(57)【要約】  診療現場で少量の患者の血液を用いて多血小板血漿（ＰＲＰ）を調製し、これからゲルを生成させる、濃縮血小板組成物により創傷を治療するための改善された方法を提供する。該方法は、創傷を診療現場で治療する容易さと速さを改善するための改善された材料の使用を伴う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定量の全血を患者から採取する段階と、
全血を赤血球、白血球および多血小板血漿に分離する段階と、
分離された多血小板血漿を抜き取る段階と、
有効量のアスコルビン酸を多血小板血漿と接触させる段階と、
有効量の石灰化トロンビンと抜き取った多血小板血漿とを接触させて、血小板を活性化し、ゲルを得る段階と、
有効量のゲルを創傷と接触させる段階と
を含むことを特徴とする患者の創傷を治療する方法。
【請求項２】
所定量の全血を患者から採取する段階が、所定量の全血を患者から、診療現場で遠心分離機で遠心分離できるように構成された１つまたは複数の血液採取管中に採取することを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
全血を赤血球、白血球および多血小板血漿に分離する段階が、１つまたは複数の血液採取管を診療現場で操作できるように構成された遠心分離機で遠心分離することを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
１つまたは複数の血液採取管を診療現場で操作できるように構成された遠心分離機で遠心分離する段階が、１つまたは複数の血液採取管を診療現場で約１．５分間遠心分離機で遠心分離することを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
分離された多血小板血漿を抜き取る段階が、分離された多血小板血漿を注射器中に抜き取ることを含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
有効量のアスコルビン酸を多血小板血漿と接触させる段階が、アスコルビン酸を注射器中に加え、注射器を逆さにして混合することを含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
有効量の石灰化トロンビンと抜き取った多血小板血漿とを接触させて、血小板を活性化し、ゲルを得る段階が、石灰化トロンビンを注射器中に加え、注射器を数回逆さにして混合することを含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
所定量の全血を患者から採取する段階が、約５から約３０ｃｃの全血を患者から採取することを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
所定量の全血を患者から採取する段階が、約２０ｃｃの全血を患者から採取することを含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
分離された多血小板血漿を抜き取る段階が、約８ｍＬの分離された多血小板血漿を抜き取ることを含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
有効量のアスコルビン酸を多血小板血漿と接触させる段階が、約１ｍＬのアスコルビン酸を多血小板血漿と接触させることを含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
有効量の石灰化トロンビンと抜き取った多血小板血漿とを接触させて、血小板を活性化し、ゲルを得る段階が、約１ｍＬの石灰化トロンビンと抜き取った多血小板血漿とを接触させることを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
所定量の全血を患者から１つまたは複数の血液採取管中に採取するための血液採取デバイス、
遠心分離機で遠心分離できるように構成された１つまたは複数の血液採取管、
全血を赤血球、白血球および多血小板血漿に分離するために診療現場で操作するように構成された遠心分離機、
所定量の分離された多血小板血漿を１つまたは複数の血液採取管から抜き取るための抜取デバイス、および
抜取デバイスに連結し、所定量の１つまたは複数の試薬を分離された多血小板血漿に加えるための混合デバイス
を含むことを特徴とする、診療現場で患者の創傷を治療するための組成物を調製するためのシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその開示が全部組み込まれる、２００５年６月３０日に提出された仮出願番号第６０／６９５２５３号の恩典を主張する。
【０００２】
本発明は、濃縮血小板組成物を用いて創傷を治療する改善された方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
創傷を治療するために過去に開発された、創傷の種類および場所ならびに重症度に依存する多くの異なる物質および方法が存在している。創傷は、ヒトまたは動物の身体の一部の損傷と一般的に定義されている。皮膚の表面の損傷が最もよく知られている種類の創傷であるが、手術中の脾臓や肝臓の破裂のように、あるいは内臓に近い体表面への外傷性強打により、内臓の表面も傷つけられることがある。
【０００４】
診療では、創傷の持続性と重症度に従って創傷を慢性または急性と特徴づける。慢性創傷は、速やかに治癒せずに、長期化したまたは長びいているものである。急性創傷は、比較的速やかに発生し、そのうえ速やかに治癒するものである。組織創傷は、単に組織（またはその表面）の異常な顕微鏡的断裂または裂のような小さいものから、熱傷罹患者におけるような身体の実質的な部分を覆う皮膚の剥脱または剥離のような大きいものまでの広いスペクトルの症状発現を含み得る。大きいまたは可動性表面における急性創傷は、通常感染を防護し、治癒させるのが最も困難である。
【０００５】
特に、糖尿病性足潰瘍は、切断術の一般的な原因である。米国における２０８０万人を超える人が糖尿病を有している。米国疾病管理センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）による２００２年データ推定は、糖尿病を有する人について８２０００例の下肢切断術が実施されたことを示している（米国疾病管理センター２００５年）。しばしば血管疾患と合併した、自律および感覚神経障害に起因する特徴的な病理学的変化が糖尿病を有する人の高リスクの状況につながる（米国糖尿病協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、１９９９；Ｍａｎｉら、１９９９）。そのような病状を有し、外傷または感染を経験する人は、足または踝の潰瘍を発現する高いリスクにさらされている。１つの研究で、症例の８１％において不完全な創傷治癒が切断術の一因となっていたことが見出された（Ｐｅｃｏｒａｒｏら、１９９０）。したがって、不完全な創傷治癒の率を低減し、切断術を防ぐことができる創傷の治療法の必要性が存在する。
【０００６】
米国糖尿病協会によれば、非外傷性下肢切断術の６０％以上が糖尿病を有する人で行われており、糖尿病を有する人における切断術の率は糖尿病を有さない人より１０倍高く、また、メキシコ系アメリカ人は下肢切断術を経験する可能性が１．８倍高く、非ヒスパニック系黒人は２．７倍高く、アメリカインディアンは３から４倍高い。糖尿病を有する女性より男性において切断術の率が１．４から２．７倍高い。１つの研究で６７０００例の糖尿病関連下肢切断術（ＬＥＡ）が推定され、同様な研究でＬＥＡが合計９８４０００入院日数をもたらし、各入院期間は平均１５日間であることが示されている（Ｆｒｙｋｂｅｒｇら、２０００）。非治癒性糖尿病性足潰瘍およびその結果行うこともある切断術は、医療システム向けのかなりの費用をもたらし、患者の生活の質を低下させる。
