(57)【要約】  ドパミンＤ１／Ｄ５受容体は、種々のタイプのヒト及び動物の白血病、リンパ腫及び活性化Ｔ−細胞において高度に過剰発現される。ドパミンＤ１受容体はまた、他のタイプの癌細胞において劇的に上昇した水準又はまったく穏やかな水準でさえまた発現される。フェノルドパムメシラートのような選択的ドパミンＤ１受容体作動薬は、ドパミンＤ１受容体を発現するそのようなヒト及び動物Ｔ−細胞を迅速に、強力にそして選択的に殺す。したがって、病気を起こす細胞を殺すことにより、リンパ腫、白血病及び免疫系の他の癌、及びＴ−細胞媒介自己免疫疾患、そして（慢性炎症のような）過剰活性化炎症性Ｔ−細胞により起こされた他の病気、あるいは移植片宿主相関症（ＧＶＨＤ）又は移植片拒絶反応により、あるいはドパミンＤ１受容体を発現する任意の他の細胞タイプにより起こされた、他の病気を治療するために、選択的ドパミンＤ１／５受容体作動薬は使用されることができる。さらに使用する前に、望ましくない白血病、リンパ腫又は活性化Ｔ−細胞から、一定の細胞集団を浄化することのようなインビボ又はインビトロでのいずれかで、これらの目的のために、選択的ドパミンＤ１／５受容体作動薬は使用されることができる。
2009503109.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドパミンＤ１受容体を発現するヒト又は他の動物の細胞を、選択的ドパミンＤ１受容体作動薬の有効な量と接触させることを包含する、前記細胞の死を起こさせる方法。
【請求項２】
ドパミンＤ１受容体を発現する前記細胞が白血病又はリンパ腫細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ドパミンＤ１受容体を発現する前記細胞が、ドパミンＤ１受容体を発現する癌細胞であって、この癌細胞が白血病又はリンパ腫細胞以外の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ドパミンＤ１受容体を発現する前記細胞が、ＴＣＲ活性化Ｔ−細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＴＣＲ−活性化Ｔ−細胞が、自己免疫Ｔ−細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞を選択的ドパミンＤ１受容体作動薬の有効な量と接触させる前記工程が、ドパミン受容体を発現する細胞の排除により軽減されることができる病気又は症状を有するヒト又は動物生体の体中に前記ドパミンＤ１受容体作動薬を投与することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記病気又は症状は、その細胞がドパミンＤ１受容体を発現している癌である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記病気又は症状が白血病又はリンパ腫であり、そしてドパミンＤ１受容体を発現する前記細胞が白血病又はリンパ腫細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記病気又は症状が、Ｔ−細胞媒介自己免疫疾患である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｔ−細胞媒介自己免疫疾患が、インスリン依存性（１型）真正糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、自己免疫心筋炎、脱毛又は乾癬症である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記病気又は症状が、過剰活性化炎症Ｔ−細胞によりひき起こされるか又は悪化させられているものである、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記病気又は症状が難治性炎症である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記病気又は症状が移植片宿主相関病であり、そしてドパミンＤ１受容体を発現する前記細胞が活性化供与者対宿主Ｔ−細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記病気又は症状が移植片拒絶反応であり、そしてドパミンＤ１受容体を発現する前記細胞が移植片組織に対して活性化された宿主Ｔ−細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記投与する工程が静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、腫瘍内注射、くも膜下内注射又は頭蓋内注射による、請求項６〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞を選択的ドパミンＤ１受容体作動薬の有効量と接触させる前記工程が、体外で前記細胞を前記ドパミンＤ１受容体作動薬と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞は、そこから白血病、リンパ腫又は活性化Ｔ−細胞を取り除くことが所望される細胞集団である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
骨髄移植、Ｔ−細胞移植又は培養により分泌された分子を回収するためのインビトロ培養のために、前記細胞集団を用いる工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が白血病又はリンパ腫を有するヒト又は他の動物生体からの自己Ｔ−細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
そのような体外処理されて、それにより白血病又はリンパ腫細胞の前記Ｔ−細胞を取り除いている自己Ｔ−細胞を、ヒト又は動物生体に戻し投与する工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記作動薬がフェノルドパム（ｆｅｎｏｌｄｏｐａｍ）の塩である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記作動薬がフェノルドパムメシラートである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記作動薬がフェノルドパム臭化水素酸塩である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記作動薬が、（１Ｒ−シス）−１−（アミノメチル）−３，４−ジヒドロ−３−トリシクロ〔３．３．１．１３，７〕デカ−１−イル−〔１Ｈ〕−２−ベンゾピラン−５，６−ジオール塩酸塩である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記作動薬が、（±）−１−フェニル−２，３，４，５−テトラヒドロ−（１Ｈ）−３−ベンゾアゼピン−７，８−ジオール臭化水素酸塩である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記作動薬が、シス−（±）−１−（アミノメチル）−３，４−ジヒドロ−３−フェニル−１Ｈ−２−ベンゾピラン−５，６−ジオール塩酸塩である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はドパミンＤ１Ｒ作動薬によるヒトリンパ腫及び白血病癌細胞及びＴＣＲ−活性化正常ヒト細胞の死滅化に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
リンパ腫及び白血病
ヒトは、非常に攻撃的な腫瘍である種々のタイプのリンパ腫及び白血病を患っている。大抵の場合、現在存在する治療様式（化学療法、放射線療法、外科手術、或る種の追加の抗癌剤及び骨髄移植術）は全く満足できるものではなく、ほんの比較的に少さい割合のリンパ腫及び白血病患者だけしか、多数年にわたって生き延びることができない。したがって、一方ではともかく正常な（悪性でない）細胞にほとんど影響を及ぼすことなしに、白血病及びリンパ腫癌細胞を選択的に殺すことができる新規な医薬を発見することの緊急な必要性が存在する。
【０００３】
ドパミン及びその受容体
神経系においての最も重要な神経伝達物質の１つであるドパミンは、Ｄ１Ｒ及びＤ５ＲからなるＤ１Ｒ系統、そしてＤ２Ｒ、Ｄ３Ｒ及びＤ４ＲからなるＤ２Ｒ系統に下位区分化される５種の受容体Ｄ１Ｒ〜Ｄ５Ｒを有する。Ｄ１クラスのドパミン受容体（またそれにＤ１Ｒ及びＤ５Ｒが属している）は、Ｇｓタンパク質カップリングされているのに対して、Ｄ２クラスのドパミン受容体（またそれにＤ２Ｒ、Ｄ３Ｒ及びＤ４Ｒが属している）は、Ｇｉカップリングされている。
【０００４】
幾つかの独立した研究は、正常ヒトＴ−細胞及び周辺リンパ球がＤ２、Ｄ３、Ｄ４及びＤ５サブタイプのドパミン作動性受容体を発現するが、しかしドパミンＤ１受容体サブタイプを発現しないことを示している。
【０００５】
フェノルドパムメシラート
フェノルドパムメシラート（ｆｅｎｏｌｄｏｐａｍ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）は、主として重度の高血圧、うっ血性心不全、及び急性及び慢性腎不全の治療においてその血管拡張作用のために広く研究されており，そしてクリニックにおいて使用されている高度に選択的なドパミンＤ１受容体作動薬である。
【０００６】
フェノルドパムメシラートは、ＢＢＢを横断せす、したがって周辺作用のみを有する。化学的には、フェノルドパムは、６−クロロ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１−（４−ヒドロキシフェニル）−〔１Ｈ〕−３−ベンゾアゼピン−７，８−ジオールメタンスルホネートである。それは米国特許第４，１９７，２９７号、同第４，６００，７１４号及び同第６，２３８，６９３号に記載されてきており、そして現在ではゼネリック医薬である。
【０００７】
フェノルドパムは、生物学的活性に応答性であるＲ−異性体を有するラセミ混合物である。Ｒ−異性体は、Ｄ１−様受容体に対して、Ｓ−異性体が発揮するよりもおよそ２５０倍高い親和性を持っている。フェノルドパムは、α２−アドレナリン受容体に結合するが、しかし穏やかな親和性をもって結合する。それは、Ｄ２−様受容体、α１及びβアドレナリン受容体、５ＨＴ１及び５ＨＴ２受容体又はムスカリン受容体に対して有意義な親和性を有しない。フェノルドパム又は何か他のＤ１受容体作動薬が癌細胞を殺す能力を有するという証拠は今までには存在しなかった。種々のタイプのヒト及び動物白血病及びリンパ腫ならびに活性化Ｔ−細胞は、Ｄ１受容体を発現しない正常な静止Ｔ−細胞に比較して、高く上昇した水準のドパミンＤ１受容体を発現することが、今や見い出された。フェノルドパム、選択的ドパミンＤ１受容体作動薬及び他の選択的ドパミンＤ１受容体作動薬は、リンパ腫、白血病及び活性化Ｔ−細胞を迅速に、強力に、そして選択的に殺すことがまた見い出された。これらの知見に基づいて、本発明は、白血病、リンパ腫、活性化Ｔ−細胞、自己免疫Ｔ−細胞及び過剰活性化炎症性Ｔ−細胞を選択的に殺すためのフェノルドパムメシラート（ｆｅｎｏｌｄｏｐａｍ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）及び他のドパミンＤ１受容体作動薬の使用に向けられている。フェノルドパムはまた、ドパミンＤ１受容体を発現する他の癌細胞を殺す能力を有することが予想される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
