(57)【要約】本発明は、試料中のポリヌクレオチド分子のプールを増幅する方法であって、ａ）試料またはＲＮＡを取得し、ＲＮＡ分子全体を逆転写することにより、全長ｃＤＮＡを創製するか、または全長ｃＤＮＡの試料を取得する工程、ｂ）３’末端の後方となるポリヌクレオチドテールで該転写ｃＤＮＡの３’末端にテール付加する工程、ｃ）１対のプライマーを用いてｃＤＮＡを増幅する工程を特徴とし、第１の（３’）プライマーは、ｃＤＮＡの５’末端に特異的であり、第２の（５１）プライマーは、ポリヌクレオチドテールの上流部であり、ｃＤＮＡの３’ポリヌクレオチドテールの上流にある次の１〜１０ヌクレオチドに特異的であることを特徴とする方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のポリヌクレオチド分子のプールを増幅する方法であって、
ａ）ＲＮＡの試料を取得し、ＲＮＡ分子全体を逆転写することにより、全長ｃＤＮＡを創製するか、または全長ｃＤＮＡの試料を取得する工程、
ｂ）３’末端の後方となるポリヌクレオチドテールで転写ｃＤＮＡの３’末端にテール付加する工程、
ｃ）１対のプライマーを用いてｃＤＮＡを増幅する工程を特徴とし、第１の（３’）プライマーは、ｃＤＮＡの５’末端に特異的であり、第２の（５’）プライマーは、ポリヌクレオチドテールの上流部であり、ｃＤＮＡの３’ポリヌクレオチドテールの上流にある次の１〜１０ヌクレオチドに特異的であることを特徴とする方法。
【請求項２】
ＲＮＡまたはｍＲＮＡの３’ポリＡテールおよびポリＡテールの上流にある次の１〜１０ヌクレオチドに特異的である、プライマーが、逆転写に用いられ、ならびに／あるいは、第１の増幅プライマーが、ＲＮＡまたはｍＲＮＡの３’ポリＡテールに相補的である、ｃＤＮＡの５’ポリＴ配列、および５’ポリＴ配列の下流にある次の１〜１０ヌクレオチドに特異的であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
３’末端のテール付加が、末端トランスフェラーゼを用いて行われることで特徴付けられる請求項１または２のいずれか１項記載の方法。
【請求項４】
増幅がＰＣＲによって行われることで特徴付けられる請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の方法であって、増幅産物がその長さにしたがって分離される、好ましくは、ゲル電気泳動、好ましくは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、パルスフィールド電気泳動、アガロースゲル電気泳動、ＰＡＧＥまたはパルスフィールドキャピラリー電気泳動によって分離される追加工程を含む方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の方法であって、増幅産物の同一性または配列を決定する、好ましくは、チップ上の自動工程によって決定する追加工程を含む方法。
【請求項７】
試料が、ある標本由来の全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ、好ましくは、精製ＲＮＡまたはｍＲＮＡを含有す、請求項１〜６記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
高厳密度条件が、逆転写および／または増幅の工程に用いられる、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
逆転写および／または増幅、特にポリメラーゼ連鎖反応の選択性が、トレハロース、ベタイン、塩化テトラメチルアンモニウム、シュウ酸テトラメチルアンモニウム、ホルムアミドおよびオリゴ遮断剤の利用、またはポリメラーゼ連鎖反応中のジメチルスルホキシドの利用により増加させることによって、ミスプライミングの発生を減少させる、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
逆転写が、モロニーマウス白血病ウィルス、ＡＭＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２に由来する逆転写酵素（ＲＴ）によって行われ、ここで、該ＲＴのＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、存在しているか、存在しないか、低下しているかのいずれかである、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
逆転写または増幅に用いられるプライマーが、ウォブル置換を有し、好ましくはｄＴが、その３’末端上の１または２個の塩基で、好ましくは最終ヌクレオチドの上流にある２〜４位間で、ｄＧ、ｄＡもしくはｄＣで置換され、またはその逆の置換を起こし、ウォブル塩基が、好ましくは、ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣなどの任意の正規核酸塩基と塩基対を形成しうるユニバーサル塩基、好ましくは、デオキシイノシン、３−ニトロピロール２’−デオキシヌクレオシド、５−ニトロインドール２’−デオキシヌクレオシドによる置換を表している、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
プライマーおよびＲＮＡまたはｃＤＮＡのヌクレオチド間のミスマッチに反応するポリメラーゼを用いて、ポリメラーゼが、ミスマッチしたエキソヌクレアーゼ耐性プライマーを伸長させず、ここで、プライマーが、特に好ましくはホスホロチオエート修飾または人工核酸により、エキソヌクレアーゼに耐性であることが好ましい、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
逆転写中に鋳型ＲＮＡまたはｍＲＮＡの５’キャップに応じて、オリゴｄＣの３’配列、好ましくは１〜６ｄＣヌクレオチドの長さを有するｃＤＮＡを生成することにより、好ましくは、オリゴｄＣのキャップ依存的３’配列が、オリゴｄＣ配列に特異的な第２プライマーを増幅中に用いることにより、完全転写ｃＤＮＡを単離するために用いられる、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
ｃＤＮＡの３’末端のテール付加が、ｄＣが存在しないことを特徴とするポリヌクレオチド配列を用いて行われる、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
増幅反応に用いられるＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆ１  ＤＮＡポリメラーゼ、ａＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｅｑｕｅｎａｓｅまたはＫｌｅｎｔａｑならびに／あるいはＰＦＵ、Ｕｌｔｍａ、Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、ＰＷＯおよびＴｌｉの各ポリメラーゼまたはイー・コリエキソヌクレアーゼＩＩＩから選択される、プルーフリーディング活性を有する酵素である、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
試料中のＲＮＡまたはｃＤＮＡが、特にＰＣＲによって前増幅されるか、またはＲＮＡ試料が、規格化またはサブトラクトされる、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
増幅反応に用いられるプライマーが、一般式ｄＰｘｄＧｙＨＮｚ（式中：Ｐｘは、３’末端のｃＤＮＡに付加した配列に相補的なヌクレオチドを表し、ｄＧはデオキシグアニレートであり、ｙは、特に２〜５の整数であり、Ｈは、ｄＴまたはｄＡまたはｄＣのいずれかであり、Ｎは、長さｚを有するヌクレオチド配列であって、その構成ヌクレオチドは、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧまたはｄＴから独立して選択され、ｚは、０〜１０、特に０〜５の整数である）によって特徴付けられる、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
増幅がＰＣＲにより行われ、ＰＣＲプライマーが、ｃＤＮＡの３’または５’オリゴヌクレオチド末端配列の末端に適切に配置することを可能とする、アンカー配列を含有する、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
増幅プライマーまたは逆転写プライマーが、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含有し、特にプロモーターが、Ｔ７またはＴ３またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼによて転写を促進する、請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
増幅プライマーおよび／または増幅産物が、レポーター基、好ましくは蛍光マーカー、化学発光マーカーまたは放射性同位体によって標識化され、好ましくは、該レポーター基が、ＤＮＡを検出するために用いられる、請求項１〜１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
任意のヌクレオチド、好ましくは１〜３ヌクレオチドが、転写後であるが（例えばポリＡ）テール付加の前に、ＲＮＡまたはｍＲＮＡの３’末端に付加し、逆転写および／またはＰＣＲ用のプライマーが、任意配列に対応するウォブルを有する配列を含有する、請求項１〜２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
増幅産物が、生成され、異なる長さを有し、異なる５’もしくは３’末端配列のＲＮＡまたは全長ｃＤＮＡを認識する異なるプライマーを用いることによって、その５’および／または３’末端の所定数のヌクレオチドにより、ＲＮＡと比較して差別的に拡大される、請求項１〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
ＲＮＡまたはｍＲＮＡ試料が用いられ、ポリＡテールまたはテール配列を有さず、好ましくは、好ましくは、ポリヌクレオチドテール、特に好ましいポリＡテールが、逆転写前に合成的に加えられる、請求項１〜２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
２種のｃＤＮＡプール間の相違の検出、好ましくは２種の試料間の対応するプールが、増殖工程中またはその終わりに、好ましくはリアルタイムＰＣＲによって行われる、請求項１〜２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
５’プライマーまたは３’プライマーまたは５’−３’プライマー対が、固体支持体上にスポットおよびまたは結合し、好ましくはスポットまたは固体支持体が、所定の２次元または３次元領域に局在し、好ましくはかかる領域が、領域に局在されるプライマーまたはプライマー対の同一性を解読する情報を含有する、請求項１〜２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
逆転写および増幅の工程が一工程で行われる、請求項１〜２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
末端トランスフェラーゼによって付加されるポリヌクレオチドテールが、鋳型ＲＮＡまたはｍＲＮＡの５’キャップに応じて、逆転写中に生成される、好ましくは１〜６ｄＣヌクレオチドの長さを有する、オリゴｄＣの３’配列の後にあるリボヌクレオチド、好ましくは２〜６リボヌクレオチド、好ましくはアデノシンまたはチミジンからなり、第２の増幅プライマー（５’プライマー）が、リボヌクレオチドおよびオリゴｄＣおよびオリゴｄＣ配列の上流にある１〜１０ヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドを含む、請求項１〜２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
テールが、逆転写酵素の鋳型切換え能により、好ましくはキャップ依存的手法で、ｃＤＮＡに付加され、第２の増幅プライマー（５’プライマー）が、こうして付加されたテールおよびオリゴｄＣおよびオリゴｄＣ配列の上流にある１〜１０ヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドを含む、請求項１〜２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか１項記載の方法を用いることで特徴付けられるメッセンジャーＲＮＡの発現量を測定する方法であって、増幅産物の分離および／または同定を含む方法。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項記載の方法のためのキットであって、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＴａｑポリメラーゼ、逆転写酵素または異種ポリメラーゼの混合物、ポリメラーゼが必要とする補因子または金属イオン、好ましくはＭｇ２＋もしくはＭｎ２＋の塩、プライマー、好ましくはＲＮＡまたはｃＤＮＡの５’および／または３’末端に選択的であるプライマー、さらにより好ましくはＲＮＡまたはｃＤＮＡの第１、第２、第３、第４および／または第５の末端ヌクレオチドに選択的であるプライマー、ならびに末端トランスフェラーゼおよび追加の緩衝物質を含むキット。
【請求項３１】
プライマーが、請求項１工程ｃ）、請求項２、請求項１１、請求項１２または請求項１７で定義され、特に好ましくは固体表面が、異なるプライマーまたは異なるプライマー対を有する異なる領域を少なくとも２箇所、より好ましくは少なくとも９箇所、特に好ましくは少なくとも２０箇所、最も好ましくは少なくとも６０箇所を含む、所定の領域中、好ましくはスポット中に、５’プライマーおよび３’プライマーまたはプライマー対を含む、固体表面、好ましくはチップ、特に好ましくはガラスチップ。
