(57)【要約】  本発明は、核酸試料中のヌクレオチド変化を検出する非PCRベースの方法であって、温度制御され、かつUV照射された容器内で、核酸試料を含む溶液を、核酸プローブと接触させるステップと、核酸試料/核酸プローブ複合体のUV吸光を測定するステップとを含む方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料中のヌクレオチド変化の検出方法であって、
a)温度制御され、かつUV照射された容器内で、核酸試料を含む溶液を、核酸プローブと接触させるステップと、
b)核酸試料/核酸プローブ複合体のUV吸光を測定するステップと
を含み、核酸増幅を含まない方法。
【請求項２】
前記複合体のTmを分析するステップを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記容器が、温度制御され、かつUV照射されたチャネルである、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸試料/核酸プローブ複合体が前記チャネルに沿って流される、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸試料/核酸プローブ複合体が前記チャネルに沿って画像化される、請求項3または4に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸試料がDNAまたはRNAを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸が1本鎖または2本鎖である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ある範囲の温度でUV吸光を測定する、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ある範囲の温度が約20℃から約110℃である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記UV吸光が温度の関数として測定される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
2本鎖核酸の存在または不在が検出される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸試料が少なくとも1つの対立遺伝子を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
候補対立遺伝子のUV吸光が、野生型対立遺伝子のUV吸光と比較される、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヌクレオチド変化がSNPである、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記SNPが疾患に関連している、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヌクレオチド変化がリアルタイムで検出される、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸プローブが標識されている、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸プローブが標識されていない、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
疾患を有するか、またはそれに罹患しやすいと患者を診断するための、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項２０】
請求項1から19のいずれか一項に記載の方法における、複数の温度制御されたチャネルを有する装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸検出の方法に関し、詳細には、核酸配列中のヌクレオチド変化の非PCRベースの検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸配列変化の検出は、多くの適用を有し、疾患の診断における特に重要なツールである。ほとんどの技法が、ごく少量の複雑な遺伝物質の増幅を可能にする(米国特許第4683202号)ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を利用するものである。PCRは、変性、アニーリング、および伸長のステップを含み、分子生物学分野でよく知られているツールである。伝統的なPCR法はアガロースゲル電気泳動法で産物を分析する。不都合な点は、この方法は時間がかかり、低い感度を示すことである。基本的なPCR法はさらに発展しており、現在では、配列特異的なPCR産物をリアルタイムで検出する方法が利用可能である。