(57)【要約】  本出願は、出生前診断及びある妊娠−関連状態のモニタリングのための新規胎児マーカーの使用を提供する。より詳細には、本発明は、胎児第２１染色体上に位置したある種のＣｐＧアイランドは、母体第２１染色体上に位置する対応するＣｐＧアイランドのそれと識別されるメチル化プロファイルを明らかにするという発見に属する。本出願は、関連状態を診断又はモニタリングするためのキットも提供する。
2009535050.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎児を身ごもった妊娠女性において妊娠−関連障害を検出又はモニタリングする方法であって：
（ａ）女性から生物学的試料を得る工程であり、ここで試料は、全血、血清、血漿、尿又は唾液である工程；
（ｂ）試料中のＣｐＧ−含有ゲノム配列のメチル化状態を決定する工程であり、ここで胎児由来のゲノム配列及び女性由来のゲノム配列が、示差的にメチル化され、これにより試料中の女性由来のゲノム配列と胎児由来のゲノム配列を識別し、ここで該ゲノム配列は、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであり、少なくとも１個のシトシンを含み、そして第２１染色体上の領域内にあり、ここで、該領域は、（１）ＣＧＩ１３７、ホスホジエステラーゼ９Ａ（ＰＤＥ９Ａ）、ホモ・サピエンスタンパク質ホスファターゼ１、調節（阻害）サブユニット２偽遺伝子２（ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２）、Ｆｅｍ１Ａ（シーエレガンス）への類似、ＣＧＩ００９、カルボニルレダクターゼ１（ＣＢＲ１）、ダウン症細胞接着分子（ＤＳＣＡＭ）、及び第２１染色体オープンリーディングフレーム２９（Ｃ２１ｏｒｆ２９）、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（ＨＬＣＳ）、及びＣＧＩ１３２からなる群より選択される、ゲノム遺伝子座；並びに、（２）この遺伝子座から１０ｋｂを超えない上流及び／又は下流のＤＮＡ配列：からなる、工程；
（ｃ）胎児由来のゲノム配列のレベルを決定する工程；並びに
（ｄ）胎児由来のゲノム配列のレベルを、標準対照と比較する工程であり、ここで標準対照からの増加又は減少は、妊娠−関連障害の存在又は進行を示す工程：を含む、方法。
【請求項２】
女性由来のゲノム配列がメチル化され、そして胎児由来のゲノム配列がメチル化されない、請求項１記載の方法。
【請求項３】
女性由来のゲノム配列がメチル化されず、そして胎児由来のゲノム配列がメチル化される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｂ）が、試料をメチル化された及びメチル化されないＤＮＡを示差的に修飾する試薬で処理することによって実行される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記試薬が、亜硫酸水素塩を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記試薬が、メチル化されたＤＮＡを優先的に切断する１種又は複数の酵素を含む、請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記試薬が、メチル化されないＤＮＡを優先的に切断する１種又は複数の酵素を含む、請求項４記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ｂ）が、メチル化−特異的ＰＣＲにより実行される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
胎児を身ごもった妊娠女性において妊娠−関連障害を検出又はモニタリングする方法であり：
（ａ）女性由来の生物学的試料中のＤＮＡを得る工程であり、ここで試料は、全血、血清、血漿、尿又は唾液である工程；
（ｂ）工程（ａ）由来のＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理する工程；並びに
（ｃ）工程（ｂ）由来のＤＮＡ及び２種のプライマーを用いて増幅反応を実行し、ＣｐＧ−含有ゲノム配列を増幅する工程であり、ここで該ゲノム配列は、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであり、少なくとも１個のシトシンを含み、そして第２１染色体上の領域内にあり、ここで該領域は、（１）ＣＧＩ１３７、ホスホジエステラーゼ９Ａ（ＰＤＥ９Ａ）、ホモ・サピエンスタンパク質ホスファターゼ１、調節（阻害）サブユニット２偽遺伝子２（ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２）、Ｆｅｍ１Ａ（シーエレガンス）への類似、ＣＧＩ００９、カルボニルレダクターゼ１（ＣＢＲ１）、ダウン症細胞接着分子（ＤＳＣＡＭ）、第２１染色体オープンリーディングフレーム２９（Ｃ２１ｏｒｆ２９）、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（ＨＬＣＳ）、及びＣＧＩ１３２からなる群より選択される、ゲノム遺伝子座；並びに、（２）この遺伝子座から１０ｋｂを超えない上流及び／又は下流のＤＮＡ配列：からなり；
並びに、ここで２種のプライマーの少なくとも１種は、胎児由来のゲノム配列へ示差的に結合する工程；並びに
（ｄ）工程（ｃ）由来のゲノム配列の増幅された部分のレベルを、標準対照と比較する工程であり、ここで標準対照からの増加又は減少は、妊娠−関連障害の存在又は進行を示す工程：を含む、方法。
【請求項１０】
前記増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅反応が、メチル化−特異的ＰＣＲである、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記増幅反応が、核酸配列に基づく増幅である、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
前記増幅反応が、鎖置換反応である、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
前記増幅反応が、分枝ＤＮＡ増幅反応である、請求項９記載の方法。
【請求項１５】
妊娠−関連障害が、子癇前症である、請求項１又は９記載の方法。
【請求項１６】
妊娠−関連障害が、早期分娩である、請求項１又は９記載の方法。
【請求項１７】
妊娠−関連障害が、妊娠悪阻である、請求項１又は９記載の方法。
【請求項１８】
妊娠−関連障害が、異所性妊娠である、請求項１又は９記載の方法。
【請求項１９】
妊娠−関連障害、染色体異数性である、請求項１又は９記載の方法。
【請求項２０】
妊娠−関連障害が、トリソミー２１である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
妊娠−関連障害が、子宮内発育遅延である、請求項１又は９記載の方法。
【請求項２２】
妊娠−関連障害を検出及びモニタリングする方法であり：
（ａ）女性由来の生物学的試料中のＤＮＡを得る工程であり、ここで試料は、全血、血清、血漿、尿又は唾液である工程；
（ｂ）工程（ａ）由来のＤＮＡを、メチル化された及びメチル化されないＤＮＡを示差的に修飾する試薬で処理する工程；
（ｃ）工程（ｂ）由来のＣｐＧ−含有ゲノム配列ヌクレオチド配列を決定する工程であり、ここでゲノム配列は、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであり、少なくとも１個のシトシンを含み、そして第２１染色体上の領域内にあり、ここで該領域は、（１）ＣＧＩ１３７、ホスホジエステラーゼ９Ａ（ＰＤＥ９Ａ）、ホモ・サピエンスタンパク質ホスファターゼ１、調節（阻害）サブユニット２偽遺伝子２（ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２）、Ｆｅｍ１Ａ（シーエレガンス）への類似、ＣＧＩ００９、カルボニルレダクターゼ１（ＣＢＲ１）、ダウン症細胞接着分子（ＤＳＣＡＭ）、及び第２１染色体オープンリーディングフレーム２９（Ｃ２１ｏｒｆ２９）、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（ＨＬＣＳ）、及びＣＧＩ１３２からなる群より選択される、ゲノム遺伝子座；並びに、（２）この遺伝子座から１０ｋｂを超えない上流及び／又は下流のＤＮＡ配列：からなる、工程；並びに
（ｄ）工程（ｃ）由来のヌクレオチド配列のプロファイルを、標準対照と比較する工程であり、ここで標準対照からのプロファイルの変化は、妊娠−関連障害の存在又は進行を示す工程：を含む、方法。
【請求項２３】
前記試薬が、亜硫酸水素塩を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記試薬が、メチル化されたＤＮＡを優先的に切断する１種又は複数の酵素を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記試薬が、メチル化されないＤＮＡを優先的に切断する１種又は複数の酵素を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
ゲノム配列を増幅するために、工程（ｂ）由来のＤＮＡ及び２種のプライマーを用いる増幅工程を更に含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
前記増幅工程が、ＰＣＲにより実行される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記増幅工程が、メチル化−特異的ＰＣＲにより実行される、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記工程（ｃ）が、質量分析により実行される、請求項２２記載の方法。
【請求項３０】
前記工程（ｃ）が、プライマー伸長により実行される、請求項２２記載の方法。
【請求項３１】
前記工程（ｃ）が、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションにより実行される、請求項２２記載の方法。
【請求項３２】
前記工程（ｃ）が、リアル−タイムＰＣＲにより実行される、請求項２２記載の方法。
【請求項３３】
工程（ｃ）が、電気泳動により実行される、請求項２２記載の方法。
【請求項３４】
妊婦内の胎児においてトリソミー２１を検出する方法であり：
（ａ）女性から生物学的試料を得る工程であり、ここで試料は、全血、血清、血漿、尿又は唾液である工程；
（ｂ）工程（ａ）由来の試料を、メチル化された及びメチル化されないＤＮＡを示差的に修飾する試薬で処理する工程；
（ｃ）ＣｐＧ−含有ゲノム配列の対立遺伝子を分析する工程であり、ここでゲノム配列は、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであり、少なくとも１個のシトシンを含み、そして第２１染色体上の領域内にあり、ここで該領域は、（１）ＣＧＩ１３７、ホスホジエステラーゼ９Ａ（ＰＤＥ９Ａ）、ホモ・サピエンスタンパク質ホスファターゼ１、調節（阻害）サブユニット２偽遺伝子２（ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２）、Ｆｅｍ１Ａ（シーエレガンス）への類似、ＣＧＩ００９、カルボニルレダクターゼ１（ＣＢＲ１）、ダウン症細胞接着分子（ＤＳＣＡＭ）、及び第２１染色体オープンリーディングフレーム２９（Ｃ２１ｏｒｆ２９）、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（ＨＬＣＳ）、及びＣＧＩ１３２からなる群より選択される、ゲノム遺伝子座；並びに、（２）この遺伝子座から１０ｋｂを超えない上流及び／又は下流のＤＮＡ配列：からなる、工程；並びに
（ｄ）これらの対立遺伝子の比を決定する工程であり、ここでトリソミー２１を有さない胎児を身ごもっている女性の比からの偏差は、その胎児のトリソミー２１を示す工程：を含む、方法。
【請求項３５】
前記試薬が、亜硫酸水素塩を含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記試薬が、メチル化されたＤＮＡを優先的に切断する１種又は複数の酵素を含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
前記試薬が、メチル化されないＤＮＡを優先的に切断する１種又は複数の酵素を含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
メチル化された又はメチル化されないゲノム配列を増幅するために、工程（ｂ）の後に増幅工程を更に含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３９】
前記増幅工程が、ＰＣＲにより実行される、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記増幅工程が、メチル化−特異的ＰＣＲにより実行される、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
前記工程（ｃ）が、質量分析により実行される、請求項３４記載の方法。
【請求項４２】
前記工程（ｃ）が、プライマー伸長アッセイにより実行される、請求項３４記載の方法。
【請求項４３】
前記工程（ｃ）が、リアル−タイムＰＣＲにより実行される、請求項３４記載の方法。
【請求項４４】
前記工程（ｃ）が、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションにより実行される、請求項３４記載の方法。
【請求項４５】
前記工程（ｃ）が、電気泳動により実行される、請求項３４記載の方法。
【請求項４６】
胎児由来のゲノム配列の２つの異なる対立遺伝子が、一塩基多型、挿入−欠失多型、又は単純な縦列反復配列多型を含む、請求項３４記載の方法。
【請求項４７】
胎児を身ごもった妊娠女性における妊娠−関連障害を検出又はモニタリングする方法であり：
（ａ）女性から生物学的試料を得る工程であり、ここで試料は、全血、血清、血漿、尿又は唾液である工程；
（ｂ）試料中のＣｐＧ−含有ゲノム配列のレベルを決定する工程であり、ここで該ゲノム配列は、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであり、少なくとも１個のメチル化されないシトシンを含み、そして第２１染色体上の領域内にあり、ここで該領域は、（１）ＣＧＩ１３７、ホスホジエステラーゼ９Ａ（ＰＤＥ９Ａ）、ホモ・サピエンスタンパク質ホスファターゼ１、調節（阻害）サブユニット２偽遺伝子２（ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２）、Ｆｅｍ１Ａ（シーエレガンス）への類似からなる群より選択される、ゲノム遺伝子座；並びに、（２）この遺伝子座から１０ｋｂを超えない上流及び／又は下流のＤＮＡ配列：からなる、工程；並びに
（ｃ）このゲノム配列のレベルを、標準対照と比較する工程であり、ここで標準対照からの増加又は減少は、妊娠−関連障害の存在又は進行を示す工程：を含む、方法。
【請求項４８】
胎児を身ごもった妊娠女性における妊娠−関連障害を検出又はモニタリングする方法であり：
（ａ）女性から生物学的試料を得る工程であり、ここで試料は、全血、血清、血漿、尿又は唾液である工程；
（ｂ）試料中のＣｐＧ−含有ゲノム配列のレベルを決定する工程であり、ここで該ゲノム配列は、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであり、少なくとも１個のメチル化されたシトシンを含み、そして第２１染色体上の領域内にあり、ここで該領域は、（１）ＣＧＩ００９、カルボニルレダクターゼ１（ＣＢＲ１）、ダウン症細胞接着分子（ＤＳＣＡＭ）、第２１染色体オープンリーディングフレーム２９（Ｃ２１ｏｒｆ２９）、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（ＨＬＣＳ）、及びＣＧＩ１３２からなる群より選択される、ゲノム遺伝子座；並びに、（２）この遺伝子座から１０ｋｂを超えない上流及び／又は下流のＤＮＡ配列：からなる、工程；並びに
（ｃ）このゲノム配列のレベルを、標準対照と比較する工程であり、ここで標準対照からの増加又は減少は、妊娠−関連障害の存在又は進行を示す工程：を含む、方法。
【請求項４９】
前記工程（ｂ）が、血液試料中に存在するＤＮＡを、メチル化された及びメチル化されないシトシンを示差的に修飾する試薬で処理する工程を含む、請求項４７又は４８記載の方法。
【請求項５０】
前記試薬が、亜硫酸水素塩を含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
前記試薬が、メチル化されたシトシンを含むＤＮＡを優先的に切断する１種又は複数の酵素を含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
前記試薬が、メチル化されないシトシンを含むＤＮＡを優先的に切断する１種又は複数の酵素を含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５３】
