(57)【要約】  本発明は、Ｔ２Ｒ味覚受容体ファミリー中の特異的なヒト味覚受容体が、特定の苦味化合物、すなわち多くのコーヒー飲料の苦味の味覚に少なくとも部分的に寄与するクロロゲン酸化合物に応答する、という発見に関する。本発明はさらに、クロロゲン酸ラクトンおよび関連する化合物による、これらの苦味受容体の活性化を調節するリガンドを同定するためのアッセイにおける、これらの受容体の使用に関し、そしてこれらリガンドは、Ｔ２Ｒに関連する苦味の味覚を調節する（遮断する）ため、添加物として使用してもよいし、および/または食品、飲料、および医薬剤から除去してもよい。好ましい態様は、コーヒーおよびコーヒー風味の食品、飲料および医薬剤における添加物としての、同定された化合物の使用である。2009501317.tif 000006
2009501317.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロロゲン酸ラクトンに特異的に応答するヒトＴ２Ｒ苦みの味覚受容体を調節する化合物を同定するためのアッセイであって、そのｈＴ２Ｒが、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、およびｈＴ２Ｒ５４から成る群より選択され、以下：
ｉ．クロロゲン酸ラクトンまたは構造的に関連する化合物により活性化される、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、ｈＴ２Ｒ５４、またはそのフラグメント、バリアント、オルソログ、変異体、もしくはキメラの活性化を誘導するクロロゲン酸ラクトン化合物における、その効果について化合物をスクリーニングすること、そして
ｉｉ．前記クロロゲン酸ラクトンまたは構造的に関連する化合物による、前記受容体の活性化におけるその効果に基づいて、前記化合物が、苦味の味覚に関連するｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、および/またはｈＴ２Ｒ５４を調節するかどうかを決定すること
を包含する前記アッセイ。
【請求項２】
前記ｈＴ２Ｒ８が、以下
ｉ．配列番号：３に含有されるアミノ酸配列、
ｉｉ．配列番号：２に含有される配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるもの、または
ｉｉｉ．配列番号：３に含有されるポリペプチドとの、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するもの、
より選択される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
前記ｈＴ２Ｒ１４が、以下
ｉ．配列番号：５に含有されるアミノ酸配列、
ｉｉ．配列番号：６に含有される配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるもの、または
ｉｉｉ．配列番号：５に含有されるポリペプチドとの、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するもの、
より選択される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項４】
前記ｈＴ２Ｒ５４が、以下
ｉ．配列番号：７に含有されるアミノ酸配列、
ｉｉ．配列番号：６に含有される配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるもの、または
ｉｉｉ．配列番号：７に含有されるポリペプチドとの、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するもの、
より選択される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項５】
前記味覚受容体が細胞膜において発現される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項６】
前記味覚受容体が単離された細胞膜において発現される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記味覚受容体が未処置の細胞において発現される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項８】
前記味覚受容体が真核細胞において発現される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項９】
前記味覚受容体が両生類、哺乳類、または昆虫の細胞により発現される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１０】
前記味覚受容体がＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、およびアフリカツメガエル卵母細胞より選択される細胞において発現される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１１】
蛍光定量的アッセイである、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１２】
結合アッセイである、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１３】
細胞内イオン濃度におけるその効果をアッセイすることにより、前記化合物における効果を検出する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１４】
細胞内ナトリウムまたはカルシウムにおける前記化合物の効果を検出する、請求項１に記載のいずれか１つのアッセイ。
【請求項１５】
細胞膜電位における前記化合物の効果を検出する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１６】
前記味覚受容体の転写における前記化合物の効果を検出する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１７】
前記味覚受容体とラニチジンとの相互作用を遮断するその能力に基づいて、前記化合物が選択される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１８】
細胞内ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、またはＩＰ３における前記化合物の効果を検出する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１９】
前記味覚受容体が、前記味覚受容体の細胞外ドメイン、または膜貫通領域を包含する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項２０】
前記アッセイが、カルシウム特異的蛍光色素を使用してカルシウムの変化を検出する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項２１】
前記アッセイが、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４、およびＦｕｒａ−２より選択される色素を使用して、細胞内カルシウムの変化を検出する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項２２】
前記味覚受容体が溶液中に存在する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項２３】
分光法の特徴、水力学の特徴、または溶解度における変化を検出する結合アッセイである、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項２４】
前記味覚受容体のＧタンパク質との複合体における、前記化合物の効果を検出する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項２５】
前記味覚受容体の、トランスジューシン、ガストジューシン、Ｇα１５、Ｇα１６、またはそのキメラより選択されるＧタンパク質との複合体における、前記化合物の効果を検出する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項２６】
蛍光偏光アッセイである、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項２７】
前記味覚受容体を固相担体に付着させる、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項２８】
ハイスループットアッセイである、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項２９】
味覚受容体がＨＥＫ２９３細胞により発現される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３０】
クロロゲン酸ラクトンである３ＣｏＱＡＬに特異的に応答する苦みの味覚受容体を調節する化合物を同定するためのアッセイであって、前記味覚受容体が、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、およびｈＴ２Ｒ５４から成る群より選択され、以下：
ｉ．３ＣｏＱＡＬまたは構造的に関連する化合物により活性化される、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、ｈＴ２Ｒ５４、またはそのフラグメント、バリアント、オルソログ、変異体、もしくはキメラの活性化を誘導する、３ＣｏＱＡＬ、または構造的に関連する化合物における、その効果について化合物をスクリーニングすること；そして
ｉｉ．３ＣｏＱＡＬ、または構造的に関連する化合物による、前記受容体の活性化におけるその効果に基づいて、前記化合物が、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、またはｈＴ２Ｒ５４を調節するかどうかを決定すること
を包含する前記アッセイ。
【請求項３１】
前記ｈＴ２Ｒ８が、以下
ｉ．配列番号：３に含有されるポリペプチド、
ｉｉ．配列番号：２に含有される配列に、特異的にハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド、および
ｉｉｉ．配列番号：３に含有されるポリペプチドとの、少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド、
から成る群より選択される、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項３２】
前記ｈＴ２Ｒ１４が、以下
ｉ．配列番号：３に含有されるポリペプチド、
ｉｉ．配列番号：２に含有される配列に、特異的にハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド、および
ｉｉｉ．配列番号：３に含有されるポリペプチドとの、少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド、
から成る群より選択される、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項３３】
前記ｈＴ２Ｒ５４が、以下
ｉ．配列番号：３に含有されるポリペプチド、
ｉｉ．配列番号：２に含有される配列に、特異的にハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド；および
ｉｉｉ．配列番号：３に含有されるポリペプチドとの、少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド、
から成る群より選択される、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項３４】
前記味覚受容体が単離された細胞膜において発現される、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項３５】
前記味覚受容体が未処置の細胞において発現される、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項３６】
前記味覚受容体が真核細胞において発現される、請求項３０、３１に記載のアッセイ。
【請求項３７】
前記味覚受容体が両生類、哺乳類、または昆虫の細胞において発現される、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項３８】
前記味覚受容体がＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、およびアフリカツメガエル卵母細胞より選択される細胞において発現される、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項３９】
蛍光定量的アッセイである、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項４０】
結合アッセイである、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項４１】
細胞内イオン濃度におけるその効果をアッセイすることにより、前記化合物における効果を検出する、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項４２】
細胞内ナトリウムまたはカルシウムにおける前記化合物の効果を検出する、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項４３】
細胞膜電位における前記化合物の効果を検出する、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項４４】
前記味覚受容体の転写における前記化合物の効果を検出する、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項４５】
前記味覚受容体とクロロゲン酸ラクトン化合物との相互作用を遮断するその能力に基づいて、前記化合物が選択される、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項４６】
細胞内ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、またはＩＰ３における前記化合物の効果を検出する、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項４７】
前記味覚受容体が、前記味覚受容体の細胞外ドメイン、または膜貫通領域を包含する、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項４８】
前記アッセイが、カルシウム特異的蛍光色素を使用してカルシウムの変化を検出する、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項４９】
前記アッセイが、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４、およびＦｕｒａ−２より選択される色素を使用して、細胞内カルシウムの変化を検出する、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項５０】
前記味覚受容体が溶液中に存在する、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項５１】
分光法の特徴、水力学の特徴、または溶解度における変化を検出する結合アッセイである、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項５２】
前記味覚受容体のＧタンパク質との複合体における、前記化合物の効果を検出する、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項５３】
前記味覚受容体の、トランスジューシン、ガストジューシン、Ｇα１５、およびＧα１６、ならびにそのキメラより選択されるＧタンパク質との複合体における、前記化合物の効果を検出する、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項５４】
蛍光偏光アッセイである、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項５５】
前記味覚受容体を固相担体に付着させる、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項５６】
ハイスループットアッセイである、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項５７】
味覚受容体がＨＥＫ２９３細胞により発現される、請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項５８】
クロロゲン酸ラクトンである３ＣＱＡＬおよび４ＣＱＡＬのいずれかまたは双方に特異的に応答する、苦みのＴ２Ｒ味覚受容体を調節する化合物を同定するためのアッセイであって、そのＴ２Ｒが、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、およびｈＴ２Ｒ５４から成る群より選択され、以下：
ｉ．３ＣＱＡＬおよび４ＣＱＡＬのいずれかもしくは双方、または構造的に関連する化合物により活性化される、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、および/もしくはｈＴ２Ｒ５４、またはそのフラグメント、バリアント、オルソログ、変異体、もしくはキメラの活性化を誘導する、デノトニウムベンゾエートまたは構造的に関連する化合物における、その効果について化合物をスクリーニングすること；そして
ｉｉ．３ＣＱＡＬおよび４ＣＱＡＬのいずれかもしくは双方、または構造的に関連する化合物による、前記受容体の活性化におけるその効果に基づいて、前記化合物が、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、および/またはｈＴ２Ｒ５４を調節するかどうかを決定すること
を包含する前記アッセイ。
【請求項５９】
前記ｈＴ２Ｒ８が、以下
ｉ．配列番号：３に含有されるアミノ酸配列、
ｉｉ．配列番号：２に含有される配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるもの、および
ｉｉｉ．配列番号：３に含有されるポリペプチドとの、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するもの、
より選択される、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項６０】
前記ｈＴ２Ｒ１４が、以下
ｉ．配列番号：５に含有されるアミノ酸配列、
ｉｉ．配列番号：４に含有される配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるもの、および
ｉｉｉ．配列番号：５に含有されるポリペプチドとの、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するもの、
より選択される、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項６１】
前記ｈＴ２Ｒ５４が、以下
ｉ．配列番号：７に含有されるアミノ酸配列、
ｉｉ．配列番号：６に含有される配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるもの、または
ｉｉｉ．配列番号：７に含有されるポリペプチドとの、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するもの、
より選択される、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項６２】
前記味覚受容体が細胞膜において発現される、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項６３】
前記味覚受容体が単離された細胞膜において発現される、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項６４】
前記味覚受容体が未処置の細胞において発現される、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項６５】
前記味覚受容体が真核細胞において発現される、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項６６】
前記味覚受容体が、両生類、哺乳類、または昆虫の細胞により発現される、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項６７】
前記味覚受容体が、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、およびアフリカツメガエル卵母細胞より選択される細胞により発現される、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項６８】
蛍光定量的アッセイである、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項６９】
結合アッセイである、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項７０】
細胞内イオン濃度におけるその効果をアッセイすることにより、前記化合物における効果を検出する、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項７１】
細胞内ナトリウムまたはカルシウムにおける前記化合物の効果を検出する、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項７２】
細胞膜電位における前記化合物の効果を検出する、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項７３】
前記味覚受容体の転写における前記化合物の効果を検出する、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項７４】
前記味覚受容体とデナトニウムとの相互作用を遮断するその能力に基づいて、前記化合物が選択される、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項７５】
