(57)【要約】  細胞のゲノム核酸が、細胞増殖培地に直接由来する細胞のゲノム核酸の分子量よりも低い分子量を有する核酸（例えば、プラスミドDNA）から分離され得る方法が、本明細書に記載される。ゲノム核酸が、清浄された溶解物を調製する必要なく、細胞溶解物中のゲノム核酸の分子量よりも低い分子量を有する核酸から分離され得る方法も、本明細書に記載される。本発明はまた、細胞または生物のゲノム核酸（例えば、RNA、DNA）の単離方法にも関する。
2009508496.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)  i)表面が、核酸に可逆的に結合する官能基と結合した固相担体、
ii)細胞または生物、および
iii)細胞または生物の溶解および該細胞または生物のゲノム核酸の固相担体上への沈殿を生じる試薬
を合わせ、それにより混合物を生成する工程、
b)  該混合物を、細胞または生物の溶解が生じ、細胞または生物のゲノム核酸が固相担体に可逆的に結合する条件下で維持し、それにより細胞または生物のゲノム核酸が結合した固相担体を生成する工程、ならびに
c)  固相担体を該混合物から分離する工程
を含む、細胞または生物のゲノム核酸を単離する方法。
【請求項２】
c)の固相担体と、固相担体からの細胞または生物のゲノム核酸の溶出を生じる溶出バッファとを接触させる工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
固相担体が磁性微粒子を担持する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
磁性微粒子が、カルボキシル基コート表面およびアミン基コート表面からなる群より選択されるコート表面を有する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
試薬がアルコールを含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
アルコールが、エタノール、イソプロパノールおよびポリアルキレングリコールからなる群より選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
試薬がさらに塩を含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項８】
塩が、NaCl、LiClおよびMgCl2からなる群より選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
溶出バッファが水を含んでなる、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
固相担体が、磁場適用、真空ろ過適用および遠心分離適用からなる群より選択される方法を用いて該混合物から分離される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
細胞がバクテリア細胞、血液細胞、培養細胞、頬細胞およびそれらの混合物からなる群より選択され、生物がウイルスである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ウイルスが肝炎ウイルスである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ゲノム核酸がDNAまたはRNAである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
工程b)における固相担体と、DNAを除去または消化する薬剤、RNAを除去または消化する薬剤、タンパク質を除去または消化する薬剤およびそれらの混合物からなる群より選択される薬剤とを接触させる工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
a)  細胞または生物および細胞または生物の溶解を生じる試薬を合わせ、それにより第一の混合物を生成する工程、
b)  第一の混合物を、細胞または生物の溶解が生じる条件下で維持し、それにより溶解物を生成する工程、
c)  溶解物と、表面が、核酸に可逆的に結合する官能基と結合した固相担体を含む結合バッファおよび細胞または生物のゲノム核酸の固相担体上への沈殿を生じる試薬とを合わせ、それにより第二の混合物を生成する工程、
d)  該混合物を、細胞または生物のゲノム核酸が固相担体に可逆的に結合する条件下で維持し、それにより細胞または生物のゲノム核酸が結合した固相担体を生成する工程、
e)  固相担体を第二の混合物から分離する工程、ならびに
それにより細胞または生物のゲノム核酸を単離する工程
を含む、細胞または生物のゲノム核酸を単離する方法。
【請求項１６】
d)の固相担体と、細胞または生物のゲノム核酸の固相担体からの溶出を生じる溶出バッファとを接触させる工程をさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
磁性微粒子が、カルボキシル基コート表面およびアミン基コート表面からなる群より選択されるコート表面を有する、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
結合バッファがアルコールを含んでなる、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
アルコールが、エタノール、イソプロパノールおよびポリアルキレングリコールからなる群より選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
結合バッファが塩をさらに含んでなる、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
塩が、NaCl、LiClおよびMgCl2からなる群より選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
溶出バッファが水を含んでなる、請求項１５記載の方法。
【請求項２３】
磁性微粒子が、磁場適用、真空ろ過適用および遠心分離適用からなる群より選択される方法を用いて混合物から分離される、請求項１５記載の方法。
【請求項２４】
細胞がバクテリア細胞、血液細胞、培養細胞、頬細胞およびそれらの混合物からなる群より選択され、生物がウイルスである、請求項１５記載の方法。
【請求項２５】
ウイルスが肝炎ウイルスである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
工程b)における固相担体と、DNAを除去または消化する薬剤、RNAを除去または消化する薬剤、タンパク質を除去または消化する薬剤およびそれらの混合物からなる群より選択される薬剤とを接触させる工程をさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項２７】
溶解バッファ、結合バッファ、不純物を除去する薬剤および洗浄バッファを含んでなるキット。
【請求項２８】
溶解バッファが、ドデシル硫酸ナトリウム、Triton X-100、EDTAおよびTris-HClを含んでなる、請求項２７記載のキット。
【請求項２９】
結合バッファが、磁性微粒子、ポリエチレングリコールおよびヨウ化ナトリウムを含んでなる、請求項２７記載のキット。
【請求項３０】
不純物を除去する薬剤が、タンパク質を消化する薬剤である、請求項２７記載のキット。
【請求項３１】
タンパク質を消化する薬剤がプロテイナーゼKである、請求項３０記載のキット。
【請求項３２】
洗浄バッファが、ポリエチレングリコールおよび尿素を含んでなる、請求項２７記載のキット。
【請求項３３】
a)  ドデシル硫酸ナトリウム、Triton X-100、EDTAおよびTrisを含んでなる溶解バッファ、
b)  磁性微粒子、ポリエチレングリコールおよびヨウ化ナトリウムを含んでなる結合バッファ、
c)  プロテイナーゼK、ならびに
d)  ポリエチレングリコールおよび尿素を含んでなる洗浄バッファ
を含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、2003年4月2日に出願された米国特許出願第10/406,141号の一部継続出願であり、米国が指定され、2004年4月1日に出願され、英語で公開された国際特許出願PCT/US2004/009960の一部継続出願である、2005年9月20日に出願された米国特許出願第11/231,363号の継続出願である。上述の出願の全教示は参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
キャピラリー電気泳動法、ヌクレオチド配列決定、逆転写クローニング、および哺乳類細胞のトランスフェクション、形質導入または顕微注入を企図する遺伝子治療プロトコル等の多くの分子生物学的応用が、高品質な核酸調製物の単離を必要とする。
【０００３】
分子生物学適用の需要の出現により、高品質核酸調製物を作製し得るハイスループットの、好ましくは、容易に自動化可能な精製プロトコルの必要性が増大した。最近の技術進歩およびロボット工学の出現は、配列決定反応工程およびゲル読取工程の自動化を容易にしたが、核酸精製の容易に自動化可能な方法の利用の可能性によりスループットはなお制限される。
【０００４】
（発明の要旨）
本明細書に記載のように、本出願人らは、細胞または生物のゲノム核酸が、細胞または生物の培養培地から直接、細胞または生物のゲノムの核酸分子量より小さい分子量を有する核酸(例えば、プラスミドDNA)から分離され得る方法を提供する。また、本出願人らは、ゲノム核酸が、清浄溶解物を調製する必要なく、細胞または生物溶解物中のゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸から分離され得る方法を提供する。
【０００５】
伝統的なアルカリ性溶解は、以下の工程：培養培地中に希釈した細胞を濃縮またはペレット化する工程；遠心分離またはボルテックスする工程；細胞をアルカリ性洗剤で溶解する工程；溶解物を振とうおよび／または攪拌する工程；中和バッファーを添加する工程；綿状塊を除去するために試料を濾過および／または操作する工程；固相担体を添加する工程；ならびに結合バッファーを添加する工程を必要とする。一般的に、以下：固相担体の添加および結合バッファーの添加のような洗剤および塩を除去するためのさらなる精製工程が必要とされる。
【０００６】
本発明の利点は、細胞または生物のゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸から細胞または生物のゲノム核酸を分離するための単純化された手順が可能になることである。固相担体ならびに細胞または生物の溶解および固相担体への細胞または生物の核酸の沈殿を引き起こす試薬(核酸沈殿剤)を提供することにより、無傷または完全な細胞または生物からの核酸の標準的な精製プロセスから１つ以上の工程が除去され得る。さらに、固相担体および固相担体への細胞または生物の核酸の沈殿を引き起こす試薬を提供することにより、細胞または生物溶解物からの核酸の標準的な精製プロセスから１つ以上の工程が除去され得る。固相担体および試薬が細胞、生物、細胞溶解物または生物溶解物と合わされる順序は、重要ではない。固相担体ならびに固相担体への細胞または生物の核酸の沈殿および／または細胞または生物の溶解を引き起こす試薬は、細胞、生物、細胞溶解物または生物溶解物と逐次(例えば、独立した成分として；２工程で)または同時に(例えば、単一の成分として；１工程で)合わされ得る。固相担体および試薬を単一の成分に合わせた場合、本明細書に記載の方法は、細胞もしくは生物、または細胞もしくは生物の培養物への単一の試薬の添加、その後、インキュベーション、(１つ以上の)固相担体の分離、およびゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する細胞または生物の核酸からの細胞または生物のゲノム核酸の分離を達成するための選択的溶出を可能にする。本発明の方法ではpH調整は必要とされない。本明細書に記載の試薬および方法によって提供される工程数の減少は、細胞、生物、細胞溶解物または生物溶解物の核酸精製プロセスの自動化を単純化する。
【０００７】