そのような方法の1つがTaqMan(登録商標)アッセイであり、このアッセイでは、PCR産物の検出がレポーターの蛍光の検出に基づいている。しかし、その利点にもかかわらず、TaqMan(登録商標)アッセイはいくつかの不都合な点も有する。例えば、プローブを構築するための配列データが利用可能でなければならない。したがって、様々な配列を検出するために様々なプローブを合成する必要がある場合には、アッセイの費用がとりわけ高くなる。一般的に使用されているリアルタイムPCRの別の方法は、2本鎖DNAには特異的に結合するが、1本鎖DNAには結合しない色素(SYBR(登録商標))を利用するものである。しかし、この方法は、上記色素が非特異的であり、擬陽性シグナルを生成する可能性があるという不都合な点を有する。他の方法は分子ビーコンまたはスコーピオンを用いるが、TaqMan(登録商標)アッセイに類似しており、これらの方法は複雑かつ高価である。
【０００３】
核酸変化には、短いタンデム反復(STR)および1塩基多型(SNP)が含まれる。SNPは、ゲノム配列中の単一ヌクレオチド(A、T、CまたはG)が改変された際に起こるDNA配列変異である。ある変異がSNPとみなされるために、それが、その集団の少なくとも1%で存在しなければならない。対立遺伝子頻度は様々な集団内でも大きく異なる。SNPは、すべてのヒト遺伝的変異の約90%を占めており、30億塩基のヒトゲノムで100から300塩基毎に存在している。通常、SNPは2種のみの形態で存在しているので、よりまれな方の対立遺伝子は、変異体またはマイナー対立遺伝子と呼ばれ、最も一般的な対立遺伝子は野生型対立遺伝子と呼ばれる。SNPは、主として2対立遺伝子(すなわち1箇所の遺伝子座に2種の可能な対立遺伝子が存在する)であるが、3対立遺伝子(すなわち2回の独立した変異イベントが同時に生じている)である可能性もある。3つ毎のSNPのうち2つがシトシン(C)をチミン(T)で置換するものである。SNPは、ゲノムのコード(遺伝子)領域および非コード領域(エクストロン(extronic)領域またはイントロン領域)の両方で起こりうる。
【０００４】
集団全体にわたって、99%超のヒトDNA配列が同じであるが、DNA配列中の変異は、疾患、病原体、および治療にヒトがどのように応答するかに関する主要な影響力を有しうる。SNPは、これによって、生物医学研究、および医薬製品または医療用診断の開発に大きな価値を有するものとなっている。したがって、効率的、正確、安価、およびユーザーフレンドリーなSNP検出法の提供は大きな価値を有するものでありうる。SNPを分析するのに使用されている現行の方法には、PCRおよびその後の配列決定、マイクロアレイ、ならびに質量分析が含まれる。しかし、マイクロアレイおよび質量分析は、とりわけ複雑かつ高価である。したがって、SNPを分析するための代替手段および改良法が必要である。
【０００５】
ほとんどのDNA分子は、変性した際に、260nmの吸光度において1.4の相対的増加を示し、これは濃色効果として知られている。濃色効果は、2重らせんにおける窒素性塩基の特定のスタッキングによって説明できる。2重らせんにおいて塩基がそれぞれの上にスタッキングされている場合、それらは光と比較的弱い相互作用をする。高温における温熱振動の増大は、DNA2重らせんを不安定化し、最終的には2本のDNA鎖を分離する。2本の鎖が分離した場合、ペントース糖は、それらのホスホジエステル結合のまわりを自由に回転できるようになり、それによって、窒素性塩基間のスタッキング相互作用の効率低下が起こり、光との相互作用が増大する。したがって、吸光度の変化は、秩序だった2重らせんDNA構造が、変性状態またはランダムで、非対のDNA鎖へと移行することによって生じるものである。したがって、DNA解離の過程は、様々な条件下におけるDNAのUV吸光特性をモニターすることによって特性分析できる。
【０００６】
2本鎖DNA(dsDNA)ヘリックス構造から1本鎖形態(ssDNA)への解離は融解と呼ばれ、それは、DNAの塩基組成の関数である温度で起こる。融解温度(Tm値)は、らせん構造の半分が失われる温度と定義されている。融解温度は、pHおよびイオン条件などの化学的規準に加えて、研究対象のDNAの塩基組成に強く依存している。G-C塩基対が多いとDNAのTmが上昇し、一方、主としてA-Tの組成を有するDNAは低い融点を有する。塩基対相互作用の性質は、その現象の説明となりうる。G-C塩基対は、2本のみの水素結合を有するA-T塩基対と比較して、3本の連結水素結合を有する。したがって、より強固なG-C相互作用を分断するには、より多くのエネルギーを必要とする。温度変化の際のDNAの吸光度を測定することによって、dsDNAの安定性の正確な測定が可能となる。
【特許文献１】米国特許第4683202号
【特許文献２】国際公開第03/036302号
