(57)【要約】  例えば、構造式：【化１】2009526076.tif 000047で表される、４アーム−ポリエチレングリコール−７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン複合体を開示する。この複合体の製造方法及びそれを用いた哺乳動物の治療方法についても開示する。
2009526076.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式（Ｉ）：
【化１】
2009526076.tif 000027
で表される化合物であって、
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、独立して、ＯＨまたは（Ｌ）m−Ｄであり、
Ｌは、二官能性のリンカーであり、
Ｄは、カンプトセシンまたはカンプトセシン類似体の残基であり、
ｍは、０または正の整数であり、
ｎは、正の整数であり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4のすべてがＯＨではないことを条件とする、
化合物。
【請求項２】
Ｄが、構造式（ＩＩ）：
【化２】
2009526076.tif 000028
の化合物の残基であることを特徴とする請求項１記載の化合物であって、
ここで、
Ｒ7は、ＮＯ2、ＮＨ2、Ｎ3、水素、ハロゲン、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＯＯＨ、ＯＨ、Ｏ−Ｃ1-8アルキル、ＳＨ、Ｓ−Ｃ1-3アルキル、ＣＮ、ＣＨ2ＮＨ2、ＮＨ−Ｃ1-3アルキル、ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ1-3アルキル、Ｎ（Ｃ1-3アルキル）2、ＣＨ2Ｎ（Ｃ1-3アルキル）、Ｏ−、ＮＨ−及びＳ−ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ）2、Ｏ−、ＮＨ−及びＳ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ）2、Ｏ−、ＮＨ−及びＳ−ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ）2、Ｏ−、ＮＨ−及びＳ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ2）2、Ｏ−、ＮＨ−及びＳ−ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（Ｃ1-3アルキル）2、Ｏ−、ＮＨ−及びＳ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（Ｃ1-3アルキル）2、ＣＨＯ及びＣ1-3アルキルからなる群より選択され、
Ｒ8は、Ｈ、Ｃ1-8アルキル及びＣＨ2ＮＲ9Ｒ10からなる群より選択され、
ここで、
Ｒ9は、Ｈ、Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-7シクロアルキル、Ｃ3-7シクロアルキル−Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、ヒドロキシ−Ｃ1-6アルキル、及びＣ1-6アルコキシ−Ｃ1-6アルキルからなる群より選択され、
Ｒ10は、Ｈ、Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-7シクロアルキル、Ｃ3-7シクロアルキル−Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、ヒドロキシ−Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ−Ｃ1-6アルキル、及びＣＯＲ11 からなる群より選択され、
ここで、
Ｒ11 は、水素、Ｃ1-6アルキル、ペルハロ−Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-7シクロアルキル、Ｃ3-7シクロアルキル−Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、ヒドロキシ−Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、及びＣ1-6アルコキシ−Ｃ1-6アルキルからなる群より選択されるか、あるいは、
Ｒ9、Ｒ10、及びＢ環の窒素が、Ｏ、ＳまたはＮＲ12を含む、飽和３〜７員の複素環を形成し、
ここで、
Ｒ12は、水素、Ｃ1-6アルキル、ペルハロ−Ｃ1-6アルキル、アリール、ならびにＣ1-6アルキル、ハロゲン、ニトロ、アミノ、Ｃ1-6アルキルアミノ、ペルハロ−Ｃ1-6アルキル、ヒドロキシ−Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルコキシ−Ｃ1-6アルキル及びＣＯＲ13からなる群より選択される１つ以上の基で置換されたアリール、からなる群より選択され、ここでＲ13は、水素、Ｃ1-6アルキル、ペルハロ−Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、アリール、ならびに、Ｃ1-6アルキル、ペルハロ−Ｃ1-6アルキル、ヒドロキシ−Ｃ1-6アルキル、及びＣ1-6アルコキシ−Ｃ1-6アルキルのうちの１つ以上の基で置換されたアリール、からなる群より選択され、
Ｒ110−Ｒ111は、それぞれ独立して、水素；ハロ、アシル、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アジド、アミド、ヒドラジン、アミノ、置換アミノ、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルカルボニルアミノ、カルバモイルオキシ、アリールスルホニルオキシ、アルキルスルホニルオキシ、−Ｃ（Ｒ117）＝Ｎ−（Ｏ）j−Ｒ118 、ここで、Ｒ117は、Ｈ、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、またはアリールであり、ｊは０または１であり、Ｒ118は、Ｈ、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、または複素環である、Ｒ119Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ここで、 Ｒ119は、ハロゲン、アミノ、置換アミノ、複素環、置換複素環、及びＲ120−Ｏ−（ＣＨ2）k−、ここで、ｋは１〜１０の整数であり、Ｒ120は、アルキル、フェニル、置換フェニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、複素環、または置換複素環である、からなる群より選択されるか、または 
Ｒ7がＲ110と一緒に、またはＲ110がＲ111と一緒に、置換または非置換のメチレンジオキシ、エチレンジオキシ、またはエチレンオキシを形成し、
Ｒ112はＨまたはＯＲ'であり、ここで、Ｒ'は、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、ハロアルキル、またはヒドロキシアルキルである。
【請求項３】
前記カンプトセシン類似体の残基が、
【化３】
2009526076.tif 000029
であることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ｌが、アミノ酸またはアミノ酸誘導体の残基であって、
前記アミノ酸誘導体が、 ２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、ピペリジン酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−アミノ酪酸、デスモシン、２，２−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロイソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、サルコシン、Ｎ−メチルイソロイシン、６−Ｎ−メチルリジン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン及びオルニチンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項５】
Ｌが、グリシン、アラニン、メチオニンまたはサルコシン残基であることを特徴とする請求項４記載の化合物。
【請求項６】
Ｌがグリシン残基であることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項７】
Ｌが、下記の群：
−［Ｃ（Ｏ）］vＮＲ21（ＣＲ22Ｒ23Ｏ）t−、
−［Ｃ（Ｏ）］vＮＲ21（ＣＲ22Ｒ23Ｏ）t（ＣＲ24Ｒ25）yＯ−、
−［Ｃ（Ｏ）］vＮＲ21（ＣＲ22Ｒ23Ｏ）t（ＣＲ24Ｒ25）y−、
−［Ｃ（Ｏ）］vＮＲ21（ＣＲ22Ｒ23）tＯ−、
−［Ｃ（Ｏ）］vＮＲ21（ＣＲ22Ｒ23）t（ＣＲ24ＣＲ25Ｏ）yＮＲ26−、
−［Ｃ（Ｏ）］vＯ（ＣＲ22Ｒ23）tＮＲ26−、
−［Ｃ（Ｏ）］vＯ（ＣＲ22Ｒ23）tＯ−、
−［Ｃ（Ｏ）］vＮＲ21（ＣＲ22Ｒ23）tＮＲ26−、
−［Ｃ（Ｏ）］vＮＲ21（ＣＲ22Ｒ23）t（ＣＲ24ＣＲ25Ｏ）y−、
−［Ｃ（Ｏ）］vＮＲ21（ＣＲ22Ｒ23Ｏ）t（ＣＲ24ＣＲ25）yＮＲ26−、
【化４】
2009526076.tif 000030
から選択されることを特徴とする請求項１記載の化合物であって、
ここで、
Ｒ21−Ｒ26 は、独立して、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、Ｃ3-19 分岐鎖アルキル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-6置換アルキル、Ｃ2-6置換アルケニル、Ｃ2-6置換アルキニル、Ｃ3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ1-6へテロアルキル、置換Ｃ1-6へテロアルキル、Ｃ1-6アルコキシ、フェノキシ、及びＣ1-6へテロアルコキシからなる群より選択され、
Ｒ27は、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、Ｃ3-19分岐鎖アルキル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-6置換アルキル、Ｃ2-6置換アルケニル、Ｃ2-6置換アルキニル、Ｃ3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ1-6へテロアルキル、置換Ｃ1-6へテロアルキル、Ｃ1-6アルコキシ、フェノキシ、Ｃ1-6へテロアルコキシ、ＮＯ2、ハロアルキル、及びハロゲンからなる群より選択され、
ｔ及びｙは、独立して、約１〜約４の正の整数から選択され、
ｖは０または１である。
【請求項８】
ｍが、約１〜約１０であることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項９】
ｍが、約１であることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項１０】
ｎが、約２８〜約３４１であることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項１１】
ｎが、約１１４〜約２２７であることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項１２】
ｎが、約２２７であることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項１３】
少なくとも約３．９の（Ｌ）m−Ｄの結合数を有することを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項１４】
下記の化合物：
【化５】
2009526076.tif 000031
【化６】
2009526076.tif 000032
【化７】
2009526076.tif 000033
【化８】
2009526076.tif 000034
【化９】
2009526076.tif 000035
【化１０】
2009526076.tif 000036
【化１１】
2009526076.tif 000037
【化１２】
2009526076.tif 000038
からなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項１５】
構造式：
【化１３】
2009526076.tif 000039
を有することを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項１６】
請求項１記載の化合物を有効量で、それを必要とする患者に投与することを含む、哺乳動物を治療する方法。
【請求項１７】
Ｄが、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン残基であることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
請求項１記載の化合物を有効量で、それを必要とする患者に投与することを含む、充実性腫瘍、リンパ腫、肺癌、小細胞肺癌、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、膠芽腫、卵巣癌、胃癌からなる群より選択される転移性の疾患を治療する方法。
【請求項１９】
前記転移性の疾患が乳癌であり、請求項１記載の化合物が
【化１４】
2009526076.tif 000040
であることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物が、約５〜約２０ｍｇ／ｋｇ／用量で投与されることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記転移性の疾患が、結腸直腸癌であり、請求項１記載の化合物が、
【化１５】
2009526076.tif 000041
であることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
前記化合物が、約１０〜約３０ｍｇ／ｋｇ／用量で投与されることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記転移性の疾患が膵臓癌であり、請求項１記載の化合物が、
【化１６】
2009526076.tif 000042
であることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物が、約１０〜約３０ｍｇ／ｋｇ／用量で投与されることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
マルチアーム高分子プロドラッグの調製方法であって、
（ａ）利用可能な２０−ヒドロキシル基を有する、１当量のカンプトセシンまたはカンプトセシン類似体と、利用可能なカルボン酸基を有する、１当量以上の二官能性リンカーとを提供し、
（ｂ）利用可能なアミン基を有する、カンプトセシン−二官能性リンカー中間体を形成するのに効果的な条件下で、前記２つの反応物質を反応させ、