したがって、本発明は、i)その表面に、核酸に可逆的に結合する官能基(例えば、カルボキシル基、アミン基)が結合された固相担体(例えば、磁気微粒子)、ii)細胞または生物ならびにiii)細胞または生物の溶解および固相担体への細胞または生物の核酸の沈殿を引き起こす試薬を合わせ、それにより混合物(combination)を作製する工程を含む、細胞または生物内のゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸(例えば、プラスミドDNA、エピソームDNA、ミトコンドリアDNA、細胞小器官DNA、ウイルスDNA)から細胞または生物のゲノム核酸を分離する方法に関する。混合物は、細胞または生物の溶解が起こり、細胞または生物の核酸が固相担体に可逆的に結合し、それにより細胞または生物の核酸が結合された固相担体が作製される条件下に維持される。固相担体は混合物から分離され、固相担体からのゲノム核酸よりも小さい分子量を有する核酸の溶出(選択的溶出)を引き起こす溶出バッファー(例えば、水)と接触される。ゲノム核酸は固相担体に結合したままであり、それにより、細胞または生物内のゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸からの細胞または生物のゲノム核酸の分離がもたらされる。
【０００８】
本発明はまた、i)その表面に核酸に可逆的に結合する官能基が結合された磁気微粒子、ii)細胞または生物およびiii)細胞または生物の溶解および磁気微粒子への細胞または生物の核酸の沈殿を引き起こす試薬(例えば、エタノール、イソプロパノール、ポリアルキレングリコールなどのアルコール)を合わせ、それにより混合物を作製する工程を含む、細胞のプラスミド核酸から細胞または生物のゲノム核酸を分離する方法に関する。混合物は、細胞または生物の溶解が起こり、細胞または生物の核酸が磁気微粒子に可逆的に結合し、それにより、細胞または生物の核酸が結合された磁気微粒子が作製される条件下に維持される。細胞または生物の核酸が結合された磁気微粒子は混合物から分離され、磁気微粒子からのプラスミド核酸の溶出を引き起こす溶出バッファーと接触される。ゲノム核酸は固相担体に結合したままであり、それにより、細胞または生物のプラスミド核酸からの細胞または生物のゲノム核酸の分離がもたらされる。
【０００９】
本発明はまた、i)その表面に核酸に可逆的に結合する官能基が結合された固相担体、ii)細胞または生物溶解物およびiii)固相担体への細胞または生物溶解物の核酸の沈殿を引き起こす試薬を合わせ、それにより混合物を作製する工程を含む、細胞または生物内のゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸(例えば、プラスミド核酸)から細胞または生物のゲノム核酸を分離する方法に関する。混合物は、細胞または生物の溶解物の核酸が固相担体に可逆的に結合し、それにより細胞の核酸が結合された固相担体が作製される条件下に維持される。固相担体は混合物から分離され、固相担体からのゲノム核酸よりも小さい分子量を有する核酸の溶出を引き起こす溶出バッファーと接触される。ゲノム核酸は固相担体に結合したままであり、それにより、細胞または生物内のゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸から細胞または生物のゲノム核酸が分離される。
【００１０】
本発明の方法において、ゲノム核酸が結合された固相担体は、任意の適当な手段(例えば、磁気手段、遠心分離)を用いて、ゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸を含む溶出液から分離され得る。次いで、固相担体は、固相担体からのゲノム核酸の溶出を引き起こす適当な溶出バッファーと接触され得る。
【００１１】
本発明はまた、i)その表面に核酸に可逆的に結合する官能基が結合された固相担体、ii)細胞または生物ならびにiii)細胞または生物の溶解および固相担体への細胞または生物の核酸の沈殿を引き起こす試薬を合わせ、それにより混合物を作製する工程を含む、細胞(例えば、原核生物細胞、哺乳動物細胞などの真核生物細胞)または生物(例えば、ウイルス、バクテリア、寄生虫、真菌などの病原体)のゲノム核酸(例えば、RNA、DNA)の単離方法に関する。混合物は、細胞または生物の溶解が起こり、細胞または生物のゲノム核酸が固相担体に可逆的に結合し、それにより細胞または生物のゲノム核酸が結合された固相担体が作製される条件下に維持される。次いで、固相担体は混合物から分離され、それにより細胞または生物のゲノム核酸が単離される。固相担体は、固相担体からのゲノム核酸の溶出を引き起こす溶出バッファーと接触され得る。
【００１２】
特別な態様において、本発明は、細胞または生物および細胞もしくは生物の溶解を引き起こす試薬を合わせ、それにより第１の混合物を作製する工程；ならびに第１の混合物を細胞または生物が溶解される条件下に維持し、それにより溶解物を作製する工程を含む、細胞または生物のゲノム核酸の単離方法に関する。溶解物は、その表面に核酸に可逆的に結合する官能基が結合された固相担体および固相担体への細胞または生物の核酸の沈殿を引き起こす試薬を含む結合バッファーと合わされ、それにより第２の混合物が作製される。第２の混合物は、細胞または生物のゲノム核酸が固相担体に可逆的に結合する条件下に維持され、それにより、細胞または生物のゲノム核酸が結合された固相担体が作製される。次いで、固相担体は第２の混合物から分離され、それにより細胞または生物のゲノム核酸が単離される。該方法は、固相担体を固相担体からのゲノム核酸の溶出を引き起こす溶出バッファーと接触することをさらに含み得る(can further comprising)。
【００１３】
本発明はまた、本明細書に記載の方法における使用のためのキットに関する。一態様において、キットは、溶解バッファー、結合バッファー、不純物を除去する薬剤および洗浄バッファーを含む。溶解バッファーは、ドデシル硫酸ナトリウム、Triton X-100、EDTAおよびTris-HClを含み得る。結合バッファーは、磁気微粒子、ポリエチレングリコールおよびヨウ化ナトリウムを含み得る。不純物を除去する薬剤は、プロテイナーゼKなどのタンパク質を消化する薬剤、DNAを消化する薬剤(例えば、DNase)および／またはRNAを消化する薬剤(例えば、RNase)を含み得る。洗浄バッファーは、ポリエチレングリコールおよび尿素を含み得る。特別な態様において、キットは、i)ドデシル硫酸ナトリウム、Triton X-100、EDTAおよびTrisを含む溶解バッファー；ii)磁気微粒子、ポリエチレングリコールおよびヨウ化ナトリウムを含む結合バッファー；iii)プロテイナーゼK；ならびにiv)ポリエチレングリコールおよび尿素を含む洗浄バッファーを含む。
【００１４】
本特許または出願(application file)は、カラーで作製された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（１つまたは複数）を含むこの特許または特許出願公開公報の複写は、請求し、必要な費用を支払うと米国特許庁から提供される。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本明細書に記載のように、本発明は、最小限の数の工程を用いて、細胞および／または生物のゲノム核酸が、ゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する細胞または生物の核酸(例えば、プラスミドDNA)から分離され得る方法を提供する。分離は、細胞または生物をペレット化する必要なく、細胞または生物培養物において直接行なわれる。また、本明細書に記載の方法は、従来の方法(例えば、遠心分離、化学的処理)を用いてゲノム核酸の溶解物を清浄にする必要なく、細胞または生物溶解物において直接行なわれ得る。細胞の核酸が主に内在性核酸(例えば、DNA、RNA)である特別な態様において、本発明は、細胞または生物の内在性核酸(例えば、ゲノム核酸(例えば、DNA、RNA)、ミトコンドリア核酸、ミトコンドリアRNA、トランスファーRNA、マイクロRNA、メッセンジャーRNA)が細胞または生物から単離される方法を提供する。該方法はまた、細胞または生物(organsim)の種々の種の内在性核酸を互いに分離する(例えば、内在性RNAから内在性DNAを分離する)ために使用され得る。
【００１６】
本発明は、核酸を単離するための方法および試薬を提供する。本明細書に記載の試薬は、細胞または生物を、固相担体ならびに細胞または生物の溶解および固相担体への細胞または生物の核酸の沈殿を引き起こす試薬と合わせることにより、細胞または生物のゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸から、(１つ以上の)細胞または生物のゲノム核酸を分離するために使用され得る。あるいは、本明細書に記載の試薬は、細胞または生物溶解物を、固相担体ならびに固相担体への細胞または生物溶解物の核酸の沈殿を引き起こす試薬と合わせることにより、細胞または生物溶解物のゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸から、細胞または生物のゲノム核酸溶解物を分離するために使用され得る。次いで、細胞または生物のゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸は、固相担体から選択的に溶出される。また別の態様において、本明細書に記載の試薬は、細胞または生物を、固相担体ならびに細胞または生物の溶解および固相担体への細胞または生物のゲノム核酸の沈殿を引き起こす試薬と合わせることにより、細胞または生物のゲノム核酸(１種類以上)を単離するために使用され得る。
【００１７】
本明細書に記載のように、該方法は、細胞、生物、細胞溶解物または生物溶解物の核酸を、官能基コート表面(例えば、カルボキシルコート表面)を有する固相担体(例えば、磁気微粒子)に非特異的および可逆的に結合することを含む。次いで、微粒子は、例えば、磁気微粒子が下方に引かれるように磁場をかけることにより上清から分離される。次いで、残りの溶液(例えば、上清)は除去され得、核酸が結合された微粒子が残る。いったん上清から分離されると、微粒子は、細胞または生物のゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸を選択的に溶出する溶出バッファーと接触され得る。その結果、未結合核酸(細胞または生物のゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する細胞または生物の核酸)ならびに細胞または生物のゲノム核酸がまだ結合された磁気微粒子を含む溶出バッファーが作製される。細胞または生物のゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸を溶出するために使用される溶出バッファーは、核酸沈殿試薬の濃度が磁気微粒子へのゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸の結合に必要とされる範囲未満である溶液である。細胞または生物の本質的にすべての核酸がゲノム核酸である態様では、次いで、微粒子が微粒子からゲノム核酸を溶出させる溶出バッファーと接触される。一態様において、溶離剤は水である。また、スクロース(20%)およびホルムアミド(100%)溶液は、核酸を溶出するために使用され得る。低イオン強度の溶出バッファー、例えば水が使用される場合、微粒子からの核酸の溶出は30秒以内に起こる。結合された核酸がいったん溶出されたら、磁気微粒子は、溶出された核酸を含む溶出バッファーから分離され得る。好ましくは、磁気微粒子は、磁気手段によって溶出バッファーから分離される。当業者に公知の他の方法を用いて上清から磁気微粒子が分離され得る。例えば、濾過または遠心分離が使用され得る。
【００１８】
一態様において、未結合核酸(例えば、細胞または生物のゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する細胞または生物の核酸)を含む溶出バッファーからいったん除去されたら、細胞または生物のゲノム核酸がまだ結合している磁気微粒子もまた、磁気微粒子から細胞または生物のゲノム核酸を溶出するための適当な溶出バッファーと接触され得る。除去されたゲノム核酸は、例えば、アガロースゲル解析、PCR増幅、制限酵素消化、診断的および／または治療的解析、ヒト身元確認試験、膜ハイブリダイゼーション(例えば、サザンおよびドット/スロットブロット)ならびにAFLP、RFLP、RAPD、マイクロサテライトおよびSNP解析(例えば、遺伝子型分類、フィンガープリンティングなどのため)に使用され得る。
【００１９】