【０００７】
糖尿病性足潰瘍の治療の目標は、できる限り速やかに創傷閉鎖を得ることである。糖尿病性足潰瘍の許容される治療目的および標準医療は、創面切除術、創傷部位の圧迫軽減、適切な創傷管理（例えば、湿潤創傷治癒（ｍｏｉｓｔ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ））、感染管理、虚血管理、共存症の内科的管理ならびに必要に応じた外科的管理などである（Ｆｒｙｋｂｅｒｇら、２０００）。多血小板血漿（ＰＲＰ）などの緊急細胞療法は、標準化された高品質の治療計画における補助的役割を果たすことができる。
【０００８】
血液および体液は、創傷治癒に影響を及ぼす様々な物質を含んでいる。血液は、治癒物質を創傷部位に送達し、外来または有害物質を創傷から運び去るための主要な媒体である。全血は、血漿として知られているタンパク質に富む溶液中に懸濁している主要な３種類の細胞から主として構成されている。全血中の３つの主要な細胞型は、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ）（赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ）としても知られている）、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）（白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ）としても知られている）および血小板（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅｓ）（血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）としても知られている）である。赤血球は、酸素の体組織への輸送と移動、および二酸化炭素の除去を促進する鉄含有細胞である。白血球は、異物の食作用および抗体の産生などの様々な機能を果たし、血液中または創傷部位内の感染および異物との戦いを主として担当する。血小板は、血管の漏れ個所の閉塞および血餅の形成をもたらす過程の開始の促進などの多くの機能を果たす。血小板は、新たな組織の形成を促進する成長因子として知られている物質を含む。
【０００９】
複数の成長因子を含む血小板放出物質（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｒｅｌｅａｓａｔｅｓ）は、１９８５年以来、創傷を治療するために用いられている。この療法の効果を実証するｉｎ  ｖｉｖｏ前向き対照試験ならびに後ろ向きおよび費用対効果試験が公表された（Ｈｏｌｌｏｗａｙら、１９９３；Ｓｔｅｅｄら、１９９２；Ａｔｒｉら、１９９０；Ｋｎｉｇｈｔｏｎら、１９９０ａ、ｂ；Ｆｙｌｌｉｎｇら、２００１；Ｇｌｏｖｅｒら、１９９７；Ｋｅｙｓｅｒ、１９９３；Ｆｙｌｌｉｎｇ、１９９２；Ｆｙｌｌｉｎｇら、１９９０ａ、ｂ；Ｄｏｕｃｅｔｔｅら、１９８９；Ｋｎｉｇｈｔｏｎら、１９８９；Ｋｎｉｇｈｔｏｎら、１９８６；Ｂｅｎｔｋｏｖｅｒら、１９９３）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究により、血小板は創傷の治癒のための成分および特性を含むことが示された（Ｂｅｎｎｅｔら、１９９３）。同様に、血漿はフィブリンマトリックスを含む（Ｍｏｓｓｅｓｓｏｎ、２００５）。血漿中に懸濁しているタンパク質の１つは、トロンビンなどの物質と反応し、創傷部位内に放出され（または創傷部位により誘引され）てフィブリンの粘着性の鎖を生成するフィブリノーゲンである。そのような反応は、フィブリン鎖の架橋をもたらして、創傷部位の他の組織物質の沈着または成長を支え、持続させる網目状組織またはマトリックスを形成する。
【００１０】
全血をその種々の成分に分離するいくつかの方法が存在するが、最も簡便で迅速な方法の１つは、血液またはその成分の一部を区別をつけて遠心分離することによって達成される（すなわち、アフェレーシス）。アフェレーシスを用いて、赤血球および白血球ならびに血漿を分離し、供血者または患者に戻し、本質的に濃縮された形の分離された血小板を創傷治癒法に用いるために残すことができる。患者から抜き取られた血液から、そのように血小板を得て、同じ患者に用いるために活性化することができる。患者自身の血液を用いる方法は、「自己由来」または「自原性」ドナー法と呼ばれている。患者による使用のために１人または複数の第三者により提供された血液を使用する方法は、「同種」または「異種」ドナー法と呼ばれ、あるいは総称して「同種異系」法と呼ばれている。
【００１１】
創傷治癒過程は、治癒カスケードと一般的に知られている、いくつかの段階で起こると一般的に考えられている。組織損傷の後に、血小板は、創傷の近くに出現する最初の細胞間に存在する。トロンビンのようなアゴニストによる血小板の活性化は、血小板からの顆粒物質の放出をもたらす。そのような顆粒活性化は、血小板のアルファ顆粒中に主として濃縮されている成長因子として知られているタンパク質の放出をもたらす。成長因子は、細胞成長および移動を誘導するマイトジェンおよび化学誘引物質として作用し、それにより、新たな組織の形成を刺激する。創傷に適用するとき、成長因子は、コラーゲンの沈着、血管の内部成長、線維芽細胞の増殖および全体的な治癒の速度を増加させることが知られている。血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）として知られているタンパク質の放出は、後に創傷内に移動する単球、好中球および線維芽細胞に対する治癒過程の炎症段階を開始するための走化性シグナルである。この期間中に単球は、線維芽細胞を補充し活性化する、ＰＤＧＦおよびトランスフォーム成長因子β１（血小板にも認められる）を含む多くの因子を分泌して、治癒過程の修復段階を開始する。その後、創傷治癒は創傷内のコラーゲンリモデリングの過程を経て続く。
【００１２】
Ｋｎｉｇｈｔｏｎは、血小板に富む濃縮物から得られる創傷治療用組成物の調製および使用を開拓した（特許文献１参照）。Ｗｏｒｄｅｎの特許文献２、Ｗｏｒｄｅｎの特許文献３、Ｈｏｏｄの特許文献４およびＧｏｒｄｉｎｅｒの特許文献５も血小板由来の創傷治療用組成物に関する。
【００１３】
血小板濃縮液は、患者自身の血液を濃縮赤血球（赤血球）、血漿および血小板濃縮液の少なくとも３種類の成分に分離することを本質的に可能にする分画遠心分離の方法により一般的に分離される。多血小板血漿は、トロンビンと混合したナトリウムまたはカルシウム（「石灰化トロンビン」）の溶液と合わせることができ、これより創傷治療薬として用いることができる活性化血小板の組成物が瞬間的に生成する。
【００１４】
【特許文献１】米国特許第５１６５９３８号明細書
【特許文献２】米国特許第６５２４５６８号明細書
【特許文献３】米国特許第６３０３１１２号明細書
【特許文献４】米国特許第５７３３５４５号明細書
【特許文献５】米国特許第５５９９５５８号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
