(57)【要約】  本発明は、好ましくはＴ１Ｒ３ポリペプチドおよび適切なＧタンパク質と一緒に、Ｔ１Ｒ１またはＴ１Ｒ２のいずれか１種のＴ１Ｒの細胞外部分またはその変異体もしくはフラグメント、およびＴ１Ｒ１またはＴ１Ｒ２のいずれかの別のＴ１Ｒの膜貫通部分またはその変異体もしくはフラグメントを含むキメラ味覚受容体に関する。これらのキメラ味覚受容体およびそのようなキメラ味覚受容体を発現する細胞は、甘味および旨味リガンドを同定するためのアッセイ、ならびに甘味および旨味エンハンサーを同定するためのアッセイにおいて有用である。その上、これらのキメラ味覚受容体および同じものを発現する細胞を使用して、特定の甘味および旨味リガンドがそれらのそれぞれの受容体とどこで相互作用するかを位置づけ、そして確認すること、および受容体活性化の機序を明らかにすることができる。
2009517003.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種のヒトＴ１Ｒの細胞外ドメインまたはその一部および別のＴ１Ｒの膜貫通ドメインまたはその一部を含むハイブリッド味覚受容体。
【請求項２】
前記Ｔ１Ｒの両方がヒトまたは齧歯類である、請求項１に記載のハイブリッド受容体。
【請求項３】
前記Ｔ１ＲがＴ１Ｒ１およびＴ１Ｒ２を含む、請求項１に記載のキメラ受容体。
【請求項４】
前記Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ２がヒトＴ１Ｒ１およびヒトＴ１Ｒ２を含む、請求項３に記載のキメラ受容体。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に含有されるｈＴ１Ｒ２−１として同定された、キメラ甘味‐旨味味覚受容体。
【請求項６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に含有されるｈＴ１Ｒ１−２として同定された、キメラ旨味‐甘味受容体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のキメラ味覚受容体をコードする核酸配列。
【請求項８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に含有される、請求項７に記載の核酸配列。
【請求項９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に含有される、請求項７に記載の核酸配列。
【請求項１０】
請求項７に説明された核酸配列を発現する細胞。
【請求項１１】
前記核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に含有される、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
前記核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に含有される、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１３】
細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、卵母細胞、両生類細胞、鳥類細胞および昆虫細胞から選択される、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１４】
哺乳動物細胞または卵母細胞である、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
ＨＥＫ−２９３細胞、ＣＳ細胞、ＢＨＫ細胞、サルＬ細胞、アフリカミドリザル細胞、ＣＨＯ細胞、ＬｔＫ細胞および卵母細胞から選択される、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
ＨＥＫ−２９３細胞である、請求項５に記載の細胞。
【請求項１７】
無差別なＧタンパク質、Ｇｑタンパク質、トランスデューシン、Ｇｉタンパク質、ガストデューシン、トランスデューシンおよびそのキメラからなる群から選択されるＧタンパク質を付加的に発現する、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１８】
Ｔ１Ｒ３配列を付加的に発現する、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１９】
別のＴ１Ｒポリペプチドに結合した、請求項１〜６のいずれか１項に記載のキメラ味覚受容体ポリペプチドを含む、ヘテロマー味覚受容体。
【請求項２０】
前記の別のＴ１ＲポリペプチドがヒトＴ１Ｒ３または齧歯類Ｔ１Ｒ３ポリペプチドである、請求項１９に記載のヘテロマー味覚受容体。
【請求項２１】
請求項１９に記載のヘテロマー味覚受容体を発現する細胞。
【請求項２２】
請求項２０に記載のヘテロマー味覚受容体を発現する細胞。
【請求項２３】
哺乳動物細胞または卵母細胞である、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２４】
哺乳動物細胞または卵母細胞である、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２５】
ＨＥＫ−２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＬｔＫ細胞、サルＬ細胞、アフリカミドリザル細胞、および卵母細胞から選択される、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２６】
ＨＥＫ−２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＬｔＫ細胞、Ｍｏｎｋｅｙ  Ｌ細胞、アフリカミドリザル細胞、および卵母細胞から選択される、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２７】
ＨＥＫ−２９３細胞である、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２８】
ＨＥＫ−２９３細胞である、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２９】
Ｇタンパク質を発現する、請求項１９に記載の細胞。
【請求項３０】
Ｇタンパク質を発現する、請求項２０に記載の細胞。
【請求項３１】
ヒトＴ１Ｒ１細胞外ドメインまたはその一部もしくは変異体、およびヒトＴ１Ｒ２膜貫通ドメインまたはその一部もしくは変異体を含むキメラ味覚受容体。
【請求項３２】
齧歯類Ｔ１Ｒ１細胞外ドメインまたはその一部もしくは変異体、および齧歯類Ｔ１Ｒ２膜貫通ドメインまたはその一部もしくは変異体を含むキメラ味覚受容体。
【請求項３３】
ヒトＴ１Ｒ２細胞外ドメインまたはその一部もしくは変異体、およびヒトＴ１Ｒ１膜貫通ドメインまたはその一部もしくは変異体を含むキメラ味覚受容体。
【請求項３４】
齧歯類Ｔ１Ｒ２細胞外ドメインまたはその一部もしくは変異体、および齧歯類Ｔ１Ｒ１膜貫通ドメインまたはその一部もしくは変異体を含むキメラ味覚受容体。
【請求項３５】
請求項３１〜３４のいずれか１項に記載のキメラ味覚受容体をコードする核酸配列。
【請求項３６】
請求項３５に記載の核酸配列を安定に発現する細胞。
【請求項３７】
請求項３５に記載の核酸配列を一過性に発現する細胞。
【請求項３８】
以下のことを含む、味覚改変化合物候補を同定するためのスクリーニングアッセイ：
（ｉ）場合によりＴ１Ｒ３ポリペプチドまたはその変異体もしくはフラグメントに結合した請求項３１〜３４のいずれか１項に記載のキメラ味覚受容体と、少なくとも１種の味覚改変化合物候補を接触させること：および
（ｉｉ）該化合物が明確に該キメラ味覚受容体ポリペプチドに結合し、および／またはその活性を改変するかどうかを検出すること。
【請求項３９】
陽性化合物がさらに、味覚に対するその作用を確認するためのヒトまたは動物味覚試験において評価される、請求項３８に記載のアッセイ。
【請求項４０】
前記化合物がエンハンサーとして機能するかどうかを検出するために、別の化合物による前記キメラ味覚受容体の活性化に対するその作用をアッセイすることを含む、請求項３８に記載のアッセイ。
【請求項４１】
前記の他の化合物が甘味リガンドである、請求項４０に記載のアッセイ。
【請求項４２】
前記の他の化合物が旨味リガンドである、請求項４０に記載のアッセイ。
【請求項４３】
前記キメラ受容体を味覚モジュレーター候補とプレインキュベーションした後、キメラ味覚受容体をキメラ味覚受容体の既知のアクチベーターと接触させる、請求項４０に記載のアッセイ。
【請求項４４】
キメラ味覚受容体をキメラ味覚受容体の既知のアクチベーターとプレインキュベーションした後、味覚改変化合物候補の作用をアッセイする、請求項４３に記載のアッセイ。
【請求項４５】
前記甘味リガンドが天然の甘味料または人工甘味料である、請求項４１に記載のアッセイ。
【請求項４６】
キメラ受容体が細胞膜上に含有される、請求項３８に記載のアッセイ。
【請求項４７】
キメラ味覚受容体が細胞によって発現される、請求項３８に記載のアッセイ。
【請求項４８】
前記細胞が哺乳動物細胞または卵母細胞である、請求項４７に記載のアッセイ。
【請求項４９】
蛍光測定によるアッセイである、請求項３８に記載のアッセイ。
【請求項５０】
電気生理学的アッセイである、請求項３８に記載のアッセイ。
【請求項５１】
結合アッセイである、請求項３８に記載のアッセイ。
【請求項５２】
キメラ受容体が直接的または間接的に、共有結合的または非共有結合的に固相に結合している、請求項３８に記載のアッセイ。
【請求項５３】
結合アッセイである、請求項３８に記載のアッセイ。
【請求項５４】
競合的結合アッセイである、請求項５３に記載のアッセイ。
【請求項５５】
細胞内イオンに対する前記味覚改変化合物候補の作用を検出する、請求項３８に記載のアッセイ。
【請求項５６】
前記イオンがカルシウムである、請求項５５に記載のアッセイ。
【請求項５７】
カルシウムに対する前記化合物の作用が膜感受性色素または電圧感受性色素を使用して検出される、請求項５６に記載のアッセイ。
【請求項５８】
読み出された情報が蛍光測定によるものである、請求項５７に記載のアッセイ。
【請求項５９】
イオン分極に対する前記味覚改変化合物候補の作用を検出する、請求項３８に記載のアッセイ。
【請求項６０】
セカンドメッセンジャーレベルに対する前記化合物の作用を検出する、請求項３８に記載のアッセイ。
【請求項６１】
セカンドメッセンジャーがＩＰ３である、請求項６０に記載のアッセイ。
【請求項６２】
細胞内環状ヌクレオチドに対する前記味覚改変化合物候補の作用を検出する、請求項３８に記載のアッセイ。
【請求項６３】
前記ヌクレオチドがｃＧＭＰまたはｃＡＭＰである、請求項６２に記載のアッセイ。
【請求項６４】
蛍光測定イメージングを使用する、請求項３８に記載のアッセイ。
【請求項６５】
ＧＴＰγＳへのＧタンパク質結合に対する前記化合物の作用を検出する、請求項３８に記載のアッセイ。
【請求項６６】
旨味エンハンサーを検出するために使用される、請求項３８に記載のアッセイ。
【請求項６７】
甘味エンハンサーを検出するために使用される、請求項３８に記載のアッセイ。
+
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規キメラヒトおよび齧歯類味覚受容体ポリペプチド、核酸配列エンコーディング、これらのキメラ味覚受容体ポリペプチドを発現する細胞、ならびに味覚モジュレーター、とりわけ甘味および旨味味覚のモジュレーターを同定することにおけるそれらの使用に関する。
【０００２】
発明の背景
ヒトＴ１Ｒファミリー味覚受容体には、ｈＴ１Ｒ１、２、および３が挙げられる。Ｔ１Ｒはクラス−ＣのＧタンパク質共役受容体に属し、それぞれのクラス−ＣのＧＰＣＲは大きなＮ−末端細胞外ドメインとＣ‐末端７回膜貫通ドメインからなる。ｈＴ１Ｒ１およびｈＴ１Ｒ３は旨味味覚変換を改変し、旨味感知物質を認識するヘテロマー受容体を形成し、一方ｈＴ１Ｒ２およびｈＴ１Ｒ３は甘味味覚変換を改変し、甘味感知物質を認識するヘテロマー受容体を形成することが一般に知られている。したがって、旨味味覚受容体（ｈＴ１Ｒ１／ｈＴ１Ｒ３）および甘味味覚受容体（ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３）は共通のサブユニットｈＴ１Ｒ３を共有することが公知である。
発明の簡単な説明および目的
旨味および／または甘味味覚刺激に反応し、および／または他の化合物により引き起こされた旨味または甘味味覚を増強するキメラ味覚受容体ポリペプチドを生産することが本発明の目的である。
【０００３】
化合物自体が甘味または旨味味覚を改変し、および／または他の化合物によって引き起こされた甘味または旨味味覚を増強する化合物を同定するためのアッセイにおいて、そのようなキメラ味覚受容体ポリペプチドを使用することが本発明の別の目的である。
【０００４】
いっそう明確には、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ２味覚受容体遺伝子の一部を組み合わせることによりキメラ味覚受容体をコードするＤＮＡ融合物を作製すること、および甘味および／または旨味味覚刺激に反応するか、または他の化合物により引き起こされた旨味または甘味味覚を増強するキメラ味覚受容体を作製するために、同じＴ１Ｒ１およびＴ１Ｒ２味覚受容体を、同じまたは異なる種のＴ１Ｒ３味覚受容体と一緒に同時発現させることが本発明の目的である。
【０００５】
よりいっそう明確には、旨味−甘味キメラ味覚受容体ポリペプチドまたはＤＮＡエンコーディングを作製するために、Ｔ１Ｒ１ポリペプチドまたはＤＮＡエンコーディング、好ましくはｈＴ１Ｒ１またはｍＴ１Ｒ１またはｒＴ１Ｒ１の細胞外ドメインのすべてまたは一部と、Ｔ１Ｒ２ポリペプチドまたはＤＮＡエンコーディング、好ましくはｈＴ１Ｒ２、ｒＴ１Ｒ２またはｍＴ１Ｒ２の膜貫通ドメインのすべてまたは一部を組み合わせることによりキメラ味覚受容体を生産することが本発明の目的である。
【０００６】
その上いっそう明確には、キメラ甘味−旨味味覚受容体ポリペプチドまたはＤＮＡエンコーディングを作製するために、Ｔ１Ｒ２ポリペプチドまたはＤＮＡエンコーディング、好ましくはｈＴ１Ｒ２、ｒＴ１Ｒ２またはｍＴ１Ｒ２の細胞外ドメインのすべてまたは一部と、Ｔ１Ｒ１ポリペプチドまたはＤＮＡエンコーディング、好ましくはｈＴ１Ｒ１、ｍＴ１Ｒ１またはｒＴ１Ｒ１の膜貫通ドメインのすべてまたは一部を組み合わせることによりキメラ味覚受容体を生産することが本発明の目的である。
【０００７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４に含有される、特定のｈＴ１Ｒ１−２およびｈＴ１Ｒ２−１核酸配列ならびにポリペプチド配列を提供することが本発明の別の目的である。
付加的に好ましくはＧタンパク質およびＴ１Ｒ３核酸配列を発現する適切なホスト細胞、好ましくはＨＥＫ−２９３細胞において、キメラ味覚受容体をコードするこれらの核酸配列を発現させることが本発明の別の目的である。
【０００８】
甘味または旨味味覚を改変する分子、たとえば旨味および甘味味覚リガンドならびに旨味および甘味エンハンサーを同定するためのアッセイにおいてこれらの細胞を使用することが本発明の別の目的である。
発明の詳細な説明
発明を明確に説明する前に、以下の定義が提供される。
【０００９】
「Ｔ１Ｒ」ファミリーという用語は、多形変異体、対立遺伝子、突然変異体、およびホモログを包含し、それらは（１）以下に、ならびに参照として本明細書に援用されたＺｕｃｋｅｒ（同上）（２００１）およびＡｄｌｅｒ（同上）（２００１）の出願において開示されたＴ１Ｒに対して、約２５アミノ酸、最適には５０〜１００アミノ酸のウィンドー（ｗｉｎｄｏｗ）にわたり、約３０〜４０％アミノ酸配列同一性、より明確には約４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％アミノ酸配列同一性を有する；（２）以下に開示されたＴ１Ｒ配列、および保存的に改変されたその変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む免疫原に対して産生された抗体に特異的に結合する；（３）以下に開示されたＴ２１  ＤＮＡ配列、および保存的に改変されたその変異体からなる群から選択される配列に対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（少なくとも約１００、場合により少なくとも約５００〜１０００ヌクレオチドのサイズで）特異的にハイブリダイズする；（４）以下に開示されたＴ１Ｒアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％同一な配列を含む、または（５）記載されたＴ１Ｒ配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするプライマーによって増幅される。
【００１０】
とりわけ、これらの「Ｔ１Ｒ」には、本出願に提供された核酸配列およびアミノ酸配列を有するｈＴ１Ｒ１、ｈＴ１Ｒ２、ｈＴ１Ｒ３、ｒＴ１Ｒ１，ｒＴ１Ｒ２、ｒＴ１Ｒ３、ｍＴ１Ｒ１、ｍＴ１Ｒ２、およびｍＴ１Ｒ３と表される味覚受容体ＧＰＣＲ、ならびにその変異体、対立遺伝子、突然変異体、オルソログおよびキメラが挙げられ、それらは特異的に、活性化剤、阻害剤およびエンハンサーを含む甘味または旨味リガンドに結合するおよび／または反応する。好ましくは、本明細書のＴ１Ｒは、Ｔ１Ｒ１ポリペプチドとＴ１Ｒ２ポリペプチドまたはそれらの対応するＤＮＡコーディング配列の一部に由来するキメラ配列である。本明細書に例示するように、本発明に記載の好ましいキメラＴ１Ｒは１種のＴ１Ｒ、すなわちＴ１Ｒ１またはＴ１Ｒ２の細胞外領域と、別のＴ１Ｒ、Ｔ１Ｒ１またはＴ１Ｒ２のいずれかの膜貫通領域を含む。
【００１１】
トポロジー的には、ある種の化学感覚ＧＰＣＲは「Ｎ−末端ドメイン」、「細胞外ドメイン」、７回膜貫通領域ならびに対応する細胞質および細胞外ループを含む「膜貫通ドメイン」、「細胞質領域」、および「Ｃ−末端領域」を有する（たとえば、Ｈｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９６：５４１−５１（１９９９）；Ｂｕｃｋ＆Ａｘｅｌ，Ｃｅｌｌ，６５：１７５−８７（１９９１）を参照されたい）。これらの領域は、疎水性および親水性ドメインを同定する配列解析プログラムのような、当業者に公知の方法を使用して構造的に確認することができる（たとえば、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（３版、１９８８）を参照されたい；ｄｏｔ．ｉｍｇｅｎ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕに見いだされるような、いくつものインターネットを基礎にした配列解析プログラムの中のいずれかも参照されたい）。これらの領域はキメラタンパク質を作製すること、および本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、たとえばリガンド結合アッセイに有用である。
【００１２】
したがって、「細胞外ドメイン」は細胞膜から突き出し、そして細胞の細胞外表面に露出したＴ１Ｒポリペプチドのドメインを表す。そのような領域は、細胞の細胞外表面に露出している「Ｎ−末端ドメイン」、および細胞の細胞外表面に露出している膜貫通ドメインの細胞外ループ、すなわち膜貫通領域２および３、膜貫通領域４および５、ならびに膜貫通領域６および７間の細胞外ループを包含することになる。「Ｎ−末端ドメイン」はＮ−末端から始まり、そして膜貫通領域の開始点に近い領域に及ぶ。これらの細胞外領域は可溶相および固相両方のｉｎ  ｖｉｔｒｏリガンド結合アッセイに有用である。その上、以下に説明する膜貫通領域も、細胞外領域と組み合わせて、または単独でのいずれかでリガンド結合に関与し、したがって同様にｉｎ  ｖｉｔｒｏリガンド結合アッセイに有用である。ヒト、ラットおよびマウスのＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３の細胞外領域またはドメインは図６に包含される。
【００１３】