細胞内ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、またはＩＰ３における前記化合物の効果を検出する、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項７６】
前記味覚受容体が、前記味覚受容体の細胞外ドメインまたは膜貫通領域を包含する、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項７７】
前記アッセイが、カルシウム特異的蛍光色素を使用してカルシウムの変化を検出する、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項７８】
前記アッセイが、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４、およびＦｕｒａ−２より選択される色素を使用して、細胞内カルシウムの変化を検出する、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項７９】
前記味覚受容体が溶液中に存在する、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項８０】
分光法の特徴、水力学の特徴、または溶解度における変化を検出する結合アッセイである、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項８１】
前記味覚受容体のＧタンパク質との複合体における、前記化合物の効果を検出する、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項８２】
前記味覚受容体の、トランスジューシン、ガストジューシン、Ｇα１５、およびＧα１６、ならびにそのキメラより選択されるＧタンパク質との複合体における、前記化合物の効果を検出する、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項８３】
蛍光偏光アッセイである、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項８４】
前記味覚受容体を固相担体に付着させる、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項８５】
ハイスループットアッセイである、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項８６】
味覚受容体がＨＥＫ２９３細胞により発現される、請求項５８に記載のアッセイ。
【請求項８７】
クロロゲン酸ラクトンである４ＦＱＡＬに特異的に応答する、ヒト味覚受容体を調節する化合物を同定するためのアッセイであって、その味覚受容体が、ｈＴ２Ｒ８、およびｈＴ２Ｒ５４から成る群より選択され、以下：
ｉ．ストリキニーネまたは構造的に関連する化合物により活性化される、ｈＴ２Ｒ８および/もしくはｈＴ２Ｒ５４、またはそのフラグメント、バリアント、オルソログ、変異体、もしくはキメラの活性化を誘導する、４ＦＱＡＬまたは構造的に関連する化合物における、その効果について化合物をスクリーニングすること；そして
ｉｉ．クロロゲン酸ラクトンである４ＦＱＡＬまたは構造的に関連する化合物による、前記受容体の活性化におけるその効果に基づいて、前記化合物が、苦味の味覚に関連するｈＴ２Ｒ８および/またはｈＴ２Ｒ５４を調節するかどうかを決定すること
を包含する前記アッセイ。
【請求項８８】
前記ｈＴ２Ｒ８が、以下
ｉ．配列番号：３に含有されるアミノ酸配列、
ｉｉ．配列番号：２に含有される配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるもの、または
ｉｉｉ．配列番号：３に含有されるポリペプチドとの、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するもの、
より選択される、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項８９】
前記ｈＴ２Ｒ１４が、以下
ｉ．配列番号：５に含有されるアミノ酸配列、
ｉｉ．配列番号：４に含有される配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるもの、または
ｉｉｉ．配列番号：５に含有されるポリペプチドとの、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するもの、
より選択される、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項９０】
前記ｈＴ２Ｒ５４が、以下
ｉ．配列番号：７に含有されるアミノ酸配列、
ｉｉ．配列番号：６に含有される配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるもの、または
ｉｉｉ．配列番号：７に含有されるポリペプチドとの、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するもの、
より選択される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項９１】
前記味覚受容体が細胞膜において発現される、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項９２】
前記味覚受容体が単離された細胞膜において発現される、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項９３】
前記味覚受容体が未処置の細胞において発現される、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項９４】
前記味覚受容体が真核細胞において発現される、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項９５】
前記味覚受容体が、両生類、哺乳類、または昆虫の細胞により発現される、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項９６】
前記味覚受容体が、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、およびアフリカツメガエル卵母細胞より選択される細胞により発現される、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項９７】
蛍光定量的アッセイである、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項９８】
結合アッセイである、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項９９】
細胞内イオン濃度におけるその効果をアッセイすることにより、前記化合物における効果を検出する、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項１００】
細胞内ナトリウムまたはカルシウムにおける前記化合物の効果を検出する、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項１０１】
細胞膜電位における前記化合物の効果を検出する、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項１０２】
前記味覚受容体の転写における前記化合物の効果を検出する、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項１０３】
前記味覚受容体とラニチジンとの相互作用を遮断するその能力に基づいて、前記化合物が選択される、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項１０４】
細胞内ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、またはＩＰ３における前記化合物の効果を検出する、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項１０５】
前記味覚受容体が、前記味覚受容体の細胞外ドメインまたは膜貫通領域を包含する、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項１０６】
前記アッセイが、カルシウム特異的蛍光色素を使用してカルシウムの変化を検出する、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項１０７】
前記アッセイが、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４、およびＦｕｒａ−２より選択される色素を使用して、細胞内カルシウムの変化を検出する、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項１０８】
前記味覚受容体が溶液中に存在する、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項１０９】
分光法の特徴、水力学の特徴、または溶解度における変化を検出する結合アッセイである、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項１１０】
前記味覚受容体のＧタンパク質との複合体における、前記化合物の効果を検出する、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項１１１】
前記味覚受容体の、トランスジューシン、ガストジューシン、Ｇα１５、およびＧα１６、ならびにそのキメラより選択されるＧタンパク質との複合体における、前記化合物の効果を検出する、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項１１２】
蛍光偏光アッセイである、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項１１３】
前記味覚受容体を固相担体に付着させる、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項１１４】
ハイスループットアッセイである、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項１１５】
味覚受容体がＨＥＫ２９３細胞により発現される、請求項８７に記載のアッセイ。
【請求項１１６】
苦味の味覚を阻害する量の、請求項１に従ってのいずれかのアッセイを使用して同定された化合物を、それに添加することを包含する、食品、飲料、または医薬剤の苦味の味覚を軽減する方法。
【請求項１１７】
苦味の味覚を阻害する量の、請求項３０に従ってのアッセイを使用して同定された化合物を、それに添加することを包含する、食品、飲料、または医薬剤の苦味の味覚を軽減する方法。
【請求項１１８】
苦味の味覚を阻害する量の、請求項５８に従ってのアッセイを使用して同定された化合物を、それに添加することを包含する、食品、飲料、または医薬剤の苦味の味覚を軽減する方法。
【請求項１１９】
苦味の味覚を阻害する量の、請求項８７に従ってのアッセイを使用して同定された化合物を、それに添加することを包含する、食品、飲料、または医薬剤の苦味の味覚を軽減する方法。
【請求項１２０】
前記食品、飲料、または医薬剤が、その苦味の味覚に起用する少なくとも１つのクロロゲン酸ラクトン化合物を包含する、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２１】
前記食品、飲料、または医薬剤が、コーヒー飲料、またはコーヒー風味の食品もしくは医薬剤である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記クロロゲン酸ラクトンが、３ＣｏＱＡＬ、４ＣＱＡＬ、４ＣＱＡＬ、および４ＦＱＡＬから成る群より選択される、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
食品、飲料または医薬剤の苦味の味覚を軽減する方法であって、クロロゲン酸ラクトン化合物によるｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、および/またはｈＴ２Ｒ５４の活性化を誘導または増強する、請求項１のアッセイのいずれか１つで同定された少なくとも１つの化合物を、それらから除去することを包含する、前記方法。
【請求項１２４】
前記化合物がクロロゲン酸ラクトンである、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記クロロゲン酸ラクトンが、３ＣｏＱＡＬ、３ＣＱＡＬ、４ＣＱＡＬ、および４ＦＱＡＬより選択される、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記除去が、コーヒー飲料、またはコーヒー風味の食品もしくは医薬剤からである、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２７】
苦味の味覚に寄与する少なくとも１つのクロロゲン酸ラクトンの量を低減する条件下で、コーヒー原料を焙煎または加工することを包含する、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
低減した苦味の食品、飲料、または医薬剤を、各々他の食品、飲料、または医薬剤と比較して同定するための方法であって、以下
ａ．一組の食品、飲料または医薬剤からの抽出物を調製する；
ｂ．請求項１に記載したアッセイを使用して、抽出物からのアリコートを接触させる；
ｃ．様々なアリコートを用いてアッセイの応答を記録する；
ｄ．異なる抽出物の応答の順位を定める；そして
ｅ．最も低い活性化活性を有する、食品、飲料または医薬剤のサンプルを選択する；
ことを包含する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００２年７月１０日に提出された米国連続第１０／１９１，０５８号、および２００１年４月５日に提出された米国連続第０９／８２５，８８２号に関し、これら双方の出願をその全内容において本明細書にて参照として援用する。これらの出願は、ｈＴ２Ｒの同定、および特異的にＴ２Ｒを活性化するリガンドの同定のためのアッセイにおけるそれらの使用に関する。これらリガンドは、味覚、特に苦味の味覚の知覚を調節するために有用である。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、苦味の味覚の知覚に関与する、Ｔ２Ｒファミリー中のいくつかの先に報告されたヒトＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を活性化する、苦味化合物の解明に関する。特に本発明は、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、およびｈＴ２Ｒ５４が、コーヒーの苦味の味覚の少なくとも一部の原因であるクロロゲン酸ラクトンに特異的に応答するという発見を伴う。それ故主題のＴ２Ｒは、例えばコーヒー中に見出される苦味化合物、および関連する苦味の味物質の苦味の味覚を調節する、好ましくは遮断する化合物を同定するために使用してよい。
【０００３】
より具体的には本発明の発見は、主題のヒト味覚受容体、そのフラグメント、またはそのオルソログ、スプライスバリアント、一塩基多型（ＳＮＰＳ）、および遺伝子操作された変異体を含むバリアントもしくはキメラが、クロロゲン酸ラクトン分子、ならびにこれら受容体を活性化する構造的に関連する化合物およびその他の化合物の苦味の味覚を、調節する（好ましくは遮断する）化合物を同定するための、アッセイ、好ましくはハイスループットの細胞に基づいたアッセイにおいて有用であることを指摘する。これらのアッセイを使用して同定された化合物は、食品、飲料または医薬製品の味覚を改善するために、それらの中に添加物として使用してよい。加えて本発明は、主題のＴ２Ｒを活性化する苦味化合物を低減または排除するように処理および製剤化された、修飾された食品、飲料および医薬剤に関する。
【０００４】
関連技術の説明
ヒトが認識することのできる基本的な味覚の特徴的属性の１つが苦味である。苦味の味覚の生理学は、ごく最近まで非常にわずかしか理解されていなかった。最近の研究により、味覚の生物学に光があてられ始めた (Lindemann, Nature (2001))。多くの苦味化合物は、細胞表面の受容体と相互作用することにより苦味の味覚を産生すると、現在考えられている。これらの受容体は、細胞内のＧタンパク質と相互作用する、７回膜貫通ドメイン受容体のファミリーに属する。Ｔ２Ｒと命名されたＧＰＣＲの新規ファミリーが、ヒトおよびげっ歯類において同定された(Adler et al., Cell 100(6):693-702 (2000); Chandrashekar et al., Cell 100(6): 703-711 (2000); Matsunami H, Montmayeur J P, Buck L B. Nature 404(6778): 601-4 (2000))。数種の系列のエビでンスは、Ｔ２Ｒが苦味化合物に対する応答を仲介することを示唆する。第１にＴ２Ｒ遺伝子は、舌および口蓋の上皮の味覚受容体細胞のサブセットにおいて特異的に発現される。第２にヒトＴ２Ｒ（ｈＴ２Ｒ１）の１つに関する遺伝子は、ヒトにおける苦味化合物である６−ｎ−プロピル−２−チオウラシルへの感受性に連結する染色体の遺伝子座に位置する（Adler et al.,（同文献）(2000)）。第３にマウスＴ２Ｒの１つ（ｍＴ２Ｒ５）は、マウスにおける苦味化合物であるシクロヘキシドへの感受性に連結する染色体の遺伝子座に位置する。ｍＴ２Ｒ５は、味細胞中に特異的に発現され、苦味の刺激伝達に連結されるＧタンパク質であるガストジューシン(gustducin)を活性化することができることもまた示された（Wong et al., Nature 381:796-800 (1996)）。ｍＴ２Ｒ５によるガストジューシンの活性化は、シクロヘキシミドに応答してのみ起こる（Chandrashekar et al., (同文献) (2000）。このようにｍＴ２Ｒファミリーはマウスにおける苦味の味覚応答を仲介するのに対して、ｈＴ２Ｒファミリーはヒトにおける苦味の味覚応答を仲介することが提唱された。数種のヒトＴ２Ｒはまた、ある種の苦味リガンドに関する受容体としても同定された（Chandrashekar et al, (同文献) 2000; Bufe et al, (同文献) 2002; Kim et al., Science 299, 2003; Pronin et al, Chemical Senses 29, 2004; Behrens et al, BBRC, 319, 2004; Kuhn et al, J. Neuroscience 24, 2004; Bufe et al, Current Biology, 15, 2005）。各ｈＴ２Ｒが、複数の苦味リガンドと結合することができることもまた示唆された。この仮説は、ｈＴ２Ｒファミリーがわずか２４の同定されたメンバーから成るのに対して、ヒトは数百の異なる化合物を苦味として認識することができるという事実に基づく。ｈＴ２Ｒの配列は先に報告されており、Zuker ら （ＷＯ  ０１／１８０５０  Ａ２、（２００１））および Adler ら（ＷＯ  ０１／７７６７６  Ａｌ（２００１））による公開されたＰＣＴ出願において開示されている（双方の文献をその全内容において本明細書にて参照として援用する）。
【０００５】
Ｔ２Ｒ機能を研究する困難さの１つは、これらの受容体が培養された哺乳類細胞株で容易に発現されないことである。Ｔ２Ｒの発現を改善するため、十分に発現されるＧＰＣＲであるロドプシン由来のＮ末端配列が、Ｔ２Ｒ配列に結合された（Chandrashekar et al., (同文献) 2000）。このＮ末端タグはまた、利用可能な抗体によるタンパク質の発現の容易なモニタリングを可能にした。ロドプシンタグの組み込みで、哺乳類細胞株でのいくつかのＴ２Ｒの発現が改善されたものの、Ｔ２Ｒの多くはまだ機能の研究に十分なほど発現されなかった。異なるアプローチにおいて、ｍＴ２Ｒ５をうまく昆虫Ｓｆ９細胞中に発現させることができ、生化学的ＧＴＰγＳ結合アッセイを使用して機能の研究に使用された（Chandrashekar et al., (同文献) 2000）。
【０００６】
出願者らの早期の特許出願である米国連続第１０／１９１，０５８号（本明細書において参照として援用する）において、出願者らは３つの異なるヒトＴ２Ｒを特異的に活性化するリガンドを発見した。加えて出願者らは、２００５年２月８日に米国仮連続第６０／６５０，５５５号を提出し、同文献においてさらに、７つの特異的なヒトＴ２Ｒに特異的に結合する、アセトアミノフェン、ラニチジン、ストリキニーネ、およびデナトニウムを含む苦味リガンド、ならびに関連するアッセイを同定した。
【０００７】
しかしながらこれまでに報告されたこと、およびＴ２Ｒメンバーが苦味の味覚を規定するという理解にもかかわらず、特異的なＴ２Ｒ受容体を活性化する特異的なリガンドの同定が必要とされている。異なるＴ２Ｒ、特にヒトＴ２Ｒの結合特性をより理解することは、所望の味覚調節特性を有する、すなわち特定の苦味化合物の味を遮断または阻害する化合物を選択する上で、その使用をより大きく促進することになるため、非常に有益であろう。
【０００８】
加えて本発明の特定の関連性として、コーヒーに関連する苦味の味覚を阻害するために使用してよい化合物を同定することが特に必要とされている。米国および世界全体におけるコーヒーの消費は、近年にわたり実質的に増加してきているが、多くのコーヒードリンカーに広く見られる不満は、多くのコーヒーが苦味の後味を誘発することである。それ故、コーヒーが苦味の後味を示す原因となる化合物を同定する、および/またはコーヒーの苦味の後味を遮断する化合物を同定するアッセイは、改善された嗜好性を有するコーヒーの生産に有益となろう。それに関して、コーヒーの焙煎および加工が、コーヒー中のクロロゲン酸ラクトンの形成に影響を与えることが報告された（Furah et al., J. Agric. Food Chem. 53(5):1505-13 (2005); Variyar et al., J. Agric. Food Chem. 51(27):7495-50 (2003)）。
【０００９】
発明の概要
