(57)【要約】本発明は、植物遺伝子学の分野にあり、脂肪酸合成経路内の複数の遺伝子の協調操作に関連する組換え核酸分子、構築体、および他の作用物質を提供する。具体的には、本発明の作用物質は、脂肪酸合成経路内の特定の遺伝子の発現の増強および同経路内の特定の他の遺伝子の発現の抑制を同時に行うことに関連する。また、そのような作用物質が組み込まれた植物、特に、植物が変化した種子油組成を示す、そのような構築体が組み込まれた植物も提供する。
2009526550.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全脂肪酸の約４２重量％〜約８５重量％のオレイン酸含量および全脂肪酸の８重量％未満の飽和脂肪酸含量を含む種子油の脂肪酸組成を示すダイズ種子。
【請求項２】
前記種子が内在性ダイズＦＡＤ２−１およびＦＡＴＢの発現を抑制する核酸配列を有するゲノムをさらに含み、前記核酸配列が約２０〜約４２０ヌクレオチドの長さのダイズＦＡＤ２−１のイントロンの断片および約４０〜約４５０ヌクレオチドの長さのダイズＦＡＴＢ遺伝子の断片を含み；前記ゲノムがβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶおよびΔ−９不飽和化酵素の一方または双方の発現を増加させる核酸配列をさらに含む、請求項１記載のダイズ種子。
【請求項３】
ダイズＦＡＤ２−１のイントロンの前記断片およびダイズＦＡＴＢの前記断片がそれぞれセンスおよびアンチセンス方向に転写され、少なくとも部分的に二本鎖であるＲＮＡがもたらされる、請求項２記載のダイズ種子。
【請求項４】
内在性ダイズＦＡＤ２−１およびＦＡＴＢの発現を抑制する前記核酸配列が、植物染色体内に挿入した後に機能的転写ユニットとして組み立てられる、請求項２記載のダイズ種子。
【請求項５】
前記種子が、連続する約２０〜約４２０ヌクレオチドの長さのダイズＦＡＤ２−１のイントロンの断片および連続する約４０〜約４５０ヌクレオチドの長さのダイズＦＡＴＢ遺伝子の断片を含む核酸配列を有するゲノムをさらに含む、請求項１記載のダイズ種子。
【請求項６】
ダイズＦＡＤ２−１のイントロンの前記断片およびダイズＦＡＴＢの前記断片がそれぞれセンスおよびアンチセンス方向に転写され、少なくとも部分的に二本鎖であるＲＮＡがもたらされる、請求項５記載のダイズ種子。
【請求項７】
前記核酸配列が、植物染色体内に挿入した後に機能的転写ユニットとして組み立てられる、請求項５記載のダイズ種子。
【請求項８】
前記種子が、約２０〜約４２０ヌクレオチドの長さのダイズＦＡＤ２−１のイントロンの断片を含む、内在性ダイズＦＡＤ２−１の発現を抑制する核酸配列を有するゲノムをさらに含み；前記ゲノムが、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶおよびΔ−９不飽和化酵素の一方または双方の発現を増加させる核酸配列をさらに含む、請求項１記載のダイズ種子。
【請求項９】
ｉ）植物細胞中で、植物細胞中の内在性ＦＡＤ２遺伝子に由来し、ＦＡＤ２のイントロン断片またはＦＡＤ２のＵＴＲ断片からなる異種ＦＡＤ２配列を発現させ；次いで
ｉｉ）内在性ＦＡＤ２遺伝子を前記異種ＦＡＤ２配列で抑制し、ここに、ＦＡＤ２遺伝子抑制の量が、ＦＡＤ２イントロンの全長またはＦＡＤ２のＵＴＲの全長からなる異種ＦＡＤ２配列を発現させることによって得られる遺伝子発現の量よりも少ない
ことを特徴とする、ＦＡＤ２のイントロン全体またはＦＡＤ２のＵＴＲ全体からなる異種ＦＡＤ２配列を含むｄｓＲＮＡｉ構築体を発現させることによって得られるＦＡＤ２遺伝子抑制の量と比較して、ＦＡＤ２遺伝子抑制の量を低下させる方法。
【請求項１０】
前記ＦＡＤ２のイントロン断片がＦＡＤ２のイントロン１全体の連続する約４０〜約３２０ヌクレオチドであり、前記ＦＡＤ２のＵＴＲ断片がＦＡＤ２の３'ＵＴＲ全体の連続する約１００〜約１４０ヌクレオチドであることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
植物細胞を、内在性ＦＡＤ２遺伝子の一部に由来する、ＦＡＤ２のイントロン断片またはＦＡＤ２のＵＴＲ断片からなる異種ＦＡＤ２配列で形質転換させ；次いで、前記異種ＦＡＤ２配列の転写が開始される条件下で前記植物細胞を成長させ、それにより前記油組成が、類似の遺伝的背景を有するが前記異種ＦＡＤ２配列を欠く植物細胞と比較して変更されていることを特徴とする、植物細胞の油組成を変更する方法。
【請求項１２】
ｉ）第１の異種ＦＡＤ２配列で形質転換した植物からのＦＡＤ２遺伝子抑制の量が、類似の遺伝的背景および第２の異種ＦＡＤ２配列を含む植物細胞におけるＦＡＤ２遺伝子抑制の量と比較して少なくとも部分的に低下するまで、前記第１の異種ＦＡＤ２配列の長さを短縮し、前記第２の異種ＦＡＤ２配列が前記第１の異種ＦＡＤ２配列よりも多くの内在性ＦＡＤ２配列からなり；
ｉｉ）類似の遺伝的背景を有するが異種ＦＡＴＢ配列を有さない植物細胞におけるＦＡＴＢの抑制と比較して、植物細胞におけるＦＡＴＢ遺伝子発現を少なくとも部分的に低下させることができる前記異種ＦＡＴＢ配列を発現させ；
ｉｉｉ）前記第１の異種ＦＡＤ２配列および前記異種ＦＡＴＢ配列を有するゲノムを含む植物を成長させ；次いで
ｉｖ）類似の遺伝的背景を有するが前記第１の異種ＦＡＤ２配列および前記異種ＦＡＴＢ配列を欠く植物由来の種子と比較して飽和脂肪酸含量が低下した種子を生産する植物を栽培する
ことを特徴とする、植物種子中のオレイン酸含量を増強し、飽和脂肪酸含量を低下させる方法。
【請求項１３】
脂肪酸合成経路内の内在性遺伝子の発現を抑制できる、少なくとも４０ヌクレオチドの長さの遺伝子要素の断片を単離し；前記遺伝子要素を温帯油種子作物の植物細胞内に導入し；トランスジェニック植物を生成し；トランスジェニック植物種子からの油の脂肪酸組成を調節する前記遺伝子要素を含むトランスジェニック植物種子を選択することを特徴とする、前記温帯油種子作物の種子由来の油の脂肪酸組成を調節する方法。
【請求項１４】
前記内在性遺伝子が脂肪酸合成経路内の２つ以上の内在性遺伝子であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子要素が、脂肪酸合成経路内の前記内在性遺伝子のイントロン、エクソン、輸送ペプチドコードＤＮＡ配列、３'−ＵＴＲ、５'−ＵＴＲ、オープンリーディングフレームまたは転写物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記内在性遺伝子がＦＡＤ２−１、ＦＡＤ３、ＦＡＴＢ、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
前記温帯油種子作物がダイズ、アブラナ、ヒマワリ、ピーナッツ、トウモロコシ、および綿からなる群から選択されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
全脂肪酸の約４２重量％〜約８５重量％のオレイン酸含量および全脂肪酸の８重量％未満の飽和脂肪酸含量を含む種子油の脂肪酸組成を示すダイズ種子の細胞。
【請求項１９】
連続する約２０〜約４２０ヌクレオチドの長さのダイズＦＡＤ２−１のイントロンの断片および連続する約４０〜約４５０ヌクレオチドの長さのダイズＦＡＴＢ遺伝子の断片を含む組換え核酸分子。
【請求項２０】
約２０〜約４２０ヌクレオチドの長さのダイズＦＡＤ２−１のイントロンの断片、約４０〜約４５０ヌクレオチドの長さのダイズＦＡＴＢ遺伝子の断片、およびβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶおよびΔ−９不飽和化酵素の一方または双方の発現を増加させる核酸配列を含む核酸配列を含む組換え核酸分子。
【請求項２１】
全脂肪酸の約４２重量％〜約８５重量％のオレイン酸含量および全脂肪酸の約８重量％以下の飽和脂肪酸含量を含む脂肪酸組成を有する非混合ダイズ油。
【請求項２２】
全脂肪酸の約４２重量％〜約８５重量％のオレイン酸含量および全脂肪酸の８重量％未満の飽和脂肪酸含量を含む種子油の脂肪酸組成を示すダイズ種子に由来するダイズミール。
【請求項２３】
ｉ）ダイズ細胞内に、ＦＡＤ３遺伝子ファミリーの少なくとも２つのメンバーからの核酸配列を含む異種核酸分子を導入し；
ｉｉ）植物細胞における内在性ＦＡＤ３遺伝子発現を少なくとも部分的に低下させることができるＦＡＤ３遺伝子から核酸配列を発現させ；
ｉｉｉ）前記ＦＡＤ３遺伝子ファミリーの少なくとも２つのメンバーからの前記核酸配列を有するゲノムを含む植物細胞を成長させ；次いで
ｉｖ）類似の遺伝的背景を有するが前記ＦＡＤ３遺伝子ファミリーの前記少なくとも２つのメンバーを欠く植物細胞と比較してリノレン酸含量が低下している前記植物細胞を栽培する
ことを特徴とする、ダイズ種子のリノレン酸含量を減少させる方法。
【請求項２４】
前記ＦＡＤ３遺伝子ファミリーがＦＡＤ３−１Ａ、ＦＡＤ３−１Ｂ、およびＦＡＤ３−１Ｃからなる群から選択されることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記ＤＮＡ断片がＦＡＤ３の転写領域５'−または３'−ＵＴＲからのものであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
ＦＡＤ３遺伝子ファミリーの少なくとも２つのメンバーからのＤＮＡ断片を含む組換えＤＮＡ構築体。
【請求項２７】
連続する約２０〜約４２０ヌクレオチドの長さのダイズＦＡＤ２−１のイントロンの断片および連続する約４０〜約４５０ヌクレオチドの長さのダイズＦＡＴＢ遺伝子の断片をさらに含む、請求項２６記載の組換えＤＮＡ構築体。
【請求項２８】
全脂肪酸の約４２重量％〜約８５重量％のオレイン酸含量、全脂肪酸の約８重量％以下の飽和脂肪酸含量、および全脂肪酸の約１.５重量％以下のリノレン酸含量を含む脂肪酸組成を有する非混合ダイズ油。
【請求項２９】
請求項２６記載の組換えＤＮＡ構築体を含むダイズ種子。
【請求項３０】
請求項２９記載のダイズ種子に由来するダイズミール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条第（ｅ）項の下、２００６年２月１３日出願、名称「改変遺伝子サイレンシング」の米国仮出願第６０／７７２,６１４号；２００６年３月１０日付けで出願された、名称「ダイズ種子および油の組成ならびにその作製方法」の米国仮出願第６０／７８１,５１９号、および２００６年３月１６日付けで出願された、名称「核酸構築体および変化した種子油組成の生成方法」の米国出願第１１／３７６,３２８号の優先権を主張するものである。
【０００２】
配列表の組み込み
配列表の紙原稿、および、ファイル名が「Ｏｍｎｉ２  ＡＳ  ＦＩＬＥＤ.ｔｘｔ」であり、サイズが６０,６９０バイト（ＭＳ−ＤＯＳで測定）であり、２００３年９月２５日に記録され、米国出願第１０／６６９,８８８号において提出されたファイルを含むディスケット上のコンピュータ−可読形態の配列表を、ここに出典明示して本明細書の一部とみなす。配列表の紙原稿、および、ファイル名が「ＯｍｎｉＣｈｉｌｄ．ｔｘｔ」であり、サイズが６１,４３４バイト（ＭＳ−ＤＯＳで測定）であり、２００６年３月１５日に記録されたファイルを含むディスケット上のコンピュータ−可読形態の配列表を、ここに出典明示して本明細書の一部とみなす。
【０００３】
本発明は、脂肪酸合成経路内の複数の遺伝子の協調操作に関連する組換え核酸分子、構築体、および他の作用物質に指向される。特に、本発明の作用物質は、脂肪酸合成経路内のある種の遺伝子の発現の増強および同経路内のある種の他の遺伝子の発現の抑制を同時に行うことに関連する。また、本発明は、そのような作用物質が組み込まれた植物、特に、植物が変化した種子油組成を示す、そのような構築体が組み込まれた植物に指向される。
【背景技術】
【０００４】
植物油は様々な用途に用いられている。新規の植物油組成物および生合成または天然植物源から油組成物を得るための改良された手法が必要とされている。意図する油の使用に応じて、様々な異なる脂肪酸組成が所望されている。植物、特に種子中に大量の油を合成する種が、食用および工業用共に重要な油源である。種子油は、脂肪酸が３つのヒドロキシル基のグリセロールにエステル化されているトリアシルグリセロールからほぼ完全に構成される。
【０００５】
ダイズ油は、典型的には、約１６〜２０％の飽和脂肪酸：１３〜１６％のパルミチン酸および３〜４％のステアリン酸を含む。一般的にＧｕｎｓｔｏｎｅら、脂質ハンドブック（Ｔｈｅ  Ｌｉｐｉｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）、Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９９４）を参照されたい。ダイズ油は、特定の市場に対して利点を生じるように様々な育種方法によって改変されている。しかしながら、サラダ油、調理用油およびフライ油の消費者などの主要なダイズ油利用者、ならびにバイオディーゼルおよびバイオルーブ市場などの産業市場に広く有益なダイズ油は、利用可能でない。以前のダイズ油は、高すぎるか、あるいは、酸化安定性、良好な揚げ物香味もしくは飽和脂肪含量などの重要な食品品質特性、または適切な一酸化窒素放出もしくは耐寒性もしくは低温フローなどの重要なバイオディーゼル特性を欠いていた。
【０００６】
高等植物は、共通の代謝経路、すなわちプラスチド内に位置する脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）経路を介して脂肪酸を合成する。β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素は、植物細胞のＦＡＳにおける重要な律速酵素であり、いくつかの変型が存在する。β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉはパルミトイル−ＡＣＰ（Ｃ１６：０）への鎖の伸長を触媒し、一方でβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＩはステアロイル−ＡＣＰ（Ｃ１８：０）への鎖の伸長を触媒する。β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶはβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＩの変異体であり、これも１８：０−ＡＣＰへの鎖の伸長を触媒できる。ダイズでは、ＦＡＳの主要な生成物は１６：０−ＡＣＰおよび１８：０−ＡＣＰである。１８：０−ＡＣＰを不飽和化して１８：１−ＡＣＰを形成することは、プラスチドに局在する可溶性のΔ−９不飽和化酵素（「ステアロイル−ＡＣＰ不飽和化酵素」とも呼ばれる）によって触媒される。Ｖｏｅｌｋｅｒら、５２  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３３５〜６１（２００１）を参照されたい。
【０００７】
プラスチドＦＡＳおよびΔ−９不飽和化酵素の産物である１６：０−ＡＣＰ、１８：０−ＡＣＰ、および１８：１−ＡＣＰは、特定のチオエステラーゼ（ＦＡＴ）によって加水分解される。植物チオエステラーゼは、配列相同性および基質優先度に基づいて２つの遺伝子ファミリーに分類できる。第１のファミリーであるＦＡＴＡには、主に１８：１−ＡＣＰに対して活性を有する長鎖アシル−ＡＣＰチオエステラーゼが含まれる。第２のファミリーであるＦＡＴＢの酵素は、一般的に１６：０−ＡＣＰ（パルミトイル−ＡＣＰ）、１８：０−ＡＣＰ（ステアロイル−ＡＣＰ）、および１８：１−ＡＣＰ（オレオイル−ＡＣＰ）を利用する。そのようなチオエステラーゼは、植物中での新規の脂肪酸生合成中に鎖の長さを決定することにおいて重要な役割を有し、したがって、これらの酵素は、脂肪酸アシル組成物の様々な修飾の提供、特に種子貯蔵油中に存在する様々な脂肪酸アシル基の相対的割合に関して有用である。
【０００８】
ＦＡＴＡおよびＦＡＴＢ反応の産物である遊離脂肪酸はプラスチドから離れ、そのそれぞれのアシル−ＣｏＡエステルに変換される。アシル−ＣｏＡは、小胞体（ＥＲ）内に位置する脂質生合成経路（ケネディー経路）の基質である。この経路は、膜脂質の形成および種子油を構成するトリアシルグリセロールの生合成を担っている。ＥＲ中にはさらなる膜結合不飽和化酵素が存在し、これは１８：１をポリ不飽和脂肪酸へとさらに不飽和化できる。Δ−１２不飽和化酵素（ＦＡＤ２）は１８：１内への二重結合の挿入を触媒し、リノール酸（１８：２）を形成する。Δ−１５不飽和化酵素（ＦＡＤ３）は１８：２内への二重結合の挿入を触媒し、リノレン酸（１８：３）を形成する。
【０００９】
現在、多くの複雑な生化学的経路が、通常は単一の遺伝子の抑制または過剰発現によって遺伝子操作されている。植物遺伝子操作の潜在性をさらに開拓するためには、経路内の複数の遺伝子の協調操作が必要である。性的交配、再形質転換、同時形質転換、および連結した導入遺伝子の使用を含めたいくつかの手法が、１つの植物内で導入遺伝子を組み合わせるために用いられている。連結した部分的な遺伝子配列を有するキメラ導入遺伝子を用いて、多数の植物内在性遺伝子を協調的に抑制できる。ウイルスポリタンパク質に基づいてモデリングした構築体を用いて、複数のコード遺伝子を植物細胞内に同時に導入できる。総説には、Ｈａｌｐｉｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４７：２９５〜３１０（２００１）を参照されたい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、所望の植物表現型には、１つまたは複数の遺伝子の発現、かつ同時にもう一つの遺伝子または複数の遺伝子の発現の低下が必要であり得る。したがって、単一のトランスジェニック構築体を用いて、植物において１つまたは複数の遺伝子を過剰発現させ、同時にもう一つの遺伝子または複数の遺伝子の発現を抑制、またはダウンレギュレーションする必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、細胞または生物内に導入した場合に、少なくとも１つまたは複数の内在性ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、またはＦＡＴＢ  ＲＮＡの発現を抑制する、少なくとも部分的に低下させる、低下させる、実質的に低下させる、または有効に排除でき、それと同時に、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶ、Δ−９不飽和化酵素、またはＣＰ４  ＥＰＳＰＳをコードしている遺伝子から転写された１つまたは複数のＲＮＡまたはタンパク質を共発現、同時発現、または協調的に産生する、１つまたは複数の組換え核酸分子を提供する。本発明はまた、１つまたは複数の核酸分子で形質転換させた植物細胞および植物、ならびに形質転換した植物から生産された種子、油、および他の産物も提供する。
【００１２】
本発明はまた、宿主細胞内で発現させた場合に、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、およびＦＡＴＢ遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つ、好ましくは２つの遺伝子の内在性発現を抑制できる第１の組のＤＮＡ配列と；宿主細胞内で発現させた場合に、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ遺伝子、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶ遺伝子、Δ−９不飽和化酵素遺伝子、およびＣＰ４  ＥＰＳＰＳからなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子の内在性発現を増加させることができる第２の組のＤＮＡ配列とを含む組換え核酸分子も提供する。
【００１３】
本発明はさらに、宿主細胞内で発現させた場合に、ｄｓＲＮＡ構築体を形成し、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、およびＦＡＴＢ遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つ、好ましくは２つの遺伝子の内在性発現を抑制でき、ＦＡＤ２遺伝子の非コード領域に対して少なくとも９０％の同一性を示す第１のＲＮＡ配列を発現する第１の非コード配列、第１のＲＮＡ配列と二本鎖ＲＮＡ分子を形成できる第１のアンチセンスＲＮＡ配列を発現する第１のアンチセンス配列、ＦＡＴＢ遺伝子の非コード領域に対して少なくとも９０％の同一性を示す第２のＲＮＡ配列を発現する第２の非コード配列、および第２のＲＮＡ配列と二本鎖ＲＮＡ分子を形成できる第２のアンチセンスＲＮＡ配列を発現する第２のアンチセンス配列を含む、第１の組のＤＮＡ配列と；宿主細胞内で発現させた場合に、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ遺伝子、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶ遺伝子、Δ−９不飽和化酵素遺伝子、およびＣＰ４  ＥＰＳＰＳからなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子の内在性発現を増加させることができる第２の組のＤＮＡ配列とを含む組換え核酸分子を提供する。
【００１４】
本発明は、植物をこれらの組換え核酸分子で形質転換させる方法を提供する。この方法には、（Ａ）植物細胞を、宿主細胞内で発現させた場合に、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、およびＦＡＴＢ遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つ、好ましくは２つの遺伝子の内在性発現を抑制できる第１の組のＤＮＡ配列、および宿主細胞内で発現させた場合に、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ遺伝子、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶ遺伝子、Δ−９不飽和化酵素遺伝子、およびＣＰ４  ＥＰＳＰＳからなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子の内在性発現を増加させることができる第２の組のＤＮＡ配列を含む組換え核酸分子で形質転換させ；次いで、（Ｂ）類似の遺伝的背景を有するが組換え核酸分子を欠く植物由来の種子と比較してオレイン酸含量が増加し、飽和脂肪酸含量が低下し、ポリ不飽和脂肪酸含量が低下した種子を生産する、形質転換した植物を成長させることを含む、オレイン酸含量が増加し、飽和脂肪酸含量が低下し、ポリ不飽和脂肪酸含量が低下した種子を有する形質転換した植物を生産する方法が含まれる。
【００１５】
さらに、植物細胞を組換え核酸分子で形質転換させる方法を提供する。この方法には、（Ａ）植物細胞を、宿主細胞内で発現させた場合に、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、およびＦＡＴＢ遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つ、好ましくは２つの遺伝子の内在性発現を抑制できる第１の組のＤＮＡ配列、および宿主細胞内で発現させた場合に、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ遺伝子、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶ遺伝子、Δ−９不飽和化酵素遺伝子、およびＣＰ４  ＥＰＳＰＳからなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子の内在性発現を増加させることができる第２の組のＤＮＡ配列を含む組換え核酸分子で形質転換させ；次いで、（Ｂ）第１の組のＤＮＡ配列および第２の組のＤＮＡ配列の転写が開始される条件下で植物細胞を成長させ、それにより油組成が、類似の遺伝的背景を有するが組換え核酸分子を欠く植物細胞と比較して変更されていることを含む、植物細胞の油組成を変更する方法が含まれる。
【００１６】
本発明はまた、宿主細胞内で発現させた場合に、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、およびＦＡＴＢ遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つ、好ましくは２つの遺伝子の内在性発現を抑制できる第１の組のＤＮＡ配列と、宿主細胞内で発現させた場合に、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ遺伝子、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶ遺伝子、Δ−９不飽和化酵素遺伝子、およびＣＰ４  ＥＰＳＰＳからなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子の内在性発現を増加させることができる第２の組のＤＮＡ配列とを含む組換え核酸分子を含む形質転換した植物も提供する。本発明はさらに、５５〜８０重量％のオレイン酸、１０〜４０重量％のリノール酸、６重量％以下のリノレン酸、および２〜８重量％の飽和脂肪酸を含む油組成を示す種子を生じる形質転換したダイズ植物、ならびにその植物に由来する供給原料、植物部位、および種子を提供する。もう一つの実施形態では、本発明は、約６５〜８０％のオレイン酸、約３〜８％の飽和物、および約１２〜３２％のポリ不飽和物を含む油組成を示す種子を生じる、形質転換したダイズ植物を提供する。また、そのような植物に由来する供給原料、植物部位、および種子も含まれる。もう一つの実施形態では、本発明は、約６５〜８０％のオレイン酸、約２〜３.５％の飽和物、および約１６.５〜３３％のポリ不飽和物を含む油組成を示す種子を生じる、形質転換したダイズ植物を提供する。また、そのような植物に由来する供給原料、植物部位、および種子も含まれる。
【００１７】
本発明は、５５〜８０重量％のオレイン酸、１０〜４０重量％のリノール酸、６重量％以下のリノレン酸、および２〜８重量％の飽和脂肪酸を含む油組成を示すダイズ種子を提供し、また、６５〜８０重量％のオレイン酸、１０〜３０重量％のリノール酸、６重量％以下のリノレン酸、および２〜８重量％の飽和脂肪酸を含む油組成を示すダイズ種子も提供する。もう一つの実施形態では、本発明は、約６５〜８０％のオレイン酸、約３〜８％の飽和物、および約１２〜３２％のポリ不飽和物を含む油組成を示すダイズ種子を提供する。もう一つの実施形態では、本発明は、約６５〜８０％のオレイン酸、約２〜３.５％の飽和物、および約１６.５〜３３％のポリ不飽和物を含む油組成を示すダイズ種子を提供する。
【００１８】
本発明はまた、６９〜７３重量％のオレイン酸、２１〜２４重量％のリノール酸、０.５〜３重量％のリノレン酸、および２〜３重量％の飽和脂肪酸を含む油組成を含むダイズ食品も提供する。
【００１９】
本発明によって提供される粗ダイズ油は、５５〜８０重量％のオレイン酸、１０〜４０重量％のリノール酸、６重量％以下のリノレン酸、および２〜８重量％の飽和脂肪酸を含む油組成を示す。本発明によって提供されるもう一つの粗ダイズ油は、６５〜８０重量％のオレイン酸、１０〜３０重量％のリノール酸、６重量％以下のリノレン酸、および２〜８重量％の飽和脂肪酸を含む油組成を示す。もう一つの実施形態では、本発明によって提供される粗ダイズ油は、約６５〜８０％のオレイン酸、約３〜８％の飽和物、および約１２〜３２％のポリ不飽和物を含む油組成を示す。もう一つの実施形態では、本発明によって提供される粗ダイズ油は、約６５〜８０％のオレイン酸、約２〜３.５％の飽和物、および約１６.５〜３３％のポリ不飽和物を含む油組成を示す。
【００２０】
本発明はまた、約４２重量％〜約８５重量％のオレイン酸および約８重量％〜約１.５重量％の飽和脂肪酸を含む油組成を示すダイズ種子も提供する。もう一つの実施形態では、本発明のダイズ種子は、約４２重量％〜約８５重量％のオレイン酸、約８重量％〜約１.５重量％の飽和脂肪酸、３５重量％未満のリノレン酸を含む油組成を示し、オレイン酸およびリノレン酸の合わせた量は全油組成の約６５重量％〜約９０重量％であり；種子は、宿主細胞内に、連続する約５０〜約４００ヌクレオチドの長さのＦＡＤ２−１のイントロンの断片、ＦＡＴＢの３'ＵＴＲ、およびＦＡＴＢの５'ＵＴＲを有するＤＮＡ配列、異種β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶ、ならびに異種Δ−９不飽和化酵素を有する組換え核酸分子を有する。
【００２１】
本発明のダイズ種子は、約５０重量％〜約８０重量％のオレイン酸、約８重量％〜約１.５重量％の飽和脂肪酸、約２重量％〜約４５重量％のリノール酸、約４重量％〜約１４重量％のリノレン酸を含む油組成を示すことができ、オレイン酸およびリノレン酸の合わせた量は全油組成の約６５重量％〜約９０重量％であり、種子は、連続する約５０〜約４００ヌクレオチドの長さのＦＡＤ２−１のイントロンの断片、ＦＡＴＢのＣＴＰコード領域、およびＦＡＴＢの５'ＵＴＲの連続する４２ヌクレオチドを含むＤＮＡ配列を含む組換え核酸分子を含む。もう一つの実施形態では、ダイズ種子は、ＦＡＤ２およびＦＡＴＢの内在性発現を抑制するＤＮＡ配列を含む組換え核酸分子を含むことができ、種子は、４６〜７５重量％のオレイン酸、１.５〜８.５重量％の飽和脂肪酸、２.５〜３８重量％のリノール酸、および４.５〜１７.５重量％のリノレン酸を含む油組成を示す。
【００２２】
本発明にはまた、ｉ）植物細胞中で、植物細胞中の内在性ＦＡＤ２遺伝子に由来し、ＦＡＤ２のイントロン断片またはＦＡＤ２のＵＴＲ断片からなる組換えＦＡＤ２配列を発現させ；次いで、ｉｉ）組換えＦＡＤ２配列を用いて内在性ＦＡＤ２遺伝子を抑制し、ここに、ＦＡＤ２遺伝子抑制の量が、ＦＡＤ２イントロンの全長またはＦＡＤ２のＵＴＲの全長からなる組換えＦＡＤ２配列を有するｄｓＲＮＡｉ構築体を発現させることによって得られる遺伝子発現の量よりも少ないことによる、ＦＡＤ２のイントロン全体またはＦＡＤ２のＵＴＲ全体からなる組換えＦＡＤ２配列を有するｄｓＲＮＡｉ構築体を発現させることによって得られるＦＡＤ２遺伝子抑制の量と比較してＦＡＤ２遺伝子抑制の量を低下させる方法も含まれる。
【００２３】
本発明はまた、内在性ＦＡＤ２遺伝子の一部に由来する組換えＦＡＤ２配列で植物細胞を形質転換させることによる、植物細胞の油組成を変更する方法も提供する。組換えＦＡＤ２配列はＦＡＤ２のイントロン断片またはＦＡＤ２のＵＴＲ断片からなり；組換えＦＡＤ２配列の転写が開始される条件下で植物細胞を成長させ、それにより油組成は、類似の遺伝的背景を有するが組換えＦＡＤ２配列を欠く植物細胞と比較して変更されている。もう一つの実施形態では、ｉ）第１の組換えＦＡＤ２配列で形質転換した植物からのＦＡＤ２遺伝子抑制の量が、類似の遺伝的背景および第２の組換えＦＡＤ２配列を含む植物細胞におけるＦＡＤ２遺伝子抑制の量と比較して少なくとも部分的に低下するまで、第１の組換えＦＡＤ２配列の長さを短縮し、ここに、第２の組換えＦＡＤ２配列が第１の組換えＦＡＤ２配列よりも多くの内在性ＦＡＤ２配列からなり；ｉｉ）類似の遺伝的背景を有するが組換えＦＡＴＢ配列を有さない植物細胞におけるＦＡＴＢの抑制と比較して、植物細胞におけるＦＡＴＢ遺伝子発現を少なくとも部分的に低下させることができる組換えＦＡＴＢ配列を発現させ；ｉｉｉ）第１の組換えＦＡＤ２配列および組換えＦＡＴＢ配列を含む組換え核酸分子を有する植物を成長させ；次いで、ｉｖ）類似の遺伝的背景を有するが第１の組換えＦＡＤ２配列および組換えＦＡＴＢ配列を欠く植物由来の種子と比較して飽和脂肪酸含量が低下した種子を生産する植物を栽培することによる、植物種子中のオレイン酸含量を増強し、飽和脂肪酸含量を低下させる方法。
【００２４】
さらにもう一つの実施形態では、本発明には、植物細胞を、ＦＡＤ２およびＦＡＴＢの内在性発現を抑制する組換えＤＮＡ配列を含む組換え核酸分子で形質転換させ、ここに、組換えＤＮＡ配列は組換えＦＡＤ２および組換えＦＡＴＢの核酸配列を有し、ＦＡＤ２配列はＦＡＤ２のイントロンの配列全体未満からなり；類似の遺伝的背景を有するが組換えＤＮＡ配列を欠く植物由来の種子と比較して飽和脂肪酸含量が低下した種子を生産する、形質転換した植物を成長させることによる、飽和脂肪酸含量が低下した種子を有する形質転換した植物を生産する方法が含まれる。
【００２５】
もう一つの実施形態では、本発明は、脂肪酸合成経路内の内在性遺伝子の発現を抑制できる、少なくとも４０ヌクレオチドの長さの遺伝子要素を単離し；遺伝子要素の複数の短縮した断片を作製し；複数の短縮した断片のそれぞれを温帯油種子作物の植物細胞内に導入してトランスジェニック植物を作製し；次いで、種子油の脂肪酸組成に望ましい変化を与える、決定された長さおよび配列の短縮した断片を含むトランスジェニック植物を選択することによる、温帯油種子作物の種子由来の油の脂肪酸組成を調節する方法に指向される。
【００２６】
本発明にはまた、植物細胞におけるＦＡＤ２の内在性発現を抑制するＤＮＡ配列を有する飽和脂肪酸含量が強く低下し、オレイン酸含量が中程度に増強された油組成を示すダイズ種子も含まれ、ここに、そのＤＮＡ配列は、ＦＡＤ２のイントロン断片からなる組換えＦＡＤ２配列を有する。本発明のもう一つの実施形態は、ＦＡＤ２−１Ａのイントロン断片が連続する約６０〜約３２０ヌクレオチドである、ＦＡＤ２−１Ａのイントロンの配列を含む核酸分子である。代替実施形態では、本発明にはまた、ダイズＦＡＤ２−１のイントロンを含む、内在性ダイズＦＡＤ２−１の発現を抑制する第１の組換えＤＮＡ配列、ならびに増加したレベルのＫＡＳＩ、Δ−９不飽和化酵素、ＫＡＳＩＶ、およびそれらの組合せからなる群から選択された遺伝子を発現する第２の組換えＤＮＡ配列を有するダイズ種子も含まれる。
【００２７】
本発明にはまた、全脂肪酸の約４２重量％〜約８５重量％のオレイン酸含量および全脂肪酸の８重量％未満の飽和脂肪酸含量を含む種子油の脂肪酸組成を示すダイズ種子のダイズ植物細胞も含まれる。また、本発明には、全脂肪酸の約４２重量％〜約８５重量％のオレイン酸含量および全脂肪酸の約３重量％未満のリノレン酸含量を含む種子油の脂肪酸組成を示すダイズ種子のダイズ植物細胞も含まれる。
【００２８】
本発明にはまた、ＦＡＤ２−１Ａのイントロンが連続する約６０〜約３２０ヌクレオチドである、ＦＡＤ２−１Ａのイントロンの配列を有する核酸分子も含まれる。また、連続する約２０〜約４２０ヌクレオチドの長さのダイズＦＡＤ２−１のイントロンの断片および連続する約４０〜約４５０ヌクレオチドの長さのダイズＦＡＴＢ遺伝子の断片を含む組換えＤＮＡ構築体も含まれる。もう一つの実施形態には、ダイズＦＡＤ２−１およびＦＡＴＢの内在性発現を抑制する、連続する約２０〜約４２０ヌクレオチドの長さのＦＡＤ２−１のイントロンの断片、ダイズＦＡＴＢの３'ＵＴＲ、およびダイズＦＡＴＢの５'ＵＴＲまたはＣＴＰコード領域が含まれる第１の組換えＤＮＡ配列、ならびにβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶおよびΔ−９不飽和化酵素からなる群から選択された遺伝子の少なくとも１つの発現を増加させる第２の組換えＤＮＡ配列を有する組換え核酸分子が含まれる。
【００２９】
本発明にはまた、全脂肪酸の約４２重量％〜約８５重量％のオレイン酸含量および全脂肪酸の約１.５％〜約８重量％の飽和脂肪酸含量を含む脂肪酸組成を有する非混合ダイズ油；全脂肪酸の約４２重量％〜約８５重量％のオレイン酸含量および全脂肪酸の約８重量％以下の飽和脂肪酸含量を含む脂肪酸組成を有する非混合ダイズ油；全脂肪酸の約４２重量％〜約８５重量％のオレイン酸含量および全脂肪酸の３重量％未満のリノレン酸含量を含む脂肪酸組成を有する非混合ダイズ油；ならびに全脂肪酸の約４２重量％〜約８５重量％のオレイン酸含量、全脂肪酸の約８重量％以下の飽和脂肪酸含量、および全脂肪酸の約１.５重量％以下のリノレン酸含量を含む脂肪酸組成を有する非混合ダイズ油も含まれる。
【００３０】
本発明にはまた、全脂肪酸の約４２重量％〜約８５重量％のオレイン酸含量および全脂肪酸の８重量％未満の飽和脂肪酸含量を含む種子油の脂肪酸組成を示すダイズ種子に由来するダイズミールも含まれる。また、全脂肪酸の約４２重量％〜約８５重量％のオレイン酸含量および全脂肪酸の約３重量％未満のリノレン酸含量を含む種子油の脂肪酸組成を示すダイズ種子に由来するダイズミールも含まれる。
【００３１】
本発明にはまた、ｉ）植物細胞中で、植物細胞中の内在性ＦＡＤ２遺伝子に由来し、ＦＡＤ２のイントロン断片またはＦＡＤ２のＵＴＲ断片からなる異種ＦＡＤ２配列を発現させ；ｉｉ）内在性ＦＡＤ２遺伝子を異種ＦＡＤ２配列で抑制し、ここに、ＦＡＤ２遺伝子抑制の量が、ＦＡＤ２イントロンの全長またはＦＡＤ２のＵＴＲの全長からなる異種ＦＡＤ２配列を発現させることによって得られる遺伝子発現の量よりも少ないことによる、ＦＡＤ２のイントロン全体またはＦＡＤ２のＵＴＲ全体からなる異種ＦＡＤ２配列を含むｄｓＲＮＡｉ構築体を発現させることによって得られるＦＡＤ２遺伝子抑制の量と比較して、ＦＡＤ２遺伝子抑制の量を低下させる方法も含まれる。
【００３２】
本発明にはまた、植物細胞を内在性ＦＡＤ２遺伝子の一部に由来する、ＦＡＤ２のイントロン断片またはＦＡＤ２のＵＴＲ断片からなる異種ＦＡＤ２配列で形質転換させ；次いで、異種ＦＡＤ２配列の転写が開始される条件下で植物細胞を成長させる、それにより油組成が、類似の遺伝的背景を有するが異種ＦＡＤ２配列を欠く植物細胞と比較して変更させることによる、植物細胞の油組成を変更する方法も含まれる。
【００３３】
本発明にはまた、ｉ）第１の異種ＦＡＤ２配列で形質転換した植物からのＦＡＤ２遺伝子抑制の量が、類似の遺伝的背景および第２の異種ＦＡＤ２配列を含む植物細胞におけるＦＡＤ２遺伝子抑制の量と比較して少なくとも部分的に低下するまで、第１の異種ＦＡＤ２配列の長さを短縮し、ここに、第２の異種ＦＡＤ２配列は、第１の異種ＦＡＤ２配列よりも多くの内在性ＦＡＤ２配列からなり；ｉｉ）類似の遺伝的背景を有するが異種ＦＡＴＢ配列を有さない植物細胞におけるＦＡＴＢの抑制と比較して、植物細胞におけるＦＡＴＢ遺伝子発現を少なくとも部分的に低下させることができる異種ＦＡＴＢ配列を発現させ；ｉｉｉ）第１の異種ＦＡＤ２配列および異種ＦＡＴＢ配列を有するゲノムを含む植物を成長させ；次いで、ｉｖ）類似の遺伝的背景を有するが第１の異種ＦＡＤ２配列および異種ＦＡＴＢ配列を欠く植物由来の種子と比較して、飽和脂肪酸含量が低下した種子を生産する植物を栽培することを含む、植物種子中のオレイン酸含量を増強し、飽和脂肪酸含量を低下させる方法も含まれる。
【００３４】
本発明にはまた、脂肪酸合成経路内の内在性遺伝子の発現を抑制できる、少なくとも４０ヌクレオチドの長さの遺伝子要素の断片を単離し；遺伝子要素を温帯油種子作物の植物細胞内に導入し；トランスジェニック植物を生成し；トランスジェニック植物種子からの油の脂肪酸組成を調節する遺伝子要素を含むトランスジェニック植物種子を選択することを含む、温帯油種子作物の種子由来の油の脂肪酸組成を調節する方法も含まれる。
【００３５】
もう一つの実施形態では、本発明には、全脂肪酸の約４２重量％〜約８５重量％のオレイン酸含量および全脂肪酸の８重量％未満の飽和脂肪酸含量を含む種子油の脂肪酸組成を示すダイズ種子の細胞が含まれる。
【００３６】
本発明にはまた、連続する約２０〜約４２０ヌクレオチドの長さのダイズＦＡＤ２−１のイントロンの断片および連続する約４０〜約４５０ヌクレオチドの長さのダイズＦＡＴＢ遺伝子の断片を含む異種核酸分子も含まれる。もう一つの実施形態では、本発明は、約２０〜約４２０ヌクレオチドの長さのダイズＦＡＤ２−１のイントロンの断片、約４０〜約４５０ヌクレオチドの長さのダイズＦＡＴＢ遺伝子の断片、およびβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶおよびΔ−９不飽和化酵素の一方または双方の発現を増加させる核酸配列を含む核酸配列を含む異種核酸分子に指向される。
【００３７】
本発明はまた、ｉ）ダイズ細胞内に、ＦＡＤ３遺伝子ファミリーの少なくとも２つのメンバーからの核酸配列を含む異種核酸分子を導入し；ｉｉ）植物細胞における内在性ＦＡＤ３遺伝子発現を少なくとも部分的に低下させることができるＦＡＤ３遺伝子から核酸配列を発現させ；ｉｉｉ）ＦＡＤ３遺伝子ファミリーの少なくとも２つのメンバーからの核酸配列を有するゲノムを含む植物細胞を成長させ；ｉｖ）類似の遺伝的背景を有するがＦＡＤ３遺伝子ファミリーの少なくとも２つのメンバーを欠く植物細胞と比較してリノレン酸含量が低下している植物細胞を栽培することによる、ダイズ種子のリノレン酸含量を減少させる方法に指向される。本発明にはまた、ＦＡＤ３遺伝子ファミリーの少なくとも２つのメンバーからのＤＮＡ断片を有する組換えＤＮＡ構築体も含まれる。
【００３８】
本発明にはまた、全脂肪酸の約４２重量％〜約８５重量％のオレイン酸含量、全脂肪酸の約８重量％以下の飽和脂肪酸含量、および全脂肪酸の約１.５重量％以下のリノレン酸含量を含む脂肪酸組成を有する非混合ダイズ油も含まれる。
【００３９】
（図面の簡単な説明）
図１〜４は、それぞれ例示的な核酸分子の配置を示す。
図５（ａ）〜（ｄ）および図６（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ第１の組のＤＮＡ配列の例示的な配置を示す。
図７〜２０は、それぞれ本発明の核酸分子を示す。
図２１は、構築体ｐＭＯＮ６８５３７を示す。
図２２は、構築体ｐＭＯＮ６８５３９を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
核酸配列の説明
配列番号１は、ＦＡＤ２−１Ａのイントロン１の核酸配列である。
【００４１】
配列番号２は、ＦＡＤ２−１Ｂのイントロン１の核酸配列である。
【００４２】
配列番号３は、ＦＡＤ２−１Ｂプロモーターの核酸配列である。
【００４３】
配列番号４は、ＦＡＤ２−１Ａゲノムクローンの核酸配列である。
【００４４】
配列番号５および６は、それぞれＦＡＤ２−１Ａの３'ＵＴＲおよび５'ＵＴＲの核酸配列である。
【００４５】
配列番号７〜１３は、それぞれＦＡＤ３−１Ａのイントロン１、２、３Ａ、４、５、３Ｂ、および３Ｃの核酸配列である。
【００４６】
配列番号１４は、ＦＡＤ３−１Ｃのイントロン４の核酸配列である。
【００４７】
配列番号１５は、部分的なＦＡＤ３−１Ａゲノムクローンの核酸配列である。
【００４８】
配列番号１６および１７は、それぞれＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲおよび５'ＵＴＲの核酸配列である。
【００４９】
配列番号１８は、部分的なＦＡＤ３−１Ｂゲノムクローンの核酸配列である。
【００５０】
配列番号１９〜２５は、それぞれＦＡＤ３−１Ｂのイントロン１、２、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、４、および５の核酸配列である。
【００５１】
配列番号２６および２７は、それぞれＦＡＤ３−１Ｂの３'ＵＴＲおよび５'ＵＴＲの核酸配列である。
【００５２】
配列番号２８は、ＦＡＴＢ−１ゲノムクローンの核酸配列である。
【００５３】
配列番号２９〜３５は、それぞれＦＡＴＢ−１のイントロンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、およびＶＩＩの核酸配列である。
【００５４】
配列番号３６および３７は、それぞれＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲおよび５'ＵＴＲの核酸配列である。
【００５５】
配列番号３８は、クフェア・プルチェリマＫＡＳ  Ｉ遺伝子の核酸配列である。
【００５６】
配列番号３９は、クフェア・プルチェリマＫＡＳ  ＩＶ遺伝子の核酸配列である。
【００５７】
配列番号４０および４１は、それぞれリシヌス・コムニスおよびシモンジア・シネンシスのΔ−９不飽和化酵素遺伝子の核酸配列である。
【００５８】
配列番号４２は、ＦＡＴＢ−２ｃＤＮＡの核酸配列である。
【００５９】
配列番号４３は、ＦＡＴＢ−２ゲノムクローンの核酸配列である。
【００６０】
配列番号４４〜４７は、それぞれＦＡＴＢ−２のイントロンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの核酸配列である。
【００６１】
配列番号４８〜６０は、ＰＣＲプライマーの核酸配列である。
【００６２】
配列番号６１および６２は、それぞれダイズＦＡＤ３−１Ｃの３'ＵＴＲおよび５'ＵＴＲの核酸配列である。
【００６３】
定義