外科的環境、特に、整形外科、形成外科および歯科分野におけるＰＲＰの使用が知られている（Ｋａｓｓｏｌｉｓら、２００５；Ｇｒａｇｅｄａ、２００４；Ｗｅｉｌｂｒｉｃｈら、２００４）。しかし、現在のＰＲＰ分離システムは、必要な処置を行うための専門技能者を必要とする。したがって、伝統的な医療環境において医療専門家が使用することができる創傷を治癒させるための自己由来ＰＲＰ分離システムを提供することが望ましいと思われる。さらに、診療現場で創傷を治療する容易さと速さを改善することが継続的に必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、濃縮血小板組成物により創傷を治療するための改善されたシステムを提供する。本発明のシステムは、診療現場で少量の患者の血液を用いて多血小板血漿（ＰＲＰ）を調製し、これからゲルを生成させるものである。本発明の１つの態様は、創傷を診療現場で治療する容易さと速さを改善するための改善された材料の使用を伴う。この技術を、医師診療室、病院ユニット、外来診療所、長期医療施設および在宅医療スタッフを含む複数の医療提供者に対して利用可能にする小型の診療現場用システムを提供する。用いるすべての構成要素および試薬は、ヒト使用に適合する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に明確に開示されている特定の構成、工程段階および物質に限定されないことを理解すべきである。本発明は、本明細書に示す開示に黙示または内在するもの、ならびにあらゆる要素のすべての同等物またはその限界を含む。本発明の範囲は、特許請求の範囲およびそれと同等のものによってのみ限定される。
【００１８】
血液採取または血液抜取りという句（あるいは同様な句）は、（例えば）抗凝固物質の包含、血液採取および注入装置などの患者または他のドナーからある体積の血液を得るための当分野で知られている技術を含む。
【００１９】
トロンビンという用語は、石灰化トロンビン、特に、５ｍｌの１０％塩化カルシウム水溶液当たり約５０００単位のトロンビンを含んでいてよく、また、石灰化ウシトロンビンならびに自己由来トロンビン、同種異系トロンビンまたは組み換えヒトトロンビンを含んでよい。
【００２０】
抗酸化剤という語は、抗酸化特性を有するあらゆる物質を指す。抗酸化剤は、ビタミンＡ、ＣおよびＥなどのビタミンならびにカロテンなどの非ビタミンを制限なしに含む。
【００２１】
本特許出願の請求の範囲に可能な最も広い解釈および構成を与えるために必要に応じて、接続語「および」は接続語「または」を含むと解釈することもでき、またその逆も同じである。同様に、複数形を用いるとき単数形を含むと解釈することもでき、またその逆も同じである。
【００２２】
本発明では少量の患者の血液を用いて診療現場で多血小板血漿（ＰＲＰ）を調製し、それからゲルを生成させ、患者の創床に適用する。以下にその手順の詳細を述べる。
【００２３】
血液採取
バタフライしゃ血セットを用いて、通常および通例の手順に従って患者から約５〜３０ｃｃ、好ましくは２０ｃｃの全血を採取する。治療する創傷の大きさによって、より多くのまたは少ない血液を採取してもよい。
【００２４】
血液は、１つまたは複数の５ｍＬ真空血液採取管中に採取する。好ましい血液採取管は、ＵＳＰ等級の抗凝固性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）を含む、ＡｕｔｏｌｏＧｅｌ（商標）システム用の注文製作真空血液採取管などの試験され、ヒトでの使用について承認された管である。ヒトでの使用について承認されるためには、血液採取管は、ラテックスを含まず、非浸出性で、非細胞毒性であることが示されなければならない。ＡｕｔｏｌｏＧｅｌ（商標）システム用の注文製作真空血液採取管は、そのように試験され、ヒトでの使用に適することが示された。
【００２５】
有利なことに、ＡｕｔｏｌｏＧｅｌ（商標）システム用の注文製作真空血液採取管は、患者の血液を採取すること、および遠心分離機に直接入れることの両方に用いることができる。これは、患者の血液を最初に注射器に吸引し、その後に遠心管に移さなければならない従来技術と比較して、速さと使用の容易さの改善をもたらす。
【００２６】
遠心分離工程
次に、全血を遠心分離し、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）および多血小板血漿（ＰＲＰ）に分離する。本発明で使用するための好ましい遠心分離機は、少量の全血から血漿と赤血球の迅速な自動的分離を可能にするように設計された卓上型の非自己傾斜ローター回転遠心分離機およびロータースリーブ使い捨て部品からなっている。当遠心分離機は、少なくとも約８３００ｒｐｍの最大速度で回転し、少なくとも約４２３６ｇの最大力を発生する。したがって、当遠心分離機は、比較的小さく、携帯用で、速い。１つの適切な遠心分離機は、ＩＲＩＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（以前はＳｔａｔＳｐｉｎ、Ｉｎｃ．）により製造されたＳｔａｔＳｐｉｎ（登録商標）３０  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｔｕｂｅ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、Ｍｏｄｅｌ  Ｎｏ．Ｍ５０３−２２として知られている。他の適切な遠心分離機も使用することができる。
【００２７】
遠心分離機に入れる前に各真空管の上部を清浄にすべきである。管を遠心分離機に入れ、奇数の管が存在する場合には、釣合いのために水の入った管を加える。遠心分離機の覆いを閉じ、遠心分離機を作動させる。好ましくは、ユニットは、約１．５分間作動し、多血小板血漿（ＰＲＰ）と赤血球の完全な分離をもたらす。ユニットはまた、自動的に停止することが好ましい。
【００２８】
ゲル化工程
次に、液体ＰＲＰを注射器に吸引し、試薬（例えば、トロンビン、塩化カルシウムおよびアスコルビン酸）を所定の配合、濃度および順序でＰＲＰに加えて、ゲルを生成させる。１つの形態において、ゲルは、８ｍｌのＰＲＰとそれに１ｍＬの分割量の石灰化トロンビン混合物（５０００Ｕ．Ｓ．単位のウシトロンビンに５ｃｃの１０％塩化カルシウムを混入したもの）およびアスコルビン酸を加えたものからなることが好ましい。
【００２９】
したがって、１つの好ましい形態において、２０ｃｃ注射器、鈍端針および三方活栓（混合チャンバー）を組み立てる。遠心分離後、真空血液採取管の弾性体上部を除去し、注射器アセンブリを用いてＰＲＰを抜き取る。好ましくは、約８ｍｌのＰＲＰを抜き取る。しかし、必要に応じて、より多くのまたはより少ないＰＲＰを用いてもよい。血小板の結果として得られる濃度は、有効性に関して最適な濃度であることが好ましい。
【００３０】
次に、所望の量のアスコルビン酸および石灰化トロンビン混合物を混合チャンバーを介して注射器アセンブリに加える。好ましくは、約１ｍＬのアスコルビン酸および約１ｍＬの石灰化トロンビン混合物を加えるが、用いるＰＲＰの量によって、必要に応じてより多くのまたはより少ないアスコルビン酸および石灰化トロンビン混合物を加えてもよい。
【００３１】
所望の量のアスコルビン酸を混合チャンバーを介して注射器アセンブリに加える。その後、注射器アセンブリを１回逆さにして混合する。石灰化トロンビン混合物も混合チャンバーを介して注射器アセンブリに加える。次いで、所望のゲル粘稠度が得られるまで、注射器アセンブリを数回逆さにして混合する。
【００３２】
上述のゲル化工程に用いる物質はすべて、試験され、ヒトでの使用が承認されているものであることが好ましい。
【００３３】
創傷の治療
注射器アセンブリ中の混合物がゲル化したと思われたとき（通常約１０〜３０秒）、混合物を準備した創傷に直ちに適用する。所望の場合、混合物のゲル化を遅延させるように、石灰化トロンビンの添加を遅らせることができる。接触層界面包帯（ｃｏｎｔａｃｔ  ｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｄｒｅｓｓｉｎｇ）を創傷上のゲルの上に直接あてることが好ましい。外側一次包帯（および必要な場合には二次包帯）も適用して創傷を覆い、創傷を湿潤した状態に維持することが好ましい。
【００３４】
自己血液由来成分を含むゲルは、身体組織と直接または間接的に相互作用することにより創傷の治癒を促進する。さらに、ゲルは望ましく湿潤した創傷環境を維持する。治癒効果は、血液由来成分および診療現場で患者から採取した少量の血液から有利に生成させることができるＰＲＰゲルの特性に起因する。