結果に向けて本発明は、Ｔ２Ｒファミリー中の数種の味覚受容体、特にｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、およびｈＴ２Ｒ５４が、コーヒー飲料の苦味の味覚の少なくとも一部の原因であると仮定される、コーヒー中に見出されるクロロゲン酸ラクトンに特異的に応答する、という発見に関する。
【００１０】
これらの発見は、特異的な苦味リガンドの存在下および不在下で、特定のＴ２Ｒを発現する細胞を使用して、Ｔ２Ｒの活性を測定する、細胞に基づいたアッセイを使用して行った。特に、下記により詳細に記載するが、上に同定した特異的なＴ２Ｒをその表面上に発現する、そして前記Ｔ２Ｒと機能的に共役するキメラＧタンパク質をさらに発現させたＨＥＫ細胞株を、細胞内カルシウム濃度の変化を検出する細胞に基づいたアッセイにおいて使用し、コーヒーおよびその他の食品および飲料において見出される具体的な苦味化合物（いくつかのクロロゲン酸ラクトン分子）により特異的に活性化されること、その一方で他のｈＴ２Ｒは類似の条件下で活性化されないことを発見した。
【００１１】
それ故本発明は、クロロゲン酸ラクトン、その誘導体、およびその他の苦味化合物によるこれら受容体の活性化を調節する、好ましくは遮断する化合物を同定するため、アッセイ、好ましくはハイスループットアッセイにおける、これらのヒト味覚受容体の使用を包括的に含む。
【００１２】
また本発明は、苦味の味覚を誘発するコーヒー、ならびにその他の苦味の食品および飲料中の化合物を同定するための、これら受容体の使用に関する。
本発明はまた、ヒトまたはそれ以外の味覚検査において、同定された調節化合物の効果を評価し、そして苦味の味覚において同定された化合物の効果を評価する付加的なステップを含むアッセイ法を、包括的に含む。また本発明は、香味剤または味覚モジュレーターとして、すなわち苦味の味覚、例えばコーヒー飲料およびコーヒー風味の食品に関連する苦味の味覚を阻害するための、食品、飲料および医薬剤における、同定された化合物の使用を包括的に含む。
【００１３】
発明の目的
ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、もしくはｈＴ２Ｒ５４、またはそのフラグメント、バリアント、オルソログ、もしくはキメラの、コーヒー中に見出されるクロロゲン酸ラクトン分子、またはこれらＴ２Ｒ受容体の少なくとも１つを活性化するそのようなクロロゲン酸ラクトンに構造的に関連する化合物による、活性化を遮断する化合物を同定することが、本発明の目的である。
【００１４】
ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、およびｈＴ２Ｒ５４、またはそのフラグメント、バリアント、オルソログ、もしくはキメラの、コーヒー中に包含されるクロロゲン酸ラクトンである３ＣｏＱＡＬ、またはこれらｈＴ２Ｒの１つもしくはすべてを活性化する同化合物に構造的に関連する化合物による、活性化を遮断する化合物を同定することが、本発明の具体的な目的である。
【００１５】
ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、およびｈＴ２Ｒ５４の、コーヒー中に見出されるクロロゲン酸ラクトンである３ＣＱＡＬおよび４ＣＱＡＬによる、またはこれら受容体の少なくとも１つを特異的に活性化する同化合物に構造的に関連する化合物による、活性化を遮断する化合物を同定することが、本発明のもう１つの具体的な目的である。
【００１６】
ｈＴ２Ｒ８、およびｈＴ２Ｒ５４の、コーヒー飲料中に見出されるクロロゲン酸ラクトンである４ＦＱＡＬ、またはこの受容体を特異的に活性化する同化合物に構造的に関連する化合物による、活性化を遮断する化合物を同定することが、本発明のもう１つの具体的な目的である。
【００１７】
ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、もしくはｈＴ２Ｒ５４、またはそのフラグメント、バリアント、オルソログ、変異体もしくはキメラを、包含するまたは（安定的または一過性に）発現する細胞または細胞膜をアッセイにおいて使用して、クロロゲン酸ラクトン、および関連する苦味化合物、例えば３ＣｏＱＡＬ、３ＣＱＡＬ、および４ＦＱＡＬによる、前記受容体の少なくとも１つの活性化を遮断する化合物を同定することが、本発明のもう１つの具体的な目的である。
【００１８】
コーヒー飲料中に包含されるクロロゲン酸ラクトンおよび関連する化合物、例えば３ＣｏＱＡＬ、３ＣＱＡＬ、４ＣＱＡＬ、および４ＦＱＡＬによる、前述のヒト味覚受容体の１つの活性化を調節する、好ましくは遮断または阻害する化合物を検出するために、細胞内カルシウムの変化を検出する細胞に基づいたアッセイにおいて、受容体と共役するＧタンパク質、例えばＧα１５、Ｇα１６、ガストジューシン、トランスジューシン(transducin)、またはそのキメラ、例えばＧα１６ガストジューシンキメラ、またはＧα１６トランスデューシンキメラ、を発現する細胞、好ましくは哺乳類、両生類または昆虫の細胞、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用することが、本発明のなおより具体的な目的である。
【００１９】
同定された化合物が、苦味の味覚、例えばクロロゲン酸ラクトン、および関連する苦味化合物、例えば味覚検査、好ましくはヒトの味覚検査においてコーヒー飲料中に見出されるもの、により誘発される苦味の味覚、を調節する、好ましくは阻害または遮断することを確認することが、本発明のもう１つの目的である。
【００２０】
これらの味覚受容体を特異的に活性化する化合物により誘発される苦味の味覚を阻害または遮断するために、組成物中の添加剤または香味調節剤として、本明細書に記載されたアッセイにおいて同定された化合物を利用することが、本発明のもう１つの目的である。本発明の好ましい目的は、クロロゲン酸ラクトンを含有する食品、飲料および医薬剤、好ましくはコーヒーまたはコーヒー風味の飲料および食品の苦味の味覚を遮断するために、上に同定したヒトＴ２Ｒ受容体の少なくとも１つの活性を阻害する化合物を使用することである。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明を具体的に記載する前に、以下の定義を提供する。
“Ｔ２Ｒ”ファミリーという用語は、：（１）下記、およびZuker (同文献) (2001)および Adler (同文献) (2001)（これらの出願を本明細書において参照として援用する）に開示されたＴ２Ｒ群との、約２５アミノ酸、最適には５０−１００アミノ酸のウインドウにわたる、約３０−４０％のアミノ酸配列の同一性、より具体的には約４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％のアミノ酸配列の同一性を有する；（２）下記に開示したＴ２Ｒ配列から成る群より選択されるアミノ酸配列、および保存的に修飾されたそのバリアントを包含する免疫原に対して作成された抗体に特異的に結合する；（３）下記に開示したＴ２Ｒ  ＤＮＡ配列から成る群より選択される配列、および保存的に修飾されたそのバリアントに対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（少なくとも約１００、所望により少なくとも約５００−１０００ヌクレオチドのサイズで）特異的にハイブリダイズする；（４）下記に開示したＴ２Ｒアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約４０％同一な配列を包含する；または（５）所望のＴ２Ｒ配列に対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするプライマーにより増幅される、多型バリアント、対立遺伝子、変異体、および相同体を含む。
【００２２】
特にこれらのＴ２Ｒは、コーヒー飲料の苦味の味覚に少なくとも寄与する苦味リガンド、すなわちクロロゲン酸ラクトンおよびその誘導体、例えば３ＣＱＡＬ、４ＣＱＡＬ、３ＣｏＱＡＬ、および４ＦＱＡＬに特異的に結合する、本出願に提供した核酸配列およびアミノ酸配列を有する、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ１Ｒ１４、およびｈＴ２Ｒ５４といわれる味覚受容体のＧＰＣＲ、ならびにそのバリアント、対立遺伝子、変異体、オルソログ、およびキメラを含む。
【００２３】
Ｔ２Ｒ遺伝子は、タンパク質レベルおよびＤＮＡレベル双方で実質的な配列の相違を示すが一方、今日までに単離されたすべてのＴ２Ｒ群は、同一である特定の領域におけるある種の共通配列を含有すること、またはAdler ら（ＷＯ  ０１／７７６７６  Ａｌ（２００１）および Zuker らＷＯ  ０１／１８０５０  Ａ２（双方をその全内容において本明細書にて参照として援用する）において先に同定されたＴ２Ｒ共通配列と少なくとも７０−７５％の配列の同一性を有すること、が発見された。
【００２４】
形態的には、ある種の化学感受性ＧＰＣＲは、“Ｎ末端ドメイン”“細胞外ドメイン（複数）”、７回膜貫通領域を包含する“膜貫通ドメイン”、および対応する細胞質ループおよび細胞外ループ、すなわち “細胞質領域”および“Ｃ末端領域”を有する（例えばHoon et al, Cell, 96:541-51 (1999); Buck & Axel, Cell, 65:175-87 (1991)を参照のこと）。これらの領域は、当業者に公知の方法、例えば疎水性ドメインおよび親水性ドメインを同定する配列分析プログラムを使用して構造的に同定することができる（例えばStryer, Biochemistry, (第３版1988)を参照のこと；いくつかのインターネットに基づいた配列分析プログラムのいずれかもまた参照のこと）。これらの領域は、キメラタンパク質の作成、および本発明のin vitroアッセイ、例えばリガンド結合アッセイに有用である。
【００２５】
“細胞外ドメイン”はそれ故、細胞膜から突出し、細胞の細胞外表面に曝露されている、Ｔ２Ｒポリペプチドのドメインをいう。そのような領域は、細胞の細胞外表面に曝露されている“Ｎ末端ドメイン”、ならびに細胞の細胞外表面に曝露されている膜貫通ドメインの細胞外ループ、すなわち膜貫通領域２および３、膜貫通領域４および５、ならびに膜貫通領域６および７の間の細胞外ループを含むことになる。“Ｎ末端ドメイン”は、Ｎ末端で始まり、膜貫通領域の開始部に近接する領域まで及ぶ。これらの細胞外領域は、溶液(soluble)相および固相の双方のin vitroリガンド結合アッセイに有用である。加えて以下に記述する膜貫通領域はまた、細胞外領域と組み合わせてまたは単独でのいずれかで、リガンドの結合に関与することができ、それ故in vitroのリガンドアッセイに有用である。
【００２６】
７回膜貫通“領域”を包含する“膜貫通ドメイン”は、原形質膜中に位置するＴ２Ｒポリペプチドのドメインをいい、対応する細部質（細胞内）ループおよび細胞外ループをまた含んでもよく、膜貫通“領域”ともいう。７回膜貫通領域、ならびに細胞外ループおよび細胞質ループは、Kyte & Doolittle, J. MoI. Biol., 157:105-32 (1982))、または Stryer、上記、に記載されているような標準的な方法を使用して同定することができる。
【００２７】
“細胞質ドメイン”は、細胞の内部に面するＴ２Ｒタンパク質のドメイン、例えば“Ｃ末端ドメイン”および膜貫通ドメインの細胞内ループ、例えば膜貫通領域１および２、膜貫通領域３および４、ならびに膜貫通領域５および６の間の細胞内ループ、をいう。“Ｃ末端ドメイン”は、最後の膜貫通領域の末端からタンパク質のＣ末端までまたがる領域をいい、正常には細部質内に位置する。
【００２８】
“７回膜貫通型受容体”という用語は、原形質膜を７回またがる７つの領域を有する膜貫通型タンパク質のスーパーファミリーに属するポリペプチドを意味する（したがって、７つの領域は“膜貫通”または“ＴＭ”ドメインのＴＭ  ＩからＴＭ  ＶＩＩと呼ばれる）。嗅覚受容体およびある種の味覚受容体のファミリーは各々、このスーパーファミリーに属する。７回膜貫通型受容体ポリペプチドは、以下にさらに詳細に考察するように、類似のそして特徴的な一次、二次、および三次構造を有する。
【００２９】
“リガンド結合領域”という用語は、膜貫通ドメインＩＩからＶＩＩ（ＴＭ  ＩＩからＶＩＩ）に実質的に組み込まれる、化学感受性受容体または味覚受容体に由来する配列をいう。この領域は、リガンド、そしてより特定すれば味覚を誘発する化合物に結合する能力があると思われる。
【００３０】
“原形質膜トランスロケーション（膜透過）ドメイン”または単に“トランスロケーションドメイン”という用語は、具体例としてのトランスロケーションドメイン（５’−ＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＷ；配列番号：１）に機能的に均等であるポリペプチドドメインを意味する。これらのペプチドドメインは、ポリペプチドをコードする配列のアミノ末端に組み込まれた時に、非常に効率的にハイブリッド（“融合”）タンパク質を原形質膜に“シャペロン”または“トランスロケーション”することができる。この特定の“トランスロケーションドメイン”は、ヒトロドプシン受容体ポリペプチドである７回膜貫通型受容体のアミノ末端から最初に誘導された。別のトランスロケーションドメインは、ウシロドプシン配列から誘導され、これもまたトランスロケーションを促進するのに有用である。ロドプシン由来配列は、７回膜貫通型融合タンパク質を原形質膜にトランスロケーションする上で特に効果がある。
【００３１】
“機能的均等性”は、類似の条件下で、具体例としての配列番号：１と同程度に効率的に、新たに翻訳されたタンパク質を原形質膜にトランスロケーションする上での、ドメインの能力および効率を意味する；相対的な効率は、本明細書に記載したように（定量的用語で）測定し、比較することができる。本発明の範疇に含まれるドメインは、２０アミノ酸長トランスロケーションドメインである配列番号：１と同じ効率で、細胞（哺乳類、アフリカツメガエル、等）の原形質膜に、新たに合成されたポリペプチドをトランスロケーションさせることにおける、それらの効率に関するルーチンのスクリーニングにより決定することができる。
【００３２】
味覚の伝達を仲介するＴ２Ｒファミリーを調節する化合物を検査するためのアッセイに関する文脈において、“機能的効果”という語句は、間接的または直接的に受容体の影響下にあるあらゆるパラメータ、例えば機能的、物理的、および化学的な効果の決定を含む。これには、in vitro 、in vivo 、およびex vivoにおける、リガンドの結合、イオン流束、膜電位、電流の流れ、転写、Ｇタンパク質の結合、ＧＰＣＲリン酸化もしくは脱リン酸化、シグナル伝達、受容体−リガンド相互作用、二次メッセンジャー（例えばｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ３、もしくは細胞内Ｃａ２＋）濃度の変化、を含み、そして神経伝達物質、またはホルモンの放出の増加または減少のようなそれ以外の生理学的効果もまた含む。
【００３３】
“機能的効果を決定する”により、間接的または直接的にＴ２Ｒファミリーメンバーの影響下にあるパラメータ、例えば機能的、物理的、および化学的な効果を増加または減少させる化合物に関するアッセイを意味する。そのような機能的効果は、当業者に公知のあらゆる手段、例えば分光法（例えば蛍光、吸光度、屈折率）、水力学（例えば形）、クロマトグラフィーの特徴、もしくは溶解度の特性における変化、パッチクランプ法、電位感受性色素、全細胞電流、放射性同位体の外向き電流、誘導性マーカー、卵母細胞のＴ２Ｒ遺伝子発現；組織培養細胞のＴ２Ｒ発現；Ｔ２Ｒ遺伝子の転写の活性化、リガンド結合アッセイ；電位、膜電位、およびコンダクタンスの変化；イオン流束アッセイ；細胞内二次メッセンジャー、例えばｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、およびイノシトール３リン酸（ＩＰ３）の変化；細胞内カルシウムレベルの変化；神経伝達物質の放出、等により、測定することができる。
【００３４】
Ｔ２Ｒタンパク質受容体の“阻害物質”、“活性化物質”、および“モジュレーター”は、味覚の伝達物質に関するin vitro およびin vivoアッセイにおいて使用して同定される、阻害分子、活性化分子、または調節分子をいうために互変的に使用する。阻害物質は、例えば結合して、部分的にまたは完全に刺激を遮断する、低減する、妨げる、活性化を遅延させる、不活性化する、脱感作させる、または味覚の伝達をダウンレギュレートする化合物、例えばアンタゴニストである。“活性化物質”は、例えば結合する、刺激する、増大する、開く、活性化する、促進する、活性化を高める、感作する、作動する、または味覚の伝達をアップレギュレートする化合物、例えばアゴニストである。モジュレーターは、例えば活性化物質または阻害物質と結合する細胞外タンパク質（例えばエブネリン、または疎水性基担体ファミリーのその他のメンバー）との、受容体の相互作用を変化させる化合物；Ｇタンパク質；キナーゼ（例えば受容体の脱活性化および脱感作に関与する、ロドプシンキナーゼおよびベータアドレナリン受容体キナーゼの相同体）；ならびにこれもまた受容体を脱活性化および脱感作するアレスチン、を含む。モジュレーターは一般に、Ｔ２Ｒファミリーメンバーの修飾されたバージョン、例えば変化した活性を有するもの、ならびに天然に発生するおよび合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、化学低分子、等を含む。
【００３５】
阻害物質および活性化物質に関するそのようなアッセイは、例えば細胞または細胞膜においてＴ２Ｒファミリーを発現させること、例えば苦味化合物を調節する化合物の存在下または不在下で推定モジュレーター化合物を適用すること、そしてその後上に記載したように、味覚伝達における機能的効果を決定すること、を含む。潜在的な活性化物質、阻害物質またはモジュレーターで処理したＴ２Ｒファミリーメンバーを包含するサンプルまたはアッセイを、阻害物質、活性化物質、またはモジュレーターを用いないコントロールサンプルと比較して、調節の程度を検討する。コントロールサンプル（モジュレーターで未処理）を、１００％の相対的Ｔ２Ｒ活性値とする。Ｔ２Ｒの阻害は、コントロールと比較してのＴ２Ｒの活性値が約８０％、所望により５０％、または２５−０％である場合に達成される。Ｔ２Ｒの活性化は、コントロールと比較してのＴ２Ｒの活性値が１１０％、所望により１５０％、所望により２００−５００％、または１０００−３０００％高い場合に達成される。
【００３６】
“精製された”、“実質的に精製された”および“単離された”という用語は本明細書において使用する場合、本発明の化合物が天然の状態で通常会合している、他の似ていない化合物を含んでいない状態をいう。好ましくは“精製された”、“実質的に精製された”および“単離された”は、当該組成物が、重量比で所定のサンプルの質量の少なくとも０．５％、１％、５％、１０％、または２０％、そして最も好ましくは少なくとも５０％または７５％包含されることを意味する。１つの好ましい態様においてこれらの用語は、本発明の化合物が重量比で、所定のサンプルの質量の少なくとも９５％包含されることをいう。本明細書において使用する場合、“精製された”、“実質的に精製された”および“単離された”という用語は、複数の核酸またはタンパク質中のある核酸またはタンパク質をいう場合、哺乳類、特にヒト、体内において天然に発生するものの精製された状態、またはそれとは異なる濃度の状態もまたいう。（１）他の会合した構造体もしくは化合物からの精製、または（２）哺乳類、特にヒト、体内において正常には会合しない構造体もしくは化合物との会合を含む、哺乳類、特にヒト、体内において天然に発生するものの、いかなる程度の精製またはより高い濃度も、“単離された”という意味の範囲内である。本明細書に記載した核酸、もしくはタンパク質、または核酸もしくはタンパク質のクラスは、当業者に公知の多様な方法および工程に従って、単離してよい、またはそうでなければ天然において正常には会合しない構造体もしくは化合物と会合してもよい。
【００３７】
本明細書において使用する場合“単離された”という用語は、核酸またはポリペプチドをいう場合、哺乳類、特にヒト、体内において天然に発生するものの精製された状態、またはそれとは異なる濃度の状態をいう。（１）天然に発生する他の会合した構造体もしくは化合物からの精製、または（２）体内において正常には会合しないものと、構造体もしくは化合物との会合を含む、体内において天然に発生するものの、いかなる程度の精製またはより高い濃度も、本明細書で使用する場合“単離された”という意味の範囲内である。本明細書に記載した核酸またはポリペプチドは、当業者に公知の多様な方法および工程に従って単離してよい、またはそうでなければそれらが天然において正常には会合しない構造体もしくは化合物と会合してもよい。
【００３８】
本明細書において使用する場合“増幅する”および“増幅”という用語は、詳細には以下に記載するが、リコンビナントまたは天然に発現される核酸を生成または検出するための、あらゆる適切な増幅法の使用をいう。例えば本発明は、in vivo またはin vitroにおける本発明の、天然に発現される（例えばゲノムもしくはｍＲＮＡの）核酸、またはリコンビナント（例えばｃＤＮＡ）核酸（例えば本発明の味覚誘発化合物との結合配列）を、（例えばポリメラーゼ連鎖反応法  ＰＣＲにより）増幅するための、方法および試薬（例えば特異的なオリゴヌクレオチドプライマーペア）を提供する。
【００３９】
“発現ベクター”という用語は、原核細胞、酵母、真菌、植物、昆虫、または哺乳類の細胞を含むあらゆる細胞において、構成的にまたは誘導的に、in vivo またはin vitroにおいて本発明の核酸配列を発現させる目的のための、あらゆるリコンビナント発現系をいう。この用語は、直鎖状または環状の発現系を含む。この用語は、エピソームとして、またはホストゲノム内に組み込まれて残存する発現系を含む。この発現系は、細胞内において自己複製能力を有することも、または有しないこと、すなわち一過性の発現としてのみ運用されることもできる。この用語は、リコンビナント核酸の転写に必要な最低限のエレメントのみを含有する、リコンビナント発現“カセット”を含む。
【００４０】
“ライブラリー”という用語は、異なる核酸分子またはポリペプチド分子の混合物である標本、例えば感覚を産生するリコンビナント、特に縮重プライマーペアを用いての核酸の増幅により産生された味覚受容体リガンド結合領域、または増幅されたリガンド結合領域を組み込むベクターの単離されたコレクション、または味覚受容体をコードする少なくとも１つのベクターで各々ランダムに形質移入された細胞の混合物、のライブラリーを意味する。
【００４１】
