(57)【要約】【課題】養殖魚種の多様化に伴い，魚類に頻発する種々の感染症とこれ等の合併症は，化学療法剤の頻用による薬剤耐性菌の出現と共に，養殖魚の品質低下や，斃死魚や病魚の廃棄による生産コストの上昇をもたらし，かかる感染症への対策は今や，養殖業界の最重要課題になっている。【解決手段】魚類のイリドウイルス感染症と連鎖球菌感染症の両者，並びにこれ等の合併症の予防に有効かつ安全な混合不活化ワクチンとその製造方法を提供する．この発明により，上記の両感染症及びこれ等の合併症の予防が，地理的・時間的観点から迅速かつ省力的に，しかも，労力や経費の節減の結果，低コストで達成される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類のイリドウイルス感染症の病原体に由来の不活化抗原と連鎖球菌感染症の病原体に由来の不活化抗原とを，少なくとも２種，混合することを特徴とする混合不活化ワクチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，魚類，例えば，スズキ目，フグ目，カレイ目等に属する魚，例えば，マダイ，チダイ，イシダイ，イシガキダイ，スズキ，ブリ，カンパチ，ヒラマサ，シマアジ，サバ，トラフグ，キジハタ，ヒラメ，クエ等での感染や発症が確認されているイリドウイルス及び連鎖球菌による両感染症，並びにこれ等の合併症の予防に有効な混合不活化ワクチンとその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
魚類のイリドウイルス感染症とそのワクチンに関しては特許文献１に，また，魚類の連鎖球菌感染症に対する予防剤は特許文献２にそれぞれ詳述され公知である。これ等の各感染症に対するワクチンは既に市販されているが，両感染症に対し有効な免疫原性のスペクトルが広い混合ワワチンの完成は未だ知られていない。
【特許文献１】特開平９−１７６０４３号公報
【特許文献２】特開平８−２３１４０８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ここ約１０年来，養殖業の隆盛と養殖魚種の多様化に伴い，魚類の感染症，例えば，マダイ，ブリ，カンパチ等のイリドウイルス（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ）感染症，Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｒｖｉｅａｅによる連鎖球菌感染症，Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｐｉｓｃｉｃｉｄａによる類結節症，及びビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）感染症等とこれ等の合併症が頻発している。その結果，経営危機をもたらすほど，養殖魚の斃死や品質不適格による病魚の廃棄等，甚大な損害が多発している。この様に，養殖業とその関連産業においては今や，魚類の感染症の予防が最も重要な課題となっている。更に，かかる状況下での化学療法剤の使用は，薬剤耐性菌を誘導し感染症対策を困難にすると共に，その選択肢を狭隘にし，養殖コストを高めるので，予防剤としての魚類用ワクチンは，益々重視されつつある。また既に，イリドウイルス感染症や連鎖球菌感染症等のワクチンが実用化されているとはいえ，これ等の各ワクチンの免疫原性はこれ等の合併症にまでは及ばず，かかる合併症がワクチンによる予防効果を見かけ上，低下させる要因になっている。従って，これ等の各感染症のみならず，合併症にも有効な免疫原性スペクトルの広いワクチンが待望され，その実用化は今や急務の課題となっている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
この発明は，魚類，例えば，スズキ目，フグ目，カレイ目等に属する魚，例えば，マダイ，チダイ，イシダイ，イシガキダイ，スズキ，ブリ，カンパチ，ヒラマサ，シマアジ，サバ，トラフグ，キジハタ，ヒラメ，クエ等での感染や発症が確認されているイリドウイルス及び連鎖球菌による両感染症，並びにこれ等の合併症の予防に有効かつ安全であり，しかも，免疫原性が病原体に特異的な混合不活化ワクチンとその製造方法を提供することにより上記の課題を解決するものである。即ち，この発明によれば，
（１）魚類のイリドウイルス感染症の病原体に由来の不活化抗原と，連鎖球菌感染症の病原体に由来の不活化抗原とを，少なくとも２種，混合することを特徴とする混合不活化ワクチンの製造方法；及び
（２）魚類のイリドウイルス感染症の病原体に由来の不活化抗原と，連鎖球菌感染症の病原体に由来の不活化抗原とを，少なくとも２種，混合することにより調製される混合不活化ワクチンが，それぞれ提供される。また，この発明は，イリドウイルス感染症，連鎖球菌感染症，及びこれ等両者の合併症の予防を迅速かつ省力的に，しかも低コストで達成するものである。