７回膜貫通「領域」を含む「膜貫通ドメイン」は細胞膜内にあるＴ１Ｒポリペプチドのドメインを表し、そしてまた膜貫通「領域」としても表される、対応する細胞質（細胞内）および細胞外ループを包含してもよい。７回膜貫通領域ならびに細胞外および細胞質ループは、Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−３２（１９８２）、またはＳｔｒｙｅｒ、上記、に記載の標準法を使用して同定することができる。ヒト、ラットおよびマウスのＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３の膜貫通ドメインまたは領域は同様に図６に包含される。
【００１４】
「細胞質ドメイン」は細胞の内側に面しているＴ１Ｒタンパク質のドメイン、たとえば「Ｃ−末端ドメイン」、および膜貫通ドメインの細胞内ループ、たとえば膜貫通領域１および２、膜貫通領域３および４、そして膜貫通領域５および６間の細胞内ループを表す。「Ｃ−末端ドメイン」はタンパク質の最後の膜貫通領域の末端からＣ−末端までに及び、そして通常細胞質内に位置する領域を表す。
【００１５】
「７回膜貫通受容体」という用語は、細胞膜に７回架かる７領域を有する膜貫通タンパク質のスーパーファミリーに属するポリペプチドを意味する（したがって、７領域は「膜貫通」または「ＴＭ」ドメイン、ＴＭＩ〜ＴＭＶＩＩと呼ばれる）。
【００１６】
「リガンド結合領域」という用語は、膜貫通ドメインＩＩ〜ＶＩＩ（ＴＭＩＩ〜ＶＩＩ）を実質的に組み込む化学感覚または味覚受容体に由来する配列を表す。該領域はリガンド、そしてより特定すれば味覚を引き出す化合物を結合することが可能であってもよい。
【００１７】
「細胞膜（ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）移動ドメイン」または単に「移動ドメイン」はポリペプチドコーディング配列のアミノ末端に組み込まれる場合、高い有効性でハイブリッド（「融合」）タンパク質を細胞膜まで「連れてくる」または「移動させる」ことができるポリペプチドドメインを意味する。例となる「移動ドメイン」は、７回膜貫通受容体であるヒトロドプシン受容体ポリペプチドのアミノ末端に由来する。別の既知の移動ドメインはウシロドプシン配列であり、移動を増強することにも有用である。ロドプシン由来配列は、７回膜貫通融合タンパク質を細胞膜まで移動することにおいてとりわけ有効性がある。
【００１８】
Ｔ１Ｒファミリーメンバーが媒介する味覚変換を改変する試験化合物のためのアッセイの状況では、「機能的作用」という句は、たとえば機能的、物理的および化学的作用のような、間接的または直接的に受容体の影響下にあるいずれかのパラメーターの測定を包含する。それは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、およびｅｘ  ｖｉｖｏにおける、リガンド結合、イオンフラックスの変化、膜電位、電流、転写、Ｇタンパク質結合、ＧＰＣＲリン酸化または脱リン酸化、シグナル伝達、受容体‐リガンド相互作用、セカンドメッセンジャー濃度（たとえば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ３、または細胞内Ｃａ２＋）を包含し、神経伝達物質またはホルモン遊離の増加または減少のような他の生理的作用も包含する。
【００１９】
「機能的作用を測定する」は、間接的または直接的にＴ１Ｒファミリーメンバーの影響下にあるパラメーター、たとえば機能的、物理的および化学的作用を増加させるか、または減少させる化合物のためのアッセイを意味する。そのような機能的作用は当業者に公知のいずれかの手段、たとえば分光学的特徴（たとえば、蛍光、吸光度、屈折率）、流体力学的（たとえば、形態）、クロマトグラフィー的、または溶解度特性、パッチクランピング、電圧感受性色素、ホールセル電流、放射性同位体エフラックス、誘導型マーカー、卵母細胞Ｔ１Ｒ遺伝子発現の変化；組織培養細胞Ｔ１Ｒ発現；Ｔ１Ｒ遺伝子の転写活性化；リガンド結合アッセイ；電圧、膜電位およびコンダクタンス変化；イオンフラックスアッセイ；ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、およびイノシトール三リン酸（ＩＰ３）のような細胞内セカンドメッセンジャーの変化；細胞内カルシウムレベルの変化；神経伝達物質遊離などにより測定することができる。
【００２０】
Ｔ１Ｒタンパク質受容体の「阻害剤」、「活性化剤」、および「モジュレーター」は、たとえばリガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、ならびにそれらのホモログおよびミメティックのような、味覚変換に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて使用する、同定された阻害性、活性化、または改変分子を表すために交換可能に使用される。阻害剤は、たとえば、結合する、部分的もしくは完全に刺激を遮断する、減少させる、妨害する、活性化を遅延させる、不活性化する、感受性を減じる、または味覚変換をダウンレギュレーションする化合物、たとえばアンタゴニストである。活性化剤は、結合する、刺激する、増大させる、開く、活性化する、高める、活性化を増強する、感受性を高める、味覚変換をアップレギュレーションする化合物、たとえばアゴニストである。モジュレーターには、たとえば、活性化剤または阻害剤に結合する細胞外タンパク質と受容体との相互作用を変化させる化合物；Ｇタンパク質；キナーゼ（たとえば受容体の非活性化、および感受性低下に関与する、ロドプシンキナーゼおよびベータアドレナリン受容体キナーゼのホモログ）；およびアレスチンが挙げられ、それらはまた、受容体を非活性化し、そしてそれらの感受性を低下させる。モジュレーターには、一般に遺伝的に改変された型のＴ１Ｒファミリーメンバー、たとえば活性が変化したもの、ならびに生来、および合成リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、小化学分子などが挙げられる。本発明において、これにはとりわけ、甘味リガンド（アゴニストまたはアンタゴニスト）、旨味リガンド（アゴニストおよびアンタゴニスト）、甘味エンハンサーおよび旨味エンハンサーならびに甘味味覚または旨味味覚阻害剤が挙げられる。
【００２１】
阻害剤および活性化剤のためのそのようなアッセイには、たとえば、細胞または細胞膜にＴ１Ｒファミリーメンバーを発現させること、たとえば甘味および旨味化合物を改変する化合物の存在下または非存在下においてモジュレーター化合物候補を適用すること、そしてその後先に記載のような、味覚変換に対する機能的作用を測定することが挙げられる。潜在的な活性化剤、阻害剤、またはモジュレーターにより処理されるＴ１Ｒファミリーメンバーを含む試料またはアッセイは、阻害剤、活性化剤、またはモジュレーターのない対照試料と比較し、改変の程度を試験する。対照試料（モジュレーターにより処理されない）は、相対Ｔ１Ｒ活性値を１００％とする。Ｔ１Ｒの阻害は、対照に比較したＴ１Ｒ活性値が約８０％、場合により５０％または２５〜０％である場合に達成される。Ｔ１Ｒの活性化は、対照に比較したＴ１Ｒ活性値が１１０％、場合により１５０％、場合により２００〜５００％、または１０００〜３０００％である場合に達成される。本発明において、これらのアッセイはＴ１Ｒ１またはＴ１Ｒ２の細胞外部分のすべてまたは一部、および別のＴ１Ｒ、すなわちＴ１Ｒ２またはＴ１Ｒ１の膜貫通ドメインのすべてまたは一部を含むキメラＴ１Ｒを使用することになる。
【００２２】
本明細書で使用する「精製された」、「実質的に精製された」、および「単離された」という用語は、本発明の化合物がその生来の状態において通常結合する、他の、類似しない化合物がない状態を表す。好ましくは、「精製された」、「実質的に精製された」、および「単離された」とは、組成物が与えられた試料の重量で、かさの少なくとも０．５％、１％、５％、１０％、または２０％、そして最も好ましくは少なくとも５０％または７５％を含むことを意味する。好ましい一態様では、これらの用語は与えられた試料の重量で、少なくともかさの９５％を含む本発明の化合物を表す。核酸またはタンパク質に言及する場合、本明細書で使用する、核酸またはタンパク質の「精製された」、「実質的に精製された」、および「単離された」という用語は、精製の状態、または哺乳動物、とりわけヒトの身体に生来存在する濃度とは異なった濃度を表す。精製のいずれかの程度、または哺乳動物、とりわけヒトの身体に生来存在する濃度より高い濃度は、「単離された」の意味の範囲内であり、（１）他の結合した構造または化合物からの精製、または（２）通常は哺乳動物、とりわけヒトの身体に結合しない構造または化合物との結合を含む。本明細書に記載の、核酸もしくはタンパク質、または核酸もしくはタンパク質のクラスは、当業者に公知の多様な方法およびプロセスに従って、単離されるか、あるいはそうでなければ本来通常は関連しない構造または化合物に関連してもよい。
【００２３】
核酸またはポリペプチドに言及する場合、本明細書で使用する「単離された」という用語は、哺乳動物、とりわけヒトの身体に生来存在する精製または濃度の状態とは異なった精製または濃度の状態を表す。精製のいずれかの程度、または哺乳動物、とりわけヒトの身体に生来存在する濃度より高い濃度は、（１）他の生来存在する、結合した構造または化合物からの精製、または（２）通常は身体に結合しない構造または化合物との結合を含み、本明細書で使用する「単離された」の意味の範囲内である。本明細書に記載の核酸もしくはポリペプチドは、当業者に公知の、多様な方法およびプロセスに従って、単離されるか、あるいはそうでなければ本来通常は結合しない構造または化合物に結合してもよい。
【００２４】
本明細書で使用する「増幅する」および「増幅」という用語は、以下に詳細に記載される、組換えまたは生来発現される核酸を生み出すか、または検出するためのいずれか適切な増幅手順の使用を表す。たとえば、本発明はｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで、生来発現される（たとえばゲノムまたはｍＲＮＡ）または本発明の組換え（たとえばｃＤＮＡ）核酸（たとえば本発明の味覚誘発化合物‐結合配列）を増幅（たとえばポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲ）するための方法および試薬（たとえば、特定のオリゴヌクレオチドプライマー対）を提供する。
【００２５】
「発現ベクター」という用語は、原核、酵母、真菌、植物、昆虫または哺乳動物細胞を含むいずれかの細胞において、構成的にまたは誘導的に、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで本発明の核酸配列を発現するためのいずれかの組換え発現系を表す。用語は線状または環状発現系を包含する。用語はエピゾームのままであるか、またはホスト細胞ゲノムに組み込まれる発現系を包含する。発現系は、自己複製するか、またはしない、すなわち、細胞において一過性の発現だけを引き起こす能力を持つことができる。用語は、組換え核酸の転写に必要な最少要素だけを含有する組換え発現カセットを包含する。
【００２６】
「ライブラリー」という用語は、縮退したプライマー対による核酸の増幅によって生じる、組換えにより生み出された感覚、とりわけ味覚受容体リガンド‐結合領域のライブラリーのような、異なる核酸またはポリペプチド分子の混合物、または増幅されたリガンド‐結合領域を組み込むベクターの単離されたコレクション、または味覚受容体をコードする少なくとも１種のベクターによりそれぞれランダムにトランスフェクションされた細胞の混合物である調製物を意味する。
【００２７】
「核酸」または「核酸配列」という用語は、１本鎖または２本鎖型のいずれかにおけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドオリゴヌクレオチドを表す。用語は天然のヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸、すなわちオリゴヌクレオチドを包含する。用語は合成骨格を持つ核酸様構造を包含する。
【００２８】
特記しない限り、特有の核酸配列は保存的に改変されたその変異体（たとえば、縮退したコドン置換物）および相補的配列、ならびに明白に示された配列を暗黙に包含する。特に、縮退したコドン置換物は、たとえば１種以上の選択されたコドンの３番目の位置が、混合‐塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生じることにより得られてもよい（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：２６０５−０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，８：９１−９８（１９９４）。核酸という用語は遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。
【００２９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書ではアミノ酸残基のポリマーを表すために互換可能に使用される。用語は、１種以上のアミノ酸残基が対応する生来存在するアミノ酸の人工的化学ミメティックであるアミノ酸ポリマー、ならびに生来存在するアミノ酸ポリマーおよび生来存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。
【００３０】
本明細書に記載の「転位ドメイン」、「リガンド‐結合領域」およびキメラ受容体組成物はまた、代表的な配列に実質的に対応する構造および活性を持つ「類似体」、または「保存的変異体」および「ミメティック」（「ペプチドミメティック」）を包含する。したがって、「保存的変異体」または「類似体」または「ミメティック」という用語は、改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを表し、その結果変更は本明細書に記載のポリペプチドの（保存的変異体の）構造および／または活性を実質的に変化させない。これらには、保存的に改変されたアミノ酸配列の変種、すなわちタンパク質活性にとって重要でないアミノ酸残基の置換物、付加物もしくは欠失物、または重要なアミノ酸の置換物さえが実質的に構造および／または活性を実質的に変化させないような、類似の特性（たとえば、酸性、塩基性、正荷電または負荷電、極性または非極性など）を有する残基を持つアミノ酸の置換物が包含される。
【００３１】
さらにとりわけ、「保存的に改変された変異体」はアミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特有の核酸配列に関しては、保存的に改変された変異体は、同一の、または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を、あるいは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を表す。遺伝コードの縮退のために、多数の機能的に同一の核酸がいずれか与えられたタンパク質をコードする。
【００３２】
たとえば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべてアミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定されるすべての位置で、コドンはコードされたポリペプチドを変更せずに記載された対応するコドンのいずれかに変更されうる。
【００３３】
そのような核酸の変異は「サイレント変異」であり、そしてそれらは保存的に改変された変異の１種である。ポリペプチドをコードする本明細書のすべての核酸配列はまた、すべての可能性のある核酸のサイレント変異を説明する。当業者は、核酸中のそれぞれのコドン（通常メチオニンにとっての唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンにとっての唯一のコドンであるＴＧＧを除く）は改変されて機能的に同一の分子を生じうることを認識することになる。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異はそれぞれの記載された配列に含まれている。
【００３４】
機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は当業者に公知である。たとえば、保存的置換を選択するための代表的なガイドラインの１種には以下のものが挙げられる（元の残基の後に代表的な置換が続く）：ａｌａ／ｇｌｙまたはｓｅｒ；ａｒｇ／ｌｙｓ；ａｓｎ／ｇｌｎまたはｈｉｓ；ａｓｐ／ｇｌｕ；ｃｙｓ／ｓｅｒ；ｇｌｎ／ａｓｎ；ｇｌｙ／ａｓｐ；ｇｌｙ／ａｌａまたはｐｒｏ；ｈｉｓ／ａｓｎまたはｇｌｎ；ｉｌｅ／ｌｅｕまたはｖａｌ；ｌｅｕ／ｉｌｅまたはｖａｌ；ｌｙｓ／ａｒｇまたはｇｌｎもしくはｇｌｕ；ｍｅｔ／ｌｅｕまたはｔｒｐもしくはｉｌｅ；ｐｈｅ／ｍｅｔまたはｌｅｕもしくはｔｙｒ；ｓｅｒ／ｔｈｒ；ｔｈｒ／ｓｅｒ；ｔｒｐ／ｔｙｒ；ｔｙｒ／ｔｒｐまたはｐｈｅ；ｖａｌ／ｉｌｅまたはｌｅｕ。代わりの代表的なガイドラインは以下の６群を使用し、それぞれはお互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｉ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；（たとえば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８４）；Ｓｃｈｕｌｔｚ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９７９）も参照されたい）。先に同定した置換は唯一可能な保存的置換ではないことを当業者は認めることになる。たとえば、ある目的の場合、すべての荷電したアミノ酸は、それらが正または負であるかにかかわらず、お互いに保存的置換として見なしてもよい。その上、コードされた配列中の単一アミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更する、添加するまたは欠失する個々の置換、欠失または付加も「保存的に改変された変動」と見なしうる。
【００３５】
「ミメティック」および「ペプチドミメティック」という用語は、ポリペプチドの同じ構造的および／または機能的特徴、たとえば本発明の転位ドメイン、リガンド‐結合領域、またはキメラ受容体を実質的に有する合成化学化合物を表す。ミメティックは合成した、非天然のアミノ酸類似体から完全に構成可能であるか、または部分的に天然のペプチドアミノ酸と部分的に非天然のアミノ酸類似体のキメラ分子であってもよい。ミメティックはまた、保存的置換がさらに実質的にミメティックの構造および／または活性を実質的に変更しない限り、いずれかの量の天然のアミノ酸のそのような置換を組み込むことが可能である。
【００３６】
保存的変異体である本発明のポリペプチドについてのように、型どおりの実験が、ミメティックが本発明の範囲内であるかどうか、すなわち、その構造および／または機能が実質的に変更されていないことを確認することになる。ポリペプチドミメティック組成物はいずれかの非天然の構造要素の組み合わせを含むことが可能であり、それらは典型的には以下の３種の構造群に由来する：ａ）天然のアミド結合（ｂｏｎｄ）（「ペプチド結合」）結合（ｌｉｎｋａｇｅ）以外の残基結合群；ｂ）生来存在するアミノ酸残基のかわりの非天然残基；またはｃ）２次構造模倣を誘導する、すなわち２次構造、たとえばベータターン、ガンマターン、ベータシート、アルファへリックスコンホメーションなどを誘導するか、または安定化する残基。ポリペプチドは、生来のペプチド結合以外の化学的手段により残基のすべてまたは一部が結合している場合、ミメティックとして特徴付けることができる。個々のペプチドミメティック残基は、たとえばグルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはＮ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）のように、ペプチド結合、他の化学結合またはカップリング手段により結合することができる。慣例のアミド結合（ｂｏｎｄ）（「ペプチド結合」）結合（ｌｉｎｋａｇｅ）の替わりとなりうる結合群としては、たとえばケトメチレン（たとえば、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−の場合の―Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ２）、アミノメチレン（ＣＨ２ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ．ｄｂｄ．ＣＨ）、エーテル（ＣＨ２Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ２−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ４）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、またはエステルが挙げられる（たとえば、Ｓｐａｔｏｌａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，７巻，２０６−３５７，Ｍａｒｃｅｌｌ  Ｄｅｋｋａｒ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，ＮＹ（１９８３）を参照されたい）。ポリペプチドはまた、生来存在するアミノ酸残基のかわりのすべての、または一部の非天然残基を含有することによってミメティックとして特徴付けることができ；非天然残基は科学的および特許文献において詳細に記載されている。