前記工程（ｂ）が、増幅反応を含む、請求項４７又は４８記載の方法。
【請求項５４】
前記増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
前記ＰＣＲが、メチル化−特異的ＰＣＲである、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記増幅反応が、核酸配列ベースの増幅である、請求項５３記載の方法。
【請求項５７】
前記増幅反応が、鎖置換反応である、請求項５３記載の方法。
【請求項５８】
前記増幅反応が、分枝ＤＮＡ増幅反応である、請求項５３記載の方法。
【請求項５９】
ゲノムＤＮＡ配列のレベルが、電気泳動により決定される、請求項４７又は４８記載の方法。
【請求項６０】
ゲノムＤＮＡ配列のレベルが、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションにより決定される、請求項４７又は４８記載の方法。
【請求項６１】
妊娠−関連障害が、子癇前症である、請求項４７又は４８記載の方法。
【請求項６２】
妊娠−関連障害が、早期分娩である、請求項４７又は４８記載の方法。
【請求項６３】
妊娠−関連障害が、妊娠悪阻である、請求項４７又は４８記載の方法。
【請求項６４】
妊娠−関連障害が、異所性妊娠である、請求項４７又は４８記載の方法。
【請求項６５】
妊娠−関連障害が、トリソミー２１である、請求項４７又は４８記載の方法。
【請求項６６】
妊娠−関連障害が、子宮内発育遅延である、請求項４７又は４８記載の方法。
【請求項６７】
ゲノム配列が、ＣｐＧアイランドである、請求項１、９、２２、３４、４７又は４８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００６年５月３日に出願された、米国特許仮出願第６０／７９７，４５６号の優先権を主張するものであり、この仮出願の内容は全体が本明細書に参照として組入れられている。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
妊娠又は出産時の合併症の可能性及び胎児の遺伝的欠陥を含む、妊娠に関連した状態の早期検出は、母体と胎児の両方の安全に必要な早期の医学的介入を可能にするので、これは極めて重大である。出生前診断は、絨毛膜絨毛検査（ＣＶＳ）又は羊水穿刺のような手法により胎児から単離された細胞を用い、慣習的に行われている。しかしこれらの従来の方法は、侵襲的であり、かつ最も慎重な操作であっても母体と胎児の両方に予測不可能なリスクが存在する(Taborら, Lancet 1:1287-1293, 1986)。
【０００３】
これらの侵襲的アプローチの代替が、いくつかの種類の胎児細胞が母体循環系に認められ(Johansenら, Prenat. Diagn. 15:921-931, 1995)、そしてより重要なことに、細胞−非含有胎児ＤＮＡの循環を、母体血漿及び血清中に検出することができる(Lo ら,., Lancet 350:485-487, 1997)という発見に従い、例えば胎児の異常を検出するための出生前スクリーニングのために開発されている。母体血液中の胎児ＤＮＡの量は、胎児細胞を単離しかつ濃厚化する工程を必要とする代替法とは対照的に、血漿又は血清の複雑な処置を行うことのない遺伝解析に十分であることが示されている。胎仔アカゲザル(Fetal rhesus)Ｄ（ＲｈＤ）遺伝子多型解析(Loら, N. Engl. J. Med. 339:1734-1738, 1998)、胎児の性別診断(Costaら, N. Engl. J. Med. 346:1502, 2002)、及びいくつかの胎児障害の診断(Amicucciら, Clin. Chem. 46:301-302, 2000；Saitoら, Lancet 356:1170, 2000；及び、Chiuら, Lancet 360:998-1000, 2002)は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)をベースにした技術を使用し、母体の血漿又は血清中の胎児のDNAを検出することにより実現されている。
【０００４】
加えて、母体血漿/血清中の胎児DNAの定量的異常が、子癇前症(Loら, Clin, Chem. 45:184-188, 1999、及び、Zhongら, Am. J. Obstet. Gynecol. 184:414-419, 2001)、胎児トリソミー21(Loら, Clin. Chem. 45:1747-1751, 1999、及びZhongら, Prenat. Diagn. 20:795-798, 2000)、及び妊娠悪阻(Sekizawaら, Clin. Chem. 47:2164-2165, 2001)において報告されている。出生前遺伝解析のための母体血液中の胎児核酸の検出も、米国特許第６，２５８，５４０号に開示されている。
【０００５】
母体血液中に存在する胎児ＲＮＡも、妊娠−関連した状態の診断道具として確立されている。例えば米国特許出願第０９／８７６，００５号は、母体血液中の胎児ＲＮＡの検出を基にした非侵襲的技術を開示し；米国特許出願第１０／７５９，７８３号は更に、母体血液中に存在するある種のｍＲＮＡ種（例えば、ｈＣＧ−β、ｈＣＲＨ、ｈＰＬ、ＫＩＳＳ１、ＴＰＦＩ２、及びＰＬＡＣｌ）の量は、子癇前症、胎児の染色体異数性、及び早期分娩のような妊娠−関連障害の診断、モニタリング、又は予測のマーカーとして使用することができることを開示している。
【０００６】
このＤＮＡの安定性は、胎児ＤＮＡ−ベースの診断に関する利点を提供するが、ひとつの重要な制限がこのアプローチには存在する：胎児及び母体の両方のDNAは、妊婦の血液の非細胞(acellular)部分、例えば血清又は血漿に存在する。従って、正確な診断を確実にするためには、胎児ＤＮＡを母体ＤＮＡから識別することが必要である。胎児及び母体ＤＮＡは、それらの異なるメチル化プロファイルにより識別することができることは、第２００３００４４３８８号として公開された米国特許出願第０９／９４４，９５１号において、最初に開示された。Ｌａｎｄｅｓらは、米国特許出願公開第２００３０２１１５２２号において、出生前診断に、示差的メチル化マーカーを使用することができることも提唱した。本開示において、第２１染色体に位置した多くのヒトゲノムＤＮＡ配列は、胎児に又は成人（例えば妊婦）に起源したゲノムＤＮＡにおいて示差的にメチル化される領域を含む遺伝子座として最初に同定された。従って、これらの示差的にメチル化されたゲノム遺伝子座は、胎児及び母体ＤＮＡの適切な同定又は定量をもたらし、その結果出生前状態の信頼できる診断を可能にする。
【発明の開示】
【０００７】
発明の簡単な概要
本発明の第一の態様において、胎児を身ごもった妊娠女性において妊娠−関連障害を検出又はモニタリングする方法が提供される。この方法は：（ａ）女性から生物学的試料を得る工程であり、ここで試料は、全血、血清、血漿、尿又は唾液である工程；（ｂ）試料中のＣｐＧ−含有ゲノム配列のメチル化状態を決定する工程であり、ここで胎児由来のゲノム配列及び女性由来のゲノム配列が、示差的にメチル化され、これにより試料中の女性由来のゲノム配列と胎児由来のゲノム配列を識別し、ここで該ゲノム配列は、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであり、少なくとも１個のシトシンを含み、及び第２１染色体上の領域内にあり、並びにここでこの領域は、（１）ＣＧＩ１３７、ホスホジエステラーゼ９Ａ（ＰＤＥ９Ａ）、ホモ・サピエンスタンパク質ホスファターゼ１、調節（阻害）サブユニット２偽遺伝子２（ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２）、Ｆｅｍ１Ａ（シーエレガンス(Caenorhabditis elegans)）への類似、ＣＧＩ００９、カルボニルレダクターゼ１（ＣＢＲ１）、ダウン症細胞接着分子（ＤＳＣＡＭ）、及び第２１染色体オープンリーディングフレーム２９（Ｃ２１ｏｒｆ２９）、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（ＨＬＣＳ）、及びＣＧＩ１３２からなる群より選択される、ゲノム遺伝子座；並びに、（２）この遺伝子座から１０ｋｂを超えない上流及び／又は下流のＤＮＡ配列：からなる、工程；（ｃ）胎児由来のゲノム配列のレベルを決定する工程；並びに、（ｄ）胎児由来のゲノム配列のレベルを、標準対照と比較する工程であり、ここで標準対照からの増加又は減少は、妊娠−関連障害の存在又は進行を示す工程：を含む。
【０００８】
一部の実施態様において、女性由来のゲノム配列はメチル化され、及び胎児由来のゲノム配列はメチル化されない。別の実施態様において、女性由来のゲノム配列はメチル化されず、及び胎児由来のゲノム配列はメチル化される。
【０００９】
一部の実施態様において、工程（ｂ）は、試料の、メチル化された及びメチル化されないＤＮＡを示差的に修飾する試薬による処理により実行される。例えば、この試薬は、亜硫酸水素塩を含んでよいか；又は、この試薬は、メチル化されたＤＮＡを優先的に切断する１種又は複数の酵素を含んでよいか；又は、この試薬は、メチル化されないＤＮＡを優先的に切断する１種又は複数の酵素を含んでよい。一部の実施態様において、工程（ｂ）は、メチル化−特異的ＰＣＲにより実行される。
【００１０】
第二の本発明の態様において、胎児を身ごもった妊娠女性において妊娠−関連障害を検出又はモニタリングする方法が提供される。この方法は：（ａ）女性由来の生物学的試料中のＤＮＡを得る工程であり、ここで試料は、全血、血清、血漿、尿又は唾液である工程；（ｂ）工程（ａ）由来のＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理する工程；並びに、（ｃ）工程（ｂ）由来のＤＮＡ及び２種のプライマーを用いて増幅反応を実行し、ＣｐＧ−含有ゲノム配列を増幅する工程であり、ここで該ゲノム配列は、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであり、少なくとも１個のシトシンを含み、及び第２１染色体上の領域内にあり、並びにここでこの領域は、（１）ＣＧＩ１３７、ホスホジエステラーゼ９Ａ（ＰＤＥ９Ａ）、ホモ・サピエンスタンパク質ホスファターゼ１、調節（阻害）サブユニット２偽遺伝子２（ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２）、Ｆｅｍ１Ａ（シーエレガンス）への類似、ＣＧＩ００９、カルボニルレダクターゼ１（ＣＢＲ１）、ダウン症細胞接着分子（ＤＳＣＡＭ）、第２１染色体オープンリーディングフレーム２９（Ｃ２１ｏｒｆ２９）、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（ＨＬＣＳ）、及びＣＧＩ１３２からなる群より選択される、ゲノム遺伝子座；並びに、（２）この遺伝子座から１０ｋｂを超えない上流及び／又は下流のＤＮＡ配列：からなり；並びに、ここで２種のプライマーの少なくとも１種は、胎児由来のゲノム配列へ示差的に結合する工程；並びに、（ｄ）工程（ｃ）由来のゲノム配列の増幅された部分のレベルを、標準対照と比較する工程であり、ここで標準対照からの増加又は減少は、妊娠−関連障害の存在又は進行を示す工程：を含む。
【００１１】
一部の実施態様において、増幅反応は、メチル化−特異的ＰＣＲのような、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。別の実施態様において、増幅反応は、核酸配列ベースの増幅、鎖置換反応、又は分枝ＤＮＡ増幅反応である。
【００１２】
この方法は、本発明の第一の態様において説明された方法に加え、子癇前症、早期分娩、妊娠悪阻、異所性妊娠、染色体異数性（例えば、トリソミー  ２１）、及び子宮内発育遅延のような状態の検出又はモニタリングに適している。
【００１３】
本発明の第三の態様において、妊娠−関連障害を検出及びモニタリングする方法が提供される。この方法は：（ａ）女性由来の生物学的試料中のＤＮＡを得る工程であり、ここで試料は、全血、血清、血漿、尿又は唾液である工程；（ｂ）工程（ａ）由来のＤＮＡを、メチル化された及びメチル化されないＤＮＡを示差的に修飾する試薬で処理する工程；（ｃ）工程（ｂ）由来のＣｐＧ−含有ゲノム配列ヌクレオチド配列を決定する工程であり、ここでゲノム配列は、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであり、少なくとも１個のシトシンを含み、及び第２１染色体上の領域内にあり、並びにここでこの領域は、（１）ＣＧＩ１３７、ホスホジエステラーゼ９Ａ（ＰＤＥ９Ａ）、ホモ・サピエンスタンパク質ホスファターゼ１、調節（阻害）サブユニット２偽遺伝子２（ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２）、Ｆｅｍ１Ａ（シーエレガンス）への類似、ＣＧＩ００９、カルボニルレダクターゼ１（ＣＢＲ１）、ダウン症細胞接着分子（ＤＳＣＡＭ）、及び第２１染色体オープンリーディングフレーム２９（Ｃ２１ｏｒｆ２９）、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（ＨＬＣＳ）、及びＣＧＩ１３２からなる群より選択される、ゲノム遺伝子座；並びに、（２）この遺伝子座から１０ｋｂを超えない上流及び／又は下流のＤＮＡ配列：からなる、工程；並びに、（ｄ）工程（ｃ）由来のヌクレオチド配列のプロファイルを、標準対照と比較する工程であり、ここで標準対照からのプロファイルの変化は、妊娠−関連障害の存在又は進行を示す工程：を含む。
【００１４】
一部の実施態様において、試薬は、亜硫酸水素塩を含むか；又は、試薬は、メチル化されたＤＮＡを優先的に切断する１種又は複数の酵素を含んでよいか；又は、試薬は、メチル化されないＤＮＡを優先的に切断する１種又は複数の酵素を含んでよい。
【００１５】
一部の実施態様において、本方法は、ゲノム配列を増幅するために、工程（ｂ）由来のＤＮＡ及び２種のプライマーを用いる増幅工程を更に含んでよい。例えば、この増幅工程は、メチル化−特異的ＰＣＲのような、ＰＣＲにより実行され得る。一部の実施態様において、工程（ｃ）は、質量分析により実行される。別の実施態様において、工程（ｃ）は、プライマー伸長により実行される。工程（ｃ）を実行するための他の可能性のある手段は、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション、リアル−タイムＰＣＲ、及び電気泳動を含む。
【００１６】
第四の本発明の態様において、妊婦の胎児においてトリソミー２１を検出する方法が提供される。この方法は：（ａ）女性から生物学的試料を得る工程であり、ここで試料は、全血、血清、血漿、尿又は唾液である工程；（ｂ）工程（ａ）由来の試料を、メチル化された及びメチル化されないＤＮＡを示差的に修飾する試薬で処理する工程；（ｃ）ＣｐＧ−含有ゲノム配列の対立遺伝子を分析する工程であり、ここでゲノム配列は、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであり、少なくとも１個のシトシンを含み、及び第２１染色体上の領域内にあり、並びにここでこの領域は、（１）ＣＧＩ１３７、ホスホジエステラーゼ９Ａ（ＰＤＥ９Ａ）、ホモ・サピエンスタンパク質ホスファターゼ１、調節（阻害）サブユニット２偽遺伝子２（ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２）、Ｆｅｍ１Ａ（シーエレガンス）への類似、ＣＧＩ００９、カルボニルレダクターゼ１（ＣＢＲ１）、ダウン症細胞接着分子（ＤＳＣＡＭ）、及び第２１染色体オープンリーディングフレーム２９（Ｃ２１ｏｒｆ２９）、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（ＨＬＣＳ）、及びＣＧＩ１３２からなる群より選択される、ゲノム遺伝子座；並びに、（２）この遺伝子座から１０ｋｂを超えない上流及び／又は下流のＤＮＡ配列：からなる、工程；並びに、（ｄ）対立遺伝子の比を決定する工程であり、ここでトリソミー２１を有さない胎児を身ごもっている女性の比からの偏差は、その胎児のトリソミー２１を示す工程：を含む。
【００１７】
一部の実施態様において、試薬は、亜硫酸水素塩を含む。別の実施態様において、試薬は、メチル化されたＤＮＡを優先的に切断する１種又は複数の酵素を含む。あるいは、試薬は、メチル化されないＤＮＡを優先的に切断する１種又は複数の酵素を含んでよい。
【００１８】
一部の実施態様において、本方法は、メチル化された又はメチル化されないゲノム配列を増幅するために、工程（ｂ）の後に増幅工程を更に含む。この増幅工程は、メチル化−特異的ＰＣＲのような、ＰＣＲにより実行されてよい。
【００１９】
特許請求された方法の工程（ｃ）の実施において、様々な可能性が存在する。例えば工程は、質量分析、プライマー伸長アッセイ、リアル−タイムＰＣＲ、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション、又は電気泳動により実行することができる。
【００２０】