“核酸”または“核酸配列”という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの、オリゴヌクレオチドをいう。この用語は、天然のヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸、すなわちオリゴヌクレオチドを包括的に含む。この用語はまた、合成の骨格をもつ核酸様構造も包括的に含む。
【００４２】
他に指摘していなければ、特定の核酸配列はまた暗黙のうちに、その保存的に修飾されたバリアント（例えば縮重コドンの置換）および相補配列、ならびに明確に表示された配列を包括的に含む。具体的には縮重コドンの置換は、１つもしくはそれより多くの選択されたコドンの第３の位置を、混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換する配列を作成することにより達成してよい（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Bibl. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., MoI. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換的に使用する。
【００４３】
“ポリペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”という用語は、アミノ酸残基のポリマーをいうため、本明細書において互換的に使用する。この用語は、１つまたはそれより多くのアミノ酸残基が、対応する天然に発生するアミノ酸の人工的な化学的擬態であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に発生するアミノ酸ポリマーおよび天然に生成されないアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００４４】
本明細書に記載した“トランスロケーションドメイン”、“リガンド結合領域”、およびキメラ受容体組成物はまた、具体例としての配列に実質的に対応する構造および活性を有する“類似体”または“保存的バリアント”および“擬態”（“ペプチド擬態”）を含む。したがって“保存的バリアント”または“類似体”または“擬態”という用語は、本明細書で定義するように、アミノ酸配列の変更（１つまたは複数）が、ポリペプチドの（保存的バリアントの）構造および/または活性を実質的に変化させないように修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。これらには、アミノ酸配列の保存的に修飾されたバリエーション、すなわちタンパク質の活性に重要な意味を持たないそれら残基の、アミノ酸の置換、付加もしくは置換、またはたとえ重要な意味を持つアミノ酸の置換であっても、実質的に構造および/または活性を変化させないような、類似の特性（酸性、塩基性、正または負の荷電、極性または非極性、等）を有する残基によるアミノ酸の置換、を含む。
【００４５】
より特定すれば、“保存的に修飾されたバリアント”は、アミノ酸配列および核酸配列の双方に適用する。特定の核酸配列に関しては、保存的に修飾されたバリアントは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、または核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合には、本質的に同一の配列をいう。遺伝子コードの縮重のため、機能的に同一な多数の核酸があらゆる所定のタンパク質をコードする。
【００４６】
例えばコドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがってコドンによりアラニンが特定されるすべての位置で、コードされたポリペプチドを変えることなく、そのコドンを、記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。
【００４７】
そのような核酸のバリエーションは、保存的に修飾されたバリエーションの１種である“サイレントバリエーション”である。本明細書においてポリペプチドをコードする各核酸配列はまた、その核酸の各潜在的サイレントバリエーションについても述べている。核酸中の各コドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一の分子を得ることができることを、当業者は認識するだろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションは、記載された各配列中に暗黙のうちに存在する。
【００４８】
機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該技術において周知されている。例えば保存的置換を選択するための１つの具体例としてのガイドラインは以下（オリジナルの残基に続いて具体例としての置換を記載）：アラニン/グリシンまたはセリン；アルギニン/リジン；アスパラギン/グルタミンまたはヒスチジン；アスパラギン酸/グルタミン酸；システイン/セリン；グルタミン/アスパラギン；グリシン/アスパラギン；グリシン/アラニンまたはプロリン；ヒスチジン/アスパラギンまたはグルタミン；イソロイシン/ロイシンまたはバリン；ロイシン/イソロイシンまたはバリン；リジン／アルギニンまたはグルタミンまたはグルタミン酸；メチオニン/ロイシンまたはチロシンまたはイソロイシン；フェニルアラニン/メチオニンまたはロイシンまたはチロシン；セリン/スレオニン；スレオニン/セリン；トリプトファン/チロシン；チロシン/トリプトファンまたはフェニルアラニン；バリン/イソロイシンまたはロイシン、を含む。これに代わる具体例としてのガイドラインは、各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する以下の６つの群：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｉ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、を使用する（例えばCreighton, Proteins (1984) ; Schultz and Schimer, Principles of Protein Structure, Springer- Verlag (1979)を参照のこと）。上に同定した置換が唯一の潜在的な保存的置換ではないことを、当業者は理解するだろう。例えば目的によっては、すべての荷電したアミノ酸を、それらが正であるか負であるかで、互いに保存的置換としてみなしてよい。加えて、コードされた配列中の１つのアミノ酸または小さな割合のアミノ酸を変更、付加、または欠失させる、個々の置換、欠失または付加もまた、“保存的に修飾されたバリエーション”と考えることができる。
【００４９】
“擬態”および“ペプチド擬態”という用語は、ポリペプチドの実質的に同じ構造的および/または機能的特徴、例えば本発明のトランスロケーションドメイン、リガンド結合領域、またはキメラ受容体、を有する合成化学化合物をいう。擬態は、合成の非天然のアミノ酸類似体からすべて構成されることができる、または部分的に天然のペプチドアミノ酸、および部分的に非天然のアミノ酸類似体のキメラ分子であってもよく、そのいずれかである。擬態はまた、あらゆる量の天然のアミノ酸の保存的置換を、そのような置換がまた擬態の構造および/または活性を実質的に変化させないかぎり、組み込むことができる。
【００５０】
保存的バリアントである本発明のポリペプチドを用いる場合、ルーチンの実験法で、擬態が本発明の範囲内にあるかどうか、すなわちその構造および/または機能が実質的に変化していなかどうかを決定することになる。ポリペプチド擬態組成物は、典型的には３つの構造的な基：すなわちａ）天然のアミド結合（“ペプチド結合”）の連鎖以外の残基連鎖基；ｂ）天然に発生するアミノ酸残基に代わる非天然残基；またはｃ）二次構造の擬態を誘導する、すなわち二次構造、例えばベータターン、ガンマターン、ベータシート、アルファヘリックスといった立体配座、等を誘発または安定化する残基、に由来する非天然の構造成分のあらゆる組み合わせを含有することができる。ポリペプチドは、その残基のすべてまたは一部が天然のペプチド結合以外の化学的手段により連結される場合、擬態として特徴付けることができる。個々のペプチド擬態残基は、ペプチド結合、その他の化学的結合、またはカップリング手段、例えばグルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、Ｎ，Ｎ’−ジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、またはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）により連結することができる。従来のアミド結合（“ペプチド結合”）の連鎖に変わることのできる連結基として、例えばケトメチレン（例えば、−−Ｃ（＝Ｏ）−−ＣＨ２または−−Ｃ（＝Ｏ）−−ＮＨ−−）、アミノメチレン（ＣＨ２ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（ＣＨ２Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ２−−Ｓ）テトラゾール（ＣＮ４）チアゾール、レトロアミド、チオアミド、またはエステル（例えばSpatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, 267-357, Marcell Dekker, Peptide Backbone Modifications, NY (1983)を参照のこと）を含む。ポリぺプチドはまた、天然に発生するアミノ酸残基の代わりに、すべてまたは一部の、非天然残基を含有することにより、擬態として特徴付けることができる；非天然の残基は科学および特許の文献において十分に記載されている。
【００５１】
“標識”または“検出可能部分”は、分光法、光化学、生化学、免疫化学、または化学的な手段により検出可能な組成である。例えば有用な標識として、３２Ｐ、蛍光色素、電子密度試薬、酵素（例えばＥＬＩＳＡにおいて一般に使用されるようなもの）、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはハプテン、そして例えばペプチド中に放射標識を組み込むことにより検出可能とすることのできる、またはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用することのできるタンパク質を含む。
【００５２】
“標識核酸プローブまたは標識オリゴヌクレオチド”は、プローブに結合した標識の存在を検出することにより、プローブの存在が検出されてよいように、共有結合によりリンカ-または化学的結合を通して、または非共有結合的にイオン結合、van der Waals結合、静電気的結合、もしくは水素結合を通してのいずれかにより、標識に結合させたものである。
【００５３】
本明細書において使用する場合、“核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド”は、１またはそれより多くのタイプの化学的結合を通して、通常相補的塩基対形成を通して、通常水素結合の形成を通して、相補的配列の標的核酸に結合する能力のある核酸、として定義する。本明細書において使用する場合プローブは、天然の塩基（すなわちＡ、Ｇ、ＣもしくはＴ）、または修飾された塩基（７−デアザグアノシン、イノシン、等）を含んでよい。加えてプローブ中の塩基は、それがハイブリダイゼーションを妨げない限り、リン酸ジエステル結合以外の連鎖により連結されてよい。したがって、例えばプローブは、構成成分の塩基がリン酸ジエステル結合ではなくペプチド結合により連結される、ペプチド核酸であってよい。プローブが、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存して、プローブ配列との完全な相補性を欠く標的配列に結合してもよいことは、当業者により理解されよう。プローブは所望により、例えば同位元素、発色団、蛍光色素(lumiphore)、色素原を用いて直接標識する、または例えばストレプトアビジン複合体がその後結合してよいビオチンを用いて間接的に標識する。プローブの有無に関するアッセイにより、選択配列または部分配列の有無を検出することができる。
【００５４】
“異種の”という用語は、核酸の部分に関して使用する場合、その核酸が、天然には互いに同一の類縁関係において見出されない、２つまたはそれより多くの部分配列を包含することを指摘する。例えば、新たな機能的核酸を作製するために配列された無関係の遺伝子由来の２つまたはそれより多くの配列、例えばある原料由来のプロモーターおよび別の原料由来のコード領域を有する核酸が、典型的には組換えにより生成される。同様に異種タンパク質は、そのタンパク質が天然には互いに同一の類縁関係において見出されない２つまたはそれより多くの部分配列を包含する(例えば融合タンパク質)ことを指摘する。
【００５５】
“プロモーター”は、核酸の転写を指示する核酸配列のアレイとして定義する。本明細書において使用する場合プロモーターは、転写の開始部位付近の必要な核酸配列、例えばポリメラーゼ１１タイププロモーターの場合にはＴＡＴＡエレメント、を含む。プロモーターはまた所望により、遠位のエンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントを含み、これらは転写開始部位から数千塩基対もの距離に位置することができる。“構成的”プロモーターは、ほとんどの環境条件および発生条件下で活性であるプロモーターである。“誘導性プロモーター”は、環境または発生の制御下で活性であるプロモーターである。“作動可能なように連結された”という用語は、核酸発現コントロール配列（例えばプロモーター、または転写因子結合部位のアレイ）および第二の核酸配列との間の機能的連結をいい、その場合発現コントロール配列は、第二の配列に対応する核酸の転写を指示する。
【００５６】
本明細書において使用する場合“リコンビナント”は、合成された、もしくはそうでなければin vitro で操作されたポリヌクレオチド（例えば“リコンビナントポリヌクレオチド”）、リコンビナントポリヌクレオチドを使用して、細胞もしくは他の生物学的システムにおいて遺伝子産生物を産生する方法、またはリコンビナントポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド（“リコンビナントタンパク質”）、をいう。“リコンビナントの手段”はまた、例えば本発明のトランスロケーションドメイン、および本発明のプライマーを使用して増幅された核酸配列を包含する融合タンパク質の誘導的または構成的な発現の、発現カセットまたは発現用ベクター中に、他の原料由来の多様なコード領域またはドメインまたはプロモーターの配列を有する、核酸の連結を包括的に含む。
【００５７】
“選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする”という語句は、特定の核酸配列が複雑な混合物（例えば全細胞またはライブラリーのＤＮＡもしくはＲＮＡ）中に存在する時に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ある分子がその特定の核酸配列としか結合、二本鎖形成、ハイブリダイズしないことをいう。
【００５８】
“ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件”という語句は、プローブが、典型的には核酸の複雑な混合物中でその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる環境では異なることになる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範囲のガイドは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)に見出せる。一般にストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度、ｐＨで、特異的配列の融解温度（Ｔｍ）より約５−１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（標的配列が過剰に存在する場合に、Ｔｍで、５０％のプローブが平衡状態で占有される）温度である。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０から８．３で、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより低い、典型的には約０．０１から１．０Ｍナトリウムイオンの濃度（または他の塩）であり、そして温度が、短いプローブ（例えば１０から５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドより長い）に関しては少なくとも約６０℃であるものとする。ストリンジェントな条件はまた、不安定化物質、例えばホルムアミドの添加により達成してもよい。選択的または特異的なハイブリダイゼーションに関して、ポジティブなシグナルは、バックグラウンドのハイブリダイゼーションの少なくとも２倍、所望によりバックグラウンドの１０倍である。具体例としてのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下のとおり：５０％  ホルムアミド、５Ｘ  ＳＳＣ、および１％  ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、または５Ｘ  ＳＳＣ、１％  ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーションおよび０．２Ｘ  ＳＳＣ、および０．１％  ＳＤＳ  ６５℃での洗浄、とすることができる。そのようなハイブリダイゼーションおよび洗浄のステップは、例えば１、２、５、１０、１５、３０、６０分；またはそれより長い時間で実行することができる。
【００５９】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸であっても、それらのコードするポリペプチドが実質的に関連していれば、まだ実質的に関連する。このことは、例えば遺伝子コードにより許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーが作成される場合に起こる。そのような場合核酸は、典型的に中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。具体例としての“中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”は、４０％  ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣl、１％  ＳＤＳのバッファー中で、３７℃でのハイブリダイゼーション、および１Ｘ  ＳＳＣ中、４５℃での洗浄を含む。そのようなハイブリダイゼーションおよび洗浄のステップは、例えば１、２、５、１０、１５、３０、６０分、またはそれより長い時間で実行することができる。ポジティブなハイブリダイゼーションは、少なくともバックグラウンドの２倍である。当業者は、これに代わるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を利用して、類似のストリンジェンシーの条件を提供することができることを、容易に認識するだろう。
【００６０】
“抗体”は、抗原に特異的に結合し、認識する、免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメントに由来するフレームワーク領域を包含するポリペプチドをいう。認識される免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、エプシロン、およびミューの定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはエプシロンとして分類され、これらを各々順に免疫グロブリンクラスのＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥと定義する。
【００６１】
具体例としての免疫グロブリン（抗体）構造ユニットは、テトラマーを包含する。各テトラマーは２つの同一のポリペプチド鎖のペアから成り、各ペアは１本の“軽鎖”（約２５ｋＤａ）および１本の“重鎖”（約５０−７０ｋＤａ）を有する。各ペプチド鎖のＮ末端は、主に抗原の認識に携わる約１００から１１０またはそれより多くのアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、各々これらの軽鎖および重鎖をいう。
【００６２】
“キメラ抗体”は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるまたは変化させたクラス、エフェクター機能および/もしくは種の定常領域に連結するように、またはキメラ抗体に新しい特性を与えるまったく異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬剤、等に連結させるように、定常領域またはその一部分が変化、置き換え、または交換されている；あるいは（ｂ）異なるまたは変化させた抗原特異性を有する可変領域で、可変領域またはその一部分が変化、置き換え、または交換されている、抗体分子である。
【００６３】
“抗Ｔ２Ｒ”抗体は、そのＴ２Ｒ遺伝子、そのｃＤＮＡ、または部分配列によりコードされたポリペプチドに特異的に結合する、抗体または抗体フラグメントである。
“免疫アッセイ”という用語は、抗原に特異的に結合する抗体を使用するアッセイである。免疫アッセイは、抗原を単離する、標的とする、および/または定量するために、特定の抗体の特異的結合特性を使用することにより特徴づけられる。
【００６４】
抗体に“特異的に（もしくは選択的に）結合する”、または“〜との特異的（もしくは選択的）免疫反応性のある”という語句は、タンパク質またはペプチドをいう場合、しばしばタンパク質およびその他の生物体のヘテロな母集団において、そのタンパク質の存在が決定力のある結合反応をいう。したがってデザインされた免疫アッセイ条件下で、特定された抗体は特定のタンパク質と、バックグラウンドの少なくとも２倍結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質と、有意な量では実質的に結合しない。そのような条件下での抗体との特異的な結合は、特定のタンパク質に対するその特異性に関して選択される抗体を必要としてよい。
