(57)【要約】  本発明は、被験体の血清または血漿サンプルにおいてリボヌクレアーゼ（ＲＮＵ）、カタラーゼ（ＣＡ）およびジペプチジルペプチダーゼＶ（ＤＰＰＶ）アスペルギルス抗原のうち少なくとも２つの組み合わせに対する抗体の量を決定することによる、アスペルギルス感染のin vitro診断法に関する。本発明はまた、前記組み合わせを含んでなる診断キットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の血清または血漿サンプルにおいてアスペルギルス抗原に対する抗体の量を決定することによる、アスペルギルス感染のin vitro診断法であって、
ａ）前記抗体および前記抗原との間で得ることができる免疫複合体の形成のために、前記血清または血漿サンプルを、アスペルギルス抗原と共にインキュベートすること、および、
ｂ）該アスペルギルス抗原に対する抗体の量を決定すること、
を含んでなり、該アスペルギルス抗原が、下記抗原：
リボヌクレアーゼ（ＲＮＵ）抗原、
カタラーゼ（ＣＡ）抗原、および
ジペプチジルペプチダーゼＶ（ＤＰＰＶ）抗原、
の少なくとも２つの組み合わせからなる群から選択される、診断法。
【請求項２】
工程（ｂ）において、陰性参照の血清または血漿サンプルで得られた量と比較して、前記２つの抗原の少なくとも１つの抗原に対する抗体の有意に上回る量が決定されることが、アスペルギルス感染の指標となる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アスペルギルス抗原が固相支持体上にコーティングされている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗原のそれぞれが、固相支持体上の異なる位置にコーティングされている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
固相支持体が酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）プレートであり、該方法が、
ａ）前記血清または血漿サンプルを、該ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされたアスペルギルス抗原と共にインキュベートすること、
ｂ）ＥＬＩＳＡプレートから、アスペルギルス抗原と結合していない前記血清または血漿サンプルの抗体を除去すること、
ｃ）酵素をコンジュゲートさせた抗免疫グロブリン（抗Ｉｇ）抗体を接触させること（ここで、抗Ｉｇ抗体は、前記血清または血漿サンプルの抗体と結合できる、
ｄ）ＥＬＩＳＡプレートから、前記血清または血漿サンプルの抗体と結合していない抗Ｉｇ抗体を除去すること、
ｅ）酵素に対応する可溶性基質を加えること、および
ｆ）ＥＬＩＳＡプレートのウェルの吸光度の値をＥＬＩＳＡリーダーにて適切な波長で読み取ること、
を含んでなり、
前記抗体の量が、得られた吸光度の値により決定される、
請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
アスペルギルス抗原が、ＲＮＵおよびＣＡ抗原の組み合わせを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
アスペルギルス抗原が、ＲＮＵおよびＤＰＰＶ抗原の組み合わせを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
アスペルギルス抗原が、ＣＡおよびＤＰＰＶ抗原の組み合わせを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
アスペルギルス抗原が、ＲＮＵ、ＣＡおよびＤＰＰＶ抗原の組み合わせを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＲＮＵ、ＣＡおよびＤＰＰＶアスペルギルス抗原の少なくとも１つが、組換え抗原である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの組換えアスペルギルス抗原が、発現ベクター中の対応するｃＤＮＡの増幅産物のクローニングにより得られる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
対応するｃＤＮＡの増幅産物が、前記少なくとも１つのアスペルギルス抗原に特異的なプライマー対を用いて、アスペルギルス・フミガーツスのｃＤＮＡライブラリーから得られる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＲＮＵ抗原に特異的なプライマー対が、配列番号ｌおよび配列番号２である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＡ抗原に特異的なプライマー対が、配列番号３および配列番号４である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＤＰＰＶ抗原に特異的なプライマー対が、配列番号５および配列番号６である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
アスペルギルス抗原が、さらにガラクトマンナン（ＧＭ）抗原を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＧＭ抗原が、アスペルギルス培養物から精製により得られる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
特定のアスペルギルス菌株に対する検出シグナルの固有のプロフィールが決定される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
それぞれのアスペルギルス菌株に関して検出シグナルプロフィールと標準プロフィールを比較し、被験体が感染している菌株の同定を可能にすることをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
アスペルギルス感染がアスペルギルス腫および／またはアレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）を引き起こす、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＡＢＰＡを引き起こすアスペルギルス感染が、嚢胞性繊維症に罹患している被験体ならびに嚢胞性繊維症に罹患していない被験体において診断される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
アスペルギルス感染が侵襲性アスペルギルス症であり、これが移植を受ける被験体において免疫抑制の前に診断可能である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
免疫不全のヒトにおけるアスペルギルス感染の診断が可能である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
血清または血漿サンプルにおいてアスペルギルス抗原に対する抗体の量を決定するための診断キットであって、
（ａ）下記アスペルギルス抗原の少なくとも２つの組み合わせ： 
ＲＮＵ抗原、
ＣＡ抗原、および
ＤＰＰＶ抗原
を含んでなる、キット。
【請求項２５】
前記アスペルギルス抗原がコーティングされている固相支持体をさらに含む、請求項２４に記載の診断キット。
【請求項２６】
（ｂ）マーカーをコンジュゲートさせた抗Ｉｇ抗体を含有する溶液
をさらに含んでなる、請求項２４または２５に記載の診断キット。
【請求項２７】
（ｃ）洗浄バッファー
をさらに含む、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の診断キット。
【請求項２８】
アスペルギルス抗原が、ＲＮＵ、ＣＡおよびＤＰＰＶ抗原の組み合わせを含んでなる、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の診断キット。
【請求項２９】
アスペルギルス抗原が、ＧＭ抗原をさらに含んでなる、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の診断キット。
【請求項３０】
固相支持体がＥＬＩＳＡプレートであり、マーカーが酵素である、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の診断キット。
【請求項３１】
（ｄ）酵素に対応する可溶性基質を含有する溶液
をさらに含んでなる、請求項３０に記載の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、被験体の血清または血漿サンプルにおいて、リボヌクレアーゼ（ＲＮＵ）、カタラーゼ（ＣＡ）およびジペプチジルペプチダーゼＶ（ＤＰＰＶ）アスペルギルス抗原の少なくとも２つの組合せに対して向けられた抗体の量を決定することによる、アスペルギルス感染のin vitro診断のための方法に関する。本発明はまた、前記組合せを含む診断キットにも関する。
