(57)【要約】被験者へ治療有効量の抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体を投与することを含む、該被験者中の動脈血栓症を予防する方法であって、該抗体、そのフラグメント又は誘導体は活性化第ＸＩＩａ因子に特異的に結合し、そして活性化第ＸＩＩａ因子とその生理学的基質との相互作用を防止するものであるところの方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量の抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体を該被験者へ投与することを含む、被験者中の動脈血栓症を予防する方法であって、
該抗体、フラグメント又は誘導体は活性化第ＸＩＩａ因子に特異的に結合し、そして活性化第ＸＩＩａ因子とその生理学的基質との相互作用を防止するところの方法。
【請求項２】
該抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体がαＸＩＩａ因子又はβＸＩＩａ因子又は５３ＫｄのＸＩＩａ因子と結合し、そして
非活性化ＸＩＩ因子との０．１％又はそれ以下の修正された交叉反応性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該投与が該被験者に血管形成術が行われた後にされる、請求項１乃至２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
該投与が該被験者における心筋梗塞の後にされる、請求項１乃至２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該被験者が、フレミンガムリスクスコア法を用いて定義された、１０％より高い冠状動脈性心臓病の推定リスクを有する、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該被験者が、該抗体又はそのエピトープ−結合ファクター又は誘導体の投与前に測定された対照集団のものと有意に異なる活性化ＸＩＩａ因子の血漿濃度を有する、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該被験者の活性化ＸＩＩａ因子の血漿濃度が、該被験者への血管形成術に向けてのヘパリン及び造影剤の投与後に対照集団のものと有意に異なる要因により上昇する、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体がモノクローナル抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体である、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体が、ｍＡｂ  ２／２１５又はその類似体、又はｍＡｂ  ２０１／９又はその類似体又は、ｍＡｂ  ２／２１５のエピトープ−結合フラグメント又は誘導体又はその類似体、又はｍＡｂ  ２０１／９のエピトープ結合フラグメント又は誘導体又はその類似体である、請求項１に直接又は非直接に従属する場合の請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体が、Ｆａｂフラグメント又は（Ｆａｂ'）2フラグメントである、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
該抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体が、ヒト化抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体である、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
該抗体又が活性化第ＸＩＩａ因子と特異的に結合し、そして薬剤として使用するためのその生理学的基質と活性化ＸＩＩａ因子の相互作用を防止する、抗体又はエピトープ−結合フラグメント又はこれらの誘導体。
【請求項１３】
該抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体が、αＸＩＩａ因子と又はβＸＩＩａ因子と又は５３ＫｄのＸＩＩａ因子と結合する能力を有し、そして非活性化ＸＩＩ因子との０．１％又はそれ以下の修正された交叉反応性を有する、請求項１２に記載の抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体。
【請求項１４】
該抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体が、モノクローナル抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体である、請求項１２乃至１３のいずれか１項に記載の抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体。
【請求項１５】
該抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体が、ｍＡｂ  ２／２１５又はその類似体、又はｍＡｂ  ２０１／９又はその類似体又は、ｍＡｂ  ２／２１５のエピトープ−結合フラグメント又は誘導体又はその類似体、又はｍＡｂ  ２０１／９のエピトープ結合フラグメント又は誘導体又はその類似体である、請求項１２に直接又は非直接に従属する場合の請求項１４に記載の抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体。
【請求項１６】
Ｆａｂフラグメント又は（Ｆａｂ'）2フラグメントである、請求項１２乃至１５のいずれか１項に記載の抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体。
【請求項１７】
ヒト化抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体である、請求項１２乃至１６のいずれか１項に記載の抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体。
【請求項１８】
請求項１２乃至１７のいずれか１項に定義された抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体を、医薬品として許容できる担体とともに含む医薬品組成物。
【請求項１９】
被験者中の動脈血栓症を予防するための薬剤の製造における、請求項１２乃至１７のいずれか１項に定義された抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体の使用。
【請求項２０】
該被験者が、請求項５乃至７のいずれか１項に定義されたものであるか、又は該薬剤が請求項３乃至４に定義された投与のためのものである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
被験者中の動脈血栓症を予防するための薬剤としての使用のための、請求項１２乃至１７のいずれか１項に定義された、抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体。
【請求項２２】
該被験者が、請求項５乃至７のいずれか１項に定義されたものであるか、又は該薬剤が請求項３乃至４に定義された投与のためのものである、請求項２１に記載の抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体。
【請求項２３】
経皮冠動脈インターベンションを受けることを選択した被験者の血中の活性化ＸＩＩａ因子の値を測定し、そして該被験者の活性化ＸＩＩａ因子の血漿濃度が有意に対照集団のものと異なっている場合に、又は該被験者の活性化ＸＩＩａ因子の血漿濃度が、該被験者に血管形成術に備えてのヘパリン及び造影剤を投与後に対照集団のものと有意に異なる要因により増加する場合に、該被験者を高リスクグループへ割り当てることを含む、該被験者の、後の動脈再狭窄のリスクを予測する方法。
【請求項２４】
標識部分へ結合した請求項１２乃至１７のいずれか１項に定義された抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体を含む、生体内イメージング剤。
【請求項２５】
該標識部分が、放射性標識又は蛍光色素である、請求項２４に記載の生体内イメージング剤。
【請求項２６】
被験者へ、請求項２６又は２５に記載の生体内イメージング剤を投与し、次いで生体内でイメージング剤の標識部分を検出すること含む、該被験者中の血栓形成部位を画像化する方法。
【請求項２７】
治療化合物に結合した、請求項１２乃至１７のいずれか１項に定義された抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体を含む、治療剤。
【請求項２８】
該治療化合物が血栓溶解剤である、請求項２７に記載の治療剤。
【請求項２９】
該治療化合物が血小板凝固阻害剤である、請求項２７に記載の治療剤。
【請求項３０】
該治療化合物がストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）、チロフィバン、クロピドグレル、又はテネクテプラーゼである、請求項２７に記載の治療剤。
【請求項３１】
被験者へ請求項２７乃至３０のいずれか１項に定義した治療剤を投与することを含む、該被験者中の望ましくない血栓形成により特徴付けられる疾患を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈血栓症の予防方法、そして関連した製品、診断方法、画像化方法及び薬剤ターゲッティング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈血栓症は病気及び死亡の主要な要因である。心臓の動脈中の閉塞性血栓又は閉塞に近い（ｎｅａｒ−ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ）血栓は、虚血及び心筋梗塞に至る心臓の局所への血液供給の中断を生じ得る。心臓への血液供給におけるあまり劇的でない減少を生じる血栓は狭心症を起こし得る。脳組織の虚血を引き起こす動脈の血栓は脳卒中の最も一般的な原因である。哺乳類に於ける動脈の血栓形成のためには第ＸＩＩ因子が必要であることが示されてきた（Ｒｅｎｎｅ等、ＪＥＭ，２０２巻、２７１−２８１頁（２００５年）（非特許文献１））。
国際公開第２００６／０６６８７８号パンフレット(特許文献１)は、第ＸＩＩ因子を阻害しそして複数の血栓及び／又は血栓の成長の形成及び安定化を防止する、少なくとも１種の抗体及び／又は１種の阻害剤の使用を開示している。
【０００３】
本発明の対象は、一般的な側面において、活性化第ＸＩＩ因子に向けた抗体を使用することにより、血栓の形成及び／又は安定化を防止することにある（一方、国際公開第２００６／０６６８７８号パンフレット（特許文献１）は第ＸＩＩ因子チモーゲンに向けた抗体の使用を開示している）。
【０００４】
第ＸＩＩ因子の欠乏は出血性素因の原因とならないことの少なからぬ証拠がある。それゆえ、活性化第ＸＩＩ因子の阻害は、血栓の形成を阻害し得る一方、多くのその他の抗血栓剤において観察されるような関連した出血リスクとならないので、動脈血栓症の予防のための興味ある治療的アプローチである。