種々の組成および複雑性の出発溶液からの高品質核酸調製物の単離は、分子生物学において基礎的な技術である。本明細書に記載の試薬および方法の結果、ゲノム核酸よりも小さい分子量を有する核酸からのゲノム核酸の分離の高速で容易に自動化可能な方法がこれで利用可能になる。開示された方法によって単離された核酸は、DNA配列決定鋳型の調製、哺乳動物細胞の顕微注入、トランスフェクションまたは形質転換、RNAiペアピンのインビトロ合成、逆転写クローニング、cDNAライブラリー構築、PCR増幅、および遺伝子療法研究などの高品質核酸を必要とする分子生物学適用、ならびに限定されないが、形質転換、制限エンドヌクレアーゼまたはマイクロアレイ解析、選択的RNA 沈殿、インビトロ転位、多様なPCR増幅産物の分離、DNAプローブおよびプライマーの調製ならびに鋳型なし(detemplating)プロトコルを含む品質要件があまり厳しくない他の適用に使用され得る。
【００２０】
本明細書に記載の試薬および方法は、その内容が参照により本明細書に援用される米国特許第5,705,628号；同第5,898,071号；同第6,534,262；米国特許公開第2002/0106686号およびWO 99/58664に記載のものを含む、種々の核酸精製技術とともに使用され得る。
【００２１】
一態様において、本発明は、i)その表面に核酸に可逆的に結合する官能基が結合された固相担体、ii)細胞または生物ならびにiii)細胞または生物の溶解および固相担体への細胞の核酸の沈殿を引き起こす試薬を合わせ、それにより混合物を作製することを含む、細胞または生物内のゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸(例えば、プラスミドDNA)から細胞または生物のゲノム核酸を分離する方法に関する。混合物は、細胞または生物の溶解が起こり、細胞または生物の核酸が固相担体に可逆的に結合し、それにより細胞または生物の核酸が結合された固相担体が作製される条件下に維持される。固相担体は混合物から分離され、固相担体からのゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸溶出を引き起こすが、固相担体からのゲノム核酸の溶出は引き起こさない溶出バッファーと接触され、それにより、細胞または生物内のゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸から細胞または生物のゲノム核酸が分離される。
【００２２】
別の態様において、本発明は、i)その表面に核酸に可逆的に結合する官能基が結合された固相担体、ii)細胞または生物溶解物およびiii)固相担体への細胞または生物溶解物の核酸の沈殿を引き起こす試薬を合わせ、それにより混合物を作製することを含む、細胞または生物内のゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸から細胞または生物のゲノム核酸を分離する方法に関する。混合物は、細胞または生物溶解物の核酸が固相担体に可逆的に結合する条件下に維持され、それにより細胞または生物の核酸が結合された固相担体が作製される。固相担体は混合物から除去され、固相担体からゲノム核酸よりも小さい分子量を有する核酸の溶出を引き起こすが、固相担体からのゲノム核酸の溶出は引き起こさない溶出バッファーと接触され、それにより、細胞または生物内のゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸から細胞または生物のゲノム核酸が分離される。
【００２３】
本発明は、さらに、細胞または生物内のゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸から細胞または生物のゲノム核酸を分離する方法であって、低分子量を有する核酸が手動またはハイスループット自動配列決定方法のいずれかで使用するのに適当である方法に関する。
【００２４】
本発明はまた、細胞(例えば、原核生物細胞、哺乳動物細胞などの真核生物細胞)または生物(例えば、ウイルス、バクテリア、ミコバクテリウム、寄生虫、真菌などの病原体)の内在性核酸(例えば、RNA、DNA)の単離方法に関する。本明細書で使用されるように、「細胞または生物の内在性核酸」は、細胞または生物において通常見出される核酸(細胞または生物が天然に生じる場合は細胞または生物に見出される核酸)をいう。
【００２５】
一態様において、本発明は、i)その表面に核酸に可逆的に結合する官能基が結合された固相担体、ii)細胞または生物ならびにiii)細胞または生物の溶解および固相担体への細胞の核酸の沈殿を引き起こす試薬を合わせ、それにより混合物を作製することを含む、細胞または生物のゲノム核酸の単離方法に関する。混合物は、細胞または生物の溶解が起こり、細胞または生物のゲノム核酸が固相担体に可逆的に結合し、それにより細胞または生物のゲノム核酸が結合された固相担体が作製される条件下に維持される。次いで、固相担体は混合物から分離され、それにより細胞または生物のゲノム核酸が単離される。固相担体は、固相担体からのゲノム核酸の溶出を引き起こす溶出バッファーと接触され得る。
【００２６】
一態様において、本発明は、細胞および細胞または生物の溶解を引き起こす試薬を合わせ、それにより第１の混合物を作製する工程；ならびに第１の混合物を細胞または生物が溶解される条件下に維持し、それにより溶解物を作製する工程を含む、細胞または生物のゲノム核酸の単離方法に関する。溶解物は、その表面に核酸に可逆的に結合する官能基が結合された固相担体を含む結合バッファーおよび固相担体への細胞または生物の核酸の沈殿を引き起こす試薬と合わされ、それにより第２の混合物が作製される。第２の混合物は、細胞または生物のゲノム核酸が固相担体に可逆的に結合し、それにより、細胞または生物のゲノム核酸が結合された固相担体が作製される条件下に維持される。次いで、固相担体は第２の混合物から分離され、それにより細胞または生物のゲノム核酸が単離される。該方法は、固相担体を固相担体からのゲノム核酸の溶出を引き起こす溶出バッファーと接触することをさらに含み得る。
【００２７】
別の態様において、本明細書に記載のゲノム核酸の単離方法は、例えば、ウイルスのゲノム核酸を単離するために使用され得る。この態様において、該方法は、i)その表面に核酸に可逆的に結合する官能基が結合された固相担体、ii)ウイルスならびにiii)ウイルスの溶解および固相担体上へのウイルスの核酸の沈殿を引き起こす試薬を合わせ、それにより混合物を作製することを含む。混合物は、ウイルスの溶解が生じ、ウイルスのゲノム核酸が固相担体に可逆的に結合し、それにより、ウイルスのゲノム核酸が結合された固相担体が作製される条件下に維持される。次いで、固相担体は混合物から分離され、それにより、ウイルスのゲノム核酸が単離される。固相担体は、固相担体からのゲノム核酸の溶出を引き起こす溶出バッファーと接触され得る。あるいは、ウイルスは、まず、ウイルスの溶解を引き起こす薬剤と接触され、次いで、その表面に核酸に可逆的に結合する官能基が結合された固相担体および固相担体上へのウイルスの核酸の沈殿を引き起こす試薬と接触され得る。
【００２８】
ゲノム核酸の単離方法において、該方法は、非ゲノムである核酸の除去を容易にする薬剤(例えば、ゲノム核酸がDNAである場合はRNase；ゲノム核酸がRNAである場合はDNase；タンパク質を除去するためのプロテイナーゼ(例えば、プロテイナーゼK))の添加をさらに含み得る。
【００２９】
本明細書に記載の方法はまた、細胞または生物からRNA(例えば、内在性RKA)を単離するために使用され得る。一態様において、該方法は、i)その表面に核酸に可逆的に結合する官能基が結合された固相担体、ii)細胞または生物ならびにiii)細胞または生物の溶解および固相担体への細胞の核酸の沈殿を引き起こす試薬を合わせ、それにより混合物を作製することを含む。混合物は、細胞または生物の溶解が起こり、細胞または生物の内在性核酸が固相担体に可逆的に結合し、それにより、細胞または生物の内在性核酸が結合された固相担体が作製される条件下に維持される。特別な態様において、固相担体は、次いで、DNAを除去または消化する薬剤と接触され、DNAが除去または消化され、RNAがインタクトなままである(RNAは除去もしくは消化されない)条件下に維持される。DNAを除去する薬剤が固相担体から核酸(例えば、DNA、RNA)を溶出する溶液中(例えば、水性)にある場合、固相担体は、次いで、固相担体上へのRNAの沈殿を引き起こす試薬と接触される。次いで、固相担体は混合物から分離され、それにより、細胞または生物のRNAを単離する。固相担体は、固相担体からのRNAの溶出を引き起こす溶出バッファーと接触され得る。
【００３０】
RNAを単離する別の態様において、該方法は、細胞および細胞または生物の溶解を引き起こす試薬合わせ、それにより第１の混合物を作製する工程；ならびに第１の混合物を細胞または生物が溶解される条件下に維持し、それにより溶解物を作製する工程を含む。溶解物は、その表面に核酸に可逆的に結合する官能基が結合された固相担体を含む結合バッファーおよび固相担体への細胞または生物の核酸の沈殿を引き起こす試薬と合わされ、それにより第２の混合物が作製される。特別な態様において、固相担体は、次いで、DNAを除去または消化する薬剤と接触され、DNAが除去または消化され、RNAがインタクトなままである(RNAは除去もしくは消化されない)条件下に維持される。DNAを除去する薬剤が固相担体から核酸(例えば、DNA、RNA)を溶出する溶液(例えば、水性)である場合、固相担体は、次いで、固相担体上へのRNAの沈殿を引き起こす試薬と接触される。次いで、固相担体は混合物から分離され、それにより、細胞または生物のRNAを単離する。固相担体は、固相担体からのRNAの溶出を引き起こす溶出バッファーと接触され得る。
【００３１】
本明細書に記載の方法は、容易に自動化可能なヌクレオチド配列決定のためのプラスミドDNA鋳型の単離方法である。本明細書に記載の試薬の使用は、代替的な容易に自動化可能な核酸分離手段をもたらす。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「分離する」または「単離する」は、問題の物質が天然に存在する環境とは異なる物理的環境に存在し、かつ／または他の核酸分子もしくは細胞成分(例えば、細胞膜、細胞小器官)から完全、実質的にもしくは部分的に分離、単離もしくは精製されていることを意味することが意図される。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」および「核酸分子」は、用語ポリヌクレオチドと同義語的に使用され、DNA（例えば、単鎖、二本鎖、共有結合により近接した（covalently closed）形態、およびほどけて環状化した（relaxed circular）形態）、RNA（例えば、単鎖および二本鎖）、RNA/DNAハイブリッドおよびポリアミド核酸（PNA）を包含することが意味される。
【００３４】
「ゲノム核酸」は、細胞または生物に存在するゲノムまたは染色体核酸をいう。典型的に、ゲノムまたは染色体核酸の分子量 は、約500キロ塩基(kb)(例えば、マイコプラスマ)〜約500ギガ塩基(Gb)である。特別な態様において、ゲノムまたは染色体核酸の分子量は、約1000kb〜約250Gb(例えば、タマネギ)；約10,000kb〜約5Gb；約100,000kb〜約1Gb；および約500,000kb〜1,000,000kbの範囲である。ゲノム核酸はDNAまたはRNAであり得る。
【００３５】
「細胞または生物のゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸」は、細胞または生物に存在し、内在性または外来性核酸であり得るゲノムまたは染色体核酸以外の核酸をいう。細胞または生物内のゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸は、典型的に、約1kb〜約250,000kb(例えば、BAC)の分子量を有する。特別な態様において、細胞または生物内のゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸は、約5kb〜約100,000kb；約100kb〜約10,000kb；および約1000kb〜約5000kbの範囲である。本明細書で使用されるように、「内在性核酸」(宿主細胞核酸)は、細胞または生物を入手したときに細胞または生物に存在する核酸をいう。「外来性核酸」(異種核酸；組換え核酸)は、入手した細胞または生物(例えば、トランスフェクト細胞または生物、形質導入細胞または生物)に存在しない核酸をいう。外来性核酸は、細胞もしくは生物への導入、または細胞もしくは生物の祖先への導入の結果、細胞または生物に存在し得る。外来性核酸は、当業者に公知の手段(例えば、形質転換またはトランスフェクション)によって細胞もしくは生物またはその祖先に直接または間接的に導入され得る。細胞または生物に導入される外来性核酸の例としては、バクテリア人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、プラスミド、コスミド、P1ベクターおよび増幅プロセス(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR))により導入された核酸が挙げられる。本明細書で使用されるように、用語「プラスミド」は、外来性供給源に由来し(例えば、宿主細胞に導入される)、宿主染色体DNAと独立して自己複製し得る二本鎖環状DNA種をいう。したがって、該用語は、任意の上記のベクターの複製から生成されたクローニングされたDNAを包含する。細胞に核酸を導入するために使用されるベクターの例としては、pUC、pOT、pBluescript、pGEM、pTZ、pBR322、pSC101、pACYC、SuperCosおよびpWE15が挙げられる。あるいは、外来性核酸は、核酸がパッケージされたファージから細胞または生物に導入され得る(例えば、コスミド、P1)。「細胞または生物内のゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸」のさらなる例としては、限定されないが、エピソーム核酸、ミトコンドリア核酸、細胞小器官核酸、RNA、siRNA、プラスチド、微小染色体、細胞小器官核酸、プライマー、ウイルス核酸、バクテリア核酸および他の病原体由来の核酸が挙げられる。
