(57)【要約】本発明は疾患における異常な血管新生を抑制することを包含する、癌の治療及び血管新生及び／又は血管透過性の抑制のためのＶＥＧＦアンタゴニスト及びアルファ５ベータ１アンタゴニストの使用に関する。本発明は又、血管新生および血管透過性を促進するためのＶＥＧＦアゴニスト及びアルファ５ベータ１アゴニストの使用に関する。本発明は又新しい抗アルファ５ベータ１抗体、それらを含む組成物及びキット、及びそれらを製造および使用する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトアルファ５ベータ１に結合し、そしてヒトアルファ５ベータ１への抗アルファ５ベータ１抗体の結合を競合的に抑制することができる抗体であって、該抗アルファ５ベータ１抗体が２００６年３月７日にＡＴＣＣにおいてアルファ５／ベータ１  ７Ｈ５．４．２．８（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−７４２１）として寄託されたハイブリドーマ及びアルファ５／ベータ１７Ｈ１２．５．１．４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−７４２０）として寄託されたハイブリドーマからなる群より選択されるハイブリドーマにより生産される、抗体。
【請求項２】
請求項１記載の抗体であって、該抗体が２００６年３月７日にＡＴＣＣにおいてアルファ５／ベータ１  ７Ｈ５．４．２．８（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−７４２１）として寄託されたハイブリドーマ及びアルファ５／ベータ１７Ｈ１２．５．１．４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−７４２０）として寄託されたハイブリドーマからなる群より選択されるハイブリドーマにより生産される、抗体。
【請求項３】
請求項１記載の抗体であって、該抗体が２００６年３月７日にＡＴＣＣにおいてアルファ５／ベータ１  ７Ｈ５．４．２．８（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−７４２１）として寄託されたハイブリドーマにより生産される抗体の可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン配列を含む、抗体。
【請求項４】
請求項１記載の抗体であって、該抗体が２００６年３月７日にＡＴＣＣにおいてアルファ５／ベータ１７Ｈ１２．５．１．４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−７４２０）として寄託されたハイブリドーマにより生産される抗体の可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン配列を含む、抗体。
【請求項５】
請求項１記載の抗体であって、該抗体が２００６年３月７日にＡＴＣＣにおいてアルファ５／ベータ１  ７Ｈ５．４．２．８（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−７４２１）として寄託されたハイブリドーマ及びアルファ５／ベータ１７Ｈ１２．５．１．４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−７４２０）として寄託されたハイブリドーマからなる群より選択されるハイブリドーマにより生産される抗アルファ５ベータ１抗体のヒト化抗体又はキメラ抗体である、抗体。
【請求項６】
前記抗体が５００ｎＭ〜１ｐＭのＫｄでアルファ５への結合の間のＫｄでヒトアルファ５ベータ１に結合する請求項１〜５の何れか１項に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体がアルファＶベータ３にもアルファＶベータ５にもアルファＶベータ１にも結合しない請求項１記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体がヒトＩｇＧのＦｃ配列を含む請求項１及び３〜５の何れか１項に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体がヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４のＦｃ配列を含む請求項１及び３〜５の何れか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を欠いたＦｃ配列を含む請求項８記載の抗体。
【請求項１１】
抗体がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）及びＦｖフラグメント；ダイアボディー及び線状抗体からなる群より選択される請求項１及び３〜５の何れか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体が多重特異性抗体である請求項１及び３〜５の何れか１項に記載の抗体。
【請求項１３】
治療薬に結合体化された請求項１及び３〜５の何れか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
前記治療薬が細胞毒性剤、放射性同位体及び化学療法剤からなる群より選択される請求項１３記載の抗体。
【請求項１５】
標識に結合体化された請求項１及び３〜５の何れか１項に記載の抗体。
【請求項１６】
前記標識が放射性同位体、蛍光染料及び酵素からなる群より選択される請求項１５記載の抗体。
【請求項１７】
請求項１〜５に記載の抗体の何れか１つの可変重鎖ドメイン（ＶＨ）又は可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）又はＶＨ及びＶＬドメインの両方をコードする単離された核酸分子。
【請求項１８】
請求項１７記載の核酸分子をコードする発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１７記載の核酸分子を含む細胞。
【請求項２０】
前記細胞が２００６年３月７日にＡＴＣＣにおいてアルファ５／ベータ１  ７Ｈ５．４．２．８（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−７４２１）として寄託されたハイブリドーマ又はアルファ５／ベータ１７Ｈ１２．５．１．４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−７４２０）として寄託されたハイブリドーマである請求項１９記載の細胞。
【請求項２１】
請求項１９又は請求項２０記載の細胞を培養すること、及び、細胞培養物から抗体を回収することを含む抗体の製造方法。
【請求項２２】
請求項１及び３〜５の何れか１項に記載の抗体および製薬上許容しうる担体を含む組成物。
【請求項２３】
患者に由来する試料に請求項１〜５の何れか１項に記載の抗体を接触させること、及び該アルファ５ベータ１蛋白に結合した該抗アルファ５ベータ１抗体を検出することによる、該試料中の該アルファ５ベータ１蛋白を検出する方法。
【請求項２４】
前記抗体が免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）又はＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用される請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
対象における血管新生及び／又は血管透過性を抑制するための医薬の製造における請求項１及び３〜５の何れか１項に記載の抗体の使用。
【請求項２６】
対象における疾患を治療するための医薬の製造における請求項１及び３〜５の何れか１項に記載の抗体の使用であって、該疾患が異常な血管新生又は血管透過性である、使用。
【請求項２７】
ＶＥＧＦアンタゴニスト及びアルファ５ベータ１アンタゴニストを投与することを含む疾患に罹患した対象における血管新生及び／又は血管透過性を抑制するための方法。
【請求項２８】
ＶＥＧＦアンタゴニスト及びアルファ５ベータ１アンタゴニストを投与することを含むＶＥＧＦアンタゴニスト及びアルファ５ベータ１アンタゴニストを含む対象における癌を治療するための方法。
【請求項２９】
ＶＥＧＦアンタゴニスト及びアルファ５ベータ１アンタゴニストを投与することを含む対象における眼疾患を治療するための方法。
【請求項３０】
ＶＥＧＦアンタゴニスト及びアルファ５ベータ１アンタゴニストを投与することを含む対象における自己免疫疾患を治療するための方法。
【請求項３１】
前記対象が前記ＶＥＧＦアンタゴニストを投与され、その後、前記アルファ５ベータ１アンタゴニストを投与される、請求項２７〜３０の何れか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象が前記ＶＥＧＦアンタゴニスト及び前記アルファ５ベータ１アンタゴニストを同時に投与される請求項２７〜３０の何れか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象が異常な血管新生又は血管透過性を有する疾患に罹患している請求項２７記載の方法。
【請求項３４】
前記疾患が腫瘍、免疫疾患又は眼の疾患からなる群より選択される請求項２７記載の方法。
【請求項３５】
前記対象がＶＥＧＦアンタゴニスト治療に非応答性となるまで該対象を前記ＶＥＧＦアンタゴニストで治療し、そして次に該対象をアルファ５ベータ１アンタゴニストで治療する請求項２７〜３０の何れか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記癌が非侵襲性である場合には前記対象を前記ＶＥＧＦアンタゴニストで治療し、前記癌が侵襲性である場合には前記アルファ５ベータ１アンタゴニストで治療する請求項２８記載の方法。
【請求項３７】
前記対象が前記疾患に罹患していない対象由来の組織と比較して罹患組織において上昇したアルファ５ベータ１レベルを有する、請求項２７記載の方法。
【請求項３８】
前記対象が、更に抗腫瘍剤、化学療法剤、増殖抑制剤および細胞毒性剤からなる群より選択される治療薬を投与される請求項２７〜３０の何れか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗ＶＥＧＦ抗体がＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）抗体によりヒトＶＥＧＦへの結合を競合的に抑制され得る、請求項２７〜３０の何れか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗ＶＥＧＦ抗体がＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）抗体である請求項４２記載の方法。
【請求項４１】
前記アルファ５ベータ１アンタゴニストが細胞毒性剤の結合体化される請求項２７〜３０の何れか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞毒性剤が放射性同位体、化学療法剤又は毒素である請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記ＶＥＧＦアンタゴニストが抗体である請求項２７〜３０の何れか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記アルファ５ベータ１アンタゴニストが抗体である請求項２７〜３０の何れか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗ＶＥＧＦ抗体がヒト化抗体又はヒト抗体である請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
前記抗アルファ５ベータ１抗体がヒト化抗体又はヒト抗体である請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
ＶＥＧＦアンタゴニスト、アルファ５ベータ１アンタゴニスト、及び製薬上許容しうる阻害剤を含む組成物。
【請求項４８】
ＶＥＧＦアンタゴニストで治療された対象においてアルファ５ベータ１を検出するための説明書を含むキット。
【請求項４９】
疾患に罹患した対象において血管新生及び／又は血管透過性を抑制するための医薬の製造における請求項４７記載の組成物の使用。
【請求項５０】
前記疾患が対象における癌、眼の疾患、自己免疫疾患からなる群より選択される請求項４９記載の使用。
【請求項５１】
前記疾患が固形腫瘍、転移性腫瘍、軟組織腫瘍、眼の新生血管形成を有する疾患、異常な血管新生を有する炎症性疾患、前記対象への移植後に生じる疾患、及び線維血管組織の異常な増殖を有する疾患からなる群より選択される請求項４９記載の使用。
【請求項５２】
前記癌が乳癌、子宮頚癌、結腸直腸癌、肺癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞癌、前立腺癌、肝癌、頭部頚部癌、メラノーマ、卵巣癌、中皮腫、軟組織癌、及び多発性骨髄腫からなる群より選択される請求項５０記載の使用。
【請求項５３】
前記疾患が網膜症、加齢誘発性黄斑変性、皮膚紅潮、乾癬、乾癬性関節炎、炎症性腎疾患、溶血性尿毒症症候群、糖尿病性腎症、関節炎、炎症性腸疾患、慢性炎症、慢性網膜剥離、慢性ブドウ膜炎、慢性硝子体炎、角膜移植片拒絶、角膜新生血管形成、角膜移植片新生血管形成、クローン病、近視、眼の血管新生性疾患、変形性関節症、パジェット病、類天疱瘡、多発性動脈炎、レーザー後の放射状角膜切開、網膜の新生血管形成、シェーグレン症候群、潰瘍性結腸炎、移植片拒絶、肺の炎症、ネフローゼ症候群、浮腫、悪性疾患に関連する腹水、卒中、血管線維腫、及び血管新生緑内障からなる群より選択される請求項４９記載の使用。
【請求項５４】
疾患に罹患した対象を治療するための医薬の製造におけるアルファ５ベータアンタゴニストの使用であって、該対象がＶＥＧＦアンタゴニストを用いた該疾患に対する治療には応答性であったが、該ＶＥＧＦアンタゴニストに対して部分的に応答するか、またはもはや応答しない、使用。
【請求項５５】
前記対象が前記疾患に罹患していない対象由来の組織と比較して罹患組織において上昇したアルファ５ベータ１レベルを有する、請求項５４記載の使用。
【請求項５６】
前記対象が更に抗腫瘍剤、化学療法剤、増殖抑制剤および細胞毒性剤からなる群より選択される治療薬を投与される請求項５４記載の使用。
【請求項５７】
疾患に罹患した対象を治療するための医薬の製造におけるＶＥＧＦアンタゴニストの使用であって、該対象がアルファ５ベータ１アンタゴニストを用いた該疾患に対する治療には応答性であったが、該アルファ５ベータ１アンタゴニストに対して部分的に応答するか、またはもはや応答しない、使用。
【請求項５８】
ＶＥＧＦアゴニスト及びアルファ５ベータ１アゴニストを含む組成物。
【請求項５９】
医薬の製造における請求項５８記載の組成物の使用。
【請求項６０】
前記医薬が創傷治癒を促進する請求項５９記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は疾患における異常な血管新生を抑制することを包含する、癌の治療及び血管新生及び／又は抑制された血管透過性の抑制のためのＶＥＧＦアンタゴニスト及びアルファ５ベータ１アンタゴニストの使用に関する。本発明は又、血管新生および血管透過性を促進するためのＶＥＧＦＲアゴニスト及びアルファ５ベータ１アゴニストの使用に関する。本発明は又抗アルファ５ベータ１抗体、それらを含む組成物及びキット、及びそれらを製造および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
病理学的及び非病理学的な血管新生におけるＶＥＧＦ−Ａの重要な役割は、十分解明されている。インビボモデルにおけるＶＥＧＦの投与は強力な血管新生応答を誘導している（非特許文献１；非特許文献２）。単一のＶＥＧＦ−Ａ対立遺伝子の損失はマウスにおいて胚性致死を生じさせている（非特許文献３；非特許文献４）。ＶＥＧＦは又、血管漏出性を誘導するその能力により血管透過性因子としても知られている（非特許文献５；非特許文献６）。即ち、ＶＥＧＦ−Ａは発生、生殖及び骨の血管新生についても、他の非病理学的血管新生に加えて関与している。
【０００３】
ＶＥＧＦ−Ａは２種の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）及びＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ、Ｆｌｋ−１）に結合する。ＶＥＧＦＲ−２は一般的にＶＥＧＦ−Ａの有糸分裂誘発、血管新生及び透過性増強作用の主要なメディエーターであると考えられている。２００４年２月において、米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）はベバシツマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、即ちヒト化抗ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）−Ａモノクローナル抗体を、５−フルオロウラシル（ＦＵ）系の化学療法レジメンとの組み合わせにおいて転移性結腸直腸癌の治療に関して認可している。その後、ＦＤＡはペガプチニブ（ｐｅｇａｐｔｉｎｉｂ）、即ちＶＥＧＦ−Ａの１６５アミノ酸アイソフォームをブロックするアプタマーを、加齢関連黄斑変性（ＡＭＤ）の湿性（血管新生）形態の治療に関して認可している。
【非特許文献１】Ｐｌｏｕｅｔ，Ｊ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８９）８：３８０１−３８０８
【非特許文献２】Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４６：１３０６−１３０９
【非特許文献３】Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．等、Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３８０：４３５−４３９
【非特許文献４】Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３８０：４３９−４４２
【非特許文献５】Ｓｅｎｇｅｒ，Ｄ．Ｒ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）２１９：９８３−９８５
【非特許文献６】Ｄｖｏｒａｋ，Ｈ．Ｆ．等、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９５）１４６：１０２９−１０３９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これらの進歩にもかかわらず、ＶＥＧＦアンタゴニストで治療されている多くの患者は最終的にはその疾患の犠牲となっている。その結果、ＶＥＧＦアンタゴニスト療法に対してもはや応答しないか、または部分的にしか応答しない疾患を治療するための新しい医薬及び治療法の開発が必要である。更に又、癌及び異常な血管新生により悪化、誘発又は作用される疾患を治療するための代替及び／又はより良好な療法の開発が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
本発明は低減された血管新生により利益を被る、異常な血管新生に罹患している、及び／又は新生物形成に罹患している患者を治療する医薬及び方法に関する。１つの実施形態によれば、本発明は治療有効量のＶＥＧＦアンタゴニスト及びアルファ５ベータ１アンタゴニストを同時又は逐次的に対象に投与する工程を含む、対象における血管新生及び／又は血管透過性を抑制するための方法を提供する。他の実施形態によれば、本発明は、治療有効量のアルファ５ベータ１アンタゴニストを疾患に罹患した対象に投与する工程を含む、対象がＶＥＧＦアンタゴニストを用いた疾患に対する治療には応答性であったが、ＶＥＧＦアンタゴニストに対して部分的に応答するか、またはもはや応答しない場合の、該対象を治療するための方法を提供する。別の実施形態によれば、本発明は治療有効量のＶＥＧＦアンタゴニストを疾患に罹患した対象に投与する工程を含む、疾患がアルファ５ベータ１アンタゴニスト療法に対し、単独又は化学療法との組み合わせにおいて、抵抗性又は難治性となっている場合の、該対象を治療するための方法を提供する。
【０００６】
本発明は又、新しい抗アルファ５ベータ１抗体、それを含むキット及び組成物、及びそれらを製造又は使用する方法に関する。１つの実施形態によれば、新しいアルファ５ベータ１抗体は本明細書に記載した７Ｈ５抗体又は７Ｈ１２抗体、又はそのヒト化又はキメラ形態である。別の特定の実施形態によれば、７Ｈ５抗体又は７Ｈ１２抗体、又はそのヒト化又はキメラ形態は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）及びＦｖフラグメント；ダイアボディー、多重特異性抗体及び線状抗体の形態であることができる。別の実施形態によれば、新しい抗アルファ５ベータ１抗体は別の実体、例えば限定しないが、治療薬又は蛍光染料又は患者中または患者試料中のアルファ５ベータ１を検出するための他のマーカーに結合体化できる。そのような新しいアルファ５ベータ１抗体は種々の治療及び診断の方法において使用できる。例えば、そのような抗アルファ５ベータ１抗体は異常な血管新生、新生物形成、眼の疾患及び自己免疫疾患を治療する場合に使用できる。そのような抗体は、患者中または患者試料中のアルファ５ベータ１蛋白にそのような抗体を接触させること、及び、アルファ５ベータ１蛋白に結合した抗アルファ５ベータ１抗体を定性的又は定量的に測定することにより、患者中または患者試料中のアルファ５ベータ１蛋白を検出するために使用できる。
【０００７】
更に別の実施形態によれば、本発明はＶＥＧＦアンタゴニスト及びアルファ５ベータ１アンタゴニストを同時又は逐次的に投与する工程を含む、対象における癌を治療する方法を提供する。１つの好ましい実施形態によれば、癌はＶＥＧＦアンタゴニスト療法に応答性である。別の実施形態においては、治療有効量のＶＥＧＦアンタゴニスト及びアルファ５ベータ１アンタゴニストを同時又は逐次的に投与する工程を含む、加齢関連黄斑変性（ＡＭＤ）、例えば湿性加齢関連黄斑変性をＡＭＤに罹患した対象において治療する方法を提供する。更に別の実施形態においては、治療有効量のＶＥＧＦアンタゴニスト及びアルファ５ベータ１アンタゴニストを同時又は逐次的に投与する工程を含む、対象における自己免疫疾患を治療する方法を提供する。
【０００８】
１つの実施形態において、治療すべき対象はまずＶＥＧＦアンタゴニストを投与され、そしてその後、アルファ５ベータ１アンタゴニストで治療される。別の実施形態においては、対象はＶＥＧＦアンタゴニスト及びアルファ５ベータ１アンタゴニストで同時に治療される。別の実施形態においては、対象はＶＥＧＦアンタゴニスト治療に非応答性となるまで対象をＶＥＧＦアンタゴニストで治療し、そして次に対象をアルファ５ベータ１アンタゴニストで治療する。１つの特定の実施形態においては、癌が非侵襲性又は初期の段階である場合には対象をＶＥＧＦアンタゴニストで治療し、癌が侵襲性である場合にはアルファ５ベータ１アンタゴニストで治療する。別の実施形態においては、アルファ５ベータ１アンタゴニストで治療される対象は、前記疾患に罹患していない対象由来の組織と比較して罹患組織において上昇したアルファ５ベータ１レベルを有する。この場合、方法は更に、ＶＥＧＦアンタゴニストを用いた治療の後に、対象において、例えば罹患組織において、アルファ５ベータ１を検出する工程を包含できる。１つの実施形態によれば、侵襲性の癌は転移癌である。別の実施形態においては、早期の癌はアジュバント療法（例えば化学療法又は外科的摘出）により治療される癌である。
【０００９】
１つの好ましい実施形態においては、対象は異常な血管新生を有する疾患に罹患している。別の実施形態によれば、疾患は癌、免疫疾患又は眼の疾患からなる群より選択される。１つの好ましい実施形態によれば、疾患は固形腫瘍、転移性腫瘍、軟組織腫瘍、眼の新生血管形成を有する疾患、異常な血管新生を有する炎症性疾患、対象への移植後に生じる疾患、及び線維血管組織の異常な増殖を有する疾患からなる群より選択される。別の好ましい実施形態によれば、癌は乳癌（転移性乳癌を包含する）、子宮頚癌、結腸直腸癌（転移性結腸直腸癌を包含する）、肺癌（非小細胞肺癌を包含する）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、慢性リンパ性白血病、腎細胞癌、前立腺癌、例えばホルモン難治性前立腺癌、肝癌、頭部頚部癌、メラノーマ、卵巣癌、中皮腫、軟組織癌、消化管間質腫瘍、多形性神経膠芽腫、及び多発性骨髄腫からなる群より選択される。別の好ましい実施形態によれば、疾患は網膜症、加齢誘発性黄斑変性（例えば湿性ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫、皮膚紅潮、乾癬、炎症性腎疾患、溶血性尿毒症症候群、糖尿病性腎症（増殖性糖尿病性腎症）、関節炎（例えば乾癬性関節炎、変形性関節症、慢性関節リューマチ）、炎症性腸疾患、慢性炎症、慢性網膜剥離、慢性ブドウ膜炎、慢性硝子体炎、角膜移植片拒絶、角膜新生血管形成、角膜移植片新生血管形成、クローン病、近視、眼の血管新生性疾患、パジェット病、類天疱瘡、多発性動脈炎、レーザー後の放射状角膜切開、網膜の新生血管形成、シェーグレン症候群、潰瘍性結腸炎、移植片拒絶、肺の炎症、ネフローゼ症候群、浮腫、悪性疾患に関連する腹水、卒中、血管線維腫、及び血管新生緑内障からなる群より選択される。１つの実施形態において、対象は更に抗腫瘍剤、化学療法剤、及び細胞毒性剤からなる群より選択される治療薬を投与される。
【００１０】
本発明の１つの好ましい実施形態によれば、アルファ５ベータ１アンタゴニストで治療されるべき対象は、ＶＥＧＦアンタゴニスト治療後の回帰に罹患しているか、又はＶＥＧＦアンタゴニスト治療に対して難治性となっている。別の実施形態によれば、アルファ５ベータ１アンタゴニストおよびＶＥＧＦアンタゴニストで治療されるべき対象は、転移癌に罹患しているか、又はアジュバント療法で以前に治療されている。１つの実施形態において、候補患者は、イリノテカンのような化学療法剤に対して回帰性、難治性又は耐性である。そのような疾患の例は、限定しないが、転移性結腸直腸癌、回帰した転移性結腸直腸癌、転移性乳癌、回帰した転移性乳癌、転移性ＨＥＲ２＋乳癌、アジュバント乳癌（ａｄｊｕｖａｎｔ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、アジュバントＨＥＲ２＋乳癌、転移膵臓癌、アジュバント結腸癌、アジュバント非小細胞肺癌、アジュバント直腸癌、アジュバント非小細胞肺癌、転移性非小細胞肺癌、転移性卵巣癌、転移性腎細胞癌、及びアジュバント腎細胞癌を包含する。
【００１１】
１つの実施形態によれば、本明細書に記載した疾患に罹患した患者はＶＥＧＦアンタゴニストによる疾患の治療の後の維持療法を受けており、その場合、維持療法はアルファ５ベータ１アンタゴニスト単独、または、ＶＥＧＦアンタゴニストと逐次的又は同時に行われる。
【００１２】
１つの好ましい実施形態によれば、ＶＥＧＦアンタゴニストは抗体、イムノアドヘシン、ペプチボディー、小分子及びストリンジェントな条件下でＶＥＧＦをコードする核酸分子にハイブリダイズする核酸（例えばリボザイム、ｓｉＲＮＡ及びアプタマー）からなる群より選択できる。１つの好ましい実施形態によれば、ＶＥＧＦアンタゴニストは抗体である。別の実施形態によれば、抗体はモノクローナル抗体である。１つの好ましい実施形態によれば、抗ＶＥＧＦ抗体はＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）抗体によりヒトＶＥＧＦへの結合を競合的に抑制され得る。別の実施形態によれば、抗ＶＥＧＦ抗体はヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。１つの特定の実施形態によれば、抗ＶＥＧＦ抗体はＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）抗体である。別の実施形態によれば抗ＶＥＧＦ抗体はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖフラグメント；ダイアボディー及び線状抗体からなる群より選択される。別の実施形態によればＶＥＧＦアンタゴニストはＶＥＧＦ及びアルファ５ベータ１に結合する二重特異性抗体であり、そしてアルファ５ベータ１アンタゴニストである。
【００１３】
１つの好ましい実施形態によれば、アルファ５ベータ１アンタゴニストは抗体、イムノアドヘシン、ペプチボディー、小分子及びストリンジェントな条件下でアルファ５ベータ１をコードする核酸分子にハイブリダイズする核酸からなる群より選択される。１つの好ましい実施形態によれば、アルファ５ベータ１抗体は抗体である。別の実施形態によれば、抗体はモノクローナル抗体である。別の実施形態によれば、モノクローナル抗体は，キメラ抗体、例えばＭ２００又はＦ２００として知られている抗ヒトアルファ５ベータ１抗体である。１つの実施形態によれば、抗アルファ５ベータ１抗体は配列番号１のＶＨ配列及び配列番号２のＶＬ配列を含む。別の実施形態によれば、抗アルファ５ベータ１抗体は配列番号３の配列及び配列番号４の配列を含む。別の実施形態によれば、抗アルファ５ベータ１抗体は配列番号４の配列及び配列番号５の配列を含む。１つの好ましい実施形態によれば、抗アルファ５ベータ１抗体は７Ｈ５及び７Ｈ１２抗体によりヒトアルファ５ベータ１への結合を競合的に抑制され得る。１つの好ましい実施形態によれば、抗アルファ５ベータ１抗体はヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。１つの特定の実施形態によれば、抗アルファ５ベータ１抗体は７Ｈ５抗体、７Ｈ１２抗体、又はそのキメラ又はヒト化抗体である。別の実施形態によれば、抗アルファ５ベータ１抗体はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖフラグメント；ダイアボディー及び線状抗体からなる群より選択される。別の実施形態によればアルファ５ベータ１アンタゴニストはＶＥＧＦ及びアルファ５ベータ１に結合する二重特異性抗体であり、そしてＶＥＧＦアンタゴニストである。更に別の実施形態によれば、抗アルファ５ベータ１アンタゴニストは改変されたエフェクター機能を有する。１つの実施形態によれば抗アルファ５ベータ１抗体を改変することにより抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を低減又は防止する（例えば抗体のＦｃ部分をコードする核酸配列を改変することによる）。更に別の実施形態によれば、抗アルファ５ベータ１抗体はヒトにおけるその半減期を向上させるために改変されている（例えば抗体のＦｃ部分をコードする核酸配列を改変することによる）。
【００１４】
１つの実施形態によれば、ＶＥＧＦアンタゴニスト又はアルファ５ベータ１アンタゴニストは細胞毒性剤又は化学療法剤に結合体化される。別の実施形態によれば、細胞毒性剤は放射性同位体又は毒素である。
【００１５】
本発明はＶＥＧＦアンタゴニスト、アルファ５ベータ１アンタゴニスト及び製薬上許容しうる担体を含む組成物を提供する。本発明はまたＶＥＧＦアンタゴニストで治療された対象においてアルファ５ベータ１を検出するための説明書を含む製造物品を提供する。
【００１６】
本発明は又、血管新生及び血管透過性を増進するためのＶＥＧＦＲアゴニスト及びアルファ５ベータ１アゴニストの使用及びＶＥＧＦアゴニスト及びアルファ５ベータ１アゴニスト及び製薬上許容しうる担体を含む組成物に関する。ＶＥＧＦＲアゴニスト及びアルファ５ベータ１アゴニストのコンビナトリアル療法は増大した血管新生及び血管透過性から利益を被る種々の疾患の治療、例えば創傷治癒において、例えば慢性創傷、急性創傷及び通常の創傷の治療において使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
理論に制約されないが、本発明者等は、増大した間質細胞のリクルートメントは、ＶＥＧＦアンタゴニスト療法により治療された患者においてＶＥＧＦの活性の損失を補うことができる他の血管成長因子を運ぶことができることを提案する。抗ａ５ｂ１抗体によるａ５ｂ１発現間質細胞のターゲティングは間質細胞の低減をもたらし、これにより潜在的に補償性の血管成長因子の生産を低減すると考えられる。或いは、又は追加的に、内皮−細胞外マトリックスの相互作用を抑制すること、特にアルファ５ベータ１の結合相互作用を抑制することが、ＶＥＧＦアンタゴニスト療法による血管後退による細胞外マトリックストラック（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｔｒａｃｋ）に沿った血管新生の復帰を抑制することによりＶＥＧＦアンタゴニスト療法を強化することを本発明者等は提案する。従って、何れかのＶＥＧＦアンタゴニスト治療と同時か、その後のアルファ５ベータ１アンタゴニストを用いた治療はＶＥＧＦアンタゴニスト治療からの血管の回復及びその結果としての新生血管成長の復帰を抑制すると考えられる。