【００３７】
「ラベル」または「検出可能な部分」とは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段により検出可能な組成物である。たとえば、有用なラベルには３２Ｐ、蛍光色素、電子‐稠密試薬、酵素（たとえば、ＥＬＩＳＡとして一般に使用されるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンおよび、たとえばペプチドに放射標識を組み込むことにより検出可能にするか、またはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用することができるタンパク質が挙げられる。
【００３８】
「標識した核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」とは、リンカーまたは化学結合により共有結合的に、あるいはイオン、ファンデルワールス、静電、または水素結合により非共有結合的に、のいずれかでラベルに結合し、プローブに結合したラベルの存在を検出することにより、プローブの存在が検出されてもよいものである。
【００３９】
本明細書で使用する「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」とは、１以上の型の化学結合により、通常相補的塩基対形成により、通常水素結合形成により、相補的配列の標的核酸に結合可能な核酸として定義される。本明細書で使用するように、プローブは天然の（たとえば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）または修飾された塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）を含んでいてもよい。その上、プローブ中の塩基は、ハイブリダイゼーションを妨害しない限り、ホスホジエステル結合（ｂｏｎｄ）以外の結合（ｌｉｎｋａｇｅ）によって結びついてもよい。したがって、たとえば、プローブは構成要素である塩基がホスホジエステル結合（ｌｉｎｋａｇｅ）よりむしろペプチド結合（ｂｏｎｄ）により結びついているペプチド核酸であってもよい。当業者は、プローブがハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存して、プローブ配列との完全な相補性を欠如する標的配列に結合してもよいことを理解することになる。プローブは場合によりたとえばアイソトープ、クロモホア、ルミホア、クロモゲンによるように、直接標識されるか、またはたとえばストレプトアビジン複合体が後に結合してもよいビオチンによるように、間接的に標識される。プローブの存在または非存在をアッセイすることにより、選抜された配列または部分配列の存在または非存在を検出することが可能である。
【００４０】
「異種」という用語は、核酸の一部に関して使用される場合、核酸が本来お互いに同じ関連の中に見いだされない２種以上のサブ配列を含むことを示す。たとえば、核酸は典型的には組換えにより生産され、新規の機能的核酸を作るように用意された関連のない遺伝子由来の２種以上の配列：たとえば１種の供与源由来のプロモーターと別の供与源由来のコーディング領域を有する。同じように、異種タンパク質は、タンパク質が本来お互いに同じ関連の中に見いだされない２種以上の配列を含むことを示す（たとえば、融合タンパク質）。
【００４１】
「プロモーター」は、核酸の転写を指図する核酸配列のアレイとして定義される。本明細書で使用するように、プロモーターは転写開始部位の近くの必須な核酸配列、たとえばポリメラーゼ１１型プロモーターの場合、ＴＡＴＡエレメントを包含する。プロモーターはまた、場合により遠位のエンハンサーまたはレプレッサーエレメントを包含し、それらは転写開始部位から数千塩基対離れて位置することが可能である。「構成型」プロモーターは、大部分の環境および成長条件下で活性なプロモーターである。「誘導型」プロモーターは環境または成長制御下で活性なプロモーターである。「操作可能に結合」という用語は、核酸発現コントロール配列（たとえばプロモーター、または転写因子結合部位のアレイ）と第２の核酸配列間の機能的結合を表し、ここで発現コントロール配列は第２配列に対応する核酸の転写を指図する。
【００４２】
本明細書で使用する「組換え」とは、合成された、さもなければｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作されたポリヌクレオチド（たとえば、「組換えポリヌクレオチド」）、細胞または他の生物学的系において遺伝子産物を生産するために組換えポリヌクレオチドを使用する方法、または組換えポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド（「組換えタンパク質」）を表す。「組換え手段」はまた、本発明の転位ドメインと本発明のプライマーを使用して増幅された核酸配列を含む融合タンパク質の発現、たとえば誘導的または構成的発現のための種々のコーディング領域もしくはドメインまたは異なる供与源由来のプロモーター配列を有する核酸と、発現カセットまたはベクターとの連結を包含する。
【００４３】
「選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」という句は、複合混合物（たとえば、全細胞またはライブラリーＤＮＡまたはＲＮＡ）中に特有のヌクレオチド配列が存在する場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下における、該配列だけへの分子の結合、二重構造化（ｄｕｐｌｅｘｉｎｇ）、またはハイブリダイゼーションを表す。
【００４４】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という句は、典型的には核酸の複合混合物中において、プローブがその標的配列にハイブリダイズし、他の配列には全くいハイブリダイズしない条件を表す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況では異なる。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する包括的な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ”（１９９３）に見いだされる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度ｐＨでの特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より低い約５〜１０℃になるように選択される。Ｔｍは（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度で）、標的に相補的なプローブの５０％が平衡（標的配列がＴｍで過剰に存在するとき、プローブの５０％は平衡において占有される）において標的配列にハイブリダイズする温度である。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより少なく、典型的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（または他の塩）濃度であり、温度は、短いプローブ（たとえば１０〜５０ヌクレオチド）の場合少なくとも約３０℃、そして長いプローブ（たとえば５０ヌクレオチドより長い）の場合、少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアルデヒドのような脱安定化剤の添加によって達成されてもよい。選択的または特異的ハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルは少なくともバックグラウンドの２倍、場合によりバックグラウンドのハイブリダイゼーションの１０倍である。代表的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下の通りでありうる：５０％ホルムアルデヒド、５ｘＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベーション；または５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベーションし、０．２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、６５℃で洗浄する。そのようなハイブリダイゼーションおよび洗浄ステップはたとえば１、２、５、１０、１５、３０、６０分間；またはそれより長く行うことが可能である。
【００４５】
ストリンジェントな条件下でお互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に関連する場合、依然として関連する。このことは、たとえば、核酸のコピーが、遺伝コードにより許される最大の縮退を使用して作製される場合に起こる。そのような場合、核酸は典型的には適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。代表的な「適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」としては、４０％ホルムアルデヒド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳのバッファー中、３７℃でのハイブリダイゼーション、および１ｘＳＳＣ中、４５℃での洗浄が挙げられる。そのようなハイブリダイゼーションおよび洗浄ステップは、たとえば１、２、５、１０、１５、３０、６０分間、またはそれより長く行うことができる。陽性のハイブリダイゼーションは少なくともバックグラウンドの２倍である。当業者は、代わりとなるハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を使用して類似のストリンジェントな条件を提供できることを容易に認識することになる。
【００４６】
「抗体」は抗原に特異的に結合し、それを認識する、イムノグロブリン遺伝子またはそのフラグメント由来のフレームワーク領域を含むポリペプチドを表す。認識されるイムノグロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、ならびに非常に多数のイムノグロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、それらが今度はイムノグロブリングラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ定義する。
【００４７】
代表的なイムノグロブリン（抗体）構造ユニットは四量体を含む。それぞれの四量体は２つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、それぞれの対は、１本の「軽鎖」（約２５ｋＤａ）および１本の「重鎖」（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。それぞれの鎖のＮ−末端は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０またはそれより多いアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を表す。
【００４８】
「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域またはその一部が、変更され、置換され、または交換されて、抗原結合部位（可変領域）が異なるかまたは変更されたクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域、またはキメラ抗体に新規な特性を授ける完全に異なる分子、たとえば酵素、トキシン、ホルモン、成長因子、薬物などに結合している；あるいは（ｂ）可変領域またはその一部が、異なるかまたは変更された抗原特異性を有する可変領域によって変更され、置換され、または交換されている抗体分子である。
【００４９】
「抗‐Ｔ１Ｒ」抗体は、Ｔ１Ｒ遺伝子、ｃＤＮＡ、またはその部分配列によってコードされるポリペプチドを特異的に結合する抗体、または抗体フラグメントである。
「イムノアッセイ」という用語は、抗原に特異的に結合する抗体を使用するアッセイである。イムノアッセイは、抗原を単離する、標的化する、および／または定量するための、特有の抗体の特定の結合特性の使用が特徴である。
【００５０】
抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」、またはタンパク質またはペプチドを表す場合は、それと「特異的に（選択的に）」免疫反応性であるという句は、タンパク質または他の生体分子（ｂｉｏｌｏｇｉｃ）の異種集団においてタンパク質の存在を限定する結合反応を表す。したがって、明示されたイムノアッセイ条件下で、特定された抗体は少なくともバックグラウンドの２倍、特有のタンパク質に結合し、試料中に存在する他のタンパク質に対して実質的に意味のある量で結合しない。そのような条件下での抗体への特異的な結合は、特有のタンパク質に対する特異性に関して選択される抗体を必要としてもよい。
【００５１】
たとえば、ラット、マウスまたはヒトのような特定の種由来のＴ１Ｒファミリーメンバーに対して産生されたポリクローナル抗体は、Ｔ１Ｒポリペプチドまたはその免疫原性部分と特異的に免疫反応性であり、Ｔ１Ｒポリペプチドのオルソログもしくは多形変異体および対立因子を除く他のタンパク質とは免疫反応性ではないポリクローナル抗体だけを得るために選択することができる。この選択は、他の種または他のＴ１Ｒ分子由来のＴ１Ｒ分子と交差反応する抗体を取り去ることにより成し遂げられてもよい。Ｔ１Ｒ  ＧＰＣＲファミリーメンバーだけを認識するが、他のファミリー由来のＧＰＣＲは認識しない抗体を選択することもできる。多様なイムノアッセイ形式を使用して、特有のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択してもよい。たとえば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイはタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために日常的に使用される（特異的な免疫反応性を確認するために使用することができるイムノアッセイ形式および条件の説明としては、たとえば、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）を参照されたい）。典型的には、特異的または選択的反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、より典型的にはバックグラウンドより１０〜１００倍多いことになる。
【００５２】
「選択的に結合する」という句は、先に記載のように、別の核酸と「選択的にハイブリダイズする」核酸の能力、または先に記載のようにタンパク質に「選択的に（または特異的に）」結合する抗体の能力を表す。
【００５３】
「発現ベクター」という用語は、原核細胞、酵母、真菌、昆虫または哺乳動物細胞を含むいずれかの細胞において、構成的または誘導的にｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで本発明の核酸配列を発現するためのいずれかの組換え発現系を表す。用語には、エピゾームのままでいるか、またはホスト細胞ゲノムに組み込まれる発現系が包含される。発現系は自己複製する、またはしない、すなわち細胞において一過性発現だけを行う能力を有することができる。用語には、組換え核酸の転写に必要な最少要素だけを含有する組換え発現「カセット」が包含される。
【００５４】
「ホスト細胞」という用語は、発現ベクターを含有し、発現ベクターの複製または発現を補助する細胞を意味する。ホスト細胞は、大腸菌のような原核細胞、または酵母、昆虫、両生類のような真核細胞、またはＣＨＯ、ＨｅＬａ，ＨＥＫ−２９３のような哺乳動物細胞、ならびに培養細胞、外植体、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞などであってもよい。
【００５５】
上記に基づいて、主題の発明は、同じまたは異なる種のＴ１Ｒ１およびＴ１Ｒ２の一部を含み、同じまたは異なる種の無傷の、または改変されたＴ１Ｒ３配列と同時発現される場合、明確に旨味および／または甘味感知化合物に反応するキメラ受容体が構築可能であること、およびこれらのキメラ味覚受容体の活性化が甘味または旨味エンハンサー化合物によって増強されるという発見に関する。したがって、これらのキメラ受容体は、甘味および旨味リガンド（感知物質）をスクリーニングするための、ならびに他の甘味および旨味感知化合物によって引き起こされる甘味または旨味味覚を増強するか、または阻害する化合物をスクリーニングするためのアッセイにおいて使用してもよい。
【００５６】
図１〜４に示すように、味覚改変化合物を同定するためのセルベースアッセイにおいて主題のキメラ受容体の効力を確立するために、発明者らはｈＴ１Ｒ２Ｎ−末端細胞外ドメインとｈＴ１Ｒ１Ｃ−末端７回膜貫通ドメインからなるｈＴ１Ｒ２−１と名付けられたｈＴ１Ｒ２とｈＴ１Ｒ１の一部、およびｈＴ１Ｒ１細胞外ドメインとｈＴ１Ｒ２Ｃ−末端７回膜貫通ドメインを含有するｈＴ１Ｒ１−２を含む、キメラ味覚受容体を構築した。これらのキメラ受容体が、このキメラ受容体ならびにＧアルファ１６のＮ−末端部分およびトランスデューシンまたはガストデューシンの２５もしくは４４カルボキシ末端アミノ酸をそれぞれ含む無差別なキメラＧタンパク質Ｇ１６−ｔ２５またはＧ１６ｇ４４を安定に発現するＨＥＫ−２９３細胞株において、ヒトまたは齧歯類Ｔ１Ｒ３配列と一緒に同時発現された場合、得られたキメラ甘味‐旨味キメラ受容体、またはキメラ旨味‐甘味味覚受容体は機能的であり、そして甘味および／または旨味リガンド化合物およびエンハンサーに明確に反応した。
【００５７】
とりわけ、ｈＴ１Ｒ２−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２）が甘味料および旨味化合物の両方に特異的に反応すること、およびこの受容体の活性が甘味アゴニストシクラメートによって増強され、そして‘８０７、およびより低濃度でエンハンサーとして同様に機能する‘３３６と表される旨味化合物の両方によって活性化されることが示された。その上、このキメラ受容体はＩＭＰまたはＭＳＧに反応せず、同様にＩＭＰは他の旨味化合物によって引き起こされた反応に対してエンハンサー作用を持たないことが示された。このことはｈＴ１Ｒ１の細胞外領域は、すべての旨味化合物が旨味受容体と相互作用するために必須ではないが、それはＭＳＧとＩＭＰとの相互作用に影響を与え、そしてそれらに必要であることを暗示する。また、生来の受容体の甘味アゴニスト、シクラメートがエンハンサーのように振る舞うということを示した結果は、化合物が生来の甘味受容体と相互作用する場合、味覚受容体の異なる部分と相互作用してもよいことを示唆する。
【００５８】
