(57)【要約】  マンガン酸化物ナノ粒子を含む磁気共鳴映像（ＭＲＩ）造影剤に関するものである。より詳しくは、前記マンガン酸化物ナノ粒子はその中心大きさが１〜１０００ｎｍであり、前記マンガン酸化物は式ＭｎＯａ（０＜ａ≦５）またはＭｎＭｂＯｃ（ＭはＬＩ、Ｎａ、Ｂｅ、Ｃａ、Ｇｅ、Ｍｇ、Ｂａ、Ｓｒ、Ｒａを含む１、２族元素、Ｇａ、Ｉｎなどを含む１３族元素、Ｙ、Ｔａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｈｇなどを含む遷移金属元素、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂなどを含むランタン系元素およびアクチニド系元素からなる群から選択される１種または２種以上の金属原子、０＜ｂ≦５、０＜ｃ≦１０）であり、好ましくはＭｎＭ’ｄＦｅｅＯｆ（Ｍ’はＬＩ、Ｎａ、Ｂｅ、Ｃａ、Ｇｅ、Ｍｇ、Ｂａ、Ｓｒ、Ｒａを含む１、２族元素、またはＧａ、Ｉｎなどを含む１３族元素、Ｙ、Ｔａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｈｇなどを含む遷移金属元素、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂなどを含むランタン系元素およびアクチニド系元素からなる群から選択される１種の金属原子、０＜ｄ≦５、０＜ｅ≦５、０＜ｆ≦１５）を有する化合物である。また、前記マンガン酸化物粒子に水溶性配位子が結合され、それを囲んでおり、水溶液において安定し、優れた磁気的性質および磁気共鳴映像造影効果を示すナノ粒子である。また、前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子に化学および生体機能性分子などの活性物質が結合され、標的特異性および細胞追跡用ＭＲＩ造影剤として用いることができる。【選択図】図１
2009517463.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性マンガン酸化物ナノ粒子を含むＭＲＩ造影剤。
【請求項２】
前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は、気相（ｇａｓ  ｐｈａｓｅ）において、または水溶液、有機溶媒および多溶媒系のうちのいずれか１つの液相（ＬＩｑｕｉｄ  ｐｈａｓｅ）において、マンガン前駆物質の化学反応を通して結晶化して得られることを特徴とする、請求項１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項３】
前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子の水に対する溶解度が１μｇ／ｍｌ以上であり、水に溶解したナノ粒子の流体力学半径が１０００ｎｍより大きくないことを特徴とする、請求項１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項４】
前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子はその中心が１〜１０００ｎｍ大きさのマンガン酸化物からなり、前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は、
式ＭｎＯａ（０＜ａ≦５）、または
式ＭｎＭｂＯｃ（ＭはＬＩ、Ｎａ、Ｂｅ、Ｃａ、Ｇｅ、Ｍｇ、Ｂａ、Ｓｒ、Ｒａを含む１、２族元素、Ｇａ、Ｉｎを含む１３族元素、Ｙ、Ｔａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｕ、 Ｚｎ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｈｇを含む遷移金属元素、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、ＴｍおよびＹｂを含むランタン系元素およびアクチニド系元素からなる群から選択される１種以上の金属原子、０＜ｂ≦５、０＜ｃ≦１０）
を有する化合物であることを特徴とする、請求項１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項５】
前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は、
式ＭｎＭ’ｄＦｅｅＯｆ（Ｍ’はＬＩ、Ｎａ、Ｂｅ、Ｃａ、Ｇｅ、Ｍｇ、Ｂａ、Ｓｒ、Ｒａを含む１、２族元素、Ｇａ、Ｉｎを含む１３族元素、Ｙ、Ｔａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｈｇを含む遷移金属元素、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂを含むランタン系元素およびアクチニド系元素から選択される１種以上の金属原子、０＜ｄ≦５、０＜ｅ≦５、０＜ｆ≦１５）
を有する化合物であることを特徴とする、請求項１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項６】
前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は、ＭｎｇＦｅｈＯ４（０＜ｇ≦４、０＜ｈ≦４）、 ＭｎiＦｅjＺｎkＯ4（０＜i≦４、０＜j≦４、０＜k≦４）、およびＭｎxＦｅyＣｕ zＯ4（０＜x≦４、０＜y≦４、０＜z≦４）からなる群から選択された１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項７】
前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は、ＭｎＯ、Ｍｎ２Ｏ３、ＭｎＯ２、Ｍｎ３Ｏ４、Ｍｎ２Ｏ５のうちの１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項８】
前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は、それ自体で水に溶けるか、水溶性多官能基配位子によってコーティングされることを特徴とする、請求項１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項９】
前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子の表面に、イオン結合、共有結合、水素結合、疏水結合および金属−配位子の配位結合のうちの１つ以上の結合によって付着した水溶性多官能基配位子を含むことを特徴とする、請求項８に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項１０】
前記水溶性多官能基配位子は、水溶性マンガン酸化物ナノ粒子に結合する付着領域（ＬＩ）を含むことを特徴とする、請求項９に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項１１】
前記水溶性多官能基配位子は、
活性成分を結合させるための活性成分結合領域（ＬＩＩ）；
配位子間の交差連結のための交差連結領域（ＬＩＩＩ）；または
前記活性成分結合領域（ＬＩＩ）と交差連結領域（ＬＩＩＩ）を同時に含む活性成分結合領域−交差連結領域（ＬＩＩ−ＬＩＩＩ）
をさらに含むことを特徴とする、請求項１０に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項１２】
前記付着領域（ＬＩ）は、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＰＯ３Ｈ、−ＰＯ４Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＯＨおよび炭素数２以上の炭化水素からなる群から選択された官能基を含むことを特徴とする、請求項１０に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項１３】
前記活性成分結合領域（ＬＩＩ）は、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＮＲ３＋Ｘ−、−Ｎ３、−ＳＣＯＣＨ３、−ＳＣＮ、エポキシ基、スルホネート基、ニトレート基、ホスホン酸基、アルデヒド基、ヒドラゾン基、アルキンおよびアルケンからなる群から選択された１種以上の官能基を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項１４】
前記水溶性多官能基配位子は、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２および−ＯＨのうちのいずれか１つ以上を側鎖として有するアミノ酸を１つ以上含むペプチドであることを特徴とする、請求項１１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項１５】
前記水溶性多官能基配位子は、付着領域（ＬＩ）の官能基として−ＣＯＯＨ基を、活性成分結合領域（ＬＩＩ）の官能基として−ＣＯＯＨ基または−ＳＨ基を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項１６】
前記水溶性多官能基配位子は、付着領域（ＬＩ）の官能基として炭素数２以上の炭化水素鎖を、活性成分結合領域（ＬＩＩ）の官能基として−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＰＯｘＨ（０＜ｘ≦４）、−ＳＯｙＨ（０＜ｘ≦４）、−ＮＲ４＋Ｘ−（Ｒ＝ＣｎＨｍ  ０≦ｎ≦１６、０≦ｍ≦３４、Ｘ＝ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ）、または−ＯＨを含むことを特徴とする、請求項１１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項１７】
前記水溶性多官能基配位子は、ジメルカプトコハク酸、ジメルカプトマレイン酸およびジメルカプトペンタジオン酸からなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項９に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項１８】
前記水溶性多官能基配位子は、デキストラン、カルボデキストラン、多糖類、セルロース、デンプン、グリコーゲン、炭水化物、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、ポリホスファゼン、ポリラクチド、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、ポリカプロラクトン、ポリ無水物、ポリリンゴ酸、ポリリンゴ酸の誘導体、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリヒドロオキシブチレート、ポリカルボネート、ポリオルトエステル、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−リジン、ポリグリコリド、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルピロリドンからなる群から選択される１種以上を含む、請求項９に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項１９】
前記水溶性多官能基配位子は、ペプチド類、アルブミン類、アビジン類、抗体類、二次抗体類、シトクロム、カゼイン、ミオシン、グリシニン、カロチン、コラーゲン、球状タンパク質類、および硬タンパク質類からなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする、請求項９に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項２０】
請求項１１に記載の水溶性多官能基配位子の活性成分結合領域（ＬＩＩ）に活性成分が結合された形態の水溶性マンガン酸化物ナノハイブリッド粒子を含むことを特徴とするＭＲＩ造影剤。
【請求項２１】
前記活性成分は、化学機能性モノマー、ポリマー、無機担体、および生体機能性物質からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２０に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項２２】
前記化学機能性モノマーは、抗ガン剤、抗生剤、ビタミン、葉酸を含む薬物、脂肪酸、ステロイド、ホルモン、プリン、ピリミジン、単糖類、二糖類からなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項２１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項２３】
前記ポリマーは、デキストラン、カルボデキストラン、多糖類、シクロデキストラン、プルラン、セルロース、デンプン、グリコーゲン、炭水化物、オリゴ糖類、ポリホスファゼン、ポリラクチド、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、ポリカプロラクトン、ポリ無水物、ポリリンゴ酸およびポリリンゴ酸の誘導体、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリヒドロオキシブチレート、ポリカルボネート、ポリオルトエステル、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−リジン、ポリグリコリド、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルピロリドンからなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項２１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項２４】
前記無機担体は、シリカ（ＳｉＯ２）、チタニア（ＴｉＯ２）、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）、ジルコニア（ＺｒＯ２）およびヒ化ガリウム（ＧａＡｓ）、シリコン（Ｓｉ）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、硫化亜鉛（ＺｎＳ）、セレン化亜鉛（ＺｎＳｅ）テルル化亜鉛（ＺｎＴｅ）、硫化カドミウム（ＣｄＳ）、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）、硫化鉛（ＰｂＳ）、セレン化鉛（ＰｂＳｅ）、テルル化鉛（ＰｂＴｅ）の半導体からなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項２１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項２５】
前記生体機能性物質は、ＤＮＡ、ＲＮＡの核酸類、ペプチド類、抗原類、抗体類、ハプテン、アビジン、ニュートラビジン、ストレプトアビジン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、レクチン、セレクチン、抗ガン剤、抗生剤、ホルモン、ホルモン拮抗剤、インターロイキン、インターフェロン、成長因子、腫瘍壊死因子、エンドトキシン、リンホトキシン、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子、プロテアーゼ阻害剤、アルキルホスホコリン、界面活性剤、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、タンパク質薬物、加水分解酵素、酸化−還元酵素、分解酵素、異性化酵素、合成酵素の生体活性酵素、酵素補助因子（ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｆａｃｔｏｒ）、および酵素抑制剤（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）からなる群から選択される１種以上のものであることを特徴とする、請求項２１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項２６】
前記ＭＲＩ造影剤は、Ｔ２スピン−スピン緩和の磁気共鳴映像診断方法に用いられることを特徴とする、請求項１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項２７】
前記ＭＲＩ造影剤は、外部刺激または生体環境変化に応じたＭｎ２＋放出によるＴ１スピン−格子緩和磁気共鳴映像診断に用いられることを特徴とする、請求項１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項２８】
前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子に放射性同位元素物質が含まれることを特徴とする、請求項１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項２９】
単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ、Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）または陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ、Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）に用いられることを特徴とする、請求項２８に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項３０】
前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子に蛍光物質が含まれることを特徴とする、請求項１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項３１】
光学イメージングおよび分光（ｏｐｔｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）に用いられることを特徴とする、請求項３０に記載のＭＲＩ造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンガン酸化物ナノ粒子を含む磁気共鳴映像（ＭＲＩ）造影剤の開発に関する。より詳しくは、
（１）その中心が１〜１０００ｎｍのマンガン酸化物ナノ粒子からなり、前記ナノ粒子はＭｎＯａ（０＜ａ≦５）またはＭｎＭｂＯｃ（ＭはＬＩ、Ｎａ、Ｂｅ、Ｃａ、Ｇｅ、Ｍｇ、Ｂａ、Ｓｒ、Ｒａを含む１、２族元素、Ｇａ、Ｉｎなどを含む１３族元素、Ｙ、Ｔａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｈｇなどを含む遷移金属元素、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂなどを含むランタン系元素およびアクチニド系元素からなる群から選択される１種または２種以上の金属原子、０＜ｂ≦５、０＜ｃ≦１０）であり、好ましくはＭｎＭ’ｄＦｅｅＯｆ（Ｍ’はＬＩ、Ｎａ、Ｂｅ、Ｃａ、Ｇｅ、Ｍｇ、Ｂａ、Ｓｒ、Ｒａを含む１、２族元素、Ｇａ、Ｉｎなどを含む１３族元素、Ｙ、Ｔａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｈｇなどを含む遷移金属元素、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂなどを含むランタン系元素およびアクチニド系元素からなる群から選択される１種の金属原子、０＜ｄ≦５、０＜ｅ≦５、０＜ｆ≦１５）、最も好ましくはＭｎＦｅ２Ｏ４であり、
（２）前記ナノ粒子はそれ自体で水に溶けるか、あるいは水溶性配位子によって囲まれており、水溶液において安定し、優れた磁気的性質を示すことを特徴とする水溶性マンガン酸化物ナノ粒子を含み、
（３）このようなナノ粒子に化学または生体機能性物質などの生体活性物質が結合された診断用マンガン酸化物ナノハイブリッド粒子を含む。
【０００２】
また本発明は、（４）前記（１）〜（３）で明示したナノ物質を用いてＭＲＩ造影剤として開発することに関するものである。
【背景技術】
【０００３】
ナノ技術は物質を原子、分子レベルにおいて調節および制御する技術として、新物質、新素子の創出に適しており、その応用分野は電子、材料、通信、機械、医薬、農業、エネルギ、環境など非常に様々である。
【０００４】
現在ナノ技術は多様に発展しており、大きく３分野に分類することができる。第１に、ナノ素材で極微細な大きさの新しい物質と材料を合成する技術に関するものである。第２に、ナノ素子でナノサイズの材料を組み合わせるか配列して、一定の機能を発揮する装置を製造する技術に関するものである。第３に、“ナノバイオ”と呼ばれるナノ技術を生命工学に応用する技術に関するものである。
【０００５】
ナノバイオ分野における磁性ナノ粒子は、生体物質の分離、磁気共鳴映像の診断プローブ、巨大磁気抵抗センサを含むバイオセンサ、マイクロ流体センサ、薬物／遺伝子伝達、磁性温熱療法などの広い応用範囲にかけて用いられている。
【０００６】
特に磁性ナノ粒子は磁気共鳴映像の診断プローブ（ｐｒｏｂｅ）として用いることができる。外部から磁場をかけた時、磁性ナノ粒子が磁化し、ナノ粒子周辺の水分子中の水素原子のスピン−スピン緩和時間を短縮させ磁気共鳴映像信号を増幅させる効果を示すため、このような造影効果を利用すると、疾病の診断、分子および細胞レベルにおける生命現象の観察に用いることができる。
【０００７】
米国特許公報ＵＳ６，２７４，１２１号は、酸化鉄のような金属を含む常磁性ナノ粒子に関するものであり、前記ナノ粒子の表面に組織特異的な結合物質、診断または薬剤学的な活性物質とカップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）できる結合部位を含む無機物質を付着したナノ粒子を開示している。
【０００８】
米国特許公報ＵＳ６，６３８，４９４号は、酸化鉄のような金属を含む超常磁性ナノ粒子に関するものであり、前記ナノ粒子の表面に特定のカルボン酸を付け、重力または磁場においてナノ粒子が凝集および沈殿することを防止する方法を開示している。前記特定のカルボン酸としては、マレイン酸、酒石酸、グルカル酸のような脂肪族ジカルボン酸またはクエン酸、シクロヘキサン、トリカルボン酸のような脂肪族ポリジカルボン酸が用いられた。
【０００９】
米国特許公報ＵＳ５，７４６，９９９号は、酸化鉄のような金属を含む超常磁性ナノ粒子に関するものであり、前記ナノ粒子の表面にシリカを用いてコーティングし、デキストランで付着させ、体内磁気共鳴映像に応用した。
【００１０】
米国特許公報ＵＳ５，０６９，２１６およびＵＳ５，２６２，１７６号は、酸化鉄のような金属を含む超常磁性ナノ粒子からなるコロイドに関するものであり、デキストランのような多糖類を付着して水溶化し、これを用いて人体の肝および胃などの臓器を磁気共鳴映像によってイメージングした。
