(57)【要約】  可溶性分子が提供される。例えば、ＣＣＲ５リガンドと結合することができるＣＣＲ５アミノ酸配列にコンジュゲート化された異種アミノ酸配列を含む可溶性分子であって、ＣＣＲ５のＮ末端ドメインを有さない分子が提供される。また、上述の分子を含む医薬組成物、およびかかる分子の使用方法も提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＣＲ５リガンドと結合することができるＣＣＲ５アミノ酸配列にコンジュゲート化された異種アミノ酸配列を含む可溶性分子であって、ＣＣＲ５のＮ末端ドメインを有さない分子。
【請求項２】
非タンパク質性成分に結合したＣＣＲ５アミノ酸配列を含む可溶性分子であって、前記ＣＣＲ５アミノ酸配列がＣＣＲ５リガンドと結合することができ、前記分子が対象において非免疫原性である分子。
【請求項３】
それぞれがＣＣＲ５リガンドと結合することができる少なくとも２つの非隣接ＣＣＲ５アミノ酸配列を含む可溶性分子。
【請求項４】
ＣＣＲ５のＮ末端ドメインを有さないＣＣＲ５アミノ酸配列に結合したタグを含む分子であって、前記ＣＣＲ５アミノ酸配列がＣＣＲ５リガンドと結合することができる分子。
【請求項５】
配列番号２または配列番号４に示される分子。
【請求項６】
請求項１、４または５に記載の分子をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
活性成分として請求項１、２または３に記載の分子と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物。
【請求項８】
請求項１、２、３および／または５に記載の分子の治癒効果的な量を対象に投与し、それにより、対象におけるＣＣＲ５および／またはＣＣＲ５リガンド関連疾患を治療することを含む、ＣＣＲ５および／またはＣＣＲ５リガンド関連疾患の治療の必要性のある対象におけるＣＣＲ５および／またはＣＣＲ５リガンド関連疾患を治療する方法。
【請求項９】
ＣＣＲ５および／またはＣＣＲ５リガンド関連疾患を治療するために特定される医薬品を製造するための請求項１、２、３および／または５に記載の分子の使用。
【請求項１０】
（ａ）ＣＣＲ５リガンドおよび請求項４に記載の分子が複合体を形成するように、生物学的サンプルを請求項４に記載の分子と接触させること；および
（ｂ）前記複合体を単離し、それにより、ＣＣＲ５リガンドを生物学的サンプルから単離すること
を含む、ＣＣＲ５リガンドを生物学的サンプルから単離する方法。
【請求項１１】
前記ＣＣＲ５リガンドは、ＣＣＬ２，ＣＣＬ３，ＣＣＬ４，ＣＣＬ５，ＣＣＬ１１およびＣＣＬ１６からなる群から選択される、請求項１、２、３、４、７、８、９または１０に記載の分子、医薬組成物、方法、または使用。
【請求項１２】
分子が非免疫原性である、請求項１、２、３、４、５、７、８または９に記載の分子、医薬組成物、方法、または使用。
【請求項１３】
前記ＣＣＲ５リガンドに対する前記ＣＣＲ５の結合親和性がＫＤ＝１０−６Ｍより上である、請求項１、２、３、４、７、８、９または１０に記載の分子、医薬組成物、方法、または使用。
【請求項１４】
前記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンアミノ酸配列を含む、請求項１、７、８または９に記載の分子、医薬組成物、方法、または使用。
【請求項１５】
前記ＣＣＲ５アミノ酸配列は配列番号１０または１８に示される、請求項１、４、７、８、９または１０に記載の分子、医薬組成物、方法、または使用。
【請求項１６】
前記疾患は、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、およびＩ型糖尿病からなる群から選択される、請求項８または９に記載の方法または使用。
【請求項１７】
前記タグはエピトープタグである、請求項４または１０に記載の分子または方法。
【請求項１８】
請求項４の分子は固体担体に結合される、請求項４または１０に記載の分子または方法。
【請求項１９】
非タンパク質性成分に結合される、請求項１、３または５に記載の分子。
【請求項２０】
前記非タンパク質性成分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ（スチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物）（ＳＭＡ）、および、ジビニルエーテルとマレイン酸無水物とのコポリマー（ＤＩＶＥＭＡ）からなる群から選択される、請求項２、７、８、９または１９に記載の分子、医薬組成物、方法、または使用。
【請求項２１】
前記医薬的に許容され得るキャリアは非経口投与のために配合される、請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記医薬的に許容され得るキャリアは実質的に非免疫原性である、請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記医薬的に許容され得るキャリアはリポアミン酸を含む、請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記医薬的に許容され得るキャリアは炭水化物を含む、請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記医薬的に許容され得るキャリアはミクロスフェアを含む、請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記医薬的に許容され得るキャリアはリポソームを含む、請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記医薬的に許容され得るキャリアはポリマーのミクロスフェアを含む請求項７または８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な分子に関し、より具体的には、ＣＣＲ５／ＣＣＲ５リガンド関連疾患（例えば、自己免疫性炎症性疾患）を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは、細胞の交通を制御する、小さい（〜８−１４ｋＤａ）構造的にサイトカイン様の分泌タンパク質である。ケモカインは初期の炎症性メディエータ（例えば、ＩＬ−１βまたはＴＮＦ−αなど）に対する応答において、および細菌やウイルスの感染に対する応答において様々な細胞型によって産生および分泌される。ケモカインは、白血球に対する化学的誘引剤として主に機能し、単核球、好中球および他のエフェクター細胞を血液から感染または傷害の部位に動員する。これらは多くの異なる細胞型（例えばマクロファージ）によって放出されることができ、白血球に対する一連の前炎症性作用、例えば、走化性の開始、脱顆粒、脂質メディエータの合成、および、インテグリン活性化などを媒介することができる。
【０００３】
ケモカインは、それらのタンパク質配列中の最初の２つのシトシンの位置に応じてＣ−Ｃ，Ｃ−Ｘ−Ｃ，ＣおよびＣ−Ｘ３−Ｃケモカインという４つのクラスに分類されることができる。これらの可溶性タンパク質とそれらの特異的な受容体（これは、７回膜貫通ドメインＧ−タンパク質結合型受容体（ＧＰＣＲ）のスーパーファミリーに属する）との相互作用は、それらの生物学的作用を媒介し、特に、細胞内カルシウム濃度の迅速な増大、細胞形状の変化、細胞接着分子の発現の増大、脱顆粒、および、細胞遊走の促進を生じさせる。
【０００４】
ここ数年で、炎症性および自己免疫障害または疾患における重要なメディエータとしてのケモカインの重要な役割が明らかになってきている。ケモカインは、多発性硬化症（ＭＳ）、アレルギー性応答、喘息、アテローム性動脈硬化、糸球体腎炎、膵炎、再狭窄、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、糖尿病性腎症、肺線維症、移植片拒絶反応、および癌における重要なメディエータとして関係づけられている。
【０００５】
とりわけ、障害および疾患で述べられている最も顕著なケモカインはＣ−Ｃケモカインである：ＭＩＰ−１α（マクロファージ炎症性タンパク質１α，ＣＣＬ３）およびＲＡＮＴＥＳ（活性化により制御され、正常なＴ細胞によって発現されて分泌されるＣＣＬ５）。ＭＩＰ−１αはマクロファージによって産生され、ヒト顆粒球（好中球、好酸球および好塩基球）の活性化因子である。ＭＩＰ−１αは、インターロイキン１（ＩＬ−１），ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの如き前炎症性サイトカインの繊維芽細胞およびマクロファージからの合成および放出を誘導する。ＲＡＮＴＥＳは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によって分泌され、Ｔ細胞、好酸球および好塩基球に対する化学走性因子である。ＲＡＮＴＥＳは、白血球を炎症部位に動員することにおいて、および特定のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖および活性化を誘導することにおいて活発な役割を果たす。
【０００６】
Ｃ−Ｃケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）は、末梢血由来の樹状細胞、ＣＤ３４＋造血先祖細胞および特定の活性化／記憶Ｔｈ１リンパ球を含むいくつかの細胞型において発現される。ＣＣＲ５は、いくつかのＣ−Ｃケモカインリガンドを有し、それらはＣＣＬ２（ＭＣＰ−１），ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α），ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１β），ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ），ＣＣＬ１１（エオタキシン）およびＣＣＬ１６［Ｂｌａｎｐａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．（１９９９）９４：１８９９−９０５；Ｎｏｍｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００１）（８）：１０２１−９］を含み、それらの大部分は病因において中心的な役割を果たす。
【０００７】
従って、最近の研究は、リウマチ様関節炎（ＲＡ）および多発性硬化症（ＭＳ）の如き炎症性疾患におけるＣＣＲ５受容体およびリガンドの重要性を証明している。ＲＡでは、ＣＣＲ５の特異的発現がマクロファージで、およびリウマチ滑液および膜における大部分のＴリンパ球で証明されている［Ｐｏｋｏｒｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ（２００５）６４：４８７−４９０；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００３）１３２：３７１−８；Ｎｉｓｓｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ（２００３）３０：１９２８−３４；Ｍａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ（１９９９）４２：９８１−８］。一方、ＭＩＰ−１α（ＣＣＬ３）およびＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）を含むケモカインの上昇したレベルは、ＲＡ滑液中に示されている［Ｈａｙａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ（２００１）３（２）：１１８−１２６；Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｓｅｒ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ（２００２）４（４）：２３３−２３６］。ＭＳは、中央神経系（ＣＮＳ）中への炎症性細胞（主にＣＤ４＋Ｔｈ１細胞）の浸潤によって特徴付けられる。炎症性Ｔ細胞は、これらの細胞上でのそれらの受容体（ＣＣＲ５）の過剰発現の結果としてＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１αの方に移動することが示されている［Ｚａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ（２０００）１２３（９）：１８７４−１８８２］。
【０００８】
従って、ＣＣＲ５／リガンド軸に対抗する潜在的な治療上の価値が証明されている。
【０００９】
ＣＣＲ５活性化を阻止するための様々なアプローチが試みられており、そのいくつかは以下に要約される。
【００１０】
ＰＣＴ公報ＷＯ  ０５０７８０９７は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介してＣＣＲ５の如き遺伝子の発現を調節し、遺伝子発現または活性の調節に応答する疾患または状態の治療において潜在的に有用でありうる多機能性の短い干渉核酸（多機能性ｓｉＮＡ）を開示する。ＲＮＡｉは高度に配列特異的であることが知られているが、遺伝子発現の減少率およびタンパク質の消失は、標的細胞の種類、細胞分裂の速度およびタンパク質の半減寿命に依存する。加えて、ｓｉＲＮＡは、タンパク質の発現を完全に阻害することはできず、いくつかの分子がなお転写されるかもしれず、それ故、遺伝子よりもむしろ最終生成物（タンパク質標的自体）を標的とすることが好まれるであろう。
【００１１】
米国特許第６９３０１７４号は、受容体結合について競合し、従ってリガンド−受容体相互作用に干渉することによって天然の反応を阻害する、ＣＣＲ５ケモカイン受容体特異的モノクローナル抗体を開示する。これらの抗体の意図された用途は、リウマチ様関節炎を含む炎症性疾患、ヒト免疫不全ウイルス１および２（ＨＩＶ−１および２）を含むウイルス感染、癌および自己免疫疾患の治療および／または予防を含む。この発明は、ｍＡｂを使用する点で以下のような欠点を有する：１）ｍＡｂは宿主における抗遺伝子型応答を誘導するかもしれない；２）ｍＡｂは、受容体結合について競合するが、活性化信号をなお伝達することができるリガンドを中和しない。受容体の細胞外断片は、Ｎ末端および第一細胞外ループ（ＥＣ１）を含む抗体産生のために意図される。ＥＣ２は言及されていない。
【００１２】
米国特許第２００３０１６６８７０号は、ＣＣＲ５に特異的に結合するｍＡｂ（抗ＣＣＲ５）であって、従って、ＣＣＲ５結合活性（例えば、ＲＡＮＴＥＳ，ＭＩＰ−１αおよび／またはＭＩＰ−１βを含むリガンド結合）、信号活性（例えば、哺乳類Ｇタンパク質の活性化）および／または細胞応答の刺激（例えば化学走化性の刺激）を含むＣＣＲ５機能を阻害するｍＡｂを開示する。この抗ＣＣＲ５ｍＡｂは、炎症性疾患の治療的介入のために並びにＨＩＶ−１および２のために使用されることができる。この発明は、上述のようにｍＡｂを使用する欠点を有する。加えて、この出願の発明者は、ＥＣ２ドメインおよびＣＣＲ５のアミノ末端ドメインの両方が、二特異性抗体産生のためのそれらの示唆されるエピトープによって表明されるようにＣＣＲ５リガンド結合のために重要であると明言している。ＣＣＲ５の第二細胞外ドメインを含む受容体キメラが記述されているが、これらのキメラは、ヒトＣＣＲ５とヒトＣＣＲ２ｂの間の共通のＢａｍＨＩ，ＡｆＩＩＩ，ＣｌａＩ，ＥｃｏＲＩおよびＸｂａｌサイトによって隣接される制限断片を移動させることによって構築されたＣＣＲ５／ＣＣＲ２キメラである。しかし、これらの受容体は、膜結合性であるにすぎず、可溶性の治療用受容体として好適でない。
【００１３】
これらの制限を克服するため、可溶性受容体に基づくアプローチが示唆されている。基本的に、リガンド結合ドメインを含む可溶性受容体デコイは、すべてのリガンドによって媒介される受容体活性化を停止させるために使用される。可能性受容体に基づくアプローチは、ｍＡｂに基づくアプローチに比べていくつかの明らかな利点を有する。まず、それらは抗体とは異なり、宿主における抗遺伝子型応答を直ちに誘導しない。次に、それらの性質のため、それらはリガンドの生物学的に機能的な決定基（これは天然受容体において活性化信号を明らかに伝達する）に結合し、従って、極めて効果的な中和化合物である。最後に、それらは最小の安全問題を呈する。
【００１４】
米国特許第６８００７２９号は、慢性感染、白血病およびＴ細胞媒介自己免疫疾患を含む疾患を治療するために使用することができるＣＣＲ５の変異体（ＨＤＧＮＲ１０とも称される）を開示する。この発明は、ヒトＭＣＰ−１受容体に対して高度の相同性を有する３５２アミノ酸残基の全長ＣＣＲ５タンパク質を記述する。記述されたＣＣＲ５の可溶性形態は、生理学的リガンド（ＭＩＰ−１の如き）と結合し、従ってリガンドが膜結合ＣＣＲ５と相互作用することを防止することができると示唆されている。この発明は全長ＣＣＲ５タンパク質を教示し、これは極めて大きく、その低い生物学的利用性および分解性のために治療に適合しない。
【００１５】
ＰＣＴ公報ＷＯ  ０５１０６４８９は、ヒトＣＣＲ５融合タンパク質を開示し、これは、炎症性疾患、血液の障害および癌を含むＣ−Ｃケモカインに関連する疾患の診断および治療のために使用されることができる。この融合タンパク質は、ガラクトシダーゼタンパク質に融合されたＣＣＲ５タンパク質を含む。この発明は、ＣＣＲ５ポリペプチドを使用して治療剤をスクリーニングする方法も提供する。従って、ＣＣＲ５に結合してＣＣＲ５媒介信号伝達を不活性化する化合物は、潜在的な治療剤として同定される。しかし、この発明の教示は、どのドメインがＣＣＲ５融合に含まれるべきか示していない。上述の通り、ＣＣＲ５はいくつもの細胞外ドメインを有する大きなタンパク質である。全可溶性細胞外ドメインは、構築するのが困難であり、その生物学的利用性および分解性のため治療に全く適合しない。
【００１６】
従って、ＣＣＲ５およびそのリガンドを標的とし、病因がこれらのタンパク質に関与する無数の炎症性疾患および自己免疫疾患の治療において使用することができる治療モダリティーが必要であることが広く認識されており、また、そのような治療モダリティーを有することは非常に好都合である。
【発明の開示】
【００１７】
本発明の１つの態様によれば、ＣＣＲ５リガンドと結合することができるＣＣＲ５アミノ酸配列にコンジュゲート化された異種アミノ酸配列を含む可溶性分子であって、ＣＣＲ５のＮ末端ドメインを有さない分子が提供される。
【００１８】
本発明の別の態様によれば、非タンパク質性成分に結合したＣＣＲ５アミノ酸配列を含む可溶性分子であって、前記ＣＣＲ５アミノ酸配列がＣＣＲ５リガンドと結合することができ、前記分子が対象において非免疫原性である分子が提供される。
【００１９】
本発明のさらに別の態様によれば、それぞれがＣＣＲ５リガンドと結合することができる少なくとも２つの非隣接ＣＣＲ５アミノ酸配列を含む可溶性分子が提供される。
【００２０】
本発明のなおさらに別の態様によれば、ＣＣＲ５のＮ末端ドメインを有さないＣＣＲ５アミノ酸配列に結合したタグを含む分子であって、前記ＣＣＲ５アミノ酸配列がＣＣＲ５リガンドと結合することができる分子が提供される。
【００２１】
本発明のさらなる態様によれば、配列番号２または配列番号４に示されるような分子が提供される。
【００２２】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の分子をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００２３】
本発明のさらなる態様によれば、活性成分として本発明の分子と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物が提供される。
【００２４】
本発明のなおさらなる態様によれば、本発明の分子の治癒効果的な量を対象に投与し、それにより、対象におけるＣＣＲ５および／またはＣＣＲ５リガンド関連疾患を治療することを含む、ＣＣＲ５および／またはＣＣＲ５リガンド関連疾患の治療の必要性のある対象におけるＣＣＲ５および／またはＣＣＲ５リガンド関連疾患を治療する方法が提供される。
【００２５】
本発明のさらなる態様によれば、ＣＣＲ５および／またはＣＣＲ５リガンド関連疾患を治療するために特定される医薬品を製造するための本発明の分子の使用が提供される。
【００２６】
本発明のなおさらなる態様によれば、ＣＣＲ５リガンドを生物学的サンプルから単離する方法が提供され、この場合、この方法は、（ａ）ＣＣＲ５リガンドおよび本発明の分子が複合体を形成するように、生物学的サンプルを本発明の分子と接触させること；および（ｂ）複合体を単離し、それにより、ＣＣＲ５リガンドを生物学的サンプルから単離することを含む。
【００２７】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、前記ＣＣＲ５リガンドは、ＣＣＬ２，ＣＣＬ３，ＣＣＬ４，ＣＣＬ５，ＣＣＬ１１およびＣＣＬ１６からなる群から選択される。
【００２８】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、分子が非免疫原性である。
【００２９】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、前記ＣＣＲ５リガンドに対する前記ＣＣＲ５の結合親和性がＫＤ＝１０−６Ｍより上である。
【００３０】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、前記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンアミノ酸配列を含む。
【００３１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＣＣＲ５アミノ酸配列は配列番号１０または１８に示される通りである。
【００３２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、疾患は、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、およびＩ型糖尿病からなる群から選択される。
【００３３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、タグはエピトープタグである。
【００３４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本発明の分子は固体担体に結合される。
【００３５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本発明の分子は非タンパク質性成分に結合される。
【００３６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、非タンパク質性成分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ（スチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物）（ＳＭＡ）、および、ジビニルエーテルとマレイン酸無水物とのコポリマー（ＤＩＶＥＭＡ）からなる群から選択される。
【００３７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬的に許容され得るキャリアは非経口投与のために配合される。
【００３８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬的に許容され得るキャリアは実質的に非免疫原性である。