Ｔ−細胞媒介自己免疫疾患
ヒトは幾つかのタイプの自己免疫疾患を患っており、これらの中の或るものは（多かれ少なかれ或る程度まで）自己免疫Ｔ−細胞により媒介されている。ヒトＴ−細胞媒介自己免疫疾患の中には以下のものがある：インスリン依存性（１型）真正糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、自己免疫心筋炎、そして恐らくはまた少なくとも１部分（近年行われた新しい観察に従えば）脱毛症及び乾癬。全てのこれらの病気の現存する治療の有益な成果は非常に限られており、とても満足できるものではない。従って、一方では静止している非活性化Ｔ−細胞については差し控えながら、活性化自己免疫Ｔ−細胞を選択的に殺すか又は不活動にさせることができる新しい医薬を見つけ出すことの緊急な必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
リンパ腫及び白血病を死滅させることに関する本発明の面は、以下の発見に基づいている：
１）ヒト及びマウスリンパ腫（これらの中には幾つかのタイプのＴ−細胞リンパ腫がある）、及びヒト及びマウス白血病（これらの中にはＴ−細胞白血病がある）の或るタイプが、Ｄ１ドパミン受容体を発現しない正常ヒト静止周辺Ｔ−細胞とは対照的に、それらの細胞表面上で発現したドパミンＤ１受容体の水準においての劇的な上昇を有する。他のタイプの非Ｔ−白血病及びリンパ腫（これらの中にはＢ−細胞バーキットリンパ腫がある）はまた、種々の水準のドパミンＤ１受容体を発現する。
２）フェノルドパムメシラートの１ｎＭ〜０．０１ｍＭ濃度に、又は他のドパミンＤ１／５受容体作動薬の同様な濃度に、（上に特定された）５つの異なるタイプのヒトリンパ腫及び白血病を、インビトロで曝露すると、これらの癌細胞の全て又はほとんど大部分の死に導く。
３）フェノルドパムメシラートへの、又は（以下に特定される）他の高度に特異性のドパミンＤ１／５受容体作動薬への、異なるタイプのヒトリンパ腫及び白血病の、比較的に短い時間期間（例えば１０〜３０分）インビトロでの曝露はリンパ腫又は白血病細胞の死を起こさせるのに十分である。試験され、そしてリンパ腫及び白血病を殺すのに有効であると分かった選択的ドパミンＤ１／Ｄ５受容体作動薬は、（１Ｒ−シス）−１−（アミノメチル）−３，４−ジヒドロ−３−トリシクロ〔３．３．１．１３，７〕デシ−１−イル−〔１Ｈ〕−２−ベンゾピラン−５，６−ジオール塩酸塩（ＴＯＣＲＩＳ  Ｃｏｏｋｓｏｎ製品名：Ａ７７６３６塩酸塩；カタログ番号：１７０１；“強力な、選択的Ｄ１−様作動薬；経口的に活性”と称せられる）、（±）−１−フェニル−２，３，４，５−テトラヒドロ−（１Ｈ）−３−ベンゾアゼピン−７，８−ジオール臭化水素酸塩（ＴＯＣＲＩＳ  ＣＯＯＫＳＯＮ製品名：ＳＫＦ３８３９３臭化水素酸塩；カタログ番号：０９２２；“Ｄ１−様ドパミン受容体選択的部分作動薬”と称せられる）、及びシス−（±）−１−（アミノメチル）−３，４−ジヒドロ−３−フェニル−１Ｈ−２−ベンゾピラン−５，６−ジオール塩酸塩（ＴＯＣＲＩＳ  ＣＯＯＫＳＯＮ製品名：１５３４；カタログ番号：Ａ６８９３０塩酸塩；“強力且つ選択的Ｄ１−様ドパミン受容体作動薬”と称せられる）である。
４）フェノルドパムメシラート及び全ての他の選択的ドパミンＤ１／Ｄ５受容体作動体によりリンパ腫及び白血病を殺すことは常に投与量依存性である。それでもやはり、予想されるように、或る種のＤ１Ｒ作動薬は他のよりも非常に有効であり、そして他のものの濃度よりも低い濃度で癌細胞を殺すことができた。フェノルドパムメシラート及びＡ７７６３６塩酸塩は最も有効な癌キラーであり、したがって本発明を使用するための好ましい態様である。
【００１０】
５）試験されたリンパ腫及び白血病細胞の殆どは、正常な（癌でない）ヒトＴ−細胞上でのＤ１／Ｄ５受容体、ドパミンＤ３受容体及びドパミンＤ２受容体それぞれの非常に低い発現に比較して、Ｄ１／Ｄ５受容体のみばかりでなくドパミンＤ３及びドパミンＤ２受容体をもまた、それらの細胞表面上に著しく上昇した水準で発現した。なお、ドパミンＤ２及びＤ３受容体作動薬はともかく、ドパミンＤ１／５受容体作動薬により発揮される効果と比較して、非常に低い抗癌死滅化活性を示した。
【００１１】
ドパミンＤ１Ｒ作動薬は、試験された白血病及びリンハ腫細胞の、主として壊死により実質的な死滅を一貫して起こさせたけれども、（その５つの受容体のサブタイプの全てを主として誘発することができる）ドパミンそれ自体は、或る場合においてはまた、ヒト白血病及びリンパ腫を殺したが、しかし他のある場合においてはそうしなかった。本明細書おいて全ての試験された高度に選択的なＤ１Ｒ作動薬の中でフェノルドパムメシラート及びＡ７７６３６塩酸塩が最も有効な癌キラーであった。
【００１２】
Ｔ−細胞媒介自己免疫疾患の治療に関連した本発明の面は、以下の発見に基づいている：
１．（上記Ｔ−細胞受容体を発現しないか又は重大でない最小の水準に発現する静止正常ヒト周辺Ｔ−細胞とは対照的に）Ｔ−細胞受容体（ＴＣＲ）−活性化正常ヒト周辺Ｔ−細胞は、それらの細胞表面上で劇的に上昇した水準のドパミンＤ１受容体を発現する。
２．フェノルドパムメシラートのような幾種かの高度に選択的なドパミンＤ１／５受容体作動薬への、インビトロでのＴＣＲ−活性化ヒト正常周辺Ｔ−細胞の曝露は、これらの活性化Ｔ−細胞の実質的な割合を殺すが、しかし静止〔活性化されていない）ヒト正常周辺Ｔ−細胞の死は有意義に低い。全ての選択的ドパミンＤ１／５受容体作動薬によりＴＣＲ−活性化Ｔ−細胞を殺すことは投与量依存性であった。それでもやはり、予想されるように、或る種のＤ１Ｒ作動薬は、他より非常にいっそう有効であり、そして他のものの濃度より低い濃度で癌細胞を殺すことができた。本明細書中で試験された全ての高度に選択的なＤ１Ｒ作動薬の中でフェノルドパムメシラート及びＡ７７６３６塩酸塩は、ＴＣＲ−活性化Ｔ−細胞の最も有効なキラーであって、したがってこの方法において使用するための好ましい態様である。
【００１３】
本発明は添付図面に関連してより良く理解されるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
好ましい態様の詳細な記載
５種の異なる選択的Ｄ１Ｒ作動薬を、本明細書において特別に開示し、そして諸実験において使用したけれども、本発明はそれらに限定されると考えられるべきでない。そのような作動薬であると知られている分子の構造を変化させ、そして作動薬的活性についてスクリーニングすることによるか、又は当業界に知られている他の手段によるような他のそのような作動薬を決定することは当業界の技術内にある。さらに単クローン性抗体はしばしば作動薬的活性を有している。したがって、抗原としてＤ１Ｒ又はそのエピトロープ類を用いて抗体を育成し、そしてＤ１Ｒ作動薬的活性について抗体をスクリーニングすることができる。次ぎに任意のそのような陽性抗体を、本発明に従って直接に使用することができるか、あるいは人化抗体、単鎖抗体、又は親抗体のＤ１Ｒ作動化活性を維持している抗体フラグメント又は誘導体を生成するための慣用の方法で遺伝学的に作り上げることができる。本明細書において用いられるものとして“抗体”と言う用語は、多クローン性抗体又は単クローン性抗体、あるいは任意の上記の遺伝学的に作り上げた抗体を包含することが意図される。
【００１５】
ドパミンＤ１Ｒ作動薬は、直接に又は間接的にドパミンＤ１受容体を活性化することができる。受容体のＧ−たんぱく質結合たんぱく質又はその下流のエフェクターたんぱく質の任意なものをまた、本発明の作動薬により直接に又は間接的に活性化することができる。本発明の効果をいったん理解したならば、所望の活性及び選択性を有する他の作動薬をスクリーニングし、そしてそれを得ることは当業者の技術内にある。
【００１６】
本明細書及び特許請求の範囲において用いられるものとして“選択的”という用語は、Ｄ２Ｒ、Ｄ３Ｒ及びＤ４Ｒに対して比較的に小さい活性を有するか又は活性を有してなく、Ｄ１Ｒ及びＤ５Ｒに対して実質的に選択的作動薬活性を有することを意味する。本発明の作動薬は、好ましくはドパミンＤ１受容体について全体的に選択的である一方で、それらはまたドパミン受容体のＤ１系統の部員であるＤ５受容体に対して幾らかの作動薬活性を有することが許容される。好ましい作動薬はＤ２Ｒ、Ｄ３Ｒ及びＤ４Ｒに対して比較的に僅かな活性を有するか又は全く活性を有しておらず、Ｄ１Ｒに関して強い活性を有し、そしてＤ５Ｒに対してできるだけ小さい活性を有する。
【００１７】
ドパミンＤ１受容体を発現する任意の細胞、特にそのような受容体を過剰に発現する細胞を、本発明により殺すことができる。本明細書に示されるように、或る種の白血病及びリンパ腫細胞（多くの場合Ｄ１Ｒについて７０〜８０％陽性）及びＴＣＲ−活性化細胞は、対応する正常な又は静止している細胞に比較してＤ１Ｒを過剰に発現する。なお、幾らかの他の癌は、非常に低いＤ１Ｒ発現（時にはほんの１０％陽性でさえある）を有するが、しかしそれらはまた本発明に従ってＤ１Ｒ作動薬により非常に有効に殺される。したがって低い又は穏やかな水準にあるＤ１Ｒでさえ、細胞を、Ｄ１Ｒ選択的作動薬により誘発される死滅に感受性にさせることができる。したがって、本発明は、低い又は穏やかな水準でさえ、Ｄ１Ｒを発現する他の悪性細胞を死滅させることをカバーすることがまた意図される。
【００１８】
ＴＣＲ−活性化Ｔ−細胞は、正常な“静止している”Ｔ−細胞に比較してＤ１Ｒを過剰に発現する。したがって、そのような活性化細胞は、前記活性化Ｔ−細胞が治療されるべき病気又は症状の一因となっている、即ちその病気又は症状が炎症性Ｔ−細胞のような活性化Ｔ−細胞により起こされるか又は悪化されている病気又は症状において排除されることができる。そのような病気又は症状の例は、インスリン依存性（１型）真正糖尿病、多発性硬化症、重症筋肉無力症、自己免疫心筋炎、脱毛症及び乾癬症のようなＴ−細胞媒介自己免疫疾患である。他のそのような病気は難治性炎症、及び炎症性Ｔ−細胞によって媒介される他の病気である。
【００１９】
本発明に従って治療することができる他の病気又は症状は、移植片宿主相関病（ＧＶＨＤ）である。ＧＶＨＤを、ヒト及び／又は動物供与体から到来する活性化宿主活性化同種Ｔ−細胞を殺すことにより予防するか又は治療することができる。そのような活性化Ｔ−細胞は、事情が変われば、完全に又は部分的に不釣り合いの組み合わせの臓器又は骨髄細胞の移植の後に、ＧＶＨＤを起こす可能性がある。同様に、本発明により、移植片拒絶反応を治療するか又は予防することができる。活性化宿主Ｔ−細胞は、完全に又は部分的に不釣り合い臓器及び骨髄細胞の移植後に供与者組織に対して宿主反応を起こし、それにより移植片拒絶反応を生ずる可能性がある。
