(57)【要約】ＲＮＡ干渉は、脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）ｍＲＮＡの発現を阻害するために、特に、アレルギ性結膜炎、眼の炎症、皮膚炎、鼻炎、喘息、アレルギまたは肥満細胞の炎症など、Ｓｙｋ関連の炎症状態の患者またはＳｙｋ関連の炎症状態が発達するリスクのある患者の治療用に提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のＳｙｋ  ｍＲＮＡの発現を減少させる方法であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）および製薬的に許容されるキャリアを具えた組成物を対象に投与するステップを具え、前記干渉ＲＮＡが、
配列番号２、配列番号１３〜４０、配列番号４４〜４７のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端のペナルチメート１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相同性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３連続ヌクレオチドの領域と、
配列番号２、配列番号１３〜４０、配列番号４４〜４７のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端のペナルチメート１４ヌクレオチドに対して、少なくとも８５％の配列相補性または少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４連続ヌクレオチドの領域と、
配列番号２、配列番号１３〜４０、配列番号４４〜４７のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端のペナルチメート１５、１６、１７または１８ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の配列相補性または少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５、１６、１７または１８連続ヌクレオチドの領域と、
からなる群から選択される領域を具え、
これにより、Ｓｙｋ  ｍＲＮＡの発現が減少することを特徴とする対象のＳｙｋ  ｍＲＮＡの発現を減少させる方法。
【請求項２】
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、かつ配列番号２、配列番号１３〜４０、配列番号４４〜４７のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端のペナルチメート１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性、または、少なくとも９０％の配列同一性を具える第２の干渉ＲＮＡを、前記組成物が更に具えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記干渉ＲＮＡがｓｈＲＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物は、エアロゾル、バックル、真皮、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、鼻、眼、口、耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮的ルートで投与されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記干渉ＲＮＡは、この干渉ＲＮＡを発現可能な発現ベクタからインビボの発現を介して投与されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記干渉ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの少なくとも一方であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｓｙｋ関連炎症状態の治療を必要とする対象を治療する方法であって、
１９〜４９ヌクレオチド長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、製薬的に許容されるキャリアと、を具える組成物を対象に投与するステップを具え、
前記干渉ＲＮＡは、
配列番号２、配列番号１３〜４０、配列番号４４〜４７のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端のペナルチメート１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３連続ヌクレオチドの領域と、
配列番号２、配列番号１３〜４０、配列番号４４〜４７のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端のペナルチメート１４ヌクレオチドに対して少なくとも８５％の配列相補性または少なくとも８５％の同一性を有する少なくとも１４連続ヌクレオチド領域と、
配列番号２、配列番号１３〜４０、配列番号４４〜４７のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端のペナルチメート１５、１６、１７または１８ヌクレオチドの各々に対して、少なくとも８０％配列相補性、または、少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５、１６、１７または１８の連続ヌクレオチド領域と、
からなる群から選択される領域を具え、
これにより、Ｓｙｋ関連の炎症状態が治療されることを特徴とする、Ｓｙｋ関連炎症状態の治療を必要とする対象のＳｙｋ関連炎症状態を治療する方法。
【請求項８】
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、かつ配列番号２、配列番号１３〜４０、配列番号４４〜４７のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端のペナルチメート１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性、または、少なくとも９０％の配列同一性を具える第２の干渉ＲＮＡを、前記組成物が更に具えることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記干渉ＲＮＡがｓｈＲＮＡであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物は、エアロゾル、バックル、真皮、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、鼻、眼、口、耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮ルートで投与されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記干渉ＲＮＡが、この干渉ＲＮＡを発現可能な発現ベクタからインビボでの発現を介して投与されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記干渉ＲＮＡが、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの少なくとも一方であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象が、Ｓｙｋ関連の炎症状態を有するか、または、Ｓｙｋ関連の炎症状態が発達するリスクを有していることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
対象のＳｙｋ  ｍＲＮＡの発現を減少させる方法であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、製薬的に許容されるキャリアと、を具える組成物を対象に投与するステップを具え、前記干渉ＲＮＡは、
ヌクレオチドのセンス鎖、ヌクレオチドのアンチセンス鎖および少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続相補性領域を具え、
前記アンチセンス鎖は、
ヌクレオチド６４２、７８９、７９１、８６０、８６１、８６２、８６７、８６８、１００９、１２７３、１３９４、１４３６、１４７１、１４７２、１５３３、１５３５、１５４７、１６８０、１７３８、１７３９、１７６６、１８８０、１９４７、２０２２、２０３６、２３２８、２３２９、２４７３、２５０９、２５２０、２５２４、２５５８または２６１３を具える配列番号１の対応するｍＲＮＡと、
ヌクレオチド１００７、１６９８または１７６９を具える配列番号１に対応するヌクレオチドと、
からなる群から選択されるｍＲＮＡの一部に、生理学的条件下で、ハイブリダイゼーションし、
これによって、Ｓｙｋ  ｍＲＮＡの発現が減少する、ことを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記対象がヒトであり、前記ヒトがＳｙｋ関連炎症状態を有するか、または、Ｓｙｋ関連炎症状態が発達するリスクが有することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象がヒトであり、前記ヒトは、Ｓｙｋ関連炎症状態を有するか、または、Ｓｙｋ関連炎症状態が発達するリスクを有することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、かつヌクレオチドのセンス鎖、ヌクレオチドのアンチセンス鎖、および少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な相補性領域を具える第２の干渉ＲＮＡを対象に投与するステップを更に具え、
前記第２の干渉ＲＮＡの前記アンチセンス鎖が、
ヌクレオチド６４２、７８９、７９１、８６０、８６１、８６２、８６７、８６８、１００９、１２７３、１３９４、１４３６、１４７１、１４７２、１５３３、１５３５、１５４７、１６８０、１７３８、１７３９、１７６６、１８８０、１９４７、２０２２、２０３６、２３２８、２３２９、２４７３、２５０９、２５２０、２５２４、２５５８または２６１３を具える配列番号１に対応するｍＲＮＡと、
ヌクレオチド１００７、１６９８または１７６９を具える配列番号１に対応するｍＲＮＡと、
からなる群から選択されるｍＲＮＡの一部に、生理学的条件下でハイブリダイゼーションすることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヌクレオチドのセンス鎖および前記ヌクレオチドのアンチセンス鎖は、ループ状ヌクレオチド鎖によって結合していることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が、エアロゾル、バックル、真皮、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、鼻、眼、口、耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮ルートで投与されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記干渉ＲＮＡが、この干渉ＲＮＡを発現可能な発現ベクタからインビボでの発現を介して投与されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
Ｓｙｋ関連炎症状態の治療を必要とする対象のＳｙｋ関連炎症状態を治療する方法であって、
１９〜４９のヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと製薬学的に許容されるキャリアとを具える組成物を対象に投与するステップを具え、前記干渉ＲＮＡが、ヌクレオチドのセンス鎖、ヌクレオチドのアンチセンス鎖および少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続相補性領域、を具え、
前記アンチセンスが、
ヌクレオチド６４２、７８９、７９１、８６０、８６１、８６２、８６７、８６８、１００９、１２７３、１３９４、１４３６、１４７１、１４７２、１５３３、１５３５、１５４７、１６８０、１７３８、１７３９、１７６６、１８８０、１９４７、２０２２、２０３６、２３２８、２３２９、２４７３、２５０９、２５２０、２５２４、２５５８または２６１３を具える配列番号１に対応するｍＲＮＡと、
ヌクレオチド１００７、１６９８または１７６９を具える配列番号１に対応するｍＲＮＡと、
からなる群から選択されるｍＲＮＡの一部に、生理学的条件下でハイブリダイゼーションし、
これによって、Ｓｙｋ関連の炎症状態が治療されることを特徴とする方法。
【請求項２２】
前記対象がヒトであり、前記ヒトがＳｙｋ関連の炎症状態を有するか、または、Ｓｙｋ関連の炎症状態が発達するリスクを有することを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
１９〜４９のヌクレオチドの長さを有し、かつヌクレオチドのセンス鎖、ヌクレオチドのアンチセンス鎖、および、少なくとも１９ヌクレオチドのほぼ完全な相補性領域を具える第２の干渉ＲＮＡを前記対象に投与するステップを更に具え、
前記第２の干渉ＲＮＡの前記アンチセンスが、
ヌクレオチド６４２、７８９、７９１、８６０、８６１、８６２、８６７、８６８、１００９、１２７３、１３９４、１４３６、１４７１、１４７２、１５３３、１５３５、１５４７、１６８０、１７３８、１７３９、１７６６、１８８０、１９４７、２０２２、２０３６、２３２８、２３２９、２４７３、２５０９、２５２０、２５２４、２５５８または２６１３を具える配列番号１に対応するｍＲＮＡと、
