(57)【要約】  本発明は、１分子当り少なくとも２つのシラノール基を含むシラノール種と、１分子当り少なくとも２つのヒドロキシル基を含む親水性のヒドロキシル種とを混合することを含むゲルの製造方法に関する。ゲルは、機械的せん断力を加えることによって液体に転化されることができ、そして液体は、該機械的せん断力がない場合に、ゲルに転化されることができる。
2009535479.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１分子当り少なくとも２つのシラノール基を含むシラノール種と、１分子当り少なくとも２つのヒドロキシル基を含む親水性のヒドロキシル種とを混合することを含んで成るゲルの製造方法。
【請求項２】
１分子当り少なくとも２つの加水分解性基を有するシランを加水分解して、該シラノール種を生成させるステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】
該シランは、テトラアルコキシシランを含む、請求項２の方法。
【請求項４】
該シラノール種と該ヒドロキシル種とを混合するステップの前に、該親水性のヒドロキシル種と、微粒子改質剤とを混合するステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
該微粒子改質剤が、フュームドシリカを含む、請求項４に記載のいずれか１つの方法。
【請求項６】
混合ステップ後で、ｐＨを約６〜約９に調整することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
該ヒドロキシル種が、１分子当たり３〜１０のヒドロキシル基を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
それぞれの分子中の該ヒドロキシル基の少なくとも２つが、該分子の末端基である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
該ヒドロキシル種が、分枝鎖種である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
該ヒドロキシル種が、ポリエーテル鎖を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法によって製造されたゲル。
【請求項１２】
機械的せん断力を加えることによって、ゲルが液体に転化されることができ、そして該機械的せん断力がない場合に、液体が該ゲルに転化されることができる、可逆的に会合できる会合性基を含む親水性鎖を含んで成る細胞を培養するためのゲル。
【請求項１３】
微粒子改質剤をさらに含む、請求項１２のゲル。
【請求項１４】
該微粒子改質剤が、フュームドシリカを含む、請求項１３のゲル。
【請求項１５】
該会合性基が、末端基である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のゲル。
【請求項１６】
該会合性基が、１分子当たり少なくとも２つの加水分解性基を含むシランから誘導されている、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のゲル。
【請求項１７】
該会合性基が、シラノール基を含む、請求項１６のゲル。
【請求項１８】
該シランが、テトラアルコキシシランである、請求項１６または請求項１７のゲル。
【請求項１９】
該親水性鎖が、ポリエーテル鎖である、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載のゲル。
【請求項２０】
該親水性鎖が、分枝鎖である、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載のゲル。
【請求項２１】
水をさらに含む、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載のゲル。
【請求項２２】
該ゲルが細胞および／またはＥＣＭを含む、請求項１１〜２１のいずれか一項に記載のゲル。
【請求項２３】
細胞を培養するための請求項１１〜２２のいずれか一項に記載のゲルの使用。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のゲルから細胞を放出させる方法であって、
該ゲルが該細胞を含み、そして、該方法が、
−該ゲルと液体とを混合すること、および、
−該液体中で該細胞の懸濁液を生成させるのに、充分な機械的せん断を該混合された液体およびゲルに加えること、
を含む、方法。
【請求項２５】
該液体が、水性液体である、請求項２４の方法。
【請求項２６】
該混合された液体およびゲル中の液体の比率が、約２５％ｖ/ｖ超である、請求項２４または請求項２５の方法。
【請求項２７】
請求項１１〜２２のいずれか一項に記載のゲルを用意すること；
−該ゲルを液体に転化させるのに充分な機械的せん断を、該ゲルに加えること；
−該液体と該物質とを混合すること；および
−該液体がゲルに戻るのに充分な時間の間、液体を液体として維持するのに不充分な機械的せん断と共に放置させること、
を含んで成る、物質をゲルに取り込む方法。
【請求項２８】
該物質が、細胞および／またはＥＣＭおよび／またはタンパク質および／または生物学的機能を有する他の分子を含む、請求項２７の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機械的可逆性ゲルおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類細胞の培養方法が１９５０年代に標準の作業手順になった時、細胞生物学者は、細胞が２次元で増殖するであろうペトリ皿の表面上で細胞の培養を始めた。平面上で成長する細胞は、光学顕微鏡の単一の固定焦点で容易に観察できたであろう。組織培地の形態の栄養源は、細胞と媒体との間の直接接触で補給され、そして物質移動の制限はない。細胞は、好都合なことに、元の表面からの細胞をトリプシン処理することによって、下の表面を損なうことなく、他のウェルまたはディッシュに再度植え付けでき、または継代培養できる。実際、２次元の（２−Ｄ）培養の磨かれた実施は、生物学および薬学における重要な発見に貢献してきた。
【０００３】
しかし、事実誤認でなければ、生体内細胞の真の環境を表すためには、２次元の細胞培養が過度に簡素化されていることが明らかになっている。腸上皮細胞を除いて、ほとんどの哺乳類の細胞は、生体内で３次元の物質または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に埋め込まれて存在する。例えば、３次元における細胞骨格要素の分布は、２次元における分布と大きく異なる。２次元で培養された線維芽細胞は、プレートと接触する細胞の表面上で、高濃度の張繊維を示すが、一方、３次元ではこれらの張繊維はない。生体力学的信号と連動して細胞の運命が機能するように導く生化学的信号という事実を考慮すると、生化学的刺激（例えば、サイトカイン/薬物）に対する細胞のさらに'自然な'応答が、３次元において観察されるであろうと推定できる。３次元培養における細胞接着、移動および表現型が２次元の細胞培養とかなり異なることが示されてきた。Ｃｕｋｉｅｒｍａｎらはまた、３次元培養における細胞に独特な細胞接着の様式を明らかにした（Ｅ．Ｃｕｋｉｅｒｍａｎ、Ｒ．Ｐａｎｋｏｖ、Ｄ．Ｒ．Ｓｔｅｖｅｎｓ、Ｋ．Ｍ．Ｙａｍａｄａ、Ｔａｋｉｎｇ  ｃｅｌｌ−ｍａｔｒｉｘ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９４（２００１）、  １７０８〜１７１２）。これに関連して、３次元の細胞および組織培養のために特別に設計された系へのニーズがある。
【０００４】
既存の３次元細胞培養系は、光架橋可能なアクリレート系ポリマー、自己組織化ペプチド、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）分解性系に主に基づく。新規な系がこの分野における熱意ある興味を反映して開発され続けてきた。しかし、これらの系は、いずれも可逆性ゲル化の特性を有さない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
３次元の細胞培養のためにゲルを生成させる既存の技術は、ゲルの架橋のために、化学的架橋剤、光開始剤、紫外線またはイオン強度の変化の使用による。反応はゲル内の細胞およびタンパク質に有害である場合があるので、化学反応に基づくゲル化は注意して行うことが好ましい。普通に使用されるタンパク質系ゲル（例えば、マトリゲルおよびコラーゲンタイプＩ）の大部分は、ゲル化を引き起こすために、温度の変化による。これは、ゲル前駆体を低温で貯蔵する不都合、および（温度変化に曝される細胞培養容器および容積によって）ゲルの設定時間における一貫性のなさを伴う。
したがって、簡便かつ堅牢な手段によって可逆的に生成可能であるゲルへのニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の目的は、上記の不利益の１つまたは２つ以上を実質的に打開するかまたは少なくとも良好にすることである。
【０００７】
本発明の第１の形態において、１分子当たり少なくとも２つのシラノール基を含むシラノール種と、１分子当たり少なくとも２つのヒドロキシル基を含む親水性のヒドロキシル種とを混合することを含む、ゲルを製造するための方法が提供される。
【０００８】
この方法は、
−シランを加水分解して、シラノール種を生成させること、
（該シランは、１分子当たり少なくとも２つの加水分解性基を有する。）、および