「ＡＣＰ」とは、アシル担体タンパク質部分をいう。「変化した種子油組成」とは、それ中の脂肪酸のレベルが、類似の遺伝的背景を有するが形質転換していない植物からの種子油と比較して変更または改変されている、本発明のトランスジェニックまたは形質転換した植物からの種子油組成をいう。
【００６４】
「アンチセンス抑制」とは、アンチセンスＲＮＡ分子の導入によって誘導される遺伝子に特異的なサイレンシングをいう。
【００６５】
「ｍＲＮＡまたはタンパク質などの複数の作用物質の共発現」とは、重なり合った時間フレームかつもう一つの作用物質と同じ細胞または組織内における、作用物質の同時発現をいう。「複数の作用物質の協調発現」とは、そのような作用物質からの転写物およびタンパク質の産生共有または同一のプロモーターを利用して実施される場合における、複数の作用物質の共発現をいう。
【００６６】
核酸配列の「相補体」とは、その完全長に沿った配列の相補体をいう。
【００６７】
「共抑制」とは、内在性遺伝子の転写物と同じ鎖のｍＲＮＡを転写できる相同的なセンス構築体の発現による、特定の内在性遺伝子または遺伝子ファミリーの発現レベル、通常はＲＮＡレベルにおける低下である。Ｎａｐｏｌｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、２：２７９〜２８９（１９９０）；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、２：２９１〜２９９（１９９０）。
【００６８】
「粗ダイズ油」とは、ダイズ種子から抽出したが精製、加工、または混合していないダイズ油をいうが、脱ガムされていてもよい。
【００６９】
「ＣＴＰ」とは、「葉緑体輸送ペプチドコード配列」によってコードされている葉緑体輸送ペプチドをいう。
【００７０】
本明細書中でタンパク質および核酸に言及する場合、「由来する」とは、既知のタンパク質または核酸からタンパク質または核酸を、直接的（例えば、既知のタンパク質もしくは核酸の配列を見て、既知のタンパク質もしくは核酸の配列に少なくとも部分的に類似の配列を有するタンパク質もしくは核酸を調製することによる）または間接的に（例えば、既知のタンパク質もしくは核酸に関連する生物からタンパク質もしくは核酸を得ることによる）得ることをいう。タンパク質または核酸を既知のタンパク質または核酸に「由来させる」他の方法は、当業者に知られている。
【００７１】
二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）、二本鎖ＲＮＡ干渉（「ｄｓＲＮＡｉ」）およびＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）はすべて、二本鎖ＲＮＡ分子を少なくとも部分的に転写できる構築体の導入によって誘導される、遺伝子に特異的なサイレンシングをいう。「ｄｓＲＮＡ分子」および「ＲＮＡｉ分子」はどちらも、相補的ヌクレオチド配列を有するセグメントを含むＲＮＡ分子の領域をいい、したがって、互いにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成できる。そのような二本鎖ＲＮＡ分子は、細胞または生物内に導入した場合に、細胞または生物の細胞中に存在するｍＲＮＡ種のレベルを少なくとも部分的に低下させることができる。さらに、ｄｓＲＮＡは、参考としてその全体が本明細書中に組み込まれている、２００５年２月１１日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００４６８１号に記載のように、非正統的組換えおよび部位特異的な組換えによる適切なＤＮＡ断片のｉｎ  ｖｉｖｏの組立て後に作製できる。
【００７２】
「エクソン」とは、発現されたタンパク質の一部またはすべてをコードしている核酸分子、通常はＤＮＡのセグメントを意味する、この用語の通常の意味をいう。
【００７３】
「脂肪酸」とは、遊離脂肪酸および脂肪酸アシル基をいう。
【００７４】
「遺伝子」とは、遺伝子産物の発現に関連する５'プロモーター領域、任意のイントロンおよびエクソン領域ならびに遺伝子産物の発現に関連する３'または５'非翻訳領域を包含する核酸配列をいう。
【００７５】
「遺伝子サイレンシング」とは、遺伝子発現の抑制または遺伝子発現のダウンレギュレーションをいう。
【００７６】
「遺伝子ファミリー」とは、類似の機能的属性を示すタンパク質をコードしている、１つの生物中の２つ以上の遺伝子であり、「遺伝子ファミリーメンバー」とは、植物の遺伝物質内に見つかる遺伝子ファミリーの任意の遺伝子であり、例えば、「ＦＡＤ２遺伝子ファミリーメンバー」とは植物の遺伝物質内に見つかる任意のＦＡＤ２遺伝子である。遺伝子ファミリーの２つのメンバーの例は、ＦＡＤ２−１およびＦＡＤ２−２である。遺伝子ファミリーは、核酸配列の類似度によってさらに分類できる。遺伝子ＦＡＤ２には、例えば、その座位での対立遺伝子が含まれる。好ましくは、遺伝子ファミリーメンバーは、遺伝子のコード配列部分で少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の核酸配列同一性を示す。
【００７７】
「異種」とは、天然に一緒に存在しないことを意味する。
【００７８】
核酸分子は、それがいかに間接的であろうと、ヒトの操作の結果として細胞または生物内に挿入された場合に、「導入された」と言う。導入された核酸分子の例には、限定されるものではないが、形質転換、形質移入、注入、および噴出によって細胞内に導入された核酸、ならびに、限定されるものではないが、コンジュゲート、エンドサイトーシス、および貪食を含めた方法によって生物内に導入された核酸が含まれる。
【００７９】
「イントロン」とは、発現されたタンパク質の一部またはすべてをコードしておらず、内在性の状況では、ＲＮＡ分子に転写されるが、ＲＮＡがタンパク質へと翻訳される前に内在性ＲＮＡからスプライシングされて除去される、核酸分子、通常はＤＮＡのセグメントを意味する、この用語の通常の意味をいう。「イントロンｄｓＲＮＡ分子」および「イントロンＲＮＡｉ分子」はどちらも、細胞または生物内に導入した場合に、細胞または生物の細胞中に存在するｍＲＮＡ種のレベルを少なくとも部分的に低下させることができる二本鎖ＲＮＡ分子をいい、二本鎖ＲＮＡ分子は、細胞または生物中に存在する遺伝子のイントロンに対して、そのイントロン配列を含むｍＲＮＡのレベルを低下させるために十分な同一性を示す。
【００８０】
「低飽和」油組成とは、３.６〜８％の飽和脂肪酸を含む。
【００８１】
「中程度オレイン酸ダイズ種子」とは、油組成中に５０％〜８５％のオレイン酸が存在する種子である。
【００８２】
「低リノレン酸」油組成とは、全脂肪酸の約３重量％未満のリノレン酸を含む。
【００８３】
用語「非コード」とは、発現されたタンパク質の一部またはすべてをコードしていない核酸分子の配列をいう。非コード配列には、限定されるものではないが、イントロン、プロモーター領域、３'非翻訳領域（３'ＵＴＲ）、および５'非翻訳領域（５'ＵＴＲ）が含まれる。
【００８４】
用語「油組成」とは、脂肪酸のレベルをいう。
【００８５】
１つまたは複数の核酸配列と「作動可能に連結した」プロモーターは、多シストロン性の配置に並べられた複数コードもしくは非コード核酸配列を含めた１つまたは複数の核酸配列の発現を駆動できる。
【００８６】
「物理的に連結した」核酸配列とは、単一の核酸分子上に見つかる核酸配列である。
【００８７】
「植物」には、全植物体、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、ならびにその植物細胞および子孫への言及が含まれる。
【００８８】
用語「植物細胞」には、限定されるものではないが、種子懸濁培養物、胚、分裂領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、および小胞子が含まれる。
【００８９】
「植物プロモーター」には、限定されるものではないが、植物ウイルスプロモーター、植物に由来するプロモーター、および植物細胞においてｍＲＮＡの発現を促進するために機能できる合成プロモーターが含まれる。
【００９０】
「多シストロン性遺伝子」または「多シストロン性ｍＲＮＡ」とは、抑制または発現の標的とされた複数の遺伝子の核酸配列に対応する転写された核酸配列を含む、任意の遺伝子またはｍＲＮＡである。そのような多シストロン性遺伝子またはｍＲＮＡは、イントロン、５'ＵＴＲ、３'ＵＴＲ、輸送ペプチドコード配列、エクソン、またはそれらの組合せに対応する配列を含み得、また、組換え多シストロン性遺伝子またはｍＲＮＡは、例えば、限定されるものではないが、１つの遺伝子からの１つまたは複数のＵＴＲおよび第２の遺伝子からの１つまたは複数のイントロンに対応する配列を含み得ることが理解されよう。
【００９１】
「種子に特異的なプロモーター」とは、種子中で優先的にまたは排他的に活性であるプロモーターをいう。「優先的な活性」とは、植物の他の組織、器官またはオルガネラよりも種子中で実質的に大きいプロモーター活性をいう。「種子に特異的な」には、限定されるものではないが、種子の澱粉層、胚乳、および／または胚における活性が含まれる。
【００９２】
「センスイントロン抑制」とは、センスイントロンまたはその断片の導入によって誘導される遺伝子サイレンシングをいう。センスイントロン抑制は、たとえばＦｉｌｌａｔｔｉによってＰＣＴ  ＷＯ０１／１４５３８  Ａ２に記載されている。
【００９３】
ｍＲＮＡまたはタンパク質などの複数の作用物質の「同時発現」とは、もう一つの作用物質と同時の作用物質の発現をいう。そのような発現は部分的にのみ重なり合う場合があり、異なる組織中または異なるレベルでも起こり得る。
【００９４】
「全油レベル」とは、脂肪酸の種類にかかわらず、脂肪酸の全凝集量をいう。本明細書中で使用する全油レベルにはグリセロール主鎖は含まれない。
【００９５】
「導入遺伝子」とは、生物内に導入した遺伝子の発現に関連する核酸配列をいう。導入遺伝子には、限定されるものではないが、生物に内在性の遺伝子または生物内に天然に存在しない遺伝子が含まれる。「トランスジェニック植物」とは、任意の性的または無性的方法による植物からのその導入遺伝子の輸送を促進する様式で導入遺伝子を安定に組み込む、任意の植物である。
【００９６】
「ゼロ飽和」油組成とは、３.６％未満の飽和脂肪酸を含む。
【００９７】
本明細書中でタンパク質および核酸に言及する場合、無修飾の大文字、たとえば「ＦＡＤ２」の使用は、酵素、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドへの言及を示し、斜体の大文字、たとえば「ＦＡＤ２」の使用は、限定されるものではないが、遺伝子、ｃＤＮＡ、およびｍＲＮＡを含めた核酸に言及するために用いる。細胞または生物は特定の酵素をコードしている複数の遺伝子のファミリーを有することができ、遺伝子名に続く大文字（Ａ、Ｂ、Ｃ）はファミリーメンバーを指定するために用いる、すなわち、ＦＡＤ２−１ＡはＦＡＤ２−１Ｂとは異なる遺伝子ファミリーメンバーである。
【００９８】
本明細書中で使用する記載した任意の範囲には、別段に記述しない限りは範囲の端点が含まれる。
【００９９】
Ａ．作用物質
本発明の作用物質は、もう一つの核酸分子とハイブリダイズする核酸分子の能力などの構造的属性、または抗体によって結合される（もしくはそのような結合に関してもう一つの分子と競合する）タンパク質の能力のどちらかに関して「生物活性のある」ことが好ましい。あるいは、そのような属性は触媒的であってもよく、したがって化学反応または応答を媒介する作用物質の能力に関与する。作用物質は、「実質的に精製」されていることが好ましい。本明細書中で使用する用語「実質的に精製」したとは、通常そのネイティブな環境条件と関連している実質的にすべての他の分子から分離された分子をいう。より好ましくは、実質的に精製した分子とは、調製物中に存在する優勢の種である。実質的に精製した分子は、天然の混合物中に存在する他の分子（溶媒を除く）を６０％超、７５％超、好ましくは９０％超、最も好ましくは９５％超含まなくてもよい。用語「実質的に精製した」とは、そのネイティブな環境条件中に存在する分子を包含することを意図しない。
【０１００】
本発明の作用物質は組換えであってもよい。本明細書中で使用する用語「組換え」とは、それがいかに間接的であろうと、ヒトが核酸分子を操作したことによる、またはその結果の、任意の作用物質を意味する（例えば、限定されるものではないがＤＮＡまたはペプチドが含まれる）。また、本発明の作用物質を、作用物質の検出を容易にする試薬、例えば、蛍光標識、化学標識、および／または修飾塩基で標識し得ることも理解されよう。
【０１０１】
本発明の作用物質には、少なくとも部分的に二本鎖である少なくとも１つのＲＮＡ分子を形成する、センスおよびアンチセンス方向に転写されることができるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子が含まれる。好ましい実施形態では、本発明の作用物質は、ＦＡＤ２、ＦＡＴＢ、またはＦＡＤ２およびＦＡＴＢの断片であるヌクレオチド配列を有する二本鎖ＲＮＡ分子である。もう一つの実施形態では、本発明の作用物質は、宿主細胞内で転写されてヌクレオチド配列のセンスおよびアンチセンス方向を生じることができるＤＮＡ分子である。もう一つの実施形態では、核酸分子は、センス方向およびアンチセンス方向のヌクレオチド配列を有することができ、または、もう一つの実施形態では、核酸分子は、センス方向またはアンチセンス方向のヌクレオチド配列を有することができる。そのようなヌクレオチド配列は、同一のプロモーター、異なるプロモーター、単一のプロモーター、または複数のプロモーターと作動可能に連結していることができる。そのようなヌクレオチド配列は、単一または複数のＤＮＡ分子上にあることができる。
【０１０２】
本発明の作用物質には、植物のコード領域もしくは非コード領域に対して、または植物のコードもしくは非コード領域に相補的な核酸配列に対して、その全長にわたって少なくとも５０％、６０％、または７０％同一であるＤＮＡ配列を含む核酸分子が含まれる。植物のコード領域もしくは非コード領域に対して、または植物のコードもしくは非コード領域に相補的な核酸配列に対して、その全長にわたって少なくとも８０％同一；少なくとも８５％同一；少なくとも９０％同一；少なくとも９５％同一；少なくとも９７％同一；少なくとも９８％同一；少なくとも９９％同一；または１００％同一であるＤＮＡ配列がより好ましい。
【０１０３】
当該技術分野でよく理解されている「同一性」とは、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上の核酸分子配列の間の関係性である。当該技術分野では、「同一性」とは、そのような配列のストリング間のマッチによって決定される、ポリペプチドまたは核酸分子配列の間の配列関連性の度合も意味する。「同一性」は、限定されるものではないが、コンピュータ分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｌｅｓｋ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；バイオコンピューティング：情報科学およびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）、Ｓｍｉｔｈ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；配列データのコンピュータ解析、パートＩ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ）、ＧｒｉｆｆｉｎおよびＧｒｉｆｆｉｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；分子生物学における配列解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；配列解析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＤｅｖｅｒｅｕｘ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１；ならびにＣａｒｉｌｌｏおよびＬｉｐｍａｎ、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ、４８：１０７３、１９８８に記載ものを含めた既知の方法によって容易に計算できる。
【０１０４】
同一性を決定する方法は、試験した配列間で最大のマッチを与えるように設計されている。さらに、同一性を決定する方法は、公的に入手可能なプログラムにコーディングされている。２つの配列間の同一性を決定するために用いることができるコンピュータプログラムには、限定されるものではないが、ＧＣＧ；一式の５つのＢＬＡＳＴ  プログラム、すなわちヌクレオチド配列のクエリー用に設計された３つ（ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、およびＴＢＬＡＳＴＸ）ならびにタンパク質配列のクエリー用に設計された２つ（ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮ）が含まれる。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩおよび他の入手源、例えば、ＢＬＡＳＴマニュアル（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ）、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ、メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ、２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０（１９９０）から公的に入手可能である。周知のスミスウォーターマンアルゴリズムを用いて同一性を決定することもできる。
【０１０５】
ポリペプチド配列を比較するためのパラメータには、典型的には、アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３〜４５３（１９７０）；比較マトリックス：ＨｅｎｔｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｔｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１０９１５〜１０９１９（１９９２）のＢＬＯＳＳＵＭ６２；ギャップペナルティ：１２；ギャップ長ペナルティ：４が含まれる。これらのパラメータで用いることができるプログラムは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（「ＧＣＧ」）、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎの「ギャップ」プログラムとして公的に入手可能である。上記パラメータおよび末端ギャップにペナルティなしがペプチド比較の初期設定パラメータである。
【０１０６】
核酸分子配列比較のパラメータには、アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．、４８：４４３〜４５３（１９７０）；比較マトリックス：マッチ−＋１０；ミスマッチ＝０；ギャップペナルティ：５０；ギャップ長ペナルティ：３が含まれる。本明細書中で使用する「％同一性」とは、上記パラメータを核酸分子配列比較の初期設定パラメータとして用いて、ＧＣＧの「ギャップ」プログラム、バージョン１０．２を用いて決定する。
【０１０７】
本発明の核酸配列のサブセットには断片核酸分子が含まれる。「断片核酸分子」とは、より大きな核酸分子の小片をいい、より大きな核酸分子の顕著な部分（もしくは複数の部分）、または実際にそのほとんどからなり得る。断片核酸分子は、連続する約１５〜約４００ヌクレオチド、より好ましくは、連続する約１５〜約４５ヌクレオチド、連続する約２０〜約４５ヌクレオチド、連続する約１５〜約３０ヌクレオチド、連続する約２１〜約３０ヌクレオチド、連続する約２１〜約２５ヌクレオチド、連続する約２１〜約２４ヌクレオチド、連続する約１９〜約２５ヌクレオチド、または連続する約２１ヌクレオチドを有するより小さなオリゴヌクレオチドを含み得る。断片核酸分子は、植物のコードもしくは非コード領域の顕著な部分（もしくは複数の部分）、または実際にそのほとんどからなり得るか、あるいはより小さなオリゴヌクレオチドを含み得る。好ましい実施形態では、断片は植物のコードまたは非コード領域に対して１００％の同一性を示す。もう一つの好ましい実施形態では、断片はより大きな核酸配列の一部分を含む。もう一つの態様では、断片核酸分子は、本発明の核酸分子の連続する少なくとも１５、２５、５０、１００、２００、３００、または４００ヌクレオチドを有する核酸配列を有する。好ましい実施形態では、核酸分子は、植物のコードまたは非コード領域の連続する少なくとも１５、２５、５０、１００、２００、３００、または４００ヌクレオチドを有する核酸配列を有する。最も好ましい実施形態では、核酸分子は、コードまたは非コード領域全体の連続するヌクレオチドの約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％を有する核酸配列を有する。好ましい実施形態では、コードまたは非コード領域全体は、遺伝子全体、単一のエクソン、単一のイントロン、シグナル配列、または非翻訳領域（ＵＴＲ）から選択された遺伝子要素であることができる。遺伝子要素全体の配列全体を有さない遺伝子要素は、遺伝子要素の断片であることができる。本発明の好ましい態様では、遺伝子要素は少なくとも４０ヌクレオチドの長さである。本発明の一態様では、遺伝子の断片は遺伝子要素全体の一部分であり、そのような断片は、遺伝子要素全体の約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％からの連続するヌクレオチドを含む。本発明の一態様では、断片核酸分子は、遺伝子要素全体の長さの約５％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約１０％〜約６０％、約１０％〜約５０％、約２５％〜約６０％、約２５％〜約５０％、約４０％〜約６０％、約４０％〜約８０％、約５０％〜約９０％である。
【０１０８】
好ましい実施形態では、ＦＡＤ２−１イントロンの断片は、連続する約２０〜約４２０、約３０および約４２０、約４０〜約３２０、約５０〜約２００、約５０〜約４００、約５０〜約４２０、約６０〜約３２０、約７０および約２２０、約１００〜約２００、約１００〜約３２０、約１５０〜約２００、約１５０〜約２２０、約１５０〜約４００、約２００〜約３００、または約３００〜約４００ヌクレオチドである。もう一つの好ましい実施形態では、ＦＡＤ２−１イントロンの断片は、連続する約１００、約１５０、約２００、約２２０、約２５０、約３００、約３２０、または約３５０ヌクレオチドの長さである。もう一つの好ましい実施形態では、ＦＡＤ２−１のイントロン断片は、配列番号１の長さと比較して、長さが連続する約２０、約４０、約６０、約８０、約１００、約１２０、約１４０、約１６０、約１８０、約２００、約２２０、約２４０、約２６０、約２８０、約２９０、約３００、約３２０、約３４０、約３６０、約３８０、約４００ヌクレオチド短縮されている。これらのＦＡＤ２−１のイントロン断片すべてについて、切断または欠失は、５'末端で開始する、３'末端で開始する、またはＦＡＤ２−１のイントロンの内部であることができる。これらのＦＡＤ２−１のイントロン断片すべてについて、ＦＡＤ２−１イントロンの配列は配列番号１であることができる。
【０１０９】
好ましい実施形態では、ＦＡＴＢ遺伝子の断片は、ＦＡＴＢ遺伝子の連続する約８０〜約４５０、約１００〜約５００、約７０〜約５００、約２００〜約４００、約１５０〜約３００、約２５０〜約３５０、約２００〜約３５０ヌクレオチドである。好ましい実施形態では、ＦＡＴＢ断片は、５'末端から開始してＦＡＴＢ中の全ヌクレオチドの１／２に由来する。これらのＦＡＴＢ断片すべてについて、切断または欠失は、５'末端で開始する、３'末端で開始する、またはＦＡＴＢの内部であることができる。好ましい実施形態では、ＦＡＴＢ断片は、ＦＡＴＢの５'末端から開始してＦＡＴＢ中の全ヌクレオチドの１／２に由来する、５'末端に最も近いＦＡＴＢ中の全ヌクレオチドの１／３に由来する。特に好ましい実施形態では、ＦＡＴＢ断片は、好ましくは葉緑体輸送ペプチドをコードしている輸送ペプチドコード配列を含む。特に好ましい実施形態では、ＦＡＴＢ断片は、好ましくは葉緑体輸送ペプチドをコードしている輸送ペプチドコード配列の断片である。もう一つの特に好ましい実施形態では、ＦＡＴＢ断片は、ＦＡＴＢの５'ＵＴＲの連続する約２０、約２５、約３０、約３５、３８、３９、４０、４１、４２、４３、約４５、約５０、約５５、または約６０ヌクレオチドをさらに含む。最も好ましい実施形態では、断片には、ＦＡＴＢの５'ＵＴＲと融合したＦＡＴＢの３'ＵＴＲなどの、２つ以上の非連続的な断片または別々の遺伝子要素の組合せが含まれる。本発明の作用物質には核酸分子が含まれる。例えば、限定されるものではないが、本発明の一態様では、本発明の核酸分子は、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２５、３２、３３、３４、３５、４４、４５、４６、もしくは４７のイントロン配列またはその断片もしくはその相補体を含む。本発明のもう一つの態様では、核酸分子は、細胞または生物内に導入した場合に、ＲＮＡまたはタンパク質の産生を抑制する一方で、もう一つのＲＮＡまたはタンパク質を同時発現、共発現または協調発現させることができる、核酸配列を含む。本発明の一態様では、核酸分子は、細胞または生物内に導入した場合に、内在性ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、および／またはＦＡＴＢのＲＮＡの発現を抑制する、少なくとも部分的に低下させる、低下させる、実質的に低下させる、または有効に排除する一方で、それと同時にβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶ、Δ−９不飽和化酵素、および／またはＣＰ４  ＥＰＳＰＳのＲＮＡまたはタンパク質の少なくとも１つを共発現、同時発現、または協調発現させることができる、核酸配列を含む。
【０１１０】
少なくとも１つまたは複数の内在性遺伝子の発現を抑制する、少なくとも部分的に低下させる、低下させる、実質的に低下させる、または有効に排除することによって、植物細胞中で利用可能なＦＡＤ２および／またはＦＡＤ３の量が低下する、すなわちタンパク質の定常状態レベルが低下し、減少したパーセンテージのリノール酸（Ｃ１８：２）およびリノレン酸（Ｃ１８：３）などのポリ不飽和脂肪酸が提供され得る。トリアシルグリセロール内に取り込むために利用可能な脂肪酸のプールにおける修飾も、同様に植物細胞中の油の組成に影響を与え得る。したがって、ＦＡＤ２および／またはＦＡＤ３の発現の減少は、オレイン酸（Ｃ１８：１）などのモノ不飽和脂肪酸の割合の増加をもたらし得る。ＦＡＴＢの量が植物細胞中で減少している場合、減少した量のパルミチン酸およびステアリン酸などの飽和脂肪酸が提供され得る。したがって、ＦＡＴＢの発現の減少は、オレイン酸（１８：１）などの不飽和脂肪酸の割合の増加をもたらし得る。したがって、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、およびＦＡＴＢの発現の同時抑制の結果、ＦＡＳ経路がオレイン酸（Ｃ１８：１）などの炭素１８個の長さのモノ不飽和脂肪酸の全体的な増加に向かって駆動される。米国特許第５,９５５,６５０号を参照されたい。
【０１１１】
植物細胞中で利用可能なβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ（ＫＡＳ  Ｉ）および／またはβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶ（ＫＡＳ  ＩＶ）の量を増加させることによって、減少したパーセンテージの１６：０−ＡＣＰが提供されて、増加したパーセンテージの１８：０−ＡＣＰがもたらされ得る。したがって、より多くの量の１８：０−ＡＣＰとＦＡＤ２、ＦＡＤ３、およびＦＡＴＢの１つまたは複数の同時抑制とがあいまって、油組成をオレイン酸（Ｃ１８：１）の全体的な増加に向かって駆動することが支援される。植物細胞中で利用可能なΔ−９不飽和化酵素の量を増加させることによって、増加したパーセンテージの不飽和脂肪酸が提供されて、ステアリン酸および全飽和物の全体的な低下がもたらされ得る。
【０１１２】
増加および減少した酵素発現のこれらの組合せを操作して、オレイン酸レベルが増加し、リノール酸、リノレン酸、ステアリン酸、および／またはパルミチン酸レベルが減少し、飽和物の全体的なレベルが減少した脂肪酸が含まれる油組成を生成し得る。植物における遺伝子発現の増強は、余剰コピー数の遺伝子のコード配列を植物細胞内に導入すること、または、好ましくは、余剰コピー数の遺伝子のコード配列を植物ゲノム内に取り込ませることによって起こり得る。過剰発現は、遺伝子の発現を調節する調節機構の活性を増加させること、すなわち遺伝子発現をアップレギュレーションすることによって起こり得る。
【０１１３】
植物細胞におけるＣＰ４  ＥＰＳＰＳの産生は、植物細胞にグリフォセートに対する耐性または抵抗を与え、したがって、グリフォセート抵抗選択による、形質転換体が成功したものを同定する好都合な方法が提供される。
【０１１４】
遺伝子サイレンシングとしても知られる、植物における遺伝子発現の抑制は、転写性レベルおよび転写後レベルのどちらでも起こる。宿主細胞における内在性配列の発現を抑制する様々な方法が存在し、限定されるものではないが、アンチセンス抑制、同時抑制、リボザイム、センスおよびアンチセンスの組合せ（二本鎖ＲＮＡｉ）、プロモーターサイレンシング、およびジンクフィンガータンパク質などのＤＮＡ結合タンパク質が含まれる。（例えば、ＷＯ９８／５３０８３、ＷＯ０１／１４５３８、および米国特許第５,７５９,８２９号（Ｓｈｅｗｍａｋｅｒ）参照）。これらの機構のうちの特定のものは、ＤＮＡまたはＲＮＡレベルでの核酸の相同性に関連している。そのような相同性とは、同一の種内または異なる種にわたるＤＮＡまたはタンパク質の配列の類似度をいう。宿主細胞に導入されたＤＮＡ配列が、導入されたＤＮＡ配列の転写物が内在性遺伝子の転写性または転写後遺伝子サイレンシングを誘導するほど十分に内在性遺伝子に相同的である場合に、遺伝子サイレンシングが起こる。定常状態発現レベルを抑制するために十分な相同性は、植物のコード領域もしくは非コード領域に対して、または植物のコードもしくは非コード領域に相補的な核酸配列に対して、ＤＮＡ配列の全長にわたって少なくとも５０％、約６０％、または約７０％の同一性であり得る。植物のコード領域もしくは非コード領域に対して、または植物のコードもしくは非コード領域に相補的な核酸配列に対して、その全長にわたって少なくとも８０％同一；少なくとも８５％同一；少なくとも９０％同一；少なくとも９５％同一；少なくとも９７％同一；少なくとも９８％同一；少なくとも９９％同一；または１００％同一であるＤＮＡ配列がより好ましい。植物では、二本鎖ＲＮＡ分子は配列に特異的なサイレンシングを誘導できる。遺伝子サイレンシングは、しばしば、植物では二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡｉ」）と呼ばれ、カエノルハブディティス・エレガンスおよび動物ではＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと呼ばれ、真菌では膨化と呼ばれる。
【０１１５】
好ましい実施形態では、本発明の核酸分子は、第１の組のＤＮＡ配列であって、そのそれぞれが、発現された場合に、コードもしくは非コード配列が由来する遺伝子、または標的のコードもしくは非コード配列に対して相同性を有する任意の遺伝子によってコードされているｍＲＮＡ転写物またはタンパク質のレベルを有効に排除する、実質的に低下させる、または少なくとも部分的に低下させることができるように、植物遺伝子の１つまたは複数のコードまたは非コード配列に対して十分な相同性を示すＤＮＡ配列を含む。
【０１１６】
好ましい実施形態では、本発明の核酸分子は、（ａ）第１の組のＤＮＡ配列であって、そのそれぞれが、発現された場合に、コードもしくは非コード配列が由来する遺伝子、または任意の遺伝子標的の非コード配列に対して相同性を有するによってコードされているｍＲＮＡ転写物またはタンパク質のレベルを有効に排除する、実質的に低下させる、または少なくとも部分的に低下させることができるように、植物遺伝子の１つまたは複数のコードまたは非コード配列に対して十分な相同性を示すＤＮＡ配列と、（ｂ）第２の組のＤＮＡ配列であって、そのそれぞれが、発現された場合に、遺伝子によってコードされているｍＲＮＡ転写物またはタンパク質のレベルを少なくとも部分的に増強する、増加させる、増強する、または実質的に増強できるように、植物遺伝子に対して十分な相同性を示すＤＮＡ配列とを含む。
【０１１７】
本明細書中で使用する、「一組」のＤＮＡ配列とは、タンパク質をコードしているまたはコードしていない１つまたは複数の配列であることができる。例えば、第１の組のＤＮＡ配列はプロモーター、非コード領域、およびターミネーターだけから構成されることができる。第２の組のＤＮＡ配列は第１の組のＤＮＡ配列の前または後に存在するか、または存在しないことができる。
【０１１８】
本明細書中で使用する、タンパク質またはｍＲＮＡなどの作用物質のレベルまたは量の「低下」とは、作用物質を低下させることができるＤＮＡ配列を欠く細胞または生物と比較して、レベルまたは量が低下していることを意味する。例えば、「少なくとも部分的な低下」とは少なくとも２５％の低下をいい、「実質的な低下」とは少なくとも７５％の低下をいい、「有効な排除」とは９５％を超える低下をいい、これらすべてにおいて、作用物質のレベルまたは量の低下とは、作用物質を低下させることができるＤＮＡ配列を欠く細胞または生物と比較したものである。
【０１１９】
本明細書中で使用する、タンパク質またはｍＲＮＡなどの作用物質のレベルまたは量が「増強した」または「増加した」とは、レベルまたは量が、類似の遺伝的背景を有するがタンパク質またはｍＲＮＡをコードしている導入された核酸分子を欠く細胞、組織または植物中に存在する作用物質のレベルまたは量よりも高いことを意味する。例えば、「少なくとも部分的に増強した」レベルとは少なくとも２５％の増加をいい、「実質的に増強した」レベルとは少なくとも１００％の増加をいい、これらのすべてにおいて、作用物質のレベルまたは量の増加とは、類似の遺伝的背景を有するがタンパク質またはｍＲＮＡをコードしている導入された核酸分子を欠く細胞、組織または植物中に存在する作用物質のレベルまたは量と比較したものである。好ましい実施形態では、発現の増加は、タンパク質が系にとって異種である任意の発現であり得る。例えば、ＣＰ４  ＥＰＳＰＳの任意の発現は、タンパク質をコードしている核酸分子を導入する前に植物中で発現が存在しなかった場合は発現の増加であることができる。
【０１２０】
作用物質のレベルを比較する場合、そのような比較は、類似の遺伝的背景を有する生物間で実施することが好ましい。好ましくは、類似の遺伝的背景とは、比較する生物が、５０％以上、より好ましくは７５％以上、さらにより好ましくは９０％以上の核遺伝物質の配列同一性を共有する背景である。もう一つの好ましい態様では、類似の遺伝的背景とは、比較する生物が植物であり、植物は植物形質転換技術を用いて最初に導入した任意の遺伝物質以外は同系である背景である。作用物質のレベルまたは量の測定は任意の適切な方法によって実施してよく、その非限定的な例には、ｍＲＮＡ転写物のレベル、タンパク質もしくはペプチドのレベル、および／または表現型、特に油含量の比較が含まれる。本明細書中で使用するｍＲＮＡ転写物にはプロセッシングされたおよびプロセッシングされていないｍＲＮＡ転写物が含まれ、タンパク質またはペプチドには任意の翻訳後修飾を有するまたは有さないタンパク質またはペプチドが含まれる。
【０１２１】
第１の組のＤＮＡ配列のＤＮＡ配列は、コード配列、イントロン配列、３'ＵＴＲ配列、５'ＵＴＲ配列、プロモーター配列、他の非コード配列、または前述の任意の組合せであり得る。第１の組のＤＮＡ配列は、発現された場合に、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、およびＦＡＴＢからなる群から選択された遺伝子によってコードされているタンパク質および転写物のどちらかまたは両方を選択的に低下させることができる、１つまたは複数の配列をコードしている。好ましい実施形態では、第１の組のＤＮＡ配列はアンチセンスＲＮＡを発現でき、個々のアンチセンス配列は、１つの転写物中で連結していてもよく、または連結していない個々の転写物中であってもよい。さらに好ましい実施形態では、第１の組のＤＮＡ配列は、単一のｄｓＲＮＡ分子を発現できる、物理的に連結した配列である。異なる好ましい実施形態では、第１の組のＤＮＡ配列はセンス共抑制ＲＮＡを発現でき、個々のセンス配列は、１つの転写物中で連結していてもよく、または連結していない個々の転写物中であってもよい。第１の組のＤＮＡ配列の例示的な実施形態は、発明を実施するための最良の形態のパートＢおよび実施例に記載されている。
【０１２２】
第２の組のＤＮＡ配列は、発現された場合に、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ（ＫＡＳ  Ｉ）、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶ（ＫＡＳ  ＩＶ）、Δ−９不飽和化酵素、およびＣＰ４  ＥＰＳＰＳからなる群から選択された遺伝子によってコードされているタンパク質および転写物の一方または両方を増加させることができる、１つまたは複数の配列をコードしている。第２の組のＤＮＡ配列のＤＮＡ配列は、物理的に連結した配列であり得る。第２の組のＤＮＡ配列の例示的な実施形態は、以下の発明を実施するための最良の形態のパートＣおよびＤに記載されている。
【０１２３】
したがって、本発明は、脂肪酸の組成ならびに油、ワックス、および脂肪などのそのような脂肪酸を含む化合物を変更する方法を提供する。本発明はまた、宿主細胞植物において特定の脂肪酸を生成する方法も提供する。そのような方法では、宿主植物細胞のＦＡＳ経路を修飾するための、本明細書中に記載の発現カセットの使用を用いる。
【０１２４】
Ｂ．第１の組のＤＮＡ配列
本発明の一態様では、核酸分子は、細胞または生物内に導入した場合に、１つまたは複数の遺伝子によってコードされているｍＲＮＡ転写物またはタンパク質のレベルを有効に排除する、実質的に低下させる、または少なくとも部分的に低下させることができる１つまたは複数の配列を発現する、第１の組のＤＮＡ配列を含む。好ましい態様には、標的として内在性遺伝子、植物遺伝子、および非ウイルス遺伝子が含まれる。本発明の一態様では、遺伝子はＦＡＤ２、ＦＡＤ３、またはＦＡＴＢ遺伝子である。
【０１２５】
一態様では、本発明の核酸分子は、植物細胞または植物内に導入して発現させた場合に、コードまたは非コード配列（もしくは複数の配列）が由来する遺伝子によってコードされているｍＲＮＡ転写物またはタンパク質のレベルを有効に排除する、実質的に低下させる、または少なくとも部分的に低下させることができる、植物遺伝子からの１つまたは複数のコードまたは非コード配列に対して十分な相同性を示すＤＮＡ配列を含む。第１の組のＤＮＡ配列のＤＮＡ配列は、抑制する遺伝子に由来するコードまたは非コード領域に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、または最も好ましくは１００％の同一性を示すＲＮＡ配列またはＲＮＡ断片を転写する。そのような％同一性はもう一つの核酸断片との比較であり得る。
【０１２６】
好ましくは、非コード配列は、植物遺伝子からの３'ＵＴＲ、５'ＵＴＲ、タンパク質をコードしている配列の一部、またはイントロンである。より好ましくは、非コード配列は、植物遺伝子からのプロモーター配列、３'ＵＴＲ、５'ＵＴＲ、またはイントロンである。イントロンは、植物遺伝子のエクソンの間に位置するか、または５'または３'ＵＴＲ内に位置し得る。コード配列は優先的にはタンパク質のコーディングフレームの一部である。
【０１２７】
第１の組のＤＮＡ配列の配列（または複数の配列）は、植物細胞または植物内に導入した場合に所望の効果を達成するために、ｄｓＲＮＡ、センス抑制ＲＮＡ、もしくはアンチセンスＲＮＡまたは任意の他の抑制転写物を産生するように設計し得る。そのようなＤＮＡ配列（または複数の配列）は断片核酸分子であり得る。
【０１２８】
植物イントロンは、内在性であるか導入したものであるかにかかわらず、遺伝子からの任意の植物イントロンであることができる。生物からのそのようなイントロンの核酸配列は、限定されるものではないが、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｓｗｉｓｐｒｏｔ／；ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／；ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／；およびｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからインターネット上で探し得るＥＭＢＬおよびＧｅｎｂａｎｋなどのデータベースを含めた、複数の入手源から得るまたはそれに由来できる。また、そのようなイントロンの核酸配列は、限定されるものではないがｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＳＣＡＮ．ｈｔｍｌからインターネット上で探し得るＧＥＮＳＣＡＮプログラムなどの入手原に由来することもできる。
【０１２９】
さらなるイントロンは、限定されるものではないが、ゲノムライブラリを既知のエクソンもしくはイントロン配列のどちらかのプローブでスクリーニングする方法、ゲノム配列をその対応するｃＤＮＡ配列と比較する方法、またはダイズｃＤＮＡなどのイントロンをたとえばアラビドプシス属などのもう一つの生物からのゲノム配列とのアラインメントによってクローニングする方法を含めた方法によっても得られ得る。さらに、イントロンの他の核酸配列が当業者に明らかであろう。また、上述の方法は、限定されるものではないが、プロモーター配列、３'ＵＴＲ配列、および５'ＵＴＲ配列を含めた他の非コード配列を由来させるかつ得るためにも用い得る。
【０１３０】
「ＦＡＤ２」、「Δ１２不飽和化酵素」または「ω−６不飽和化酵素」遺伝子は、カルボキシル末端から数えて１２位の脂肪酸アシル部分内への二重結合の挿入を触媒できる酵素（ＦＡＤ２）をコードしている。用語「ＦＡＤ２−１」とは、種子組織内で特異的な様式で天然に発現されるＦＡＤ２遺伝子をいうために用い、用語「ＦＡＤ２−２」とは、（ａ）ＦＡＤ２−１遺伝子とは異なる遺伝子であり、かつ（ｂ）種子を含めた複数の組織内で天然に発現されるＦＡＤ２遺伝子をいうために用いる。代表的なＦＡＤ２配列には、限定されるものではないが、２００２年６月２１日付けで出願された米国特許出願第１０／１７６,１４９号および配列番号１〜６に記載のものが含まれる。
【０１３１】
「ＦＡＤ３」、「Δ１５不飽和化酵素」または「ω−３不飽和化酵素」遺伝子は、カルボキシル末端から数えて１５位の脂肪酸アシル部分への二重結合の挿入を触媒できる酵素（ＦＡＤ３）をコードしている。用語「ＦＡＤ３−１、ＦＡＤ３−Ａ、ＦＡＤ３−ＢおよびＦＡＤ３−Ｃ」とは、種子を含めた複数の組織内で天然に発現されるＦＡＤ３遺伝子ファミリーメンバーをいうために用いる。代表的なＦＡＤ３配列には、限定されるものではないが、２００２年６月２１日付けで出願された米国特許出願第１０／１７６,１４９号および配列番号７〜２７に記載のものが含まれる。
【０１３２】
「ＦＡＴＢ」または「パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ」遺伝子は、その好ましい反応としてパルミトイル−ＡＣＰのパントテン補欠分子族内の炭素−硫黄チオエステル結合の加水分解切断を触媒できる酵素（ＦＡＴＢ）をコードしている。他の脂肪酸−ＡＣＰチオエステルの加水分解もこの酵素によって触媒され得る。代表的なＦＡＴＢ−１配列には、限定されるものではないが、２００２年６月２１日付けで出願された米国仮出願第６０／３９０,１８５号；米国特許第５,９５５,３２９号；第５,７２３,７６１号；第５,９５５,６５０号；および第６,３３１,６６４号；ならびに配列番号２８〜３７に記載のものが含まれる。代表的なＦＡＴＢ−２配列には、限定されるものではないが、配列番号４２〜４７に記載のものが含まれる。
【０１３３】