【００３９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬的に許容され得るキャリアはリポアミン酸を含む。
【００４０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬的に許容され得るキャリアは炭水化物を含む。
【００４１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬的に許容され得るキャリアはミクロスフェアを含む。
【００４２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬的に許容され得るキャリアはリポソームを含む。
【００４３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬的に許容され得るキャリアはポリマーのミクロスフェアを含む。
【００４４】
本発明は、ＣＣＲ５／ＣＣＲ５リガンド関連疾患を治療するための可溶性分子、組成物およびその使用方法を提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。
【００４５】
本明細書で使用される技術用語と科学用語はすべて、特に断らない限り、本発明の属する技術分野の当業者が共通して理解しているのと同じ意味を持っている。本明細書に記載されているのと類似のまたは等価な方法と材料は本発明を実施または試験するのに使用できるが、好適な方法と材料は以下に述べる。争いが生じた場合、定義を含めて本特許明細書が基準である。さらに、本明細書の材料、方法および実施例は例示することだけを目的とし本発明を限定するものではない。
【００４６】
図面の簡単な記述
本明細書では本発明を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００４７】
図１は、本発明のヒトＩｇ−ＣＣＲ５−ＥＣ２ペプチド（配列番号４）をコードする発現構築物の生成を記述する模式図である。
【００４８】
図２Ａ〜Ｃは、様々な商業的に入手可能なネズミの組換えＣ−Ｃケモカイン：ＭＩＰ−１α（ＣＣＬ３），ＭＩＰ−１β（ＣＣＬ４）およびＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）に対するネズミのＣＣＲ５−ＩｇＧ融合タンパク質のＥＣ１，ＥＣ２，ＥＣ３およびＮドメインの結合特異性を示す棒グラフである。特異的結合は、直接ＥＬＩＳＡによって決定された。結果は、４５０ｎｍで読み取られたＯ．Ｄ．として示されている。図２Ａは、ｍＣＣＬ３に対するｍＣＣＲ５（ＥＣ１，ＥＣ２，ＥＣ３またはＮ）−ＩｇＧの用量依存性結合を示す。図２Ｂは、ｍＣＣＬ４に対するｍＣＣＲ５（ＥＣｌ，ＥＣ２，ＥＣ３またはＮ）−ＩｇＧの用量依存性結合を示す。図２Ｃは、ｍＣＣＬ５に対するｍＣＣＲ５（ＥＣ１，ＥＣ２，ＥＣ３またはＮ）−ＩｇＧの用量依存性結合を示す。
【００４９】
図３Ａ〜Ｂは、様々なネズミのケモカイン：ＭＩＰ−１α（ＣＣＬ３），ＭＩＰ−１β（ＣＣＬ４），ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５），ＩＴＡＣ，ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２），ＣＸＣＬ１６，ＭＩＧおよびＩＬ−４に結合する可溶性受容体ｍＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧの能力を示す棒グラフである。特異的結合は、直接ＥＬＩＳＡによって決定された。結果は、４５０ｎｍで読み取られたＯ．Ｄ．として示されている。図３Ａは、上述のケモカインに対する異なる濃度の可溶性ｍＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧの結合を示すグラフである。図３Ｂは、上述のケモカインに対する１０００ｎｇの可溶性ｍＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧの結合を示すグラフである（単一濃度）。
【００５０】
図４は、ｍＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧとヒトＣＣＬ３，ＣＣＬ４およびＣＣＬ５との間の交差反応性を示す棒グラフである。ネズミＣＣＬ３は、受容体結合の陽性コントロールとして使用され、ｍＩＴＡＣは、陰性コントロールとして使用された。特異的結合は、直接ＥＬＩＳＡによって決定された。結果は、４５０ｎｍで読み取られたＯ．Ｄ．として示されている。
【００５１】
図５Ａ〜Ｃは、ＣＣＬ３，ＣＣＬ４およびＣＣＬ５によって誘導されるＴＨＰ−１細胞移動を特異的に中和することに対するｍＣＣＲ５−ＩｇＧのＥＣ２，ＥＣ３およびＮドメインの能力を示す棒グラフである。生体外トランスウェル移動アッセイが行われた。簡単に述べると、トランスウェルは、１μｇ／ウェルまたは１０μｇ／ウェルの様々なｍＣＣＲ５−ＩｇＧ細胞外ドメイン（上述の通り）に加えて、１５ｎｇ／ウェルのネズミＣＣＬ３、１０ｎｇ／ウェルのネズミＣＣＬ４および５０ｎｇ／ウェルのネズミＣＣＬ５と共に３０分間インキュベートされた。ＴＨＰ−１細胞は、２４時間飢餓され、トランスウェルプレートの上部チャンバーに添加された。３７℃で３時間のインキュベート後、移動したＴＨＰ−１細胞は、ＦＡＣＳによって計数された。図５Ａは、ネズミＣＣＬ３によって誘導された化学的走性を示すグラフである。図５Ｂは、ネズミＣＣＬ４によって誘導された化学的走性を示すグラフである。図５Ｃは、ネズミＣＣＬ５によって誘導された化学的走性を示すグラフである。
【００５２】
図６は、ＭＩＰ−１α（ＣＣＬ３）によって誘導されるＴＨＰ−１細胞移動を阻害することに対するヒトＣＣＲ５−ＩｇＧの能力を示すグラフである。生体外トランスウェル移動アッセイが行われた。簡単に述べると、ＴＨＰ−１細胞（１０６個／ウェル）はトランスウェルプレートの上部チャンバーに添加され、ＣＣＬ３（組換えヒトＭＩＰ−１α）またはコントロールＣＣＬ２（組換えヒトＭＣＰ−１）は、図に示されるようにｈＣＣＲ５−ＩｇＧを補充されたまたは補充されない下部ウェルに添加された。３７℃で３時間のインキュベート後、移動したＴＨＰ−１細胞は、ＦＡＣＳによって計数された。結果は三連の平均±ＳＥで示される。
【００５３】
図７は、ネズミにおける進行中の実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）を抑制することに対するＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧの能力を示すグラフである。簡単に述べると、Ｃ５７／Ｂマウスの３つの群（各群について４匹）は、ＭＯＧｐ３５−５５によるＥＡＥの活性誘導に供された。疾患の発症の日の翌日（１２日目）から、これらのマウスはＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧ（四角）、アイソタイプ整合ＩｇＧ（三角）またはＰＢＳ（丸）のいずれかを３００μｇ／マウスの量で繰返し（一日おきに）静脈内投与されることによって治療された。実験手順を知らされていない観測者が、疾患の臨床上の表れについてＥＡＥを毎日スコア化した。
【００５４】
図８Ａ〜Ｃは、ＥＡＥに由来する脾臓細胞によって生体外サイトカイン分泌を変化させることに対するｍＣＣＲ５−ＩｇＧの能力を示すグラフである。簡単に述べると、Ｃ５７／Ｂマウスの３つの群（各群について４匹）は、ＭＯＧｐ３５−５５によるＥＡＥの活性誘導に供された。９日間に、脾臓細胞は収穫され、アイソタイプ整合ＩｇＧ（ｍＩｇＧ）（菱型）、コントロールＣＣＲ５［ＣＣＲ５（ＥＣ３）−ＩｇＧ（四角）］、またはＣＣＲ（ＥＣ２）ＩｇＧ（三角）の異なる濃度と共に５０μｇ／ｍｌのＭＯＧｐ３５−５５で７２時間再刺激された。上澄みはサイトカイン産生についてＥＬＩＳＡによって分析された。図８Ａは、ＥＡＥに由来する脾臓細胞によるＴＮＦ−α分泌を示すグラフである。図８Ｂは、ＥＡＥに由来する脾臓細胞によるＩＦＮ−γ分泌を示すグラフである。図８Ｃは、ＥＡＥに由来する脾臓細胞によるＩＬ−１２分泌を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
本発明は、ＣＣＲ５／ＣＣＲ５リガンド関連疾患（例えば、ガンなど）を治療するための可溶性分子、該分子を含む組成物、および、該分子を使用する方法に関する。
【００５６】
本発明の原理および操作は、図面および付随する説明を参照してより良く理解することができる。
【００５７】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。また、本明細書中において用いられる表現法および用語法は説明のためであって、限定として見なされるべきでないことを理解しなければならない。
【００５８】
ＣＣＲ５は、Ｃ−Ｃケモカイン受容体のメンバーであり、Ｔｈ１リンパ球を含む多くの細胞型で発現される。ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）およびＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）を含むいくつかのＣ−Ｃケモカインリガンドが、ＣＣＲ５に結合する。最近、リウマチ様関節炎（ＲＡ）および多発性硬化症（ＭＳ）の如き炎症性疾患の病因におけるＣＣＲ５およびそのリガンドの重要性が証明されてきている。
【００５９】
中和リガンドの使用は、ＣＣＲ５によって媒介される信号伝達を阻止することが示唆されてきた。しかし、抗体療法の使用は、宿主における抗遺伝子型応答の有害な誘導を伴う。加えて、抗体療法は、ＣＣＲ５リガンドの全レパートリーを中和するのには有効でなく、ＣＣＲ５リガンドが信号を活性化することを誘発する。
【００６０】
代替的なアプローチは、可溶性受容体の使用に関する。このアプローチは、様々な文献で示唆されているが、具体的なＣＣＲ５分子は想定されていないし、かかる分子は決して構築されていない。
【００６１】
本発明を実施に移している間に、本発明者らは、ＣＣＲ５の細胞外ドメイン２（ＥＣ２）（ＣＣＲ５  ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＰ  ０００５７０のアミノ酸座標１６５〜１９５；配列番号１８）は高親和性で排他的にＣＣＲ５リガンドと結合するが、他の細胞外ドメインであるＥＣ１（ＣＣＲ５  ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＰ  ０００５７０のアミノ酸座標８８〜１０２；配列番号１６）、ＥＣ３（ＣＣＲ５  ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＰ  ０００５７０のアミノ酸座標２６１〜２９１；配列番号２０）及びＮ（ＣＣＲ５  ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＰ  ０００５７０のアミノ酸座標１〜３４；配列番号１４）は極めて低い親和性でＣＣＲ５リガンドと結合することを発見した（以下の実施例の節の実施例２）。従って、ＣＣＲ５のＥＣ２ドメインを含む可溶性分子は、ＣＣＲ５リガンド（例えばＣＣＬ３，ＣＣＬ４およびＣＣＬ５）を明らかに捕らえることによってＣＣＲ５関連疾患を治療するために使用することができることが想定される。本発明の教示に従って生成された可溶性デコイタンパク質は、ヒトの治療に使用するのに十分活性であり、小さく、生物学的に利用可能である。
【００６２】
以下におよび実施例の節で示されるように、本発明者らは、ヒトとマウスの可溶性ＣＣＲ５融合ポリペプチドを構築し、それらを真核生物細胞系中で発現させた（以下の実施例の節の実施例１参照）。様々なＣＣＲ５リガンドに対するＣＣＲ５−ＥＣ２ドメインの排他的親和性が実施例２〜３に示された。マウスＣＣＲ５−ＥＣ２ドメインとヒトＣＣＲ５リガンドとの間の交差反応性はＥＬＩＳＡによって示された（実施例４参照）。本発明の教示に従って生成された分子は、ＣＣＲ５リガンドによって誘導される細胞移動を阻害することによって表明されるように機能的であることが証明された（実施例５および６参照）。これらの結果は、進行中の脳脊髄炎を抑制することによって生体内で（実施例７参照）、およびＥＡＥにおける前炎症性サイトカインの産生を抑制することによって生体外で（実施例８参照）さらに実証された。
【００６３】
総合すると、今回の教示は、本発明の可溶性分子に対する治療上の価値を描写する。
【００６４】
従って、本発明では、ＣＣＲ５のＥＣ２ドメインを含み、かつ、好ましくは、ＣＣＲ５のＮ末端ドメインを有さない任意のＣＣＲ５アミノ酸配列の使用、および／または、ＣＣＲ５／ＣＣＲ５リガンド関連疾患（例えば、ＭＳなど）を治療するための、そのような配列を含む組成物が想定される。重要なことには、本発明の組成物は、最大の治癒的効力を達成するために非免疫原性である。従って、本発明では、例えば、ＣＣＲ５配列を、ＣＣＲ５配列がタンパク質性成分（例えば、異種アミノ酸配列）または非タンパク質性成分（例えば、ＰＥＧ）（これらのそれぞれが循環における組成物の半減期を延ばすことができる）に結合される複合体で含むことが想定される。
【００６５】
従って、本発明の１つの態様によれば、ＣＣＲ５リガンドと結合することができるＣＣＲ５アミノ酸配列にコンジュゲート化された異種アミノ酸配列を含む可溶性分子であって、ＣＣＲ５のＮ末端ドメインを有さない分子が提供される。
【００６６】
本明細書中で使用される用語「可溶性」は、実質的な凝集なしに生理学的水溶液に溶解する本発明の分子の能力（ｐＨ約７、例えば＞１００μｇ／ｍｌの水性媒体中での可溶性レベル）を示す。
【００６７】
本明細書中で使用される「ＣＣＲ５アミノ酸配列」は、ＣＣＲ５リガンドについての親和性結合を有する、哺乳動物（例えば、ヒト）のケモカインＣ−Ｃ受容体５タンパク質のペプチド部分を示す。１つだけのＣＣＲ５アミノ酸配列が本発明の分子に含まれ得ること、しかし、それぞれがＣＣＲ５と（好ましくは、大きい親和性で）結合することができる少なくとも２つのＣＣＲ５アミノ酸配列（例えば、類似の親和性のもの）を含むことが好ましい場合があることに留意しなければならない。増大した結合活性のために、これらのポリペプチドはＣＣＲ５リガンド活性の強力な阻害剤として使用することができ、また、より少ない投薬量を投与することができる。ＣＣＲ５アミノ酸配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＰ  ０００５７０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＭ  ０００５７９によってコードされる）；またはＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＰ  ０３４０４７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＭ  ００９９１７によってコードされる）に規定されている。
【００６８】
本発明のＣＣＲ５アミノ酸配列は、受容体のＥＣ２ドメインを含むが、受容体のアミノ末端（Ｎ−ｔｅｒ）部分を有さないことが好ましい（以下の表１によるヒトおよびマウスドメインについての指定を参照）。以下の実施例の節の実施例２に示されるように、ＣＣＲ５のそのリガンドへの結合は、ＥＣ２ドメイン単独によって媒介されるが、Ｎ−ｔｅｒおよびＥＣ３ドメインは、リガンド結合において無視しうる程度の役割しか果たさない。
【００６９】
2009531022.tif 000002
【００７０】
本明細書中で使用される用語「結合親和性」は、少なくとも１０−６Ｍ，１０−７Ｍ，１０−８Ｍ，１０−９Ｍ，１０−１０Ｍ．．．．の最小ＫＤ値を示す。
【００７１】
本明細書中で使用される用語「ペプチド」には、天然のペプチド（分解産物または合成的に合成されたペプチドまたは組換えペプチドのいずれか）、ペプチド模倣体（典型的には合成的に合成されたペプチド）そしてペプチドアナログであるペプトイドおよびセミペプトイドが含まれ、これらは、例えば、ペプチドを体内でより安定化させる修飾、またはペプチドの細胞浸透能力を高める修飾を有し得る。そのような修飾には、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合の修飾（ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨを含むが、これらに限定されない）、骨格の修飾、および残基の修飾が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド模倣体化合物を調製するための方法はこの分野では十分に知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に具体的に記載される（これは、全体が本明細書中に示されるように参考として組み込まれる）。これに関するさらなる詳細は本明細書中下記に示される。
【００７２】
ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキル（例えば、メチル）である）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子において自然界で示される「通常」の側鎖である）によって置換することができる。これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合の任意のところに存在させることができ、そして同時に数カ所（２カ所〜３カ所）においてさえ存在させることができる。
【００７３】
天然の芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）は、フェニルグリシン、ＴＩＣ、ナフチレンアミン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成された非天然型の酸に置換することができる。
【００７４】
上述のことに加えて、本発明のペプチドは一以上の修飾されたアミノ酸または一以上の非アミノ酸モノマー（例えば脂肪酸、複合体炭水化物など）も含むことができる。
【００７５】
本明細書中および請求項の節で使用される用語「アミノ酸」には、２０個の天然に存在するアミノ酸；インビボで多くの場合には翻訳後修飾されたそのようなアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンを含む）；および他の非通常型アミノ酸（２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含むが、これらに限定されない）が含まれることが理解される。さらに、用語「アミノ酸」には、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方が含まれる。
【００７６】
下記の表２および表３には、本発明で使用される天然に存在するアミノ酸（表２）および非通常型アミノ酸または修飾型アミノ酸（例えば合成アミノ酸、表３）が示される。
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【００７７】
本発明のペプチドは好ましくは線状形態で利用されるが、環化がペプチドの特性を大きく妨害しない場合には、ペプチドの環状形態もまた利用され得ることが理解される。
【００７８】
本明細書中上記で記載されるようなペプチド模倣体の作製は、例えば、ディスプレー技術を含めて、様々な方法を使用して達成することができる。
【００７９】
従って、本発明では、ＣＣＲ５のＥＣ２のポリペプチド配列（例えば、配列番号１０または１８）に由来する少なくとも５個の連続するアミノ酸、少なくとも７個の連続するアミノ酸、少なくとも１１個の連続するアミノ酸、少なくとも１５個の連続するアミノ酸、少なくとも２０個の連続するアミノ酸、少なくとも２５個の連続するアミノ酸をそれぞれが呈示する多数のディスプレービヒクル（例えば、ファージ、ウイルスまたは細菌など）を含むディスプレーライブラリーが意図される。
【００８０】
そのようなファージライブラリーを構築する様々な方法が当該技術分野では広く知られている。そのような方法が、例えば、Ｙｏｕｎｇ  ＡＣ他、「クリプトコッカス・ネオフォルマンスに対する多糖結合抗体およびファージディスプレーライブラリー由来ペプチドとのその複合体の三次元構造：ペプチドミモトープを特定するための密接な関係」、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１９９７（１２月１２日）、２７４（４）：６２２〜３４；Ｇｉｅｂｅｌ  ＬＢ他、「環状ペプチドファージライブラリーのスクリーニングによるストレプトアビジンと大きい親和性で結合するリガンドの特定」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９５（１１月２８日）、３４（４７）：１５４３０〜５；Ｄａｖｉｅｓ  ＥＬ他、「ニワトリの免疫グロブリン遺伝子に由来するライブラリーを使用する特異的なファージディスプレー抗体の選択」、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５（１０月１２日）、１８６（ｌ）：１２５〜３５；Ｊｏｎｅｓ  Ｃ  ＲＴ他、「分子認識およびバイオセパレーションにおける現在の傾向」、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ、１９９５（７月１４日）、７０７（１）：３〜２２；Ｄｅｎｇ  ＳＪ他、「合成遺伝子ライブラリーに由来する改善された炭水化物結合性単鎖抗体を選択するための基礎」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９５（５月２３日）、９２（１１）：４９９２〜６；Ｄｅｎｇ  ＳＪ他、「ファージディスプレーによる改善された炭水化物結合性の抗体単鎖可変フラグメントの選択」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９９４（４月１日）、２６９（１３）：９５３３〜８に記載される（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００８１】
ペプチド模倣体はまた、コンピュータを利用した生物学を使用して発見することができる。三次元構造モデルを表示するために有用なソフトウエアプログラム、例えば、ＲＩＢＢＯＮＳ（Ｃａｒｓｏｎ，Ｍ．、１９９７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２７７、２５）、Ｏ（Ｊｏｎｅｓ，ＴＡ．他、１９９１、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、Ａ４７、１１０）、ＤＩＮＯ（ＤＩＮＯ：Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００１）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｉｎｏ３ｄ．ｏｒｇ）、ならびに、ＱＵＡＮＴＡ、ＩＮＳＩＧＨＴ、ＳＹＢＹＬ、ＭＡＣＲＯＭＯＤＥ、ＩＣＭ、ＭＯＬＭＯＬ、ＲＡＳＭＯＬおよびＧＲＡＳＰ（Ｋｒａｕｌｉｓ，Ｊ．、１９９１、Ａｐｐｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、２４、９４６において総説される）などを、ＭＣＰ−１と、予想されるペプチド模倣体との間での相互作用をモデル化し、それにより、特異的なＭＣＰ−１領域に結合する最大の確率を示すペプチドを特定するために利用することができる。タンパク質−ペプチド相互作用のコンピュータを利用したモデル化が合理的薬物設計において使用され、成功している。さらに詳しくは、Ｌａｍ他、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６３、３８０；Ｗｌｏｄａｗｅｒ他、１９９３、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６２、５４３；Ａｐｐｅｌｔ、１９９３、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ、１、２３；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ、１９９３、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ、１、１０９；およびＭａｕｒｏ  ＭＪ．他、２００２、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．、２０、３２５〜３４を参照のこと。