本方法の一部の実施態様において、胎児由来の第２１染色体上のゲノム配列の２つの異なる対立遺伝子は、一塩基多型、挿入−欠失多型、又は単純な縦列反復配列多型を含む。
【００２１】
本発明の第五の態様において、胎児を身ごもった妊娠女性における妊娠−関連障害を検出又はモニタリングする方法が提供される。この方法は：（ａ）女性から生物学的試料を得る工程であり、ここで試料は、全血、血清、血漿、尿又は唾液である工程；（ｂ）試料中のＣｐＧ−含有ゲノム配列のレベルを決定する工程であり、ここで該ゲノム配列は、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであり、少なくとも１個のメチル化されないシトシンを含み、及び第２１染色体上の領域内にあり、並びにここでこの領域は、（１）ＣＧＩ１３７、ホスホジエステラーゼ９Ａ（ＰＤＥ９Ａ）、ホモ・サピエンスタンパク質ホスファターゼ１、調節（阻害）サブユニット２偽遺伝子２（ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２）、Ｆｅｍ１Ａ（シーエレガンス）への類似からなる群より選択される、ゲノム遺伝子座；並びに、（２）この遺伝子座から１０ｋｂを超えない上流及び／又は下流のＤＮＡ配列：からなる、工程；並びに、（ｃ）このゲノム配列のレベルを、標準対照と比較する工程であり、ここで標準対照からの増加又は減少は、妊娠−関連障害の存在又は進行を示す工程：を含む。
【００２２】
一部の実施態様において、工程（ｂ）は、血液試料中に存在するＤＮＡを、メチル化された及びメチル化されないシトシンを示差的に修飾する試薬により処理する工程を含む。この試薬は、亜硫酸水素塩を含んでよいか、又はこれは、メチル化されたシトシンを含むＤＮＡを優先的に切断する１種又は複数の酵素を含んでよいか、又はこれは、メチル化されないシトシンを含むＤＮＡを優先的に切断する１種又は複数の酵素を含んでよい。
【００２３】
一部の実施態様において、工程（ｂ）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、特にメチル化−特異的ＰＣＲのような増幅反応を含む。この増幅反応は、核酸配列ベースの増幅、鎖置換反応、分枝ＤＮＡ増幅反応であってもよい。一部の実施態様において、ゲノムＤＮＡ配列のレベルは、電気泳動又はポリヌクレオチドハイブリダイゼーションにより決定される。
【００２４】
この方法は、子癇前症、早期分娩、妊娠悪阻、異所性妊娠、トリソミー２１、及び子宮内発育遅延を含む、多くの妊娠−関連障害を検出又はモニタリングするのに適している。
【００２５】
本発明の第六の態様において、胎児を身ごもった妊娠女性における妊娠−関連障害を検出又はモニタリングする方法が提供される。この方法は：（ａ）女性から生物学的試料を得る工程であり、ここで試料は、全血、血清、血漿、尿又は唾液である工程；（ｂ）試料中のＣｐＧ−含有ゲノム配列のレベルを決定する工程であり、ここで該ゲノム配列は、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであり、少なくとも１個のメチル化されたシトシンを含み、及び第２１染色体上の領域内にあり、並びにここでこの領域は、（１）ＣＧＩ００９、カルボニルレダクターゼ１（ＣＢＲ１）、ダウン症細胞接着分子（ＤＳＣＡＭ）、第２１染色体オープンリーディングフレーム２９（Ｃ２１ｏｒｆ２９）、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（ＨＬＣＳ）、及びＣＧＩ１３２からなる群より選択される、ゲノム遺伝子座；並びに、（２）この遺伝子座から１０ｋｂを超えない上流及び／又は下流のＤＮＡ配列：からなる、工程；並びに、（ｃ）このゲノム配列のレベルを、標準対照と比較する工程であり、ここで標準対照からの増加又は減少は、妊娠−関連障害の存在又は進行を示す工程：を含む。
【００２６】
一部の実施態様において、工程（ｂ）は、血液試料中に存在するＤＮＡを、メチル化された及びメチル化されないシトシンを示差的に修飾する試薬で処理する工程を含む。この試薬は、亜硫酸水素塩を含んでよいか、又はこれはメチル化されたシトシンを含むＤＮＡを優先的に切断する１種又は複数の酵素を含んでよいか、又はこれは、メチル化されないシトシンを含むＤＮＡを優先的に切断する１種又は複数の酵素を含んでよい。
【００２７】
一部の実施態様において、工程（ｂ）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、特にメチル化−特異的ＰＣＲのような増幅反応を含む。増幅反応は、核酸配列ベースの増幅、鎖置換反応、分枝ＤＮＡ増幅反応であってもよい。一部の実施態様において、ゲノムＤＮＡ配列のレベルは、電気泳動又はポリヌクレオチドハイブリダイゼーションにより決定される。
【００２８】
この方法は、子癇前症、早期分娩、妊娠悪阻、異所性妊娠、トリソミー２１、及び子宮内発育遅延を含む、多くの妊娠−関連障害を検出又はモニタリングするのに適している。
【００２９】
前述の全ての態様における本発明の実践において、ＣｐＧアイランドは、場合によってはＣｐＧ−含有ゲノム配列として使用されることがあるが、別の場合には、ＣｐＧ−含有ゲノム配列は、ＣｐＧアイランドではないことがある。
【００３０】
本発明の方法は、全ての態様において、女性において実行されるあらゆる工程を伴うことなく実行することができる。これらの実施態様において、本発明の方法は、女性から生物学的試料を得る工程を省略し、試料について実行される最初に列記された工程で始まる。本出願における他の開示は全て、状況がそうでないことを明確に必要としない限りは、これらの実施態様に同等に適用される。
【００３１】
従って本実施態様の第一の態様の方法は：胎児を身ごもった妊娠女性における妊娠−関連障害を検出又はモニタリングする方法となり、これは：（ａ）［省略］；（ｂ）女性由来の生物学的試料中のＣｐＧ−含有ゲノム配列のメチル化状態を決定する工程であり、ここで試料は、全血、血清、血漿、尿又は唾液であり、ここで胎児由来のゲノム配列及び女性由来のゲノム配列は、示差的にメチル化され、これにより試料中の女性由来のゲノム配列と胎児由来のゲノム配列を識別し、ここで該ゲノム配列は、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであり、少なくとも１個のシトシンを含み、及び第２１染色体上の領域内にあり、並びにここでこの領域は、（１）ＣＧＩ１３７、ホスホジエステラーゼ９Ａ（ＰＤＥ９Ａ）、ホモ・サピエンスタンパク質ホスファターゼ１、調節（阻害）サブユニット２偽遺伝子２（ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２）、Ｆｅｍ１Ａ（シーエレガンス）への類似、ＣＧＩ００９、カルボニルレダクターゼ１（ＣＢＲ１）、ダウン症細胞接着分子（ＤＳＣＡＭ）、及び第２１染色体オープンリーディングフレーム２９（Ｃ２１ｏｒｆ２９）、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（ＨＬＣＳ）、及びＣＧＩ１３２からなる群より選択される、ゲノム遺伝子座；並びに、（２）この遺伝子座から１０ｋｂを超えない上流及び／又は下流のＤＮＡ配列：からなる、工程；（ｃ）胎児由来のゲノム配列のレベルを決定する工程；並びに、（ｄ）胎児由来のゲノム配列のレベルを標準対照と比較する工程であり、ここで標準対照からの増加又は減少は、妊娠−関連障害の存在又は進行を示す工程：を含む。
【００３２】
同様に、本実施態様の第二の態様の方法は：胎児を身ごもった妊娠女性における妊娠−関連障害を検出又はモニタリングする方法となり、これは：（ａ）［省略］；（ｂ）女性由来の生物学的試料のＤＮＡを亜硫酸水素塩で処置する工程であり、ここで試料は、全血、血清、血漿、尿又は唾液である工程；（ｃ）工程（ｂ）由来のＤＮＡ及び２種のプライマーを用いて増幅反応を行い、ＣｐＧ−含有ゲノム配列を増幅する工程であり、ここで該ゲノム配列は、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであり、少なくとも１個のシトシンを含み、及び第２１染色体上の領域内にあり、並びにここでこの領域は、（１）ＣＧＩ１３７、ホスホジエステラーゼ９Ａ（ＰＤＥ９Ａ）、ホモ・サピエンスタンパク質ホスファターゼ１、調節（阻害）サブユニット２偽遺伝子２（ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２）、Ｆｅｍ１Ａ（シーエレガンス）への類似、ＣＧＩ００９、カルボニルレダクターゼ１（ＣＢＲ１）、ダウン症細胞接着分子（ＤＳＣＡＭ）、第２１染色体オープンリーディングフレーム２９（Ｃ２１ｏｒｆ２９）、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（ＨＬＣＳ）、及びＣＧＩ１３２からなる群より選択される、ゲノム遺伝子座；（２）この遺伝子座から１０ｋｂを超えない上流及び／又は下流のＤＮＡ配列：からなり、並びにこれらの２種のプライマーの少なくとも１種は、胎児由来のゲノム配列に示差的に結合する工程；並びに、（ｄ）工程（ｃ）由来のゲノム配列の増幅された部分のレベルを標準対照と比較する工程であり、ここで標準対照からの増加又は減少は、妊娠−関連障害の存在又は進行を示す工程：を含む。
【００３３】
同様に、本実施態様の第三の態様の方法は：妊娠−関連障害を検出又はモニタリングする方法となり、これは：（ａ）［省略］；（ｂ）女性由来の生物学的試料のＤＮＡを、メチル化された及びメチル化されないＤＮＡを示差的に修飾する試薬で処置する工程であり、ここで試料は、全血、血清、血漿、尿又は唾液である工程；（ｃ）工程（ｂ）由来のＣｐＧ−含有ゲノム配列のヌクレオチド配列を決定する工程であり、ここで該ゲノム配列は、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであり、少なくとも１個のシトシンを含み、及び第２１染色体上の領域内にあり、並びにここでこの領域は、（１）ＣＧＩ１３７、ホスホジエステラーゼ９Ａ（ＰＤＥ９Ａ）、ホモ・サピエンスタンパク質ホスファターゼ１、調節（阻害）サブユニット２偽遺伝子２（ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２）、Ｆｅｍ１Ａ（シーエレガンス）への類似、ＣＧＩ００９、カルボニルレダクターゼ１（ＣＢＲ１）、ダウン症細胞接着分子（ＤＳＣＡＭ）、第２１染色体オープンリーディングフレーム２９（Ｃ２１ｏｒｆ２９）、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（ＨＬＣＳ）、及びＣＧＩ１３２からなる群より選択される、ゲノム遺伝子座；（２）この遺伝子座から１０ｋｂを超えない上流及び／又は下流のＤＮＡ配列：からなる工程；並びに、（ｄ）工程（ｃ）由来のヌクレオチド配列のプロファイルを標準対照と比較する工程であり、ここで標準対照からのプロファイルの変化は、妊娠−関連障害の存在又は進行を示す工程：を含む。
【００３４】
同様に、本実施態様の第四の態様の方法は：妊婦の胎児においてトリソミー２１を検出する方法となり、これは：（ａ）［省略］；（ｂ）女性由来の生物学的試料を、メチル化された及びメチル化されないＤＮＡを示差的に修飾する試薬で処置する工程であり、ここで試料は、全血、血清、血漿、尿又は唾液である工程；（ｃ）ＣｐＧ−含有ゲノム配列の対立遺伝子を分析する工程であり、ここで該ゲノム配列は、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであり、少なくとも１個のシトシンを含み、及び第２１染色体上の領域内にあり、並びにここでこの領域は、（１）ＣＧＩ１３７、ホスホジエステラーゼ９Ａ（ＰＤＥ９Ａ）、ホモ・サピエンスタンパク質ホスファターゼ１、調節（阻害）サブユニット２偽遺伝子２（ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２）、Ｆｅｍ１Ａ（シーエレガンス）への類似、ＣＧＩ００９、カルボニルレダクターゼ１（ＣＢＲ１）、ダウン症細胞接着分子（ＤＳＣＡＭ）、第２１染色体オープンリーディングフレーム２９（Ｃ２１ｏｒｆ２９）、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（ＨＬＣＳ）、及びＣＧＩ１３２からなる群より選択される、ゲノム遺伝子座；（２）この遺伝子座から１０ｋｂを超えない上流及び／又は下流のＤＮＡ配列：からなる工程；並びに、（ｄ）対立遺伝子の比を決定する工程であり、ここでトリソミー２１を有さない胎児を身ごもっている女性の比からの偏差は、胎児におけるトリソミー２１を示す工程：を含む。
【００３５】
同様に、本実施態様の第五の態様の方法は：胎児を身ごもった妊娠女性における妊娠−関連障害を検出又はモニタリングする方法となり、これは：（ａ）［省略］；（ｂ）女性由来の生物学的試料のＣｐＧ−含有ゲノム配列のレベルを決定する工程であり、ここで試料は、全血、血清、血漿、尿又は唾液であり、ここで該ゲノム配列は、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであり、少なくとも１個のメチル化されないシトシンを含み、及び第２１染色体上の領域内にあり、並びにここでこの領域は、（１）ＣＧＩ１３７、ホスホジエステラーゼ９Ａ（ＰＤＥ９Ａ）、ホモ・サピエンスタンパク質ホスファターゼ１、調節（阻害）サブユニット２偽遺伝子２（ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２）、Ｆｅｍ１Ａ（シーエレガンス）への類似からなる群より選択される、ゲノム遺伝子座；（２）この遺伝子座から１０ｋｂを超えない上流及び／又は下流のＤＮＡ配列：からなる工程；並びに、（ｃ）このゲノム配列のレベルを標準対照と比較する工程であり、ここで標準対照からの増加又は減少は、妊娠−関連障害の存在又は進行を示す工程：を含む。
【００３６】
同様に、本実施態様の第六の態様の方法は：胎児を身ごもった妊娠女性において妊娠−関連障害を検出又はモニタリングする方法となり、これは：（ａ）［省略］；（ｂ）女性由来の生物学的試料のＣＰＧ−含有ゲノム配列のレベルを決定する工程であり、ここで試料は、全血、血清、血漿、尿又は唾液であり、ここで該ゲノム配列は、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであり、少なくとも１個のメチル化されたシトシンを含み、及び第２１染色体上の領域内にあり、並びにここでこの領域は、（１）ＣＧＩ００９、カルボニルレダクターゼ１（ＣＢＲ１）、ダウン症細胞接着分子（ＤＳＣＡＭ）、第２１染色体オープンリーディングフレーム２９（Ｃ２１ｏｒｆ２９）、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（ＨＬＣＳ）、及びＣＧＩ１３２からなる群より選択される、ゲノム遺伝子座；（２）この遺伝子座から１０ｋｂを超えない上流及び／又は下流のＤＮＡ配列：からなる工程；並びに、（ｃ）このゲノム配列のレベルを標準対照と比較する工程であり、ここで標準対照からの増加又は減少は、妊娠−関連障害の存在又は進行を示す工程：を含む。
【００３７】
定義
本出願において使用される用語「妊娠−関連障害」は、妊婦、女性が身ごもっている胎児、又は女性と胎児の両方に影響を及ぼし得るいずれかの状態又は疾患を意味する。このような状態又は疾患は、限定された期間、例えば妊娠もしくは出産時にその症状を顕在化するか、又は胎児が誕生後の全生存期間続くことがある。妊娠−関連障害の一部の例は、異所性妊娠、子癇前症、早期分娩、及びトリソミー２１のような胎児の染色体異常である。
【００３８】
本明細書において使用される「ＣｐＧ−含有ゲノム配列」は、ヒト胎児又は妊婦のような個体のゲノムにおける規定された位置でのＤＮＡ配列のセグメントを意味する。典型的には「ＣｐＧ−含有ゲノム配列」は、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであり、及び少なくとも１個のシトシンを含む。好ましくはこれは、長さが少なくとも３０、５０、８０、１００、１５０、２００、２５０、又は３００個のヌクレオチドであり、及び少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、又は３０個のシトシンを含むことができる。例えば第２１染色体上の所定の遺伝子座（例えばＣｐＧアイランドＣＧＩ１３７、ＰＤＥ９Ａ、ＣＧＩ００９など）の周囲に中心のある領域内などの、所定の位置のいずれかひとつの「ＣｐＧ−含有ゲノム配列」に関して、ヌクレオチド配列変動は、個体毎に、及び同じ個体についてであっても対立遺伝子毎に存在することができる。典型的には、このような規定された遺伝子座（例えばＣｐＧアイランド）の周囲に中心のある領域は、その遺伝子座に加え、上流及び／又は下流の配列を含む。上流又は下流の各配列（各々、その遺伝子座の５’又は３’境界から数える）は、１０ｋｂほども長いことができ、別の場合は、５ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、５００ｂｐ、２００ｂｐ、又は１００ｂｐの長さであってよい。更に「ＣｐＧ−含有ゲノム配列」は、タンパク質生成のために転写された又は転写されないヌクレオチド配列を包含することができ、このヌクレオチド配列は、タンパク質−コード配列、非タンパク質−コード配列（例えば転写プロモーター）、又はそれらの組合せであることができる。