とりわけ、ｈＴ１Ｒ１−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および４）は、Ｌ−グルタミン酸塩、Ｌ−アスパラギン酸塩およびＬ−ＡＰ４を含む旨味化合物に反応し、このキメラ味覚受容体の活性が５′ヌクレオチドＩＭＰおよびＧＭＰによって増強されることが示された。認められるように、これらの結果は、ｈＴ１Ｒ１の細胞外部分が一部の旨味リガンドおよびそれらのエンハンサーを認識することに関与するということを暗示する。対照的に、炭水化物、甘味アミノ酸および合成甘味料を含む試験した甘味化合物はいずれもｈＴ１Ｒ１−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および４）を活性化しなかった。
【００５９】
さらに明確には、発明者らは、ｈＴ１Ｒ２−１またはｈＴ１Ｒ１−２配列およびＴ１Ｒ３配列、すなわちｈＴ１Ｒ３またはｒＴ１Ｒ３、ならびにキメラＧタンパク質である、ガストデューシンの最後の４４アミノ酸に融合したＧアルファ１６のＮ−末端部分からなるＧ１６−ｇ４４、またはＧアルファ１６のＮ−末端部分とトランスデューシンのＣ−末端尾部（最後の２５アミノ酸残基）をコードするコドンによって置換された最後の２５コドンからなるＧ１６−ｔ２５を構成的に発現する安定なＨＥＫ−２９３細胞株を生み出した。したがって、得られたキメラＧタンパク質において、Ｇアルファ１６の最後の２５アミノ酸はトランスデューシンタンパク質配列の最後の２５アミノ酸残基によって置換されるか、または最後の４４アミノ酸がガストデューシンに由来する。
【００６０】
ｈＴ１Ｒ２−１を発現する安定なＨＥＫ−２９３細胞株を使用して、発明者らは、スクロース、フルクトース、Ｄ−トリプトファン、アスパルテーム、シクラメート、サッカリンおよびズルチンを含む、甘味料の作用を試験した（図７）。シクラメートを除いて、これらの甘味料はすべてｈＴ１Ｒ２−１／ｈＴ１Ｒ３キメラ受容体を活性化し、ｈＴ１Ｒ２Ｃ−末端７回膜貫通ドメインがこれらの甘味料と甘味味覚受容体（ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３）との相互作用に必要でないことを示唆した。図９〜１２に示すように、シクラメートはアスパルテーム、Ｄ−トリプトファン、スクロース、およびフルクトースによる、このキメラ受容体の活性化を増強した。図１３に示すように、登録された旨味リガンド‘８０７はこのキメラ受容体の活性を誘発し、この活性はシクラメートによりさらに増強された。
【００６１】
付加的な実験において、発明者らはまた、キメラＨＴ１Ｒ２−１受容体に対するＬ−グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）、ＩＭＰ、‘８０７および‘３３６を含む、この安定な細胞株に対する、種々の旨味感知化合物およびエンハンサーの作用を試験した。ＭＳＧまたはＩＭＰは、キメラ甘味‐旨味味覚受容体に対して作用が全くないことが見いだされた。また、ＩＭＰは安定な細胞株において発現された受容体の活性に対して増強作用が全く見られず、ｈＴ１Ｒ１Ｎ−末端細胞外ドメインが旨味味覚受容体（ｈＴ１Ｒ１／ｈＴ１Ｒ３）とＭＳＧ／ＩＭＰの相互作用に明らかに必要であることを示唆した。また、‘８０７および‘３３６と同定された、２種の登録された旨味リガンドはキメラ受容体を強く活性化した。これらの結果は、ｈＴ１Ｒ１Ｎ−末端ドメインは、旨味味覚受容体と相互作用し、そしてそれを活性化するこれらの化合物にとって明らかに必要ではないことを暗示することになる。
【００６２】
シクラメートは、発明者らが以前にｈＴ１Ｒ３Ｃ−末端７回膜貫通ドメインと相互作用することを証明した甘味料であるため、発明者らはエンハンサーとしてのシクラメートの作用を試験した。述べたように、以前に甘味味覚受容体（ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３）のアゴニストであることが見いだされたシクラメートは、旨味味覚受容体（ｈＴ１Ｒ１／ｈＴ１Ｒ３）のエンハンサーであった。したがって、発明者らは、アルパルテーム、スクロース、フルクトースを含む、天然の、および合成の甘味リガンドへの対象キメラｈＴ１Ｒ２−１受容体の反応に対する、および‘８０７の作用に対するシクラメートの作用、そして逆にアスパルテーム反応に対する‘８０７の作用を評価する実験を行った。
【００６３】
とりわけ、図９〜１２に示すように、シクラメートは種々の甘味料（アスパルテーム、Ｄ−トリプトファン、スクロース、フルクトース）へのｈＴ１Ｒ２−１の反応を増強することが認められ、そしてシクラメートは安定なｈＴ１Ｒ２−１／ｈＴ１Ｒ３細胞株において、単独では甘味‐旨味キメラ受容体（ｈＴ１Ｒ２−１／ｈＴ１Ｒ３）を活性化しないが、甘味料ならびに旨味化合物‘８０７および‘３３６に対するその反応を増強することが認められた。これらの結果は、甘味味覚受容体（ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３）のアゴニストであるシクラメートが甘味‐旨味キメラ受容体（ｈＴ１Ｒ２−１／ｈＴ１Ｒ３）に対するエンハンサーのように振る舞うことを暗示する。
【００６４】
述べたように、‘８０７および‘３３６はｈＴ１Ｒ１Ｃ−末端膜貫通ドメインと相互作用することが示された。甘味‐旨味キメラ受容体を活性化すること以外に、８０７および３０６はまた、より低濃度でキメラ甘味‐旨味味覚受容体活性を増強することが認められた。
【００６５】
先に言及したように、キメラｈＴ１Ｒ１−２受容体、キメラＧ１６ｇｕｓｔ４４タンパク質、およびラットＴ１Ｒ３配列を発現するＨＥＫ−２９３細胞株を使用して実験を行い、このキメラ味覚受容体が旨味感知化合物に反応したこと、そしてその活性がＩＭＰおよびＧＭＰによって増強されることを明らかにした。
【００６６】
したがって、前記に基づいて、本発明に記載のキメラ‐甘味‐旨味キメラ受容体またはキメラ旨味‐甘味味覚受容体、およびこれらのキメラ味覚受容体を発現する安定な、または一過性細胞株を使用して、甘味味覚エンハンサー、旨味味覚エンハンサー、甘味料、および旨味感知分子を同定することができる。また、これらのキメラ味覚受容体およびこれらのキメラ味覚受容体を発現する細胞株を使用して、甘味および旨味リガンドがどの残基においてそれらのそれぞれの味覚受容体と相互作用するかを確認するためのマッピングおよび機能的研究を行うことができる。その上、これらの分子を使用して甘味および旨味受容体の活性化および活性化増強の機序を解明することができる。
【００６７】
以下においてより詳細に論ずるように、これらのハイブリッド受容体は、２００１年７月３日に出願された、米国シリアル番号０９／８９７，４２７、および２００２年６月２６日に出願された米国シリアル番号１０／１７９，３７３を含む、出願者らの初期のＴ１Ｒ関連出願に開示されたスクリーニングアッセイのいずれかにおいて使用することができる。これらの特許出願およびその中に引用された参考文献はそのまま、本明細書に参照として援用される。その上、以下に論じるように、これらのハイブリッド受容体は本明細書に開示された発現ベクターおよび細胞のいずれかを使用して発現させることができる。しかし、発現のための好ましい細胞には、ＨＥＫ−２９３、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＭＤＫ、ＢＨＫ、サルＬおよび（カエル）卵母細胞のような、ＧＰＣＲアッセイにおいて典型的に使用される細胞が挙げられる。
【００６８】
以下に論じるような機能的セルベースアッセイにおいて、キメラ受容体は好ましくは適切なＧタンパク質、たとえば無差別なＧタンパク質、たとえばＧアルファ１５、Ｇアルファ１６、トランスデューシン、ガストデューシン、Ｇｐタンパク質、Ｇｉタンパク質またはＧアルファ１６とガストデューシンに由来するキメラタンパク質のようなキメラＧタンパク質と結合して発現されることになる。本明細書に例示されるのは、Ｇ１６、およびトランスデューシンまたはガストデューシンに由来するキメラタンパク質である。
【００６９】
また、本出願は特定の甘味‐旨味およびキメラ旨味‐甘味核酸およびタンパク質配列を例示するが、本発明はさらにその変異体、たとえば少なくともそれらとの８０％配列同一性、より好ましくはそれらとの９０％配列同一性、そしていっそう典型的にはそれらとの９５、９６、９７、９８、または９９％配列同一性を有する核酸配列およびポリペプチドを企図することを理解すべきである。同様に、これらのキメラ配列は野生型または変異Ｔ１Ｒ３配列と一緒に発現してもよく、すなわち、変異体は少なくともヒトまたは齧歯類Ｔ１Ｒ３配列との８０％配列同一性、より典型的にはそれらとの９０％配列同一性、そしていっそう典型的にはそれらとの９５、９６、９７、９８、または９９％配列同一性を有する。
【００７０】
対象キメラ味覚受容体を使用して同定された旨味および甘味リガンドおよびエンハンサーの味覚改変作用は、好ましくはヒトまたは動物味覚試験において確認されることになる。たとえば、それらは単独で、あるいは他の化合物（甘味化合物または旨味感知化合物）と一緒に甘味または旨味味覚を改変することを確認することになる。これらの化合物は、食物、飲料、医薬品および化粧品を含む種々の組成物において、風味添加物として使用されてもよい。
【００７１】
好ましくは、これらのアッセイは、以下に同定されたアミノ酸配列の１種を有するｈＴ１ＲをコードするＤＮＡを発現する試験細胞を使用することになる。しかし、これらのキメラ甘味‐旨味または旨味‐甘味味覚受容体の機能的特性を保持する、すなわち一部の甘味もしくは旨味化合物またはそのエンハンサーに反応するこれらの受容体ポリペプチドのフラグメント、オルソログ、変異体またはキメラもこれらのアッセイにおいて有用であることが期待される。そのような変異体の例としては、組換えもしくは化学的手段によって生産される、または生来存在するスプライス変異体、一ヌクレオチド多形、対立遺伝子変異体、および突然変異体が挙げられる。本発明のアッセイにおいて使用されるＴ１Ｒの単離および発現のための手段、およびこれらの受容体の活性化を阻害する化合物を同定するための本発明における使用を企図したアッセイは以下に説明される。
Ｔ１Ｒの単離および発現
本発明のＴ１Ｒ、またはそのフラグメントもしくは変異体の単離および発現は、本出願に開示されたＴ１Ｒ核酸配列に基づいて構築されるプローブまたはプライマーを使用して、十分に確立されたクローニング手順により達成することができる。関連したＴ１Ｒ配列はまた、本明細書に開示された配列を使用したヒトまたは他の種のゲノムデータベース、および公知のコンピューターを基礎にした検索技術、たとえばＢＬＡＳＴ配列検索法から同定してもよい。特定の態様において、本明細書に開示された偽遺伝子を使用して機能的な対立遺伝子または関連遺伝子を同定することができる。
【００７２】
次に発現ベクターを使用して、これらの配列の機能的発現のためにホスト細胞を感染させるか、トランスフェクトすることができる。これらの遺伝子およびベクターはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで作製し、発現させることができる。当業者は、核酸発現を変化させるか、またはコントロールするための所望する表現型は、本発明のベクター内の遺伝子および核酸（たとえば、プロモーター、エンハンサーなど）の発現または活性を改変することにより得られうることを認識することになる。記載された公知の方法のいずれかを使用して、発現または活性を増加させるか、または減少させることができる。本発明は当該技術分野で公知のいずれかの方法またはプロトコールと一緒に実行することができ、それらは科学および特許文献に詳細に記載されている。
【００７３】
あるいは、これらの核酸は、たとえばＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１−１８（１９８２）；Ａｄａｍｓ，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０５：６６１（１９８３）；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３４４０−３４４４（１９９７）；Ｆｒｅｎｋｅｌ，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９：３７３−３８０（１９９５）；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：７８８６−７８９６（１９９４）；Ｎａｒａｎｇ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０（１９７９）；Ｂｒｏｗｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９（１９７９）；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９（１９８１）；米国特許第４，４５８，０６６号に記載のような、公知の化学合成技術によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することができる。次に、２本鎖ＤＮＡフラグメントは相補鎖を合成し、そして適切な条件下で鎖を一緒にアニーリングするか、またはＤＮＡポリメラーゼを使用して適切なプライマー配列と一緒に相補鎖を添加することのいずれかにより得てもよい。
【００７４】
核酸操作のための技術、たとえば配列に突然変異を生み出すこと、サブクローニング、プローブを標識すること、配列決定、ハイブリダイゼーションなどは科学および特許文献に詳細に記載されている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ編，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２版），１〜３巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７）；Ｔｉｊｓｓｅｎ編，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｃｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照されたい。
【００７５】
核酸、ベクター、キャプシド、ポリペプチドなどは当業者に公知の多数の一般法のいずれかによって分析し、定量することができる。これらには、たとえば、ＮＭＲ、分光光学法、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、および超核酸クロマトグラフィー、種々の免疫学的方法、たとえば液体またはゲル沈降素反応、免疫拡散、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、サウザン解析、ノーザン解析、ドット‐ブロット解析、ゲル電気泳動（たとえば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、他の核酸または標的またはシグナル増幅法、放射標識法、シンチレーション計数、およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
【００７６】
オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、Ｔ１Ｒリガンド‐結合領域をコードする核酸を増幅してもよい。本明細書に記載の核酸はまた、増幅技術を使用してクローニングするか、または定量的に測定することができる。増幅法も当該技術分野で公知であり、そして、たとえば、以下のものが挙げられる：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｉｎｎｉｓ編，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｉｎｎｉｓ編，ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９５）；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４：５６０（１９８９）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１０７７（１９８８）；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ，Ｇｅｎｅ，８９：１１７（１９９０）；転写増幅（Ｋｗｏｈ，ＰＮＡＳ，８６：１１７３（１９８９））；ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，ＰＮＡＳ，８７：１８７４（１９９０）；Ｑベータレプリカーゼ増幅法（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５：１４７７−９１（１９９７））；自動Ｑ−ベータレプリカーゼ増幅法（Ｂｕｒｇ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、１０：２５７−７１（１９９６））；および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術（たとえばＮＡＳＢＡ，Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）。Ｂｅｒｇｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５２：３０７−１６（１９８７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ；米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号；Ｓｏｏｋｎａｎａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：５６３−６４（１９９５）も参照されたい。
【００７７】
所望する場合、いったん増幅されると、当該技術分野で公知の方法に従って、核酸は個々に、またはライブラリーとして、慣例の分子生物学的方法を使用して多様なベクターのいずれかにクローニングされてもよく；ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増幅された核酸をクローニングするための方法は、たとえば、米国特許第５，４２６，０３９号に記載される。増幅された配列のクローニングを増強するために、制限酵素部位をＰＣＲプライマー対に「ビルトインする」ことができる。たとえば、ＰｓｔＩおよびＢｓｐＥ１部位が本発明の代表的なプライマー対に設計された。これらの特有の制限部位は、連結した場合、それらがスプライスされる７回‐膜受容体「ドナー」コーディング配列に関して「インフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）」である配列を有する（リガンド‐結合領域コーディング配列は７回‐膜ポリペプチドに対して内在し、したがって、コンストラクトが制限酵素スプライス部位の下流に翻訳されることを所望する場合、アウトオブフレーム（ｏｕｔ  ｏｆ  ｆｒａｍｅ）という結果は回避されるべきであり；このことは挿入されたリガンド‐結合領域が実質的に膜貫通ＶＩＩ領域の大部分を含む場合は必要でなくてもよい）。プライマーは「ドナー」「７回−膜受容体」の元の配列を保持するように設計することができる。あるいは、プライマーは保存的置換物（たとえば疎水性残基に対して疎水性残基、上記の検討を参照されたい）または機能的に温和な置換物（たとえば細胞膜挿入を妨げない、ペプチダーゼによる開裂を引き起こさない、受容体の異常なフォールディングを引き起こさないなど）であるアミノ酸残基をコードすることができる。
【００７８】
プライマー対はＴ１Ｒタンパク質のリガンド‐結合領域を選択的に増幅するように設計されてもよい。これらの結合領域は異なるリガンドに対して変化してもよく；したがって、１種のリガンドにとって最小結合領域であってもよいものは、第２の潜在的なリガンドにとって限定的でありすぎてもよい。したがって、異なるドメイン構造を含む異なるサイズの結合領域が増幅されてもよい；たとえば７回‐膜貫通Ｔ１Ｒの、膜貫通（ＴＭ）ドメインＩＩからＶＩＩまで、ＩＩＩからＶＩＩまで、ＩＩＩからＶＩまでもしくはＩＩからＶＩまで、またはその変形（たとえば、特定のドメインの部分配列だけ、ドメインの順序の混合、など）。
【００７９】