【０００２】
アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)は、免疫適格者ならびに免疫不全宿主において様々な感染症の原因となる日和見病原体である。異なるタイプのアスペルギルス症の管理は、両タイプの患者における診断の確立が困難であることにより上手くいかないことが多い。診断策は、患者の免疫学的状態に合わせてなされる(Latge J., Clin Microbiol Rev 1999; 12: 310-350.)。免疫不全宿主および侵襲性アスペルギルス症患者において、検査室診断のための「ゴールド・スタンダード」は、循環抗原を見つけ出すことである。免疫適格宿主のアスペルギルス症では、特異的抗アスペルギルス抗体の存在に基づいて診断する。
【０００３】
抗アスペルギルス抗体量の測定のための新規の定量的および再現性のあるアッセイの開発は、多くの理由から、近年新たな関心を集めている：（ｉ）結核、肺癌、気腫および慢性閉塞性気管支肺疾患の再発により、すでに空洞を有する患者の数が増加している；これらの患者はアスペルギルス腫を引き起こす危険性があり、血清学的調査は、臨床学的には無症状の重篤なアスペルギルス腫に罹患する可能性のあるこれらの患者に対して、臨床学的関連性があるとしている(Chu et al. 2004 J. Clin. Microbiol. 42:665-669; Denning, D. W. 1998. Clin. Infect. Dis. 26:781-803; Meersseman et al. 2004, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170:621-625)；（ｉｉ）カビアレルゲンに対するアトピーは喘息の重篤度を悪化させる；英国での最近の研究では、カビ感作は重篤な喘息発作と関連があり、入院を要することが示されている(Nelson et al., 1999, J. Allergy Clin. Immunol. 104:775-785; O'Driscoll et al., 1998, American Rev. Respir. Dis. 157:A623; Zureik et al., 2002, Bmj 325:411-414)。皮膚プリックテストの定量化またはこれらのテストで用いられる粗真菌抽出物中のいくつかの真菌に共通のＩｇＥ結合アレルゲンの存在については、常に議論されてきたため、現在はアスペルギルスアレルゲンに対する喘息患者の感作を定量化するためには、抗アスペルギルス抗体力価の測定が適切であるとされている；（ｉｉｉ）ＡＢＰＡは、高齢の嚢胞性繊維症患者集団で最もよく起こる、カビアレルギーの極端な徴候である；このリスク集団の年齢は引き続き増加し、ＡＢＰＡは診断が難しい合併症を残すため、この病態に関しては正確な血清学的診断が最も役立つであろう(Stevens et al., 2003, Clin. Infect. Dis. 3:S225-S264)；（ｉｖ）最後に、最近のデータから、抗体の定量化はまた、ＩＡにかかるリスクがある患者集団においても有用であることが示されている。
免疫不全の集団における侵襲性アスペルギルス症発生のピークは、現在では、免疫系が再初期化される時期である移植６ヶ月後にその発現時期が変わってきている(Morgan et al., 2004, Med. Mycol. 00:1-10)。さらに、最近の臨床学的調査では、集中治療室において血液学的な悪性腫瘍のない患者におけるＩＡの罹患率の増加が示された(Meersseman et al., 2004, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170:621-625)。これらの、比較的免疫適格である患者におけるＩＡは、アスペルギルスに対する抗体力価の増加に関連している可能性がある。また、患者は、アスペルギルスに侵されていながら移植されている可能性があることも示唆されている（しかし、詳細には調べられてはいない）。移植される患者における免疫抑制に先立って認められる高い抗体力価は、既存のアスペルギルス感染を示唆するものであり、菌学的検査および／または抗真菌薬の予防的処置の指標となり得る。
【０００４】
アスペルギルス症患者における抗体検出は、免疫電気泳動法、対向免疫電気泳動法または血球凝集法などの半定量的方法において、粗抗原を用いてさらに行われる(Latge et al., 1991, Infect. Immun. 59:2586-2594)。自家製造された粗抗原バッチを用いるＥＬＩＳＡ法も導入されてきているが、しかし、診断を担当する異なる研究所間の標準化がなされていないことは、バッチ間変動があるために、アスペルギルス症診断における効率の比較の評価を困難にしている。
【０００５】
嚢胞性繊維症の被験体は、慢性的にアスペルギルス属の真菌に侵される可能性がある。アスペルギルス属の真菌はアレルゲンとして活動し、肺の内部で過敏性反応を誘発し、ＡＢＰＡを引き起こし得る。ＡＢＰＡの臨床的特徴は、嚢胞性繊維症の呼吸器系症状により隠されるか似ている可能性があり、結果として過剰診断をもたらしやすい。５０％もの嚢胞性繊維症の被験体が、いつかどれかの陽性血清学的試験が陽性となるであろう。
【０００６】
侵襲型のアスペルギルス症は、環境汚染、化学療法薬および抗生物質の一層の使用などが原因の免疫抑制された状態において、ますます重要となってきている。最も感染しやすい宿主は、臓器移植症例、白血病またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）患者などの、免疫不全患者である。
【０００７】
従来の研究、特にＣｒａｍｅｒｉのグループによる研究では、免疫化学的試験による抗アスペルギルス抗体の再現性のある定量は、組換え抗原を用いて達成し得ることが示されている(Crameri R., Chem Immunol 2002; 81: 73-93; Crameri R, Kodzius R., Comb Chem High Throughput Screen 2001; 4: 145-155; Herrmann S. et al. J Allergy Clin Immunol 1999; 104: 601-607; Kodzius R. et al, Comb Chem High Throughput Screen 2003; 6: 147- 154; Kurup VP. et al., CHn Exp Allergy 2000; 30: 988-993)。この１０年の間に、発明者らはアスペルギルス・フミガーツスのいくつかの抗原を特徴づけ、その中には、Biguetのグループの研究以来、アスペルギルス症の診断の研究に用いられている古典的な「キモトリプシンおよびカタラーゼ抗原」またはLongbottomの抗原Ｃがある(Beauvais A. et al. J Biol Chem 1997; 272: 6238-6244 ; Calera JA. et al. Infect Immun 1997; 65: 4718-4724; Kobayasbi H. et al. Infect Immun 1993; 61: 4767-4771; Latge JP. et al Infect Immun 1991; 59: 2586-2594.; Paris S. et al. FEMS Microbiol Lett 1993; 111: 31-36)。
【０００８】
これらの既知のアスペルギルス抗原にもかかわらず、これまでに、いずれの被験体に対しても再現性のある、アスペルギルス感染を診断するin vitro法は存在しない。実際に、特定のアスペルギルス抗原に対して向けられた抗体レベルは被験体によって異なり、診断用の主たる抗原は被験体によって同じではない。これはおそらく、様々な被験体のＢ細胞集団における遺伝的多様性のためであろう；それはまた、真菌の菌株がin vivoでそれぞれの抗原を様々な量で生成することに関連しているかもしれない。
【０００９】
よって、患者が誰であっても効果的で再現性のある、被験体におけるアスペルギルス感染の新規in vitro診断方法が求められている。発明者らは、共に組合せた場合に、高い信頼性で被検体がアスペルギルス感染であると結論付けるのに有意な結果をもたらすものを、当業者に公知の複数のアスペルギルス抗原から選択することにより、そのような新規の方法を開発した。
【００１０】
本法は、アスペルギルス腫およびＡＢＰＡの診断に適している。ＡＢＰＡの特異的な診断は、非常に困難な課題である嚢胞性繊維症ならびに非嚢胞性繊維症患者の間であっても可能である。抗アスペルギルス抗体の検索はまた、免疫抑制療法を待つ患者におけるアスペルギルスの初感染の追跡にも使用可能である。
【００１１】
第１の態様において、本発明は、被験体の血清または血漿サンプルにおいてアスペルギルス抗原に対する抗体の量を決定することによる、アスペルギルス感染のin vitro診断方法であって、
ａ）前記抗体および前記抗原との間で得ることができる免疫複合体の形成のために、前記血清または血漿サンプルをアスペルギルス抗原と共にインキュベートすること、および、