Ｃ．第２の組のＤＮＡ配列
本発明の一態様では、核酸分子は、細胞または生物内に導入した場合に、１つまたは複数の遺伝子によってコードされているｍＲＮＡ転写物またはタンパク質のレベルを部分的に増強する、増加させる、増強する、または実質的に増強できる、第２の組のＤＮＡ配列を含む。本発明の一態様では、遺伝子は内在性遺伝子である。本発明のもう一つの態様では、遺伝子は異種遺伝子であることができる。好ましい態様では、異種および内在性の遺伝子は同一の核酸分子上にあることができる。本発明の一態様では、遺伝子は植物遺伝子である。本発明のもう一つの態様では、遺伝子は、完全な遺伝子によって触媒される反応を触媒できる切断遺伝子である。本発明の一態様では、遺伝子は、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ遺伝子、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶ遺伝子、Δ−９不飽和化酵素遺伝子、ＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子、またはこれらの遺伝子の組合せである。
【０１３４】
本発明の遺伝子は、内在性であるか導入したものであるかにかかわらず、任意の遺伝子であることができる。そのような遺伝子の核酸配列は、限定されるものではないが、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｓｗｉｓｐｒｏｔ／；ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／；ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／；およびｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからインターネット上で探し得るＥＭＢＬおよびＧｅｎｂａｎｋなどのデータベースを含めた、多数の入手源から由来できる。また、そのような遺伝子の核酸配列は、限定されるものではないが、ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＳＣＡＮ．ｈｔｍｌからインターネット上で探し得るＧＥＮＳＣＡＮプログラムなどの入手源に由来することもできる。
【０１３５】
さらなる遺伝子は、限定されるものではないが、ゲノムライブラリまたはｃＤＮＡライブラリをどちらかの既知の遺伝子配列のプローブでスクリーニングする方法、遺伝子をたとえばアラビドプシス属などのもう一つの生物からの遺伝子またはプローブとのアラインメントによってクローニングする方法を含めた方法によっても得られ得る。さらに、遺伝子の他の核酸配列が当業者に明らかであろう。さらなる遺伝子は、例えば、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅して、本発明の実施形態で用い得る。さらに、遺伝子の他の核酸配列が当業者に明らかであろう。
【０１３６】
自動核酸合成機を、この目的のため、および細胞または生物中でも見つかる配列を有する核酸分子を作製するために用い得る。そのような合成の代わりに、ＰＣＲで用いて第１の遺伝子の任意の所望の核酸分子または断片を増幅かつ得ることができるプライマー対を定義するために核酸分子を用い得る。
【０１３７】
「ＫＡＳ  Ｉ」または「β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ」遺伝子は、脂肪酸アシル部分がパルミトイル−ＡＣＰ（Ｃ１６：０）まで伸長することを触媒できる酵素（ＫＡＳ  Ｉ）をコードしている。代表的なＫＡＳ  Ｉ配列には、限定されるものではないが、米国特許第５,４７５,０９９号および国際公開公報ＰＣＴ  ＷＯ９４／１０１８９号、ならびに配列番号３８に記載のものが含まれる。
【０１３８】
「ＫＡＳ  ＩＶ」または「β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶ」遺伝子は、中鎖アシル−ＡＣＰの縮合を触媒し、１８：０−ＡＣＰの生成を増強できる酵素（ＫＡＳ  ＩＶ）をコードしている。代表的なＫＡＳ  ＩＶ配列には、限定されるものではないが、国際公開公報ＰＣＴ  ＷＯ９８／４６７７６号および配列番号３９に記載のものが含まれる。
【０１３９】
「Δ−９不飽和化酵素」または「ステアロイル−ＡＣＰ不飽和化酵素」または「ω−９不飽和化酵素」遺伝子は、カルボキシル末端から数えて９位の脂肪酸アシル部分内への二重結合の挿入を触媒できる酵素をコードしている。本発明の好ましいΔ−９不飽和化酵素は植物またはラン藻Δ−９不飽和化酵素であり、より好ましくは、カーサーマス・ティンクトリアス、リシヌス・コムニス、シモンジア・シネンシス、およびブラシカ・カンペストリスからなる群から選択された生物中にも見つかるΔ−９不飽和化酵素である。代表的なΔ−９不飽和化酵素配列には、限定されるものではないが、米国特許第５,７２３,５９５号および配列番号４０〜４１に記載のものが含まれる。
【０１４０】
「ＣＰ４  ＥＰＳＰＳ」または「ＣＰ４  ５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素」遺伝子は、植物細胞およびそれから作製された植物に相当な度合のグリフォセート抵抗を与えることができる酵素（ＣＰ４  ＥＰＳＰＳ）をコードしている。ＣＰ４  ＥＰＳＰＳ配列は、米国特許第５,６３３,４３５号に記載のアグロバクテリウム・ツメファシエンス種のＣＰ４に由来するＣＰ４  ＥＰＳＰＳ配列またはその変異体もしくは合成形であり得る。代表的なＣＰ４  ＥＰＳＰＳ配列には、限定されるものではないが、米国特許第５,６２７,０６１号および第５,６３３,４３５号に記載のものが含まれる。
【０１４１】
Ｄ．組換えベクターおよび構築体
本発明の核酸構築体の１つまたは複数を植物の形質転換または形質移入に用い得る。転写物またはタンパク質などの生成物のレベルは、植物などの生物全体にわたって増加もしくは減少させるか、または生物の１つもしくは複数の特定の器官もしくは組織に局在させ得る。例えば、生成物のレベルは、限定されるものではないが、根、塊茎、茎、葉、柄、果実、液果、殻果、樹皮、鞘、種子および花を含めた植物の組織および器官の１つまたは複数内で増加または減少させ得る。好ましい器官は種子である。例えば、外来性遺伝物質を植物細胞内に移植し、植物細胞を完全な繁殖可能または繁殖不能の植物または植物部分へと再生し得る。
【０１４２】
「外来性遺伝物質」とは、天然に存在するかどうかにかかわらず、任意の生物内に挿入されることができる、任意の源からの任意の遺伝物質である。そのような外来性遺伝物質には、限定されるものではないが、本発明の核酸分子および構築体が含まれる。外来性遺伝物質は、そのような目的のために設計されたＤＮＡベクターまたは構築体を用いることによって宿主細胞内に移植し得る。同様に、ウイルスが外来性遺伝物質を宿主細胞内に移植できる。外来性遺伝物質は、内在性遺伝子と同一であるが、内在性遺伝子の発現を抑制する目的でＤＮＡベクターまたは構築体を用いることによって宿主細胞に再導入されたＤＮＡ配列を有し得る。そのようなベクターの設計は、一般的に当業者の技術範囲内にある（例えば、植物分子生物学：実験室の手引き（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｌａｒｋ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７）参照）。好ましい実施形態では、外来性遺伝物質は組換えＤＮＡである。
【０１４３】
構築体またはベクターには、選択した核酸分子を発現させるための、植物細胞中で機能的なプロモーター、または植物プロモーターが含まれ得る。植物細胞中で活性のあるいくつかのプロモーターが文献に記載されており、ＣａＭＶ３５ＳおよびＦＭＶプロモーターが植物での使用に好ましい。好ましいプロモーターの他の例には、マメアルセリンおよび７Ｓαが含まれる。さらなる好ましいプロモーターは、ＣａＭＶ３５ＳおよびＦＭＶ３５Ｓプロモーターの強化または重複した変形である。Ｏｄｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０〜８１２（１９８５）；米国特許第５,３７８,６１９号。利用し得るさらなるプロモーターは、例えば、米国特許第５,３７８,６１９号；第５,３９１,７２５号；第５,４２８,１４７号；第５,４４７,８５８号；第５,６０８,１４４号；第５,６０８,１４４号；第５,６１４,３９９号；第５,６３３,４４１号；第５,６３３,４３５号；および第４,６３３,４３６号に記載されている。さらに、組織に特異的なエンハンサーを使用し得る。
【０１４４】
特に好ましいプロモーターを、本発明の核酸分子を種子または果実中で発現させるために用いることもできる。実際、好ましい実施形態では、用いるプロモーターは種子に特異的なプロモーターである。そのようなプロモーターの例には、ナピン（Ｋｒｉｄｌら、Ｓｅｅｄ  Ｓｃｉ．Ｒｅｓ．、１：２０９〜２１９（１９９１））、ファセオリン、ステアロイル−ＡＣＰ不飽和化酵素、７Ｓα、７ｓα'（Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８３：８５６０〜８５６４（１９８６））、ＵＳＰ、アルセリンおよびオレオシンなどの遺伝子からの５'調節領域が含まれる。種子中の発現に好ましいプロモーターは、７Ｓα、７Ｓα'、ナピン、およびＦＡＤ２−１Ａプロモーターである。
【０１４５】
構築体またはベクターには、限定されるものではないが、３'転写ターミネーター、３'ポリアデニル化シグナル、他の非翻訳核酸配列、輸送配列または標的化配列、選択マーカーまたはスクリーニングマーカー、プロモーター、エンハンサー、およびオペレーターを含めた他の遺伝子要素も含まれ得る。また、構築体またはベクターは、挿入時に内在性プロモーターを利用し得る、プロモーターを有さない遺伝子を含んでいてもよい。
【０１４６】
植物の形質転換または形質移入に用い得る核酸分子は、本発明の核酸分子の任意のものであり得る。本発明を例示した実施形態に限定することは意図しない。例示的な核酸分子は発明を実施するための最良の形態のパートＡに記載されており、さらなる非限定的な例示的な核酸分子は、以下に記載し、図１〜４および実施例に例示する。
【０１４７】
ここで図を参照し、本発明の核酸分子の実施形態を図１〜４に示す。上述のように、核酸分子は、１つまたは複数のＴ−ＤＮＡ領域上に位置する（ａ）第１の組のＤＮＡ配列および（ｂ）第２の組のＤＮＡ配列を含み、そのそれぞれが右境界および左境界に隣接している。Ｔ−ＤＮＡ領域内では、転写の方向を矢印によって示す。記載した核酸分子は、ＤＮＡ配列が単シストロン性または多シストロン性の配置に並べられていてもよい。好ましい配置には、第１の組のＤＮＡ配列および第２の組のＤＮＡ配列が単一のＴ−ＤＮＡ領域上に位置する配置が含まれる。
【０１４８】
例示した実施形態のそれぞれにおいて、発現された場合に、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、およびＦＡＴＢからなる群から選択された遺伝子によってコードされている１つ、２つまたはすべてのタンパク質および転写物を選択的に低下させることができる１つまたは複数の配列を含む、第１の組のＤＮＡ配列を含む。好ましくは、第１の組のＤＮＡ配列中のそれぞれの配列は、発現された場合に、限定されるものではないが異なる遺伝子ファミリーメンバーを含めた異なる遺伝子の発現を抑制できる。配列には、コード配列、イントロン配列、３'ＵＴＲ配列、５'ＵＴＲ配列、他の非コード配列、または前述の任意の組合せが含まれ得る。第１の組のＤＮＡ配列は、ｄｓＲＮＡ構築体として、センス共抑制構築体、またはアンチセンス構築体としての形態を含めて、任意の適切な形態で発現され得る。第１の組のＤＮＡ配列は、配列の発現を駆動する少なくとも１つのプロモーターと作動可能に連結しており、これは、植物中で機能的な任意のプロモーター、または任意の植物プロモーターであることができる。好ましいプロモーターには、限定されるものではないが、ナピンプロモーター、７Ｓαプロモーター、７Ｓα'プロモーター、アルセリンプロモーター、またはＦＡＤ２−１Ａプロモーターが含まれる。
【０１４９】
第２の組のＤＮＡ配列はコード配列を含み、そのそれぞれが、発現された場合に、ＫＡＳ  Ｉ、ＫＡＳ  ＩＶ、Δ−９不飽和化酵素、およびＣＰ４  ＥＰＳＰＳからなる群から選択された遺伝子によってコードされているタンパク質および転写物の一方または両方を増加させることができる配列をコードしているＤＮＡ配列である。それぞれのコード配列はプロモーターと結合しており、これは、植物中で機能的な任意のプロモーター、または任意の植物プロモーターであることができる。第２の組のＤＮＡ配列での使用に好ましいプロモーターは、ＦＭＶプロモーターおよび／または種子に特異的なプロモーターである。特に好ましい種子に特異的なプロモーターには、限定されるものではないが、ナピンプロモーター、７Ｓαプロモーター、７Ｓα'プロモーター、アルセリンプロモーター、Δ−９不飽和化酵素プロモーター、またはＦＡＤ２−１Ａプロモーターが含まれる。
【０１５０】
図１および２に示す実施形態では、第１の組のＤＮＡ配列は、発現された場合に、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、およびＦＡＴＢからなる群から選択された遺伝子によってコードされている、またはそれから転写されたタンパク質ならびに転写物の一方または両方の発現を抑制できるｄｓＲＮＡ分子を形成できる。図１に示した第１の組のＤＮＡ配列は３つの非コード配列を含み、そのそれぞれが、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、およびＦＡＴＢ遺伝子からなる群から選択された遺伝子の非コード領域に対して同一性を示すＲＮＡ配列（示さず）を発現する。非コード配列はそれぞれ、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、およびＦＡＴＢ遺伝子からなる群から選択された遺伝子の非コード領域に対して少なくとも９０％の同一性を示すＲＮＡ配列を発現する。また、第１の組のＤＮＡ配列は３つのアンチセンス配列も含み、そのそれぞれが、そのそれぞれの対応するＲＮＡ配列（非コード配列によって発現される）と二本鎖ＲＮＡ分子を形成できるアンチセンスＲＮＡ配列（示さず）を発現する。
【０１５１】
非コード配列は、スペーサー配列、好ましくはｄｓＲＮＡ分子の形成を促進するものによってアンチセンス配列から隔てられ得る。そのようなスペーサー配列の例には、Ｗｅｓｌｅｙら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、２７（６）：５８１〜９０（２００１）、およびＨａｍｉｌｔｏｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１５：７３７〜７４６（１９８８）に記載のものが含まれる。好ましい態様では、スペーサー配列は、Ｗｅｓｌｅｙら、上記に例示されたヘアピン構造を形成できる。本コンテキスト中で特に好ましいスペーサー配列は、植物イントロンまたはその一部である。特に好ましい植物イントロンは、スプライシング可能なイントロンである。スプライシング可能なイントロンには、限定されるものではないが、ＰＤＫイントロン、ＦＡＤ３−１ＡまたはＦＡＤ３−１Ｂのイントロン＃５、ＦＡＤ３のイントロン＃１、ＦＡＤ３のイントロン＃３Ａ、ＦＡＤ３のイントロン＃３Ｂ、ＦＡＤ３のイントロン＃３Ｃ、ＦＡＤ３のイントロン＃４、ＦＡＤ３のイントロン＃５、ＦＡＤ２のイントロン＃１、およびＦＡＤ２−２のイントロンからなる群から選択されたイントロンが含まれる。好ましいスプライシング可能なイントロンには、限定されるものではないが、ＦＡＤ３のイントロン＃１、ＦＡＤ３のイントロン＃３Ａ、ＦＡＤ３のイントロン＃３Ｂ、ＦＡＤ３のイントロン＃３Ｃ、およびＦＡＤ３のイントロン＃５からなる群から選択されたイントロンが含まれる。他の好ましいスプライシング可能なイントロンには、限定されるものではないが、長さが約０.７５ｋｂ〜約１.１ｋｂであり、ＲＮＡヘアピン構造を促進できる、スプライシング可能なイントロンが含まれる。特に好ましいスプライシング可能なイントロンの非限定的な一例はＦＡＤ３のイントロン＃５である。
【０１５２】
センス方向の非コード分子は、所望により、ＤＮＡのスペーサーセグメントによって対応するアンチセンス方向の分子から隔てられ得る。スペーサーセグメントは遺伝子断片または人工ＤＮＡであることができる。スペーサーセグメントは、ヘアピンｄｓＲＮＡの形成を促進するために短いか、またはヘアピン構造なしのｄｓＲＮＡの形成を促進するために長くあることができる。スペーサーは、ＵＳ２００５／０１７６６７０  Ａ１号に開示のように、センスまたはアンチセンス分子の一方の長さを伸長することによって提供できる。あるいは、米国特許出願第２００５／０１８３１７０号に開示のように、植物ゲノム内に挿入した後に右境界−右境界（「ＲＢ−ＲＢ」）配列を作製できる。
【０１５３】
ここで図１を参照し、核酸分子は２つのＴ−ＤＮＡ領域を含み、そのそれぞれが右境界および左境界に隣接している。第１のＴ−ＤＮＡ領域はプロモーターと作動可能に連結した第１の組のＤＮＡ配列を含み、第１のＴ−ＤＮＡ領域は、第１のコード配列と作動可能に連結した第１のプロモーターと第２のコード配列と作動可能に連結した第２のプロモーターとを含む第２の組のＤＮＡ配列の第１の部分をさらに含む。第２のＴ−ＤＮＡ領域は、第３のコード配列と作動可能に連結した第３のプロモーターを含む第２の組のＤＮＡ配列の第２の部分を含む。図２に示した好ましい実施形態では、核酸分子は、右境界および左境界に隣接している単一のＴ−ＤＮＡ領域を含む。第１および第２の組のＤＮＡ配列はすべて単一のＴ−ＤＮＡ領域上に位置する。
【０１５４】
図１および２に示したｄｓＲＮＡを発現させる実施形態では、配列の順序は例示かつ記載したものから変更されていてもよいが、非コード配列およびアンチセンス配列は、好ましくは、発現された場合に、単一のｄｓＲＮＡ分子が形成されることができるように第１の非コード配列が第１のアンチセンス配列とハイブリダイズでき、第２の非コード配列が第２のアンチセンス配列とハイブリダイズでき、第３の非コード配列が第３のアンチセンス配列とハイブリダイズできるように、スペーサー配列の周りに並べられている。好ましくは、非コード配列はセンス方向であり、アンチセンス配列はプロモーターと比較してアンチセンス方向である。非コード、アンチセンス、およびコード配列の数、ならびにＴ−ＤＮＡ領域（または複数の領域）上でのその様々な相対位置も、本発明の目的を達成するために適した任意の様式で変更されていてもよい。
【０１５５】
ここで図３および４を参照し、例示した核酸分子は、右境界および左境界に隣接しているＴ−ＤＮＡ領域を含み、それ上に第１および第２の組のＤＮＡ配列が位置する。第１の組のＤＮＡ配列はプロモーターおよび転写終止シグナルと作動可能に連結している。第１のコード配列と作動可能に連結した第１のプロモーター、第２のコード配列と作動可能に連結した第２のプロモーター、および第３のコード配列と作動可能に連結した第３のプロモーターを含む第２の組のＤＮＡ配列。転写終止シグナルは、植物中で機能的な任意の転写終止シグナル、または任意の植物転写終止シグナルであることができる。好ましい転写終止シグナルには、限定されるものではないが、エンドウマメルビスコＥ９の３'配列、ブラシカ属のナピンの３'配列、ｔｍｌの３'配列、およびｎｏｓの３'配列が含まれる。
【０１５６】
図３に示した実施形態では、第１の組のＤＮＡ配列は、発現された場合に、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、およびＦＡＴＢからなる群から選択された遺伝子によってコードされている、またはそれに由来する１つまたは複数のタンパク質または転写物の発現を抑制できるセンス共抑制構築体を形成できる。第１の組のＤＮＡ配列は３つの非コード配列を含み、そのそれぞれが、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、およびＦＡＴＢ遺伝子からなる群から選択された遺伝子の１つまたは複数の非コード領域に対して十分な同一性を示すＲＮＡ配列（示さず）を発現する。非コード配列はそれぞれ、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、およびＦＡＴＢ遺伝子からなる群から選択された遺伝子の１つまたは複数の非コード領域に対して少なくとも９０％の同一性を示すＲＮＡ配列を発現する。第１の組のＤＮＡ配列内での非コード配列の順序は、本明細書中に例示かつ記載したものから変更されていてもよいが、非コード配列はプロモーターと比較してセンス方向に並べられている。
【０１５７】
図４は、第１の組のＤＮＡ配列が、発現された場合に、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、およびＦＡＴＢからなる群から選択された遺伝子によってコードされている、またはそれに由来する１つまたは複数のタンパク質または転写物の発現を抑制できるアンチセンス構築体を形成できる実施形態を示す。第１の組のＤＮＡ配列は３つのアンチセンス配列を含み、そのそれぞれが、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、およびＦＡＴＢ遺伝子からなる群から選択された遺伝子の１つまたは複数の非コード領域に対して同一性を示すアンチセンスＲＮＡ配列（示さず）を発現する。アンチセンス配列はそれぞれ、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、およびＦＡＴＢ遺伝子からなる群から選択された遺伝子の１つまたは複数の非コード領域に対して少なくとも９０％の同一性を示すアンチセンスＲＮＡ配列を発現する。第１の組のＤＮＡ配列内でのアンチセンス配列の順序は、本明細書中に例示かつ記載したものから変更されていてもよいが、アンチセンス配列はプロモーターと比較してアンチセンス方向に並べられている。
【０１５８】
上述の核酸分子は、本発明の目的、特長および利点を達成する好ましい実施形態である。本発明を例示した実施形態に限定することは意図しない。核酸分子内の第１および第２の組のＤＮＡ配列中の配列の配置は、例示かつ記載した配置に限定されず、本明細書中に記載し、添付の図に例示した本発明の目的、特長および利点を達成するために適した任意の様式で変更されていてもよい。
【０１５９】
Ｅ．トランスジェニック生物、およびその生成方法
本発明の核酸分子および構築体のうちの任意のものを、永久的または一過性の様式で植物または植物細胞内に導入し得る。本発明の好ましい核酸分子および構築体は、上記発明を実施するための最良の形態のパートＡ〜Ｄおよび実施例に記載されている。本発明のもう一つの実施形態は、適切な植物または植物細胞を選択する工程、植物または植物細胞を組換えベクターで形質転換させる工程、および形質転換した宿主細胞を得る工程を一般的に含むトランスジェニック植物を生成する方法に指向される。
【０１６０】
好ましい実施形態では、植物もしくは細胞は、食用および工業用に使用するための植物油の生成に関与する植物であるか、またはそれに由来する。温帯油種子作物が特に好ましい。目的の植物には、限定されるものではないが、アブラナ（ナタネおよび高エルカ酸品種）、トウモロコシ、ダイズ、ハマナ、マスタード、トウゴマ、ピーナッツ、ゴマ、綿、アマニ、ベニバナ、アブラヤシ、アマ、ヒマワリ、およびココナツが含まれる。本発明は単子葉または双子葉の種どちらにも同様に適用可能であり、新規および／または改良された形質転換および調節技術に容易に適用可能であろう。
【０１６１】
ＤＮＡを植物細胞内に導入する方法および技術は当業者に周知であり、核酸分子を細胞内に導入し得る事実上任意の方法が本発明での使用に適している。適切な方法の非限定的な例には、化学的方法；微量注入、電気穿孔、遺伝子銃、微粒子銃、および真空浸潤などの物理的方法；ウイルスベクター；ならびに受容体に媒介される機構が含まれる。細胞の形質転換の他の方法も使用でき、限定されるものではないが、ＤＮＡを花粉内に直接移植することによる、ＤＮＡを植物の生殖器内に直接注入することによる、またはＤＮＡを未熟胚の細胞内に直接注入し、続いて乾燥させた胚の再水和による、植物内へのＤＮＡの導入が含まれる。
【０１６２】
アグロバクテリウム属に媒介される移植は、遺伝子を植物細胞内に導入するための広く適用可能な系である。例えば、Ｆｒａｌｅｙら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：６２９〜６３５（１９８５）；Ｒｏｇｅｒｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３：２５３〜２７７（１９８７）を参照されたい。移植するＤＮＡの領域は境界配列によって定義され、介在ＤＮＡが通常は植物ゲノム内に挿入されている。Ｓｐｉｅｌｍａｎｎら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２０５：３４（１９８６）。最新のアグロバクテリウム属形質転換ベクターはイー・コリおよびアグロバクテリウム属内で複製されることができ、好都合な操作が可能となる。Ｋｌｅｅら、植物ＤＮＡ感染作用物質（Ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ａｇｅｎｔｓ）、ＨｏｈｎおよびＳｃｈｅｌｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ページ１７９〜２０３（１９８５）。
【０１６３】
単一の植物プロトプラスト形質転換体または様々な形質転換した外植片からの植物の再生、発生および栽培は、当該技術分野で周知である。一般的に、Ｍａｌｉｇａら、植物分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ、植物分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９８８）を参照されたい。本発明の植物は、育種プログラムの一部であるか、またはそれから作製でき、また、アポミクシスを用いて繁殖させてもよい。アポミクシス植物を生成する方法は当該技術分野で知られている。例えば、米国特許第５,８１１,６３６号を参照されたい。
【０１６４】
好ましい実施形態では、発現された場合に、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、および／もしくはＦＡＴＢのタンパク質のレベルを、ならびに／またはＦＡＤ２、ＦＡＤ３、および／もしくはＦＡＴＢの転写物のレベルを選択的に低下させることができる核酸配列が含まれる本発明の植物を、発現された場合にもう一つの酵素を過剰発現できる核酸配列が含まれる本発明のもう一つの植物と交雑させる。好ましくは、他の酵素は、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶ、Δ−９不飽和化酵素、およびＣＰ４  ＥＰＳＰＳからなる群から選択される。
【０１６５】
もう一つの態様では、本発明の植物は、トランスジェニックまたは非トランスジェニックであるもう一つの植物と交雑させることができる。本発明の植物を、改変されたレベルの脂肪酸を含む油組成、例えば、限定されるものではないが、より低いレベルのリノレン酸を有する油組成の品種を有するもう一つの植物と交雑させることができる。好ましい実施形態では、本発明の植物を、３重量％未満のリノレン酸を有する品種と交雑させ、またはもう一つの実施形態では、本発明の植物を、２０重量％を超えるステアリン酸を有するもう一つの植物と交雑させる。改変されたレベルの脂肪酸を有するそのような植物は当該技術分野で知られており、例えば、ＨａｗｋｉｎｓおよびＫｒｉｄｌ（１９９８）、Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １３（６）：７４３〜７５２および米国特許第６,３６５,８０２号に記載されている。
【０１６６】
Ｆ．本発明の生成物
本発明の植物は全体または部分的に用い得る。好ましい植物部位には、生殖部分または貯蔵部分が含まれる。本明細書中で使用する用語「植物部位」には、限定されるものではないが、種子、胚乳、胚珠、花粉、根、塊茎、茎、葉、柄、果実、液果、殻果、樹皮、鞘、種子および花が含まれる。本発明の特に好ましい実施形態では、植物部分は種子である。
【０１６７】
本発明の植物またはその一部の任意のものを加工して、飼料、ミール、タンパク質、または油調製物を生成し得る。好ましい実施形態では、本発明は、本発明の脂肪酸組成を有する油を有する本発明の植物であることができる。この目的に特に好ましい植物部分は種子である。好ましい実施形態では、飼料、ミール、タンパク質または油調製物は、家畜動物、魚もしくはヒト、または任意の組合せ用に設計されている。飼料、ミール、タンパク質および油調製物を生成する方法は当該技術分野で知られている。例えば、米国特許第４,９５７,７４８号、第５,１００,６７９号、第５,２１９,５９６号、第５,９３６,０６９号、第６,００５,０７６号、第６,１４６,６６９号、および第６,１５６,２２７号を参照されたい。好ましい実施形態では、タンパク質調製物は高タンパク質調製物である。そのような高タンパク質調製物、好ましくは、５％ｗ／ｖ、より好ましくは１０％ｗ／ｖ、さらにより好ましくは１５％ｗ／ｖを超えるタンパク質含量を有する。
【０１６８】
好ましい油調製物では、油調製物は、５％ｗ／ｖ、より好ましくは１０％ｗ／ｖ、さらにより好ましくは１５％ｗ／ｖを超える、本発明の植物またはその一部に由来する油含量を有する高油調製物である。好ましい実施形態では、油調製物は液体であり、１、５、１０または５０リットルを超える容量である。本発明は、本発明の植物から生成した、または本発明の方法によって作製した油を提供する。そのような油は強化された酸化安定性を示し得る。また、そのような油は、生じた任意の生成物の少量成分または主成分であり得る。
【０１６９】
さらに、そのような油を他の油と混合し得る。好ましい実施形態では、本発明の植物から生成した、または本発明の方法によって作製した油は、任意の生成物の油成分の０.５容量または重量％、１容量または重量％、５容量または重量％、１０容量または重量％、２５容量または重量％、５０容量または重量％、７５容量または重量％または９０容量または重量％超を構成する。もう一つの実施形態では、油調製物を混合してもよく、混合物の１０容量％、２５容量％、３５容量％、５０容量％または７５容量％超を構成できる。本発明の植物から生成した油を１つまたは複数の有機溶媒または石油留出物と混合できる。
【０１７０】
植物の種子を容器内に入れ得る。本明細書中で使用する容器とは、そのような種子を保持できる任意の物体である。容器は、好ましくは約５００個、１,０００個、５,０００個、または２５,０００個を超える種子を含み、種子の少なくとも約１０％、２５％、５０％、７５％または１００％が本発明の植物に由来する。本発明はまた、約１０,０００個、より好ましくは約２０,０００個、さらにより好ましくは約４０,０００個を超える種子の容器も提供し、種子の約１０％、より好ましくは約２５％、より好ましくは５０％、さらにより好ましくは約７５％または９０％超が本発明の植物に由来する種子である。本発明はまた、約１０ｋｇ、より好ましくは約２５ｋｇ、さらにより好ましくは約５０ｋｇを超える種子の容器も提供し、種子の約１０％、より好ましくは約２５％、より好ましくは約５０％、さらにより好ましくは約７５％または９０％超が本発明の植物に由来する種子である。
【０１７１】
Ｇ．油組成物
多くの油用途には、飽和脂肪酸レベルは好ましくは８重量％未満、より好ましくは約２〜３重量％である。飽和脂肪酸は、多くの用途で望ましくない高融点を有する。供給原料または燃料として用いる場合、飽和脂肪酸は低温で曇りを引き起こし、流動点および目詰まり点などの乏しい低温フロー特性を燃料に与える。低飽和脂肪酸レベルを含む油生成物は、より健康的であると認知されているかつ／またはＦＤＡ指針に従って「飽和脂肪を含まない」表示し得るので、消費者および食品工業にとって好ましい場合がある。さらに、低飽和油は、サラダ油などの食品用途の油を脱蝋する必要性を軽減または排除する。バイオディーゼルおよび潤滑剤の用途では、低飽和脂肪酸レベルを有する油は、改良された低温フロー特性を与え、低温で曇らない。
【０１７２】
特定の油の物理特性を支配する要素は複雑である。パルミチン酸、ステアリン酸および他の飽和脂肪酸は、典型的には室温で固体であり、これは、液体のままである不飽和脂肪酸とは対照的である。飽和脂肪酸はアシル鎖内に二重結合を有さないので、これらは高温で酸化に対して安定に保たれる。飽和脂肪酸はマーガリンおよびチョコレート製剤の重要な構成成分であるが、多くの食品用途では、低いレベルの飽和脂肪酸が所望される。
【０１７３】
オレイン酸は１つの二重結合を有するが、それでも高温で比較的安定であり、高レベルのオレイン酸を有する油が、調理および加熱を要する他の加工に適している。近年では、オレイン酸が高密度リポタンパク質（「ＨＤＬ」）のレベルに影響を与えずに低密度リポタンパク質（「ＬＤＬ」）の血液レベルを下げると考えられているので、高オレイン酸油の消費を増やすことが推奨されている。しかしながら、オレイン酸が高温で分解した場合、ネガティブな香味化合物を生じてリノール酸の酸化によって生じるポジティブな香味を減少させるので、オレイン酸レベルの何らかの制限を行うことが望ましい。Ｎｅｆｆら、ＪＡＯＣＳ、７７：１３０３〜１３１３（２０００）；Ｗａｒｎｅｒら、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．、４９：８９９〜９０５（２００１）。好ましい油は、フライ油およびフライ食品などの食品用途で異臭を制限するために６５〜８５重量％以下のオレイン酸レベルである。他の好ましい油は、酸化安定性を向上させるために５５重量％を超えるオレイン酸レベルを有する。
【０１７４】
リノール酸は食品中の主要なポリ不飽和脂肪酸であり、ヒトの必須栄養素である。これは、フライ食品を美味しくする２,４デカジエナールなどのフライ食品の香味物質の主要な前駆体であるので、多くの食品用途に望ましい構成成分である。しかしながら、リノール酸は加熱した場合に限られた安定性しか有さない。好ましい食品油は、望ましいフライ食品の香味物質の形成を増強するために１０％重量以上のリノール酸レベルを有し、また、異臭の形成が低下するように２５重量％以下を有する。また、リノール酸はコレステロールを低下させる特性も有するが、食事による過剰摂取はヒトの細胞が自身を酸化損傷から保護する能力を低下させて、心血管病の危険性を増加させる可能性がある。Ｔｏｂｏｒｅｋら、Ａｍ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｊ．、７５：１１９〜１２５（２００２）。一般的に、脂質食品の香味化学（Ｆｌａｖｏｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｆｏｏｄｓ）、Ｄ．Ｂ．Ｍｉｎ＆Ｔ．Ｈ．Ｓｍｏｕｓｅ編、Ａｍ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、イリノイ州Ｃｈａｍｐａｉｇｎ（１９８９）を参照されたい。
【０１７５】
オレイン酸よりも低い融点を有するリノール酸はさらに、バイオディーゼルおよびバイオ潤滑剤用途に望ましい向上した低温フロー特性に寄与する。リノール酸の酸化はフライ油、食品、飼料、燃料および潤滑剤の製品の有用な貯蔵または使用期間を制限するので、ほとんどの用途の好ましい油は３０重量％以下のリノール酸レベルを有する。一般的に、脂肪、油、および乳化剤の物理特性（Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｆａｔｓ，Ｏｉｌｓ，ａｎｄ  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ）、Ｎ．Ｗｉｄｌａｋ編、ＡＯＣＳ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；ＥｒｈａｎおよびＡｓａｄａｕｓｋａｓ、植物油由来の潤滑基材（Ｌｕｂｒｉｃａｎｔ  Ｂａｓｅｓｔｏｃｋｓ  ｆｒｏｍ  Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  Ｏｉｌｓ）、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｒｏｐｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、１１：２７７〜２８２（２０００）を参照されたい。さらに、畜牛飼料中の高リノール酸レベルは、乳牛の乳中に望ましくないほど高いレベルのリノール酸をもたらし、したがって乏しい酸化安定性および香味をもたらす可能性がある。Ｔｉｍｍｏｎｓら、Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．、８４：２４４０〜２４４９（２００１）。広範に有用な油組成は１０〜２５重量％のリノール酸レベルを有する。
【０１７６】
リノレン酸はヒトの食事の重要な構成成分でもある。これは、長鎖脂肪酸のω−３ファミリーおよびそれに由来するプロスタグランジンを合成するために用いられる。しかしながら、その二重結合は酸化に対して非常に感受性が高く、高レベルのリノレン酸を有する油は暴気されると、特に高温では迅速に劣化する。食物製品中で使用できる前に、油を加熱した際の異臭および酸敗の形成を遅延させるためにそのような油の部分的な水素化がしばしば必要であるが、水素化は健康に良くないトランス脂肪酸を生じ、これは心血管病に寄与する可能性がある。酸化安定性の向上を達成し、油を水素化する必要性を軽減させるために、好ましい油は、本発明の油中の全脂肪酸の８重量％以下、６％以下、４％以下、約３％未満、より好ましくは０.５〜２重量％のリノレン酸レベルを有する。
【０１７７】
本発明のダイズからの油は、混合油生成物を作製するための混合源として用いることもできる。混合源とは、他の油の脂肪酸組成、香味、および酸化安定性などの特徴を向上させるために、本発明のダイズからの油を他の植物油と混合できることを意味する。使用できる本発明のダイズからの油の量は、生じる最終混合油生成物中で達成を求める所望の特性に依存する。混合油生成物の例には、限定されるものではないが、マーガリン、ショートニング、フライ油、サラダ油などが含まれる。本発明のダイズからの油は、混合油、合成油、または、好ましい実施形態では、適切な油組成を有する油種子から作製した油であることができる。油種子から直接作製した油は非混合油である。もう一つの態様では、油は成熟油種子から直接のものである。この態様では、飼料として販売するものなど、商業的農作業で畑から収穫した種子によって定義される成熟種子。好ましい実施形態では、油はダイズ油である。油は、粗ダイズ油などの粗油であることができるか、または加工油であることができ、例えば、油を精製、漂白、脱臭、および／もしくは脱蝋できる。本明細書中で使用する、「精製」とは、不純物を除去するために天然または加工した脂肪または油を処理する加工をいい、脂肪または油を苛性ソーダで処理し、続いて遠心分離を行い、水で洗浄し、真空下で加熱することによって達成し得る。「漂白」とは、脂肪または油中の色素のレベルを除去または低下させるために脂肪または油を処理する加工をいう。漂白は、脂肪または油を活性炭またはフラー土（珪藻土）で処理することによって達成し得る。「脱臭」とは、最終産物に好ましくない香味または臭気を与える構成成分を脂肪または油から除去するプロセスをいい、高真空および過熱蒸気洗浄を使用することによって達成し得る。「脱蝋」とは、油から飽和グリセリドを除去する加工をいい、冷却し、油から固化した脂肪部分を除去することによって達成し得る。
【０１７８】
本発明の好ましい油は、低い飽和油組成、またはゼロ飽和油組成を有する。他の好ましい実施形態では、本発明の油は、オレイン酸レベルが増加しており、飽和脂肪酸レベルが低下しており、ポリ不飽和脂肪酸レベルが低下している。さらなる好ましい実施形態では、本発明の油は、オレイン酸レベルが増加しており、飽和脂肪酸レベルが低下している。好ましい実施形態では、油はダイズ油である。本明細書中で使用する脂肪酸含量、または脂肪酸レベルのパーセンテージとは、重量パーセンテージをいう。
【０１７９】
第１の実施形態では、本発明の油は、好ましくは、５５〜８０％のオレイン酸、約１２〜４３％のポリ不飽和物、および２〜８％の飽和脂肪酸の油組成を有し；より好ましくは、５５〜８０％のオレイン酸、約１４〜４２％のポリ不飽和物、および３〜６％の飽和脂肪酸の油組成を有し；さらにより好ましくは、５５〜８０％のオレイン酸、約１６.５〜４３％のポリ不飽和物、および２〜３.６％の飽和脂肪酸の油組成を有する。
【０１８０】
第２の実施形態では、本発明の油は、好ましくは、６５〜８０％のオレイン酸、約１２〜３３％のポリ不飽和物、および２〜８％の飽和脂肪酸の油組成を有し；より好ましくは、６５〜８０％のオレイン酸、約１４〜３２％のポリ不飽和物、および３〜６％の飽和脂肪酸の油組成を有し；さらにより好ましくは、６５〜８０％のオレイン酸、約１６.５〜３３％のポリ不飽和物、および２〜３.６％の飽和脂肪酸の油組成を有する。
【０１８１】
第３の実施形態では、本発明の油は、好ましくは、約４２〜約８５％のオレイン酸および約８％〜約１.５％の飽和脂肪酸の油組成を有し；より好ましくは、油組成はさらに、全油組成の約６５重量％〜約９５重量％に等しい、合わせた量のオレイン酸およびリノレン酸を有する。さらにより好ましくは、本発明の油組成は、全油組成の約７５重量％〜約９０重量％、約７５重量％〜約９５重量％、約７５重量％〜約８５重量％、約６５重量％〜約９０重量％、約７０重量％〜約９０重量％に等しい、合わせた量のオレイン酸およびリノレン酸を有する。
【０１８２】
第４の実施形態では、本発明の油は、約４２〜約８５％のオレイン酸、約８％〜約１.５％の飽和脂肪酸、約６重量％〜約１５重量％のリノレン酸の油組成を有し；より好ましくは、約４２〜約８５％のオレイン酸、約８％〜約１.５％の飽和脂肪酸、３５重量％未満のリノレン酸の油組成を有し；さらにより好ましくは、約４２〜約８５％のオレイン酸、約８％〜約１.５％の飽和脂肪酸、約９重量％のリノレン酸の油組成を有する。
【０１８３】
第５の実施形態では、本発明の油は、約５０％〜約８５％のオレイン酸および約８％〜約１.５％の飽和脂肪酸；より好ましくは約５０％〜約８５％のオレイン酸、約８％〜約１.５％の飽和脂肪酸、約４重量％〜約１４重量％のリノレン酸の油組成を有し；より好ましくは、約５０％〜約８５％のオレイン酸、約８％〜約１.５％の飽和脂肪酸、３５重量％未満のリノレン酸の油組成を有し；さらにより好ましくは、約４２〜約８５％のオレイン酸、約８％〜約１.５％の飽和脂肪酸、約２重量％〜約４５重量％のリノレン酸の油組成を有する。
【０１８４】
もう一つの実施形態では、本発明の油は、約６５〜８０％のオレイン酸、約３〜８％の飽和物、および約１２〜３２％のポリ不飽和物の油組成を有する。もう一つの実施形態では、本発明の油は、約６５〜８０％のオレイン酸、約２〜３.５％の飽和物、および約１６.５〜３３％のポリ不飽和物の油組成を有する。
【０１８５】
特に好ましい実施形態では、本発明の油は、約４７〜８３％のオレイン酸および約５％の飽和物；約６０〜８０％のオレイン酸および約５％の飽和物；約５０〜８５％のオレイン酸および約２〜７％の飽和物；約５５〜８５％のオレイン酸および約２.５〜７％の飽和物；約４７〜８８％のオレイン酸および約３〜７％の飽和物；約４３〜８５％のオレイン酸および約５〜７％の飽和物；約８１〜８５％のオレイン酸および約５％の飽和物；約７４〜８３％のオレイン酸および約６％の飽和物；約６５〜８７％のオレイン酸および約６％の飽和物；約６６〜８０％のオレイン酸および約６％の飽和物；約４２〜７７％のオレイン酸および約５〜８％の飽和物；約６０〜７７％のオレイン酸および約６％の飽和物；約７０〜８１％のオレイン酸および約５〜７％の飽和物；約５２〜７１％のオレイン酸および約５〜７％の飽和物；約４４〜７１％のオレイン酸および約６％の飽和物；約６１〜７１％のオレイン酸および約８％の飽和物；約５７〜７１％のオレイン酸および約７％の飽和物；約２３〜５８％のオレイン酸および約８〜１４％の飽和物；約２０〜７０％のオレイン酸および約６％の飽和物；約２１〜３５％のオレイン酸および約５〜６％の飽和物；または約１９〜２８％のオレイン酸および約５％の飽和物の油組成を有する。
【０１８６】