【００８２】
述べられたように、本発明のこの態様のキメラ分子は異種アミノ酸配列を含む。
【００８３】
本明細書中で使用される表現「異種アミノ酸配列」は、ＣＣＲ５アミノ酸配列の一部分を形成しない非免疫原性のアミノ酸配列を示す。この配列は、好ましくは、溶解性を本発明のこの態様のキメラ分子にもたらし、これにより、好ましくは、血清中におけるキメラ分子の半減期を増大させる。
【００８４】
異種アミノ酸配列は一般には、本発明のＣＣＲ５ペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に局在化される。
【００８５】
述べられたように、少なくとも１つの異種アミノ酸配列を本発明のＣＣＲ５アミノ酸配列にコンジュゲート化することができる。例えば、少なくとも１つのＣＣＲ５アミノ酸配列を、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ（１９９１）、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８：１０２７〜１０３７などによって記載されるように、２つの異種配列の間に埋め込むことができる。異種アミノ酸配列はペプチド結合または非ペプチド結合のいずれによってもＣＣＲ５アミノ酸配列に結合することができる。異種アミノ酸配列に対するＣＣＲ５アミノ酸配列の結合は、直接的な共有結合性の結合（ペプチド結合または置換されたペプチド結合）によって、または、例えば、官能基を有するリンカーの使用などによる間接的な結合によって達成することができる。官能基には、限定されないが、遊離カルボン酸基（Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、遊離アミノ基（ＮＨ２）、エステル基（Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、式中、Ｒは、アルキル、シクロアルキルまたはアリールである）、ハロゲン化アシル基（（Ｃ（＝Ｏ）Ａ、式中、Ａは、フルオリド、クロリド、ブロミドまたはヨージドである）、ハロゲン化物（フルオリド、クロリド、ブロミドまたはヨージド）、ヒドロキシル基（ＯＨ）、チオール基（ＳＨ）、ニトリル基（Ｃ≡Ｎ）、遊離Ｃ−カルバミン酸基（ＮＲ”−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲ’、式中、Ｒ’およびＲ”のそれぞれは独立して、水素、アルキル、シクロアルキルまたはアリールである）が含まれる。
【００８６】
本発明のこの態様に従って使用することができる異種アミノ酸配列の一例が免疫グロブリンの配列であり、例えば、免疫グロブリン重鎖ドメインのヒンジ領域およびＦｃ領域などである（米国特許第６７７７１９６号を参照のこと）。本発明のこの態様のキメラ体における免疫グロブリン成分は、本明細書中下記でさらに議論されるように、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇ４のサブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから得ることができる。
【００８７】
適切な免疫グロブリン定常ドメイン配列に連結された受容体配列から構築された様々なキメラ体（イムノアドヘシン）が当該技術分野で知られている。文献に報告されるイムノアドヘシンには、Ｔ細胞受容体の融合体［Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：２９３６〜２９４０（１９８７）］、ＣＤ４の融合体［Ｃａｐｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５〜５３１（１９８９）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３９：６８〜７０（１９８９）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ他、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ、９：３４７〜３５３（１９９０）；Ｂｙｒｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３４４：６６７〜６７０（１９９０）］；Ｌ−セレクチン（ホーミング受容体）の融合体［（Ｗａｔｓｏｎ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１０：２２２１〜２２２９（１９９０）；Ｗａｔｓｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３４９：１６４〜１６７（１９９１）］；ＣＤ４４の融合体［Ａｒｕｆｆｏ他、Ｃｅｌｌ、６１：１３０３〜１３１３（１９９０）］；ＣＤ２８およびＢ７の融合体（Ｌｉｎｓｌｅｙ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７３：７２１〜７３０（１９９１）］；ＣＴＬＡ−４の融合体［Ｌｉｓｌｅｙ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７４：５６１〜５６９（１９９１）］；ＣＤ２２の融合体［Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ他、Ｃｅｌｌ、６６：１１３３〜１１４４（１９９１）］；ＴＮＦ受容体の融合体［Ａｓｈｋｅｎａｚｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：１０５３５〜１０５３９（１９９１）；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７：２８８３〜２８８６（１９９１）；Ｐｅｐｐｅｌ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７４：１４８３〜１４８９（１９９１）］；ＮＰ受容体の融合体［Ｂｅｎｎｅｔｔ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：２３０６０〜２３０６７（１９９１）］；および、ＩｇＥ受容体αの融合体［Ｒｉｄｇｗａｙ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１  １５：ａｂｓｔｒ、１４４８（１９９１）］が含まれる。
【００８８】
典型的には、そのような融合体において、キメラ分子は免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも機能的に活性なヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを保持する。融合体はまた、定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端に対して、あるいは、重鎖のＣＨ１または軽鎖の対応する領域のすぐＮ末端側に対して作製することができる。
【００８９】
異種配列とＣＣＲ５アミノ酸配列との間での融合（コンジュゲート化）が行われる正確な部位は重要でない。具体的な部位が当該技術分野では広く知られており、そのような部位を、本発明のこの態様のキメラ分子の生物学的活性、分泌または結合特性を最適化するために選択することができる（下記の実施例の節の実施例１を参照のこと）。
【００９０】
重鎖の定常領域全体を本発明のＣＣＲ５アミノ酸配列にコンジュゲート化することが可能であり得るが、より短い配列を融合することが好ましい。例えば、重鎖定常領域の最初の残基が１１４であることを考えると、パパイン切断部位（これは化学的にはＩｇＧのＦｃを規定する；残基２１６）、または、他の免疫グロブリンの類似する部位の直ぐ上流側のヒンジ領域において始まる配列が融合体において使用される。特に好ましい実施形態において、ＣＣＲ２アミノ酸配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３の重鎖のヒンジ領域ならびにＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインに、または、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインに融合される（米国特許第６７７７１９６号を参照のこと）。融合が行われる正確な部位は重要でなく、最適な部位を日常的な実験によって決定することができる。
【００９１】
述べられたように、本発明のこの態様のキメラ分子の構築において使用される免疫グロブリン配列はＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖定常ドメインに由来し得る。（例えば、配列番号２１，２２，２５および２６に示されるような）ヒトのＩｇＧ１免疫グロブリン配列およびＩｇＧ３免疫グロブリン配列の使用が好ましい。ＩｇＧ１を使用することの大きな利点は、ＩｇＧ１が固定化プロテインＡにおいて効率的に精製できることである。対照的に、ＩｇＧ３の精製では、著しく好都合な媒体ではないが、プロテインＧが要求される。しかしながら、免疫グロブリンの他の構造的性質および機能的性質を、具体的なキメラ構築物のためのＩｇＧ融合パートナーを選ぶときには考慮しなければならない。例えば、ＩｇＧ３のヒンジはより長く、より柔軟であり、従って、ＩｇＧ３のヒンジは、ＩｇＧ１に融合されたときには正しく折り畳まれ得ないか、または、正しく機能しないことがあるより大きいＣＣＲ５アミノ酸配列を受け入れることができる。別の検討事項は価数である場合がある：ＩｇＧは二価のホモ二量体であり、これに対して、ＩｇＡおよびＩｇＭのようなＩｇサブタイプは基本的なＩｇホモ二量体ユニットの二量体構造または五量体構造をそれぞれ生じさせ得る。本発明のこの態様のキメラ分子の免疫グロブリン部分を選択することにおける他の検討事項が米国特許第６７７７１９６号に記載される。
【００９２】
融合タンパク質の構築に一般的に使用される異種アミノ酸配列のさらなる例は、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、コリオン性ゴナドトロフィン（ＣＧβ）からのカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を含むが、これらに限定されない。
【００９３】
本明細書中で使用される表現「ＣＣＲ５リガンド」は、ＣＣＲ５にＫＤ＝１０−６Ｍの最小親和性で結合する任意の分子であって、そこからの信号伝達（例えば前炎症性サイトカイン産生）を活性化する分子を示す。かかる分子の例は、可溶性または非可溶性の天然または合成ケモカインリガンド、並びにＣＣＲ５陽性細胞に対する栄養性を有する感染病因［例えばＨＶＩの如きウイルス（Ｐｒｉｎｃｅｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｏｌｓ，Ｃｙｔｏｋ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．（２００５）１６（６）：６５９−７７）］を含む。ＣＣＲ５ケモカインリガンドの例は、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１），ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α），ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１β），ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ），ＣＣＬ１１（エオタキシン）およびＣＣＬ１６を含むが、これらに限定されない［Ｂｌａｎｐａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．（１９９９）９４：１８９９−９０５；Ｎｏｍｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００１）（８）：１０２１−９］。
【００９４】
本発明のこの態様の好ましい実施態様によれば、本発明のこの態様の可溶性分子は、配列番号２または４に示される。
【００９５】
従って、本発明のこの態様のキメラ分子は、上記で記載されたように、異種アミノ酸配列を含むことができる。
【００９６】
加えて、または、代替として、本明細書中上記で述べられたように、本発明のＣＣＲ５アミノ酸配列は非タンパク質性成分に結合させることができ、そのような分子は対象において特定の非免疫原性であるように選択されることが好ましい。
【００９７】
従って、本発明の１つの態様によれば、非タンパク質性成分に結合したＣＣＲ５アミノ酸配列（上述のような）を含む分子であって、前記ＣＣＲ５アミノ酸配列がＣＣＲ５リガンドと結合することができ、前記分子が対象において非免疫原性である分子が提供される。
【００９８】
そのような分子は非常に安定であり（おそらくは非タンパク質性成分によってもたらされる立体的障害のためにインビボでのタンパク質分解活性に対して抵抗性であり）、また、本明細書中下記においてさらに記載されるように、安価であり、かつ、非常に効率的である一般的な固相合成法を使用して製造することができる。しかしながら、組換え技術を依然として使用することができ、従って、組換えペプチド生成物はインビトロ修飾（例えば、本明細書中下記においてさらに記載されるようなＰＥＧ化）に供されることが理解される。
【００９９】
本明細書中で使用される表現「非タンパク質性成分」は、上記のＣＣＲ５アミノ酸配列に結合される、（ペプチド結合した）アミノ酸を含まない分子を示す。現時点で好ましい実施形態によれば、本発明のこの態様の非タンパク質性成分はポリマーまたはコポリマー（合成または天然）である。本発明の非タンパク質性成分の限定されない例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ジビニルエーテルおよびマレイン酸無水物のコポリマー（ＤＩＶＥＭＡ；例えば、Ｋａｎｅｄａ  Ｙ他、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２３９：１６０〜５を参照のこと）、および、ポリ（スチレンｃｏマレイン酸無水物）（ＳＭＡ；例えば、Ｍｕ  Ｙ他、１９９９、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．、２５５：７５〜９を参照のこと）が含まれる。
【０１００】
かかる非タンパク質成分は、分子の安定性および所望により可溶性を促進するために、上述の融合分子（即ち、異種アミノ酸配列を含むもの）に結合されてもよいことは理解されるであろう。
【０１０１】
そのような非タンパク質性成分のバイオコンジュゲート化は、その生物学的活性を保持し、かつ、その半減期を延ばしながら、安定性（例えば、プロテアーゼ活性に対して）および／または溶解性（例えば、生物学的流体（例えば、血液、消化液など）において）を有するＣＣＲ５アミノ酸配列をもたらす。バイオコンジュゲート化は、短い半減期および血液からの迅速なクリアランスを示す治癒的タンパク質の場合には特に好都合である。バイオコンジュゲート化されたタンパク質の血漿中の増大した半減期は、タンパク質コンジュゲートの増大したサイズ（これにより、その腎糸球体ろ過が制限される）およびポリマーの立体的障害による低下したタンパク質分解から生じている。一般には、ペプチドあたりの結合したポリマー鎖が多くなるほど、半減期の延長が大きくなる。しかしながら、様々な対策が、本発明のＣＣＲ５アミノ酸配列の特異的な活性（すなわち、ＣＣＲ５リガンド結合）を低下させないために取られる。
【０１０２】
ＰＥＧによるＣＣＲ５アミノ酸配列のバイオコンジュゲート化（すなわち、ＰＥＧ化）を、ＰＥＧ誘導体を使用して、例えば、ＰＥＧカルボン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、モノメトキシＰＥＧ２−ＮＨＳ、カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシンイミジルエステル（ＳＣＭ−ＰＥＧ）、ＰＥＧのベンゾトリアゾールカルボナート誘導体、ＰＥＧのグリシジルエーテル、ＰＥＧのｐ−ニトロフェニルカルボナート（ＰＥＧ−ＮＰＣ、例えば、メトキシＰＥＧ−ＮＰＣなど）、ＰＥＧアルデヒド、ＰＥＧ−オルトピリジル−ジスルフィド、カルボニルジイミダゾール活性化ＰＥＧ、ＰＥＧ−チオール、ＰＥＧ−マレイミドなどを使用して達成することができる。そのようなＰＥＧ誘導体が様々な分子量で市販されている［例えば、カタログ（ポリエチレングリコールおよび誘導体、２０００）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｌｌｅ、Ａｌａ．）を参照のこと］。所望であれば、上記誘導体の多くがモノ官能性のモノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）形態で入手可能である。一般には、本発明のＣＣＲ５アミノ酸配列に付加されるＰＥＧは、分子量（ＭＷ）が数百ダルトン〜約１００ｋＤａの範囲でなければならない（例えば、３ｋＤａ〜３０ｋＤａ）。より小さいＭＷのＰＥＧを使用することができるが、より低分量のＰＥＧはＰＥＧ化ペプチドの収率のいくらかの喪失をもたらし得る。より小さいＭＷのＰＥＧについて得ることができる純度と同じくらい高い純度のより大きいＭＷのＰＥＧを得ることは困難である場合があるので、より大きいＰＥＧ分子の純度にも気をつけなければならない。少なくとも８５％の純度のＰＥＧ、より好ましくは、少なくとも９０％の純度、９５％の純度またはそれ以上の純度のＰＥＧを使用することが好ましい。分子のＰＥＧ化が、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９６））において第１５章に、また、Ｚａｌｉｐｓｋｙ他、「ポリエチレングリコールのスクシンイミジルカルボナート」（ＤｕｎｎおよびＯｔｔｅｎｂｒｉｔｅ編、Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．（１９９１））においてさらに記載される。
【０１０３】
好都合には、ＰＥＧは、コンジュゲートの活性（すなわち、ＣＣＲ５リガンド結合）が保持される限り、部位特異的変異誘発によってＣＣＲ５アミノ酸配列における選ばれた位置に結合させることができる。例えば、配列番号１に示されるようなＣＣＲ５アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端におけるシステイン残基がＰＥＧ化のために標的であり得る。加えて、または、代替として、他のシステイン残基をＣＣＲ５アミノ酸配列に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端において）付加することができ、それにより、ＰＥＧ化のために標的として役立たせることができる。コンピュータ分析を、活性を損なうことを伴わない変異誘発のための好ましい位置を選択するために行うことができる。
【０１０４】
活性化ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−ビニルスルホン（ＶＳ）、ＰＥＧ−アクリラート（ＡＣ）、ＰＥＧ−オルトピリジルジスルフィドなど）の様々なコンジュゲート化化学を用いることができる。活性化ＰＥＧ分子を調製する様々な方法が当該技術分野では知られている。例えば、ＰＥＧ−ＶＳは、ＰＥＧ−ＯＨのジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液をＮａＨと反応し、次いで、ジビニルスルホンと反応することによってアルゴン下で調製することができる（モル比；ＯＨ  １：ＮａＨ  ５：ジビニルスルホン  ５０、０．２グラムＰＥＧ／ｍＬ（ＤＣＭ））。ＰＥＧ−ＡＣが、ＰＥＧ―ＯＨのＤＣＭ溶液をアクリロイルクロリドおよびトリエチルアミンと反応することによってアルゴン下で作製される（モル比；ＯＨ  １：アクリロイルクロリド  １．５：トリエチルアミン  ２、０．２グラムＰＥＧ／ｍＬ（ＤＣＭ）で）。そのような化学基を、線状化された２アームＰＥＧ分子、４アームＰＥＧ分子または８アームＰＥＧ分子に結合することができる。
【０１０５】
システイン残基へのコンジュゲート化は、本発明のＣＣＲ５アミノ酸配列がＰＥＧ化され得る１つの好都合な方法ではあるが、他の残基もまた、所望であれば、使用することができる。例えば、無水酢酸を、ＣＯＯＨ基、Ｓ−−Ｓ基または−−ＳＣＨ３基とではなく、ＮＨ２基およびＳＨ基と反応させるために使用することができ、一方、過酸化水素を、ＮＨ２基とではなく、ＳＨ基および−−ＳＣＨ３基と反応させるために使用することができる。反応を、十分に確立された反応性を利用する化学反応を用いて、ペプチドにおける所望される残基に対するコンジュゲート化のために適切である条件のもとで行うことができる。
【０１０６】
ＰＶＰとの本発明のＣＣＲ５アミノ酸配列のバイオコンジュゲート化のために、末端ＣＯＯＨを有するＰＶＰが、ラジカル開始剤としての４，４’−アゾビス−（４−シアノ吉草酸）および連鎖移動剤としての３−メルカプトプロピオン酸の助けをかりたジメチルホルアミド中でのラジカル重合によってＮ−ビニル−２−ピロリドンから合成される。平均分子量Ｍｒが６０００である得られたＰＶＰを高速液体クロマトグラフィーによって分離および精製することができ、合成ＰＶＰの末端ＣＯＯＨがＮ−ヒドロキシスクシンイミド／ジシクロヘキシルカルボジイミド法によって活性化される。ＣＣＲ５アミノ酸配列が６０倍モル過剰の活性化ＰＶＰと反応させられ、反応がアミノカプロン酸（活性化ＰＶＰに対して５倍モル過剰）により停止される（これは本質的には、Ｈａｒｕｈｉｋｏ  Ｋａｍａｄａ他、２０００、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６０：６４１６〜６４２０（これは参考として全体が本明細書中に組み込まれる）に記載される通りである）。
【０１０７】
得られるコンジュゲート化されたＣＣＲ５分子（例えば、ＰＥＧ化ＣＣＲ５またはＰＶＰ−コンジュゲート化ＣＣＲ５）は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、分離、精製および定量される。加えて、本発明のこの態様の精製されたコンジュゲート化分子は、本質的には他のケモカインについて記載されるように［例えば、ＭＩＰ−１α、例えば、Ｈｅｓｓｅｌｇｅｓｓｅｒ  Ｊ、１９９８（上掲）（これは参考として全体が本明細書中に組み込まれる）を参照のこと］、例えば、ＣＣＲ５リガンドのその受容体（例えば、ＣＣＲ５）に対する結合特異性が本発明のＣＣＲ５コンジュゲートの存在下または非存在下で試験されるインビトロアッセイを使用してさらに定量することができる。