−混合ステップ後に、ｐＨを約６〜約９に調整すること、
のステップの１つまたは両方をさらに含む。
さらにこの方法は、シラノール種とヒドロキシル種とを混合するステップの前に、親水性のヒドロキシル種と、微粒子改質剤とを混合することを含むことができる。微粒子改質剤は、シリカ、例えば、フュームドシリカを含むことができる。フュームドシリカは、表面修飾されていることができる。例えば、アミン基、ペプチド基またはいくつかの他のタイプの基またはそれらの混合物を導入するために、表面修飾されてもよい。
【０００９】
本発明の態様において、
−１分子当り少なくとも２つのシラノール基を含むシラノール種と、１分子当り少なくとも２つのヒドロキシル基を含む親水性のヒドロキシル種とを混合すること；ならびに、
−ｐＨを約６〜約９に調整すること、
を含む、ゲルの製造方法が提供される。
【００１０】
別の態様では、この方法は、
−シランを加水分解して、シラノール種を生成させること、（該シランは、１分子当り少なくとも２つの加水分解性基を有する。）；
−シラノール種と、１分子当り少なくとも２つのヒドロキシル基を含む親水性のヒドロキシル種とを混合すること；および
−ｐＨを約６〜約９に調整すること、
を含む。
別の態様では、この方法は、
−シランを加水分解して、シラノール種を生成させること、
（該シランは、１分子当り少なくとも２つの加水分解性基を有する。）；
−１分子当り少なくとも２つのヒドロキシル基を含む親水性のヒドロキシル種と、微粒子改質剤とを混合すること；
−シラノール種と、混合された親水性ヒドロキシル種および微粒子改質剤とを混合すること；ならびに、
−ｐＨを約６〜約９に調整すること、
を含む。
【００１１】
別の態様では、この方法は、
−シランを加水分解して、シラノール種を生成させること、
（該シランは、１分子当り少なくとも２つの加水分解性基を有する。）；
−１分子当り少なくとも２つのヒドロキシル基を含む親水性のヒドロキシル種と、フュームドシリカとを混合すること；
−シラノール種と、混合された親水性のヒドロキシル種およびフュームドシリカとを混合すること；ならびに、
−ｐＨを約６〜約９に調整すること
を含む。
【００１２】
シランは、１分子当たり２〜１０個の加水分解性基を有することができる。シランは、ゾルゲルの前駆体であることができる。加水分解性基は、アルコキシルシリル基であることができる。シランは、例えば、テトラアルコキシシランを含むことができる。シラノール種は、モノマー種であることができる。この場合、シラノール種は、１分子当たり２〜４個のシラノール基を有することができる。シラノール種は、オリゴマー種またはポリマー種であることができる。この場合、シラノール種は、１分子当たり少なくとも３個のシラノール基を有することができるが、重合度によって、１分子当たりさらに多く（例えば、約３〜１００、または３〜１０００以上までも）のシラノール基を有することができる。
【００１３】
ヒドロキシル種は、１分子当たり３〜１０個のヒドロキシル基を含むことができる。ヒドロキシル種は、親水性鎖を含むことができる。それは、長鎖の親水性ヒドロキシル種であることができる。鎖は、少なくとも約１０原子長、または少なくとも約２０、５０または１００原子長、または約１０〜約１０００原子長であることができる。ヒドロキシル種のそれぞれの分子において、ヒドロキシル基の少なくとも２つは、分子の末端基であることができる。ヒドロキシル種は、分枝鎖の種であることができる。それぞれの分枝鎖は、ヒドロキシル末端基を有することができ、またはいくつかの分枝鎖は、ヒドロキシル末端基を有することができ、そしていくつかは、ヒドロキシル末端基を有さないことができる。ヒドロキシル種は、ポリエーテル鎖、例えば、分枝ポリエーテル鎖を含むことができる。
【００１４】
本発明はまた、第１の形態の方法によって製造されたゲルを提供する。
第１の形態の方法の生成物は、細胞を培養するのに好適であるゲルであることができる。ゲルは、可逆的に会合できる会合性基を含む親水性鎖を含むことができ、それによって、ゲルは、機械的せん断力を加えることによって液体に転化可能であり、そして液体は、該機械的せん断力がない場合にはゲルに転化可能である。会合性基は、ＯＨ基を含むことができ、またはＯＨ基であることができる。
【００１５】
本発明の第２の形態において、細胞を培養するためのゲルが提供され、該ゲルは可逆的に会合できる会合性基を含む親水性鎖を含み、それによってゲルは機械的せん断力を加えることによって液体に転化でき、そしてこの機械的せん断力がない場合に、液体はゲルに転化できる。
【００１６】
会合性基は、末端基であることができる。会合性基のいくつかは、末端基であることができ、そしていくつかは末端基でないことができる。会合性基は、１種または２種以上の水素結合可能な基、例えば、ＯＨ、ＮＨ、ＳＨ等を含むことができる。会合性基は、１分子当たり少なくとも２つの加水分解性基を含むシランから誘導されることができる。少なくともいくつか、任意選択的に全ての加水分解性基の加水分解によって、シランから誘導できる。少なくともいくつか、任意選択的に全ての会合性基は、ＯＨ基を含むことができ、またはＯＨ基であることができる。少なくともいくつか、任意選択的に全ての会合性基は、シラノール基を含むことができ、またはシラノール基であることができる。会合性基のいくつかは、シラノール基であることができ、そしていくつかは、ヒドロキシル基であることができる。会合性基のいくつかは、他の水素結合性基、例えば、アミン、チオール等であることができる。
【００１７】
シランは、１分子当たり２〜１０個の加水分解性基を有することができる。加水分解性基は、アルコキシルシリル基であることができる。シランは、例えば、テトラアルコキシシランを含むことができる。
親水性鎖は、ポリエーテル鎖であることができる。親水性鎖は、分枝鎖であることができる。親水性鎖は、分枝したポリエーテル鎖であることができる。
ゲルは、水をさらに含むことができる。ゲルは、細胞および／またはＥＣＭを含むことができる。
【００１８】
本発明の第３の形態において、細胞を培養するために、本発明の第２の形態による、または本発明の第１の形態によって製造された、ゲルの使用が提供される。
本発明の第４の形態において、本発明の第２の形態による、または本発明の第１の形態によって製造されたゲルから細胞を放出させる方法が提供され、該ゲルは細胞を含み、そして該方法は、
−ゲルと液体とを混合すること、および
−液体中に細胞の懸濁液を生成させるのに充分な機械的せん断を、混合された液体およびゲルに加えること、
を含む。
【００１９】
混合された液体およびゲル中の液体の比率は、約２５％ｖ/ｖ超、または約５０％ｖ/ｖ超であることができる。液体は、水性液体であることができる。液体は、水であることができる。液体は、細胞のための培地であることができる。液体中の細胞の懸濁液はまた、ゲルの粒子を含むことができる。この方法は、液体からゲルの粒子を除去するステップをさらに含むことができる。このステップは、懸濁液を濾すことまたはろ過することを含むことができる。この方法は、液体からゲルの粒子を分離させるために、例えば、１００μｍのセルストレイナーを通して、懸濁液を濾すことを含む。
【００２０】
本発明の第５の形態において、
−本発明の第２の形態による、または本発明の第１の形態によって製造されたゲルを提供すること；
−ゲルを液体に転化させるのに充分な機械的せん断を、該ゲルに加えること；
−液体と物質とを混合すること；および、
−該液体がゲルに戻るのに充分な時間の間、液体を液体として維持するのに不充分な機械的せん断と共に放置させること、
を含む物質をゲルに取り込むための方法が提供される。
この物質は、細胞および／またはＥＣＭおよび／またはタンパク質および／または生物学的機能を有する他の分子を含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、３次元の細胞培養および組織工学の用途のための機械的可逆性ゲルに関する。ゲルは、ゲルを生成するために、会合（または凝集）できる種を含む。機械的せん断力の影響下では、ゲルは液体に転化できる。ゲルからなる種の会合は、可逆的であることができる。従って、充分な機械的せん断力を加えると、凝集の逆転を生じることができ、それによって相互に対して種を動かすことができ、そしてそれによってゲルを液体に転化させる。発明者らは、種の会合が少なくとも部分的にファンデルワールス力または水素結合によると仮定した。これらは、中程度のせん断力によって壊れる種の比較的弱い会合となる。せん断力を除くと、または液体状態を保持するのに不充分であるレベルまでせん断力を減少させると、種の会合が再構築され、液体のゲルへの転化となる。
【００２２】
図１は、これを図式的に具体的に示す。図１において、会合性基Ｘは、鎖の末端に位置する。ゲル状態において、Ｘ基は隣接した分子上の類似の基と会合する。これは、ゆるい架橋となり、ゲルネットワークを生成する。この場合の架橋は、例えば、水素結合、ファンデルワールス誘引力等による物理的な架橋または会合であることができる、充分な機械的せん断を加えると、Ｘ基の会合の破壊を生じ、それによって緩い架橋を壊し、そしてそれによって分子が相互に対して動くことができる液体状態の形成となる。せん断力の除去は、Ｘ基の会合が再形成されることを可能にし、（物理的架橋であることができる。）架橋の再形成およびゲル状態への逆転となる。
【００２３】