【００１８】
「アルファ５ベータ１」又は「α５β１」又は「ａ５ｂ１」とは、２つの異なる蛋白（すなわちサブユニットであるアルファ５及びベータ１）を含むインテグリンである。アルファ５ベータ１はフィブロネクチン、Ｌ１−ＣＡＭ及びフィブリノーゲンに結合することが分かっている。アルファ５ベータ１インテグリンは又、最晩期活性化−５、ＶＬＡ−５  、アルファ５ベータ１、ＣＤ４９ｅ／ＣＤ２９、フィブロネクチン受容体、ＦＮＲ及びＧＰＩｃ−ＩＩａとも称されている。好ましい実施形態によれば、アルファ５ベータ１はヒトアルファ５ベータ１である。
【００１９】
「アルファ５」は又、ＣＤ４９ｅ、アルファ５、インテグリンアルファ５サブユニット、ＶＬＡ−５アルファサブユニット、ＧＰＩｃ−ＩＩａのＩＣサブユニット及びＦＮＲアルファとしても知られており、鎖はオルタナティブスプライシングにより形成された４つのアイソフォームを有する（Ａ−Ｄ）。それらはそれらの細胞質ドメイン内で変動する。アルファ５のヒトアイソフォームに関するアミノ酸配列は例えばそれぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ０７９７９、Ｕ３３８７９、Ｕ３３８８２及びＵ３３８８０に見出され得る。
【００２０】
「ベータ１」はＣＤ２９、ベータ１、血小板ＧＰＩＩａ；ＶＬＡ−ベータ鎖；ベータ−１インテグリン鎖、ＣＤ２９；ＦＮＲＢ；ＭＤＦ２；ＶＬＡＢ；ＧＰＩＩＡ；ＭＳＫ１２及びＶＬＡ５Ｂとも称される。ヒトベータ１のアミノ酸配列は例えばＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ０６２５６で知ることができる。
【００２１】
「ＶＥＧＦ」又は「ＶＥＧＦ」という用語は本明細書においては、Ｌｅｕｎｇ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１３０６（１９８９）およびＨｏｕｃｋ等、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．，５：１８０６（１９９１）に記載の通り、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞成長因子、及び関連の１２１−、１８９−及び２０６−アミノ酸のヒト血管内皮細胞成長因子、並びにその天然に存在する対立遺伝子及びプロセシングされた形態を指す。「ＶＥＧＦ」という用語はまた非ヒトの種、例えばマウス、ラット又は霊長類に由来するＶＥＧＦも指す。場合により特定の種に由来するＶＥＧＦを例えばヒトＶＥＧＦについてはｈＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦについてはｍＶＥＧＦ等という用語により示す。「ＶＥＧＦ」という用語はまた１６５アミノ酸ヒト血管内皮細胞成長因子のアミノ酸８〜１０９又は１〜１０９を含むポリペプチドのトランケーションされた形態をさすためにも使用する。ＶＥＧＦの何れかのそのような形態に言及する場合は、本出願においては、例えば「ＶＥＧＦ（８−１０９）」、「ＶＥＧＦ（１−１０９）」又は「ＶＥＧＦ１６５」により識別する場合がある。「トランケーションされた」ネイティブのＶＥＧＦに関するアミノ酸の位置はネイティブのＶＥＧＦ配列において示される数とする。例えばトランケーションされたネイティブのＶＥＧＦにおけるアミノ酸位１７（メチオニン）はまたネイティブのＶＥＧＦにおける１７位（メチオニン）となる。トランケーションされたネイティブのＶＥＧＦはネイティブのＶＥＧＦに匹敵するＫＤＲ及びＦｌｔ−１受容体に対する結合特性を有する。好ましい実施形態によれば、ＶＥＧＦはヒトＶＥＧＦである。
【００２２】
「ＶＥＧＦアンタゴニスト」とはＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体１つ以上又はそれらをコードする核酸への自身の結合を包含する、ＶＥＧＦ活性を中和、ブロック、抑制、消失、低減又は干渉することができる分子を指す。好ましくは、ＶＥＧＦアンタゴニストはＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体に結合する。ＶＥＧＦアンタゴニストは抗ＶＥＧＦ抗体及びその抗原結合フラグメント、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ受容体に結合してリガンド−受容体相互作用をブロックするポリペプチド（例えばイムノアドヘシン、ペプチボディー）、抗ＶＥＧＦ受容体抗体及びＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの小分子阻害剤、ＶＥＧＦに結合するアプタマー、及びＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体をコードする核酸配列にストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸（例えばＲＮＡｉ）を包含する。１つの好ましい実施形態によれば、ＶＥＧＦアンタゴニストはＶＥＧＦに結合し、インビトロのＶＥＧＦ誘導内皮細胞増殖を抑制する。１つの好ましい実施形態によれば、ＶＥＧＦアンタゴニストはＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体に対し非ＶＥＧＦ又は非ＶＥＧＦ受容体よりも高い親和性で結合する。１つの好ましい実施形態によれば、ＶＥＧＦアンタゴニストは１ｕＭ〜１ｐＭのＫｄでＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体に結合する。別の好ましい実施形態によれば、ＶＥＧＦアンタゴニストは５００ｎＭ〜１ｐＭのＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体に結合する。
【００２３】
好ましい実施形態によれば、ＶＥＧＦアンタゴニストは抗体、ペプチボディー、イムノアドヘシン、小分子またはアプタマーからなる群より選択される。好ましい実施形態においては、抗体は抗ＶＥＧＦ抗体、例えばＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）抗体又は抗ＶＥＧＦ受容体抗体、例えば抗ＶＥＧＦＲ２又は抗ＶＥＧＦＲ３抗体である。ＶＥＧＦアンタゴニストの他の例は、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、Ｍｕｃａｇｅｎ、ＰＴＫ７８７、ＳＵ１１２４８、ＡＧ−０１３７３６、Ｂａｙ４３９００６（ソラフェニブ）、ＺＤ−６４７４、ＣＰ６３２、ＣＰ−５４７６３２、ＡＺＤ−２１７１、ＣＤＰ−１７１、ＳＵ−１４８１３、ＣＨＩＲ−２５８、ＡＥＥ−７８８、ＳＢ７８６０３４、ＢＡＹ５７９３５２、ＣＤＰ−７９１、ＥＧ−３３０６、ＧＷ−７８６０３４、ＲＷＪ−４１７９７５／ＣＴ６７５８及びＫＲＮ−６３３を包含する。
【００２４】
「抗ＶＥＧＦ抗体」は十分な親和性及び特異性でＶＥＧＦに結合する抗体である。好ましくは、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はＶＥＧＦ活性が関与している疾患又は状態をターゲティング又は干渉する場合の治療薬として使用できる。抗ＶＥＧＦ抗体は通常は他のＶＥＧＦ相同体、例えばＶＥＧＦ−Ｂ又はＶＥＧＦ−Ｃ、又は他の成長因子、例えばＰＩＧＦ、ＰＤＧＦ又はｂＦＧＦには結合しない。好ましい抗ＶＥＧＦ抗体はハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ１０７０９により生産されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である。より好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体はＰｒｅｓｔａ等、（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９により形成される組み換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体、例えば限定しないが、ベバシツマブ（ＢＶ；Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））として知られる抗体である。別の実施形態によれば、使用できる抗ＶＥＧＦ抗体はＷＯ２００５／０１２３５９に開示されている抗体を含むが、それに限定されない。１つの実施形態によれば、抗ＶＥＧＦ抗体はＷＯ２００５／０１２３５９の図２４、２５、２６、２７及び２９に開示されている抗体（例えばＧ６、Ｇ６−２３、Ｇ６−３１、Ｇ６−２３．１、Ｇ６−２３．２、Ｂ２０、Ｂ２０−４及びＢ２０．４．１）の何れか１つの可変重鎖及び可変軽鎖領域を成す。別の好ましい実施形態においては、ラニビツマブとして知られる抗ＶＥＧＦ抗体は糖尿病性神経障害及びＡＭＤのような眼の疾患に対して投与されるＶＥＧＦアンタゴニストである。
【００２５】
抗ＶＥＧＦ抗体「ベバシツマブ（ＢＶ）」、別名「ｒｈｕＭＡｂＶＥＧＦ」又は「Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）」はＰｒｅｓｔａ等、（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９により形成される組み換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。これは突然変異したヒトＩｇＧ１フレームワーク領域及びヒトＶＥＧＦのその受容体への結合をブロックするマウス抗ｈ−ＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ４．６．１に由来する抗原結合相補性決定領域を含む。フレームワーク領域の大部分を包含するベバシツマブのアミノ酸配列の約９３％はヒトＩｇＧ１から誘導されており、そして配列の約７％はマウス抗体Ａ４．６．１から誘導されている。ベバシツマブは約１４９，０００の分子質量を有し、そしてグリコシル化されている。他の抗ＶＥＧＦ抗体は米国特許６８８４８７９及びＷＯ２００５／０４４８５３に記載されている抗体を包含する。
【００２６】
抗ＶＥＧＦ抗体ラニビツマブ、即ちＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）抗体又はｒｈｕＦａｂＶ２はヒト化親和性成熟抗ヒトＶＥＧＦＦａｂフラグメントである。ラニビツマブはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ発現ベクターにおける標準的な組み換え手法及び細菌発酵により製造される。ラニビツマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）はグリコシル化されておらず、そして分子質量約４８，０００を有している。ＷＯ９８／４５３３１及び米国特許出願ＵＳ２００３０１９０３１７を参照できる。
【００２７】
「アルファ５ベータ１アンタゴニスト」とは、アルファ５ベータ１の生物学的活性を抑制する何れかの分子を指す。１つの好ましい実施形態によれば、アンタゴニスト分子はアルファ５ベータ１に特異的に結合する。１つの好ましい実施形態によれば、アンタゴニスト分子はアルファ５に結合する。１つの好ましい実施形態によれば、アルファ５ベータ１アンタゴニストは非アルファ５ベータ１インテグリンに比較して高い親和性でアルファ５ベータ１に優先的に結合する。１つの好ましい実施形態によれば、アンタゴニストは例えばアルファ５ベータ１のそのリガンド（特にフィブロネクチン）への結合を抑制するポリペプチド、抗体、ペプチボディー又はイムノアドヘシン、小分子又はアプタマー、又はアルファ５ベータ１をコードする核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（例えばアルファ５発現を妨害するＲＮＡｉ）からなる群より選択される。アルファ５ベータ１の生物学的活性は（１）フィブロネクチンへの結合、（２）フィブロネクチン上の細胞移動の増強、（３）フィブロネクチン存在下におけるアルファ５ベータ１を含む細胞の生存の増大、（４）フィブロネクチン存在下におけるアルファ５ベータ１を含む細胞の増殖の増大、及び（５）フィブロネクチン存在下におけるアルファ５ベータ１を含む細胞の管形成の増大、からなる群より選択される作用の何れか１つ、組み合わせ又は全てであることができる。
【００２８】
抗アルファ５ベータ１アンタゴニスト抗体の例は、Ｍ２００及びＦ２００（ＷＯ２００４／０８９９８８Ａ２）、本明細書に記載する７Ｈ５抗体及び７Ｈ１２抗体、及びそのキメラ、完全ヒト型、及びヒト化抗体を包含する。例えばＭ２００及びＦ２００抗体はマウス抗ヒトアルファ５ベータ１抗体、ＩＩＡ１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ）の可変重鎖及び可変軽鎖から誘導できる。アルファ５ベータ１小分子阻害剤の例はＡｃ−ＰＨＳＣＮ−ＮＨ２（ＷＯ−９８２２６１７Ａ１）及び（Ｓ）−２−［（２，４，６−トリメチルフェニル）スルホニル］アミノ−３−［７−ベンジルオキシカルボニル−８−（２−ピリジニルアミノメチル）−１−オキサ−２，７−ジアザスピロ−（４，４）−ノナ−２−エン−３−イル］カルボニルアミノ］プロパン酸を包含する。１つの好ましい実施形態によれば、アルファ５ベータ１アンタゴニストはアルファ５ベータ１に結合するが、アルファＶベータ３、アルファＶベータ５、アルファＶベータ１には結合しない。１つの好ましい実施形態によれば、アルファ５ベータ１アンタゴニストは１ｕＭ〜１ｐＭのＫｄでアルファ５ベータ１に結合する。別の好ましい実施形態によれば、アルファ５ベータ１アンタゴニストは５００ｎＭ〜１ｐＭのＫｄでアルファ５に結合する。１つの好ましい実施形態によれば、アルファ５ベータ１抗体は競合的結合試験においてアルファ５ベータ１への結合に関し、７Ｈ５抗体又は７Ｈ１２抗体と競合できる抗体である。別の好ましい実施形態によれば、抗体は２００６年３月７日にアルファ５／ベータ１  ７Ｈ５．４．２．８（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−７４２１）として寄託されたハイブリドーマ及びアルファ５／ベータ１７Ｈ１２．５．１．４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−７４２０）として寄託されたハイブリドーマから生産される抗体により、アルファ５ベータ１に対する結合を競合的に抑制され得る抗体である。
【００２９】
「ＶＥＧＦＲアゴニスト」とはＶＥＧＦ受容体を活性化できるか、又はその発現を増大できる分子を指す。ＶＥＧＦＲアゴニストは限定しないが、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦの変異体、抗体及び活性フラグメントのリガンドアゴニストを包含する。
【００３０】
「アルファ５ベータ１アゴニスト」とはアルファ５ベータ１を活性化又はその発現を増大させることができる分子を指す。アルファ５ベータ１アゴニストは限定しないが、例えばアルファ５ベータ１のリガンドアゴニストを包含する。
【００３１】
標的上の重複又は同様の区域に結合することを特徴とする抗体のような分子は競合的抑制／結合試験により識別することができる。
【００３２】
１つの実施形態において、ＨＵＶＥＣ又は他のアルファ５ベータ１発現細胞を競合的抑制試験において使用し、そしてＦＡＣＳを用いて相互に比較した場合の２つの抗アルファ５ベータ１抗体の結合の局所性を評価する。例えばＨＵＶＥＣ細胞を三角試験管中で洗浄し、５分間１０００ｒｐｍで遠心分離する。ペレットは典型的には２回洗浄する。次に細胞を再懸濁し、計数し、使用時まで氷上に保存する。最初の抗アルファ５ベータ１抗体１００ｕｌ（例えば１ｕｇ／ｍｌ濃度以下の濃度で開始）をウェルに添加することができる。次に１００μｌ（例えば細胞２０×１０５個）の細胞をウェル当たり添加し、３０分間氷上でインキュベートする。次に１００μｌのビオチン化抗アルファ５ベータ１抗体（５μｇ／ｍｌ保存液）を各ウェルに添加し、３０分間氷上でインキュベートする。次に細胞を洗浄し、５分間１０００ｒｐｍでペレット化する。上澄みを吸引する。２回目の抗体Ｒ−フィコエリスリン結合体ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ０１６−１１０−０４８）をウェルに添加する（１：１０００で１００μｌ）。次にプレートをホイルで包装し、３０分間氷上でインキュベートする。インキュベーションの後、ペレットを洗浄し、５分間１０００ｒｐｍでペレット化する。ペレットを再懸濁し、マイクロ力価測定試験管に移し、ＦＡＣＳ分析に付す。
【００３３】
「血管新生因子または薬剤」とは血管の発生を刺激する、例えば血管新生、内皮細胞飼育、血管の安定性及び／又は脈管形成等を増進する成長因子である。例えば血管新生因子は限定しないが、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦファミリーのメンバー、ＰＩＧＦ、ＰＤＧＦファミリー、線維芽細胞成長因子ファミリー（ＦＧＦ）、ＴＩＥリガンド（アンジオポエチン）、エフリン、Ｄｅｌ−１、線維芽細胞成長因子：酸性（ａＦＧＦ）及び塩基性（ｂＦＧＦ）、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）／散乱因子（ＳＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、レプチン、ミドカイン、胎盤成長因子、血小板誘導内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板誘導成長因子、特にＰＤＧＦ−ＢＢ又はＰＤＧＦＲ−ベータ、プレイオトロピン（ＰＴＮ）、プログラヌリン、プロリフェリン、形質転換成長因子−アルファ（ＴＧＦ−アルファ）、形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ−ベータ）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）／血管透過性因子（ＶＰＦ）等を包含する。更に又、創傷治癒を加速させる因子、例えば成長ホルモン、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＶＩＧＦ、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ＣＴＣＧ及びそのファミリーメンバー、及びＴＧＦ−アルファ及びＴＧＦ−ベータを包含する。例えばＫｌａｇｓｂｒｕｎ  ａｎｄ  Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５３：２１７−３９（１９９１）；Ｓｔｒｅｉｔ  ａｎｄ  Ｄｅｔｍａｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：３１７２−３１７９（２００３）；Ｆｅｒｒａｒａ  ＆  Ａｌｉｔａｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（１２）：１３５９−１３６４（１９９９）；Ｔｏｎｉｎｉ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：６５４９−６５５６（２００３）（例えば既知の血管新生因子を列挙した表１）；及びＳａｔｏ  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，８：２００−２０６（２００３）を参照できる。
【００３４】
本発明の抗ＶＥＧＦ抗体に関する「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」とは、１つの好ましい実施形態においては、一連の力価の未標識ＶＥＧＦの存在下（１２５Ｉ）標識ＶＥＧＦ（１０９）の最小濃度でＦａｂを平衡化させ、次に、抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートを用いて結合ＶＥＧＦをキャプチャーすることによるＶＥＧＦに対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する後述の試験により説明される通り、抗体のＦａｂ型とＶＥＧＦ分子を用いて行われる放射標識ＶＥＧＦ結合試験（ＲＩＡ）により測定される（Ｃｈｅｎ，等、（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１）。試験の条件を確立するために、マイクロプレート（Ｄｙｎｅｘ）を５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中キャプチャー用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）５ｕｇ／ｍｌで一晩コーティングし、そしてその後、室温で２〜５時間（約２３℃）ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンでブロッキングする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）中、１００ｐＭ又は２６ｐＭ［１２５Ｉ］−ＶＥＧＦ（１０９）を目的のＦａｂ、例えばＦａｂ−１２の連続希釈物と混合する（Ｐｒｅｓｔａ等、（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９）。次に目的のＦａｂを一晩インキュベートするが、インキュベートは確実に平衡が達成されるようにより６５時間継続してよい。その後、混合物を１時間室温インキュベーションのためにキャプチャープレートに移す。次に溶液を取り出し、プレートをＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で８回洗浄する。プレートが乾燥した時点で、シンチラント（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０；Ｐａｃｋａｒｄ）１５０ｕｌ／ウェルを添加し、プレートをＴｏｐｃｏｕｎｔガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間計数する。最大結合の２０％以下を与える各Ｆａｂの濃度を競合的結合試験で使用するために選択する。別の実施形態によれば、Ｋｄ又はＫｄ値は〜１０応答単位（ＲＵ）において固定化されたｈＶＥＧＦ（８−１０９）ＣＭ５チップを用いて２５℃においてＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いた表面プラズモン共鳴試験により測定する。簡潔にはカルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を入手元の取扱説明書に従って塩酸Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。ヒトＶＥＧＦを５ｕｇ／ｍｌ（〜０．２ｕＭ）まで１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．８で希釈した後に５ｕｌ／分の流量で注入し、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリング蛋白を達成する。ヒトＶＥＧＦ注入後、１Ｍエタノールアミンを注入して未反応の基をブロッキングする。動態の測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈物（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で２５℃流量約２５ｕｇ／分で注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることにより単純な１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を用いて計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。例えばＣｈｅｎ，Ｙ．，等、（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３：８６５−８８１を参照できる。上記した表面プラズモン共鳴試験によるｏｎの速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を超過する場合は、ｏｎ速度は、攪拌キュベットを有するストップフロー装着分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）又は８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）のような分光計において測定した場合のヒトＶＥＧＦ短鎖型（８−１０９）又はマウスＶＥＧＦの漸増濃度の存在下ＰＢＳｐＨ７．２中２０ｎＭ抗ＶＥＧＦ抗体（Ｆａｂ型）の２５℃における蛍光発光強度の増大又は低減を測定する蛍光クエンチングの手法（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）により測定することができる。同様の結合試験は、標的としてアルファ５ベータ１を使用しながら抗アルファ５ベータ１Ｆａｂ又は抗体のＫｄを測定するために使用することができる。
【００３５】
本明細書においては、治療すべき対象は哺乳類（例えばヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ等）である。対象は臨床患者、臨床治験ボランティア、実験動物などであってよい。対象は癌、免疫疾患又は異常な血管新生を有する何れかの他の疾患を有することが疑われるか、有する危険性があるか、癌、免疫疾患又は異常な血管新生を有する何れかの他の疾患と診断されてよい。癌、免疫疾患又は異常な血管新生を有する何れかの他の疾患に関する多くの診断方法及びそれらの疾患の臨床的概要は当業者の知る通りである。１つの好ましい実施形態によれば、本発明により治療すべき対象はヒトである。
【００３６】
用語である異常な血管新生は、新しい血管の過剰または不適切（例えば血管新生の位置、時期又は発生が医学的見地から望ましくない）な成長が疾患状態において生じるか、それが疾患状態を誘発する場合に起こる。過剰、不適切又は制御不能な血管新生は、癌、特に血管新生した固形腫瘍及び転移性腫瘍（例えば結腸、肺の癌（特に小細胞肺癌）又は前立腺癌）の場合のような疾患状態又は疾患状態の原因、眼の血管新生により生じた疾患、特に糖尿病性失明、網膜症、原発性糖尿病性網膜症又は加齢誘発性黄斑変性、脈絡膜の血管新生（ＣＮＶ）、糖尿病性の黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル−リンダウ病、眼のヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞（ＣＲＶＯ）、角膜の血管新生、網膜の新生血管形成及び紅潮；乾癬、乾癬性関節炎、血管芽腫、例えば血管腫；炎症性腎疾患、例えば糸球体腎炎、特に糸球体間質増殖性糸球体腎炎、溶血性尿毒症症候群、糖尿病性腎症又は高血圧性腎硬化症；種々の炎症性疾患、例えば関節炎、特に慢性関節リューマチ、炎症性腸疾患、乾癬、サルコイドーシス、動脈硬化症及び移植後に起こる疾患、子宮内膜症又は慢性喘息及び７０超の他の状態の悪化に寄与する新しい血管の形成がある場合に生じる。新しい血管は疾患組織に補給し、正常組織を破壊し、そして癌の場合は、新しい血管は腫瘍細胞の循環系内への逃避及び多臓器内への定着（転移）を可能にする。本発明は上記した疾患を発症する危険性のある患者を治療することを意図している。
【００３７】
本発明の抗体又はポリペプチドを投与する候補となる他の患者は、線維血管組織の異常な増殖、しゅさ性挫創、後天性免疫不全症候群、動脈閉塞、アトピー性角膜炎、細菌性潰瘍、ベーチェット病、血液媒介性の腫瘍、頸動脈閉塞性疾患、脈絡膜血管新生、慢性炎症、慢性網膜剥離、慢性ブドウ膜炎、慢性硝子体炎、コンタクトレンズ過剰着用、角膜移植片拒絶、角膜新生血管形成、角膜移植片新生血管形成、クローン病、イールズ病、流行性角結膜炎、真菌性潰瘍、単純疱疹感染、帯状疱疹感染、過粘稠度症候群、カポジ肉腫、白血病、脂質編成、ライム病、辺縁角質溶解、モーレン潰瘍、らい病以外のマイコバクテリア感染、近視、眼の血管新生性疾患、視神経乳頭先天的構造欠損、オースラー・ウエーバー症候群（オースラー・ウエーバー・ランデュ変形性関節症）、パジェット病、毛様体輪炎、類天疱瘡、フリクテン症、多発性動脈炎、レーザー後の合併症、原虫感染症、弾性線維仮性黄色腫、翼状片乾性角結膜炎、放射状角膜切開、網膜血管新生、未熟児網膜症、水晶体後線維増殖症、類肉腫、強膜炎、鎌状赤血球貧血、シェーグレン症候群、固形腫瘍、シュタルガルト病、ステーブンスジョンソン病、上輪郭角膜炎、全身性狼瘡、テリエン辺縁変性、トキソプラスマ症、外傷、ユーイング肉腫の腫瘍、神経芽腫の腫瘍、骨肉腫の腫瘍、網膜芽腫の腫瘍、横紋筋肉腫の腫瘍、潰瘍性結腸炎、静脈閉塞、ビタミンＡ欠乏症及びウェーゲナーのサルコイドーシス、糖尿病に関連する望ましくない血管新生、寄生虫疾患、異常な創傷治癒、手術、傷害又は外傷後の過形成、毛髪生育の抑制、排卵及び黄体形成の抑制、着床の抑制及び子宮内の胚の発生の抑制を有するか、発症する危険性がある。
【００３８】
抗血管新生療法は、移植片拒絶、肺の炎症、ネフローゼ症候群、子癇前症、心内膜液浸出、例えば心内膜炎に関連するもの、及び胸水、望ましくない血管の透過性を特徴とする疾患及び障害、例えば脳腫瘍に関連する浮腫、悪性疾患に関連する腹水、メイグズ症候群、心筋梗塞及び卒中等の後の状態のような心臓血管疾患に関連する肺の炎症、ネフローゼ症候群、心内膜液浸出、胸水、透過性の全般的治療において有用である。
【００３９】
本発明の他の血管新生依存性疾患は血管線維腫（出血し易い異常な血管）、血管新生緑内障（眼の血管の成長）、動静脈奇形（動脈と静脈の間の異常な連絡）、偽関節骨折（治癒しない骨折）アテローム性動脈硬化症性のプラーク（動脈の硬化）、化膿性肉芽腫（血管を含む一般的な皮膚の罹患部）、硬皮症（結合組織疾患の１形態）、血管腫（血管を含む腫瘍）、トラコーマ（第３世界における失明の最大原因）、血友病性関節、血管癒着及び過形成性の瘢痕（異常な瘢痕形成）を包含する。
【００４０】
「治療」とは施療的な治療及び予防的又は防止的な手段の両方を指す。治療が必要なものはすでに障害を有する者並びに障害を防止すべき者を包含する。
【００４１】
「再発」、「回帰」又は「回帰した」という用語は癌又は疾患が、疾患消失を臨床的に評価した後に復帰することをさす。遠位の転移または局所的な再発の診断は回帰とみなすことができる。
【００４２】
「難治性」又は「抵抗性」という用語は治療に応答していない癌又は疾患を指す。
【００４３】
「アジュバント療法」という用語は通常は手術である主要な療法の後に行われる治療を指す。癌又は疾患のアジュバント療法は免疫療法、化学療法、放射線療法又はホルモン療法を包含する。
【００４４】
「維持療法」という用語は以前の治療効果を維持する際の補助となる予定された再治療を指す。維持療法は疾患の進行に関わりなく癌を後退させ続けるか、又は特定の療法に対する応答を延長する際の補助とするために行われる場合が多い。
【００４５】
「侵襲性の癌」という用語は癌が正常な周囲組織内への侵入を開始する組織の層を越えて広がったものを指す。
【００４６】
「非侵襲性の癌」という用語は極めて早期の癌であるか、又は起源の組織を越えて広がっていない癌を指す。
【００４７】
「無進行生存」という用語は、癌医学においては、癌が成長しない治療中及び治療後の時間の長さを指す。無進行生存は完全な応答又は部分的な応答を患者が経験している時間の量、並びに、安定した疾患を患者が経験している時間の量を包含する。
【００４８】
「進行性の疾患」という用語は、癌医学においては、腫瘍の質量の増大又は拡散のいずれかにより、治療開始時から２０パーセントを超えて腫瘍の成長があることを指す。
【００４９】
「障害」とは抗体による治療から利益を被る何れかの状態である。例えば異常な血管新生（過剰、不適切又は制御不能の血管新生）又は血管の透過性に罹患しているかそれに対する予防が必要な哺乳類である。これには慢性及び急性の障害又は疾患、例えば問題となる障害に哺乳類を罹患し易くする病理学的状態を包含する。本明細書において治療すべき障害の非限定的な例は、悪性及び良性の腫瘍；非白血病及びリンパ性悪性疾患；ニューロン、グリア、星状細胞、視床下部及び他の腺性、マクロファージ性、上皮性、基質性及び胞胚腔性の障害；及び炎症性、血管新生性及び免疫学的な障害を包含する。
【００５０】
