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＣＣ−３’（配列番号８）］及びＢｓｐＨＩ（３’）［５’−ＴＴＡＡＴＣＡＴＧＡＴＧＴＧＧＣＣＡＴＡＴＴＡＴＣＡＴＣＧＴ−３’（配列番号９）］オーバーハングを導入した。前記フラグメントはＮｃｏＩ及びＢｓｐＨＩ制限酵素を使って消化し、ＮｃｏＩ制限消化により直線化したプラスミドｐＨ１９−ＤＴＡ−ＫＡＮＡ（Ｇｅｎｅａｒｔ  ＧｍｂＨ）に一方向にクローン化した。コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のトランスフェクション後、単一コロニーを部位特異的ＰＣＲにより分析した。前記プラスミドＤＮＡは１つの陽性クローンから精製し、濃度は紫外分光法により決定した。前記陽性構築物は塩基配列決定により検証した。
【０１４８】
（ｉｉ）ヒトＴＮＦα遺伝子及び隣接する制限部位を合成オリゴヌクレオチドから組み立て、ＫｐｎＩ及びＳａｃＩ制限部位を使って標準的クローニングベクター（ｐＰＣＲｓｃｒｉｐｔ）にクローン化した。前記ＴＮＦα読取り枠はＢｓｐＨＩ及びＮｃｏＩ制限酵素を使って切除し、ＮｃｏＩで消化したｐＨ１９−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ−ＫＡＮＡ（段階（ｉ）で入手）にサブクローン化した。コンピテント大腸菌のトランスフェクション後、単一コロニーを部位特異的ＰＣＲにより分析した。前記プラスミドＤＮＡは１つの陽性クローンから精製し、濃度は紫外分光法により決定した。最終構築物（図１ｂに図式的に示す。構築物配列は配列番号１３に記載している）は、以下のプライマー、すなわち、Ｈ１９−ＤＴＡ−１ｆ（８２５）：５’−ＧＡＡＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＴＡＧ−３’（配列番号１０）；Ｈ１９−ＤＴＡ−２ｒ（９６８）：５’−ＣＣＣＧＴＧＧＴＡＣＧＡＡＧＡＡＡＡＧ−３’（配列番号１１）；及びＨ１９−ＤＴＡ−４ｒ（７１ＩＲＥＳ）：５’−ＧＡＣＡＡＡＣＧＣＡＣＡＣＣＧＧＣ−３’（配列番号１２）を使って塩基配列決定により検証した。
【０１４９】
ルシフェラーゼアッセイ。
製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）のプロトコルに従って実行した。
【０１５０】
ＥＬＩＳＡアッセイ。
製造業者（Ｅｎｄｏｇｅｎ）のプロトコルに従って実行した。
【０１５１】
動物モデルにおける腫瘍増殖。
ＥＳ−２ヒト卵巣癌細胞（２００万の細胞が各マウスに注入された？）を、異所性卵巣癌のモデルを開発するために、生後６〜７週間の胸腺欠損雌マウスの背中に皮下注射した。皮下細胞接種の１０日後、前記マウスは測定可能な異所性腫瘍を発症した。前記ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ、ｐＨ１９−ＴＮＦα又はｐＨ１９−ＤＴＡベクターの治療可能性を、前記腫瘍に２５μｇ／腫瘍のそれぞれの発現ベクターを直接注射することにより試験した。対照として、２５μｇ／腫瘍のｐＨ１９−Ｌｕｃベクターを注射した。
【０１５２】
（実施例１）
Ｈ１９プロモーターの転写制御の下でＴＮＦα及び／又はジフテリア毒素（ＤＴＡ）を使った癌細胞の増殖の阻害。
ＴＮＦαは広範囲の抗癌活性を有する。しかし、ＴＮＦαを全身送達しても、主に、用量規制毒性効果が厳しいので、臨床上の成功は制限された。本発明者は、この制限は、ＴＮＦタンパク質の産生が癌細胞では発現するが正常細胞では発現しない遺伝子のプロモーターに制御されている遺伝子送達アプローチを使うことによって克服できることを明らかにした。この目的のために、本発明者は、Ｈ１９プロモーターの制御下にＴＮＦαコード配列をクローン化した。
【０１５３】
ＴＮＦα及びジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）は、ＤＮＡ断片化の引き金を引き、動態が類似した細胞溶解を標的にする。ＤＴＡによるタンパク質合成阻害は、細胞溶解を標的にするには十分ではない。これらの類似性に基づいて、ＤＴＡ及びＴＮＦαは、一般的な細胞溶解経路を共有していてもよいし、又はその細胞溶解経路が重複していてもよい。本発明者は、ｐＨ１９−ＤＴＡ構築物をｐＨ１９−ＴＮＦα構築物と併用して使い、以下のように癌細胞の増殖を阻害した。
【０１５４】
実験結果。
細胞にｐＨ１９−ＤＴＡ又はｐＨ１９−ＴＮＦα発現ベクターの一方をトランスフェクトすると、細胞増殖活性が阻害された。
ＤＴＡ及びＴＮＦαの潜在的相乗効果を決定するために、ｐＨ１９−ＤＴＡ又はｐＨ１９−ＴＮＦαプラスミドのいずれかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ治療可能性を、Ｔ２４Ｐ、Ｈｅｐ３Ｂ、及びＴＯＶ−１２２Ｄ細胞系（それぞれ、図２ａ、２ｂ及び２ｃ）で試験した。手短に言えば、細胞に、２μｇ／ウェルのＬｕｃＳＶ４０及び指示濃度のｐＨ１９−ＤＴＡ又はｐＨ１９−ＴＮＦαプラスミドを同時トランスフェクトし、ｐＨ１９−ＤＴＡ又はｐＨ１９−ＴＮＦαプラスミドの存在の下でのルシフェラーゼ活性の減少を、細胞にＬｕｃＳＶ４０プラスミドのみをトランスフェクトした場合（１００％ルシフェラーゼ活性と見なされる）に観察される減少と比較した。図２ａ〜ｃに示すように、ＬｕｃＳＶ４０及びｐＨ１９−ＤＴＡ又はｐＨ１９−ＴＮＦαベクターのいずれか一方を同時トランスフェクトした場合、ルシフェラーゼ活性の減少が３種類の細胞系すべてで検出され、Ｈ１９プロモーターはＤＴＡ又はＴＮＦαコード配列の発現を促進し、したがってＬｕｃＳＶ４０活性を低下させることができることを実証している。さらに、ｐＨ１９−ＤＴＡプラスミドによって引き起こされる阻害は、ｐＨ１９−ＴＮＦαベクターで引き起こされる阻害より著しいことが見出された。ＬｕｃＳＶ４０と比べて低濃度のｐＨ１９−ＤＴＡベクターでも、試験した細胞系すべてにおいてルシフェラーゼ活性レベルを減少させることができた。０．０１２５〜０．０２５μｇ／ウェルのＤＴＡ含有ベクターの濃度では、２μｇＬｕｃＳＶ４０により誘発されるルシフェラーゼ全活性が低下した。しかし、比較的高濃度（０．１μｇ／ウェル）のＴＮＦα含有ベクターは、２μｇ／ウェルＬｕｃＳＶ４０により誘発される全ルシフェラーゼ活性の低下を引き起こした。ＬｕｃＳＶ４０の量はｐＨ１９−ＤＴＡ又はｐＨ１９−ＴＮＦαベクターの量よりもはるかに多いので、ルシフェラーゼ活性の減少は、細胞に入るＬｕｃＳＶ４０の量の減少を引き起こすｐＨ１９−ＤＴＡ又はｐＨ１９−ＴＮＦαベクターとの競合のせいではなく、ＤＴＡ又はＴＮＦα活性の直接の結果であると考えることができる。
【０１５５】