【００２０】
本発明の作動薬は、インビボ又はインビトロのいずれかでＤ１Ｒ受容体を発現する細胞の死を起こさせるために用いられることができる。ヒト又は他の動物生体においての病気を治療する場合、本発明の作動薬を、当業界に既知の任意の都合の良い方法で、全身的にあるいは治療されるべき細胞の部位に局所的に投与することができる。したがって、作動薬を、静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、腫瘍内注射、くも膜下内注射又は頭蓋内注射により投与することができる。その作動薬を、経皮軟膏又は植え込み型医薬送り出しポンプにより投与することができる。その作動薬をまた、経口的に投与することができる。
【００２１】
本発明の作動薬をまた、体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で用いることができる。例えば、自己骨髄移植法のために後で使用されるべき自己幹細胞の調整材料内の癌細胞を殺すためのような、白血病及び／又はリンパ腫細胞を浄化し、そして／又は殺すような方法で、それらを用いることができる。事実、骨髄移植、Ｔ−細胞移植、又は任意の他の用途のために“清浄化”細胞集団をさらに使用する前に、望ましくない白血病、リンパ腫又は活性化Ｔ−細胞から、骨髄細胞のような一定の細胞集団を浄化するか又は“清浄化”するためにドパミンＤ１受容体作動薬を使用することができる。例えばＴ−細胞サイトカイン又は成長因子又は任意のＴ−細胞分泌物たんぱく質、等を採取する、癌の免疫治療のためのようなさらにインビトロ培養するためにそのような“清浄化された”細胞集団をまた使用することができる。
【実施例】
【００２２】
例  １：
材料及び方法
それらの抗癌効果について試験されるドパミンＤ１受容体作動薬
５種の異なる高度に選択的なドパミンＤ１／５受容体作動薬を、それらの抗−リンパ腫及び抗−白血病死滅化活性について試験した：
１）ＴＯＣＲＩＳ  Ｃｏｏｋｓｏｎ製品名：Ａ７７６３６塩酸塩；カタログ番号：１７０１；化学名：（１Ｒ−シス）−１−（アミノメチル）−３，４−ジヒドロ−３−トリシクロ〔３．３．１．１３，７〕デシ−１−イル−〔１Ｈ〕−２−ベンゾピラン−５，６−ジオール塩酸塩（“強力な、選択的Ｄ１−様作動薬；経口的に活性”と称せられている）。
２）ＴＯＣＲＩＳ  ＣＯＯＫＳＯＮ製品名：ＳＫＦ３８３９３臭化水素酸塩；カタログ番号：０９２２；化学名：（±）−１−フェニル−２，３，４，５−テトラヒドロ−（１Ｈ）−３−ベンゾアゼピン−７，８−ジオール臭化水素酸塩（“Ｄ１−様ドパミン受容体選択的部分作動薬”と称されている）。
３）ＴＯＣＲＩＳ  ＣＯＯＫＳＯＮ製品名：１５３４；カタログ番号：Ａ６８９３０塩酸塩；化学名：シス−（±）−１−（アミノメチル）−３，４−ジヒドロ−３−フェニル−１Ｈ−２−ベンゾピラン−５，６−ジオール塩酸塩（“強力且つ選択的Ｄ１−様ドパミン受容体作動薬”と称されている）。
４）フェノルドパムメシラート（ＦＤ）（“フェノルドパムメシラート注射ＵＳＰ”と名づけられたＢｅｄｆｏｒｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ／ＵＳＡ製品（フェノルドパムは、６−クロロ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１−（４−ヒドロキシフェニル）−〔１Ｈ〕−３−ベンゾピラン−７，８−ジオールメタンスルホネートである）。
５）フェノルドパム臭化水素酸塩：ＳＩＧＭＡ製品番号Ｆ−６８００、ＣＡＳ＃：Ｄ７２２７−５６−９；同義語１：ＳＫＦ８２５２６。
ドパミン及び他のドパミン−受容体類似体を対照として使用した。
ｉ．ドパミン及びドパミンＤ３Ｒ選択的作動薬：Ｕ−９９１９４マレイン酸塩（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
ドパミンＤ１Ｒ選択的作動薬：ＳＫＦ  ３８３９３。
ドパミンＤ２Ｒ選択的作動薬：キンピロール（Ｑｕｉｎｐｉｒｏｌｅ）。
ドパミンＤ３Ｒ選択的作動薬：７−ヒドロキシ−ＤＰＡＴ。
ｉｉ．ドパミンＤ４Ｒ選択的作動薬：ＰＤ１６８０７７。
ドパミンＤ２Ｒ選択的作動薬：Ｌ−７４１，６２６。
ドパミンＤ４Ｒ選択的作動薬：Ｌ−７４１，７４１
（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｃｏｏｋｓｏｎ）。
【００２３】
ヒト癌細胞系
ヒトＢ−リンパ腫（バーキットリンパ腫）系：Ｒａｊｉ及びＤａｕｄｉ；
ヒトＴ−細胞白血病系：Ｊｕｒｋａｔ；ヒトＴ−リンパ腫（皮膚“Ｓｅｚａｒｙ”Ｔ−リンパ腫）系：Ｈｕｔ７８；及びヒト慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）：Ｋ−５６２を、アメリカン  タイプ  セル  カルチュア（ＡＴＣＣ）から得た、そして１０％ＦＣＳ、１％グルタミン及び１％抗生物質を補充した（ＩＭＤＭ又はＲＰＭＩ−１６４０のいずれかの）組織培地中に維持した（３７℃、湿潤化インキュベータ、５％ＣＯ２）。
【００２４】
正常な周辺ヒトＴ−細胞
赤血球、死んだ細胞、多形核白血球及び顆粒球からリンパ球を分離するために密度勾配遠心分離を用いた。血液銀行により供給された、血漿が存在しない且つ前冷凍されていない“新しい”５０ｍｌの白血球のサンプルをＰＢＳ中に１：１に希釈し、そして底に５．６％のポリスクロース及び９．６％のメトリゾエートナトリウムの溶液を含有する（イスラエル国エルサレムのＮｏｖａｍｅｄ製の）Ｕｎｉ−ＳＥＰｍａｘｉ＋試験管に加えた。その試験管を遠心分離（１２００ｒｐｍ、３０分）し、そして（血漿とポリスクロース／メトリゾエートナトリウムとの界面に移動する）リンパ球の得られた層を２ｍｌのピペットにより取り出した。そのリンパ球を、ＰＢＳで２回洗浄し（１０００ｒｐｍ、１０分）、そして５％ＦＣＳを含有する８ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。次ぎに他のリンパ球（即ちＢ−細胞及びＮＫ−細胞）からＴ−細胞を分離するためにナイロンウールカラムを用いた。ＰＢＳ／５％ＦＣＳと共に３７℃で３０分間予備インキュベートしたナイロンウールカラム（Ｎｏｖａｍｅｄ製）上に（注射器注入により）細胞懸濁液を装入した（カラム当たり２ｍｌ）。この細胞装入の後に室温で１時間水平においてそのカラムをさらにインキュベートした。インキュベーションの後に、非粘着性のＴ−細胞を溶離するためにＰＢＳ（カラム当たり１２ｍｌ）をカラムに加えた。溶離された細胞を清浄な試験管に集めそして遠心分離した（８００ｒｐｍ、１５分）。得られた細胞集団は、ＴＣＲ染色及びＦＡＣＳｏｒｔを用いる流動細胞光度測定法により数値を求めたときに、＞９０％Ｔ−細胞からなっていた。その細胞を、１０％ＦＣＳ、１％グルタミン及び１％抗生物質を補充したＲＰＭＩ−１６４０中に維持した（３７℃、湿潤化インキュベータ、５％ＣＯ２）。
【００２５】
正常な周辺ヒトＴ−細胞のＴ−細胞受容体（ＴＣＲ）活性化
非組織培養処理された２４ウェルのプレート（ニュージャージー州、フランクリンレークスのＦａｌｃｏｎ製）を４℃で一夜、抗−ＣＤ３及び抗−ＣＤ２８単クローン性抗体（ｍＡｂｓ）（カリフォルニア州サンホーゼのＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製）でコーティングした（ＰＢＳ中１０ｇ／ｍｌ）。そのウェルを次ぎにＰＢＳで洗浄し、３７℃で１時間封鎖し（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ）、そして再び洗浄した。新しく精製した正常なヒトＴ−細胞を、それらのそれぞれの新しい媒体に再懸濁させ、そして抗−ＣＤ３／ＣＤ２８−コーティングウェル中に接種し（１ｘ１０６／ウェル）、そしてそれらのプレートを７２時間インキュベートした（３７℃、湿潤化インキュベータ、５％ＣＯ２）。次ぎに、各々のウェルからそれらの細胞及びそれらの媒体を収集し、５０ｍｌ試験管に移し、遠心分離し（１２００ｒｐｍ、１０分）、そしてＴＣＲ−活性化細胞及びそれらの培養液の両方を収集し、そして清浄な別の試験管に移した。
【００２６】
癌細胞ならびに正常な“静止”Ｔ−細胞及び正常なＴＣＲ−活性化Ｔ−細胞の、Ｄ１Ｒ作動薬（これらの中でＦＤ）への曝露
ヒト癌細胞、そして平行して“静止”正常ヒトＴ−細胞及びＴ−細胞受容体（ＴＣＲ）−活性化正常ヒトＴ−細胞を、９６の組織培養ウェルに接種し（２０万〜５０万細胞／ウェル）、そして１分〜７２時間の範囲の種々の時間期間にわたって、（他のように示さない限り）通常０．１ｎＭ〜０．１ｍＭの範囲で、順次希釈でＤ１Ｒ作動薬を加えた。後に、細胞生存能力を試験した。ＦＤを用いる大部分の実験において、０、１５分、３０分及び６０分の時間で合計１時間の間に４回（ＦＤｘ４）、０．０１ｎＭ〜０．１ｍＭの順次希釈で、この薬剤を再び加えた。
【００２７】
ＬＤＨ放出を追跡することによる細胞生存能力に対するＦＤの効果を試験する
ＬＤＨの放出を測定することによる細胞死の測定を、製造者の取り扱い説明書に従ってＣｙｔｏＴｏｘ  ９６Ｒ非−放射能細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて行った。
【００２８】
詳細：ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６Ｒ非−放射能細胞毒性アッセイは、５１Ｃｒ放出細胞毒性アッセイに対する比色代替アッセイである。ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６Ｒアッセイは、５１Ｃｒが放射能アッセイで放出されるとほぼ同じ様式で、細胞溶解の際に放出される安定な細胞質ゾル酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を定量的に測定する。培養上澄み液中に放出されたＬＤＨを、赤色ホルマザン生成物への、テトラゾリウム塩（ＩＮＴ）の変換を生ずる３０分カップリングされた酵素アッセイで測定する。形成される色の量は、溶解細胞の数に比例する。可視波長吸光度データを、標準の９６−ウェルプレート読取器を用いて収集する。
【００２９】
流動細胞光度測定法を用いて細胞死、細胞消滅及び壊死を追跡することによる細胞生存能力に対するＦＤの効果を試験する
流動細胞光度測定法及びホスファチジルセリンの検出による細胞死の測定を、製造者の取り扱い説明書に従って、ＩＱプロダクツキット（Ｒ＆Ｄシステムズ）を用いて行った。
【００３０】
詳細：ホスファチジルセリン検出キットは、流動細胞光度測定法による細胞消滅の検出のための迅速な且つ信頼できる方法を提供する。この方法は、単一細胞水準での検出を可能にし、そしてまた、細胞消滅と壊死との間の識別を可能にする。
【００３１】