【発明の効果】
【０００５】
この発明は，イリドウイルス感染症，連鎖球菌感染症，及びこれ等両者の合併症に対する予防を，地理的・時間的観点から迅速かつ省力的に，しかも労力・経費に関し低コストで達成するものである。従って，養殖業とその関連産業における生産性と品質の向上，及び養殖における環境衛生の改善に多大に寄与すると共に，これ等の産業に福音をもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
（１）イリドウイルス感染症の病原体に由来の抗原：魚類のイリドウイルスの感染により発症又は死亡した魚類，例えば，スズキ目，フグ目，カレイ目等に属する魚，例えば，マダイ，チダイ，イシダイ，イシガキダイ，スズキ，ブリ，カンパチ，ヒラマサ，シマアジ，サバ，トラフグ，キジハタ，ヒラメ，クエ等から切除又は摘出した器官，例えば，脾臓，心臓，腎臓，鰓，肝臓等から分離したイリドウイルス株，例えば，マダイイリドウイルスＥｈｉｍｅ−１株を病原体として用いることができる。かかる病原体に由来の抗原として，完全ウイルス粒子であるビリオン，不完全ウイルス粒子，ビリオン構成成分とその翻訳後修飾体，ビリオン構成成分であるＭＣＰ（ｍａｊｏｒ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ），ビリオン非構造タンパクとその翻訳後修飾体，感染防御抗原，中和反応のエピトープ等を用いることができる。抗原を量産するためのイリドウイルスの培養宿主としては，例えば，ＢＦ−２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ ５８），ＦＨＭ，ＣＨＳＥ−２１４，ＪＳＫＧ，ＫＲＥ−３，ＲＴＧ−２，ＹＴＦ，ＧＦ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ ９１）等，公知の細胞株を用いることができる。尚，イリドウイルス感染症に対するワクチンとその製造方法は，特許文献１に詳述されている。
【０００７】
（２）連鎖球菌感染症の病原体に由来の抗原：魚類の連鎖球菌感染症の病原体として現在，ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションにより，少なくとも次の５種，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ（Ｓ．ｓｈｉｌｏｉと同義），Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ，Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｒｖｉｅａｅ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｌｉｏｒｉｃｉｄａと同義，α溶血性連鎖球菌感染症の病原体），Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｉｓｃｉｕｍ，及びＶａｇｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｕｍが知られており（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｏｚａｔｉｏｎ，ｖｏｌ．９０，ｐｐ．１５３−１６０，１９９７），この発明では，これ等の病原体，例えば，ＮＣＤＯ ２１５５（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４３９２１），ＹＴ−３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４９１５６），Ｓ−１４７７（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４９１５７），α溶血性連鎖球菌Ｎｏ．４３株等を用いることができる。かかる病原体に由来の抗原として，種々の表現型の全菌体，感染防御抗原，中和反応のエピトープ等を用いることができる。尚，表現型に関し，例えば，Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｒｖｉｅａｅでは，ＫＧ−（非凝集性で莢膜あり）及びＫＧ＋（凝集性で莢膜なし）の２つの表現型が免疫原として有用性であることが知られており（Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ａｑｕａｔｉｃ Ｏｒｇａｎｉｓｍ，ｖｏｌ．３７，ｐｐ．１２１−１２６，１９９９），この発明では，これ等の表現型の菌体を抗原として用いることができる。また，将来，連鎖球菌感染症の魚類から分離される病原体に由来の抗原も上記と同様に用いることができる。かかる抗原を量産するための病原菌体の培養培地としては，細菌培養用の公知の固形培地や液体培地，例えば，寒天培地，ブイヨン培地等を用いることができる。