【００６５】
例えば、具体的な種、例えばラット、マウス、またはヒト由来のＴ２Ｒファミリーメンバーに対して作製されたポリクローナル抗体を選択して、Ｔ２Ｒポリペプチドまたはその免疫原性部分との特異的免疫反応性があり、Ｔ２Ｒポリペプチドのオルソログまたは多型バリアントおよび対立遺伝子を除く、他のタンパク質とは反応しないポリクローナル抗体のみを得ることができる。この選択は、他の分子種または他のＴ２Ｒ分子に由来するＴ２Ｒ分子と交差反応する抗体を除外することにより達成してよい。Ｔ２Ｒ  ＧＰＣＲファミリーメンバーのみを認識して、他のファミリー由来のＧＰＣＲを認識しない抗体もまた、選択することができる。多様な免疫アッセイフォーマットを使用して、特定のタンパク質との特異的免疫反応性のある抗体を選択してよい。例えば固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイをルーチン的に使用して、タンパク質との特異的な免疫反応性のある抗体を選択する（特異的免疫反応性を決定するために使用することのできる免疫アッセイフォーマットおよび条件の記載に関して、例えばHarlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988)を参照のこと）。典型的には特異的または選択的反応は、バックグラウンドのシグナルまたはノイズの少なくとも２倍、そしてより典型的にはバックグラウンドの１０から１００倍より高いものとする。
【００６６】
“〜と選択的に会合する”という語句は、上に定義したように、別の核酸と“選択的にハイブリダイズする”核酸の能力、または上に定義したように、タンパク質に“選択的に（または特異的に）結合する”抗体の能力をいう。
【００６７】
“発現ベクター”という用語は、原核細胞、酵母、真菌、植物、昆虫、または哺乳類の細胞を含むあらゆる細胞において、構成的にまたは誘導的に、in vivo またはin vitroにおいて本発明の核酸配列を発現する目的のための、あらゆるリコンビナント発現系をいう。この用語は、直鎖状または環状の発現系を含む。この用語は、エピソームとして、またはホストゲノム内に組み込まれて残存する発現系を含む。この発現系は、細胞内において自己複製能力を有することも、または有しないこと、すなわち一過性の発現としてのみ運用されることもできる。この用語は、リコンビナント核酸の転写に必要な最低限のエレメントのみを含有する、リコンビナント発現“カセット”を含む。
【００６８】
“ホスト細胞”により、発現ベクターを含有し、複製または発現ベクターの発現をサポートする細胞を意味する。ホスト細胞は、原核細胞  例えば大腸菌、もしくは真核細胞  例えば酵母、昆虫、両生類、または哺乳類の細胞  例えばＣＨＯ、ＨｅＬa，ＨＥＫ２９３、等、例えば培養細胞、外植片、およびin vivoの細胞であってよい。
【００６９】
前述に基づいて、本発明は、苦味化合物、例えばコーヒーおよび他の食品および飲料中に見出されるクロロゲン酸ラクトン、ならびに構造的に関連する化合物による、先に同定したヒト苦味味覚受容体の特異的活性化を、調節する、好ましくは遮断する化合物を同定するためのアッセイを提供する。特に本発明は、コーヒー中に見出される化合物、すなわち図１に含有されるようなクロロゲン酸ラクトンによる、特異的なヒトＴ２Ｒの活性化を調節する化合物を同定するための、細胞に基づいたアッセイを提供する。特に本発明は、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、もしくはｈＴ２Ｒ５４の活性化が、クロロゲン酸ラクトンである３ＣｏＱＡＬ、もしくは構造的に関連する化合物により影響を受ける；クロロゲン酸ラクトンである３ＣＱＡＬおよび４ＦＱＡＬもしくは構造的に関連する化合物による、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、もしくはｈＴ２Ｒ５４の活性化；またはクロロゲン酸ラクトンである４ＦＱＡＬもしくは構造的に関連する化合物による、ｈＴ２Ｒ８およびｈＴ２Ｒ５４の活性化、についての発見に関与する。記したように、これらの特異的なクロロゲン酸ラクトン、およびその他の化合物の構造を、図１に含有する。本発明に従ってのアッセイを使用して同定された化合物は、ヒト被験者におけるこれらの味覚受容体に関連する苦味の味覚を調節するものと予測される。このことは味覚検査で確認するものとする。
【００７０】
上の味覚受容体が、苦味リガンド、すなわちコーヒー中に見出されるクロロゲン酸ラクトン、例えば３ＣＱＡＬ、４ＣＱＡＬ、３ＣｏＱＡＬ、および４ＦＱＡＬに特異的に応答することは、他の公開文献、ならびに本代理人(Assignee)により提出された特許出願、例えば米国連続第１０／１９１，０５８号および０９／８２５，８８２号（双方をその全内容において本明細書にて参照として援用する）において報告された、ＨＥＫ２９３発現系およびカルシウム画像化法を使用して決定した。より特定すれば本発明者らは、カルボキシ−４４アミノ酸残基をガストジューシンのアミノ酸残基で置換することにより修飾されたＧα１６Ｇタンパク質配列を包含する、キメラＧタンパク質（Ｇ１６gust４４）と共に、特定のｈＴ２Ｒを用いてＨＥＫ２９３細胞に形質移入し、カルシウム画像化法により、特異的な苦味リガンドに対するこれらの細胞の応答を記録した。
【００７１】
図２に示したように、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、およびｈＴ２Ｒ５４は、３ＣｏＱＡＬに対して異なる濃度で、そして用量に依存した様式で応答することが発見された。反対に、これらの細胞は同じ濃度のショ糖には応答しない。それ故、これらの細胞、またはこれらの受容体を機能的に発現するその他の細胞をアッセイにおいて使用して、苦味化合物、すなわちクロロゲン酸ラクトンによるこれらの受容体の活性化を調節する化合物、例えばこれらの受容体の３ＣｏＱＡＬによる活性化を遮断する化合物を同定してよい。
【００７２】
また図３に示したように、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、またはｈＴ２Ｒ５４を発現するＨＥＫ２９３細胞が、２ｍＭ濃度で、クロロゲン酸ラクトンである３ＣＱＡＬおよび４ＣＱＡＬに特異的に応答することが観察された。反対にこれらの細胞はショ糖（コントロール）には応答しない。
【００７３】
さらに図４に示したように、これらの同じカルシウム画像化法を使用して、ｈＴ２Ｒ８、またはｈＴ２Ｒ５４を発現するＨＥＫ２９３細胞が、用量に依存した様式で、クロロゲン酸ラクトンである４ＦＱＡＬに特異的に応答することが観察された。反対にこれらの細胞はショ糖（コントロール）には応答しない。
【００７４】
これらの結果は、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、およびｈＴ２Ｒ５４味覚受容体のいずれか１つを機能的に発現する細胞を、例えばコーヒー飲料、およびその他のクロロゲン酸ラクトンを含有する苦味の味覚の食品、飲料または医薬剤に見出されるクロロゲン酸ラクトンまたは構造的に関連する化合物、により誘発される、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、およびｈＴ２Ｒ５４に関連する苦味の味覚を調節するリガンドを同定するためのアッセイにおいて使用してよい。
【００７５】
好ましくはこれらのアッセイは、以下に同定するアミノ酸配列の１つを有するｈＴ２ＲをコードするＤＮＡを発現する検査細胞を、利用するものとする。しかしながらこれらの苦味の味覚の機能的特性を保持する、すなわちいくつかの苦味化合物に応答する、これらの受容体ペプチドのフラグメント、オルソログ、バリアント、またはキメラもまた、これらのアッセイにおいて有用であると予測される。そのようなバリアントの例として、スプライスバリアント、一塩基多型、対立遺伝子のバリアント、およびリコンビナントもしくはキメラの手段により作成される変異体、または天然に発生する変異体を含む。本発明のアッセイにおいて使用するＴ２Ｒの単離および発現のための手段、およびこれらの受容体の活性化を阻害する化合物を同定するための、本発明において使用することを考慮するアッセイについて、以下に述べることにする。
【００７６】
Ｔ２Ｒの単離および発現
本発明のＴ２Ｒ、またはそのフラグメントもしくはバリアントの単離および発現は、本出願で開示したＴ２Ｒ核酸配列に基づいて構築されたプローブまたはプライマーを使用して、十分に確立されたクローニング法により達成することができる。関連するＴ２Ｒ配列はまた、本明細書に開示した配列、および公知のコンピュータに基づいた検索技術、例えばＢＬＡＳＴ配列検索を使用して、ヒトまたはその他の種のゲノムデータべースから同定してよい。特定の態様において、本明細書に開示した偽遺伝子を、機能的な対立遺伝子または関連する遺伝子を同定するために使用することができる。
【００７７】
次に発現ベクターを使用して、これらの配列の機能的発現のためホスト細胞に感染または形質移入することができる。これらの遺伝子およびベクターは、in vitro またはin vivoで作成し、発現させることができる。当業者は、核酸の発現を変更およびコントロールするための所望の表現型を、本発明のベクター内の遺伝子および核酸（例えばプロモーター、エンハンサー、等）の発現または活性を調節することにより得ることができることを認識するだろう。発現または活性を増加または減少させるために記載された公知の方法のいずれかを使用することができる。本発明は、科学および特許の文献に十分に記載されている、当該技術において公知のあらゆる方法またはプロトコルと組み合わせて実施することができる。
【００７８】
あるいはこれらの核酸は、例えばCarruthers, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-18 (1982); Adams, Am. Chem. Soc, 105:661 (1983); Belousov, Nucleic Acids Res. 25:3440-3444 (1997); Frenkel, Free Radic. Biol. Med. 19:373-380 (1995); Blommers, Biochemistry 33:7886-7896 (1994); Narang, Meth. Enzymol. 68:90 (1979); Brown, Meth. Enzymol. 68:109 (1979); Beaucage, Tetra. Lett. 22:1859 (1981); 米国特許第４，４５８，０６６号に記載されているような、周知の化学的合成技術により、in vitroで合成することができる。その後二本鎖ＤＮＡフラグメントは、相補鎖を合成し、適当な条件下でそれら鎖を合わせてアニーリングすることにより、または適当なプライマー配列を用いてＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を付加することにより、のいずれかにて得てよい。
【００７９】
核酸の操作、例えば配列中の変異の作成、サブクローニング、プローブの標識化、配列決定、ハイブリダイゼーション、等に関する技術は、科学および特許の文献に十分に記載されている。例えばSambrook, 編, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第２版), 第１−３巻, Cold Spring Harbor Laboratory (1989); Ausubel, 編, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); Tijssen, 編, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I, Theory and Nucleic Acid Preparation, Elsevier, N. Y. (1993)を参照のこと。
【００８０】
核酸、ベクター、キャプシド、ポリペプチド、等は、当業者に周知のいくつかの一般的な手段いずれかにより、分析および定量することができる。これらには、例えば分析的生化学的方法、例えばＮＭＲ、分光法、Ｘ線検査、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄相クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、および超拡散クロマトグラフィー、多様な免疫学的方法、例えば液体またはゲル内沈降反応、免疫拡散法、免疫電気泳動法、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、サザン解析、ノーザン解析、ドットブロット分析、ゲル電気泳動法（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、その他の核酸または標的またはシグナルの増幅法、放射標識、シンチレーションカウント、およびアフィニティークロマトグラフィーを含む。
【００８１】
オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、Ｔ２Ｒリガンド結合領域をコードする核酸を増幅してよい。本明細書に記載した核酸はまた、増幅技術を使用してクローニング、または定量的に測定することができる。増幅法はまた、当該技術分野において周知されており、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Innis 編、 PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, Academic Press, N.Y. (1990); Innis 編、 PCR Strategies, Academic Press, Inc., N.Y. (1995)）；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Wu, Genomics, 4:560 (1989); Landegren, Science, 241:1077 (1988); Barringer, Gene, 89:117 (1990)）；転写増幅（Kwoh, PNAS, 86:1173 (1989)））；３ＳＲ法(self-sustained sequence replication) (Guatelli, PANS, 86: 1874 (1990))；Ｑベータレプリカーゼ増幅（Smith, J. Clin. Microbiol., 35:1477-91 (1997)）；自動化Ｑベータレプリカーゼ増幅アッセイ(Burg, Mol. Cell. Probes, 10: 257-71 (1996))；およびその他のＲＮＡポリメラーゼを介した技術（例えばNASBA, Cangene, Mississauga, Ontario）を含む。Berger, Methods ErizymoL, 152:307-16 (1987); Sambrook; Ausubel; 米国特許第４，６８３，１９５号および４，６８３，２０２号; Sooknanan, Biotechnology, 13:563-64 (1995)もまた参照のこと。
【００８２】
一度増幅させれば、核酸は当該技術において公知の方法に従って個々にまたはライブラリーとして、所望であればルーチンの分子生物学の方法を使用して多様なベクターのいずれかの中にクローン化してよい；in vitroで増幅された核酸をクローニングする方法は、例えば米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。増殖された配列のクローニングを促進するため、制限酵素部位をＰＣＲプライマーペアに“はめ込む”ことができる。例えばＰｓｔＩおよびＢｓｐ  Ｅ１部位を、本発明の具体例としてのプライマーペア内にデザインした。これらの特定の制限部位は、連結された時に、それらがその中にスプライスされる７回膜貫通受容体“ドナー”のコード配列に関して“フレーム内”である配列を有する（リガンド結合領域コード配列は、７回膜貫通ポリペプチドの内部にあり、したがってコンストラクトが制限酵素スプライス部位の下流を翻訳されることが所望される場合は、フレーム外の結果は排除されなければならない；挿入されるリガンド結合領域が実質的にほとんどの膜貫通ＶＩＩ領域を包含する場合は、このことは必ずしも必要ではないと思われる）。プライマーは、“ドナー”の７回膜貫通受容体のオリジナル配列を保持するようにデザインすることができる。あるいはプライマーは、保存的置換（例えば疎水性の残基に対しては疎水性、上の考察を参照のこと）、または機能的に良性の置換（例えば原形質膜の挿入を妨げない、ペプチダーゼによる開裂の原因とならない、受容体の異常なフォールディングの原因とならない、等）であるアミノ酸残基をコードすることができる。
【００８３】
プライマーペアは、Ｔ２Ｒタンパク質のリガンド結合領域を選択的に増幅するようにデザインしてよい。これらの領域は、異なるリガンドに対して変化してよい；したがって１つのリガンドに対しては最小の結合領域であってよいものが、第二の潜在的リガンドに対しては過度に限定的であってもよい。したがって異なるドメイン構造を包含する異なるサイズの結合領域；例えば７回膜貫通型Ｔ２Ｒの膜貫通（ＴＭ）ドメインのＩＩからＶＩＩ、ＩＩＩからＶＩＩ、ＩＩＩからＶＩ、もしくはＩＩからＶＩ、またはそれらのバリエーション（例えば特定のドメインの配列のみ、ドメインの順序を混合したもの、等）、が増幅されてよい。
【００８４】
多くの７回膜貫通型Ｔ２Ｒタンパク質のドメインの構造および配列が知られているため、当業者はドメイン側方およびドメイン内の配列を、縮重増幅プライマーペアをデザインするためのモデル配列として、容易に選択することができる。例えばドメイン領域ＩＩからＶＩＩをコードする核酸配列を、プライマーペアを使用してＰＣＲ増幅により作成することができる。膜貫通ドメインＩ（ＴＭ  Ｉ）配列を包含する核酸を増幅するために、上に記載したＴ２Ｒファミリーの共通配列１のアミノ酸配列をコードする核酸から、縮重プライマーをデザインすることができる。そのような縮重プライマーを使用して、ＴＭ  ＩからＴＭ  ＩＩＩ、ＴＭ  ＩからＴＭ  ＩＶ、ＴＭ  ＩからＴＭ  Ｖ、ＴＭ  ＩからＴＭ  ＶＩ、またはＴＭ  ＩからＴＭ  ＶＩＩを組み入れている結合領域を作成することができる。他の縮重プライマーも、本明細書に提供した他のＴ２Ｒファミリーの共通配列に基づいてデザインすることができる。そのような縮重プライマーを使用して、ＴＭ  ＩＩＩからＴＭ  ＩＶ、ＴＭ  ＩＩＩからＴＭ  Ｖ、ＴＭ  ＩＩＩからＴＭ  ＶＩ、またはＴＭ  ＩＩＩからＴＭ  ＶＩＩを組み入れている結合領域を作成することができる。
【００８５】
縮重プライマーペアをデザインするためのパラダイムは、当該技術において周知されている。例えばCOnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer (CODEHOP)戦略コンピュータープログラムは、
1203917228625_0.html
としてアクセスすることができ、公知の味覚受容体リガンド結合領域として、一組の関連するタンパク質の配列を用いて開始するハイブリッドプライマーの予測に関しては、BlockMaker multiple sequence alignment（複数配列のアラインメント）サイトから直接リンクする（例えばRose, Nucleic Acids Res., 26:1628-35 (1998); Singh, Biotechniques, 24:318-19 (1998)を参照のこと）。
【００８６】
オリゴヌクレオチドプライマーペアを合成する手段は、当該技術において周知されている。“天然の”塩基対、または合成の塩基対を使用することができる。例えば人工の核酸塩基は、プライマー配列を操作し、より複雑な増幅産生物の混合物を作成するための、多目的なアプローチを提供する。人工の核酸塩基の多様なファミリーは、結合間の回転を通して複数の水素結合の配向を仮定し、縮重分子を認識するための手段を提供することができる。ＰＣＲプライマーの１つの位置にこれらの類似体を組み入れることで、増殖産生物の複雑なライブラリーの作製を可能にする。例えばHoops, Nucleic Acids Res., 25:4866-71 (1997)を参照のこと。非極性分子をまた使用して、天然のＤＮＡ塩基の形を擬態することができる。アデニンに関する非水素結合の形の擬態は、チミンに関する非極性の形の擬態に対して、効率的および選択的に複製することができる（例えばMorales, Nat. Struct. Biol., 5:950-54 (1998)を参照のこと）。例えば２つの縮重塩基は、ピリミジン塩基の６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［ｌ，２］オキサジン−７−オン、またはプリン塩基のＮ６−メトキシ−２，６−ジアミノプリン（例えばHill, PNAS, 95:4258-63 (1998)を参照のこと。）であることができる。本発明の具体例としての縮重プライマーは、核酸塩基類似体である５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシ−シチジン、３’−［（２−シアノエチル）−−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト(phosphoramidite)を組み入れている（配列中の用語“Ｐ”については上記参照のこと）。このピリミジン類似体の水素は、Ａ残基およびＧ残基を含むプリンと結合する。
【００８７】
本明細書に開示した味覚受容体と実質的に同一である、多型バリアント、対立遺伝子、および種間相同体は、上に記載した核酸プローブを使用して単離することができる。あるいは発現ライブラリーを使用して、Ｔ２Ｒポリペプチドに対して作製された抗血清抗体または精製抗体（この抗体はまたＴ２Ｒ相同体を認識し、選択的に結合する）を用いて、発現された相同体を免疫学的に検出することにより、Ｔ２Ｒポリペプチド、ならびにその多型バリアント、対立遺伝子、および種間相同体をクローン化することができる。
【００８８】
味覚受容体のリガンド結合領域をコードする核酸は、適当な（完全なまたは縮重）プライマーペアを使用して適当な核酸配列の増幅（例えばＰＣＲ）により、作成してもよい。増幅される核酸は、あらゆる細胞もしくは組織由来のゲノムＤＮＡ、または味覚受容体発現細胞由来のｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡであることができる。
【００８９】