ｂ）アスペルギルス抗原に対する抗体の量を決定すること、
を含み、
アスペルギルス抗原は、下記抗原：
リボヌクレアーゼ（ＲＮＵ）抗原、
カタラーゼ（ＣＡ）抗原、および
ジペプチジルペプチダーゼＶ（ＤＰＰＶ）抗原、
の少なくとも２つの組合せからなる群から選択される、方法に関する。
【００１２】
本願明細書において、「免疫グロブリン」および「抗体」とは、区別せずに用いられる。
【００１３】
ＲＮＵ、ＣＡおよびＤＰＰＶ抗原は、アスペルギルス・フミガーツスから得るのが好ましい。
これらの抗原を得るためには、例えば、精製、化学合成（固相法）または前記抗原をコードする核酸および発現ベクター（以下参照）を用いる分子生物学などの、当業者に十分公知のいずれの方法を用いてもよい。
【００１４】
「被験体」とは、任意の哺乳類、好ましくは、ヒトを意味する。
【００１５】
好ましくは、工程（ｂ）において、陰性参照の血清または血漿サンプルで得られた量と比較した場合に、前記２つの抗原のうち少なくとも１つの抗原に対する抗体の有意に上回る量が決定されることが、アスペルギルス感染の指標となる。
【００１６】
陰性参照の血清または血漿サンプルで得られた量と比較して、有意に上回る量をどのように決定するかは当業者であれば分かる。通常、適切な統計学的分析法が用いられる（実施例、特に実施例のパラグラフ６「抗原コーティングおよびＥＬＩＳＡ」を参照）。有意に上回る量は、本発明の方法で用いられる条件によって異なる。「陰性参照の血清または血漿サンプル」という表現は、アスペルギルス感染にかかっていない被験体から得られた任意の血清または血漿サンプルを意味する。
【００１７】
免疫複合体形成のために適切な媒体、適切な条件、およびプロトコールは、免疫学の分野で働く当業者に公知である。例として、用いることかできる様々な方法およびプロトコールは、「国立衛生研究所」のJohn E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H.Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober- Wiley Interscienceにより毎年更新（４巻）および編集される「免疫学における最新のプロトコール」に記載されている。
【００１８】
好ましくは、該アスペルギルス抗原は、固相支持体上にコーティングされている。有利には、前記抗原のそれぞれは、該固相支持体上の異なる位置にコーティングされている。
【００１９】
抗原コーティングは、好ましくは、直接的またはスペーサーを用いて間接的に、当業者に公知の様々な固相支持体上で実現し得る。該固相支持体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロンまたは天然もしくは修飾セルロースが挙げられる。これらの支持体は、可溶性または不溶性であってよい。マイクロビーズ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）ストリップ、または（ＥＬＩＳＡ）プレートなどのマイクロタイタープレート中に存在してもよい。
【００２０】
例として、工程（ａ）において、該血清または血漿サンプルは、あらかじめ固相支持体上にコーティングされている該アスペルギルス抗原と共にインキュベートすることができる。次に、コーティングされているアスペルギルス抗原と免疫複合体を形成していない、該血清または血漿サンプルの該抗体を、例えば洗浄バッファーを用いて除去する。以下に示す工程において、マーカーとコンジュゲートさせた抗免疫グロブリン（抗Ｉｇ）抗体（抗ＩｇＧ、抗ＩｇＥおよび抗ＩｇＡ抗体など）を、固相支持体上に形成された免疫複合体と接触させればよい。該免疫複合体の該抗体と相互作用しなかった、コンジュゲート抗Ｉｇ抗体を除去する。最後に、工程（ｂ）において、該マーカーを用いて得られる該検出シグナルにより前記抗体の量を決定する。
【００２１】
使用してもよいマーカーは当業者に十分公知であり、酵素；色素；放射性発光剤（例えばγ線カウンターまたはシンチレーションカウンター、オートラジオグラフィーなどを用いて検出され得る１４Ｃ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、１５２Ｅｕ、５９Ｆｅ、３Ｈ、１２５１、１３１１、３２Ｐ、３５Ｓ、７５ＳＥおよび９９ｍＴｃなど）、生物発光剤、化学発光(chimioluminescent)剤（ルミノール、ジオキセタン、ルシフェラーゼ、ルシフェリン）、蛍光剤、およびリン光剤などの発光剤；ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、５−ブロモ−デオキシウリジンなどのリガンド；放射性同位元素から選択されてよい。従って、該抗Ｉｇ抗体は、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、アンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、ｌａリンゴ酸デヒドロゲナーゼまたはグルコース−６リン酸デヒドロゲナーゼなどの酵素とコンジュゲートさせる。蛍光マーカーは、例えば、フルオレセインおよびその派生物、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、フィコエリトリン−シアニン５（ＰＣ５）およびフィコエリトリン（ＰＥ）、カルセイン（ＡＭ）、赤色蛍光テトラメチル−ローダミンまたはローダミンおよびその派生物、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ダンシル、ウンベリフェロンなどであってよい。
【００２２】
好ましい実施形態では、固相支持体はＥＬＩＳＡプレートであり、該方法は、
ａ）前記血清または血漿サンプルを、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされたアスペルギルス抗原と共にインキュベートすること、
ｂ）ＥＬＩＳＡプレートからアスペルギルス抗原と結合していない前記血清または血漿サンプルの抗体を除去すること、
ｃ）酵素とコンジュゲートさせた抗免疫グロブリン（抗Ｉｇ）抗体と接触させること（ここで、前記抗Ｉｇ抗体は、前記血清または血漿サンプルの該抗体と結合可能である）、
ｄ）ＥＬＩＳＡプレートから前記血清または血漿サンプルの該抗体と結合していない抗Ｉｇ抗体を除去すること、
ｅ）酵素に対応する可溶性基質を加えること、および
ｆ）ＥＬＩＳＡプレートのウェルの吸光度の値をＥＬＩＳＡリーダーにて適切な波長で読み取ること、
を含んでなり、
前記抗体の量が、得られた吸光度の値により決定される。
【００２３】
適切な媒体および条件は、例えば、以下に用いられたようなものであってよい（実施例、特に実施例のパラグラフ６「抗原コーティングおよびＥＬＩＳＡ」を参照）。
【００２４】
有利には、酵素および対応する可溶性基質は、
アルカリ性ホスファターゼおよび可溶性基質４−ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）；
ペルオキシダーゼおよび可溶性基質オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）；
β−ガラクトシダーゼおよび可溶性基質２−ニトロフェニルβ−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）；または
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび可溶性基質グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）
からなる群から選択される。
【００２５】
一実施形態では、アスペルギルス抗原はＲＮＵおよびＣＡ抗原の組合せを含む。別の実施形態では、アスペルギルス抗原は、ＲＮＵおよびＤＰＰＶ抗原の組合せを含む。さらに別の実施形態では、アスペルギルス抗原は、ＣＡおよびＤＰＰＶ抗原の組合せを含む。最も好ましくは、アスペルギルス抗原は、ＲＮＵ、ＣＡおよびＤＰＰＶ抗原の組合せを含む。
【００２６】
該アスペルギルス抗原に加えて、ガラクトマンナン（ＧＭ）抗原、ポリ糖類抗原もまた、使用することができる。このＧＭ抗原は、アスペルギルス培養物の精製により得ることができ（例えば、パートＩ：「材料および方法」、ポイント３：「ガラクトマンナンの精製」を参照）、または当業者に十分公知の任意の他の方法により得ることもできる。
【００２７】
有利には、ＲＮＵ、ＣＡ、ＤＰＰＶおよびＧＭ抗原のそれぞれは、０．１〜１０μｇ／ｍＬ、より有利には、１μｇ／ｍＬの範囲の密度で該固相支持体上にコーティングされる。
【００２８】
さらに好ましい実施形態では、ＲＮＵ、ＣＡおよびＤＰＰＶアスペルギルス抗原の少なくとも１つは、組換え抗原である。有利には、ＲＮＵ、ＣＡおよびＤＰＰＶアスペルギルス抗原の少なくとも２つは、組換え抗原である。最も有利には、ＲＮＵ、ＣＡおよびＤＰＰＶアスペルギルス抗原の３つが組換え抗原である。