「癌」及び「癌性の」という用語は調節不可能な細胞の成長を典型的な特徴とする哺乳類における生理学的状態を指すか、それを説明するものである。癌の例は限定しないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫及び白血病を包含する。このような癌のより特定的な例は、扁平上皮細胞癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、頭部頚部の癌、直腸癌、結腸直腸癌、肺癌、例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌（例えば上皮の扁平上皮細胞癌）、前立腺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌又は腹部の癌、例えば胃腸の癌、膵臓癌、神経膠芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、莢膜細胞腫、男化腫瘍、ヘパトーマ、血液学的悪性疾患、例えば非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫及び急性の血液学的な悪性疾患、子宮内膜又は子宮の癌腫、子宮内膜症、腺維肉腫、絨毛癌、唾液腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、食道癌、肝臓の癌腫、肛門癌、陰茎癌、鼻咽頭癌腫、喉頭癌、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚の癌腫、神経鞘腫、乏突起神経膠細胞腫、神経芽腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、尿道癌腫、甲状腺癌腫、ウイルムス腫瘍、並びにＢ−細胞リンパ腫（例えば低等級
／小胞状非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ性（ＳＬ）ＮＨＬ；中間等級／小胞状ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小非分割細胞性ＮＨＬ；バルキー疾患ＮＨＬ；被膜細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；及びウォルデンストロムマクログロブリン血症）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後のリンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、並びに母斑症に伴う異常な血管の増殖、及びメイグズ症候群を包含する。
【００５１】
「腫瘍」とは、本明細書においては、悪性又は良性に関わらず全ての新生物性の細胞の成育及び全ての前癌性及び癌性の細胞及び組織を指す。
【００５２】
「抗腫瘍組成物」又は「抗腫瘍剤」という用語は少なくとも１つの活性な治療薬、例えば「抗癌剤」を含む癌を治療する場合に有用な組成物を指す。治療薬（抗癌剤）の例は、限定しないが、例えば化学療法剤、増殖抑制剤、細胞毒性剤、放射線療法において使用される薬剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤及び他の癌を治療するための薬剤、例えば抗ＨＥＲ−２抗体、抗ＣＤ２０抗体、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）アンタゴニスト（例えばチロシンキナーゼ阻害剤）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ阻害剤（例えばエルロチニブ（ＴａｒｃｅｖａＴＭ）、血小板誘導成長因子阻害剤（例えばＧｌｅｅｖｅｃＴＭ（イマチニブメシレート））、ＣＯＸ−２阻害剤（例えばセレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的、即ちＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＢＡＦＦ、ＢＲ３、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ又はＶＥＧＦ受容体、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２の１つ以上に結合するアンタゴニスト（例えば中和抗体）及び他の生物学的に活性な、そして有機性の化学物質等を包含する。これらの組み合わせもまた本発明において意図される。
【００５３】
本明細書において使用する場合の「増殖抑制剤」とは、インビトロ及び／又はインビボで細胞の成長を抑制する化合物又は組成物を指す。即ち増殖抑制剤はＳ期の細胞のパーセントを顕著に低減するものであってよい。増殖抑制剤の例は細胞周期の進行を（Ｓ期以外の時点において）ブロックする薬剤、例えばＧ１停止及びＭ期停止を誘導する薬剤を包含する。古典的なＭ期ブロッカーはビンカ類（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）及びトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド及びブレオマイシンを包含する。Ｇ１を停止させるこれらの薬剤はまたＳ期停止にまで作用を派生させるものがあり、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル及びａｒａ−Ｃが挙げられる。更に詳細な説明はＴｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ａｎｄ  Ｉｓｒａｅｌ編、Ｃｈａｐｔｅｒ１の表題「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ」、Ｍｕｒａｋａｍｉ等（ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  １９９５）、特にｐ．１３に記載されている。
【００５４】
「細胞毒性剤」という用語は本明細書においては、細胞の機能を抑制又は防止、及び／又は細胞の破壊を誘発する物質を指す。用語は放射性同位体（例えばＩ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６）、化学療法剤、及び毒素、例えば細菌、カビ、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素並びにそのフラグメントを包含する。
【００５５】
「化学療法剤」とは癌の治療において有用な化学物質である。化学療法剤の例は癌の治療において有用な化学物質である。化学療法剤の例はアルキル化剤類、例えばチオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド；アルキルスルホネート類、例えばブスルファン、イムプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン類、例えばベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ及びウレドパ；エチレンイミン類及びメチラメラミン類、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホアミド、トリエチレンチオホスホアミド及びトリメチロールオメラミン；アセトゲニン類（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（例えば合成類縁体トポテカン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（例えばアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類縁体）；クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎ）類（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（例えば合成類縁体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェンマスタード類、例えばクロランブシル、クロマファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、塩酸酸化メクロレタミン、メルファラン、ノべンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素類、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムヌスチン；抗生物質、例えばエネジン抗生物質（例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマＩＩ及びカリケアマイシンオメガＩＩ（例えばＡｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）参照）；ジネマイシン、例えばジネマイシンＡ；ビスホスホネート、例えばクロドロネート；エスペラマイシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連の色素蛋白エネジン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、オーソラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（例えばモルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類、例えばマイトマイシンＣ、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝アンタゴニスト、例えばメトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類縁体、例えばデノプテリン、メトトレ���セート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類縁体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類縁体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、デキシフルリジン、エノシタビン、フロクスリジン；アンドロゲン類、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗アドレナル類（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補給剤、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトラキセート；デホファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルホミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシノイド類、例えばマイタンシン及びアンサミトシン類；マイトグアゾン；マイトキサトロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメト；ピアルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、べラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；マイトブロニトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類、例えばＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ  Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ−非含有、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類縁体、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イソフォスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノヴァントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ；イバンドロネート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ，ＣＰＴ−１１）（イリノテカンと５−ＦＵ及びロウコボリンの治療レジメンを包含）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド類、例えばレチノイン酸；カペシタラビン；コンブレスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン、例えばオキサリプラチン治療レジメン（ＦＯＬＦＯＸ）；細胞増殖を低減するＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ及びＥＧＦＲの阻害剤（例えばエルロチニブ（ＴａｒｃａｖａＴＭ））及び上記いずれかの製薬上許容しうる塩、酸又は誘導体を包含する。
【００５６】
この定義に同様に包含されるものは腫瘍に対するホルモンの作用を調節又はブロックする作用を有する抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、例えばタモキシフェン（例えばＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェン）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン及びＦＡＲＥＳＴＯＮトレミフェン；副腎におけるエストロゲン生産を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４（５）−イミダゾール類、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲステロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタニー、ファドゾロール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アラストロゾール；および抗アンドロゲン剤、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類縁体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えばＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ及びＨ−Ｒａｓのような異常な細胞増殖に関与するとされるシグナリング経路内の遺伝子の発現を抑制するもの；リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現抑制剤（例えばＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）リボザイム）及びＨＥＲ２発現抑制剤；ワクチン類、例えば遺伝子療法ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ビノレルビン及びエスペラマイシン（米国特許４，６７５，１８７参照）及び上記何れかの製薬上許容しうる塩、酸又は誘導体である。
【００５７】
「プロドラッグ」という用語は本出願においては親薬剤と比較して疾患細胞に対して低い細胞毒性を有し、そして酵素的に活性化又は変換されてより活性の高い親形態になることができる薬学的に活性の物質（例えば小分子）の前駆体又は誘導体の形態を指す。例えばＷｉｌｍａｎ，“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１４，ｐｐ．３７５−３８２，６１５ｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）及びＳｔｅｌｌａ等、“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ等、（ｅｄ．），ｐｐ．２４７−２６７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照できる。本発明のプロドラッグは限定しないが、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、スルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、場合により置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、又は場合により置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシン及びより活性な細胞毒性の遊離の薬剤に変換されることができる他の５−フルオロウリジンプロドラッグを包含する。本発明において使用するためのプロドラッグ形態に誘導体化できる細胞毒性剤の例は、限定しないが、上記した化学療法剤を包含する。
【００５８】
「単離された」とは、本明細書に開示する種々のポリペプチドを説明するために使用する場合、それが発現された細胞又は細胞培養物から同定及び分離及び／又は回収されているポリペプチドを意味する。その天然の環境の混入成分はポリペプチドの診断又は治療上の使用を典型的には妨害する物質であり、そして、酵素、ホルモン及び他の蛋白性又は非蛋白性の溶質を包含する。好ましい実施形態においては、ポリペプチドは（１）スピニングカップシーケンサーの使用によりＮ末端又は内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、又は（２）クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで均質となるまで精製される。単離されたポリペプチドはポリペプチドの天然の環境の少なくとも１つの成分も存在しなくなるため、組み換え細胞内のインサイチュのポリペプチドを包含する。しかしながら通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により製造する。
【００５９】
「単離された」ポリペプチドコード核酸分子又は他のポリペプチドコード核酸はポリペプチドコード核酸の天然の原料中で通常は会合している混入核酸分子少なくとも１つから識別され、分離されている核酸分子である。単離されたポリペプチドコード核酸分子は自身が天然に存在する形態または周囲状況にはないものである。従って単離されたポリペプチドコード核酸分子はそれが天然の細胞中に存在する状態の特定のポリペプチドコード核酸分子からは区別される。しかしながら、単離されたポリペプチドコード核酸分子は、例えばポリペプチドコード核酸分子が天然の細胞とは異なる染色体位置にあるポリペプチドを通常発現する細胞内に含有されるポリペプチドコード核酸分子を包含する。
【００６０】
「制御配列」という用語は特定の宿主生物における作動可能に連結したコーディング配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に適する制御配列はプロモーター、場合によりオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を包含する。真核生物はプロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用していることが知られている。
【００６１】
核酸はそれが他の核酸配列と機能的関係となるように位置する場合、「作動可能に連結された」という。例えばプレ配列または分泌リーダーに関するＤＮＡはそれがポリペプチドの分泌に関与するプレ蛋白として発現されれば、ポリペプチドに関するＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーター又はエンハンサーはそれが配列の転写に影響すればコーディング配列に作動可能に連結されており；或いは、リボソーム結合部位はそれが翻訳を促進するように位置していればコーディング配列に作動可能に連結している。一般的に「作動可能に連結」とは連結されるＤＮＡ配列が隣接している場合、そして分泌リーダーの場合は隣接し、且つ読み枠が合う場合を意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接する必要はない。連結は好都合な制限部位におけるライゲーションにより行う。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを従来の慣行に従って使用する。
【００６２】
「ストリンジェントな条件」又は「高ストリンジェンシー条件」とは、本明細書において定義する場合は、（１）低いイオン強度及び高い洗浄温度、例えば０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃において使用するか；（２）ハイブリダイゼーションの間は変性剤、例えばホルムアミド、例えば５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド＋０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５＋７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを４２℃で用いるか；又は（３）一晩ハイブリダイゼーションを溶液中、５０％ホルミアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ及び１０％デキストランスルフェートを４２℃で使用し、その後、洗浄を４２℃において１０分間０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）次に１０分間、５５℃におけるＥＤＴＡ含有０．１ｘＳＳＣよりなる高ストリンジェンシー洗浄条件を用いるものとして認識される。
【００６３】
本明細書に記載するポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」とは、最大のパーセント配列同一性を達成できるように配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入し、そして如何なる保存的置換も配列同一性の部分とみなさない場合の比較すべきポリペプチドにおけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは当業者の知る種々の方法において、例えば市販のコンピューターソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアを用いて達成できる。当業者はアライメントを測定するための適切なパラメーター、例えば比較すべき配列の完全長に渡って最大のアライメントを達成するために必要ないずれかのアルゴリズムを決定できる。しかしながら本発明の目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて発生させる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により著作されており、そしてソースコード（表１）は米国著作権局Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．２０５５９にユーザードキュメンテーションとともにファイルされており、そこで米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下に登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能である。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＵＮＩＸ（登録商標）のＯＳ、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）のＶ４．０Ｄ上での使用のためにコンパイルしなければならない。全ての配列比較パラメーターはＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変化しない。
【００６４】
本明細書に記載したアミノ酸配列は特段の記載が無い限り隣接アミノ酸配列である。
【００６５】
本明細書においては、「イムノアドヘシン」とは異種蛋白（「アドヘシン」）の結合特異性を免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と組み合わせた抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは抗体の抗原認識及び結合の部位とは異なる所望の結合特異性を有するアミノ酸配列（異種）及び免疫グロブリン定常ドメイン配列の融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドヘシン部分は典型的にはＶＥＧＦＲ又はフィブロネクチンリガンドのような受容体又はリガンドの結合部位を少なくとも含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列はいずれかの免疫グロブリン、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（例えばＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭから得ることができる。免疫グロブリンのＦｃ部分に融合された標的に特異的に結合する配列のファージディスプレイセレクションから誘導された配列を含むことが多いペプチボディーは本明細書においてはイムノアドヘシンとみなすことができる。
【００６６】
「抗体」という用語はもっとも広範な意味において使用され、そしてとくに、例えば単一のモノクローナル抗体（例えばアゴニスト、アンタゴニスト及び中和抗体）、多エピトープ特異性を有する抗体組成物、ポリクローナル抗体、単鎖抗抗体、及び、ネイティブのポリペプチドに特異的に結合し、及び／又は本明細書の生物学的活性又は免疫学的活性を呈する限りにおいて、抗体のフラグメント（下記）を包含する。１つの実施形態によれば、抗体は標的蛋白のオリゴマー型、例えば３量体型に結合する。別の実施形態によれば、抗体は蛋白に特異的に結合し、その結合は本明細書のモノクローナル抗体により抑制できる（例えば本発明の寄託抗体など）。抗体の「機能的フラグメント又は類縁体」という表現は言及している抗体と共通した定性的生物学的活性を有する化合物である。例えば本明細書の抗体の機能的フラグメント又は類縁体は、ＶＥＧＦ又はアルファ５ベータ１に特異的に結合できるものであることができる。１つの実施形態において抗体は細胞増殖を誘導するＶＥＧＦの能力を防止、又は実質的に低減することができる。
【００６７】
「単離された抗体」は、その天然の環境の成分から識別され、そして分離及び／又は回収されたものである。その天然の環境の混入物成分は抗体の診断又は治療上の使用を妨害する可能性があり、そして、酵素、ホルモン及び他の蛋白性又は非蛋白性の溶質を包含する。好ましい実施形態においては抗体の精製は（１）Ｌｏｗｒｙ法で測定した場合に抗体の９５重量％超、最も好ましくは９９重量％超まで、（２）スピニングカップシーケンサーの使用によりＮ末端又は内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、又は（３）クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで均質となるまで行う。単離された抗体は、抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分も存在しなくなるため、組み換え細胞内のインサイチュの抗体を包含する。しかしながら通常は単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により製造する。
【００６８】
基本４鎖抗体単位は２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖を含むヘテロ４量体の糖蛋白である（ＩｇＭ抗体はＪ鎖と呼ばれる別のポリペプチドとともに基本ヘテロ４量体単位５つより成り、従って、１０抗原結合部位を含有するのに対し、分泌されたＩｇＡ抗体は重合体化することによりＪ鎖に沿って基本４鎖単位２〜５つを含む多価の組立体を形成することができる）。ＩｇＧ類の場合は、４鎖単位は一般的に約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は１つの共有ジスルフィド結合によりＨ鎖と連結されており、２つのＨ鎖はＨ鎖のアイソタイプに応じてジスルフィド結合１つ以上により相互に連結されている。各Ｈ及びＬ鎖は又規則的に間隔をおいた鎖内のジスルフィド架橋部を有する。各Ｈ鎖はＮ末端、可変ドメイン（ＶＨ）とそれに後続する３つの定常ドメイン（ＣＨ）をα及びγ鎖の各々について、そして４つのＣＨドメインμ及びイプシロンのアイソタイプについて有している。各Ｌ鎖はＮ末端、可変ドメイン（ＶＬ）とそれに後続する定常ドメイン（ＣＬ）をその他方の端部に有する。ＶＬはＶＨとアラインし、そしてＣＬは重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とアラインしている。特定のアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変ドメインの間の界面を形成していると考えられている。ＶＨとＶＬの対形成は単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性については例えばＢａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ  Ｉ．Ｔｅｒｒ  ａｎｄ  Ｔｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（ｅｄｓ．），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４，ｐａｇｅ７１及び  Ｃｈａｐｔｅｒ  ６を参照できる。
【００６９】
何れの脊椎動物由来のＬ鎖もその定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ及びラムダと称される２つの明確に異なった型の１つに割りあてることができる。その重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラス又はアイソタイプに割りあてることができる。免疫グロブリンには５つのクラス、即ち、それぞれがα、δ、γ、ε及びμと表記される重鎖を有するＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在する。γ及びαのクラスは更にＣＨ配列及び機能における比較的小さい相違に基づいてサブクラスに分割され、例えばヒトは以下のサブクラス、即ちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を発現する。
【００７０】
「可変」という用語は可変ドメインの特定のセグメントは抗体間で広範に配列が異なっているという事実を指す。Ｖドメインは抗原結合を媒介し、そして特定の抗体のその特定の抗原に対する特異性を定義している。しかしながら可変性は可変ドメインの１１０アミノ酸のスパンに渡って均一に分布していない。むしろ、Ｖ領域は各々が９〜１２アミノ酸長の「超可変領域」と称される究極的な可変性のより短い領域により分離された１５〜３０アミノ酸の比較的不変性のストレッチよりなる。ネイティブの重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、ベータシート構造を連結する、そして一部の場合はその部分を形成するループを形成する３つの超可変領域により連結されたベータシート配置を大部分が採用しているＦＲ４つを含む。各鎖の超可変領域はＦＲにより近接して保持されており、そして他の鎖の超可変領域と一緒になって、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）参照）。定常ドメインは抗体から抗原への結合には直接関与しないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）における抗体の関与を示す。
【００７１】
「超可変領域」という用語は本明細書においては、抗原結合を担っている抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般的に「相補性決定領域」即ち「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基（例えばＶＬにおいては概ね残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）そしてＶＨにおいては概ね３１−３５Ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）（１つの実施形態においてはＨ１は概ね３１〜３５である）；Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））及び／又は「超可変ループ」に由来する残基（例えばＶＬにおいてはば残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）、そしてＶＨにおいては２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）ａｎｄ  ９６−１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。