【０１０８】
本発明のこの態様の分子は、例えば、様々な標準的な固相技術を使用することなどによって生化学的に合成することができる。これらの方法には、完全固相合成、部分固相合成法、フラグメント縮合および古典的溶液合成が含まれる。これらの方法は、好ましくは、ペプチドが比較的短い（すなわち、１０ｋＤａである）とき、および／または、ペプチドが組換え技術によって産生できないとき（すなわち、核酸配列によってコードされないとき、例えば、本明細書中下記においてさらに記載される「タグ」など）に使用され、従って、異なる化学を伴う。
【０１０９】
様々な固相ペプチド合成手法が当該技術分野では広く知られており、Ｊｏｈｎ  Ｍｏｒｒｏｗ  ＳｔｅｗａｒｔおよびＪａｎｉｓ  Ｄｉｌｌａｈａ  Ｙｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８４）によってさらに記載される。
【０１１０】
合成ペプチドは調製用の高速液体クロマトグラフィーによって精製することができ［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ  Ｔ．（１９８３）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｉｎｃｐｌｅｓ、ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．］、その組成をアミノ酸配列決定によって確認することができる。
【０１１１】
多量の本発明のペプチドが所望される場合、本発明のペプチドは、例えば、Ｂｉｔｔｅｒ他（１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３：５１６〜５４４、Ｓｔｕｄｉｅｒ他（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８５：６０〜８９；Ｂｒｉｓｓｏｎ他（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：５１１〜５１４；Ｔａｋａｍａｔｓｕ他（１９８７）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６：３０７〜３１１；Ｃｏｒｕｚｚｉ他（１９８４）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、３：１６７１〜１６８０；Ｂｒｏｇｌｉ他（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４：８３８〜８４３；Ｇｕｒｌｅｙ他（１９８６）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、６：５５９〜５６５；Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ、１９８８、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、第ＶＩＩＩ節、４２１頁〜４６３頁などによって記載される組換え技術を使用して作製することができる。
【０１１２】
簡単に記載すると、本発明の（場合により、異種アミノ酸配列をコードする核酸配列、例えば配列番号２１または２５に読み枠を合わせて融合された）ＣＣＲ５アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド（すなわち、その天然に存在する供給源から単離されたポリヌクレオチド、例えば、配列番号１，３，９，１７）を調節エレメント（例えば、プロモーターなど）の転写制御下に設置されて含む発現構築物（すなわち、発現ベクター）が宿主細胞に導入される。
【０１１３】
例えば、本発明のＣＣＲ５ペプチドをコードする核酸配列（例えば、配列番号９または１７）が、免疫グロブリンのｃＤＮＡ配列（例えば、配列番号２１または２５）に読み枠を合わせて連結される。ゲノムの免疫グロブリンフラグメントの連結もまた使用され得ることが理解される。この場合、融合は、発現のために免疫グロブリン調節配列の存在を必要とする。ＩｇＧの重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡを、ハイブリダイゼーションによって、または、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって、脾臓または末梢血リンパ球に由来するｃＤＮＡライブラリーから、発表された配列に基づいて単離することができる。ＣＣＲ５アミノ酸配列および免疫グロブリンをコードする核酸を、選択された宿主細胞における効率的な発現（これは本明細書中下記でさらに記載される）を導く発現構築物（ベクター）にタンデムで連結することができる。哺乳動物細胞における発現のために、ｐＲＫ５に基づくベクター［Ｓｃｈａｌｌ他、Ｃｅｌｌ、６１：３６１〜３７０（１９９０）］、および、ＣＤＭ８に基づくベクター［Ｓｅｅｄ、Ｎａｔｕｒｅ、３２９：８４０（１９８９）］を使用することができる。正確な接合を、オリゴヌクレオチド特異的欠失変異誘発［Ｚｏｌｌｅｒ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１０：６４８７（１９８２）；Ｃａｐｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３７：５２５〜５３１（１９８９）］を使用して、設計された接合部コドンの間の余分な配列を除くことによって生じさせることができる。それぞれの半分が所望の接合部の両側での配列に対して相補的である合成オリゴヌクレオチドを使用することができる；理想的には、これらは１１ｍｅｒ〜４８ｍｅｒである。あるいは、ＰＣＲ技術を、適切なベクターと読み枠を合わせて分子の２つの部分をつなぐために使用することができる。
【０１１４】
発現構築物を宿主細胞に導入する様々な方法が当該技術分野で広く知られており、これらには、エレクトロポレーション、リポフェクションおよび化学的形質転換（例えば、リン酸カルシウム）が含まれる。下記の実施例の節の実施例１もまた参照のこと。
【０１１５】
「形質転換された」細胞は、核酸配列によってコードされるキメラ分子の発現を可能にする好適な条件のもとで培養される。
【０１１６】
所定の期間の後、発現したキメラ分子が細胞または細胞培養物から回収され、精製が組換えポリペプチドの最終的な使用に従って行われる。
【０１１７】
利用された宿主／ベクター系に依存して、構成的プロモーターおよび誘導可能なプロモーター、転写エンハンサー配列、転写ターミネーターなどを含めて、数多くの好適な転写エレメントおよび翻訳エレメントはどれも、発現ベクターにおいて使用することができる［例えば、Ｂｉｔｔｅｒ他（１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３：５１６〜５４４を参照のこと］。
【０１１８】
（キメラ体をコードする）挿入されたコード配列の転写および翻訳のための必要なエレメントを含有すること以外に、本発明の発現構築物はまた、発現した融合タンパク質の安定性、産生、精製、収率または毒性を最適化するために操作された配列を含むことができる。
【０１１９】
様々な原核生物細胞または真核生物細胞を、融合タンパク質をコードする配列を発現させるための宿主−発現系として使用することができる。これらには、微生物、例えば、キメラ体をコードする配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌；キメラ体をコードする配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母など；キメラ体をコードする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））を感染させた植物細胞系、または、キメラ体をコードする配列を含有する組換え植物発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミドなど）により形質転換された植物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物発現システムが、好ましくは、本発明のキメラ体を発現させるために使用される。
【０１２０】
本発明の分子を発現させるための宿主細胞株の選択は、主として、発現ベクターに依存する。真核生物発現システムが、これらは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）を可能にするので好ましい（例えば、哺乳動物および昆虫）。別の検討事項は、要求されるタンパク質の量である。ミリグラム量を、多くの場合、一過性トランスフェクションによって産生させることができる。例えば、アデノウイルスＥＩＡにより形質転換された２９３ヒト胚性腎臓細胞株は、効率的な発現を可能にするためにリン酸カルシウム法の改変によってｐＲＫ５系ベクターにより一過性にトランスフェクションすることができる。ＣＤＭ８系ベクターを、ＤＥＡＥ−デキストラン法によってＣＯＳ細胞をトランスフェクションするために使用することができる［Ａｒｕｆｆｏ他、Ｃｅｌｌ、６１：１３０３〜１３１３（１９９０）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ他、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．ＵＳ、９：３４７〜３５３（１９９０）］。より多量のタンパク質が所望であれば、分子は宿主細胞株の安定的な形質転換の後で発現させることができる（実施例の節の実施例１を参照のこと）。分子のＮ末端における疎水性のリーダー配列の存在はトランスフェクション細胞による分子のプロセシングおよび分泌を確実にすることが理解される。
【０１２１】
細菌宿主系または酵母宿主系の使用は、製造コストを軽減するために好ましい場合があることが理解される。しかしながら、細菌宿主系はタンパク質グリコシル化機構を有していないので、産生後のグリコシル化が必要となる場合がある。
【０１２２】
いずれの場合でも、形質転換された細胞は、多量の組換えポリペプチドの発現を可能にする効果的な条件のもとで培養される。効果的な培養条件には、タンパク質の産生を可能にする効果的な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が含まれるが、これらに限定されない。効果的な培地は、細胞が、本発明の組換えキメラ分子を産生するために培養される任意の培地を示す。そのような培地には、典型的には、同化可能な炭素源、窒素源およびリン酸源、ならびに、適切な塩、ミネラル、金属および他の栄養分（例えば、ビタミンなど）を有する水溶液が含まれる。本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリ皿で培養することができる。培養は、組換え細胞のために適切である温度、ｐＨおよび酸素含有量で行うことができる。そのような培養条件は当業者の専門的知識の範囲内である。
【０１２３】
製造のために使用されたベクターおよび宿主の系に依存して、本発明の生じたタンパク質は組換え細胞内に留まり得るか、または、発酵培地に分泌され得るか、または、２つの細胞膜の間の空間（例えば、大腸菌における細胞周辺腔など）に分泌され得るか、または、細胞膜もしくはウイルス膜の外膜に保持され得る。
【０１２４】
培養での所定の時間の後、組換えタンパク質の回収が行われる。表現「組換えタンパク質を回収すること」は、タンパク質を含有する発酵培地全体を集めることを示し、分離または精製のさらなる工程を伴う必要はない。本発明のタンパク質は、様々な標準的なタンパク質精製技術（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマト分画および示差的可溶化（これらに限定されない）など）を使用して精製することができる。
【０１２５】
本発明の分子は、好ましくは、「実質的に純粋な」形態で回収される。本明細書中で使用される「実質的に純粋な」は、本明細書中下記で記載される種々の適用におけるタンパク質の効果的な使用を可能にする純度を示す。
【０１２６】
免疫グロブリンのアミノ酸配列を含むキメラ分子はアフィニティークロマトグラフィーによって都合良く精製することができる。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの好適性は、キメラ体において使用される免疫グロブリンＦｃドメインの種およびイソタイプに依存する。プロテインＡを、ヒトのγ１重鎖、γ２重鎖またはγ４重鎖に基づくキメラ分子を精製するために使用することができる［Ｌｉｎｄｍａｒｋ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、６２：１〜１３（１９８３）］。プロテインＧが、好ましくは、すべてのマウスイソタイプについて、また、ヒトγ３について使用される［Ｇｕｓｓ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．、５：１５６７〜１５７５（１９８６）］。アフィニティーリガンドが結合される固体担体は、ほとんどの場合アガロースであるが、他の固体担体もまた利用可能である。機械的に安定な固体担体（例えば、制御細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなど）は、アガロースを用いて達成され得るよりも速い流速および短い処理時間を可能にする。キメラ分子をプロテインＡまたはプロテインＧのアフィニティーカラムに結合するための条件は、Ｆｃドメインの特徴、すなわち、その種およびイソタイプによって完全に決定される。一般には、適切なリガンドが選ばれるとき、効率的な結合が未調整の培養液から直接に生じる。本発明のこの態様のキメラ分子の１つの特徴的な特徴が、ヒトγ１分子については、プロテインＡについての結合能が、同じＦｃタイプの抗体と比較して若干低下することである。本発明のこの態様の結合したキメラ分子は、酸性ｐＨ（約３．０以上）において、または、穏和なカオトロピック塩を含有する中性ｐＨ緩衝液で、そのどちらでも効率よく溶出することができる。このアフィニティークロマトグラフィー工程により、９５％を超える純度のキメラ分子調製物を得ることができる。医療用規格の純度が治癒的適用のためには不可欠である。
【０１２７】
当該技術分野で知られている他の方法を、免疫グロブリンの一部分を含むキメラ分子を精製するために、プロテインＡまたはプロテインＧでのアフィニティークロマトグラフィーの代わりに、あるいは、プロテインＡまたはプロテインＧでのアフィニティークロマトグラフィーに加えて使用することができる。そのようなキメラ分子はイオウ親和性（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ）ゲルクロマトグラフィー［Ｈｕｔｃｈｅｎｓ他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５９：２１７〜２２６（１９８６）］および固定化金属キレートクロマトグラフィー［Ａｌ−Ｍａｓｈｉｋｈｉ他、Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．、７１：１７５６〜１７６３（１９８８）］において抗体と同様に挙動する。しかしながら、抗体とは対照的に、イオン交換カラムでのその挙動は、その等電点によってだけではなく、そのキメラ性のために分子に存在し得る電荷双極子によってもまた決定される。
【０１２８】
従って、本発明は、ＣＣＲ５リガンドと結合する可溶性分子であってそこからの信号伝達を中和する分子の多数の構成を提供する。
【０１２９】
上述の分子は、治療効率を最大化するために非免疫原性であることが好ましい。
【０１３０】
本明細書中で使用される用語「非免疫原性」は、そのような物質が投与された対象において免疫応答を実質的に生じさせることができない物質を示す。例えば、ヒトにおいて非免疫原性であるとは、本発明のこの態様のキメラ分子をヒトの適切な組織と接触させたとき、キメラ分子に対する感受性または抵抗性の何らかの状態が、適切な潜伏期間（例えば、８日〜１４日）の後でのキメラ分子の２回目の投与のときにはっきり現れないことを意味する。
【０１３１】
以下の実施例の節の実施例５および６において示されるように、本発明者らは、本発明の分子を使用して、ＣＣＲ５によって媒介される細胞移動を阻害して進行中の免疫疾患を抑制することができ（実施例７）、本発明の分子の治療における使用を実証した。
【０１３２】
従って、本発明の別の態様によれば、その必要性のある対象におけるＣＣＲ５／ＣＣＲ５リガンド関連疾患を治療する方法が提供される。この方法は、本発明の分子の治癒効果的な量を対象に投与し、それにより、対象におけるＣＣＲ５／ＣＣＲ５リガンド関連疾患を治療することを含む。
【０１３３】
本明細書中で使用される用語「対象」は哺乳動物対象を示し、好ましくは、ヒト対象を示す。
【０１３４】
本明細書中で使用される用語「治療すること」は、ＣＣＲ５／ＣＣＲ５リガンド関連疾患の有害な作用を防止すること、治癒すること、逆戻りさせること、弱めること、緩和すること、最小限に抑えること、抑制すること、または、停止させることを示す。
【０１３５】
本明細書中で使用される表現「ＣＣＲ５／ＣＣＲ５リガンド関連疾患」は、発症または進行についてＣＣＲ５リガンドとＣＣＲ５との間での相互作用に依存する医学的状態（例えば、疾患、症候群、状態）を示す。
【０１３６】
ＣＣＲ５／ＣＣＲ５リガンド関連疾患の例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギー症状（例えば喘息）、炎症性腸疾患（例えば、クーロン病および潰瘍性大腸炎）、硬皮症、乾癬、炎症性皮膚病（例えば皮膚炎）、関節炎［例えばリウマチ様関節炎（Ｐｏｋｏｒｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ（２００５）６４：４８７−４９０；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００３）１３２：３７１−８；Ｎｉｓｓｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ（２００３）３０：１９２８−３４；Ｍａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ（１９９９）４２：９８１−８）］、多発性硬化症［Ｚａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ（２０００）１２３（９）：１８７４−１８８２］、全身性特発性エリテマトーデス、重症筋無力症、若年性発症糖尿病、腎炎（例えば糸球体腎炎）、自己免疫甲状腺炎、バーチエット病、癌（皮膚または器官の白血球浸潤を伴うような癌）、特定の血液悪性腫瘍、サイトカインによって誘導される毒性（例えば、敗血症ショックやエンドトキシンショック）、アテローム性動脈硬化、免疫抑制（例えば、エイズのような免疫不全症候群によるもの）、ウイルス病［例えばＨＩＶ  １および２（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９６）８６：３６７−３７７）］。
【０１３７】
様々な例の炎症性疾患が本発明の範囲に含まれるが、これらに限定されない。
【０１３８】
本明細書中で使用される表現「炎症性疾患」は、慢性炎症性疾患および障害、並びに急性炎症性疾患および障害を含むが、これらに限定されない。かかる疾患および状態の例は以下にまとめられる。
【０１３９】
過敏症に関連する炎症性疾患
過敏症の例には、Ｉ型過敏症、ＩＩ型過敏症、ＩＩＩ型過敏症、ＩＶ型過敏症、即時過敏症、抗体媒介過敏症、免疫複合体媒介過敏症、Ｔリンパ球媒介過敏症およびＤＴＨが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４０】
Ｉ型過敏症または即時過敏症、例えば、喘息など。
【０１４１】