【００２９】
好ましくは、少なくとも１つの組換えアスペルギルス抗原は、発現ベクター中の対応するｃＤＮＡの増幅産物のクローニングにより得られる。より好ましくは、対応するｃＤＮＡの増幅産物は、前記の少なくとも１つのアスペルギルス抗原に特異的なプライマー対を用いてアスペルギルス・フミガーツスｃＤＮＡライブラリーから得られる。
【００３０】
当業者であれば、ＲＮＵ、ＣＡおよびＤＰＰＶ抗原のクローニングおよび組換え発現を実現するために分子生物学および細胞生物学的ツールを自由に使うことができる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.(1989)およびAusubel et al., Current Protocol in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY (1992)を参照）。例えば、細菌宿主および対応する既知の細菌プラスミド、酵母細胞／酵母発現ベクター、昆虫細胞／昆虫発現ベクター、哺乳類細胞／哺乳類発現ベクターなど、様々な発現宿主／ベクターの組合せを用いることができる。さらに、これらのベクター中で任意の好適な発現制御配列を用いることができる。
【００３１】
好ましくは、前記の少なくとも１つの組換えアスペルギルス抗原は、ＧＳ１１５およびＫＭ７１酵母株などのピキア・パストリス(Pichia pastoris)酵母、ならびにｐＫＪ１１１(Monod M. et al, Contrib Microbiol 1999; 2:182-192)、ｐＫＪ１１３(Borg-von Zepelin M. et al, Moｌ Microbiol 1998; 28: 543- 554)、ｐＨＩＬＳ１およびｐＰＩＣＺαＡ(Invitrogen)などの好適な発現ベクターを用いて得られる。
【００３２】
使用してよいｃＤＮＡライブラリーは、Monod M. et al (1991)のアスペルギルス・フミガーツスλｇｔｌｌｃＤＮＡライブラリーである。
【００３３】
有利には、ＲＮＵ抗原に特異的なプライマー対は、配列番号１および配列番号２である。より有利には、ＣＡ抗原に特異的なプライマー対は、配列番号３および配列番号４である。最も有利には、ＤＰＰＶ抗原に特異的なプライマー対は、配列番号５および配列番号６である。
【００３４】
もう１つの好ましい実施形態では、特定のアスペルギルス菌株に対する検出シグナルの固有のプロフィールが決定される。
【００３５】
より好ましくは、本発明の該方法は、それぞれのアスペルギルス菌株に関して検出シグナルプロフィールと標準プロフィールを比較し、該被験体が感染している菌株の同定を可能にすること、をさらに含む。
【００３６】
好ましくは、アスペルギルス感染は、アスペルギルス腫および／またはアレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）を引き起こす。
【００３７】
アスペルギルス腫は、アスペルギルス真菌の菌糸部分の塊に起因する、特徴的な肺の病変であり、繊維性の壁の肺空洞内に球状の塊を形成し、通常それが気管支へと続く。
【００３８】
より好ましくは、ＡＢＰＡを引き起こすアスペルギルス感染は、嚢胞性繊維症に罹患している被験体ならびに嚢胞性繊維症に罹患していない被験体において診断される。
【００３９】
有利には、アスペルギルス感染は侵襲性アスペルギルス症であり、これは移植を受ける被験体において免疫抑制の前に診断可能である。
【００４０】
より有利には、免疫不全のヒト、有利には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染しているヒトにおけるアスペルギルス感染の診断を可能にする。
【００４１】
第２の態様において、本発明は、血清または血漿サンプル中のアスペルギルス抗原に対する抗体の量を決定するための診断キットであって、
（ａ）下記アスペルギルス抗原：
ＲＮＵ抗原、
ＣＡ抗原、および
ＤＰＰＶ抗原
の少なくとも２つの組み合わせを含んでなる、診断キットに関する。
【００４２】
好ましくは、本発明の診断キットは、前記アスペルギルス抗原でコーティングされている固相支持体をさらに含む。有利には、前記抗原のそれぞれは、固相支持体上の異なる位置にコーティングされている。
【００４３】
有利には、該診断キットは、
（ｂ）マーカーとコンジュゲートさせた抗Ｉｇ抗体を含有する溶液
をさらに含む。
【００４４】
より有利には、該診断キットは、
（ｃ）洗浄バッファー
をさらに含む。
【００４５】
一実施形態では、アスペルギルス抗原は、ＲＮＵおよびＣＡ抗原の組合せを含む。別の実施形態では、アスペルギルス抗原は、ＲＮＵおよびＤＰＰＶ抗原の組合せを含む。さらに別の実施形態では、アスペルギルス抗原は、ＣＡおよびＤＰＰＶ抗原の組合せを含む。最も好ましくは、診断キットのアスペルギルス抗原は、ＲＮＵ、ＣＡおよびＤＰＰＶ抗原の組合せを含む。
【００４６】
さらなる実施形態では、診断キットのアスペルギルス抗原は、ＧＭ抗原をさらに含む。
【００４７】
有利には、ＲＮＵ、ＣＡ、ＤＰＰＶおよびＧＭ抗原のそれぞれは、０．１〜１０μｇ／ｍＬ、より有利には、１μｇ／ｍＬの範囲の密度で該固相支持体上にコーティングされる。
【００４８】
さらに好ましい実施形態では、ＲＮＵ、ＣＡおよびＤＰＰＶアスペルギルス抗原の少なくとも１つは、組換え抗原である。有利には、ＲＮＵ、ＣＡおよびＤＰＰＶアスペルギルス抗原の少なくとも２つは、組換え抗原である。最も有利には、ＲＮＵ、ＣＡおよびＤＰＰＶアスペルギルス抗原の３つが組換え抗原である。
【００４９】
好ましい実施形態では、固相支持体はＥＬＩＳＡプレートであり、マーカーは酵素である。
【００５０】
より好ましい実施形態では、診断キットは、
（ｄ）酵素に対応する可溶性基質を含有する溶液
をさらに含む。
【００５１】
第３の態様において、本発明はヒトにおけるアスペルギルス感染の診断のための下記の抗原：
ＲＮＵ抗原、
ＣＡ抗原、および
ＤＰＰＶ抗原
の少なくとも２つの組合せの使用に関する。
【００５２】
好ましくは、ＲＮＵ、ＣＡおよびＤＰＰＶ抗原の組み合わせである。
【００５３】
別の好ましい実施形態では、ＥＬＩＳＡ試験が診断に用いられる。
【００５４】
さらに好ましい実施形態では、アスペルギルスの感染がアスペルギルス腫および／またはアレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）を引き起こす場合の本発明の使用である。好ましくは、ＡＢＰＡを引き起こすアスペルギルス感染は、嚢胞性繊維症を罹患している被験体ならびに嚢胞性繊維症に罹患していない被験体において診断される。
【００５５】
別の好ましい実施形態では、アスペルギルス感染は侵襲性アスペルギルス症であり、これは移植を受けるヒトにおいて免疫抑制の前に診断可能である。
【００５６】
別の好ましい実施形態では、本発明の使用は、免疫不全のヒト、有利には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染しているヒトにおける該アスペルギルス感染の診断を可能にする。
【００５７】
本発明を、以下の実施例でさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に例示のために示されるものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。多くの実施状況に当たっては様々なシナリオが関連するが、それらは当業者にとって単に例示を目的とするものである。従って、本発明は任意のおよび総ての変形形態を包含すると解釈され、それらは本明細書で示される教示の結果として明らかとなる。
【実施例】
【００５８】
Ｉ．材料および方法
１．菌株およびプラスミド
使用する菌株Ａ．フミガーツスは、臨床由来の菌株ＣＢＳ１４４．８９である。組換え抗原を発現させるために、ピキア・パストリスＧＳ１１５およびＫＭ７１、ならびに発現ベクターｐＫＪ１１１(Monod M. et al, 1999)、ｐＫＪ１１３(Borg-von Zepelin M. et al., 1998)、ｐＨＩＬＳ1およびｐＰＩＣＺαＡ(Invitrogen)を用いた。総てのプラスミドクローニング実験は、大腸菌(E. coli)ＸＬ１ｂｌｕｅにおいて行った。バクテリオファージλｇｔ１１(Promega)の増殖用には大腸菌ＬＥ３９２を使用した。
【００５９】
２．組換えポリペプチドの産生