本発明の態様において、会合性基は、シランの加水分解で誘導されたシラノール基である。図２は、ゲル中に存在できる幾つかのタイプの会合を具体的に示す。図２では、丸の中のＳｉによって表されるシラノール種は、モノマー、オリゴマーまたはポリマーであることができる。従って、テトラアルコキシシランの加水分解は、Ｓｉ（ＯＨ）４（または部分的にもしくは完全に脱プロトン化されたそれらの誘導体）、それらのオリゴマー（例えば、（Ｓｉ（ＯＨ）３）２Ｏ、（ＨＯ）３Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ（ＯＨ）２）−Ｏ−Ｓｉ（ＯＨ）３）等）、およびポリマーおよび／または架橋ネットワークを生成することができる。これらの架橋ネットワークは、シリカ様構造を示すことができる。しかし、それぞれの場合において、シラノール種は少なくとも２つのシラノール基を含むであろうし、そしてさらに多くを含むことができる。シリカ様架橋構造の場合、重合度によって１高分子当たり数百、数千以上のシラノール基があることができる。従って、図２に示された構造は、
ａ）２つの別個の親水性鎖上の２つのＯＨ基が、単一のシラノール種にそれぞれ水素結合し、機械的せん断によって少なくとも部分的に破壊され、または壊されることができる一時的な架橋部位を形成する；
ｂ）シラノール種は、そのシラノール基の１つと、親水性鎖のＯＨ基との縮合によって親水性鎖に共有結合を生成した。得られた種は、別の親水性鎖のＯＨ基に水素結合して、機械的せん断によって破壊されることができる一時的な架橋部位を生成できる；
ｃ）シラノール種は、そのシラノール基の１つと、親水性鎖のＯＨ基との縮合によって親水性鎖に共有結合を形成した。得られた種は、別の親水性鎖上の別の類似の基と水素結合して、機械的せん断によって破壊できる一時的な架橋部位を生成できる；
ｄ）シラノール種は、そのシラノール基の１つとそれぞれの鎖上のＯＨ基との縮合によって、２つの親水性鎖を結合させ、それによって２つの鎖を共有結合した。シラノール種上の第３のシラノール基は、いくつかの他のＯＨ（例えば、親水性鎖上のシラノール種等）と水素結合して、機械的せん断によって破壊できる一時的な架橋部位を生成できる。示された例において、水素結合は、２つの類似の基の間にあるが、しかしこれは、必ずしもそうとは限らない。
【００２４】
上記で明確に示されていない他の類似の構造はまた、水素結合および／またはファンデルワールス誘引力によって形成されて、機械的せん断によって破壊できる一時的な架橋部位を形成できることは当業者に明らかであろう。本発明のゲルにおいては、１超のおそらくすべての上記の構造が、存在できることはまた、明らかであろう。
【００２５】
本発明は、上記の様にゲルを製造する方法を提供する。方法は、１分子当り少なくとも２つのシラノール基を含むシラノール種と、１分子当り少なくとも２つのヒドロキシル基を含む親水性のヒドロキシル種とを混合すること含む。
【００２６】
この方法は、
−シランを加水分解してシラノール種を生成させること、
（該シランは、１分子当り少なくとも２つの加水分解性基を有する。）、および、
−混合ステップ後で、ｐＨを約６〜約９に調整すること、
のステップの１つまたは両方をさらに含むことができる。
【００２７】
シラノール種は、モノマー種であることができる。この場合、シラノール種は、１分子当たり２〜４（例えば、２、３または４）シラノール基を有することができる。シラノール種は、オリゴマー種またはポリマー種であることができる。この場合は、シラノール種は、１分子当たり少なくとも３つのシラノール基を有することができるが、重合度によって１分子当たりさらに多くの（例えば、約３〜１００、または３〜以上１０００までもの）シラノール基を有することができる。従って上記の様に、（テトラアルコキシシランの加水分解によって生成できる。）Ｓｉ（ＯＨ）４は、ポリマー化またはオリゴマー化できる。シラノール種は、ダイマー、トリマー、テトラマー等を形成できる。シラノール種は、直鎖、分枝鎖および／または架橋構造を形成できる。全てのこれらの構造は、複数のシラノール基を有することによって特徴付けられる。架橋する場合、構造は、シリカ様構造を有することができる。シラノール種は、水中に可溶性であることができ、またはシラノール種は、水中に不溶性であることができ、またはシラノール種は、水に溶けにくいことができる。シラノール種は、任意の２種または３種以上の上記の構造を含むことができ、例えば、シラノール種は、モノマーのシラノール種と共に、任意選択的に重合の異なる度合いを有する１種または２種以上のオリゴマーのシラノール種を含むことができる。（それぞれのまたは）シラノール種は、１〜１００以上、または１〜５０、１〜２０、１〜１０、１〜５、２〜１００、５〜１００、１０〜１００、５０〜１００、５〜５０、５〜２０もしくは５〜１０、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００の重合度を有することができる。
【００２８】
シラノールが作られるシランは、１分子当たり２〜１０個の加水分解性基を有することができる。シランは、モノマーであることができる。シランはオリゴマーであることができる。シランは、２〜４個の加水分解性基、または２〜６、４〜１０もしくは３〜８個の加水分解性基、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の加水分解性基であることができる。シランはまた、任意選択的に、１分子当たり１つまたは２つ以上の非加水分解性基を有することができる。シランは、アルキル基（例えば、Ｃ１〜C１２、またはＣｌ〜Ｃ６、またはＣｌ〜Ｃ４アルキル、（それらの全ては、直鎖または分枝鎖のいずれか）、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ヘキシル等であることができる。）であることができ、またはアリール基（例えば、フェニル、ナフチル、アントラセル等のＣ６〜Ｃ１４のアリール、またはＣ６〜ＣｌＯアリール）であることができ、または官能基もしくは官能性アルキル基であることができる。シランは、例えば、アミノアルキルまたはハロアルキル（例えば、アミノプロピルまたはハロプロピル）基であることができる。ハロゲンは、この場合は、ＦＣｌ、ＢｒまたはＩであることができる。加水分解性基は、アルコキシルシリル基であることができ、またはオキシモシリル基であることができ、またはアルカノイロキシシリル（例えば、アセトキシシリル）基であることができ、またはベンズアミドシリル基であることができ、またはエノロキシシリル基であることができ、またはなにか他のタイプの加水分解性シリル基であることができ、または異なるそうした加水分解性基の混合物を有することができる。シランは、例えば、テトラアルコキシシランを含むことができる。シランは、テトラメチル、テトラエチル、テトラプロピル、テトライソプロピルまたはテトラブチルシランであることができる。シランは、トリアルコキシルシラン、例えば、メチルトリメトキシシラン、メチルトリエトキシシラン、イソプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン等であることができる。
【００２９】
シランを加水分解するステップは、水を含有する酸性溶液にシランを曝すことを含むことができる。それは、酸性水溶液であることができる。酸性水溶液は、有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、ギ酸、クエン酸およびマロン酸等であることができ、または無機酸、例えば、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸等であることができる。酸の濃度は、少なくとも部分的に酸の性質（特にｐＫａ）によって、約０.００１〜１Ｍ、または約０.０１〜１、０.１〜１、０.００１〜０.１、０.００１〜０.０１または０.０１〜０.１Ｍであることができる。酸性水溶液のｐＨは、約１〜約４、または約１〜３、１〜２、２〜４、３〜４または２〜３、例えば、約１、１.５、２、２.５、３、３.４または４であることができる。加水分解は、生成物が酸性水溶液中で可溶性である程度に加水分解するのに、シランにとって充分な時間であることができる。時間は、約１分〜約１２時間、または約３０分〜１２時間、１〜１２、２〜１２または６〜１２時間、または約１〜６０、１〜３０、１〜１０、１〜５、５〜６０、１０〜６０または３０〜６０分、例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０または５０分、または約１、１.５、２、２.５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２時間であることができる。温度は、生成物が所望の時間で、酸性水溶液中で可溶性である程度にシランを加水分解するのに充分な温度であることができる。普通、加水分解は、室温で行われるが、約５〜５０℃、または約５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１５、５〜１０、１０〜５０、２０〜５０、３０〜５０、１０〜３０または１５〜２５℃の任意の好適な温度、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０℃以上で行われることができる。例では、テトラアルコキシシランは、有機酸の水溶液中で加水分解される。テトラアルコキシシラン：有機酸の比率は、体積基準で、約１：２〜約１：２０、または約１：２〜１：１０、１：２〜１：５、１：５〜１：２０、１：１０〜１：２０、１：５〜１：１５、１：５〜１：１０または１：８〜１：１０、例えば、約１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９または１：２０であることができる。
【００３０】