ヌクレオチド１００７、１６９８または１７６９を具える配列番号１に対応するｍＲＮＡと、
からなる群から選択されるｍＲＮＡの一部に、生理学的条件下で、ハイブリダイゼーションすることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヌクレオチドのセンス鎖および前記ヌクレオチドのアンチセンス鎖が、ループ状のヌクレオチドによって結合されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物が、エアロゾル、バックル、真皮、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、鼻、眼、口、耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮ルートで投与されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記干渉ＲＮＡが、この干渉ＲＮＡを発現可能な発現ベクタからインビボでの発現を介して投与されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の一本鎖干渉ＲＮＡと、製薬的に許容されるキャリアと、を具える組成物を対象に投与するステップを具え、
前記一本鎖干渉ＲＮＡが、
ヌクレオチド６４２、７８９、７９１、８６０、８６１、８６２、８６７、８６８、１００９、１２７３、１３９４、１４３６、１４７１、１４７２、１５３３、１５３５、１５４７、１６８０、１７３８、１７３９、１７６６、１８８０、１９４７、２０２２、２０３６、２３２８、２３２９、２４７３、２５０９、２５２０、２５２４、２５５８または２６１３を具える配列番号１に対応するｍＲＮＡと、
ヌクレオチド１００７、１６９８または１７６９を具える配列番号１に対応するｍＲＮＡと、
からなる群から選択されるｍＲＮＡの一部に、生理学的条件下で、ハイブリダイゼーションし、
前記干渉ＲＮＡが、配列番号１に対応したハイブリダイゼーションするｍＲＮＡの一部に少なくともほぼ完全な連続相補性領域を有し、
これにより、Ｓｙｋ  ｍＲＮＡの発現が減少することを特徴とする方法。
【請求項２８】
前記組成物は、エアロゾル、バックル、真皮、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、鼻、眼、口、耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮ルートで投与されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記干渉ＲＮＡが、この干渉ＲＮＡを発現可能な発現ベクタからインビボでの発現を介して投与されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記干渉ＲＮＡが、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの少なくとも一方であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
眼の炎症または結膜炎の治療を必要とする対象の眼の炎症または結膜炎の炎症を治療する方法であって、
ＲＮＡ干渉を介してＳｙｋ遺伝子の発現を下方調節する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を具える組成物を対象に投与するステップと、
ｓｉＲＮＡ分子の鎖の各々が、互いに独立に約１９〜２７ヌクレオチドの長さであり、
ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、Ｓｙｋ遺伝子に対応するｍＲＮＡに実質的な相補性を有するヌクレオチド配列を具え、ｓｉＲＮＡ分子が、ＲＮＡ干渉を介して前記ｍＲＮＡを開裂することを特徴とする方法。
【請求項３２】
前記組成物が、エアロゾル、バックル、真皮、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、鼻、眼、口、耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮ルートで投与されることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記干渉ＲＮＡが、この干渉ＲＮＡを発現可能な発現ベクタからインビボでの発現を介して投与されることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記干渉ＲＮＡが、ｍｉＲＮＡであることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｓｉＲＮＡ分子の各々が、互いに独立に、約１９〜２５の長さであるか、または、互いに独立に約１９〜２１ヌクレオチドの長さであることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、かつ配列番号２、配列番号１３〜４０、配列番号４４〜４７のいずれか１つに対応するヌクレオチド配列、あるいは、その相補体を具える干渉ＲＮＡと、製薬的に許容されるキャリアと、を具えることを特徴とする組成物。
【請求項３７】
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、かつ配列番号２、配列番号１３〜４０、配列番号４４〜４７のいずれか１つに対応するヌクレオチド配列、あるいは、その相補体からなる干渉ＲＮＡと、製薬的に許容されるキャリアと、を具えることを特徴とする組成物。
【請求項３８】
前記干渉ＲＮＡが、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの少なくとも１つを具えることを特徴とする請求項３６に記載の組成物。
【請求項３９】
前記干渉ＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの少なくとも１つを具えることを特徴とする請求項３７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２００６年４月１３日に出願された同時係属中の米国特許仮出願番号６０／７９１，８４７号の優先権を主張し、その内容は、参照することで本明細書に特別に組み込まれるものとする。
【０００２】
本発明は、脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）をサイレンシングし、Ｓｙｋ関連の炎症状態の治療に関する干渉ＲＮＡ組成物の分野に関する。このような症状は、例えば、アレルギ性結膜炎、眼の炎症、皮膚炎、鼻炎、喘息、アレルギ反応または肥満細胞疾患などを含む。
【背景技術】
【０００３】
アレルギ性結膜炎、眼の炎症、皮膚炎、鼻炎、喘息、アレルギ反応および肥満細胞疾患は、歴史的には、経口、経鼻または局所適用抗ヒスタミン剤療法、もしくは、経口または経鼻用ステロイド療法、アレルギ反応の場合はアレルゲン注入治療、で治療されてきた。全身の治療は、通常、必要な治療部位に有効量の濃度を提供するために、投与される薬剤化合物の濃度をより高くする必要がある。抗ヒスタミン化合物は、中枢神経系活性を有することで周知であり；眠気および粘液膜の乾燥は、抗ヒスタミン使用の一般的な副作用である。
【０００４】
ＩｇＥレセプタ（ＦｃεＲＩ）などの免疫レセプタを介したシグナルは、非レセプタ性チロシンキナーゼ、Ｓｙｋなどシグナルカスケードの複数の成分の補充および活性化を含む。Ｓｙｋ活性化は、ＰＬＣγおよびＰＩ３Ｋ経路を活性化し、最終的には肥満細胞の脱顆粒化し、活性化する。Ｓｙｋ  ｍＲＮＡをターゲティングすることでＳｙｋタンパクの濃度を減少させ、ＦｃεＲＩ経路を遮断される可能性がある。このような反応は、ＩｇＥを介した肥満細胞の脱顆粒化、ならびに、ヒスタミンおよび他の炎症誘発性伝達物質の放出を阻害する。
【０００５】
エアロゾル化したアンチセンスを用いた気道のアレルギ性炎症の抑制は、Ｓｔｅｔｏｎ，Ｇ．Ｒ．等（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１０２８−１０３６（２００２））によって報告されている。気管上皮細胞株のＨＳ−２４、および、卵アルブミン（ＯＡ）誘導喘息において、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）手段によるＳｙｋ発現の抑制が、誘導炎症反応に特徴的な発現を阻害するとされている（公開された国際特許出願ＷＯ２００５００７６２３）。ＦＣεＲ１ＡをターゲティングするショートヘアピンＲＮＡを用いて、ＩｇＥ生成に関与する遺伝子発現を阻害すること、喘息およびアレルギ性鼻炎などＩｇＥを介する疾患の治療は、公開された国際特許出願ＷＯ２００５０８５４４３に報告されている。これらのドキュメントは、本発明の干渉ＲＮＡを開示していない。
【特許文献１】国際特許公開公報ＷＯ２００５００７６２３
【特許文献２】国際特許公開公報ＷＯ２００５０８５４４３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
さらなる薬剤および治療方法が、全身抗ヒスタミン治療の副作用を回避しつつ、内因性肥満細胞脱顆粒の作用を阻害し、ヒスタミンおよび他の炎症誘発性伝達物質の放出を阻害するように、Ｓｙｋチロシンキナーゼをターゲティングするために必要とされる。本発明の実施例は、このような薬剤および治療方法に関する当分野の必要性を解決する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の実施例は、Ｓｙｋ関連の炎症状態の極めて強力で効果のある治療、予防または処置を提供することによって、先行技術の欠陥を解決する。一態様において、本発明の方法は、Ｓｙｋ  ｍＲＮＡの発現をサイレンスする干渉ＲＮＡを投与することによって、Ｓｙｋ関連の炎症状態またはＳｙｋ関連の炎症状態の発達のリスクを有する対象の治療を含み、ＰＬＣγおよびＰＩ３Ｋシグナル経路を妨げ、肥満細胞脱顆粒に関する事象のカスケードを阻害し、ヒスタミンの放出およびＳｙｋ関連炎症状態におけるその他の炎症誘発性伝達物質の放出を阻害する。
【０００８】
本発明は、Ｓｙｋ  ｍＲＮＡをターゲティングし、これによりＳｙｋ  ｍＲＮＡの発現を干渉する干渉ＲＮＡ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）に関する。本発明の干渉ＲＮＡは、Ｓｙｋ関連の症状またはＳｙｋ関連の症状が発達するリスクを有する患者の治療に有用である。
【０００９】
本発明の実施例は、対象のＳｙｋ  ｍＲＮＡの発現を減少させる方法であり、この方法は、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、製薬的に受容可能なキャリアと、を具える組成物を被験者に投与するステップを具える。Ｓｙｋ  ｍＲＮＡの発現は、これによって減少する。
【００１０】
本発明の他の実施例は、Ｓｙｋ関連の炎症状態の治療方法を必要とする対象のＳｙｋ関連の炎症状態を治療する方法である。この方法は、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、製薬的に許容されるキャリアと、を具える組成物を対象に投与するステップを具える。これにより、Ｓｙｋ関連の炎症状態が治療される。一実施例において、対象はヒトであり、ヒトはＳｙｋ関連の炎症状態を有し、他の実施例において、対象はヒトであり、ヒトはＳｙｋ関連の炎症状態が発達するリスクを有する。
【００１１】
上述の実施例に関して、干渉ＲＮＡは、配列番号２、配列番号１３〜４０および配列番号４４〜４７のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端のペナルチメート１３ヌクレオチドと、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３の連続ヌクレオチド領域を具える。
【００１２】
上述の方法のさらなる実施例において、本発明の組成物は、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、かつ配列番号２、配列番号１３〜４０および配列番号４４〜４７のいずれか１つに対応する第２のｍＲＮＡの３’末端のペナルチメート１３ヌクレオチドと少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３ヌクレオチドの領域を具える第２の干渉ＲＮＡを具える。
【００１３】
本発明の他の実施例において、対象のＳｙｋ  ｍＲＮＡの発現を減少させる方法は、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、製薬的に許容されるキャリアと、を具える組成物を対象に投与するステップを具え、干渉ＲＮＡは、ヌクレオチドセンス鎖、ヌクレオチドアンチセンス鎖および少なくともほぼ完全な連続相補性１９ヌクレオチドの領域、を具え、この領域では、アンチセンス鎖が、生理学的条件下で、ヌクレオチド６４２、７８９、７９１、８６０、８６１、８６２、８６７、８６８、１００９、１２７３、１３９４、１４３６、１４７１、１４７２、１５３３、１５３５、１５４７、１６８０、１７３８、１７３９、１７６６、１８８０、１９４７、２０２２、２０３６、２３２８、２３２９、２４７３、２５０９、２５２０、２５２４、２５５８または２６１３を具える配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部に対してハイブリダイズする。これにより、Ｓｙｋ  ｍＲＮＡの発現が減少される。さらなる実施例において、本発明の組成物は、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡを具え、ここで、生物学的条件下で、ヌクレオチド１００７、１６９８または１７６９を具える配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部にアンチセンス鎖がハイブリダイズする。一実施例において、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド１００７、１６９８または１７６９で始まる配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部にハイブリダイズし、アンチセンス鎖は１９または２０ヌクレオチドの長さである。