Ａ．フミガーツス抗原のｃＤＮＡは、あらかじめ構築されたλｇｔ１１のｃＤＮＡライブラリーの１０６クローンから調製されたＤＮＡを用い、ＰＣＲにより得た(Monod M. et al.,1991)。プライマーは、アルカリプロテアーゼＡＬＰ(Monod M. et al., 1993, FEMS Microbiol Lett.106:39-46)、メタロプロテアーゼＭＥＰ(Jaton-Ogay et al., 1994, Mol. Microbiol. 14:917-928)、アスパラギン酸プロテアーゼＰＥＰ(Reichard et al., 1995, FEMS Microbiol. Lett. 130:69-74)、リボヌクレアーゼＲＮＵ(Paris et al., 1993, FEMS Microbiol. Lett. 111:31-36)、スーパーオキシドジスムターゼＳＯＤ(Holdom et al.,2000, J. Clin. Microbiol. 38:558- 562)、カタラーゼＣＡＴ(Calera et al., 1997, Infect. Immun. 65:4718-4724)、ジペプチジルペプチドＩＶ  ＤＰＰＩＶ(Beauvais et al., 1997, Infect. Imm. 65:3042-3047)、およびジペプチジルペプチダーゼＶ  ＤＰＰＶ(Beauvais et al., 1997, J. Biol. Chem.:6238-6244)をコードする遺伝子のゲノムＤＮＡ配列から得た（表１）。標的ＤＮＡを２００ｎｇ、濃度４２ｍＭのセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドをそれぞれ１０μｌ、およびデオキシヌクレオチド混合物（ｄＮＴＰをそれぞれ１０ｍＭ含有）８μｌを、ＰＣＲバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸  ｐＨ８．３、５０ｍＭ  塩化カリウムおよび１．５ｍＭ塩化マグネシウム）１００μｌに溶解させた。それぞれの反応物に、２．５ＵのＡｍｐｌｉＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ(Perkin Elmer)を加えた。反応混合物を９４℃にて５分間インキュベートし、９４℃にて０．５分間、５５℃にて０．５分間、および７２℃にて０．５分間の２５サイクルを行い、最後に７２℃にて１０分間インキュベートした。
【００６０】
発現プラスミドは、ｃＤＮＡ  ＰＣＲ産物をＰ．パストリス発現ベクターにクローニングすることにより構築した。該ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ精製キット(Roche Diagnostics)を用いて精製し、その部位がプライマーの５’末端にあらかじめ設計されている制限酵素で消化した（表１）。Ｐ．パストリス形質転換、形質転換体の選択、およびメタノール媒体中での組換え酵素の生成は、従前に記載されているように行った(Beggah S. et al., Microbiology 2000; 146: 2765-2773; Borg-von Zepelin M. et al, 1998)。ＤＰＰＩＶを除き、総ての６ｘＨｉｓ標識タンパク質がＰｒｏｂｏｎｄカラム(Invitrogen)に結合した。０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭ、ｐＨ６のリン酸バッファーでカラムを洗浄した後、５０ｍＭヒスチジンを用いてＮｉ２＋カラムからタンパク質を溶出させた。ＲＮＵを溶出させるためには、５００ｍＭイミダゾールバッファーｐＨの使用が必要であり、該タンパク質を５０ｍＭヒスチジン溶液に対して透析した。５０ｍＭヒスチジン溶液中に様々な抗原を可溶化させることは、抗原のマイクロタイタープレートへの直接コーティングを可能にしたものの、イミダゾールはコーティングおよびそれに続く比色定量反応を妨害した（データは示されていない）。
【００６１】
他の抗原とは対照的に、ＤＰＰＩＶはＮｉ２＋カラムに結合しなかった。１／１０００に希釈した抗ポリヒスチジンクローンＨｉｓ１モノクローナル抗体(Sigma)を用いるＤＰＰＩＶのウエスタンブロット解析は陰性であったが、ＤＰＰＶ対照は陽性であった（データは示されていない）。この結果は、Ｎｉカラムに結合しなかった理由は、タンパク質の特異的三次元構造のために、６Ｈｉｓ標識がＮｉへ接近できなかったためではなく、ＤＰＰＩＶ組換えタンパク質中に６Ｈｉｓ標識の配列コードがなかったためであることを示している。ＤＰＰＩＶｐの精製は、従前に記載されているものを一部変更して行った(Beauvais A. et al. Infect Imm 1997; 65: 3042-3047)。ＤＰＰＩＶｐを精製するために、ピキアの培養濾液を４倍容量のエタノールで沈澱させ、この沈殿物を水に溶かし、ｐＨ８．０の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸バッファーに対して透析した。タンパク質をＭｏｎｏＱ  ＨＲ５／５カラムにロードし、０〜５００ｍＭの塩化ナトリウムを用いてタンパク質を溶出させた。前述(Beauvais A. et al, 1997)のように測定された、ジペプチジルペプチダーゼ活性を含む画分を合わせ、真空濃縮した。最終精製は、０．１２Ｍの塩化ナトリウムを含有するｐＨ８．０の２０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸バッファーを用いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ  １０／３０ゲル浸透カラムで行った。精製されたタンパク質は、前述の(Beauvais A. et al, 1997)ジペプチジルペプチダーゼ活性を有していることが実証された。
【００６２】
異なるバッチの抗原の純度は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおいて１０％分離用アクリルアミドゲルにオーバーロードした後、夾雑タンパク質バンドを欠くことにより、コントロールした。
【００６３】
３．ガラクトマンナン（ＧＭ）の精製
従前に記載されているように(Hearn et al, 1990, In R. A. Samson and J.I.Pitt (ed.), Modern concepts in Penicillum and Aspergillus classification, Plenum Press, London, New York)、Ａ．フミガーツスを培養槽の中で４０時間増殖させた。ヒドラジンの商品化が終了したため、ＧＭの精製は別のプロトコールに従って行った。該培養濾液をエタノールで沈澱させ、その沈殿物を最初に、アミラーゼ（バチルス・リケニフォルミス(Bacilluslicheniformis)由来、Sigma A4551参照)を、１００ｍＭの酢酸ナトリウムバッファーｐＨ５．６中、1：３０の割合で（乾重量）で用いて３７℃にて３日間消化し、次に、プロナーゼ（ストレプトミセス・グリセウス(streptomyces griseus)由来、Sigma P5147参照)を１：６の割合で（乾重量）３７℃で３日間インキュベートした。反応混合物を１００℃にて１０分間沸騰させ、さらに水酸化ナトリウム（１Ｍ終濃度）の存在下で６０℃にて１時間処理した。中和した後、ＧＭを透析して凍結乾燥させた。ＧＭの純度は、前述のように(Fontaine et al., 2000, J. Biol. Chem. 275:27594-27607, Large et al., 1994, Infect. Immun. 62:5424-5433)ガスクロマトグラフィーにより確認した。
【００６４】
４．患者
病変は、それぞれの病院で確立されている基準に従って、臨床症状に基づいて各施設で特定した。３つの施設で、５７人のアスペルギルス腫患者、および４１人の対照を採用した（トゥールーズ、グルノーブルおよびストラスブール）。さらに、トゥールーズの施設では、患者あたり２〜９（平均３．９）サンプルを連続して採取した。トゥールーズおよびグルノーブルの施設では、嚢胞性繊維症集団中の１６人のＡＢＰＡ患者および５１人の対照を分析した。嚢胞性繊維症ではない集団中の１２人のＡＢＰＡ患者を２７人の対照と比較した。トゥールーズにおいては、１４人のＡＢＰＡ患者（嚢胞性繊維症または非嚢胞性繊維症バックグラウンド）の患者ごとの連続サンプル（３〜１６、平均８．６）が利用可能であった。総てのＩＡ患者は、セントルイス病院（パリ）由来であり：２３人はＩＡであることが判明しているかまたはＩＡであると疑われ、２１人はＩＡである可能性があり、および３４人は対照であり、ＩＡ患者として免疫抑制または／および移植されていた。それぞれの一連の患者に対して、１〜５サンプル（平均７．５）、２〜１１サンプル（平均６）、および１〜１２サンプル（平均３．９）が、それぞれ、ＩＡであると判明している／疑われる患者、ＩＡである可能性がある患者、および対照患者について入手可能であった。移植前または免疫抑制療法開始前に、患者あたり１〜７血清もまた入手可能であった。
【００６５】
５．免疫電気泳動（ＩＥＰ）
メーカーの取扱説明書に適応させた後、Ｂｅｃｋｍａｎ−ＩＥＰ  Ｐａｒａｇｏｎ  ｓｙｓｔｅｍを用いて、高速の免疫電気泳動を行った。要するに、アスペルギルスの菌体抗原および代謝産物抗原(Sanofi Pasteur Diagnosis, Marnes la Coquette, France)の泳動を、１００Ｖにて１２分間行った。原血清と共に１８〜２４時間インキュベーションを持続させた。クエン酸ナトリウムで洗浄した後、カタラーゼ活性を持つ沈降素の存在を３％過酸化水素を用いて可視化し、乾燥させたゲルをクーマシーブルー染色またはパラゴンバイオレットアシッド染色した後に沈降素の総数を計数した。