他の実施形態では、オレイン酸のパーセンテージは、５０％以上；５５％以上；６０％以上；６５％以上；７０％以上；７５％以上；もしくは８０％以上であるか；または５０〜８０％；５５〜８０％；５５〜７５％；５５〜６５％；６０〜８５％；６０〜８０％；６０〜７５％；６０〜７０％；６５〜８５％；６５〜８０％；６５〜７５％；６５〜７０％；もしくは６９〜７３％の範囲である。また、本発明の油中のオレイン酸含量の適切なパーセンテージ範囲には、下限が５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０％のパーセンテージから選択され；上限が６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０％のパーセンテージから選択される範囲も含まれる。
【０１８７】
これらの他の実施形態では、本発明の油中のリノール酸のパーセンテージは、１０〜４０％；１０〜３９％；１０〜３０％；１０〜２９％；１０〜２８％；１０〜２５％；１０〜２１％；１０〜２０％；１１〜３０％；１２〜３０％；１５〜２５％；２０〜２５％；２０〜３０％；または２１〜２４％の範囲である。また、本発明の油中のリノール酸含量の適切なパーセンテージ範囲には、下限が１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０％のパーセンテージから選択され；上限が２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０％のパーセンテージから選択される範囲も含まれる。
【０１８８】
これらの他の実施形態では、本発明の油中のリノレン酸のパーセンテージは、１０％以下；９％以下；８％以下；７％以下；６％以下；５％以下；４.５％以下；４％以下；３.５％以下；３％以下；３.０％以下；２.５％以下；もしくは２％以下であるか；または０.５〜２％；０.５〜３％；０.５〜４.５％；０.５％〜６％；３〜５％；３〜６％；３〜８％；１〜２％；１〜３％；もしくは１〜４％の範囲である。これらの他の実施形態では、本発明の油組成物中の飽和脂肪酸のパーセンテージは、１５％以下；１４％以下；１３％以下；１２％以下、１１％以下；１０％以下；９％以下；８％以下；７％以下；６％以下；５％以下；４％以下；もしくは３.６％以下であるか；または２〜３％；２〜３.６％；２〜４％；２〜８％；３〜１５％；３〜１０％；３〜８％；３〜６％；３.６〜７％；５〜８％；７〜１０％；もしくは１０〜１５％の範囲である。
【０１８９】
他の実施形態では、本発明の油中の飽和脂肪酸には、パルミチン酸およびステアリン酸脂肪酸の組合せが含まれる。一実施形態では、飽和脂肪酸のパーセンテージは、約１０％以下；約９％以下；約８％以下；約７％以下；約６％以下；約５％以下；約４.５％以下；約４％以下；約３.５％以下；約３％以下；約３.０％以下；約２.５％以下；もしくは約２％以下の範囲であるか；または０.５〜２％；０.５〜３％；０.５〜４.５％；０.５〜６％；０.５〜７％；０.５〜８％；０.５〜９％；１〜４％；１〜５％；１〜６％；１〜７％；１〜８％；１〜９％；１.５〜５％；１.５〜６％；１.５〜７％；１.５〜８％；１.５〜９％；２〜５％；２〜６％；２〜７％；２〜８％；２〜９％；３〜５％；３〜６％；３〜７％；３〜８％；３〜９％；４〜７％；４〜８％；４〜９％；５〜７％；５〜８％；および５〜９％の範囲である。また、これらの実施形態では、本発明の油中の飽和脂肪酸含量の適切なパーセンテージ範囲には、下限が０.５、１、１.５、２.、２.５、３、３.５、４、４.５、５、５.５、６、または６.５％のパーセンテージから選択され；上限が１１、１０、９、８、７、６、５、４.５、４、３.５、３、２.５、２、１.５、１、または０.５％のパーセンテージから選択される範囲も含まれる。
【０１９０】
他の実施形態では、本発明の油組成物中のパルミチン酸脂肪酸のパーセンテージは、６％以下；５％以下；４.５％以下；４％以下；３.５％以下；３％以下；３.０％以下；２.５％以下；もしくは２％以下の範囲であるか；または０.５〜２％；０.５〜３％；０.５〜４.５％；０.５〜６％；１〜３％；１〜４％；１〜５％；１〜６％；１.５〜２％；１.５〜３％；１.５〜４％；１.５〜４.５％；１.５〜５％；１.５〜５.５％；１.５〜６％；１.５〜６.５％；１.５〜７％；２〜３％；２〜３.５％；２〜４％；２〜４.５％；２〜５％；２〜６％；２〜７％；２〜８％；３〜５％；３〜６％；３〜７％；３〜８％；３〜９％の範囲である。また、これらの実施形態では、本発明の油中のリノール酸含量の適切なパーセンテージ範囲には、下限が０.５、１、１.５、２.、２.５、３、３.５、４、４.５、５、５.５、６、６.５、７または７.５％のパーセンテージから選択され；上限が１１、１０、９、８、７、６、５、４.５、４、３.５、３、または２％のパーセンテージから選択される範囲も含まれる。
【０１９１】
他の実施形態では、本発明の油組成物中のステアリン酸脂肪酸のパーセンテージは、３％以下；３.０％以下；２.５％以下；もしくは２％以下の範囲であるか；または０.５〜１％；０.５〜１.５％；０.５〜２％；０.５〜２.５％；０.５〜３％；０.５〜４％；１〜２％；１〜３％；１〜４％；１.５〜２％；１.５〜３％；もしくは１.５〜４％の範囲である。また、これらの実施形態では、本発明の油中のリノール酸含量の適切なパーセンテージ範囲には、下限が０.５、１、１.５、２.、２.５、３、または３.５％のパーセンテージから選択され；上限が３.５、３、２.５、２、または１.５％のパーセンテージから選択される範囲も含まれる。
【０１９２】
本発明の油は、調理用またはフライ油としての使用に特に適している。そのポリ不飽和脂肪酸含量が低いため、好ましくない臭気および着色化合物がより少量しか存在しないので、本発明の油は典型的な油の大規模な加工を必要としない。さらに、本発明の油の低い飽和脂肪酸含量は油の低温フロー特性を向上させ、結晶化または固化を防止するために貯蔵した油を加熱する必要性が取り除かれる。低温フローの向上は、フライ食品材料をフライ油から取り出した後の油切りが強化され、脂肪がより低い生成物がもたらされる。Ｂｏｕｃｈｏｎら、Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、６６：９１８〜９２３（２００１）を参照されたい。本発明の油中の低レベルのリノレン酸は、異臭を低下させるためにフライで特に有利である。
【０１９３】
本発明の油は、サラダ油（４０〜５０°Ｆの冷蔵庫温度で透明度が保たれる油）としての使用にもよく適している。その低い飽和脂肪酸および中程度のリノール酸含量によるその冷蔵庫温度における向上された透明度により、サラダ油として使用する前に油を脱蝋する必要性が軽減または排除される。
【０１９４】
さらに、本発明の油の中程度のリノレン酸および低リノレン酸含量により、これはショートニング、マーガリンおよび食料品に用いられる他の半固体植物性脂肪の生成によく適している。これらの脂肪の生成は、典型的には、ダイズ油、トウモロコシ油、またはカノーラ油の不飽和油の水素化を含む。本発明の油の増加した酸化安定性および香味安定性は、これが、マーガリンおよびショートニングなどで使用するために典型的な植物油が水素化される程度まで水素化する必要がないことを意味し、したがって、加工コストおよび健康に良くないトランス異性体の生成が低下する。
【０１９５】
本発明の油はまた、特にそのような油から作製したバイオディーゼルは低温フローが向上しており、発火性（セタン価）が向上しており、酸化安定性が向上しており、一酸化窒素排出が低下しているので、バイオディーゼルを生成するための供給原料としての使用にも適している。バイオディーゼルとは、飽和、モノ不飽和、およびポリ不飽和のＣ１６〜Ｃ２２脂肪酸のメチルエステルから典型的になる代替ディーゼル燃料である。セタン価は発火性の尺度であり、エンジン内の燃料の発火遅れ時間が短いほどセタン価が高い。バイオディーゼル燃料のＡＳＴＭ標準仕様（Ｄ６７５１−０２）は、最低４７のセタン価を要する。
【０１９６】
慣用のディーゼルエンジンでのバイオディーゼルの使用は、石油ディーゼル燃料と比較して硫酸化物、一酸化炭素、および粒子などの汚染物質の実質的な低下をもたらし、スクールバスで使用することで、子供が毒性のあるディーゼル排気に曝されることを大きく軽減できる。１００％慣用のバイオディーゼルを燃料として使用すること制限は、２号ディーゼル（−１６℃）と比較して慣用のダイズバイオディーゼルの曇り点（２℃）が高いことである。Ｄｕｎｎら、Ｒｅｃｅｎｔ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖｅｌ．ｉｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．、１：３１〜５６（１９９７）。本発明の油から作製したバイオディーゼルは曇り点および目詰まり点が向上（低下）しており、動物脂肪（牛脂、豚脂、鶏脂）およびパーム油などの脂肪の安価であるが高飽和の油源から作製したバイオディーゼルの低温特性を向上させるために混合物中で用いてもよい。また、バイオディーゼルは任意のレベルで石油ディーゼルと混合することもできる。
【０１９７】
バイオディーゼルは、典型的には、遊離脂肪およびリン脂質を除去するためにダイズ油を抽出、濾過および精製し、その後、油をメタノールでトランスエステル化して脂肪酸のメチルエステルを形成することによって得られる。例えば、米国特許第５,８９１,２０３号を参照されたい。生じるダイズメチルエステルが一般的に「バイオディーゼル」と呼ばれる。本発明の油は、たとえばアセタールを油と混合することによってなど、メチルエステルを形成させないディーゼル燃料としても用い得る。例えば、米国特許第６,０１３,１１４号を参照されたい。その低温フローおよび酸化安定性の特性が向上していることで、本発明の油はまた、潤滑剤として、およびディーゼル燃料添加剤としても有用である。例えば、米国特許第５,８８８,９４７号、第５,４５４,８４２号および第４,５５７,７３４号を参照されたい。
【０１９８】
本発明のダイズおよび本発明の油は、豆乳、ダイズバター、納豆、およびテンペなどの全ダイズから作製する様々なダイズ食品、ならびにダイズミール、ダイズ粉、ダイズタンパク質濃縮物、ダイズタンパク質単離物、組立ダイズタンパク質濃縮物、加水分解ダイズタンパク質、ホイップトッピング、調理用油、サラダ油、ショートニング、およびレシチンを含めた加工ダイズおよびダイズ油から作製したダイズ食品での使用にも適している。全ダイズも食用であり、典型的には、生豆、焙煎豆、または枝豆として消費者に販売される。典型的には全ダイズを浸して磨砕することによって生成する豆乳は、そのままで、噴霧乾燥して、または加工してダイズヨーグルト、ダイズチーズ、豆腐、もしくは湯葉を形成して消費し得る。本発明のダイズまたは油は、その向上した酸化安定性、低下した異臭前駆体、およびその低い飽和脂肪酸レベルにより、これらおよび他のダイズ食品に有利に用い得る。
【０１９９】
Ｇ．抑制の調節
本発明のもう一つの実施形態は、遺伝子抑制レベルを調節する方法に指向される。遺伝子抑制の調節は、多かれ少なかれ、遺伝子抑制をもたらすことができる。遺伝子産物の抑制は、本発明の構築体を植物ゲノム内に挿入することからもたらされることができる。同様に、遺伝子抑制の調節は、本発明の構築体を植物ゲノム内に挿入することからもたらされることができる。遺伝子抑制を調節する方法の他の例には、限定されるものではないが、本発明の構築体を用いたアンチセンス技術、共抑制、ＲＮＡ干渉（ｄｓＲＮＡｉ）、トランスジェニック動物、ハイブリッド、およびリボザイムが含まれる。以下の例を例示によって提供し、本発明の制限であることを意図しない。
【０２００】
遺伝子の抑制は、配列が抑制を標的とした遺伝子に由来する、抑制に用いる転写可能なＤＮＡの長さを変更することによって調節できる。多くの方法を、転写後遺伝子サイレンシング機構を用いた遺伝子の抑制に用いることができる。理論に限定されずに、これらの方法は、もう一つのＲＮＡ分子とハイブリダイズするＲＮＡ分子の発現を共通して有すると考えられている。驚くべきことに、標的内在性遺伝子の定常状態発現レベルを調節または中程度に抑制するために特定の長さのＲＮＡ分子を使用することに利点が存在する可能性がある。
【０２０１】
ＦＡＤ２−１の遺伝子抑制は、オレイン酸レベルの上昇およびリノール酸レベルの低下をもたらす。ＦＡＤ２−１を大幅に抑制した場合、オレイン酸のレベルは６５％を超えることができ、これによりパルミチン酸およびリノレン酸のレベルの低下が引き起こされる。例えば、ＦＡＤ２−１を抑制した場合、オレイン酸レベルは８５％に達することができ、合わせたパルミチン酸およびステアリン酸のレベルが約１０％まで低下する。同様に、ＦＡＴＢのダウンレギュレーションは、飽和脂肪酸、主にパルミチン酸のレベルの減少をもたらす。オレイン酸レベルが約８５％であるようにＦＡＤ２およびＦＡＴＢを抑制した場合、飽和レベルは約１０％である。オレイン酸レベルが８５％を超えるようにＦＡＤ２およびＦＡＴＢを抑制した場合、飽和レベルは１０％未満に下がる可能性がある。
【０２０２】
本発明に鑑みて、オレイン酸を８５％より高くに増強せずに、飽和レベルを１０％未満まで低下させることができる。一実施形態では、ＦＡＤ２の抑制は、植物内に導入するＦＡＤ２−１のイントロンの長さを短縮することによって調節する。ＦＡＤ２の抑制を少なくすることで、中程度のレベルのオレイン酸、約４０〜８５％のオレイン酸がもたらされる。導入するＦＡＤ２−１のイントロン断片の長さを短縮するにつれて、ＦＡＤ２の抑制が低下する。例えば、長さが連続する少なくとも１００ヌクレオチド短縮されたＦＡＤ２−１のイントロンは、ＦＡＤ２の抑制を低下させ、対応してオレイン酸レベルを増加させ、リノール酸レベルを減少させることができる。
【０２０３】
内在性遺伝子抑制の減少と相同ＤＮＡの長さの減少との関係性は、異なる長さのＤＮＡを導入することによって経験的に決定できる。例えば、導入した相同ＤＮＡの長さを短縮することによって得ることができる抑制の低下の量は、導入する相同ＤＮＡの増加部分を欠失させ、標的遺伝子の発現についてアッセイを行うことによって、決定できる。
【０２０４】
本発明には、植物において飽和レベルの大幅な低下を有したままでＦＡＤ２の抑制を調節する方法が含まれる。そのような植物では、オレイン酸レベルは４０〜８５％の範囲であることができる。同様に、完全長ＦＡＴＢ遺伝子を宿主細胞に導入した場合と比較して、合わせた３'および５'非翻訳領域を導入した場合には、生じるＦＡＴＢの抑制は完全未満である。同様に、そのほとんどが葉緑体輸送ペプチドをコードしているオープンリーディングフレームの５'部分を宿主細胞内に導入した場合は、ＦＡＴＢの抑制レベルが低下する。本発明による方法を用いてＦＡＤ２およびＦＡＴＢを抑制した細胞では、オレイン酸レベルは４０〜８５％であることができる一方で、飽和レベルは１〜９％であることができる。
【０２０５】
一実施形態では、本発明は、遺伝子要素全体からの抑制と比較して抑制を低下させるために遺伝子抑制を調節する方法を対象とし、遺伝子要素全体は、遺伝子全体、エクソン全体、イントロン全体、シグナル配列全体、またはＵＴＲ全体であることができ、その後、遺伝子要素からの内在性配列の断片を含む組換え核酸分子を構築し；宿主細胞内で組換え核酸分子の発現を開始させ；内在性遺伝子を組換え核酸分子で抑制する。抑制する遺伝子は、ＦＡＤ２およびＦＡＴＢを含めた任意の遺伝子であることができる。一実施形態では、本発明は、宿主細胞内で部分的なＦＡＤ２またはＦＡＴＢ遺伝子要素配列を発現させ、ここに、ＦＡＤ２もしくはＦＡＴＢ遺伝子要素は宿主細胞中の内在性ＦＡＤ２またはＦＡＴＢ遺伝子からのものであり、ＦＡＤ２もしくはＦＡＴＢ遺伝子要素配列は、ＦＡＤ２もしくはＦＡＴＢ遺伝子、ＦＡＤ２もしくはＦＡＴＢエクソン、ＦＡＤ２もしくはＦＡＴＢのイントロン、ＦＡＤ２もしくはＦＡＴＢ輸送ペプチドコード領域、またはＦＡＤ２もしくはＦＡＴＢのＵＴＲであることができる；部分的なＦＡＤ２またはＦＡＴＢ遺伝子要素配列はＦＡＤ２またはＦＡＴＢ遺伝子要素配列全体未満である；次いで、内在性ＦＡＤ２またはＦＡＴＢを部分的なＦＡＤ２またはＦＡＴＢ遺伝子要素配列で抑制し、ここに、宿主細胞におけるＦＡＤ２またはＦＡＴＢ内在性遺伝子の抑制レベルは、類似の遺伝的背景およびＦＡＤ２またはＦＡＴＢ遺伝子要素のＦＡＤ２またはＦＡＴＢ遺伝子要素配列全体を含む第２のＦＡＤ２またはＦＡＴＢ核酸配列を有する宿主細胞におけるＦＡＤ２またはＦＡＴＢ内在性遺伝子の抑制レベル未満であることを含む、ＦＡＤ２またはＦＡＴＢの抑制を調節する方法に指向される。
【０２０６】
もう一つの実施形態では、本発明は、植物細胞を、ＦＡＤ２、ＦＡＴＢ、またはＦＡＤ２およびＦＡＴＢの内在性発現を抑制するＤＮＡ配列を含む組換え核酸分子で形質転換させ、ここに、ＤＮＡ配列が、遺伝子、エクソン、イントロン、輸送ペプチドコード領域、３'−ＵＴＲ、５'−ＵＴＲ、およびオープンリーディングフレームから選択された遺伝子要素全体の配列全体よりも短いＦＡＤ２、ＦＡＴＢ、またはＦＡＤ２およびＦＡＴＢの核酸配列を含み；前記ＤＮＡ配列の転写が開始される条件下で植物細胞を成長させ、それにより油組成が、類似の遺伝的背景を有するが組換え核酸分子を欠く植物細胞と比較して変更されていことによって、植物細胞の油組成を変更する方法に指向される。ＦＡＤ２またはＦＡＴＢの遺伝子要素は、長さが５０、７５、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、８００、１０００、２０００、３０００、または４０００ヌクレオチド短縮していることができる。ＦＡＤ２またはＦＡＴＢの遺伝子要素の長さは、５０、７５、１００、１５０、１７５、２００、２２０、２５０、３００、３２０、３５０、４００、４２０、４５０、５００、５５０、６００、８００、または１０００ヌクレオチドであることができる。
【０２０７】
もう一つの実施形態では、本発明は、ｉ）形質転換した植物からのＦＡＤ２発現の抑制の量が、類似の遺伝的背景および外来性ＦＡＤ２遺伝子のＤＮＡ配列全体を有する宿主細胞内におけるＦＡＤ２発現の抑制と比較して少なくとも部分的に低下するまで、宿主細胞中の外来性ＦＡＤ２ＤＮＡ配列の長さを短縮し；ｉｉ）ＦＡＤ２の内在性発現を少なくとも部分的に抑制する短縮したＦＡＤ２ＤＮＡ配列を含む核酸分子を有する植物を成長させ；ｉｉｉ）類似の遺伝的背景を有するが短縮したＦＡＤ２ＤＮＡ配列を欠く植物由来の種子と比較して飽和脂肪酸含量が低下した種子を生産する植物を栽培することによる、植物種子中のオレイン酸含量を増強し、飽和脂肪酸含量を低下させる方法に指向される。内在性ＦＡＤ２の抑制を少なくとも部分的に低下させるための、外来性ＦＡＤ２ＤＮＡ配列を短縮する量は、異なる長さのＤＮＡを導入することによって経験的に決定できる。例えば、導入した相同ＤＮＡの長さを短縮することによって得ることができる抑制の低下の量は、導入する相同ＤＮＡの増加させた部分を欠失させ、標的遺伝子の発現についてアッセイを行うことによって、決定できる。ＦＡＤ２発現の抑制の量は、平均して植物から３個以上、６個以上、１０個以上、１５個以上、または２０個以上の種子として得ることができる。
【０２０８】
もう一つの実施形態では、本発明は、植物細胞を、ＦＡＤ２およびＦＡＴＢの内在性発現を抑制するＤＮＡ配列を含む組換え核酸分子で形質転換させ、ここに、ＤＮＡ配列が、遺伝子、エクソン、イントロン、輸送ペプチドコード領域、およびＵＴＲから選択された遺伝子要素全体の配列全体よりも短いＦＡＤ２の核酸配列を含み；類似の遺伝的背景を有するが前記組換え核酸分子を欠く植物由来の種子と比較して飽和脂肪酸含量が低下した種子を生産する、形質転換した植物を成長させることによる、飽和脂肪酸含量が低下した種子を有する、形質転換した植物を生産する方法に指向される。
【０２０９】
もう一つの実施形態では、本発明は、脂肪酸合成経路内の内在性遺伝子の発現を抑制できる少なくとも４０ヌクレオチドの長さの遺伝子要素を単離し；遺伝子要素の複数の短縮した断片を作製し；複数の短縮した断片のそれぞれを温帯油種子作物の植物細胞内に導入してトランスジェニック植物を作製し；次いで、種子油の脂肪酸組成に望ましい変化を与える、決定された長さおよび配列の短縮した断片を含むトランスジェニック植物を選択することによる、温帯油種子作物の種子由来の油の脂肪酸組成を調節する方法に指向される。好ましい実施形態では、上記方法には、種子油の脂肪酸組成に異なる望ましい変化をもたらす２つの異なる内在性遺伝子の少なくとも２つの短縮した断片を有する組換えＤＮＡ構築体を構築し；組換えＤＮＡ構築体を温帯油種子作物の植物細胞内に導入してトランスジェニック植物を作製し；次いで、少なくとも２つの短縮した断片および少なくとも２つの短縮した断片によってもたらされた複数の望ましい変化を有する種子からの油の脂肪酸組成を含むトランスジェニック植物を選択することも含まれる。
【０２１０】
もう一つの実施形態では、本発明は、飽和脂肪酸含量が強く低下し、オレイン酸含量が中程度に増強され、宿主細胞においてＦＡＤ２の内在性発現を抑制するＤＮＡ配列を有し、ＤＮＡ配列が、遺伝子、エクソン、イントロン、輸送ペプチドコード領域、およびＵＴＲから選択された遺伝子要素全体の配列全体よりも短いＦＡＤ２の核酸配列を有する、油組成を示すダイズ種子に指向される。
【０２１１】
以下の実施例は例示的であり、いかなる様式でも限定することを意図しない。
【０２１２】
本明細書中で言及したすべての出版物、特許、および特許出願は、それぞれの個々の出版物、特許、または特許出願が具体的かつ個別に参考として組み込まれていると指定した場合と同じ程度に、本明細書中に参考として組み込まれている。
【実施例】
【０２１３】
（実施例１）  ＦＡＴＢ−２配列の単離
葉組織をＡｓｇｒｏｗダイズ品種Ａ３２４４から得て、液体窒素中で磨砕し、使用時まで−８０℃で貯蔵した。６ｍｌのＳＤＳ抽出緩衝液（６５０ｍｌの滅菌ｄｄＨ２Ｏ、１００ｍｌの１Ｍのトリス−Ｃｌ、ｐＨ８、１００ｍｌの０.２５ＭのＥＤＴＡ、５０ｍｌの２０％のＳＤＳ、１００ｍｌの５ＭのＮａＣｌ、４μｌのβ−メルカプトエタノール）を２ｍｌの凍結／磨砕した葉組織に加え、混合物を６５℃で４５分間インキュベーションを行った。サンプルを１５分間毎に振盪。氷冷した２ｍｌの５Ｍの酢酸カリウムをサンプルに加え、サンプルを振盪し、その後、氷上で２０分間インキュベーションを行った。３ｍｌのＣＨＣｌ３をサンプルに加え、サンプルを１０分間振盪した。
【０２１４】
サンプルを１０,０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を採取した。２ｍｌのイソプロパノールを上清に加え、混合した。その後、サンプルを１０,０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を排出した。ペレットを２００μｌのＲＮａｓｅに再懸濁させ、６５℃で２０分間インキュベーションを行った。３００μｌの酢酸アンモニウム／イソプロパノール（１：７）を加え、混合した。その後、サンプルを１０,０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを５００μｌの８０％のエタノールですすぎ、空気乾燥させた。その後、ゲノムＤＮＡのペレットを２００μｌのＴ１０Ｅ１（１０ｍＭのトリス：１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁させた。
【０２１５】
ダイズＦＡＴＢ−２ｃＤＮＡコンティグ配列（配列番号４２）を用いて、遺伝子にまたがる１３個のオリゴヌクレオチドを設計した：Ｆ１（配列番号４８）、Ｆ２（配列番号４９）、Ｆ３（配列番号５０）、Ｆ４（配列番号５１）、Ｆ５（配列番号５２）、Ｆ６（配列番号５３）、Ｆ７（配列番号５４）、Ｒ１（配列番号５５）、Ｒ２（配列番号５６）、Ｒ３（配列番号５７）、Ｒ４（配列番号５８）、Ｒ５（配列番号５９）、およびＲ６（配列番号６０）。オリゴヌクレオチドは、単離したダイズゲノムＤＮＡからのＰＣＲ増幅のために対で用いた：対１（Ｆ１＋Ｒ１）、対２（Ｆ２＋Ｒ１）、対３（Ｆ３＋Ｒ２）、対４（Ｆ４＋Ｒ３）、対５（Ｆ５＋Ｒ４）、対６（Ｆ６＋Ｒ５）、および対７（Ｆ７＋Ｒ６）。対５のＰＣＲ増幅は以下のように実施した：１サイクル、９５℃で１０分間；３０サイクル、９５℃で１５秒間、４３℃で３０秒間、７２℃で４５秒間；１サイクル、７２℃で７分間。すべての他のオリゴ対では、ＰＣＲ増幅を以下のように実施した：１サイクル、９５℃で１０分間；３０サイクル、９５℃で１５秒間、４８℃で３０秒間、７２℃で４５秒間；１サイクル、７２℃で７分間。陽性断片がプライマー対１、２、４、５、６および７から得られた。それぞれの断片をベクターｐＣＲ２.１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングした。断片２、４、５および６が確認され、配列決定を行った。これら４つの配列を整列させて、ＦＡＴＢ−２遺伝子のゲノム配列（配列番号４３）を形成した。
【０２１６】
ゲノム配列をｃＤＮＡ配列と比較することによって、４つイントロンがダイズＦＡＴＢ−２遺伝子中で同定された：イントロンＩ（配列番号４４）はゲノム配列（配列番号４３）の塩基１１９〜塩基１３３３にまたがり、長さが１２１５ｂｐであり；イントロンＩＩ（配列番号４５）はゲノム配列（配列番号４３）の塩基２２３１〜塩基２５６８にまたがり、長さが３３８ｂｐであり；イントロンＩＩＩ（配列番号４６）はゲノム配列（配列番号４３）の塩基２７０２〜塩基３３４２にまたがり、長さが６４１ｂｐであり；イントロンＩＶ（配列番号４７）はゲノム配列（配列番号４３）の塩基３４５７〜塩基３８２３にまたがり、長さが３６７ｂｐである。
【０２１７】
（実施例２）  抑制構築体
２Ａ．ＦＡＤ２−１構築体
ＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１（配列番号１）を、発現カセットｐＣＧＮ３８９２内に、センスおよびアンチセンス方向にクローニングした。ベクターｐＣＧＮ３８９２はダイズ７ＳプロモーターおよびエンドウマメｒｂｃＳの３'を含む。その後、どちらの遺伝子融合体も、ＦＭＶプロモーターによって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＣＧＮ９３７２内に別々にライゲーションした。生じた発現構築体（ｐＣＧＮ５４６９センスおよびｐＣＧＮ５４７１アンチセンス）をダイズの形質転換に用いた。
【０２１８】
ＦＡＤ２−１Ｂのイントロン（配列番号２）を、プラスミドｐＣＧＮ５４６８（ＦＡＤ２−１Ａのイントロン（センス）およびエンドウマメｒｂｃＳの３'と融合したダイズ７Ｓプロモーターを含む）またはｐＣＧＮ５４７０（ＦＡＤ２−１Ａのイントロン（アンチセンス）およびエンドウマメｒｂｃＳの３'と融合したダイズ７Ｓプロモーターを含む）内のＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１の３'末端と、それぞれセンスおよびアンチセンス方向に融合させた。その後、生じたイントロン組合せ融合体を、ＦＭＶプロモーターによって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＣＧＮ９３７２内に別々にライゲーションした。生じた発現構築体（ｐＣＧＮ５４８５、ＦＡＤ２−１ＡおよびＦＡＤ２−１ＢのイントロンセンスおよびｐＣＧＮ５４８６、ＦＡＤ２−１ＡおよびＦＡＤ２−１Ｂのイントロンアンチセンス）をダイズの形質転換に用いた。
【０２１９】
２Ｂ．ＦＡＤ３−１構築体
ＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃１、＃２、＃４および＃５（それぞれ配列番号７、８、１０および１１）、ＦＡＤ３−１Ｂのイントロン＃３Ｃ（配列番号２３）および＃４（配列番号２４）をすべて、ｐＣＧＮ３８９２内に、センスまたはアンチセンス方向に別々にライゲーションした。ｐＣＧＮ３８９２はダイズ７ＳプロモーターおよびエンドウマメｒｂｃＳの３'を含む。これらの融合体を、ダイズ内に形質転換させるために、ＦＭＶプロモーターによって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＣＧＮ９３７２内にライゲーションした。生じた発現構築体（ｐＣＧＮ５４５５、ＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃４センス；ｐＣＧＮ５４５９、ＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃４アンチセンス；ｐＣＧＮ５４５６、ＦＡＤ３のイントロン＃５センス；ｐＣＧＮ５４６０、ＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５アンチセンス；ｐＣＧＮ５４６６、ＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃２アンチセンス；ｐＣＧＮ５４７３、ＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃１アンチセンス）をダイズの形質転換に用いた。
【０２２０】
２Ｃ．ＦａｔＢ構築体
ダイズＦＡＴＢ−１のイントロンＩＩ配列（配列番号３０）を、ＦＡＴＢ−１部分的ゲノムクローンを鋳型として用いたＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅は以下のように実施した：１サイクル、９５℃で１０分間；２５サイクル、９５℃で３０秒間、６２℃で３０秒間、７２℃で３０秒間；１サイクル、７２℃で７分間。ＰＣＲ増幅により、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれる長さが８５４ｂｐの生成物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって発現カセットｐＣＧＮ３８９２内にセンス方向に直接クローニングして、ｐＭＯＮ７０６７４を形成した。ベクターｐＣＧＮ３８９２はダイズ７ＳプロモーターおよびエンドウマメｒｂｃＳの３'を含む。その後、ｐＭＯＮ７０６７４をＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターによって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ７０６７８を、アグロバクテリウム方法を用いたダイズの形質転換に用いた。
【０２２１】
ダイズＦＡＴＢ−１のイントロンＩＩ配列（配列番号３０）を含む２つの他の発現構築体を作製した。ｐＭＯＮ７０６７４をＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターによって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子およびナピンプロモーターによって調節されるＫＡＳ  ＩＶ遺伝子を含むｐＭＯＮ７０６７５内にライゲーションして、ｐＭＯＮ７０６８０がもたらされた。その後、発現ベクターｐＭＯＮ７０６８０をＳｎａＢＩで切断し、７Ｓプロモーターによって調節されるセンス方向のホホバΔ−９不飽和化酵素遺伝子（配列番号４１）の遺伝子融合体とライゲーションした。発現構築体ｐＭＯＮ７０６８０およびｐＭＯＮ７０６８１を、アグロバクテリウム方法を用いたダイズの形質転換に用いた。
【０２２２】
２Ｄ  組合せ構築体
第１の組のＤＮＡ配列の様々な順列を含む発現構築体を作製した。第１の組のＤＮＡ配列は、記載したもののうちの任意のもの、もしくは図５および６に例示したもの、または、ｄｓＲＮＡ構築体、センス共抑制構築体、アンチセンス構築体、もしくは前述の様々な組合せを形成できるように、センス、アンチセンス、もしくはセンスおよびアンチセンスのＦＡＤ２、ＦＡＤ３、およびＦＡＴＢ非コードもしくはコード領域の様々な組合せを含む、任意の他のＤＮＡ配列の組である。
【０２２３】
図５（ａ）〜（ｃ）は、本発明によるセンス共抑制構築体またはアンチセンス構築体を発現できるいくつかの第１の組のＤＮＡ配列を示し、その非コード配列を以下の表１および２に記載する。非コード配列は、単一の配列、配列の組合せ（例えば、３'ＵＴＲと連結した５'ＵＴＲ）、または前述の任意の組合せであり得る。センス共抑制構築体を発現させるためには、すべての非コード配列がセンス配列であり、アンチセンス構築体を発現させるためには、すべての非コード配列がアンチセンス配列である。図５（ｄ）は、本発明によるセンスおよびアンチセンス構築体を発現できる第１の組のＤＮＡ配列を示す。
【０２２４】
図６（ａ）〜（ｃ）は、本発明によるｄｓＲＮＡ構築体を発現できるいくつかの第１の組のＤＮＡ配列を示し、その非コード配列を以下の表１および２に記載する。図６に示した第１の組のＤＮＡ配列は、例えば、第１のセンス配列によって発現されるＲＮＡが、第１のアンチセンス配列によって発現されるアンチセンスＲＮＡと二本鎖ＲＮＡを形成できるように並べられた、関連するセンスおよびアンチセンス配列の対を含む。例えば、図６（ａ）および例示的な組合せ番号１（表１）を参照し、第１の組のＤＮＡ配列は、センスＦＡＤ２−１配列、センスＦＡＤ３−１配列、アンチセンスＦＡＤ２−１配列およびアンチセンスＦＡＤ３−１配列を含む。どちらのアンチセンス配列も、第１の組のＤＮＡ配列の発現産物が互いに二本鎖ＲＮＡを形成できるように、センス配列に対応している。センス配列は、スペーサー配列、好ましくはｄｓＲＮＡ分子の形成を促進するものによって、アンチセンス配列から隔たられていてよい。そのようなスペーサー配列の例には、Ｗｅｓｌｅｙら、上記、およびＨａｍｉｌｔｏｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１５：７３７〜７４６（１９８８）に記載のものが含まれる。プロモーターは、植物中で機能的な任意のプロモーター、または任意の植物プロモーターである。適切なプロモーターの非限定的な例は、発明を実施するための最良の形態のパートＤに記載されている。
【０２２５】
第１の組のＤＮＡ配列を、センスまたはアンチセンス方向のどちらかで、様々なＤＮＡ操作技術を用いて発現構築体内に挿入する。好都合な制限部位がＤＮＡ配列中に存在する場合は、制限エンドヌクレアーゼで消化し、利用可能なクローニング部位の１つまたは複数で消化された構築体内にライゲーションすることによって発現構築体内に挿入する。好都合な制限部位がＤＮＡ配列中に利用可能でない場合は、構築体またはＤＮＡ配列のどちらかのＤＮＡを、ＤＮＡ配列の構築体内へのクローニングを容易にする様々な方法で改変する。ＤＮＡを改変する方法の例には、ＰＣＲ、合成リンカーまたはアダプターライゲーション、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発、オーバーハング５'または３'末端を埋めるまたは切断することによる方法などが含まれる。これらおよびＤＮＡを操作する他の方法は、当業者に周知である。
【０２２６】
ｐＭＯＮ９７５５２は、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲの連続する４２ヌクレオチドと作動可能に連結している、３'末端から連続する１４０ヌクレオチドが短縮されているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているダイズ７Ｓα'プロモーター、続いて、ＦＡＴＢ−１ａのＣＴＰコード領域とアンチセンス方向に作動可能に連結しているＦＡＤ３−１Ａのイントロン４からの７０ヌクレオチドと作動可能に連結している、ＦＡＴＢ−１ａのＣＴＰコード領域、続いて、アンチセンス方向のＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲの連続する４２ヌクレオチド、続いて、ＥＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列と作動可能に連結しているＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を有するＨ６  ３'ポリアデニル化セグメントと作動可能に連結している、３'末端から連続する１４０ヌクレオチドが短縮されており、かつアンチセンス方向のダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）を含み、これらはすべてＲＢおよびＬＢに隣接している。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２２７】
ｐＭＯＮ９３７５８は、５'末端から連続する１６０ヌクレオチドが短縮されており、ＦＡＴＢ−１ａの３'ＵＴＲとライゲーションしているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているダイズ７Ｓα'プロモーター、続いて、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲとアンチセンス方向に作動可能に連結しているＦＡＤ３−１Ａのイントロン４からの７０ヌクレオチドと作動可能に連結している、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲ、続いて、アンチセンス方向のＦＡＴＢ−１ａの３'ＵＴＲ、続いて、ＥＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列と作動可能に連結しているＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を有するＨ６  ３'ポリアデニル化セグメントと作動可能に連結している、５'末端から連続する１６０ヌクレオチドが短縮されており、かつアンチセンス方向のダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）を含み、これらはすべて同一のＤＮＡ分子上のＲＢおよびＬＢに隣接している。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２２８】
ｐＭＯＮ９７５５３は、３'末端から連続する２００ヌクレオチドが短縮されており、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲの連続する４２ヌクレオチドとライゲーションしているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているダイズ７Ｓα'プロモーター、続いて、ＦＡＴＢ−１ａのＣＴＰコード領域とアンチセンス方向に作動可能に連結しているＦＡＤ３−１Ａのイントロン４からの７０ヌクレオチドと作動可能に連結している、ＦＡＴＢ−１ａのＣＴＰコード領域、続いて、アンチセンス方向のＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲの連続する４２ヌクレオチド、続いて、ＥＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列と作動可能に連結しているＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を有するＨ６  ３'ポリアデニル化セグメントと作動可能に連結している、３'末端から連続する２００ヌクレオチドが短縮されており、かつアンチセンス方向のダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）を含み、これらはすべて同一のＤＮＡ分子上のＲＢおよびＬＢに隣接している。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２２９】
ｐＭＯＮ９３７７０は、３'末端から連続する２４０ヌクレオチドが短縮されており、ＦＡＴＢ−１ａの３'ＵＴＲとライゲーションしているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているダイズ７Ｓα'プロモーター、続いて、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲとアンチセンス方向に作動可能に連結しているＦＡＤ３−１Ａのイントロン４からの７０ヌクレオチドと作動可能に連結している、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲ、続いて、アンチセンス方向のＦＡＴＢ−１ａの３'ＵＴＲ、続いて、ＥＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列と作動可能に連結しているＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を有するＨ６  ３'ポリアデニル化セグメントと作動可能に連結している、３'末端から連続する２４０ヌクレオチドが短縮されており、かつアンチセンス方向のダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）を含み、これらはすべて同一のＤＮＡ分子上のＲＢおよびＬＢに隣接している。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２３０】
ｐＭＯＮ９３７５９は、５'末端から連続する２４０ヌクレオチドが短縮されており、ＦＡＴＢ−１ａの３'ＵＴＲとライゲーションしているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているダイズ７Ｓα'プロモーター、続いて、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲとアンチセンス方向に作動可能に連結しているＦＡＤ３−１Ａのイントロン４からの７０ヌクレオチドと作動可能に連結している、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲ、続いて、アンチセンス方向のＦＡＴＢ−１ａの３'ＵＴＲ、続いて、ＥＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列と作動可能に連結しているＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を有するＨ６  ３'ポリアデニル化セグメントと作動可能に連結している、５'末端から連続する２４０ヌクレオチドが短縮されており、かつアンチセンス方向のダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）を含み、これらはすべて同一のＤＮＡ分子上のＲＢおよびＬＢに隣接している。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２３１】
ｐＭＯＮ９７５５４は、３'末端から連続する２６０ヌクレオチドが短縮されており、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲの連続する４２ヌクレオチドとライゲーションしているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているダイズ７Ｓα'プロモーター、続いて、ＦＡＴＢ−１ａのＣＴＰコード領域とアンチセンス方向に作動可能に連結しているＦＡＤ３−１Ａのイントロン４からの７０ヌクレオチドと作動可能に連結している、ＦＡＴＢ−１ａのＣＴＰコード領域、続いて、アンチセンス方向のＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲの連続する４２ヌクレオチド、続いて、ＥＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列と作動可能に連結しているＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を有するＨ６  ３'ポリアデニル化セグメントと作動可能に連結している、３'末端から連続する２６０ヌクレオチドが短縮されており、かつアンチセンス方向のダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）を含み、これらはすべて同一のＤＮＡ分子上のＲＢおよびＬＢに隣接している。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２３２】
ｐＭＯＮ９３７７１は、３'末端から連続する３００ヌクレオチドが短縮されており、ＦＡＴＢ−１ａの３'ＵＴＲとライゲーションしているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているダイズ７Ｓα'プロモーター、続いて、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲとアンチセンス方向に作動可能に連結しているＦＡＤ３−１Ａのイントロン４からの７０ヌクレオチドと作動可能に連結している、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲ、続いて、アンチセンス方向のＦＡＴＢ−１ａの３'ＵＴＲ、続いて、ＥＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列と作動可能に連結しているＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を有するＨ６  ３'ポリアデニル化セグメントと作動可能に連結している、３'末端から連続する３００ヌクレオチドが短縮されており、かつアンチセンス方向のダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）を含み、これらはすべて同一のＤＮＡ分子上のＲＢおよびＬＢに隣接している。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２３３】