ＩＩ型過敏症には、下記の疾患が含まれるが、それらに限定されない：リウマチ様疾患、リウマチ様自己免疫疾患、リウマチ様関節炎（Ｋｒｅｎｎ  Ｖ．他、Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ、２０００（Ｊｕｌ）、１５（３）：７９１）、脊椎炎、強直性脊椎炎（Ｊａｎ  Ｖｏｓｗｉｎｋｅｌ他、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ、２００１、３（３）：１８９）、全身性疾患、全身性自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス（Ｅｒｉｋｓｏｎ  Ｊ．他、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ、１９９８、１７（１−２）：４９）、硬化症、全身性硬化症（Ｒｅｎａｕｄｉｎｅａｕ  Ｙ．他、Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９９（Ｍａｒ）、６（２）：１５６）；Ｃｈａｎ  ＯＴ．他、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ、１９９９（Ｊｕｎ）、１６９：１０７）、腺疾患、腺の自己免疫疾患、膵臓の自己免疫疾患、糖尿病、Ｉ型糖尿病（Ｚｉｍｍｅｔ  Ｐ．、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ、１９９６（Ｏｃｔ）、３４  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ１２５）、甲状腺疾患、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴス病（Ｏｒｇｉａｚｚｉ  Ｊ．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ、２０００（Ｊｕｎ）、２９（２）：３３９）、甲状腺炎、自発性自己免疫性甲状腺炎（Ｂｒａｌｅｙ−Ｍｕｌｌｅｎ  Ｈ．およびＹｕ  Ｓ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００（Ｄｅｃ  １５）、１６５（１２）：７２６２）、橋本甲状腺炎（Ｔｏｙｏｄａ  Ｎ．他、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ、１９９９（Ａｕｇ）、５７（８）：１８１０）、粘液水腫、特発性粘液水腫（Ｍｉｔｓｕｍａ  Ｔ．、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ、１９９９（Ａｕｇ）、５７（８）：１７５９）、自己免疫性生殖疾患、卵巣疾患、卵巣の自己免疫性（Ｇａｒｚａ  ＫＭ．他、Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８（Ｆｅｂ）、３７（２）：８７）、自己免疫性抗精子不妊症（Ｄｉｅｋｍａｎ  ＡＢ．他、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００（Ｍａｒ）、４３（３）：１３４）、反復した胎児消失（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ．他、Ｌｕｐｕｓ、１９９８、７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１０７−９）、神経変性疾患、神経学的疾患、神経学的自己免疫疾患、多発性硬化症（Ｃｒｏｓｓ  ＡＨ．他、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ、２００１（Ｊａｎ  １）、１１２（１−２）：１）、アルツハイマー病（Ｏｒｏｎ  Ｌ．他、Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｓｕｐｐｌ、１９９７；４９：７７）、重症筋無力症（Ｉｎｆａｎｔｅ  ＡＪ．およびＫｒａｉｇ  Ｅ、Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９９、１８（１−２）：８３）、運動神経障害（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ＡＪ．、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０００（Ｍａｙ）、７（３）：１９１）、ギラン・バレー症候群、神経障害および自己免疫性神経障害（Ｋｕｓｕｎｏｋｉ  Ｓ．、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ、２０００（Ａｐｒ）、３１９（４）：２３４）、筋無力症疾患、ランバード・イートン筋無力症症候群（Ｔａｋａｍｏｒｉ  Ｍ．、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ、２０００（Ａｐｒ）、３１９（４）：２０４）、腫瘍随伴性神経学的疾患、小脳萎縮症、腫瘍随伴性小脳萎縮症、腫瘍非随伴性スティッフマン症候群、小脳萎縮症、進行性小脳萎縮症、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索��化症、シドナム舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群、多発性内分泌腺症、自己免疫性多発性内分泌腺症（Ａｎｔｏｉｎｅ  ＪＣ．およびＨｏｎｎｏｒａｔ  Ｊ．、Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｌ（Ｐａｒｉｓ）、２０００（Ｊａｎ）、１５６（１）：２３）、神経障害、異常免疫性神経障害（Ｎｏｂｉｌｅ−Ｏｒａｚｉｏ  Ｅ．他、Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｕｐｐｌ、１９９９、５０：４１９）；ニューロミオトニー、後天性ニューロミオトニー、先天性多発性関節拘縮症（Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ａ．他、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１９９８（Ｍａｙ  １３）、８４１：４８２）、心臓血管疾患、心臓血管の自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化（Ｍａｔｓｕｕｒａ  Ｅ．他、Ｌｕｐｕｓ、１９９８、７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１３５）、心筋梗塞（Ｖａａｒａｌａ  Ｏ．、Ｌｕｐｕｓ、１９９８、７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１３２）、血栓症（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ．他、Ｌｕｐｕｓ、１９９８、７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１０７〜９）、肉芽腫症、ヴェーゲナー肉芽腫症、動脈炎、高安動脈炎および川崎症候群（Ｐｒａｐｒｏｔｎｉｋ  Ｓ．他、Ｗｉｅｎ  Ｋｌｉｎ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ、２０００（Ａｕｇ  ２５）、１１２（１５−１６）：６６０）；抗第ＶＩＩＩ因子の自己免疫疾患（Ｌａｃｒｏｉｘ−Ｄｅｓｍａｚｅｓ  Ｓ．他、Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ、２０００、２６（２）：１５７）；血管炎、壊死性小血管血管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、糸球体腎炎、少免疫性巣状壊死性糸球体腎炎、半月体形成性糸球体腎炎（Ｎｏｅｌ  ＬＨ．、Ａｎｎ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎｅ（Ｐａｒｉｓ）、２０００（Ｍａｙ）、１５１（３）：１７８）；抗リン脂質症候群（Ｆｌａｍｈｏｌｚ  Ｒ．他、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ、１９９９、１４（４）：１７１）；心不全、心不全におけるアゴニスト様β−アドレナリン作動性受容体抗体（Ｗａｌｌｕｋａｔ  Ｇ．他、Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ、１９９９（Ｊｕｎ  １７）、８３（１２Ａ）：７５Ｈ）、血小板減少性紫斑病（Ｍｏｃｃｉａ  Ｆ．、Ａｎｎ  Ｉｔａｌ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔ、１９９９（Ａｐｒ−Ｊｕｎ）、１４（２）：１１４）；溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血（Ｅｆｒｅｍｏｖ  ＤＧ．他、Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ、１９９８（Ｊａｎ）、２８（３−４）：２８５）、胃腸疾患、胃腸管の自己免疫疾患、腸疾患、慢性炎症性腸疾患（Ｇａｒｃｉａ  Ｈｅｒｏｌａ  Ａ．他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２０００（Ｊａｎ）、２３（１）：１６）、セリアック病（Ｌａｎｄａｕ  ＹＥ．およびＳｈｏｅｎｆｅｌｄ  Ｙ．、Ｈａｒｅｆｕａｈ、２０００（Ｊａｎ  １６）、１３８（２）：１２２）、筋組織の自己免疫疾患、筋炎、自己免疫性筋炎、シェーグレン症候群（Ｆｅｉｓｔ  Ｅ．他、Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００（Ｓｅｐ）、１２３（１）：９２）；平滑筋の自己免疫疾患（Ｚａｕｌｉ  Ｄ．他、Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ、１９９９（Ｊｕｎ）、５３（５−６）：２３４）、肝疾患、肝臓の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎（Ｍａｎｎｓ  ＭＰ．、Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２０００（Ａｕｇ）、３３（２）：３２６）��よび原発性胆汁性肝硬変（Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ  ＣＰ．他、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ、１９９９（Ｊｕｎ）、１１（６）：５９５）。
【０１４２】
ＩＶ型過敏症またはＴ細胞媒介過敏症には、下記の疾患が含まれるが、それらに限定されない：リウマチ様疾患、リウマチ様関節炎（Ｔｉｓｃｈ  Ｒ、ＭｃＤｅｖｉｔｔ  ＨＯ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９４（Ｊａｎ  １８）、９１（２）：４３７）、全身性疾患、全身性自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス（Ｄａｔｔａ  ＳＫ．、Ｌｕｐｕｓ、１９９８、７（９）：５９１）、腺疾患、腺の自己免疫疾患、膵臓疾患、膵臓の自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病（Ｃａｓｔａｎｏ  Ｌ．およびＥｉｓｅｎｂａｒｔｈ  ＧＳ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８：６４７）、甲状腺疾患、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴス病（Ｓａｋａｔａ  Ｓ．他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１９９３（Ｍａｒ）、９２（１）：７７）、卵巣疾患（Ｇａｒｚａ  ＫＭ．他、Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８（Ｆｅｂ）、３７（２）：８７）、前立腺炎、自己免疫性前立腺炎（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＲＢ．他、Ｕｒｏｌｏｇｙ、１９９７（Ｄｅｃ）、５０（６）：８９３）、多腺性症候群、自己免疫性多腺性症候群、Ｉ型自己免疫性多腺性症候群（Ｈａｒａ  Ｔ．他、Ｂｌｏｏｄ、１９９１（Ｍａｒ  １）、７７（５）：１１２７）、神経学的疾患、自己免疫性神経学的疾患、多発性硬化症、神経炎、視神経炎（Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ  Ｍ．他、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１９９４（Ｍａｙ）、５７（５）：５４４）、重症筋無力症（Ｏｓｈｉｍａ  Ｍ．他、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９０（Ｄｅｃ）、２０（１２）：２５６３）、スティッフマン症候群（Ｈｉｅｍｓｔｒａ  ＨＳ．他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００１（Ｍａｒ  ２７）、９８（７）：３９８８）、心臓血管疾患、シャガス病における心臓の自己免疫性（Ｃｕｎｈａ−Ｎｅｔｏ  Ｅ．他、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１９９６（Ｏｃｔ  １５）、９８（８）：１７０９）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（Ｓｅｍｐｌｅ  ＪＷ．他、Ｂｌｏｏｄ、１９９６（Ｍａｙ  １５）、８７（１０）：４２４５）、抗ヘルパーＴリンパ球自己免疫性（Ｃａｐｏｒｏｓｓｉ  ＡＰ．他、Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８、１１（１）：９）、溶血性貧血（Ｓａｌｌａｈ  Ｓ．他、Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ、１９９７（Ｍａｒ）、７４（３）：１３９）、肝疾患、肝臓の自己免疫疾患、肝炎、慢性活動性肝炎（Ｆｒａｎｃｏ  Ａ．他、Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、１９９０（Ｍａｒ）、５４（３）：３８２）、胆汁性肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（Ｊｏｎｅｓ  ＤＥ．、Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ（Ｃｏｌｃｈ）、１９９６（Ｎｏｖ）、９１（５）：５５１）、腎疾患、腎臓の自己免疫疾患、腎炎、間質性腎炎（Ｋｅｌｌｙ  ＣＪ．、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ、１９９０（Ａｕｇ）、１（２）：１４０）、結合組織疾患、耳疾患、自己免疫性結合組織疾患、自己免疫性耳疾患（Ｙｏｏ  ＴＪ．他、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９４（Ａｕｇ）、１５７（１）：２４９）、内耳の疾患（Ｇｌｏｄｄｅｋ  Ｂ．他、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１９９７（Ｄｅｃ  ２９）、８３０：２６６）、皮膚疾患、皮膚病、皮膚の疾患、水疱性皮膚疾患、尋常性天��瘡、水疱性類天疱瘡および落葉状天疱瘡。
【０１４３】
遅発型過敏症の例には、接触性皮膚炎および薬疹が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４４】
様々なタイプのＴリンパ球媒介過敏症の例には、ヘルパーＴリンパ球および細胞障害性Ｔリンパ球が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４５】
ヘルパーＴリンパ球媒介過敏症の例には、Ｔｈ１リンパ球媒介過敏症およびＴｈ２リンパ球媒介過敏症が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４６】
自己免疫疾患
これには、心臓血管疾患、リウマチ様疾患、腺疾患、胃腸疾患、皮膚疾患、肝疾患、神経学的疾患、筋疾患、腎疾患、生殖関連疾患、結合組織疾患および全身性疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４７】
自己免疫性による心臓血管疾患の例には、アテローム性動脈硬化（Ｍａｔｓｕｕｒａ  Ｅ他、Ｌｕｐｕｓ、１９９８、７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１３５）、心筋梗塞（Ｖａａｒａｌａ  Ｏ、Ｌｕｐｕｓ、１９９８、７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１３２）、血栓症（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ他、Ｌｕｐｕｓ、１９９８、７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１０７〜９）、ヴェーゲナー肉芽腫症、高安動脈炎および川崎症候群（Ｐｒａｐｒｏｔｎｉｋ  Ｓ他、Ｗｉｅｎ  Ｋｌｉｎ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ、２０００（Ａｕｇ  ２５）、１１２（１５−１６）：６６０）、抗第ＶＩＩＩ因子による自己免疫疾患（Ｌａｃｒｏｉｘ−Ｄｅｓｍａｚｅｓ  Ｓ他、Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ、２０００、２６（２）：１５７）、壊死性小血管血管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、少免疫性巣状壊死性糸球体腎炎および半月体形成性糸球体腎炎（Ｎｏｅｌ  ＬＨ、Ａｎｎ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎｅ（Ｐａｒｉｓ）、２０００（Ｍａｙ）、１５１（３）：１７８）、抗リン脂質症候群（Ｆｌａｍｈｏｌｚ  Ｒ他、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ、１９９９、１４（４）：１７１）、抗体誘導の心不全（Ｗａｌｌｕｋａｔ  Ｇ他、Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ、１９９９（Ｊｕｎ  １７）、８３（１２Ａ）：７５Ｈ）、血小板減少性紫斑病（Ｍｏｃｃｉａ  Ｆ、Ａｎｎ  Ｉｔａｌ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔ、１９９９（Ａｐｒ−Ｊｕｎ）、１４（２）：１１４；Ｓｅｍｐｌｅ  ＪＷ他、Ｂｌｏｏｄ、１９９６（Ｍａｙ  １５）、８７（１０）：４２４５）、自己免疫性溶血性貧血（Ｅｆｒｅｍｏｖ  ＤＧ他、Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ、１９９８（Ｊａｎ）、２８（３−４）：２８５；Ｓａｌｌａｈ  Ｓ他、Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ、１９９７（Ｍａｒ）、７４（３）：１３９）、シャガス病における心臓の自己免疫性（Ｃｕｎｈａ−Ｎｅｔｏ  Ｅ他、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１９９６（Ｏｃｔ  １５）、９８（８）：１７０９）、および、抗ヘルパーＴリンパ球による自己免疫性（Ｃａｐｏｒｏｓｓｉ  ＡＰ他、Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８、１１（１）：９）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４８】
自己免疫によるリウマチ様疾患の例には、リウマチ様関節炎（Ｋｒｅｎｎ  Ｖ他、Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ、２０００（Ｊｕｌ）、１５（３）：７９１；Ｔｉｓｃｈ  Ｒ、ＭｃＤｅｖｉｔｔ  ＨＯ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ｕｎｉｔｓ  Ｓ  Ａ、１９９４（Ｊａｎ  １８）、９１（２）：４３７）および強直性脊椎炎（Ｊａｎ  Ｖｏｓｗｉｎｋｅｌ他、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ、２００１、３（３）：１８９）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４９】
自己免疫による腺疾患の例には、膵臓疾患、Ｉ型糖尿病、甲状腺疾患、グレーヴス病、甲状腺炎、突発性自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、特発性粘液水腫、卵巣の自己免疫性、自己免疫性抗精子不妊症、自己免疫性前立腺炎およびＩ型自己免疫性多腺性症候群が含まれるが、これらに限定されない。疾患には、膵臓の自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病（Ｃａｓｔａｎｏ  ＬおよびＥｉｓｅｎｂａｒｔｈ  ＧＳ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８：６４７；Ｚｉｍｍｅｔ  Ｐ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ、１９９６（Ｏｃｔ）、３４  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ１２５）、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴス病（Ｏｒｇｉａｚｚｉ  Ｊ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ、２０００（Ｊｕｎ）、２９（２）：３３９；Ｓａｋａｔａ  Ｓ他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１９９３（Ｍａｒ）、９２（１）：７７）、突発性自己免疫性甲状腺炎（Ｂｒａｌｅｙ−Ｍｕｌｌｅｎ  ＨおよびＹｕ  Ｓ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００（Ｄｅｃ  １５）、１６５（１２）：７２６２）、橋本甲状腺炎（Ｔｏｙｏｄａ  Ｎ他、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ、１９９９（Ａｕｇ）、５７（８）：１８１０）、特発性粘液水腫（Ｍｉｔｓｕｍａ  Ｔ、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ、１９９９（Ａｕｇ）、５７（８）：１７５９）、卵巣の自己免疫性（Ｇａｒｚａ  ＫＭ他、Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８（Ｆｅｂ）、３７（２）：８７）、自己免疫性抗精子不妊症（Ｄｉｅｋｍａｎ  ＡＢ他、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００（Ｍａｒ）、４３（３）：１３４）、自己免疫性前立腺炎（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＲＢ他、Ｕｒｏｌｏｇｙ、１９９７（Ｄｅｃ）、５０（６）：８９３）およびＩ型自己免疫性多腺性症候群（Ｈａｒａ  Ｔ他、Ｂｌｏｏｄ、１９９１（Ｍａｒ  １）、７７（５）：１１２７）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５０】
自己免疫による胃腸疾患の例には、慢性炎症性腸疾患（Ｇａｒｃｉａ  Ｈｅｒｏｌａ  Ａ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２０００（Ｊａｎ）、２３（１）：１６）、セリアック病（Ｌａｎｄａｕ  ＹＥおよびＳｈｏｅｎｆｅｌｄ  Ｙ、Ｈａｒｅｆｕａｈ、２０００（Ｊａｎ  １６）、１３８（２）：１２２）、大腸炎、回腸炎およびクローン病が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５１】
自己免疫による皮膚疾患の例には、自己免疫による水疱性の皮膚疾患（例えば、尋常性天疱瘡、水疱性天疱瘡および落葉状天疱瘡など、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５２】
自己免疫による肝疾患の例には、肝炎、自己免疫性慢性活動性肝炎（Ｆｒａｎｃｏ  Ａ他、Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、１９９０（Ｍａｒ）、５４（３）：３８２）、原発性胆汁性肝硬変（Ｊｏｎｅｓ  ＤＥ、Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ（Ｃｏｌｃｈ）、１９９６（Ｎｏｖ）、９１（５）：５５１；Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ  ＣＰ他、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ、１９９９（Ｊｕｎ）、１１（６）：５９５）および自己免疫性肝炎（Ｍａｎｎｓ  ＭＰ、Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２０００（Ａｕｇ）、３３（２）：３２６）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５３】