細胞消滅の早期の段階の間にホスファチジルセリン（ＰＳ）は細胞膜の外側に曝されるようになる。細胞消滅のこの早期段階は、ＰＳ結合たんぱく質（アネキシンＶ）により特異的に検出されることができる。
【００３２】
細胞消滅の早期の段階の間で細胞膜はそのままの状態にあり、そして細胞は沃化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）（ＰＩ）を排除する。後に、細胞消滅の過程の間に膜は多孔性になり、そしてＰＩはＤＮＡと会合されるようになる。ＰＩのその取り込みは壊死の表示である。
【００３３】
標準の顕微鏡を用いてのトリパンブルーによる生存細胞及び死んだ細胞の計数
トリパンブルーを吸収する細胞は、死んでいるか又は死への過程にある。
ドパミンＤ１受容体及び流動細胞光度測定法のための免疫表現型染色
氷上で３０分間、１：５０希釈／１ｘ１０６細胞／１００Ａ１で、いずれかのＤ１Ｒに対して向けられたウサギ抗血清（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製）を用いて、正常なヒトＴ−細胞（静止しているか又はＴＣＲ−活性化７２時間後のいずれか）を、単一又は二重の免疫蛍光染色に付した。アイソタイプ制御を用いて染色するために細胞を、正常なウサギ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒｔｏｒｉｅｓ製）で染色した。次ぎにそれらの細胞を、フルオロレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−共役ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（１：１００希釈の１００Ａ１：Ｊａｃｋｓｏｎ製）で染色した。幾つかの実験において、ＰＥ−共役化マウス抗−ヒトＴＣＲａｂ  ｍＡｂ（貯蔵物の２０Ａ１；Ｓｅｒｏｔｅｃ製）で二重染色を行った。第２及び第３抗体でのみ染色された細胞を、追加の陰性の対照として供した。蛍光プロフィルをＦＡＣＳｏｒｔにおいて記録した。
【００３４】
例  ２：
ヒトＴ−細胞癌はそれらの細胞表面上に非常に高い水準のドパミンＤ１Ｒを発現する一方で、正常なヒトＴ−細胞はそれを発現しない
正常なＴ−細胞、そして癌Ｔ−細胞白血病細胞及びリンパ腫細胞の細胞表面上のドパミンＤ１受容体（Ｄ１Ｒ）の発現は、最初にウサギ抗−Ｄ１Ｒ特異性抗体を用い、次ぎにＦＩＴＣ−共役化抗−ウサギ抗体を用い、そしてＦＡＣＳｏｒｔを用いる流動細胞光度測定分析により、これらの細胞の免疫蛍光染色により、研究された。非−特異性アイソタイプコントロール染色のためにウサギ血清を用いた。
【００３５】
図１に示される結果は、ヒトＴ−白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ）及びマウスＴ−リンパ腫細胞（ＥＬ−４）が、それらの細胞表面上に非常に高い水準のドパミンＤ１Ｒを発現する一方で、正常なヒトＴ−細胞はそれを発現しないことを立証する。したがって、ヒト白血病上の正味の特異性Ｄ１Ｒ染色は６１％（７４．８％特異性染色−１３．７％制御非特異性染色）であって、ヒトＴ−リンパ腫上の正味の特異性Ｄ１Ｒ染色は５７．８％（７１％特異性染色−１３．２％コントロール非特異性染色）であったが、その一方で正常な周辺ヒトＴ−細胞についての正味のそれは、ほんの５．７％（１３．９％特異性染色−８．２％コントロール非特異性染色）であった（図１Ａ〜図１Ｆ）。
【００３６】
幾つかのタイプの非−Ｔヒトリンパ腫及び白血病、即ちヒトバーキットＢ−リンパ腫（Ｄａｕｄｉ及びＲａｊｉ）及びヒト慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｋ−５６２）細胞はまた、それらの細胞表面上に種々の程度のＤ１Ｒを発現することがさらに見い出された（データ示さず）。
【００３７】
例  ３：
生存細胞の数により明らかであるようにフェノルドパムメシラートはヒト癌白血病及びリンパ腫を殺す
また血圧を調節するためのＦＤＡ−認可医薬でもあるフェノルドパムメシラート（ＦＤＭ）のような選択的Ｄ１Ｒ作動薬がドパミンＤ１Ｒを発現するヒト癌細胞を殺すことができることを立証するために、さらに試験を行った。この目的のためにＪｕｒｋａｔ  Ｔ−細胞白血病系、Ｈｕｔ−７８ヒトＴ−リンパ腫（皮膚“Ｓｅｚａｒｙ”Ｔ−リンパ腫）系、及びＫ−５６２ヒト慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及びＤａｕｄｉヒトＢ−リンパ腫（バーキットリンパ腫）系を、組織培養ウェルに接種した（５０万細胞／０．５ｍｌ／ウェル）。（ＭＷ＝４０１、１０ｍｇ／ｍｌ＝２５ｍＭの最初濃度で、最初の臨床的に使用されるアンプルから）ＦＤＭを、１０−２Ｍ〜１０−１０Ｍの順次希釈に、（製造者により説明されているように）０．９％塩化ナトリウム注射を用いて希釈した。次ぎにＦＤＭを対応するマイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）ウェルに加え（０．５ｍｌ細胞に与える濃度でＦＤＭの５マイクロリットル、１：１００希釈）、その結果、試験された最終ＦＤＭ濃度は１０−４Ｍ〜１０−１２であった。
【００３８】
０、１５分、３０分及び６０分の時間で合計１時間の間に４回対応するマイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）ウェルに、（各々の上記濃度で）ＦＤＭを加えた。流動細胞光度測定法を用いて、生きている細胞の数を計数することにより、３日後に、細胞生存／死を評価した。
【００３９】
表１は、非常に有意義に且つ投与量に依存性の様式で、ＦＤＭがヒトＴ−細胞白血病、Ｓｅｚａｒｙ  Ｔ−細胞リンパ腫及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を殺したことを示す。
【００４０】
【表１】
2009503109.tif 000003
【００４１】
興味深いことには、表１は、１０−４ＭのＦＤＭ（患者の血圧を下げるために、ＦＤＡ−認可された４８時間注入治療のために患者に注射された最初のＦＤＭ濃度）の１時間で癌細胞の全ての死滅を起こさせることを示す。（４８時間ＦＤＡ認可注入を受けている患者の循環においてＦＤＭの報告されたおよその定常状態濃度である）１０−８Ｍ（＝０．１ｎＭ）ＦＤＭの１０，０００低い濃度で、６２％のヒトＴ−白血病、３２％のヒトＳｅｚａｒｙ  Ｔ−リンパ腫、及び２５％のヒトＣＭＬ細胞の死を起こさせた。
【００４２】
上記した同じヒトＴ−白血病、Ｔ−リンパ腫及びＣＭＬ細胞ならびにヒトバーキットＢ細胞リンパ腫（Ｄａｕｄｉ）を用いての続いての実験において（合計１時間の間の１５分間隔の４回細胞にもう一度加えられた）幾つかの濃度でのＦＤＭが、細胞死／溶解の際に放出される安定な細胞質ゾル酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の増大した放出により明らかなように、ヒトＴ−細胞、Ｂ−細胞及びＣＭＬ癌の全ての４つのタイプの細胞を殺したことが示された（図２〜５）。
【００４３】
留意点として、増大したＬＤＨ放出を、ＦＤＭの添加の１時間後に直ちに測定した。ＦＤＭの明らかな死滅化効果にもかかわらず、この効果の投与量依存性は複雑であり、予期されてなく、そして各々の癌のタイプに対して異なっている（図２〜図５）。
【００４４】
例  ４：
活性化された正常なヒトＴ−細胞はまた、それらの細胞表面上に非常に高い水準のドパミンＤ１Ｒを発現する一方で、静止している正常ヒトＴ−細胞はそれを発現しない
ドパミンＤ１Ｒはまた、（抗−ＣＤ３及び抗−ＣＤ２８単クローン性抗体を用いて）インビトロで“古典的な”Ｔ−細胞受容体（ＴＣＲ）活性化を受けた正常な（即ち、非癌性の）周辺ヒトＴ−細胞において非常に高い水準で発現される一方で、“静止”（即ち活性化されていない）正常なヒトＴ−細胞は発現しない（２人の異なる健康なヒト個人から由来するＴ−細胞を表す図６及び図７）。そのようなＴＣＲ−活性化は、適当な抗原提供細胞（ＡＰＣ’ｓ）により提供される異質（ｆｏｒｅｉｇｎ）抗原に出会うＴ−細胞がＴＣＲを介して高度に活性化されるようになるインビボ状況を模倣するために通常用いられる。
【００４５】
例  ５：
フェノルドパムメシラートは、ＴＣＲ−活性化された正常なヒト周辺Ｔ−細胞の著しい死を誘発するが、しかし静止している正常なヒトＴ−細胞の死を誘発しない
ＴＣＲ−活性化正常なヒトＴ−細胞において本明細書にて見い出されるＤ１Ｒ発現の上昇した水準を有する線に沿って（図６及び図７）、１０−４Ｍ〜１０−１０ＭでのＦＤＭは、これらの活性化細胞の著しい死を起こした（図８）一方で、静止している正常なヒトＴ−細胞には殆ど影響せず（図９）；後者の静止している細胞は、事実、ここで試験された最も高いＦＤＭ濃度（１０−４Ｍ）によってのみ死んだ。
【００４６】
例  ６：
ヒト白血病及びリンパ腫に対するフェノルドパム臭化水素酸塩の効果
次ぎに、ＦＤＭに類似している化学構造を有するフェノルドパム臭化水素酸塩が、ヒト白血病及びリンパ腫を殺すその能力について試験した。表２〜４は、投与量及び時間依存性様式でフェノルドパム臭化水素酸塩が、ヒトＢ−細胞リンパ腫（表２）からの、Ｔ−細胞リンパ腫（表３）からの、及びＣＭＬ（表４）からのＬＤＨの放出を実質的に増大させることが事実本当であることを示す。表２は、ヒトＢ−細胞リンパ腫の最大死滅化が１０−８Ｍのフェルドパム臭化水素酸塩を用いて観察されたことを示す。
【００４７】
表３及び４は、効果の速度論を研究するために主として計画された実験の結果を示す（ここで、フェノルドパム臭化水素酸塩を１０−４Ｍ〜１０−６Ｍの範囲の濃度でのみ試験した）、そしてフェノルドパム臭化水素酸塩添加の１分後には、すでに増大したＬＤＨが存在することを示している。なお、死滅の程度は、時間（１０分、３０分及び６０分）と共に徐々に増大し、そして１時間後には、癌細胞が、はなはだしい細胞死を示す劇的な水準のＬＤＨを放出した。
【００４８】
【表２】
2009503109.tif 000004
【００４９】
【表３】
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【００５０】
【表４】
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【００５１】
例  ７：
リンパ腫及び白血病細胞に対する他の選択的ドパミンＤ１Ｒ作動薬の効果
３種の追加の高度に選択的なドパミンＤ１Ｒ作動薬が、ヒトリンパ腫及び白血病細胞を殺すことがまた示された。これらの高度に選択的なＤ１Ｒ作動薬は、“強力な、選択的Ｄ１−様作動薬、経口的に活性”として称せられる、Ａ７７６３６塩酸塩；“Ｄ１−様ドパミン受容体選択的部分的作動薬”として称せられるＳＫＦ３８３９３臭化水素酸塩；及び“強力且つ選択的なＤ１−様ドパミン受容体作動薬”として称せられるＡ６８９３０塩酸塩（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｃｏｏｋｓｏｎカタログ）を包含した。