【００３５】
以下の実施例は、本発明の方法および生成物を記述し、例証する。これらの実施例は、本発明の単に例証となることを意図するものであって、その範囲または精神を制限するものではない。当業者は、これらの実施例で述べる材料、条件および方法の変形形態を用いることができることを容易に理解するであろう。本明細書で引用するすべての参考文献は、参照によりそれらの全部が組み込まれる。
【実施例１】
【００３６】
以下の実施例は、対照療法（正常食塩水ゲル）に対する本発明により得られるＰＲＰゲルによる糖尿病性足潰瘍の治療の安全性および有効性を実証する（Ｄｒｉｖｅｒら、２００６）。１２週間試験の主要な目的は、試験の終了時のＰＲＰゲル治療創傷と対照治療創傷との間の安全性と完全な創傷閉鎖の発生率を比較することであった。副次的な目的は、１２週間の試験中の創傷治癒の率および３カ月のフォローアップ期間中の治癒した潰瘍における創傷常習性の発生率を比較することなどであった。安全性変数は、有害事象、重篤な有害事象および臨床検査などであった。
【００３７】
試験デザインおよび方法
この前向き無作為化対照二重盲検多施設試験は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の治験医療機器規則適用免除（ＩＤＥ）規則に従って実施された。Ｃｏｎｓｔｅｌｌａ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）が試験を実施し、モニターし、データを中央データベースに収集し、データを監査する臨床研究機関（ＣＲＯ）としての役割を果たした。データ安全性モニタリング委員会は、本試験の治療段階を通しての安全性に関連する事象の評価を行った。独立統計学者が最初に試験に検出力を与え、統計的計画を策定し、安全性および有効性データを解析する契約を結んだ。
【００３８】
全国の１４治験施設が試験に参加した。施設は、創傷治療医および足痛治療医の診療室所、外来創傷治療センター、大学付属足病学カレッジ診療所（ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  ｐｏｄｉａｔｒｉｃ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｃｌｉｎｉｃ）、復員軍人庁創傷治療診療所ならびに陸軍病院四肢保存プログラムなどであった。各施設は、試験を行うためにＩＲＢ承認を得た。
【００３９】
試験適格性：少なくとも４週間の持続期間の潰瘍を有する１８歳から９５歳の１型または２型糖尿病を有する人は、ヘモグロビンＡ１Ｃ＜１２、足裏、足（全足指表面を含む）の内側または外側にあるインデックス（ｉｎｄｅｘ）足潰瘍、０．５ｃｍ２から２０ｃｍ２までの創傷面積（長さ×幅）の測定値の追加の組み入れ／除外基準を満たしていた場合、試験に適格であった。Ｃｈａｒｃｏｔ変形のもとにある創傷は、急性変化があってはならず、適切な構造の強化を受けていなければならなかった。インデックス潰瘍は、臨床的に非感染性であり（培養は得られたが、感染は培養結果でなく、臨床徴候および症状により診断された（Ｌｉｐｓｋｙら、２００４））、骨、筋肉、靭帯または腱の露出を伴わない全層性でなければならなかった（テキサス大学治療に基づく糖尿病性足分類システム：グレード１Ａ（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、１９９８））。
【００４０】
プロトコールは、壊死組織切除術後に、潰瘍が壊死組織片、異物、洞、トンネルおよびポケットを含まず、健常な血管化組織を含み、他の創傷から少なくとも４ｃｍの距離にあることを要求していた。さらに、四肢は、検査ならびに非侵襲的血管試験足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）および足指上腕血圧比（ＴＢＩ）により示される十分な潅流を有していなければならなかった。妊娠の可能性のある年齢の女性は、妊娠または泌乳することはできなかった。男性および女性は、試験中および６カ月間の追跡期間中医学的に許容される種類の受胎調節を自発的に用いなければならなかった。患者病歴、身体的検査（神経障害のＳｅｍｍｅｓ  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎモノフィラメント試験を含む）およびベースライン臨床検査用血液を得た。
【００４１】
患者がすべての指定された治療および来院要件に従うことができることを明記した承認済みかつ署名済み説明同意文書を患者、介護者または法定代理人から試験開始前に取得した。研究者は、患者が医学的に安定で、試験を完了することができるという合理的な見込みを証拠資料で立証した。試験除外基準を表１に示す。
【００４２】
【表１】
2009500352.tif 000002
【００４３】
すべての最初の組み入れ基準を満たし、説明同意文書に署名した後、すべての患者が７日間のスクリーニング期間を完了した。これは、最初の切除術／壊死組織切除術、ベースライン創傷測定および評価ならびに対照生理食塩水ゲルの創傷への適用を含んでいた。標準化のために、鋭利な壊死組織切除術ガイドラインをプロトコールの一部として提供した。患者、家族の一員または他の指名当事者に支給品を供給し、スクリーニング期間中の途中で１回包帯を交換するように指示した。患者に、包帯交換のためおよび夜に除去できる固定足根関節−足変形矯正器を使用することも要求した。さらなる安全のために松葉杖または歩行器を使用した。スクリーニングデータは、データ解析のために症例報告書（ＣＲＦ）に記録した。スクリーニング期間中に創傷の面積が＞５０％減少した患者は、より高度のインターベンションなしに治癒することができると思われたため、治療に無作為化せず、さらなる試験参加を中止させた。
【００４４】
無作為化および盲検化の手順：無作為化スケジュールを電子的に発生させ、治験実施施設ごとにブロックし、契約研究機関（ＣＲＯ）により施設に提供された。各適格試験参加者は、２つの治療群のうちの１つ、すなわちＰＲＰまたは対照に割り付けられ、次の使用可能な連続した無作為化番号を受けた。各施設は、患者（これも盲検化されている）を扱い、治験責任医師、治験実施施設のスタッフ、患者、治験依頼者ならびにＣＲＯスタッフおよびモニターの盲検化を維持するために安全な私的な場所に文書を保管する１人の指名された「非盲検化された」人を有していた。この人は、患者の治療の他のいずれの局面にも参加しなかった。盲検化治験責任医師およびスタッフは、創傷を測定し、すべての検査、評価および壊死組織切除術を実施し、創傷閉鎖を判定した。戦略的に置いたドレープにより患者がどの治療が創傷に適用されたかを見ることを防止した。盲検化を維持するために、血液を治療および対照患者の両方から採取した。
【００４５】
ＰＲＰ調製方法：上述のように、本発明の、本試験で用いたＰＲＰ分離システムは、非治癒性創傷の治療に用いることができる処理自己由来血小板および血漿を得るための新世代の診療現場システムである。このシステムは、全血をＰＲＰに分離するための小型の携帯用遠心分離機、ならびに血液採取、処理およびＰＲＰゲルの適用のための品目を含むコンビニエンスキットを含む。多血小板血漿ゲル（ＡｕｔｏｌｏＧｅｌ（商標）、Ｃｙｔｏｍｅｄｉｘ，Ｉｎｃ．Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州）を用いて治療群の患者を治療した。対照群の創傷は、生理食塩水ゲル（Ｎｏｒｍｌｇｅｌ（登録商標）、Ｍｏｌｎｌｙｃｋｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ジョージア州）を用いて治療した。ＰＲＰゲルまたは生理食塩水ゲルのいずれかを準備した創傷床に適用した。
【００４６】