ヒドロキシル種は、１分子当たり３〜１０個のヒドロキシル基、または約３〜８、３〜６または３〜５、例えば、約３、４、５、６、７、８、９または１０個のヒドロキシル基を含むことができる。ヒドロキシル種は、親水性鎖を含むことができる。ヒドロキシル種は、長鎖の親水性ヒドロキシル種であることができる。鎖は、少なくとも約１０原子長、または少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００原子長、または約１０〜約１０００原子長または約１０〜５００、１０〜１００、１０〜５０、５０〜１０００、１００〜１０００、２００〜１０００、５００〜１０００、５０〜５００または１００〜５００原子長、例えば、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００または１０００原子長であることができる。ヒドロキシル種は、ポリマーであることができる。ヒドロキシル種は、オリゴマーであることができる。ヒドロキシル種は、デンドリマーであることができる。ヒドロキシル種は、超分岐ポリマーまたはオリゴマーであることができる。ヒドロキシル種のそれぞれの分子中のヒドロキシル基の少なくとも２つは、分子の末端基であることができる。ヒドロキシル種は、分枝鎖種であることができる。それぞれの分枝鎖は、ヒドロキシル末端基を有することができ、またはいくつかの分枝鎖は、ヒドロキシル末端基を有することができ、そしていくつかは、ヒドロキシル末端基を有さないことができる。いくつかの態様において、それぞれの分枝鎖の末端基は、ヒドロキシル基である。ヒドロキシル種は、ポリエーテル鎖、例えば、分枝ポリエーテル鎖を含むことができる。従っていくつかの態様において、ヒドロキシル種は、それぞれの鎖末端にヒドロキシル基を有する分枝鎖（例えば、４鎖の）ポリエーテルである。ヒドロキシル種の分子量は、約５００〜約５００００または約５００〜１００００、５００〜５０００、５００〜１０００、１０００〜５００００、１００００〜５００００、２００００〜５００００または１０００〜１００００、例えば、約５００、６００、６００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００または５００００以上であることができる。シラノール当たり、または分枝鎖当りの分子量は、約２００〜約２００００、または約５０００〜２００００、１０００〜２００００、５０００〜２００００、１００００〜２００００、２００〜１００００、２００〜２０００、１００〜１０００、２００〜５００、５００〜５０００、１０００〜５０００または５００〜２０００、例えば、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、２５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００または２００００であることができる。分枝鎖は、同じ長さであることができ、または、類似の長さであることができ、または、異なる長さであることができる。分枝鎖のいくつかは、同じまたは類似の長さであることができ。そして、いくつかは、異なる長さであることができる。ヒドロキシル種は、ＰＥＧ、またはポリサッカリド等のなんらかの他のヒドロキシル含有ポリマーを含むことができる。ヒドロキシル種は、天然ポリマーであることができる。ヒドロキシル種は、合成ポリマーであることができる。ヒドロキシル種は、修飾された天然ポリマーであることができる。アルコキシ官能性ポリマーは、ヒドロキシル含有ポリマーの代わりに使用できる。この場合、方法は、ポリマーのアルコキシ基を加水分解することを含むことができる。これは、シラノール種に曝す前に行うことができ、またそれはｉｎ  ｓｉｔｕで行うことができる。それは、同時にシラノール種との相互作用と同時に起こることができる。
【００３１】
いくつかの態様において、方法は、シラノール種と、ヒドロキシル種とを混合するステップの前に、親水性のヒドロキシル種と、微粒子改質剤とを混合することを含むことができる。微粒子改質剤は、シリカ、例えば、フュームドシリカを含むことができる。フュームドシリカは、表面修飾されていることができる。それは、例えば、アミン基、ペプチド基またいくつかの他のタイプの基またはそれらの混合物を導入するために表面修飾されていることができる。従って水素結合は、親水性のヒドロキシル種を、シリカの粒子に結合させることができる。シリカは、フュームドシリカの形態であることができ、小さい一次粒子を有することができる。当然のことながら、シリカ粒子は、多数のシラノールを表面上に有し、そしてしたがって親水性のヒドロキシル種の幾つかの分子に水素結合できる。シリカは、任意選択的に表面修飾されたシリカであることができる。シリカは、シリカの表面上にアミン基、ペプチド基または他の官能基を有することができる。微粒子改質剤の表面上の官能基は、水素結合性基であることができる。微粒子改質剤は、ゲルの物理的特性を改質できる。微粒子改質剤は、フィラーとみなすことができる。他の周知の微粒子改質剤は、例えば、アルギネート、ヘパリン、キトサン、キチン等のセルロースまたはポリサッカリドとして使用できる。
【００３２】
ヒドロキシル基を含有する化合物は、ゲルの化学的および物理的特性を改質するために導入されてもよい。例えば、エタノールアミンは、アミン官能性をゲルに導入するように、ＰＥＧと加水分解されたＴＥＯＳの塩基触媒縮合の前に加えられることができ、そしてそれによってそれをさらに親水性にする。ＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲルはまた、種々のシランによって官能化できる。他の改質化合物は、ヒドロキシ酸、単糖、オリゴサッカリド、ポリサッカリドおよびペプチドを含む。これらは、ゲルの形成前にヒドロキシル種を改質するために使用でき、またはヒドロキシル種がシラノール種と混合された後で、ゲルを改質するために使用できる。
【００３３】
ヒドロキシル種：シラノール種の比は、体積基準で、約１：５〜約１：１、または約１：５〜１：２、１：５〜１：３、１５〜１：４、１：４〜１：１、１：３〜１：１、１：２〜１：１、１：４〜１：２または１：２〜１：１.５、例えば、約１：１、１：１.５、３：５、１：２、１：２.５、１：３、１：３.５、１：４、１：４.５または１：５であることができる。比率は、シラノール種の官能性およびヒドロキシル種の官能性、およびシラノール種の濃度によっていくらかの他の比率であることができる。
【００３４】
混合に続いて、生じる混合物は、例えば、攪拌、渦、旋回、振動、超音波分解等でかき混ぜられることができる。混合物は、目視で同種になるまでかき混ぜられることができる。混合物は、次に殺菌される。これは、殺菌フィルター、例えば、０.４５、０.２または０.１１μｍフィルターを通したろ過、好ましくは殺菌ろ過によって達成される。あるいはまたはさらに、混合物は、ＵＶ照射またはいくらかの他のタイプ殺菌によって殺菌されることができる。
【００３５】
混合物はｐＨを調整できる。調整は、所望のｐＨを達成するのに充分な塩基またはバッファーを加えることを含むことができる。塩基は、例えば、水酸化物（例えば、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムまたは水酸化アンモニウム）またはなんらかの他の塩基であることができる。調整が起こるｐＨであることができる。それは、シラノール種がゲル化できるｐＨであることができる。調整は、塩基性のｐＨであることができる。それは、約６〜約１０、または約６〜９、７〜９、７〜１０、７.５〜１０、７.５〜９、７〜７.４、７.１〜９または７.１〜８、例えば、約６、６.５、７、７.１、７.２、７.３、７.４、７.５、７.６、７.７、７.８、７.９、８、８.５、９、９.５または１０のｐＨであることができる。これは、シラノール種に縮合、オリゴマー化、架橋、ポリマー化または１超のこれらのものを生じさせることができる。放置でゲルが生成できる。放置は、攪拌しないこと、または非常に緩やかな攪拌によってできる。全ての攪拌は、充分に緩やかでゲルの形成を可能にすることが好ましい。放置は、少なくとも１時間、または少なくとも約２、３、４、５、６、９、１２、１５、１８または２４時間、または約１〜約４８時間、または約１〜３６、１〜２４、１〜１８、１〜１２、６〜４８、１２〜４８、２４〜４８、６〜２４、６〜１８または１８〜２４時間、例えば、約１、２、３、４、５、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、３０、３６、４２または４８時間の間であることができる。
【００３６】
本発明の態様において、
−シランを加水分解して、シラノール種を生成させること、
（該シランは、１分子当り少なくとも２つの加水分解性基を有する。）
−１分子当たり少なくとも２つのシラノール基を含むシラノール種と、１分子当り少なくとも２つのヒドロキシル基を含む親水性のヒドロキシル種とを混合すること、および
−混合ステップ後に、ｐＨを約６〜約９に調整すること、
を含む、ゲルの製造方法が提供される。
別の態様では、
−酸性水溶液中でテトラアルコキシシランを加水分解して、シラノール種を生成させること、
シラノール種と、１分子当たり少なくとも２つのヒドロキシル末端基を含む分枝ポリエーテルとを混合すること、および
−混合ステップ後のｐＨを、約７〜約８に調整すること、
を含む、ゲルの製造方法が提供される。
別の態様では、
−酸性水溶液中でテトラアルコキシシランを加水分解して、シラノール種を生成させること、
−シラノール種と、１分子当たり少なくとも２つのヒドロキシル末端基を含む分枝ポリエーテルとを混合して、混合物を生成させること、
−混合物を殺菌すること、
−混合ステップ後で、混合物のｐＨを約７〜約８に調製すること、および、