【００１１】
米国特許公開公報ＵＳ２００４／５８４５７号は、単層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）で囲まれた機能性ナノ粒子に関するものであり、前記単層には二機能性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）ペプチドが付着され、前記ペプチドにはＤＮＡおよびＲＮＡを含む様々なバイオポリマー（ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ）が結合することができる。
【００１２】
米国特許公報ＵＳ５，３３６，５０６号は、癌細胞を選択的に表示できる葉酸（ｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）が付着されたデキストランでコーティングされた酸化鉄磁性ナノ粒子に関するものであり、体外において磁気共鳴映像を用いて癌細胞を診断した。
【００１３】
米国特許公報ＵＳ４，７７０，１８３号は、デキストランおよびＢＳＡのようなタンパク質が付着された酸化鉄磁性ナノ粒子に関するものであり、それを磁気共鳴映像を用いた人体の肝映像および体内分布に応用した。
【００１４】
大韓民国特許出願第１０−１９９８−０７０５２６２号は、デンプンコーティングと任意のポリアルキレンオキシドコーティングを備えた超常磁性鉄酸化物コア粒子を含む粒子とそれを含むＭＲＩ造影剤を開示している。
【００１５】
このような磁気共鳴映像の造影剤として用いられる磁性ナノ粒子が本用途において最適性能をもって用いられるためには、
１）印加された磁場に敏感に反応する高い磁化率を有するべきであり、
２）優れた磁気共鳴映像の造影効果を示すべきであり、
３）生体内、すなわち水溶性環境において安定した輸送および分散が行われるべきであり、
４）生体活性物質と容易に結合可能であるべきであり、
５）低毒性および高生体親和力を示さなければならない。
【００１６】
特に３次元映像、高分解能などの非常に優れた生体イメージング効果を有する磁気共鳴映像の最弱点として見なされてきた低診断感度を解決するためには、優れた磁気的性質および造影効果を有する磁性ナノ粒子の開発が至急である。
【００１７】
しかし、前記先行特許および公知のＣＬＩＯ、Ｆｅｒｉｄｅｘ、Ｒｅｓｏｖｉｓｔなどの代表的なＭＲＩ造影剤を含む既存の酸化鉄ナノ粒子の場合、その磁化率が低く（６０〜９０ｅｍｕ／ｇＦｅ）、それにより、低い磁気共鳴映像の造影効果（例：低いＲ２緩和係数（６０〜１５０Ｌ・ｍｏｌ−１ｓｅｃ−１））を有する。これは、ＭＲＩ造影剤としての低下した信号増幅効果を示し、磁気共鳴映像診断において大きい問題点として指摘されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
上記問題を解決するために、本発明は、既存の酸化鉄ナノ粒子の問題点を大きく克服し、磁気的性質および磁気共鳴映像の造影効果に非常に優れ、水溶液において安定性が高く、磁気共鳴映像診断効果を画期的に改善した新しい概念のＭＲＩ造影剤として水溶性マンガン酸化物ナノ粒子を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
そのために、本研究者らは、既存の酸化鉄ナノ粒子を用いる代わりに、磁気的性質に遥かに優れ、水溶液において安定性が高く、生体親和性が良く、生体機能性成分との結合が容易な水溶性マンガン酸化物ナノ粒子を開発した。また、このようなマンガン酸化物ナノ粒子に化学機能性分子および生体機能性分子（タンパク質、抗原、抗体、ペプチド、核酸、酵素など）をリンカーリガンドを介して結合させることにより、マンガン酸化物ナノハイブリッド粒子を開発することができた。このような水溶性マンガン酸化物ナノ粒子とマンガン酸化物ナノハイブリッド粒子は、癌細胞などの生体診断において画期的な診断感度の増加を示し、磁気共鳴映像において高感度診断使用を可能にする。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係る水溶性マンガン酸化物ナノ粒子と水溶性マンガン酸化物ナノハイブリッド物質は、均一な大きさを有し、水溶液において特に安定し、磁気的性質に非常に優れており、既存の酸化鉄ナノ粒子に比べて磁性性質を顕著に増加させ、磁気共鳴映像感度を画期的に増加させる効果を有する。本発明の水溶性マンガン酸化物ナノ粒子あるいはそれらが生体物質と結合したナノハイブリッド粒子は、既存の磁気共鳴映像の画期的な改善および診断治療システムなどに有用に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本願明細書における“マンガン酸化物ナノ粒子”は、酸化マンガン（ｍａｎｇａｎｅｓｅ  ｏｘｉｄｅ）またはマンガン金属酸化物（ｍａｎｇａｎｅｓｅ  ｍｅｔａｌ  ｏｘｉｄｅ）のナノ粒子を意味する。本明細書では、前記酸化マンガンまたはマンガン金属酸化物のナノ粒子を“マンガン酸化物ナノ粒子”と称する。
【００２２】
本発明の明細書における“マンガン酸化物ナノ粒子”はナノサイズの粒子を意味するものであり、その直径は１ｎｍ〜１０００ｎｍ範囲内にあり、好ましくは２ｎｍ〜１００ｎｍ範囲の粒子を意味する。また、水に対する溶解度が少なくとも１μｇ／ｍｌ以上であり、水に溶解したナノ粒子の流体力学半径（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｒａｄｉｕｓ）が１０００ｎｍ以下の範囲を有する粒子を意味する。
【００２３】
本発明における“水溶性マンガン酸化物ナノ粒子”は、前記マンガン酸化物ナノ粒子に水溶性多官能基配位子（ｍｕｌｔｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ  Ｌｉｇａｎｄ）が結合され、前記ナノ粒子を囲む形態を有するか、または特別な配位子と結合せずにそれ自体で水溶液に安定して溶解または分散できるナノ粒子を意味する。
【００２４】
本発明における“水溶性マンガン酸化物ナノハイブリッド粒子”は、前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子が化学（例：モノマー、ポリマー、無機担体など）または生体機能性物質（例：細胞、タンパク質、ペプチド、抗原、遺伝子、抗体、酵素など）と結合している物質を意味する。
【００２５】
本発明に係る水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は様々な様態として提供することができ、いかなるマンガン酸化物質と多官能基配位子を選択するかによって決定される。
【００２６】
本発明のマンガン酸化物質はＭｎＯａ（０＜ａ≦５）またはＭｎＭｂＯｃ（ＭはＬＩ、Ｎａ、Ｂｅ、Ｃａ、Ｇｅ、Ｍｇ、Ｂａ、Ｓｒ、Ｒａを含む１、２族元素、またはＧａ、Ｉｎなどを含む１３族元素、Ｙ、Ｔａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｈｇなどを含む遷移金属元素、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂなどを含むランタン系元素およびアクチニド系元素からなる群から選択される１種または２種以上の金属原子、０＜ｂ≦５、０＜ｃ≦１０）であり、
好ましくはＭｎＭ’ｄＦｅｅＯｆ（Ｍ’はＬＩ、Ｎａ、Ｂｅ、Ｃａ、Ｇｅ、Ｍｇ、Ｂａ、Ｓｒ、Ｒａを含む１、２族元素、Ｇａ、Ｉｎなどを含む１３族元素、Ｙ、Ｔａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｈｇなどを含む遷移金属元素、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂなどを含むランタン系元素およびアクチニド系元素からなる群から選択される１種の金属原子、０＜ｄ≦５、０＜ｅ≦５、０＜ｆ≦１５）、
最も好ましくはＭｎＦｅ２Ｏ４である。
【００２７】
本発明の明細書における“水溶性多官能基配位子”は（ａ）付着領域（ＬＩ、ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を含むことができ、（ｂ）活性成分結合領域（ＬＩＩ、ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｒｅｇｉｏｎ）または（ｃ）交差連結領域（ＬＩＩＩ、ｃｒｏｓｓ  ｌｉｎｋｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をさらに含むことができる。以下では水溶性多官能基配位子についてより具体的に説明する。
【００２８】
前記“付着領域（ＬＩ）”は、ナノ粒子と付着できる官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ）を含む多官能基配位子の一部分であって、好ましくはその末端を意味する。よって、付着領域はナノ粒子をなす物質と親和性が高い官能基を含むことが好ましい。この時、ナノ粒子と付着領域との結合は、イオン結合、共有結合、水素結合、疏水結合、または金属−配位子の配位結合によって付着することができる。これにより、多官能基配位子の付着領域は、ナノ粒子を構成する物質によって多様に選択され得る。例えば、イオン結合、共有結合、水素結合、金属−配位子の配位結合を用いた付着領域は−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＰＯ３Ｈ、−ＰＯ４Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−Ｎ３、−ＮＲ３ＯＨ（Ｒ＝ＣｎＨ２ｎ＋１、０≦ｎ≦１６）または−ＯＨを含むことができ、疏水結合を用いた付着領域は炭素数２以上からなる炭化水素鎖を含むことができるが、これに限定されるものではない。
【００２９】
前記“活性成分結合領域（ＬＩＩ）”は、活性成分、すなわち化学または生体機能性物質と付着できる官能基を含む多官能基配位子の一部分であって、好ましくは前記付着領域の反対側に位置した末端を意味する。前記活性成分結合領域の官能基は、活性成分の種類およびその化学式によって異なり得る（表１参照）。本発明において、活性成分結合領域は−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＰＯ３Ｈ、−ＰＯ４Ｈ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＮＲ４＋Ｘ−（Ｒ＝ＣｎＨ2n+1、  ０≦ｎ≦１６）基を含むことができるが、これに限定されるものではない。
【００３０】
前記“交差連結領域（ＬＩＩＩ）”は、近接した多官能基配位子と交差連結できる官能基を含む多官能基配位子の一部分、好ましくは中心部を意味する。“交差連結”とは、ある多官能基配位子が近接して位置した他の多官能基配位子と分子間相互作用（ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）によって結合することを意味する。前記分子間相互作用は、疏水性相互作用、水素結合、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）、ファンデルワールス結合、イオン結合などがあるが、特にこれに限定されるものではない。よって、交差連結できる官能基は目的とする分子間相互作用の種類に応じて多様に選択され得る。交差連結領域は、例えば、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−エポキシ（ｅｐｏｘｙ）、−エチレン（ｅｔｈｙｌｅｎｅ）、−アセチレン（ａｃｅｔｙｌｅｎｅ）、−アジド（ａｚｉｄｅ）、−ＰＯ３Ｈ、または−ＳＯ３Ｈを官能基として含むことができる。
【００３１】
【表１】
2009517463.tif 000003
多官能基配位子に含まれ得る活性成分結合領域の官能基の例
（Ｉ：多官能基配位子の活性成分結合領域の官能基、ＩＩ：活性成分、ＩＩＩ：ＩとＩＩの反応による結合例）
【００３２】
本発明では上記のような官能基を本質的に保有する化合物を、水溶性多官能基配位子として用いることもできるが、当業界において公知の化学反応によって上記のような官能基を備えるように修飾または合成された化合物を多官能基配位子として用いることもできる。
【００３３】
本発明に係る水溶性ナノ粒子において好ましい多官能基配位子の１例は、ジメルカプトコハク酸である。ジメルカプトコハク酸は、本質的に、付着領域、交差連結領域、および活性成分結合領域を含んでいるためである。すなわち、ジメルカプトコハク酸の一側の−ＣＯＯＨはジスルフィド結合によって連結される役割をし、末端部のＣＯＯＨおよびＳＨは活性成分と結合する役割をする。前記ジメルカプトコハク酸の他にも付着領域（ＬＩ）の官能基として−ＣＯＯＨを、活性成分結合領域（ＬＩＩＩ）の官能基として−ＣＯＯＨまたは−ＳＨを含む化合物は好ましい多官能基配位子として用いることができる。このような化合物の例としてはジメルカプトマレイン酸（ｄｉｍｅｒｃａｐｔｏｍａｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ジメルカプトペンタジオン酸（ｄｉｍｅｒｃａｐｔｏｐｅｎｔａｄｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）などがあるが、これに制限されるものではない。
【００３４】
本発明に係る水溶性ナノ粒子において、好ましい多官能基配位子の他の例はタンパク質である。タンパク質はペプチドよりさらに多いアミノ酸、すなわち数百〜数十万個のアミノ酸からなるポリマーであり、両末端に−ＣＯＯＨと−ＮＨ２官能基を有しているだけでなく、数十個の−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＣＯＮＨ２などを含んでいる。これにより、タンパク質は前述したペプチドのようにその構造に応じて自然に付着領域、交差連結領域、活性成分結合領域を備えることができるため、本発明の相転移配位子として有用に用いることができる。相転移配位子として好ましいタンパク質の代表的な例としては、構造タンパク質、貯蔵タンパク質、輸送タンパク質、ホルモンタンパク質、収容体タンパク質、収縮タンパク質、防御タンパク質、酵素タンパク質などが挙げられる。より詳しくは、アルブミン、抗体、抗原、アビジン（ａｖｉｄｉｎ）、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ｓ、免疫グロブリン、レクチン（ｌｅｃｔｉｎ）、セレクチン（ｓｅｌｅｃｔｉｎ）、アンジオポイエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）、坑癌タンパク質、抗生タンパク質、ホルモン拮抗タンパク質、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）、インターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）、成長因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）タンパク質、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）タンパク質、エンドトキシン（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）タンパク質、リンホトキシン（ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ）タンパク質、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、ウロキナーゼ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）、ストレプトキナーゼ（ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ）、プロテアーゼ阻害剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、アルキルホスホコリン（ａｌｋｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、界面活性剤、心血管系薬物（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）タンパク質、神経系薬物（ｎｅｕｒｏ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）タンパク質、胃腸管系薬物タンパク質（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）等が挙げられる。
【００３５】
本発明に係る水溶性ナノ粒子において好ましい多官能基配位子の他の例は、疏水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）官能基と親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）官能基を同時に有している両親媒性（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ）配位子である。有機溶媒上で合成されたナノ粒子の場合、その表面には疏水性の長い炭素鎖からなる配位子が存在している。この時、付加される両親媒性配位子に存在する疏水性官能基とナノ粒子表面の疏水性配位子が分子間相互作用によって結合されナノ粒子を安定化させ、ナノ粒子の最外側には親水性官能基が出て、結果的に水溶性ナノ粒子を製造することができる。ここで、分子間相互作用は疏水結合、水素結合、ファンデルワールス結合などを含む。この時、ナノ粒子と疏水性相互作用によって結合される部分が付着領域（ＬＩ）であり、これと共に有機化学的な方法によって交差連結領域（ＬＩＩ）および活性成分結合領域（ＬＩＩＩ）を導入することができる。
【００３６】
また、水溶液中での安定度の増加のために、このようないくつかの疏水性官能基と親水性官能基が結合している多重両親媒性配位子として、ポリマーを用いるか連結分子を用いて表面を交差連結させることができる。このような相転移配位子として好ましい両親媒性配位子の例として、先ず疏水性官能基に含まれるものは、炭素数が２以上である鎖からなって線形または分岐構造を有している疏水性分子であり、より好ましくはエチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、イコシル、テトラコシル、ドデシル、およびシクロペンチル、シクロヘキシルなどのアルキル官能基と、エチニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、オクテニル、デセニル、オレイルなどの炭素−炭素２重結合、およびプロピニル、イソプロピニル、ブチニル、イソブチニル、オクチニル、デシニルなどの炭素−炭素３重結合を有する不飽和炭素鎖を有する官能基などが挙げられる。
また、親水性官能基に含まれるものは、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＰＯ３Ｈ、−ＰＯ４Ｈ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ−ＮＲ４＋Ｘ−などのように、特定ｐＨでは中性を示すが、より高いか低いｐＨでは正電荷または負電荷を帯びる官能基をいう。
このような好ましい例としてポリマーおよびブロックコポリマーなどを用いることができ、ここで用いられるモノマーとしてはアクリル酸、アルキルアクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマル酸、アクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、ビニルスルホン酸、ビニルリン酸、ビニル乳酸、スチレンスルホン酸、アリルアンモニウム、アクリロニトリル、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルホルムアミドなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３７】
本発明に係る水溶性ナノ粒子において好ましい多官能基配位子の他の例はペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）である。ペプチドは数個のアミノ酸からなるオリゴマー／ポリマーであり、アミノ酸は両末端に−ＣＯＯＨと−ＮＨ２官能基を有しているため、ペプチドは自然に付着領域と活性成分結合領域を備えるようになる。
【００３８】
本発明で用いられる多官能基配位子は、生分解性高分子と結合した形態であり得る。前記生分解性高分子の例にはデキストラン、カルボデキストラン、多糖類、シクロデキストラン、プルラン、セルロース、デンプン、グリコーゲン、炭水化物、単糖類、二糖類およびオリゴ糖類、ポリホスファゼン、ポリラクチド、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、ポリカプロラクトン、ポリ無水物、ポリリンゴ酸、ポリリンゴ酸の誘導体、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリヒドロオキシブチレート、ポリカルボネート、ポリオルトエステル、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−リジン、ポリグリコリド、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルピロリドンなどが含まれる。
【００３９】
また他の観点において、本発明では、前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子の活性成分結合領域に、生体機能性を示す化学機能性分子および生体機能性物質を結合させた水溶性マンガン酸化物ナノハイブリッド粒子を提供する。
【００４０】
本発明において、水溶性マンガン酸化物ナノハイブリッド粒子の１例として水溶性マンガン酸化物に化学機能性分子が結合された形態がある。化学機能性分子には様々な機能性モノマー、ポリマー、無機担体などが含まれる。ここで、モノマーの例としては、様々な種類のモノマーとして、抗ガン剤、抗生剤、ビタミン、葉酸を含む薬物、脂肪酸、ステロイド、ホルモン、プリン、ピリミジン、単糖類、二糖類が挙げられるが、これに限定されるものではない。高分子の例としてはデキストラン、カルボデキストラン、多糖類、シクロデキストラン、プルラン、セルロース、デンプン、グリコーゲン、炭水化物、単糖類、二糖類およびオリゴ糖類、ポリホスファゼン、ポリラクチド、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、ポリカプロラクトン、ポリ無水物、ポリリンゴ酸およびポリリンゴ酸の誘導体、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリヒドロオキシブチレート、ポリカルボネート、ポリオルトエステル、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−リジン、ポリグリコリド、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。無機担体の例としてはシリカ（ＳｉＯ２）、チタニア（ＴｉＯ２）、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）、炭素物質（ナノチューブ、黒鉛、フラーレンなど）、半導体基板（ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＺｎＯ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、Ｓｉ、ＧａＡｓ、ＡｌＡｓなど）、金属基板（Ａｕ、Ｐｔ、Ａｇ、Ｃｕなど）が挙げられるが、これに制限されるものではない。