ｐＨ１９−ＴＮＦαベクターからのＴＮＦタンパク質のｉｎ−ｖｉｔｒｏ発現。
ＴＮＦは通常は細胞から分泌され、その受容体に結合する。この結合のために、広範囲の細胞活性が形質導入される。ルシフェラーゼ活性の低下が、形質転換されたプラスミドからのＴＮＦαの発現及び分泌により引き起こされるのかどうかを検査するために、ＥＬＩＳＡアッセイを用いた。ＴＯＶ−１２２Ｄ細胞へのｐＨ１９−ＴＮＦα構築物のトランスフェクションの４８時間後、上澄みを集め、ＴＮＦ特異的ＥＬＩＳＡを使ってアッセイするまで−８０℃で保管した。ＴＮＦαタンパク質の量は、ＴＮＦの濃度を高めながら検量線に規準化した。図３に示すように、分泌されたＴＮＦタンパク質のレベルは、ＯＶ−１２２Ｄ細胞系にトランスフェクトされたｐＨ１９−ＴＮＦαプラスミドの濃度の増加とともに増加した。０．２５μｇ／ウェルのｐＨ１９−ＴＮＦαプラスミドのトランスフェクション後、約２５００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦαが検出された。対照プラスミドトランスフェクト細胞ではきわめてわずかな量のＴＮＦが検出された（データは示していない）。これらの結果から、Ｈ１９プロモーターはＴＮＦα遺伝子の発現を促進すること、及びＴＮＦαタンパク質は培養培地に分泌されることが示されている。
【０１５６】
ｐＨ１９−ＤＴＡとｐＨ１９−ＴＮＦαベクターの併用の細胞毒性効果。
ｐＨ１９−ＤＴＡとｐＨ１９−ＴＮＦαベクターの併用により、Ｔ２４Ｐ細胞において細胞毒性及び競合作用が増強されるかどうかを決定するために、細胞に２μｇ／ウェルのＬｕｃＳＶ４０、一定濃度のｐＨ１９−ＤＴＡ（０．０５μｇ／ウェル）又はｐＨ１９−ＴＮＦα（０．２５μｇ／ウェル）ベクター、及びそれぞれ指示濃度のｐＨ１９−ＤＴＡ又はｐＨ１９−ＴＮＦαを同時トランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性を決定し、ＬｕｃＳＶ４０のみをトランスフェクトした細胞のルシフェラーゼ活性と比較した。図４に示す結果は、一定濃度のｐＨ１９−ＤＴＡと不定濃度のｐＨ１９−ＴＮＦα、又は一定濃度のｐＨ１９−ＴＮＦαと不定濃度のｐＨ１９−ＤＴＡのいずれか一方を同時トランスフェクトした細胞系において、ｐＨ１９−ＤＴＡ又はｐＨ１９−ＴＮＦαベクターのみをトランスフェクトした細胞系と比べて、ルシフェラーゼ活性の減少を示している。０．２５μｇ／ウェルのｐＨ１９−ＴＮＦα及び０．１μｇ／ウェルのｐＨ１９−ＤＴＡの構築物を使うことによる、さらに著しいルシフェラーゼ活性の低下が注目された。
【０１５７】
全体で、これらの結果は、ＤＴＡ又はＴＮＦαがＨ１９プロモーターによって促進される両方の発現ベクターを使うと、癌細胞増殖の阻害において細胞毒性及び競合作用が増強されることを実証している。これは、ＤＴＡ又はＴＮＦを含む種々の薬物に抵抗性の腫瘍では特に重要である（たとえば、ＳＫ−ＯＶ３卵巣細胞）。
【０１５８】
（実施例２）
癌細胞系におけるＨ１９プロモーターの制御の下にあるＴＮＦα及びＤＴＡコード配列の細胞毒性効果。
ＤＴＡ及びＴＮＦα両方のコード配列がＨ１９プロモーターの制御の下にあるベクターの可能性を試験するために、本発明者は、ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターを構築し、このベクターを使って、以下のように種々の癌細胞系にトランスフェクトした。
【０１５９】
実験結果。
種々の癌細胞系におけるｐＨ１９−ＤＴＡ、ｐＨ１９−ＴＮＦα又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ発現ベクターの抗増殖活性。
Ｈ１９プロモーターの制御の下にあるＴＮＦα及びＤＴＡコード配列の両方を坦持しているベクターの細胞毒性効果を、卵巣癌細胞、膵癌細胞、膀胱癌細胞、及び肝細胞癌細胞で試験した。細胞に、２μｇ／ウェルのＬｕｃＳＶ４０と指示濃度のｐＨ１９−ＤＴＡ、ｐＨ１９−ＴＮＦα、又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡプラスミドを同時トランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性を決定し、ＬｕｃＳＶ４０のみをトランスフェクトした細胞のルシフェラーゼ活性と比較した。図５ａ〜ｉに示すように、プラスミドｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡの癌細胞に対する死滅効果は、ｐＨ１９−ＤＴＡ又はｐＨ１９−ＴＮＦαベクターのみにより示される効果より有意に高い。ＤＴＡ及びＴＮＦ抵抗性卵巣細胞（ＳＫ−ＯＶ３；４）は、ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡプラスミドを使うと効率的に死滅し、ＤＴＡ−Ｈ１９プラスミドのみを使っても細胞毒性効果は検出されなかった。
【０１６０】
ＴＮＦαｍＲＮＡのｉｎ−ｖｉｔｒｏ発現。
ＴＮＦαｍＲＮＡレベルは、０．０２μｇ／ウェルのｐＨ１９−ＴＮＦα若しくはｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ発現ベクターのトランスフェクション、又は１０ｎｇ／ｍｌ若しくは１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαタンパク質の培養培地への添加に続いてＳＫ−ＯＶ３細胞系（ＤＴＡ及びＴＮＦ抵抗性である）においてＲＴ−ＰＣＲにより決定した。トランスフェクション又はＴＮＦタンパク質の培養培地への添加の４８時間後、全ＲＮＡを細胞から抽出した。図６ａ〜ｂに示すように、ＴＮＦα転写物は、対照プラスミド（ＬｕｃＳＶ４０）をトランスフェクトした細胞、及び無処置細胞に存在している（レーン１、６）。ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターをトランスフェクトした細胞（レーン４）では、ｐＨ１９−ＴＮＦαベクターをトランスフェクトした細胞（レーン２）と比べると、高いレベルのＴＮＦα転写物が検出された。さらに、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαタンパク質で処置した細胞（レーン３）で決定したレベルと比べると、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαタンパク質で処置した細胞（レーン５）ではＴＮＦαＲＮＡレベルの減少が見られる。
【０１６１】