【００３９】
本出願における「ＣｐＧアイランド」は、最小の長さ、最小のＧＣ含量、及び観察されたＣｐＧ頻度／予測されたＣｐＧ頻度（ＯＣＦ／ＥＣＦ）の最低比を有するゲノムにおいて認められたＤＮＡ配列のセグメントを説明する。Yamadaらの論文(Genome Research 14:247-266, 2004)は、ＣｐＧアイランドの決定に関する一式の標準を説明しており：これは、長さが少なくとも４００個のヌクレオチドであり、５０％よりも大きいＧＣ含量を有し、かつ０．６よりも大きいＯＣＦ／ＥＣＦ比を有さなければならない。他の研究者ら(Takaiら, Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:3740-3745, 2002)は、長さが少なくとも２００個のヌクレオチドであり、５０％よりも大きいＧＣ含量を有し、かつ０．６よりも大きいＯＣＦ／ＥＣＦ比を有する配列として、より厳密さの低いＣｐＧアイランドを規定している。本出願において使用される第２１染色体上の「ＣｐＧアイランド」の概念は、前記判定基準を基にした染色体の走査のためにデザインされた現在利用可能なコンピュータプログラムのいずれかひとつにより提供される、ＣｐＧアイランドプロファイルが合致するものであり、スクリーニングプロセスにおいてウィンドウサイズ１００、２００、又は３００個のヌクレオチド及びシフト又はステップサイズ１、２、又は３個のヌクレオチドを使用する場合に得られた結果を包含している。本開示において命名された個々のＣｐＧアイランドは更に、本明細書の表１に示されているように、それらの対応するゲノムコンティグのＧｅｎＢａｎｋでの寄託番号、バージョン及び領域、ＵＣＳＣゲノムブラウザのＨｕｍａｎ  Ｍａｙ  ２００４  （ｈｇｌ７）アセンブリ(genome.ucsc.edu)の第２１染色体配列に対する染色体位置、並びに所定の条件下でＰＣＲプライマーにより増幅されるそれらの能力により規定される。
【００４０】
本明細書において使用される用語「エピジェネティックな状態」又は「エピジェネティック状況」は、主要なヌクレオチド配列以外の核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）の分子レベルでの任意の構造特徴を意味する。例えば、ゲノムＤＮＡのエピジェネティックな状態は、例えばそのメチル化パターン又はその細胞タンパク質との会合により決定もしくは影響されたその二次又は三次構造を含んでよい。
【００４１】
ゲノム配列のメチル化の状態を説明するために本出願において使用される用語「メチル化プロファイル」又は「メチル化状態」は、メチル化に関連した特定のゲノム遺伝子座でのＤＮＡセグメントの特徴を意味する。このような特徴は、このＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基のいずれかがメチル化されているかどうか、メチル化されたＣ残基（複数）の位置、残基のいずれか特定のストレッチでのメチル化されたＣの割合、及び例えば対立遺伝子の起源の差に起因したメチル化における対立遺伝子の差などを含むが、これらに限定されるものではない。用語「メチル化プロファイル」又は「メチル化状態」は、生物学的試料中のいずれか特定の残基のストレッチでのメチル化されたＣ又はメチル化されないＣの相対濃度又は絶対濃度も意味する。
【００４２】
本明細書において使用される用語「一塩基多型」又は「ＳＮＰ」は、同じゲノム配列の異なる対立遺伝子内の単独のヌクレオチド残基に存在するポリヌクレオチド配列変動を意味する。この変動は、ゲノム配列がタンパク質生成時に転写される場合に、ゲノム配列のコード領域又は非−コード領域（すなわちプロモーター領域）内で起こり得る。１つ又は複数のＳＮＰの検出は、単独のゲノム配列の異なる対立遺伝子の鑑別をもたらす。
【００４３】
本明細書において使用される用語「血液」は、妊婦又は妊娠の可能性について試験される女性からの血液試料又は血液調製品を意味する。この用語は、全血又は血液の任意の画分、例えば通常の定義の血清及び血漿を包含している。
【００４４】
本明細書において使用される用語「亜硫酸水素塩」は、メチル化されたシトシンを化学修飾することなく、シトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）に化学転換することが可能である、従ってＤＮＡのメチル化状態を基にＤＮＡ配列を示差的に修飾するために使用することができる、全ての種類の亜流酸水素塩、例えば亜硫酸水素ナトリウムを包含している。
【００４５】
本明細書において使用されるメチル化又は非−メチル化ＤＮＡを「示差的に修飾する」試薬とは、それにより識別可能な生成物がメチル化及び非−メチル化ＤＮＡから生じ、これによりＤＮＡメチル化状態を確定することができるプロセスにおいて、メチル化された及び／又はメチル化されないＤＮＡを修飾する任意の試薬を包含している。このようなプロセスは、化学反応（例えば亜硫酸水素塩によるＣ−＞Ｕ転換）及び酵素処理（例えば、メチル化−依存型エンドヌクレアーゼによる切断）を含むが、これらに限定されるものではない。従って、メチル化されたＤＮＡを優先的に切断又は消化する酵素は、ＤＮＡがメチル化された場合にはるかにより高い効率でＤＮＡ分子を切断又は消化することが可能であるものであるのに対し、メチル化されないＤＮＡを優先的に切断又は消化する酵素は、ＤＮＡがメチル化されない場合に有意により高い効率を示す。
【００４６】
用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形の、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及びそれらのポリマーを意味する。特に限定しない限りは、この用語は、参照核酸と類似した結合特性を有し、かつ天然のヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含している。別に指定しない限りは、特定の核酸配列は、それらの保存的に修飾された変種（例えば縮重コドン置換）、対立遺伝子、相同分子種、一塩基多型（ＳＮＰｓ）、及び相補配列、更には明確に指定された配列も暗に包含している。具体的には縮重コドン置換は、１つ又は複数の選択された（又は全ての）コドンの三番目の位置が、ゆらぎ塩基(mixed-base)及び/又はデオキシイノシン残基により置換されている配列を作出することにより実現され得る(Batzerら, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsukaら, J. Biol Chem. 260:2605-2608 (1985)；及び、Rossoliniら, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。用語核酸は、遺伝子、遺伝子によりコードされたｃＤＮＡ、及びｍＲＮＡと互換的に使用される。
【００４７】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の作出に関連したＤＮＡのセグメントを意味し；これは、遺伝子産物の転写／翻訳並びに転写／翻訳の調節に関連したコード領域に先行する及び後続する領域（リーダー及びトレーラー）、更には個々のコードセグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン）を含む。
【００４８】
本出願において用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、アミノ酸残基の高分子を意味するようここでは互換的に使用される。これらの用語は、１個又は複数のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の人工的化学模倣物質であるアミノ酸高分子に加え、天然のアミノ酸高分子及び非天然のアミノ酸高分子に適用されてよい。本明細書において使用されるこれらの用語は、その中のアミノ酸残基は、共有ペプチド結合により連結されているような、完全長タンパク質（すなわち抗原）を含む、あらゆる長さのアミノ酸鎖を包含している。
【００４９】
用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸及び合成アミノ酸、更には天然のアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物質を意味する。天然のアミノ酸は、遺伝暗号によりコードされたもの、更には後に修飾されるそのようなアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸及びＯ−ホスホセリンなどである。
【００５０】
アミノ酸は本明細書において、生化学命名に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)により推奨される一般に公知の三文字記号又は一文字記号のいずれかにより示される。同様にヌクレオチドは、それらの一般に受け入れられている一文字コードにより示される。
【００５１】
本出願において使用される「増加」又は「減少」は、確立された標準対照からの検出可能な正又は負の量の変化を意味する。増加は、対照値の好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは５０％、更により好ましくは２倍、なおより好ましくは少なくとも５倍、及び最も好ましくは少なくとも１０倍の正の変化である。同様に減少は、対照の好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは５０％、更により好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の負の変化である。比較基準からの量の変化又は差異を示す他の用語、例えば「より多い」又は「より少ない」は、本出願において先に説明したものと同様の様式で使用される。
【００５２】
本明細書において使用される「ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション法」は、好適なハイブリダイゼーション条件下で、既知の配列のポリヌクレオチドプローブとＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合を形成するその能力を基にした、ポリヌクレオチドの存在及び／又は量を検出する方法を意味する。このようなハイブリダイゼーション法の例は、サザンブロット及びノーザンブロットがある。
【００５３】
本明細書において使用される「プライマー」は、例えば様々なメチル化状態で、第２１染色体上のＣｐＧアイランドＣＧＩ１３７、ＰＤＥ９Ａ、又はＣＧＩ００９内に位置したもののような、特定のゲノム配列に対応したポリヌクレオチド配列を基にヌクレオチド配列を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅法において使用することができるオリゴヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチド配列の増幅のためのＰＣＲプライマーの少なくとも１つは、その配列に関して配列−特異的である。
【００５４】
本明細書において使用される「標準対照」とは、被験試料中に存在する例えば第２１染色体上のＣｐＧアイランドＣＧＩ１３７、ＰＤＥ９Ａ、又はＣＧＩ００９内に位置したもののような、特定のゲノム配列の量又はメチル化状態を比較するために、本発明の方法の使用に適した予め定められた量又はメチル化プロファイル（これは、メチル化に関連した複数の異なる区分可能な特性を含んでよい）のゲノム配列を含有する試料を意味する。標準対照として利用される試料は、胎児と母体の両方が妊娠−関連障害又は合併症を発症するリスクがない、正常胎児を身ごもっている平均的健常妊婦の血液中の、妊娠時の規定された時間（例えば第１三半期）について典型である関心対象の遺伝子の平均の量又はメチル化プロファイルを提供する。
【００５５】
妊婦を説明する文脈で使用される用語「平均」は、その女性が染色体異常の胎児を有する、又は妊娠−関連状態（例えば異所性妊娠、子癇前症又は早期分娩など）に罹患しているというような、少なくとも１種の関連状態を有さないという事実を意味する。他の文脈で使用される用語「平均」は、染色体が正常な胎児を妊娠し、かついかなる妊娠−関連疾患又は状態にも罹患していない健常女性の無作為に選択された群を代表する女性の血液中に認められる母体及び胎児起源の両方の特定のゲノム配列（例えば第２１染色体上のＣｐＧアイランドＣＧＩ１３７、ＰＤＥ９Ａ、又はＣＧＩ００９内に位置したもの）のメチル化プロファイルのような、ある特徴を意味する。この選択された群は、これらの女性間での関心対象のゲノム配列の平均の量又はメチル化プロファイルは、妥当な精度で、正常胎児を伴う健常妊婦の一般集団における対応するプロファイルを反映するために、十分な数の女性を含まなければならない。加えて選択された女性群は一般に、潜在的妊娠−関連障害の徴候に関して血液が試験される女性の在胎月齢と同様の在胎月齢を有する。本発明を実践するのに好ましい在胎月齢は、スクリーニングされる障害に応じて変動してよい。例えば妊婦は、子癇前症のリスクについて妊娠第２三半期の間にスクリーニングされることが好ましいのに対し、胎児の染色体異数性は、可能な限り早期にスクリーニングされ診断されることが好ましい。更に試験するのに好ましい在胎月齢は、試験における関心対象の遺伝子によっても異なってよい。
【００５６】
本明細書において使用される用語「子癇前症」は、妊娠時に生じる状態を意味し、その主な症状は、尿タンパク質及び浮腫（膨潤）の存在を随伴することが多い高血圧の様々な形である、子癇前症は時には、妊娠中毒と称され、これは発作を伴う子癇前症である「子癇」と称されるより重篤な障害に関連している。これらの状態は通常、妊娠後期（２０週以降）に発症するが、誕生直後又は妊娠２０週以前に発症することもある。
【００５７】
本明細書において使用される用語「早期分娩」又は「早産」は、約４０週の妊娠期間満期の３週以上前に始まる分娩で、治療しない場合未熟児に繋がることが多い分娩の状態を意味する。
【００５８】
本明細書において使用される用語「妊娠悪阻」は、妊娠中、特に第１三半期の、極端で持続する悪心及び吐気を意味する。悪心及び吐気は、脱水につながり、妊娠に必要な体重増加を妨げることがある。
【００５９】
「異所性妊娠」は、受精卵が子宮の外側に着床した異常妊娠を意味する。異所性妊娠のほとんどの症例において、卵は卵管内に定着するが、この用語は、受精卵が女性の卵巣、腹部又は頸部に着床する異常な妊娠も包含している。
【００６０】
発明の詳細な説明
Ｉ．  緒言
母体血漿中の胎児ＤＮＡの存在は、１９９７年に最初に報告され、かつ単純に母体血液試料の分析による非侵襲的出生前診断の可能性を提示している(Loら, Lancet 350:485-487, 1997)。今日まで、多くの可能性のある臨床適用が開発されている。特に母体血漿中の胎児DNA濃度の量的異常は、子癇前症、早期分娩、分娩前出血、侵襲的胎盤形成、胎児のダウン症、及びその他の胎児の染色体異数性を含む、多くの妊娠-関連障害に関連していることがわかっている。従って母体血漿中の胎児ＤＮＡの分析は、胎児母体の健全性のモニタリングの可能性のあるマーカーであることが示唆されている。
【００６１】
しかし胎児ＤＮＡは、母体血漿中のバックグラウンドの母体ＤＮＡと共存している。従ってほとんどの報告された適用は、Ｙ−染色体配列の検出に頼っており、その理由はこれらは最も好都合なことに母体ＤＮＡから識別可能であるからである。このようなアプローチは、現存するアッセイの適用可能性を、全ての妊娠のわずかに５０％に、すなわち男性胎児の場合に制限する。従って母体血漿検出のための性別と無関係の胎児ＤＮＡマーカーの開発の大きい必要性が存在する。
【００６２】
胎児及び母体ＤＮＡは、それらのメチル化状態の差異により識別することができることが、先に明らかにされた（米国特許出願公開第２００３００４４３８８号）。メチル化は、エピジェネティック現象であり、これはＤＮＡ配列の変化に関わることなく表現型を変更するプロセスを意味する。本発明者のひとり(Y.M.D. Lo)とそのグループは、ゲノムインプリンティングを示す遺伝子座であるＨ１９での父親−及び母親−から受け継いだ対立遺伝子の間のＤＮＡメチル化状態の差異（示差的メチル化、従って特定の対立遺伝子の親起源に関連した単独の遺伝子の２つの対立遺伝子の示差的発現）を調べることにより、母体血漿から胎児−由来の母親から受け継いだＤＮＡ配列を検出するためのエピジェネティックマーカー使用の実現可能性を最初に明らかにした(Poonら, Clin. Chem. 48:35-41, 2002)。Landesらも、非侵襲的出生前診断のためのエピジェネティックマーカーの使用を提唱した（米国特許出願公開第２００３０２１１５２２号）。
【００６３】