【００４１】
本発明のナノハイブリッド粒子の１例は、水溶性マンガン酸化物ナノ粒子と生体機能性物質が選択的に結合された形態のものである。生体機能性物質には、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、ハプテン（ｈａｐｔｅｎ）、アビジン（ａｖｉｄｉｎ）、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）、ニュートラビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、レクチン（ｌｅｃｔｉｎ）、セレクチン（ｓｅｌｅｃｔｉｎ）のような組織特異的結合成分（ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）；抗ガン剤、抗生剤、ホルモン、ホルモン拮抗剤、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）、インターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）、成長因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）、エンドトキシン（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）、リンホトキシン（ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ）、ウロキナーゼ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）、ストレプトキナーゼ（ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ）、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、プロテアーゼ阻害剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、アルキルホスホコリン（ａｌｋｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏＬＩｎｅ）、界面活性剤、心血管系薬物（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、胃腸管系薬物（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、神経系薬物（ｎｅｕｒｏ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のような薬剤学的活性成分、加水分解酵素、酸化−還元酵素、分解酵素、異性化酵素、合成酵素などの生体活性酵素、酵素補助因子（ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｆａｃｔｏｒ）、酵素抑制剤（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）などが含まれるが、これに制限されるものではない。
【００４２】
本発明によって形成された水溶性マンガン酸化物ナノハイブリッド粒子は、既存の酸化鉄を含むＭＲＩ造影剤に比べて優れた磁気モーメントを有するため、遥かに高いレベルの高感度診断を可能にする。また、既存の用いられていたＭＲＩ造影剤に比べて、より少ない量だけを用いても所望する程度の信号増加効果をもたらすことができ、既存の物質に比べて体内毒性および副作用がさらに少ない造影剤として用いることができる。
【００４３】
以下にて、本発明の水溶性マンガン酸化物ナノ粒子の製造方法について具体的に説明する。
【００４４】
本発明に係る水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は、当業界に知られている気相（ｇａｓ  ｐｈａｓｅ）におけるナノ粒子合成法、あるいは水溶液、有機溶媒、または多溶媒系などを含む液相（ｌｉｑｕｉｄ  ｐｈａｓｅ）におけるナノ粒子合成法によって得ることができる。
【００４５】
本発明のナノ粒子の好ましい製造方法の１例として、（１）水不溶性ナノ粒子を有機溶媒において合成するステップ、（２）前記水不溶性ナノ粒子を第１溶媒に溶解し、水溶性多官能基配位子を第２溶媒に溶解するステップ、（３）前記ステップ（２）による２つの溶液を混合して水不溶性ナノ粒子の表面に多官能基配位子を導入させ、水溶液に溶解して分離するステップによって製造することができる。
【００４６】
上述した製造方法のステップ（１）は、水不溶性ナノ粒子の製造方法に関するものである。本発明では、１例として、表面安定剤を含む１０〜６００℃の有機溶媒にナノ粒子先駆物質を投入し、目的とする水不溶性ナノ粒子を製造するのに適した温度および時間を維持し、前記ナノ粒子先駆物質を化学反応してナノ粒子を成長させた後、これより形成された水不溶性ナノ粒子を分離および精製するステップを経て水不溶性ナノ粒子を製造することができる。
【００４７】
前記有機溶媒としては、ベンゼン系溶媒（例えば、ベンゼン、トルエン、ハロベンゼンなど）、炭化水素溶媒（例えば、オクタン、ノナン、デカンなど）、エーテル系溶媒（例えば、ベンジルエーテル、フェニルエーテル、炭化水素エーテルなど）、ポリマー溶媒、イオン性液体溶媒を用いることができるが、これに制限されるものではない。
【００４８】
前記製造方法のステップ（２）においては、先に製造されたナノ粒子を第１溶媒に溶解する一方、多官能基配位子を第２溶媒に溶解する。前記第１溶媒としては、ベンゼン系溶媒（例えば、ベンゼン、トルエン、ハロベンゼンなど）、炭化水素溶媒（例えば、ペンタン、ヘキサン、ノナン、デカンなど）、エーテル系溶媒（例えば、ベンジルエーテル、フェニルエーテル、炭化水素エーテルなど）、ハロ炭化水素（例えば、塩化メチレン、臭化メタンなど）、アルコール類（例えば、メタノール、エタノールなど）、スルホキシド系溶媒（例えば、ジメチルスルホキシドなど）、アミド系溶媒（例えば、ジメチルホルムアミドなど）などを用いることができる。前記第２溶媒としては前述した第１溶媒として用いることができる溶媒の他にも、水を用いることができる。
【００４９】
前記製造方法のステップ（３）においては前記２つの溶液を混合するが、このとき、水不溶性ナノ粒子の有機性表面安定剤が水溶性多官能基配位子で置換される。このように、水溶性多官能基配位子で置換されたナノ粒子は、当業界において公知の方法を用いて分離することができる。一般的に、水溶性ナノ粒子は沈殿物として生成されるため、遠心分離または濾過によって分離することが好ましい。前記分離後には、より安定に分散している水溶性ナノ粒子を収得するために、滴定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）するステップを経てｐＨを５〜１０に調節することが好ましい。
【００５０】
また本発明の水溶性ナノ粒子は、他の方法として、水溶液中での金属前駆体物質の化学反応を通した結晶成長によって合成することもできる。この方法は、多官能基配位子を含む水溶液にマンガンイオン前駆体物質を添加することによって、水溶性マンガン酸化物ナノ粒子を合成する方法であり、既存の公知された水溶性ナノ粒子の合成方法によってなされ得る。
【００５１】
以下にて、水溶性マンガン酸化物のナノ物質を含むＭＲＩ造影剤を用いた応用について具体的に説明する。
【００５２】
水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は、既存の酸化鉄ナノ粒子に比べて遥かに優れたスピン−スピン緩和磁気共鳴映像信号の増幅効果（Ｒ２スピン−スピン緩和係数：〜３６０Ｌｍｏｌ−１ｓｅｃ−１）を示す。そのため、既存の磁気共鳴映像を用いた診断を画期的に発展させ、疾病の早期診断および極少量の生体分子の検出を可能にする。一般的に癌細胞のような病原体の表面には、特に過発現する生物学的マーカーが存在する。当業界における公知の方法により、このような生物学的マーカーと選択的に結合可能な抗体を得ることができる。既に知られた物質を用いることもできる。このような方法によって得た抗体などの物質と水溶性マンガン酸化物ナノ粒子を、上記で説明した方法の通りにナノ粒子の活性成分結合領域に結合させる。このように合成されたハイブリッド粒子は選択的に癌細胞と結合することができる。このようにして、癌細胞に表示された磁性粒子は磁気共鳴映像信号を示すようになって診断が可能となる。
【００５３】
この時、水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は既存に用いられてきた酸化鉄を含む磁性ナノ粒子に比べて遥かに優れた敏感度を有しているため、遥かに高感度の癌診断を可能にする。よって、遥かに小さい大きさの癌細胞の診断を介した癌の早期診断を可能にする。
【００５４】
また、本発明で提示された水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は、ｐＨ変化、温度変化などの外部刺激によって、マンガンイオンを放出させることができる。このように放出されたマンガンイオンは、磁気共鳴映像において、Ｔ１スピン−格子緩和時間を増加させＴ１造影効果を示すことができる。そのため、特定の生体内環境変化によるマンガンイオンの放出を通して、磁気共鳴映像診断が可能である。
【００５５】
また、水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は、他の診断プローブと結合し、二重または多重の診断プローブとして用いることができる。例えば、水溶性マンガン酸化物にＴ１磁気共鳴映像診断プローブを結合させると、Ｔ２磁気共鳴映像およびＴ１磁気共鳴映像の診断を同時に進行することができ、光学診断プローブを結合させると磁気共鳴映像と光学イメージングを同時に行うことができ、ＣＴ診断造影剤を結合させると磁気共鳴映像とＣＴ診断を同時に行うことができる。また、放射性同位元素と結合させると磁気共鳴映像とＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ診断を同時に行うことができる。
【実施例】
【００５６】
以下の実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者であれば明らかである。
【００５７】
実施例１：マンガンフェライト（ＭｎＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子と、酸化鉄、コバルトフェライト、およびニッケルフェライトナノ粒子の磁気共鳴映像効果の比較
本明細書で開発されたマンガンフェライトナノ粒子（１２ｎｍ）が、既存の酸化鉄および他の金属フェライトナノ粒子よりも、さらに良い磁気共鳴映像造影効果を示すことを確認するために、同じ大きさの酸化鉄、コバルトフェライトおよびニッケルフェライトのナノ粒子（ＭＦｅ２Ｏ４、Ｍ＝Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ）の磁化率およびＲ２スピン−スピン緩和磁気共鳴映像を測定した。
【００５８】
先ず、各々のナノ粒子は、大韓民国特許第１０−０６０４９７６号、大韓民国特許第１０−０６５２２５１号、ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００２５０９、大韓民国特許第１０−０６０４９７６号、ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００３０８８、大韓民国特許出願第２００６−００１８９２１号に開示された方法によって合成した。得られたナノ粒子は、図１（ａ）に示すように、全部同じ大きさの均一な１２ｎｍ大きさの球状であり、その表面はジメルカプトコハク酸でコーティングされている。
【００５９】
得られた各々のナノ粒子の磁化率を測定するために、ＭＰＭＳ  ｓｕｐｅｒｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｄｅｖｉｃｅ（ＳＱＵＩＤ）  ｍａｇｎｅｔｏｍｅｔｅｒを用い、−５Ｔ〜５Ｔ範囲の外部磁場大きさの変化を与えて観測した。
【００６０】
図１（ｂ）に示すように、マンガンフェライトナノ粒子は１１０ｅｍｕ／ｇ（Ｍｎ＋Ｆｅ）（＠１．５Ｔ）において最も高い磁気的性質を示す反面、酸化鉄ナノ粒子およびコバルトフェライト、ニッケルフェライトのナノ粒子はこれより低い磁気的性質を示す（各々１０１、９９、８５ｅｍｕ／（ｇ（Ｍ＋Ｆｅ））。このような結果は、スピネル構造を有する金属フェライトナノ粒子に各々異なるｄオービタルスピンモーメントを有する金属イオン置換効果に起因する。
【００６１】
このようなナノ粒子の磁気共鳴映像の造影効果を調べるために、Ｔ２スピン−スピン緩和磁気共鳴映像を測定した。このためにｍｉｃｒｏ−４７コイルが装着された１．５Ｔ（Ｉｎｔｅｒａ；Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｓｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）システムを使った。磁気共鳴映像結果はＣａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌ（ＣＰＭＧ）ｓｅｑｕｅｎｃｅを利用して得た。具体的なパラメータは次の通りである：解像度１５６  ｘ  １５６μｍ、切片厚さ０．６ｍｍ、ＴＥ＝２０ｍｓ、ＴＲ＝４００ｍｓ、映像励起回数１、映像獲得時間６分。
【００６２】
図１（ｃ）に示すように、マンガンフェライトナノ粒子が最も強い磁気共鳴映像信号（黒色）を示し、酸化鉄、コバルトフェライト、ニッケルフェライトの磁気共鳴映像信号が次第に淡い灰色に変わりながら減少することが分かる。マンガンフェライトナノ粒子の、造影効果比較の尺度であるＲ２スピン−スピン緩和係数は３５８ｍＭ−１ｓ−１であり、同じ大きさを有している酸化鉄を含む他の金属フェライトナノ粒子に比べて、遥かに高い値を示すことが分かる。これは、当業界において現在まで最も良い分子ＭＲＩ造影剤と知られているｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ（ＣＬＩＯ）酸化鉄ナノ粒子のＲ２係数（６８ｍＭ−１ｓ−１）の、約５倍以上高い値である（図１（ｄ））。
【００６３】
このようなマンガンフェライトナノ粒子の優れた磁気共鳴造影効果が、コーティングされた配位子に関わらず、常に示されるかどうかを確認するために、様々な多官能基配位子でコーティングされたマンガンフェライトナノ粒子と酸化鉄ナノ粒子との磁気共鳴造影効果を比較した。配位子としては、上記で提示したジメルカプトコハク酸に加えて、一般的に多く用いられる配位子である３−カルボキシルプロピルホスホン酸とデキストランを用いた。
【００６４】
図１（ｅ）と図１（ｆ）に示すように、多官能基配位子の種類に関わらず、マンガンフェライトナノ粒子が、酸化鉄ナノ粒子に比べて常に高い磁気共鳴映像信号（黒色）を示した。またＲ２−緩和時間図表から分かるように、水溶性マンガン酸化物ナノ粒子が、既存の酸化鉄ナノ粒子に比べて、約２０〜１２０％、さらに強い信号を示すことを確認することができた。
【００６５】
磁気共鳴映像造影効果は、粒子の大きさによっても大きく影響を受けるため、様々な大きさのマンガンフェライトナノ粒子と、それと同じ大きさの酸化鉄ナノ粒子との磁気共鳴映像効果に対する比較を行った。このために、６，９，１２ｎｍ大きさのマンガンフェライトナノ粒子および酸化鉄ナノ粒子を、大韓民国特許第１０−０６０４９７６号、大韓民国特許第１０−０６５２２５１号、ＰＣＴ  ＫＲ２００４／００２５０９、大韓民国特許第１０−０６０４９７６号、ＰＣＴ  ＫＲ２００４／００３０８８、大韓民国特許出願第２００６−００１８９２１号に開示された方法によって合成した。合成した粒子を、前記で提示されたＣａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌ（ＣＰＭＧ）ｓｅｑｕｅｎｃｅを利用して、磁気共鳴映像を測定した。
【００６６】
図２（ａ）には、合成されたナノ粒子の電子顕微鏡写真を示す。得られたマンガンフェライトナノ粒子の質量磁化率は、図２（ｂ）に示すようにその大きさが増加するにつれて高まることが分かる。マンガンフェライトナノ粒子の大きさが増加するにつれ、磁気共鳴イメージが次第に黒色に変化しながら信号が強まることが分かり（図２（ｃ）、測定されたＲ２緩和係数も増加することが分かる（図２（ｄ））。同じ大きさのマンガンフェライトナノ粒子と酸化鉄ナノ粒子を比較した場合は、６，９，１２ｎｍのすべての大きさにおいて、マンガンフェライトナノ粒子が酸化鉄ナノ粒子よりも増加した造影効果を示すことを確認することができる。
【００６７】
実施例２：様々な多官能基配位子で囲まれた水溶性マンガンフェライトナノ粒子の水溶液上のコロイド安定性の確認
水溶性マンガンフェライトナノ粒子の水溶液上のコロイド安定性を確認するために、アガロースゲル電気泳動分析および様々な塩濃度および酸度における安定性検査を行った。各々の様々な配位子でコーティングされたマンガンフェライトナノ粒子は、大韓民国特許第１０−０６０４９７６号、大韓民国特許第１０−０６５２２５１号、ＰＣＴ  ＫＲ２００４／００２５０９、大韓民国特許第１０−０６０４９７６号、ＰＣＴ  ＫＲ２００４／００３０８８、大韓民国特許出願２００６−００１８９２１号に開示された方法によって合成した。
【００６８】
図３（ａ）に示すように、配位子としてジメルカプトコハク酸で囲まれたナノ粒子は、アガロースゲルにおいて細い電気泳動バンドを示し、（＋）電極側に移動することから、水溶液においてムラなく均一な大きさでよく分散していることを確認できる。また、様々な種類の水溶性配位子で表面安定化した水溶性マンガンフェライトナノ粒子に対し、安定度検査を行った（図３（ｂ）〜図３（ｉ））。その結果、全種類のナノ粒子とも、０．２Ｍの塩濃度およびｐＨ５〜ｐＨ９で安定しており、デキストラン、ヒプロメロース、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）、ヒト血清アルブミン、ニュートラビジンで表面安定化したナノ粒子の場合には、１Ｍの塩濃度ですら安定していることを確認した。
【００６９】
なかでも、デキストラン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミンで表面安定化したナノ粒子は、非常に広範囲の酸度（ｐＨ１〜ｐＨ１１）において非常に高いコロイド安定性を有することを確認した。また、オクチルアミン−ポリアクリル酸共重合体高分子を用い、疏水結合によって表面安定化したナノ粒子の場合にも０．５Ｍ塩濃度およびｐＨ３〜１１の範囲で安定していた。これは、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはＩｎ  ｖｉｖｏ実験における塩濃度が約０．１Ｍであることを考慮する時、非常に高い水溶液性コロイド安定性を示すことを意味する。
【００７０】
実施例３：乳癌診断用マンガンフェライトハーセプチンナノハイブリッド粒子の製造
ナノハイブリッド製造過程に関する要約図を図４（ａ）に示す。ハーセプチン［（１０ｍｇ／ｍｌ、ｉｎ  １０ｍＭリン酸緩衝溶液、ｐＨ７．２）Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ］１００μｌを取ってエッペンドルフチューブに入れた後、０．２ｍｇのｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ［４０（Ｎ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ３−ｓｕｌｆｏ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｓｕｃｃｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ］を添加し、室温で３０分間反応させて、ハーセプチンのリジン残基をマレイミド基で置換させた。過量のｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ分子はＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  ｃｏｌｕｍｎを通して除去した後、マレイミド基で置換されたハーセプチンを、２００μｌの水溶性マンガンフェライトナノ粒子を含有した溶液（１０ｍＭ  ＰＢ、ｐＨ７．２、２ｍｇ／ｍｌ）と、２４時間室温で反応させた。
【００７１】
反応が完了した後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ｃｏｌｕｍｎを通して反応しないハーセプチンと酸化鉄水溶性ナノ粒子を除去した後、セントリコン濾過キット（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）を利用し、約２ｍｇ／ｍｌの濃度に濃縮させる過程によって、マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子を製造した。製造されたナノハイブリッド粒子を、アガロースゲル電気泳動実験によって分析した。クマシー・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ）タンパク質の染色の結果、ナノハイブリッドが生成されたことを確認することができた（図４（ｂ））。
【００７２】
実施例４：マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子のＩｎ  Ｖｉｔｒｏにおける腫瘍細胞選択性確認および酸化鉄ナノハイブリッド粒子との感度比較
実施例３で製造されたマンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子の、乳癌表示抗原であるＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原に対する結合特異性および効率を分析するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ磁気共鳴映像実験を行った。
【００７３】
ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原の未発現、発現、および過発現の細胞株に対し、マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子を反応させる過程は、次の通りである。先ず、前記細胞株を室温で０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて分離した。マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子を、１０７細胞を含む５０μｌのＰＢＳ緩衝溶液に、ナノ粒子基準で２．５ｎＭ濃度で添加した。これを４℃で３０分間反応させた後に３回洗浄した。一方、対照群としてＣＬＩＯ−ハーセプチンナノハイブリッド粒子を用いた。
【００７４】
磁気共鳴映像を利用して、マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子の抗原特異性を分析するために、各々の細胞をＰＣＲ用チューブに移した後に遠心分離して、細胞を沈殿させた。各細胞株の抗原特異性による磁気共鳴映像の造影効果を調べるために、１．５Ｔ（Ｉｎｔｅｒａ；Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｓｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）システムを使い、ｍｉｃｒｏ−４７コイルを利用した。Ｆａｓｔ  Ｆｉｅｌｄ  Ｅｃｈｏ（ＦＦＥ）パルスシーケンスをもって、冠状面の映像を得た。具体的なパラメータは次の通りである：解像度１５６  ｘ  １５６μｍ、切片厚さ０．６ｍｍ、ＴＥ＝２０ｍｓ、ＴＲ＝４００ｍｓ、映像励起回数１、映像獲得時間６分。
【００７５】
抗原特異性に対する磁気共鳴映像造影効果の定量的評価を行うために、Ｔ２マップを行った。具体的なパラメータは次の通りである：解像度１５６  ｘ  １５６μｍ、切片厚さ０．６ｍｍ、ＴＲ＝４０００ｍｓ、ＴＥ＝２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０ｍｓ、映像励起回数２、映像獲得時間４分。
【００７６】
図５の結果は、マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッドがＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍マーカーを、磁気共鳴映像を通して検知する評価を示す。図から分かるように、最も低いＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するＢｘ−ＰＣ−３細胞の場合、〜１０％映像造影の増強効果（ΔＲ２／Ｒｃｏｎｔｒｏｌ）を示し、腫瘍マーカーを効果的に検知することができた（図５（ａ）、図５（ｂ））。また、より多いＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する細胞、すなわち、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ−７、ＮＩＨ３Ｔ６．７細胞の場合には、〜４０％、７０％、１３０％の造影増強効果を示すことが分かった（図５（ａ）、図５（ｂ））。
【００７７】
その一方、対照群ＣＬＩＯ−ハーセプチンナノハイブリッドの場合、最も高いＨＥＲ２／ｎｅｕ発現を示すＮＩＨ３Ｔ６．７細胞の場合にだけ、〜１０％の造影増強効果を示し、これより低い腫瘍マーカー発現を示す細胞に対しては６％以下の微々たる造影効果だけを示した（図５（ｃ））。
【００７８】
開発されたマンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッドをＮＩＨ３Ｔ６．７細胞に投与した場合と、ＣＬＩＯ−ハーセプチンナノハイブリッドをＮＩＨ３Ｔ６．７細胞に投与した場合との、Ｒ２緩和係数の変化を比較すると、本明細書で提示されたマンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッドを用いたときに、約１３倍程度の大きいＲ２緩和係数の変化があることを確認することができる。
【００７９】
また、マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッドを投与したＢｘ−ＰＣ−３細胞と、ＣＬＩＯ−ハーセプチンナノハイブリッドを投与したＮＩＨ３Ｔ６．７細胞とにおいて、ほぼ同じ造影増強効果を示すことと；２つの細胞のＨＥＲ２／ｎｅｕ発現比率が、１（Ｂｘ−ＰＣ−３）：〜２３００（ＮＩＨ３Ｔ６．７）であることを考慮すると、開発されたマンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッドが、既存の酸化鉄−ハーセプチンナノハイブリッドに比べ、乳癌マーカーの約２３００倍の検出限界の増加を示すことを確認することができた（図５（ｄ））。
【００８０】
実施例５：マンガン酸化物の細胞安定性評価
このようなナノ粒子がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて磁気共鳴映像診断剤として用いられるためには、このようなナノ粒子の安定性評価も重要である。よって、実施例１で合成されたジメルカプトコハク酸でコーティングされたマンガンフェライトナノ粒子、および実施例４で用いたマンガンフェライト−ハーセプチンハイブリッドナノ粒子の、細胞毒性実験を行った。図６に示すように、前記２つのナノ粒子は２００μｇ／ｍｌまでの実験範囲濃度において、ほぼ〜１００％の細胞生存率を示し、毒性を示さないことを確認することができた。
【００８１】
実施例６：酸化マンガン（Ｍｎ３Ｏ４）を用いたＴ２磁気共鳴映像診断
水溶性酸化マンガンナノ粒子のＴ２磁気共鳴映像効果を調べるために、３ｎｍ  ｘ  ８ｎｍ大きさの酸化マンガンナノ粒子溶液のＴ２マップ磁気共鳴映像を測定した。図６に示されている酸化マンガンナノ粒子は、大韓民国特許第１０−０６０４９７６号、大韓民国特許第１０−０６５２２５１号、ＰＣＴ  ＫＲ２００４／００２５０９、大韓民国特許第１０−０６０４９７６号、ＰＣＴ  ＫＲ２００４／００３０８８、大韓民国特許出願第２００６−００１８９２１号に開示された方法によって合成した。得られたナノ粒子の電子顕微鏡写真は図７（ａ）に示す。ナノ粒子が含まれていない水溶液に比べて、Ｔ２磁気共鳴映像において大きい造影効果を示すことができた（図７）。よって、酸化マンガンナノ粒子はＴ２造影剤として用いることができることが分かる。
【００８２】
実施例７：マンガンイオン放出効果を用いたＴ１磁気共鳴映像診断
マンガンフェライトおよび酸化マンガンナノ粒子に含まれているマンガンイオン放出効果を利用して、Ｔ１磁気共鳴映像診断が可能であるかを確認するために、ｐＨ変化に応じたＴ１磁気共鳴映像を測定した。
【００８３】
磁気共鳴映像の造影効果を調べるために、１．５Ｔ（Ｉｎｔｅｒａ  ＰｈｉＬＩｐｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｓｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）システムを使い、ｍｉｃｒｏ−４７コイルを利用した。Ｆａｓｔ  Ｆｉｅｌｄ  Ｅｃｈｏ（ＦＦＥ）パルスシーケンスをもって冠状面の映像を得た。具体的なパラメータは次の通りである：解像度１５６  ｘ  １５６μｍ、切片厚さ０．６ｍｍ、ＴＥ＝２０ｍｓ、ＴＲ＝４００ｍｓ、映像励起回数１、映像獲得時間６分。マンガンフェライトナノ粒子は実施例１で合成された１２ｎｍ大きさのナノ粒子を用い、酸化マンガンナノ粒子は実施例６で合成されたナノ粒子を用いた。
【００８４】
図８（ｂ）に示すように、マンガンフェライトナノ粒子の場合、中性の溶液中では非常に弱いＴ１造影効果が示すが（図８ｂ（９））；酸性の低いｐＨ（ｐＨ＝２、４）溶液中ではマンガンフェライトナノ粒子からＭｎ２＋が放出され、磁気共鳴映像結果においてＴ１信号が明るい色に変わる造影効果を示す（図８ｂ（７）、図８ｂ（８））。また、図８（ｃ）に示すように、中性の溶液中では酸化マンガンが全くＴ１造影効果を示さないが（図８ｃ（１２））；酸性の低いｐＨ（ｐＨ＝２）溶液では酸化マンガンナノ粒子からＭｎ２＋が放出され、磁気共鳴映像結果においてＴ１信号が明るい色に変わる造影効果を示す（図８ｃ（１１）、図８ｃ（１６））。
【００８５】
ナノ粒子が溶解してできたＭｎ２＋に対する定量化のために、所定の濃度のＭｎ２＋イオンを含む溶液に対するＴ１を測定して、検量線を作成した（図８（ａ））。これに基づき、図８（ｅ）に示すように、酸化マンガンナノ粒子の場合、ｐＨ４において１５０μＭのＭｎ２＋イオンが、ｐＨ２において２００μＭのＭｎ２＋イオンが、溶液中に存在することが分かった。同じく、ＭｎＦｅ２Ｏ４ナノ粒子の場合にも、検量線を利用してｐＨ２、ｐＨ４において存在するＭｎ２＋濃度の増加を確認することができた（図８（ｄ））。
【００８６】
よって、酸化マンガンナノ粒子は、特定位置に注入した後、外部刺激によってＭｎ２＋を放出して、Ｔ１造影効果を示す診断プローブとして使用可能であることを確認することができた。
【００８７】
実施例８：水溶性マンガンフェライトナノ粒子−ハーセプチンハイブリッドシステムを利用したＩＮ  ＶＩＶＯ高感度癌診断
水溶性マンガンフェライトハーセプチンナノハイブリッドシステムを利用し、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＲＩ上において、小さい大きさの乳癌組織を診断するのに成功した。マンガンフェライトナノ粒子−ハーセプチンハイブリッド粒子は、実施例３に示す通りに合成した。Ｈｅｒ２／ｎｅｕマーカーが過発現したＮＩＨ３Ｔ６．７細胞株が移植された後に３日経過後に、腫瘍大きさが５ｍｍ  ｘ  ５ｍｍ  ｘ  ２ｍｍに育ったヌードマウス（ｎ＝８）に、この物質を尾静脈注射で２０ｍｇ／ｋｇの濃度で注射した。注射後１，２，８時間が経過した後に、磁気共鳴映像を測定した。これと共に、対照群としてＣＬＩＯ−ハーセプチンハイブリッドおよび酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）−ハーセプチンナノハイブリッドを用いて同じ実験を行った。
【００８８】
図９に示すカラーコーディングされた磁気共鳴映像結果により、マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド（図９（ａ）〜図９（ｃ））を、酸化鉄−ハーセプチンナノハイブリッド（図９（ｄ）〜図９（ｆ））およびＣＬＩＯ−ハーセプチンナノハイブリッド（図９（ｇ）〜図９（ｉ））と比較すると、腫瘍部位において、２時間が経過した後に初めてのものと比較したときに、その色が赤色から青色に完全に変わることが分かる。一方、酸化鉄−ハーセプチンナノハイブリッドの場合は、２時間が経過した後にその色が赤色から赤色と黄色が混合している状態に変化する。ＣＬＩＯ−ハーセプチンナノハイブリッドの場合は、２時間が経過した後に全く色の変化がなかった。
【００８９】
また、各々の物質に対して腫瘍部位のＭＲ  Ｒ２変化値（ΔＲ２／Ｒ２ｃｏｎｔｒｏｌ）を測定してみた結果、図９（ｊ）に示すように、マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッドの場合は、８時間経過した後に３５％のＲ２緩和係数の変化が観測された。一方、酸化鉄−ハーセプチンナノハイブリッドおよびＣＬＩＯ−ハーセプチンナノハイブリッドの場合は、各々１０％と３％のＲ２緩和係数の変化が観察された。
【００９０】
上記の結果により、マンガンフェライト−ハーセプチンハイブリッド粒子を磁気共鳴映像癌診断造影剤として用いた場合には、既存の物質−酸化鉄およびＣＬＩＯ−に比べ、さらに優れた信号増強効果をもたらすことが分かり、これにより、小さい大きさの癌診断に成功した。
【００９１】
実施例９：放射性同位元素１１１Ｉｎで表示されたマンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子のＩＮ  ＶＩＶＯ生体分布
マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子に放射性同位元素である１１１Ｉｎを付けて、ｉｎ  ｖｉｖｏ上における体内分布を確認した。Ｉｎ  ｖｉｖｏ実験に使ったマウスは、実施例７で使ったものと同じ条件のマウス（ｎ＝３）を使った。１１１Ｉｎで表示されたマンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子は、次のような方法によって合成された。先ず、１０ｍｇのハーセプチンを１ｍｌの２．５ｍＭ  ｐＨ６．５の酢酸ナトリウムバッファに溶かした後、各々１ｍｇのＤＴＰＡ（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｔｒｉａｍｉｎｅ  ｐｅｎｔａａｃｅｔａｔｅ）とｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを混ぜた。１時間の反応後、マレイミドおよびＤＴＰＡで活性化したハーセプチンを、セファデックスＧ−２５カラムを通して分離し、直ちに４ｍｇの水溶性マンガンフェライトナノ粒子と混ぜて反応させた。
【００９２】
４時間後、反応せずに残っているハーセプチンおよびナノ粒子をセファクリルＳ−３００カラムで分離した後、分離したナノ粒子溶液に３ｍＣｉの１１１ＩｎＣｌ３を混ぜて反応させた。１時間の反応後、１１１Ｉｎで表示されたマンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子は、セファデックスＧ−２５カラムを用いて分離した後、０．４ｍｇ（Ｍ＋Ｆｅ）の物質を直ちに尾静脈注射でマウスの生体内に投入した。その後、ｇ−カメラおよびｇ−カウンターを使って生体分布図を調べた。
【００９３】
図１０（ａ）と図１０（ｂ）に示すように、２時間経過後、ナノハイブリッド粒子は主に肝臓、脾臓、膀胱などに分布することが分かり、尾の注射点にも強い信号が観察された。しかし、２４時間経過後、尾の注射地点における信号は減少し、腫瘍がある部位で信号が検知されることを確認した。それに基づき、その後、各々の臓器を摘出し、ｇ−カウンターを用いて生体分布を調べた結果、図１０（ｃ）に示すように、肝臓、脾臓、筋肉に各々１２．８±３．０、８．７±３．２、１．０±０．３の信号が示され、腫瘍においては３．４±０．７％ＩＤ／ｇの生体分布度を観察した。
【００９４】
実施例１１：光学−ＭＲＩ二重モード診断用ナノハイブリッドシステム
光学的性質と磁性を同時に有する診断用プローブを開発するために、ウシ血清アルブミンで表面安定化したマンガンフェライトナノ粒子に蛍光染料（ＦＩＴＣ）を付け、磁性と蛍光を同時に有するハイブリッド粒子を開発した（図１１（ａ））。このために、ウシ血清アルブミンに存在する−ＮＨ２のモル比で、２０倍程度過量のＮＨＳ−ＦＩＴＣをいれ、１０ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）において常温で２時間反応させた。その後、反応せずに残っている過量のＮＨＳ−ＦＩＴＣを、緩衝溶液上において透析（ＭＷＣＯ、〜２０００）によって除去した。その結果、図１１に示すように、この光学−磁性ハイブリッド粒子は蛍光を有し、且つ磁気共鳴映像信号も同時に有していることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、１２ｎｍ大きさのジメルカプトコハク酸で囲まれたマンガンフェライト（ＭｎＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子と、同じ大きさの酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、コバルトフェライト（ＣｏＦｅ２Ｏ４）、ニッケルフェライト（ＮｉＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子との、磁気共鳴映像造影効果の比較である。図１（ａ）は合成されたナノ粒子の電子顕微鏡分析である。図１（ｂ）は合成されたナノ粒子に１．５Ｔ外部磁場を印加した時の質量磁化率である。図１（ｃ）と図１（ｄ）は各ナノ粒子のＴ２スピン−スピン緩和磁気共鳴造影効果の比較であり、各ナノ粒子のＴ２スピン−スピン磁気共鳴映像結果（図１（ｃ））およびＲ２（＝１／Ｔ２）緩和係数である。図１（ｅ）は様々な配位子で囲まれたマンガンフェライトナノ粒子と酸化鉄ナノ粒子との磁気共鳴映像造影効果の比較であり、（１）と（２）は各々デキストランで囲まれたマンガンフェライトナノ粒子と酸化鉄ナノ粒子、（３）と（４）は各々３−カルボキシプロピルホスフェートで囲まれたマンガンフェライトナノ粒子と酸化鉄ナノ粒子、（５）と（６）は各々ジメルカプトコハク酸で囲まれたマンガンフェライトナノ粒子と酸化鉄ナノ粒子を含む水溶液のＴ２スピン−スピン緩和磁気共鳴映像結果である。図１（ｆ）は各々の配位子で囲まれたマンガンフェライトナノ粒子と同じ大きさの酸化鉄ナノ粒子とのＲ２緩和係数の比較である。
【図２】図２は、色々な大きさのマンガンフェライトおよび酸化鉄のナノ粒子の磁気共鳴映像造影効果の比較である。図２（ａ）は６ｎｍ，９ｎｍ，１２ｎｍ大きさのマンガンフェライトナノ粒子の電子顕微鏡写真、図２（ｂ）は各大きさに応じたマンガンフェライトナノ粒子のヒステリシスループ（Ｈｙｓｔｅｒｅｓｉｓ  ｌｏｏｐｓ）、図２（ｃ）は各大きさに応じたマンガンフェライトナノ粒子のＴ２スピン−スピン緩和磁気共鳴映像結果、図２（ｄ）は各大きさに応じたマンガンフェライトおよび酸化鉄のナノ粒子のＲ２緩和係数の比較である。
【図３】図３は、様々な配位子で囲まれたマンガンフェライトナノ粒子のコロイド安定性の評価である。図３（ａ）は６ｎｍ，９ｎｍ，１２ｎｍ大きさを有するジメチルメルカプトコハク酸で囲まれたマンガンフェライトナノ粒子のアガロースゲル電気泳動写真である。図３（ｂ）〜図３（ｉ）は、色々な配位子でコーティングされたマンガンフェライトナノ粒子の塩（ＮａＣｌ）溶液およびｐＨ変化に応じたコロイド安定性および溶解度のテストである。
【図４】図４は、マンガンフェライト（１２ｎｍ）−ハーセプチンナノハイブリッド粒子の製造過程（ａ）と合成されたナノハイブリッドのアガロースゲル電気泳動上のクマシー・ブルータンパク質染色結果（ｂ）である。
【図５】図５は、マンガンフェライト−ハーセプチンハイブリッドナノ粒子を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ乳癌の磁気共鳴映像診断感度の評価である。図５（ａ）は用いられた癌細胞（Ｂｘ−ＰＣ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ−７、ＮＩＨ３Ｔ６．７）の相対的なＨＥＲ２／ｎｅｕ乳癌マーカー発現程度である。図５（ｂ）はマンガンフェライト−ハーセプチンハイブリッドナノ粒子を各々の癌細胞に処理した後に得たＴ２スピン−スピン緩和磁気共鳴映像結果である。図５（ｃ）は対照群として既に知られている代表的な分子ＭＲＩ造影剤であるｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ（ＣＬＩＯ）を各々の癌細胞に投与した後に得た磁気共鳴映像結果である。図５（ｄ）は図５（ｂ）と図５（ｃ）で提示された磁気共鳴映像結果のＲ２緩和信号に対するグラフである。
【図６】図６は、マンガンフェライトナノ粒子およびマンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子の細胞毒性実験に対する結果を示すものである。図６（ａ）と図６（ｂ）はマンガンフェライトナノ粒子を各々ＨｅＬａおよびＨｅｐＧ２細胞に投与した時の細胞生存度を示すものであり、図６（ｃ）と図６（ｄ）はマンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子を各々ＨｅＬａおよびＨｅｐＧ２細胞に投与した時の細胞生存度を示すものである。
【図７】図７は、酸化マンガンナノ粒子の電子顕微鏡写真（ａ）と、このナノ粒子のＴ２スピン−スピン緩和磁気共鳴映像結果（ｂ）である。対照群としてはナノ粒子を含まない水が用いられた。
【図８】図８は、酸化マンガンナノ粒子のマンガンイオン放出によるＴ１スピン−格子磁気共鳴映像結果である。図８（ａ）は標準物質としてＭｎ２＋イオンのＴ１スピン−格子磁気共鳴映像結果であり、図８（ｂ）と図８（ｃ）は各々マンガンフェライトナノ粒子およびマンガン酸化物ナノ粒子がｐＨ２、４、７水溶液に溶けている時、マンガンイオン放出によるＴ１スピン−格子造影効果を示す磁気共鳴映像結果である。図８（ｄ）と図８（ｅ）は図８（ｂ）と図８（ｃ）の磁気共鳴映像結果から得たＲ１（＝１／Ｔ１）緩和信号に対するグラフである。
【図９】図９は、マンガンフェライト（１２ｎｍ）−ハーセプチンナノハイブリッド粒子を、ｉｎ  ｖｉｖｏ上において小さい大きさ（５０ｍｇ、２ｍｍ  ｘ  ５ｍｍ  ｘ  ５ｍｍ）の乳癌組織診断に応用した結果を示すものである。図９（ａ）〜図９（ｃ）は、マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子を股部に乳癌腫瘍細胞を有しているヌードマウスに投与した実験において、投与前（ａ）、１時間後（ｂ）および２時間後（ｃ）にスキャンしたＴ２スピン−スピン緩和磁気共鳴映像結果であり、前記マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子実験と同じ条件下において、図９（ｄ）〜図９（ｆ）は酸化鉄−ハーセプチンナノハイブリッド粒子を投与した後に得た磁気共鳴映像結果であり、図９（ｇ）〜図９(ｉ)はＣＬＩＯ−ハーセプチンハイブリッドナノ粒子を投与した後に得た磁気共鳴映像結果である。図面において、乳癌組織はＲ２スピン−スピン磁気緩和信号をカラーコーディング（ｃｏｌｏｒ−ｃｏｄｉｎｇ）し、赤色は低い磁気共鳴映像信号を、青色は強い磁気共鳴映像信号を示す。図９（ｊ）は図９（ａ）〜図９(ｉ)に示したイメージにおいて乳癌組織のＲ２磁気緩和信号の変化（ΔＲ２／Ｒ２ｃｏｎｔｒｏｌ）をグラフで示すものである。
【図１０】図１０は、１１１Ｉｎで表示されたマンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子を股部に乳癌腫瘍細胞を有しているヌードマウスに投与した後、２時間後（ａ）および２４時間後（ｂ）に得たγカメライメージである。図１０（ｃ）は投与して２４時間後、ヌードマウスから各々の臓器を摘出し、γカウンターで測定したマンガンフェライトナノハイブリッド粒子の生体分布度（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ、％ＩＤ／ｇ：ｐｅｒｃｅｎｔ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｄｏｓｅ  ｐｅｒ  ｇｒａｍ  ｏｆ  ｏｒｇａｎ）を示す表である。
【図１１】図１１は、マンガンフェライトナノ粒子に蛍光染料（ＦＩＴＣ）を結合させて得た磁性−光学二重モードナノ粒子の模式図（ａ）、蛍光性質の光発光スペクトル分析（ｐｈｏｔｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ）および蛍光イメージ（ｂ）、二重モードナノ粒子のＲ２スピン−スピン緩和係数および磁気共鳴映像結果（ｃ）を示すものである。