自己免疫による神経学的疾患の例には、多発性硬化症（Ｃｒｏｓｓ  ＡＨ他、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ、２００１（Ｊａｎ  １）、１１２（１−２）：１）、アルツハイマー病（Ｏｒｏｎ  Ｌ他、Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｓｕｐｐｌ、１９９７、４９：７７）、重症筋無力症（Ｉｎｆａｎｔｅ  ＡＪおよびＫｒａｉｇ  Ｅ、Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９９、１８（１−２）：８３；Ｏｓｈｉｍａ  Ｍ他、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９０（Ｄｅｃ）、２０（１２）：２５６３）、神経障害、運動神経障害（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ＡＪ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０００（Ｍａｙ）、７（３）：１９１）、ギラン・バレー症候群および自己免疫性神経障害（Ｋｕｓｕｎｏｋｉ  Ｓ、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ、２０００（Ａｐｒ）、３１９（４）：２３４）、筋無力症、ランバード・イートン筋無力症症候群（Ｔａｋａｍｏｒｉ  Ｍ、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ、２０００（Ａｐｒ）、３１９（４）：２０４）、腫瘍随伴性神経学的疾患、小脳萎縮症、腫瘍随伴性の小脳萎縮症およびスティッフマン症候群（Ｈｉｅｍｓｔｒａ  ＨＳ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ｕｎｉｔｓ  Ｓ  Ａ、２００１（Ｍａｒ  ２７）、９８（７）：３９８８）；腫瘍非随伴性スティッフマン症候群、進行性小脳萎縮症、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シドナム舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群および自己免疫性多発性内分泌腺症（Ａｎｔｏｉｎｅ  ＪＣおよびＨｏｎｎｏｒａｔ  Ｊ、Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｌ（Ｐａｒｉｓ）、２０００（Ｊａｎ）、１５６（１）：２３）；異常免疫による神経障害（Ｎｏｂｉｌｅ−Ｏｒａｚｉｏ  Ｅ他、Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｕｐｐｌ、１９９９、５０：４１９）；後天性ニューロミオトニー、先天性多発性関節拘縮症（Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ａ他、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１９９８（Ｍａｙ  １３）、８４１：４８２）、神経炎、視神経炎（Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ  Ｍ他、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１９９４（Ｍａｙ）、５７（５）：５４４）および神経変性疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５４】
自己免疫による筋疾患の例には、筋炎、自己免疫性筋炎および原発性シェーグレン症候群（Ｆｅｉｓｔ  Ｅ他、Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００（Ｓｅｐ）、１２３（１）：９２）、および、平滑筋の自己免疫疾患（Ｚａｕｌｉ  Ｄ他、Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ、１９９９（Ｊｕｎ）、５３（５−６）：２３４）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５５】
自己免疫による腎疾患の例には、腎炎、および、自己免疫性間質性腎炎（Ｋｅｌｌｙ  ＣＪ、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ、１９９０（Ａｕｇ）、１（２）：１４０）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５６】
生殖に関連する自己免疫疾患の例には、反復した胎児消失（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ他、Ｌｕｐｕｓ、１９９８、７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１０７〜９）が含まれるが、これに限定されない。
【０１５７】
自己免疫による結合組織疾患の例には、耳の疾患、自己免疫による耳の疾患（Ｙｏｏ  ＴＪ他、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９４（Ａｕｇ）、１５７（１）：２４９）、および、内耳の自己免疫疾患（Ｇｌｏｄｄｅｋ  Ｂ他、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１９９７（Ｄｅｃ  ２９）、８３０：２６６）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５８】
自己免疫全身性疾患の例には、全身性エリテマトーデス（Ｅｒｉｋｓｏｎ  Ｊ他、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ、１９９８、１７（１−２）：４９）および全身性硬化症（Ｒｅｎａｕｄｉｎｅａｕ  Ｙ他、Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９９（Ｍａｒ）、６（２）：１５６；Ｃｈａｎ  ＯＴ他、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ、１９９９（Ｊｕｎ）、１６９：１０７）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５９】
感染性疾患
感染性疾患の例には、慢性の感染性疾患、亜急性の感染性疾患、急性の感染性疾患、ウイルス疾患、細菌疾患、原虫疾患、寄生虫疾患、真菌疾患、マイコプラズマ疾患およびプリオン疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６０】
移植片拒絶疾患
移植片の移植に関連する疾患の例には、移植片拒絶、慢性の移植片拒絶、亜急性の移植片拒絶、超急性の移植片拒絶、急性の移植片拒絶および移植片対宿主病が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６１】
アレルギー性疾患
アレルギー性疾患の例には、喘息、皮疹、じんま疹、花粉アレルギー、ほこり・ダニアレルギー、毒液アレルギー、化粧品アレルギー、ラテックスアレルギー、化学物質アレルギー、薬物アレルギー、昆虫咬傷アレルギー、動物鱗屑アレルギー、刺毛植物アレルギー、ツタウルシアレルギーおよび食物アレルギーが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６２】
ガン性疾患
ガンの例には、ガン腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が含まれるが、これらに限定されない。ガン性疾患の具体的な例には、下記の疾患が含まれるが、それらに限定されない：骨髄性白血病、例えば、慢性骨髄性白血病、成熟に伴う急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、増大した好塩基球を伴う急性非リンパ球性白血病、急性単球性白血球、好酸球増加症を伴う急性骨髄単球性白血病など；悪性リンパ腫、例えば、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫など；リンパ性白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病など；骨髄増殖性疾患、例えば、固形腫瘍、良性髄膜腫、唾液腺の混合腫瘍、慢性腺腫など；腺ガン、例えば、小細胞肺ガン、腎臓、子宮、前立腺、膀胱、卵巣、結腸、肉腫、脂肪肉腫、粘液様、滑膜肉腫、横紋筋肉腫（肺胞）、骨外性粘液様軟骨肉腫、ユーイング肉腫など。他のガンには、精巣および卵巣の未分化胚細胞腫、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、悪性メラノーマ、中脾腫、乳房、皮膚、前立腺および卵巣が含まれる。
【０１６３】
本発明の分子は、それ自体で、あるいは、本発明の分子が好適なキャリアまたは賦形剤と混合される医薬組成物において対象に投与することができる。
【０１６４】
従って、本発明の別の態様によれば、医薬組成物および医薬的に許容され得るキャリアが提供される。
【０１６５】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。好ましくは、医薬組成物は免疫原性ではない。
【０１６６】
本明細書中において、用語「有効成分（活性成分）」は、生物学的効果を担うことができる本発明の分子を示す。
【０１６７】
以降、交換可能に使用されうる表現「医薬的に許容され得るキャリア」および表現「生理学的に許容され得るキャリア」は、生物に対する著しい刺激を生じさせず、投与された化合物の生物学的な活性および性質を阻害しないキャリアまたは希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に含まれる。
【０１６８】
従って、例えば、本発明の医薬的に許容され得るキャリアはリポアミン酸を含むことができる。
【０１６９】
あるいは、本発明によって使用される医薬的に許容され得るキャリアは埋め込み用物質（例えば、ポリオール（すなわち、炭水化物）など）を含むことができる。賦形剤としての使用に好適である炭水化物の限定されない例には、マルトデキストリン（例えば、Ｇｌｕｃｉｄｅｘ、Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）、トレハロース（例えば、Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、Ｍｅｒｃｋ）、セロビオース、グルコース、フルクトース、マルツロース、ｉｓｏ−マルツロース、ラクツロース、マルトース、ゲントビオース、ラクトース、イソマルトース、マルチトール（例えば、Ｍａｌｔｉｓｏｒｂ、Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）、ラクチトール、エリトリトール、パラチニトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、ズルシトールおよびリビトール、スクロース、ラフィノース、ゲンチアノース、プランテオース、ベルバスコース、スタキオース、メレジトース、デキストランおよびイノシトールが含まれる。
【０１７０】
さらに代替として、本発明によって使用される医薬的に許容され得るキャリアは、経口投与に好適なミクロスフェアである。例えば、ミクロスフェアは、本質的には米国特許第６８４９２７１号（Ｖａｇｈｅｆｉ他）（これは参考として全体が本明細書中に組み込まれる）に記載されるように、胃において見出されるｐＨレベル（４未満のｐＨレベル）での溶解または酸分解に対して抵抗性がある有機物質の水不溶性マトリックスを含むことができる。そのような有機マトリックス物質は、例えば、トリグリセリド、水素化植物油、ワックスまたはワックスの混合物、ポリアルコキシアルキルエーテル、ポリアルコキシアルキルエステル、および、水不溶性の部分的に分解されたタンパク質が可能である。
【０１７１】
バイオコンジュゲート化ポリマー（例えば、本発明のＰＥＧ化ＣＣＲ５ペプチド）は、医薬的に許容され得るキャリアにおいて、または、医薬的に許容され得るキャリアの一部として使用することができ、従って、ＣＣＲ５アミノ酸配列を送達するためのキャリア分子として役立ち、一方で、同時に送達ビヒクルの成分として役立つことが理解される。この二重使用の好ましい実施形態が、例えば、米国特許出願公開第２００３０１８６８６９号（Ｐｏｉａｎｉ，Ｇｅｏｒｇｅ他）（これは参考として全体が本明細書中に組み込まれる）に記載されるように、リポソームビヒクル（例えば、ＰＥＧコンジュゲート化リポソーム）である。
【０１７２】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１７３】
薬物の配合および投与のための様々な技術が“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出され得る（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１７４】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれ得る。
【０１７５】
あるいは、例えば、患者の身体の特定部位に直接的に調製物の注射をすることによって、全身的な方法よりも局所的に調製物を投与しうる。
【０１７６】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
【０１７７】
本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用され得る調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の医薬的に許容され得るキャリアを使用して従来の様式で配合することできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０１７８】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な生理的食塩緩衝液など）において配合することができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０１７９】
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物をこの分野で広く知られている医薬的に許容され得るキャリアと組み合わせることによって容易に配合され得る。そのようなキャリアは、医薬組成物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物を、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し錠剤または糖衣錠コアを得るために、所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤には、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーがある。所望する場合には、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
【０１８０】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料を、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えることができる。
【０１８１】
経口使用され得る医薬組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分を好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。また、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【０１８２】
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１８３】
鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量が、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定され得る。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジで、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジを配合することができる。
【０１８４】
本明細書中に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合することができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供され得る。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、また、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０１８５】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態での活性調製物の水溶液が含まれる。また、有効成分の懸濁物を適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０１８６】
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン非含有水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態にすることができる。
【０１８７】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合することができる。
【０１８８】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物には、有効成分が、その意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、「治療効果的な量（治癒効果的な量）」は、治療されている対象の病状（例えば、虚血）を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、または、治療されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分（例えば、核酸構築物）の量を意味する。
【０１８９】
治療効果的な量の決定は、特に本明細書中に示される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１９０】
本発明の方法において使用される任意の調製物について、用量または治療効果的な量は、最初はインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、用量は所望の濃度または力価を得るために動物モデルにおいて配合することが可能である（以下の実施例の節の実施例７，９，１０参照）。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０１９１】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物における、インビトロで標準的な薬学的手法によって、明らかにすることができる。これらのインビトロでの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に対する投薬量範囲を決定するために使用することができる。投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（Ｆｉｎｇｌ，ｅｔ  ａｌ，（１９７５年）「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１ｐ．１参照）。
【０１９２】
投薬量および投薬間隔は、生物学的作用を誘導または抑制するための有効成分の十分な血漿中レベルまたは脳内レベル（すなわち、最小有効濃度、ＭＥＣ）を提供するために個々に調節することができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について変化するが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は、個体の特徴、および、投与経路に依存する。様々な検出アッセイを、血漿中濃度を求めるために使用することができる。
【０１９３】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行うことができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０１９４】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている患者、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存する。
【０１９５】
本発明の組成物は、所望されるならば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパックなど）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。医薬的に許容され得るキャリアに配合された本発明の調製物を含む組成物もまた、上で詳細に記載されたように、適応される状態の治療のために調製され、適切な容器に入れられ、かつ標識され得る。
【０１９６】
本発明のこの態様の分子（例えば、キメラのタンパク質性分子）は遺伝子療法によって対象に提供され得ることが理解される。従って、上記の哺乳動物発現構築物を、本明細書中上記で記載される任意の好適な投与様式を用いて対象に投与することができる（すなわち、インビボ遺伝子療法）。あるいは、核酸構築物は、適切な遺伝子送達ビヒクル／方法（トランスフェクション、形質導入、相同的組換えなど）および必要とされるような発現システムによって好適な細胞に導入され、その後、改変された細胞が培養で拡大され、対象に戻される（すなわち、エクスビボ遺伝子療法）。
【０１９７】
現在好ましいインビボ核酸移入技術には、ウイルス構築物または非ウイルス構築物（例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルスまたはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）など）によるトランスフェクション、および、脂質に基づくシステムが含まれる。遺伝子の脂質媒介による移入のための有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌなどである［Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１４（１）：５４〜６５（１９９６）］。遺伝子療法において使用される最も好ましい構築物はウイルスであり、最も好ましくは、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスまたはレトロウイルスである。ウイルス構築物（例えば、レトロウイルス構築物など）は、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサー、または、遺伝子座を規定するエレメント、あるいは、遺伝子発現を他の手段（例えば、メッセンジャーの選択スプライシング、核ＲＮＡ輸出または翻訳後修飾など）によって制御する他のエレメントを含む。そのようなウイルス構築物はまた、ウイルス構築物に既に存在しない限り、パッケージングシグナル、長末端反復（ＬＴＲ）またはその一部、ならびに、使用されたウイルスに対して適切なプラス鎖およびマイナス鎖のプライマー結合部位を含む。加えて、そのような構築物は、典型的には、構築物が置かれている宿主細胞からペプチドを分泌させるためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は哺乳動物のシグナル配列であり、例えば、Ｉｇκのリーダー配列（例えば、配列番号７および配列番号８など）である。場合により、構築物はまた、ポリアデニル化を導くシグナル、ならびに、１つ以上の制限部位、および、翻訳終結配列を含むことができる。例として、そのような構築物は典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、および、３’ＬＴＲまたはその一部分を含む。非ウイルスである他のベクターを使用することができる（例えば、カチオン性脂質、ポリリシンおよびデンドリマーなど）。