ＰＲＰ分離工程の最初の段階は、患者から創傷の大きさによって＜２０ｍＬの血液を採取するための静脈穿刺を実施することを含む。血液を小型の携帯用遠心分離機で１．５分間遠心分離して全血からＰＲＰを分離する。ＰＲＰを注射器中に抜き取り、試薬を加えて、血小板および血漿を活性化し、また適切なゲルの粘稠度を達成する（ゲルの粘稠度は通常１５から３０秒以内に達成された）。次いで、ゲルを直ちに創傷に適用した。接触層包帯をゲルの上にあてた。ＰＲＰゲルが吸収されないように、フォーム包帯（非吸収材側）を接触包帯層の上にあてた。これをフォーム包帯の吸収材側で覆い（創傷滲出液の漏れを吸収させるために）、固定した。保護のために、創傷の周りの完全な皮膚にバリアクリームを塗布した。
【００４７】
対照群に無作為化された患者については、創傷床を準備した後に、正常食塩水ゲルを創傷に適用した。ＰＲＰゲルの適用と同様に、接触層包帯を生理食塩水ゲルの上にあてた後、フォーム包帯の非吸収材側をあて、固定する前にフォーム包帯の吸収材側で覆った。
【００４８】
臨床的評価および処置：各来院時に創傷を評価し、メートル法テープメジャーを用いて測定した（長さ、幅および深さ）。測定値およびポケットまたはトンネルなどの他の創傷変数、創傷滲出液の特性（すなわち、存在、色、量および臭気）、壊死組織ならびに肉芽組織を記録した（Ｃｏｏｐｅｒ、２０００）。
【００４９】
各治療来院時に提供した治療および管理努力は、創傷の浄化と評価、ならびにバイタルサイン、および前回の来院以来の有害事象、併用薬、栄養および体重支持状態、および治療の他の側面に関する情報を含む中間創傷歴を得ることなどであった。施設被指名者が静脈切開を実施し、非盲検化者がすべての後続のゲル処理を実施した。治療手順を観察しなかった主席治験医師は、治療来院時に創傷治療の提供を指示した。
【００５０】
製品の適用の一貫性および盲検法の維持の必要性から、状況によって診療所に出席できない場合には在宅で１回の包帯交換を行うという規定以外は、包帯は治験責任医師の施設においてのみ適用することが要求された。患者は３または４日間隔で週２回戻った。記載した手順および処理を最長１２週間にわたり各来院時に実施した。創傷が治癒するまで、１２週間の治療相が完了するまで、あるいは、治験責任医師、治験依頼者により、または患者が同意を撤回もしくは来院のために戻らなかったために、患者の試験参加が終了されるまで、治療を継続した。
【００５１】
安全性を評価するために、臨床検査を試験中に実施して治療インターベンションの影響を判断した（表２を参照）。試験中に発生した予測された、または予測できなかった有害事象（ＡＥ）は、治験責任医師により観察されたか、または患者により観察されたかにかかわりなく、詳細に報告した。治験責任医師は、パラメーターが正常値に戻るまで、またはフォローアップがもはや必要でないと判断されるまで、患者をＡＥまたは臨床検査異常について監視した。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
治療終了来院手順：治験責任医師が創傷閉鎖（すなわち、１００％上皮形成）を宣言したとき、患者に１週間後に来院を予定させたが、オフロード装具ウォーカー（ｏｆｆｌｏａｄｉｎｇ  ｏｒｔｈｏｓｉｓ  ｗａｌｋｅｒ）を装着し続けるように依頼した。この来院時に、創傷が再び開いていた場合、患者を同じタイムラインで試験に再参加させ（継続的治療のための復帰来院と一致）、創傷が治癒するまで、または治癒しない場合の来院１である１３週目まで継続させる。創傷が１週後に治癒したままである場合、患者はフォローアップ相に参加し、３、７および１１週後に戻った。
【００５４】
この３カ月間のフォローアップ相中に、治癒した創傷を分類について評価し、患者に有害事象に関して質問した。
【００５５】
１２週間の治療期間の終了時に、治癒していない創傷は医師のプロトコールに従って治療した。患者は、患者選択の施設でのフォローアップのために治験実施施設から退院させた。すべての参加者に無作為化日の後の２４週目に最終第Ｖ因子試験のために戻るように依頼した。試験の終了は、２４週目の臨床検査評価の完了時、患者の同意の撤回時または患者の死亡時に発生した。完全な病歴ならびに足脈拍の試験、血管試験（ＡＢＩおよびＴＢＩ）、Ｓｅｍｍｅｓ−Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎモノフィラメント試験を含む身体的検査、臨床検査、治験責任医師の命令による包帯交換および健康管理選択肢の討議による教育などの患者処置／指示を繰り返した（図１を参照）。
【００５６】
統計解析
治癒率：試験の能力は、２つのデータ源に基づいて決定した。ＰＲＰゲル治癒率は、未公表の糖尿病性足潰瘍後ろ向き試験（Ｆｙｌｌｉｎｇら、２００１）およびＰＲＰゲルを使用した臨床医からのフィードバック（Ｂｅｒｉｏｕら、２００４）から決定した。対照群の治癒率は、１０前向き試験（Ｍａｒｇｏｌｉｓら、１９９９）の対照群の治癒率のメタ解析に基づいていた。
【００５７】
標本の大きさ：標本の大きさを決定するために、完全に閉鎖した創傷を有する患者の予想される割合をＰＲＰゲル群で０．６０（πｔ）、対照群で０．２０（πｃ）とした。標本の大きさを計算するために、以下の帰無仮説（Ｈ０）および対立仮説（ＨＡ）を立てた。
【００５８】
Ｈ０：πｔ＝πｃ対Ｈ０：πｔ≠πｃ
フィッシャーの直接確率法は、各治療群の標本の大きさが２７（すなわち、合計５４例の患者）である場合、両側有意水準を０．０５０でＰＲＰゲルの割合πｔと０．２０のπｃとの差を検出する８０％の能力を有するであろう。標本の大きさは、脱落例を考慮して５４から７２に増加させた。
【００５９】
主要な有効性変数は、治癒した創傷を有する患者の割合であった。各治験実施施設の各群および統合したすべての群内の治癒の割合について２つの治療法を比較するのにフィッシャーの直接確率法を適用した。
【００６０】
各施設の登録が異なっていた（患者１例から１４例まで）ので、解析の目的のために各施設を提供者の状況および人口統計学的特性に従って群分けした（群ＩからＶまで）。治験実施施設の性質と患者を登録するそれらの能力が異なるため、施設を教育施設、陸軍施設、私的診療所の医師（２施設）および外来治療診療所の５つのカテゴリーに群分けした。その目的は、各群に８から２１例の患者を登録することであった。独立監査の結果により、ｐｅｒ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ＰＰ）解析のために１つの群のすべての患者が除外され、４つの群が残された。
【００６１】
オッズ比／信頼水準：治癒した創傷を有する患者の割合について、各群のオッズ比および９５％信頼区間を計算した。マンテル−ヘンゼル（Ｍ−Ｈ）総合オッズ比（各群にわたって総合）ならびに９５％信頼区間を計算した。さらに、各群のオッズ比の均一性に関するＭ−Ｈ検定を行った。Ｍ−Ｈ法を用いて、Ｍ−Ｈ総合オッズ比が１であったかどうかの仮説を検定した。
【００６２】
追加の変数：他の有効性変数は、１）試験来院の終了（ＥＯＳＶ）時の創傷面積のベースライン（ＢＬ）からの変化率、２）ＥＯＳＶ時の創傷体積のＢＬからの変化率、３）ＥＯＳＶ時の１日当たりの面積閉鎖率、および４）ＥＯＳＶ時の１日当たりの体積閉鎖率であった。これらの有効性変数は、連続型であった。変数のそれぞれについて、スチューデントのｔ検定を用いて２つの治療法を比較した。統計的検定は、ソフトウェアパッケージＳＴＡＴＡ、リリース８．２（Ｓｔａｔａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｔｅｘ）を用いて行った。
【００６３】
カプラン−マイヤ：さらに、カプラン−マイヤ（Ｌｅｅ、１９８０；Ｋａｌｂｆｌｅｉｓｃｈら、１９８０）の積−極限法を用いてＰＰ損傷の治癒までの時間および創傷サイズデータセットの大多数を解析した。各データセットについてＰＲＰゲルおよび対照群のカプラン−マイヤ関数または曲線を得た。対数順位検定を用いて、カプラン−マイヤ治癒関数が２つの治療法にわたって同じであるという仮説を検定した。