【図１】
2009517463.tif 000004
【図２】
2009517463.tif 000005
【図３】
2009517463.tif 000006
【図４】
2009517463.tif 000007
【図５】
2009517463.tif 000008
【図６】
2009517463.tif 000009
【図７】
2009517463.tif 000010
【図８】
2009517463.tif 000011
【図９】
2009517463.tif 000012
【図１０】
2009517463.tif 000013
【図１１】
2009517463.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月30日(2007.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性マンガン酸化物ナノ粒子を含むＭＲＩ造影剤。
【請求項２】
前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は、気相（ｇａｓ  ｐｈａｓｅ）において、または水溶液、有機溶媒および多溶媒系のうちのいずれか１つの液相（ＬＩｑｕｉｄ  ｐｈａｓｅ）において、マンガン前駆物質の化学反応を通して結晶化して得られることを特徴とする、請求項１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項３】
前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子の水に対する溶解度が１μｇ／ｍｌ以上であり、水に溶解したナノ粒子の流体力学半径が１０００ｎｍより大きくないことを特徴とする、請求項１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項４】
前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子はその中心が１〜１０００ｎｍ大きさのマンガン酸化物からなり、前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は、
式ＭｎＯａ（０＜ａ≦５）、または
式ＭｎＭｂＯｃ（ＭはＬＩ、Ｎａ、Ｂｅ、Ｃａ、Ｇｅ、Ｍｇ、Ｂａ、Ｓｒ、Ｒａを含む１、２族元素、Ｇａ、Ｉｎを含む１３族元素、Ｙ、Ｔａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｈｇを含む遷移金属元素、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、ＴｍおよびＹｂを含むランタン系元素およびアクチニド系元素からなる群から選択される１種以上の金属原子、０＜ｂ≦５、０＜ｃ≦１０）
を有する化合物であることを特徴とする、請求項１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項５】
前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は、
式ＭｎＭ’ｄＦｅｅＯｆ（Ｍ’はＬＩ、Ｎａ、Ｂｅ、Ｃａ、Ｇｅ、Ｍｇ、Ｂａ、Ｓｒ、Ｒａを含む１、２族元素、Ｇａ、Ｉｎを含む１３族元素、Ｙ、Ｔａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｈｇを含む遷移金属元素、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂを含むランタン系元素およびアクチニド系元素から選択される１種以上の金属原子、０＜ｄ≦５、０＜ｅ≦５、０＜ｆ≦１５）
を有する化合物であることを特徴とする、請求項１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項６】
前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は、式ＭｎｇＦｅｈＯ４（０＜ｇ≦４、０＜ｈ≦４）を有する化合物であることを特徴とする、請求項１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項７】
前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は、ＭｎＯ、Ｍｎ２Ｏ３、ＭｎＯ２、Ｍｎ３Ｏ４、Ｍｎ２Ｏ５のうちの１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項８】
前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は、それ自体で水に溶けるか、水溶性多官能基配位子によってコーティングされることを特徴とする、請求項１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項９】
前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子の表面に、イオン結合、共有結合、水素結合、疏水結合および金属−配位子の配位結合のうちの１つ以上の結合によって付着した水溶性多官能基配位子を含むことを特徴とする、請求項８に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項１０】
前記水溶性多官能基配位子は、水溶性マンガン酸化物ナノ粒子に結合する付着領域（ＬＩ）を含むことを特徴とする、請求項９に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項１１】
前記水溶性多官能基配位子は、
活性成分を結合させるための活性成分結合領域（ＬＩＩ）；
配位子間の交差連結のための交差連結領域（ＬＩＩＩ）；または
前記活性成分結合領域（ＬＩＩ）と交差連結領域（ＬＩＩＩ）を同時に含む活性成分結合領域−交差連結領域（ＬＩＩ−ＬＩＩＩ）
をさらに含むことを特徴とする、請求項１０に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項１２】
前記付着領域（ＬＩ）は、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＰＯ３Ｈ、−ＰＯ４Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＯＨおよび炭素数２以上の炭化水素からなる群から選択された官能基を含むことを特徴とする、請求項１０に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項１３】
前記活性成分結合領域（ＬＩＩ）は、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＮＲ３＋Ｘ−、−Ｎ３、−ＳＣＯＣＨ３、−ＳＣＮ、エポキシ基、スルホネート基、ニトレート基、ホスホン酸基、アルデヒド基、ヒドラゾン基、アルキンおよびアルケンからなる群から選択された１種以上の官能基を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項１４】
前記水溶性多官能基配位子は、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２および−ＯＨのうちのいずれか１つ以上を側鎖として有するアミノ酸を１つ以上含むペプチドであることを特徴とする、請求項１１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項１５】
前記水溶性多官能基配位子は、付着領域（ＬＩ）の官能基として−ＣＯＯＨ基を、活性成分結合領域（ＬＩＩ）の官能基として−ＣＯＯＨ基または−ＳＨ基を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項１６】
前記水溶性多官能基配位子は、付着領域（ＬＩ）の官能基として炭素数２以上の炭化水素鎖を、活性成分結合領域（ＬＩＩ）の官能基として−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＰＯｘＨ（０＜ｘ≦４）、−ＳＯｙＨ（０＜ｘ≦４）、−ＮＲ４＋Ｘ−（Ｒ＝ＣｎＨｍ  ０≦ｎ≦１６、０≦ｍ≦３４、Ｘ＝ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ）、または−ＯＨを含むことを特徴とする、請求項１１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項１７】
前記水溶性多官能基配位子は、ジメルカプトコハク酸、ジメルカプトマレイン酸およびジメルカプトペンタジオン酸からなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項９に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項１８】
前記水溶性多官能基配位子は、デキストラン、カルボデキストラン、多糖類、セルロース、デンプン、グリコーゲン、炭水化物、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、ポリホスファゼン、ポリラクチド、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、ポリカプロラクトン、ポリ無水物、ポリリンゴ酸、ポリリンゴ酸の誘導体、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリヒドロオキシブチレート、ポリカルボネート、ポリオルトエステル、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−リジン、ポリグリコリド、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルピロリドンからなる群から選択される１種以上を含む、請求項９に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項１９】
前記水溶性多官能基配位子は、ペプチド類、アルブミン類、アビジン類、抗体類、二次抗体類、シトクロム、カゼイン、ミオシン、グリシニン、カロチン、コラーゲン、球状タンパク質類、および硬タンパク質類からなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする、請求項９に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項２０】
請求項１１に記載の水溶性多官能基配位子の活性成分結合領域（ＬＩＩ）に活性成分が結合された形態の水溶性マンガン酸化物ナノハイブリッド粒子を含むことを特徴とするＭＲＩ造影剤。
【請求項２１】
前記活性成分は、化学機能性モノマー、ポリマー、無機担体、および生体機能性物質からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２０に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項２２】
前記化学機能性モノマーは、抗ガン剤、抗生剤、ビタミン、葉酸を含む薬物、脂肪酸、ステロイド、ホルモン、プリン、ピリミジン、単糖類、二糖類からなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項２１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項２３】
前記ポリマーは、デキストラン、カルボデキストラン、多糖類、シクロデキストラン、プルラン、セルロース、デンプン、グリコーゲン、炭水化物、オリゴ糖類、ポリホスファゼン、ポリラクチド、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、ポリカプロラクトン、ポリ無水物、ポリリンゴ酸およびポリリンゴ酸の誘導体、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリヒドロオキシブチレート、ポリカルボネート、ポリオルトエステル、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−リジン、ポリグリコリド、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルピロリドンからなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項２１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項２４】
前記無機担体は、シリカ（ＳｉＯ２）、チタニア（ＴｉＯ２）、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）、ジルコニア（ＺｒＯ２）およびヒ化ガリウム（ＧａＡｓ）、シリコン（Ｓｉ）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、硫化亜鉛（ＺｎＳ）、セレン化亜鉛（ＺｎＳｅ）テルル化亜鉛（ＺｎＴｅ）、硫化カドミウム（ＣｄＳ）、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）、硫化鉛（ＰｂＳ）、セレン化鉛（ＰｂＳｅ）、テルル化鉛（ＰｂＴｅ）の半導体からなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項２１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項２５】
前記生体機能性物質は、ＤＮＡ、ＲＮＡの核酸類、ペプチド類、抗原類、抗体類、ハプテン、アビジン、ニュートラビジン、ストレプトアビジン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、レクチン、セレクチン、抗ガン剤、抗生剤、ホルモン、ホルモン拮抗剤、インターロイキン、インターフェロン、成長因子、腫瘍壊死因子、エンドトキシン、リンホトキシン、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子、プロテアーゼ阻害剤、アルキルホスホコリン、界面活性剤、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、タンパク質薬物、加水分解酵素、酸化−還元酵素、分解酵素、異性化酵素、合成酵素の生体活性酵素、酵素補助因子（ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｆａｃｔｏｒ）、および酵素抑制剤（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）からなる群から選択される１種以上のものであることを特徴とする、請求項２１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項２６】
前記ＭＲＩ造影剤は、Ｔ２スピン−スピン緩和の磁気共鳴映像診断方法に用いられることを特徴とする、請求項１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項２７】
前記ＭＲＩ造影剤は、外部刺激または生体環境変化に応じたＭｎ２＋放出によるＴ１スピン−格子緩和磁気共鳴映像診断に用いられることを特徴とする、請求項１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項２８】
前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子に放射性同位元素物質が含まれることを特徴とする、請求項１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項２９】
単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ、Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）または陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ、Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）に用いられることを特徴とする、請求項２８に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項３０】
前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子に蛍光物質が含まれることを特徴とする、請求項１に記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項３１】
光学イメージングおよび分光（ｏｐｔｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）に用いられることを特徴とする、請求項３０に記載のＭＲＩ造影剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンガン酸化物ナノ粒子を含む磁気共鳴映像（ＭＲＩ）造影剤の開発に関する。より詳しくは、
（１）その中心が１〜１０００ｎｍのマンガン酸化物ナノ粒子からなり、前記ナノ粒子はＭｎＯａ（０＜ａ≦５）またはＭｎＭｂＯｃ（ＭはＬＩ、Ｎａ、Ｂｅ、Ｃａ、Ｇｅ、Ｍｇ、Ｂａ、Ｓｒ、Ｒａを含む１、２族元素、Ｇａ、Ｉｎなどを含む１３族元素、Ｙ、Ｔａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｈｇなどを含む遷移金属元素、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂなどを含むランタン系元素およびアクチニド系元素からなる群から選択される１種または２種以上の金属原子、０＜ｂ≦５、０＜ｃ≦１０）であり、好ましくはＭｎＭ’ｄＦｅｅＯｆ（Ｍ’はＬＩ、Ｎａ、Ｂｅ、Ｃａ、Ｇｅ、Ｍｇ、Ｂａ、Ｓｒ、Ｒａを含む１、２族元素、Ｇａ、Ｉｎなどを含む１３族元素、Ｙ、Ｔａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｈｇなどを含む遷移金属元素、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂなどを含むランタン系元素およびアクチニド系元素からなる群から選択される１種の金属原子、０＜ｄ≦５、０＜ｅ≦５、０＜ｆ≦１５）、最も好ましくはＭｎＦｅ２Ｏ４であり、
（２）前記ナノ粒子はそれ自体で水に溶けるか、あるいは水溶性配位子によって囲まれており、水溶液において安定し、優れた磁気的性質を示すことを特徴とする水溶性マンガン酸化物ナノ粒子を含み、
（３）このようなナノ粒子に化学または生体機能性物質などの生体活性物質が結合された診断用マンガン酸化物ナノハイブリッド粒子を含む。
【０００２】
また本発明は、（４）前記（１）〜（３）で明示したナノ物質を用いてＭＲＩ造影剤として開発することに関するものである。
【背景技術】
【０００３】
ナノ技術は物質を原子、分子レベルにおいて調節および制御する技術として、新物質、新素子の創出に適しており、その応用分野は電子、材料、通信、機械、医薬、農業、エネルギ、環境など非常に様々である。
【０００４】
現在ナノ技術は多様に発展しており、大きく３分野に分類することができる。第１に、ナノ素材で極微細な大きさの新しい物質と材料を合成する技術に関するものである。第２に、ナノ素子でナノサイズの材料を組み合わせるか配列して、一定の機能を発揮する装置を製造する技術に関するものである。第３に、“ナノバイオ”と呼ばれるナノ技術を生命工学に応用する技術に関するものである。
【０００５】
ナノバイオ分野における磁性ナノ粒子は、生体物質の分離、磁気共鳴映像の診断プローブ、巨大磁気抵抗センサを含むバイオセンサ、マイクロ流体センサ、薬物／遺伝子伝達、磁性温熱療法などの広い応用範囲にかけて用いられている。
【０００６】
特に磁性ナノ粒子は磁気共鳴映像の診断プローブ（ｐｒｏｂｅ）として用いることができる。外部から磁場をかけた時、磁性ナノ粒子が磁化し、ナノ粒子周辺の水分子中の水素原子のスピン−スピン緩和時間を短縮させ磁気共鳴映像信号を増幅させる効果を示すため、このような造影効果を利用すると、疾病の診断、分子および細胞レベルにおける生命現象の観察に用いることができる。
【０００７】
米国特許公報ＵＳ６，２７４，１２１号は、酸化鉄のような金属を含む常磁性ナノ粒子に関するものであり、前記ナノ粒子の表面に組織特異的な結合物質、診断または薬剤学的な活性物質とカップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）できる結合部位を含む無機物質を付着したナノ粒子を開示している。
【０００８】
米国特許公報ＵＳ６，６３８，４９４号は、酸化鉄のような金属を含む超常磁性ナノ粒子に関するものであり、前記ナノ粒子の表面に特定のカルボン酸を付け、重力または磁場においてナノ粒子が凝集および沈殿することを防止する方法を開示している。前記特定のカルボン酸としては、マレイン酸、酒石酸、グルカル酸のような脂肪族ジカルボン酸またはクエン酸、シクロヘキサン、トリカルボン酸のような脂肪族ポリジカルボン酸が用いられた。
【０００９】
米国特許公報ＵＳ５，７４６，９９９号は、酸化鉄のような金属を含む超常磁性ナノ粒子に関するものであり、前記ナノ粒子の表面にシリカを用いてコーティングし、デキストランで付着させ、体内磁気共鳴映像に応用した。
【００１０】
米国特許公報ＵＳ５，０６９，２１６およびＵＳ５，２６２，１７６号は、酸化鉄のような金属を含む超常磁性ナノ粒子からなるコロイドに関するものであり、デキストランのような多糖類を付着して水溶化し、これを用いて人体の肝および胃などの臓器を磁気共鳴映像によってイメージングした。
【００１１】
米国特許公開公報ＵＳ２００４／５８４５７号は、単層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）で囲まれた機能性ナノ粒子に関するものであり、前記単層には二機能性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）ペプチドが付着され、前記ペプチドにはＤＮＡおよびＲＮＡを含む様々なバイオポリマー（ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ）が結合することができる。
【００１２】
米国特許公報ＵＳ５，３３６，５０６号は、癌細胞を選択的に表示できる葉酸（ｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）が付着されたデキストランでコーティングされた酸化鉄磁性ナノ粒子に関するものであり、体外において磁気共鳴映像を用いて癌細胞を診断した。
【００１３】
米国特許公報ＵＳ４，７７０，１８３号は、デキストランおよびＢＳＡのようなタンパク質が付着された酸化鉄磁性ナノ粒子に関するものであり、それを磁気共鳴映像を用いた人体の肝映像および体内分布に応用した。