【００５２】
これらの３種の高度に選択的なＤ１Ｒ作動薬は、投与量依存性様式で、実質的な数のヒトＴ−細胞白血病（図１０〜１２）、Ｔ−細胞リンパ腫（図１３〜１５）、２つのタイプのＢ−細胞リンパ腫（図１６〜１８（Ｄａｕｄｉ）、図１９〜２１（Ｒａｊｉ））及びＣＭＬ（図２２〜２４）を事実、殺した。それとは反対に、ともかく正常な（即ち、癌でない）ヒトＴ−細胞に対しては実質的に低い作用を有した（図２５〜２７）。全ての上記セットの実験（図１０〜２４）において、Ｄ１Ｒ作動薬の添加の３日後に生存している細胞の数により細胞死を評価した。興味深いことには、それら３種のＤ１Ｒ作動薬はそれらを殺す能力に関して異なっており、通常最も有効なのはＡ７７６３６塩酸塩である。さらに、一定のＤ１Ｒ作動薬により誘発される癌細胞死の程度は、癌のタイプによって癌の種類毎に変化した（図１０〜２４）。
【００５３】
選択的Ｄ１Ｒ作動薬により誘発される癌の死滅は、Ｄ１受容体に対して高度に特異的である。図２８は、ＬＤＨの放出においての〜３倍上昇により明らかであるように、Ｄ１Ｒ作動薬（この場合においてＡ７７６３６）への、ほんの１分間だけのヒトＢ細胞癌の曝露が細胞を殺すのに十分であることを示す。ＬＤＨへのいっそう長い曝露（１０分、３０分及び６０分）は、細胞死の程度においてさらに増加し、１時間で横ばい状態に達し、その結果、２時間Ｄ１Ｒ作動薬の添加は有意義にさらに有効であることはなかった。図２９は、Ｄ１Ｒ作動薬への１分間だけのＣＭＬの曝露（そして次ぎに細胞の洗浄、及び作動薬が存在しない媒体中への再懸濁）は、３日後、流動細胞光度測定法により計数された生存細胞の数から明らかであるように、細胞の〜４８％を殺すのに十分であったことを示す。Ｄ１Ｒ作動薬への１５分間のＣＭＬ細胞の曝露は、６０％の細胞を殺し、そしてＤ１Ｒ作動薬への１時間のＣＭＬ細胞の曝露は、７６％の細胞を殺した。Ｄ１Ｒ作動薬と共にのＣＭＬ細胞の非常に長いインキュベーション（７２時間）は、１時間の効果を超えての追加の価値が存在しなかった。図３０は、Ｔ−白血病細胞について、Ｄ１Ｒ作動薬と共にの１分間インキュベーションが、著しい細胞死を起こさせるために十分ではなかったことを示す。その効果は１５分後に有意義なものとなり、そして１時間インキュベーションの後に最大に到達し−細胞の９４％を殺す。さらにまた、Ｄ１Ｒ作動薬と共に７２時間インキュベーションは、それ以上の効果がなかった。
【００５４】
癌死滅化は選択的Ｄ１Ｒ作動薬によってのみ誘発されそしてＤ２Ｒ及びＤ３Ｒ作動薬によっては誘発されなく、効果がＤ１Ｒ受容体によってのみ特異的に媒介されたことを示す
ドパミンＤ１Ｒ作動薬によって誘発される効果の選択性を試験するために、ドパミンＤ２Ｒ−キンピロール（Ｑｕｉｎｐｉｒｏｌｅ）及びドパミンＤ３Ｒ−Ｒ７−ヒドロキシ−ＤＰＡＴについて高度に選択的な作動薬の効果を、平行して（即ち、同じ実験内で）試験した。（勿論そのＤ１Ｒ−５受容体の全てを活性化することができる）ドパミンそれ自体の効果をまた試験した。これらの分子の全てを同様な濃度（１０−４Ｍ）で試験した。表５及び６は、Ｄ１Ｒ作動薬（１時間）が実質的な数のヒトＢ−リンパ腫及びＣＭＬを殺したけれども、Ｄ２Ｒ及びＤ３Ｒ作動薬はそのような効果を有しなかったことを示す。Ｄ１Ｒに対する特異性及びその効果の制限はまた、表７及び８において見られる。これらの結果は、癌細胞の死滅化がドパミンＤ１Ｒにより特異的に媒介されたことを示す。興味深いことには、ドパミンそれ自体は、Ｂ−リンパ腫細胞を殺したが、しかしＣＭＬを殺さなかった（表５及び６）。
【００５５】
【表５】
2009503109.tif 000007
【００５６】
【表６】
2009503109.tif 000008
【００５７】
例  ８：
Ｄ１Ｒ作動薬と共にインキュベーションした後の細胞死のメカニズムの研究
選択的Ｄ１Ｒ作動薬により誘発される癌死は壊死を経て起こる。癌細胞が、Ｄ１Ｒ作動薬と共にのそれらのインキュベーションに起因して死ぬメカニズムを研究するために、ホスファチジルセリン検出キットを使用した。このキットは、流動細胞光度測定法による細胞消滅の検出のための迅速な且つ信頼できる方法を提供し、単一細胞水準での検出を可能にし、そしてまた細胞消滅と壊死との間の識別を可能にする。
【００５８】
細胞消滅の早期の段階の間に、ホスファチジルセリン（ＰＳ）は細胞膜の外側に曝されるようになる。この細胞消滅の早期段階を、ＰＳ結合たんぱく質（アネキシンＶ）により特異的に検出することができる。細胞消滅の早期の段階の間に、細胞膜はそのままの状態にあり、そして細胞は沃化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）（ＰＩ）を排除する。後に、細胞消滅の過程の間に該膜は多孔性になり、そしてＰＩはＤＮＡと会合するようになる。ＰＩの取り込みは壊死の表示である。したがって、アネキシンＶ＋ＰＩ−は細胞消滅を受けている細胞と考えられる一方で、アネキシンＶ＋ＰＩ＋は壊死を受けている細胞と考えられる。生存細胞はアネキシンＶ−ＰＩ−である。
【００５９】
表７及び８は、Ｄ１Ｒ（しかしＤ２Ｒ又はＤ３Ｒでない）作動薬に１時間曝されるＴ−白血病及びＴ−リンパ腫細胞が主として壊死のメカニズムを経て死ぬことを示す。事実、１時間後生存細胞の数においての著しい減少に平行して、アネキシンＶ＋ＰＩ＋壊死Ｔ−白血病細胞のパーセントが、６．３％から９０．４％に劇的に上昇した一方で、細胞消滅の細胞のパーセントは変化しなかった（表７）。
【００６０】
【表７】
2009503109.tif 000009
【００６１】
Ｓｅｚａｒｙ  Ｔ−リンパ腫に関して（表８）。Ｄ１Ｒ作動薬は壊死細胞の数において劇的な増加を起こしたが、しかしまた細胞消滅の細胞のパーセント％を２倍増加させた。
【００６２】
【表８】
2009503109.tif 000010
【００６３】
例  ９：
ＴＣＲ−活性化正常周辺ヒトＴ−細胞及び静止正常周辺ヒトＴ−細胞に対するフェノルドパム以外のＤ１Ｒ作動薬の効果
フェノルドパム以外のＤ１Ｒ作動薬はまた、静止している正常な周辺ヒトＴ−細胞よりも非常に多くのＴＣＲ−活性化正常周辺ヒトＴ−細胞を殺す。ＴＣＲ−活性化正常ヒトＴ−細胞において、ここで見い出されるＤ１Ｒ発現の上昇した水準（図６及び７）、そしてＦＤＭがこれらの活性化細胞の著しい死を起こさせる（図８）一方で、静止している正常なヒトＴ−細胞に対しては殆ど影響しない（図９）ことの発見との線に沿って他のＤ１Ｒ作動薬は同様な性質を示す（図３１）。したがって、例えば１０−５Ｍで用いられたＡ７７６３６の高度に選択的なドパミンＤ１Ｒ作動薬は、静止正常ヒトＴ−細胞の１２％、及びＴＣＲ−活性化正常ヒトＴ−細胞の４６％（即ち３．８培多い）を殺した（図３１）。
【００６４】
特定の態様の上記記載は、不当な実験を行うことなしに、そして一般的な概念から離れることなしに、他者が現在の知識を適用することによりそのような特定の態様を種々の適用のために容易に修正し、そして／又は適合させることができる、本発明の一般的な特質を非常に十分に明らかにするだろう。それ故、そのような適合化及び修正は、開示された態様の等価値の意味及び範囲内にあることが理解されるべきであり、そして理解されることが意図される。本明細書において使用されている用語又は術語は、記載の目的のためであって、限定のためではないことが理解されるべきである。種々の開示された機能を実施するための手段、材料及び工程は本発明から離れることなしに種々の別の形をとることができる。したがって機能的な記述の後に続く、上記明細書に及び／又は特許請求の範囲に見られるような、“．．．．．する手段”及び“．．．．．のための手段”又は任意の方法工程の言語は、明細書中に上に開示された１つの態様及び複数の態様に正確に等価値であろうと、そうでなかろうと、挙げられた機能を実施する現在又は将来において存在することができる、どんな構造的、物理的、化学的又は電気的要素又は構造であれ、又はどんな方法工程であれ、規定し且つカバーすることが意図され、即ち同じ機能を実施するための他の手段又は工程が使用されることができ、そしてそのような表現は、それらの最も広い解釈で与えられることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図面において、図１Ａ〜図１Ｆは、ドパミンＤ１受容体が、殆ど大部分のＴ−白血病及びＴ−リンパ腫細胞において発現されるが、しかし正常ヒトＴ−細胞においては殆ど発現されないことを立証する流動細胞光度測定法ＦＡＣＳｏｒｔ結果を示す。図１Ａ〜図１Ｃにおいて、新しく単離された正常ヒトＴ−細胞ならびにヒトＴ−白血病細胞系（Ｊｕｒｋａｔ）及びマウスＴ−リンパ腫細胞系（ＥＬ−４）を、ウサギ抗−ＤＲ１  ＩｇＧを用い次ぎにＦＩＴＣ−共役化抗−ウサギＩｇＧ（第２Ａｂ）及びＰＥ−共役化抗−ヒトＴＣＲαβ  ｍＡｂ（第３Ａｂ）（後者は全て試験された細胞のＴ−細胞起源を確認するため）を用いて二重免疫蛍光染色に付した。図１Ｄ〜図１Ｆにおいて、全て３つのタイプのＴ−細胞のアイソトープ・コントロール非特異的染色は、正常なウサギ血清及び同様な第２及び第３Ａｂ類を用いている。Ｔ−細胞タイプの各々の内のＴＣＲ＋Ｄ１Ｒ＋二重陽性細胞の実際のパーセンテージを、（各々上方図の窓枠で囲まれた）特異的染色から、（各々下方図での窓枠で囲まれた）非特異的染色を引き算することにより推定した：正常ヒトＴ−細胞：％ＴＣＲ＋Ｄ１Ｒ＋細胞＝１３．９−８．２１＝５．６９％；ヒトＴ−細胞白血病：％ＴＣＲ＋Ｄ１Ｒ＋細胞＝７４．８−１３．７＝６１．１％；マウスＴ−細胞リンパ腫：％ＴＣＲ＋Ｄ１Ｒ＋細胞＝７１−１３．２＝５７．８％。行われた４回からの代表的実験。
【図２】図２は、高度に選択的なドパミンＤ１Ｒ作動薬のフェノルドパムメシラート（ＦＤＭ）が、投与量依存性様式でヒトＴ−細胞白血病を殺すことを示すグラフである。ヒトＴ−細胞白血病（Ｊｕｒｋａｔ）を、９６ウェルのプレートに接種（２０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、そして１０−２Ｍ〜１０−１０Ｍの出発濃度でＦＤＭを加え、そして対応するウェル中に１：００に希釈し、その結果、試験された最終ＦＤＭ濃度範囲は１０−４Ｍ〜１０−１２Ｍであった。（各々の上記濃度での）ＦＤＭを、０、１５分、３０分及び４５分の時間で合計１時間の間に４回対応するマイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）ウェルに加えた。ＦＤＭのこれらの添加間にてマイクロタイタプレートを湿潤化インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２を有する）に置いた。ＦＤＭの最後の添加の１５分後、５０マイクロリットルの上澄み液を各々のウェルの上部部分から注意深く取り出し、細胞死／溶解の際に放出される安定な細胞質ゾル酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の、上記上澄み液への放出の程度を、製造者の取り扱い説明書に従って市販のキットを用い、そして（例１の）材料及び方法に記載されたようにして測定した。