【０００８】
（３）不活化抗原の調製：この発明では，上述した病原体に由来の抗原を不活化抗原のかたちで使用する。不活化抗原は，例えば，ビリオンや菌体等に不活化剤を作用させ，これ等の感染能を失活させることにより調製される。尚，この不活化工程は，抗原を固定化し，その立体構造を安定化するためにも用いる。不活化剤としては，例えば，ホルマリン，グルタルジアルデヒド，β−プロピオラクトン等をワクチン原液の調製の前又は後に添加混合して用いる。ホルマリンを使用の場合，その添加量は約０．０００４−０．７％（Ｖ／Ｖ），不活化温度は約２−３７℃，不活化時間は，約５−１８０日である。但し，不活化により抗原性あるいは免疫原性が損なわれる場合には，不活化条件を緩和するための創意工夫を要する。かかる緩和は，例えば，不活化剤の減量，中性アミノ酸や塩基性アミノ酸等の添加混合，不活化温度の低下等により達成することができる。また，不活化工程で残存する遊離ホルムアルデヒドは，必要なら，等量の亜硫酸水素ナトリウムを添加してこれを中和するか，透析により除去することができる。
【０００９】
（４）混合不活化ワクチンの調製：不活化抗原の量に関し，例えば，病原体がイリドウイルスの場合には，不活化前での感染ウイルス量ＴＣＩＤ５０（Ｍｅｄｉａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ Ｄｏｓｅ）が対数値ｌｏｇ（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）に換算して約４−８になるよう，塩類溶液や培地等，例えば，ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ），ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）等でワクチン原液を希釈する。病原体がＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｒｖｉｅａｅの場合には，不活化前での感染菌体量ＣＦＵ（Ｃｏｌｏｎｙ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ）が対数値ｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍｌ）に換算して約４−９になるよう，ワクチン原液を上記と同様に希釈できる。即ち，かかる希釈により，不活化抗原の量が，免疫を誘導するに必要な量となるよう調整する。次いで，これより得られた不活化抗原，即ち，イリドウイルス感染症の病原体に由来の少なくとも１種の不活化抗原と，連鎖球菌感染症の病原体に由来の少なくとも１種の不活化抗原とを混合することにより混合不活化ワクチンを調製する。
【００１０】
ところで，２種以上の不活化抗原の混合において特に留意すべきは，かかる混合によるワクチン副作用の増強や増幅，及び抗原相互の干渉，例えば，混合前の各抗原に特異的な抗原性と免疫原性の低下や消失であり，これ等の諸現象がいずれも，混合後に皆無であることを確認する必要がある。確認ができない場合は，その混合あるいは組合せは不適格である。尚，この発明は，イリドウイルス感染症と連鎖球菌感染症に係る各病原体に由来の不活化抗原の混合においては，上記の抗原性と免疫原性が確保され，かつ，副作用が見られず，かかる２種混合がワクチンとして適格であるという知見に基づき完成された。
【００１１】
更に，ワクチンの調製においては，その耐熱性を増強するための安定化剤や，免疫原性を高める補助剤としてのアジュバントを添加混合することができる。例えば，安定化剤として，糖類やアミノ酸類，また，アジュバントとして，鉱物油，植物油，ミョウバン，リン酸アルミニウム，ベントナイト，シリカ，ムラミルジペプチド誘導体，サイモシン，インターロイキン等を利用できる。次いで，適当な容積，例えば，約１０−５００ｍｌ容のバイアルに分注し，密栓・密封の後，ワクチンとして使用に供する。かかるワクチンは，液状のみならず，分注後に凍結乾燥を行うことにより，乾燥製剤として使用に供することができる。尚，乾燥製剤は，使用の直前に，添付の滅菌液で乾燥物質を完全に再溶解して用いる。
【００１２】
また，調製したワクチン製剤は，使用あるいは市販に供する前に，その品質を保証するため，安全性と有効性に関する検定を行う必要があり，検定に係る各種試験は，薬事法（昭和３５年法律第１４５号）に基づく「動物用生物学的製剤基準」において定める「まだいイリドウイルス感染症不活化ワクチン」，「ブリα溶血性連鎖球菌症不活化経口ワクチン」等の「動物用生物学的製剤検定基準］に準拠して行うことができる。