１つの態様において、トランスロケーション配列に融合させたＴ２Ｒをコードする核酸を包含する、ハイブリッドタンパク質コード領域配列を構成してよい。また、トランスロケーションモチーフ、および化学感受性受容体、特に味覚受容体の他のファミリーの味覚誘発化合物の結合領域を包含する、ハイブリッドＴ２Ｒを提供する。これらの核酸配列は、転写または翻訳のコントロールエレメント、例えば転写および翻訳の開始配列であるプロモーターおよびエンハンサー、転写および翻訳のターミネーターであるポリアデニル化配列、ならびにＤＮＡをＲＮＡに転写するのに有用なその他の配列に、作動可能なように連結することができる。リコンビナント発現カセット、ベクター、および遺伝子導入を構成する上で、プロモーターフラグメントを利用して、すべての所望の細胞または組織中に所望の核酸の発現を指示することができる。
【００９０】
もう１つの態様において融合タンパク質は、Ｃ末端またはＮ末端のトランスロケーション配列を含んでよい。さらに融合タンパク質は、例えばタンパク質の検出、精製、またはその他の適用のための付加的なエレメントを包含することができる。検出および精製を促進するドメインは、例えば金属キレートペプチド  例えばポリヒスチジン配列(tract)、ヒスチジン−トリプトファンモジュール、もしくは固定化した金属上での精製を可能にするその他のドメイン；マルトース結合タンパク質；固定化した免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン；またはＦＬＡＧＳ伸長/アフィニティー精製システム（Immunex Corp, Seattle Wash.）で利用されるドメイン、を含む。
【００９１】
トランスロケーションドメイン（効率的な原形質膜での発現のため）および新たに翻訳されるポリペプチドの残り部分の間に、開裂可能なリンカ-配列、例えば第Ｘａ因子（例えばOttavi, Biochimie, 80:289-93 (1998)を参照のこと）、サブチリシンプロテアーゼ認識モチーフ（例えばPolyak, Protein Eng., 10:615-19 (1997)を参照のこと）；エンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego, Calif.）、等を含むことは、精製を促進するために有用であると思われる。例えば１つのコンストラクトとして、６つのヒスチジン残基に続いてのチオレドキシン、エンテロキナーゼ開裂部位（例えばWilliams, Biochemistry, 34:1787-97 (1995)を参照のこと）、そしてＣ末端のトランスロケーションドメインに連結された、ポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。ヒスチジン残基は検出および精製を促進し、一方エンテロキナーゼ開裂部位は、所望のタンパク質（１つまたは複数）を融合タンパク質の残りのものから精製するための手段を提供する。融合タンパク質をコードするベクター、および融合タンパク質の適用に関係する技術は、科学および特許の文献に十分に記載されている（例えばKroll, DNA Cell. Biol., 12:441-53 (1993)を参照のこと）。
【００９２】
リガンド結合領域をコードする配列を包含する、個々の発現ベクターとしてまたは発現ベクターのライブラリーとしてのいずれかの発現ベクターは、科学および特許の文献に十分に記載されている多様な従来技術により、ゲノム内、または細胞の細胞質もしくは核内に導入し、発現させてよい。例えばRoberts, Nature, 328:731 (1987); Berger 上記；Schneider, Protein Expr. Purif., 6435:10 (1995); Sambrook; Tijssen; Ausubelを参照のこと。生物学的試薬および実験装置での製造からの産生物の情報はまた、公知の生物学的方法に関する情報を提供する。ベクターは天然の原料から単離する、ＡＴＣＣもしくはGenBankのライブラリーのようなソースから入手する、または合成もしくはリコンビナントの方法により調製することができる。
【００９３】
核酸は、細胞内で安定発現または一過性発現される、発現カセット、ベクター、またはウイルス（例えばエピソームの発現系）において発現させることができる。選択マーカーを発現カセットおよびベクター内に組み入れて、形質転換された細胞および配列に選択可能な表現型を与えることができる。例えばマーカーは、ホストゲノム内への組み込みを必要としないように、エピソームのメインテナンスおよび複製に関してコードすることができる。例えばマーカーは、抗生物質耐性（例えばクロラムフェニコール、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン）または除草剤耐性（例えばクロロスルフロンまたはバスタ(Basta)）をコードして、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の選択を可能にしてよい（例えばBlondelet-Rouault, Gene, 190:315-17 (1997); Aubrecht, J. Pharmacol. Exp. Ther., 281:992-97 (1997)を参照のこと）。ネオマイシンまたはハイグロマイシンの様な基質に対して耐性を与える選択可能なマーカー遺伝子は、組織培養においてしか利用することができないため、化学療法剤抵抗性遺伝子をまた、in vitro およびin vivoにおける選択可能なマーカーとして使用する。
【００９４】
７回膜貫通型受容体のポリペプチドは、類似の一次配列、および二次構造および三次構造を有するため、キメラ核酸配列は、あらゆる７回膜貫通型ポリペプチド内にＴ２Ｒリガンド結合領域をコードしてよく、構造のドメイン（例えば細胞外ドメイン、ＴＭドメイン、細胞質ドメイン）は配列分析により容易に同定することができる。例えば相同性モデル化、フーリエ解析、およびへリックスの周期性の検出(helical periodicity detection)により、７回膜貫通型受容体配列に伴う７つのドメインを同定し、特徴付けることができる。高速フーリエ変換（ＦＦＴ）のアルゴリズムを使用して、分析した配列の疎水性および可変性のプロフィールを特徴付ける卓越周期を評価することができる。周期性の検出の増強、およびアルファへリックスの周期性の指標は、例えばDonnelly, . Protein ScL, 2:55-70 (1993)による様に行うことができる。その他のアラインメントおよびモデル化アルゴリズムも、当該技術において周知されている（例えばPeitsch, Receptors Channels, 4:161-64 (1996); Kyte & Doolittle, J. Md. Biol., 157:105-32 (1982); およびCronet, Protein Eng., 6:59-64 (1993)を参照のこと）
本発明はまた、具体的な核酸配列およびアミノ酸配列を有する核酸分子およびポリペプチドだけでなく、そのフラグメント、特に例えば４０、６０、８０、１００、１５０、２００、または２５０ヌクレオチドのフラグメント、ならびに例えば１０、２０、３０、５０、７０、１００または１５０アミノ酸またはそれより長いポリペプチドフラグメントもまた含む。所望により核酸フラグメントは、Ｔ２Ｒファミリーメンバーに対して作成された抗体に結合することのできる、抗原ポリペプチドをコードすることができる。さらに本発明のタンパク質フラグメントは所望により、Ｔ２Ｒファミリーメンバーに対して作成された抗体に結合することのできる、抗原フラグメントであることができる。
【００９５】
別のＧＰＣＲのすべてまたは一部を表す付加的なアミノ酸、好ましくは７回膜貫通型スーパーファミリーのメンバーと共役した、本明細書に記載したＴ２Ｒポリペプチドの少なくとも１つの１つの、少なくとも１０、２０、３０、５０、７０、１００または１５０アミノ酸またはそれより長いアミノ酸を包含する、キメラタンパク質もまた考慮する。これらのキメラは、本受容体および別のＧＰＣＲから作製することができる、または本受容体の２またはそれより多くを組み合わせることにより作製することができる。１つの態様において、キメラの一部分は、本発明のＴ２Ｒポリペプチドの膜貫通ドメインに対応、または由来する。もう１つの態様において、キメラの一部分は、本明細書に記載したＴ２Ｒポリペプチドの膜貫通領域の１つまたはそれより多くに対応または由来し、そして残りの一部分または複数部分は、別のＧＰＣＲに由来することができる。キメラ受容体は当該技術において周知されており、そしてそれらを作出する技術、およびそこに援用するためのＧタンパク質共役型受容体のドメインまたはフラグメントの選択および境界域もまた周知されている。したがって当業者のこの知識をそのまま使用して、そのようなキメラ受容体を作出することができる。そのようなキメラ受容体を使用して、例えば、別の受容体、例えば先行技術のアッセイシステムで使用された周知の受容体の特徴的なシグナル伝達と共役した、本明細書に具体的に開示した受容体の１つに特徴的な味覚の選択性を、提供することができる。
【００９６】
例えば、ある領域、例えばリガンド結合領域、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、Ｎ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、またはそれらのあらゆる組み合わせを、共有結合により異種タンパク質に連結することができる。例えばＴ２Ｒ膜貫通領域を、異種のＧＰＣＲ膜貫通ドメインに連結することができる、または異種のＧＰＣＲ細胞外ドメインを、Ｔ２Ｒ膜貫通領域に連結することができる。他の異種タンパク質の選択として、例えば緑色蛍光タンパク質、ベータガラクトシダーゼポリペプチド、グルタメート受容体、およびロドプシンポリペプチド、例えばロドプシン  例えばウシロドプシンのＮ末端フラグメント、を含むことができる。
【００９７】
本発明のＴ２Ｒ、フラグメント、またはバリアントを発現するための異なるホスト細胞使用することもまた、本発明の範囲内である。クローン化遺伝子または核酸、例えば本発明のＴ２Ｒ、フラグメント、またはバリアントをコードするｃＤＮＡ、の高レベルの発現を得るため、当業者は、転写を指示する強いプロモーター、転写/翻訳のターミネーター、そしてタンパク質をコードする核酸に関する場合には、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、を含有する発現ベクター中に、典型的には興味ある核酸配列をサブクローニングする。適切な細菌のプロモーターは、当該技術において周知されており、例えばSambrook et al.に記載されている。好ましくは真核細胞発現系を使用して、主題のｈＴ２Ｒ受容体を発現させる。
【００９８】
外来核酸配列をホスト細胞内に導入するための周知の方法のいずれかを使用してよい。これらには、リン酸カルシウムによる形質移入、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウイルスベクター、そしてクローン化ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはその他の外来遺伝子材料を、ホスト細胞内に導入するためのその他の周知の方法のいずれか、を含む（例えばSambrook et al.を参照のこと）。使用する特定の遺伝子操作法で、本発明のＴ２Ｒ、フラグメント、またはバリアントを発現することのできるホスト細胞内に少なくとも１つの遺伝子をうまく導入できることだけが、必要であるに過ぎない。
【００９９】
発現ベクターを細胞内に導入した後、形質移入された細胞を興味ある受容体、フラグメント、またはバリアントの発現に好ましい条件下で培養し、その後標準的な技術を使用して培養液から回収する。そのような技術の例は、当該技術において周知されている。例えばＷＯ  ００／０６５９３（本開示と一致する様式において、参照として援用する）を参照のこと。
【０１００】
（本発明に従ってのＴ２Ｒの活性を調節する化合物の検出のためのアッセイ）
検査化合物が本発明のＴ２Ｒポリペプチドに特異的に結合するかどうかを、in vitroおよび in vivoの双方において決定するための方法および組成物を、以下に記載する。細胞生理学の多くの側面をモニタリングし、天然に発生するＴ２ＲまたはキメラＴ２Ｒにリガンド結合する効果を評価することができる。これらのアッセイは、Ｔ２Ｒポリペプチドを発現する未処置の細胞、透過処置した細胞、または標準的な方法により生成された膜画分において実施してよい。
【０１０１】
味覚受容体は味覚誘発化合物に結合し、化学的刺激の電気的シグナルへの伝達を開始する。活性化または阻害されたＧタンパク質は、順に標的酵素、チャネル、およびその他のエフェクタータンパク質の特性を変化させる。いくつかの例として、視覚システムにおける伝達によるｃＧＭＰホスホジエステラーゼの活性化、刺激されたＧタンパク質によるアデニルシクラーゼの活性化、Ｇｑおよびその他の同族のＧタンパク質によるホスホリパーゼＣの活性化、そしてＧｉおよびその他のＧタンパク質による多様なチャネルの調節、が挙げられる。下流の結果、例えばホスホリパーゼＣによるジアシルグリセロールおよびＩＰ３の産生、そして次にはＩＰ３によるカルシウムの動員についてもまた、調べることができる。
【０１０２】
アッセイの、主題のｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、およびｈＴ２Ｒ５４タンパク質またはポリペプチドは、典型的には配列番号：３、５、および７に含有される配列を有するポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは保存的に修飾されたバリアント、より選択されるものとする。
【０１０３】
あるいは、アッセイのＴ２Ｒタンパク質またはポリペプチドは、真核ホスト細胞に由来することができ、そして配列番号：２、４、もしくは７と同一のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列、またはその保存的に修飾されたバリアント、を含むことができる。一般にアミノ酸配列の同一性は、少なくとも３０％、好ましくは３０−４０％、より具体的には５０−６０、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％とする。所望により本アッセイのＴ２Ｒタンパク質またはポリペプチドは、Ｔ２Ｒポリペプチドのある領域、例えば細胞外ドメイン、膜貫通領域、細胞質ドメイン、リガンド結合ドメイン、等を包含することができる。所望により、Ｔ２Ｒポリペプチドまたはその一部を、異種タンパク質に連結して、本明細書に記載したアッセイにおいて使用するキメラタンパク質を作出することができる。
【０１０４】
Ｔ２Ｒ活性のモジュレーターは、リコンビナントまたは天然に発生する、そのいずれかの、上に記載したようなＴ２Ｒタンパク質またはポリペプチドを使用して検査してよい。リコンビナントまたは天然に発生する、そのいずれかの、細胞内で発現させた、細胞由来の膜内で発現させた、組織内または動物内で発現させたＴ２Ｒタンパク質またはポリペプチドを、単離することができる。例えば舌切片、舌由来の解離細胞、形質転換細胞、または膜、を使用することができる。調節は、本明細書に記載したin vitroまたは in vivoのアッセイの１つを使用して検査することができる。
【０１０５】
（モジュレーターの検出）
検査化合物が本発明のＴ２Ｒ受容体に特異的に結合するかどうかを、in vitroおよび in vivoの双方において決定するための組成物および方法を、以下に記載する。細胞生理学の多くの側面をモニタリングし、本発明のＴ２Ｒポリペプチドにリガンド結合する効果を評価することができる。これらのアッセイは、化学感受性受容体を発現する未処置の細胞、透過処置した細胞、もしくは標準的な方法により生成された膜画分において、またはin vitroにおいて新たに合成されたタンパク質を用いて、実施してよい。
【０１０６】
in vivoにおいて、味覚受容体は味覚誘発化合物に結合し、化学的刺激の電気的シグナルへの伝達を開始する。活性化または阻害されたＧタンパク質は、順に標的酵素、チャネル、およびその他のエフェクタータンパク質の特性を変化させる。いくつかの例として、視覚システムにおける伝達によるｃＧＭＰホスホジエステラーゼの活性化、刺激されたＧタンパク質によるアデニルシクラーゼの活性化、Ｇｑおよびその他の同族のＧタンパク質によるホスホリパーゼＣの活性化、そしてＧｉおよびその他のＧタンパク質による多様なチャネルの調節、が挙げられる。下流の結果、例えばホスホリパーゼＣによるジアシルグリセロールおよびＩＰ３の産生、そして次にはＩＰ３によるカルシウムの動員についてもまた、調べることができる。
【０１０７】
あるいは、アッセイのＴ２Ｒタンパク質またはポリペプチドは、真核ホスト細胞に由来することができ、そして本明細書に開示したＴ２Ｒポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列、またはそのフラグメントもしくは保存的に修飾されたバリアントであることができる。一般にアミノ酸配列の同一性は、少なくとも３０％から５０％、または所望により７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％とする。所望により本アッセイのＴ２Ｒタンパク質またはポリペプチドは、Ｔ２Ｒタンパク質のあるドメイン、例えば細胞外ドメイン、膜貫通領域、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、リガンド結合ドメイン、等を包含することができる。さらに上に記載したように、Ｔ２Ｒタンパク質、またはそのドメインを、異種タンパク質に共有結合により連結して、本明細書に記載したアッセイにおいて使用するキメラタンパク質を作出することができる。
【０１０８】
Ｔ２Ｒ受容体の活性のモジュレーターは、リコンビナントまたは天然に発生する、そのいずれかの、上に記載したようなＴ２Ｒタンパク質またはポリペプチドを使用して検査する。リコンビナントまたは天然に発生する、そのいずれかの、細胞内で発現させた、細胞由来の膜内で発現させた、組織内または動物内で発現させたＴ２Ｒタンパク質またはポリペプチドを、単離することができる。例えば舌切片、舌由来の解離細胞、形質転換細胞、または膜、を使用することができる。調節は、本明細書に記載したin vitroまたは in vivoのアッセイの１つを使用して検査することができる。
【０１０９】
１．in vitro結合アッセイ
味覚の伝達はまた、本発明のＴ２Ｒポリペプチドを使用して、溶液(soluble)または固体の反応を用いてin vitroにおいて検査することができる。特定の態様において、Ｔ２Ｒリガンド結合ドメインを、溶液または固体の反応においてin vitroで使用して、リガンド結合に関してアッセイすることができる。
【０１１０】
リガンド結合ドメインは、細胞外ドメインの付加的な部分、例えば膜貫通ドメインの細胞外ループと合わせてのＮ末端ドメインにより形成してよい可能性がある。
in vitro結合アッセイは、他のＧＰＣＲ、例えば代謝型グルタミン酸受容体を用いて使用されてきた（例えばHan and Hampson, J. Biol. Chem. 274:10008-10013 (1999)を参照のこと）。これらのアッセイは、放射活性または蛍光標識のリガンドに置き換えること、内因的な蛍光の変化、またはタンパク質分解の感受性の変化、等を測定することを伴うかもしれない。
【０１１１】
本発明に従ってのＴ２Ｒポリペプチドへのリガンドの結合は、溶液、所望により固相に付着させた二層膜、脂質単層、またはベシクルにおいて検査することができる。モジュレーターの結合は、例えば分光法（例えば蛍光、吸光度、屈折率）、水力学（例えば形）、クロマトグラフィーの特徴、または溶解度の特性における変化を使用して、検査することができる。
【０１１２】
本発明の好ましい態様において、[３５Ｓ]ＧＴＰγＳ結合アッセイを使用する。上に記載したように、ＧＰＣＲの活性化で、Ｇタンパク質複合体のＧαサブユニットが刺激されて、ＧＤＰとの結合がＧＴＰに交換される。リガンドを介してのＧタンパク質の交換活性の刺激は、推定リガンドの存在下で、添加された放射能標識[３５Ｓ]ＧＴＰγＳのＧタンパク質への結合を測定する生化学的アッセイにおいて、測定することができる。典型的には、興味ある化学感受性受容体を含有する膜を、Ｇタンパク質と混合する。潜在的阻害物質および/または活性化物質、ならびに[３５Ｓ]ＧＴＰγＳをアッセイに加え、[３５Ｓ]ＧＴＰγＳのＧタンパク質への結合を測定する。結合は液体シンチレーションカウントにより、またはシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を含む当該技術において公知のあらゆるその他の手段により、測定することができる。その他のアッセイフォーマットでは、蛍光標識ＧＴＰγＳを利用することができる。
【０１１３】
２．蛍光偏光アッセイ
もう１つの態様において、蛍光偏光（“ＦＰ”）に基づいたアッセイを使用して、リガンドの結合を検出およびモニタリングしてよい。蛍光偏光は、平衡状態の結合、核酸のハイブリダイゼーション、および酵素活性を測定するための多目的な実験技術である。蛍光偏光アッセイは、分離ステップ、例えば遠心、濾過、クロマトグラフィー、沈澱、または電気泳動を必要としない点で、均質である。これらのアッセイはリアルタイムで、直接溶液中で行い、固定相を必要としない。偏光の測定は迅速でサンプルを破壊しないため、偏光値は、繰り返して、そして試薬の添加後に測定することができる。一般にこの技術を使用して、ピコモルからマイクロモルの低レベルのフルオロフォアの偏光値を測定することができる。このセクションでは、シンプルで定量的な方法で、蛍光偏光をどのように使用して、本発明のＴ２Ｒポリペプチドへのリガンドの結合を測定することができるかについて記載する。
【０１１４】
蛍光標識分子を平面偏光で励起させると、その分子の回転に可逆的に比例する一定の偏光を有する光を発光する。大きな蛍光標識分子は、励起状態の間（フルオレセインの場合４ナノ秒）相対的に定常状態を保持し、偏光は励起および発光間で相対的に一定に保持される。小さな蛍光標識分子は、励起状態の間すばやく回転するので、偏光は励起および発光間で有意に変化する。それ故、低分子は低い偏光値を有し、高分子は高い偏光値を有する。例えば１本鎖のフルオレセイン標識オリゴヌクレオチドは、相対的に低い偏光値を有するが、それが相補鎖にハイブリダイズされると、より高い偏光値を有する。ＦＰを使用して、本発明の化学感受性受容体を活性化または阻害すると思われる、味覚誘発化合物の結合を検出およびモニタリングする場合、蛍光標識した味覚誘発化合物、または自家蛍光味覚誘発化合物を使用してよい。
【０１１５】
蛍光偏光（Ｐ）は以下のように定義する：
【０１１６】
【化１】
2009501317.tif 000003
【０１１７】