【００７２】
「モノクローナル抗体」という用語は本明細書においては、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち集団に含まれる個々の抗体はわずかな量において存在する場合がある可能な天然に生じた突然変異を除き、同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向される。更に又、異なる決定基（エピトープ）に指向された異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に指向される。その特異性のほかに、モノクローナル抗体は他の抗体に混入されることなく合成できるという点において好都合である。「モノクローナル」という修飾語は何れかの特定の方法による抗体の生産を必要とするとはみなされるべきではない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））により初めて報告されたハイブリドーマ方法により製造でき、又は、細菌、真核生物の動物又は植物細胞中の組み換えＤＮＡ法を用いて作成できる（例えば米国特許４，８１６，５６７参照）。「モノクローナル抗体」とはまたＣｌａｃｋｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１），Ｍａｒｋｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）及び例えば後述する実施例に記載する通りの手法を用いてファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
【００７３】
本明細書に記載するモノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の種から誘導されるか、又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体における相当する配列と同一又は相同であるが、鎖の残余は別の種から誘導されるか、又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体における相当する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体、並びに本発明の生物学的活性を呈する限りそのような抗体のフラグメントを包含する（例えば米国特許４，８１６，５６７；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）参照）。本明細書における目的のキメラ抗体は非ヒト霊長類（例えば旧世界サル、類人猿等）から誘導された可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化された」抗体を包含する。
【００７４】
「未損傷の」抗体とは抗原結合部位並びにＣＬ及び少なくとも重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインはネイティブの配列の定常ドメイン（例えばヒトのネイティブの配列の定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であることができる。好ましくは未損傷の抗体は１つ以上のエフェクター機能を有する。
【００７５】
「抗体フラグメント」とは、未損傷の抗体の一部分、好ましくは未損傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント、ダイアボディー；線状抗体（米国特許５，６４１，８７０，実施例２；Ｚａｐａｔａ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］参照）；単鎖抗体分子；及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を包含する。
【００７６】
「線状抗体」という表現は一般的にＺａｐａｔａ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）に記載されている。簡潔にはこれらの抗体は直列のＦｄセグメントの対（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を有し、これらは相補な軽鎖ポリペプチドと一緒になって抗体結合領域の対を形成する。線状抗体は二重特異性又は単一特異性である。
【００７７】
抗体のパパイン消化により「Ｆａｂ」と称する２つの同一の抗原結合フラグメント、及び残余の「Ｆｃ」フラグメント、即ち容易に結晶化する能力を反映した標記のものが生じる。Ｆａｂフラグメントは完全なＬ鎖と共にＨ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）及び１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）より成る。各Ｆａｂフラグメントは抗原結合に関して１価であり、即ちこれらは単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理により２価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合したＦａｂフラグメントに概ね相当し、そしてなお抗原と交差結合できる単一の大型のＦ（ａｂ’）２が生じる。Ｆａｂ’フラグメントは抗体ヒンジ領域に由来するシステイン１つ以上を含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端において追加的な数個の残基を有することによりＦａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を担持しているＦａｂ’に関する本明細書における標記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは当初は間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として作成された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも知られている。
【００７８】
Ｆｃフラグメントはジスルフィドによりともに担持された両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能はＦｃ領域における配列により決定され、この領域もまた特定の型の細胞上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）により認識される部分である。
【００７９】
「Ｆｖ」は完全な抗原認識及び結合部位を含有する最小の抗体フラグメントである。このフラグメントは堅固な非共有結合の会合における１つの重鎖及び１つの軽鎖の可変領域ドメインの２量体より成る。これらの２つのドメインの折り畳みにより、抗原結合のためのアミノ酸残基を与え、そして抗体への抗原結合特異を付与する超可変ループ６つ（Ｈ及びＬ鎖から各々３ループ）が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的なＣＤＲ僅か３つのみを含むＦｖの半分）であっても、完全な結合部位より低親和性ではあるが、抗原を認識して結合する。
【００８０】
「単鎖Ｆｖ」は又「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略記され、単一のポリペプチド鎖内に連結されたＶＨ及びＶＬの抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。好ましくはｓＦｖポリペプチドは更にｓＦｖが抗原結合のための望ましい構造を形成できるようにするＶＨ及びＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーを含む。ｓＦｖに関する考察は、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  １９９５後記）を参照できる。
【００８１】
「ダイアボディー」という用語はＶドメインの鎖内対形成ではなく鎖間対形成が達成されることにより２価のフラグメント、即ち２つの抗原結合部位を有するフラグメントが生じるように、ＶＨ及びＶＬドメインの間に短いリンカー（約５〜１０残基）を用いてｓＦｖフラグメントを構築すること（上記の段落を参照のこと）により製造される小型の抗体フラグメントを指す。二重特異性ダイアボディーは２つの「クロスオーバー」したｓＦｖフラグメントのヘテロ２量体であり、それにおいては２つの抗体のＶＨ及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在している。ダイアボディーは例えばＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）により詳細に説明されている。
【００８２】
非ヒト（例えばげっ歯類）抗体の「ヒト化」型は非ヒト抗体から誘導された最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分についてはヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、その場合レシピエントの超可変領域に由来する残基は所望の抗体特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域に由来する残基により置き換えられている。一部の例においては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が相当する非ヒト残基により置き換えられている。更に又、ヒト化抗体はレシピエントの抗体中、又はドナーの抗体中には存在しない残基を含むことができる。これらの修飾は抗体の性能を更に向上させるために行われる。一般的に、ヒト化抗体は実質的に全ての、少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインを含み、その場合、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、そしてＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は場合により更に免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部分を含む。更に詳細な説明はＪｏｎｅｓ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）に記載されている。
【００８３】
「種依存性抗体」とは、第１の哺乳類主に由来する抗原に対して、第２の哺乳類種に由来する抗原の相同体に対してそれが有するよりも、より強力な結合親和性を有する抗体である。通常は種依存性抗体はヒト抗原に対して「特異的に結合」する（即ち約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは約１×１０−８Ｍ以下、そして最も好ましくは約１×１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有する）が、第２の非ヒト哺乳類種由来の抗原の相同体に対する結合親和性は、ヒト抗原に対するその結合親和性の少なくとも約１／５０、又は少なくとも約１／５００、又は少なくとも約１／１０００である。種依存性抗体は上記した抗体の種々の型の何れかであることができるが、好ましくはヒト化抗体又はヒト抗体である。
【００８４】
そのような実施形態において、「非標的」蛋白に対するポリペプチド、抗体、アンタゴニスト又は組成物の結合の程度は、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析又は放射性免疫沈降（ＲＩＡ）により測定されるその特定の標的蛋白に対するポリペプチド、抗体、アンタゴニスト又は組成物の結合の約１０％未満となる。標的分子に対するポリペプチド、抗体、アンタゴニスト又は組成物の結合に関しては、「特異的結合」又は特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に特異的に結合する」又は「に対して特異的な」とは、非特異的相互作用とは測定可能に異なっている結合を意味する。特異的結合は例えば一般的に結合活性を有さない同様な構造の分子である対照分子の結合と比較しながら分子の結合を測定することにより求められる。例えば、特異的結合は標的と同様の対照分子、例えば未標識の標的の過剰量との競合により測定できる。この場合、標識された標的のプローブへの結合が過剰の未標識標的により競合的に抑制されれば、特異的結合が示される。「特異的結合」又は特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に特異的に結合する」又は「に対して特異的な」とは、本明細書においては、少なくとも約１０−４Ｍ、或いは少なくとも約１０−５Ｍ、或いは少なくとも約１０−６Ｍ、或いは少なくとも約１０−７Ｍ、或いは少なくとも約１０−８Ｍ、或いは少なくとも約１０−９Ｍ、或いは少なくとも約１０−１０Ｍ、或いは少なくとも約１０−１１Ｍ、或いは少なくとも約１０−１２Ｍ又はそれ以上の標的に対するＫｄを有する分子により示されることができる。１つの実施形態において、「特異的結合」という用語は何れかの他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープには実質的に結合することなく特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに分子が結合する場合の結合を指す。
【００８５】
抗体の「エフェクター機能」とは抗体のＦｃ領域（ネイティブ配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体のＦｃ領域）に起因する生物学的活性を指し、そして抗体アイソタイプにより変動する。抗体エフェクターの例は、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞毒性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細胞表面受容体のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化を包含する。「ネイティブ配列Ｆｃ領域」は天然に存在するＦｃ領域のアミノ酸配列に同一であるアミノ酸配列を含む。Ｆｃ配列の例は例えば限定しないが、Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）に記載されている。
【００８６】
「変異体Ｆｃ領域」は本明細書に記載した少なくとも１つの「アミノ酸修飾」のためにネイティブの配列のＦｃ領域のものとは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは変異体Ｆｃ領域はネイティブの配列のＦｃ領域と、又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較した場合に少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば約１〜約１０のアミノ酸置換、そして好ましくは約１〜約５つのアミノ酸置換を、ネイティブ配列のＦｃ領域中、又は親ポリペプチドのＦｃ領域中に有する。１つの実施形態において、本発明の変異体Ｆｃ領域はネイティブ配列のＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、少なくとも約８５％の相同性、少なくとも約９０％の相同性、少なくとも約９５％の相同性、又は少なくとも約９９％の相同性を有することになる。別の実施形態によれば、本発明の変異体Ｆｃ領域は親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、少なくとも約８５％の相同性、少なくとも約９０％の相同性、少なくとも約９５％の相同性、又は少なくとも約９９％の相同性を有することになる。
【００８７】
本明細書に記載するポリペプチド及び抗体に関して「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」又は「相同性」とは、如何なる保存的置換も配列同一性の部分とみなしながら配列をアラインした後に、比較すべきポリペプチドにおけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは当業者の知る種々の方法において、例えば市販のコンピューターソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアを用いて達成できる。当業者はアライメントを測定するための適切なパラメーター、例えば比較すべき配列の完全長に渡って最大のアライメントを達成するために必要ないずれかのアルゴリズムを決定できる。しかしながら本発明の目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて発生させる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により著作されており、そしてソースコードは米国著作権局Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．２０５５９にユーザードキュメンテーションとともにファイルされており、そこで米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下に登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能である。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＵＮＩＸ（登録商標）のＯＳ、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）のＶ４．０Ｄ上での使用のためにコンパイルしなければならない。全ての配列比較パラメーターはＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変化しない。
【００８８】
「Ｆｃ領域含有ポリペプチド」という用語はＦｃ領域を含む抗体又はイムノアドヘシン（後に定義）のようなポリペプチドを指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングシステムによれば残基４４７）は例えばポリペプチドの精製の間、又はポリペプチドをコードする核酸の組み換え操作により、除去してよい。従って、本発明のＦｃ領域を有する抗体を包含するポリペプチドを含む組成物は、全てのＫ４４７残基が除去されたポリペプチド集団、Ｋ４４７残基が除去されていないポリペプチド集団、又はＫ４４７残基含有及び非含有のポリペプチドの混合物を有するポリペプチドの集団を含むことができる。
【００８９】
本明細書及び請求項全体を通じて、可変ドメイン内の残基（概ね、軽鎖の残基１〜１０７及び重鎖の残基１〜１１３）に言及する場合は一般的にＫａｂａｔのナンバリングシステムを使用する（例えばＫａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。免疫グロブリン重鎖定常領域における残基に言及する場合は一般的に「ＥＵナンバリングシステム」又は「ＥＵインデックス」を使用する（例えば参照により本明細書に組み込まれるＫａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）において報告されているＥＵインデックス）。特段の記載が無い限り、抗体の可変ドメインにおける残基数に言及する場合は、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムによる残基のナンバリングを意味する。特段の記載が無い限り、抗体の定常ドメインにおける残基数に言及する場合は、ＥＵのナンバリングシステムによる残基のナンバリングを意味する。
【００９０】
「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」という用語は抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明するために使用する。１つの実施形態において、本発明のＦｃＲはＩｇＧ抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、そしてＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩのサブクラスの受容体を包含し、そしてこれらの受容体の対立遺伝子変異体及びオルタナティブスプライシング形態も包含する。ＦｃγＲＩＩ受容体はＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「抑制受容体」）を包含し、これらはその細胞質ドメインにおいて主に異なる同様のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡはその細胞質ドメイン内に免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。抑制受容体ＦｃγＲＩＩＢはその細胞質ドメイン内に免疫受容体チロシン系抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｍ．ｉｎ  Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）参照）。用語はアロタイプ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡアロタイプ：ＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｐｈｅ１５８、ＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｖａｌ１５８、ＦｃγＲＩＩＡ−Ｒ１３１及び／又はＦｃγＲＩＩＡ−Ｈ１３１を包含する。ＦｃＲ類はＲａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ等、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；及びｄｅ  Ｈａａｓ等、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）において検討されている。将来発見されるものを含めて他のＦｃＲは本明細書における「ＦｃＲ」という用語に包含される。用語は又、母ＩｇＧの胎仔への転移を担っている新生仔受容体ＦｃＲｎも包含する（Ｇｕｙｅｒ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。
【００９１】
「ＦｃＲｎ」という用語は新生仔Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を指す。ＦｃＲｎは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）と構造的に同様であり、そして、２−ミクログロブリンに非共有結合的に結合している鎖よりなる。新生仔Ｆｃ受容体ＦｃＲｎの多数の機能はＧｈｅｔｉｅ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８，７３９−７６６において検討されている。ＦｃＲｎは母動物から仔への免疫グロブリンＩｇＧの受動送達及び血清中ＩｇＧレベルの調節において役割を果たしている。ＦｃＲｎは細胞内及び細胞間を渡る双方において未損傷の形態のピノサイトーシスに付されたＩｇＧに結合して運搬し、そしてそれらをデフォルトの分解経路から救済するサルベージ受容体として機能する。
【００９２】
ＷＯ００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）及びＳｈｉｅｌｄｓ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）はＦｃＲ類への向上又は減衰した結合を有する抗体変異体を記載している。これらの公開物の内容は特に参照により本明細書に組み込まれる。
【００９３】
ヒトＩｇＧのＦｃ領域の「ＣＨ１ドメイン」（「Ｈ１」ドメインの「Ｃ１」とも称される）は通常は約アミノ酸１１８〜約アミノ酸２１５（ＥＵナンバリングシステム）に伸長している。
【００９４】
「ヒンジ領域」は通常はヒトＩｇＧのＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０までのストレッチとして定義される（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１−２０６（１９８５））。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は同じ位置において重鎖内Ｓ−Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を入れることによりＩｇＧ１配列とアラインしてよい。
【００９５】
Ｆｃ領域の「低ヒンジ領域（ｌｏｗｅｒ  ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）」は通常はヒンジ領域に対して直ぐＣ末端の残基、即ちＦｃ領域の残基２３３〜２３９のストレッチとして定義される。以前の報告においては、ＦｃＲ結合は一般的にＩｇＧＦｃ領域の低ヒンジ領域中のアミノ酸残基に起因するとされていた。
【００９６】
ヒトＩｇＧのＦｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｈ２」ドメインの「Ｃ２」とも称される）は通常は約アミノ酸２３１〜約アミノ酸３４０に伸長している。ＣＨ２ドメインはそれらが他のドメインと緊密に対形成しない点において独特である。むしろ、２つのＮ連結分枝炭水化物鎖が未損傷のネイティブのＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に挿入されている。炭水化物はドメイン−ドメインの対形成の代替を与え、そしてＣＨ２ドメインの安定化を支援していると推定されている。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１−２０６（１９８５）。
【００９７】
「ＣＨ３ドメイン」（「Ｈ３」ドメインの「Ｃ２」とも称される）はＦｃ領域のＣＨ２ドメインに対してＣ末端に残基のストレッチを含む（即ち抗体配列の約アミノ酸残基３４１からＣ末端、典型的にはＩｇＧのアミノ酸残基４４６又は４４７において）。
【００９８】
「機能的Ｆｃ領域」はネイティブ配列のＦｃ領域の「エフェクター機能」を保有している。例示される「エフェクター機能」は、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞毒性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体、ＢＣＲ）のダウンレギュレーション等を包含する。そのようなエフェクター機能は一般的に結合ドメイン（例えば抗体可変ドメイン）と組み合わせられるためにはＦｃ領域を必要とし、そして例えば本明細書に開示する通り種々の試験を用いて評価できる。
【００９９】
「Ｃ１ｑ」が免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合部位を包含するポリペプチドである。Ｃ１ｑは２つのセリンプロテアーゼ、Ｃ１ｒ及びＣ１ｓと一緒になって複合体Ｃ１、即ち補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）の経路の第１の要素を形成する。ヒトＣ１ｑは例えばＱｕｉｄｅｌ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから販売されている。
【０１００】
「結合ドメイン」という用語は別の分子に結合するポリペプチドの領域を指す。ＦｃＲの場合は結合ドメインはＦｃ領域への結合を担っているそのポリペプチド鎖（例えばそのアルファ鎖）の１部分を含むことができる。１つの有用な結合ドメインはＦｃＲアルファ鎖の細胞外ドメインである。
【０１０１】
「改変された」ＦｃＲ結合親和性、又はＡＤＣＣ活性を有する変異体ＩｇＧＦｃを有する抗体又はペプチボディーは、親ポリペプチド又はネイティブ配列のＦｃ領域を含むポリペプチドと比較して、増強又は減衰したＦｃＲ結合活性（例えばＦｃγＲ又はＦｃＲｎ）及び／又はＡＤＣＣ活性の何れかを有するものである。ＦｃＲに対して「増大した結合を示す」変異体Ｆｃは親ポリペプチド又はネイティブ配列ＩｇＧＦｃよりも高値の親和性（例えば低値の見かけのＫｄ又はＩＣ５０値）で少なくとも１つのＦｃＲに結合する。一部の実施形態によれば、親ポリペプチドと比較した場合の結合の向上は約３倍、好ましくは約５、１０、２５、５０、６０、１００、１５０、２００、〜５００倍、又は約２５％〜１０００％の結合の向上となる。ＦｃＲへの「低下した結合を示す」ポリペプチド変異体は、親ポリペプチドよりも低値の親和性（例えば高値の見かけのＫｄ又は高値のＩＣ５０値）で少なくとも１つのＦｃＲに結合する。親ポリペプチドと比較した場合の結合の低下は約４０％以上の結合低下であってよい。
【０１０２】
「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」即ち「ＡＤＣＣ」とは特定の細胞毒性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＲｃＲ類）に結合した分泌Ｉｇがこれらの細胞毒性エフェクター細胞を抗原担持標的細胞に特異的に結合し、その後細胞毒により標的細胞を殺傷することを可能とする細胞毒性の形態を指す。抗体は細胞毒性細胞を「武装」させ、そしてそのような殺傷のためには絶対的に必要である。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲの発現はＲａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）の４６４ページの表３中に総括されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を測定するためには、米国特許５，５００，３６２又は５，８２１，３３７又は後述する実施例に記載されたもののようなインビトロのＡＤＣＣ試験を実施してよい。そのような試験のための有用なエフェクター細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を包含する。或いは、又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は例えばＣｌｙｎｅｓ等、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているもののような動物モデルにおいてインビボで試験してよい。
【０１０３】
「増大したＡＤＣＣを示す」又は野生型ＩｇＧＦｃを有するポリペプチド又は親ポリペプチドよりもより効果的にヒトエフェクター細胞の存在下に抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介する変異体Ｆｃ領域は、試験において変異体Ｆｃ領域を有するポリペプチド及び野生型Ｆｃ領域を有するポリペプチドの量が本質的に同じである場合は、インビトロ又はインビボでＡＤＣＣの媒介において実質的により効果的であるものである。一般的に、そのような変異体は本明細書に開示する通りインビトロのＡＤＣＣ試験を用いて識別されるが、例えば動物モデル等、ＡＤＣＣ活性を測定するための別の試験又は方法も意図される。１つの実施形態において、好ましい変異体は野生型Ｆｃ（又は親ポリペプチド）よりもＡＤＣＣ媒介において約５倍〜約１００倍、例えば約２５〜約５０倍、より効果的である。
【０１０４】
「補体依存性細胞毒性」即ち「ＣＤＣ」とは、補体の存在下における標的細胞の溶解を指す。古典的な補体経路の活性化は自身の同族体抗原に結合した抗体（適切なサブクラス）への補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）の結合により開始される。補体活性化を試験するためには、ＣＤＣ試験、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）において記載されるものを実施してよい。
【０１０５】
改変されたＦｃ領域のアミノ酸配列及び増大又は低下したＣ１ｑ結合能力を有するポリペプチド変異体は、米国特許６，１９４，５５１Ｂ１及びＷＯ９９／５１６４２に記載されている。これらの特許出願の内容は参照により本明細書に組み込まれる。更にまたＩｄｕｓｏｇｉｅ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）も参照できる。