全体では、これらの結果は、Ｈ１９プロモーターの転写制御の下にあるＴＮＦα及びＤＴＡコード配列の両方の発現は、ＤＴＡ及びＴＮＦ処置の両方に抵抗性であることが知られている細胞系を含む多種多様の癌細胞の増殖を抑制する点で高度に効率的であることを実証している。さらに、前記結果は、ＴＮＦαの細胞内レベルは、ｐＨ１９−ＴＮＦαベクターをトランスフェクトした細胞又は培養培地に与えられる外因性ＴＮＦαタンパク質の存在の下で増殖する細胞においてより、ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターをトランスフェクトした細胞のほうが高いことを実証している。
【０１６２】
（実施例３）
ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターは癌のｉｎ  ｖｉｖｏ治療に適している。
ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターの癌治療能力をさらに検証するために、皮下腫瘍に以下のように種々のＨ１９調節発現構築物を注入した。
【０１６３】
実験結果。
異所性皮下腫瘍の治療。
ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ、ｐＨ１９−ＴＮＦα、又はｐＨ１９−ＤＴＡベクターのｉｎ−ｖｉｖｏでの癌細胞死滅を促進し、腫瘍増殖を阻害する能力を分析した。ＥＳ−２ヒト卵巣癌細胞を、異所性卵巣癌のモデルを開発するために、生後６〜７週間の胸腺欠損雌マウスの背中に皮下注射した。皮下細胞接種の１０日後、前記マウスは測定可能な異所性腫瘍を発症した。ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ、ｐＨ１９−ＴＮＦα、又はｐＨ１９−ＤＴＡベクターの治療可能性を、発症した卵巣癌腫瘍に発現ベクターを直接注入することにより試験した。手短に言えば、各グループのマウスの腫瘍に、２５μｇ／腫瘍のｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ、ｐＨ１９−ＴＮＦα、又はｐＨ１９−ＤＴＡベクターを直接注入し、対照グループの腫瘍は２５μｇ／腫瘍のｐＨ１９−Ｌｕｃベクターで処置した。腫瘍のサイズを決定し、腫瘍サイズのｉｎ−ｖｉｖｏ倍増は各処置の最後に計算した。図７ａ〜ｂに示すように、ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ、ｐＨ１９−ＴＮＦα、又はｐＨ１９−ＤＴＡベクターの４回の注入により、レポーターベクターｐＨ１９−Ｌｕｃの４回の注入に比べて、腫瘍成長をそれぞれ５５％、４１％、及び３２％阻害することができた。ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ処置腫瘍の腫瘍増殖阻害は、ｐＨ１９−ＴＮＦα又はｐＨ１９−ＤＴＡ処置腫瘍と比べて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察されたような相乗的ではなく、相加効果を示した（図５ａ〜ｉを参照されたい）。
【０１６４】
全体として、これらの結果は、ＴＮＦα及び／又はＤＴＡのＨ１９促進発現を使って、卵巣癌腫瘍などの定着した腫瘍を治療できることを実証している。
【０１６５】
分析と考察。
ＴＮＦα及びＤＴＡはＤＮＡ断片化の引き金を引き、動態が類似する細胞溶解を標的にする。ＤＴＡによるタンパク質合成阻害は、細胞溶解を標的にするには十分ではない。これらの類似点に基づき、ＤＴＡ及びＴＮＦαは、一般的細胞溶解経路を共有していてもよいし、その細胞溶解経路が重複していてもよい。
【０１６６】
本明細書に提示される結果は、併用して使用した場合、ＤＴＡ及びヒトＴＮＦαは、ヒト卵巣癌細胞系、膵癌細胞系、膀胱癌細胞系、及び肝細胞癌細胞系に対するその細胞毒性活性において相乗的に作用することを実証している。細胞毒性活性は感受性細胞でも抵抗性細胞でも観察された。
【０１６７】
したがって、細胞へのｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ構築物のトランスフェクトにより、細胞毒性が増強された。ＤＴＡ及びＴＮＦ抵抗性卵巣細胞、すなわちＳＫ−ＯＶ３は、Ｈ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡプラスミドを使った場合は効率的に死滅するが、ｐＨ１９−ＤＴＡプラスミドを使った場合は細胞毒性効果は検出されていない。これは、ＤＴＡ又はＴＮＦを含む種々の薬物に抵抗性の腫瘍においては重要になりそうである。
【０１６８】
図７ａ〜ｂに示されるｉｎ−ｖｉｖｏ実験により、ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ構築物の異所性マウスモデルへの投与によって、（ｐＨ１９−ＴＮＦα又はｐＨ１９−ＤＴＡベクターの使用と比べると）相加効果が生じ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験で示されたような相乗効果は生じないことが実証されている。これらの結果は、おそらく、動物モデルにおいてｐＨ１９−ＴＮＦαのみにより示され、細胞系では検出されなかった細胞毒性効果のせいである。
【０１６９】
これらの結果は、ヒト卵巣又は腎細胞癌細胞系に対してＤＴＡ及びＴＮＦタンパク質を併用して使うと、相乗的細胞毒性活性が生じた（４，３０）追加の結果により支持されている。
【０１７０】
明確にするために、別々の実施形態の文脈に記載されている本発明のある種の特徴は、１つの実施形態において組み合わせて提供されてもよいことは認識されている。逆に、簡潔にするために、１つの実施形態の文脈に記載されている本発明の種々の特徴は、別々に、又はいかなるものであれ適切なサブコンビネーションで提供されてもよい。
【０１７１】
本発明はその特定の実施形態と併せて記載されてきたが、多くの代案、修正及び変形が当業者には明らかになることは明白である。したがって、添付の特許請求の精神と広い範囲内であるそのような代案、修正及び変形をすべて包含することが企図されている。本明細書で言及しているあらゆる出版物、特許及び特許出願公開、並びにジェンバンク受託番号は、個々の出版物、特許、若しくは特許出願公開、又はジェンバンク受託番号がそれぞれ参照により本明細書に組み込まれるように明確に及び個々に指示されている場合と同程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。さらに、本出願書類中のいかなる参考文献の引用又は確認も、そのような参考文献は本発明の先行技術として利用することができることを承認したものとして解釈してはならない。
【０１７２】
（参考文献）
（本文中に引用された追加の参考文献）
2009508516.tif 000003