式中、Ｉｎｔｐａｒは、平面励起光に対して平行な発光の強度であり、Ｉｎｔｐｒｅｐは、平面励起光に対して垂直な発光の強度である。光の強度の比率であるＰは、単位のない (dimensionless)数値である。例えばBeacon（登録商標）および Beacon 2000（登録商標）システムをこれらのアッセイに接続して使用してよい。そのようなシステムは典型的には、ミリ偏光ユニットで偏光を表す（１偏光（Ｐ）ユニット＝１０００ｍＰユニット）。
【０１１８】
分子の回転およびサイズ間の関係は、Perrinの式により記載されているが、読者は、この式について総括する、Jolley, M. E. (1991) , Journal of Analytical Toxicology, pp. 236-240（参照として援用する）を参照されたい。まとめるとPerrinの式は、偏光が回転緩和時間、すなわち分子がおよそ６８．５°の角度で回転するのに要する時間に直接比例する、ことを表す。回転緩和時間は、以下の式：２（回転緩和時間）＝３ＶＲＴ  により、粘性（ｅｔａ）、絶対温度（Ｔ）、分子体積（Ｖ）、および気体定数（Ｒ）に関連する。
【０１１９】
回転緩和時間は、低分子（例えばフルオロセイン）に関しては小さく（≒１ナノ秒）、高分子（例えば免疫グロブリン）に関しては大きい（≒１００ナノ秒）。粘性および温度が一定に保たれていれば、回転緩和時間、そしてそれ故偏光は、直接分子体積に関連する。分子体積の変化は、蛍光標識分子の、他の分子との相互作用、解離、ポリマー化、変性、ハイブリダイゼーション、または立体構造の変化によってよい。例えば蛍光偏光は、プロテアーゼ、ＤＮａｓｅ、およびＲＮａｓｅによる、高分子蛍光標識ポリマーの酵素による開裂を測定するために使用されてきた。この方法はまた、タンパク質/タンパク質相互作用、抗体/抗原の結合、およびタンパク質/ＤＮＡの結合に関する、平衡状態の結合を測定するために使用されてきた。
【０１２０】
固体および溶液のハイスループットアッセイ
なおもう１つの態様において本発明は、Ｔ２Ｒポリペプチド；またはＴ２Ｒポリペプチドを発現する細胞もしくは組織、を使用しての溶液のアッセイを提供する。もう１つの態様において本発明は、ハイスループットフォーマットの固相を基本としたin vitroアッセイを提供する。その場合Ｔ２Ｒポリペプチド、またはＴ２Ｒポリペプチドを発現する細胞または組織を、固相担体にまたは味覚刺激化合物に付着させ、Ｔ２Ｒ受容体と接触させ、適当なタグまたはＴ２Ｒ受容体に対して作製された抗体を使用して、結合を検出する。
【０１２１】
本発明のハイスループットアッセイにおいて、数千までの異なるモジュレーターまたはリガンドを１日でスクリーニングすることが可能である。特にマイクロタイタープレートの各ウェルを使用して、選択された潜在的なモジュレーターに対して個別のアッセイを進行させることができ、または濃度もしくはインキュベーション時間の効果を観察しようとする場合には、５−１０ずつのウェルで１つのモジュレーターを検査することができる。したがって１枚の標準的なマイクロタイタープレートで、約１００（例えば９６）のモジュレーターをアッセイすることができる。１５３６ウェルプレートを使用すれば、その場合には１枚のプレートで約１０００から約１５００の異なる化合物を容易にアッセイすることができる。各プレートのウェル内で、複数の化合物をアッセイすることがもまた可能である。１日当たりいくつかの異なるプレートをアッセイすることが可能である；約６，０００から２０，０００までの異なる化合物までに関してスクリーニングするアッセイが、本発明の統合されたシステムを使用すれば可能である。より最近、試薬操作への微小溶液のアプローチが開発された。
【０１２２】
興味ある分子は、固体成分に直接または間接的に、共有結合または非共有結合による連結を介して、例えばタグを介して結合することができる。タグは多様な成分のいずれであることができる。一般に、タグ（タグバインダー）を結合する分子を固体支持体に固定し、そして興味あるタグされた分子（例えば興味ある味覚伝達分子）を、タグおよびタグバインダーの相互作用により固体支持体に付着させる。
【０１２３】
文献に十分に記載されている公知の分子間相互作用に基づいて、いくつかのタグおよびタグバインダーを使用することができる。例えばタグが天然のバインダー、例えばビオチン、プロテインＡ，またはプロテインＧを有する場合、それを、適当なタグバインダー（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、免疫グロブリンのＦｃ領域、等）と組み合わせて使用することができる。天然のバインダーを有する分子、例えばビオチンに対する抗体もまた、広範囲に利用可能であり、適当なタグバインダーである（SIGMA Immunochemicals 1998 カタログSIGMA, St. Louis Mo.を参照のこと）。
【０１２４】
同様にあらゆるハプテン化合物または抗原化合物も、タグ/タグバインダーのペアを形成する適当な抗体と組み合わせて使用することができる。数千もの特異的な抗体が市販にて入手可能であり、多くのさらなる抗体が文献に記載されている。例えば１つの一般的な立体配置において、タグは第一抗体であり、タグバインダーは、第一抗体を認識する第二抗体である。抗体−抗原相互作用に加えて、受容体−リガンド相互作用もまた、タグおよびタグバインダーのペアとして適当である。例えば細胞膜受容体のアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば細胞受容体−リガンド相互作用、例えばトランスフェリン、ｃ−ｋｉｔ、ウイルス受容体リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン受容体および抗体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリー、等；例えばPigott & Power, The Adhesion Molecule Facts Book I (1993)を参照のこと）。同様に、毒素および毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えばアヘン剤、ステロイド剤、等）、分子内受容体（例えばステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドおよびビタミンＤ；ペプチドを含む様々な低分子リガンドの効果を調節する）、薬剤、レクチン、糖類、核酸（直鎖ポリマーおよび環式ポリマー双方の立体配置）、オリゴ糖、タンパク質、リン脂質、および抗体はすべて、様々な細胞の受容体と相互作用することができる。
【０１２５】
合成ポリマー、例えばポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、およびポリアセテートもまた、適当なタグまたはタグバインダーを形成することができる。本開示を再検討すれば当業者には明らかであるように、多くのその他のタグ/タグバインダーもまた、本明細書に記載したアッセイシステムにおいて有用である。
【０１２６】
一般的なリンカー、例えばペプチド、ポリエーテル、等もまたタグとして供給でき、ポリペプチド配列、例えば約５および２００アミノ酸の間のポリｇｌｙ配列を含むことができる。そのようなフレキシブルなリンカーは当業者に公知である。例えばポリ（エチレングリコール）リンカーは、Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Ala.より入手可能である。これらのリンカーは所望により、アミドの連鎖、スルフヒドリルの連鎖、またはヘテロ官能性の連鎖を有する。
【０１２７】
タグバインダーは、現在利用可能な多様な方法のいずれかを使用して、固体担体に固定させる。固体担体は一般に、タグバインダーの一部分との反応性のある担体表面に化学基を固定する化学試薬に、担体のすべてまたは一部分を暴露させることにより、誘導体化するまたは官能性を持たせる。例えばより長い鎖部分への付着に適する基は、アミン基、ヒドロキシル基、チオール基、およびカルボキシル基を含むことになろう。アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランは、多様な表面、例えばガラス表面に官能性を持たせるために使用ことができる。そのような固相バイオポリマーのアレイの作成については、文献に十分に記載されている。例えばMerrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963) (例えばペプチドの固相の合成について記載している); Geysen et al., J. Immun. Meth. 102:259-274 (1987) (ピン上での固相成分の合成について記載している); Frank & Doring, Tetrahedron 44:6031-6040 (1988) (セルロースディスク上の様々なペプチド配列の合成について記載している); Fodor et al., Science, 251:767-777 (1991); Sheldon et al., Clinical Chemistry 39(4):718-719 (1993);およびKozal et al., Nature Medicine 2(7):753-759 (1996)（すべて、固体担体に固定されたバイオポリマーのアレイについて記載している）を参照のこと。タグバインダーを担体に固定するための非化学的アプローチは、その他の一般的方法、例えば加熱、ＵＶ照射による架橋、等を含む。
【０１２８】
３．細胞に基づいたアッセイ
１つの好ましい態様においてＴ２Ｒタンパク質は、未修飾の形で、またはその変異、および分泌経路を通しての標的化を促進する異種のシャペロン配列を含む、もしくは好ましくは含まない、キメラ、バリアント、もしくは切断型の受容体としてのいずれかで、真核細胞中で発現させる。そのようなＴ２Ｒポリペプチドは、あらゆる真核細胞、例えばＨＥＫ−２９３細胞中に発現させることができる。好ましくは細胞は、キメラ受容体を細胞内シグナリング経路と共役させる、またはシグナリングタンパク質、例えばホスホリパーゼＣと共役させる能力のある機能的なＧタンパク質、例えばＧα１５、もしくはキメラＧα１６、ガストジューシンもしくはトランスジューシン、またはキメラＧタンパク質、例えばＧ１６gust４４キメラもしくはＧα１６trans４４キメラを包含する。そのような細胞におけるＴ２Ｒ受容体の活性化は、あらゆる標準的な方法を用いて、例えば細胞内カルシウムの変化を、細胞内のＦＵＲＡ−２依存性の蛍光を検出することにより、検出することができる。そのようなアッセイは、本出願に表した実験による発見の基礎である。
【０１２９】
活性化されたＧＰＣＲ受容体はしばしば、その受容体のＣ末端（そしておそらく他の部位も同様に）をリン酸化するキナーゼの基質である。したがって活性化物質は、放射標識ＡＴＰ由来の３２Ｐの、受容体への移行を促進することになり、これをシンチレーションカウンターを用いてアッセイすることができる。Ｃ末端のリン酸化は、アレスチン様タンパク質の結合を促進し、Ｇタンパク質の結合を妨げることになる。ＧＰＣＲシグナル伝達およびシグナル伝達をアッセイする方法の一般的総説については、例えばMethods in Enzymology, 237巻および 238巻 (1994) および96巻 (1983); Bourne et al., Nature, 10:349:117-27 (1991); Bourne et al., Nature, 348:125-32 (1990); Pitcher et al., Annu. Rev. Biochem., 67:653-92 (1998)を参照のこと。
【０１３０】
Ｔ２Ｒの調節は、推定Ｔ２Ｒモジュレーターで処理したＴ２Ｒポリペプチドの応答を、
未処理のコントロールサンプル、または公知の“潜在的”コントロールを含有するサンプルの応答と比較することにより、アッセイしてよい。そのような推定Ｔ２Ｒモジュレーターは、Ｔ２Ｒポリペプチド活性を阻害または活性化のいずれかとする分子を含むことができる。１つの態様において、Ｔ２Ｒを活性化する化合物で処理したコントロールサンプルを、相対的Ｔ２Ｒ活性値  １００とする。Ｔ２Ｒポリペプチドの阻害は、コントロールサンプルと比較してのＴ２Ｒ活性値が、約９０％、所望により５０％、所望により２５−０％である場合に達成される。Ｔ２Ｒポリペプチドの活性化は、コントロールと比較してのＴ２Ｒ活性値が１１０％、所望により１５０％、２００−５００％、または１０００−２０００％である場合に達成される。
【０１３１】
イオン流束の変化は、Ｔ２Ｒポリペプチドを発現する細胞または膜のイオンの分極（すなわち電位）の変化を決定することにより、評価してよい。細胞の分極の変化を決定する１つの手段は、ボルテージクランプ法およびパッチクランプ法（例えば“細胞接着”型、“インサイドアウト”型、および“全細胞”型、例えばAckerman et al., New Engl. J Med., 336:1575-1595 (1997)を参照のこと）を用いて、電流の変化を測定する（それにより分極の変化を測定する）ことによる。全細胞電流は、標準的な方法を使用して従来通り決定する。その他の公知のアッセイとして以下を含む：放射標識イオン流束アッセイ、および電位感受性色素を使用しての蛍光測定（例えばVestergarrd-Bogind et al., J. Membrane Biol., 88:67-75 (1988); Gonzales & Tsien, Chem. Biol., 4:269-277 (1997); Daniel et al., J. Pharmacol. Meth., 25:185-193 (1991); Holevinsky et al, J. Membrane Biology, 137:59-70 (1994)を参照のこと）。
【０１３２】
ポリペプチドの機能における検査化合物の効果は、上に記載したパラメータのいずれかを検討することにより測定することができる。ＧＰＣＲ活性に影響を及ぼすあらゆる適切な生理学的変化を使用して、本発明のポリペプチドにおける検査化合物の影響を評価することができる。機能的な結果を未処置の細胞または動物を使用して決定する場合、多様な効果、例えば伝達物質の放出、ホルモンの放出、公知のマーカーおよび特徴付けられていない遺伝子マーカーの双方に対する転写の変化（例えばノーザンブロット）、細胞の代謝  例えば細胞の成長の変化またはｐＨの変化、および細胞内二次メッセンジャー  例えばＣａ２＋、ＩＰ３、ｃＧＭＰ、またはｃＡＭＰの変化、についてもまた測定することができる。
【０１３３】
ＧＰＣＲに関する好ましいアッセイは、受容体の活性を報告するイオン感受性色素または電位感受性色素を負荷した細胞を含む。そのような受容体の活性を決定するためのアッセイはまた、コントロールとして他のＧタンパク質と共役する受容体に関する公知のアゴニストおよびアンタゴニストを使用して、検査する化合物の活性を評価することができる。調節化合物（例えばアゴニスト、アンタゴニスト）を同定するためのアッセイにおいて、細胞質中のイオンレベル、または膜電位の変化を、各々イオン感受性または膜電位の蛍光インジケータを使用してモニタリングすることになる。利用してよいイオン感受性インジケータおよび電位プローブに、Molecular Probes 1997カタログに開示されているものが挙げられる。Ｇタンパク質共役型受容体に関して、乱交雑のＧタンパク質、例えばＧα１５およびＧα１６を、選択すべきアッセイにおいて使用することができる（Wilkie et al., Proc. Nat'l Acad. Sci., 88:10049-10053 (1991)）。あるいは他Ｇタンパク質、例えばガストジューシン、トランスジューシン、およびキメラＧタンパク質、例えばＧα１６gust４４、またはＧα１６trans４４を使用してもよい。
【０１３４】
受容体の活性化は、その後の細胞内イベント、例えば二次メッセンジャーの増加を開始する。いくつかのＧタンパク質共役型受容体の活性化は、ホスホリパーゼＣを介したホスファチジルイノシトールの加水分解を通して、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）の形成を刺激する（Berridge & Irvine, Nature, 312:315- 21 (1984)）。ＩＰ３は次には、細胞内貯蔵カルシウムイオンの放出を刺激する。したがって細胞質カルシウムイオンレベルの変化、または二次メッセンジャー、例えばＩＰ３のレベルの変化を使用して、Ｇタンパク質共役型受容体の機能を評価することができる。そのようなＧタンパク質共役型受容体を発現する細胞は、細胞内貯蔵からのカルシウムの放出、および原形質膜イオンチャネルを経ての細胞外カルシウムの流入の双方からの寄与の結果として、増加した細胞質カルシウムレベルを示すと思われる。
【０１３５】
好ましい態様において、ホスホリパーゼＣシグナル伝達経路に受容体を連結する乱交雑Ｇタンパク質を含む異種細胞において、Ｔ２Ｒ遺伝子を発現させることにより、Ｔ２Ｒポリペプチド活性を測定する（Offermanns & Simon, J. Biol. Chem., 270:15175-15180 (1995)を参照のこと）。好ましくは細胞株はＨＥＫ−２９３（正常にはＴ２Ｒ遺伝子を発現しない）であり、乱交雑Ｇタンパク質は、Ｇα１５（Offermanns & Simon, 上記記載）またはキメラＧタンパク質  例えばＧα１６gust４４である。味覚の伝達の調節は、Ｔ２Ｒポリペプチドに関連する分子の投与を介しての、Ｔ２Ｒシグナル伝達経路の調節に応答して変化する、細胞内Ｃａ２+レベルの変化を測定することによりアッセイする。Ｃａ２+レベルの変化は、所望により蛍光Ｃａ２＋インジケータ色素および蛍光画像化を使用して測定する。
【０１３６】
もう１つの態様において、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の加水分解を、米国特許第５，４３６，１２８号（本明細書において参照として援用する）に従って分析することができる。手短にはこのアッセイは、３Ｈ−ミオイノシトールで４８時間またはそれより多くの時間細胞を標識することを伴う。標識した細胞を検査化合物で１時間処理する。処理した細胞を溶菌し、クロロホルム−メタノール−水で抽出し、その後イノシトールリン酸をイオン交換クロマトグラフィーにより分離し、シンチレーションカウントにより定量する。刺激の倍数は、バッファーコントロールの存在下でのｃｐｍに対する、アゴニストの存在下でのｃｐｍの比率を算出することにより決定する。同様に阻害の倍数は、バッファーコントロール（アゴニストを含有していてもしていなくてもよい）の存在下でのｃｐｍに対する、アンタゴニストの存在下でのｃｐｍの比率を算出することにより決定する。
【０１３７】
その他の受容体のアッセイとして、細胞内サイクリックヌクレオチド、例えばｃＡＭＰまたはｃＧＭＰのレベルを決定することを伴うことができる。受容体の活性化がサイクリックヌクレオチドのレベルの減少をもたらす場合、アッセイにおいて受容体を活性化する化合物を細胞に添加する前に、細胞内サイクリックヌクレオチドレベルを増加させる物質、例えばフォルスコリンに、細胞を暴露させることが望ましいと思われる。１つの態様において、細胞内のｃＡＭＰまたはｃＧＭＰの変化は、免疫アッセイを使用して測定することができる。Offermanns & Simon, J. Bio. Chem., 270:15175-15180 (1995)に記載されている方法を使用して、ｃＡＭＰレベルを決定してよい。またFelley-Bosco et al., Am. J. Resp. Cell and MoI. Biol., 11:159- 164 (1994)に記載されている方法を使用して、ｃＧＭＰレベルを決定してもよい。さらにｃＡＭＰおよび/またはｃＧＦＭＰを測定するためのアッセイキットは、米国特許第４，１１５，５３号に記載されており、本明細書において参照として援用する。
【０１３８】
もう１つの態様において、転写レベルを測定して、シグナル伝達における検査化合物の効果を評価することができる。興味あるＴ２Ｒポリペプチドを含有するホスト細胞を、あらゆる相互作用を達成するための十分な時間、検査化合物と接触させ、その後遺伝子発現レベルを測定する。そのような相互作用を達成するための時間の長さは、経験的に、例えばタイムコースを取り、時間の関数として転写レベルを測定することにより、決定してよい。転写の量は、当業者に公知の適切なあらゆる方法を使用することにより測定してよい。例えば興味あるタンパク質のｍＲＮＡ発現は、ノーザンブロットを使用して検出してよい、またはそれらのポリペプチド産生物は、免疫アッセイを使用して同定してよい。あるいは受容体遺伝子を使用しての転写に基づいたアッセイは、米国特許第５，４３６，１２８号（本明細書において参照として援用する）に記載されているように使用してよい。受容体遺伝子は、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、およびアルカリホスファターゼであることができる。さらに興味あるタンパク質を、二次レポーター、例えば緑色蛍光タンパク質への結合を介しての間接的レポーターとして使用することができる（例えばMistili & Spector, Nature Biotechnology, 15:961-964 (1997)を参照のこと）。
【０１３９】
次に転写量を、検査化合物不在下の同じ細胞における転写の量と比較する、または興味あるＴ２Ｒポリペプチド（１つまたは複数）を欠く実質的に同一の細胞における転写の量と比較してもよい、そのいずれかとする。実質的に同一の細胞は、リコンビナント細胞がそれから調製された、しかし異種ＤＮＡの導入により修飾されていない、同じ細胞に由来してよい。転写量のいかなる相違も、検査化合物が、興味あるＴ２Ｒポリペプチドの活性を何らかの様式で変化させたことを示す。
【０１４０】
４．化学感受性受容体を発現するヒト以外のトランスジェニック動物
本発明の１つまたはそれより多くの味覚受容体配列を発現するヒト以外の動物はまた、受容体アッセイのために使用することができる。そのような発現を使用して、化学感受性受容体またはそのリガンド結合領域をコードする核酸で、安定的または一過性に形質移入したヒト以外の動物を、検査化合物と接触させ、受容体ポリペプチド複合体への特異的な結合により動物が検査化合物に反応するかどうかを決定することにより、検査化合物が、in vivoで哺乳類の味覚膜貫通受容体に特異的に結合するかどうかを決定することができる。
【０１４１】
本発明のベクターで形質転換または感染させた動物は、特定のまたは一組の受容体に結合することのできる味覚刺激を同定し、特徴付けるためのアッセイに、特に有用である。ヒト味覚受容体配列を発現するそのようなベクターで感染させた動物は、味覚刺激、および例えば細胞生理学（例えば味覚ニューロン）、ＣＮＳ、または振舞いにおけるそれらの効果を、in vivoでスクリーニングするために使用することができる。