【請求項３２】
所定の領域中、好ましくはスポット中に、請求項１７で定義される一般式またはその相補体を含む５’プライマーまたは３’プライマー含む固体表面、好ましくはチップ、特に好ましくはガラスチップであって、好ましくは以下の配列：ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴ  ＧＡ、ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  Ｔ  ＧＧ、ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  Ｔ  ＧＣ、ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴ  ＧＴ、ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴ  ＣＡ、ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴ  ＡＧ、ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＡＡ、ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＡＴＡ、ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＡＣＡ、ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＡＧＡ、ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＡＡＡ、ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＧＴＡ、ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＣＴＡ、ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＴＴＡの１つを含むプライマーから選択され、特に好ましくは該固体表面が、異なるプライマーまたはプライマー対を有する異なる領域を少なくとも２箇所、より好ましくは少なくとも９箇所、特に好ましくは少なくとも２０箇所、最も好ましくは少なくとも６０箇所含む、固体表面、好ましくはチップ、特に好ましくはガラスチップ。
【請求項３３】
試料中のポリヌクレオチド分子のプールを増幅する方法であって、
ａ）ＲＮＡの試料を取得し、ＲＮＡ分子全体を逆転写することにより、全長ｃＤＮＡを創製するか、または全長ｃＤＮＡの試料を取得する工程、
ｂ）３’末端の後方となるポリヌクレオチドテールで転写ｃＤＮＡの３’末端にテール付加する工程、
ｃ）該ｃＤＮＡを１対のプライマーを用いて増幅する工程
によって特徴付けられ、ここで、第１の（３’）プライマーは、該ｃＤＮＡの５’末端に特異的であり、第２の（５’）プライマーは、ポリヌクレオチドテールの上流部、およびｃＤＮＡの３’ポリヌクレオチドテールの上流にある次の１〜１００ヌクレオチド、好ましくは次の１〜５０ヌクレオチド、特に好ましくは次の１〜２０ヌクレオチド、特に好ましくは次の１〜１０ヌクレオチドに特異的であり、さらに、特に好ましくは１〜１００ヌクレオチド範囲内の上流部にある、非特異的なウォブルヌクレオチドも含み、少なくとも１ヌクレオチドは、ｃＤＮＡのヌクレオチドに特異的である方法；さらに好ましくは、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
ＲＮＡの３’テール（付加されていてもよい３’テール）またはｍＲＮＡ（好ましくは内因性３’ポリＡテール）および３’テールの上流にある、次の１〜１００ヌクレオチド、好ましくは次の１〜５０ヌクレオチド、特に好ましくは次の１〜２０ヌクレオチド、特に好ましくは対ｇの１〜１０ヌクレオチドに特異的である、プライマーが逆転写に用いられ、ならびに／あるいは第１の増幅プライマーが、ＲＮＡまたはｍＲＮＡの３’テールに相補的である、ｃＤＮＡの５’テール、および５’テールの下流にある、次の１〜１００ヌクレオチド、好ましくは次の１〜５０ヌクレオチド、特に好ましくは次の１〜２０ヌクレオチド、億に好ましくは次の１〜１０ヌクレオチドに特異的であることを特徴とする、請求項１〜３３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のポリヌクレオチド増幅の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物自体が示す異なる状態の原因を理解するためには、それを引き起こす要因および過程を見出す必要がある。この探索における中心的な一要素は、非常に保存的手法で何世代にもわたって伝播することができるように、情報が保存されているゲノムである。ゲノム中に含まれる情報を行使する際、ＤＮＡはＲＮＡに転写され、さらにタンパク質に翻訳される。ゲノム（ＤＮＡ）、トランスクリプトーム（ＲＮＡ）およびプロテオーム（タンパク質）の研究は、生物の分子的基礎に関する理解に近年大いに貢献してきた。
【０００３】
ＲＮＡ試料同士をインビトロで比較するために、一連の可能性が存在している。初期の手法は、差別的ハイブリッド形成または差別的スクリーニングの方法である（Ｒｅｂａｇｌｉａｔｉら、１９８５年）。ｃＤＮＡライブラリーからクローン（または配列）をランダムに採取し、ＲＮＡ試料中においてそれらが異なる濃度で存在することを調べることに関する。その集団は１％未満と考えられるので、示差発現する単一の転写物の同定に厖大な労力を注がねばならない。この問題を克服するために、スクリーニングの前に示差発現した転写物を富化することによる、ハイブリッドサブトラクションが提案されてきた。この存在率の問題に対処する別法が、高密度マイクロアレイの導入により拓かれた。マイクロアレイ技術の使用では、対象とする遺伝子のＲＮＡに対応する数百種から数千種のｃＤＮＡを表面上にスポットし、結合させる。そうしたｃＤＮＡは、通常は配列決定済みのＥＳＴライブラリーに由来しており、（重複がなければ）その膜上に付けたスポットと同数の転写物に及ぶことができる。手短に言えば、対象とする細胞または組織から抽出したＲＮＡを、例えば逆転写中に標識し、これらのマイクロアレイにハイブリッド形成させる。次いで、２種以上のＲＮＡ調製物間で、対応スポットのシグナル強度を比較することができる。この技術は大量のデータを生み出してはきたが、こうしたハイブリッド形成技法のすべてに根本的な欠点が２つある。１つはクロスハイブリダイゼーションである。これは、ハイブリッド形成するために、２本のＤＮＡ分子はその配列全体にわたって相補的である必要がないことを意味する。したがって、このためにスポットにハイブリッド形成（結合）する分子の同一性に対して、あいまいさが持ち込まれる。第２に、スポットした分子だけしか比較できないため、その探査が、アレイの生成に用いたライブラリー中に存在する配列に限られてしまう。
【０００４】
今日一般に「ディファレンシャルディスプレー」（ＤＤ）の名で知られている代替手法が１９９２年に導入された（Ｌｉａｎｇら、１９９２年；Ｗｅｌｓｈら、１９９２年）。ＤＤでは、逆転写（ＲＴ）中に、試料の全ｍＲＮＡ集団を規定した各ｃＤＮＡプールにまず分割する。これは、塩基を１、２またはｘ個アンカーしたオリゴｄＴプライマーでＲＴをプライミングし、その試料を３、１２または３×４ｘ−１個の画分に細分することにより実現される。こうしたアンカー塩基は、ポリＡテールの直ぐ上流にある塩基とハイブリッドを形成する。したがって、ポリＡテールの直ぐ上流にある塩基がプライマーのアンカー塩基に相補的なｍＲＮＡ分子を、逆転写すべき対象として選択すること。その後のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）では、任意プライマーおよびアンカー付加プライマーを使用して規定した各ｃＤＮＡプールを増幅する。対応する各プールは、サイズ分離を行うゲル上で並べて操作する。発現量の差異は、バンド強度の差異に反映される。対象とするバンドは、ゲルから切り出し、再増幅し、その配列を決定する。当初のＤＤの一欠点は、増幅に任意プライマーが使用されることである。かかる手当たり次第の手法では、トランスクリプトームを数度包含させることにより、完全にトランスクリプトームを包含できるのは統計的に過ぎない。したがって、ディスプレー中に数回必然的に提示されるＲＮＡ分子もあろうし、まったく存在しない恐れのある分子もある。
【０００５】
ＲＮＡの各プールをより系統的に増幅させる方法が、最近導入されてきた（Ｐｒａｓｈａｒら、１９９６年；Ｐｒａｓｈａｒら、１９９９年）。原理的に、さらに３工程が必要となる。第１鎖ｃＤＮＡの合成後、第２鎖の合成を実行して２本鎖ＤＮＡを取得し、それを制限酵素で切断することができる。第３工程では、そうした断片の５’末端にアダプターを連結する。次いで、こうした断片を、５’アダプター配列に相補的な１つのプライマーおよびＲＴに使用したアンカープライマーを用いたＰＣＲで増幅する。著者らの推定によれば、６塩基切断性の各制限酵素は、ｍＲＮＡの３’ポリＡテールから５０〜４００塩基間の位置でｃＤＮＡの８％を切断する。したがって、トランスクリプトームを完全に包含しようとすれば、１２種を超える制限酵素が必要となろう。この方法のもう少し洗練された変法がＭａｔｚら（１９９７年）により記載されたが、彼らは、ＰＣＲ抑制作用を利用する「オーダードディファレンシャルディスプレー」を導入した。
【０００６】
しかし、トランスクリプトームを何らかの水準で統計的にしか包含していないことの他に、以上のＤＤ法にはすべてもう１つの欠点がある。そうした方法では、示差的に発現されるｍＲＮＡ配列の一部しか研究者には得られないことになろう。こうしたＤＤ技術の下流では、ｃＤＮＡライブラリー、もしくはオンラインで入手可能であれば全長クローンに対する配列ライブラリーをスクリーニングするか、またはＲＡＣＥ（Ｆｒｏｈｍａｎら、１９８８年）などの部分的に既知のｍＲＮＡ配列から５’および３’配列を発見できる手順を採用することが、なお必要となろう。かかる全長転写物を同定したとしても、真核生物ではゲノム複雑性の主要因がスプライシングであるので、見出したｍＲＮＡが当該シグナルを生成したｍＲＮＡであるとの確信は、少なくとも真核生物ではなお得られることはなかろう。したがって、ディスプレーで見出される配列は、数種のスプライス変異体に共通していることもある。さらに、ある遺伝子のスプライス変異体が異なれば機能も異なり得るので、当該シグナルを生成した正しいスプライス変異体を知ることが非常に望ましい。
【非特許文献１】Ａｍａｒａら，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，３４６５−３４７０
【非特許文献２】Ｂａｒｎｅｓ，１９９４，ＰＮＡＳ  ９１，２２１６−２２２０
【非特許文献３】Ｂｅｈｒら，１９９９，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２０，１４９２−１５０７
【非特許文献４】Ｃａｒｎｉｎｃｉら，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９５，５２０−５２４
【非特許文献５】Ｃｌａｒｋ，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６，９６７７−９６８６
【非特許文献６】Ｄｉ  Ｇｉｕｓｔｏら，２００４  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２，ｅ３２  １−８
【非特許文献７】Ｆｒｏｈｍａｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ  ８５，８９９８−９００２
【非特許文献８】Ｆｕｒｕｉｃｈｉら，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５３，３７４−３７５
【非特許文献９】Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎら，２００４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１４，８７０−８７７
【非特許文献１０】Ｈａｗｋｉｎｓら，２００３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３４，７６８−７７３
【非特許文献１１】Ｈｅｌｌｅｒら，２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６２，２９３−３０５
【非特許文献１２】Ｉｒｉｅら，２０００，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１，３６７−３７４
【非特許文献１３】Ｊｉｎら，２００４，ＲＮＡ．１０，１６９５−１６９７
【非特許文献１４】Ｋｏｖａｒｏｖａら，２０００，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８，ｅ７０ｉ−ｅ７０ｉｉｉ
【非特許文献１５】Ｌｉａｎｇら，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７，９６７−９７１
【非特許文献１６】Ｍａｇｎｕｓｄｏｔｔｉｒら，２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６２，３２３−３３１
【非特許文献１７】Ｍａｔｚら，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，２５４１−２５４２