（ｃ）活性部位当たり１当量以上の、結果として得られた前記中間体と、１当量の構造式（Ｉ）：
【化１７】
2009526076.tif 000043
で表される活性化ポリマーとを、
下記構造式を有するマルチアーム高分子プロドラッグを形成するのに効果的な条件下で反応させる、各工程を有してなる方法であって、
【化１８】
2009526076.tif 000044
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、独立してＯＨまたは（Ｌ）m−Ｄであり、
Ｌは、二官能性のリンカーであり、
Ｄは、カンプトセシンまたはカンプトセシン類似体であり、
ｍは、０または正の整数であり、
ｎは、正の整数であり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4のすべてがＯＨではないことを条件とする、
方法。
【請求項２６】
マルチアーム高分子プロドラッグの調製方法であって、
（ａ）利用可能な２０−ヒドロキシル基を有する、１当量のカンプトセシンまたはカンプトセシン類似体を、
利用可能なカルボン酸基を有する、１当量以上の二官能性リンカーと、
利用可能なアミン基を有するカンプトセシン−二官能性リンカー中間体を形成するのに効果的な条件下で反応させ、
（ｂ）活性部位当たり１当量以上の、工程（ａ）から得られた前記中間体を、
１当量の構造式（Ｉ）：
【化１９】
2009526076.tif 000045
で表される活性化ポリマーと、
下記構造式を有するマルチアーム高分子プロドラッグを形成するのに効果的な条件下で反応させる、各工程を有してなり、
【化２０】
2009526076.tif 000046
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、独立してＯＨまたは（Ｌ）m−Ｄであり、
Ｌは、二官能性のリンカーであり、
Ｄは、カンプトセシンまたはカンプトセシン類似体であり、
ｍは、０または正の整数であり、
ｎは、正の整数であり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4のすべてがＯＨではないことを条件とする、
方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本願は、参照することにより各内容が本願に援用される、２００６年２月９日出願の米国仮特許出願第６０／７７２，４６４号、２００６年６月９日の出願の同第６０／８０４，３９１号、２００６年９月１５日出願の同第６０／８４４，９３８号、２００６年１１月６日の出願の同第６０／８６４，５１６号の各号の優先権の利益を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンのマルチアーム高分子プロドラッグに関する。具体的には、本発明は、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンの４−アームポリエチレングリコール複合体及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
長年にわたり、生物学的に有効な物質を哺乳動物に投与する方法が、いくつか提案されている。所望の薬剤が液体に不溶性の場合、問題が生じる。アルカロイドは、特に、可溶化が困難であることが多い。
【０００４】
カンプトセシンは、中国に自生しているカンレンボク(Camptotheca accuminata)の樹木、及びインドに自生しているクサミズキ（Nothapodytes foetida）の樹木から産生される、水不溶性の細胞毒性アルカロイドである。カンプトセシン及び関連する類似体は、抗がん剤として有望であることが知られており、インビトロ及びインビボでの治療活性が実証されている。
【０００５】
カンプトセシン及び類似体は、ＤＮＡトポイソメラーゼＩ阻害剤として知られている。例えば、カンプトセシン類似体の１つに、ＤＮＡトポイソメラーゼＩ阻害剤としても知られ、かつ、抗癌活性も示す、イリノテカン（ＣＰＴ−１１、カンプトサー（Camptosar（登録商標））がある。７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンは、ＣＰＴ−１１の活性代謝産物である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の問題を克服し、ＰＥＧ化を通じて薬物送達の技術を向上させることを目的とした、マルチアーム化ＰＥＧを直接使用して適切なリンカーを通じて薬物分子に共役させる、新規の方法を提供する。この方法では、ＰＥＧに、面倒な分岐鎖部分を取り入れる必要がない。さらには、薬物分子は互いに、比較的離れている。したがって、ＰＥＧに対する共役効率は著しく向上する。ＰＥＧ複合体の溶解性もまた、末端を分岐させた手法よりも改善される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の１つの態様では、構造式（Ｉ）の化合物が提供される：
【化１】
2009526076.tif 000003
【０００８】
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3 及びＲ4 は、独立して、ＯＨまたは（Ｌ）m−Ｄであり、
Ｌは、２官能性のリンカーであり、
Ｄは、例えば、
【化２】
2009526076.tif 000004
【０００９】
で表される、カンプトセシンまたはカンプトセシン類似体の残基であり、
ｍは０または正の整数であり、
ｎは正の整数であり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3 及びＲ4 は、すべてがＯＨではないことを条件とする。
【００１０】
本発明のこの態様では、カンプトセシンまたはカンプトセシン類似体は、２０−ＯＨ基自体が４−アームポリマーと複合体を形成するように、ポリマーと反応する。
【００１１】
本発明の１つの好ましい態様では、Ｌはアミノ酸残基である。本発明のある好ましい態様では、ｎは約２８〜約３４１であり、約２２７であることが好ましい。
【００１２】
複合体の製造方法、ならびに、本発明の化合物を使用する治療法についても、提供する。
【００１３】
以下の説明及び図面から、利点が明らかになるであろう。
【００１４】
本発明において、「残基」という用語は、当然ながら、化合物の一部を意味するものと理解されたい。その言葉の指すものとは、すなわち、別の化合物と置換反応させた後も残存する、カンプトセシン類似体である７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンやアミノ酸などである。
【００１５】
本発明において、「ポリマー含有残基」または「ＰＥＧ残基」という用語は、当然ながら、それぞれ、カンプトセシンまたはカンプトセシン類似体含有化合物と反応させた後も残存する、ポリマーまたはＰＥＧの一部を意味するものと理解されたい。
【００１６】
本発明において、当然ながら、「アルキル」という用語には、直鎖、分岐鎖、置換が含まれるものとして理解されたい。この場合の置換は、例えばハロ、アルコキシ、ニトロ、Ｃ1-12などであるが、Ｃ1-4アルキル、Ｃ3-8シクロアルキル、または置換シクロアルキルなどが好ましい。
【００１７】
本発明において、当然ながら、「置換（された）」という用語には、官能基または化合物中に含まれる１以上の原子に１以上の異なる原子を加えるか、１以上の原子を１以上の異なる原子と置き換えること、が含まれるものと理解されたい。
【００１８】
本発明において、置換アルキルとしては、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、ヒドロキシアルキル及びメルカプトアルキルが挙げられ、置換アルケニルとしては、カルボキシアルケニル、アミノアルケニル、ジアルケニルアミノ、ヒドロキシアルケニル及びメルカプトアルケニルが挙げられ、置換アルキニルとしては、カルボキシアルキニル、アミノアルキニル、ジアルキニルアミノ、ヒドロキシアルキニル及びメルカプトアルキニルが挙げられ、置換シクロアルキルとしては、４−クロロシクロヘキシルなどの部分が挙げられ、アリールとしては、ナフチルなどの部分が挙げられ、置換アリールとしては、３−ブロモフェニルなどの部分が挙げられ、アラルキルとしてはトリルなどの部分が挙げられ、ヘテロアルキルとしてはエチルチオフェンなどの部分が挙げられ、置換へテロアルキルとしては３−メトキシ−チオフェンなどの部分が挙げられ、アルコキシとしてはメトキシなどの部分が挙げられ、フェノキシとしては、３−ニトロフェノキシなどの部分が挙げられる。当然ながら、ハロにはフルオロ、クロロ、ヨード及びブロモが含まれるものと理解されたい。
【００１９】
本発明において、「有効量」及び「十分な量」という用語は、当然ながら、所望の効果または治療効果を実現する量を意味し、このような効果は当業者には明らかであろう。
【００２０】
本発明の１つの実施の形態では、構造式（Ｉ）：
【化３】
2009526076.tif 000005
【００２１】
の化合物が提供され、
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3 及びＲ4 は、独立して ＯＨまたは（Ｌ）m−Ｄであり、
Ｌは二官能性のリンカーであり、
Ｄは、例えば、
【化４】
2009526076.tif 000006
【００２２】
で表される、カンプトセシンまたはカンプトセシン類似体残基であり、
ｍは０または正の整数であり、約１〜約１０が好ましく、１がさらに好ましく、
ｎは正の整数であり、約２８〜約３４１が好ましく、約２２７がさらに好ましく、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3 及びＲ4 のすべてがＯＨではないことを条件とする。
【００２３】
Ａ．カンプトセシン及び関連するカンプトセシン類似体
カンプトセシンは、中国に自生しているカンレンボクの樹木、及びインドに自生しているクサミズキの樹木から産生される、水不溶性の細胞毒性アルカロイドである。カンプトセシンならびに関連する化合物及び類似体はまた、抗がん剤または抗腫瘍剤として有望であることが知られており、実験動物でのインビトロ及びインビボにおいて、これらの活性を発現することが示されている。
【００２４】
カンプトセシン及び特定の関連類似体は下記の構造：
【化５】
2009526076.tif 000007
【００２５】
を共有している。
【００２６】
このコア構造から、いくつかの既知の類似体が調製されている。例えば、Ａ環の１０位及び１１位のいずれかまたは両方がＯＨで置換されうる。Ａ環は、随意的に、ヘテロ原子、すなわち−Ｏまたは−Ｎによって環に連結された、直鎖または分岐鎖のＣ1-30アルキルまたはＣ1-17アルコキシで置換することができる。Ｂ環の７位を、直鎖または分岐鎖Ｃ1-30アルキル（Ｃ2アルキルが好ましい）、Ｃ5-8シクロアルキル、Ｃ1-30アルコキシ、フェニルアルキルなど、アルキルカーバメート、アルキルカルバジド、フェニルヒドラジン誘導体などで置換することができる。Ｃ、Ｄ及びＥ環における他の置換も可能である。例えば、参照することによりその内容を本願に援用する、米国特許第５，００４，７５８号、同第４，９４３，５７９号、米国再発行特許第３２，５１８号の各明細書を参照のこと。熟練した技術者が認識するように、１０−ヒドロキシカンプトセシン、１１−ヒドロキシカンプトセシン、及び１０，１１−ジヒドロキシカンプトセシン類似体は、カンレンボク及びその近縁種において、微量成分の１種として天然に存在する。これらの化合物に対するさらなる置換、すなわち、７−アルキル−、７−置換アルキル−、７−アミノ−、７−アミノアルキル−、７−アラルキル−、９−アルキル−、９−アラルキル−カンプトセシンなどの誘導体を、不必要な実験をすることなく、既知の合成手法を用いて作ることができる。一部のカンレンボクのアルカロイド(camptotheca alkaloids)は、以下に示す構造：
【化６】
2009526076.tif 000008
【００２７】
を有する。
【００２８】
上記構造において、Ｒ7は、ＮＯ2、ＮＨ2、Ｎ3、水素、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、ＣＯＯＨ、ＯＨ、Ｏ−Ｃ1-8アルキル、ＳＨ、Ｓ−Ｃ1-3アルキル、ＣＮ、ＣＨ2ＮＨ2、ＮＨ−Ｃ1-3アルキル、ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ1-3アルキル、Ｎ（Ｃ1-3アルキル）2、ＣＨ2Ｎ（Ｃ1-3アルキル）、Ｏ−、ＮＨ−及びＳ−ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ）2,、Ｏ−、ＮＨ−及びＳ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ）2、Ｏ−、ＮＨ−及びＳ−ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ）2、Ｏ−、ＮＨ−及びＳ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ2）2、Ｏ−、ＮＨ−及びＳ−ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（Ｃ1-3アルキル）2、Ｏ−、ＮＨ−及びＳ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（Ｃ1-3アルキル）2、ＣＨＯまたはＣ1-3アルキルのうちの１つである。
【００２９】
上記構造（ＩＩ）におけるＲ8は、ＨまたはＣ1-8アルキル（好ましくはＣ2アルキル）またはＣＨ2ＮＲ9Ｒ10であって差し支えなく、ここで、
（ａ）Ｒ9及びＲ10は、独立して、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-7シクロアルキル、Ｃ3-7シクロアルキル−Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、ヒドロキシ−Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ−Ｃ1-6アルキルであるか、あるいは、
（ｂ）Ｒ9は、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-7シクロアルキル、Ｃ3-7シクロアルキル−Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、ヒドロキシ−Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ−Ｃ1-6アルキルであって差し支えなく、Ｒ10は、−ＣＯＲ11であって差し支えなく、ここでＲ11は、水素、Ｃ1-6アルキル、ペルハロ−Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-7シクロアルキル、Ｃ3-7シクロアルキル−Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、ヒドロキシ−Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルコキシ−Ｃ1-6アルキルであるか、または