【００１４】
Ｓｙｋ関連炎症状態の治療を必要とする対象のＳｙｋ関連炎症状態を治療する方法は、本発明の実施例であり、方法は、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、製薬的に許容されるキャリアを具える組成物を対象に投与するステップを具え、干渉ＲＮＡは、センス鎖ヌクレオチド、アンチセンス鎖ヌクレオチド、および、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続相補性領域を具え、アンチセンス鎖は、生理学的条件下で、ヌクレオチド６４２、７８９、７９１、８６０、８６１、８６２、８６７、８６８、１００９、１２７３、１３９４、１４３６、１４７１、１４７２、１５３３、１５３５、１５４７、１６８０、１７３８、１７３９、１７６６、１８８０、１９４７、２０２２、２０３６、２３２８、２３２９、２４７３、２５０９、２５２０、２５２４、２５５８または２６１３を具える配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部にハイブリダイズする。Ｓｙｋ関連炎症状態は、これにより治療される。さらなる実施例において、本発明の組成物は、１９〜４９ヌクレオチド長さを有する有効量の干渉ＲＮＡを具え、アンチセンス鎖は、生理学的条件下で、ヌクレオチド１００７、１６９８または１７６９を具える配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部にハイブリダイズする。一実施例において、アンチセンス鎖は、１００７、１６９８または１７６９で始まる配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部にハイブリダイズし、アンチセンス鎖は、１９または２０ヌクレオチドの長さである。
【００１５】
さらに、１９〜４９ヌクレオチド長さを有する第２の干渉ＲＮＡを対象に投与可能であり；第２の干渉ＲＮＡは、センス鎖ヌクレオチド、アンチセンス鎖ヌクレオチド、および、少なくともほぼ完全に相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を具え、干渉ＲＮＡは、センス鎖ヌクレオチド、アンチセンス鎖ヌクレオチド、および、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続相補性領域を具え、第２の干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、生理学的条件下で、ヌクレオチド６４２、７８９、７９１、８６０、８６１、８６２、８６７、８６８、１００９、１２７３、１３９４、１４３６、１４７１、１４７２、１５３３、１５３５、１５４７、１６８０、１７３８、１７３９、１７６６、１８８０、１９４７、２０２２、２０３６、２３２８、２３２９、２４７３、２５０９、２５２０、２５２４、２５５８または２６１３を具える配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部にハイブリダイズする。第２の干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、生理学的条件下で、ヌクレオチド１００７、１６９８または１７６９を具える配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部にハイブリダイズする。一実施例において、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド１００７、１６９８または１７６９で始まる配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部にハイブリダイズし、このアンチセンス鎖は、１９または２０ヌクレオチドの長さである。
【００１６】
本発明のさらなる実施例である、対象のＳｙｋ  ｍＲＮＡの発現を減少させる方法が、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の一本鎖干渉ＲＮＡと、製薬的に許容可能なキャリアと、を具える組成物を対象に投与するステップを具え、一本鎖干渉ＲＮＡは、生理学的条件下で、上記のヌクレオチドを具える配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部にハイブリダイズする。
【００１７】
本発明は、さらなる実施例として、１９〜４９のヌクレオチドの長さを有し、配列番号２、配列番号１３〜４０および配列番号４４〜４７またはこれらの相補配列のいずれか１つに対応するヌクレオチド配列を具える干渉ＲＮＡと、製薬的に許容可能なキャリアと、を含む組成物を具える。１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、配列番号４１〜４７またはこれらの相補配列のいずれか１つに対応するヌクレオチド配列を具える干渉ＲＮＡと、製薬的に許容可能なキャリアと、を含む組成物は、本発明のさらなる実施例である。
【００１８】
眼の炎症または結膜炎の治療を必要とする対象の眼の炎症または結膜炎を治療する方法は、本発明の一実施例である。本発明は、ＲＮＡ干渉を介してＳｙｋ遺伝子の発現を下方調節する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を具える組成物を対象に投与するステップを具え、ｓｉＲＮＡ分子の各々の鎖は、互いに独立に、１９〜２７ヌクレオチドの長さであり、一本鎖のｓｉＲＮＡ分子は、Ｓｙｋ遺伝子に対応するｍＲＮＡに実質的に相補的であるヌクレオチド配列を有し、ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡ干渉を介してこのｍＲＮＡの開裂（ｃｌｅａｖｅｇｅ）する。この方法のさらなる実施例において、ｓｉＲＮＡ分子の各々の鎖は、互いに独立に、約１９〜２５ヌクレオチドの長さであるか、約１９〜２１ヌクレオチドの長さである。
【００１９】
本明細書に記載されているＳｙｋ  ｍＲＮＡの発現を減少させる医薬の調製において、本明細書に記載されるいずれかの実施例の使用も、本発明の実施例である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
例示的な手順または本明細書に記載される説明に対するその他の細かな補足説明を提供する範囲にわたり、本発明に引用される参考文献は、参照することによって組み込まれる。
【００２１】
本発明の開示の範囲において、当分野の当業者であれば、本明細書に開示される実施例の明らかな修正が、本発明の精神および範囲を逸脱することなく行われることを理解されたい。本明細書に開示される実施例の全ては、本明細書に開示される範囲における不適当な実験なしで行われ、実施される。本発明の全範囲は、開示およびこれと同等の実施例において規定される。本明細書は、本発明を包含する保護される全範囲を不当に狭めるように解釈されるべきではない。
【００２２】
特別に指定のない限り、本明細書で使用されるとき、１つの（「ａ」および「ａｎ」）は、「１つ」、「少なくとも１つ」または「１又はそれ以上」を意味する。
【００２３】
本明細書に使用される「Ｓｙｋ関連炎症状態」という用語は、アレルギ性結膜炎、眼の炎症、皮膚炎、鼻炎、喘息、アレルギ、および、肥満細胞疾患などの症状を含む、ヒスタミンおよび炎症誘発性応答を含み、Ｓｙｋ関連炎症状態を直接または間接的に引き起こすＳｙｋ−ｍＲＮＡの発現に由来する細胞変化を含む。本明細書に示される干渉ＲＮＡは、非特異的な薬剤による望まない副作用を避けつつ、サイレンシングなどを提供する。
【００２４】
本明細書に使用される用語「アレルギ性結膜炎」は、結膜の炎症を意味し、結膜は、繊細な膜であり、まぶたを裏打ちし、強膜（ｓｃｌｅｒａ）の暴露された表面を覆う。用語「アレルギ性結膜炎」は、例えば、アトピ性角結膜炎、巨大乳糖結膜炎、枯草熱結膜炎、通年性アレルギ結膜炎、および、春季角結膜炎などを含む。
【００２５】
本明細書に使用される用語「皮膚炎」は、皮膚の炎症を意味し、例えば、アレルギ性接触皮膚炎、皮脂欠乏症皮膚炎（下脚のドライスキン）、アトピ性皮膚炎、セルカリア皮膚炎、刺激源接触皮膚炎およびウルシオール誘導性接触皮膚炎などの接触皮膚炎、ヘルペス性皮膚炎、発汗異常皮膚炎、湿疹、重力性（ｇｒａｖｉｔａｔｉｏｎａｌ）皮膚炎、感染性皮膚炎、貨幣状皮膚炎、外耳炎、口周囲皮膚炎、シュードモナス皮膚炎（ホットタブ発疹）および脂漏皮膚炎を含む。
【００２６】
本明細書に使用される用語「鼻炎」は、鼻粘膜の炎症を意味し、例えば、アレルギ性鼻炎、アトピ性鼻炎、感染性鼻炎、刺激性鼻炎、エオシン好性の非アレルギ鼻炎、薬物性鼻炎、好中球の鼻副鼻腔炎を含む。
【００２７】
本明細書に使用される用語「喘息」は、口や鼻から肺まで空気を輸送する気道が狭くなる気道の炎症を意味し、例えば、アレルギ性喘息、アトピ性喘息、アトピ性ＩｇＥ気管支喘息、気管支喘息、細気管支炎、気腫喘息、実質的喘息、運動誘発性喘息、環境因子によって生じる外因性喘息、初期の喘息、病態生理学的妨害によって生じる内因性喘息、非アレルギ性鼻炎および喘鳴小児症候群を含む。
【００２８】
本明細書に使用される用語「アレルギ」は、通常有害ではない物質に対する免疫システムの異常反応を意味し、例えば、アトピ性皮膚炎、発疹および血管浮腫など肌アレルギ；アレルギ性鼻炎、および、ほこりやカビに対する反応など呼吸アレルギ；牛乳、卵白、ピーナッツ、小麦、大豆、ベリー、貝、コーン、豆、黄色食用色素Ｎｏ．５およびアラビアゴムなどのタンパク質に対する反応などの食物アレルギ；ペニシリン、スルファニルアミド剤、バルビツール剤、抗けいれん剤、インスリン、局所麻酔および造影剤に反応する薬剤アレルギ；蜂、スズメバチ（ｗａｓｐ、ｈｏｒｎｅｔ、ｙｅｌｌｏｗ  ｊａｃｋｅｔ）およびカミアリの毒針の毒に対する反応など虫刺されによるアレルギ；である。
【００２９】
本明細書に使用される用語「肥満細胞疾患」は、組織中の肥満細胞蓄積によって特徴付けられる肥満細胞を意味する。このような蓄積は、骨髄、肌、消化管、肝臓および脾臓など組織に影響を与える可能性がある。医師は、肌以外の身体の部分において肥満細胞を発見することによって、全身の肥満細胞症と診断し、通常、抗ヒスタミン剤で治療する。
【００３０】
フレーズ「（配列番号）のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端のペナルチメート１３ヌクレオチドと、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３の連続するヌクレオチドの領域」は、１つのヌクレオチドの置換が可能である。２つのヌクレオチドの置換（すなわち１１／１３＝８５％の同一性／相補性）は、このようなフレーズに含まれない。
【００３１】
「ハイブリダイゼーション」は、塩基配列と相補的またはほぼ相補的な一本鎖の核酸が、ハイブリッドと呼ばれる水素結合した複合体を形成するように接触する工程を意味する。ハイブリダイゼーション反応は、敏感であり、選択性がある。インビトロでは、ハイブリダイゼーションの特異性（すなわち、ストリンジェンシー（厳密性））は、例えば、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション溶液における塩またはホルムアミドの濃度によって、および、ハイブリダイゼーション温度によって制御され、このような工程は、当分野において周知である。特に、ストリンジェンシーは、塩の濃度を減少すること、ホルムアミドの濃度を上昇させること、ハイブリダイゼーション温度を上げることによって、向上される。
【００３２】
本明細書に使用されるように、用語「同一性の割合（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、第２の核酸分子と長さが同じ連続ヌクレオチドセットと同一の第１の核酸分子の連続ヌクレオチドの割合を示す。用語「相補性の割合（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）」は、第２の核酸分子中の連続ヌクレオチドセットと、ワトソン−クリックのセンス鎖においてベースペアを形成する第１の核酸分子における連続ヌクレオチドの割合を示す。
【００３３】
ｍＲＮＡの発現を減少させる：本明細書に使用されるように、フレーズ「ｍＲＮＡの発現を減少させる」は、ある量の干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を投与または発現させ、ｍＲＮＡの開裂または翻訳を直接阻害することによって、ターゲットｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を減少させる。ターゲットｍＲＮＡの発現または対応するタンパク質の減少は、一般的に「ノックダウン」と呼ばれ、コントロールの非ターゲットＲＮＡ（例えば、コントロールの非ターゲティングｓｉＲＮＡ）の投与または発現後、示される濃度に対して報告される。５０〜１００％の量の発現のノックダウンは、本明細書の実施例によって予測される。しかしながら、このようなノックダウンレベルは、本発明の目的を達成するために必須ではない。一実施例において、Ｓｙｋ  ｍＲＮＡをターゲティングするシングル干渉ＲＮＡが投与される。他の実施例において、Ｓｙｋ  ｍＲＮＡをターゲティングする２又はそれ以上の干渉ＲＮＡが投与される。