本発明者らは最近、胎盤−由来のＲＮＡを、母体血漿中で検出することができることを明らかにした(Ngら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:4748-4753, 2003)。他方で、正常な個人の血漿ＤＮＡは、主に造血細胞に由来することが示された(Luiら, Clin. Chem. 48:421-427, 2002)。従って母体ＤＮＡの支配的給源は、末梢血細胞由来であるのに対し、胎盤は、母体血漿へ放出される胎児ＤＮＡの可能性のある給源であることが仮定された。従って母体血漿中で検出するための汎用の胎児−特異性ＤＮＡマーカー開発の一つの戦略は、胎盤と母体末梢血細胞の間で示差的にメチル化された遺伝子を同定することである。
【００６４】
本発明者らは、最初に、第２１染色体上の特定のゲノム座に位置した多くのゲノム配列は、胎児由来（例えば胎盤由来）の胎児ＤＮＡと、母親の末梢血細胞由来の母体ＤＮＡの間で示差的にメチル化されていることを明らかにした。従ってこの発見は、胎児及び母体のゲノムＤＮＡを識別する新規アプローチ並びに非侵襲的出生前診断の新規方法を提供する。
【００６５】
ＩＩ．  全般的方法
本発明を実践する上で、分子生物学の分野において慣習的技術を利用する。本発明において使用する一般的方法を明らかにする基本書は、Sambrook及びRussellの「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」(第3版、2001)；Krieglerの「Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual」(1990)；並びに、「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausubelら編集, 1994))を含む。
【００６６】
核酸に関して、サイズは、キロベース（ｋｂ）又は塩基対（ｂｐ）のいずれかで示される。これらは、アガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動、配列決定された核酸、又は公開されたＤＮＡ配列に由来した概算値である。タンパク質に関して、サイズは、キロダルトン（ｋＤａ）又はアミノ酸残基数で示される。タンパク質サイズは、ゲル電気泳動、配列決定されたタンパク質、由来したアミノ酸配列、又は公開されたタンパク質配列から推定される。
【００６７】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、例えば、Beaucage及びCaruthersにより最初に説明された固相ホスホロアミダイトトリエステル法(Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981))に従うか、Van Devanterらにより説明された自動合成装置の使用(Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168 (1984))により、化学的に合成した。オリゴヌクレオチドの精製は、例えばPearson及びReanierにより説明されたような未変性アクリルアミドゲル電気泳動又は陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）(J. Chrom. 255: 137-149 (1983))などの、いずれかの技術分野において認められた戦略を用い実行される。
【００６８】
本発明のゲノム配列、例えばＣＧＩ１３７、ＰＤＥ９Ａ、及びＣＧＩ００９のような第２１染色体上のＣｐＧアイランド内に位置するもの、並びに合成オリゴヌクレオチドのポリヌクレオチド配列は、例えばWallaceらの二本鎖鋳型配列決定のための鎖終結法(Gene 16: 21-26 (1981))を用いて証明することができる。
【００６９】
ＩＩＩ．血液試料の獲得及びＤＮＡの抽出
本発明は、妊娠−関連状態又は障害の存在を検出及び／又は進行をモニタリングするための非侵襲的手段として、母体血液中に認められた胎児ＤＮＡのエピジェネティック状態を分析することに関する。従って本発明を実践する第一の工程は、妊婦から血液試料を得、その試料からＤＮＡを抽出することである。
【００７０】
Ａ．  血液試料の獲得
血液試料は、本発明の方法を用い試験するのに適した在胎月齢の妊婦から得られる。好適な在胎月齢は、以下に説明されるように、試験される障害によって決まる。女性からの血液採取は、一般に下記の病院又は診療所の標準プロトコールに従い実行される。適量の末梢血、例えば典型的には５〜５０ｍｌが採取され、更に調製されるまで、標準手順に従い貯蔵されてよい。
【００７１】
Ｂ．  血液試料の調製
本発明の母体血液中に認められた胎児ＤＮＡの分析は、例えば全血、血清又は血漿を用いて実行されてよい。母体血液からの血清又は血漿の調製法は、当業者に周知である。例えば妊婦の血液を、血液凝固を防ぐために、ＥＤＴＡ含有チューブ又はVacutainer SST(Becton Dickinson, フランクリンレーク, NJ)のような特定の市販の製品に入れ、その後血漿を、遠心分離により全血から得ることができる。他方で血清は、血液凝固後の遠心分離を伴う又は伴わずに得ることができる。遠心分離が使用される場合、これは典型的には、好適な速度、例えば１，５００〜３，０００ｘｇで行われるが、これらに限定されるものではない。血漿又は血清は、ＤＮＡ抽出のための新たなチューブに移す前に、追加の遠心分離工程に供されてもよい。
【００７２】
全血の非細胞部分に加え、ＤＮＡも、女性からの全血試料の遠心分離及び血漿の除去後に得ることができる、バフィーコート部分に濃厚化された、細胞画分から回収されてよい。
【００７３】
Ｃ．  ＤＮＡの抽出
血液を含む生物学的試料からＤＮＡを抽出する多くの方法が存在する。ＤＮＡ調製の一般的方法（例えば、Sambrook及びRussell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第3版, 2001に記載)は、以下である：様々な市販の試薬又はキット、例えばQiaAmp DNA Mini Kit又はQiaAmp DNA Blood Mini Kit(Qiagen, ヒルデン, 独国)、GenomicPrep(商標)Blood DNA Isolation Kit(Promega, マジソン, WI)、及びGFX(商標)Genomic Blood DNA Purification Kit(Amersham, ピスカタウェイ, NJ)などを使用し、妊婦由来の血液試料からＤＮＡを得ることができる。これらの方法の２種以上の組合せを使用してもよい。
【００７４】
ＩＶ．  ＤＮＡのメチル化−特異的化学修飾
妊婦の血液試料からの抽出時に、ＤＮＡは、メチル化−示差的様式でＤＮＡを化学修飾することが可能である試薬により処理され、すなわち、処理後に、メチル化されたシトシン（Ｃ）残基及びメチル化されないＣ残基から異なる識別可能な化学構造を生じる。典型的にはそのような試薬は、ＤＮＡ分子中のメチル化されないＣ残基（複数）と反応し、各メチル化されないＣ残基をウラシル（Ｕ）残基へ転換する一方で、メチル化されたＣ残基は変化しないままである。このＣ−＞Ｕ転換は、核酸の一次配列の変化を基にしたメチル化状態を検出及び比較することができる。本目的に適した試薬の例は、亜硫酸水素ナトリウムのような亜硫酸水素塩である。ＤＮＡの化学修飾に亜硫酸水素塩を使用する方法は、当該技術分野において周知であり（例えば、Hermanら, Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:9821-9826, 1996を参照のこと)、ここでは詳細には論じない。
【００７５】
当業者が認めるように、ここでは名称を挙げないがメチル化された及びメチル化されないＤＮＡを示差的に修飾する同じ化学特性（又はいずれか他の機構により）を有するいずれか他の試薬を、本発明の実践に使用することができる。例えばＤＮＡのメチル化−特異的修飾は、メチル化−感受性制限酵素によっても実行され、その一部は典型的には、メチル化されないＤＮＡ断片を切断するが、メチル化されたＤＮＡ断片は切断しないのに対し、他のもの（例えば、メチル化−依存型エンドヌクレアーゼＭｃｒＢＣ）は、メチル化されたシトシンを含むＤＮＡを切断するが、メチル化されないＤＮＡは切断しない。加えて、化学修飾と制限酵素処理の組合せ、例えば一緒にした亜硫酸水素塩制限併用分析（ＣＯＢＲＡ）を、本発明の実践に使用することができる。
【００７６】
Ｖ．  ポリヌクレオチド配列増幅及び決定
メチル化−示差的様式でＤＮＡを化学修飾した後、次に処理されたＤＮＡを、配列−ベースの分析に供し、その結果、胎児ＤＮＡ由来の１種又は複数の本発明のゲノム配列（例えばＣＧＩ１３７、ＰＤＥ９Ａ、及びＣＧＩ００９のような、第２１染色体上のＣｐＧアイランド内に位置するもの）を、母体ＤＮＡ由来のそれらの対応物から識別することができ、かつ胎児のゲノム配列メチル化プロファイルを決定し、かつ標準対照と比較することができる。更に、一旦胎児起源のひとつの特定のゲノム配列が、母体対応物と比べ高メチル化されるか又は低メチル化されることが決定されされたならば、この胎児のゲノム配列の量は、その特異的メチル化状態を基に決定することができる。引き続き、この量は、標準対照値と比較され、ある種の妊娠−関連障害の可能性の指標として役立つ。
【００７７】
Ａ．  ヌクレオチド配列の増幅
メチル化特異的修飾後の、ゲノム配列の配列解析前に、増幅反応は任意である。一部の本発明の実施態様において、増幅は、特定のメチル化パターンを有する第２１染色体上のＣｐＧ−含有ゲノム配列を優先的に増幅するために実行され、その結果ひとつの特定の給源由来の、例えば胎盤又は胎児の他の組織由来のゲノム配列のみが、検出されかつ分析される。
【００７８】
様々なポリヌクレオチド増幅法が、十分に確立され、かつ研究に頻用されている。例えば、ポリヌクレオチド配列増幅に関するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の一般的方法は、当該技術分野において周知であり、従ってここでは詳細に説明しない。ＰＣＲの方法、プロトコール、プライマーデザインの原理の総説に関しては、例えばInnisらの「PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications」, Academic Press, Inc. N. Y., 1990を参照のこと。ＰＣＲ試薬及びプロトコールは、Roche Molecular Systemsのような商業的業者から入手することもできる。
【００７９】
ＰＣＲは、熱に安定した酵素を使用する自動化されたプロセスとして最も頻繁に実行される。このプロセスにおいて、反応混合物の温度は、変性領域、プライマーアニーリング領域、及び伸長反応領域を自動的に循環される。具体的にこの目的に適合された装置が、市販されている。
【００８０】
標的ポリヌクレオチド配列（例えば、胎児及び母体配列が示差的にメチル化される第２１染色体上のＣｐＧ−含有ゲノム配列）のＰＣＲ増幅は、典型的には本発明の実践において使用されるが、当業者は、母体血液試料に認められたゲノム配列の増幅は、その各々は十分な増幅を提供する、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写−媒介型増幅、及び自家持続配列複製法又は核酸配列−ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）のようないずれか公知の方法で実現することができることを認めるであろう。より最近になって開発された分岐ＤＮＡ技法も、特定のメチル化パターンを示す本発明の特定のゲノム配列の存在を定性的に示すため、又は母体血液中のこの特定のゲノム配列の量を定量的に決定するために使用することができる。臨床試料における核酸配列の直接定量に関する分岐ＤＮＡシグナル増幅の総説については、Nolte, Adv. Clin. Chem. 33:201-235, 1998を参照のこと。
【００８１】
Ｂ．  ポリヌクレオチド配列の決定
ポリヌクレオチド配列決定の技術も、よく確立されており、関連研究分野で広く実践されている。例えば、ポリヌクレオチド配列決定の基本原理及び一般技術は、分子生物学及び組換え遺伝子の様々な研究論文及び専門書に説明されており、例えばWallaceらの論文(前掲)；Sambrook及びRussellの論文(前掲)；並びに、Ausubelらの論文(前掲)がある。手動又は自動のいずれかで、研究室において日常的に実践されているＤＮＡ配列決定法は、本発明の実践に使用することができる。本発明の方法の実践のためにポリヌクレオチド配列の変化（例えばＣ−＞Ｕ）を検出するのに適した追加の手段は、質量分析、プライマー伸長、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション、リアル−タイムＰＣＲ、及び電気泳動を含むが、これらに限定されるものではない。
【００８２】
ＶＩ．  標準対照の確立
本発明の方法の実践のために標準対照を確立する目的で、健常胎児を身ごもっている健常な妊婦の群が、最初に選択される。これらの女性は、同様の在胎月齢であり、これは子癇前症、胎児の染色体異数性、及び早期分娩などの状態の本発明の方法を用いるスクリーニングに適当な妊娠期間内である。同様に標準対照が、健常な非−妊婦の群からの試料を用いて確立される。
【００８３】
選択された妊婦及び女性たちが身ごもっている胎児の健常な状態は、女性の血圧のモニタリング、分娩開始の記録、並びにＣＶＳ及び羊水穿刺を用いる胎児の遺伝分析の実行を含むが、これらに限定されるものではない、よく確立された日常的に使用される方法により確認される。
【００８４】
更に、健常な胎児を身ごもっている健常な妊婦の選択された群は、妥当なサイズでなければならず、その結果母体血液中の胎児を起源とする本発明のゲノム配列の平均量、又はこの群から得られた母体血液中の胎児ゲノム配列のメチル化プロファイルは、健常な胎児を身ごもっている健常な女性の一般集団の中の正常又は平均の量又はメチル化プロファイルの代表と当然みなすことができる。選択された群は、少なくとも１０名の女性を含むことが好ましい。
【００８５】
胎児のゲノム配列メチル化プロファイルに関する標準対照は、この特定のゲノム配列のメチル化状態の複数の差異及び区分可能な態様を反映している。例えば、メチル化プロファイルのひとつの態様は、いずれか所定のＣ残基がメチル化されているかどうかであり；別の態様は、特定のゲノム配列内のメチル化されたＣ塩基の数であり；このプロファイルの更なる態様は、いずれか所定の位置でメチル化されたＣの割合である。メチル化プロファイルの追加の態様は、メチル化の対立遺伝子の差、示差的にメチル化された対立遺伝子の比などを含むが、これらに限定されるものではない。胎児ゲノム配列メチル化プロファイルは、例えば胎盤又は他の胎児組織などの組織の種類に応じて変動してもよい。従って個別の標準対照は、試験において使用される様々な胎児組織について確立されてよい。
【００８６】
選択された健常な対照群の各女性において認められた個別の値を基にした母体血液中に存在する特定の胎児ゲノム配列について、一旦平均レベル又はメチル化プロファイルが確立されたならば、この平均又は中央値又は代表値又はプロファイルは、標準対照とみなされる。従って同様の胎児ゲノム配列の量又は同様の胎児ゲノム配列のメチル化プロファイルを含む血液試料は、標準対照として使用することができる。更に平均又は中央値又は代表量のゲノムＤＮＡ配列、もしくは平均又は中央値又は代表のメチル化プロファイルのゲノムＤＮＡ配列を含む溶液を、人工的に集成することができ、これは標準対照として役立つ。加えて個別の標準対照が、胎児起源のゲノム配列のメチル化プロファイルの様々な態様について確立されてもよい。
【実施例】
【００８７】
下記実施例は、単に例証により提供され、限定するものではない。当業者は、本質的に同じ又は同様の結果を得るために、変更又は修飾することができる様々な重要でないパラメータを容易に認めるであろう。
【００８８】
実施例１
本発明者らは、母体血液中の胎児−特異的であるエピジェネティックマーカーを同定することを目的とした。先行するデータは、母体血漿中の胎児ＤＮＡ分子は、主に胎盤に由来する(Chimら, Proc Natl Acad Sci USA., 102: 14753-14758；Masuzakiら, J Med Genet 41, 289-292, 2004；Floriら, Hum Reprod 19, 723-724, 2004)が、母体血漿中のバックグラウンドＤＮＡは、母体血液細胞に由来する(Luiら, Clin Chem 48, 421-427, 2002)ことを示唆している。従って、胎児のエピジェネティックマーカーを同定するために、これら２種の組織型間で示差的メチル化を明らかにする遺伝子座を確定することを目的として、遺伝子座のメチル化プロファイルを胎盤組織及び母体血液細胞の両方で評価した。このようなマーカーは、出生前診断及び妊娠−関連状態のモニタリングに使用することができる。
【００８９】
材料及び方法