【０１０６】
「ヒトエフェクター細胞」は１つ以上のＦｃＲを発現し、そしてエフェクター機能を実施する白血球である。１つの実施形態によれば、細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、そしてＡＤＣＣエフェクター機能を実施する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞及び好中球を包含し；ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞はそのネイティブの原料から、例えば本明細書に記載する通り血液又はＰＢＭＣから単離してよい。
【０１０７】
ＦｃＲｎへの結合を測定する方法は知られており（例えばＧｈｅｔｉｅ  １９９７，Ｈｉｎｔｏｎ  ２００４参照）、そして後述する実施例にも記載されている。インビボにおけるヒトＦｃＲｎへの結合及びヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清中半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又はトランスフェクトされたヒト細胞株において、又は、Ｆｃ変異体ポリペプチドを投与された霊長類において試験できる。１つの実施形態において、特に、変異体ＩｇＧＦｃを有する本発明の抗アルファ５ベータ１抗体は野生型ＩｇＧＦｃを有するポリペプチドよりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１２５倍、少なくとも１５０倍高値のヒトＦｃＲｎに対する増大した結合親和性を示す。特定の実施形態においては、ヒトＦｃＲｎに対する結合親和性は約１７０倍高い。
【０１０８】
ＦｃＲｎへの結合親和性に関しては、１つの実施形態において、ポリペプチドのＥＣ５０又は見かけのＫｄ（ｐＨ６．０において）は１ｕＭ未満、より好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下である。１つの実施形態においては、ＦｃγＲＩＩＩ（Ｆ１５８；即ち低親和性アイソタイプ）に対する増大した結合親和性のためには、ＥＣ５０又は見かけのＫｄは１０ｎＭ以下であり、そしてＦｃγＲＩＩＩ（Ｖ１５８；高親和性アイソタイプ）に対しては、ＥＣ５０又は見かけのＫｄは３ｎＭ以下である。別の実施形態によれば対照抗体（例えばＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体）と比較した場合のＦｃ受容体に対する抗体の結合の減少は、被験抗体及び対照抗体の結合曲線の中点における吸光度値の比が（例えばＡ４５０ｎｍ（抗体）／Ａ４５０ｎｍ（対照Ａｂ））が４０％以下であれば対照抗体と比較して有意とみなしてよい。別の実施形態によれば対照抗体（例えばＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体）と比較した場合のＦｃ受容体に対する抗体の結合の増大は、被験抗体及び対照抗体の結合曲線の中点における吸光度値の比が（例えばＡ４５０ｎｍ（抗体）／Ａ４５０ｎｍ（対照Ａｂ））が１２５％以上であれば対照抗体と比較して有意とみなしてよい。例えば実施例１６を参照できる。
【０１０９】
「親ポリペプチド」又は「親抗体」とは、変異体ポリペプチド又は抗体の作成元であり、そして変異体ポリペプチド又は抗体を比較する相手であるアミノ酸配列を含むポリペプチド又は抗体である。典型的には、親ポリペプチド又は親抗体は本明細書に開示したＦｃ領域修飾１つ以上を欠いており、そして本明細書に開示したポリペプチド変異体と比較してエフェクター機能が異なる。親ポリペプチドはネイティブ配列のＦｃ領域または既存のアミノ酸配列修飾（例えば付加、欠失及び／又は置換）を有するＦｃ領域を含んでよい。
【０１１０】
本発明の抗体はファージディスプレイから誘導できる。本明細書においては、「ライブラリ」とは、複数の抗体又は抗体フラグメント配列、又はそのような配列をコードする核酸を指し、配列は本発明の方法によりこれらの配列に導入された変異体アミノ酸の組み合わせにおいて異なっている。
【０１１１】
「ファージディスプレイ」とは、変異体ポリペプチドを、ファージ、例えば繊維状ファージ、の粒子の表面上のコート蛋白の少なくとも一部分に対する融合蛋白としてディスプレイする手法である。ファージディスプレイの利用性はランダム化された蛋白変異体の大型のライブラリは、高い親和性で標的抗原に結合する配列を得るために迅速かつ効率的にソートできるという事実にある。ファージ上のペプチド及び蛋白のライブラリのディスプレイは特定の結合特性を有するものを求めて数１００万のポリペプチドをスクリーニングするために使用されている。多価ファージディスプレイ法は繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩの何れかへの融合を介して小型のランダムペプチド及び小型の蛋白をディスプレイするために使用されている。Ｗｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，３：３５５−３６２（１９９２）及びその引用文献。一価のファージディスプレイにおいては、蛋白又はペプチドのライブラリを遺伝子ＩＩＩ又はその一部分に融合させ、ファージ粒子が融合蛋白を１コピーディスプレイするか全くディスプレイしないように、野生型遺伝子ＩＩＩ蛋白の存在下に低レベルで発現させる。アビディティの作用は、ソーティングが内因性リガンド親和性に基づき、高ファージと比較して低減されており、そしてファージミドベクターを使用することによりＤＮＡ操作を簡素化している。Ｌｏｗｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３：２０５−０２１６（１９９１）。
【０１１２】
「ファージミド」は最近の複製起点、例えばＣｏ１Ｅ１及びバクテリオファージの遺伝子間領域のコピーを有するプラスミドベクターである。ファージミドは何れかの知られたバクテリオファージ上、例えば繊維状バクテリオファージ及びラムダ字状（ｌａｍｂｄｏｉｄ）のバクテリオファージ上で使用してよい。ファージミドは又一般的に抗生物質耐性に関して選択可能なマーカーを含有する。これらのベクターにクローニングされたＤＮＡのセグメントはプラスミドとして増殖させることができる。これらのベクターを保有している細胞にファージ粒子製造のために必要なすべての遺伝子を提供すれば、プラスミドの複製の様式はローリングサークル複製に変化し、プラスミドＤＮＡの１つの鎖のコピーが形成され、そしてファージ粒子がパッケージされる。プラスミドは感染性又は非感染性のファージ粒子を形成してよい。この用語は、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面上にディスプレイされるように遺伝子融合物としての異種ポリペプチド遺伝子に連結されたファージコート蛋白遺伝子又はそのフラグメントを含有するファージミドを包含する。
【０１１３】
「ファージベクター」という用語は異種遺伝子を含有し、複製が可能であるバクテリオファージの２本鎖複製性形態を意味する。ファージベクターはファージの複製およびファージ粒子の形成を可能にするファージ複製起点を有する。ファージは好ましくは、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ３ファージ又はその誘導体、又はラムダ状ファージ、例えばラムダ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、８２、４２４、４３４等又はその誘導体である。
【０１１４】
ペプチボディー、イムノアドヘシン、抗体及び短鎖ポリペプチドのようなポリペプチドの共有結合修飾体は本発明の範囲に包含される。共有結合修飾の１つの型はポリペプチドのターゲティングされたアミノ酸残基をポリペプチドの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端の残基と反応することができる有機性の誘導体化剤と反応させることを包含する。２官能性の薬剤で誘導体化することは、例えば、抗体を精製するための方法において使用するための水不溶性指示体又は表面にポリペプチドを交差結合させるために有用であり、またその逆もあり得る。一般的に使用されている交差結合剤は例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ２官能性イミドエステル、例えばジスクシンイミジル  エステル、例えば３，３’−ジチオビス−（スクシンイミジル−プロピオネート）、２官能性マレイミド、例えばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン及びメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）−ジチオ］プロピオイミデートのような薬剤を包含する。
【０１１５】
その他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基を脱アミド化してそれぞれ相当するグルタミル及びアスパルチル残基とすること、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のホスホリル化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３）］、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び何れかのＣ末端カルボキシル基のアミド化を包含する。
【０１１６】
その他の修飾は、毒素のアンタゴニストへのコンジュゲーション、例えばマイタンシン及びマイタンシノイド、カリケアマイシン及び他の細胞毒性剤が包含される。
【０１１７】
ポリペプチドの共有結合修飾の他の型は、米国特許４，６４０，８３５；４，４９６，６８９；４，３０１，１４４；４，６７０，４１７；４，７９１，１９２又は４，１７９，３３７に記載の態様において、ポリペプチドを種々の非蛋白性の重合体の１つ、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレンに連結することを包含する。
【０１１８】
本発明のポリペプチドは又、別の異種のポリペプチド又はアミノ酸配列（例えばイムノアドヘシン又はペプチボディー）に融合したポリペプチドを含むキメラ分子を形成するための方法においても、好都合であれば修飾できる。
【０１１９】
１つの実施形態において、そのようなキメラ分子は、例えばヒト免疫不全ウィルスＴＡＴ蛋白の蛋白トランスダクションドメインを用いて、種々の組織への、そしてより特定すれば血液脳関門を通過する送達のためにポリペプチドをターゲティングする蛋白トランスダクションドメインとのポリペプチドの融合を含む（Ｓｃｈｗａｒｚｅ等、１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５６９−７２）。
【０１２０】
別の実施形態においては、そのようなキメラ分子は抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを与えるタグポリペプチドとのポリペプチドの融合を含む。エピトープタグは一般的にポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。そのようなポリペプチドのエピトープタグ型の存在はタグポリペプチドに対する抗体を用いて検出できる。更に又エピトープタグを与えることは、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合するアフィニティーマトリックスの別の型を用いたアフィニティー精製により、ポリペプチドを容易に精製可能とする。種々のタグポリペプチド及びその対応する抗体は当業者の知る通りである。例としてはポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ  ＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２１５９−２１６５（１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３６１０−３６１６（１９８５）］；及び単純疱疹ウィルス糖蛋白Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）：５４７−５５３（１９９０）］が包含される。他のタグポリペプチドはＦｌａｇ−ペプチド［Ｈｏｐｐ等、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４−１２１０（１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２−１９４（１９９２）］；α−チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１５１６３−１５１６６（１９９１）］；及びＴ７遺伝子１０蛋白ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３−６３９７（１９９０）］を包含する。
【０１２１】
別の実施形態においては、キメラ分子は免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定の領域とのポリペプチドの融合を含むことができる。キメラ分子の２価の形態（例えばイムノアドヘシン）については、そのような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものとなる。本発明のＩｇ融合はＩｇ分子内の可変領域少なくとも１つの代わりに、概ね、又は僅かヒトの残基９４〜２４３ｍ残基３３〜５３、又は残基３３〜５２を含むポリペプチドを包含する。特に好ましい実施形態においては、免疫グロブリン融合はＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を包含する。免疫グロブリン融合物の製造に関しては、１９９５年６月２７日に発行された米国特許５，４２８，１３０を参照できる。
【０１２２】
本発明は回帰性の腫瘍成長又は回帰性の癌細胞の成長を抑制または防止するための方法及び組成物を提供する。種々の実施形態において、癌は回帰性の腫瘍成長又は回帰性の癌細胞の成長であり、その場合、癌細胞の数は有意には低減していないか、又は増大しているか、又は腫瘍のサイズが有意には低減していないか、又は増大しているか、又は癌細胞の大きさ又は数におけるそれ以上の低減が不可能である。癌細胞が回帰性の腫瘍成長又は回帰性の癌細胞の成長であるかどうかの決定は、癌細胞に対する治療の有効性を評価するための当該分野で知られた何れかの方法によりインビボ又はインビトロの何れかで行うことができる。抗ＶＥＧＦ治療に対する腫瘍の抵抗性は回帰性腫瘍成長の１例である。
【０１２３】
本明細書に開示するポリペプチド、抗体、アンタゴニスト又は組成物の「有効量」とは、特に記載された目的を実施するために十分な量である。「有効量」は実験的に、そして記載された目的に関する知られた方法により決定することができる。
【０１２４】
「治療有効量」という用語は哺乳類（別称患者）における疾患又は障害を「治療する」ために有効な本発明の抗体、ポリペプチド又はアンタゴニストの量を指す。癌の場合は薬剤の治療有効量は癌細胞の数を低減；腫瘍のサイズ又は重量を低減；周辺臓器へのがん細胞の浸潤を抑制（即ち、ある程度緩徐化及び好ましくは停止）；腫瘍転移を抑制（即ち、ある程度緩徐化及び好ましくは停止）；腫瘍成長をある程度まで抑制；及び／又は癌に関連する症状の１つ以上をある程度まで緩和することができる。薬剤が既存の癌細胞に対して成長防止及び／又は殺傷できる限り、それは細胞増殖抑制性及び／又は細胞毒性であることができる。１つの実施形態において、治療有効量は成長抑制量である。別の実施形態においては、治療有効量は患者の生存を延長する量である。別の実施形態においては、治療有効量は患者の無進行生存を向上させる量である。
【０１２５】
創傷治癒の場合、「有効量」又は「治療有効量」という用語は対象における創傷治癒を加速又は向上させるために有効な薬剤の量を指す。治療的用量は患者に対して治療効果を示す用量であり、そして、治療未満用量とは治療される患者に対して治療効果を呈さない用量である。
【０１２６】
「慢性創傷」とは治癒しない創傷を指す。例えばＬａｚａｒｕｓ等、Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｗｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｌｉｎｇ，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３０：４８９−９３（１９９４）を参照できる。慢性創傷は、限定しないが、例えば動脈の潰瘍、糖尿病性潰瘍、圧力潰瘍、静脈潰瘍等を包含する。急性の創傷は慢性の創傷に発展する場合がある。急性の創傷は、限定しないが、例えば熱的傷害により生じた創傷、外傷、手術、広範な皮膚癌の切除、深部のカビ又は細菌感染、血管炎、硬皮症、天疱瘡、毒性表皮壊死疾患等を包含する。例えばＢｕｆｏｒｄ，Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｓｏｒｅｓ，ＨｅａｌｉｎｇＷｅｌｌ．ｃｏｍ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎ：Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２４，２００１参照できる。「正常な創傷」とは通常の創傷治癒修復が起こる創傷を指す。
【０１２７】
本発明のポリペプチド、抗体、アンタゴニスト及び組成物の「成長抑制量」とは細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の成長をインビトロ又はインビボの何れかで抑制することができる量である。新生物性の細胞の成長を抑制する目的のための本発明のポリペプチド、抗体、アンタゴニスト及び組成物の「成長抑制量」は実験的に、そして知られた方法により、又は本明細書に記載する例により決定することができる。
【０１２８】
本発明のポリペプチド、抗体、アンタゴニスト及び組成物の「細胞毒性量」とは細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の破壊をインビトロ又はインビボの何れかで誘発することができる量である。新生物性の細胞の成長を抑制する目的のための本発明のポリペプチド、抗体、アンタゴニスト及び組成物の「細胞毒性量」は実験的に、そして当該分野で知られた方法により決定することができる。
【０１２９】
「自己免疫疾患」とは、本明細書においては、個体自身の組織から生じ、そしてそれに対して指向される障害又は疾患、又はその同時派生又は顕在化又はそれから生じる状態である。自己免疫疾患又は障害の例は限定しないが、関節炎（慢性関節リューマチ、例えば急性関節炎、慢性の慢性関節リューマチ、痛風性関節炎、急性痛風性関節炎、慢性炎症性関節炎、変性関節炎、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、脊椎関節炎及び若年発生性慢性関節リューマチ、変形性関節症、進行性慢性関節炎、変形性関節炎、慢性多発性一次関節炎、反応性関節炎、及び強直性脊椎炎）、炎症性増殖亢進性皮膚疾患、乾癬、例えばプラーク乾癬、滴状乾癬（gutatte psoriasis）、膿疱性乾癬及び爪乾癬、皮膚炎、例えば接触性皮膚炎、慢性接触性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、及びアトピー性皮膚炎、ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群、蕁麻疹、例えば慢性特発性蕁麻疹、例えば慢性自己免疫性蕁麻疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、毒性表皮壊死、硬皮症（例えば全身性硬皮症）、硬化症、例えば多発性硬化症（ＭＳ）、例えば脊髄視神経ＭＳ、一次進行性ＭＳ及び回帰性弛張性ＭＳ、進行性全身硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、播種性硬化症及び失調性硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えばクローン病、結腸炎、例えば潰瘍性結腸炎、結腸潰瘍、顕微鏡的結腸炎、コラーゲン性結腸炎、結腸ポリポーシス、壊死性腸炎、及び経壁性結腸炎、及び自己免疫性の炎症性腸疾患）、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、一次硬化性胆管炎、上強膜炎）、呼吸促進症候群、例えば成人性又は急性の呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）、髄膜炎、ブドウ膜の全部又は部分の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫性血液学的生涯、リューマチ様脊椎炎、突然聴力損失、ＩｇＥ媒介疾患、例えばアナフィラキシー及びアレルギー性及びアトピー性の鼻炎、脳炎、例えばラスムッセン脳炎及び辺縁系及び／又は脳幹の脳炎、ブドウ膜炎、急性前部ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、又は自己免疫性ブドウ膜炎、糸球体腎炎（ＧＮ）で腎症候群を伴うか伴わないもの、例えば慢性又は急性の糸球体腎炎、例えば一次性ＧＮ、免疫媒介ＧＮ、膜性ＧＮ（膜性腎症）、特発性膜性ＧＮ、膜性増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）、例えばＩ型及びＩＩ型、及び急速進行性ＧＮ、アレルギー性状態、アレルギー性反応、湿疹、例えばアレルギー性又はアトピー性湿疹、喘息、例えば気管支の喘息、気管支喘息、及び自己免疫性喘息、Ｔ細胞の浸潤及び慢性の炎症性応答の関与する状態、慢性の肺の炎症性疾患、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は全身エリテマトーデス、例えば皮膚ＳＬＥ、亜急性皮膚エリテマトーデス、新生児性エリテマトーデス（ＮＬＥ）、播種性エリテマトーデス、狼瘡（例えば腎炎、脳炎、小児性、非腎性、円板状脱毛）、若年発症性（Ｉ型）の真性糖尿病、例えば小児インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）、成人発症性真性糖尿病（ＩＩ型糖尿病）、自己免疫性糖尿病、特発性尿崩症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎｓｉｐｉｄｕｓ）、サイトカイン及びＴリンパ球により媒介される急性及び遅発性の高血圧に関連する免疫応答、結核、サルコイドーシス、肉芽腫症、例えばリンパ腫様肉芽腫症、ウェーゲナー肉芽腫症、顆粒球減少症、血管腫類、例えば血管腫（例えば大型血管の血管炎（例えばリューマチ性多発性筋痛及び巨細胞性（高安）動脈炎）、中型血管の血管炎（例えば川崎病及び結節性多発性動脈炎）、顕微鏡性多発性動脈炎、ＣＮＳ血管炎、壊死性、皮膚性又は高血圧性の血管炎、全身性壊死性血管炎、及びＡＮＣＡ−関連性血管炎、例えばチャーグ−ストラウス血管炎又は症候群（ＣＳＳ））、側頭動脈炎、再生不良性貧血、自己免疫性再生不良性貧血、クームス陽性貧血、ダイアモンドブラックファン貧血、溶血性貧血又は免疫性溶血性貧血、例えば自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、悪性貧血（悪性の貧血）、アジソン病、赤芽球性貧血又は再生不良（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子不全、Ａ型血友病、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球漏出の関連する疾患、ＣＮＳ炎症性障害、多臓器傷害症候群、例えば敗血症、外傷又は出血に二次的なもの、抗原−抗体複合体媒介疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス−ジョンソン症候群、類天疱瘡、例えば類天疱瘡性水疱及び皮膚類天疱瘡、天疱瘡（例えば尋常天疱瘡、落葉状天疱瘡、粘膜天疱瘡、及び紅斑性天疱瘡）、自己免疫性多発性内分泌腺症、ライター病又は症候群、免疫複合体性腎炎、抗体媒介腎炎、慢性神経障害、例えばＩｇＭ多発性神経障害又はＩｇＭ媒介神経障害、血小板減少症（例えば心筋梗塞患者が発症する者）、例えば血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）及び自己免疫性又は免疫媒介性の血小板減少症、例えば特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、例えば慢性又は急性のＩＴＰ、精巣及び卵巣の自己免疫疾患、例えば自己免疫性精巣炎及び卵巣炎、一次性甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫性内分泌症、例えば甲状腺炎、例えば自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、又は亜急性の甲状腺炎、自己免疫性甲状腺症、特発性甲状腺機能低下症、グレーブス病、多腺性症候群、例えば自己免疫性多腺性症候群（又は多腺性内分泌病症候群）、腫瘍随伴性症候群、例えば神経学的腫瘍随伴性症候群、例えばランバート−イートン筋無力症症候群又はイートン−ランバート症候群、スティッフマン又はスティッフパーソン症候群、脳脊髄炎、例えばアレルギー性脳脊髄炎又はアレルギー性の脳脊髄炎、及び実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、重症筋無力症、脳変性、神経筋緊張症、眼球クローヌス又は眼球クローヌス筋クローヌス症候群（ＯＭＳ）、及び二次性神経障害、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、慢性肝炎、ルポイド肝炎、巨細胞肝炎、慢性活動性肝炎又は自己免疫性慢性活動性肝炎、リンパ様間質性肺炎、閉塞性細気管支炎（非移植）ｖｓ  ＮＳＩＰ、ギヤン−バレー症候群、ベルガー病（ＩｇＡ腎症）、特発性ＩｇＡ腎症、線状ＩｇＡ皮膚病、一次胆汁性肝硬変、肺硬変、自己免疫性腸症症候群、セリアック病、セリアック症、セリアックスプルー（グ���テン腸症）、難治性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルーゲーリック病）、冠動脈疾患、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、又は自己免疫性聴覚損失、眼球クローヌス筋クローヌス症候群（ＯＭＳ）、多発性軟骨炎、例えば難治性又は回帰性の多発性軟骨炎、肺胞蛋白症、アミロイド症、強膜炎、非癌性リンパ球増加症、一次リンパ球増加症、例えばモノクローナルＢ細胞リンパ球増加症（例えば良性の単一クローン高ガンマグロブリン血症及び意義不明の単一クローン高ガンマグロブリン血症、ＭＧＵＳ）、末梢神経障害、新生物随伴症候群、チャンネル病、例えば癲癇、片頭痛、不整脈、筋肉障害、聾唖、盲目、周期的麻痺、及びＣＮＳのチャンネル病、自閉症、炎症性筋障害、巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、内分泌性眼症、ブドウ膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓障害、線維性筋痛症、多発性内分泌障害、シュミット症候群、副腎炎、胃の萎縮、初老性痴呆症、脱髄性疾患、例えば自己免疫性脱髄性疾患、糖尿病性腎症、ドレスラー症候群、円形脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着症、レイノー現象、食道運動不全、手指硬化症及び毛細管拡張症）、雌雄の自己免疫性不妊、混合型結合組織病、シャーガス病、リューマチ熱、再発性流産、農夫肺、多形性紅斑、心臓切開後症候群、クッシング症候群、鳥飼育者肺、アレルギー性肉芽腫性血管炎、良性リンパ性血管炎、アルポート症候群、肺胞炎、例えばアレルギー性肺胞炎及び繊維性肺胞炎、間質性肺疾患、輸液反応、らい病、マラリア、リューシュマニア症、キパノソミアシス（ｋｙｐａｎｏｓｏｍｉａｓｉｓ）、住血吸虫症、回虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維症、びまん性間質性肺線維症、間質性肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、眼内炎、持続性隆起性紅斑、胎児性赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シャルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、毛様体炎、例えば慢性毛様体炎、異虹彩色性毛様体炎、又はフックス毛様体炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）感染症、エコーウィルス感染症、心筋症、アルツハイマー病、パルボウィルス感染症、風疹ウィルス感染症、ワクチン後症候群、先天性風疹感染症、エプスタイン−バーウィルス感染症、おたふくかぜ、エバンス症候群、自己免疫性生殖腺不全、シドナム舞踏病、連鎖球菌感染後の腎炎、血栓性血管炎、甲状腺中毒症、脊髄ろう、絨毛炎、巨細胞多発性筋痛、内分泌性眼症、慢性高血圧性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎臓症候群、微小変化腎症、良性の家族性及び虚血再灌流性の傷害、網膜の自己免疫、関節の炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道病、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化性障害、無精液症、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュプュイトラン拘縮、眼内水晶体アナフィラキシー、アレルギー性腸炎、らい性結節性紅斑、特発性顔面麻痺、慢性疲労症候群、リューマチ熱、ハンマン−リッチ病、感覚神経聴覚消失、ヘモグロビン尿症性発作、性機能低下症、地域性回腸炎、白血球減少症、感染性単核細胞症、横断脊髄炎、一次特発性粘液水腫、腎症、交感神経性眼���、肉芽腫性精巣炎、膵臓炎、急性多発性神経根炎、壊疽性膿皮症、ケルバイン甲状腺炎、後天性脾臓形成不全、抗精子抗体による不妊、非悪性胸腺腫、白斑、ＳＣＩＤ及びエプスタイン−バーウィルス関連の疾患、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、寄生虫病、例えばリューシマニア症、毒性ショック症候群、食物中毒、Ｔ細胞浸潤の関与する状態、白血球接着不全、サイトカイン及びＴリンパ球により媒介される急性及び遅発性の高血圧に関連する免疫応答、白血球漏出の関連する疾患、多臓器傷害症候群、抗原−抗体複合体媒介疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫性多発性内分泌腺症、卵巣炎、一次粘液水腫、自己免疫性萎縮性胃炎、交感神経性眼症、リューマチ症、混合型結合組織病、腎症候群、インスリン炎、多発性内分泌障害、末梢神経障害、Ｉ型自己免疫性多内分泌腺症候群、特発性副甲状腺機能亢進症の成人発症（ＡＯＩＨ）、完全脱毛症、拡張性心筋症、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、ヘモクロマトーシス、心筋炎、腎症候群、一次硬化性胆管炎、化膿性又は非可能性の副鼻腔炎、急性又は慢性の副鼻腔炎、篩骨、前頭、上顎又は蝶形骨副鼻腔炎、好酸球関連の障害、例えば好酸球増加症、肺浸潤好酸球、好酸球増加症−筋痛症候群、レフラー症候群慢性好酸球性肺炎、局所的肺好酸球症、気管支肺アスペルギルス症、アスペルギルス腫、又は好酸球を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、セロネガティブ脊椎関節炎、多発性内分泌性自己免疫疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性の粘膜皮膚カンジダ症、ブルトン症候群、幼児における一過性低ガンマグロブリン血症、ビスコット−オールドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調、コラーゲン病に関連する自己免疫性障害、リューマチ、神経学的障害、虚血再灌流障害、血圧応答の低減、血管機能不全、血管拡張症、組織傷害、心臓血管虚血、痛覚過敏、脳虚血、及び脈管形成を伴う疾患、アレルギー性過敏症障害、糸球体腎炎、再灌流傷害、心筋又は他の組織の再灌流傷害、急性炎症性要素を伴った皮膚症、急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系の炎症性障害、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘導毒性、急性重症炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺硬化症、糖尿病性網膜症、糖尿病性大型動脈障害、動脈内膜過形成、消化性潰瘍、心弁膜炎及び子宮内膜炎を包含する。