多くの７回‐膜Ｔ１Ｒタンパク質のドメイン構造および配列は公知であるため、当業者はモデル配列としてのドメイン‐フランキングおよび内部ドメイン配列を容易に選択し、縮退増幅プライマー対を設計することができる。たとえば、ドメイン領域ＩＩからＶＩＩまでをコードする核酸配列は、プライマー対を使用してＰＣＲ増幅によって生み出すことができる。膜貫通ドメインＩ「ＴＭＩ」配列を含む核酸を増幅するために、縮退プライマー対は先に記載のＴ１Ｒファミリーコンセンサス配列１のアミノ酸配列をコードする核酸から設計することができる。そのような縮退プライマーを使用して、ＴＭＩからＴＭＩＩＩまで、ＴＭＩからＴＭＩＶまで、ＴＭＩからＴＭＶまで、ＴＭＩからＴＭＶＩまで、またはＴＭＩからＴＭＶＩＩまでを組み込む結合領域を生み出すことができる。他の縮退プライマーは、本明細書に提供された他のＴ１Ｒファミリーコンセンサス配列に基づいて設計することができる。そのような縮退プライマーを使用して、ＴＭＩＩＩからＴＭＩＶまで、ＴＭＩＩＩからＴＭＶまで、ＴＭＩＩＩからＴＭＶＩまで、またはＴＭＩＩＩからＴＭＶＩＩまでを組み込む結合領域を生み出すことができる。
【００８０】
縮退プライマー対を設計するためのパラダイムは当該技術分野で公知である。たとえば、ＣＯｎｓｅｎｓｕｓ−ＤＥｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（ＣＯＤＥＨＯＰ）法コンピュータープログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｂｌｏｃｋｓ．ｆｈｃｒｃ．ｏｒｇ／ｃｏｄｅｈｏｐ．ｈｔｍｌとしてアクセス可能であり、公知の味覚受容体リガンド‐結合領域としての、１組の関連したタンパク質配列で始まるハイブリッドプライマー予言のためのＢｌｏｃｋＭａｋｅｒ多重配列アラインメントサイトから直接リンクする（たとえば、Ｒｏｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６：１６２８−３５（１９９８）；Ｓｉｎｇｈ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２４：３１８−１９（１９９８）を参照されたい）／
オリゴヌクレオチドプライマー対を合成するための手段は当該技術分野で公知である。「天然の」塩基対または合成塩基対を使用することができる。たとえば、人工ヌクレオベースの使用は、プライマー配列を操作し、より複雑な増幅産物の混合物を生み出すための用途の広い研究方法を提供する。種々の人工ヌクレオベースファミリーは、内部の結合回転により多数の水素結合オリエンテーションを推定し、縮退分子認識のための手段を提供することができる。ＰＣＲプライマーの１カ所へのこれらの類似体の組み込みは、増幅産物の複雑なライブラリーの作製を考慮する。たとえば、Ｈｏｏｐｓ，ｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：４８６６−７１（１９９７）を参照されたい。非極性分子を使用して、天然のＤＮＡ塩基の形態を模倣することもできる。アデニンの非水素結合形態ミミックは、チミンの非極性ミミックに対して、効率的に、そして選択的に複製可能である（たとえば、Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，５：９５０−５４（１９９８）を参照されたい）。たとえば、２種の縮退塩基は、ピリミジン塩基６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサゾン−７−オンまたはプリン塩基Ｎ６−メトキシー２，６−ジアミノプリンでありうる（たとえば、Ｈｉｌｌ，ＰＮＡＳ，９５：４２５８−６３（１９９８）を参照されたい）。本発明の代表的な縮退プライマーは、ヌクレオベース類似体５′−ジメトキシトリチル−Ｎ−ベンゾイル−２′−デオキシ−シチジン、３′−［２−シアノエチル］−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイト（配列中の用語「Ｐ」、上記参照）を組み込む。このピリミジン類似体は、ＡおよびＧ残基を含む、プリンと水素結合する。
【００８１】
多形変異体、対立遺伝子、および本明細書に開示された味覚受容体に実質的に同一である種間ホモログは、先に記載の核酸プローブを使用して単離することができる。あるいは、発現ライブラリーを使用して、Ｔ１Ｒポリペプチドに対して作製され、その上、Ｔ１Ｒホモログを認識し、選択的にそれに結合する抗血清、または精製された抗体により発現されたホモログを免疫学的に検出することにより、Ｔ１Ｒポリペプチドならびにその多形変異体、対立遺伝子、および種間ホモログをクローニングすることができる。
【００８２】
味覚受容体のリガンド‐結合領域をコードする核酸は、適切な（完全、または縮退）プライマー対を使用して、適切な核酸配列の増幅（たとえばＰＣＲ）により生み出されてもよい。増幅された核酸は、いずれかの細胞もしくは組織由来のゲノムＤＮＡ、または味覚受容体‐発現細胞由来のｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡでありうる。
【００８３】
一態様において、転位配列に融合した、キメラまたは生来のＴ１Ｒをコードする核酸を含む、ハイブリッドタンパク質‐コーディング配列が構築されてもよい。また、転位モチーフと化学感覚受容体、とりわけ味覚受容体の他のファミリーの味覚誘発化合物‐結合領域を含むハイブリッドＴ１Ｒが提供される。これらの核酸配列は、ＤＮＡをＲＮＡに転写することにおいて有用な、転写または翻訳コントロールエレメント、たとえば転写および翻訳開始配列、プロモーターおよびエンハンサー、転写および翻訳ターミネーター、ポリアデニル化配列、および他の配列に操作可能に連結することができる。組換え発現カセット、ベクター、およびトランスジェニックの構築において、プロモーターフラグメントを使用して、すべての所望する細胞または組織において所望する核酸を発現させることができる。
【００８４】
別の態様において、融合タンパク質はＣ−末端またはＮ−末端転位配列を包含していてもよい。さらに、融合タンパク質は、たとえばタンパク質検出、精製、または他の適用のための、付加的なエレメントを含むことができる。検出および精製増強ドメインには、たとえば、固定化された金属上での精製を可能にするポリヒスチジントラクト（ｔｒａｃｔ）のような金属キレートペプチド、ヒスチジン‐トリプトファンモジュール、もしくは他のドメイン；マルトース結合タンパク質；固定化されたイムノグロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン；またはＦＬＡＧＳ伸張／親和精製系（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ，Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｗａｓｈ．）で使用されるドメインが挙げられる。
【００８５】
転位ドメイン（効率的な細胞膜発現のための）と新規に翻訳されたポリペプチドの残部の間の、開裂可能なリンカー配列、たとえば第Ｘａ因子（たとえば、Ｏｔｔａｖｉ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，８０：２８９−９３（１９９８）を参照されたい）、スブチリシンプロテアーゼ認識モチーフ（たとえば、Ｐｏｌｙａｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１０：６１５−１９（１９９７）を参照されたい）；エンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）などの包含は、精製を増強するために有用であるかもしれない。たとえば、１コンストラクトが、６つのヒスチジン残基に連結し、チオレドキシン、エンテロキナーゼ開裂部位（たとえば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４：１７８７−９７（１９９５）を参照されたい）、およびＣ−末端翻訳ドメインが続く核酸配列をコードするポリペプチドを包含することができる。ヒスチジン残基は検出および精製を増強し、一方エンテロキナーゼ開裂部位は融合タンパク質の残余部分から所望するタンパク質を精製するための手段を提供する。融合タンパク質をコードするベクターに関連する技術および融合タンパク質の適用は科学および特許文献に詳細に記載されている（たとえば、Ｋｒｏｌｌ，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１２：４４１−５３（１９９３）を参照されたい）。
【００８６】
リガンド‐結合領域コーディング配列を含む、個々の発現ベクターとしての、または発現ベクターのライブラリーとしてのいずれかの発現ベクターを、ゲノムに、または細胞の細胞質もしくは核に導入し、そして科学および特許文献に詳細に記載されている多様な慣用の技術により発現させてもよい。たとえば、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｂｅｒｇｅｒ  上記；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｏｒ．Ｐｕｒｉｆ．，６４３５：１０（１９９５）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ；Ｔｉｊｓｓｅｎ；Ａｕｓｕｂｅｌを参照されたい。生物学的試薬および実験装置の製造業者由来の製品情報は、公知の生物学的方法に関する情報も提供する。ベクターは天然の供与源から単離する、ＡＴＣＣもしくはＧｅｎＢａｎｋライブラリーのような供与源から得る、または合成もしくは組換え法により製造することができる。
【００８７】
核酸は、細胞において安定に、または一過性に発現している発現カセット、ベクターまたはウイルス中に発現させることができる（たとえばエピゾーム発現系）。選択マーカーは発現カセットまたはベクターに組み込まれ、形質転換された細胞および配列に対して選択可能な表現型を授けることができる。たとえば、選択マーカーは、ホストゲノムへの統合が必要でないように、エピゾームの維持および複製に関してコードすることができる。たとえば、マーカー抗生物質（たとえば、クロラムフェニコール、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ヒグロマイシン）耐性または除草剤（たとえば、クロロスルフロンまたはＢａｓｔａ）耐性をコードして、所望するＤＮＡ配列により形質転換された細胞の選択を可能にしてもよい（たとえば、Ｂｌｏｎｄｅｌｅｔ−Ｒｏｕａｕｌｔ，Ｇｅｎｅ，１９０：３１５−１７（１９９７）；Ａｕｂｒｅｃｈｔ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８１：９９２−９７（１９９７）を参照されたい）。ネオマイシンまたはヒグロマイシンのような基質への耐性を授ける選択可能なマーカー遺伝子は組織培養においてだけ使用可能であるため、化学耐性遺伝子もｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける選択可能なマーカーとして使用される。
【００８８】
キメラ核酸配列は、いずれかの７回‐膜貫通ポリペプチド内にＴ１Ｒリガンド‐結合領域をコードしてもよい。７回‐膜貫通受容体ポリペプチドは類似の一次配列、ならびに二次および三次構造を有するため、構造ドメイン（たとえば、細胞外ドメイン、ＴＭドメイン、細胞質ドメインなど）は配列解析によって容易に同定することができる。たとえば、相同性モデリング、フーリエ解析およびらせん周期性検出は、７回‐膜貫通受容体配列を持つ７つのドメインを同定し、特徴付けることができる。高速フーリエ変換（ＦＦＴ）アルゴリズムを使用して、解析した配列の疎水性および変動性の特性を特徴付ける、主要な周期を評価することができる。周期性検出増強およびアルファへリックス周期性インデックスは、たとえばＤｏｎｎｅｌｌｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，２：５５−７０（１９９３）のように行うことができる。他のアラインメントおよびモデリングアルゴリズムは当該技術分野で公知である（たとえば、Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ，４：１６１−６４（１９９６）；Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｄ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−３２（１９８２）；およびＣｒｏｎｅｔ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，６：５９−６４（１９９３）を参照されたい）。
【００８９】
本発明はまた、特定された生来の、およびキメラＴ１Ｒ核酸およびアミノ酸配列を有する、核酸分子およびポリペプチドだけでなく、そのフラグメント、とりわけ、たとえば４０、６０、８０、１００、１５０、２００もしくは２５０、またはそれより多いヌクレオチドのフラグメント、ならびに１０、２０、３０、５０、７０、１００、もしくは１５０、またはそれよい多いアミノ酸のポリペプチドフラグメントも包含する。付加的に、核酸配列フラグメントは、Ｔ１Ｒファミリーメンバーに対して産生された抗体に結合することができる抗原性ポリペプチドをコードすることができる。さらに、本発明のタンパク質フラグメントは、場合によりＴ１Ｒファミリーメンバーに対して産生された抗体に結合することができる抗原性フラグメントでありうる。
【００９０】
また、別のＧＰＣＲ、好ましくは７回‐膜貫通スーパーファミリーのメンバーのすべてまたは一部を表す、付加的なアミノ酸に結合した、本明細書に記載の少なくとも１種のＴ１Ｒポリペプチドの１種の中の、少なくとも１０、２０、３０、５０、７０、１００、もしくは１５０、またはそれよい多いアミノ酸を含むキメラタンパク質が企図される。これらのキメラは本発明の受容体および別のＧＰＣＲから作製可能であり、あるいはそれらは２種以上の本発明の受容体を合わせることにより作製することができる。一態様において、キメラの一部分は、本発明のＴ１Ｒポリペプチドの膜貫通ドメインに対応するか、またはそれに由来する。別の態様において、キメラの一部分は、本明細書に記載のＴ１Ｒポリペプチドの１種以上の膜貫通ドメインに対応するか、またはそれに由来し、残余の一部分または複数の部分は別のＧＰＣＲに由来することが可能である。キメラ受容体は当該技術分野で公知であり、それらを作製するための技術およびその中に組み込むためのＧタンパク質‐共役受容体のドメインまたはフラグメントの選択および境界も公知である。したがって、当業者のこの知識を使用して、そのようなキメラ受容体は容易に作製することができる。そのようなキメラ受容体の使用は、たとえば、先行技術アッセイ系で使用された公知の受容体のような、別の受容体のシグナル伝達特性と一緒になった、本明細書に明確に開示された受容体の１種の味覚選択性特性を提供することができる。
【００９１】
たとえば、リガンド‐結合領域のような領域、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、Ｎ−末端ドメイン、Ｃ−末端ドメイン、またはいずれかその組み合わせは、異種タンパク質に共有結合的に結合することができる。たとえば、Ｔ１Ｒ膜貫通領域は異種ＧＰＣＲ膜貫通ドメインに連結することが可能であり、あるいは異種ＧＰＣＲ細胞外ドメインはＴ１Ｒ膜貫通領域に連結することが可能である。一般に好まれる他の異種タンパク質には、たとえば緑色蛍光タンパク質、ベータ‐ガラクトシダーゼポリペプチド、グルタミン酸受容体、およびロドプシンポリペプチド、たとえばロドプシンのＮ−末端フラグメント、たとえばウシロドプシンが挙げられる。
【００９２】
本発明のＴ１Ｒ、フラグメント、または変異体を発現するための異なるホスト細胞を使用することも本発明の範囲内である。本発明のＴ１Ｒ、フラグメント、または変異体をコードするｃＤＮＡのような、クローニングされた遺伝子または核酸の高レベル発現を獲得するために、当業者は典型的には、転写を指図する強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、およびタンパク質をコードする核酸の場合、転写開始のためのリボソーム結合部位を含む発現ベクターに関心のある核酸配列をサブクローニングする。適切な細菌プロモーターは当該技術分野で公知であり、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，に記載される。好ましくは、真核細胞発現系を使用して対象ｈＴ１Ｒ受容体を発現させる。
【００９３】
ホスト細胞に外来ヌクレオチド配列を導入するための公知の手順のいずれかを使用してもよい。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウイルスベクター、およびホスト細胞にクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは外来遺伝物質を導入するための公知の方法のいずれかの使用が包含される（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，を参照されたい）。使用される特定の遺伝子工学的手順が、関心のあるＴ１Ｒ、フラグメント、または変異体を発現することが可能なホスト細胞に少なくとも１種の核酸分子を首尾よく導入可能であることだけが必要である。
【００９４】
発現ベクターがホスト細胞に導入された後、トランスフェクションされた細胞は、関心のある受容体、フラグメント、または変異体を発現に好都合な条件下で培養され、その後それらは標準技術を使用して培養物から回収される。そのような技術の例は当該技術分野で公知である。たとえば、この開示と一致した様式で参照として援用される、ＷＯ００／０６５９３を参照されたい。
本発明に記載のＴ１Ｒの活性を改変する化合物検出のための方法
試験化合物がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ両方において、明確に本発明のＴ１Ｒポリペプチドに結合するかどうかを確認するための方法および組成物は以下に記載される。細胞生理学の多くの側面は、生来の、またはキメラのＴ１Ｒへのリガンド‐結合の作用を評価するためにモニターすることができる。これらのアッセイはＴ１Ｒポリペプチドを発現する無傷細胞に対して、透過化処理細胞に対して、または標準法により生産された膜画分に対して実施してもよい。
【００９５】
味覚受容体は、味覚誘発化合物に結合し、化学刺激から電気シグナルへの変換を開始する。活性化された、または阻害されたＧタンパク質は次に標的酵素、チャンネル、および他のエフェクタータンパク質の特性を変化させることになる。いくつかの例としては、視覚系におけるトランスデューシンによるｃＧＭＰホスホジエステラーゼ、刺激性Ｇタンパク質によるアデニル酸シクラーゼ、Ｇｑおよび他の同系Ｇタンパク質によるホスホリパーゼの活性化、ならびにＧｉおよび他のＧタンパク質による多様なチャンネルの改変が挙げられる。ホスホリパーゼＣによるジアシルグリセロールおよびＩＰ３の生成、続くＩＰ３によるカルシウム動員のような下流の成り行きも試験することができる。
【００９６】
アッセイの対象キメラＴ１Ｒポリペプチドは典型的には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および４に含有される配列を有するポリペプチドまたはそのフラグメント、もしくは保存的に改変された変異体から選択されることになる。
【００９７】
あるいは、アッセイのキメラＴ１Ｒタンパク質またはポリペプチドは真核ホスト細胞に由来することが可能であり、そしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２もしくは４または保存的に改変されたその変異体にアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。一般に、アミノ酸配列同一性は少なくとも３０％、好ましくは３０〜４０％、より好ましくは５０〜６０、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。場合により、アッセイのＴ１Ｒタンパク質またはポリペプチドは細胞外ドメイン、膜貫通領域、細胞質ドメイン、リガンド‐結合ドメインなどのような、Ｔ１Ｒポリペプチドの領域を含み得る。場合により、Ｔ１Ｒポリペプチド、またはその一部が異種タンパク質に共有結合的に結合して、本明細書に記載のアッセイにおいて使用されるキメラタンパク質を作製することができる。
【００９８】