（ｃ）Ｒ9及びＲ10は、それらに付加する窒素原子と一緒に、Ｏ、ＳまたはＮＲ12 基を含んでいてもよい飽和３〜７員の複素環を形成し、ここでＲ12は、水素、Ｃ1-6アルキル、ペルハロ−Ｃ1-6アルキル、アリール、あるいは、Ｃ1-6アルキル、ハロゲン、ニトロ、アミノ、Ｃ1-6アルキルアミノ、ペルハロ−Ｃ1-6アルキル、ヒドロキシ−Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルコキシ−Ｃ1-6アルキル及び−ＣＯＲ13からなる群より選択される１またはそれ以上の基で置換されたアリールであって、ここで、Ｒ13は、水素、Ｃ1-6アルキル、ペルハロ−Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、アリール、及び、Ｃ1-6アルキル、ペルハロ−Ｃ1-6アルキル、ヒドロキシ−Ｃ1-6アルキル、またはＣ1-6アルコキシ−Ｃ1-6アルキル基の１つ以上の基で置換されたアリール、であり、
Ｒ110〜Ｒ111は、それぞれ独立して、水素、ハロ、アシル、アルキル（例えば、Ｃ1-6アルキル）、置換アルキル、アルコキシ（例えば、Ｃ1-6アルコキシ）、置換アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アジド、アミド、ヒドラジン、アミノ、置換アミノ（例えば、モノアルキルアミノ及びジアルキルアミノ）、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルカルボニルアミノ、カルバモイルオキシ、アリールスルホニルオキシ、アルキルスルホニルオキシ、−Ｃ（Ｒ117）＝Ｎ−（Ｏ）j−Ｒ118、ここで、Ｒ117はＨ、アルキル、アルケニル、シクロアルキルまたはアリールであり、ｊは０または１であり、Ｒ118は、Ｈ、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、または複素環である、及びＲ119Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ここで、Ｒ119は、ハロゲン、アミノ、置換アミノ、複素環、置換複素環、または Ｒ120−Ｏ−（ＣＨ2）k−であって、ここでｋは１〜１０の整数であり、Ｒ120は、アルキル、フェニル、置換フェニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、複素環、または置換複素環である、からなる群より選択されるか、あるいは、
Ｒ7がＲ110と一緒に、またはＲ110がＲ111と一緒に、置換または非置換のメチレンジオキシ、エチレンジオキシ、またはエチレンオキシを形成し、
Ｒ112は、ＨまたはＯＲ'であり、ここで、Ｒ'はアルキル、アルケニル、シクロアルキル、ハロアルキル、またはヒドロキシアルキルである。
【００３０】
好ましいアリール基は、フェニル及びナフチルである。Ｒ9とＲ10が、それらに付加する窒素原子と一緒に環を形成する場合の適切な複素環としては、アジリジン、アゼチジン、ピロリジン、ピペリジン、ヘキサメチレンイミン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、イソオキサゾリジン、ピペラジン、Ｎ−メチルピペラジン、テトラヒドロアゼピン、Ｎ−メチル−テトラヒドロアゼピン、チアゾリジンなどが挙げられる。共役後に残存するカンプトセシン類似体は、非共役化合物残基と称される。
【００３１】
説明を簡略化するためであって、限定するわけではないが、好ましい、例示する化合物としてのカンプトセシン類似体として、本説明は、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンについて言及する。請求の範囲に記載される発明は、類似体が、ポリマーへの付加点として２０−ＯＨ基などのＯＨを有する限り、これらの誘導体及び類似体のすべてを包含する。カンプトセシン及びカンプトセシン類似体は、ラセミ体混合物または光学的に純粋な異性体であって構わない。２０（Ｓ）カンプトセシンまたはカンプトセシン類似体などの、実質的に純粋な活性体をマルチアーム高分子プロドラッグに用いることが好ましい。
【００３２】
Ｂ．二官能性リンカー
本発明のある好ましい態様では、Ｌはアミノ酸残基である。既知の天然に存在するＬ-アミノ酸のいずれかから選択されるアミノ酸としては、いくつかの例を挙げるとすれば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、セリン、スレオニン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、及び／またはこれらの組合せが挙げられる。別の態様では、Ｌはペプチド残基であってもよい。ペプチドは、例えば、約２〜約１０アミノ酸残基の長さであって差し支えない。
【００３３】
天然アミノ酸の誘導体及び類似体もまた、疎水性または非疎水性の、当技術分野で知られたさまざまな非天然アミノ酸（ＤまたはＬ体）と同様に、本発明の範囲内にあることが意図されている。単に例を挙げると、アミノ酸類似体及び誘導体としては、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、ピペリジン酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−アミノ酪酸、デスモシン、２，２−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロイソロイシン、Ｎ−メチルグリシンまたはサルコシン、Ｎ−メチルイソロイシン、６−Ｎ−メチルリジン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン及び他のものなど、枚挙にいとまがないが、それらは、参照することにより本願に援用される、米国特許商標庁審査ガイドライン63 Fed. Reg. 29620, 29622に記載されている。一部の好ましいＬ基としては、グリシン、アラニン、メチオニンまたはサルコシン残基が挙げられる。本発明の化合物としては、リンカー基（Ｌ）としてのグリシン残基がさらに好ましい。
【００３４】
本発明の別の態様では、カンプトセシン類似体とポリマーの間に付加した後のＬは、
−［Ｃ（Ｏ）］vＮＲ21（ＣＲ22Ｒ23Ｏ）t−、
−［Ｃ（Ｏ）］vＮＲ21（ＣＲ22Ｒ23Ｏ）t（ＣＲ24Ｒ25）yＯ−、
−［Ｃ（Ｏ）］vＮＲ21（ＣＲ22Ｒ23Ｏ）t（ＣＲ24Ｒ25)y−、
−［Ｃ（Ｏ）］vＮＲ21（ＣＲ22Ｒ23）tＯ−、
−［Ｃ（Ｏ）］vＮＲ21（ＣＲ22Ｒ23）t（ＣＲ24ＣＲ25Ｏ）yＮＲ26−、
−［Ｃ（Ｏ）］vＯ（ＣＲ22Ｒ23）tＮＲ26−、
−［Ｃ（Ｏ）］vＯ（ＣＲ22Ｒ23）tＯ−、
−［Ｃ（Ｏ）］vＮＲ21（ＣＲ22Ｒ23)tＮＲ26−、
−［Ｃ（Ｏ）］vＮＲ21（ＣＲ22Ｒ23）t（ＣＲ24ＣＲ25Ｏ）y−、
−［Ｃ（Ｏ）］vＮＲ21（ＣＲ22Ｒ23Ｏ)t（ＣＲ24ＣＲ25）yＮＲ26−、
【化７】
2009526076.tif 000009
【００３５】
から選択され、ここで、
Ｒ21〜Ｒ26は、独立して、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、Ｃ3-19分岐鎖アルキル、Ｃ3-8 シクロアルキル、Ｃ1-6置換アルキル、Ｃ2-6置換アルケニル、Ｃ2-6置換アルキニル、Ｃ3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ1-6ヘテロアルキル、Ｃ1-6アルコキシ、フェノキシ、Ｃ1-6へテロアルコキシからなる群より選択され、
Ｒ27は、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、Ｃ3-19分岐鎖アルキル、Ｃ3-8 シクロアルキル、Ｃ1-6置換アルキル、Ｃ2-6置換アルケニル、Ｃ2-6置換アルキニル、Ｃ3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ1-6ヘテロアルキル、Ｃ1-6アルコキシ、フェノキシ、Ｃ1-6へテロアルコキシ、ＮＯ2、ハロアルキル及びハロゲンからなる群より選択され、
ｔ及びｙは、独立して、約１〜約４の正の整数から選択され、
ｖは０または１である。
【００３６】
本発明の一部の好ましい態様では、化合物には二官能性リンカーの１単位が含まれ、したがってｍは１である。
【００３７】
さらなるリンカーについては、参照することによりその内容が本願に援用される、Greenwaldら (Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1998, 6:551-562) の表１に示されている。
【００３８】
Ｃ．マルチアーム・ポリマー
マルチアームＰＥＧは、参照することによりその開示を援用する、NOF社のDrug Delivery System catalog, Ver. 8, April 2006に記載されている。ある特に好ましいマルチアームＰＥＧは、以下の構造式：
【化８】
2009526076.tif 000010
【００３９】
を有し、
ここで、ｎは正の整数である。
【００４０】
本発明のある好ましい実施の形態では、ポリマー（ｎ）の重合度は約２８〜約３４１であり、約５，０００〜６０，０００の総分子量を有するポリマーを提供し、重合度約１１４〜約２２７、総分子量２０，０００〜４０，０００を有するポリマーを提供することが好ましい。これは、ポリマー鎖における繰り返し単位の数を表しており、ポリマーの分子量によって決まる。本発明のある特に好ましい実施の形態では、ｎは約２２７である。
【００４１】
Ｄ．プロドラッグの合成
一般に、本発明のプロドラッグは、１当量以上の活性化マルチアーム・ポリマーを、例えば活性部位当たり１当量以上のカンプトセシン−アミノ酸複合体と、該複合体がポリマーのカルボン酸と反応し、結合を形成するためのアミノ基を効率的に生じさせるのに十分な条件下で、反応させることによって調製される。
【００４２】
さらに具体的には、本方法は、
１）利用可能な２０−ヒドロキシル基を含む、１当量のカンプトセシンまたはカンプトセシン類似体と、利用可能なカルボン酸基を含む１当量以上の二官能性リンカーとを提供し、
２）その２つの反応物質を反応させて、１，（３−ジメチルアミノプロピル）３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）（または１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、任意の適切なジアルキルカルボジイミド、向山試薬（例えば２−ハロ−１−アルキル−ピリジニウムハライド）、またはプロパンホスホン酸環状無水物（ＰＰＡＣＡ）など）等のカップリング剤及びＤＭＡＰなどの適切な塩基の存在下、ＤＣＭ（またはＤＭＦ、クロロホルム、トルエン、またはこれらの混合物）などの不活性溶媒中でカンプトセシン−二官能性リンカー中間体を形成し、
３）アミン基を有している、活性部位当たり１当量以上（実施例では２当量）の得られた中間体と、ＰＥＧ−酸などの１当量の活性化ポリマーを、ＤＣＭ（またはＤＭＦ、クロロホルム、トルエン、またはこれらの混合物）などの不活性溶媒中で、１，（３−ジメチルアミノプロピル）３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、ＰＰＡＣ（または１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、任意の適切なジアルキルカルボジイミド、向山試薬（例えば２−ハロ−１−アルキル−ピリジニウムハライド）、またはプロパンホスホン酸環状無水物（ＰＰＡＣＡ）など）等のカップリング剤、及び、例えばシグマ・ケミカル社などの商業的供給源から入手可能であるか、あるいは公知の技術を利用して合成された、ＤＭＡＰなどの適切な塩基の存在下、０℃〜２２℃までの温度で反応させる、
各工程を有していてもよい。
【００４３】
ある好ましい態様では、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンの１０−ヒドロキシル基は、工程１）の前に保護される。
【００４４】
７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン中間体自体が良好な溶解性を有し、能率的かつ効果的に、高純度の形態で精製可能なことから、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンにおける１０−ヒドロキシル基のようなカンプトセシンまたはカンプトセシン類似体のＯＨ基を保護するためには、芳香族の保護基が好ましい。例えば、ＴＢＤＰＳＣｌ、ＴＢＤＭＳＣｌ及びＴＭＳＣｌなどのシリル含有保護基を、カンプトセシンまたはカンプトセシン類似体の１０−ヒドロキシル基の保護に使用することができる。
【００４５】
活性化ポリマー、すなわち、１−４末端カルボン酸基を含むポリマーは、例えば、ＮＯＦサンブライト（登録商標）型、または末端ＯＨ基を有する他の分岐鎖ポリマーを、当業者に周知の標準的な技法を用いて、対応するカルボン酸誘導体に転換することによって、調製することができる。例えば、本明細書の実施例１〜２、及び、参照することにより本願に援用される、本発明の譲受人に譲渡された米国特許第５，６０５，９７６号明細書を参照のこと。
【００４６】
第１及び第２カップリング剤は、同一でも、異なっていてもよい。
【００４７】
好ましい二官能性リンカー基の例としては、グリシン、アラニン、メチオニン、サルコシンなどが挙げられ、合成については実施例に示す。別の特異的合成に関しては、実施例に提供する。
【００４８】
例えば、本発明の化合物としては、
【化９】
2009526076.tif 000011
【化１０】
2009526076.tif 000012
【化１１】
2009526076.tif 000013
【化１２】
2009526076.tif 000014
【化１３】
2009526076.tif 000015
【化１４】
2009526076.tif 000016
【化１５】
2009526076.tif 000017
【００４９】
及び
【化１６】
2009526076.tif 000018
【００５０】
が挙げられる。
【００５１】
１つの特に好ましい化合物は、
【化１７】
2009526076.tif 000019
【００５２】
であり、
ここで、ポリマーの４つのアームすべてが、グリシンを介して、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンと共役している。本発明のこの態様に従って調製された化合物のＨＰＬＣ分析は、平均して４つの７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン分子が、１つのＰＥＧ分子に共役していることを示す（４重量％）。
【００５３】
Ｅ．組成物／製剤
本発明のポリマー複合体を含む医薬組成物は、例えば、さまざまな周知の混合、溶解、顆粒化、粉末化(levigating)、乳化、カプセル化、封入化、または凍結乾燥化する方法など、当技術分野で周知の方法によって製造されて差し支えない。活性化合物を薬剤的に使用可能な製剤に加工する工程を容易にする、補助剤及び賦形剤を含む１種類以上の生理的に許容できる担体と共に、組成物を製剤化してもよい。適切な製剤は、選択する投与経路に応じて決まる。本発明の多くの態様では、非経口の経路が好ましい。
【００５４】