【非特許文献１】Michael Bornsら、「Comparing PCR Performance and Fidelity of Commercial Pfu DNA polymerases」、http://www.biocompare.com/techart.asp?id=121
【非特許文献２】International SNP Map Working Group、2001年、Nature 409、928〜934頁、「A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、核酸検出の方法に関し、詳細には、核酸変化の非PCRベースの検出に関する。PCRベースの方法は、例えば多くの熱安定性ポリメラーゼによって導入されるエラー発生率など、多くの不都合な点を有するので、上記方法は、PCRを利用する現行の方法の改良を目的とするものである。
【０００８】
国際公開第03/036302号は、タンパク質のフォールディングおよびアンフォールディングをモニターする方法と、タンパク質の温度依存的立体配座を分析する装置とを開示している。国際公開第03/036302号の内容を参照により本明細書に組み込む。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第1の態様では、本発明は、核酸試料中のヌクレオチド変化の検出方法であって、
a)温度制御され、かつUV照射された容器内で、核酸試料を含む溶液を、核酸プローブと接触させるステップと、
b)核酸試料/核酸プローブ複合体のUV吸光を測定するステップと
を含み、核酸増幅を含まない方法に関する。
【００１０】
第2の態様の観点からは、本発明は、疾患を有するか、またはそれに罹患しやすいと患者を診断するための、本発明による方法の使用に関する。
【００１１】
さらに別の態様によれば、本発明は、本発明の方法における、複数の温度制御されたチャネルを有する装置の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明をさらに説明する。下記に、本発明の様々な態様を、より詳細に定義する。そのように定義された各態様は、その反対が明確に指示されない限り、1つまたは複数の任意の他の態様と併せることができる。詳細には、好ましいか、または好都合であると示された任意の特徴を、好ましいか、または好都合であると示された1つまたは複数の任意の他の特徴と併せることができる。
【００１３】
本発明の第1の態様によれば、核酸試料中のヌクレオチド変化の検出方法であって、
a)温度制御され、かつUV照射された容器内で、核酸試料を含む溶液を、核酸プローブと接触させるステップと、
b)核酸試料/核酸プローブ複合体のUV吸光を測定するステップと
を含み、上記核酸の増幅を含まない方法が提供される。
【００１４】
したがって、本発明の方法はPCR増幅を含まない。
【００１５】
したがって、上記方法の第1のステップは、核酸試料を含む溶液を、核酸プローブと接触させることを含む。上記プローブは、核酸試料中の標的配列にそれが相補的となるように設計されることが好ましく、それによって、それは上記核酸試料と複合体を形成するであろう。標的へのプローブの結合を図4に図示する。
【００１６】
上記方法は、核酸試料/核酸プローブ複合体のTmを測定するステップを含むことが好ましい。
【００１７】
本発明の核心は、濃色効果、すなわち1本鎖DNAが2本鎖DNAより多くのエネルギーを吸収するという事実を用いることである。本発明は、1次構造上の特定の位置にプロービングするように設計された相補的なプローブが上記核酸試料中の上記標的配列から解離または融解する温度を測定するステップを含む。上記プローブは、例えば、1塩基多型(SNP)など、潜在的な点突然変異部位に結合するように設計する。上記変異が標的配列および野生型配列に相補的なプライマープローブに存在する場合、上記プローブは、配列が完全に相補的である場合より低いエネルギーで結合するであろう。別法では、上記プローブが上記SNP配列に相補的な塩基を含有する場合、それは、SNP配列に結合するより少ないエネルギーで野生型配列に結合するであろう。これらの場合には、上記試料中の標的配列と、上記プローブとの間で形成される2本鎖が完全に相補的であるいかなる場合よりも、融解温度が低くなるであろう。融解温度におけるこの相違が、点突然変異の存在または不在を確認するのに利用されるであろう。本発明は、無標識の画像化を提供するが、本発明の特定の実施形態ではプローブを標識することもできる。
【００１８】
したがって、本発明は核酸の濃色効果を利用する。本発明によれば、溶液にUV光を照射して、所与の温度で核酸試料によって吸収される光の量を測定する。したがって、適用された1つまたは複数の温度、またはある範囲の温度で核酸試料によって吸収された光の量を測定する。吸収された光の量は、2本鎖核酸の存在を示し、それによって、ヌクレオチド変化の存在または不在を示す。