【００１４】
大韓民国特許出願第１０−１９９８−０７０５２６２号は、デンプンコーティングと任意のポリアルキレンオキシドコーティングを備えた超常磁性鉄酸化物コア粒子を含む粒子とそれを含むＭＲＩ造影剤を開示している。
【００１５】
このような磁気共鳴映像の造影剤として用いられる磁性ナノ粒子が本用途において最適性能をもって用いられるためには、
１）印加された磁場に敏感に反応する高い磁化率を有するべきであり、
２）優れた磁気共鳴映像の造影効果を示すべきであり、
３）生体内、すなわち水溶性環境において安定した輸送および分散が行われるべきであり、
４）生体活性物質と容易に結合可能であるべきであり、
５）低毒性および高生体親和力を示さなければならない。
【００１６】
特に３次元映像、高分解能などの非常に優れた生体イメージング効果を有する磁気共鳴映像の最弱点として見なされてきた低診断感度を解決するためには、優れた磁気的性質および造影効果を有する磁性ナノ粒子の開発が至急である。
【００１７】
しかし、前記先行特許および公知のＣＬＩＯ、Ｆｅｒｉｄｅｘ、Ｒｅｓｏｖｉｓｔなどの代表的なＭＲＩ造影剤を含む既存の酸化鉄ナノ粒子の場合、その磁化率が低く（６０〜９０ｅｍｕ／ｇＦｅ）、それにより、低い磁気共鳴映像の造影効果（例：低いＲ２緩和係数（６０〜１５０Ｌ・ｍｏｌ−１ｓｅｃ−１））を有する。これは、ＭＲＩ造影剤としての低下した信号増幅効果を示し、磁気共鳴映像診断において大きい問題点として指摘されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
上記問題を解決するために、本発明は、既存の酸化鉄ナノ粒子の問題点を大きく克服し、磁気的性質および磁気共鳴映像の造影効果に非常に優れ、水溶液において安定性が高く、磁気共鳴映像診断効果を画期的に改善した新しい概念のＭＲＩ造影剤として水溶性マンガン酸化物ナノ粒子を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
そのために、本研究者らは、既存の酸化鉄ナノ粒子を用いる代わりに、磁気的性質に遥かに優れ、水溶液において安定性が高く、生体親和性が良く、生体機能性成分との結合が容易な水溶性マンガン酸化物ナノ粒子を開発した。また、このようなマンガン酸化物ナノ粒子に化学機能性分子および生体機能性分子（タンパク質、抗原、抗体、ペプチド、核酸、酵素など）をリンカーリガンドを介して結合させることにより、マンガン酸化物ナノハイブリッド粒子を開発することができた。このような水溶性マンガン酸化物ナノ粒子とマンガン酸化物ナノハイブリッド粒子は、癌細胞などの生体診断において画期的な診断感度の増加を示し、磁気共鳴映像において高感度診断使用を可能にする。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係る水溶性マンガン酸化物ナノ粒子と水溶性マンガン酸化物ナノハイブリッド物質は、均一な大きさを有し、水溶液において特に安定し、磁気的性質に非常に優れており、既存の酸化鉄ナノ粒子に比べて磁性性質を顕著に増加させ、磁気共鳴映像感度を画期的に増加させる効果を有する。本発明の水溶性マンガン酸化物ナノ粒子あるいはそれらが生体物質と結合したナノハイブリッド粒子は、既存の磁気共鳴映像の画期的な改善および診断治療システムなどに有用に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本願明細書における“マンガン酸化物ナノ粒子”は、酸化マンガン（ｍａｎｇａｎｅｓｅ  ｏｘｉｄｅ）またはマンガン金属酸化物（ｍａｎｇａｎｅｓｅ  ｍｅｔａｌ  ｏｘｉｄｅ）のナノ粒子を意味する。本明細書では、前記酸化マンガンまたはマンガン金属酸化物のナノ粒子を“マンガン酸化物ナノ粒子”と称する。
【００２２】
本発明の明細書における“マンガン酸化物ナノ粒子”はナノサイズの粒子を意味するものであり、その直径は１ｎｍ〜１０００ｎｍ範囲内にあり、好ましくは２ｎｍ〜１００ｎｍ範囲の粒子を意味する。また、水に対する溶解度が少なくとも１μｇ／ｍｌ以上であり、水に溶解したナノ粒子の流体力学半径（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｒａｄｉｕｓ）が１０００ｎｍ以下の範囲を有する粒子を意味する。
【００２３】
本発明における“水溶性マンガン酸化物ナノ粒子”は、前記マンガン酸化物ナノ粒子に水溶性多官能基配位子（ｍｕｌｔｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ  Ｌｉｇａｎｄ）が結合され、前記ナノ粒子を囲む形態を有するか、または特別な配位子と結合せずにそれ自体で水溶液に安定して溶解または分散できるナノ粒子を意味する。
【００２４】
本発明における“水溶性マンガン酸化物ナノハイブリッド粒子”は、前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子が化学（例：モノマー、ポリマー、無機担体など）または生体機能性物質（例：細胞、タンパク質、ペプチド、抗原、遺伝子、抗体、酵素など）と結合している物質を意味する。
【００２５】
本発明に係る水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は様々な様態として提供することができ、いかなるマンガン酸化物質と多官能基配位子を選択するかによって決定される。
【００２６】
本発明のマンガン酸化物質はＭｎＯａ（０＜ａ≦５）またはＭｎＭｂＯｃ（ＭはＬＩ、Ｎａ、Ｂｅ、Ｃａ、Ｇｅ、Ｍｇ、Ｂａ、Ｓｒ、Ｒａを含む１、２族元素、またはＧａ、Ｉｎなどを含む１３族元素、Ｙ、Ｔａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｈｇなどを含む遷移金属元素、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂなどを含むランタン系元素およびアクチニド系元素からなる群から選択される１種または２種以上の金属原子、０＜ｂ≦５、０＜ｃ≦１０）であり、
好ましくはＭｎＭ’ｄＦｅｅＯｆ（Ｍ’はＬＩ、Ｎａ、Ｂｅ、Ｃａ、Ｇｅ、Ｍｇ、Ｂａ、Ｓｒ、Ｒａを含む１、２族元素、Ｇａ、Ｉｎなどを含む１３族元素、Ｙ、Ｔａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｈｇなどを含む遷移金属元素、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂなどを含むランタン系元素およびアクチニド系元素からなる群から選択される１種の金属原子、０＜ｄ≦５、０＜ｅ≦５、０＜ｆ≦１５）、
最も好ましくはＭｎＦｅ２Ｏ４である。
【００２７】
本発明の明細書における“水溶性多官能基配位子”は（ａ）付着領域（ＬＩ、ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を含むことができ、（ｂ）活性成分結合領域（ＬＩＩ、ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｒｅｇｉｏｎ）、配位子間連結のための（ｃ）交差連結領域（ＬＩＩＩ、ｃｒｏｓｓ  ｌｉｎｋｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）、または前記活性成分結合領域（ＬＩＩ）と交差連結領域（ＬＩＩＩ）を同時に含む活性成分結合領域−交差連結領域（ＬＩＩ−ＬＩＩＩ）をさらに含むことができる。以下では水溶性多官能基配位子についてより具体的に説明する。
【００２８】
前記“付着領域（ＬＩ）”は、ナノ粒子と付着できる官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ）を含む多官能基配位子の一部分であって、好ましくはその末端を意味する。よって、付着領域はナノ粒子をなす物質と親和性が高い官能基を含むことが好ましい。この時、ナノ粒子と付着領域との結合は、イオン結合、共有結合、水素結合、疏水結合、または金属−配位子の配位結合によって付着することができる。これにより、多官能基配位子の付着領域は、ナノ粒子を構成する物質によって多様に選択され得る。例えば、イオン結合、共有結合、水素結合、金属−配位子の配位結合を用いた付着領域は−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＰＯ３Ｈ、−ＰＯ４Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−Ｎ３、−ＮＲ３ＯＨ（Ｒ＝ＣｎＨ２ｎ＋１、０≦ｎ≦１６）または−ＯＨを含むことができ、疏水結合を用いた付着領域は炭素数２以上からなる炭化水素鎖を含むことができるが、これに限定されるものではない。
【００２９】
前記“活性成分結合領域（ＬＩＩ）”は、活性成分、すなわち化学または生体機能性物質と付着できる官能基を含む多官能基配位子の一部分であって、好ましくは前記付着領域の反対側に位置した末端を意味する。前記活性成分結合領域の官能基は、活性成分の種類およびその化学式によって異なり得る（表１参照）。本発明において、活性成分結合領域は−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＮＲ３＋Ｘ−、−Ｎ３、−ＳＣＯＣＨ３、−ＳＣＮ、エポキシ基、スルホネート基、ニトレート基、ホスホン酸基、アルデヒド基、ヒドラゾン基、アルキンおよびアルケンからなる群から選択された１種以上の官能基を含むことができ、または−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＰＯｘＨ（０＜ｘ≦４）、−ＰＯ３Ｈ、−ＰＯ４Ｈ２、−ＳＯｙＨ（０＜ｘ≦４）、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＮＲ４＋Ｘ−（Ｒ＝ＣｎＨｍ  ０≦ｎ≦１６、０≦ｍ≦３４、Ｘ＝ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ）基を含むことができるが、これに限定されるものではない。
【００３０】
前記“交差連結領域（ＬＩＩＩ）”は、近接した多官能基配位子と交差連結できる官能基を含む多官能基配位子の一部分、好ましくは中心部を意味する。“交差連結”とは、ある多官能基配位子が近接して位置した他の多官能基配位子と分子間相互作用（ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）によって結合することを意味する。前記分子間相互作用は、疏水性相互作用、水素結合、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）、ファンデルワールス結合、イオン結合などがあるが、特にこれに限定されるものではない。よって、交差連結できる官能基は目的とする分子間相互作用の種類に応じて多様に選択され得る。交差連結領域は、例えば、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−エポキシ（ｅｐｏｘｙ）、−エチレン（ｅｔｈｙｌｅｎｅ）、−アセチレン（ａｃｅｔｙｌｅｎｅ）、−アジド（ａｚｉｄｅ）、−ＰＯ３Ｈ、または−ＳＯ３Ｈを官能基として含むことができる。
【００３１】
【表１】
2009517463.tif 000015
多官能基配位子に含まれ得る活性成分結合領域の官能基の例
（Ｉ：多官能基配位子の活性成分結合領域の官能基、ＩＩ：活性成分、ＩＩＩ：ＩとＩＩの反応による結合例）
【００３２】
本発明では上記のような官能基を本質的に保有する化合物を、水溶性多官能基配位子として用いることもできるが、当業界において公知の化学反応によって上記のような官能基を備えるように修飾または合成された化合物を多官能基配位子として用いることもできる。
【００３３】
本発明に係る水溶性ナノ粒子において好ましい多官能基配位子の１例は、ジメルカプトコハク酸である。ジメルカプトコハク酸は、本質的に、付着領域、交差連結領域、および活性成分結合領域を含んでいるためである。すなわち、ジメルカプトコハク酸の一側の−ＣＯＯＨはジスルフィド結合によって連結される役割をし、末端部のＣＯＯＨおよびＳＨは活性成分と結合する役割をする。前記ジメルカプトコハク酸の他にも付着領域（ＬＩ）の官能基として−ＣＯＯＨを、活性成分結合領域（ＬＩＩＩ）の官能基として−ＣＯＯＨまたは−ＳＨを含む化合物は好ましい多官能基配位子として用いることができる。このような化合物の例としてはジメルカプトマレイン酸（ｄｉｍｅｒｃａｐｔｏｍａｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ジメルカプトペンタジオン酸（ｄｉｍｅｒｃａｐｔｏｐｅｎｔａｄｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）などがあるが、これに制限されるものではない。
【００３４】
本発明に係る水溶性ナノ粒子において、好ましい多官能基配位子の他の例はタンパク質である。タンパク質はペプチドよりさらに多いアミノ酸、すなわち数百〜数十万個のアミノ酸からなるポリマーであり、両末端に−ＣＯＯＨと−ＮＨ２官能基を有しているだけでなく、数十個の−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＣＯＮＨ２などを含んでいる。これにより、タンパク質は前述したペプチドのようにその構造に応じて自然に付着領域、交差連結領域、活性成分結合領域を備えることができるため、本発明の相転移配位子として有用に用いることができる。相転移配位子として好ましいタンパク質の代表的な例としては、構造タンパク質、貯蔵タンパク質、輸送タンパク質、ホルモンタンパク質、収容体タンパク質、収縮タンパク質、防御タンパク質、酵素タンパク質などが挙げられる。より詳しくは、アルブミン、抗体、抗原、アビジン（ａｖｉｄｉｎ）、二次抗体、シトクロム、カゼイン、ミオシン、グリシニン、カロチン、コラーゲン、球状タンパク質、硬タンパク質、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ｓ、免疫グロブリン、レクチン（ｌｅｃｔｉｎ）、セレクチン（ｓｅｌｅｃｔｉｎ）、アンジオポイエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）、坑癌タンパク質、抗生タンパク質、ホルモン拮抗タンパク質、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）、インターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）、成長因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）タンパク質、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）タンパク質、エンドトキシン（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）タンパク質、リンホトキシン（ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ）タンパク質、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、ウロキナーゼ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）、ストレプトキナーゼ（ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ）、プロテアーゼ阻害剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、アルキルホスホコリン（ａｌｋｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、界面活性剤、心血管系薬物（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）タンパク質、神経系薬物（ｎｅｕｒｏ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）タンパク質、胃腸管系薬物タンパク質（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）等が挙げられる。
【００３５】
本発明に係る水溶性ナノ粒子において好ましい多官能基配位子の他の例は、疏水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）官能基と親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）官能基を同時に有している両親媒性（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ）配位子である。有機溶媒上で合成されたナノ粒子の場合、その表面には疏水性の長い炭素鎖からなる配位子が存在している。この時、付加される両親媒性配位子に存在する疏水性官能基とナノ粒子表面の疏水性配位子が分子間相互作用によって結合されナノ粒子を安定化させ、ナノ粒子の最外側には親水性官能基が出て、結果的に水溶性ナノ粒子を製造することができる。ここで、分子間相互作用は疏水結合、水素結合、ファンデルワールス結合などを含む。この時、ナノ粒子と疏水性相互作用によって結合される部分が付着領域（ＬＩ）であり、これと共に有機化学的な方法によって交差連結領域（ＬＩＩ）および活性成分結合領域（ＬＩＩＩ）を導入することができる。
【００３６】
また、水溶液中での安定度の増加のために、このようないくつかの疏水性官能基と親水性官能基が結合している多重両親媒性配位子として、ポリマーを用いるか連結分子を用いて表面を交差連結させることができる。このような相転移配位子として好ましい両親媒性配位子の例として、先ず疏水性官能基に含まれるものは、炭素数が２以上である鎖からなって線形または分岐構造を有している疏水性分子であり、より好ましくはエチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、イコシル、テトラコシル、ドデシル、およびシクロペンチル、シクロヘキシルなどのアルキル官能基と、エチニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、オクテニル、デセニル、オレイルなどの炭素−炭素２重結合、およびプロピニル、イソプロピニル、ブチニル、イソブチニル、オクチニル、デシニルなどの炭素−炭素３重結合を有する不飽和炭素鎖を有する官能基などが挙げられる。
また、親水性官能基に含まれるものは、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＰＯ３Ｈ、−ＰＯ４Ｈ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ−ＮＲ４＋Ｘ−などのように、特定ｐＨでは中性を示すが、より高いか低いｐＨでは正電荷または負電荷を帯びる官能基をいう。
このような好ましい例としてポリマーおよびブロックコポリマーなどを用いることができ、ここで用いられるモノマーとしてはアクリル酸、アルキルアクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマル酸、アクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、ビニルスルホン酸、ビニルリン酸、ビニル乳酸、スチレンスルホン酸、アリルアンモニウム、アクリロニトリル、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルホルムアミドなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３７】
本発明に係る水溶性ナノ粒子において好ましい多官能基配位子の他の例はペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）である。ペプチドは数個のアミノ酸からなるオリゴマー／ポリマーであり、アミノ酸は両末端に−ＣＯＯＨと−ＮＨ２官能基を有しているため、ペプチドは自然に付着領域と活性成分結合領域を備えるようになる。また、特に側鎖として−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２および−ＯＨのうちのいずれか１つ以上を側鎖として有するアミノ酸を１つ以上含むペプチドは好ましい多官能基配位子として用いることができる。
【００３８】
本発明で用いられる多官能基配位子は、生分解性高分子と結合した形態であり得る。前記生分解性高分子の例にはデキストラン、カルボデキストラン、多糖類、シクロデキストラン、プルラン、セルロース、デンプン、グリコーゲン、炭水化物、単糖類、二糖類およびオリゴ糖類、ポリホスファゼン、ポリラクチド、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、ポリカプロラクトン、ポリ無水物、ポリリンゴ酸、ポリリンゴ酸の誘導体、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリヒドロオキシブチレート、ポリカルボネート、ポリオルトエステル、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−リジン、ポリグリコリド、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルピロリドンなどが含まれる。
【００３９】
また他の観点において、本発明では、前記水溶性マンガン酸化物ナノ粒子の活性成分結合領域に、生体機能性を示す化学機能性分子および生体機能性物質を結合させた水溶性マンガン酸化物ナノハイブリッド粒子を提供する。
【００４０】
本発明において、水溶性マンガン酸化物ナノハイブリッド粒子の１例として水溶性マンガン酸化物に化学機能性分子が結合された形態がある。化学機能性分子には様々な機能性モノマー、ポリマー、無機担体などが含まれる。ここで、モノマーの例としては、様々な種類のモノマーとして、抗ガン剤、抗生剤、ビタミン、葉酸を含む薬物、脂肪酸、ステロイド、ホルモン、プリン、ピリミジン、単糖類、二糖類が挙げられるが、これに限定されるものではない。高分子の例としてはデキストラン、カルボデキストラン、多糖類、シクロデキストラン、プルラン、セルロース、デンプン、グリコーゲン、炭水化物、単糖類、二糖類およびオリゴ糖類、ポリホスファゼン、ポリラクチド、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、ポリカプロラクトン、ポリ無水物、ポリリンゴ酸およびポリリンゴ酸の誘導体、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリヒドロオキシブチレート、ポリカルボネート、ポリオルトエステル、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−リジン、ポリグリコリド、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。無機担体の例としてはシリカ（ＳｉＯ２）、チタニア（ＴｉＯ２）、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）、炭素物質（ナノチューブ、黒鉛、フラーレンなど）、半導体基板（ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＺｎＯ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、Ｓｉ、ＧａＡｓ、ＡｌＡｓなど）、金属基板（Ａｕ、Ｐｔ、Ａｇ、Ｃｕなど）が挙げられるが、これに制限されるものではない。