注射用としては、限定はしないが、静脈、筋肉及び皮下注射が挙げられ、本発明の化合物を水溶液で製剤化して差し支えなく、緩衝生理食塩水などの生理的に適合する緩衝液、または限定はしないがピロリドンまたはジメチルスルホキシドなどを含む極性溶媒で製剤化することが好ましい。
【００５５】
化合物は、また、例えば、ボーラス注入または持続注入などによる、非経口的投与のための製剤であってもよい。注射用の製剤は、例えばアンプル剤または多数回投与型の容器など、単位投与量剤形(unit dosage form)で存在して差し支えない。有用な組成物としては、限定はしないが、懸濁液、溶液または、油性または水性媒体中のエマルションが挙げられ、懸濁化剤、安定化剤及び／または分散剤などの添加剤を含めてもよい。非経口的投与用の医薬組成物としては、限定はしないが、活性化合物の塩（好ましい）などの水溶性の形態の水溶液が挙げられる。さらには、活性化合物の懸濁液を脂肪親和性の媒体で調製してもよい。適切な脂肪親和性の媒体としては、ゴマ油などの脂肪油、オレイン酸エチル及びトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームなどの物質が挙げられる。水性懸濁注射液は、カルボキシルメチル・セルロース・ナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなど、懸濁液の粘度を増大させる物質を含んでいてもよい。随意的に、適切な安定化剤及び／または、化合物の溶解性を向上させる薬剤を懸濁液に含めて、高濃度の溶液を調製できるようにしてもよい。あるいは、活性成分は、使用前に、滅菌された、発熱物質を含まない(pyrogen-free)水などの適切な媒体で構成するための粉末の形態であって差し支えない。
【００５６】
活性化合物を、当技術分野で周知の薬剤的に許容できる担体と組み合わせることにより、化合物を経口投与用に製剤化してもよい。これらの担体は、本発明の化合物を、錠剤、丸薬、トローチ剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、ペースト、スラリー、溶液、懸濁液、患者が飲用水で希釈するための濃縮液及び高濃度懸濁液、患者の食事で希釈するためのプレミックスなど、患者の経口摂取用として製剤化することができる。固体の賦形剤を使用し、随意的に、得られた混合物を粉末化し、必要に応じて他の適切な補助剤を加えた後、顆粒の混合物を処理して、錠剤または糖衣錠の中心部を得ることにより、経口用の医薬品を調製することができる。有用な賦形剤としては、特に、乳糖、しょ糖、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類などの充填剤、例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン及びジャガイモデンプンなどのセルロース調製物、及びゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム、及び／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの他の物質が挙げられる。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸などの崩壊剤も加えて構わない。アルギン酸ナトリウムなどの塩もまた使用して差し支えない。
【００５７】
吸入による投与には、加圧型のパックまたは噴霧器及び適切な推進体を用いたエアゾール噴霧の形態で、本発明の化合物を便利に送達させることができる。
【００５８】
本化合物は、例えばカカオ脂または他のグリセリドなどの慣用的な座薬基剤を使用する、坐剤または保持浣腸(retention enema)などの直腸用組成物として製剤してもよい。
【００５９】
上述の製剤に加えて、化合物はまた、徐放性製剤として製剤して差し支えない。このような長時間作用型の製剤は、移植（例えば、皮下または筋肉内に）または筋肉注射によって投与されて構わない。この発明の化合物は、適切なポリマーまたは疎水性物質（例えば、薬剤的に許容できる油とのエマルション中）と共に、イオン交換樹脂と共に、または、限定はしないが難溶性の塩などの難溶性誘導体として、投与経路用に製剤されて差し支えない。
【００６０】
リポソーム及びエマルションなど、他の送達システムもまた使用することができる。
【００６１】
さらには、化合物は、治療薬を含む固体の疎水性ポリマーの半透性の基剤などの持続放出性の製剤を使用して送達されてもよい。さまざまな持続放出性の物質が確立されており、当業者には周知である。持続放出性のカプセルは、それらの化学的性質に応じて、数週間から１００日を越えるまで、化合物を放出して差し支えない。特定の化合物の化学的性質及び生物学的安定性に応じて、さらなる安定化の方法を用いてもよい。
【００６２】
Ｆ．投薬量
治療に有効な量とは、カンプトセシンまたは関連する類似体、すなわち７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン感受性の状態を予防、軽減、または改善するのに効果的な化合物の量のことをいう。治療に有効な量の決定は、特に、本明細書の開示を考慮すれば、十分に、当業者が対応できる範囲内にある。
【００６３】
本発明の方法に使用する任意の化合物のための治療に有効な量は、最初にインビトロ試験から推定することができる。次に、動物モデルに使用するための投薬量を製剤化して、有効な投薬量を含む血中濃度幅を達成することができる。次いで、このような情報を用いて、患者に有用な投薬量をさらに正確に決定することができる。
【００６４】
当技術分野で周知の方法を使用して、細胞培養または実験動物における標準的な医薬的手段によって、本明細書に記載の化合物の毒性及び治療効果を決定することができる。当然ながら、投薬量は、投与形態及び投与経路に応じて変化しうる。患者の状態を考慮して、内科医がそれぞれ、的確な剤形、投与経路及び投薬量を選択して差し支えない。しかしながら、一般的には、本発明の化合物の全身送達のための、目下の好ましい投薬量の範囲は、約１〜約１００ｍｇ／ｋｇ／週であり、約２〜約６０ｍｇ／ｋｇ／週が好ましい。
【００６５】
組成物は、１日１回投与して差し支えなく、または、複数週の治療プロトコルの一環として与えることが可能な複数回投与に分けて投与してもよい。正確な投薬量は、当業者に認識されるように、症状の段階及び重症度、ポリマー−プロドラッグ組成物に対する腫瘍の感受性、及び、治療される患者の個々の特性に応じて決まるであろう。
【００６６】
Ｇ．治療方法
上記を考慮して、化学式（Ｉ）で表される本発明の化合物を、それを必要としている患者に有効量で投与することを含む、哺乳動物を治療する方法も提供する。ここでＤは生物活性部分、すなわちカンプトセシン類似体である。本発明のある好ましい態様では、Ｄは７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン残基である。
【００６７】
本発明の別の態様は、哺乳動物におけるさまざまな病状の治療方法を提供する。本組成物は、とりわけ、哺乳動物における、腫瘍性疾患の治療、全身腫瘍組織量の低減、腫瘍の転移の抑制及び腫瘍の (tumor/neoplastic)増殖の再発予防に有用である。別の態様では、治療される癌は、充実性腫瘍、リンパ腫、小細胞肺癌、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、膵臓癌、膠芽腫、卵巣癌、胃癌などのうちの１つ以上でありうる。
【００６８】
例えば、プロドラッグとして使用する、組成物の投与量は、そこに含まれる親分子によって決まるであろう。一般に、治療方法に用いられるプロドラッグの量とは、哺乳動物において所望の治療結果を効果的に達成する量である。当然、さまざまなプロドラッグ化合物の投薬量は、親分子、インビボでの加水分解速度、ポリマーの分子量などによって、多少、変化するであろう。一般に、カンプトセシンのポリマーエステル誘導体及び関連する組成物は、約１〜約１００ｍｇ／ｋｇ／週の量で投与され、約２〜約６０ｍｇ／ｋｇ／週が好ましい。上に定義された範囲は例示であり、当業者は臨床経験及び治療適応に基づいて、選択したプロドラッグの最適量を決定するであろう。
【００６９】
本発明の別の態様では、治療方法は、本明細書に記載の化合物を、それを必要としている、トポイソメラーゼの干渉によって治療可能な病状を患っている、哺乳動物または患者に、有効量で投与することが含まれる。
【実施例】
【００７０】
以下の実施例は、本発明がさらに正しく認識されるためのものであり、いかなる方法によっても本発明の効力範囲を制限することは意味していない。実施例中に挙げられる下線及び太字の数字は、図１〜５に対応している。
【００７１】
一般的手法。すべての反応は、乾燥窒素またはアルゴン雰囲気下で行なわれた。市販の試薬は、さらに精製することなく使用した。すべてのＰＥＧ化合物を、使用前に、真空下またはトルエンから共沸蒸留することによって乾燥させた。13Ｃ ＮＭＲスペクトルは、特別の定めのない限り、Varian Mercury 300 NMRスペクトロメーター、ならびに、溶媒として重クロロホルム及びメタノールを使用し、７５．４６Ｈｚで取得した。化学シフト（δ）は、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）から低磁場側の１００万分の１（ｐｐｍ）単位で報告された。
【００７２】
ＨＰＬＣ法。反応混合物ならびに中間体及び最終生成物の純度は、ベックマン・コールターのSystem Gold（商標登録）ＨＰＬＣ機器でモニタした。１ｍＬ／分の流量の０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中の１０−９０％アセトニトリル勾配を用いて、多波長ＵＶ検出器と共に、ZOBAX 300SB C8逆相カラム（１５０×４．６ｍｍ)またはフェノメネックスジュピター(Phenomenex Jupiter)（登録商標）300A C18逆相カラム（１５０×４．６ｍｍ)を用いた。
【００７３】
実施例１．40k４アーム−ＰＥＧ−ｔ−ブチルエステル（化合物２）：
40k４アーム−ＰＥＧ−ＯＨ（１２．５ｇ、１当量）を２２０ｍｌのトルエンと共に共沸蒸留し、３５ｍｌのトルエン／水を除去した。溶液を３０℃まで冷却し、ｔ−ブタノール中の１．０Ｍカリウム−ｔ−ブトキシド（３．７５ｍｌ、３当量×４＝１２当量）を加えた。混合物を３０℃で３０分間攪拌し、次に、ブロモ酢酸ｔ−ブチル（０．９７５ｇ、４当量×４＝１６当量）を加えた。反応を３０℃で１時間保持した後、２５度まで冷却した。１５０ｍｌのエーテルをゆっくり加えて生成物を沈殿させた。得られた懸濁液を１７℃まで冷却し、１７℃で０．５時間置いた。粗生成物を濾過し、湿ったケーキをエーテルで２回洗浄した（２×１２５ｍｌ）。単離された湿ったケーキを５０ｍｌのＤＣＭに溶解し、生成物を３５０ｍｌのエーテルで沈殿させ、濾過した。湿ったケーキをエーテルで２回洗浄した（２×１２５ｍｌ）。生成物を４０℃で真空乾燥させた（収率＝９８％、１２．２５ｇ）。13Ｃ ＮＭＲ(75.4 MHz, CDCl3):δ27.71, 68.48-70.71 (PEG), 80.94, 168.97。
【００７４】
実施例２．40k４アーム−ＰＥＧ酸（化合物３）：
40k４アーム−ＰＥＧ−ｔ−ブチルエステル（化合物２、１２ｇ）を１２０ｍｌのＤＣＭに溶解し、６０ｍｌのＴＦＡを加えた。混合物を室温で３時間攪拌し、次に、溶媒を３５℃で真空除去した。得られた油状残渣を３７．５ｍｌのＤＣＭに溶解させた。粗生成物を３７５ｍｌのエーテルで沈殿させた。湿ったケーキを３０ｍｌの０．５％ＮａＨＣＯ3に溶解させた。生成物をＤＣＭで２回抽出した（２×１５０ｍｌ）。合わせた有機層を２．５ｇのＭｇＳＯ4で乾燥させた。溶媒を室温で真空除去した。得られた残渣を３７．５ｍｌのＤＣＭに溶解し、生成物を３００ｍｌのエーテルで沈殿させ、濾過した。湿ったケーキをエーテルで２回洗浄した（２×１２５ｍｌ）。生成物を４０℃で真空乾燥させた（収率＝９０％、１０．７５ｇ）。13Ｃ ＮＭＲ(75.4 MHz, CDCl3):δ67.93 − 71.6 (PEG), 170.83。
【００７５】
実施例３．ＴＢＤＰＳ−（１０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）（化合物５）：
１００ｍｌの無水ＤＣＭ中の７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン（化合物４、２．０ｇ、５．１０ｍｍｏｌ、１当量）の懸濁液にＥｔ3Ｎ（４．３ｍｌ、３０．５８ｍｍｏｌ、６当量）及びＴＢＤＰＳＣｌ（７．８ｍｌ、３０．５８ｍｍｏｌ、６当量）を加えた。反応混合物を一晩加熱還流した後、０．２ＮのＨＣｌ溶液（２×５０ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ3溶液（１００ｍｌ）、及び塩水（１００ｍｌ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過し、真空下で蒸発濃縮させた。残渣を無水ＤＣＭに溶解し、ヘキサンを加えて沈殿させた。ＤＣＭ／ヘキサンで沈殿を繰り返し、過剰のＴＢＤＰＳＣｌを除去した。固形物を濾過し、真空乾燥させて、２．０９ｇの生成物を得た（収率６５％）。1Ｈ ＮＭＲ(300 MHz, CDCl3):δ0.90 (3 H, t, J = 7.6 Hz), 1.01 (3 H, t, J = 7.3 Hz), 1.17 (9H, s), 1.83-1.92 (2H, m), 2.64 (2H, q, 6.9 Hz), 3.89 (1 H, s, OH), 5.11 (2H, s), 5.27 (1H, d, J = 16.1 Hz), 5.72 (1H, d, J = 16.4 Hz), 7.07 (2 H, d, J = 2.63 Hz), 7.36-7.49 (7 H, m), 7.58 (1 H, s), 7.75-7.79 (4H, m), 8.05 (1 H, d, J = 9.4 Hz)。13Ｃ ＮＭＲ(75.4 MHz, CDCl3):δ7.82, 13.28, 19.52, 22.86, 26.48, 31.52, 49.23, 66.25, 72.69, 97.25, 110.09, 117.57, 125.67, 126.57, 127.65, 127.81, 130.02, 131.69, 131.97, 135.26, 143.51, 145.05, 147.12, 149.55, 149.92, 154.73, 157.43, 173.72。
【００７６】
実施例４．ＴＢＤＰＳ−（１０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（２０）−Ｇｌｙ−Ｂｏｃ（化合物６）：