【００１９】
容器という用語は、チャンバー、キャピラリーまたはチャネルなど、上記反応を実行するために上記核酸試料を保持するものを指し、それは、本発明によれば、温度制御およびUV照射されうる。例えば、核酸試料およびプローブを含む混合物は、サーモサイクラー中に置かれたマイクロ遠心管中に保持されうる。別の実施形態では、チャネルに沿って上記混合物を流し、このチャネルがマイクロ流体チップの一部を形成しうる。上記容器は、限定されるものではないが、プラスチック、石英またはガラスなど、様々なUV透過性素材から作製されたものでありうる。
【００２０】
一実施形態では、本発明の方法で使用される容器は、温度制御され、かつUV照射されたチャネルである。したがって、上記核酸試料/核酸プローブ複合体を含む溶液が上記チャネルに沿って流され、チャネルの長さに沿って様々な温度が適用されうる。好ましい実施形態では、上記核酸試料/核酸プローブ複合体を含む溶液がチャネルに沿って画像化される。
【００２１】
温度制御されるという用語は、本発明によれば、容器内の温度を制御することを指す。例えば、温度分布はチャネルの長さに沿って適用され、それによってチャネル内の溶液に適用される。本発明によれば、チャネルの長さに沿ってある範囲の温度を溶液に適用できるように、温度が制御される。したがって、チャネルの長さに沿った任意の所与の点に、指定された温度をチャネルに(したがって溶液に)適用できる。したがって、チャネルの長さに沿ったそれぞれの可能な位置にある溶液に、特定の温度を適用することが可能である。例えば、上記チャネルは通常、温度制御を行うペルチェセルの間で36mmにわたって続いている。温度分解能は、実験条件に合うように調整できるが、1ミリメートルあたり0.1℃以下の解像度が使用されうる。
【００２２】
上記小容積液体成分は100ミリ秒以内に必要な温度に加熱または冷却できるので、本発明の方法は、高速の反応時間を可能にする。さらに、直列フォーマット内または並列フォーマット内での操作によって、複数の反応を同時に行うことが可能となる。
【００２３】
本発明によれば、温度勾配は、スタートポイントの温度がエンドポイントより高くなるように、チャネルに適用できる。別法では、スタートポイントで温度が最高となり、チャネルの長さに沿って低下し、チャネルの終端で最小に達するように勾配を定義できる。別法では、チャネルが多値勾配によって制御されるように、ある範囲の温度が適用される。試料全体が均等に加熱されるように、チャネル全体にわたって温度を上げることもできる。したがって、一実施形態では、適用される温度が温度勾配である。別の実施形態では、適用される温度が多値勾配である。別の実施形態では、チャネル全体が均等に加熱される。
【００２４】
適用される温度は、約20℃から約110℃の範囲であることが好ましい。
【００２５】
上記チャネルは、熱的加熱ストリップまたはペルチェセルなどの加熱要素の使用によって温度制御されうる。温度は、チャネルの長さに沿って位置する温度検出器でモニターできる。国際公開第03/036302号は、タンパク質、および生物学的因子とのタンパク質の複合体の温度依存的立体配座を分析する装置を開示している。本発明の方法の特定の実施形態では、上記方法が、国際公開第03/036302号に記載のものに類似した装置を用いて実施されうる。したがって、さらに別の態様では、本発明は、複数のチャネルを有する核酸検出用の装置の使用にも関する。好ましい実施形態では、上記装置は、その長さに沿って伸長する複数のチャネルを有する多レーンチップを含み、各チャネルは、分析するべき核酸配列の検出用に準備されており、1つまたは複数のチャネルに沿って温度分布を作り出すためのチップを備えた加熱要素を含む。
【００２６】
本発明によるチャネルの幅は、数十マイクロメートルから数百マイクロメートルの範囲にある。マイクロ流体システムは通常、50×50μMから400×400μMまでの範囲にあり、縦横比がこれらの値周辺の範囲にある。好ましい実施形態では、上記チャネルが幅50マイクロメートルおよび深さ200マイクロメートルである。他の作用機序も本発明の範囲内にあるが、溶液が圧力ポンプシステムまたは界面動電注入などの作用機序により移動し、チャネルに沿った溶液の動きが可能となるような様式で、チャネルを準備することができる。
【００２７】
上記チャネルは、平行に並び、上からUV光で照射されることが好ましい。上記チャネルは、チップの部分を形成し、下にある光学検出器を含むことが好ましい。上記検出器の出力を分析することができるように、上記検出器をコンピュータシステムに接続することができる。したがって、UV光は、チャネル内の溶液を通り抜け、チップを通り抜け、そして下にある光学検出器で検出される。2本鎖または1本鎖核酸の存在を検出するために、260nmの吸光を測定する。したがって、吸光は温度の関数として測定される。
【００２８】