【００３４】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的、又は、ほぼ相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸が、ハイブリッドと呼ばれる水素結合複合体を形成する工程を意味する。ハイブリダイゼーション反応は、敏感であり選択的である。インビトロにおいて、ハイブリダイゼーションの特異性（ストリンジェンシー）は、例えば、プレハイブリダイゼーション溶液およびハイブリダイゼーション溶液の塩またはホルムアミドの濃度によって、および、ハイブリダイゼーション温度によって制御され、このような工程は、当分野において周知である。特に、塩濃度を低下させるか、ホルムアミドの濃度を増加させるか、または、ハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによって、ストリンジェンシーは増大される。
【００３５】
例えば、高ストリンジェンシー状態は、３７〜４２℃で約５０％のホルムアミドで生じる可能性がある。低減されたストリンジェンシー状態は、３０〜３５度で約３５〜２５ホルムアミドで生じる。ハイブリダイゼーションに対するストリンジェンシー状態の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーのさらなる例は、４００ｍＭ  ＮａＣｌ，４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１２〜１６時間、その後７０℃で０．３ＸＳＳＣで洗浄、または、４ＸＳＳＣ、７０℃又は４ＸＳＳＣ、５０℃、５０％ホルムアミド中でハイブリダイゼーションし、その後、１ＸＳＳＣで６７℃で洗浄する。ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低く、以下の計算を用いて、Ｔｍは、１９〜４９塩基対長さのハイブリッドについて決定される：Ｔｍ°Ｃ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋]）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、ここでＮは、ハイブリッドの塩基の数、および、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーションバッファ中のナトリウムイオン濃度である。
【００３６】
ノックダウンは、定量ポリメラーゼ鎖反応（ｑＰＣＲ）増幅、ウェスタンブロッティングまたは酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）を用いて、ｍＲＮＡ濃度を測定することによって、通常、評価される。タンパク質濃度を分析することによって、ｍＲＮＡの開裂および翻訳阻害の両方を評価できる。ノックダウンを測定するさらなる技術は、ＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、マイクロアレイを用いた遺伝子発現のモニタリング、抗体結合、放射性免疫アッセイ、および、蛍光活性化細胞分析を含む。
【００３７】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、この工程によって二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が遺伝子発現をサイレンシングするために使用される工程である。理論により拘束されないが、ＲＮＡｉは、ＲＮａｓｅＩＩＩ様酵素であるダイサーによって、比較的に長いｄｓＲＮＡを短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へと開裂するとともに開始する。ＳｉＲＮＡは、通常、長さが約１９〜２８ヌクレオチド、あるいは、２０〜２５ヌクレオチド、２１〜２２ヌクレオチドであり、また２−ヌクレオチド３’突出部（オーバーハング）、ならびに、５’リン酸塩末端および３’ヒドロキシル基末端を含むｄｓＲＮＡである。ｓｉＲＮＡの一本鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として周知なリボヌクレオタンパク質複合体に組み込まれる。ＲＩＳＣは、組み込まれるｓｉＲＮＡ鎖に少なくとも部分的に相補的であるｍＲＮＡ分子を同定するために、ｓｉＲＮＡ鎖を使用し、次いで、ターゲットＲＮＡを開裂するか、あるいは、その翻訳を阻害する。従って、ＲＩＳＣに組み込まれるｓｉＲＮＡ鎖は、ガイド鎖またはアンチセンス鎖として周知である。パッセンジャー鎖またはセンス鎖として周知である他のｓｉＲＮＡ鎖は、ｓｉＲＮＡから除去され、このｓｉＲＮＡ鎖は、ターゲットｍＲＮＡに対して少なくとも部分的に相同性がある。当分野の当業者であれば、原則として、ｓｉＲＮＡのいずれかの鎖が、ＲＩＳＣに組み込まれ、ガイド鎖として機能することが出来ることを理解されたい。しかしながら、ｓｉＲＮＡ設計（例えば、アンチセンス鎖の５’末端のｓｉＲＮＡデュプレックスの安定性の減少など）は、アンチセンス鎖をＲＩＳＣに組み込まれることが望ましい。
【００３８】
ガイド鎖に少なくとも部分的に相補的な配列を有するｍＲＮＡのＲＩＳＣを介した開裂は、ｍＲＮＡと、このｍＲＮＡによってコード化される対応するタンパク質と、の安定状態の濃度を低下させる。代替として、ＲＩＳＣは、ターゲットｍＲＮＡを開裂せずに、翻訳阻止を介して対応するタンパク質の発現を減少させることもできる。さらに、他のＲＮＡ分子およびＲＮＡ様分子は、ＲＩＳＣと相互作用し、遺伝子発現をサイレンシングすることができる。ＲＩＳＣと相互作用するその他のＲＮＡ分子の例は、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、一本鎖ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および、ダイサー−基質２７マーのデュプレックスを含む。本明細書に使用される用語「ｓｉＲＮＡ」は、特段の指定がない限り、二本鎖干渉ＲＮＡを意味する。ＲＩＳＣと相互作用するＲＮＡ様分子の例は、１又はそれ以上の化学的に修飾されたヌクレオチドを含むＲＮＡ分子、１又はそれ以上のデオキシリボヌクレオチド、および／または、１又はそれ以上の非ホスホジエステル結合を含む。本明細書の開示の目的に関し、ＲＩＳＣと相互作用し、ＲＩＳＣを介した遺伝子発現の変化に加わることが可能なＲＮＡまたはＲＮＡ様分子の全てが、「干渉ＲＮＡ」として呼ばれる。従って、ＳｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびダイサー基質２７マーのデュプレックスは、「干渉ＲＮＡ」のサブセットである。
【００３９】
本発明の実施例の干渉ＲＮＡは、触媒のように、ターゲットｍＲＮＡの開裂に作用し、すなわち、干渉ＲＮＡは、準化学量論的な量のターゲットｍＲＮＡの阻害に効果を有する可能性がある。アンチセンス治療と比較すると、このような開裂条件下で治療効果を与えるのに必要とされる干渉ＲＮＡは相当少ない。
【００４０】
本発明は、Ｓｙｋ  ｍＲＮＡ、非レセプタチロシンキナーゼの発現を阻害する干渉ＲＮＡの使用に関する。ＩｇＥレセプタ（ＦｃεＲＩ）などの免疫応答を介したシグナリングは、Ｓｙｋなどのシグナリングカスケードの複数の成分を補充して活性化することを含む。Ｓｙｋ活性化は、ＰＣＬγおよびＰＩ３Ｋ経路を活性化し、肥満細胞の脱顆粒化および活性化を引き起こす。本明細書に示されるようにＳｙｋ  ｍＲＮＡをターゲティングすることによって、Ｓｙｋタンパク質の濃度を低下させ、ＦｃεＲＩ経路を阻害する。このような作用は、ＩｇＥを介した肥満細胞の脱顆粒化を阻害し、ヒスタミンおよび他の炎症誘発性伝達物質の放出を阻害する。本発明によれば、外因的に付与されるか、または外因的に発現される干渉ＲＮＡは、Ｓｙｋ  ｍＲＮＡをスライシングするのに部分的に効果的である。
【００４１】
本明細書に引用される核酸配列は、特段の指定のない限り、５’から３’方向へと記載される。本明細書に使用される用語「核酸」は、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味するか、あるいは、ＤＮＡ（アデニン「Ａ」、シトシン「Ｃ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」）またはＲＮＡ（アデニン「Ａ」、シトシン「Ｃ」、グアニン「Ｇ」、ウラシル「Ｕ」）中のプリン塩基またはピリミジン塩基を具えるＤＮＡまたはＲＮＡの修飾された形態、を意味する。本明細書に記載される干渉ＲＮＡは、「Ｔ」塩基は天然ではＲＮＡ中に生じないが、特に、３’末端に「Ｔ」塩基を具えてもよい。「核酸」は、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」を含み、一本鎖分子または二本鎖分子を意味することがある。二本鎖分子は、アデニン塩基とチミン塩基との間、シトシンとグアニンとの間、およびアデニンとウラシルとの間のワトソン−クリックの塩基対によって形成される。二本鎖分子の鎖は、互いに対して、部分的に、実質的に、または完全に相補的であってもよく、二本鎖ハイブリッドを形成し、その結合の強度は、性質および塩基配列の相補性の度合に対応する。
【００４２】
ｍＲＮＡ配列は、対応するＤＮＡ配列から容易に推定される。例えば、配列番号１は、ＳｙｋのｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列を提供する。このｍＲＮＡ配列は、「Ｔ」塩基を「Ｕ」塩基で置換したＤＮＡセンス鎖と同一である。従って、ｍＲＮＡ配列は、配列番号１から得られる。
【００４３】
脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｋｙ）ｍＲＮＡ：ジーンバンクデータベースは、アクセス番号ＮＭ＿００３１７７として、ＳｙｋのＤＮＡ配列を提供し、配列番号１として「配列リスト」に提供される。配列番号１は、Ｓｙｋをコード化したｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列を提供する（「Ｕ」塩基に代わる「Ｔ」塩基の除く）。Ｓｙｋのコード化配列は、１４８〜２０５５ヌクレオチドである。
【００４４】
上記の引用されたＳｙｋ  ｍＲＮＡ配列に同等のものは、選択的スプライスフォーム、対立形質、アイソザイム、または、これらと同族（ｃｏｇｎａｔｅ）のものである。同族は、配列番号１に相同（すなわち、オルソログ）な別の哺乳類からの脾臓チロシンキナーゼｍＲＮＡである。配列番号１に関するＳｙｋ核酸配列は、ジーンバンクアクセス番号ＢＣ００１６４５，ＢＣ００２９６２，Ｌ２８８２４，Ｘ７３５６８，ＢＣ０１１３９９およびＺ２９６３０を含む。
【００４５】
Ｓｙｋ阻害は、さらに、インビトロで、免疫学的に攻撃された以下の肥満細胞におけるヒスタミン放出をモニタリングすることによって決定される。単分散ヒト肥満細胞の調製が、免疫学的活性化に基づいて炎症誘発性伝達物質を放出させる。活性化の度合は、抗原または抗ヒトＩｇＥを用いた細胞の刺激に際し、培養上澄み液に放出されたヒスタミンの定量化によって決定される。（Ｍｉｌｌｅｒ他、Ｏｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｎｆｌａｍｍ．４：３９−４９，２００６参照）。Ｓｙｋをターゲティングする干渉ＲＮＡをトランスフェクションした肥満細胞の免疫学的攻撃は、非トランスフェクションの肥満細胞、または、非ターゲティングのコントロール干渉ＲＮＡをトランスフェクションした肥満細胞の免疫攻撃に観察されるよりも、ヒスタミン放出は大幅に少ない結果となる。
【００４６】
さらに、Ｓｙｋの阻害は、ヒト結膜組織肥満細胞またはＬＡＤ２肥満細胞を用いたインビトロでのＩｇＥを介したヒスタミン放出を試験することによって決定される。ヒト結膜組織の肥満細胞は、例えば、米国特許第５，３６０，７２０号に概説されている方法論を用いて得られる。ＬＡＤ２肥満細胞は、メリーランド州ベセスダの米国国立衛生研究所アレルギ疾患研究室からライセンス許可を得た（Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ．２００３  Ａｕｇ．２７（８）：６７７−８２）。概略すると、ヒト結膜組織肥満細胞は、ヒト結膜組織から酵素的に放出され、次いで、ＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）クッションに亘って密度遠心分離によって部分的に濃縮される。単分散細胞懸濁液は、最終的なペレットから得られ、これらの細胞は、ヒスタミン放出アッセイ用に使用される。肥満細胞脱顆粒化および上澄みへのヒスタミン放出の引き金を引く抗ヒトＩｇＥ刺激の７２時間前に、細胞に、Ｓｙｋ干渉ＲＮＡまたはコントロールのＲＮＡをトランスフェクションする。ヒスタミンは、次いで、ＲＩＡ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＥＩＡ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、または当業者に周知な方法によって、上澄み中で測定される。コントロールのトランスフェクション細胞または非トランスフェション細胞に対してＳｙｋ干渉ＲＮＡをトランスフェクションした細胞におけるヒスタミン放出の減少は、干渉ＲＮＡが、Ｓｙｋを効果的に減少させ、ＦｃｅＲＩシグナル経路を阻害することを示唆する。