【００６６】
６．抗原コーティングおよびＥＬＩＳＡ
カタラーゼは４μｇ／ｍｌでコーティングした以外は、総ての抗原は１μの濃度で、総てのタンパク質抗原およびガラクトマンナンを用いてＥＬＩＳＡプレート(Greiner Ref. 762070)をコーティングした。コーティングの後、ウェルを空にして、２％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳ３００μｌで満たした。室温にて１時間インキュベーションした後、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液を、５％グルコースおよび２．５％脱脂乳を含有するＰＢＳ３００μｌと交換し、プレートを室温にて２分間インキュベートした。ウェルを再び空にし、オーブン中で６０℃にて１０分間乾燥させた。乾燥後、プレートを凍結保存した。抗原のコーティング濃度およびプロトコールは、これらの濃度が抗アスペルギルス抗体を多量に含有することが知られているアスペルギルス腫患者由来の血清プールの最適なＯＤ値の読み取りを保証することを示した予備試験に基づくものであった。患者血清は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で５００倍希釈した。トゥールーズおよびセントルイス由来の血清は、発明者の研究所で分析した。グルノーブルおよびストラスブールの血清は、従来の以下の工程：患者血清と共に３７℃にて１時間インキュベーションし；０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄し；ペルオキシダーゼとコンジュゲートさせた二次抗ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体(Sigma)と共にインキュベーションし；５回洗浄し、ＯＤ値読み取りのためにオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）と共にインキュベーションすることを含む、パスツールで用いられているプロトコールに従って現地で試験した。実験は二重測定で行い、少なくとも１回は繰り返した。
【００６７】
７．統計学的解析
データの統計学的解析は、ＪＭＰソフトウエア(SAS, Cary, NC)を用いて行った。平均値を算出し、標準誤差はコンピューターで計算した。用いた方法は、分散分析に続いて、スチューデントのｔ検定により解析された最小二乗平均差を用いる平均の順位付けであった。有意性を求めるために、ピアソン相関のｒ値を用いる密度楕円フィッティングを介して、１つの連続可変量の別の可変量に対する分布を分析する二変量解析を行った。判別分析では、抗原に対するＯＤ値を、病変に基づいてあらかじめ定義された患者群に分類した。解析は、群の分類に最も適した、二次元においてポイントおよび多変量平均を示す正準プロットとして提示した。感度、特異性、陰性的中率および陽性的中率は、対照患者から計算した最適カットオフ値に基づいて推定した。
【００６８】
ＩＩ．結果
１．アスペルギルス腫
図１は、タンパク質抗原のうちで、ＤＰＰＶ、カタラーゼおよびリボヌクレアーゼ抗原が、患者と対照の間を最も判別することを示す。対照血清における抗体レベルは高いが、ＤＰＰＩＶもまた、アスペルギルス腫患者の同定に有用であった。一方では、プロテアーゼ（アスパラギン酸、メタロおよびセリン−プロテアーゼ）ならびにスーパーオキシドジスムターゼはアスペルギルス腫患者において特異的な液性応答反応を誘発しなかった（セリンプロテアーゼについてはデータは示されていない）。３元配置分散分析では、施設×抗原×病変の相互作用因子に関して有意な応答（ｐ＝０．０３）が示された。これは、トゥールーズの患者では判別されたが、他の施設においては判別されなかったＤＰＰＩＶに対する応答に起因するものであった（データは示されていない）。その一方で、リボヌクレアーゼ、ジペプチジルペプチダーゼおよびカタラーゼの判別効率は、３施設において良好であった。抗ＲＮＵ、抗ＣＡＴおよび抗ＤＰＰＶ抗体レベルは、試験を行った総ての３つの施設の患者集団において、対照集団よりも有意に高かった。表２は、試験に含められる抗原の数が増えると共に、試験の感度が高くなることを示している；３つの抗原を用いて得られたＯＤ値をコンピューターで計算した場合、最大値９５％に達した。その一方で、複数の抗原を使用した場合、特異性の値はわずかに低下した。
【００６９】
発明者らは患者ごとの複数の連続サンプルを有しているので、トゥールーズの施設の患者の詳細な解析を行った。この一連の患者において、ガラクトマンナン（ＧＭ）抗原もまた試験し、前記で判別可能であることが示された３つの判別組換えタンパク質抗原、ＲＮＵ、ＣＡＴおよびＤＰＰＶと比較した。ＥＬＩＳＡのＯＤ値は、ガラクトマンナン抗原もまた、この病変に関して判別可能であることを示した。対照患者のＯＤ値の平均は、ＧＭおよびＣＡＴ抗原の値の方がＲＮＵおよびＤＰＰＶよりも高かった。試験条件下では、アスペルギルス腫患者血清中のＲＮＵ、ＤＰＰＶ、ＧＭおよびＣＡＴそれぞれに対し、０．８２±０．０５、０．９５±０．０８、１．０±０．０７および０．７１±０．０４の平均ＯＤ値が得られ、一方、対照患者血清中のこれらの値は、０．２６±０．０７、０．２５±０．０６、０．７４±０．０６および０．４７±０．０９であった。総ての抗原に関して良好な相関スコアが得られ、最も良好な相関は、ＧＭ、ＣＡＴおよびＤＰＰＶ抗原で得られた。さらに、二変量解析では、得られたＩＥＰバンド数と、３つの組換え型抗原およびＧＭで得られたＯＤ値との間に、良好で統計学的に有意な相関が示された。沈降素バンド数と最もよい相関が得られたのは、ＤＰＰＶのＯＤ値でｒ値は０．６（図２）であり、ＲＮＵ、ＧＭおよびＣＡＴではそれぞれ０．３８、０．３１および０．２８の値が得られた。
【００７０】
トゥールー病院の１３人の患者の動態分析から、患者間でこの４つの異なる抗原に対する抗体力価に変動が見られることが示された（４人の患者の例として図３）。全体としてアスペルギルス腫患者と対照患者の間に有意差があったが（図１）、抗体の応答は患者にも抗原にも依存していなかった。第一に、個々の抗原に対する抗体のレベルは患者によって異なっていた。例えば、患者Ｍａｚでは、ＣＡＴおよびＤＰＰＶに対する応答に最高のＯＤ値が伴っていたが、患者Ｂｅｒでは、これら２つの抗原では最低のＯＤ値しか得られなかった。第二に、抗体のレベルはまた極めて経時的に抗原および患者に依存している可能性があった。例えば、患者Ｂｅｎでは、抗原ＲＮＵに対する抗体のレベルが上昇していたが、同じ患者で、試験した他の３つの抗原に対する抗体のレベルは時間が経っても一定であった（図３）。
【００７１】
２．ＡＢＰＡ
ＡＢＰＡは嚢胞性繊維症患者ならびに非嚢胞性繊維症患者双方の主要な合併症である。嚢胞性繊維症患者は多くの場合、アスペルギルスが定着し、この定着が高いレベルの抗アスペルギルス抗体を伴っている場合があり、これが、嚢胞性繊維症集団において定着患者と本当のＡＢＰＡ患者を識別することを困難にしている。このため、本発明者らは、嚢胞性繊維症を有しない対照、嚢胞性繊維症を有する対照、嚢胞性繊維症を有しないＡＢＰＡおよび嚢胞性繊維症を有するＡＢＰＡ、の４集団の患者を分析した。
【００７２】
図４は、本発明者らのＥＬＩＳＡが、ＡＢＰＡ患者と、アトピー集団または嚢胞性繊維症集団の双方の対照患者とを識別可能であったことを示す。正準プロットにおいて総ての抗体データをプールしたところ、４つの異なる集団の厳格な分離が示された（図５）。アスペルギルス腫患者の場合と同様、最も判別性の高い３つの抗原は、総ての臨床施設で、ＲＮＵ、ＣＡＴおよびＤＰＰＶであった（表３）。
【００７３】
この試験により、嚢胞性繊維症患者が総ての抗原、特にＤＰＰＩＶに対する抗アスペルギルス抗体を高いレベルで有していたことが確認された。この結果は、総ての嚢胞性繊維症患者がＡ．フミガーツスを永久的に保持しているという事実と一致した。しかしながら、これらの抗体力価は、ＡＢＰＡ患者で見られた抗アスペルギルス力価よりも低いままであった。これらのデータから、嚢胞性繊維症患者の追跡調査中に抗体力価のモニタリングを用いれば、定着の悪化または／およびＡＢＰＡ病変の発症を同定することができることが示唆された。表４は、分析した嚢胞性繊維症集団の特異性、感受性ならびにＡＢＰＡの陰性および推定値を示している。これら３つの異なる各抗原を個別に考えると、最低の感受性値（３８％）はＣＡＴで得られた。最高の診断パラメーター値はＲＮＵとＤＰＰＶの組合せで得られた。よって、これらの２つの抗原は、ＡＢＰＡの診断にとって最も有益な抗原であると考えられた。ＡＢＰＡ集団を非嚢胞性繊維症のバックグラウンドにおいて分析した場合にも同様のデータが認められた（データは示されていない）。
【００７４】