2009508516.tif 000004
2009508516.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１ａ】ｐＨ１９−ＴＮＦα発現ベクターの構築を描く概略図である。ＴＮＦαのコード配列（核酸配列−配列番号４；アミノ酸配列−配列番号１８）はＨ１９プロモーター（Ｈ１９ｐｒｏｍｏ）配列（配列番号３）の転写制御の下にある。
【図１ｂ】ｐＨ１９−ＴＮＦα−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ発現ベクターの構築を描く概略図である。ＴＮＦα（配列番号４）及びＤＴＡ（配列番号１）のコード配列はＨ１９プロモーター配列（配列番号３）の転写制御の下にある。ＩＲＥＳ−ＥＣＭＶ由来ＩＲＥＳ；Ｋａｎａ（Ｒ）−カナマイシン耐性遺伝子。
【図２ａ】Ｔ２４Ｐ細胞系におけるｐＨ１９−ＤＴＡ又はｐＨ１９−ＴＮＦα発現ベクターの死滅潜在能力を、ルシフェラーゼ活性の低下として描いているグラフである。細胞に、２μｇ／ウェルのＬｕｃＳＶ４０ベクター及び指示濃度のｐＨ１９−ＤＴＡ（ダイアモンド）又はｐＨ１９−ＴＮＦα（三角形）を同時トランスフェクトした。対照として（１００％ルシフェラーゼ活性）、細胞系それぞれにＬｕｃＳＶ４０ベクターのみをトランスフェクトした。トランスフェクション実験は４８時間後に停止させ、レポーター遺伝子活性を評価した。同時トランスフェクトした細胞でのＬｕｃＳＶ４０活性の低下を、ＬｕｃＳＶ４０ベクターのみをトランスフェクトした細胞のルシフェラーゼ活性と比較した。ｐＨ１９−ＤＴＡベクターをトランスフェクトした細胞のルシフェラーゼ活性の著しい低下に注目されたい。
【図２ｂ】Ｈｅｐ３Ｂ細胞系におけるｐＨ１９−ＤＴＡ又はｐＨ１９−ＴＮＦα発現ベクターの死滅潜在能力を、ルシフェラーゼ活性の低下として描いているグラフである。細胞に、２μｇ／ウェルのＬｕｃＳＶ４０ベクター及び指示濃度のｐＨ１９−ＤＴＡ（ダイアモンド）又はｐＨ１９−ＴＮＦα（三角形）を同時トランスフェクトした。対照として（１００％ルシフェラーゼ活性）、細胞系それぞれにＬｕｃＳＶ４０ベクターのみをトランスフェクトした。トランスフェクション実験は４８時間後に停止させ、レポーター遺伝子活性を評価した。同時トランスフェクトした細胞でのＬｕｃＳＶ４０活性の低下を、ＬｕｃＳＶ４０ベクターのみをトランスフェクトした細胞のルシフェラーゼ活性と比較した。ｐＨ１９−ＤＴＡベクターをトランスフェクトした細胞のルシフェラーゼ活性の著しい低下に注目されたい。
【図２ｃ】ＴＯＶ−１２２Ｄ細胞系におけるｐＨ１９−ＤＴＡ又はｐＨ１９−ＴＮＦα発現ベクターの死滅潜在能力を、ルシフェラーゼ活性の低下として描いているグラフである。細胞に、２μｇ／ウェルのＬｕｃＳＶ４０ベクター及び指示濃度のｐＨ１９−ＤＴＡ（ダイアモンド）又はｐＨ１９−ＴＮＦα（三角形）を同時トランスフェクトした。対照として（１００％ルシフェラーゼ活性）、細胞系それぞれにＬｕｃＳＶ４０ベクターのみをトランスフェクトした。トランスフェクション実験は４８時間後に停止させ、レポーター遺伝子活性を評価した。同時トランスフェクトした細胞でのＬｕｃＳＶ４０活性の低下を、ＬｕｃＳＶ４０ベクターのみをトランスフェクトした細胞のルシフェラーゼ活性と比較した。ｐＨ１９−ＤＴＡベクターをトランスフェクトした細胞のルシフェラーゼ活性の著しい低下に注目されたい。
【図３】ｐＨ１９−ＴＮＦα発現ベクターをトランスフェクトしたＴＯＶ−１２２Ｄ細胞におけるＴＮＦ特異的ＥＬＩＳＡアッセイを描くヒストグラムである。ＴＮＦαの濃度［ピコグラム（ｐｇ）／ミリリットル（ｍｌ）で測定］は、ＴＯＶ−１２２Ｄ細胞にトランスフェクトするのに使ったｐＨ１９−ＴＮＦαベクター（μｇ／ウェルで測定）の濃度の関数として示している。ＴＯＶ−１２２Ｄ細胞のトランスフェクション後に発現されるＴＮＦα分泌タンパク質の量が前記細胞にトランスフェクトするのに使ったｐＨ１９−ＴＮＦαベクターの量に比例して増加していることに注目されたい。
【図４】ｐＨ１９−ＤＴＡ及びｐＨ１９−ＴＮＦα発現ベクターのＴ２４Ｐ細胞に対する相乗的細胞毒性効果を描くグラフである。ｐＨ１９−ＤＴＡ（青ダイアモンド）又はｐＨ１９−ＴＮＦα（ピンク四角形）ベクター単独の、又は、一定濃度のｐＨ１９−ＤＴＡと不定濃度のｐＨ１９−ＴＮＦαの併用（茶「Ｘ」）、若しくは一定濃度のｐＨ１９−ＴＮＦαと不定濃度のｐＨ１９−ＤＴＡの併用（緑三角形）の死滅潜在能力を、Ｔ２４Ｐ細胞において、ＬｕｃＳＶ４０活性の低下として測定した。細胞に、２μｇ／ウェルのＬｕｃＳＶ４０、０．０５μｇ／ウェルのｐＨ１９−ＤＴＡ又は０．２５μｇ／ウェルのｐＨ１９−ＴＮＦα、及びそれぞれ指示濃度のｐＨ１９−ＴＮＦα又はｐＨ１９−ＤＴＡを同時トランスフェクトした。対照として（１００％ルシフェラーゼ活性）、細胞にＬｕｃＳＶ４０ベクターのみをトランスフェクトした。トランスフェクション実験は４８時間後に停止させ、レポーター遺伝子活性を評価した。ｐＨ１９−ＤＴＡベクターを単独で、又はｐＨ１９−ＴＮＦαベクターと併用してトランスフェクトした細胞におけるルシフェラーゼ活性の著しい低下に注目されたい。
【図５ａ】ｐＨ１９−ＤＴＡ（ＤＴＡ、青ダイアモンド）、ｐＨ１９−ＴＮＦα（ＴＮＦ、ピンク四角形）又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ（ＴＮＦ−ＤＴＡ、緑三角形）ベクターの同時トランスフェクションに続く、卵巣（ＥＳ−２、ＴＯＶ−１２２Ｄ、ＳＫ−ＯＶ３）、膵臓（Ｌ３．６ＰＬ、ＣＲＬ２１１９、及びＣＲＬ２５４７）、膀胱（Ｔ−５０、Ｔ２４Ｐ）、並びに肝細胞癌（Ｈｅｐ３Ｂ）細胞系におけるルシフェラーゼ活性の低下を描くグラフである。ＥＳ−２細胞におけるｐＨ１９−ＤＴＡベクター、ｐＨ１９−ＴＮＦαベクター又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターの死滅潜在能力をＬｕｃＳＶ４０活性の低下として測定した。細胞には、２μｇ／ウェルのＬｕｃＳＶ４０及び指示濃度のｐＨ１９−ＤＴＡ、ｐＨ１９−ＴＮＦα、又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターを同時トランスフェクトした。対照として（１００％ルシフェラーゼ活性）、細胞系それぞれに、ＬｕｃＳＶ４０のみをトランスフェクトした。トランスフェクション実験は４８時間後に停止させ、レポーター遺伝子活性を評価した。同時トランスフェクトした細胞でのＬｕｃＳＶ４０活性の低下を、ＬｕｃＳＶ４０トランスフェクトした細胞の活性と比較した。併用したベクターの強力な死滅効果を実証する、ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターのトランスフェクションに続く試験した細胞系すべてにおけるルシフェラーゼ活性の著しい低下に注目されたい。