Ｔ１Ｒ活性のモジュレーターは、先に記載の組換えまたは生来、のいずれかのＴ１Ｒタンパク質またはポリペプチドを使用して試験されてもよい。組換えまたは生来、のいずれかのＴ１Ｒタンパク質またはポリペプチドは、単離され、細胞に発現され、細胞由来の膜に発現され、組織にまたは動物に発現されうる。たとえば、舌スライス、舌由来の解離した細胞、形質転換細胞、または膜を使用することができる。本明細書に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイの１種を使用して、改変を試験することができる。
モジュレーターの検出
試験化合物がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方において、本発明のＴ１Ｒ受容体に特異的に結合するかどうかを確認するための組成物および方法は以下に記載される。細胞生理学の多くの側面は、本発明のＴ１Ｒポリペプチドへのリガンド結合の影響を評価するためにモニターすることができる。これらのアッセイは、化学感覚受容体を発現する無傷細胞に対して、透過化処理された細胞に対して、もしくは標準法により生産された膜画分に対して、または新規に合成されたタンパク質を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて実施されてもよい。
【００９９】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、味覚受容体は味覚改変化合物に結合し、化学刺激から電気シグナルへの変換を開始する。活性化された、または阻害されたＧタンパク質は次に標的酵素、チャンネルおよび他のエフェクタータンパク質の特性を変化させることになる。いくつかの例としては、視覚系におけるトランスデューシンによるｃＧＭＰホスホジエステラーゼ、刺激性Ｇタンパク質によるアデニル酸シクラーゼ、Ｇｑおよび他の同系Ｇタンパク質によるホスホリパーゼの活性化、ならびにＧｉおよび他のＧタンパク質による多様なチャンネルの改変が挙げられる。ホスホリパーゼＣによるジアシルグリセロールおよびＩＰ３の生成、続くＩＰ３によるカルシウム動員のような下流の成り行きも試験することができる。
【０１００】
あるいは、アッセイのＴ１Ｒタンパク質またはポリペプチドは真核ホスト細胞に由来することが可能であり、そして本明細書に開示されたＴ１Ｒポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは保存的に改変された変異体に同一のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含み得る。一般に、アミノ酸配列同一性は少なくとも３５〜５０％、または場合により７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。場合により、アッセイのＴ１Ｒタンパク質またはポリペプチドは、細胞外ドメイン、膜貫通領域、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、リガンド‐結合ドメインなどのようなＴ１Ｒタンパク質のドメインを含み得る。さらに、先に記載のように、Ｔ１Ｒタンパク質またはそのドメインは共有結合的に異種タンパク質に連結して、本明細書に記載のアッセイにおいて使用されるキメラタンパク質を作製することができる。
【０１０１】
Ｔ１Ｒ受容体活性のモジュレーターは、先に記載の、組換えまたは生来、のいずれかのＴ１Ｒタンパク質またはポリペプチドを使用して試験される。組換えまたは生来、のいずれかのＴ１Ｒタンパク質またはポリペプチドは、単離され、細胞に発現され、細胞由来の膜に発現され、組織にまたは動物に発現されうる。たとえば、舌スライス、舌由来の解離した細胞、形質転換細胞、または膜を使用することができる。本明細書に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイの１種を使用して、改変を試験することができる。
・  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ
味覚変換はまた、本発明のＴ１Ｒポリペプチドを使用して、可溶性または固相反応により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験することができる。特定の態様では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの可溶性または固相反応において、Ｔ１Ｒリガンド‐結合ドメインを使用して、リガンド結合をアッセイすることができる。
【０１０２】
リガンド‐結合ドメインは、膜貫通ドメインの細胞外ループのような細胞外ドメインの付加的な部分と一緒にＮ−末端ドメインにより形成されてもよいということはありうる。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイは、代謝型グルタミン酸受容体のような、他のＧＰＣＲと一緒に使用されている（Ｈａｎ  ａｎｄ  Ｈａｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１０００８−１００１３（１９９９）を参照されたい）。これらのアッセイには放射能により、または蛍光的に標識したリガンドを置換すること、固有の蛍光における変化またはタンパク質分解感受性における変化を測定することなどを包含してもよい。
【０１０３】
本発明に記載のＴ１Ｒポリペプチドへのリガンド結合は、溶液において、場合により固相に結合した二重膜において、脂質単層膜において、または小胞において試験することができる。モジュレーターの結合は、たとえば分光光学的特徴（たとえば、蛍光、吸光度、屈折率）、流体力学的（形態）、クロマトグラフィー的、または溶解度特性における変化を使用して試験することができる。
【０１０４】
本発明の好ましい態様において、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合アッセイが使用される。先に記載のように、ＧＰＣＲが活性化されると、Ｇタンパク質複合体のＧαサブユニットが刺激されて結合ＧＤＰをＧＴＰに交換する。Ｇタンパク質交換活性のリガンド‐媒介刺激は、リガンド候補の存在下において、添加された放射能標識［３５Ｓ］ＧＴＰγＳのＧタンパク質への結合を測定する生化学的アッセイにおいて測定することができる。典型的には、関心のある化学感覚受容体を含有する膜をＧタンパク質と混合する。潜在的な阻害剤および／または活性化剤および［３５Ｓ］ＧＴＰγＳがアッセイに添加され、そしてＧタンパク質への［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの結合が測定される。結合は液体シンチレーション計数により、またはシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を含む当該技術分野で公知のいずれか他の手段により測定することができる。他のアッセイ形式では、蛍光標識された［３５Ｓ］ＧＴＰγＳを使用することができる。
２．蛍光偏光アッセイ
別の態様において、蛍光偏光（「ＦＰ」）を基礎にしたアッセイを使用して、リガンド結合を検出し、モニターしてもよい。蛍光偏光は平衡結合、核酸ハイブリダイゼーション、および酵素活性を測定するための用途の多い研究室技術である。蛍光偏光アッセイは、それらが遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、沈降反応、または電気泳動のような分離ステップを必要としない点で均質である。これらのアッセイは溶液中で、直接的に、リアルタイムに行われ、固定化相を必要としない。偏光の測定は迅速で、試料を破壊しないため、偏光値は反復して、および試薬の添加後に測定することができる。一般に、この技術を使用して、低いピコモルからマイクロモルレベルまでのフルオロフォアの偏光値を測定することができる。この項では、どのようにして、単純で定量的な様式で、蛍光偏光を使用して、本発明のＴ１Ｒポリペプチドへのリガンド結合を測定できるかを説明する。
【０１０５】
蛍光的に標識された分子が平面偏光によって励起される場合、それは分子回転に逆比例した度合いの偏光を放つ。大きな蛍光標識分子は、励起状態（フルオレセインの場合、４ナノ秒）中、相対的に静止状態のままであり、光の偏光は励起と放射間で相対的に一定のままである。小さな蛍光標識分子は励起状態中、速やかに回転し、偏光は励起と放射間で著しく変化する。したがって、小分子は低い偏光値を有し、大分子は高い偏光値を有する。たとえば、１本鎖フルオレセイン‐標識オリゴヌクレオチドは相対的に低い偏光値を有するが、それが相補鎖にハイブリダイズする場合は、高い偏光値を有する。本発明の化学感覚受容体を活性化するか、または阻害してもよい味覚誘発化合物‐結合を検出し、そしてモニターするためにＦＰを使用する場合、蛍光‐標識味覚誘発化合物または自己‐蛍光味覚誘発化合物が使用されてもよい。
【０１０６】
蛍光偏光（Ｐ）は以下のように定義される：
Ｐ＝［Ｉｎｔｐａｒ−Ｉｎｔｐｅｒｐ］
［Ｉｎｔｐａｒ＋Ｉｎｔｐｅｒｐ］
式中、Ｉｎｔｐａｒは励起光平面に平行な放射光の強度であり、そしてＩｎｔｐｅｒｐは励起光平面に垂直な励起光の強度である。光強度の比であるＰは、次元のない数である。たとえば、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）およびＢｅａｃｏｎ２０００（登録商標）系がこれらのアッセイと関連して使用されてもよい。そのような系は典型的にはミリ偏光単位で偏光を表す（１偏光単位＝１０００ｍＰ  Ｕｎｉｔｓ）。
【０１０７】
分子回転とサイズ間の関係はＰｅｒｒｉｎ方程式により説明され、読者には、この方程式を十分に説明するＬｏｌｌｙ，Ｍ．Ｅ．（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２３６−２４０中のＪｏｌｌｙ，Ｍ．Ｅ．を提示し、これを参照として援用する。手短に述べると、Ｐｅｒｒｉｎ方程式は、偏光が回転緩和時間に直接比例し、緩和時間とは分子が約６８．５°の角度により回転するために要する時間であるということを述べる。回転緩和時間は、以下の方程式：２（回転緩和時間）＝３ＶＲＴにより、粘度（ｅｔａ．）、絶対温度（Ｔ）、分子容積（Ｖ）、および気体定数（Ｒ）に相関する。
【０１０８】
回転緩和時間は小分子（たとえばフルオレセイン）には小さく（〜ナノ秒）、そして大分子（たとえばイムノグロブリン）には大きい（〜１００ナノ秒）。粘度および温度が一定に保たれる場合、回転緩和時間、従って偏光は分子容積に直接相関する。分子容積の変化は他の分子との相互作用、解離、重合、分解、ハイブリダイゼーション、または蛍光標識分子のコンホメーション変化のためであってもよい。たとえば、蛍光偏光を使用して、プロテアーゼ、ＤＮアーゼ、およびＲＮアーゼによる、大きなフルオレセイン標識ポリマーの酵素的開裂が測定されている。それを使用して、タンパク質／タンパク質相互作用、抗体／抗原結合、およびタンパク質／ＤＮＡ結合の平衡結合も測定されている。
Ａ．固相および可溶性ハイスループットアッセイ
さらに別の態様において、本発明はＴ１Ｒポリペプチド；またはＴ１Ｒポリペプチドを発現する細胞もしくは組織を使用して、可溶性アッセイを提供する。別の態様において、本発明はハイスループット形式における固相を基礎にしたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを提供し、ここではＴ１Ｒポリペプチド、またはＴ１Ｒポリペプチドを発現する細胞もしくは組織は固相基質または味覚刺激化合物に結合し、そして結合は適切なタグまたはＴ１Ｒ受容体に対して産生された抗体を使用して検出される。
【０１０９】
本発明のハイスループットアッセイでは、１日に数千に至るまでの異なるモジュレーターまたはリガンド結合をスクリーニングすることが可能である。とりわけ、マイクロタイタープレートのそれぞれのウェルを使用して、選択された潜在的なモジュレーターに対する別々のアッセイを行うことが可能であり、あるいは、濃度またはインキュベーション時間作用が観察されることになる場合、５〜１０ウェル毎に１つのモジュレーターを試験することができる。したがって、１つの標準マイクロタイタープレートは約１００（たとえば９６）モジュレーターをアッセイすることができる。１５３６ウェルプレートが使用される場合、１つのプレートが約１０００から約１５００までの異なる化合物を容易にアッセイすることができる。それぞれのプレートウェルにおいて複数の化合物をアッセイすることも可能である。１日につきいくつかの異なるプレートをアッセイすることが可能であり；本発明の統合された系を使用して、約６，０００〜２０，０００に至るまでの異なる化合物のためのアッセイスクリーニングが可能である。より最近では、試薬操作のためのマイクロ流体学的方法が開発されている。
【０１１０】
関心のある分子は、共有結合または非共有結合により、たとえばタグを介して、直接的に、または間接的に固体状態要素に結合することができる。タグは多様な要素のいずれでもあり得る。一般に、タグを結合する分子（タグバインダー）は固体支持物に固定され、そして関心のあるタグ付き分子（たとえば関心のある味覚変換分子）はタグとタグバインダーとの相互作用により固体支持物に結合する。
【０１１１】
文献に詳細に記載された公知の分子間相互作用に基づいて、いくつものタグおよびタグバインダーを使用することができる。たとえば、タグが天然のバインダー、たとえば、ビオチン、プロテインＡ、またはプロテインＧを有する場合、それは適切なタグバインダー（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、イムノグロブリンのＦｃ領域など）と一緒に使用することができる。ビオチンのような天然のバインダーを持つ分子に対する抗体は、広範に役立ち、適切なタグバインダーでもある（ＳＩＧＭＡ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  １９９８  カタログＳＩＧＭＡ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｍｏ．を参照されたい）。
【０１１２】
同様に、いずれかのハプテン性または抗原性化合物を適切な抗体と一緒に使用して、タグ／タグバインダー対を形成することができる。非常に多数の特異的抗体が市販されていて、多くの付加的な抗体が文献に記載されている。たとえばある一般的なコンフィギュレーションにおいて、タグは第１抗体であり、そしてタグバインダーは第１抗体を認識する第２抗体である。抗体‐抗原相互作用に加え、受容体‐リガンド相互作用もタグとタグバインダー対として適切である。たとえば、細胞膜受容体のアゴニストおよびアンタゴニスト（たとえばトランスフェリン、ｃ−ｋｉｔ、ウイルス受容体リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体、イムノグロブリン受容体と抗体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリーなどのような細胞受容体‐リガンド相互作用；たとえばＰｉｇｏｔｔ  ＆  Ｐｏｗｅｒ，Ｔｈｅ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ  Ｉ（１９９３）を参照されたい）。同様に、トキシンおよびヴェノム、ウイルスエピトープ、ホルモン（たとえば、オピエート、ステロイドなど）細胞内受容体（たとえば、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドおよびビタミンＤ；ペプチドを含む種々の小リガンドの効果を媒介する）、薬物、レクチン、糖、核酸（線状および環状両方のポリマーコンフィギュレーション）、オリゴサッカライド、タンパク質、リン脂質ならびに抗体はすべて種々の細胞受容体と相互作用することができる。
【０１１３】
合成ポリマー、たとえばポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、およびポリアセテートも適切なタグまたはタグバインダーを形成することができる。この開示を概観すれば当業者には明らかなように、多くの他のタグ／タグバインダー対も本明細書に記載のアッセイシステムにおいて有用である。
【０１１４】
ペプチド、ポリエーテルなどのような一般的なリンカーもタグとして使用可能であり、約５〜２００アミノ酸のポリｇｌｙ配列のような、ポリペプチド配列を包含する。そのようなフレキシブルなリンカーは当業者に公知である。たとえば、ポリ（エチレングリコール）リンカーはＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａ．から入手可能である。これらのリンカーは、場合によりアミド結合、スルフヒドリル結合、またはヘテロ官能基結合（ｈｅｔｅｒｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｌｉｎｋａｇｅ）を有する。
【０１１５】
タグバインダーは、現在利用可能な多様な方法のいずれかを使用して、固体基質に固定される。固体基質は一般に、タグバインダーの一部と反応する表面に化学基を固定する化学試薬に、基質のすべてまたは一部を曝すことにより、誘導体化、または機能化される。たとえば、より長い鎖部分への連結に適した基には、アミン、ヒドロキシル、チオール、およびカルボキシル基が挙げられる。アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランを使用して、ガラス表面のような、多様な表面を機能化することができる。そのような固相バイオポリマーアレイの構築は、文献に詳細に記載されている。たとえば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４（１９６３）（たとえばペプチドの固相合成を記載する）；Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．，１０２：２５９−２７４（１９８７）（ピン上での固相要素の合成を記載する）；Ｆｌａｎｋ  ＆  Ｄｏｒｉｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４４：６０３１６０４０（１９８８）（セルロースデスク上での種々のペプチド配列の合成を記載する）；Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７−７７７（１９９１）；Ｓｈｅｌｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９（４）：７１８−７１９（１９９３）；およびＫｏｚａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２（７）：７５３７５９（１９９６）（すべて、固体基質に固定されたバイオポリマーのアレイを記載する）。タグバインダーを固定するための化学的でない方法には、熱、ＵＶ照射による架橋などのような一般的な方法が挙げられる。
３．セルベースアッセイ
ある好ましい態様において、Ｔ１Ｒタンパク質は改変されない型で、または分泌経路を経由して成熟および標的化を増強する異種シャペロン配列を持つ、好ましくは持たない、キメラ、変異体または欠失受容体として真核細胞に発現される。そのようなＴ１Ｒポリペプチドはいずれかの真核細胞、たとえばＨＥＫ−２９３細胞に発現することができる。好ましくは、細胞は機能的Ｇタンパク質、たとえばＧα１５、またはキメラＧα１６、ガストデューシンもしくはトランスデューシンまたはキメラ受容体を細胞内シグナリング経路に、またはホスホリパーゼＣのようなシグナリングタンパク質にカップリングさせることが可能なＧ１６ｇｕｓｔ４４のようなキメラＧタンパク質を含む。そのような細胞におけるＴ１Ｒ受容体の活性化は、標準方法のいずれか、たとえば細胞のＦＵＲＡ−２依存的蛍光を検出することにより細胞内カルシウムの変化を検出することを使用して検出することができる。そのようなアッセイは本出願に提示された実験的発見の根拠である。
【０１１６】