【０００５】
第ＸＩＩ因子は通常の血液中に存在する不活性酵素原である。それは生体内で、カリクレイン、高分子量キニノゲン及び負に帯電した表面の存在下で、酵素として活性である、第ＸＩＩａ因子として知られる第ＸＩＩ因子のフォームに容易に転換する。生体内における、第ＸＩＩａ因子の二つのフォームが報告されてきた。セリン・プロテイナーゼの８０Ｋｄフォーム（しばしばαＸＩＩａ因子と呼ばれる。）は、２８Ｋｄの軽鎖に対してジスルフィド結合により結合した５２Ｋｄの重鎖を有している。この因子のタンパク質分解は、前記重鎖からペプチドを放出して、生成物であるβＸＩＩａ因子を生じさせ、該βＸＩＩａ因子はセリン・プロテアーゼ活性を維持するが、しかし、前記因子においては、αＸＩＩａ因子の２８Ｋｄ鎖は、先の５２Ｋｄ重鎖から誘導された小さいペプチドフラグメントにジスルフィド結合している。多くの場合において、前記小さいペプチドフラグメントは約１０００ｄの分子量を有するが、しかし、異なる寸法のフラグメントが生体内で観察された。生体内で見出され、そして５３Ｋｄの分子量を有する活性化第ＸＩＩａ因子のさらなるフォームは、最初に国際出願第ＧＢ２００６／００００７２号明細書（特許文献２）において報告され、その開示はここに参照によって取り込まれる。
【０００６】
国際公開第９０／０８８３５号パンフレット（特許文献３）は第ＸＩＩａ因子に対するイムノアッセイを開示している。国際公開第９０／０８８３５号パンフレットはまた、モノクローナル抗体２／２１５及び２０１／９（これらは、活性化第ＸＩＩａ因子の全ての既知分子量フォームに結合する。）及びそれらの産生方法を開示している。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）２／２１５は、１９９０年１月１６日に、英国、サリスバリー  エスピー４ ０ジェイジー（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ  ＳＰ４ ０ＪＧ）、ポートン  ダウン（Ｐｏｒ
ｔｏｎ  Ｄｏｗｎ）のピーエイチエルエス  センター  フォー  アプライド  ミクロバイオロジー  アンド  リサーチ（ＰＨＬＳ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅｒｃｈ）、ディビジョナル  オブ  バイオロジクス（Ｄｉｖｉｓｉｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）のヨーロピアン  コレクション
オブ  アニマル  セル  カルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＥＣＡＣＣとして知られている。）に、寄託番号第９００１１６０６号の下に寄託され、そして、２００４年６月１４日にＥＣＡＣＣに、寄託番号第０４０６１４０３号の下に再寄託されたハイブリドーマ２／２１５により産生される。モノクローナル抗体２０１／９を産生するハイブリドーマ２０１／９は、１９９０年１月１８日にＥＣＡＣＣに、寄託番号第９００１１８９３号の下に寄託され、そして２００４年６月１４日にＥＣＡＣＣに、寄託番号第０４０６１４０２号の下に再寄託された。
【０００７】
第ＸＩＩａ因子は、生体内の血液凝集の接触系に関わることが従来知られていた。より最近の研究は、第ＸＩＩａ因子はまた、線維素溶解、キニン生成及び更に補体活性化及び血管形成を含む他の系に関わることを指摘している。多くの臨床及び実験データが蓄積され、前記接触系が血液凝固以外にも拡張していること及び、それは血管完全性及び血圧を維持する役割を有すること、それは内皮細胞の種々の機能に影響を及ぼすこと及び、それは線維素溶解の制御及び血管内腔の本質的抗凝固性の維持に関与することを示唆している。別の臨床的及び実験的研究は、前記接触系が急性又は慢性炎症、異なる原因によるショック、糖尿病、アレルギー、播種性血管内血液凝固を含む血栓−出血性障害、並びに腫瘍疾患に関与することを示している。このような症状は、敗血症、自然流産及び血栓塞栓症を含む。加えて第ＸＩＩａ因子は、組織防御及び修復に関与し得る。Ｙａｒｏｖａｙａ等（Ｙａｒｏｖａｙａ  Ｇ．Ａ．、Ｂｌｏｋｈｉｎａ  Ｔ．Ｂ及びＮｅｓｈｋｏｖａ  Ｅ．Ａ．）、「接触系。活性化機構及び生物学的調整機構についての新概念。（Ｃｏｎｔａｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｎｅｗ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｏｎ  ａｃｉｖｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｒｅｇｕｌａｔａｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，）」、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｕｔｒｙ）（モスクワ）、２００２年１月、第６７巻（第１号）：第１３〜２４頁（非特許文献２）は前記接触系及び活性化機構及び生物学的調整機構についての新概念の最近の概説である。
【０００８】
国際公開第０４／０５７３４３号パンフレット（特許文献４）は、第ＸＩＩａ因子が体内に種々のフォームで存在し、そしてこれらの異なるフォームの濃度の測定が種々の臨床病態に対する有意義な情報を提供することを開示している。国際公開第９１／１７２５８号パンフレット（発明者Ｎｕｉｊｅｎｓ等）（特許文献５）は、敗血症における治療剤として用いられた第ＸＩＩ因子／活性化第ＸＩＩ因子と結合する抗体を特許請求の範囲に記載している。国際特許出願公開第９９／３６４３９号パンフレット（発明者Ｓｅａｌｅ等）（特許文献６）は第ＸＩＩ因子と関連する種々の疾患のための治療剤として使用され得るヘメンテリア（Ｈａｅｍｅｎｔｅｒｉａ）ヒルから派生したポリペプチドを特許請求の範囲に記載している。
【特許文献１】国際公開第２００６／０６６８７８号パンフレット
【特許文献２】国際特許出願第ＧＢ２００６／００００７２号明細書
【特許文献３】国際公開第９０／０８８３５号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０４／０５７３４３号パンフレット
【特許文献５】国際公開第９１／１７２５８号パンフレット
【特許文献６】国際公開第９９／３６４３９号パンフレット
【非特許文献１】Ｒｅｎｎｅ等、ＪＥＭ，２０２巻、２７１−２８１頁（２００５年）
【非特許文献２】Ｙａｒｏｖａｙａ等（Ｙａｒｏｖａｙａ  Ｇ．Ａ．、Ｂｌｏｋｈｉｎａ  Ｔ．Ｂ及びＮｅｓｈｋｏｖａ  Ｅ．Ａ．）、「接触系。活性化機構及び生物学的調整機構についての新概念。（Ｃｏｎｔａｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｎｅｗ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｏｎ  ａｃｉｖｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｒｅｇｕｌａｔａｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，）」、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｕｔｒｙ）（モスクワ）、２００２年１月、第６７巻（第１号）：第１３〜２４頁
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、治療有効量の抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体を被験者に投与することを含む、該被験者の動脈血栓症を予防する方法であって、該抗体、フラグメント又は誘導体は特異的に活性化第ＸＩＩａ因子と結合し、そして活性化第ＸＩＩａ因子とその生理学的基質との相互作用を予防するところの方法、を提供する。
【００１０】
本発明はまた、抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体を提供し、該抗体は活性化第ＸＩＩａ因子に特異的に結合しそして薬剤として用いられるために活性化第ＸＩＩａ因子とその生理学的基質との相互作用を防止する。
【００１１】
本発明はまた、本発明による抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体を、医薬品として許容し得る担体とともに含む医薬品組成物を提供する。
【００１２】
本発明はまた、抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体の被験者の動脈血栓症を予防する薬剤の製造における使用を提供し、該抗体は特異的に活性化第ＸＩＩａ因子と相互作用し、そして活性化第ＸＩＩａ因子とその生理学的基質との相互作用を防止する。
【００１３】
本発明はまた、抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体を提供し、該抗体は特異的に活性化第ＸＩＩａ因子と相互作用し、そして被験者の動脈血栓症を予防する薬剤として使用するために活性化第ＸＩＩａ因子とその生理学的基質との相互作用を防止する。
【００１４】
本発明はまた、経皮冠動脈インターベンションを受けるために選択された被験者の血中活性化ＸＩＩａ因子の値を測定し、そして該被験者の活性化ＸＩＩａ因子の血漿濃度が対照集団のものと有意に異なっている場合に、又は被験者の活性化ＸＩＩａ因子の血漿濃度が、該被験者に血管形成術に備えてのヘパリン及び造影剤を投与後に対照集団のものと有意に異なる要因により増加する場合に、該被験者を高リスクグループへ割り当てることを含む、該被験者の、後の再狭窄のリスクを予測する方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、標識部分へ結合した、本発明による抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体を含む、生体内イメージング剤を提供する。
【００１６】
本発明はまた、本発明の生体内イメージング剤を被験者に投与し、次いで生体内でイメージング剤の標識部分を検出することを含む、該被験者の血栓形成部位を画像化する方法を提供する。
【００１７】
本発明はまた、治療化合物へ結合した、本発明による抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体を含む治療剤を提供する。
【００１８】
本発明はまた、被験者へ本発明による治療剤を投与することを含む、該被験者の中の望ましくない血栓形成により特徴付けられる疾患を治療する方法を提供する。
【００１９】
本発明はまた、被験者の動脈血栓症を予防するために使用するための、非活性化第ＸＩ
Ｉ因子に対する抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体を提供し、ここで該抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体は第ＸＩＩ因子の多分子集合を防止するかあるいは該抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体は活性化第ＸＩＩａ因子の形成を防止する。