【０１３０】
癌の治療は例えば限定しないが、腫瘍の後退、腫瘍の重量またはサイズの縮小、進行までの時間、生存期間、無進行生存、全体的応答率、応答期間、クオリティーオブライフ、蛋白発現及び／又は活性により評価できる。本明細書に記載した抗血管新生剤は腫瘍の脈管形成をターゲティングし、必ずしも新生物細胞自体をターゲティングしないため、それらは抗癌剤の独特のクラスとなり、そしてそのため、薬剤への臨床応答の独特の尺度及び定義を必要とする場合がある。例えば２次元分析において５０％超の腫瘍縮小は応答を宣言するための標準的なカットオフである。しかしながら、本明細書のアルファ５ベータ１アンタゴニスト及びＶＥＧＦアンタゴニストは原発腫瘍の縮小を伴うことなく転移拡張の抑制をもたらす場合があり、或いは単に腫瘍増殖抑制作用を示す場合がある。従って、治療の効果を測定する方策、例えば血漿中又は尿中の血管新生剤マーカーの測定及び放射線撮影を介した応答の測定を使用することができる。
【０１３１】
治療すべき適応症及び当該分野の医師がよく知る投薬に関連する因子に応じて、本発明の抗体は毒性及び副作用を最小限としつつその適応症の治療のために有効である用量において投与される。癌、自己免疫疾患又は免疫不全疾患の治療のためには、治療有効用量は、例えば５０ｍｇ／投薬〜２．５ｇ／ｍ２の範囲であることができる。１つの実施形態において、投与される用量は約２５０ｍｇ／ｍ２〜約４００ｍｇ／ｍ２又は５００ｍｇ／ｍ２である。別の実施形態によれば、用量は約２５０〜３７５ｍｇ／ｍ２である。更に別の実施形態において、用量範囲は２７５〜３７５ｍｇ／ｍ２である。
【０１３２】
加齢関連黄斑変性（ＡＭＤ）の治療は限定しないが、視野の損失の速度の低減又は更なる進行の防止により評価できる。ＡＭＤ治療のためにはインビボの薬効は例えば以下の１つ、即ち、所望の時期までのベースラインからの最高補正視力（ＢＣＶＡ）における平均の変化を測定すること、ベースラインと比較した場合の所望の時期における視力において１５文字より少ない損失の対象の比率を測定すること、ベースラインと比較した場合の所望の時期における視力において１５文字より多い獲得の対象の比率を測定すること、所望の時期における２０／２０００又はこれより悪い視力スネレン等量を有する対象の比率を測定すること、ＮＥＩ視覚機能アンケートを測定すること、フルオレセインアンジオグラフィーで測定した場合の所望の時期におけるＣＮＶのサイズ及びＣＮＶの漏出量を測定すること等により測定できる。
【０１３３】
「検出する」という用語は物質の存在又は非存在を測定すること、又は物質の量を定量することを包含する。即ち用語は定性的及び定量的測定のための本発明の物質、組成物及び型法の使用を指す。一般的に、検出のために使用される特定の手法は本発明の実施のためには厳密ではない。
【０１３４】
例えば、本発明により「検出する」とは、アルファ５遺伝子産物、ｍＲＮＡ分子、又はアルファ５ポリペプチドの存在又は非存在；アルファ５ポリペプチドのレベル又は標的に結合した量の変化；アルファ５ポリペプチドの生物学的機能／活性の変化を観察することを包含する。一部の実施形態においては、「検出する」とは野生型のアルファ５のレベルを検出することを包含する（例えばｍＲＮＡ又はポリペプチドのレベル）。検出は１０％と９０％の間の何れかの値の、又は３０％と６０％の間の何れかの値の、又は１００％を超える変化（増大又は低下）を定量することを包含してよい。検出は２倍〜１０倍以上の何れかの値、例えば１００倍の変化を定量することを包含する。
【０１３５】
本明細書において使用する場合の単語である「標識」とは、抗体に直接又は間接的に結合体化される検出可能な化合物又は組成物を指す。標識はそれ自体検出可能（例えば放射性同位体標識又は蛍光標識）であるか、又は、酵素標識の場合は、検出可能な物質の化合物又は組成物の化学的改変を触媒してよい。
【０１３６】
新しい抗アルファ５ベータ１抗体
ヒトアルファ５ベータ１に結合し、そしてヒトアルファ５ベータ１への抗アルファ５ベータ１抗体の結合を競合的に抑制することができる新しい抗体を本明細書において提供する。１つの実施形態によれば、抗アルファ５ベータ１抗体は２００６年３月７日にＡＴＣＣにおいてアルファ５／ベータ１  ７Ｈ５．４．２．８（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−７４２１）として寄託されたハイブリドーマ及びアルファ５／ベータ１７Ｈ１２．５．１．４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−７４２０）として寄託されたハイブリドーマからなる群より選択されるハイブリドーマにより生産される。別の実施形態によれば、抗体は２００６年３月７日にＡＴＣＣにおいてアルファ５／ベータ１  ７Ｈ５．４．２．８（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−７４２１）として寄託されたハイブリドーマ及びアルファ５／ベータ１７Ｈ１２．５．１．４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−７４２０）として寄託されたハイブリドーマからなる群より選択されるハイブリドーマにより生産される。更に別の実施形態によれば、抗体は請求項１記載の抗体であって、抗体が２００６年３月７日にＡＴＣＣにおいてアルファ５／ベータ１  ７Ｈ５．４．２．８（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−７４２１）として寄託されたハイブリドーマにより生産される抗体の可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン配列を含む。別の実施形態においては、抗体は、２００６年３月７日にＡＴＣＣにおいてアルファ５／ベータ１７Ｈ１２．５．１．４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−７４２０）として寄託されたハイブリドーマにより生産される抗体の可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン配列を含む。寄託したハイブリドーマの抗体のヒト及びキメラ型も意図される。
【０１３７】
１つの実施形態によれば、抗体は５００ｎＭ〜１ｐＭのＫｄでヒトアルファ５ベータ１に結合する。別の実施形態によれば、抗体がアルファＶベータ３にもアルファＶベータ５にもアルファＶベータ１にも結合しない。別の実施形態によれば、抗体はヒトＩｇＧ、例えばヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４のＦｃ配列を含む。別の実施形態においては、Ｆｃ配列は、そのＦｃ受容体（ＦｃＲ類）への結合に関係している場合が多い抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を欠いているように、改変又は別様に変更されている。エフェクター機能を改変することができるＦｃ配列に対する変更または突然変異には多くの例が存在する。例えば、ＷＯ００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）ａｎｄ  Ｓｈｉｅｌｄｓ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）はＦｃＲ類への向上した、又は減衰した結合を有する抗体変異体を記載している。これらの刊行物の内容は、具体的に参考として本明細書に援用される。抗体はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ、Ｆｖフラグメント；ダイアボディー及び線状抗体の形態であることができる。更に又、抗体はアルファ５ベータ１に結合し、そしてアルファ５ベータ１アンタゴニストであるが、他の標的１つ以上にも結合してそれらの機能（例えばＶＥＧＦ）を抑制する多重特異性の抗体であることもできる。抗体は治療薬（例えばサイトカイン剤、放射性同位体及び化学療法剤）又は画像化により患者試料中、又はインビボのアルファ５ベータ１を検出するための標識（例えば放射性同位体、蛍光染料及び酵素）に結合体化することができる。
【０１３８】
抗アルファ５ベータ１抗体をコードする核酸分子、可変ドメインの一方又は両方をコードする核酸分子を含む発現ベクター、及び核酸分子を含む細胞も意図される。これらの抗体は本明細書に記載した治療において、そして患者試料中（例えばＦＡＣＳ、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ＥＬＩＳＡアッセイ）又は患者中のアルファ５ベータ１蛋白を検出するために使用できる。
【０１３９】
新しい組み合わせ
疾患に罹患した対象における血管新生及び／又は血管透過性を抑制するための新しい組み合わせであり、その組み合わせはＶＥＧＦアンタゴニスト及びアルファ５ベータ１アンタゴニストを含む。ＶＥＧＦアンタゴニスト及びアルファ５ベータ１アンタゴニストは同時又は逐次的な治療サイクルにおいて投与できる。そのような複合療法は異常な血管新生及び／又は血管透過性を有し、そして抗血管新生療法から利益を被る疾患を包含する疾患を治療するために有用である。そのような疾患は、限定しないが、癌、眼の疾患及び自己免疫疾患を包含する。或いは、対象はＶＥＧＦアンタゴニストで治療され、そして後にアルファ５ベータ１アンタゴニストを投与されることができ、例えば対象がＶＥＧＦアンタゴニスト治療に非応答性となるまでＶＥＧＦアンタゴニストで治療し、そして次に対象をアルファ５ベータ１アンタゴニストで治療する。１つの実施形態によれば、対象は癌が非侵襲性である場合にはＶＥＧＦアンタゴニストで治療し、癌が侵襲性である場合にはアルファ５ベータ１アンタゴニストで治療される。非疾患患者又は対照と比較して、天然に、又はＶＥＧＦアンタゴニスト療法に応答して、上昇したアルファ５ベータ１レベルを経験する一部の患者は、この複合治療に特に応答性となる場合がある。治療薬（例えば抗腫瘍剤、化学療法剤、増殖抑制剤及び細胞毒性剤）を更に含む組み合わせが意図される。例えば化学療法剤（例えばイリノテカン）及びアルファ５ベータ１アンタゴニストで治療される予定の、又は、化学療法及びアルファ５ベータ１アンタゴニストで治療されている患者は、ＶＥＧＦアンタゴニスト療法から利益を被ることができる。或いは、化学療法及びＶＥＧＦアンタゴニストで治療されている患者は、アルファ５ベータ１アンタゴニスト療法から利益を被ることができる。１つの好ましい実施形態においては、抗ＶＥＧＦ抗体はＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）抗体である。別の好ましい実施形態においては抗アルファ５ベータ１抗体は本明細書に記載した抗アルファ５ベータ１抗体である。ＶＥＧＦアンタゴニスト、アルファ５ベータ１アンタゴニスト及び場合により化学療法剤を含むキットが意図される。
【０１４０】
医薬品製剤
本発明により使用される抗体の治療用製剤は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態において、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））に所望の程度の純度を有する抗体を混合することにより保存用に製造される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は使用される用量及び濃度においてレシピエントに非毒性であり、そして、緩衝物質、例えばリン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；セタノール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；蛋白、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、２糖類及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース又はデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えばＺｎ−蛋白複合体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含する。例示される抗体製剤は参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９８／５６４１８に記載されている。皮下投与に適する凍結乾燥製剤はＷＯ９７／０４８０１に記載されている。そのような凍結乾燥された製剤は適当な希釈剤で再構成して高蛋白濃度とし、そして再構成製剤を本明細書における治療すべき哺乳類に皮下投与してよい。
【０１４１】
本発明の製剤は又、治療すべき特定の適応症のために必要に応じて１種より多い活性化合物、好ましくは相互に悪影響を与えない補完的活性を有するものを含有してよい。例えば、更に細胞毒性剤、化学療法剤、サイトカイン又は免疫抑制剤（例えばＴ細胞に作用するもの、例えばシクロスポリン又はＴ細胞に結合する抗体、例えばＬＦＡ−１に結合するもの）を与えることが望ましい。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、疾患又は障害又は治療の型、及び上記した他の要因に応じたものとなる。それらは一般的に本明細書に記載した用量及び投与経路と同様に、又は、これまで使用された用量の約１〜９９％で使用される。
【０１４２】
活性成分はまた例えばコアセルベーション法によるか、又は、界面重合により製造されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマクロエマルジョン中に捕獲させてもよい。このような手法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載されている。
【０１４３】
持続放出製剤を製造してよい。持続放出製剤の適当な例はアンタゴニストを含有する固体疎水性重合体の半透過性マトリックスを包含し、そのようなマトリックスは形状付与された物品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許３，７７３，９１９）、Ｌ−グルタミン酸及びエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドよりなる注射可能なマイクロスフェア）及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を包含する。
【０１４４】
インビボ投与のために使用されるべき製剤は滅菌されていなければならない。これは滅菌濾過メンブレンを通過する濾過により容易に達成される。
【０１４５】
製造物品及びキット
本発明の別の実施形態は腫瘍、眼の疾患又は自己免疫疾患及び関連の状態の治療のために有用な材料物質を含有する製造物品が提供される。製造物品は容器及び容器上又はそれに伴ったラベル又はパッケージインサートを含む。適当な容器は例えばビン、バイアル、シリンジ等を包含する。容器は種々の材料、例えばガラス又はプラスチックから形成してよい。一般的に容器は状態の治療に有効となる組成物を保持しており、そして滅菌された接触口を有してよい（例えば容器は静脈内投与用の溶液バッグ又は皮下注射針により穿刺可能な蓋つきのバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は本発明のＶＥＧＦアンタゴニスト又はアルファ５ベータ１アンタゴニスト又はＶＥＧＦアゴニスト又はアルファ５ベータ１アゴニストである。ラベル又はパッケージインサートは、組成物が特定の状態を扱うために使用されることを示している。ラベル又はパッケージインサートは更に患者への抗体組成物の投与に関する説明書を含むことになる。本明細書に記載したコンビナトリアル療法を含む製造物品及びキットもまた意図される。
【０１４６】
パッケージインサートとは治療用製品の市販用パッケージ内に寛容的に包含される説明書を指し、それはそのような治療用製品の使用に関する、適応症、レジメン、用量、投与、禁忌及び／又は警告に関する情報を含んでいる。１つの実施形態において、パッケージインサートは非ホジキンリンパ腫を治療するために組成物が使用されることを示している。
【０１４７】
更に又、製造物品は製薬上許容しうる緩衝物質、例えば殺菌増殖抑制性の注射用水（ＢＷＦＩ）、ホスフェート緩衝食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液を含む第２の容器を更に含んでよい。それは更に商業的、及びユーザーの見地から望ましい他の物質、例えば他の緩衝物質、希釈剤、充填剤、針及びシリンジを包含してよい。
【０１４８】
種々の目的のため、例えば患者におけるアルファ５ベータ１及び／又はＶＥＧＦの単離又は検出のために有用なキットもまた、場合により製造物品と組み合わせて提供される。アルファ５ベータ１の単離及び精製のためには、キットはビーズ（例えばセファロースビーズ）にカップリングさせた抗アルファ５ベータ１抗体を含有できる。例えばＥＬＩＳＡ
又はウエスタンブロットにおけるインビトロのアルファ５ベータ１及び／又はＶＥＧＦの検出及び定量のための抗体を含有するキットを提供できる。製造物品の場合と同様に、キットは容器及び容器上又はそれに付随したラベル又はパッケージインサートを含む。例えば、容器は本発明の抗アルファ５ベータ１抗体少なくとも１つを含む組成物を保持している。例えば希釈剤及び緩衝剤、対照抗体を含有する別の容器を包含させてよい。ラベル又はパッケージインサートは組成物の説明並びに意図されるインビトロ又は診断上の使用のための説明書を提示してよい。
【０１４９】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は例えばＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により記載されたもののようなハイブリドーマ法を用いて製造することができ、あるいは、組み換えＤＮＡ法（米国特許４，８１６，５６７）により作成することができ、あるいは実施例のセクションにおいて本明細書に記載した方法により製造することができる。ハイブリドーマ法においては、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤で免疫化することにより免疫化剤に特異的に結合することになる抗体を生産するか生産することができるリンパ球を生じさせる。或いは、リンパ球をインビトロで免疫化できる。
【０１５０】
免疫化剤は典型的にはポリペプチド又は目的の蛋白の融合蛋白又は蛋白を含む組成物を包含する。一般的には、ヒト起源の細胞が望まれる場合は末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を使用し、或いは非ヒト哺乳類原料が望まれる場合は脾細胞又はリンパ節細胞を使用する。次にリンパ球をポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて不朽化された細胞に融合させることにより、ハイブリドーマ細胞を形成する。Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６），ｐｐ．５９−１０３。不朽化された細胞株は通常は形質転換された哺乳類細胞、特にげっ歯類、ウシ及びヒト起源の骨髄腫細胞である。通常は、ラット又はマウスの骨髄腫細胞株を使用する。ハイブリドーマ細胞は未融合の不朽化細胞の成長又は生存を抑制する物質１つ以上を好ましくは含有する適当な培地中で培養できる。例えば親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いている場合は、ハイブリドーマ用の培地は典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含むことになり（「ＨＡＴ培地」）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を防止する。
【０１５１】
好ましい不朽化細胞株は効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定で高レベルの発現を支援し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性のものである。より好ましい不朽化細胞株はマウス骨髄腫系統であり、これは例えばＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから入手できる。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も又ヒトモノクローナル抗体の製造のために報告されている。Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ等、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）ｐｐ．５１−６３。
【０１５２】
次にハイブリドーマ細胞を培養する培地をポリペプチドに対して指向されたモノクローナル抗体の存在に関して試験することができる。ハイブリドーマ細胞により製造されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降により、又はインビトロの結合試験、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）により測定できる。そのような手法及び試験は当業者の知る通りである。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばＭｕｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスカッチャード分析により測定できる。
【０１５３】
所望のハイブリドーマ細胞が発見された後、限界希釈操作法によりクローンをサブクローニングし、そして標準的な方法により生育させることができる。Ｇｏｄｉｎｇ、上出。この目的のための適当な培地は、例えばダルベッコの変性イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０培地を包含する。或いは、ハイブリドーマ細胞は哺乳類中の腹水としてインビボで生育させることができる。
【０１５４】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は従来の免疫グロブリン精製の操作法、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーにより培地又は腹水から単離又は精製することができる。
【０１５５】
モノクローナル抗体は又組み換えＤＮＡ法、例えば米国特許４，８１６，５６７に記載のものにより製造できる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは従来の方法（例えばマウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる）を用いて容易に単離及び配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい原料として機能する。単離された後、ＤＮＡは発現ベクター内に入れることができ、次にそれを宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は免疫グロブリン蛋白を別様に生産しない骨髄腫細胞にトランスフェクトすることにより、組み換え宿主細胞中のモノクローナル抗体の合成を達成することができる。ＤＮＡは又例えば相同のマウス配列の代わりにヒトの重鎖及び軽鎖の定常ドメインに関するコーディング配列を置換することにより（米国特許４，８１６，５６７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、上出）又は、非免疫グロブリンポリペプチドに関する定常ドメイン配列の全て又は部分を免疫グロブリンコーディング配列に共有結合することにより、修飾することができる。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代替となることができ、又は、本発明の抗体の１つの抗原複合化部位の可変ドメインの代替となることができる。
【０１５６】
抗体は１価の抗体であることができる。１価の抗体を製造するための方法は当該分野で知られている。例えば１つの方法は免疫グロブリン軽鎖及び修飾された重鎖の組み換え発現を包含する。重鎖は一般的にＦｃ領域の何れかの位置においてトランケーションされることにより重鎖の交差結合を防止する。或いは、該当するシステイン残基を別のアミノ酸残基と置換するか、欠失させることにより交差結合を防止する。
【０１５７】
インビトロの方法も又１価の抗体を製造するために適している。抗体を消化してそのフラグメント、特にＦａｂフラグメントを製造することは、限定しないが、当業者の知る方法により行える。
【０１５８】
ヒト及びヒト化抗体
抗体はヒト化抗体又はヒト抗体であることができる。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化型は典型的には非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はそのフラグメント（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合サブ配列）である。ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を包含し、その場合レシピエントのＣＤＲ由来の残基は所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基により置き換えられている。一部の場合においては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は相当する非ヒト残基により置き換えられている。ヒト化抗体は又レシピエント抗体中、又はインポートされたＣＤＲ又はフレームワーク配列中の何れにも存在しない残基を含むことができる。一般的にヒト化抗体は少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことができ、その場合、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、そしてＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものとなる。ヒト化抗体は好ましくは又、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含むことになる。Ｊｏｎｅｓ等、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）。
【０１５９】
非ヒト抗体をヒト化するための一部の方法は当該分野及び後述する実施例に記載されている。一般的に、ヒト化抗体は非ヒトの原料由来のそれに導入されたアミノ酸残基１つ以上を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は「インポート」残基と称される場合が多く、これは典型的には「インポート」可変ドメインから取り出される。１つの実施形態によれば、ヒト化は本質的には、Ｗｉｎｔｅｒ等の方法（Ｊｏｎｅｓ等、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って、げっ歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の相当する配列の代替とすることにより行うことができる。従って、このような「ヒト化」抗体は未損傷のヒト可変ドメインには実質的に満たないものが非ヒト種の相当配列により置換されている抗体（米国特許４，８１６，５６７）である。実際はヒト化抗体は典型的には一部のＣＤＲ残基及び恐らくは一部のＦＲ残基がげっ歯類抗体の類縁の部位に由来する残基により置換されている。
【０１６０】
ヒト化の代替として、ヒト抗体を作成できる。例えば、内因性免疫グロブリン生産の非存在下においてヒト抗体の完全なレパートリーを生産することが免疫化により可能になるトランスジェニック動物（例えばマウス）を作成することが現在は可能である。例えばキメラ及び生殖細胞株の突然変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）のホモ接合欠失は内因性抗体生産の完全な抑制をもたらすことが報告されている。ヒト生殖細胞株免疫グロブリン遺伝子アレイのそのような生殖細胞株突然変異体マウス内への転移は、抗原攻撃時のヒト抗体の生産をもたらす。例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ等、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；米国特許５，５４５，８０６，５，５６９，８２５，５，５９１，６６９（ａｌｌ  ｏｆ  ＧｅｎＰｈａｒｍ）；５，５４５，８０７；及びＷＯ９７／１７８５２を参照できる。或いはヒト抗体はヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されているトランスジェニック動物、例えばマウスに導入することにより、作成することができる。攻撃時に、ヒト抗体の生産が観察され、それは遺伝子の再配列、組み立て及び抗体レパートリーを包含する全ての点において、ヒトにおいて観察されるものと酷似している。このアプローチは例えば米国特許５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；及び５，６６１，０１６、そして以下の科学文献、即ち、Ｍａｒｋｓ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ等、Ｎａｔｕｒｅ，３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３６８：８１２−８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：８４５−８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：６５−９３（１９９５）に記載されている。
【０１６１】
或いは、ファージディスプレイ手法（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３  ［１９９０］）を使用することにより、未免疫化ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからインビトロでヒト抗体及び抗体フラグメントを製造できる。この手法の１つの実施形態によれば、抗体のＶドメイン配列をＭ１３又はｆｄのような繊維状バクテリオファージのメジャー又はマイナーコート蛋白遺伝子の何れかにインフレームにクローニングする。ファージディスプレイは後述する実施例のセクションにおいて、或いは例えば（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３））において考察されているとおり、種々のフォーマットにおいて実施できる。Ｖ遺伝子セグメントの数種の原料をファージディスプレイのために使用できる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）は免疫化されたマウスの秘蔵から誘導されたＶ遺伝子の小さいランダムな組み合わせのライブラリから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離している。未免疫化ヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、そして、抗原（自己抗原を包含する）の多様なアレイに対する抗体を本質的にＭａｒｋｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１），ｏｒ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）により記載された手法に従って単離することができる。また米国特許５，５６５，３３２及び５，５７３，９０５を参照できる。
【０１６２】
上記した通り、ヒト抗体は又インビトロの活性化Ｂ細胞により形成することもできる（米国特許５，５６７，６１０及び５，２２９，２７５参照）。
【０１６３】
ヒト抗体は又ファージディスプレイライブラリを包含する当該分野で知られた種々の手法を用いて製造できる。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。Ｃｏｌｅ等、ａｎｄ  Ｂｏｅｒｎｅｒ等、の方法も又、ヒトモノクローナル抗体の作成のために使用される。Ｃｏｌｅ等、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）及びＢｏｅｒｎｅｒ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）。