ＣｐＧ−含有ゲノム配列の同定。ＤＮＡメチル化は、ＣｐＧジヌクレオチド中のシトシン残基の５番目の炭素位置へのメチル基の付加を意味する。第２１染色体ｑ上のそのようなＣｐＧジヌクレオチドのクラスターは、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｓｉｔｅのゲノムブラウザ(genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)によりコンピュータで同定した(Yamadaら, Genome Res 14, 247-266, 2004)。ＣｐＧ部位は更に、下記判定基準を基に予備選択した(subselect)：最低のグアニン及びシトシン含量が50％、観察されたCpG頻度/予想されたＣｐＧ頻度の最小比が少なくとも０．６である、長さが少なくとも４００ｂｐのＤＮＡ配列のストレッチ。ＣｐＧ含有ゲノム配列が同定された後、本発明者らは、先に同定されたゲノム領域の更に上流及び下流のＣｐＧ部位へ、例えばＰＤＥ９Ａ領域Ａ及びＣに分岐させた(branched)。
【００９０】
対象の募集及び試料採取。胎盤組織及び対応する血液試料を、妊娠の第１及び第３三半期の女性から収集した。胎盤組織は、帝王切開出産後の第３三半期対象から、及び妊娠中絶後の第１三半期対象から得た。分娩の始まる前又は任意の産科手技の行われる前に、母体の血液（１０ｍＬ）を、ＥＤＴＡ血液チューブに収集した。血液試料は、１６００ｘｇで、４℃で１０分間遠心した。血漿を慎重に除いた後、バフィーコート部分を得、これを−２Ｏ℃で個別に貯蔵した。胎盤組織は、リン酸緩衝生理食塩水ですすぎ、飾りのない(plain)ポリプロピレン製チューブ中で−８０℃で貯蔵した。
【００９１】
亜硫酸水素塩処理塩基配列決定。ＤＮＡを、胎盤組織及び母体バフィーコートから、各々、QIAamp DNA Mini Kit及びQIAanip DNA Blood Mini Kit(Qiagen, ヒルデン, 独国)を製造業者の指示に従い使用し、抽出した。各試料に関して、CpGenome DNA Modification Kit(Intergen, ブルリントン, MA)を製造業者の指示に従い使用し、ＤＮＡ  １μｇを、亜硫酸水素塩転換に供し、これはメチル化されないシトシン残基をウラシルへ転換するが、メチル化されたシトシン残基は未変化のまま留める。次に亜硫酸水素塩転換されたＤＮＡは、ＣｐＧ部位に隣接するプライマー対（表１）による、ＰＣＲ増幅に供した。一部のＣｐＧ−含有ゲノム配列は、２又は３種のＰＣＲ、すなわち領域Ａ、Ｂ及びＣにより調べた。プライマーは、あらゆる可能性のあるメチル化されたシトシン残基に結合しないようにデザインした。これらのプライマーは、例証として示しているが、この目的のために使用することができるプライマーの範囲を限定するものとみなしてはならない。TaqMan PCR Core Reagent Kit (Applied Biosystems, フォスターシティ, CA)において供給された試薬を使用した。各ＰＣＲのための試薬組成は、表１に詳述した。典型的には、ＰＣＲは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はベタインを含む又は含まずに、ＭｇＣｌ2、プライマー、ＴａｑＧｏｌｄ、１Ｘ緩衝液ＩＩ、各ｄＮＴＰの２００μＭを含み、最終反応容積２５μｌ中で実行した。温度プロファイルは、９５℃１０分間の最初の変性工程、それに続く９５℃で１分間、５５〜６５℃のアニーリング温度範囲で１分間（表１）、７２℃で１分間を４０サイクル、７２℃で１０分間の最後の伸長からなった。単独分子の分解時のメチル化状態を分析するために、ＰＣＲ産物は、プラスミドベクターへ、pGEM-T Easy Vector System (Promega, マジソン, WI)を使用し、ＴＡ−クローニングした。正の(positive)組換え体クローン由来の挿入断片を、BigDye Terminator Cycle Sequencing v1.1キット(Applied Biosystems)を製造業者の指示に従い使用するサイクルシークエンシングにより分析した。genCLEANカラム(Genetix)による精製後、試料８μｌを、Ｈｉ−Ｄｉホルムアミド１２μｌへ添加し、3100 DNA Analyzer (Applied Biosystems)上を試行させた。
【００９２】
【表１】
2009535050.tif 000003
【表２】
2009535050.tif 000004
【００９３】
データ比較及び統計解析。ＣｐＧ部位は、配列がシトシンである場合に、メチル化されたとしてスコア化し；それがチミン残基（ウラシルのデオキシ対応物）により占拠された場合に、メチル化されないとしてスコア化した。各ＣｐＧ部位に関するメチル化されたシトシン残基の割合を、胎盤組織試料に加え母体血液試料の間で決定した。メチル化された及びメチル化されないシトシンの分布を、各ＣｐＧ部位に関して、胎盤組織と母体バフィーコートの間で、カイ二乗検定により比較した。ｐ値＜０．０５は、統計学的に有意差とみなした。統計解析は、Sigma Stat 3.0ソフトウェア(SPSS)を用いて実行した。
【００９４】
結果と考察
コンピュータ検索により同定されたＣｐＧ−含有ゲノム配列の中で、１３遺伝子座に、本研究は注目した。これらの遺伝子座の名称、染色体位置及びＧｅｎＢａｎｋ寄託番号を、表１に列記した。試験した各遺伝子座に関して、胎盤組織及び母体血液細胞上で亜硫酸水素塩処理塩基配列決定を実行した。
【００９５】
ＣＧＩ１３７。ＣＧＩ１３７のメチル化プロファイルを、５名の妊娠第３三半期から収集した胎盤組織及び対応する母体血液細胞間で試験した。５症例全ての領域Ａ及びＢに関する亜硫酸水素塩処理塩基配列決定データは、各々、図１Ａ及び１Ｂに示した。各パネルの各行は、１個のクローンに関する亜硫酸水素塩処理塩基配列決定の結果を示すのに対し、各列は、ゲノム配列内の個別のＣｐＧジヌクレオチドを表す。ＣｐＧ部位での配列決定されたクローン全ての中のメチル化されたクローンの割合であるメチル化指標は、５名の胎盤組織及び母体血液細胞試料の全てについて決定した。このデータは、図２Ａ及び２Ｂにまとめた。胎盤は、母体血液細胞に比べ、低メチル化されたことが認められる。カイ二乗検定を、各ＣｐＧ部位での胎盤組織及び母体血液細胞の間のメチル化された及びメチル化されないクローンの分布を比較するために、実行した。胎盤と母体血液細胞の間のメチル化指標の差は、２１種のＣｐＧ部位全てについて統計学的に有意であった（カイ二乗、Ｐ＜０．０００１、表２Ａ及び２Ｂ）。
【００９６】
【表３】
2009535050.tif 000005
【００９７】
【表４】
2009535050.tif 000006
【００９８】
ホスホジエステラーゼ９Ａ（ＰＤＥ９Ａ）。ＰＤＥ９Ａのメチル化プロファイルを、５名の妊娠第３三半期及び５名の第１三半期から収集した胎盤組織及び対応する母体血液細胞間で試験した。クローニング及び亜硫酸水素塩処理塩基配列決定を実行し、並びに領域Ａアンプリコンに関する胎盤組織及び母体血液細胞中の試験したＣｐＧ部位のメチル化指標を、図３Ａ及び３Ｂにまとめた。領域Ｂに関する対応するデータを、図３Ｃ及び３Ｄにまとめた。領域Ｃに関する第３三半期の胎盤組織及び母体血液細胞の間の比較を、図３Ｅに示した。概して、胎盤は、母体血液細胞に比べ、低メチル化された。先に説明したようにカイ二乗検定を実行し、これら２種の組織間の統計学的有意差を評価した。第３三半期の比較のＣｐＧ２２５０以外は全て、妊娠第１及び第３三半期の両方において統計学的に有意差があった（カイ二乗検定、表３Ａから３Ｅ）。
【００９９】
【表５】
2009535050.tif 000007
【０１００】
【表６】
2009535050.tif 000008
【０１０１】
【表７】
2009535050.tif 000009
【０１０２】
【表８】
2009535050.tif 000010
【０１０３】
【表９】
2009535050.tif 000011
【０１０４】
ホモ・サピエンスタンパク質ホスファターゼ１、調節（阻害）サブユニット２偽遺伝子２（ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２）。ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２領域Ａのメチル化プロファイルを、５名の妊娠第３三半期及び５名の第１三半期から収集した胎盤組織及び対応する母体血液細胞間で試験した。クローニング及び亜硫酸水素塩処理塩基配列決定を実行し、並びに胎盤組織及び母体血液細胞中の領域Ａに関する試験したＣｐＧ部位のメチル化指標を、図４Ａ及び４Ｂにまとめた。概して、胎盤は、母体血液細胞に比べ、低メチル化された。先に説明したようにカイ二乗検定を実行し、これら２種の組織間の統計学的有意差を評価した。試験したＣｐＧ部位の中で、２３種は、妊娠第３三半期において統計学的有意差があり、並びに２３名は、妊娠第１三半期において統計学的有意差があった（カイ二乗検定、表４Ａ及び４Ｂ）。加えて、ＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２領域ＢのＣｐＧ部位のメチル化プロファイルも、５名の妊娠第３三半期から収集した胎盤組織及び対応する母体血液細胞間のクローニング及び亜硫酸水素塩処理塩基配列決定により分析した。領域ＢのほとんどのＣｐＧ部位に関して、胎盤組織は、母体血液細胞に比べ、低メチル化された。領域Ｂのメチル化指標を、図４Ｃにまとめた。先に説明したようにカイ二乗検定を実行し、これら２種の組織間の統計学的有意差を評価した。１２種の試験したＣｐＧ部位の中で、５種は、統計学的に有意差があった（カイ二乗検定、表４Ｃ）。
【０１０５】
【表１０】
2009535050.tif 000012
【０１０６】
【表１１】
2009535050.tif 000013
【０１０７】
【表１２】
2009535050.tif 000014
【０１０８】
Ｆｅｍ１Ａ（シーエレガンス(C. elegans))への類似。Ｆｅｍ１Ａ（シーエレガンス）への類似のメチル化プロファイルを、５名の妊娠第３三半期から収集した胎盤組織及び対応する母体血液細胞間で試験した。クローニング及び亜硫酸水素塩処理塩基配列決定を実行し、並びに胎盤組織及び母体血液細胞中の試験したＣｐＧ部位のメチル化指標を、各々、図５Ａ及び５Ｂにまとめた。概して、胎盤は、母体血液細胞に比べ、低メチル化された。先に説明したようにカイ二乗検定を実行し、これら２種の組織間の統計学的有意差を評価した。試験したＣｐＧ部位の中で、８種は、領域Ａにおいて統計学的有意差があり、及び７種は、領域Ｂにおいて統計学的有意差があった（カイ二乗検定、表５Ａ及び５Ｂ）。
【０１０９】
【表１３】
2009535050.tif 000015
【０１１０】
【表１４】
2009535050.tif 000016
【０１１１】
ＣＧＩ００９。２名の母体血液細胞試料由来のＣＧＩ００９のメチル化プロファイルを、正常妊娠から収集した２名の第１三半期及び２名の第３三半期の胎盤組織試料、更には胎児がトリソミー２１を有する妊娠からの２名の第１三半期胎盤組織試料のものと比較した。クローニング及び亜硫酸水素塩処理塩基配列決定を実行し、並びに胎盤組織及び母体血液細胞中の試験したＣｐＧ部位のメチル化指標を、図６にまとめた。概して、胎盤は、母体血液細胞に比べ、高メチル化された。
【０１１２】
カルボニルレダクターゼ１（ＣＢＲ１）。２名の母体血液細胞試料由来のＣＢＲ１のプロファイルを、正常妊娠から収集した２名の第１三半期胎盤組織試料、更には胎児がトリソミー２１を有する妊娠からの２名の第１三半期胎盤組織試料のものと比較した。クローニング及び亜硫酸水素塩処理塩基配列決定を実行し、並びに胎盤組織及び母体血液細胞中の試験したＣｐＧ部位のメチル化指標を、図７にまとめた。概して、胎盤は、母体血液細胞に比べ、高メチル化された。２０種の試験したＣｐＧ部位の中で、正常妊娠及びトリソミー２１妊娠の両方の母体血液細胞及び第１三半期胎盤組織の間で全て、統計学的有意差があった（カイ二乗検定、表６）。
【０１１３】
【表１５】
2009535050.tif 000017
【０１１４】
ダウン症細胞接着分子（ＤＳＣＡＭ）。２名の母体血液細胞試料由来のＤＳＣＡＭのメチル化プロファイルを、正常妊娠から収集した２名の第１三半期及び２名の第３三半期の胎盤組織試料、更には胎児がトリソミー２１を有する妊娠からの２名の第１三半期の胎盤組織試料のものと比較した。クローニング及び亜硫酸水素塩処理塩基配列決定を実行し、並びに胎盤組織及び母体血液細胞中の試験したＣｐＧ部位のメチル化指標を、図８にまとめた。概して、胎盤は、母体血液細胞に比べ、高メチル化された。２７種の試験したＣｐＧ部位の中で、正常妊娠及びトリソミー２１妊娠の両方の母体血液細胞及び第１三半期胎盤組織の間で全て、統計学的有意差があった（カイ二乗検定、表７）。
【０１１５】
【表１６】
2009535050.tif 000018
【０１１６】
第２１染色体オープンリーディングフレーム２９（Ｃ２１ｏｒｆ２９）。２名の母体血液細胞試料由来のＣ２１ｏｒｆ２９のメチル化プロファイルを、正常妊娠から収集した１名の第１三半期及び２名の第３三半期の胎盤組織試料、更には胎児がトリソミー２１を有する妊娠からの２名の第１三半期の胎盤組織試料のものと比較した。クローニング及び亜硫酸水素塩処理塩基配列決定を実行し、並びに胎盤組織及び母体血液細胞中の試験したＣｐＧ部位のメチル化指標を、図９にまとめた。概して、胎盤は、母体血液細胞に比べ、高メチル化された。１６種の試験したＣｐＧ部位の中で、母体血液細胞とトリソミー２１妊娠第１三半期胎盤組織、正常妊娠の妊娠第１三半期及び第３三半期の胎盤組織の間で、各々、全て、９種及び１０種の部位が、統計学的有意差があった（カイ二乗検定、表８）。
【０１１７】
【表１７】
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【０１１８】
胎盤組織と母体血液細胞の間で示差的メチル化パターンを示さなかった遺伝子座。胎盤組織と母体血液細胞の間の示差的メチル化は、試験した遺伝子座全てについて普遍的には認められなかった。ＣＧＩ１１１のメチル化  プロファイルを、４名の妊娠第３三半期から収集した胎盤組織と対応する母体血液細胞の間で試験した。クローニング及び亜硫酸水素塩処理塩基配列決定を実行し、結果を図１０に示した。母体血液細胞及び胎盤組織の両方に由来するクローンは、優先的にメチル化されなかった。
【０１１９】
同様に、５名の妊娠第３三半期の母体血液細胞と胎盤組織の間のメチル化プロファイルは、ＣＧＩ１２１に関して、ＣｐＧ部位１６０３を除いて、有意差はなかった（図１１及び表９）。
【０１２０】
【表１８】
2009535050.tif 000020
【０１２１】
他方で、ＫＩＡＡ０６５６、熱ショック転写因子２結合タンパク質（ＨＳＦ２ＢＰ）及びＣＯＬ６Ａ１に関して、試験した胎盤組織及び母体血液細胞は、両方とも優先的にメチル化されたが、そのメチル化指標間に有意差はなかった。
【０１２２】
実施例２
胎盤組織と母体血液細胞の間で示差的メチル化プロファイルを伴うＣＧ−含有ゲノム配列は、母体血液検出のための胎児のエピジェネティックマーカーとして有用である。母体血液中の胎児−由来のＤＮＡ分子を母体に由来するものから識別するためには、アッセイは、各々示差的にメチル化された遺伝子座の胎盤−特異的エピジェネティック型の検出を目標としなければならない。ＣＧＩ１３７の胎盤−特異的型（図１）を、すなわちメチル化されない分子を標的化するアッセイが開発され、並びにその特異性について評価された。
【０１２３】
材料及び方法
試料の処理及びＤＮＡ抽出。第３三半期の胎盤組織試料及び対応する母体血液試料を、選択された(elective)帝王切開による出産を経験している対象から収集した。母体血液（１０ｍＬ）を、出産前と出産後に、ＥＤＴＡチューブに採取した。これらの血液試料を、１６００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離した。血漿を慎重に除去した後に、バフィーコート部分を得、個別に−２０℃で貯蔵した。更に血漿を、１６，０００ｘｇで１０分間遠心分離し、血漿１．６ｍＬを、清潔なポリプロピレン製チューブへ、下側層細胞ペレットを破壊しないように注意深く移した。胎盤組織の生検試料を、リン酸緩衝生理食塩水ですすぎ、飾りのないポリプロピレン製チューブ内で−８０℃で貯蔵した。QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, ヒルデン, 独国)を用い、胎盤組織からＤＮＡを抽出した。母体の血漿及びバフィーコート由来のＤＮＡを、QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, ヒルデン, 独国)を製造業者の指示に従い使用し、抽出した。胎盤及びバフィーコートの各ＤＮＡ試料について、１μｇ  ＤＮＡを、Methylamp(商標)DNA Modification Kit (Epigentek Inc., ニューヨーク, NY)により、製造業者の指示に従い、メチル化されないシトシン残基をウラシルへ転換するが、メチル化されたシトシン残基は未変化で残す亜硫酸水素塩転換に供した。１．６ｍＬ血漿から抽出されたＤＮＡも、亜硫酸水素塩転換に供した。バフィーコート及び胎盤のＤＮＡ調製物の９５：５の比の混合物で構成される、混合された亜硫酸水素塩−転換されたＤＮＡの追加のアリコートも調製した。
【０１２４】