１００ｍｌの無水ＤＣＭ中のＴＢＤＰＳ−（１０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）（化合物５、３．７８ｇ、５．９９ｍｍｏｌ、１当量）及びＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１．５７ｇ、８．９９ｍｍｏｌ、１．５当量）の０℃の溶液に、ＥＤＣ（１．７２ｇ、８．９９ｍｍｏｌ、１．５当量）及びＤＭＡＰ（３２９ｍｇ、２．６９ｍｍｏｌ、０．４５当量）を加えた。反応混合物を０℃で、出発物質がＨＰＬＣで完全に消えるまで攪拌した（およそ１時間４５分）。有機層を０．５％ＮａＨＣＯ3溶液（２×５０ｍｌ）、水（１×５０ｍｌ）、０．１ＮのＨＣｌ溶液（２×５０ｍｌ）、及び塩水（１×５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させた。濾過及び真空下で蒸発濃縮後、４．９４ｇの粗生成物を得た（定量的収率）。粗固形物をさらに精製することなく、次の反応に使用した。1Ｈ ＮＭＲ(300 MHz, CDCl3):δ0.89 (3 H, t, J = 7.6 Hz), 0.96 (3 H, t, J = 7.5 Hz), 1.18 (9H, s), 1.40 (9H, s), 2.07-2.29 (3H, m), 2.64 (2H, q, 7.5 Hz), 4.01-4.22 (2H, m), 5.00 (1 H, br s), 5.01 (2H, s), 5.37 (1H, d, J = 17.0 Hz), 5.66 (1H, d, J = 17.0 Hz), 7.08 (1 H, d, J = 2.34 Hz), 7.16 (1H, s), 7.37-7.50 (7 H, m), 7.77 (4H, d, J = 7.6 Hz), 8.05 (1 H, d, J = 9.4 Hz)。13Ｃ ＮＭＲ(75.4 MHz, CDCl3):δ7.52, 13.30, 19.50, 22.86, 26.45, 28.21, 31.64, 42.28, 49.14, 67.00, 76.65, 79.96, 95.31, 110.13, 118.98, 125.75, 126.45, 127.68, 127.81, 130.03, 131.54, 131.92, 135.25, 143.65, 144.91, 145.19, 147.08, 149.27, 154.75, 155.14, 157.10, 166.98, 169.17。
【００７７】
実施例５．ＴＢＤＰＳ−（１０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（２０）−Ｇｌｙ・ＨＣｌ（化合物７）：
５ｍｌの無水ジオキサン中のＴＢＤＰＳ−（１０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（２０）−Ｇｌｙ−Ｂｏｃ（化合物６、１ｇ、１．２７ｍｍｏｌ）にジオキサン中の４Ｍ ＨＣｌ溶液５ｍｌを加えた。反応混合物を室温で、出発物質がＨＰＬＣで完全に消えるまで攪拌した（１時間）。反応混合物に５０ｍｌのエチルエーテルを加え、得られた固形物を濾過した。固形物を５０ｍｌのＤＣＭに溶かし、塩水で洗浄した（飽和ＮａＨＣＯ3溶液を加えてｐＨを２．５に合わせた）。有機層をＭｇＳＯ4で乾燥し、真空下で蒸発濃縮した。残渣を５ｍｌのＤＣＭに溶かし、５０ｍｌのエチルエーテルを加えて沈殿させた。濾過により、７７０ｍｇ（収率８４％）の最終生成物を得た。1Ｈ ＮＭＲ(300 MHz, CDCl3):δ0.84 (3 H, t, J = 7.6 Hz), 1.05 (3 H, t, J = 7.3 Hz), 1.16 (9H, s), 2.15-2.30 (3H, m), 2.59 (2H, q, 7.6 Hz), 4.16 (1H, d, J = 17.9 Hz), 4.26 (1H, d, J = 17.9 Hz), 5.13 (2H, s), 5.46 (1H, d, J = 17.0 Hz), 5.60 (1H, d, J = 17.0 Hz), 7.11 (1 H, d, J = 2.34 Hz), 7.30 (1H, s), 7.40-7.51 (6 H, m), 7.56 (1H, dd, J = 2.34, 9.4 Hz), 7.77 (4H, dd, J = 7.6, 1.6 Hz), 7.98 (1 H, d, J = 9.1 Hz)。13Ｃ ＮＭＲ(75.4 MHz, CDCl3):δ8.09, 13.72, 20.26, 23.61, 26.94, 31.83, 41.01, 50.71, 67.62, 79.51, 97.03, 111.65, 119.69, 127.13, 128.97, 128.99, 129.11, 131.43, 131.96, 133.00, 133.03,136.51, 145.62, 145.81, 147.24, 148.29, 150.58, 156.27, 158.68, 167.81, 168.34。
【００７８】
実施例６．40k４アーム−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−（２０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（１０）−ＴＢＤＰＳ（化合物８）：
１４ｍｌの無水ＤＣＭ中の40k４アーム−ＰＥＧＣＯＯＨ（化合物３、１．４ｇ、０．０３６ｍｍｏｌ、１当量）の溶液にＴＢＤＰＳ−（１０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（２０）−Ｇｌｙ・ＨＣｌ（化合物７、２０７ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ、活性部位当たり２．０当量）、ＤＭＡＰ（１７５ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ、１０当量）及びＰＰＡＣ（０．８５ｍｌのＥｔＯＡｃ中の５０％溶液、１．４４ｍｍｏｌ、１０当量）を加えた。反応混合物を室温で一晩攪拌した後、真空蒸発させた。得られた残渣をＤＣＭに溶かし、生成物をエーテルで沈殿させて濾過した。残渣をＤＭＦ／ＩＰＡで再結晶化し、生成物（１．２５ｇ）を得た。13Ｃ ＮＭＲ(75.4 MHz, CDCl3):δ7.45, 13.20, 19.39, 22.73, 26.42, 31.67, 40.21, 49.01, 66.83, 95.16, 110.02, 118.83, 125.58, 126.40, 127.53, 127.73, 129.96, 131.49, 131.76, 131.82, 135.12, 143.51, 144.78, 145.13, 146.95, 149.21, 154.61, 156.92, 166.70, 168.46, 170.30。
【００７９】
実施例７．40k４アーム−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−（２０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）（化合物９）：
化合物40k４アーム−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−（２０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（１０）−ＴＢＤＰＳ（化合物８、１．２５ｇ）に、ＴＨＦ及び０．０５ＭのＨＣｌ溶液の１：１混合液（１２．５ｍｌ）中のＴＢＡＦ（１２２ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、４当量）溶液を加えた。反応混合物を室温で４時間攪拌した後、ＤＣＭで２回抽出した。合わせた有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過し、真空下で蒸発濃縮した。残渣を７ｍｌのＤＭＦに溶かし、３７ｍｌのＩＰＡで沈殿させた。固形物を濾過し、ＩＰＡで洗浄した。ＤＭＦ／ＩＰＡで沈殿を繰り返した。最後に、残渣を２．５ｍｌのＤＣＭに溶かし、２５ｍｌのエーテルを加えて沈殿させた。固形物を濾過し、４０℃の真空オーブンで一晩乾燥させた（８６０ｍｇ）。13Ｃ ＮＭＲ(75.4 MHz, CDCl3):δ7.48, 13.52, 22.91, 31.67, 40.22, 49.12, 66.95, 94.82, 105.03, 118.68, 122.54, 126.37, 128.20, 131.36, 142.92, 144.20, 144.98, 147.25, 148.29, 156.44, 156.98, 166.82, 168.49, 170.39。このＮＭＲデータには、ＰＥＧ−ＣＯＯＨの痕跡がなく、このことは、すべてのＣＯＯＨが反応したことを示唆している。蛍光検出によって測定された結合数(loading)は、ポリマーの４本の分岐鎖のそれぞれに７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンがすべて満たされた状態と一致する、３．９であると判明した。この実験のさらに大規模での反復実施においても、同一の結果を得た。
【００８０】
実施例８．Ｂｏｃ−（１０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）（化合物１０）：
２５０ｍｌの無水ＤＣＭ中の７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン（化合物４、２．４５ｇ、１当量）の懸濁液に、Ｎ2下、室温で、二炭酸ジ-ｔ-ブチル(Di-tert-butyl dicarbonate)（１．７６４ｇ、１．３当量）及び無水ピリジン（１５．２ｍｌ、３０当量）を加えた。懸濁液を室温で一晩攪拌した。濁った溶液を、セライト（１０ｇ）を通して濾過し、濾液を０．５ＮのＨＣｌで３回（３×１５０ｍｌ）、及びＮａＨＣＯ3飽和溶液（１×１５０ｍｌ）で洗浄した。溶液をＭｇＳＯ4（１．２５ｇ）で乾燥させた。溶媒を３０℃で真空除去した。生成物を４０℃で真空乾燥した（収率＝８２％、２．５２５ｇ）。13Ｃ ＮＭＲ(75.4 MHz, CDCl3):δ173.53, 157.38, 151.60, 151.28, 150.02, 149.70, 147.00, 146.50, 145.15, 131.83, 127.19, 127.13, 124.98, 118.53, 113.88, 98.06, 84.26, 72.80, 66.18, 49.33, 31.62, 27.73, 23.17, 13.98, 7.90。
【００８１】
実施例９．Ｂｏｃ−（１０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（２０）−Ａｌａ−Ｂｓｍｏｃ（化合物１１）：
無水ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）中のＢｏｃ−（１０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）（化合物１０、０．８５ｇ、１．７１ｍｍｏｌ）及びＢｓｍｏｃ−Ａｌａ（０．６８ｇ、２．３ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で、ＥＤＣ（０．５１ｇ、２．６７ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．０６５ｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物をＮ2下、０℃で４５分間攪拌した後、室温まで温めた。反応の完了をＨＰＬＣで確認し、反応混合物を１％ＮａＨＣＯ3（２×５０ｍｌ）、水（５０ｍｌ）及び０．１ＮのＨＣｌ（２×５０ｍｌ）で洗浄した。有機相を無水ＭｇＳＯ4で乾燥させ、濾過した。溶媒を減圧除去した。得られた固形物を４０℃以下で一晩真空乾燥し、収率９５％で１．２８ｇの生成物を得た。13Ｃ ＮＭＲ(75.4 MHz, CDCl3):δ171.16,166.83, 157.16, 154.78, 151.59, 151.33, 149.82, 147.17, 146.68, 145.35, 145.15, 139.08, 136.88, 133.60, 131.83, 130.45, 130.40, 130.33, 127.40, 127.08, 125.32, 125.14, 121.38, 120.01, 114.17, 95.90, 84.38, 77.19, 76.64, 67.10, 56.66, 53.45, 49.96, 49.34, 31.7, 27.76, 17.94, 14.02, 7.53。ESI-MS, 786.20［Ｍ＋Ｈ］+。
【００８２】
実施例１０．Ｂｏｃ−（１０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（２０）−Ａｌａ（化合物１２）：
無水ＣＨ2Ｃｌ2（２００ｍｌ）中のＢｏｃ−（１０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（２０）−Ａｌａ−Ｂｓｍｏｃ（化合物１１、４．２ｇ、５．３５ｍｍｏｌ）及び４−ピペリジノピペリジン（１．１７ｇ、６．９６ｍｍｏｌ）の溶液を室温で５時間、攪拌した。次にこの混合物を０．１ＮのＨＣｌ（２×４０ｍｌ）で洗浄後、有機層を無水ＭｇＳＯ4で乾燥した。この溶液を濾過し、溶媒を減圧蒸留によって除去し、ＨＰＬＣによる純度９３％、２．８ｇの生成物を得た。この生成物をさらに、エーテル（３×２０ｍｌ）によって倍散(trituration)した後、酢酸エチル（４×２０ｍｌ）によって倍散して精製し、純度９７％、１．５２ｇ（２．７０ｍｍｏｌ）を得た。13Ｃ ＮＭＲ(75.4 MHz, CDCl3):δ168.39, 166.63, 156.98, 151.20, 151.15, 149.69, 146.67, 146.56, 145.37, 144.53, 131.66, 127.13, 124.99, 119.80, 113.82, 96.15, 84.21, 77.67, 67.16, 49.48, 49.06, 31.56, 27.74, 23.14, 15.98, 13.98, 7.57。
【００８３】
実施例１１．40k４アーム−ＰＥＧ−Ａｌａ−（２０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（１０）−Ｂｏｃ（化合物１３）：
無水ＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）に、Ｂｏｃ−（１０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（２０）−Ａｌａ（化合物１２、１．５０ｇ、２．５ｍｍｏｌ）及び４アームＰＥＧ−ＣＯＯＨ（化合物３、１０．０１ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を室温で加えた。溶液を０℃まで冷却した後、ＥＤＣ（０．２９ｇ、１．５ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．３０ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を加えた。混合液をＮ2下、０℃で１時間攪拌した。その後、室温に一晩保った。溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を４０ｍｌのＤＣＭに溶かし、エーテル（３００ｍｌ）で粗生成物を沈殿させた。濾過によって得られた湿った固形物を、ＤＭＦ／ＩＰＡ（６０／２４０ｍｌ）の混合液に６５℃で溶解させた。溶液を２〜３時間のうちに室温まで冷却し、生成物を沈殿させた。次に、固形物を濾過し、エーテルで洗浄した（２×２００ｍｌ）。湿ったケーキを４０℃以下で一晩真空乾燥し、８．５ｇの生成物を得た。
【００８４】