【００３６】
「固相担体」は、核酸が沈殿され得る条件下で本質的に不溶性である実体である。本発明の方法における使用のための適切な固相担体は、効率的な結合を可能にする十分な表面積を有し、核酸に可逆的に結合し得る表面を有することによってさらに特徴付けられる。適切な固相担体としては、限定されないが、核酸に対して親和性を有し、固相の表面積を最大にし、かつ微小規模の操作に影響を受けやすい担体を具体化する場合には、形態が規則的または不規則的のいずれかである種々の形状を具体化し得る、微粒子、繊維、ビーズおよび支持体が挙げられる。１つの態様において、固相担体は、常磁性、例えば、常磁性微粒子（磁気応答性）である。別の態様において、固相担体としては、官能基コート表面が挙げられる。例えば、固相担体はアミンコート常磁性微粒子、カルボキシルコート常磁性微粒子、またはカプセル化されたカルボキシル基コート常磁性微粒子であり得る。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「常磁性微粒子」は、外部磁場（例えば希土（例えばネオジム）磁石が埋め込まれたプラスチックチューブまたはマイクロタイタープレートホルダー）に応答するが、磁場が除去されると消磁する微粒子をいう。従って、常磁性微粒子は、磁石を使用して溶液から効率的に分離されるが、磁気的に誘導される凝集が起こることなしに容易に再懸濁され得る。好ましい常磁性微粒子は、純粋なポリマー殻によってカプセル化された磁鉄鉱富化核を含む。適切な常磁性微粒子は、約20〜35%の磁鉄鉱/カフ゜セル化比を含む。例えば、約23%、25%、28%、30%、32%または34%の磁鉄鉱/カプセル化比を含む磁性粒子は、本発明における使用に適切である。約20%未満の比を含む磁性粒子は、磁気分離を達成するために使用される磁石にわずかに弱く引き付けられる。宿主細胞の性質、細胞成長速度およびベクターの性質(例えば、多数または少数のコピー)に依存して、より高いパーセンテージの磁鉄鉱を含む常磁性微粒子が考慮されるべきである。表面に露出された鉄またはFe3O4を有さないカプセル化された常磁性微粒子の使用によって、単離されたDNAの特定の下流の操作においてポリメラーゼ機能に鉄が干渉する可能性が排除される。しかし、磁鉄鉱の核が大きいほど、カプセル化漏出の機会（例えば酸化鉄の放出）はより大きくなる。本発明において使用するための適当な常磁性微粒子は、例えば、Bangs Laboratories Inc.、Fishers、IN (例えば、estapor(登録商標)カルボキシレート修飾カプセル化磁気マイクロスフィア)、Agencourt BiosciencesおよびSeradynから入手され得る。
【００３８】
適切な常磁性微粒子は、例えば磁気的手段またはろ過による溶液からの分離が困難でない大きさであるべきである。また、好ましい常磁性微粒子は、それほど大きくあるべきではないため、表面積が最小であるかまたは微小規模の操作には適切でない。適切な大きさは、約0.1平均直径〜約100平均直径の範囲である。好ましい大きさは、約1.0平均直径である。適切な磁性微粒子は、PerSeptive Diagnosticsから市販されており、BioMag COOHと称される。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「官能基コート表面」は、核酸（例えばDNA、RNAまたはポリアミド核酸（PNA））に可逆的に結合する部分でコートされた表面をいう。一例は、アミノシランのアミノ基または微粒子に結合される遊離官能基を各々が有する部分でコートされた表面である；その結果として、微粒子の表面は官能基含有部分でコートされる。官能基は、沈殿核酸（例えばポリアルキレングリコール沈殿DNA）に対するバイオアフィニティー吸着体として作用する。一態様において、官能基はカルボン酸である。遊離カルボン酸官能基を有する適切な部分は、カルボン酸基の１つがアミド結合を介してアミノシランのアミンに結合され、第２のカルボン酸が結合されず、常磁性微粒子の表面に付着またはつなぎ留められる遊離カルボン酸基を生じるコハク酸部分である。カルボン酸コート磁性粒子は、PerSeptive Diagnostics (BioMag COOH)から市販される。可逆的に核酸分子を結合する官能基コート表面を有する適切な固相担体は、例えば、非限定的にアミノコート常磁性微粒子、カルボキシルコート常磁性微粒子およびカプセル化カルボキシル基コート常磁性微粒子のような官能基コート表面を有する磁気応答性固相担体である。
【００４０】
適切な出発材料としては、生物、細胞(無傷または完全細胞)、組織(例えば、固体組織、パラフィン包埋組織)、細胞溶解物 (培養中または培地中の細胞)およびかかる細胞または生物から調製される溶解物が挙げられる。一態様において、出発材料は、クエン酸塩、EDTAまたはヘパリン抗凝固剤を含有し得る新鮮または凍結血液(例えば、全血)および血清である。別の態様において、出発材料は頬細胞である。適切な出発材料としては、哺乳動物 (すなわち、ヒト、霊長類(チンパンジー)、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、マウス)組織または体液のいずれかから得た細胞およびかかる細胞から調製された溶解物が挙げられる。したがって、核酸(例えば、ゲノム核酸；ゲノム核酸の分子量より小さい分子量を有する核酸)を有する任意の型の細胞または生物が使用され得る。本発明の方法の使用のための細胞の例は、限定されないが、哺乳動物細胞（例えば、全血細胞のような血液細胞）、バクテリア細胞（例えば、DH5、DH10B、DH12S、C600又はXL-1 Blueのような大腸菌）、酵母細胞、植物細胞、組織細胞（例えば、線虫、マウス尾部、ヒト生検由来の細胞）ならびに宿主細胞染色体DNAおよび他の宿主細胞生体分子から単離のために標的となる外来性核酸（例えば、組換えＤＮＡ、バクテリアＤＮＡまたは複製型ＤＮＡ）を含む宿主細胞が挙げられる。生物の例としては、ウイルス(例えば、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス)、バクテリア、ミコバクテリア(M. bovis BCG、M. leprae、M. tuberculosis)、真菌(例えば、C. cerevisiae、C. albicansなどの酵母)、および寄生虫 (例えば、Leishmania)が挙げられる。あるいは、出発材料は、かかる細胞から調製された溶解物であり得る。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」または「宿主生物」は外来性核酸が導入され得、それによって宿主細胞または生物核酸の他に、外来性核酸を含む宿主細胞または宿主生物を生じる任意の細胞である。本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞または生物核酸」および「内在性核酸」とは、宿主細胞または生物を得たときに該細胞または生物に存在する核酸種（例えば、ゲノムまたは染色体核酸）のことをいう。本明細書で使用される場合、用語「外来性」とは、宿主細胞または生物核酸（例えば、プラスミド）以外の核酸のことをいい；外来性核酸は、宿主細胞または生物に導入されるか、あるいは宿主細胞または生物の祖先に導入される結果として、宿主細胞または生物中に存在し得る。このように、例えば、特定の宿主細胞または生物に外来性である核酸種は、非内在性である（得られたときの宿主細胞もしくは生物または宿主細胞もしくは生物の祖先には存在しない）核酸種である。適切な宿主細胞としては、限定されないが、バクテリア細胞、酵母細胞、植物細胞および哺乳動物細胞が挙げられる。
【００４２】
本明細書に記載のように、本発明の利点は、最小限の数の工程を用いて、細胞または生物のゲノム核酸が、ゲノム核酸の分子量よりも小さい分子量を有する細胞または生物の核酸から分離され得ることである。本明細書に記載のように、分離は、細胞または生物をペレット化する必要なく、細胞または生物培養物において直接行なわれる。また、該方法は、細胞または生物溶解物において行なわれ得、このとき、本発明の方法は、内在性核酸の分子量よりも小さい分子量を有する核酸から細胞または生物のゲノム核酸を分離するために溶解物を清浄にすることを不必要にする。細胞または生物の本質的にすべての核酸が内在性核酸(例えば、DNA、RNA)である態様では、本明細書に記載の方法は、細胞または生物から内在性核酸(例えば、ゲノム核酸；全RNA)の特定の種を単離するために使用され得る。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「溶解物」は、ゲノム核酸およびゲノム核酸よりも小さい分子量を有する核酸を含有する細胞または生物の成分を含有し、任意の手段によって細胞膜が破壊され、その結果その核酸を含む細胞または生物の含有物が溶液中に存在する溶液である。「清浄化溶解物」は、細胞または生物の染色体またはゲノム核酸、タンパク質および膜が、溶解物の化学処理または遠心分離によるなどして除去された溶解物である。細胞または生物は公知の方法を用いて溶解され、それによって本発明の方法での使用に適切な混合物を調製する。例えば、細胞または生物は化学手段（例えば、アルカリまたはアルカリおよび陰イオン洗浄剤処理）、等張ショック、または物理的破壊（例えば、ホモジネーション）を用いて溶解され得る。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞溶解懸濁物」または「宿主生物溶解懸濁物」は、何らかの手段（例えば、アルカリもしくはアルカリおよび陰イオン洗浄剤処理、等張性ショック等の化学的、またはホモジネーションによる物理的破壊）により膜が破壊された宿主細胞または生物を含む懸濁物について言い；かかる懸濁物は宿主細胞生体分子、細胞内容物および破壊された膜残屑の混合物である。一態様において、本発明での使用に適した宿主細胞または生物溶解懸濁物は、宿主細胞または生物とアルカリおよび陰イオン洗浄剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS））溶液（例えば0.2N NaOH、1% SDS）とを接触させることにより調製される。任意に、リゾチームは溶解バッファに含まれ得る。溶解溶液中の陰イオン洗浄剤の存在は、タンパク質の有効な電荷を中和することによる抗タンパク質環境を作り出すために機能し、それにより官能基コート常磁性微粒子の表面へのタンパク質の誘引を最小限にする。一態様において、宿主細胞または生物溶解懸濁物は非中和性である。任意に、宿主細胞RNAを分解し、それにより、RNAなし、または本質的なしでDNAが磁気微粒子に結合するのを可能にするために、宿主細胞または生物溶解物にRNaseが添加され得る。
【００４５】
本発明の方法によれば、細胞または生物は、固相担体および細胞または生物の核酸が固相担体に非特異的および可逆的に結合することを引き起こす試薬と合わされる。
【００４６】
「非特異的核酸結合」は、種々の核酸分子の核酸配列または大きさの違いに関わらず、常磁性微粒子にほぼ類似した親和性でもって異なる核酸分子が結合することをいう。本明細書中で使用される場合、「容易化された吸着」は、沈殿試薬（例えば、ポリアルキレングリコール）が、最初混合物中に存在したある種のDNA分子の固相担体の表面への沈殿、その後の吸着を促進するために使用されるプロセスをいう。その結果の可逆的相互作用は、例えば、その組成または配列に基づいて特定の生体分子を単離する目的のために従来使用される２つの結合パートナーの間の相互作用(例えば、ストレプトアビジン/ビオチン、抗体/抗原または配列特異的相互作用)とは異なる。