【００２０】
本発明はまた、抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体の治療有効量を被験者へ投与することを含む、該被験者の動脈血栓症を防止する方法を提供し、該抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体は第ＸＩＩ因子の多分子集合を防止するかあるいは該抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体は活性化第ＸＩＩａ因子の形成を防止する。
【００２１】
図面の簡単な説明
図１は、選択的ＰＣＩを受けている被験者１１名における血漿第ＸＩＩａ因子の値を示す図である。
図２は、胸痛により入院した被験者８７１名における血漿第ＸＩＩａ因子値の四分割に関する１２ヶ月の生存データを示す図である。
図３は、胸痛により入院した被験者で血漿ＴｎＴ＞０．０５ｎｇ／ｍＬであった図２に示した被験者のサブグループの血漿第ＸＩＩａ因子値の四分割に関する１２ヶ月の生存データを示す図である。
図４は、胸痛により入院した被験者で血漿ＴｎＴ≦０．０５ｎｇ／ｍＬであった図２に示した被験者のサブグループの血漿第ＸＩＩａ因子値の四分割に関する１２ヶ月の生存データを示す図である。
図５は、心筋梗塞での入院から４日間の被験者群の血漿第ＸＩＩ因子濃度において観測された変化を示す図である。
図６は、図５において示された同じデータを血漿第ＸＩＩａ因子濃度における百分率変化として示す図である。
【００２２】
ＸＩＩａ因子、あるいは活性化ＸＩＩ因子ともよばれる、とは、チモーゲン、αＸＩＩａ因子、βＸＩＩａ因子及び５３ＫｄのＸＩＩａ因子を含む第ＸＩＩ因子の酵素的に活性なあらゆるフォームあるいはフラグメントを意味する。
【００２３】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）２／２１５、またいわゆる抗体２／２１５は、１９９０年１月１６日に、英国、サリスバリー  エスピー４  ０ジェイジー、ポートン  ダウン、ピーエイチエルエス  センター  フォー  アプライド  ミクロバイオロジー  アンド  リサーチ、ディビジョナル  オブ  バイオロジクスのヨーロピアン  コレクション  オブ  アニマル  セル  カルチャーズ（ＥＣＡＣＣとして知られている。）に、寄託番号第９００１１６０６号の下に寄託され、そして、２００４年６月１４日にＥＣＡＣＣに、寄託番号第０４０６１４０３号の下に再寄託されたハイブリドーマ２／２１５により産生された抗体である。
【００２４】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）２／２１５類似体は、ｍＡｂ２／２１５抗体のものと実質的に同一の第ＸＩＩａ因子結合性を有する抗体を示す。
【００２５】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）２０１／９、またいわゆる抗体２０１／９は、１９９０年１月１８日にＥＣＡＣＣに、寄託番号第９００１２５１２号の下に寄託され、そして２００４年６月１４日にＥＣＡＣＣに、寄託番号第０４０３１４０２号の下に再寄託されたハイブリドーマ２０１／９により産生された抗体である。
【００２６】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）２０１／９類似体は、ｍＡｂ２０１／９抗体のものと実質的に同一の第ＸＩＩａ因子結合性を有する抗体を示す。
【００２７】
本発明は、第ＸＩＩ因子チモーゲン（国際公開第２００６／０６６８７８号パンフレットに記載されているような）ではなく活性化第ＸＩＩ因子に向けた抗体の使用が多くの利点を与えるという認識に基づく。第ＸＩＩ因子チモーゲンは、体内の至るところを比較的高い濃度で循環し（約４０ｍｇ／Ｌ）、一方、活性化第ＸＩＩ因子の組織濃度は約２μｇ／Ｌであり、それ故第ＸＩＩ因子の濃度は、活性化第ＸＩＩ因子の約２０，０００倍であり、したがって後者の場合抗体のはるかに少量が使用され得る。さらに、本明細書中に示されたように、高濃度の活性化第ＸＩＩ因子が、血栓それ自身中において明らかであり、したがって活性化第ＸＩＩ因子への抗体の投与は、血栓形成の病原部位を標的としかつそこに局在され、一方、第ＸＩＩ因子チモーゲンと有意な反応性を示す抗体は全身に分布する傾向にある。活性化第ＸＩＩ因子に直接対する抗体を使用するその他の利点は、活性化第ＸＩＩ因子は多くの異なるフォームで存在することが示されてきたことである（国際公開第０４／０５７３４３号パンフレット及び国際特許出願第ＧＢ２００６／００００７２号明細書）。
活性化第ＸＩＩ因子に直接対する抗体はこれらの異なるフォームと反応する一方、第ＸＩＩ因子チモーゲンと直接対する抗体は、関連エピトープが欠損しているため、活性化したフォームとは反応し得ない。さらに、臨床試験からのデータは活性化第ＸＩＩ因子は血栓症の危険性の重要な寄与要因であることを示すが、第ＸＩＩ因子と血栓症の危険性の間にそのような関連性はみられず、従って、このように活性化第ＸＩＩ因子は臨床的に重要な指標であることを示している。さらに、活性化第ＸＩＩ因子は臨床的に関連指標でありそしてゆえに第ＸＩＩ因子チモーゲンよりもよりよい治療標的であるという更なる証拠が、活性化第ＸＩＩ因子の減少が改善された予後をもたらし、一方活性化第ＸＩＩ因子の増加は悪い予後をもたらすという観察により提供されている。
【００２８】
本発明は、治療有効量の抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体を被験者に投与することを含む、該被験者の動脈血栓症を予防する方法であって、該抗体、フラグメント又は誘導体は特異的に活性化第ＸＩＩａ因子と結合し、そして活性化第ＸＩＩａ因子とその生理学的基質との相互作用を予防するところの方法、を提供する。
【００２９】
好ましくは、該抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体は、αＸＩＩａ因子又はβＸＩＩａ因子または５３Ｋｄ第ＸＩＩａ因子と結合し、そして、非活性化第ＸＩＩ因子との０．１％又はそれ以下の補正された交差反応性を有する。
【００３０】
本発明の特定の実施態様によれば、該投与は該被験者へ行われる血管形成術に先行し、術中に又は術後である。血管形成術後の投与は、引き続いて起こる望ましくない血栓の形成の可能性を減少させるためである。
【００３１】
その他の実施態様によれば、該投与は該被験者の心筋梗塞後である。心筋梗塞後の投与は、さらなる望ましくない血栓の形成の可能性を減少させるためである。
【００３２】
特定の実施態様によれば、該投与は、フラミンガムリスクスコア法を用いて定義された、１０％より高い、好ましくは１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８又は３０％より高い冠状動脈性心臓病の推定リスクを有する被験者へのものである。該投与は望ましくない血栓形成のリスクそしてしたがって冠状動脈性心臓病の危険性を減少させるためのものである。
【００３３】
特定の実施態様によれば、該投与は、該抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体の投与前に測定された活性化第ＸＩＩａ因子の血漿濃度が対象集団よりも有意に異なる被験者へのものである。
【００３４】
特定の実施態様によれば、該投与は、被験者への血管形成術に備えてのヘパリン及び造影剤の投与の後に、対象集団よりも有意に異なる要因により増加した該被験者の活性化第ＸＩＩａ因子の血漿濃度へのものである。この群の血管形成術被験者における被験者らは、血管形成術後の動脈再狭窄の特に高い危険性があることが見出されている。
【００３５】
一例として、１５０μＭより高い活性化第ＸＩＩａ因子の血漿濃度は、対象集団のものよりも有意に異なる。２倍又はそれ以上の活性化第ＸＩＩａ因子の血漿濃度の上昇は対象集団のものよりも有意に異なるものとして見なされ得る。
【００３６】
該抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体は、モノクローナル抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体であり得る。
【００３７】
好ましくは、該抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体は、ｍＡｂ  ２／２１５又はその類似体、又はｍＡｂ  ２０１／９又はその類似体又は、ｍＡｂ  ２／２１５のエピトープ−結合フラグメント又は誘導体又はその類似体、又はｍＡｂ  ２０１／９エピトープ−結合フラグメント又は誘導体又はその類似体である。
【００３８】
該抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体は、Ｆａｂフラグメント又は（Ｆａｂ‘）2フラグメントであり得る。
【００３９】
好ましくは、該抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体はヒト化抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体である。
【００４０】
本発明はまた、抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体を提供し、該抗体は活性化第ＸＩＩａ因子に特異的に結合しそして薬剤として用いられるために活性化第ＸＩＩａ因子とその生理学的基質との相互作用を防止する。
【００４１】
その様な抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体は、本発明の方法に関し上記に記載した１つ又はそれ以上の追加的な特徴をとり込み得る。
【００４２】
本発明はまた、医薬品として許容できる担体と共に、本発明による抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体を含む医薬品組成物を提供する。
【００４３】
本発明はまた、抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体の被験者の動脈血栓症を予防する薬剤の製造における使用を提供し、該抗体は特異的に活性化第ＸＩＩａ因子と相互作用し、そして活性化第ＸＩＩａ因子とその生理学的基質との相互作用を防止する。
【００４４】
本発明はまた、経皮冠動脈インターベンションを受けるために選択された被験者の血中活性化ＸＩＩａ因子の値を測定し、そして該被験者の活性化ＸＩＩａ因子の血漿濃度が対照集団のものと有意に異なっている場合に、又は被験者の活性化ＸＩＩａ因子の血漿濃度が、該被験者に血管形成術に備えてのヘパリン及び造影剤を投与後に対照集団のものと有意に異なる要因により増加する場合に、該被験者を高リスクグループへ割り当てることを含む、該被験者の、後の再狭窄のリスクを予測する方法を提供する。
【００４５】