ｐＭＯＮ９７５５５は、３'末端から連続する３２０ヌクレオチドが短縮されており、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲの連続する４２ヌクレオチドとライゲーションしているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているダイズ７Ｓα'プロモーター、続いて、ＦＡＴＢ−１ａのＣＴＰコード領域とアンチセンス方向に作動可能に連結しているＦＡＤ３−１Ａのイントロン４からの７０ヌクレオチドと作動可能に連結している、ＦＡＴＢ−１ａのＣＴＰコード領域、続いて、アンチセンス方向のＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲの連続する４２ヌクレオチド、続いて、ＥＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列と作動可能に連結しているＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を有するＨ６  ３'ポリアデニル化セグメントと作動可能に連結している、３'末端から連続する３２０ヌクレオチドが短縮されており、かつアンチセンス方向のダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）を含み、これらはすべて同一のＤＮＡ分子上のＲＢおよびＬＢに隣接している。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２３４】
ｐＭＯＮ９３７６０は、５'末端から連続する３２０ヌクレオチドが短縮されており、ＦＡＴＢ−１ａの３'ＵＴＲとライゲーションしているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているダイズ７Ｓα'プロモーター、続いて、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲとアンチセンス方向に作動可能に連結しているＦＡＤ３−１Ａのイントロン４からの７０ヌクレオチドと作動可能に連結している、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲ、続いて、アンチセンス方向のＦＡＴＢ−１ａの３'ＵＴＲ、続いて、ＥＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列と作動可能に連結しているＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を有するＨ６  ３'ポリアデニル化セグメントと作動可能に連結している、５'末端から連続する３２０ヌクレオチドが短縮されており、かつアンチセンス方向のダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）を含み、これらはすべて同一のＤＮＡ分子上のＲＢおよびＬＢに隣接している。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２３５】
ｐＭＯＮ９３７７２は、３'末端から連続する３６０ヌクレオチドが短縮されており、ＦＡＴＢ−１ａの３'ＵＴＲとライゲーションしているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているダイズ７Ｓα'プロモーター、続いて、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲとアンチセンス方向に作動可能に連結しているＦＡＤ３−１Ａのイントロン４からの７０ヌクレオチドと作動可能に連結している、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲ、続いて、アンチセンス方向のＦＡＴＢ−１ａの３'ＵＴＲ、続いて、ＥＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列と作動可能に連結しているＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を有するＨ６  ３'ポリアデニル化セグメントと作動可能に連結している、３'末端から連続する３６０ヌクレオチドが短縮されており、かつアンチセンス方向のダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）を含み、これらはすべて同一のＤＮＡ分子上のＲＢおよびＬＢに隣接している。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２３６】
ｐＭＯＮ９７５５６は、３'末端から連続する３８０ヌクレオチドが短縮されており、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲの連続する４２ヌクレオチドとライゲーションしているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているダイズ７Ｓα'プロモーター、続いて、ＦＡＴＢ−１ａのＣＴＰコード領域とアンチセンス方向に作動可能に連結しているＦＡＤ３−１Ａのイントロン４からの７０ヌクレオチドと作動可能に連結している、ＦＡＴＢ−１ａのＣＴＰコード領域、続いて、ＥＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列と作動可能に連結しているＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を有するＨ６  ３'ポリアデニル化セグメントと作動可能に連結している、３'末端から連続する３８０ヌクレオチドが短縮されており、かつアンチセンス方向のダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結している、アンチセンス方向のＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲの連続する４２ヌクレオチドを含み、これらはすべて同一のＤＮＡ分子上のＲＢおよびＬＢに隣接している。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２３７】
ｐＭＯＮ９３７６４は、３'末端から連続する４００ヌクレオチドが短縮されているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しており、ＦＡＴＢ−１ａのＣＴＰコード領域とライゲーションしているダイズ７Ｓα'プロモーター、続いて、ＦＡＴＢ−２ａのＣＴＰコード領域とアンチセンス方向に作動可能に連結しているＦＡＤ３−１Ａのイントロン４からの７０ヌクレオチドと作動可能に連結している、ＦＡＴＢ−２ａのＣＴＰコード領域、続いて、アンチセンス方向のＦＡＴＢ−１ａのＣＴＰコード領域、続いて、ＦＡＴＢ−２ａのＣＴＰコード領域とアンチセンス方向に作動可能に連結している、３'末端から連続する４００ヌクレオチドが短縮されており、かつアンチセンス方向のダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）、続いて、ＥＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列と作動可能に連結しているＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を有するＨ６  ３'ポリアデニル化セグメントと作動可能に連結しているアンチセンス方向のＦＡＴＢ−２ａの５'ＵＴＲの連続する４２ヌクレオチドを含み、これらはすべて同一のＤＮＡ分子上のＲＢおよびＬＢに隣接している。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２３８】
【表１−１】
2009526550.tif 000003
【０２３９】
【表１−２】
2009526550.tif 000004
【０２４０】
【表２】
2009526550.tif 000005
【０２４１】
（実施例３）  組合せ構築体
図７〜１５では、プロモーターを矢印によって示し、コード配列（コードおよび非コード）を転写の方向を指す五角形によって示し、センス配列を通常テキストで表示し、アンチセンス配列を上下逆のテキストで表示した。これらの図中で用いた略記には、７Ｓａ＝７Ｓαプロモーター；７Ｓａ'＝７Ｓα'プロモーター；Ｂｒナピン＝ブラシカ属のナピンプロモーター；ＦＭＶ＝ＦＭＶプロモーター；ＡＲＣ＝アルセリンプロモーター；ＲＢＣ  Ｅ９  ３'＝ルビスコＥ９終止シグナル；Ｎｏｓ３'＝ｎｏｓ終止シグナル；ＴＭＬ３'＝ｔｍｌ終止シグナル；ナピン３'＝ナピン終止シグナル；'３（ＦＡＤまたはＦＡＴと同一のボックス内で）＝３'ＵＴＲ；５'（ＦＡＤまたはＦＡＴと同一のボックス内で）＝５'ＵＴＲ；Ｃｒ＝クフェア・プルチェリマ；Ｇｍ＝グリシンマックス；Ｒｃ＝リシヌス・コムニス；ＦＡＢ２＝Δ９ステアロイル−不飽和化酵素遺伝子のＦＡＢ２対立遺伝子；およびＩｎｔｒまたはＩｎｔ＝イントロンが含まれる。
【０２４２】
３Ａ．ｄｓＲＮＡ構築体
図７〜９は、第１の組のＤＮＡ配列がｄｓＲＮＡ構築体を発現できる本発明の核酸分子を示す。図７〜９に示した第１の組のＤＮＡ配列は、関連するセンスおよびアンチセンス配列の対、例えば、第１のセンス配列によって発現されるＲＮＡが、第１のアンチセンス配列によって発現されるアンチセンスＲＮＡと二本鎖ＲＮＡを形成できるように並べられた対を含む。図９に示すように、センス配列は、アンチセンス配列に隣接しているか、またはスペーサー配列によってアンチセンス配列から隔てられていてもよい。
【０２４３】
第２の組のＤＮＡ配列はコード配列を含み、そのそれぞれが、発現された場合に、ＫＡＳ  Ｉ、ＫＡＳ  ＩＶ、Δ−９不飽和化酵素、およびＣＰ４  ＥＰＳＰＳからなる群から選択された遺伝子によってコードされているタンパク質および転写物の一方または両方を増加させることができる配列をコードしているＤＮＡ配列である。それぞれのコード配列はプロモーターと結合しており、これは、植物中で機能的な任意のプロモーター、または任意の植物プロモーターであることができ、ＦＭＶプロモーター、ナピンプロモーター、７Ｓ（７Ｓαもしくは７Ｓα'）プロモーター、アルセリンプロモーター、Δ−９不飽和化酵素プロモーター、またはＦＡＤ２−１Ａプロモーターであり得る。
【０２４４】
ここで図７を参照し、ダイズＦＡＤ２−１のイントロン１（配列番号１または２）、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ（配列番号１６）、およびＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ（配列番号３６）配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センスおよびアンチセンス方向に、スプライシング可能なダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン５（配列番号１１）によって隔てて、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。ブラシカ属のナピンプロモーターおよびブラシカ属のナピンの３'終止配列によって調節されるシー・プルチェリマＫＡＳ  ＩＶ遺伝子（配列番号３９）、ならびにダイズＦＡＤ２プロモーターおよびｎｏｓの３'終止配列によって調節されるアール・コムニスのΔ−９不飽和化酵素（ＦＡＢ２）遺伝子（配列番号４０）を含むベクターを適切な制限酵素で切断し、ｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ６８５３９を図７に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２４５】
ダイズＦＡＤ２−１のイントロン１（配列番号１または２）、ＦＡＤ３−１Ａのイントロン４（配列番号１０）、およびＦＡＴＢ−１のイントロンＩＩ（配列番号３０）の配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センスおよびアンチセンス方向に、スプライシング可能なダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン５（配列番号１１）によって隔てて、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ６８５４０を図７に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２４６】
ダイズＦＡＤ２−１のイントロン１（配列番号１または２）、ＦＡＤ３−１Ａのイントロン４（配列番号１０）、およびＦＡＴＢ−１のイントロンＩＩ（配列番号３０）の配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センスおよびアンチセンス方向に、スプライシング可能なダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン５（配列番号１１）によって隔てて、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。ブラシカ属のナピンプロモーターおよびブラシカ属のナピンの３'終止配列によって調節されるシー・プルチェリマＫＡＳ  ＩＶ遺伝子（配列番号３９）を含むベクターを適切な制限酵素で切断し、ｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ６８５４４を図７に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２４７】
ダイズＦＡＤ２−１のイントロン１（配列番号１または２）、ＦＡＤ３−１Ａのイントロン４（配列番号１０）、ＦＡＴＢ−１のイントロンＩＩ（配列番号３０）、およびＦＡＤ３−１Ｂのイントロン４（配列番号２４）の配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センスおよびアンチセンス方向に、スプライシング可能なダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン５（配列番号１１）によって隔てて、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ６８５４６を図７に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２４８】
ここで図８を参照し、ダイズＦＡＤ２−１のイントロン１（配列番号１または２）、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ（配列番号１６）、およびＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ（配列番号３６）配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センスおよびアンチセンス方向に、スプライシング可能なダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン５（配列番号１１）によって隔てて、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ６８５３６を図８に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２４９】
ダイズＦＡＤ２−１のイントロン１（配列番号１または２）、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ（配列番号１６）、およびＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ（配列番号３６）配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センスおよびアンチセンス方向に、スプライシング可能なダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン５（配列番号１１）によって隔てて、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。ダイズＦＡＤ２プロモーターおよびｎｏｓの３'終止配列によって調節されるアール・コムニスのΔ−９不飽和化酵素（ＦＡＢ２）遺伝子（配列番号４０）を含むベクターを適切な制限酵素で切断し、ｔｍｌの３'終止配列のすぐ上流にライゲーションした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ６８５３７を図８に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２５０】
ダイズＦＡＤ２−１のイントロン１（配列番号１または２）、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ（配列番号１６）、およびＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ（配列番号３６）配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センスおよびアンチセンス方向に、スプライシング可能なダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン５（配列番号１１）によって隔てて、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。ブラシカ属のナピンプロモーターおよびブラシカ属のナピンの３'終止配列によって調節されるシー・プルチェリマＫＡＳ  ＩＶ遺伝子（配列番号３９）を含むベクターを適切な制限酵素で切断し、ｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ６８５３８を図８に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２５１】
ここで図９を参照し、ダイズＦＡＤ２−１の３'ＵＴＲ（配列番号５）、ＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ（配列番号３６）、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ（配列番号１６）、およびＦＡＤ３−１Ｂの３'ＵＴＲ（配列番号２６）の配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センスおよびアンチセンス方向に、スプライシング可能なダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン５（配列番号１１）によって隔てて、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ８０６２２を図９に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２５２】
ダイズＦＡＤ２−１の３'ＵＴＲ（配列番号５）、ＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ（配列番号３６）、およびＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ（配列番号１６）配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センスおよびアンチセンス方向に、スプライシング可能なダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン５（配列番号１１）によって隔てて、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ８０６２３を図９に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２５３】
ダイズＦＡＤ２−１の５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号６および５）、ＦＡＴＢ−１の５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号３７および３６）、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ（配列番号１６）ならびにＦＡＤ３−１Ｂの５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号２７および２６）の配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センスおよびアンチセンス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体Ｏ５を図９に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２５４】
ダイズＦＡＤ２−１の５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号６および５）、ＦＡＴＢ−１の５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号３７および３６）ならびにＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ（配列番号１６）配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センスおよびアンチセンス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。ブラシカ属のナピンプロモーターおよびブラシカ属のナピンの３'終止配列によって調節されるシー・プルチェリマＫＡＳ  ＩＶ遺伝子（配列番号３９）を含むベクターを適切な制限酵素で切断し、ｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体Ｏ６を図９に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２５５】
３Ｂ．センス共抑制構築体
図１０〜１３および１９〜２０は、第１の組のＤＮＡ配列がセンス共抑制構築体を発現できる本発明の核酸分子を示す。第２の組のＤＮＡ配列はコード配列を含み、そのそれぞれが、発現された場合に、ＫＡＳ  Ｉ、ＫＡＳ  ＩＶ、Δ−９不飽和化酵素、およびＣＰ４  ＥＰＳＰＳからなる群から選択された遺伝子によってコードされているタンパク質および転写物の一方または両方を増加させることができる配列をコードしているＤＮＡ配列である。それぞれのコード配列はプロモーターと結合しており、これは、植物中で機能的な任意のプロモーター、または任意の植物プロモーターであることができ、ＦＭＶプロモーター、ナピンプロモーター、７Ｓプロモーター（７Ｓαもしくは７Ｓα'）、アルセリンプロモーター、Δ−９不飽和化酵素プロモーター、またはＦＡＤ２−１Ａプロモーターであり得る。
【０２５６】
ここで図１０を参照し、ダイズＦＡＤ２−１のイントロン１（配列番号１または２）、ＦＡＤ３−１Ｃのイントロン４（配列番号１４）、ＦＡＴＢ−１のイントロンＩＩ（配列番号３０）、ＦＡＤ３−１Ａのイントロン４（配列番号１０）、およびＦＡＤ３−１Ｂのイントロン４（配列番号２４）の配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ６８５２２を図１０に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２５７】
ダイズＦＡＤ２−１のイントロン１（配列番号１または２）、ＦＡＤ３−１Ａのイントロン４（配列番号１０）、ＦＡＤ３−１Ｂのイントロン４（配列番号２４）、およびＦＡＴＢ−１のイントロンＩＩ（配列番号３０）の配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。ブラシカ属のナピンプロモーターおよびブラシカ属のナピンの３'終止配列によって調節されるシー・プルチェリマＫＡＳ  ＩＶ遺伝子（配列番号３９）、ならびにダイズＦＡＤ２プロモーターおよびｎｏｓの３'終止配列によって調節されるアール・コムニスのΔ−９不飽和化酵素（ＦＡＢ２）遺伝子（配列番号４０）を含むベクターを適切な制限酵素で切断し、ｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ８０６１４を図１０に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２５８】
ダイズＦＡＤ２−１のイントロン１（配列番号１または２）、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ（配列番号１６）、およびＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ（配列番号３６）配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ６８５３１を図１０に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２５９】
ダイズＦＡＤ２−１のイントロン１（配列番号１または２）、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ（配列番号１６）、およびＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ（配列番号３６）配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。ブラシカ属のナピンプロモーターおよびブラシカ属のナピンの３'終止配列によって調節されるシー・プルチェリマＫＡＳ  ＩＶ遺伝子（配列番号３９）、ならびにダイズＦＡＤ２プロモーターおよびｎｏｓの３'終止配列によって調節されるアール・コムニスのΔ−９不飽和化酵素（ＦＡＢ２）遺伝子（配列番号４０）を含むベクターを適切な制限酵素で切断し、ｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ６８５３４を図１０に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２６０】
ダイズＦＡＤ２−１のイントロン１（配列番号１または２）、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ（配列番号１６）、およびＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ（配列番号３６）配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。ダイズＦＡＤ２プロモーターおよびｎｏｓの３'終止配列によって調節されるアール・コムニスのΔ−９不飽和化酵素（ＦＡＢ２）遺伝子（配列番号４０）を含むベクターを適切な制限酵素で切断し、ｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ６８５３５を図１０に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２６１】
ここで図１１を参照し、ダイズＦＡＤ２−１の３'ＵＴＲ（配列番号５）、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ（配列番号１６）、およびＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ（配列番号３６）配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ８０６０５を図１１に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２６２】
ダイズＦＡＤ２−１の３'ＵＴＲ（配列番号５）、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ（配列番号１６）、およびＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ（配列番号３６）配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。ブラシカ属のナピンプロモーターおよびブラシカ属のナピンの３'終止配列によって調節されるシー・プルチェリマＫＡＳ  ＩＶ遺伝子（配列番号３９）を含むベクターを適切な制限酵素で切断し、ｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ８０６０６を図１１に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２６３】
ダイズＦＡＤ２−１の３'ＵＴＲ（配列番号５）、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ（配列番号１６）、およびＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ（配列番号３６）配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。ダイズＦＡＤ２プロモーターおよびｎｏｓの３'終止配列によって調節されるアール・コムニスのΔ−９不飽和化酵素（ＦＡＢ２）遺伝子（配列番号４０）を含むベクターを適切な制限酵素で切断し、ｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ８０６０７を図１１に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２６４】
ダイズＦＡＤ２−１の３'ＵＴＲ（配列番号５）、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ（配列番号１６）、およびＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ（配列番号３６）配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。ブラシカ属のナピンプロモーターおよびブラシカ属のナピンの３'終止配列によって調節されるシー・プルチェリマＫＡＳ  ＩＶ遺伝子（配列番号３９）、ならびにダイズＦＡＤ２プロモーターおよびｎｏｓの３'終止配列によって調節されるアール・コムニスのΔ−９不飽和化酵素（ＦＡＢ２）遺伝子（配列番号４０）を含むベクターを適切な制限酵素で切断し、ｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ８０６１４を図１１に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２６５】
ここで図１２を参照し、ダイズＦＡＤ２−１の３'ＵＴＲ（配列番号５）、ＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ（配列番号３６）、およびＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ（配列番号１６）配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センス方向に、ダイズ７Ｓαプロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ８０６２９を図１２に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２６６】
ダイズＦＡＤ２−１のイントロン１（配列番号１または２）、ＦＡＤ３−１Ａのイントロン４（配列番号１０）、ＦＡＴＢ−１のイントロンＩＩ（配列番号３０）、およびＦＡＤ３−１Ａのイントロン４（配列番号１０）の配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センス方向に、ダイズ７Ｓαプロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ８１９０２を図１２に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２６７】
ダイズＦＡＤ２−１の５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号６および５）、ＦＡＤ３−１の５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号１７および１６、または一緒にライゲーションされている配列番号２７および２６）、ならびにＦＡＴＢ−１の５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号３７および３６）の配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＦＡＤ２−１のＰＣＲ産物を、センス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。同様に、ＦＡＤ３−１のＰＣＲ産物を、センス方向に、ダイズ７Ｓαプロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。ＦＡＴＢ−１のＰＣＲ産物を、センス方向に、アルセリンプロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体Ｏ１を図１２に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２６８】
ダイズＦＡＤ２−１の５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号６および５）、ＦＡＤ３−１の５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号１７および１６、または一緒にライゲーションされている配列番号２７および２６）、ならびにＦＡＴＢ−１の５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号３７および３６）の配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＦＡＤ２−１のＰＣＲ産物を、センス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。同様に、ＦＡＤ３−１のＰＣＲ産物を、センス方向に、ダイズ７Ｓαプロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。ＦＡＴＢ−１のＰＣＲ産物を、センス方向に、アルセリンプロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。ブラシカ属のナピンプロモーターおよびブラシカ属のナピンの３'終止配列によって調節されるシー・プルチェリマＫＡＳ  ＩＶ遺伝子（配列番号３９）を含むベクターを適切な制限酵素で切断し、ｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体Ｏ２を図１２に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２６９】
ここで図１３を参照し、ダイズＦＡＤ２−１の５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号６および５）、ＦＡＴＢ−１の５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号３７および３６）、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ（配列番号１６）、ならびにＦＡＤ３−１Ｂの５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号２７および２６）の配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、これらのベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。ブラシカ属のナピンプロモーターおよびブラシカ属のナピンの３'終止配列によって調節されるシー・プルチェリマＫＡＳ  ＩＶ遺伝子（配列番号３９）を含むベクターを適切な制限酵素で切断し、ｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体Ｏ７を図１３に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２７０】
ダイズＦＡＤ２−１のイントロン１（配列番号１または２）を、ＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。ダイズＦＡＴＢ−１の５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号３７および３６）、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ（配列番号１６）、ならびにＦＡＤ３−１Ｂの５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号２７および２６）の配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センス方向に、ダイズ７Ｓαプロモーターおよびｎｏｓの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。ブラシカ属のナピンプロモーターおよびブラシカ属のナピンの３'終止配列によって調節されるシー・プルチェリマＫＡＳ  ＩＶ遺伝子（配列番号３９）を含むベクターを適切な制限酵素で切断し、ｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体Ｏ９を図１３に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２７１】
ここで図１９を参照し、ダイズＦＡＴＢ−２非コード配列（配列番号４４〜４７）、ＦＡＤ２−１非コード配列（配列番号１および５〜６）、ならびにＦＡＴＢ−１非コード配列（配列番号２９〜３７）をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ８０６１２内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体を図１９−Ａに示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２７２】
７ＳαプロモーターおよびＴＭＬの３'終止配列によって調節されるΔ−９不飽和化酵素を含むＤＮＡ配列を適切な制限酵素で切断し、上記発現構築体内にライゲーションした。生じた発現構築体を図１９−Ｂに示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２７３】
マメアルセリンプロモーターおよびナピンの３'終止配列によって調節されるシー・プルチェリマＫＡＳ  ＩＶ遺伝子（配列番号３９）を含むベクターを適切な制限酵素で切断し、上記発現構築体内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体を図１９−Ｃに示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２７４】
ここで図２０を参照し、ダイズＦＡＴＢ−２非コード配列（配列番号４４〜４７）、ＦＡＤ２−１非コード配列（配列番号１および５〜６）、ＦＡＴＢ−１非コード配列（配列番号２９〜３７）、ＦＡＤ３−１Ａ非コード配列（配列番号７〜１３および配列番号１６〜１７）、ならびにＦＡＤ３−１Ｂ非コード配列（配列番号１９〜２７）をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ８０６１２内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体を図２０−Ａに示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２７５】
７ＳαプロモーターおよびＴＭＬの３'終止配列によって調節されるΔ−９不飽和化酵素を含むＤＮＡ配列を適切な制限酵素で切断し、上記発現構築体内にライゲーションした。生じた発現構築体を図２０−Ｂに示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２７６】
ブラシカ属マメアルセリンプロモーターおよびナピンの３'終止配列によって調節されるシー・プルチェリマＫＡＳ  ＩＶ遺伝子（配列番号３９）を含むベクターを適切な制限酵素で切断し、上記発現構築体内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体を図２０−Ｃに示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２７７】
ｐＭＯＮ９３５０１は、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびＨ６  ３'終止配列と作動可能に連結しているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）、ブラシカ属のナピンプロモーターおよびブラシカ属のナピンの３'終止配列と作動可能に連結しているシー・プルチェリマＫＡＳ  ＩＶ遺伝子（配列番号３９）、ダイズ７ＳＡプロモーターおよびｎｏｓの３'終止配列と作動可能に連結しているリシヌス・コムニスΔ９不飽和化酵素遺伝子（米国特許出願第２００３／００２２９９１８  Ａ１号）、ならびにＥＦＭＶプロモーター（ゴマノハグサモザイクウイルスに由来する構成的プロモーター）プロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列と作動可能に連結しているＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含み、これらはすべて、アグロバクテリウム属のＴ−ＤＮＡ境界因子、すなわち右境界ＤＮＡ（ＲＢ）および左境界ＤＮＡ（ＬＢ）に隣接している。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２７８】
３Ｃ．アンチセンス構築体
図１４は、第１の組のＤＮＡ配列がアンチセンス構築体を発現できる本発明の核酸分子を示し、図１５〜１８は、第１の組のＤＮＡ配列がセンスおよびアンチセンス構築体の組合せを発現できる本発明の核酸分子を示す。第２の組のＤＮＡ配列はコード配列を含み、そのそれぞれが、発現された場合に、ＫＡＳ  Ｉ、ＫＡＳ  ＩＶ、Δ−９不飽和化酵素、およびＣＰ４  ＥＰＳＰＳからなる群から選択された遺伝子によってコードされているタンパク質および転写物の一方または両方を増加させることができる配列をコードしているＤＮＡ配列である。それぞれのコード配列はプロモーターと結合しており、これは、植物中で機能的な任意のプロモーター、または任意の植物プロモーターであることができ、ＦＭＶプロモーター、ナピンプロモーター、７Ｓ（７Ｓαもしくは７Ｓα'）プロモーター、アルセリンプロモーター、Δ−９不飽和化酵素プロモーター、またはＦＡＤ２−１Ａプロモーターであり得る。
【０２７９】