【００４７】
ＬＡＤ２肥満細胞株は、レセプタに結合したＩｇＥに結合し、脱顆粒をトリガーする抗ヒトＩｇＥで刺激するまえに、ヒトＩｇＥミエローマで受動的に感作させる以外に、ほぼ同様に使用される。
【００４８】
Ｓｙｋの阻害は、さらに、アレルギ性結膜炎、眼の炎症、皮膚炎、鼻炎、喘息、アレルギまたは肥満症疾患などのＳｙｋ関連症状の兆候の改善を観察することによって、ヒトまたは哺乳類において推定される。例えば、浮腫、かゆみ、炎症、または環境的攻撃への耐性などの改善は、Ｓｙｋ阻害の指標である。
【００４９】
干渉ＲＮＡ：本発明の一実施例において、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、センス鎖およびアンチセンス鎖を有し、センス鎖およびアンチセンス鎖は、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続相補性領域を具える。さらに本発明の実施例において、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、センス鎖およびアンチセンス鎖を有し、アンチセンス鎖は、Ｓｙｋ  ｍＲＮＡのターゲット配列に対して少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続相補性領域を具え、センス鎖は、Ｓｙｋ  ｍＲＮＡのターゲット配列と少なくとも１９ヌクレオチドが少なくともほぼ完全に同一である連続領域を具える。本発明のさらなる実施例においては、干渉ＲＮＡは、ｍＲＮＡ内の対応するターゲット領域の３’末端のペナルチメート１３、１４、１５、１６、１７または１８ヌクレオチドに対するある割合の配列相補性、または、ある割合の配列同一性を有する少なくとも１３、１４、１５、１６、１７または１８の連続ヌクレオチドの領域、を具える。
【００５０】
干渉ＲＮＡ鎖の各々の長さは、１９〜４９ヌクレオチドを具えてもよく、１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８または４９ヌクレオチドの長さを具えてもよい。
【００５１】
ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖はＲＩＳＣに組み込まれるという点でｓｉＲＮＡの誘導活性因子であり、従って、ＲＩＳＣが、開裂または翻訳阻止のために、アンチセンスｓｉＲＮＡに少なくとも部分的に相補的であるターゲットｍＲＮＡを特定することができる。
【００５２】
本発明の実施例において、ターゲットｍＲＮＡ配列内の干渉ＲＮＡターゲット配列（例えば、ｓｉＲＮＡターゲット配列）は、入手可能な設計ツールを用いて選択される。Ｓｙｋターゲット配列に対応する干渉ＲＮＡは、次いで、ターゲットｍＲＮＡを発現する細胞のトランスフェクションによって試験され、上述したようにノックダウンが評価される。
【００５３】
ｓｉＲＮＡのターゲット配列を選択する技術は、ロックフェラー大学のウェブサイトから入手可能な、２００４年５月６日に改訂されたＴｕｓｃｈｌ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．「ｓｉＲＮＡユーザガイド」；Ａｍｂｉｏｎ社のウェブサイトの技術会報＃５０６「ｓｉＲＮＡ設計ガイダンス」Ａｍｂｉｏｎ社；および、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＧｅｎｓｃｒｉｐｔまたはＰｒｏｌｉｇｏのウェブサイトでその他のウェブベースの設計ツール；によって提供される。初期のサーチパラメータは、３５〜５５％のＧ／Ｃ含有量と、１９〜２７ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ長さと、を含む。ターゲット配列は、コード化領域に配置されてもよく、ｍＲＮＡの５’または３’の未翻訳領域に配置されてもよい。
【００５４】
Ｓｙｋ  ｍＲＮＡに対する１９ヌクレオチドのＤＮＡターゲット配列の実施例は、配列番号１のヌクレオチド７８９〜８０７である：
５’−ＧＣＡＣＴＡＴＣＧＣＡＴＣＧＡＣＡＡ−３’            配列番号２
配列番号２に対応するｍＲＮＡ配列をターゲティングし、２１ヌクレオチド鎖および２−ヌクレオチド３’突出部を有するする本発明のｓｉＲＮＡは；
５’−ＧＣＡＣＵＡＵＣＧＣＡＵＣＧＡＣＡＡＡＮＮ−３’  配列番号３
３’−ＮＮＣＧＵＧＡＵＡＧＣＧＵＡＧＣＵＧＵＵＵ  −５’    配列番号４
である。各「Ｎ」残基は、いずれかのヌクレオチド（Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｕ，Ｔ）または修飾されたヌクレオチドでもよい。３’末端は、１、２、３、４、５および６を含む多くの「Ｎ」残基を有し得る。各鎖のこれらの「Ｎ」残基は、同一の残基（例えば、ＵＵ，ＡＡ，ＣＣ，ＧＧまたはＴＴ）、あるいは、異なる残基（例えば、ＡＣ，ＡＧ，ＡＵ，ＣＡ，ＣＧ，ＣＵ，ＧＡ，ＧＣ，ＧＵ，ＵＡ，ＵＣまたはＵＧ）でもよい。３’突出部は、同一または異なっていてもよい。一実施例において、２つの鎖は、３’ＵＵ突出部である。
【００５５】
配列番号２に対応するｍＲＮＡ配列をターゲティングし、各々の鎖が２１ヌクレオチド鎖および３’ＵＵ突出部を有する本発明のｓｉＲＮＡは：
５’−ＧＣＡＣＵＡＵＣＧＣＡＵＣＧＡＣＡＡＡＵＵ−３’  配列番号５
３’−ＵＵＣＧＵＧＡＵＡＧＣＧＵＡＧＣＵＧＵＵＵ  −５’    配列番号６
である。
【００５６】
干渉ＲＮＡは、さらに、ヌクレオチドの５’突出部を有するか、あるいは、平滑末端を有してもよい。配列番号２に対応するｍＲＮＡ配列をターゲティングし、１９ヌクレオチド鎖および平滑末端を有する本発明のｓｉＲＮＡは：
５’−ＧＣＡＣＵＡＵＣＧＣＡＵＣＧＡＣＡＡＡ−３’  配列番号７
３’−ＣＧＵＧＡＵＡＧＣＧＵＡＧＣＵＧＵＵＵ−５’  配列番号８
である。
【００５７】
二本鎖干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の鎖は、ヘアピンまたはステムループ構造（例えば、ｓｈＲＮＡ）を形成する。配列番号２に対応するｍＲＮＡ配列をターゲティングし、１９塩基対の二本鎖ステム領域および３’ＵＵ突出部を有する本発明のｓｈＲＮＡは：
2009533475.tif 000003
である。Ｎは、ヌクレオチドＡ，Ｔ，Ｃ，Ｇ，Ｕまたは当業者に周知な修飾された形態である。ループ中のヌクレオチドＮの数は、３〜２３、５〜１５、７〜１３、４〜９または９〜１１の間の数であるか、あるいは、ヌクレオチドＮの数は９である。ループ中のヌクレオチドのいくつかは、ループ中の他のヌクレオチドと相互作用する塩基対を含むことができる。ループを形成するために使用可能なオリゴヌクレオチド配列の例は、５’−ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ−３’（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９６：５５０）および５’−ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ−３’（Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＲＮＡ８：１４５４）を含む。当分野の当業者であれば、得られた一本鎖のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ機構と相互作用可能な二本鎖領域を具えるステムループまたはヘアピン構造を形成することを理解されたい。
【００５８】
上述の特定されたｓｉＲＮＡターゲット配列は、３’末端で伸長可能であり、ダイサー−基質２７マーのデュプレックスの設計を容易にする。Ｓｙｋ  ＤＮＡ配列（配列番号１）において同定される１９ヌクレオチドＤＮＡターゲット配列（配列番号２）を６ヌクレオチド伸長することによって、配列番号１のヌクレオチド７８９〜８１３にある２５ヌクレオチドＤＮＡターゲット配列を得る：
５’−ＧＣＡＣＴＡＴＣＧＣＡＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＧ−３’  配列番号１０
配列番号１０に対応するｍＲＮＡ配列をターゲティングする本発明のダイサー−基質２７マーのデュプレックスは、
５’−ＧＣＡＣＵＡＵＣＧＣＡＵＣＧＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＧ−３’配列番号１１
３’−ＵＵＣＧＵＧＡＵＡＧＣＧＵＡＧＣＵＧＵＵＵＣＵＧＵＵＣ−５’配列番号１２
である。センス鎖の３’末端の２つのヌクレオチド（すなわち、配列番号１１のＡＧヌクレオチド）は、エンハンスプロセス用のデオキシヌクレオチドでもよい。本明細書に記載されるように、１９−２１ヌクレオチドターゲット配列からのダイサー−基質２７マーのデュプレックスの設計は、さらに、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）のウェブサイトおよびＫｉｍ，Ｄ．−Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：２；２２２−２２６（Ｆｅｂｒｕａｒｙ，２００５）で検討されている。
【００５９】
干渉ＲＮＡは化学合成によって生成されるときに、一方または双方（存在する場合）の鎖の５’末端でのヌクレオチドの５’位置のリン酸化は、必須ではないが、リン酸化が細胞間で生じるので、ｓｉＲＮＡ効率および結合したＲＩＳＣ複合体の特異性を促進する。
【００６０】
さらに、対象のＳｙｋ  ｍＲＮＡを減少させる方法は、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）と、製薬的に許容されるキャリアと、を具える組成物を対象に投与するステップを具え、前記干渉ＲＮＡは、
配列番号２および配列番号１３〜４０のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端のペナルチメート１３ヌクレオチドに対して少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３の連続ヌクレオチドの領域と、
配列番号２、配列番号１３〜４０および配列番号４４〜４７のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端のペナルチメート１４ヌクレオチドに対して少なくとも８５％の配列相補性または少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４の連続ヌクレオチドの領域と、
配列番号２、配列番号１３〜４０および配列番号４４〜４７のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端のペナルチメート１５、１６、１７または１８ヌクレオチドの各々に対して少なくとも８０％の配列相補性または少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５、１６、１７または１８の連続ヌクレオチド領域と、
からなる群から選択される領域を具え、
これによって、Ｓｙｋ  ｍＲＮＡの発現を減少させることが、本明細書に開示されている。
【００６１】
Ｓｙｋ関連の炎症状態の治療を必要とする対象のＳｙｋ関連の炎症状態の治療方法は、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと製薬的に許容されるキャリアとを具える成分を対象に投与するステップを具え、
前記干渉ＲＮＡは、
配列番号２、配列番号１３〜４０および配列番号４４〜４７のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端のペナルチメート１３ヌクレオチドに対して少なくとも９０％配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３の連続ヌクレオチドの領域と、
配列番号２、配列番号１３〜４０に対応するｍＲＮＡの３’末端のペナルチメート１４ヌクレオチドに対して少なくとも８５％の配列相補性または少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４の連続ヌクレオチドの領域と、
配列番号２、配列番号１４〜４０および配列番号４４〜４７のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端に対応して各々、少なくとも８０％の配列相補性および少なくとも８０％の配列相補性および少なくともの配列同一性を有する少なくとも１５、１６、１７または１８の連続ヌクレオチドの領域と、  
からなる群から選択される領域を具え、
これにより、Ｓｙｋ関連炎症状態が治療されることが、開示されている。
【００６２】
さらなる実施例は、対象のＳｙｋ  ｍＲＮＡの発現を減少させる方法を具え、この方法は、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、製薬的に許容されるキャリアと、を具える組成物を対象に投与するステップを具え、前記干渉ＲＮＡは、
ヌクレオチドのセンス鎖、ヌクレオチドのアンチセンス鎖、および、少なくとも１９のヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続相補性領域を具え、
前記アンチセンス鎖は、生理学的条件下で、
ヌクレオチド６４２、７８９、７９１、８６０、８６１、８６２、８６７、８６８、１００９、１２７３、１３９４、１４３６、１４７１、１４７２、１５３３、１５３５、１５４７、１６８０、１７３８、１７３９、１７６６、１８８０、１９４７、２０２２、２０３６、２３２８、２３２９、２４７３、２５０９、２５２０、２５２４、２５５８または２６１３を具える配列番号１に対応するｍＲＮＡと、