【図５ｂ】ｐＨ１９−ＤＴＡ（ＤＴＡ、青ダイアモンド）、ｐＨ１９−ＴＮＦα（ＴＮＦ、ピンク四角形）又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ（ＴＮＦ−ＤＴＡ、緑三角形）ベクターの同時トランスフェクションに続く、卵巣（ＥＳ−２、ＴＯＶ−１２２Ｄ、ＳＫ−ＯＶ３）、膵臓（Ｌ３．６ＰＬ、ＣＲＬ２１１９、及びＣＲＬ２５４７）、膀胱（Ｔ−５０、Ｔ２４Ｐ）、並びに肝細胞癌（Ｈｅｐ３Ｂ）細胞系におけるルシフェラーゼ活性の低下を描くグラフである。ＴＯＶ−１２２Ｄ細胞におけるｐＨ１９−ＤＴＡベクター、ｐＨ１９−ＴＮＦαベクター又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターの死滅潜在能力をＬｕｃＳＶ４０活性の低下として測定した。細胞には、２μｇ／ウェルのＬｕｃＳＶ４０及び指示濃度のｐＨ１９−ＤＴＡ、ｐＨ１９−ＴＮＦα、又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターを同時トランスフェクトした。対照として（１００％ルシフェラーゼ活性）、細胞系それぞれに、ＬｕｃＳＶ４０のみをトランスフェクトした。トランスフェクション実験は４８時間後に停止させ、レポーター遺伝子活性を評価した。同時トランスフェクトした細胞でのＬｕｃＳＶ４０活性の低下を、ＬｕｃＳＶ４０トランスフェクトした細胞の活性と比較した。併用したベクターの強力な死滅効果を実証する、ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターのトランスフェクションに続く試験した細胞系すべてにおけるルシフェラーゼ活性の著しい低下に注目されたい。
【図５ｃ】ｐＨ１９−ＤＴＡ（ＤＴＡ、青ダイアモンド）、ｐＨ１９−ＴＮＦα（ＴＮＦ、ピンク四角形）又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ（ＴＮＦ−ＤＴＡ、緑三角形）ベクターの同時トランスフェクションに続く、卵巣（ＥＳ−２、ＴＯＶ−１２２Ｄ、ＳＫ−ＯＶ３）、膵臓（Ｌ３．６ＰＬ、ＣＲＬ２１１９、及びＣＲＬ２５４７）、膀胱（Ｔ−５０、Ｔ２４Ｐ）、並びに肝細胞癌（Ｈｅｐ３Ｂ）細胞系におけるルシフェラーゼ活性の低下を描くグラフである。ＳＫ−ＯＶ３細胞におけるｐＨ１９−ＤＴＡベクター、ｐＨ１９−ＴＮＦαベクター又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターの死滅潜在能力をＬｕｃＳＶ４０活性の低下として測定した。細胞には、２μｇ／ウェルのＬｕｃＳＶ４０及び指示濃度のｐＨ１９−ＤＴＡ、ｐＨ１９−ＴＮＦα、又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターを同時トランスフェクトした。対照として（１００％ルシフェラーゼ活性）、細胞系それぞれに、ＬｕｃＳＶ４０のみをトランスフェクトした。トランスフェクション実験は４８時間後に停止させ、レポーター遺伝子活性を評価した。同時トランスフェクトした細胞でのＬｕｃＳＶ４０活性の低下を、ＬｕｃＳＶ４０トランスフェクトした細胞の活性と比較した。併用したベクターの強力な死滅効果を実証する、ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターのトランスフェクションに続く試験した細胞系すべてにおけるルシフェラーゼ活性の著しい低下に注目されたい。
【図５ｄ】ｐＨ１９−ＤＴＡ（ＤＴＡ、青ダイアモンド）、ｐＨ１９−ＴＮＦα（ＴＮＦ、ピンク四角形）又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ（ＴＮＦ−ＤＴＡ、緑三角形）ベクターの同時トランスフェクションに続く、卵巣（ＥＳ−２、ＴＯＶ−１２２Ｄ、ＳＫ−ＯＶ３）、膵臓（Ｌ３．６ＰＬ、ＣＲＬ２１１９、及びＣＲＬ２５４７）、膀胱（Ｔ−５０、Ｔ２４Ｐ）、並びに肝細胞癌（Ｈｅｐ３Ｂ）細胞系におけるルシフェラーゼ活性の低下を描くグラフである。Ｌ３．６ＰＬ細胞におけるｐＨ１９−ＤＴＡベクター、ｐＨ１９−ＴＮＦαベクター又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターの死滅潜在能力をＬｕｃＳＶ４０活性の低下として測定した。細胞には、２μｇ／ウェルのＬｕｃＳＶ４０及び指示濃度のｐＨ１９−ＤＴＡ、ｐＨ１９−ＴＮＦα、又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターを同時トランスフェクトした。対照として（１００％ルシフェラーゼ活性）、細胞系それぞれに、ＬｕｃＳＶ４０のみをトランスフェクトした。トランスフェクション実験は４８時間後に停止させ、レポーター遺伝子活性を評価した。同時トランスフェクトした細胞でのＬｕｃＳＶ４０活性の低下を、ＬｕｃＳＶ４０トランスフェクトした細胞の活性と比較した。併用したベクターの強力な死滅効果を実証する、ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターのトランスフェクションに続く試験した細胞系すべてにおけるルシフェラーゼ活性の著しい低下に注目されたい。
【図５ｅ】ｐＨ１９−ＤＴＡ（ＤＴＡ、青ダイアモンド）、ｐＨ１９−ＴＮＦα（ＴＮＦ、ピンク四角形）又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ（ＴＮＦ−ＤＴＡ、緑三角形）ベクターの同時トランスフェクションに続く、卵巣（ＥＳ−２、ＴＯＶ−１２２Ｄ、ＳＫ−ＯＶ３）、膵臓（Ｌ３．６ＰＬ、ＣＲＬ２１１９、及びＣＲＬ２５４７）、膀胱（Ｔ−５０、Ｔ２４Ｐ）、並びに肝細胞癌（Ｈｅｐ３Ｂ）細胞系におけるルシフェラーゼ活性の低下を描くグラフである。ＣＲＬ２１１９細胞におけるｐＨ１９−ＤＴＡベクター、ｐＨ１９−ＴＮＦαベクター又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターの死滅潜在能力をＬｕｃＳＶ４０活性の低下として測定した。細胞には、２μｇ／ウェルのＬｕｃＳＶ４０及び指示濃度のｐＨ１９−ＤＴＡ、ｐＨ１９−ＴＮＦα、又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターを同時トランスフェクトした。対照として（１００％ルシフェラーゼ活性）、細胞系それぞれに、ＬｕｃＳＶ４０のみをトランスフェクトした。トランスフェクション実験は４８時間後に停止させ、レポーター遺伝子活性を評価した。同時トランスフェクトした細胞でのＬｕｃＳＶ４０活性の低下を、ＬｕｃＳＶ４０トランスフェクトした細胞の活性と比較した。併用したベクターの強力な死滅効果を実証する、ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターのトランスフェクションに続く試験した細胞系すべてにおけるルシフェラーゼ活性の著しい低下に注目されたい。