【図３】図３は、フェノルドパムメシラート（ＦＤＭ）が、投与量依存様式でヒト皮膚Ｓｅｚａｒｙ  Ｔ−細胞リンパ種を殺すことを示すグラフである、ヒト皮膚Ｓｅｚａｒｙ  Ｔ−細胞リンパ腫細胞（ＨＵＴ−７８）を、９６ウェルのプレートに接種（２０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、そして１０−２Ｍ〜１０−１０Ｍの出発濃度でＦＤＭを加え、そして対応するウェルに１：００に希釈し、その結果、試験された最終ＦＤＭ濃度は１０−４Ｍ〜１０−１２Ｍであった。０、１５分、３０分及び４５分の時間での合計１時間の間に４回、対応するマイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）ウェルに（各々の上記濃度で）ＦＤＭを加えた。ＦＤＭのこれらの添加間にてマイクロタイタプレートの湿潤化インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２を有する）中に置いた。ＦＤＭの最後の添加の１５分後、各々のウェルの上部部分から５０マイクロリットルの上澄み液を注意深く取り出し、細胞死／溶解の際に放出される安定な細胞質ゾル酵素であるＬＤＨの、上記上澄み秋への放出の程度を製造者の取り扱い説明書に従って市販のキットを用い、そして（例１の）材料及び方法に記載されたようにして測定した。
【図４】図４は、ＦＤＭが投与量依存様式でヒト慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を殺すことを示すグラフである。ヒトＣＭＬ（Ｋ−５６２）細胞を９６ウェルのプレートに接種（２０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）しそして１０−２Ｍ〜１０−１０Ｍの出発濃度でＦＤＭを加え、そして対応するウェル中に１：００に希釈し、その結果、試験された最終ＦＤＭ濃度範囲は１０−４Ｍ〜１０−１２Ｍであった。（各々の上記濃度で）ＦＤＭを、０、１５分、３０分及び４５分の時間での合計１時間の間に４回、対応するマイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）ウエルに加えた。これらのＦＤＭの添加間にて、マイクロタイタプレートを湿潤化インキュベータ（３７℃、５％のＣＯ２を有する）中に置いた。ＦＤＭの最後の添加の１５分後、各々のウェルの上部部分から５０マイクロリットルの上澄み液を注意深く取り出し、細胞死／溶解の際に放出される安定な細胞質ゾル酵素であるＬＤＨの、上記上澄み液中への放出の程度を製造者の取り扱い説明書に従って市販のキットを用い、そして（例１の）材料及び方法に記載されたようにして測定した。
【図５】図５は、ＦＤＭが投与量依存性様式でヒトバーキットＢ−リンパ腫を殺すことを示すグラフである。ヒトバーキットＢ−リンパ腫細胞（Ｄａｕｄｉ）を、９６ウェルのプレートに接種（２０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、そして１０−２Ｍ〜１０−１０Ｍの出発濃度でＦＤＭを加え、そして対応するウェル中に１：００に希釈し、その結果試験された最終ＦＤＭ濃度範囲は１０−４Ｍ〜１０−１２であった。（各々の上記濃度で）ＦＤＭを、０、１５分、３０分及び４５分の時間での合計１時間の間に４回対応するマイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）ウェルに加えた。ＦＤＭのこれらの添加間にてマイクロタイタプレートを湿潤化インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２を有する）中に置いた。ＦＤＭの最後の添加の１５分後、各々のウェルの上部部分から５０マイクロリットルの上澄み液を注意深く取り出し、細胞死／溶解の際に放出される安定な細胞質ゾル酵素であるＬＤＨの、上記上澄み液中への放出の程度を製造者の取り扱い説明書に従って市販のキットを用い、そして（例１の）材料及び方法に記載されたようにして、測定した。
【図６】図６Ａ及び図６Ｂは、ドパミンＤ１受容体がヒトＴＣＲ−活性化周辺Ｔ−細胞上の殆ど大部分において発現される（図６Ｂ）が、しかし静止している正常周辺Ｔ−細胞においては発現されない（図６Ａ）ことを示すグラフである。任意の個人の“新しい”血液サンプルから精製された正常なヒトのＴ−細胞を、なんらさらに処理せず、そして湿潤化インキュベータ中の７２時間インキュベーションのためにそのままに放置するかあるいは（材料及び方法において記載されたように抗−ＣＤ３及び抗−ＣＤ２８単クローン性抗体を用いて）、インビトロで“古典的”Ｔ−細胞受容体（ＴＣＲ）活性化を受けさせる（図６Ｂ）のいずれかを行った。次に“静止している”Ｔ−細胞及びＴＣＲ−活性化Ｔ−細胞を、ウサギ抗−ＤＲ１  ＩｇＧを用い、次ぎにＦＩＴＣ−共役化抗−ウサギＩｇＧ（第２Ａｂ）を用いて単一免疫蛍光染色に付した（図６Ａ）。平行して、抗−Ｄ１Ｒ抗体の代わりに正常なウサギ血清を用いて非特異性コントロール染色に付した（図６Ａ及び図６Ｂにおいて別の線としてまた示される）。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、ドパミンＤ１受容体がヒトＴＣＲ−活性化周辺Ｔ−細胞の殆ど大部分において発現される（図７Ｂ）が、しかし静止している正常な周辺Ｔ−細胞において発現されない（図７Ａ）ことを示すグラフである。他の任意の個人の“新しい”血液サンプルから精製された正常なヒトＴ−細胞を、図６において記載されたようにして、処理し且つ厳密に試験した。
【図８】図８は、ＦＤＭが投与量依存性様式で、ヒトＴＣＲ−活性化Ｔ−細胞を殺すことを示すグラフである。一定の任意の個人のための“新しい”血液サンプルから精製された正常なヒトＴ−細胞を、そのままに放置するか又は（材料及び方法において記載されたようにして、抗−ＣＤ３及び抗−ＣＤ２８単クローン性抗体を用いて）インビトロで“古典的”Ｔ−細胞受容体（ＴＣＲ）活性化を受けさせるかのいずれかを行った。次ぎに、ＴＣＲ−活性化Ｔ−細胞及び静止している非処理細胞（図９に示される結果）の両方を、９６ウェルのプレートに接種（２０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、１０−２Ｍ〜１０−８Ｍの出発濃度でＦＤＭを加え、そして対応するウェル中に１：００に希釈し、その結果試験されたＦＤＭの最終濃度範囲は１０−４Ｍ〜１０−１０Ｍであった。０、１５分、３０分及び４５分の時間で合計１時間の間に４回対応するマイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）ウェルに（上記の濃度の各々で）ＦＤＭを加えた。ＦＤＭのこれらの添加間にて、マイクロタイタプレートを湿潤化インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２を有する）に置いた。ＦＤＭの最後の添加の１５分後、５０マイクロリットルの上澄み液を各々のウェルの上部部分から注意深く取り出し、そして細胞死／溶解の際に放出される安定な細胞質ゾル酵素であるＬＤＨの、上記上澄み液への放出の程度を、製造者の取り扱い説明書に従って市販のキットを用い、そして（例１の）材料及び方法に記載されたようにして測定した。
【図９】図９は、ＦＤＭが静止している正常なヒトＴ−細胞に対して非常穏やかな死滅効果を有することを示すグラフである。一定の任意の個人のための“新しい”血液サンプルから精製された正常なヒトＴ−細胞を、そのままに放置するか又は（材料及び方法において記載されたようにして、（抗−ＣＤ３及び抗−ＣＤ２８単クローン性抗体を用いて）インビトロで“古典的”Ｔ−細胞受容体（ＴＣＲ）活性化を受けさせるかのいずれかを行った。次ぎに、ＴＣＲ−活性化Ｔ−細胞（図８に示される結果）及び静止している非処理細胞の両方を、９６ウェルのプレートに接種（２０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、１０−２Ｍ〜１０−８Ｍの出発濃度でＦＤＭを加え、そして対応するウェル中に１：００に希釈し、その結果試験された最終ＦＤＭ濃度範囲は１０−４Ｍ〜１０−１０Ｍであった。０、１５分、３０分及び４５分の時間で合計１時間の間に４回、対応するマイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）ウェルに（上記濃度の各々で）ＦＤＭを加えた。ＦＤＭのこれらの添加間にて、マイクロタイタプレートを湿潤化インキュベータ（３７℃、５％のＣＯ２を有する）に置いた。ＦＤＭの最後の添加の１５分後、５０マイクロリットルの上澄み液を上記各々のウェルの上部部分から注意深く取り出し、そして細胞死／溶解の際に放出される安定な細胞質ゾル酵素であるＬＤＨの、上記上澄み液への放出の程度を、製造者の取り扱い説明書に従って市販のキットを用い、そして（例１の）材料及び方法に記載されたようにして測定した。
【図１０】図１０は、高度に選択的のドパミンＤ１Ｒ作動薬のＡ７７６３６塩酸塩が、投与量依存様式でヒトＴ−細胞白血病の著しい細胞死を誘発することを示すグラフである。ヒトＴ−細胞白血病（Ｊｕｒｋａｔ）細胞を、９６ウェルのプレートに接種（５０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、そしてＡ７７６３６塩酸塩を加え、そして１０−１Ｍ〜１０−４Ｍの出発濃度でウェル中に１：００に希釈し、その結果、試験された最終濃度範囲は１０−３Ｍ〜１０−６Ｍであった。後に、そのマイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートを３日間インキュベータ（３７℃、湿潤化インキュベータ、５％ＣＯ２）に置いた。次ぎに流動細胞光度測定法により生きている細胞の数を求めた（細胞を１分の固定した時間長さにわたってＦＡＣｓｏｒｔにより計数し、それらにおいて各々のサンプルの１００マイクロリットルを試験した）。留意点として、Ａ７７６３６塩酸塩は、製造者（Ｔｏｃｒｉｓ）に依れば、経口的に活性なＤ１Ｒ作動薬である。
【図１１】図１１は、高度に選択的のドパミンＤ１Ｒ作動薬のＡ６８９３０塩酸塩が、投与量依存性様式でヒトＴ−細胞白血病の著しい細胞死を誘発することを示すグラフである。ヒトＴ−細胞白血病（Ｊｕｒｋａｔ）細胞を、９６ウェルのプレートに接種（５０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、そしてＡ６８９３０塩酸塩を加え、そして１０−１Ｍ〜１０−４Ｍの出発濃度でウェル中に１：００に希釈し、その結果、試験された最終濃度範囲は１０−３Ｍ〜１０−６Ｍであった。後に、そのマイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートを３日間インキュベータ（３７℃、湿潤化インキュベータ、５％ＣＯ２）に置いた。次ぎに流動細胞光度測定法により生きている細胞の数を求めた（細胞を、１分の固定時間長さにわたってＦＡＣｓｏｒｔにより計数し、それらにおいて、各々のサンプルの１００マイクロリットルを試験した）。