−ゲルが生成するのに充分な時間、混合物を攪拌せずに放置すること、
を含む、ゲルの製造方法が提供される。
【００３７】
本発明のゲルは、会合性基を含む親水性鎖を含む。上記の様に、これらの基は可逆的に会合できる。従って、基が会合している場合、会合は可逆的架橋を形成し、そしてゲルは、ゲル形態にある。可逆的な架橋の少なくともいくつかを破壊するのに充分な機械的せん断力を加えることによって、ゲルは液体形態に転化されることができる。機械的せん断力を除くと、または機械的せん断力を閾値レベルより下に低下させると、可逆的な架橋が再形成するので、液体はゲルに転化されることができる。液体のゲルへの転化は、約１０〜約１時間、または、約３０〜１時間、１分〜１時間、５分〜１時間、１０分〜１時間、３０分〜１時間、１０〜３０分、１０〜１０分、１０〜１分、１０〜３０、１〜３０分、１〜１０分、１〜５分または５〜２０分、例えば、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０または５５、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０または５５分または約１時間かかることができ、または１時間より多くかかることができる。これらの時間は温度に依存することができる。これらは、約１０〜３０℃、または約１０〜２０、２０〜３０または１５〜２５℃、例えば、約１０、１５、２０、２５または３０℃の温度において適用できる。
【００３８】
会合性基は、親水性鎖に沿ってあることができ、または親水性鎖の末端にあることができ、またいくつかは親水性鎖の末端にあることができ、そして、いくつかは、鎖に沿ってある（すなわち末端でない）ことができる。会合性基は、上記の様な１分子当たり少なくとも２つの加水分解性基を含むシランから誘導されていることができる。
【００３９】
シランは、１分子当たり２〜１０個の加水分解性基または２〜６、２〜４、４〜１０または６〜１０、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の加水分解性基を有することができる。加水分解性基は、アルコキシルシリル基または上記に記載した他の基であることができる。
【００４０】
従って、態様において、細胞を培養するためのゲルが提供され、該ゲルは、該鎖の末端において会合性基を含む親水性鎖を含み、該基は可逆的に会合でき、それによって、ゲルは、機械的せん断力を加えることにより、液体に転化されることができ、そして液体は、該機械的せん断力がない場合にゲルに転化されることができる。
【００４１】
別の態様では、細胞を培養するためのゲルが提供され、該ゲルは、テトラアルコキシシランの加水分解から誘導された会合性基を含む親水性鎖を含み、該基は、該基が可逆的に会合できる該鎖の末端にあり、それによって、ゲルは、機械的せん断力を加えることにより液体に転化されることができ、そして液体は、該機械的せん断力がない場合に、ゲルに転化されることができる。
【００４２】
親水性鎖は、ポリエーテル鎖であることができる。それらは、分枝鎖であることができる。それらは、分枝したポリエーテル鎖であることができる。それらは、２〜２０個以上の末端基、または２〜１０、２〜６、３〜２０、６〜２０または１０〜２０、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の末端基を有することができる。親水性鎖は、いくつかの態様において、超分岐ポリマー、超分岐オリゴマー、星形デンドリマーまたはいくつかの他の分枝鎖構造を含むことができる。
【００４３】
ゲルは、水をさらに含むことができる。いくつかの態様において、ゲルは、ヒドロゲルであることができる。ゲルは、細胞および／またはＥＣＭを含むことができる。細胞および／またはＥＣＭは、機械的な動きによるゲルから液体への転化によって、ゲルから放出されることができる。
【００４４】
さらなる態様において、細胞を培養するためのゲルが提供され、該ゲルは、
−可逆的に会合できる会合性基を含む親水性鎖、
−水；ならびに、
−細胞および／またはＥＣＭ、
（それによって、ゲルが機械的せん断力を加えることによって液体に転化されることができ、そして液体が、該機械的せん断力がない場合に、ゲルに転化されることができる。）
を含む。
【００４５】
本発明のゲルは、細胞を培養するために好適であることができる。ゲルは、任意選択的に、細胞のための栄養源および他の必要な物質を含むことができ、そして細胞の成長を支えることができる環境を提供できる。細胞は、ゲル中で一旦培養されると、機械的な動きによって、そこから放出されることができる。
【００４６】
従って、本発明はまた、ゲル（ゲルが上記のようである。）から細胞を放出させる方法を提供する。方法は、ゲルと液体とを混合すること、および液体中に細胞の懸濁液を生成させるのに充分な機械的せん断を、混合された液体およびゲルに加えることを含む。
【００４７】
混合された液体およびゲル中の液体の比率は、約２５％ｖ/ｖより多いことができ、または約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０もしくは９５％ｖ/ｖより多いことができ、または約２５〜約９５％、もしくは約２５〜８０、２５〜６０、２５〜５０、３０〜９５、４０〜９５、５０〜９５、６０〜９５、３０〜８０、４０〜８０、５０〜８０、３０〜７０もしくは４０〜６０％、例えば、約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０もしくは９５％であることができ、またいくつかの例では、９５％より多いことができる。液体は、水性液体であることができる。液体は、細胞のための培地であることができる。液体は、水中の栄養源の溶液であることができる。液体中の細胞の懸濁液はまた、ゲルの部分的な分解によって形成されるゲルの粒子を含むことができる。方法は、液体からゲルの粒子を除くステップをさらに含むことができる。このステップは、懸濁液を濾すことまたはろ過することを含むことができる。それは、例えば、１００μｍセルストレイナーを通して懸濁液を濾して、液体からゲルの粒子することを含むことができる。セルストレイナー、またはフィルター遮断は、細胞の直径より大きいであることができる。細胞の性質、特に細胞のサイズ、およびゲル粒子のサイズによって、それは、例えば、約１０、２５、５０、１００、１５０または２００μｍ超、または約１０〜２００、１０〜１００、１０〜５０、２０〜２００、５０〜２００、１００〜２００または５０〜１５０μｍ、例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００μｍであることができる。濾しまたはろ過は、重力下、または濾し器またはフィルターを通る懸濁液の通過を加速させるために、穏やかな吸引もしくは穏やかな圧力下で行うことができる。
【００４８】
本発明のゲルのある態様は、加水分解されたシランと混合されたポリエチレングリコールを含む。これを、本明細書中において’’ＰＥＧ−ＳｉＯ２’’というが、加水分解されたシランの構造は、シリカ様構造、オルト珪酸様構造および上記に記載された他の構造を含むことができることが認識することが好ましい。
【００４９】
この態様にしたがって、発明者らは、３次元の（３次元の）細胞培養および組織工学のために機械的で可逆的なレオロジー的特性を有するポリマーシリカ複合物ゲルを開発した。このゲルは、４鎖のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と、加水分解されたテトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）との間の塩基触媒反応によって生成され、縮合ＰＥＧ−ＳｉＯ２ネットワークを生じる。ＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲルは、可逆性ゲル化の独自特性を有する。それは、ボルテックスして、配位子および細胞が加えられることを可能にする場合に液化され、そしてほんの数分でゲルに復帰できた。液体ゲルの設定時間は、ゲルの組成を変えることによって調整できた。ゲルは、堅牢で強く、そして持ち上げでき、そして取り扱いできた。ゲルは不溶性であったが、細胞培地のためには充分に多孔質で、栄養源およびガスがゲルを通って拡散する。３次元の細胞培養のための既存のゲルに対する、このゲルの利点は、その独自の可逆性のゲル化特性である。ＰＥＧ−ＳｉＯ２は、ボルテックスされて、配位子および細胞が加えられることができる場合に、液化でき、そして短時間、例えば、数分でゲルに復帰できる。
【００５０】
生死試験および共焦点顕微鏡は、ＰＲＧＤ配位子を含有するＥＧ−ＳｉＯ２ゲル中で１週間後に、人間間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）の生存および３次元拡散を示し、このＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲルが非有毒性であり、そして細胞の成長を支持することを確信した。ＲＧＤは、配列がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのトリペプチドである。ＭＣ−３Ｔ３は、マウス前骨芽細胞株である。取り込まれる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を有するおよび有さないゲル中でのＭＣ−３Ｔ３細胞の生存能力をまた、確立した。本発明のゲルの独自の液化特性により、細胞はトリプシン処理なしで継代できた。従って、細胞培養実験の最後に、培地またはホスフェート緩衝生理食塩水を加えることができ、そして穏やかな攪拌は、ゲルを不可逆的に分離させ、細胞、細胞集合体または組織構造を放出させるであろう。細胞構造およびＥＣＭはまた、このように取り入れることができた。さらに、ＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲルは生体不活性であり、そして特定の細胞型の接着および信号伝達のための、所望のタイプの配位子で容易に官能化できた。