実施例１２．40k４アーム−ＰＥＧ−Ａｌａ−（２０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）（化合物１４）：
無水ＣＨ2Ｃｌ2中の３０％ＴＦＡ溶液（１３０ｍｌ）に、40k４アーム−ＰＥＧ−Ａｌａ−（２０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（１０）−Ｂｏｃ（化合物１３、７．９８ｇ）を室温で加えた。混合物を、３時間、または出発物質の消失がＨＰＬＣで確認されるまで、攪拌した。溶媒を３５℃、真空下で、可能な限り除去した。残渣を５０ｍｌのＤＣＭに溶かし、エーテル（３５０ｍｌ）で粗生成物を沈殿させ、濾過した。湿った固形物をＤＭＦ／ＩＰＡ（５０／２００ｍｌ）の混合液に６５℃で溶解させた。溶液を２〜３時間のうちに室温まで冷却し、生成物を沈殿させた。次に、固形物を濾過し、エーテルで洗浄した（２×２００ｍｌ）。湿ったケーキを４０℃以下で一晩真空乾燥し、６．７ｇの生成物を得た。13Ｃ ＮＭＲ(75.4 MHz, CDCl3):δ170.75, 169.30, 166.65, 157.00, 156.31, 148.36, 147.19, 145.03, 144.29, 143.00, 131.49, 128.26, 126.42, 122.47, 118.79, 105.10, 94.57, 78.08, 77.81, 77.20, 71.15, 70.88, 70.71, 70.33, 70.28, 70.06, 69.93, 69.57, 66.90, 49.14, 47.14, 31.53, 22.95, 17.78, 13.52, 7.46。
【００８５】
実施例１３．Ｂｏｃ−（１０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（２０）−Ｍｅｔ−Ｂｓｍｏｃ（化合物１５）：
無水ＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍｌ）中のＢｏｃ−（１０）−７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン（化合物１０、２．７３ｇ、５．５３ｍｍｏｌ）及びＢｓｍｏｃ−Ｍｅｔ（３．１９ｇ、８．５９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＥＤＣ（１．６４ｇ、０．５９ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．２１ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。混合液をＮ2下、０℃で４５分間、攪拌した後、室温まで温めた。反応の完了をＨＰＬＣで確認し、反応混合物を１％ＮａＨＣＯ3（２×１００ｍｌ）、水（１００ｍｌ）及び０．１ＮのＨＣｌ（２×１００ｍｌ）で洗浄した。有機相を無水ＭｇＳＯ4で乾燥させ、濾過した。溶媒を減圧除去した。得られた固形物を４０℃以下で一晩真空乾燥し、収率８８％、４．２ｇの生成物を得た。13Ｃ ＮＭＲ(75.4 MHz, CDCl3):δ170.3, 166.8, 157.1, 155.2, 151.4, 151.2, 149.7, 147.0, 146.6, 145.3, 145.1, 138.9, 136.6, 133.5, 131.7, 130.5, 130.3, 130.2, 127.3, 127.0, 125.3, 125.1, 121.2, 119.8, 114.1, 96.1, 84.3, 76.7, 67.0, 56.7, 53.5, 53.4, 49.3, 31.6, 31.0, 29.7, 27.7, 23.1, 15.4, 13.9, 7.4; ESI-MS, 846.24［Ｍ＋Ｈ］+。
【００８６】
実施例１４．Ｂｏｃ−（１０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（２０）−Ｍｅｔ−ＮＨ2・ＨＣｌ（化合物１６）：
無水ＣＨ2Ｃｌ2（２００ｍｌ）中のＢｏｃ−（１０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（２０）−Ｍｅｔ−Ｂｓｍｏｃ（化合物１５、４．１ｇ、４．８５ｍｍｏｌ）及び４−ピペリジノピペリジン（１．０６ｇ、６．３１ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で５時間、攪拌した。次に、この混合液を０．１ＮのＨＣｌ（２×４０ｍｌ）で洗浄した後、有機層を無水ＭｇＳＯ4で乾燥した。この溶液を濾過後、溶媒を減圧蒸留によって除去し、ＨＰＬＣによる純度９７％で２．８ｇの生成物を得た。この生成物をさらに、エーテル（３×２０ｍｌ）によって倍散した後、酢酸エチル（４×２０ｍｌ）によって倍散して精製し、純度９７％で１．５４ｇを得た。13Ｃ ＮＭＲ(75.4 MHz, CDCl3):δ167.2, 166.5, 156.9, 151.12, 150.9, 149.8, 146.3, 145.9, 145.8, 144.9, 131.3, 127.2, 127.0, 125.1, 119.6, 113.8, 96.7, 84.3, 78.2, 67.0, 60.4, 52.2, 49.4, 31.4, 29.6, 29.1, 27.7, 23.2, 15.1, 13.9, 7.7。
【００８７】
実施例１５．40k４アーム−ＰＥＧ−Ｍｅｔ−（２０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（１０）−Ｂｏｃ（化合物１７）：
無水ＣＨ2Ｃｌ2（８０ｍｌ）溶液に、Ｂｏｃ−（１０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（２０）−Ｍｅｔ（化合物１６、１．４８ｇ、２．２５ｍｍｏｌ）及び４アーム−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（化合物３、９．０ｇ、０．９ｍｍｏｌ）を室温で加えた。溶液を０℃まで冷却した後、ＥＤＣ（０．２６ｇ、１．３５ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．２７ｇ、２．２５ｍｍｏｌ）を加えた。混合液をＮ2下、０℃で１時間、攪拌した。その後、室温で一晩保持した。反応混合物を７０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、３０ｍｌの０．１Ｎ ＨＣｌ／１Ｍ ＮａＣｌ水溶液で抽出した。有機層をＭｇＳＯ4で乾燥し、溶媒を減圧蒸発させた。残渣を４０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶かし、エーテル（３００ｍｌ）で粗生成物を沈殿させた。濾過によって得られた湿った固形物を６５℃で２７０ｍｌのＤＭＦ／ＩＰＡに溶解した。溶液を２〜３時間のうちに室温まで冷却し、生成物を沈殿させた。次に、固形物を濾過し、エーテルで洗浄した（２×４００ｍｌ）。ＤＭＦ／ＩＰＡ中での上記結晶化の手順を繰り返した。湿ったケーキを４０℃で一晩、真空乾燥し、７．０ｇの生成物を得た。13Ｃ ＮＭＲ(75.4 MHz, CDCl3):δ169.8, 169.6, 166.5, 156.9, 151.2, 151.1, 149.9, 147.0, 146.6, 145.0, 131.7, 127,1, 126.8, 124.9, 119.7, 113.8, 95.5, 84.1, 70.1, 69.9, 66.9, 50.7, 49.2, 31.5, 31.2, 29.6, 27.6, 23.1, 15.3, 13.9, 7.5。
【００８８】
実施例１６．40k４アーム−ＰＥＧ−Ｍｅｔ−（２０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）（化合物１８）：
無水ＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）の３０％ＴＦＡ溶液に、硫化ジメチル（２．５ｍｌ）及び４アーム−ＰＥＧ−Ｍｅｔ−（２０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（１０）−Ｂｏｃ（化合物１７、６．０ｇ）を室温で加えた。混合物を、３時間、または出発物質の消失がＨＰＬＣで確認されるまで、攪拌した。溶媒を３５℃、真空下で、可能な限り除去した。残渣を５０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶かし、エーテル（３５０ｍｌ）で粗生成物を沈殿させ、濾過した。湿った固形物をＤＭＦ／ＩＰＡ（６０／３００ｍｌ）の混合液に６５℃で溶解させた。溶液を２〜３時間のうちに室温まで冷却し、生成物を沈殿させた。次に、固形物を濾過し、エーテルで洗浄した（２×２００ｍｌ）。湿ったケーキを４０℃以下で一晩真空乾燥し、５．１ｇの生成物を得た。13Ｃ ＮＭＲ(75.4 MHz, CDCl3):δ169.7, 166.6, 157.0, 156.3, 148.4, 147.3, 145.0, 144.4, 142.9, 131.5, 128.3, 126.4, 122.5, 118.7, 105.2, 94.7, 78.1, 67.0, 50.7, 49.2, 31.6, 31.3, 29.7, 23.0, 15.3, 13.5, 7.5；７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンのＰＥＧに対する割合：２．１重量％。
【００８９】
実施例１７．Ｂｏｃ−（１０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（２０）−Ｓａｒ−Ｂｏｃ（化合物１９）：
７５ｍｌのＤＣＭ中のＢｏｃ−（１０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）（化合物１０、７５０ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｂｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ（４３２ｍｇ、２．２８７ｍｍｏｌ）を加え、０℃まで冷却した。ＤＭＡＰ（４３２ｍｇ、２．２８７ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（８３７ｍｇ、０．６８６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を０℃〜室温にて１．５時間、攪拌した。次に反応混合物を０．５％ＮａＨＣＯ3（２×７５ｍｌ）、水（２×７５ｍｌ）、最後に０．１ＮのＨＣｌ（１×７５ｍｌ）で洗浄した。ジクロロメタン層を無水ＭｇＳＯ4で乾燥させ、溶媒を真空蒸発させ、乾燥した。収量＝０．９００ｍｇ（８９％）。構造をＮＭＲにて確認した。
【００９０】
実施例１８．７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン−（２０）−Ｓａｒ・ＴＦＡ（化合物２０）：
Ｂｏｃ−（１０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（２０）−Ｓａｒ−Ｂｏｃ（化合物１９、９００ｍｇ、１．３５７ｍｍｏｌ）を、４ｍｌのＴＦＡ及び１６ｍｌのＤＣＭの溶液に加え、室温で１時間攪拌した。反応混合物を３０℃でトルエンと共に蒸発させた。残渣を１０ｍｌのＣＨＣｌ3に溶かし、エチルエーテルで沈殿させた。生成物を濾過し、乾燥させた。収量７００ｍｇ（１．０５５ｍｍｏｌ、７８％）。13Ｃ ＮＭＲ(67.8 MHz, CDCl3):δ168.26, 167.07, 158.84, 158.71, 148.82, 147.94, 147.22, 146.34, 144.04, 131.18, 130.08, 128.97, 124.46, 119.78, 106.02, 97.23, 79.84, 79.34, 66.87, 50.84, 49.86, 31.81, 23.94, 15.47, 13.84, 8.08。
【００９１】
実施例１９．ＴＢＤＭＳ−（１０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（２０）−Ｓａｒ・ＨＣｌ（化合物２１）：
無水ＤＭＦ（３０ｍｌ）中の７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン−（２０）−Ｓａｒ・ＴＦＡ（化合物２０、２．１７ｇ、３．７５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を２００ｍｌの無水ＤＣＭで希釈した。Ｅｔ3Ｎ（２．４ｍｌ、１７．４０ｍｍｏｌ、４．５当量）を加えた後、ＴＢＤＭＳＣｌ（２．０４ｇ、１３．５３ｍｍｏｌ、３．５当量）を加えた。ＨＰＬＣが出発物質の消失を示すまで（およそ１時間）、反応混合物を室温で攪拌した。有機層を０．５％ＮａＨＣＯ3で２回、水で１回、塩水で飽和させた０．１Ｎ ＨＣｌ溶液で２回洗浄した後、ＭｇＳＯ4で乾燥させた。濾過し、溶媒を真空蒸発させた後、得られた油をＤＣＭに溶解させた。エーテルを加えて得た固形物を、細または中程度のブフナー漏斗を使用して濾過した（２．００ｇ、収率８７％）。固形物のＨＰＬＣは、純度９６％を示した。1Ｈ ＮＭＲ及び13Ｃ ＮＭＲによって構造を確認した。1Ｈ ＮＭＲ(300 MHz, CD3OD): δ0.23 (6H, s), 0.96 (9H, s), 0.98 (3 H, t, J = 7.3 Hz), 1.30 (3 H, t, J = 7.6 Hz), 2.13-2.18 (2H, m), 2.67 (3H, s), 3.11 (2 H, q, J = 7.6 Hz), 4.10 (1H, d, J = 17.6 Hz), 4.22 (1H, d, J = 17.6 Hz), 5.23 (2 H, s), 5.40 (1 H, d, J = 16.7 Hz), 5.55 (1H, d, J = 16.7 Hz), 7.32 (1H, s), 7.38-7.43 (2H, m), 8.00 (1H, d, J = 9.1 Hz)。13Ｃ ＮＭＲ(75.4 MHz, CD3OD):δ-4.14, 8.01, 14.10, 19.30, 23.98, 26.16, 31.78, 33.52, 49.46, 50.95, 67.66, 79.80, 97.41, 111.96, 119.99, 127.75, 129.28, 129.67, 131.57, 145.24, 146.86, 147.16, 148.02, 150.34, 156.69, 158.72, 167.02, 168.27。
【００９２】
実施例２０．40k４アーム−ＰＥＧ−Ｓａｒ−（２０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（１０）−ＴＢＤＭＳ（化合物２２）：