【０１６４】
多重特異性抗体
多重特異性抗体は２つ以上の異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナルの、好ましくはヒト又はヒト化抗体（例えば少なくとも２つの抗原に対して結合特異性を有する二重特異性抗体）である。例えば、結合特異性の１つはアルファ５ベータ１抗体に対するものであることができ、そして他方は何れかの他の抗原に対するものであることができる。１つの好ましい実施形態によれば、他の抗原は細胞表面蛋白又は受容体又は受容体サブユニットである。例えば、細胞表面蛋白はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞受容体であることができる。即ち、１つの実施形態によれば、本発明の二重特異性抗体はアルファ５ベータ１に結合でき、そしてＶＥＧＦに結合できる。
【０１６５】
二重特異性抗体を作成するための方法は報告されている。伝統的には、二重特異性抗体の組み換え製造は２つの重鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく。Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな取り合わせが原因となり、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は潜在的に１０種の異なる抗体分子の混合物を生産し、その内僅か１つのみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は通常はアフィニティークロマトグラフィー工程により行う。同様の操作法は１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０８８２９及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に記載されている。
【０１６６】
所望の結合特異性を有する抗体の可変ドメイン（抗体−抗原複合体化部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合することができる。融合は好ましくは少なくとも部分的にヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインと行う。融合物の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物及び所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別個の発現ベクター内に挿入し、そして適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。二重特異性抗体を作成は更に詳細には例えばＳｕｒｅｓｈ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）に記載されている。
【０１６７】
組み換え体の細胞培養物から直接二重特異性抗体フラグメントを作成して単離するための種々の手法が報告されている。例えば二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用しながら製造されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎ蛋白に由来するロイシンジッパー蛋白を遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結している。抗体ホモ２量体をヒンジ領域において還元することにより単量体とし、次に再酸化することにより抗体ヘテロ２量体を形成する。この方法は又、抗体ホモ２量体の製造のためにも利用できる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）により記載された「ダイアボディー」技術は二重特異性抗体フラグメントを作成するための代替となる機序を提供している。フラグメントは同じ鎖上の２つのドメインの間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーによりＶＬに連結されたＶＨを含む。従って１つのフラグメントのＶＨ及びＶＬドメインを強制的に、別のフラグメントの相補ＶＨ及びＶＬドメインと対形成させることにより２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）２量体の使用による二重特異性抗体フラグメントを作成するための他の方策もまた報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照できる。
【０１６８】
２価より高い抗体も意図される。例えば３重特異性抗体を作成できる。Ｔｕｔｔ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１６９】
ヘテロ結合体抗体
ヘテロ結合体抗体は２つの共有結合により連結された抗体を含む。そのような抗体は例えば望ましくない細胞に免疫系細胞をターゲティングするため（米国特許４，６７６，９８０）、及びＨＩＶ感染症を治療するために提案されている。ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ  ０３０８９。抗体は合成蛋白化学における知られた方法、例えば交差結合剤を使用するものを用いてインビトロで製造できる。例えば免疫毒素をジスルフィド交換反応を用いて、又はチオエステル結合を形成することにより、構築することができる。この目的のための適当な試薬の例はイミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチルイミデート及び例えば米国特許４，６７６，９８０に開示されているものを包含する。
【０１７０】
エフェクター機能の操作
例えば癌の治療における抗体の有効性が増強されるようにエフェクター機能に関して本発明の抗体を修飾することが望ましい場合がある。例えばシステイン残基をＦｃ領域に導入することにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にすることができる。このようにして形成されたホモ２量体抗体は向上した内在化能力及び／又は増大した補体媒介細胞殺傷及び抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有することができる。Ｃａｒｏｎ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：１１９１−１１９５（１９９２）ａｎｄ  Ｓｈｏｐｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照できる。増強され抗腫瘍活性を有するホモ２量体抗体はまた、Ｗｏｌｆｆ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載される通りヘテロ２官能性交差結合剤を用いて製造できる。或いは、二重のＦｃ領域を有し、そしてこれにより増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能力を有する抗体を操作することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ等、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９−２３０（１９８９）を参照できる。
【０１７１】
Ｆｃ領域配列における突然変異又は改変をＦｃＲ結合（例えばＦｃガンマＲ、ＦｃＲｎ）を向上させるために行うことができる。１つの実施形態によれば、本発明の抗体はＡＤＣＣ、ＣＤＣ及びネイティブＩｇＧ又は親抗体と比較した場合の向上したＦｃＲｎ結合からなる群より選択される改変されたエフェクター機能少なくとも１つを有する。数種の有用な特定の突然変異の例は、例えばＳｈｉｅｌｄｓ，ＲＬ等、（２００１）ＪＢＣ  ２７６（６）６５９１−６６０４；Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．，（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０（４）：４８７−４９０；及び、ＷＯｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ００／４２０７２に記載されている。
【０１７２】
１つの実施形態によれば、Ｆｃ受容体突然変異はＦｃ領域の２３８、２３９、２４６、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８又は４３９からなる群より選択される位置少なくとも１つにおける置換であり、その場合Ｆｃ領域における残基のナンバリングはＥＵナンバリングシステムに従う。
【０１７３】
免疫結合体
本発明は又細胞毒性剤、例えば化学療法剤、毒素（例えば細菌、カビ、植物又は動物期限の酵素的に活性な毒素又はそのフラグメント）又は放射性同位体（すなわちラジオコンジュゲート）に結合体化された抗体を含む免疫結合体に関する。
【０１７４】
そのような免疫結合体の形成に有用な化学療法剤は上記した通りである。使用できる酵素的に活性な毒素及びそのフラグメントはジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エキソトキシンＡ鎖（シュードモナス・アエルギノーサ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、アレウリテス・フォルジ蛋白、ジアンシン蛋白、フィトラカ・アメリカナ蛋白（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルジカ・チャランチア阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセン類を包含する。種々の放射性核種がラジオコンジュゲート抗体の製造のために使用される。例としては２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが包含される。
【０１７５】
抗体と細胞毒性剤の結合体は種々の２官能性の蛋白カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えば塩酸ジメチルアジピミデート）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド類（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトリエン２，６−ジイソシアネート）及びビス−活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作成される。例えばリシン免疫毒はＶｉｔｅｔｔａ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載の通り製造できる。１４Ｃ標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン５酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は抗体への放射性核種のコンジュゲーションのための例示されるキレート形成剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照できる。
【０１７６】
別の実施形態においては抗体は腫瘍を予備ターゲティングする場合に利用するための「受容体」（例えばストレプトアビジン）に結合体化することができ、その場合、抗体−受容体結合体を患者に投与し、その後キレート形成剤を用いて循環系から未結合の結合体を除去し、そして次に細胞毒性剤（例えば放射性核種）に結合体化した「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
【０１７７】
イムノリポソーム（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅ）
本明細書に開示した抗体は又イムノリポソームとして製剤できる。抗体を含有するリポソームは当該分野で知られた方法、例えばＥｐｓｔｅｉｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；及び米国特許４，４８５，０４５及び４，５４４，５４５に記載される通り製造される。増強された循環時間を有するリポソームは米国特許５，０１３，５５６に記載されている。
【０１７８】
とくに有用なリポソームはホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法により形成できる。リポソームを所定の後継のフィルターを通して押し出すことにより所望の直径を有するリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド交換反応を介してＭａｒｔｉｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載の通りリポソームに結合体化できる。化学療法剤（例えばドキソルビシン）を場合によりリポソーム内に含有させる。Ｇａｂｉｚｏｎ等、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照できる。
【０１７９】
抗体及びポリペプチドの医薬組成物
本明細書に記載したポリペプチド並びに上記開示したスクリーニング試験により発見される他の分子に特異的に結合する抗体は医薬組成物の形態において上記及び後記する通り種々の疾患の治療のために投与できる。
【０１８０】
リポフェクチン又はリポソームを使用することにより細胞内に本明細書のポリペプチド及び抗体又は組成物を送達できる。抗体フラグメントを使用する場合、標的蛋白の結合ドメインに特異的に結合する最も小さい抑制性のフラグメントが好ましい。例えば抗体の可変領域配列に基づいて、標的蛋白配列に結合する能力を保持しているペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは化学合成及び／又は組み換えＤＮＡ技術により製造することができる。例えばＭａｒａｓｃｏ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３（１９９３）を参照できる。
【０１８１】
本明細書に記載した製剤は治療すべき特定の適応症に対して必要に応じて活性化合物１つ以上、好ましくは相互に悪影響しない補完的活性を有する者も含有できる。或いは、又は追加的に、組成物はその機能を増強させる薬剤、例えば、細胞毒性剤、化学療法剤又は増殖抑制剤を含むことができる。そのような分子は適宜、意図される目的のために有効な量において複合化物中に存在する。
【０１８２】
活性成分は又例えばコアセルベーションの手法により、又は界面重合により製造されたマイクロカプセル、例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中、コロイド性薬剤送達系（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中、又は、マクロエマルジョン中に捕獲させることができる。そのような手法は上出のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。
【０１８３】
インビボ投与のために使用されることになる製剤は滅菌されていなければならない。これは滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０１８４】
除放性製剤を製造できる。除放性製剤の適当な例は抗体を含有する固体疎水性重合体の半透過性マトリックスを包含し、そのようなマトリックスは形状付与された物品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。除放性マトリックスの例はポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド類（米国特許３，７７３，９１９）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、非分解性エチレンビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ  ＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドよりなる注射可能なマイクロスフェア）及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を包含する。エチレンビニルアセテート及び乳酸−グリコール酸のような重合体は１００日間に渡って分子の放出を可能とするが、特定のヒドロゲルはより短い期間蛋白を放出する。カプセル化された抗体が長時間身体内に残存する場合、それらは３７℃における水分への曝露の結果として変性又は凝集する場合があり、その結果、生物学的活性の損失及び免疫原性の変化の可能性が生じる。関与する機序に応じて安定化のための合理的な方策を考案することができる。例えば、凝集機序がチオ−ジスルフィド交換を介した分子間Ｓ−Ｓ結合の形成である場合は、安定化は、スルフィドリル基を修飾すること、酸性の溶液から凍結乾燥すること、水分含有量を制御すること、適切な添加剤を使用すること、及び、特定の重合体マトリックス組成物を開発することにより達成することができる。
【０１８５】
診断上の使用及び画像化
ポリペプチドに特異的に結合する標識された抗体、及びその誘導体及び類縁体は、本発明のポリペプチドの発現、異常な発現及び／又は活性に関連する疾患及び／又は障害を検出、診断又はモニタリングするために使用できる。１つの好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は対象内への抗体の注射を行う診断試験又は画像化試験において使用できる。本発明は（ａ）本発明の抗体１つ以上を用いて個体の細胞（例えば組織）又は体液中のポリペプチドの発現を試験すること、及び（ｂ）遺伝子発現のレベルを標準的な遺伝子発現のレベルと比較することにより、標準的な発現レベルと比較した場合の試験した遺伝子発現のレベルの増大又は低下が異常発現を示すようにすること、を含むＶＥＧＦ又はアルファ５ベータ１ポリペプチドの異常な発現の検出を可能とする。
【０１８６】
本発明の抗体は当該分野で知られた古典的な免疫組織学的な方法を用いて生物学的試料中の蛋白レベルを試験するために使用できる（例えばＪａｌｋａｎｅｎ，等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）参照）。蛋白遺伝子発現を検出するために有用な他の抗体系の方法はイムノアッセイ、例えば酵素連結免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を包含する。適当な抗体試験標識は当該分野で知られており、そして酵素標識、例えばグルコースオキシダーゼ；放射性同位体、例えばヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５ｍＩｎ、１１３ｍＩｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、及びテクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ；ルミノール；及び蛍光標識、例えばフルオレセイン及びローダミン、及びビオチンを包含する。
【０１８７】
当該分野で知られた手法を本発明の標識抗体に適用してよい。そのような手法は限定しないが、２官能性の結合体形成剤の使用を包含する（例えば米国特許５，７５６，０６５；５，７１４，６３１；５，６９６，２３９；５，６５２，３６１；５，５０５，９３１；５，４８９，４２５；５，４３５，９９０；５，４２８，１３９；５，３４２，６０４；５，２７４，１１９；４，９９４，５６０；及び５，８０８，００３を参照でき；その各々の内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１８８】
動物、好ましくは哺乳類そして最も好ましくはヒトにおけるＶＥＧＦ及び／又はアルファ５ベータ１の発現又は異常な発現に関連する疾患又は障害の診断は、哺乳類におけるアルファ５ベータ１及び／又はＶＥＧＦを検出する工程を含むことができる。１つの実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニストを投与した後、診断は（ａ）標識されたアルファ５ベータ１抗体の有効量を哺乳類に投与（例えば非経腸、皮下又は腹腔内）すること、（ｂ）アルファ５ベータ１分子が発現されている対象における部位において標識された分子が優先的に濃縮されるための（そして未結合の標識された分子についてはバックグラウンドレベルまで浄化されるための）投与後の時間間隔を置くこと；（Ｃ）バックグラウンドレベルを測定すること；及び（ｄ）バックグラウンドレベルを超えた標識された分子の検出は、アルファ５ベータ１の発現又は異常な発現に関連する特定の疾患又は障害を対象が有することを示すように、対象における標識された分子を検出すること、を含む。バックグラウンドレベルは種々の方法、例えば特定の系に関して予め測定された標準値に検出標識分子量を比較することにより測定できる。
【０１８９】
１つの特定の実施形態によれば、アルファ５ベータ１ポリペプチドの発現又は過剰発現は細胞表面上に存在するアルファ５ベータ１のレベルを評価する（例えば抗アルファ５ベータ１抗体を用いた免疫組織化学試験による）ことによりＶＥＧＦアンタゴニスト治療薬の投与の後に診断又は予後の試験において測定する。或いは、又は追加的に例えばアルファ５ベータ１コード核酸又はその相補体に相当する核酸系プローブを用いた蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開されたＷＯ９８／４５４７９参照）、サザンブロッティング、ノーザンブロッテイング、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手法、例えばリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により細胞内のアルファ５ベータ１ポリペプチドコード核酸又はｍＲＮＡのレベルを測定することができる。また更に、例えば抗体系試験を用いて血清のような生物学的液体中の脱離した抗原を測定することによりアルファ５ベータ１の過剰発現を調べることができる（例えば１９９０年６月１２日発行の米国特許４，９３３，２９４；１９９１年４月１８日公開のＷＯ９１／０５２６４；１９９５年３月２８日発行の米国特許５，４０１，６３８；及びＳｉａｓ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３２：７３−８０（１９９０）参照）。上記した試験以外に種々のインビボの試験を専門家は使用できる。例えば哺乳類の身体内部の細胞を場合により検出可能な標識、例えば放射性同位体で標識した抗体に曝露させ、そして哺乳類中の細胞への抗体の結合を例えば放射能の外部からのスキャニングにより、又は抗体に予め曝露した哺乳類から得られた生検試料を分析することにより、評価できる。
【０１９０】
本明細書において引用した全ての公開物（特許及び特許出願を包含）は、特に２００６年３月２１日出願の米国暫定出願６０／７８４，７０４、２００６年３月２２日出願の米国暫定出願６０／７８５，３３０；及び２００６年１２月２２日出願の米国暫定出願６０／８７１，７４３を含めて参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０１９１】
以下のＤＮＡ配列はブダペスト条約下に以下の通りＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９，ＵＳＡに寄託されている。
【０１９２】
【化１】
2009536921.tif 000002
この寄託は特許手続き及びその下の規制の目的のための微生物の寄託の国際的認識に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の条項下に行われている。これにより寄託日から３０年間寄託物の生存培養物の維持が確保される。寄託物はブダペスト条約下にＡＴＣＣにより使用可能とされ、そしてＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．及びＡＴＣＣの間の合意に付され、これは該当する合衆国の特許の発行時、又は何れかの合衆国特許又は外国特許の出願の公開時の何れか早い時点において寄託物の培養物の子孫の永久的及び無制限の入手可能性を確保するものであり、そして、合衆国特許庁長官が米国特許法１２２及びそれに従った長官の規則（特に８６６ＯＧ６３８を参照する３７ＣＦＲ１．１４）に従って資格有りと判断された者への子孫の入手可能性を確保するものである。
【０１９３】
本出願の譲渡人は寄託されている物質の培養物が安定な条件下で培養されている状態において死滅または損失または破壊された場合、物質は告知の元に迅速に同物質の別品と置き換えられることに合意している。寄託された物質の入手可能性は何れかの当局の権威下にその特許法に従って認めた権利に違反して本発明を実施するための免許とみなしてはならない。
【０１９４】
実施例において言及する市販の試薬は特段の記載が無い限り製造元の説明書に従って使用した。以下の実施例および明細書全体に渡ってＡＴＣＣアクセッション番号により識別される細胞の入手元はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡである。特段の記載が無い限り、本発明は上記及び以下の参考文献：Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、上出；Ａｕｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）；Ｉｎｎｉｓ等、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．：Ｎ．Ｙ．，１９９０）；Ｈａｒｌｏｗ等、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８８）；Ｇａｉｔ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９８７；Ｃｏｌｉｇａｎ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９１に記載されるもののような、組み換えＤＮＡ手法の標準的な操作法を使用している。
【０１９５】
本明細書及び請求項全体を通して、「含む」という単語及びその変化形は記載された整数又は整数の群を包含することを意図するものであるが、いずれかの他の整数又は整数の群を排除するものではない。
【０１９６】
上記文書は当業者が本発明を実施できるようにするために十分なものとみなされる。以下の実施例は説明目的のみであり、如何なる態様においても本発明の範囲を制限するものではない。実際、本明細書に記載したもの以外にも本発明の種々の変形例が上記から当業者には明らかであり、そして添付請求項の範囲に属するものである。
【実施例】
【０１９７】
（実施例１）抗ＶＥＧＦ療法後のアルファ５ベータ１発現間質細胞のリクルートメント
無胸腺マウスにおいて抗ＶＥＧＦ抗体Ｂ２０−４．１単独療法で治療されていたＨＴ−２９ヒト結腸直腸癌腫異種移植片の切片を抗アルファ５ベータ１発現に関して染色した。本試験において対照抗体（抗ブタクサ抗体）で治療されていた対照群と比較して、Ｂ２０−４．１単独療法は活性が殆どないか、皆無であることに相当する終点までのメジアンの時間（ＴＴＥ）を示した。腫瘍は５８日の期間、週２回測定した。動物はその腫瘍が１０００ｍｍ３の終点体積に到達した時点、又は第５８日の何れか早い時点で安楽死させ、そして各マウスにつき（ＴＴＥ）を計算した。治療の結果は対照マウスと比較した場合の治療マウスのメジアンＴＴＥにおける増大のパーセントとして定義されるパーセント腫瘍成長遅延（％ＴＧＤ）から求め、差はＬｏｇｒａｎｋ分析を用いて０．０１≦Ｐ≦０．０５で有意とみなし、そしてＰ＜０．０１で高度に有意とみなした。対照群のメジアンＴＴＥ値は２０．６日であった。Ｂ２０−４．１単独療法による治療は無活性に相当する２０．１日のメジアンＴＴＥを示した。
【０１９８】
図１は抗アルファ５ベータ１抗体で染色された腫瘍切片を示す。増大した間質細胞リクルートメントが抗ＶＥＧＦ治療後に観察された。これらの間質細胞はインテグリンａ５ｂ１に対して陽性であった（明緑色染色）。
【０１９９】
（実施例２）抗アルファ５ベータ１抗体
マウスに精製ヒトアルファ５ベータ１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＣＣ１０２７）を注射した。抗アルファ５ベータ１抗体を発現しているプラズマ細胞腫細胞を単離し、ハイブリドーマ細胞株に形質転換した。７Ｈ５．４．２．８及び７Ｈ１２．５．１．４と命名された２つのハイブリドーマ細胞株をＡＴＣＣに寄託した。上記参照。７Ｈ５．４．２．８ハイブリドーマから生産された抗体はｍＩｇＧ２ａ  Ｋａｐｐａ抗体（本明細書においては「７Ｈ５抗体」とも称する）である。７Ｈ１２．５．１．４ハイブリドーマから生産された抗体はｍＩｇＧ２ｂ  Ｋａｐｐａ抗体（本明細書においては「７Ｈ１２抗体」とも称する）である。
【０２００】
（実施例３）ＨＵＶＥＣ直接結合試験
成長中の人臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を含有する組織培養物をＰＢＳで２回洗浄した。細胞を５ｍＭＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液３〜４ｍｌを用いて培養フラスコから脱離させた。新しい培地を細胞に添加して混合した。混合物中の細胞のアリコートを計数した。細胞を遠心分離し、洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で１回洗浄した。細胞濃度は、細胞が３８４ウェルプレート上で２５，０００個／ウェル又は４，０００個／ウェルとなるように９６穴ＭＳＤ高結合プレート（それぞれＣａｔ＃Ｌ１１ＸＢ−１又は＃Ｌ１１ＸＢ−２、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＬＬＣ）上にウェル当たり２５ｕＬで細胞が播種されるように調節した。細胞をプレート上室温で１時間インキュベートすることによりキャプチャーさせた。ウェルをブロックするために、２５ｕＬの保存緩衝液（ＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中３０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１ｍＭＣａＣｌ２／１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ｐＨ７．５）をウェルに添加し、３０〜１時間室温でインキュベートした。
【０２０１】
抗アルファ５ベータ１抗体を試験緩衝液（ＴＢＳ＋１ｍＭ  ＣａＣｌ２／１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ｐＨ７．２＋２〜４％  ＦＢＳ）中連続希釈することにより種々の抗体濃度とした。ウェルを洗浄緩衝液で２回洗浄し、次にブロッティングして乾燥した。抗体希釈物２５ｕＬをウェルに添加し、次に１時間氷上でインキュベートした。ウェルをＴＢＳで３回洗浄した。
【０２０２】
２５ｕｌの０．５ｕｇ／ｍｌ  ｘｍｕＦｃ−スルホ−タグ溶液を各ウェルに添加し、４５分〜１時間氷上でインキュベートした。ｘｍｕＦｃ−スルホ−タグはヤギ抗マウスＩｇＧ：Ｒ２３−ＡＣ−５、ＭＳＤ−ＳＡ−タグ：Ｒ３２−２１−ＡＤ−５であり、４５〜１時間氷上においた。ウェルを３回ＴＢＳで洗浄した。１５０ｕＬの２×読み取り緩衝液を各ウェルに添加した（４×ＭＳＤ読み取り緩衝液、ｄＨ２Ｏで２×に希釈、ｃａｔ＃Ｒ９２ＴＤ−１（界面活性剤非含有））。結果として生じる電気化学発光（ＥＣＬ）シグナルを光ダイオードで測定し、ＭＳＤリーダー（デフォルト６０００プロトコル）を用いて相対的光単位として定量する。図２はＨＵＶＥＣ直接結合試験の結果を示す。７Ｈ５抗体のＥＣ５０は０．２２ｎＭであった。７Ｈ１２抗体のＥＣ５０は０．３８ｎＭであった。
【０２０３】
（実施例４）抗アルファ５ベータ１抗体ＦＡＣＳ試験
７Ｈ１２又は７Ｈ５抗体を１００ｕＬにおいてＲＡＪＩ細胞（アルファ５ベータ１ｍＲＮＡを発現しない細胞株）又はＨＵＶＥＣ細胞（高レベルのアルファ５ベータ１ｍＲＮＡを発現する細胞株）と共にインキュベートした。結合細胞を蛍光結合体二次抗体を用いて検出した。図３は７Ｈ１２及び７Ｈ５がＨＵＶＥＣ細胞には結合するがＲＡＪＩ細胞には結合しないことをＦＡＣＳ分析によって示している。同様の手法をウサギ滑膜細胞（ＨＩＧ−８２）及びアカゲザル細胞（ＣＬ−１６０アカゲザル線維芽細胞又はＣＲＬ−１７８０網膜内皮細胞）と共に使用した場合、本発明者等は７Ｈ１２及び７Ｈ５がウサギ及びサルの細胞に結合することを観察した。