【００４７】
「核酸沈殿試薬」または「核酸沈殿剤」または「クラウディング（crowding）試薬」は、細胞または生物の核酸を溶液へ放出させる組成物である。適切な沈殿剤としては、アルコール（例えば、エタノールまたはイソプロパノール等の短鎖アルコール）およびポリ-OH化合物（例えば、ポリアルキレングリコール）が挙げられる。核酸沈殿試薬は、1つ以上のこれらの薬剤を含み得る。核酸沈殿試薬は、固相担体に細胞の核酸を非特異的および可逆的に結合させる十分な濃度で存在する。
【００４８】
本発明の方法の使用のための適切なアルコール（例えば、エタノール、イソプロパノール）濃度（最終濃度）は、約40%〜約60%;約45%〜約55%;および約50%〜約54%である。
【００４９】
適切なポリアルキレングリコールとしては、ポリエチレングリコール（PEG）およびポリプロピレングリコールが挙げられる。適切なPEGは、Sigma（Sigma Chemical Co., St. Louis MO., 分子量8000, DnaseおよびRnase fee, からログ番号25322-68-3）から入手可能である。ポリエチレングリコール（PEG）の分子量は、約6000〜約10,000、約6000〜約8000、約7000〜約9000、約8000〜約10,000の範囲であり得る。特定の態様において、約8000の分子量を有するPEGが用いられる。一般に、PEGの存在は、溶液から親水性核酸分子を追い出す疎水性溶液を提供する。１つの態様において、PEG濃度は、約5%〜約20%である。他の態様において、PEG濃度は、約7%〜約18%;約9%〜約16%;および約10%〜約15%の範囲である。
【００５０】
上記のように、出発材料が細胞または生物である態様において、試薬は、細胞または生物の溶解を引き起こすように配合される。種々の溶解成分(アルカリ、アルカリおよびアニオン系洗剤処理または等張性ショックなど)は、膜の破壊を引き起こすために使用され得る。細胞または生物の溶解を引き起こす試薬は、例えば、水酸化ナトリウム(NaOH)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、Triton、ラウリルサルコシンナトリウムおよび／またはイソチオシアン酸グアニジンを含み得る。一態様において、試薬の溶解成分は、アルカリ(NaOH)および／またはアニオン系洗剤(例えば、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS))溶液(例えば、細胞に添加する場合は、0.2N NaOH、1%SDSの最終濃度)である。任意に、リゾチームが第１の試薬の溶解成分に含まれ得る。溶解成分中のアニオン系洗剤の存在は、タンパク質の有効電荷を中和して、抗タンパク質環境を作製するために機能し、それにより、固相担体(例えば、官能基コート常磁性微粒子)の表面へのその誘引を最小限にする。任意に、宿主細胞RNAを分解し、それにより、RNAなし、または本質的なしでDNAが固相担体に結合するのを可能にするために、溶解成分にRNase (例えば、1.75ng/μl RNase/ddH2O)が添加され得る。RNase工程を含む必要性は、実施される特定の核酸沈殿において単離のために標的化される核酸種の大きさによって大きく決定される。例えば、単離に選択された条件が少なくとも4,000塩基対を含む核酸の単離に適切である場合、RNA種が認識可能な汚染物質になることは起こりにくい。
【００５１】
上記の方法で使用される試薬は、細胞または生物からの核酸の単離に有用である。この試薬は、核酸沈殿剤および固相担体を含有し、また、細胞(１種または複数)または生物(１種または複数)の溶解を引き起こすように配合され得る。核酸沈殿剤は、細胞または生物の核酸を沈殿させるのに充分な濃度である。この試薬中の固相担体は、細胞または生物の核酸に結合する表面を含む。試薬の成分は、単一の試薬または別個の成分として含有され得る。該成分は細胞と同時または逐次合わされ得る。混合物の要素が合わされる順序は重要でない。試薬中に含有される成分の性質および量は、上記の方法で記載のとおりである。試薬は、本明細書の方法において記載の機能およびまたは濃度を得るために希釈が必要とされるように、濃縮形態で配合され得る。
【００５２】
任意に、固相担体への細胞の核酸の沈殿を引き起こすために塩が試薬に添加され得る。単離のために標的化される核酸分子の磁気応答性微粒子への吸着を容易にするのに有用な適当な塩としては、塩化ナトリウム(NaCl)、塩化リチウム(LiCl)、塩化バリウム(BaCl2)、塩化カリウム(KCl)、塩化カルシウム(CaCl2)、塩化マグネシウム(MgCl2)およびセシウム(CsCl) が挙げられる。一態様において、塩化ナトリウムが使用される。一般に、塩の存在は、核酸分子の負電荷の斥力を最小限にする機能を果たす。該方法での使用に適した広範な塩は、多くの他の塩もまた使用され得、当業者によって適当なレベルが経験的に決定され得ることを示す。塩濃度は、約0.1M〜約0.5M；約0.15M〜約0.4M；約2M〜約4Mであり得る。
【００５３】
高塩濃度(例えば、高イオン強度と同義)では、適当な常磁性微粒子があらゆる大きさのDNA断片を吸着する。用語「高塩濃度」は、約0.5Mより大きい塩濃度をいう。「低塩濃度」(または低イオン強度)では、本明細書で使用される場合は約0.2M未満の濃度を意味し、12%(重量/容量)という高いPEG濃度の存在下であっても、本質的にどのような大きさのDNAも沈殿しない(Lis、John T、Methods in Enzymology 65：437-353 (1980)。試薬にはさらなる成分が添加され得る。一態様において、RNaseが核酸沈殿剤に添加される。
【００５４】
本発明の方法により、該組合せから核酸コート固相担体を除去して細胞または生物の核酸分子の単離を完遂する。固相担体（例えば、常磁性微粒子）は第一の組合せから、例えば真空ろ過、遠心分離により、または磁場にかけて固相担体（例えば、常磁性微粒子）を引きおろすことにより回収され得る。好ましくは常磁性微粒子は、少なくとも1000ガウスの磁場にかけるなど、磁気的手段を用いて分離される。しかしながら、当業者に公知の他の方法を用いて上清から磁性微粒子を除去し得る（例えば、真空ろ過または遠心分離）。次いで、残りの溶液を除去し得、細胞または生物の核酸が表面に吸着された固相担体を残す。一旦混合物から分離されると、固相担体に吸着され、細胞または生物のゲノム核酸の分子量よりも低い分子量を有する核酸は、固相担体と適当な溶出バッファを接触させることにより回収され得る。その結果、1）溶出バッファ中のゲノム核酸よりも低い分子量を有する核酸分子を含む溶液、および2）細胞または生物のゲノム核酸が結合した固相担体が生成される。
【００５５】
一態様において、本発明の方法の使用のための適当な「溶出バッファ」は、細胞または生物のゲノム核酸の分子量よりも低い分子量を有する細胞または生物の核酸を選択的に溶出するバッファである。細胞または生物中の実質的に全ての核酸がゲノム核酸（例えば、DNA、RNA）である態様において、適当な溶出バッファは固相担体からゲノム核酸を溶出するバッファである。一態様において、本発明に使用される適当な溶出バッファは水、または上述の、核酸沈殿剤（例えば、イソプロパノールおよび／またはPEG）の濃度が細胞または生物のゲノム核酸の分子量より低い分子量を有する細胞または生物の核酸の固相担体への結合に必要な濃度よりも低い濃度である任意の水溶液であり得る。例えば有用なバッファとしては、TRIS-HCl、Tris酢酸、スクロース（20％）およびホルムアミド（100％）溶液が挙げられるがこれらに限定されない。適当な低イオン強度溶出バッファが使用される場合、細胞または生物のゲノム核酸の分子量よりも低い分子量を有する細胞または生物の核酸の、固相担体からの溶出は、迅速に起こり得る（例えば、30秒以下）。結合した核酸が一旦溶出されると、細胞または生物のゲノム核酸に結合した固相担体は、ゲノム核酸の分子量よりも低い分子量を有する核酸を含む溶出バッファから分離される。次いで固相担体は、固相担体からゲノム核酸の溶出を生じる適当な溶出バッファと接触され得る。
【００５６】
任意に、固相担体から微粒子結合核酸を分離する前に、核酸が結合した常磁性微粒子と不純物を除去および／または溶解する薬剤を接触させること（例えば、微粒子と適当な洗浄バッファ溶液を接触させること）で、不純物（例えば、宿主細胞成分、特に核酸、タンパク質、代謝物、化学物質または細胞残屑）が除去され得る。不純物を除去および／または溶解する薬剤は、特にDNA（例えば、DNase）、RNA（例えば、RNasse）などの核酸またはタンパク質（例えば、Proteinase K）を溶解する薬剤であり得る。あるいは、不純物を溶解する薬剤は、微粒子に直接結合するかまたは吸着された核酸と結合するかいずれかの不純物溶解または除去するが固相担体に結合した核酸は可溶化しない組成物である「洗浄バッファ」であり得るか、または洗浄バッファに含まれ得る。洗浄バッファのpHおよび溶質組成および濃度は、存在することが予想される不純物の種類によって異なり得る。例えば、エタノール（例えば、70％）は、過剰なPEGおよび塩の除去に有用な好ましい洗浄バッファとして例示される。核酸と結合した磁性微粒子はまた、1種より多くの洗浄バッファ溶液で洗浄され得る。微粒子は、所望の不純物の除去に必要とされるたびにしばしば（例えば、3〜5回）洗浄され得る。しかしながら、結合した核酸の収量の消失を最小にするために、洗浄の回数は好ましくは制限される。適切な洗浄バッファ溶液は、いくつかの特徴を有する。第一に、洗浄バッファ溶液は、磁性微粒子に結合した核酸が微粒子から溶出せずに微粒子に結合し続けるように、充分に高い塩濃度（充分に高いイオン強度）を有さなければならない。適切な塩濃度は約0.1Mよりも高く、好ましくは約0.5Mである。第二に、バッファ溶液は、核酸または微粒子に結合した不純物を溶解するように選択される。バッファ溶液のpHおよび溶質組成および濃度は存在することが予想される不純物の種類によって異なり得る。適切な洗浄液は、以下、0.5 x 5 SSC、100mM硫酸アンモニウム、400mM Tris pH 9、25mM MgCl2および1％ウシ血清アルブミン（BSA）、および0.5M NaClを含む。一態様において、洗浄バッファ溶液は、25mM Tris酢酸（pH 7.8）、100mM酢酸カリウム（KOAc）、10mM酢酸マグネシウム（Mg2OAc）、および1mMジチオトレイトール（dithiothreital）（DTT）を含む。別の態様において、洗浄液は、2％ SDS、10％ Tweenおよび／または10％Tritonを含む。
【００５７】
種々の組成および複雑物の開始液からの高品質な核酸調製物の単離は、分子生物学の基本的な技術である。従って、本明細書に記載される作業の結果、新規で容易に自動化可能な、ゲノム核酸の分子量よりも低い分子量を有する核酸分子を分離する方法がここで利用可能となる。一態様において、複数試料運搬デバイスにより試薬が細胞または生物に添加される。別の態様において、第一の試薬は複数の試料、例えばそれぞれが1つ以上の細胞または生物を含む少なくとも6、12、24、96、384、または1536の試料に同時に添加される。別の態様において、第一の試薬は、それぞれが1つ以上の細胞または生物を含む複数の試料（例えば、少なくとも6、12、24、96、384、または1536の試料）に連続して送達される。本発明は、複数の核酸試料の分析方法を含む。該方法は、本明細書に記載された方法により単離された複数の核酸試料を提供する工程、および試料を分析する工程、例えば試料の配列決定を実施する工程を含む。
【００５８】
別の態様において、1つまたは複数の試料の単離された核酸はさらなる分析（例えば、配列決定）に適用される。開示される方法により単離された核酸は、高品質な核酸、例えばDNA配列決定の鋳型、顕微注入、哺乳動物細胞のトランスフェクションもしくは形質転換、RNAプローブのインビトロ合成、逆転写クローニング、cDNAライブラリーの構築、PCR増幅、または遺伝子治療研究の調製物を必要とする分子生物学的適用、ならびに形質転換、制限エンドヌクレアーゼもしくはマイクロアレイ解析、選択的RNA沈殿、インビトロ転位、多重PCR増幅産物の沈殿物、インビトロsiRNA、RNAiヘアピン、DNAプローブおよびプライマーの調製ならびに脱鋳型プロトコル（detemplating protocol）を含むがそれらには限定されないより低いストリンジェント品質を必要とする他の適用に使用され得る。
【００５９】