【図１２】図１２は、高度に選択的のドパミンＤ１Ｒ作動薬のＳＫＦ３８３９３臭化水素酸塩が、投与量依存様式でヒトＴ−細胞白血病の著しい細胞死を誘発することを示すグラフである。ヒトＴ−細胞白血病（Ｊｕｒｋａｔ）細胞を、９６ウェルのプレートに接種（５０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、そしてＳＫＦ３８３９３臭化水素酸塩を加え、そして１０−１Ｍ〜１０−４Ｍの出発濃度でウェル中に１：００に希釈し、その結果、試験された最終濃度範囲は１０−３Ｍ〜１０−６Ｍであった。後に、そのマイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートを３日間インキュベータ（３７℃、湿潤化インキュベータ、５％ＣＯ２）に置いた。次ぎに流動細胞光度測定法により生きている細胞の数を求めた（細胞を、１分の固定時間長さにわたってＦＡＣｓｏｒｔにより計数し、それらにおいて各々のサンプルの１００マイクロリットルを試験した）。
【図１３】図１３は、Ａ７７６３６塩酸塩が、投与量依存性様式でヒト皮膚Ｓｅｚａｒｙ  Ｔ−リンパ腫の著しい細胞死を誘発することを示すグラフである。ヒト皮膚Ｓｅｚａｒｙ  Ｔ−リンパ腫細胞（ＨＵＴ−７８）を、９６ウェルのプレートに接種（５０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、そしてＡ７７６３６塩酸塩を加え、そして１０−１Ｍ〜１０−４Ｍの出発濃度でウェル中に１：００に希釈し、その結果、試験された最終濃度範囲は１０−３Ｍ〜１０−６Ｍであった。後に、マイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートを３日間インキュベータ（３７℃、湿潤化インキュベータ、５％ＣＯ２）に置いた。次ぎに流動細胞光度測定法により生きている細胞の数を求めた（細胞を、１分の固定時間長さにわたってＦＡＣｓｏｒｔにより計数し、それらにおいて各々のサンプルの１００マイクロリットルを試験した）。
【図１４】図１４は、Ａ６８９３０塩酸塩が、投与量依存性様式でヒト皮膚Ｓｅｚａｒｙ  Ｔ−リンパ腫の著しい細胞死を誘発することを示すグラフである。ヒト皮膚Ｓｅｚａｒｙ  Ｔ−リンパ腫細胞（ＨＵＴ−７８）を、９６ウェルのプレートに接種（５０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、そしてＡ６８９３０塩酸塩を加え、そして１０−１Ｍ〜１０−４Ｍの出発濃度でウェル中に１：００に希釈し、その結果、試験された最終濃度範囲は１０−３Ｍ〜１０−６Ｍであった。後に、マイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートを３日間インキュベータ（３７℃、湿潤化インキュベータ、５％ＣＯ２）に置いた。次ぎに流動細胞光度測定法により生きている細胞の数を求めた（細胞を、１分の固定時間長さにわたってＦＡＣｓｏｒｔにより計数し、それらにおいて各々のサンプルの１００マイクロリットルを試験した）。
【図１５】図１５は、ＳＫＦ３８３９３臭化水素酸塩が、投与量依存性様式でヒト皮膚Ｓｅｚａｒｙ  Ｔ−リンパ腫の著しい細胞死を誘発することを示すグラフである。ヒト皮膚Ｓｅｚａｒｙ  Ｔ−リンパ腫細胞（ＨＵＴ−７８）を、９６ウェルのプレートに接種（５０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、そしてＳＫＦ３８３９３臭化水素酸塩を加え、そして１０−１Ｍ〜１０−４Ｍの出発濃度でウェル中に１：００に希釈し、その結果、試験された最終濃度範囲は１０−３Ｍ〜１０−６Ｍであった。後に、マイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートを３日間インキュベータ（３７℃、湿潤化インキュベータ、５％ＣＯ２）に置いた。次ぎに流動細胞光度測定法により生きている細胞の数を求めた（細胞を、１分の固定時間長さにわたってＦＡＣｓｏｒｔにより計数し、それらにおいて各々のサンプルの、１００マイクロリットルを試験した）。
【図１６】図１６は、Ａ７７６３６塩酸塩が、投与量依存性様式でヒトバーキットＢ−リンパ腫の著しい細胞死を誘発することを示すグラフである。ヒトバーキットＢ−リンパ腫細胞（Ｄａｕｄｉ）を、９６ウェルのプレートに接種（５０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、そしてＡ７７６３６塩酸塩を加え、そして１０−１Ｍ〜１０−４Ｍの出発濃度でウェル中に１：００に希釈し、その結果、試験された最終濃度範囲は１０−３Ｍ〜１０−６Ｍであった。後に、マイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートを３日間インキュベータ（３７℃、湿潤化インキュベータ、５％ＣＯ２）に置いた。次ぎに流動細胞光度測定法により生きている細胞の数を求めた（細胞を、１分の固定時間長さにわたってＦＡＣｓｏｒｔにより計数し、それらにおいて各々のサンプルの１００マイクロリットルを試験した）。
【図１７】図１７は、Ａ６８９３０塩酸塩が、投与量依存性様式でヒトバーキットＢ−リンパ腫の著しい細胞死を誘発することを示すグラフである。ヒトバーキットＢ−リンパ腫細胞（Ｄａｕｄｉ）を、９６ウェルのプレートに接種（５０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、そしてＡ６８９３０塩酸塩を加え、そして１０−１Ｍ〜１０−４Ｍの出発濃度でウェル中に１：００に希釈し、その結果、試験された最終濃度範囲は１０−３Ｍ〜１０−６Ｍであった。後に、マイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートを３日間インキュベータ（３７℃、湿潤化インキュベータ、５％ＣＯ２）に置いた。次ぎに流動細胞光度測定法により生きている細胞の数を求めた（細胞を、１分の固定時間長さにわたってＦＡＣｓｏｒｔにより計数し、それらにおいて各々のサンプルの１００マイクロリットルを試験した）。
【図１８】図１８は、ＳＫＦ３８３９３臭化水素酸塩が、投与量依存性様式でヒトバーキットＢ−リンパ腫の著しい細胞死を誘発することを示すグラフである。ヒトバーキットＢ−リンパ腫細胞（Ｄａｕｄｉ）を、９６ウェルのプレートに接種（５０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、そしてＳＫＦ３８３９３臭化水素酸塩を加え、そして１０−１Ｍ〜１０−４Ｍの出発濃度でウェル中に１：００に希釈し、その結果、試験された最終濃度範囲は１０−３Ｍ〜１０−６Ｍであった。後に、マイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートを３日間インキュベータ（３７℃、湿潤化インキュベータ、５％ＣＯ２）に置いた。次ぎに流動細胞光度測定法により生きている細胞の数を求めた（細胞を、１分の固定時間長さにわたってＦＡＣｓｏｒｔにより計数し、それらにおいて各々のサンプルの１００マイクロリットルを試験した）。
【図１９】図１９は、Ａ７７６３６塩酸塩が、投与量依存性様式でヒトバーキットＢ−リンパ腫の著しい細胞死を誘発することを示すグラフである。ヒトバーキットＢ−細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）細胞を、９６ウェルのプレートに接種（５０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、そしてＡ７７６３６塩酸塩を加えそして１０−１Ｍ〜１０−４Ｍの出発濃度でウェル中に１：００に希釈し、その結果、試験された最終濃度範囲は１０−３Ｍ〜１０−６Ｍであった。後にマイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートを３日間インキュベータ（３７℃、湿潤化インキュベータ、５％ＣＯ２）に置いた。次ぎに流動細胞光度測定法により生きている細胞の数を求めた（細胞を、１分の固定時間長さにわたってＦＡＣｓｏｒｔにより計数し、それらにおいて各々のサンプルの１００マイクロリットルを試験した）。
【図２０】図２０は、Ａ６８９３０塩酸塩が、投与量依存性様式でヒトバーキットＢ−リンパ腫の著しい細胞死を誘発することを示すグラフである。ヒトバーキットＢ−細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）細胞を、９６ウェルのプレートに接種（５０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、そしてＡ６８９３０塩酸塩を加えそして１０−１Ｍ〜１０−４Ｍの出発濃度でウェル中に１：００に希釈し、その結果、試験された最終濃度範囲は１０−３Ｍ〜１０−６Ｍであった。後にマイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートを３日間インキュベータ（３７℃、湿潤化インキュベータ、５％ＣＯ２）に置いた。次ぎに流動細胞光度測定法により生きている細胞の数を求めた（細胞を、１分の固定時間長さにわたってＦＡＣｓｏｒｔにより計数し、それらにおいて各々のサンプルの１００マイクロリットルを試験した）。
【図２１】図２１は、ＳＫＦ３８３９３臭化水素酸塩が、投与量依存性様式でヒトバーキットＢ−リンパ腫の著しい細胞死を誘発することを示すグラフである。ヒトバーキットＢ−細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）細胞を９６ウェルのプレートに接種（５０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、そしてＳＫＦ３８３９３臭化水素酸塩を加え、そして１０−１Ｍ〜１０−４Ｍの出発濃度でウェル中に１：００に希釈し、その結果、試験された最終濃度範囲は１０−３Ｍ〜１０−６Ｍであった。後にマイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートを３日間インキュベータ（３７℃、湿潤化インキュベータ、５％ＣＯ２）に置いた。次ぎに流動細胞光度測定法により生きている細胞の数を求めた（細胞を、１分の固定時間長さにわたってＦＡＣｓｏｒｔにより計数し、それらにおいて各々のサンプルの１００マイクロリットルを試験した）。
【図２２】図２２は、Ａ７７６３６塩酸塩が、投与量依存性様式で慢性骨髄性白血病の著しい細胞死を誘発することを示すグラフである。ヒト慢性骨髄性白血病細胞（ＣＭＬ）（Ｋ−５６２）を、９６ウェルのプレートに接種し（５０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）そしてＡ７７６３６塩酸塩を加えそして１０−１Ｍ〜１０−４Ｍの出発濃度でウェル中に１：００に希釈し、その結果試験された最終濃度範囲は１０−３Ｍ〜１０−６Ｍであった。後にマイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートを３日間インキュベータ（３７℃、湿潤化インキュベータ、５％ＣＯ２）に置いた。次ぎに流動細胞光度測定法により生きている細胞の数を求めた（細胞を、１分の固定時間長さにわたってＦＡＣｓｏｒｔにより計数し、それらにおいて各々のサンプルの１００マイクロリットルを試験した）。