【図５ｆ】ｐＨ１９−ＤＴＡ（ＤＴＡ、青ダイアモンド）、ｐＨ１９−ＴＮＦα（ＴＮＦ、ピンク四角形）又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ（ＴＮＦ−ＤＴＡ、緑三角形）ベクターの同時トランスフェクションに続く、卵巣（ＥＳ−２、ＴＯＶ−１２２Ｄ、ＳＫ−ＯＶ３）、膵臓（Ｌ３．６ＰＬ、ＣＲＬ２１１９、及びＣＲＬ２５４７）、膀胱（Ｔ−５０、Ｔ２４Ｐ）、並びに肝細胞癌（Ｈｅｐ３Ｂ）細胞系におけるルシフェラーゼ活性の低下を描くグラフである。ＣＲＬ２５４７細胞におけるｐＨ１９−ＤＴＡベクター、ｐＨ１９−ＴＮＦαベクター又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターの死滅潜在能力をＬｕｃＳＶ４０活性の低下として測定した。細胞には、２μｇ／ウェルのＬｕｃＳＶ４０及び指示濃度のｐＨ１９−ＤＴＡ、ｐＨ１９−ＴＮＦα、又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターを同時トランスフェクトした。対照として（１００％ルシフェラーゼ活性）、細胞系それぞれに、ＬｕｃＳＶ４０のみをトランスフェクトした。トランスフェクション実験は４８時間後に停止させ、レポーター遺伝子活性を評価した。同時トランスフェクトした細胞でのＬｕｃＳＶ４０活性の低下を、ＬｕｃＳＶ４０トランスフェクトした細胞の活性と比較した。併用したベクターの強力な死滅効果を実証する、ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターのトランスフェクションに続く試験した細胞系すべてにおけるルシフェラーゼ活性の著しい低下に注目されたい。
【図５ｇ】ｐＨ１９−ＤＴＡ（ＤＴＡ、青ダイアモンド）、ｐＨ１９−ＴＮＦα（ＴＮＦ、ピンク四角形）又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ（ＴＮＦ−ＤＴＡ、緑三角形）ベクターの同時トランスフェクションに続く、卵巣（ＥＳ−２、ＴＯＶ−１２２Ｄ、ＳＫ−ＯＶ３）、膵臓（Ｌ３．６ＰＬ、ＣＲＬ２１１９、及びＣＲＬ２５４７）、膀胱（Ｔ−５０、Ｔ２４Ｐ）、並びに肝細胞癌（Ｈｅｐ３Ｂ）細胞系におけるルシフェラーゼ活性の低下を描くグラフである。Ｔ−５０細胞におけるｐＨ１９−ＤＴＡベクター、ｐＨ１９−ＴＮＦαベクター又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターの死滅潜在能力をＬｕｃＳＶ４０活性の低下として測定した。細胞には、２μｇ／ウェルのＬｕｃＳＶ４０及び指示濃度のｐＨ１９−ＤＴＡ、ｐＨ１９−ＴＮＦα、又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターを同時トランスフェクトした。対照として（１００％ルシフェラーゼ活性）、細胞系それぞれに、ＬｕｃＳＶ４０のみをトランスフェクトした。トランスフェクション実験は４８時間後に停止させ、レポーター遺伝子活性を評価した。同時トランスフェクトした細胞でのＬｕｃＳＶ４０活性の低下を、ＬｕｃＳＶ４０トランスフェクトした細胞の活性と比較した。併用したベクターの強力な死滅効果を実証する、ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターのトランスフェクションに続く試験した細胞系すべてにおけるルシフェラーゼ活性の著しい低下に注目されたい。
【図５ｈ】ｐＨ１９−ＤＴＡ（ＤＴＡ、青ダイアモンド）、ｐＨ１９−ＴＮＦα（ＴＮＦ、ピンク四角形）又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ（ＴＮＦ−ＤＴＡ、緑三角形）ベクターの同時トランスフェクションに続く、卵巣（ＥＳ−２、ＴＯＶ−１２２Ｄ、ＳＫ−ＯＶ３）、膵臓（Ｌ３．６ＰＬ、ＣＲＬ２１１９、及びＣＲＬ２５４７）、膀胱（Ｔ−５０、Ｔ２４Ｐ）、並びに肝細胞癌（Ｈｅｐ３Ｂ）細胞系におけるルシフェラーゼ活性の低下を描くグラフである。Ｔ２４Ｐ細胞におけるｐＨ１９−ＤＴＡベクター、ｐＨ１９−ＴＮＦαベクター又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターの死滅潜在能力をＬｕｃＳＶ４０活性の低下として測定した。細胞には、２μｇ／ウェルのＬｕｃＳＶ４０及び指示濃度のｐＨ１９−ＤＴＡ、ｐＨ１９−ＴＮＦα、又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターを同時トランスフェクトした。対照として（１００％ルシフェラーゼ活性）、細胞系それぞれに、ＬｕｃＳＶ４０のみをトランスフェクトした。トランスフェクション実験は４８時間後に停止させ、レポーター遺伝子活性を評価した。同時トランスフェクトした細胞でのＬｕｃＳＶ４０活性の低下を、ＬｕｃＳＶ４０トランスフェクトした細胞の活性と比較した。併用したベクターの強力な死滅効果を実証する、ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターのトランスフェクションに続く試験した細胞系すべてにおけるルシフェラーゼ活性の著しい低下に注目されたい。
【図５ｉ】ｐＨ１９−ＤＴＡ（ＤＴＡ、青ダイアモンド）、ｐＨ１９−ＴＮＦα（ＴＮＦ、ピンク四角形）又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ（ＴＮＦ−ＤＴＡ、緑三角形）ベクターの同時トランスフェクションに続く、卵巣（ＥＳ−２、ＴＯＶ−１２２Ｄ、ＳＫ−ＯＶ３）、膵臓（Ｌ３．６ＰＬ、ＣＲＬ２１１９、及びＣＲＬ２５４７）、膀胱（Ｔ−５０、Ｔ２４Ｐ）、並びに肝細胞癌（Ｈｅｐ３Ｂ）細胞系におけるルシフェラーゼ活性の低下を描くグラフである。ＨＥＰ３Ｂ細胞におけるｐＨ１９−ＤＴＡベクター、ｐＨ１９−ＴＮＦαベクター又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターの死滅潜在能力をＬｕｃＳＶ４０活性の低下として測定した。細胞には、２μｇ／ウェルのＬｕｃＳＶ４０及び指示濃度のｐＨ１９−ＤＴＡ、ｐＨ１９−ＴＮＦα、又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターを同時トランスフェクトした。対照として（１００％ルシフェラーゼ活性）、細胞系それぞれに、ＬｕｃＳＶ４０のみをトランスフェクトした。トランスフェクション実験は４８時間後に停止させ、レポーター遺伝子活性を評価した。同時トランスフェクトした細胞でのＬｕｃＳＶ４０活性の低下を、ＬｕｃＳＶ４０トランスフェクトした細胞の活性と比較した。併用したベクターの強力な死滅効果を実証する、ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターのトランスフェクションに続く試験した細胞系すべてにおけるルシフェラーゼ活性の著しい低下に注目されたい。