【非特許文献１８】Ｍｉｚｕｎｏら，１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７，１３４５−１３４９
【非特許文献１９】Ｍｏｒｒｉｓら，２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６２，３０７−３２１
【非特許文献２０】Ｐｒａｓｈａｒら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９３，６５９−６６３
【非特許文献２１】Ｐｒａｓｈａｒら，１９９９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３０３，２５８−２７２
【非特許文献２２】Ｒｅｂａｇｌｉａｔｉら，１９８５，Ｃｅｌｌ  ４２，７６９−７７７
【非特許文献２３】Ｓｃｈｍｉｄｔら，１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７，ｅ３１
【非特許文献２４】Ｓｐｉｅｓｓら，２００２，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０１，１６８−１７４
【非特許文献２５】Ｓｋｅｒｒａ，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０，３５５１−５４
【非特許文献２６】Ｔｈｉｅｌら，１９９７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５２，６２−７０
【非特許文献２７】Ｗｅｌｓｈら，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０，４９６５−４９７０
【非特許文献２８】Ｗｉｔｔｗｅｒら，１９９７ａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２，１３０−１３８
【非特許文献２９】Ｗｉｔｔｗｅｒら，１９９７ｂ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２，１７６−１８１
【非特許文献３０】Ｘｉｅら，２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６２，６７−８３
【非特許文献３１】Ｙａｎｇら，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３２８，２６５−２７２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目標は、試料中に存在する全ｍＲＮＡ分子に完全に及んでいる、規定した全長転写物亜集団を増幅（富化）できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この度、本発明は、試料中のポリヌクレオチド分子のプールを増幅する方法であって、  ａ）ＲＮＡの試料を取得（または提供）し、ＲＮＡ分子全体を逆転写することにより、全長ｃＤＮＡを創製するか、または全長ｃＤＮＡの試料を取得（もしくは提供）する工程、
ｂ）３’末端の後方となるポリヌクレオチドテールで転写ｃＤＮＡの３’末端にテール付加する工程、
ｃ）１対のプライマーを用いてｃＤＮＡを増幅する工程
を特徴とし、第１の（３’）プライマーは、ｃＤＮＡの５’末端に特異的であり、第２の（５’）プライマーは、ポリヌクレオチドテールの上流部、およびｃＤＮＡの３’ポリヌクレオチドテールの上流にある次の１〜１０ヌクレオチド（即ち、次の１もしくは２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチド）、好ましくは１〜５ヌクレオチド、さらに一層好ましい３〜５ヌクレオチドに特異的であることを特徴とする方法を提供する。当然ながら、第２のプライマーは、テール特異的領域（相補体）の上流にある１〜１０ヌクレオチド領域のさらに上流にある、より特異的なヌクレオチドも含みうる。
【０００９】
全長ｃＤＮＡは、下記の逆転写プロセス、または最先端で知られている方法により創製されうる。全長ｃＤＮＡを生成する方法は、当業者には十分に知られており、例えば米国特許第５９６２２７１号および米国特許第５９６２２７２号に開示されている。かかる生成ｃＤＮＡはまた、全長ｃＤＮＡを異なる画分にプールするための出発物質としても用いられうる。こうした方法では、ｃＤＮＡの５’末端へ規定した配列をキャップ依存的に付加する逆転写酵素の鋳型切換え能を用いる。したがって、その後の増幅で必要なプライマーは、ｃＤＮＡのこうして生成した３’末端に相補的であり、増幅されるｍＲＮＡ分子の５’末端により規定される追加の塩基数個、例えば１〜１０個を介して増幅されるｃＤＮＡ部分を規定するような部分を有することになろう。
【００１０】
したがって、好ましくはキャップ依存的手法で逆転写酵素の鋳型切換え能により、テールをｃＤＮＡに付加し、第２の増幅プライマー（５’プライマー）が、こうして付加されたテールおよびオリゴｄＣおよびオリゴｄＣ配列の上流にある１〜１０ヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドを含むことが好ましい。
【００１１】
本明細書で用いられる場合、用語「逆転写酵素」とは、逆転写酵素活性を有し、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するために使用できる任意のポリメラーゼに関する。
【００１２】
本明細書で用いられる場合、用語「全長ｃＤＮＡ」とは、ＲＮＡの第１塩基から最終塩基にわたり、そのＲＮＡ配列に相補的な配列を含むＤＮＡと定義される。例えば大部分の真核性ｍＲＮＡに当てはまるように、キャップおよび／またはポリＡテールを有するＲＮＡ分子の場合、「全長ｃＤＮＡ」とは、キャップ、例えばＲＮＡの７−メチルグアノシンキャップ即ちＲＮＡ  ｍ７Ｇキャップの後にある第１塩基から、鋳型として使用されるＲＮＡのポリＡテールの前にある最終塩基にわたるまで、そのＲＮＡ配列に相補的な配列を含むＤＮＡと定義される。
【００１３】
本明細書で使用する場合、用語「全長増幅産物」とは、ＲＮＡの第１塩基から最終塩基にわたり、そのＲＮＡ配列に相補的な配列を含むＤＮＡと定義される。例えば大部分の真核性ｍＲＮＡに当てはまるように、キャップおよび／またはポリＡテールを有するＲＮＡ分子の場合、「全長増幅産物」とは、鋳型として使用されるＲＮＡのキャップの後にある第１塩基からポリＡテールの前にある最終塩基にわたり、そのＲＮＡ配列に相補的な配列を含む増幅産物と定義される。
【００１４】
本発明の中核要素は、全長ＲＮＡ分子を、５’および／または３’末端に関して規定される亜集団中に表現できるという事実である。原理的にその意味するところは、当技術分野で公知の任意の手段で全長ｃＤＮＡを生成した後、５’および／または３’配列を使用して、以下の特質を有するプライマー組合せの集合（プライマーマトリックス）を系統立てることができることである。
１）各ｃＤＮＡは、１プライマー対だけによりミスプライミングなしに増幅されるであろう。したがって、重複せずにトランスクリプトームの完全な包含に達することができる。
２）規定したかかるプール内の各ｃＤＮＡ配列は、対応ＲＮＡから翻訳されるタンパク質の全アミノ酸配列をコードすることであろう、さらに、
３）その遺伝子上にある転写開始部位を規定されたい（異なる転写開始部位を有し得る同じ遺伝子から転写されるＲＮＡ分子は、異なり得ると思われる）。
特質（１）を元のＤＤと比較すると、後者の場合、任意プライマーは、特定のｃＤＮＡに非相補的、１回相補的、２回以上相補的のいずれかの性質を有していると言うことができる。したがって、各ｃＤＮＡは、まったく表現できないか、または１回もしくは２回以上表現できる。制限酵素が含まれる代替的手順を用いた場合、各制限酵素は、特定のｃＤＮＡをまったく切断しないか、または１回もしくは２回以上切断することになろう。したがって、真に完全なトランスクリプトームの包含には達することができない。さらに、ｍＲＮＡが、ディスプレー中に少なくとも１回表現される確率の増加は、重複の増加を意味するであろう。
【００１５】
これまで用いられたディファレンシャルディスプレーによる場合、ＲＡＣＥなどの下流技術を採用しない限り特質（２）および（３）に到達することもできない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、示差発現されたＲＮＡ分子の定性的および定量的検出を介して、トランスクリプトームを増幅し、検出する方法を提供する。本発明に記載の技法は、組織化された全長発現ディスプレーである。
【００１７】
好ましい実施形態では、本発明に記載の方法は、ＲＮＡもしくはｍＲＮＡの（好ましくは３’ポリＡ）テールと、（ポリＡ）テールの上流にある次の１〜１０ヌクレオチド、好ましくは１〜５ヌクレオチド、さらに一層好ましい３〜５ヌクレオチドとに特異的であって、逆転写に使用されるプライマーを含む、および／または１つの増幅用プライマーは、ＲＮＡもしくはｍＲＮＡの（３’ポリＡ）テールに相補的である、ｃＤＮＡの対応する（５’ポリＴ）配列と、ｃＤＮＡの対応する（５’ポリＴ）配列の下流にある次の１〜１０ヌクレオチド、好ましくは１〜５ヌクレオチド、さらに一層好ましい３〜５ヌクレオチドとに特異的である。したがって、上記の選択的な３’プライマーに加えて、選択的な５’プライマーを使用して、プライマー対の選択能を高めることにより、末端配列アンカーに隣接する特定のヌクレオチド類に規定されるｃＤＮＡプールの数を増加させることができる。
【００１８】
逆転写のプライマーは、デオキシヌクレオチドからなるのが好ましい。
【００１９】
一般に、本明細書全般にわたるプライマーは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドなどの任意のヌクレオチドからなり得る。大抵の場合にデオキシヌクレオチドが好ましいが、リボヌクレオチドプライマーも可能である。したがって、下記の例に示すような、所与のプライマー中のデオキシリボヌクレオチドは、そのリボヌクレオチド類縁体（例えば、ｄＧをＧで、ｄＡをＡで、ｄＣをＣで、ｄＴをＴもしくはＵで）、または他のヌクレオチド類縁体の１つで置換してもよい。
【００２０】
３’末端のテール付加は、末端トランスフェラーゼを用いて行うのが好ましい。しかし、例えば、規定した任意の配列とし得るテール配列の連結など、他のテール付加法も開示されてはいる。末端トランスフェラーゼは、１つのヌクレオチド型から好ましくは一様に選択された、ある特定数のヌクレオチドを付加することができる。テール付加、即ちテール配列を付加する他の任意の手段も使用することができ、例えば、逆転写酵素の鋳型切換え能の使用、または一様な１種のヌクレオチドもしくは異なるヌクレオチドからなり得るテール配列の連結がある。かかるテールは、好ましくは５〜５００ヌクレオチドの範囲、より好ましい４００未満、３００未満、２００未満、１００未満、５０未満、または３０ヌクレオチド未満の配列である。
【００２１】
好ましい実施形態では、選択的プライマー対を用いたｃＤＮＡ配列の増幅は、ＰＣＲにより行われる。ＰＣＲまたはポリメラーゼ連鎖反応は、ポリメラーゼ、ヌクレオチド三リン酸、プライマー、緩衝物質およびＭｇイオンなどの補因子、ならびにハイブリッド形成、重合および融解またはストランド分離に対する温度処方を用いてポリヌクレオチドを増幅する、最先端で知られている十分に確立された技法である。
【００２２】
増幅の第１のプライマーおよび／または第２のプライマーは、デオキシヌクレオチドからなるのが好ましい。
【００２３】
好ましい実施形態では、本発明に記載の方法は、増幅産物をその長さにしたがって分離する追加工程を含む。創製したポリヌクレオチドの分離によって、選択的重合後の特性決定、単離および配列決定が各プールに対して可能となり、この好ましい実施形態を実施する上で相当な利点となる。
【００２４】
分離は、ゲル電気泳動で行うのが好ましく、好ましくはアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはキャピラリー電気泳動である。
【００２５】
本発明に記載の方法は、増幅産物の同一性または配列を決定する追加工程を含むことがさらに一層好ましい。配列決定は、例えばゲル配列決定、例えば、ジデオキシヌクレオチドを用いるＰＣＲ、または自動シークエンサーにより行うことができる。
【００２６】
増幅産物の同一性または配列を決定する追加工程は、チップ上の自動化プロセスにより行うのが好ましい。
【００２７】
逆転写に用いる試料は、ある標本由来のＲＮＡまたはｍＲＮＡの全体、好ましくは精製したＲＮＡまたはｍＲＮＡを含有するのが好ましい。総ＲＮＡには、それだけに限らないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などのコードＲＮＡと称するタンパク質コードＲＮＡ、およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、小分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、小分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）などのタンパク質非コードＲＮＡ（非コードＲＮＡまたはｎｃＲＮＡ）が挙げられる。これらの部類の各類は、単独または１類もしくは複数類と共に、本発明の範囲に入る方法に従って分析することができる。
【００２８】
こうしたＲＮＡ分子は、例えばオリゴｄＴ−セルロースカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することが好ましい。こうして、ポリＡテールを有するｍＲＮＡを予備選択することができる。
【００２９】