【図２３】図２３は、Ａ６８９３０塩酸塩が、投与量依存性様式で慢性骨髄性白血病の著しい細胞死を誘発することを示すグラフである。ヒト慢性骨髄性白血病細胞（ＣＭＬ）（Ｋ−５６２）を、９６ウェルのプレートに接種（５０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、そしてＡ６８９３０塩酸塩を加え、そして１０−１Ｍ〜１０−４Ｍの出発濃度でウェル中に１：００に希釈し、その結果試験された最終濃度範囲は１０−３Ｍ〜１０−６Ｍであった。後にマイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートを３日間インキュベータ（３７℃、湿潤化インキュベータ、５％ＣＯ２）に置いた。次ぎに流動細胞光度測定法により生きている細胞の数を求めた（細胞を、１分の固定時間長さにわたってＦＡＣｓｏｒｔにより計数し、それらにおいて各々のサンプルの１００マイクロリットルを試験した）。
【図２４】図２４は、ＳＫＦ３８３９３臭化水素酸塩が、投与量依存性様式で慢性骨髄性白血病の著しい細胞死を誘発することを示すグラフである。ヒト慢性骨髄性白血病細胞（ＣＭＬ）（Ｋ−５６２）を、９６ウェルのプレートに接種（５０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、そしてＳＫＦ３８３９３臭化水素酸塩を加え、そして１０−１Ｍ〜１０−４Ｍの出発濃度でウェル中に１：００に希釈し、その結果、試験された最終濃度範囲は１０−３Ｍ〜１０−６Ｍであった。後にマイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートを３日間インキュベータ（３７℃、湿潤化インキュベータ、５％ＣＯ２）に置いた。次ぎに流動細胞光度測定法により生きている細胞の数を求めた（細胞を、１分の固定時間長さにわたってＦＡＣｓｏｒｔにより計数し、それらにおいて各々のサンプルの１００マイクロリットルを試験した）。
【図２５】図２５は、Ａ７７６３６塩酸塩が、静止している正常なヒトのＴ−細胞に対して非常に穏やかな死滅化効果を有することを示すグラフである。他の任意の個人の“新しい”血液サンプルから精製した正常なヒトＴ−細胞を、９６ウェルのプレートに接種（５０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、そしてＡ７７６３６塩酸塩を加え、そして１０−１Ｍ〜１０−４Ｍの出発濃度でウェル中に１：００に希釈し、その結果、試験された最終濃度範囲は１０−３Ｍ〜１０−６Ｍであった。後に、そのマイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートを３日間インキュベータ（３７℃、湿潤化インキュベータ、５％ＣＯ２）に置いた。次ぎに流動細胞光度測定法により生きている細胞の数を求めた（細胞を１分の固定時間長さにわたってＦＡＣｓｏｒｔにより計数し、それらにおいて各々のサンプルの１００マイクロリットルを試験した）。
【図２６】図２６は、Ａ６８９３０塩酸塩が、静止している正常なヒトのＴ−細胞に対して非常に穏やかな死滅化効果を有することを示す。他の任意の個人の“新しい”血液サンプルから精製した正常なヒトＴ−細胞を、９６ウェルのプレートに接種（５０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、そしてＡ６８９３０塩酸塩を加え、そして１０−１Ｍ〜１０−４Ｍの出発濃度でウェル中に１：００に希釈し、その結果、試験された最終濃度範囲は１０−３Ｍ〜１０−６Ｍであった。後に、そのマイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートを３日間インキュベータ（３７℃、湿潤化インキュベータ、５％ＣＯ２）に置いた。次ぎに流動細胞光度測定法により生きている細胞の数を求めた（細胞を、１分の固定時間長さにわたってＦＡＣｓｏｒｔにより計数し、それらにおいて各々のサンプルの１００マイクロリットルを試験した）。
【図２７】図２７は、ＳＫＦ３８３９３臭化水素酸塩が、静止している正常なヒトのＴ−細胞に対して非常に穏やかな死滅化効果を有することを示す。他の任意な個人の“新しい”血液サンプルから精製した正常なヒトＴ−細胞を、９６ウェルのプレートに接種（５０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、そしてＳＫＦ３８３９３臭化水素酸塩を加え、そして１０−１Ｍ〜１０−４Ｍの出発濃度でウェル中に１：００に希釈し、その結果、試験された最終濃度範囲は１０−３Ｍ〜１０−６Ｍであった。後に、そのマイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートを３日間インキュベータ（３７℃、湿潤化インキュベータ、５％ＣＯ２）に置いた。次ぎに流動細胞光度測定法により生きている細胞の数を求めた（細胞を、１分の固定時間長さにわたってＦＡＣｓｏｒｔにより計数し、それらにおいて各々のサンプルの１００マイクロリットルを試験した）。
【図２８】図２８は、Ａ７７６３６塩酸塩が、ヒトバーキットＢ−リンパ腫の非常に迅速な死を起こさせることを示す。ヒトバーキットＢ−リンパ腫細胞（Ｒａｊｉ）を、９６ウェルのプレートに接種（５０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、Ａ７７６３６塩酸塩を加え、そして１０−２Ｍの固定した出発濃度でウェル中に１：００に希釈し、その結果、試験された最終濃度は１０−４であった。次ぎに１分、１０分、３０分、６０分又は１２０分インキュベーションのために細胞をインキュベータ（３７℃、湿潤化インキュベータ、５％ＣＯ２）に移した。次ぎに各々のウェルの上部分から５０マイクロリットルの上澄み液を注意深く取り出し、そして細胞死／溶解の際に放出される安定な細胞質ゾル酵素であるＬＤＨの、前記上澄み液への放出の程度を、製造者の取り扱い説明書に従って市販のキットを用いて（例１の）材料及び方法に記載されたようにして測定した。
【図２９】図２９は、Ａ７７６３６塩酸塩が、ヒト慢性骨髄性白血病の非常に迅速な死を起こさせることを示すグラフである。ヒト慢性骨髄性白血病細胞（ＣＭＬ）（Ｋ−５６２）を、９６ウェルのプレートに接種（５０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、Ａ７７６３６塩酸塩を加え、そして１０−２Ｍの固定した出発濃度でウェル中に１：００に希釈し、その結果、試験された最終濃度は１０−４Ｍであった。その実験は、１分、１５分、１時間又は７２時間、Ｄ１Ｒ作動薬に細胞を曝露することの効果を試験するために計画された。かくして、Ｄ１Ｒ作動薬の添加の１分後又は１５分後又は１時間後に、対応する細胞を試験管に移し、遠心分離し（１０分間１０００ｒｐｍ）、そして上澄み液を取り出した。次ぎにそれらの細胞を新しい媒体（即ちＤ１Ｒ作動薬を含有しない媒体）中に再懸濁し、新しい清浄なマイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）ウェルに接種し、そして追加の３日間インキュベータに戻した。７２時間サンプルは、Ｄ１Ｒ作動薬の添加後そのような遠心分離を受けなかった。したがってその媒体は置き換えられなく、そしてこれらの細胞は７２時間インキュベータ中にそのままの状態におかれた。７２時間インキュベーションの終わりに生きている細胞の数を、流動細胞光度測定法により求めた（細胞を、１分の固定した時間長さにわたってＦＡＣｓｏｒｔにより計数し、それらにおいて各々のサンプルの１００マイクロリットルを試験した）。
【図３０】図３０は、Ａ７７６３６塩酸塩が、ヒトＴ−細胞白血病の非常に迅速な死を起こさせることを示す。ヒトＴ−白血病（Ｊｕｒｋａｔ）細胞を、９６ウェルのプレートに接種（５０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）し、Ａ７７６３６塩酸塩を加え、そして１０−２Ｍの固定した出発濃度でウェル中に１：００に希釈し、その結果、試験された最終濃度は１０−４Ｍであった。その実験は、１分、１５分、１時間又は７２時間、Ｄ１Ｒ作動薬に細胞を曝露することの効果を試験するために計画された。かくして、Ｄ１Ｒ作動薬の添加の、１分後又は１５分後又は１時間後に、対応する細胞を試験管に移し、遠心分離し（１０分間１０００ｒｐｍ）、そして上澄み液を取り出した。次ぎにそれらの細胞を新しい媒体（即ちＤ１Ｒ作動薬を含有しない媒体）中に再懸濁し、新しい清浄なマイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）ウェルに接種し、そして追加の３日間インキュベータに戻した。７２時間サンプルは、Ｄ１Ｒ作動薬の添加後そのような遠心分離を受けなかった。したがって、その媒体は置き換えられなく、そしてこれらの細胞は７２時間インキュベータ中にそのままの状態におかれた。７２時間インキュベーションの終わりに生きている細胞の数を、流動細胞光度測定法により求めた（細胞を、１分の固定した時間長さにわたってＦＡＣｓｏｒｔにより計数し、それらにおいて各々のサンプルの１００マイクロリットルを試験した）。
【図３１】図３１Ａ及び図３１Ｂは、Ａ７７６３６塩酸塩が静止している正常な（図３１Ａ）ヒトＴ−細胞よりも非常に多くのＴＣＲ−活性化（図３１Ｂ）ヒトＴ−細胞を殺すことを示すグラフである。一定の任意の個人の“新しい”血液サンプルから精製された正常なヒトＴ−細胞を、そのままに放置するか、又は（材料及び方法に記載されたようにして抗−ＣＤ３又は抗−ＣＤ２８単クローン性抗体を用いて）インビトロで、“古典的”Ｔ−細胞受容体（ＴＣＲ）活性化を受けさせるかのいずれかを行った。次ぎに、ＴＣＲ−活性化Ｔ−細胞（図３１Ｂ）及び静止している非処理細胞（図３１Ａ）の両方を、９６ウェルのプレートに接種し（２０万細胞／ｍｌの０．５ｍｌ／ウェル）、そして高度に選択的なドパミンＤ１Ｒ作動薬であるＡ７７６３６塩酸塩を１０−５Ｍの最終濃度で加えた。次ぎに、細胞を７２時間インキュベーションのためにインキュベータに移した。７２時間インキュベーションの終わりに、各々のウェル中の生きている細胞の数を、流動細胞光度法により求めた（１分の固定した時間長さにわたって細胞をＦＡＣｓｏｒｔにより計数し、それらにおいて各々のサンプルの１００マイクロリットルを試験した）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【国際調査報告】
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