本発明はまた、本明細書に記載の方法における使用のための1つ以上の試薬を含むキットも包含する。一態様において、該キットは、細胞または生物の溶解を生じる試薬（例えば、TRIS-HCL、洗剤、ドデシル硫酸ナトリウム、Triton X-100、EDTA）および核酸の固相担体への結合を生じる試薬（例えば結合バッファ）を含む。特定の態様において、結合バッファは、PEG等の核酸沈殿試薬、NaI等の塩および／または磁性微粒子等の固相担体を含む。該キットは、不純物を溶かす薬剤をさらに含み得る。一態様において、不純物を溶かす薬剤は、タンパク質を消化する薬剤（例えば、プロテイナーゼK）である。さらに、キットは（1つ以上の）洗浄バッファ（例えば、PEG、尿素、NaCl、TRIS-HCL）および／または（1つ以上の）溶出バッファなどのさらなるバッファを含み得る。特定の態様において、キットは溶解バッファ（例えば、TRIS、洗剤）、結合バッファ（例えば、PEG等の核酸沈殿試薬および／またはNaI等の塩および磁性微粒子）、タンパク質を消化する薬剤（例えば、プロテイナーゼK）および洗浄バッファ（例えば、PEG、尿素）を含む。キットの試薬は、別々に存在し得るか、またはキット中の多くの試薬の1つを合わせ得る。キット中に提供され得るさらなる化合物は、複数試料容器（multisample vessel）（例えば、マイクロタイタープレート）、磁性複数試料ホルダー（例えば、マイクロタイタープレートホルダー）および複数試料運搬デバイス（例えば、マルチチャネルピペット）を含む。該キットは、キットおよびその成分の使用説明書をさらに含み得る。
【実施例】
【００６０】
実施例１  細胞中のゲノム核酸よりも低い分子量を有する核酸の分離のためのプロトコルの一態様
以下のプロトコルは図1に示される。
【００６１】
バクテリア培養物の増殖
1. 適切な抗生物質を含む200Lの2xYTバクテリア増殖培地を、300l Costar 96ウェル丸底プレート（カタログ番号3750）の各ウェルにピペットで移す。
2. 単一プラスミド含有大腸菌バクテリアコロニー（DH10B、DH5α：Invitrogen）を各ウェルに播種する。増殖培養物を、寒天菌叢またはグリセロール（glyceral）ストックから直接播種する。
3. プレートを多孔質シールで覆い、37℃で16時間激しく振盪する（例えば、300rpm）。
【００６２】
精製手順
1. 60Lの常磁性溶解バッファ（0.4N NaOH、2％SDS、0.0016％固形Agencourt COOH磁性微粒子）溶液を元のプレートの各ウェルに添加し、振盪するかまたはチップで混合する。
2. 60Lの洗浄A液（100％イソプロパノール）を試料に添加する。一旦洗浄A液を添加して15回チップで混合する。チップ混合条件は、チップ（tup）開口部により異なり得る。
3. 元のプレートを磁性SPRIplate96-R(TM)（カタログ番号Agencourt Biosciences）上に5分間置いて、ビーズと溶液を分離させる。
4. SPRIplate96-R(TM)（リング型磁石）上に置きながら、目的のプレートから透明な溶液を吸引し、廃棄する。
5. 200Lの洗浄B液（70％エタノール）を洗浄液として目的のプレートの各ウェルに分配する。
6. エタノール洗浄液を除去し工程を4回繰り返す。
7. 目的のプレートを37℃で30分間乾燥させる。
8. 40Lの溶出バッファ（ddH2O + 1.75ng/l RNAse A）をプレートの各ウェルに添加して振盪する。試薬等級水が推奨の溶出バッファであり、溶出バッファを添加後、プレートをボルテックスにかけるかもしくは振盪するあｋまたは溶出が起こるのを10分待つ。
【００６３】
配列決定手順：
1/24倍のBigDye反応液を添加：
60lの精製DNA
1lのBigDyeカクテル
【００６４】
BigDyeカクテル
5部のBigDye Terminator
1部の200mM 13〜21プライマー
4部の15 x BigDyeバッファ
【００６５】
サイクルシーケンス
95℃、2分間
（54℃ 15秒、60℃ 2.5分、95℃ 5秒）の50サイクル
終了（cleanup）まで4℃
【００６６】
配列決定反応物を、Agencourt CleanSeqキット（カタログ番号000121および000222）のいずれかの標準的エタノール沈殿を用いて精製する。
【００６７】
30lのddH2O中のCleanSeq反応物の沈殿物を溶出し、配列検出のためにABI 3700または3730に設置する。
【００６８】
ABI 3700でPOP5ポリマーを用いた11,000を超えるリード配列（reads sequence）は、90％のパスレート（pass rates）（パスリードは100〜300bpで平均phred20でなければならない）を生じ、625 Phred20塩基であった。
【００６９】
実施例２  バクテリア細胞中のゲノム核酸よりも低い分子量を有する外来性核酸の単離
方法および材料
クローニングおよび精製：
チンパンジーゲノムDNAを切断（shear）し、T4ポリメラーゼおよびKlenow（NEB）で末端を修復し、pOTバクテリアベクターにクローニングした。DH10B細胞（Invitrogen）にエレクトロポレーションし、25μg/mlのクロラムフェニコールアガーにプレーティングして、一晩で増殖させた。Gentix Qpixでコロニーを選び、200μlの2XYT、50μg/mlのクロラムフェニコールブロースに移し、16時間増殖させた。Beckman FX自動化プラットフォームで、増殖プレート中でクローンを精製した。
【００７０】
精製プロセス
本明細書に記載される方法（ワンステップPrep）を米国特許第6,534,262号（McPrep）と比較する。
【００７１】
２つの異なる精製法、McPrepおよび本明細書に記載される１ステップ精製法を用いて24の試料を精製した。回収量を比較するために対照試料をアガロースゲルに流した（図2）。
【００７２】
60μlの100％イソプロパノール（または100μlの40％PEG）に加えて、60μlの常磁性溶解バッファ（0.4N NaOH、2％SDS、160mg/リットルSeradyn COOH常磁性ビーズ）を細胞培養物に添加し、チップで15回混合した。試料を6分間、Agencourt Magnet Plate（1000ガウス）で分離した。上清を除去し、分離したビーズを70％エタノールで5回すすいだ。1.75ng/μlのRNAseA/ddH2O（Sigma)で溶出後、試料を96 E-Gel（Invitrogen）にのせ、相対的DNA回収量を推定した（図2）。Pico Green Analysis（Molecular Probes）も試料にかけて、平均DNA回収量は20ng/μlであった。試料の平均導電率を記録して、10ウェルの溶出物の全量40μlをプールすることにより、増殖培地から任意の塩汚染物を推定した。導電率は20μs/cmであった。
【００７３】
配列決定反応の設定：
試料を40μlの1.75ng/μl RNAse/ddH20に溶出し（where eluted）、2Hzで20サイクルの.5cmで自動的に振盪した。3μlのDNAを吸い取り、3pモルの約21プライマーを加えた0.5μl（1/3X BigDye）試薬中に移した。反応物をミネラルオイルで覆い、384ウェルプレートでサイクル配列決定を行なった。製造業者の指示書に従い、試料をサイクル配列決定にかけた。AgencourtのCleanSeqキットで配列決定反応物を精製し、15μlのddH20に溶出してABI 3700に流す前に熱でシールした。
【００７４】
検出：
ABI3700配列決定プラットフォームおよび1/48倍のBigDye V3.1 Sequencing ChemistryおよびPOP5ポリマーを用いてDNA配列決定データを標準化した。5800Vで30秒の注入で電気泳動を行なった。
【００７５】
結果：
6336の精製試料から12672配列リードを標準化した（表1）。48倍希釈のBigDye配列決定化学反応について、得られた高パスレート、高シグナル強度および高平均Phred20塩基対（Ewing et al., Genome Research, 8:175-185 (1998)）は例外である。リードパフォーマンス（read performance）のヒストグラムを図3にプロットする。
【００７６】
図2は、13列で8段の96ウェルアガロースゲルを示す。13列目は200ngのpGEM 3.2kbベクター（Promega）である。正電極は写真の下側である。調製試料を40μlの種々の溶出バッファに溶出し、10μlをゲルに流す。アガロースウェル中に大腸菌ゲノムDNAが残る様子のない3〜5kbのプラスミドをゲル上に見ることができる。ウェル中に、1.75ng/μlのRNAseに溶出しなかったRNAをみることができる（F段）。
【００７７】
McPrep法を用いたものに対して1ステップ法を用いると、より多くのプラスミドDNAが回収されることが分かり得る（A段対B段およびC段対D段）。これは、McPrep法は大腸菌ゲノムDNAが一組のビーズに結合することおよびプラスミドに富んだ上清が第二の混合物に結合するために別のプレートへと除去されることを必要とするためであると予想される。この上清の除去工程は、ゲノムDNA磁気ビーズを乱すことなく100％のプラスミド上清を吸引することを困難にするため、DNAの消失が予想される。
【００７８】
A段：10μl/40μl McPrep
B段：10μl/40μlワンステップPrep
C段：10μl/40μl McPrep
D段：10μl/40μlワンステップPrep
E段およびF：RNAse有りおよび無しの10μl/40μlワンステップ
G段：RNAse無しの10μl/40μl McPrep
【００７９】
3μlの溶出されたプラスミドDNAをBigDye配列決定に使用した。電気泳動図により読んだ量を、Phred（Ewing et al., Genome Research, 8:175-185 (1998)）にかけて測定した。Phred30塩基は1000分の1のエラー率を有し、Phred40塩基は10,000分の1のエラー率を有する。それぞれのリードが生じるphred20塩基の数を計測することは、標準的な計質配列決定である（表）。
【００８０】
パスレートはPASS基準／全リードを満たすリードの数で規定される
P30 = 384ウェルプレート当りのPhred30の平均数
P20 = 384ウェルプレート当りのPhred20の平均数
CP20 = 384ウェルプレート当りの連続Phred20の平均数
P15 = 384ウェルプレート当りのPhred15の平均数
Qual = 全リードを通しての平均Phredスコア：384ウェルプレート全体で平均される
【００８１】
PASS基準-リードは100bp〜300bpの200bpウィンドウにおけるPhred20の質を平均しなければならない。
SigA = 96リードについてのAチャネルの平均相対蛍光単位
SigG = 96リードについてのGチャネルの平均相対蛍光単位
SigC = 96リードについてのCチャネルの平均相対蛍光単位
SigT = 96リードについてのTチャネルの平均相対蛍光単位
【００８２】
2009508496.tif 000003
2009508496.tif 000004
【００８３】
図3は、リードにより生じたPhred20（赤）および（ad）Phred30（黒）塩基の棒グラフである。Y軸はリード数であり、X軸は50bpごとに増加するphred20ビン（bin）である。
【００８４】
実施例3  ウマ全血細胞の、ゲノム核酸よりも低い分子量を有する核酸の単離
材料および方法
供給源
ウマの全血をAlsever抗凝固薬（2.05％デキストロース、0.5％クエン酸ナトリウム、0.055％クエン酸、0.42％塩化ナトリウム）と1：1の割合で得た。
【００８５】
精製プロセス
80μlの100％イソプロパノールに加えて、60μlの常磁性溶解バッファ（0.4NaOH、2％SDS、160mg/リットルSeradyn COOH常磁性ビーズ）を細胞培養物に添加し、チップで15回混合した。試料をAgencourt Magnet Plate（1000ガウス）で15分間かけて分離した。上清を除去して分離したビーズを70％エタノールで5回すすいだ。ddH2O（Sigma）に溶出後、試料を96 E-Gel（Invitrogen）にかけて相対DNA回収量を推定した（図4）。試料にPico Green Analysis（Molecular Probes）も作用させて、平均DNA回収量は0.5ng/μlである（図5）。一般的なその後の適用であるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）への適用性においてDNAの質を評価した（図6）。
【００８６】