【０１９８】
ＣＣＲ５リガンドに対する本発明のＣＣＲ５ペプチドの親和性はＣＣＲ５リガンドの精製および検出におけるその使用を可能にする。
【０１９９】
従って、本発明のさらに別の態様によれば、ＣＣＲ５のＮ末端ドメインを有さないＣＣＲ５アミノ酸配列に結合したタグを含む分子であって、前記ＣＣＲ５アミノ酸配列がＣＣＲ５リガンドと結合することができる分子が提供される。
【０２００】
本明細書中で使用される用語「タグ」は、結合性パートナー（例えば、抗体分子、キレーター分子またはアビジン（ビオチン）分子など）によって特異的に認識される成分を示す。タグは、その生物学的活性（例えば、リガンド結合）を妨害しない限り、ＣＣＲ５ペプチドのＣ末端またはＮ末端に設置することができる。
【０２０１】
例えば、タグポリペプチドは、それに対する抗体を作製することができるエピトープを提供するための十分な残基を有するが（すなわち、エピトープタグ）、ＣＣＲ５ペプチドの生物学的活性を妨害しないように十分に短い。エピトープタグは好ましくはまた、それに対する抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないようにかなり特有である。好適なタグポリペプチドは一般には少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、通常的には約８個〜５０個のアミノ酸残基（好ましくは、約９個〜３０個の残基）を有する。例えば、ポリヒスチジン配列が好ましく、この配列はニッケルと結合し、これにより、記載されたように［Ｌｉｎｄｓａｙ他、Ｎｅｕｒｏｎ、１７：５７１〜５７４（１９９６）］、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによるタグ化タンパク質の単離を可能にする。
【０２０２】
ＣＣＲ５のかかるエピトープタグ化形態が望ましい。これは、その存在がタグポリペプチドに対する標識化抗体を使用して検出され得るからである。また、エピトープタグの提供は、本発明のＣＣＲ５ペプチドが、抗タグ抗体を使用するアフィニティー精製によって容易に精製されることを可能にする。抗体を伴うアフィニティー精製技術および診断アッセイが本明細書中下記に記載される。
【０２０３】
様々なタグポリペプチドおよびそれらのそれぞれの抗体が当該技術分野では広く知られている。例には、インフルエンザＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、８：２１５９〜２１６５（１９８８））；ｃ−ｍｙｃタグおよびそれに対する抗体の８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０（Ｅｖａｎ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、５：３６１０〜３６１６（１９８５））；および、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）およびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３（６）：５４７〜５５３（１９９０））が挙げられる。他のタグポリペプチドが開示されている。例には、Ｆｌａｇペプチド［Ｈｏｐｐ他、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１２０４〜１２１０（１９８８）］、ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５５：１９２〜１９４（１９９２）、α−チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：１５１６３〜１５１６６（１９９１）］、および、Ｔ７の遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６３９３〜６３９７（１９９０）］が挙げられる。タグポリペプチドが選択されると、それに対する抗体を、当該技術分野で広く知られている方法を使用して作製することができる。そのような抗体が、例えば、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、米国）などから市販されている。
【０２０４】
本発明のこの態様によれば、ＣＣＲ５リガンドを生物学的サンプルから単離する方法、または、生物学的サンプルにおけるＣＣＲ５リガンドの存在を検出する方法が提供される。
【０２０５】
本明細書中で使用される表現「生物学的サンプル」は、ＣＣＲ５リガンドが存在する生物学的流体を示し、例えば、血液、血清、血漿、リンパ液、胆汁、尿、唾液、痰、滑液、精液、涙液、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄液、腹水、膿および馴化培地などを示す。
【０２０６】
本発明のこの態様によるＣＣＲ５リガンドの単離は、生物学的サンプルを本発明のこの態様の分子と接触させ、その結果、ＣＣＲ５リガンドおよび分子が（分子がＣＣＲ５リガンドに結合することを可能にする緩衝液、温度条件を使用して）複合体を形成するようにすること（例えば、Ｄａｔｔａ−ＭａｎｎａｎおよびＳｔｏｎｅ（２００４、上掲）を参照のこと）、および、複合体を単離し、それにより、ＣＣＲ５リガンドを生物学的サンプルから単離することによって行われる。
【０２０７】
複合体を単離するために、分子は、好ましくは、固体担体に固定化される。本明細書中で使用される表現「固体担体」は、目的とする試薬（例えば、本発明のこの態様の分子）が接着することができる非水性マトリックスを示す。固体担体の例には、一部または全体がガラス（例えば、制御細孔ガラス）から形成される固体担体、多糖（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコールおよびシリコーンが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、状況に依存して、固体担体はアッセイプレートの壁を含むことができる。他の実施形態では、固体担体は精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）である。この用語はまた、ばらばらの粒子（例えば、米国特許第４２７５１４９号に記載される粒子など）の不連続な固相を包含する。
【０２０８】
あるいは、そのような分子は、生物学的サンプルにおけるＣＣＲ５リガンドのレベルを検出するために使用することができる。診断適用のために、分子は典型的には、検出可能な成分により標識される。検出可能な成分は、検出可能シグナルを直接的または間接的のどちらかで生じさせることができる任意の成分が可能である。例えば、検出可能な成分は、放射性同位体、蛍光性化合物もしくは化学発光性化合物、または、タグ（例えば、標識された抗体が結合することができる本明細書中上記で記載されるタグなど）であり得る。本発明の分子は、任意の知られているアッセイ方法（例えば、競合的結合アッセイ、直接的および間接的なサンドイッチアッセイ、ならびに、免疫沈殿アッセイなど）において用いることができる。Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７頁〜１５８頁（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８７）。
【０２０９】
本発明のこの態様の分子は、本発明のこの態様の分子、ならびに、場合により、固体担体および画像化試薬（例えば、抗体、発色性基質など）が、適切な緩衝液および保存剤とともに好適な容器に包装され、診断のために使用され得る診断キットにおいて含むことができる。
【０２１０】
従って、本発明は分子、組成物、およびこれらを診断や治療で使用する方法を提供する。
【０２１１】
本明細書中で使用される用語「約」は±１０％を示す。
【０２１２】
本発明の追加の目的、利点および新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０２１３】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
【０２１４】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている［例えば以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ    ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号および５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号および５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉ��ｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０２１５】
実施例１
組換えヒトおよびネズミＣＣＲ５−Ｆｃ融合タンパク質（ＣＣＲ５−Ｉｇ）の作成および細胞系中での安定発現
組換えヒト（ｈ）またはネズミ（ｍ）ＣＣＲ５−Ｉｇ融合タンパク質は、治療用途のために産生された。
【０２１６】
材料および実験手順
ヒトＣＣＲ５−Ｉｇ構築物の作成
本発明のＣＣＲ５−Ｉｇ融合タンパク質をコードする核酸ベクターの構築は、図１に模式的に示されている。ＩｇＧ１構築物は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇの作成のために以前に利用された基本的プロトコール［Ｖａｎ  Ｏｏｓｔｅｒｈｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９９７）１７：３８６］に従って、ただし以下の修正を加えて産生された：ヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）をコードするｃＤＮＡは、ＬＰＳおよびＩＬ−４で活性化された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からｐＳｅｃＴａｇ２／Ｈｙｇｒｏ  Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）上にクローニングされた。ヒトＣＣＲ５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ  ０００５７９、配列番号３３）は、以下のような受容体の細胞外２（ＣＣＲ５のＥＣ２核酸座標４９３〜５８５；配列番号１７）ドメインに対して相補的なプライマーを使用して、ＬＰＳ活性化されたヒトＰＢＭＣからサブクローニングされた：センス：ｃｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｇａｔｃｔｃａａａａａｇａａｇｇ（配列番号３５）、アンチセンス：ｃｃｇｃｔｃｇａｇａｔｔｃｔｔｃｃａｇａａｔｔｇａｔａｃｔ（配列番号３６）。配列検証後、増幅されたＰＣＲ産物は、ｐＳｅｃ−Ｔａｇ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中にクローニングされた。ヒトＩｇＧ  Ｆｃγのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（配列番号２１）は、ＣＣＲ５の下流のプラスミド（ｐＳｅｃ−ＣＣＲ５）にライゲーションされ、融合タンパク質ｈＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧ（配列番号４）を生成した。
【０２１７】
ネズミＣＣＲ５−Ｉｇ構築物の作成
ネズミＣＣＲ５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ  ００９９１７）は、以下のような受容体の細胞外１（ＣＣＲ５のＥ１またはＥＣ１アミノ酸座標２７１〜３３６；配列番号７）ドメインに対して相補的なプライマー：センス：ｃｃｃａａｇｃｔｔｔａｔｇｃｔｇｃａａａｔｇａｇｔｇｇｇｔ（配列番号３９）、アンチセンス：ｃｃｇｃｔｃｇａｇａａｔｇｔｇａｔａｇａｇｃｃｃｔｇｔｇａ（配列番号４０）；以下のような受容体の細胞外２（ＣＣＲ５のＥ２またはＥＣ２アミノ酸座標５０８〜５９７；配列番号９）ドメインに対して相補的なプライマー：センス：ｃｃｃａａｇｃｔｔａｇａｔｃｔｃａｇａａａｇａａｇｇｔｔｔ（配列番号３１）、アンチセンス：ｃｃｇｃｔｃｇａｇｃｔｔｔａａｔｇｔｔｔｇｇａａａｃｔｃｔ（配列番号３２）；以下のような受容体の細胞外３（ＣＣＲ５のＥ３またはＥＣ３アミノ酸座標７９０〜８６４；配列番号１１）ドメインに対して相補的なプライマー：センス：ｃｃｃａａｇｃｔｔｇａａｔｔｃｔｔｔｇｇａｃｔｇａａｔａａ（配列番号４１）、アンチセンス：ｃｃｇｃｔｃｇａｇｃａｔｔｃｃａａｇａｇｔｃｔｃｔｇｔｔｇ（配列番号４２）；および以下のような受容体のＮ末端（ＣＣＲ５のＮアミノ酸座標１〜８１；配列番号５）ドメインに対して相補的なプライマー：センス：ｃｃｃａａｇｃｔｔａｔｇｇａｔｔｔｔｃａａｇｇｇｔｃａｇｔ（配列番号３７）、アンチセンス：ｃｃｇｃｔｃｇａｇｃａｃａｔｔｇａｔｔｔｔｔｔｇｇｃａｇｇ（配列番号３８）を使用して、ＬＰＳ活性化されたネズミＰＢＭＣからサブクローニングされた。配列検証後、増幅されたＰＣＲ産物は、ｐＳｅｃ−Ｔａｇ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中にクローニングされた。ネズミＩｇＧ  Ｆｃγのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（配列番号２５）は、ＣＣＲ５の下流のプラスミド（ｐＳｅｃ−ＣＣＲ５）にライゲーションされ、融合タンパク質ｍＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧ（配列番号２）を生成した。
【０２１８】
安定なヒトＣＣＲ５−ＩｇＧ発現細胞系の作成
ｐＳｅｃ−ＣＣＲ５−ＩｇＧプラスミドは、ジェットＰＥＩ（ポリパルス形質転換、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ  Ｃｅｄｅｘ、フランス）を製造者のプロトコールに従って使用して、ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞を高効率で形質転換するＣＨＯ  ＤＨＦＲミニ遺伝子ベクターと共に、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子について二重欠失を有するＤＧ４４チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（米国のコロンビア大学のＤｒ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｃｈａｓｉｎから提供されたＤＧ４４  ＣＨＯ  ＤＨＦＲ−／−細胞、ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−９０９６）中に共形質転換された。安定に形質転換された細胞は、ハイグロマイシン（２００μｇ／ｍｌ）および増大する量のメトトリキシエート（２．５ｎＭ〜０．１ｍＭ）を含有する培養培地（ＭＥＭ−アルファ）中に選択された。ｈＣＣＲ５（ＥＣ２）−Ｉｇ融合タンパク質は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｕｐｐｓｉａ、スウェーデン）から得られたプロテインＡ−セファロースカラムによって、ＤＨＦＲ陽性形質転換体の上澄みから精製され、マウス抗ｍｙｃ（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ  ロット番号ｄ０３０６）を一次抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ロット番号５８７３４）を二次抗体として使用するウェスタンブロット分析によって検証された。
【０２１９】
安定なネズミＣＣＲ５−ＩｇＧ発現細胞系の作成
ｐＳｅｃ−ＣＣＲ５−ＩｇＧプラスミドは、ジェットＰＥＩ（ポリパルス形質転換、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ  Ｃｅｄｅｘ、フランス）を製造者のプロトコールに従って使用して、ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞を高効率で形質転換するＣＨＯ  ＤＨＦＲミニ遺伝子ベクターと共に、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子について二重欠失を有するＤＧ４４チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（米国のコロンビア大学のＤｒ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｃｈａｓｉｎから提供されたＤＧ４４  ＣＨＯ  ＤＨＦＲ−／−細胞、ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−９０９６）中に共形質転換された。安定に形質転換された細胞は、ハイグロマイシン（２００μｇ／ｍｌ）および増大する量のメトトリキシエート（２．５ｎＭ〜０．１ｍＭ）を含有する培養培地（ＭＥＭ−アルファ）中に選択された。ｍＣＣＲ５（ＥＣ２）−Ｉｇ融合タンパク質は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｕｐｐｓｉａ、スウェーデン）から得られたプロテインＡ−セファロースカラムによって、ＤＨＦＲ陽性形質転換体の上澄みから精製され、マウス抗ｍｙｃ（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ  ロット番号ｄ０３０６）を一次抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ロット番号５８７３４）を二次抗体として使用するウェスタンブロット分析によって検証された。
【０２２０】
実施例２
ＣＣＲ５リガンドに対する異なるＣＣＲ５−ＩｇＧ細胞外ドメインの結合特性
ＣＣＲ５の天然リガンド（ＣＣＬ３，ＣＣＬ４およびＣＣＬ５）と特異的に結合するｍＣＣＲ５−ＩｇＧのＥＣ１，ＥＣ２，ＥＣ３およびＮドメインの能力がＥＬＩＳＡアッセイによって調査された。
【０２２１】
材料および実験手順
ＥＬＩＳＡ
様々な商業的に入手可能なネズミ組換えＣ−Ｃケモカイン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＮＭ）（ＭＩＰ−１α（ＣＣＬ３），ＭＩＰ−１β（ＣＣＬ４）およびＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）を含む）に対するネズミＣＣＲ５−ＩｇＧ融合タンパク質の様々な細胞外ドメイン（ＥＣ１，ＥＣ２，ＥＣ３およびＮ）の結合特性は、以下のようにして直接ＥＬＩＳＡによって決定された：９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）は、１０ｎｇ／ウェルのネズミＣＣＬ３，ＣＣＬ４またはＣＣＬ５でコートされ、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロックされた。ウェルは洗浄され、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌまたは１０００ｎｇ／ｍｌのＣＣＲ５−ＩｇＧ（ＥＣ１，ＥＣ２，ＥＣ３，Ｎ）で一晩インキュベートされた。ウェルは洗浄され、ＣＣＲ５−ＩｇＧの存在は、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ロット番号５８７３４）を使用して検出された。結果は４５０ｎｍで読み取られたＯ．Ｄ．として示される。
【０２２２】
結果
ＣＣＲ５の天然リガンド（ＣＣＬ３，ＣＣＬ４およびＣＣＬ５）に対するｍＣＣＲ５−ＩｇＧのＥＣ１，ＥＣ２，ＥＣ３およびＮドメインの結合が直接ＥＬＩＳＡによって決定された。図２Ａ〜Ｃに示されるように、ｍＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧのみが３つのリガンド全てと特異的に結合したが、ｍＣＣＲ５（ＥＣ１）−ＩｇＧおよびｍＣＣＲ５（Ｎ）−ＩｇＧはいずれのリガンドとも結合しなかった。高タンパク質濃度（１０００ｎｇ）では、ｍＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧはリガンドとある程度結合した。
【０２２３】
実施例３
ｍＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧはＣＣＬ３，ＣＣＬ４およびＣＣＬ５と選択的に結合する
様々なケモカインと結合する可溶性受容体ｍＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧの能力がＥＬＩＳＡアッセイによって調査された。
【０２２４】
材料および実験手順
ＥＬＩＳＡ
様々な商業的に入手可能なネズミ組換えケモカイン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＮＭ）（ＭＩＰ−１α（ＣＣＬ３），ＭＩＰ−１β（ＣＣＬ４），ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５），ＩＴＡＣ，ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２），ＣＸＣＬ１６，ＭＩＧおよびＩＬ−４）に対するネズミＣＣＲ５−ＩｇＧ可溶性受容体の結合特性は、以下のようにして直接ＥＬＩＳＡによって決定された：９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）は、１０ｎｇ／ウェルのネズミＣＣＬ３，ＣＣＬ４，ＣＣＬ５，ＩＴＡＣ，ＭＣＰ−１，ＣＸＣＬ１６，ＭＩＧまたはＩＬ−４でコートされ、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロックされた。ウェルは洗浄され、１μｇ／ウェルのＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧで一晩インキュベートされた。ウェルは洗浄され、ＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧの存在は、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ロット番号５８７３４）を使用して検出された。結果は４５０ｎｍで読み取られたＯ．Ｄ．として示される。