一例として、１５０μＭより高い活性化第ＸＩＩａ因子の血漿濃度は、対象集団のものよりも有意に異なる。２倍又はそれ以上の活性化第ＸＩＩａ因子の血漿濃度の上昇は対象集団のものよりも有意に異なるものとして見なされ得る。
【００４６】
高い危険度の群に分類された被験者は動脈の再狭窄を予防するために特別の治療又はモ
ニターされ得る。あるいは、選択的ＰＣＩは中止され得る。
【００４７】
本発明はまた、標識部分に結合した、本発明による抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体を含む、生体内イメージング剤を提供する。
【００４８】
本発明はまた、被験者へ本発明による生体内イメージング剤を投与し、次いで生体内でイメージング剤の標識部分を検出することを含む、該被験者の血栓形成部分を画像化する方法を提供する。
【００４９】
本発明はまた、治療化合物に結合した、本発明による抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体を含む、治療剤を提供する。
【００５０】
該抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体、そして該被験者は、本発明の方法に関して上記に定義されたようなものであり得、該薬剤は望ましくない血栓形成と関連する疾患の治療のためのものであり得る。例えば、該薬剤は、血管形成、心筋梗塞又は脳卒中の後の投与のためのものであり得る。
【００５１】
本発明はまた、本発明による抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体を提供し、該抗体は特異的に活性化第ＸＩＩａ因子と相互作用しそして被験者の動脈血栓症を予防するための薬剤として使用するために活性化第ＸＩＩａ因子とその生理学的基質との相互作用を防止する。
【００５２】
該治療化合物は好ましくは、血栓溶解剤、又は他の抗血栓剤、例えば、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）、チロフィバン、クロピドグレル、又はテネクテプラーゼである。
【００５３】
本発明はまた、該被験者へ本発明による治療剤を投与すること含む、該被験者の望ましくない血栓形成により特徴付けられる疾患の治療方法を提供する。
【００５４】
本発明はまた、被験者の動脈血栓症を予防するために使用するための、非活性化第ＸＩＩ因子に対する抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体を提供し、ここで該抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体は第ＸＩＩ因子の多分子集合を防止するかあるいは該抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体は活性化第ＸＩＩａ因子の形成を防止する。
【００５５】
本発明はまた、抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体の治療有効量を被験者へ投与することを含む、該被験者の動脈血栓症を防止する方法を提供し、該抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体は第ＸＩＩ因子の多分子集合を防止するかあるいは該抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体は活性化第ＸＩＩａ因子の形成を防止する。
【００５６】
活性化第ＸＩＩａ因子に特異的な抗体の産生
本発明において使用するための活性化第ＸＩＩａ因子に特異的な抗体の産生のために、適する抗原を注射することにより、種々の宿主動物が免疫化され得る（以下の、抗原選択の詳細を参照）。このような宿主動物は、豚、兎、マウス、山羊、馬及びラットを含み得るが、しかし、それらに限定されるものではない。免疫応答を増加させるために、宿主に依存して、フロインドアジュバント（完全及び不完全）、鉱物塩例えば水酸化アルミニウム又は燐酸アルミニウム、界面活性物質例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、多価アニオン、ペプチド、油性乳剤、及び潜在的に有用なヒトアジュバント例えばＢＣＧ［バシル  カルメット−ゲリン（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）］
及びコリネバクテリウム  パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）を含むが、しかし、それらに限定されない種々の助剤が使用され得る。
【００５７】
或いはまた、免疫応答は、応答強化剤、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、オボアルブミン、コレラ毒素又はそれらのフラグメントと組み合わせる及び／又は結合させることにより、増強され得る。
【００５８】
ポリクローナル抗体もまた本発明において使用され得る。ポリクローナル抗体は、免疫化動物の血清から誘導される抗体分子の不均質な集団である。
【００５９】
特定の抗原に対する抗体の均質な集団であるモノクローナル抗体は、培養液中での連続継代細胞系による抗体分子の産生を提供する如何なる技術によっても得ることができる。
【００６０】
これらは、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）及びミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）［１９７５年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６、４９５〜４９７、及び米国特許第４，３７６，１１０号明細書］のハイブリドーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術［コスボー（Ｋｏｓｂｏｒ）他、１９８３年、今日の免疫学（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ）４、７２；コール（Ｃｏｌｅ）他、１９８３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、８０、２０２６〜２０３０］並びに、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術［コール（Ｃｏｌｅ）他、１９８５年、モノクローナル抗体及び癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、アラン  アール．  リス  インコーポレーテッド（Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．）、第７７９６頁、を含むが、しかし、それらに限定されるものではない。
【００６１】
ｍＡｂを産生する本発明のハイブリドーマは生体外又は生体内で培養され得、そして、得られたｍＡｂは慣用技術により精製され得る。生体内における高力価のｍＡｂの産生は、これを好ましい産生方法になし得る。しかしながら、動物の使用に関する法的、商業的又は倫理的制約が生体内での産生を望ましくないものにする場合には、生体外の産生が好ましいことであり得る。
【００６２】
ヒト化抗体
加えて、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物学的活性の異なった種の抗体分子、例えばヒト抗体分子からの遺伝子と一体に接続することにより、“キメラ抗体”そして特に“ヒト化抗体”［モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）他、１９８４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１、６８５１〜６８５５；ノイベルガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）他、１９８４年、ネイチャー、３１２、６０４〜６０８；タケダ（Ｔａｋｅｄａ）他、１９８５年、ネイチャー、３１４、４５２〜４５４］の産生のために開発された技術を使用することができる。キメラ抗体は、ネズミｍＡｂから誘導される可変領域及びヒトイムノグロブリン定常領域を有するもののような、異なる部分が異なる動物種から誘導される分子である。このような技術は、米国特許第６，０７５，１８１号明細書及び同第５，８７７，３９７号明細書並びにそれらの個別の開示（これらは、その全体にわたり、参照として本明細書中に取り込まれている。）に記載されている。本発明により更に包含されるのは、米国特許第６，１５０，５８４号明細書（これは、その全体にわたり、参照として本明細書中に取り込まれている。）に記載されたような、完全ヒト化モノクローナル抗体の使用である。ヒト又はヒト化動物ｍＡｂは、ヒトにおける治療用途のために好ましいものであり得る。
【００６３】
抗体誘導体
本発明において使用されるための抗体誘導体の例は、一本鎖抗体である。  一本鎖抗体の産生のための記載された技術［米国特許第４，９４６，７７８号明細書；バード（Ｂｉ
ｒｄ）、１９８８年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４２、４２３〜４２６；ヒューストン（Ｈｕｓｔｏｎ）他、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、米国、８５、５８７９〜５８８３；及びウォード（Ｗａｒｄ）他、１９８９年、ネイチャー、３４１、５４４〜５４６］が、一本鎖抗体の産生のために採用され得る。一本鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントとをアミノ酸ブリッジを介して結合させ、一本鎖ポリペプチドを得ることにより形成される。
【００６４】
抗体フラグメント
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知技術により製造され得る。例えば、このようなフラグメントは、抗体分子のペプシン分解により産生され得るＦ（ａｂ’）2 フラグメント及び、Ｆ（ａｂ’）2 フラグメントのジスルフィドブリッジを還元することにより製造され得るＦａｂフラグメントを含むが、しかし、それらに限定されるものではない。或いはまた、望ましい特異性を持つモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速且つ容易な同定を可能にするために、Ｆａｂ発現ライブラリーが構築され得る［ヒュース（Ｈｕｓｅ）他、１９８９年、サイエンス、２４６、１２７５〜１２８１］。
【００６５】
本発明の抗体及びそのフラグメント及び誘導体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びこれらのどのような亜類をも含むどのような免疫グロブリン類のものであってもよい。
【００６６】
抗体の産生のために適する抗原の選択及び製造
抗原の選択