【００１３】
（５）混合不活化ワクチンの用法：感染の危険性がある任意の年齢の魚類に使用できる。但し，養魚保全の観点から，幼魚ないしは稚魚への使用が望ましい。使用法として，例えば，腹腔内，筋肉内，又は皮下接種，浸漬法，経口投与等が可能である。接種による免疫では，１ドーズ当たりワクチン約０．０５−１．０ｍｌの使用が望ましく，浸漬による免疫には飼育水又は低張飼育水でワクチンを約１０−１００００倍に希釈して用いることができる。該ワクチンは，凍結しない冷温，例えば，約２−８℃の冷暗所で保存する。
【００１４】
この発明に係る混合不活化ワクチンは，魚類のイリドウイルス感染症及び連鎖球菌感染症の両者の同時免疫及びこれ等の合併症の予防に極めて有効である。以下，この発明の態様並びに構成と効果を，参考例及び実施例を示し，具体的に説明する。但し，本発明は，これ等に限定されるものではない。
【実施例】
【００１５】
参考例１
イリドウイルスの量産：マダイイリドウイルスＥｈｉｍｅ−１／ＧＦ１４株をシードに用いてイリドウイルス（ワクチン用抗原）を量産した。
培地にＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）を用い，１Ｌ容のルー瓶５本に培養したＧＦ細胞モノシートに、上記シードウイルスを接種し（感染多重度ＭＯＩ＝０．０１），２５℃で１４日間，静置培養した。新鮮培地との交換は，培養開始日から３日目ごとに行った。但し，培養１０−１４日目の間は培地交換をしなかった。ＣＰＥ（ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）が細胞モノシートの約８０％に達した１４日目に，培養液を採取し，低速遠心（３，０００ｒｐｍ，２０分）の後，その上清を回収しウイルス浮遊液５００ｍｌを得た。
【００１６】
イリドウイルス量の測定：ＧＦ細胞に１０倍階段希釈したウイルス浮遊液を接種して培養し，各希釈点でのＣＰＥの有無を判定することによりウイルス感染価，ｌｏｇ（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を測定した。その結果，ウイルス量（抗原量）は，６．０であった。
【００１７】
不活化イリドウイルス抗原とワクチン原液の調製：ウイルス浮遊液３００ｍｌにホルマリンを最終濃度が０．０３％（Ｖ／Ｖ）になるよう添加混合し，６℃で２５日間，不活化した。不活化終了後，不活化ワクチン原液として４℃の冷暗室で保存した。
【００１８】
不活化ワクチン原液の検定：不活化ワクチン原液を１００ｍｌ分取し，薬事法（昭和３５年法律第１４５号）に基づく「動物用生物学的製剤基準」に定める「まだいイリドウイルス感染症不活化ワクチン」の検定基準に準拠し，不活化試験，染色試験，ホルマリン含量試験，無菌試験等を行った。その結果，このワクチン原液は，不活化ワクチン原液として適格であることが確認された。
【００１９】
参考例２
連鎖球菌の量産：α溶血性連鎖球菌Ｎｏ．４３株を種菌に用い，連鎖球菌（ワクチン用抗原）を量産した。
２Ｌ容の培養容器中のブイヨン培地（１Ｌ中にトリプトン１７．０ｇ，ソイペプトン３．０ｇ，ブドウ糖２．５ｇ，リン酸二カリウム２．５ｇ及び塩化ナトリウム５．０ｇをそれぞれ含有）５００ｍｌに，上記種菌０．５ｍｌを植菌した後，これを３０℃で２４時間，培養した。
【００２０】
また，上記の培養終了後，培養液を分取してＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳで１０倍階段希釈し，これを内径６ｃｍの寒天プレートに接種した後，３０℃で２４時間培養し，生じたα溶血性コロニーを計数することにより菌数計算を行った。その結果，感染菌体数（抗原量）ｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍｌ）は８．７であった。尚，寒天プレートには，血液寒天培地（１Ｌ中にペプトン１４．５ｇ，ダイズペプトン５．０ｇ，塩化ナトリウム５．０ｇ，成長因子１．５ｇ，寒天１４．０ｇ及びヒツジ脱繊維血液５０ｍｌをそれぞれ含有）を用いた。
【００２１】
不活化連鎖球菌抗原とワクチン原液の調製：上記の連鎖球菌培養液３００ｍｌにホルマリンを最終濃度が０．１％（Ｖ／Ｖ）になるよう添加混合し，３０℃で５日間，不活化した。不活化終了後，不活化ワクチン原液として４℃の冷暗室に保存した。
【００２２】
不活化ワクチン原液の検定：不活化ワクチン原液を１００ｍｌ分取し，薬事法（昭和３５年法律第１４５号）に基づく「動物用生物学的製剤基準」に定める「ブリα溶血性連鎖球菌感染症不活化経口ワクチン」の検定基準に準拠し，不活化試験，染色試験，ホルマリン含量試験，無菌試験等を行った。その結果，このワクチン原液は，不活化ワクチン原液として適格であることが確認された。