図4は、50μlのウマ血液から調製されたgDNA二本鎖を示す。図5は、調製した8試料のgDNAのPicoGreen Analysisを示す。図6は、上述の調製されたgDNAの濃度勾配PCR（225bpの推定アンプリコン（amplicon）サイズを有するY3B19マーカーを使用）を示す。
【００８７】
実施例4  ワンステップ溶解および結合法を用いたウマの全血からのゲノムDNAの単離
1.  50μlのウマ血液をマルチウェルプレートに移した。
2.  200μlの溶解バッファ（20％PEG1000、1M NaCl、0.5％SDS、1％Triton X-100、10mM EDTA、20mM Tris HCl、0.29％固体磁気ビーズ）を添加して、ピペットで10回混合した。5分間インキュベートした。
3.  磁気プレート上に約5分間置いた。
4.  上清を除去してビーズを残した。
5.  ビーズを250μlの洗浄バッファ（6M尿素/14％PEG100O、1M NaCl）に再懸濁した。磁気スタンド無しで5分間待った。
6.  磁気スタンド上に5分間置いた。上清を除去した。
7.  工程5および6を繰り返した。
8.  ビーズを70％エタノールに再懸濁し、磁力によりビーズを3回分離した。
9.  5〜10分間風乾させた。
10.  50〜200μlのヌクレアーゼを含まない水を添加し、60〜70℃で予備加熱した。10分間混合した。
11.  プレートを磁気プレート上に置いてビーズを分離した。溶出したDNAを除去した。
【００８８】
結果
DNAを0.8％アガロースe-ゲルに流した。OD260解析（readings）を用いて濃度を測定した。OD260/280解析を用いて純度を示した。
【００８９】
結論
図7に示すように、本明細書に記載する方法を用いて、全血から高収量、高品質のゲノムDNAを単離し得る。
【００９０】
実施例5  ツーステップ溶解および結合法を用いたブタの全血由来のゲノムDNAの単離
1.  200μlの新しいブタ血液を1.2 mlの96ウェルプレートに等分した。
2.  2倍量の溶解バッファ（0.5％SDS、1％Triton-X-100、10mM EDTA、20mM Tris pH 7.4）および12μlの20μg/μlプロテイナーゼKを添加してチップで緩やかに5回混合した。
3.  37℃で10分間インキュベートした。
4.  0.5倍量の結合バッファ（40％PEG1000、1.5M NaCl、0.29％固体磁気ビーズ）を添加して、チップで緩やかに10回混合した。
5.  磁気プレート上に15分間置いた。
6.  上清を除去して廃棄した。
7.  磁石から外して、ビーズを800μlの洗浄バッファ（6M尿素、14％PEG1000、1M NaCl）に再懸濁した。
8.  磁気プレート上に10分間置いた。
9.  上清を廃棄して、2回目の洗浄のために工程7および8を繰り返した。
10.  磁石上で、ビーズを乱すことなくそれぞれ800μlの70％エタノールでビーズを3回洗浄した。
11.  最後の洗浄の後、エタノールの全ての残りを除去した。ビーズを磁気プレート上で5分間乾燥させた。
12.   磁石から外してビーズを1倍量のヌクレアーゼを含まない水で再懸濁し、ベンチ上で2分間静置し、次いでビーズを再懸濁した。
13.  磁気プレート上に10分間置いた。
14.  DNAを含む上清を保存のためにきれいなウェルに移した。
【００９１】
結果
9ウェルからの10μLのDNAを0.8％アガロースe-ゲルに流した。OD260解析を用いて濃度および収量を測定した。OD260/280を用いて純度を示した。
【００９２】
結論
図8に示すように、本明細書に記載の方法を用いて、全血から高収量、高品質のゲノムDNAを単離し得る。
【００９３】
実施例6  ツーステップ溶解および結合法を用いたヒト全血からのゲノムDNAの単離
1.  3人の異なる健常ドナー由来の200μlの凍結したヒト血液を1.2mlの96ウェルプレートに等分した。
2.  2倍量の溶解バッファ（0.5％SDS、1％Triton-X-100、10mM EDTA、20mM Tris pH 7.4）および12μlの20μg/μlプロテイナーゼKを添加し、緩やかにチップで5回混合した。
3.  37℃で10分間インキュベートした。
4.  0.5倍量の結合バッファ（40％PEG100O、1.5M NaCl、0.29％固体磁気ビーズ）を添加し、緩やかにチップで10回混合した。
5.  磁気プレート上に15分間置いた。
6.  上清を除去して廃棄した。
7.   磁石から外してビーズを800μlの洗浄バッファ（6M尿素、14％PEG100O、1M NaCl）に再懸濁した。
8.  磁気プレート上に10分間置いた。
9.  上清を廃棄し、2回目の洗浄のために工程7および8を繰り返した。
10.  磁石上で、その都度ビーズを乱すことなく、800μlの70％エタノールでビーズを3回洗浄した。
11.  最後の洗浄後、エタノールの残りの全てを除去した。磁気プレート上でビーズを5分間乾燥させた。
12.   磁石から外して、1倍量のヌクレアーゼを含まない水でビーズを再懸濁してベンチ上に2分間静置し、次いでビーズを再懸濁した。
13.  磁気プレート上に10分間置いた。
14.  保存のため、DNAを含有する上清をきれいなウェルに移した。
【００９４】
結果
各試料由来の10μLのDNAを0.8％アガロースe-ゲルに流した。OD260解析を用いて濃度および収量を測定した。OD260/280を用いて純度を示した。
【００９５】
結論
図9に示すように、本明細書に記載される方法を用いて、ヒト全血から高収量、高品質のゲノムDNAを単離し得る。
【００９６】
実施例7  培養細胞からの全RNAの単離（ワンステップ法）
手順
1.  培養293T細胞（約lxl05細胞/ウェル）の96ウェルプレートのウェルから全細胞培地を完全に除去した。各ウェルの細胞に直接、ピペットで溶解バッファ（20mMクエン酸ナトリウムpH 7.5、10mM EDTA pH 8、1mMオーリントリカルボン酸、1％triton-x-100、2％ラウリルサルコシンナトリウム、1M LiCl、0.075％固体磁気ビーズ）を添加した。ほとんどの細胞がプレートおよび懸濁液から無くなったと思われるまでピペットで繰り返し混合した。数分間静置し、次いで、ピペットで数回全ての細胞をプレートから取り除いた。
2.  1.7mlのRNaseを含まないエッペンドルフチューブに移して磁気スタンドに静置した。5分間静置して溶液からビーズを分離した。
3.  チューブから透明な溶液をゆっくりと吸い取り廃棄した。
4.  1〜1.5mlの70％エタノールで1回ビーズを洗浄した。磁気ビーズ上に直接ピペッティングし、5分間または上清が透明になるまで静置した。ビーズを乱すことなく注意深くエタノールを吸い取った。
5.   磁石から外してエッペンドルフを動かし、30μLのDNaseI溶液（10mM Tris pH 7.5、2.5mM MgCl2、0.5mM CaCl2、0.4U/μL DNaseI）を添加した。
6.  ビーズが再び懸濁するまでピペッティングし、磁力をかけずに15分間静置し、DNAを消化した。
7.  DNaseIインキュベーションを収量する際に、150μLの結合バッファ（20mMクエン酸ナトリウムpH 7.5、10mM EDTA pH 8、1mMオーリントリカルボン酸、1％triton-x-100、2％ラウリルサルコシンナトリウム、1M LiCl、30％イソプロパノール）をビーズ/DNaseI混合物に添加して充分に混合されるまで5回ピペッティングした。
8.  チューブを再び磁気スタンドに置き、5分間静置した。
9.  上清を注意深く吸い取った。
10.  150μlの洗浄バッファ（25mMクエン酸ナトリウム、1M塩酸グアニジン、1％Triton-x-100）を添加して磁石から外してビーズを再懸濁した。すぐに磁気スタンド上に置き、5分間または上清が透明になるまで静置した。
11.  上清を注意深く吸い取った。
12.  さらに4回の70％エタノール中の洗浄で洗浄を繰り返した。磁気スタンド上に置きながら1mlの70％エタノールをピペットでエッペンドルフチューブに移し、1分間静置して除去した。
13.  最後のエタノール洗浄液を吸い取った後反応チューブを磁気スタンド上で、風乾で10分間静置した。
14.  ビーズを40μlのRNaseを含まない水で完全に再懸濁し、ビーズから精製産物を溶出した。
15.   磁石から外して5分間静置し、次いで磁気スタンド上に5分間置いた。
16.  精製したRNAを新しいプレートに移した。
17.  各プレート由来の12の試料を0.8％アガロースe-ゲルに流した。OD260解析を用いて濃度および収量を測定した。OD260/280解析を用いて純度を示した。
【００９７】
結果
96ウェルプレートの2段から8ウェルのRNAを0.8％アガロースe-ゲルに流した。図8は、高収量で、良質なRNAを示す（indicting）完全なリボソームRNAを示す。OD260解析を用いて濃度を測定した。OD260/280解析を用いて純度を示した。
【００９８】
結論
図10に示すように、本明細書に記載の方法を用いて、培養哺乳動物細胞から高収量で高品質な全RNAを単離し得る。
【００９９】
実施例8  固体組織からの全RNAの単離
1.  96ウェル溶解プレートの各ウェルに400μlの溶解バッファ（2Mグアニジンイソシアネート、200mMクエン酸ナトリウム、1mM DTT、1％triton-x-100、1.2mg/mlプロテイナーゼK）、1種類の金属ビーズ、および10mgまでの種々のラット組織を添加した。プレートを透明なプレートシーリングテープでシールし、ボルテックスミキサー（vortexor）に当てた。ボルテックスミキサーを高に設定しプレートを10分間ボルテックスにかけて組織を均質化する。
2.  プレートをボルテックスミキサーから取り除き、50℃でサーモサイクラーに15分間置いた。
3.  室温で5分間冷却した。
4.  400μlの結合バッファ（80％イソプロパノール、1％磁気ビーズ固体）を溶解物に添加し5回ピペッティングして混合した。室温で2分間インキュベートした。
5.  400μlの結合反応液を新しい1.2mlプレートに移し、磁気プレート上に5分間置いた。
6.  上清を除去し、磁気プレート上で5分間、残りの400μlの結合反応液を1.2mlプレートに移した。
7.  上清を完全に除去した。
8.  磁気プレートからプレートを取り除き、ウェル当り600μlの70％EtOHを添加して洗浄し5回ピペッティングして混合した。
9.  プレートを磁気プレート上に5分間、再び戻した。
10.  エタノール洗浄液を完全に除去しプレートを磁気プレートから外した。
11.  100μlのDNase溶液（10mM Tris pH 7.5、2.5mM MgCl2、0.5mM CaCl2、0.4U/μL DNaseI）を添加して、5回ピペッティングして混合し、37℃で15分間インキュベートした。
12.  550μlの再結合バッファ（1Mグアニジンイソシアネート、100mMクエン酸ナトリウム、0.5mM DTT、0.5％triton-x-100、40％イソプロパノール）を添加して、5回ピペッティングして混合し、室温で2分間インキュベートした。
13.  プレートを磁気プレート上に置き、15分間インキュベートした。
14.  上清を除去し、600μlの70％EtOHを添加して洗浄して、5回ピペッティングして混合した（プレートを磁石において）。
15.  合計4回の洗浄のために工程13をさらに4回繰り返した。
16.  最後のエタノールを完全に除去し、ビーズを室温で10分間風乾させた。
17.  プレートを磁気プレートから取り除き、最低限の40μlのヌクレアーゼを含まない水を添加してRNAを溶出し、10回ピペッティングして混合した。室温で2分間インキュベートした。
18.  プレートを再び磁気プレートに1分間戻し、溶出したRNAを注意深く除去した。
【０１００】
結果
Bioanalyzer 2100でキャピラリー電気泳動により各RNA試料の1μLを解析した。OD260解析を用いて濃度および収量を測定した。OD260/280解析を用いて純度を示した。
【０１０１】
結論
図11は、本明細書に記載の方法を用いて固体組織から高品質の全RNAを単離し得ることを示す。
【０１０２】
実施例9  全血からの全RNAの単離
1.  3〜50mL遠心分離チューブ中で、3本の別々の10mL Paxgeneチューブに回収した血液試料を3.3mLの溶解バッファ（4MGITC、400mMクエン酸Na、2％TX-100）、13.2μL 0.5M DTTおよび660μLプロテイナーゼK（20mg/mL）と混合した。
2.  55℃で30分間インキュベートした。
3.  6.2mLのイソプロパノールおよび100μLの5％固体磁気ビーズを試料に添加した。充分に混合した。室温で10分間インキュベートした。