均質ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤアッセイ。胎盤組織はＣＧＩ１３７で母体血液細胞に関して低メチル化されているので（図１及び２）、ＣＧＩ１３７のメチル化されない型の検出を標的とするアッセイをデザインした。本アッセイは、MassARRAY (Sequenom, サンディエゴ, CA)プラットフォームを基本にしている。メチル化特異的プライマーを、ＣＧＩ１３７のメチル化されない型の特異的増幅のためにデザインした。これらのプライマーの位置の図解は図１２に示し、これらのプライマー配列は表１０に列記した。フォワードプライマーは、ＣｐＧ部位４７２、４７７、４８１及び４８６に及ぶ。リバースプライマーは、ＣｐＧ部位５５３及び５６１に及ぶ。アンプリコンは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：  ＮＴ ０１１５１５の座標２７４２９９８−２７４３１３０間に広がる。ＣｐＧ部位５４１のメチル化状態を調べるために、均質MassEXTEND (hME)プロトコールを基本にしたプライマー伸長アッセイ（図１２）をデザインした。基本的に、このプライマーの伸長プライマーは、ＣｐＧ部位５４１までヌクレオチド３’へ広がる（表１０）。メチル化されない分子は、ｄｄ（２’，３’−ジデオキシヌクレオシド）ＡＴＰの取込みにより、１個のヌクレオチドだけ伸長される一方、メチル化された分子は、ｄＧＴＰ、引き続きｄｄＡＴＰの取込みにより、２個のヌクレオチドだけ伸長する。メチル化されない分子及びメチル化された分子は、引き続き検出され、それらの質量差について、MassARRAY(商標)Analyzer Compact (Sequenom)質量分析において分解される。
【０１２５】
【表１９】
2009535050.tif 000021
【０１２６】
胎盤（亜硫酸水素塩転換前のＤＮＡ  １５０ｎｇと等量）、母体バフィーコート試料及び混合物由来の亜硫酸水素塩−転換されたＤＮＡの３μＬに加え、亜硫酸水素塩−転換された血漿ＤＮＡの１０μＬ（母体血漿１．６ｍＬから抽出したＤＮＡと等量）を、各２５μＬのＰＣＲ反応において増幅した。各反応液は、２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 (Applied Biosystems)、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰの各々２００μＭ、ｄＵＴＰの４００μＭ(Applied Biosystems)、フォワード及びリバースプライマー各々２００ｎＭ(Integrated DNA Technologies, コラルビル, IA)、並びにAmpliTaq Gold（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ１Ｕ(Applied Biosystems)を含む、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝液(Applied Biosystems, フォスターシティー, CA)を含んだ。ＰＣＲ反応は、９５℃１０分間で開始し、引き続き９４℃で３０秒間の変性、６０℃で４０秒間のアニーリング、７２℃で４０秒間の伸長を４０サイクルし、並びに最後に７２℃で５分間のインキュベーションした。
【０１２７】
ＰＣＲ産物に、エビのアルカリホスファターゼ処理を施し、残留するｄＮＴＰを脱リン酸化し、後続のプライマー伸長アッセイにおけるそれらの取込みを防いだ。各２５μＬのＰＣＲ反応液に関して、ｈＭＥ緩衝液(Sequenom)０．３４μＬ、エビのアルカリホスファターゼ(Sequenom)0．６μＬ、及び水３．０６μＬを添加した。この反応混合液を、３７℃で４０分間インキュベーションし、引き続き８５℃で５分間失活させた。
【０１２８】
プライマー伸長反応に関して、１５００ｎＭの伸長プライマー(Integrated DNA Technologies)、１．１５ＵのThermosequenase (Sequenom)、並びにｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰ各６４μＭ(Sequenom)を含有する、塩基伸長反応カクテル４μＬを、ＰＣＲ産物１０μＬへ添加した。反応条件は、９４℃で２分間、引き続き９４℃で５秒間、５２℃で５秒間、及び７２℃で５秒間を７５サイクルであった。
【０１２９】
質量分析を妨害するかもしれない塩を除去するために、最終塩基伸長産物を、SpectroCLEAN (Sequenom)樹脂できれいにした。水２４μＬ及び樹脂１２ｍｇを、各塩基伸長産物に添加した。最終混合物を、回転板(rotator)で２０分間混合した。３６１ｇで５分間遠心分離した後、反応液およそ１０ｎＬを、SpectroPointナノディスペンサー(Sequenom)を用い、３−ヒドロキシピコリン酸のマトリックスを予めスポットした３８４−フォーマットSpectroCHIP(Sequenom)上に分注した。MassARRAY(商標)Analyzer Compact質量分析計(Sequenom)を使用し、SpectroCHIPからデータ獲得した。質量分析データを、SpectroTYPER (Sequenom)データベースへ解析のために自動的に取り込んだ。
【０１３０】
結果と考察
MassARRAY解析のための質量スペクトルを、図１３に示している。ＣＧＩ１３７のメチル化されない型のプライマー伸長産物を、胎盤及び出産前血漿ＤＮＡ試料に加え、母体バフィーコートと胎盤ＤＮＡの９５：５混合物において検出することができる。これらのデータは、本アッセイは、画分濃度５％まで低下された、母体血漿及びＤＮＡ混合物中のＣＧＩ１３７の胎盤−由来のメチル化されない型の検出に対し感度がよいことを示唆している。出産後母体血漿試料において、シグナルは検出されず、このことはＣＧＩ１３７のメチル化されない型の妊娠−特異性を確認している。母体バフィーコート試料中のシグナルの欠如も、本アッセイのＣＧＩ１３７のメチル化されない型の検出に対する特異性を確認している。まとめると、胎盤組織と母体血液細胞の間のＣＧＩ１３７のメチル化プロファイルの差異のために、母体血液細胞由来のＣＧＩ１３７メチル化された分子のバックグラウンド間で、ＣＧＩ１３７の胎盤−由来の型を検出することを目標とする、感度の良い特異的アッセイを開発することができる。胎盤は、胎児ＤＮＡの母体循環への放出の組織給源であり(Chimら, 前掲)、母体循環は母体血液細胞由来のＤＮＡの高いバックグラウンド含む(Liuら, 前掲)ので、胎盤−特異的エピジェネティックマーカーを標的化するアッセイは、母体血液中の胎児−特異的核酸分子を検出するために有用である。
【０１３１】
実施例３
別の方法である亜硫酸水素塩制限併用解析（ＣＯＢＲＡ）(Xiong及びLaird, Nucleic Acids Res 25: 2532-2534, 1997)を使用し、胎盤及び母体血液細胞由来のＤＮＡの間の第２１染色体上の３ゲノム配列（表１１）の示差的メチル化の存在を評価した。
【０１３２】
【表２０】
2009535050.tif 000022
【０１３３】
材料及び方法
亜硫酸水素塩制限併用解析(Combined Bisulfite Restriction Analysis) （ＣＯＢＲＡ）。ＤＮＡ  １μｇを、EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research, オレンジ, CA)により、製造業者の指示に従い、亜硫酸水素塩転換に供した。その後亜硫酸水素塩へ転換されたＤＮＡ（当初の非転換ＤＮＡ投入量を基に）４０ｎｇに、一部変更した実施例１に説明されたようなＰＣＲ増幅を施した。HotStar Taq DNA Polymerase Kit (Qiagen, ヒルデン, 独国)供給の試薬を使用した。各ＰＣＲのための試薬組成は、表１１に詳細に示した。典型的には、ＰＣＲは、ＭｇＣｌ2、プライマー、ＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝液、各ｄＮＴＰの５０μＭ、及び２Ｘ  ＰＣＲｘエンハンサー(Invitrogen, カールスバッド, CA)を含む、最終反応容積２０μｌで実行した。温度プロファイルは、最初の変性工程９５℃で１５分間、引き続き９５℃で２０秒間、５８もしくは６０℃で３０秒間（表１１）、７２℃で１．５分間の５０〜５５サイクル、並びに最後の伸長７２℃で３分間からなった。その後ＰＣＲ産物に、制限酵素消化を施した。各遺伝子座それぞれに使用した制限酵素は、亜硫酸水素塩転換後のメチル化された配列とメチル化されない配列の間のその識別能に関して選択した。本質的に制限部位は、メチル化された配列又はメチル化されない配列のいずれか一方のみに存在し、両方には存在せず、そのためこれらの配列の一方が消化されるのに対し、他方は依然無傷である（表１２）。制限酵素消化は、ＰＣＲ産物５μｌ、１Ｘ好適な緩衝液、及び１０Ｕ制限酵素（又は偽消化のために含まず）を含む、最終反応容積２０μｌ中で、製造業者の推奨温度で２時間実行した。全ての酵素は、New England Biolabs (ビバリー, MA)から購入した。その後消化産物は、ゲル電気泳動により分析した。
【０１３４】
【表２１】
2009535050.tif 000023
【０１３５】
クローニング及び亜硫酸水素塩処理塩基配列決定。先に示した「亜硫酸水素塩制限併用解析（ＣＯＢＲＡ）」セッションにおいて説明したものと同じＰＣＲ増幅反応由来のＤＮＡを、クローニング及び亜硫酸水素塩処理塩基配列決定に使用した。単独の分子の分解時のメチル化状態を分析するために、ＰＣＲ産物を、プラスミドベクターへ、pGEM-T Easy Vector System (Promega, マジソン, WI)を使用し、ＴＡ−クローニングした。正の組換え体クローン由来の挿入断片を、BigDye Terminator Cycle Sequencing v1.1キット(Applied Biosystems)を製造業者の指示に従い使用し、サイクルシークエンシングにより分析した。エタノール沈殿による精製後、これらの試料を、Ｈｉ−ジホルムアミド１０μｌに再懸濁し、3100 DNA Analyzer (Applied Biosystems)上を試行させた。
【０１３６】
結果と考察
ホロカルボキシラーゼ合成酵素（ＨＬＣＳ）。２名の母体血液細胞試料由来のＨＬＣＳの推定プロモーター領域のメチル化プロファイルを、正常妊娠から収集した２名の第１三半期及び２名の第３三半期胎盤組織試料、更にはトリソミー２１妊娠からの２名の第１三半期の胎盤組織試料のそれと比較した。ＣＯＢＲＡアッセイを行い、並びに領域Ａ、領域Ｂ１及び領域Ｂ２に関するゲル電気泳動データを、各々、図１４Ａ、１４Ｂ及び１４Ｃに示した。概して、胎盤は、母体血液細胞と比べ、高メチル化された。単独の分子の分解時のメチル化状態を更に分析するために、領域Ｂ２に関してクローニング及び亜硫酸水素塩処理塩基配列決定実験を実行し、図１７に示された結果は、ＨＬＣＳのメチル化は胎盤特異的であることを確認した。
【０１３７】
ＣＧＩ００９。２名の母体血液細胞試料由来のＣＧＩ００９のメチル化プロファイルを、正常妊娠から収集した２名の第１三半期及び２名の第３三半期胎盤組織試料、更にはトリソミー２１妊娠からの２名の第１三半期の胎盤組織試料のそれと比較した。ＣＯＢＲＡアッセイを行い、並びにゲル電気泳動データを、図１５に示した。概して、胎盤は、母体血液細胞と比べ、高メチル化された。
【０１３８】
ＣＧＩ１３２。２名の母体血液細胞試料由来のＣＧＩ１３２のメチル化プロファイルを、正常妊娠から収集した２名の第１三半期及び２名の第３三半期胎盤組織試料、更にはトリソミー２１妊娠からの２名の第１三半期の胎盤組織試料のそれと比較した。ＣＯＢＲＡアッセイを行い、並びにゲル電気泳動データを、図１６に示した。概して、胎盤は、母体血液細胞と比べ、高メチル化された。
【０１３９】
実施例４
胎盤組織及び母体血液細胞中で同定されたマーカーの示差的メチル化の特徴を基に、胎盤及び母体血液細胞由来のＤＮＡ間のＨＬＣＳ領域Ｂ２のゲノム配列（表１１）の示差的メチル化を定量的に分析するために、メチル化感受性制限酵素消化、それに続くリアルタイム定量的ＰＣＲを使用する別法を開発した。
【０１４０】
材料及び方法
メチル化感受性制限酵素消化。ＤＮＡを、QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, ヒルデン, 独国)を用い、胎盤組織から抽出した。母体バフィーコート及び血漿由来のDNAは、QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, ヒルデン, 独国)を用い、製造業者の指示に従い抽出した。胎盤及びバフィーコートＤＮＡ試料の各々について、ＤＮＡ  １００ｎｇに、メチル化感受性制限酵素消化を施した。制限酵素消化は、ＤＮＡ、１Ｘ好適な緩衝液、並びに２５ＵのＨｐａＩＩ及び５０ＵのＢｓｔＵＩ（又は偽消化のため含まず）を含む、最終反応容積５０μｌにおいて、製造業者の推奨温度で少なくとも１６時間実行した。各母体血漿試料に関して、血漿１．６ｍｌを、ＤＮＡ抽出に使用し、脱イオン水５０μｌで溶出し、その２１μｌに、制限酵素消化を施した。酵素消化は、ＤＮＡ、１Ｘ好適な緩衝液、並びに２０ＵのＨｐａＩＩ及び３０ＵのＢｓｔＵＩ（又は偽消化のため含まず）を含む、最終反応容積３０μｌにおいて、製造業者の推奨温度で少なくとも１６時間実行した。全ての酵素は、New England Biolabs(ビバリー, MA)から購入した。その後消化産物は、リアルタイム定量的ＰＣＲにより分析した。これらの選択された制限酵素は、メチル化されないＤＮＡのみを消化し、メチル化されたＤＮＡは消化しなかった。実施例３由来のデータは、ＨＬＣＳは、胎盤組織において高メチル化され及び母体血液細胞において低メチル化されたことを示したので、本発明者らは、母体血液細胞由来のほとんどのＤＮＡは消化され、結果制限酵素処理後検出不可能であるのに対し、ある割合の胎盤組織由来のＤＮＡは、検出可能であり続けると予想した。
【０１４１】
リアルタイム定量的ＰＣＲ。リアルタイムＰＣＲアッセイを、制限酵素消化を伴う及び伴わないＨＬＣＳゲノムＤＮＡの定量分析のために開発した。制限酵素処理したＤＮＡ又は偽消化試料４μｌを、リアルタイムＰＣＲアッセイに使用した。各反応液は、１Ｘ TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, フォスターシティ, CA)、３００ｎＭフォワードプライマー(5’-CCGTGTGGCCAGAGGTG-3’)、３００ｎＭリバースプライマー(5’-TGGGAGCCGGAACCTACC-3’)、及び100nMのTaqManプローブ(5’-6FAM-TCCCGACCTGGCCCTTTGCC-TAMRA-3 ’)を含んだ。温度プロファイルは、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、９５℃で１５秒、及び６０℃で１分間を５０サイクルであった。全ての反応は、２つ組で試行し、平均量を採用した。光学密度測定により当初定量した連続希釈したヒトゲノムＤＮＡは、本アッセイの定量標準として使用した。制限酵素消化後に検出可能なＨＬＣＳ  ＤＮＡはメチル化された画分を表したので、本発明者らは、メチル化指標としてリアル−タイム定量的ＰＣＲを表した。試料のメチル化指標は、酵素消化後のＨＬＣＳ  ＤＮＡ濃度を、偽消化で得られた濃度で除算することにより計算した。
【０１４２】
結果と考察
８名の母体血液細胞試料由来のＨＬＣＳの推定プロモーター領域のメチル化プロファイルを、正常妊娠から収集した２名の第１三半期及び２名の第３三半期の胎盤組織試料のそれと比較した。制限酵素消化、それに続くリアルタイムＰＣＲ分析を実行し、結果を図１８に示した。全ての母体血液細胞試料由来のＤＮＡは、制限酵素によりほとんど消化され、０に近づくメチル化指標を生じたのに対し；胎盤組織由来のＤＮＡは、部分的に消化され、０．５６７〜０．９６６の範囲のメチル化指標を生じた。
【０１４３】
先のデータは、胎盤は、胎児ＤＮＡの主要組織供給源であるのに対し、母体血液細胞は、母体血漿中で検出可能であるバックグラウンド母体ＤＮＡの主な貢献者であることを示唆している。本発明者らは、ＨＬＣＳ  ＤＮＡの胎盤−特異的（母体血液細胞に関して）画分、すなわちメチル化された又は非−消化画分は、母体血漿中で検出され、かつ妊娠−特異的であると考えている。２５名の正常妊娠個人から、対形成した出産前及び出産後の第３三半期血漿試料を収集した。制限酵素消化、それに続くリアルタイムＰＣＲアッセイを実行し、結果を図１９に示した。ＨＬＣＳシグナルは、酵素消化された出産前第３三半期血漿試料において正に検出され、出産後低下することが示されている。酵素消化後の出産後血漿試料中のＨＬＣＳ濃度の中央値は、酵素消化後の出産前の血漿試料のＨＬＣＳ濃度の中央値の８．１％であった（図１９Ａ）。酵素処理した出産前及び出産後の血漿のクリアランスパターンは、検出されたＨＬＣＳシグナルは、妊娠−特異的であることを指摘している。対照的に、偽制限酵素消化された出産後母体血漿中のＨＬＣＳ  ＤＮＡ濃度の中央値は、偽消化した出産前試料のそれの８３．８％であった（図１９Ｂ）。
【０１４４】