ここで図１４を参照し、ダイズＦＡＤ２−１の３'ＵＴＲ（配列番号５）、ＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ（配列番号３６）、およびＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ（配列番号１６）配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、アンチセンス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ８０６１５を図１４に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２８０】
ダイズＦＡＤ２−１の３'ＵＴＲ（配列番号５）、ＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ（配列番号３６）、およびＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ（配列番号１６）配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、アンチセンス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。ブラシカ属のナピンプロモーターおよびブラシカ属のナピンの３'終止配列によって調節されるシー・プルチェリマＫＡＳ  ＩＶ遺伝子（配列番号３９）を含むベクターを適切な制限酵素で切断し、ｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ８０６１６を図１４に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２８１】
ダイズＦＡＤ２−１の３'ＵＴＲ（配列番号５）、ＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ（配列番号３６）、およびＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ（配列番号１６）配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、アンチセンス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。ダイズＦＡＤ２プロモーターおよびｎｏｓの３'終止配列によって調節されるアール・コムニスのΔ−９不飽和化酵素（ＦＡＢ２）遺伝子（配列番号４０）を含むベクターを適切な制限酵素で切断し、ｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ８０６１７を図１４に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２８２】
ダイズＦＡＤ２−１の３'ＵＴＲ（配列番号５）、ＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ（配列番号３６）、およびＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ（配列番号１６）配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、アンチセンス方向に、ダイズ７Ｓαプロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ８０６３０を図１４に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２８３】
ダイズＦＡＤ２−１の５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号６および５）、ＦＡＴＢ−１の５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号３７および３６）、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ（配列番号１６）、ならびにＦＡＤ３−１Ｂの５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号２７および２６）の配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、アンチセンス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。ブラシカ属のナピンプロモーターおよびブラシカ属のナピンの３'終止配列によって調節されるシー・プルチェリマＫＡＳ  ＩＶ遺伝子（配列番号３９）を含むベクターを適切な制限酵素で切断し、ｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体Ｏ８を図１４に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２８４】
ここで図１５を参照し、ダイズＦＡＤ２−１の５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号６および５）、ＦＡＤ３−１ａの５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号１７および１６）、ならびにＦＡＴＢ−１の５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号３７および３６）の配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センスおよびアンチセンス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、センスおよびアンチセンス配列の間に位置する追加のダイズ７Ｓαプロモーターを用いて、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体Ｏ３を図１５に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２８５】
ダイズＦＡＤ２−１の５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号６および５）、ＦＡＤ３−１ａの５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号２７および２６）、ならびにＦＡＴＢ−１の５'ＵＴＲ〜３'ＵＴＲ（一緒にライゲーションされている配列番号３７および３６）の配列をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センスおよびアンチセンス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、センスおよびアンチセンス配列の間に位置する追加のダイズ７Ｓαプロモーターを用いて、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作したＸｈｏＩ部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターをＮｏｔＩで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。ブラシカ属のナピンプロモーターおよびブラシカ属のナピンの３'終止配列によって調節されるシー・プルチェリマＫＡＳ  ＩＶ遺伝子（配列番号３９）を含むベクターを適切な制限酵素で切断し、ｐＭＯＮ４１１６４内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体Ｏ４を図１５に示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２８６】
ここで図１６を参照し、ダイズＦＡＴＢ−２非コード配列（配列番号４４〜４７）、ＦＡＴＢ−１非コード配列（配列番号２９〜３７）、ならびにＦＡＤ２−１非コード配列（配列番号１および５〜６）をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センスおよびアンチセンス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に直接クローニングした。その後、ベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターｐＭＯＮ８０６１２内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体を図１６−Ａに示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２８７】
７ＳαプロモーターおよびＴＭＬの３'終止配列によって調節されるΔ−９不飽和化酵素を含むＤＮＡ配列を適切な制限酵素で切断し、上記発現構築体内にライゲーションした。生じた発現構築体を図１６−Ｂに示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２８８】
マメアルセリンプロモーターおよびナピンの３'終止配列によって調節されるシー・プルチェリマＫＡＳ  ＩＶ遺伝子（配列番号３９）を含むベクターを適切な制限酵素で切断し、上記発現構築体内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体を図１６−Ｃに示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２８９】
ここで図１７を参照し、ダイズＦＡＴＢ−２非コード配列（配列番号４４〜４７）、ＦＡＴＢ−１非コード配列（配列番号２９〜３７）、ＦＡＤ２−１非コード配列（配列番号１および５〜６）、ならびにＦＡＤ３−１Ａ非コード配列（配列番号７〜１３および配列番号１６〜１７）をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センスおよびアンチセンス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に直接クローニングした。その後、ベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ８０６１２内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体を図１７−Ａに示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２９０】
７ＳαプロモーターおよびＴＭＬの３'終止配列によって調節されるΔ−９不飽和化酵素を含むＤＮＡ配列を適切な制限酵素で切断し、上記発現構築体内にライゲーションした。生じた発現構築体を図１７−Ｂに示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２９１】
マメアルセリンプロモーターおよびナピンの３'終止配列によって調節されるシー・プルチェリマＫＡＳ  ＩＶ遺伝子（配列番号３９）を含むベクターを適切な制限酵素で切断し、上記発現構築体内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体を図１７−Ｃに示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２９２】
ここで図１８を参照し、ダイズＦＡＴＢ−２非コード配列（配列番号４４〜４７）、ＦＡＴＢ−１非コード配列（配列番号２９〜３７）、ＦＡＤ２−１非コード配列（配列番号１および５〜６）、ＦＡＤ３−１Ａ非コード配列（配列番号７〜１３および配列番号１６〜１７）ならびにＦＡＤ３−１Ｂ非コード配列（配列番号１９〜２７）をＰＣＲによって増幅して、両末端に再度遺伝子操作した制限部位が含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センスおよびアンチセンス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に直接クローニングした。その後、ベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼで切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクターであるｐＭＯＮ８０６１２内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体を図１８−Ａに示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２９３】
７ＳαプロモーターおよびＴＭＬの３'終止配列によって調節されるΔ−９不飽和化酵素を含むＤＮＡ配列を適切な制限酵素で切断し、上記発現構築体内にライゲーションした。生じた発現構築体を図１８−Ｂに示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２９４】
マメアルセリンプロモーターおよびナピンの３'終止配列によって調節されるシー・プルチェリマＫＡＳ  ＩＶ遺伝子（配列番号３９）を含むベクターを適切な制限酵素で切断し、上記発現構築体内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体を図１８−Ｃに示し、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。上述の核酸分子は、本発明の目的、特長および利点を達成する好ましい実施形態である。本発明を例示した実施形態に限定することは意図しない。核酸分子内の第１および第２の組のＤＮＡ配列中の配列の配置は、例示かつ記載した配置に限定されず、本明細書中に記載し、添付の図に例示し、特許請求の範囲に包含された本発明の目的、特長および利点を達成するために適した任意の様式で変更されていてもよい。
【０２９５】
３Ｄ．Ｉｎ  ｖｉｖｏでの組立て
本発明の一態様には、植物内で、二本鎖ＲＮＡを形成できる植物染色体上の組換え転写ユニットへと組み立てられる、ＤＮＡ構築体が含まれる。遺伝子を抑制するための、そのような構築体の組立ておよびｉｎ  ｖｉｖｏで組換え転写ユニットを組み立てる方法は、参考としてその全体が本明細書中に組み込まれている国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００６８１号に記載されている。
【０２９６】
ｐＭＯＮ９３５０５は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組立てに用いる構築体であり、それぞれがアグロバクテリウム属のＴ−ＤＮＡ境界因子、すなわち右境界ＤＮＡ（ＲＢ）および左境界ＤＮＡ（ＬＢ）に隣接している２つのＴ−ＤＮＡセグメントを有する。第１のＴ−ＤＮＡセグメントは、３'末端から連続する１００ヌクレオチドが短縮されており、ＦＡＴＢ−１ａの３'ＵＴＲとライゲーションしているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているダイズ７Ｓα'プロモーター、続いて、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲ、ブラシカ属のナピンプロモーターおよびブラシカ属のナピンの３'終止配列と作動可能に連結しているシー・プルチェリマＫＡＳ  ＩＶ遺伝子（配列番号３９）、ダイズ７ＳＡプロモーターおよびｎｏｓの３'終止配列と作動可能に連結しているリシヌス・コムニスΔ９不飽和化酵素遺伝子（米国特許出願第２００３／００２２９９１８  Ａ１号）、ならびにｅＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列と作動可能に連結しているＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含み、これらはすべてアグロバクテリウム属のＴ−ＤＮＡ境界因子、すなわち右境界ＤＮＡ（ＲＢ）および左境界ＤＮＡ（ＬＢ）に隣接している。同一の構築体上で、もう一つのＲＢおよびＬＢに隣接している第２のＴ−ＤＮＡセグメント中には、３'末端から連続する１００ヌクレオチドが短縮されており、ＦＡＴＢ−１ａの３'ＵＴＲとライゲーションしているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているＨ６  ３'終止配列、続いて、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲが存在する。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２９７】
上記構築体の２つのＴ−ＤＮＡセグメントをＲＢからＲＢの方向に宿主生物の染色体の単一の座位内に挿入した場合、組み立てられる転写ユニットは、センスおよびアンチセンス方向のダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１ならびにＦＡＴＢ−１ａＤＮＡ断片と作動可能に連結したダイズ７Ｓα'プロモーターを有する。転写された際、作動可能に連結したセンスおよびアンチセンス方向のＲＮＡ配列は、ＦＡＤ２−１ＡおよびＦＡＴＢの抑制に有効な二本鎖ＲＮＡを形成できる。
【０２９８】
ｐＭＯＮ９３５０６は、それぞれがアグロバクテリウム属のＴ−ＤＮＡ境界因子、すなわち右境界ＤＮＡ（ＲＢ）および左境界ＤＮＡ（ＬＢ）に隣接している２つのＴ−ＤＮＡセグメントを有する、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組立てに用いる構築体である。第１のＴ−ＤＮＡは、３'末端から連続する１００ヌクレオチドが短縮されており、ＦＡＴＢ−１ａの３'ＵＴＲとライゲーションしているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているダイズ７Ｓα'プロモーター、続いて、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲ、ダイズ７ＳＡプロモーターおよびｎｏｓの３'終止配列と作動可能に連結しているリシヌス・コムニスΔ９不飽和化酵素遺伝子（米国特許出願第２００３／００２２９９１８  Ａ１号）、ならびにＥＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列と作動可能に連結しているＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含み、これらはすべてＬＢおよびＲＢに隣接している。同一のベクター上で、第２のＴ−ＤＮＡセグメント中には、もう一つのＲＢおよびＬＢに隣接している、３'末端から連続する１００ヌクレオチドが短縮されており、ＦＡＴＢ−１ａの３'ＵＴＲとライゲーションしているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているＨ６  ３'終止配列、続いて、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲが存在する。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０２９９】
上記構築体の２つのＴ−ＤＮＡセグメントをＲＢからＲＢの方向に宿主生物の染色体の単一の座位内に挿入した場合、組み立てられる転写ユニットは、センスおよびアンチセンス方向のダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１ならびにＦＡＴＢ−１ａＤＮＡ断片と作動可能に連結したダイズ７Ｓα'プロモーターを有する。転写された際、作動可能に連結したセンスおよびアンチセンス方向のＲＮＡ配列は、ＦＡＤ２−１ＡおよびＦＡＴＢの抑制に有効な二本鎖ＲＮＡを形成できる。
【０３００】
ｐＭＯＮ９５８２９は、それぞれがアグロバクテリウム属のＴ−ＤＮＡ境界因子、すなわち右境界ＤＮＡ（ＲＢ）および左境界ＤＮＡ（ＬＢ）に隣接している２つのＴ−ＤＮＡセグメントを有する、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組立てに用いる構築体である。第１のＴ−ＤＮＡは、３'末端から連続する１００ヌクレオチドが短縮されており、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲの連続する４２ヌクレオチドとライゲーションしているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているダイズ７Ｓα'プロモーター、続いて、ＦＡＴＢ−１ａ葉緑体輸送ペプチド（「ＣＴＰ」）コード領域、ならびにＥＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列と作動可能に連結しているＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含み、これらはすべてアグロバクテリウム属のＴ−ＤＮＡ境界因子、すなわち右境界ＤＮＡ（ＲＢ）および左境界ＤＮＡ（ＬＢ）に隣接している。同一のベクター上で、もう一つのＲＢおよびＬＢに隣接している第２のＴ−ＤＮＡセグメント中には、３'末端から連続する１００ヌクレオチドが短縮されており、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲの連続する４２ヌクレオチドとライゲーションしているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているＨ６  ３'終止配列、続いて、ＦＡＴＢ−１ａ葉緑体輸送ペプチド（「ＣＴＰ」）コード領域が存在する。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０３０１】
上記構築体の２つのＴ−ＤＮＡセグメントをＲＢからＲＢの方向に宿主生物の染色体の単一の座位内に挿入した場合、組み立てられる転写ユニットは、センスおよびアンチセンス方向のダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１ならびにＦＡＴＢ−１ａＤＮＡ断片と作動可能に連結したダイズ７Ｓα'プロモーターを有する。転写された際、作動可能に連結したセンスおよびアンチセンス方向のＲＮＡ配列は、ＦＡＤ２−１ＡおよびＦＡＴＢの抑制に有効な二本鎖ＲＮＡを形成できる。
【０３０２】
ｐＭＯＮ９７５９５は、それぞれがアグロバクテリウム属のＴ−ＤＮＡ境界因子、すなわち右境界ＤＮＡ（ＲＢ）および左境界ＤＮＡ（ＬＢ）に隣接している２つのＴ−ＤＮＡセグメントを有する、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組立てに用いる構築体である。第１のＴ−ＤＮＡセグメントは、３'末端から連続する３２０ヌクレオチドが短縮されており、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲの連続する４２ヌクレオチドとライゲーションしているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているダイズ７Ｓα'プロモーター、続いて、ＦＡＴＢ−１ａ葉緑体輸送ペプチド（「ＣＴＰ」）コード領域、ならびにＥＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列と作動可能に連結しているＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含み、これらはすべてアグロバクテリウム属のＴ−ＤＮＡ境界因子、すなわち右境界ＤＮＡ（ＲＢ）および左境界ＤＮＡ（ＬＢ）に隣接している。第２のＴ−ＤＮＡセグメント上には、もう一つのＲＢおよびＬＢに隣接して、３'末端から連続する３２０ヌクレオチドが短縮されており、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲの連続する４２ヌクレオチドとライゲーションしているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているＨ６  ３'終止配列、続いて、ＦＡＴＢ−１ａのＣＴＰコード領域が存在する。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０３０３】
上記構築体の２つのＴ−ＤＮＡセグメントをＲＢからＲＢの方向に宿主生物の染色体の単一の座位内に挿入した場合、組み立てられる転写ユニットは、センスおよびアンチセンス方向のダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１ならびにＦＡＴＢ−１ａＤＮＡ断片と作動可能に連結したダイズ７Ｓα'プロモーターを有する。転写された際、作動可能に連結したセンスおよびアンチセンス方向のＲＮＡ配列は、ＦＡＤ２−１ＡおよびＦＡＴＢの抑制に有効な二本鎖ＲＮＡを形成できる。
【０３０４】
ｐＭＯＮ９７５８１は、それぞれがアグロバクテリウム属のＴ−ＤＮＡ境界因子、すなわち右境界ＤＮＡ（ＲＢ）および左境界ＤＮＡ（ＬＢ）に隣接している２つのＴ−ＤＮＡセグメントを有する、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組立てに用いる構築体である。第１のＴ−ＤＮＡセグメントは、ＦＡＴＢ−１ａ葉緑体輸送ペプチド（「ＣＴＰ」）コード領域とライゲーションしており、３'末端から連続する３２０ヌクレオチドが短縮されているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているダイズ７Ｓα'プロモーター、ならびにＥＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列と作動可能に連結しているＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含み、これらはすべてアグロバクテリウム属のＴ−ＤＮＡ境界因子、すなわち右境界ＤＮＡ（ＲＢ）および左境界ＤＮＡ（ＬＢ）に隣接している。同一の構築体上で、もう一つのＲＢおよびＬＢに隣接している第２のＴ−ＤＮＡセグメント中には、ＦＡＴＢ−１ａのＣＴＰコード領域とライゲーションしている、３'末端から連続する３２０ヌクレオチドが短縮されているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているＨ６  ３'終止配列が存在する。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０３０５】
上記構築体の２つのＴ−ＤＮＡセグメントをＲＢからＲＢの方向に宿主生物の染色体の単一の座位内に挿入した場合、組み立てられる転写ユニットは、センスおよびアンチセンス方向のダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１ならびにＦＡＴＢ−１ａＤＮＡ断片と作動可能に連結したダイズ７Ｓα'プロモーターを有する。転写された際、作動可能に連結したセンスおよびアンチセンス方向のＲＮＡ配列は、ＦＡＤ２−１ＡおよびＦＡＴＢの抑制に有効な二本鎖ＲＮＡを形成できる。
【０３０６】
ｐＭＯＮ９７５９６は、それぞれがアグロバクテリウム属のＴ−ＤＮＡ境界因子、すなわち右境界ＤＮＡ（ＲＢ）および左境界ＤＮＡ（ＬＢ）に隣接している２つのＴ−ＤＮＡセグメントを有する、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組立てに用いる構築体である。第１のＴ−ＤＮＡセグメントは、ＦＡＴＢ−１ａ葉緑体輸送ペプチド（「ＣＴＰ」）コード領域の５'の１８０ｂｐとライゲーションしており、３'末端から連続する３２０ヌクレオチドが短縮されているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているダイズ７Ｓα'プロモーター、ならびにＥＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列と作動可能に連結しているＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含み、これらはすべてアグロバクテリウム属のＴ−ＤＮＡ境界因子、すなわち右境界ＤＮＡ（ＲＢ）および左境界ＤＮＡ（ＬＢ）に隣接している。同一の構築体上で、もう一つのＲＢおよびＬＢに隣接している第２のＴ−ＤＮＡセグメント中には、ＦＡＴＢ−１ａのＣＴＰコード領域の５'の１８０ｂｐとライゲーションしており、３'末端から連続する３２０ヌクレオチドが短縮されているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているＨ６  ３'終止配列が存在する。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０３０７】
上記構築体の２つのＴ−ＤＮＡセグメントをＲＢからＲＢの方向に宿主生物の染色体の単一の座位内に挿入した場合、組み立てられる転写ユニットは、センスおよびアンチセンス方向のダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１ならびにＦＡＴＢ−１ａＤＮＡ断片と作動可能に連結したダイズ７Ｓα'プロモーターを有する。転写された際、作動可能に連結したセンスおよびアンチセンス方向のＲＮＡ配列は、ＦＡＤ２−１ＡおよびＦＡＴＢの抑制に有効な二本鎖ＲＮＡを形成できる。
【０３０８】
ｐＭＯＮ９７５９７は、それぞれがアグロバクテリウム属のＴ−ＤＮＡ境界因子、すなわち右境界ＤＮＡ（ＲＢ）および左境界ＤＮＡ（ＬＢ）に隣接している２つのＴ−ＤＮＡセグメントを有する、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組立てに用いる構築体である。第１のＴ−ＤＮＡセグメントは、ＦＡＴＢ−１ａ葉緑体輸送ペプチド（「ＣＴＰ」）コード領域の５'の１２０ｂｐとライゲーションしており、３'末端から連続する３２０ヌクレオチドが短縮されているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているダイズ７Ｓα'プロモーター、ならびにＥＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列と作動可能に連結しているＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含み、これらはすべてアグロバクテリウム属のＴ−ＤＮＡ境界因子、すなわち右境界ＤＮＡ（ＲＢ）および左境界ＤＮＡ（ＬＢ）に隣接している。同一の構築体上で、もう一つのＲＢおよびＬＢに隣接している第２のＴ−ＤＮＡセグメント中には、ＦＡＴＢ−１ａのＣＴＰコード領域の５'の１２０ｂｐとライゲーションしており、３'末端から連続する３２０ヌクレオチドが短縮されているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているＨ６  ３'終止配列が存在する。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０３０９】
上記構築体の２つのＴ−ＤＮＡセグメントをＲＢからＲＢの方向に宿主生物の染色体の単一の座位内に挿入した場合、組み立てられる転写ユニットは、センスおよびアンチセンス方向のダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１ならびにＦＡＴＢ−１ａＤＮＡ断片と作動可能に連結したダイズ７Ｓα'プロモーターを有する。転写された際、作動可能に連結したセンスおよびアンチセンス方向のＲＮＡ配列は、ＦＡＤ２−１ＡおよびＦＡＴＢの抑制に有効な二本鎖ＲＮＡを形成できる。
【０３１０】
ｐＭＯＮ９７５９８は、それぞれがアグロバクテリウム属のＴ−ＤＮＡ境界因子、すなわち右境界ＤＮＡ（ＲＢ）および左境界ＤＮＡ（ＬＢ）に隣接している２つのＴ−ＤＮＡセグメントを有する、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組立てに用いる構築体である。第１のＴ−ＤＮＡセグメントは、ＦＡＴＢ−１ａ葉緑体輸送ペプチド（「ＣＴＰ」）コード領域とライゲーションしており、３'末端から連続する３４０ヌクレオチドが短縮されているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているダイズ７Ｓα'プロモーター、ならびにＥＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列と作動可能に連結しているＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含み、これらはすべてアグロバクテリウム属のＴ−ＤＮＡ境界因子、すなわち右境界ＤＮＡ（ＲＢ）および左境界ＤＮＡ（ＬＢ）に隣接している。同一の構築体上で、もう一つのＲＢおよびＬＢに隣接している第２のＴ−ＤＮＡセグメント中には、ＦＡＴＢ−１ａのＣＴＰコード領域とライゲーションしており、３'末端から連続する３４０ヌクレオチドが短縮されているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているＨ６  ３'終止配列が存在する。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０３１１】
上記構築体の２つのＴ−ＤＮＡセグメントをＲＢからＲＢの方向に宿主生物の染色体の単一の座位内に挿入した場合、組み立てられる転写ユニットは、センスおよびアンチセンス方向のダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１ならびにＦＡＴＢ−１ａＤＮＡ断片と作動可能に連結したダイズ７Ｓα'プロモーターを有する。転写された際、作動可能に連結したセンスおよびアンチセンス方向のＲＮＡ配列は、ＦＡＤ２−１ＡおよびＦＡＴＢの抑制に有効な二本鎖ＲＮＡを形成できる。
【０３１２】
（実施例４）  植物の形質転換および分析
実施例２および３の構築体を、ＭｃＣａｂｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：９２３〜９２６（１９８８）の方法、またはアグロバクテリウム属に媒介される形質転換を含めた既に記載した方法によってダイズ（例えば、Ａｓｇｒｏｗ品種Ａ４９２２またはＡｓｇｒｏｗ品種Ａ３２４４またはＡｓｇｒｏｗ品種Ａ３５２５）内に安定に導入した。形質転換したダイズ植物は、グリフォセートを含む培地上での選択によって同定した。脂肪酸組成は、構築体で形質転換したダイズ系の種子からガスクロマトグラフィーを用いて分析した。さらに、どの構築体も他の目的配列、およびプロモーターの様々な組合せを含み得る。
【０３１３】
一部の用途には、改変した脂肪酸組成を発生中の種子中で検出するが、油プロフィールを分析するため、後にＦＡＳ経路内で起こる脂肪酸の改変を検出するため、または脂肪酸組成の軽微な改変を検出するためなどの他の場合では、成熟種子からの脂肪酸または油の分析が好ましい。さらに、個々の種子の油および／または脂肪酸含量の分析が、特に分離Ｒ１種子集団中の油の改変を検出する場合に、望ましい場合がある。本明細書中で使用するＲ０世代とは、本明細書中に記載の形質転換／再生プロトコルから生じる植物を示し、Ｒ１世代とは、自己受粉したトランスジェニックＲ０植物上で育った種子を示す。Ｒ１植物はＲ１種子から育てる。
【０３１４】
実施例３の構築体で形質転換したダイズ系の種子について脂肪酸組成を決定した。トランスジェニックおよび対照のダイズ系のそれぞれの１〜１０個の種子を、油を抽出するために組織ホモジナイザー（Ｐｒｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて個別に磨砕した。磨砕したダイズ種子からの油を、トリヘプタデカノイン（０.５０ｍｇ／ｍｌ）を含む１.５ｍｌのヘプタン中で終夜抽出した。５００μｌの無水メタノール中のナトリウムメトキシドを添加して、２００μｌの抽出した油のアリコートをメチルエステルに誘導体化した。誘導体化反応を２０分間５０℃で進行させた。５００μｌの１０％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウムおよび４００μｌのヘプタンを同時に加えることによって反応を停止させた。ヘキサンで抽出した生じた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄモデル６８９０ＧＣ（カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）によって分離した。ＧＣにはＳｕｐｅｌｃｏｗａｘ２５０カラム（３０ｍ、内径０.２５ｍｍ、フィルム厚０.２５ミクロン）（Ｓｕｐｅｌｃｏ、ペンシルバニア州Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ）を装着した。カラム温度は注入時に１７５℃であり、温度は４０℃／分で１７５℃から２４５℃から１７５℃にプログラミングした。注入口および検出器の温度はそれぞれ２５０℃および２７０℃であった。
【０３１５】
（実施例５）  バイオディーゼル特性が向上した合成燃料油
以下の脂肪酸メチルエステルの混合物を有する合成燃料油脂肪酸組成物を調製した：７３.３％のオレイン酸、２１.４％のリノール酸、２.２％のパルミチン酸、２.１％のリノレン酸および１.０％のステアリン酸（すべて重量による）。精製した脂肪酸メチルエステルは、Ｎｕ−Ｃｈｅｋ  Ｐｒｅｐ，Ｉｎｃ．、米国ミネソタ州Ｅｌｙｓｉａｎから得た。この組成物のセタン価および発火遅れは、Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって発火性テスター（Ｉｇｎｉｔｉｏｎ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｅｒ、「ＩＱＴ」）６１３（Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、米国テキサス州Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ）を用いて決定された。
【０３１６】
ＩＱＴは、電気的に加熱する定容量燃焼チャンバ、燃料注入システム、および実験を制御し、データを記録し、データの解釈を提供するために用いるコンピュータからなる。燃料注入システムには、燃焼チャンバへの入口を形成する燃料注入口ノズルが含まれる。燃料注入口ノズル内の針弁リフトセンサーが、燃焼チャンバ内への燃料の流れを検出する。燃焼チャンバに取り付けられた圧力変換器がシリンダー圧、燃焼チャンバ内の圧力を測定する。ＩＱＴの基本的な概念は、燃焼チャンバ内への燃料注入開始から燃焼の開始までの時間の測定である。発火遅れ時間の常時測定を提供するために燃焼チャンバ内の熱力学的条件は正確に制御する。
【０３１７】
セタン価および発火遅れの試験には、５ミクロンのフィルターを用いて試験燃料を濾過する。燃料リザーバ、注入ライン、およびノズルを加圧窒素でパージする。その後、燃料リザーバを綿ほこりのない布で掃除する。試験燃料の一部分を用いて燃料リザーバ、注入ライン、およびノズルに流す。リザーバに試験燃料を満たし、全部の空気をシステムから流し出す。リザーバを５０ｐｓｉｇまで加圧する。この方法は、基本的には、高圧で、正確に計量された量の試験燃料を、所望の圧力および温度まで空気を充填した燃焼チャンバ内に注入することからなる。測定は、しばしば発火遅れ時間と呼ばれる注入開始から燃焼発生までの時間を決定することからなる。この決定は、測定した針弁リフトおよび燃焼チャンバ圧に基づく。通常のセタン価決定手順は、表面温度を５６７.５℃に設定し、空気圧を２.１ＭＰａに設定することを要求する。
【０３１８】
装置が正常なパラメータ内で作動していることを確認するために、一日の最初に既知の注入遅れを有する燃料をＩＱＴ燃焼容器で実行する。その後、試験合成物を実行する。システムが変化していないことを確認するために、既知の燃料を再度実行する。燃料リザーバを燃料注入ポンプに再度接続した後、ＰＣコントローラで試験手順を開始させる。コンピュータは、空気の充填、燃料の注入、および排気事象を含めたすべての手順を制御する。３２回の繰り返し燃焼事象を行う。
【０３１９】
発火遅れとは、注入開始から発火開始までの時間である。これは、針弁リフトおよびシリンダー圧のデータから決定する。注入針の持ち上がりが注入の開始を合図する。燃料気化の冷却効果によりシリンダー圧がわずかに低下する。燃焼の開始は、燃焼により燃料注入の直前の圧力まで増加する、シリンダー圧の回復時間として定義される。
【０３２０】
その後、測定した発火遅れ時間を用いて、データ収集および整理ソフトウェアに組み込まれている検量線に基づいてセタン価を決定する。発火遅れ時間の関数としてのセタン価からなる検量線は、一次標準燃料およびＮＥＧ検査燃料の混合物を用いて作製する。周囲条件で液体の試験燃料の場合、既知のセタン価の少なくとも１つの検査燃料を用いて検量線を毎日検査する（Ｒｙａｎ、「セタン価に対する物理的および化学的発火遅れの相関（Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｇｎｉｔｉｏｎ  Ｄｅｌａｙ  ｔｏ  Ｃｅｔａｎｅ  Ｎｕｍｂｅｒ）」、ＳＡＥ  Ｐａｐｅｒ、８５２１０３（１９８５）；Ｒｙａｎ、「定容量燃焼容器内で決定したディーゼル燃料の発火性（Ｄｉｅｓｅｌ  Ｆｕｅｌ  Ｉｇｎｉｔｉｏｎ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ａｓ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｉｎ  ａ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｃｏｍｂｕｓｔｉｏｎ  Ｂｏｍｂ）」、ＳＡＥ  Ｐａｐｅｒ、８７０５８６（１９８６）；Ｒｙａｎ、「携帯用燃料セタン品質モニターの開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｆｕｅｌ  Ｃｅｔａｎｅ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒ）」、Ｂｅｌｖｏｉｒ  Ｆｕｅｌｓ  ａｎｄ  Ｌｕｂｒｉｃａｎｔｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ報告書第２７７号、１９９２年５月；Ｒｙａｎ、「ディーゼル発火および燃焼のエンジンおよび定容量容器の研究（Ｅｎｇｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｂｏｍｂ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｄｉｅｓｅｌ  Ｉｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｂｕｓｔｉｏｎ）」、ＳＡＥ  Ｐａｐｅｒ、８８１６１６（１９８８）；ならびにＡｌｌａｒｄら、「発火性テスター（ＩＱＴ）で決定したディーゼル燃料の発火性（Ｄｉｅｓｅｌ  Ｆｕｅｌ  Ｉｇｎｉｔｉｏｎ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ａｓ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｉｇｎｉｔｉｏｎ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｅｒ（「ＩＱＴ」））」、ＳＡＥ  Ｐａｐｅｒ、９６１１８２（１９９６））。表３に示すように、合成油組成物は、例えば、限定されるものではないがバイオディーゼル油のために使用するのに適したセタン価および発火遅れを示す。
【０３２１】
【表３】
2009526550.tif 000006
【０３２２】
密度（ＡＳＴＭ  Ｄ−４０５２）、曇り点（ＡＳＴＭ  Ｄ−２５００）、流動点（ＡＳＴＭ  Ｄ−９７）、および目詰まり点（ＩＰ３０９／ＡＳＴＭ  Ｄ−６３７１）を、合成油についてＡＳＴＭ  Ｄプロトコルを用いて決定する。ＡＳＴＭ  Ｄプロトコルは、ＡＳＴＭ、１００  Ｂａｒｒ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｄｒｉｖｅ、米国ペンシルバニア州Ｗｅｓｔ  Ｃｏｎｓｈｏｈｏｃｋｅｎから得られる。これらの試験の結果を表４に示す。表４に示すように、合成油組成物は、例えば、限定されるものではないがバイオディーゼル油としての使用に適した数値を示す。
【０３２３】
【表４】
2009526550.tif 000007
【０３２４】
一酸化窒素排出のレベルは、生物学に基づいた燃料の不飽和レベルを評価することによって、燃料密度を測定して推定排出レベルを間接的に計算することによって、または直接測定することによって、推定する。一酸化窒素排出のレベルを直接測定するために利用可能な標準プロトコルも存在する。合成油中の不飽和の全体的なレベルの評価に基づいて、合成油は、慣用のダイズ油から作製した脂肪酸のメチルエステルよりも低い一酸化窒素排出レベルを有すると推定される。より多くの二重結合数を含む、すなわち、より高い度合の不飽和を有する油は、より高い一酸化窒素排出を生じる傾向がある。表５に示すように、この油は合計１２３個の二重結合を有し、それと比較して慣用のダイズ油は合計１５３個の二重結合を有する。