本発明の抗原は、非活性化第ＸＩＩ因子に優先して活性化第ＸＩＩａ因子の少なくとも１つのフォームに結合することが要求される。それ故それらは、活性化ＸＩＩａに存在し且つアクセス可能であるが、しかし、非活性化第ＸＩＩ因子に存在しないか又はアクセス不可能であるエピトープを認識せねばならない。抗原の選択に対する一つの手法は、それ故、αＸＩＩａ因子、βＸＩＩａ因子又は５３ｋＤＸＩＩａ因子上でアクセス可能であるが、非活性化第ＸＩＩａ因子上でアクセス不可能な第ＸＩＩａ因子アミノ酸配列を有するペプチド抗原を選択することである。
【００６７】
抗原の製造
プロテイン抗原の寸法、凝集の程度及び相対的天然性、即ち、相対的欠損又は変性は全て、産生された抗体の品質及び量に劇的な影響を及ぼし得る。小さいポリペプチド（＜１０Ｋｄａ）及び非プロテイン抗原は、一般的に、免疫性を増加させ且つＴ細胞エピトープを産生するために、より大きい、免疫学的、キャリアプロテインと結合又は交差結合することが必要である。可溶性の、凝集していないプロテインの注射は、十分な抗体応答よりもむしろ耐性を生じさせ得る。それ故、前記抗原をより大きいプロテイン、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合させることが望ましいことであり得る。ポリ−Ｌ−リジンもまた、小さい抗原ペプチドのための骨核として成功裏に使用されている。
【００６８】
抗原は常に、それらが微生物汚染を有しないことを保証する技術を使用して製造されるべきである。抗原組成物は、０．２２μｍフィルターを通すことにより滅菌され得る。
【００６９】
ポリクローナル抗体の精製
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、公知技術、例えば、プロテイン−Ａ又はプロテイン−Ｇ親和性クロマトグラフィーカラムを使用して、非免疫グロブリン汚染物から精製され得る。本発明のポリクローナル抗体は、交差反応性を除去又は低減するために、更なる精製を必要とし得る。非活性化第ＸＩＩ因子のとの交差反応性を除去するために、親和性精製法により、ポリクローナル血清から前記抗体種を除去することが必要であ
り得る。フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）他、１９８８年、セル（Ｃｅｌｌ）、５４、８１３〜８２２（この開示は、参照として本明細書中に取り込まれている。）は、ポリクローナル抗体の親和性精製のために適するプロトコルの詳細を与える。要するに、このような精製技術は、前記抗原或いは交差反応性の問題を引き起こしている抗原を、固体基材、例えば実験室プラスチックウェア物品の壁又はクロマトグラフィーカラム内に充填された固体ビーズに固定すること、及び、ポリクローナル血清を前記固体基材の中又は上を通過させることを含み、その結果、交差反応性を示す抗体種が保持されそして交差反応性を示さない抗体種が液相中に保持される。本発明のポリクローナル抗体の産生のための親和性精製技術の使用例として、ポリクローナル抗体応答を、動物に活性化型第ＸＩＩａ因子を接種することにより該動物中に生じさせ得、ここで得られたポリクローナル血清は、その後、固定された非活性化αＸＩＩａ因子を含むクロマトグラフィーカラムを通過させることにより、親和性精製され得る。非活性化第ＸＩＩ因子との交差反応性を示す抗体種はカラム中に保持され、そして、活性化型第ＸＩＩａ因子の１フォームに結合し得るがしかし非活性化第ＸＩＩ因子に結合し得ない抗体種は液相中に残り、そしてカラム溶出液に含まれる。
【００７０】
試料と試料調製
試料
活性化第ＸＩＩａ因子フォームの様々な測定は、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液又は涙液、といった体液の試料；あるいは、体液から分離された細胞、すなわち、生体内で存在している液相から実質的に解放された細胞からなる試料；あるいは、組織又は組織試料から得られた細胞からなる試料に対して実施され得る。好ましくは、測定は血漿試料において行われる。
【００７１】
試料調製
試料は一般的な技法を用いて得られならびに調製され得、たとえば以下を参照のこと：ヤング，Ｄ．Ｓ．ならびにベルメス，Ｅ．Ｗ．，「試料の採集と加工」，ティーツ臨床化学テキストブック 第二版」，バーティス、Ｃ．Ａ．ならびにアシュウッド編、Ｅ．Ｒ．
，サウンダース（１９９４）、また、酵素学の手法，Ｈ．ヴァン ヴナキスならびにＪ．
Ｊ．ランゴン（編者），１９８１，７２（Ｂ）；酵素免疫検定法の実践と理論，P ティッセン，生化学ならびに分子生物学の実験テクニック，Ｒ．Ｊ．バーデンならびにＰ．Ｈ．ヴァン ニッペンバーグ（編者），エルセビア，１９８５；放射性免疫検定法の手引きと
関連テクニック，Ｔ．チャード，同書，第三版，１９８７；ならびに、酵素学における方法、Ｈ．ヴァン ヴナキスならびにＪ．Ｊ．ロンゴン（編者）１９８１，７４（Ｃ）。
【００７２】
抗体交差反応性
本発明の抗体は、１０％又はそれ未満、より好ましくは５％又はそれ未満、更により好ましくは２％又はそれ未満、更により好ましくは１％又はそれ未満、更により好ましくは０．５％又はそれ未満、更により好ましくは０．１％又はそれ未満の、非活性化第ＸＩＩ因子との補正された交差反応性を有する。好ましくは、前記抗体は、例えば０．５％又はそれ未満、より好ましくは０．１％又はそれ未満の、第ＸＩＩ因子との低い交差反応性を有する。本発明の抗体と第ＸＩＩ因子との交差反応性を評価する際に考慮すべき要因は、第ＸＩＩ因子シルバーベルグ（Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇ）及びカプラン（Ｋａｐｌａｎ）、血液（Ｂｌｏｏｄ）、６０、１９８２、６４〜７０に説明されているように、第ＸＩＩ因子製剤は第ＸＩＩａ因子で不可避的に汚染されていることである。国際公開第９０／０８８３５号パンフレットは、第ＸＩＩ因子との補正された交差反応性を評価する方法の詳細を与えている。特記しない限り、用語“交差反応性”は、補正された交差反応性を意味するために本明細書中で使用される。
【００７３】
モノクローナル抗体を産生するために使用される方法は周知である［例えば、酵素学に
おける方法、エイチ．ヴァン  ヴナキス及びジェイ．ジェイ．ランゴン（著者）、１９８１、７２（Ｂ）及び同１９８３、９２（Ｅ）を参照］。
【００７４】
モノクローナル抗体は、例えば、コーラー及びミルシュタインの方法の変法により産生され得る［ジー．コーラー及びシー．ミルシュタイン、ネイチャー、１９７５、２５６、４９５］。
【００７５】
国際公開第９０／０８８３５号パンフレット（これは、参考文献として本明細書中に取り込まれている。）は、活性化第ＸＩＩ因子に結合し、そして０．１％又はそれ未満の、第ＸＩＩ因子との補正された交差反応性を示す抗体をどのようにして産生するかを一般的な表現で記載しており、そしてｍＡｂ２／２１５及びｍＡｂ２０１／９の産生の具体的な詳細を与える。その中に記載された一般的及び特定の方法は、本発明の使用のために適するモノクローナル抗体、例えば、活性化第ＸＩＩａ因子と結合するが、しかし、不活性化第ＸＩＩ因子と結合しないモノクローナル抗体を産生するために使用され得る。
国際公開第９０／０８８３５号パンフレットの開示に基づく、本発明の使用のために適するモノクローナル抗体を産生するための一般的な手順は、国際公開第０４／０５７３４３号パンフレット（これは、参考文献として本明細書中に取り込まれている。）の実施例２２に与えられている。
【００７６】
モノクローナル抗体を産生するために使用される方法は周知である［例えば、酵素学における方法、エイチ．ヴァン  ヴナキス及びジェイ．ジェイ．ランゴン（著者）、１９８１、７２（Ｂ）及び同１９８３、９２（Ｅ）を参照］。モノクローナル抗体は、例えば、コーラー及びミルシュタインの方法の変法により産生され得る［ジー．コーラー及びシー．ミルシュタイン、ネイチャー、１９７５、２５６、４９５］。モノクローナル抗体の産生の際に使用される抗原は、αＸＩＩａ因子又は５３Ｋｄ第ＸＩＩａ因子又はβＸＩＩａ因子であってよい。得られたモノクローナル抗体は、第ＸＩＩ因子の1つとの有意な結合
性を示さないもの、例えば、０．１％又はそれ未満の、第ＸＩＩ因子との補正された交差反応性を有するものについて選別され得る。
【００７７】
活性化第ＸＩＩａ因子と結合する抗体のためのスクリーニングにおいて対照抗体としてモノクローナル抗体２／２１５又は２０１／９をそれぞれ使用することが効果的であろう。
【００７８】
本発明はネズミ又は一部ネズミ起源のハイブリドーマに限定されない。双方の融合パートナー（脾臓細胞及び骨髄腫）は、どのような適する動物からも得られ得る。組み換え抗体が産生され得る。抗体は、所望により、キメラ又はヒト化フォームにされ得る。ハイブリドーマは好ましくは、生体内で培養される。
【００７９】
ポリクローナル抗体
本発明はまた、活性化第ＸＩＩａ因子の一つ又はそれより多くのフォームに選択的に反応可能である、ポリクローナル抗血漿とも呼ばれるポリクローナル抗体を提供する。
【００８０】
血管形成術
血管形成術は、病的動脈を持つ被験者を治療するために用いられる外科技術である。該手順は動脈閉塞を拡大（拡張）させ、それは、アテローム性動脈硬化症の合併症を予防する一助となり得る。血管形成術は通常、詰まった動脈中においてそれを開ける支えの補助をしそして再閉塞の機会を減少させるステントの移植と併用される。血管形成術はまた、冠動脈バルーン拡張、バルーン血管形成術及び経皮冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）として知られている。
【００８１】
血管形成術は一般に被験者の鼠径部中の動脈（大腿動脈）を通して行われる。一般的ではないが、腕又は手首の領域中の動脈を用いて行われ得る。
【００８２】
シースと呼ばれる短い管が大腿動脈中へ挿入される。次に、ガイドがシース中に挿入される。モニター上のＸ線画像を用いて、医師はその動脈を通して閉塞または狭窄した動脈に到達するに至るまでガイドカテーテルを通す。
【００８３】
典型的には、抗凝固剤、典型的にはヘパリンが血管形成術に備えて投与される。動脈中の閉塞又は狭窄の領域がＸ線画像に映し出されるように造影剤もまた注射され、それにより、医師は治療の標的をどこにするかを知ることができる。
【００８４】
フラミンガムリスクスコア法
フラミンガム心臓研究は、長期にわたるそして進行中の、米国国立心臓肺血管研究所とボストン大学の研究プロジェクトである。この研究の成果の一つは、冠状動脈性心臓病のリスクにある個人の同定に用いられ得るフレミンガムリスクスコアの開発である。リスクスコアは、年齢、ライフスタイル及び医学的検査のような要因に基づき個人に割り当てられたポイントを合計することにより該個人のために計算される。
【００８５】
本発明は、被験者に治療有効量の抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体を投与することを含む、該被験者の動脈血栓症を予防する方法であって、該抗体、フラグメント又は誘導体は特異的に活性化第ＸＩＩａ因子と結合し、そして活性化第ＸＩＩａ因子とその生理学基質との相互作用を防止し、該被験者は、フレミンガムリスクスコア法を用いて定義された、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８又は３０％より大きい冠状動脈性心臓病の推定リスクを有するところの方法を提供する。本発明はまた、類似の組成物製品及び使用を提供する。本発明は、前記の推定リスクスコアが、フレミンガムリスクスコア法の変法、派生法、改良法又は代替法により計算されるところの関連する方法を包含する。