本発明法では、高厳密度（ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）の条件で逆転写を実施することにより、１種の重合反応におけるアンカー付加プライマーの１プールとして、ならびに各種の重合反応に対する個別のプライマーとして使用できる、アンカー付加プライマーの選択性を高めることが好ましい。本発明においては、「厳密なハイブリッド形成条件」または「厳密な条件」という語句は、本発明のプライマーが、標的配列にはハイブリッド形成するが、他の配列には最小数しかハイブリッド形成しないような条件を指す。高厳密度は、例えば、高いアニーリング温度だけの使用、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、シュウ酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＯ）などの薬品添加剤との併用により実現することができる（Ｋｏｖａｒｏｖａら、２０００年）。高厳密度ハイブリッド形成条件の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．１９９４に示されている。標準的ＰＣＲ条件下では、プライマーの融解温度より約５℃低いアニーリング温度を選定することが多い。反応条件を一定に維持すると、融解温度は、オリゴヌクレオチドの長さおよびＧＣ含量に主に依存するが、そのＧＣ含量は当技術分野で公知の汎用手段により算出することができる。より厳密な条件下では、ミスプライミングの可能性を減らすために、標準条件で用いる温度よりアニーリング温度を高くする。アニーリング温度は、増幅のためのプライミング事象がなお十分に起こり得ると見込まれる温度に上げることができる。例えば、プライマーの融解温度が５０℃であり、標準条件下であれば４５℃のアニーリング温度が選定されるとすれば、５０℃のアニーリング温度は、４５℃より厳密となろう。例えば、ｄＴ１６ＶＮ型のプライマーは、通常のＲＴ条件下で強くミスプライミングを起こし、そのため合成されたｃＤＮＡプールの特異性を低下させる恐れがある（Ｍｉｚｕｎｏら、１９９９年）。同様な結果が、ＡＭＶおよびＨＩＶ−１の逆転写酵素について報告されてきた。プライマーの混乱は、アニーリングおよび逆転写中の温度を上げることにより、減少させることができる。このために、逆転写酵素活性を示す耐熱酵素を使用することができる、または反応混合物にトレハロースなどの耐熱保護剤を添加することにより、逆転写酵素を熱から保護することができる（Ｃａｒｎｉｎｃｉら、１９９８年）。トレハロースの使用で加わる便益は、全長ｃＤＮＡの量が増加することである（Ｃａｒｎｉｎｃｉら、１９９８年）。この性質はＳｐｉｅｓｓら（２００２年）によっても記載された。その上、Ｓｐｉｅｓｓは、ベタインも全長ｃＤＮＡの量を増加させることができ、ベタインおよびトレハロースを併用すると最良の結果が得られることを示した（Ｓｐｉｅｓｓら、２００２年）。かかるＲＴは、モロニ���マウス白血病ウィルス（Ｍ−ＭＬＶ）（ＵＳ４９４３５３１Ａ）、またはより好ましい実施形態ではＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を欠いたＭ−ＭＬＶ（ＵＳ５４０５７７６Ａ）から誘導することができる。プライマーの特異性を高めるさらに別の可能性は、Ｍｉｚｕｎｏら（１９９９年）が記載したように競合的なオリゴヌクレオチド遮断剤を含めることである。したがって、本発明は、逆転写および／または増幅のプロセスに対して高厳密度条件を使用する方法も含む。
【００３０】
本発明に記載の方法では、逆転写および／または増幅反応、特にポリメラーゼ連鎖反応の選択性は、トレハロース、ベタイン、塩化テトラメチルアンモニウム、シュウ酸テトラメチルアンモニウム、ホルムアミドおよびオリゴ遮断剤の利用、またはポリメラーゼ連鎖反応中のジメチルスルホキシドの利用により増加させることによって、ミスプライミングの発生を減少させ、全長ｃＤＮＡを増量することが好ましい。
【００３１】
すべての逆転写酵素は高いエラー率を有するので、反応中にプルーフリーディング活性を含めることが好ましい。３’→５’エキソヌクレアーゼ機能を介してかかる活性を有する酵素は、例えば、ＰＦＵ、Ｕｌｔｍａ、Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、ＰＷＯおよびＴｌｉ、またはイー・コリエキソヌクレアーゼＩＩＩなどのポリメラーゼである。ＲＴ中にｃＤＮＡに持ち込まれるエラーを減少させることの他に、プルーフリーディング活性を含めることにより、全長ｃＤＮＡの合成を増強することもできる（Ｈａｗｋｉｎｓ、２００３年）。
【００３２】
かかるプルーフリーディング活性は、本法のＰＣＲ工程に含めることもさらに好ましい。一方では、この結果、ＰＣＲ中の配列に持ち込まれるエラーが減少し、同時に、増幅することのできるｃＤＮＡ分子のサイズが拡大するであろう（Ｂａｒｎｅｓ、１９９４年）。かかる３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は、反応中に用いられるプライマーを分解する恐れがあるので、例えば、プライマーの３’末端にホスホロチオエート結合を導入すること（Ｓｋｅｒｒａ、１９９２年；Ｄｉ  Ｇｉｕｓｔｏ、２００４年）、またはＬＮＡ（ロックト核酸）を使用することにより、プライマーを分解から保護することが好ましい。
【００３３】
逆転写および／またはＰＣＲ中に、処理能力および忠実度の高い酵素または酵素の組合せを用いることが好ましい。
【００３４】
本発明は、少なくとも原理的にはトランスクリプトームを完全に包含し、重複のない方法を提供する。しかし、そうとは言え、ミスプライミングやポリメラーゼ停止などの手順上の特性は、その結果に影響する恐れがある。したがって、長いｍＲＮＡの包含は使用する酵素に依存する。長いＰＣＲ法に使用するプルーフリーディング酵素は、所与の酵素および方法パラメーター（例えば、長い伸長時間）にとって理想的な条件下で、トランスクリプトームの包含範囲を少なくとも９９％に拡大する。例えば、厳密度およびプルーフリーディング活性によりミスアニーリングが最小限にできると、包含されるトランスクリプトームの重複を制限し得る。
【００３５】
ディスプレーすることのできるＲＮＡ分子の最長は、逆転写および増幅反応、例えばＰＣＲの特質に特に依存する。原理的に、長いＰＣＲは、ＤＮＡを少なくとも３５ｋｂまで（Ｂａｒｎｅｓ、１９９４年）、ＲＴ−ＰＣＲを少なくとも２０ｋｂまで（Ｔｈｉｅｌら、１９９７年）増幅することができ、したがって全転写物の少なくとも９９．９％をディスプレーすることができる。しかし、約８０ｋｂの長さを有するタイチン（ＮＣＢＩ受入番号Ｘ９０５６８）などの異常に長いＲＮＡ分子が存在しており、理論的にはディスプレーすることができても、実用上かかる転写物にディスプレーを合わせることは恐らくなかろう。
【００３６】
逆転写は、モロニーマウス白血病ウィルス、ＡＭＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２に由来する逆転写酵素（ＲＴ）により行うのが好ましいが、こうしたＲＴのＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、存在しているか、存在しないか、低下しているかのいずれかである。逆転写は、逆転写酵素活性を有する任意の酵素、例えば、Ｍｎ２＋の存在下で逆転写酵素活性を示すＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼにより行うことができる。加えて、該ＲＮＡは、逆転写工程の後、例えばＲＮａｓｅなどのＲＮＡ分解酵素で分解することにより、長いＰＣＲを促進することができる。
【００３７】
逆転写ならびに増幅に対しては、熱サイクル手順とは無関係に設計した酵素を使用することができる、即ち等温重合をすることができることが好ましい。
【００３８】
逆転写に使用されるプライマーは、特異性をさらに高めるために、３’末端上の１個または複数の塩基、好ましくは１、２、３、４または５個の塩基に、好ましくは末端ｄＴ配列の最終ｄＴの上流にある２〜４位間にウォブル（ｗｏｂｂｌｅ）を有することが、さらに好ましい。
【００３９】
本明細書で使用する場合、用語「プライマー」とは、同じ配列を有するオリゴヌクレオチドの混合物を指す。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「ウォブルプライマー」とは、「ウォブル」の部分となる１個または複数の塩基を別とすれば、同じ配列を有するオリゴヌクレオチドの混合物を指す。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「ウォブル」とは、２種または３種または４種のヌクレオチドの混合物として存在する、プライマープール内の塩基を指す。
【００４２】
例えば、ウォブルプライマーは、配列ＡＣＡＣＡＣＮのオリゴヌクレオチドからなることができ、Ｎをウォブルと称し、ＮはＡまたはＣまたはＴまたはＧである。そこで、該ウォブルプライマーは、配列ＡＣＡＣＡＣＡ、ＡＣＡＣＡＣＣ、ＡＣＡＣＡＣＴおよびＡＣＡＣＡＣＧのヌクレオチドの混合物からなるであろう。
【００４３】
ウォブルプライマー中の混合物としてヌクレオチドＮ（ＮはｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびｄＴの混合物）を使用する際、デオキシイノシン、３−ニトロピロール２’−デオキシヌクレオシドおよび５−ニトロインドール２’−デオキシヌクレオシドなどのユニバーサル塩基を有するヌクレオチドを代用することができる。ユニバーサル塩基は、任意のヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）と塩基対を形成するであろう。
【００４４】
したがって、本発明によれば、逆転写または増幅に使用されるプライマーは、ウォブル置換を有するのが好ましく、例えば、３’末端上の１個または２個の塩基で、好ましくは最終ヌクレオチドの上流にある２〜４位間で、ｄＴがｄＧ、ｄＡ、ｄＣに置換され、またその逆の置換を起こしてもよいが、該最終ヌクレオチドは、５’ＲＴプライマー（５’→３’ストランド合成用）および３’増幅プライマーに対してはｄＴであり、５’増幅プライマーに対してはｄＡであることが好ましい。本法のＰＣＲ工程では、かかる「ウォブル」プライマーを使用して、増幅すべきｃＤＮＡ分子の５’および３’両末端に対する特異性を高めることができる。
【００４５】
ウォブルは、元のＲＮＡの（例えばポリＡ）テールに相補的なプライマーを、そのテールの直ぐ上流にある塩基に固定化するためにも使用することができる。この場合、様々なプールへの選択は、元のＲＮＡのキャップ後塩基に対応する塩基に選択的なプライマーにより実現することができる。ウォブルが、元のＲＮＡのキャップ下流にある塩基に対応する塩基に、プライマーを固定化できるｃＤＮＡの３’末端にも、同じ理屈を適用することができる。したがって、様々なプールへの選択は、元のＲＮＡの（例えばポリＡ）テールの直ぐ上流にある、塩基に対応する塩基に選択的なプライマーを介して行われるであろう。
【００４６】
さらに一層好ましくは、ウォブル塩基が、ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣなどの任意の正規核酸塩基と塩基対を形成できるユニバーサル塩基、好ましくはデオキシイノシン、３−ニトロピロール２’−デオキシヌクレオシドまたは５−ニトロインドール２’−デオキシヌクレオシドによる置換を表している、本発明に記載の方法である。
【００４７】
好ましい実施形態では、増幅されるｃＤＮＡの特異性は、３’末端がエキソヌクレアーゼ耐性である（例えば、ホスホロチオエート修飾または人工核酸の導入により）プライマーと、３’→５’エキソヌクレアーゼ機能との併用により増強することができるが、そのエキソヌクレアーゼ活性は、例えばＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの性質である。これによって、単一のミスマッチまたは多重のミスマッチが、プライマーの３’末端から最初の８塩基で起こった場合、増幅の「スイッチ切断」がなされるであろう（Ｙａｎｇら、２００５年）。プライマーの３’先端にある塩基は、本発明に提示した手順においてｃＤＮＡプール同士を識別するものであるので、かかる「スイッチ切断」を含めることにより、ｃＤＮＡにミスマッチしたプライマーの伸長を停止し、したがって特異性をさらに増強することは好ましい。本発明の方法では、プライマーおよびＲＮＡまたはｃＤＮＡのヌクレオチド間のミスマッチに反応するポリメラーゼを使用し（逆転写中、増幅中のいずれかで）、該ポリメラーゼが、ミスマッチしたエキソヌクレアーゼ耐性プライマーを伸長させないことが好ましく、その場合、該プライマーが、特に好ましくはホスホロチオエート修飾またはＬＮＡにより、エキソヌクレアーゼに耐性であることが好ましい。
【００４８】
好ましい実施形態では、逆転写に使用されるプライマーは、アンカーのないオリゴｄＴ配列またはテール相補的配列からなる。特異的ＲＮＡの選択は、上記の増幅工程を経たｃＤＮＡ段階で行うので、ＲＴ段階での特異性（アンカーの）は必要ない。当然ながらミスプライミングは回避すべきであり、（オリゴＴ）プライマーがＲＮＡの（ポリＡ）テール配列の上流にある配列と整列する場合は特にそうである。ミスプライミングは、厳密な条件の使用および／またはプルーリーディング性酵素の使用により回避することができる。ＲＴプロセス中のアニーリング温度は、使用するプライマーの融解温度に応じて３０〜５０℃の範囲にあることが好ましい。
【００４９】
高めのアニーリング温度、ウォブルプライマーおよびオリゴ遮断剤の使用などの厳密な条件の利用が、逆転写（ＲＴ）中にミスプライミング事象を減少させることができたとしても、好ましい解決策は、ＲＴ中に相異なるプールに分離しないことである。逆転写酵素反応は、増幅反応（例えばＰＣＲ反応）より、伸長すべき配列のミスプライミングを増加させるので、プールへの分離を増幅反応中に行うことが最も好ましい。こうすることで、ディスプレーすべき試料当たり必要なＲＴ反応も減少する。
【００５０】