【０２２５】
結果
様々なケモカインに対するｍＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧの結合は、ｍＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧのその天然リガンドに対する特異性を確認した。図３Ａ〜Ｂに示されるように、ｍＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧは、高親和性でＣＣＬ５と（図３Ａ〜Ｂ）、並びにＣＣＬ３およびＣＣＬ４と（図３Ｂ）結合した。あまり重要でないが、ＭＣＰ−１およびＣＸＣＬ１６に対するｍＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧの低い親和性結合が高タンパク質濃度（１０００ｎｇ、図３Ａ〜Ｂ）で検出された。
【０２２６】
実施例４
ｍＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧとヒトＣＣＬ３，ＣＣＬ４およびＣＣＬ５との間の交差反応性
ヒトＣ−Ｃケモカインと結合する可溶性受容体ｍＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧの能力がＥＬＩＳＡアッセイによって調査された。
【０２２７】
材料および実験手順
ＥＬＩＳＡ
様々な商業的に入手可能なネズミ組換えケモカイン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＮＭ）（ＭＩＰ−１α（ＣＣＬ３），ＭＩＰ−１β（ＣＣＬ４）およびＲＡＮＴＥＳ）、並びにネズミ組換えケモカイン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＮＭ）（ＭＩＰ−１α（ＣＣＬ３）およびＩＴＡＣ）に対するネズミＣＣＲ５−ＩｇＧ可溶性受容体の結合特性は、以下のようにして直接ＥＬＩＳＡによって決定された：９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）は、１０ｎｇ／ウェルのヒトＣＣＬ３，ＣＣＬ４，ＣＣＬ５、並びにネズミＣＣＬ３またはＩＴＡＣでコートされ、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロックされた。ウェルは洗浄され、１μｇ／ウェルのＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧで一晩インキュベートされた。ウェルは洗浄され、ＣＣＲ５（ＥＣ）−ＩｇＧの存在は、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ロット番号５８７３４）を使用して検出された。結果は４５０ｎｍで読み取られたＯ．Ｄ．として示される。
【０２２８】
結果
図４に示されるように、ｍＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧは、高親和性でヒトＣＣＬ３，ＣＣＬ４およびＣＣＬ５と結合した。ネズミ可溶性受容体ＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧの結合について、ネズミリガンドとヒトリガンドとでは顕著な差はなかった。
【０２２９】
実施例５
ｍＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧは、ＣＣＲ５リガンドによって誘導される細胞移動を中和する
ＣＣＬ３，ＣＣＬ４およびＣＣＬ５によって誘導される細胞移動を特異的に中和することに対するネズミＣＣＲ５−ＩｇＧのＥＣ２，ＥＣ３またはＮドメインの能力が化学的走性アッセイによって調査された。
【０２３０】
材料および実験手順
細胞系
ＣＣＲ５およびＣＣＲ２を発現するＴＨＰ−１細胞（ヒト急性単球白血病細胞系）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＡＴＣＣアクセッション番号ＴＩＢ−２０２）から得られ、生産者のプロトコールに従って増殖された。
【０２３１】
細胞移動アッセイ
ネズミＣＣＬ３，ＣＣＬ４およびＣＣＬ５によって誘導されるＴＨＰ−１細胞の移動を阻害することに対するｍＣＣＲ５（ＥＣ２，ＥＣ３およびＮ）−ＩｇＧの能力がテストされた。化学走性アッセイは、Ｔｒａｎｓ  Ｗｅｌｌチャンバー（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して行われた。ＴｒａｎｓＷｅｌｌは、１０μｇ／ウェルの様々なｍＣＣＲ５−ＩｇＧ細胞外ドメイン（上述のような）に加えて、１５ｎｇ／ウェルのネズミＣＣＬ３，１０ｎｇ／ウェルのネズミＣＣＬ４および５０ｎｇ／ウェルのネズミＣＣＬ５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＮＭ）と共に３０分間インキュベートされた。ＴＨＰ−１細胞は培地を含まない媒体（Ｌ−Ｇｌｕ，Ｎａ−Ｐｙｒおよびペニシリン−ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ）中で２４時間枯渇され、トランスウェルの上部チャンバーに置かれた（１×１０６細胞／ウェル）。次に、トランスウェルは、７．５％のＣＯ２を含む加湿空気中で３７℃で３時間インキュベートされた。移動している単球は下部チャンバーから収集され、ＦＡＣＳによって計数された。
【０２３２】
結果
図５Ａ〜Ｃは、可溶性受容体ｍＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧが、ＣＣＬ３（図５Ａ）、ＣＣＬ４（図５Ｂ）およびＣＣＬ５（図５Ｃ）によって誘導されるＴＨＰ−１移動を実質的にすべて阻害したことを示す。加えて、ｍＣＣＲ５（ＥＣ３）−ＩｇＧは、ＣＣＬ４およびＣＣＬ５によって誘導されるＴＨＰ−１移動を実質的に阻害した（約５０％まで）が、ｍＣＣＲ５（Ｎ）−ＩｇＧは、ケモカインによって誘導される細胞移動を阻害しなかった。
【０２３３】
実施例６
ｈＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧは、ＣＣＲ３によって誘導される細胞移動を中和する
ＣＣＬ３によって誘導される細胞移動を特異的に中和することに対する融合タンパク質ｈＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧの能力が化学的走性アッセイによって調査された。
【０２３４】
材料および実験手順
細胞系
ＣＣＲ５およびＣＣＲ２を発現するＴＨＰ−１細胞（ヒト急性単球白血病細胞系）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＡＴＣＣアクセッション番号ＴＩＢ−２０２）から得られ、生産者のプロトコールに従って増殖された。
【０２３５】
細胞移動アッセイ
ＣＣＬ３によって誘導されるＴＨＰ−１細胞の移動を阻害することに対するｈＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧの能力がテストされた。化学走性アッセイは、ＴｒａｎｓＷｅｌｌチャンバー（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して行われた。２００ｎｇ／ウェルの可溶性ｈＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧを補充された、もしくは補充されていない、媒体もしくは組換えヒトＭＩＰ−１α（ＣＣＬ３，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＮＭ）での下部チャンバーの平衡化後に、媒体を含むＴＨＰ−１細胞（１×１０６細胞／ウェル）は、トランスウェルの上部チャンバーに添加された。ケモカイン特異性を評価するために、ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＮＭ）がコントロールとして使用された。次に、トランスウェルは、７．５％のＣＯ２を含む加湿空気中で３７℃で３時間インキュベートされた。移動している単球は下部チャンバーから収集され、ＦＡＣＳによって計数された。
【０２３６】
結果
図６は、可溶性受容体ｈＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧが、ＭＩＰ−１α（ＣＣＬ３）によって誘導されるＴＨＰ−１細胞の移動を有意に（５０％）および選択的に阻害したが、ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）によって誘導されるＴＨＰ−１細胞の移動は阻害しなかった（ｐ＜０．００１）ことを示す。
【０２３７】
実施例７
ＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧは、実験的自己免疫性脳脊髄炎の進行を抑制する
ネズミの可溶性受容体ＣＣＲ５−ＩｇのＥＣ２ドメインは、多発性硬化症（ＭＳ）についての動物モデルであるマウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の進行を抑制することにおいて極めて効果的であることが示された。
【０２３８】
材料および実験手順
マウスにおけるＥＡＥの誘導、およびＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧを使用した、進行中の疾患の抑制
Ｃ５７／Ｂマウスの３つの群（各群４匹のマウス）は、以前に記述されたようにしてＭＯＧｐ３５−５５（ミエリンオリゴ樹状細胞糖タンパク質）によるＥＡＥの活性誘導化に供された［Ｋａｓｓｉｏｔｉｓ  ａｎｄ  Ｋｏｌｌｉａｓ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（２００１）１９３（４）：４２７−４３４］。疾患の発症の１日後（１２日目）から、これらのマウスは、ＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧ、アイソタイプ整合ＩｇＧ、またはＰＢＳの３００μｇ／マウスの繰返しの静脈内投与（一日おき）で治療された。実験手順を知らされていない観察者が、疾患の臨床上の表れについてＥＡＥを毎日評価した。
【０２３９】
結果
ＥＡＥマウスに対するｍＣＣＲ５−ＩｇＧのＥＣ２ドメインの投与は、疾患の後遺症なしにＥＡＥの緩解を開始したが、ＰＢＳまたはコントロールのＩｇＧで処置されたマウスは、重度のＥＡＥを発展させた（図７）。
【０２４０】
実施例８
ＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧは、生体外で最初のＥＡＥ応答のサイトカインプロフィールを変化させる
ＥＡＥ脾臓細胞によるインビトロでのサイトカイン分泌を変化させるネズミの可溶性受容体ＣＣＲ５−Ｉｇの能力が分析された。
【０２４１】
材料および実験手順
マウスにおけるＥＡＥの誘導、およびサイトカイン産生のためのＥＡＥ脾臓細胞の再活性化
Ｃ５７／Ｂマウスの３つの群（各群４匹のマウス）は、以前に記述されたようにしてＭＯＧｐ３５−５５（ミエリンオリゴ樹状細胞糖タンパク質）によるＥＡＥの活性誘導化に供された［Ｋａｓｓｉｏｔｉｓ  ａｎｄ  Ｋｏｌｌｉａｓ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（２００１）１９３（４）：４２７−４３４］。９日目に、脾臓細胞は収穫され、様々な濃度のアイソタイプ整合ＩｇＧ（ｍＩｇＧ）、コントロールのＣＣＲ５［ＣＣＲ５（ＥＣ３）−ＩｇＧ］またはＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧと共に、５０μｇ／ｍｌのＭＯＧｐ３５−５５で７２時間再刺激された。上澄みはＥＬＩＳＡによってサイトカイン産生について分析された。
【０２４２】
ＥＬＩＳＡは、Ｅｌｉ−ｐａｉｒキット（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｆｌｅｍｉｎｇ、フランス）をプロトコールに従って使用して行われた。
【０２４３】
結果
抗原特異的な一次培養（ＥＡＥによって誘導された脾臓細胞）のＣＣＲ５−Ｉｇ（Ｅ２）による刺激は、ＴＮＦ−α産生を顕著に抑制し（図８Ａ）、生体外ＩＬ−１２産生を有意に減少させた（ｐ＜０．０１、図８Ｃ）。しかし、ＣＣＲ５−Ｉｇ（Ｅ２）はＩＦＮ−γ産生に影響を与えなかった（図８Ｂ）。アイソタイプ整合ＩｇＧまたはコントロールのｍＣＣＲ５（ＥＣ３）−ＩｇＧによる刺激は、ＥＡＥによって誘導された脾臓細胞による高レベルのサイトカイン分泌を示した（図８Ａ〜Ｃ）。ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２は、炎症性疾患、特にＥＡＥに関与する主要な炎症性サイトカインである。ＣＣＲ５−Ｉｇ（ＥＣ２）の使用によるＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２の顕著な減少は、治療効果を指摘する。
【０２４４】
実施例９
ＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧは、ＮＯＤマウスで証明されるようにＩ型糖尿病を治療することができる
Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）を治療するＣＣＲ５−ＩｇのＥＣ２ドメインの能力が、この疾患についての十分に確立された動物モデルであるＮＯＤマウスにおいて決定された。
【０２４５】
非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスは、自発的な自己免疫性糖尿病を発展させ、ヒトのインスリン依存性糖尿病についての実験モデルとして一般的に使用されている［Ｍｉａｚａｋｉ  Ａ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）６０：６２２；Ｈａｒａｄａ，Ｍ．，Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（１９８７）８９：２５１］。６〜１２週齢のＮＯＤ／Ｌｔｊの雌のマウスは、標準的な実験室動物飼料を自由に摂食させられ、特異的病原非含有（ＳＰＦ）動物小屋で保持される。
【０２４６】
ＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧでのマウスの治療
６匹の２０日齢のＮＯＤマウスの３つの群は、皮下投与により治療される。第一の群は、ＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧを繰返し投与される（マウスあたり一日あたり１００μｇ）。第二の群は、整合量のＰＢＳを投与され、第三の群は、アイソタイプ整合コントロールＩｇＧを投与される。
【０２４７】
結果
ＮＯＤマウスへのＣＣＲ５−ＩｇＧのＥＣ２ドメインの投与は、（例えば膵臓細胞死アッセイによって）インスリン炎を減少させると予測される。これらの発見は、Ｔ１ＤＭを治療するための本発明の組成物の使用を支持する。
【０２４８】
実施例１０
ＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧはリウマチ様関節炎を治療することができる
ヒトの可溶性受容体ＣＣＲ５−ＩｇのＥＣ２ドメインは、リウマチ様関節炎（ＲＡ）についての動物モデルである若年性誘導型関節炎（ＡＡ）の進行を抑制することにおいて極めて効果的であることが示される。
【０２４９】
材料および実験手順
マウスにおけるコラーゲン誘導性の関節炎の誘導、およびＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧを使用した、進行中の疾患の抑制
マウスにおいて関節炎を誘導するため、雄のＤＢＡ／１マウス（８〜１２週齢）は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ．ａｌによって記述されるように、ウシ関節軟骨から精製されて完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，米国）中に乳化された２００μｇのＩＩ型コラーゲンを尾の根本に皮内注射される［Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９２）８９：９７８４−９７８８］。マウスは、第一用量の３週間後に、ＣＦＡ中に乳化された２００μｇのＩＩ型コラーゲンのブースター注射を受ける。マウスは毎日検査され、１つ以上の肢に紅斑および／またははれものを有する各動物は、３つの群の１つに無作為に割り当てられ、これらは、ＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧ（マウスあたり一日あたり１００μｇ）、アイソタイプ整合ヒトＩｇＧ（ＩｇＧ１）、またはＰＢＳの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を受ける。各マウスは、疾患の発症日（０日目）およびそれから一日おきに１０日間、５００μｌのＰＢＳ中の１００μｇの可溶性受容体を注射される。関節炎は、足のはれものを測定することによって１０日間の治療にわたって監視される。
【０２５０】
足のはれものを測定するため、それぞれの罹患した後足の厚さがマイクロカリパスを使用して測定される。結果は、ミリメートルでの足の幅の直接測定値として表される。
【０２５１】
結果
ＡＡマウスへのＣＣＲ５−ＩｇＧのＥＣ２ドメインの投与は、コラーゲン誘導性関節炎を緩和し、従って、ＰＢＳまたはＩｇＧを注射されたマウスと比べて治療されたマウスでの足のはれものを減少させると予測される。これらの発見は、ＲＡを治療するための本発明の組成物の使用を支持する。
【０２５２】
明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０２５３】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許、特許願およびＧｅｎＢａｎｋアクセション番号はすべて、個々の刊行物、特許、特許願またはＧｅｎＢａｎｋアクセション番号が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０２５４】
【図１】本発明のヒトＩｇ−ＣＣＲ５−ＥＣ２ペプチド（配列番号４）をコードする発現構築物の生成を記述する模式図である。
【図２】図２Ａ〜Ｃは、様々な商業的に入手可能なネズミの組換えＣ−Ｃケモカイン：ＭＩＰ−１α（ＣＣＬ３），ＭＩＰ−１β（ＣＣＬ４）およびＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）に対するネズミのＣＣＲ５−ＩｇＧ融合タンパク質のＥＣ１，ＥＣ２，ＥＣ３およびＮドメインの結合特異性を示す棒グラフである。
【図３】図３Ａは、上述のケモカインに対する異なる濃度の可溶性ｍＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧの結合を示すグラフである。図３Ｂは、上述のケモカインに対する１０００ｎｇの可溶性ｍＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧの結合を示すグラフである（単一濃度）。
【図４】ｍＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧとヒトＣＣＬ３，ＣＣＬ４およびＣＣＬ５との間の交差反応性を示す棒グラフである。
【図５ａ−ｂ】図５Ａは、ネズミＣＣＬ３によって誘導された化学的走性を示すグラフである。図５Ｂは、ネズミＣＣＬ４によって誘導された化学的走性を示すグラフである。
【図５ｃ】ネズミＣＣＬ５によって誘導された化学的走性を示すグラフである。
【図６】ＭＩＰ−１α（ＣＣＬ３）によって誘導されるＴＨＰ−１細胞移動を阻害することに対するヒトＣＣＲ５−ＩｇＧの能力を示すグラフである。
【図７】ネズミにおける進行中の実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）を抑制することに対するＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧの能力を示すグラフである。
【図８ａ−ｂ】図８Ａは、ＥＡＥに由来する脾臓細胞によるＴＮＦ−α分泌を示すグラフである。図８Ｂは、ＥＡＥに由来する脾臓細胞によるＩＦＮ−γ分泌を示すグラフである。
【図８ｃ】図８Ｃは、ＥＡＥに由来する脾臓細胞によるＩＬ−１２分泌を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【０２５５】
配列番号１は、マウスＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧ１構築物のコード配列である。
配列番号２は、マウスＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧ１のポリペプチドである。
配列番号３は、ヒトＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧ１構築物のコード配列である。
配列番号４は、ヒトＣＣＲ５（ＥＣ２）−ＩｇＧ１のポリペプチドである。
配列番号５は、ｍＣＣＲ５  Ｎ′コードポリヌクレオチドである。
配列番号６は、ｍＣＣＲ５  Ｎ′ポリペプチドである。
配列番号７は、ｍＣＣＲ５  ＥＣ１ドメインコードポリヌクレオチドである。
配列番号８は、ｍＣＣＲ５  ＥＣ１ドメインポリペプチドである。
配列番号９は、ｍＣＣＲ５  ＥＣ２ドメインコードポリヌクレオチドである。
配列番号１０は、ｍＣＣＲ５  ＥＣ２ドメインポリペプチドである。
配列番号１１は、ｍＣＣＲ５  ＥＣ３ドメインコードポリヌクレオチドである。
配列番号１２は、ｍＣＣＲ５  ＥＣ３ドメインポリペプチドである。
配列番号１３は、ｈＣＣＲ５  Ｎ′コードポリヌクレオチドである。
配列番号１４は、ｈＣＣＲ５  Ｎ′ポリペプチドである。
配列番号１５は、ｈＣＣＲ５  ＥＣ１ドメインコードポリヌクレオチドである。
配列番号１６は、ｈＣＣＲ５  ＥＣ１ドメインポリペプチドである。
配列番号１７は、ｈＣＣＲ５  ＥＣ２ドメインコードポリヌクレオチドである。
配列番号１８は、ｈＣＣＲ５  ＥＣ２ドメインポリペプチドである。
配列番号１９は、ｈＣＣＲ５  ＥＣ３ドメインコードポリヌクレオチドである。
配列番号２０は、ｈＣＣＲ５  ＥＣ３ドメインポリペプチドである。
配列番号２３，２４，２７，２８，３１，３２及び３５〜４２は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
【図１】
2009531022.tif 000007
【図２】
2009531022.tif 000008
【図３】
2009531022.tif 000009
【図４】
2009531022.tif 000010
【図５ａ−ｂ】
2009531022.tif 000011
【図５ｃ】
2009531022.tif 000012
【図６】
2009531022.tif 000013
【図７】
2009531022.tif 000014
【図８ａ−ｂ】
2009531022.tif 000015
【図８ｃ】
2009531022.tif 000016
【配列表】
2009531022000001.xml
【国際調査報告】
2009531022.tif 000033
2009531022.tif 000034
2009531022.tif 000035