【００８６】
本発明はまた、望ましくない血栓形成により引き起こされる任意の障害を防止するための同様の方法であって、前記被験者はその障害の同様の高リスク、例えば好適なリスクスコア法を用いて定義された脳卒中の高リスク、を有するところの方法を包含する。
【００８７】
医薬品組成物
本発明は、本発明の抗体、フラグメント又は誘導体を含む有効成分又は本発明の治療剤又は本発明の生体内イメージング剤（まとめて“有効成分”として知られる）を、医薬品として許容可能な担体と組み合わせて含有する医薬品組成物に関する。典型的には、そのような医薬品組成物は、注射液又は輸液のための好適な形態であろう。
【００８８】
該組成物は、単位用量形態で都合よく提供され得、そして製薬学の分野においてよく知られた任意の方法により製造され得る。全ての方法は、有効成分を１種又はそれ以上の副成分を構成する医薬品担体と結合させる工程を含む。一般的に、配合物は均一そして密に、活性成分を液体担体又は微細に分割された固体担体又は両方と結合させることにより製造され、そして次に、必要に応じて、望ましい配合にする。
【００８９】
種々の医薬品として許容可能な担体及びそれらの処方は、標準的な処方の論文、例えば、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによるレミントンの医薬品科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｎｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｎｃｅｓ）に記載されている。また、Ｗａｎｇ、Ｙ．Ｊ．及びＨａｎｓｏｎ、Ｍ．Ａ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  第１０号、Ｓｕｐｐ．４２：２Ｓ（１９８８年）参照のこと。
【００９０】
非経口投与のための配合物は、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬及びその配合物を所定の受容者の血液と等張にする溶質を含み得る水性及び非水性滅菌注射液、そして懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液を含む。該配合物は単位用量又は複数用量容器、例えば封入アンプル及びバイアル、中で提供され得、そして、使用直前に滅菌液体担体、例えば生理食塩水又は注射用水、の添加のみ必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態において貯蔵され得る。即時の注射用溶液及び懸濁液は、上記の種類の滅菌粉末、顆粒及びタブレットより製造され得る。非経口投与のための典型的な組成物は、例えば、マンニトール、１，３−ブタンジオール、水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液のような好適な無毒の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒、又は合成モノ−又はジクリセリドなどのその他の好適な分散又は湿潤剤及び懸濁化剤、及びオレイン酸などの脂肪酸又はクレモホールを含む、注射用溶液又は懸濁液を含む。水性担体は、例えば、約３．０乃至約８．０のｐＨの、好ましくは約３．５乃至約７．４のｐＨ、例えば、３．５乃至６．０、例えば３．５乃至５．０の、等張緩衝剤溶液であり得る。有用な緩衝液は、クエン酸ナトリウム−クエン酸及びリン酸ナトリウム−リン酸、及び酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液を含む。該組成物は好ましくは、有効成分に有害であると知られている化合物を含まないものである。
【００９１】
含み得る賦形剤は、例えば、ヒト血清アルブミン又は血漿製剤のようなその他のタンパク質である。必要に応じ、医薬品組成物はまた、少量の、湿潤剤又は乳化剤、防腐剤、及びｐＨ緩衝剤等、例えば酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレートのような非毒性の補助物質を含み得る。
【００９２】
好ましい単位用量配合物は、有効成分の、ここに前記されたような有効量、又は、その適切な一部を含むものである。
【００９３】
本発明の組成物は、ポンプ（Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻１５２７−１５３３頁、１９９０年；Ｓｅｆｔｏｎ、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｆ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．、１４巻２０７頁、１９８７年；Ｂｕｃｈｗａｌｄ等、Ｓｕｒｇｅｒｙ，８８巻：５０７頁、１９８０年；Ｓａｕｄｅｋ等、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．  Ｍｅｄ．、３２１巻；５７４頁、１９８９年参照）を手段として、または、例えばミニ−ポンプを用いた持続皮下注入により送達され得る。点滴用バッグ溶液もまた採用され得る。適切な用量を選択する際の主要な要因は、全体重の減少分又は脂肪部分対非脂肪分（ｆａｔ  ｔｏ  ｌｅａｎ
ｍａｓｓ）の比により、又は医師により適切と判断された、肥満のコントロール又は予防あるいは肥満に関連した状態の予防のためのその他の基準により測定された、得られた結果である。その他の調整された放出システムは、上記Ｌａｎｇｅｒによる概説において検討されている。本開示のその他の側面において、本発明の化合物は、例えば、米国特許第６，４３６，０９１号明細書；米国特許第５，９３９，３８０号明細書；米国特許第５，９９３，４１４号明細書に記載されている、埋め込み式のポンプを手段として送達される。
【００９４】
薬物又はその他の任意の治療薬の持続的且つ長期間の投与又は注入を被験者に提供するために、埋め込み式輸液用器具が用いられる。本質的にそのような器具は、能動的なもの又は受動的なもののどちらかとして分類され得る。本発明の化合物は、デポー製剤として調合され得る。そのような長期間作用するデポー配合物は、例えば、皮下又は筋肉内埋め込み、又は筋肉注射により投与され得る。したがって、例えば、化合物は、例えば、許容される油脂中のエマルジョンとして；又はイオン交換樹脂；又は難溶性誘導体、例えば難溶性塩として、適切なポリマー物質又は疎水性物質を用いて調合され得る。
【００９５】
治療有効量の本発明の化合物は、ボーラス投与としてのシングルパルスドーズ、又は長
時間投与されるパルスドーズとして投与され得る。したがって、パパルスドーズにおいては、本発明の化合物のボーラス投与がもたらされ、次いで本発明の化合物が被験者に投与される期間があり、次いで第二のボーラス投与がある。特定の、限定されない例においては、本発明の化合物のパルスドーズは、１日の間に、１週間の間に、又は１月の間に投与される。
【００９６】
イメージング剤
本発明は、標識部分に結合した本発明による抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体を含む生体内イメージング剤を、本発明による生体内イメージング剤を被験者に投与し次いで該イメージング剤の標識部分を生体内で検出することを含む該被験者の中の血栓形成の部位を画像化する方法に加えて提供する。そのような剤及び方法は臨床的使用を有するだけでなく、研究手段として、特に血栓形成の非ヒトの動物モデル中の血栓形成の画像化において、使用され得る。画像化システムは、蛍光標識体の結合したイメージング剤を用いる蛍光イメージングのＧＥヘルスケア製ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ（登録商標）装置、生物発光標識又はラジオアイソトープ標識を用いるその他のイメージング装置を含む。本発明は血栓形成の部位において集積するであろうイメージング剤を提供する。この集積は、それが結合している標識の部分とは無関係であり、そして本発明は任意の好適な標識部分を含むイメージング剤を提供する。
【００９７】
治療剤
本発明は、治療化合物に結合した、本発明による抗体又はそのエピトープ−結合フラグメント又は誘導体を含む治療剤、及び、本発明による治療剤を被験者に投与することを含む該被験者の望ましくない血栓生成により特徴付けられる疾患の治療方法を提供する。多くの治療化合物が被験者の中の望ましくない血管形成の治療のために知られている。そのような化合物は、血栓溶解剤又は“クロットバスター”そしてまた血小板凝集の阻害剤を含む。特定の化合物は、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ｔＰＡ、チロフィバン及びクロピドグレルを含む。そのような剤を本発明の抗体又はエピトープ−結合フラグメント又は誘導体と結合させることにより、治療化合物は、血栓形成の部位は活性化第ＸＩＩａ因子の上昇した値を含むであろうため、その様な部位を標的とし得る。治療化合物をそれらが必要としている部位へ向け的を絞る利点は、治療化合物の高い局所濃度に起因するより大きな治療効率、及び化合物の低い全身での濃度に起因する低い副作用を含む。活性化第ＸＩＩａ因子とその生理学的基質との相互作用を阻害することにより、本発明の抗体、そのフラグメント及び誘導体は抗血栓作用を示す。該抗体をさらに抗血栓化合物とカップリングした場合、抗血栓作用の相乗的増加があり得る。
【００９８】
以下の限定されない実施例で本発明を説明する。
【実施例】
【００９９】
実施例
実施例１
経皮経管冠動脈形成術後の動脈再狭窄におけるＸＩＩａ
経皮冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）は、心臓の動脈疾患、例えば、細流に近い状態まで血流を低下し得る脂質、コレステロール及び血中のその他の物質（プラークと呼ばれる）の増加により引き起こされる胸痛、又は動脈を完全に閉塞する大きな血栓に起因する心臓発作、を有する被験者を治療するために使用される種々の手法を包含する。
【０１００】
典型的には、ＰＣＩは、鼠径部中の動脈から心臓の動脈中の問題部分へ向かって、細長いバルーン−チップの管−カテーテル−を通すことにより行われる（これは、経皮経管冠動脈形成術と呼ばれ−またＰＴＣＡ、冠動脈バルーン拡張又はバルーン血管形成としても知られている。）。バルーンは、その後膨らまされ、プラークを圧縮しそして狭窄した冠
動脈を拡張し、それにより血液がより容易に流れ得るようになる。これはしばしば、拡張可能な金属ステントの挿入を伴い得る。ステントはＰＴＣＡ後に動脈を支え広げるために用いられるワイヤーメッシュ状の管である。
【０１０１】
ＰＣＩ後の動脈の再狭窄は、該技術の主な限界であり、そしてそのようなリスクにある被験者を同定及び特別に治療する手段は、非常に有用であろう。
【０１０２】
少なくとも１種の障害に対する選択的ＰＣＩを受けている１１名の被験者が、手術の開始直前（ヘパリン又は造影剤液を投与前）とヘパリン及び造影剤液投与後に採取した血液検体において、測定した活性化第ＸＩＩ因子値を測ってもらった。