１５０ｍｌの無水ＤＣＭ中の40k４アーム−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（化合物３、１０ｇ、０．２５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、２０ｍｌの無水ＤＭＦ中のＴＢＤＭＳ−（１０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−Ｓａｒ・ＨＣｌ（化合物２１、１．５３ｇ、２．５ｍｍｏｌ、２．５当量）の溶液を加え、混合液を０℃まで冷却した。この溶液にＥＤＣ（７６７ｍｇ、４ｍｍｏｌ、４当量）及びＤＭＡＰ（３６７ｍｇ、３ｍｍｏｌ、３当量）を加え、反応混合物を室温までゆっくりと温め、室温で一晩攪拌した。次に、反応混合物を真空蒸発させ、残渣を最小量のＤＣＭに溶解させた。エーテルを加えて、固形物を形成させ、これを真空下で濾過した。残渣を３０ｍｌの無水ＣＨ3ＣＮに溶かし、６００ｍｌのＩＰＡを加えて沈殿させた。固形物を濾過し、ＩＰＡ及びエーテルで洗浄し、生成物（９．５ｇ）を得た。ＮＭＲで構造を確認した。
【００９３】
実施例２１．40k４アーム−ＰＥＧ−Ｓａｒ−（２０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）（化合物２３）：
方法Ａ．40k４アーム−ＰＥＧ−Ｓａｒ−（２０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（１０）−ＴＢＤＭＳ（化合物２２）を、Ｈ2Ｏ中のＴＦＡ５０％混合液（２００ｍｌ）に溶解させた。反応混合物を室温で１０時間攪拌した後、１００ｍｌのＨ2Ｏで希釈し、ＤＣＭ（２×３００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相をＨ2Ｏ（２×１００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過し、真空蒸発させた。残渣を１００ｍｌの無水ＤＭＦに溶かし、ヒートガン(heat gun)で徐々に温め、４００ｍｌのＤＭＦをゆっくり加えて沈殿させた。固形物を濾過し、ＩＰＡ中の２０％ＤＭＦ及びエーテルで洗浄した。固形物をＤＣＭに溶かし、エーテルで沈殿させた（６．８ｇ）。構造をＮＭＲで確認した。
【００９４】
方法Ｂ．40k４アーム−ＰＥＧ−Ｓａｒ−（２０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）−（１０）−ＴＢＤＭＳ（１ｇ）を、１０ｍｌの１Ｎ ＨＣｌ溶液に溶解させた。反応混合物を室温で１時間攪拌し（ＨＰＬＣで確認）、その後、ＤＣＭ（２×４０ｍｌ）で抽出した。有機層をＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過し、真空蒸発させた。得られた鮮黄色の残渣を１０ｍｌのＤＭＦに溶かし（ヒートガンで若干温めた）、次に、４０ｍｌのＩＰＡを加えた。得られた固形物を濾過し、４０℃で一晩、真空オーブンにて乾燥させた。構造をＮＭＲで確認した。
【００９５】
生物学データ
実施例２２．毒性データ
ヌードマウスを使用して、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンと共役した４アームＰＥＧの最大耐用量（ＭＴＤ）を試験した。マウスは、死亡率及び病気の徴候について１４日間モニタされ、体重の減少が治療前体重の＞２０％の時点で屠殺した。
【００９６】
表１は各化合物の単回投与及び複数回投与の両方における最大耐用量を示す。複数回投与での各投与は、マウスに１日おきに１０日間与えられ、その後の４日間を含め、全部で１４日間、マウスを観察した。
【表１】
2009526076.tif 000020
【００９７】
単回投与の場合の40k４アーム−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−（２０）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）（化合物９）のＭＴＤは、３０ｍｇ／ｋｇであり、複数回投与の場合は１０ｍｇ／ｋｇ（ｑ２ｄ×５）であることが判明した。
【００９８】
実施例２３．インビトロにおけるデータ
表２において、細胞毒性（ＩＣ50の結果を、各化合物についてμＭで示す）は、インビトロにおける、各化合物の抗腫瘍作用の指標を提供する。この試験を、４アームＰＥＧ化された７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン複合体のＰＥＧ化の効果の測定に用いた。ＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン及びＣＰＴ−１１のインビトロにおける細胞毒性を、ＭＴＳ試験を用いて測定した。細胞を、３７℃で７２時間、薬剤で培養した。培養の後、ＭＴＳ染料を加え、着色した生成物（ホルマザン）の形成を４９０ｎｍで測定した。
【００９９】
４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）及びＣＰＴ−１１のＩＣ50値は、４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）が、試験した腫瘍細胞のすべてにおいて、ＣＰＴ−１１よりもはるかに高いインビトロにおける抑制効果を有することを示唆している。さらには、４−アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）が、ＨＴ２９腫瘍細胞を除いて、天然の７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンよりも著しく高いインビトロにおける抑制効果を有することを示唆している。
【０１００】
ＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）複合体は、カンプトサーに比べて、約１０〜６００倍の効能があった。ＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）複合体は、ＣＯＬＯ２０５、ＨＴ−２９及びＯＶＣＡＲ−８の各細胞株において、Pegamotecan（カンプトセシンのＰＥＧ化プロドラッグ）に比べて、約８〜１６倍感受性であった。
【表２】
2009526076.tif 000021
【０１０１】
さまざまなアミノ酸を含むＰＥＧ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）複合体は、表３にまとめた癌細胞株群に対し、インビトロにおける細胞毒性効果がある。すべてのＰＥＧ−７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン複合体は、インビトロにおいて、小分子プロドラッグであるＣＰＴ−１１及びPegamotecanの活性を上回る、抗腫瘍活性効果を示した。
【表３】
2009526076.tif 000022
【０１０２】
実施例２４．インビボにおけるデータ：乳房腫瘍異種移植マウスにおける単回投与の有効性
ヌードマウスで増殖したヒトの皮下乳癌（ＭＸ−１）に対する４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）複合体（化合物９）の有効性を次のように測定した。少なくとも１週間の順応期間の後、供与マウスから、ヌードマウスの左側腹部(left auxiliary flank region)の単一の皮下部位に腫瘍小片を移植することにより、腫瘍を生着させた。腫瘍移植部位を週に２回観察し、１回は触診した。各マウスの腫瘍容積を、測径器で二次元測定し、公式：腫瘍容積＝（長さ×幅2）を利用して計算することによって、決定した。腫瘍が、約１００ｍｍ3の平均量に達した時点で、マウスを、非治療対照群、本明細書の実施例７に従って調製した４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）群、ここに参照することにより本願に援用されるConoverら（Anti-Cancer Drug Design, 1999, 14:499-506）の記載に従って調製したＰＥＧ−Ａｌａ−ＣＰＴ群、及びＣＰＴ−１１群からなる実験群に割付した。薬剤は、２０ｍｇ／ｋｇマウス体重の単回投与として、尾静脈を介した静脈注射によって投与された。複合体の用量は、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンに相当する量のことを指す。試験開始時及び単回投与後３１日目に、マウスの体重及び腫瘍の大きさを測定した。
【０１０３】
表４は、２０ｍｇ／ｋｇマウス体重の静脈注射による単回投与後３１日目の、ＭＸ−１乳房腫瘍を異種移植されたマウスにおける腫瘍の縮小の測定結果を示している。腫瘍の全体的な成長を平均腫瘍容積（ＴＶ）として算出した。治療群の対照群に対する比（Ｔ／Ｃ）も算出した。腫瘍の回帰の割合は、インビボにおける各化合物の活性を示唆している。４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン複合体は、マウスの生存率１００％、及び治癒率１００％の顕著な抗腫瘍活性を示した。ＣＰＴ−１１群及び生理食塩水対照群では、抑制は見られず、生存率０％であったことを示した。すべてのデータを表４にまとめる。
【表４】
2009526076.tif 000023
【０１０４】
結果は、４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）が、乳癌の治療において、ＰＥＧ−Ａｌａ−ＣＰＴまたはＣＰＴ−１１と比較して、有意に効果があることを示している。
【０１０５】
ＭＸ−１乳房腫瘍モデルでは、４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）での治療により、腫瘍の増殖がほぼ１００％抑制され、すべての動物が完全に治癒した。等価の投与量でのＣＰＴ−１１の治療では、２６％の腫瘍増殖抑制を生じた。
【０１０６】
実施例２５．インビボにおけるデータ：乳房腫瘍異種移植マウスにおける複数回投与の有効性
ヌードマウスにおけるヒトの乳癌（ＭＸ−１）の増殖に対する、一連の４アームＰＥＧ−アミノ酸（誘導体）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）複合体の有効性を測定した。マウスを、本明細書の記載に従ってそれぞれ調製した、４アームＰＥＧ−Ａｌａ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）、４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）、４アームＰＥＧ−Ｍｅｔ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）、４アームＰＥＧ−Ｓａｒ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）、ＣＰＴ−１１または生理食塩水対照の各群に割り付けた。マウスに、６日間連続して、５ｍｇ／ｋｇ／日を投与した（２日毎［ｑ×２ｄ］×６回）。マウス体重及び腫瘍の大きさを初回投与後及びその後の投与３１日目までモニタした。
【０１０７】
表５は、５ｍｇ／ｋｇ／日を６日間（ｑ２ｄ×６）静脈注射後、３１日目に、ＭＸ−１乳房腫瘍細胞を異種移植されたマウスにおける腫瘍の縮小の測定結果を示している。４アームＰＥＧ−アミノ酸（誘導体）−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）複合体のすべてにおいて、マウスの生存率１００％、回帰１００％という顕著な抗腫瘍活性を示した。ＣＰＴ−１１群及び生理食塩水対照群では、生存率０％であり、抑制されなかったことを示した。すべてのデータを表５にまとめる。
【表５】
2009526076.tif 000024
【０１０８】
データは、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンの４アームＰＥＧ−アミノ酸誘導体が、乳癌の治療において、ＣＰＴ−１１と比較して著しく効果があることを示している。
【０１０９】
実施例２６．大小の乳房腫瘍を異種移植されたマウスのインビボにおける有効性  
小（約１００ｍｍ3）または大（約４５０ｍｍ3）のヒト乳房腫瘍ＭＸ−１を生着させたヌードマウスにおいて、４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）の抗腫瘍効果を、評価した。単回投与及び複数回投与の投与計画の両方につて、マウスにおける抗腫瘍治療活性を測定した。小さい乳房腫瘍を異種移植されたマウスでは、４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）の単回投与（２０ｍｇ／ｋｇ）での治療で、ＴＧＩが１００％に至った。４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）の複数回投与（２０ｍｇ／ｋｇ、ｑ２ｄ×５）での治療の結果もまた、ＴＧＩ１００％に至った。ＣＰＴ−１１の単回投与（２０ｍｇ／ｋｇ）では、腫瘍の増殖は抑制されず、ＣＰＴ−１１の複数回投与（２０ｍｇ／ｋｇ、ｑ２ｄ×５）では、３１日目の時点でＴＧＩ４４％の結果となった。
【０１１０】
大きい乳房腫瘍を移植されたマウスでは、４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）の最大耐用量（ＭＴＤ）の単回投与（３０ｍｇ／ｋｇ）での治療の結果は、ＴＧＩ９６％に至った。６匹のマウスのうち４匹が、５４日目の時点で治癒した。ＣＰＴ−１１の最大耐用量（ＭＴＤ）の単回投与（８０ｍｇ／ｋｇ）での治療では、１３日目にＴＧＩ７０％の結果となった。全身腫瘍組織量が過剰になったため、２０日目には、すべての動物を屠殺した。ＭＴＤ投与（１０ｍｇ／ｋｇ、ｑ２ｄ×５）での４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）の複数回投与でも、ＴＧＩは９６％に至り、６匹のマウスのうち５匹が５４日目の時点で治癒した。ＣＰＴ−１１では、ＭＴＤ（４０ｍｇ／ｋｇ  ｑ２ｄ×５）での複数回投与で、１３日目の時点で〜９５％のＴＧＩに至った。しかしながら、〜５週間後、６匹のマウスのうちの４匹で腫瘍が再増殖した。ＣＰＴ−１１では、４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）と等価の投与量（１０ｍｇ／ｋｇ、ｑ２ｄ×５）を与えた場合、治療が中断されるまでは有効なＴＧＩを有したが、その後、腫瘍が再増殖した。結果を図６Ａ及び６Ｃに記載する。ＭＴＤを与えた場合に、４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）またはＣＰＴ−１１のいずれかでの治療では、図６Ｂ及び６Ｄに示すように、治療の継続期間中に動物の体重が顕著に減少しなかったことから、抗腫瘍効果は、一般的な毒性効果に起因しているのではない。
【０１１１】
単回投与または複数回投与の注射をしたＭＸ−１乳房腫瘍モデルでは、４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）は、小（１００ｍｍ3）及び大（４５０ｍｍ3）の大きさで生着させた腫瘍における腫瘍増殖を、効果的に抑制した。ＭＸ−１乳房腫瘍を異種移植されたマウスにおいて、約７５ｍｍ3〜約４５０ｍｍ3の大きさの腫瘍の治療に成功した。
【０１１２】
実施例２７．インビボにおけるデータ：結腸直腸腫瘍を異種移植されたマウスにおける単回投与の有効性