公開されたアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列を含む、本出願に引用された全ての特許、特許出願、及び他の刊行物は、その全体が全ての目的で参照として組入れられている。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１Ａ】対形成した胎盤組織及び母体血液細胞の間のＣＧＩ１３７（Ａ）領域Ａ及び（Ｂ）領域Ｂのクローニング及び亜硫酸水素塩処理塩基配列決定。個別のＣｐＧ部位は、ＵＣＳＣゲノムブラウザのＨｕｍａｎ  Ｍａｙ  ２００４  （ｈｇｌ７）アセンブリのｃｈｒ２１：４６，２４９，６３６  （＋１）に対して規定されたヌクレオチド位置で、第一行にわたって番号付けした。各後続行は、クローニングにより単離された単独のＤＮＡ分子におけるＣｐＧ部位にわたるメチル化状態を示す。黒丸及び白丸は、各々、メチル化された及びメチル化されないＣｐＧ部位を表す。胎盤組織試料由来のクローンは、接頭文字「ＰＬＮ」で記したのに対し、母体血液細胞由来のクローンは、接頭文字「ＭＢＮ」で記した。同じ妊娠個体由来の胎盤及び母体血液細胞は、「ＰＬＮ」又は「ＭＢＮ」の後の同じ試料番号により確定される。
【図１Ｂ】図１Ａに同じ。
【０１４６】
【図２Ａ】ＣＧＩ１３７（Ａ）領域Ａ及び（Ｂ）領域Ｂ内の試験したＣｐＧ部位の各々に関する胎盤試料及び母体血液細胞試料の配列決定されたクローンの全ての間でのメチル化指標のボックスプロット。ｘ−軸にわたり、個別のＣｐＧ部位を、ＵＣＳＣゲノムブラウザのＨｕｍａｎ  Ｍａｙ  ２００４  （ｈｇｌ７）アセンブリのｃｈｒ２１：４６，２４９，６３６  （＋１）に対するそれらのヌクレオチド位置で示した。
【図２Ｂ】図２Ａに同じ。
【０１４７】
【図３Ａ】領域Ａ（Ａ及びＢ）、領域Ｂ（Ｃ及びＤ）並びに領域Ｃ（Ｅ）に関する妊娠第３三半期及び妊娠第１三半期の間のＰＤＥ９Ａ内の試験されたＣｐＧ部位の各々に関する胎盤試料及び母体血液細胞試料の配列決定されたクローンの全ての間でのメチル化指標のボックスプロット。図３Ａ及び３Ｂに関して、ｘ−軸にわたり、個別のＣｐＧ部位が、ＵＣＳＣゲノムブラウザのＨｕｍａｎ  Ｍａｙ  ２００４  （ｈｇｌ７）アセンブリのｃｈｒ２１：４２，９７８，４２４  （＋１）の逆鎖に対するそれらのヌクレオチド位置で示され；並びに、図３Ｃ及び３Ｄに関して、ｃｈｒ２１：  ４２，９７８，７１８  （＋１）のフォワード鎖に対し；図３Ｅに関して、ｃｈｒ２１：４２，９７８，００５  （＋１）のフォワード鎖に対し示されている。
【図３Ｂ】図３Ａに同じ。
【図３Ｃ】図３Ａに同じ。
【図３Ｄ】図３Ａに同じ。
【図３Ｅ】図３Ａに同じ。
【０１４８】
【図４Ａ】（Ａ）妊娠第３三半期及び（Ｂ）妊娠第１三半期の間のＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２の領域Ａ内、並びに（Ｃ）妊娠第３三半期の間のＰＰＰ１Ｒ２Ｐ２の領域Ｂ内の試験されたＣｐＧ部位の各々に関する胎盤及び母体血液細胞試料の配列決定されたクローンの全ての間でのメチル化指標のボックスプロット。ｘ−軸にわたり、個別のＣｐＧ部位が、ＵＣＳＣゲノムブラウザのＨｕｍａｎ  Ｍａｙ  ２００４  （ｈｇｌ７）アセンブリのｃｈｒ２１：３６，１８０，４９３  （＋１）に対するそれらのヌクレオチド位置で示されている。
【図４Ｂ】図４Ａに同じ。
【図４Ｃ】図４Ａに同じ。
【０１４９】
【図５Ａ】Ｆｅｍ１Ａ（シーエレガンス）類似の（Ａ）領域Ａ及び（Ｂ）領域Ｂ内の試験されたＣｐＧ部位の各々に関する胎盤試料及び母体血液細胞試料の配列決定されたクローンの全ての間でのメチル化指標のボックスプロット。ｘ−軸にわたり、個別のＣｐＧ部位が、ＵＣＳＣゲノムブラウザのＨｕｍａｎ  Ｍａｙ  ２００４  （ｈｇｌ７）アセンブリのｃｈｒ２１：  １４，０５６，０７０  （＋１）に対するそれらのヌクレオチド位置で示されている。
【図５Ｂ】図５Ａに同じ。
【０１５０】
【図６】ＣＧＩ００９内の試験されたＣｐＧ部位の各々に関する胎盤試料及び母体血液細胞試料の配列決定されたクローンの全ての間でのメチル化指標のボックスプロット。ｘ−軸にわたり、個別のＣｐＧ部位が、ＵＣＳＣゲノムブラウザのＨｕｍａｎ  Ｍａｙ  ２００４  （ｈｇｌ７）アセンブリのｃｈｒ２１  ：  ２５，８５５，７０１  （＋１）に対するそれらのヌクレオチド位置で示されている。
【０１５１】
【図７】カルボニルレダクターゼ１内の試験されたＣｐＧ部位の各々に関する胎盤試料及び母体血液細胞試料の配列決定されたクローンの全ての間でのメチル化指標のボックスプロット。ｘ−軸にわたり、個別のＣｐＧ部位が、ＵＣＳＣゲノムブラウザのＨｕｍａｎ  Ｍａｙ  ２００４  （ｈｇｌ７）アセンブリのｃｈｒ２１：  ３６，３６３，５３８  （＋１）に対するそれらのヌクレオチド位置で示されている。
【０１５２】
【図８】ダウン症細胞接着分子内の試験されたＣｐＧ部位の各々に関する胎盤試料及び母体血液細胞試料の配列決定されたクローンの全ての間でのメチル化指標のボックスプロット。ｘ−軸にわたり、個別のＣｐＧ部位が、ＵＣＳＣゲノムブラウザのＨｕｍａｎ  Ｍａｙ  ２００４  （ｈｇｌ７）アセンブリのｃｈｒ２１  ：  ４１，１３９，８７２  （＋１）に対するそれらのヌクレオチド位置で示されている。
【０１５３】
【図９】Ｃ２１ｏｒｆ２９内の試験されたＣｐＧ部位の各々に関する胎盤試料及び母体血液細胞試料の配列決定されたクローンの全ての間でのメチル化指標のボックスプロット。ｘ−軸にわたり、個別のＣｐＧ部位が、ＵＣＳＣゲノムブラウザのＨｕｍａｎ  Ｍａｙ  ２００４  （ｈｇｌ７）アセンブリのｃｈｒ２１：  ４４，９５３，２８８  （＋１）に対するそれらのヌクレオチド位置で示されている。
【０１５４】
【図１０】対形成した胎盤組織及び母体血液細胞の間のＣＧＩ１１１のクローニング及び亜硫酸水素塩処理塩基配列決定。個別のＣｐＧ部位は、ＵＣＳＣゲノムブラウザのＨｕｍａｎ  Ｍａｙ  ２００４  （ｈｇｌ７）アセンブリのｃｈｒ２１：  ４４，６９９，０７２  （＋１）に対して規定されたヌクレオチド位置で、第一行にわたって番号付けした。各後続行は、クローニングにより単離された単独のＤＮＡ分子におけるＣｐＧ部位にわたるメチル化状態を示す。黒丸及び白丸は、各々、メチル化された及びメチル化されないＣｐＧ部位を表す。胎盤組織試料由来のクローンは、接頭文字「ＰＬＮ」で記したのに対し、母体血液細胞由来のクローンは、接頭文字「ＭＢＮ」で記した。同じ妊娠個体由来の胎盤及び母体血液細胞は、「ＰＬＮ」又は「ＭＢＮ」の後の同じ試料番号により確定される。
【０１５５】
【図１１】ＣＧＩ１２１内の試験されたＣｐＧ部位の各々に関する胎盤試料及び母体血液細胞試料の配列決定されたクローンの全ての間でのメチル化指標のボックスプロット。ｘ−軸にわたり、個別のＣｐＧ部位が、ＵＣＳＣゲノムブラウザのＨｕｍａｎ  Ｍａｙ  ２００４  （ｈｇｌ７）アセンブリのｃｈｒ２１：  ４５，２６２，１１２  （＋１）に対するそれらのヌクレオチド位置で示されている。
【０１５６】
【図１２】ＣＧＩ１３７の非メチル化型を標的化する相同ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤアッセイの図。増幅された領域に広がるヌクレオチド配列が示されている。オリジナルのＤＮＡ配列は、亜硫酸水素塩−転換された配列の上に並置している。ＣｐＧ部位は、「＋＋」印で確定される。ＣｐＧ部位は追加的に番号付けし、この番号付けは図１Ａ及び２Ａ並びに表２Ａに対応している。ＣｐＧジヌクレオチドの一部ではないシトシン残基は、「：」印で確定される。示された亜硫酸水素塩−転換された配列は、全てのＣｐＧ部位はメチル化されたという仮定を基にしている。フォワードプライマー、伸長プライマー及びリバースプライマーの並置は、亜硫酸水素塩−転換された配列の下側に示している。
【０１５７】
【図１３−１】ＣＧＩ１３７の非メチル化型を標的化する相同ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤアッセイの質量分析トレーシンング。純粋な胎盤ＤＮＡ、母体バフィーコートＤＮＡ、９５：５（母体バフィーコートＤＮＡ：胎盤ＤＮＡ）混合物、出産前及び後の母体血漿並びに非鋳型対照（ＮＴＣ）の結果を示している。全ての質量スペクトルに関して、ｘ−軸は、検出された伸長産物の分子量（鋭いピークで示される）を示すのに対し、ｙ−軸は、任意の単位で強度を示す。メチル化されない分子の予想された位置には、印を付けた。
【図１３−２】図１３−１に同じ。
【０１５８】
【図１４Ａ】（Ａ）ホロカルボキシラーゼ合成酵素の領域Ａ、（Ｂ）領域Ｂ１、及び（Ｃ）領域Ｂ２の亜硫酸水素塩制限併用解析（ＣＯＢＲＡ）。２種のトリソミー２１胎盤（Ｔ２１  ＰＬＮ）、２種の第１三半期正常胎盤（正常ＰＬＮ  １ｓｔ）、２種の第３三半期正常胎盤（正常ＰＬＮ  ３ｒｄ）、及び２種の第１三半期母体血液細胞（バフィーコート）を分析した。ＰＣＲ産物を、ＢｓｔＵＩ酵素を含む（＋）又は含まず（−）に消化した。ＤＮＡメチル化は、より小さいサイズの消化産物の出現により検出した。１ｋｂラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カールスバッド，  ＣＡ）（Ｍ）を、ゲル電気泳動において使用した。
【図１４Ｂ】図１４Ａに同じ。
【図１４Ｃ】図１４Ａに同じ。
【０１５９】
【図１５】ＣＧＩ００９のＣＯＢＲＡ分析。２種のトリソミー２１胎盤（Ｔ２１  ＰＬＮ）、２種の第１三半期正常胎盤（正常ＰＬＮ  １ｓｔ）、２種の第３三半期正常胎盤（正常ＰＬＮ  ３ｒｄ）、及び２種の第１三半期母体血液細胞（バフィーコート）を分析した。ＰＣＲ産物を、ＢｓｔＵＩ酵素を含む（＋）又は含まず（−）に消化した。ＤＮＡメチル化は、より小さいサイズの消化産物の出現により検出した。１ｋｂラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カールスバッド，  ＣＡ）（Ｍ）を、ゲル電気泳動において使用した。
【０１６０】
【図１６】ＣＧＩ１３２のＣＯＢＲＡ分析。２種のトリソミー２１胎盤（Ｔ２１  ＰＬＮ）、２種の第１三半期正常胎盤（正常ＰＬＮ  １ｓｔ）、２種の第３三半期正常胎盤（正常ＰＬＮ  ３ｒｄ）、及び２種の第１三半期母体血液細胞（バフィーコート）を分析した。ＰＣＲ産物を、ＢｓｔＵＩ酵素を含む（＋）又は含まず（−）に消化した。ＤＮＡメチル化は、より小さいサイズの消化産物の出現により検出した。１ｋｂラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カールスバッド，  ＣＡ）（Ｍ）を、ゲル電気泳動において使用した。
【０１６１】
【図１７】胎盤組織及び母体血液細胞の間のＨＬＣＳ領域Ｂ２のクローニング及び亜硫酸水素塩処理塩基配列決定。個別のＣｐＧ部位は、ＵＣＳＣゲノムブラウザのＨｕｍａｎ  Ｍａｙ  ２００４  （ｈｇｌ７）アセンブリのｃｈｒ２１：３７，２７４，６８２−３７，２７５，０３６の逆鎖に対して規定されたヌクレオチド位置で、第一行にわたって番号付けした。各後続行は、クローニングにより単離された単独のＤＮＡ分子におけるＣｐＧ部位にわたるメチル化状態を示す。黒丸及び白丸は、各々、メチル化された及びメチル化されないＣｐＧ部位を表す。トリソミー２１、正常第１三半期及び正常第３三半期の胎盤組織試料由来のクローンは、各々、接頭文字「Ｔ２１  ＰＬＮ」、「正常ＰＬＮ  １ｓｔ」及び「正常ＰＬＮ  ３ｒｄ」で記したのに対し、母体血液細胞由来のクローンは、接頭文字「バフィーコート」で記した。同じ妊娠個体由来の胎盤及び母体血液細胞は、接頭文字の後の同じ試料番号により確定される。
【０１６２】
【図１８】胎盤組織及び母体バフィーコート由来のＨＬＣＳ  ＤＮＡの定量。メチル化指標は、同じ試料の偽消化対照において決定された総濃度で除算した、制限酵素処理後のＨＬＣＳ  ＤＮＡ濃度と規定した。胎盤組織由来のＤＮＡは、「正常ＰＬＮ」と記し、母体バフィーコート由来のＤＮＡは、「ＭＢＣ」と記している。
【０１６３】
【図１９Ａ】第３三半期母体血漿中の胎児−特異性ＨＬＣＳ検出。ＨＬＣＳシグナルは、メチル化感受性制限酵素処理を行った（図１９Ａ）又は行わなかった（図１９Ｂ）母体血漿試料において検出した。出産前血漿試料を、「Ｐｒｅ」と記したのに対し、出産後血漿試料は、「Ｐｏｓｔ」と記した。制限酵素ＨｐａＩＩ及びＢｓｔＵＩを、消化反応において使用し、このプロットにおいて「（＋）」と記した。酵素処理しない偽消化は、「（−）」と記した。
【図１９Ｂ】図１９Ａに同じ。
【図１Ａ】
2009535050.tif 000024
【図１Ａ−２】
2009535050.tif 000025
【図１Ａ−３】
2009535050.tif 000026
【図１Ｂ】
2009535050.tif 000027
【図１Ｂ−２】
2009535050.tif 000028
【図１Ｂ−３】
2009535050.tif 000029
【図２Ａ】
2009535050.tif 000030
【図２Ｂ】
2009535050.tif 000031
【図３Ａ】
2009535050.tif 000032
【図３Ｂ】
2009535050.tif 000033
【図３Ｃ】
2009535050.tif 000034
【図３Ｄ】
2009535050.tif 000035
【図３Ｅ】
2009535050.tif 000036
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
2009535050.tif 000043
【図８】
2009535050.tif 000044
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【配列表】
2009535050000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年1月5日(2009.1.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
【表１】
2009535050.tif 000062
【表２】
2009535050.tif 000063
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
【表１９】
2009535050.tif 000064
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
【表２０】
2009535050.tif 000065
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
リアルタイム定量的ＰＣＲ。リアルタイムＰＣＲアッセイを、制限酵素消化を伴う及び伴わないＨＬＣＳゲノムＤＮＡの定量分析のために開発した。制限酵素処理したＤＮＡ又は偽消化試料４μｌを、リアルタイムＰＣＲアッセイに使用した。各反応液は、１Ｘ TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, フォスターシティ, CA)、３００ｎＭフォワードプライマー(5’-CCGTGTGGCCAGAGGTG-3’；配列番号６０)、３００ｎＭリバースプライマー(5’-TGGGAGCCGGAACCTACC-3’；配列番号６１)、及び100nMのTaqManプローブ(5’-6FAM-TCCCGACCTGGCCCTTTGCC-TAMRA-3 ’；配列番号６２)を含んだ。温度プロファイルは、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、９５℃で１５秒、及び６０℃で１分間を５０サイクルであった。全ての反応は、２つ組で試行し、平均量を採用した。光学密度測定により当初定量した連続希釈したヒトゲノムＤＮＡは、本アッセイの定量標準として使用した。制限酵素消化後に検出可能なＨＬＣＳ  ＤＮＡはメチル化された画分を表したので、本発明者らは、メチル化指標としてリアル−タイム定量的ＰＣＲを表した。試料のメチル化指標は、酵素消化後のＨＬＣＳ  ＤＮＡ濃度を、偽消化で得られた濃度で除算することにより計算した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
【図１２】ＣＧＩ１３７の非メチル化型を標的化する相同ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤアッセイの図。増幅された領域に広がるヌクレオチド配列が示されている。オリジナルのＤＮＡ配列（配列番号１）は、亜硫酸水素塩−転換された配列（配列番号２）の上に並置している。ＣｐＧ部位は、「＋＋」印で確定される。ＣｐＧ部位は追加的に番号付けし、この番号付けは図１Ａ及び２Ａ並びに表２Ａに対応している。ＣｐＧジヌクレオチドの一部ではないシトシン残基は、「：」印で確定される。示された亜硫酸水素塩−転換された配列は、全てのＣｐＧ部位はメチル化されたという仮定を基にしている。フォワードプライマー、伸長プライマー及びリバースプライマーの並置（配列番号３−５）は、亜硫酸水素塩−転換された配列の下側に示している。
【国際調査報告】
2009535050.tif 000066
2009535050.tif 000067
2009535050.tif 000068
2009535050.tif 000069
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2009535050.tif 000071
2009535050.tif 000072