好ましい実施形態では、全長ｃＤＮＡの生成をさらに進めることができる。非最適条件下では、逆転写酵素は、重合を停止させる、および／またはＲＮＡ分子の５’末端に達する前にＲＮＡストランドから離れる恐れがある。一般に、この状況は、融解しておらず、ポリメラーゼが横断できない二次構造に起因している。したがって、部分的ｃＤＮＡの生成も起こる。かかる転写物がその後の（ＰＣＲ）増幅を妨害する確率を下げるために、ｍＲＮＡ分子の５’キャップ末端に達する（Ｃｌａｒｋ、１９８８年）や、数少ない（Ｍｎ２＋およびＭｇ２＋依存性の１〜６ヌクレオチド、Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９９年）ｄＣを付加する逆転写酵素の固有能力を利用することができる。キャップ（Ｆｕｒｕｉｃｈｉら、１９７５年）構造は、キャップ構造を有していないｍＲＮＡに比べて、ＲＴの鋳型非依存ヌクレオチド付加能を著しく増大させる。これを使用して、全長ｃＤＮＡをさらに富化することができる。その後のＰＣＲ反応において、５’プライマーの相補位置にｄＧヌクレオチドを含めることによって、これらの存在するＣを有するｃＤＮＡを選択することができる。かかる場合、テール付加は、ｄＣ以外の任意のヌクレオチド、好ましくはｄＴまたはｄＡを用いて行うことができる。したがって、５’末端にＣ３個を付加したｃＤＮＡに選択的と思われる５’プライマーの全体構造は、ｄＴｘｄＧｄＧｄＧＨＮｙまたはｄＡｘｄＧｄＧｄＧＨＮｙまたはｄＣｘｄＧｄＧｄＧＨＮｙとなり、ＨはｄＡまたはｄＣまたはｄＴのいずれかになりうる。
【００５１】
好ましい実施形態では、本発明に記載の方法は、逆転写中に鋳型ＲＮＡまたはｍＲＮＡの５’キャップに応じて、オリゴｄＣ、好ましくはｄＣヌクレオチド１〜６個の長さの３’配列を有するｃＤＮＡの生成を含む。
【００５２】
オリゴｄＣの３’配列を生成する逆転写酵素の能力は、逆転写のプロセス中にＭｎ２＋イオンを添加することにより、増加することが好ましい。ヌクレオチドの付加数は、Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９９年に記載のように、ＲＴ反応にＭｎイオンを導入することにより、増加させることができる。したがって、好ましい実施形態では、ＲＴ反応にＭｎイオンを導入することにより、ｃＤＮＡの３’末端上でのｄＣの鋳型非依存的付加がキャップ依存的に定量的に増加する。それに続くテール付加は、キャップ依存的ｄＣを選択するために、ｄＣ以外の任意のヌクレオチドを用いて実施する。テール付加中の付加ヌクレオチドの選択は、このプロセス中に所望のヌクレオチドだけを与えることにより、行うことができる。したがって、（ＰＣＲ）増幅に使用される１つのプライマーは、一般式ｄＰｘｄＧｙＨＮｚを有し、式中Ｐｘはテールに相補的なヌクレオチドを表し、ｄＧはデオキシグアニレートであり、ｙは０〜１０、好ましくは１〜５、より好ましくは３〜５の整数であり、ＨはｄＡまたはｄＣまたはｄＴのいずれかとなり得るものであり、Ｎはヌクレオチド配列であって、その構成員はｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴから独立して選択され、ｚは０〜１０、好ましくは０〜５の整数である。
【００５３】
好ましい実施形態では、オリゴｄＣのキャップ依存的３’配列を使用して、オリゴｄＣ配列に特異的な第２のプライマーを増幅中に使用することにより、完全転写ｃＤＮＡを単離する。これは、上記のプライマーを使用することにより行うことができる。
【００５４】
ｃＤＮＡの３’末端のテール付加は、ｄＣが存在しないことを特徴とするポリヌクレオチド配列を用いて行うことが好ましい。
【００５５】
増幅反応に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、ａＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｅｑｕｅｎａｓｅまたはＫｌｅｎｔａｑであることが、より一層好ましい。
【００５６】
特別な実施形態では、好ましくはＰＦＵ、Ｕｌｔｍａ、Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、ＰＷＯおよびＴｌｉの各ポリメラーゼから選択される、プルーフリーディング活性を有する酵素が使用され、イー・コリエキソヌクレアーゼＩＩＩが増幅反応中に使用される。かかる酵素は、ポリメラーゼの他に、好ましくはポリメラーゼより低い濃度で使用することができる、またはそれ自体ポリメラーゼである場合には、代用することができる。プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼは、ＤＮＡ重合中の停止を防止し、エラー数を有意に低下させた長い転写物を確保する。プルーフリーディング能を有するかかる酵素は、前記のポリメラーゼと併用することが好ましい。
【００５７】
より好ましい実施形態では、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応である増幅反応に使用されるプライマーは、一般式ｄＰｘｄＧｙＨＮｚを特徴とし、式中Ｐｘは、例えば、末端トランスフェラーゼ、または逆転写酵素の鋳型切換え特性、または他の任意の手段により、ｃＤＮＡの３’末端に付加されるテールに相補的なヌクレオチドを表し、ｄＧはデオキシグアニレートであり、ｙは０を含み、好ましくは２〜５の整数であり、ＨはｄＴ、ｄＡ、ｄＣのいずれかであり、Ｎは長さｚのヌクレオチド配列であって、その構成ヌクレオチドはｄＡ、ｄＣ、ｄＧまたはｄＴから独立して選択され、ｚは０〜１０、好ましくは０〜５の整数である。
【００５８】
ＲＴおよびＰＣＲに使用されるプライマーの５’末端は、ＲＴおよびＰＣＲの実行を可能とするような任意の配列に固定化することもできる。５’および３’ＰＣＲプライマーは、異なる融解温度を有してもよく、該プライマーの一方または両方にアンカーを付加することを介して、プライマー対の融解温度を均一化することにより、ＰＣＲ条件を最適化してもよい。下流でのある種の適用のために、ＲＮＡポリメラーゼ転写（例えば、Ｔ７もしくはＴ３）を開始できるプロモーターなどの特定の配列を付加すること、または制限酵素部位を含めることも、有益になり得ると思われる。
【００５９】
最も好ましい実施形態では、増幅はＰＣＲにより行われ、ＰＣＲプライマーは、ｃＤＮＡの３’または５’オリゴヌクレオチド末端配列の末端に適切に配置することを可能とする、アンカー配列を含有する。
【００６０】
増幅プライマーまたは逆転写プライマーは、ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーターを含有することが好ましい。所望により有するこの特徴によって、ｃＤＮＡおよびそのＰＣＲ産物の転写が可能となる。
【００６１】
該プロモーターは、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼによる転写を増強することが好ましい。
【００６２】
プライマーならびにＰＣＲ産物は、その検出を可能にする当該技術分野で公知の任意のレポーター基で標識することができる。レポーター基の例には、蛍光基、化学発光基または放射性同位体、および当技術分野で公知のその他のものが挙げられる。蛍光測定、化学発光測定、シンチレーション計数および当技術分野で公知の他の手段などの技法によって検出できる、任意のレポーター基を使用することができる。
【００６３】
したがって、本発明の好ましい実施形態では、増幅プライマーおよび／または増幅産物は、レポーター基、好ましくは蛍光マーカー、化学発光マーカーまたは放射性同位体で標識される。こうしたレポーター基は、ＤＮＡの検出に使用することが好ましい。
【００６４】
近年、アラビドプシスなどの一部の真核生物（Ｊｉｎら、２００４年）は、転写中にＲＮＡ分子のポリＡテール直前の３’末端に、任意のヌクレオチドを大抵の場合１または２個付加できることが示された。さらにある種の遺伝子内でも、かかるヌクレオチド付加は異種遺伝子型となり得る。したがって、逆転写中にポリＡの上流にある第１および／または第２の塩基を識別する１組のプライマーを用いて、あるｍＲＮＡ種を特定のｃＤＮＡプール類に意図的にプール分けすることは、ある種の転写物については不成功に終わるであろう。しかし、その画分を規定するプライマーのために、こうした任意付加ヌクレオチドの上流にあるヌクレオチドを用いて、より高度のプール分けを実現することができる。ポリＡテールに相補的で、こうした付加物の上流にある塩基に選択的であると見込まれる、逆転写およびＰＣＲ増幅用の好ましいプライマーは、次の一般構造ｄＴｘＶＮｙＭｚを有し、式中ｄＴは、ｘ個反復されるデオキシチミジレートを表し、ＶおよびＮは、ウォブル塩基であって、ＶはｄＡ、ｄＣ、ｄＧのいずれかであり、Ｎは、各構成員が独立に選択されたｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴの配列であり、ｙは０以上、好ましくは１〜５の整数であり、Ｍは、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴのいずれかであり、ｚは１を超え、好ましくは１〜１０の整数である。かかるプライマーでは、Ｍｚが増幅すべきｃＤＮＡを明示することになろう。ポリアデニル化前にＲＮＡ分子に付加されるヌクレオチド数は、特定の転写物に対しても異なり得ると思われるので、１つのプライマーは、Ｎにおけるｙ量が異なるオリゴヌクレオチドの混合物となり得る。追加の便益は、ポリメラーゼが連鎖を伸長できるためには、該ウォブル後の塩基の適正なハイブリッド形成に対する圧力が強力に増加し、そのため増幅される画分を規定する塩基のミスプライミングが減少し、その結果特異性が増加する見込みとなることである。
【００６５】
本発明に記載の好ましい方法では、任意のヌクレオチド、好ましくは１〜３個のヌクレオチドが、転写後であるが（例えばポリＡ）テール付加の前に、ＲＮＡまたはｍＲＮＡの３’末端に付加し、逆転写および／またはＰＣＲ用のプライマーは、該任意配列に対応するウォブルを有する配列を含有している。
【００６６】
全長ｃＤＮＡを特異的に選択するとは見込まれない本発明の単純化変形体は、ＲＴ酵素の鋳型非依存的３’（ｄＣ）付加機能を用いずに系統立てることができる。通常のＲＴ条件下ではｄＣがまったく付加されることのない、全長ｃＤＮＡの一部がなお存在することになろう。テール付加およびＰＣＲは、ｃＤＮＡの各プールを選択的に増幅するために、前記のように使用することができる。各ｃＤＮＡは、丁度１つのプール中になお存在することになろう。しかし、全長ＲＮＡ分子に対応するＰＣＲ産物の存在率は、ＲＴ反応だけの特質で決定されることになろう。続くＰＣＲ反応は全長ｃＤＮＡコピーに選択的ではないので、複数のｃＤＮＡ分子が、単一のＲＮＡ分子を代表するＰＣＲ産物を生じ、そのため重複を持ち込む恐れがある。それでも、各ＲＮＡ分子は少なくとも１回は代表されることになろう。重複は、上記に開示したようなトレハロースおよび／またはベタインの添加、ならびに／あるいは温度上昇などの全長逆転写を促進する方法の採用により、最小限に抑えることができる。この実施形態では重複がなくならない恐れはあっても、各ＲＮＡ分子はなお少なくとも１回存在することになろう。このことは、特定のｍＲＮＡ分子を代表することに到達できるのが統計的に過ぎない他のＤＤ技法と比較すれば、１つの改良である。
【００６７】
ポリＡテールおよびキャップ構造を有していないＲＮＡの分子種も存在する。しかし、かかるＲＮＡ分子は、本発明が意図するように、規定した画分を富化するために、その後の増幅中に使用できる５’および３’先端を有することにもなろう。
【００６８】
キャップを有することも有しないこともあり、ポリＡテールを有することも有しないこともあるＲＮＡの例は、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、小分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）などのタンパク質非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）である。
【００６９】
ポリＡテールを有していないＲＮＡ分子では、ポリＡテールなどのテールが、逆転写の前に合成的（例えば、酵素的）に付加される。ヌクレオチドがＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕのいずれかとは無関係に選択されるポリヌクレオチドテールを付加することが好ましい。
【００７０】
長さが約１９〜２３塩基であるｍｉＲＮＡのように、ある一定のサイズ範囲を有するＲＮＡ種が存在する。したがって、ｍｉＲＮＡに由来する増幅産物のプール同士をサイズ分離するには、限界がある。１９〜２３塩基のサイズ範囲を有するｍｉＲＮＡをディスプレーする場合、１プール当たり最大５分子を大きさに従って分離することができる。したがって、すべてのｍｉＲＮＡ分子を分離するためには、極めて大きなプライマー集合（プライマーマトリックス）を使用しなければならない。
【００７１】
代替的手法では、ｍｉＲＮＡの一端のヌクレオチドを使用して、ｍｉＲＮＡの末端配列に従って特定数のヌクレオチドに対して、その増幅産物を人工的に拡大することができる。かかるプライマーの一般式はＰｘＮｙであり、式中Ｐはテールに相補的なヌクレオチドを表し、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔいずれかから独立に選択されるヌクレオチドを表し、ｙは０〜１０の整数であり、ｘはヌクレオチドの個数を規定し、すべてのＮｙに対して異なっている。ｍｉＲＮＡの５’末端をかかるサイズ拡大に使用する場合、ある一定のまたはありとあらゆる５’プライマーを含有するプライマーミックスを、ｍｉＲＮＡ分子の末端にあるヌクレオチド類に選択的な３’プライマーと併用することにより、特定のプールを規定する。本発明の原理に従って考え得る１つのプライマーマトリックスを図６に示す。