【０３２５】
【表５】
2009526550.tif 000008
【０３２６】
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、契約番号ＡＣＧ−８−１７１０６−０２最終報告書、ＤＤＣシリーズ６０ディーゼルエンジンからのエンジン排出に対するバイオディーゼル組成の効果（Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｏｆ  Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｏｎ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎｓ  Ｆｒｏｍ  Ａ  ＤＤＣ  Ｓｅｒｉｅｓ  ６０  Ｄｉｅｓｅｌ  Ｅｎｇｉｎｅ）（２０００年６月）に報告されているように、バイオディーゼル組成物の硝酸排出は、式ｙ＝４６.９５９ｘ−３６.３８８によって予測される（式中、ｙはオキシド排出のグラム数／軸馬力時であり；ｘはバイオディーゼルの密度である）。この式は、１６個のバイオディーゼル燃料を含む試験における硝酸排出データの回帰分析に基づいている。この試験では、１９９１キャリブレーション、生産シリーズ６０モデルのＤｅｔｒｏｉｔ  Ｄｉｅｓｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのエンジンを使用する。
【０３２７】
合成油の密度は、Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅによってＡＳＴＭ  Ｄ４０５２の方法を用いて決定した。表４に示した結果を上記方程式で用いて、４.８９ｇ／ｂｈｐ−ｈの一酸化窒素排出値を予測した。この結果を対照ダイズ生成物と比較する。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの報告書は、対照ダイズに基づくバイオディーゼル（メチルダイズエステルＩＧＴ）の密度および一酸化窒素排出を与えている。対照バイオディーゼルの密度は０.８８７７ｇ／ｍＬであり、５.３０ｇ／ｂｈｐ−ｈの計算一酸化窒素排出が与えられる。この計算排出値は５.３２ｇ／ｂｈｐ−ｈの一酸化窒素排出の実験値に相似している。合成油組成物が示す数値は対照と比較して向上しており、例えば、限定されるものではないがバイオディーゼル油としての使用に適している。
【０３２８】
（実施例６）  健康な血清脂質レベルに最適な脂肪酸組成
植物組成物のコレステロール低下特性は、血清脂質レベルに対して慣用のダイズ油よりも好都合な効果（すなわち、より低いＬＤＬ−コレステロールおよびより高いＨＤＬ−コレステロール）を有する脂肪酸組成を同定するために決定する。２７個の臨床治験に基づいた公開された方程式（Ｍｅｎｓｉｎｋ，Ｒ．Ｐ．およびＫａｔａｎ，Ｍ．Ｂ．、動脈硬化症および血栓症（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）、１２：９１１〜９１９（１９９２））を用いて、ヒトにおける血清脂質レベルに対する新規油種子組成の効果を通常のダイズ油の効果と比較する。
【０３２９】
以下の表６は、炭水化物からの食事性エネルギーの３０％で脂質によって置き換えた場合の、血清脂質レベルの変化の結果を表す。結果により、ダイズ油は、食事中の炭水化物に置き換わった場合に既に血清脂質に対して好都合な効果を有することが示される。飽和脂肪レベルを低下させて、全脂肪酸の１０〜３０％、好ましくは全脂肪酸の約１５〜２５％リノール酸レベルを得ることによって、この組成の向上が可能である。リノール酸の割合が全脂肪酸の１０％未満である場合、飽和脂肪含量は全脂肪酸の５％まで低下するが、新規組成物は対照ダイズ油と比較してＬＤＬ−コレステロールを上昇させる。リノール酸の割合を増加した場合、組成物が血清ＨＤＬレベルを上昇させる能力が低下する。したがって、好ましいリノール酸の組成は全脂肪酸の約１５〜２５％であると決定された。
【０３３０】
【表６】
2009526550.tif 000009
【０３３１】
（実施例７）
以下の１４個の工程は、ダイズにおいてＦＡＤ２、ＦＡＤ３、およびＦＡＴＢ遺伝子を抑制し、Δ−９不飽和化酵素を過剰発現させるために植物を形質転換させるために設計したベクターｐＭＯＮ６８５３７の構築を例示する。具体的には、構築体は、ダイズのセンス方向のイントロンおよび３'ＵＴＲ、すなわち、ＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ、ＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ、ヘアピンループを形成するスプライシング可能なイントロンと作動可能に連結している７Ｓαプロモーター、ならびにダイズのアンチセンス方向のイントロンおよび３'ＵＴＲ'、すなわち、ＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲおよびＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１の一連の相補体、ならびにΔ−９不飽和化酵素を駆動するダイズＦＡＤ２プロモーターを含む。
【０３３２】
工程１−ｄｓＲＮＡｉ構築体のスプライシング可能なイントロン部分として役割を果たすダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５を、ダイズのゲノムＤＮＡを鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
５'プライマー＝１９０３７＝
ＡＣＴＡＧＴＡＴＡＴＴＧＡＧＣＴＣＡＴＡＴＴＣＣＡＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＴＡＴＴ
ＧＴＴＴＡＡＡＣＡＴＡＧＣＴＡＧＣＡＴＡＴＴＡＣＧＣＧＴＡＴＡＴＴＡＴＡＣＡＡＧＣＴＴＡＴＡＴＴＣＣＣＧＧＧＡＴＡＴＴＧＴＣＧＡＣＡＴＡＴＴＡＧＣＧＧＴＡＣＡＴＴＴＴＡＴＴＧＣＴＴＡＴＴＣＡＣ
３'プライマー＝１９０４５＝
ＡＣＴＡＧＴＡＴＡＴＴＧＡＧＣＴＣＡＴＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＴＣＴＣＧＡＧ
ＡＴＡＴＴＣＡＣＧＧＴＡＧＴＡＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＡＣＴＧＧＴＴＴＴＧＣＴＧＣＴＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡＧＴＧＡＡＴＣ。
【０３３３】
これらのプライマーは、５'および３'末端にクローニング部位を付加する。５'末端には：ＳｐｅＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｔＸＩ、ＰｍｅＩ、ＮｈｅＩ、ＭｌｕＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｍａＩ、ＳｍａＩ、ＳａｌＩ。３'末端には：ＳｐｅＩ、ＳａｃＩ、Ｓｓｅ８３８７Ｉ、ＸｈｏＩ。ダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５のＰＣＲ産物をｐＣＲ２.１内にクローニングし、ＫＡＷＨＩＴ０３.００６５がもたらされた。その後、ＫＡＷＨＩＴ０３.００６５をＳｐｅＩで消化し、末端をＰｆｕポリメラーゼで埋め、ｐＭＯＮ６８５２６（空のクロラムフェニコール（本明細書中で以下ＣＭ）耐性ベクター）をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、末端をＰｆｕポリメラーゼで埋めた。その後、ＫＡＷＨＩＴ０３.００６５およびｐＭＯＮ６８５２６をライゲーションして、ｐＭＯＮ６８５４１（Ａｍｐ耐性ベクター中に、複数のクローニング部位を有するダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５）を作製した。
【０３３４】
工程２−ダイズＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲを、以下のプライマーを用いて増幅した：１８６６２＝ＴＴＴＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＴＧＡＧＡＴＴＴＡＣＴＧＣ（５'末端にＢｓｐ１２０Ｉを付加）および１８６６１＝ＧＧＧＣＣＣＧＡＴＴＴＧＡＡＡＴＧＧＴＴＡＡＣＧ。その後、ＰＣＲ産物をｐＣＲ２.１内にライゲーションしてＫＡＷＨＩＴ０３.００３６を作製した。
【０３３５】
工程３−その後、ＫＡＷＨＩＴ０３.００３６をＢｓｐ１２０ＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、その後、ＫＡＷＨＩＴ０３.００３２（複数のクローニング部位を有する空のＣＭ耐性ベクター）内にクローニングして、ＫＡＷＨＩＴ０３.００３７（空のＣＭ耐性ベクター中にＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ）を作製した。
【０３３６】
工程４−ダイズＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲを、以下のプライマーを用いて増幅した：１８６３９＝ＧＧＧＣＣＣＧＴＴＴＣＡＡＡＣＴＴＴＴＴＧＧ（５'末端にＢｓｐ１２０Ｉを付加）および１８５４９＝ＴＧＡＡＡＣＴＧＡＣＡＡＴＴＣＡＡ。その後、ＰＣＲ産物をｐＣＲ２.１内にライゲーションして、ＫＡＷＨＩＴ０３.００３４を作製した。
【０３３７】
工程５−ＫＡＷＨＩＴ０３.００３４をＢｓｐ１２０ＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、その後、ＫＡＷＨＩＴ０３.００３２（複数のクローニング部位を有する空のＣＭ耐性ベクター）内にライゲーションして、ＫＡＷＨＩＴ０３.００３５（空のＣＭ耐性ベクター中にＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ）を作製した。
【０３３８】
工程６−ダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１を、ダイズのゲノムＤＮＡを鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：５'プライマー＝１８６６３＝ＧＧＧＣＣＣＧＧＴＡＡＡＴＴＡＡＡＴＴＧＴＧＣ（５'末端にＢｓｐ１２０Ｉ部位を付加）；および３'プライマー＝１８６６４＝ＣＴＧＴＧＴＣＡＡＡＧＴＡＴＡＡＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧ。生じたＰＣＲ産物をｐＣＲ２.１内にクローニングして、ＫＡＷＨＩＴ０３.００３８を作製した。
【０３３９】
工程７−ＫＡＷＨＩＴ０３.００３８中にダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１のＰＣＲ産物を、制限部位Ｂｓｐ１２０ＩおよびＥｃｏＲＩを用いて、ＫＡＷＨＩＴ０３.００３２（複数のクローニング部位を有する空のＣＭ耐性ベクター）内にクローニングした。生じたプラスミドはＫＡＷＨＩＴ０３.００３９（空のＣＭ耐性ベクター中にダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１）である。
【０３４０】
工程８−ＫＡＷＨＩＴ０３.００３９をＡｓｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＭＯＮ６８５４１（ＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５のｄｓＲＮＡｉ  ＡＭＰ耐性基底ベクター）をＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。その後、ダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１をｐＭＯＮ６８５４１内に方向性クローニングして、ＫＡＷＨＩＴ０３.００７１（ダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１とダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５）を作製した。
【０３４１】
工程９−ＫＡＷＨＩＴ０３.００３５（ＣＭ耐性ベクター中にＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ）をＡｓｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＫＡＷＨＩＴ０３.００７１（ＦＡＤ２−１ＡのイントロンおよびＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５のｄｓＲＮＡｉ  ＡＭＰ耐性基底ベクター）をＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。その後、ダイズＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲをＫＡＷＨＩＴ０３.００７１内に方向性クローニングして、ＫＡＷＨＩＴ０３.００７２（ダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１およびＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲとダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５）を作製した。
【０３４２】
工程１０−ＫＡＷＨＩＴ０３.００３７（ＣＭ耐性ベクター中にＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ）をＡｓｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＫＡＷＨＩＴ０３.００７２をＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。その後、ＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲをＫＡＷＨＩＴ０３.００７２内に方向性クローニングして、ＫＡＷＨＩＴ０３.００７３（ダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ、ＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲとＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５）を作製した。
【０３４３】
工程１１−ＫＡＷＨＩＴ０３.００７３をＢｓｔＸＩおよびＳａｌＩで消化し、ＦＡＤ２−１Ａのイントロン、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲおよびＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲを含む断片をゲル精製した。異なる管内で、ＫＡＷＨＩＴ０３.００７３をＸｈｏＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉで消化した。その後、イントロン／３'ＵＴＲ断片を、ＫＡＷＨＩＴ０３.００７３内に、ダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５の他の部位上に反対の方向に、クローニングして戻して、ＫＡＷＨＩＴ０３.００７４（ダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１センス、ダイズＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲセンス、ダイズＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲセンス、ダイズ、スプライシング可能なダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５、ダイズＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲアンチセンス、ダイズＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲアンチセンス、ダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１アンチセンス）を作製した。
【０３４４】
工程１２−ｄｓＲＮＡｉ構築体を７Ｓα'プロモーターおよびＴＭＬの３'と連結させるために、ＫＡＷＨＩＴ０３.００７４およびｐＭＯＮ６８５２７（７Ｓａ'／ＴＭＬの３'カセット）をＳａｃＩで消化し、一緒にライゲーションさせて、ｐＭＯＮ６８５６３（７Ｓα'プロモーター−ＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１センス、ダイズＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲセンス、ダイズＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲセンス、スプライシング可能なダイズダイズＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲアンチセンス、ダイズＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲアンチセンス、ダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１アンチセンス−ＴＭＬの３'）を作製した。
【０３４５】
工程１３−組み立てたｄｓＲＮＡｉ構築体をｐＭＯＮ７０６８２内に導入するために、ｐＭＯＮ６８５６３およびｐＭＯＮ７０６８２をＮｏｔＩで消化し、一緒にライゲーションさせて、ＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１センス、ダイズＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲセンス、ダイズＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲセンス、スプライシング可能なダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５、ダイズＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲアンチセンス、ダイズＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲアンチセンス、ダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１アンチセンスおよびＴＭＬの３'ターミネーターの二本鎖ＲＮＡを形成する構築体と作動可能に連結している７Ｓα'プロモーター）を含むｐＭＯＮ６８５３６を形成した。
【０３４６】
工程１４−その後、ｐＭＯＮ６８５３６をＡｓｃＩおよびＲｓｒＩＩで消化し、ｐＭＯＮ６８５２９（ＦＭＶプロモーターおよびＲＢＣＳの３'と融合した選択マーカーＣＰ４ならびにΔ９不飽和化酵素を駆動するダイズＦＡＤ２プロモーターを含む）をＳａｎＤＩおよびＡｓｃＩで消化した。その後、ｐＭＯＮ６８５３６のｄｓＲＮＡｉ部分をｐＭＯＮ６８５２９内に方向性クローニングして、ｐＭＯＮ６８５３７（ＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１センス、ダイズＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲセンス、ダイズＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲセンス、スプライシング可能なダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５、ダイズＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲアンチセンス、ダイズＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲアンチセンス、ダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１アンチセンスおよびＴＭＬの３'ターミネーターならびにΔ９不飽和化酵素を駆動するダイズＦＡＤ２プロモーターの二本鎖ＲＮＡを形成する構築体と作動可能に連結している７Ｓα'プロモーター）を作製した。
【０３４７】
（実施例８）
以下の１５個の工程は、ダイズにおいてＦＡＤ２、ＦＡＤ３、およびＦＡＴＢ遺伝子を抑制し、Δ−９不飽和化酵素およびＫＡＳＩＶ酵素を過剰発現する植物を形質転換させるために設計したベクターｐＭＯＮ６８５３９（図２２）の構築を例示する。具体的には、構築体は、ダイズのセンス方向のイントロンおよび３'ＵＴＲ、すなわち、ＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ、ＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ、ヘアピンループを形成するスプライシング可能なイントロンと作動可能に連結している７Ｓαプロモーター、ならびにダイズのアンチセンス方向のイントロンおよび３'ＵＴＲ'、すなわち、ＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲおよびＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１の一連の相補体、Δ−９不飽和化酵素を駆動するダイズＦＡＤ２プロモーター、ならびにＫＡＳＩＶを駆動するナピンプロモーターを含む。
【０３４８】
工程１−ｄｓＲＮＡｉ構築体のスプライシング可能なイントロン部分として役割を果たすダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５を、ダイズのゲノムＤＮＡを鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
５'プライマー＝１９０３７＝
ＡＣＴＡＧＴＡＴＡＴＴＧＡＧＣＴＣＡＴＡＴＴＣＣＡＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＴＡＴＴＧ
ＴＴＴＡＡＡＣＡＴＡＧＣＴＡＧＣＡＴＡＴＴＡＣＧＣＧＴＡＴＡＴＴＡＴＡＣＡＡＧＣＴＴＡＴＡＴＴＣＣＣＧＧＧＡＴＡＴＴＧＴＣＧＡＣＡＴＡＴＴＡＧＣＧＧＴＡＣＡＴＴＴＴＡＴＴＧＣＴＴＡＴＴＣＡＣ
３'プライマー＝１９０４５＝
ＡＣＴＡＧＴＡＴＡＴＴＧＡＧＣＴＣＡＴＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＴＣＴＣＧＡＧ
ＡＴＡＴＴＣＡＣＧＧＴＡＧＴＡＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＡＣＴＧＧＴＴＴＴＧＣＴＧＣＴＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡＧＴＧＡＡＴＣ。
【０３４９】
これらのプライマーは、５'および３'末端にクローニング部位を付加する。５'末端には：ＳｐｅＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｔＸＩ、ＰｍｅＩ、ＮｈｅＩ、ＭｌｕＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｍａＩ、ＳｍａＩ、ＳａｌＩ。３'末端には：ＳｐｅＩ、ＳａｃＩ、Ｓｓｅ８３８７Ｉ、ＸｈｏＩ。ダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５のＰＣＲ産物をｐＣＲ２.１内にクローニングし、ＫＡＷＨＩＴ０３.００６５がもたらされた。その後、ＫＡＷＨＩＴ０３.００６５をＳｐｅＩで消化し、末端をＰｆｕポリメラーゼで埋め、ｐＭＯＮ６８５２６（空のＣＭ耐性ベクター）をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、末端をＰｆｕポリメラーゼで埋めた。ＫＡＷＨＩＴ０３.００６５およびｐＭＯＮ６８５２６をライゲーションして、ｐＭＯＮ６８５４１（Ａｍｐ耐性ベクター中に、複数のクローニング部位を有するダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５）を作製した。
【０３５０】
工程２−ダイズＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲを、以下のプライマーを用いて増幅した：１８６６２＝ＴＴＴＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＴＧＡＧＡＴＴＴＡＣＴＧＣ（５'末端にＢｓｐ１２０Ｉを付加）および１８６６１＝ＧＧＧＣＣＣＧＡＴＴＴＧＡＡＡＴＧＧＴＴＡＡＣＧ。その後、ＰＣＲ産物をｐＣＲ２.１内にライゲーションしてＫＡＷＨＩＴ０３.００３６を作製した。
【０３５１】
工程３−その後、ＫＡＷＨＩＴ０３.００３６をＢｓｐ１２０ＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、その後、ＫＡＷＨＩＴ０３.００３２（複数のクローニング部位を有する空のＣＭ耐性ベクター）内にクローニングして、ＫＡＷＨＩＴ０３.００３７（空のＣＭ耐性ベクター中にＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ）を作製した。
【０３５２】
工程４−ダイズＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲを、以下のプライマーを用いて増幅した：１８６３９＝ＧＧＧＣＣＣＧＴＴＴＣＡＡＡＣＴＴＴＴＴＧＧ（５'末端にＢｓｐ１２０Ｉを付加）および１８５４９＝ＴＧＡＡＡＣＴＧＡＣＡＡＴＴＣＡＡ。その後、ＰＣＲ産物をｐＣＲ２.１内にライゲーションして、ＫＡＷＨＩＴ０３.００３４を作製した。
【０３５３】
工程５−ＫＡＷＨＩＴ０３.００３４をＢｓｐ１２０ＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、その後、ＫＡＷＨＩＴ０３.００３２（複数のクローニング部位を有する空のＣＭ耐性ベクター）内にライゲーションして、ＫＡＷＨＩＴ０３.００３５（空のＣＭ耐性ベクター中にＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ）を作製した。
【０３５４】
工程６−ダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１を、ダイズのゲノムＤＮＡを鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：５'プライマー＝１８６６３＝ＧＧＧＣＣＣＧＧＴＡＡＡＴＴＡＡＡＴＴＧＴＧＣ（５'末端にＢｓｐ１２０Ｉ部位を付加）；および３'プライマー＝１８６６４＝ＣＴＧＴＧＴＣＡＡＡＧＴＡＴＡＡＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧ。生じたＰＣＲ産物をｐＣＲ２.１内にクローニングして、ＫＡＷＨＩＴ０３.００３８を作製した。
【０３５５】
工程７−ＫＡＷＨＩＴ０３.００３８中にダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１のＰＣＲ産物を、制限部位Ｂｓｐ１２０ＩおよびＥｃｏＲＩを用いて、ＫＡＷＨＩＴ０３.００３２（複数のクローニング部位を有する空のＣＭ耐性ベクター）内にクローニングした。生じたプラスミドはＫＡＷＨＩＴ０３.００３９（空のＣＭ耐性ベクター中にダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１）である。
【０３５６】
工程８−ＫＡＷＨＩＴ０３.００３９をＡｓｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＭＯＮ６８５４１（ＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５のｄｓＲＮＡｉ  ＡＭＰ耐性基底ベクター）をＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。その後、ダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１をｐＭＯＮ６８５４１（複数のクローニング部位を有するＡｍｐ耐性ベクター中にＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５）内に方向性クローニングして、ＫＡＷＨＩＴ０３.００７１（ダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１とダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５）を作製した。
【０３５７】
工程９−ＫＡＷＨＩＴ０３.００３５（ＣＭ耐性ベクター中にＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ）をＡｓｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＫＡＷＨＩＴ０３.００７１（ＦＡＤ２−１ＡのイントロンおよびＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５のｄｓＲＮＡｉ  ＡＭＰ耐性基底ベクター）をＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。その後、ダイズＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲをＫＡＷＨＩＴ０３.００７１内に方向性クローニングして、ＫＡＷＨＩＴ０３.００７２（ダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１およびＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲとダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５）を作製した。
【０３５８】
工程１０−ＫＡＷＨＩＴ０３.００３７（ＣＭ耐性ベクター中にＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲ）をＡｓｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＫＡＷＨＩＴ０３.００７２をＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。その後、ＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲをＫＡＷＨＩＴ０３.００７２内に方向性クローニングして、ＫＡＷＨＩＴ０３.００７３（ダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ、ＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲとＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５）を作製した。
【０３５９】
工程１１−ＫＡＷＨＩＴ０３.００７３をＢｓｔＸＩおよびＳａｌＩで消化し、ＦＡＤ２−１Ａのイントロン、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲおよびＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲを含む断片をゲル精製した。異なる管内で、ＫＡＷＨＩＴ０３.００７３をＸｈｏＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉで消化した。その後、イントロン／３'ＵＴＲ断片を、ＫＡＷＨＩＴ０３.００７３内に、ダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５の他の部位上に反対の方向に、クローニングして戻して、ＫＡＷＨＩＴ０３.００７４（ダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１センス、ダイズＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲセンス、ダイズＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲセンス、ダイズ、スプライシング可能なダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５、ダイズＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲアンチセンス、ダイズＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲアンチセンス、ダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１アンチセンス）を作製した。
【０３６０】
工程１２−ｄｓＲＮＡｉ構築体を７Ｓα'プロモーターおよびＴＭＬの３'と連結させるために、ＫＡＷＨＩＴ０３.００７４およびｐＭＯＮ６８５２７（７Ｓａ'／ＴＭＬの３'カセット）をＳａｃＩで消化し、一緒にライゲーションさせて、ｐＭＯＮ６８５６３（７Ｓα'プロモーター−ＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１センス、ダイズＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲセンス、ダイズＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲセンス、スプライシング可能なダイズダイズＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲアンチセンス、ダイズＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲアンチセンス、ダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１アンチセンス−ＴＭＬの３'）を作製した。
【０３６１】
工程１３−組み立てたｄｓＲＮＡｉ構築体をｐＭＯＮ７０６８２内に導入するために、ｐＭＯＮ６８５６３およびｐＭＯＮ７０６８２をＮｏｔＩで消化し、一緒にライゲーションさせて、ＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１センス、ダイズＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲセンス、ダイズＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲセンス、スプライシング可能なダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５、ダイズＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲアンチセンス、ダイズＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲアンチセンス、ダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１アンチセンスおよびＴＭＬの３'ターミネーターの二本鎖ＲＮＡを形成する構築体と作動可能に連結している７Ｓα'プロモーター）を含むｐＭＯＮ６８５３６を形成した。
【０３６２】
工程１４−その後、ｐＭＯＮ６８５３６をＡｓｃＩおよびＲｓｒＩＩで消化し、ｐＭＯＮ６８５２９（ＦＭＶプロモーターおよびＲＢＣＳの３'と融合した選択マーカーＣＰ４ならびにΔ９不飽和化酵素を駆動するダイズＦＡＤ２プロモーターを含む）をＳａｎＤＩおよびＡｓｃＩで消化した。その後、ｐＭＯＮ６８５３６のｄｓＲＮＡｉ部分をｐＭＯＮ６８５２９内に方向性クローニングして、ｐＭＯＮ６８５３７（ＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１センス、ダイズＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲセンス、ダイズＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲセンス、スプライシング可能なダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５、ダイズＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲアンチセンス、ダイズＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲアンチセンス、ダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１アンチセンスおよびＴＭＬの３'ターミネーターならびにΔ９不飽和化酵素を駆動するダイズＦＡＤ２プロモーターの二本鎖ＲＮＡを形成する構築体と作動可能に連結している７Ｓα'プロモーターを作製した。
【０３６３】
工程１５−その後、ｐＭＯＮ６８５３７をＳａｎＤＩおよびＡｓｃＩで消化し、ｐＭＯＮ７０６８３（ＫａｓＩＶを駆動するナピン）をＡｓｃＩおよびＲｓｒＩＩで消化した。ナピン／ＫａｓＩＶ断片をｐＭＯＮ６８５３７内に方向性クローニングして、ｐＭＯＮ６８５３９（ＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１センス、ダイズＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲセンス、ダイズＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲセンス、スプライシング可能なダイズＦＡＤ３−１Ａのイントロン＃５、ダイズＦＡＴＢ−１の３'ＵＴＲアンチセンス、ダイズＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲアンチセンス、ダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン＃１アンチセンスおよびＴＭＬの３'ターミネーター、Δ９不飽和化酵素を駆動するダイズＦＡＤ２プロモーターならびにＫａｓＩＶを駆動するナピンプロモーターの二本鎖ＲＮＡを形成する構築体と作動可能に連結している７Ｓα'プロモーターを作製した。
【０３６４】
（実施例９）
本実施例は、抑制された遺伝子を有するダイズ植物を生成するための植物の形質転換を例示する。
【０３６５】
Δ１２不飽和化酵素、Δ１５不飽和化酵素、およびＦＡＴＢの遺伝子を抑制するために、実施例７に記載のように調製した形質転換ベクターｐＭＯＮ６８５３７を用いて、イントロン／３'ＵＴＲの二本鎖ＲＮＡを形成する構築体をダイズ内に導入した。ベクターｐＭＯＮ６８５３７はΔ−９不飽和化酵素（ＦＡＢ２）およびＣＰ４の遺伝子も含む。ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＢＩによってダイズ（Ａｓｇｒｏｗ品種Ａ４９２２）内に安定に導入される（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌ、米国特許第６,３８４,３０１号）。ＣＰ４選択マーカーにより、形質転換したダイズ植物を、グリフォセート除草剤を含む培地上での選択によって同定することが可能となる。
【０３６６】
ガスクロマトグラフィーを用いて、脂肪酸組成をイントロン／３'ＵＴＲ  ｄｓＲＮＡｉ発現構築体で形質転換したダイズ系の種子から分析した。Ｒ１のプールした種子およびＲ１の単一の種子油組成により、モノおよびポリ不飽和脂肪酸組成が、形質転換していないダイズの種子からの油と比較してトランスジェニックダイズ系からの種子の油で変更されていることが実証された（表７参照）。例えば、ＦＡＤ２の抑制はオレイン酸エステル化合物の量が増加した植物をもたらし；ＦＡＤ３の抑制はリノレン酸エステル化合物が減少した植物をもたらし；ＦＡＴＢの抑制は飽和脂肪酸エステル化合物、たとえばパルミチン酸およびステアリン酸が低下した植物をもたらす。選択は、所望の相対的脂肪酸組成に応じてそのような系から行うことができる。脂肪酸組成は、ガスクロマトグラフィーを用いて構築体で形質転換したダイズ系の種子から分析した。
【０３６７】
（実施例１０）
本実施例は、抑制された遺伝子を有するダイズ植物を生成するための植物の形質転換を例示する。
【０３６８】
Δ１２不飽和化酵素、Δ１５不飽和化酵素、およびＦＡＴＢの遺伝子を抑制するために、実施例３に記載のように調製した形質転換ベクターｐＭＯＮ６８５３９を用いて、イントロン／３'ＵＴＲの二本鎖ＲＮＡを形成する構築体をダイズ内に導入した。ベクターｐＭＯＮ６８５３９はＫａｓＩＶおよびＣＰ４の遺伝子も含む。ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＢＩによってダイズ（Ａｓｇｒｏｗ品種Ａ４９２２）内に安定に導入される（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌ、米国特許第６,３８４,３０１号）。ＣＰ４選択マーカーにより、形質転換したダイズ植物を、グリフォセート除草剤を含む培地上での選択によって同定することが可能となる。
【０３６９】
ガスクロマトグラフィーを用いて、脂肪酸組成をイントロン／３'ＵＴＲ  ｄｓＲＮＡｉ発現構築体で形質転換したダイズ系の種子から分析した。Ｒ１のプールした種子およびＲ１の単一の種子油組成により、モノおよびポリ不飽和脂肪酸組成が、形質転換していないダイズの種子からの油と比較してトランスジェニックダイズ系からの種子の油で変更されていることが実証された（表８参照）。例えば、ＦＡＤ２の抑制はオレイン酸エステル化合物が増加した植物をもたらし；ＦＡＤ３の抑制はリノレン酸エステル化合物が減少した植物をもたらし；ＦＡＴＢの抑制は飽和脂肪酸エステル化合物、たとえばパルミチン酸およびステアリン酸が低下した植物をもたらす。選択は、所望の相対的脂肪酸組成に応じてそのような系から行うことができる。脂肪酸組成は、ガスクロマトグラフィーを用いて構築体で形質転換したダイズ系の種子から分析した。
【０３７０】
【表７−１】
2009526550.tif 000010
【０３７１】
【表７−２】
2009526550.tif 000011
【０３７２】
【表７−３】
2009526550.tif 000012
【０３７３】
【表７−４】
2009526550.tif 000013
【０３７４】
【表７−５】
2009526550.tif 000014
【０３７５】
【表７−６】
2009526550.tif 000015
【０３７６】
【表８】
2009526550.tif 000016
【０３７７】
（実施例１１）
Ｆａｄ２遺伝子を抑制するために、実施例３Ｄに記載の構築体ｐＭＯＮ９５８２９を用いて、ＦＡＤ２−１のイントロン、二本鎖ＲＮＡを形成する構築体をダイズ内に導入した。ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＢＩによってダイズ（Ａｓｇｒｏｗ品種Ａ４９２２）内に安定に導入される（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌ、米国特許第６,３８４,３０１号）。ＣＰ４選択マーカーにより、形質転換したダイズ植物を、グリフォセート除草剤を含む培地上での選択によって同定することが可能となる。次いで、形質転換した植物のゲノムを、第１のＴ−ＤＮＡおよび第２のＴ−ＤＮＡの同時タンデム挿入、すなわち「右境界から右境界」の組立てについてスクリーニングする。スクリーニングはサザンハイブリダイゼーションマッピング方法を用いて行った。そのゲノム内に好ましい配置を含む形質転換したダイズ植物を温室に移して種子を生産させる。