【００４１】
本発明のナノハイブリッド粒子の１例は、水溶性マンガン酸化物ナノ粒子と生体機能性物質が選択的に結合された形態のものである。生体機能性物質には、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、ハプテン（ｈａｐｔｅｎ）、アビジン（ａｖｉｄｉｎ）、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）、ニュートラビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、レクチン（ｌｅｃｔｉｎ）、セレクチン（ｓｅｌｅｃｔｉｎ）のような組織特異的結合成分（ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）；抗ガン剤、抗生剤、ホルモン、ホルモン拮抗剤、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）、インターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）、成長因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）、エンドトキシン（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）、リンホトキシン（ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ）、ウロキナーゼ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）、ストレプトキナーゼ（ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ）、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、プロテアーゼ阻害剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、アルキルホスホコリン（ａｌｋｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏＬＩｎｅ）、界面活性剤、心血管系薬物（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、胃腸管系薬物（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、神経系薬物（ｎｅｕｒｏ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のような薬剤学的活性成分、加水分解酵素、酸化−還元酵素、分解酵素、異性化酵素、合成酵素などの生体活性酵素、酵素補助因子（ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｆａｃｔｏｒ）、酵素抑制剤（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）などが含まれるが、これに制限されるものではない。
【００４２】
本発明によって形成された水溶性マンガン酸化物ナノハイブリッド粒子は、既存の酸化鉄を含むＭＲＩ造影剤に比べて優れた磁気モーメントを有するため、遥かに高いレベルの高感度診断を可能にする。また、既存の用いられていたＭＲＩ造影剤に比べて、より少ない量だけを用いても所望する程度の信号増加効果をもたらすことができ、既存の物質に比べて体内毒性および副作用がさらに少ない造影剤として用いることができる。
【００４３】
以下にて、本発明の水溶性マンガン酸化物ナノ粒子の製造方法について具体的に説明する。
【００４４】
本発明に係る水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は、当業界に知られている気相（ｇａｓ  ｐｈａｓｅ）におけるナノ粒子合成法、あるいは水溶液、有機溶媒、または多溶媒系などを含む液相（ｌｉｑｕｉｄ  ｐｈａｓｅ）におけるナノ粒子合成法によって得ることができる。
【００４５】
本発明のナノ粒子の好ましい製造方法の１例として、（１）水不溶性ナノ粒子を有機溶媒において合成するステップ、（２）前記水不溶性ナノ粒子を第１溶媒に溶解し、水溶性多官能基配位子を第２溶媒に溶解するステップ、（３）前記ステップ（２）による２つの溶液を混合して水不溶性ナノ粒子の表面に多官能基配位子を導入させ、水溶液に溶解して分離するステップによって製造することができる。
【００４６】
上述した製造方法のステップ（１）は、水不溶性ナノ粒子の製造方法に関するものである。本発明では、１例として、表面安定剤を含む１０〜６００℃の有機溶媒にナノ粒子先駆物質を投入し、目的とする水不溶性ナノ粒子を製造するのに適した温度および時間を維持し、前記ナノ粒子先駆物質を化学反応してナノ粒子を成長させた後、これより形成された水不溶性ナノ粒子を分離および精製するステップを経て水不溶性ナノ粒子を製造することができる。
【００４７】
前記有機溶媒としては、ベンゼン系溶媒（例えば、ベンゼン、トルエン、ハロベンゼンなど）、炭化水素溶媒（例えば、オクタン、ノナン、デカンなど）、エーテル系溶媒（例えば、ベンジルエーテル、フェニルエーテル、炭化水素エーテルなど）、ポリマー溶媒、イオン性液体溶媒を用いることができるが、これに制限されるものではない。
【００４８】
前記製造方法のステップ（２）においては、先に製造されたナノ粒子を第１溶媒に溶解する一方、多官能基配位子を第２溶媒に溶解する。前記第１溶媒としては、ベンゼン系溶媒（例えば、ベンゼン、トルエン、ハロベンゼンなど）、炭化水素溶媒（例えば、ペンタン、ヘキサン、ノナン、デカンなど）、エーテル系溶媒（例えば、ベンジルエーテル、フェニルエーテル、炭化水素エーテルなど）、ハロ炭化水素（例えば、塩化メチレン、臭化メタンなど）、アルコール類（例えば、メタノール、エタノールなど）、スルホキシド系溶媒（例えば、ジメチルスルホキシドなど）、アミド系溶媒（例えば、ジメチルホルムアミドなど）などを用いることができる。前記第２溶媒としては前述した第１溶媒として用いることができる溶媒の他にも、水を用いることができる。
【００４９】
前記製造方法のステップ（３）においては前記２つの溶液を混合するが、このとき、水不溶性ナノ粒子の有機性表面安定剤が水溶性多官能基配位子で置換される。このように、水溶性多官能基配位子で置換されたナノ粒子は、当業界において公知の方法を用いて分離することができる。一般的に、水溶性ナノ粒子は沈殿物として生成されるため、遠心分離または濾過によって分離することが好ましい。前記分離後には、より安定に分散している水溶性ナノ粒子を収得するために、滴定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）するステップを経てｐＨを５〜１０に調節することが好ましい。
【００５０】
また本発明の水溶性ナノ粒子は、他の方法として、水溶液中での金属前駆体物質の化学反応を通した結晶成長によって合成することもできる。この方法は、多官能基配位子を含む水溶液にマンガンイオン前駆体物質を添加することによって、水溶性マンガン酸化物ナノ粒子を合成する方法であり、既存の公知された水溶性ナノ粒子の合成方法によってなされ得る。
【００５１】
以下にて、水溶性マンガン酸化物のナノ物質を含むＭＲＩ造影剤を用いた応用について具体的に説明する。
【００５２】
水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は、既存の酸化鉄ナノ粒子に比べて遥かに優れたスピン−スピン緩和磁気共鳴映像信号の増幅効果（Ｒ２スピン−スピン緩和係数：〜３６０Ｌｍｏｌ−１ｓｅｃ−１）を示す。そのため、既存の磁気共鳴映像を用いた診断を画期的に発展させ、疾病の早期診断および極少量の生体分子の検出を可能にする。一般的に癌細胞のような病原体の表面には、特に過発現する生物学的マーカーが存在する。当業界における公知の方法により、このような生物学的マーカーと選択的に結合可能な抗体を得ることができる。既に知られた物質を用いることもできる。このような方法によって得た抗体などの物質と水溶性マンガン酸化物ナノ粒子を、上記で説明した方法の通りにナノ粒子の活性成分結合領域に結合させる。このように合成されたハイブリッド粒子は選択的に癌細胞と結合することができる。このようにして、癌細胞に表示された磁性粒子は磁気共鳴映像信号を示すようになって診断が可能となる。
【００５３】
この時、水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は既存に用いられてきた酸化鉄を含む磁性ナノ粒子に比べて遥かに優れた敏感度を有しているため、遥かに高感度の癌診断を可能にする。よって、遥かに小さい大きさの癌細胞の診断を介した癌の早期診断を可能にする。
【００５４】
また、本発明で提示された水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は、ｐＨ変化、温度変化などの外部刺激によって、マンガンイオンを放出させることができる。このように放出されたマンガンイオンは、磁気共鳴映像において、Ｔ１スピン−格子緩和時間を増加させＴ１造影効果を示すことができる。そのため、特定の生体内環境変化によるマンガンイオンの放出を通して、磁気共鳴映像診断が可能である。
【００５５】
また、水溶性マンガン酸化物ナノ粒子は、他の診断プローブと結合し、二重または多重の診断プローブとして用いることができる。例えば、水溶性マンガン酸化物にＴ１磁気共鳴映像診断プローブを結合させると、Ｔ２磁気共鳴映像およびＴ１磁気共鳴映像の診断を同時に進行することができ、光学診断プローブを結合させると磁気共鳴映像と光学イメージングを同時に行うことができ、ＣＴ診断造影剤を結合させると磁気共鳴映像とＣＴ診断を同時に行うことができる。また、放射性同位元素と結合させると磁気共鳴映像とＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ診断を同時に行うことができる。
【実施例】
【００５６】
以下の実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者であれば明らかである。
【００５７】
実施例１：マンガンフェライト（ＭｎＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子と、酸化鉄、コバルトフェライト、およびニッケルフェライトナノ粒子の磁気共鳴映像効果の比較
本明細書で開発されたマンガンフェライトナノ粒子（１２ｎｍ）が、既存の酸化鉄および他の金属フェライトナノ粒子よりも、さらに良い磁気共鳴映像造影効果を示すことを確認するために、同じ大きさの酸化鉄、コバルトフェライトおよびニッケルフェライトのナノ粒子（ＭＦｅ２Ｏ４、Ｍ＝Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ）の磁化率およびＲ２スピン−スピン緩和磁気共鳴映像を測定した。
【００５８】
先ず、各々のナノ粒子は、大韓民国特許第１０−０６０４９７６号、大韓民国特許第１０−０６５２２５１号、ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００２５０９、大韓民国特許第１０−０６０４９７６号、ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００３０８８、大韓民国特許出願第２００６−００１８９２１号に開示された方法によって合成した。得られたナノ粒子は、図１（ａ）に示すように、全部同じ大きさの均一な１２ｎｍ大きさの球状であり、その表面はジメルカプトコハク酸でコーティングされている。
【００５９】
得られた各々のナノ粒子の磁化率を測定するために、ＭＰＭＳ  ｓｕｐｅｒｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｄｅｖｉｃｅ（ＳＱＵＩＤ）  ｍａｇｎｅｔｏｍｅｔｅｒを用い、−５Ｔ〜５Ｔ範囲の外部磁場大きさの変化を与えて観測した。
【００６０】
図１（ｂ）に示すように、マンガンフェライトナノ粒子は１１０ｅｍｕ／ｇ（Ｍｎ＋Ｆｅ）（＠１．５Ｔ）において最も高い磁気的性質を示す反面、酸化鉄ナノ粒子およびコバルトフェライト、ニッケルフェライトのナノ粒子はこれより低い磁気的性質を示す（各々１０１、９９、８５ｅｍｕ／（ｇ（Ｍ＋Ｆｅ））。このような結果は、スピネル構造を有する金属フェライトナノ粒子に各々異なるｄオービタルスピンモーメントを有する金属イオン置換効果に起因する。
【００６１】
このようなナノ粒子の磁気共鳴映像の造影効果を調べるために、Ｔ２スピン−スピン緩和磁気共鳴映像を測定した。このためにｍｉｃｒｏ−４７コイルが装着された１．５Ｔ（Ｉｎｔｅｒａ；Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｓｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）システムを使った。磁気共鳴映像結果はＣａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌ（ＣＰＭＧ）ｓｅｑｕｅｎｃｅを利用して得た。具体的なパラメータは次の通りである：解像度１５６  ｘ  １５６μｍ、切片厚さ０．６ｍｍ、ＴＥ＝２０ｍｓ、ＴＲ＝４００ｍｓ、映像励起回数１、映像獲得時間６分。
【００６２】
図１（ｃ）に示すように、マンガンフェライトナノ粒子が最も強い磁気共鳴映像信号（黒色）を示し、酸化鉄、コバルトフェライト、ニッケルフェライトの磁気共鳴映像信号が次第に淡い灰色に変わりながら減少することが分かる。マンガンフェライトナノ粒子の、造影効果比較の尺度であるＲ２スピン−スピン緩和係数は３５８ｍＭ−１ｓ−１であり、同じ大きさを有している酸化鉄を含む他の金属フェライトナノ粒子に比べて、遥かに高い値を示すことが分かる。これは、当業界において現在まで最も良い分子ＭＲＩ造影剤と知られているｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ（ＣＬＩＯ）酸化鉄ナノ粒子のＲ２係数（６８ｍＭ−１ｓ−１）の、約５倍以上高い値である（図１（ｄ））。
【００６３】
このようなマンガンフェライトナノ粒子の優れた磁気共鳴造影効果が、コーティングされた配位子に関わらず、常に示されるかどうかを確認するために、様々な多官能基配位子でコーティングされたマンガンフェライトナノ粒子と酸化鉄ナノ粒子との磁気共鳴造影効果を比較した。配位子としては、上記で提示したジメルカプトコハク酸に加えて、一般的に多く用いられる配位子である３−カルボキシルプロピルホスホン酸とデキストランを用いた。
【００６４】
図１（ｅ）と図１（ｆ）に示すように、多官能基配位子の種類に関わらず、マンガンフェライトナノ粒子が、酸化鉄ナノ粒子に比べて常に高い磁気共鳴映像信号（黒色）を示した。またＲ２−緩和時間図表から分かるように、水溶性マンガン酸化物ナノ粒子が、既存の酸化鉄ナノ粒子に比べて、約２０〜１２０％、さらに強い信号を示すことを確認することができた。
【００６５】
磁気共鳴映像造影効果は、粒子の大きさによっても大きく影響を受けるため、様々な大きさのマンガンフェライトナノ粒子と、それと同じ大きさの酸化鉄ナノ粒子との磁気共鳴映像効果に対する比較を行った。このために、６，９，１２ｎｍ大きさのマンガンフェライトナノ粒子および酸化鉄ナノ粒子を、大韓民国特許第１０−０６０４９７６号、大韓民国特許第１０−０６５２２５１号、ＰＣＴ  ＫＲ２００４／００２５０９、大韓民国特許第１０−０６０４９７６号、ＰＣＴ  ＫＲ２００４／００３０８８、大韓民国特許出願第２００６−００１８９２１号に開示された方法によって合成した。合成した粒子を、前記で提示されたＣａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌ（ＣＰＭＧ）ｓｅｑｕｅｎｃｅを利用して、磁気共鳴映像を測定した。
【００６６】
図２（ａ）には、合成されたナノ粒子の電子顕微鏡写真を示す。得られたマンガンフェライトナノ粒子の質量磁化率は、図２（ｂ）に示すようにその大きさが増加するにつれて高まることが分かる。マンガンフェライトナノ粒子の大きさが増加するにつれ、磁気共鳴イメージが次第に黒色に変化しながら信号が強まることが分かり（図２（ｃ）、測定されたＲ２緩和係数も増加することが分かる（図２（ｄ））。同じ大きさのマンガンフェライトナノ粒子と酸化鉄ナノ粒子を比較した場合は、６，９，１２ｎｍのすべての大きさにおいて、マンガンフェライトナノ粒子が酸化鉄ナノ粒子よりも増加した造影効果を示すことを確認することができる。
【００６７】
実施例２：様々な多官能基配位子で囲まれた水溶性マンガンフェライトナノ粒子の水溶液上のコロイド安定性の確認
水溶性マンガンフェライトナノ粒子の水溶液上のコロイド安定性を確認するために、アガロースゲル電気泳動分析および様々な塩濃度および酸度における安定性検査を行った。各々の様々な配位子でコーティングされたマンガンフェライトナノ粒子は、大韓民国特許第１０−０６０４９７６号、大韓民国特許第１０−０６５２２５１号、ＰＣＴ  ＫＲ２００４／００２５０９、大韓民国特許第１０−０６０４９７６号、ＰＣＴ  ＫＲ２００４／００３０８８、大韓民国特許出願２００６−００１８９２１号に開示された方法によって合成した。
【００６８】
図３（ａ）に示すように、配位子としてジメルカプトコハク酸で囲まれたナノ粒子は、アガロースゲルにおいて細い電気泳動バンドを示し、（＋）電極側に移動することから、水溶液においてムラなく均一な大きさでよく分散していることを確認できる。また、様々な種類の水溶性配位子で表面安定化した水溶性マンガンフェライトナノ粒子に対し、安定度検査を行った（図３（ｂ）〜図３（ｉ））。その結果、全種類のナノ粒子とも、０．２Ｍの塩濃度およびｐＨ５〜ｐＨ９で安定しており、デキストラン、ヒプロメロース、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）、ヒト血清アルブミン、ニュートラビジンで表面安定化したナノ粒子の場合には、１Ｍの塩濃度ですら安定していることを確認した。
【００６９】
なかでも、デキストラン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミンで表面安定化したナノ粒子は、非常に広範囲の酸度（ｐＨ１〜ｐＨ１１）において非常に高いコロイド安定性を有することを確認した。また、オクチルアミン−ポリアクリル酸共重合体高分子を用い、疏水結合によって表面安定化したナノ粒子の場合にも０．５Ｍ塩濃度およびｐＨ３〜１１の範囲で安定していた。これは、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはＩｎ  ｖｉｖｏ実験における塩濃度が約０．１Ｍであることを考慮する時、非常に高い水溶液性コロイド安定性を示すことを意味する。
【００７０】
実施例３：乳癌診断用マンガンフェライトハーセプチンナノハイブリッド粒子の製造
ナノハイブリッド製造過程に関する要約図を図４（ａ）に示す。ハーセプチン［（１０ｍｇ／ｍｌ、ｉｎ  １０ｍＭリン酸緩衝溶液、ｐＨ７．２）Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ］１００μｌを取ってエッペンドルフチューブに入れた後、０．２ｍｇのｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ［４０（Ｎ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ３−ｓｕｌｆｏ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｓｕｃｃｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ］を添加し、室温で３０分間反応させて、ハーセプチンのリジン残基をマレイミド基で置換させた。過量のｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ分子はＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  ｃｏｌｕｍｎを通して除去した後、マレイミド基で置換されたハーセプチンを、２００μｌの水溶性マンガンフェライトナノ粒子を含有した溶液（１０ｍＭ  ＰＢ、ｐＨ７．２、２ｍｇ／ｍｌ）と、２４時間室温で反応させた。
【００７１】
反応が完了した後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ｃｏｌｕｍｎを通して反応しないハーセプチンと酸化鉄水溶性ナノ粒子を除去した後、セントリコン濾過キット（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）を利用し、約２ｍｇ／ｍｌの濃度に濃縮させる過程によって、マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子を製造した。製造されたナノハイブリッド粒子を、アガロースゲル電気泳動実験によって分析した。クマシー・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ）タンパク質の染色の結果、ナノハイブリッドが生成されたことを確認することができた（図４（ｂ））。
【００７２】
実施例４：マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子のＩｎ  Ｖｉｔｒｏにおける腫瘍細胞選択性確認および酸化鉄ナノハイブリッド粒子との感度比較
実施例３で製造されたマンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子の、乳癌表示抗原であるＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原に対する結合特異性および効率を分析するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ磁気共鳴映像実験を行った。
【００７３】
ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原の未発現、発現、および過発現の細胞株に対し、マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子を反応させる過程は、次の通りである。先ず、前記細胞株を室温で０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて分離した。マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子を、１０７細胞を含む５０μｌのＰＢＳ緩衝溶液に、ナノ粒子基準で２．５ｎＭ濃度で添加した。これを４℃で３０分間反応させた後に３回洗浄した。一方、対照群としてＣＬＩＯ−ハーセプチンナノハイブリッド粒子を用いた。
【００７４】
磁気共鳴映像を利用して、マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子の抗原特異性を分析するために、各々の細胞をＰＣＲ用チューブに移した後に遠心分離して、細胞を沈殿させた。各細胞株の抗原特異性による磁気共鳴映像の造影効果を調べるために、１．５Ｔ（Ｉｎｔｅｒａ；Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｓｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）システムを使い、ｍｉｃｒｏ−４７コイルを利用した。Ｆａｓｔ  Ｆｉｅｌｄ  Ｅｃｈｏ（ＦＦＥ）パルスシーケンスをもって、冠状面の映像を得た。具体的なパラメータは次の通りである：解像度１５６  ｘ  １５６μｍ、切片厚さ０．６ｍｍ、ＴＥ＝２０ｍｓ、ＴＲ＝４００ｍｓ、映像励起回数１、映像獲得時間６分。
【００７５】
抗原特異性に対する磁気共鳴映像造影効果の定量的評価を行うために、Ｔ２マップを行った。具体的なパラメータは次の通りである：解像度１５６  ｘ  １５６μｍ、切片厚さ０．６ｍｍ、ＴＲ＝４０００ｍｓ、ＴＥ＝２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０ｍｓ、映像励起回数２、映像獲得時間４分。
【００７６】
図５の結果は、マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッドがＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍マーカーを、磁気共鳴映像を通して検知する評価を示す。図から分かるように、最も低いＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するＢｘ−ＰＣ−３細胞の場合、〜１０％映像造影の増強効果（ΔＲ２／Ｒｃｏｎｔｒｏｌ）を示し、腫瘍マーカーを効果的に検知することができた（図５（ａ）、図５（ｂ））。また、より多いＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する細胞、すなわち、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ−７、ＮＩＨ３Ｔ６．７細胞の場合には、〜４０％、７０％、１３０％の造影増強効果を示すことが分かった（図５（ａ）、図５（ｂ））。
【００７７】
その一方、対照群ＣＬＩＯ−ハーセプチンナノハイブリッドの場合、最も高いＨＥＲ２／ｎｅｕ発現を示すＮＩＨ３Ｔ６．７細胞の場合にだけ、〜１０％の造影増強効果を示し、これより低い腫瘍マーカー発現を示す細胞に対しては６％以下の微々たる造影効果だけを示した（図５（ｃ））。
【００７８】
開発されたマンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッドをＮＩＨ３Ｔ６．７細胞に投与した場合と、ＣＬＩＯ−ハーセプチンナノハイブリッドをＮＩＨ３Ｔ６．７細胞に投与した場合との、Ｒ２緩和係数の変化を比較すると、本明細書で提示されたマンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッドを用いたときに、約１３倍程度の大きいＲ２緩和係数の変化があることを確認することができる。
【００７９】
また、マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッドを投与したＢｘ−ＰＣ−３細胞と、ＣＬＩＯ−ハーセプチンナノハイブリッドを投与したＮＩＨ３Ｔ６．７細胞とにおいて、ほぼ同じ造影増強効果を示すことと；２つの細胞のＨＥＲ２／ｎｅｕ発現比率が、１（Ｂｘ−ＰＣ−３）：〜２３００（ＮＩＨ３Ｔ６．７）であることを考慮すると、開発されたマンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッドが、既存の酸化鉄−ハーセプチンナノハイブリッドに比べ、乳癌マーカーの約２３００倍の検出限界の増加を示すことを確認することができた（図５（ｄ））。
【００８０】
実施例５：マンガン酸化物の細胞安定性評価
このようなナノ粒子がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて磁気共鳴映像診断剤として用いられるためには、このようなナノ粒子の安定性評価も重要である。よって、実施例１で合成されたジメルカプトコハク酸でコーティングされたマンガンフェライトナノ粒子、および実施例４で用いたマンガンフェライト−ハーセプチンハイブリッドナノ粒子の、細胞毒性実験を行った。図６に示すように、前記２つのナノ粒子は２００μｇ／ｍｌまでの実験範囲濃度において、ほぼ〜１００％の細胞生存率を示し、毒性を示さないことを確認することができた。
【００８１】
実施例６：酸化マンガン（Ｍｎ３Ｏ４）を用いたＴ２磁気共鳴映像診断
水溶性酸化マンガンナノ粒子のＴ２磁気共鳴映像効果を調べるために、３ｎｍ  ｘ  ８ｎｍ大きさの酸化マンガンナノ粒子溶液のＴ２マップ磁気共鳴映像を測定した。図６に示されている酸化マンガンナノ粒子は、大韓民国特許第１０−０６０４９７６号、大韓民国特許第１０−０６５２２５１号、ＰＣＴ  ＫＲ２００４／００２５０９、大韓民国特許第１０−０６０４９７６号、ＰＣＴ  ＫＲ２００４／００３０８８、大韓民国特許出願第２００６−００１８９２１号に開示された方法によって合成した。得られたナノ粒子の電子顕微鏡写真は図７（ａ）に示す。ナノ粒子が含まれていない水溶液に比べて、Ｔ２磁気共鳴映像において大きい造影効果を示すことができた（図７）。よって、酸化マンガンナノ粒子はＴ２造影剤として用いることができることが分かる。
【００８２】
実施例７：マンガンイオン放出効果を用いたＴ１磁気共鳴映像診断
マンガンフェライトおよび酸化マンガンナノ粒子に含まれているマンガンイオン放出効果を利用して、Ｔ１磁気共鳴映像診断が可能であるかを確認するために、ｐＨ変化に応じたＴ１磁気共鳴映像を測定した。
【００８３】
磁気共鳴映像の造影効果を調べるために、１．５Ｔ（Ｉｎｔｅｒａ  ＰｈｉＬＩｐｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｓｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）システムを使い、ｍｉｃｒｏ−４７コイルを利用した。Ｆａｓｔ  Ｆｉｅｌｄ  Ｅｃｈｏ（ＦＦＥ）パルスシーケンスをもって冠状面の映像を得た。具体的なパラメータは次の通りである：解像度１５６  ｘ  １５６μｍ、切片厚さ０．６ｍｍ、ＴＥ＝２０ｍｓ、ＴＲ＝４００ｍｓ、映像励起回数１、映像獲得時間６分。マンガンフェライトナノ粒子は実施例１で合成された１２ｎｍ大きさのナノ粒子を用い、酸化マンガンナノ粒子は実施例６で合成されたナノ粒子を用いた。
【００８４】
図８（ｂ）に示すように、マンガンフェライトナノ粒子の場合、中性の溶液中では非常に弱いＴ１造影効果が示すが（図８ｂ（９））；酸性の低いｐＨ（ｐＨ＝２、４）溶液中ではマンガンフェライトナノ粒子からＭｎ２＋が放出され、磁気共鳴映像結果においてＴ１信号が明るい色に変わる造影効果を示す（図８ｂ（７）、図８ｂ（８））。また、図８（ｃ）に示すように、中性の溶液中では酸化マンガンが全くＴ１造影効果を示さないが（図８ｃ（１２））；酸性の低いｐＨ（ｐＨ＝２）溶液では酸化マンガンナノ粒子からＭｎ２＋が放出され、磁気共鳴映像結果においてＴ１信号が明るい色に変わる造影効果を示す（図８ｃ（１１）、図８ｃ（１６））。
【００８５】
ナノ粒子が溶解してできたＭｎ２＋に対する定量化のために、所定の濃度のＭｎ２＋イオンを含む溶液に対するＴ１を測定して、検量線を作成した（図８（ａ））。これに基づき、図８（ｅ）に示すように、酸化マンガンナノ粒子の場合、ｐＨ４において１５０μＭのＭｎ２＋イオンが、ｐＨ２において２００μＭのＭｎ２＋イオンが、溶液中に存在することが分かった。同じく、ＭｎＦｅ２Ｏ４ナノ粒子の場合にも、検量線を利用してｐＨ２、ｐＨ４において存在するＭｎ２＋濃度の増加を確認することができた（図８（ｄ））。
【００８６】
よって、酸化マンガンナノ粒子は、特定位置に注入した後、外部刺激によってＭｎ２＋を放出して、Ｔ１造影効果を示す診断プローブとして使用可能であることを確認することができた。
【００８７】
実施例８：水溶性マンガンフェライトナノ粒子−ハーセプチンハイブリッドシステムを利用したＩＮ  ＶＩＶＯ高感度癌診断
水溶性マンガンフェライトハーセプチンナノハイブリッドシステムを利用し、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＲＩ上において、小さい大きさの乳癌組織を診断するのに成功した。マンガンフェライトナノ粒子−ハーセプチンハイブリッド粒子は、実施例３に示す通りに合成した。Ｈｅｒ２／ｎｅｕマーカーが過発現したＮＩＨ３Ｔ６．７細胞株が移植された後に３日経過後に、腫瘍大きさが５ｍｍ  ｘ  ５ｍｍ  ｘ  ２ｍｍに育ったヌードマウス（ｎ＝８）に、この物質を尾静脈注射で２０ｍｇ／ｋｇの濃度で注射した。注射後１，２，８時間が経過した後に、磁気共鳴映像を測定した。これと共に、対照群としてＣＬＩＯ−ハーセプチンハイブリッドおよび酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）−ハーセプチンナノハイブリッドを用いて同じ実験を行った。
【００８８】
図９に示すカラーコーディングされた磁気共鳴映像結果により、マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド（図９（ａ）〜図９（ｃ））を、酸化鉄−ハーセプチンナノハイブリッド（図９（ｄ）〜図９（ｆ））およびＣＬＩＯ−ハーセプチンナノハイブリッド（図９（ｇ）〜図９（ｉ））と比較すると、腫瘍部位において、２時間が経過した後に初めてのものと比較したときに、その色が赤色から青色に完全に変わることが分かる。一方、酸化鉄−ハーセプチンナノハイブリッドの場合は、２時間が経過した後にその色が赤色から赤色と黄色が混合している状態に変化する。ＣＬＩＯ−ハーセプチンナノハイブリッドの場合は、２時間が経過した後に全く色の変化がなかった。
【００８９】
また、各々の物質に対して腫瘍部位のＭＲ  Ｒ２変化値（ΔＲ２／Ｒ２ｃｏｎｔｒｏｌ）を測定してみた結果、図９（ｊ）に示すように、マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッドの場合は、８時間経過した後に３５％のＲ２緩和係数の変化が観測された。一方、酸化鉄−ハーセプチンナノハイブリッドおよびＣＬＩＯ−ハーセプチンナノハイブリッドの場合は、各々１０％と３％のＲ２緩和係数の変化が観察された。
【００９０】
上記の結果により、マンガンフェライト−ハーセプチンハイブリッド粒子を磁気共鳴映像癌診断造影剤として用いた場合には、既存の物質−酸化鉄およびＣＬＩＯ−に比べ、さらに優れた信号増強効果をもたらすことが分かり、これにより、小さい大きさの癌診断に成功した。
【００９１】
実施例９：放射性同位元素１１１Ｉｎで表示されたマンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子のＩＮ  ＶＩＶＯ生体分布
マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子に放射性同位元素である１１１Ｉｎを付けて、ｉｎ  ｖｉｖｏ上における体内分布を確認した。Ｉｎ  ｖｉｖｏ実験に使ったマウスは、実施例７で使ったものと同じ条件のマウス（ｎ＝３）を使った。１１１Ｉｎで表示されたマンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子は、次のような方法によって合成された。先ず、１０ｍｇのハーセプチンを１ｍｌの２．５ｍＭ  ｐＨ６．５の酢酸ナトリウムバッファに溶かした後、各々１ｍｇのＤＴＰＡ（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｔｒｉａｍｉｎｅ  ｐｅｎｔａａｃｅｔａｔｅ）とｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを混ぜた。１時間の反応後、マレイミドおよびＤＴＰＡで活性化したハーセプチンを、セファデックスＧ−２５カラムを通して分離し、直ちに４ｍｇの水溶性マンガンフェライトナノ粒子と混ぜて反応させた。
【００９２】
４時間後、反応せずに残っているハーセプチンおよびナノ粒子をセファクリルＳ−３００カラムで分離した後、分離したナノ粒子溶液に３ｍＣｉの１１１ＩｎＣｌ３を混ぜて反応させた。１時間の反応後、１１１Ｉｎで表示されたマンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子は、セファデックスＧ−２５カラムを用いて分離した後、０．４ｍｇ（Ｍ＋Ｆｅ）の物質を直ちに尾静脈注射でマウスの生体内に投入した。その後、ｇ−カメラおよびｇ−カウンターを使って生体分布図を調べた。
【００９３】
図１０（ａ）と図１０（ｂ）に示すように、２時間経過後、ナノハイブリッド粒子は主に肝臓、脾臓、膀胱などに分布することが分かり、尾の注射点にも強い信号が観察された。しかし、２４時間経過後、尾の注射地点における信号は減少し、腫瘍がある部位で信号が検知されることを確認した。それに基づき、その後、各々の臓器を摘出し、ｇ−カウンターを用いて生体分布を調べた結果、図１０（ｃ）に示すように、肝臓、脾臓、筋肉に各々１２．８±３．０、８．７±３．２、１．０±０．３の信号が示され、腫瘍においては３．４±０．７％ＩＤ／ｇの生体分布度を観察した。
【００９４】
実施例１１：光学−ＭＲＩ二重モード診断用ナノハイブリッドシステム
光学的性質と磁性を同時に有する診断用プローブを開発するために、ウシ血清アルブミンで表面安定化したマンガンフェライトナノ粒子に蛍光染料（ＦＩＴＣ）を付け、磁性と蛍光を同時に有するハイブリッド粒子を開発した（図１１（ａ））。このために、ウシ血清アルブミンに存在する−ＮＨ２のモル比で、２０倍程度過量のＮＨＳ−ＦＩＴＣをいれ、１０ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）において常温で２時間反応させた。その後、反応せずに残っている過量のＮＨＳ−ＦＩＴＣを、緩衝溶液上において透析（ＭＷＣＯ、〜２０００）によって除去した。その結果、図１１に示すように、この光学−磁性ハイブリッド粒子は蛍光を有し、且つ磁気共鳴映像信号も同時に有していることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、１２ｎｍ大きさのジメルカプトコハク酸で囲まれたマンガンフェライト（ＭｎＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子と、同じ大きさの酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、コバルトフェライト（ＣｏＦｅ２Ｏ４）、ニッケルフェライト（ＮｉＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子との、磁気共鳴映像造影効果の比較である。図１（ａ）は合成されたナノ粒子の電子顕微鏡分析である。図１（ｂ）は合成されたナノ粒子に１．５Ｔ外部磁場を印加した時の質量磁化率である。図１（ｃ）と図１（ｄ）は各ナノ粒子のＴ２スピン−スピン緩和磁気共鳴造影効果の比較であり、各ナノ粒子のＴ２スピン−スピン磁気共鳴映像結果（図１（ｃ））およびＲ２（＝１／Ｔ２）緩和係数である。図１（ｅ）は様々な配位子で囲まれたマンガンフェライトナノ粒子と酸化鉄ナノ粒子との磁気共鳴映像造影効果の比較であり、（１）と（２）は各々デキストランで囲まれたマンガンフェライトナノ粒子と酸化鉄ナノ粒子、（３）と（４）は各々３−カルボキシプロピルホスフェートで囲まれたマンガンフェライトナノ粒子と酸化鉄ナノ粒子、（５）と（６）は各々ジメルカプトコハク酸で囲まれたマンガンフェライトナノ粒子と酸化鉄ナノ粒子を含む水溶液のＴ２スピン−スピン緩和磁気共鳴映像結果である。図１（ｆ）は各々の配位子で囲まれたマンガンフェライトナノ粒子と同じ大きさの酸化鉄ナノ粒子とのＲ２緩和係数の比較である。
【図２】図２は、色々な大きさのマンガンフェライトおよび酸化鉄のナノ粒子の磁気共鳴映像造影効果の比較である。図２（ａ）は６ｎｍ，９ｎｍ，１２ｎｍ大きさのマンガンフェライトナノ粒子の電子顕微鏡写真、図２（ｂ）は各大きさに応じたマンガンフェライトナノ粒子のヒステリシスループ（Ｈｙｓｔｅｒｅｓｉｓ  ｌｏｏｐｓ）、図２（ｃ）は各大きさに応じたマンガンフェライトナノ粒子のＴ２スピン−スピン緩和磁気共鳴映像結果、図２（ｄ）は各大きさに応じたマンガンフェライトおよび酸化鉄のナノ粒子のＲ２緩和係数の比較である。
【図３】図３は、様々な配位子で囲まれたマンガンフェライトナノ粒子のコロイド安定性の評価である。図３（ａ）は６ｎｍ，９ｎｍ，１２ｎｍ大きさを有するジメチルメルカプトコハク酸で囲まれたマンガンフェライトナノ粒子のアガロースゲル電気泳動写真である。図３（ｂ）〜図３（ｉ）は、色々な配位子でコーティングされたマンガンフェライトナノ粒子の塩（ＮａＣｌ）溶液およびｐＨ変化に応じたコロイド安定性および溶解度のテストである。
【図４】図４は、マンガンフェライト（１２ｎｍ）−ハーセプチンナノハイブリッド粒子の製造過程（ａ）と合成されたナノハイブリッドのアガロースゲル電気泳動上のクマシー・ブルータンパク質染色結果（ｂ）である。
【図５】図５は、マンガンフェライト−ハーセプチンハイブリッドナノ粒子を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ乳癌の磁気共鳴映像診断感度の評価である。図５（ａ）は用いられた癌細胞（Ｂｘ−ＰＣ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ−７、ＮＩＨ３Ｔ６．７）の相対的なＨＥＲ２／ｎｅｕ乳癌マーカー発現程度である。図５（ｂ）はマンガンフェライト−ハーセプチンハイブリッドナノ粒子を各々の癌細胞に処理した後に得たＴ２スピン−スピン緩和磁気共鳴映像結果である。図５（ｃ）は対照群として既に知られている代表的な分子ＭＲＩ造影剤であるｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ（ＣＬＩＯ）を各々の癌細胞に投与した後に得た磁気共鳴映像結果である。図５（ｄ）は図５（ｂ）と図５（ｃ）で提示された磁気共鳴映像結果のＲ２緩和信号に対するグラフである。
【図６】図６は、マンガンフェライトナノ粒子およびマンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子の細胞毒性実験に対する結果を示すものである。図６（ａ）と図６（ｂ）はマンガンフェライトナノ粒子を各々ＨｅＬａおよびＨｅｐＧ２細胞に投与した時の細胞生存度を示すものであり、図６（ｃ）と図６（ｄ）はマンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子を各々ＨｅＬａおよびＨｅｐＧ２細胞に投与した時の細胞生存度を示すものである。
【図７】図７は、酸化マンガンナノ粒子の電子顕微鏡写真（ａ）と、このナノ粒子のＴ２スピン−スピン緩和磁気共鳴映像結果（ｂ）である。対照群としてはナノ粒子を含まない水が用いられた。
【図８】図８は、酸化マンガンナノ粒子のマンガンイオン放出によるＴ１スピン−格子磁気共鳴映像結果である。図８（ａ）は標準物質としてＭｎ２＋イオンのＴ１スピン−格子磁気共鳴映像結果であり、図８（ｂ）と図８（ｃ）は各々マンガンフェライトナノ粒子およびマンガン酸化物ナノ粒子がｐＨ２、４、７水溶液に溶けている時、マンガンイオン放出によるＴ１スピン−格子造影効果を示す磁気共鳴映像結果である。図８（ｄ）と図８（ｅ）は図８（ｂ）と図８（ｃ）の磁気共鳴映像結果から得たＲ１（＝１／Ｔ１）緩和信号に対するグラフである。
【図９】図９は、マンガンフェライト（１２ｎｍ）−ハーセプチンナノハイブリッド粒子を、ｉｎ  ｖｉｖｏ上において小さい大きさ（５０ｍｇ、２ｍｍ  ｘ  ５ｍｍ  ｘ  ５ｍｍ）の乳癌組織診断に応用した結果を示すものである。図９（ａ）〜図９（ｃ）は、マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子を股部に乳癌腫瘍細胞を有しているヌードマウスに投与した実験において、投与前（ａ）、１時間後（ｂ）および２時間後（ｃ）にスキャンしたＴ２スピン−スピン緩和磁気共鳴映像結果であり、前記マンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子実験と同じ条件下において、図９（ｄ）〜図９（ｆ）は酸化鉄−ハーセプチンナノハイブリッド粒子を投与した後に得た磁気共鳴映像結果であり、図９（ｇ）〜図９(ｉ)はＣＬＩＯ−ハーセプチンハイブリッドナノ粒子を投与した後に得た磁気共鳴映像結果である。図面において、乳癌組織はＲ２スピン−スピン磁気緩和信号をカラーコーディング（ｃｏｌｏｒ−ｃｏｄｉｎｇ）し、赤色は低い磁気共鳴映像信号を、青色は強い磁気共鳴映像信号を示す。図９（ｊ）は図９（ａ）〜図９(ｉ)に示したイメージにおいて乳癌組織のＲ２磁気緩和信号の変化（ΔＲ２／Ｒ２ｃｏｎｔｒｏｌ）をグラフで示すものである。
【図１０】図１０は、１１１Ｉｎで表示されたマンガンフェライト−ハーセプチンナノハイブリッド粒子を股部に乳癌腫瘍細胞を有しているヌードマウスに投与した後、２時間後（ａ）および２４時間後（ｂ）に得たγカメライメージである。図１０（ｃ）は投与して２４時間後、ヌードマウスから各々の臓器を摘出し、γカウンターで測定したマンガンフェライトナノハイブリッド粒子の生体分布度（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ、％ＩＤ／ｇ：ｐｅｒｃｅｎｔ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｄｏｓｅ  ｐｅｒ  ｇｒａｍ  ｏｆ  ｏｒｇａｎ）を示す表である。
【図１１】図１１は、マンガンフェライトナノ粒子に蛍光染料（ＦＩＴＣ）を結合させて得た磁性−光学二重モードナノ粒子の模式図（ａ）、蛍光性質の光発光スペクトル分析（ｐｈｏｔｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ）および蛍光イメージ（ｂ）、二重モードナノ粒子のＲ２スピン−スピン緩和係数および磁気共鳴映像結果（ｃ）を示すものである。
【国際調査報告】
2009517463.tif 000016
2009517463.tif 000017
2009517463.tif 000018
2009517463.tif 000019