ヌクレオチド１００７、１６９８、１７６９を具える配列番号１に対応するｍＲＮＡと、
からなる群から選択されるｍＲＮＡの一部とハイブリダイゼーションし、
これによって、Ｓｙｋ  ｍＲＮＡの発現が減少する。
【００６３】
Ｓｙｋ関連炎症状態の治療を必要とする対象のＳｙｋ関連炎症状態の治療方法は、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉ＲＮＡと、製薬的に許容されるキャリアと、を具える組成物を対象に投与するステップを具え、前記干渉ＲＮＡは、ヌクレオチドのセンス鎖、ヌクレオチドのアンチセンス鎖、および、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続相補性領域を具え、
前記アンチセンス鎖は、生理学的条件下で、
ヌクレオチド６４２、７８９、７９１、８６０、８６１、８６２、８６７、８６８、１００９、１２７３、１３９４、１４３６、１４７１、１４７２、１５３３、１５３５、１５４７、１６８０、１７３８、１７３９、１７６６、１８８０、１９４７、２０２２、２０３６、２３２８、２３２９、２４７３、２５０９、２５２０、２５２４、２５５８または２６１３を具える配列番号１に対応するｍＲＮＡと、
ヌクレオチド１００７、１６９８または１７６９を具える配列番号１に対応するｍＲＮＡと、
からなる群から選択されるｍＲＮＡの一部にハイブリダイゼーションし、
これにより、Ｓｙｋ関連の炎症状態が治療されることが本明細書に開示されている。
【００６４】
さらに、実施例は、対象のＳｙｋ  ｍＲＮＡの発現を減少させる方法を具え、この方法は、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する一本鎖干渉ＲＮＡの有効量と、製薬的に許容されるキャリアと、を具える組成物を対象に投与するステップを具え、
一本鎖干渉ＲＮＡは、生理学的条件下で、
ヌクレオチド６４２、７８９、７９１、８６０、８６１、８６２、８６７、８６８、１００９、１２７３、１３９４、１４３６、１４７１、１４７２、１５３３、１５３５、１５４７、１６８０、１７３８、１７３９、１７６６、１８８０、１９４７、２０２２、２０３６、２３２８、２３２９、２４７３、２５０９、２５２０、２５２４、２５５８または２６１３を具える配列番号１に対応するｍＲＮＡと、
ヌクレオチド１００７、１６９８または１７６９を具える配列番号１に対応するｍＲＮＡと、
からなる群から選択されるｍＲＮＡの一部にハイブリダイゼーションし、
これによって、Ｓｙｋ  ｍＲＮＡの発現を減少させる。
【００６５】
眼の炎症または結膜炎の治療を必要としている対象の眼の炎症または結膜炎を治療する方法は、
ＲＮＡ干渉を介してＳｙｋ遺伝子の発現を下方制御する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を具える組成物を対象に投与するステップを具え、
前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は、互いに独立に、約１９〜２７ヌクレオチドの長さであり、
前記ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖は、Ｓｙｋ遺伝子に対応するｍＲＮＡに対して実質的相補性を有するヌクレオチド配列を具え、ｓｉＲＮＡ分子はＲＮＡ干渉を介してｍＲＮＡの開裂を行うことが開示されている。
【００６６】
さらに、各種組成物は、１９〜４９ヌクレオチド長さを有し、かつ配列番号２、配列番号１３〜４０および配列番号４４〜４７またはこれらの相補体（ｃｏｍｐｌｅｍａｎｔ）のいずれか１つに対応するヌクレオチド配列を具える干渉ＲＮＡと、製薬的に許容されるキャリアと、を具えることが開示される。その他の各種組成物は、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、かつ配列番号４１〜４７またはこれらの相補体のいずれか１つに対応するヌクレオチド配列から実質的になる干渉ＲＮＡと、製薬的に許容されるキャリアと、を具える。
【００６７】
本発明の一実施例が示され、記載されており、当分野の当業者であれば、各種変形および代替の実施例を理解されたい。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲の用語にのみ限定されることを意図する。
【００６８】
本発明は、本発明の精神または本質的な特徴から逸脱することなく他の特定な形態において実施することができる。記載された実施例は、全ての点において、例示のみを目的とするものであり、限定を意図するものではない。本発明の範囲は、従って、上述した記載ではなく添付の特許請求の範囲によって規定される。特許請求の範囲と同等の意味または範囲内にくる本発明の特許請求の範囲に対する変化の全ては、本発明の範囲に包含されるものとする。さらに、本明細書に記載された公開された資料、特許および出願は、その全体が記載されているかのように、参照したことにより組み込まれるものとする。
【００６９】
実施例
表１は、上述したように、配列番号１のＳｙｋ  ＤＮＡターゲット配列の例を列挙しており、本発明のｓｉＲＮＡは、配列番号１から設計される。Ｓｙｋは、上述のように、脾臓チロシンキナーゼをコード化する。
2009533475.tif 000004
2009533475.tif 000005
【００７０】
上述の実施例で言及されるように、当分野の当業者であれば、配列番号１の配列位置を参照し、配列番号１に対して相補的なまたはほぼ相補的なヌクレオチドを加えること、または、削除することによって、表１に示されるターゲット配列情報を利用して、表１に示される配列よりも短いまたは長い長さの干渉ＲＮＡを設計することができる。
【００７１】
ｓｉＲＮＡおよび他の形状の干渉ＲＮＡによってガイドされるターゲットＲＮＡの開裂反応は、配列特異性が高い。一般的に、ターゲットｍＲＮＡの一部と配列において同一のヌクレオチドのセンス鎖と、ターゲットｍＲＮＡの一部と完全に相補的なヌクレオチドのアンチセンス鎖と、を具えるｓｉＲＮＡは、本明細書に記載されるｍＲＮＡを阻害するためのｓｉＲＮＡの実施例である。しかしながら、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖とターゲットｍＲＮＡとの間の１００％配列相補性、または、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖とｓｉＲＮＡのセンス鎖との間の１００％配列相補性は、本発明の実施には必須ではない。従って、例えば、本発明は、遺伝的変異、種による多型または進化的多様性によると考えられる配列のばらつきを許容する。
【００７２】
本発明の一実施例において、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ターゲットｍＲＮＡと少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続相補性を有する。本明細書に使用される「ほぼ完全」は、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、ターゲットｍＲＮＡの少なくとも一部に「実質的に相補的」であり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖がターゲットｍＲＮＡの少なくとも一部に「実質的に同一」である。当分野の当業者に周知な「同一」は、順番に一致させることによって決定されるヌクレオチド配列間の配列関連性、および、配列間のヌクレオチドの同一の程度である。一実施例において、ターゲットｍＲＮＡ配列に対する８０％の相補性、および、８０から１００％（例えば、８５％、９０％または９５％の相補性など）までの相補性は、ほぼ完全に相補的であるとみなされ、本発明に使用される。「完全な」連続相補性は、隣接している塩基対の標準的ワトソン−クリック塩基対である。「少なくともほぼ完全な」連続相補性は、本明細書で使用されるように、「完全な」相補性を含む。同一性または相補性を決定するためのコンピュータを用いた方法は、例えば、ＢＬＡＳＴＮなど、ヌクレオチド配列を最も適合するように特定するように、指定される。（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）
【００７３】
ターゲットｍＲＮＡ（センス鎖）とｓｉＲＮＡの一方の鎖（センス鎖）との間の関係性は、同一性の関係である。ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、存在すれば、パッセンジャー鎖とも呼ばれる。ターゲットｍＲＮＡ（センス鎖）とｓｉＲＮＡの他方の鎖（アンチセンス鎖）との関係は、相補性の関係である。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ガイド鎖とも呼ばれる。
【００７４】
５’から３’方向に記載される核酸配列中のペナルチメート塩基は、最後の塩基の隣りであり、すなわち、３’塩基の隣りの塩基である。５’から３’方向で記載される核酸配列のペナルチメート１３塩基は、３’塩基の隣の最後の１３塩基の配列であり、３’塩基を含まない。同様に、ペナルチメート１４、１５、１６、１７または１８塩基の配列は、各々、３’塩基の隣であり、３’塩基を含まない。
【００７５】
本発明の一実施例において、連続ヌクレオチド領域は、各配列番号によって特定される配列に対応するｍＲＮＡの３’末端のペナルチメート１４ヌクレオチドに対して少なくと８５％配列相補性または少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４の連続ヌクレオチド領域である。２つのヌクレオチド置換（すなわち、１２／１４＝８６％同一／相補性）は、このフレーズに含まれる。
【００７６】
本発明のさらなる実施例において、配列番号の配列に対応するｍＲＮＡの３’末端のペナルチメート１４ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の配列相補性または少なくとも８０％の配列同一性を有する連続ヌクレオチド領域は、少なくとも１５、１６、１７または１８の連続ヌクレオチド領域である。３つのヌクレオチドの置換は、このフレーズには含まれる。
【００７７】
配列番号１に対応するｍＲＮＡのターゲット配列は、ｍＲＮＡの５’または３’の未翻訳領域ならびにｍＲＮＡのコード化領域でもよい。
【００７８】
二本鎖干渉ＲＮＡの一方または双方の鎖は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはこれらの混合物でもよい１〜６ヌクレオチドの３’突出部を有してもよい。突出したヌクレオチドは、塩基対を形成しなくてもよい。本発明の一実施例において、干渉ＲＮＡは、ＴＴまたはＵＵの３’突出部を具える。本発明の他の実施例において、干渉ＲＮＡは、少なくとも１つの平滑末端を具える。末端は、通常、５’リン酸基または３’ヒドロキシル基を有する。他の実施例において、アンチセンス鎖は、５’リン酸基を有し、センス鎖は、５’ヒドロキシル基を有する。他の実施例において、末端は、他の分子または官能基の共有結合的付加によってさらに修飾される。
【００７９】
二本鎖ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、上述した２つの一本鎖からなるデュプレックス形態でもよく、相補性領域が塩基対を形成しており、一本鎖を形成するようにヘアピンループによって共有結合的に結合される単一分子鎖（ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）でもよい。ヘアピンは、ダイサーに基づいたタンパク質によって細胞間で開裂され、塩基対が形成された２つの独立したＲＮＡ分子からなる干渉ＲＮＡを形成すると考えられる。
【００８０】
干渉ＲＮＡは、付加、欠失、置換または修飾によって、自然発生的なＲＮＡとは異なっていてもよい。非ヌクレオチド材料は、５’末端、３’末端またはその中間では、干渉ＲＮＡに結合してもよい。このような修飾は、通常、干渉ＲＮＡのヌクレアーゼ耐性が上昇するように設計され、細胞取り込みを改善し、細胞ターゲティングを促進し、干渉ＲＮＡのトレーシングを支援し、安定性をさらに改善し、または、インターフェロン経路の活性化に対する潜在能力を低下させる。例えば、干渉ＲＮＡは、突出部の末端にプリンヌクレオチドを具えてもよい。さらに、例えば、ピロリジンリンカー手段によって、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端に対してコレステロールを結合させることで、ｓｉＲＮＡの安定性が提供される。
【００８１】
さらなる修飾は、例えば、３’末端のビオチン分子、細胞浸透機能を有することで周知のペプチド、ナノ粒子、ペプチド模倣体、蛍光染料またはデンドリマなどを含む。
【００８２】
ヌクレオチドは、分子の塩基部位、糖部位、または、リン酸部位に修飾され、本発明の実施例において機能することができる。修飾は、例えば、アルキル、アルコキシ、アミノ、デアザ（ｄｅａｚａ）、ハロゲン、ヒドロキシル基、チオール基またはこれらの組合せを含む。ヌクレオチドは、リボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドに置換するか、または、例えば、２’アミノ基、２’Ｏ−メチル基、２’メトキシエチル基または２’−Ｏ，４’−Ｃメチレンブリッジによって置換される２’ＯＨ基など糖修飾基を有するように、より安定状態になるように類似体に置換されてもよい。ヌクレオチドのプリンまたはピリミジン類似体の例は、キサンチン、ヒポキサンチン、アザプリン、メチルチオアデニン、７−デアザ−アデノシンおよびＯ−およびＮ−修飾ヌクレオチドを含む。ヌクレオチドのリン酸基は、リン酸基の１又はそれ以上の酸素を、窒素または硫黄（ホスホロチオエート）で置換することによって修飾可能である。修飾は、例えば、機能の促進、安定性または浸透性の改善、あるいは、局在化またはターゲティングするのに有用である。