全ての被験者は、手術前に３００ｍｇのアスピリンを摂取しそしてＰＣＩ前か又はＰＣＩ直後の何れかにおいて３００ｍｇのクロピドグレルを与えられた。未分画へパリンをＰＣＩ前の全ての被験者に手術直前に投与した［５０００−７５００ＩＵボーラス、ＡＣＴ（活性凝固時間）＞３００秒を達成するように調節して］。局所麻酔の後、大腿部又は橈骨の動脈シースを単一壁エントリー手法（ｓｉｎｇｌｅ−ｗａｌｌ  ｅｎｔｒｙ  ｔｅｃｈｎｉｃｈｑｕｅ）により取り付けた。
【０１０３】
局所麻酔の後、大腿部動脈シースを単一壁エントリー手法により取り付けた。冠動脈造影を全ての被験者において標準的な手法で、カテーテルを経て導入された非イオン性造影剤（Ｉｏｍｅｒｏｎ−Ｒ）を用いて、手術中を通じて数回の注射を適用し、行った。所定のＰＣＩを、モノレールバルーンカテーテルを用いて行った。血液検体を動脈シースより得た。
血液検体は、２０℃において２０００−ｘｇにおいて１５分間遠心分離した。ＸＩＩａの測定を遠心分離後速やかに行った。
【０１０４】
ＸＩＩａ測定を、全ての検体においてマイクロタイタープレートＥＬＩＳＡアッセイを用いて行った。アッセイは、ＸＩＩａと反応するが第ＸＩＩ因子チモーゲンとの検出可能な結合を示さない、高特異的モノクローナル抗体（Ｍａｂ２／２１５）を採用した。
【０１０５】
第ＸＩＩａ因子は、Ｍａｂ２／２１５を１５μｇ／ｍＬにおいてコートしたマイクロタイタープレートを用いて測定した。検体インキュベーション工程は、抗体と結合させるために他の方法では入手し得ないＸＩＩａの放出能を有する、Ｔｒｉｔｏｎのような剤の非存在下で行った。したがって、このアッセイは、ＸＩＩａのみを測定し、ここで、ＸＩＩａ上のエピトープへの抗体の結合は、その他の種と複合体を形成した抗体によって立体的に障害されない。複合体として用いられる抗体は第ＸＩＩ因子チモーゲンに対してもたらされたポリクローナル抗体であった。このポリクローナル抗体は複数のエピトープと反応するが、しかしこの抗体の特に重要な点は、非触媒的βＸＩＩａ重鎖と結合することである。
【０１０６】
これらの１１名の被験者において得られたＸＩＩａ値を表１及び図１に示す。１１名の被験者中１０名はＰＣＩ後の再狭窄の兆候を示さず、一方、１名の被験者（被験者１１）は、ＰＣＩ後３日に再狭窄（緊急の血栓溶解による治療を必要とする）があった。この被験者は、ヘパリン／造影剤液の注入前後の何れにおいてもその他の１０名の被験者と比較して明らかに高いＸＩＩａ濃度を有していた。これらのデータは、開始されたＰＣＩ手術の生理学的インターベンション前の上昇したＸＩＩａは、この被験者が再狭窄のリスクを有したこと示したことを示唆する。これは、再狭窄は上昇したＸＩＩａ濃度の結果であること、そしてＸＩＩａ阻害剤を用いた治療は再狭窄の発生の可能性を減少するであろうことが仮定された。
【０１０７】
表１  待機的ＰＣＩを受けている１１名の被験者において得られたＸＩＩａ値。
【表１】
2009533407.tif 000002
【０１０８】
実施例２
本実施例は、提供された第ＸＩＩａ因子の上昇値が、心筋梗塞及び急性冠症候群が疑われて入院した被験者の死亡を引き起こす全ての増加したリスクと関連付けられることを示す。
【０１０９】
入院した８７１人の被験者についてデータが得られた。各被験者は、第ＸＩＩａ因子を測定してもらった。これらの分析からのデータは、それが、あらゆる原因による死亡の第一次の臨床的エンドポイントの予測を提供するかどうかを解明するために研究された。
【０１１０】
前記分析の予測的有用性は、第ＸＩＩａ因子値を段階付け（最低から最高まで）し、次いで、被検者数を四分割する、即ち、最低の第ＸＩＩａ因子濃度を持つ２５％の個人は四分割の一番目であり、そして最高の第ＸＩＩａ因子濃度を持つ２５％の個人は四分割の四番目であるとすることにより決定された。
【０１１１】
試料をヨウ素−１２５標識化抗体と反応させた後に、ＸＩＩａのフォームは高性能液体クロマトグラフィーを使用して測定された。
【０１１２】
抗体２／２１５のＦａｂ抗体フラグメントは、“イムノピュアＦａｂ調製キット（Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ  Ｆａｂ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）”［ピース（Ｐｉｅｒｃｅ）、３７４７エヌ  メリジアン  ロード（Ｍｅｒｉｄｉａｎ  Ｒｏａｄ）、私書箱１１７、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ、米国］を製造者の使用説明書に従って使用して調製された。Ｆａｂフラグメントは次いで、アマシャム  ファルマシア  バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）［ポラーズ  ウッド（Ｐｏｌｌａｒｄｓ  Ｗｏｏｄ）、ナイチンゲールズ  レイン（Ｎｉｇｈｔｉｎｇａｌｅｓ  Ｌａｎｅ）、チャルフォント  セント  ゲイルズ（Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｓｔ  Ｇｉｌｅｓ）、エイチピー８  ４エスピー、英国］によるヨウ素−１２５を用いて放射性標識化された。
【０１１３】
放射性標識化された抗体１μＬを、多数の健常人ボランティアの各々からの血漿１ｍＬに添加した。４時間インキュベートした後、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、血漿の成分を分離した。使用したＨＰＬＣシステムは、アジレント１１００シス
テムであった。
【０１１４】
ＨＰＬＣのために使用した移動相は、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  トリス塩酸、０．４％（重量／容量）クエン酸三ナトリウム、ｐＨ７，５であった。固定相は、直列の２×３０ｃｍバイオセプ（ＢｉｏＳｅｐ）−ＳＥＣ−Ｓ３０００カラム［フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、クインーズ  アべニュー（Ｑｕｅｅｎｓ  Ａｖｅｎｕｅ）、ハーズフィールド  インダストリアル  エステート（Ｈｕｒｄｓｆｉｅｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｅｓｔａｔｅ）、チェシャー（Ｃｈｅｓｈｉｒｅ）、エスケイ１０  ２ビーエヌ、英国］を含んでいた。流速は０．７ｍＬ／分であり、そして、注入容量は１００μＬであった。
【０１１５】
２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、そして、フロー−カウント  ラジオクロマトグラフィー検出器（Ｆｌｏｗ−Ｃｏｕｎｔ  Ｒａｄｉｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）［ラブロジック（ＬａｂＬｏｇｉｃ）、シェフィールド（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ）、英国］を使用して放射能をモニターすることにより、ＨＰＬＣ溶出液をモニターした。
【０１１６】
分子量標準を流し、そしてこれらと比較することから、ＸＩＩａピークを同定することができた。このピーク（放射能シグナル）の下の面積の積算は、ＸＩＩａの定量的測定を提供した。定量化のキャリブレーションは、ＸＩＩａの３０ｋＤフォーム（βＸＩＩａ）の既知量を持つ標準を流すことにより得られた。
【０１１７】
表２は、異なる追跡調査時点におけるＸＩＩａ濃度と関連付けられる、あらゆる原因による死亡の相対的危険性を示す。全ての場合において、最高のＸＩＩａ濃度を持つ前記被験者は、統計的に有意に増加した死のリスクがあった。これは全ての被験者［心筋梗塞（０．０５ｎｇ／ｍＬより大きい入院時トロポニンＴ（ＴｎＴ）として定義された。）で入院した被験者、しかし特に、トロポニン陰性（０．０５ｎｇ／ｍＬより小さいか又は等しいＴｎＴ）の胸痛で入院した被験者］に当てはまった。図２ないし図４は、全ての被験者［それぞれ、０．０５ｎｇ／ｍＬより大きい入院時ＴｎＴを有する被験者、及び、０．０５ｎｇ／ｍＬより小さいか又は等しい入院時ＴｎＴを有する被験者］に対するカプラン・マイヤー生存プロットを示す。
【０１１８】
表２．ＸＩＩａ濃度に関するあらゆる原因による死亡のオッズ比
【表２】
2009533407.tif 000003
【０１１９】
実施例３
本実施例は、提供された第ＸＩＩａ因子の濃度変化が、心筋梗塞で入院した被験者における第二次の心筋梗塞のリスクと関連することを示す。
【０１２０】
入院した３１５人の被験者についてデータが得られた。血液試料は入院時及び入院４日後に得られた。各被験者は、第ＸＩＩａ因子を測定してもらった。これらの分析からのデータは、第ＸＩＩａ因子の濃度変化が、入院３０日以内の第二次の心筋梗塞の第一次の臨床的エンドポイントの予測を提供するかどうかを解明するために研究された。追跡調査３０日の時点で、２４人の被験者が第二次の心筋梗塞を発症した。
【０１２１】
試料をヨウ素−１２５で標識化抗体と反応させた後に、ＸＩＩａは高性能液体クロマトグラフィーを使用して測定された。
【０１２２】
抗体２／２１５のＦａｂ抗体フラグメントは、“イムノピュアＦａｂ調製キット”［ピアス、３７４７エヌ  メリジアン  ロード、私書箱１１７、ロックフォード、イリノイ、米国］を製造者の使用説明書に従って使用して調製された。これらのＦａｂフラグメントは次いで、アマシャム  ファルマシア  バイオテク［ポラーズ  ウッド、ナイチンゲールズ  レイン、チャルフォント  セント  ゲイルズ、エイチピー８  ４エスピー、英国］によるヨウ素−１２５を用いて放射性標識化された。
【０１２３】
放射性標識化された抗体１μＬを、多数の健常人ボランティアの各々からの血漿１ｍＬに添加した。４時間インキュベートした後、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、血漿の成分を分離した。ＨＰＬＣシステムはアジレント１１００システムであった。
【０１２４】
ＨＰＬＣのために使用した移動相は、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  トリス塩酸、
０．４％（重量／容量）クエン酸三ナトリウム、ｐＨ７，５であった。固定相は、直列の２×３０ｃｍバイオセプ−ＳＥＣ−Ｓ３０００カラム［フェノメネックス、クインーズ  アべニュー、ハーズフィールド  インダストリアル  エステート、チェシャー、エスケイ１０  ２ビーエヌ、英国］を含んでいた。流速は０．７ｍＬ／分であり、そして、注入容量は１００μＬであった。
【０１２５】
２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、そして、フロー−カウント  ラジオクロマトグラフィー検出器［ラブロジック、シェフィールド、英国］を使用して放射能をモニターすることにより、ＨＰＬＣ溶出液をモニターした。
【０１２６】
分子量標準を流し、そしてこれらと比較することから、ＸＩＩａピークを同定することができた。このピーク（放射能活性シグナル）の下の面積の積算は、ＸＩＩａの定量的測定を提供した。定量化のキャリブレーションは、ＸＩＩａの３０ｋＤフォーム（βＸＩＩａ）の既知量を持つ標準を流すことにより得られた。
【０１２７】