【００６４】
臨床検査による安全性：臨床検査による安全性の評価のために、各来院時の観測値ならびにベースライン後来院およびエンドポイントにおけるベースラインからの変化を各治療群ごとに記述的に要約した（数（ｎ）、平均値、標準偏差（ＳＤ）、最小値、中央値、最大値）。エンドポイントにおける治療法間の結果をノンパラメトリック分散分析法（ウィルコクスンの順位和検定、両側）を用いて比較した。
【００６５】
シフト分析：ベースラインからエンドポイントまでに正常範囲の内および外に移った各治療群の患者の数および割合を各臨床検査変数ごとに計算した。重要なシフト変化について治療法を比較するために、臨床検査結果がベースラインにおける正常または低からエンドポイントにおいて高に移った患者およびベースラインにおける正常または高からエンドポイントにおいて低に移った患者の数を個別の２×２表で比較し、差を両側フィッシャーの直接確率法を用いて統計的有意性について検定した。臨床検査結果がベースライン範囲からシフトしなかった患者またはエンドポイントにおいて正常であった患者波、範囲外シフトを示した患者とともに解析し、治療群を比較した（行［Ｒ］×列［Ｃ］表の直接確率法）。これらの３つの独立した解析により、高および低の偏りが有意である可能性がある場合、変数を問題の一方向シフトまたは両方向のシフトについて評価することができる。
【００６６】
結果
最初に１２９例の患者が説明同意文書を提出し、現行のスクリーニングに参加した（図１を参照）。これらの患者のうち、５７例（４４％）は、７日間のスクリーニング期間中に創傷のサイズが≧５０％減少したため、または除外／組み入れ基準に適合しなかったため、試験から脱落した。最終的に、７２例の患者が登録され、各患者は試験組み入れのために指定された１つの創傷（インデックス潰瘍）を有していた。
【００６７】
ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ（ＩＴＴ）集団においては、２つの治療群における年齢の平均値と標準偏差（ＳＤ）、ＨｇｂＡ１Ｃ、創傷面積および体積は有意に異なっていなかったが、ＰＲＰゲル群の創傷体積は対照群より変動が大きかった（ＳＤ４．１対１．２、Ｐ＜０．０００１）（表３を参照）。潰瘍位置情報が９例の患者（ＰＲＰゲル群の３例および対照群の６例）で欠落していた。２つの治療群の間に患者の人口統計学的特性、創傷分布または潰瘍位置の有意な差は認められなかった。ＩＴＴ解析の目的のために、ＩＴＴ集団は、試験を完了したすべての有効患者、ならびにフォローアップ不能であった、治療を完了しなかった、またはプロトコール違反を有していた患者を含んでいた。ＩＴＴ群において、ＰＲＰゲル群の４０例の患者のうちの１３例（３２．５％）および対照群の３２例の患者のうちの９例（２８．１％）が１２週後に完全に治癒した創傷を有していた（Ｐ＝０．７９）。ＩＴＴ解析の結果が以前の臨床的転帰を反映していなかったように思われたため、治験依頼者は治験実施施設における臨床試験の実施に関する基準（ＧＣＰ）への試験の準拠を保証するために独立監査を依頼した。
【００６８】
監査中、患者原資料、症例報告書（ＣＲＦ）および他の試験原資料を再検討した。５つの客観的基準を策定し、それらに対してすべての監査対象患者記録を評価した。患者の除外をもたらしたプロトコール違反は、誤った遠心分離の使用（患者に正しい治療（すなわち、ＰＲＰゲル）を受けさせない）、症例報告書の記載事項を裏付ける原資料の欠如ならびに組み入れ／除外基準に適合しなかった患者および／または創傷の組み入れなどであった。あらかじめ定めた統計的計画により、解析は治療を完了した患者について実施されたことが確認された。したがって、インデックス創傷と無関係の理由のために早期に終了した患者およびフォローアップ不能であった患者もＰＰ解析から除外された。
【００６９】
【表３】
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【００７０】
施設の監査により、７２例の患者のうちの３２例（４４％）がプロトコール違反を有していたか、または試験中参加の基準に適合していなかった。３２例の除外された患者のうち、２４例（７５％）はプロトコール違反を有し、８例（２５％）は治療を完了しなかった。プロトコール違反は転帰に影響を及ぼしたように思われ、したがって、ＰＰデータセットは、監査の完了時に解析のための主要なデータセットになり、１９例の患者がＰＲＰゲル群に属し、２１例の患者が対照群に属していた。これらの患者の転帰は患者／創傷治療ＰＰを反映していた。
【００７１】
ＰＰ群においては、非白人参加者に対する白人の割合のみが有意に異なっていた（Ｐ＝０．０２）。白人の割合はＰＲＰゲル群で有意に高かった。年齢、ＨｇｂＡ１Ｃ、創傷面積、創傷体積、性または創傷位置に関してはＰＲＰゲル群と対照群との間の統計的に有意な差は認められなかった。これは、ＩＴＴ群と同じである（表４を参照）。
【００７２】
【表４】
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【００７３】
有効性転帰：ＰＰデータセットにおいては、ＰＲＰゲル群の１９例中１３例（６８．４％）の患者および対照群の２１例中９例（４２．９％）の患者が治癒した（Ｐ＝０．１２５、両側フィッシャーの直接確率法）。完全に治癒した創傷の割合の９５％ＣＩは、ＰＲＰゲルおよび対照群でそれぞれ４７．５％から８９．３％および２１．７％から６４．０％であった。完全閉鎖までの時間のカプラン−マイヤ中央値は、ＰＲＰゲルで４５日であったのに対して対照で８５日であった（対数順位検定、Ｐ＝０．１２６）（図２を参照）。
【００７４】
組み入れ／除外基準は少なくとも０．５ｃｍ２から２０ｃｍ２以下までの面積範囲を有する創傷を含んでいたが、サイズ頻度分布は大多数（４０例のうちの３５例、８８％）の創傷のサイズが面積が≦７．０ｃｍ２で、体積が≦２．０ｃｍ３の範囲にあり、５例（ＰＲＰ群の３例の患者／創傷および対照群の２例）はアウトライアーであった。アウトライアーの平均面積は、ＰＲＰおよび対照群でそれぞれ１０．５３ｃｍ２（ＳＤ８．９）および１４．６３ｃｍ２（ＳＤ１．６）であった。この群のサイズ範囲は公表された複数の糖尿病性足潰瘍試験（Ｍａｒｇｏｌｉｓ、２００３）における平均創傷サイズと相関しているので、このサイズ範囲のみにおける潰瘍を用いて解析を繰り返した。ＰＰデータセットのこのサブセットを大多数創傷群と呼ぶこととする。
【００７５】
サイズ（平均面積ＰＲＰ＝２．０１ｃｍ２（ＳＤ１．３）および対照２．４３ｃｍ２（ＳＤ１．６））について標準化したとき、完全に治癒した創傷の割合は、ＰＲＰゲルおよび対照治療群でそれぞれ１６例のうちの１３例（８１．３％）および１９例のうちの８例（４２．１％）であった（Ｐ＝０．０３６、フィッシャーの直接確率法）。完全に治癒した創傷の割合の９５％ＣＩは、ＰＲＰゲル群で６２．１％から１００％であり、対照群で１９．９％から６４．３％であった。
【００７６】
大多数創傷データセットの時間の経過に伴う完全に治癒した創傷の割合のカプラン−マイヤ曲線は、２つの曲線が約２８日目に互いに分離し始めたことを示した（図３を参照）（対数順位検定、Ｐ値＝０．０１８）。
【００７７】
４治験実施施設群における治癒転帰の範囲を評価したとき、施設群間の治癒転帰の広い変動が認められた。ＰＰデータセットについては、完全な治癒の割合の施設群パーセントは、ＰＲＰゲル治療創傷で５０％から１００％まで変化し、対照治療創傷で２５％から６７％まで変化した。大多数創傷データセットについては、完全な治癒の割合の施設群パーセントは、ＰＲＰゲルおよび対照治療創傷でそれぞれ６０％から１００％までおよび２５％から６０％まで変化した。対照群と比較してＰＲＰ群の創傷治癒の増大の傾向も認められた。施設群間の変動があるにもかかわらず、各治療群の治癒転帰は、一貫しており、ｐｅｒ  ｐｒｏｔｏｃｏｌおよび大多数創傷群の総データセットにおいて同様であった。