活性化されたＧＰＣＲ受容体はしばしば、受容体のＣ−末端尾部を（およびおそらく他の部位も同様に）リン酸化するキナーゼの基質である。したがって、活性化剤は放射標識されたＡＴＰから受容体への３２Ｐの移動を増強することになる。ＧＰＣＲシグナル伝達およびシグナル伝達をアッセイする方法の一般的な総説に関しては、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２３７および２３８巻（１９９４）ならびに９６巻（１９８３）；Ｂｏｕｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１０：３４９：１１７−２７（１９９１）；Ｂｏｕｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：１２５−３２（１９９０）；Ｐｉｔｃｈｅｒ  ｅｔ  Ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：６５３−９２（１９９８）を参照されたい。
【０１１７】
Ｔ１Ｒの改変は、Ｔ１Ｒモジュレーター候補で処理した本発明に記載のキメラＴ１Ｒポリペプチドの反応を、非処理対照試料または既知の「陽性」対照を含有する試料の反応と比較することによりアッセイしてもよい。そのようなＴ１Ｒモジュレーター候補には、Ｔ１Ｒポリペプチド活性を阻害するか、または活性化する分子を挙げることができる。一態様において、Ｔ１Ｒを活性化する化合物で処理した対照試料は、Ｔ１Ｒ活性値１００を割り当てられる。Ｔ１Ｒポリペプチドの阻害は、対照試料に比較したＴ１Ｒ活性値が約９０％、場合により５０％、場合により２５〜０％である場合に達成される。Ｔ１Ｒポリペプチドの活性化は、対照に比較したＴ１Ｒ活性値が１１０％、場合により１５０％、２００〜５００％、または１０００〜２０００％である場合に達成される。
【０１１８】
イオンフラックスの変化は、Ｔ１Ｒポリペプチドを発現する細胞または膜のイオン分極の変化を測定することにより評価してもよい。細胞分極の変化を測定するための一手段は、ボルテージ‐クランプおよびパッチ‐クランプ技術により電流の変化を測定する（それによって分極の変化を測定する）ことによるものである（たとえば、「細胞結合（ｃｅｌｌ−ａｔｔａｃｈｅｄ）」様式、「裏返し（ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ）」様式、および「ホールセル（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ）」様式、たとえば、Ａｃｋｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ  Ｍｅｄ．，３３６：１５７５−１５９５（１９９７）を参照されたい）。ホールセル電流は好都合には標準法により測定される。他の公知のアッセイには以下のものが挙げられる：放射標識イオンフラックスアッセイおよび電圧感受性色素を使用した蛍光アッセイ（たとえば、Ｖｅｓｔｅｒｇａｒｒｄ−Ｂｏｇｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ．，８８：６７−７５（１９８８）；Ｇｏｎｚａｌｅｓ  ＆  Ｔｓｉｅｎ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：２６９−２７７（１９９７）；Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２５：１８５−１９３（１９９１）；Ｈｏｌｅｖｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３７：５９−７０（１９９４）を参照されたい）。
【０１１９】
ポリペプチドの機能に対する試験化合物の作用は、先に記載のパラメーターのいずれかを検討することによって測定することができる。ＧＰＣＲ活性に影響を与えるいずれか適切な生理的変化を使用して、本発明のポリペプチドに対する試験化合物の影響を評価することができる。無傷の細胞または動物を使用して機能的成り行きが測定される場合、多様な作用、たとえば伝達物質遊離、ホルモン遊離、既知および性状不明の遺伝マーカー両方に対する転写変化（たとえばノーザンブロット）、細胞増殖またはｐＨ変化のような細胞代謝における変化、およびＣａ２＋、ＩＰ３、ｃＧＭＰ、またはｃＡＭＰのような細胞内セカンドメッセンジャーの変化も測定することができる。
【０１２０】
ＧＰＣＲに関する好ましいアッセイには、受容体活性を報告するためにイオンまたは電圧感受性色素を負荷した細胞が挙げられる。そのような受容体の活性を測定するためのアッセイは、対照として他のＧタンパク質‐共役受容体の既知のアゴニストおよびアンタゴニストを使用して、試験化合物の活性を評価することができる。改変化合物（たとえば、アゴニスト、アンタゴニスト）を同定するためのアッセイにおいて、細胞質におけるイオンレベルまたは膜電位の変化は、それぞれイオン感受性または膜電位蛍光インジケーターを使用してモニターされることになる。使用してもよいイオン‐感受性および電位プローブとしては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  １９９７カタログに開示されたものの中にある。Ｇタンパク質‐共役受容体に関しては、無差別なＧタンパク質、たとえばＧα１５およびＧα１６が一般に好まれるアッセイにおいて使用可能である（Ｗｉｌｋｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８８：１００４９−１００５３（１９９１））。あるいは、他のＧタンパク質、たとえばガストデューシン、トランスデューシンおよびＧα１６ｇｕｓｔ４４またはＧ１６ｇ４４のようなキメラＧタンパク質が使用されてもよい。
【０１２１】
受容体活性化はそれに続く細胞内事象、たとえばセカンドメッセンジャーの増加を開始する。一部のＧタンパク質‐共役受容体の活性化はホスファチジルイノシトールのホスホリパーゼＣ−媒介加水分解によるイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の形成を刺激する（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ  ＆  Ｉｒｖｉｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：３１５−２１（１９８４））。ＩＰ３は次に細胞内カルシウムイオンストアの遊離を刺激する。したがって、細胞質カルシウムイオンレベルの変化、またはＩＰ３のようなセカンドメッセンジャーレベルの変化を使用して、Ｇタンパク質‐共役受容体機能を評価することができる。そのようなＧタンパク質‐共役受容体を発現する細胞は、細胞内ストアからのカルシウム遊離および細胞膜イオンチャンネルを介した細胞外カルシウム流入の両方に由来する関与の結果としての、細胞質カルシウムレベル増加を示してもよい。
【０１２２】
好ましい態様において、Ｔ１Ｒポリペプチド活性は、非相同細胞において、ホスホリパーゼＣシグナル伝達経路に受容体を連結させる無差別なＧタンパク質によりＴ１Ｒ遺伝子を発現させることによって測定される（Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ  ＆  Ｓｉｍｏｎ，ｊ．ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．，２７０：１５１７５−１５１８０（１９９５）を参照されたい）。好ましくは、細胞株はＨＥＫ−２９３（通常ではＴ１Ｒ遺伝子を発現しない）であり、無差別なＧタンパク質はＧα１５（Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ  ＆  Ｓｉｍｏｎ，同上）またはＧα１６ｇｕｓｔ４４のようなキメラＧタンパク質である。味覚伝達の改変は、Ｔ１Ｒポリペプチドに結合した分子の適用によるＴ１Ｒシグナル伝達経路の改変に反応して変化する、細胞内Ｃａ２＋レベルの変化を測定することによりアッセイされる。Ｃａ２＋レベルの変化は、場合により、蛍光Ｃａ２＋インジケーター色素および蛍光測定イメージングを使用して測定される。
【０１２３】
別の態様において、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）加水分解は、本明細書に参照として援用される米国特許第５，４３６，１２８号に従って分析することができる。手短に述べると、アッセイには、４８時間またはそれより長い時間３Ｈ−ミオイノシトールで細胞を標識することを包含する。標識細胞は試験化合物で１時間処理される。処理細胞を溶解し、クロロホルム‐メタノール‐水で抽出し、その後イノシトールリン酸をイオン交換クロマトグラフィーにより分離し、シンチレーション計数により定量する。倍数刺激は、バッファー対照の存在下におけるｃｐｍに対する、アゴニストの存在下におけるｃｐｍの比を計算することにより決定される。同様に、倍数阻害はバッファー対照（アゴニストを含んでいてもよく、いなくてもよい）の存在下におけるｃｐｍに対する、アンタゴニストの存在下におけるｃｐｍの比を計算することにより決定される。
【０１２４】
他の受容体アッセイには、細胞内環状ヌクレオチド、たとえばｃＡＭＰまたはｃＧＭＰのレベルを測定することを挙げることができる。受容体の活性化が環状ヌクレオチドレベルの減少に帰着する場合、ホルスコリンのような細胞内環状ヌクレオチドレベルを増加させる薬剤に細胞を曝した後に、アッセイにおいて細胞に受容体‐活性化化合物を添加することが好ましくてもよい。一態様において、細胞内ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰの変化はイムノアッセイを使用して測定することができる。Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ  ＆  Ｓｉｍｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１５１７５−１５１８０（１９９５）に記載の方法を使用してｃＡＭＰのレベルを測定してもよい。また、Ｆｅｌｌｙ−Ｂｏｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：１５９−１６４（１９９４）に記載された方法を使用して、ｃＧＭＰのレベルを測定してもよい。さらに、ｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰを測定するためのアッセイキットが米国特許第４，１１５，５３８号に記載され、これを参照として本明細書に援用する。
【０１２５】
別の態様において、転写レベルを測定して、シグナル伝達に対する試験化合物の作用を評価することができる。関心のあるＴ１Ｒポリペプチドを含有するホスト細胞は、いずれかの相互作用を行うために十分な時間試験化合物に接触させ、遺伝子発現のレベルが測定される。そのような相互作用を行うための時間の長さは、たとえば、時間経過を観察し、時間の関数として転写のレベルを測定することによるように、経験的に決定してもよい。転写の量は当業者に公知のいずれか適切な方法を使用することにより測定してもよい。たとえば、関心のあるタンパク質のｍＲＮＡ発現は、ノーザンブロットを使用して検出してもよく、あるいはそれらのポリペプチド産物がイムノアッセイを使用して同定されてもよい。あるいは、レポーター遺伝子を使用した、転写を基礎にしたアッセイが、本明細書に参照として援用される米国特許第５，４３６，１２８号に記載されたように使用されてもよい。レポーター遺伝子は、たとえば、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、ベータ‐ラクタマーゼおよびアルカリホスファターゼでありうる。その上、関心のあるタンパク質を緑色蛍光タンパク質のようなセカンドレポーターへの結合を介した、間接的なレポーターとして使用することができる（たとえば、Ｍｉｓｔｉｌｉ  ＆  Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：９６１−９６４（１９９７）を参照されたい）。
【０１２６】
次に、転写の量は、試験化合物の非存在下における同じ細胞の転写の量と比較するか、またはそれを、関心のあるＴ１Ｒポリペプチドを欠く実質的に同一の細胞における転写の量と比較してもよい。実質的に同一の細胞は、組換え細胞が作製されるが、異種ＤＮＡの導入によって改変されていない細胞と同じ細胞に由来してもよい。転写の量におけるどんな差でも、試験化合物が関心のあるＴ１Ｒポリペプチドの活性を何らかの様式で変化させたことを示唆する。
４．化学感覚受容体を発現するトランスジェニック非‐ヒト動物
また、本発明の１種以上の味覚受容体配列を発現する非‐ヒト動物を受容体アッセイに使用することができる。そのような発現を使用して、化学感知受容体またはそのリガンド‐結合領域をコードする核酸を安定に、または一過性にトランスフェクトされた非‐ヒト動物を試験化合物と接触させること、そして動物が受容体ポリペプチド複合体に明確に結合することによって試験化合物に反応するかどうかを確認することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験化合物が哺乳動物味覚膜貫通受容体に明確に結合するかどうかを確認することができる。
【０１２７】
本発明のベクターによりトランスフェクトされるか、または感染した動物は、特定の受容体または受容体のセットに結合することができる味覚刺激を同定し、特徴付けるためのアッセイにとりわけ有用である。ヒト味覚受容体配列を発現する、そのようなベクター感染動物は、味覚刺激および、たとえば細胞生理学（たとえば味覚ニューロン上の）、ＣＮＳ、または行動に対するそれらの作用のｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングに使用することができる。
【０１２８】
個々に、またはライブラリーとしてのいずれかで核酸およびベクターを感染させる／発現させる手段は当該技術分野で公知である。多様な個々の細胞、器官、またはホールアニマルパラメーターは多様な手段によって測定することができる。本発明のＴ１Ｒ配列は、たとえば、アデノウイルス発現ベクターのような感染因子による送達によって動物味覚組織に発現することができる。
【０１２９】
内因性味覚受容体遺伝子は依然として機能的なままであることが可能であり、そして野生型（生来の）活性は依然として存在することができる。別の状況において、すべての味覚受容体活性が導入された外因性ハイブリッド受容体によるものであることが所望される場合、ノックアウト株の使用が好ましい。非‐ヒトトランスジェニック動物、とりわけトランスジェニックマウスの構築のための方法、および形質転換細胞を生み出すための組換えコンストラクトの選択および作製は当該技術分野で公知である。
【０１３０】
「ノックアウト」細胞および動物の構築は、抑制されることになる遺伝子のＤＮＡ配列のある部分を遮断することに役立つ新規なＤＮＡ配列をゲノムに導入することにより、哺乳動物細胞における特定の遺伝子の発現レベルを減少させるか、または完全に除去することができるという前提に基づく。また、「遺伝子トラップ挿入」を使用して、ホスト遺伝子を破壊することが可能であり、そしてマウス胚性幹（ＥＳ）細胞を使用してノックアウトトランスジェニック動物を生産することが可能である（たとえば、Ｈｏｌｚｓｃｈｕ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ６：９７−１０６（１９９７）を参照されたい）。外因性配列の挿入は典型には相補的核酸配列間の相同組換えによる。外因性配列はエキソン、イントロン、または転写調節配列のような改変されることになる標的遺伝子の一部分、もしくは標的遺伝子の発現のレベルに影響を与えることが可能であるいずれかのゲノム配列；またはその組み合わせである。多能性胚性幹細胞における相同組換えによる遺伝子ターゲッティングにより、関心のあるゲノム配列を直接改変することが可能になる。いずれかの技術を使用して、ノックアウト動物を作製し、スクリーニングし、繁殖させることができる、たとえば、Ｂｉｊｖｏｅｔ，Ｈｕｍ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．７：５３−６２（１９９８）；Ｍｏｒｅａｄｉｔｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７５：２０８−２１６（１９９７）；Ｔｏｊｏ，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９：１６１−１６５（１９９５）；Ｍｕｄｇｅｔｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：１６７−１８４（１９９５）；Ｌｏｎｇｏ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．６：３２１−３２８（１９９７）；米国特許第５，６１６，４９１号；５，４６４，７６４号；５，６３１，１５３号；５，４８７，９９２号；５，６２７，０５９号；５，２７２，０７１号；ＷＯ９１／０９９５５；ＷＯ９３／０９２２２；ＷＯ９６／２９４１１；ＷＯ９５／３１５６０；ＷＯ９１／１２６５０を参照されたい。
【０１３１】
また、本発明の核酸を使用して「ノックアウト」ヒト細胞およびその子孫を生産することができる。同様に、本発明の核酸を試薬として使用して「ノックイン」マウスを生産することもできる。ヒトまたはラットＴ１Ｒ遺伝子配列はマウスゲノムのオルソログＴ１Ｒを置換することができる。このようにして、ヒトまたはラットＴ１Ｒを発現するマウスが生産される。次にこのマウスを使用して、ヒトまたはラットＴ１Ｒの機能を解析し、そのようなＴ１Ｒにとってのリガンドを同定することができる。
モジュレーター
Ｔ１Ｒファミリーメンバーのモジュレーターとして試験される化合物は、タンパク質、糖、核酸または脂質のような、いずれかの小分子化学化合物、または生物学的実体でありうる。
【０１３２】
あるいは、モジュレーターはＴ１Ｒファミリーメンバーの遺伝的に変化したものでありうる。典型的には、試験化合物は小さい化学分子およびペプチドであってもよい。本質的にどのような化合物も、本発明のアッセイにおける潜在的なモジュレーターまたはリガンドとして使用することができるが、もっともしばしば化合物は使用される水性または有機（とりわけＤＭＳＯベースの）溶液に溶解することができる。アッセイは、アッセイステップを自動化し、いずれか都合のよいアッセイのための供与源由来の化合物を提供することによって、大きな化学ライブラリーをスクリーニングするために設計されてもよく、それらは典型的には平行して行われる（たとえば、ロボットアッセイにおけるマイクロタイタープレート上のマイクロタイターフォーマットにおいて）。Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．（Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｋａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）などを含む、化学化合物の多くの製造業者があることは理解される。
【０１３３】
一態様において、ハイスループットスクリーニング法は、多数の潜在的な治療的化合物（潜在的なモジュレーターまたはリガンド化合物）を含むコンビナトリアル化学またはペプチドライブラリーを提供することを含む。そのような「コンビナトリアル化学ライブラリー」または「リガンドライブラリー」は次に、本明細書に記載の１種以上のアッセイにおいてスクリーニングされ、所望する特徴的な活性を提示するライブラリーメンバー（特定の化学種またはサブクラス）を同定する。そのようにして同定された化合物は、コンビナトリアル「リード化合物」として使用できるか、あるいは潜在的または実際の消費者製品としてそれら自体使用可能である。
【０１３４】
コンビナトリアル化学ライブラリーは、試薬の様な多数の化学的「ビルディングブロック」を組み合わせることにより、化学合成または生物学的合成のいずれかによって生成された多様な化学化合物のコレクションである。たとえば、ポリペプチドライブラリーのような線状のコンビナトリアル化学ライブラリーは、指定された化合物の長さにとってのすべての可能な方法で１組の化学的ビルディングブロック（アミノ酸）を組み合わせることにより形成される。非常に多数の化学化合物はそのような化学ビルディングブロックのコンビナトリアルミキシングにより合成することができる。
【０１３５】