【図６ａ】ｐＨ１９−ＴＮＦα若しくはｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡプラスミドをトランスフェクトしたＳＫ−ＯＶ３細胞から、又は培養培地でＴＮＦαタンパク質の存在の下で増殖したＳＫ−ＯＶ３細胞から単離したＲＮＡのＴＮＦα転写物のレベルを描くＲＴ−ＰＣＲ分析の図である。プライマー５’−ＧＣＣＡＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣ−３’（配列番号１４）及び５’−ＣＧＣＣＡＣＣＡＣＧＣＴＣＴＴＣＴ−３’（配列番号１５）を使ったＴＮＦα  ＲＴ−ＰＣＲ分析。レーン１−１．５μｇ／ｍｌの制御プラスミドｌｕｃ１をトランスフェクトした細胞；レーン２−０．０２μｇ／ウェルのｐＨ１９−ＴＮＦαプラスミドをトランスフェクトした細胞；レーン３−培養培地において１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαタンパク質の存在の下で増殖した細胞；レーン４−０．０２μｇ／ウェルのｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡプラスミドをトランスフェクトした細胞；レーン５−培養培地において１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαタンパク質の存在の下で増殖した細胞；レーン６−未処置細胞；及び、レーン７−ＲＴ−ＰＣＲ反応のための負の対照（すなわち、ＲＮＡなし）。ＴＮＦα及びＧＡＤＰ内部標準ＰＣＲ産物の位置はマークされている（黒矢印）。“Ｍ”−１００−ｂｐ分子量マーカー。
【図６ｂ】ｐＨ１９−ＴＮＦα若しくはｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡプラスミドをトランスフェクトしたＳＫ−ＯＶ３細胞から、又は培養培地でＴＮＦαタンパク質の存在の下で増殖したＳＫ−ＯＶ３細胞から単離したＲＮＡのＴＮＦα転写物のレベルを描くＲＴ−ＰＣＲ分析の図である。プライマー５’−ＧＧＣＴＣＴＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣ−３’（配列番号１６）及び５’−ＧＧＧＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧ−３’（配列番号１７）を使ったＧＡＤＰ  ＲＴ−ＰＣＲ分析。レーン１−１．５μｇ／ｍｌの制御プラスミドｌｕｃ１をトランスフェクトした細胞；レーン２−０．０２μｇ／ウェルのｐＨ１９−ＴＮＦαプラスミドをトランスフェクトした細胞；レーン３−培養培地において１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαタンパク質の存在の下で増殖した細胞；レーン４−０．０２μｇ／ウェルのｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡプラスミドをトランスフェクトした細胞；レーン５−培養培地において１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαタンパク質の存在の下で増殖した細胞；レーン６−未処置細胞；及び、レーン７−ＲＴ−ＰＣＲ反応のための負の対照（すなわち、ＲＮＡなし）。ＴＮＦα及びＧＡＤＰ内部標準ＰＣＲ産物の位置はマークされている（黒矢印）。“Ｍ”−１００−ｂｐ分子量マーカー。
【図７ａ】ヌードマウスにおける皮下卵巣腫瘍の増殖に対するｐＨ１９−ＤＴＡ、ｐＨ１９−ＴＮＦα又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターの直接腫瘍内投与の効果を描くヒストグラムである。マウスは、２日間の間隔のうちに２５μｇのｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ（ＴＮＦ−ＤＴＡ−Ｋａｎ）、ｐＨ１９−ＴＮＦα（ＴＮＦ−Ｋａｎ）、ｐＨ１９−ＤＴＡ（ＤＴＡ−Ｋａｎ）又はＰＥＩと複合したｐＨ１９−Ｌｕｃ（ＬＵＣ−Ｋａｎ）の注射を４回受けた。最後の処置の１日後、動物は屠殺した。腫瘍寸法はプラスミドでの処置に先立って屠殺後にｉｎ  ｓｉｔｕで測定した。ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ、ｐＨ１９−ＴＮＦα、ｐＨ１９−ＤＴＡ及びｐＨ１９−Ｌｕｃベクターによる処置に続く腫瘍サイズの平均倍増（「平均倍増」は開始平均容積間に対する最終平均容積の比を表す）。
【図７ｂ】ヌードマウスにおける皮下卵巣腫瘍の増殖に対するｐＨ１９−ＤＴＡ、ｐＨ１９−ＴＮＦα又はｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡベクターの直接腫瘍内投与の効果を描くヒストグラムである。マウスは、２日間の間隔のうちに２５μｇのｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ（ＴＮＦ−ＤＴＡ−Ｋａｎ）、ｐＨ１９−ＴＮＦα（ＴＮＦ−Ｋａｎ）、ｐＨ１９−ＤＴＡ（ＤＴＡ−Ｋａｎ）又はＰＥＩと複合したｐＨ１９−Ｌｕｃ（ＬＵＣ−Ｋａｎ）の注射を４回受けた。最後の処置の１日後、動物は屠殺した。腫瘍寸法はプラスミドでの処置に先立って屠殺後にｉｎ  ｓｉｔｕで測定した。ｐＨ１９−ＴＮＦ−ＩＲＥＳ−ＤＴＡ、ｐＨ１９−ＴＮＦα、ｐＨ１９−ＤＴＡ及びｐＨ１９−Ｌｕｃ処置腫瘍の腫瘍増殖プログレッション（ＴＰＧ）［ＴＰＧ＝（Ｖｆ／Ｖｉ×１００）−１００］，Ｖｉ＝開始容積及びＶｆ＝最終容積。
【図１ａ】
2009508516.tif 000006
【図１ｂ】
2009508516.tif 000007
【図２ａ】
2009508516.tif 000008
【図２ｂ】
2009508516.tif 000009
【図２ｃ】
2009508516.tif 000010
【図３】
2009508516.tif 000011
【図４】
2009508516.tif 000012
【図５ａ】
2009508516.tif 000013