チャネル沿い、またはキャピラリー内のいずれかにおける、様々な位置の温度を正確に制御する能力は、例えばチャネルの長さに沿った、核酸試料の任意の所与の位置における温度の制御を可能にするので、本発明の方法の重要な特徴である。したがって、チャネル内の核酸の位置に応じて、温度をモニターすることができる。
【００２９】
本発明によれば、1本鎖または2本鎖核酸の存在または不在を検出するために、UV吸光が温度の関数として測定される。さらに、濃色効果は核酸配列に依存しているので、本発明の方法は、核酸試料の配列を分析するのにも使用できる。
【００３０】
本発明によれば、核酸試料という用語は、DNAまたはRNAを含む試料を指す。核酸試料は、溶液中に含まれてもよく、上記溶液は、例えば緩衝剤を含有しうる。DNAはcDNAを含んでもよく、RNAはmRNAまたはsiRNAを含んでもよい。核酸試料は、1本鎖DNAもしくはRNA、または2本鎖DNAもしくはRNAを含むことが好ましい。上記核酸試料が2本鎖核酸を含む場合、その核酸は最初に、容器内の溶液に約94℃の温度を適用することによって変性されうる。一実施形態では、上記核酸が天然の2次構造要素を含むか、またはその変性型の形態にある。一実施形態では、上記核酸試料が、微生物、動物または植物から単離された核酸を含みうる。別の実施形態では、上記核酸が合成配列、例えば、ベクターまたはオリゴヌクレオチドの一部である。さらなる実施形態では、上記核酸試料が、動物もしくは植物細胞または微生物の細胞を含む。
【００３１】
本発明の方法によれば、検出がリアルタイムでありうる。
【００３２】
本発明によるヌクレオチド変化は、核酸の配列の変化を意味し、それは、例えば変異による、例えばヌクレオチドまたは塩基対の置換、欠失または付加でありうる。本発明によれば、1つまたは複数のヌクレオチド変化が検出されてもよい。詳細には、上記変化は、STR、SNP、または標的遺伝子改変(GM)ステップでありうる。上記ヌクレオチド変化はSNPであることが好ましい。SNPは、ゲノムDNA中の単一塩基対の位置であり、その位置で、なんらかの集団の正常な個体における、様々な配列選択肢(対立遺伝子)が存在し、その際、最も低頻度の対立遺伝子でも1%以上の存在比を有する。SNPはしばしば疾患と関連しているので、SNPの検出は診断分野で特に価値がある。したがって、本発明の一実施形態では、SNPが疾患に関連している。本発明によるSNPの検出は、したがって、温度制御され、かつUV照射されたチャネルに沿って、核酸試料および核酸プローブを含む溶液を流すステップと、核酸試料/核酸プローブ複合体のUV吸光を測定するステップとを含む方法を使用することによって実施することができる。そのようにして、1本鎖または2本鎖核酸の存在または不在を判定する。SNPが存在する場合には、試料/プローブ複合体は、より不安定であり、より低い融解温度を示すであろう。相違が非常に小さい場合でさえ、本発明の方法の温度分解能は、1本鎖または2本鎖DNAの検出を可能にし、それによって、SNPの存在の判定を可能にするだろう。
【００３３】
本発明による核酸プローブを、対象とする配列に特異的にアニールする核酸断片と定義する。したがって、標的の配列は既知であることが好ましい。上記核酸プローブの配列は、したがって、対象とする配列にそれが相補的となるように設計する。例えば、上記核酸プローブは、対象とする遺伝子配列にアニールする合成オリゴヌクレオチドまたはcDNA断片でありうる。別の実施形態では、上記核酸プローブはRNAを含みうる。本発明に従って使用される核酸プローブは、通常、10〜30ヌクレオチド、好ましくは15〜25ヌクレオチドを含むが、2次構造を有するもの、または他の用途には、さらに大きなものでありうる。本発明の方法によれば、上記核酸プローブは、さらなるレベルの検出を得るために標識することもできる。そのような標識は、当業者には既知であり、それらには蛍光色素標識または放射性標識が含まれる。チャネルの正確な温度制御は、使用される特定のプローブに必要な温度の正確な調整を可能にする。
【００３４】
SNPは、疾患に関連していると提唱されており、したがって、それらは、アルツハイマー病、心臓病、糖尿病または癌など、特定の状態に対する罹患性を予測する助けとなりうる。そのような状態にSNPを関連づけるのには、関連性研究が用いられる。本発明の方法は、候補対立遺伝子にSNPが存在するか、存在しないかを試験する方法を提供し、それによって患者の罹病性に関する指標を与える。したがって、別の態様では、本発明は、疾患を有するか、またはそれに罹患しやすいと患者を診断するための、本明細書に記載した方法の使用に関する。SNPは、患者の個々のプロフィールを考慮に入れて、個人化された薬物治療計画を開発するのにも使用できる。したがって、本発明の方法は、特定の薬物治療計画を開発する際に使用することができる。ロバスト(robust)かつ安価な非PCRベースのSNP検証の開発は、対立遺伝子特異的な治療法の開発に非常に大きな価値があろう。