【００７８】
治癒率：ＰＰデータセットにおいては、１日当たりの平均創傷面積閉鎖率は、ＰＲＰ群で０．０５１ｃｍ２であったのに対して対照群では０．０５４ｃｍ２であった。大多数創傷データセットにおいては、１日当たりの創傷面積閉鎖は、ＰＲＰゲル群で０．０４２ｃｍ２であり、対照群で０．０４３ｃｍ２であった。これらの差は統計的に有意でなかった。
【００７９】
ＰＰデータセットにおいて、ＰＲＰゲル群の創傷は平均４２．９日（ＳＤ１８．３）後に治癒したのに対して、対照群の創傷は４７．５日（ＳＤ２２．０）後に治癒した。治癒までの日数は大多数創傷群で同じであった（平均値４２．９および４２．８日）が、ＰＲＰゲル治療創傷の８１．３％および対照ゲル治療創傷の４２．１％がその期間中に治癒した。
【００８０】
フォローアップ：ＰＰデータセットにおける４０例の患者のうち、治癒した創傷を有する２２例が１２週間のフォローアップ相に参加した。それらのうち、ＰＲＰゲル群の１例は再び開いた創傷を有していた。対照治療患者の創傷はいずれも再び開かなかった。この差は、統計的に有意でなかった。
【００８１】
安全性転帰：有害事象（ＡＥ）：治験薬を投与した臨床試験患者におけるＡＥは、発生が治験製品の使用に関連するか否かにかかわりなく、試験の開始の後に出現または悪化した異常な医学的出来事である。有害事象は、患者の７日間のスクリーニング期間の開始から試験治療薬の最終投与を受けてから３０日後までに出現または悪化した臨床的異常について取り込んだ。
【００８２】
１２７件の有害事象のうち、５件は無作為化前の７日間のスクリーニング期間中に２例の患者に発生した。無作為化後に発生した残りの１２２件の有害事象のうち、６０件（４９％）はＰＲＰゲル群に、６２件（５１％）は対照群に存在していた。これらのうち、２件は治療に明確に関連したものと確認された。すなわち、１例の接触皮膚炎がＰＲＰゲル治療創傷に発生し、１例の浸軟が対照治療創傷に発生した。
【００８３】
安全性転帰：重篤な有害事象（ＳＡＥ）：ＳＡＥは、以下の転帰基準のいずれかを満たす有害事象である。すなわち、致命的である；生命を脅かす（すなわち、患者が治験責任医師の見解では、発生したとき反応による死亡の即時のリスクにさらされていた；しかし、それは、より重篤な形で発生した場合、死亡をもたらすような反応を含まない）；入院または入院期間の延長を必要とする；重大または持続的な障害／機能不能をもたらす；先天性異常または先天性欠損；患者を危険にさらす可能性のある、または上の他の転帰の１つを防ぐために患者が内科的もしくは外科的インターベンションを受けることを必要とする、適切な医学的判断に基づく重要な医学的事象。
【００８４】
無作為化後の１２２件の有害事象のうち、２３件は重篤な有害事象と分類された。６件がＰＲＰゲル群で、１７件が対照群で発生した。すべての重篤な有害事象は、治験責任医師により規定された機器の使用との関係はありそうもない、または無関係のものであった（表５を参照）。
【００８５】
【表５】
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【００８６】
臨床検査結果：ＰＲＰゲルによる患者の治療の安全性を解析するために、所定の試験時間枠に従って臨床試験を実施した。糖尿病を有する患者におけるＰＲＰゲルの使用に関する前向き試験は以前に実施されなかったため、血液採取、ウシトロンビンの使用または治療自体が糖尿病を有する人に対して全身性の影響を及ぼすかどうかという疑問が提起された。これらの懸念により、試験中に実施された臨床検査が決定された（表６を参照）。
【００８７】
【表６】
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【００８８】
７２例の参加患者のうち、５６例（７８％）が１６８日目の臨床検査のために戻った。ベースラインからエンドポイントまでの血液学的検査、凝固因子および第Ｖ因子検査の検査値の変化にＰＲＰゲルと対照との間の統計的または臨床的に重要な差は認められなかった。凝固因子の変化に関してＰＲＰゲルと対照との間の統計的に有意な差は認められなかったが、両治療群でＰＴおよびＰＴＴ結果の変化（延長）が認められた。第Ｖ因子活性に対するＰＲＰゲルおよび対照の影響に関する懸念をもたらすような凝固因子の臨床的に重要な変化は、併用薬を含む医療記録の独立モニターレビュー時に認められなかった。
【００８９】
ベースラインからエンドポイントまでのナトリウム、カリウム、塩化物、重炭酸塩、クレアチニンまたはアルブミンに関する化学検査結果にＰＲＰゲルと対照との間の臨床的または統計的に重要な差は認められなかった。血中尿素窒素（ＢＵＮ）のベースラインからの変化に治療法の間の統計的に有意な差が認められ、ＰＲＰゲル治療患者のＢＵＮは低下したが、対照患者のＢＵＮは上昇した（説明は確定されなかった）。
【００９０】
血清グルコースまたはＨｂＡ１Ｃ結果は、対照群と比較してＰＲＰゲル群における多くの患者がエンドポイントにおいて高値に変化したことを示した。これらの差は、統計的に有意でもなく、臨床的に重要でもなかった。それらは、ＰＲＰゲル群のより多くの患者がコントロールされていない糖尿病を有していたことを示唆していた。
【００９１】
これらの安全性結果は、有害事象の発生が最小限であることを実証している。重篤な有害事象はＰＲＰゲルに帰せられず、臨床検査の変化に帰せられるものは最小限であった。これらの影響は、対照群と同等であった。
【００９２】
考察
これは、糖尿病性足潰瘍の治療のためのＰＲＰの使用に関する米国における報告される最初の前向き無作為化盲検対照試験である。このＦＤＡ承認試験において、それらの要件の一部（特定の組み入れ／除外基準、盲検化システム、対照治療の選択、広範な臨床検査および文書化）が試験デザインの厳密さと複雑さに加えられ、ひいては患者の登録のある程度の困難をもたらした。
【００９３】
本試験は、２つのレベルのスクリーニング、すなわち、予備および実（ａｃｔｉｖｅ）スクリーニングを含んでいた。最初に、治験責任医師が患者が試験の潜在的候補であったかどうかを評価した。１２９例の実スクリーニング患者を確保するために、約６５０例の患者を予備スクリーニングした（すなわち、可能な組み入れについて治験責任医師がレビューした）。実スクリーニングは、ベースライン創傷評価、身体的検査、臨床検査、創傷培養、血管試験、創傷切開／壊死組織切除および要件を満たした患者の７日間のスクリーニング期間を含んでいた。１２９例の実際にスクリーニングした患者から、７２例が無作為化され、４０例が試験プロトコール要件を満たしていた（臨床データ監査が３２例の患者の除外を促進し、ＰＰ数を４０例の患者に減少させた）。したがって、最終的に、予備スクリーニング処置に参加した患者の６％のみが登録された。
【００９４】
ＰＰ群の解析時に、頻度分布は、試験に無作為化された創傷の大多数（４０のうちの３５）が創傷面積≦７．０ｃｍ２および体積≦２．０ｃｍ３の基準を満たしていたことを示した。残りの５つのより大きい創傷は９ｃｍ２から２０ｃｍ２までの面積を有し、様々な試験の結果は＜７．０ｃｍ２の創傷サイズが最も一般的であることを示唆している（Ｍａｒｇｏｌｉｓら、１９９９；Ｌｅｅ、１９８０；Ｋａｌｂｆｌｅｉｓｃｈら、１９８０）。「大多数創傷」のサブセットについて有効性変数も解析した。
【００９５】