【０１４２】
核酸およびベクターを、個々にまたはライブラリーとしてのいずれかで、感染/発現させるための手段は、当該技術において周知されている。多様な個々の細胞、臓器、または動物全身のパラメータは、多様な手段により測定することができる。本発明のＴ２Ｒ配列は例えば、感染物質、例えばアデノウイルス発現ベクターを用いての送達により、動物味覚組織内に発現させることができる。
【０１４３】
内在する味覚受容体が機能性を維持している可能性があり、野生型（ネイティブ）の活性がまだ存在している可能性がある。他の状態において、すべての味覚受容体の活性が、導入された外来性ハイブリッド受容体によるものであることが望ましい場合には、ノックアウト株の使用が好ましい。ヒト以外のトランスジェニック動物、特にトランスジェニックマウスの作成に関する方法、ならびに形質転換された細胞を産生するためのリコンビナントコンストラクトの選択および調製は、当該技術において周知されている。
【０１４４】
“ノックアウト”細胞および動物の作成は、哺乳類細胞内の特定の遺伝子の発現レベルを、抑制すべき遺伝子のＤＮＡ配列のある部分を中断するのに役立つ新しいＤＮＡ配列をゲノム内に導入することにより、低減または完全に抑止することができる、という前提に基づく。また“遺伝子トラップの挿入”を使用してホスト遺伝子を破壊することができ、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞を使用して、ノックアウトトランスジェニック動物を産生することができる（例えばHolzschu, Transgenic Res 6:97-106 (1997)を参照のこと）。外来配列の挿入は典型的には、相補的核酸配列間の相同組換えによる。外来配列は、修飾すべき標的遺伝子のある部分、例えばエクソン、イントロン、もしくは転写の調節配列、または標的遺伝子の発現レベルに影響を与えることのできるあらゆるゲノム配列；またはその組み合わせである。多能性胚性幹細胞における相同組換えを介しての遺伝子の標的化は、興味あるゲノム配列を正確に修飾することを可能にする。あらゆる技術を使用して、ノックアウト動物を作出し、スクリーニングし、繁殖させることができる、例えばBijvoet, Hum. MoI. Genet. 7:53-62 (1998); Meredith, J. MoI. Med. 75:208-216 (1997); Tojo, Cytotechnology 19:161-165 (1995); Mudgett, Methods MoI. Biol. 48:167-184 (1995); Longo, Transgenic Res. 6:321-328 (1997); 米国特許第５，６１６，４９１号；５，４６４，７６４号；５，６３１，１５３号；５，４８７，９９２号；５，６２７，０５９号；５，２７２，０７１号；ＷＯ  ９１／０９９５５；ＷＯ  ９３／０９２２２；ＷＯ  ９６／２９４１１；ＷＯ  ９５／３１５６０；ＷＯ  ９１／１２６５０を参照のこと。
【０１４５】
本発明の核酸はまた、“ノックアウト”ヒト細胞およびそれらの子孫を作成するための、試薬として使用することができる。同様に本発明の核酸配列はまた、マウスにおける“ノックイン”を作成するための試薬として使用することができる。ヒトまたはラットのＴ２Ｒ遺伝子配列を、マウスゲノム中のオルソログＴ２Ｒと置き換えることができる。この方法で、ヒトまたはラットのＴ２Ｒを発現するマウスを作成する。次にこのマウスを使用して、ヒトまたはラットのＴ２Ｒの機能を分析し、そのようなＴ２Ｒに関するリガンドを同定することができる。
【０１４６】
モジュレーター
Ｔ２Ｒファミリーメンバーのモジュレーターとして検査する化合物は、あらゆる低分子化学化合物、または生物学的実体、例えばタンパク質、糖、核酸または脂質であることができる。あるいはモジュレーターは、Ｔ２Ｒファミリーメンバーの遺伝子改変バージョンであることができる。典型的には検査化合物は、低分子化学分子およびペプチドであってよい。本質的にはあらゆる化学化合物を、潜在的モジュレーターまたはリガンドとして本発明のアッセイにおいて使用することができるが、しかしながら最も頻繁には、水溶液または有機溶液（特にＤＭＳＯベース）中に溶解することのできる化合物を使用する。アッセイは、アッセイのステップを自動化し、あらゆる簡便な原料に由来する化合物をアッセイに提供することにより、大きな化学的ライブラリーをスクリーニングするようにデザインし、それらを（例えば自動アッセイ装置のマイクロタイタープレート上でのマイクロタイターフォーマットにおいて）典型的には並行して進行させる。Sigma (St. Louis, Mo.), Aldrich (St. Louis, Mo.), Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo.), Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs Switzerland)等を含む、化学的化合物の多くの供給元があることは、理解されているものとする。
【０１４７】
１つの態様において、ハイスループットスクリーニング法は、多数の潜在的な治療用化合物（潜在的なモジュレーターまたはリガンドの化合物）を含有する、コンビナトリアル化学またはペプチドのライブラリーを提供することを伴う。次にそのような“コンビナトリアル化学ライブラリー”または“リガンドライブラリー”について、所望の特徴的活性を示すライブラリーのメンバー（特に化学種またはサブクラス）を同定するため、本明細書に記載したような、１つまたはそれより多くのアッセイでスクリーニングする。そのように同定された化合物を、従来の“リード化合物”として供給することができ、それら自体を潜在的なあるまたは実際の消費者用の製品として使用することができる。
【０１４８】
コンビナトリアル化学ライブラリーは、化学的合成または生物学的合成のいずれかにより、いくつかの化学的“構成要素”、例えば試薬を組み合わせることにより生成された、多様な化学化合物のコレクションである。例えば直鎖状のコンビナトリアル化学ライブラリー、例えばポリペプチドライブラリーは、所定の化合物の長さ（すなわちポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）となるように、一組の化学的構成要素（アミノ酸）を可能な各方法で組み合わせることにより形成される。何百万もの化学化合物を、化学的構成要素のそのようなコンビナトリアル的な混合を通して合成することができる。
【０１４９】
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者に周知されている。そのようなコンビナトリアル化学ライブラリーは、ペプチドライブラリー（例えば米国特許第５，０１０，１７５号、 Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991) およびHoughton et al., Nature 354:84-88 (1991)を参照のこと）を含むがこれに限定されない。化学的な多様なライブラリーを作成するため、それ以外の化学物質もまた使用することができる。そのよう化学物質として以下を含むがこれに限定されない：ペプトイド（例えばＷＯ  ９１／１９７３５）、コードされたペプチド（例えばＷＯ  ９３／２０２４２）、ランダムなバイオ−オリゴマー（ＷＯ  ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（例えば米国特許第５，２８８，５１４号）、ダイバーソマー  例えばヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド（Hobbs et al., PNAS., 90:6909-6913 (1993)）、ビニロガスポリペプチド(Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992))、グルコースの足場を用いた非ペプチド性ペプチド模倣分子(Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992))、類似体有機合成による低分子化合物ライブラリー(Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994))、オリゴカルバメート (Cho et al.. Science 261:1303 (1993))、ペプチジルホスホネート(Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658 (1994))、核酸ライブラリー (Ausubel, BergerおよびSambrook、すべて上記記載)、ペプチド核酸ライブラリー (米国特許第５，５３９，０８３号)、抗体ライブラリー(Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996) およびPCT/US96/10287)、炭水化物ライブラリー(例えば、Liang et al., Science, 274:1520-1522 (1996) および米国特許第５，５９３，８５３号)、有機低分子ライブラリー(例えば、ベンゾジアゼピン、Baum C&EN, January 18, ページ33 (1993); チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第５，５４９，９７４号;ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号; ベンゾジアゼピン、第５，２８８，５１４号、等を参照のこと)。
【０１５０】
コンビナトリアルライブラリーの調製のためのデバイスは、市販にて入手可能である（例えば357 MPS, 390 MPS, (Advanced Chem Tech, Louisville Ky.), Symphony, (Rainin, Woburn, Mass.), 433A (Applied Biosystems, Foster City, Calif.), 9050 Plus, (Millipore, Bedford, Mass.)を参照のこと）。加えて、多数のコンビナトリアルライブラリーそのものが市販にて入手可能である（例えばComGenex, Princeton, N.J., Tripos, Inc., St. Louis, Mo.; 3D Pharmaceuticals, Exton, PA.; Martek Biosciences; Columbia, Md.; 等を参照のこと）。
【０１５１】
本発明の１つの側面においてＴ２Ｒモジュレーターは、それにより所望の様式で製品、組成物、または成分の味覚を調節するために、あらゆる食品製品、菓子、医薬剤組成物、またはその成分中に使用することができる。例えば苦味の味覚の感覚を高めるＴ２Ｒモジュレーターを添加して、製品または組成物に苦味の味覚を提供することができ、一方、苦味の味覚の感覚を遮断するＴ２Ｒモジュレーターを添加して、製品または組成物の苦味の味覚を遮断することができる。また本発明は、食品、飲料および医薬剤において見出される苦味化合物を同定し、その化合物を含まないまたは低減した量を有する、味覚の改善された食品、飲料および医薬剤を生産する手段を提供する。
【０１５２】
本発明により同定された化合物の使用
本発明に従って同定された化合物は、苦味化合物、例えばコーヒーまたは他の食品および飲料中に見出されるクロロゲン酸ラクトン、および構造的に関連する化合物、例えばクロロゲン酸の他の苦味化合物、によるｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、およびｈＴ２Ｒ５４の活性化により引き起こされる苦味の味覚を調節する、好ましくは遮断するために、食品、飲料または医薬剤組成物に添加してよい。例えば、クロロゲン酸ラクトンまたは関連する化合物によるｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、またはｈＴ２Ｒ５４の活性化を遮断する化合物は、クロロゲン酸ラクトンまたは関連する化合物に関連する苦味の味覚を遮断するために、コーヒー飲料およびコーヒー風味の食品中に添加物として使用してよい。例えばこれらの化合物は、苦味の味覚を阻害するのに有効な量で、コーヒー風味の食品および飲料に添加してよい。
【０１５３】
先に記したように、好ましくは、主題のＴ２Ｒの細胞に基づいたアッセイにおいて同定された化合物の味覚調製特性は、味覚検査、例えばヒト味覚検査において確認されるものとする。
【０１５４】
キット
Ｔ２Ｒ遺伝子およびそれらの相同体は、味覚受容体細胞を同定するため、法医学的および父性の決定のため、ならびに味覚の伝達を検討するための、有用なツールである。Ｔ２Ｒ核酸、例えばＴ２Ｒプローブおよびプライマー、に特異的にハイブリダイズするＴ２Ｒファミリーメンバーに特異的な試薬、およびＴ２Ｒタンパク質、例えばＴ２Ｒ抗体に特異的に結合するＴ２Ｒ特異的試薬を使用して、味細胞の発現および味覚伝達の制御について検討する。
【０１５５】
サンプル中のＴ２Ｒファミリーメンバーに関するＤＮＡおよびＲＮＡの存在についての核酸アッセイは、当業者に公知の多数の技術、例えばサザン解析、ノーザン解析、ドットブロット、ＲＮａｓｅ保護、Ｓ１分析、増幅技術  例えばＰＣＲ、およびin situハイブリダイゼーション、を含む。in situハイブリダイゼーションにおいて、例えば標的核酸は、その後の解釈および分析のための細胞の形態を保持したまま、細胞内でのハイブリダイゼーションに利用可能となるように、その細胞の周囲から解放する。以下の文献は、in situハイブリダイゼーションの技術の概要を提供する：Singer et al., Biotechniques, 4:230250 (1986); Haase et al., Methods in Virology, VII巻, 189-226 (1984); およびNames et al., 編, Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (1987)。加えてＴ２Ｒタンパク質は、上に記載した様々な免疫アッセイ技術を用いて検出することができる。検査サンプルは典型的には、ポジティブコントロール（例えばリコンビナントＴ２Ｒタンパク質を発現するサンプル）、およびネガティブコントロールの双方と比較する。
【０１５６】
本発明はまた、Ｔ２Ｒファミリーメンバーのモジュレーターに関するスクリーニングのためのキットについても提供する。そのようなキットは、容易に入手できる材料および試薬から調製することができる。例えばそのようなキットは、以下の材料：Ｔ２Ｒ核酸またはタンパク質、反応試験管、およびＴ２Ｒ活性を検査するための添付文書、のいずれか１つまたはそれより多くを包含することができる。所望によりキットは機能的Ｔ２Ｒポリペプチドを含有する。広く多様なキットおよび構成成分を、本発明に従って、キットのユーザーの意図、およびユーザーの特定の必要性に依存して、調製することができる。
【０１５７】
ここまで本発明について一般的に記載してきたが、前記内容は以下の実施例を参照としてより容易に理解されることと思うが、これら実施例は説明として提供しており、限定するものとして意図してはいない。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な修飾および変更を、本明細書に開示した実施例の態様に加えることができることは、理解されよう。
【０１５８】
実施例
実施例１
この実施例において、苦味のクロロゲン酸ラクトン化合物である３ＣｏＱＡＬが、本出願に含有されるＤＮＡ配列を有するヒト苦味受容体であるｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、およびｈＴ２Ｒ５４を、特異的に活性化することを示す。
【０１５９】
３ＣｏＱＡＬによるこれらの受容体の活性化を、細胞内カルシウム濃度の変化を検出する、細胞に基づいたアッセイにおいて測定する。手短にはヒト胚性腎細胞を４８ウェル組織培養プレートに播種する。２４時間後細胞に、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、またはｈＴ２Ｒ５４の核酸配列のいずれかを含有するプラスミド、およびキメラＧタンパク質（Ｇ１６gust４４）を含有するプラスミドを用いて、一過性形質移入を行う。さらに２４時間後細胞を、細胞内カルシウム濃度の変化を検出するための、速く、簡単な、そして信頼できる蛍光に基づいた方法を提供する、カルシウム特異的な蛍光色素（Ｆｌｕｏ−４またはＦｕｒａ−２；Molecular Probes）と共にインキュベーションする。Ｔ２Ｒの活性化がシグナリングカスケードを誘発し、ＰＬＣの活性化および、その後の細胞内カルシウム濃度の増加をもたらす。このカルシウム濃度の増加が、細胞内のカルシウム色素の蛍光特性を変化させる。これらの変化を、蛍光顕微鏡および特別にデザインされたソフトウェア（Imaging Workbench, Axon）を使用して、モニタリングする。このアプローチを使用して、クロロゲン酸ラクトンである３ＣＱＡＬおよび４ＣＱＡＬの双方が、これらＴ２Ｒを発現する細胞を特異的に活性化する（細胞内カルシウム濃度を増加させる）ことを観察した（図３を参照のこと）。（図２に列記した検査投与量を参照のこと）。
【０１６０】
実施例２
この実施例において、２つの苦味のクロロゲン酸ラクトン化合物である３ＣＱＡＬおよび４ＣＱＡＬが、本出願において各々配列番号：２、４および６に含有されるＤＮＡ配列を有するヒト苦味受容体である、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、およびｈＴ２Ｒ５４を、特異的に活性化することを示す。
【０１６１】
３ＣＱＡＬおよび４ＣＱＡＬによるこの受容体の活性化を、細胞内カルシウム濃度の変化を検出する、細胞に基づいたアッセイにおいて測定する。手短にはヒト胚性腎細胞を４８ウェル組織培養プレートに播種する。２４時間後細胞に、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、またはｈＴ２Ｒ５４の核酸配列のいずれかを含有するプラスミド、およびキメラＧタンパク質（Ｇ１６gust４４）を含有するプラスミドを用いて、一過性形質移入を行う。さらに２４時間後細胞を、細胞内カルシウム濃度の変化を検出するための、速く、簡単な、そして信頼できる蛍光に基づいた方法を提供する、カルシウム特異的な蛍光色素（Ｆｌｕｏ−４またはＦｕｒａ−２；Molecular Probes）と共にインキュベーションする。Ｔ２Ｒの活性化がシグナリングカスケードを誘発し、ＰＬＣの活性化および、その後の細胞内カルシウム濃度の増加をもたらす。このカルシウム濃度の増加が、細胞内のカルシウム色素の蛍光特性を変化させる。これらの変化を、蛍光顕微鏡および特別にデザインされたソフトウェア（Imaging Workbench, Axon）を使用して、モニタリングする。このアプローチを使用して、クロロゲン酸ラクトンである３ＣＱＡＬおよび４ＣＱＡＬの双方が、これらＴ２Ｒを発現する細胞を特異的に活性化する（細胞内カルシウム濃度を増加させる）ことを観察した（図３を参照のこと）。
【０１６２】
実施例３
この実施例において、苦味のクロロゲン酸ラクトン化合物である４ＦＱＡＬが、本出願において各々配列番号：２、４および６に含有されるＤＮＡ配列を有するヒト苦味受容体である、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、およびｈＴ２Ｒ５４を、特異的に活性化することを示す。
【０１６３】
４ＦＱＡＬによるこの受容体の活性化を、細胞内カルシウム濃度の変化を検出する、細胞に基づいたアッセイにおいて測定する。手短にはヒト胚性腎細胞を４８ウェル組織培養プレートに播種する。２４時間後細胞に、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、またはｈＴ２Ｒ５４の核酸配列のいずれかを含有するプラスミド、およびキメラＧタンパク質（Ｇ１６gust４４）を含有するプラスミドを用いて、一過性形質移入を行う。さらに２４時間後細胞を、細胞内カルシウム濃度の変化を検出するための、速く、簡単な、そして信頼できる蛍光に基づいた方法を提供する、カルシウム特異的な蛍光色素（Ｆｌｕｏ−４またはＦｕｒａ−２；Molecular Probes）と共にインキュベーションする。Ｔ２Ｒの活性化がシグナリングカスケードを誘発し、ＰＬＣの活性化および、その後の細胞内カルシウム濃度の増加をもたらす。このカルシウム濃度の増加が、細胞内のカルシウム色素の蛍光特性を変化させる。これらの変化を、蛍光顕微鏡および特別にデザインされたソフトウェア（Imaging Workbench, Axon）を使用して、モニタリングする。このアプローチを使用して、クロロゲン酸ラクトンである４ＦＱＡＬが、これらＴ２Ｒを発現する細胞を特異的に活性化する（細胞内カルシウム濃度を増加させる）ことを観察した（図４を参照のこと）。
【０１６４】
本明細書に例示するｈＴ２Ｒ遺伝子およびポリペプチドの配列
【０１６５】
【表１−１】
2009501317.tif 000004
【０１６６】
【表１−２】
2009501317.tif 000005
【０１６７】
前述の詳細な記載により本発明のいくつかの態様を記載してきたが、上の記載は説明であるに過ぎず、開示した発明を限定するものではないことと理解されるものとする。本発明は、以下に示す請求項によってのみ限定されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】図１は、様々なクロロゲン酸ラクトンの構造を示す。
【図２】図２は、前記クロロゲン酸ラクトンの１つ（３ＣｏＱＡＬ）に対する、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、およびｈＴ２Ｒ５４の用量応答曲線を示す。
【図３】図３は、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ１４、およびｈＴ２Ｒ５４が、図１に示した２つのクロロゲン酸ラクトンである３ＣＱＡＬおよび４ＣＱＡＬに、特異的に応答したことを示す、カルシウム画像化実験の結果を示す。
【図４】図４は、ｈＴ２Ｒ８およびｈＴ２Ｒ５４が、図１に示したもう１つのクロロゲン酸ラクトンである４ＦＱＡＬに、用量に依存した様式で応答したことを明らかにした、カルシウム画像化実験の結果を示す。
【図１】
2009501317.tif 000007
【図２】
2009501317.tif 000008
【図３】
2009501317.tif 000009
【図４】
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