アスペルギルス腫患者では、患者間でも同じ患者で経時的にでも、抗原に対する抗体力価に有意な変動が見られた（図６）。例えば、患者Ａｕｄは低い抗ＤＰＰＶ力価を有していたが、患者Ｄｅｌは低い抗ＲＮＵ力価を有し、これに対して、患者ＡｕｂはＲＮＵに対して高レベルの抗体力価を有していた。抗体のレベルは、患者ＡｕｂとＤｅｌでは一定であったが、患者Ａｕｄではかなり変動があった。抗体力価の上昇はＡＢＰＡエピソードと関連があるものと思われたが、抗体力価の低下は患者の改善と相関していた（図６）。
【００７５】
３．侵襲性アスペルギルス症
免疫適格集団またはアトピー集団において病態を示した最も判別性の高い抗原がＲＮＵ、ＣＡＴおよびＤＰＰＶであったことから、これら３つの抗原を試験し、侵襲性アスペルギルス症における抗体の状態を調べた。さらに、ＧＭに対する抗体は、アスペルギルス腫患者の肺組織における真菌増殖に関連し（上記参照）、また、ガラクトマンナン抗原血症の検出に基づくＩＡの診断に用いられるＰｌａｔｅｌｉａキットで得られる偽陰性の原因であることが示唆された(Hearn et al., 1995, J. Clin. Microbiol. 33:982-986; Herbrecht et al., 2002, J. Clin. Oncol. 20:1898-906)ことから、この抗体を分析した。ＩＡであることが判明している、またＩＡが疑われる免疫不全患者および同じ臨床処置を受けたが真菌感染が見られなかった対照のコホートにおいて、これら４つの抗原に対する抗体レベルを測定した。
【００７６】
まず、同じ患者で、移植または免疫抑制後と臨床的ＩＡ診断後の血清力価を比較したところ、これらの免疫不全患者におけるＩＡ過程では抗体レベルの上昇はないことが示された（誤差ｄｆ１１８で、ｐ値０．８３）。この結果により、本発明者らの研究において、ＩＡを有する免疫不全患者は疾病の進行中、真菌に対する、検出可能な抗体を産生しなかったことが確認された。ＣＡＴ、ＲＮＵ、ＤＰＰＶまたはＧＭに対する抗体レベルとは対照的に、同じ血清における循環ガラクトマンナンのレベルはＩＡに関して判別可能であり、ＩＡの進行中、経時的に抗原の放出量の増加を伴っていた（誤差ｄｆ１１８で、ｐ値＜０．０１）。
【００７７】
疾病の経過中、抗体のレベルには変化はなかったが、ＩＡであることが判明している患者集団における抗体応答の分析によれば、試験した４つの抗原に対する高レベルの抗体が、判明している（proven）／疑わしい（probable）侵襲性アスペルギルス症の発生と正の相関があることが示された。表５は、最も判別性の高い抗原がＣＡＴと、それより劣るがＤＰＰＶであったことを示している。ＲＮＵおよびＧＭは判別性が低かった（表５ではこれら２つの抗原の感受性の値が低いことを参照）。図７は、患者の供試血清で得られた、ＣＡＴ抗原およびＤＰＰＶ抗原の場合のＯＤ値に基づく階層的クラスタリングを示しており、それぞれ１０人（ａ群）および１３人（ｂ群）を含む２群の患者が明確に区別された。低力価の患者群（ｂ）で示されたＯＤ値は、対照群（ｃ）とは有意に異なっていなかった。これに対し、抗体力価の高いもう１つの患者群（ａ）でのＯＤ値は他のｂ群およびｃ群と有意に異なっていた（図８）。集団ａ（患者１０人）と対照集団（３４人）について得られた感受性および特異性の最高値はそれぞれＤＰＰＶでは８９％と７０％、ＣＡＴでは１００％と９７％であった。患者のこの部分集団における抗Ａ．フミガーツス抗体の検出は、ＩＡの極めてよい推定因子となる。これらの患者の免疫抑制前の血清に高レベルの抗体が存在することは、これらの患者が移植または免疫抑制処置前に感染していたことを示唆した。本発明者らのＥＬＩＳＡ試験条件下で得られたＯＤ値に対してＪＭＰソフトウエアのパーティションプラットフォームを用い、ここでサンプル抽出した集団では、これら４つの抗原に対して陰性の血清の指標となるＯＤ値は、ＲＮＵ、ＤＰＰＶ、ＣＡＴおよびＧＭについてそれぞれ０．２１、０．１２、０．４４および０．５４であった。同じ抗原に対して０．３６、０．３５、１．０８および１．０５を超える値はアスペルギルス感染の指標となった。ロジスティック回帰データから、ｐ値＜０００１である最も判別性の高い抗原はＣＡＴおよびＤＰＰＶであったことが確認された（データは示されていない）。
【００７８】
免疫適格患者では、種々の抗原に対する各患者の応答に重要な変動が見られた。図９は、異なる６人の患者における抗体抗原反応の漸進的変化の例を示している。上記で定義した群の患者ＰＩＥ、ＢＡＲおよびＲＵＤでは、最大の反応性を誘導する抗原はそれぞれＧＭ、ＣＡＴおよびＤＰＰＶであった。患者ＧＯＲでは、ＲＮＵおよびＧＭに対する抗体は高レベルであったが、ＣＡＴおよびＤＰＰＶに対する抗体は低レベルであった。図９に示される患者ＧＯＲまたはＰＩＥでは、循環体液中の低レベルの抗原性ガラクトマンナンは高い抗ＧＭ抗体力価に関連しているものと思われ、ＩＡであることが判明している患者において抗ＧＭ抗体とＰｌａｔｅｌｉａ指数の間で得られる相関係数は−０．０４であった（ｄｆ１７２で、有意でないｐ値０．２２）。この研究では、ＩＡ  Ｐｌａｔｅｌｉａにおける陰性結果は、抗ＧＭ抗体の存在と直接の関係はなかった。
【００７９】
これらのデータは、免疫抑制前の患者の血清における抗体レベルの感度測定は、ＩＡの良好な陽性推定値となることを示した（図１０）。この結論は判明している患者と対照患者を分析した場合に得られたものである。また、疑わしい患者の何人かが本当にＩＡであることを示唆する抗体レベルに基づく疑わしい集団と対照集団の分離にはある傾向が存在する。
【００８０】
ＩＩＩ．考察
ＥＬＩＳＡ形式を用いた、種々のクラスのアスペルギルス症患者の抗体応答に関するこの研究では、本発明者らの研究室でこれまでに同定されたリボヌクレアーゼ、ジペプチジルペプチダーゼＶおよび菌糸カタラーゼ１である３つの組換え抗原の重要な診断可能性が示された(Beauvais et al., 1997, Infect. Imm. 65:3042-3047; Calera et al., 1997, Infect. Immun. 65:4718-4724; Large, J., 1999, Clin. Microbiol. Rev. 12:310-350; Paris, S. et al., 1993, FEMS Microbiol. Lett. 111:31-36)。
【００８１】
これら３つの抗原がアスペルギルス腫、ＡＢＰＡおよびＩＡの診断に使用できる場合、これら３つの各抗原の個々の能力は分析される集団によって異なる。カタラーゼは、免疫適格集団および免疫不全集団の双方において最も有用な抗原であった。アスペルギルス腫患者では、ＲＮＵおよびＤＰＰＶ抗原はＣＡＴと同等か、または高い判別性であった。ＡＢＰＡ患者では、最も判別性の高い抗原はＲＮＵおよびＤＰＰＶであった。ＩＡ患者では、ＲＮＵは適当な抗原とは言えなかったが、ＤＰＰＶおよび総てのＣＡＴはほとんどの場合で認識された抗原であった。さらに、アスペルギルス症患者の追跡調査では、どの抗原に対する抗体のレベルも患者によって異なること、および主要な診断抗原が患者によって異なることが多いことが示された。この結果が異なる患者のＢ細胞集団における遺伝的変異によるものであるかどうか、あるいはそれがin vivoにおいて種々の量の個々の抗原を産生する感染性の真菌株と関連しているのかどうかはこれまでのところまだ分かっていない。ＡＢＰＡ患者ではアスペルギルス腫患者よりも低い感受性および陽性的中率が得られた。この結果は、この病変の診断が難しいこととと一致していた。最も重要であり、生命を脅かすアスペルギルス症、すなわち、アスペルギルス腫、ＡＢＰＡおよび侵襲性肺アスペルギルス症の診断にとっては、リボヌクレアーゼ抗原、カタラーゼ抗原およびジペプチジルペプチダーゼ抗原のうち少なくとも２つ、最良には３つの関連が理想的である。
【００８２】
嚢胞性繊維症対照集団では、高力価の抗アスペルギルス抗体が見られた。この結果は、これらの患者の共通の持続的Ａ．フミガーツス定着と一致していた。興味深いことに、ＤＰＰＩＶタンパク質に対する抗体のレベルは、非嚢胞性繊維症集団中のＡＢＰＡ患者よりも嚢胞性繊維症対照集団でより高かったが、このことは、ＣＤ２６と相同なこの抗原は、嚢胞性繊維症の病変で役割を果たす可能性があることを示唆している。本発明者らの研究では、ＡＢＰＡは、アトピー集団または嚢胞性繊維症集団で、特異的抗アスペルギルス抗体の定量によってのみ診断可能であることが示された。Ｃｒａｍｅｒｉのグループによる集団ででは、ＡＢＰＡの診断に関して同じ抗体が同定されなかった(Hemmann et al., 1999, J. Allergy Clin. Immunol. 104:601-607)。Ｃｒａｍｅｒｉの研究室による抗原選択はファージディスプレー系に基づいたものであり、このＣＡＴ抗原およびＤＰＰＶ抗原は、Ｃｒａｍｅｒｉのライブラリーで示されるに至らない可能性がある高分子量タンパク質抗原である。Ｒ．Ｃｒａｍｅｒｉとの共同研究では、ＤａｖｏｓのＡＢＰＡ患者がＲＮＵ、ＣＡＴおよびＤＰＰＶと有意に反応することが示されていることから(Crameri, personnal communication)、これもこういったケースであると思われる。さらに、Ｃｒａｍｅｒｉの研究では、一次選択はＩｇＥ結合に基づいていたが、本発明者らの分析はＩｇＧレベルを考慮したものであり、ＡＰＢＡでは、特異的抗アスペルギルスＩｇＥおよびＩｇＧがこれらの患者の種々のエピトープを認識し得ることが分かっている。