【００７２】
したがって本発明の好ましい実施形態では、ＲＮＡまたは全長ｃＤＮＡの５’または３’配列に従ったある一定数のヌクレオチドによって差別的に拡大される、増幅産物、特に全長増幅産物が生成する。
【００７３】
異なる長さを有し、ＲＮＡまたは全長ｃＤＮＡの異なる５’または３’末端配列を認識する異なったプライマーの使用によって、５’および／または３’末端にある規定数のヌクレオチドにより、ＲＮＡと比較して差別的に拡大される増幅産物が生成することが好ましい。また、各プライマーが異なる末端配列を認識し、異なる長さを有するプライマーの混合物を５’および／または３’プライマーとして、好ましくは使用することによって、５’および／または３’末端にある規定数のヌクレオチドにより、ＲＮＡと比較して差別的に拡大される増幅産物の各プールを生成することもできる。該プライマーは、ｃＤＮＡ（増幅工程中）またはＲＮＡ（逆転写工程中）に相補的でない規定された配列を有することが好ましい。
【００７４】
原核生物では、ｍＲＮＡはポリＡテールをまったく有していない。合成ポリＡテールの付加など、かかる分子から全長ｃＤＮＡを作製できる方法が考案された（Ａｍａｒａら、１９９７年）。前記方法をかかる分子に適用することも本発明の範囲に入る。
【００７５】
本発明に記載の方法では、ポリＡテールまたはテール配列を有していないＲＮＡまたはｍＲＮＡの試料を使用するのが好ましく、逆転写前にポリヌクレオチドテール、特に好ましくはポリＡテールを合成的（酵素的）に付加することが好ましい。
【００７６】
ディスプレーを行うためのＲＮＡ必要量を減らすために、増幅反応、例えばＰＣＲの前に予備増幅工程を導入することができる。各プールへの分離が逆転写（ＲＴ）工程でなされたか否かを問わず、予備増幅工程は、規定した各プールへ増幅（ＰＣＲ）工程で分離することを意図しているすべてのｃＤＮＡを増幅するように設計しなければならない。予備増幅工程は、特定のプライマーを用いる主増幅工程の前のテール付加前またはテール付加後に導入することができる。
【００７７】
例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼなどのプロモーターは、ＲＴ反応のプライミングに使用されるプライマーの５’末端に付加することができる。ＲＴの後で増幅（ＰＣＲ）の前に、そのプロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成することができる。このようにして得た増幅ＲＮＡは、再び逆転写しなければならないが、ＲＮＡの第１塩基に相補的であり、増幅反応（ＰＣＲ）をこの末端でプライミングするのに使用できるｃＤＮＡ塩基の下流に、ある配列が存在するか否かに応じて、例えば、逆転写酵素の鋳型切換え能により、または末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによるテール付加によりかかる配列を付加しなければならない。
【００７８】
予備増幅工程の別の例は、予備増幅ＰＣＲの使用である。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼでテール付加したｃＤＮＡの場合、１つのプライマーはかかる付加テールに特異的でなければならない。例えば、ポリＴテール付加ｃＤＮＡは、ｄＡｘなどのプライマー、および元のＲＮＡのポリＡテールに相補的なプライマー、例えばｄＴｘを必要とするであろう。完全に逆転写されたｃＤＮＡだけにプライマーがハイブリッド形成できるように、可変量のＧ、例えば１〜５個を導入することにより、したがって逆転写酵素が、非鋳型ヌクレオチド付加能によりキャップ依存的にＣ（複数）に付加した場合だけに、全長ｃＤＮＡを予備増幅できることが好ましい。その上、元のＲＮＡのポリＡテールに相補的な配列にハイブリッド形成できるプライマーは、１個または複数のウォブルを導入することにより、ポリＡテールの５’末端に固定化することができる。こうすると、ポリＡテールの長い配列を必要なだけ増幅することにより、得られる増幅（ＰＣＲ）産物の長さを増加させることが促進されるであろう。かかるプライマーは、ｄＴｘＶＮｙ（ｘはｄＴの量、ＶはＧ、Ｃ、Ａのいずれかで、Ｎは任意のヌクレオチド）の一般式を有する。
【００７９】
ｃＤＮＡの異なるプールへの識別は、複数の増幅（ＰＣＲ）工程の使用を伴うこともできる。各増幅（ＰＣＲ）工程は、増幅すべきプールに対して、より特異的となるであろう。例えば、第１の増幅（ＰＣＲ）では、ＲＮＡのポリＡテール側に相補的な側でｃＤＮＡにハイブリッド形成するために、ｄＴｘなどのプライマーを用いるであろう。このプライマーは識別性を示すことはなかろう。次の工程では、３種の反応、ｄＴｘＧでプライミングされる反応、ｄＴｘＡを用いる反応、およびｄＴｘＣを用いる反応を使用することができよう。したがって、３種のプールが創製されよう。別のＰＣＲ工程では、こうしたプールをさらに分割することができる。例えば、ｄＴｘＧプールを、ｄＴｘＧＡ、ｄＴｘＧＣ、ｄＴｘＧＧおよびｄＴｘＧＴでプライミングすることにより、４種のプールに分割することができる。したがって、合計１２種のプールが創製される。同じ理屈は、ｃＤＮＡの反対末端にも適用でき、所望であれば、両側のプール分割を組み合わせることができる。かかる配列のプール分割は、一方で出発原料（ＲＮＡ）の必要量をさらに減少させ、または調査試料の複雑度もしくは所望する調査の深度に合わせたプール分割の実現を補助することができる。
【００８０】
ＲＮＡまたはＲＮＡ由来のｃＤＮＡもしくはＰＣＲの各産物間での規格化またはサブトラクションを行う方法で組み合わせた２種以上のＲＮＡ試料も、開示した方法に従ってディスプレーできることは、本発明の範囲内に入る。例えば、高濃度のＲＮＡ種を減少させることにより、ＲＮＡを（前）処理することができる。
【００８１】
したがって、本発明は、試料中のＲＮＡもしくはそのｃＤＮＡを好ましくはＰＣＲで予備増幅するか、またはＲＮＡ試料を規格化またはサブトラクションする方法にも関する。こうした（前）処理工程は、主（識別性）増幅ｃ）の前に導入することが好ましい。
【００８２】
本発明に記載の方法のさらなる実施形態では、増幅産物の分画工程が、ゲル電気泳動、パルスフィールド電気泳動、アガロースゲル電気泳動、ＰＡＧＥ、キャピラリー電気泳動、またはパルスフィールドキャピラリー電気泳動により行われる。ＰＣＲ中に生成した試料の分画および比較は、配列やサイズなどの特定の性質に従ったＤＮＡ分子の識別を可能とする任意の方法によって、行うことができる。かかる方法には、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）などのゲル電気泳動が含まれる。分離能が高く、しかも多数の試料を並行して容易に分析できるため、キャピラリーゲル電気泳動が特に好ましい（Ｂｅｈｒら、１９９９年）。現在の標準的キャピラリー電気泳動装置は、１回で３８４種の試料を処理することができる。適当な手順の使用でさらに、広範囲のサイズにわたって必要な分離能を実現することができる。パルスフィールドキャピラリー電気泳動を用いて、特に長い断片を十分に分離することができる（Ｈｅｌｌｅｒら、２００１年；Ｍｏｒｒｉｓら、２００１年）。キャピラリー中で分離された分子の画分を収集する方法も、考案された（Ｉｒｉｅら、２０００年；Ｍａｇｎｕｓｄｏｔｔｉｒら、２００１年）。次いで、対象とする転写物を代表するかかる画分（例えば、示差発現遺伝子）は、その分子の同一性を決定するために、配列決定などのさらなる分析を受けることができる。
【００８３】
好ましい実施形態では、２種のｃＤＮＡプール間の差異検出は、本法のＰＣＲ工程中に含めることができる。ＰＣＲにおけるＤＮＡ量および／またはかかる量の変化を測定できるかかる手法は、「リアルタイムＰＣＲ」と一般に呼称する（例えば、Ｗｉｔｔｗｅｒら、１９９７年ａ；Ｗｉｔｔｗｅｒら、１９９７年ｂ）。適用可能な一手順では、ＰＣＲ反応に添加しておいたＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ色素の蛍光を測定する。該色素は、２本鎖ＤＮＡに挿入した際に蛍光の強い増大を示すことになろう。反応中に存在するＤＮＡが多いほど、蛍光がそれだけ強くなる。したがって、反応中に存在するＤＮＡ量を算出する手段が提供される。該測定は、その産物が２本鎖となるはずの重合工程終期に普通行う。その後のサイクル中にＤＮＡ量が増加するにつれ、蛍光も増加することになろう。該データは、例えば、曲線上にブロットすることにより比較でき、曲線同士を試料間で比較することができる。増幅するｃＤＮＡが１種だけの場合は、曲線は対数期を有することになろう。試料間で対数期の開始を比較することにより、ＤＮＡの相対量を算出することができる。所与の試料中に２種以上の産物が存在すれば、曲線同士が相互に加算され、勾配が変化することになろう。増幅されるｃＤＮＡプールがそれほど複雑でなければ、かかるデータでもなお異なる試料間で比較することができる。１つのＰＣＲ反応で増幅されるｃＤＮＡ量は、各産物の増幅量の差をなお検出できるような点まで、減少することが好ましい。リアルタイムＰＣＲを使用した際に試料を分析する別法は、各サイクルの終了時に存在するＤＮＡの融解曲線を算出する可能性である。反応中に存在する各ＰＣＲ産物は、その配列により規定される特定の温度で融解することになろう。産物が融解して単鎖となりつつあるとき、色素がＤＮＡにこれ以上挿入していることはなく、したがって蛍光の減少が起こることになろう。異なる温度で融解する産物は、融解曲線の異なる領域における勾配の増加に続く減少として表されよう。サイクル間、および増幅すべき同一ｃＤＮＡプールの異なる試料間の曲線を比較すると、プロファイルの異なる試料を同定することができる。融解曲線の分析は、ＰＣＲの終了時だけに行うこともできるが、既に平坦域に達した産物間の差異は、検出できない恐れがある。
【００８４】
かかる分析法を好ましくは自動操作で使用することにより、ＰＣＲの最中または終了時に差異を示す試料を迅速にスクリーニングし、ゲル電気泳動などの分画操作を経てそうした試料全部を分析する必要性を除くことができる。
【００８５】
したがって、好ましい実施形態では、２種のｃＤＮＡプール、好ましくは２種以上の試料間の対応するプールの間の差異検出は、本法の増幅工程、好ましくはＰＣＲ工程の最中または終了時に、好ましくはリアルタイムＰＣＲにより行われる。
【００８６】
本発明に記載の方法が、部分的または完全な自動化プロセスに統合できることは明白である。例えば、サイズ分画、異なる試料間比較、画分の収集および配列決定は、すべて１つのチップ上で行うことができる。この技術は、原理的に既に示された（Ｘｉｅら、２００１年）。
【００８７】
本法のチップ上へのかかる統合は、本法のＰＣＲ工程に対しても行うことができる。固相ＤＮＡ増幅（例えば、ＰＣＲにより）を可能とするように、固体支持体上にプライマーまたはプライマー対をスポットおよび／または結合することが好ましい。固体支持体上にプライマーの全セットをマイクロアレイ化またはナノアレイ化または単分子アレイ化することにより、プライマーマトリックス全体またはその一部を含有する単一反応容器を創製することができる。したがって、各５’−３’プライマー対に対して独自の反応容器を使用する代わりに、単一反応容器がすべての５’−３’プライマー対を含有する。各プライマー対は、規定した領域に配置することが好ましい。
【００８８】
各５’−３’プライマー対を独自の固体支持体（例えば、ビーズ）上に結合し、次いで、各々のプライマー組合せまたはプライマー対が独立してアドレスできるように、その固体支持体自体を配列したプライマーマトリックスも創製することができる。例えば、マイクロウェル中にビーズのマトリックスをランダムに配置し、当技術分野に公知の方法で各ビーズの位置を解読することができる（例えば、Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎら、２００４年）。したがって、Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎが記載したような方法は、本発明に適応させ、組み込むことができる。この方法では、数千種のＤＮＡ配列を高精度に同定するために、数少ない標識およびいくつかの逐次的ハイブリッド形成だけが必要である。プライマーマトリックスに関しては、各領域上のプライマーは、それ自体を解読するための情報（例えば、ハイブリッド形成、検出および洗浄の数工程により他の標識オリゴヌクレオチドで解読できる配列として）を含み得る、または本発明のプライマーと共に、解読用オリゴヌクレオチドを担体上に結合することができる。
【００８９】
したがって、好ましい実施形態では、５’プライマーまたは３’プライマーまたは５’−３’プライマー対が、固体支持体上にスポットおよび／または結合され、好ましくは該スポットまたは固体支持体が、規定した二次元または三次元領域に配置され、しかもかかる領域が、その領域に配置されたプライマーまたはプライマー対の同一性を解読する情報を含有することが好ましい。
【００９０】
好ましい実施形態では、プライマーマトリックスは、５’プライマーまたは３’プライマーまたは５’−３’プライマー対のチップ上直接合成により生成される。
【００９１】
本発明に記載の好ましい方法では、逆転写および増幅の工程は１工程で行われる。
【００９２】
全長ｃＤＮＡを富化する他の可能性も存在することは、当業者には明白である。かかる方法は、５’末端に相補的なヌクレオチドおよび／またはポリＡテールの上流にある３’末端上のヌクレオチドを介して規定される、全長ｃＤＮＡの各プールを次に増幅するように容易に適応させることができる。
【００９３】