【００５１】
このように、本発明は、チキソトロピーおよび可逆性のゲル化に基づく。ゲル化のメカニズムは、ファンデルワールス力の再構築を含むと考えられており、そして何らかの化学反応を含むとは考えられていない。市販されている３次元の細胞培養系に比較すると、本発明のゲルは、独自の可逆性のゲル化特性を有する。それは、ボルテックスされて、配位子および細胞が加えられることができる場合に、液化されるが、短時間で、例えば、数分でゲルに復帰することができる。液体ゲルの設定時間は、ＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲルの組成を変えることによって調整でき、製造工程の間に予め操作できる。細胞培養実験の終わりには、培地またはホスフェート緩衝生理食塩水を加えることができ、そして穏やかな攪拌がゲルを不可逆的に分離させ、細胞、細胞集合体または組織構造を放出させるであろう。
【００５２】
液体前駆体の形態で、販売されている大部分の既存の系と異なり、本発明のゲルは、プレフォームドゲルの形態で販売できる。手順は、細胞懸濁液を加える前に、ゲルのボルテックスを単純に含むので、それは使用に好都合である。
【００５３】
ゲルの成分、ＰＥＧおよびＳｉＯ２は、哺乳類生理学中で自然に存在しないので、それらは、幹細胞が分化するかまたは未分化状態のままでいるように、シグナル伝達しそうにない。これは、生物学的成分によるシグナル伝達事象が発生し、そして幹細胞の型によって変化するであろう、マトリゲルまたはコラーゲンタイプＩ等の生物学的材料から誘導されたゲルと異なる。例えば、ｈＭＳＣのコラーゲンタイプＩへの曝露は、骨芽細胞へのその分化となり、細胞培養の目的が幹細胞の増殖である場合には、望ましくない結果になるであろうことが報告された。従って、本明細書中に示されたゲルは、生体信号がカスタマイズ化した方式で示されることができる不活性なレオロジー的プラットフォームを提供する。
【００５４】
以前の３次元の培養系では、ゲル化現象は、架橋反応またはゲル前駆体のイオン強度における変化によって引き起こされた、共有結合の形成またはイオンの相互作用を含む分子の相互作用に基づいていた。対照的に、示された系は、チキソトロピーおよび可逆性のゲル化に基づく。液体ゲルの設定時間は、材料中で異なる濃度のＰＥＧ−ＳｉＯ２を使用することによって調整できる。充分な量の液体培地の添加および穏やかな攪拌は、ゲルを分離させ、細胞を放出させることができる。この分離は、不可逆的であることができる。これは、細胞構造およびＥＣＭの取り入れを促進するであろう。この独自の'液化特性'はまた、細胞にトリプシン処理なしで継代させることができた。
【００５５】
ＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲルは、幹細胞技術に向けた用途には、特に魅力的であることができる。第１の目的が細胞を健康な、増殖性の状態に保つことである細胞株の培養と対照的に、幹細胞の培養は、多能性状態にある細胞を維持するか、または特別な分化経路に沿ってそれを動かすかのいずれかのために、シグナル伝達の提供を必要とする。ＰＥＧおよびＳｉＯ２は、哺乳類生理学において自然に存在しないので、ＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲルは、分化または未分化状態のいずれかへのシグナル伝達をしそうにない。これは、コラーゲンタイプＩまたはマトリゲル等の生物学的材料から誘導されたゲルと対照的であろうし、細胞型によって、幹細胞の培養に、ほとんど確実に影響するであろう。ＰＥＧおよびＳｉＯ２の官能化の容易さは、ＰＥＧ−ＳｉＯ２系のさらなる開発および改質を促進するであろう。複数の配位子の導入は、幹細胞増殖および分化のためのシグナル伝達が、３次元の環境において制御された方式で提供できる多官能性ゲルとなるであろう。これは、治療的組織工学のための、および幹細胞生物学の基礎研究のための貴重なツールを提供するであろう。
【００５６】
レオロジー制御された'機械的可逆性ゲルの一般的な概念は、３次元の培養系に広く適用できるであろう。いくつかの態様において、本ゲルは、ＰＥＧ−ＳｉＯ２に基づくが、他のゲル組成物は、記載された機械的に可逆なレオロジー的特性を提供するために存在できる。
【００５７】
本発明の媒体のための適用は、
−細胞株、第１細胞、または幹細胞のための３次元の細胞培養；
（細胞は、癌研究（例えば、転移のモデル）、薬物開発および細胞毒性試験、またはハイコンテント薬のスクリーニングのための体外モデルとして３次元で組織内において成長できるであろう）；
−組織工学：（組織および臓器の工学、および再生のための生体外および生体内の両者）；
−免疫標識と併用して、３次元における細胞の画像化のための基材として；
−３次元形（例えば、管）へのゲルのパターンニング、層化、および成形のため；
−細胞および組織の低温保存での使用のため、
を含む。
【実施例】
【００５８】
本実験では、鎖がペンタエリスリトール  Ｃ（ＣＨ２ＯＨ）４で接続されている等しい長さの鎖を有するＭＷ約２０００の、４鎖のＰＥＧを使用した。４鎖のＰＥＧを０.４５μｍフィルターに通して殺菌ろ過した、そして同種の混合物が得られるまでフュームドシリカ（ＦＳ、Ｃａｂ−ｏｓｉｌ  Ｍ５、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）とボルテックスした。０、５、１０および１５ｗｔ％のＦＳ充填量を使用した。１時間または単相が得られるまで０.１５Ｍの酢酸（容積で、ＴＥＯＳ：酢酸＝１：９）でボルテックスすることによって、ＴＥＯＳを加水分解した。加水分解されたＴＥＯＳ溶液を、４鎖のＰＥＧ−ＦＳに、（モルで、ＴＥＯＳ：ＰＥＧ＝１：２．０９）３：５の容積比率で加え、そして同種になるまでボルテックスした。混合物を、細胞培養実験のための０.２０または０.４５μｍのフィルターを通して、殺菌ろ過した。最終のｐＨが約７.４になるまで、アンモニア溶液（２５〜３５％）を混合物に加えた。容器を覆って一晩放置するとゲルが生成した。ゲルを、１％のペニシリン/ストレプトマイシン（抗生物質）を有する脱イオン水で洗浄して、使用前にエタノールを除いた。ゲルは、水中で微粒子懸濁液を生成し、３００〜１０００ｒｃｆで遠心分離することによって集めた。
【００５９】
細胞培養のために、ゲルを、最初に液体状態にボルテックスした。それぞれの媒体中で細胞懸濁液を、細胞が一様に分散するように穏やかな滴定で、次にゲルに加えた。ゲルを、容積で２０％の細胞懸濁液にまで希釈した。ゲルおよび細胞の混合物を、次に培養容器（すなわちフラスコ、ペトリ皿またはカバースリップ）に移した。ゲルが復帰する（すなわち１〜１５分）前に、組織培地を加えた。培養容器を次に細胞培養インキュベーターに移した。
【００６０】
加水分解されたＴＥＯＳの塩基触媒ゲル化によって生成されたシリカゲル、および乾燥したＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲルの特性を示すために、フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光法を使用した。ゲル液体の転化に必要な最小のせん断応力（τ最小）、およびせん断応力を除いた場合の液体ゲル転化（τ液体−ゲル）時間を決定するために、ＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲルをレオロジー的なテストに曝した。液体−ゲル転化時間は、ゲル化が再び起こる前の、細胞、配位子等を、液化したゲルに加えるための最も長い作業時間であった。τ最小およびｔ液体−ゲルを変化させるために、ＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲルをまた０〜２０％の細胞培地で希釈した。
【００６１】
例１：ＲＧＤ配位子の活性ＰＥＧへの導入
トリエチルアミンの存在下で、４鎖のＰＥＧを求核置換によってトレシルクロリドに結合させることができた。アミノ基を含有する配位子を次に、活性化された４鎖のＰＥＧに結合させることができ、最終の、配位子で修飾された４鎖のＰＥＧとなった。この配位子で修飾されたＰＥＧを１０％ｖ/ｖの修飾されていない４鎖のＰＥＧおよび加水分解されたＴＥＯＳと次に混合し、そしてゲルの生成（図３ａ）を触媒するために、ｐＨを高めた。
修飾されたＰＥＧの合成
４鎖のＰＥＧを、標準法を使用してトレシルクロリドで活性化した。トレシルクロリドで活性化された４鎖のＰＥＧを、使用前に１ｍＭのＨＣｌに溶解し、そして貯蔵した。ガラクトース配位子のカップリングでは、０.１１２６ｇの１−アミノ−１−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトースを、１５ｍＬのｐＨ８.５のＰＢＳ中に溶解した。１５ｍＬのＰＢＳ溶液に、１０ｍＬのトレシルクロリドで活性化された４鎖のＰＥＧを加えた。反応混合物を２２時間、４℃で攪拌し、そして４℃で貯蔵した。ＲＧＤ（ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ）配位子のカップリングでは、７５μＬのＲＧＤ溶液を１.４２５ｍＬのｐＨ８.５のＰＢＳに溶解した。１.５ｍＬのＰＢＳ溶液に、１ｍＬのトレシルクロリドで活性化された４鎖のＰＥＧを加えた。