【００８３】
配列番号１の部分に相補的でない１または複数の干渉ＲＮＡアンチセンス鎖領域があってもよい。非相補性領域は、相補性領域の３’末端、５’末端または両端でもよく、または、２つの相補性領域の間でもよい。
【００８４】
干渉ＲＮＡは、化学合成、インビトロ転写、または、ダイサーまたは同様の活性を有する別の適宜なヌクレアーゼで、比較的長い二本鎖ＲＮＡを開裂すること、によって外因的に生成できる。従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成を用いて保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトから生成された化学的に合成された干渉ＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．（テキサス州オースチン）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）またはＤｈａｒｍａｃｏｎ（コロラド州ラファエット）などの商業的供給者から得られることができる。干渉ＲＮＡは、例えば、溶媒または樹脂を用いた抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィまたはこれらの組合せによって精製される。代替として、干渉ＲＮＡは、サンプル処理による損失をさけるために、例えあったとしても、わずかに精製するだけで利用することができる。
【００８５】
さらに、干渉ＲＮＡは、プラスミドまたはウィルス性発現ベクター、あるいは、例えば１又はそれ以上のプロモータおよび干渉ＲＮＡ用の適宜の１又はそれ以上のテンプレートを具えるＰＣＲで生成したフラグメントなどの、最小限発現カセットから、外因的に発現させることができる。ｓｈＲＮＡ用の商業的に入手可能なプラスミドベースの発現ベクタの例は、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒシリーズ（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースチン）およびｐＣｐＧ−ｓｉＲＮＡ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）の部材を含む。干渉ＲＮＡを発現するウィルス性ベクタは、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、レンチウィルス（例えば、ＨＩＶ、ＦＩＶおよびＥＩＡＶ）およびヘルペスウィルスを含む各種ウィルスから得られる。ｓｈＲＮＡ発現用の商業的に入手可能なウィルスベクタの例は、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  ａｄｅｎｏ（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースチン）およびｐＬｅｎｔｉ６／ＢＬＯＣＫ−ｉＴＴＭ−ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を含む。ウィルス性ベクタの選択、ベクタから干渉ＲＮＡを発現させる方法、および、ウィルスベクタを送達する方法は、当分野の当業者の範囲である。ＰＣＲを生成したｓｈＲＮＡ発現カセットの生成物に対するキットの例は、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｍｂｉｏｎ，テキサス州オースチン）およびｓｉＸｐｒｅｓｓ（Ｍｉｒｕｓ、ウィスコンシン州マディソン）を含む。第１の干渉ＲＮＡは、この第１の干渉ＲＮＡを発現可能な第１の発現ベクタからインビボでの発現を介して投与されるか、第２の干渉ＲＮＡは、この第２の干渉ＲＮＡを発現可能な第２の発現ベクターからインビボ発現を介して投与されるか、または、両方の干渉ＲＮＡは、両方の干渉ＲＮＡを発現可能な１つの発現ベクタからインビボの発現を介して投与されることができる。
【００８６】
干渉ＲＮＡは、当分野の当業者に周知なように、Ｕ６またはＨ１プロモータなどのｐｏｌＩＩＩプロモータ、および、サイトメガロウィルスプロモータなどのｐｏｌＩＩプロモータを含む各種真核細胞のプロモータから発現可能である。当分野の当業者であれば、これらのプロモータは、さらに、干渉ＲＮＡの誘導可能に発現できるように調節可能であることを理解されたい。
【００８７】
生理学的条件下でのハイブリダイゼーション：本発明の実施例において、干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＲＩＳＣ複合体の一部としてインビボでｍＲＮＡとハイブリダイゼーションする。
【００８８】
上述したようにインビトロのハイブリダイゼーションアッセイは、候補ｓｉＲＮＡとターゲットとの間の結合が特異的であるかどうかを予測する方法を提供する。なお、ＲＩＳＣ複合体の文脈において、ターゲットの特異的開裂は、インビトロでのハイブリダイゼーションに対する高いストリンジェンシーを示さないアンチセンス鎖でも生じる。
【００８９】
一本鎖化された干渉ＲＮＡ：上述のように、干渉ＲＮＡは、最終的に、一本鎖として機能する。二本鎖ＲＮＡよりも効果が低くても、一本鎖化された（ｓｓ）干渉ＲＮＡが、ｍＲＮＡをサイレンシングする効果を有することがわかっている。従って、本発明の実施例は、更に、一本鎖干渉ＲＮＡの投与を提供し、この一本鎖干渉ＲＮＡは、生理学的条件下で配列番号１の部分にハイブリダイゼーションし、かつハイブリダイゼーションする配列番号１の一部を有する少なくとも１９ヌクレオチドのほぼ完全な連続相補性領域を有する。表１の一本鎖干渉ＲＮＡは、上述した二本鎖干渉ＲＮＡに関する１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する。一本鎖干渉ＲＮＡは、５’リン酸を有するか、インサイチュウまたはインビボにおいて５’位置がリン酸化される。用語「５’リン酸化」は、例えば、エステル結合を介して、糖（例えば、リボース、デオキシリボースまたは同様の類似体）のＣ５ヒドロキシル基に、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’末端で結合した、リン酸基を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを示すために使用される。
【００９０】
一本鎖干渉ＲＮＡは、化学的にまたはインビトロ転写によって合成されるか、あるいは、二本鎖ＲＮＡに関するベクタまたは発現カセットから外因的に発現される。リン酸基は、キナーゼを介して付加されるか、５’リン酸は、ＲＮＡのヌクレアーゼ開裂の結果であってもよい。輸送（Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）は二本鎖干渉ＲＮＡと同様である。一実施例において、保護された末端とヌクレアーゼ耐性修飾を有する一本鎖干渉ＲＮＡは、サイレンシングのために投与される。一本鎖干渉ＲＮＡは、貯蔵のために乾燥されるか、水溶液に溶解される。この溶液は、アニーリングを阻止するため、または、安定化のために、緩衝液または塩を含んでもよい。
【００９１】
ヘアピン干渉ＲＮＡ：ヘアピン干渉ＲＮＡは、ステムループまたはヘアピン構造（例えばｓｈＲＮＡ）における干渉ＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の双方を具える単一分子（例えば、単一のオリゴヌクレオチド鎖）である。例えば、ｓｈＲＮＡは、ＤＮＡベクタから発現可能であり、このＤＮＡベクタにおいて、干渉ＲＮＡのセンス鎖をコードしているＤＮＡオリゴヌクレオチドは、短い空間を介して、逆方向に（ｒｅｖｅｒｓｅ）相補的な干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドに結合している。選択された発現ベクタが必要とされるとき、３’末端のＴ’ｓおよび制限サイトを形成するヌクレオチドが付加される。得られたＲＮＡ転写産物は、ステムループ構造を形成するように、転写産物自体に折りたたまれる。
【００９２】
投与モード：干渉ＲＮＡは、例えば、エアロゾル、バッカル、真皮、皮内、吸入、筋肉内、経鼻、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、鼻、眼、口、耳、腸管外、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮投与を介して送られる。
【００９３】
投与は、眼の周囲、結膜、サブテノン（ｓｕｂｔｅｎｏｎ）、前房内（ｉｎｔｒａｃａｍｅｒａｌ）、ガラス体内（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ）、眼内、網膜下、結膜下、眼球後（ｒｅｔｒｏｂｕｌｂａｒ）、小管内または脈絡膜（ｓｕｐｒａｃｈｏｒｏｉｄａｌ）投与などの眼の組織への投与によって直接的に目に投与されるか：注射されるか、カテーテルあるいは、レチナールペレット、眼内挿入、座薬（ｓｕｐｐｏｓｉｔｏｒｙ）または多孔、非多孔またはゼラチン状物質を具えるインプラントなど、配置デバイスを用いて目に直接適用されるか；局所的眼用ドロップ（ｏｃｕｌａｒ  ｄｒｏｐ）または外用薬；盲嚢（ｃｕｌ−ｄｅ−ｓａｃ）内、強膜（ｓｃｌｅｒａ（ｔｒａｎｓｓｃｌｅｒａｌ））に隣接して、または、目の中に、インプラントされた徐放性デバイスによって、目に直接投与される。前房内（ｉｎｔｒａｃａｍｅｒａｌ）注射は、角膜を介して前房（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｈａｍｂｅｒ）へとなされ、薬剤が小柱網（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  ｍｅｓｈｗｏｒｋ）に到達可能となる。小管内注射は、シュレム管に放出される静脈集積チャネルへとなされてもよい。さらなる投与モードは、タブレット、ピルおよびカプセルを含む。
【００９４】
投与は、例えば、局所的耳用ドロップ（ｏｔｉｃ  ｄｒｏｐ）または外用薬、耳内の徐放性デバイス、耳に隣接してインプラントされることによって、耳に直接行ってもよい。局所的投与は、耳の筋肉内、中耳内キャビティおよび蝸牛内（ｉｎｔｒａｏｃｈｌｅａｒ）注射投与経路を含む。さらに、薬剤は、ジェルフォーム、または、同様の吸湿剤および粘着製品の配置によって内耳に投与可能であり、中耳／内耳の窓膜（ｗｉｎｄｏｗ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）またはその周辺構造に対して干渉ＲＮＡで浸すことができる。
【００９５】
投与は、例えば、エアロゾル化された調製液を介して、および、例えば、吸入器またはネブライザを介した吸入によって、肺に直接行ってもよい。
【００９６】
対象：Ｓｙｋ関連の炎症状態の治療を必要とする対象またはＳｙｋ関連の炎症状態が発達するリスクのある対象は、アレルギ性結膜炎、眼の炎症、皮膚炎、鼻炎、喘息、アレルギ、または、例えば、上述したような望まないもしくは不適切なＳｙｋの発現または活性に関連した肥満細胞疾患などの、Ｓｙｋ関連の炎症状態を有するか、Ｓｙｋ関連の炎症状態が発達するリスクのあるヒトまたはその他の哺乳類である。
【００９７】
このような疾患に関連した眼の構造は、例えば、眼、網膜、脈絡膜、レンズ、角膜、小柱網（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  ｍｅｓｈｗｏｒｋ）、虹彩、視神経乳頭、強膜、眼房（ａｑｕｅｏｕｓ  ｃｈａｍｂｅｒ）、ガラス体腔、毛様体、または、後区（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ）を含む。
【００９８】
このような疾患に関連した耳構造は、例えば、内耳、中耳、外耳、鼓室または鼓膜、蝸牛、あるいは、耳管（Ｅｕｓｔａｃｈｉａｎ  ｔｕｂｅ）を含む。
【００９９】
このような疾患に関連した肺構造は、鼻、口、咽頭（ｐｈａｒｙｎｘ）、喉頭（ｌａｒｙｎｘ）、気管支、気管、気管分岐部（右および左の主気管の開口部を分ける隆起部）および肺、特に、細気管支および肺胞など肺の下側を含んでもよい。
【０１００】
さらに、対象は、耳の細胞、肺の細胞、眼の細胞、細胞株、器官、エキソビボ器官または組織を含んでもよい。
【０１０１】
製剤および投与量：製薬的薬剤は、水、緩衝液、食塩水、グリシン、ヒアルロン酸、マンニトールなど、最大９９重量％の生理学的に許容されるキャリア媒体と混合される、本発明の干渉ＲＮＡまたはその塩を具える。
【０１０２】
本発明の干渉ＲＮＡは、固体、溶液、懸濁液またはエマルジョンとして投与される。以下は、本発明によって実現される可能な製剤の例である。
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【０１０３】
一般的に、本発明の実施例の有効量の干渉ＲＮＡは、１００ｐＭ〜１００ｎＭ、１ｎＭ〜５０ｎＭ、５ｎＭから約１０ｎＭもしくは約２５ｎＭのターゲット細胞表面での細胞外濃度となる。このような局所的な濃度を達成するために必要な投与量は、送達方法、送達部位、送達部位とターゲット細胞または組織との間の細胞層の数、送達が局所的であるか全身であるか、などを含む、多数の因子に依存して変化する。送達部位での濃度は、ターゲット細胞表面または組織表面の濃度よりも、相当高い。局所的な組成物は、技術力のある臨床医の通常の判断に従って、１日あたり１〜４回、または、毎日、毎週、２週に一度、毎月、もしくはより長い間隔など拡張された送達スケジュール、のターゲット器官の表面に送達される。製剤のｐＨは、約ｐＨ４〜９またはｐＨ４．５〜７．４である。