4.  チューブを磁気スタンド上に30分間置いて、磁力により溶液からビーズを分離した。上清を注意深く除去した。
5.  30mLの洗浄溶液（30％イソプロパノール、2M GITC、200mMクエン酸Na、1％TX-100、1mM DTT）でビーズを2回洗浄した。
6.  30mLの70％エタノールでビーズを2回洗浄した。
7.  ビーズを10分間風乾した。
8.  ビーズを640μLのヌクレアーゼを含まない水で再懸濁した。2mLの遠心分離チューブに移した。室温で5分間インキュベートした。
9.  磁気スタンド上で磁力により上清からビーズを分離した。上清を2mLチューブに移した。
10.  試料に160μL DNaseIバッファ（10mM Tris pH 7.5、2.5mM MgCl2、0.5mM CaCl2、0.4U/μL DNaseI）を添加した。ピペットで上下して混合した。
11.  室温で15分間インキュベートした。
12.  540μLのイソプロパノール、350μLの溶解バッファおよび10μLの新しいビーズを添加した。充分に混合し室温で5分間インキュベートした。
13.  磁力により上清からビーズを分離した。上清を廃棄した。
14.  1.6mL70％エタノールでビーズを3回洗浄した。
15.  ビーズを10分間風乾させた。
16.  50μLのヌクレアーゼを含まない水にビーズを再懸濁した。室温で5分間インキュベートした。
17.  RNAを回収して-80℃で保存した。
【０１０３】
結果
Bioanalyzer2100でキャピラリー電気泳動により各RNA試料の1μLを解析した。OD260解析を用いて濃度および収量を測定した。OD260/280解析を用いて純度を示した。また、0.8％アガロースe-ゲル解析した1つの試料を示す。
【０１０４】
結論
図12より、本明細書に記載の方法を用いて、全血から高品質の全RNAを単離し得ることが示される。
【０１０５】
実施例10  口内洗浄液回収物を用いた頬細胞由来のゲノムDNAの単離
1.  口を吹き（swish）10mlの口内洗浄液を50mlの円錐形チューブに回収した。
2.  細胞を3000 x gで10分間遠心分離し、ペレット化した。
3.  上清を除去し、細胞を400μLの懸濁バッファ（10mM Tris pH 8、1mM EDTA、pH 8、1.75ng/μL RNaseA）に再懸濁した。
4.  600μLの溶解バッファ（10mM Trsi pH 8、4M塩酸グアニジン、10％Tween-20、1％n-ラウリルサルコシン）を添加して緩やかに混合した。
5.  室温で30分間インキュベートした。
6.  150μLの溶解物を新しいチューブに移し、150μLの結合バッファ（18％PEG 8000、2.2M NaCl、0.115％固体磁気ビーズ）とチップで10回混合し、磁石上に置いてビーズを分離した。
7.  上清を廃棄し、200μLの70％エタノールで3回洗浄した。
8.  ビーズを5分間乾燥させた。
9.  40μLの水を添加し、チップで10回混合して磁石上に置いて分離した。
10.  DNA含有上清を除去した。
【０１０６】
結果
単離されたゲノムDNAを、0.8％e-ゲルのアガロースゲル電気泳動で解析した。平均収量は、調製物当り1.8μgであったが、被験体ごとに大きく異なった。543bp産物を生じるヒトADPリボシル化因子1プライマーを用いて、各試料の1μLをPCRに使用した。
【０１０７】
結論
図13は、本明細書に記載の方法を用いて口内洗浄液回収物方法により、頬細胞から、高品質、高収量のgDNAを単離し得ることを示す。以降のPCR解析においてgDNAは機能的である。
【０１０８】
実施例11  綿棒回収を用いた頬細胞からのゲノムDNAの単離
1.  滅菌した綿棒で頬の内部を20回こすりとった。
2.  綿棒を200μLの懸濁バッファ（10mM Tris pH 8、1mM EDTA、pH 8、1.75 ng/μL RNaseA）に入れ、10回転させて細胞を放出させた。
3.  300μLの溶解バッファ（10mM Trsi pH 8、4M塩酸グアニジン、10％Tween-20、1％n-ラウリルサルコシン）を添加して綿棒を10回転させて混合した。綿棒をチューブの先端に押し付け繊維から任意の液体を放出させた。
4.  室温で15分間インキュベートした。
5.  150μLの溶解物を新しいチューブに移し、150μLの結合バッファ（18％ PEG 8000、2.2M NaCl、0.115％固体磁気ビーズ）と合わせ、チップで10回混合して磁石上に置いてビーズを分離した。
6.  上清を廃棄して、200μLの70％エタノールで3回洗浄した。
7.  ビーズを5分間乾燥させた。
8.  40μLの水を添加し、チップで10回混合して磁石上において分離した。
9.  DNA含有上清を除去した。
【０１０９】
結果
単離したゲノムDNAを0.8％e-ゲルでアガロースゲル電気泳動により解析した。平均収量は調製物当り1.8μgであったが、被験体毎に大きく異なった。各試料の1μLを、370bpの産物を生じるヒト細胞骨格βアクチンプライマーにより、PCRに使用した。
【０１１０】
結論
図14は、本明細書に記載の方法を用いて綿棒回収物プロトコルにより、頬細胞から高品質、高収量のgDNAを単離し得ることを示す。以降のPCR解析におけるgDNAは機能的である。
【０１１１】
実施例12  ウイルスゲノムDNAの単離および検出
1.  147μLの溶解バッファ（4M GITC、400mMクエン酸Na、2％TX-100）、0.5μLポリA RNA（10μg/μL）および40μLプロテイナーゼK（20mg/mL）を400μLの50コピー/mLでHBVを含有するヒト血漿に添加した。少なくとも15回ピペットで上下して混合した。
2.  試料を56℃で30分間インキュベートした。
3.  室温まで冷却させた。260μLの100％イソプロパノールおよび10μl 5％固体磁気ビーズを添加した。少なくとも15回ピペットで上下させて混合した。
4.  試料の半分量（約430μL）を新しいウェルに移した。プレートベンチに5分間静置した。
5.  プレートを少なくとも7分間プレート磁石上に置いて分離させた。
6.  上清を吸い取った。
7.  プレートを磁石から取り除いた。500μLの洗浄バッファ（30％イソプロパノール、2M GITC、200mMクエン酸Na、1％TX-100、1mM DTT）を添加してピペットで10回混合した。
8.  プレートをベンチに5分間静置した。プレートを再び磁石上に7分間置いた。上清を吸い取った。
9.  洗浄工程7〜8をさらに2回繰り返した。
10.  磁石からプレートを取り除いた。500μL 70％エタノールを添加しピペットで混合してビーズを再懸濁した。
11.  プレートを磁石上に7分間戻した。上清を吸い取った。
12.  エタノール洗浄工程10〜11をさらに2回繰り返した。3回目の洗浄後、エタノールをできるだけ多く除去した。
13.  プレートを磁石上に20分間静置し、ビーズを乾燥させた。
14.  プレートを磁石から取り出した。20μLのヌクレアーゼを含まない水を添加してピペットで混合して5分間インキュベートした。
15.  プレートを磁石上に戻した。上清をきれいなチューブに移した。
【０１１２】
結果
10μlの各試料を、HBV特異的プライマーによる50μl PCR反応に使用した。HBVを含まない血漿の（sof plasma）偽（mock）抽出物は陰性であり、HBVを含む全16試料は陽性であった。
【０１１３】
結論
図15は、本明細書に記載される方法を用いて極めて低コピー数のウイルスからDNAを単離および検出し得ることを示す。
【０１１４】
実施例13  パラフィン包埋試料からのゲノムDNAの単離
組織消化：
1.  2〜20mgのパラフィン包埋組織片から、組織を薄く（10μm）切片に切り出し、1.5mlチューブに入れる。フタを閉じて、組織試料がチューブの底に落ちるまでベンチでチューブをタップした。
2.  100μlの脱架橋バッファ（50mM HEPESバッファ、pH7.9、1％水酸化アンモニウム）を添加し70℃で1時間インキュベートした。
3.  20μlの20mg/mlプロテアーゼKと共に100μlの溶解バッファ（5OmM HEPES、pH7.9、1％SDS、1mM EDTA）を添加した。
4.  55℃1時間で組織を消化した。
【０１１５】
DNA抽出：
1.  200μlの消化した組織を含有するチューブに結合バッファ（200μl 4M GITC、400mMクエン酸Na（pH 7.0）、2％Triton X-100；6μl 5％固体磁気ビーズ；200μlイソプロパノール）を添加した。
2.  混合して室温で1分間インキュベートした。
3.  チューブを磁気スタンド上に1分間置いた。
4.  上清を廃棄した。
5.  ビーズを300μlの洗浄バッファ（2M GITC、200mMクエン酸Na、1％TX-100および30％イソプロパノール）に再懸濁し、室温で1分間インキュベートした。
6.  磁気スタンド上に1分間置いた。上清を廃棄した。
7.  工程6および7を繰り返した。
8.  ビーズを200μlの70％エタノールに再懸濁した。室温で1分間インキュベートした。
9.  上清を廃棄した。
10.  工程9および工程10を2回繰り返した。
11.  ビーズを10〜15分間風乾した。
12.  ビーズを50μlの水に再懸濁し、室温で1分間放置した。
13.  チューブを磁気スタンド上に1分間置いた。
14.  DNA溶出物を新しいチューブに移した。
【０１１６】
結果
20μlのDNAを0.8％アガロースゲルに流した。DNA収量は20mgの組織中1.5〜3μgであった。（上段のゲル）レーン1および2はパラフィン中に固定された組織から単離されたDNAの典型的なパターンを示す。（下段のゲル）2つの抽出された試料（レーン1および2）、鋳型無しコントロール（レーン3）および陽性コントロールDNA（レーン4）からの遺伝子特異的PCR増幅。
【０１１７】
結論
図16に示すように、本明細書に記載の方法を用いて、パラフィン包埋された組織切片から、以降のPCR増幅で機能するのに充分な量のゲノムDNAを単離することができる。
【０１１８】
本発明は、その好ましい態様に関して具体的に示され記載されるが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、本明細書において形態および詳細における種々の変形がなされ得ることを、当業者は理解しよう。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図1は、細胞内でのゲノム核酸よりも小さい分子量を有する核酸からの細胞のゲノム核酸の分離のためのプロトコルの図である。
【図２】図2は、細胞内でのプラスミドからの細胞の大腸菌ゲノム核酸の分離を示す96ウェルアガロースゲルである。
【図３】図3は、読取りによって作成されたPhred 20(赤)およびPhred 30(黒)塩基のヒストグラムである。Y軸は読取りの数であり、X軸は、Phred 20が結合した場合の50bp単位の増分である。
【図４】図4は、50μlのウマ血液から調製したgDNA二本鎖を示す。
【図５】図5は、ウマ血液から調製したgDNAの8つの試料のPicoGreen解析を示す。
【図６】図6は、ウマ血液から調製されたgDNAの(225bpの予測アンプリコンサイズを有するY3B19マーカーを用いた)勾配PCRを示す。
【図７】図7は、ウマ全血から単離されたゲノムDNAのアガロースe-ゲルである。
【図８】図8は、ブタ全血から単離されたゲノムDNAのアガロースe-ゲルである。
【図９】図9は、溶解および結合が２工程で行なわれる方法を用いてヒト全血から単離されたゲノムDNAのアガロースe-ゲルである。
【図１０】図10は、培養哺乳動物細胞から単離された全RNAのアガロースe-ゲルである。
【図１１】図11は、固体組織から単離されたRNAのキャピラリー電気泳動の結果を示す。
【図１２】図12は、全血から単離されたRNAの試料のキャピラリー電気泳動の結果およびアガロースe-ゲルを示す。
【図１３】図13は、口内洗浄回収液を用いて頬細胞から単離されたゲノムDNAのアガロースe-ゲルおよびPCRの結果を示す。
【図１４】図14は、綿棒回収物を用いて頬細胞から単離されたゲノムDNAのアガロースe-ゲルおよびPCRの結果を示す。
【図１５】図15は、血漿試料中のB型肝炎ウイルス(HBV)ゲノムDNAの単離および検出のPCRの結果を示す。
【図１６】図16は、パラフィン包埋試料から単離されたゲノムDNAのアガロースe-ゲルおよびPCRの結果を示す。
【図１】
2009508496.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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