例えば、逆転写およびｃＤＮＡの３’末端へのテール付加の各工程を代替するために、ＣａｐＳｅｌｅｃｔ法（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９９年）を使用することができる。この方法は、逆転写酵素によるＣヌクレオチドの非鋳型付加、およびポリＮテール、好ましくはポリＡテールの付加に対しても引き出される。しかし、末端トランスフェラーゼは、非指定量のデオキシリボヌクレオチドと比較して、３〜４個のリボヌクレオチドだけを好ましくは付加するであろうと主張されているように、ポリＡテールは、デオキシリボヌクレオチドの代わりにリボヌクレオチドからなっている。このことは、次の工程でアダプターが、３’−ＡＡＡＣＣＣ−５’を選択してｃＤＮＡの３’末端に特異的に結合することになるので、この方法にとって重要である。このアダプターに相補的なプライマーおよびポリＡテールに相補的なプライマーを用いて、全長ｃＤＮＡを増幅することを意図している。すべてのｃＤＮＡを増幅するためにユニバーサルプライマーを用いる代わりに、５’および／または３’ヌクレオチドを選択し、ｃＤＮＡの各プールを増幅することになるプライマーの各セットを使用することができる。ポリＡテールにハイブリッド形成し、ポリＡテール前のｘ量の塩基を選択するプライマー構造は、前記と同じものとなろう。ｍＲＮＡの５’末端を増幅するためには、３〜４個のＴおよび３〜４個のＧが後続するアダプター配列と、ＲＮＡ転写物の５’配列に対応するｘ量の塩基とを使用することができる。ｘを増加すれば、かかるプライマーにより増幅される転写物の個数は減少することになろう。
【００９４】
好ましくは、末端トランスフェラーゼが付加するポリヌクレオチドテールは、鋳型ＲＮＡまたはｍＲＮＡの５’キャップに応じて逆転写中に生成する、好ましくは長さが１〜６ｄＣヌクレオチドのオリゴｄＣの３’配列の後にあるリボヌクレオチド、好ましくはアデノシンまたはチミジンの好ましくは２〜６個のリボヌクレオチドからなり、第２の増幅プライマー（５’プライマー）は、該リボヌクレオチドおよびオリゴｄＣならびにオリゴｄＣ配列の上流にある１〜１０ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含む。
【００９５】
ｍＲＮＡ由来のある種のｃＤＮＡを増幅する方法は、個々のｍＲＮＡの発現量を決定するためにも使用することができる。メッセンジャーＲＮＡの発現量を測定するためには、増幅産物の分離および／または同定を含めて、本発明に記載の方法を採用することが好ましい。異なる発現量の可視化を改善するために、ある種の細胞系の類似した一般的ＤＤ結果を比較することができる。
【００９６】
さらに、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＴａｑポリメラーゼ、逆転写酵素または異種ポリメラーゼの混合物、ポリメラーゼが必要とする補因子または金属イオン、好ましくはＭｇ２＋もしくはＭｎ２＋の塩、プライマー、ならびに所望により末端トランスフェラーゼおよび追加の緩衝物質を含む、本発明に記載の方法のためのキットを提供する。該プライマーは、上記のようにＲＮＡまたはｃＤＮＡの５’および３’末端に選択的であることが好ましい。プライマーセットのプライマーは、ＲＮＡまたはｃＤＮＡの第１、第２、第３、第４および／または第５の末端ヌクレオチド（両末端のもので、相互に独立に）に選択であることが、さらに一層好ましい。好ましくは、該キットは１、２、３、４、５、１０、１０超、２０超または３０超のプライマー対を含む。このキットを用いて、本発明に記載のディスプレー法を容易に迅速に行うことができる。好ましくは、本法を実施するための説明書も含まれる。好ましくは、完全なプライマーセット（プライマーマトリックス）またはその一部、好ましくは各プライマー対１組をチップ、好ましくはガラスチップなどの固体支持体に結合する。
【００９７】
本発明の別の態様では、規定した領域中、好ましくはスポット中に１対のプライマーを含む固体表面、好ましくはチップ、特に好ましくはガラスチップが提供され、そこにおける相異なるプライマーは、好ましくはＲＮＡまたはｃＤＮＡから選択される標的ポリヌクレオチドの異なる３’または５’末端配列の少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、より一層好ましくは少なくとも４個、最も好ましくは少なくとも１０個に選択的であり、かつ各領域は、少なくとも２個の異なる末端配列に対するプライマー（例えば、１対の５’および３’プライマー）を含み、１個のプライマーは、好ましくは（例えば、ポリＡ）テールまたはその相補体に選択的であり、より一層好ましくはその次の１〜１０ヌクレオチド、好ましくはその次の１、２、３または４ヌクレオチドに選択的である（５’および／または３’プライマーのうち）。該プライマーは、上記のように特異的になることができる。これらのプライマーは、例えばこうした組合せにおいて、該キットまたは方法においても使用し得る。ｍＲＮＡに選択的な１領域中のプライマー対は、ポリＡテールおよび５’（キャップ）末端、ならびにその次のヌクレオチド１個（各領域で異なる）に対して特異的である。好ましくは、該固体表面は、少なくとも２組、少なくとも４組、少なくとも１０組、少なくとも２０組、または少なくとも４０組の異なるプライマー対を含む。
【００９８】
規定した領域中、好ましくはスポット中に５’プライマーおよび３’プライマーまたは１対のプライマーを含む固体表面、好ましくはチップ、特に好ましくはガラスチップがさらに提供され、そこにおけるプライマーは、上記の通りであって、ｃＤＮＡまたはＲＮＡの両末端に特異的であり、特に式ｄＰｘｄＧｙＨＮｚを含む。特に好ましくは、該固体表面は、異なるプライマーまたはプライマー対を有する異なる領域を少なくとも２箇所、より好ましくは少なくとも９箇所、特に好ましくは少なくとも２０箇所、最も好ましくは少なくとも６０箇所含む。
【００９９】
規定した領域中、好ましくはスポット中に、上記に規定した一般式（ｄＰｘｄＧｙＨｎｚ）またはその相補体を含んだ５’プライマーまたは３’プライマーを含む固体表面、好ましくはチップ、特に好ましくはガラスチップも提供され、該プライマーは、以下の配列：ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴ  ＧＡ、ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  Ｔ  ＧＧ、ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  Ｔ  ＧＣ、ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴ  ＧＴ、ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴ  ＣＡ、ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴ  ＡＧ、ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＡＡ、ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＡＴＡ、ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＡＣＡ、ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＡＧＡ、ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＡＡＡ、ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＧＴＡ、ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＣＴＡ、ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＴＴＡの１つを含むプライマーから選択され、特に好ましくは該固体表面が、異なるプライマーまたはプライマー対を有する異なる領域を少なくとも２箇所、より好ましくは少なくとも９箇所、特に好ましくは少なくとも２０箇所、最も好ましくは少なくとも６０箇所含む。
【０１００】
さらなる態様では、試料中のポリヌクレオチド分子のプールを増幅する方法であって、
ａ）ＲＮＡの試料を取得（または提供）し、ＲＮＡ分子全体を逆転写することにより、全長ｃＤＮＡを創製するか、または全長ｃＤＮＡの試料を取得（もしくは提供）する工程、
ｂ）３’末端の後方となるポリヌクレオチドテールで該転写ｃＤＮＡの３’末端にテール付加する工程、
ｃ）１対のプライマーを用いてｃＤＮＡを増幅する工程
を含み、第１の（３’）プライマーは、該ｃＤＮＡの５’末端に特異的であり、第２の（５’）プライマーは、ポリヌクレオチドテールの上流部、およびｃＤＮＡの３’ポリヌクレオチドテールの上流にある次の１〜１００ヌクレオチド、好ましくは次の１〜５０ヌクレオチド、特に好ましくは次の１〜２０ヌクレオチド、特別に好ましくは次の１〜１０ヌクレオチド（即ち、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチド）に特異的であり、さらに、特に好ましくは１〜１００ヌクレオチド範囲内の上流部にある、非特異的なウォブルヌクレオチドも含むことが好ましいが、そのヌクレオチド範囲内の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドが、ｃＤＮＡのヌクレオチドに特異的であり、かつ該方法が、さらに好ましくは上記に規定した通りである方法が提供される。
【０１０１】
方法は、ＲＮＡ（所望により３’テールが追加されている）またはｍＲＮＡ（好ましくは、内因性３’ポリＡテール）の３’テールに特異的なプライマーの使用を含むことが好ましく、３’テールの上流にある次の１〜１００ヌクレオチド、好ましくは次の１〜５０ヌクレオチド、特に好ましくは次の１〜２０ヌクレオチド、特別に好ましくは次の１〜１０ヌクレオチド（即ち、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のヌクレオチド）は、逆転写に使用され、および／または第１の増幅プライマーは、ＲＮＡまたはｍＲＮＡの３’テールに相補的なｃＤＮＡの５’テールと、５’テールの下流にある次の１〜１００ヌクレオチド、好ましくは次の１〜５０ヌクレオチド、特に好ましくは次の１〜２０ヌクレオチド、特別に好ましくは次の１〜１０ヌクレオチド（即ち、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のヌクレオチド）とに特異的である。当然ながら、５’および３’プライマー中で共に、または相互に独立に、テール（またはテール相補体）の次のヌクレオチド配列（１〜１００ヌクレオチド）は、増幅産物の異なるプール（プール分離をした、またはしていない）を選択する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超える特異的ヌクレオチドに加えて、非特異的ヌクレオチド（ウォブルヌクレオチドなど）も含み得る。かかるプライマーは、逆転写にも当然ながら使用することができる。かかるウォブルプライマーの産物（ウォブル位置に対応する位置に任意のヌクレオチドが存在し得る）は、全長ｃＤＮＡまたは全長増幅産物の要件をなお満たすが、非特異的ヌクレオチド位置に対応する位置では、配列が保存されていない恐れがある。より長い非特異的ヌクレオチドプライマー配列を使用すると、プライマーループが発生するため、長さの変化した産物を生じ得るが、この産物は、本発明の全長のｃＤＮＡまたは増幅産物になお等価であると見なされる。
【０１０２】
本発明は、以下の実施例および図により、それに限定することなくさらに例示される。
【実施例】
【０１０３】
実施例１：操作の原理
本発明に記載のポリヌクレオチド増幅操作の一例の概要は、図１に示されている。逆転写用のアンカー付加プライマーは、ＶまたはＶＮｙ部と組み合わさって、ＲＴ反応を首尾よくプライミングするのに十分高い特異性および融解温度を有する式ｄＴｘＶまたはｄＴｘＶＮｙ（ｘはデオキシチミジレート（「ｄＴ」）の反復数を規定する）であって、Ｖはデオキシグアニレート（「ｄＧ」）、デオキシアデニレート（「ｄＡ」）、デオキシシチジレート（「ｄＣ」）のいずれかであり、ＮはｄＡ、ｄＣ、ｄＧまたはｄＴから独立に選択されるヌクレオチドｙ個の配列であり、アンカー付加プライマーのために複数の塩基が使される場合はｙがその数を規定し、ｙの増加は、逆転写物の亜集団を増加させることになる前記の式に従うことができる。かかる合成ｃＤＮＡの３’末端のポリＮテールによるテール付加は、末端トランスフェラーゼを用いて行うことができ、Ｎは、逆転写プライマーで表示した「Ｎ」とは独立に、ｄＴ、ｄＡ、ｄＣまたはｄＧから選択される均一なヌクレオチドの配列を表す。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって規定されるＶＮｙ配列で所望により予備選択される、ｃＤＮＡプールの増幅は、末端トランスフェラーゼが付加するヌクレオチドのような末端配列（ｃＤＮＡの３’であり、元のｍＲＮＡの５’末端に対応）およびポリＴ配列（ｃＤＮＡの５’であり、元のｍＲＮＡの３’ポリＡテールに相補的）を選択し、さらに、Ｎが、やはりｄＴ、ｄＡ、ｄＣまたはｄＧから独立に選択され、テールに直接隣接する塩基ｙ個により異なるｍＲＮＡ集団を規定するヌクレオチド数個の配列である、オリゴｄＮｙ配列を選択することによって、ｃＤＮＡの５’および３’末端にハイブリッド形成するプライマーを用いて行われる。
【０１０４】
実施例２：試料中に存在する全ＲＮＡ分子の増幅