この実施例では、３０ｍｇ／ｋｇの４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）またはＣＰＴ−１１を単回投与で静脈注射した後、４、８、１１、１５、１８、及び２２日目に、ＨＴ−２９結腸直腸腫瘍細胞を異種移植したマウスの腫瘍の縮小を測定した。ＣＰＴ−１１は、８０ｍｇ／ｋｇの量でも投与した。結果を図７に記載する。４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）複合体は、顕著な抗腫瘍活性を示した。生理食塩水による対照群では、抑制は見られず、生存率０％であった。結果は、４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）が、結腸直腸癌の治療において、ＣＰＴ−１１と比較して著しく効果があることを示している。
【０１１３】
実施例２８．インビボにおけるデータ：結腸直腸腫瘍を異種移植されたマウスにおける複数回投与の有効性
１０ｍｇ／ｋｇ／用量の４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）またはＣＰＴ−１１を５日間静脈注射した後、４、８、１１、１５、１８、及び２２日目に、ＨＴ−２９結腸直腸腫瘍細胞を異種移植したマウスの腫瘍の縮小を測定した。ＣＰＴ−１１は、４０ｍｇ／ｋｇ／用量を５日間の投与も行った。結果を図８に記載する。複数回投与でも、同様の結果が観察された。さらには、４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）の複数回投与では、ＣＰＴ−１１と比較して、顕著な治療効果を示した。結果は、４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）の複数回投与が、結腸直腸癌の治療において、ＣＰＴ−１１と比較して著しく効果があることを示している。ＭＸ−１腫瘍を異種移植されたマウスに見られたように、４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）またはＣＰＴ−１１での治療では、治療期間中にマウスの体重は顕著には減少しなかった。
【０１１４】
実施例２９．インビボにおけるデータ：膵臓腫瘍を異種移植されたマウスにおける単回投与の有効性
この実施例では、３０ｍｇ／ｋｇの４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）またはＣＰＴ−１１を単回投与で静脈注射した後、４、８、１１、１５、１８、及び２２日目に、ＭｉａＰａＣａ−２膵臓腫瘍細胞を異種移植したマウスの腫瘍の縮小を測定した。ＣＰＴ−１１は、８０ｍｇ／ｋｇの量でも投与した。結果を図９に記載する。４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）複合体は、顕著な抗腫瘍活性を示した。生理食塩水による対照群及びＣＰＴ−１１群では、抑制は見られなかった。結果は、４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）が、膵臓癌の治療において、ＣＰＴ−１１と比較して著しく効果があることを示している。４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）の単回投与での治療では、７１％のＴＧＩの結果となったのに対し、ＣＰＴ−１１の単回投与の注射での治療では、ＴＧＩは０％であった。
【０１１５】
実施例３０．インビボにおけるデータ：膵臓腫瘍を異種移植されたマウスにおける複数回投与の有効性
１０ｍｇ／ｋｇ／用量の４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）またはＣＰＴ−１１を５日間静脈注射した後、４、８、１１、１５、１８、及び２２日目に、ＭｉａＰａＣａ−２膵臓腫瘍細胞を異種移植したマウスの腫瘍の縮小を測定した。結果を図１０に記載する。４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）の複数回投与では、ＣＰＴ−１１と比較して、顕著な治療効果を示した。結果は、４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）の複数回投与が、膵臓癌の治療において、ＣＰＴ−１１と比較して著しく効果があることを示している。４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）の複数回投与での治療では、９５％のＴＧＩの結果となったのに対し、ＣＰＴ−１１では、ＴＧＩは３４％であった。
【０１１６】
実施例３１．インビトロでの代謝
ＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）複合体のインビトロにおける代謝を、ラット肝細胞で観察した。ＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）をラット肝細胞と共に、３７℃、ｐＨ７．５で２時間培養した。図１１に示すように、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン及び７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン−グルクロニド（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン−Ｇ）が主要な代謝産物として確認され、これは、インビボにおける７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンの既知の代謝経路と一致している。
【０１１７】
実施例３２．ＰＥＧ複合体の特性
表６に、４種類のＰＥＧ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）複合体の生理食塩水における溶解度を示す。４種類のＰＥＧ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）複合体のすべてにおいて、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンで最大４ｍｇ／ｍｌに相当する、良好な溶解性を示した。ヒト血漿中では、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンは、２２〜５２分の倍加時間でＰＥＧ複合体から着実に放出され、その放出は、次の実施例３３に記載するように、ｐＨ及び濃度依存性のように見えた。
【表６】
2009526076.tif 000025
【０１１８】
ＰＥＧ−７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン複合体は、生理食塩水及び他の水性溶媒中で、室温で最大２４時間まで、良好な安定性を示す。
【０１１９】
実施例３３．安定性における濃度及びｐＨの影響
先の研究に基づいて、２０−ＯＨ位のアシル化によって、活性化された閉環構造中に、ラクトン環を保護する。ＵＶ系のＨＰＬＣ法を用いて、ラット及びヒト血漿における水溶液中の安定性及び加水分解の特性をモニタした。４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）複合体を、各試料と共に、室温で５分間、培養した。
【０１２０】
緩衝液中のＰＥＧ−７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン複合体の安定性は、ｐＨに依存した。図１２は、さまざまな試料における４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）の安定性を示している。図１３は、ＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）からの７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンの放出速度がｐＨの上昇に従って増大することを示している。
【０１２１】
実施例３４．薬物動態学
腫瘍を有しないＢａｌｂ／Ｃマウスに、４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）複合体を２０ｍｇ／ｋｇの単回投与によって注射した。さまざまな時点において、マウスを屠殺し、ＨＰＬＣで、原形のままの複合体及び放出された７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンについて、血漿を分析した。非コンパートメント解析(WinNonlin)を用いて、薬物動態学的分析を行った。詳細を表７に記す。
【表７】
2009526076.tif 000026
【０１２２】
図１４に示すように、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンのＰＥＧ化は、循環半減期の長期化及び天然薬である７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンへの高濃度の曝露を生じる。４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）複合体の腸肝循環が見られた。マウスにおけるＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）の薬物動態プロファイルは、最初の２時間の間に急速な血漿の分布相を示し、その後、複合体の１８〜２２時間の最終排泄相の半減期、及びそれに付随する７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンの１８〜２６時間の最終排泄相の半減期を示す、二相性であった。
【０１２３】
さらに、ラットにおいて、４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）の薬物動態プロファイルを調査した。ラットでは、３、１０及び３０ｍｇ／ｋｇ（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン相当）の投与量を用いた。ラットにおける薬物動態プロファイルはマウスのものと一致した。
【０１２４】
ラットでは、ＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）は、１２〜１８時間の消失半減期を伴う、循環からの二相性のクリアランスを示した。４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）複合体から放出された７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンは、２１〜２２時間の明白な消失半減期を有していた。最大血漿濃度（Ｃmax）及び濃度曲線下面積（ＡＵＣ）は、ラットでは、用量依存性の形で増大した。マウスまたはラットでは、４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）複合体から放出された７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンの明白な半減期は、ＣＰＴ−１１から放出された７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンの明白な半減期として報告されたよりも著しく長く、また、４アームＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）から放出された７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンの曝露は、ＣＰＴ−１１から放出された７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンの曝露として報告されたよりも著しく大きい。親化合物のクリアランスは、ラットにおいて、０．３５ｍｌ／時間／ｋｇであった。親化合物の定常状態での推定される分配量（Ｖｓｓ）は、５．４９ｍｌ／ｋｇであった。放出された７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンのクリアランスは、ラットにおいて、１３１ｍｌ／時間／ｋｇであった。放出された７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンの推定Ｖｓｓは、ラットにおいて、２３８４ｍｌ／ｋｇであった。放出された７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシンの腸肝循環が、マウス及びラットの両方において観察された。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】４−アームポリエチレングリコール酸を調製する反応スキームを図式的に示す。
【図２】実施例３〜７に記載した、４アーム−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）の調製の反応スキームを図式的に示す。
【図３】実施例８〜１２に記載した、４アーム−ＰＥＧ−Ａｌａ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）の調製の反応スキームを図式的に示す。
【図４】実施例１３〜１６に記載した、４アーム−ＰＥＧ−Ｍｅｔ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）の調製の反応スキームを図式的に示す。
【図５】実施例１７〜２１に記載した、４アーム−ＰＥＧ−Ｓａｒ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）の調製の反応スキームを図式的に示す。
【図６】実施例２６に記載した、大きいＭＸ−１乳房腫瘍を異種移植されたマウスにおける、単回投与及び複数回投与の有効性を示す。
【図７】実施例２７に記載した、ＨＴ−２９結腸直腸腫瘍を異種移植されたマウスにおける、単回投与の有効性を示す。
【図８】実施例２８に記載した、ＨＴ−２９結腸直腸腫瘍を異種移植されたマウスにおける、複数回投与の有効性を示す。
【図９】実施例２９に記載した、ＭｉａＰａＣａ−２膵臓腫瘍を異種移植されたマウスにおける、単回投与の有効性を示す。
【図１０】実施例３０に記載した、ＭｉａＰａＣａ−２膵臓腫瘍を異種移植されたマウスにおける、複数回投与の有効性を示す。
【図１１】実施例３１に記載した、４アーム−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）のインビトロ代謝を示す。
【図１２】実施例３３に記載した、４アーム−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）の安定性を示す。
【図１３】実施例３３に記載した、４アーム−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）の安定性におけるｐＨの影響を示す。
【図１４】実施例３４に記載した、４アーム−ＰＥＧ−Ｇｌｙ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトセシン）の薬物動態プロファイルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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