【００８３】
本発明者らの研究の最も重要な発見は、移植を受ける患者の約半数に高力価の抗アスペルギルス抗体が存在するということであった。これまでに、免疫不全のＩＡ患者における抗アスペルギルス抗体の存在を報告している刊行物がいくつかある(Hearn et al., 1995, J. Clin. Microbiol. 33:982-986; Herbrecht et al., 2002, J. Clin. Oncol. 20:1898-906)。この研究で検討された、患者の疾病の経過中に抗体レベルの増加が見られないということは、抗体の発生は真菌感染に対する患者の応答ではないことを示唆している。これに対し、免疫抑制療法を受ける大部分の患者が入院時に実際にアスペルギルス感染を有していたことを示唆している。興味深いことに、本発明者らのグループによる初期の疫学研究では(Chan et al., 2002, J. Clin. Microbiol. 40:2041-2045; Debeaupuis et al., 1995, Can. J. Bot. 73:1087-1091)、症例の約５０％でＩＡの起源が院内にあったことを示している。この抗体検出試験では、ＩＡ患者の約５０％（１０／２３人）が入院時の感染であったことが示唆された。これらの結果は、免疫抑制前に定着している可能性があること、およびこの潜伏アスペルギルス感染が今、相当数の患者でＩＡの起源として推測されていることから、ＩＡリスクのある患者にとっては最も重大である。抗体を探すということは、集中免疫療法およびその後の移植を始める前に、本質的なスクリーニングとなりうる。肺から真菌を排除する試みが行えるということから、これらの知見は総て、免疫抑制前の患者の管理に大きな影響を及ぼす。また、免疫不全状態における抗アスペルギルス抗体試験の重要性は、ＩＡのピークが移植後６か月に移ること(Morgan et al., 2004, Med. Mycol. 00:1-10)、および集中管理室からの免疫適格患者の出現(Meersseman et al., 2004, Crit. Care Med. 170:621-625)という点でも強調される。
【００８４】
これまでの研究では、免疫不全患者の真菌感染にける循環抗原のクリアランスに多量の抗体の存在が関与している可能性があることが報告された。このような知見は、低い抗原レベルが高いマンナン抗体濃度と関連しているカンジダ感染でも繰り返し見られている(Sendid et al., 2003, J. Clin. Microbiol. 41:4551-4558; Sendid et al., 1999, J. Clin. Microbiol. 37:1510-1517)。アスペルギルス感染でもまた、いくつかの研究が、偽陰性抗原血症判定が、血清中に高レベルの抗ガラクトマンナン抗体の存在によることを示唆している(Herbrecht et al., 2002, J. Clin. Oncol. 20:1898-906; Marr et al., 2004, J. Infect. Dis. 190:641-649; Pinel et al., 2003, J. Clin. Microbiol. 41:2184-2186)。本発明者らの試験では、ＧＭに対する抗体の存在が数種の血清では、低力価の抗原と関連していると思われ、ＧＭ抗原濃度と抗ＧＭ抗体濃度間に統計学的に有意な負の相関は示すことができない。ＩＡ偽陰性患者によっては、低レベルのＧＭと抗ＧＭ抗体がともに見られた。これらの偽陰性データは説明できないままであるが、Ｐｌａｔｅｌｉａキットにおいて偽陰性を作り出す抗体の能力を排除するか、または少なくとも最小とする。
【００８５】
これらの知見は総て、治癒または真菌の除去という点で、免疫抑制前の患者の管理に大きな影響を及ぼす。ＩＡの起源としての潜伏アスペルギルス感染は今や相当数の患者に対して予測される。
【００８６】
【表１】
2009500620.tif 000002
【００８７】
【表２】
2009500620.tif 000003
【００８８】
【表３】
2009500620.tif 000004
【００８９】
【表４】
2009500620.tif 000005
【００９０】
【表５】
2009500620.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】アスペルギルス腫および対照患者の血清中の７つの組換え抗原に対する抗体反応の図である。値は、３施設からの５７人の患者および４１人の対照のＥＬＩＳＡの光学密度（ＯＤ）の平均値（患者１人当たり１血清）を示す。「診断可能性」の欄にアスタリスクがある抗原から得られるＯＤ値は、施設、抗原および病変を因子とする３元配置分散分析において有意差がある（ＤＰＰＩＶは１施設でのみ有意）。
【図２】ＩＥＰバンド数および抗ＤＰＰＶ抗体レベルの相関図である（ＯＤ値で示されている）。直線のフィット（ＤＰＰＶのＯＤ値＝０．３＋０．０５  ＩＥＰバンド数）は統計学的に有意である（ｐ＜．０００１  誤差ｄｆ１０１）。
【図３】４人のアスペルギルス腫患者（Ｂｅｎ、Ｂｅｒ、Ｐｉｎ、Ｍａｚ）の血清における、ＣＡＴ、ＲＮＵ、ＤＰＰＶおよびＧＭに対する抗体レベルの追跡調査。抗組換え抗原抗体レベルは、ＯＤ値で示してある。ＣＡＴ＝□、ＤＰＰＶ＝◇；ＲＮＵ＝Δ；ＧＭ＝◆
【図４】７つの組換え抗原に対するＡＢＰＡ患者およびそれぞれに対応するアトピー性または嚢胞性繊維症対照の抗体反応を示す図である。示したＯＤ値は、１２人のＡＢＰＡおよび１６人のＡＢＰＡ／嚢胞性繊維症および５１人の嚢胞性繊維症および３７人の対照患者の平均である（患者１人あたり１血清、２施設）。データの有意性は表３に示す。
【図５】ＡＢＰＡ集団のそれぞれの対照からの分離を示す正準プロット(Canonical plot)。判別分析のために、総ての組換え抗原から得られたＯＤ値を用いた。正準プロットは、最も離れた患者群の二次元におけるポイントおよび多変量平均を示す。円の大きさは、平均に対する９５％信頼限界に相当する。有意差のある群は、円が交差しない傾向がある。
【図６】４人のＡＢＰＡ患者（Ａｕｄ、Ｂｏｄ、Ａｕｂ、Ｄｅｌ）の血清におけるＣＡＴ、ＲＮＵ、およびＤＰＰＶに対する抗体レベルの追跡調査。抗組換え抗原抗体レベルは、ＯＤ値で示してある。バーは、臨床医により定められたＡＢＰＡの期間を示す（ＣＡＴ＝□；ＤＰＰＶ＝◇；ＲＮＵ＝Δ）。
【図７】ＩＡであることが判明している２３人の患者の階層的クラスタリング（ウォード法）。クラスタリングは、患者の入院時に採取された血清中のＣＡＴおよびＤＰＰＶ抗原を用いるＥＬＩＳＡにより得られたＯＤ値に基づいている；ａ：抗体力価の高い患者；ｂ：抗体力価の低い患者。
【図８】移植前の抗体力価が高いＩＡ患者集団（ａ）は、患者集団ｂおよび対照集団とは異なっていたことを示す一元配置分散分析（患者のクラスタリングに関しては図７を参照）。ひし形部分の平均値は、サンプルの平均および９５％信頼区間を示す。円は、スチューデントの両側検定を視覚化したものである：結果の有意性は、２つの円が交差しないことにより示される。
【図９】ＩＡであることが判明している６人の患者における、ＲＮＵ、ＣＡＴ、ＤＰＰＶ、ＧＭおよびＧＭ抗原に対する抗体力価の漸進的変化。０日は、患者の入院時に最初のサンプルを採取した日である。移植（行われる場合）は、矢印で示されている。患者であるＰＩＥ、ＢＡＲおよびＲＵＤは、ＤＰＰＶおよびＣＡＴに対する抗体レベルが高いことを特徴とするクラスター(図７参照)に属している。患者であるＭＯＵ、ＭＯＲおよびＧＯＲは、ＣＡＴおよびＤＰＰＶに対する抗原レベルの低い患者のクラスターｂに属している。ＣＡＴ＝□；ＤＰＰＶ＝◇；ＲＮＵ＝Δ；ＧＭ＝◆；ＧＭＡｇ（黒丸）
【図１０】入院時の抗体レベルで判別された３つの患者集団（明らかなＩＡ、ＩＡが疑われるもの、または陰性）を示す正準プロット。判別分析のために、ＤＰＰＶ、ＧＭ、ＲＮＵおよびＣＡＴ抗原から得られたＯＤ値を用いた。正準プロットは、最も離れた患者群の二次元におけるポイントおよび多変量平均を示す。円の大きさは、平均に対する９５％信頼限界に相当する。有意差のある群は、円が交差しない傾向がある。
【図１】
2009500620.tif 000007
【図２】
2009500620.tif 000008
【図３】
2009500620.tif 000009
【図４】
2009500620.tif 000010
【図５】
2009500620.tif 000011
【図６】
2009500620.tif 000012
【図７】
2009500620.tif 000013
【図８】
2009500620.tif 000014
【図９】
2009500620.tif 000015
【図１０】
2009500620.tif 000016
【配列表】
2009500620000001.app
【国際調査報告】
2009500620.tif 000017
2009500620.tif 000018
2009500620.tif 000019