試料中に存在する全ｍＲＮＡ分子は、ヒトまたはマウスの肝臓などの特性が十分に決定された組織でも未知であり、その個数はおそらく数千であるので、その試料中に存在する全ＲＮＡ分子が検出されることを示すために、人工的に合成したｍＲＮＡ分子１４種のプールを使用する手法を選定した。この目的のために、マウスＧＡＰＤＨ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入：ＮＣ＿００００７２）由来のゲノムＤＮＡの長さが異なる配列を、標準的ＰＣＲで増幅した。固定化したＴ７ポリメラーゼプロモーターを有する５’プライマーを使用した。そのプロモーターの後に、５’末端で各ｍＲＮＡを規定すると思われる塩基４個の組合せを導入した。３’末端用に選定したプライマーは、ＧＡＰＤＨ特異配列の後に、ポリＡテールの上流でこうした分子を規定すると思われる塩基４個の組合せを含んでいた。この４塩基の後に、２１ｄＴ、または１種のＲＮＡでは２２ｄＴをポリＡテールに対して導入した。得られたＰＣＲ産物は、ゲルで精製し、７−メチルグアノシン（キャップ）を含めて標準的Ｔ７  ＲＮＡ転写を行った。かかるＴ７反応産物は、再びゲルで精製した。取得したかかる合成ｍＲＮＡ分子の混合物を、逆転写（ＲＴ）用の出発物質として使用した。開示した方法がｍＲＮＡ分子の５’ならびに３’末端に特異的であることを示すために、分子１４種中７種は、５’末端に一定配列、および３’末端に可変配列を有し、７種の分子は、３’末端に一定配列、および５’末端に可変配列を有していた。生成した人工的ｍＲＮＡ分子の配列に関しては、表１を参照されたい。
【０１０５】
逆転写は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．６Ｍトレハロース、２Ｍベタイン、０．５ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．５ｍＭ  ｄＴＴＰ、０．５ｍＭ  ｄＣＴＰ、０．５ｍＭ  ｄＧＴＰ、４０ｎＭプライマー（オリゴｄＴ（２１））からなる反応混合物２５μｌ中で実施した。人工的ｍＲＮＡ混合物は、約４ｎｇ／μｌ反応容量の量で含まれていた。反応混合物（ＲＴなし）を７０℃、２０秒間と３２℃、２分間加熱した。次いで、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を欠くモロニーマウス白血病ウィルス逆転写酵素（Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ（−Ｈ））を４〜８単位／μｌ反応容量の濃度で添加し、反応を３２℃、２分間継続した。この時点でＰｆｕポリメラーゼ０．５Ｕを添加した。５０℃、１０分および６０℃、１０秒の４サイクルを用いてＲＮＡを完全に逆転写し、その後反応混合物を４℃に冷却した。
【０１０６】
【表１】
2009517052.tif 000002
【０１０７】
ｃＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、Ｈ２Ｏ１０μｌ中に溶解した。ポリＴテール付加を０．２ｍＭ  ｄＴＴＰ、１００ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＣｏＣｌ２、０．１ｍＭ  ＤＴＴおよび末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ１５単位を含有する反応混合物２０μｌ中で３７℃、１５分間実施した。反応混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、Ｈ２Ｏ１００μｌ中に溶解した。
【０１０８】
ＰＣＲは、テール付加ｃＤＮＡ２．５μｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．８）、１４ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、各プライマー（表２、図２）０．２μＭ、Ｔａｑポリメラーゼ０．５単位およびＰｆｕポリメラーゼ０．０３単位を含有する反応混合物１０μｌ中で実施した。試料は９３℃、３０秒間変性し、９３℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１０分のサイクルを２１回行った。５５℃の初期アニーリング温度は、各サイクルで０．５℃分低下させた。その後、９３℃で１０秒、４９℃で３０秒、７２℃で１０分の１９サイクルを続け、最終伸長工程を７２℃で２分行った。
【０１０９】
【表２】
2009517052.tif 000003
【０１１０】
反応生成物２．５μｌを１００％ホルムアミドローディングバッファー２．５μｌへ添加し、９６℃、２分間変性し、氷上で冷却し、３．５％アクリルアミド、７Ｍ尿素のゲル上にローディングし、１８０Ｖで２時間操作した後、その銀染色を行った。
【０１１１】
結果は図２で見ることができる。レーン１〜７ではプライマー８番をプライマー１番〜７番と共に使用した。レーン８〜１３ではプライマー１番をプライマー９番〜１４番と共に使用した。表１に示すＰＣＲ産物の予測長さは、ゲル上の産物の長さに完全に一致するので、各レーンにおいてＰＣＲにより特定の産物が増幅された。
【０１１２】
レーン１におけるプライマーの組合せは、ディスプレーすべきＲＮＡに対応する特定の産物２種を増幅する。レーン１で実施した反応は、ＲＮＡ１番および８番を代表する２種の産物を増幅しなければならないので、この１セットの中で最も困難な反応である。その上、表１から分かるように、レーン１に表すＰＣＲ反応のミスプライミングを増大させるように各ＲＮＡ分子を設計した。すべてのＲＮＡ分子（ＲＮＡ６番を除く）は、ＲＮＡ１番および８番の１位および２位と同じ塩基を、Ｔテール前の３位および４位に有している。プライマー１番は、増幅すべきｃＤＮＡを選択するためにこの最後の２塩基を使用しているので、試料中に存在する他のｃＤＮＡのいずれかとミスプライミングする恐れが潜在的にある。さらにｃＤＮＡ分子１番〜８番は他方の末端上に同一の塩基を有するので、反応１におけるこの８種の分子間で選択をするのは、プライマー１番のこの最後の２塩基だけである。しかし、増幅すべき２種の該ＲＮＡだけがディスプレーされているため、かかるディスプレーで大きな特異性に達し得ることが示される。
【０１１３】
レーン２はこの反応の限界を示す。増幅すべきバンド以外に、ＲＮＡ４番に対応する薄いバンドが増幅された。しかし、増幅すべきバンドは、ミスプライミング事象から生じたそのバンドより数倍も強い。その上、熱サイクルのためにタッチダウン手順を使用しても、異なるすべてのプライマー組合せに対して同じプロファイルが使用された。特定のプライマーセットに対して反応を原理的に最適化できることを示すために、ベタイン１．３０２ＭおよびＤＭＳＯ１．３％を含む別の反応を実施した。その生成物がレーン１４に示されており、適正なバンドだけがディスプレーされている。
【０１１４】
実施例３：マウス肝臓の総ＲＮＡの増幅
マウス肝臓の総ＲＮＡ（１３μｇ）を、実施例２における人工的ＲＮＡセット全体に対する場合と同一条件下で、逆転写し、テール付加し、ＰＣＲで増幅した。
【０１１５】
ＲＴ、テール付加およびＰＣＲに対する同一条件は、人工的ＲＮＡで可能な条件と同じ厳密な条件下で、複雑な混合物からＲＮＡ分子をディスプレーするのが可能であることを示すために用いた。ＰＣＲ産物は、より長い分子を分離するために、０．７％アガロースゲル上で操作した。図３で分かるように、各々のプライマー組合せは特異なプロファイルを増幅する。
【０１１６】
図３にディスプレーしたＲＮＡ分子の長さ分布は、非重複全長マウスｃＤＮＡクローンをスクリーニングしたＮＣＢＩヌクレオチドデータベースにおけるｃＤＮＡの長さ分布（図５）と非常に良く一致している。
【０１１７】
各レーン上に平均約１０〜１５バンドを認めることができるので、プライマー組合せ７６８組（３×４４）の全セットは、肝臓中に発現する全長ＲＮＡ分子類を代表するＰＣＲ産物約７６８０〜１１５２０種をディスプレーする。単純な０．７％アガロースゲル上かかるプロファイルを分離できることは、この方法の能力、および研究室で実施できる手軽さを示す。
【０１１８】
実施例４：ＰＣＲ予備増幅工程の利用
予備増幅を、実施例３のように生成した精製テール付加ｃＤＮＡ２．５μｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．８）、１４ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、プライマーｄＴ（２１）０．２μＭ、プライマーｄＡ（２１）０．２μＭ、Ｔａｑポリメラーゼ０．５単位およびＰｆｕポリメラーゼ０．０３単位を含有する反応混合物１０μｌ中で実施した。試料を９３℃、３０秒間変性し、９３℃で１０秒、４２℃で３０秒、７２℃で１１分のサイクルを１１回行い、最終伸長工程を７２℃で２分行った。該反応混合物を、Ｈ２Ｏ９９０μｌ添加することにより１ｍｌに希釈した。該希釈液２．５μｌは、最終の２サイクルを省略した違いはあるが、実施例３と同じＰＣＲ条件を用いた次のＰＣＲで使用した。図４で分かるように、各プライマー組合せに対して個別のバンド形成を認めることができる。この実施例で使用するような予備増幅工程は、脳のような組織の非常に複雑なＲＮＡ混合物を分離するのに必要と思われる、ＲＮＡ１試料当たり７６８種の反応を伴うまさに大きなディスプレーに対して、総ＲＮＡ５００ｎｇで原料を提供するのに十分であることを示している。ＲＮＡの使用量は、予備増幅中のサイクルを増加することによって、容易に削減することができる。したがって、ディスプレーの感度は、限られた量のＲＮＡしか利用できない最も厳しい用途さえも満足させるはずである。さらに、プライマー対当たりのバンド量は、実施例３と比べて増加した。実施例３、４双方の識別的ＰＣＲ工程に用いた高いアニーリング温度が、極度に高い厳密度を示すので、予備増幅工程を使用しない場合には、いくつかの少量転写物はわずかに検出限界に達しない恐れがある。
【０１１９】
実施例５：ｍｉＲＮＡディスプレー
ＲＮＡがキャップもポリＡテールも有していない、この例ではマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の場合の本発明に記載のポリヌクレオチド増幅操作の一例の概要を図６に示す。
【０１２０】
ポリＡテールを有していないｍｉＲＮＡから全長ｃＤＮＡを逆転写しうるために、合成テールをポリＡポリメラーゼを用いることにより付加する。第２工程では、ポリＡテール付加ＲＮＡを、オリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡに逆転写する。末端トランスフェラーゼでｃＤＮＡへポリヌクレオチドテールを付加した後、ｃＤＮＡ試料は、元のｍｉＲＮＡ分子の５’および３’配列にしたがって相異なるプールに、プライマーがｃＤＮＡ配列をアニーリングし、増幅することを可能とするのに十分に長いヌクレオチド末端を有する（図６ａ）。
【０１２１】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子は約１９〜２３塩基のサイズを有するので、十分に大きなプライマーマトリックス（５’および３’プライマーのありとあらゆる組合せ）を、試料間の発現差を測定できる相異なるプールにすべてのｍｉＲＮＡを分離するためには用いなければならない。
【０１２２】
あるいは、ｍｉＲＮＡ配列のある末端は、ｍｉＲＮＡの末端配列に従って特定数のヌクレオチドについて増幅産物を人工的に拡大するために用いられうる。図６ｂは、かかるマトリックスの一例を示す。この場合において、５’プライマーは、ｍｉＲＮＡの第２および第３のヌクレオチドに従って異なる長さに、ｍｉＲＮＡ増幅産物を分割するために用いられうる。異なるプール間の比較を追加のサイズ分別（キャピラリーゲル電気泳動など）で行う場合において、図６ｂの５’プライマー全１６種は、プライマー混合物として用いられうる。該プライマー混合物は、１つの３’プライマーと一緒になってプールを規定する。したがって、１９２プールは、各５’プライマーを各３’プライマーと共に使用したとした場合の１９２×１６＝３０７２プールと比較したとき、類似の分離性を有する。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】全長ｃＤＮＡを増幅して規定した亜集団に分けるための、本発明の原理を使用した手順の図表示を示す図である。プライマー中に示したオリゴＴおよびオリゴＧの配列は、プライマーの末端アンカーであり、Ｎ、ＮＮおよびＮＮｙは、亜集団を規定するためにＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃから選択されるヌクレオチドを示す。
【図２】実施例２による人工的ｍＲＮＡ分子のプールのディスプレーに関するゲル電気泳動産物を示す図である。レーン１〜７ではプライマー８番をプライマー１番〜７番と共に使用した。レーン８〜１３ではプライマー１番をプライマー９番〜１４番と共に使用した。
【図３】実施例３によるマウス肝臓ＲＮＡの組織化された全長発現ディスプレーに関するゲル電気泳動産物を示す図である。
【図４】ＰＣＲ予備増幅を用いた実施例４による、マウス肝臓ＲＮＡの組織化された全長発現ディスプレーに関するゲル電気泳動産物を示す図である。
【図５】全長マウスｃＤＮＡの非重複クローンに対するＮＣＢＩヌクレオチドデータベースのスクリーニングを示す図である。データベース中に存在する１６８５４クローンの９９％は、長さが２００〜６０００塩基の間にあり、９９．９％は７５００塩基未満であり、９５００塩基を超えるクローンはなかった。
【図６】ｍｉＲＮＡなどのキャップおよびテールのないＲＮＡが、亜集団に分割される次第を示す図である。ａ）操作の工程を示す図である。プライマーの命名は図１に示す通り。ｂ）増幅産物のサイズ範囲を増加させることにより、分離能を高める１つの可能なプライマーマトリックスを示す図である。５’プライマー中のＢは、Ｔ、Ｇ、Ｃから選択される混合塩基（ウォブル）を示す。
【配列表】
2009517052000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年7月29日(2008.7.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009517052000001.app
【国際調査報告】
2009517052.tif 000011
2009517052.tif 000012
2009517052.tif 000013