【００３５】
本発明の別の実施形態によれば、上記核酸試料は少なくとも1つの対立遺伝子を含みうる。候補対立遺伝子のUV吸光は、様々な温度で、結合プローブの存在下および非存在下で、野生型対立遺伝子のUV吸光と比較することが好ましい。この実施形態では、少なくとも1つの候補対立遺伝子を含む核酸試料が1つのチャネルを通り抜け、野生型対立遺伝子を含む核酸試料が第2のチャネルを通り抜けるように、複数のチャネルを用いることによって、上記方法を実施することができる。
【００３６】
さらに別の態様では、本発明は、前記請求項のいずれかに記載の方法における、複数の温度制御されたチャネルを有する装置の使用に関する。
【００３７】
限定されるものではないが、提示したシステムの主な利点は以下の通りである。
【００３８】
SNP検証には、非PCRベースのシステムの使用が極めて望ましい。SNP検証は、標的鋳型上の何百もの塩基のなかから、単一塩基変化を検出するシステム能力に強く依存している。PCRに関する重要な問題は、すべての熱安定性ポリメラーゼおよび他のDNAポリメラーゼに本来的に備わっているエラー発生率が存在することである。これは進化過程には重要な機能である。下表に、一般的なポリメラーゼの一般的なエラー発生率の詳細を示す(Michael Bornsら、「Comparing PCR Performance and Fidelity of Commercial Pfu DNA polymerases」、http://www.biocompare.com/techart.asp?id=121)。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
このエラーの可能性のある領域を排除することは、この方法で極めて有益であろう。PCRは、その反応の成分が進行中のいかなるSNPプログラムでも主要な予算品目となりうるという、費用に関する固有の意味合いも有する。TaqManシステムはさらに一層高価である。ヒトゲノムには何十万もの潜在的SNPが存在し(International SNP Map Working Group、2001年、Nature 409、928〜934頁、「A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms」)、これは、効率的な方法でそれらを調査するためには莫大な資本支出となることを示唆している。これが「個人化」された薬剤の必要性と結びついた場合、個人は薬物治療の前にSNP分析の利益が得られるであろうが、非PCRシステムのみが実現可能であろう。提示したシステムはこれらの不利益のいずれも有しない。
【００４１】
本発明の方法によれば、UV吸光は、UV増感フォトダイオードアレイ(PDA)または電荷結合素子(CCD)を用いて測定できる。例えば、図1に示す通り、光源(重水素ランプまたはUVダイオードレーザなど)、光学部品(UVレンズ)、分離フェーズ、および検出器を共通のレール上に配列する。ノイズが低い重水素ランプまたはUVダイオードレーザからの光は、検出波長の選択を可能にするフィルターホイールを通り抜ける。その後、光は、通常内径50〜100マイクロメートル(μm)の融解石英のキャピラリーに焦点を結ぶ。核酸が光線を通過する際に、核酸がそのスペクトル特性に応じたエネルギーを吸収する。その後、光線は検出器に焦点を結び、核酸によって吸収されたエネルギーによるシグナルの低下を測定する。
【００４２】
本発明は、非限定的な図を参照することによって、さらに理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】光学的配置を示す図である。
【図２】温度制御システムを示す図である。ペルチェセル、空気もしくは液体加熱器、ジュール加熱器または任意の他の適切なシステムで温度環境を制御できるであろう。
【図３】マイクロ流体チップまたはキャピラリーを示す図である。
【図４】非PCRベースのSNP分析を示す図である。使用されるシステムの感受性により、本発明はプライマー/鋳型複合体の融解温度を検出することを目的とする。したがって、2箇所の潜在的な対立遺伝子をプロービングするために、1種のみの対立遺伝子特異的プライマーまたはプローブを用いて、融解温度分析によって、鋳型への対立遺伝子特異的プライマーの親和性を測定することが可能でありうる。SNPが存在している場合には、プローブ/鋳型複合体は、より不安定であり、より低い融解温度を示すであろう。相違が非常に小さい場合でさえ、この方法の温度分解能は0.1℃であり、それによって、この分析が可能となるはずであり、そして、濃色効果による増大が測定可能であろう。
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2009517074.tif 000009
2009517074.tif 000010