【０２０４】
（実施例５）抗アルファ５ベータ１抗体存在下のフィブロネクチンへの細胞接着
フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ  Ｆ１１４１（ウシ）又はＲｏｃｈｅ  １０８０９３８（ヒト））を炭酸ナトリウム緩衝液で１ｕｇ／ｍｌに希釈した。フィブロネクチン溶液１００μｌをＮＵＮＣマキシソープ９６穴プレートのウェル当たりに添加し、４℃で一晩放置して結合させた（ＮＵＮＣ９６穴平底イムノプレート、ＭａｘｉＳｏｒｐＮ／Ｓｔｅｒ  ４３９４５４（ＶＷＲ６２４０９−００２））。次にウェルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、少なくとも３０分間１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ９４１８）でブロックした。次にプレートをＰＢＳで３回洗浄した。２０，０００ＨＵＶＥＣ細胞を各ウェルに添加し、１．４ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び１．４ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する生育培地中、７Ｈ５及び７Ｈ１２の種々の濃度でインキュベートした。次にインキュベーション混合物をフィブロネクチンコーティングプレートに添加した。同じ生育培地中の約２０，０００個の細胞を、抑制性抗体を添加していない対照ウェル各々に添加した。
【０２０５】
プレートを１４０ｇで５分間遠心分離することにより、細胞の基材との接触を同期させた。細胞を種々の長さの時間（０〜１２０分）ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。インキュベーション時間の長さは細胞株ごとに変えた。次にプレートをＰＢＳ中で３回洗浄した。全液体をウェルから除去し、ウェルを−８０℃で凍結した。次にプレートを室温で解凍した。ＣｙＱｕａｎｔ緩衝液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ＣｙＱｕａｎｔ  Ｃ７０２６）をウェルに添加し、プレートを１０分間室温でインキュベートした。ＯＤ読み取り値を測定した。図４は７Ｈ５抗体のＩＣ５０が０．８５ｕｇ／ｍｌ（３．４４ｎＭ）であり、７Ｈ１２抗体のＩＣ５０が０．７ｕｇ／ｍｌ（４．３８ｎＭ）であることを示している。
【０２０６】
（実施例６）ＨＵＶＥＣ細胞を用いた増殖試験
９６穴プレートを一晩フィブロネクチン（１μｇ／ｋｇ）でコーティングした。次にプレートをＰＢＳで洗浄した。３０００〜５０００個の内皮細胞（ＥＣ）を９６穴当たり添加し、ウェルに完全に結合させた。抗アルファ５抗体を添加した（アイソタイプ対照を包含する）。各条件につき３ウェルを使用した。次に細胞を１〜２４時間抗体と共にインキュベートした。抗インテグリンアルファ５ベータ１抗体を数種の濃度において試験した（例えば０μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、１２０μｇ／ｍｌ）。
【０２０７】
次に細胞を１ｍｌ組織培養培地（ＥＧＭ２＋全補充物、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓより入手（Ｃａｔ＃ＣＣ−４１７６））中にＢｒｄＵ保存溶液２μｌ（ＰＢＳ中２５ｍｇ／ｍｌ）と共にインキュベートすることによりそれらをＢｒｄＵで標識した。このインキュベーションの後、細胞を４％ＰＦＡで固定し、１ＮのＨＣｌで２０分間処理し、ＰＢＳで数回洗浄し、次に１０％ヤギ血清（０．２％Ｔｒｉｔｏｎ添加ＰＢＳ）で１〜２時間ブロックした。次に細胞をＢｒｄＵ（ＢＤ  Ｃａｔ＃３４７５８０  １：４０）ＰＢＳ＋０．２％Ｔｒｉｔｏｎ及び５％ヤギ血清）に対するモノクローナル抗体で染色し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、Ａｌｅｘａ−５９４結合体抗ウサギ（１：８００）二次抗体と共に暗所室温で４時間インキュベートした。ウェルを再度洗浄し、ＤＡＰＩ（ＰＢＳ中１：１０，０００）と共に１０分間インキュベートした。ＰＢＳでの最後の洗浄の後、ウェル当たりの総細胞数を５ＸでＤＡＰＩ染色の写真を撮ることにより計数した。同じ視野においてＢｒｄＵに関して陽性であった細胞を赤色フィルターを用いて撮影した。視野においてＢｒｄＵに関して陽性の細胞のパーセントとして増殖を評価する。次に結果をＥｘｃｅｌを用いて分析した。図５ａは５０００の開始細胞数の後３２時間におけるＨＵＶＥＣ総細胞数を示す。図５ｂは抗体濃度２０μｇ／ｍｌ中での２４時間後におけるＨＵＶＥＣ総細胞数を示す。
【０２０８】
（実施例７）移動試験プロトコル
ＨＵＶＥＣ細胞をコンフルエントとなるまで５μｇ／ｍｌフィブロネクチンコーティング２４穴プレート上でＥＧＭ２＋全補充物（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓより入手、Ｃａｔ＃ＣＣ−４１７６）中で生育させた。次に各ウェルの中央の細胞を２μｌピペットの先端で剥離させ、剥離により除去された細胞を洗浄除去した。対照抗体、７Ｈ５又は７Ｈ１２のいずれかを含有する細胞培養培地を異なるウェルに添加した。全被験抗体は２０μｇ／ｍｌで使用した。次に細胞を１〜２日間生育させた。創傷の生じた領域をモニタリングした。図６は０時間及び３０時間におけるＥＣＭ−２中２０μｇ／ｍｌ抗アルファ５抗体（７Ｈ５）を含有する５μｇ／ｍｌフィブロネクチン上のＨＵＶＥＣ移動の写真を示す。図７は７Ｈ５及び７Ｈ１２抗体で処理した細胞に関する３０時間における％移動のグラフである。
【０２０９】
（実施例８）ＨＵＶＥＣ活性化カスパーゼ−３免疫染色アポトーシス試験
９６穴プレートを一晩フィブロネクチン（１μｇ／ｍｌ）上でコーティングした。プレートをＰＢＳで洗浄した。次に３０００〜５０００のＨＵＶＥＣ細胞を９６穴当たりにプレーティングし、完全培地中で一晩生育させた（ＥＢＭ−２培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  ＣＣ−３１５６）＋ＥＧＭ−２、ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（Ｃａｍｂｒｅｘ  ＣＣ−４１７６））。２Ｈ−１１マウスの内皮細胞をアポトーシス試験に使用する場合は、培地を１０％ＦＢＳとの５０／５０培地とする。
【０２１０】
翌日、ウェルの１セットを血清非含有培地に交換し、４〜６時間インキュベートすることにより細胞を飢餓させ、それらを非増殖状態とした。他のセットの細胞は完全培地中に維持し、活動的に増殖している細胞とした。４〜６時間後、抗体を添加した（アイソタイプ対照を包含）。一般的に、各条件につき３ウェルを使用する。次に細胞を１〜４８時間抗体と共にインキュベートした。抗インテグリンアルファ５ベータ１抗体は一般的に以下の濃度、即ち０μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ及び１２０μｇ／ｍｌで試験した。
【０２１１】
このインキュベーションの後、細胞を４％ＰＦＡで固定し、１０％ヤギ血清（ＰＢＳ＋０．２％Ｔｒｉｔｏｎ）で１〜２時間ブロックし、そして次にカスパーゼ３の活性化形態が他を特異的に認識するモノクローナル抗体で染色した（例えばＢｉｏＶｉｓｉｏｎより入手可能なウサギ抗活性カスパーゼ−３抗体、ＰＢＳ＋０．２％Ｔｒｉｔｏｎ及び５％ヤギ血清中に１：５０希釈）。抗カスパーゼ３抗体及び固定された細胞を４℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、Ａｌｅｘａ−５９４結合体抗ウサギ（１：８００）二次抗体と共に暗所室温で４時間インキュベートした。ウェルを再度洗浄し、ＤＡＰＩ（ＰＢＳ中１：１０，０００）と共に１０分間インキュベートした。ＰＢＳ中最終洗浄の後、ウェル当たりの総細胞数を５ＸでＤＡＰＩ染色の写真を撮ることにより計数した。同じ視野において活性化カスパーゼ３に関して陽性であった細胞を赤色フィルターを用いて撮影した。活性化カスパーゼ−３に関して陽性であった細胞のパーセントとしてアポトーシスを評価した。次に結果をＥｘｃｅｌを用いて分析した。図８は７Ｈ５及び７Ｈ１２がアポトーシスを活動的に誘導しないことを示す。
【０２１２】
（実施例９）ＨＵＶＥＣカスパーゼ−３／７活性比色試験
カスパーゼ３／７活性試験を７Ｈ５及び７Ｈ１２抗体を用いて実施した（Ｐｒｏｍｅｇａより入手したＡｐｏ−Ｏｎｅカスパーゼ−３／７試験、標準的な９６穴試験の説明書についてはＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．２９５参照）。
【０２１３】
一般的に、９６穴プレートを一晩フィブロネクチン（１μｇ／ｍｌ）上でコーティングした。プレートをＰＢＳで洗浄した。次に３０００〜５０００のＨＵＶＥＣ細胞を９６穴当たりにプレーティングし、完全培地中で一晩生育させた（ＥＢＭ−２培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  ＣＣ−３１５６）＋ＥＧＭ−２、ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（Ｃａｍｂｒｅｘ  ＣＣ−４１７６））。２Ｈ−１１マウスの内皮細胞をアポトーシス試験に使用する場合は、培地を１０％ＦＢＳとの５０／５０培地とする。
【０２１４】
翌日、ウェルの１セットを血清非含有培地に交換し、４〜６時間インキュベートすることにより細胞を飢餓させ、それらを非増殖状態とした。他のセットの細胞は完全培地中に維持し、活動的に増殖している細胞とした。４〜６時間後、抗体を添加した（アイソタイプ対照を包含）。一般的に、各条件につき３ウェルを使用する。次に細胞を２４〜４８時間抗体と共にインキュベートした。抗インテグリンアルファ５ベータ１抗体は一般的に以下の濃度、即ち０μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ及び１２０μｇ／ｍｌで試験した。
【０２１５】
このインキュベーションの後、Ａｐｏ−Ｏｎｅカスパーゼ−３／７試薬１００μｌを各ウェルに添加し、プレートを３０秒間３００ｒｐｍでプレート振とう機を用いて穏やかに混合した。次にプレートを１〜８時間室温でインキュベートし、そして次にプレートリーダーを用いた。励起波長４８５ｎｍ、発光波長５３０ｎｍにおいて各ウェルの蛍光を測定した。
【０２１６】
カスパーゼ３／７基質の切断から生じる蛍光シグナル（ＲＬＵ）はアポトーシスを示していた。図９は７Ｈ５及び７Ｈ１２がアポトーシスを活動的に誘導しないことを示している。
【０２１７】
（実施例１０）管形成試験
抗アルファ５ベータ１抗体が管形成を抑制する能力について試験できる。以下はＮａｋａｔｓｕ等、（２００３）Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６（２００３）１０２-１１２において記載されたＨＵＶＥＣ発芽及び管形成試験に基づいた管形成試験の例である。
【０２１８】
一般的に、ＨＵＶＥＣ細胞を、ＥＧＦ−２培地１ｍｌ中ビーズあたり４００ＨＵＶＥＣの濃度において、デキストランコーティングＣｙｔｏｄｅｘ  ３微小担体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｇｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と混合し得る。細胞を伴ったビーズを３７℃及び５％ＣＯ２において４時間、２０分毎に穏やかに振とうし得る。インキュベーションの後、細胞を伴ったビーズを２５ｃｍ２の組織培養用フラスコ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に移し、３７℃及び５％ＣＯ２において５ｍｌのＥＧＭ−２中１２〜１６時間放置し得る。翌日、細胞を伴ったビーズを１ｍｌのＥＧＭ−２で３回洗浄し、フィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）２．５ｍｇ／ｍｌ中の２００細胞コーティングビーズ／ｍｌの濃度において再懸濁し得る。５００マイクロリットルのフィブリノーゲン／ビーズ溶液を２４穴組織培養プレートの１ウェル中トロンビン（Ｓｉｇｍａ）０．６２５単位に添加し得る。フィブリノーゲン／ビーズ溶液を室温で５分間、そして次に３７℃５％ＣＯ２で２０分間凝固させ得る。１ミリリットルのＥＧＭ−２（２％ＦＢＳ含有）を各ウェルに添加し、３０分間３７℃及び５％ＣＯ２においてフィブリン凝固と平衡化させ得る。培地をウェルから除去し、１ｍｌの新しい培地と交換する。概ね、２０，０００個の皮膚線維芽細胞（Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５５１，ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を凝固部の上面にプレートし得る。培地は１日おきに交換する。ビーズ試験は７日間モニタリングする。
【０２１９】
ＨＵＶＥＣコーティングビーズはフィブリンゲル中、抗アルファ５ベータ１抗体（７Ｈ５及び７Ｈ１２）５００ｕＬの存在下又は非存在下に、ゲルの上面において２〜３日間培養し、次に多次元軸を有するＮｉｃｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ３００のステージに移し、そして３７℃及び５％ＣＯ２において７２時間維持した。使用すべき最終抗体濃度はフィブリンゲルの容量を考慮することにより、即ち、最終抗体濃度＝総抗体重量／培地容量＋フィブリンゲル容量として、計算できる。画像はＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウエアを用いて２０分毎に多数のビーズからキャプチャーできる。インビトロの管の定量はビーズの高分解能の画像を用いて行える（例えば４ｘ対物のＩＸ７０  Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡）。ビーズ当たりの発芽数は対照（未投与）と比較しながら測定し、その場合、発芽はビーズの直径に等しい長さの管として定義し得る。発芽長は任意の単位により測定し得る。
【０２２０】
（実施例１１）異種移植片／自家移植片腫瘍モデルの組み合わせ研究
アルファ５ベータ１アンタゴニスト療法及びＶＥＧＦアンタゴニスト療法の同時及び逐次的投与を異種移植片／自家移植片腫瘍モデルにいて評価することができる。好ましくは、モデルはＶＥＧＦアンタゴニスト単独療法に対しては殆ど又は全く応答しない。使用できるモデルの例は以下の通り、即ち（ａ）無胸腺ヌードマウスにおけるＦｏ５自家移植片（ｍｍｔｖ−Ｈｅｒ２トランスジェニックマウスから誘導した乳房腫瘍）（Ｆｉｎｋｌｅ，Ｄ．等、（２００４）  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：２４９９−２５１１）；（ｂ）無胸腺ヌードマウスにおけるＨＴ２９異種移植片（ヒト結腸直腸系統）；及び（ｃ）ＲＩＰ−ＴｂＡｇ（Ｔｇモデルにおける膵臓腫瘍）である。治療は典型的には腹腔内、皮下又は静脈内に投与し得る。例えば、抗ＶＥＧＦ抗体は１０ｍｇ／ｋｇにおいて週１回又は５ｍｇ／ｋｇにおいて週２回投与してよい。投与すべき抗体のようなアルファ５ベータ１アンタゴニストの量はその親和性及び活性に基づいて推定できる。１つの実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニスト及びアルファ５ベータ１アンタゴニストを同日程において５〜６週間投与できる。或いは、又は追加的に、ＶＥＧＦアンタゴニスト及びアルファ５ベータ１アンタゴニストを逐次的に投与できる（例えば抗ＶＥＧＦ抗体を３週間、その後、抗アルファ５ベータ１抗体を３週間投与）。
【０２２１】
治療の効果は特に腫瘍の進行、腫瘍の灌流、腫瘍の血管密度、形態及び／又は生存に基づいて評価できる。腫瘍の進行は例えば腫瘍体積及び／又は腫瘍重量により計測できる。ＦＩＴＣレクチン灌流、並びに血管マーカー染色を用いて新生物の進行と同時におこる血管の変化を評価できる。
【０２２２】
（実施例１２）ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳房腫瘍モデル
ＨＲＬＮ雌性ヌードマウスの側腹部に５×１０６ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳癌細胞を皮下注射した（ＨＲＬＮは株の名称）。腫瘍を平均８０〜１２０ｍｍ３となるまで生育させた。次に腫瘍担持マウスを４群に分割し、群当たりの平均腫瘍体積が〜１００ｍｍ３となった時点で治療を開始した。
【０２２３】
腫瘍体積を、試験期間中週２回計測した。腫瘍体積の計測は標準的なカリパス測定法を用いて実施した。ハムスター抗マウスインテグリンアルファ５ｍａｂ、即ち１０Ｅ７として知られるものはＧｅｎｅｎｔｅｃｈにおいて作成されている。実験の終点は腫瘍が１．５グラムになるか６０日が経過するかの何れか早い方とした。応答個体は場合により更に長期間追跡観察している。動物は終点に達した時点で安楽死させた。
【０２２４】
治療の詳細を以下に記載する。
（１）対照群：抗ブタクサ対照ｍａｂ注射（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉｐ）、週１回）
（２）抗ＶＥＧＦ単剤群：抗ＶＥＧＦ  ｍａｂ  Ｂ２０．４．１注射（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ、週１回）
（３）組み合わせ群：Ｂ２０．４１（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ、週１回）＋ハムスター抗マウスインテグリンアルファ５  ｍａｂ  １０Ｅ７（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ、週２回）
（４）抗インテグリンアルファ５単剤群：ハムスター抗マウスインテグリンアルファ５  ｍａｂ  １０Ｅ７注射（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ、週２回）
【０２２５】
【表１】
2009536921.tif 000003
【０２２６】
【表２】
2009536921.tif 000004
【０２２７】
【表３】
2009536921.tif 000005
【０２２８】
【表４】
2009536921.tif 000006
この予備的データは抗アルファ５＋抗ＶＥＧＦの組み合わせの活性の早期の兆候を示している。
【０２２９】
試験の終点の後、各群の平均腫瘍体積を計算した（図１１Ａ）。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットも作成することにより、時間の関数として試験に残存している動物のパーセントを示した（図１１Ｂ）。データは抗インテグリンα５β１抗体が乳癌モデルにおいて抗ＶＥＧＦの薬効を増強させることを示している。
【０２３０】
（実施例１３）ウサギ耳創傷治癒モデルにおける７Ｈ１２及びベバシツマブ
ニュージーランド白ウサギを計量し、イソフルオランで麻酔した。各ウサギにおいて、両方の耳介の内面から、そして辺縁に沿って剃毛した。脱毛ローションを用いて全ての残存する体毛を外科処置部位から除去した。外科処置部位はベタジンスクラブで浄化し、その後アルコールですすいだ。無菌的手法を用いて、環状８ｍｍパンチ生検器具を用いて各耳介の耳軟骨の深さまで１つの創傷を作成した。根底にある軟骨膜を骨膜起子（ｐｅｒｉｏｓｔｅａｌ  ｅｌｅｖａｔｏｒ）及び精密鋏を用いて除去した。Ｏｐｓｉｔｅ（登録商標）接着包帯を各創傷上に設置し、ウサギを麻酔から回復させた。
【０２３１】
Ｏｐｓｉｔｅ（登録商標）包帯は毎日除去し、創傷を観察し、局所治療を行い、そして新しい包帯を適用した。創傷幅は第０（外科処置直後）、７、１０、１４及び１８日に創傷の直径を計測することにより計算した。
投与群は以下の通りである。
ベバシツマブ（抗ＶＥＧＦ抗体）１００ｕｇ／３０ｕＬを各創傷に毎日（ｎ＝４）
７Ｈ１２（抗アルファ５ベータ１抗体）１００ｕｇ／３０ｕＬを各創傷に毎日（ｎ＝４）
ベバシツマブを１００ｕｇ／１５ｕＬ＋７Ｈ１２を１００ｕｇ／１５ｕＬ、各創傷に毎日（ｎ＝４）
トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２抗体）１００ｕｇ／３０ｕＬを各創傷に毎日（ｎ＝３）。
【０２３２】
データはこの血管新生モデルｖｓ単剤単独において、抗ＶＥＧＦ及び抗アルファ５ベータ１のコンビナトリアル療法が明確な作用を有することを示している（図１０）。
【０２３３】
（実施例１４）結腸癌における抗アルファ５ベータ１及び抗ＶＥＧＦ複合療法
ＨＲＬＮ雌性ｎｕ／ｎｕマウスの側腹部に１ｍｍ３のＨＴ２９腫瘍フラグメント（結腸腫瘍）を皮下注射した。腫瘍は治療薬投与前に８０〜１２０ｍｍ３の平均の大きさに到達するまで生育させた。次に腫瘍担持マウスを４群に分割した。
【０２３４】
【表５】
2009536921.tif 000007
腫瘍体積測定は週２回、標準的なカリパス測定法を用いて実施した。ハムスター抗マウスインテグリンアルファ５  ｍａｂ、即ち１０Ｅ７として知られるものはＧｅｎｅｎｔｅｃｈにおいて作成されている。対照ＩｇＧは抗ブタクサモノクローナル抗体とした。体重は２日間にわたり５回、その後は週あたり２回（ｂｉｗｋ）試験終了時まで計測した。実験の終点は腫瘍が１グラムになるか９０日が経過するかの何れか早い方とした。一部の応答個体は更に長期間追跡観察している。動物は終点に達した時点で安楽死させた。投薬容量は１０ｍＬ／ｋｇ（ｏ．２００ｍｌ／２０ｇマウス）とし、この容量は体重に対して調節した。完全な後退（ＣＲ）を示した動物については腫瘍移植部位の組織を終点において採取し、ホルマリン、その後７０％ＥｔＯＨ中に保存し、後の試験に付した。凍結すべき全試料はクリオモールド中に入れ、ホイルで包装し、液体窒素中に急速凍結した。
【０２３５】
試験の終点の後、各群に関する平均腫瘍体積を計算した（図１２Ａ）。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットも作成することにより、時間の関数として試験に残存している動物のパーセントを示した（図１２Ｂ）。データは抗インテグリンα５β１抗体が結腸癌モデルにおいて抗ＶＥＧＦの薬効を増強させることを示している。
【０２３６】
（実施例１５）結腸癌における抗アルファ５ベータ１＋化学療法
ＨＲＬＮ雌性ｎｕ／ｎｕマウスの側腹部に５×１０６ＨＴＣ１１６腫瘍細胞（結腸腫瘍細胞）を皮下注射した。腫瘍は治療薬投与前に８０〜１２０ｍｍ３の平均の大きさに到達するまで生育させた。次に腫瘍担持マウスを４群に分割した。
【０２３７】
【表６】
2009536921.tif 000008
腫瘍体積測定は週２回、標準的なカリパス測定法を用いて実施した。ハムスター抗マウスインテグリンアルファ５  ｍａｂ、即ち１０Ｅ７として知られるものはＧｅｎｅｎｔｅｃｈにおいて作成されている。体重は２日間にわたり５回、その後は週あたり２回（ｂｉｗｋ）試験終了時まで計測した。実験の終点は腫瘍が１．５グラムになるか６０日が経過するかの何れか早い方とした。一部の応答個体は更に長期間追跡観察している。動物は終点に達した時点で安楽死させた。投薬容量は１０ｍＬ／ｋｇ（ｏ．２００ｍｌ／２０ｇマウス）とし、この容量は体重に対して調節した。１０Ｅ７はイリノテカン投与の前３０分に投与した。完全な後退（ＣＲ）を示した動物については腫瘍移植部位の組織を終点において採取し、ホルマリン、その後７０％ＥｔＯＨ中に保存し、後の試験に付した。凍結すべき全試料はクリオモールド中に入れ、ホイルで包装し、液体窒素中に急速凍結した。
【０２３８】
試験の終点の後、各群に関する平均腫瘍体積を計算した（図１３Ａ）。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットも作成することにより、時間の関数として試験に残存している動物のパーセントを示した（図１３Ｂ）。データは抗インテグリンアルファ５ベータ１抗体は結腸癌モデルにおいて化学療法剤（イリノテカン）の薬効活性を増強しないが、化学療法剤の活性を妨害することもないことを示している。この観察結果は血管損傷は抗アルファ５ベータ１療法が一般的に抗血管新生、そして特に腫瘍学的セッティングにおける抗血管新生において有意に有用となり得る前に生じるはずであるという本発明者等の考えと合致している。そのような血管の損傷はＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）抗体のようなＶＥＧＦアンタゴニストにより誘発されえる。それ自体では、本モデルにおける化学療法剤は有意な血管損傷を誘発しなかった。ＶＥＧＦアンタゴニストが存在することにより血管の損傷を誘発するように、これらの薬剤の全て（ＶＥＧＦアンタゴニスト／アルファ５ベータ１アンタゴニスト／化学療法剤）の同時又は逐次的使用が想定できる。
【０２３９】
（実施例１６）アルファ５ベータ１スカッチャードプロット
抗アルファ５ベータ１抗体を、Ｉｏｄｏｇｅｎ法を用いてヨウ素化し、放射標識した抗体を遊離の１２５Ｉ−ＮａからＰＤ−１０カラムを用いたゲル濾過により精製した。Ｒ９ａｂ細胞、即ちウサギ線維芽細胞株（ＡＴＣＣより購入、ＣＣＬ−１９３）を２４穴プレート中ウェル当たり〜５０，０００で播種し、４８時間５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。細胞を結合緩衝液（５０：５０ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、２％ＦＢＳ及び５０ｍＭＨＥＰＥＳ含有、ｐＨ７．２）で３回洗浄し、次に１５分間氷上でインキュベートした。洗浄した細胞を４時間氷上において、３連で試験する１３濃度について結合緩衝液中０．５ｕＭから連続希釈した未標識抗アルファ５ベータ１モノクローナル抗体の漸減濃度を含有する１２５Ｉ−抗アルファ５ベータ１モノクローナル抗体約５０ｐＭでインキュベートした。細胞を結合緩衝液で３回洗浄し、次に２００ｕＬのＳＤＳ溶解緩衝液（１％ＳＤＳ、８Ｍ尿素、１００ｍＭグリシン、ｐＨ  ３．０）で可溶化した。細胞をＷａｌｌａｃ  Ｗｉｚａｒｄ  １４７０ガンマカウンターで計数した。結合データは、抗体の結合親和性及び結合部位の濃度を測定するためにＭｕｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｏｂａｒｄ（Ｍｕｎｓｏｎ，Ｐ．ａｎｄ  Ｒｏｂａｒｄ，Ｄ．（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０−２３９）の曲線フィッティングアルゴリズムを使用しているＧｅｎｅｎｔｅｃｈのプログラムＮｅｗＬｉｇａｎｄを用いて評価した。図１４及び１５はこれらの結合試験においてそれぞれ、７Ｈ５抗体が０．１０ｎＭのＫｄを有し、そして７Ｈ１２抗体が０．３０ｎＭのＫｄを有することを示している。
【０２４０】
（実施例１７）抗インテグリンアルファ５ベータ１ＩｇＧエピトープマッピング／競合結合試験
抗インテグリンα５β１ＩｇＧの３倍連続希釈物を室温で１〜２時間、ＰＢＳＴ緩衝液（ＰＢＳ及び０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）中、ヒトインテグリンα５β１抗原（１ｕｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）でコーティングした９６穴Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートと共にまずインキュベートし、その後、０．３ｎＭビオチン化ｈ７Ｈ５．ｖ１  ｈＩｇＧ１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の作成した７Ｈ５の抗体変異体）を添加し、これをまず１５分間最大未満の結合シグナル（５０〜７０％）により測定した。次にプレートをＰＢＴ緩衝液（ＰＢＳ及び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄した。結合したビオチン化ｈ７Ｈ５．ｖ１  ｈＩｇＧ１をＰＢＳＴ緩衝液中１：２５００希釈したストレプトアビジンセイヨウワサビパーオキシダーゼ結合体（Ｐｉｅｒｃｅ）で検出し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）基質で約５分間発色させ、１．０ＭのＨ３ＰＯ４でクエンチングし、そして４５０ｎｍにおいて分光光度的に読み取った。曲線を４パラメーター非線形回帰曲線フィッティングプログラム（Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ，Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）によりフィットさせた。
【０２４１】
図１６は結合ｈ７Ｈ５．ｖｌが漸増量のコールドｍ７Ｈ５に競合されたことを示している。実際、ｍ７Ｈ５競合曲線はｈ７Ｈ５．ｖｌ競合曲線とほぼ同一であった（データ示さず）。コールドｍ７Ｈ１２も又アルファ５ベータ１への結合についてビオチンｈ７Ｈ５．ｖｌと競合し、アルファ５ベータ１上のｈ７Ｈ５．ｖｌとｍ７Ｈ１２の結合エピトープが重複していることを示していた。一方、対照抗体は結合ｈ７Ｈ５．ｖｌと競合しなかった。
【図面の簡単な説明】
【０２４２】
【図１】図１は抗ＶＥＧＦ抗体Ｂ２０−４．１を用いたＨＴ２９異種移植片腫瘍の治療の後のアルファ５ベータ１発現間質細胞のリクルートメントの増大を示す。
【図２】図２は直接結合試験においてＨＵＶＥＣ細胞に結合している７Ｈ５及び７Ｈ１２抗体を示すグラフである。
【図３】図３はＦＡＣＳ分析によるＨＵＶＥＣには結合するがＲＡＪＩ細胞には結合しない７Ｈ５及び７Ｈ１２抗体を示す。
【図４】図４は精製された７Ｈ５及び７Ｈ１２モノクローナル抗体の存在下におけるフィブロネクチンへのＨＵＶＥＣ接着を示すグラフである。
【図５】図５は（Ａ）総細胞数によるＨＵＶＥＣ細胞増殖に対する７Ｈ５及び７Ｈ１２の作用を示すグラフであり、そして（Ｂ）別の試験におけるアラマーブルー染色によるＨＵＶＥＣ細胞増殖に対する７Ｈ５及び７Ｈ１２の作用を示す棒グラフである。
【図６】図６は陰性対照（ＩｇＧ）と比較した場合の０時間及び３０時間における７Ｈ５による治療の後のＨＵＶＥＣ細胞移動の写真である。
【図７】図７は７Ｈ５及び７Ｈ１２による治療の後のＨＵＶＥＣ細胞移動を定量的に示す棒グラフである。
【図８】図８は７Ｈ５及び７Ｈ１２による治療の後のアポトーシス試験における活性化カスパーゼ−３を発現するＨＵＶＥＣ細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。
【図９】図９は７Ｈ５及び７Ｈ１２による治療の後のＨＵＶＥＣカスパーゼ３／７の活性を示す棒グラフである。
【図１０】図１０はウサギ耳介創傷治癒モデルにおける７Ｈ１２及び／又はベバシツマブ活性を示すグラフである。
【図１１】（Ａ）投与マウスの群メジアン腫瘍体積を示すグラフ、又は（Ｂ）時間の関数としての試験における残存動物のパーセントを示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットとして、乳癌モデルにおける抗ＶＥＧＦ抗体＋／−抗アルファ５ベータ１抗体で治療したマウスの結果を示す。動物はその腫瘍が１５００ｍｍ３に到達または超過した時点で試験から除外した。
【図１２】（Ａ）投与マウスの群メジアン腫瘍体積を示すグラフ、又は（Ｂ）時間の関数としての試験における残存動物のパーセントを示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットとして、結腸癌モデルにおける抗ＶＥＧＦ抗体＋／−抗アルファ５ベータ１抗体で治療したマウスの結果を示す。動物はその腫瘍が１５００ｍｍ３に到達または超過した時点で試験から除外した。
【図１３】（Ａ）投与マウスの群メジアン腫瘍体積を示すグラフ、又は（Ｂ）時間の関数としての試験における残存動物のパーセントを示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットとして、結腸癌モデルにおける抗アルファ５ベータ１抗体又は化学療法剤で治療したマウスの結果を示す。動物はその腫瘍が１５００ｍｍ３に到達または超過した時点で試験から除外した。
【図１４】図１４はウサギ線維芽細胞の細胞株であるＲ９ａｂ上のアルファ５ベータ１への１２５Ｉ−７Ｈ５の結合のスカッチャードプロットを示す。
【図１５】図１５はウサギ線維芽細胞の細胞株であるＲ９ａｂ上のアルファ５ベータ１への１２５Ｉ−７Ｈ１２の結合のスカッチャードプロットを示す。
【図１６】図１６は種々の抗アルファ５ベータ１抗体を用いた抗インテグリンアルファ５ベータ１ＩｇＧエピトープマッピング／競合的結合試験の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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