大多数創傷群の平均ベースライン面積は、再生組織試験（ｎ＝２０８：平均創傷面積２．９７〜３．１ｃｍ２）（Ｖｅｖｅｓら、２００１）、他の再生組織（ｎ＝１５創傷；＜６ｃｍ２創傷で有効性が認められた）（Ｌｉｐｋｉｎら、２００３）、２つの組み換え成長因子試験（それぞれｎ＝１１８例の患者および１３２創傷；平均面積５．５ｃｍ２および２．６ｃｍ２）（Ｓｔｅｅｄ、１９９５；Ｗｉｅｍａｎら、１９９８）および糖尿病性足潰瘍の１つの後ろ向き試験（ｎ＝２６５９９例の患者、５３２０創傷の面積が平均１．５３ｃｍ２、５３２０創傷平均１．８４ｃｍ２および５３１９創傷平均４．４１ｃｍ２）（Ｍａｒｇｏｌｉｓ、２００１）で報告されたものと同様であった。現在までに公表された最大の試験において、患者の６０％が本ＰＲＰゲル試験の大多数群と一致した創傷を有しており、本試験結果の潜在的な外的妥当性を増大させている（Ｍａｒｇｏｌｉｓ、２００１）。
【００９６】
大多数創傷群において、対照群の治癒率が他の試験において報告された大部分の対照群の治癒率より高かった（１２週後に４２％治癒）にもかかわらず、ＰＲＰゲル治療創傷は対照治療創傷より治癒する可能性が有意に大きかった（Ｍａｒｇｏｌｉｓ、１９９９）。特に、他の糖尿病性足前向き試験の対照群の治癒転帰のメタ解析の結果は、１２週間の十分な治療が提供された後に２４％が治癒すると予測できることを示唆している（前出）。ほとんどの試験で、医学界（米国糖尿病協会２００６年１月２５日）により対照包帯として認められた標準療法である湿潤（ｗｅｔ−ｔｏ−ｍｏｉｓｔ）ガーゼ生理食塩水ガーゼ包帯が使用されている。しかし、湿潤（ｗｅｔ−ｔｏ−ｍｏｉｓｔ）包帯は、患者または介護者による１日３回から４回の包帯交換が必要であり、治癒のための最適な水分環境を提供しない可能性がある。いくつかの試験で、ある種の潰瘍の治療にはヒドロコロイド包帯が湿潤（ｗｅｔ−ｔｏ−ｍｏｉｓｔ）包帯より有効であることが示された（Ｂｒａｄｌｅｙら、１９９９）。
【００９７】
検出力計算は、他の試験における対照治療の報告された結果および各治療群の２７の標本の大きさに基づいていた。予想以上に良好な対照治癒率と多数のプロトコール違反がＰＰおよび大多数創傷群の検出力不足をもたらしたが、ある程度の統計的に有意な差が認められ、より大きい標本の大きさを用いた試験では、より大きい群間の差が予想できることが示唆される。
【００９８】
患者が試験中に定期的な血液学的検査および他の臨床検査を受けたので、健康および安全に対する少量であるが頻繁な血液採取（各来院時に３０ｍＬ以下）の影響に関するＦＤＡの懸念に対応した。検査結果は、これらの頻繁な血液採取はヘモグロビン、ヘマトクリットまたは血小板数を減少させなかったことを実証した。ウシトロンビンをＰＲＰを活性化するための処理に用い、大用量のウシトロンビンに曝露された患者における出血障害につながる第Ｖ因子の証拠が存在する（Ｍａｒｇｏｌｉｓ、２００３）ので、患者がウシトロンビンへの少量での頻繁な曝露によりウシトロンビンに対する第Ｖ因子抗体を同様に発生するかどうかについての懸念が提起された。この潜在的影響を評価するために、無作為化群にかかわりなくすべての患者について６週間隔および無作為化後２４週目に第Ｖ因子検査を行った。いずれの患者も試験中およびフォローアップ中第Ｖ因子阻害を示さなかった。これは、これが前向き試験において文書化された最初のものである。
【００９９】
臨床検査は、大多数の患者が試験期間中に高い血糖を有していたことを示した。高い血糖値は治癒を低減することが示された（Ｊｅｆｆｃｏａｔｅら、２００４；Ｍａｒｓｔｏｎ、２００６）が、本試験では、大多数の創傷が治癒した。
【０１００】
外科的環境、特に、整形外科、形成外科および歯科分野におけるＰＲＰの使用に関する多くの論文が公表された（Ｋａｓｓｏｌｉｓら、２００５；Ｇｒａｇｅｄａ、２００４；Ｗｅｉｌｂｒｉｃｈら、２００４）。用いるＰＲＰ分離システムの一部は、必要な処置を行うために特殊技術を必要とする。これは、伝統的な医療環境において医療専門家が使用することができる創傷を治癒させるための自己由来ＰＲＰ分離システムの最初の試験である。本明細書で述べたもののような小型の診療現場用システムは、医師診療室、病院ユニット、外来診療所、長期医療施設および在宅医療スタッフを含む複数の医療提供者に対してこの技術を利用可能にする。
【０１０１】
結論
我々は、ＰＲＰゲルは非治癒性糖尿病性足潰瘍の治療における使用で安全であると判断した。最も一般的なサイズの糖尿病性足潰瘍（面積が≦７．０ｃｍ２で、体積が≦２．０ｃｍ３）において、ＰＲＰゲル治療創傷は対照治療創傷より治癒する可能性も有意に大きい。ＰＲＰまたは生理食塩水ゲルによる創傷の治療は約６カ月での治癒をもたらしたが、最も一般的な創傷サイズにおいては、ほぼ２倍多くのＰＲＰ治療創傷がその時間枠で治癒した。有害事象の数は最小限であり、いずれの有害事象も重篤でなかった。さらに、本試験は、ＰＲＰの調製に用いたウシトロンビンは第Ｖ因子阻害をもたらさないことを実証した。したがって、ウシトロンビンは凝固障害を引き起こさない。さらに、週２回の少量の血液の採取は患者のヘモグロビン、ヘマトクリットまたは血小板数に影響を及ぼさなかった。ベースラインからエンドポイントまでの試験した臨床検査値の臨床的に意味のある変化は認められなかった。この種のＰＲＰシステムは、複数の環境において糖尿病性足潰瘍を治療するために医療提供者により用いることができる。糖尿病性足潰瘍を治療するためにＰＲＰゲルを用いることは、治癒を促進することができるだけでなく、非治癒性創傷によってもたらされる下肢の切断を予防することもできる。
【０１０２】
将来の研究について暗示されるものは，これらの結果の妥当性の確認のためのより大きい標本の大きさに基づくより多くの被験者の登録を可能にするような試験デザインを構築することなどである。本試験は、第Ｖ因子阻害、患者の血液学的検査および他の臨床検査結果に対する影響、ならびに以前に前向き試験で実施されなかった管理の影響などの本試験で答えたいくつかの重大な疑問を再評価する必要はないであろう。困難な症状（すなわち、軽度から中等度の血管疾患、腱もしくは骨の露出、および／または不十分な栄養状態）を伴う糖尿病性足潰瘍は、ＰＲＰゲルがこれらの危険をもたらすシナリオにおいて治癒を促進することができるかどうかを判断するために試験することができた。さらに、この新規の療法が他の高度な創傷治療モダリティと相乗作用的であることを確認するための試験を行うことができた。
【０１０３】
本明細書で引用したすべての参考文献は、参照により完全に組み込まれる。今や本発明を十分に記述したので、本発明の精神もしくは範囲またはそのあらゆる実施形態に影響を及ぼすことなく、本発明を条件、パラメーター等の広く、同等な範囲内で実施することができることは、当業者により理解されるであろう。
【０１０４】
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【０１０５】
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【０１０６】
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【０１０７】
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【０１０８】
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【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】濃縮血小板組成物を診療現場で調製し、適用する方法のフローチャートである。
【図２】実施例１で記載した試験プロファイルのフローチャートである。
【図３】プロトコールに準拠した患者群（ｎ＝４０）カプラン−マイヤの治癒までの時間曲線を示すグラフである。
【図４】大多数の創傷患者群（ｎ＝３５）カプラン−マイヤの治癒までの時間曲線を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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