【００２３】
実施例１
混合不活化ワクチンの調製：参考例１及び参考例２で得た両ワクチン原液を各５０ｍｌずつ分取し，これ等の両者を混合することにより，混合不活化ワクチンを調製し，これをイリド・レンサ混合不活化ワクチン（以下「２混」という）と命名した。
【００２４】
また，上記の各ワクチン原液５０ｍｌにＰＢＳをそれぞれ５０ｍｌ添加混合し，イリド不活化ワクチン（以下「イリド」という），及びレンサ不活化ワクチン（以下「レンサ」いう）を調製した。
【００２５】
これ等のワクチンは，２０ｍｌ容のバイアルに１０ｍｌずつ分注し，密栓・秘封の後，実施例２に記載の安全性と有効性に係る試験，実施例３，及び実施例４に記載の試験に供した。
【００２６】
実施例２
２混の安全性と有効性：実施例１で調製した２混ワクチンの安全性と有効性とを確認するため，ブリ稚魚（体重１８．６５−２８．３４ｇ，体長１２．０−１３．３ｃｍ），及びカンパチ稚魚（体重１７．８３−２９．５２ｇ，体長１０．６−１２．５ｃｍ）をそれぞれ２００尾ずつ用い，直接攻撃法による試験を行った。即ち，先ず，上記の両稚魚を，２５尾／試験区，合計８試験区に無作為に分配した後、２混ワクチンを接種する試験区，及びその比較対照として，実施例１で調製したイリドとレンサの各ワクチンを接種する試験区，及びワクチンを接種しない無処理の試験区にわりあてた。次に，ワクチンを各稚魚の腹腔内に０．１ｍｌ接種した後，その１１日目にイリドウイルス（１０６ ＴＣＩＤ５０／尾）又は連鎖球菌（１０６ ＣＦＵ／尾）を各稚魚の腹腔内に０．１ｍｌ接種することにより直接攻撃し，飼育下で発症の有無を観察した。尚，飼育は，水温２５±１℃の隔離した水槽（内容積６０Ｌの水槽に海水４０Ｌを入れ，これに新鮮海水を２Ｌ／ｍｉｎ流入かつ旧水を等量排出し飼育海水を連続交換する）内で行った。その結果を表１に示す。
【００２７】
この発明に係るイリド・レンサ混合不活化ワクチンは，安全かつ有効であり，しかも，その効果としての免疫原性は，各病原体特異的であった。尚，表中のＲＰＳ（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｐｅｒｃｅｎｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ）は次式に基づき算出される：
ＲＰＳ＝［（無処理区死亡率−接種区死亡率）］／無処理区死亡率］×１００．
【００２８】
【表１】
2006312646.tif 000002
【００２９】
実施例３
２混の接種部位が安全性と有効性に及ぼす影響：実施例１で調製した２混ワクチンの接種部位の違いと安全性・有効性との相関を確認するため，３５０尾のブリ稚魚（体重１７．２８−２６．５４ｇ，体長１１．８−１３．１ｃｍ）を用い，直接攻撃試験を行った。これ等の稚魚を，２５尾／試験区，合計１４試験区に無作為に分配した後，ワクチンを各稚魚の腹腔内，又は筋肉内に０．１ｍｌ接種した。 尚，２混ワクチンを接種した試験区の比較対照の設定，直接攻撃による試験方法，飼育観察，及びＲＰＳの算出は，実施例２の記載と同様にして行った。
【００３０】
その結果を表２に示す。この発明に係るイリド・レンサ混合不活化ワクチンは，腹腔内及び筋肉内のいずれの接種によっても，安全かつ有効であった。
【００３１】
【表２】
2006312646.tif 000003
【００３２】
実施例４
２混ワクチンのイリド・連鎖混合感染に対する予防効果：次の点以外は，実施例２の記載と同様にして行った。５０尾のブリ稚魚（体重１７．１３−２６．６７ｇ，体長１１．６−１３．２ｃｍ）を試験区と比較対照区（無処理区）の合計２区に無作為に２５尾ずつ分配した後，試験区の各稚魚の腹腔内に２混ワクチンを０．１ｍｌずつ接種し，無処理区にはワクチンを接種しなかった。また，混合感染に係る直接攻撃は，ワクチン接種後１１日目に，イリドウイルス（１０６ ＴＣＩＤ５０／尾），及び連鎖球菌（１０６ ＣＦＵ／尾）を腹腔内にそれぞれ０．１ｍｌ接種することにより行った。その後の観察の結果，死亡率は無処理区が９６％，ワクチンを接種した試験区が４％，そして，ＲＰＳは９６であり，この発明の２混はイリド・連鎖混合感染の予防に有効であると判断された。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
この発明は，イリドウイルス感染症，連鎖球菌感染症，及びこれ等両者の合併症に対する予防を，地理的・時間的観点から迅速かつ省力的に，しかも労力・経費に関し低コストで達成するものである。従って，養殖業とその関連産業における生産性と品質の向上，及び養殖における環境衛生の改善に多大に寄与すると共に，これ等の産業に福音をもたらす。