前記分析の予測的有用性は、第ＸＩＩａ因子値の変化を段階付け（最低から最高まで）し、次いで、被検者数を四分割する、即ち、入院時と４日後との間に５３ｋＤ第ＸＩＩａ因子濃度における減少が最も大きかった２５％の個人は四分割の一番目であり、そして濃度における増加が最も大きかった２５％の個人は四分割の四番目であるとすることにより決定された。
【０１２８】
ＸＩＩａの濃度変化の分布（ｐＭと表現する。）を図５に示し、そして、ＸＩＩａの５３ｋＤフォームの相対的な濃度変化（入院時の値に対する％変化として表現する。）を図６に示す。
【０１２９】
ＸＩＩａ濃度における変化に基づく発症率を表３に与える。ＸＩＩａ濃度における絶対及び相対変化（入院からの％変化）共に、危険性に強く関連していた。ＸＩＩａ濃度における変化をＱ１と比較した場合、Ｑ４における再発ＴｎＴ陽性発症についてのオッズ比は、入院時の値に対して、絶対変化で１５．３６（ｐ＝０．００４６）であり、そして％変化で１３．９７（ｐ＝０．００６２）であった。それ故、入院時から心筋梗塞の４日後までのＸＩＩａの濃度における変化は、３０日間の追跡調査の間の心筋梗塞を強く予測すると結論される。
【０１３０】
表３．入院時と心筋梗塞４日後の間のＸＩＩａにおける変化に関する、心筋梗塞に対する入院後３０日以内のＴｎＴ陽性心臓発作の発症
【表３】
2009533407.tif 000004
【０１３１】
実施例４
この実施例は、血栓形成における活性化ＸＩＩ因子の関与を説明する、免疫組織化学的染色により動脈血栓の構成成分としての活性化ＸＩＩ因子の存在を実証するものである。
【０１３２】
血栓物質のサンプルを、ノルウェーの地域専門家センターにおいて急性経皮経管冠動脈形成術を受けている個人の心臓動脈から入手した。活性化ＸＩＩ因子の検出のため適切な対照として機能させるため、一連のその他の組織もまた入手した。倫理委員会の承認及び被験者のインフォームドコンセントをこの研究のために得た。
【０１３３】
組織検体（血栓物質を含む）を、ダコ・エンビジョン免疫組織化学システムと結合したこの分子に特異的な抗体を用いて第ＸＩＩａ因子の存在を試験した。
【０１３４】
免疫組織化学的染色に先立ち、組織は固定されそして処理された。固定は、切除組織の自己分解、壊死を防止し、そして検体の抗原性を保つ。検体は１０％中性リン酸緩衝ホルマリンを用いて固定した。固定の後、処理を自動組織処理装置を用いて完了させた。組織は、段階的アルコール溶液を用いて脱水し、キシレンを用いて除去しそしてパラフィンワックスを浸透させた。次いで、該組織をカセット中のパラフィンワックスで包埋した。
【０１３５】
包埋した組織をミクロトームを用いて切片としそして組織切片を清潔なスライドグラスに収集した。検体をオーブン中で５６℃において６０分間のインキュベーションにより乾燥させた。染色に先立ち、組織スライドはキシレン浴中にスライドを置き、そして５分間インキュベートことにより脱パラフィンをした。スライドは次に、第二の新しいキシレン浴に置きそしてさらに５分間インキュベートした。余分な液体をスライドから落としそして次いでこれらを純アルコール浴中に３分間置いた。余分な液体を落とし、そしてスライドを第二の新しい純アルコールを含む浴中に置いた。余分の液体をスライドから落とし、そして次いでこれらを９５％アルコール浴に３分間置いた。余分の液体を落としそしてスライドを第二の新しい９５％ルコールを含む浴中に置いた。余分の液体を落としそしてスライドを蒸留水中に６０秒置いた。次いでスライドを０．０５Ｍのトリス緩衝生理食塩液ｐＨ７．４中に処理の次の段階まで保存した。
【０１３６】
余分の緩衝液を組織切片が取り付けられたスライドから落とした。標本周りのくずのない組織を注意深く拭き取ることでいかなる余分の液体も除去された。標本は、ダコ・サイトメーション製ペルオキシダーゼブロック試薬を用いて覆い、そして５分間インキュベートした。
【０１３７】
次いで該組織検体は洗浄ボトルからの０．０５Ｍトリス緩衝生理食塩液でゆるやかにすすぎ、そして０．０５Ｍトリス緩衝生理食塩液を含む新しい緩衝液浴中に置いた。
【０１３８】
次の工程を始めるにあたり、余分の緩衝液を組織切片が取り付けられたスライドから落とした。標本周りのくずのない組織を注意深く拭き取ることでいかなる余分の液体も除去された。標本は、０．０５Ｍトリス塩酸、ｐＨ７．４の１％ウシ血清アルブミン（ダコ・サイトメーション製エンビジョン抗体希釈剤、コードS０８０９）を含む、１０μｇ／ｍ
Ｌの２／２１５モノクローナル抗体を用いて
覆い、そして３０分間インキュベートした。
【０１３９】
複製した検体を、２／２１５の代わりに対照抗体として作用する対照抗体で、インキュベートした。陰性対照抗体は、ハムスターＩｇＧ（シグマ製Ｈ２４１２）に向けたマウスモノクローナル抗体（２／２１５と同じサブクラス）であり、そして濃度及びインキュベーション時間は２／２１５抗ＸＩＩａ抗体のために用いられるものと同様とした。更なる陰性対照はダコ・サイトメーション製の一般陰性対照（コードＮＰ０１５）を用いて行った。
【０１４０】
第一の抗体を用いた３０分間のインキュベーションの後、該組織検体は洗浄ボトルからの０．０５Ｍトリス緩衝生理食塩液でゆるやかにすすぎ、そして０．０５Ｍトリス緩衝生理食塩液を含む新しい緩衝液浴中に置いた。
【０１４１】
次の工程を始めるにあたり、余分の緩衝液を組織切片が取り付けられたスライドから落とした。標本周りのくずのない組織を注意深く拭き取ることでいかなる余分の液体も除去された。標本は、ダコ・サイトメーション、エンビジョン（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ）標識ポリマーを用いて覆い、そして３０分間インキュベートした。該組織検体は洗浄ボトルからの０．０５Ｍトリス緩衝生理食塩液でゆるやかにすすぎ、そして０．０５Ｍトリス緩衝生理食塩液を含む新しい緩衝液浴中に置いた。
【０１４２】
余分の緩衝液を組織切片が取り付けられたスライドから落とした。標本周りのくずのない組織を注意深く拭き取ることでいかなる余分の液体も除去された。標本は、製造者の指示により再構成されたダコ・サイトメーション製エンビジョン液体ＤＡＢ＋基質クロマゲン溶液を用いて覆い、そして１０分間インキュベートした。検体はここで洗浄ボトルからの蒸留水でゆるやかにすすいだ。
【０１４３】
検体は、ここでヘマトキシリン浴中に２分間浸すことより対比染色し、次いで蒸留水浴中で緩やかにすすいだ。スライドはそして０．０３７Ｍアンモニアを含む浴中へ浸し、そして次に蒸留水浴で５分間すすいだ。標本を次に、非水溶性の永久封入剤を用いて装着し、カバースリップした。
【０１４４】
標本を次に免疫化学的（ＩＨＣ）染色の存在を顕微鏡で観察し（褐色の染色としての痕跡）、そしてその結果を表４にまとめた。
【０１４５】
モノクローナル抗体２／２１５（抗第ＸＩＩａ因子）を用いた場合かなりのＩＨＣ染色が、血栓物質において現われたが、対照抗体を用いた場合はこの組織中の如何なる染色も現われなかったので、第ＸＩＩａ因子が動脈血栓の重要成分であることが含まれ得る。観測された広範囲の染色は、活性化ＸＩＩ因子が高濃度で存在することを示し、そしてしたがって、活性化ＸＩＩ因子は血栓形成及び／又は安定化において重要な役割を果たすと結論付けるのは妥当である。
【０１４６】
表４  ２／２１５抗第ＸＩＩａ因子及び陰性対照抗体を用いた、異なる組織検体の免疫組織化学的染色からの結果。
【表４】
2009533407.tif 000005
【０１４７】
実施例５
この実施例は、血栓形成における活性化第ＸＩＩ因子の関与を説明する、ホモジナイズした組織のＥＬＩＳＡにより動脈血栓の構成成分としての活性化第ＸＩＩ因子の存在を実証するものである。
【０１４８】
血栓物質のサンプルを、ノルウェーの地域専門家センターにおいて経皮経管冠動脈形成術を受けている個人の心臓動脈から入手した。倫理委員会の承認及び被験者のインフォームドコンセントをこの研究のために得た。
【０１４９】
９２ｍｇの動脈血栓の検体をオムニ（Ｏｍｎｉ）ハードティシューチップホモフィナイジングキットを用いてホモジナイズし、ホモジネートの最終容量は９２０μＬであった。
【０１５０】
組織ホモジネートは、それぞれの希釈の総組織質量／容量含有量は、１００ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬになるように連続希釈を行った。
【０１５１】
モノクローナル抗体２／２１５は、Ｎｕｎｃ（ナンク  エスー／エー、カルスルプエ（ＮｕｎｃＡ／Ｓ、Ｋａｒｕｓｔｒｕｐｕｅｊ）９０、私書箱２８０、４０００ロスキレ、デンマーク）マキシソルブ（Ｍａｘｉｓｏｒｂ）マイクロプレート（ウェルあたり１００μＬの抗体をコートした）上に、炭酸コーティング緩衝液ｐＨ９．６中に１５μｇｍＬ-1の濃度においてコートした）。Ｔｒｉｔｏｎｘ−１００（シグマ、ファンシーロード、プール、ドーセット、英国）を用い最終Ｔｒｉｔｏｎ濃度が０．５％（ｖ／ｖ）となるよう添加した各組織ホモジネート希釈液の１００μＬをマイクロタイタープレートのウェルへ添加し、そして室温において６０分間インキュベートした。マイクロタイタープレートのウェルを洗浄した後、１００μＬの結合体を添加した。この結合体は、アルカリホスファターゼと結合させたモノクローナル抗体２０１／９を含む。６０分間のインキュベーションの後、マイクロタイタープレートのウェルを再び洗浄しそして１００μＬのフェノールフタレインリン酸塩を含む基質溶液を添加した。室温において６０分間のインキュベーションの後、反応を強塩基性溶液（５０ｇ／Ｌ炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．５）の添加によって停止させ、そして５５０ｍにおける吸光度を測定した。βＸＩＩａの標準溶液（０、１、２．５、５及び１０ｎｇ／ｍＬ）もまたアッセイをおこなった。結果を表５に示す。全ての血栓ホモジネート希釈液は、高濃度の活性化第ＸＩＩ因子を含有することを示す、最も高いβＸＩＩａ標準液でのものよりも高い吸光度を与えた。
【０１５２】
表５．ホモジナイズした動脈血栓のＥＬＩＳＡからの吸光度。
【表５】
2009533407.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】図１は、選択的ＰＣＩを受けている被験者１１名における血漿第ＸＩＩａ因子の値を示す図である。
【図２】図２は、胸痛により入院した被験者８７１名における血漿第ＸＩＩａ因子値の四分割に関する１２ヶ月の生存データを示す図である。
【図３】図３は、胸痛により入院した被験者で血漿ＴｎＴ＞０．０５ｎｇ／ｍＬであった図２に示した被験者のサブグループの血漿第ＸＩＩａ因子値の四分割に関する１２ヶ月の生存データを示す図である。
【図４】図４は、胸痛により入院した被験者で血漿ＴｎＴ≦０．０５ｎｇ／ｍＬであった図２に示した被験者のサブグループの血漿第ＸＩＩａ因子値の四分割に関する１２ヶ月の生存データを示す図である。
【図５】図５は、心筋梗塞での入院から４日間の被験者群の血漿第ＸＩＩ因子濃度において観測された変化を示す図である。
【図６】図６は、図５において示された同じデータを血漿第ＸＩＩａ因子濃度における百分率変化として示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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