【００６２】
例２：チオール添加を介したＲＧＤおよびヘパリンの導入
ＰＥＧ−ＶＳの経路では：ＰＥＧ−ＶＳ  （ポリエチレングリコールビニルスルホン）（８.６２ｍｇ/ｍｌ）とＲＧＤ（１ｍｇ/ｍｌ）とを、９：１の容積比で混合した。このＰＥＧ−ＶＳ−ＲＧＤ混合物を、次にシステインヘパリン（３３.２ｍｇ/ｍｌ）７：６の容積比で混合した。
【００６３】
ＭＡＬ−ＰＥＧ−ＭＡＬ経路では：ＭＡＬ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（マレインイミドポリエチレングリコールマレインイミド）（１０.８ｍｇ/ｍｌ）と、ＲＧＤ（４ｍｇ/ｍｌ）とを、１.２２：１の容積比で混合した。このＭＡＬ−ＰＥＧ−ＭＡＬ−ＲＧＤ混合物を次にシステインアルギネート（７.３５ｍｇ/ｍｌ）と、１：１.５９の容積比で混合した。
【００６４】
４鎖のＰＥＧ−ＶＳまたはＭＡＬ−ＰＥＧ−ＭＡＬと、システインヘパリンおよびチオールを含有するＲＧＤペプチドであるＧＣＧＹＧＲＧＤＳＰＧとを異なる比で反応させた。ゲルネットワーク（図３ｂ）の生成においてヒドロキシル基（点線で示した）を縮合させるために塩基の添加によってｐＨを高める前に、配位子で修飾されたＰＥＧと、修飾されていない４鎖のＰＥＧおよび加水分解されたＴＥＯＳとを、２０％までの容積分率で混ぜた。
【００６５】
例３：ＭＣ−３Ｔ３ＥＣＭの取り込み
ＭＣ−３Ｔ３、骨芽細胞株からＥＣＭを文献に記載の方法によって単離した。簡潔に、ｐＨ８のトリスバッファー中で、１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）および０.５％デオキシコラートの溶液を使用して、１週間で密集度を成長させたＭＣ−３Ｔ３細胞を溶解した。０.０２％ＤＮＡＳＥ  ＩおよびＰＭＳＦを含有する溶液を、次に遺伝子材料を除くために導入した。ＥＣＭを分離し、そして脱イオン水を使用して懸濁し、そして遠心分離によって洗浄した。ＥＣＭをゲル中に取り込むために、ＥＣＭを５００ｒｃｆ、４℃、５分間でペレット化した。５００μＬの（１００ｍｍ−直径ペトリ皿から抽出した）液化ＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲルを、ＥＣＭに加えた。生じた懸濁液をボルテックスして均一の分散体を得た。細胞の培養では、１０μＬの細胞懸濁液中４.５×１０５の細胞を、１００μＬのバイアル中で静かに摘定して液化したゲル中に分散し、そして、２４−ウェルプレート中のカバースリップに移した。５〜１５分後に、α−ＭＥＭ組織培地をウェルに加え、そしてプレートを３７℃で、５％ＣＯ２のインキュベーターに戻した。全体的に、細胞をＲＧＤ−およびヘパリンで修飾されたＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲル中で培養し、そして、生死試験を行う前に、１週間でＥＣＭをゲルに取り込んだ。
【００６６】
例４：ＲＧＤ配位子で修飾されたフュームドシリカ（ＦＳ）への導入
フュームドシリカ（図７（ｉ））上の自由なＯＨ基を、ＮＨ２基（図７（ｉｉ））で置換するように、ＦＳを最初にアミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＳ）を使用して修飾した。ＲＧＤ等の配位子は、次にＮ−ヒドロキシスクシンイミドポリエチレングリコールマレイミジル（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ）を使用して、修飾されたフュームドシリカに結合される（図７（ｉｉｉ））。５.２５ｍｇのＮＨ２−修飾されたＦＳを、ｐＨ６のナトリウムホスフェートバッファー中のＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（３.３ｍｇ/ｍＬ）の溶液に加え、そして混合物を２時間ボルテックスした。反応懸濁液を、５０００ｒｐｍ、１０分で遠心分離した。ペレットを５０μＬのＲＧＤ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）中で再分散させ、そして一晩ボルテックスした。（ＲＧＤ溶液と平衡の）上澄み中のＲＧＤ濃度を、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔａｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  （Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して測定した。吸着ＲＧＤを有する粒子を洗浄するために、ペレットを、５０μＬの脱イオン水中で再分散し、そして４０００ｒｐｍで、１０分間遠心分離した。上澄みのＲＧＤ濃度を測定し、そして第１の洗浄として報告した。再分散および遠心分離のステップを繰り返し、第２のおよび第３の洗浄のための上澄みＲＧＤ濃度を得た。３回洗浄後の結合したＲＧＤのパーセンテージを、（ＲＧＤ溶液と平衡にある）結合したＲＧＤの濃度から、第１の洗浄、第２の洗浄および第３の洗浄を混合された上澄みのＲＧＤの濃度を差し引くことによって得て、そして初期のＲＧＤ濃度のパーセンテージとして表した。結果を、図７の表に示す。
【００６７】
結果および検討
加水分解されたＴＥＯＳの塩基触媒ゲル化からのシリカゲル（図４ａ）と比較して、ＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲルは、ＰＥＧおよびそのＣＨ２基にそれぞれ帰属する８００〜１５００ｃｍ−１および２８００〜３０００ｃｍ−１にさらなるＦＴＩＲピークを有する（図４ｂ）。両サンプルは、シリカ（９６０ｃｍ−１および３５００〜４０００ｃｍ−１）中に存在する残留ＯＨ基によるＦＴＩＲピーク、自由なシラノール基（３７４５ｃｍ−１）のＳｉＯ−Ｈ伸張、およびＳｉ−Ｏ−Ｓｉ伸張（１０９１ｃｍ−１）を示した。
【００６８】
ＲＧＤ−およびヘパリン修飾されたＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲル上のｈＭＳＣの生死試験（図５ａ−ｄ）は、ゲルが細胞へのガスおよび栄養源の拡散のために、充分に多孔質であったことを示すゲル内で生き残った細胞を示した。より高い濃度のＲＧＤ配位子を有するゲルは、より広い３次元の細胞の拡散を促進した。ｔＲＧＤ配位子なしで、ゲル中で培養された細胞はまた、生き残った（図５ｅ）。
【００６９】
培養された細胞（細胞株、第１細胞）から単離したＥＣＭは、マトリックス分子および成長因子の豊富な供給源を提供した。ＥＣＭのＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲルへの取り込みは、ＥＣＭの好ましい生物学的活性と、ＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲルの加工性とを混合するであろう。ＭＣ−３Ｔ３細胞株から単離したＥＣＭは、短時間の単なるボルテックスによって、ゲル中で一様に分散できたことを示す。次いで起こるＥＣＭの分離を、ゲルの粘度を高めることによって防止した。ゲル中で培養されたＭＣ−３Ｔ３細胞は、それらの生存能力を維持した（図５ｆ−ｇ）。
【００７０】
レオロジーの研究は、ｏｎ−ｏｆｆ環状のせん断応力に曝される場合に、ＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲルが、機械的可逆のゲル−液体−ゲル特性を有する（図６ｂ）ことを裏付けた。ゲルが液化する最小せん断応力（τ最小）が存在した（図６ａ）。せん断応力を除いた後で、液体がゲルに転化（Ｔ液体−ゲル）するのに必要な最小時間がまたあった。τ最小およびＴ液体−ゲルの両者は、ＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲルを、０〜２０％の細胞培地（図６ｃを参照のこと）で希釈することによって調整できた。ＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲルがその機械的な可逆的特性を失うので、>２０％の細胞培地による希釈は、勧められなかった。
【００７１】
本明細書中に記載されたＰＥＧ−ＳｉＯ２調合物は、所望の細胞型の成長を好ましく支持するように、生体信号がカスタマイズした方式で存在できる不活性なレオロジー的プラットフォームを提供した。ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ（ＲＧＤ）配列に加えて、ヘパリンおよび細胞株から単離したＥＣＭ、他の細胞接着ペプチド、シグナル伝達分子、ＥＣＭ構成部分（例えば、構造的なタンパク質、プロテオグリカンおよび成長因子）およびサイトカイン（例えば、血小板およびトランスフェクト細胞株）の細胞源は、ＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲル上に存在できた。
【００７２】
結論
発明者らは、機械的可逆的レオロジー的な特性と４鎖のＰＥＧおよびＳｉＯ２に基づくゲルを開発した。このゲルは、体外での３次元の細胞培養に好適あり、そして組織工学用途に有望であることが示された。ゲルは、堅牢で、そして多孔質であった。ゲルは、生体不活性であり、そして配位子（例えば、ＲＧＤ）および／またはタンパク質（例えば、ＥＣＭ、成長因子および血小板）を、ゲルが所望の細胞型の成長をより好ましく支持できるように、加えることができた。
【００７３】
ＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲルは、可逆性のゲル化の独自特性を示した。それは、配位子および細胞を加えることができるようにボルテックスされると液化でき、そして数分でゲルに復帰した。その液化特性により、細胞はまた、トリプシン処理なしで継代でき、そして細胞構造およびＥＣＭを、容易に採集できた。生死試験および共焦点顕微鏡は、ＲＧＤ配位子を含有するゲル中で１週間後に、ｈＭＳＣの生き残りおよび３次元拡散を示し、この新規な材料が非毒性であり、そして細胞の成長を支持することを示した。この機械的可逆性ゲルの使用の生体適合性および簡便性は、３次元の細胞培養およびさらに生物学的に関連した環境における細胞の挙動の基礎研究を大幅に促進する。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
本発明の好ましい態様が、添付図面を参照して、例のみによって以下に記載される：
【図１】図１は、本発明における液体およびゲルの相互転化の図示である；
【図２】本発明による図２は、結合が破壊されて液体を形成できるゲル中で異なる型の結合の具体的な説明である；
【図３】図３は、（ａ）ＲＧＤ配位子の活性ＰＥＧへの導入、および（ｂ）チオール添加を介したＲＧＤおよびヘパリンの取り込みを示す図である；
【図４】図４は、（ａ）加水分解されたＴＥＯＳの塩基触媒ゲル化によるＳｉＯ２ゲル、（ｂ）洗浄され、そして乾燥されたＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲル、および（ｃ）４鎖のＰＥＧのＦＴＩＲスペクトルを示す；
【図５】図５は、（ａ、ｃ）１：３および（ｂ、ｄ）１：１のモル比率でＲＧＤおよびヘパリンを含有するＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲル中で１週間培養されたｈＭＳＣ細胞の生死試験の共焦点顕微鏡写真を示す。比較のために、ＭＣ３Ｔ３細胞はまた、（ｅ）ＭＣ−３Ｔ３ＥＣＭなし、および（ｆ、ｇ）ｈＭＣ−３Ｔ３ＥＣＭありでＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲル内で培養された；
【図６】図６は、せん断応力（τ）を増加させる関数としての、ＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲルの（ａ）典型的な貯蔵係数（Ｇ'）、損失係数（Ｇ’’）およびτ（ｔａｎ−１（Ｇ’’／Ｇ'））を具体的に示すグラフを示す（ここで、より小さいδでは、より粘性のある材料であり：Ｇ'>Ｇ’’では、ＰＥＧ−ＳｉＯ２系は、ゲル形態に止まり、そしてそれは、Ｇ'<Ｇ’’の場合に液化される：最小のせん断応力（τ最小）に必要なゲル液体の転化が、ｏによって示された）；（ｂ）繰り返しせん断応力（τ）に曝された場合の、時間の関数としてのＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲルの典型的なＧ'、Ｇ’’およびδ：せん断応力を除いた後の液体ゲル転化（ｔ液体−ゲル）に必要な時間が、Ｇ'、Ｇ’’、およびδが、せん断応力がかけられる前のそれらの元のレベルに戻るのに必要な期間によって与えられた；（ｃ）およびＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲルと細胞培地との混合物におけるｖｏｌ％ＰＥＧ−ＳｉＯ２ゲルの関数としての、τ最小およびｔ液体−ゲルのグラフ；および
【図７】図７は、ＦＳのＲＧＤペプチドによる修飾の図：（ｉ）修飾されていないＦＳ、（ｉｉ）ＮＨ２で修飾されたＦＳ、（ｉｉｉ）ＭＡＬで修飾されたＦＳ、および３回の洗浄ステップの前および後での修飾されていないおよび修飾されたＦＳに結合されたＲＧＤのパーセンテージの表を示す。
【図１】
2009535479.tif 000003
【図２】
2009535479.tif 000004
【図３】
2009535479.tif 000005
【図４】
2009535479.tif 000006
【図５】
2009535479.tif 000007
【図６】
2009535479.tif 000008
【図７】
2009535479.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月29日(2008.2.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１分子当り少なくとも２つのシラノール基を含むシラノール種と、１分子当り少なくとも２つのヒドロキシル基を含む親水性のヒドロキシル種とを混合することを含んで成る機械的可逆性ゲルの製造方法。
【請求項２】
１分子当り少なくとも２つの加水分解性基を有するシランを加水分解して、該シラノール種を生成させるステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】
該シランは、テトラアルコキシシランを含む、請求項２の方法。
【請求項４】
該シラノール種と該ヒドロキシル種とを混合するステップの前に、該親水性のヒドロキシル種と、微粒子改質剤とを混合するステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
該微粒子改質剤が、フュームドシリカを含む、請求項４に記載のいずれか１つの方法。
【請求項６】
混合ステップ後で、ｐＨを約６〜約９に調整することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
該ヒドロキシル種が、１分子当たり３〜１０のヒドロキシル基を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
それぞれの分子中の該ヒドロキシル基の少なくとも２つが、該分子の末端基である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
該ヒドロキシル種が、分枝鎖種である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
該ヒドロキシル種が、ポリエーテル鎖を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法によって製造されたゲル。
【請求項１２】
機械的せん断力を加えることによって、ゲルが液体に転化されることができ、そして該機械的せん断力がない場合に、液体が該ゲルに転化されることができる、該ゲル可逆的に会合できる会合性基を含む親水性鎖を含み、該ゲルが、１分子当り少なくとも２つのシラノール基を含むシラノール種と、１分子当り少なくとも２つのヒドロキシル基を含む親水性のヒドロキシル種とを含む、細胞を培養するためのゲル。
【請求項１３】
微粒子改質剤をさらに含む、請求項１２のゲル。
【請求項１４】
該微粒子改質剤が、フュームドシリカを含む、請求項１３のゲル。
【請求項１５】
該会合性基が、末端基である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のゲル。
【請求項１６】
該会合性基が、１分子当たり少なくとも２つの加水分解性基を含むシランから誘導されている、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のゲル。
【請求項１７】
該会合性基が、シラノール基を含む、請求項１６のゲル。
【請求項１８】
該シランが、テトラアルコキシシランである、請求項１６または請求項１７のゲル。
【請求項１９】
該親水性鎖が、ポリエーテル鎖である、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載のゲル。
【請求項２０】
該親水性鎖が、分枝鎖である、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載のゲル。
【請求項２１】
水をさらに含む、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載のゲル。
【請求項２２】
該ゲルが細胞および／またはＥＣＭを含む、請求項１１〜２１のいずれか一項に記載のゲル。
【請求項２３】
細胞を培養するための請求項１１〜２２のいずれか一項に記載のゲルの使用。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のゲルから細胞を放出させる方法であって、
該ゲルが該細胞を含み、そして、該方法が、
−該ゲルと液体とを混合すること、および、
−該液体中で該細胞の懸濁液を生成させるのに、充分な機械的せん断を該混合された液体およびゲルに加えること、
を含む、方法。
【請求項２５】
該液体が、水性液体である、請求項２４の方法。
【請求項２６】
該混合された液体およびゲル中の液体の比率が、約２５％ｖ/ｖ超である、請求項２４または請求項２５の方法。
【請求項２７】
請求項１１〜２２のいずれか一項に記載のゲルを用意すること；
−該ゲルを液体に転化させるのに充分な機械的せん断を、該ゲルに加えること；
−該液体と該物質とを混合すること；および
−該液体がゲルに戻るのに充分な時間の間、液体を液体として維持するのに不充分な機械的せん断と共に放置させること、
を含んで成る、物質をゲルに取り込む方法。
【請求項２８】
該物質が、細胞および／またはＥＣＭおよび／またはタンパク質および／または生物学的機能を有する他の分子を含む、請求項２７の方法。
【国際調査報告】
2009535479.tif 000010
2009535479.tif 000011
2009535479.tif 000012