【０１０４】
Ｓｙｋ  ｍＲＮＡに対して送られるｓｉＲＮＡを用いた患者の治療は、作用期間を上昇させることによって低分子治療に有益であることが期待され、投与の頻度が少なく、より高い患者の服薬率となる。
【０１０５】
製剤の有効量は、例えば、対象の年齢、人種、性別、Ｓｙｋ関連の炎症状態の重症度、ターゲット遺伝子の転写／タンパク質のターンオーバの比率、干渉ＲＮＡの能力および干渉ＲＮＡの安定性などの要素に依存する。一実施例において、干渉ＲＮＡは、ターゲット器官に局所的に送達され、脾臓チロシンキナーゼを含む組織に治療量が到達し、従って、Ｓｙｋ関連プロセスを改善する。
【０１０６】
許容されるキャリア：許容されるキャリアは、ほとんどの場合、眼への刺激がなく、必要があれば、適宜な保存剤を提供し、均質な投与で本発明の干渉ＲＮＡを送達するキャリアを意味する。本発明の実施例の干渉ＲＮＡの投与のための許容されるキャリアは、陽イオン脂質ベーストランスフェクション試薬ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＴＫＯ（Ｍｉｒｕｓ社、ウィスコンシン州マディソン）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）またはＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴＴＭ  （Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、コロラド州ラファラット）、ポリエチレンイミンなどのポリ陽イオン；Ｔａｔなどの陽イオンペプチドまたはＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ（Ａｎｔｐ  ｐｅｐｔｉｄｅ）；またはリポソームを含む。リポソームは、標準的なビークル形成脂質およびコレステロールなどのステロールから形成され、例えば、内皮細胞表面抗原に対する結合親和性を有するモノクロナール抗体などのターゲティング分子を含む。さらに、リポソームは、ＰＥＧ化されたリポソームでもよい。
【０１０７】
干渉ＲＮＡは、溶液、懸濁液、生体内分解性または生体内非分解性送達デバイスに送達されてもよい。干渉ＲＮＡは、単独で、または、確定された共有結合成分として送達されてもよい。さらに、干渉ＲＮＡは、陽イオン脂質、陽イオンペプチドまたは陽イオンポリマと複合体を形成するか；（例えばプロタミンなど）核酸結合機能を有するタンパク質、融合タンパク質またはタンパク質ドメインと複合体化するか；または、ナノ粒子にカプセル化することも可能である。組織−または細胞−特異的送達は、抗体または抗体フラグメントなどの適宜なターゲット部位を包含することによってなされる。
【０１０８】
眼、耳、肺への送達に関して、干渉ＲＮＡは、眼科学的、光学的、または、肺に受容可能である保存剤、共溶媒、界面活性剤、粘性促進剤、浸透増進剤、緩衝液、塩化ナトリウムまたは水と混合され、水性滅菌懸濁液または溶液を形成可能である。溶液製剤は、生理学的に許容されるアイソトニック水溶性緩衝液に干渉ＲＮＡを溶解することによって調製可能である。さらに、溶液は、阻害剤の溶解をアシストするように、許容される界面活性剤を含むことができる。ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの粘度増強剤を、本発明の組成物に点火して、化合物の維持（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）を改善する。
【０１０９】
滅菌外用薬製剤を調製するために、干渉ＲＮＡは、ミネラルオイル、リキッドラノリンまたは白色ワセリンなどの適宜なビークルに保存剤と混合される。滅菌ゲル製剤は、当分野において周知な方法に従って、例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）−９４０（Ａｌｃｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，テキサス州フォートフォース）などを組み合わせることから調製された親水性塩基に干渉ＲＮＡを懸濁することによって調製される。ＶＩＳＣＯＡＴ（登録商標）（Ａｌｃｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，テキサス州フォートフォース）は、例えば、眼内注射に使用されてもよい。本発明の他の組成物は、干渉ＲＮＡが対象の器官または組織への浸透が少ない場合、ＣｒｅｍｅｐｈｏｒおよびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）、浸透増進剤を含むことができる。
【０１１０】
キット：本発明の実施例は、本明細書に記載されるように、細胞中のｍＲＮＡの発現を減少させる試薬を含むキットを提供する。このキットは、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの発現ベクタを含有する。ｓｉＲＮＡおよび非ウィルス性ｓｈＲＮＡ発現ベクタに関して、キットは、さらに、トランスフェクション試薬またはその他の適宜な送達ビークルを含んでもよい。ウィルス性ｓｈＲＮＡ発現ベクタに関して、キットは、ウィルスベクタ及び／又はウィルスベクタ生成に必要な成分を含んでもよい（例えば、パッケージング細胞株、ならびに、ウィルスベクタテンプレートおよび付加的なヘルパーベクタを具えたベクタなど）。このキットは、ポジティブおよびネガティブコントロールのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ発現ベクタ（例えば、コントロールの非ターゲッティングｓｉＲＮＡ、または、関連のないｍＲＮＡをターゲティングするｓｉＲＮＡ）を含有する。このキットは、さらに、意図したターゲティング遺伝子のノックダウンを評価するための試薬を含有する（例えば、ウェスタンブロッティング用の対応するタンパク質に対するターゲットｍＲＮＡ及び／又は抗体を検出するための、定量的ＰＣＲ用プライマおよびプローブなど）。代替として、キットは、ｓｉＲＮＡ配列またはｓｈＲＮＡ配列、ならびに、インビトロ転写によってｓｉＲＮＡを生成するか、ｓｈＲＮＡ発現ベクタを構築するために必要な指令および物質を具えてもよい。
【０１１１】
さらに提供されるキット中の製薬学的組合せは、密に封入されるコンテナ手段を受けるように構成されたキャリア手段と、干渉ＲＮＡ組成物および許容されるキャリアを含む第１のコンテナ手段と、をパッケージ化合物（ｐａｃｋａｇｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）に具える。このようなキットは、さらに、必要であれば、例えば、当分野の当業者には明らかであるような１又はそれ以上の製薬的に許容されるキャリア、付加的な容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）など、従来の１又はそれ以上の各種製薬学的キット成分を具える。投与されるべき成分の量、投与のガイドライン及び／又は成分を混合するためのガイドラインを表記してある、インサートまたはラベルとしてのプリントされた指示は、キットに含むことができる。
【０１１２】
例えば、ヒト角膜上皮細胞における内因性Ｓｙｋ発現の濃度をノックダウンするＳｙｋ干渉ＲＮＡの能力は、以下のようにインビトロで評価される。例えば、ＣＥＰＩ−１７細胞株（Ｏｆｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．  ４０：１０９１−１１０１）など、形質転換されたヒト角膜上皮細胞は、ＫＧＭケラチオサイト培地（Ｃａｍｂｒｅｘ、ニュージャージー州イーストラザフォード）でトランスフェクションする２４時間前にプレートにまかれる。トランスフェクションは、０．１〜１００ｎＭの範囲のＳｙｋ干渉ＲＮＡ濃度で、製造者の指示に従ってＤｈａｒａｍａＦＥＣＴＴＭを用いて（Ｄｈａｍａｃｏｎ、コロラド州ラファエット）行った。コントロールの非ターゲティング干渉ＲＮＡおよびラミンＡ／Ｃ干渉ＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を、コントロールとして使用する。ターゲットｍＲＮＡ濃度は、例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）フォワードプライマおよびリバースプライマならびにターゲットサイトを包含するプローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を用いてトランスフェクションして２４時間後、ｑＰＣＲによって評価される。ターゲットタンパク質濃度は、トランスフェクションして約７２時間後（タンパク質のターンオーバレートに対応した実際の時間）、例えば、ウェスタンブロッティングによって、評価される。培養細胞からＲＮＡ及び／又はタンパク質を単離するための標準的な技術は、当分野の当業者に周知である。非特異的なオフターゲット効果の機会を減少させるために、ターゲット遺伝子発現のノックダウンの所望の濃度を生成する可能な最低濃度のＳｙｋ干渉ＲＮＡが使用される。
【０１１３】
本明細書に記載される工程に対して補足する例示的な工程または他の詳細を提供する、本明細書に記載される参考文献は、参照することによって特別に組み込まれる。
【０１１４】
本開示において、当分野の当業者であれば、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に開示された実施例の修正であることが明らかなものを評価できるであろう。本発明に開示された実施例の全ては、本開示の範囲において、適切でない実験をせずに、実施および実行される。本発明の全範囲は、開示された範囲およびこれと同等の実施例で表される。明細書によって、本発明が包含する保護範囲全体は不当に狭く解釈されるべきではない。
【０１１５】
２９３ＦＴ細胞中のＳＹＫを特異的にサイレンシングをする干渉ＲＮＡ
【０１１６】
本実験は、培養された２９３ＦＴ細胞中の内因性ＳＹＫタンパク質発現濃度をノックダウンするためのＳＹＫ干渉ＲＮＡ能力を試験した。
【０１１７】
２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）のトランスフェクションは、ＳＹＫのｓｉＲＮＡ、ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ−ＲＩＳＣフリーｓｉＲＮＡ＃１、または、ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ非ターゲティングｓｉＲＮＡ＃２（ＮＴＣ２）およびＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ（登録商標）＃１トランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、コロラド州ラファエット）のインビトロでの標準的な濃度を用いて行った。全てのｓｉＲＮＡを、１ＸｓｉＲＮＡバッファ、２０ｍＭのＫＣｌ、６ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．２ｍＭのＭｇＣｌ２の水溶液に溶解した。コントロールサンプルは、ｓｉＲＮＡを等量の１ＸｓｉＲＮＡバッファ（−ｓｉＲＮＡ）で置換したバッファコントロールを含む。抗ＳＹＫ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州サンタクルス）を用いてウェスタンブロッティングを行い、ＳＹＫタンパク質の発現を評価した。ＳＹＫ  ｓｉＲＮＡは、以下のターゲットに対して特異性を有する二本鎖干渉ＲＮＡである：ｓｉＳＹＫ＃２は、配列ＡＡＵＧＣＣＵＵＧＧＵＵＣＣＡＵＧＧＡ（配列番号４４）をターゲティングし；ｓｉＳＹＫ＃５は、配列ＧＧＡＡＵＡＡＵＣＵＣＡＡＧＡＡＵＣＡ（配列番号４５）をターゲティングし；ｓｉＳＹＫ＃６は、配列ＧＡＡＣＵＧＧＧＣＵＣＵＧＧＵＡＡＵＵ（配列番号４６）をターゲティングし；ｓｉＳＹＫ＃８は、配列ＧＡＡＣＡＧＡＣＡＵＧＵＣＡＡＧＧＡＵ（配列番号４７）をターゲティングする。図１のデータによって示されるように、ｓｉＳＹＫ＃５、ｓｉＳＹＫ＃６およびｓｉＳＹＫ＃８のｓｉＲＮＡは、コントロールｓｉＲＮＡに対して、１０ｎＭおよび１ｎＭ濃度でＳＹＫタンパク質の発現を有意に減少させた。ｓｉＳＹＫ＃６およびｓｉＳＹＫ＃８を一部有効であった。ｓｉＳＹＫ＃２ｓｉＲＮＡは、３つの濃度全てで不活性であった。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】図１は、それぞれ１０ｎＭ、１ｎＭおよび０．１ｎＭで、ＳＹＫ  ｓｉＲＮＡ＃２、＃５、＃６および＃８およびコントロールのＲＩＳＣフリーｓｉＲＮＡ；１０ｎＭで、コントロールの非ターゲティングｓｉＲＮＡ（ＮＴＣ２）；および干渉コントロール（−ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクションした２９３ＦＴ細胞のＳＹＫウェスタンブロッティングを提供する。矢印は、７２ｋＤａ  ＳＹＫおよび４２−ｋＤａアクチンバンドの位置を示している。
【図１】
2009533475.tif 000007
【国際調査報告】
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2009533475.tif 000009
2009533475.tif 000010
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