【図５ｂ】
2009508516.tif 000014
【図５ｃ】
2009508516.tif 000015
【図５ｄ】
2009508516.tif 000016
【図５ｅ】
2009508516.tif 000017
【図５ｆ】
2009508516.tif 000018
【図５ｇ】
2009508516.tif 000019
【図５ｈ】
2009508516.tif 000020
【図５ｉ】
2009508516.tif 000021
【図６ａ】
2009508516.tif 000022
【図６ｂ】
2009508516.tif 000023
【図７ａ】
2009508516.tif 000024
【図７ｂ】
2009508516.tif 000025
【配列表】
2009508516000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月10日(2007.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）をコードする第１核酸配列、
（ｉｉ）ジフテリア毒素をコードする第２核酸配列、及び
（ｉｉｉ）癌特異的プロモーターを含む少なくとも１個の追加の核酸配列
を含み、前記ＴＮＦαをコードする配列及びジフテリア毒素をコードする配列が前記癌特異的プロモーターの発現制御の下にある核酸構築物。
【請求項２】
前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列が、リンカー核酸配列を介して転写的に連結されている請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
前記リンカー核酸配列が配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む、又はプロテアーゼ切断認識部位をコードしている請求項２に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記ＴＮＦαが分泌型ＴＮＦαである請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記ＴＮＦαが非分泌型ＴＮＦαである請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記癌特異的プロモーターが、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２  Ｐ３及びＩＧＦ−２  Ｐ４プロモーターからなる群から選択される請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記癌特異的プロモーターがＨ１９プロモーターである請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項８】
前記構築物が配列番号１３に記載する核酸配列を有する請求項７に記載の核酸構築物。
【請求項９】
前記少なくとも１個の追加の核酸配列が、それぞれ独立して癌特異的プロモーターを含む２個の核酸配列を含み、前記ＴＮＦαをコードする配列が１個の癌特異的プロモーターの発現制御の下にあり、前記ジフテリア毒素をコードする配列がもう１個の癌特異的プロモーターの発現制御の下にある請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
前記２個の癌特異的プロモーターが同一である請求項９に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
（ａ）（ｉ）ＴＮＦαをコードする第１の核酸配列、
（ｉｉ）第１の癌特異的プロモーター配列を含む第２の核酸配列
を含み、前記ＴＮＦαをコードする配列が前記第１の癌特異的プロモーター配列の発現制御の下にある第１の核酸構築物、
（ｂ）（ｉ）ジフテリア毒素をコードする第３の核酸配列、
（ｉｉ）第２の癌特異的プロモーター配列を含む第４の核酸配列
を含み、前記ジフテリア毒素をコードする配列が前記第２の癌特異的プロモーター配列の発現制御の下にある第２の核酸構築物
を含む核酸構築物システム。
【請求項１２】
前記第１及び第２の癌特異的プロモーター配列がそれぞれ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２  Ｐ３及びＩＧＦ−２  Ｐ４プロモーターからなる群から選択される請求項１１に記載の核酸構築物システム。
【請求項１３】
前記癌特異的プロモーターがＨ１９プロモーターである請求項１１に記載の核酸構築物システム。
【請求項１４】
前記構築物が配列番号１３に記載の核酸配列を有する請求項１３に記載の核酸構築物システム。
【請求項１５】
前記第１及び第２の癌特異的プロモーター配列が同一である請求項１１に記載の核酸構築物システム。
【請求項１６】
前記第１及び第２の癌特異的プロモーター配列が異なる請求項１１に記載の核酸構築物システム。
【請求項１７】
その必要のある対象の癌を治療する方法であって、対象の癌細胞に請求項１から１６までに記載の核酸構築物のうちのいずれかの治療有効量を投与し、それにより対象の癌を治療することを含む方法。
【請求項１８】
前記癌細胞がＴＮＦ−α又はジフテリア毒素に抵抗性である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
対象を化学療法又は放射線療法で治療することをさらに含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
活性成分として請求項１から１０までに記載の核酸構築物のいずれか、及び薬剤的に許容可能な担体又は希釈剤を含む薬剤組成物。
【請求項２１】
活性成分として請求項１１から１６までに記載の核酸構築物システムのいずれか、及び薬剤的に許容可能な担体又は希釈剤を含む薬剤組成物。
【請求項２２】
トランスフェクション剤をさらに含む請求項２０又は２１に記載の薬剤組成物。
【請求項２３】
癌治療のために同定された薬物を製造するための請求項１から１０までに記載の核酸構築物のいずれかの使用。
【請求項２４】
癌治療のために同定された薬物を製造するための請求項１１から１６までに記載の核酸構築物システムのいずれかの使用。
【請求項２５】
前記薬物が抗癌剤をさらに含む請求項２３又は２４に記載の使用。
【請求項２６】
ＴＮＦα又はジフテリア毒素に抵抗性の癌を治療するために同定された薬物の製造のための請求項２３又は２４に記載の使用。
【国際調査報告】
2009508516.tif 000026
2009508516.tif 000027
2009508516.tif 000028
2009508516.tif 000029