【０３７８】
例えば、構築体ｐＭＯＮ９５８２９で形質転換したＲ０植物から葉組織を採取し、サザン分析を行った。両Ｔ−ＤＮＡの右境界−右境界（「ＲＢ−ＲＢ」）の組立てを含む事象を同定するためにプローブおよび制限酵素の消化が選択される。典型的には、全形質転換体の約２５％が正しく組み立てたＲＢ−ＲＢのＴ−ＤＮＡを有する。
【０３７９】
脂肪酸組成を、ｐＭＯＮ９５８２９構築体で形質転換したダイズ系の種子から、実施例４に記載のようにガスクロマトグラフィーを用いて分析して、種子から抽出した脂肪酸化合物のメチルエステルを同定した。最初に、構築体ｐＭＯＮ９５８２９で形質転換したダイズ植物から採取した６つのＲ１種子を収穫し、それぞれの単一の種子の脂肪酸組成を決定した。それぞれの事象のＲ１植物が導入遺伝子に分離しているので、したがって、慣用のダイズ組成を有する種子および改変した変種が得られる。陽性種子をプールし、それぞれの事象の平均をとった。プールした陽性平均により、モノおよびポリ不飽和脂肪酸組成が、形質転換していないダイズの種子からの油と比較してトランスジェニックダイズ系からの種子の油で変更されていることが実証された（表９参照）。例えば、ＦＡＤ２の抑制によりオレイン酸エステル化合物の量が増加した植物がもたらされる。
【０３８０】
【表９】
2009526550.tif 000017
【０３８１】
（実施例１２）
Ｆａｄ２遺伝子を抑制するために、実施例３Ｄに記載の構築体ｐＭＯＮ９３５０５を用いて、ＦＡＤ２−１Ａのイントロン、二本鎖ＲＮＡを形成する構築体をダイズ内に導入した。ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＢＩによってダイズ（Ａｓｇｒｏｗ品種Ａ４９２２）内に安定に導入される（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌ、米国特許第６,３８４,３０１号）。ＣＰ４選択マーカーにより、形質転換したダイズ植物を、グリフォセート除草剤を含む培地上での選択によって同定することが可能となる。次いで、形質転換した植物のゲノムを、第１のＴ−ＤＮＡおよび第２のＴ−ＤＮＡの同時タンデム挿入、すなわち「右境界から右境界」の組立てについてスクリーニングする。スクリーニングはサザンハイブリダイゼーションマッピング方法を用いて行った。そのゲノム内に好ましい配置を含む形質転換したダイズ植物を温室に移して種子を生産させる。
【０３８２】
例えば、構築体ｐＭＯＮ９３５０５で形質転換したＲ０植物から葉組織を採取し、サザン分析を行った。両Ｔ−ＤＮＡの右境界−右境界（「ＲＢ−ＲＢ」）の組立てを含む事象を同定するためにプローブおよび制限酵素の消化が選択される。典型的には、全形質転換体の約２５％が正しく組み立てたＲＢ−ＲＢのＴ−ＤＮＡを有する。
【０３８３】
脂肪酸組成を、ｐＭＯＮ９３５０５構築体で形質転換したダイズ系の種子から、実施例４に記載のようにガスクロマトグラフィーを用いて分析して、種子から抽出した脂肪酸化合物のメチルエステルを同定した。最初に、構築体ｐＭＯＮ９３５０５で形質転換したダイズ植物から採取した６つのＲ１種子を収穫し、それぞれの単一の種子の脂肪酸組成を決定した。それぞれの事象のＲ１植物が導入遺伝子に分離しているので、したがって、慣用のダイズ組成を有する種子および改変した変種が得られる。陽性種子をプールし、それぞれの事象の平均をとった。プールした陽性平均により、モノおよびポリ不飽和脂肪酸組成が、形質転換していないダイズの種子からの油と比較してトランスジェニックダイズ系からの種子の油で変更されていることが実証された（表１０参照）。例えば、ＦＡＤ２の抑制によりオレイン酸エステル化合物の量が増加した植物がもたらされる。
【０３８４】
【表１０】
2009526550.tif 000018
【０３８５】
（実施例１３）
ＦＡＤ２遺伝子を抑制するために、実施例３Ｄに記載の構築体ｐＭＯＮ９３５０６を用いて、ＦＡＤ２−１Ａのイントロン、二本鎖ＲＮＡを形成する構築体をダイズ内に導入した。ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＢＩによってダイズ（Ａｓｇｒｏｗ品種Ａ４９２２）内に安定に導入される（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌ、米国特許第６,３８４,３０１号）。ＣＰ４選択マーカーにより、形質転換したダイズ植物を、グリフォセート除草剤を含む培地上での選択によって同定することが可能となる。次いで、形質転換した植物のゲノムを、第１のＴ−ＤＮＡおよび第２のＴ−ＤＮＡの同時タンデム挿入、すなわち「右境界から右境界」の組立てについてスクリーニングする。スクリーニングはサザンハイブリダイゼーションマッピング方法を用いて行った。そのゲノム内に好ましい配置を含む形質転換したダイズ植物を温室に移して種子を生産させる。
【０３８６】
例えば、構築体ｐＭＯＮ９３５０６で形質転換したＲ０植物から葉組織を採取し、サザン分析を行った。両Ｔ−ＤＮＡの右境界−右境界（「ＲＢ−ＲＢ」）の組立てを含む事象を同定するためにプローブおよび制限酵素の消化が選択される。典型的には、全形質転換体の約２５％が正しく組み立てたＲＢ−ＲＢのＴ−ＤＮＡを有する。
【０３８７】
脂肪酸組成を、ｐＭＯＮ９３５０６構築体で形質転換したダイズ系の種子から、実施例４に記載のようにガスクロマトグラフィーを用いて分析して、種子から抽出した脂肪酸化合物のメチルエステルを同定した。最初に、構築体ｐＭＯＮ９３５０６で形質転換したダイズ植物から採取した６つのＲ１種子を収穫し、それぞれの単一の種子の脂肪酸組成を決定した。それぞれの事象のＲ１植物が導入遺伝子に分離しているので、したがって、慣用のダイズ組成を有する種子および改変した変種が得られる。陽性種子をプールし、それぞれの事象の平均をとった。プールした陽性平均により、モノおよびポリ不飽和脂肪酸組成が、形質転換していないダイズの種子からの油と比較してトランスジェニックダイズ系からの種子の油で変更されていることが実証された（表１１参照）。例えば、ＦＡＤ２の抑制によりオレイン酸エステル化合物の量が増加した植物がもたらされる。
【０３８８】
【表１１】
2009526550.tif 000019
【０３８９】
（実施例１４）
ＦＡＤ２遺伝子を抑制するために、実施例３Ｂに記載の構築体ｐＭＯＮ９３５０１を用いて、ＦＡＤ２−１Ａのイントロン、二本鎖ＲＮＡを形成する構築体をダイズ内に導入した。ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＢＩによってダイズ（Ａｓｇｒｏｗ品種Ａ４９２２）内に安定に導入される（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌ、米国特許第６,３８４,３０１号）。ＣＰ４選択マーカーにより、形質転換したダイズ植物を、グリフォセート除草剤を含む培地上での選択によって同定することが可能となる。
【０３９０】
脂肪酸組成を、ｐＭＯＮ９３５０１構築体で形質転換したダイズ系の種子から、実施例４に記載のようにガスクロマトグラフィーを用いて分析して、種子から抽出した脂肪酸化合物のメチルエステルを同定した。最初に、構築体ｐＭＯＮ９３５０１で形質転換したダイズ植物から採取した６つのＲ１種子を収穫し、それぞれの単一の種子の脂肪酸組成を決定した。それぞれの事象のＲ１植物が導入遺伝子に分離しているので、したがって、慣用のダイズ組成を有する種子および改変した変種が得られる。陽性種子をプールし、それぞれの事象の平均をとった。プールした陽性平均により、モノおよびポリ不飽和脂肪酸組成が、形質転換していないダイズの種子からの油と比較してトランスジェニックダイズ系からの種子の油で変更されていることが実証された（表１２参照）。例えば、ＦＡＤ２の抑制によりオレイン酸エステル化合物の量が増加した植物がもたらされる。
【０３９１】
【表１２】
2009526550.tif 000020
【０３９２】
（実施例１５）
ＦＡＤ２遺伝子を抑制するために、実施例２Ｄに記載の構築体ｐＭＯＮ９７５５２を用いて、ＦＡＤ２−１Ａのイントロン、二本鎖ＲＮＡを形成する構築体をダイズ内に導入した。ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＢＩによってダイズ（Ａｓｇｒｏｗ品種Ａ４９２２）内に安定に導入される（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌ、米国特許第６,３８４,３０１号）。ＣＰ４選択マーカーにより、形質転換したダイズ植物を、グリフォセート除草剤を含む培地上での選択によって同定することが可能となる。
【０３９３】
脂肪酸組成を、ｐＭＯＮ９７５５２構築体で形質転換したダイズ系の種子から、実施例４に記載のようにガスクロマトグラフィーを用いて分析して、種子から抽出した脂肪酸化合物のメチルエステルを同定した。最初に、構築体ｐＭＯＮ９７５５２で形質転換したダイズ植物から採取した６つのＲ１種子を収穫し、それぞれの単一の種子の脂肪酸組成を決定した。それぞれの事象のＲ１植物が導入遺伝子に分離しているので、したがって、慣用のダイズ組成を有する種子および改変した変種が得られる。陽性種子をプールし、それぞれの事象の平均をとった。プールした陽性平均により、モノおよびポリ不飽和脂肪酸組成が、形質転換していないダイズの種子からの油と比較してトランスジェニックダイズ系からの種子の油で変更されていることが実証された（表１３参照）。例えば、ＦＡＤ２の抑制によりオレイン酸エステル化合物の量が増加した植物がもたらされる。
【０３９４】
【表１３】
2009526550.tif 000021
【０３９５】
（実施例１６）
ＦＡＤ２遺伝子を抑制するために、実施例２Ｄに記載の構築体ｐＭＯＮ９３７５８を用いて、ＦＡＤ２−１Ａのイントロン、二本鎖ＲＮＡを形成する構築体をダイズ内に導入した。ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＢＩによってダイズ（Ａｓｇｒｏｗ品種Ａ４９２２）内に安定に導入される（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌ、米国特許第６,３８４,３０１号）。ＣＰ４選択マーカーにより、形質転換したダイズ植物を、グリフォセート除草剤を含む培地上での選択によって同定することが可能となる。
【０３９６】
脂肪酸組成を、ｐＭＯＮ９３７５８構築体で形質転換したダイズ系の種子から、実施例４に記載のようにガスクロマトグラフィーを用いて分析して、種子から抽出した脂肪酸化合物のメチルエステルを同定した。最初に、構築体ｐＭＯＮ９３７５８で形質転換したダイズ植物から採取した６つのＲ１種子を収穫し、それぞれの単一の種子の脂肪酸組成を決定した。それぞれの事象のＲ１植物が導入遺伝子に分離しているので、したがって、慣用のダイズ組成を有する種子および改変した変種が得られる。陽性種子をプールし、それぞれの事象の平均をとった。プールした陽性平均により、モノおよびポリ不飽和脂肪酸組成が、形質転換していないダイズの種子からの油と比較してトランスジェニックダイズ系からの種子の油で変更されていることが実証された（表１４参照）。例えば、ＦＡＤ２の抑制によりオレイン酸エステル化合物の量が増加した植物がもたらされる。
【０３９７】
【表１４】
2009526550.tif 000022
【０３９８】
（実施例１７）
ＦＡＤ２遺伝子を抑制するために、実施例２Ｄに記載の構築体ｐＭＯＮ９７５５３を用いて、ＦＡＤ２−１Ａのイントロン、二本鎖ＲＮＡを形成する構築体をダイズ内に導入した。ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＢＩによってダイズ（Ａｓｇｒｏｗ品種Ａ４９２２）内に安定に導入される（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌ、米国特許第６,３８４,３０１号）。ＣＰ４選択マーカーにより、形質転換したダイズ植物を、グリフォセート除草剤を含む培地上での選択によって同定することが可能となる。
【０３９９】
脂肪酸組成を、ｐＭＯＮ９７５５３構築体で形質転換したダイズ系の種子から、実施例４に記載のようにガスクロマトグラフィーを用いて分析して、種子から抽出した脂肪酸化合物のメチルエステルを同定した。最初に、構築体ｐＭＯＮ９７５５３で形質転換したダイズ植物から採取した６つのＲ１種子を収穫し、それぞれの単一の種子の脂肪酸組成を決定した。それぞれの事象のＲ１植物が導入遺伝子に分離しているので、したがって、慣用のダイズ組成を有する種子および改変した変種が得られる。陽性種子をプールし、それぞれの事象の平均をとった。プールした陽性平均により、モノおよびポリ不飽和脂肪酸組成が、形質転換していないダイズの種子からの油と比較してトランスジェニックダイズ系からの種子の油で変更されていることが実証された（表１５参照）。例えば、ＦＡＤ２の抑制によりオレイン酸エステル化合物の量が増加した植物がもたらされる。
【０４００】
【表１５】
2009526550.tif 000023
【０４０１】
（実施例１８）
ＦＡＤ２遺伝子を抑制するために、実施例２Ｄに記載の構築体ｐＭＯＮ９３７７０を用いて、ＦＡＤ２−１Ａのイントロン、二本鎖ＲＮＡを形成する構築体をダイズ内に導入した。ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＢＩによってダイズ（Ａｓｇｒｏｗ品種Ａ４９２２）内に安定に導入される（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌ、米国特許第６,３８４,３０１号）。ＣＰ４選択マーカーにより、形質転換したダイズ植物を、グリフォセート除草剤を含む培地上での選択によって同定することが可能となる。
【０４０２】
脂肪酸組成を、ｐＭＯＮ９３７７０構築体で形質転換したダイズ系の種子から、実施例４に記載のようにガスクロマトグラフィーを用いて分析して、種子から抽出した脂肪酸化合物のメチルエステルを同定した。最初に、構築体ｐＭＯＮ９３７７０で形質転換したダイズ植物から採取した６つのＲ１種子を収穫し、それぞれの単一の種子の脂肪酸組成を決定した。それぞれの事象のＲ１植物が導入遺伝子に分離しているので、したがって、慣用のダイズ組成を有する種子および改変した変種が得られる。陽性種子をプールし、それぞれの事象の平均をとった。プールした陽性平均により、モノおよびポリ不飽和脂肪酸組成が、形質転換していないダイズの種子からの油と比較してトランスジェニックダイズ系からの種子の油で変更されていることが実証された（表１６参照）。例えば、ＦＡＤ２の抑制によりオレイン酸エステル化合物の量が増加した植物がもたらされる。
【０４０３】
【表１６】
2009526550.tif 000024
【０４０４】
（実施例１９）
ＦＡＤ２遺伝子を抑制するために、実施例２Ｄに記載の構築体ｐＭＯＮ９３７５９を用いて、ＦＡＤ２−１Ａのイントロン、二本鎖ＲＮＡを形成する構築体をダイズ内に導入した。ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＢＩによってダイズ（Ａｓｇｒｏｗ品種Ａ４９２２）内に安定に導入される（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌ、米国特許第６,３８４,３０１号）。ＣＰ４選択マーカーにより、形質転換したダイズ植物を、グリフォセート除草剤を含む培地上での選択によって同定することが可能となる。
【０４０５】
脂肪酸組成を、ｐＭＯＮ９３７５９構築体で形質転換したダイズ系の種子から、実施例４に記載のようにガスクロマトグラフィーを用いて分析して、種子から抽出した脂肪酸化合物のメチルエステルを同定した。最初に、構築体ｐＭＯＮ９３７５９で形質転換したダイズ植物から採取した６つのＲ１種子を収穫し、それぞれの単一の種子の脂肪酸組成を決定した。それぞれの事象のＲ１植物が導入遺伝子に分離しているので、したがって、慣用のダイズ組成を有する種子および改変した変種が得られる。陽性種子をプールし、それぞれの事象の平均をとった。プールした陽性平均により、モノおよびポリ不飽和脂肪酸組成が、形質転換していないダイズの種子からの油と比較してトランスジェニックダイズ系からの種子の油で変更されていることが実証された（表１７参照）。例えば、ＦＡＤ２の抑制によりオレイン酸エステル化合物の量が増加した植物がもたらされる。
【０４０６】
【表１７】
2009526550.tif 000025
【０４０７】
（実施例２０）
ＦＡＤ２遺伝子を抑制するために、実施例２Ｄに記載の構築体ｐＭＯＮ９７５５４を用いて、ＦＡＤ２−１Ａのイントロン、二本鎖ＲＮＡを形成する構築体をダイズ内に導入した。ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＢＩによってダイズ（Ａｓｇｒｏｗ品種Ａ４９２２）内に安定に導入される（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌ、米国特許第６,３８４,３０１号）。ＣＰ４選択マーカーにより、形質転換したダイズ植物を、グリフォセート除草剤を含む培地上での選択によって同定することが可能となる。
【０４０８】
脂肪酸組成を、ｐＭＯＮ９７５５４構築体で形質転換したダイズ系の種子から、実施例４に記載のようにガスクロマトグラフィーを用いて分析して、種子から抽出した脂肪酸化合物のメチルエステルを同定した。最初に、構築体ｐＭＯＮ９７５５４で形質転換したダイズ植物から採取した６つのＲ１種子を収穫し、それぞれの単一の種子の脂肪酸組成を決定した。それぞれの事象のＲ１植物が導入遺伝子に分離しているので、したがって、慣用のダイズ組成を有する種子および改変した変種が得られる。陽性種子をプールし、それぞれの事象の平均をとった。プールした陽性平均により、モノおよびポリ不飽和脂肪酸組成が、形質転換していないダイズの種子からの油と比較してトランスジェニックダイズ系からの種子の油で変更されていることが実証された（表１８参照）。例えば、ＦＡＤ２の抑制によりオレイン酸エステル化合物の量が増加した植物がもたらされる。
【０４０９】
【表１８】
2009526550.tif 000026
【０４１０】
（実施例２１）
ＦＡＤ２遺伝子を抑制するために、実施例２Ｄに記載の構築体ｐＭＯＮ９３７７１を用いて、ＦＡＤ２−１Ａのイントロン、二本鎖ＲＮＡを形成する構築体をダイズ内に導入した。ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＢＩによってダイズ（Ａｓｇｒｏｗ品種Ａ４９２２）内に安定に導入される（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌ、米国特許第６,３８４,３０１号）。ＣＰ４選択マーカーにより、形質転換したダイズ植物を、グリフォセート除草剤を含む培地上での選択によって同定することが可能となる。
【０４１１】
脂肪酸組成を、ｐＭＯＮ９３７７１構築体で形質転換したダイズ系の種子から、実施例４に記載のようにガスクロマトグラフィーを用いて分析して、種子から抽出した脂肪酸化合物のメチルエステルを同定した。最初に、構築体ｐＭＯＮ９３７７１で形質転換したダイズ植物から採取した６つのＲ１種子を収穫し、それぞれの単一の種子の脂肪酸組成を決定した。それぞれの事象のＲ１植物が導入遺伝子に分離しているので、したがって、慣用のダイズ組成を有する種子および改変した変種が得られる。陽性種子をプールし、それぞれの事象の平均をとった。プールした陽性平均により、モノおよびポリ不飽和脂肪酸組成が、形質転換していないダイズの種子からの油と比較してトランスジェニックダイズ系からの種子の油で変更されていることが実証された（表１９参照）。例えば、ＦＡＤ２の抑制によりオレイン酸エステル化合物の量が増加した植物がもたらされる。
【０４１２】
【表１９】
2009526550.tif 000027
【０４１３】
（実施例２２）
ＦＡＤ２遺伝子を抑制するために、実施例２Ｄに記載の構築体ｐＭＯＮ９７５５５を用いて、ＦＡＤ２−１Ａのイントロン、二本鎖ＲＮＡを形成する構築体をダイズ内に導入した。ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＢＩによってダイズ（Ａｓｇｒｏｗ品種Ａ４９２２）内に安定に導入される（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌ、米国特許第６,３８４,３０１号）。ＣＰ４選択マーカーにより、形質転換したダイズ植物を、グリフォセート除草剤を含む培地上での選択によって同定することが可能となる。
【０４１４】
脂肪酸組成を、ｐＭＯＮ９７５５５構築体で形質転換したダイズ系の種子から、実施例４に記載のようにガスクロマトグラフィーを用いて分析して、種子から抽出した脂肪酸化合物のメチルエステルを同定した。最初に、構築体ｐＭＯＮ９７５５５で形質転換したダイズ植物から採取した６つのＲ１種子を収穫し、それぞれの単一の種子の脂肪酸組成を決定した。それぞれの事象のＲ１植物が導入遺伝子に分離しているので、したがって、慣用のダイズ組成を有する種子および改変した変種が得られる。陽性種子をプールし、それぞれの事象の平均をとった。プールした陽性平均により、モノおよびポリ不飽和脂肪酸組成が、形質転換していないダイズの種子からの油と比較してトランスジェニックダイズ系からの種子の油で変更されていることが実証された（表２０参照）。例えば、ＦＡＤ２の抑制によりオレイン酸エステル化合物の量が増加した植物がもたらされる。
【０４１５】
【表２０】
2009526550.tif 000028
【０４１６】
（実施例２３）
ＦＡＤ２遺伝子を抑制するために、実施例２Ｄに記載の構築体ｐＭＯＮ９３７６０を用いて、ＦＡＤ２−１Ａのイントロン、二本鎖ＲＮＡを形成する構築体をダイズ内に導入した。ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＢＩによってダイズ（Ａｓｇｒｏｗ品種Ａ４９２２）内に安定に導入される（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌ、米国特許第６,３８４,３０１号）。ＣＰ４選択マーカーにより、形質転換したダイズ植物を、グリフォセート除草剤を含む培地上での選択によって同定することが可能となる。
【０４１７】
脂肪酸組成を、ｐＭＯＮ９３７６０構築体で形質転換したダイズ系の種子から、実施例４に記載のようにガスクロマトグラフィーを用いて分析して、種子から抽出した脂肪酸化合物のメチルエステルを同定した。最初に、構築体ｐＭＯＮ９３７６０で形質転換したダイズ植物から採取した６つのＲ１種子を収穫し、それぞれの単一の種子の脂肪酸組成を決定した。それぞれの事象のＲ１植物が導入遺伝子に分離しているので、したがって、慣用のダイズ組成を有する種子および改変した変種が得られる。陽性種子をプールし、それぞれの事象の平均をとった。プールした陽性平均により、モノおよびポリ不飽和脂肪酸組成が、形質転換していないダイズの種子からの油と比較してトランスジェニックダイズ系からの種子の油で変更されていることが実証された（表２１参照）。例えば、（配列番号１）の５'末端から長さが連続する３２０ヌクレオチド短縮されており、ｄｓＲＮＡを形成できるＦＡＤ２−１のイントロンは、ＦＡＤ２を少なくとも部分的に抑制する。
【０４１８】
【表２１】
2009526550.tif 000029
【０４１９】
（実施例２４）
ＦＡＤ２遺伝子を抑制するために、実施例２Ｄに記載の構築体ｐＭＯＮ９３７７２を用いて、ＦＡＤ２−１Ａのイントロン、二本鎖ＲＮＡを形成する構築体をダイズ内に導入した。ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＢＩによってダイズ（Ａｓｇｒｏｗ品種Ａ４９２２）内に安定に導入される（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌ、米国特許第６,３８４,３０１号）。ＣＰ４選択マーカーにより、形質転換したダイズ植物を、グリフォセート除草剤を含む培地上での選択によって同定することが可能となる。
【０４２０】
脂肪酸組成を、ｐＭＯＮ９３７７２構築体で形質転換したダイズ系の種子から、実施例４に記載のようにガスクロマトグラフィーを用いて分析して、種子から抽出した脂肪酸化合物のメチルエステルを同定した。最初に、構築体ｐＭＯＮ９３７７２で形質転換したダイズ植物から採取した６つのＲ１種子を収穫し、それぞれの単一の種子の脂肪酸組成を決定した。それぞれの事象のＲ１植物が導入遺伝子に分離しているので、したがって、慣用のダイズ組成を有する種子および改変した変種が得られる。陽性種子をプールし、それぞれの事象の平均をとった。プールした陽性平均により、モノおよびポリ不飽和脂肪酸組成が、形質転換していないダイズの種子からの油と比較してトランスジェニックダイズ系からの種子の油で変更されていることが実証された（表２２参照）。例えば、（配列番号１）の３'末端から長さが連続する３６０ヌクレオチド短縮されており、ｄｓＲＮＡを形成できるＦＡＤ２−１のイントロンは、一部の事象においてＦＡＤ２を少なくとも部分的に抑制する。
【０４２１】
【表２２】
2009526550.tif 000030
【０４２２】
（実施例２５）
ＦＡＤ２遺伝子を抑制するために、実施例２Ｄに記載の構築体ｐＭＯＮ９７５５６を用いて、ＦＡＤ２−１Ａのイントロン、二本鎖ＲＮＡを形成する構築体をダイズ内に導入した。ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＢＩによってダイズ（Ａｓｇｒｏｗ品種Ａ４９２２）内に安定に導入される（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌ、米国特許第６,３８４,３０１号）。ＣＰ４選択マーカーにより、形質転換したダイズ植物を、グリフォセート除草剤を含む培地上での選択によって同定することが可能となる。
【０４２３】
脂肪酸組成を、ｐＭＯＮ９７５５６構築体で形質転換したダイズ系の種子から、実施例４に記載のようにガスクロマトグラフィーを用いて分析して、種子から抽出した脂肪酸化合物のメチルエステルを同定した。最初に、構築体ｐＭＯＮ９７５５６で形質転換したダイズ植物から採取した６つのＲ１種子を収穫し、それぞれの単一の種子の脂肪酸組成を決定した。それぞれの事象のＲ１植物が導入遺伝子に分離しているので、したがって、慣用のダイズ組成を有する種子および改変した変種が得られる。陽性種子をプールし、それぞれの事象の平均をとった。プールした陽性平均により、モノおよびポリ不飽和脂肪酸組成が、形質転換していないダイズの種子からの油と比較してトランスジェニックダイズ系からの種子の油で変更されていることが実証された（表２３参照）。例えば、（配列番号１）の３'末端から長さが連続する２００ヌクレオチド短縮されており、ｄｓＲＮＡを形成できるＦＡＤ２−１のイントロンは、ＦＡＤ２を少なくとも部分的に抑制する。
【０４２４】
【表２３】
2009526550.tif 000031
【０４２５】
（実施例２６）
ＦＡＤ２遺伝子を抑制するために、実施例２Ｄに記載の構築体ｐＭＯＮ９３７６４を用いて、ＦＡＤ２−１Ａのイントロン、二本鎖ＲＮＡを形成する構築体をダイズ内に導入した。ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＢＩによってダイズ（Ａｓｇｒｏｗ品種Ａ４９２２）内に安定に導入される（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌ、米国特許第６,３８４,３０１号）。ＣＰ４選択マーカーにより、形質転換したダイズ植物を、グリフォセート除草剤を含む培地上での選択によって同定することが可能となる。
【０４２６】
脂肪酸組成を、ｐＭＯＮ９３７６４構築体で形質転換したダイズ系の種子から、実施例４に記載のようにガスクロマトグラフィーを用いて分析して、種子から抽出した脂肪酸化合物のメチルエステルを同定した。最初に、構築体ｐＭＯＮ９３７６４で形質転換したダイズ植物から採取した６つのＲ１種子を収穫し、それぞれの単一の種子の脂肪酸組成を決定した。それぞれの事象のＲ１植物が導入遺伝子に分離しているので、したがって、慣用のダイズ組成を有する種子および改変した変種が得られる。陽性種子をプールし、それぞれの事象の平均をとった。プールした陽性平均により、飽和脂肪酸組成が、形質転換していないダイズの種子からの油と比較してトランスジェニックダイズ系からの種子の油で変更されていることが実証された（表２４参照）。また、（配列番号１）の３'末端から長さが連続する４００ヌクレオチド短縮されており、ｄｓＲＮＡを形成できるＦＡＤ２−１のイントロンは、ＦＡＤ２の発現を実質的に低下させない。
【０４２７】
【表２４】
2009526550.tif 000032
【０４２８】
（実施例２７）
ＴａｑＭａｎとは、選択的増幅およびリアルタイム蛍光測定によって核酸を定量するアッセイである（リアルタイムＰＣＲとも呼ばれる）。この手順を用いて、発生中のトランスジェニック種子における標的転写物の抑制程度を決定した。サンプル中の標的ｍＲＮＡの絶対的転写レベルを決定するために、それぞれのＴａｑＭａｎ実験において検量線を確立した。この目的のために、アブラナからの２０ｎｇの全ＲＮＡで希釈した様々な量のクローニングしたダイズ標的遺伝子配列を、未知の標的の量のサンプルと平行して増幅させた。この方法で決定した転写物のコピー数の精度の許容誤差は２５％であった。
【０４２９】
鋳型物質には、ＡＢＩ６１００  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐ  Ｓｔａｔｉｏｎを用いて全ＲＮＡを抽出し、ＴａｑＭａｎサンプル１個あたり２０ｎｇを用いた。サンプルを、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ−Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを用いてＡＢＩ７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ装置で分析した。ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ反応終了時からのＴａｑＭａｎ計数（Ｃｔ）値を既知の量の合成標的配列に対してプロットして、未知のサンプル中のＦＡＤ２−１標的ＤＮＡの量をそれぞれのＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ反応終了時に作成したＴａｑＭａｎ  Ｃｔ値から決定できるように、直線回帰を計算した。
【０４３０】
植物は、すべてＦＡＤ２−１Ａを抑制するｐＭＯＮ６８５４０、ｐＭＯＮ６８５４６、またはｐＭＯＮ８０６２３のいずれかで形質転換した（構築体の説明にはセクション３Ａおよび図７を参照）。
【０４３１】
ヌルおよび形質転換した植物からＡＢＩ６１００  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐ  Ｓｔａｔｉｏｎを用いて全ＲＮＡを得た。形質転換した植物は第３世代のホモ接合体であり、５０％を超えるオレイン酸レベルを有する。別々のＴａｑＭａｎサンプル中で、試験するそれぞれの植物からの全ＲＮＡにＦＡＤ２−１Ａプライマー、ＦＡＤ２−１Ｂプライマー、またはＦＡＤ２−２Ａプライマーを加えた。サンプルをＡＢＩＰｒｉｓｍ−Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを用いてＡＢＩ７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ装置で分析した。
【０４３２】
すべてのトランスジェニック植物がＦＡＤ２−１ＡおよびＦＡＤ２−１Ｂの転写レベルを実質的に抑制した。どのトランスジェニック植物も、ＦＡＤ２−２ＡまたはＦＡＤ２−２Ｂ  レベルを部分的にも低下させなかった。
【０４３３】
ヌル植物におけるＦＡＤ２−１Ａ転写レベルの植物対植物の比較により、植物間の天然の変異が決定される。複数の植物内でプローブ配列を産生するＰＣＲプライマーを用いて、発生中の種子からのＦＡＤ２−１ＡのｍＲＮＡのアッセイを行った。０.２ｇの新鮮重の大きさの種子を４つの異なるＲ２ヌル分離植物から採取し、それぞれの植物は異なる系のものであった。同じ大きさのクラスかつ４つの異なるヌル分離体からのＲ２種子のプールを試験した。ＰＣＲ反応を３つ組で行い、結果をそれぞれのサンプル中の１８ＳのＲＮＡの量と比較して正規化した。ＦＡＤ２−１Ａ転写物における植物対植物の生物学的なばらつきは低い。４つのサンプルのうち３つが約６５の正規化ＴａｑＭａｎ計数（Ｃｔ）値を有し、１つのサンプルが約５０の正規化ＴａｑＭａｎ  Ｃｔ値を有していた。
【０４３４】
（実施例２８）
ダイズＦＡＤ２−１のイントロン１（配列番号１）配列の２００個の連続する断片をＰＣＲによって増幅して、配列番号１の５'末端から開始して配列番号１の最初の２００ヌクレオチドが含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作した制限部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターを制限酵素で切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクター内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０４３５】
脂肪酸組成を、この構築体で形質転換したダイズ系の種子から、実施例４に記載のようにガスクロマトグラフィーを用いて分析して、種子から抽出した脂肪酸化合物のメチルエステルを同定した。最初に、この構築体で形質転換したダイズ植物から採取した６つのＲ１種子を収穫し、それぞれの単一の種子の脂肪酸組成を決定した。それぞれの事象のＲ１植物が導入遺伝子に分離しているので、したがって、慣用のダイズ組成を有する種子および改変した変種が得られる。陽性種子をプールし、それぞれの事象の平均をとった。プールした陽性平均により、飽和脂肪酸組成が、形質転換していないダイズの種子からの油と比較してトランスジェニックダイズ系からの種子の油で変更されていることが実証された。
【０４３６】
（実施例２９）
ダイズＦＡＤ２−１のイントロン１（配列番号１）配列の１８０個の連続する断片をＰＣＲによって増幅して、配列番号１の３'末端から開始して最初の１８０ヌクレオチドが含まれるＰＣＲ産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、センス方向に、ダイズ７Ｓα'プロモーターおよびｔｍｌの３'終止配列を含むベクター内に、ＰＣＲプライマーの５'末端上に遺伝子操作した制限部位によって、直接クローニングした。その後、ベクターを制限酵素で切断し、ＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列によって調節されるＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むベクター内にライゲーションした。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた形質転換に使用した。
【０４３７】
脂肪酸組成を、この構築体で形質転換したダイズ系の種子から、実施例４に記載のようにガスクロマトグラフィーを用いて分析して、種子から抽出した脂肪酸化合物のメチルエステルを同定した。最初に、この構築体で形質転換したダイズ植物から採取した６つのＲ１種子を収穫し、それぞれの単一の種子の脂肪酸組成を決定した。それぞれの事象のＲ１植物が導入遺伝子に分離しているので、したがって、慣用のダイズ組成を有する種子および改変した変種が得られる。陽性種子をプールし、それぞれの事象の平均をとった。プールした陽性平均により、飽和脂肪酸組成が、形質転換していないダイズの種子からの油と比較してトランスジェニックダイズ系からの種子の油で変更されていることが実証された。
【０４３８】
（実施例３０）
ｐＭＯＮ９７５６２は、３'末端から連続する１００ヌクレオチドが短縮されており、ＦＡＤ３−１Ａの５'ＵＴＲと連結しているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているダイズ７Ｓα'プロモーター、続いて、ＦＡＤ３−１Ｂの５'ＵＴＲと連結したＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ、続いて、ＦＡＤ３−１Ｂの３'ＵＴＲ、続いて、ＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲ、続いて、ＦＡＴＢ−１ａの３'ＵＴＲとアンチセンス方向に作動可能に連結しているＦＡＤ３−１Ａのイントロン４からの７０ヌクレオチドと作動可能に連結している、ＦＡＴＢ−１ａの３'ＵＴＲ、続いて、ＦＡＤ３−１Ｂの３'ＵＴＲとアンチセンスで連結したアンチセンス方向のＦＡＴＢ−１ａの５'ＵＴＲ、続いて、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲとアンチセンスで連結したアンチセンスのＦＡＤ３−１Ｂの５'ＵＴＲ、続いて、アンチセンスのＦＡＤ３−１Ａの５'ＵＴＲ、続いて、ＥＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列と作動可能に連結しているＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を有するＨ６  ３'ポリアデニル化セグメントと作動可能に連結している、３'末端から連続する１００ヌクレオチドが短縮されており、かつアンチセンス方向のダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）を含み、これらはすべて同一のＤＮＡ分子上のＲＢおよびＬＢに隣接している。生じた遺伝子発現構築体は、本明細書中に記載の方法を用いたダイズ形質転換に使用した。脂肪酸組成を、この構築体で形質転換したダイズ系の種子から、実施例４に記載のようにガスクロマトグラフィーを用いて決定した。表２５に代表的な種子の組成を示す。１８：３のレベルが約１％まで低下していた。
【０４３９】
【表２５】
2009526550.tif 000033
【０４４０】
（実施例３１）
ｐＭＯＮ９７５６３は、３'末端から連続する１００ヌクレオチドが短縮されており、ＦＡＤ３−１Ａの５'ＵＴＲと連結しているダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）と作動可能に連結しているダイズ７Ｓα'プロモーター、続いて、ＦＡＤ３−１Ｂの５'ＵＴＲと連結したＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲ、続いて、ＦＡＤ３−１Ｃの５'ＵＴＲと連結したＦＡＤ３−１Ｂの３'ＵＴＲ、続いて、ＦＡＤ３−１Ｃの３'ＵＴＲ、続いて、ＦＡＴＢ−１ａのＣＴＰコード領域、続いて、ＦＡＴＢ−２ａのＣＴＰコード領域とアンチセンス方向に作動可能に連結しているＦＡＤ３−１Ａのイントロン４からの７０ヌクレオチドと作動可能に連結している、ＦＡＴＢ−２ａのＣＴＰコード領域、続いて、ＦＡＤ３−１Ｃの３'ＵＴＲとアンチセンスで連結しているアンチセンス方向のＦＡＴＢ−１ａのＣＴＰコード領域、続いて、ＦＡＤ３−１Ｂの３'ＵＴＲとアンチセンスで連結したアンチセンスのＦＡＤ３−１Ｃの５'ＵＴＲ、続いて、ＦＡＤ３−１Ａの３'ＵＴＲとアンチセンスで連結したアンチセンスのＦＡＤ３−１Ｂの５'ＵＴＲ、続いて、アンチセンスのＦＡＤ３−１Ａの５'ＵＴＲ、続いて、ＥＦＭＶプロモーターおよびエンドウマメルビスコＥ９の３'終止配列と作動可能に連結しているＣＰ４  ＥＰＳＰＳ遺伝子を有するＨ６  ３'ポリアデニル化セグメントと作動可能に連結している、３'末端から連続する１００ヌクレオチドが短縮されており、かつアンチセンス方向のダイズＦＡＤ２−１Ａのイントロン１（配列番号１）を含み、これらはすべて同一のＤＮＡ分子上のＲＢおよびＬＢに隣接している。生じた遺伝子発現構築体を、本明細書中に記載の方法を用いた植物の形質転換に使用した。脂肪酸組成を、この構築体で形質転換したダイズ系の種子から、実施例４に記載のようにガスクロマトグラフィーを用いて決定した。表２６に代表的な種子の組成を示す。１８：３のレベルが約１％まで低下していた。
【０４４１】
【表２６】
2009526550.tif 000034
【０４４２】
本明細書中に開示かつ特許請求したすべての組成物および／または方法は、本発明の開示に鑑みて、必要以上の実験を行わずに作製および実施できる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して記載したが、当業者には、本発明の概念、精神および範囲から逸脱せずに、本明細書中に記載の方法の組成物および／または方法ならびに工程または工程の配列に変形を適用し得ることは明らかであろう。より具体的には、化学的かつ生理的に関連する特定の作用物質で本明細書中に記載の作用物質を置き換えても、同一または同様の結果が達成され得ることが、明らかであろう。当業者に明らかなすべてのそのような類似の置換体および変形は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念内にあると見なされる。
【図面の簡単な説明】
【０４４３】
【図１】図１は、例示的な核酸分子の配置を示す。
【図２】図２は、例示的な核酸分子の配置を示す。
【図３】図３は、例示的な核酸分子の配置を示す。
【図４】図４は、例示的な核酸分子の配置を示す。
【図５】図５(ａ)〜(ｄ)は、それぞれ第１の組のＤＮＡ配列の例示的な配置を示す。
【図６】図６(ａ)〜(ｃ)は、それぞれ第１の組のＤＮＡ配列の例示的な配置を示す。
【図７】図７は、本発明の核酸分子を示す。
【図８】図８は、本発明の核酸分子を示す。
【図９】図９は、本発明の核酸分子を示す。
【図１０】図１０は、本発明の核酸分子を示す。
【図１１】図１１は、本発明の核酸分子を示す。
【図１２】図１２は、本発明の核酸分子を示す。
【図１３】図１３は、本発明の核酸分子を示す。
【図１４】図１４は、本発明の核酸分子を示す。
【図１５】図１５は、本発明の核酸分子を示す。
【図１６】図１６は、本発明の核酸分子を示す。
【図１７】図１７は、本発明の核酸分子を示す。
【図１８】図１８は、本発明の核酸分子を示す。
【図１９】図１９は、本発明の核酸分子を示す。
【図２０】図２０は、本発明の核酸分子を示す。
【図２１】図２１は、構築体ｐＭＯＮ６８５３７を示す。
【図２２】図２２は、構築体ｐＭＯＮ６８５３９を示す。
【図１】
2009526550.tif 000035
【図２】
2009526550.tif 000036
【図３】
2009526550.tif 000037
【図４】
2009526550.tif 000038
【図５ａ−ｂ】
2009526550.tif 000039
【図５ｃ−ｄ】
2009526550.tif 000040
【図６ａ−ｂ】
2009526550.tif 000041
【図６ｃ】
2009526550.tif 000042
【図７】
2009526550.tif 000043
【図８】
2009526550.tif 000044
【図９】
2009526550.tif 000045
【図１０】
2009526550.tif 000046
【図１１】
2009526550.tif 000047
【図１２】
2009526550.tif 000048
【図１３】
2009526550.tif 000049
【図１４】
2009526550.tif 000050
【図１５】
2009526550.tif 000051
【図１６】
2009526550.tif 000052
【図１７】
2009526550.tif 000053
【図１８】
2009526550.tif 000054
【図１９】
2009526550.tif 000055
【図２０】
2009526550.tif 000056
【図２１】
2009526550.tif 000057
【図２２】
2009526550.tif 000058
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月7日(2008.10.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009526550000001.app
【国際調査報告】
2009526550.tif 000059
2009526550.tif 000060
2009526550.tif 000061
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