コンビナトリアル化学ライブラリーの作製およびスクリーニングは当業者に公知である。そのようなコンビナトリアル化学ライブラリーには、ペプチドライブラリー（たとえば、米国特許第５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋａ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，３７：４８７−９３（１９９１）およびＨｏｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８４−８８（１９９１）を参照されたい）が挙げられるが、それらに限定されない。化学的多様性ライブラリーを生み出すための他の化学も使用可能である。そのような化学には、ペプトイド（たとえば、ＷＯ９２／１９７３５）、エンコーデッドペプチド（たとえば、ＷＯ９３／２０２４２）、ランダムバイオ‐オリゴマー（たとえば、ＷＯ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（たとえば、米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドのようなダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（Ｈｏｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ．，９０：６９０９−１３（１９９３）
ビニル性ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：６５６８（１９９２））、グルコース足場を持つ非ペプチド性ペプチドミメティック（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：９２１７−１８（１９９２））、小化合物ライブラリーの類似有機合成物（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６：２６６１（１９９４））、オリゴカーバメート（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１：１３０３（１９９３））、ペプチジルホスホネート（Ｃａｍｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５９：６５８（１９９４））、核酸ライブラリー（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｂｅｒｇｅｒ，およびＳａｍｂｒｏｏｋ，すべて上記）、ペプチド核酸ライブラリー（米国特許第５，５３９，０８３号）抗体ライブラリー（Ｖａｕｇｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３）：３０９−１４（１９９６）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７）、炭水化物ライブラリー（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：１５２０−２２（１９９６）および米国特許第５，５９３，８５３号）、小有機分子ライブラリー（ベンゾジアゼピン，Ｂａｕｍ，Ｃ＆ＥＮ，１月１８日，３３ページ（１９９３）；チアゾリジノンおよびメタチアゾリジノン、米国特許第５，５４９，９７４号；ピンロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、５，２８８，５１４号など）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１３６】
コンビナトリアルライブラリーの作製のための装置は市販されている（たとえば、３５７ＭＰＳ、３９０ＭＰＳ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  Ｋｙ．）、シンホニー（Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，Ｍａｓｓ．）、４３３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）、９０５０  Ｐｌｕｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ）を参照されたい）。その上、非常に多数のコンビナトリアルライブラリーがそれら自体市販されている（たとえば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．；Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．；３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，Ｐａ．，；Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍｄ．；などを参照されたい）。
【０１３７】
本発明の一側面において、Ｔ１Ｒモジュレーターをいずれかの食品、菓子類、医薬組成物、またはその成分に使用し、それによって所望する様式で製品、組成物、またはその成分の味覚を改変することができる。たとえば、甘味または旨味味覚感覚を引き起こすＴ１Ｒモジュレーターを添加して、製品または組成物に改善された甘味または旨味味覚を提供することができるが、一方甘味または旨味感覚を増強するＴ１Ｒモジュレーターを添加して、食物または飲料製品または組成物のような組成物中の別の化合物の甘味または旨味味覚を増強することができる。また、本発明は食物、飲料および薬品に見いだされる甘味または旨味化合物、およびエンハンサーを同定し、そしてそれらを欠くか、またはそれらの量が減少した、味覚が改善された食物、飲料および薬物を生産する手段を提供する。
本発明によって同定された化合物の使用
本発明に従って同定された化合物は、甘味または旨味味覚を改変するために食物、飲料または医薬組成物に添加されてもよい。
【０１３８】
先に述べたように、好ましくは、対象細胞を基礎にしたアッセイにおいて同定された化合物の味覚改変特性は、ヒト味覚試験のような、味覚試験において確認されることになる。
キット
対象キメラＴ１Ｒ遺伝子およびそれらのホモログは、味覚受容体細胞を同定すること、発生源（フォレンシックス）および起源確認、および味覚変換を試験することに有用な手段である。Ｔ１Ｒプローブおよびプライマーのような、Ｔ１Ｒ核酸に明確にハイブリダイズするＴ１Ｒファミリーメンバー‐特異的試薬、およびＴ１Ｒ抗体のような、Ｔ１Ｒタンパク質に明確に結合するＴ１Ｒ特異的試薬を使用して味覚細胞発現、および味覚伝達制御を試験する。
【０１３９】
試料中のＴ１ＲファミリーメンバーのＤＮＡおよびＲＮＡの存在に関する核酸アッセイには、当業者に公知の多数の技術、たとえばサウザン解析、ノーザン解析、ドットブロット、ＲＮアーゼ保護、ＳＩ解析、ＰＣＲのような増幅技術、およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが挙げられる。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでは、たとえば標的核酸は細胞内ハイブリダイゼーションに利用可能になるように、その細胞環境から遊離し、一方その後の解釈および解析のために細胞形態は保持される。以下の論文はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術のあらましを提供する：Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４：２３０２５０（１９８６）；Ｈａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ＶＩＩ巻，１８９−２２６（１９８４）；およびＮａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，編，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８７）。その上、Ｔ１Ｒタンパク質は先に記載の種々のイムノアッセイ技術により検出可能である。試験試料は典型的には陽性対照（たとえば組換えＴ１Ｒタンパク質を発現する試料）および陰性対照の両方と比較する。
【０１４０】
本発明はまた、Ｔ１Ｒファミリーメンバーのモジュレーターをスクリーニングするためのキットを提供する。そのようなキットは容易に入手可能な材料および試薬から作製することができる。たとえば、そのようなキットは以下の材料のいずれか１種以上を包含することができる：Ｔ１Ｒ核酸またはタンパク質、反応チューブ、およびＴ１Ｒ活性を試験するための手引き。場合により、キットは機能的Ｔ１Ｒポリペプチドを含む。多様なキットおよび構成要素は、予定されたキットのユーザーおよびユーザーの特定の必要性に依存して、本発明に従って作製することができる。
【０１４１】
今や本発明は大部分説明され、同じことは以下の実施例を参照することによりいっそう容易に理解されることになるが、そのような実施例は説明の手段として提供され、限定することを意図しない。本発明の意図および範囲から逸脱することなく、本明細書に開示された代表的な態様に対して種々の改変および変更が行われてもよいことは理解される。
実施例１
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に含まれるハイブリッドｈＴ１Ｒ２−１核酸配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に含まれるキメラ旨味‐甘味ｈＴ１Ｒ１−２核酸配列をコードする核酸配列が構築された。始めのｈＴ１Ｒ２−１配列はｈＴ１Ｒ２の細胞外ドメインとｈＴ１Ｒ１の膜貫通ドメインを含み、そして第２の配列はｈＴ１Ｒ１の細胞外ドメインとｈＴ１Ｒ２の膜貫通ドメインを含む。これらのハイブリッド味覚受容体を安定に生産するＨＥＫ−２９３細胞株が作製された。とりわけ、安定に構成的にキメラｈＴ１Ｒ２−１配列、ｈＴ１Ｒ３、およびキメラＧタンパク質Ｇ１６−ｔ２５を発現する、安定なＨＥＫ−２９３細胞株が生産され、それは同時にｈＴ１Ｒ２−１、ｈＴ１Ｒ３、およびこのキメラＧタンパク質を発現する。その上、安定に構成的にキメラｈＴ１Ｒ１−２、ｒＴ１Ｒ３、およびＧ１６のＮ−末端残基とガストデューシンの対応する４４残基によって置換された最後の４４カルボキシ残基を含む別のキメラＧタンパク質Ｇ１６ｇ４４を発現する安定なＨＥＫ−２９３細胞株が生産された。これらの安定なＨＥＫ−２９３細胞株は、以下の実施例に記載されるように、甘味および旨味リガンドならびにエンハンサーに関するアッセイに使用された。
実施例２
実施例１の安定なｈＴ１Ｒ２−１細胞株は、図７に示した濃度でいくつかの甘味リガンドに対してスクリーニングし、細胞内カルシウムおよびｈＴ１Ｒ２−１受容体活性に対する作用は蛍光イメージングによって検出した。これらのアッセイは、シクラメートの例外を除いて試験したすべての甘味化合物が試験した濃度でキメラｈＴ１Ｒ２−１受容体を活性化することを示した。特定の甘味化合物アスパルテーム、Ｄ−Ｔｒｐ、スクロース、フルクトースおよびシクラメートのｈＴ１Ｒ２−１／ｈＴ１Ｒ３に対する有効濃度（ＥＣ５０）はまた、これらの同じ化合物が野生型甘味受容体ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３を活性化するために使用される場合のＥＣ５０と比較した。これらの結果は図８に包含される。
実施例３
アスパルテームによるキメラｈＴ１Ｒ２−１味覚受容体の活性化に対するシクラメートの作用を確認するためにアッセイが行われた。図９に示すように、ｈＴ１Ｒ２−１安定細胞株において、シクラメートの添加はアスパルテーム反応を増強した。図９に示すようにアスパルテームのＥＣ５０はシクラメートの非存在下では０．９７であり、１０ｍＭシクラメートの存在下では０．４４であった。その上、図１０〜１２それぞれの実験結果によって示すように、シクラメートはｈＴ１Ｒ２−１のＤ−トリプトファン、スクロースおよびフルクトース活性化も増強した。
実施例４
さらに、‘８０７と表される登録された旨味リガンドによるｈＴ１Ｒ２−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の活性化に対するシクラメートの作用を評価するためにアッセイが行われた。シクラメートの非存在下における‘８０７化合物のＥＣ５０は０．４２であり、シクラメート５ｍＭの存在下では０．３１であった。さらに、図１４に示すように、‘８０７化合物はアスパルテームに対するｈＴ１Ｒ２−１の活性化反応を増強した。
実施例５
図１５に示すように、ｈＴ１Ｒ１−２およびｒＴ１Ｒ３を同時発現する安定な細胞株における、種々の旨味リガンド（Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ａｓｐ、およびＬ−ＡＰ４）に対する、およびＤ−Ｇｌｕに対するキメラ旨味‐甘味受容体ｈＴ１Ｒ１−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の反応も、ＩＭＰ、ＧＭＰおよびＣＭＰの存在下および非存在下においてアッセイされた。試験された旨味リガンドはキメラ旨味‐甘味受容体を活性化することが見いだされた。また、図１６に示すように、ｈＴ１Ｒ１−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）のＭＳＧ誘発活性化に対するＩＭＰの作用を評価するためにさらに実験が行われた。その中の実験結果に示されるように、ＩＭＰ化合物はＩＭＰの存在下および非存在下におけるその中のＥＣ５０値に基づいて、エンハンサーとしての役割を果たした。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】ヒトＴ１Ｒ１の膜貫通部分に融合したヒトＴ１Ｒ２の細胞外ドメインを含むｈＴ１Ｒ２−１を示す、本発明に記載のキメラ甘味‐旨味味覚受容体の核酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を包含する。
【図２】ヒトＴ１Ｒ２の細胞外ドメインとヒトＴ１Ｒ１の膜貫通部分を含むｈＴ１Ｒ２−１を示す、本発明に記載のキメラ甘味‐旨味味覚受容体のポリペプチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を包含する。
【図３】ｈＴ１Ｒ１の細胞外ドメインとｈＴ１Ｒ２の膜貫通ドメインを含むｈＴ１Ｒ１−２を示す、本発明に記載のキメラ味覚受容体の核酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を包含する。
【図４】ｈＴ１Ｒ１−２を示す、本発明に記載のキメラ受容体のポリペプチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を含み、そしてガストデューシンの４４カルボキシ末端アミノ酸に融合したＧアルファ１６のＮ−末端部分を含む、本発明で使用されるキメラＧタンパク質Ｇ１６ｇｕｓｔ４４のタンパク質配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を包含する。
【図５】生来のＴ１Ｒ２／Ｔ１３、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３、ならびにキメラ甘味‐旨味ｈＴ１Ｒ２−１／Ｔ１Ｒ３およびキメラ旨味‐甘味ｈＴ１Ｒ１−２／Ｔ１Ｒ３の概要を包含する。
【図６−１】ヒトおよびマウスおよびラットのＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３の核酸配列およびタンパク質配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜１７）を包含する。
【図６−２】ヒトおよびマウスおよびラットのＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３の核酸配列およびタンパク質配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜１７）を包含する。
【図６−３】ヒトおよびマウスおよびラットのＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３の核酸配列およびタンパク質配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜１７）を包含する。
【図６−４】ヒトおよびマウスおよびラットのＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３の核酸配列およびタンパク質配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜１７）を包含する。
【図６−５】ヒトおよびマウスおよびラットのＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３の核酸配列およびタンパク質配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜１７）を包含する。
【図６−６】ヒトおよびマウスおよびラットのＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３の核酸配列およびタンパク質配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜１７）を包含する。
【図７】図１におけるキメラｈＴ１Ｒ２−１受容体がシクラメート以外のすべての試験した甘味料（スクロース、フルクトース、Ｄ−Ｔｒｐ、Ａｃｅｋ、Ｄｕｌｃｉｎ）に反応することを示す、このキメラ味覚受容体を発現するＨＥＫ−２９３細胞を使用したカルシウムイメージング実験の結果を包含する。
【図８】キメラｈＴ１Ｒ２−１に対する比較において、生来のｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３受容体を活性化する異なる甘味料の有効の濃度（ＥＣ５０）を比較する実験結果を包含する。
【図９】対象キメラｈＴ１Ｒ２−１および改変されていないｈＴ１Ｒ３配列を安定発現するＨＥＫ−２９３細胞株において、シクラメートがアスパルテーム反応を増強することを示す実験を包含する。
【図１０】ｈＴ１Ｒ２−１キメラ味覚受容体および改変されていないｈＴ１Ｒ３配列を発現する安定なＨＥＫ−２９３細胞株において、シクラメートがＤ−トリプトファン反応を増強することを示す実験を包含する。
【図１１】対象ｈＴ１Ｒ２−１キメラ味覚受容体および改変されていないｈＴ１Ｒ３配列を発現する安定な細胞株において、シクラメートがスクロース反応を増強することを示す実験を包含する。
【図１２】対象キメラ受容体ｈＴ１Ｒ２−１および改変されていないｈＴ１Ｒ３配列を発現する安定なＨＥＫ−２９３細胞株において、シクラメートがフルクトース反応を増強することを示す実験を包含する。
【図１３】対象キメラ受容体ｈＴ１Ｒ２−１および改変されていないｈＴ１Ｒ３配列を発現する安定なＨＥＫ−２９３細胞株において、シクラメートが登録された旨味アゴニスト化合物（‘８０７と表す）によって引き起こされた反応を増強すること、および旨味化合物‘８０７がキメラｈＴ１Ｒ２−１受容体を活性化することを示す実験を包含する。
【図１４】ｈＴ１Ｒ２−１およびｈＴ１Ｒ３を発現する安定なＨＥＫ−２９３細胞株において登録された旨味リガンドアゴニスト化合物‘８０７がアスパルテーム反応を増強することを示す実験を包含する。
【図１５】キメラ受容体ｈＴ１Ｒ１−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）およびｒＴ１Ｒ３受容体を発現する安定なＨＥＫ−２９３細胞株の反応を示し、このキメラ受容体が旨味リガンドＬ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ａｓｐ、およびＬ−ＡＰ４に反応すること、および反応がＩＭＰまたはＧＭＰの存在によって増強されることを示す実験を包含する。
【図１６】ＭＳＧによる本発明に記載のキメラｈＴ１Ｒ１−２／ｒＴ１Ｒ３受容体の活性化がＩＭＰにより増強されることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図７】
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【図１１】
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【図１４】
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【配列表】
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